(57)【要約】本発明は、選択された表現型の質を調節するための方法を開示する。この選択された表現型は、生物またはその一部によって示される表現型であり、かつ、選択された表現型を産生する生物またはその一部によって使用される際の優先度が、置換対象のコドンよりも高いまたは低い同義コドンでそのポリヌクレオチドの少なくとも1つのコドンを置換することにより、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現から生じる。本発明はまた、生物またはその一部によって示される選択された表現型の質を調節するため、そのように構築されたコドン改変ポリヌクレオチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の生物またはその一部に対して、選択された表現型を、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドによって付与される表現型とは異なる質で付与するためにポリヌクレオチドが産生可能である、合成ポリヌクレオチドを構築するための方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)同義コドンで置換するために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する段階であって、該同義コドンは、試験生物またはその一部における表現型優先度の比較において第1のコドンとは異なる表現型優先度を示すことに基づいて選択され、そして該試験生物は関心対象の生物と同じ種の生物、および関心対象の生物に関連する生物からなる群より選択される、段階;ならびに
(b)合成ポリヌクレオチドを構築するために該第1のコドンを該同義コドンで置換する段階。
【請求項２】
試験生物またはその一部におけるコドンの表現型優先度が、以下の段階によって比較される、請求項1記載の方法:
(i)該試験生物またはその一部に個々の合成構築物を別々に導入する段階であって、該合成構築物の各々は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合したコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含み、該レポータータンパク質は、選択された表現型および選択された表現型と同じクラスの表現型からなる群より選択される対応する表現型を産生するかまたは産生することが予測される、段階;ならびに
(ii)コドンの相対的な表現型優先度を決定するために、該試験生物またはその一部によって示される表現型の質を比較する段階。
【請求項３】
レポータータンパク質が、選択された表現型を産生する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
レポータータンパク質が、選択された表現型を産生しないが選択された表現型と同じクラスの表現型を産生する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
レポータータンパク質が、病原性生物由来、癌抗原由来、自己抗原由来、移植抗原由来、増殖因子由来、ホルモン由来、および毒素由来の抗原から選択される、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
表現型が、免疫、抗原寛容性、血管形成、抗血管形成、臨床的徴候の改善、細胞死の減少または増加、細胞分化の減少または増加、細胞増殖の減少または増加、腫瘍または癌の退縮、組織または器官の増殖および修復、線維症の減少、細胞老化の阻害または逆転、細胞移動の増加または減少、生物またはその一部の異なる細胞または組織間のタンパク質の差次的な発現、外傷回復、熱傷からの回復、抗生物質耐性または抗生物質感受性、除草剤耐性または除草剤感受性、デンプンの生合成または修飾、脂肪酸生合成、疾患抵抗性または疾患耐性、昆虫耐性または昆虫抵抗性を含む悪疫耐性または悪疫抵抗性、ウイルス抵抗性またはウイルス耐性、真菌抵抗性または真菌耐性、スクロース代謝を含む代謝形質、凍結抵抗性または凍結耐性、ストレス耐性、および食物含量の改善、または収量の増加から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
表現型が免疫応答である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
免疫応答が体液性免疫応答である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
免疫応答が細胞媒介免疫応答である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
免疫応答が先天性免疫媒介応答である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
合成構築物が、同一の導入様式または類似の導入様式を使用して試験生物に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
合成構築物が、同一の部位または対応する部位で試験生物に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
関心対象の生物が哺乳動物であり、かつ合成構築物が経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻内経路、口腔経路、皮下経路、経皮経路、口腔経路、または舌下経路によって導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
合成構築物が、関心対象の生物の1つまたは複数の細胞または組織型に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
合成構築物が、筋肉細胞、皮膚細胞、脳細胞、肺細胞、腎細胞、膵臓細胞、生殖器の細胞、心臓細胞、血管細胞、肝細胞、眼細胞、花卉細胞、成長点細胞、根細胞、および葉細胞から選択される細胞に導入される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
合成構築物の各々のタンデムリピートが、少なくとも3コピーの対応するコドンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
同義コドンが、第1のコドンよりも高い表現型優先度を有するように選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質が第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質よりも少なくとも約5%高い場合に、同義コドンが選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
同義コドンが、第1のコドンよりも低い表現型優先度を有するように選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質が第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質よりも少なくとも約5%低い場合に、同義コドンが選択される、請求項19記載の方法。。
【請求項２１】
関心対象の生物が単細胞生物である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
関心対象の生物が多細胞生物である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
多細胞生物が動物である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
多細胞生物が哺乳動物である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
多細胞生物が植物である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入し、該前駆細胞を、該試験生物またはその一部が産生されるのに十分な時間および条件下で増殖または培養し、それによって該合成構築物が、該生物またはその一部の1つまたは複数の細胞型に含有される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前駆細胞が、幹細胞、多能性細胞、成長点細胞、および胚性カルスから選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
以下の段階を含む、関心対象の生物またはその一部における第1のコドンの表現型優先度を決定するための方法:
(a)合成構築物を試験生物またはその一部に導入する段階であって、該試験生物は、関心対象の生物と同じ種の生物および関心対象の生物に関連する生物からなる群より選択され、該合成構築物は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合した第1のコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含み、該レポータータンパク質は、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測される、段階;ならびに
(b)該生物またはその一部によって示される対応する表現型の質を決定する段階。
【請求項２９】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法:
(i)第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、試験生物またはその一部によって示される対応する表現型の質と、(ii)第2のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、試験生物またはその一部によって示される対応する表現型の質とを比較する段階であって、該第2のコドンは該第1のコドンと同じアミノ酸をコードし、それによって該試験生物またはその一部における該第2のコドンの表現型優先度に対して該第1のコドンの表現型優先度を決定する、段階。
【請求項３０】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法:
(1)合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入する段階;および
(2)合成構築物を含有する該試験生物またはその一部を、該前駆細胞から産生する段階。
【請求項３１】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法:
(1)合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入する段階;および
(2)合成構築物を含有する細胞を含む該試験生物またはその一部を、該前駆細胞から増殖させる段階。
【請求項３２】
合成構築物を、試験生物またはその一部の選択された細胞に導入する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
請求項1または請求項28記載の方法に従って構築された合成ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項1または請求項28記載の方法に従って構築された合成ポリヌクレオチドを含有する、関心対象の生物またはその一部。
【請求項３５】
生物またはその一部において選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測されるレポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合した第1のコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含む合成構築物を含む、関心対象の生物またはその一部。
【請求項３６】
関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を調節する方法であって、以下の段階を含む方法:
生物またはその一部における第1のコドンとは異なる表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、該生物またはその一部に導入する段階。
【請求項３７】
関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を高める方法であって、以下の段階を含む方法:
生物またはその一部における第1のコドンよりも高い表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、該生物またはその一部に導入する段階。
【請求項３８】
関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を下げる方法であって、以下の段階を含む方法:
生物またはその一部における第1のコドンよりも低い表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、該生物またはその一部に導入する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に遺伝子発現に関する。より詳細には、本発明は、選択された表現型の質を調節するための方法に関する。この選択された表現型は、生物またはその一部によって示される表現型であり、かつ、選択された表現型を産生するためにその生物またはその一部によって使用される際の優先度が置換対象のコドンよりも高いまたは低い同義コドンを用いて、そのポリヌクレオチドの少なくとも1つのコドンを置換することにより、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現から生じる。さらにより詳細には、本発明は、生物またはその一部によって示される選択された表現型の質を調節するために、そのコドン組成物が改変された、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換された細胞における外来性の異種遺伝子の発現は現在一般的である。例えば、マウスおよびヒトの遺伝子を含む多数の哺乳動物遺伝子が、細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳動物の宿主細胞を含む種々の宿主細胞において首尾よく発現された。それにも関わらず、発現系および組換えDNA技術の急増する知識に関わらず、選択された宿主細胞中で外来性のまたは合成の遺伝子を発現するように試みるときに顕著な障害が残っている。例えば、合成遺伝子の翻訳は、強力なプロモーターと連結された場合でさえ、しばしば予測されるよりもはるかにゆっくりと進行する。同じことは、宿主細胞に対して外来性である外因性遺伝子で頻繁に当てはまる。予測されるよりも低いこの翻訳効率は、しばしば、宿主細胞において高度に発現される遺伝子のコドン使用パターンと類似しないコドン使用パターンを有する遺伝子のタンパク質コード領域に起因する。この点に関して、コドン使用は高度に偏っており、かつ異なる生物中で顕著に変化すること、およびコドン使用における偏りはペプチド伸長速度を変化させ得ることが知られている。コドン使用パターンがtRNAイソアクセプターの相対的な存在量に関連すること、および遺伝子がコードするタンパク質の存在量の多い少ないの比較で、それらのコドン優先度の違いが示されることもまた知られている。
【０００３】
遺伝子発現に対するコドン優先度現象の意味合いは、これらの現象がメッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率に影響し得るという点において明白である。この点に関しては、対応するイソ-tRNAが他のイソ-tRNAと比較して存在量が少ない「まれなコドン」の翻訳が、リボソームに翻訳の間の中断を引き起こす可能性があり、これが新生ポリペプチド鎖の完成を失敗させ、ならびに転写および翻訳の脱共役をもたらし得ることが広く知られている。従って、外因性遺伝子の発現は、生物の特定の宿主細胞または生物それ自体が外因性遺伝子の1つまたは複数のコドンに対応する存在量の少ないイソ-tRNAを有する場合に、激しく妨害され得る。従って、この分野における研究者達の主要な目的は、外因性遺伝子が発現される特定の細胞についてのコドン優先度を最初に確認すること、および続いてこれらの細胞における最適化された発現に関してその遺伝子のコドン組成を変化させることである。
【０００４】
コドン最適化技術は、翻訳的に効率的でないタンパク質コード領域の翻訳反応速度を改善することが知られている。伝統的に、これらの技術は、宿主細胞中でまれにまたは頻繁でなく使用されるコドンを、宿主によって好まれるコドンでの置換することに基づいていた。コドン頻度は、多くの生物の高度に発現される遺伝子についての文献における供給源に由来し得る(例えば、Nakamuraら、1996、Nucleic Acids Res 24:214-215を参照されたい)。これらの頻度は一般的に、好ましく高度に発現される、その生物のタンパク質をコードする遺伝子のコレクションにわたって、対応するアミノ酸をコードするために同義コドンが使用される頻度を、パーセンテージとして、「生物全体の平均的な基礎(basis)」で一般的に表現される。
【０００５】
典型的には、コドンは、(a)それらの使用頻度が、約4/3×（コドン使用頻度のいかなる偏りもなく予測される使用頻度）を上回る場合の「共通」コドン（すなわち、「好ましい」コドン）；(b)それらの使用頻度が、約2/3×（コドン使用頻度のいかなる偏りもなく予測される使用頻度）を下回る場合の「まれな」コドン（すなわち、「好ましくない」コドン）；および(c)それらの使用頻度が、「共通」コドンの使用頻度と「まれな」コドンの使用頻度の間である場合の「中程度」コドン（すなわち、「あまり好ましくない」コドン）として分類される。アミノ酸は、2、3、4、または6種のコドンによってコードされ得るので、コドン使用頻度のいかなる偏りもなく予測され、任意の選択されたコドンの使用頻度は、選択されたコドンと同じアミノ酸をコードする同義コドンの数に依存する。従って、特定のアミノ酸について、「共通」、「中程度」、および「まれな」のカテゴリーにコドンを分類するための頻度の閾値は、そのアミノ酸についての同義コドンの数に依存する。結果的に、同義コドンの選択を6種有するアミノ酸については、コドン使用頻度のいかなる偏りもなく予測されるコドン使用頻度は16%であり、従って、「共通」コドン、「中程度」コドン、および「まれな」コドンは、それぞれ、20%を上回る、10%と20%の間、および10%を下回る使用頻度を有するコドンとして定義される。同義コドンの選択を4種有するアミノ酸については、コドン使用頻度の偏りがなく予測されるコドン使用頻度は25%であり、従って、「共通」コドン、「中程度」コドン、および「まれな」コドンは、それぞれ、33%を上回る、16%と33%の間、および16%を下回る使用頻度を有するコドンとして定義される。イソロイシンについては、同義コドンの選択を3種有する唯一のアミノ酸であり、コドン使用頻度のいかなる偏りもなく予測されるコドン使用頻度は33%であり、従って、イソロイシンについての「共通」コドン、「中程度」コドン、および「まれな」コドンは、それぞれ、45%を上回る、20%と45%の間、および20%を下回る使用頻度を有するコドンとして定義される。同義コドンの選択を2種有するアミノ酸については、コドン使用頻度の偏りがなく予測されるコドン使用頻度は50%であり、従って、「共通」コドン、「中程度」コドン、および「まれな」コドンは、それぞれ、60%を上回る、30%と60%の間、および30%を下回る使用頻度を有するコドンとして定義される。従って、コドンの「共通」、「中程度」、および「まれな」のクラス（すなわち、それぞれ、「好ましい」、「あまり好ましくない」、または「好ましくない」）へのカテゴリー化は、一般的な生物について（例えば、ヒト全体）、または一般的な生物のクラスについて（例えば、哺乳動物全体）のコドン使用頻度をまとめることに慣習的に基づいてきた。例えば、一般的な哺乳動物細胞について、好ましいコドン、あまり好ましくないコドン、および好ましくないコドンを開示する、Seed（米国特許第5,786,464号および同第5,795,737号）を参照することができる。しかし、本発明者らは、WO 99/02694およびWO 00/42190において、1つの多細胞生物（例えば、哺乳動物または植物）の異なる細胞または組織において、特定のイソ-tRNAの相対的な存在量に実質的な違いが存在すること、およびこれが、所定のコドン���用または組成を用いてコード配列からタンパク質を翻訳する際に中心的な役割を果たしていることを示した。
【０００６】
従って、多細胞生物の異なる細胞がコドン使用において同じ偏りを有するという当技術分野で認識された推測とは対照的に、多細胞生物の1つの細胞型が、同じ生物の別の細胞型とは別個の様式でコドンを使用することが最初に明らかにされた。換言すれば、1つの生物の異なる細胞が、同じコドンについて異なる翻訳効率を示し得ること、および、選択された細胞型において、どのコドンが好ましいか、あまり好ましくないか、または好ましくないかを予測することが可能ではなかったことが明らかにされた。従って、選択された細胞型におけるタンパク質の産生を調節するために、または選択された細胞型にその産生を方向付けるために、遺伝子のコドン組成とともに、細胞型間のコドン翻訳効率の違いが利用され得ることが提案された。
【０００７】
従って、特定の細胞型におけるタンパク質コードポリヌクレオチドの発現を最適化するために、生物全体の平均的な基礎に基づいて計算されたコドン頻度に頼るよりはむしろ、その細胞型における各コドンについての翻訳効率を最初に決定すること、次いでその決定に基づいてポリヌクレオチドをコドン改変することが必要である。
【０００８】
上記のすべての方法は、選択された細胞型において発現を調節するための、または選択された細胞間でこれらのポリヌクレオチドを差次的に発現するための、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化に関する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な概要
本発明は、関心対象の生物によって示され、かつポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を変化させるための新規なストラテジーに関する。従来記載された方法と対照的に、このストラテジーは、関心対象の生物に適用可能であり得るコドン使用データまたはコドン翻訳効率に依存しない。その代わりに、これは、選択された表現型を産生するために関心対象の生物によるコドン使用優先度に従ってポリペプチド中のアミノ酸をコードする個々の同義コドンをランク付けすることに依存する。換言すれば、対象の方法は、個々の同義コドンの「表現型優先度」を決定することに基づく。有利には、表現型優先度は、関心対象の生物または関連する生物に、調節ポリヌクレオチドを含む合成構築物を導入することによって決定することができる。この調節ポリヌクレオチドはレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合したコドンのタンデムリピートに機能的に連結され、このレポーターポリヌクレオチドは、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測されるタンパク質をコードする。次いで、関心対象の生物または関連する生物における合成構築物の発現によって産生される表現型の質は、適切なアッセイ法を使用して決定される。選択された表現型は、免疫、寛容性、病原体抵抗性など、または他の有益な形質(修復プロセスの増強または妨害、悪疫抵抗性、凍結抵抗性、除草剤耐性などを含む)を含む治療的または予防的な表現型であってもよい。一連の同義コドンが、しばしば、一定の範囲の表現型優先度を示すが、これを、本発明に従って、異なる表現型優先度を有する同義コドンとの置換に向けて、もともとのポリヌクレオチドにおけるコドンを合理的に選択するための基礎として使用することができる。
【００１０】
従って、本発明の1つの局面において、合成ポリヌクレオチドを構築するための方法を提供し、ここから、関心対象の生物またはその一部に対して、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドによって付与される表現型とは異なる質で、選択された表現型を付与するために、ポリヌクレオチドが産生可能である。これらの方法は一般的に以下の段階を含む:(a)同義コドンで置換するために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する段階であって、この同義コドンは、試験生物またはその一部における表現型優先度の比較において第1のコドンとは異なる表現型優先度を示すことに基づいて選択され、そしてこの試験生物は関心対象の生物と同じ種の生物、および関心対象の生物に関連する生物からなる群より選択される、段階;ならびに(b)合成ポリヌクレオチドを構築するためにこの第1のコドンをこの同義コドンで置換する段階。
【００１１】
試験生物またはその一部におけるコドンの表現型優先度は、以下の段階によって適切に比較される:(i)試験生物またはその一部に個々の合成構築物を別々に導入する段階であって、この合成構築物の各々は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合したコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含み、このレポータータンパク質は、選択された表現型および選択された表現型と同じクラスの表現型からなる群より選択される対応する表現型を産生するかまたは産生することが予測される、段階;ならびに(ii)コドンの相対的な表現型優先度を決定するために、試験生物またはその一部によって示される表現型の質を比較する段階。
【００１２】
本発明の合成構築物は、典型的には、同じかまたは類似の導入様式を使用して試験生物またはその一部に導入される。このことは、対応する表現型またはその質が合成構築物の導入の特定の様式または経路に依存する場合に望ましい。
【００１３】
ある態様において、各々の合成構築物のタンデムリピートは、対応するコドンの少なくとも3コピーを含む。
【００１４】
ある態様において、同義コドンは、第1のコドンよりも高い表現型優先度を有するように選択される。本発明に従って、より高い表現型優先度は、選択された表現型のより高い質と相関する。従って、これらの態様のための同義コドンは、同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質が、第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質よりも適切に少なくとも約5%高い場合に、好ましく選択可能である。
【００１５】
他の態様において、同義コドンは、第1のコドンよりも低い表現型優先度を有するように選択される。本発明に従って、より低い表現型優先度は、選択された表現型のより低い質と相関する。従って、これらの態様のための同義コドンは、同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質が、第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質よりも適切に少なくとも約5%低い場合に、好ましく選択可能である。
【００１６】
本発明は単細胞生物にまで及ぶが、これは植物および動物を含む多細胞生物に好ましく適用可能である。
【００１７】
別の局面において、本発明は、関心対象の生物またはその一部における第1のコドンの表現型優先度を決定するための方法を提供する。これらの方法は、一般的に以下の段階を含む:(a)合成構築物を試験生物またはその一部に導入する段階であって、この試験生物は、関心対象の生物と同じ種の生物および関心対象の生物に関連する生物からなる群より選択され、この合成構築物は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合した第1のコドンのタンデムリピートに機能的に連結されている調節ポリヌクレオチドを含み、このレポータータンパク質は、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測される、段階;ならびに(b)この生物またはその一部によって示される対応する表現型の質を決定する段階。
【００１８】
ある態様において、本発明の方法は、以下の段階をさらに含む:(i)第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、試験生物またはその一部によって示される対応する表現型の質と、(ii)第2のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、試験生物またはその一部によって示される対応する表現型の質とを比較する段階であって、この第2のコドンは、第1のコドンと同じアミノ酸をコードし、それによってこの試験生物またはその一部におけるこの第2のコドンの表現型優先度に対してこの第1のコドンの表現型優先度を決定する、段階。
【００１９】
ある態様において、本発明の方法は、以下の段階をさらに含む:(1)合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入する段階;および(2)合成構築物を含む試験生物またはその一部をこの前駆細胞から産生する段階。
【００２０】
他の態様において、本発明の方法は、以下の段階をさらに含む:(1)合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入する段階;および(2)合成構築物を含む細胞を含む試験生物またはその一部をこの前駆細胞から増殖させる段階。
【００２１】
なお他の態様において、本発明の方法はさらに、合成構築物を試験生物またはその一部に導入する段階をさらに含む。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、上記の方法のいずれか1つに従って構築された合成ポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
なおさらに別の局面において、本発明は、上記の方法のいずれか1つに従って構築された合成ポリヌクレオチドを含む関心対象の生物またはその一部を含む。
【００２４】
なお別の局面において、本発明は、合成構築物を含む関心対象の生物またはその一部を意図し、この合成構築物は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合した第1のコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含み、このレポータータンパク質は、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測される。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を調節する方法を含む。これらの方法は、一般的に以下の段階を含む:生物またはその一部における第1のコドンとは異なる表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、この生物またはその一部に導入する段階。
【００２６】
なおさらなる局面において、本発明は、関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を高める方法を含む。これらの方法は、一般的に以下を含む: 生物またはその一部における第1のコドンよりも高い表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、この生物またはその一部に導入する段階。
【００２７】
なおまださらなる局面において、本発明は、関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を下げる方法を含む。これらの方法は、一般的に以下を含む: 生物またはその一部における第1のコドンよりも低い表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、この生物またはその一部に導入する段階。
【００２８】
発明の詳細な説明
1. 定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様かまたは等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的のために、次の用語が以下に定義される。
【００２９】
冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法的な対象物の1つまたは1つより多く(すなわち、少なくとも1つ)をいうために本明細書中で使用される。例として、「エレメント(an element)」は、1つのエレメントまたは1つより多くのエレメントを意味する。
【００３０】
「約」という用語は、特定のパラメーター(例えば、量、濃度、表現型付与効率、時間など)に対して、30%、20%、15%、10%、5%、または4%、3%、2%、1%と同程度変化するパラメーターをいうために本明細書中で使用される。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「シス作用性配列」または「シス調節性領域」という用語または同様の用語は、遺伝子配列の発現が、少なくとも部分的にそのヌクレオチドの配列によって調節される、発現可能な遺伝子配列から誘導されるヌクレオチドの任意の配列を意味すると取られるべきである。当業者は、シス調節性領域が、任意の構造遺伝子配列の発現のレベルおよび/または細胞型特異性および/または発生の特異性を、活性化、サイレンシング、増強、抑制、またはさもなくば変化させることが可能であり得ることを承知である。
【００３２】
本明細書中を通して、文脈が他を必要としない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、および「含んでいる（comprising）」という単語は、言及された段階もしくは要素、または段階もしくは要素の群を含むことを意味するが、いかなる他の段階もしくは要素、または段階もしくは要素の群も除外するとは意味しないことが理解される。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「付与された表現型」とは、関心対象の生物もしくは関心対象の生物のクラスの状態、あるいは関心対象の生物の一部もしくは組織またはその生物の細胞もしくは細胞型もしくは細胞のクラスの状態の一過性あるいは永続的な変化をいい、これは、その細胞への、または細胞のクラスへの、または部分もしくは組織もしくは細胞もしくは細胞型もしくは細胞のクラスへの、またはその生物もしくは部分もしくは組織もしくは細胞もしくは細胞型もしくは細胞のクラスの前駆体への、ポリヌクレオチドの導入後に起こり、およびこれは、その導入がなければ起こらない。典型的には、このような一過性または永続的な変化は、細胞中、あるいは関心対象の生物中または関心対象の生物のクラスのクラス中の少なくとも1つの細胞もしくは細胞型もしくは細胞のクラス中、ポリヌクレオチド中に含まれる遺伝情報の転写および/または翻訳の結果として起こり、および、ポリヌクレオチドが関心対象の類似の生物から提供された、関心対象の生物、または関心対象の生物のクラス、またはその一部もしくは組織もしくは細胞もしくは細胞型もしくは細胞のクラス、またはこれらの遺伝的子孫を、あるいはポリヌクレオチドが関心対象の類似の生物から提供されなかった、関心対象の生物のクラス、またはその一部もしくは組織もしくは細胞もしくは細胞型もしくは細胞のクラス、またはこれらの遺伝的子孫を区別するために使用され得る。
【００３４】
「発現ベクター」とは、ベクターによってコードされるタンパク質の合成を方向付けることができる任意の自律性遺伝子エレメントを意味する。このような発現ベクターは、当業者によって公知である。
【００３５】
「遺伝子」という用語は、本明細書中で使用される場合、宿主ゲノム、または機能的RNA(例えば、tRNA、rRNA、調節的RNA(例えばリボザイム、翻訳後遺伝子サイレンシングRNAなど))のみをコードする領域ならびに付随する非コード領域および任意の調節領域の任意のおよびすべての別個のコード領域をいう。特定の態様において、「遺伝子」という用語は、その範囲に、特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、ならびに発現の調節に関与する、隣接する5'および3'非コードヌクレオチド配列を含む。この点に関して、遺伝子は、制御シグナル(例えばプロモーター、エンハンサー、所定の遺伝子と天然に付随する終結シグナルおよび/またはポリアデニル化シグナル、または異種制御シグナルなど)をさらに含んでいてもよい。遺伝子配列は、cDNAまたはゲノムDNAまたはそのフラグメントであってもよい。この遺伝子は染色体外での維持のため、または宿主への組み込みのために適切なベクターに導入され得る。
【００３６】
「調節すること」、「調節する」などは、直接的または間接的に、選択された表現型の質を増加または減少させることを意味する。
【００３７】
「天然の遺伝子」とは、タンパク質を天然にコードする遺伝子を意味する。しかし、親のポリヌクレオチドが、天然に存在しないが組換え技術を使用して操作されたタンパク質をコードすることが可能である。
【００３８】
「5'非コード領域」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の、発現可能な遺伝子の上流領域に由来するすべてのヌクレオチド配列を含むように、その最も広い文脈において本明細書中で使用され、ここで5'非翻訳領域は、少なくとも部分的に、遺伝子の発現を付与または活性化またはさもなくば容易にする。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、ホスホジエステル結合（またはその関連する構造的改変体または構造的アナログ）を介して連結された多数のヌクレオチド単位（デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその関連する構造的改変体またはその合成アナログ）から構成されるポリマーをいう。従って、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、ヌクレオチドおよびそれらの間の連結が天然に存在するヌクレオチドポリマーをいい、この用語は、その範囲内に、ペプチド核酸（PNA）、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、2-O-メチルリボ核酸などを含むがこれらに限定されない種々のアナログもまた含むことが理解される。分子の正確なサイズは特定の用途に依存して変化し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には、いくぶん長さが短く、一般的には約10から30ヌクレオチドであるが、しかしこの用語は任意の長さのヌクレオチドをいい得るけれども、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、典型的には、大きなオリゴヌクレオチドのために使用される。
【００４０】
「機能的に結合される」または「機能的に連結される」という用語は、本明細書中で使用される場合、プロモーターの調節的制御下に構造遺伝子を配置し、次いで、そのプロモーターが遺伝子の転写および任意に翻訳を制御することを意味する。異種プロモーター/構造遺伝子の組み合わせの構築においては、遺伝子配列またはプロモーターと、その天然の設定においてプロモーターが制御する遺伝子（すなわち、遺伝子配列またはプロモーターがそこから誘導された遺伝子）との間の距離とほぼ同じである遺伝子転写開始部位からの一定の距離に、遺伝子配列またはプロモーターを配置することが一般的に好ましい。当技術分野において公知であるように、この距離のいくつかのバリエーションが、機能の損失を伴うことなく適合され得る。同様に、その制御下に配置される異種遺伝子に関する調節配列エレメントの好ましい配置は、その天然の設定におけるエレメントの配置（すなわち、それがそこから誘導された遺伝子）によって規定される。
【００４１】
「前駆体(precursor)」および「前駆細胞(progenitor)」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心対象の生物を生じ得る細胞または生物の一部をいい、ここで表現型発現が所望されるか、またはコドンの表現型優先度が決定される。
【００４２】
「表現型」という用語は、生物、組織、もしくは細胞、または生物、組織、もしくは細胞のクラスの遺伝的構成(すなわち、遺伝子型)と環境との間の相互作用から一般的に生じる、生物、組織、もしくは細胞、または生物、組織、もしくは細胞のクラスの、任意の1つまたは複数の、検出可能な物理的または機能的な特徴、特性、属性、または形質を意味する。特定の態様において、「表現型」という用語は、レポータータンパク質によって直接的に付与される、選択薬剤に対する抵抗性または酵素的または光放射活性をスクリーニングすることを除外する。
【００４３】
「表現型優先度(phenotypic preference)」とは、生物が、選択された表現型を産生するためにコドンを使用する優先度を意味する。この優先度は、例えば、選択された表現型を産生するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームにおいてコドンを含むポリヌクレオチドによって産生可能な選択された表現型の質によって証明され得る。特定の態様において、コドン使用の優先度は、ポリヌクレオチドが生物に導入される経路とは無関係である。しかし、他の態様において、コドン使用の優先度は、生物へのポリヌクレオチドの導入の経路に依存する。
【００４４】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、本明細書中で使用される場合、mRNA、RNA、cRNA、cDNA、またはDNAを意味する。この用語は、典型的には、30ヌクレオチド長より長いオリゴヌクレオチドをいう。
【００４５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書中で、アミノ酸残基のポリマーならびにその改変体および合成アナログをいうために交換可能に使用される。従って、これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸（例えば、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログ）であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。
【００４６】
「産生する」および同様の用語（例えば、「産生」および「産生可能」）は、タンパク質産生の文脈において、タンパク質に付随する特定の機能を達成するのに十分なレベルまでのタンパク質の産生を意味する。対照的に、「産生可能でない」および「実質的に産生可能でない」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される場合、（a）タンパク質の産生がない、（b）タンパク質に付随する特定の機能もしくは表現型をもたらすには十分でないレベルまでのタンパク質の産生、（c）タンパク質に特異的なモノクローナル抗体によって検出することができないタンパク質の産生、または（d）通常タンパク質を産生する野生型細胞において産生されるレベルの1%未満であるタンパク質の産生をいう。
【００４７】
「プロモーター」への本明細書中での言及は、その最も広い文脈において取られ、CCAATボックス配列、ならびに、発生および/もしくは環境の刺激に応答して、または組織特異的もしくは細胞型特異的な様式で遺伝子発現を変化させる付加的な調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサー、およびサイレンサー）を有するかまたは有さない、正確な転写開始のために必要であるTATAボックスを含む、古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。プロモーターは、通常、しかし必須ではなく、プロモーターがその発現を調節する構造遺伝子の上流すなわち5'に配置される。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは、通常、遺伝子の転写の開始部位の2kb以内に配置される。本発明に従う好ましいプロモーターは、細胞中での発現をさらに増強するために、および/またはそれが機能的に結合されている構造遺伝子の発現のタイミングを変化させるために、1つまたは複数の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含み得る。
【００４８】
「質」という用語は、その最も広い意味において本明細書中で使用され、表現型の測定値、強さ、強度、程度または等級を含む。例えば、優れているかまたは劣っている免疫応答、増加したかまたは減少した疾患抵抗性、より高いかまたはより低いスクロース蓄積、より良好かまたはより悪い塩耐性などである。
【００４９】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技術を使用して、すなわち、組換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドの発現を通して作製されたポリペプチドを意味する。
【００５０】
「合成ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの操作によって、自然界には通常存在しない形態にインビトロで形成されるポリヌクレオチドをいう。例えば、合成ポリヌクレオチドは、発現ベクターの形態であり得る。一般的に、このような発現ベクターは、ポリヌクレオチドに機能的に連結された転写および翻訳の調節ポリヌクレオチドを含む。
【００５１】
「同義コドン」という用語は、本明細書中で使用される場合、別のコドンと異なるヌクレオチド配列を有するが、他のそのコドンと同じアミノ酸をコードするコドンをいう。
【００５２】
「ベクター」とは、核酸配列が挿入またはクローニングされ得る、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスに由来する、核酸分子、好ましくはDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは、1つまたは複数の独特な制限部位を含み、規定された宿主細胞（標的の細胞もしくは組織、またはその子孫の細胞もしくは組織を含む）中で自律的複製が可能であってもよく、あるいはクローニングされた配列が再生可能であるように規定された宿主のゲノムに組み込み可能であってもよい。従って、ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、細胞外実体として存在するベクター）であってもよく、その複製は染色体複製と独立し、例えば、線状または閉環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含み得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に、ゲノムに組み込まれ、およびそれが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、2つ以上のベクターもしくはプラスミド（これは、宿主細胞のゲノムに導入される全体のDNAを一緒に含む）、またはトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、そのベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターはまた、適切な形質転換体の選択のために使用され得る抗生物質耐性遺伝子のような選択マーカーを含み得る。このような耐性遺伝子の例は当業者に周知である。
【００５３】
2. コドンの表現型優先度
本発明は、関心対象の生物によって示されるか、または示されることが提案される選択された表現型の質を高めるか、または質を下げるための新規なストラテジーを提供する。このストラテジーは、それ自体によってまたは他の分子と付随してのいずれかで、表現型に関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン改変を含み、関心対象の生物において、その生物上で選択された表現型を与えるかまたは付与する。しかし、以前の方法とは異なり、このストラテジーは、生物または生物のクラスにおけるコドン使用優先度に従って同義コドンのランク付けを提供するデータに依存しない。これは、生物または生物のクラスの1つまたはそれ以上の細胞におけるそれらの翻訳効率に従って同義コドンのランク付けを提供するデータにも依存しない。その代わりに、これは、選択された表現型を産生するために、生物もしくは生物のクラス、またはその一部によるコドン使用頻度の優先度に従って、表現型関連ポリペプチドにおけるアミノ酸をコードする個々の同義コドンをランク付けすることに依存する。本明細書中で使用される場合、生物もしくは生物のクラス、またはその部分による個々のコドンの使用頻度の優先度が「表現型優先度」といわれる。このような優先度は、選択された表現型を達成することに対する個々のコドンの影響を定性的または定量的に決定することによって決定することができ、それゆえに、これは、これまでに記載したようなコドン頻度または翻訳効率の計算を必要としない。
【００５４】
有利なことに、同義コドンの表現型優先度は、関心対象の生物もしくは関連する生物、またはこのような生物の一部に、調節ポリヌクレオチドを含む合成構築物を導入することによって決定できる。この調節ポリヌクレオチドは、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するか、またはその表現型を産生すると予測される、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合したコドンのタンデムリピートに機能的に連結されている。1つの態様において、レポータータンパク質は、選択された表現型(例えば、メラノーマに対する免疫)を産生する対象である、表現型関連ポリペプチド(例えば、メラノーマ関連抗原(例えばBAGEまたはGAGE-1など))である。別の態様において、表現型関連ポリペプチド(例えば、緑色蛍光タンパク質または胃腸管関連抗原(例えば17-1A))は、選択された表現型(例えば、メラノーマに対する免疫)を産生することができないが、選択された表現型と同じクラスの表現型(例えば、免疫応答)を産生する。例示的な例において、表現型関連ポリペプチドは、病原性生物または癌からの抗原(例えば、その表現型が疾患に対する免疫である場合)および自己抗原または移植抗原(例えば、その表現型が、生物またはその一部のサイズ、創傷治癒、細胞増殖、細胞分化、細胞移動、免疫細胞機能から選択される場合)、ホルモン(例えば、その表現型が乳汁分泌の増加(例えば、オキシトシンを使用して)、または糖尿病状態の改善(例えば、インスリンを使用して)である場合)、および毒素(例えば、その表現型が腫瘍退縮または細胞死である場合)から選択される。
【００５５】
合成構築物の設計は、好ましくは、国際公開公報WO 00/42215におけるFrazerらの合成構築物設計に基づくが、レポーターポリヌクレオチドとそれぞれインフレームで融合された、異なるが同義のストレッチである同一のコドンが、所定の細胞型中で産生されるレポータータンパク質のレベルに相違をもたらすことができるという決定を前提としている。選択された細胞型において産生されるレポータータンパク質のレベルは、構築物の同一のコドンに対応するイソ-tRNA種の細胞内の存在量に感受性であり、それゆえに、所定のコドンを翻訳するための細胞の優先度の直接的な相関を提供する。しかし、選択された細胞型における同義コドンの翻訳効率を決定することに主として関係するWO 00/42215とは対照的に、本発明は、合成構築物によって産生される表現型関連タンパク質に応答して生物またはその一部によって示される表現型または表現型のクラスに対する同一のコドンのそれらの同義ストレッチの影響を、これらの合成構築物を使用して決定することに関係する。これは、例えば、同一の第1のコドンのタンデムなシリーズを有する合成構築物が提供される選択された生物またはその一部によって示される表現型の質が、同一の第2のコドンを有する合成構築物が提供される選択された生物またはその一部によって示される表現型の質よりも低いならば(すなわち、ここで、第1のコドンは、第2のコドンと異なるが同義である)、選択された生物またはその一部が、産生される表現型の質に関して、第1のコドンよりも第2のコドンについてのより高い優先度を有することが推定され得ることを意味する。言い換えれば、この第2のコドンは、選択された生物またはその一部において、この第1のコドンよりも高い表現型優先度を有する。
【００５６】
適切には、タンデムリピートは少なくとも3つの同一のコドンを含み、好ましくは4つから7つまでの同一のコドン、およびより好ましくは5つから6つまでの同一のコドンを含む。
【００５７】
このタンデムリピートは、レポーターポリヌクレオチドに隣接した位置で、またはレポーターポリヌクレオチド中の位置で融合され得る。この位置は、好ましくは、このタンデムリピートが、表現型関連タンパク質の少なくとも一部の翻訳を妨害するように選択される。好ましくは、このタンデムリピートがレポーターポリヌクレオチドからすぐ上流(翻訳的に)位置する。
【００５８】
同一のアミノ酸残基のタンデムリピート(例えば、オリゴ-プロリンリピート)が表現型関連タンパク質を不安定にし得ることは当然可能である。典型的には、タンパク質の不安定性は、レポーターポリヌクレオチドの発現によって付与される表現型がタンデムリピートに対応するアミノ酸に特異的なイソアクセプティングコドンの任意の選択を用いて検出可能でない場合に検出される。しかし、このようなタンパク質の不安定性は、同一のコドンのタンデムリピート中での少なくとも1つのスペーサーコドンの使用によって緩和でき、ここでこのスペーサーコドンは天然のアミノ酸をコードする。
【００５９】
スペーサーコドンは、タンデムリピートに対応する同一のコドンのいくつかまたはそのすべてに隣接するか、またはそれらの間に介在して配置され得る。例えば、同一のコドンのペンタ反復について適切な介在は以下から選択することができる:
2006506986.tif 000002
ここで、Iはタンデムリピートの同一なコドンに対応し、Sはスペーサーコドンに対応する。
【００６０】
好ましくは、スペーサーコドンは、他の同義コドンと比較して、生物の細胞型または生物それ自体において効率的に翻訳される。このことは重要であり、その結果、スペーサーコドンの翻訳が律速でない。中性のアミノ酸には、アラニンまたはグリシンが含まれるがこれらに限定されない。
【００６１】
レポーターポリヌクレオチドは、それ自体によって、または他の分子と連係してのいずれかで、生物またはその一部に、表現または表現型のクラスを付与する任意の適切なタンパク質をコードし得る。特定の態様において、選択された表現型または表現型のクラスは、参照の状態または条件と比較して、生物またはその一部の有益なまたは改善されたまたは優れた状態または条件に対応する。例示的な例において、参照の状態または条件は、病態生理学的状態に対応する。本発明によって意図される表現型には任意の所望される有益な形質が含まれ、この形質には以下が含まれるがこれらに限定されない:免疫(例えば、病原体性感染または癌に対する免疫);抗原寛容性(例えば、抗原特異性Tリンパ球アレルギーや、アレルゲン、移植抗原および自己抗原に対する寛容性);血管形成(例えば、心臓および血管系における、ならびに腫瘍増殖における血管形成);抗血管形成(例えば、虚血性心臓疾患および腫瘍の処置);臨床的徴候の改善(例えば、熱;炎症;脳炎;体重減少;貧血;感覚性症状(例えば感覚異常または知覚過敏);運動失調;神経痛;麻痺;眩暈;泌尿器または腸の移動性異常;および認知障害(例えば記憶障害、注意障害、問題解決困難性、情報処理遅延、および認知課題間の切り替えの困難性));細胞死(例えば、アポトーシス)の減少または増加;細胞分化の減少または増加;細胞増殖の減少または増加;腫瘍または癌の退縮;組織または器官の増殖または修復;線維症の減少;細胞老化の阻害または逆転;細胞移動の増加または減少;生物またはその一部の異なる細胞または組織の間のタンパク質の差次的発現;外傷の回復;熱傷からの回復;抗生物質耐性または感受性(例えば、アミノグリコシド性抗生物質(例えばゲネチシンおよびパロモマイシン)に対する耐性または感受性);除草剤耐性または感受性(例えば、グリフォセートおよびグルフォシネートに対する耐性または感受性);デンプン生合成または修飾(例えば、デンプン分枝酵素、デンプン合成酵素、ADP-グルコースピロホスホリラーゼを使用する);脂肪酸生合成(例えば、デサチュラーゼまたはヒドロキシラーゼを使用する);疾患抵抗性または耐性(例えば、動物疾患(例えば心臓血管疾患、自己免疫、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病、AIDSなど)に対する抵抗性、または植物病害(例えば、さび病、萎縮病、腐敗病、黒穂病、かび病、かさ病、およびうどん粉病など)に対する抵抗性);昆虫抵抗性または耐性を含む悪疫抵抗性または耐性(例えば、穿孔虫およびぜん虫に対する抵抗性);ウイルス抵抗性または耐性(例えば、動物ウイルス(例えばヘルペスウイルス、ヘパドナウイルス、アデノウイルス、フラビウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルスなど)または植物ウイルス(例えばバドナウイルス、カリモウイルス、ポチウイルス、ルテオウイルス、ラブドウイルスなど)に対する抵抗性);真菌抵抗性または耐性(例えば、アーバスキュラー菌根真菌、内部寄生真菌などに対する抵抗性);スクロース代謝を含む代謝的形質(例えば、スクロース異性化);凍結抵抗性または耐性;ストレス耐性(例えば、塩耐性、乾燥耐性);および食物含量の改善または収量の増大。当業者は、上記の表現型の例示的なクラスが表現型のサブクラスに細分でき、そのようなサブクラスもまた本発明によって意図される表現型クラス��範囲内に入ることを認識する。例えば、免疫のサブクラスには、生得の免疫(これはとりわけ、補体系、単球、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラー細胞にさらに細分され得る)、細胞性免疫(これはとりわけ、細胞溶解性Tリンパ球、樹状細胞、およびTヘルパーリンパ球にさらに細分され得る)、体液性免疫(これはとりわけ、抗体サブクラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMにさらに細分され得る)が含まれる。
【００６２】
本発明の方法は、原核生物宿主ならびに真核生物宿主に適用可能であり、これらには、単細胞生物および特に多細胞生物(例えば酵母、植物、および動物(例えば哺乳動物、爬虫類、魚類、鳥類など)、ならびに無脊椎動物(例えば後生動物、海綿動物、ぜん虫、軟体動物、線虫、甲殻類、棘皮動物など))が含まれるがこれらに限定されない。本発明の特定の態様において、関心対象の生物は植物および動物より選択される。
【００６３】
真核生物の例示的な例には以下が含まれるがこれらに限定されない:酵母および糸状菌のような菌類(アスペルギルス属、トリコデルマ属、およびアカパンカビ属の種を含む);脊椎動物を含む動物宿主(これらの例示的な例には以下が含まれる:魚類(例えば、サケ、マス、ティラピア、マグロ、コイ、ヒラメ、オヒョウ、メカジキ、タラ、およびゼブラフィッシュ)、鳥類(例えば、ニワトリ、カモ、ウズラ、キジ、およびシチメンチョウ、ならびに他のヤケイまたは狩猟用の鳥)および哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、バッファロー、シカ、ヒツジ、ウサギ、齧歯類(マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット)、ヤギ、ブタ、霊長類、海洋哺乳類(イルカおよびクジラを含む))、ならびに任意の組織または幹細胞型のヒト細胞株または他の哺乳動物細胞株などの細胞株(例えば、COS細胞、NIH 3T3 CHO細胞、BHK細胞、293細胞、またはHeLa細胞)、および幹細胞(多能性および非多能性の胚性幹細胞および非ヒト接合体を含む)、ならびに無脊椎動物(例示的な例には以下が含まれる:線虫(その典型的な属には、動物に感染するもの(例えば以下を含むがこれらに限定されない:鉤虫属、回虫目、回虫属、ブノストムム属、シノラブディス(Caenorhabditis)、毛細線虫属、シャベルティア(Chabertia)、クーペリア属、ディクチオカウルス属、ヘルノンクス(Haernonchus)、ヘテラキス属、ネマトディルス(Nematodirus)、腸結節虫属、オステルタジア属、蟯虫属、パラスカリス(Parascaris)、円虫属、小回虫(Toxascaris)、鞭虫属、毛様線虫属、ツフリコネーマ(Tflichonema)、トキソカラ属(Toxocara)、ウンシナリア属)および植物に感染するもの(例えば以下を含むがこれらに限定されない:ブルサファレンクス(Bursaphalenchus)、クリコネリエラ(Criconerriella)、ディイレンクス(Diiylenchus)、ディティレンクス(Ditylenchus)、グロボデラ(Globodera)、ヘリコティレンクス(Helicotylenchus)、ヘテロデラ(Heterodera)、ロンギドルス(Longidorus)、メロドイギネ(Melodoigyne)、ナコブス(Nacobbus)、パラティレンクス(Paratylenchus)、プラティレンクス(Pratylenchus)、ラドフォルス(Radopholus)、ロテリンクス(Rotelynchus)、ティレンクス(Tylenchus)、およびクシフィネルナ(Xiphinerna))および他のぜん虫、ショウジョウバエ、および他の昆虫(例えば、ミツバチ科、ゾウムシ科、コガネムシ科、ミバエ科(Tephritidae)、ハマキガ科から、とりわけ、これらの典型的な目には、鞘翅目、双翅目、鱗翅目、および同翅目が含まれる)が含まれる)。
【００６４】
特定の態様において、関心対象の生物は、単子葉植物、双子葉植物、および裸子植物から適切に選択される植物である。この植物は、装飾用植物または作物植物であり得る。例示的な装飾用植物の例には以下が含まれるがこれらに限定されない:リンゴ属の種(Malus spp.)、サンザシ属の種(Crataegus spp.)、バラ属の種(Rosa spp.)、マカンバ属の種(Betula spp.)、ナナカマド属の種(Sorbus spp.)、オリーブ属の種(Olea spp.)、キョウチクトウ属の種(Nerium spp.)、ヤナギ属の種(Salix spp.)、ポプラ属の種(Populus spp.)。作物植物の例示的な例には以下が含まれるがこれらに限定されない:オクラ(オクラ)、アカシア属の種(Acacia spp.)、アガベ・フォウルクロイデス(Agave fourcroydes)(ヘネッケン)、アガベ・サイザラーナ(Agave sisalana)(サイザルアサ)、アルビジア属の種(Albizia spp.)、ネギ(房状タマネギ)、オオニンニク(ニンニク)、ネギ属の種(Allium spp.)(タマネギ)、アルピニア・ガランガ(Alpinia galanga)(大型ガランガ)、アマランツス・カウダツス(Amaranthus caudatus)、ヒユ属の種(Amaranthus spp.)、カシュー属の種(Anacardium spp.)(カシュー)、パイナップル(パイナップル)、イノンド(イノンド)、アノンナ・ケリモラ(Annona cherimola)(チェリモヤ)、アピオス・アメリカナ(Apios americana)(アメリカ落花生)、ナンキンマメ(ピーナッツ)、ゴボウ属の種(Arctium spp.)(ゴボウ)、ヨモギ属の種(Artemisia spp.)(ヨモギ)、アスパラサス・リネアリス(Aspalathus linearis)(レッドブッシュティー)、アテロトニア・ディベルシフォリア(Athertonia diversifolia)、アトリプレクス・ヌムラリア(Atriplex nummularia)(オールドマンソルトブッシュ)、アベロア・カランボア(Averrhoa carambola)(スターフルーツ)、アザディラクタ・インディカ(Azadirachta indica)(ニームノキ)、バックホウシア属の種(Backhousia spp.)、ホウライチク属の種(Bambusa spp.)(タケ)、サトウダイコン(テンサイ)、カラムシ(カラムシ)、チンゲン菜、ボロニア・メガスティグマ(Boronia megastigma)(スウィートボロニア)、ブラシカ・カリナタ(Brassica carinata)(アビシニアマスタード)、カラシナ(インドマスタード)、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)(アブラナ)、キャべツ(キャベツ、ブロッコリ)、キャベツの変種アルボガブラ(Albogabra)(ガイラム(gai lum))、ブラシカ・パラキネンシス(Brassica parachinensis)(チョイサム(choi sum))、ブラシカ・ペケンシス(Brassica pekensis)(ウォンボク(Wong bok)またはチャイニーズキャベツ)、アブラナ属の種(Brassica spp.)、ブルセラ・オボバタ(Burcella obovata)、カヤヌス・カヤン(Cajanus cajan)(キマメ)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(チャ)、アサ(非薬物アサ)、トウガラシ属の種(Capsicum spp.)、パパイヤ属の種(Carica spp.)(パパイヤ)、ベニバナ(サフラワー)、ヒメウイキョウ(キャラウェー)、カシニア属の種(Cassinia spp.)、カスタノスペルム・オーストラレ(Castanospermum australe)(ブラックビーン)、カスアリナ・クニンガミアナ(Casuarina cunninghamiana)(モクマオウ)、イナゴマメ(イナゴマメ)、カマエメルム・ノビル(Chamaemelum nobile)(カモミール)、カメラウシウム属の種(Chamelaucium spp.)(ジェラルトンワックス)、ケノポジウム・キノア(Chenopodium quinoa)(キノア)、キク属の種(Chrysanthemum)(タナシータム)、シネラリイフォリウム(cinerariifolium)(ジョチュウギク)、ヒヨコマメ(ヒヨコマメ)、キクニガナ(チコリ)、センニンソウ属の種(Clematis spp.)、クリアンサス・フォルモサス(Clianthus formosus)(スターツデザートピー)、ココヤシ(ココナッツ)、コーヒー属の種(coffea spp.)(コーヒー)、コロカシア・エスクレンタ(Colocasia esculenta)(タロ)、コリアンドルム・サティブム(Coriandrum sativum)(コリアンダー)、クランベ・アビシニカ(Crambe abyssinica)(ハマナ)、サフラン(サフラン)、ククルビタ・フォエティディッシマ(Cucurbita foetidissima)(バッファローゴード)、カボチャ属の種(Cucurbita spp.)(ゴード)、シアノプシス・テトラゴノローバ(Cyamopsis tetragonoloba)(グアー)、シムボポゴン属の種(Cymbopogon spp.)(レモングラス)、シティサス・プロリフェルス(Cytisus proliferus)(タガサステ)、ニンジン(ニンジン)、ヒメギンネム属の種(Desmanthus spp.)、ディオスコレア・エスクレンタ(Dioscorea esculenta)(アジアヤムイモ)、ディオスコレア属の種(Dioscorea spp.)(ヤムイモ)、ディオスピロス属の種(Diospyros spp.)(カキ)、ドロニクム属の種(Doronicum spp.)、エキナセア属の種(Echinacea spp.)、エレオカリス・ドゥルシス(Eleocharis dulcis)(ヒシ)、シコクビエ(フィンガーミレット)、エマンサス・アルンディナセウス(Emanthus arundinaceus)、エラゴロスティス・テフ(Eragrostis tef)(テフ)、エリアンサス・アルンディナセウス(Erianthus arundinaceus)、ビワ(ビワ)、ユーカリ属の種(Eucalyptus spp.)、ユーカリ属の種(ジルマリー)、ユークレア属の種(Euclea spp.)、ユーゲニア・マラセンシス(Eugenia malaccensis)(ジュンバ)、トウダイグサ属の種(Euphorbia spp.)、リュウガン(リュウガン)、エウトレマ・ワサビ(Eutrema wasabi)(ワサビ)、ソバ(ソバ)、フェストゥカ・アルンディナセア(Festuca arundinacea)(ヒロハノウシノケグサ)、イチジク属の種(Ficus spp.)(イチジク)、フラコウルティア・イネルミス(Flacourtia inermis)、フリンデルシア・グライリアナ(Flindersia grayliana)(クイーンズランドメープル)、フォエニクルム・オレアリア(Foeniculum olearia)、ウイキョウ(ウイキョウ)、マンゴスチン(マンゴスチン)、グリシン・ラティフォリア(Glycine latifolia)、ダイズ(ダイズ)、ダイズ(植物ダイズ)、カンゾウ(カンゾウ)、ワタ属の種(Gossypium spp.)(ワタ)、グレビレア属の種(Grevillea spp.)、グリンデリア属の種(Grindelia spp.)、グイゾティア・アビシニカ(Guizotia abyssinica)(ニガー)、ハルパゴフィルム属の種(Harpagophyllum sp.)、ヒマワリ(高オレイン酸ヒマワリ)、ヒマワリ(モノサンヒマワリ)、キクイモ(エルサレムアーティチョーク)、ヒビスクス・カンナビヌス(Hibiscus cannabinus)(ケナフ)、ホルデウム・バルボーサム(Hordeum bulbosum)、ホルデウム属の種(Hordeum spp.)(ワキシーバーリー)、オオムギ(オオムギ)、オオムギの亜種スポンタネウム(spontaneum)、ホップ(ホップ)、ヒドラスチス(ゴールデンシール)、ヒメナクン属の種(Hymenachne spp.)、ヒソップ(ヒソップ)、インディゴフェラ属の種(Indigofera spp.)、インガ・エデュリス(Inga edulis)(アイスクリームビーン)、イノカルプス・ツギター(Inocarpus tugiter)、イポモエア・バタタス(Ipomoea batatas)(サツマイモ)、サツマイモ属の種(Ipomoea sp.)(カンコン)、ラブラブ・プルプレウス(Lablab purpureus)(ホワイトラブラブ)、ラクツカ属の種(Lactuca spp.)(レタス)、ラティルス属の種(Lathyrus spp.)(ベッチ)、ラバンジュラ属の種(Lavandula spp.)(ラベンダー)、レンズ属の種(Lens spp.)(レンチル)、レスキュエレラ属の種(Lesquerella spp.)(ベシカリア)、 レウカエナ属の種(Leucaena spp.)、ユリ属の種(Lilium spp.)、リムナンテス属の種(Limnanthes spp.)(メドウフォーム)、アマ(アマ)、アマ(リンシード)、アマ(リノラ(Linola.TM.))、レイシ(ライチ)、ロトゥス・コ��ニクラトゥス(Lotus corniculatus)(ミヤコグサ)、ロトゥス・ペドゥンクラトゥス(Lotus pedunculatus)、ロトゥス属の種(Lotus sp.)、ヘチマ属の種(Luffa spp.)、ルナリア・アンヌア(Lunaria annua)(ゴウダソウ)、ルピヌス・ムタビリス(Lupinus mutabilis)(パールルピナス)、ルピヌス属の種(Lupinus spp.)(ルピナス)、マカダミア属の種(Macadamia spp.)、マンギフェラ・インディカ(Mangifera indica)(マンゴー)、マニホット・エスクレンタ(Manihot esculenta)(キャッサバ)、ウマゴヤシ属の種(Medicago spp.)(ムラサキウマゴヤシ)、ウマゴヤシ属の種、メラレウカ属の種(Melaleuca spp.)(ティーツリー)、メラレウカ・ウンシナタ(Melaleuca uncinata)(ブルームブッシュ)、メンサ・タスマンニア(Mentha tasmannia)、メンサ・スピカタ(Mentha spicata)(スペアミント)、メンサ×ピペリタ(Mentha X piperita)(ペパーミント)、ツルレイシ(Momordica charantia)(ビターメロン)、ムサ属の種(Musa spp.)(バナナ)、ミルキアリア・カウリフロラ(Myrciaria cauliflora)(ジャボチカバ)、ミロタムヌス・フラベリフォリア(Myrothamnus flabellifolia)、ネフェリウム・ラパセウム(Nephelium lappaceum)(ランブータン)、ネリネ属の種(Nerine spp.)、オキムム・バジリクム(Ocimum basilicum)(バジル)、オエナンセ・ジャバニカ(Oenanthe javanica)(ウォータードロップウワート)、オエノセラ・ビエニス(Oenothera biennis)(マツヨイグサ)、オリーブノキ(Olea europaea)(オリーブ)、オレアリア属の種(Olearia sp.)、オリガヌム属の種(Origanum spp.)(マジョラム、オレガノ)、オリザ属の種(Oryza spp.)(イネ)、オキザリス・ツベローサ(Oxalis tuberosa)(オカリナ)、オゾタムヌス属の種(Ozothamnus spp.)(ライスフラワー)、パキルリズス・アヒパ(Pachyrrhizus ahipa)(クズイモ)、パナクス属の種(Panax spp.)(ヤクヨウニンジン)、キビ(コモンミレット)、ケシ属の種(Papaver spp.)(ポピー)、パルセニウム・アルゲンタツム(Parthenium argentatum)(グアユールゴムノキ)、パッシフロラ属の種(Passiflora sp.)、キリ(プリンセスツリー)、ペラルゴニュウム・グラベオレンス(Pelargonium graveolens)(ニオイテンジクアオイ)、ペラルゴニュウム属の種(Pelargonium spp.)、ペニセツム・アメリカヌム(Pennisetum americanum)(ブルラッシュまたはパールミレット)、ペルソニア属の種(Persoonia spp.)、ペトロセリヌム・クリスプム(Petroselinum crispum)(パセリ)、ファセリア・タナセティフォリア(Phacelia tanacetifolia)(ヨモギギク)、ファラリス・カナリエンシス(Phalaris canariensis)(クサヨシ)、ファラリス属の種(Phalaris sp.)、ファセオルス・コキネウス(Phaseolus coccineus)(スカーレットランナービーン)、アオイマメ(ライマメ)、ファセオルス属の種(Phaseolus spp.)、インゲンマメ(キュリナリービーン)、インゲンマメ(ネイビービーン)、インゲンマメ(レッドキドニービーン)、エンドウ(フィールドピー)、プランタゴ・オバタ(Plantago ovata)(アメリカオオバコ)、ポリゴヌム・ミヌス(Polygonum minus)、ポリゴヌム・オドラツム(Polygonum odoratum)、ウメ(ジャパニーズアプリコット)、バンジロウ(グアバ)、プソフォカルプス・テトラゴノロブス(Psophocarpus tetragonolobus)(シカクマメ)、ナシ属の種(Pyrus spp.)(ナシ)、ラファヌス・サトゥルス(Raphanus satulus)(ロングホワイトラディッシュまたはダイコン)、ルアゴディア属の種(Rhagodia spp.)(ソルトブッシュ)、クロスグリ(クロフサスグリ)、トウゴマ(ヒマ)、マンネンロウ(ローズマリー)、ルンギア・クロッシ(Rungia klossii)(ランジア)、サトウキビ(サトウキビ)、サルビア(セージ)、サルビア・スクラレア(Salvia sclarea)(クラリーセージ)、アキノタムラソウ属の種(Salvia sp.)、サンダーソニア属の種(Sandersonia sp.)、サンタルム・アクミナツム(Santalum acuminatum)(スイートクアンドング)、サンタルム属の種(Santalum spp.)(ビャクダン)、スクレロカリア・カフェラ(Sclerocarya caffra)(マルラ)、スクテラリア・ガレリクラタ(Scutellaria galericulata)(スカルキャップ)、ライムギ(ライムギ)、ゴマ(ゴマ)、アワ(フォックステールミレット)、シモンドシア属の種(Simmondsia spp.)(ホホバ)、ナス属の種(Solanum spp.)、ソルグム・アルムム(Sorghum almum)(モロコシ)、カッコウソウ(Stachys betonica)(ウッドベトニー)、ステナンセムム・スコルテケニイ((Stenanthemum scortechenii)、ストリクノス・コクロイデス(Strychnos cocculoides)(モンキーオレンジ)、スタイロサンテス属の種(Stylosanthes spp.)(スタイロ)、シジギウム属の種(Syzygium spp.)、タスマンニア・ランセオラタ(Tasmannia lanceolata)(マウンテンペッパー)、テルミナリア・カルンバシイ(Terminalia karnbachii)、カカオ(カカオ)、タチジャコウソウ(タイム)、トゥーナ・オーストラリス(Toona australis)(レッ
ドシーダー)、トリフォリウム属の種(Trifoliium spp.)(クローバー)、トリフォリウム・アレクサンドナム(Trifolium alexandrinum)(エジプトクローバー)、トリフォリウム・レスピナツム(Trifolium resupinatum)(ペルシャクローバー)、コムギ属の種(Triticum spp.)、トリチクム・タウスシイ(Triricum tauschii)、チロセマ・エスクレンツム(Tyrosema esculentum)(モラマビーン)、カノコソウ属の種(Valeriana sp.)(カノコソウ)、ベノニア属の種(Venonia spp.)、ベチバー(ベチベルソウ)、ビシア・ベングアレンシス(Vicia benghalensis)(パープルベッチ)、ソラマメ(ファバビーン)、ビシア・ナルボネンシス(Vicia narbonensis)(ナーボンビーン)、ビシア・サティバ(Vicia sativa)、ビシア属の種(Vicia spp.)、ビグナ・アコニティフォリア(Vigna aconitifolia)(モスビーン)、ビグナ・アングラリス(Vigna angularis)(アズキマメ)、ビグナ・ムンゴ(Vigna mungo)(ブラックグラム)、ビグナ・ラディアタ(Vigna radiata)(マングビーン)、ビグナ属の種(Vigna spp.)、ビグナ・ウンギクラタ(Vigna unguiculata)(ササゲ)、ブドウ属の種(Vitis spp.)(ブドウ)、ボアンドゼイア・スブテラネア(Voandzeia subterranea)(バンバラグラウンドナット)、トリティコセカレ(Triticosecale)(トリチカレ)、トウモロコシ(二色スイートコーン)、トウモロコシ(トウモロコシ)、トウモロコシ(スイートコーン)、トウモロコシの亜種メキシカナ(mexicana)(テオシント)、ジエリア属の種(Zieria spp.)、ショウガ(ジンジャー)、ショウガ属の種(Zizania spp.)(野生イネ)、ナツメ(Ziziphus jujuba)(一般ナツメ)。本発明の実施のために所望される作物には以下が含まれる:タバコ(タバコ)ならびに、例えば、パイナップル(パイナップル)、サトウキビ属の種(サトウキビ)、ムサ属の種(バナナ)、トマト(トマト)およびジャガイモ(ジャガイモ)のような園芸学的作物種。
【００６５】
本発明の合成構築物は、関心対象の生物、または1つもしくはそれ以上のその一部(例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、腎臓、膵臓、生殖器官(例えば精巣、卵巣、および乳房など)、眼、肝臓、心臓、血管細胞、根、葉、花卉、茎、または成長点)、またはその生物の器官に直接的に導入され得る。または、この合成構築物は、生物の前駆細胞に導入され、次いでこの前駆細胞が、関心対象の生物を産生するために十分な時間および条件下で増殖または培養され、それによって合成構築物が、その生物の1つまたはそれ以上の細胞型に含まれる。適切な前駆細胞には、幹細胞(例えば胚性幹細胞)、多能性免疫細胞、成長点細胞、および胚性カルスが含まれるがこれらに限定されない。特定の態様において、この合成構築物は、特定の投与経路(例えば、哺乳動物については、経口、非経口(例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳室内、間接内)、粘膜(例えば、鼻内、肺内、経口、口腔、舌下、直腸、膣内)、皮膚(局所的、皮下、経皮);植物については、花卉、成長点、根、葉、または茎への投与)を使用して、関心対象の生物に導入される。当業者は、投与の経路が、関心対象の生物の選択および追求される表現型に依存して異なることを認識している。望ましくは、合成構築物は、同じかまたは対応する部位に導入される。他の態様において、合成構築物は、関心対象の生物の細胞(例えば、自系細胞)に、または関心対象の生物と適合可能な細胞(例えば、同系細胞または同種異系細胞)に導入され、そのように産生された遺伝子改変細胞が、選択された部位で関心対象の生物に、またはその生物の一部に導入される。
【００６６】
本発明の合成構築物は、任意の適切な方法を使用して関心対象の生物またはその一部に導入でき、利用される方法の種類は、意図される関心対象の細胞型、部分、および/または生物に依存して異なる。例えば、細胞に核酸分子を送達するための方法の4つの一般的なクラスが記載されている:(1)リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール(PEG)-媒介沈殿およびリポフェクションのような化学的方法;(2)マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、加速方法および真空浸透のような物理的方法;(3)細菌ベクターおよびウイルスベクター媒介形質転換のようなベクターに基づく方法;ならびに(4)レセプター媒介。これらのクラスおよび他のクラスに当てはまる形質転換技術は当業者に周知であり、新規な技術も継続的に公知になりつつある。形質転換技術の特定の選択は、特定の種を形質転換するその効率によって、ならびに特定の選択の方法論を用いて本発明を実施する個人の経験および好みによって決定される。本発明の合成構築物を細胞に導入するための形質転換系の特定の選択は、それが受容可能なレベルの核酸移入を達成するならば必須ではなく、または本発明の制限ではないことが当業者に明らかである。従って、この合成構築物は、任意の数の経路(ウイルス感染、ファージ感染、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または小胞(vesicle)の融合、リポフェクション、アグロバクテリウム・ツメファシエンスもしくはA. リゾゲネス(A. rhizogenes)による感染、またはプロトプラスト融合を含む)によって組織または宿主細胞に導入される。ジェット注入もまた、筋肉内投与のために使用され得る(例えばFurthら、1992、Anal Biochem 205:365-368によって記載される)。この合成構築物は、微粒子発射物にコートを施してもよく、そして粒子ボンバードメント装置、すなわち「遺伝子銃」(例えば、Tangら、1992、Nature 356:152-154を参照されたい)によって宿主細胞または組織に送達される。または、この合成構築物は、宿主生物に直接的に摂食されてもよく、もしくは注入されてもよく、または細胞に導入されてもよく(すなわち、細胞内に)、または生物の腔、間質腔、循環に細胞外に導入されても、経口的に導入されてもよい。経口導入のための方法には、生物体の食物と合成構築物との直接的混合が含まれる。特定の態様において、流体力学的な核酸投与プロトコールが利用される(例えば以下を参照されたい:Changら、2001、J. Virol. 75:3469-3473;Liuら、1999、Gene Ther. 6:1258-1266;Wolffら、1990、Science 247:1465-1468;Zhangら、1999、Hum. Gene Ther. 10:1735-1737;およびZhangら、1999、Gene Ther. 7:1344-1349)。核酸送達の他の方法には、リポソーム媒介移入、裸のDNAの送達(直接的注入)およびレセプター媒介移入(リガンド-DNA複合体)が含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
本発明に従って、個々の合成構築物が試験生物またはこのような生物の試験部分に別々に導入され、この生物は、好ましくは、関心対象の生物と同じ種の生物、または関心対象の生物に関連する生物から選択される。関連する生物は、一般的に、同じ門、好ましくは同じ亜門内の種、より好ましくは上綱内の種、なおより好ましくは同じ綱内の種、なおより好ましくは同じ目内の種、およびさらになおより好ましくは同じ属内の種である。例えば、関心対象の動物がヒトである場合、関連する種は、ヒトと同じ綱に属するマウス、ウシ、イヌ、もしくはネコから、またはヒトと同じ目に属するチンパンジーから適切に選択される。または、関心対象の生物がバナナである場合、関連する生物は、すべて非イネ科単子葉植物であり、かつ園芸学的および植物学的類縁体を形成する、タロ、ジンジャー、タマネギ、ニンニク、パイナップル、アナナス、ヤシ、ラン、ユリ、アイリスなどから選択され得る。
【００６８】
試験生物またはその一部への合成構築物の導入後、それらの表現型の質は適切なアッセイ法によって決定され、次いで同義コドンの相対的な表現型優先度を決定するために比較される。その質は、適切に、表現型の強さ、強度、もしくは等級の測定値であり、または2つ以上の所望の表現型形質の相対的な強さ、強度、もしくは等級である。
【００６９】
選択されたレポータータンパク質の産生によって付与される種々の表現型についてのアッセイ法は当業者に公知である。例えば、免疫は、外来性のまたは疾患特異的な抗原(例えば、癌抗原)に応答する動物の能力の増加を検出する任意の適切な方法によってアッセイされ得る。すなわち、このような抗原を攻撃するようにプライムされたこれらの細胞は、これらの抗原を検出および破壊するために数、活性、および能力が増加している。免疫応答の強度は、以下を含む標準的な試験によって測定される:当技術分野において公知の手段による末梢血リンパ球の直接測定;ナチュラルキラー細胞細胞傷害性アッセイ(例えば、Provincialiら(1992, J. Immunol. Meth. 155:19-24)を参照されたい)、細胞増殖アッセイ(例えば、VollenweiderおよびGroseurth(1992, J. Immunol. Meth. 149:133-135)を参照されたい)、免疫細胞およびサブセットのイムノアッセイ(例えば、Loefflerら(1992, Cytom. 13:169-174);Rivoltiniら(1992, Can. Immunol. Immunother. 34:241-251)を参照されたい);または細胞媒介免疫の皮膚試験(例えば、Changら(1993, Cancer Res. 53:1043-1050)を参照されたい)。増強された免疫応答はまた、身体的な徴候(例えば、発熱および炎症、ならびに全身性および局所的感染の治癒、および疾患の徴候の減少、すなわち、腫瘍サイズの減少、疾患の徴候または状態(以下を含むがこれらに制限されない、ハンセン病、結核、マラリア、ナフサ潰瘍、疱疹性のおよび乳頭腫性いぼ、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症(artherosclerosis)、AIDSの付随物(例えばカポジ肉腫、気管支感染など))の緩和)によって示される。このような身体的な徴候はまた、生物によって示される表現型または表現型のクラスの質を検出または規定するために使用され得る。または、除草剤耐性が、除草剤耐性タンパク質遺伝子(例えば、グリフォセート耐性EPSPシンターゼのようなグリフォセート耐性タンパク質遺伝子)を発現する試験生物(例えば、ワタ植物などの植物)を、除草剤(例えば、グフォセート)で処理すること、およびその植物によって示される除草剤耐性の効力を決定することによってアッセイされ得る。例えば、ワタにおいて除草剤耐性を付与するための合成構築物の効力を決定する場合、莢(boll)を保持している総計が効力の尺度であり、所望の形質である。
【００７０】
試験生物によって、または試験部分によって示される選択された表現型の質は、次いで、選択された表現型を付与するために、生物またはその一部によって使用される際の優先度に従って、合成構築物中でタンデムに反復されている、特定のアミノ酸をコードする個々のコドンのランク付けされた順番を提供するために比較される。当業者は、それによって、その発現が関心対象の生物に選択された表現型を伝達するポリペプチド中の各アミノ酸についての「コドン優先度表」を決定することができる。次いで、コドン優先度表中の同義コドンの比較が、選択された表現型の質を調節するための合成ヌクレオチドの調整用にコドンを同定する目的で使用され得る。
【００７１】
3. 同義コドンおよび第1のコドンの選択
本発明に従って、表現型関連ポリペプチドが関心対象の生物またはその部分においてそこから産生可能である合成ポリヌクレオチドを構築するための基礎として使用され得る、関心対象の生物または関連する生物またはその試験部分における同義コドンについて表現型優先度の比較が決定され得る。合成ポリヌクレオチドは、生物またはその一部における合成ポリヌクレオチドの発現がその生物またはその一部に選択された表現型を付与するが、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドによって付与される表現型とは異なる質であるように構築される。本発明の方法は、同義コドンで置換するために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する段階を含み、ここで、この同義コドンは、セクション2において決定されたように、関心対象の生物または関連する生物またはその一部における表現型優先度の比較において、それが第1のコドンとは異なる表現型優先度を示すということに基づいて選択される。次いで、この第1のコドンは合成ポリヌクレオチドを構築するために同義コドンで置換される。
【００７２】
このようにして、本発明に従い、親のポリヌクレオチドは、改変されたポリヌクレオチド(合成ヌクレオチド)によって付与される選択された表現型の質が、親のポリヌクレオチドからのものよりも高いように、同義コドンを用いて改変することができる。一般的に、合成ポリヌクレオチドによって付与される表現型の質と、親のポリヌクレオチドによって付与される表現の質のそれぞれの間の違いは、同義コドンによって置換される第1のコドンの数、および関心対象の生物またはその一部における第1のコドンと同義コドンとの間の表現型優先度の違いに依存する。言い換えれば、このような置換がより少なければ、および/または同義コドンと第1のコドンの間の表現型優先度の違いがより小さければ、合成ポリヌクレオチドと親のポリヌクレオチドの間の表現型の質においてより小さな違いが存在する。逆に、このような置換がより大きければ、および/または同義コドンと第1のコドンの間の表現型優先度の違いがより大きければ、合成ポリヌクレオチドと親のポリヌクレオチドの間の表現型の質においてより大きな違いが存在する。
【００７３】
1つの態様において、本発明は、表現型関連ポリペプチドをコードし、かつ関心対象の生物またはその一部によって示される選択された表現型の、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドによって付与される質よりも、高い質を付与する合成ポリヌクレオチドを構築する方法を意図する。この態様において、親のポリヌクレオチドの第1のコドンは同義コドンとの置換のために選択され、ここで、この同義コドンは、関心対象の生物または関連する生物またはその一部において、それが表現型優先度の比較において、第1のコドンよりも高い表現型優先度を示すことに基づいて選択される。
【００７４】
本発明に従って、選択された表現型のより高い質が、第1のコドンよりも高い表現型優先度を有する同義コドンを選択することによって達成され得る。一般的に、より高い表現型優先度は、選択された表現型のより高い質と相関する。従って、このような相関の非限定的な例において、同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、生物またはその一部によって示される表現型の質が、第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、生物またはその一部によって示される表現型の質よりも少なくとも約5%高い場合に、同義コドンは第1のコドンよりも少なくとも約5%高い表現型優先度を有すると見なされる。同義コドンを選択するときに、関心対象の生物において、第1のコドンの表現型優先度の少なくとも約105%、適切には少なくとも約110%、好ましくは少なくとも約120%、より好ましくは少なくとも約130%、なおより好ましくは少なくとも約140%、なおより好ましくは少なくとも約150%、なおより好ましくは少なくとも約160%、なおより好ましくは少なくとも約170%、なおより好ましくは少なくとも約180%、なおより好ましくは少なくとも約190%、なおより好ましくは少なくとも約200%、なおより好ましくは少なくとも約250%、なおより好ましくは少なくとも約300%、なおより好ましくは少なくとも約350%、なおより好ましくは少なくとも約400%、なおより好ましくは少なくとも約450%、なおより好ましくは少なくとも約500%、なおより好ましくは少なくとも約550%、なおより好ましくは少なくとも約600%、なおより好ましくは少なくとも約650%、およびさらになおより好ましくは約700%である表現型優先度を有することが好ましい。類似の表現型優先度を有する2つ以上の同義コドンの場合、これらのコドンのいずれか1つが第1のコドンを置換するために使用され得ることが理解される。一般的に、親のヌクレオチドが低い表現型優先度コドンおよび中程度の表現型優先度コドンの選択を有する場合、第1の例において、低い表現型優先度コドンのいくつか、またはより好ましくはすべてを、中程度、または好ましくは高い表現型優先度を有する同義コドンで置換することが好ましい。典型的には、中程度または高い表現型優先度コドンで低い表現型優先度コドンを置換すると、構築された合成ポリヌクレオチドによって付与される表現型の質の実質的な増加が生じる。しかし、選択された表現型において、最適な質を付与するために高い翻訳効率コドンで、中程度の表現型優先度コドンのいくつか、または好ましくはすべてを置換することもまた、好ましい。
【００７５】
別の態様において、本発明は、表現型関連ポリペプチドをコードし、かつ関心対象の生物またはその一部によって示される選択された表現型の、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドによって付与される質よりも、低い質を付与する合成ポリヌクレオチドを構築する方法を意図する。この態様において、親のポリヌクレオチドの第1のコドンは同義コドンとの置換のために選択され、ここで、この同義コドンは、関心対象の生物または関連する生物またはその一部において、それが表現型優先度の比較において、第1のコドンよりも低い表現型優先度を示すことに基づいて選択される。
【００７６】
本発明に従って、より低い質の選択された表現型が、第1のコドンよりも低い表現型優先度を有する同義コドンを選択することによって達成され得る。一般的に、より低い表現型優先度は、より低い質の選択された表現型と相関する。従って、このような相関の非限定的な例において、同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、生物またはその一部によって示される表現型の質が、第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、生物またはその一部によって示される表現型の質よりも少なくとも約5%低い場合に、同義コドンは第1のコドンよりも少なくとも約5%低い表現型優先度を有すると見なされる。この態様についての同義コドンを選択するときに、関心対象の生物において、第1のコドンの表現型優先度の少なくとも約95%、適切には少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約80%、なおより好ましくは少なくとも約75%、なおより好ましくは少なくとも約70%、なおより好ましくは少なくとも約65%、なおより好ましくは少なくとも約60%、なおより好ましくは少なくとも約55%、なおより好ましくは少なくとも約50%、なおより好ましくは少なくとも約45%、なおより好ましくは少なくとも約40%、なおより好ましくは少なくとも約35%、なおより好ましくは少なくとも約30%、なおより好ましくは少なくとも約25%、なおより好ましくは少なくとも約20%、なおより好ましくは少なくとも約15%、なおより好ましくは少なくとも約10%、およびさらになおより好ましくは約5%である表現型優先度を有することが好ましい。
【００７７】
関心対象の生物またはその一部において、第1のコドンよりも高いかまたは低い表現型優先度を有する同義コドンで親のポリヌクレオチドのすべてのコドンを置換することが好ましいがこれは必須ではない。例えば、より高いかまたはより低い表現型の質は部分的置換を用いてでも達成され得る。典型的には、置換段階は、親のポリヌクレオチドの第1のコドンの5%、10%、15%、20%、25%、30%、より好ましくは35%、40%、50%、60%、70%、またはそれ以上に影響を与える。より高い表現型の質を必要とする好ましい態様において、第1のコドンと同義コドンの数、およびこれらの間の表現型優先度の違いは、表現型関連ポリペプチドが、選択された生物または生物の一部において親のポリヌクレオチドによって付与される表現型の質の、少なくとも約110%、適切には少なくとも約150%、好ましくは少なくとも約200%、より好ましくは少なくとも約250%、なおより好ましくは少なくとも約300%、なおより好ましくは少なくとも約350%、なおより好ましくは少なくとも約400%、なおより好ましくは少なくとも約450%、なおより好ましくは少なくとも約500%、およびさらになおより好ましくは少なくとも約1000%である質で、その選択された生物または生物の一部に表現型を付与するために合成ポリヌクレオチドから産生されるように選択される。逆に、より低い表現型の質を必要とする好ましい態様において、第1のコドンと同義コドンの数、およびこれらの間の表現型優先度の違いは、表現型関連ポリペプチドが、選択された生物または生物の一部において親のポリヌクレオチドによって付与される表現型の質の、約90%以下、適切には約80以下%、好ましくは約70%以下、より好ましくは約60%以下、なおより好ましくは約50%以下、なおより好ましくは約40%以下、なおより好ましくは約30%以下、なおより好ましくは約20%以下、なおより好ましくは約10%以下、およびさらになおより好ましくは約5%以下である質で、その選択された生物または生物の一部に表現型を付与するために合成ポリヌクレオチドから産生されるように選択される。
【００７８】
4. 合成ポリヌクレオチドの構築
1つのコドンから別のコドンへの置換は当技術分野において公知である標準的な方法を使用して達成され得る。例えば、親のポリヌクレオチドのコドン改変は、いくつかの公知の変異誘発技術を使用してもたらすことができ、これには例えば、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いる変異誘発、および領域特異的変異誘発が含まれる。例示的なインビトロ変異誘発技術は、例えば、米国特許第4,184,917号、同第4,321,365号、および同第4,351,901号、またはAusubelら(「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」, John Wiley & Sons, Inc. 1997)およびSambrookら(「MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL」, Cold Spring Harbor Press, 1989)の関連するセクションにおいて記載されている。インビトロ変異誘発の代わりに、合成ポリヌクレオチドが、例えば、米国特許第4,293,652号において記載されているような容易に利用可能な機構を使用してデノボ合成され得る。しかし、本発明は、合成ポリヌクレオチドを構築するための任意の1つの特定の技術に依存せず、かつそれに指向されないことに注意するべきである。
【００７９】
親のポリヌクレオチドは、適切には天然の遺伝子である。しかし、親のポリヌクレオチドが、天然に存在しないが組換え技術を使用して操作されたものであることが可能である。親のポリヌクレオチドは、任意の適切な供給源から(例えば、哺乳動物または他の動物、および病原性生物(例えば酵母、細菌、原生生物、およびウイルスなど)を含むがこれらに限定されない真核生物または原核生物から)入手可能である。
【００８０】
本発明はまた、表現型関連ポリペプチドの1つまたはそれ以上の所望の部分をコードする合成ポリヌクレオチドを意図する。この点に関して、合成ポリヌクレオチドは表現型関連ポリペプチドの少なくとも1つの機能的ドメインをコードすることが好ましく、これは、そのポリペプチドの少なくとも約10、より好ましくは少なくとも約20、なおより好ましくは少なくとも約50、なおより好ましくは少なくとも約100、なおより好ましくは少なくとも約150、およびさらになおより好ましくは少なくとも約500の連続するアミノ酸残基である。
【００８１】
本発明はさらに、調節ポリヌクレオチドに機能的に連結された本発明の合成ポリヌクレオチドを含む合成構築物(または発現ベクター)を意図する。この調節ポリヌクレオチドは、適切には、転写制御配列および/または翻訳制御配列を含み、これは、関心対象の生物またはその生物の細胞における発現のために適合可能である。典型的には、転写調節制御配列および翻訳調節制御配列には以下が含まれるがこれらに限定されない:プロモーター配列、5'非コード領域、シス調節性領域(例えば転写調節タンパク質または翻訳調節タンパク質についての機能的結合部位)、上流オープンリーディングフレーム、リボソーム結合配列、転写開始部位、翻訳開始部位、ならびに/またはリーダー配列、終止コドン、翻訳終止部位、および3'非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列。当技術分野において公知であるような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターは本発明によって意図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであっても、または1つより多くのプロモーターのエレメントを合わせるハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。本発明によって意図されるプロモーター配列は、関心対象の生物に対してネイティブであっても、または代替的な供給源由来であってもよく、ここでその領域は選択された生物において機能的である。プロモーターの選択は意図される宿主に依存して異なる。例えば、植物における発現のために使用され得るプロモーターには、以下のような植物プロモーターが含まれる:構成的植物プロモーターの例には、CaMV35S植物プロモーター、CaMV19S植物プロモーター、FMV34S植物プロモーター、サトウキビバチルスバドナウイルス植物プロモーター、CsVMV植物プロモーター、シロイヌナズナACT2/ACT8アクチン植物プロモーター、シロイヌナズナユビキチンUBQ1植物プロモーター、オオムギ葉チオニンBTH6植物プロモーター、およびイネアクチン植物プロモーター、DLEC植物プロモーター、PHSβ植物プロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質植物プロモーター;ダイズ由来コングルチンγ植物プロモーター、AT2S1遺伝子植物プロモーター、シロイヌナズナ由来ACT11アクチン植物プロモーター、ブラシカ・ナプス由来napA植物プロモーターおよびジャガイモパタチン遺伝子植物プロモーターを例示に含む組織特異的植物プロモーター;ならびにエンドウrbcS遺伝子由来の光誘導性植物プロモーター、アルファルファrbcS遺伝子由来の植物プロモーター、乾燥において活性であるDRE、MYC、およびMYB植物プロモーターを例示に含む誘導性植物プロモーター;高塩濃度および浸透圧ストレスにおいて活性であるINT、INPS、prxEa、Ha、hsp17.7G4、およびRD21植物プロモーター、ならびに病原性ストレスにおいて活性であるhsr203Jおよびstr246C植物プロモーターが含まれる。または、哺乳動物における発現のために使用され得るプロモーターには、カドミウムのような重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーター、β-アクチンプロモーター、ならびにウイルスプロモーター(例えば、SV40ラージT抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)最初期(IE)プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルスプロモーター、またはHPVプロモーターが含まれ、特にHPV上流調節領域(URR)もまた使用され得る。すべての���れらのプロモーターは十分に記載されており、当技術分野において容易に利用可能である。
【００８２】
本発明の合成構築物はまた、3'非翻訳配列を含み得る。3'非翻訳配列とは、mRNAプロセシングおよび遺伝子発現をもたらすことができるポリアデニル化シグナルおよび任意の他の調節シグナルを含むDNAセグメントを含む遺伝子の部分をいう。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3'末端にポリアデニル酸トラクトの付加をもたらすことによって特徴付けられる。ポリアデニル化シグナルは、標準型5'AATAAA-3'に対する相同性の存在によって一般的に認識されているが、バリエーションが一般的でないわけではない。3'非翻訳調節DNA配列は、好ましくは、約50から1,000ヌクレオチドまでの塩基対を含み、そしてポリアデニル化シグナルおよびmRNAプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる任意の他の調節シグナルに加えて、転写および翻訳の終結配列を含み得る。
【００８３】
好ましい態様において、本発明の合成構築物は、合成構築物を含む生物またはその前駆体の選択を可能にするための選択マーカー遺伝子をさらに含む。選択遺伝子は当技術分野において周知であり、生物またはその前駆体における発現について適合可能である。
【００８４】
しかし、異種系においてタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現が現在周知であること、および本発明は、任意の特定のベクター、転写制御配列、またはその産生のための技術に指向されていない、またはそれに依存していないことが理解される。むしろ、本明細書中に記載される方法に従って調製された合成ポリヌクレオチドは、任意の適切な様式で、任意の適切な合成構築物またはベクターと組み合わせて、関心対象の生物またはその前駆体もしくは前駆細胞に導入することができ、そして合成ポリヌクレオチドは、任意の従来的な様式で公知のプロモーターを用いて発現され得る。
【００８５】
ある態様において、本発明の合成構築物は、ウイルスベクター(例えば、シミアンウイルス40(SV40)またはウシパピローマウイルス(BPV))の型であり、これは、染色体外エレメントとして複製する能力を有する(Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman編、1982;Sarverら、1981, Mol. Cell. Biol. 1:486)。ウイルスベクターには、レトロウイルス(レンチウイルス)、アデノ関連ウイルス(例えば、Okada、1996, Gene Ther. 3:957-964;Muzyczka、1994, J. Clin. Invest. 94:1351;AAVベクターを記載する米国特許第6,156,303号;同第6,143,548号;同第5,952,221号を参照されたい;米国特許第6,004,799号;同第5,833,993号もまた参照されたい)、アデノウイルス(例えば、米国特許第6,140,087号;同第6,136,594号;同第6,133,028号;同第6,120,764号を参照されたい)、レオウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルスのゲノムなどが含まれ、細胞におけるポリヌクレオチドまたはトランスジーンの導入およびその発現を指向するために改変される。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(例えば、米国特許第6,132,731号を参照されたい)、テナガザル白血病ウイルス(例えば、米国特許第6,033,905号を参照されたい)、シミアン免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(例えば、米国特許第5,985,641号を参照されたい)に基づくもの、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。
【００８６】
ベクターにはまた、インビボで動物細胞(例えば、幹細胞)に遺伝子を効率的に送達するものが含まれる(例えば、米国特許第5,821,235号および同第5,786,340号;Croyleら、1998, Gene Ther. 5:645;Croyleら、1998, Pharm. Res. 15:1348;Croyleら、1998, Hum. Gene Ther. 9:561;Foremanら、1998, Hum. Gene Ther. 9:1313;Wirtzら、1999, Gut 44:800を参照されたい)。インビボ送達のために適切なアデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターは、例えば、米国特許第5,700,470号、同第5,731,172号および同第5,604,090号において記載されている。インビボ送達のために適切なさらなるベクターには、単純ヘルペスウイルスベクター(例えば、米国特許第5,501,979号を参照されたい)、レトロウイルスベクター(例えば、米国特許第5,624,820号、同第5,693,508号、および同第5,674,703号;ならびにWO92/05266およびWO92/14829を参照されたい)、ウシパピローマウイルス(BPV)ベクター(例えば、米国特許第5,719,054号を参照されたい)、CMVに基づくベクター(例えば、米国特許第5,561,063号を参照されたい)、ならびにパルボウイルスベクター、ロタウイルスベクター、およびノーウォークウイルスベクターが含まれる。レンチウイルスベクターは、分裂している細胞および分裂していない細胞に感染するために有用である(例えば、米国特許第6,013,516号を参照されたい)。
【００８７】
昆虫細胞発現のためのベクターは、バキュロウイルスベクターおよび他の核多核体病ウイルス、例えば、カイコ核多核体病ウイルスベクターの組換えバリエーションを一般的に使用する(例えば、Choi, 2000, Arch. Virol. 145:171-177を参照されたい)。例えば、鱗翅目細胞および鞘翅目細胞を使用して、バキュロウイルスによって運ばれる外来性遺伝子の発現を促進するためにバキュロウイルスを複製する。例えば、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞は、異種(例えば、ヒト)コード配列を有する組換えオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(AcNPV)で感染させる(例えば、Lee, 2000, J. Virol. 74:11873-11880;Wu, 2000, J. Biotechnol. 80:75-83を参照されたい)。例えば、米国特許第6,143,565号を参照されたい。この文献は、鱗翅目および鞘翅目の昆虫細胞株のゲノムに核酸を安定に組み込むために、寄生性ハチ、グリプタパンテレス・インディエンシス(Glyptapanteles indienis)のポリへドナウイルスの使用を記載する。例えば、米国特許第6,130,074号;同第5,858,353号;同第5,004,687号もまた参照されたい。
【００８８】
植物においてタンパク質を発現することができる発現ベクターは当技術分野で周知であり、これには、例えば、アグロバクテリウム属の種からのベクター、ジャガイモウイルスX(例えば、Angell, 1997, EMBO J. 16:3675-3684を参照されたい)、タバコモザイクウイルス(例えば、Casper, 1996, Gene 173:69-73を参照されたい)、トマトブッシースタントウイルス(例えば、Hillman, 1989, Virology 169:42-50を参照されたい)、トマトエッチウイルス(例えば、Dolja, 1997, Virology 234:243-252を参照されたい)、ビーンゴールデンモザイクウイルス(例えば、Morinaga, 1993, Microbiol Immunol. 37:471-476を参照されたい)、カリフラワーモザイクウイルス(例えば、Cecchini, 1997, Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101を参照されたい)、トウモロコシAc/Ds転移性エレメント(例えば、Rubin, 1997, Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302;Kunze, 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194を参照されたい)、およびトウモロコシサプレッサー-ミューテイター(Spm)転移性エレメント(例えば、Schlappi, 1996, Plant Mol. Biol. 32:717-752を参照されたい);ならびにこれらの誘導体が含まれる。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の合成構築物を含む生物を意図し、または、本発明の方法によって産生される生物の一部、前駆体、細胞、もしくは組織を意図する。
【００９０】
本発明を容易に理解し、かつ実用的な効果を実現させるために、ここに特定の好ましい態様を以下の非限定的な実施例として記載する。
【００９１】
実施例1
抗原に対する哺乳動物の抗体応答を増強するための、抗原コードポリヌクレオチドのコドン改変
試薬:
単一のアミノ酸をコードする同義コドンの各セットについて、2〜6個の遺伝子構築物を1セットとして構築する。各構築物は、1つのアミノ酸を6コピー含むリーダー配列を伴った緑色蛍光タンパク質をコードする。セット全体にわたって、セットの各メンバーは、そのアミノ酸をコードすることのできる同義コドンのトリプレット(XXX)を各6コピー、リーダー配列に含む以外は同一である。
【００９２】
これらの遺伝子構築物の一般式は以下の通りである:
真核生物プロモーター-ATG-(XXX)6-GFP遺伝子-ポリアデニル化シグナル
【００９３】
GFP遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号:1および配列番号:2に記載される。異なるリーダー配列の核酸配列および推定アミノ酸配列は配列番号:3から配列番号:120に記載される。
【００９４】
遺伝子構築物のこのようなセット20個をスーパーセットとして構築する。これにはすべての可能な天然に存在するアミノ酸がコードされ、アミノ酸に対する冗長なコードトリプレットが存在するため、全体で59個の遺伝子構築物が含まれる。
【００９５】
方法:
8〜10匹の6週齢Balb/c雌性マウスの群を、微粒子銃送達系(例えば、Biorad遺伝子銃またはPowderject送達系)を使用して、遺伝子構築物59個のうちの1つを用いて、3週間間隔で1から3回、経皮的に免疫する。プラスミド(1〜2μg)を、製造業者の指示書に従って金ビーズ(Biorad)または糖(Powderject)材料にコートする。ビーズを、マウスの剃毛した腹部皮膚に送達させる。Powderject系を表皮基底に対する送達のために最適化する。Biorad系は、送達のために使用されるガス圧を調整することによって送達の深さを変化させる性能を有する。データを、表面、基底上皮、または真皮への送達のために最適化されたガス圧について収集する。これは、皮膚にビーズを送達し、かつ顕微鏡切片を調べて真皮および上皮における種々の深さでビーズのパーセンテージを点数付けすることによって、特定の遺伝子銃およびビーズについて較正される。
【００９６】
血清試料を、免疫後3週および6週目に眼窩後方の出血によって採取し、ならびに免疫後9週目に末端心臓穿刺によって採取し、各血清についてELISAを用いてGFPに対する抗体の力価を決定する。ELISAについては、GFP(Sigma)をプレートにコートし、血清の反応性を標準的なプロトコールに従って決定する(例えば、Walshら、2000, J Gen Virol. 709-718を参照されたい)。
【００９７】
結果および解釈:
所定のアミノ酸をコードする構築物の各セットによって誘導されるGPFに対する平均抗体力価をランク付けし、微粒子銃送達系によって送達されるポリヌクレオチドを使用した抗体産生について最適なコドン(逆に言えば抗体産生を回避するための最適なコドン)を決定する。
【００９８】
従って、最適なコドンのリストが作成される。試験された皮膚への送達系によって送達され、かつ最大の抗体力価を誘導するように設計されたポリヌクレオチドワクチンについての改善された遺伝子構築物は、関心対象の遺伝子(例えば、インフルエンザヘマグルチニン)における最適ではないコドンが、最大の抗体力価を引き出すために最適であるものに置換されているものである。
【００９９】
実施例2
哺乳動物において抗原に対する寛容性を付与するための、抗原コードポリヌクレオチドのコドン改変
試薬:
単一のアミノ酸をコードする同義コドンの各セットについて、2〜6個の遺伝子構築物を1セットとして構築する。各構築物は、1つのアミノ酸を6コピー含むリーダー配列を伴ったグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)をコードする。セット全体にわたって、セットの各メンバーは、そのアミノ酸をコードすることのできる同義コドンのトリプレット(XXX)を各6コピー、リーダー配列に含む以外は同一である。
【０１００】
このような遺伝子構築物の一般式は以下の通りである:
真核生物プロモーター-ATG-(XXX)6-GAD遺伝子-ポリアデニル化シグナル
【０１０１】
GAD遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号:121および配列番号:122に記載される。
【０１０２】
遺伝子構築物のこのようなセット20個をスーパーセットとして構築する。これにはすべての可能な天然に存在するアミノ酸がコードされ、アミノ酸に対する冗長なコードトリプレットが存在するため、全体で59個の遺伝子構築物が含まれる。
【０１０３】
方法:
4週齢NOD(非肥満性糖尿病)雌性マウスの群を、微粒子銃送達系(例えば、Biorad遺伝子銃またはPowderject送達系)を使用して、遺伝子構築物59個のうちの1つを用いて、3週間間隔で1から3回、経皮的に免疫する。プラスミド(1〜2μg)を、製造業者の指示書に従って金ビーズ(Biorad)または糖(Powderject)材料にコートする。ビーズを、マウスの剃毛した腹部皮膚に送達させる。Powderject系を表皮基底に対する送達のために最適化する。Biorad系は、送達のために使用されるガス圧を調整することによって送達の深さを変化させる性能を有する。データを、表面、基底上皮、または真皮への送達のために最適化されたガス圧について収集する。これは、皮膚にビーズを送達し、かつ顕微鏡切片を調べて真皮および上皮における種々の深さでビーズのパーセンテージを点数付けすることによって、特定の遺伝子銃およびビーズについて較正される。
【０１０４】
マウスは続いて、眼窩後部の出血によって得られる毎週の血液試料において、10mM/Lを超える血糖レベルから評価されるように、糖尿病を発症する。糖尿病の発症は、糖尿病のマウス、および26週目に糖尿病でないと見なされたマウスにおいて、糖尿の試験、および糖尿マウスで決定される膵臓の組織像によって確認される。
【０１０５】
結果および解釈:
所定のアミノ酸をコードする構築物の各セットを用いて免疫されるマウスについての糖尿病の発症の平均時間をランク付けし、微粒子銃送達系によって送達されるポリヌクレオチドを使用した、病原性免疫応答の妨害のための原因となる部位における関心対象の遺伝子を発現するための最適なコドンを決定する。
【０１０６】
従って、宿主の防御的免疫(耐性)を誘導するのに最適な部位でポリヌクレオチドワクチンからのタンパク質発現を確実にするための最適なコドンのリストが作成される。試験された皮膚への送達系によって送達され、かつ最大の防御的免疫耐性を誘導するように設計された、ポリヌクレオチドワクチンについての改善された遺伝子構築物は、関心対象の遺伝子(例えば、ヒト糖尿病を制御する目的でのインスリン)における最適ではないコドンが、最適であるものに置換されているものである。
【０１０７】
実施例3
種子のタンパク質産生を維持しながら、トランスジェニック植物の除草剤に対する耐性を最適化するためのコドン改変
試薬:
単一のアミノ酸をコードする同義コドンの各セットについて、2〜6個の遺伝子構築物を1セットとして構築する。各構築物は、1つのアミノ酸を6コピー含むリーダー配列を伴ったフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ(bar遺伝子によってコードされる)をコードする。セット全体にわたって、セットの各メンバーは、そのアミノ酸をコードすることのできる同義コドンのトリプレット(XXX)を各6コピー、リーダー配列に含む以外は同一である。
【０１０８】
このような遺伝子構築物の一般式は以下の通りである:
植物プロモーター-ATG-(XXX)6-BAR遺伝子-植物ポリアデニル化シグナル
【０１０９】
BAR遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号:123および配列番号:124に記載される。
【０１１０】
遺伝子構築物のこのようなセット20個をスーパーセットとして構築する。これにはすべての可能な天然に存在するアミノ酸がコードされ、全体で59個の遺伝子構築物が含まれる。
【０１１１】
方法:
稔性トランスジェニックコムギ(Triticum aestivum)の独立株の産生のためのWeeksらの方法(1993, Plant Physiol 102(4):1077-1084)。手短に述べると、未成熟胚由来のカルス(0.5〜1mm長)に、マーカー遺伝子として、フォスフィノスリシン耐性をコードするbar遺伝子およびβ-グルクロニダーゼ(GUS)をコードする遺伝子(各々トウモロコシユビキチンプロモーターの制御下にある)を含むDNAでコートした微粒子発射物を射出する。この射出を胚切除の5日後、カルス増殖の開始直後に実行する。1または3mg/Lのビアラフォスの存在下での未発育植物の発根する能力は、形質転換植物を同定するために使用される信頼できる選択判断基準である。安定な形質転換は、マーカー遺伝子発現アッセイ法および得られる植物の高分子量染色体DNAにおけるbar配列の存在によって確認される。平均して、T0植物の射出および開花のために胚切除の間に168日間が経過する。T1世代への耐性表現型およびbar DNAの両方の伝達が、生殖系列形質転換が起こったことを立証した。
【０１１２】
除草剤耐性をSinghおよびWrightの方法(2002, Lett. Appl. Microbiol. 35(1):12-16)を使用して測定し、種子中のタンパク質濃度をTurnerらの方法(1990, Plant Mol. Biol. 14(5):793-803)によって測定する。
【０１１３】
結果および解釈:
各アミノ酸リーダー配列について、植物を、バスタ・ヘルビシデ(Basta Herbicide)に対するそれらの耐性およびそれらの種子のタンパク質含量に従ってランク付けする。各セットからの最適コドンは、植物に十分な除草剤耐性および最大の種子タンパク質収量を与えるものである。
【０１１４】
このようにして、最適コドンのリストを作成し、トランスジェニック穀物植物に除草剤耐性を伝達する遺伝子についての改善された遺伝子構築物は、最適ではない関心対象の遺伝子(2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D))、2-メチル-4-クロロフェノキシ酢酸、および3-クロロ安息香酸の分解のための遺伝子(例えば、Kleinsteuberら、2001, Extremophiles. 5(6):375-384を参照されたい)を有する広範な宿主範囲のプラスミドpJP4におけるもの)におけるコドンが(大部分)最適なコドンによって置換されているものである。
【０１１５】
実施例4
周囲の正常皮膚に対する損傷を伴わずに皮膚腫瘍を制御するための、増殖阻害遺伝子の選択性を最適化するためのコドン改変
試薬:
単一のアミノ酸をコードする同義コドンの各セットについて、2〜6個の遺伝子構築物を1セットとして構築する。各構築物は、1つのアミノ酸を6コピー含むリーダー配列を伴ったE2F1ドミナントネガティブインヒビターをコードする。セット全体にわたって、セットの各メンバーは、そのアミノ酸をコードすることのできる同義コドンのトリプレット(XXX)を各6コピー、リーダー配列に含む以外は同一である。
【０１１６】
このような遺伝子構築物の一般式は以下の通りである:
真核生物プロモーター-ATG-(XXX)6-E2F1dn遺伝子-IRES-GFP遺伝子-ポリアデニル化シグナル
【０１１７】
E2F1ドミナントネガティブインヒビター遺伝子の核酸配列および推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号:125および配列番号:126に記載される。
【０１１８】
遺伝子構築物のこのようなセット20個をスーパーセットとして構築する。これにはすべての可能な天然に存在するアミノ酸がコードされ、アミノ酸に対する冗長なコードトリプレットが存在するため、全体で59個の遺伝子構築物が含まれる。
【０１１９】
方法:
標準的なDMBA/TPAプロモーション/誘導レジメを使用して、化学発癌剤を塗布することによってFVBマウスの皮膚に腫瘍を誘導する。腫瘍を有する雌性マウスの群に、微粒子銃送達系(例えば、Biorad遺伝子銃またはPowderject送達系)を使用して、遺伝子構築物59個のうちの1つを用いて、3週間間隔で1から3回、経皮的に免疫する。プラスミド(1〜2μg)を、製造業者の指示書に従って金ビーズ(Biorad)または糖(Powderject)材料にコートする。ビーズを、マウスの剃毛した腹部皮膚に送達させる。Powderject系を表皮基底に対する送達のために最適化する。Biorad系は、送達のために使用されるガス圧を調整することによって送達の深さを変化させる性能を有する。データを、表面、基底上皮、または真皮への送達のために最適化されたガス圧について収集する。これは、皮膚にビーズを送達し、かつ顕微鏡切片を調べて真皮および上皮における種々の深さでビーズのパーセンテージを点数付けすることによって、特定の遺伝子銃およびビーズについて較正される。
【０１２０】
処理の24時間後、腫瘍由来の皮膚および周囲の正常皮膚を切除し、および単一の細胞に脱凝集させる。高速フローサイトメトリーによってGFPの発現について分別し、GFPポジティブ細胞のクローン原性潜在能力を、各構築物について、ならびに正常組織および腫瘍組織について評価する。クローン原性潜在能力は、最小KGM倍地中で、コラーゲンコートしたプレート上で細胞をプレーティングすること、および10000インプット細胞あたりに樹立されたコロニーを計数することによって確立される。腫瘍組織から得られたコロニーに対する正常組織から得られたコロニーの比は、腫瘍組織への特定の構築物の標的化の効率の尺度である。腫瘍細胞と比較して正常皮膚細胞についてのより高いコロニー形成効率は、腫瘍に遺伝子治療を正確に送達するためのより好ましいコドンを示す。
【０１２１】
結果および解釈:
平均コロニー形成効率比(正常細胞/腫瘍細胞)をランク付けし、微粒子銃送達系によって送達されたポリヌクレオチドを使用した、正常な皮膚を保存しながら腫瘍増殖を阻害するための最適なコドンを決定する。このようにして最適コドンのリストが作成される。試験された送達系によって皮膚に送達され、および正常組織よりも腫瘍について最大の選択性を誘導するように設計された、皮膚癌を治療するための改善された遺伝子構築物は、皮膚癌治療のための関心対象の遺伝子におけるコドンが最適リストに最も類似しているものである。
【０１２２】
本明細書中で引用されるすべての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
本明細書中におけるいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本願に対する「先行技術」として利用可能であることの認可として解釈されるべきではない。
【０１２４】
本明細書全体を通して、その目的は、本発明を任意の1つの態様または特定の特徴の一群に制限することなく、本発明の好ましい態様を記載することであった。従って、当業者は、本開示に鑑みて、種々の改変および変更が、本明細書の範囲から逸脱することなく、特定の例示された態様においてなされ得ることを理解する。すべてのそのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図される。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月8日(2005.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の生物またはその一部に対して、選択された表現型を、同じポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドによって付与される表現型とは異なる質で付与するためにポリヌクレオチドが産生可能である、合成ポリヌクレオチドを構築するための方法であって、該選択された表現型は、細胞において発現しポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって細胞に付与される表現型以外の表現型である、以下の段階を含む方法:
(a)同義コドンで置換するために親のポリヌクレオチドの第1のコドンを選択する段階であって、該同義コドンは、試験生物またはその一部における表現型優先度の比較において第1のコドンとは異なる表現型優先度を示すことに基づいて選択され、そして該試験生物は関心対象の生物と同じ種の生物、および関心対象の生物に関連する生物からなる群より選択される、段階;ならびに
(b)合成ポリヌクレオチドを構築するために該第1のコドンを該同義コドンで置換する段階。
【請求項２】
試験生物またはその一部におけるコドンの表現型優先度が、以下の段階によって比較される、請求項1記載の方法:
(i)該試験生物またはその一部に個々の合成構築物を別々に導入する段階であって、該合成構築物の各々は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合したコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含み、該レポータータンパク質は、選択された表現型および選択された表現型と同じクラスの表現型からなる群より選択される対応する表現型を産生するかまたは産生することが予測される、段階;ならびに
(ii)コドンの相対的な表現型優先度を決定するために、該試験生物またはその一部によって示される表現型の質を比較する段階。
【請求項３】
レポータータンパク質が、選択された表現型を産生する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
レポータータンパク質が、選択された表現型を産生しないが選択された表現型と同じクラスの表現型を産生する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
レポータータンパク質が、病原性生物由来、癌抗原由来、自己抗原由来、移植抗原由来、増殖因子由来、ホルモン由来、および毒素由来の抗原から選択される、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
表現型が、免疫、抗原寛容性、血管形成、抗血管形成、臨床的徴候の改善、細胞死の減少または増加、細胞分化の減少または増加、細胞増殖の減少または増加、腫瘍または癌の退縮、組織または器官の増殖および修復、線維症の減少、細胞老化の阻害または逆転、細胞移動の増加または減少、生物またはその一部の異なる細胞または組織間のタンパク質の差次的な発現、外傷回復、熱傷からの回復、抗生物質耐性または抗生物質感受性、除草剤耐性または除草剤感受性、デンプンの生合成または修飾、脂肪酸生合成、疾患抵抗性または疾患耐性、昆虫耐性または昆虫抵抗性を含む悪疫耐性または悪疫抵抗性、ウイルス抵抗性またはウイルス耐性、真菌抵抗性または真菌耐性、スクロース代謝を含む代謝形質、凍結抵抗性または凍結耐性、ストレス耐性、および食物含量の改善、または収量の増加から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
表現型が免疫応答である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
免疫応答が体液性免疫応答である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
免疫応答が細胞媒介免疫応答である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
免疫応答が先天性免疫媒介応答である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
合成構築物が、同一の導入様式または類似の導入様式を使用して試験生物に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
合成構築物が、同一の部位または対応する部位で試験生物に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
関心対象の生物が哺乳動物であり、かつ合成構築物が経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、鼻内経路、口腔経路、皮下経路、経皮経路、口腔経路、または舌下経路によって導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
合成構築物が、関心対象の生物の1つまたは複数の細胞または組織型に導入される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
合成構築物が、筋肉細胞、皮膚細胞、脳細胞、肺細胞、腎細胞、膵臓細胞、生殖器の細胞、心臓細胞、血管細胞、肝細胞、眼細胞、花卉細胞、成長点細胞、根細胞、および葉細胞から選択される細胞に導入される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
合成構築物の各々のタンデムリピートが、少なくとも3コピーの対応するコドンを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
同義コドンが、第1のコドンよりも高い表現型優先度を有するように選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質が第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質よりも少なくとも約5%高い場合に、同義コドンが選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
同義コドンが、第1のコドンよりも低い表現型優先度を有するように選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
同義コドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質が第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物によって付与される表現型の質よりも少なくとも約5%低い場合に、同義コドンが選択される、請求項19記載の方法。。
【請求項２１】
関心対象の生物が単細胞生物である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
関心対象の生物が多細胞生物である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
多細胞生物が動物である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
多細胞生物が哺乳動物である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
多細胞生物が植物である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入し、該前駆細胞を、該試験生物またはその一部が産生されるのに十分な時間および条件下で増殖または培養し、それによって該合成構築物が、該生物またはその一部の1つまたは複数の細胞型に含有される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
前駆細胞が、幹細胞、多能性細胞、成長点細胞、および胚性カルスから選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
以下の段階を含む、関心対象の生物またはその一部における第1のコドンの表現型優先度を決定するための方法であって、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型は、細胞で発現しポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって細胞に付与される表現型以外の表現型である、方法:
(a)合成構築物を試験生物またはその一部に導入する段階であって、該試験生物は、関心対象の生物と同じ種の生物および関心対象の生物に関連する生物からなる群より選択され、該合成構築物は、レポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合した第1のコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含み、該レポータータンパク質は、選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測される、段階;ならびに
(b)該生物またはその一部によって示される対応する表現型の質を決定する段階。
【請求項２９】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法:
(i)第1のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、試験生物またはその一部によって示される対応する表現型の質と、(ii)第2のコドンのタンデムリピートを含む合成構築物が提供された、試験生物またはその一部によって示される対応する表現型の質とを比較する段階であって、該第2のコドンは該第1のコドンと同じアミノ酸をコードし、それによって該試験生物またはその一部における該第2のコドンの表現型優先度に対して該第1のコドンの表現型優先度を決定する、段階。
【請求項３０】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法:
(1)合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入する段階;および
(2)合成構築物を含有する該試験生物またはその一部を、該前駆細胞から産生する段階。
【請求項３１】
以下の段階をさらに含む、請求項28記載の方法:
(1)合成構築物を試験生物またはその一部の前駆細胞に導入する段階;および
(2)合成構築物を含有する細胞を含む該試験生物またはその一部を、該前駆細胞から増殖させる段階。
【請求項３２】
合成構築物を、試験生物またはその一部の選択された細胞に導入する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
請求項1または請求項28記載の方法に従って構築された合成ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項1または請求項28記載の方法に従って構築された合成ポリヌクレオチドを含有する、関心対象の生物またはその一部。
【請求項３５】
生物またはその一部において選択された表現型または選択された表現型と同じクラスの表現型を産生するかまたは産生することが予測されるレポータータンパク質をコードするレポーターポリヌクレオチドとインフレームで融合した第1のコドンのタンデムリピートに機能的に連結された調節ポリヌクレオチドを含む合成構築物を含む関心対象の生物またはその一部であって、該選択された表現型または該選択された表現型と同じクラスの表現型は、細胞で発現しポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって細胞に付与される表現型以外の表現型である、関心対象の生物またはその一部。
【請求項３６】
関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を調節する方法であって、該選択された表現型は、細胞で発現しポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって細胞に付与される表現型以外の表現型である、以下の段階を含む方法:
生物またはその一部における第1のコドンとは異なる表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、該生物またはその一部に導入する段階。
【請求項３７】
関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を高める方法であって、該選択された表現型は、細胞で発現しポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって細胞に付与される表現型以外の表現型である、以下の段階を含む方法:
生物またはその一部における第1のコドンよりも高い表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、該生物またはその一部に導入する段階。
【請求項３８】
関心対象の生物またはその一部によって示され、かつポリペプチドをコードする親のポリヌクレオチドの発現から生じる選択された表現型の質を下げる方法であって、該選択された表現型は、細胞で発現しポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって細胞に付与される表現型以外の表現型である、以下の段階を含む方法:
生物またはその一部における第1のコドンよりも低い表現型優先度を示す同義コドンで親のポリヌクレオチドにおける第1のコドンを置換することによって親のポリヌクレオチドから区別される合成ポリヌクレオチドを、該生物またはその一部に導入する段階。
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月24日(2005.11.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006506986000001.app
【国際調査報告】
2006506986.tif 000047
2006506986.tif 000048
2006506986.tif 000049