(57)【要約】本発明は、核酸分子の増幅方法を提供する。オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを内含する標的ポリヌクレオチドを増幅するための方法が提供される。本発明は、該方法を実践するための組成物及びキットならびに増幅産物を使用する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１本鎖であるか又は１本鎖にされた単数又は複数の標的ポリヌクレオチドの中に存在する増幅されたＲＮＡ配列の製造方法であって、以下の：
ａ）前記標的ポリヌクレオチドの中に存在する配列であってプロモータに操作可能な形でリンクされているものを含む２本鎖ｃＤＮＡ鋳型を、
ｉ）  第１の複合体を形成するべく、各々ランダムプライマ配列を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを用いて前記１本鎖標的ポリヌクレオチドをアニールすること、
ｉｉ）前記第１の複合体の逆転写により第１ストランドｃＤＮＡを合成し、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を使用して前記第１ストランドｃＤＮＡに単独重合体尾部を付加すること、
ｉｉｉ）任意には、エキソヌクレアーゼ活性で上記ｉ）又はｉｉ）の中で使用されていない第１のオリゴヌクレオチドを分解させること、
ｉｖ）第２の複合体の集団を形成するべく、前記単独重合体尾部に相補的でかつプロモータ領域に操作可能な形でリンクされたプライマ配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを用いて、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを変性させるか又は前記ハイブリッドからＲＮＡを分解させた後、前記第１ストランドｃＤＮＡをアニールすること、及び
ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて前記第２の複合体集団から２本鎖ｃＤＮＡ鋳型を形成すること、
によって形成するステップ、及び
ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの配列を含む増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を生成するべく前記プロモータ領域を介して転写を開始する能力をもつＲＮＡポリメラーゼで前記ｃＤＮＡ鋳型を転写するステップ、
を含む前記製造方法。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ調製物の中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ調製物がＦＦＰＥ誘導標本である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ調製物がポリアデニル化されたｍＲＮＡ分子について富化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ポリヌクレオチドが乳癌細胞標本由来のＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ランダムプライマ配列が少なくとも約６個のランダムヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ランダムプライマ配列が少なくとも約９個のランダムヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性のものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性がエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ、Ｔaqポリメラーゼ活性及びそれらの組合せから選択されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
単数又は複数の標的ポリヌクレオチド内に存在する増幅されたＲＮＡ配列の産生が、ａＲＮＡの配列の全て又は一部分を含む付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型を調製し、付加的な鋳型から転写を開始することによって増大され、
−  前記ａＲＮＡをプライマ領域を含む第３のオリゴヌクレオチドにアニールして第３の複合体を形成するステップ；
−  前記第３の複合体の逆転写により前記付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型の第１のストランドを合成するステップ；
−  第４の複合体を形成するべく操作可能な形でリンクされたプロモータ領域を含む前記第２のオリゴヌクレオチドを用いて、ａＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させるか又は前記ハイブリッドからａＲＮＡを分解させた後、付加的なＤＮＡ鋳型の前記ストランドをアニールするステップ、
−  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて前記第４の複合体から付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するステップ、及び
−  前記標的ポリヌクレオチドの配列を含む付加的な増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を産生するべく前記プロモータ領域を介して転写を開始する能力をもつＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記２本鎖ＤＮＡ鋳型を転写するステップ、
を含み、
上記成分のアニーリング、合成、アニーリング、形成及び／又は転写段階が、任意には、単数又は複数の標的ポリヌクレオチドに相補的な前記ＲＮＡ配列をさらに増幅させるべく反復される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第３のオリゴヌクレオチドがランダムプライマ領域を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ランダムプライマ領域が少なくとも約６個のランダムヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ランダムプライマ領域が少なくとも約９個のランダムヌクレオチドを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ欠損クレノウ及びＴaqポリメラーゼ活性を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第３のオリゴヌクレオチドが既知のプライマ配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記既知のプライマ配列が前記ａＲＮＡの３′領域に相補的である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
１本鎖であるか又は１本鎖にされた単数又は複数の標的ポリヌクレオチドに相補的であるか又はその中に存在するＲＮＡ配列を増幅する方法において、以下の：
ａ）  前記標的ポリヌクレオチドの中に存在する配列であってプロモータ領域に操作可能な形でリンクされているものを含む２本鎖ｃＤＮＡ鋳型を、
ｉ）  第１の複合体を形成するべく、各々ランダムプライマ配列を含む複数の第１のオリゴヌクレオチドを用いて前記１本鎖標的ポリヌクレオチドをアニールすること、
ｉｉ）  前記第１の複合体の逆転写により第１ストランドｃＤＮＡを合成し、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を使用して前記第１ストランドｃＤＮＡに単独重合体尾部を付加すること、
ｉｉｉ）  任意には、エキソヌクレアーゼ活性で上記ｉ）又はｉｉ）の中で使用されていない第１のオリゴヌクレオチドを分解させること、
ｉｖ）  第２の複合体の集団を形成するべく、前記単独重合体尾部に相補的でかつプロモータ領域に操作可能な形でリンクされたプライマ配列を含む第２のオリゴヌクレオチドを用いて、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを変性させるか又は前記ハイブリッドからＲＮＡを分解させた後、前記第１ストランドｃＤＮＡをアニールすること、及び
ｖ）  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて前記第２の複合体集団から２本鎖ｃＤＮＡ鋳型を形成すること、
によって形成するステップ、及び
ｂ）  前記標的ポリヌクレオチドの配列を含む増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を生成するべく前記プロモータ領域を介して転写を開始する能力をもつＲＮＡポリメラーゼで前記ｃＤＮＡ鋳型を転写するステップ、
ｃ）  前記ａＲＮＡから付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型を、
ｉ）  プロモータ領域に対し操作可能な形でリンクされたプライマ配列を含第３のオリゴヌクレオチドで前記ａＲＮＡをアニールして第３の複合体を形成すること；
ｉｉ）  前記第３の複合体の逆転写により前記付加的なＤＮＡ鋳型の第１のストランドを合成すること；
ｉｉｉ）  第４の複合体の集団を形成するべく前記第２のオリゴヌクレオチドを用いて、ａＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させるか又は前記ハイブリッドからａＲＮＡを分解させた後、付加的なＤＮＡ鋳型の前記ストランドをアニールすること；
ｉｖ）  ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて前記第４の複合体集団から付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成すること、
により形成するステップ；
ｄ）  前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を含む付加的な増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を産生するべく前記第３のオリゴヌクレオチドのプロモータ領域を介してか又は前記標的ポリヌクレオチドの配列を含むａＲＮＡを産生するために前記第２のオリゴヌクレオチドのプロモータ領域を介して転写を開始する能力をもつＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記付加的なＤＮＡ鋳型を転写するステップ、
を含む前記方法。
【請求項１８】
前記ａＲＮＡからの付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型の前記形成には、付加的な２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成する前にエキソヌクレアーゼ活性を用いて、ｃ）ｉ）又はｃ）ｉｉ）で使用されていない第３のオリゴヌクレオチドを分解するステップがさらに含まれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡを含むＲＮＡ調製物の中にある、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡ調製物がＦＦＰＥ誘導標本である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡ調製物がポリアデニル化されたｍＲＮＡ分子について富化される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的ポリヌクレオチドが乳癌細胞標本由来のＲＮＡである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ランダムプライマ配列が少なくとも約６個のランダムヌクレオチドを含む、請求項１７〜２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ランダムプライマ配列が少なくとも約９個のランダムヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ欠損クレノウ及びＴaqポリメラーゼ活性を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第３のオリゴヌクレオチドがランダムプライマ配列を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ランダムプライマ配列が少なくとも約６個のランダムヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ランダムプライマ配列が少なくとも約９個のランダムヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第３のオリゴヌクレオチドが既知のプライマ配列を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記既知のプライマ配列が前記ａＲＮＡの３′領域に相補的である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１のオリゴヌクレオチドがＴ７プロモータ領域を含む、請求項１、１０又は１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記第３のオリゴヌクレオチドがＴ３又はＳＰ６プロモータ領域を含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、本書中にあたかもその全てが記されているかのごとく援用される２００３年３月２１日出願の仮米国特許出願第６０／４５６，８２５号明細書からの優先権の利益を請求するものである。
【０００２】
発明の技術分野
本発明の技術分野は、核酸の酵素的増幅である。より特定的には、本発明は、標的ポリヌクレオチドを増幅（すなわちその多数のコピーを作製）してその多数のコピーを産生することに関連する方法、組成物及びキットを提供する。多数のコピーは、増幅された標的ポリヌクレオチドのセンス又はアンチセンス配列のいずれかを含有し得る。本発明は同様に、その後の分析又は調製目的で使用するため、たとえ制限された数量でしか存在しない場合でも標的ポリヌクレオチドの増幅を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
テスト集団内のｍＲＮＡ種の示差的発現分析には、その集団内の異なるｍＲＮＡレベルの定量的決定が必要とされる。核酸の検出及びその配列分析は、プローブハイブリダイゼーションによって実施できるが、該方法は一般に、テスト標本中の標的核酸の量が少ない場合に感度が欠如している。コピー数の少ない核酸標本は、酵素、蛍光プローブ、及び放射性同位体といったようなきわめて感度の高いリポータ基を用いた場合でさえ、検出が困難である。稀少なｍＲＮＡ種の検出は同様に、異種細胞集団、材料の不足及び検定方法の検出限度といったような要因によっても複雑になっている。ｍＲＮＡの異種集団を増幅する方法は同様に、異なるｍＲＮＡ種の相対量に有意な変化を導入するという懸念をひき起こす。
【０００４】
核酸増幅方法の利用分野としては、稀少な細胞、病原体、悪性腫瘍における改変された遺伝子発現などの検出が含まれる。核酸増幅は、低レベルで存在する核酸の検出といったような定性分析ならびに発現された遺伝子の定量化の両方にとって潜在的に有用である。後者は、病原性配列の査定ならびに悪性細胞の形質転換に付随する遺伝子の増殖又は消失の決定に、特に有用である。例えば指数増幅、リンクされた線形増幅、ライゲーションベースの増幅及び転写ベースの増幅といったように核酸増幅のための数多くの方法が記述されてきた、指数的核酸増幅方法の一例としては、数多くの刊行物の中で開示されてきたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である（例えばMullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.５１：２６３−２７３（１９８６）；ＰＣＲクローニングプロトコル：分子クローニングから遺伝子工学まで、分子生物学における方法、White, B.A., ed, 第６７巻（１９９８）；Mullis 欧州特許第２０１，１８４号明細書；Mullis et al., 米国特許第５８２，７８８号明細書及び４，６８３，１９５号明細書 Erlich et al.,欧州特許第５０，４２４、欧州特許第８４，７９６、欧州特許第２５８，０１７、欧州特許第２３７，３６２号明細書及びSaiki R. et al., 米国特許第４，６８３，１９４号明細書を参照のこと）。リンクされた線形増幅は、米国特許第６，０２７，９２３号明細書によって開示されている。ライゲーションベースへの増幅の例としては、Genomics４：５６０（１９８９）中にWu et alによって開示されたライゲーションベース増幅反応（ＬＡＲ）及び欧州特許出願第０３２０３０８Ｂ１号明細書に開示されたリガーゼ連鎖反応がある。Hampton et al. （Nucl. Acids Res.２４（２３）：４８３２−４８３５，１９９６）は、包括的ＰＣＲ増幅の一部として使用するための指向性ランダムオリゴヌクレオチドプライミング（ＤＲＯＰ）方法について記述している。
【０００５】
等温標的増幅方法には、増幅の早期においてＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列がプライマ拡張産物内に取込まれ（国際公開第 ８９／０１０５０号パンフレット、標的配列又はその補体がＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中間体内でＲＮＡストランドの転写及び消化によって増幅される、転写ベースの増幅方法が含まれる（例えば米国特許第５，１６９，７６６号明細書及び４，７８６，６００号明細書を参照のこと）。これらの方法には転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）及びそれらの変形形態が含まれる。（Gustelli et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ８７：１８７４−１８７８（１９９０）；米国特許第５，７６６，８４９（ＴＭＡ）号明細書及び５，６５４，１４２号明細書（ＮＡＳＢＡ）を参照のこと）。
【０００６】
一部の転写ベースの増幅方法（Malek et al. 米国特許第５，１３０，２３８号明細書；Kacian及びFultz, 米国特許第５，３９９，４９１号明細書；Burg et al., 米国特許第５，４３７，９９０号明細書）は、プライマ依存性ＮＣ合成の付加的なラウンドのための鋳型として役立つＤＮＡ又はＲＮＡ産物を生成するためにプライマ依存性核酸合成を用いる。これらの方法は、標的核酸配列の異なるストランドに相補的な配列を各々有する少なくとも２つのプライマを使い、標的配列のコピー数の指数的増幅を結果としてもたらす。しかしながら、これらの方法は、包括的遺伝子発現監視の利用分野のためには適していない。
【０００７】
単一のプライマを利用する増幅方法は同様に、異種ｍＲＮＡ集団の増幅にも有用である。ｍＲＮＡの大部分がその３′末端（ポリ−Ａ尾部）上に２０〜２５０個のアデノシン残基の単独重合体を含むことから、ポリ−ｄＴプライマをｃＤＮＡ合成のために使用することができる。「単一プライマ増幅」プロトコルは、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列及び所望の核酸標的配列の３′末端に相補的なオリゴ−ｄＴといったような配列（「プロモータープライマ」）を含有する単一のプライマを利用する（Kacian et al., 米国特許第５，５５４，５１６号明細書；van Gelder et al., 米国特許第５，５４５，５２２（ ‘５２２）、５，７１６，７８５（ ’７８５）及び５，８９１，６３６（’６３６））。これらの方法は、異種ｍＲＮＡ集団の増幅のためにpoly-ｄＴを含むプライマを使用するか又は使用するように適合させることができる。 ’５２２，’７８５及び ’６３６の中に記述された方法においては、プロモータープライマは、第１のストランドの合成をプライミングするために使用され、内因的に誘導されたプライマが第２ストランドの合成のために用いられる。このように生成された２本鎖ｃＤＮＡは、標的ＲＮＡに対応する配列にカップリングされたプロモータを内含し、ＲＮＡポリメラーゼの使用による標的配列（「アンチセンスＲＮＡ」）に相補的なＲＮＡの多数のコピーの合成のための鋳型として使用される。米国特許第５，７１６，７８５号明細書の中で記述された方法は、遺伝子発現を監視するため、細胞ｍＲＮＡを増幅するのに使用されてきた（例えばvan Gelder et al.（１９９０），Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ８７，１６６３；Lockhart et al.（１９９６），Nature Biotechnol.１４，１６７５）。
【０００８】
問題の１本鎖核酸が、２本鎖プロモータ及び問題の核酸と相補的な１本鎖セグメントを含有するオリゴヌクレオチドと組合わされる、ＲＮＡポリメラーゼで「アンチセンスＲＮＡ」を産生するためのもう１つの方法が、Loewy（米国特許第５，９１４，２２９号明細書）によって開示されている。Eberwine（Bio Techniques ２０；５８４−４９１（１９９６））は、必要なｃＤＮＡを産生するべく固定化されたオリゴ（ｄＴ）−Ｔ７プライマを使用することにより、ｍＲＮＡを増幅し「アンチセンスＲＮＡ」を産生するさらにもう１つの手段を開示している。Wang et al.（米国特許第５，９３２，５４１号明細書）は、第２のｃＤＮＡストランドの合成に先立ち（「捕捉可能なプライマ」を介して）固体支持体上に固定化されないうちにｃＤＮＡの第１のストランドを産生するための「捕捉可能な」プライマの使用について開示している。
【０００９】
２つのプライマ系（米国特許第６，１３２，９９７号明細書から修正）及び適合されたＰＣＲカップリングされた系を用いるもう１つのin vitro転写プロトコルが、Hughes et al.,（Nature Biotech，１９；３４２−３４７，２００１年４月）によって開示されている。
【００１０】
上述の文書の引用は、以上のもののいずれかが適切な従来技術であるということの是認として意図されているものではない。日付に関する供述又はこれらの文書の内容についての表現は、該出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付又は内容に関する何らかの是認を構成するものではない。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明は、標的ポリヌクレオチドを増幅し、増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）を生成することに関連する方法、組成物及びキットを提供している。ａＲＮＡは一般に、増幅中の標的ポリヌクレオチドの全長にわたる配列を含有する。本発明は、標的ポリヌクレオチドとしてＤＮＡ分子を用いて実施できるが、好ましくは標的ポリヌクレオチドとしてＲＮＡ分子を用いて実施される。かくして１つの態様では、本発明は、転移、リボソーム及び／又は伝令ＲＮＡ分子（それぞれ以下ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びｍＲＮＡ分子と呼ぶ）の混合物を内含する複数のＲＮＡ分子の全長を増幅するための一般的方法に関する。
【００１２】
好ましくは、標本中の合計ＲＮＡ種（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ）は、２００〜１０００塩基の範囲のａＲＮＡ分子を産生するべくランダムプライミングされる。これらのａＲＮＡ分子は、増幅されたＲＮＡ種内に存在する配列のフラグメントを含むことができる。さらに、本発明は、ＲＮＡ分子の特定的種の増幅、特にｍＲＮＡ分子の優先的増幅のために富化を行なう方法を提供する。
【００１３】
本発明の方法は、ＲＮＡ分子の最も３′の末端を増幅することに制限されず、むしろ増幅中の全てのＲＮＡ分子の全長に相当する重複フラグメントを増幅する。特に、本発明は、ｍＲＮＡの増幅されたフラグメントの富化を提供する。
【００１４】
本発明は、ホルマリン固定された組織から抽出されたＲＮＡの集団及び／又はｍＲＮＡスプライス変異体の集団を増幅するために使用可能である。これらの使用のいずれかの後に産生されるａＲＮＡは、ａＲＮＡが本書に記述されるように標識される既知の配列のマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションを含めた任意の手段によって分析可能である。
【００１５】
本発明の実施により産生されるａＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドの中に見い出される配列の全て又は一部を含む「センス」ＲＮＡ分子か又は標的ポリヌクレオチド中に見い出される配列の全て又は一部分に相補的な配列を含む「アンチセンス」ＲＮＡ分子のいずれかの形態をしている可能性がある。
【００１６】
本発明の１態様においては、２本鎖分子は、問題の標的ポリヌクレオチドの配列の全て又は一部分ならびに２本鎖ＤＮＡのいずれかのストランドの転写を開始する能力をもつ少なくとも１つのプロモータを含有するように産生される。２本鎖ＤＮＡの産生は、プライマとしてランダム配列を含む第１のオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドの１つのストランドをハイブリッド形成させることによる、最初のストランド「アンチセンス」ＤＮＡの初期産生で始まる。ランダム配列は、ハイブリダイゼーションが標的ポリヌクレオチドの長さに沿って、さまざまな配列で起こりうるような形で、さまざまな長さのものでありうる。１つの変形実施形態においては、第１のオリゴヌクレオチドは、オリゴｄＴプライマと組合せて使用される。
【００１７】
第１のオリゴヌクレオチドは任意には、その５′末端を介して規定の（又は既知の）配列に直接的に又は間接的にリンクされ得る。同様にして、本発明の実践において使用されるオリゴｄＴプライマは同じく、その５′末端にリンクされた規定の配列を含み得る。好ましくは、規定の配列は比較的ハイブリッド形成不可能であるか又は、塩基対合の法則に従ってポリヌクレオチド標的と非相補的である。
【００１８】
標的ポリヌクレオチドが１本鎖である場合それを直接使用することが可能である。標的ポリヌクレオチドが２本鎖である場合、それはまず最初に１本鎖標的ポリヌクレオチドを生成するべく変性される。該１本鎖標的ポリヌクレオチドは、前記第１ストランドのＤＮＡの産生のための鋳型として使用される。
【００１９】
前記ハイブリッド形成事象の後、第１のオリゴヌクレオチドを拡張させることによって、標的ポリヌクレオチドに相補的な第１ストランドのＤＮＡが産生される。鋳型として使用される標的ポリヌクレオチドが１本鎖ＲＮＡ分子である場合、逆転写酵素活性を用いた第１のオリゴヌクレオチドの酵素的拡張を使用することができる。標的ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が使用される。本発明の任意の実施形態として、第１ストランドＤＮＡ分子をプライミングするために使用されていない余剰の又は残留する第１のオリゴヌクレオチドが、例えばＳ１ヌクレアーゼ処理などによって分解される。代替的には、ｄＮＴＰの反応を枯渇させるためにアルカリホスファターゼが添加される。
【００２０】
第１ストランドのＤＮＡの産生の後、それはその３′末端において、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ又はｄＣヌクレオチドの３′単独重合体尾部を付加するべく（例えば末端デオキシリボヌクレオチルトランスフェラーゼの使用を介してといったように）末端トランスフェラーゼ活性を介して拡張される。好ましくは、ｄＴの単独重合体が付加される。任意には、第１ストランドＤＮＡハイブリッドはまず最初に、末端トランスフェラーゼ活性でのテーリング反応の前に標的ポリヌクレオチド鋳型から分離される。これは、反応成分を加熱することによって達成され得、この作業は、逆転写酵素活性をも終結させる。
【００２１】
このとき第１ストランドＤＮＡは、前記第１ストランドＤＮＡの３′末端に単独重合体尾部の全て又は一部分に相補的であるプライマ領域を含む第２のオリゴヌクレオチドに対しハイブリッド形成される。第２のオリゴヌクレオチドは、その５′末端を介して、プロモータ配列に対し直接的又は間接的にリンクされる。プロモータ配列は、１つのプロモータを形成するように２本鎖にされた時点でこのプロモータが該プロモータから単独重合体尾部と相補的なプライマ配列の方向に転写を開始する能力を有するような形で、１本鎖であって良い。好ましくは、プロモータ配列は、比較的ハイブリッド形成不可能であるか、又は、塩基対合の法則に従って第１のＤＮＡストランドと非相補的である。
【００２２】
第２のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の後、２本鎖ＤＮＡは、第１ストランドＤＮＡの全て又は一部分に相補的である第２ストランドＤＮＡをプライマ拡張を介して形成することにより産生される。プライマ拡張プロセスは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及び必要なデオキシリボヌクレオチドを利用する。好ましくは、第２のオリゴヌクレオチド内の任意のプロモータ配列に対し完全に相補的なものとなるように、その３′末端において第１のＤＮＡストランドを拡張するために３′エキソ活性をもつＤＮＡポリメラーゼが使用される。この結果、２本鎖ＤＮＡ分子がもたらされる。
【００２３】
リンクされたプロモータ配列を伴う第２のオリゴヌクレオチドの使用を介して第２のストランドＤＮＡが産生されたことから、結果としての２本鎖ＤＮＡは、第１ストランドＤＮＡの３′末端に対応する２本鎖ＤＮＡの末端にカップリングされたプロモータを有する。第２のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、プライマ配列の全て又は一部分及び第２のオリゴヌクレオチド中に存在する任意のあらゆる「リンカー」配列を含有するＲＮＡを産生する転写を２本鎖プロモータ領域が開始できるようにするように設計される。
【００２４】
本発明のもう１つの態様においては、２本鎖ＤＮＡの産生後、ＤＮＡ上に存在するプロモータは、第1ストランドＤＮＡ上に存在する配列に相補的な増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）の単数又は複数のコピーを転写するためプロモータから転写を開始する能力をもつＲＮＡポリメラーゼと接触させられる。第２のオリゴヌクレオチド配列にリンクされたプロモータから開始された転写は、５′から３′への順で、任意に存在する「リンカー」配列、第２のプライマ配列、標的ポリヌクレオチドの全部又は一部である配列、及び第１のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むａＲＮＡを発現する。かくして、結果として得られたａＲＮＡは、問題の標的ポリヌクレオチドとの関係において「センス」となる。
【００２５】
上述の方法は、「センス」ａＲＮＡを産生するため「ラウンド１」の増幅と考えることができる。
【００２６】
本発明のもう１つの態様においては、「センス」ａＲＮＡのさらなる増幅を可能にするため、「ラウンド２」の増幅が提供される。ラウンド２の増幅は、標的ポリヌクレオチドをさらに増幅するべく２本鎖ＤＮＡ構成体の多重コピーを産生するために上述のａＲＮＡを使用することによって可能である。ラウンド２では、「センス」ａＲＮＡは、もう１つの第1ストランドＤＮＡをまず最初に産生するために使用される。「ラウンド２」の第1ストランドＤＮＡは、上述のように単数又は複数の第1のオリゴヌクレオチドとａＲＮＡを最初にハイブリッド形成することによって産生される。「ラウンド２」の第1ストランドＤＮＡは、「センス」ａＲＮＡが鋳型として作用している状態で、逆転写酵素活性で第１のオリゴヌクレオチド（単複）を拡張した時点で産生される。「ラウンド２」第1ストランドＤＮＡの産生後、それは、（任意にはａＲＮＡ 鋳型から分離され、）第1ストランドＤＮＡの３′末端に対し相補的である「ラウンド１」の第２のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成される。第２のオリゴヌクレオチドの拡張は、第1ストランドＤＮＡに対しハイブリッド形成されて、２本鎖ＤＮＡ分子を形成する「ラウンド２」の２本鎖ＤＮＡを産生する。
【００２７】
第1ストランドＤＮＡの３′末端にリンクされたプロモータから開始された転写は、「ラウンド２」において出発用鋳型として使用される「センス」ａＲＮＡの配列を含有する「ラウンド２」ａＲＮＡの単数又は複数のコピーの産生を結果としてもたらす。好ましくは、このラウンド２のａＲＮＡは５′から３′への順で、第２のオリゴヌクレオチドの任意に存在する「リンカー」配列、第２のオリゴヌクレオチドのプライマ配列、「センス」ａＲＮＡの全部又は一部（そしてかくして、原標的ポリヌクレオチドの全部又は一部）である配列、及び使用された第１のオリゴヌクレオチド（単複）に相補的な配列を含んでいる。結果として得られたａＲＮＡはここでも又、問題の原標的ポリヌクレオチドとの関係において「センス」となる。
【００２８】
次に、転写の時点でａＲＮＡをさらに大量に産生するのに使用できる多数の「ラウンド２」２本鎖ＤＮＡを調製するために大量の「ラウンド１」のａＲＮＡを使用できることから、「ラウンド２」を使用することで標的ポリヌクレオチドの有意なさらなる増幅が可能になる。
【００２９】
「ラウンド１」で使用された第１のオリゴヌクレオチドがその５′末端に規定の配列を含んでいた「ラウンド２」の変形実施形態においては、「ラウンド２」で第1ストランドＤＮＡの合成をプライミングするのに使用されたオリゴヌクレオチドは、前記規定の配列の全部又は一部であるプライマ配列の５′末端に直接的又は間接的にカップリングされたプロモータ配列を任意に含み得る。このオリゴヌクレオチドの拡張とそれに続く「ラウンド１」の第２のオリゴヌクレオチドでのプライミング及び拡張は、結果として、「ラウンド１」の第２のオリゴヌクレオチドにカップリングされたプロモータ及び／又は「ラウンド２」において第1ストランドＤＮＡの合成をプライミングするために用いられたオリゴヌクレオチドにカップリングされたプロモータから開始される転写用鋳型として両方のストランドが役立ち得る２本鎖ＤＮＡ分子をもたらす。この考えられる実施形態により２つのプロモータ領域が異なっている１つの実施形態が可能となる。この結果、２本鎖ＤＮＡは、「ラウンド１」の第２のオリゴヌクレオチドにカップリングされたプロモータから開始される転写による「センス」ａＲＮＡ及びその他のプロモータから開始される転写による「アンチセンス」ａＲＮＡを産生することができるようになる。「センス」及び「アンチセンス」という語のもつ意味は、原標的ポリヌクレオチドとの関係におけるものにとどまる。
【００３０】
上述の方法の全てにおいて、「外因性プライマ」は、少なくとも、「ラウンド１」において第２のＤＮＡストランドの又は「ラウンド２」においてＤＮＡストランドの合成をプライミングするのに使用されるオリゴヌクレオチドの形で存在する、という点に留意すべきである。
【００３１】
本発明のもう１つの変形実施形態においては、「ラウンド２」は、「ラウンド１」の第1ストランドＤＮＡの５′末端にカップリングされたプロモータの利益になるように「ラウンド１」の第1ストランドＤＮＡにカップリングされたプロモータを除去するために用いることができる。この実施形態は図２に示され、以下でさらに記述されている。
【００３２】
本発明の方法は、細胞又は生体から問題のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を検出するために使用可能である。好ましくは、細胞は真核生物又はヒトの細胞であり、より好ましいのは、癌特に乳癌に関連するものといった悪性細胞由来の細胞である。当該方法は、ホルマリンで固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）、ホルマリン固定された、又はアルコール固定された標本を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）固定標本から得られた（抽出された）ＲＮＡ分子集団を増幅するために使用することができる。かかる標本の一定の与えられた細胞／組成／生体中のＲＮＡの分解された（又は修飾された）性質によって、本発明の方法が（全てのＲＮＡ分子を増幅できるように）包括的にかつ（特定のＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子の特定の領域についてのいかなる偏向も結果として生じないように）非偏向的にＲＮＡを増幅することが妨げられるわけではない。本発明の方法の有用性には、より多くのＲＮＡを生成するために、生物標本又は供給源の任意の又は全てのＲＮＡ種を増幅する必要があるあらゆる状況が含まれる。かかる状況の制限的意味のない例としては、少量のＲＮＡが利用可能である（例えば総ＲＮＡ１ｎｇ未満）ケースが含まれる。１つの任意の実施形態においては、結果として得られた増幅されたＲＮＡは、特定のＲＮＡ分子のためのＰＣＲ又は定量的ＰＣＲ反応用の鋳型として使用可能である。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態においては、ヒトの病気のモデル生体又は実際のヒト組織（死後又は生検材料）由来の固定された組織からレーザー捕捉された単数又は複数の細胞（レーザー捕捉顕微解剖）由来の（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡを含めた）全ＲＮＡ集団が増幅される。代替的には、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ又はｒＲＮＡ）分子の特定の亜集団を、以下で開示するように増幅のために選択することができる。
【００３４】
複数の細胞に、１つの細胞培養又は１つの組織又はその中の細胞型からの複数の又は他の多数の細胞が内含されている。本発明の実施形態において使用できる細胞としては、制限的な意味なく、一次細胞、培養細胞、腫瘍細胞、非腫瘍細胞、血液細胞、下垂体又はその他の内分泌腺の細胞、骨細胞、リンパ節細胞、脳細胞、肺細胞、心臓細胞、脾臓細胞、肝細胞、腎細胞及び脈管組織細胞が含まれる。癌細胞以外にも、本発明は、任意の疾病又は望ましくない身体条件に関与する又はそれらに付随する組織（及びその中の細胞型）に応用することが可能である。例えば、発明を制限することなく、本発明は、パーキンソン病及びアルツハイマー病を含む神経変性疾患；多発性硬化症；及び躁うつ病、食欲制御欠如及び多動症候群といった統合失調症及び情動障害を含めた精神障害といった（ただしこれらに制限されない）神経系の障害に関与する神経細胞及び非神経細胞内での遺伝子発現を見極めるために使用可能である。同じ型又は亜型の単一の又は多数の細胞のいずれかによる上述の障害に関与する又は関連する異なる神経細胞型からの発現済み核酸を、本発明を用いてさらなる特徴づけのために増幅することができる。同様にして、（小グリア細胞、星状細胞、乏突起膠細胞及び湿潤炎症細胞を含む（ただしこれらに制限されない））かかる障害に関連する非神経細胞からの発現済み核酸も、本発明を用いて増幅することができる。
【００３５】
同様に、本発明を制限することなく、心臓血管及び泌尿器系の障害に結びつけられる細胞からの発現された核酸を、本発明で増幅することができる。心臓血管病野の例としては、平滑筋細胞、内皮細胞及びマクロファージが含まれるがこれらに制限されるわけではない。一方腎障害の例には、皮質、骨髄、糸球体、近位及び遠位細管、ボーマン嚢及びヘンレのループが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００３６】
炎症性及び自己免疫疾患は、それに関与する又は関連する組織及び細胞が本発明と組合せて使用され得る障害の付加的な制限的意味のない例である。かかる障害の例としては、関節リウマチ、重症筋無力症、エリトマトーデス、或る種の貧血症、多発性硬化症及び若年発症糖尿病が含まれる。かかる疾病に関与する細胞としては、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、リンパ球が含まれる。
【００３７】
本発明と併せて使用しうる癌細胞の付加的な例としては、肉腫、癌腫、リンパ腫、白血病、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、柔組織癌、生検、皮膚癌、脳腫瘍、肝癌、卵巣癌及び膵癌由来の細胞が含まれるがそれらに制限されるわけではない。本発明のプライマ又はポリメラーゼといったような単数又は複数の成分を、任意には同定用の記述又はラベル又は本発明の方法におけるその使用に関する取扱い説明書と共に収納するキットも同じく本発明により提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
発明の実施態様
Ａ．定義
「ポリヌクレオチド」というのは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態である。この語は分子の一次構造のみを意味する。かくして、この語には、２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。これには同様に、当該技術分野において既知の標識、メチル化、「キャップ」、天然に発生するヌクレオチドのうちの単数又は複数のものと１つの類似体の置換を含めた既知のタイプの修飾、及び未帯電リンケージ（例えばホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）、付随的部分（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどといったタンパク質を含む）、挿入剤（例えばアクリジン、プソラレンなど）、キレート剤（例えば金属、放射性金属など）、アルキル化剤、修飾済みリンケージ（アルファアノマー核酸など）といったようなヌクレオチド間修飾ならびに未修飾形態のポリヌクレオチドも含まれる。
【００３９】
本書で使用される「標的ポリヌクレオチド」又は「標的配列」は、増幅が望まれる問題のポリヌクレオチド配列が含まれる。標的配列は、その実際の配列に関して既知のものであっても未知のものであってもよい。一般に、本書で使用される「鋳型」というのは、標的ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。一部のケースでは、「標的配列」、「鋳型ＤＮＡ」、「鋳型ＲＮＡ」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」及びその変形態様は、互換的に用いられている。
【００４０】
本書で用いられている通りの既知の配列を含むプライマ領域は、増幅されるべき各々の特異的配列に対し「実質的に」相補的であるように選択される。すなわち、プライマはそのそれぞれの標的に対しハイブリッド形成するのに充分な相補性を有するはずである。従って、プライマ配列は標的の正確な配列を反映する必要はなく、実際「縮重し」うる。プライマ配列がハイブリダイゼーション及び拡張を可能にするよう増幅されるのに充分な相補性を標的の配列に対して有することを条件として、非相補性塩基又はさらに長い配列をプライマの中に散在させることができる。
【００４１】
本書で使用される通りのランダム配列を含有するプライマ領域は、必ずしも増幅対象の標的配列に相補的であるものとしては知られていないが、好ましくはポリメラーゼ活性を介してプライマ拡張反応を可能にするのに充分な相補性を標的配列に対して有する配列を内含している。プライマは、使用されている条件下でのハイブリダイゼーション及びプライマ拡張に適した任意の長さのものでありうる。上述のように、プライマは、それらが非相同配列を含有するような形で無作為であり得る。長さが非相同なプライマを本発明の実施において使用することもできる。プライマは構造がＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのキメラ組合せであってよい。好ましいランダムプライマ長さは約４個〜約１０個のヌクレオチドである。さらに一層好ましいのは、長さが９又は約９個のヌクレオチドであるランダムプライマである。既知の配列のプライマは、長さが約１２個乃至約５０〜１００個のヌクレオチドのものであってよい。「増殖する」という語は、標本内に標的分子が存在することによって作り出される、例えば付加的な標的分子又は標的様の分子又は標的分子に相補的な分子を内含しうる増幅産物を作り出すことを意味するべく広義にて用いられる。標的が核酸である状況においては、増幅産物は、２本鎖ＤＮＡを生成する上でＤＮＡポリメラーゼが関与している状態で、ＲＮＡポリメラーゼによって酵素的に作ることができる。
【００４２】
本書で使用する「増幅」という語は、一般に、所望の配列の多重コピーを産生するプロセスに関する。「多重コピー」というのは、少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」というのは必ずしも、鋳型配列に対する完全な配列相補性又は同一性を意味しない。例えば、コピーには、デオキシイノシンといったようなヌクレオチド類似体、意図的な配列改変（例えば、鋳型に対してハイブリッド形成可能であるものの相補的でない配列を含むプライマを通して導入される配列改変）、及び／又は増幅の間に発生する配列の誤りが含まれる可能性がある。
【００４３】
本発明は同様に、ｍＲＮＡを増幅するための方法をも提供する。かくして、本発明は、出発標的ｍＲＮＡから増幅された量のＲＮＡを産生する方法を提供する。増幅された量というのは、各々の出発ｍＲＮＡについて、多数の対応する増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）が産生され、そこで増幅されたＲＮＡが初期ｍＲＮＡと同一か又は相補的な配列を有することを意味する。対応するというのは、ａＲＮＡが出発ｍＲＮＡ又はその補体と実質的な量の配列同一性を共有することを意味する。実質的量というのは、少なくとも９５％、通常は少なくとも９８％、さらに通常は少なくとも９９％を意味し、配列同一性は、（公開された省略時設定すなわちパラメータｗ＝４、ｔ＝１７を用いて）Altschul et al.（１９９０），J. Mol. Biol.２１５；４０３−４１０に記述されているようなＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定される。一般に、線形増幅方法の間に各々の出発ｍＲＮＡについて産生される対応するａＲＮＡ分子の数は少なくとも約１０、通常は少なくとも約５０、さらに通常は少なくとも約１００となり、ここでこの数は６００以上にもなり得るが、約５０００を超えないことが多い。本発明によるｍＲＮＡの増幅倍数は、１ラウンドにつき約１０００倍から約５０００倍である。ここで用いる「リンカー」又は「リンカー配列」という語は、本書に開示されているようにプライマ領域をプロモータ領域にリンクするのに役立ち得る特異的核酸配列を意味する。
【００４４】
「マイクロアレイ」は、各々、固体支持体の表面上に形成された定義済みの部域を有する好ましくは離散的な領域の線形又は二次元のアレイである。マイクロアレイ上の離散的領域の密度は、単一の固相支持体の表面上で検出すべき標的ポリヌクレオチドの合計数によって決定され、好ましくは少なくとも約５０／cm2、より好ましくは少なくとも約１００／cm2、さらに一層好ましくは少なくとも約５００／cm2、そしてなお一層好ましくは少なくとも約１，０００／cm2である。本書で使用されているＤＮＡマイクロアレイというのは、チップ又はその他の表面上に置かれたオリゴヌクレオチドプライマ又はｃＤＮＡのアレイである。アレイ内のプライマ又はｃＤＮＡの各々の特定のグループの位置は既知であることから、標的ポリヌクレオチドの同一性は、マイクロアレイ内の特定の位置に対するその結合に基づいて決定可能である。
【００４５】
「標識」という語は、検定標本中の標的ポリヌクレオチドの存在を表わす検出可能なシグナルを産生する能力をもつ組成物を意味する。適切な標識としては、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁気粒子、生物発光部分などが含まれる。従って、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物である。
【００４６】
「支持体」又は「固体培地」という語は、ビーズ、粒子、ディップスティック、繊維、フィルタ、膜、といったような従来の支持体及びガラススライドといったシラン又はケイ酸塩の支持体を意味する。
【００４７】
本書で使用される「生物学的標本」というのは、例えば血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸管、胃腸管及び泌尿生殖路の外分泌物、涙、唾液、乳汁、細胞（血液細胞を含むがこれに制限されるわけではない）、腫瘍、器官ならびにin vitro 細胞培養成分の標本を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）個体から単離された組織又は流体の標本を意味する。
【００４８】
本書で使用される「生物学的供給源」という語は、標的ポリヌクレオチドが由来する供給源を意味する。供給源は、細胞、組織又は流体を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）上述の通りの「生物標本」のあらゆる形態であり得る。「異なる生物学的供給源」というのは、同じ個体の異なる細胞、組織又は器官又は、同じ種の異なる個体からの細胞、組織又は器官、又は異なる種からの細胞、組織又は器官を意味し得る。この語は、同様に、悪性の又はその他の形で癌特に乳癌と結びつけられるものといったような細胞特にヒト細胞、及びヒトの疾病のモデル生体由来の固定された組織から又は実際のヒト組織（死後又は生検材料）からレーザー捕捉される細胞（レーザー捕捉顕微解剖）をも意味しうる。
【００４９】
「複合体」というのは、成分の集合体である。複合体は、安定したものであってもよいし又安定していなくてもよく、直接的に又は間接的に検出され得る。例えば、本書に記述されているように、１つの反応のいくつかの成分及びその反応の産物（単複）のタイプがわかれば、１つの複合体の存在を推論することができる。本発明の目的では、複合体は一般に、最終的増幅産物との関係において１つの中間体である。
【００５０】
ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの「プライマ」又は「リンカー」配列は、２つ以上の塩基の隣接する配列である。かかる配列は、少なくともおよそ３、５、１０、１５、２０、２５個のいずれかの隣接するヌクレオチドである。
【００５１】
もう１つの配列に「隣接する」領域、部分又は配列は、その領域、部分又は配列と直接境を接している。例えば、複合プライマの５′ＤＮＡ部分に隣接するＲＮＡ部分は、その領域と直接境を接している。
【００５２】
「反応」又は「反応混合物」というのは、適切な条件下で反応して１つの複合体（これは中間体であってもよい）及び／又は産物（単複）を形成する成分の集合体である。
【００５３】
本明細書及び添付のクレーム内で使用されているように、単数形「ａ」「an」及び「the」には、前後関係が明らかに相反する決定を示しているのでないかぎり、対応する複数形も含まれるということを指摘しておかなくてはならない。
【００５４】
「発現」には、デオキシリボ核酸の転写及び／又はリボ核酸の翻訳が含まれる。この語はかくして、本書に開示されているようなａＲＮＡを産生するための転写といったようなＤＮＡ鋳型の転写に関連するものである。
【００５５】
本書で使用されているように、「〜を含む（comprising）」という語及びその同語源の語は、その包含的意味で、すなわち「〜を内含する（including）」及びその対応する同語源の語と同等の意味で使用されている。
【００５６】
１つの事象の発生を「可能にする」条件又は１つの事象が発生するのに「適した」条件（例えばハイブリダイゼーション、ストランド拡張など）又は「適切な」条件というのは、かかる事象が発生するのを妨げない条件である。かくして、これらの条件は、その事象を可能にし、増進し、容易にしかつ／又はそれを導くものである。当該技術分野において既知であり本書に記述されているこのような条件は、例えば、ヌクレオチド配列の性質、温度及び緩衝液条件に左右される。これらの条件は同様に、ハイブリダイゼーション、分割、ストランド拡張又は転写といったようなどの事象が望まれているかにも左右される。
【００５７】
「３′」（３ダッシュ）という語は一般に同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド内の１つの領域又は位置から（下流側）３′のところにあるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド内の領域又は位置を意味している。
【００５８】
「５′」（５ダッシュ）という語は一般に同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド内の１つの領域又は位置から（上流側）５′のところにあるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド内の領域又は位置を意味している。
【００５９】
「３′−ＤＮＡ部分」、「３′−ＤＮＡ領域」、「３′−ＲＮＡ部分」及び「３′−ＲＮＡ領域」という語は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの３′末端に向かって位置設定されたポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの部分又は領域を意味し、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの最も３′のヌクレオチド（単複）又はそれに付着した部分を内含していてもいなくてもよい。最も３′のヌクレオチド（単複）は、好ましくは約１〜約２０個、より好ましくは約３〜約１８個、さらに一層好ましくは約５〜約１５個のヌクレオチドであり得る。
【００６０】
「５′−ＤＮＡ部分」、「５′−ＤＮＡ領域」、「５′−ＲＮＡ部分」及び「５′−ＲＮＡ領域」という語は、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５′末端に向かって位置設定されたポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの部分又は領域を意味し、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの最も５′のヌクレオチド（単複）又はそれに付着した部分を内含していてもいなくてもよい。最も５′のヌクレオチド（単複）は、好ましくは約１〜約２０個、より好ましくは約３〜約１８個、さらに一層好ましくは約５〜約１５個のヌクレオチドであり得る。
【００６１】
「検出」という語は、直接及び間接的検出を含めてあらゆる検出手段を内含する。例えば「検出可能な形でより少ない」産物を直接又は間接的に観察することができ、この語は、あらゆる減少（産物無しも含む）を表わす。同様にして、「検出可能な形でより多い」産物というのは、直接的又は間接的のいずれで観察されたかに拘らずあらゆる増加を意味する。
【００６２】
相反する定義づけのないかぎり、本書で使用されるあらゆる技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
【００６３】
Ｂ．図中に示された実施形態
図１に関しては、第１の矢印のステップ１は、逆転写酵素活性でのランダムプライマ配列を含む第１のオリゴヌクレオチドからの合成を介して第１ストランドＤＮＡを産生する。上述の通り、第１のオリゴヌクレオチドは同様に、ランダムプライマ配列の５′末端に対し直接的又は間接的にリンクされた定義済みの配列を含み得る。第１ストランドＤＮＡの合成後、（この例では）その３′末端は、ポリｄＴ尾部を内含するべく末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を用いてテーリングされる（第１の矢印のステップ２）が、対応するｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＧＴＰの使用によりｄＡ、ｄＣ、又はｄＧ単独重合体尾部を導入することも可能である。
【００６４】
第２の矢印のステップ１は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列に対し単独重合体プライマの５′末端でリンクされた（第１ストランドＤＮＡの３′末端に付加された尾部と相補的な）単独重合体プライマを含む第２のオリゴヌクレオチドの使用を介した、第２ストランドＤＮＡの産生に関するものである。この図には示されていないものの、上述のように、リンカー配列は任意には、単独重合体プライマとプロモータ配列の間に存在しうる。そして、「exo’ Klenow／Taq」は、使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性としてのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ及びＴaq ポリメラーゼの組合せの使用を意味しているものの、その他のＤＮＡポリメラーゼも同様に使用可能である。
【００６５】
第２の矢印のステップ２は、第２ストランドＤＮＡの合成をプライミングするのに用いられる第２のオリゴヌクレオチドに対し相補的なものとなるための第１ストランドＤＮＡの３′末端の拡張ならびに、３′エキソヌクレアーゼ活性をもつＤＮＡポリメラーゼとしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより例証される、平滑末端となるための結果としての２本鎖ＤＮＡの末端の「仕上げ」に関する。
【００６６】
第３の矢印のステップ１は、使用された第２のオリゴヌクレオチド内に存在するＴ７プロモータ配列から転写を開始するためのＴ７のＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）反応を介した「センス」増幅されたＲＮＡ（ａＲＮＡ）の産生に関するものである。プロモータ配列が第１の矢印のステップ１で使用された第１のオリゴヌクレオチドにリンクされた場合、同族プロモータとしてそのプロモータ配列を用いるＲＮＡポリメラーゼを用いたＩＶＴ反応を実施して「アンチセンス」ａＲＮＡを産生することができる。ここでも又、「センス」及び「アンチセンス」は、その配列がここでは「センス」として定義されている原ＲＮＡ分子鋳型を基準としたものである。
【００６７】
図１に示されている通りの「ラウンド１」の後、結果としてのａＲＮＡは「ラウンド２」の増幅の中で使用可能である。１実施形態において、第１の矢印のステップ１の中の第１のオリゴヌクレオチドが定義済みの配列を含まなかった場合、「ラウンド２」は、図１に示されているような「ラウンド１」から産生された「センス」ａＲＮＡにハイブリッド形成されたランダムプライマを介した第１ストランド合成を完成させることにより行なわれる。このとき、第２ストランドＤＮＡは、５′−Ｔ７−オリゴ（ｄＡ）プライマと合成され、その後Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼとＩＶＴ反応させられる。こうして第２ラウンドの増幅が完成することになる。第１の矢印のステップ１内の第１のオリゴヌクレオチドが定義済み配列を明らかに内含している場合、「ラウンド２」の増幅は、ランダムプライマの代りにプライマとして定義済み配列を使用することによって実施可能である。
【００６８】
第１の矢印のステップ１で第１のオリゴヌクレオチドと組合わせた形でオリゴｄＴプライマが使用された本発明の実施形態においては、オリゴｄＴプライマをランダムプライマ又は定義済み配列のプライマと組合わせて使用して、「ラウンド２」で第１ストランドＤＮＡを合成することができる。
【００６９】
図２に関して言うと、これは、２ラウンドの線形増幅を介して（増幅されたＲＮＡ産物のための）ストランド反転を例示している。ストランド反転は、ａＲＮＡを第２のＩＶＴ反応において標識された形態で合成させ本発明のいくつかの利用分野においてプローブとして使用できるようにする。かかる利用分野の制限的意味のない例としては、AffymetrixのGene ChipTM及びAgilentアレイといったマイクロアレイに対するハイブリダイゼーションが含まれる。
【００７０】
第１の矢印のステップ１は、ＲＮＡ分子の特定の集団が増幅の前に富化される本発明の任意の実施形態に関するものである。ポリアデニル化されたＲＮＡ分子（第１の矢印の後「Ａｎ」により示されている）のための富化が例証として示されている。特定の集団の富化は、単数又は複数の所望の集団についての正の選択によるものか又は単数又は複数の望ましくない集団の除去による負の選択によるものであってよい。例えば、本発明を制限することなく、ｍＲＮＡ集団をｍＲＮＡ分子のポリアデニル化された３′尾部を使用することによって正で選択することができる。これは、（制限的な意味なく、例えば、ポリアデニル化された尾部とオリゴｄＴ配列の間の塩基対相補性に基づきポリアデニル化されたｍＲＮＡに対しハイブリッド形成するべく使用されるオリゴｄＴ配列にカップリングされたビーズ、カラム培地又はフィルタのような固体培地の使用といったような）ポリアデニル化されたｍＲＮＡのオリゴｄＴ媒介単離に基づくものを含めた、当該技術分野において既知の手段によって実施可能である。使用されたオリゴｄＴ培地に結合しないその他のＲＮＡ種は、本発明で使用するためのポリアデニル化されたＲＮＡの単離を可能にするように洗い流される。
【００７１】
代替的には、ポリアデニル化されたＲＮＡは、制限的な意味のない例としてｒＲＮＡの除去といったようなその他のＲＮＡ種の除去により富化され得る。ｒＲＮＡの除去は、固体培地にカップリングされ（その上に固定化され）得るリボソームＲＮＡ配列の使用に基づくものを含めた当該技術分野において既知の標準的手段の使用によるものであって良い。これらのリボソームＲＮＡ配列は、ｒＲＮＡ分子がリボソームＲＮＡ配列に対してハイブリッド形成することになるようにｒＲＮＡ分子に対し相補的である。制限的な意味のない一例として、リボソームＲＮＡ配列は、ｒＲＮＡ分子（例えば１８Ｓ及び２８ＳのｒＲＮＡ）とのハイブリッド形成の後、２本鎖デュプレックスＲＮＡがビーズの除去によりビーズ特に磁気ビーズの表面上に固定化されたストレプトアビジンといったようなアビジンに対する結合の後に除去されうるような形で、ビオチニル化される。その他の制限的意味のない方法には、ｒＲＮＡ分子に対し相補的なビオチニル化ＤＮＡオリゴの使用とそれに続く溶液からのＤＮＡ−ＲＮＡヘテロデュプレックスの除去が含まれる。
【００７２】
当然のことながら、上述の方法は、望ましい場合、ｒＲＮＡ分子について富化するべくポリアデニル化されたＲＮＡを除去するのにオリゴｄＴ媒介の手段を使用するため、又はｒＲＮＡ分子について富化するべく相補的ｒＲＮＡ配列を使用するために逆転することができる。さらなる変形実施形態においては、ポリアデニル化されたＲＮＡ分子を、上述のとおりの本発明の第１のオリゴヌクレオチド内のプライマ配列としてオリゴｄＴプライマを使用すること（そしてその後第１ストランドＤＮＡを合成し末端トランスフェラーゼ活性によりそれをテーリングすること）によって選択することができる。富化の利点としては、富化された種の中の「比活性」が大きくなることの利点が含まれる。制限的意味のない例としては、ｍＲＮＡの富化は、ｍＲＮＡのより大きな「比活性」（すなわち合計ＲＮＡ中のリボソームＲＮＡといったその他のＲＮＡ種に対するｍＲＮＡの割合が大きくなる）を可能にする。
【００７３】
第２の矢印のステップ１は、逆転写酵素活性を用いた、ｄＧのデカマーとして例証される既知の（又は定義済みの）配列にリンクされた（例証としてランダムノナマーとして示された）ランダムプライマ配列を含む、第１のオリゴヌクレオチドからの合成を介した第１ストランドＤＮＡの産生に関するものである。第２の矢印のステップ２は、末端デオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性との合成の後の１本鎖ＤＮＡの３′末端のテーリングに関するものである。この例証は、ポリｄＴ尾部の導入を示しているが、ｄＡ、ｄＣ又はｄＧ単独重合体尾部を対応するｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＧＴＰの使用によって導入することも可能である。
【００７４】
第３の矢印は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列に対し単独重合体プライマの５′末端でリンクされた（第１ストランドＤＮＡの３′末端に付加された尾部と相補的な）単独重合体プライマを含む第２のオリゴヌクレオチドの使用を介した、第２ストランドＤＮＡの産生に関するものである。この図には示されていないものの、本発明により提供されているように、リンカー配列は任意には、単独重合体プライマとプロモータ配列の間に存在しうる。そして、「exo’ Klenow／Taq」は、使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性としてのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ及びＴaq ポリメラーゼの組合せの使用を意味しているものの、その他のＤＮＡポリメラーゼも同様に使用可能である。
【００７５】
この例証中には示されていないが、第３の矢印は、同様に、第２ストランドのＤＮＡの合成をプライミングするために使用される第２のオリゴヌクレオチドに対し相補的になるための（又は制限的な意味のない例としてＴ４ＤＮＡポリメラーゼの使用により２本鎖ＤＮＡを平滑末端化する）第１ストランドＤＮＡの３′末端の拡張にも関連し得る。
【００７６】
第４の矢印は、使用された第２のオリゴヌクレオチドの中に存在するＴ７プロモータ配列から転写を開始するためのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）反応を介した「センス」aＲＮＡの産生に関連している。ここでも又、「センス」ａＲＮＡは、その配列が本書で「センス」として定義されている、原ポリアデニル化されたＲＮＡ分子鋳型を基準にしたものである。
【００７７】
上述のことは、「第１」ラウンド（又は「ラウンド１」増幅として左側に示された図２の一部分を要約している。図２の下部分は、ＩＶＴ反応を介して「アンチセンス」ａＲＮＡの産生を可能にするべく２本鎖ＤＮＡ分子のもう一方の末端に１つのプロモータが導入される「ラウンド２」（「第２」ラウンドとして示されている）を例示している。これは以下の通りに起こる。
【００７８】
図２に示されている通りの「第１」ラウンドの後、結果としてのａＲＮＡは、既知の（定義済みの）配列に対し相補的であるプライマ配列（この例証においてはｄＧデカマーである）を含みかつ既知の配列の５′末端にリンクされたプロモータ配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて第１ストランドＤＮＡを産生するために使用されている。図２中の第５の矢印のステップ１は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータに対しその５′末端でリンクされたｄＧの１８量体を含むオリゴヌクレオチドの使用を例証しているが、本発明の実施においては、（使用される「既知の」配列に応じて）その他のプライマ配列及びその他のプロモータ配列を使用することができる。逆転写酵素活性をも用いた第１ストランドＤＮＡの合成の後、第５の矢印のステップ２は、使用されたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性としてのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ及びＴaqポリメラーゼの組合せの使用に関するものである「exo Klenow／Ｔaq」を伴う第２の矢印のステップ２で付加された尾部に対し相補的である（そしてハイブリッド形成されている）オリゴヌクレオチドからの第２ストランドのＤＮＡの合成に関するものである。その他のＤＮＡポリメラーゼも同様に使用することができる。
【００７９】
こうして、第６の矢印のステップ１により示されているようなＩＶＴ反応において「アンチセンス」ａＲＮＡを産生するべく転写を開始できるＴ７プロモータを用いて２本鎖ＤＮＡ分子が産生される。
【００８０】
上述の通り、ｄＴ残基の単独重合体を導入することといったようなテーリング反応の例証は、制限的な意味をもつものではない。同様にして、第１ストランドＤＮＡ合成内でｄＧ重合体を使用することの例証も又、制限的意味のないものである。相補的配列のハイブリッド形成のために塩基対合の法則が維持されるかぎり（すなわちＡ−Ｔ及びＧ−Ｃ）、その他の単独重合体ヌクレオチド配列を使用してもうまくいくことだろう。
【００８１】
Ｃ．一般的技術
本発明の実践には、相反する指示のないかぎり、当該技術分野の技能範囲内に入る分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術が利用されることになる。かかる技術は、「分子クローニング：実験室マニュアル」第２版（Sambrook et al.,１９８９）；「オリゴヌクレオチド合成」（M.J. Gait, ed, １９８４）；「動物細胞培養」（R.I. Freshney ed, １９８７）；「酵素学における方法」（Academic Press, Inc.）；「分子生物学における現行プロトコル」（F.M.Ausubel et al., eds.,１９８７、及び定期的更新）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応」（Mullis et al., eds., １９９４）といった文献において充分に説明されている。
【００８２】
本発明において利用されているプライマ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の標準的技術を用いて生成可能である。
【００８３】
本発明は溶液状態で、実施されるのが最も一般的であるが、その全て又は一部分は、固体（又は固定化された）状態、又はインサイチュ状態の一部としても実施可能である。例えば、本発明を制限する意味なく、第１のｃＤＮＡストランドの合成は、インサイチュでか又は、（制限的な意味なくビーズ又は膜又は固体容器の表面といった）固体支持体上に固定化されている第１のプライマプロモータオリゴヌクレオチドを用いて、実施可能である。
【００８４】
Ｄ．プロモータ−プライマオリゴヌクレオチド
一部の実施形態においては、該方法は、プロモータ−プライマオリゴヌクレオチド（又はプライマ配列及びプロモータ配列の両方を含むオリゴヌクレオチド）によって提供される転写のためのプロモータ配列を利用する。本発明の方法及び組成物の中で使用するための１つのプロモータ−プライマは、ＲＮＡポリメラーゼの２本鎖プロモータの形成のために設計されたプロモータ配列及び、好ましくはその３′末端又はその近くにある鋳型配列に対しハイブリッド形成する能力をもつ部分を含む、１本鎖ポリヌクレオチド、一般にはＤＮＡである。１実施形態において、該プロモータ配列は、オリゴヌクレオチドの５′部分内に位置設定され、ハイブリッド形成配列はオリゴヌクレオチドの３′部分内に位置設定される。もう１つの実施形態においては、標準的に、プロモータ及びハイブリッド形成配列は異なる配列である。もう１つの可能な実施形態においては、プロモータ及びハイブリッド形成配列は配列同一性が重複している。さらにもう１つの実施形態いおいては、プロモータ及びハイブリッド形成配列は同じ配列であり、かくしてプロモータ−プライマ上の同じ場所にある。鋳型に対するプロモータ−プライマのハイブリダイゼーションが結果として、オーバーハングを含むデュプレックスをもたらす実施形態においては、適切なＲＮＡポリメラーゼによる転写をもたらす能力をもつ２本鎖プロモータを作り出すべくオーバーハングを充填するために、ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
【００８５】
数多くのＲＮＡポリメラーゼプロモータが、プロモータ−プライマのプロモータ領域のために使用可能である。適切なプロモータ領域は、適切な条件下でＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドの存在下で操作可能な形でリンクされたＤＮＡ配列から転写を開始する能力を有することになる。プロモータ領域は、「細胞の分子生物学」第２版（Garland Publishing, Inc.）内でAlberts et al.（１９８９）において記述されているように、天然に発生するＲＮＡポリメラーゼプロモータ、コンセンサスプロモータ領域又は人工プロモータ領域からの通常約１５〜２５０個のヌクレオチド好ましくは約１７〜６０個のヌクレオチドを通常含むことになる。一般に、原核生物プロモータの方が真核生物プロモータよりも好まれ、ファージ又はウイルスプロモータが最も好ましい。本書で使用されているように、「操作可能な形でリンク」という語は、影響を及ぼす配列（標準的にはプロモータ）と制御された配列（ｍＲＮＡ結合部位）の間の機能的リンケージを意味している。プロモータ配列は原核生物又は真核生物の供給源に由来し得る。
【００８６】
特に有利な代表的プロモータ領域としては、Chamberlin及びRyan,「酵素」（ed. P. Boyer, Academic Press, New York）（１９８２）ｐｐ８７−１０８の中で記述されている通りのＴ７、Ｔ３及びＳＰ６が含まれる。好ましい実施形態においては、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列は、上流側フランキング配列特に上流側Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータフランキング配列の少なくとも２０個の、好ましくは少なくとも３０個のヌクレオチドに好ましくは接合された野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列の少なくともヌクレオチド−１７〜＋６を含むＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列である。付加的な下流側フランキング配列、特に下流側Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータフランキング配列、例えばヌクレオチド＋７〜＋１０も同様に有利に使用可能である。例えば１つの特定の実施形態においては、プロモータは天然クラスＩＩＩＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列のヌクレオチド−５０〜＋１０を含む。
【００８７】
一部の実施形態においては、プロモータ−プライマは、プロモータ配列とポリヌクレオチド鋳型の３′末端にハイブリッド形成する能力をもつ部分との間に介入するリンカー配列を含んでいる。介入リンカー配列の適切な長さは、経験的に決定することができ、少なくとも約１、２、４、６、８、１０、１２、１５又はそれ以上のヌクレオチドであり得る。介入リンカー配列の適切な配列同一性も同様に経験的に決定でき、該配列は好ましくは（ただし必ずではなく）、配列の削除に比べ増幅度及びその後の選択肢を増進するように設計される。１つの実施形態においては、介入配列は、使用されるＲＮＡポリメラーゼによる増強された又はより最適な転写を提供するように設計された配列である。一般に、該配列は、標的核酸に関係しない（すなわち、実質的にハイブリッド形成しない）。より最適な転写は、前記配列に操作可能な形でリンクされたプロモータからのポリメラーゼの転写活性がリンクされていないプロモータからのものよりも大きい場合に発生する。最適な転写のための実際のプロモータの内部での配列必要条件は、一般に、例えば米国特許第５，７６６，８４９号明細書及び５，６５４，１４２号明細書などにおいてさまざまなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについて以前に記述されている通り当該技術分野において既知のものであり、同じく経験的に決定可能である。
【００８８】
標的鋳型に対してハイブリッド形成するプロモータ−プライマの部分の長さは、好ましくは約５〜約５０個のヌクレオチドであり、より好ましくは約１０〜約４０ヌクレオチド、さらに一層好ましくは約１５〜約３５個のヌクレオチド、最も好ましくは約２０〜３０個のヌクレオチドである。一部の実施形態においては、ハイブリッド形成部分は少なくともおよそ３、５、１０、１５、２０のうちのいずれかであり、およそ３０、４０、５０、６０のうちのいずれかより少ない。標的核酸上のその意図された結合配列に対するハイブリッド形成部分の相補性は好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに一層好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％〜１００％である。ポリアデニル化された標的ポリヌクレオチドの増幅のためには、プライマ部分は好ましくは以上及び以下に記述する長さのポリｄＴである。
【００８９】
以上及び本明細書全体を通して記述されているプライマ及びプロモータ−プライマオリゴヌクレオチドは、例えば既知のホスホトリエステル及び亜リン酸トリエステル方法又はその自動化された実施形態といったいずれかの適切な方法を用いて調製可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば Ozaki et al, Nucleic Acids Research, ２０：５２０５−５２１４（１９９２）；Agarwal et al, Nucleic Acids Research, １８：５４１９−５４２３（１９９０）；などの数多くのアプローチによって合成可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置、例えばApplied Biosystems, Inc. Foster City, Calif, ３９２型又は３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上で、例えば以下の参考文献中で開示されているホスホルアミジット化学といって標準的な化学を用いて、適切に合成可能である：Beaucage及びTyer, テトラヘドロン、４８：２２２３−２３１１（１９９２）；Molko et al, 米国特許第４，９８０，４６０号明細書；Koster et al, 米国特許第４，７２５，６７７号明細書；Caruthers et al, 米国特許第４，４１５，７３２号明細書；４，４５８，０６６号明細書；及び４，９７３，６７９号明細書など。
【００９０】
例えばホスホロチオアエート、ホスホルアミダートなどといった天然でないバックボーン基を結果としてもたらす代替的化学も同様に、結果として得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率及び／又は利用されるエキソヌクレアーゼの分割効率が不利な影響を受けないことを条件として、利用可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが２０〜１００個のヌクレオチドの範囲内にある。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは長さが２０〜８５個のヌクレオチドの範囲内にある。本発明のオリゴヌクレオチドの精確な配列及び長さは、それが結合する標的ポリヌクレオチドの性質によって一部左右される。特定の実施形態のための適切なアニール及び融解特性を達成するために、結合場所及び長さを変動させることができる。設計の選択を行なうための指針は、「Taqman」タイプの検定について記述する上述の参考文献の多くの中に見い出すことができる。改質された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための１つの方法は、米国特許第４，４５８，０６６号明細書の中で記述されている。生物学的供給源（例えばクローニングされたゲノミックＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化といった）生物学的供給源から単離されたプライマを使用することも同様に可能である。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態においては、プライマ対鋳型配列のモル比は、約５００：１〜約８０００：１である。より好ましいのは、約１０００：１、約１５００：１、約１６００：１、約１７００：１、約１８００：１、約１９００：１、約２０００：１、約２５００：１、約３０００：１、約３５００：１、約４０００：１、約４５００：１、約５０００：１、約５５００：１、約６０００：１、約６５００：１、約７０００：１及び約７５００：１のモル比である。最も好ましいのは、約１１００：１、約１２００：１、約１３００：１、及び約１４００：１のモル比である。プライマ対鋳型のより低い比が、その後の反応における余剰のプライマの望ましくない効果を低減させるために好ましい。プライマ対ＲＮＡ鋳型のモル比を、当該技術分野において既知の方法により決定することが可能である。
【００９２】
Ｅ．ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ及びＲＮＡポリメラーゼ
本発明の増幅方法は、以下の酵素活性を利用している：ＤＮＡポリメラーゼ、任意には、ＲＮアーゼＨといったリボヌクレアーゼ及びＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ。本発明の好ましい実施形態には、ＤＮＡポリメラーゼ活性の一部として存在するか又は外生的に供給されたまま存在するかに関わらず、ＲＮアーゼＨ活性の使用が内含される。任意には、本発明の方法は、必要に応じて余剰のプライマ（第１ストランドｃＤＮＡ合成をプライミングするのに使用されていないもの）を分解するべく（制限的な意味なく、E.coliからのエキソヌクレアーゼＩ、ＳＩヌクレアーゼ、マング・ビーン・ヌクレアーゼ又は単数又は複数の１本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ全般といったような）エキソヌクレアーゼ活性の使用を内含する。本発明の好ましい実施形態には、後続する反応に進む前に容易に不活性化され得るエキソヌクレアーゼＩの使用が内含される。もう１つの好ましい実施形態は、余剰の第１のプライマを分解するためのエキソヌクレアーゼの使用と、第２ストランド合成に用いられるプライマを保護する一方で第２ｃＤＮＡストランドを合成するためのエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼの使用を組合わせる。
【００９３】
本発明の方法及び組成物において使用するためのＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に従って複合プライマの拡張を実施する能力をもつ。従って、好ましいポリメラーゼは、少なくとも主としてデオキシリボヌクレオチドから成る核酸鋳型に沿って核酸プライマを拡張させる能力をもつポリメラーゼである。該ポリメラーゼは、変位対象ストランドが結合されているポリヌクレオチドから核酸ストランドを変位させることができなくてはならず、一般に、ポリメラーゼが示すストランド変位能力が（さほどストランド変位能力をもたないその他のポリメラーゼと比べて）高くなればなるほど好ましい。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、核酸ストランドに対しハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドの３′末端において結合するための高い親和力を有する。
【００９４】
本発明の実践のために同じく好ましいのは、ＤＮＡポリメラーゼが実質的なニッキング活性を有していない場合である。好ましくは、ポリメラーゼは、プライマ、終結又はプライマ拡張ポリヌクレオチドの分解を最小限におさえるべく５′→３′エキソヌクレアーゼ活性をほとんど又は全く有していない。一般に、このエキソヌクレアーゼ活性は、ｐＨ、塩濃度、鋳型が２本鎖であるか１本鎖であるかなどといった、全て当業者にとっては親しみのある因子によって左右される。５′→３′エキソヌクレアーゼ活性が欠失させられたか又は５′＞３′及び３′→５エキソヌクレアーゼ活性が欠失させられた突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において既知であり、本書に記述された増幅方法に適している。本発明の方法及び組成物において使用するための適切なＤＮＡポリメラーゼには、米国特許第５，６４８，２１１号明細書及び５，７４４，３１２号明細書で開示されているものが内含され得、これらには、exo” Vent (New England Biolabs), exo” Deep Vent (New England Biolabs), Bst (BioRad), exo”Pfu(Stratagene), Bca(Panvera), 配列決定グレードのTaq (Promega),及びThermoanaerobacter thermohydrosulfuricusからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００９５】
ＤＮＡポリメラーゼが、ポリメラーゼとプライマ拡張産物の５′末端の間の接触発生の少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに一層好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％において、鋳型核酸からプライマ拡張産物を変位させることが好ましい。一部の実施形態では、ストランド変位活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。米国特許第５，７４４，３１２号明細書（及びその中に引用されている参考文献）中に記述されているものといったこのようなポリメラーゼが当該技術分野において既知である。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはプルーフリーディング活性をほとんど乃至全く有していない。
【００９６】
発明は単にＤＮＡポリメラーゼ活性の使用を必要としているが、本発明は好ましくは、個々のポリメラーゼが、標的ポリヌクレオチドに対応するｃＤＮＡ分子の第２のストランドの合成において任意にはＲＮアーゼＨの存在下でエキソヌクレアーゼ欠損クレノウ、Ｔaq ポリメラーゼ及びシーケナーゼTMから個別に選択されている、ポリメラーゼ活性の組合せを用いて実施される。最も好ましいのは、ＲＮアーゼＨの存在下又は不在下での単独で又はＴaq ポリメラーゼとの組合せの形でのエキソヌクレアーゼ欠損クレノウの使用である。エキソヌクレアーゼ欠損クレノウとＴaq ポリメラーゼの組合せは、この組合せがその他のポリメラーゼに比べ改善されたｃＤＮＡ合成ひいてはａＲＮＡ産生をもたらすという予想外の発見を結果としてもたらした。本発明の実施において使用するための、研究又は商業的応用に適していない活性及び条件の識別を含めた、さまざまなポリメラーゼ活性及び条件をテストし最適化する方法が、当該技術分野において既知である。
【００９７】
エキソヌクレアーゼ欠損クレノウ及びＴaq組合せの使用のための好ましい条件は、３７℃でクレノウを機能させ、その後低いクレノウ活性条件下でＴaq ポリメラーゼが機能できるようにするため温度を上昇させることである。本発明の好ましい実施形態においては、約９５℃での熱処理から除去された後（例えば氷内又は氷水浴上への配置）、第１ストランドｃＤＮＡというランダムプライマの混合物に対し、２つの酵素が添加される。その後混合物を約５〜約１０分間室温に置き、その後約１０〜約３０分間３７℃まで上昇させ、その後約５〜約１５分間約７２℃に置く。本発明の好ましい実施形態においては、ランダムプライマ及びＤＮＡポリメラーゼ活性の付加後第２のｃＤＮＡストランドの合成が完了するまで室温以上に混合物を維持する。
【００９８】
本発明の変形実施形態においては、時間及び温度を以上の条件との関係において調整することができるが、第２ストランドｃＤＮＡ合成のための時限は、好ましくは約３時間を超えず、好ましくは約１〜約２時間の範囲内で完了させられる。最も好ましいのは、この時限が約１時間又は約３０分未満となることである。
【００９９】
本発明の実践においては、Superscript ＲＴＩＩ（任意にはＲＮアーゼＨマイナス）、「正規の」ＭＭＬＶ−ＲＴ（固有のＲＮアーゼＨ活性を伴う）、ＡＭＶＲＴ又はそれらの組合せを含めた（ただしそれらに制限されるわけではない）あらゆる逆転写酵素を使用することができる。
【０１００】
本発明の方法及び組成物において使用するためのリボヌクレアーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリット内でリボヌクレオチドを分割する能力を有する。好ましくは、リボヌクレアーゼは、分割されるべきリボヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの同一性及びタイプとは無関係にリボヌクレオチドを分割する。リボヌクレアーゼが配列同一性とは独立して分割することが好ましい。本発明の方法及び組成物のための適切なリボヌクレアーゼの例は、E.coliからのリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）又はレトロウイルス逆転写酵素と結びつけられたＲＮアーゼＨを含め、当該技術分野において周知である。
【０１０１】
Ｆ．付加的な増幅ラウンド
出発ＲＮＡ標的ポリヌクレオチドの合計レベルが制限されている場合（例えば、総ＲＮＡの２０ng未満又はポリ（Ａ）ＲＮＡの形でのｍＲＮＡの最高４００pg未満）、本発明の方法に従って、ａＲＮＡの増幅の第２ラウンド及びさらなるラウンドを実施することができる。かかる付加的ラウンドは、当然のことながら、１回以上、例えば２回、３回又は４回（ただしこれらに制限されるわけではない）実施可能である。
【０１０２】
標準的に少なくとも増幅１ラウンドにつき約２０〜４０、標準的に５０〜１００又は２５０倍まで、又は５００〜１０００倍又は５００〜２０００倍以上となる増幅は、ナノグラム量未満の総ＲＮＡ（従ってピコグラムのポリ（Ａ）ＲＮＡ出発材料）から達成でき、標準的な分子生物学実験室条件下で経済的にかつ簡単に実施される。同様に、それは容易にキット形態に適応させることができる。
【０１０３】
本発明の任意の１実施形態において、１つ又は両方のｃＤＮＡ ストランドの合成は、アデノシン、シトシン、チミジン、グアニン又はイノシンのデオキシリボ又はリボヌクレオチドの重合体といったような（ただしこれに制限されるわけではない）反復的ポリヌクレオチドの存在下で行なわれる。特に好ましいのは、標的ポリヌクレオチドの量、特に標的ＲＮＡの量がピコグラム範囲内といったように非常に少ない状況においてその内含が特に有利であり得るポリイノシン（ポリＩ）の使用である。多い方の標的量がナノグラム範囲といったようにさらに多い場合、かかる重合体の内含に対する付加的利点は少なくなる。
【０１０４】
総ＲＮＡの精製におけるpolyＩの使用は、Winslow et al.により評価されてきた（Nucl. Acids Res.１９（１２）；３２５１−３２５３，１９９１）。
【０１０５】
Ｇ．用途：ポリヌクレオチド発現の検出及び関連する診断方法
特定の制限的な意味のない実施形態において、本発明は、癌細胞を検出し、対象の体内の癌及びその重症度（例えば腫瘍の異型度、全身腫瘍組織量など）の診断を容易にし、対象の予後の決定を容易にし、療法に対する対象の応答性を（例えば、化学療法処方計画中又はその後に全身腫瘍組織量を査定することなどを通して治療効果の尺度を提供することにより）査定するために有用な方法を提供する。検出は、細胞内で示差的に発現されたポリヌクレオチドの検出、及び／又は細胞内で示差的に発現されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの検出に基づく可能性がある。本発明の検出方法は、インビトロ又はインビボで、単離された細胞上で又は全組織内又は体液（例えば血液、血漿、血清、尿など）の中で実施可能である。
【０１０６】
生きた又は固定された（レーザー捕捉顕微解剖又はその他の切開方法を介して組織切片から）、単一又は多数の細胞からのｍＲＮＡ又はＲＮＡのａＲＮＡを、以下のものを生成するのに充分な形で増幅させることができる：ハイブリダイゼーション実験（例えばＤＮＡマイクロアレイ又はマクロアレイ）のためひいてはさまざまな細胞型又は個々の細胞の遺伝子発現プロフィールを（Serafini et al., 米国特許第６，１１０，７１１号明細書により開示されているものと類似の要領で）生成するための標識されたプローブ；  選択された細胞由来のｍＲＮＡを含有しその後正規化されたライブラリ又はさまざまなサブトラクティブハイブリダイゼーション方法を生成するのに用いられるｃＤＮＡライブラリ；そのときＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＲＴ−ＰＣＲのために（個々のｍＲＮＡをその後定量化するため）用いられるｃＤＮＡ；示差的に発現された遺伝子を生み出すさまざまな方法（すなわち示差的表示及び増幅差分析（ＲＤＡ）のために後に使用するためのｃＤＮＡ；及びサブトラクティブハイブリダイゼーションといったようなさまざまなサブトラクティブ方法において使用可能な増幅されたＲＮＡ、単一の細胞からのｍＲＮＡの増幅は本発明の１つの好ましい実施形態であり、２つ以上の細胞の使用に起因する異種ｍＲＮＡを増幅させる可能性を無くする上で利点を提供する。しかしながら、本発明は同様に、約１００以下の細胞、約１００〜２００個、約２００〜３００個、約３００〜４００個、約４００〜５００個、約５００〜６００個、約６００〜７００個、約７００〜８００個、約８００〜９００個又は約９００〜１０００以上の細胞の集団で実施することもできる。
【０１０７】
上述の通り、本発明の方法は、増幅したＲＮＡ集団内の特定の遺伝子配列から転写されたＲＮＡの存在又は不在を見極めることにより細胞又は細胞集団上の（遺伝的多型に起因して異なる配列を含むもののこれらに制限されるわけではない）特定の遺伝子配列の発現を検出するために使用可能である。特定の遺伝子の発現レベルは同様に、増幅されたＲＮＡの集団全体の中で増幅されたその他のＲＮＡとの関係においても決定可能である。異なる組織又は細胞型（又は同じ組織又は細胞型の異なる生理学的状態）の間の発現レベルも同様に、異なる組織又は細胞型（又は癌及び非癌細胞といった（ただしこれに制限されるわけではない）異なる生理学的状態の下での同じ組織又は細胞型）から増幅されたＲＮＡを調製し、異なる供給源から産生した増幅されたＲＮＡの種を比較することによって、比較することができる。本発明の異なる生理学的状態には、異なる薬物（又はその他の活性作用物質）に誘発された状態、異なる挙動状態、異なる発達状態、異なる刺激状態、異なる活性化又は阻害状態又は異なる覚醒状態が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１０８】
当該方法は同様に、サブトラクティブハイブリダイゼーションプローブとして使用されるか又は（例えば増幅第２ラウンドの後でインビトロ転写無く）ｃＤＮＡライブラリの成員のための鋳型として使用される増幅されたＲＮＡを産生するためにも使用可能である。サブトラクティブハイブリダイゼーションのための技術は当該技術分野において既知であり、当該方法の使用は、サブトラクションにおいて使用するためのＲＮＡを産生する有利な手段を提供する。同様にして、ｃＤＮＡライブラリを調製するための技術は、当該技術分野において既知であり、当該方法は、ライブラリの成員配列を産生する有利な手段を提供する。
【０１０９】
Ｈ．増幅された分子の標識と検出
標識された標的ポリヌクレオチドの検出は、標識された配列を検出するために用いられる標準的方法によって実施可能である。例えば、鋳型として増幅されたＲＮＡを用いたｃＤＮＡ生成の中に蛍光ヌクレオチドを取込むことなどによって直接蛍光標識又は放射性標識を検出することができる。その他の標識技術は、ビオチン又はジゴキシゲニンといったような標識がＤＮＡ又はＲＮＡ内に取込まれ（増幅されたＲＮＡから生成されたｃＤＮＡ内で又は増幅中）、標識されているか又はそれ自体標識された分子を結合しうる抗体又はその他の結合分子（例えばストレプトアビジン）により検出されることを必要とする可能性がある。例えば、標識された分子は、蛍光分子（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド及びローダミン）又は酵素的に活性な分子のいずれかに接合された抗ストレプトアビジン抗体又は抗ジゴキサゲニン抗体であり得る。新たに合成された分子上の標識が何であろうと、標識がＤＮＡ内に直接存在するか又はＤＮＡに結合する分子に接合されている（又はＤＮＡに結合する分子に結合する）かに関わらず、標識（例えば蛍光、酵素、化学発光又は比色分析）は、標識に応じてレーザースキャナ又はＣＣＤカメラ、又はＸ線フィルムによって、又は特定の標識を検出するためのその他の適切な手段によって検出することができる。
【０１１０】
増幅された標的ポリヌクレオチドは、増幅中に取込まれた標識されたヌクレオチドを用いることにより（例えば、直接標識するためのｄＮＴＰ−蛍光標識；及び間接的標識のためのｄＮＴＰ−ビオチン又はｄＮＴＰ−ジゴキシゲニン）、又は鋳型として増幅されたＲＮＡを用いる場合にはｃＤＮＡ合成中にそれを取込むことによって、検出可能である。間接的に標識されたＤＮＡのためには、検出は蛍光又はその他の酵素接合されたストレプトアビジン又は抗−ジゴキシゲニン抗体により実施される。該方法は、ポリヌクレオチド標的に対する新たに合成された補体の中で取込まれた組織を検出することによる、ポリヌクレオチドの検出を利用している。この目的で、例えば以上で記述され又当該技術分野において既知である通りのフルオロ−ｄＮＴＰ、ビオチン−ｄＮＴＰ、又はジゴキシゲニン−ｄＮＴＰといった、合成された通りのＤＮＡ内に取込まれ得るあらゆる標識を使用することが可能である。示差的発現系内では、起源に基づいて増幅された標的ポリヌクレオチドを示差的に（例えば赤色染料及び緑色染料）標識することによって、異なる生物学的供給源に由来する増幅産物を検出することができる。
【０１１１】
好ましい実施形態においては、ｃＤＮＡ合成を介したその後のプローブ生成の間蛍光性ヌクレオチドを取込むための鋳型として増幅されたＲＮＡが使用される。
【０１１２】
検出のためには、光検出手段が好まれるが、放射活性、原子スペクトルなどといったようなその他の検出方法を利用することも可能である。光検出手段としては、蛍光、リン光、吸収、化学発光などを利用することができる。最も便利であるのは、数多くの形態をとり得る蛍光であろう。特にシフト幅の広い（少なくとも２０ｎｍ）複数の発光波長を有することが望まれる場合、個別の蛍光剤又は蛍光剤対を使用することができる。蛍光剤の一例としては、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、シアニン染料、フィコエリスリン、チアゾールオレンジ及びブルーなどが含まれる。
【０１１３】
ａＲＮＡの特に意図された用途に応じて、ａＲＮＡを標識することができる。当該発明で使用されうる１つの標識方法は、32Ｓ、32Ｐ、3Ｈなどといった放射性標識で単数又は複数のヌクレオチドが標識される同位体標識である。もう１つの標識手段は、例えばＣＴＰなどの蛍光タグの付いたヌクレオチドが転写中にａＲＮＡ産物内に取込まれる蛍光標識である。標識されたアンチセンスＲＮＡを産生するためにヌクレオチドをタグ付けするべく使用可能である蛍光部分には、フルオロセイン、シアニン染料、例えばＣｙ３、Ｃｙ５、Alexa５４２、Bodipy６３０／６５０などが含まれる。
【０１１４】
Ｉ．核酸の特徴づけ
本発明の方法によって得られた増幅産物は、一部には該産物が１本鎖であることを理由にして、さらなる特徴づけに特に敏感に反応する。ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであれ、増幅された産物は、ニトロセルロースといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）固体支持体上のサザン及びノーザンブロッティングといったような当該技術分野において既知のプローブハイブリダイゼーション技術を用いて分析可能である。増幅された産物は同様に、オリゴヌクレオチドプローブ又はｃＤＮＡを含むマイクロアレイとそれらを接触させることによっても分析可能である。プローブの同一性は、増幅された産物の配列同一性、ひいては外挿法により前記鋳型核酸を含有する疑いのある標本中に存在する鋳型核酸の同一性の特徴づけを提供する。上述のハイブリダイゼーションベースの技術を、同様に、単一の遺伝子配列からの発現を検出するために使用することもできる。
【０１１５】
Ｊ．キット
同様に提供されているのは、当該発明において使用するためのキットであり、ここでかかるキットは、例えば緩衝液、適切なヌクレオチド３リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び単数又は複数の配列特異的プライマ、縮重プライマ、ランダムプライマ、ポリ−ｄＴプライマ及び本発明の対応するプロモータ−プライマ及びタグ付きプライマを内含する、該方法内で利用された（標準的に濃縮した形態の）さまざまな試薬のうちの単数又は複数のものを各々伴う容器を含み得る。本発明のｍＲＮＡ増幅方法におけるキットコンポーネントについて記述するラベル又はインジケータ又はその使用のための説明書一式も同じく標準的に内含されることになり、ここでこれらの説明書は、パッケージインサート及び／又はキット又はそのコンポーネントの包装と結びつけられていてよい。
【０１１６】
以上で本発明について全般的に記述してきたが、同じことは、例示として提供され、相反する規定のないかぎり本発明を制限するよう意図されたものではない以下の例を参照することによって、さらに容易に理解できることであろう。使用される数（例えば量、温度など）に関する精度を確保するように努力がなされてきたが、幾分かの実験上の誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。相反する指示のないかぎり、部分数は、重量部分であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度、圧力は大気圧又は大気圧前後である。
【実施例】
【０１１７】
実施例
実施例１；増幅技術の比較
増幅方法及びｍＲＮＡの全長を同等に表わすこの方法の能力を実証するべく、図１に概略説明された増幅方法を総ＲＮＡと共に使用した。２００１年１０月２５日に提出され２００３年１月３０日付けで米国特許第２００３／００２２１９４号として公開された米国特許出願第１０／０６２，８５７号明細書中に記述されているRibo AmpTM増幅プロセスの１ラウンドを対照として実施した。Ribo AmpTMプロセスは、ｍＲＮＡ分子の３′末端の増幅に向かう偏向を有するものであることが観察されてきた。真核生物細胞から抽出した１０ｎｇの総ＲＮＡを包括的増幅又はRibo Amp 増幅のいずれかに付した。図３は、増幅方法の各々についてのゲルを示している。
【０１１８】
実施例２：  発明の包括的増幅方法における偏向の欠如
各セットが３つの領域の１つに対応する３つの別々のプライマセットを使用して、β−アクチンｍＲＮＡの５′、中央及び３′部分で３つのヒトβ−アクチンアンプリコンの存在を調査するべく、Light CyclerTMを用いたＱ−ＰＣＲを介して、例１のｃＤＮＡ合成反応のアリコートを検定した。結果は図４に示されている。
【０１１９】
Ｑ−ＰＣＲの結果は、ＩＶＴ増幅後の標本についての閾値サイクル数（ＣT）と、増幅前標本についてのＣTの間の差である△ＣTとして表現されており、ＣTは、蛍光対サイクルデータの外挿法を介してバックグラウンドよりも蛍光が著しく高いことが見極められた点である。結果は、（「GlobalAmp」として表わされた）本発明の増幅方法が、β−アクチンｍＲＮＡの３′、中央及び５′領域の各々から誘導された均等な量の材料を結果としてもたらすということを示している。これら３つの領域についてのΔＣT値はそれぞれ６．６５、６．１０及び６．０１であった。
【０１２０】
これは、ｍＲＮＡの３′末端から誘導された材料がはるかに多いという結果をもたらすRibo Amp方法（それぞれベータアクチンｍＲＮＡの３′、中央及び５′領域の各々について５．５５、６．６５及び９．６２のΔＣｒ値）との比較におけるものである。これらの結果は、本発明の包括的増幅方法の非偏向性を実証している。
【０１２１】
特許、特許出願及び刊行物を含む、本書で引用されている全ての参考文献は、以前に特定的に包含されていたか否かに関わらず、ここにその全体が参考として内含されている。
【０１２２】
ここに本発明について完全に記述してきたが、当業者であれば、本発明の本質及び範囲から逸脱することなくかつ過度の実験なく同等のパラメータ、濃度及び条件の広い範囲内でこれを実施できるということを認識することだろう。
【０１２３】
本発明は、その特定の実施形態に関連して記述されてきたが、それはさらに修正が可能であることもわかるだろう。本出願は、一般に本発明の原理に従い、本発明が関連する技術の範囲内の既知の又は慣行的実践の範囲内に入るような、そして以上で記した基本的特長に適用しうるような本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形形態、用途又は適応を網羅するように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、標的ポリヌクレオチドとして１本鎖ＲＮＡ分子を用いた全ＲＮＡの線形増幅のための本発明の１つの実施例の例示である。この図は、本発明の選択された態様を指摘することにより本書で開示された通りの「ラウンド１」の実施形態を示している。
【図２】図２は、「センス」ａＲＮＡを産生するＤＮＡ鋳型が「アンチセンス」ａＲＮＡを産生するべく転換されるような形でストランドの反転を実証するための、本発明のもう１つの実施形態の例示である。
【図３】図３は、２００１年１０月２５日に出願され２００３年１月３０日に米国特許第２００３／００２２１９４号明細書として公表された米国特許出願第１０／０６２，８５７号明細書の方法と比べた本発明の方法を用いた増幅の結果を示している。本書の実施例１を参照のこと。
【図４】図４は、図３由来の産物の定量的ＰＣＲ分析の結果を示している。本書の実施例２を参照のこと。
【図１】
2006520603.tif 000002
【図２】
2006520603.tif 000003
【図３】
2006520603.tif 000004
【図４】
2006520603.tif 000005
【国際調査報告】
2006520603.tif 000006
2006520603.tif 000007
2006520603.tif 000008