(57)【要約】本発明の第１の態様は、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む組合せに関する。本発明の第２の態様は、治療に同時に、順次又は別々に使用するための組合せ製剤として、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む医薬品に関する。本発明の第３の態様は、増殖異常を治療する方法に関し、前記方法は、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を対象に同時に、順次又は別々に投与するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む組合せ。
【請求項２】
ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤である、請求項１に記載の組合せ。
【請求項３】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ及びオロムチンから選択される、請求項１又は２に記載の組合せ。
【請求項４】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンである、請求項１から３のいずれかに記載の組合せ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の組合せ、及び製剤上許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項６】
増殖異常治療用の薬物の製剤における請求項１から５のいずれか一項に記載の組合せの使用。
【請求項７】
増殖異常が癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
癌が結腸直腸癌又は肺癌である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
治療に同時に、順次又は別々に使用するための組合せ製剤として、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む医薬品。
【請求項１０】
ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤を順次投与する、治療に別々に又は順次使用するための請求項９に記載の医薬品。
【請求項１１】
ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤である、請求項９又は１０に記載の医薬品。
【請求項１２】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ及びオロムチンから選択される、請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１３】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンである、請求項９から１２のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１４】
製剤上許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む薬剤組成物の形の請求項９から１３のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１５】
増殖異常の治療に使用するための請求項９から１４のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１６】
増殖異常が癌である、請求項１５に記載の医薬品。
【請求項１７】
癌が結腸直腸癌又は肺癌である、請求項１６に記載の医薬品。
【請求項１８】
増殖異常を治療する方法であって、ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤を対象に同時に、順次又は別々に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
対象にＣＰＴ−１１を順次又は別々に投与する前に、前記対象にＣＤＫ阻害剤を投与するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象にＣＤＫ阻害剤を順次又は別々に投与する前に、前記対象にＣＰＴ−１１を投与するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ２又はＣＤＫ４の阻害剤である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチン、プルバラノールＡ、プルバラノールＢ及びオロムチンから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
個々の構成成分に関して治療上有効な量のＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１をそれぞれ投与する、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
個々の構成成分に関して治療量以下の量のＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１をそれぞれ投与する、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
増殖異常が癌である、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
増殖異常が結腸直腸癌又は肺癌である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記治療が、ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤を対象に同時に、順次又は別々に投与するステップを含む使用。
【請求項２９】
増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１の使用。
【請求項３０】
増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤の使用であって、前記薬物が、ＣＰＴ−１１との併用療法で使用するためのものである使用。
【請求項３１】
増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＰＴ−１１の使用であって、前記薬物が、ＣＤＫ阻害剤との併用療法で使用するためのものである使用。
【請求項３２】
ＣＤＫ１レベルの上昇を引き起こすのに十分な量のＣＰＴ−１１を投与する、請求項６から８又は２８から３１のいずれか一項に記載の使用、或いは請求項１８から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
アポトーシスを誘導するのに十分な量のＣＤＫ阻害剤を投与する、請求項６から８又は２８から３１のいずれか一項に記載の使用、或いは請求項１８から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＤＫ阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤を含む組合せ。
【請求項３５】
ＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤が、ＣＰＴ−１１、カンプトセシン、トポテカン及びルルトテカンから選択される、請求項３４に記載の組合せ。
【請求項３６】
対象の増殖異常を治療する方法であって、
（ｉ）ＣＤＫ１レベルの上昇を引き起こすのに十分な量のＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤を投与するステップと、
（ii）アポトーシスを誘導するのに十分な量のＣＤＫ阻害剤を投与するステップとを含む方法。
【請求項３７】
ＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤がＣＰＴ−１１である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＤＫ阻害剤がロスコビチンである、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｉ）及び（ii）が順次的である、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌及び他の増殖異常の治療に適した薬剤の組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の細胞周期の開始、進行、及び完了は、様々なサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）複合体によって制御され、この複合体は細胞増殖に重要である。この複合体は、少なくとも触媒（ＣＤＫ自体）サブユニット及び制御（サイクリン）サブユニットを含む。細胞周期制御により重要ないくつかの複合体には、サイクリンＡ（ｃｄｃ２、及びＣＤＫ２としても知られているＣＤＫ１）、サイクリンＢ１〜Ｂ３（ＣＤＫ１）、サイクリンＣ（ＣＤＫ８）、サイクリンＤ１〜Ｄ３（ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６）、サイクリンＥ（ＣＤＫ２）、サイクリンＫ及びＴ（ＣＤＫ９）並びにサイクリンＨ（ＣＤＫ７）がある。これらの複合体はそれぞれ、細胞周期の特定の段階に関与する。
【０００３】
ＣＤＫの活性は、他のタンパク質との一時的な結合、及びその細胞内局在の変化によって翻訳後に制御される。腫瘍発生は、ＣＤＫ及びその制御因子の遺伝子変化及び制御解除と密接に関係し、このことから、ＣＤＫの阻害剤が抗癌治療に有用である可能性があることが示唆される。実際、初期の結果から、形質転換細胞と正常細胞が、例えばサイクリンＡ／ＣＤＫ２の必要性の点で異なり、従来の細胞毒性薬及び細胞分裂停止薬で認められる全身性の宿主毒性を欠く新規の抗腫瘍薬を開発できる可能性があることが示唆される。
【０００４】
ＣＤＫの機能は、例えば、網膜芽細胞種タンパク質、ラミン、ヒストンＨ１、及び紡錘体の構成成分を含めた特定のタンパク質をリン酸化し、それによってそのタンパク質を活性化又は不活化することである。ＣＤＫによって媒介される触媒ステップには、ＡＴＰから高分子の酵素基質へのリン酸転移反応が関与する。いくつかの群の化合物（N. Gray, L. Detivaud, C. Doerig, L. Meijer, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 859に概説されている）に、ＣＤＫ特異的なＡＴＰ拮抗作用による抗増殖特性があることが認められている。
【０００５】
ロスコビチンは、化合物６−ベンジルアミノ−２−［（Ｒ）−１−エチル−２−ヒドロキシエチルアミノ］−９−イソプロピルプリンである。ロスコビチンは、サイクリン依存性キナーゼ酵素、特にＣＤＫ２の強力な阻害剤であることが示されている。この化合物は、抗癌剤として現在開発中である。ＣＤＫ阻害剤は、細胞周期のＧ１／Ｓ期及びＧ２／Ｍ期からの細胞の経過を遮断すると理解されている。ロスコビチンはまた、網膜芽細胞種のリン酸化の阻害剤であることが示されており、したがって、Ｒｂ陽性腫瘍に対してより強力に作用することに関係するとみなされている。
【０００６】
治療法を最適化するために活性な薬剤を併用してしばしば投与することができることは、当技術分野で十分に確立されている。したがって本発明は、増殖異常、特に癌に特に適した既知の薬剤の新たな組合せの提供を探求するものである。より具体的には、本発明は、特定の薬剤を組み合わせて使用することと関係する、驚くべき且つ予期しない効果を中核とするものである。
【非特許文献１】N. Gray, L. Detivaud, C. Doerig, L. Meijer, Curr. Med. Chem. 1999, 6, 859
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む組合せを提供する。
【０００８】
第２の態様は、製剤上許容される担体、希釈剤又は賦形剤と混合した、本発明に従った組合せを含む薬剤組成物を提供する。
【０００９】
第３の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤における、本発明に従った組合せの使用に関する。
【００１０】
第４の態様は、治療に同時に、順次又は別々に使用するための組合せ製剤として、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む医薬品に関する。
【００１１】
第５の態様は、増殖異常を治療する方法に関し、前記方法は、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を対象に同時に、順次又は別々に投与するステップを含む。
【００１２】
第６の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤の使用に関し、前記治療は、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を対象に同時に、順次又は別々に投与するステップを含む。
【００１３】
第７の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１の使用に関する。
【００１４】
第８の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤の使用に関し、前記薬物は、ＣＰＴ−１１との併用療法で使用するためのものである。
【００１５】
第９の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＰＴ−１１の使用に関し、前記薬物は、ＣＤＫ阻害剤との併用療法で使用するためのものである。
【００１６】
本発明の第１０の態様は、ＣＤＫ阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤を含む組合せに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に示す好ましい実施形態は、上記した本発明の態様すべてに適用可能である。
【００１８】
上記したように、本発明は、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む組合せに関する。
【００１９】
イリノテカンとしても知られているＣＰＴ−１１は、二本鎖切断を誘導するＤＮＡトポイソメラーゼ１の阻害剤である。ＣＰＴ−１１は、カンプトセシンの半合成誘導体であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでその活性型ＳＮ−３８に転換され、ＤＮＡと結合した核の酵素トポイソメラーゼ１（ｔｏｐ１）とそれが結合してその酵素を阻害することによって細胞毒性効果を発揮し、それによってｔｏｐ１とＤＮＡの切断可能な三重複合体が安定化する（５）。これは、ＤＮＡ再連結反応を妨げ、その結果ＤＮＡ二本鎖が切断され、最終的にアポトーシスが誘導される（６）。
【００２０】
薬剤の組合せの効果は、本来予測不可能であり、一方の薬剤が他方の効果を部分的に又は完全に阻害する傾向がしばしば認められる。本発明は、ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤（例えば、ロスコビチン）を併用して、同時に、別々に又は順次投与しても、その２つの作用物質間でどんな有害な相互作用も導かないという驚くべき観察結果に基づくものである。そのようなどんな拮抗的相互作用も予期せず生じないことは、臨床への適用に重要である。
【００２１】
好ましくは、その組合せは相乗効果を有し、すなわちその組合せは相乗的である。
【００２２】
上記したように、本発明の一態様は、治療に同時に、順次又は別々に使用するための組合せ製剤として、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む医薬品に関する。
【００２３】
ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を同時に、併用して、順次又は別々に（投与法の一部として）投与することができる。
【００２４】
本発明において、「同時に」は、２つの作用物質を同時に投与することを意味するのに使用するが、「併用して」という用語は、同時でない場合、同じ時間枠内でそのどちらの治療上の作用も利用できる時間枠内で「順次」それらを投与することを意味するのに使用する。したがって、最初に投与した作用物質の循環半減期が作用物質のどちらも治療上有効な量で同時に存在するようなものであれば、一方の作用物質を、他方の作用物質を与えた後５分、１０分又は数時間以内に、「順次」投与してもよい。その構成成分の投与間にある時間の遅延は、構成成分の正確な性質、その間にある相互作用、及びそのそれぞれの半減期に応じて変わる。
【００２５】
「併用して」又は「順次」と異なり、本明細書において「別々に」は、一方の作用物質と他方の投与の間がかなり長い、すなわち、第２の作用物質を投与するときに、最初に投与した作用物質が治療上有効な量で血流中に存在しなくなっていてもよいことを意味するのに使用する。
【００２６】
本発明の一態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤の使用に関し、前記治療は、ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤を対象に同時に、順次又は別々に投与するステップを含む。
【００２７】
好ましくは、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を同時に又は順次投与する。
【００２８】
好ましい一実施形態では、ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤を同時に投与する。
【００２９】
特に好ましい一実施形態では、対象にＣＰＴ−１１を順次又は別々に投与する前に、前記対象にＣＤＫ阻害剤を投与する。
【００３０】
本発明の他の態様は、増殖異常を治療する方法に関し、その方法は、治療上有効な量のＣＤＫ阻害剤を、その後治療上有効な量のＣＰＴ−１１を順次投与するステップを含む。
【００３１】
本発明の他の態様は、増殖異常の治療に使用する薬物の製造におけるロスコビチンの使用に関し、その使用は、治療上有効な量のＣＤＫ阻害剤を、その後治療上有効な量のＣＰＴ−１１を順次投与するステップを含む。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、対象にＣＤＫ阻害剤を順次又は別々に投与する前に、前記対象にＣＰＴ−１１を投与する。
【００３３】
特に好ましい一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を順次投与する。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態では、個々の構成成分に関して治療上有効な量のＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１をそれぞれ投与する。
【００３５】
本発明の他の好ましい実施形態では、個々の構成成分に関して治療量以下の量のＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１をそれぞれ投与する。
【００３６】
本発明の他の好ましい実施形態では、ＣＤＫ１レベルの上昇を引き起こすのに十分な量のＣＰＴ−１１を投与する。
【００３７】
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、アポトーシスを誘導するのに十分な量のＣＤＫ阻害剤を投与する。
【００３８】
本発明の特に好ましい一実施形態では、１、８、及び５日目にＣＰＴ−１１を投与し、２〜５日目、９〜１２日目及び１６〜１９日目にＣＤＫ阻害剤を投与する。好ましくは、ＣＤＫ阻害剤はロスコビチンである。
【００３９】
好ましくは、約２００〜約５００ｍｇ／ｋｇ／日の、より好ましくは約３００〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の量のロスコビチンを投与する。より好ましくは、約３００〜約４００ｍｇ／ｋｇ／日の量のロスコビチンを２回に分けて、すなわち２×１５０〜２００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。好ましくは、１日２回の投与は、間隔を６〜８時間空ける。
【００４０】
好ましくは、ロスコビチンを経口投与する。
【００４１】
好ましくは、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の、より好ましくは約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ／日の、さらに好ましくは約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日の、はるかに好ましくは約４０ｍｇ／ｋｇ／日のＣＰＴ−１１を投与する。
【００４２】
好ましくは、腹腔内経路によってＣＰＴ−１１を投与する。
【００４３】
本発明の他の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１の使用に関する。
【００４４】
本発明のさらに他の態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＤＫ阻害剤の使用に関し、前記薬物は、ＣＰＴ−１１との併用療法で使用するためのものである。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、増殖異常治療用の薬物の製剤におけるＣＰＴ−１１の使用に関し、前記薬物は、ＣＤＫ阻害剤との併用療法で使用するためのものである。
【００４６】
本明細書において、「併用療法」という用語は、ＣＰＴ−１１及びＣＤＫ阻害剤を、同時でない場合、同じ時間枠内でそのどちらの治療上の作用も利用できる時間枠内で順次投与する療法を指す。
【００４７】
本明細書において、「薬物の製剤」という語句は、そのような薬物の製剤の任意の段階でのその使用に加えて、薬物としての直接的な、本発明の構成成分の使用を含む。
【００４８】
「増殖異常」という用語は、本明細書において広い意味で使用して、細胞周期の調節を必要とする任意の異常、例えば再狭窄や心筋症などの心血管系の異常、糸球体腎炎や関節リウマチなどの自己免疫異常、乾癬などの皮膚の異常、マラリア、気腫や脱毛などの抗炎症性、抗真菌性、抗寄生虫性の異常を含む。これらの異常において、本発明の構成成分は、必要に応じて所望の細胞内でアポトーシスを誘導し又は静止状態を維持することができる。
【００４９】
好ましくは、増殖異常は癌又は白血病であり、最も好ましくは癌である。
【００５０】
増殖異常が癌である場合、癌はｐ５３依存性の癌でもよく、或いはｐ５３非依存性の癌でもよい。
【００５１】
特に好ましい一実施形態では、増殖異常はｐ５３非依存性の癌である。
【００５２】
特に好ましい一実施形態では、増殖異常は結腸直腸癌であり、より好ましくは結腸癌である。
【００５３】
他の好ましい実施形態では、増殖異常は肺癌である。
【００５４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、西洋諸国における癌による死亡の第２の原因であり、化学療法を改善する努力がなされているにも関わらず、奏功率は、著しい生存上の利点に結びついていない。長年にわたって、進行性ＣＲＣの標準療法は、チミジル酸合成酵素阻害剤５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に基づくものであった。最近、作用機構が異なる新たな化合物が、奏功率を高めることが実証された（１）。ＣＰＴ−１１は、単一の作用物質として、５−ＦＵ耐性のＣＲＣ患者で腫瘍反応を示す（２）。ＣＰＴ−１１は、５−ＦＵ及び調節物質ロイコボリンとの組合せで、転移ＣＲＣ患者の第一選択の化学療法として承認されている（３、４）。しかし、ロスコビチンなどのＣＤＫ阻害剤と併用してＣＰＴ−１１を投与することは今日まで提案されていない。
【００５５】
進行性ＣＲＣには、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の突然変異が関与することが知られている。ＣＰＴ−１１は最近、疾患の進行段階で極めて重要なアジュバント療法に組み込まれている。ＤＮＡ損傷チェックポイントはｐ５３の活性化に依存するので、ｐ５３の状態は、ＣＰＴ−１１に対する反応に決定的な影響を及ぼす可能性がある。
【００５６】
ＣＰＴ−１１に対する感受性は、ｔｏｐ１の活性がＤＮＡ修復及び細胞周期制御の欠陥を伴い、癌細胞がアポトーシスを抑制することができないことに依存する可能性がある。この場面において、ＣＰＴ−１１に対する腫瘍細胞の反応へのｐ５３の状態の影響には、依然として議論がある。第１に、ｐ５３は、ＣＰＴ−１１が誘導する損傷から細胞を保護することによって寄与するが、このことは、ＣＰＴ−１１がｐ５３＋／＋のＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞系統での長期の停止、及びｐ５３−／−ノックアウト由来のＨＣＴ１１６細胞系統でのアポトーシスと相関することによって示されている（７）。さらに、ｐ５３不活化後のＭＣＦ−７乳癌細胞及びＨＣＴ１１６細胞で細胞毒性の上昇が観察された（８）。第２に、ｐ５３は、ＣＰＴ−１１に対して細胞を感作し、このことは、様々なヒト癌細胞系統及び正常ヒト線維芽細胞において記載がある（９）。ヒト結腸直腸癌を異種移植したｉｎ  ｖｉｖｏの研究から、ｐ５３が変異型である状態が、ＣＰＴ−１１に対する反応が不良であり（１０）、カンプトセシンによって捕捉されたＤＮＡトポイソメラーゼＩ複合体のレベルが著しく低い（１１）ことと相関することが示されている。最後に、照射とＳＮ−３８治療の組合せによって、ｐ５３の状態と無関係に、線維芽細胞に対して相乗効果が示された（１２）。
【００５７】
ｐ５３の関与についてよりよく理解するために、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９結腸癌細胞系統及びｗｔ−ｐ５３のサブクローンＨＴ２９−Ａ４でＣＰＴ−１１に対する感受性を比較した。これらの研究のさらなる詳細は、添付した実施例中に認めることができる。
【００５８】
概要としては、Ｇ０／Ｇ１に同期化した細胞をＣＰＴ−１１で処理した後の細胞周期の分析から、トランスフェクトした野生型ｐ５３が活性化し、それに続いてｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１依存的に細胞周期がＳ期で遮断されることが実証された。また活性化したｗｔ−ｐ５３によってアポトーシスが増加し、ＣＰＴ−１１に対する感受性が高くなった。ＤＮＡマイクロアレイ分析から、ｐ５３欠損細胞では、細胞周期制御機構がＣＰＴ−１１と反応せず、Ｇ２／ＭのＣＤＫ１／サイクリンＢ複合体が蓄積したことが示された。その後、細胞周期進行を妨げるｃｄｋ阻害因子ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１のｐ５３非依存的な活性化が観察された。出願人による研究から、驚くべきことに、ｐ５３欠損細胞でのＣＤＫ１誘導を利用して、ロスコビチンなど、ｃｄｋ阻害剤でさらに処理することによってＣＰＴ−１１に対する感受性を高めることができることが示された。したがって、ｐ５３変異型の結腸癌細胞系統でのＣＰＴ−１１に対する感受性の増大は、野生型ｐ５３の機能を回復させ、又はｃｄｋ阻害剤でさらに処理することによって実現することができる。
【００５９】
他の特に好ましい実施形態では、本発明は、ＣＤＫ依存性又は感受性の異常の治療における、本明細書に記載する組合せの使用に関する。ＣＤＫ依存性の異常は、通常レベル以上の１種又は複数種のＣＤＫ酵素の活性を伴う。そのような異常は、好ましくは異常なレベルのＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４の活性を伴う。ＣＤＫ感受性の異常とは、ＣＤＫレベルの異常が主因ではないが、主要な代謝異常の下流にある異常である。そのような筋書では、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４は、感受性のある代謝経路の一部であるといえ、したがって、ＣＤＫ阻害剤は、そのような異常を治療する際に活性であってもよい。そのような異常は、好ましくは癌又は白血病的異常である。
【００６０】
好ましくは、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ２及び／又はＣＤＫ４の阻害剤である。より好ましくは、ＣＤＫ阻害剤は、ロスコビチン、プルバラノール（purvalanol）Ａ、プルバラノールＢ、オロムチン（olomucine）及びＷＯ９７／２０８４２、ＷＯ９８／０５３３５（CV Therapeutics）、ＷＯ９９／０７７０５（カリフォルニア大学理事）に記載されている他の２，６，９−トリ置換プリンから選択される。
【００６１】
はるかに好ましくは、ＣＤＫ阻害剤は、ロスコビチン及びプルバラノールＡから選択される。
【００６２】
特に好ましい一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤はロスコビチンである。
【００６３】
ロスコビチンは、化合物２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンであり、２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンとも記載される。本明細書において、「ロスコビチン」という用語は、分解したＲ及びＳの光学異性体、その混合物、並びにそのラセミ体を含む。
【００６４】
ロスコビチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は以下の通りである：
【００６５】
［表］
2006527251.tif 000002
【００６６】
治療法を最適化するために、多数の抗癌剤が併用投与される。上記したように、ＣＰＴ−１１は、５−ＦＵ及び調節物質ロイコボリンとの組合せで、転移ＣＲＣ患者の第一選択の化学療法として承認されている（３、４）。しかし、ロスコビチンと併用してＣＰＴ−１１を投与することは今日まで提案されていない。
【００６７】
はるかに好ましくは、その組合せは、ロスコビチン及びＣＰＴ−１１を含む相乗的な組合せである。
【００６８】
好ましい実施形態では、ＣＰＴ−１１とロスコビチンの組合せによって、どちらかの薬剤の単独投与と比べて高い効果が生じる。この観察結果の驚くべき性質は、従来技術に基づいて予想されるものとは逆である。
【００６９】
本発明の特に好ましい一実施形態では、その組合せはロスコビチンと、ＣＰＴ−１１の活性代謝物であるＳＮ−３８を含む。
【００７０】
本発明の他の態様は、ＣＤＫ阻害剤及びＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤を含む組合せに関する。
【００７１】
一例として、好ましいＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤には、ＣＰＴ−１１、カンプトセシン、トポテカン及びルルトテカン（lurtotecan）がある。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのデータから、ＣＰＴ−１１で処理したＨＴ−２９細胞がＧ２／Ｍのｃｄｋ１／サイクリンＢ複合体を蓄積し、ＣＰＴ−１１で、その後ＣＹＣ２０２でこの細胞を順次処理すると、ｃｄｋ１の誘導が阻止され、細胞の死滅が増加することが示されている。
【００７３】
したがって、本発明の他の態様は、対象の増殖異常を治療する方法に関し、前記方法は、
（ｉ）ＣＤＫ１レベルの上昇を引き起こすのに十分な量のＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤を投与するステップと、
（ii）アポトーシスを誘導するのに十分な量のＣＤＫ阻害剤を投与するステップとを含む。
【００７４】
好ましくは、この態様で、ＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤はＣＰＴ−１１である。
【００７５】
好ましくは、この態様で、ＣＤＫ阻害剤はロスコビチンである。
【００７６】
はるかに好ましくは、ステップ（ｉ）及び（ii）は順次的であり、すなわち、ＣＤＫ阻害剤に対して、ＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤を別々に又は順次投与する。
【００７７】
さらにはるかに好ましくは、ＤＮＡトポイソメラーゼ１阻害剤の投与後、ＣＤＫ阻害剤を別々に又は順次投与する。
【００７８】
薬剤組成物
本発明の構成成分（その製剤上許容される塩、エステル及び製剤上許容される溶媒和物を含む）を単独で投与することができるが、ヒトの治療では、これらは一般に、製剤上の担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与する。
【００７９】
したがって本発明の好ましい実施形態は、製剤上許容される賦形剤、希釈剤又は担体と混合した、ＣＤＫ阻害剤及びＣＰＴ−１１を含む薬剤組成物に関する。本明細書に記載されている種々の異なる型の薬剤組成物に適したそのような賦形剤の例は"Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerの中に認めることができる。
【００８０】
治療への使用に許容される担体又は希釈剤は、製剤技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどがある。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール及び水がある。
【００８１】
製剤上の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図されている投与経路、及び標準的な製剤上の慣習に関連して選択することができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれに加えて、任意の適切な（複数の）結合剤、（複数の）潤滑剤、（複数の）懸濁剤、（複数の）被覆剤、（複数の）可溶化剤を含んでよい。
【００８２】
適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然の糖、無水ラクトース、自由流動性ラクトース、βラクトース、トウモロコシの甘味料、アカシアやトラガカントやアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース並びにポリエチレングリコールがある。
【００８３】
適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。
【００８４】
保存剤、安定化剤、色素を、また着香料も、薬剤組成物中に入れることができる。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルがある。抗酸化剤及び懸濁剤を使用することもできる。
【００８５】
塩／エステル
本発明の作用物質は、塩又はエステル、特に薬剤として許容される塩又はエステルとして存在する可能性がある。
【００８６】
本発明の作用物質の薬剤として許容される塩は、適切なその酸付加塩又は塩基性塩を含む。適切な薬剤としての塩についての総説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)中に認めることができる。塩は、例えば、鉱酸などの強無機酸、例えば硫酸、リン酸又はハロゲン化水素酸を用いて；酢酸など、置換されていない又は（例えばハロゲンによって）置換された１〜４個の炭素原子からなるアルカンカルボン酸などの強有機カルボン酸を用いて；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、又はテトラフタル酸を用いて；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸を用いて；アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸を用いて；安息香酸を用いて；或いはメタン又はｐ−トルエンスルホン酸など、置換されていない又は（例えばハロゲンによって）置換された（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル又はアリールスルホン酸などの有機スルホン酸を用いて形成される。
【００８７】
エステルは、エステル化される官能基に応じて有機酸又はアルコール／水酸化物を用いて形成される。有機酸には、酢酸など、置換されていない又は（例えばハロゲンによって）置換された１〜１２個の炭素原子からなるアルカンカルボン酸などのカルボン酸；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸、又はテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸；アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸；安息香酸；或いはメタン又はｐ−トルエンスルホン酸など、置換されていない又は（例えばハロゲンによって）置換された（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル又はアリールスルホン酸などの有機スルホン酸がある。適切な水酸化物には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムなどの無機水酸化物がある。アルコールには、１〜１２個の炭素原子からなるアルカンアルコールがあり、その炭素原子は、置換されていなくてもよく、或いは（例えばハロゲンによって）置換されていてもよい。
【００８８】
光学異性体／互変異性体
本発明はまた、適切な場合にその作用物質のすべての光学異性体及び互変異性体を含む。当業者なら、光学的特性（１つ又は複数のキラル炭素原子）又は互変異性体の性質を有する化合物を認識するであろう。当技術分野で知られている方法によって、対応する光学異性体及び／又は互変異性体を単離／調製することができる。
【００８９】
立体異性体及び幾何異性体
本発明の作用物質のうちいくつかは、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在する可能性があり、例えば、１つ又は複数の不斉中心及び／又は幾何中心を有する可能性があり、そのため２種以上の立体異性体の及び／又は幾何的な形態で存在する可能性がある。本発明は、その作用物質の個々の立体異性体及び幾何異性体、並びにその混合物すべての使用を意図するものである。特許請求の範囲で使用する用語は、これらの形態が（必ずしも同じ程度ではないが）適当な機能的活性を保持する限り、前記の形態を包含する。
【００９０】
本発明はまた、作用物質又は薬剤として許容されるその塩の適切な同位体的変形形態すべてを含む。本発明の作用物質又は薬剤として許容されるその塩の同位体的変形形態は、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号であるが原子量が自然界に通常みられる原子量と異なる原子によって置換されたものとして定義される。作用物質及び薬剤として許容されるその塩に取り込むことができる同位体の例には、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体がある。作用物質及び薬剤として許容されるその塩の特定の同位体的変形形態、例えば、３Ｈや１４Ｃなどの放射性同位体が取り込まれたものは、薬剤及び／又は基質の組織分布の研究に有用である。トリチウム化された、すなわち３Ｈの、及び炭素１４の、すなわち１４Ｃの同位体は、その調製し易さ及び検出能から特に好ましい。さらに、重水素、すなわち２Ｈなどの同位体で置換すると、高い代謝安定性、例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の延長、又は投与要求性の低下から生じる特定の治療上の利点が得られることがあり、したがってその置換はある状況では好ましいことがある。本発明の作用物質及び薬剤として許容されるその塩の同位体的変形形態は、適切な試薬の適当な同位体的変形形態を使用する従来の手順によって一般に調製することができる。
【００９１】
溶媒和物
本発明はまた、溶媒和物型の本発明の作用物質をも含む。特許請求の範囲で使用する用語は、この型を包含する。
【００９２】
多形体
本発明はさらに、その種々の結晶型、多形型及び含（無）水型の本発明の作用物質に関する。そのような化合物の合成製剤中で使用する溶媒和物からの精製及び／又は単離の方法をわずかに変更することによって、そのような型のうちのいずれかとして化学化合物を単離できることは、製薬業界内で十分に確立されている。
【００９３】
化学的誘導体
本発明はまた、その作用物質の誘導体を含む組合せにも関する。本明細書において「誘導体」という用語は、作用物質の化学修飾を含む。ハロ基、アルキル基、アシル基又はアミノ基による水素の置換がそのような化学修飾の例示となる。
【００９４】
プロドラッグ
本発明はさらに、プロドラッグ型の本発明の作用物質を含む。そのようなプロドラッグは一般に、ヒト又は哺乳動物対象への投与後に修飾を元に復帰させることができるように１つ又は複数の適当な基が修飾された化合物である。そのような復帰は通常、そのような対象中に天然に存在する酵素によって行うが、ｉｎ  ｖｉｖｏで復帰を行うために第２の作用物質をそのようなプロドラッグと一緒に投与することが可能である。そのような修飾の例には、エステラーゼなどによって復帰を実施することができるエステル（例えば、上記に記載のもののいずれか）がある。他のそのようなシステムは、当業者に周知であろう。
【００９５】
投与
本発明の薬剤組成物を、経口、直腸、膣内、非経口、筋内、腹腔内、動脈内、鞘内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、経鼻、口腔又は舌下の投与経路に適合させることができる。
【００９６】
経口投与では、圧縮した錠剤、丸剤、錠剤、ゼラチンカプセル剤、滴剤、及びカプセル剤を特に使用する。好ましくは、これらの組成物は、投与１回当たりに有効成分を１〜２０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１０００ｍｇ含む。
【００９７】
投与の他の型は、静脈内に、動脈内に、鞘内に、皮下に、皮内に、腹腔内に又は筋内に注射することができ、滅菌した又は滅菌可能な溶液から調製される液剤又は乳剤を含む。本発明の薬剤組成物はまた、坐剤、膣坐剤、懸濁剤、乳剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム、ゲル、噴霧剤、液剤又は散粉剤の型のものでもよい。
【００９８】
経皮投与の代替の手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、ポリエチレングリコールの水性乳剤又は液体パラフィンからなるクリーム中に有効成分を組み込むことができる。必要のある場合に応じてそのような安定化剤及び保存剤と一緒にした白蝋又は白い軟パラフィンからなる軟膏中に、１〜１０重量％の濃度で有効成分を組み込むこともできる。
【００９９】
注射可能な型は、投与１回当たりに有効成分を１０〜１０００ｍｇ、より好ましくは１０〜５００ｍｇ含んでよい。
【０１００】
単位剤形で、すなわち単位投与量、或いは複数の又は副次単位の単位投与量を含む別個の部分の型で組成物を製剤することができる。
【０１０１】
特に好ましい実施形態では、本発明の組合せ又は薬剤組成物を静脈内投与する。
【０１０２】
投与量
当業者は、過度に実験を行うことなく対象に投与する本組成物の１つの適当な投与量を容易に決定することができる。通常、医師が個々の患者に最も適する実際の投与量を決定し、それは、使用する特定の作用物質の活性、その作用物質の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与様式及びその期間、排泄速度、薬剤の組合せ、特定の状態の重症度、並びに個々の受けている治療を含めた様々な要因によって決まる。本明細書で開示されている投与量は、平均の場合の例示である。もちろん、より高い又はより低い投与量の範囲が正当である個々の例が存在する可能性があり、そのようなものは本発明の範囲内である。
【０１０３】
必要に応じて、体重１ｋｇ当たり０．１〜３０ｍｇ、又は１ｋｇ当たり２〜２０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１ｍｇの投与量でその作用物質を投与することができる。
【０１０４】
上記のように、好ましくは薬剤として許容される組成物の形態で、各活性構成成分ＣＤＫ阻害剤とＣＰＴ−１１を治療上有効な量で投与する。これらの量は、当業者によく知られている。手引きとして、ＣＰＴ−１１は通常、静脈内、経口又は局所投与する。静脈内及び経口の投与量は通常ＣＰＴ−１１を２５０ｍｇ又は５００ｍｇ含み、患者の体重に応じた全体的な投与量で、例えば経口で週に１５ｍｇ／ｋｇ、最大投与量１ｇ／日で、或いは静脈内で１日に４時間にわたって１２ｍｇ／ｋｇ又は２４時間にわたって２４〜４９ｍｇ／ｋｇを５日間で、医師の指示に従ってそれを投与する。経口投与は、通常カプセル剤で行うが、静脈内投与は一般に数時間、通常４時間にわたって行う。
【０１０５】
好ましくは、ロスコビチンは、投与量１〜５ｇ／日での経口又は静脈内投与として投与する。次いで、上記の適当な投与量で、最も適切と思われる形でＣＰＴ−１１を投与する。好ましい一実施形態では、ロスコビチンを投与してから少なくとも２４時間後にＣＰＴ−１１を投与する。
【０１０６】
ロスコビチンは通常、投与量約０．０５〜約５ｇ／日で、好ましくは約０．５〜約５ｇ／日又は１〜約５ｇ／日で、はるかに好ましくは約１〜約３ｇ／日で経口又は静脈内投与する。或いは、ロスコビチンは、好ましくは投与量約０．４〜３ｇ／日で投与する。ロスコビチンは、好ましくは錠剤又はカプセル剤で経口投与する。ロスコビチンの１日総投与量を単回投与として投与することもでき、或いは１日に２、３又は４回の別々の投与に分けることもできる。
【０１０７】
実施例を通じ、添付図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１０８】
本明細書で使用する略語は以下の通りである：ＣＰＴ、カンプトセシン；ＣＲＣ、結腸直腸癌；５−ＦＵ、５−フルオロウラシル；ＣＤＫ、サイクリン依存性キナーゼ；ＰＡＲＰ、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ；ＳＣＦ、Ｓｋｐ１−キュリン（cullin）−Ｆｂｏｘ；ＡＰＣ／Ｃ、後期促進複合体／サイクロソーム；ＣＤＫ−Ｉ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤；ＡＰＣ、腺腫様結腸ポリープ症；ＴＧＴ、腫瘍増殖時間；ＴＧＩ、腫瘍増殖抑制；ＰＲ、部分奏功。
【０１０９】
材料及び方法
薬剤
ＣＰＴ−１１（カンプト（Campto）（登録商標）、イリノテカン）は、Aventis（Vitry sur Seine, France）より快く提供を受け、ロスコビチン（以下「ＣＹＣ２０２」と称する）はCyclacel（Dundee, UK）から入手した。
【０１１０】
細胞系統
ＨＴ２９（Ａｌａ２７３コドンにおけるｐ５３変異）細胞系統は、Ｂ１段階のＳ状結腸癌に由来し、そのサブクローンＨＴ２９−Ａ４は、ｗｔ  ｐ５３発現ベクターをトランスフェクトしたものであった（１３）。トランスフェクトしたｗｔ  ｐ５３はＨＴ２９−Ａ４細胞系統中で優性の機能を有し、このことは以前にＨＴ２９−Ａ３細胞系統で示されている（非公開データ；（１４））。１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地中で細胞を維持し、ｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４細胞系統についてはジェネティシンでの継続的な選択下で維持した。
【０１１１】
細胞周期の進行及び細胞増殖
４８時間血清飢餓状態にすることによって細胞をＧ０／Ｇ１に同期化した。血清及び新鮮培地を添加すると、その遮断から細胞が解放され、その周期進行を促進した。記載の通りに（１３）、ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン；Sigma）取り込みによって細胞周期進行を分析した。示されているように（１５）、ＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム；Sigma）比色還元法を用いて細胞増殖を測定した。
【０１１２】
ＤＮＡマイクロアレイ
細胞周期制御に関与する一団の９６遺伝子のプロファイル発現分析を、Human Cell-cycle GEArray Qシリーズ（SuperArray, Inc., Bethesda, MD）を用いて行った。ＲＮＡ精製キット（Quiagen, Valencia, CA）を用いて、製造業者の推奨に従って総ＲＮＡを単離し、３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブ合成用の鋳型として使用した。９６種の細胞周期制御遺伝子の遺伝子特異的ｃＤＮＡ断片が４重スポットでプリントされたナイロン膜上で、６０℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣ（食塩−クエン酸ナトリウム）及びＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）緩衝液（２×ＳＳＣ／１％ＤＳＤ；０．１×ＳＳＣ／０．５  ＳＤＳ）で広範に洗浄した後、リン光画像化装置を用いて膜のデジタル画像を取得し、ImageQuantソフトウェア（SuperArray）で定量を行った。
【０１１３】
免疫沈降及びウェスタンブロット分析
１μＭのＣＰＴ−１１の存在下で２４時間インキュベートした、同期化したｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液（トリス５０ｍＭ、ｐＨ８、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＮＰ４０  １％、ＤＯＣ０．５％、ＳＤＳ０．１％、プロテアーゼ阻害剤）で溶解した。その上清をプロテインＡセファロース（Amersham Bioscience, Sweden）とともに予めインキュベートした後、モノクローナルｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１抗体（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）５μｇとともに４℃で１晩インキュベートした。プロテインＡセファロースビーズを使用して、抗体と結合した標的タンパク質を単離した。溶解緩衝液で広範に洗浄した後、ビーズをLaemmli緩衝液に再懸濁させ、沸騰させ、ウェスタンブロット分析用に処理した。或いは、細胞を溶解し、その上清をLaemmli緩衝液中で沸騰させた。試料を１０〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, France）上に移し、１次抗体（１：２０００ｍＡｂ∝アクチン、Sigma；１：５０ｍＡｂ∝ｐ５３  Ｘ７７、T. Soussi, Curie, Franceから贈与；２μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ∝ｍｄｍ−２、Oncogene Research Products, San Diego, CA；１：１００ｐＡｂ∝ＰＡＲＰ  ｐ８５断片、Promega, Madison, WI；１：１０００ｐＡｂ∝切断型カスパーゼ３、Cell Signaling Technology, Beverly, MA；１：２５００ｍＡｂ∝ｃｄｋ１、BD Transduction Laboratories, San Jose, CA；１：４００ｐＡｂ∝ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１、Becton Dickinson；１：５００ｐＡｂ∝サイクリンＢ及び１：５００ｐＡｂ∝サイクリンＡ；Sigma）とともにインキュベートした。アルカリホスファターゼ結合抗体（１：７５００、Promega）及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ発色基質（Promega）を用いてタンパク質を明らかにした。
【０１１４】
アポトーシスのモニター
アポトーシスをモニターする適切な方法には、１種又は複数種の下記のものが含まれる：フローサイトメトリー、ＰＡＲＰ切断の分析、カスパーゼ切断の分析、ＴＵＮＥＬ染色、アネキシンＶ標識、Ｍ３０標識及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によるプロテオームプロファイルの分析。
【０１１５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
６〜１５週齢のSwiss ｎｕ／ｎｕマウス（２５〜３５ｇ／体重）を、the Curie Institut, Paris (France)の動物施設で飼育し、特定病原体不在の条件下で維持した。その世話及び居住環境は、フランス倫理委員会（French Ethical Committee）の施設ガイドライン（Ministere de l'Agriculture et de la Peche, Ministere de la Recherche, France）に従い、また公認の調査員の監督下にあった。ＨＴ２９及びＨＴ２９−Ａ４細胞系統は、細胞２×１０６個の皮下注射により移植可能な腫瘍として樹立された。６０〜２５０ｍｍ３の腫瘍断片の皮下移植片を有する無作為化したマウスをＣＰＴ−１１で処理し、間欠的スケジュールを用いてｉ．ｐ．で体積０．２ｍｌを投与した：２４０ｍｇ／ｋｇ（４日毎に４０ｍｇ／ｋｇ／日を６回注射）の高い総投与量及び４０ｍｇ／ｋｇ（４日毎に１０ｍｇ／ｋｇ／日を４回注射）の低い総投与量の２つの投与量について試験した。対照群のマウスに、製剤用溶媒を０．２ｍｌ投与した。腫瘍の体積（Ｖ＝Ａ×Ｂ２、式中Ａはミリメートル単位での腫瘍の幅、Ｂはその長さ）を３日毎に測定し、記載の通りに（１５）腫瘍の増殖を算出した。ＣＰＴ−１１とロスコビチンの併用は、７日毎にＣＰＴ−１１を４０ｍｇ／ｋｇでｉ．ｐ．投与、その後２００ｍｇ／ｋｇでの強制経口投与による１日２回のロスコビチンの３〜４連続投与からなる連続した周期によって行われた。
【０１１６】
投与量
強制経口投与では、各回の前に５０ｍＭ  ＨＣｌでＣＹＣ２０２を溶解させた。溶媒を加えた後それを約５分間超音波処理し、投与中磁気撹拌機で撹拌した。予め秤量したＣＹＣ２０２の入った瓶中に適当な量のＨＣｌを添加することによって、終濃度１〜１０ｍｇ／ｍｌの溶液を下記の表に示すように調製した。
【０１１７】
ｍｇ／ｍｌ単位の投与量    体積ｍｌ      瓶内の薬剤      ５０ｍＭ  ＨＣｌの添加量
１                        ３００        ３００ｍｇ      ３００ｍｌ
５                        ３００        １５００        ２９８ｍｌ
７．５                    ２００        １５００        １９８ｍｌ
１０                      １５０        １５００        １４８ｍｌ
【０１１８】
投与の順序及び期間
単独で投与するとき、ＣＹＣ２０２は、１日２回（２×２００ｍｇ／ｋｇ又は２×１５０ｍｇ／ｋｇ／日で）約８時間間隔で（ほぼ午前１０時とほぼ午後６時に）、化学療法を受ける群と同じ期間投与した。ＣＹＣ２０２で処置したマウスには、その製品のバイオアベイラビリティーを妨げないように、８時間の投与期間の間は飼料を与えなかった。
【０１１９】
異種移植片を有する動物で化学療法と組み合わせて投与するとき、ＣＹＣ２０２は以下の通りに投与した：ＣＹＣ２０２（２×２００ｍｇ／ｋｇ／日）２〜５日目、９〜１２日目、１６〜１９日目、ＣＰＴ−１１  １、８、１５日目。
【０１２０】
投与経路
ＣＹＣ２０２は、強制経口投与により、マウス１匹当たり体積１００〜２００μｌで投与した。ＣＰＴ−１１溶液は、ＩＰ経路によって投与した。個々の化合物の注射体積は、マウス１匹当たり１００〜２００μｌであった。
【０１２１】
腫瘍の移植
腫瘍の異種移植片は、免疫不全マウスへの連続した移植によって維持した。薬剤効果についてのアッセイでは、以前の継代に由来する断片状態の腫瘍の皮下移植片をマウスに投与する。このアッセイの断片は、以前の腫瘍継代を有する供与マウス５匹に由来し、そのマウスは、腫瘍が直径１２〜１５ｍｍに達したときに屠殺した。同じ実験のマウスはすべて、同じ日に移植した。１群当たりに少なくともマウスが１０匹含まれていた。担癌供与マウスを頚椎脱臼によって屠殺した。腫瘍を無菌的に切除した。培地を含むペトリ皿に腫瘍を入れ、慎重に解剖して腫瘍を通常囲んでいる線維被膜を除去した。壊死している腫瘍は除去した。移植の手順の間は、培地中で腫瘍組織を維持した。異種移植は無菌的に行った。アバーチン（avertine）で麻酔し、７０％アルコール／水溶液で皮膚を消毒した後、肩甲骨の領域のレベルで皮膚を切開し、腫瘍の断片を皮下組織中に入れた。皮膚をクリップで閉じた。
【０１２２】
抗腫瘍効果の評価
生データはすべて手書きで帳面に記録し、コンピュータへと移した。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、１日目での最初の体積で割り１００を掛けた、時間ｔでの体積の比として算出した。ＲＴＶ１００％以下（腫瘍退縮）のとき、これらのデータから、増殖の欠如を迅速に評価することが可能である。処置群及び対照群における時間の関数としての平均ＲＴＶの曲線を得、この報告中に示した。最適増殖抑制は、対照でのＲＴＶで割った、処置群でのＲＴＶの比（×１００）として算出した。増殖遅延時間とは、処置群及び対照群における最初の腫瘍体積２００〜４００ｍｍ３の５倍（又は４倍）となるのに必要な日数単位の時間であった。週１回マウスを個々に体重測定した。最初の体重と比較した体重の変動、及び１群当たりの平均値（又は中央値）を算出した。
【０１２３】
統計
統計試験はすべて、Statviewソフトウェアを用いて行った。下記のパラメーターを比較した：腫瘍体積及び／又はＲＴＶ、最適増殖抑制、増殖遅延時間、体重変化。治療の効果の統計分析は、対応のあるｔ検定によって行った。
【０１２４】
結果
安定にトランスフェクトしたｗｔ−ｐ５３の活性化により、ＣＰＴ−１１で処置したＨＴ２９細胞の細胞周期進行が遮断される
ＣＰＴ−１１の、細胞周期進行に対する、特に、このｔｏｐ１阻害剤がその作用を発揮するＳ期に対する効果を特徴付けるために、血清飢餓状態にすることによって細胞をＧ０／Ｇ１に同期化した（材料及び方法を参照）。血清によって誘導されるその遮断からの解放から６時間後、細胞が周期を進行し始めたとき、同期化したＨＴ２９細胞を有効に遮断する（示さず）濃度１μＭのＣＰＴ−１１を培地中に添加し、ｗｔ−ｐ５３及びｍｕｔ−ｐ５３の処置細胞での細胞周期の進行を分析した。どちらの型の非処置細胞も、その遮断からの解放後１６時間辺りでＳ期へと進行し、２４時間でＧ２／Ｍを介し、約３６時間で細胞周期を完了した（図１Ａ）。３６時間までにＣＰＴ−１１の存在下でインキュベートしたとき、ｗｔ−ｐ５３の細胞もｍｕｔ−ｐ５３の細胞もＳ期で遮断された（図１Ｂ）。興味深いことに、ｗｔ−ｐ５３の細胞は初期のＳ期で遮断され、それと異なりｍｕｔ−ｐ５３の細胞は後期のＳ期で停止した（図１Ｂ）。このことから、ｗｔ  ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４では、細胞周期停止が、ＣＰＴ−１１に反応してｗｔ  ｐ５３が即座に安定化し活性化する結果生じたことが示唆される。ｐ５３の誘導は、ＣＰＴ−１１処置対非処置ｗｔ−ｐ５３細胞でのウェスタンブロットによってさらに確認された（図１Ｃ）。ｍｕｔ−ｐ５３細胞のＣＰＴ−１１処置後のｐ５３タンパク質レベルもわずかに上昇したが、これはおそらく変異不活性型のｐ５３の上昇を反映するものである（図１Ｃ）。ｐ５３の下流にある遺伝子ｍｄｍ２の誘導について試験することにより、誘導されたｐ５３の機能性をさらに分析した。ｍｄｍ２タンパク質は、ｐ５３と結合し、ｐ５３をユビキチン化しそれをプロテアソームによる分解に向かうように指定するその主要な細胞のアンタゴニストとして働く。さらに、ｍｄｍ２遺伝子はｐ５３による正の転写活性化の直接的な標的であり、それによってｐ５３活性を継続的に抑制し生物学的に不活性な状態でそれを維持する基本的なｐ５３／ｍｄｍ２の自己制御ループが規定される（１６）。ｍｄｍ２は、ＣＰＴ−１１処置ｗｔ−ｐ５３細胞で誘導されることが認められた（図１Ｃ）。これらの結果から、ＣＰＴ−１１に反応して、安定にトランスフェクトしたｗｔ  ｐ５３が活性化されｐ５３依存的な細胞周期停止を促進したと結論付けられる。
【０１２５】
ｗｔ−ｐ５３対ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞のＣＰＴ−１１に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの感受性の増大
ｗｔ  ｐ５３の優性な発現が、この結腸癌細胞系統のＣＰＴ−１１に対する感受性に影響を及ぼすかどうかを調べる研究に着手した。細胞増殖アッセイで示されるように、ｗｔ−ｐ５３の細胞を１μＭのＣＰＴ−１１とともに７２時間インキュベートすると、非処理細胞に関して、ｍｕｔ−ｐ５３の細胞と比べて細胞増殖が有意に低下した（図２Ａ）。このことから、安定にトランスフェクトしたｐ５３の活性化による細胞周期停止に加えて、ＣＰＴ−１１処置がｗｔ−ｐ５３細胞でのアポトーシスの増加に関係することが示唆された。このことは、１１６ｋＤａの完全なタンパク質のカスパーゼ切断から生じるＰＡＲＰ（ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ）のｐ８５断片（１７）のウェスタンブロット分析によってさらに確認された（図２Ｂ）。さらに、アポトーシスの主要な実行因子の１つであり、ＰＡＲＰ切断の原因であるカスパーゼ３の、活性化ｐ１７及びｐ１２サブユニットへのタンパク質分解性プロセシングによる活性化が、ｍｕｔ−ｐ５３の細胞と比較して、ＣＰＴ−１１で処置したｗｔｐ５３細胞で確認された（図２Ｂ）。
【０１２６】
ｗｔ−ｐ５３対ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞のＣＰＴ−１１に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの感受性の増大
定着した異種移植片を用いて、ｗｔ−ｐ５３とｍｕｔ−ｐ５３でのＣＰＴ−１１に対する反応を比較した。ＣＰＴ−１１が高濃度でも低濃度でも、ｗｔ−ｐ５３の異種移植片の増殖が抑制され、それぞれ平均ＴＧＩが６０％、平均ＴＧＴが１８（±７）及び８７％、平均ＴＧＴが３０（±７）であった（表１）。さらに、どちらの投与量のＣＰＴ−１１処置でも、時間の関数として、体積２０００ｍｍ３に達した個々の腫瘍（マウス）（倫理的に屠殺）の累積百分率として示される、ｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４ｈＣＲＣ異種移植片を有するマウスの生存スコアが有意に上昇した（図２Ｃ）。それと異なり、ｍｕｔ−ｐ５３の異種移植片では反応は認められなかった（示さず）。これらの結果から、少なくとも使用した結腸癌細胞モデルでは、機能的なｐ５３が存在するとＣＰＴ−１１に対する反応が有意に高くなることが示唆される。
【０１２７】
ＣＰＴ−１１によって誘導される細胞周期停止におけるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の関与
ｐ５３欠損腫瘍細胞におけるＣＰＴ−１１に反応した細胞周期停止の根底にある機構を理解するために、ＤＮＡマイクロアレイ技術（SuperArray）を使用して、細胞周期制御に関与する一団の９６遺伝子の発現プロファイルを分析した。これらのアレイは、細胞周期の主要な制御因子であるサイクリン依存性キナーゼ（ｃｄｋ）遺伝子、及びサイクリン、ｃｄｋ阻害因子、ｃｄｋホスファターゼやｃｄｋキナーゼなど複数のレベルでｃｄｋの活性を制御する遺伝子に焦点が合わせられている。さらに、ＤＮＡ損傷及び有糸分裂紡錐体チェックポイントに不可欠な遺伝子、並びにＳＣＦ（Ｓｋｐ１−キュリン−Ｆｂｏｘ）及びＡＰＣ／Ｃ（後期促進複合体／サイクロソーム）ユビキチン結合複合体中の遺伝子を含んでいる。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１のわずかな活性化が、１μＭのＣＰＴ−１１で処置したｗｔ−ｐ５３とｍｕｔ−ｐ５３のどちらの細胞系統でも認められた（図３Ａ）。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１がＣＰＴ−１１に対する反応に関与するというＤＮＡマイクロアレイで示唆されたことを確認するためにウェスタンブロット分析を行った。ｗｔ−ｐ５３の処置細胞のものと比べて、ｍｕｔ−ｐ５３の処理細胞でのｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１のタンパク質レベルの有意に高い誘導に対応する弱い転写活性が認められた（図３Ｂ）。このことから、ｗｔ−ｐ５３とｍｕｔ−ｐ５３のどちらの細胞系統もＣＰＴ−１１の存在下でインキュベートしたときに観察されたＳ期の細胞周期停止が、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導から生じたことが示唆される。
【０１２８】
ＣＰＴ−１１で処理したｐ５３欠損細胞でのｃｄｋ１の誘導
ＤＮＡマイクロアレイ分析から、非処置及びＣＰＴ−１１処置のｗｔ−ｐ５３対ｍｕｔ−ｐ５３細胞間の発現における最も有意な差が、Ｓ期を介してＧ２／有糸分裂へと細胞周期を進行する役割を果たすキナーゼｃｄｃ２／ｃｄｋ１に対応していたことが示された（図３Ａ）。ウェスタンブロット分析から、１μＭのＣＰＴ−１１で処置したｍｕｔ−ｐ５３の細胞でのｃｄｋ１レベルの上昇が確認された（図３Ｂ）。ｃｄｋは、細胞周期の段階に応じてそのそれぞれのサイクリンと複合体を形成し、サイクリンは制御単位であり、ｃｄｋは触媒の相手である。ｃｄｋ１発現の上昇が、その対応するサイクリン：後期のＳ／Ｇ２期でｃｄｋ１と複合体を形成することが知られているサイクリンＡ、又はＧ２／Ｍ移行に関与するサイクリンＢのうち１つの発現と相関するかどうかを調べる研究に着手した。ＣＰＴ−１１で処置したｍｕｔ−ｐ５３の細胞でのｃｄｋ１発現の動態は、サイクリンＡではなくサイクリンＢのものと対応した（図３Ｃ）。このことから、細胞がＳ期で遮断されたが、その細胞周期制御因子はＧ２／Ｍ移行のものと対応したことが示唆された。興味深いことに、ｃｄｋ１／サイクリンＢ発現の上昇は、強力なｃｄｋ阻害因子として働くことにより細胞周期進行を遮断することが知られているｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の上昇の前に起こったことも観察された（図３Ｃ）。さらに、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導は、ＣＰＴ−１１で処置したｍｕｔ−ｐ５３の細胞を、強力且つ選択的なｃｄｋ阻害剤（ｃｄｋ−Ｉ）であるロスコビチン（１８）とともにさらにインキュベートしたときに完全に消滅した。１μＭのＣＰＴ−１１とともにインキュベートした後の高いｃｄｋ１レベル（図３Ｄ、第１レーン）は、ＣＰＴ−１１＋１０μＭのロスコビチンでさらに処置することにより抑制された（図３Ｄ、第２レーン）。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の抑制はｃｄｋ１の抑制と相関し、このことから、ｍｕｔ−ｐ５３の細胞において、ＣＰＴ−１１で処置した後、ｃｄｋ１／サイクリンＢ複合体の蓄積に反応してｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１が誘導されたことが示唆される。このことは、１μＭのＣＰＴ−１１とともに２４時間インキュベートしたｍｕｔ−ｐ５３の細胞でｃｄｋ１がｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１に対する抗体と同時に免疫沈降したことによって確認された（図３Ｅ）。このことから、高レベルのｃｄｋ１に対する反応がｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導によって相殺され、したがってｃｄｋ１抑制を促進することが知られている相互作用が細胞のＧ２／Ｍへの進行を妨げる（１９）ことが示唆される。
【０１２９】
ロスコビチンでのさらなる処置後のｐ５３欠損ＨＴ２９細胞のＣＰＴ−１１に対する感受性の増大
ｐ５３−ｍｕｔのＨＴ２９細胞でのＣＰＴ−１１に対する反応の根底にある分子機構の特徴付けにより、処置してから２４時間後のｃｄｋ１の蓄積を利用し、特異的なｃｄｋ−Ｉであるロスコビチンとのさらなるインキュベーションを設計することによってＣＰＴ−１１に対するその感受性を高める努力が促された。ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞を最初に１μＭのＣＰＴ−１１で２４時間前処置し、次いでロスコビチンを培地に添加し、細胞を両方の薬剤の存在下で最大２４時間までさらにインキュベートした（図４Ａ）。非処置細胞、ＣＰＴ−１１単独で４８時間処置した細胞、及びロスコビチン単独で２４時間処置した細胞を対照として用いた。ロスコビチン単独での処置は、細胞周期の遮断を促進した（図４Ｂ）。それに対して、ＣＰＴ−１１での前処置によってｃｄｋ１が蓄積した細胞にロスコビチンを添加すると、ＣＰＴ−１１単独と比較したときに細胞増殖が有意に低下した（図４Ｂ）。カスパーゼ３切断のウェスタンブロット分析から、ロスコビチン又はＣＰＴ−１１単独と比較して、ロスコビチンでさらに処置した後にアポトーシスが増加したことが示された（図４Ｃ）。ＨＴ２９の腫瘍の異種移植片を有するヌードマウスにＣＰＴ−１１及びロスコビチンを順次投与することにより、この仮説についてｉｎ  ｖｉｖｏでも分析した。腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ；腫瘍体積が処置開始時のサイズから４倍の増加に達する日数）は、ＣＰＴ−１１単独（ＴＧＤ±ＳＤ：２２±１，９）、ロスコビチン単独（１２±１，２）又は非処置対照（９±１）と比較したとき、ＣＰＴ−１１とロスコビチンとの組合せで相加／相乗効果を示した（３０±１，７）（図４Ｄ）。これらの結果から、ｐ５３の変異によってｔｏｐ１阻害剤ＣＰＴ−１１に対する感受性が減弱しているとき、ＣＰＴ−１１とｃｄｋ−Ｉの組合せが、結腸直腸癌の治療において治療上有効であることが示唆される。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬剤効果の結果
抗腫瘍活性のデータを表２に要約し、腫瘍増殖曲線（時間に対する平均の相対腫瘍体積）として示す。処置開始時の平均腫瘍体積は、ＨＴ２９結腸腺癌で２６３．４＋／−１７．６ｍｍ３であった。
【０１３１】
以前の忍容性試験から選択された投与量では、ＣＹＣ２０２は、単独で又は化学療法との組合せで、３〜６回の４日周期で十分な忍容性を示した。４００ｍｇ／ｋｇ／ｄのＣＹＣ２０２は、ＨＴ−２９モデルにおいて４０ｍｇ／ｋｇのＣＰＴ−１１との組合せで十分な忍容性を示した。
【０１３２】
単剤としてのＣＹＣ２０２
ＣＹＣ２０２は、最大耐量の４００ｍｇ／ｋｇ／日で最大６週間投与したとき、異種移植モデルで抗腫瘍活性を示さなかった。
【０１３３】
化学療法と組み合わせたＣＹＣ２０２
ＣＹＣ２０２とＣＰＴ−１１の組合せから有意な結果が得られ、有望な相乗作用がＨＴ２９結腸癌で認められた。その共同の効果は、ＴＧＤに関してもＴＧＩに関しても統計上有意であった（表２及び図４Ｄを参照）。
【０１３４】
考察
ＣＲＣは、遺伝子変化が腫瘍形成に伴う（２０）が、代替の遺伝的経路が疾患の進行に寄与する可能性がある（２１、２２）多段階進行癌モデルの範例とみなされている。決定的な分子上の事象には、腺腫様結腸ポリープ症（ＡＰＣ）及びカーステン（Kirsten）−ｒａｓ（Ｋ−ｒａｓ）遺伝子の変化又は突然変異が関与する。さらに、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の突然変異は、ＣＲＣの後期の現象であると思われ、細胞周期停止及びアポトーシスを回避する複数の遺伝子変化を伴う腫瘍を増殖させる可能性がある（２３、２４）。最近では抗腫瘍効果に直接的な役割を果たすことに加えて、ＤＮＡを損傷する作用物質が、細胞周期チェックポイントを活性化することによって損傷後の反応を開始する可能性があることが広く想定されている（２５）。したがって、これらの損傷反応の統合性も治療感受性に影響を及ぼす可能性があり、抗癌剤によって活性化されるアポトーシス経路の無能化は、耐性に寄与する可能性がある（２６）。
【０１３５】
上記の研究は、ｗｔ  ｐ５３をトランスフェクトした、Ｇ０／Ｇ１で同期化したＨＴ２９細胞をＣＰＴ−１１で処置すると、機能的に活性なｐ５３がＳ期で細胞周期停止を導くことを明らかにするものである。機能的なｐ５３の存在が、ＣＰＴ−１１に反応して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスの増加と、ｉｎ  ｖｉｖｏで感受性の向上と相関したことも観察された。これらの結果は、変異型ｐ５３がＣＰＴ−１１に対する反応不良と相関したことが示された、ｗｔ／ｍｕｔ  ｐ５３のｈＣＲＣ異種移植片間の比較研究で得られた結果と一致する（１０）。
【０１３６】
細胞周期制御に関与する一団の遺伝子の発現プロファイル分析から、ＣＰＴ−１１によって誘導されるＳ期での細胞周期停止が、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導から生じたことが示された。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１は、サイクリン及びｃｄｋを含む複合体中に認められ、ｃｄｋ活性の普遍的な抑制因子であるように思われる。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導は、ｐ５３依存性と非依存性のどちらの上方制御でも、ＤＮＡ損傷又は分裂刺激に反応して、また分化の間にも起こる可能性がある。ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の上方制御は、ＣＰＴ処置後の乳癌におけるｐ５３依存性と非依存性のどちらのアポトーシスにも関係し（２７）、Ｆａｓ経路及びセラミドのシグナル伝達が、カンプトセシンで処置したｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞によるｐ５３非依存性アポトーシス誘導に関係していた（２８、２９）。さらなる研究から、ＣＰＴ−１１で処置したｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞では、ｐ２１の誘導がＧ２／Ｍのサイクリン依存性キナーゼｃｄｋ１の特異的な蓄積に依存することが実証された。ＣＰＴ−１１で処置したヒト前骨髄球性白血病ＨＬ６０細胞で、アポトーシスの前にｃｄｋ１の不定期な活性化が観察された（３０）。これらすべての結果から、ｗｔ−ｐ５３及びｍｕｔ−ｐ５３の条件においてＣＰＴ−１１に対する反応を説明する２つの機構の提唱が導かれる（図５Ａ）。第１に、機能的なｐ５３は、おそらくＤＮＡ二本鎖切断に反応してＤＮＡ損傷チェックポイントを活性化することによってＣＰＴ−１１に対する直接の反応を引き起こすことができる。これには、下流の上方制御されたｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の活性化が関与し、遮断が持続する結果、最終的にアポトーシスが促進される。第２に、変異型ｐ５３細胞では、おそらく細胞がＤＮＡ合成をうまく完了できないことにより、ＣＰＴ−１１がＳ期の間に細胞周期の進行を強制停止する。それにも関わらず、ＣＰＴ−１１に対する反応を活性化する機能的ｐ５３の不在下では、細胞周期の機構は進行しｃｄｋ１／サイクリンＢ複合体を蓄積し続ける；したがってｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１は、ｐ５３非依存性の形で誘導されて、ｃｄｋ１活性を抑制し、Ｇ２／Ｍへの進行から細胞を保護する。
【０１３７】
本発明の様々な変更形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。特定の好ましい実施形態と結び付けて本発明を説明してきたが、請求に係る本発明が、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるはずである。実際、その関連分野の技術者に明白な、本発明の実施について記載された形態の様々な変更形態は、本発明に含まれるものとする。
【０１３８】
【表１】
2006527251.tif 000003
【０１３９】
【表２】
2006527251.tif 000004
【０１４０】
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ＣＰＴ−１１に反応した、ｐ５３の活性化及び細胞周期の遮断を示す図である。さらに詳細には、４８時間血清飢餓状態にすることによって、ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞及びｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４細胞をＧ０／Ｇ１に同期化した。（Ａ）は、非処置対照のＨＴ２９／ＨＴ２９−Ａ４細胞における、遮断からの解放後の、Ｇ１期からＳ期への及びＧ２／Ｍ移行を介する細胞周期の進行を示すヒストグラムである。（Ｂ）は、同期化したｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４処置細胞及びｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９処置細胞におけるＢｒｄＵの取り込み及び細胞周期の分布を示す図である。Ｇ０／Ｇ１からの解放から６時間後に１μＭのＣＰＴ−１１を培地に添加し、細胞を最大３０時間インキュベートした。非処置細胞がすでに１周期完了し、解放から３６時間後に次のＧ１に進行していることに留意されたい。（Ｃ）は、ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９処置細胞と比べて、ｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４処置細胞でｐ５３が安定化し活性化していることを実証する、同期化した非処置及びＣＰＴ−１１処置細胞のウェスタンブロット分析を示す図である。１μＭのＣＰＴ−１１を加えて又は加えずに、同期化した細胞を２４時間インキュベートした。ｍｄｍ−２発現は、ｐ５３活性化のマーカーとして使用した；添加試料量の対照としてアクチンを示す。
【図２】ｗｔ  ｐ５３の安定な発現によって、ＣＰＴ−１１に対してＨＴ２９細胞が感作されることを示す図である。さらに詳細には、図２は、（Ａ）１μＭのＣＰＴ−１１で７２時間インキュベートした、同期化したｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４細胞及びｍｕｔ−ｐ５３のＨ２９細胞での細胞増殖アッセイを示す。結果は、新鮮培地とともに７２時間インキュベートした非処置細胞に対する細胞生存の百分率として示す。（Ｂ）は、ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９処置細胞と比べて、ｗｔ  ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４処置細胞でアポトーシスの著しく高い誘導が生じることを実証する、（Ａ）と同様に処理した細胞のウェスタンブロット分析を示す図である。ＰＡＲＰ及びカスパーゼ３の切断産物は、アポトーシスのマーカーとして使用した。（Ｃ）は、ＨＴ２９−Ａ４の異種移植片を有するマウスでのＣＰＴ−１１（１０及び４０ｍｇ／ｋｇ／日）の抗腫瘍効果を示す図である。体積２０００ｍｍ３に達した個々の腫瘍（マウス）（倫理的に屠殺）の累積百分率を、マウスの生存時間に対応する時間の関数としてプロットしている。
【図３】ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞での、ＣＰＴ−１１に反応したｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１及びｃｄｋ１の活性化を示す図である。さらに詳細には、図３は、（Ａ）ｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４細胞及びｍｕｔ  ｐ５３のＨＴ２９細胞におけるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１及びｃｄｋ１の発現パターンのプロファイルを示す。Ｇ０／Ｇ１からの解放から６時間後、１μＭのＣＰＴ−１１を加えて又は加えずに、同期化した細胞をさらに２４時間インキュベートし、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、及びHuman Cell Cycle GEArray Qシリーズの膜（材料及び方法を参照）上でのハイブリダイゼーションで処理した。示した４重スポットは、対応する遺伝子発現プロファイルの標準化したシグナルである。（Ｂ）は、（Ａ）と同じ条件下で１μＭのＣＰＴ−１１を加えて及び加えずに処置した、同期化したｗｔ−ｐ５３のＨＴ２９−Ａ４細胞及びｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞におけるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１及びｃｄｋ１タンパク質発現のウェスタンブロット分析を示す図である。（Ｃ）は、ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞におけるサイクリンＡ、サイクリンＢ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１及びｃｄｋ１のタンパク質発現の時間経過を示す図である。Ｇ０／Ｇ１遮断からの解放から６時間後、１μＭのＣＰＴ−１１とともにさらに１８、２４、及び３０時間インキュベートした。ｃｄｋ１／サイクリンＢ複合体の発現がｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の活性化と相関することに留意されたい。（Ｄ）は、ｃｄｋ阻害剤のロスコビチン（ＣＹＣ−２０２）とのインキュベーション後にｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導が消滅することを示す図である。Ｇ０／Ｇ１からの解放から６時間後、同期化したｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞を１μＭのＣＰＴ−１１の存在下で２４時間インキュベートし（第１レーン）、ＣＰＴ−１１＋１０μＭのロスコビチンとともにさらに２４時間インキュベートした（第２レーン）。ＣＰＴ−１１処置後ｃｄｋ１の誘導と相関するｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１の誘導は、ｃｄｋ１を特異的に阻害したときに消滅した。（Ｅ）は、（Ｃ）の場合と同様に処理したｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞におけるｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１及びｃｄｋ１の特異的な同時免疫沈降を示す図である。
【図４】ロスコビチンのさらなる投与による、ｐ５３欠損ＨＴ２９細胞のＣＰＴ−１１に対する感受性の増大を示す図である。（Ａ）は、ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞を１μＭのＣＰＴ−１１で２４時間処置し、次いで１０μＭのロスコビチンを培地に添加し、細胞をさらに最大２４時間インキュベートしたことを示す図である。（Ｂ）は、ＣＰＴ−１１単独（影付きの棒）又はロスコビチン単独（斜線の入った棒）での４８時間の単剤処置と比べて、さらなるインキュベーション（斜線の入った影付きの棒）後にｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞生存の百分率が低下することを示すヒストグラムである。（Ｃ）は、ＣＰＴ−１１又はロスコビチン処置単独と比べて、さらなる処置後にアポトーシス誘導が増加することを示している、（Ｂ）の場合と同様に処理したｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞におけるカスパーゼ３の切断のウェスタンブロット分析を示す図である。＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）は、ヌードマウス中のＨＴ２９結腸腫瘍異種移植片の増殖に対する、単独での又は併用でのＣＰＴ−１１及びロスコビチンの効果を示す図である。材料及び方法に示すように、ＣＰＴ−１１及びロスコビチンを投与した。Ｐ値は、ＣＰＴ−１１とＣＰＴ−１１＋ロスコビチンの併用との間の有意差を示す。
【図５】（Ａ）は、ｗｔ−ｐ５３及びｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞でのＣＰＴ−１１に対する反応の概略図である。ＣＰＴ−１１によって誘導されるＤＮＡ損傷は、ＨＴ２９−Ａ４細胞中でｐ５３依存性の反応を活性化し、その結果細胞周期停止へと導くｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１が誘導され、遮断が持続する結果、最終的にアポトーシスが引き起こされる。ｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞では、ＣＰＴ−１１によって誘導されるＤＮＡ損傷後にｐ５３依存性の反応は活性化されず、細胞周期の制御機構はＳ期を経由して進行する；次いでｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１が活性化されて、蓄積したｃｄｋ１／サイクリンＢの複合体を阻害し、それによってＧ２／有糸分裂への細胞の進行が妨げられる。（Ｂ）は、ｗｔ−ｐ５３及びｍｕｔ−ｐ５３のＨＴ２９細胞でのＣＰＴ−１１に対する感受性を示す図である。ＣＰＴ−１１に反応したｐ５３の活性化によって、細胞周期停止が持続する結果、最終的にアポトーシスが導かれる。ｍｕｔ−ｐ５３の細胞では、ロスコビチンとのさらなるインキュベーションは、ｃｄｋ１／サイクリンＢの複合体の蓄積を利用して、停止細胞にアポトーシスを誘導することによりＣＰＴ−１１に対する感受性を高める。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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