(57)【要約】本発明は、これに限定されないがウイルス等の病原体による哺乳動物および鳥類における感染の治療および予防に有用な化合物を提供する。本発明はさらに、肝硬変および肝細胞癌等の他の疾患状態の治療に有用な化合物を提供する。本発明はさらに、病原性の生物およびウイルスによる感染または他の疾患状態を診断する方法、および診断手順において有用な薬剤を提供する。本発明はさらに、病状をモニターする方法、および病原性の生物またはウイルスによる感染または他の病的状態の発症に対する、対象の感受性の指標を提供する方法を意図する。特に、本発明により、対象が感染または疾患状態の治療的または予防的介入に反応する可能性のレベルの予測を含めて、対象がそのような介入に反応するかどうかを決定することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含む、病原体による感染もしくは疾患状態またはそれらの素因の存在を検出する方法であって、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって病原体による感染または疾患状態もしくはそれらの素因の存在が示される方法。
【請求項２】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が上方制御される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
病原体がC型肝炎ウイルス（HCV）である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
病態が肝硬変である、請求項2記載の方法。
【請求項５】
病態が肝細胞癌である、請求項2記載の方法。
【請求項６】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が下方制御される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
病原体がB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
病原体が、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属（Pasteurella）、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属（Ureaplasma）、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属（Chlamydophila）、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属（Burkholderia）、ディケロバクター属（Dichelobacter）、ヘモフィルス属、ラルストニア属（Ralstonia）、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属（Erwinia）、エンテロバクター属、アロゾナ属（Arozona）、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属（Arcobacteria）、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属（Bacterioides）、コクシジオミセス属（Coccidiomyces）、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、およびヘリコバクター属から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびロタウイルスから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがそれらをコードするmRNAの量によって決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがタンパク質レベルで決定される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含む、病原体による感染または疾患状態の発症に向けられた治療手順に対する反応をモニターする方法であって、処置前のレベルおよび/または標準化対照と比較した場合のTLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって治療反応の有効性が決定される方法。
【請求項１３】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が治療手順によって上方制御される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が治療手順によって下方制御される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
病原体がC型肝炎ウイルス（HCV）である、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
病態が肝硬変である、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
病態が肝細胞癌である、請求項12記載の方法。
【請求項１８】
病原体がB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項12記載の方法。
【請求項１９】
病原体が、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属、ディケロバクター属、ヘモフィルス属、ラルストニア属、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属、エンテロバクター属、アロゾナ属、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属、コクシジオミセス属、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、およびヘリコバクター属から選択される、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびロタウイルスから選択される、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがそれらをコードするmRNAの量によって決定される、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがタンパク質レベルで決定される、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含む、対象が病原体による感染または疾患状態の治療的または予防的介入に対して反応するかどうかを決定する方法であって、処置前のレベルおよび/または標準化対照と比較した場合のTLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって治療的介入の潜在的有効性が決定される方法。
【請求項２４】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が上方制御される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
病原体がC型肝炎ウイルス（HCV）である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
病態が肝硬変である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
病態が肝細胞癌である、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が下方制御される、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
病原体がB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
病原体が、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属、ディケロバクター属、ヘモフィルス属、ラルストニア属、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属、エンテロバクター属、アロゾナ属、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属、コクシジオミセス属、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、およびヘリコバクター属から選択される、請求項23記載の方法。
【請求項３１】
病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびロタウイルスから選択される、請求項23記載の方法。
【請求項３２】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがそれらをコードするmRNAの量によって決定される、請求項23記載の方法。
【請求項３３】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがタンパク質レベルで決定される、請求項23記載の方法。
【請求項３４】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含む、病原体による感染または疾患状態の発症に向けられた治療手順の転帰を予測する方法であって、処置前のレベルおよび/または標準化対照と比較した場合のTLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって治療反応の有効性が決定される方法。
【請求項３５】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が治療手順によって上方制御される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が治療手順によって下方制御される、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
病原体がC型肝炎ウイルス（HCV）である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
病態が肝硬変である、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
病態が肝細胞癌である、請求項34記載の方法。
【請求項４０】
病原体がB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
病原体が、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属、ディケロバクター属、ヘモフィルス属、ラルストニア属、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属、エンテロバクター属、アロゾナ属、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属、コクシジオミセス属、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、およびヘリコバクター属から選択される、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびロタウイルスから選択される、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがそれらをコードするmRNAの量によって決定される、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがタンパク質レベルで決定される、請求項34記載の方法。
【請求項４５】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体を上方制御または下方制御する薬剤の有効量を対象に投与する段階を含む、病原体によって感染した、もしくは疾患状態を有する、またはそれらの素因を有する対象を治療する方法。
【請求項４６】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が薬剤によって上方制御される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体が薬剤によって下方制御される、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
病原体がC型肝炎ウイルス（HCV）である、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
病態が肝硬変である、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
病態が肝細胞癌である、請求項45記載の方法。
【請求項５１】
病原体がB型肝炎ウイルス（HBV）である、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
病原体が、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属、ディケロバクター属、ヘモフィルス属、ラルストニア属、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属、エンテロバクター属、アロゾナ属、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属、コクシジオミセス属、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、およびヘリコバクター属から選択される、請求項45記載の方法。
【請求項５３】
病原体が、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびロタウイルスから選択される、請求項45記載の方法。
【請求項５４】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがそれらをコードするmRNAの量によって決定される、請求項45記載の方法。
【請求項５５】
TLR-2もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルがタンパク質レベルで決定される、請求項45記載の方法。
【請求項５６】
対象が、ヒト、非ヒト霊長動物、家畜動物、ペット動物、または鳥類から選択される、請求項45記載の方法。
【請求項５７】
対象がヒトである、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
薬剤が、大化学分子もしくは小化学分子、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、またはRNAiから選択される、請求項45記載の方法。
【請求項５９】
薬剤がアンチセンス分子である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
薬剤が抗体である、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
薬剤がセンス分子またはアンチセンス核酸分子またはRNAiである、請求項58記載の方法。
【請求項６２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項58記載の方法。
【請求項６３】
抗体が非免疫化抗体である、請求項58記載の方法。
【請求項６４】
TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のアンタゴニストまたはアゴニストならびに1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む、病原体による感染もしくは疾患状態またはそれらの素因の治療において使用するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、これに限定されないがウイルス等の病原体による哺乳動物および鳥類における感染の治療および予防に有用な化合物を提供する。本発明はさらに、肝硬変および肝細胞癌等の他の疾患状態の治療に有用な化合物を提供する。本発明はさらに、病原体およびウイルスによる感染または他の疾患状態を診断する方法、および診断手順において有用な薬剤を提供する。本発明はさらに、病状をモニターする方法、および病原体またはウイルスによる感染または他の病的状態の発症に対する対象の感受性の指標を提供する方法を意図する。特に、本発明により、対象が感染または疾患状態の治療的または予防的介入に反応する可能性のレベルの予測を含めて、対象がそのような介入に反応するかどうかを決定することが可能になる。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書において言及する出版物の書誌的詳細もまた、本記載の末尾に収載する。
【０００３】
本明細書におけるいかなる先行技術への言及も、この先行技術があらゆる国における共通の一般知識の一部を形成することを認識するものでも、いかなる形で示唆するものでもなく、またそのように解釈されるべきではない。
【０００４】
世界中では1億7千万人を超える人々がC型肝炎ウイルス（HCV）に感染しており、疾患の大きな苦しみおよび著しく高い死亡率をもたらしている。HCVが感染の急性期に排除されることは稀であり、ほとんどの患者が慢性的に感染した状態になる；これらの患者のある割合が進行性肝疾患および線維症を発症する。感染の転帰は先天性免疫系および同族（cognate）免疫系の両方の免疫応答に依存し、これら免疫系はサイトカインおよびケモカインのネットワークによって組織化されている。
【０００５】
B型肝炎ウイルス（HBV）もまた衰弱させる疾患状態をもたらし、急性肝不全を起こし得る。HBVはRNA中間体を介して複製するDNAウイルスであり、その複製方法において逆転写を利用する。HBVゲノムは、表面遺伝子、コア遺伝子、ポリメラーゼ遺伝子、およびX遺伝子をコードする重複したオープンリーフディングフレームを有する、部分的に二本鎖DNA構造を有する複雑な性質をしている。
【０００６】
宿主とウイルスとの関係は動的過程であり、HCVおよびHBV等の多くのウイルスはそれらの認知度を最大限にしようとし、宿主は感染を妨げ根絶しようとする。ウイルスが複製し他の細胞に感染するためには、最初に標的細胞と結合してその細胞に侵入し、適当な細胞内コンパートメントへ移動しなければならない。感染細胞ではウイルスによって、ウイルスの複製サイクルの1つまたは複数の段階を阻害するサイトカイン（例えば、TNF-αおよびIFN-γ）の産生が誘発され得り、それにより感染の程度が制限される。
【０００７】
宿主の単球およびマクロファージは、感染に対する直接的および間接的効果を有するIL-1、TNF-α、IL-6、IL-12、およびIL-18等の炎症促進性サイトカインを分泌し、ウイルスに対する初期応答において重要な役割を担う。これらはさらなる単球、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびT細胞を動員して機能し得り、また適切なTh機能への転換を支持してウイルスの根絶に役立ち得る。
【０００８】
これらの炎症促進性サイトカインの産生をもたらす微生物病原体に対する先天性免疫は、トール様受容体（TLR）の活性化の結果として起こる。細菌の産物、例えばエンドトキシンおよびペプチドグリカンが関与するTLRの役割は最近明らかにされた（Akashi et al., J Immunol. 164: 3471-3475, 2000；Takeuchi et al., Immunity, 11: 443-451, 1999；Trapping et al., J Immunol. 165: 5780-5787, 2000）。10を超えるTLRが同定されたが、それらは多くの異なる細菌による活性化において重要な役割を果たす。呼吸器合胞体ウイルス（RSV）がマウスモデルにおいてTLR-4を刺激すると実証されたことにより、最近になってこれがウイルスにまで拡張された（Kurt-Jones et al., Nat Immunol, 1:398-401, 2000；Haeberle et al., J Infect Dis. 186: 1199-1206, 2002）。さらに、麻疹ウイルス（MV）がTLR-2依存性シグナルを活性化することが示され（Bieback et al., J Virol, 76:8729-8736, 2002）、また二本鎖DNA（多くのウイルスの中核）がTLR-3を介する応答を直接媒介することが示された（Matsumoto et al., Biochem Biophys Res Commun. 293: 1364-1369, 2002）。
【０００９】
TNF-α等の炎症促進性サイトカインの循環レベルは、肝硬変および進行中の肝障害を有する患者において有意に増加している
2006520588.tif 000002
。TNF-αは、動物モデルにおけるアルコール誘導性急性肝障害の発症において重要な因子であることが示された（Iimuro et al., Hepatology 26: 1530-1537, 1997；Yin et al., Gastroenterology 117: 942-952, 1999）。グラム陰性菌の細胞壁の成分であるエンドトキシンによるマクロファージの活性化は、そのようなモデルにおけるTNF-α過剰産生および肝障害の病因において重要な役割を果たす（Enomoto et al., J. Biomed Sci. 8: 20-27, 2001）。この設定において、腸管内腔からのエンドトキシンの移行の増加および肝クリアランス能の低下を含むいくつかの要因により内毒血症が促進される（Nanji et al., Am J Pathol. 142: 367-373, 1993；Rivera et al., Am J Physiol. 275: G1252-1258, 1998）。この臨床設定において、いくつかの研究により肝硬変を患う患者の循環エンドトキシンレベルが比較的穏やかではあるが有意に増加することが示され
2006520588.tif 000003
、また内毒血症がこの群における循環TNF-αレベルの増加に関与すると想定された（Tilg et al., 1992、前記；von Baehr et al., 2000、前記；Schafer et al., Z Gastroenterol 33: 503-508, 1995；Deviere  et al., Gastroenterology 103: 1296-1301, 1992）。内毒血症はまた、肝硬変において見られる可溶性TNF受容体（sTNFR）等の抗炎症媒介物質の末梢血レベルの上昇に関与すると想定された（von Baehr et al., 2000、前記；Tilg et al., Hepatology, 18: 1132-1138, 1993）。それにもかかわらず、循環エンドトキシンとサイトカインレベルの有意な相関関係は一般に実証されておらず（Khoruts et al., 1991、前記；Tilg et al., 1993、前記；von Baehr et al., 2000、前記；Chan et al., 1997、前記）、動物モデルの場合とは異なりエンドトキシン以外の刺激が重要であるという可能性が提起される。
【００１０】
微生物刺激に応答したマクロファージによるTNF-α産生がTLRの活性化に決定的に依存することが最近実証された（Medzhitov et al., N Engl J Med. 343: 338-344, 2000；Yoshimura et al., J Immunol. 163: 1-5, 1999；Akira et al., Nature Immunolog, 2: 675-680, 2001）。上記のように、TLRは保存された分子パターンの認識を介して微生物病原体に対する先天性免疫の誘導において重要な役割を果たす。特に、TLR-4はCD14と会合して、エンドトキシンに応答してTNF-αの産生をもたらすシグナル伝達に関与することが知られている。一方、TLR-2は、細菌全体ならびにペプチドグリカンおよびリポテイコ酸（LTA）等の細胞壁成分を含む多くのグラム陽性菌刺激に応答したシグナル伝達に必要である（Medzhitov et al., 2000、前記；Yoshimura et al., 1999；前記；Akira et al., 2001、前記）。
【００１１】
微生物またはウイルス等の病原体による感染または他の病的状態におけるTLRの役割を調査する必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という用語または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」等の変化形は、規定した要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を含むことを意味するが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を排除することを意味するものではないと理解される。
【００１３】
本発明は、病原体またはウイルスによる感染に応答して、または他の疾患状態に応答して差次的に影響を受ける細胞表面マーカーを同定する。したがって、細胞表面マーカーは有用な治療および/または診断標的である。特に、本発明は、微生物およびウイルス等の病原体による感染または他の疾患状態の発症の有用な治療および診断マーカーとしてトール様受容体（TLR）を同定する。さらに、TLRは治療的介入に対する対象の潜在的反応性に関する有用な指標であり、これにはその可能性に関するまたはさもなければ治療的介入に有利に反応する対象の予測を可能にすることが含まれる。そのような予測はリスク評価の形式である。TLRはロイシンリッチな反復を有する外部ドメインを含み、インターロイキン-1受容体I型（IL-1RI）およびIL-1RIアクセサリータンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインと高度に相同的な細胞内モチーフを含む。これまでに、TLR-1〜TLR-11と命名された11のTLRが同定されている。
【００１４】
本発明に従って、TLR、特にTLR-2およびTLR-4が、微生物またはウイルス等の病原体による感染後に、末梢血単核細胞（PBMC）、特にCD14+ PMBC（すなわち単球）および肝細胞において差次的に影響を受けることが同定される。したがって、TLR、特にTLR-2およびTLR-4は、病原体による感染を治療するまたは感染の予防を促進する治療薬または予防薬の有用な標的である。TLRはまた、これらに限定されないが肝硬変および肝細胞癌（HCC）等の他の疾患状態に応答して差次的に影響を受ける。これらはまた、対象が病原体に感染するかどうかもしくは感染しているかどうか、または対象が持続感染する傾向があるかどうかもしくは持続感染を有するかどうかもしくは別の疾患状態を有するかどうかを決定するための有用な診断標的であり、臨床的または疫学的管理手段として使用することができる。
【００１５】
したがって、本発明は、TLR-2およびTLR-4等のTLRのレベルを調節し得る治療薬および/または予防薬を提供する。例えば、C型肝炎ウイルス（HCV）による感染過程では、TLR-2およびTLR-4レベルはPBMC、特に単球および肝細胞において上昇する。よって、これらのTLRを下方制御する治療薬および予防薬を設計するかまたは選択する。逆に、B型肝炎ウイルス（HBV）による感染はTLR-2レベルを下方制御する。よって、TLR-2レベルを上方制御する治療薬を設計するかまたは選択する。さらに、TLR-2レベルは肝硬変またはHCC等の肝臓病態において上昇する。
【００１６】
本発明はさらに、PMBCおよび/または肝細胞におけるTLR-2および/またはTLR-4等のTLRのレベルを決定することによる、微生物またはウイルス等の病原体による感染を診断または評価する方法を提供する。一例においては、初期の治療過程において、TLR-2および/またはTLR-4レベルが変化（例えば、増加または減少）し得ないことによって、その治療手順が作用しない何らかの可能性を有するという示唆が提供される。
【００１７】
したがって本発明は、哺乳動物もしくは鳥類における病原体による感染または感染の素因もしくは感染の残存の治療、予防、および/または診断に有用である治療薬および診断薬ならびにそれらを含む組成物を意図する。本発明のこの局面は、これらに限定されないが肝硬変およびHCC等の他の疾患状態の治療および診断にまで拡張される。
【００１８】
本発明はさらに、治療に対する反応をモニターする方法および治療計画の有効性を決定する方法を提供する。
【００１９】
好ましい哺乳動物はヒトである。好ましい鳥類は家禽鳥類である。
【００２０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、一つには、微生物またはウイルス等の特定の病原体による感染または他の疾患状態の発症に関連する特定の細胞表面マーカーのレベルの決定に基づく。より詳細には、本発明は、微生物またはウイルス等の病原体による感染過程において、または肝硬変および肝細胞癌（HCC）等の特定の疾患状態の発症過程において差次的に発現されるTLR遺伝子を同定する。
【００２１】
1つの特定の態様では、HCVによる感染によってCD14+ PMBC（すなわち単球）および肝細胞におけるTLR-2およびTLR-4のレベルが上昇する。TLR-2およびTLR-4のレベルの上昇により、HCV感染またはHCV感染の素因もしくはその感染の残存の診断指標が提供される。TLRのレベルはまた、対象が治療的介入に有利に反応する可能性の有用な指標である。「可能性」への言及には、その可能性またはさもなければ治療手順の成否の予測を行うこと、およびそれらのリスク評価を行うことが含まれる。さらに、TLR-2およびTLR-4はTLR-2および/またはTLR-4レベルを下方制御する薬剤の治療標的になる。
【００２２】
別の態様においては、HBVによる感染によってCD14+ PMBCおよび肝細胞においてTLR-2が下方制御される。この場合も同様に、このことによって、HBV感染の診断マーカーとして、およびHBVに感染したまたはHBVによる感染の素因もしくは残存を有する対象においてTLR-2を上方制御する薬剤の標的としてTLR-2のレベルを用いることが可能になる。治療手順を介して、予測におけるTLR-2および/またはTLR-4のレベルを正常化することが役立つ。治療前のレベルまたは標準化対照のデータベースに対して都合よく比較を行う。
【００２３】
さらに別の態様では、肝硬変およびHCCによりTLR-2レベルの上昇が誘導される。よって、TLR-2を肝臓疾患の診断マーカーとしておよび肝臓疾患を治療するための治療標的として用いることができる。
【００２４】
したがって、本発明は、TLR、特にTLR-2および/またはTLR-4のレベルを調節する薬剤、TLR-2および/またはTLR-4のレベルを決定する診断試薬、ならびに病原体またはウイルスによる感染または別の疾患状態の発症の治療法および/または予防法、および治療計画をモニターする方法、および病原体による感染に対する対象の素因もしくは感染の残存または肝硬変もしくはHCC等の別の疾患状態の素因を決定する方法を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、治療手順に対する反応をモニターする方法および治療計画の有効性を決定する手段を意図する。特に、本発明は、哺乳動物、特にヒト等の動物における感染および他の疾患状態の発症の治療的または疫学的管理手段を提供する。
【００２６】
特に好ましい態様において、病原体はHBVまたはHCV等の肝炎ウイルスである。しかしながら、本発明は一連のウイルスおよび微生物にまで及ぶ。
【００２７】
微生物の例には、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属（Pasteurella）、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属（Ureaplasma）、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属（Chlamydophila）、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属（Burkholderia）、ディケロバクター属（Dichelobacter）、ヘモフィルス属、ラルストニア属（Ralstonia）、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属（Erwinia）、エンテロバクター属、アロゾナ属（Arozona）、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属（Arcobacteria）、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属（Bacterioides）、コクシジオミセス属（Coccidiomyces）、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、またはヘリコバクター属が含まれる。
【００２８】
ウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはロタウイルスが含まれる。
【００２９】
好ましい肝臓病態は肝硬変またはHCCである。
【００３０】
したがって、本発明の1つの局面は、病原体による感染もしくは疾患状態またはそれらの素因の存在を検出する方法であって、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含み、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって病原体による感染または疾患状態もしくはそれらの素因の存在が示される方法を意図する。
【００３１】
別の局面では、病原体による感染または疾患状態の発症に向けられた治療手順に対する反応をモニターする方法であって、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含み、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって治療反応の有効性が決定される方法を提供する。
【００３２】
さらに別の局面は、対象が病原体による感染または疾患状態の治療的または予防的介入に対して反応する可能性を決定する方法であって、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含み、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって治療的介入の潜在的有効性が決定される方法を意図する。
【００３３】
さらなる局面では、病原体による感染または疾患状態の発症に向けられた治療手順の転帰を予測する方法であって、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルを決定する段階を含み、TLR-2および/もしくはTLR-4またはそれらの相同体のレベルの上昇または減少によって治療反応の有効性が決定される方法を提供する。
【００３４】
本発明のリスク評価の局面に従って、初期治療において、TLR-2および/またはTLR-4のレベルの変化またはレベルの変化の傾向をもたらす変化を予測する場合がある。このようなことが起こる場合、治療的介入が成功する可能性は適切に高いと見なされる。TLRレベルが変化しない傾向にある場合、これは治療手順が成功に満たない徴候である。
【００３５】
特記しない限り、本発明は特定の化合物の処方、製造法、投与計画等に限定されず、それ自体変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用する専門用語は、特定の態様を説明する目的のためのみに用いられ、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００３６】
本明細書で使用する単数形「1つの」、「ある」、および「その」とは、特記する場合を除き、複数の局面も含むことに留意しなければならない。したがって、例えば1つの「化合物」への言及には単一の化合物のほかに2つまたはそれ以上の化合物もまた含まれ；「1つの活性物質」への言及には単一の活性物質のほかに2つまたはそれ以上の活性物質もまた含まれ；以下同様である。
【００３７】
本発明の記載および請求においては、以下に説明する定義に従って以下の専門用語を用いる。
【００３８】
「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性物質」、「医薬品」、「活性物（active）」、および「薬物」という用語は本明細書において互換的に用いられ、所望の薬理学的および/または生理的効果を誘導する化学物質を指す。これらの用語はまた、これらに限定されないが塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体等を含む、本明細書に具体的に記載する活性物質の薬学的に許容されるおよび薬理学的に活性のある成分もまた包含する。「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性物質」、「医薬品」、「活性物」、および「薬物」という用語を用いる場合、これには活性物質自体および薬学的に許容される、薬理学的に活性のある塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体等が含まれることが理解されるべきである。「化合物」という用語は化学物質という意味のみに解釈されるべきではなく、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、ならびにRNA、DNA、およびそれらの化学類似体等の遺伝分子にまで及ぶ。「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」への言及には、多糖またはリポ多糖成分を有する分子も含まれる。「増強剤」という用語は、TLR-2またはTLR-4等のTLRのレベルを上方制御する化合物、活性物質、薬理学的活性物質、医薬品、活性物、および薬物の例である。「上方制御する」という用語は、TLR遺伝子の発現の増加および下流のシグナル伝達経路の成分の操作を包含する。「アンタゴニスト」という用語は、、TLR-2またはTLR-4等のTLRのレベルを下方制御する化合物、活性物質、薬理学的活性物質、医薬品、活性物、および薬物の例である。下方制御はまた、TLRシグナル伝達系路の阻害剤のレベルの上昇を含み得る。
【００３９】
したがって、TLRへの言及には、リガンドとTLRとの相互作用に関連したシグナル伝達経路への言及が含まれる。
【００４０】
したがって、本発明は、TLR-2および/またはTLR-4等のTLRの上方制御または一般的なもしくは特定のTLRシグナル伝達において有用な化合物を意図する。「調節（modulating）」という用語または「調節する（modulate）」もしくは「調節（modulation）」等のその変化形は、上方制御または下方制御を説明するために用いられる。化合物は、病原体もしくはウイルスによる感染の低減もしくは予防もしくは治療に、または肝硬変もしくはHCC等の別の疾患状態の治療に効果を及ぼす。調節すべきTLRを保有する好ましい細胞には、PBMCおよび肝細胞が含まれる。PBMCには、CD14+ PMBC、特に単球が含まれ、肝細胞には肝実質細胞が含まれる。「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性物質」、「医薬品」、「活性物」、および「薬物」への言及には、TLRまたはTLRシグナル伝達の増強剤またはアンタゴニスト等の2つまたはそれ以上の活性物の「組み合わせ」が含まれる。「組み合わせ」にはまた、薬剤が個別に提供されて、個別に与えられるかもしくは投薬されるまたは混合してから投薬される2部分等の複数部分の薬学的組成物が含まれる。
【００４１】
例えば、複数部分の薬学的パックは、TLRの調節因子および1つまたは複数の抗菌剤または抗ウイルス剤を含み得る。
【００４２】
本明細書で用いる薬剤の「有効量」および「治療有効量」という用語は、所望の治療効果または生理的効果を提供するのに十分な薬剤の量を意味する。さらに、薬剤の「効果的なTLR増強量」または「有効なTLR拮抗量」とは、TLR-2またはTLR-4等の特定のTLRの機能を直接もしくは間接的に上方制御するもしくは下方制御する、またはTLRシグナル伝達を妨げるもしくは増強するのに十分な薬剤の量である。これは、TLRもしくはそのシグナル伝達成分のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用する薬剤によって、TLRシグナル伝達の成分であるもしくは成分を模倣する薬剤によって、他の細胞受容体を介してTLRシグナル伝達経路を誘導する薬剤によって、またはTLRシグナル伝達成分の阻害剤を拮抗する薬剤によって達成され得る。望ましくない効果、例えば副作用が所望の治療効果と共に現れる場合があり；したがって、実行者は適切な「有効量」の決定において潜在的利益と潜在的リスクの均衡を保たせる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および一般的健康状態、投与方法等に応じて対象によって変動することになる。したがって、正確な「有効量」を特定することは不可能であると考えられる。しかし、任意の個々の場合における適切な「有効量」は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００４３】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または希釈剤とは、生物学的にもその他の点でも所望される物質からなる薬学的媒体を意味し、すなわちその物質は、いかなる副作用も起こさずにまたは実質的な副作用を起こさずに選択された活性物質と共に患者に投与することができる。担体には、賦形剤、および希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、保存剤等の他の添加剤が含まれ得る。薬学的組成物はまた、処方に応じてワクチン組成物と称され得る。
【００４４】
同様に、本明細書において提供する化合物の「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体とは、生物学的にもその他の点でも所望される塩、エステル、アミド、プロドラッグ、または誘導体である。
【００４５】
本明細書において用いる「治療（treating）」および「治療（treatment）」という用語は、感染または疾患の症状の重症度および/または頻度の低減、症状および/または根底にある原因の排除、感染の症状および/またはその根底にある原因の発生の予防、ならびに障害の好転または改善を指す。例えばウイルス感染後に付随する障害は、肝臓の肝硬変またはHCC等の肝臓障害であってよい。
【００４６】
患者の「治療」は、感受性の高い個体における感染または他の疾患状態または有害な生理的事象の予防、および感染または他の疾患状態または肝臓障害もしくは癌等の下流の病態を抑制することによる臨床徴候を示す個体の治療を含み得る。一般に、そのような病態また疾患は感染であり、より詳細にはウイルス感染であり、さらに詳細にはHBVまたはHCVによる感染である。または、他の疾患状態は肝硬変またはHCC等の肝臓病態である。したがって、例えば、感染を有するまたは感染を発症する傾向を有する患者を「治療する」本方法は、感染または他の疾患の予防および一度確立された感染または他の疾患状態の治療を包含する。いずれにせよ、本発明は、病原体もしくはウイルスによる感染の治療もしくは予防または別の疾患状態の治療を意図する。病原体は原核生物もしくは真核生物またはウイルスであってよい。原核生物の例には、サルモネラ属、エシェリキア属、クレブシエラ属、パスツレラ属、バシラス属（炭疽菌を含む）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、アクチノミセス属、マイコバクテリウム属、クラミジア属、クラミドフィラ属、レプトスピラ属、スピロヘータ属、ボレリア属、トレポネーマ属、シュードモナス属、バークホルデリア属、ディケロバクター属、ヘモフィルス属、ラルストニア属、ザントモナス属、モラクセラ属、アシネトバクター属、ブランハメラ属、キンゲラ属、エルウィニア属、エンテロバクター属、アロゾナ属、シトロバクター属、プロテウス属、プロビデンシア属、エルシニア属、シゲラ属、エドワードシエラ属、ビブリオ属、リケッチア属、コクシエラ属、エーリキア属、アルコバクテリア属、ペプトストレプトコッカス属、カンジダ属、アスペルギルス属、トリコモナス属、バクテリオイデス属、コクシジオミセス属、ニューモシスティス属、クリプトスポリジウム属、ポルフィロモナス属、アクチノバシラス属、ラクトコッカス属、ラクトバシラス属、ザイモモナス属、サッカロミセス属、プロピオン酸菌属、ストレプトミセス属、アオカビ属、ナイセリア属、スタフィロコッカス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、またはヘリコバクター属が含まれる。ウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、単純ヘルペスウイルス（HSV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、ライノウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、フラビウイルス、エボラウイルス、パラミキソウイルス、インフルエンザウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはロタウイルスが含まれる。
【００４７】
しかしながら、感染はHBVまたはHCVによることが好ましい。「HBV」もしくは「HCV」または「B型肝炎ウイルス」もしくは「C型肝炎ウイルス」等のそれらの完全な用語への言及には、ヌクレオシド類似体または免疫薬等の特定の治療薬に対して耐性である変種を含むすべての変種が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「患者」とは、本発明の薬学的製剤および方法から恩恵を受け得る動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。本明細書に記載した薬学的製剤および方法から恩恵を受け得る動物の種類に制限はない。ヒトであるか非ヒト動物であるかにかかわらず、患者は個体、対象、動物、宿主、またはレシピエントと称され得る。本発明の化合物および方法は、ヒト医学、獣医学、および一般に家畜または野生動物の管理において用途を有する。便宜上、家禽鳥類、飼い鳥、または狩猟鳥等の鳥類を「動物」に含める。アヒル等の家禽鳥類が鳥類の好ましい例である。
【００４９】
本発明の化合物は大分子もしくは小分子、核酸分子（アンチセンス分子またはセンス分子を含む）、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはRNAi複合体もしくはsiRNA複合体等のハイブリッド分子、リボザイム、もしくはDNAzymeであってよい。化合物は細胞への進入を促進するように修飾する必要がある場合がある。化合物が細胞外受容対と相互作用する場合には、これは必要ではない。薬剤の例には、TLRと相互作用する化学物質および抗体、またはTLRもしくはTLRシグナル伝達経路の化合物をコードする遺伝子の発現を下方制御するもしくは上方制御する遺伝分子が含まれる。
【００５０】
上記のように、好ましい動物はヒトもしくは他の霊長動物、家畜動物、実験動物、ペット動物、または捕獲野生動物、および鳥類である。
【００５１】
実験動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびハムスターが含まれる。ウサギならびにラットおよびマウス等の齧歯類動物は、簡便な試験系または動物モデルを提供する。家畜動物には、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびロバが含まれる。鳥類（アヒル等）、ゼブラフィッシュ、両生類（オオヒキガエルを含む）、およびキイロショウジョウバエ等のショウジョウバエ種のような非哺乳動物もまた意図される。
【００５２】
したがって、本発明はTLR-2および/またはTLR-4等のTLRを拮抗するまたは作動させる（すなわち増強するまたは活性化する）薬剤を提供する。
【００５３】
本発明は、例えば、候補薬剤をTLR-2もしくはTLR-4等のTLRまたはその一部と接触させる段階を含む、そのような薬剤をスクリーニングする方法を意図する。そのようなTLR分子を本明細書では「標的」または「標的分子」と称する。スクリーニング手順は、(i) 薬剤と標的との複合体の存在、または(ii) 標的をコードする核酸分子の発現レベルの変化についてアッセイする段階を含む。アッセイ法の1つの形式は競合的結合アッセイ法を含む。そのような競合的結合アッセイ法においては、典型的に標的を標識する。任意の推定複合体から遊離の標的を分離し、遊離の（すなわち複合体化していない）標識の量を被験薬剤の標的分子に対する結合の尺度とする。遊離の標的ではなく結合した標的の量を測定してもよい。標的ではなく化合物を標識して、被験薬剤の存在下および非存在下において標的に結合する化合物の量を測定することも可能である。そのような化合物は、例えばHCV感染または他の疾患状態の治療に必要とされるTLR-2および/またはTLR-4の阻害剤の発見において有用である標的を阻害する可能性があり、またはHBV感染の治療に必要とされるTLR-2または他の成分を阻害から保護する可能性がある。
【００５４】
薬剤スクリーニングの別の技法は、標的に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニング法を提供し、これはGeysen（国際公開公報第84/03564号）に詳述されている。簡潔に説明すると、プラスチックピンまたは何らかの他の表面等の固相担体上で多数の異なる小ペプチド被験化合物を合成する。ペプチド被験化合物を標的と反応させ、洗浄する。次いで、結合した標的分子を当技術分野において周知の方法によって検出する。この方法は非ペプチド化学物質のスクリーニングに適合化することができる。したがって、この局面は、TLR-2またはTLR-4等のTLRの標的アンタゴニストまたはアゴニストのスクリーニングに対する組み合わせ方法にまで及ぶ。
【００５５】
精製した標的を上記の薬剤スクリーニング技法において用いるプレートに直接コーティングすることができる。しかし、標的に対する非中和抗体を用いて、標的を固相上に固定化することも可能である。TLR-2またはTLR-4等のTLRに特異的な抗体もまた、例えばHCV感染または他の疾患状態の治療におけるこれらのTRLの阻害剤として有用である可能性がある。
【００５６】
本発明は、標的と特異的に結合し得る中和抗体が標的またはその断片に対する結合に関して被験化合物と競合する競合的薬剤スクリーニングアッセイ法の使用もまた意図する。このような方法で、抗体を使用して、標的の1つまたは複数の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
【００５７】
TLRに対する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体は多くの手段のいずれかによって調製し得る。TLRの検出に関しては、抗体は、必然的ではないが一般に、霊長動物、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）、およびペット動物（例えば、イヌ、ネコ）等の非ヒト動物に由来する。一般に、抗体に基づくアッセイ法は、細胞または組織生検試料においてインビトロで行う。しかし、抗体が適切に非免疫化されれば、またはヒトに使用する場合にはヒト化されれば、抗体を例えば核タグで標識し、対象に投与し、放射線学的技法によって核標識の蓄積部位を決定することができる。このため、TLR抗体は病原性マーカー標的化薬剤と見なされる。したがって、本発明は、ヒト対象および非ヒト対象における病原性標的画像化に用いるための非免疫化型の抗体にまで及ぶ。これについては以下にさらに説明する。
【００５８】
TLRに対する抗体を作製するためには、この酵素を、これがヒト組織を含む動物由来のものであれば生物試料から、または組換え手段によって産生される場合には細胞培養物から抽出する必要がある。一般に、単球および肝細胞が簡便な供給源である。TLRは、任意の適切な手段により生物試料から分離することができる。例えば、分離には、TLRの表面荷電特性、大きさ、密度、生物活性、および別の実体（例えば、それが結合するかまたはさもなければ会合する別のタンパク質または化合物）に対する親和性のうちの任意の1つまたは複数を利用し得る。したがって、例えば、生物試料からのTLRの分離は、超遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動）、サイズ分離（例えば、ゲル濾過、限外濾過）、および親和性を介した分離（例えば、これらに限定されないが、Dynabead（商標）分離等の磁気ビーズ分離、免疫クロマトグラフィー、免疫沈降を含む免疫親和性分離）のうちの任意の1つまたは複数によって達成することができる。用いる分離法の選択は、求めている特定のTLRの生物活性もしくは物理的特性、またはそれを得るための組織に依存し得る。
【００５９】
生体液からTLRを分離する際には、キナーゼ上に存在する高次構造エピトープが保たれることが好ましく、したがって、酵素の変性を引き起こす方法を回避することが適切である。当業者は、動物に対して曝露されるTLR上の抗原決定基または活性部位が天然酵素のものと構造的に同一であることを確実にするために、TLRにとって固有の生理的条件（例えば、それを得た生物試料）にできるだけ近い条件を維持または模倣する重要性を認識していると考えられる。これにより、免疫した動物において、天然タンパク質を認識する適切な抗体が産生されることが確実となる。
【００６０】
免疫化およびその後のモノクローナル抗体の産生は、例えばKohlerおよびMilstein（Kohler and Milstein, Nature 256: 495-499, 1975；Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6(7): 511-519, 1976）、Coligan et al.,（「Current Protocols in Immunology」, John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997）、またはToyama et al.,（Kodansha Scientific出版の「Monoclonal Antibody, Experiment Mannual」, 1987）によって記載されているように標準的な手順を用いて行うことができる。本質的には、標準的な方法により、TLRまたはTLRを含む試料を動物に免疫し、抗体産生細胞、特に抗体産生体細胞（例えばBリンパ球）を産生させる。次いで、免疫した動物からこれらの細胞を採取して不死化させる。
【００６１】
抗体作製のためにTLRの断片を用いる場合には、それをまず担体と会合させることが必要な場合がある。「担体」とは、免疫原性がないかまたは乏しい物質（例えばハプテン）と自然にまたは人為的に結合することによってその免疫原性を高める、典型的に高分子量である任意の物質を意味する。
【００６２】
抗体産生細胞の不死化は、当技術分野で周知の方法を用いて行うことができる。例えば、不死化は、エプスタイン・バーウイルス（EBV）を用いる形質転換法（Kozbor et al., Methods in Enzymology 121: 140, 1986）によって達成することができる。好ましい態様においては、抗体産生細胞は細胞融合法（Coligan et al., 1991-1997, 前記に記載されている）を用いて不死化させるが、これはモノクローナル抗体の作製のために広く用いられている。この方法では、抗体産生能を有する抗体産生体細胞、特にB細胞を骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、感作動物、好ましくはマウスおよびラット等の齧歯類動物のリンパ節、脾臓、および末梢血に由来し得る。マウス脾細胞が特に有用である。しかし、ラット、ウサギ、ヒツジ、もしくはヤギの細胞、または他の動物種由来の細胞を代わりに用いることも可能であると考えられる。
【００６３】
ハイブリドーマを作製する融合手順に用いるために特化した骨髄腫細胞株がリンパ球性腫瘍から開発されている（Kohler and Milstein, 1976, 前記；Shulman et al., Nature 276: 269-270, 1978；Volk et al., J. Virol. 42(1): 220-227, 1982）。これらの細胞株は少なくとも3つの理由から開発された。第1の理由は、融合しておらず同様に無限に自己増殖する骨髄腫細胞からの、融合したハイブリドーマの選択を容易にするためである。これは通常、ハイブリドーマの増殖を支持するある種の選択培地における増殖を不可能にする酵素欠損を有する骨髄腫を用いることによって達成される。第2の理由は、リンパ球性腫瘍細胞が自らの抗体を産生する固有の能力に起因する。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生が起こらないように、内因性免疫グロブリン軽鎖または重鎖を産生することができない骨髄腫細胞株を用いる。これらの細胞株の選択に関する第3の理由は、それらに融合に対する適性があり、効率が高いことによる。
【００６４】
融合細胞雑種の作製には、例えば、P3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1（NS-1）、Sp2/0-Ag14、およびS194/5.XXO.Bu.1を含む、多くの骨髄腫細胞株を用いることができる。P3X63-Ag8およびNS-1細胞株は、KohlerおよびMilstein（1976、前記）によって記載されている。Shulman et al.,（1978、前記）は、Sp2/0-Ag14骨髄腫株を開発した。S194/5.XXO.Bu.1株は、Trowbridge（J. Exp. Med. 148(1): 313-323, 1978）によって報告された。
【００６５】
抗体産生脾細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞との雑種を作製する方法は、通常、細胞膜の融合を促進する1つまたは複数の作用因子（化学的、ウイルス的,
または電気的）の存在下で、体細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ10:1の割合（この割合は約20:1から約1:1まで変動し得る）で混合する段階を含む。融合方法は以前に記載されている（Kohler and Milstein, 1975, 前記；Kohler and Milstein, 1976, 前記；Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3: 231-236, 1977；Volk et al., 1982, 前記）。このような研究者らによって用いられた融合促進性の作用因子は、センダイウイルスおよびポリエチレングリコール（PEG）であった。
【００６６】
融合手順によって生存可能な雑種が生じるのは極めて低い頻度であるため（例えば、脾臓を体細胞の供給源として用いる場合、概ね1x105個の脾細胞当たり1個の雑種しか得られない）、融合していない残りの細胞、特に融合していない骨髄腫細胞から融合細胞雑種を選択する手段を有することが好ましい。所望の抗体産生ハイブリドーマを、生じた他の融合細胞雑種の中から検出する手段もまた必要である。一般に、融合細胞雑種の選択は、ハイブリドーマの増殖は支持するが、通常は無限に分裂を続けると考えられる融合していない骨髄腫細胞の増殖は阻止する培地中で、細胞を培養することによって達成される。融合に用いる体細胞はインビトロ培養下では長期的な生存性を維持せず、このため問題とはならない。本発明の実施例においては、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠く（HPRT陰性の）骨髄腫細胞を用いた。これらの細胞に対する選択は、ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン（HAT）培地中で行われ、融合細胞雑種はこの培地中で脾細胞のHPRT陽性遺伝子型のために生存する。遺伝子型の点で適格性のある雑種の増殖を支持する培地中で選択し得る、種々の遺伝子欠陥（薬剤感受性等）を有する骨髄腫細胞を用いることも可能である。
【００６７】
融合細胞雑種を選択的に培養するには数週間を要する。この期間の初期には、その後クローニングし増殖できるように、所望の抗体を産生する雑種を同定することが必要である。一般に、得られた雑種の約10%が所望の抗体を産生するが、約1〜約30%の範囲であることも珍しくない。抗体を産生する雑種の検出は、例えばKennet et al.,（Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp. 376-384, Plenum Press, New York, 1980）に記載されているような、酵素結合免疫測定法および放射免疫測定法を含むいくつかの標準的なアッセイ方法のうちのいずれか1つによって、およびFACS解析（O'Reilly et al., Biotechniques 25: 824-830, 1998）によって達成することができる。
【００６８】
ひとたび所望の融合細胞雑種を選択し、個々の抗体産生細胞株へのクローニングを行ったならば、各細胞株を2種類の標準的な方法のいずれかにより増殖させることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性のある動物に注入し得る。その後、注入された動物は、融合細胞雑種によって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生じることになる。血清または腹水等の動物の体液を採取することにより、高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。または、個々の細胞株をインビトロにおいて実験用培養容器内で増殖させ得る。単一の特異的モノクローナル抗体を高濃度に含む培地を、デカンテーション、濾過、または遠心分離によって回収し、その後精製することができる。
【００６９】
任意の適切な免疫検出手段により、TLRを検出する特異性に関して細胞株を試験する。例えば、細胞株を多数のウェルに分注し、インキュベートし得り、各ウェルからの上清を、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、間接蛍光抗体法等により解析する。標的TLRを認識し得るが非標的エピトープは認識しないモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し、次いでインビトロで直接培養するか、または組織適合性のある動物に注入して腫瘍を形成させ、必要な抗体を産生させ、回収し、精製する。
【００７０】
これらの抗体はTLR特異的である。このことは、抗体が特定のTLRと他の分子を区別し得ること意味する。正常細胞内の分子と交差反応しない限り、さらに広域性の抗体を用いることも可能である。
【００７１】
モノクローナル抗体を例えばTLR-2またはTLR-4を阻害するための治療薬として使用することを予定している場合、抗体を導入しようとする宿主（例えばヒト）に対してこれを非免疫化することが必要であると考えられる。非免疫化過程は、本発明に従って調製したモノクローナル抗体と同じまたは類似の特異性を有するキメラ抗体の調製を含む、多くの形態のいずれかをとり得る。キメラ抗体とは、その軽鎖および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築された抗体である。したがって、本発明に従い、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られたところで、1つの種の結合領域が別の種の抗体の非結合領域と組み合わされた種間モノクローナル抗体を作製するための技術を用いる（Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987）。例えば、非ヒト（例えばマウス）モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体に移植し、それによりマウス抗体を「ヒト化」することができる（欧州特許第0 239 400号；Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986；Verhoeyen et al., Sceience 239: 1534-1536, 1988；Richmann et al., Nature 332: 323-327, 1988）。この場合、非免疫化過程はヒトに対して特異的である。より詳細には、CDRを、ヒト定常領域を有するまたは有さないヒト抗体可変領域に移植し得る。CDRを提供する非ヒト抗体は一般に「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト抗体は一般に「アクセプター」と称される。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち、少なくとも約85〜90%同一、好ましくは約95%またはそれ以上同一でなければならない。このため、おそらくはCDRを除く、ヒト化抗体のすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。したがって、「ヒト化抗体」とは、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ドナー抗体は「ヒト化」の過程によって「ヒト化」されたと言われるが、これは結果として生じるヒト化抗体が、CDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予想されるためである。本明細書における「ヒト化」への言及には、特定の宿主、この場合にはヒト宿主に対して非免疫化された抗体への言及が含まれる。
【００７２】
非免疫化抗体が、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を及ぼさない、さらなる保存的アミノ酸置換を有し得ることは理解されると考えられる。表1に従って、例示的な保存的置換を行うことができる。
【００７３】
（表１）
2006520588.tif 000004
【００７４】
本発明による非免疫化抗体を作製するために用い得る例示的な方法は、例えば、Richmann et al., 1998, 前記；欧州特許第0 239 400号；米国特許第6,056,957号、米国特許第6,180,370号、米国特許第6,180,377号に記載されている。
【００７５】
したがって、1つの態様において、本発明は、TLR-2またはTLR-4等のTLRに対するモノクローナル抗体によって認識されるエピトープに対する特異性を有する非免疫化抗体分子であって、非免疫化抗体の可変ドメインのCDRのうち少なくとも1つがTLRに対するモノクローナル抗体に由来し、非免疫化抗体分子の残りの免疫グロブリン由来部分が、抗体を非免疫化しようとする対象である宿主からの免疫グロブリンまたはその類似体に由来する非免疫化抗体分子を意図する。
【００７６】
本発明のこの局面は、非ヒト抗体のフレームワーク領域の操作を含む。
【００７７】
本発明は、TLRに対する特異性を依然として保持する、本抗体の変異体および誘導体にまで及ぶ。
【００７８】
「変異体」または「誘導体」という用語には、1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、および/または欠失が含まれる。
【００７９】
本明細書で用いる「CDR」という用語には、分子の結合部分にあるβ鎖を架橋する、抗体フレームワーク領域の可変部分における3つの軽鎖領域および3つの重鎖領域にわたるCDR構造ループが含まれる。これらのループは特徴的な限界構造を有する（Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901, 1987；Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799, 1992）。
【００８０】
「フレームワーク領域」とは、CDRとも称される3つの超可変領域によって分断された、免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域の領域を意味する。フレームワーク領域およびCDRの範囲は、厳密に規定されている（例えば、Kabat et al.,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, U.S. Department of Health and Human Sciences, 1983を参照のこと）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種の内部では比較的保存されている。本明細書で用いる「ヒトフレームワーク領域」とは、天然ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一（約85%またはそれ以上、通常は90〜95%またはそれ以上）であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成要素である軽鎖および重鎖による複合的なフレームワーク領域は、CDRの配置および整列化に役立つ。CDRは、TLRのエピトープに対する結合の主な原因となる。
【００８１】
本明細書で用いる「重鎖可変領域」という用語は、アミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列に対応し、重鎖のアミノ末端（N末端）アミノ酸残基から始まる、約110〜125アミノ酸残基長のポリペプチドを意味する。同様に、「軽鎖可変領域」という用語は、アミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列に対応し、軽鎖のN末端アミノ酸残基から始まる、約95〜130アミノ酸残基長のポリペプチドを意味する。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約25 Kdまたは214アミノ酸）は、NH2末端は可変領域遺伝子（約110アミノ酸）にコードされ、COOH末端はκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」（約50 Kdまたは446アミノ酸）も同様に、可変領域遺伝子（約116アミノ酸）および他の前述の定常領域遺伝子の1つ、例えばγ（約330アミノ酸をコードする）によってコードされる。
【００８２】
「免疫グロブリン」または「抗体」という用語は、本明細書において、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指すために用いられる。認知されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。免疫グロブリンの1つの形態が、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、それぞれの対が軽鎖1本および重鎖1本を有する、免疫グロブリン鎖の2つの同一な対からなる。各対において、軽鎖および重鎖の可変領域はともに抗原に対する結合を担い、定常領域は抗体エフェクター機能を担う。免疫グロブリンは、抗体に加えて、例えばFv、Fab、Fab'、および(Fab')2を含む様々な他の形態で存在し得る。
【００８３】
本発明は、例えばFv、Fab、Fab'、およびF(ab')2断片を含む、本発明の方法によって作製されるモノクローナル抗体の断片の使用および作製もまた意図する。このような断片は、例えばColigan et al.,（1991〜1997、前記）によって記載されているように標準的な方法によって調製することができる。
【００８４】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体と同じまたは類似の特異性を有する合成または組換え抗原結合分子を意図する。この種の抗原結合分子には、安定化された合成Fv断片が含まれ得る。この種の例示的な断片には、ペプチドリンカーを用いてVHドメインのN末端またはC末端をVLドメインのそれぞれC末端またはN末端と架橋した一本鎖Fv断片（sFv、多くの場合scFvと称される）が含まれる。ScFvは抗体全体のうち定常部分をすべて欠いており、補体を活性化する能力がない。VHおよびVLドメインを連結するのに適したペプチドリンカーは、VHドメインおよびVLドメインが折りたたまれて、Fv断片の由来となった抗体全体の抗原結合部位と類似した三次元構造を備えた抗原結合部位を有する単一のポリペプチド鎖となることを可能にするリンカーである。所望の特性を有するリンカーは、米国特許第4,946,778号に開示されている方法によって得ることができる。しかし、場合によってはリンカーは存在しない。ScFvは、例えば、Krebber et al.,（J. Immunol. Methods 201(1): 35-55, 1997）に概説されている方法に従って調製することができる。または、ScFvは、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号、またはWinterおよびMilstein（Nature 349: 293, 1991）およびPluckthun et al.,（Antibody engineering: A practical approach 203-252, 1996）による論文に記載されている方法によって調製することもできる。
【００８５】
または、安定化された合成Fv断片には、VHおよびVLドメイン内にシステイン残基が導入されて、完全に折りたたまれたFv分子において2つの残基間にジスルフィド結合が形成される、ジスルフィド安定化Fv（dsFv）も含まれる。dsFvを作製するのに適した方法は、例えば、（Glockshuber et al., Biochem. 29: 1363-1367, 1990；Reiter et al., J. Biol Chem. 269: 18327-18331, 1994；Reiter et al., Biochem. 33: 5451-5459, 1994；Reiter et al., Cancer Res. 54: 2714-2718, 1994；Webber et al., Mol. Immunol. 32: 249-258, 1995）に記載されている。
【００８６】
合成または組換え抗原結合分子として同様に意図しているのは、例えば、（Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989；Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446-448, 1993；Davies & Reichmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994）に開示されている、単一の可変領域ドメイン（dAbと称される）である。
【００８７】
または、合成または組換え抗原結合分子には「ミニボディ（minibody）」も含まれ得る。この点に関して、ミニボディは抗体全体の小型版であり、抗体全体のうちの必須成分を一本鎖内にコードしている。ミニボディは、例えば米国特許第5,837,821号に開示されているように、免疫グロブリン分子のヒンジ領域およびCH3ドメインに融合された、天然抗体のVHおよびVLドメインからなることが適している。
【００８８】
代替的な態様において、合成または組換え抗原結合分子には、非免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークが含まれ得る。例えば（Ku & Schutz., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552-6556, 1995）に言及することができるが、これは、抗原結合に関して選択されたCDRを生じるように、ランダム化した2つのループを有する4本ヘリックスバンドルタンパク質シトクロムb562を開示している。
【００８９】
合成または組換え抗原結合分子は、多価（すなわち、2つ以上の抗原結合部位を有する）であってもよい。このような多価分子は、1つまたは複数の抗原に対して特異的である可能性がある。この種の多価分子は、例えば（Adams et al., Cancer Res. 53: 4026-4034, 1993；Cumber et al., J. Immunol. 149: 120-126, 1992）によって開示されているように、システイニル含有ペプチドを介した2つの抗体断片の二量体化によって調製することができる。または、二量体化は、抗体断片と、自然に二量体化する両親媒性ヘリックスとの融合（Plunckthun, Biochem. 31: 1579-1584, 1992）によって、または優先的にヘテロ二量体化するドメイン（ロイシンジッパーjunおよびfos等）の使用（Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992）によって促進してもよい。多価抗体は、例えばTLR-2およびTLR-4等の異なった形態のTLRの検出において有用である。
【００９０】
TLR活性の調節に有用な化合物のさらに別の有用な供給源は、TLR経路を活性化し得るまたは阻害し得る、化学的に修飾した、サイトカインまたはTLRの他の活性化因子等のリガンドである。
【００９１】
さらに、TLRとそのリガンドとの相互作用を遮断するまたは拮抗するまたは作動させる化合物を選択することができる。
【００９２】
本明細書において意図するタンパク質性分子（例えば、TLRのリガンド）の類似体には、これらに限定されないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の合成時における非天然アミノ酸および/またはその誘導体の取り込み、ならびにタンパク質性分子またはその類似体に対して高次構造上の制約を課す架橋剤および他の方法の使用が含まれる。
【００９３】
本発明の意図する側鎖修飾の例には、アルデヒドとの反応後にNaBH4で還元することによる還元的アルキル化；メチルアセトイミデートによるアミド化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸によるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；およびピリドキサル-5-リン酸によりリジンをピリドキシル化し、その後NaBH4により還元する等のアミノ基の修飾が含まれる。
【００９４】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサール等の試薬を用いた複素環式縮合産物の形成により修飾し得る。
【００９５】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレアの形成を介してカルボジイミドを活性化し、その後、例えば、対応するアミドに誘導化することにより修飾し得る。
【００９６】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、および他の水銀剤を用いる水銀誘導体の形成；アルカリ性pHにおけるシアン酸によるカルバモイル化等の方法により修飾し得る。
【００９７】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化、または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化によって修飾し得る。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により改変されて3-ニトロチロシン誘導体を形成し得る。
【００９８】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボネートによるN-カルベトキシル化によって達成し得る。
【００９９】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を取り込む例には、これらに限定されないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれる。本明細書において意図する非天然アミノ酸の一覧を表2に示す。
【０１００】
（表２）非従来型アミノ酸のためのコード
2006520588.tif 000005
2006520588.tif 000006
2006520588.tif 000007
2006520588.tif 000008
【０１０１】
例えば、n=1〜n=6の(CH2)nスペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル等のホモ二官能性架橋剤、およびN-ヒドロキシスクシンイミド等のアミノ反応性部分とマレイミドまたはジチオ部分（SH）またはカルボジイミド（COOH）等の別の基に特異的な反応性部分とを通常含むヘテロ二官能性試薬を使用して、3D高次構造を安定化させるために架橋剤を用いることができる。加えて、例えばCαおよびNα-メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のCα原子とCβ原子との間への二重結合の導入、およびN末端とC末端間、二つの側鎖間、または一つの側鎖とN末端もしくはC末端との間にアミド結合を形成する等の共有結合の導入による環状ペプチドまたは類似体の形成により、ペプチドに高次構造的な制約を加えることができる。
【０１０２】
したがって、本発明の1つの局面は、TLR-2もしくはTLR-4等のTLRまたはTLRシグナル伝達経路の成分と結合するかまたはさもなければ相互作用して、TLRまたはTLRシグナル伝達経路の増強または上方制御または拮抗または下方制御をもたらす任意の化合物を意図する。
【０１０３】
別の有用な化合物群は模倣体である。「ペプチド模倣体」、「標的模倣体」、または「模倣体」という用語は、標的と何らかの化学的類似性を有し、標的を拮抗するまたは作動させるまたは模倣する物質を指すことを意図する。この場合の標的はTLRリガンドであってよい。ペプチド模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であってよい（Johnson et al., 「Peptide Turn Mimetics」、Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993）。ペプチド模倣体の使用の背後にある基礎となる論理的根拠は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原、酵素と基質または足場タンパク質のような分子相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向させるよう主として存在するというものである。ペプチド模倣体は、天然分子と類似した分子相互作用を可能にするように設計される。ペプチドまたは非ペプチド模倣体は、例えば、TLRもしくはTLR経路を活性化するため、またはTLRを競合的に阻害するために有用である可能性がある。この場合の好ましいTLRはTLR-2およびTLR-4である。
【０１０４】
さらに、本発明の化合物は標的のみと相互作用するように選択してもよいし、または単一もしくは複数の化合物を用いて複数の標的に影響を及ぼしてもよい。例えば、複数の標的には、TLRおよび微生物またはウイルス自体が含まれ得る。
【０１０５】
スクリーニングアッセイに使用する標的TLRまたは断片は、溶液中に遊離の状態であっても、固相支持体に固定化されても、または細胞表面上にあってもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法は、TLRまたは断片を発現する組換えポリヌクレオチドを安定に形質転換した真核または原核宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用する。生存している形態または固定した形態のそのような細胞を標準的な結合アッセイに用いることができる。例えば、TLRもしくは断片と被験薬剤との複合体の形成を測定することができ、またはTLRもしくは断片とリガンドとの複合体の形成が被験薬剤によって支持されるもしくは妨げられる程度を試験することができる。
【０１０６】
標的機能または遺伝子活性の調節因子として同定される物質は、天然のペプチドであっても非ペプチドであってもよい。非ペプチド「小分子」は、多くのインビボ薬学的用途に好ましい場合が多い。したがって、薬学的用途のために、物質（特にそれがペプチドである場合）の模倣体（mimeticまたはmimic）を設計することができる。
【０１０７】
薬学的活性化合物に対する模倣体の設計は、「リード」化合物に基づいた医薬品開発の既知のアプローチである。これは、活性化合物の合成が困難であるかもしくは費用がかかる場合、またはそれが特定の投与方法には不適切である場合、例えばペブチドが消化管内のプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるためにそれが経口組成物の活性物質として適さない場合、望ましいと考えられる。模倣体の設計、合成、および試験は、一般に、標的特性について多数の分子を無作為にスクリーニングする必要を避けるために用いられる。
【０１０８】
所与の標的特性を有する化合物から模倣体を設計する際には、通例行われるいくつかの段階が存在する。最初に、標的特性を決定する上で不可欠および/または重要である化合物の特定部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチド内のアミノ酸残基を体系的に変更することにより、例えば各残基を順番に置換することにより行い得る。そのようなペプチドモチーフを絞り込むために、ペプチドのアラニンスキャンが通常用いられる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基はその「ファルマコフォア」として知られている。
【０１０９】
ファルマコフォアが解明されたならば、その物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズ、および/または電荷に従い、一連の情報源、例えば分光学的技法、X線回析データ、およびNMRからのデータを用いてその構造をモデル化する。コンピュータ解析、類似度マッピング（原子間の結合よりもむしろファルマコフォアの電荷および/または容積をモデル化する）、および他の技法をこのモデル化過程で用いることができる。
【０１１０】
このアプローチの1つの変形では、TLRとそのリガンドとの三次元構造をモデル化する。これは、TLRおよび/またはそのリガンドが結合によって高次構造を変える場合に特に有用であり、これによりモデルが模倣体の設計においてこれを考慮に入れることが可能になる。モデリングを用いて、直鎖状の配列または三次元立体配置と相互作用する阻害剤を作製することができる。
【０１１１】
次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基を接ぎ合わすことができる鋳型分子を選択し得る。鋳型分子およびその上に接ぎ合わす化学基は、リード化合物の生物活性を保持しつつ、模倣体の合成が容易であり、模倣体が薬理学的に許容される可能性が高く、かつインビボで分解されないように都合よく選択することができる。または、模倣体がペプチドに基づく場合、ペプチドを環化してその強剛性を増すことによってさらなる安定性を達成することができる。次いで、このアプローチによって発見された1つまたは複数の模倣体を、それらが標的特性を有するかどうか、またはそれらが標的特性をどの程度示すかを調べるためにスクリーニングすることができる。次に、さらなる最適化または修飾を行って、インビボ試験または臨床試験用の1つまたは複数の最終模倣体に達することができる。
【０１１２】
理論的薬物設計の目標は、例えばポリペプチドのより活性のあるもしくは安定な形態である薬物、または例えばインビボでポリペプチドの機能を増強もしくは妨害する薬物を作製するために、関心対象の生物活性ポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、または賦活剤）の構造類似体を作製することにある。例えばHodgson（Bio/Technology 9: 19-21, 1991）を参照されたい。1つのアプローチでは、最初に、x線結晶学により、コンピュータモデリングにより、最も典型的にはアプローチの組み合わせにより、TLRリガンドの三次元構造を決定する。TLRリガンドの構造に関する有用な情報は、相同タンパク質の構造に基づいたモデリングによって得られる場合もある。理論的薬物設計の例は、HIVプロテアーゼ阻害剤の開発である（Erickson et al., Science 249: 527-533, 1990）。さらに、アラニンスキャンによって標的分子を解析することも可能である（Wells, Methods Enzymol. 202: 2699-2705, 1991）。この技法においては、アミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に及ぼすその効果を決定する。ペプチドのアミノ酸残基のそれぞれをこの方法で解析し、ペプチドの重要な領域を決定する。
【０１１３】
またプロテオミクスを用いて、異なる生理的条件に応答したおよび/または候補薬物の存在下での、TLRシグナル伝達経路の成分またはTLR-2およびTLR-4等の特定のTLRの差次的産生に関してスクリーニングすることも可能である。
【０１１４】
また、（上記の方法によるなどして）TLR特異的またはTLRリガンド特異的な抗体を単離し、次いでその結晶構造を解明することも可能である。原理的には、このアプローチによって、後に薬物設計が基礎を置き得るファルマコフォアが得られる。機能的な薬理学的に活性のある抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗id）を作製することにより、タンパク質結晶学を完全に迂回することができる。鏡像の鏡像であるため、抗idの結合部位は元の受容体の類似体であると考えられる。次いで、抗idを用いて、化学的または生物学的に作製されたペプチドのバンクからペプチドを同定および単離することができると考えられる。選択されたペプチドはファルマコフォアとして機能すると考えられる。
【０１１５】
本発明は、TLR-2もしくはTLR-4等のTLRをコードする遺伝子の発現を上方制御するもしくは下方制御する、またはTLRシグナル伝達経路における化合物を上方制御するもしくは下方制御する遺伝的アプローチにまで及ぶ。一般に、転写前または転写後遺伝子サイレンシング等の遺伝子サイレンシングを誘導する遺伝的手段を用いることがより簡便である。しかしながら、一般的技法を用いて、遺伝子コピー数を増加させるまたは遺伝子発現の阻害因子を拮抗するなどして、遺伝子を上方制御することができる。
【０１１６】
「核酸」、「ヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」という用語には、センス鎖およびアンチセンス鎖双方のRNA、cDNA、ゲノムDNA、合成型、および混合ポリマーが含まれ、当業者によって容易に理解されるように、化学的もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、1つまたは複数の天然ヌクレオチドの類似体（モルフォリン環等）による置換、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント基（例えばポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤、および修飾結合（例えばαアノマー核酸等）等のヌクレオチド間修飾が含まれる。水素結合および他の化学的相互作用を介して所定の配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。そのような分子は当技術分野において周知であり、例えば、分子の骨格中のリン酸結合がペプチド結合で置き換えられた分子が含まれる。
【０１１７】
アンチセンスポリヌクレオチド配列は、例えば、TLR-2またはTLR-4遺伝子転写産物等のTLR遺伝子転写産物のサイレンシングにおいて有用である。細胞内でそのようなアンチセンス構築物を発現させることにより、TLR遺伝子の転写および/または翻訳が妨げられる。さらに、共抑制およびRNAiまたはsiRNAを誘導する機構を用いることも可能である。または、アンチセンスまたはセンス分子を直接投与することもできる。後者の態様では、アンチセンスまたはセンス分子を組成物中に製剤化し、次いで様々な手段によって標的細胞に投与することができる。
【０１１８】
アンチセンスおよびセンス分子の変形は、モルフォリンヌクレオチド誘導体とホスホロジアミデート結合から構成されるオリゴヌクレオチドであるモルフォリノの使用を含む（例えば、Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7: 187-195, 1997）。そのような化合物は胚に注入され、mRNAの干渉効果が認められる。
【０１１９】
1つの態様において、本発明は、TLR-2またはTLR-4等のTLRをコードするような核酸分子の機能または効果の調節において使用するために、オリゴヌクレオチドおよび類似種等の化合物を採用する、すなわちオリゴヌクレオチドにより転写前または転写後遺伝子サイレンシングが誘導される。これは、TLR遺伝子転写産物をコードする1つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって達成される。オリゴヌクレオチドは細胞に直接提供してもよいし、細胞内で作製してもよい。本明細書で用いる「標的核酸」および「TLR遺伝子転写産物をコードする核酸分子」という用語は、便宜上、TLRをコードするDNA、そのようなDNAから転写されるRNA（pre-mRNAおよびmRNAまたはそれらの一部を含む）、およびそのようなRNAに由来するcDNAを包含するように使用している。本発明の化合物とその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、一般に「アンチセンス」と称される。よって、本発明のいくつかの好ましい態様の実施に含まれると考えられる好ましい機構を、本明細書では「アンチセンス阻害」と称する。そのようなアンチセンス阻害は、典型的に、少なくとも1つのオリゴヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド部分が切断される、分解される、またはさもなければ機能不能となるような、オリゴヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド部分の水素結合に基づいたハイブリダイゼーションに基づく。この点で、そのようなアンチセンス阻害のために、特定の核酸分子およびそれらの機能を標的することがここでは好ましい。
【０１２０】
妨げるべきDNAの機能には、複製および転写が含まれ得る。複製および転写は、例えば内因性の細胞の鋳型、ベクター、プラスミド構築物、または他ものに由来し得る。妨げるべきRNAの機能には、RNAのタンパク質翻訳部位への移行、RNAのRNA合成部位から離れた細胞内の部位への移行、1つまたは複数のRNA種を生成するためのRNAのスプライシング、およびRNAが関与し得るもしくはRNAによって促進され得る触媒活性またはRNAを含む複合体形成が含まれる。1つの例では、TLR転写産物機能のそのような干渉の結果は、TLRレベルの減少である。本発明との関連において、「調節」および「発現の調節」とは、例えばDNAまたはRNAといった遺伝子をコードする核酸分子の量またはレベルの上昇（促進）または減少（抑制）を意味する。抑制は発現の調節の好ましい形態であり、mRNAが好ましい標的核酸である場合が多い。
【０１２１】
本発明との関連において、「ハイブリダイゼーション」とはオリゴマー化合物の相補鎖の対合を意味する。本発明において、対合の好ましい機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシド塩基またはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間の、ワトソン-クリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合、または逆フーグスティーン型水素結合であってよい水素結合を含む。例えば、アデニンとチミンは相補的な核酸塩基であり、水素結合の形成を介して対合する。ハイブリダイゼーションは様々な環境下で起こり得る。
【０１２２】
アンチセンス化合物は、標的核酸に対する化合物の結合が標的核酸の正常な機能を妨げて活性の損失をもたらし、特異的な結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下で、インビトロアッセイの場合にはアッセイを行う条件下で、非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１２３】
本明細書で用いる「相補的」とは、オリゴマー化合物の2つの核酸塩基間で正確に対合する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチド（オリゴマー化合物）の特定の位置の核酸塩基が、DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子である標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合し得る場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との水素結合の位置は相補的であると見なされる。オリゴヌクレオチドとさらなるDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子は、それぞれの分子における十分な数の相補的な位置が相互に水素結合し得る核酸塩基によって占有されている場合、互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対合または相補性を示すために用いられる用語である。
【０１２４】
本発明に従って、化合物には、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（EGS）オリゴヌクレオチド、オルターネートスプライサー（alternate splicer）、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズする他のオリゴマー化合物が含まれる。したがって、これらの化合物を一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入することができ、これらは内部または末端のバルジまたはループ等の構造要素を含み得る。系に導入されたならば、本発明の化合物は1つまたは複数の酵素または構造タンパク質の作用を誘発して標的核酸の修飾をもたらし得る。そのような酵素の1つの非限定的な例は、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼであるRNase Hである。「DNA様」の一本鎖アンチセンス化合物がRNAse Hを誘発することは当技術分野で周知である。したがって、RNase Hの活性化によりRNA標的の切断が起こり、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチドを介した抑制の効率が大きく増強される。同様の役割は、酵素のRNaseIIIおよびリボヌクレアーゼLファミリーのような他のリボヌクレアーゼについても仮定されている。
【０１２５】
アンチセンス化合物の好ましい形態は一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種では、二本鎖RNA（dsRNA）分子等の二本鎖構造の導入によって、遺伝子またはその関連遺伝子産物の機能のアンチセンスを介した強力かつ特異的な減少が誘導されることが示されている。この現象は植物および動物において起こる。
【０１２６】
本発明との関連において、「オリゴマー化合物」という用語は複数個の単量体単位を含むポリマーまたはオリゴマーを指す。本発明との関連において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（RNA）もしくはデオキシリボ核酸（DNA）、またはその模倣体、キメラ、類似体、および相同体のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語には、天然核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間の共有結合（骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞の取り込みの増加、標的核酸に対する親和性の増加、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増加といった所望の特性のために天然型よりも好ましい場合が多い。
【０１２７】
オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形態であるが、本発明は、こらに限定されないが本明細書に記載するようなオリゴヌクレオチド類似体および模倣体を含む化合物の他のファミリーも同様に包含する。
【０１２８】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すことが当技術分野において周知であるオープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」は、効率的に標的し得る領域である。本発明との関連において、1つの領域は遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始または終止コドンを含む遺伝子内の領域である。
【０１２９】
その他の標的領域には、翻訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの部分を指し、したがってmRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含むことが当技術分野において周知である5'非翻訳領域（5'UTR）、および翻訳終止コドンから3'方向におけるmRNAの部分を指し、したがってmRNAの翻訳終止コドンと3'末端との間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含むことが当技術分野において周知である3'非翻訳領域（3'UTR）が含まれる。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの最も5'側の残基と結合するN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体に加えて、キャップ部位に隣接する最初の50ヌクレオチドも含むと考えられている。5'キャップ領域を標的することもまた好ましい。
【０１３０】
いくつかの真核細胞mRNA転写産物は直接翻訳されるが、多くは1つまたは複数の「イントロン」として知られる領域を含み、それらは翻訳される前に転写産物から切り出される。残りの（したがって翻訳される）領域は「エクソン」として知られ、共にスプライシングされて連続したmRNA配列を形成する。異常なスプライシングが疾患に関与しているか、または特定のスプライス産物の過剰生産が疾患に関与している状況では、スプライス部位、すなわちイントロン-エクソン接合部を標的することもまた特に有用であると考えられる。再構成または欠失による異常な融合接合部位もまた好ましい標的部位である。異なる遺伝子供給源から2つの（またはそれ以上の）mRNAのスプライシングの過程を介して産生されるmRNA転写産物は、「融合転写産物」として周知である。例えばDNAまたはpre-mRNAを標的するアンチセンス化合物を用いてイントロンを効率的に標的し得ることもまた周知である。
【０１３１】
当技術分野において周知のように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環塩基である。このような複素環塩基の2つの最も一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、糖の2'、3'または5'ヒドロキシル基部分にリン酸基が結合し得る。オリゴヌクレオチドを形成する際には、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、直鎖ポリマー化合物を形成する。次に、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの末端がさらに結合して環状化合物を形成することもできるが、直鎖化合物が一般的に好ましい。さらに、直鎖化合物は内部に核酸塩基相補性を有する場合があり、したがって完全にまたは部分的に二本鎖化した化合物を産生するように折りたたまれる場合がある。オリゴヌクレオチドにおいて、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成すると見なされる。RNAおよびDNAの標準的な結合または骨格は、3'から5'のホスホジエステル結合である。
【０１３２】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書において定義するように、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持するものおよび骨格中にリン原子を有さないものが含まれる。本明細書においては、当技術分野において参照される場合があるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドであると見なし得る。
【０１３３】
リン原子を含む好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネート、およびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ならびにボラノホスフェートであって、通常の3'-5'結合を有する修飾オリゴヌクレオチド骨格、これらの2'-5'結合類似体、および1つまたは複数のヌクレオチド間結合が3'-3'、5'-5'、または2'-2'結合である逆向きの極性を有するものが含まれる。逆向きの極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も3'側のヌクレオチド間結合において単一の3'-3'結合を含む、すなわち脱塩基し得る（核酸塩基が失われるかまたはその代わりにヒドロキシル基を有する）単一の逆向きヌクレオチド残基を含む。様々な塩、混合塩、および遊離酸型もまた含まれる。
【０１３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、吸入、局所的手段、または全身性の手段を含む任意の簡便な手段によって投与することができる。
【０１３５】
別の態様においては、DNAワクチンを含む遺伝子構築物を用いてインビボでアンチセンス分子を生成することができる。さらに、上記の好ましい特徴の多くは、TLRのレベルを促進するためのセンス核酸分子または遺伝子治療用途に適している。
【０１３６】
TLRまたはTLR経路を増強するまたは拮抗する薬剤を同定した後に、これを調製物、すなわち製造物もしくは処方物、または医薬品、薬学的組成物、もしくは薬物等の組成物中で製造および/または使用することができる。
【０１３７】
したがって、本発明は、TLR活性もしくはTLR遺伝子発現またはTLRシグナル伝達経路の成分の活性もしくは遺伝子発現のアゴニストまたはアンタゴニストを含む薬学的組成物、医薬品、薬物、または貼付剤もしくは徐放製剤を含む他の組成物にまで及ぶ。
【０１３８】
本発明の別の局面は、例えば感染または他の疾患状態の治療または予防のためにそのような組成物を対象に投与する段階を含む方法を意図する。さらに本発明は、本発明の化合物を薬学的に許容される賦形剤、媒体、または担体、任意に他の成分と混合する段階を含む、薬学的組成物を作製する方法を意図する。複数の組成物が提供される場合、そのような組成物は同時に与えてもよいし、または連続して与えもよい。連続投与には、数ナノセカンド、数秒、数分、数時間、または数日以内の投与が含まれる。連続投与は数秒または数分以内であることが好ましい。
【０１３９】
TLR-2またはTLR-4等のTLRを増強するまたは抑制する成分および抗菌剤または抗ウイルス剤のような複数成分を含む、2部分を含む複数部分の薬学的組成物またはパックもまた意図される。そのような複数部分の薬学的組成物またはパックは、異なる薬剤または薬剤群を個別に維持する。これらは個別に投薬するか、または混合してから投薬する。
【０１４０】
したがって、本発明の別の局面は、本明細書に記載するような化合物またはこれを含む組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、対象における感染または他の疾患状態を治療するまたは予防する方法を意図する。
【０１４１】
対象は、ヒト等の哺乳動物、またはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ゼブラフィッシュ、もしくは両生類等の実験動物、またはアヒル等の鳥類が好ましい。
【０１４２】
本方法はまた、野生型または突然変異標的遺伝子機能を細胞に提供する段階を含む。これは、動物モデルを作製する場合に特に有用である。または、これは遺伝子治療アプローチの一部であってよい。標的遺伝子またはその遺伝子の一部は、遺伝子が染色体外に残存するようなベクターにおいて細胞内に導入することができる。そのような場合、遺伝子は細胞によって染色体外の位置から発現されることになる。突然変異標的対立遺伝子を保有する細胞に遺伝子の一部を導入し発現させる場合には、その遺伝子部分は標的タンパク質の一部をコードすべきである。組換えのためおよび染色体外維持のための遺伝子導入用ベクターは当技術分野において周知であり、任意の適切なベクターを使用することができる。エレクトロポレーション、カルシウムリン酸共沈法、およびウイルス形質導入等のDNAを細胞に導入する方法は、当技術分野において周知である。
【０１４３】
当技術分野において周知の遺伝子導入系は、遺伝子操作の実施において有用であると考えられる。これらにはウイルスおよび非ウイルス導入法が含まれる。パポバウイルス（例えばSV40、Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-1536, 1992）、アデノウイルス
2006520588.tif 000009
、ワクシニアウイルス（Moss, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992；Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, 1996）、アデノ随伴ウイルス（Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol.158: 97-129, 1992；Ohi et al., Gene 89: 279-282, 1990；Russell and Hirata, Nature Genetics 18: 323-328, 1998）、HSVおよびEBVを含むヘルペスウイルス
2006520588.tif 000010
、レンチウイルス（Naldini et al., Science 272: 263-267, 1996）、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルス（Berglund et al., Biotechnology 11: 916-920, 1993）、ならびにトリ（Bandyopadhyay and Temin, Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984；Petropoulos et al, J. Virol. 66: 3391-3397, 1992)、マウス
2006520588.tif 000011
、およびヒト
2006520588.tif 000012
起源のレトロウイルスを含む多くのウイルスが、遺伝子導入ベクターとして、または遺伝子導入ベクターを調製するための修復するための基礎として用いられている。
【０１４４】
リン酸カルシウム共沈殿を含む化学的技法、例えばマイクロインジェクションといった機械的方法、リポソームを介する膜融合媒介性導入、ならびに直接的DNA取り込みおよび受容体媒介性DNA導入等の非ウイルス遺伝子導入法が当技術分野において周知である。ウイルス媒介遺伝子導入をリポソーム送達を用いる直接的インビボ遺伝子導入と組み合わせることができ、これによりウイルスベクターを特定の細胞に方向づけることが可能になる。または、レトロウイルスベクター産生細胞株を特定の組織に注入することができる。その後、産生細胞の注入によりベクター粒子の継続的供給源が提供される。
【０１４５】
生物学的および物理的遺伝子導入法を組み合わせるアプローチにおいては、任意のサイズのプラスミドDNAをアデノウイルスヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン結合抗体と結合させ、生じた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。次いで、3分子複合体を用いて細胞を感染させる。アデノウイルスベクターは、連結されたDNAが損なわれる前に、効率的な結合、内部移行、およびエンドソームの分解を可能にする。アデノウイルスに基づくベクターを送達するための他の方法に関しては、米国特許第5,691,198号を参照されたい。
【０１４６】
リポソーム/DNA複合体が直接的インビボ遺伝子導入を媒介し得ることが示されている。標準的なリポソーム調製物においては、遺伝子導入過程は非特異的であるが、例えば直接的インサイチュー投与後に腫瘍沈着において局在的なインビボ取り込みおよび発現が報告されている。
【０１４７】
ポリヌクレオチドがセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムもしくはDNAzymeをコードする場合、発現によりセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムもしくはDNAzymeが生じる。したがってこの関連においては、発現はタンパク質産物が合成されることを必要としない。発現ベクターは、ベクター内にクローニングされたポリヌクレオチドに加えて、真核細胞において機能するプロモーターもまた含む。クローニングされたポリヌクレオチド配列はこのプロモーターの制御下にある。適切な真核プロモーターには上記のものが含まれる。発現ベクターには、本明細書において記載する選択マーカーおよび他の配列等の配列もまた含まれ得る。
【０１４８】
突然変異標的対立遺伝子（例えば、TLR-2またはTLR-4）を保有する、または一方もしくは両方の対立遺伝子が欠失しているかもしくは上方制御される細胞をモデル系として使用し、感染または他の疾患状態の影響を研究することができる。
【０１４９】
本発明の化合物、薬剤、医薬品、核酸分子、および他の標的アンタゴニストまたはアゴニストは、従来の薬学的配合法に従って調製される薬学的組成物中に処方することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. （1990, Mack Publishing Company, Easton, PA, U.S.A.)を参照されたい。組成物は、活性物質または活性物質の薬学的に許容される塩を含み得る。これらの組成物は、1つの活性物質に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤、または当技術分野において周知の他の物質も含み得る。そのような物質は無毒性であるべきであり、また有効成分の効力を妨害すべきではない。担体は、例えば、局所的、静脈内、経口、くも膜下腔内、神経弓上、または非経口といった投与に望ましい調製物の形態に依存して、多種多様な形態をとり得る。
【０１５０】
経口投与に関しては、化合物をカプセル剤、丸薬、錠剤、トローチ剤、散剤、、懸濁液、または乳濁液等の固体または液体調製物に製剤化することができる。経口剤形の組成物の調製においては、通常の薬学的媒体のいずれかを用いることができ、例えば、経口液体調製物（例えば、懸濁液、エリキシル剤、および溶液等）の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香料添加剤、保存剤、着色剤、懸濁化剤等；または経口固体調製物（例えば、粉剤、カプセル剤、および錠剤等）の場合には、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等の担体を用いることができる。投与での簡便性から、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口投与単位形態を示し、この場合、当然ながら固体薬学的担体が用いられる。必要に応じて、標準的な技術により錠剤に糖衣または腸溶衣をかけてもよい。活性物質をカプセル化し、血液脳関門の通過を可能にするのと同時に、胃腸管を安定に通過させることができる。例えば、国際公開公報第96/11698号を参照されたい。
【０１５１】
非経口投与に関しては、化合物を薬学的担体中に溶解し、溶液または懸濁液として投与することができる。適切な担体の例は、水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、果糖溶液、エタノール、または動物性、植物性、もしくは合成起源の油である。担体はまた、他の成分、例えば、保存剤、懸濁化剤、可溶化剤、緩衝液等を含んでもよい。化合物をくも膜下腔内に投与する場合には、化合物を脳脊髄液中に溶解してもよい。
【０１５２】
活性物質は治療有効量で投与することが好ましい。実際の投与量ならびに投与の速度および時間経過は、治療を受ける病態の性質および重症度に依存することになる。治療の指示、例えば投与量、タイミング等の決定は一般開業医または専門医の責任の範囲内にあり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に周知である他の要因を考慮に入れる。技法および手順の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、前記において見出すことができる。
【０１５３】
または、ターゲティング療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドまたは特異的核酸分子のようなターゲティング系の使用により、活性物質を特定の種類の細胞により特異的に送達することも可能である。ターゲティングは、種々の理由から、例えば、物質が許容できない毒性である場合、またはさもなければ非常に高い投与量を必要とする場合、またはさもなければ標的細胞に侵入することができない場合に望ましいと考えられる。
【０１５４】
これらの物質を直接投与する代わりに、それらを標的細胞内で、例えば、上記のようなウイルスベクター内で、または米国特許第5,550,050号および国際公開公報第92/19195号、第94/25503号、第95/01203号、第95/05452号、第96/02286号、第96/02646号、第96/40871号、第96/40959号、および第97/12635号に記載のような細胞に基づく送達系において産生させることができる。ベクターは標的細胞に標的することができる。細胞に基づく送達系は、患者の体内において所望の標的部位に移植されるように設計され、標的薬剤のコード配列を含む。または、物質は、治療すべき細胞内で産生されるか、またはそのような細胞に標的される活性化剤によって活性型に変換される前駆体型で投与することもできる。例えば、欧州特許出願第0 425 731A号および国際公開公報第90/07936号を参照されたい。
【０１５５】
本発明はさらに、感染または他の疾患状態の存在または非存在、感染が慢性になっているかどうか、感染および/または治療手順の有効性に対する対象の感受性を決定するためなどの診断手順を意図する。
【０１５６】
免疫学に基づくTLR検出手順は、様々な形態をとり得る。例えば、特定のTLRまたはTLRを含む単球もしくは肝細胞に対してそれぞれが異なる特異性を有する多数の抗体をアレイ内に固定化してもよい。次いで、生検試料の細胞を抗体アレイと接触させ、細胞上で上昇したまたは下方制御されたTLRのレベルおよび種類に関して診断を行うことができる。
【０１５７】
ELISA、ウェスタンブロット解析、免疫沈降解析、免疫蛍光解析、免疫化学解析、またはFACS解析によるなど、他のより慣習的なアッセイを行うことも可能である。
【０１５８】
したがって、本発明は、TLR、またはTLRを含む細胞、またはTLRの断片、変種、もしくは誘導体を検出する方法であって、試料を抗体またはその断片もしくは誘導体と接触させる段階、ならびに抗体およびTLRまたはその断片、変種、もしくは誘導体を含む複合体のレベルを正常対照と比較して検出する段階を含み、TLRのレベルの変化によって感染または他の疾患状態の存在または非存在が示される方法を提供する。
【０１５９】
TLRはTLR-2および/またはTLR-4であることが好ましい。他の疾患状態は肝硬変またはHCC等の肝疾患であることが好ましい。
【０１６０】
以上に考察した通り、複合体の形成を判定するのに適した任意の方法を用いることができる。例えば、レポーター分子を付随させた本発明による抗体を免疫測定法に用いてもよい。そのような免疫測定法には、これらに限定されないが、当業者に周知である放射免疫測定法（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、および免疫クロマトグラフィー法（ICT）、ウェスタンブロッティング法が含まれる。例えば、本発明に従って用い得る種々の免疫測定法を開示しているColigan et al., 1991-1997、前記に言及することができる。免疫測定法には競合アッセイ法も含まれ得る。本発明が定性的および定量的な免疫測定法を含むことは理解されると考えられる。
【０１６１】
適切な免疫測定法は、例えば、米国特許第4,016,043号、第4,424,279号、および第4,018,653号に記載されている。これらには、非競合型の一部位および二部位アッセイ法、ならびに従来の競合結合アッセイ法が含まれる。これらのアッセイ法には、標識した抗原結合分子の標的抗原との直接結合も含まれる。この場合の抗原はTLRまたはその断片である。
【０１６２】
二部位アッセイ法は本発明における使用に特に好ましい。これらのアッセイ法には多くの変法が存在し、これらはすべて本発明に含まれるものとする。簡潔に説明すると、典型的な順方向アッセイ法では、非標識抗体等の非標識抗原結合分子を固相単体上に固定化し、被験試料を、結合してある分子と接触させる。抗体-抗原複合体を形成するのに十分である適当な期間インキュベーションした後、検出可能なシグナルを生じ得るレポーター分子で標識した別の抗原結合分子（抗原に対して特異的な二次抗体が適している）を添加してインキュベートし、抗体-抗原-標識抗体という別の複合体が形成されるのに十分な時間をおく。未反応の物質を洗浄除去し、レポーター分子によって生じるシグナルを観察することにより抗原の存在を判定する。結果は視認し得るシグナルの単純な観察による定性的なものでもよく、または既知量の抗原を含む対照試料との比較によって定量化してもよい。順方向アッセイ法の変法には、結合してある抗体に対して試料および標識抗体の両方を同時に添加する同時アッセイ法が含まれる。容易に明白であると考えられるわずかな変更を含め、これらの方法は当業者には周知である。
【０１６３】
典型的な順方向アッセイ法では、抗原またはその抗原性部分に対する特異性を有する一次抗体を、固相表面に対して共有結合させるかまたは受動的に結合させる。固相表面は典型的にはガラスまたはポリマーであり、最もよく用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル、またはポリプロピレンである。固相支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、または免疫測定を行うのに適した任意の他の表面の形態であってよい。結合過程は当技術分野において周知であり、一般に架橋共有結合または物理的吸着からなり、被験試料の調製時にポリマー-抗体複合体を洗浄する。次いで被験試料の一定分割量を固相複合体に添加し、十分な期間および適切な条件下でインキュベートして、存在する抗原を抗体に結合させる。インキュベーション期間の後に、抗原-抗体複合体を洗浄して乾燥させ、抗原の一部分に対して特異的な二次抗体と共にインキュベートする。二次抗体には一般に、二次抗体と抗原との結合を示すために用いられるレポーター分子が付随している。付随するレポーター分子によって測定される、結合する標識抗体の量は、固定化した一次抗体と結合した抗原の量に比例する。
【０１６４】
変法では、生物試料中の抗原を固定化する段階、および次いで固定化抗原を特異的抗体（レポーター分子で標識してもしなくてもよい）に対して曝露する段階を含む。標的の量およびレポーター分子のシグナルの強さに依存して、抗体による直接標識化により、結合した抗原を検出することができる。または、一次抗体に対して特異的な標識二次抗体を標的-一次抗体複合体に対して曝露し、標的-一次抗体-二次抗体という三次複合体を形成させる。この複合体は、レポーター分子が発するシグナルにより検出される。
【０１６５】
上記の内容から、抗原結合分子に付随するレポーター分子には以下が含まれ得ることが理解されると考えられる：
(a) レポーター分子の抗体との直接的な結合；
(b) レポーター分子の抗体との間接的な結合；すなわち、レポーター分子と、後に抗体に結合させる別のアッセイ試薬との結合；および
(c) 抗体の以後の反応産物との結合。
【０１６６】
レポーター分子は、色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、常磁性イオン、ユーロピウム（Eu34）等のランタニドイオン、他の核標識タグを含む放射性同位体、および直接観察用標識を含む群より選択され得る。
【０１６７】
直接観察用標識の場合には、コロイド状の金属性もしくは非金属性粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル生成物質を含む他の小胞等を用い得る。
【０１６８】
レポーター分子として用いるのに適した数多くの酵素が、米国特許第4,366,241号、第4,843,000号、および第4,849,338号に開示されている。本発明において有用である適切な酵素には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。酵素は単独で用いてもよく、または溶液中の二次酵素と組み合わせて用いてもよい。
【０１６９】
適切な蛍光色素には、これらに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、R-フィコエリトリン（RPE）、およびテキサスレッドが含まれる。他の例示的な蛍光色素には、国際公開公報第93/06121号によって考察されるものが含まれる。米国特許第5,573,909号および第5,326,692号に記載されている蛍光色素に言及することもできる。または、米国特許第5,227,487号、第5,274,113号、第5,405,975号、第5,433,896号、第5,442,045号、第5,451,663号、第5,453,517号、第5,459,276号、第5,516,864号、第5,648,270号、および第5,723,218号に記載されている蛍光色素に言及することも可能である。
【０１７０】
酵素免疫測定法の場合には、一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により、酵素を二次抗体と結合させる。しかし、容易に認識されるように、当業者が容易に利用し得る広範な種々の結合法が存在する。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般に、対応する酵素による加水分解によって検出可能な色の変化を生じるように選択される。適切な酵素の例には前記のものが含まれる。また、上記の発色基質ではなく、蛍光産物を生じる蛍光基質を用いることも可能である。いずれの場合にも、酵素標識抗体を一次抗体-抗原複合体に対して添加し、結合させ、次いで過剰な試薬を洗浄除去する。続いて、適切な基質を含む溶液を抗体-抗原-抗体という複合体に対して添加する。この基質は二次抗体に連結されている酵素と反応して定性的な視覚シグナルを生じるが、これをさらに定量すること（通常は分光測定で）により、試料中に存在した抗原の量の指標を得ることができる。
【０１７１】
または、フルオレセイン、ローダミン、およびランタニド、ユーロピウム（EU）等の蛍光化合物を、抗体に対して、その結合能を変化させることなく化学的に結合させてもよい。特定波長の光の照射により活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収して分子の励起状態を誘導し、その後、光学的顕微鏡により視覚的に検出できる特徴的な色調の光を放射する。蛍光標識抗体を、一次抗体-抗原複合体と結合させる。結合していない試薬を洗浄除去した後、残存するる三次複合体に適当な波長の光を照射する。観察される蛍光は、関心対象の抗原の存在を示す。免疫蛍光アッセイ法（IFMA）は当技術分野において十分に確立されており、本方法にとっても特に有用である。しかし、放射性同位元素、化学発光分子、または生物発光分子等の他のレポーター分子を用いることも可能である。
【０１７２】
TLRに対するモノクローナル抗体を、ELISAを介したTLRの検出において用いることもできる。これは、抗TLR抗体を固相支持体に固定し、これらをPBMCおよび/または肝細胞と接触させるなど多くの方法で行い得る。次いで、標識抗TLR抗体を用いて固定化されたTLRを検出する。または、他のPBMCまたは肝細胞表面マーカーに対する抗体を使用する。このアッセイ法は様々な様式で変動し得り、すべての変法は本発明によって包含される。このアプローチにより、TLRレベルの迅速な検出および定量化が可能になる。
【０１７３】
本抗体は、生検試料物質等のインサイチューハイブリダイゼーション解析においても有用である。そのような解析により、TLR-2およびTLR-4等のTLRのレベルの迅速な診断が可能になる。
【０１７４】
別の態様では、検出法は、TLRをコードするポリヌクレオチドの細胞内での発現レベルを検出する段階を含む。そのようなポリヌクレオチドの発現は、任意の適切な方法を用いて決定し得る。例えば、TLRをコードする標識ポリヌクレオチドを、細胞から得られたRNA抽出物のノーザンブロットのプローブとして用いることができる。好ましくは、RT PCR等の核酸増幅反応において、動物からの核酸抽出物を、キナーゼをコードするポリヌクレオチドまたはその隣接配列のセンス配列およびアンチセンス配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーと共に利用する。種々の自動化固相検出法もまた適している。例えば、例えばFodor et al.,（Science 251: 767-777, 1991）およびKazal et al.,（Nature Medicine 2:753-759, 1996）によって記載されているように、非常に大規模な固定化プライマーアレイ（VLSIPS（商標））が核酸の検出に用いられる。上記の遺伝子技法は当業者には周知である。
【０１７５】
例えば、TLRをコードするRNA転写産物のため、TLR RNAを含むと予想される細胞試料からRNAを単離する、例えばヒトPBMCから全RNAを単離する。RNAは、例えばTRIZOL（商標）試薬（GIBCO-BRL/Life Technologies、メリーランド州、ゲイサーズバーグ）を用いるなど当技術分野において周知の方法によって単離することができる。オリゴdT、またはランダム配列オリゴヌクレオチド、および配列特異的オリゴヌクレオチドを逆転写反応のプライマーとして使用し、単離したRNAから第1鎖cDNAを調製することができる。次いで、生じた第1鎖cDNAをPCR反応において配列特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅し、増幅産物を取得する。
【０１７６】
「ポリメラーゼ連鎖反応法」または「PCR法」とは、核酸、RNAおよび/またはDNAの所定の断片の量を米国特許第4,683,195号に記載されるように増幅する手順または技法を指す。一般に、関心対象の領域の末端またはその先からの配列情報を利用して、オリゴヌクレオチドプライマーをを設計する。これらのプライマーは、増幅すべき鋳型の逆鎖と同一または類似の配列となる。PCRを用いて、特定のRNA配列および全細胞RNAから転写されたcDNAを増幅することができる。一般的には、Mullis et al.,（Quant．Biol.，51: 263, 1987；Erlich，eds.，PCR Technology, Stockton Press，NY，1989）を参照されたい。したがって、PCRによる特定の核酸配列の増幅は、関連遺伝子またはタンパク質配列のアラインメント、例えば哺乳動物TLR遺伝子の配列比較から推定される保存されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドまたは「プライマー」に依存する。例えば、TLRをコードするcDNA分子のアンチセンス鎖にアニーリングすると予測される一方のプライマーを調製し、センス鎖とアニーリングすると予測されるもう一方のプライマーを調製する。
【０１７７】
増幅された産物を検出するには、反応混合物を典型的にはアガロースゲル電気泳動または他の簡便な分離法に供し、増幅されたTLR特異的DNAの相対的な存在を検出する。例えば、増幅されたTLR DNAは、特異的オリゴヌクレオチドプローブによるサザンハイブリダイゼーションを用いて、またはその電気泳動移動度を既知分子量のDNA標準物質と比較することにより検出することができる。増幅されたTLR DNAの単離、精製、および特徴づけは、ゲルから断片を切り出すかまたは溶出し（例えば、参考文献Lawn et al., Nucleic Acids Res. 2: 6103, 1981；Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057-1980を参照のこと）、増幅された産物を適切なベクター、例えばpCRIIベクター（Invitrogen）のクローニング部位にクローニングし、クローニングされた挿入物を配列決定し、そのDNA配列をTLRの既知配列と比較することにより達成することができる。次いで、TLR mRNAおよびcDNAの相対量を決定し得る。
【０１７８】
リアルタイムPCRは、PCR遺伝子の転写レベルを決定する上で特に有用である。転写活性の決定には、得られるmRNA転写産物に基づいた潜在的転写活性の測定もまた含まれる。リアルタイムPCRおよび他のPCR手順は、DNA結合フルオロフォアの結合、5'エンドヌクレアーゼ、隣接する線状およびヘアピンオリゴプローブ、ならびに自己蛍光単位複製配列を含む、PCR産物を検出するための多くの化学を使用する。これらの一般的な化学およびリアルタイムPCRは、例えばMackay et al., Nucleic Acids Res 30(6): 1292-1305, 2002；Walker, J. Biochem. Mol. Toxicology 15(3): 121-127, 2001；Lewis et al., J. Pathol. 195: 66-71, 2001において考察されている。
【０１７９】
本発明はさらに、mRNA転写産物の上方制御または下方制御に関してスクリーニングするための遺伝子アレイおよび/または遺伝子チップを提供する。本発明のこの局面は、TLR遺伝子転写産物の上方制御または下方制御をもたらす病態を同定する上で特に有用である。さらに、TLR転写産物、特にTLR-2およびTLR-4転写産物を上方制御するまたは下方制御する化合物を容易にスクリーニングすることができる。
【０１８０】
以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。
【０１８１】
実施例1
TLR-2およびTLR-4の発現に及ぼすHCVの影響
患者
試験群は、生検試料が慢性C型肝炎（CHC）であると判明した、大学付属病院の専門肝臓外来に通院する16名の外来患者を含んだ［表3および4］。肝疾患の病歴がなく、アルコール摂取量が<20 g/日であり、かつ肝機能検査が正常である32名の年齢および性別の一致した無症候性ボランティアを対照とした。South Eastern Area Health Service Research Ethics Committee、Department of Health、ニューサウスウェールズ州、オーストラリアから倫理的承認を得た。
【０１８２】
血液採取
発熱物質のない注射針、シリンジ、および容器（Becton-Dickinson、シンガポール）を用いて末梢血を採取した。4℃で冷却遠心分離して血漿と血清を分離し、採取してから6週間以内に分析するまで、発熱物質のないポリエチレンcryotube（Nunc、デンマーク）中で-70℃にて保存した。全血は、末梢血単球上のTLR発現を決定するために使用した。
【０１８３】
血清TNF-αアッセイ
血清TNF-αは、Quantikine HS Human TNF-γ Immunoassay（R&D Systems Inc.、米国、ミネアポリス）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定した。アッセイの感度は0.5 pg/mLであった。
【０１８４】
TLR発現を決定するためのフローサイトメトリー
以下の抗ヒトモノクローナル抗体：抗TLR-2-フルオロイソチオシアネート（FITC）および抗TLR-4-フィコエリトリン（PE）（eBioscience）、ならびに抗CD14-ペリジニンクロロフィルタンパク質（PerCP）（Becton Dickinson、米国）を用いて、全血の細胞表面染色を行った。アイソタイプの一致する非結合対照を比較のために使用した。各試料について1万個のCD14陽性細胞を取得し、FACSCaliber flow cytometer（Becton Dickinson、米国）にて光散乱特性に基づき死細胞をゲートから排除した。フローサイトメトリーのセッションごとに少なくとも2名の対照患者を標準化目的で使用した。TLR-2値およびTLR-4値は、個々の試験患者の幾何平均蛍光とそのセッションの平均対照値との比として表した。
【０１８５】
（表３）患者の特徴
2006520588.tif 000013
【０１８６】
（表４）CHC患者の特徴
2006520588.tif 000014
【０１８７】
本実施例により、CD14陽性単球のTLR-2およびTLR-4発現がHCV患者において有意に上方制御されており、TLR-2レベルが循環するTNF-α ALTレベルと有意に相関することが実証される。これらの知見から、免疫受容体の上方制御がHCVの直接の影響であり得ることが示唆される。さらに、TLR-4ではなくTLR-2を介するシグナル伝達が、CHCにおいて見られるTNF-αの循環レベルの上昇およびそれに対応したALTレベルの上昇に寄与する可能性が高い。TNF-αレベルとALTレベルの優れた相関性から、HCV感染における肝臓破壊のいくつかの直接的な原因機構が示唆され得る。
【０１８８】
実施例2
TLR-2発現に及ぼすHBV感染の影響
慢性B型肝炎（CHB）を患い、ウイルス複製が進行中である（HBV DNA >200,000ゲノム/mL、n=12および200〜10,000ゲノム/mL、n=6；Cobas Amplicor HBV Monitor（商標）試験、米国）18名の非硬変患者、および32名の健常対照被験者を試験した。CD14陽性末梢血単球細胞（PBMC）におけるTLR-2およびTLR-4の発現を、抗CD14モノクローナル抗体（Becton Dickinson）ならびに抗TLR-2および抗TLR-4モノクローナル抗体（eBioscience、米国）を用いたフローサイトメトリーによって測定した。ラミブジンによる処置後にHBV DNAが>200,000から<200ゲノム/mLに減少した5名の患者において、TLR発現を再評価した。5名の対照被験者において、ベースラインで、および部分精製した組換えHBVにより20 h刺激した後に、PBMCによるインビトロTLR-2発現を測定した。TLR-2発現（対照結果に対する比として表す）は、対照と比較してHBV DNA >200,000ゲノム/mLを有する慢性B型肝炎患者（平均：0.63；範囲0.05〜1.52）（P=0.0001）およびHBV DNA 200〜10,000ゲノム/mLを有する慢性B型肝炎患者（平均：0.98；範囲0.94〜1.17）（P=0.04）において有意に減少していた。TLR-4発現については3群の間で有意な変化はなかった。HBV DNAが検出できなくなったラミブジンにより処置した5名の患者のそれぞれにおいて、TLR-2発現は正常化した。TLR-2のインビトロ発現は、組換えHBVに対する曝露後に濃度依存的様式で減少した。
【０１８９】
本実施例から、HBVによりPBMCにおけるTLR-2発現が下方制御されることが示される。HBVによって誘導される先天性免疫の異常が持続的感染の発症に寄与することが本明細書において提唱される。
【０１９０】
実施例3
肝硬変におけるTLRの発現
患者
試験群は、一連の病因論を背景として、およびチャイルド・ピュー分類（Pughet al., Br J Surg. 60:646-649, 1973）によって示される肝機能障害の一連の程度にわたる肝硬変を有する、大学付属病院の専門肝臓外来に通院する36名の外来患者を含んだ（表5）。8名の患者が、ラクツロース（β-ガラクトフルクトシダーゼ；Solvay Pharmaceuticals、オーストラリア、シドニー）（この非吸収性の二糖によってエンドトキシン含有グラム陰性腸管内菌叢の腸含有量が減少するという関連性がある）（van Leeuwen et al., Surgery 110: 169-174, 1991）による肝性脳症の治療を受けていた。アルコール摂取量が5年を超える期間で男性では80 g/日、女性では30 g/日を上回り、ウイルス、代謝、および免疫病因論に関する試験が陰性であった場合に、患者をアルコール関連性肝硬変であると見なした（Hanck et al., 2001、前記）。アルコールはエンドトキシンに対するマクロファージの感受性およびPBMCによるTNF-αの産生に影響を及ぼすため（Manrekar et al., Alcohol Clin Exp Res. 21: 1226-1231, 1997；Enomoto et al., Gastroenterology 115: 443-451, 1998）、少なくとも3ヶ月間アルコールを禁断した患者のみを含めた。アルコール性肝炎の組織学的特徴を有する患者は除外した。除外の基準には、感染、抗生物質剤もしくは免疫調節剤の使用、または消化管出血等の循環エンドトキシンおよび/またはTNF-α濃度に影響を及ぼし得る、以前の6週間以内の他の要因の履歴もまた含めた。TNF-αは腎臓によって除去されるため、腎不全を有する患者（血清クレアチニン>20μmol/L）もまた除外した（von Baehr et al., 2000、前記；Hanck et al., 2001、前記；Bigatello et al., Am J Gastroenterol. 82: 11-15, 1987）。肝疾患の病歴がなく、アルコール摂取量が<20 g/日であり、かつ肝機能検査が正常である32名の年齢および性別の一致した無症候性ボランティアを対照とした。各患者から、書面によるインフォームドコンセントを得た。試験手順は、South Eastern Area Health Service Research Ethics Committee、Department of Health、ニューサウスウェールズ州、オーストラリアによる事前の承認によって示されるように1975年ヘルシンキ宣言の倫理指針に従った。
【０１９１】
血液採取
発熱物質のない注射針、シリンジ、および容器（Becton-Dickinson、シンガポール）を用いて末梢血を採取した。4℃で冷却遠心分離して血漿と血清を分離し、採取してから6週間以内に分析するまで、発熱物質のないポリエチレンcryotubesNunc、デンマーク）中で-70℃にて保存した。全血は、末梢血単球上のTLR発現を決定するために使用した。
【０１９２】
血漿エンドトキシンアッセイ
血漿エンドトキシンは、発色性カブトガニ変形細胞溶解液アッセイ（chromogenic limulus amoebocyte lysate assay）（Associate of Cape Cod Inc.、米国、マサチューセッツ州）を用いて、製造業者の取扱説明書に従って測定した。アッセイの感度は3 pg/mLであった。
【０１９３】
血清TNF-αアッセイ
血清TNF-αは、Quantikine HS Human TNF-α Immunoassay（R&D Systems Inc.、米国、ミネアポリス）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定した。アッセイの感度は0.5 pg/mLであった。
【０１９４】
血清sTNFRアッセイ
血清sTNF RI（p55）およびsTNF RII（p75）は、Quantikine HS Human sTNFR Immunoassay（R&D Systems Inc.、米国、ミネアポリス）を用いて製造業者の取扱説明書に従って測定した。sTNF RIおよびsTNF RIIアッセイの感度は、それぞれ3.0 pg/mLおよび1.0 pg/mLであった。
【０１９５】
TLR発現を決定するためのフローサイトメトリー
以下の抗ヒトモノクローナル抗体：抗TLR-2-フルオロイソチオシアネート（FITC）および抗TLR-4-フィコエリトリン（PE）（eBioscience）、ならびに抗CD14-ペリジニンクロロフィルタンパク質（PerCP）（Becton Dickinson、米国）を用いて、全血の細胞表面染色を行った。アイソタイプの一致する非結合対照を比較のために使用した。各試料について1万個のCD14陽性細胞を取得し、FACSCaliberフローサイトメーター（Becton Dickinson、米国）にて光散乱特性に基づき死細胞をゲートから排除した。フローサイトメトリーのセッションごとに少なくとも2名の対照患者を標準化目的で使用した。TLR-2値およびTLR-4値は、個々の試験患者の幾何平均蛍光とそのセッションの平均対照値との比として表した。
【０１９６】
PBMCによるTNF-αのインビトロ産生
Ficoll-Paque勾配（Pharmacia；スウェーデン、ウプサラ）により、全血からPBMCを単離した。PBMCを洗浄した後、抗生物質および3% v/v熱非働化ウシ胎児血清を添加したRPMIで2x106細胞/mlとなるように調整した。PBMCを96ウェル丸底組織培養プレートに2x105細胞/200μl培地でプレーティングした。それぞれ10 ng/mL濃度のエンドトキシンまたはブドウ球菌エンテロトキシンB（SEB）で、細胞を二つ組みで刺激した。予備実験において、これらの濃度が対照被験者で一貫したTNF-α応答を生じることが示された。20時間後に上清を回収し、解析するまで-20℃で保存した。TNF-αは、捕獲ELISA（TNF-α OptEIA（商標）、BD Pharmingen、米国、カリフォルニア州）により、製造業者の仕様書にわずかな変更を加えて測定した。ELISA感度は8 pg/mLであった。値は、エンドトキシンまたはSEB刺激細胞の培養上清中のTNF-α濃度と、個々の対照および肝硬変患者の非刺激細胞の培養上清中のTNF-α濃度の比として表した。
【０１９７】
Synbioticグラム陽性腸管内菌叢療法の経口補充
肝硬変を有する11名の患者（アルコール=7；C型肝炎ウイルス=3、および原発性胆汁性肝硬変=1；チャイルド・ピュークラスA=7；クラスB=2；クラスC=2）は、10 gの生理活性繊維（βグルカン、2.5 g；イヌリン2.5 g；ペクチン、2.5 g；難消化性デンプン、2.5ｇ）と共に、小袋当たりそれぞれ4x1010コロニー形成単位のラクトバシラス・プランタラム2362（Lactobacillus plantarum 2362）、ラクトバシラス・パラカセイ・パラカセイ亜種19（Lactobacillus paracasei subsp paracasei 19）、ペディアコッカス・ペントセセウス5-33:3（Pediacoccus pentoseceus 5-33:3）、およびラクトコッカス・ラフィノラクチス32-77:1（Lactococcus Raffinolactis 32-77:1）を含む凍結乾燥グラム陽性腸管内菌叢療法（Synbiotic 2000；Medipharm、スウェーデン、Kagerod）の経口補充を受けた。患者は7日間、毎日2回、1袋を与えられた。介入期間の前または期間中は、どの患者もラクツロースによる処置を受けなかった。PBMCにおけるTLR-2発現、血清TNF-αレベル、およびSEBによる刺激に応答したPBMCによるTNF-αのインビトロ産生を、ベースライン時、補充から7日後、および補充を休止してから28日後に測定した。腸管内菌叢療法の補充を受けていない5名の無症候性ボランティアを、これらの3時点におけるTLR-2解析の標準化目的のための対照とした。
【０１９８】
統計解析
統計解析は、必要に応じてクラスカル・ワリス検定、マン・ホイットニー順位和検定、スペアマン順位相関検定、およびウィルコクソンの順位和検定を用いて行った（Systat for Windows、バージョン5.02、Systat Inc.、米国、イリノイ州、エバンストン）。P≦0.05の確立水準を統計的有意とした。
【０１９９】
血漿エンドトキシンレベル
血漿エンドトキシンレベルは、病因論を問わず、健常対照と比較して肝硬変患者において有意に増加していた（図3）。チャイルド・ピュー等級に関して試験した場合、エンドトキシンレベルの上昇は、等級Aの肝硬変を有する患者において認められたが、より重症の肝機能障害を有する患者（等級BおよびC）では認められなかった（図3）。
【０２００】
血清TNF-αレベル
血清TNF-αレベルは、肝硬変の病因にもチャイルド・ピュー等級にもかかわらず、対照被験者よりも肝硬変患者において有意に高かった（図4）。これらのレベルは、血漿エンドトキシンレベルと有意に相関していなかった（r=0.01、P=0.99）。
【０２０１】
血清sTNFRレベル
血清sTNF RIおよびsTNF RIIレベルはそれぞれ、肝硬変の病因にもチャイルド・ピュー等級にもかかわらず、対照よりも肝硬変患者において有意に高かった（図5および6）。sTNF RIおよびsTNF RIIレベルは、血漿エンドトキシンレベルと有意に相関していなかった（それぞれr=0.07、P=0.80およびr=0.21、P=0.09）
【０２０２】
全血からゲートを設定したCD14陽性末梢血単球におけるTLR-4およびTLR-2発現
CD14陽性末梢血単球におけるTLR-4の発現（図7）は、血漿エンドトキシンレベルの有意な上昇が実証されたチャイルド・ピュークラスA患者であっても、肝硬変患者と対照とに有意な相違は認められなかった（図8）。対照的に、TLR-2発現は（図7）肝硬変患者において有意に増加していた。この上方制御は肝硬変の病因およびチャイルド・ピュー分類を問わず起こり（図8）、TNF-αの血清レベル（r=0.49；P<0.0005）、sTNF RI（r=0.53；P=0.0005）、およびsTNF RII（r=0.63；P=0.0005）と高度に相関していた。
【０２０３】
PBMCによるTNF-αのインビトロ産生
エンドトキシンによる刺激後のTNF-αのインビトロ産生は、血漿エンドトキシンレベルの増加が実証されたチャイルド・ピュークラスA患者であっても、肝硬変患者と対照とに有意な相違は認められなかった（図9）。対照的に、SEBによる刺激後のTNF-αのインビトロ産生は、非刺激と比較して増加するものの、肝硬変の病因にもチャイルド・ピュー分類にもかかわらず、対照被験者よりも有意に少ない程度で増加した（図9）。
【０２０４】
SEBで刺激したPBMCによるTNF-αのインビトロ産生と血清TNF-αレベルとの間に有意な逆相関が認められた（r=-0.32；P=0.02）。
【０２０５】
試験パラメータに及ぼすラクツロースの影響
チャイルド・ピュークラスA患者よりも多くのチャイルド・ピュークラスBおよびC対応物が（それぞれ7/16｛43.8%｝対1/20｛5%｝）、ラクツロースによる処置を受けていた。ラクツロースによる処置率がこのように高いことが、全体としてチャイルド・ピュークラスB群およびC群において血漿エンドトキシンレベルが増加しなかったという知見の主な原因になったと考えられた。ラクツロースによる処置を受けたチャイルド・ピューBおよびC患者のサブグループにおける血漿エンドトキシン値は、対照被験者における値と有意な相違は認められなかった；逆に、ラクツロースを受けていないチャイルド・ピューBおよびC患者におけるレベルは、対照またはこのカテゴリー内のラクツロース処置を受けた患者において認められるレベルよりも有意に高かった（表6）。
【０２０６】
エンドトキシン値とは対照的に、ラクツロース処置は他の試験パラメータのいずれにも有意な影響を及ぼさなかった。したがって、ラクツロース処置群および非処置群のいずれにおいても、TNF-αならびに可溶性TNF RIおよびsTNF RIIの血清濃度、さらにPBMCによるTLR-2発現はそれぞれ対照レベルと比較して有意に増加し、SEBに応答したPBMCによるTNF-αのインビトロ産生は対照レベルと比較して有意に減少した。PBMCによるTLR-4発現およびエンドトキシンに応答したPBMCによるTNF-αのインビトロ産生は、ラクツロース処置群においても非処置群においても、対照値との有意な変化は認められなかった（表6）。
【０２０７】
肝硬変患者の、Synbioticグラム陽性腸管内菌叢療法の経口補充
肝硬変患者におけるCD14陽性PBMCによるTLR-2発現は、補充前の値と比較して、synbioticグラム陽性腸管内菌叢療法の経口補充をしてから7日後に有意に増加した。そのような追跡データが得られた8名の患者すべてにおいて、レベルは補充休止後28日目までに実質的に減少した（3名の患者は、この時点までに消化管出血｛n=1｝および抗生物質の使用を必要とする感染｛n=2｝を含む除外基準を生じた）（図10）。
【０２０８】
補充7日後の血清TNF-αレベルは、8/11（72.7%）の肝硬変患者において、補充前のレベルと比較して平均20%（範囲：1〜129%）増加した。追跡データが得られたこれら8名の患者のうちの6名すべてにおいて、レベルは補充休止後28日目までにベースラインに低下した。
【０２０９】
補充が血清TNF-αレベルの増加と関連した7名の患者を含む8/11（72.7%）の肝硬変患者において、補充してから7日後の、SEBによる刺激に応答したPBMCによるインビトロTNF-α産生は、補充前のレベルと比較して平均46%（範囲：8〜67%）減少した。補充休止後28日目における追跡データは、これら8名の患者のうち6名で得ることができた。SEBに対するPBMCの反応性は、3名のそのような患者ではベースラインまで改善され、残りの3名では持続した）。
【０２１０】
共生的なサプリメント（synbiotic supplement）の投与は、報告される有害事象も一般的な臨床状態の変化もなく良好に許容された。
【０２１１】
実施例4
HBVおよびTLR発現のインビトロ解析
全血のB型肝炎刺激
6名の健常ボランティアから末梢血をLi-ヘパリンチューブに回収した。抗生物質および5%ウシ胎児血清を添加した等量のRPMIで全血を希釈した。末梢血細胞1個に対して1、10、および50ウイルス粒子の比率で、希釈血液1 mlを野生型1.5（遺伝子型A）HBVで刺激した。しっかりと蓋を閉めた5 mlポリスチレンチューブ中で、穏やかに回転させながら希釈血液を37℃でインキュベートした。20時間後、培養上清を回収してTNF-α ELISAを行った。残りの細胞はフローサイトメトリー解析用に染色した。
【０２１２】
HBVは、以前に記載されている通りに、組換えHBV/バキュロウイルス系を用いた細胞の形質導入により調製した（Delaney 4th and Isom; Hepatology; 28:1134-46, 1998）。
【０２１３】
TNF-α ELISA
全血培養上清によるTNF-αは、製造業者の仕様書に従ってTNF-α OptEIAセット（BD）を使用し、捕獲ELISAにより測定した。感度は8 pg/mLであった。全患者のTNF-αの結果を図11aおよびbに示す。
【０２１４】
フローサイトメトリー
CD14-PerCP抗体（MφP9；BD）、TLR2-FITC抗体（TL2.1；eBioscience）、およびTLR4-PE抗体（HTA125；eBioscience）を用いて、末梢血リンパ球の細胞表面染色を行った。適切なアイソタイプ対照を用いた。FACSCaliber flow cytometer（BD）にて、散乱特性に基づき、単球にゲートを設定してリンパ球尾部（tail）を収集した。データはFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を用いて解析した。相対傾向強度は、非刺激対照の幾何平均傾向強度を刺激試料から差し引くことによって決定した。野生型HBVによる刺激後の6名の患者すべてのTLR2およびTLR4の結果を図11（c、d、e、およびf）に示す。
【０２１５】
HBVバキュロウイルス感染HepG2（Hershy）
HBVは、以前に記載されている通りに、組換えHBV/バキュロウイルス系を用いた細胞の形質導入により調製した（Delaney 4th and Isom; Hepatology; 1998、前記）。
【０２１６】
HepG2（Hershy）細胞にHBV1:3野生型を形質導入するか、またはバキュロウイルスで偽感染させ、7日間培養してからフローサイトメトリー用に回収して染色した。いくつかの細胞は保存しておき、RNeasy mini kit（Qiagen）を用いて製造業者の仕様書に従って全RNAを抽出した。
【０２１７】
フローサイトメトリー
TLR2-FITC（TL2.1；eBioscience）抗体およびTLR4-PE抗体（HTA125；eBioscience）を用いて、HepG2の細胞表面染色を行った。適切なアイソタイプ対照を用いた。FACSCaliber flow cytometer（BD）にて、散乱特性に基づき死細胞をゲートから排除した。各試料について、全部で10000個の細胞を取得した。データはFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc.）を用いて解析した。相対傾向強度は、偽感染細胞の幾何平均傾向強度を野生型感染細胞から差し引くことによって決定した。
【０２１８】
QPCR
ランダムヘキサマーを用いて全RNAを逆転写してから、cDNAのリアルタイム解析を行った。PCRは、TaqMan Universal PCR Master MixならびにAssays-On-Demand Gene Expression Assayプローブおよびプライマー（Applied Biosystems）を用いて、最終容量10μl中、三つ組で行った。シグナルの検出は、50℃、2分；95℃、10分；95℃、15秒；60℃、1分の40サイクルにプログラムしたABI Prism 7700配列決定システムにより行った。各遺伝子のサイクル閾値（CT）を18SのCT値（ΔCT）と比較し、各試料について相対発現単位（REU）を算出した。したがって、REU=2＾CT（関心対象遺伝子）-CT（18S）=2＾ΔCTである。
【０２１９】
（表５）肝硬変を有する患者の臨床的詳細
2006520588.tif 000015
HCV: C型肝炎ウイルス  
HBV: B型肝炎ウイルス  
PBC: 原発性胆汁性肝硬変  
PSC: 原発性硬化性胆管炎
【０２２０】
（表６）試験パラメータに及ぼすラクツロース処置の影響
2006520588.tif 000016
太字は対照と比較した場合の有意な相違を示す；
a対照と比較してP=0.05；
bラクツロース処置群と比較してP=0.02；
c対照と比較してP=0.0009；
d対照と比較してP<0.0005；
e対照と比較してP=0.02；
f対照と比較してP=0.001；
g対照と比較してP=0.007
【０２２１】
実施例5
治療的介入の転帰の予測
実施例2に提供した方法を用いて、HBVに曝露された可能性のある対象を、治療的介入の前にTLR-2および/またはTLR-4のレベルに関してスクリーニングする。対象が初期治療の過程においてTLR-2および/またはTLR-4のレベルの変化（すなわち、TLR-2および/またはTLR-4のレベルが正常化する傾向）を示した場合、この治療が機能していることが予測される。レベルの変化は、治療前および/または標準化正常対照のレベルと比較した場合の上昇または減少であってよい。
【０２２２】
HCVに曝露されたまたは感染した可能性のある対象に対しても、同様の診断または予測過程を適用することができる。
【０２２３】
当業者は、本明細書に記載した本発明が具体的に記載した以外の変更および修飾を受け得ることを理解すると考えられる。本発明はそのような変更および修飾のすべてを含むものと理解されるべきである。本発明はまた、本明細書に引用するまたは示す段階、特徴、組成物、および化合物のすべてを個別にまたはまとめて含み、さらにそのような段階または特徴の任意の2つまたはそれ以上のありとあらゆる組み合わせを含む。
【０２２４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】図1Aおよび1Bは、対照被験者およびCHCを有する患者のTLRプロファイルを示すグラフ表示である。CD14およびTLR-2またはTLR-4に対する直接コンジュゲート化した抗体により全血を染色した。図表は、CD14にゲートを設定した10,000個の細胞を表す。実線はアイソタイプ対照の発現を表し、点線は対照被験者の発現を表し、破線はCHC患者の発現を表す。
【図２】図2Aおよび図2Bは、対照被験者およびHCV感染を有する患者のCD14陽性末梢血単球におけるTLR-4およびTLR-2発現を示すグラフ表示である。TLR-2およびTLR-4発現は、HCV感染を有する患者において有意に増加していた。
【図３】対照被験者および肝硬変患者における血漿エンドトキシンレベルを示すグラフ表示である。箱ヒゲ図は、各群についての全範囲、四分位範囲、および中央値を表す。
【図４】対照被験者および肝硬変患者における血清腫瘍壊死因子（TNF）-αレベルを示すグラフ表示であり、肝硬変の病因およびチャイルド・ピュークラスのそれぞれにかかわらず、肝硬変患者において値が有意に増加していたことを示す。
【図５】対照被験者および肝硬変患者における血清可溶性TNF-α受容体Iレベルを示すグラフ表示であり、肝硬変の病因およびチャイルド・ピュークラスのそれぞれにかかわらず、肝硬変患者において値が有意に増加していたことを示す。
【図６】対照被験者および肝硬変患者における血清可溶性TNF-α受容体IIレベルを示すグラフ表示であり、肝硬変の病因およびチャイルド・ピュークラスのそれぞれにかかわらず、肝硬変患者において値が有意に増加していたことを示す。
【図７】対照被験者および肝硬変患者の典型的なトール様受容体（TLR）プロファイルを示すグラフ表示である。CD14およびTLR-2またはTLR-4に対する直接コンジュゲート化した抗体により全血を染色した。図表は、CD14にゲートを設定した10,000個の細胞を表す。点線はアイソタイプ対照の発現を表し、実線は対照被験者の発現を表し、破線は肝硬変患者の発現を表す。
【図８】対照被験者および肝硬変患者のCD14陽性末梢血単球におけるトール様受容体4（TLR-4）およびTLR-2発現を示すグラフ表示である。TLR-4発現は、肝硬変の病因（右側中段パネル）およびチャイルド・ピュークラス（右側下段パネル）を問わず、肝硬変患者と対照患者とに有意な相違は認められなかった。逆に、TLR-2発現は肝硬変患者において有意に増加していた（左側パネル）。
【図９】対照被験者および肝硬変患者における、エンドトキシン（10 ng/mL）およびSEB（10 ng/mL）による刺激後のPBMCによるTNF-αのインビトロ産生を示すグラフ表示である。
【図１０】グラム陽性腸管内菌叢療法の7日間の経口補充前後の、11名の肝硬変患者のCD14陽性末梢血単球におけるTLR-2発現を示すグラフ表示である。補充は、ベースラインと比較した場合の値の有意な増加と関連していた。そのような追跡データが得られた8名の患者すべてにおいて、値は補充休止後28日目までに実質的に減少した。
【図１１】HBVによる刺激後の末梢血におけるTNF-α（図11aおよびb）、TLR2（図11cおよびd）、およびTLR4（図11eおよびf）のインビトロ発現を示す、6名の患者によるデータのグラフ表示である。b、d、およびfのそれぞれは、平均刺激のグラフ表示を示す。
【図１２】組換えHBV/バキュロウイルスによる形質導入後の、HepG2細胞におけるTLR-2およびTLR4のインビトロ発現を示すグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006520588.tif 000029
【図９】
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【図１０】
2006520588.tif 000031
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2006520588.tif 000033
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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