(57)【要約】本発明は、所定の酵素を製造するためのシュウ酸欠損 A. niger 菌株であって、それが由来する野生型菌株と少なくとも同じ量の酵素を同じ培養条件下で産生するシュウ酸欠損 A. niger 菌株に関する。シュウ酸欠損 A.niger 菌株は、好ましくは、それが由来する野生型菌株より多くの酵素を同じ培養条件下で産生するものである。シュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、酵素をコードする遺伝子を含有する発現構築物で形質転換された場合に、それが由来する野生型菌株が、前記シュウ酸欠損菌株と同じ発現構築物で形質転換された場合に同じ培養条件下で産生する量以上の前記酵素を産生するものである。本発明はまた、そのようなシュウ酸欠損 A. niger 菌株を得る方法に関する。本発明は更に、由来する野生型菌株と少なくとも同じ量の酵素を同じ培養条件下で産生するシュウ酸欠損 A. niger 菌株を用いる、酵素の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の酵素を製造するためのシュウ酸欠損 A. niger 菌株であって、それが由来する野生型菌株と少なくとも同じ量の前記酵素を同じ培養条件下で産生するシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項２】
前記野生型菌株より多くの前記酵素を同じ培養条件下で産生する、請求項１に記載のシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項３】
モデル反応で検出される前記野生型菌株の細胞内ＯＡＨ活性の１％〜２５％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有する、請求項１又は２に記載のシュウ酸欠損菌株。
【請求項４】
シュウ酸欠損 A. niger 菌株であって、酵素をコードする遺伝子を含有する発現構築物で形質転換された場合に、それが由来する野生型菌株が、前記シュウ酸欠損菌株と同じ発現構築物で形質転換された場合に同じ培養条件下で産生する量以上の前記酵素を産生することを特徴とするシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項５】
前記遺伝子が異種の遺伝子であることを特徴とする、請求項４に記載のシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項６】
A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生した量以上の、好ましくはそれより多い酵素を同じ培養条件下で産生する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項７】
前記酵素が菌類αアミラーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項８】
前記菌類αアミラーゼが Aspergillus oryzae 又は A. niger に由来する、請求項７に記載のシュウ酸欠損 A. niger 菌株。
【請求項９】
由来する野生型菌株が産生する量以上の酵素を同じ培養条件下で製造するのに適したシュウ酸欠損 A. niger 菌株を得る方法であって、
ａ）A. niger をＵＶ照射に曝すステップと、
ｂ）ａ）で得た生存コロニーのＭＴＰ培養を、ａ）で保持した培養条件下で実現するステップと、
ｃ）前記野生型菌株が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する選択を、ＭＴＰ培養物内で行うステップと、
ｄ）前記野生型菌株が産生する量以上の酵素を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する第２の選択を、ステップｃ）で得た変異体内で行うステップと、
を含む方法。
【請求項１０】
モデル反応で検出される前記野生型菌株の細胞内ＯＡＨ活性の１％〜２５％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有するように、ステップｄ）で選択した変異体を更に選択する追加のステップｅ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
所定の酵素を製造するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシュウ酸欠損 A. niger 菌株、或いは請求項９又は１０に記載の方法によって得ることができるシュウ酸欠損 A. niger 菌株の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドを製造するためのシュウ酸欠損 Aspergillus niger（アスペルギルス・ニガー）菌株、その使用、及び、そのような菌株を得る方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
シュウ酸は、発酵中に細胞の培養上清に蓄積する望ましくない副産物であり、望ましい化合物の下流側の処理において問題を生じさせる。
【０００３】
Ｒｕ１〜Ｒｕ４（以下で定義する。）と名付けられた４件のロシアの先行技術文献は、古典的な変異誘発方法を用いてシュウ酸欠損 Aspergillus niger（A. niger）菌株を得る方法を記載している。シュウ酸欠損 A. niger 菌株は、それが由来する親菌株より少ないシュウ酸を産生する菌株と定義される。これらの先行技術文献は、変異誘発因子の選択は重要でないことを明らかにしている。すなわち、変異誘発因子としてＵＶ又は化学物質を、或いは両者を組み合わせて用いれば、シュウ酸欠損 A. niger 菌株が得られる。由来する親菌株より少ないシュウ酸、又は親菌株より多いクエン酸を産生する菌株が、クロマトグラフィーアッセイを用いて選択されている。このような菌株をポリペプチドの製造に用いることは考えられていない。
【０００４】
・Ｒｕ１：有機酸を合成する能力が変化した A. niger 変異体を選択する方法に関する。IDKasatkina 及び E.G.Zheltova，Mikrobiologiya，第34巻第3号，511-518ページ，1965年(5-6月)。
・Ｒｕ２：ＲＵ２０８９６１５。新規の A. niger 菌株はクエン酸産生菌の性質を有し、微生物産業において用いることができる（ＤＷ１９９８−２４９１６４）。
・Ｒｕ３：ニトロソメチル尿素及び紫外線の単独作用及び混合作用の影響下の A. niger （クエン酸産生菌）の変異性。E.Y. Shcherbakova，Z. S.Karadzhova 及び V. P. Ermakova，Mikrobiologiya，第43巻第3号，508-513ページ，1974年(5-6月)。
・Ｒｕ４：変異原性因子の影響下の A. niger におけるクエン酸及びシュウ酸の比率の変化。V. M. Golubtsova，E. Y.Shcherbakova，L. Y. Runkovskaya 及び V. P. Ermakova，Mikrobiologiya，第４８巻第６号，1060-1065ページ，1979年(11-12月)。
【０００５】
別の刊行物（国際公開第００／５０５７６号パンフレット）には、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠損宿主細胞を、ポリペプチド、一次及び二次代謝産物のような望ましい化合物の製造に用いることができることが記載されている。これらの宿主細胞は、それが由来する親細胞より低いオキサロ酢酸ヒドロラーゼ活性を有する。結果として、これらのオキサロ酢酸ヒドロラーゼ（ＯＡＨ）欠損細胞は、それが由来する親細胞より少ないシュウ酸を産生する。この特許出願明細書は、オキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠損細胞がポリペプチド産生菌として適していることを明らかにする実験データを示していない。更に、Pedersen 他（Pedersen, H． 他，Metabolic Eng.，(2000)2，34-41）は、グルコアミラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物で形質転換されたオキサロ酢酸ヒドロラーゼ欠損 Aspergillus niger 菌株が、それが由来する野生型菌株と同じレベルのグルコアミラーゼ酵素を同じ培養条件下で産生することができないこと、すなわち、変異体が産生するグルコアミラーゼの量が野生型より５０％少ないことを後に報告している。そのような変異体は、工業的な状況におけるポリペプチド産生菌として適していない。
【０００６】
野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを産生することができ、かつ、工業的な状況におけるポリペプチド産生菌として用いることができるシュウ酸欠損 A. niger 菌株が依然として求められている。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
所定のポリペプチド又は酵素を工業的な状況で製造するのに適したシュウ酸欠損 A. niger 菌株を単離した。これらのシュウ酸欠損菌株は、驚くべきことに、それが由来する野生型菌株と少なくとも同じ量のポリペプチド又は酵素を同じ培養条件下で産生する。これらの変異体は、好ましくは、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生する量以上のポリペプチド又は酵素を同じ培養条件下で産生するものである。
【０００８】
本出願明細書では、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 を、A. niger 培養において得られる野生型のシュウ酸レベルの基準として、A. niger 培養において得られる野生型のポリペプチドレベルの基準として、また、A. niger 培養において得られる細胞内ＯＡＨ活性の基準として採用する。シュウ酸欠損 A. niger 菌株は、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 より少ないシュウ酸を同じ培養条件下で産生する菌株と定義される。用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、好ましくは、それが由来する野生型菌株が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生するものである。用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、それが由来する野生型菌株が産生する量の１／３以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生するものである。用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、最も好ましくは、それが由来する野生型菌株が産生する量の１／５以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生するものである。用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、A.niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生するものである。用いるシュウ酸欠損A. niger 菌株は、より好ましくは、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生する量の１／３以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生するものである。用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、最も好ましくは、A.niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生する量の１／５以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生するものである。本発明の好ましい実施形態によれば、用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、本出願明細書で後に明示する方法を適用することによって得ることができる。
【０００９】
本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、好ましくは、それが由来する野生型菌株より多くの所定のポリペプチドを同じ培養条件下で産生する菌株である。本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、A.niger 菌株ＣＢＳ 513.88 より多くの所定のポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。
【００１０】
ポリペプチドを検出するシステムとしては、多種多様なものが当業者に知られている。検出システムには、ポリペプチド又は酵素活性を検出するための、考えうるあらゆるアッセイが含まれる。これらのアッセイシステムとしては、例えば、比色測定アッセイ、光度測定アッセイ、濁度測定アッセイ、粘度測定アッセイ、免疫学的アッセイ、生物学的アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ及び利用可能な他のアッセイに基づくアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
産生されるポリペプチドが酵素である場合、産生された活性のある酵素の量は、モデル反応における酵素活性を測定することによって決定するのが好ましい（実施例を参照されたい）。
【００１２】
本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、好ましくは、モデル反応で検出されるような検出可能な細胞内ＯＡＨ活性を有する菌株である（実施例における実験情報を参照されたい）。本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、モデル反応で検出される元の野生型菌株の細胞内ＯＡＨ活性の０．１〜１００％（好ましくは０．５〜９０％、より好ましくは０．５〜８０％、更により好ましくは１〜５０％の範囲、最も好ましくは１〜２５％、更に最も好ましくは１〜１０％）の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有する菌株である。別の好ましい実施形態によれば、シュウ酸欠損 A. niger 菌株は、モデル反応で検出されるＣＢＳ 513.88 寄託菌株の細胞内ＯＡＨ活性の０．１〜１００％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有するものである。本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、モデル反応で検出されるＣＢＳ 513.88 寄託菌株の細胞内ＯＡＨ活性の１〜９０％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有する菌株である。
【００１３】
ＯＡＨはシュウ酸の形成に関係する唯一の分子であると考えられていたので、検出可能なＯＡＨ活性を依然として有するそのようなシュウ酸欠損菌株の存在は驚くべきことである。検出可能なレベルのＯＡＨ活性を依然として有する変異体は、検出可能なＯＡＨ活性を有しないシュウ酸欠損菌株と比較して、いくつかの利点を有する（Pedersen, H. 他，Metabolic Eng.，(2000) 2，34-41）。例えば、そのような変異体は、それが由来する野生型菌株が産生する量以上の所定のポリペプチドを同じ培養条件下で産生することができる。更に、ほぼ確実に、内因性の有機酸代謝経路が乱れていない。
【００１４】
更に別の好ましい実施形態によれば、本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現構築物で形質転換された場合に、それが由来する野生型菌株が、前記シュウ酸欠損菌株と同じ発現構築物で形質転換された場合に同じ培養条件下で産生する量以上の前記ポリペプチドを産生するという事実を特徴とするものである。
【００１５】
産生されるポリペプチドをコードする遺伝子は、用いるシュウ酸欠損 A. niger 菌株に対して同種であっても異種であってもよい。「異種」という用語は、ポリペプチドが A. niger 細胞にとって生来的なものではないことを意味する。発現構築物に含まれる遺伝子は、好ましくは、A. niger にとって異種の遺伝子である。
【００１６】
好ましい異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、ラクトフェリン、キモシン又はホスホリパーゼＡ２である。本発明の好ましい実施形態によれば、シュウ酸欠損菌株は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物で形質転換されているものである。ポリペプチドは、好ましくは酵素である。産生させることができる酵素は、カルボヒドラーゼ、例えば、セルラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ又はβ−グルコシダーゼ）、ヘミセルラーゼ又はペクチン分解酵素（例えば、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ又は糖類分解酵素）；ホスファターゼ（例えば、フィターゼ）、エステラ−ゼ（例えば、リパーゼ）、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ（例えば、オキシダーゼ）、トランスフェラーゼ、或いはイソメラーゼである。産生される糖類分解酵素は、好ましくはαアミラーゼ（EC 3.2.1.1.、α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ又はEC 3.2.1.2）である。ＤＮＡ配列は、より好ましくは、菌類αアミラーゼをコードするものである。菌類αアミラーゼをコードするＤＮＡ配列は、最も好ましくは、A. niger 又は Aspergillus oryzae（アスペルギルス・オリゼ）に由来するものである。別の実施形態によれば、産生される酵素はプロリン特異的エンドプロテアーゼ（EC 3.4.16.2）である。別の実施形態によれば、産生される酵素はホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）（EC 3.1.1.32）である。ＤＮＡ配列は、より好ましくは、菌類ＰＬＡ１をコードするものである。菌類ＰＬＡ１をコードするＤＮＡ配列は、最も好ましくは、A. niger 又は Aspergillus oryzae に由来するものである。
【００１７】
産生されるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、前記ＤＮＡ配列の高レベルの発現、好ましくは更に前記ポリペプチドの高い分泌レベルを確実にするために、作動可能な形で適当なＤＮＡ調節領域に連結してもよい。産生されるポリペプチドが Aspergillus niger にとって生来的である場合は、その生来的な分泌シグナルを用いるのが好ましい。或いは、産生されるポリペプチドが Aspergillus niger にとって生来的でない場合は、産生される異種の遺伝子と融合した Aspergillus niger のグルコアミラーゼ遺伝子を含有する融合構築物を作製するのが好ましい。本発明の好ましい実施形態によれば、Aspergillus oryzae のαアミラーゼ遺伝子の調節領域が用いられる。本発明のより好ましい実施形態によれば、Aspergillus niger のグルコアミラーゼ遺伝子の調節領域が用いられる。本発明の好ましい実施形態によれば、αアミラーゼの分泌シグナルが用いられる。ＤＮＡ構築物はまた、選択マーカーを含有していてもよい。或いは、選択マーカーは別のＤＮＡ構築物に存在していてもよい。これらのマーカーとしては、例えば、amdS 遺伝子（アセトアミダーゼ遺伝子）、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、argB、trpC 又は pyrG）、及び、例えば、フレオマイシン、ヒグロマイシンＢ又はＧ４１８に対する抵抗性を与える抗生物質耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子は、好ましくは、Aspergillus nidulans 由来のアセトアミダーゼ遺伝子である。Aspergillus nidulans 由来のアセトアミダーゼ遺伝子は、より好ましくは、gpdA プロモーターに融合されたものである。A. niger の形質転換方法は当業者に広く知られている（Biotechnology of Filamentous fungi：Technology and Products. (1992) Reed Publishing（米国）；第６章：形質転換，113-156ページ）。当業者は、A.niger の形質転換を成功させるために、必ずしも、本明細書中に具体的に例示する、ベクター、選択マーカーシステム、プロモーター及び形質転換プロトコルを用いる必要がないことを理解することができるだろう。形質転換後、典型的には、A. niger の集団をペトリ皿内の固体培地上で培養する。固体培地上の培養後選択された形質転換体は、典型的には、３〜７日間、フラスコで培養して、ポリペプチドの発現の有無を確認する。
【００１８】
工業的な状況においてシュウ酸欠損 A. niger 菌株中でポリペプチドを製造する場合、典型的には、フェドバッチ（fed-batch）発酵プロセスを用いることができる。ポリペプチドは、発酵終了時に、当業者に知られている技術に従って精製することができる。そのような回収技術は、例えば、次に説明する通りである。発酵停止時に宿主を殺す必要がある。これは、致死剤が効果的に作用することができる特定の温度で致死剤を添加することによって達成される。致死剤は、例えば、安息香酸ナトリウム又はソルビン酸カリウムである。選ばれた致死剤の特性に応じて、ブロスの温度を、当業者に知られている古典的な冷却方法を用いて、この致死剤の対応する作用温度に調節する。発酵培地に分泌されるポリペプチドの場合、ポリペプチドから細胞物質を分離するには、例えば、単純な濾過処理を行う。すなわち、発酵ブロスを、織布を備えたメンブランフィルタープレスを用いて濾過する（メンブランフィルタープレス及び織布は Harborlite から入手することができる）。濾過パフォーマンスを改善するために、適当な濾過助剤をフィルター布の適当なプレコートと共に用いることができる。
【００１９】
残留小粒子を除くために、更なる濾過ステップを、透明な濾液を得ることができるような方法で行うことができる。濾液は、平均細孔サイズが典型的には１〜１０ミクロンであるフィルタープレートで濾過することにより、浄化することができる。この場合に適したフィルタープレートとして、数タイプのものが当業者に知られている。次に、微生物の大部分を除くために、細孔サイズが約０．４マイクロメートルのフィルターを用いて、微生物濾過を行ってもよい。これら２つの濾過に関しては、濾過パフォーマンスを改善するために、プレコートを用いてもよい。その後、濾液は、限外濾過（ＵＦ）によって、典型的には１０〜２５倍の倍率で濃縮してもよい。この場合に適したＵＦメンブランとして数タイプのものがある。ＵＦ中に、数千未満（分子の形状にもよる。）の典型的な分子量を有する分子が濾液から除去される。従って、目的のポリペプチドに対する低分子量分子の相対的な量は、ＵＦ後、約１／１０〜１／２５に減少させてもよい。ＵＦの継続時間は、濾液の粘度及び濾過性（これらは原料における自然変動のために変動する。）に応じて異なる。この段階では、限外濾過液に存在するポリペプチドの濃度は、通常、ポリペプチドを、意図する適用法に応じて、液体製剤又は乾燥製剤のいずれかに製剤化するのに十分に高いものとなっている。
【００２０】
高収率のポリペプチドを製造するのに適し、かつ、工業的な状況におけるポリペプチド産生菌として用いることができるシュウ酸欠損 A. niger 菌株を得る方法を開発した。ポリペプチドは、前記 A. niger に対して同種であっても異種であってもよい。異種のポリペプチド又は酵素の場合、本発明の方法が適用される野生型菌株は、本明細書で前述した通り、そのようなポリペプチド又は酵素をコードする遺伝子を発現するように、より早い段階で形質転換されていてもよい。そのようなシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、それが由来する野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。シュウ酸欠損 A. niger 菌株は、好ましくは、それが由来する野生型菌株より多いポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。別の好ましい実施形態によれば、変異体は、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生した量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。変異体は、より好ましくは、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生した量より多いポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。
【００２１】
本発明の方法は、下記のステップを含むものである。
ａ）A. niger をＵＶ照射に曝すステップ
ｂ）ステップａ）で得た生存コロニーのＭＴＰ培養を実現するステップ
ｃ）由来する野生型菌株が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する選択を、ＭＴＰ培養物内で行うステップ
ｄ）上記野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生する変異体を選択する第２の選択を、ステップｃ）で得た変異体内で行うステップ
【００２２】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法は下記のステップを含む。
ａ）発酵終了時の発酵培地におけるシュウ酸産生量が、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の場合に少なくとも１５ｍＭであるか、又はフラスコ培養の場合に少なくとも３０ｍＭである培養条件を確立するステップ
ｂ）A. niger をＵＶ照射に曝すステップ
ｃ）ステップｂ）で得た生存コロニーのＭＴＰ培養を、ステップａ）で保持した培養条件下で実現するステップ
ｄ）由来する野生型菌株が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する選択を、ＭＴＰ培養物内で行うステップ
ｅ）上記野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生する変異体を選択する第２の選択を、ステップｄ）で得た変異体内で行うステップ
【００２３】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の方法は下記のステップを含む。
ａ）発酵終了時の発酵培地におけるシュウ酸産生量が、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の場合に少なくとも１５ｍＭであるか、又はフラスコ培養の場合に少なくとも３０ｍＭである培養条件を確立するステップ
ｂ）A. niger の分生胞子（conidiospore）をＵＶ照射に曝すステップ
ｃ）ステップｂ）で得た生存コロニーのＭＴＰ培養を、ステップａ）で保持した培養条件下で実現するステップ
ｄ）由来する野生型菌株が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する選択を、ＭＴＰ培養物内で行うステップ
ｅ）上記野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生する変異体を選択する第２の選択を、ステップｄ）で得た変異体内で行うステップ
【００２４】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の方法は下記のステップを含む。
ａ）A. niger をＵＶ照射に曝すステップ
ｂ）ステップａ）で得た生存コロニーのＭＴＰ培養を実現するステップ
ｃ）由来する野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生する変異体を選択する選択を、ＭＴＰ培養物内で行うステップ
ｄ）上記野生型菌株が産生する量の半分以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する第２の選択を、ステップｃ）で得た変異体内で行うステップ
【００２５】
これらの方法の各ステップは更に、下記の特徴を有する。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、第１のステップでは、まず、発酵終了時の発酵培地におけるシュウ酸産生量が、ＭＴＰの場合に少なくとも３０ｍＭであるか、又はフラスコ培養の場合に少なくとも１００ｍＭである培地において A. niger のコロニーを培養する。発酵時間は少なくとも３日である。更に、この培地のｐＨを手動補正する必要がないというのが、この方法の好ましい実施形態である。このステップの培地のｐＨは３〜７、好ましくは３．５〜６．５、より好ましくは４〜６の範囲に維持される。この培地のｐＨは、最も好ましくは、ｐＨ５〜６の範囲に維持される。そのようなｐＨ値では、シュウ酸の産生量が高いことが知られている。培地のｐＨは、濃度が０．１〜１Ｍ、より好ましくは０．１５〜０．５５Ｍの範囲にある２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）の溶液で緩衝化されているのが好ましい。ＭＥＳ濃度は、最も好ましくは０．５Ｍである。窒素源は、このステップの培地中に存在する。窒素源として好ましいのは、細胞による取込みの結果として発酵培地の酸性化が引き起こされない窒素源である。このステップの培地の窒素源は、より好ましくは尿素である。本発明の好ましい実施形態によれば、このステップで用いる培地はフラスコ規定培地２（ＦＤＭ２）である（実施例１を参照されたい）。本発明の好ましい実施形態によれば、このステップで用いる A. niger 菌株はＷＴ２又は A.niger 菌株ＣＢＳ 513.88 である（実験情報を参照されたい）。
【００２７】
第２のステップでは、A. niger をＵＶ照射に曝して、生存率が０．０１％〜６０％の範囲にあるようにする。生存率は、好ましくは０．０５％〜５０％である。生存率は、より好ましくは０．１％である。分生胞子が、A. niger を物理的又は化学的な手段で変異誘発させる材料として好ましいことは、当業者によく知られている。しかしながら、変異体は菌糸体細胞からも得ることができる。本明細書中に記載の選択方法は、分生胞子又は菌糸体細胞から得た変異体を選択するために適用してもよい。
【００２８】
第３のステップでは、第２のステップで得た生存集団のＭＴＰ培養を、少なくとも３日間行う。
【００２９】
第３のステップのＭＴＰ培養が終了した時点で、変異体は、シュウ酸産生量に基づく第４のステップ（シュウ酸選択ステップ）で選択することができる。好ましくは、由来する野生型菌株が産生する量の１／３以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する。より好ましくは、由来する野生型菌株が産生する量の１／５以下のシュウ酸を同じ培養条件下で産生する変異体を選択する。
【００３０】
培地に存在するシュウ酸を定量するのに用いることができるアッセイは実施例に説明されている。実際的な理由により、最良の変異体（シュウ酸産生量が最も低い菌）が更なる解析用に留保される。好ましくは、５〜５０個の変異体が更なる解析用に留保される。典型的には、フラスコ培養において７日後に、これらの選択した変異体が野生型菌株よりはるかに少ないシュウ酸を産生することを確認することができる。図７に示すケースでは、野生型菌株の発酵培地で見出されたシュウ酸が４０〜４５ｍＭであるのに対して、変異体の発酵培地で見出されたシュウ酸は５ｍＭ未満である。７日間の発酵の後、選択した変異体による培地の酸性化の程度が、野生型菌株によるそれより小さいかどうかを更に確認することができる。変異体で測定された低レベルのシュウ酸が、選択した変異体の発育不良及び／又は低い代謝活性の結果でないこともまた、産生されたバイオマスの測定及び残存グルコース濃度の測定を、発酵期間中、種々の間隔で行うことによって確認することができる。
【００３１】
シュウ酸選択ステップの前又は後に変異体に適用することができる第２の選択ステップは次の通りである。由来する野生型菌株が産生する量以上のポリペプチドを同じ培養条件下で産生する変異体を選択する。変異体は、好ましくは、上記野生型菌株より多くの所定のポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。別の好ましい実施形態によれば、変異体は、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 が産生した量以上の所定のポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。変異体は、より好ましくは、A. niger 菌株ＣＢＳ 513.88 より多くの所定のポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。この最後のステップを行うために、前のステップで得た変異体と、野生型の対照とを、適当な培地で少なくとも３日間、液体培養する。培養は、好ましくは少なくとも５日間行う。培養終了時には、産生されたポリペプチドの量を、本出願明細書で既に説明した、前記ポリペプチドの検出システムを用いて測定してもよい。好ましくは、産生されるポリペプチドが酵素である場合、産生された活性のある酵素の量は、モデル反応における酵素活性を測定することによって決定するのが好ましい（実施例を参照されたい）。
【００３２】
必要に応じて更に第６のステップを適用して、モデル反応で検出されるような検出可能な細胞内ＯＡＨ活性を有するシュウ酸欠損 A. niger 菌株を選択してもよい。モデル反応は、好ましくは、実施例の実験情報に記載の反応である。このステップは、より好ましくは、モデル反応で検出される元の野生型菌株の細胞内ＯＡＨ活性の０．１〜１００％、好ましくは０．５〜９０％、より好ましくは０．５〜８０％、更により好ましくは１〜５０％、最も好ましくは１〜２５％、更に最も好ましくは１〜１０％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有するシュウ酸欠損 A. niger 菌株の選択を可能にするものである。別の好ましい実施形態によれば、シュウ酸欠損 A. niger 菌株は、モデル反応で検出されるＣＢＳ 513.88 寄託菌株の細胞内ＯＡＨ活性の０．１〜１００％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有するものである。本発明のシュウ酸欠損 A. niger 菌株は、より好ましくは、モデル反応で検出されるＣＢＳ 513.88 寄託菌株の細胞内ＯＡＨ活性の１〜９０％の範囲にある細胞内ＯＡＨ活性を有する菌株である。
【００３３】
本発明はまた、所定のポリペプチドを製造するためのシュウ酸欠損 A. niger 菌株の使用に関する。従って、本発明はまた、本出願明細書で定義されるシュウ酸欠損 A. niger 菌株を用いる、所定のポリペプチドの製造方法に関する。そのような菌株は、由来する野生型菌株と少なくとも同じ量の前記ポリペプチドを同じ培養条件下で産生する。菌株は、好ましくは、上記野生型菌株より多くの前記ポリペプチドを同じ培養条件下で産生するものである。別の好ましい実施形態によれば、菌株は、ＣＢＳ 513.88 の A. niger 菌株と少なくとも同じ量の前記ポリペプチド又は酵素を同じ培養条件下で産生するものである。菌株は、より好ましくは、ＣＢＳ 513.88 の A. niger 菌株より多くの前記ポリペプチド又は酵素を同じ培養条件下で産生するものである。
【実施例】
【００３４】
〔実験情報〕
（菌株）
ＷＴ１：A. niger 菌株を、シュウ酸レベル、所定のポリペプチドのレベル及び細胞内ＯＡＨ活性のレベルに関する対照として用いる。この菌株はＣＢＳ機関に寄託番号ＣＢＳ 513.88 の下に寄託されている。
【００３５】
ＷＴ２：ゲノムに組み込まれた A. oryzae α−アミラーゼ遺伝子を含有する発現カセットの数コピーを保有するＷＴ１菌株。この遺伝子は既に他の文献（Wirsel 他 (1989)，Mol. Microbiol.，3:3-14）に記載されているものである。A. oryzae α−アミラーゼ遺伝子によってコードされる本来のシグナル配列は、A. niger 由来のグルコアミラーゼ遺伝子のシグナル配列によって置き換えられた。ＷＴ２は、欧州特許出願公開第６３５５７４号明細書及び国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載の、当業者に既知の技術によって構築選択された。
【００３６】
〈ＯＡＨ活性アッセイ〉
種々の A. niger 菌株の振盪フラスコ発酵を、以下の記載のように行った。細胞を、５００ｍｌ無バッフル振盪フラスコ内の１００ｍｌ ＯＡＨ培養培地中で３日間、３０℃、１７０ｒｐｍで培養した。ＯＡＨ培地は下記表１に規定した通りである。その後、Ｎａ２ＣＯ３を添加してｐＨを８に変更し、細胞を更に１５〜１８時間培養した。菌糸体を濾過によって集め、０．９％（w/v）ＮａＣｌで洗浄し、液体窒素で凍結し、−８０℃で貯蔵した。凍結細胞を液体窒素下、乳鉢中で粉砕し、その後、抽出緩衝液（１００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（ＭＯＰＳ＝モリホリノプロパンスルホン酸）、２ｍＭ ＭｎＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、５％スクロース）に懸濁した。懸濁液を、Eppendorf 遠心分離器５４１７Ｒ内で、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。９２５μｌのアッセイ緩衝液（アッセイ緩衝液：１００ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）／２ｍＭ Ｍｎ２＋）を２５℃で予備加熱し、この予備加熱された混合物に２５μｌの４０ｍＭ オキサロ酢酸溶液を加えた。オキサロ酢酸溶液は、０．０５３ｇのオキサロ酢酸を１０ｍｌのアッセイ緩衝液に溶解することによって調製した。遠心分離後得られた懸濁液の５０μｌを、予備加熱された混合物に加えた。ＯＡＨ活性を、Pedersen 他，2000，Mol. Gen. Genet.，263:281-286 に記載の方法に従って測定した。要するに、オキサロ酢酸は基質として用いられる。酵素活性は、２０秒の時間間隔で３分間、２５５ｎｍで測定した吸光度の減少速度（δＡ／分）、及びオキサロ酢酸の吸収係数から決定した。アッセイは２５℃で行った。
【００３７】
【表１】
2006516399.tif 000002
【００３８】
〈タンパク質アッセイ〉
サンプル中のタンパク質含有量を、製造者の使用説明書（Pierce，製品番号23236）に従って、ウシ血清アルブミンを標準物質として用いるクマシープラスタンパク質アッセイによって測定した。
【００３９】
実施例１では、シュウ酸欠損 A. niger 菌株が、それが由来する親菌株が産生するレベルと少なくとも同じレベルで、同じ培養条件下で産生することができる酵素として、αアミラーゼを例示する。
【００４０】
〔実施例１：高ポリペプチド産生菌であるシュウ酸欠損 Aspergillus niger 変異体の作製方法〕
シュウ酸欠損 A. niger 変異体をＷＴ２から作製した。
【００４１】
（１．成長培地）
培養は、振盪速度２２０ｒｐｍの回転振盪機において、９６ウエルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で、又は、１つのバッフルを有する３００ｍｌフラスコ中で、３４℃で行った。
【００４２】
フラスコ前培養物に、１ｍｌ当たり１７０００個の胞子を接種した。１００ｍｌの培養液に、１０ｍｌの前培養物を接種した。
【００４３】
【表２】
2006516399.tif 000003
【００４４】
【表３】
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【００４５】
フラスコ規定培地２（ＦＤＭ２），ｐＨ６：  ＦＤＭ２培地は、１５グラム／リットルの（ＮＨ４）２ＳＯ４の代わりに１５グラム／リットルの尿素が存在する点を除いて、ＦＤＭ１と同じ組成を有するものだった。この培地は、ＭＥＳを、１リットル当たり３０グラムではなく、１リットル当たり１００グラム含有していた。
【００４６】
【表４】
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【００４７】
（２．A. niger 培養上清におけるシュウ酸検出アッセイ）
Sigma diagnostics から入手可能な市販のキット（Sigma，シュウ酸診断キット，カタログ番号591，2000-2001年）を用いて、シュウ酸定量を行った。最終アッセイ体積を、製造者が推奨する体積から４８μｌまで減少させて、アッセイを３８４ウエルＭＴＰで行った。Beckman Multimek 96 を用いてすべての液体輸送を行い、ＢＭＧ分光蛍光計で５５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。シュウ酸アッセイの標準曲線を図１に示す（光学濃度（ＯＤ）がシュウ酸濃度の関数として示されている）。これらの条件の下で、アッセイが２．５ｍＭまで直線的に上昇することが判明した。
【００４８】
（３．シュウ酸産生量を最大化する培養条件の確立）
この節を通して用いられた野生型菌株はＷＴ１である。
【００４９】
ｐＨは、シュウ酸産生における最も重要なパラメーターとして、文献に記載されている。高いシュウ酸産生を達成するために、A. niger 培養液のｐＨは６付近の値に維持される必要がある（Kubicek, C. P. 他，Appl. Environ. Microbiol. (1988)，54，633-637；及び Ruljter, G. J. G. 他，Microbiology (1999)，145，2569-2576）。ｐＨが４未満になると、シュウ酸産生量は急激に低下する（Ruljter, G. Ｊ. G．，van de Vondervoort, P. J. I.，及び Visser, J.，1999，Microbiology，145，2569-2576）。いくつかの有機酸がこの菌によって産生されるので、A. niger 培養において６付近のｐＨを維持することはほとんど不可能である。ＦＤＭ１培地において培養ｐＨがどの程度重要であるかを評価するために、三つ組のフラスコ培養を、滅菌水酸化ナトリウムの添加による手動のｐＨ補正を毎日行って、又は行わずに、野生型 A. niger 菌株を用いて行った。ＦＰＭ１培地における４８時間の前培養をＦＤＭ１培地の接種前に行った。ＦＤＭ１培地には、A. niger 成長中の培地の酸性化を緩衝化するために、１５Ｍ ＭＥＳ（３０ｇ／Ｌ）が存在した。
【００５０】
図２から明らかなように、培地に存在する緩衝剤は、A. niger による有機酸の産生を相殺するのに十分ではなかった。図３は、シュウ酸収量が培養ｐＨによって大きく影響されたことを示している。ｐＨが補正された培養では、ｐＨが補正されなかった培養より約５倍多いシュウ酸が産生された。
【００５１】
シュウ酸欠損菌株のスクリーニング中は、シュウ酸欠損菌株を選択することができるように、また、野生型レベルのシュウ酸を産生する菌株からシュウ酸欠損菌株を容易に区別することができるように、A. niger は、シュウ酸産生量が最大になる条件で培養される。実際的な理由により、手動のｐＨ補正は、非常に多数の変異体が依然として評価されている最初のスクリーニング段階では、シュウ酸産生量を最大化するために選択しうる手段ではない。培養ｐＨを補正しなくてもシュウ酸産生レベルが改善されるように、ＦＤＭ１培地において、培地中のＭＥＳ濃度及び窒素源の性質という２つのパラメーターを調節した。
【００５２】
図４に示されるように、ＭＥＳ濃度を増大させ、かつ、硫酸アンモニウムを尿素に置き換えたことは、最大シュウ酸濃度に対して大きな影響を及ぼし、その最大シュウ酸濃度には、ｐＨ補正を行わない A. niger 培養において到達することができた。図５には、発酵培地の組成に応じて６日間又は７日間の発酵の後に到達した最大シュウ酸濃度が示されている。
【００５３】
１Ｍ ＭＥＳは A. niger の成長に悪影響を及ぼしたので、中間の０．５Ｍ ＭＥＳが選ばれた。従って、スクリーニング時のフラスコ培養のために最終的に選ばれた成長培地は、ＭＥＳ濃度が０．５Ｍであり、硫酸アンモニウムが尿素によって置き換えられたＦＤＭ１であった。以下、その培地をＦＤＭ２という。
【００５４】
図５は、ＦＤＭ２においてｐＨ補正なしに到達したシュウ酸濃度が、ｐＨ補正を行ったＦＤＭ１で到達したシュウ酸濃度と同等であったことを示している（図３と比較されたい）。こうして、ｐＨ補正はもはや必要でなくなった。
【００５５】
（４．第１の選択：シュウ酸産生）
A. niger の分生胞子を、ポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地（Difco，ポテトデキストロース寒天，培養培地，カタログ番号213400，1996-1997年）上で胞子形成しているＷＴ２コロニーから集めた。１ｍｌ当たり４×１０６個の分生胞子を含有する懸濁液１０ｍｌを、０．１７８３Ｊ／ｃｍ２のエネルギーが与えられるまで、２５４ｎｍのＵＶ照射に曝した（Sylvania，１５ワットブラックライトブルー管，モデル FT15T8/BLB）。最初のコロニー数の０．１％の生存体が得られた。変異誘発後の胞子溶液をＰＤＡ培地に置床し、１００００個の生存体を、Genomic Solutions Flexys コロニー選択装置を用いて選択し、９６ウエルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に入れて更に成長させた。「マスタープレート」と呼ばれるこれらのＭＴＰを、強い胞子形成が明らかになるまで、３４℃でインキュベートした。
【００５６】
マスタープレートを、Genomic Solutions Flexys コロニー選択装置を用いて、４０μｌのＦＰＭ１を含有するＭＴＰにレプリカプレートし、３４℃で４８時間インキュベートした。その後、１７０μｌのＭＤＭ１を加え、ＭＴＰを３４℃で更に７日間インキュベートした。
【００５７】
１００００個の個々の培養物の上清について、シュウ酸の存在をアッセイした。採用された培養条件下では、ＷＴ１菌株及びＷＴ２菌株の培養物において到達したシュウ酸濃度は４０ｍＭの範囲内にあった。成長培地におけるシュウ酸濃度が１２ｍＭ未満である変異体を、更なる選択処理のために選択した。２５５個の変異体が留保された。この第２の選択は、偽陽性のものを排除することができるように、第１の選択より厳格に行った。
【００５８】
第２の変異体選択は、四つ組のＭＴＰ培養及びシュウ酸アッセイからなるものだった。採用した条件は、上述した条件と同じだった。下記の表５第２列には、変異体の中で産生量が最も低い菌、及び野生型のＭＴＰ培養物において到達したシュウ酸濃度が示されている。
【００５９】
【表５】
2006516399.tif 000006
【００６０】
１Ｕ／ｍｌは、１時間当たり１ｇの可溶性デンプンを生成物に変換するために必要とされるαアミラーゼの量である。この生成物の形成は、ｐＨ５．５及び３０℃でヨウ素を添加した後、６２０ｎｍにおける吸収を追跡することによって測定されている。ヨウ素とのインキュベーション時間は１５〜２５分である。
【００６１】
図６は、選択した変異型菌株が成長時にＭＤＭ１成長培地を酸性化する程度が、野生型菌株と比較して小さいことを示している。
【００６２】
（５．第２の選択：αアミラーゼ産生）
第２の選択ステップとして、次に、前のパラグラフで得た３４個の変異体を、αアミラーゼを産生する能力との関係で選択した。
【００６３】
３４個の変異体及びＷＴ２を、前のパラグラフの場合と同じように成長させ、α−アミラーゼ産生量との関係で解析した。
【００６４】
培養上清に存在するα−アミラーゼ活性を、Megazyme から入手したαアミラーゼアッセイキット（Megazyme，CERALPHA αアミラーゼアッセイキット，カタログ参照番号 K-CERA，2000-2001年）を用いて測定した。表５第３列には、ＷＴ２及び３４個の変異体で検出された平均αアミラーゼ産生量が示されている。
【００６５】
図７には、３４個の変異体及び野生型のαアミラーゼの平均産生量が、シュウ酸産生量の関数として示されている。３４個の変異体のすべてが、由来する野生型菌株より著しく多いα−アミラーゼを産生したことが、表５第３列及び図７において認めることができる。前のパラグラフで見出されたシュウ酸変異体のすべてを、由来する野生型と同じ量以上の酵素を同じ培養条件下で産生することができる変異体として留保した。
【００６６】
変異体１５、１９及び２２を更なる選択のために選択した。
【００６７】
（６．第３の選択：ＯＡＨ活性）
更なる選択として、細胞内ＯＡＨ活性を、前のパラグラフで選択した３つの変異体（１５、１９、２２）において測定し、また、対照として、ＷＴ１及びＷＴ２において測定した。一部の菌株については、図８に示すように、測定を２回（Ａ、Ｂ）行った。ＯＡＨ活性を測定するために行った試験を実験データの形で記載する。変異体１５及び２２は検出可能なＯＡＨ活性を示し（図８）、その活性はＷＴ１又はＷＴ２の約１０〜２０％だった。驚くべきことに、変異体１９は、ＷＴ２のＯＡＨ活性に類似した高いＯＡＨ活性を示した。驚くべきことに、これら３つのシュウ酸欠損変異体は比較的高いＯＡＨ活性を依然として有する。更に、それらはまた、良好な酵素産生能力を有する。
【００６８】
〔実施例２：A. niger シュウ酸欠損変異体の解析〕
（１．成長培地）
【表６】
2006516399.tif 000007
【００６９】
（２．A. niger シュウ酸欠損変異体の解析）
変異体１８、２２、１５、２３、１９、３３を、ＦＰＭ１における４８時間の前培養段階の後、ＦＤＭ２培地で成長させ、そのシュウ酸産生量及びいくつかの成長パラメーター（残存グルコース量、ｐＨ及び形成バイオマス量）に関して解析した。ＦＤＭ２培地を用いて得た結果により、これらの変異体のシュウ酸産生レベルが、野生型菌株と比較して低いことが確認された（図９）。
【００７０】
野生型及び変異型菌株の成長中のＦＤＭ２培地に存在する残存グルコース量は、Sigma Diagnostics から入手したグルコースアッセイキット（Sigma，グルコース診断キット，カタログ番号 510-A，2000-2001年）を用いて測定した。図１０から明らかなように、グルコースは、７日間の培養の後、いくつかの変異体培養物でほぼ完全に消費されていた。このことは、選択した変異体で見出された低いシュウ酸レベルが低い代謝活性を反映しているわけではなかったことを示唆している。変異体２３のみは、低下した代謝活性を有するようであった。
【００７１】
培養液のｐＨもまた追跡した。以前に観測されたように（実施例１を参照されたい）、培養培地の酸性化は、変異体では、野生型の培養の場合より進行しなかった（図１１を参照されたい）。
【００７２】
最後に、変異体の低下したシュウ酸産生が発育不良のためではなかったことを確かめるために、バイオマス形成を、培養物中に形成されたバイオマスの乾燥重量を種々の培養時間で測定することによって追跡した。フラスコを、検討される各々の時間間隔で処理し、バイオマス乾燥重量を含むフラスコの総重量を測定した。
【００７３】
図１２から明らかなように、変異体は様々な成長プロフィルを示したが、７日間の培養の後は、親菌株のＷＴ２と同じバイオマスレベルに到達する傾向を示した。変異体２３は、低レベルのバイオマス形成を示した唯一の変異体であったが、このレベルは依然として、ＷＴ２の元である野生型菌株ＷＴ１が到達したレベルに匹敵するものだった。変異体２３は、更なる解析用のシュウ酸欠損変異体として留保されなかった。変異体の胞子形成能力を目視評価した。変異体の胞子形成レベルは、それが由来する野生型菌株の胞子形成レベルに匹敵するものであることが見出された。１つの変異体のみが、より低い胞子形成能力を有するようであった。
【００７４】
後述の実施例では、変異体２２が、種々の酵素を製造するためのシュウ酸欠損 A. niger 菌株として用いられた。この変異体はＷＴ２から、更に遡れば、ＷＴ１から得られたものである。他の酵素をこの変異体で発現させるために、αアミラーゼ遺伝子の全コピーを、アセトアミド遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いて、欧州特許出願公開第６３５５７４号に記載の方法に従って欠失させた。外来の酵素コード遺伝子を保有しないこの変異体は、後述の実施例ではＦＩＮＡＬと名付けられる。続いて、ＦＩＮＡＬは、後述の実施例に記載する通り、発現させる対応する酵素をコードする遺伝子を含有する発現構築物で形質転換した。特定の酵素をＷＴ１において発現させるために、ＦＩＮＡＬに導入された発現構築物はまた、後述の実施例に記載する通り、ＷＴ１にも導入した。コピー数を確認した。プロリン特異的エンドプロテアーゼ及びＰＬＡ１の産生に関して、変異体２２を試験し、ＷＴ１と比較した。変異体２２は、試験された酵素のすべてについて、それが由来するＷＴ１と同じ量又はそれより多い量を同じ培養条件下で産生した。
【００７５】
〔実施例３：ＷＴ１及びＦＩＮＡＬ菌株におけるプロリン特異的エンドプロテアーゼ産生量の比較〕
用いられた、プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子は、既に他で公表されている（国際公開第０２／４５５２４号パンフレット）。国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載のプロリン特異的エンドプロテアーゼをＷＴ１及びＦＩＮＡＬで発現させるために、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示す構築物（pGBFIN11-EPO）を、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載のような同時形質転換によってこれらの菌株に導入した。
【００７６】
推定保有コピー数が類似した形質転換体を選択し、５００ｍｌのバッフル付き振盪フラスコを用いて、インキュベーター振盪機において、３４℃及び１７０ｒｐｍで、欧州特許出願公開第６３５５７４号明細書に記載のような培地１００ｍｌ中で振盪フラスコ実験を行った。４日間の発酵の後、サンプルを採取し、プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性を測定した。プロリン特異的エンドプロテアーゼのタンパク質分解活性は、Ｚ−Gly（グリシン）−Pro（プロリン）−pNA を基質として用いて、ｐＨ５及び約３７℃で、適当な時点で分光光度法によって測定した。１Ｕのプロリン特異的エンドプロテアーゼは、ｐＨ５及び３７℃において、１分当たり１マイクロモルのＺ−Gly（グリシン）−Pro（プロリン）−pNA を変換する酵素量と定義される。
【００７７】
図１３は、推定保有コピー数が異なる A. niger 形質転換体のプロリン特異的エンドプロテアーゼ活性が４２Ｕ／ｌ〜１３５Ｕ／ｌの範囲内にあることを示している。推定保有コピー数が１の菌株は４２Ｕ／ｌ〜４６Ｕ／ｌの活性を有し、推定保有コピー数が２の菌株及び３の菌株の活性とよく相関している。本発明者らは、ＦＩＮＡＬが、ＷＴ１と少なくとも同じ量のプロリン特異的エンドプロテアーゼを同じ培養条件下で産生すると推論した。
【００７８】
〔実施例４：ＷＴ１及びＦＩＮＡＬ菌株におけるホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）産生量の比較〕
本発明者らは、A. oryzae 由来のＰＬＡ１をＷＴ１及びＦＩＮＡＬにおいて発現させることを選択した。この酵素をコードする遺伝子は既に公表されている（Watanabe I 他，Biosci. Biotechnol. Biochem. (1999)，第63巻第5号，820-826ページ）。この遺伝子は、プロリン特異的エンドプロテアーゼ遺伝子を pGBFIN11-EPO にクローニングする技術と同じ、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載の技術を用いて、pGBNFIN11 にクローニングされた。この構築物は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載のような同時形質転換によってこれらの菌株に導入された。振盪フラスコにおけるＰＬＡ１の発現に関して、ＷＴ１及びＦＩＮＡＬの３つの独立した形質転換体を試験した。推定保有コピー数が類似した形質転換体を、５００ｍｌのバッフル付き振盪フラスコを用いて、インキュベーター振盪機において、３４℃及び１７０ｒｐｍで、欧州特許出願公開第６３５５７４号明細書に記載のものと同じ培地１００ｍｌ中で培養した。２日間、３日間、４日間、５日間の発酵の後、サンプルを採取し、ＰＬＡ１活性を測定した。Aspergillus niger（ＰＬＡ１）由来のホスホリパーゼＰＬＡ１活性を、人工基質の１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリン（diC8，基質）を用いて、分光光度法で測定する。ＰＬＡ１はＡ１位のスルフィド結合を加水分解して、チオオクタン酸を解離させる。チオオクタン酸は４，４−ジチオピリジン（発色試薬，４−ＤＴＤＰ）と反応して、４−チオピリドンを形成する。４−チオピリドンは、３３４ｎｍの波長を有する放射線を吸収する４−メルカプトピリジンとの間で、互変異性の平衡状態にある。その波長における吸光変化を測定する。１ユニットは、３７℃及びｐＨ４．０において、１分当たり１ｎｍｏｌのチオオクタン酸を１，２−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンから遊離させる酵素量である。
【００７９】
基質溶液は、６６ｍｌのエタノールに２６４ｍｌの酢酸緩衝液を加えたものに、１ｇの diC8 結晶を溶解することによって調製される。酢酸緩衝液は、０．２％ Triton-X100を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８５）を含むものである。発色試薬は１１ｍＭ４，４−ジチオピリジン溶液である。これは、５．０ｍｇの４，４−ジチオピリジンを２ｍｌのエッペンドルフサンプルカップに計り取り、１．００ｍｌのエタノールに溶解することによって調製した。１．００ｍｌのミリＱ水を加えた。結果を図１４に示す。ＷＴ１の形質転換体の培養物におけるＰＬＡ１活性が４〜５日後に低下したことが示されている。しかしながら、ＦＩＮＡＬの形質転換体のＰＬＡ１活性は発酵中に蓄積し、活性の低下を観測することはできなかった。本発明者らは、ＦＩＮＡＬが、それが由来する野生型の対応菌株より多いＰＬＡ１を同じ培養条件下で産生すると推論した。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】シュウ酸アッセイの標準曲線を示す図である。測定された光学濃度は、溶液中に存在するシュウ酸の濃度の関数として与えられる。
【図２】ｐＨ補正を行った、又は行わなかったＦＤＭ１培地における発酵中の野生型 A. niger の培養上清のｐＨの推移を示す図である。
【図３】ｐＨ補正を行った、又は行わなかったＦＤＭ１培地における野生型 A. niger の発酵中に得られた平均シュウ酸産生量を示す図である。
【図４】アンモニウム又は尿素を窒素源として用い、かつ、ｐＨ補正を行わなかったＦＤＭ１培地における野生型 A. niger の発酵中に得られた平均シュウ酸産生量を、ＭＥＳ濃度の関数として示す図である。
【図５】ｐＨ補正を行わなかったＦＤＭ２培地における野生型 A. niger の発酵中に得られた平均シュウ酸産生量を示す図である。
【図６】ＭＤＭ１培地における、野生型 A. niger 及びいくつかの選択したシュウ酸欠損 A. niger の発酵中のｐＨの推移を示す図である。
【図７】ＦＤＭ２培地における発酵後、野生型及び３４個の変異体によって産生された平均αアミラーゼ量を、シュウ酸産生量の関数として示す図である。
【図８】３つのシュウ酸欠損 A. niger 変異体及び野生型において測定されたＯＡＨ活性を示す図である。
【図９】ｐＨ補正を行わなかったＦＤＭ２培地における野生型及びシュウ酸欠損 A. niger の発酵中に得られた平均シュウ酸産生量を示す図である。
【図１０】ＦＤＭ２培地における野生型及びシュウ酸欠損 A. niger の発酵中に存在した残存グルコースの濃度を示す図である。
【図１１】ＦＤＭ２培地で発酵した野生型及びシュウ酸欠損 A. niger の培養上清のｐＨの推移を示す図である。
【図１２】ＦＤＭ２培地における野生型及びシュウ酸欠損 A. niger の発酵中に産生されたバイオマス量の推移を示す図である。
【図１３】プロリン特異的エンドプロテアーゼをコードする遺伝子の推定保有コピー数が同じであるＷＴ１及びＦＩＮＡＬ（変異体２２）におけるプロリン特異的エンドプロテアーゼの産生量を示す図である。
【図１４】振盪フラスコ内のＷＴ１及びＦＩＮＡＬ（変異体２２）におけるホスホリパーゼＡ１の産生量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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