(57)【要約】  ヒトまたは動物における癌および癌性腫瘍を処理するため、Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｉｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓから得られた少なくとも１種の成分、特にエキスとして投与するための方法が記載される。Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓからのエキスの新規な組成物、これら新規な組成物の製造方法、およびこれらの組成物の記載した方法における使用も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍細胞に対して細胞毒性を示すＰｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの少なくとも１種の成分を対象へ投与することを含む、悪性腫瘍癌を処置する方法。
【請求項２】
処置される癌は、ヒトの白血病、骨肉腫、頸部癌、腎臓腫瘍、単細胞白血病、前立腺癌、エストロゲン依存性またはエストロゲン非依存性乳癌、黒色腫、または膀こう癌である請求項１の方法。
【請求項３】
処理される癌は、ヒトの白血病、骨肉腫、頸部癌、腎臓腫瘍、または単細胞白血病である請求項１の方法。
【請求項４】
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの少なくとも１種の成分は、凍結乾燥した粉砕したイガイ全体として提供される請求項１の方法。
【請求項５】
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの少なくとも１種の成分は、凍結乾燥した粉砕したイガイ全体のエキスとして提供される請求項１の方法。
【請求項６】
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの少なくとも１種の成分は、凍結乾燥した粉砕したイガイ全体のポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン界面活性剤による抽出物として提供される請求項１の方法。
【請求項７】
抽出物は、１００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するための限外濾過によって精製される請求項６の方法。
【請求項８】
抽出物は、３００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するための限外濾過によって精製される請求項６の方法。
【請求項９】
抽出物は、１００ｋＤより小さいサイズの物質および３００ｋＤより大きいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製される請求項６の方法。
【請求項１０】
抽出物は、それが塩基性ｐＨを持つようにＯＨ−イオンを提供する剤で処理される請求項６の方法。
【請求項１１】
抽出物は、７以上７の範囲のｐＨを持っている請求項６の方法。
【請求項１２】
成分は  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分である請求項１の方法。
【請求項１３】
ポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン界面活性剤で抽出された凍結乾燥粉砕Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの抽出物を含む組成物。
【請求項１４】
組成物は、１００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製される請求項１３の組成物。
【請求項１５】
組成物は、３００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製される請求項１３の組成物。
【請求項１６】
組成物は、１００ｋＤより小さいサイズの物質および３００ｋＤより大きい物質を除去するため限外濾過によって精製される請求項１３の組成物。
【請求項１７】
組成物は塩基性ｐＨを持っている請求項１３の組成物。
【請求項１８】
組成物は７以上９の範囲のｐＨを持っている請求項１３の組成物。
【請求項１９】
抽出剤としてポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン界面活性剤を含んでいる、粉砕した凍結乾燥した  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓの水溶液を準備し、
混合物をかきまぜ、
混合物を遠心し、
抽出物として液体部分を得るために１回以上傾しゃし、そして任意に、液体部分抽出物中に残っている小さい固形物を除去するために１回以上濾過することを含む、  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの少なくとも１種の成分を含んでいるエキスを調製するための方法。
【請求項２０】
胞子を含むすべての形の生きている生物を除去するのに十分なサイズのフィルターを通すことによって濾過滅菌することをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２１】
特定の寸法範囲の成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２２】
１００ｋＤより小さい成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２３】
３００ｋＤより小さいサイズの成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２４】
１００ｋＤより小さいサイズの成分および３００ｋＤより大きいサイズの成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２５】
ｐＨを上げるためＯＨ−イオンを提供する剤でエキスを処理することをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２６】
ｐＨは７以上７の範囲へ上げられる請求項２５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは哺乳類における癌および／または癌性腫瘍を処置するための  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓから得られる少なくとも１成分の使用を含む。本発明はまた、Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓからのエキスの新規な組成物、これら新規な組成物の製造方法、および記載した方法にこれら組成物の使用を含む。
アオイガイ、すなわちＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓの成分およびエキスを本発明に従って似たように提供し、使用することができ、そしてＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＰＣＥへのここでの言及はＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓおよびその成分またはエキスを含むものと理解すべきである。
【背景技術】
【０００２】
治療効果のため  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓからの調製物の使用は１７世紀なかばから少なくとも２５年遡る。関節炎の症状の緩和における凍結乾燥した  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓの栄養および治療性質は、Ｃｒｏｆｔ，１９７９，Ｒｅｌｉｅｆ  Ｆｒｏｍ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（Ｔｈｏｒｓｏｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）に報告されている。この報文はＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓからの可能性ある抗癌効果の以前の研究において「抗癌活性は認められなかった」ことを注記している。動物およびヒト実験における研究は、混合結果を与えたが、しかし全体としてイガイの特定の成分は関節炎に関係する炎症および痛みの寛解に潜在的に有用であったことを指示する。例えば、ＭｃＦａｒｌｅｎｅ，Ｊｕｎｅ  １９７５，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐ．５６９；Ａｕｄｅｖａｌ  ａｎｄ  Ｂｏｕｃｈａｒｔ，１９８６，Ｇａｚｅｔｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌｅ  ９３：１１１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３８：１３９；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｉｎｆｌａｍｍｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙを見よ。
【０００３】
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓへのＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの抗炎症目的のための類似性は、例えばＨｏａｇｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｏｄｓ  Ｈｏｌｅ  Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＷＨＯＩ）Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｏｌｉｃｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｃｔ．２１，２００１において論じられている。
【発明の開示】
【０００４】
今やＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓから得られる少なくとも１成分（ここでは  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓエキス（ＰＣＥ）という。）は、広い範囲の癌の形の処置、特に広い範囲の癌細胞、すなわち悪性腫瘍細胞に対する細胞毒性の発揮において活性を有することが見出された。
【０００５】
ここで使用する処置とは、病気の予防、緩和または治癒のための本発明の成分の治療的投与に関する。
【０００６】
ＰＣＥ成分は、栄養補助食品の調製または医薬品調製物の使用に適した、イガイの肉またはその器官から得られるどんな治療上活性な成分でもよい。本発明は、全イガイまたはその任意の治療上活性なエキスのような、イガイの未精製成分の使用を意図する。特に、ＰＣＥは、例えばＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，Ｖｅｒｍｏｎｔから提供されるＳｅａ  Ｍｕｓｓｅｌ製品、またはＤａＶｉｎｃｉ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，Ｖｅｒｍｏｎｔから提供されるＰｅｒｎａ製品のような、凍結乾燥しそして粉砕したイガイ全体の調製物であることができる。加えて、  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓの治療上活性なエキスも採用することができる。そのような治療上活性なエキスは以下のように記載されている。Ｍａｃｒｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｋａｌａｆａｔｉｃ，ＰＣＴ／ＡＵ９５／００４８５，ＷＯ９６／０５１６４（精製した脂質エキス）；Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：２３７−２４６（精製した脂質エキス）；Ｋｏｓｕｇｅ  ａｎｄ  Ｓｕｇｉｙａｍａ，米国特許Ｎｏ．４，８０１，４５３（安定化イガイエキス）；Ｃｏｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９５：８０３（タンパク分画）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３８：１３９（水性分画）。以下に記載する新規なエキスもこの方法において有用である。
【０００７】
ここに使用する、本発明に従った治療的に活性なＰＣＥ成分は、癌細胞、特にヒトまたは動物における悪性腫瘍に対して細胞毒性を示す成分である。例えば、いくつかの癌細胞ラインがこの分野において抗癌有効性モデルのために知られており、そして抗癌活性を決定するために使用することができる。そのようなモデルは、例えばバレイショ腫瘍アッセイ（これはマウス３ＰＳ抗白血病モデルと良好な一致性を持つことが報告されている。例えばＧａｌｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，６７，ｐ．６８９（１９８１）を見よ）、ヒト骨肉腫（ＭＧ−６３）、ヒト頸部癌（ＳｉＨａ）、ヒト腎臓腫瘍（ＢＨＫ−２１）、およびヒト単細胞白血病細胞ラインを含む。本発明の一部として、Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分を含んでいるエキスがこれら細胞ラインモデルの各自において細胞成長の阻害に活性であることが発見された。このように  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分を含んでいるエキスは、白血球、骨肉腫、頸部癌、腎臓腫瘍、および単細胞白血病に対する活性、特にヒトのそれらに活性のためのモデルとなる。しかしながら異なる細胞ラインにおいてこの広い範囲の活性が与えられれば、  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分は広範囲に適用可能な抗癌活性、特に抗腫瘍活性を持つと結論することもできる。例えば、  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分は上記以外に前立腺癌、エストロゲン依存性またはエストロゲン非依存性乳癌、黒色腫および膀こう癌に対して活性であろう。
【０００８】
阻害は、めいめいのこれら細胞ラインにおいて、Ｓ−フェーズ（成長フェーズ）においてのみ発生し、Ｇｏフェーズ（休息フェーズ）において起こらない。この理論に拘束される訳ではないが、実施例において示されたカンプトセシンのように、このエキスはある未知のポイントにおいて細胞サイクリングを標的とし、そして段階において癌細胞を破壊するらしいと信じられる。従って洗剤またはＴＷＥＥＮ活性からのような溶解はない。休息細胞へのこのエキスの添加は、もし細胞がＳ−フェーズへ入る前に希釈されるならば有害な効果を持たない。インビボでは、これは大部分休息フェーズにある正常細胞に対して損傷を与えないであろうことを指示する。
【０００９】
阻害活性は、タンパク分解酵素によるＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分の前処理によって影響されないことが示された。図８および１３を見よ。このことは阻害効果を提供する因子はタンパクではないことの証明である。それは多分脂質もしくは炭水化物分画であり得るが、これは未だ知られていない。
【００１０】
本発明のために  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ抽出物を有する有用なエキスとして、本発明のさらなる特徴をなす新規なエキスが含まれる。これらのエキスは、粉砕し凍結乾燥した  Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ全体をポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン界面活性剤で抽出することによって調製される。ポリオキシエチレンソルビタンエステルとして特に好ましいのは、ＴＷＥＥＮの名称で販売されているポリソルベート、例えばＴＷＥＥＮ２０，４０，６０，６５，８０および８５である。エキスは、粉砕凍結乾燥したＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓイガイ全体と抽出剤、例えばＴＷＥＥＮ活性剤の水溶液を用意し、混合物をかきまぜ、遠心し、そして一回またはそれ以上傾しゃし、液体部分を得て、次に液体部分に残っている小さい固形物を濾去するため次々に小さいフィルター（例えばミリポアフィルター）を通して一回またはそれ以上濾過することによって調製される。望む液体エキスは、任意に最終ステップとして濾過滅菌することができる。濾過滅菌は胞子を含むすべての形の生きている生物を除去するのに十分なサイズのフィルター、例えば０．２２μｍ無菌フィルターを通し、そして将来の使用のため無菌容器中へ通過させることを含む。
【００１１】
本発明のため他の有用なＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分含有エキスは、Ａｒｏｍａ  ＮＺ，Ｌｔｄ（クライストチャーチ、ニュージーランド）によって供給されているようなグリコーゲンエキスである。このエキスは上に記載した遠心および濾過ステップによってさらに処理することができる。
【００１２】
本発明の他の一面において、エキスは一定の分子サイズ範囲へ付加的に精製することができる。この精製は好ましくは限外濾過法によって実施される。限外濾過はどんなエキスでも実施することができるが、しかし上で論じたポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン活性剤抽出物が好ましい。限外濾過は好ましくは小さいサイズの物質を除去するために実施される。このように例えばエキスは１００ｋＤ（キロダルトン）フィルター、例えば１００，０００ＭＷＣＯによって濾過することができ、そしてこのフィルターによって阻止された物質が保留される。他の具体例においては、３００，０００ＭＷＣＯフィルターによって保留される物質、または１００，０００ＭＷＣＯによって保留されるがしかし３００，０００ＭＷＣＯを通過する物質が提供される。保留される物質は１００ｋＤまたはそれ以上の化合物のみでなく、フィルターを通過するのに大き過ぎる物質へ凝集したより小さい分子量の分子を含有し得る。この分野で知られている限外濾過装置に記載した濾過ステップのためのこの分野で知られた態様において使用することができる。例えば、限外濾過ステップは洗浄、バックフィルターおよび溶出ステップを含むことができる。
【００１３】
本発明の他の一面において、エキスはｐＨ処理される。ｐＨ処理は上に記載した限外濾過処理による精製と、濾過前または濾過後に組合わせて実施することができる。ｐＨ処理はエキス（これはさもなければ約中性ｐＨにある）とＨ＋イオン源、例えばＨＣｌとｐＨを下げるように、またはＯＨ−イオン、例えばＮａＯＨとｐＨを上げるように混合することによって実施される。ｐＨを変えるそのような方法はこの分野において知られており、そして変法を採用しても良い。エキスが中性ないし塩基性ｐH，特にｐＨ７−９を持つようにｐＨを変えるのが好ましい。しかしながら酸性ｐＨへ変えたエキスも活性を示し（実施例、特に図６を見よ）、胃腸管の酸性環境に露出された時でさえもそれらの使用の有効性を証明する。
【００１４】
ここで使用するように、術語動物（上に記載した方法が適用できるもの）は、限定でなく哺乳類を含む。本発明方法に従った処置のための好ましい哺乳動物は、ヒト、ウマ、農場動物および家庭内ペットを含む。
【００１５】
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分、特に記載したエキスの投与のためのルートは経口投与である。例えばこれは投与形の高無菌性を必要としない。筋肉内注射、腹腔内注射、非経口投与等によって投与することもできる。
【００１６】
本発明において使用されるＰｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分は、慣用の補助剤、例えば活性化合物に悪影響しない薬学的に許容し得る非経口、経腸（例えば経口）適用に適した有機または無機担体との混合物において採用することができる。好適な薬学的に許容し得る担体は、限定でなく、水、食塩水、アルコール類、アラビアガム、植物油、ベルジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖のような炭水化物、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香料油、脂肪酸モノグリセライド、ジグリセライド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を含む。製剤は滅菌することができ、そして望むならば活性化合物に悪影響しない例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧調節剤、バッファー、着色剤、香味剤および／または芳香物質等のような補助剤と混合することができる。他の薬学的に許容し得る担体は、例えばその中味をここに参照として取り入れる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されているような、活性化合物に悪影響しない塩、保存剤、バッファー等を含む水溶液、非毒性補助成分を含む。薬剤組成物のｐＨおよび種々の成分の実際の濃度はこの分野においてルーチンな技術に従って調節される。Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓを見よ。
【００１７】
Ｐｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分を含む薬剤組成物は、好ましくは投与単位に調製され、投与される。固形投与単位は錠剤、カプセルおよび坐剤を含む。対象の処置のため、化合物の活性、投与方法、病気の性格および重篤度、年令および患者の体重に応じて異なる日毎の投与量を必要とする。しかしながらある種の状況の下では、より高いまたはより低い１日投与量が適切であり得る。本発明の化合物の平均１日投与量は、記載した抗癌方法のために使用する時、限定でなく、約１ないし約５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１０ないし約１００ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約２０ないし６０ｍｇ／ｋｇ／日（粉砕したイガイ全体の重量に基いて）である。Ｐｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分がエキスの形である時、平均１日投与量は変動するであろうが、しかし当業者によって容易に決定することができる。１日投与量は１日１回投与として、または分割した投与量の１日複数回投与として投与することができる。１日投与量は、例えば２回毎または３日毎に、好ましくは上に記載した平均１日投与量が達成されるような非毎日投与ベースにおいて投与することができる。
【００１８】
Ｐｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分は、癌を処置するための慣用的に採用される他の治療的処置と同時または交互に投与することができる。特定の具体例において、Ｐｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分は、好ましくはエキスとしてジメチルグリシン（ＤＭＧ）と同時投与される。ＤＭＧの活性の使用は、例えばここに参照として取り入れる米国特許Ｎｏ．４，９９４，４９２に論じられている。
【００１９】
本発明の特定の具体例は以下のものを含む。
ａ）対象へ少なくとも１種のＰｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ成分を投与することよりなる方法。
ａ１）処置される癌がヒトの白血病、骨肉腫、頸部癌、腎臓腫瘍または単細胞白血病である方法ａ）。
ａ２）処置される癌がヒトの白血病、骨肉腫、頸部癌、腎臓腫瘍、単細胞白血病、前立腺癌、エストローゲン依存性またはエステローゲン非依存性乳癌、黒色腫、または膀こう癌である方法ａ）。
ｂ）Ｐｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ成分が凍結乾燥した粉砕イガイ全体である方法ａ）。
ｃ）Ｐｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓ成分が凍結乾燥した粉砕イガイ全体のエキスである方法ａ）。
ｄ）Ｐｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓがポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン界面活性剤により凍結乾燥した粉砕イガイ全体の抽出物である方法ａ）。
ｅ）エキスが１００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製されている方法ｄ）。
ｆ）エキスが３００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製されている方法ｄ）。
ｇ）エキスが１００ｋＤより小さいおよび３００ｋＤより大きいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製されている方法ｄ）。
ｈ）エキスが塩基性ｐＨを持つようにＯＨ−イオンを供給する剤で処理されている方法ｄ）または方法ｅ）。
ｉ）エキスが約７ないし９の範囲のｐＨを持つ方法ｈ）。
ｊ）成分がＰｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓ成分である方法ａ）ないしｉ）。
ｋ）ポリオキシエチレンソルビタンエステルによる凍結乾燥した粉砕Ｐｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイ全体の抽出物を含む組成物。
ｌ）組成物が１００ｋＤより小さいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製されている組成物ｋ）。
ｍ）組成物が３００ｋＤより大きいサイズの物質を除去するため限外濾過によって精製されている組成物ｋ）。
ｎ）組成物が１００ｋＤより小さいおよび３００ｋＤより大きいサイズの物質を除去する限外濾過によって精製されている組成物ｋ）。
ｏ）塩基性ｐＨを有する組成物ｋ），ｌ）またはｍ）。
ｐ）組成物が７以上９の範囲のｐＨを有する組成物ｋ），ｌ）またはｍ）。
ｑ）抽出剤としてポリオキシエチレンソルビタンエステル非イオン界面活性剤を含む粉砕した凍結乾燥イガイ全体の水溶液を準備し、混合物をかきまぜ、遠心し、次に液体部分を得るため１回以上傾しゃし、そして液体部分中に残っている小さい固形物を除去するため１回以上濾過することを含む、Ｐｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓまたはＭｙｔｉｌｕｓ  ｅｄｕｌｉｓイガイの成分を含んでいるエキスを調製する方法。
ｒ）エキスを胞子を含む生きた生物のすべての形を除去するのに十分なサイズのフィルターを通過させることによって濾過滅菌することをさらに含む方法ｑ）。
ｓ）特定のサイズ範囲の成分を除去するエキスを限外濾過へかけることをさらに含む方法ｑ）またはｒ）。
ｔ）１００ｋＤより小さいサイズの成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む方法ｑ）またはｒ）。
ｕ）３００ｋＤより小さいサイズの成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む方法ｑ）またはｒ）。
ｖ）１００ｋＤより小さいそして３００ｋＤより大きいサイズの成分を除去するためエキスを限外濾過へかけることをさらに含む方法ｑ）またはｒ）。
ｗ）ｐＨを上げるためＯＨ−イオンを提供する剤でエキスを処理することをさらに含む方法ｑ），ｒ），ｓ），ｔ），ｕ）またはｖ）。
ｘ）ｐＨが塩基性ｐＨへ上げられる方法ｗ）。
ｙ）ｐＨが７以上９へ上げられる方法ｘ）。
【００２０】
以上および以下で引用したすべての出願、特許および発表と、２００３年３月１４日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６０／４５４，３４０を参照としてここに取り入れる。
【００２１】
さらに考究することなく、以上の説明を用いて当業者は本発明をその全範囲において利用することができるものと信じられる。それ故以下の好ましい特定具体例は単に例証であり、開示の残部の限定と考えるべきでない。
【実施例】
【００２２】
以下の実施例において、特記しない限りすべての部および％は重量による。
【００２３】
実施例１  治療上活性ＰＣＥ成分の調製
Ｐｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓの治療的に活性な製剤は、このイガイの肉を凍結乾燥し、それを粉末に粉砕することによって調製される。生成物はアルファルファ、セルロースおよびステアリン酸マグネシウムの賦形剤と共にカプセルに処方される。
【００２４】
実施例２  Ｐｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓのＴＷＥＥＮ抽出物の調製
粗製Ｐｅｒｍａ粉末（Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．）２０ｇを蒸留水中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０）溶液１００ｍｌと共に５００ｍｌフラスコに入れる。Ｐｅｒｎａスラリーを与えるように混合物を４℃で２４時間かきまぜる。このスラリーを４０００×ｇにおいて２０分間遠心する。液体部分を傾しゃし、それ以上ペレットが形成されなくなるまで１時間間隔で再遠心する。次に液体サンプルを１．２ｍｍフィルター、次に０．８ｍｍフィルター、次に０．４５ｍｍフィルター、最後に０．２２ｍｍフィルターの４７ｍｍミリポアセットを用いて濾過する。液体サンプルを次に０．２２ｍｍフィルターと無菌貯蔵容器を用いて濾過滅菌する。エキスは次にＢｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパクアッセイを用いてタンパク質含量についてテストする。蒸留水中１：１０，１：１００，１：２００，１：４００，１：５００，１：８００，１：１０００および１、１６００の希釈液が提供される。
【００２５】
実施例３  Ｐｅｒｎａ  Ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓのグリコーゲンエキスの調製
Ｐｅｒｎａからの実験的グリコーゲンエキスをＦｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．から得る。グリコーゲン粉末１ｇを蒸留水１０ｍｌと混合し、実施例２のＰｅｒｎａと同じ態様で処理する。蒸留水中１：１０，１：１００，１：２００，１：４００，１：５００，１：８００，１：１０００および１：１６００の希釈液が提供された。
【００２６】
実施例４  濾過を含むＰｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓのＴＷＥＥＮ抽出物の調製
分子量カットオフ１００ｋＤ、３００ｋＤおよび１０ｋＤを有する遠心フィルターを用いることにより、ＴＷＥＥＮ抽出物のバリエーションがつくられる。１０ｋＤ未満、１０−１００ｋＤ間、１００ｋＤより大、１００−３００ｋＤ間、および３００ｋＤより大の分画が得られ、そして以下に記載するようにテストされる。
【００２７】
実施例５  濾過およびｐＨ処理を含むＰｅｒｎａ  ＣａｎａｌｉｃｕｌｕｓのＴＷＥＥＮ抽出物の調製
上で論じた態様で行った濾過の前に、ｐＨ調節によってＴＷＥＥＮ抽出物のバリエーションを得る。ｐＨはＮａＯＨの添加により上昇またはＨＣｌの添加により下降される。ｐＨ２，７，８および９のエキスが調節され、テストされる。
【００２８】
実施例６  シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素阻害
Ｐｅｒｎａエキスは、比色分析Ｃｏｘ（ヒツジ）阻害剤スクリーニングアッセイにおいてテストされる。エキスは凍結乾燥され、そしてＤＭＳＯ中望む濃度において再懸濁される。分析は、Ｃｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙからの比色分析ＣＯＸ（ヒツジ）阻害剤スクリーニングアッセイ（７６０１１１）を用いて行われる。結果は５９５ｎｍにおいてマイクロプレートリーダーを用いて読み取られる。当初の結果はインビトロにおいてＣｏｘ−１およびＣｏｘ−２酵素の両方の有意な阻害を示した。図１および２を見よ。
【００２９】
実施例７  バレイショ腫瘍アッセイ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｂ６株）がＹＥＭプレート上で２８℃において４８時間培養される。Ｒｕｓｓｅｔバレイショが洗浄され、Ｃｌｏｒｏｘで消毒される。バレイショから無菌コルク孔あけ（１０ｍｍ）で円筒がカットされ、無菌ｐH４蒸留水中に入れられる。約０．５cm厚みのディスクがメスを用いて円筒からカットされ、各ウエル中１５％水寒天の約１ｍｌを含む２４ウエル培養プレートに入れられた。
【００３０】
Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの標準溶液はリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．２）中、１×１０９ＣＦＵ／ｍｌへつくられる。エキスおよびカンプトセシン対照は、（１）エキスまたは０．１ｐｐｍカンプトセシンの４００μｌ，（２）水１００μｌ，および（３）Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁液５００μｌを加えることによって調製される。２４ウエル培養プレート中の各バレイショディスクは次に適切なエキス／水／バクテリア混合物の５０μｌでオーバーレイされ、そして室温で１２日間インキュベートされる。
【００３１】
日１２にバレイショディスクはルゴール試薬で染色され、そして腫瘍がカウントされる。
【００３２】
種々の濃度、精製、ｐＨおよび酵素処理におけるバレイショ腫瘍アッセイにおけるＴＷＥＥＮおよびグリコーゲン抽出物の活性が図３−１３に示されている。
【００３３】
実施例８  ＳｉＨａ頸部カルチノーマ細胞ラインモデルに対するＰｅｒｎａ細胞毒性
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓのＴＷＥＥＮ抽出物は図１４に示した濃度において図に示した程度で頸部カルチノーマ（ＳｉＨａ）細胞を阻害することを示す。細胞死滅は、細胞呼吸活性の変化を検出する比色分析代謝テストによって証明される。
【００３４】
実施例９  ＭＧ−６３骨カルチノーマ細胞ラインモデルに対するＰｅｒｎａ細胞毒性
Ｐｅｒｎａ  ｃａｎａｌｉｃｕｌｕｓのＴＷＥＥＮ抽出物は図１５に示した濃度において図に示した程度で骨カルチノーマ（ＭＧ−６３）細胞を阻害することを示す。細胞死滅は、細胞呼吸活性の変化を検出する比色分析代謝テストによって証明される。
【００３５】
実施例１０  ＢＨＫ−２１腎臓癌細胞ラインモデルに対するＰｅｒｎａ細胞毒性
２％から消失する希釈度１０００％まで変動する濃度において、Ｔｗｅｅｎ  Ｐｅｒｎａ抽出物は、比色分析代謝テストによって証明されるように、ＢＨＫ−２１細胞のすべての成長を完全に阻害する。このためこれを証明するため図は必要でない。
【００３６】
以上の実施例は、これら実施例で使用した反応剤および／または条件を一般的にまたは特定的に記載した本発明の反応剤および／または条件に代えることによって類似の成功度をもって繰り返すこができる。
【００３７】
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神および範囲を逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるため種々の変更および修飾を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】Ｃｏｘ−１の５０％阻害は、Ｔｗｅｅｎ抽出物の１：２００と１：４００希釈の間、そしてグリコーゲン抽出物の１：１０と１：１００希釈の間に見られる。
【図２】Ｃｏｘ−２の５０％阻害は、Ｔｗｅｅｎ抽出物の１：２００と１：４００希釈の間、そしてグリコーゲン抽出物の１：１０と１：１００希釈の間に見られる。
【図３】腫瘍の有意な阻害は、Ｔｗｅｅｎ抽出物の１：１０および１：１００希釈において見られる。
【図４】バレイショ腫瘍の有意な阻害は、グリコーゲン抽出物の１：１０希釈で見られる。
【図５】１００Ｋフィルターによって保留されるＴｗｅｅｎ抽出物の分画は、１：１０および１：１００濃度の両方においてバレイショ腫瘍の有意な阻害を示す。
【図６】Ｔｗｅｅｎ抽出物のｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨおよび１０Ｎ  ＮＣｌを用いて変える。バレイショ腫瘍の有意な阻害は、ｐＨ２＞１００Ｋサンプルの１：１０および１：１００濃度、ｐＨ２の１００Ｋ−１０Ｋサンプルの１：１０濃度、ｐＨ２＜１０Ｋサンプルの１：１０および１：１００濃度、およびｐＨ９＜１００Ｋサンプルの１：１０および１：１００濃度においておこる。
【図７】Ｔｗｅｅｎ抽出物のｐＨを濾過前に１Ｎ  ＮａＯＨを用いて変える。これらの抽出物は１：１０の濃度においてテストされる。バレイショ腫瘍の有意な阻害は、ｐＨ９＞１００Ｋサンプル、ｐＨ８＞１００Ｋサンプル、およびｐＨ７＞１００Ｋサンプルにおいて見られる。
【図８】Ｔｗｅｅｎ抽出物を独立にプロナーゼおよびプロテイナーゼで処理し、３７℃で０ないし４８時の範囲の時間インキュベートする。酵素活性はインキュベーションチューブ内で８０℃で１５分間で停止される。Ｔｘは他のサンプルと共に４８時間インキュベートした未処理の全強度Ｔｗｅｅｎ抽出物である。サンプルは１：１０の濃度においてテストされる。どのサンプルにもどのタンパク分解酵素の処理によって活性に有意な変化は見られない。
【図９】Ｔｗｅｅｎ抽出物の＞３００Ｋおよび３００Ｋ−１００Ｋ分画において腫瘍の有意な阻害が見られる腫瘍の有意な阻害はグリコーゲン抽出物の＞３００Ｋ分画で見られる。Ｃａｍｐｔｏは０．１ｐｐｍカンプトセシンである。
【図１０】１００Ｋフィルターによって保留されたグリコーゲン抽出物の分画は、１：１０および１：１００濃度の両方においてバレイショ腫瘍の有意な阻害を示す。１００Ｋフィルターを通過したが３０Ｋフィルターによって保留されたグリコーゲン抽出物の分画は、１：１０および１：１００の濃度においてバレイショ腫瘍の僅かに有意な阻害を示す。
【図１１】グリコーゲン抽出物のｐＨを１０Ｎ  ＮａＯＨおよび１０Ｎ  ＨＣｌを用いて濾過前に変える。バレイショ腫瘍の有意て阻害は、ｐＨ２＞１００Ｋサンプルの１：１０および１：１００濃度、ｐＨ９＞１００Ｋサンプルの１：１０および１：１００濃度、およびｐＨ９＞１０Ｋサンプルの１：１０濃度において見られる。
【図１２】グリコーゲン抽出物のｐＨを濾過前に１Ｎ  ＮａＯＨを用いて変える。これら抽出物は１：１０の濃度においてテストされる。バレイショ腫瘍の有意な阻害は、ｐＨ９＞１００Ｋサンプル、ｐＨ９  １００Ｋ−１０Ｋサンプル、ｐＨ８＞１００Ｋサンプル、ｐＨ７＞１００Ｋサンプル、およびｐＨ７  １００Ｋ−１０Ｋサンプルにおいて見られる。
【図１３】グリコーゲン抽出物は独立にプロナーゼおよびプロテイナーゼで処理し、３７℃で０ないし４８時間の範囲の時間インキュベートする。酵素活性はインキュベーションチューブ中で８０℃で１５分間で停止される。Ｇｘは他のサンプルと共に４８時間インキュベートした未処理の全強度グリコーゲン抽出物である。サンプルは１：１０の濃度においてテストされる。どのサンプルにもどのタンパク分解酵素の処理によって活性に有意の変化は見られない。
【図１４】Ｐｅｒｎａ抽出物は示した％濃度において頸部カルチノーマ（ＳｉＨａ）細胞を阻害することを示す。
【図１５】Ｐｅｒｎａ抽出物は示した％濃度において骨カルチノーマ（ＭＧ−６３）細胞を阻害することを示す。
【図１】
2006520389.tif 000002
【図２】
2006520389.tif 000003
【図３】
2006520389.tif 000004
【図４】
2006520389.tif 000005
【図５】
2006520389.tif 000006
【図６】
2006520389.tif 000007
【図７】
2006520389.tif 000008
【図８】
2006520389.tif 000009
【図９】
2006520389.tif 000010
【図１０】
2006520389.tif 000011
【図１１】
2006520389.tif 000012
【図１２】
2006520389.tif 000013
【図１３】
2006520389.tif 000014
【図１４】
2006520389.tif 000015
【図１５】
2006520389.tif 000016
【国際調査報告】
2006520389.tif 000017
2006520389.tif 000018