(57)【要約】本発明の一局面は、所望の核酸鎖の正確で、単純かつ効率的な検出および定量を可能にする、特定の組成物および使用方法を提供する。本発明の教示はまた、特定の標的核酸鎖のアニーリングのため、および所望の核酸鎖の増幅のための特に正確な増幅反応プライマーを設計するための、新規かつ効率的なプライマー設計を提供する。本発明の一局面に従い、活発に複製するウイルスの複製可能ネガティブ鎖を識別、検出および定量する、高度に特異的であり、迅速かつ感度の高い方法が、提供される。この方法は、インビトロ転写ＲＮＡおよびウイルス感染細胞の両方を用い、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡに対して少なくとも１０５倍異なる特異性で、所望のネガティブ鎖を独占的に検出する。さらに、この方法は、例示的な複製可能ネガティブＲＮＡ鎖のインビトロ検出を可能にする。
2006506978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖特異的増幅のための方法であって、該方法は、以下：
標的核酸鎖の核酸配列を決定する工程；
該標的核酸鎖に少なくとも部分的に基づく、転換可能オリゴヌクレオチドを設計する工程；
該転換可能オリゴヌクレオチドおよび該標的核酸鎖を利用して転写反応を行い、少なくとも１つの生じた相補鎖を提供する工程；
増幅反応を行って該少なくとも１つの生じた相補鎖を増幅する工程；ならびに
該増幅反応を分析する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記設計工程が、前記転換可能オリゴヌクレオチドの熱力学的分析を行って、前記転写反応の少なくとも１つおよび前記増幅反応の反応条件下における該転換可能オリゴヌクレオチドの二次構造を予測する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記転換可能オリゴヌクレオチドの前記予測される二次構造が、前記転写反応の条件下で、ステム−ループ立体構造にその少なくとも一部分を提供する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記設計工程が、前記転換可能オリゴヌクレオチドの少なくとも第１部分および第２部分の、異なる反応条件下での予測される二次構造を考慮する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記設計工程が、ヌクレオチドを選択し、前記転換可能オリゴヌクレオチドに、少なくとも１つのステム−ループ部分および前記標的核酸鎖の少なくとも一部分に対するアニーリングのための部分を提供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記増幅反応における使用のための、少なくとも１つの半ネステッドプライマーを提供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記少なくとも１つの半ネステッドプライマーが、前記増幅反応の反応条件下で、前記１つの転換可能オリゴヌクレオチドのＴｍと実質的に類似のＴａを有する、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記半ネステッドプライマーが、転写反応生成物に相補的な付加ヌクレオチドを有する３’部分を含み、該転写反応生成物は、前記標的配列に対し、それ自体が少なくとも部分的に相補的である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記設計工程が、前記標的核酸鎖に相補的なヌクレオチドおよび該標的核酸鎖に非相補的な部分を含む前記１つの転換可能オリゴヌクレオチドを設計し、ここで、該非相補的部分は、前記転写反応条件下で第１の立体構造を形成し、そして該同一の非相補性部分は、前記増幅条件下で第２の立体構造を形成する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記第１の立体構造が、少なくとも１つのステム−ループ部分を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
転換可能オリゴヌクレオチドであって、以下：
第１の自己アニーリング部分；および
標的核酸配列に、少なくとも部分的に相補的な第２の部分、
を含む、転換可能オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の転換可能オリゴヌクレオチドであって、前記第１の自己アニーリング部分は、第１の反応条件下でステム−ループ立体構造であり、該第１の反応条件と異なる反応条件下で、第２の実質的に直線状の立体構造に転換する、転換可能オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１に記載の転換可能オリゴヌクレオチドであって、前記第２の部分が、約５〜約１５ヌクレオチドまたは約８〜約１２ヌクレオチドである、転換可能オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１２に記載の転換可能オリゴヌクレオチドであって、前記転換可能オリゴヌクレオチドのグアニン、シトシンまたはこの両方の組み合わせの含量が、全ヌクレオチド組成の５０％以上である、転換可能オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載の転換可能オリゴヌクレオチドであって、前記第１の自己アニーリング部分は、転写反応条件下で約≦−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有する、転換可能オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１２に記載の転換可能オリゴヌクレオチドであって、前記異なる反応条件は、少なくとも転写反応条件および増幅反応条件である、転換可能オリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
多重立体構造的キメラヌクレオチドおよび半ネステッドプライマーを設計するための方法であって、該方法は、以下：
５’ステム−ループセグメントおよび３’標的アニーリングセグメントの２つのセグメントを有する、ステム−ループキメラ逆転写オリゴヌクレオチドを設計する工程；
該ステム−ループキメラ逆転写オリゴヌクレオチドおよび標的核酸配列を使用する逆転写反応を行う工程であって、ここで、該逆転写反応の間、該ステム−ループキメラ逆転写オリゴヌクレオチドの３’標的アニーリングセグメントは該標的核酸配列にアニールし、そして該５’ステム−ループセグメントは自己アニーリングステム−ループ構造を形成する、工程；
該逆転写反応の反応生成物を、増幅反応に供する工程であって、ここで該ステム−ループキメラ逆転写オリゴヌクレオチドの核酸配列は、該増幅反応における使用のための半ネステッドプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするために十分な第２の構造をとる、工程；ならびに
該増幅反応から得られた結果を分析する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記ステム−ループセグメントの自由エネルギーおよびＴｍを計算する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記３’セグメントの融解温度が、前記逆転写反応の温度の約＋／−７℃である、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記３’標的アニーリングセグメントが、前記逆転写反応条件下で約−０．５ｋｃａｌ／モル以上のΔＧを有する、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、前記５’ステム−ループセグメントが、前記逆転写反応条件下で約−０．５ｋｃａｌ／モル以下のΔＧを有する、方法。
【請求項２２】
ステム−ループキメラオリゴヌクレオチドであって、以下：
第１の一連の反応条件の下で自己アニーリングステム−ループを形成可能な第１の部分；
該第１の一連の反応条件下で実質的に直線状の立体構造を維持し、核酸の特定の鎖上で標的核酸配列にアニーリング可能な第２の部分；
を含む、ステム−ループキメラオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項２２に記載のステム−ループキメラオリゴヌクレオチドであって、前記第１の部分が、自己アニーリングステム−ループを形成可能であり、そして前記第１の一連の反応条件と類似しない第２の一連の反応条件において、前記第２の部分が、実質的に直線状の立体構造を形成するために適切なヌクレオチド配列を有する、ステム−ループキメラオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２または請求項２３に記載のステム−ループキメラオリゴヌクレオチドであって、前記第１の一連の反応条件が、転写反応条件であり、前記第２の一連の反応条件が、増幅反応条件である、ステム−ループキメラオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／４０８，８１８号（２００２年９月６日出願、表題「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ」）に関連しかつその優先権を主張する。この出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学技術に関する。より詳細には、本発明は、核酸（ＲＮＡ鎖を含む）の特定の鎖を識別し、検出しそして定量するための組成物および関連方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
分子生物学における近年の進歩は、核酸の検出のための種々の等温増幅方法（核酸配列決定ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ローリングサイクル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、分枝鎖ＤＮＡ増幅）および熱増幅方法（ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応）をもたらした。これらの方法は、病原を検出および同定するために、首尾よく使用されている。従来的ＰＣＲに関する改善は、蛍光発生定量的実時間ＰＣＲ（Ｑｒｔ−ＰＣＲ）の近年の開発である。
【０００４】
核酸を検出し、そして定量するための全ての増幅方法は、１つの重要な制限に悩まされ得、それは、ウイルスＲＮＡの複製から得られた増幅とウイルスゲノムの複製から得られた増幅との間が識別し得ないことである。これらの増幅方法は、従って、生物体の状態（生または死）に関係なく核酸を検出し、診断的に正確に陽性の結果であるが、臨床的に擬陽性である結果をもたらす。このような制限は、ウイルス複製部位（レザバ）を同定するための、従って、ウイルス−細胞親和性を同定するためのこれらの方法の使用を制限する。複製するウイルスを検出し、迅速に定量する能力は、多くのウイルス性疾患の病原を解明するために重要であり、また、ウイルス複製を阻害するために設計された薬物を評価するためにも重要である。
【０００５】
従来的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＲＮＡウイルスの複製可能形態を検出するための近年の試みは、幾つかの成功を得ている（Ｌａｎｆｏｒｄら，１９９４；Ｇｕｎｊｉら，１９９４；Ｍｉｚｕｔａｎｉら，１９９６；Ｌｅｒａｔら，１９９６；Ｌａｓｋｕｓら，１９９７；Ｌｉｕら，１９９７；Ｍｅｌｌｏｒら，１９９８；Ｓｅｉｐｐら，１９９８；Ｃｒａｇｇｓら，２００１；Ｌｉｎら，２００２；Ｗａｎｇら，２００２；Ｖａｕｇｈａｎら，２００２；Ｎａｖａｓら，２００２）。しかし、これらの方法のうちの幾つかは、検出の特異性を達成するために、サザンブロッティングのようなＰＣＲ後操作を必要とする（Ｌａｎｆｏｒｄら，１９９４；Ｌａｓｋｕｓら，１９９７；Ｌｉｕら，１９９７；Ｓｅｉｐｐら，１９９８；Ｎａｖａｓら，２００２）。従って、先行技術方法論は、開発しにくく、または高処理スクリーニングに組み込みにくく、そして複製可能ＲＮＡの検出のみを可能にし、定量を可能にしない。結果として、ウイルス疾患の病原をもたらした際の複製可能ウイルスの寄与は、決定され得ない。
【０００６】
報告された他の方法は、従来的ＲＴ−ＰＣＲにおいて、タグ逆転写（ＲＴ）プライマーおよびホットスタートを使用する（Ｓｅｉｐｐら，１９９８；Ｃｒａｇｇｓら，２００１；Ｎａｖａｓら，２００２；Ｌｉｎら，２００２）。これらの研究は、複製可能ＲＮＡ鎖の増幅を報告するが、上述のように、特異性の検証の余地がある。増幅の特異性は、最初に逆転写を７０℃で行うことを、２周のネステッドＰＣＲ増幅と組み合わせることによって改善される（Ｃｒａｇｇｓら，２００１）。しかし、これらの大規模な改変を用いてさえも、このストラテジーは、重要な欠陥、すなわち、高濃度（２１０４コピー）の誤ったポジティブ鎖ＲＮＡにおけるタグ化ＲＴプライマーのミスプライミングに悩まされる。
【０００７】
複製可能なウイルス核酸を検出するための代表的な先行方法の例として、標的の複製可能鎖に相補的なオリゴヌクレオチド（ゲノム配列と同じ極性）を用いる逆転写（ＲＴ）が、まず実行される。複製可能プロセスの例は、図１に示され、ここで、ゲノムは、ポジティブ鎖である。次いで、従来的先行方法（例えば、ＰＣＲ／サザンブロット分析）によってｃＤＮＡが増幅され、そしてＱｒｔ−ＰＣＲによって検出されるか、または定量される。この先行技術ストラテジーに基づく２つのアプローチが報告されている。１つは、ＲＴプライマーとしてのウイルスゲノム特異的オリゴヌクレオチドの使用であり、他方は、ＲＴプライマーとしてのキメラオリゴヌクレオチドの使用である。
【０００８】
デング熱（ＤＦ）およびデング出血熱（ＤＨＦ）は、重要なヒトのベクター荷担ウイルス疾患として過去２５年間出現している。デングウイルスの拡散の増加それに関連するヒトへの高い罹患率が、親和性または非親和性で都市社会にはびこることは、主要な懸念である。デング伝播の危険に瀕した領域に居住するヒトは２５０億人に見積もられるため、ＤＦおよびＤＨＦの両方は、これらの猟奇において徐々に重要な健康問題をもたらしている（Ｇｕｂｌｅｒ，２００２；Ｇｕｚｍａｎら，２００２）。
【０００９】
１本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスの単に１つの例であるデングウイルスは、１つのポリペプチド前駆体をコードし、このポリペプチド前駆体は、その後小胞体内の２つの構造タンパク質（Ｃ、ｐｒｅＭ、およびＥ）および７つの非構造（ＮＳ）タンパク質にプロセスされる（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９０）。感染に際し、ネガティブＲＮＡ鎖およびポジティブＲＮＡ鎖の両方は、新規に合成され、そしてビリオンがカプシド化される。ウイルスＲＮＡの３つの異なる形が、複製の間に合成される：ポジティブ鎖ＲＮＡ、二本鎖複製可能形態（ＲＦ）ＲＮＡおよび複製可能中間（ＲＩ）ＲＮＡであり、後者２つは、ネガティブ鎖ウイルスＲＮＡを含む（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，２００２；Ｃｈｕら，１９８５；Ｃｌｅａｖｅｓら，１９８１）。
【００１０】
現在、デング感染を診断するために利用される代表的な方法としては、デング特異的抗体の血清学的検出、デングウイルス単離およびウイルス感染した蚊細胞株からの同定が挙げられる（Ｖｏｒｎｄａｍら，１９９７）。これらの方法は、疫学目的に充分であり、診断を可能にするが、患者管理の際にはあまり影響を有さない（Ｉｓｔｕｒｉｓら，２０００）。デング感染を、疾病の急性期に診断するための抗体は、差時的診断および患者ケア管理を助けるための手段を提供する。
【００１１】
分子生物学の近年の進歩は、デング同定のための種々の増幅方法の開発をもたらした（Ｄｅｕｂｅｌ，１９９７）。デングＲＮＡゲノムに存在する共通配列に相補的なプライマーを用いる、ウイルスの診断および血清型分類を可能にする特異的ＰＣＲベースの試験が、開発されている（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉら，１９９２）。蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲｎｏ
使用における近年の報告は、デングウイルスの再現性、感度および定量性を有意に拡大している（Ｃａｌｌａｈａｎら，２００１；Ｈｏｕｎｇら，２０００；Ｈｏｕｎｇら，２００１；Ｌａｕｅら，１９９９；Ｗａｒｒｉｌｏｗら，２００２）。
【００１２】
しかし、上述のＰＣＲベースの研究は、上述のように、重要な限定、すなわち複製するウイルス由来のウイルスＲＮＡ増幅と不活性ウイルス由来のウイルスＲＮＡ増幅との識別ができないことに悩み、これは、デングウイルス細胞向性の重大な局面である。その結果、特定の核酸鎖（例えば、例えば複製するデングウイルスを含むウイルス核酸鎖）の正確な検出および定量を可能にする組成物および方法の必要が存在する。さらに、複製するＲＮＡの特異的かつ定量的なアッセイの有用性は、例えば、ウイルス複製を阻害するために設計された薬物を評価するために有用であることを証明し得る。サザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲの方法論を用いる、上で考察された近年の試みは、手間がかかり（Ｌｉｕら，１９９７）、かつ非定量的である（Ｖａｕｇｈａｎら，２００２）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
ここで、発明の一局面に従い、核酸の特異的鎖を識別、検出および定量するための組成物ならびにこれを提供する関連方法および使用する関連方法が見出されている。
【００１４】
本発明の一局面に従い、活発に複製するウイルスの複製可能ネガティブ鎖を識別、検出および定量する、高度に特異的であり、迅速かつ感度の高い方法が、提供される。この方法は、インビトロ転写ＲＮＡおよびウイルス感染細胞の両方を用い、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡに対して少なくとも１０５倍異なる特異性で、所望のネガティブ鎖を独占的に検出する。さらに、この方法は、例示的な複製可能ネガティブＲＮＡ鎖のインビトロ検出を可能にする。
【００１５】
本発明の一実施形態に従い、例示的なウイルス（デング、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、西ナイル熱ウイルスが挙げられる）の複製可能形態の定量が、本発明の教示に従って提供される。
【００１６】
本発明の例示的実施形態に従い、Ｑｒｔ−ＰＣＲによる増幅および検出が使用される。本発明の基本的な教示の適応は、他の増幅方法（等温方法（ＮＡＳＢＡ法、ローリングサイクル法、分枝鎖法など）が挙げられるが、これらに限定されない）に適用され得る。
【００１７】
本発明の別の局面に従い、開示される方法の高い特異性が、２工程で達成される：ＲＴ工程においては、標的配列（例えば、ウイルス特異的配列）およびＲＴ特異性を増大する最適のエネルギー論でループ構造に折り畳まれる独特の配列を含むキメラステム−ループＲＴプライマーを含む転換可能オリゴヌクレオチドを用いることによる；そしてＰＣＲ工程のような増幅工程において、ステム−ループキメラＲＴオリゴヌクレオチドプライマー（ＳＣＲＯ）に、特異的ネステッドＰＣＲプライマーを用いる。特定の実施形態において、ポジティブ（＋）鎖ＲＮＡウイルスおよびネガティブ鎖ＲＮＡウイルス（−）が使用される（すなわち、検出され、かつ定量性である）。本発明の教示は、ゲノムの極性に関わらずいかなる一本鎖ＲＮＡウイルス（ＨＩＶを含む）にも、かつ任意のＲＮＡウイルスの複製可能状態がインビボおよびインビトロでの定量にも達し得る。
【００１８】
本発明のなお別の局面において、特定のオリゴヌクレオチド熱力学特性（例えば、ＳＣＲＯの融解温度プロフィール）の設計および考慮は、特定の標的核酸種に対するＳＣＲＯのアニーリング特異性が増加するように決定され、また、ミスプライミングを減少させるのを助けるＳＣＲＯのステム−ループ構造もまた、提供される。
【００１９】
本発明の別の局面に従い、鎖特異的増幅の方法が提供され、この方法は、標的核酸鎖の核酸配列を決定する工程、この標的核酸鎖に少なくとも一部分基づく、転換可能オリゴヌクレオチドを設計する工程、この転換可能オリゴヌクレオチドおよび標的核酸鎖を利用して転写反応を行い、少なくとも１つの生じた相補鎖を提供する工程、ならびにこの増幅反応を分析する工程、を包含する。特定の実施形態において、この設計工程は、上記転換可能オリゴヌクレオチドの熱力学的分析を行って、少なくとも転写反応の１つおよび増幅反応の反応条件下における転換可能オリゴヌクレオチドの二次構造を予測する工程を、さらに包含する。特定の実施形態において、転換可能オリゴヌクレオチドの予測される二次構造は、転写反応の条件下で、ステム−ループ立体構造にその少なくとも一部分を提供する。
【００２０】
なお他の実施形態において、上記設計工程は、転換可能オリゴヌクレオチドの少なくとも第１部分および第２部分の、異なる反応条件下での予測される二次構造を考慮する工程を、さらに包含する。幾つかの実施形態は、ヌクレオチドが選択され、転換可能オリゴヌクレオチドに、少なくとも１つのステム−ループ部分および標的核酸鎖の少なくとも一部分に対するアニーリングのための部分を提供する、設計工程を提供する。
【００２１】
特定の実施形態において、前記増幅反応における使用のための、少なくとも１つの半ネステッドプライマーが、提供される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの半ネステッドプライマーは、増幅反応の反応条件下で、転換可能オリゴヌクレオチドのＴｍと実質的に類似のＴａを有する。この半ネステッドプライマーは、転写反応生成物に相補的な付加ヌクレオチドを有する３’部分を有し得、この転写反応生成物は、標的配列に対し、それ自体が少なくとも１部分相補的である。
【００２２】
なお別の実施形態において、上記設計工程は、標的核酸鎖に相補的なヌクレオチドおよび標的核酸鎖に非相補的な部分を含む転換可能オリゴヌクレオチドを設計し、ここで、この非相補的部分は、転写反応条件下で第１の立体構造を形成し、そして同非相補性部分は、増幅条件下で第２の立体構造を形成する、工程を包含する。
【００２３】
幾つかの実施形態において、第１の立体構造は、少なくとも１つのステム−ループ部分を有する。
【００２４】
幾つかの実施形態において、転換可能オリゴヌクレオチドが提供され、この転換可能オリゴヌクレオチドは、第１の自己アニーリング部分；および標的拡散配列に少なくとも一部分相補的な第２の部分を含む。幾つかの場合、上記第１の自己アニーリング部分は、第１の反応条件下でステム−ループ立体構造であり、この第１の反応条件と異なる反応条件下で、第２の実質的に直線状の立体構造に転換する。この異なる反応条件は、少なくとも転写反応条件および増幅反応条件であり得る。この転換可能オリゴヌクレオチは、標的核酸配列にアニールする３’（第２）部分を有し、この３’部分は、約５〜約１５ヌクレオチドまたは約８〜約１２ヌクレオチドである。幾つかの実施形態において、この転換可能オリゴヌクレオチドのグアニン、シトシンまたはこの両方の組み合わせの含量は、転換可能オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチド組成の５０％以上である。特定の実施形態において、上記第１の自己アニーリング部分は、転写反応条件下で約≦−０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有する。
【００２５】
本発明のなお別の実施形態において、ステム−ループキメラオリゴヌクレオチドが提供され、このステム−ループキメラオリゴヌクレオチドは、第１の一連の反応条件の下で自己アニーリングステム−ループを形成可能な第１の部分、この第１の一連の反応条件下で実質的に直線の立体構造を維持し、核酸の特定の鎖状で標的核酸配列にアニーリング可能な第２の部分を、含む。キメラオリゴヌクレオチドを形成するこのステム−ループは、自己アニーリングステム−ループを形成可能な第１の部分、および第１の一連の反応条件と類似しない第２の一連の反応条件において、実質的に直線状の立体構造を形成するために適切な核酸配列を有する第２の部分を有し得る。この第１の一連の反応条件は、転写反応条件であり得、第２の一連の反応条件は、増幅反応条件であり得る。
【００２６】
従って、本発明の教示は、任意のＲＮＡウイルスの複製可能状態のインビトロおよびインビボでの定量に達し得る。
【００２７】
本発明の上記局面および伴う多くの利点は、添付の図面と組み合わせて、以下の詳細な説明を参照してより容易に理解され得る。
【００２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の特定の実施形態が、その原理および操作を説明する目的で、より詳細に以下に記載される。しかし、種々の改変がなされ得、そして本発明の範囲は、記載される例示的な実施形態にも操作にも限定されない。例えば、ネガティブ鎖の検出および定量が具体的に参照されるが、任意の特定の核酸鎖が、本発明の教示に従って、検出および定量され得ることが理解され得る。同様に、従って、本発明の教示は、単独でかまたは組み合わせて、当業者に認識され得るように、転写反応および増幅反応に適用可能である。
【００２９】
本明細書中で利用される略号は、以下のとおりである：Ｑｒｔ−ＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ；ＲＴ、逆転写；Ｏｌｉｇｏ、オリゴヌクレオチド；Ｔｍ、融解温度；Ｔａ、ＰＣＲのアニーリング温度；ｎｔ、ヌクレオチド；ｂｐ、塩基対。
【００３０】
例示的な実施形態として、そして原理の証拠を示すために、例示的なポジティブ（＋）鎖ＲＮＡウイルスおよびネガティブ（−）鎖ＲＮＡウイルス［デングウイルス（＋）、ＲＳウイルス（−）］が本明細書中で開示され、そして本発明の教示に従って利用される。方法論ならびに得られる組成物および使用が、任意の一本鎖ＲＮＡウイルス（ＨＩＶがが挙げられる）に対して、ゲノムの極性にかかわらず拡張可能である。Ｑｒｔ−ＰＣＲ（核酸を定量するための非常に信頼性のある方法）が、増幅の目的で例示的に使用された。
【００３１】
特定の核酸鎖の検出および定量に包含される工程の一般的な概説が、以下に記載される（図２）：
工程１：特定の転換可能なステム−ループ型キメラオリゴヌクレオチドの設計：ステム−ループ型のキメラオリゴヌクレオチドの設計は、特に、以下に記載されるような適切な熱力学を有する独特の標的配列の選択に依存する。これらの最適な熱力学パラメータの使用は、ＲＴ反応の増強を提供するが、下流のプロセス（例えば、ＰＣＲ）に影響を与えない。
【００３２】
工程２：半ネステッド増幅プライマーの設計：増幅反応において使用するための特定のプライマーの使用であって、これらのプライマーは、ＲＴ反応から生じる得られる核酸鎖のキメラの遺伝子特異的配列にアニールする。この半ネステッドプライマーは、キメラ配列を越えて伸張して、増幅段階で特異的に増加し得る。
【００３３】
特定の標的の多重化は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（内部コントロールおよび標的の多重化のための検出方法論の１つの例）の利用によって実現され得、これは、ＲＴ−ＰＣＲの効率的な決定を提供する。プローブ（例えば、Ｂｅａｃｏｎ、Ｔａｑｍａｎ、ハイブリダイゼーションプローブであるが、これらに限定されない）はまた、本発明の教示に従って提供される増幅産物を検出するために利用され得る。   増幅された配列の１つの部分がＦＲＥＴプローブで検出される場合、配列のこの別の部分の伸張は、異なる波長の別のプローブで検出され得る。配列の１つが変異（例えば、欠失）される場合、他の部分は、第二のプローブによってなお検出され得る。
【００３４】
ＲＮＡウイルスの複製を包含する工程は、当業者に周知である。ウイルスＲＮＡ複製は、最初に、相補的配列（複製鎖）をウイルスＲＮＡゲノムから合成することによって進行する（デングウイルスの場合、ＲＮＡポリメラーゼであるＮＳ５が、複製鎖の合成に関与する）。引き続いて、このゲノムは、複製鎖に相補的な配列を合成することによって、複製される。このプロセスは、複製プロセスとして単に公知である（Ｃｈｕら、１９８５）。
【００３５】
先行技術の方法に付随する特異性の欠如および厄介さに応答して、本発明の技術は、特別に設計された転換可能オリゴヌクレオチド（例えば、ＳＣＲＯおよび半ネステッドＰＣＲプライマー）を利用することによる、所望の核酸鎖の選択的な同定および定量の新規方法を提供する。
【００３６】
種々の分子生物学的プロトコルにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するための従来技術の方法（例えば、逆転写など）は、プライマーが自己アニールするべきではないことを教示する。これは、自己アニーリングが回避されるように種々のオリゴ設計ソフトウェアによってプログラムされ、そして利用される問題である。本発明の１つの局面に従い、そして本明細書中に適用される教示を利用することによって、提供されるオリゴヌクレオチドの特定の熱力学的特徴が、選択された反応条件下で、実際に、自己アニーリングに遭遇するように選択／設計される。特定の実施形態において、このことは、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分のステム−ループ形成を提供し、そしてその結果、これらのステム−ループ構造（例えば、転写反応条件下でステム−ループを形成し、そして増幅反応条件下で線形化する）は、増幅反応の間、非常に選択的（特異的）なプライミング部位として働き得、一方で、以下に詳述される転写反応条件下で、所望でないオリゴ−オリゴ相互作用を回避する。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明の教示に従って、ステムループおよび半ネステッドＰＣＲ方法を利用するウイルス複製ＲＮＡ鎖の検出および増幅は、例示的に、図２に示される。本明細書中に記載される方法の特異性は、半ネステッドＰＣＲプライマーを使用する特異的増幅と組み合わせて、ＲＴ段階で達成される。図２に示されるように、順方向ＰＣＲプライマー２は、ランダムヘキサマーでプライムされたｃＤＮＡにアニールしない。なぜなら、このようなｃＤＮＡは、キメラオリゴ配列を含まないからである。半ネステッドＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ段階においてキメラＲＴオリゴにアニールするオリゴ配列として定義される。
【００３８】
先に議論されたように、増幅ウイルスを定量することが可能であるためには、利用される方法は、増幅ウイルスは、増幅の前に、ゲノムに対して特異的な配列を合成するように、鎖特異的なアッセイを提供しなければならない。一般に、このアッセイは、以下の基準を有する：
１．正しい鎖からの正しくない鎖の区別。    
【００３９】
ｉ）鎖特異性研究は、好ましくは、純粋な合成核酸を用いて実施される。このことは、このアッセイのダイナミックレンジの決定を可能にする。    
【００４０】
ｉｉ）鎖特性研究は、合成されたｃＤＮＡウイルスゲノムのランダムヘキサマーの存在下で実施される。細胞核酸が、ＲＴのためのランダムプライマーとして働き得るので（Ｇｕｎｆｉら、１９９４）、このアッセイは、ランダムプライマーを用いて合成されたｃＤＮＡを用いて増幅が実施される場合に、いかなる産物をも生成させてはならない。    
【００４１】
ｉｉｉ）鎖特異的研究は、宿主（細胞）ＲＮＡとウイルスＲＮＡとの両方を含む異種核酸混合物の存在下で実施されるべきである。
【００４２】
２．大きいダイナミックレンジの検出／増幅。正しい鎖と正しくない鎖との間に、約１０６以上のダイナミックレンジを有するべきである。
【００４３】
３．高い感度：アッセイは、所望の鎖の１〜１０個のコピーを検出することが可能であるべきである。
【００４４】
４．ハイスループットの分析に適用可能であることが望ましい：アッセイは、従来技術の方法によって教示されるような、複数の工程を有するべきではなく、または労力集約型の検出方法（例えば、サザンブロット分析および多数回のＰＣＲ（ネステッドプライマーを使用する））を利用するべきではない。
【００４５】
ＲＴとＰＣＲとの両方のために遺伝子特異的オリゴを利用する先行技術の方法（例えば、Ｌａｓｋｕｓら、１９９７、Ｌｉｕら、１９９７；Ｖａｕｇｈｎら、２００２；Ｗｎａｇら、２００２）、ならびにＲＴおよび引き続くタグに指向されたプライマーを用いるＰＣＲによる増幅のために５’タグ配列を有するキメラオリゴ（非遺伝子／標的関連配列）を利用する先行技術の方法（Ｌｅｒａｔら、１９９６；Ｍｅｌｌｏｒら、１９９８；Ｓｉｅｐｐｓら、１９９８；Ｃｒａｇｇら、２００１；Ｎａｖａｓら、２００２；Ｌｉｎら、２００２）は、一般に、低い特異性（正しくない鎖からの正しい鎖の間を区別する能力）を達成する。ＲＴとＰＣＲとの両方についての同じオリゴの使用は、鎖特異性の欠如を生じ、そしてまた、ＲＴ段階でのミスプライミングおよび引き続く非特異的産物の増幅に悩まされる。
【００４６】
同様に、キメラオリゴ（非売りするタグおよびウイルス配列を有する）の、ｃＤＮＡ合成のための先行技術の利用、ならびに引き続く、タグに対するプライマーおよびウイルス特異的逆方向プライマーを利用するＰＣＲ増幅もまた、欠如する。これらの先行技術の方法によって利用されるプライマーは、望ましいＴｍプロフィールを有さず、従って、二次構造（例えば、本発明によって教示されるステムループ）を形成せず、従って、ミスアニーリングおよび結果としての誤増幅を生じる。
【００４７】
本発明の教示に従う、転換可能なオリゴヌクレオチドを設計するための１つのストラテジーの例示的な機構が、図３に示される。本発明のＳＣＲＴおよび半ネステッドＰＣＲプライマーを提供するための、独特の部分（例えば、タグ、ウイルス配列およびこれらの組み合わせ）を設計するための例示的な工程および問題が、以下に記載される。
【００４８】
本発明の教示に従って教示される理論的根拠およびストラテジーは、転換可能なコンホメーションを有するステム−ループキメラＲＴオリゴの設計および半ネステッドＰＣＲプライマーを提供する。選択されたヌクレオチド鎖（例えば、複製ＲＮＡ鎖）を区別および増幅する際のこの方法の使用を説明するために使用される、例示的なモデルウイルスは、デングウイルスおよびＲＳウイルス（ＲＳＶ）である（表１）。これらのウイルスの反復サイクルは、ポジティブＲＮＡ鎖（デング）またはポジティブＲＮＡ鎖（ＲＳＶ）のデノボ合成を包含する。従って、これらの部分の検出は、能動的煮増幅するウイルスの存在の指標である。
【００４９】
【表１】
2006506978.tif 000003
以下の特徴／局面は、例示的なＳＣＲＴを設計する場合に、本明細書中では、例えば、本発明の教示に従って、デング検出を増幅する際に使用するために、考慮されるべきである。
【００５０】
（ステム−ループキメラＲＴオリゴの選択）
１．プライマーの最適なサイズ：（注記：本明細書中で利用される例示的な場合（デングおよびＲＳＶ）については、哺乳動物配列に対する配列相同性が考慮される。）従って、長いプライマー配列は、哺乳動物配列との高い相同性をもたらすが（望ましくない）、短いプライマーサイズは、標的ウイルス配列を特異的にプライミングする際に困難を有する。従って、約５〜１５ｎｔ、より好ましくは８〜１２ｎｔのオリゴ長さが、最適であることが見出される。
【００５１】
２．プライマーのＧ＋Ｃ含有量：増幅（例えば、ＰＣＲ）段階における比較的高いアニーリング温度を可能にするためには、５０％以上。
【００５２】
３．３’配列部分の特性は、ウイルス（標的）配列に標的される。
【００５３】
４．タグ配列を有するステム−ループ型構造の形成（キメラＲＴオリゴ）。
【００５４】
デングウイルスの例示的な場合において、標的ＮＳ遺伝子（約１０ｋｂの全ゲノムサイズ）からのオーバーラップする短いオリゴマー（１２マーの長さ）の合成は、少数の潜在的な独特のウイルス配列を生じ、これらの配列のうちのいくつかが、以下に列挙される。分析されたオリゴマーの大部分は、外来哺乳動物配列に対する相同性を示し、これらのオリゴマーを、このストラテジーにおける使用に不適切にした（図３）。類似の経験が、ＲＳＶに対する適切なオリゴマーを設計する際に遭遇された。
【００５５】
（外来哺乳動物配列との低い相同性を有する、例示的な独特のデングウイルス配列）
ａ）デングＮＳ−１（ＤＮＳ−１））
ドメインの長さ：１０５６ｂｐ
走査された塩基の数：１０５６ｂｐ
基準に合うプライマーの数：１；ＤＮＳ−１（ＤＮＳ−１配列の収容されたコピーを表す）
ｂ）デングＮＳ−２（ＤＮＳ−２））
ドメインの長さ：１０４４ｂｐ
走査された塩基の数：１０４４ｂｐ
基準に合うプライマーの数：６；ＤＮＳ２−１、ＤＮＳ２−２〜ＤＮＳ２−６。
【００５６】
組み立てられるべきＳＣＲＯのウイルス（遺伝子／標的鎖特異的）セグメントを選択する際に、種々の問題（例えば、ＳＣＲＯの遺伝子特異的配列の長さ）が考慮されなければならない。例慈雨的な長さ（例えば、約６〜１５ｂｐ、より好ましくは、約８〜１２ｂｐ、またはそれより長い）が、特異的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションのＴｍがＲＴについて使用される温度の±１０℃である限り、利用され得る。短いオリゴを使用する理由は、短いオリゴが、一般に、ＲＴについて使用される温度に匹敵する低いＴｍを有し、従って、これらの範囲の長さが、逆転写の特異性を増加させることである。
【００５７】
しかし、ＳＣＲＯの遺伝子特異的配列が、ＲＴについて使用される温度（４２±５℃）と類似のＴｍを有する場合、この配列は、単独では、ＰＣＲのアニーリング温度（Ｔａ）にて、標的ｃＤＮＡにハイブリダイズすることが不可能である。従って、ＳＣＲＯの遺伝子特異的セグメントは、Ｔａにおいて、ＰＣＲプライマーとして働かない。
【００５８】
一例として、Ｔａより十分に低いＴｍを有するランダムヘキサマーが、ＲＴのために使用され得、従って、ＰＣＲにおいて増幅プライマーとして働かない（Ｇのヘキサマーを考慮すること。この配列は、２０℃より低いＴｍを有する）。この考慮は、ＲＴがＰＣＲより低い温度で実施されることを可能にし、そしてこのヘキサマーがＰＣＲ段階に有意に持ち越される場合でさえも、これらのヘキサマーは、Ｔａにおいて、ｃＤＮＡテンプレートにアニールすることが不可能である。
【００５９】
１つの例において、本発明のＳＣＲＯがＰＣＲプライマーがアニールするテンプレートとして働くことを目的として、外部配列（タグ）が、５’末端に付加される。この得られるオリゴは、タグおよび遺伝子特異的／鎖特異的配列のキメラであり、これは、ステム−ループを提供する（図４）。このオリゴの５’末端のタグ部分は、目的の遺伝子に対する配列相同性を有するべきではない。
【００６０】
ＲＴ段階において非特異的標的に対するミスプライミング／ミスアニーリングを回避する目的で、タグの選択は、好ましくは無関係の生物由来である配列に基づく。一例として、本明細書中で例示的に利用されるデングウイルスおよびＲＳＶウイルスの例示的な場合において、非哺乳動物配列が、ＲＴ段階におけるミスプライミングを回避するために選択された（図２および３）。タグ配列のステムループの形成は、β−アクチン転写を利用する記載される研究（以下）に示されるように、ミスプライミングを減少させる（図６）。β−アクチンを、故意にタグとして使用した。非構成的オリゴ（ループを形成しない）と比較される場合、ステム−ループ型オリゴは、４０サイクルのＰＣＲの後でさえも、β−アクチン配列へのミスプライミングを防止した。
【００６１】
ステム−ループ型セグメントを含むプライマー（代表的なプライマー設計の直観に反するプライマー構造）の利用が、実際に、ミスプライミングを減少させることを検証する目的で、以下の実験を実施した。
【００６２】
比較を、β−アクチン転写にミスプライムするように故意に設計された２つのキメラＲＴオリゴの間で行った。β−アクチンは、肝臓内で豊富に発現されるので、これらの２つのキメラＲＴオリゴ（ｐａｒ２およびｐａｒ２−ｚｉｐ９）を、逆転写のために使用し、引き続いて、同じ逆方向プライマーを用いるＰＣＲを行った。
【００６３】
従って、１μｇの全肝臓ＲＮＡを、０．１μＭのＰａｒ２またはＰａｒ２ｚｉｐ９  ＳＣＲＯのいずれかを用いる逆転写（ＲＴ）に供した。ＲＴを、ＩｍＰｒｏｍＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳ）を使用して４２℃で４５分間実施し、続いて、７０℃で５分間の熱不活性化を行った。合成されたｃＤＮＡの２５％を、半ネステッドＰＣＲプライマー（ＮＥＳＴ）および逆方向プライマー（ＡｃｔｉｎＳ）を用いて増幅した（４０サイクルの９５℃で０．５分間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸張）。次いで、産物の３０％を２％アガロースで電気泳動し、そしてエチジウムブロミドによって可視化した（図６）。
【００６４】
ＲＴおよびＰＣＲオリゴの配列を、以下に与える：下線を引いた文字は、デング配列を表し、太字の配列は、βアクチンをプライムする。
【００６５】
【化１】
2006506978.tif 000004
Ｐａｒ２ｚｉｐ９の予測される二次構造が、図７に示される。Ｐａｒ２オリゴは、ＲＴ段階において、いずれの安定な二次構造をも形成しない。
【００６６】
（結果）：ステム−ループ（Ｐａｒ２ｚｉｐ９）を提供することにより、図６のＰａｒ２ｚｉｐ９レーンにおける増幅産物の欠如によって示されるように、β−アクチンの増幅が減少する。従って、５’末端において外因性配列の二次構造を形成することによって、キメラＲＴプライマーのアクチンへのアニーリングを防止することが可能であった。（結論）：ステム−ループは、５’配列へのプライミングを防止する。
【００６７】
先に議論されたように、本発明の教示に従って、適切なタグ（ステム−ループ）配列の設計において利用されたテンプレートの例は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのキャロンシンターゼ遺伝子である。この例において、タグ配列は、哺乳動物配列または目的のウイルスゲノムにアニーリングしない、任意の配列であり得る。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ配列の使用の選択（参照配列：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのキャロンシンターゼ遺伝子；Ｇｅｎｂａｎｋ寄託：Ｍ８６３５８）は、植物と哺乳動物との間の遺伝的差異に起因したが、他の種々の広範な進化的関係もまた、特に有用な配列（低い相同性）を考慮する目的で利用され得、これによって、ミスプライミングの可能性を減少させる。
【００６８】
１つの実施形態の１つの局面において、上記ウイルスオリゴの設計の場合と同様に、オリゴマーのタグ（ステム−ループ型）部分の設計において使用される基準は、上で議論されたとおりである：
１．ＰＣＲにおける最適な熱力学を達成するための、タグの最適なサイズおよびウイルス配列
２．５０％以上のプライマーのＧ＋Ｃ含有量
３．５’配列を有するステム−ループ型構造の形成（ステム−ループ型キメラＲＴオリゴ）
４．組み合わせられた、タグを含む生成されたキメラＲＴオリゴおよびウイルス配列は、標的ウイルス配列に対するアニーリングの特異性を維持し、哺乳動物配列への有意な交差プライミングを伴わない。
【００６９】
ここで、ウイルス配列の分析においてと同様に、キャロンシンターゼ遺伝子（全サイズ約２ｋｂ）由来の例示的なオーバーラップする短いオリゴマー（１２マーの長さ）は、２つの潜在的な独特に配列を生じ、これらは、以下に列挙される、このストラテジーにおけるタグとして使用され売る。分析されたオリゴマーの大部分は、外来哺乳動物配列に対して有意な相同性（＞７０％）を示し、ここでまた、これらのオリゴマーを、使用に不適切にした。
【００７０】
キャロンシンターゼ：
ドメインの長さ：１９９９ｂｐ
走査された塩基の数：１９９９ｂｐ
基準に合うプライマーの数：２
結果１（改変された配列：１６６８〜１６８５）
結果２（６９１〜７０８）。
【００７１】
考慮するべき本発明の局面は、タグ配列のステム−ループ部分が、好ましくは、ＲＴ段階の間の条件で形成され、そしてまたしかし、増幅段階（例えば、ＰＣＲ）のＴａにおいて、プライマーが効率的にアニールするために十分に融解しなければなららないことである。タグ配列が望ましくない配列（例えば、哺乳動物配列）にアニールする場合、このタグのＴｍは、そのＴａと実質的に類似であってはならない。そうでなければ、ＳＣＲＯのステム−ループ型部分が、ハイブリダイゼーションに起因してアンフォールディングし得、そして外因性配列へのミスアニーリングを生じ得る。これらの特徴は、キメラオリゴのステム−ループ部分の熱力学（ギブスの自由エネルギー（ΔＧ））の研究によって調査され得る。
【００７２】
反応についてのΔＧは、反応が平衡からいかに遠いかの直接的尺度とみなされ得る。これはしばしば、以下の形で記載される：ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳ。ここで、ΔＨ＝エンタルピー変化；Ｔ＝反応温度；およびΔＳ＝エントロピー変化。この反応が発熱（熱を放出する）反応である場合、ΔＨは（転換によって）負である。例えば、ＮａＣｌ（非常に構造的な結晶）が溶解する場合には、逆の筋書き（吸熱）が生じ、この場合には、ΔＨは性の値である（溶液が冷たく感じられる）。
【００７３】
反応式全体の場合、ΔＧの値がより正になるほど、その反応を前に進めるためにはより大きいエネルギーが必要とされる。逆の（ΔＧがより負である）結果は、この反応が単独でより進行しやすい場合に生じる。本発明の教示に従って、ΔＧは、目的の温度で計算される。例えば、ＲＴ段階については、４２℃でのΔＧなどである。
【００７４】
反応が起こる傾向を表すための別の方法は、ΔＧを、反応の平衡の観点で記載することである。例示的なＳＣＲＯ、デングオリゴヌクレオチドＤＮＳ−１のフォールディング状態対アンフォールディング状態の例示的な場合を考慮する。この例において、反応は、簡単に、以下のように記載され得る：
【００７５】
【化２】
2006506978.tif 000005
平衡において：
Ｋｅｑ＝［ＤＮＳ−１（フォールド）］／（ＤＮＳ−１（アンフォールド）］      （２）
ギブスの自由エネルギーはまた、反応の平衡の関係で表され得る：
ΔＧ＝ＲＴｌｎＫｅｑ      （３）
ＤＮＳ−１（アンフォールド）より多いＤＮＳ−１（フォールド）の分子が存在する場合、Ｋｅｑは、１より大きくなる。Ｋｅｑの値を式３に代入することによって、自由エネルギーが負になることが明らかである。ΔＧがより負になるほど、その反応はより自発的である。
【００７６】
従って、ΔＧの観点で記載される反応を用いて、オリゴヌクレオチドは、２つの極端な形態（式１）で存在し得、そしてその平衡は、Ｋｅｑによって記載される。実際に、フォールドとアンフォールドとの間には、多くの状態が存在する。
【００７７】
従って、オリゴヌクレオチド配列（ＤＮＳ−１）は、独特であり（公知の哺乳動物配列にプライミングしない）、そしてＲＴ条件において、より安定な構造（負のΔＧ）を有する。このオリゴの５’末端は、ミスプライミングが減少されるように、独特の遺伝子特異的配列の一部分に「ジップ」アップ（自己アニール）するように設計された。安定なステム−ループ型構造を形成することによって、タグ配列は、いずれの配列へのアニーリングのためにも利用可能ではない。負のΔＧは、ステム−ループ型の形成が、ＲＴのための条件において好ましいことを示す。従って、ギブスの自由エネルギー（ΔＧ）をこのように記載および利用することによって、本発明の教示に従う安定な二次構造（ステム−ループ型）を設計する能力が提供される。二次構造の予測は、例えば、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ  ｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ）において見出されるＺｕｃｋｅｒプログラムを使用して計算され得る。二次構造を予測する他のプログラムもまた、利用され得る。
【００７８】
本発明の別の局面は、設計されたＳＲＯのＴｍ（融解温度）の考慮である。従って、ＳＣＲＯおよび半ネステッドＰＣＲプライマーのＴｍが、例示的な計算によって、以下で決定される。これらは、ガイドとして使用される。なぜなら、これらは、実験データに基づく予測ツールであり、そして本明細書中に提示される種々の実施形態において利用される種々の考慮を設計するための有用なガイドを提供したからである。
【００７９】
（熱力学的Ｔｍ）：Ｔｍを計算するための例示的な方法は、隣接熱力学値法（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、１９８６）である。Ｔｍを決定するための式は、以下である：
Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ−Ｒｌｎ［ＤＮＡ｝）−２７３．１５＋１６．６×（ｌｏｇ１０［ＤＮＡ｝）
ここで、ΔＨは、エンタルピーであり；ΔＳは、エントロピーであり、Ｒは、１．９８７ｃａｌ  Ｋ−１  ｍｏｌ−１であり、［ＤＮＡ］は、ＤＮＡ濃度であり、そしてＣｓは、塩濃度である。
【００８０】
（ハイブリダイゼーションＴｍ）：この方法は、一般的に、特に高塩およびホルムアミドの存在下において、ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリダイゼーションのために使用される。より長いオリゴ（約１５〜約２０個のヌクレオチド）でより正確である。このＴｍは、以下の式を使用して計算される：
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリダイゼーションについて：Ｔｍ＝７９．８＋１８．５＊（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．５８＊［％（Ｇ＋Ｃ）］＋１１．８＊［％（Ｇ＋Ｃ）］２−０．５＊（％ホルムアミド）−８２０／Ｌ−１．５（％ミスマッチ）；
ここで、Ｌは、オリゴヌクレオチドの長さ（塩基）であり、Ｎａ＋は、ＲＴの間に使用される塩の濃度である。
【００８１】
ＧＣ＋ＡＴ  Ｔｍ：推定Ｔｍを、各塩基の分布の合計である：ＡおよびＴについて２℃、ならびにＧおよびＣについて４℃。
【００８２】
先に記載されるように、本発明の別の局面は、増幅工程の間に利用される半ネステッドＰＣＲプライマーのそれらからの設計および得られた特徴に関連する。プライマーは、タグおよびＳＣＲＯの遺伝子特異的配列（図５）にアニールしなければならない。ＳＣＲおの遺伝子特異的セグメントが適切なＴｍを有さないかもしれないので、さらなるタグ配列は、上に示されるように、ＰＣＲプライマーが特異的にアニールし得るのに十分なＴｍを増加する。
【００８３】
ＳＣＲＯが他の遺伝子に（偶然に）相同配列を有する場合、特定の遺伝子に伸長する外部３’ｎｔを使用して、非特異的プライミングを減少し得る。以前の研究は、重複した接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ）配列が、高い特異性（特異性において１０４倍の増加）で関連した転写の間で判断し得る。ＰＣＲプライマーの突出（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）配列は、限定しないが約５ｂｐの短さであり得る（図８）。
【００８４】
図５に示されるように、突出ＰＣＲプライマーは、Ｔａに近いＴｍ（＋／−５℃）を有するべきである。ランダムプライマーを使用して合成されたｃＤＮＡにアニールすることは、可能ではない。従って、ＳＣＲＯの遺伝子特異的セグメント（３’突出ｎｔを含む）は、Ｔａに類似のＴｍを有さず、低い（＜１０℃）。使用される逆プライマーは、遺伝子特異的である。
【００８５】
従って、本発明の１つの実施形態に従って、ＲＮＡウイルス（デングウイルス）のネガティブ鎖として例示的に示される特定の核酸鎖の定量化のための、キメラステム−ループオリゴおよび半ネステッドＰＣＲプライマーの設計のためのガイドラインは、以下を含む：
（１）２つのセグメントを有するＳＣＲＯ：ウイルス配列に関連しない５’タグ配列および３’セグメント（例えば、約８〜１２ｎｔ長）は、所望のウイルス配列に対して相補的である。
（２）ＳＣＲＯオリゴ配列は、データベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）の公知の哺乳動物配列に対して有意な相同性（約７０％）を有するべきではない。
（３）所望のウイルス配列にハイブリダイズした場合、３’セグメントの融点（Ｔｍ）は、ＲＴについて使用される温度の＋／−７℃であるべきである。
（４）ＳＣＲＯの３’セグメントは、ＲＴについて使用される条件において任意の安定な二次構造をとるべきではない（ΔＧ≧−０．５ｋｃａｌ／モル）。
（５）５’タグ配列は、ＲＴについて使用される条件において安定な二次構造（ステム−ループ）をとるべきである（ΔＧ≦−０．５ｋｃａｌ／モル）。
（６）ループは、公知の哺乳動物配列にアニールするべきではない。ループ配列が哺乳動物配列に相補的である場合、相補配列とループのハイブリダイゼーションのＴｍは、ステム部分のＴｍよりも低くなければならない。
（７）ステムループの自由エネルギーおよびＴｍを、最接近熱力学計算を使用して計算し得、そして例えば、Ｚｕｃｋｅｒプログラムを使用して計算し得る。
（８）使用したＰＣＲ条件において、キメラＲＴオリゴは、半ネステッドＰＣＲプライマーの効率的なアニーリングを可能にするために、任意の安定な二次構造をとるべきではない。
（９）半ネステッドＰＣＲプライマーは、Ｔａと類似（＋／−１０℃）のＴＭを有する配列にハイブリダイズするべきである。
（１０）ＳＣＲＯプライマーおよびＰＣＲプライマーの配列は、バックグラウンドノイズ／シグナルを増加し得る相補性の領域がないように設計されるべきである。
【００８６】
ステム−ループ構造を使用するための原理は、以下から明らかである：
（ａ）熱力学的に安定なステム−ループは、偽の外来配列にミスアニーリングすることから５’末端でタグを抑制し得る。
（ｂ）逆転写が例えば４２℃で実行されるので、相補的なウイルスに最適な構造（タグ配列に対してではない）を、核酸の複製ウイルス鎖にアニールさせることが必要である。従って、この独特のキメラ配列は、５’末端において、ステム−ループ構造に折り畳まれる。
（ｃ）半ネステッドＰＣＲプライマーの設計は、ステム−ループＲＴオリゴによって逆転写された標的複製ＲＮＡのみの増幅を可能にする。キメラＲＴオリゴを広げることは、高い効率のＰＣＲ（＞７０％）を可能にするために、アニーリング温度（Ｔａ）でエネルギー的に支持されなければならない。
【００８７】
例として、キメラプライマー（ＤＮＳ−１）は、組み合わせた配列および以下に示される特徴を有する（ギャップは、タグおよびウイルス部分を区別するためにのみ示される（図１０））：
【００８８】
【化３】
2006506978.tif 000006
例示的なＢＬＡＳＴ検索は、キメラ配列の３’末端に対する有意な哺乳動物配列のアニールがないということを見出した（ＤＮＳ−１）。この実施例において、このタグ配列が公知の哺乳動物配列にアニールするループ配列のＴｍについての考慮は、この例において適用可能ではない。
【００８９】
３’突出配列を有する半ネステッドＰＣＲプライマー（図８）の使用は、先行技術の内部ネステッドプライマーの使用無しで、高い特異性を達成するために使用され得る。これらのプライマーの設計は、ステム−ループキメラＲＴオリゴの特性に高度に依存し、そして以下に議論される。
【００９０】
図８において、半ネステッドＰＣＲプライマーは、正しいテンプレートに対して３’配列を有し、キメラＲＴ−プライマーから突出する。３’配列のアニーリングが、ＤＮＡポリメラーゼによる、ウイルスｃＤＮＡ（ここで、既に行われたＲＴに起因して組み込まれたＳＣＲＯを有する）の伸長に重要であるので、間違ったテンプレート上への３’末端でのミスアニーリングは、効率的に伸長しない。
【００９１】
３’突出半ネステッドＰＣＲプライマー（遺伝子／鎖特異的配列を含む）の長さは、ハイブリダイゼーションのＴｍに依存する。このセグメントがＴａに近いＴｍを有する場合、プライマーは、ＳＣＲＯを用いて合成されたｃＤＮＡにアニールする必要なしに、テンプレートにアニールし得る。従って、これは、間違ったｃＤＮＡテンプレートにプライムし得、また、ランダムプライマーを用いて合成されたｃＤＮＡを用いて増幅する場合に生成物を生じ、従って避けるべきである。
【００９２】
（３’突出半ネステッドＰＣＲプライマーを設計するためのガイドライン）
１．ＳＣＲＯの遺伝子特異的セグメントおよび突出３’配列のＴｍを計算する。遺伝子特異的セグメント／配列のＴｍは、Ｔａの約≦１０℃である。
２．続いて、Ｔａに近い（約＋／−１０℃）Ｔｍを有するように、このセグメントにタグ配列を追加する。
【００９３】
テンプレートとしてＤｅｎ２ゲノムを使用して、図９のボックス１に列挙される基準に基づく例示的なＰＣＲプライマーを示す。ＳＣＲＯが遺伝子特異的配列ＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＧＡＡＡＣＣＧ（配列番号６）を有すると仮定すると、これは、ＰＣＲ段階において約６２℃のＴｍを有する。６０℃のＴａにおいて、この配列は、相補配列にアニーリングするために最適である。
【００９４】
ＳＣＲＯの遺伝子／鎖特異的セグメントを設計する際に、この配列は、ＲＴのために使用される温度に類似のＴｍを有さなければならず、従って、これは、この配列を約１２ｂｐ以下に減少させる（ＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡ（配列番号７）は、４３℃のＴｍを有する）。１０マーが設計される（ＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡ）（配列番号８）と仮定すると、Ｔｍは、ここで約３５℃である。これは、ＲＴに適切であるが、ＰＣＲに対して最適ではない。３’余分配列が追加される場合、全体の配列は、Ｔａの＜１０℃のＴｍを有する。従って、余分な３塩基を追加する（ＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡ（配列番号９））を追加することによって、この配列のＴｍ（４４℃）は、６０℃アニーリングにおいてＰＣＲに最適ではない。従って、３’突出半ネステッドＰＣＲプライマーのＴｍは、全体的なＴｍがおよそＴａになるまで、５’タグ配列の添加によって増加する。
【００９５】
３’突出半ネステッドＰＣＲプライマーの配列の例は、以下である：
ＧＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡ（配列番号１０）Ｔｍ＝６１℃。
ここで、ＧＧＧＧは、タグの一部であり、ＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡは、ＳＣＲＯの遺伝子／鎖特異的配列であり、そして３’末端のＧＡＡは、突出配列である。ＧＧＧＧが示されるモノの、船体的なＴ，をおよそＴａにする任意のさらなるｂｐが十分である（ＳＣＲＯ配列は、ＧＧＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡ（配列番号１１）である）。遺伝子特異的鎖のＴｍは、３５℃であり、これは、ＲＴに対して適切であるが、ＰＣＲについては適切ではない。
【００９６】
例えば、Ｑｒｔ−ＰＣＲによって高い相同性の配列の識別を可能にするための突出３’配列の使用という概念の証明は、最近の論文に示される（Ｗｏｎｇ  ＆  Ｔｏｏ，２０００；Ｗｏｎｇ，Ｓｉａ，Ｔｏｏ，２００２；Ｔｏｏ，２００３）。これらの研究において、ＧＦＲ２レセプターの選択的にスプライシングされたアイソフォームの増幅の特異性を区別することが可能であったことが示された。これらの論文におけるストラテジーは、５’末端において３つのアイソフォームに同一にアニールするが、３’末端（隣接接合部）において５ｎｔ異なるプライマーを使用することであった。結果は、このような突出（重複）プライマーの使用は、１０４倍だけ各アイソフォームの特異的増幅を可能にしたことを示した。従って、このストラテジーは、本発明によって教示されるように、半ネステッドＰＣＲプライマーの設計に採用され得る。
【００９７】
本発明の教示に従って設計および提供されたＳＣＲＯの例を図１０に示す。このステム−ループキメラＲＴオリゴの種々の例示的な物理化学的特性は、以下の通りである：
ＲＴ工程におけるヘアピンループの計算したΔＧ＝−２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ＲＴ工程でのＴｍ（融点）＝６２℃
Ｎａ＋＝７５ｍＭ
Ｍｇ２＋＝３ｍＭ
ＲＴ温度＝４２℃
ＰＣＲ工程でのヘアピンループの計算したΔＧ＝０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ
ＰＣＲでのヘアピンループのＴｍ＝６４℃
Ｎａ＋＝５０ｍＭ
Ｍｇ２＋＝２．５ｍＭ
アニーリング温度＝６０℃。
【００９８】
従って、ＲＴに使用されるこれらの例示的な塩および温度条件において、ステム−ループ構造の形成は、高度に支持される。しかし、ＰＣＲのために使用される条件、この研究において使用される６０℃のアニーリング温度を用いて、ステム−ループの形成は、あまり支持されず、従って、組み込まれたＳＣＲＯ部分の十分な弛緩および線形性を可能にし、特異的増幅のための独特な配列への半ネステッドＰＣＲプライマーの効率的なアニーリングを提供する。
【００９９】
ＤＮＳ−１のステムループ部分が欠失する（この場合、５’ＴＣＡＣＣＧ（配列番号１２）のステム配列）場合、およそ同じエネルギーの別の例示的なステムループ構造が、図１１に示されるように、形成される（ｍｏｄ−ＤＮＳ−１、配列番号２８）。３’末端における特異的な配列は、デング配列へのアニーリングのために利用可能である。
【０１００】
リアルタイムＰＣＲにおける使用のための半ネステッドＰＣＲプライマーを設計するためのストラテジーの例は、５’順方向プライマーがＳＣＲＯ内で、例えば、プライマーの３’末端においてデング配列の４塩基でネステッドされて、ウイルスゲノムのミスアニーリングおよび伸長を妨げるように、設計されたＰＣＲプライマーを含む。３’逆ＰＣＲプライマーは、先に考察されるように、ウイルスゲノムに基づいて設計される。従って、標的鎖（例示的には、複製鎖ＲＮＡ）の増幅は、ＲＴ−ＰＣＲがＳＣＲＯプライマーおよび鎖特異的半ネステッドＰＣＲプライマーの組み合わせを使用して実行され、例えば、デング感染細胞において見出される、ランダムプライムされた全デングＲＮＡから得られた増幅がない。
【０１０１】
従って、以下の非限定的な例を、本発明の教示をさらに示すために提供し、ここで、例示的に、２つのウイルス（デングウイルスおよびＲＳＶ）の複製形態の核酸鎖特定的検出および定量に適用する。特定の例において、検出は、インビボおよびインビトロの供給源からのウイルスから示される。
【０１０２】
これらのサンプルにおいて、以下の例示的な材料および方法を利用した。
【０１０３】
細胞株およびウイルス：蚊細胞株Ｃ６／３６を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充したＬｅｉｂｏｗｉｔｚ  Ｌ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）において維持し、２８℃で培養した。子のハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞株を、５％ＣＯ２において、３７℃で培養し、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。デング２  Ｎｅｗ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｃ（ＮＧＣ）株ウイルスを、ＧｏｕｌｄおよびＣｌｅｇｇ，１９８５に記載されるように、３２℃でＣ６／３６細胞において増殖させた。デング２ウイルスの力価を、ＢＨＫ−２１細胞においてプラークアッセイによって評価した。
【０１０４】
デングウイルス感染および力価決定：Ｃ６／３６またはＢＨＫ−２１細胞の単層を２４ウェルプレートにおいて増殖させ、そしてデング２ウイルスを用いて次の日に感染させた。１時間の吸着後、未結合ウイルスを、吸引によって除去し、細胞をＰＢＳでリンスし、そしてそれぞれの維持培地において増殖させた。デングウイルス感染の無い細胞、または熱不活化ウイルス（５６℃で３０分）を接種した細胞を、コントロールとして使用した。いくつかの実験において、ＢＨＫ−２１細胞を、デング２ウイルスで感染させ、ウイルス転写を阻害するために種々の濃度のリバビリン（１−ｆｌ−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキシイミド；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を無しでまたは存在下で増殖させた。リバビリン処理に起因する細胞の細胞傷害性を、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって決定した。デング２ウイルスの力価を、ＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイによって決定した。簡単に述べると、ウイルスの一連の希釈を、上記のように、ＢＨＫ−２１単層細胞上に吸着させた。次いで、ウイルス接種物（ｉｎｏｃｕｌｉ）を、２％ＦＢＳおよび１％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０で置換した。感染の６日後に、細胞を固定し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で１％結晶バイオレット−４％ホルマリン溶液で染色し、そしてプラーク数を数えた。全てのアッセイを３連で行った。
【０１０５】
新生仔マウスへのデングウイルスの接種：新生仔Ｂａｌｂ／ｃマウスへのデング２の頭蓋内（ｉ．ｃ．）接種を、（ＧｏｕｌｄおよびＣｌｅｇｇ，１９８５）に記載されるように実施した。新生仔マウスの同腹仔を、１×１〜３ＰＦＵの生きたまたは熱不活化デング２ウイルスを頭蓋内に接種した。次いで、マウスを５日後に屠殺し、それらの脳を除去し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）中でホモジナイズし、そして全ＲＮＡを製造業者の説明書に従って調製した。各ＲＮＡサンプルを、変性ゲル電気泳動によって分析し、そして分光光度計によって定量化した（２１）。各脳サンプルからの３〜５μｇの全ＲＮＡを、連続的に、以下に記載されるように、ＲＴ、続いて、ＰＣＲのために使用した。
【０１０６】
プラスミドの構築およびインビトロ転写によるＲＮＡ転写の調製：デング２ゲノムＲＮＡを、（Ｔｏｏら、１９９５）に記載されるように抽出し、そしてＲＴによるウイルスｃＤＮＡの合成のためにテンプレートとして使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  ２００１）。以下の例の概略を、図２２によって提供し、これは、本明細書中に開示される教示に従って、種々のオリゴ／プライマーの使用を示す。簡単に述べると、第１鎖ｃＤＮＡを、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ＝ＷＩ）を使用して、１時間、４２℃でＲＴによって生成した。ＲＴに続いて、全デング２  ＮＳ２Ａ領域を、ＰＣＲ鎖を作製するための全ＮＳ２Ａ遺伝子を増幅するためおよび一本鎖ＲＮＡ合成のためのテンプレートとして、ＮＳ２Ａ全順方向（５’−ＧＧＡＣＡＴＧＧＧＣＡＧＡＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１３））およびＮＳ２Ａ全逆（５’−ＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣ−３’（配列番号１４））プライマーを使用して、標準ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ  Ｒａｐｉｄ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して精製し、そしてｐＧｅｍＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。ヌクレオチド３４７８〜４１３２（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ２９０９５）からのデングゲノム配列を含むポジティブクローンｐＧｅｍＴ−ＤＮＳ２Ａを、配列決定によって変化させた。次いで、デングＮＳ２ＡのポジティブおよびネガティブＲＮＡ鎖を、製造業者の説明書に従って、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）インビトロ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、線形化したｐＧｅｍＴ−ＤＮＳ２Ａのインビトロ転写によって合成した。転写されたＲＮＡを、分光光度計によって定量化し、そして一体性を変性ゲル電気泳動によって実証した。
【０１０７】
デング核酸のＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲ：全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して感染細胞から調製した。得られたＲＮＡを、分光光度計によって定量化し、そしてそれらの一体性は、ゲル電気泳動によって分析した。ＲＴ反応を、全容量１０μｌで、１２．５ｐｍｏｌのランダムへキサマー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはＤＮＳ−１（５’−ＴＣＡＣＣＧＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＧＧＣＧＣＴＡＣ−３’（配列番号５））のいずれかを用いて、１００ＵのＭ−ＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、（２１）に記載されるように２〜５μｇの全ＲＮＡで４２℃で実施した。ＤＮＳ−１（デングＮＳ２Ａ領域のネガティブ複製鎖に対するセンスプライマー）は、ＲＴ工程でのミスプライミングを避けるためのヘアピンステム−ループ構造、および増幅工程での高い特異性を達成するための独特のデング配列を有するように設計された（図１０）。ＲＴ工程でのヘアピンループの計算されたΔＧは、６２℃のＴｍ（融点）で、−２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。従って、ＲＴについて使用される塩および温度条件において、ヘアピンループの形成は、高度に支持される。しかし、ＰＣＲについて使用される条件で、ヘアピンループのΔＧおよびＴｍは、それぞれ、−０．４ｋｃａｌ／ｍｏｌおよび６４℃であった。
【０１０８】
従って、この実施例で使用されるアニーリング温度（６０℃）において、ヘアピンループの形成は、あまり支持されず、従って、独特の配列にＰＣＲプラマー（ＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒ）の効率的なアニーリングを可能にする。リアルタイム定量的ＰＣＲのために使用されるプライマーの配列を、表２に与える。
【０１０９】
【表２】
2006506978.tif 000007
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ、接尾辞「ｆ」および「ｒ」で示した。デング配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号Ｍ２９０９５に従って割り当てた。アクチンプライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＪ３１２０９２に報告される配列に従って設計した。
【０１１０】
全てのリアルタイム定量的ＰＣＲを、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｊＱＴＭ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で実施した。閾値サイクル（Ｃｔ）を、Ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｖ２．３Ｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して計算した。全ての鎖テンプレートは、標的に対してサイズおよび配列が同一であり、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）および５０ｎＭの各プライマーを使用するＰＣＲによって、以下のサイクル条件で作製した：３ｍｍについて９５℃工程；３０ｓについて９５℃、３０ｓについての５５℃、および１ｍｍについての７２℃の２５サイクル；および７ｍｍについての７２℃での伸長工程。全てのＤＮＡ配列を、配列決定によって確認した。他に示さない限り、全てのリアルタイム定量的ＰＣＲを、９５℃の３０ｓ変性、６０℃での３０ｓアニーリング、および７２℃での３０ｓ伸長の４０サイクルで実行した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（Ｘ−ｔｅｎｓａＭＩＸ−ＳＧ；ＢｉｏＷＯＲＫＳ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）の蛍光検出を、伸長相において実行した。「ホット−スタート」リアルタイム定量的ＰＣＲを、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含む、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して実施した。サイクルパラメーターは、上記パラメーターと同一である（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化するための１０分間、９５℃でさらなる工程）。
【０１１１】
（結果）
ＳＣＲＯおよびネステッドＰＣＲプライマー（ウイルスネガティブ鎖ＲＮＡを検出するために設計される）を使用するＤＮＡ増幅は、複製デングウイルスで感染した細胞に特異的である。デングウイルスのネガティブＲＮＡ鎖は、活性ウイルス複製が存在する場合のみ細胞に存在する（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、１９９０）。従って、この部分の定量化は、デング複製の進行を評価するために使用され得る。プライマーＤＮＳ−１（デングＮＳ２Ａ領域のネガティブ鎖への（上記のような）ミスアニーリングを妨げ、そして標的化プライミングを促進するために、独特の配列を有するステム−ループを有するように設計された）を使用して、複製鎖を特異的に逆転写するが、デングウイルスのゲノムは逆転写せず（図１０）、ここで、デングのネガティブ複製鎖に相補的な第１鎖は、５’−ＧＧＴＧＧＧＣＧＣＴＡＣ−３’（配列番号２３）である。検出の特異性を評価するために、１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で複製または熱不活化デング２ウイルスのいずれかを感染したＣ６／３６細胞から得られた全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを実行した。全ＲＮＡを、約５０％のシンクチア（ｓｙｎｃｔｉａ）が複製ウイルスで感染したＣ６／３６細胞で観察された場合、各サンプルから収集した。各サンプルについて、ＲＴ反応を、ＤＮＳ−１を使用して実施し、続いて、プライマーＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒを使用するＰＣＲを実施した（表２）。ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動によって分析される場合、複製（レーン１〜３）で感染された細胞で３２０ｂｐの予期されるサイズを示したが、不活化（レーン４〜６）デングウイルスでは示されなかった（図１２）。ＰＣＲ産物の同定を、配列決定によって確認した。
【０１１２】
より詳細には、図１２は、複製または不活化デング２ウイルスを感染したＣ６／３６細胞のＲＴ−ＰＣＲを示す。蚊Ｃ６／３６細胞を、１のｍ．ｏ．ｉで、複製（レーン１〜３）または熱不活化（レーン４〜６）デング２ウイルスで、３連で感染させた。各サンプルからの全ＲＮＡを、鎖特異的ＤＮＳ−１オリゴヌクレオチドを逆転写し、そしてプライマーＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒで増幅した。ネガティブＲＮＡ鎖から増幅された予期されるＤＮＡフラグメント（３１５ｂｐ）は、（Ｄｅｎ）を示す。増幅生成物は、不活化ウイルスに暴露された細胞から観察された。レーンＭ、ＤＮＡ分子サイズメーカー（１００ｂｐラダー）。この研究は、同一の結果で少なくとも二回再現した。
【０１１３】
デングウイルスのネガティブ鎖ＲＮＡに特異的なプライマーは、ポジティブ鎖ゲノムＲＮＡを増幅することはできなかった。上記データは、プライマーが、所望のデングＮＳ２Ａ領域を正確に増幅することができた。デングネガティブＲＮＡ鎖を検出するためのこの方法の特異性は、２つの異なるアプローチを使用してさらに評価した。
【０１１４】
最初に、連続希釈した逆転写した鎖特異的ｃＤＮＡの増幅を実行した。ポジティブ鎖ＲＮＡおよびネガティブ鎖ＲＮＡを、デングＮＳ２Ａ配列をコードするｐＧｅｍＴ−ＤＮＳ２Ａを使用するインビトロ転写によって、合成した。等量の上記各ＲＮＡを、ＤＮＳ１プライマーによって逆転写し、リアルタイムＰＣＲを、プライマーＤＳＮ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒを使用して、連続希釈したｃＤＮＡに対して実行した。ネガティブ鎖デングＲＮＡサンプルが、試験した濃度範囲にわたって効率的に検出された（図１３Ａ）。しかし、コントロールに対するそのＣｔ値の類似性により示されるように、ポジティブ鎖ＲＮＡサンプルを用いると、いかなる特異的増幅も観察されなかった。この知見を検証するために、上記ＰＣＲ産物のゲル電気泳動は、連続希釈したネガティブ鎖ＲＮＡから増幅した推定ＤＮＡフラグメント３２０ｂｐ（レーン１〜５）を示したが、連続希釈したポジティブ鎖サンプルの対応するサンプルを用いた場合には示さなかった（レーン６〜１０）（図１３Ｂ）。ポジティブ鎖ＲＮＡおよびネガティブ鎖ＲＮＡの完全性の差異の可能性を排除するために、両方を、ランダムヘキサマーを用いて逆転写し、内部デング特異的プライマーＮＳ２Ａ−ｆおよびＮＳ２Ａ−ｒを使用するリアルタイムＰＣＲにより定量した（表２）。ポジティブＮＳ２Ａ  ＲＮＡ鎖サンプルおよび−ＮＳ２Ａ  ＲＮＡ鎖サンプルの両方は、匹敵するＣｔ値を示し（図１３Ｃ）、推定ＰＣＲ産物サイズ２０５ｂｐを生じた（図１３Ｄ）。従って、このデータは、このストラテジーが、対応するネガティブ鎖ＲＮＡより少なくとも５ｌｏｇ濃度、デングＮＳ２ＡネガティブＲＮＡ鎖を特異的に検出することが可能であった。
【０１１５】
上記のように、図１３は、特異的オリゴヌクレオチドおよびリアルタイムＰＣＲを用いる逆転写（ＲＴ）による、デングネガティブ鎖ＲＮＡの検出の特異性および感度を示す。（図１３Ａ）デングＮＳ２Ａのポジティブ鎖ＲＮＡおよびネガティブ鎖ＲＮＡを、上記のようなｐＧＥｍＴ−ＤＮ２Ａを使用するインビトロ転写によって、合成した。ネガティブ鎖ＮＳ２Ａ  ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＮＳ２Ａ  ＲＮＡを、ＤＮＳ−１オリゴヌクレオチドを使用して逆転写し、連続希釈し、その後、リアルタイム定量ＰＣＲにより検出した。下にあるバーは、異なる希釈物における、ネガティブ鎖ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＲＮＡを用いて作成した曲線の相対位置を示す。ネガティブ鎖ＲＮＡは有効に増幅されたが、ポジティブ鎖は、そうではなかった。この実験からの生成物を、図１３Ｂにおいて記載するようにゲル電気泳動により検証した。連続希釈したネガティブ鎖ＲＮＡのテンプレート希釈のｌｏｇに対するＣｔプロットの傾き（３．９±０．１）および対応する標準物に対するＣｔプロットの傾き（４．３±０．１）は、類似した。この実験を、少なくとも３回反復した。（図１３Ｂ）デングＮＳ２Ａネガティブ鎖ＲＮＡ（レーン１〜５）およびデングＮＳ２Ａポジティブ鎖ＲＮＡ（レーン６〜１０）のリアルタイム定量ＰＣＲからの増幅ＤＮＡ産物のゲル電気泳動。（Ｓ）上記のように調製したデングＮＳ２Ａ  ｃＤＮＡ標準物を使用するポジティブコントロール。推定サイズに対応する増幅産物は、ポジティブ鎖ＮＲＡ（レーン６〜１０）を用いて得られなかったことに留意のこと。（Ａ）において観察されるポジティブ鎖デングＲＮＡの明らかな増幅は、プライマー−ダイマー形成に起因した（図１３Ｃ）。リアルタイム定量ＰＣＲによる、インビトロ転写したネガティブ鎖ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＲＮＡの完全性の検証。上記ＲＮＡを、ランダムヘキサマーから逆転写し、内部デングＮＳ２Ａ特異的プライマーを使用して定量し、その後、ゲル電気泳動分析した（図１２Ｄ）。いずれかの鎖ＲＮＡのすべての希釈物が、効率的に増幅された。しかし、（図１３Ａ）における逆転写（ＲＴ）の間にＤＮＳ１を使用してポジティブ鎖ＲＮＡの特異的増幅を検することを失敗したのは、インビトロ転写の効率の差異には起因しなかった。（Ｍ）ＤＮＡ分子サイズマーカー（１００ｂｐラダー）。
【０１１６】
この方法の特異性を決定するための第２のアプローチは、デングウイルスストックから直接ネガティブＲＮＡ鎖を検出する試みであった。逆転写（ＲＴ）工程および増幅工程におけるこのストラテジーの鎖特異性を検証するために、ランダムプライム逆転写（ＲＴ）を、ウイルスストックから直接抽出したデングゲノムＲＮＡを用いて実行し、その後、エンベロープに対するプライマー（Ｅｎｇ−ｆおよびＥｎｇ−ｒ）または鎖特異的プライマー（ＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒ）を使用してリアルタイムＰＣＲした。ランダムヘキサマーでプライムしたデングゲノムは、上記エンベロープに対する非鎖特異的プライマーを用いて効率的に増幅されたが、上記鎖特異的プライマー対（ＤＮＳ−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒ）を用いてはそうではなかった。上記結果は、５１１ｂｐ  ＤＮＡフラグメントが、上記エンベロープに対するプライマーを使用して増幅された（図１４レーン２）が、鎖特異的プライマーを用いては、増幅は得られなかった（図１４レーン５）ことを示した。これは、予測した結果と一致した。さらに、ネガティブ鎖ＲＮの増幅が、デング感染細胞由来の全ＲＮＡに対して、ＤＮＳ−１および半ネステッド鎖特異的ＰＣＲプライマー（ＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒ）の組み合わせを使用するＲＴ−ＰＣＲを実施した場合にのみ、得られた（レーン４、３２０ｂｐ）。感染細胞のランダムプライム全ＲＮＡに対して、これらの半ネステッド鎖特異的プライマーを使用するＲＣＴを実施した場合に、増幅は得られなかった（データ示さず）。従って、本発明により教示される方法に従って、この方法は、複製ネガティブ鎖デングＲＮＡの鎖特異的な転写および増幅を提供する。
【０１１７】
考察されるように、図１４は、逆転写デングゲノムＲＮＡの指向性増幅の結果を示し、この増幅は、本発明の教示によって可能になる。増幅の特異性は、１．２５×１０３ＰＦＵのデングウイルスストックから調製したランダムヘキサマープライムｃＤＮＡを使用して、決定される。その後、ウイルスゲノム（レーン２）およびネガティブ鎖ＲＮＡ（レーン５）を、それぞれ、Ｅｎｇプライマー対および鎖特異的ＮＳ２Ａプライマー対（ＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒ）を使用するＰＣＲを実施して、検出した。上記鎖特異的プライマーの完全性を、ＤＮＳ１センスプライマーによりプライムした感染細胞の全細胞ＲＮＡに対して試験した（レーン４）。ウイルスゲノムの検出用のポジティブコントロール（レーン１）および複製ＲＮＡの検出用のポジティブコントロール（レーン３）を、以前に記載されたように調製したデングＥｎｖ  ｃＤＮＡ標準物およびＮＳ２Ａ  ｃＤＮＡ標準物を使用して実施した。
【０１１８】
複製ネガティブ鎖ＲＮＡの減少は、デングに関連したリバビリン処理ＢＨＫ−２１細胞でのプラークベースアッセイと相関した。上記研究は、デングＮＳ２Ａの複製ネガティブＲＮＡ鎖を検出する際の高い特異性および感度を明らかに示した。この方法の利用性をさらに検証するために、リバビリンで処理した感染細胞における複製ウイルスレベルを相関付けるために、直接測定を実行した。リバビリンは、デングを含む多くのＲＮＡウイルスの複製を阻害することが公知である（Ｋｏｆｆら、１９８２；Ｓｉｄｗｅｌｌ，１９７９）。ＢＨＫ２１細胞のデング感染の速度論を、まず測定して、妥当な動的範囲で検出可能なレベルの複製ＲＮＡを生成するために必要な最小感染後時間を確率した。ＢＨＫ−２１細胞に、デングウイルスの１０倍連続希釈物を感染させ、ＲＮＡを、感染後１日目、２日目および３日目に収集した。デングウイルスを感染させなかったＢＨＫ−２１細胞を、ネガティブコントロールとして役立てた。その後、複製ネガティブ鎖ＲＮＡを検出するためのＲＴ−ＰＣＲを、等量の全細胞ＲＮＡに対して実施した。デングネガティブＲＮＡ鎖を、わずかｍ．ｏ．ｉ．  ０．００１２５で、感染後２日目に検出した（図１５Ａレーン６）。３日目に、ネガティブ鎖ＲＮＡは、ウイルスの４ｌｏｇ希釈物を超えて検出可能であった（図１５Ａレーン１１〜１４）。ランダムヘキサマープライムＲＮＡサンプルと、エンベロープに対するプライマーとを用いるデングゲノムの検出により、類似する速度論が示された（データは示さず）。従って、リバビリンを使用するその後のすべての研究は、感染後３日目に実行した。
【０１１９】
複製ウイルスのレベルとリバビリンの効果とを相関付けるために、ＢＨＫ−２１細胞に、まず、種々の濃度のリバビリンの存在下または非存在下で、ｍ．ｏ．ｉ．０．００１２５にてデングウイルスを感染させた。細胞外デングウイルスを含む上清を、感染3日間後に収集し、それを使用して、記載される（１４）ようにＢＨＫ−２１細胞の新鮮な培養物に感染させ、そしてＬＤＨ放出により細胞毒性を測定した。その後、形成したプラークの数（ＰＦＵ）を、プラークアッセイにより決定し、リバビリン処理したサンプルの相対ＰＦＵを、算出した。使用した最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）のリバビリンは、検出可能な細胞死を誘導しなかった。同様に、感染後３日目に、デング感染細胞を用いて、有意な細胞死は観察されなかった（約２％）。リバビリンは、濃度依存性様式でウイルス複製を阻害した（図１５Ｂ）。全ＲＮＡのランダムヘキサマープライム逆転写（ＲＴ）およびエンベロープ領域に対するプライマー（表２）を用いる定量は、ウイルス転写物の対応する減少を示した。複製−デングＲＮＡ鎖の定量は、漸増濃度のリバビリンによる同時減少を示した（図１５Ｂ）。これらの結果は、上記ウイルスの複製形態を定量するためのこの方法の利用性をさらに検証した。
【０１２０】
プラーク力価測定アッセイおよびリアルタイムＰＣＲアッセイを使用する、ウイルスＲＮＡ定量の相関付け。リアルタイム定量ＰＣＲは、診断および定量のための頑丈かつ迅速かつ信頼できる方法であるので、本明細書中で開発されたストラテジーは、従来の「金標準」プラークベースアッセイと比較される。リアルタイムＰＣＲによる活性ウイルスの定量を、プラーク力価測定アッセイを相関付けるために、デングウイルスの連続希釈物を使用して、複製物においてＢＨＫ−２１細胞に感染させた。その後、全細胞ＲＮＡを、これらの複製物のうちの１つから感染３日間後に単離した。他の複製物を、プラーク力価測定アッセイのために使用した。感染３日間後に、有意な細胞死は、ＬＤＨ放出により測定した場合には、観察されなかった（約２％）図１６に示されるデータは、複製デングＲＮＡ鎖の定量から得られる値が、ウイルス力価と高く相関することを示した。
【０１２１】
特異的デングプライマーは、感染マウスの濃度から、複製デングウイルスを検出して増幅することが可能であった。上記インビトロ研究を拡大するために、この方法を使用して、複製ウイルスをインビボで増幅した。新生児マウスに、１×１０３ＰＦＵの複製デングウイルスまたは熱非働体化デングウイルスのいずれかを、腹腔内接種した。重篤な症状が、複製ウイルスを接種したマウスにおいて５日目に明らかであった。対照的に、非働体化デングウイルスを接種したマウスは、コントロールに対いて検出可能な物理的際を全く示さなかった。その後、全ＲＮＡを全脳から調製し、ＤＮＳ−１を用いて逆転写させ、その後、リアルタイム定量ＰＣＲにより定量した（図１７Ａ）。これらの２つの群のマウス由来の同一量のＲＮＡを使用して、ＤＮＳ−１を用いる逆転写（ＲＴ）およびＤＮＳ−ｆプライマーおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒプライマーを用いる増幅は、有意な差異を示した。特異的増幅が、活性（複製）ウイルスを接種したマウスの脳から単離したサンプルを用いた場合に観察されたが、非働体化ウイルスを接種したマウスから単離したサンプルを用いては観察されなかった（図１７Ｂ）。推定３２０ｂｐフラグメントが、ゲル電気泳動により分析した場合に（図１７Ｂ）、活性ウイルスを接種したマウスの脳由来のサンプルにおいてのみ検出され（レーン３〜５）、非働体化ウイルスを接種したマウス由来のサンプルにおいては検出されなかった（レーン１および２）。非働体化ウイルスからの増幅（図１７Ａ）は、プライマー−ダイマー形成から生じた。
【０１２２】
「ホットスタート」は、鎖特異的デングプライマーを使用するリアルタイムＰＣＲの検出限界を拡大した。リアルタイム定量ＰＣＲの検出限界の改善を探索するために、「ホットスタート」ストラテジーを使用した。「ホットスタート」の非存在下での連続希釈デングＤＮＡ鎖の定量は、検出限界約１０−２０モルを示した。この限界よりも下で、プライマー−ダイマー形成が検出された（図１３Ｃ）。Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、その検出は、６ｌｏｇ濃度のテンプレートの範囲にわたって線形であり、検出限界は、ゼプトモル未満の範囲にあり、プライマー−ダイマーの形成はなかった（図１８Ａ）。テンプレート濃度のｌｏｇに対するＣｔのプロットの傾き（４．１８±０．０４；図１８Ｂ）（「ホットスタート」法を使用するデングフラグメントの増幅効率を示す）は、「ホットスタート」なしで得た傾き（４．３０±０．１）と同様であった。この実験を、少なくとも３回反復して、同様の結果を得た。
【０１２３】
本実施例は、活性に複製するデングウイルスの複製ＲＮＡ鎖を網羅的に検出および定量するための、本発明により教示される簡単だが特異的かつ感度の高い方法を例示する。この方法は、複製デングウイルスの検出のために報告された現在存在するストラテジーを超える有意な改善であり、これは、デング感染の定量的診断において、および感染の間の宿主細胞におけるデングウイルス親和性の研究のために、潜在的に有用なツールである。
【０１２４】
この新規な方法の特異性は、２つのレベルで達成された：（１）デング配列と独特の配列とを含むＳＣＲＯプライマー（これは、至適エネルギー特性を有するヘアピンステムループ構造へと折畳まれて、逆転写（ＲＴ）工程におけるミスプライミングを回避する）の設計；ならびに（２）そのＳＣＲＯに対する特異的ネステッドＰＣＲプライマーの使用。このストラテジーを使用して、ネガティブ鎖ＲＮＡを、等価なポジティブＲＮＡ鎖に対して少なくとも５ｌｏｇ濃度の差異で検出した（図１３Ａ）。この増幅は、ＤＮＳ−１  ＲＴプライマーによってのみ逆転写されたネガティブＲＮＡ鎖に対して特異的であり、ランダムヘキサマープライムデングｃＤＮＡを用いて、増幅は観察されなかった（図１３Ｂ）。連続希釈したデングＤＮ２Ａ  ｃＤＮＡ標準物を用いて評価したこの方法の感度は、１００コピー数〜１０００コピー数であることがわかった。これは、リアルタイムＰＣＲによる以前に報告された検出方法と匹敵した（Ｃａｌｌａｈａｎら、２００１；Ｈｏｕｎｇら、２０００；Ｈｏｕｎｇら、２００１；Ｌａｕｅら、１９９９；Ｗａｒｒｉｌｏｗら、２００２）。検出感度は、「ホットスタート」ポリメラーゼを使用することで、ゼプトモル範囲未満（１０コピー数）にまで改善され、ＰＣＲ効率に変化はなかった（図１７Ａ）。
【０１２５】
本明細書中で開発された方法の有用性を、種々の濃度のリバビリンで処理した感染し亜房における複製デングウイルスの量とＰＦＵ数との間の良好の相関を示すことによって、さらに検証した（図１５Ｂ）。定量した複製ＲＮＡの量は、ＰＦＵよりも低かったことに留意されるべきである。リバビリン誘導性転写阻害に起因するＰＦＵの減少を評価する際に、処理した感染細胞からの培地を使用して、リバビリンの非存在下で新鮮なＢＨＫ−２１細胞を感染させた。これは、新たに合成されたウイルスＲＮＡの転写阻害が軽減される条件であった。複製ウイルスＲＮＡの量の良好な相関関係はまた、従来のプラークベースアッセイとも観察された（図１５Ａ）。従って、合わせた結果は、定量診断におけるこの方法の潜在的使用を示す。従来の労働集約的なプラークアッセイを超えるこのストラテジーの明確な利点は、分析時間の有意な減少である（この方法による最大３日間と比較して、デングプラークアッセイのために６〜１４日間かかる）。カ細胞株およびより高いｍ．ｏ．ｉ．の使用は、なおより短い時間での複製中間体の検出を可能にした（Ｌｕｉら、１９９７；Ｖａｕｇｈａｎら、２００２）。しかし、カ細胞株の検出はプラーク形成による定量を可能にはしない。この研究におけるＢＨＫ−２１細胞の使用は、本明細書中に記載される定量方法を、「金標準物」プラークアッセイと同時比較することを可能にした。この方法の使用は、感染マウスの脳における複製デングウイルスのインビボ検出まで拡大された（図１６）。
【０１２６】
ＰＣＲは、非複製生物からＤＮＡを増幅し得、診断上正確な結果をポジティブとして生じる。これは、臨床上は偽陽性であり得る（Ｂｕｒｋａｒｄｔ，２０００）。分子技術を使用してデングウイルスの複製形態を検出する試みは、いくらかの成功を満たした（Ｌｕｉら、１９９７；Ｖａｕｇｈａｎら、２００２）。血清型デングウイルスに対するＬａｎｃｃｉｏｔｔｉらの研究（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉら、１９９２）に基づいて、Ｖａｕｇｈａｎおよび共同研究者らは、従来のＲＴ−ＰＣＲによるデングＲＩ  ＲＮＡの検出を報告した。この方法は、Ｌｉｕらにより記載された方法よりも迅速であると報告された。Ｌｉｕらにより記載された方法は、最終的同定のためにサザンブロッティングを必要とした。これらの研究において記載されるプライマーを使用して、感染細胞からのＤ１プライムデングＲＮＡ、Ｔ２プライムデングＲＮＡ、およびランダムプライムデングＲＮＡからの増幅（非公開知見）が生じた。これは、使用した先行技術のストラテジーにおいて、鎖特異性が欠如したことを示した。対照的に、本発明の教示は、例示的なネガティブ鎖ＲＮＡの増幅を提供する。これは、ＲＴ−ＰＣＲを、ＤＮＳ−１プライマーと鎖特異的ＰＣＲプライマー（ＤＮＳ２−ｆおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒ）との組み合わせを使用して実施した場合にのみ得られた。デング感染細胞のランダムプライム全ＲＮＡからは、増幅は得られなかった。さらに、ＬｉｕらおよびＶａｕｇｈａｎらの両方のアプローチは、複製デングウイルスを検出する際に定量的ではなかった。本発明の教示は、複製ＲＮＡ鎖の定量的かつ排他的検出を提供する。これは、以前に公知であった方法を超える顕著な利点である。
【０１２７】
従って、デング複製鎖ＲＮＡを特異的に検出するためのこの方法の利用可能性により、感染の間の宿主細胞に対するデングウイルス親和性の研究が可能になる。本発明の教示に従って、複製デングウイルスの検出のために本明細書中にて開発された方法は、他のウイルスの研究まで拡張され得る。このアプローチは、感染細胞および感染マウスの両方において、別のフラビウイルスである西ナイルウイルスの複製形態の定量に首尾良く適用された。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の教示はまた、別の例示的ウイルス（すなわち、ＲＳウイルス（ＲＳＶ））のポジティブ複製鎖を検出するために使用された。適切な逆転写（ＲＴ）プライマーおよびＰＣＲプライマーを、上記の基準に基づいて設計して、ＲＳＶの複製ポジティブ鎖を検出した。その後、これらのプライマーの特異性および感度を、デングウイルスと同じ形式で評価した。
【０１２９】
ウイルスポジティブ鎖ＲＮＡに標的化したＲＳＶ特異的プライマーは、ＲＳＶ特異的ＭＰ２領域を検出および増幅可能であった。ＲＳＶのポジティブＲＮＡ鎖は、活性ウイルス複製が生じる場合にのみ、細胞中に存在する。従って、この部分の定量は、複製の進行を評価するために使用し得る。本明細書中で教示した熱力学的パラメーターおよび配列選択パラメーターに従って、ミスアニーリングを防ぎかつＲＳＶ  ＭＰ２領域のポジティブ鎖に対する標的化プライミングを促進するように設計したプライマーであるＲＳＶＲＴ１を、複製鎖を特異的に逆転写するがＲＳＶウイルスのゲノムは特異的には逆転写しないために使用した（図１９；配列番号２９）。
【０１３０】
図１９は、本発明の教示に従って設計した別の例示的ＳＣＲＯを示す。ＲＳＶＲＴ１オリゴヌクレオチドの一次配列および推定二次構造が、示される。Ｄ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＭ．Ｚｕｃｋｅｒにより設計されたフォールディングアルゴリズムを使用して、熱力学的パラメーターを作成した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍａｔｈ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／〜ｚｕｋｅｒｍ／）。ポジティブ複製鎖に対して相補的な一次配列は、５’−ＣＡＣＧＧＴＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２４）。
【０１３１】
本発明の教示に従って設計した独特のＲＳＶプライマーは、高い特異性および感度で、ＲＳＶウイルスのポジティブ鎖ＲＮＡを排他的に検出して増幅した。この方法がＲＳＶポジティブ鎖ＲＮＡを検出する感度を、２つの異なるアプローチを使用して評価した。最後に、連続希釈した逆転写鎖特異的ｃＤＮＡの増幅を、実行した。ポジティブ鎖ＲＮＡおよびネガティブ鎖ＲＮＡの増幅を、マトリックス２（ＭＰ２）ＤＮＡ配列をコードするｐＧｅｍＴ−ＲＳＶＭＰ２を使用するインビトロ転写によって、合成した。連続希釈した等量の各ＲＮＡを、逆転写し、プライマーＲＳＶＳおよびＲＳＶｎＡＳ（表３）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実行した。ポジティブ鎖ＲＳＶ  ＲＮＡサンプルを、試験した濃度範囲にわたって効率的に検出した（図２０Ａ）。しかし、コントロールに対するＣｔ値の類似性により示されるように、ゲノム鎖ＲＮＡサンプルのいずれを用いても、特異的増幅は観察されなかった。これらの置換を検証するために、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動は、連続希釈したポジティブ鎖ＲＮＡを用いた予期されたＤＮＡフラグメント３２０ｂｐ（レーン１〜５）を示したが、連続希釈したネガティブ鎖サンプルの対応サンプルを用いた場合は、示さなかった（レーン６〜１０）（図２０Ｂ）。
【０１３２】
図２０Ａは、ＳＣＲＯを用いるＲＴおよびリアルタイムＰＣＲによる、ＲＳＶポジティブ鎖ＲＮＡの検出の特異性および感度を模式的に示す。ネガティブ鎖ＭＰ２  ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＭＰ２  ＲＮＡを、連続希釈し、ＲＳＶＲＴ１オリゴヌクレオチドを使用して逆転写し、そしてリアルタイム定量ＰＣＲによりその後検出した。下にあるバーは、異なる希釈でのネガティブ鎖ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＲＮＡを用いて作成した曲線の相対位置を示す。ポジティブ鎖ＲＮＡは、有効に増幅されたが、ネガティブ鎖ＲＮＡは、そうではなかった。この実験からの生成物を、以前に記載されたようにゲル電気泳動により検証した。Ｓ；標準物。；
ポジティブ鎖ＲＮＡおよびネガティブ鎖ＲＮＡの完全性の差異の可能性を排除するために、両方を、ランダムヘキサマーを用いて逆転写し、ＲＳＶ  ＭＰ２特異的プライマーであるＲＳＶＳおよびＲＳＶＭＰ２ＡＳ（表３）を使用するリアルタイム定量ＰＣＲにより定量した。使用したプライマーの配列が、表２に示される。ポジティブＭＰ２  ＲＮＡ鎖サンプルおよびネガティブＭＰ２  ＲＮＡ鎖サンプルの両方が、匹敵するＣｔ値を示し（図２０）、予測ＰＣＲ産物サイズ５５９ｂｐを生じた（図２０Ｃ）。
【０１３３】
（表３．ＰＳＶ  ＰＣＲアッセイにおいて使用したプライマーの配列）
【０１３４】
【表３】
2006506978.tif 000008
センスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、それぞれ、接尾語「Ａ」および「ＡＳ」とともに示した。ＲＳＶ配列に、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０１３２５４に従って割当てた。アクチンプライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＪ３１２０９２にておいて報告された配列に従って設計した。この研究において使用したプライマーの配列（表３）は、本発明の教示に従うストラテジーの例を提供し、これは、ゲノム鎖を少なくとも５ｌｏｇ上回るＲＳＶ複製ポジティブ鎖ＲＮＡの検出を提供する。
【０１３５】
プラーク力価測定アッセイおよびリアルタイムＰＣＲアッセイを使用するウイルスＲＮＡ定量の相関付け。リアルタイム定量ＰＣＲは、診断および定量のための頑丈かつ迅速かつ信頼できる方法であるので、本明細書中で開発されたストラテジーは、従来の「金標準」プラークベースアッセイと比較される。リアルタイムＰＣＲによる活性ウイルスの定量を、プラーク力価測定アッセイを相関付けるために、デングウイルスの連続希釈物を使用して、複製物においてＶｅｒｏ細胞に感染させた。その後、全細胞ＲＮＡを、これらの複製物のうちの１つから感染６日間後に単離した。他の複製物を、プラーク力価測定アッセイのために使用した。感染６日間後に、有意な細胞死は、ＬＤＨ放出により測定した場合には、観察されなかった（約２％）。図２１に示されるデータは、複製ＲＳＶ  ＲＮＡ鎖の定量から得られる値が、ウイルス力価と高く相関することを示した。これらの結果は、平均±ＳＤとして表される。この実験を、少なくとも３回反復した。
【０１３６】
本発明の教示は、複製状態を示すＲＮＡ部分を区別して検出することによって、任意のＲＮＡウイルスの複製状態の定量まで、および他の核酸鎖まで、拡張され得る。このアプローチは、ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスおよびネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの両方の複製形態の定量に首尾良く適用されている。
【０１３７】
このストラテジーにおいて増幅された複製ＲＮＡを検出するために使用される例示的検出方法は、リアルタイムＰＣＲ（熱サイクリング）を使用するが、等温増幅方法（例えば、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークルなど）が、本明細書中に記載される技術に従って使用され得、そして当業者によってそれに従って各形式のために改変され得る。
【０１３８】
さらに、複数の複製ウイルスが、多重化により同時に検出され得る。各標的のためのＳＣＲＯが、設計され得、そして特異的多重ＦＲＥＴ蛍光プローブが、増幅産物の遺伝子特異的配列を検出するために使用され得る。
【０１３９】
複製ＲＮＡを検出するために本明細書中に記載されるＳＣＲＯの使用は、均質な液相において例示的には実施される。ＳＣＲＯはまた、固相上に固定され得、特異性のために必要な特徴すべてをインタクトに維持し、そして複製ＲＮＡまたは目的の他の適切な核酸鎖の検出および転写のために逆転写（ＲＴ）において使用され得る。
【０１４０】
種々の研究に対する参考文献が、本明細書中で引用されており、すべては、各々の研究が個別に参考として援用されたかのように、その全体が参考として援用される。
【０１４１】
本発明は、本発明を実施する好ましい形態に関して記載されてきたが、当業者は、多くの改変が、本発明の趣旨から逸脱することなく好ましい形態に対してなされ得ることを、理解する。従って、本発明の範囲は、上記の説明によってはいかなる様にも限定されないことが、意図される。
【０１４２】
【数１】
2006506978.tif 000009
【０１４３】
【数２】
2006506978.tif 000010
【０１４４】
【数３】
2006506978.tif 000011
【０１４５】
【数４】
2006506978.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、複製可能鎖を検出するための例示的先行技術方法の略図である。
【図２】図２は、本発明の教示に従う標的核酸鎖を検出および増幅するための方法の略図である。
【図３】図３は、ＲＴ  ＰＣＲのための独特のタグおよびウイルス配列ならびにこれらの組み合わせを得るための１つのストラテジーの例示的図である。
【図４】図４は、本発明の教示に従う例示的ステムループの形成を図示する。
【図５】図５は、遺伝子／鎖特異的部分を有し、例示的物理特性を有するステム−ループタグの形成の略図である。
【図６】図６は、例示的ステムループＲＴオリゴを、ＲＴ段階において予測される二次構造を有さないオリゴと比較した実験の結果を図示する電気泳動ゲルである。
【図７】図７は、本発明の教示に従う例示的転換可能オリゴヌクレオチドの予測される二次構造を示す。
【図８】図８は、３’突出配列を有する半ネステッドＰＣＲプライマーを示す略図である。
【図９】図９は、本発明の教示に従うＰＣＲプライマーを設計するための例示的判断基準を示す。
【図１０】図１０は、例示的ＳＣＲＯオリゴヌクレオチドの一次配列および予測される二次構造を示す。
【図１１】図１１は、ステムループ構造を形成する別の例示的オリゴヌクレオチドを図示する。
【図１２】図１２は、複製可能デング２ウイルスまたは不活性デングウイルスに感染したＣ６／３６細胞の分析のＲＴ−ＰＣＲ結果を図示する。
【図１３−１】図１３Ａは、例示的デングネガティブ鎖ＲＮＡの検出の例示的な特異性および感度を図示し、これは、種々の希釈でのネガティブ鎖ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＲＮＡによって産生される曲線の関連の位置を示すバーに基づく。図１３Ｂは、電気泳動ゲルに泳動させた図１３Ａの実験からの生成物を示し、非標的（ポジティブ）鎖由来の予測される生成物が存在しないことを示す。
【図１３−２】図１３Ｃは、インビトロ転写したネガティブ鎖ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＲＮＡの完全性の、実時間定量的ＰＣＲによる評価を図示する。図１３Ｄは、インビトロ転写したネガティブ鎖ＲＮＡおよびポジティブ鎖ＲＮＡを含む電気泳動ゲルを示す。
【図１４】図１４は、逆転写デングゲノムＲＮＡの例示的増幅を含む、電気泳動ゲルである。
【図１５】図１５Ａは、ＲＴ−ＰＣＲによるデング複製可能ＲＮＡ鎖合成の動態学を図示する、電気泳動ゲルである。図１５Ｂは、デングウイルス複製のリバビリン阻害を図示するグラフである。
【図１６】図１６は、デングウイルスに感染したＢＨＫ−２１細胞の全ＲＮＡを用いた実時間定量的ＰＣＲによる複製可能デングＲＮＡの定量とプラーク滴定との間の相関関係を示す。
【図１７】図１７Ａは、複製可能ウイルスまたは不活性化ウイルスを接種したマウス脳からの複製可能鎖ＲＮＡの定量的実時間ＰＣＲの例示的結果を図示する。図１７Ｂは、不活性化ウイルスを接種したマウス脳に由来する複製可能増幅生成物（レーン３〜５）および複製不能増幅生成物（レーン１〜３）で感染させたマウスからの増幅生成物を示す電気泳動ゲルである。
【図１８】図１８Ａは、ＤＮＳ２−ｆプライマーおよびＮＳ２Ａ−マイナス−ｒプライマー（０．１ｆｍｏｌｅｓ／２５μｌ（検出可能）の１０倍の一連希釈）を使用するデング標準によって得られた「ホット−スタート」増幅プロットである。図１８Ｂは、既知の量の標準の対数に対してプロットされたＣｔ値を示す。
【図１９】図１９は、本発明の教示に従って設計された別の例示的ＳＣＲＯの一次配列および予測される二次構造を示す。
【図２０−１】図２０Ａは、ＲＳＶウイルスの例示的ポジティブ鎖ＲＮＡの検出の例示的な特異性および感度を、本発明に従うプライマーおよび増幅方法を使用して図示する。図２０Ｂは、図２０Ａに示す結果を評価する電気泳動ゲルを示す。
【図２０−２】図２０Ｃは、ＲＳＶのポジティブ鎖ＲＮＡおよびネガティブ鎖ＲＮＡについてのＣｔ値を示し、これらのＲＮＡは両方ともランダムヘキサマーによってプライムされる。図２０Ｄは、ランダムプライムされたＲＳＶ  ＲＮＡのポジティブ鎖およびネガティブ鎖の予測される正確なサイズを示す。
【図２１】図２１は、ＲＳＶ感染Ｖｅｒｏ細胞の全ＲＮＡ由来の複製可能ＲＳＶ  ＲＮＡの定量とプラーク滴定との間の相関関係を示す。
【図２２】図２２は、本発明の教示に従う種々のプライマーのオーダーおよび使用の例示的略図を示す。
【配列表】
2006506978.tif 000013
2006506978.tif 000014
2006506978.tif 000015
2006506978.tif 000016
2006506978.tif 000017
2006506978.tif 000018
2006506978.tif 000019
2006506978.tif 000020
2006506978.tif 000021
2006506978.tif 000022
【図１】
2006506978.tif 000023
【図２】
2006506978.tif 000024
【図３】
2006506978.tif 000025
【図４】
2006506978.tif 000026
【図５】
2006506978.tif 000027
【図６】
2006506978.tif 000028
【図７】
2006506978.tif 000029
【図８】
2006506978.tif 000030
【図９】
2006506978.tif 000031
【図１０】
2006506978.tif 000032
【図１１】
2006506978.tif 000033
【図１２】
2006506978.tif 000034
【図１３−１】
2006506978.tif 000035
【図１３−２】
2006506978.tif 000036
【図１４】
2006506978.tif 000037
【図１５】
2006506978.tif 000038
【図１６】
2006506978.tif 000039
【図１７】
2006506978.tif 000040
【図１８】
2006506978.tif 000041
【図１９】
2006506978.tif 000042
【図２０−１】
2006506978.tif 000043
【図２０−２】
2006506978.tif 000044
【図２１】
2006506978.tif 000045
【図２２】
2006506978.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006506978000001.app
【国際調査報告】
2006506978.tif 000047
2006506978.tif 000048
2006506978.tif 000049
2006506978.tif 000050
2006506978.tif 000051
2006506978.tif 000052
2006506978.tif 000053