(57)【要約】【解決手段】  C.tropicalisの遺伝子改変株であって、ＰＯＸ４及び／又はＰＯＸ５座で野生型活性に変異しないものが開示されている。その株はβ−酸化が遮断され、ＰＯＸ４及び／又はＰＯＸ５遺伝子の一部分を欠失する構成体との相同性組換によって形質変換される。改変株は株の宿主細胞内で生産されるジカルボン酸の産出を増加させるために使用されてもよい。また、C.tropicalis宿主細胞内のβ−酸化経路を遮断する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
破壊染色体ＰＯＸ４遺伝子を有するカンジダ・トロピカリス細胞であって、
前記ＰＯＸ４遺伝子の一部が、選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片との相同な組換えによって欠失され、前記選択マーカー遺伝子が、前記ＰＯＸ４遺伝子の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列の両端に隣接しており、
前記ＰＯＸ４遺伝子の欠失部分の存在により機能ＰＯＸ４遺伝子の組換えを妨げるカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項３】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項４】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項５】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項６】
株Ｈ５３を含む請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項７】
実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸を生産する方法であって、
窒素源、有機基質及び補基質を含む培養培地において請求項１に記載のカンジダ・トロピカリス細胞を培養することを含む方法。
【請求項８】
破壊染色体ＰＯＸ４遺伝子を有するカンジダ・トロピカリス細胞であって、
前記ＰＯＸ５遺伝子の一部が、選択マーカー遺伝子を含有するＤＮＡ断片との相同な組換によって欠失され、前記選択マーカー遺伝子が、前記ＰＯＸ５遺伝子の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列の両端に隣接し、前記ＰＯＸ５遺伝子の欠失部分の存在により機能ＰＯＸ５遺伝子への組換えを妨げるカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項９】
染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１０】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１１】
株Ｈ５３を含む請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１２】
実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸を生産する方法であって、
窒素源、有機基質及び補基質を含む培養培地において請求項８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞を培養することを含む方法。
【請求項１３】
破壊染色体ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子を有するカンジダ・トロピカリスであって、
前記ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の一部が、選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片との相同な組換えによって欠失され、前記選択マーカー遺伝子が前記ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列の両端に隣接しており、
ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の欠失部分の存在により機能ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子への組換えを妨げるカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１４】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１５】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１６】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１７】
染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１８】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項１９】
株Ｈ５３を含む請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２０】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項１７に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２１】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項１７に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２２】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方である請求項１７に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２３】
実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸を生産する方法であって、
窒素源、有機基質及び補基質を含む培養培地において請求項１３に記載のカンジダ・トロピカリス細胞を培養することを含む方法。
【請求項２４】
選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片を有するＰＯＸ４遺伝子の一部を相同な組換えによって破壊することを含むカンジダ・トロピカリス宿主細胞のβ−酸化経路を完全に遮断する方法であって、
前記選択マーカー遺伝子が、前記ＰＯＸ４遺伝子の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列の両端に隣接しており、
前記ＰＯＸ４遺伝子の欠失部分の存在が機能ＰＯＸ４遺伝子の組換えを妨げる方法。
【請求項２５】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項２４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２６】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項２４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項２７】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
カンジダ・トロピカリス宿主細胞が株Ｈ５３を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片を有するＰＯＸ５遺伝子の一部を相同な組換えによって破壊することを含むカンジダ・トロピカリス宿主細胞のβ−酸化経路を完全に遮断する方法であって、
前記選択マーカー遺伝子が前記ＰＯＸ５遺伝子の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列の両端に隣接しており、
ＰＯＸ５遺伝子の欠失部分の存在が機能ＰＯＸ５遺伝子の組換えを妨げる方法。
【請求項３１】
宿主細胞が染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
カンジダ・トロピカリス宿主細胞が株Ｈ５３を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
選択マーカー遺伝子からなるＤＮＡ断片を有するＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の一部を相同な組換えによって破壊することを含むカンジダ・トロピカリス宿主細胞のβ−酸化経路を完全に遮断する方法であって、
前記選択マーカー遺伝子が前記ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の連続しない部分に相同性を有するＤＮＡ配列の両端に隣接しており、
ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の双方の欠失部分の存在が機能ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の組換えを妨げる方法。
【請求項３５】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項３４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項３６】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項３４に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項３７】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
宿主細胞が染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ＤＮＡ断片がＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
カンジダ・トロピカリス宿主細胞が株Ｈ５３を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａである請求項３８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項４２】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ｂである請求項３８に記載のカンジダ・トロピカリス細胞。
【請求項４３】
ＰＯＸ４遺伝子がＰＯＸ４Ａ及びＰＯＸ４Ｂの双方を含む請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、先に出願され、同時に係属している２００２年５月２３日に出願された対応米国仮出願番号第６０／３８３，３３２号の３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｅ)に基づく利益を主張するものであって、その内容を参照としてここに組み込む。
連邦政府の後援を受ける研究開発であることの陳述
本発明は、少なくとも部分的に、商務省標準技術研究所先端技術計画協定番号70NANB8H4033の認可の下で助成された。従って、政府は本発明において一定の権利を有することができる。
本発明の背景
脂肪族二酸は、香料、ポリマー、接着剤、マクロライド系抗生物質の製造原料として有用な可変性の化学的中間体である。長鎖α，ω−ジカルボン酸の合成にはいくつかの化学的な手段が利用可能であるが、その一方で、合成は容易でなく、殆どの方法ではより短鎖のものを含む混合物になる。その結果、高度な精製工程が必要になる。長鎖二酸は、アルカン、脂肪酸又はそれらエステルの微生物の形質変換によっても産生され得ることが知られているが、現行の生物学的取組みでの限界のため、化学合成が最も商業的に実現可能な経路にとどまっている。
【０００２】
いくつかの酵母株は、炭素源としてアルカン又は脂肪酸で培養された際、副産物としてα，ω−ジカルボン酸を排出することが知られている。特に、C.albicans, C.cloacae, C.guillermondii, C.intermedia, C.lipolytica, C.maltosa, C.parapsilosis及びC.zeylenoidesのようなカンジダ族に属する酵母はそのようなジカルボン酸を産生することが知られている（Agr. Biol. Chem. 35:2033-2042 (1971)）。また、種々のC.tropicalis株がＣ11からＣ18の鎖長範囲でジカルボン酸を産生することも知られており（Okinoら、"Production of Macrocyclic Musk Compounds via Alkanedioic Acids Produced From N-Alkanes"、Lawrenceら(編)、Flavors and Fragrances: A World Perspective.  Proceeding of the 10th International Conference of Essential Oils, Flavors and Fragrances, Elsevier Science Publishers BV Amsterdam,pp.753-760(1988)）、それはBuhler及びSchindler、Aliphatic Hydrocarbons in Biotechnology、H. J. Rehm及びG. Reed (編)、Vol. 169, Verlag Chemie, Weinheim (1984）で再検討されたように、いくつかの特許の基礎となっている。
【０００３】
アルカン及び脂肪酸を代謝する酵母による生化学的プロセスの研究によって、３種の酸化反応が明らかになった：アルカンのアルコールへのα−酸化、脂肪酸のα，ω−ジカルボン酸へのω−酸化、脂肪酸の二酸化炭素及び水への分解β−酸化。先の２種の酸化はミクロソーム酵素により触媒され、一方、後の１種はペルオキシソームによって行われる。C.tropicalisでは、ω−酸化経路での第１ステップは、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及びＮＡＤＰＨシトクロムリダクターゼを包む膜結合酵素複合体（ω−ヒドロキシラーゼ複合体）により触媒される。このヒドロキシラーゼ複合体は、例えば、参考としてここに組み込むGilewiczら、Can. J. Microbiol. 25:201(1979)で詳述されているように、アルカン及び脂肪酸における末端メチル基の一次酸化を担っている。その複合体のシトクロムＰ４５０及びＮＡＤＰＨリダクターゼ成分をコードする遺伝子は、それぞれＰ４５０ＡＬＫ及びＰ４５０ＲＥＤとして同定されている。また、例えば、参考としてここに組み込むSanglardら、Gene 76:121-136(1989)で詳述されるように、クローン化及び配列決定されている。Ｐ４５０ＡＬＫは、Ｐ４５０ＡＬＫ１とも称されている。つい最近では、ＡＬＫ遺伝子は記号ＣＹＰで表され、ＲＥＤ遺伝子は記号ＣＰＲで表されている。例えば、参照としてここに組み込むNelsonのPharmacogenetics 6(1):1-42 (1996)を参照。また、それぞれ、参照としてここに組み込むOhkumaら、DNA and Cell Biology 14:163-173 (1995)、Seghezziら、DNA and Cell Biology 、11:767-780 (1992)及びKargelら、Yeast 12:333-348 (1996)を参照。さらに、ＣＰＲ遺伝子は、現在ＮＣＰ遺伝子とも称される（例えば、De Backerら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45:1660(2001)を参照）。また、例えば、Ｐ４５０ＡＬＫはNelsonの用語集、supraによりＣＹＰ５２とも表されている。
【０００４】
脂肪酸は、２つの付加的な酸化工程の後、アルコールオキシダーゼ（例えば、参照としてここに組み込むKempらのAppl.Microbiol. and Biotechnol. 28:370-374(1988)等に詳述されているように）及びアルデヒド脱水素酵素により触媒され、アルカンから最終的に形成される。脂肪酸は、同一又は類似の経路によって、対応するジカルボン酸にさらに酸化され得る。脂肪酸のω−酸化は、ω−ヒドロキシ脂肪酸及びそのアルデヒド誘導体を経て、ＣｏＡ活性化を必要とすることなく、対応するジカルボン酸を生じさせる。しかし、ペルオキシソームにおけるβ−酸化経路によって、対応するアシル−ＣｏＡエステルに対する活性化の後、脂肪酸及びジカルボン酸の双方が分解されることになり、鎖短を招く。哺乳動物系において、ω−酸化での脂肪酸及びジカルボン酸双方の生成物は、等しい割合で、それらのＣｏＡエステルを活性化し、ミトコンドリア及びペルオキシソームのβ−酸化双方に対する基質となる（J.Biochem.，102:225-234(1987)）。酵母では、ペルオキシソームにおいてβ−酸化が単独で行われる（Agr.Biol.Chem. 49:1821-1828 (1985)）。
【０００５】
C.tropicalisを含むほとんどの酵母による発酵によって産生されたジカルボン酸は、おおむね、１以上の炭素原子対程度、本来の基質よりも短くなり、混合物が通常である（Oginoら、"Studies of Utilization of Hydrocarbons by Yeasts Part II. Diterminal Oxidation of Alkanes by Yeast", Agr. Biol. Chem., Vol.29, No.11, pp.1009-1015 (1965)、Shiioら、"Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkanes, Part I.  Screening and Properties of Microorganism Producing Dicarboxylic Acids", Agr. Biol. Chem., Vol. 35, No. 13, pp. 2033-2012(1971); Rehmら、"Mechanisms and Occurrence of Microbial Oxidation of Long-chain Alkanes", Institute for Microbiologie, pp. 176-217 (1980); Hillら、"Studies on the Formation of Long-chain Dicarboxylic Acids from Pure n-alkanes by a Mutant of Candida tropicalis", Appl. Microbiol. Biotechnol., 24:168-174 (1986)）。これは、基質及び生成物のペルオキシソームのβ−酸化経路による分解のためである。この一連の酵素反応は、反復して２炭素アセチル−ＣｏＡ分子を切断することによって活性化アシル−ＣｏＡの連続的な短縮化に導く。その経路における最初のステップは、アシル−ＣｏＡからそのエノイル−ＣｏＡ誘導体への酸化を伴い、アシル−ＣｏＡオキシダーゼにより触媒される。エノイル−ＣｏＡは、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼによるα及びβ炭素間の切断に不可欠なものとして、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの反応によって、さらにβ−ケト酸に代謝される。これらの後半の反応を部分的に遮断する変異体は、不飽和あるいは３−ヒドロキシ−モノカルボン酸又は３−ヒドロキシ−ジカルボン酸を形成するに至る（Meussdoeffer, 1998）。これらの好ましくない副産物が、しばしばジカルボン酸の生物学的産生に付随する。
【０００６】
二酸の形成は、適当な変異体を用いることにより、実質的に増加させることができることが知られている（Shiioら、supra；Furukawaら、"Selection of High Brassylic Acid Producing Strains of Torulopsis candida by Single-Cell Cloning and by Mutation", J. Ferment. Technol., Vol. 64, No.2, pp. 97-101 (1986）；Hillら、supra； Okinoら、supra)。野生型酵母は、たとえあるとしても、ジカルボン酸をほとんど産生しないが、その一方、アルカン、脂肪酸又はジカルボン酸の基質での成長能において部分的に欠陥を有する変異体は、しばしばジカルボン酸の収率を高める効果を示す。しかし、これらの変異体は、成長のための炭素源として、これらの化合物を利用する能力が減少していること以外に特徴づけることはできなかった。おそらく、ジカルボン酸を産生するそれらの能力は、β−酸化経路の部分的な遮断によって高められている。また、β−酸化を遮断することが知られている化合物（つまり、アクリレート）は、ジカルボン酸の収率の増加をもたらすことも知られている（Jianlongら、"The Regulation of Alanine on the Fermentation of Long-Chain Dicarboxylic Acids in Candida tropicalis NpcoN22"、p.4 (1988)）。
【０００７】
Ｈ５３４３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２０９６２）のようなβ−酸化が遮断されたC.tropicalis株が米国特許第５，２５４，４６６号に開示されており、その全内容を参照としてここに組み込む。これらのC.tropicalis株は、染色体ＰＯＸ４Ａ、ＰＯＸ４Ｂ及び双方のＰＯＸ５遺伝子が破壊されている。ＰＯＸ遺伝子の破壊は、ＵＲＡ３栄養性マーカーが、アシルCoAオキシダーゼ、ＰＯＸ４又はＰＯＸ５をコードする遺伝子を有する構成体に挿入され、標的有機体に形質転換された、挿入破壊により行われる。相同な組換えにより、ＰＯＸ４及びＰＯＸ５が破壊された有機体を産出した。
【０００８】
ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子は、長鎖アシルCoAオキシダーゼの特異なサブユニットをコードし、それらはＰＸＰ−４及びＰＸＰ−５とそれぞれ称されるペルオキシソームポリペプチド（ＰＸＰ）である。これらのＰＸＰをコードするＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の破壊は、その第１の反応（アシルＣｏＡオキシダーゼにより触媒される）で、β−酸化経路を効果的に遮断し、β−酸化経路によるジカルボン酸生成物の分解及び／又は再利用を妨げる一方、それによって、ω−酸化経路へ基質を転嫁する。従って、不飽和化、水酸化又は炭素鎖短縮化等のβ−酸化経路の通過に伴う望ましくない鎖の改変をもたらす生合成経路はもはや機能しないので、４つ全てのＰＯＸ遺伝子を破壊したC.tropicalis株は、実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸の産生を増量させて合成する。
【０００９】
また、C.tropicalis株は、増幅された１以上のシトクロムＰ４５０(Ｐ４５０ＡＬＫ)遺伝子及び／又はリダクターゼ(Ｐ４５０ＲＥＤ)遺伝子を有してもよく、その結果、Ｐ４５０遺伝子の増幅による律速ω−水酸化酵素の増量をもたらし、ω−酸化経路を通る基質流の割合を増加させる。ＣＰＲ（リダクターゼ）遺伝子の特別な例は、例えば、それぞれの内容を参考としてここに組み込む米国特許第６，３３１，４２０号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０７９７号で詳述されるように、C.tropicalis 20336のＣＰＲＡ及びＣＰＲＢ遺伝子を含む。他に公知のC.tropicalis株は、４つ全てのＰＯＸ遺伝子がＵＲＡ３選択マーカーにより破壊された増幅Ｈ５３４３株であるＡＲ４０を含み、それは、また、３つの付加的なシトクロムＰ４５０遺伝子の複製及び２つの付加的なリダクターゼ遺伝子であるＰ４５０ＲＥＤ遺伝子の複製を含んでいる。株Ｒ２４は、ＵＲＡ３選択マーカーにより４つ全てのＰＯＸ遺伝子が破壊され、またリダクターゼ遺伝子の複数の複製を含む、増幅Ｈ５３４３株である。株ＡＲ４０及びＲ２４は、米国特許第５，６２０，８７８号及び第５，６４８，２４７号に記載されており、その内容はそれぞれ参考としてここに組み込む。
【００１０】
これらの株は、ジカルボン酸生産プロセスでの使用のために創り出され、何年もの間採用されている、新たな改変株の基礎となっている。しかし、β−酸化遮断酵母株を用いる脂肪酸及び／又はアルカン基質の発酵においては、そのような株はＰＯＸ４座で復帰変異を示す。野生型ＰＯＸ４遺伝子への復帰変異によって、β−酸化経路はもはや遮断されず、ジカルボン酸の産生の減少をもたらす。従って、野生型活性に復帰変異していない、安定したＰＯＸ４破壊を含む改良酵母株の存在が必要である。
【発明の開示】
【００１１】
本発明の要約
β−酸化経路が遮断され、染色体標的遺伝子の一部が欠失した新規の酵母株を開示する。染色体標的遺伝子の一部の欠失は、その株が野生型活性に復帰変異しない十分なサイズの欠失である。
好ましい実施態様では、酵母株がC.tropicalisであって、染色体標的遺伝子がＰＯＸ４遺伝子又はＰＯＸ５遺伝子である。ＰＯＸ４又はＰＯＸ５遺伝子の一部分の欠失は、非復帰変異可能なβ−酸化が遮断されたC.tropicalis株をもたらす。より好ましい実施態様では、β−酸化経路の他の遺伝子の破壊ならびにシトクロムＰ４５０遺伝子及び／又はリダクターゼ遺伝子の増幅である。このように、得られた株は、遮断されたβ−酸化経路及び律速ω−ヒドロキシラーゼの増量の双方を伴い、それは、ω−酸化経路を通る基質流の割合を増加させ、実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸の産生をもたらす。
【００１２】
ＰＯＸ４遺伝子は、ＰＯＸ４Ａ、ＰＯＸ４Ｂ又はＰＯＸ４ＡとＰＯＸ４Ｂとの双方であってもよい。ＰＯＸ５遺伝子は、いくつかの実施態様では、染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製とすることができる。いくつかの実施態様では、ＰＯＸ４Ａ、ＰＯＸ４Ｂ、ＰＯＸ５、染色体ＰＯＸ５遺伝子の双方の複製又はそれらのいかなる組み合わせであってもよい。
【００１３】
好ましくは、染色体標的遺伝子、つまり、ＰＯＸ４又はＰＯＸ５の一部分の欠失が、前記ＰＯＸ４又はＰＯＸ５に相同性を有するＤＮＡ配列で両端に隣接された選択マーカー遺伝子を含むＤＮＡ断片を有する前記ＰＯＸ４又はＰＯＸ５遺伝子の相同な組換えにより生じるが、前記ＤＮＡ配列は連続していない。得られるベクターはここでＰＯＸ４欠失破壊カセット又はＰＯＸ５欠失破壊カセットと言及する。選択マーカーは、ＤＮＡ断片が形質転換した細胞に特定のフェノタイプを与えるものである。より好ましくは、選択マーカーが形質転換した細胞に、例えば、特定のピリミジンに対して、原栄養のフェノタイプを与え、それによって、形質転換細胞は、その後、ピリミジン欠乏培地でのそれらの成長能により選択可能となる。最も好ましい態様では、選択マーカー遺伝子はＵＲＡ３である。
【００１４】
本発明によれば、ＰＸＯ４欠失破壊カセットで形質転換された酵母の宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ４遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ４遺伝子を有する。同様に、ＰＯＸ５欠失破壊カセットで形質転換された酵母の宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ５遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ５遺伝子を有する。いずれの場合でも、得られる酵母株はそのβ−酸化経路が遮断され、野生型活性に復帰変異しないであろう。
【００１５】
特に好ましい態様では、C.tropicalis Ｈ５３は、ＰＯＸ４からの２つの連続しないフランキング配列が隣接した６４７ｂｐプロモーター、８０３ｂｐ ＯＲＦ及び２２６ｂｐ ＵＴＲを含む１６７６ｂｐ ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を含むＰＯＸ４欠失破壊カセットで形質転換されている。C. tropicalisゲノムに組み込まれた場合、ＰＯＸ４欠失破壊カセットはＰＯＸ４ＯＲＦの６５３ｂｐを欠失し、１６７６ｂｐ ＵＲＡ３選択マーカーを挿入する。Ｈ５３（ＰＯＸ５／ＰＯＸ５）における欠失ＰＯＸ４対立遺伝子を含む、その得られた形質転換C. tropicalis株はＨＤＣ１００と呼ばれる。
【００１６】
本発明の別の側面によれば、β−酸化経路の１以上の遺伝子の一部分を欠失させることによって、それらのβ酸化経路を有する形質転換酵母株を生産する方法を提供する。好ましくは、これらの株が、酵母ゲノムとの相同な組換えの後、宿主細胞における標的遺伝子の部分的な欠失をもたらすベクターで酵母宿主細胞を形質転換することによって生産される。より好ましくは、標的遺伝子がＰＯＸ４又はＰＯＸ５であり、ベクターが、それぞれ、ＰＯＸ４欠失破壊カセット又はＰＯＸ５欠失破壊カセットとして示される。ＰＯＸ４欠失破壊カセットは、ＰＯＸ４遺伝子の一部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片と、選択マーカー遺伝子と、ＰＯＸ４遺伝子の異なる部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片とを含む。ＰＯＸ５欠失破壊カセットは、ＰＯＸ５遺伝子の一部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片と、選択マーカー遺伝子と、ＰＯＸ５遺伝子の異なる部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片とを含む。ＰＯＸ４欠失破壊カセットで形質転換された酵母宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ４遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ４遺伝子と、選択マーカー遺伝子とを有する。同様に、上述したＰＯＸ５欠失破壊カセットで形質転換された酵母宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ５遺伝子と、選択マーカー遺伝子とを有する。
【００１７】
本発明のさらに別の側面によれば、β−酸化経路が遮断され、染色体標的遺伝子の一部が欠失された形質転換酵母株で培養培地を発酵させることにより、収量を増加させ、実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸の特異的生産性を増加させる方法を提供する。好ましい実施態様では、変質転換酵母株は、そのＰＯＸ４遺伝子の一部分が欠失されたC.tropicalis宿主を含む。いくつかの実施態様では、C.tropicalis 株は、そのＰＯＸ４遺伝子の一部分の欠失を含む破壊されたＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の全てを有してもよく、また、１以上の増幅されたシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０ＡＬＫ）遺伝子及び／又はリダクターゼ（Ｐ４５０ＲＥＤ）遺伝子を有してもよい。好ましくは、培養培地が窒素源、有機基質及び補基質を含む。より好ましい実施態様では、培養培地の窒素源が通常微生物を培養する過程で使用される無機又は有機窒素源である；有機基質は、脂肪族化合物の少なくとも１つの炭素末端がメチル基である脂肪族化合物であり、脂肪族化合物が約４から約２２の炭素原子を有する；補基質はブドウ糖、果糖、麦芽糖、グリセロール及び酢酸ナトリウムからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】C. tropicalisのＰＯＸ４遺伝子の調節及びコード領域を含む完全なＤＮＡ配列を示す。
【図２】C. tropicalis ＡＴＣＣ２０３３６からＵＲＡ３Ａをコードする完全なＤＮＡ配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、遮断されたβ−酸化経路を有する改良酵母株を提供する。その対象酵母株はβ−酸化経路の１以上の遺伝子が欠失した部分を有しており、野生型活性への復帰変異が回避されているため当技術分野における改良である。好ましくは、酵母株はカンジダ属に属する。本発明で使用することができるカンジダ種の例は、限定されるものでないのが、C. albicans, C. cloacae, C. guillermondii, C. intermedia, C. lipolytica, C. maltosa, C. parasilosis及びC. zeylenoidesを含む。より好ましい実施態様においては、酵母はC.tropicalisである。
【００２０】
１つの実施形態では、本発明は、染色体ＰＯＸ４遺伝子の欠失を有する酵母株を含む。その欠失の大きさは変動してもよいが、その酵母株が発酵のストレスに付されると、ＰＯＸ４座で野生型活性への復帰変異を妨げるのに十分な大きさである。さらに、欠失は１ヌクレオチド程度を含んでいてもよいが、好ましくは酵母株は、ＰＯＸ４遺伝子の約４００から約９００ヌクレオチド又は塩基対（ｂｐ）の欠失を有している。より好ましくは、対象酵母株は、約５００から約８００ｂｐのＰＯＸ４遺伝子の欠失を有している。さらに好ましくは、欠失はＰＯＸ４遺伝子の約６５０ｐｂを含む。最も好ましい実施態様では、欠失は、ＰＯＸ４遺伝子配列のヌクレオチド１１７８−１８２９に対応する、ＰＯＸ４遺伝子からの６５３ｂｐの配列である（図１参照）。
【００２１】
本発明の改良酵母株は、酵母ゲノムとの相同な組換えの後、宿主細胞における標的遺伝子の部分的な欠失をもたらすベクターで酵母宿主細胞を形質転換することにより生産される。酵母染色体ＰＯＸ４遺伝子を置換するために、例えば、ＰＯＸ４欠失破壊カセットを用いることができる。同様に、酵母染色体ＰＯＸ５遺伝子を置換するために、ＰＯＸ５欠失破壊カセットを用いることができる。
【００２２】
ベクターは、宿主細胞に外来核酸分子を導入することができるあらゆる線状又は環状の核酸分子として定義される。好ましくは、ベクターは組込み型ベクターである。組込み型ベクターは、宿主細胞のゲノムにおける標的部位に対し、相同性のある核酸配列を有するものであるため、ベクター核酸は、宿主細胞の核ＤＮＡに組み込まれるかもしれない。
線状ＤＮＡベクターは、天然でない（外来）ＤＮＡの細胞への導入を避けることが望まれる場合に有利であろう。例えば、細胞に本来備わっているＤＮＡ配列に隣接する所望の標的遺伝子からなるＤＮＡは、電気穿孔法、酢酸リチウム形質転換、スフェロプラスト等により、細胞に導入されてもよい。フランキングＤＮＡ配列は選択マーカー及び／又は他の遺伝子工学の手段を含んでもよい。
【００２３】
非復帰変異可能なβ−酸化遮断酵母株を産生するために、宿主細胞のゲノムにおける標的部位に対し相同性を有する組込み型ベクターを用いることができる。好ましくは、ベクター内に含まれる核酸配列は、選択マーカー遺伝子、非機能複製又は複製を含み、それは、宿主の核ＤＮＡ内に存在してもよい。ベクター内の核酸配列が宿主のゲノムのいくらかの部分に相同性を有するという事実は、相同性のある領域で、それをゲノムに組込み可能にさせる。より好ましくは、核酸配列はＤＮＡである。ここで用いられるように、用語「組込み可能」は宿主配列のどちらか一端に共有結合された領域として宿主ゲノムに導入され得ることを意味する。ベクターからの核酸配列が組み込まれた宿主ゲノムの領域は標的部位と定義される。本発明によれば、標的部位は、β−酸化経路に必要とされる酵素をコードする遺伝子である。好ましくは、標的遺伝子は、ＰＯＸ４又はＰＯＸ５である。最も好ましくは、標的遺伝子はＰＯＸ４である。
【００２４】
非復帰変異可能なβ−酸化遮断酵母株を産生するために使用されるベクターは、その中に含まれる欠失と共に標的遺伝子を含む。そのようなベクターは、天然酵母ゲノムにおけるβ−酸化経路の酵素をコードする遺伝子に対し相同性を有するＤＮＡ断片と、選択マーカー遺伝子と、天然酵母ゲノムにおけるβ−酸化経路の酵素をコードする遺伝子の異なった部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片とを含む、一連に配列された線状ＤＮＡ断片を含んでいてもよい。従って、選択マーカーは、β−酸化経路の酵素をコードする天然酵母ゲノムにおける遺伝子に相同であるＤＮＡ配列の両端に隣接するが、その配列は連続的ではない。
【００２５】
例えば、ベクターはＰＯＸ４欠失破壊カセット又はＰＯＸ５欠失破壊カセットを含んでいてもよい。ＰＯＸ４欠失破壊カセットは、ＰＯＸ４遺伝子の一部に対して相同性を有するＤＮＡ断片と、選択マーカー遺伝子と、ＰＯＸ４遺伝子の異なる部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片とを含む。ＰＯＸ５欠失破壊カセットは、ＰＯＸ５遺伝子の一部に対して相同性を有するＤＮＡ断片と、選択マーカー遺伝子と、ＰＯＸ５遺伝子の異なる部分に対して相同性を有するＤＮＡ断片とを含む。上述したＰＯＸ４欠失破壊カセットで形質転換された酵母宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ４遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ４遺伝子を有する。同様に、上述したＰＯＸ５欠失破壊カセットで形質転換された酵母宿主細胞は、部分的に欠失したＰＯＸ５遺伝子で置換されたその染色体ＰＯＸ５遺伝子を有する。
【００２６】
破壊カセットは、欠失がある標的遺伝子に対応するＤＮＡ配列に、選択マーカーをサブクローニングすることにより構築することができる。標的遺伝子に無関係のいかなる種類の選択マーカーが使用されてもよい。好ましくは、選択マーカーは、破壊カセットが形質転換される細胞に対して特定のフェノタイプを与えるものである。最も好ましくは、選択マーカーは、可逆的に栄養要求性に変化しうる形質転換細胞に対し、原栄養のフェノタイプを与えるものであるので、所望により、同一の選択マーカーが、その後、同一株での複数の遺伝子破壊に使用されてもよい。
【００２７】
例えば、特定のピリミジンに栄養要求性であるC.tropiclis形質転換宿主は、特定のピリミジンの合成に必要な機能選択マーカー遺伝子を含むＰＯＸ４又はＰＯＸ５欠失破壊カセットにより原栄養型に形質転換されてもよい。得られる形質転換体は、前記特定のピリミジンに対する原栄養型とされており、ピリミジン欠乏培地で成長するそれらの機能により選択される。これらの形質転換体は、前記欠失を含む非機能標的遺伝子での機能標的遺伝子の置換により標的遺伝子欠失を含む。
【００２８】
酵母がC. tropicalisである場合、適切なマーカー遺伝子は、限定されるものではないが、ＵＲＡ３Ａ、ＵＲＡ３Ｂ又はＨＩＳ４遺伝子を含む。選択マーカーがＵＲＡ遺伝子である場合、宿主細胞はウラシルに対して栄養要求性であり、選択マーカーがＨＩＳ４遺伝子である場合、宿主細胞はヒスチジンに対して栄養要求性である。
好ましい実施態様では、ウラシルに対して栄養要求性（Ura-）であるC. tropicalis 形質転換宿主は、選択マーカーとしてのＵＲＡ３機能遺伝子を含む破壊カセットでウラシル原栄養型に形質転換される。形質転換された細胞はウラシルの無い状態で成長する機能により選択される。
【００２９】
酵母形質転換宿主細胞が、特定のフェノタイプ、例えばウラシルに対してすでに原栄養型である場合、得られる形質転換株におけるpox−フェノタイプの確認は、単独の炭素源として、デカン及びドデカンのようなアルカンを含有する培地での成長能がない株によって、行うことができる。
好ましくは、標的遺伝子、つまりＰＯＸ４のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の重要な部分が、選択マーカー遺伝子、つまりＵＲＡ３の導入前又は導入中に除去される。選択マーカー遺伝子は、５'−ＰＯＸ４配列の一端及び３'−ＰＯＸ４配列の他端に隣接している。５'−ＰＯＸ４配列及び３'−ＰＯＸ４配列は連続しておらず、ＰＯＸ４遺伝子の異なる部分に対応している。従って、形質転換細胞は、２つのＰＯＸ４フランキング配列間のゲノム領域に位置したＰＯＸ４遺伝子のヌクレオチドを欠いている。標的遺伝子のＯＲＦの一部分を欠失することにより、選択マーカー遺伝子の除去は、野生型機能、つまりβ−酸化に対する復帰変異をもたらさないだろう。
【００３０】
特に好ましい実施態様では、C.tropicalis Ｈ５３は、１６７６ｂｐ ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子からなるＰＯＸ４破壊カセットで形質転換されてもよく、１６７６ｂｐ ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子は、ＰＯＸ４から２つの連続しないフランキング配列に隣接した、６４７ｂｐプロモーター、８０３ｂｐ ＯＲＦ及び２２６ｂｐ ＵＴＲを含む。C. tropicalisゲノムに組換えられる際、ＰＯＸ４破壊カセットは、ＰＯＸ４ＯＲＦのコード領域で６５３ｂｐの欠失があり、１６７６ｂｐ ＵＲＡ３選択マーカーの導入がある酵母をもたらす。Ｈ５３（pox５／pox５）における欠失ＰＯＸ４対立遺伝子を含む、得られた形質転換C.tropicalis株は、ＨＤＣ１００と呼ばれる。ＨＤＣ１００は非復帰変異可能(pox４△::ＵＲＡ３/pox４△::ＵＲＡ３ pox５/pox3)株である。形質転換細胞は、破壊されたＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の４つ全てを有しているので、それらはβ−酸化経路の初期のステップで必要とされる酵素であるアシル−ＣｏＡオキシダーゼを殆ど又は全く産生せず、β−酸化が遮断されている。ＰＯＸ４遺伝子の一部欠失は、さらに機能プロテインをコードするＰＯＸ４遺伝子への組換えを妨げる。従って、野生型活性への復帰変異及びβ−酸化経路によるジカルボン酸生成物の再利用が避けられる。よって、得られたＨＤＣ１００株は、β−ヒドロキシ酸、不飽和酸又はより短鎖の酸のような不要な副産物のいずれをも、殆ど産生しない。
【００３１】
得られたβ−酸化遮断C.tropicalis細胞は、β−酸化経路の１以上の遺伝子の一部が欠失した遺伝子組換えC. tropicalis株である。好ましくは、欠失は染色体ＰＯＸ４又はＰＯＸ５遺伝子の一部に対するものであり、いくつかの実施態様では、β−酸化経路の他の遺伝子も破壊されている。本発明の方法は、野生型株に用いてもよいが、β−酸化経路がすでに遮断され又は部分的に遮断された株に使用することが特に適している。以下の株はここに記載された方法を用いて形質転換することができる：Ｈ５３、ＰＯＸ５遺伝子の双方が破壊されているもの；Ｈ５３４３、ＰＯＸ４及びＰＯＸ５遺伝子の４つ全てが破壊されているもの；Ｈ４１、ＰＯＸ４Ａ遺伝子が破壊されているもの；Ｈ４１Ｂ、ＰＯＸ４Ｂ遺伝子が破壊されているもの；Ｈ４３、ＰＯＸ４遺伝子の双方が破壊されているもの；Ｈ４３５、ＰＯＸ５遺伝子の一方及びＰＯＸ４遺伝子の双方が破壊されているもの；Ｈ５１、ＰＯＸ５遺伝子の一方が破壊されているもの；Ｈ４５、一方のＰＯＸ５及びＰＯＸ４Ａ遺伝子が破壊されているもの；Ｈ５３４、ＰＯＸ５の双方の複製及びＰＯＸ４Ａが破壊されているもの；及びＨ５３４Ｂ、ＰＯＸ５の双方の複製及びＰＯＸ４Ｂ遺伝子が破壊されているもの。本発明の教示によれば、上に挙げられたいずれの株もＰＯＸ４又はＰＯＸ５座で、１以上の対立遺伝子が破壊されるだけではなく、欠失を含むように、形質変換することができる。ＰＯＸ４又はＰＯＸ５遺伝子の欠失部分は、その株が野生型活性に復帰変異するのを妨げる。
【００３２】
他の実施態様では、C. tropicalis株が１以上の増幅されたシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０ＡＬＫ）遺伝子及び／又はリダクターゼ（Ｐ４５０ＲＥＤ）遺伝子を有していてもよく、それによりＰ４５０遺伝子増幅による律速ω−水酸化酵素の量的な増加及びω−酸化経路をとおる基質流の割合の増加をもたらす。好ましい実施態様では、米国特許第６，３３１，４２０号及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２０７９７号に記載されるC. tropicalis２０３３６のＣＰＲＡ及びＣＰＲＢ遺伝子を含むＣＰＲ（リダクターゼ）遺伝子が含まれる。
【００３３】
本発明の他の面は、ジカルボン酸を産生するこれらの形質転換酵母株の使用を包含する。好ましい実施態様では、ＰＯＸ遺伝子の破壊及び欠失により、競合するβ−酸化経路の機能不活性の結果、形質転換C. tropicalis株における基質流がω−酸化経路に転嫁される。最も好ましい実施態様は、その酵母株ＨＤＣ１００を利用することであり、それはβ−酸化が遮断されており、ＰＯＸ４遺伝子の一部分の欠失の結果、野生型活性に復帰変異しないであろう。これらの株は、適切な培地で培養された場合、実質的に純粋なα，ω−ジカルボン酸の特異的な産生の増加を示す。
【００３４】
α，ω−ジカルボン酸の産生を行う適切な培地は、容易に当該分野の当業者によって決定することができるが、最も好ましい実施態様では、培地は窒素源、有機基質及び補基質を含有する。
培養培地の窒素源は微生物を培養する過程において通常使用される、いかなる無機又は有機窒素源であってもよい。無機窒素源は硝酸ナトリウム又は硝酸カリウム等の硝酸アルカリ金属；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩等を含む。有機窒素源は尿素、コーン・スティープ・リカー、酵母エキス、当該分野の当業者に公知の他の有機窒素源を含む。
【００３５】
培養培地の有機基質は、約４から約２２の炭素原子を有するいかなる脂肪族化合物であってもよく、それは、末端炭素の少なくとも一つがメチル基、末端カルボキシル基及び／又はバイオ酸化によりカルボキシル基に酸化し得る末端官能基である。そのような化合物は、アルカン、アルケン、アルキン、カルボン酸及びそれらのエステルならびにアレーンを含む。好ましい基質は、約４から約２２の炭素原子を有するアルカン及び脂肪酸並びにアシル部分が約４から約２２の炭素原子を含むそれらのメチル又はエチルエステルである。最も好ましい基質はドデカン、トリデカン、テトラデカン、オレイン酸、オレイン酸メチル、パルミチン酸メチル、パルミトオレイン酸メチル及びミリスチン酸メチルである。
【００３６】
補基質はグルコース、フルクトース、マルトース、グリセロール、酢酸ナトリウム及びそれらの組み合わせを含んでもよい。好ましい補基質はグルコースである。本発明の方法で使用されるC.tropicalis株のβ−酸化経路は全体的又は部分的に遮断され、かつエネルギーは基質の酸化から得られないため、補基質は必要である。基質に所定の割合でグルコースを加えることにより、α，ω−ジカルボン酸への基質の部分的酸化を行わせながら、細胞へのエネルギー源の供給の均衡をとる。
【００３７】
以下の実施例は本発明を説明するものではあるが、限定するものではない。
実施例
ＰＯＸ４破壊構成体を、１６７６ｂｐ（６４７ｂｐプロモーター、８０３ｂｐＯＲＦ及び２２６ｂｐＵＴＲ）ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を導入する一方、ＰＯＸ４ＯＲＦの６５３ｂｐを欠失するよう設計した。ＰＣＲプライマーはＰＯＸ４ＯＲＦの２つのフランキング領域（590bp及び815bp）を増幅するように設計した。これらのプライマーはＵＲＡ３遺伝子のクローニングを促進するために制限感受性クローニング部位を含んでいた。フランキングＰＯＸ４領域の順調なＰＣＲによって、ＤＮＡを制限し、ゲル分離し、所望のＰＯＸ４破壊構成体を産生するためのライゲーションで使用した。この構成体は、C. tropicalis Ｈ５３(pox５/pox5)ura- をpox４/pox４ URA+フェノタイプに形質転換するために使用した。４つのC. tropicalis pox５/pox５ pox４/pox４同型接合体を、サザン分析により確認した。さらに、これらの株は、それらのpox−フェノタイプを示すドデカン／デカンで、成長能がなかった。これらの株をＨＤＣ１００−１、−２、−３及び−４と名付けた。
【００３８】
実施例１
ＰＯＸ４のフランキング配列の生成
破壊カセットを直接組込んでＰＯＸ４フランキング配列を生成するために、２組のＰＣＲプライマーを設計した。
【００３９】
【化１】
2006513693.tif 000002
【００４０】
【化２】
2006513693.tif 000003
これら２つのフランキング配列のＰＣＲ断片を精製し、AscI、PacI及びPmeI制限酵素 (Set＃１断片に対してAscI及びPacI及びSet＃２断片に対してPacI及びPmeI)で制限し、精製されたゲル、ニューイングランドバイオラボ（バーバリー、マサチューセッツ州）から購入したプラスミドpNEB193のAscI-PmeI消化物で浄化されたQiaexIIにライゲートした。ライゲーションは１６℃で１６時間、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ〈ニューイングランドバイオラボ〉を使用して、ＤＮＡ末端と等モル数で行った。製造業者の推奨に従って、ライゲーションは大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞  （ストレートジーン、ラホーヤ、カリフォルニア州）に形質転換した。白色コロニーを分離し、成長させ、プラスミドＤＮＡを分離し、AscI-PmeIで消化し、pNEB193へのフランキング配列の挿入を確認した。
【００４１】
制限酵素−感受性クローニング部位を、斜体で示したように、各プライマーに組み込んだ。プライマーセット番号１は、塩基対５８７−１１７７でＤＮＡ領域を増幅するために使用した。同様にプライマーセット番号２は、塩基対１８３０−２６４５でＤＮＡ領域を増幅するために使用した。
これらの断片は、以下の実施例２により生産された栄養マーカー（ＵＲＡ３）にライゲートされ、カンジダ・トロピカリスゲノムに組み込まれる際、ヌクレオチド１１７８−１８２９でＰＯＸ４ＯＲＦの６５３塩基対の欠失を生じた（図１参照）。
【００４２】
実施例２
ＵＲＡ３選択マーカーの生成
プライマーセットを、ＰａｃＩ制限感受性クローニング部位を含む１６７６塩基対ＵＲＡ３を増幅するために作った。
【００４３】
【化３】
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プライマーを、C. tropicalis 20336のＵＲＡ３A遺伝子の1712bp配列に基づき設計し、合成した(図２参照)。上述したプライマー179a及び179bを、C. tropicalis 20336ゲノムＤＮＡと共にＰＣＲで用い、図２に示すようにヌクレオチド９及び１６８５間のＵＲＡ３A配列を増幅した。これらのプライマーは、固有のPacI制限部位をも、得られた増幅ＵＲＡ３A断片に導入するために設計した。ＵＲＡ３A遺伝子のＰＣＲ断片を精製し、PacI制限酵素で制限した。得られたベクターはPacI制限−感性クローニング部位と共に1676bp（647bpプロモーター、803bp ORF及び226bp UTR)ＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を有する。
【００４４】
実施例３
ＰＯＸ４−欠失破壊構成体の生成
この破壊構成体を生成するために、実施例２により産生されたPacI制限−感受性クローニング部位を有する1676bpＵＲＡ３選択マーカー遺伝子を、実施例１により産生されたＰＯＸ４フランキング断片を含むPacI制限及び脱燐酸化pNEB193 ベクターにクローニングした。本発明の好ましい観点では、合成制限部位配列により特に提供されたＤＮＡ以外にいかなる外来ＤＮＡも、C.troicalisゲノムにクローニングされたＤＮＡに組み込まなかった。すなわち、制限部位ＤＮＡのほかは、天然C.tropicalisＤＮＡ配列のみがゲノムに組み込まれた。
【００４５】
実施例１に従って産生されたＰＯＸ４フランキング断片を含有するPacI制限pNEB 193ベクターは、PacI、精製されたQiaex IIで消化され、製造業者の推奨に従って、エビアルカリホスファターゼ(SAP、ユナイティッドステーツ  バイオケミカル  クレーブランド、オハイオ）で脱燐酸化した。ＰＯＸ４フランキング断片を含む約５００ngのPacI 線状pNEB193ベクターを、DNA末端１pmolにつき0.2単位の酵素の濃度で、ＳＡＰを使用して、３７℃で１時間、脱燐酸化した。その反応は、６５℃での２０分間の熱不活化により停止させた。
【００４６】
次いで、上記の実施例２に記載された方法から誘導されたPacI ＵＲＡ３A断片を、PacIで消化されたＰＯＸ４フランキング断片を含む脱燐酸化pNEB193ベクターにライゲートした。ライゲーション法は、上の実施例１と同様の方法に従った。ライゲーション混合物を、大腸菌XL1 Blue MRF' (遺伝子層)に形質転換した。形質転換体を選択し、ベクター配列、ＰＯＸ４フランキング配列、ＵＲＡ３A選択マーカー遺伝子を含み、ＰＯＸ４フランキング配列間（ヌクレオチド1178-1829のＰＯＸ４ORFの653塩基対（図１参照））の領域を欠く、適切な構成体をスクリーニングした。適切と認定された構成体を配列決定し、ＵＲＡ３Aと比較して、ＰＣＲがアミノ酸変化を起こしうるＤＮＡ塩基の変化を導入していないことを確認した。
【００４７】
実施例４
酢酸リチウムを使用したC. tropicalisの形質転換
上の実施例３で述べた構成体のライゲーション及び確認の後に、AscI及びPmeIによって、酢酸リチウム変質転換プロトコルにより、予めＰＯＸ５遺伝子においてウラシル原栄養性が破壊されたカンジダ・トロピカリス株（Ｈ５３）を形質転換するために使用した3083塩基対断片を遊離した。
【００４８】
C.tropicalisを形質転換するために使用した酢酸リチウム形質転換プロトコルは、参照としてここに組み込まれるMolecular Biology, Supplement 5, 13.7.1 (1989)におけるCurrent Protocolsに記載された一般的な方法に従った。YEPD５ｍｌを凍結株からC. tropicalis H53（予めウラシル原栄養性が破壊された）に接種し、30℃、170rpmにて、一晩、New Brunswick shakerで培養した。翌日、一晩の培養物10μlを50mlYEPDに接種し、３０℃、170rpmで成長させた。次の日、細胞を、1.0のOD600で採取した。その培養物を、50mlのポリプロピレン製チューブに移し、1000Xgで10分間遠心分離した。細胞沈殿物を１０ｍｌの無菌TE（10ｍM Tris-CL及び1mM EDTA、ｐH8.0）に再懸濁した。細胞を、再度、1000Xgで10分間遠心分離し、細胞沈殿物を10 mlの無菌の酢酸リチウム溶液[LiAc(0.1 M酢酸リチウム、10ｍM Tris-Cl、pH 8、１ｍM EDTA)]  に再懸濁した。続いて、1000Xgで10分間遠心分離し、沈殿物を0.5mlのLiAcに再懸濁した。この溶液を、50rpmで穏やかに振盪させながら、30℃で一時間培養した。この懸濁液のアリコート0.1 mlを、３０分間振盪させずに３０℃で、形質転換DNA５μｇとともに培養した。0.7ｍｌPEG溶液（40％wt/vol ポリエチレングリコール3340、0.1M酢酸リチウム、１０ｍM Tris-Cl、ｐH8.0、1mM EDTA）を加え、３０℃で４５分間培養した。次いで、チューブを、４２℃で５分間放置した。0.2ｍｌのアリコートを、ウラシル欠乏の合成完全培地(ＳＣ−ウラシル)(参照としてここに組み込むKaiserら、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1994)上に載置した。形質転換体の成長を５日間モニターした。３日後、いくらかの形質転換体を選び取り、ゲノムDNAの製造及びスクリーニングのためにＳＣ−ウラシルプレートに移した。形質転換体は株ＨＤＣ１００として同定した。
【００４９】
実施例５
形質転換体分析
次いで、実施例４に従って製造された形質転換体を分析した。形質転換体を、初めに単独の炭素源としてのドデカン及びデカンを含有する培地上に載置した。ウラシルの原栄養性を保持する間、この培地で成長しないか又はゆっくり成長した（ＰＯＸ４遺伝子の一方又は両方が破壊されたことを示す）形質転換体を、サザン分析した。サザン分析からのバンドシグナルの強度を、組込みイベント（つまり、存在するＵＲＡ３A選択マーカー遺伝子の複製が多くなればなるほど、交配シグナルは強くなる）の基準として使用した。
【００５０】
形質転換体を、３０℃、１７０ｒｐｍで、ゲノムＤＮＡの製造用ＳＣ−ウラシル培地で成長させた。形質転換体からのゲノムＤＮＡの分離に続いて、ＤＮＡを、PacI又はEcoRIで消化し、その消化物を、標準サザン法により分析した。0.95%アガロースゲルを、サザンハイブリダイゼーションブロットの調製のために使用した。Sambrookら、Molecular Cloning：A laboratory Manual 2ed. Cold Spring Harbor Press, USA (1989)のアルカリ移動方法に従って、ゲルからのＤＮＡをMagnaCharge ナイロンフィルター膜（MSI Technologies, ウエストボロ、マサチューセッツ州）に転写した。サザンハイブリダイゼーションでは、1.7kb ＵＲＡ３DNA断片を、PacI消化物のハイブリダイゼーションプローブとして使用し、6.6KbＰＯＸ４プローブをEcoRI消化物に使用した。300ngのＵＲＡ３Ａ ＤＮＡをＥＣＬ直接標識及び検出システム (アマーシャム) を使用して標識付けし、サザンをＥＣＬキット仕様書にしたがって行った。ブロットを0.125ml/cm2に対応する30mlのハイブリダイゼーション液量で分析した。４２℃で、１時間のプレハイブリダイゼーションに続いて、300 ngのＵＲＡ３Aプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを続けた。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットを、４２℃で、２０分ごとに、尿素を含む一次洗浄液で２回洗浄した。RTで二次洗浄を５分間、２回行い、その後それぞれの使用法に応じて検出した。ブロットは推奨により１６時間空気にさらした。
【００５１】
破壊／欠失構造を受けたこれらの株は、予期した1.676 Kb 帯を産生しただけであった。11.8Kb 断片の存在は、ＰＯＸ４遺伝子が破壊されたことを示した。10.8Kb 断片はＰＯＸ４遺伝子が野生型であることを示した。野生型対立遺伝子及び破壊対立遺伝子の双方が存在するこれらのケースにおいて、これらの株を5-フルオロオロト酸 (5−FOA)処理に付して、ＵＲＡ３選択マーカーを再生した。
【００５２】
株を、Ura+細胞に有害であるウラシル経路中間体の類似物である、５−FOA の種々の濃度を含む培地で成長について試験した。双方の株は、YEPD 培地(2% バクト−ペプトン、2%グルコース、1% バクト−酵母抽出物)で中間ログフェーズに成長し、種々の希釈でFOA培地（Boekeら、[1984] Molec. Gen. Genet 197; p345-346）又はYEPD培地に載置された。
ウラシル栄養要求体と同定された株を、非破壊ＰＯＸ４対立遺伝子を破壊するために再び破壊構造体に形質転換した。単一の11.8 Kb帯が存在することは、ＰＯＸ４遺伝子の双方の対立遺伝子の破壊を示した。４つのC.tropicalis pox５/pox５ pox４/pox4 同型接合体がサザン分析により確認された。これらの株はＨＤＣ１００−１、−２、−３及び−４であった。
【００５３】
実施例６
非復帰変異の発酵分析
株H5343又はその後代を用いた発酵条件下において、β−酸化への復帰変異は、概して、基質導入後約７２時間起こった。この条件はグルコースの制限により促進することができる。Ｈ５３４３でのベータ酸化を誘導する同一条件での発酵がＨＤＣ１００に適用される場合、β−酸化へのいかなる復帰変異も観察されなかった。これはβ−酸化がＨＤＣ１００において依然として遮断されていることを示した。さらに、これらの発酵培養物のサンプルが単一の炭素源としてドデカン及びデカンを含有する培地に置かれた時、それらのpox−フェノタイプを示す、ＨＤＣ１００のいかなる成長も観察されなかった。
【００５４】
ここに開示された実施態様に種々の改変がなされることは理解されるだろう。従って、上記の詳述に限定されるものではなく、単に好ましい実施態様の例示にすぎない。当業者はここに添付されたクレームの範囲及び意図において他の改変に想到するであろう。
【図１】
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【図１】
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【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月12日(2005.1.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006513693000001.app
【国際調査報告】
2006513693.tif 000011
2006513693.tif 000012