(57)【要約】哺乳動物、たとえばヒト被検者における、細胞特異的抗原を検出し、定位する方法であって、ＰＢＭＣ中のＴリンパ球を抗原特異的活性化する条件で、該哺乳動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗原の免疫原性ペプチドエピトープに暴露し、それによって、該細胞特異的抗原に少なくとも結合する抗原特異的Ｔリンパ球を生じさせることを含む方法を開示する。標識された抗原特異的Ｔリンパ球は、一般に、ＩＬ−２なしで、哺乳動物に腹腔内または静脈内投与される。該哺乳動物におけるこれらの細胞の分布は、画像化によって確定され、それによって、哺乳動物内の細胞特異的抗原を検出し、定位する。ＰＢＭＣの免疫原性ペプチドへの暴露は、一般に、無細胞ペプチド調製物およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含むが、さらなる細胞たとえば別々に抗原パルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含まない。抗原特異的Ｔリンパ球は、一般に、細胞特異的抗原を発現している細胞に対して細胞溶解性であり、またＣＤ４＋、ＣＤ８＋、および／またはＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、細胞特異的抗原を検出して定位する方法であって、
（ａ）前記哺乳動物から末梢血単核細胞を得るステップ、
（ｂ）前記末梢血単核細胞中のＴリンパ球が抗原特異的活性化を受け、それによって前記細胞特異的抗原に結合する抗原特異的Ｔリンパ球を生じる条件で、前記末梢血単核細胞を、前記細胞特異的抗原の免疫原性エピトープを提示するペプチドに暴露するステップ、
（ｃ）前記抗原特異的Ｔリンパ球を、画像化により検出可能な標識で標識し、それによって標識された抗原特異的Ｔリンパ球を生じさせるステップ、
（ｄ）前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球を、前記哺乳動物に投与するステップ、および
（ｅ）前記哺乳動物における、前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球の分布を、画像化により確定し、それによって、哺乳動物における前記細胞特異的抗原を検出し、定位するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記末梢血単核細胞を、前記ペプチドに暴露する、前記ステップ（ｂ）が、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記末梢血単核細胞を前記ペプチドに暴露する前記ステップ（ｂ）が、前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球を前記哺乳動物に投与するステップ（ｄ）の前に、さらなる細胞を前記末梢血単核細胞に加えずに、前記ペプチドの無細胞調製物を前記末梢血単核細胞に加えることによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原特異的Ｔリンパ球が、前記細胞特異的抗原を発現する細胞に対して細胞溶解性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原特異的Ｔリンパ球が、ＣＤ４＋リンパ球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原特異的Ｔリンパ球が、ＣＤ８＋リンパ球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原特異的Ｔリンパ球が、ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原特異的Ｔリンパ球が、ごく少量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球を前記哺乳動物に投与するステップ（ｄ）が、前記Ｔリンパ球とともに実施されるか、またはその後、前記哺乳動物における前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球の分布を確定するステップ（ｅ）を実施する前に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球を、前記哺乳動物に投与するステップ（ｄ）が、前記リンパ球を腹腔内に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識された抗原特異的Ｔリンパ球を前記哺乳動物に投与するステップ（ｄ）が、前記リンパ球を静脈内に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複合糖質を前記哺乳動物に投与せずに前記リンパ球を投与するときと比較して、前記リンパ球を静脈内に投与することが、前記リンパ球の前記トラフィックが変化するように複合糖質を前記哺乳動物に投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
複合糖質を投与することを含む複合糖質を投与することが、アシアロオロソムコイドを投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
複合糖質を投与することを含む複合糖質を投与することが、オロソムコイドを投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記細胞特異的抗原が腫瘍特異的抗原であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、ヒトムチン１（ＭＵＣ−１）のエピトープを提示する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗原特異的Ｔリンパ球が、ＭＵＣ−１の前記エピトープを担持する細胞に対してＭＨＣ非制限的細胞障害性を示すＣＤ４＋リンパ球を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＵＣ−１のエピトープを提示する前記ペプチドが、配列ＰＤＴＲＰを含むＭＵＣ−１配列の円形順列であるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドが、アミノ酸配列ＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が、γエミッタ、ポジトロンエミッタ、磁性材料、密度ベースの造影剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識が、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、およびそれらの混合物からなる群から選択されるγエミッタである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識がインジウム−１１１である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記画像化が、ラジオイメージング、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層画像法およびＸ線コンピュータ断層画像法からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記画像化が、シングルスキャンおよび連続スキャンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記画像化が、前記哺乳動物の全身スキャンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記画像化が、少なくとも２つの別々のスキャンを含み、前記別々のスキャンのそれぞれが、ポジトロン放出断層画像法およびＸ線コンピュータ断層画像法からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
２つ以上の別々のスキャンから得られる画像化データが比較される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
２つ以上の別々のスキャンから得られる画像化データが、１つの表示画像に融合される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６０／４１７，３０３号（全ての目的のために、参照によりその全てを本明細書に組み入れる）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、診断および治療を含む、臨床医学の分野である。本発明は、細胞特異的抗原、たとえば腫瘍特異的エピトープに対して作られた活性化リンパ球、それらが感作された腫瘍エピトープに遊走して付着する能力、非常に小さい腫瘍の定位を高めるこれらの細胞の能力の使用、および既知の免疫原性エピトープを有する未知の原発腫瘍、特にムチン産生性腺癌の同定における、それらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
造影剤または抗体を使用して、損傷していないの人体内のリンパ組織等の組織を画像化する方法は公知である。たとえば、１９８８年４月５日に発行の、ゴールデンバーグに付与された米国特許第４，７３５，２１０号は、リンパ系造影法および器官造影法ならびにキット、特に、特異的抗体造影剤を用いて作成された陽画像から、グロス（ｇｒｏｓｓ）造影剤を使用して作成された陰性画像の控除を含む、リンパ管シンチグラフィーまたは磁気共鳴リンパ系造影法の改良された方法を開示している。この発明の別の実施形態は、リンパ管用造影剤としてリンパ組織に対する抗体を使用する。さらなる実施形態は、磁気共鳴リンパ系造影法向けの磁気共鳴画像法強調剤を使用する。また別の実施形態は、シンチグラフィー画像および磁気共鳴器官画像用の器官抗原に対する標識抗体を使用する。
【０００４】
人の全身の、放射標識された細胞、たとえばリンパ球の画像化も周知である。たとえば、Ｗａｇｓｔａｆｆ，Ｊ．ら、「インジウム−１１１オキシン標識を使用した、ヒトリンパ球トラフィックを追跡する方法（Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｄｉｕｍ-１１１  ｏｘｉｎｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）」、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３月；４３（３）：４３５−４４２（１９８１ａ）は、多数のヒトリンパ球を末梢血から分離して、インジウム−１１１オキシンでｉｎ  ｖｉｔｒｏ標識される方法を開示している。自己再注入後、連続血液サンプル、表面プローブカウントおよびガンマカメラ画像法を使用して、体内分布を追跡する。筆者は、リンパ系構造の優れた解像力は、ガンマカメラ画像法を使用して得られ、また器官分布で記録される変化は、リンパ球遊走の動物モデルのデータと関連していることを報告する。したがって、ヒトリンパ球のインジウム−１１１オキシン標識は、ヒトリンパ球の遊走特性を追跡することができる非侵襲的方法を提供する。Ｗａｇｓｔａｆｆ，Ｊ．ら、「インジウム−１１１オキシン標識により評価されるヒトリンパ球トラフィック：臨床観察（Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｉｕｍ-１１１  ｏｘｉｎｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ）」、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：４４３−４４９（１９８１ｂ）は、ヒト末梢血リンパ球のインジウム−１１１オキシンを使用した臨床試験を開示している。ガンマカメラ画像法上の骨髄および肝臓局在性の生理学的意義が論議され、また結果を解釈するときに、研究中のリンパ球の表面マーカーの特徴を考慮する重要性が強調されている。
【０００５】
様々なリンパ球様細胞が、末梢血中に存在する異なるタイプの細胞を含む、哺乳動物全身の画像化に使用されてきた。たとえば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｃ．Ｗ．らによる、「ラットにおけるナチュラルキラー活性。ＩＶ。静脈内および腹腔内移入後の大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）の分布（Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ.  ＩＶ.  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  （ＬＧＬ）  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８６：３７１−３８０（１９８４）は、ラット大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）およびＴリンパ球の非常に富化した個体群が、パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）の不連続密度勾配で作製され、111Ｉｎ−オキシンまたは51Ｃｒのいずれかで標識され、正常な同系レシピエントに静脈内（ｉｖ）または腹腔内（ｉｐ）のいずれかで注射されたことを開示している。正常なレシピエントに標識されたＬＧＬまたはＴ細胞をｉｖ接種した後、放射能の大部分（１８〜３３％）が、数分内に肺に回収された。移入の２〜４時間後の間、Ｔ細胞（６．４％）より有意に多いＬＧＬ（１３．５％）が肺に残存していた。この差は、４８時間まで持続した（５．４％対０．８％）。肺における放射能のレベル低下は、脾臓および肝臓で、相当するカウントの増加を伴った。早い時点で、有意に高い比率のＴ細胞が、脾臓内に分布し、標識ＬＧＬは、血中ならびに肺の中に長時間存続した。正常なレシピエントにｉｐ接種した後、放射標識されたＬＧＬおよびＴ細胞の腹腔からのクリアランスは緩徐であり、放射標識の２０％未満が、２４時間の間、末梢器官内に存在した。これらの結果は、既報の、様々な器官におけるこれらの細胞の比率に似た、ＬＧＬおよびＴ細胞の分布パターンを示すと考えられた。
【０００６】
一般に養子リンパ球移入または養子免疫療法として知られる手順である、様々な条件で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションにより細胞障害性にした後、放射標識も使用して、様々な癌患者に注入された自己「キラー」血液単球の分布が解明されてきた。たとえば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｈ．Ｃ．らによる、「腹膜癌腫症患者の腹腔内に養子的に移入されたγ−インターフェロン−活性化キラー血液単球の運命（Ｆａｔｅ  ｏｆ  ｇａｍｍａ-ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓ）」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：６１００−６１０３（１９８７）は、腹膜表面に広範囲に転移している結腸直腸癌患者５例を、ヒトγ−インターフェロンとのｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションにより細胞障害性にさせた自己血液単球の注入によりｉ．ｐ投与したことを開示している。血球成分除去法（ｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）および逆流遠心浄化法（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）の組合せによって、単球を精製した；養子免疫療法として、単回ｉ．ｐ．点滴注入法により、毎週およそ３億５０００万個の活性化単球を患者に与えた。処置の第８サイクルで、細胞を111Ｉｎで予め標識することにより、ｉ．ｐ．注入された血液単球のトラフィックを、患者２例で試験した。これらの活性化細胞は、腹腔内に広く分布した。注入の２日後および５日後に、腹膜内のそれらの位置は変化していなかった。111Ｉｎ−標識単球注入の３６時間後に腹膜検体を得たとき、標識単球は、漿膜表面と結びついていることが、オートラジオグラフ分析で証明された。ｉ．ｐ．注入された111Ｉｎ−標識単球は、５日間の試験の間に他の器官にトラフィックしないことが、腹腔外の構造をシンチスキャンすることによって分かった。著者は、自己キラー血液単球のｉ．ｐ．養子移入は、これらの細胞障害性細胞を、これらの癌患者の腹膜表面の腫瘍担持部位に送達する有効な方法であると、結論づけた。
【０００７】
キラーリンパ球の画像化に関する別の報告書、Ｓｗｉｆｔ，Ｒ．Ｉ．らによる、「腫瘍活性化キラーリンパ球を用いた、転移性結腸直腸癌の画像化（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｕｒ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）」Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：１５１１−１５１２（１９９１）は、転移性結腸直腸癌患者６例からリンパ球を採取し、原発腫瘍患者由来の細胞と共に培養して、腫瘍活性化キラー（ＴＡＫ）リンパ球を生じさせたことを開示している。これらの研究者は、転移を可視化するために、各患者に111Ｉｎ標識ＴＡＫ細胞を再注入した。注入の４８時間後まで、γ−カメラで撮像した。肺では早くも４時間に、また腹部では４８時間にようやく、転移が明らかになった。肝画像は、転移性病変に相当する『コールド』スポットを示した。リンパ節は可視化されなかった。自己結腸直腸腫瘍に対して生じさせたＴＡＫ細胞の再注入により、転移部位が明らかにされる。ＴＡＫ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後、ＩＬ−２を必要としないことにも、著者は注目した。
【０００８】
同様に、腫瘍細胞によりｅｘ  ｖｉｖｏ刺激された様々なタイプの放射標識自己末梢血リンパ球の分布が、放射標識細胞の画像化によって決定されている。一例として、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｒ．Ｐ．およびＢ．Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，「腫瘍感作された（「教化された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）」）、放射標識リンパ球の、腫瘍定位のための利用」Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．９：７８３−７８６（１９８８）は、照射を受けた自己腫瘍細胞の存在下で、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を共培養したとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害性特性によって示される通り、該ＰＢＬを、該腫瘍に感作（または、恐らくより正確には、再感作）できることを開示している。該細胞を、インターロイキン−２の存在下で増殖させ、111Ｉｎで放射標識し、細胞ドナーに注入し戻すことができる。この技術を使用して、患者７例中５例で、腫瘍沈着が定位された。この研究の延長で、Ｍｕｋｈｅｒｊｉ，Ｂ．らによる、「ヒト癌における、事前にｉｎ  ｖｉｔｒｏ感作し、インターロイキン−２増殖させた自己リンパ球のイメージングパターン（Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-２  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ）」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄ  Ａｐｐｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍ  Ｂ，１５：４１９−４２７（１９８８）は、ラジオイムノ検出および養子免疫細胞療法の代替法の有力候補として、転移性癌患者７例で試験した、自己腫瘍に（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）対して感作したリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏパターンを開示している。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）で活性化するか［リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞］、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養（ＩＶＣ）により自己腫瘍細胞に感作させて、ＩＬ−２で増殖させるか（教化（ｅｄｕｃａｔｅｄ）細胞）のいずれかであった。次いで、両者を111Ｉｎで標識した。標識された自己細胞（１×１０7〜５×１０8）を患者に投与し、様々な時間間隔で、ガンマカメラで、画像化することにより、生体内分布を研究した。４／７例で、「教化」細胞を用いた画像化は、臨床的に検出可能な転移性腫瘍と正の相関関係を示す部位に、放射能の集積を示した。それに反して、ＬＡＫ細胞を用いた場合には、わずか１例で積極的な取り込みが認められただけであった。教化リンパ球は、自己腫瘍細胞に対して細胞障害性であり、また該教化細胞の細胞障害反応性は、ＩＬ−２中での連続培養で、４〜６週間維持された。放射標識された教化自己細胞がＬＡＫ細胞より有意に高い頻度で蓄積するという証拠は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖した教化ＰＢＬが、ヒト癌のラジオイムノ検出のよりよい候補であり得ること、およびこのような教化自己ＰＢＬの連続培養が、これらのエフェクタ細胞を反復投与するためのソースになり得ることを示唆すると考えられる。
【０００９】
養子免疫療法および放射標識による人体内の画像化に使用されてきた別のタイプのリンパ球様細胞は、たとえば、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらにより開発された、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。一例として、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｂ．らによる、「転移性黒色腫患者における、養子移入されたインジウム−１１１標識腫瘍浸潤リンパ球の腫瘍局在性（Ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｉｎｄｉｕｍ-１１１  ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ）」、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．７：２５０−２６１（１９８９）は、ヒト腫瘍内に浸潤するリンパ球様細胞は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有する培地でｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖させることができることを開示している。著者は、インジウム１１１（111Ｉｎ）オキシンで標識して注入されたＴＩＬは、トラフィックして腫瘍の転移性沈着に局在できるかどうかを調査した。皮下疾患、結節性疾患、および／または内臓疾患の複数の部位を有する転移性悪性黒色腫患者６名が、この研究の被験者であった。患者は、ＴＩＬの静脈内（ＩＶ）注入の３６時間前にシクロホスファミドの投与を受け、続いて８時間ごとに、ＩＬ−２  ＩＶを受けた。ＴＩＬの分布および局在性は、連続全身ガンマカメラ画像法、連続血液および尿サンプリング、および腫瘍および正常組織の連続生検を使用して評価した。111Ｉｎ標識ＴＩＬは、活性の注入後２時間以内に肺、肝臓、および脾臓に局在化した。肺における放射能は、２４時間以内に減少した。画像化試験または生検標本のいずれかまたはその両者を使用して、111Ｉｎ標識ＴＩＬ注射の早くも２４時間後に、患者全６例で転移性沈着部位へのＴＩＬの局在化が証明された。腫瘍組織生検における111Ｉｎ活性は、正常組織における活性より３〜４０倍大きい範囲であった。腫瘍沈着部位で、放射能カウントの漸増が見られた。この研究から、標識ＴＩＬは、腫瘍に優先的に局在化することができ、したがって、ＴＩＬの治療効果の可能なメカニズムに関する情報を提供することができる。
【００１０】
他起源のＴＩＬおよびリンパ球様細胞を用いた画像化の比較を含む、養子免疫療法に関する多くのさらなる研究が報告されている。たとえば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｋ．Ｄ．らによる、「転移性黒色腫患者における、養子移入されたインジウム−１１１標識腫瘍浸潤リンパ球および末梢血リンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ分布」、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１：１７０９−１７１７（１９８９）は、ガンマカメラ画像法および生検を使用して、シクロホスファミド（ＣＰＭ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いた治療を受けている転移性黒色腫患者を、彼らの111Ｉｎ標識ＴＩＬまたは末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が、腫瘍部位に局在化できる力について試験したことを開示している。放射標識ＴＩＬの１９注入を患者１８例に投与し、同時に、患者５例は、ＴＩＬ治療中に、放射標識した自己ＰＢＬを受けた。111Ｉｎ−ＴＩＬレシピエントに対して実施された１８の核スキャンシリーズ中１３で、はっきりとした腫瘍局在性が見られたが、111Ｉｎ−ＰＢＬ投与患者では、４つのスキャンシーケンスのうち１つだけが、腫瘍が画像化された。患者１例を、ＣＰＭ、ＴＩＬ、およびＩＬ−２の３連続治療コースに対する核スキャンで試験した。該患者は、最初、111Ｉｎ−ＴＩＬにより、幾つかの部位における明白な腫瘍局在性を示し、次いで、111Ｉｎ−ＰＢＬにより、一部位におけるかすかな局在性を、その後、繰り返し111Ｉｎ−ＴＩＬ注入で、複数の部位における陽性腫瘍画像化を示した。以上の結果により、ＣＰＭ前投与およびその後に続くＩＬ−２と共に移入されたヒトＴＩＬは、腫瘍部位に優先的に局在するという、我々の初期データを確認するとともに拡大し、またこの局在性は、ＰＢＬよりＴＩＬで大きいことを示す。
【００１１】
ＴＩＬを用いたさらなる画像化試験としては、Ｃｈｉｎ．Ｙ．らにより、「癌患者における、放射標識された腫瘍浸潤リンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ分布（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏ-ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ７：２７−３０（１９９３）などがあり、処置における腫瘍浸潤リンパ球の効果を評価するために、これらのリンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ遊走および分布を研究しようと試みたことを開示している。悪性の転移性乳癌または黒色腫に罹患した患者５例から単離され、低用量の組換えインターロイキン−２を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養し、増殖させた腫瘍浸潤リンパ球を、111インジウム−オキシンで標識し、該患者に注入した。大観ガンマカメラを使用して、注入されたＴＩＬの分布および局在性を評価した。肺における111Ｉｎ標識ＴＩＬの局在化は、注入後２時間以内に見られ、また２４時間に、肺、肝臓および脾臓で、高レベルの放射能が確認された。肺における放射能は、７２時間後に減少した。転移部位で、111Ｉｎ標識ＴＩＬの特異的局在化は確認されなかった。
【００１２】
ＴＩＬ画像化のもう１つの研究は、Ｐｏｃｋａｊ，Ｂ．Ａ．らによる、「養子免疫療法を受けている患者における、111インジウム標識腫瘍浸潤リンパ球の腫瘍への局在。シクロホスファミドによる増強および応答との相関（Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  111Ｉｎｄｉｕｍ-ｌａｂｅｌｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ.  Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」、Ｃａｎｃｅｒ  ７３：１７３１−１７３７（１９９４）に開示されており、インターロイキン−２（ＩＬ−２）培養腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入は、転移性黒色腫患者で、腫瘍退行を引き起こす可能性があることを開示している。ガンマカメラ画像法および生検で、高用量ＩＬ−２およびＴＩＬを受けている転移性黒色腫患者３８例を、自己の111Ｉｎ標識ＴＩＬが、転移性腫瘍沈着に局在できる能力について試験した。ガンマカメラ画像法で、111Ｉｎ標識ＴＩＬによる腫瘍局在化が２６（６８．４％）の治療コースでみられた。ＴＩＬトラフィックに影響する因子の単変量解析で、シクロホスファミド投与は、放射性核種画像化により腫瘍を定位できる力と有意に関連していた（Ｐ２=０．０２６）。著者は、ｔ111Ｉｎ−ＴＩＬで腫瘍が画像化されなかった患者では、臨床応答がみられなかったため、腫瘍における局在化は、ＴＩＬ抗腫瘍活性のメカニズムにおいて重要であり、またＩＬ−２治療前のシクロホスファミド投与および多数のＴＩＬ投与は、腫瘍へのＴＩＬ局在化の頻度を向上させると考えられるという結論を下した。
【００１３】
ＴＩＬの画像化はまた、Ｄｉｌｌｍａｎ，Ｒ．Ｏ．により、「転移性腎細胞癌腫、黒色腫、および結腸直腸癌に罹患した患者における、インジウム−１１１で標識した腫瘍浸潤リンパ球による腫瘍定位（Ｔｕｍｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｉｕｍ-１１１  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ,  ｍｅｌａｎｏｍａ,  ａｎｄ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１２：６５−７１（１９９７）にも開示されている。この論文は、自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた養子免疫療法における問題点は、このような細胞が、静脈内注入後に実際に腫瘍部位に遊走するかどうかであることを開示している。著者は、転移性黒色腫患者における放射標識ＴＩＬの腫瘍取り込みに関して数報のレポートがあったことに注目したが、他の腫瘍タイプで放射標識ＴＩＬを用いて腫瘍を可視化する努力は不成功に終わったと報告されている。ここで、転移性癌患者８例（腎５例、黒色腫２例、結腸１例）は、５００μＣｉインジウム−１１１に結合され、インターロイキン−２（ＩＬ−２）と同時投与された、５０００万個のＴＩＬを含む、２〜１０００億個の自己ＴＩＬの静脈内注入を受けた。患者１例は、ＴＩＬの１日前に１ｇｍ／ｍ2のシクロホスファミドを受け；患者７例は、ＴＩＬを受ける前に４日間、インターフェロンα２ｂを受けた。単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を含む、全身ガンマカメラ画像法を、２４時間および４８時間に実施した。患者全８例は、111インジウム標識ＴＩＬの、１つ以上の既知の腫瘍部位内への取り込みを示した。画像化されなかった既知の腫瘍部位はなかった。画像化された転移部位は、骨、脳、縦隔リンパ節、肺門リンパ節、肺および肝臓実質、腹部大動脈周囲リンパ節、および骨盤内腫瘤を含んでいた。患者１例は、明白な疾患を呈していなかったとき、ＴＩＬスキャン陰性であったが、数週間後、液窩再発の診断につながるＴＩＬスキャン陽性を示したため、陰性対照の役割をした。著者は、転移性腎細胞癌腫および他の癌腫による放射標識ＴＩＬの取り込みは、ＣＤ８＋であろうとＣＤ４＋であろうと、既報の黒色腫における取り込みと類似しているという結論を下した。シクロホスファミドの前投与は、画像化の必要条件ではなく、またＴＩＬ取り込みは、腫瘍応答を予見するものではなかった。
【００１４】
リンパ系組織を含む疾患を有する患者の末梢血に由来するリンパ球はまた、該疾患の病期決定の補助として、体内の画像化のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激なしで放射標識されてきた。一例として、Ｇｒｉｍｆｏｒｓ，Ｇ．らによる、「ホジキン病における病期決定方法としての、インジウム−１１１オキシン標識自己リンパ球の腫瘍画像化（Ｔｕｍｏｕｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｕｍ-１１１  ｏｘｉｎｅ-ｌａｂｅｌｌｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）」Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．４２：２７６−２８３（１９８９）は、ホジキン病（ＨＤ）患者３５例で、インジウム−１１１オキシン標識自己リンパ球注入後、３９のリンパ球シンチグラフィを実施したことを開示している。リンパ球は、白血球アフェレーシスおよびリンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）勾配遠心法後に得て、単球を排除するために、付着ステップでさらに精製した。中央値１．２（０.２〜３．７）×１０9細胞を、６．７（１．９〜１６．６の範囲）Ｍｂｑのインジウム−１１１オキシンで標識し、該患者に再注入した。ＧＥ  ４００  ＡＴで、ガンマカメラ画像法を実施した。リンパ節腫大を示す６１部位中５４部位で、放射能の蓄積が見られた。放射能増加はまた、以前に腫瘍の臨床証拠がなかった１６部位でも見られた。これらの著者は、データは非常に有望のようであり、方法論がさらに改良されれば、リンパ管シンチグラフィーは、病期決定手順およびＨＤ患者のフォローアップにおける重要な補足物になる可能性があることを示唆している。
【００１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化しない放射標識末梢血リンパ球の画像化は、他のリンパ性悪性腫瘍でも使用されてきた。たとえば、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．による、「リンパ性悪性腫瘍患者における、インジウム−１１１オキシン標識ヒト末梢血単核細胞のＩｎ  ｖｉｖｏ追跡（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｃｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｕｍ-１１１  ｏｘｉｎｅ-ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．３０：１００５−１０１１（１９８９）は、［111Ｉｎ］オキシン標識末梢単核細胞（ＰＭＮＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏ遊走を、様々なリンパ性悪性腫瘍および触診可能なリンパ節腫大を有する患者２０名で試験したことを開示している。１０μＣｉ（０．３７ＭＢｑ）［111Ｉｎ］オキシン／１０8ＰＭＮＣという最大標識線量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞生存能力またはリンパ球増殖のいずれにも悪影響を及ぼさなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で、１．５×１０9ＰＭＮＣがリンパ球アフェレーシスで得られ、放射標識後静脈内に再注入された（１５０μＣｉ（５．５５ＭＢｑ））。触診可能なリンパ節腫大の標識は、ホジキン病患者３例中３例および高悪性度リンパ腫患者５例中５例で達成されたが、低悪性度リンパ腫患者７例中３例が陽性のリンパ節画像を示し、慢性リンパ性白血病患者は陽性のリンパ節画像を示さなかった。従って、この著者は、ＰＭＮＣは、［111Ｉｎ］オキシン標識後に、それらの遊走能力を保有し、またこれらの細胞は、全部ではなく一部の、血液学的悪性腫瘍のリンパ節病変にトラフィックするという結論を下した。
【００１６】
異なる経路で注入した後、動物およびヒトにおけるヒトＰＢＬの分布も研究されてきた。たとえば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｈ．らによる、「ヒト結腸癌異種移植片における、抗腫瘍×抗ＣＤ３ヘテロ凝集抗体（ｈｅｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）および培養ヒト末梢血リンパ球の局所分布および全身分布（Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ-ｔｕｍｏｒ  ｘ  ａｎｔｉ-ＣＤ３  ｈｅｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  異種移植片）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３５０７−３５１５（１９９０）は、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）に共有結合した抗腫瘍抗体（３１７Ｇ５）は、ＰＢＬを標的にすることができるヘテロ凝集（ｈｅｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅ（ＨＡ））抗体を生じさせて、当該腫瘍抗原を発現している腫瘍細胞を溶解できることを開示している。放射標識ＨＡ抗体３１７Ｇ５×ＯＫＴ３、および放射標識された培養ヒトＰＢＬの、ｉ．ｖ．分布およびｉ．ｐ．分布を、ヒト結腸腫瘍系統ＬＳ１７４Ｔから樹立された腹腔内充実性腫瘍を担持する無胸腺のヌードマウスで試験した。マウスに125Ｉ標識ＨＡ抗体、125Ｉ標識抗腫瘍ｍＡｂ、または111Ｉｎ標識ＰＢＬを注射し、指定された時点に、組織を採取して放射能を測定した。125Ｉ−３１７Ｇ５×ＯＫＴ３は、腫瘍部位に特異的に局在した。125Ｉ−３１７Ｇ５×ＯＫＴ３のｉ．ｖ．投与とｉ．ｐ．投与との間で認められた放射能レベルの主な差は、ｉ．ｖ．ＨＡ抗体投与後の、肝放射能の増加であった。抗腫瘍×抗ＣＤ３ＨＡ抗体は、腹腔内腫瘍に特異的に局在すること、ｉ．ｐ．投与されたＨＡ抗体は、腫瘍に直接侵入すること、およびｉ．ｖ．投与されたＨＡ抗体は、腫瘍血管系に沿って分布すること、が、オートラジオグラフィで確認された。培養ヒトＰＢＬは、ｉ．ｐ．投与されたとき、腹腔内腫瘍に中程度の濃度で分布したが、ｉ．ｖ．投与されたときはそうではなかった。著者らは、ｉ．ｖ．注射したＰＢＬの腫瘍への不十分な局在性は、ホーミング受容体および／または内皮細胞リガンドにおける種差を表す可能性があり、同系モデルで克服することが可能な問題であると考えた。彼らは、これらの結果から、ＨＡ抗体およびＰＢＬを用いた局所治療は、初期臨床治験のための全身療法に勝る利点を提供することが示唆されるという結論を下した。
【００１７】
腫瘍塊以外の組織に由来するリンパ球（すなわち、ＴＩＬ）または末梢血も、放射標識リンパ球またはそれらに対する抗体の画像化による分布を含む、養子免疫療法に関して、研究されてきた。たとえば、１９９８年９月２９日発行の、マーティン・ジュニア（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊｒ．）らに付与された米国特許第５，８１４，２９５号は、腫瘍反応性細胞が豊富なリンパ節の決定、それらの増殖および養子細胞治療におけるそれらの使用について開示している。特に、該発明は、腫瘍反応性細胞、たとえば、ＣＤ４＋腫瘍特異的リンパ球が豊富なリンパ節を確実に決定する方法に関する。この方法は、新生物組織により産生されるかまたは新生物組織に関連があるマーカーを特異的に結合する、放射標識ロケータの有効量を患者に投与するステップを含む。患者における、新生物組織からの光子放出とバックグラウンド光子放出との比率を高めるために、投与後、放射標識ロケータが新生物組織に優先的に集中するための、また未結合の放射標識ロケータが取り除かれるための、時間の経過が認められている。該時間が経過した後、リンパ節部位における放射線のレベル上昇をプローブで検出することにより、放射標識ロケータの付着を示しているリンパ節部位を決定するための放射線検出プローブで、該患者に接触する。このような放射線レベルの上昇を示しているリンパ節を摘出して、肉眼的視覚分析に付したが、代わりに、このような部位を、組織学的分析に付してもよい。肉眼観察でも腫瘍がないと決定されるか、または肉眼的転移性疾患がない、決定されて摘出されたリンパ節を選択し、腫瘍反応性細胞を増殖するために培養する。選択されたリンパ節を、分裂促進刺激に付す。該リンパ節は、インターロイキン−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、および自己腫瘍であっても同種腫瘍であってもよい新生物組織の存在下で培養する。この特許は、このような刺激されたリンパ節細胞が投与された患者２例（患者番号３および４）は、外因性ＩＬ−２の有無にかかわらず腫瘍退行の証拠を示したこと、111Ｉｎ標識細胞（患者５）を使用した細胞トラフィック試験を含む広範な免疫学的データが収集されたこと、しかし、決定的な結論を導くには次期尚早であることも開示している。
【００１８】
最近の養子免疫療法は、抗原提示細胞、特に様々な抗原ソースでパルスされた樹状細胞によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激される様々なソース由来のＴ細胞を使用してきた。たとえば、Ｐｅｎｇ，Ｌ．らによる、「広い抗腫瘍効果を有するヘルパー非依存的、Ｌ−セレクチンlowＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍進行中に自然に感作される（Ｈｅｌｐｅｒ-ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ,  Ｌ-ｓｅｌｅｃｔｉｎlow  ＣＤ８+  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ａｎｔｉ-ｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｒｅ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５７３８−５７４９（２０００）は、培養活性化することができ、ＩＬ−２の同時投与なしでも、同系マウスにおける樹立された肺腫瘍および頭蓋内腫瘍を根絶するために養子移入することができる、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）で低いＬ−セレクチン発現（ＣＤ６２Ｌlow）を示すＣＤ４（＋）Ｔ細胞サブセットについて、著者らが最近報告したことを開示している。このレポートは、これらの研究を拡大して、弱免疫原性腫瘍を担持するマウスのＴＤＬＮに自然に存在するＬ−セレクチンlowＣＤ８（＋）Ｔ細胞の小さいサブセットを特性決定している。単離されたＬ−セレクチンlowＣＤ８（＋）Ｔ細胞は、ヘルパー非依存的Ｔ細胞の機能的表現型を示し、養子移入されたとき、Ｌ−セレクチンlowＣＤ４（＋）Ｔ細胞と同様に、外因性ＩＬ−２の共投与なしで、樹立された肺腫瘍および頭蓋内腫瘍の両者を、一貫して根絶することができた。培養活性化Ｌ−セレクチンlowＣＤ８（＋）Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、関連する腫瘍標的を溶解しなかったが、関連する腫瘍調製物で特異的に刺激したとき、分泌されたＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦは溶解した。著者らは、特定のワクチン操作がなくても、進行性の腫瘍成長は、採取時には表現型的にＬ−セレクチンlowであり、それぞれが、非常に強力な独立型エフェクターを暴露するために培養活性化のみを必要とする、ＴＤＬＮ中のＣＤ４（＋）およびＣＤ８（＋）抗腫瘍Ｔ細胞の非依存的感作に導くことが、これらのデータから分かるという結論を下した。
【００１９】
様々なソースに由来する腫瘍抗原でパルスした自己樹状細胞により準備刺激されたＴ細胞を用いたヒト患者の養子免疫療法も、報告されている。一例として、Ｓａｎｔｉｎ，Ａ．Ｄ．ら、「転移性子宮内膜癌患者における、腫瘍溶解物でパルスした自己樹状細胞により準備刺激された養子移入Ｔ細胞の開発および治療効果（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｉｍｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ-ｐｕｌｓｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ）」Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｉｎｖｅｓｔ．４９：１９４−２０３（２０００）は、外科手術で切除不能でかつ化学療法耐性の大きい子宮内膜癌腫の肝臓転移を有する、腫瘍溶解物でパルスした自己樹状細胞（ＤＣ）で刺激した末梢血Ｔ細胞注入で治療された、６５才の女性について記述している。ＤＣ活性化Ｔ細胞の広範なｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定は、表現型分析、細胞障害性、および細胞内サイトカイン分泌を含んでいた。自己腫瘍細胞に対して高い細胞障害性が確認されたが、ＮＫ感受性Ｋ５６２細胞、自己Ｃｏｎ−Ａリンパ芽球、または自己エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒｖｉｒｕｓ）形質転換リンパ芽球状細胞に対しては確認されなかった。阻止試験（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｔｕｄｙ）では、溶解活性が、ＨＬＡクラスＩ限定的であることを示した。２色フローサイトメトリ分析は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のかなりの部分がＣＤ５６＋でもあることを示し、細胞内ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４発現の分析は、タイプ１サイトカイン偏向を示唆した。患者を、腫瘍特異的Ｔ細胞を３〜４週間隔で３回注入することにより処置し、111Ｉｎオキシン標識および連続ガンマカメラ画像法で、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ分布を追跡した。各注射後の一連の時点で、標識リンパ球の腫瘍局在性および蓄積が絶えず検出された。しかし、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像法により三次元で評価したとき、活性化Ｔ細胞による該大きい腫瘍塊の深部浸潤は極小であった。臨床的には、治療中ずっと、大きい肝臓転移の安定化が認められた。総合すると、以上の結果は、子宮内膜癌患者で、腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞応答を生じさせることができることを示し、また、転移性疾患を持つ患者では、Ｔ細胞免疫療法は、治療的に価値があることを示唆する。図５から分かる通り、99mＴｃ−イオウコロイド・シンチグラフィを用いて比較したとき、該腫瘍周囲の［111Ｉｎオキシン標識ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の］放射能の局在性は、残りの正常な肝臓実質のそれをしのいでいた。
【００２０】
ヒトムチン１（ＭＵＣ１、ＭＵＣ−１とも呼ばれる）は、乳房、肺、膵臓、前立腺、胃、結腸、および卵巣を含む、全ての腺癌の９０％で過剰に発現される上皮ムチン糖タンパク質である。充実性腺癌患者で、増殖中の腫瘍を根絶できるほど十分強くない、ＭＵＣ１に対する低レベルの細胞性および体液性免疫応答が確認されているため、ＭＵＣ１は、免疫介入の標的である。たとえば、Ｈｉｌｔｂｏｌｄ，Ｅ．Ｍ．ら、「自然に処理された腫瘍抗原ＭＵＣ１由来のクラスＩＩエピトープは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を準備刺激する（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＭＵＣ１  ｐｒｉｍｅｓ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ４+  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５０６６−５０７０（１９９８）は、上皮細胞ムチンＭＵＣ１は、乳房、膵臓、卵巣および他の腫瘍で腫瘍抗原の役割をするグリコシル化形で腺癌上に発現されること、２つの支配的なＭＵＣ１特異的免疫応答、ＭＵＣ１タンパク質コア上の縦列反復エピトープを認識するＣＤ８＋  ＣＴＬ、およびＩｇＭ抗体が、患者でみられることを報じている。癌患者におけるＭＵＣ１特異的ＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞に関するレポートがそれまでなかったことを主張し、ＭＵＣ１特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞が、削除も寛容化もされていないこと、およびＭＵＣ１の適切な可溶形を使用するとき、ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を生じさせることができることを示した。健常なドナー由来のナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞を、樹状細胞により提示される、５つの非グリコシル化縦列反復を示す、１００アミノ酸の合成ＭＵＣ１ペプチドに対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで準備刺激した。それらは、ＩＦＮ−γを産生し、また中程度の細胞溶解活性を有していた。著者らはまた、ＨＬＡ−ＤＲ３により提示されたとき、この応答を引き出すコアペプチド配列ＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴを同定した。
【００２１】
ＭＵＣ１は、この抗原上の腫瘍特異的ペプチドエピトープのＭＨＣ非制限的ＴＣＲ認識が生じる可能性がある点で、特異である。一例として、Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．らによる、「上皮抗原ＭＵＣ１上の腫瘍特異的ペプチドエピトープのＭＨＣ非限定的ＴＣＲ認識後の、細胞間および細胞内事象（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ＭＨＣ-ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＴＣＲ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｕｍｏｒ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＭＵＣ１）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３１１１−３１２０（１９９８）は、ＭＵＣ１上の腫瘍特異的ペプチドエピトープの直接ＴＣＲ認識に関与する機能的パラメーターおよび分子パラメーターを開示している。このペプチドエピトープは縦列反復であり、処理されてＭＨＣに結合した分子よりむしろ自然の分子を認識した。Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．らに教示されている通り、Ｔリンパ球は、一般に、ＡＰＣ表面上の自己ＭＨＣ分子の溝内で提示される、抗原性ペプチドを認識する。このＭＨＣ限定的認識は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体により仲介される。該ＴＣＲ／ＣＤ３による、該抗原性ペプチドの認識は、シグナル−形質導入事象のカスケードにより、該Ｔ細胞の活性化を招く結果となる。該Ｔ細胞の活性化は、最終的に、サイトカイン類の放出、新しい表面分子の発現、およびエフェクタ機能の成熟に導く様々な遺伝子の増殖および転写活性化を招く結果となる。
【００２２】
Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．らはまた、ＭＵＣ１上のペプチドエピトープ、導管上皮細胞ならびに同一起源の癌細胞の表面上に発現されるタイプＩ貫膜糖タンパク質を、認識するＭＨＣ非制限的βＴ細胞に関して以前に報告したことも記している。その細胞外ドメインの大部分は、Ｔ細胞エピトープを含有する縦列反復２０アミノ酸配列からなる。該ＭＵＣ１縦列反復エピトープのＭＨＣ非制限的認識は、ＴＣＲおよびＣＤ３複合体に対する抗体によって阻止され、この認識がＴＣＲ介在性であることが分かる。これらの研究者は、ＭＵＣ１縦列反復は、ＭＨＣ分子による提示の必要性を回避する剛構造としてのＴＣＲに、未処理エピトープの高密度アレイを直接示すことを提案した。合成ペプチド類似体を使用するＭＵＣ１縦列反復タンパク質コアの構造研究により、Ｔ細胞エピトープが、ポリペプチドコアの伸長したβ−ターン・ヘリック構造を越えて突出するループを形成する安定した秩序ある構造を呈することが確認された。
【００２３】
つい最近、ある種のＭＵＣ１エピトープに関して、別々に調製された抗原提示細胞を使用したペプチドを提示しない、エピトープ提示ペプチドのみとのインキュベーションによる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭＵＣ１抗原特異的抗腫瘍リンパ球の活性化が報告された。一例として、ＷｒｉｇｈｔＳ．Ｅ．ら、「自然のＭＵＣ１ムチンおよびグリコシル化部位で変異したムチンペプチドにより刺激された、腺癌を有するヒト由来の細胞障害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｎａｔｉｖｅ  ＭＵＣ１  ｍｕｃｉｎ  ａｎｄ  ａ  ｍｕｃｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｔ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：２−１０（２０００）は、ＭＵＣ１ムチンペプチドが、腺癌を有するヒト由来の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激したことを開示している。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、腫瘍流入領域リンパ節（ＴＤＬＮ）細胞、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、乳房または卵巣の腺癌を有するヒト由来の単核細胞を使用し、それぞれ、（ａ）２０アミノ酸の、自然のＭＵＣ１ムチン縦列反復ペプチド（ＭＵＣ１−ｍｔｒ１）＋組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）、（ｂ）変異した（Ｔ３Ｎ）ＭＵＣ１−ｍｔｒ１＋ＩＬ−２、または（ｃ）固定化抗ＣＤ３＋ＩＬ−２、または（ｄ）ＩＬ−２のみを使用して、刺激された。これらの４つの条件のそれぞれで刺激されたＣＴＬは、主としてＣＤ４＋であった。しかし、抗ＣＤ３＋ＩＬ−２またはＩＬ−２のみのいずれかにより刺激されたＣＴＬに比べて、自然のＭＵＣ１−ｍｔｒ１または（Ｔ３Ｎ）ＭＵＣ１−ｍｔｒ１のいずれかにより刺激されたＣＴＬは、ＭＵＣ１を発現する乳癌細胞系の５−１０倍大きい細胞障害性を示した。各インキュベーション条件は、異なる可変β遺伝子ファミリーのＴ細胞受容体を有するＣＴＬを生じさせ、それぞれの、限定されたＣＴＬレパートリのオリゴクローナル増殖を示す。したがって、ペプチド刺激Ｔ細胞は、非特異的（抗ＣＤ３またはＩＬ−２）刺激により誘導されない、細胞障害性細胞の発現を示した。さらに、これらの著者らは、ムチン−ペプチド刺激細胞系の細胞障害性は、たぶん、乳癌を有するドナー由来のＰＢＬＣの場合には、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩのレベルで、また卵巣癌を有するドナー由来のＴＩＬの場合には、少なくともクラスＩのレベルで、非ＨＬＡ限定的であると報じた。この研究は、本発明者により拡大され（Ｗｒｉｇｈｔ，Ｓ．Ｅ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｃ．Ａ．らによる、「ムチン１刺激ヒト末梢血単核細胞を用いた、ムチン１発現腺癌の養子免疫療法（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｃｉｎ１  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）」Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．９：４０１−４０４（２００２））、非肥満糖尿病、重症複合免疫不全（ＮＯＤ  ＳＣＩＤ）マウスに養子移入された、乳癌患者由来のムチン１刺激造血単核細胞（Ｍ１���ＨＭＣ）は、大きい腺癌の治療モデルで生存時間を延長し、また極小疾患モデルで腫瘍成長を防止することを示した。Ｍ１ＳＨＭＣは、ムチン１を発現しているヒト乳房腺癌（ｂｒｅａｓｔ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞系、ＭＣＦ−７の特異的溶解を示し、またインターフェロンγを産生した。ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスで、ＭＣＦ−７の皮下（ＳＣ）注射後、大きい、触診可能な腫瘍が出現した後、Ｍ１ＳＨＭＣを腹腔内（ＩＰ）注射した。無Ｍ１ＳＨＭＣ対照と比較して、生存時間が増加した。しかし、腫瘍は、最終的に全てのマウスで再び成長した。極小疾患（ＭＤ）をコントロールできるかどうかを決定するために、ＮＯＤ  ＳＣＩＤにＭＣＦ−７細胞を注射し、同じ日に、Ｍ１ＳＨＭＣをＩＰ注射した。Ｍ１ＳＨＭＣを注射したマウスは、腫瘍成長をから守られた。以上の結果は、Ｍ１ＳＨＭＣは、生存期間を延長することができるが、大きい触診可能な腺癌を担持するＮＯＤ  ＳＣＩＤを治すことはできないことを示す。しかし、極小疾患モデルでは、腫瘍成長が阻止された。
【００２４】
脂質修飾したｍｕｃ−１誘導体に関する、２００３年７月２９日発行の、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らに付与された米国特許第６，６００，０１２号は、複数の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と抗原負荷リポソームを組合せて抗原負荷ＰＢＬを生じさせ、該抗原負荷ＰＢＬを、ナイーブアネルギー性Ｔ細胞またはメモリーＴ細胞と組み合せて、活性化Ｔ細胞を生じさせることにより、活性化Ｔ細胞の混合物を作る方法を開示している。このような活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行される。発明の方法に従って調製された該抗原負荷ＰＢＬおよび活性化Ｔ細胞は、癌およびウイルス性疾患を治療するための細胞性ワクチンとしての用途があると考えられる。この特許およびその中に引用された参考文献は、樹状細胞（ＤＣ）は最初、ナイーブＴ細胞を準備刺激するための強力なＡＰＣであると考えられたこと、およびＤＣは、一次抗原特異的ＣＴＬ応答のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激のためのＡＰＣとして使用されてきたことを教示している。ＤＣは、未抗原刺激Ｔ細胞と集中的に凝集することができ、また高密度のアクセサリー分子、たとえば、ナイーブ休止Ｔ細胞の刺激に不可欠なＢ７．１およびＢ７．２．を発現することが示唆されている。しかし、Ａｇｒａｗａｌらはさらに、（１）免疫療法のための、様々なペプチドの免疫原性の決定および（２）養子細胞治療用の増殖のためのＴ細胞刺激には、ＤＣがすぐれた候補ではないことを教示している。この点に関して、先行技術は、ＤＣを使用した、抗原特異的ＣＤ８．ｓｕｐ．＋ＣＴＬ応答の創出に関する。Ａｇｒａｗａｌらによれば、開示されている発明は、（ａ）リポソーム封入ペプチド抗原を、複数の末梢血リンパ球と組み合せて、抗原負荷抗原提示細胞を作るステップ、（ｂ）ナイーブＴ細胞またはアネルギー性Ｔ細胞を、上記抗原負荷抗原提示細胞と組み合せるステップ、（ｃ）活性化されたＴ細胞を、（ｂ）の組み合せから単離するステップ、を含む、活性化Ｔ細胞を生じさせる方法を提供する。さらなる実施形態で、本発明は、上記活性化Ｔ細胞がＴヘルパー細胞であるような方法を提供し、また上記活性化Ｔ細胞が細胞障害性Ｔ細胞である方法を提供する。好ましい実施形態は、ナイーブＴ細胞を、リポソーム封入ペプチド抗原を事前に負荷したＰＢＬ（ＡＰＣとして）で活性化することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで作られる、ＭＵＣ−１ペプチド特異的、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団の製造に関する。別の実施形態では、本発明は、リポソーム封入抗原および抗原提示細胞としての自己末梢全血リンパ球（ＰＢＬ）とともに、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、およびアネルギー性Ｔ細胞、または全３つの細胞型の混合物を使用した、活性化Ｔ細胞の創出に関する。
【００２５】
非腫瘍細胞特異的抗原を画像化するためのリンパ球の使用も開示されている。たとえば、Ｍａｚｚｏｎｉ，Ｇ．らによる、「移植片拒絶を診断するための、インジウム標識した前感作Ｔ細胞（Ｉｎｄｉｕｍ-ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）」Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｒｅｓ．５２：８５−８８（１９９２）は、報告した実験の目的は、必要な、初期同種移植片拒絶の正確な診断に安全な非侵襲的方法であったことを開示している。ドナーとしてブラウン・ノルウェイ（Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（ＢＮ））ラットを使用し、レシピエントとしてルイス（Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ））を使用して、異所的に心臓−肺同種移植を実施した。Ｔ細胞懸濁液は、激しく拒絶された全幅ＢＮ皮膚移植片を有していた、特異的に感作されたＬＥＷラットのリンパ節から調製した。細胞数を５０×１０（６）細胞／ｍｌに調節した。該懸濁液は、111Ｉｎ酸化物（１ｍＣｉ−ｍｌ）と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした。心臓−肺移植の３日後および６日後に、４０×１０6細胞を含有する標識細胞懸濁液のアリコートおよび総放射能２００ｍＣｉを各動物に静脈内投与した。大視野ガンマカメラで、Ｔ細胞のトラフィックおよび摘出臓器をｉｎ  ｖｉｖｏで追跡した。心臓が活発に拍動しているとき、該ガンマカメラは、術後５日に始まった移植片の放射能を示したが、同系移植された臓器部位では、放射能を示さなかった。組織学は、ラジオイメージング強度の程度と平行して、軽度ないし中等度の細胞性浸潤を示した。インジウム標識した前感作Ｔ細胞の注射は、拒絶の臨床症状がなくかつ／または拒絶カスケードを逆進させることができる初期に、拒絶経過を検知することができた。
【００２６】
哺乳動物体内の細胞を画像化するための、様々な他の放射標識に基づく方法が知られている。たとえば、Ａｎｄｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．によるとら、「早期ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＳＰＥＣＴガリウム−６７スキャン。免疫学的病期と相関させるための、異常のスキャン失敗（ＳＰＥＣＴ  ｇａｌｌｉｕｍ-６７  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  （ＨＩＶ）  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ.  Ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｔｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔａｇｉｎｇ）」Ｃｌｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．１５：２９５−３０２（１９９０）は、ＡＩＤＳ患者の治療におけるガリウムスキャンの使用について開示している。またＫｏｒｆ，Ｊ．らによると、「ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴを使用したリンパ球分布を研究するための標識としての二価コバルトｕｓｉｎｇ（Ｄｉｖａｌｅｎｔ  ｃｏｂａｌｔ  ａｓ  ａ  ｌａｂｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＰＥＴ  ａｎｄ  ＳＰＥＣＴ）」Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．３９：８３６−８４１（１９９８）は、細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで適切に前標識されていれば、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴは、生きているヒトで、リンパ球の分布に関する研究を可能にすることを教示しており、さらに、二価コバルト同位元素（55Ｃｏ2+、ＰＥＴでは、半減期１７．５時間；57Ｃｏ2+、ＳＰＥＣＴでは、半減期２７０日）のリンパ球を標識する能力について記述している。またさらに、１９９８年１１月２４日発行の、Ｌａｍｂｅｒｔらに付与された米国特許第５，８４０，８５９号は、たとえば、ヨウ素の放射性同位元素、すなわち、123Ｉ、125Ｉ、または131Ｉで細胞膜を放射標識するための（アミノスチリル）ピリジニウム化合物、または１当量の金属放射性同位元素、たとえば、ポリカルボン酸でキレート化された111Ｉｎまたは99mＴｃを含むキレート基を開示している。Ｌａｍｂｅｒｔらは、開示の方法に従って標識された自己リンパ球は、リンパ性悪性腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏリンパ球トラフィックおよび臨床画像化に使用できる可能性があることを教示しており、また開示の化合物は、養子免疫療法に先立って転移性黒色腫を画像化するために培養リンパ球を標識する好ましい薬剤として、111インジウム−オキシンに取って代わる可能性があると示唆している。
【００２７】
２０００年１１月１４日発行の、Ｒｕｂｉｎらに付与された米国特許第６，１４６，６１４号は、画像化を使用して、哺乳動物におけるリンパ球分布およびトラフィックを決定する方法に関する。標識リガンドがｉｎ  ｖｉｖｏでリンパ球と相互に作用し、結果として標識されたリンパ球を生じるように、哺乳動物のリンパ球と特異的に相互に作用できる標識リガンドを該哺乳動物に投与するか、または、該標識リガンドが該リンパ球と相互に作用して、結果として標識されたリンパ球を生じるように、該標識リガンドを該リンパ球とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、これらの標識リンパ球が該哺乳動物に投与されるかのいずれかである。該哺乳動物における該標識リンパ球の分布またはトラフィックは、画像化によって確定される。哺乳動物のリンパ球分布またはトラフィックパターンを確定することにより、哺乳動物における疾患の進行の程度を診断する方法、疾患を有する哺乳動物における、治療に対する応答をモニターする方法、薬剤がリンパ球の分布またはトラフィックを変える力を評価する方法、および疾患を有する哺乳動物を治療するのに有用な薬剤を同定する方法も記載されている。ある実施形態では、該哺乳動物は、疾患、たとえば、ＨＩＶ感染、自己免疫疾患、感染性疾患、または悪性腫瘍を有する。該リンパ球は、たとえば、Ｂ細胞またはＴ細胞であってもよい。ある実施形態には、該リンパ球は、ＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞であることが好ましい。該リガンドは、たとえば、抗体、たとえば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、たとえば、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、ペプチド、ペプチド擬似物、炭水化物または糖タンパク質であってもよい。
【発明の開示】
【００２８】
発明の簡単な概要
本発明は、標識された抗原特異的リンパ球、好ましくは、このような細胞を、該細胞特異的抗原の免疫原性エピトープを提示するペプチドに暴露することにより、哺乳動物の末梢血単核細胞から得た活性化Ｔ細胞を投与し、画像化することにより、該哺乳動物における標識リンパ球の分布を決定することによって、哺乳動物における細胞特異的抗原を検出し、定位するための方法を特徴とする。本発明は、本発明者により高く評価された下記の有効な要素に一部基づく。
腫瘍特異的エピトープに向けられた放射標識された活性化リンパ球群は、本発明の診断手法に有用であり、
このような細胞は、感作される腫瘍エピトープに遊走して付着する能力を有し、
このような細胞は、非常に小さい腫瘍（たとえば、直径２ｍｍ以下）の定位を高める能力を有し、また
このような細胞は、既知の免疫原性エピトープ、たとえば抗ムチンペプチド細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、すなわち、ムチンポリペプチドのアミノ酸配列に由来する免疫原性ペプチドまたは別の腫瘍抗原で活性化されたＴ細胞を使用して検出することができるムチン産生性腺癌と共に未知の原発腫瘍を同定するために有用である。
【００２９】
したがって、本発明の方法の一実施形態は、
患者の血液に由来するリンパ系集団、または他のリンパ系含有区画を、ある特定の腫瘍エピトープ、たとえばムチンに接触して刺激する、
活性化リンパ球様細胞が、特定の腫瘍をｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させるかまたは認識できるそれらの能力について評価する、
活性化されたリンパ球様細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、インジウムオキシンまたは他の類似した放射性同位元素により放射標識する、すなわち「タグを付ける」、
放射標識された細胞が、静脈内または腹腔内（腹腔腫瘍）のいずれかに送達される、
生体内分布は、核医学により４８時間モニターされ、たとえばプロスタシンチ（ＰｒｏｓｔａＳｃｉｎｔ）（登録商標）前立腺スクリーン技術で、「ホットスプット」の存在について画像を分析する、
ＳＰＥＣＴ核医学画像を、ＣＴまたはＭＲＩ画像と融合させて、これらの部位にはっきりとした腫瘍が存在するかどうかを決定し、またさらなる確認のために、これらの画像を、ＰＥＴ画像と比較できる、
ことを含む。
本発明者はさらに、これらの非侵襲的診断モダリティの使用は、たとえば、転移がないことを確認する試験開腹術後の、外科的回復のために失われる不必要な時間を防止し、また、たとえば、処置が開始された後で、新たな位置に転移性疾患が検出された場合、より有効なモダリティの使用を促進することを、高く評価した。ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）のみを使用する診断方法が、臨床処置を劇的に変えることが証明されている。したがって、本発明者は、この方法論は、単独で、または他の技術たとえばＰＥＴと組み合せて、癌の早期発見ならびにより正確な病期決定を可能にすると考えている。
【００３０】
本発明の方法を用いた初期臨床試験は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｃ．Ａ．らによる、「養子免疫療法における検討事項としてのトラフィック：投与経路は、いかに、腫瘍への細胞障害性Ｔリンパ球の送達に影響するか（Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｈｏｗ  ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ？）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（６）：Ｓ３４（２００２年１１月／１２月）に、以下のように開示されている。
特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を使用する養子免疫療法は、従来の外科手術、放射線および化学療法の後、残存腫瘍を破壊することを目的とする実験的治療である。異なる経路で投与された、養子移入されたＣＴＬ調製物の遊走パターンは、患者で、最小限、調査されている。我々は、腫瘍ムチンペプチドに接触して刺激された111インジウム標識ＣＴＬ調製物のｉｎ  ｖｉｖｏ移動をモニターした。これらの細胞の生体内分布は、静脈内に投与された時と、腹腔内に投与された時で、非常に異なる。小さい一連の乳癌患者（腫瘍２例および腫瘍なし２例）および再発性腫瘍（ＢＢ  ＩＮＤ  ８６２０）を有する卵巣癌患者５例で、活性化リンパ球の調製物を投与した。プロトコールには、１ヶ月に２回の注入（１回は放射標識で、１回は無標識、４ヶ月間にわたる）が書かれていた。乳癌患者では、静脈内に投与されたＣＴＬ調製物の生体内分布は、インジウムオキシン白血球スキャンの特色を示していた。経時的生体内分布の定量化により、非細胞障害性Ｔおよび非特異的細胞障害性細胞は、腫瘍にトラフィックしないことが明らかになった。経時的細胞遊走の詳細を示す。卵巣癌患者では、該パターンは、まさに注目すべきものであった。腹腔内に注入された、放射標識ＣＴＬ調製物は、第１の画像で、識別できるパターンを実証し、それに続く数日間、精密化して、各患者に特有になる。腹膜からの移動は急速で、１時間でおよそ１０％、９８時間でおよそ３０％である。放射標識ＣＴＬ調製物は、腹腔内および腹腔外の、既知の腫瘍（ＣＴスキャンによる）および腫瘍転移として以前に確認されなかった領域に局在していた。乳癌患者および卵巣癌患者の、具体的な症例の放射標識ＣＴＬ調製物生体内分布、ならびに卵巣症例のＣＴスキャンおよびＳＰＥＣＴ画像の融合を示す。ＣＴＬ送達に関する症例事項を、詳細に論じる。
【００３１】
以上のことを考慮すると、本発明の目的は、活性化抗原特異的リンパ球分布および個々のトラフィックを検出することにより、安全で、効果的かつ容易な、好ましくは非侵襲的な、細胞特異的抗原を検出する方法を提供することである。
【００３２】
本発明のもう１つの目的は、画像化技術を使用して、各人の活性化リンパ球分布およびトラフィックパターンから、細胞特異的抗原の局在性を測定することである。
【００３３】
本発明のまた別の目的は、各人の活性化リンパ球分布およびトラフィックパターンから細胞特異的抗原の局在性を測定することにより、疾患の進行を評価することである。
【００３４】
本発明のさらに別の目的は、各人の活性化リンパ球分布およびトラフィックパターンから、細胞特異的抗原の局在性に対する治療効果を評価することにより、疾患の治療法の効力を評価することである。
【００３５】
したがって、一態様では、本発明は、ヒトなどの哺乳動物で、細胞特異的抗原を検出し、定位する方法であって、（ａ）末梢血単核細胞を該哺乳動物から入手するステップ、（ｂ）末梢血単核細胞中のＴリンパ球が抗原特異的活性化を受ける（その結果、該細胞特異的抗原に結合する活性化抗原特異的Ｔリンパ球を生じる）条件で、該末梢血単核細胞を、細胞特異的抗原の免疫原性エピトープを提示する免疫原性ペプチドに暴露するステップ、（ｃ）画像化により検出可能な標識で、該抗原特異的Ｔリンパ球を標識するステップ、（ｄ）該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を、該哺乳動物に投与するステップ、および（ｅ）画像化により、哺乳動物における該標識抗原特異的Ｔリンパ球の分布を確定し、それによって該哺乳動物における細胞特異的抗原を検出し、定位するステップ；を含む方法を提供する。
【００３６】
上記、本発明の方法の幾つかの実施形態において、該末梢血単核細胞を該免疫原性ペプチドに暴露するステップ（ｂ）は、Ｔ細胞の活性化を促進するために、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で実施される。
【００３７】
有利には、該末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を該免疫原性ペプチドに暴露するステップ（ｂ）は、該標識抗原特異的Ｔリンパ球が該哺乳動物に投与されるステップ（ｄ）より前に、さらなる細胞を該ＰＢＭＣに加えることなく、該ペプチドの無細胞調製物を該末梢血単核細胞に加えることによって実施される。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として作用する末梢血白血球（ＰＢＬ）で、ＰＢＭＣ中のナイーブＴ細胞を活性化することにより、ＭＵＣ−１ペプチド特異的、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じさせた、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らに付与された米国特許第６，６００，０１２号で以前に開示されたＴ細胞活性化方法とは異なる。これらのＰＢＬは、別の培養液中で、リポソーム封入ペプチド抗原が添加され、次いで、ＰＢＭＣ由来のナイーブＴ細胞の培養に加えられ、それによって、Ｔ細胞活性化プロセスの複雑さ、および汚染または多細胞培養の操作に固有の他の原因による損失の危険も増大する。
【００３８】
本発明でさらに好都合なことは、細胞特異的抗原を発現する細胞に対して細胞溶解性である抗原特異的Ｔリンパ球を使用することである。したがって、細胞溶解性（または、より一般的には、細胞障害性）Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、非細胞溶解性抗原特異的Ｔ細胞より効果的に、標的細胞特異的抗原を担持する細胞に結合することが可能である。しかし、養子免疫療法利用とは異なり、本診断方法は、抗原を担持する標的細胞を効果的に死滅させることができるＴ細胞を絶対に必要とするとは限らない。したがって、本発明の方法の該活性化抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋リンパ球またはＣＤ８＋リンパ球またはそれらの混合物を含んでもよい。本発明の方法の活性化抗原特異的細胞はまた、メモリーＴ細胞、特にＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞も含んでもよい。ＰＢＭＣ由来のＴ細胞を、無細胞抗原、たとえば該標的抗原のエピトープを提示するポリペプチドまたはペプチドに暴露することにより、抗原特異的Ｔリンパ球を生じさせるための本発明の方法の別の利点は、このような抗原特異的Ｔリンパ球が、ごく少量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（たとえば、ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋表現型を有する細胞のパーセンテージで示すとき、たとえば、約１０％未満、好ましくは約６％未満、より好ましくは約３％未満）を含んでもよいことである。
【００３９】
幾つかの実施形態では、有利には、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を、該哺乳動物に投与するステップ（ｄ）は、哺乳動物における、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球の分布を確定するステップ（ｅ）を実施する前に、Ｔリンパ球とともに、またはその後、サイトカイン類、特にＩＬ−２を、該哺乳動物に投与せずに実施される。したがって、Ｔ細胞、たとえばＴＩＬ細胞を用いた養子免疫療法は、それらの細胞障害性を維持するために、活性化細胞障害性Ｔ細胞と共に、およびその後、高用量のサイトカイン類、特にＩＬ−２が患者に投与されることを一般に必要とするが、本発明で診断のために使用される場合、該活性化Ｔ細胞は、最初に細胞障害性活性化状態であるか、または細胞障害性活性化状態で維持されることを必要としない。したがって、本発明の方法によって活性化されたＴ細胞を使用することにより、他のタイプの活性化Ｔ細胞の養子移入に必要な、高用量のＩＬ−２投与の追加費用および潜在的副作用を回避することができる。
【００４０】
本発明の方法の幾つかの実施形態では、標識された抗原特異的Ｔリンパ球を該哺乳動物に投与するステップ（ｄ）は、該リンパ球を腹腔内に投与することを含む。したがって、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｃ．Ａ．らによって（上掲）に開示されている通り、腫瘍ムチンペプチドに接触して刺激された該養子移入ＣＴＬ調製物の遊走パターンは、静脈内に投与されたときと、腹腔内に投与されたときで、非常に異なる。乳癌患者における、静脈内に投与されたＣＴＬ調製物の生体内分布は、インジウムオキシン白血球スキャンの特色を示していた。たとえば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｃ．Ｗ．ら（上掲）は、標識ＬＧＬまたはＴ細胞を正常なレシピエントにｉｖ接種した後、放射能の大部分（１８〜３３％）は数分以内に肺内に回収されたことを教示している。肺内の放射能のレベル低下は、脾臓および肝臓におけるカウントの相当する上昇を伴う。同様に、Ｃｈｉｎ．Ｙ．ら（上掲）は、注入後２時間以内に、肺における111Ｉｎ標識ＴＩＬの局在化が見られ、また２４時間に、肺、肝臓および脾臓で、高レベルの放射能が確認されることを報告した。肺における放射能は、７２時間後に低減したが、転移部位における111Ｉｎ標識ＴＩＬの特異的局在化は認められなかった。最後に、Ｓｗｉｆｔ，Ｒ．Ｉ．ら（上掲）は、111Ｉｎ標識腫瘍活性化キラー（ＴＡＫ）細胞は、肺では早くも４時間に、腹部では４８時間にようやく、転移を示すが、肝臓画像は、正常な肝臓組織における細胞の高いバックグラウンドに起因すると考えられる、転移性病変に相当する「コールド」スポットを示すことを報告した。
【００４１】
様々なリンパ球の静脈内投与を用いた一般所見とは違って、本発明者は、腹腔内に注入された、放射標識ＣＴＬ調製物は、第１の画像で、識別できるパターンを実証し、それに続く数日間、精密化して、各患者に特有になることを発見した。腹膜からの移動は急速で、１時間でおよそ１０％、９８時間でおよそ３０％である。放射標識ＣＴＬ調製物は、腹腔内および腹腔外の、既知の腫瘍（ＣＴスキャンによる）および腫瘍転移として以前に確認されなかった領域に局在していた。
【００４２】
本発明の方法のまた他の実施形態では、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を該哺乳動物に投与するステップ（ｄ）は、該リンパ球を静脈内に投与することを含む。有利には、このような実施形態では、該リンパ球を静脈内に投与することは、該複合糖質を投与しない該リンパ球の投与に比べてリンパ球のトラフィックが変化するような方法で、複合糖質を該哺乳動物に投与することをさらに含む。このように、２００３年３月１４日にＷＯ  ０３／０７７８６４  Ａ２として公告された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７８３４号（参照により、その全てを本明細書に組み入れる）は、細胞を、標的細胞に向ける方法を開示している。これらの方法の幾つかの実施形態は、同時または逐次的に、炭水化物提示分子（たとえば、複合糖質）および細胞を、該哺乳動物に投与するステップを含む。これらの方法では、複合糖質、特にアシアロ血漿タンパク質たとえばアシアロオロソムコイド（アシアロα−（１）−酸糖タンパク質）を含む、アシアロ複合糖質は、肝アシアロ糖タンパク受容体を一時的に結合し、その結果、それらの肝受容体により結合されるアシアロ決定基を担持する、リンパ球および特にＣＤ４＋細胞を含む細胞の結合を、競合的に阻害すると考えられる。理論に束縛されることを望まない場合、本発明者は、低シアル化（ｈｙｐｏｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）および脱シアル化（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）されたタンパク質／複合糖質（アシアロ複合糖質とも呼ばれる）ならびに類似した決定基を担持する細胞は、肝アシアロ糖タンパク受容体への結合の結果として、肝臓内で結合される、すなわち「捕らえられる」と考える。アシアロ複合糖質による該受容体の占拠は、肝臓における、当該類似決定基を担持する細胞の封鎖を阻害する。したがって、本発明の方法において、抗原特異的Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋リンパ球の静脈内投与より前または投与と同時の、アシアロ複合糖質、たとえばアシアロオロソムコイドの投与は、このようなリンパ球が正常な肺組織および肝臓組織に蓄積するのを防止し、それによって、このような組織における標識細胞のバックグラウンドを低減し、これらの組織における、抗原担持細胞たとえば腫瘍細胞の検出を向上させる。加えて、上記ＰＣＴ開示内容は、開示された発明の複合糖質が、注入された細胞が肺胞血管系に集中するのを防止することを示す。したがって、抗原特異的Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋リンパ球の静脈内投与前の、または静脈内投与と同時の、シアロ複合糖質たとえばオロソムコイドの投与もまた、このようなリンパ球が正常な肺組織に蓄積するのを防止し、その結果、肝臓および脾臓への細胞送達を増強しながら、この組織における標識細胞のバックグラウンドを減少させる。
【００４３】
別の態様において、本発明は、該細胞特異的抗原が腫瘍特異的抗原である細胞特異的抗原を、検出し、定位する方法を提供する。有利には、該抗原は、ヒトムチン１（ＭＵＣ−１）などの腫瘍特異的ムチンであり、また該ペプチド免疫原は、ＭＵＣ−１のエピトープを提示する。ＭＵＣ−１（ＭＵＣ１とも呼ばれる）は、乳房、肺、膵臓、前立腺、胃、結腸、および卵巣を含む、全ての腺癌の９０％で過剰に発現される上皮ムチン糖タンパク質である。有利には、ＭＵＣ−１のエピトープを提示する免疫原性ペプチドを使用する本発明の方法は、ＭＵＣ−１エピトープを担持する細胞に対してＭＨＣ非制限的細胞障害性を示すＣＤ４＋リンパ球を包含するＴ細胞を提供する。一例として、Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．ら（上掲）は、ＭＵＣ−１上の腫瘍特異的ペプチドエピトープのＭＨＣ非制限的ＴＣＲ認識について論じている。さらに、Ｗｒｉｇｈｔ  Ｓ．Ｅ．ら（上掲）は、ＭＵＣ１ムチンペプチドは、腺癌に罹患したヒト由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することを開示している。そして、ペプチド刺激Ｔ細胞は、非特異的（抗ＣＤ３またはＩＬ−２）刺激により誘導されなかった、細胞障害性細胞の発現を示した。さらに、これらの著者は、該ムチン・ペプチド刺激細胞系の細胞障害性は、非ＨＬＡ制限的（すなわち、ＭＨＣ非制限的）であることを報告した。ＭＨＣ非制限的細胞障害性を示す抗原特異的Ｔリンパ球を提供する免疫原を使用することの利点は、ＭＨＣバックグラウンドに関係なく、任意の患者に由来する抗原特異的Ｔリンパ球を生じさせるために、１つのこのような免疫原を本発明で使用できることである。
【００４４】
Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、およびその中に引用されている参考文献で開示されている通り、Ａｇ特異的ＭＨＣ非制限的認識の他の例も記載されている。たとえば、関節リウマチ患者の滑液、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の免疫をもつマウスから、マイコバクテリウムのＡｇに特異的なＭＨＣ非制限的Ｔ細胞が単離されている。ＡｇたとえばＢ細胞腫瘍上のＩｇ  Ｉｄｓ、ヘルペスウイルス糖タンパク質、および非ペプチド・プレニルピロリン酸に特異的なＭＨＣ非制限的Ｔ細胞もまた、単離されている。Ａｇ特異的、ＭＨＣ非制限的βＴ細胞はまた、複合タンパク質たとえばアビジンおよびミエリン塩基性タンパク質、ならびに非ペプチドＡｇたとえばヘモグロビンのヘム部分に関して記述されている。幾つかの研究は、ＭＨＣ分子の非存在下でＡｇを認識することができるアルソネート特異的およびフルオレセイン特異的Ｔ細胞についても記述している。水疱性口内炎ウイルス核タンパク質に由来するグリコシル化ペプチド上の炭水化物部分に特異的な炭水化物特異的ＭＨＣ非制限的Ｔ細胞もまた創出されている。
【００４５】
有利には、本発明によるＭＵＣ−１を発現する細胞の定位の場合、該免疫原性ペプチドは、配列（従来の一文字コードで表現される）：（配列番号：１）ＰＤＴＲＰを含むＭＵＣ−１配列の円形順列であるアミノ酸配列を含むＭＵＣ−１のエピトープを示す。有利には、該ペプチドは、アミノ酸配列（配列番号：２）ＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰを有する。抗原特異的Ｔ細胞応答を生じさせ、またアミノ酸配列ＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号．３）の約７〜約２０アミノ酸の配列を含む、ＭＵＣ−１ペプチドを含むがその限りではない、本発明で使用することができる他のＭＵＣ−１免疫原性ペプチドおよびそれらの誘導体は、他所で、たとえば、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らに付与された米国特許第６，６００，０１２号で、開示されている。
【００４６】
さらに有利には、たとえば、本発明の方法が、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らにより教示された通りに、（ａ）リポソーム封入ペプチド抗原を、複数の末梢血リンパ球と組み合わせて、抗原負荷抗原提示細胞を作り出すこと、（ｂ）ナイーブＴ細胞またはアネルギー性Ｔ細胞を、上記抗原負荷抗原提示細胞と組み合せること、および（ｃ）活性化Ｔ細胞を、ステップ（ｂ）の組合せから単離すること、を含む方法を用いて生じさせた活性化Ｔ細胞を使用するとき、本発明の方法で使用される該免疫原性ペプチドは、リポソームに封入されたペプチド、または脂質部分で共有結合的に修飾されているＭＵＣ−１ペプチドである。
【００４７】
本発明によるリンパ球の検出に使用される標識は、哺乳動物の体内で細胞を検出する技術分野で公知の任意の標識であってもよい。有利には、該標識は、γエミッタ、ポジトロンエミッタ、磁性材料、密度ベースの造影剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される。該標識がγエミッタであるとき、該標識は、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、およびそれらの混合物からなる群から選択することが可能である。有利には、該標識は、一般的には、インジウムオキシンの形のインジウム−１１１である。
【００４８】
本発明の方法における標識されたリンパ球を定位するための画像化技術は、もちろん、標識の性質に応じて、ラジオイメージング、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層画像法およびＸ線コンピュータ断層画像法からなる群から選択することが可能である。さらに、該画像化は、シングルスキャンまたは連続スキャンで実施することが可能である。有利には、本発明の方法で使用される画像化は、該哺乳動物の全身スキャンを含む。
【００４９】
幾つかの実施形態では、画像化は、少なくとも２つの別々のスキャンを含み、各別々のスキャンは、ラジオイメージング、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層（ＰＥＴ）およびＸ線コンピュータ断層（ＣＴ）画像法からなる群から選択される。有利には、このような実施形態では、２つ以上の別々のスキャンにより得られる画像化データを、たとえば、マルチプルスキャンによるデータを単一表示画像に融合する処理によって、比較する。たとえば、１９８８年４月５日発行の、ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）に付与された米国特許第４，７３５，２１０号は、リンパ系造影法、器官画像化方法、およびキット、特に、特異的抗体造影剤を用いて作成された陽画像から、グロス（ｇｒｏｓｓ）造影剤を使用して作成された陰画像を減ずることを含む、リンパ管シンチグラフィーまたは磁気共鳴リンパ系造影法のための改良された方法を開示している。つい最近、２００２年１２月３日発行の、タウンゼンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）らに付与された米国特許第６，４９０，４７６号は、内臓の運動に起因する配置調整、スキャナベッド特徴の変動、およびスキャンに対する患者の位置の問題を解決する、１つの装置でＣＴ画像およびＰＥＴ画像を連続的に獲得するための、ＰＥＴおよびＸ線ＣＴ併用断層写真およびその使用方法を教示している。該断層写真は、体外マーカーまたは体内標識を使用せずに、正確に同時記録された機能的および解剖学的画像を獲得する。
【００５０】
発明の詳細な説明
本発明の１つの目的は、標準画像化技術で現在可能であるより早く、より小さい腫瘍を検出すること、ならびに最初の原発腫瘍が容易に発見されない腫瘍を発見することである。もう１つの利益は、該患者に最適なケアプランを考案して、不必要な外科手術を回避できるように、再発がより正確に段階づけられることである。この技術を使用すれば、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、および臨床検査等の所見を検証することができる。
【００５１】
したがって、一態様において、本発明は、ヒトなどの哺乳動物で、細胞特異的抗原を検出し、定位する方法であって、（ａ）末梢血単核細胞を該哺乳動物から入手するステップ、（ｂ）末梢血単核細胞中のＴリンパ球が抗原特異的活性化を受ける（その結果、該細胞特異的抗原に結合する抗原特異的Ｔリンパ球を産生する）条件で、該末梢血単核細胞を、該細胞特異的抗原の免疫原性エピトープを提示する免疫原性ペプチドに暴露するステップ、（ｃ）画像化により検出可能な標識で、該抗原特異的Ｔリンパ球を標識するステップ、（ｄ）該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を、該哺乳動物に投与するステップ、および（ｅ）画像化により、哺乳動物における該標識抗原特異的Ｔリンパ球の分布を確定し、それによって該哺乳動物における細胞特異的抗原を検出し、定位するステップ、を含む方法を提供する。この方法は、ヒト被検者、とりわけ、細胞性抗原、たとえば腫瘍特異的抗原の異常な発現を含む疾患または状態を有する患者で、特に有用である。
【００５２】
１．活性化抗原特異的Ｔリンパ球
本発明で使用するための、該哺乳動物からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の獲得は、一般に、当該技術分野で公知の任意の従来の方法で実施される。たとえば、「バフィーコート」は、末梢血リンパ球を他成分から分離するためのフィコール・ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心法等の方法を使用して、末梢血サンプルから回収される。たとえば、免疫学における最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９１）の７．０．５から７．１．５ページ（参照により、本明細書に組み込む）に記載されている技術を参照されたい。
【００５３】
本発明の方法は、特に、ＰＢＭＣ中のＴリンパ球が、抗原特異的活性化を受ける（その結果、該細胞特異的抗原に結合する活性化された抗原特異的Ｔリンパ球を生じる）条件で、該ＰＢＭＣを、該細胞特異的抗原の免疫原性エピトープを提示する免疫原性ペプチドに暴露することにより、該哺乳動物由来のＰＢＭＣ中の抗原特異的Ｔ細胞を活性化することをさらに含む。本明細書で使用されるとき、「活性化された」Ｔリンパ球またはＴ細胞は、有糸分裂および／または細胞分裂を経験している。活性化Ｔリンパ球は、Ｔヘルパー（ＴH）細胞または細胞障害性Ｔ細胞（細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬまたはＴC））であってもよい。ナイーブＴ細胞の活性化は、このような細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（抗原／ＭＨＣ複合体を含む）およびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、γ−ＩＦＮ、および類似のリンホカイン類等の分子に暴露することにより開始することが可能である。抗原／ＭＨＣ複合体は、該Ｔ細胞の表面上の受容体（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））と相互に作用する。Ｇｏｌｕｂら編、免疫学：合成、２章「Ｔ細胞受容体」（１９９１年）（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２：“ＴｈｅＴ-ｃｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒ”（１９９１））。したがって、本発明の方法の幾つかの実施形態では、該末梢血単核細胞を免疫原性ペプチドに暴露するステップ（ｂ）は、Ｔ細胞の活性化を促進するために、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下で実施される。
【００５４】
有利には、該末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、該免疫原性ペプチドに暴露するステップ（ｂ）は、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球が、該哺乳動物に投与されるステップ（ｄ）の前に、さらなる細胞を該ＰＢＭＣに加えることなく、該ペプチドの無細胞調製物を、該末梢血単核細胞に加えることにより実施される。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の役割をする末梢血白血球（ＰＢＬ）で、ナイーブＴ細胞を活性化することにより、ＭＵＣ−１ペプチド特異的、活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞集団を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じさせた、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らに付与された米国特許第６，６００，０１２号で以前に開示されたＴ細胞活性化方法とは違って、本発明は、好都合なことに、腫瘍特異的抗原を発現している被検者のＰＢＭＣ中のＴリンパ球前駆体を使用することにより、抗原提示細胞を必要としない。したがって、理論に束縛されなくても、本発明者は、腫瘍特異的抗原、特にＭＵＣ−１腫瘍抗原を発現している被検者のＰＢＭＣは、その抗原の免疫原性ペプチドエピトープに直接暴露することによって活性化されて、該腫瘍抗原に少なくとも結合することができる抗原特異的Ｔリンパ球の前駆体を含み、該ペプチドを提示するためのＡＰＣを必要としないと考える。たとえば、腫瘍特異的抗原を発現している被検者のＰＢＭＣ中のＴリンパ球は、腫瘍特異的抗原を発現する宿主内で、「初回抗原刺激」を経験した可能性がある。本明細書では、「初回抗原刺激」は、結果的に活性化および／または記憶を生じさせる方法で、動物（ヒトを含む）または培養細胞を抗原に暴露することを意味するために使用される。標的抗原に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の発生は、通例、自然感染または意図的な免疫化のいずれかによるｉｎ  ｖｉｖｏ初回抗原刺激に依存する。いずれにしても、本発明の方法の臨床試験において、活性化抗原特異的Ｔリンパ球を産生する詳細な臨床プロトコールは、以下の実施例１で紹介する。
【００５５】
あるいは、本発明の方法で使用される活性化抗原特異的Ｔリンパ球は、該細胞特異的抗原に暴露されたことがないナイーブＴ細胞を、抗原を負荷した、特に標的細胞特異的抗原のペプチドエピトープ、またはこのようなペプチドエピトープの免疫原性誘導体を負荷した、ＡＰＣにｉｎ  ｖｉｔｒｏ暴露することによる活性化によって、産生することができる。たとえば、該ＡＰＣは、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らに付与された米国特許第６，６００，０１２号に記載の通りに、別の培養で、リポソーム封入ペプチド抗原が予め負荷され、次いでＰＢＭＣ由来のナイーブＴ細胞の培養に添加されたＰＢＬであってもよい。
【００５６】
また本発明で好都合なことは、細胞特異的抗原を発現する細胞に対して細胞溶解性である抗原特異的Ｔリンパ球の使用である。したがって、細胞溶解性（または、より一般的には、細胞障害性）Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、非細胞溶解性抗原特異的Ｔ細胞より効果的に、標的細胞特異的抗原を担持する細胞に結合することが可能である、しかし、養子免疫療法利用とは異なり、本診断方法は、抗原を担持する標的細胞を効果的に死滅させることができるＴ細胞を絶対に必要するとは限らない。したがって、本発明の方法の該活性化抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋リンパ球またはＣＤ８＋リンパ球またはそれらの混合物を含んでもよい。本発明の方法の活性化抗原特異的細胞はまた、メモリーＴ細胞、特にＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞も含んでもよい。本明細書で使用される場合、「記憶表現型」Ｔ細胞としても知られる「メモリーＴ細胞」は、以前にペプチド抗原に遭遇したことがあるが、現在は休止していて活性化され得る、Ｔリンパ球群を示すために使用される。メモリーＴ細胞は、抗原に暴露されたことがあり、その後、刺激性抗原が存在せずに、体内で長期間生き続けるＴ細胞である。しかし、これらのメモリーＴ細胞は、「リコール」抗原に応答する。ペプチド抗原に対するナイーブＴ細胞応答と比較するとき、概して、メモリーＴ細胞は、「リコール」抗原により敏感である。記憶細胞は、ある種の細胞表面抗原、たとえば、分化したＴ細胞用のマーカーであるＣＤ４５Ｒ０、ＣＤ５８、ＣＤ１１α、ＣＤ２９、ＣＤ４４およびＣＤ２６の存在によって認識される。メモリーＴ細胞は、当業者に周知の技術で単離される。たとえば、簡単に記載すると、全Ｔ細胞集団を単離し、続いて抗ＣＤ４５Ｒ０、抗ＣＤ４４または抗ＣＤ２６モノクローナル抗体を使用して、蛍光活性細胞分類（ＦＡＣＳ）を行う。Ｈｏｌｌｓｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９：１７０（１９９３）；Ｂｒｕｎｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：３７（１９９５）；およびＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（パート１）：３１１９（１９９３）を参照されたい。
【００５７】
ＰＢＭＣ由来のＴ細胞を、無細胞抗原、たとえば該標的抗原のエピトープを提示するポリペプチドまたはペプチドに暴露することにより、本発明に従って抗原特異的Ｔリンパ球を生じさせるための本発明の方法のもう１つの利点は、このような抗原特異的Ｔリンパ球がごく少量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（たとえば、ＣＤ３−、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋表現型を有する細胞のパーセンテージで示すとき、たとえば、約１０％未満、好ましくは約６％未満、より好ましくは約３％未満）を含んでもよいことである。たとえば、Ｗｒｉｇｈｔ  Ｓ．Ｅ．ら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２３：２−１０（２０００）は、活性化調製物中の全細胞の３〜６％が、上記ＮＫ表現型を示すことを報告した。さらに、本発明の方法に従って生じさせた抗原特異的Ｔ細胞は、活性化後、少なくとも数ヶ月間、凍結保存することができ、その結果、たとえば、数週間または数ヶ月間にわたる処置の治療経過を追跡するために、同一患者で抗原を多回定位するための再現可能な標識条件および画像化条件のために、均質なＴ細胞源が提供される。
【００５８】
２．活性化Ｔリンパ球の投与
幾つかの実施形態では、好都合なことに、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を該哺乳動物に投与するステップ（ｄ）は、該哺乳動物における、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球の分布を確定するステップ（ｅ）を実施する前に、該Ｔリンパ球と共に、またはその後、サイトカイン類、特にＩＬ−２を該哺乳動物に投与せずに実施される。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏサイトカイン支援を必要とする、Ｔ細胞たとえばＴＩＬ、ＬＡＫまたはＮＫ（が、ＴＡＫは違う）細胞を用いた養子免疫療法の場合と同様に、抗原特異的リンパ球の投与と同時におよび／または抗原特異的リンパ球が投与された後で、サイトカイン類、特にＩＬ−２の投与が含まれてもよい。たとえば、Ｐｏｃｋａｊ，Ｂ．Ａ．ら（上掲）は、高用量ＩＬ−２およびＴＩＬの投与を受けている転移性黒色腫患者における、インターロイキン−２（ＩＬ−２）培養腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入を開示している。
【００５９】
該哺乳動物への該標識リンパ球の投与は、たとえば、注射、注入、付着、移植、経口摂取または局所投与を含む、様々な方法で行うことができる。好ましくは、投与は、注射による。注射は、たとえば、静脈内、皮内、皮下、筋内または腹腔内であってもよい。本発明の方法の幾つかの実施形態では、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を該哺乳動物に投与するステップ（ｄ）は、有利には、該リンパ球を腹腔内に投与することを含む。したがって、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｃ．Ａ．ら（上掲）に記載されているように、腫瘍ムチンペプチドに接触して刺激された該養子移入ＣＴＬ調製物の遊走パターンは、静脈内に投与された場合と、腹腔内に投与された場合とでは非常に異なる。
【００６０】
本発明による、乳癌患者における、静脈内投与されたＣＴＬ調製物の生体内分布は、インジウムオキシン白血球スキャンの特色を示していた。たとえば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｃ．Ｗ．ら（上掲）は、標識されたＬＧＬまたはＴ細胞を正常なレシピエントに静脈内接種した後、放射能の大部分（１８〜３３％）は、数分内に、肺内に回収されたことを教示している。肺内の放射能のレベル低下は、脾臓および肝臓におけるカウントの相当する上昇を伴う。同様に、Ｃｈｉｎ．Ｙ．ら（上掲）は、注入後２時間以内に、肺における111Ｉｎ標識ＴＩＬの局在化が見られ、また２４時間で、肺、肝臓および脾臓で、高レベルの放射能が確認されることを報告した。肺における放射能は、７２時間後に低減したが、転移部位における111Ｉｎ標識ＴＩＬの特異的局在化は認められなかった。最後に、Ｓｗｉｆｔ，Ｒ．Ｉ．ら（上掲）は、111Ｉｎ標識腫瘍活性化キラー（ＴＡＫ）細胞は、肺では早くも４時間に、腹部では４８時間にようやく、転移を示すが、肝臓画像は、正常な肝臓組織における細胞の高いバックグラウンドに起因すると考えられる、転移性病変に相当する「コールド」スポットを示すことを報告した。
【００６１】
様々なリンパ球の静脈内投与を用いた一般的な所見とは違って、本発明者は、腹腔内に注入された、放射標識ＣＴＬ調製物は、第１の画像で、識別できるパターンを実証し、それに続く数日間、精密化して、各患者に特有になることを発見した。腹膜からの移動は急速で、１時間でおよそ１０％、９８時間でおよそ３０％である。放射標識ＣＴＬ調製物は、腹腔内および腹腔外の、既知の腫瘍（ＣＴスキャンによる）および腫瘍転移として以前に確認されなかった領域に局在していた。
【００６２】
したがって、本発明による活性化リンパ球の腹腔内投与は、標的細胞抗原を発現している腹腔内組織塊、たとえば腫瘍特異的抗原を発現している転移を有する、癌患者、特に卵巣癌患者等の被検者に特に有用であるが、これに制限されるものではない。たとえば、本発明の方法は、他の方法では非侵襲的に検出することができないほど小さいかもしれない転移でさえも同定するために、腹腔内外科手術の前に使用することができ、化学療法を開始する前の外科手術後フォローアップ評価中、および化学療法中または一連の化学療法後に、小さくても残存する腫瘍塊の応答の欠如に基づいて、該介入の効果を評価し、またさらなるまたは異なる治療モダリティの必要性を指示することができる。
【００６３】
本発明の方法のまた他の実施形態では、該標識された抗原特異的Ｔリンパ球を上記哺乳動物に投与するステップ（ｄ）は、該リンパ球を静脈内に投与することを含む。有利には、このような実施形態で、該リンパ球を静脈内に投与することは、該複合糖質を投与しない該リンパ球の投与に比べてリンパ球のトラフィックが変化するような方法で、複合糖質を該哺乳動物に投与することをさらに含む。このように、２００３年３月１４日にＷＯ  ０３／０７７８６４  Ａ２として公告された、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７８３４号（参照により、その全てを本明細書に組み入れる）は、細胞を、標的細胞に向ける方法を開示している。
【００６４】
本発明での使用に適当な複合糖質は、一般に、一般式Ｐ−（Ｓ）x−Ｇａｌ（式中、Ｐは、ヒト血清糖タンパク質のペプチド残基であり、Ｓは、ヒト血清糖タンパク質の糖残基であり、ｘは、１〜１００の整数であり、Ｇａｌは、ガラクトース残基である）で表される。該複合糖質は、部分的にまたは完全にアシアリル化されていてもよい。特に有用な複合糖質としては、フェチュイン類、アシアロフェチュイン類、オロソムコイド類およびアシアロオロソムコイド類などがある。
【００６５】
該複合糖質は、該抗原特異的細胞の投与を基準にして任意の時間枠内に、該哺乳動物に投与することが可能である。該複合糖質は、該細胞の投与前、投与後、または投与と同時に、投与してもよい。代表的な実施形態では、該複合糖質は、該細胞より前に投与される。任意の適当な経路で投与することが可能である。好ましい実施形態では、該複合糖質は、哺乳動物に、非経口的に、さらに好ましくは静脈内に、投与される。したがって、本発明の方法では、抗原特異的Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋リンパ球の静脈内投与より前の、または静脈内投与と同時の、アシアロ複合糖質、たとえばアシアロオロソムコイドの投与は、このようなリンパ球が、正常な肺および肝臓組織に蓄積するのを防止する。さらに、本発明による抗原特異的Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋リンパ球の静脈内投与より前、または静脈内投与と同時の、シアロ複合糖質、たとえばオロソムコイドの投与もまた、このようなリンパ球が正常な肺および肝臓組織に蓄積するのを防止し、同時に細胞の送達を増進する。
【００６６】
３．免疫原性エピトープおよび抗原
別の態様において、本発明は、該細胞特異的抗原が腫瘍特異的抗原である細胞特異的抗原を検出し、定位するための方法を提供する。有利には、該抗原は、腫瘍特異的ムチンたとえばヒトムチン１（ＭＵＣ−１）であり、また該ペプチド免疫原は、ＭＵＣ−１のエピトープを提示する。ＭＵＣ−１（ＭＵＣ１とも呼ばれる）は、乳房、肺、膵臓、前立腺、胃、結腸、および卵巣を含む、全ての腺癌の９０％で過剰に発現される上皮ムチン糖タンパク質である。有利には、ＭＵＣ−１のエピトープをを提示する免疫原性ペプチドを使用する本発明の方法は、ＭＵＣ−１エピトープを担持する細胞に対してＭＨＣ非制限的細胞障害性を示すＣＤ４＋リンパ球を包含するＴ細胞を提供する。一例として、Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．ら（上掲）は、ＭＵＣ−１上の腫瘍特異的ペプチドエピトープのＭＨＣ非制限的ＴＣＲ認識について論じている。さらに、Ｗｒｉｇｈｔ  Ｓ．Ｅ．ら（上掲）は、ＭＵＣ１ムチンペプチドは、腺癌に罹患したヒト由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することを開示している。そして、ペプチド刺激Ｔ細胞は、非特異的（抗ＣＤ３またはＩＬ−２）刺激により誘導されなかった、細胞障害性細胞の発現を示した。さらに、これらの著者は、該ムチン・ペプチド刺激細胞系の細胞障害性は、非ＨＬＡ制限的（すなわち、ＭＨＣ非制限的）であることを報告した。ＭＨＣ非制限的細胞障害性を示す抗原特異的Ｔリンパ球を提供する免疫原を使用することの利点は、ＭＨＣバックグラウンドに関係なく、任意の患者に由来する抗原特異的Ｔリンパ球を生じさせるために、１つのこのような免疫原を本発明で使用できることである。
【００６７】
有利には、本発明によるＭＵＣ−１を発現する細胞の定位の場合、該免疫原性ペプチドは、配列（従来の一文字コードで表現される）：（配列番号：１）ＰＤＴＲＰを含むＭＵＣ−１配列の円形順列であるアミノ酸配列を含むＭＵＣ−１のエピトープを示す。有利には、該免疫原性ペプチドは、アミノ酸配列（配列番号：２）ＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰを有する。本発明で使用することができる他のＭＵＣ−１免疫原性ペプチドおよびそれらの誘導体は、他所で、たとえば、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）らに付与された米国特許第６，６００，０１２号、およびＭＵＣ１、または癌ワクチンに含まれ得る、本方法で癌患者に使用される他の癌ペプチドによく似たペプチドを開示している、２００２年２月５日発行の、Ｓａｎｄｒｉｎらに付与された米国特許第６，３４４，２０３号で、開示されている。
【００６８】
Ｍａｇａｒｉａｎ−Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、およびその中に引用されている参考文献で開示されている通り、Ａｇ特異的ＭＨＣ非制限的認識の他の例も記載されている。たとえば、関節リウマチ患者の滑液、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の免疫をもつマウスから、マイコバクテリウムのＡｇに特異的なＭＨＣ非制限的Ｔ細胞が単離されている。ＡｇたとえばＢ細胞腫瘍上のＩｇ  Ｉｄｓ、ヘルペスウイルス糖タンパク質、および非ペプチド・プレニルピロリン酸に特異的なＭＨＣ非制限的Ｔ細胞もまた、単離されている。Ａｇ特異的、ＭＨＣ非制限的βＴ細胞はまた、複合タンパク質たとえばアビジンおよびミエリン塩基性タンパク質、ならびに非ペプチドＡｇたとえばヘモグロビンのヘム部分に関して記述されている。幾つかの研究は、ＭＨＣ分子の非存在下でＡｇを認識することができるアルソネート特異的およびフルオレセイン特異的Ｔ細胞についても記述している。水疱性口内炎ウイルス核タンパク質に由来するグリコシル化ペプチド上の炭水化物部分に特異的な炭水化物特異的ＭＨＣ非制限的Ｔ細胞もまた創出されている。
【００６９】
ａ．一般的に有用な抗原
抗原特異的ＭＨＣクラスＩＩおよびクラスＩ制限的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、様々な病気に対する重要な宿主免疫応答である。したがって、特に関心があるのは、抗原特異的Ｔ細胞応答の発生である。本明細書で使用されるとき、「抗原特異的」Ｔ細胞応答は、他の刺激を用いた場合には明白でないペプチド、たとえば異なるアミノ酸配列を有するペプチド（対照ペプチド）等の、所与の抗原性刺激に対するＴ細胞応答（増殖性、細胞障害性、サイトカイン分泌）である。Ｔ細胞の応答性は、ＣＤ２５およびＣＤ６９を含むがその限りではないＴ細胞活性化に特有である、細胞表面分子の出現を評価することにより測定される。このようなアッセイは当該技術分野で公知である。
【００７０】
本方法は、概して、非常に様々な抗原に適用される。これらの抗原は、Ｔ細胞特異的免疫応答を引き出すことができれば、ほとんどどんな化学構造のものであってもよく、少なくとも１つのＴ細胞特異的エピトープを含むことができる。代表的な抗原は、ペプチド、炭水化物、脂質、および特にそれらの組合せに由来してもよい。特に重要な抗原は、ペプチド、リポペプチドおよびグリコペプチドである。イディオタイプ抗原および抗イディオタイプ抗原が特に含まれる。
【００７１】
主題の方法を使用することが極めて有利と考えられる抗原としては、腫瘍抗原などがある。腫瘍抗原は、通例、腫瘍の存在と相関関係がある固有の抗原または外来抗原である。腫瘍抗原は、異常組織を正常組織と識別する際に有用であるため、診断の場合のみならず、治療的介入の標的としても、有用である。したがって、腫瘍抗原に対するＴ細胞特異的免疫応答を生じさせるための本方法の使用は、本発明の重要な態様である。
【００７２】
腫瘍抗原は、当該技術分野で周知である。事実、幾つかの例が十分に特性決定されており、また、現在、腫瘍特異的治療法の創出に大きな関心が集まっている。腫瘍抗原の非限定的な例は、前述のムチン、たとえばＭＵＣ−１に加えて、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、黒色腫抗原（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）である。
【００７３】
ＭＵＣ−１ムチン抗原は、多数の腺癌に対する免疫を生じさせるための潜在的な免疫療法標的として認識されてきた。したがって、本発明の一実施形態は、ＡＰＣの表面上のクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子のいずれかまたは両者に結合することができる「ＭＵＣ−１誘導体」の、本発明の方法における使用に関する。「ＭＵＣ−１誘導体」は、一般に、上記ＭＵＣ−１ペプチドを含むがその限りではない、ペプチドであるかまたはペプチドを主成分とする。ＭＵＣ−１誘導体は、ＭＵＣ−１タンパク質の断片であってもよい。このような断片は、グリコシル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明に従えば、本発明の範囲内の断片は、プロテアーゼ、たとえばペプシンまたはパパインを用いた消化を含む方法を使用して、精製ＭＵＣ−１または組換えＤＮＡ方法で生じさせたＭＵＣ−１から得られる。もちろん、ＭＵＣ−１断片はまた、組換え方法で直接製造することもできる。加えて、本発明に包含されるＭＵＣ−１断片は、自動化ペプチドシンセサイザー、たとえばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、マルチプル・ペプチド・システムズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）等々により商業的に供給されるものを使用して合成することができ、または当該技術分野で周知の技術を使用して、手動で製造することも可能である。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０２：２５９（１９７８）を参照されたい。本発明の方法で使用するのに適当なさらなるＭＵＣ−１誘導体は、アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）ら（上掲）に記載されている。さらに、コア配列の１つ以上のアミノ酸は、好ましくは、当該技術分野で公知の保存的様式で、必要不可欠なＴ細胞活性化活性が維持されるように、変化していてもよい。代表的な置換は、下記のアミノ酸グループの間で行うことが可能である（ａ）Ｇ、Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ；（ｂ）ＧおよびＰ；（ｃ）Ｓ、Ｃ、Ｔ、Ｍ；（ｄ）Ｆ、Ｙ、およびＷ；（ｅ）Ｈ、ＫおよびＲ；ならびに（ｆ）Ｄ、Ｅ、Ｎ、およびＱ。幾つかの好ましい置換は、下記のグループ間で行われる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ａ（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。
【００７４】
上述の通り、これらの好ましいＭＵＣ−１誘導体は、当該技術分野で公知の方法に従って、グリコシル化または部分的にグリコシル化することが可能である。さらに、ＭＵＣ−１およびＭＵＣ−１誘導体は、より大きい分子量のポリマー、たとえばポリエチレングルコール類で修飾できると考えられる。加えて、脂質修飾は、カプセル封入または該誘導体とリポソームとの相互作用を容易にすることが可能なため、好ましい。この目的に有用な代表的な脂質部分は、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基およびデカノイル基、または、より一般的には、任意のＣ2〜Ｃ30飽和、一価不飽和または多価不飽和脂肪酸アシル基を含むがその限りではない。非ペプチド「擬似物」、すなわち、ＭＵＣ−１タンパク質の１つ以上の機能的特徴によく似た化合物もまた、本発明とともに使用するのに適当なＭＵＣ−１誘導体の１例である。類似物は、概して水溶性、タンパク質分解抵抗性、かつ非免疫原性である。ＭＵＣ−１によく似た、配座固定された環状有機ペプチドは、たとえば、Ｓａｒａｇｏｖｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：７９２（１９９１）により記述された公知の方法で製造することができる。「ＭＵＣ−１炭水化物誘導体」も考えられる。本明細書で使用されるとき、このような誘導体は、ＭＵＣ−１誘導体の免疫刺激特性を保有するグリコペプチドである。このような炭水化物誘導体は、ＭＵＣ−１タンパク質に付いている炭水化物の全部または一部を含んでもよい。ＭＵＣ−１炭水化物の少なくとも１つの特性を模倣した類似物も、使用することが可能である。
【００７５】
当業者は、活性化Ｔ細胞を生じさせるために、他の抗原を使用してもよいことが分かるであろう。このような抗原の例としては、非自己（外来の）ペプチド抗原、およびウイルス、腫瘍、細菌または他の寄生虫に由来するペプチド抗原などがあるが、この限りではない。
【００７６】
ｂ．他の有用な抗原の同定
本方法で有用な完全な抗原は、様々なＴ細胞応答を測定するための認められている方法論を使用して同定することができるが、特定のエピトープと関連した、より特異的な応答を生じさせることは興味深い。この手法は、はるかに小さい、したがってより経済的に産生される抗原性刺激の使用を可能にする。したがって、好ましい抗原は、小さい分子、一般的には、およそ約１００アミノ酸未満、通例は約６０アミノ酸未満の、ペプチドまたはペプチド誘導体である。
【００７７】
当該技術分野で公知の方法によれば、いったん自然のままの（大きい）抗原が同定されると、さらに、その抗原性を１つまたは数個の特異的エピトープに絞り込むことができる。伝統的な一方法は、より小さい抗原を得るために、該大きい抗原のタンパク質分解処理を含む。加えて、タンパク質抗原の断片は、組換えＤＮＡ技術で作り出して、特定のエピトープを同定するためにアッセイすることができる。さらに、小さいペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成法で作り出して、アッセイすることができる。無傷の抗原の一部を作り、次いでそれらをアッセイするランダム・アプローチに代わるものとして、より生物学的に適切なアプローチが可能である。具体的に記載すると、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子に結合する抗原断片は、特に重要であるため、１つの代表的なアプローチは、該ＭＨＣ分子自身を単離し、次いでそれらと関連したペプチドを単離することである。概して、この方法は、腫瘍抗原の特に有用なエピトープをさらに明確にする際に役立つ。
【００７８】
代表的な方法では、当該抗原を発現している原発腫瘍細胞または細胞系が提供される。加えて、食作用を有する抗原提示細胞（または任意のＡＰＣ）、たとえばマクロファージは、大きい抗原（またはそれらの一部）を食べ物とすることができ、したがってこれらの方法の出発材料の役割をすることが、理解されるであろう。該ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子は、公知の方法、たとえば抗体アフィニティ（ＭＨＣ特異的抗体ｓ）およびクロマトグラフィー技術を使用して、これらの出発細胞から単離することができる。次いで、単離されたＭＨＣ分子は、結合しているペプチドを放出するように処理される。これは、結合しているペプチドと該ＭＨＣ分子との間の相互作用を分断させる薬剤、たとえば、デタージェント、尿素塩化グアニジウム、二価陽イオン、様々な塩類および極端なｐＨによる処理によって達成される。放出された該ペプチドは、従来のクロマトグラフィーおよび抗体アフィニティ（抗原特異的抗体を使用）方法論を使用して、さらに精製することができる。精製されたペプチドは、次には、たとえばペプチドシークエンシング、ガスクロマトグラフィおよび／または質量分析法を使用して、配列決定および構造決定に付される。この方法で、クラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子と関連した、最も一般的なペプチドエピトープの配列／構造を決定することが可能である。この配列／構造情報の提供を受けて、上述の通りに、決定された配列の並べ替えを行い、公知のＴ細胞アッセイを使用して、アッセイすることができる。
【００７９】
４．細胞標識および画像化
本発明によるリンパ球の検出に使用される標識は、哺乳動物の体内の細胞を検出に関する技術分野で周知の、いかなる標識であってもよい。都合がよいことに、本明細書に引用されている参考文献に記載されている、当該技術分野で周知の従来の方法を使用して、リンパ球を直接標識するために、一般に、インジウムオキシンの形の、インジウム−１１１が使用される。しかし、哺乳動物の体内の細胞を画像化するために知られている様々な他の放射標識に基づく方法、たとえば、Ａｎｄｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．ら（上掲）に開示されている、ＳＰＥＣＴによるガリウム−６７検出、Ｋｏｒｆ，Ｊ．ら（上掲）に開示されている、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを使用する二価コバルト検出、またはたとえば、細胞膜を放射標識するための（アミノスチリル）ピリジニウム化合物、ヨウ素の放射性同位元素、すなわち、123Ｉ、125Ｉ、または131Ｉ；または、Ｌａｍｂｅｒｔら（上掲）により教示されている、ポリカルボン酸でキレート化された、１当量の金属放射性同位元素たとえば111Ｉｎまたは99mＴｃを含むキレート基も使用することができる。
【００８０】
あるいは、本発明の方法で使用される活性化Ｔ細胞は、標識されたリガンドがリンパ球とｉｎ  ｖｉｖｏで相互に作用するように、リンパ球と特異的に相互に作用することができる標識されたリガンドが哺乳動物に投与され、結果として標識されたリンパ球が生じるか、または、該標識されたリガンドを、リンパ球とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させ、結果として生じた標識されたリンパ球が該哺乳動物に投与される、Ｒｕｂｉｎら（上掲）による教示通り、活性化Ｔ細胞に特異的に結合する標識されたリガンドを使用して、間接的に標識することが可能である。標識されたリガンドの標識は、たとえば、γエミッタ、たとえば、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍ、テクネチウム−９９またはヨウ素−１２３、ポジトロンエミッタ、たとえば、フッ素−１８、炭素−１１、またはヨウ素−１２４、磁性材料、たとえば、ガドリニウム、超常磁性物質、または水和酸化鉄粒子、または密度ベースの造影剤であってもよい。
【００８１】
標識されたリンパ球の体内分布は、画像化技術によって確定される。画像化は、非侵襲的方法による、体内における該標識の分布の検出を意味する。本発明の方法で使用される画像化技術は、もちろん、標識の性質に応じて、ラジオイメージング、磁気共鳴画像法、ポジトロン放出断層画像法およびＸ線コンピュータ断層画像法からなる群から選択することが可能である。さらに、該画像化は、シングルスキャンで構成されても連続スキャンで構成されてもよく、また、該哺乳動物の全身スキャンであっても部分スキャンであってもよい。有利には、本発明の方法で使用される画像化は、該哺乳動物の全身スキャン、特に111Ｉｎ標識リンパ球のＳＰＥＣＴ画像化を含む。
【００８２】
好ましくは、該哺乳動物に投与される標識リンパ球の用量は、適量の放射能が投与されるように、被検者の全血約５０〜約７５ｃｍ3中に存在するリンパ球の量とほぼ等しい。放射能の量は、使用される同位元素によって異なり、また必要以上の実験をせずに、当業者が決定することができる。たとえば、一般に、約１．５〜約３．０ｍＣｉ／投与のインジウム−１１１、約１０〜約３０ｍＣｉ／投与のテクネチウム−９９、約５〜約１０ｍＣｉ／投与のヨウ素−１２３、約５〜約１０ｍＣｉ／投与のヨウ素−１２４、約１０〜約２０ｍＣｉ／投与のフッ素−１８および約２０〜約３０ｍＣｉ／投与の炭素−１１を使用することが好ましい。ある実施形態では、標識リンパ球の多回投与を使用することができる。
【００８３】
幾つかの実施形態では、画像化は、少なくとも２つの別々のスキャンを含み、各別々のスキャンは、ラジオイメージング、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層（ＰＥＴ）およびＸ線コンピュータ断層（ＣＴ）画像法からなる群から選択される。有利には、このような実施形態では、２つ以上の別々のスキャンにより得られる画像化データを、たとえば、マルチプルスキャンによるデータを単一表示画像に融合する処理によって、比較する。たとえば、１９８８年４月５日発行の、ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）に付与された米国特許第４，７３５，２１０号は、リンパ系造影法、器官画像化方法、およびキット、特に、特異的抗体造影剤を用いて作成された陽画像から、グロス（ｇｒｏｓｓ）造影剤を使用して作成された陰画像を減ずることを含む、リンパ管シンチグラフィーまたは磁気共鳴リンパ系造影法のための改良された方法を開示している。
【００８４】
つい最近、２００２年１２月３日発行の、タウンゼンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）らに付与された米国特許第６，４９０，４７６号は、内臓の運動に起因する配置調整、スキャナベッド特徴の変動、およびスキャンに対する患者の位置の問題を解決する、１つの装置でＣＴ画像およびＰＥＴ画像を連続的に獲得するための、ＰＥＴおよびＸ線ＣＴ併用断層写真およびその使用方法を教示している。該断層写真は、体外マーカーまたは体内標識を使用せずに、正確に同時記録された機能的および解剖学的画像を獲得する。
【００８５】
標識リンパ球の投与後、スキャンのタイミングは、分、時間、日、週または月であってもよい。個々のタイミングは、多くの因子、たとえば、標識のタイプ、標識の量、リンパ球の挙動および疾患状態によって左右される。該タイミングは、このような因子を使用し、また所定内の実験を使用して、当業者が決定できる。
【００８６】
５．本発明の方法の用途
上述の用途に加えて、本発明の方法は、疾患の進行を、細胞特異的抗原または病原体特異的抗原の分布の変化によって確定することができる、哺乳動物における疾患の進行の程度を診断するために使用することができる。たとえば、該疾患は、ウイルス感染、たとえば、ＨＩＶ感染、または他の感染性疾患、自己免疫疾患、たとえば、関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、または乾癬、または悪性腫瘍、たとえば、骨髄腫、リンパ腫、白血病または上述の腫瘍を含む充実性腫瘍であってもよい。該方法は、このような疾患で発現される冒された細胞特異的抗原または病原体特異的抗原の免疫原性ペプチドエピトープにより活性化され得るリンパ球を有する哺乳動物で使用することができる。該疾患の進行の程度を診断するために、標識リンパ球の分布またはトラフィックパターンを、異なる時に同一哺乳動物で、または疾患に罹っていない別の哺乳動物で生じた、標準と比較する。本発明は、本発明の方法の活性化Ｔリンパ球を使用する養子免疫療法を含む、免疫調節治療が有用かもしれない疾患に、特に有用である。
【００８７】
本発明の別の態様は、疾患を有する哺乳動物で、治療に対する応答をモニターする方法である。処置ステップに対する哺乳動物の応答は、該治療が、活性化抗原特異的リンパ球の分布またはトラフィックパターンを変えるかどうかを画像化で確定することにより、モニターされる。
【００８８】
本発明の別の態様は、薬剤が、活性化抗原特異的リンパ球の分布またはトラフィックパターンを変えるかどうかを画像化で確定することにより、疾患、たとえばＨＩＶ感染、自己免疫疾患、感染性疾患、または悪性腫瘍を有する哺乳動物の処置に有用な薬剤を同定する方法である。
【実施例】
【００８９】
実施例１
活性化Ｔリンパ球を、活性化して採取する臨床手順
ＣＴＬ生成標準操作手順
第０日：患者のアフェレーシス・バッグおよびネームラベル、ならびに特別の密封管状物に入ったサンプルを、コーヒー・ブラド・センター（Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）から受け取る。これを、ＣＢＣ（完全血球算定）のためにＨＣＣに運ばれる、スナップキャップ型バイアルに放出する。アフェレーシスバッグの容量を書き留める。患者ラベルを培養バッグに付け、治験番号−患者番号−アフェレーシス４を記入したラベルを付けた。もう１つの患者ノートは、初回アフェレーシスから開始される。全ての関連データ、情報およびこの検査室で行われた結果は、このノートに記録される。
【００９０】
十分なＡＩＭ−Ｖ培地を、２〜３リットルの３７℃水浴で温める。オティリ・フレッシュ１（Ｏｔｉｌｙ  ｆｒｅｓｈ  １）未開封ビンを使用する。一度開封すると、そのビンは、その患者専用に指定される。アフェレーシスバッグからアフェレーシス産物を取り出しやすくするために、アフェレーシスバッグの容量を１０００ｍｌから差し引き、その容量のＡＩＭ−Ｖを培養バッグに移す。
【００９１】
該培養バッグ上の適切なポートに、ルアー・ロック（ｌｕｅｒ−ｌｏｃｋ）６０ｍｌシリンジを取り付けることにより、ＡＩＭ−Ｖ培地を培養バッグに移す。他の全てのポートは閉じている。次いで、トランスファー・チュービングを使用して、該アフェレーシスバッグと該培養バッグを突き通し、アフェレーシスバッグの中身を培養バッグに空ける。ＳＥＢＲＡヒートシーラーを使用して、該培養バッグにもっとも近いチュービングを４回シールする。培養バッグから３番目のシールの内側で、該チュービングを切断する。
【００９２】
ＣＲＣからの白血球数を細胞数／ｍｌとして使用し、アフェレーシスバッグの容量を乗じて、アフェレーシスバッグ内の（細胞総数）を決定する。この数値を１０００ｍｌで割ると、（培養バッグ中の細胞濃度）を与える。培養バッグの最大容量は２０００ｍｌである。細胞は、２×１０^細胞／ｍｌで開始されるため、必要な細胞の最大数は、４０００×１０（４×１０^０９）である。バッグ内の細胞総数が４×１０9を超えなければ、そのときは細胞を除去しない。細胞総数が４×１０9を超えれば、そのときは適切な容量を除去する。（バッグ中の細胞総数−４×１０9細胞が除去される）。（除去すべき細胞）を（培養バッグ中の細胞濃度）で割って、除去すべき容量を決定する。
【００９３】
最初に、細胞を除去する必要がない場合：
プランジャを取り外してわずかに元に戻し、適切なバッグ・ポートに取り付けた、６０ｍｌルアー・ロック・シリンジを用いて、ＡＭ培地を培養バッグに移す。１リットル超を加える場合、こぼさないように気を付けて、ＡＩＭ−Ｖのビン全部をシリンジ内に注ぎ込む（そのとき、ロートの役割をする）。１リットル未満を加える場合、滅菌して個別に包装された５０ｍｌピペットを使用して、該培地をビンからシリンジ／ロートに移すことができる。該培養バッグを、定期的に、前後左右に穏やかに揺り動かして、内容を混合する。
【００９４】
最初に、細胞を除去する必要がある場合：
ルアー・ロック６０ｍｌシリンジを適切なポートに取り付け、そのプランジャを適所に置く。該培養バッグを、前後左右に穏やかに揺り動かして、内容を混合する。シリンジ・プランジャを引き上げて、該細胞懸濁液をシリンジ内に入れ、再度押し戻して、該細胞を混合する。これを１〜２回繰り返して、シリンジ内で十分に混合する。２回または３回解かした後、液面を、シリンジの４５ｍｌの印まで持ってくる。ポートをシリンジから取り外し、バッグの上にあげて閉じる。シリンジ内の懸濁液を５０ｍｌ管に放出し、これを閉じる。該培養バッグのポートを、再び該シリンジに取り付け、必要量が除去されるまで、この工程を繰り返す。必要な５０ｍｌ管の数は、除去される容量によって異なる。これらの細胞は、さらなる実験用に、バイアル内で、または、さらなる培養バッグ用に、まとめて、凍結させる。
【００９５】
その後の細胞障害性およびサイトカインアッセイ用の、細胞および上澄の０日サンプルを提供するために、この時点で、サンプルを培養バッグから除去しなければならない。通常、４０×１０6細胞が除去される。２×１０6細胞／ｍｌで、これはおよそ２０ｍｌである。混合するためにバッグを穏やかに揺り動かすことを含め、余分な細胞を除去するときと同じ方法で、このサンプルを除去することができる。６０ｍｌシリンジの代わりに、３０ｍｌシリンジを使用することができる。除去された細胞は、５０ｍｌ管に入れる。これらを４００ｇ（１２００ｒｐｍ）で１０分間、回転させる。上澄６ｍｌを保存し、ラベルを付けた１ｍｌ滅菌バイアル中に等分して、−２０℃で凍結させる。残りの上澄は廃棄する。該細胞は凍結培地（ウシ胎仔血清＋１０％ジメチルスロキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｏｘｉｄｅ））４ｍｌ中に再懸濁して、濃度１０×１０6細胞／ｍｌとする。ラベルを付けた滅菌クリオバイアル３本のそれぞれに、１ｍｌずつ等分した。凍結培地１ｍｌを、残りの細胞懸濁液１ｍｌに加え、５×１０6細胞／ｍｌの濃度を実現し、ラベルを付けた滅菌クリオバイアル２本のそれぞれに、１ｍｌずつ等分した。発泡スチロールのラックが入っている発泡スチロールの箱を、常に−８５℃のフリーザー内で保存した。その後、−１３５℃のフリーザーに入れる翌日まで、全てのクリオバイアルをこの容器に入れる。これらのバイアルの位置（フリーザー・ラック、箱および配置）を、治験番号−患者番号−アフェレーシス番号、日付、インキュベーションの日、細胞数、容量およびフタの色（必要に応じて）と共に、３×５のカードに記入する。これらのカードは、臨床治験インベントリ・ボックス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  Ｂｏｘ）に入れておく。
【００９６】
次に、「ムチン」ペプチドおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）を該バッグに加える。両者の添加量は、バッグの容量によって異なるため、除去または添加するｍｌ数を、患者のノートに注意深く記録する。バッグ中の「ムチン」濃度は、１μｇ／ｍｌである。「ムチン」の原液は、ｌμｇ／μｌであり、そのため、該バッグに添加されるμｌ量は、バッグ内のｍｌ数に等しい。バッグ内の１−２サイトカイン濃度は、１００ＩＵ／ｍｌである。ＩＬ−２の原液濃度は異なる可能性があるため、必要なＩＵ総数は、該バッグの容量（ｍｌ）×１００ＩＵ／ｍｌによって決定しなければならない。次いで。このＩＵ総数を原液濃度で割って、必要なμｌ数を与える。ロートの役割をするシリンジと同じ手はずで、これらの両者を加えることができる。３．５ｍｌシリンジまたは１０ｍｌシリンジを使用することができる。プランジャを取り外してからバッグ・ポートに取り付け、別々の、滅菌して個別に包装したマイクロピペット先端を使用して、「ムチン」およびＩＬ−２を、できる限りシリンジの下方に加える。用時調製したＡＩＭ−Ｖ培地２ｍ１を使用して、シリンジおよびバッグ・チュービングをすすぎ落とす。この２ｍｌをバッグ総容量に加える。
【００９７】
前と同様に、前後左右に揺り動かすことにより、バッグを穏やかに混合する。次いで、これを、ＣＯ2５％の３７℃インキュベーターに入れる。
【００９８】
第３日：該バッグからサンプルを採取する前に、バッグを穏やかに揺り動かして混合しなければならない。１０ｍｌシリンジを使用し、数回引き出して押し戻した後、ｂｒｉｎｇｔｈｅシリンジ内のレベルを１ｍｌの印に持ってくる。ポートを上げて閉じた後、ＣＢＣに使用するために、このサンプルを非滅菌バイアルに入れてもよく、その後廃棄する。濃度が２×１０6細胞／ｍｌより高ければ、培地を加えて濃度を下げなければならない。次いで４０×１０6細胞を取り出し、第０日と同様に、その後のアッセイのために凍結させる。第０日と同様に、上澄６ｍｌを、１ｍｌ／バイアルに等分し、−２０℃で凍結させる。添加または除去した容量を記録しなければならない。前と同様に、必要な総ＩＵを決定して原液濃度で割り、ＩＬ−２を加える。
【００９９】
第７日：第３日と同様、ＣＲＣのために、バッグから１ｍｌを採取する。細胞濃度を決定し、培地を加えなければならない。無菌性サンプル（１３ｍｌ）をこの日に取り出す。バッグ容量の加算／減算を含め、第０日と同様に、「ムチン」ペプチドおよびＩＬ−２を加える。
【０１００】
無菌性：１３ｍｌを、８ｍｌおよび５ｍｌの、２つの部分に分ける。細胞および上澄のアリコート５ｍｌを、マイクロ・テスト・インク（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ．）Ｍ４−ＲＴ管（マルチ・マイクロ・メディア（Ｍｕｌｔｉ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｅｄｉａ））に入れる。この管に、治験番号−患者番号−アフェレーシス番号および日付を記入したラベルを付ける。これを、規定のバイオハザード・バッグのファスナーポケットに入れ、イエロー・フォームを後ろポケットに入れる。このバッグをＨＣＣに持って行き、ＰＣＲマイコプラズマ検査のために、スペシャルティ・ラブズに翌日配達の発送品を集荷するよう、宅配便会社に電話をかける。結果を患者のノートに書き留める。
【０１０１】
８ｍｌのアリコートを４００ｇ（１２００ｒｐｍ）で１０分間、回転させる。治験番号−患者番号−アフェレーシス番号を記入したラベルを付けた滅菌試験管に、上澄をデカントする。別の滅菌試験管に、２ｍｌを取る（ハーディ・ダイアグノスティックス  ＴＢＳ（ＨＡＲＤＹ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＴＳＢ）およびフルイド・チオグリコレート管（Ｆｌｕｉｄ  Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  ｔｕｂｅ）用）。管内の、残りを、コールド・パックと共に発泡スチロールの箱に入れる。必要な用紙をコピーし、プラスチック製のジッパー・バッグに入れ、サンプルと共に封じる。ＬＡＬ検査で内毒素レベルを測定するために、該箱を、翌日配達で、空輸によりバイオホイッタカー（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に発送する。結果を、患者のノートに書き留める。
【０１０２】
先に取り除いた上澄２のうち１ｍｌを、それぞれ、ラベルを貼ったＴＳＢおよびフルイド・チオグリコレート管（Ｆｌｕｉｄ  Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  ｔｕｂｅ）の１つに嫌気的に接種する。これは、サンプルで満たした１ｍｌピペットを、各管の底にそっと置くことによって行われる。次いで、ピペット内のサンプルをゆっくり押し出して、管の底に落ち着かせる。気泡が流体中に導入されないように、ピペットを注意深く撤収し、管をしっかり閉じる。各種の未接種管にも、他の管と同様に、ラベルを付ける。次いで、フルイド・チオグリコレート管（Ｆｌｕｉｄ  Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  ｔｕｂｅ）を３４℃インキュベーターに入れ、フタを緩める。ＴＳＢ管を、室温のキャビネットに入れる。３、７および１４日間のインキュベーション後に、管を検査する。濁りの徴候は、細菌増殖を示す。結果を、患者のノートに書き留める。
【０１０３】
第８日：バッグを混合した後、十分な容量を除去して、細胞障害性およびサイトカインアッセイに十分な細胞および上澄を提供し、ならびに第０日と同様にサンプル（４０×１０6）を凍結する。また、１ｍｌを、グラム染色（Ｇｒａｍ  Ｓｔａｉｎ）のためにＢＳＡに出す滅菌管に移し、患者のラベルによって確認する。前日（第７日）の細胞数を使用して、細胞総数、および除去する必要がある容量を決定することができる。通例、ＸＴＴおよびアルマー・ブルー（Ａｌｍａｒ  Ｂｌｕｅ）細胞障害性アッセイには、１×１０6細胞が必要である。該細胞を４００ｇ（１２００ｒｐｍ）で、通常は１０分間、遠心分離し、少なくとも６ｍｌの上澄を、１ｍｌ／バイアルで６つのバイアルに等分する。細胞障害性アッセイを、できるかぎり早く開始する（ＸＴＴおよびアルマー・ブルー（ＡｌｍａｒＢｌｕｅ）手順を参照）。サイトカインアッセイ（通例、γ−ＩＦＮおよびＩＬ−１０）を、できるかぎり早く開始する（サイトカイン手順を参照）。サイトカインアッセイの結果を６時間以内に入手し、注入基準を決定しなければならない。
【０１０４】
注入基準：サイトカインアッセイのいずれでも、第０日のサンプルより第８日のサンプルが統計学的に有意に上昇していることは、ＣＴＬ産生の十分な証拠であり、グラム染色の結果が陰性である限り、注入に取りかかってもよい。いずれかのサイトカインアッセイで統計学的に有意な上昇がなければ、そのときは、翌日、ＸＴＴの結果がまとまるまで、注入を遅らせる。協議／承認のために、アッセイのデータをＤｒ．Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｗｒｉｇｈｔに提供する。できる限り早くＮａｎｃｙ  Ｂｌａｄｅｓに連絡をとり、注入の時期を決定する。細胞の採取および調製（採取手順を参照）には、２〜３時間を要する。
【０１０５】
ＣＴＬ採取標準操作手順
いったん採取を開始したら、常に検査室に一人残る。
１）全ての溶液のロット番号および有効期限を、採取用紙（Ｈａｒｖｅｓｔ  Ｆｏｒｍ）に記録する。特に明記されていない限り、全ての手順を、層流フード内で実施する。全ての使用済みの用品は、バイオハザード廃棄物として処理する。
２）５ｍｌシリンジを支持クランプに挿入する。培養バッグをインキュベーターから取り出し、前後左右に、穏やかに揺り動かして、混合する。バッグポート／フタを、アルコール・スワブで消毒する。フタを外し、アルコール・スワブの上に置き、ポートをシリンジに接続する。チュービング・クランプを緩め、生じる締め付けを減少させるようにチュービングを操作する。
ａ）プランジャを、該シリンジの全量までゆっくり引っ張ることにより、細胞懸濁液をシリンジ内に引き込む。プランジャゆっくり押し下げて、懸濁液をバッグに戻す。２回繰り返す。
ｂ）プランジャを再度引き上げ、穏やかに、２ｍｌの印まで下げる。
ｃ）シリンジからはずし；ポートを上げて、液体をバッグ内に逆流させ、次いでポートにフタをする。チュービング・クランプを締める。
ｄ）グラム染色のためにＢＳＡ・マイクロバイオロジ・ラボラトリ（ＢＳＡ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に出す滅菌バイアルに、シリンジ内のサンプル１ｍｌを入れる。該細胞を患者に戻す前に、グラム染色による「微生物は見られない」という結果を、ポケベルで、受け取らなければならない。このメッセージは、両技術者が聞いて理解し、採取用紙に記録される。
ｅ）ＣＢＣのためにハリントン・キャンサー・センター・ラボラトリ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）出す微量遠沈管に、残りのサンプル１ｍｌを入れる。
ｆ）５ｍｌシリンジを支持クランプから取り外し、廃棄物として処理する。
３）患者の体表面積によって採取すべき細胞数を決定する：１〜４×１０8細胞／ｍ2。下記の方法で、該バッグから必要な細胞数を取り出す。
ａ）該バッグから取り出すべき容量（必要な細胞を、バッグ中の１ｍｌ当たりの細胞数（ＣＢＣによる）で割った商）を決定する。
ｂ）前と同様に、６０ｍｌシリンジを、支持クランプに挿入し、バッグを穏やかに混合し、低いラックまたは箱で支える。
ｃ）バッグのフタ／ポートをアルコール・スワブで消毒する。前と同様に、フタを外し、ポートをシリンジに取り付ける。チュービング・クランプを緩め、生じる締め付けを減少させるようにチュービングを操作する。チュービングの異なる部分のクランプを毎回締め付けることにより、チュービングを「元に戻す」。
ｄ）前と同様に、細胞懸濁液をシリンジに引き入れる（３×）。最後に引き上げて、４５ｍｌの印まで下げる。
ｅ）バッグ・ポートをはずし、上にあげ、フタをする。チュービング・クランプを閉じる。
ｆ）細胞懸濁液を５０ｍｌ滅菌管に分注し、管にすっぽりフタをする。
ｇ）必要に応じて「ｃ）」から繰り返して、適量の細胞懸濁液を引き抜く。
４）培養バッグをインキュベーターに戻す。
５）遠心分離機ホルダー内の全ての管を釣り合わせる。必要に応じてバランス・チューブを使用する。（４００×ｇ）で１１分間回転させる。制動装置はオンである。
６）細胞を遠心分離している間に：
ａ．）シリンジ／針を使用し、前後に、確実に全ての接続をアルコールで消毒して、２５％ｖ／ｖのアルブミン２５ｍｌを、注入バッグに移す。
ｂ）０．９％ＮａＣｌ約２５０ｍｌを、滅菌したビンまたはフラスコに移す。シリンジ／針または「チュービング」セットを使用し、前後に、確実に全ての接続を消毒して、０．９％ＮａＣｌ約２５０ｍｌを、滅菌したビンまたはフラスコに移す。シリンジ／針を使用し、前後に、確実に全ての接続をアルコールで消毒して、ＮａＣｌ５０ｍｌを該注入バッグに加える。
７）遠心分離機が止まった後、管をキャリヤから注意深く取り出し、フードに戻す。
８）真空／吸引システムを使用して、上澄を吸引する。真空フラスコには、中に「漂白剤」１００ｍｌが入っている。
ａ）滅菌したガラス製パスツール・ピペットを、吸引フラスコ・チュービングに取り付ける。
ｂ）ペレットは柔らかいため、注意を払わなければならない。管を直立に保ち、数ｍｌを底に残して、管の円錐部分まで上澄を吸引する。
ｃ）全ての管を吸引した後、別個の小さいフラスコから、漂白剤をピペット内に吸引し、ピペットおよびチュービングをきれいにする。
９）各管には、細胞ペレットが入っており、これらのペレット全部を、１つに混合しなければならない。
ａ）ＡＩＭ−Ｖ培地２５ｍｌを第１の管に加え、該ペレットの上面に培地を放出することにより、該ペレットを穏やかに再懸濁させる。該培地の全てを入れ、ピペット内に引き上げ、再度放出する。該ペレットが完全にばらばらに壊れるまで、繰り返す。
ｂ）該細胞ペレットが壊れた後、細胞懸濁液２５ｍｌを引き上げ、これを次の管に加える。同じ２５ｍｌを使用して、全ての管に対して再懸濁工程を繰り返す。
ｃ）用時調製したＡＩＭ−Ｖ培地１０ｍｌを使用して、全ての管をすすぎ、洗浄液を先の細胞懸濁液２５ｍｌに加える。
１０）管を釣り合わせ、１２００ｒｐｍ（４００ｇ）で１１分間遠心分離する。制動装置はオンである。
１１）遠心分離機が止まったとき、上澄を吸引する。
１２）該細胞ペレットを、生理食塩水２５ｍｌ中に再懸濁させることにより、細胞を０．９％ＮａＣｌで１回洗浄する。
１３）管を釣り合わせ、１２００ｒｐｍ（４００ｇ）で１１分間、遠心分離する。制動装置はオンである。
１４）上澄を吸引する。細胞ペレットを、０．９％ＮａＣｌ  ２５ｍｌ中に再懸濁させる。この細胞懸濁液を、３０ｍｌシリンジ／針で引き上げ、前後に、確実に全ての接続をアルコールで消毒して、注入バッグに注射する。
１５）それを使用して、２５ｍｌ超の０．９％ＮａＣｌを管に引き上げ、側面および底部をすすぐ。一度管をすすいだら、洗浄液を３０ｍｌシリンジ／針で取り除き、前後に、確実に全ての接続をアルコールで消毒して、注入バッグに注射する。
１６）バッグを傾けることにより、注入バッグの内容を穏やかに混合する。
１７）患者の氏名、細胞数、バッグ内の流体の量、およびプロトコール番号、患者番号およびアフェレーシス番号を記入したラベルを付ける。
１８）次いで、注入バッグをハリントン・キャンサー・センター（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）に持って行き、我々の患者担当の看護士に渡す。技術者および看護士の両者が、トラッキング用紙（Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｆｏｒｍ）に署名する。コピーをＮａｎｃｙ  Ｂｌａｄｅｓに渡し、原本を患者の検査室ノートに挿入する。
【０１０６】
全ての出版物、特許、特許出願、および本明細書に記載の他の資料は、本発明が関連する当業者のレベルを示す。個々の出版物、特許、特許出願、または他の資料が、あたかも、全ての目的のために、参照によりその全てを本明細書に組み入れるように具体的かつ個別に指示されたのと同じ程度まで、全ての出版物、特許、特許出願、および他の資料を、全ての目的のために、参照によりその全てを本明細書に組み入れる。小見出しは、本書の再吟味を容易にするために含まれているに過ぎず、決して、本書の内容を制限する意図はない。
【０１０７】
理解を明確にするために、実例および実施例として、前述の発明を、かなり詳細に記述してきたが、ある種の変更および修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内で実施されることは明白であろう。
【国際調査報告】
2006505554.tif 000002
2006505554.tif 000003
2006505554.tif 000004
2006505554.tif 000005
2006505554.tif 000006
2006505554.tif 000007