(57)【要約】本発明は、ＨＣＶ感染の予防的及び治療的処置において有用である免疫原性及びワクチン組成物に関する。より詳細には、前記組成物は、ＨＣＶ外被ペプチドＥ１及びＨＣＶ非構造ペプチドＮＳ３を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を含むＨＣＶ免疫原性組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を有効量含んで成るＨＣＶワクチン組成物。
【請求項３】
予防用ＨＣＶワクチン組成物である、請求項２に記載のＨＣＶワクチン組成物。
【請求項４】
治療用ＨＣＶワクチン組成物である、請求項２に記載のＨＣＶワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＨＣＶ外被ペプチドがＥ１ペプチドであり、前記ＨＣＶ非構造ペプチドがＮＳ３ペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ペプチドがアミノ酸１９２〜３２６にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域で構成されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｅ１ペプチドが酵母内発現により産生される、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵母がＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドがアミノ酸１１８８〜１４６８にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域を含んでいる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドが、アミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域を含んでいる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドが、アミノ酸１１８８〜１４６８にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域及びアミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域を含んでいる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＨＣＶ  Ｅ１ペプチドが配列番号１により定義づけされる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
アミノ酸１１８８〜１４６８にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域が配列番号２により定義づけされる、請求項９又は１１に記載の組成物。
【請求項１４】
アミノ酸１０７１〜１０８４にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域が配列番号３により定義づけされる、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１５】
アミノ酸１０７１〜１０８４にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域の前記一部分が、アミノ酸１０７３〜１０８１にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１６】
アミノ酸１０７３〜１０８１にわたる前記ＨＣＶポリタンパク質領域の前記一部分が配列番号４により定義づけされる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドが配列番号５により定義づけされる、請求項５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＨＣＶペプチドが所望によりスペーサを介してリンクされている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＨＣＶペプチドが合成ペプチド又は組換え型ペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＨＣＶペプチドの少なくとも１つのシステインが可逆的又は不可逆的に遮断されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＨＣＶ外被ペプチドの少なくとも１つのシステインがアルキル化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＨＣＶ非構造ペプチドの少なくとも１つのシステインがスルホン化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＨＣＶ外被ペプチドがウイルス様粒子として前記組成物に付加されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記医薬上許容される担体がミョウバンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ外被ペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ非構造ペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ外被ペプチド及び異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された非構造ペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
医薬品として使用するための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＨＣＶペプチドに対する液性応答を誘発するための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＨＣＶペプチドに対する細胞性応答を誘発するための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＨＣＶペプチドに対する液性及び細胞性応答を誘発するための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記細胞性応答がＣＤ４＋Ｔ−細胞増殖応答であるか又はＣＤ８＋細胞毒性Ｔ−細胞応答であるか又はサイトカイン分泌応答である、請求項３０又は３１に記載の組成物。
【請求項３３】
慢性ＨＣＶ感染に対する哺乳動物の予防的防御のための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
慢性ＨＣＶ感染に対する哺乳動物の治療的処置のための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＨＣＶ感染が同種ＨＣＶ又は異種ＨＣＶによるものである、請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＨＣＶ感染哺乳動物における肝疾患を低減させるための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
ＨＣＶ感染哺乳動物における血清肝酵素活性レベルを低減させるための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３８】
前記肝酵素がアラニンアミノトランスフェラーゼ又はガンマ−グルタミルペプチダーゼである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
ＨＣＶ感染哺乳動物におけるＨＣＶ  ＲＮＡレベルを低減させるための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項４０】
ＨＣＶ感染哺乳動物における肝線維症の進行を減速させるための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項４１】
ＨＣＶ感染哺乳動物における肝線維症を低減させるための、請求項２８に記載の組成物。
【請求項４２】
ＨＣＶを処置するための医薬品の製造のための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４３】
ＨＣＶワクチンの製造のための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項４４】
ワクチンが治療用ＨＣＶワクチンである、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
ワクチンが予防用ＨＣＶワクチンである、請求項４３に記載の使用。
【請求項４６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３３〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
ＤＮＡワクチン及び請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物を含む、ＨＣＶワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＣＶ感染の予防的及び治療的処置において有用である免疫原性及びワクチン組成物の分野に関する。より詳細には、前記組成物はＨＣＶ外被ペプチド及びＨＣＶ非構造ペプチドを含む。
【０００２】
背景技術
ＨＣＶウイルスの約９．６ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノムは、５’−及び３’−非コーディング領域（ＮＣＲ）とこれらのＮＣＲの間の約３０００個のアミノ酸のＨＣＶポリタンパク質をコードする約９ｋｂの単一の長い読取り枠を含んでいる。
【０００３】
ＨＣＶポリペプチドは、読取り枠からの翻訳とそれに続く結果として得られた約３３０ｋＤａのポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングによって生成される。ポリタンパク質のアミノ末端４分の１から構造タンパク質が誘導され、これには、カプシド又はコアタンパク質（約２１ｋＤａ）、Ｅ１外被糖タンパク質（約３１ｋＤａ）及び従来ＮＳ１と呼ばれていたＥ２外被糖タンパク質（約７０ｋＤａ）が含まれる。ＨＣＶポリタンパク質の残りの部分から非構造ＨＣＶタンパク質が誘導され、これには、ＮＳ２（約２３ｋＤａ）、ＮＳ３（約７０ｋＤａ）、ＮＳ４Ａ（約８ｋＤａ）、ＮＳ４Ｂ（約２７ｋＤａ）、ＮＳ５Ａ（約５８ｋＤａ）、及びＮＳ５Ｂ（約６８ｋＤａ）が含まれる（Ｇｒａｋｏｕｒｉら１９９３年）。Ｅ２タンパク質は、ｐ７タンパク質のＣ末端融合を伴って又はこれを伴わずに発生し得る（Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏら１９９５年）。最近、Ｆ（フレームシフト（Ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ））タンパク質と呼ばれる約１７ｋＤａのタンパク質をコードし発現するコア領域内の代替的読取り枠が発見された（Ｘｕら２００１年；ＯｕおよびＸｕ米国特許出願公開第２００２／００７６４１５号明細書）。同じ領域内で、その他の１４−１７ｋＤａのＡＲＦＰ（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａ１〜Ａ４のためのＯＲＦが発見され、少なくともＡ１、Ａ２、及びＡ３に対する抗体が、慢性感染した患者の血清中で検出された（Ｗａｌｅｗｓｋｉら２００１年）。
【０００４】
ＨＣＶは、世界中の非Ａ、非Ｂ型肝炎の主な原因である。急性ＨＣＶ感染（全急性肝炎感染の２０％）は慢性肝炎（全慢性肝炎症例の７０％）及び末期肝硬変を導くことが多い。ＨＣＶ慢性担体の最高２０％が約２０年の時限にわたり肝硬変を発生させ得、そのうち１〜４％／年の間の肝硬変を有する者は肝ガンを発生するリスクが高い（ＬａｕｎｅｒおよびＷａｌｋｅｒ２００１年、Ｓｈｉｆｆｍａｎ１９９９年）。ＨＣＶを原因とする末期肝疾患の寿命を延長させるための１つの選択肢は肝移植である（世界中の全ての肝移植の３０％はＨＣＶ感染によるものである）。
【０００５】
肝臓損傷及びウイルス浄化の病理学的メカニズムについて得られる情報は限られたものにすぎない。ＨＣＶに対する有効な予防用及び／又は治療用ワクチンの開発に向けての第１歩として、防御免疫（Ｂ細胞又は液性応答及びＴ細胞又は細胞性応答）に関与するＨＣＶ成分を同定することに多大な努力が払われてきた。
【０００６】
ウイルスの浄化及び疾病の消散又はウイルスの存続及び慢性疾患のいずれが起こっているかについての決定は、ＨＣＶ感染の急性期の間の免疫応答にあると考えられている。感染の初期における免疫応答の強さ、広さ及び維持そして恐らくは特にＴ細胞／ＣＴＬ応答が感染を消散させるために根本的重要性をもつ可能性があることを複数の研究が示唆していると思われる（Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒら１９９５年、１９９７年；Ｍｉｓｓａｌｅら１９９６年；Ｃｏｏｐｅｒら１９９９年；Ｅｒｉｃｋｓｏｎら２００１年）。しかしながら、感染の自然発生的な消散は、慢性感染へと進化している患者の体内でＨＣＶタンパク質及びＨＣＶ特異的Ｔ細胞に対する抗体の存続が検出可能であるにもかかわらず（ひいては免疫応答の検出が可能であるにも関わらず）、ＨＣＶ感染者の約３０％において発生しているにすぎない。
【０００７】
ＨＣＶ感染を治療するための選択肢は、現在非常に限られたものであり、通常、抗ウイルスリバビリン及びインタフェロン−α（又はペグインタフェロン（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−α）の治療計画を含む。今日の最適な治療計画（ペグインタフェロン−αとリバビリン及び遺伝子型及びウイルス負荷に基づく療法の拡大との組合せ）は、結果として重度の副作用（患者の約２５％は早期に療法を停止する）をもたらし、治療計画を完了できた者のうちでも、世界中で最も優勢な遺伝子型である遺伝子型１に感染している場合に、持続した応答を示すのは５０％だけである（Ｍａｎｎｓら２００１年）。さらに、この療法は、ＨＣＶにおいて頻発する身体条件である貧血症、自己免疫疾患又はうつ病歴の弁別的特徴が予め存在している患者については勧められない。これらの及びその他の医学的合併症のため、最高７５％のＨＣＶ患者が今日療法から除外されている（Ｆａｌｃｋ−Ｙｔｔｅｒら２００２年）。シェリング・プラウ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）は、現行の療法に応答しなかった人の数は２０１０年までに１００万人まで増加するものと計算した（Ｊ．Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，ＥＡＳＬ，Ｍａｄｒｉｄ，Ａｐｒｉｌ  ２００２）。
【０００８】
ＨＣＶ感染を予防するための選択肢は、現在ＨＣＶ抗体及び／又はウイルスＲＮＡの存在について献血をスクリーニングすることに制限されている。しかしながら、未知の経路を介して、静脈内薬物ユーザーを介して又はＨＣＶウイルスの担体であることに気づいていない人を介して、大量の新たなＨＣＶ感染が発生している。かくして、ＨＣＶ感染の予防と治療の両方において有用である作用物質に対する明白かつ緊急なニーズが存在している。
【０００９】
ＨＣＶワクチンは、ＤＮＡベースのワクチン、タンパク質又はペプチドベースのワクチンであり得、そうでなければＤＮＡ−初回免疫・タンパク質−追加免疫ワクチン接種の組合せを適用することもできる。
【００１０】
ＤＮＡ−初回免疫・タンパク質−追加免疫ワクチン接種の研究は、マウスの体内でコア（Ｈｕら１９９９年）及びＥ２（Ｓｏｎｇら２０００年）について実施されてきた。コアＤＮＡワクチン接種は主にＩｇＭ抗体産生を生成し、一方、タンパク質追加免疫は、ＩｇＧ抗体レベルの増大をひき起こした。コアＤＮＡ−ワクチン接種により誘発されたＴ細胞増殖応答は、タンパク質追加免疫により増大させられた。コアタンパク質単独で注射を行なった場合ＣＴＬ応答は観察されなかったが、ＤＮＡ−初回免役ワクチン接種及びＤＮＡ−初回免疫・タンパク質−追加免疫ワクチン接種の両方において検出できた。Ｅ２については、ＤＮＡワクチン接種時点で惹起された抗体応答及びＣＴＬ応答の両方がタンパク質追加免疫により増大した。
【００１１】
タンパク質ベースのＨＣＶワクチンでの研究は、非常に限られたものであり、コア（Ｓｈｉｒａｉら１９９６年、Ｈｕら１９９９年）、Ｅ１（Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉａｚ  ｄｅ  Ｃｅｒｉｏら１９９９年）、Ｅ２（Ｎａｋａｎｏら米国特許出願公開第２００２／０１１９４９５号；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら米国特許出願公開第２００２／０００２２７２号）、Ｅ１／Ｅ２又はＥ１／Ｅ２＋コア（Ｄｒａｎｅら国際公開第ＷＯ０１／３７８６９号）及びＮＳ５（Ｓｈｉｒａｉら１９９６年）のフラグメントでのマウスの免疫化を含んでいる。
【００１２】
マウスは、ＮＳ５か又はヘルパーペプチド（ＨＩＶｇｐ１６０タンパク質のフラグメント）に共有結合で付着されたＮＳ５又はコアのいずれかで初回免疫され、その後ＣＴＬ−応答は、ＮＳ５又はコアの存在下での再刺激の後に測定された。ＮＳ５−ＨＩＶ融合タンパク質及びコアタンパク質についてはＣＴＬ応答が見られたが、ＮＳ５タンパク質単独については見られなかった。ＮＳ５−ＨＩＶ融合タンパク質に対するＣＴＬ応答は、使用されたアジュバントに左右された。サポニンアジュバント（ＱＳ２１）はＣＴＬ−応答を支援したが、一方で完全フロイントアジュバントはこれを支援しなかった。ＮＳ５に対するいかなる増殖応答も検出されなかった（Ｓｈｉｒａｉら１９９６年）。Ｈｕら（１９９９年）により概略的に示されている通りの条件下では、コアに対するいかなるＣＴＬ−応答も検出されなかった。
【００１３】
Ｅ１−ペプチド（アミノ酸１２１−１３５）でのマウスの免疫化は、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞ならびに、アジュバントの不在下でも同様に得られた長期持続性ＣＤ８＋ＣＴＬ−応答（Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉａｚ  ｄｅ  Ｃｅｒｉｏら１９９９年）を誘発した。
【００１４】
Ｎ及びＣ末端部分が欠如し昆虫細胞によって産生されたＥ２ペプチドで予めマウスを免疫化した場合、Ｔ細胞増殖応答が指摘された。この応答は、Ｅ２ペプチドにＱＳ２１又はＭＰＬ−ＴＤＭをアジュバントとして付加した場合にのみ検出可能で、ミョウバンをアジュバントとした場合には検出できなかった。液性抗Ｅ２応答は、ＱＳ２１をアジュバントとしたＥ２でマウスを免疫化した場合にのみ検出された（Ｎａｋａｎｏら米国特許出願公開第２００２／０１１９４９５号）。Ｅ１／Ｅ２ヘテロ２量体性複合体の注射を受けたマウスは、有意な抗Ｅ２抗体応答を増大させなかった。Ｅ１／Ｅ２にＭＦ５９をアジュバントとして用いた場合、又はコア−ＩＳＣＯＭを付加した場合、検出可能で同程度の抗Ｅ２抗体応答が観察された。Ｅ２に対する液性応答は、マウスをＥ２発現プラスミドで免疫化した場合（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら米国特許出願公開第２００２／０００２２７２号）に比べてＥ２ペプチド（ＭＦ５９をアジュバントとする）で免疫化した場合にさらに高いものであった。
【００１５】
以上の調査目的のワクチン接種は全て、ＨＣＶ感染についての動物モデル系でないげっ歯類について実施された。従って、得られた結果は、マカクといった霊長類又はチンパンジー又はヒト（このうち後者の２つがＨＣＶ感染を受ける可能性が高い）に対し先験的に外挿することはできない。従って、より有利なのは、チンパンジーに対し実施される予防用及び治療用ワクチン接種又はＨＣＶ感染したヒトの治療用ワクチン接種である。マウス、マカク及びチンパンジーのＥ２ＤＮＡ−ワクチン接種については、Ｆｏｒｎｓら（１９９９年、２０００年）の２つの研究の中で記述された。液性免疫応答（マウス及びマカクの両方における）は、細胞質ゾル内で発現されたＥ２変異体の場合と比べ細胞表面上で発現されたＥ２変異体の場合により早く発生し、より強いものであった。さらにマカクにおける液性応答は、１ｍｇのプラスミドＤＮＡをマカクに注射したにも関わらず、マウスにおける応答よりも低いものであった（Ｆｏｒｎｓら１９９９年）。追跡研究においては、細胞表面をターゲティングしたＥ２ＤＮＡ−ワクチンがチンパンジーに投与された（１０ｍｇのプラスミドＤＮＡ３回）。このワクチン接種は、１００ＣＩＤ５０（５０％のチンパンジー感染用量）同種モノクローナルＨＣＶでの抗原投与感染の時点で、殺菌性免疫を結果としてもたらさなかったが、急性ＨＣＶ感染からの回復は明らかであった。興味深いことに、急性ＨＣＶ感染からの回復は、以前にＨＣＶに感染した確率が最も高いチンパンジーにおいてより急速であった（Ｆｏｒｎｓら２０００年）。
【００１６】
アカゲザルに、コア発現ワクチニアウイルス、ＬＴＫ６３をアジュバントとするコア又はＩＳＣＯＭをアジュバントとするコアが、Ｄｒａｎｅら（国際公開第ＷＯ０１／３７８６９号）の研究において注射された。コア発現ワクチニアウイルス又はＩＳＣＯＭをアジュバントとするコアでの免役化により、ＣＤ８＋ＣＴＬ−応答が惹起された。コア−ＩＳＣＯＭで免役化された動物のさらなる分析が、持続性ＣＴＬ−応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答ならびにコアに対する液性応答を明らかにした。
【００１７】
Ｅ１／Ｅ２又はコア／Ｅ１／Ｅ２複合体でのチンパンジーの予防用ワクチン接種が、Ｃｈｏｏら１９９４年、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら１９９５年中に記述されている。１０ＣＩＤ５０同種ＨＣＶ（１ａ型のＨＣＶ−１）での抗原投与感染の時点で、抗原投与時にワクチンに対する最高の抗Ｅ１／Ｅ２−抗体応答をもつチンパンジーから感染が消散した。抗Ｅ２ＨＶＲＩ抗体レベルとウイルス抗原投与の成果のレベル間ではこのような相関関係は、Ｅ２−ＨＶＲＩに対する結合抗体の中和の存在が報告されているにも関わらず、全く明らかではなかった（Ｉｓｈｉｉら１９９８年、Ｓｈｉｍｉｚｕら１９９４年）。再抗原投与の時点でそして異種ＨＣＶ（もう１つの１ａ型分離株であるＨＣＶ−Ｈ）６４ＣＩＤ５０での最初の抗原投与を消散させたワクチン接種されたチンパンジーの再免役化の後、チンパンジーは、ウイルス血症は遅延されたものの、感染状態になった。
【００１８】
Ｅ１タンパク質でのチンパンジーの予防用及び治療用ワクチン接種については、ＷＯ９９／６７２８５およびＷＯ０２／０５５５４８の中で記述されている。治療的効果（ＡＬＴレベル、検出可能なＥ２−抗原及び肝臓炎症の減少）が、同じサブタイプ内部での異種設定（もう１つの１ｂ型ＨＣＶ分離株での感染を受けたチンパンジーにおいて有効な１ｂ型Ｅ１のワクチン）及び交差サブタイプ設定（１ａ型ＨＣＶでの感染を受けたチンパンジーにおいて有効な１ｂ型Ｅ１のワクチン）の両方において観察された。同じワクチンは同様に、異種１ｂ型ＨＣＶ１００ＣＩＤ５０での抗原投与を受けたワクチン接種済みのナイーブなチンパンジーにおける急性ＨＣＶ感染の消散をも結果としてもたらした。興味深いことに、チンパンジーで観察された免疫応答は、ＨＣＶ感染を受けたヒト及び健康なボランティアにおいても見られた。
【００１９】
以上のことから、ＨＣＶタンパク質により惹起された応答が、アジュバントのタイプ及びヘルパーペプチドの有無などのさまざまな因子によって左右されるという結論を下すことができる。免役応答も同様に、ペプチドの組合せによる惹起とペプチド単独での惹起の間で異なっている。ヒト以外の霊長類では、これまで、コア（アジュバントに応じた免役応答、予防的及び治療的効果は現在不明）、Ｅ１／Ｅ２又はコア／Ｅ１／Ｅ２タンパク質複合体（同種ＨＣＶに対する予防的防御）又はＥ１（予防的及び治療的効果）でのみ、調査目的のワクチン接種が実施されてきた。これらの調査目的のワクチン接種研究は、有望なものであったが、ＨＣＶタンパク質組合せに基づくワクチン組成物は、より広い免役応答ひいてはＨＣＶ感染に対する改善された予防的及び／又は治療的効果をもたらす結果となり得る。
【００２０】
発明の概要
１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を含むＨＣＶ免疫原性組成物に関する。前記ＨＣＶ免疫原性組成物は、少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を有効量含むＨＣＶワクチン組成物であり得る。前記ＨＣＶワクチン組成物は、それぞれ予防的及び／又は治療的有効量の少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を含む予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物であり得る。
【００２１】
特に、本発明のＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物はＨＣＶ  Ｅ１外被ペプチド及びＨＣＶ  ＮＳ３非構造ペプチドを含む。
【００２２】
１つの実施形態においては、本発明のＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物は、アミノ酸１９２−３２６にわたるＨＣＶポリタンパク質領域で構成されているＨＣＶ  Ｅ１ペプチド及びアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含んでいるＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドを含む。より詳細には、前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドはさらに、アミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたるＨＣＶポリタンパク質領域、例えばアミノ酸１０７３〜１０８１にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含み得る。前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドはアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶポリタンパク質領域及びアミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含むこともできる。さらなる実施形態においては、本発明のＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物は、配列番号１により定義されるＨＣＶ  Ｅ１ペプチド及び配列番号２により定義されるアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含むＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドを含む。より詳細には、前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドはさらに、例えば配列番号４により定義されるアミノ酸１０７３〜１０８１にわたるＨＣＶポリタンパク質領域といったような、配列番号３により定義されるアミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含み得る。前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドは、同様に、配列番号２及び配列番号３又は配列番号４により定義されるＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドをも含み得る。特に、かかるＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドは配列番号５により定義され得る。
【００２３】
さらなる態様においては、本発明は、そのいずれかが任意の医薬上許容される担体の他に少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチドを含んでおり、前記ＨＣＶペプチドが所望によりスペーサを介してリンクされている、ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物に関する。
【００２４】
さらなる態様においては、本発明は、そのいずれかが任意の医薬上許容される担体の他に少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチドを含んでおり、かつ、
−  前記ＨＣＶペプチドが合成ペプチド又は組換え型ペプチドであり、かつ／又は
−  前記ＨＣＶペプチドの少なくとも１つのシステインが可逆的又は不可逆的に遮断されており、かつ／又は
−  前記ＨＣＶ外被ペプチドの少なくとも１つのシステインがアルキル化されており、かつ／又は、
−  前記ＨＣＶ非構造ペプチドの少なくとも１つのシステインがスルホン化されており、かつ／又は
−  前記ＨＣＶ外被ペプチドがウイルス様粒子として前記組成物に添加されている、
ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物に関する。
【００２５】
もう１つの態様においては、本発明は、そのいずれかが、任意の医薬上許容される担体の他に、
−  異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド、又は
−  少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ非構造ペプチド、又は
−  異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ外被ペプチド及び異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ非構造ペプチド、
を含んでいる、ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物に関する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、本発明に従ったＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物の、
−  前記組成物のいずれかに含まれているＨＣＶペプチドに対する液性応答を哺乳動物の体内で誘発するため、及び／又は
−  ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答、及び／又はＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答及び／又はサイトカインの産生増加であり得る、前記組成物のいずれかの中に含まれるＨＣＶペプチドに対する細胞応答を、哺乳動物の体内で誘発するため、及び／又は
−  ＨＣＶが同種又は異種ＨＣＶであり得る、慢性ＨＣＶ感染に対する哺乳動物の予防的防御のため、及び／又は
−  ＨＣＶが同種又は異種ＨＣＶであり得る、慢性的にＨＣＶに感染した哺乳動物を治療的処置のため、及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物において肝疾患を低減させるため、及び／又は
−  全体イシャク（Ｉｓｈａｋ）評点に従って少なくとも２点だけ慢性ＨＣＶ感染哺乳動物内の肝疾患を低減させるため、及び／又は
−  例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はガンマ−グルタミルペプチダーゼであり得る血清肝酵素のＨＣＶ感染哺乳動物体内の活性レベルを低減させるため、及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物体内のＨＣＶ  ＲＮＡレベルを低減させるため、及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物体内の肝線維症の進行を減速させるため、及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物体内の肝線維症を低減させるため、
の使用を含んでいる。
【００２７】
前記哺乳動物は明らかにヒトであり得る。
【００２８】
特に、本発明に従った使用は、哺乳動物又はヒトに対し前記組成物のいずれかを投与することを含む、前述の効果のうちの少なくとも１つを得るための方法である。
【００２９】
本発明のその他の態様は、ＤＮＡワクチン及び本発明に従ったＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物を投与することを含む、ＨＣＶ−ナイーブな又はＨＣＶ感染した哺乳動物にワクチン接種する方法に関する。
【００３０】
発明の詳細な記述
本発明に導いた研究作業は、ＨＣＶ外被タンパク質、より詳細にはＥ１及びＨＣＶ非構造タンパク質、より詳細にはＮＳ３を、共に同じアジュバントを伴う処方の形で同時注射することで、ヒト以外の霊長類においてＨＣＶ抗原の両方に対する強い細胞性応答及び強い液性応答が惹起されるという予想外の効果を結果としてもたらした。この免役応答は、これまで調査目的のＨＣＶタンパク質ベースの免疫原性／ワクチン組成物で得られた免役応答に比べて広いものである。従って、観察された広い免役応答は、ＨＣＶ外被タンパク質抗原及びＨＣＶ非構造タンパク質抗原を、例えば治療的又は予防的目的のためワクチン組成物として哺乳動物の体内で使用可能な単一の免疫原性組成物の形で処方する途を開くものである。
【００３１】
かくして１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を含むＨＣＶ免疫原性組成物に関する。前記ＨＣＶ免疫原性組成物は、有効量の少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を含むＨＣＶワクチン組成物であってよい。前記ＨＣＶワクチン組成物は、それぞれ予防的及び／又は治療的有効量の少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド、少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド及び所望により医薬上許容される担体を含む予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物であり得る。
【００３２】
「免疫原性の」という語は、免役応答の少なくとも１つの要素を産生する１つのタンパク質又は物質の能力を意味する。免役応答は、抗原の導入に対する動物の体の全体的応答であり、抗体形成（液性応答又は液性免疫性）、細胞性応答、過敏性又は免疫学的寛容を含めた多数の要素を含んでいる。細胞免疫は、抗原により惹起される細胞性応答を意味し、Ｔヘルパー細胞及び／又はＣＴＬ応答を含む。「抗原」という語は、ペプチド、タンパク質又はその他の物質が抗原性又は免疫原性をもつ能力を意味する。抗原は少なくとも１つのエピトープを含むものと理解される。
【００３３】
「抗原性の」という語は、惹起された液性及び／又は細胞性免役応答によって認識されるタンパク質又は物質の能力を意味する。標準的には、タンパク質又は物質の抗原性の質は、インビトロアッセイによって決定される。液性応答については、例えばタンパク質又は物質が惹起された抗体により認識され得、かかる認識が例えば比色分析、蛍光検出又は放射能検出又は沈降物形成により測定可能である例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、免疫沈降アッセイ又は任意の類似のアッセイの中で、惹起された抗体によって認識される場合に、そのタンパク質又は物質は抗原性であると言うことができる。細胞性応答については、タンパク質又は物質は、例えば免役応答が惹起された個体から引出されたＴ細胞の存在下でそれがインキュベートされ例えば増殖応答、細胞溶解応答、サイトカイン分泌によりＴ細胞による認識が測定される、例えばＴ細胞増殖アッセイ、５１Ｃｒ−放出アッセイ、サイトカイン分泌アッセイなどにおいて、惹起されたＴ細胞応答によってそれが認識される場合に、抗原性であると言うことができる。抗原性のタンパク質又は物質はそれ自体免疫原性であり得るが、免疫原性となるために付加的構造を必要とする可能性もある。
【００３４】
「免疫原性組成物」というのは、免疫原性があるとされる組成物、すなわち、免役応答をひき起こす能力をもつ動物の体内に導入された時点で自らの中に含まれた抗原に対する免役応答の少なくとも１つの要素を惹起する能力を有する抗原を含む組成物である。免疫原性組成物は、明らかに２つ以上の抗原、すなわち例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上、例えば最高１５、２０、２５、３０、４０又は５０個以上の全く異なる抗原といった複数の抗原を含み得る。特に、本発明の免疫原性組成物は、抗原が、ＨＣＶ外被タンパク質抗原及び／又はＨＣＶ非構造タンパク質抗原といったようなＨＣＶ抗原であるＨＣＶ免疫原性組成物である。
【００３５】
「ワクチン組成物」というのは、以下の効果のうちの１つ又は両方をひき起こすのに充分な広さ及び強さをもつ免役応答を惹起する能力をもつ免疫原性組成物である。
−  宿主の体内にすでに存在しそれに対してワクチン組成物がターゲティングされている病原体の増幅に対する安定化効果、及び
−  宿主の体内に新たに導入された病原体が、この病原体に対してターゲティングされたワクチン組成物での免疫化の後に前記宿主から消散される速度を増大させる効果。
【００３６】
ワクチン組成物は明らかに、宿主内にすでに存在する病原体の生存に対し負の効果を及ぼすのに充分な広さ及び強さを有する、又は新たに導入された病原体によってひき起こされる疾病症候を免疫化済み宿主が発生させないようにするのに充分な広さ及び強さを有する免役応答をひき起こすこともできる。特に、本発明のワクチン組成物は、病原体がＨＣＶであるＨＣＶワクチン組成物である。
【００３７】
１つのワクチン組成物内の抗原の「有効量」は、免役応答を惹起するために必要かつ充分である抗原の量として言及されている。当業者にとっては、ワクチン組成物によって想定されている効果をひき起こすのに充分な広さ及び強さを有する免役応答には、ワクチン接種スキーム又はワクチン接種計画の一部分として（時間的に）連続するワクチン組成物での免疫化が必要となる可能性がある、ということは明白であろう。「有効量」は、処置を受ける個体の健康状態及び体調、処置を受ける個体の分類学的グループ（例えばヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の有効な免役応答を開始する能力、望まれる防御の度合、ワクチンの処方、処置担当医師の査定、感染性病原体の菌株及びその他の関連因子に応じて変動し得る。この量は、日常的試行を通して決定可能な比較的広い範囲の中に入ると予想される。通常、この量は０．０１〜１０００μｇ／用量、より詳細には０．１〜１００μｇ／用量まで変動することになる。投薬治療は、単一用量計画又は多重用量計画であってよい。ワクチンは、その他の免疫調節作用物質と併用して投与してもよい。
【００３８】
「予防用ワクチン組成物」というのは、防御免疫すなわち予防用ワクチン組成物で免疫化された宿主の抗原投与の時点で疾病の発生を防止する免疫を提供するワクチン組成物である。特にＨＣＶについては、予防用ＨＣＶワクチン組成物は、抗原投与ＨＣＶ感染を急速に消散させるのを助けかつ／又は抗原投与ＨＣＶ感染が慢性感染にまで進行するのを防ぐ防御免疫を提供する能力をもつワクチン組成物として理解されるべきである。かくして、本発明に従った予防用ＨＣＶ組成物でのワクチン接種により、加速化されたＨＣＶウイルス浄化又は加速化されたＨＣＶ抗原投与感染制御が想定される。
【００３９】
予防用ワクチン組成物内の抗原の「予防的有効量」は、防御免疫の発生を可能にする免疫応答を惹起するのに必要かつ充分な抗原の量として言及されている。当業者にとっては、予防用ワクチン組成物により想定された効果をひき起こすのに充分な広さ及び強さをもつ免役応答が、予防用ワクチン組成物での（時間的に）連続する免疫化を要求する必要があるかもしれない、ということは明白であろう（「有効量」も参照のこと）。
【００４０】
「治療用ワクチン組成物」は、治ゆ的免役応答、すなわちすでに確立した病原体の感染に付随する疾病症候の逆転をもたらす能力をもつか又は少なくともその中止をもたらす能力を有する免役応答を提供するワクチン組成物である。特にＨＣＶについては、治療的ＨＣＶワクチン組成物というのは、血中の例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はγ−グルタミルペプチダーセ（γ−ＧＴ）といった血清肝酵素の活性レベルを低減させる能力及び／又はＨＣＶ  ＲＮＡレベルを低減させる能力及び／又は肝疾患を低減させる能力及び／又は肝線維症を低減させる能的及び／又は肝線維症の進行を減速させる能力をもつワクチン組成物として理解されるべきである。
【００４１】
治療用ワクチン組成物内の抗原の「治療上の有効量」は、治ゆ的免役応答の発生を可能にする免役応答を惹起するのに必要かつ充分な抗原の量として言及されている。当業者にとっては、治療用ワクチン組成物により想定された効果をひき起こすのに充分な広さ及び強さをもつ抗原性又は免疫原性応答が治療用ワクチン組成物での（時間的に）連続する免疫化を要求する必要があるかもしれない、ということは明白であろう（「有効量」も参照のこと）。
【００４２】
特に、本発明のＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物は、ＨＣＶ  Ｅ１外被ペプチド及びＨＣＶ  ＮＳ３非構造ペプチドを含む。ＨＣＶ外被ペプチド及びＨＣＶ非構造ペプチドのその他の組合せも、除外されるわけではなく、例えばＥ１とＮＳ２、Ｅ１とＮＳ４、Ｅ１とＮＳ４Ａ、Ｅ１とＮＳ４Ｂ、Ｅ１とＮＳ５、Ｅ１とＮＳ５Ａ、Ｅ１とＮＳ５Ｂ、Ｅ２とＮＳ２、Ｅ２とＮＳ４、Ｅ２とＮＳ４Ａ、Ｅ２とＮＳ４Ｂ、Ｅ２とＮＳ５、Ｅ２とＮＳ５Ａ及びＥ２とＮＳ５Ｂを含む。
【００４３】
「ＨＣＶ外被ペプチド」というのは、本明細書では、免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物の中に含まれた場合、それぞれ免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物について定義された通りの免役応答を惹起する能力をもつあらゆるＨＣＶＥ１又はＥ２タンパク質、そのあらゆるフラグメント又はそのあらゆる誘導体を意味する。より詳細には、免役原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物は、それぞれ本発明に従ったＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、治療用ＨＣＶワクチン組成物又は予防用ＨＣＶワクチン組成物である。
【００４４】
「ＨＣＶ非構造ペプチド」というのは、本明細書では、免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物の中に含まれた場合、それぞれ免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物について定義された通りの免役応答を惹起する能力をもつあらゆるＨＣＶＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５タンパク質、そのあらゆるフラグメント（例えばＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）又はそのあらゆる誘導体を意味する。より詳細には、免役原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物は、それぞれ本発明に従ったＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、治療用ＨＣＶワクチン組成物又は予防用ＨＣＶワクチン組成物である。
【００４５】
ＨＣＶペプチドの誘導体というのは、修飾されたアミノ酸（例えばビオチン又はジゴキシゲニン、非天然アミノ酸と接合されたもの）を含むＨＣＶペプチド、１つ以上のアミノ酸の（天然に発生するＨＣＶ配列との関係における）挿入又は欠失を含むＨＣＶペプチドならびに融合タンパク質を含むよう意図されている。融合タンパク質は、全く異なる２つのＨＣＶペプチド間（以下参照）、又はＨＣＶペプチドとＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ又はサイトカインといったようなもう１つのペプチド、又はタンパク質の間で形成され得る。その他のペプチド又はタンパク質の融合パートナとしては、ウシ血清アルブミン（ａｌｂｕｍ）、キーホールリンペットヘモシアニン、ダイズ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ又はジヒドロ葉酸還元酵素又は（ヒスチジン）６−ｔａｇ、タンパク質Ａ、マルトース結合タンパク質、Ｔａｇ・１００エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ、タンパク質Ｃエピトープ又はＶＳＶエピトープといった異種エピトープが含まれる。その他のタンパク質としては、ヒストン、１本鎖結合タンパク質（ｓｓＢ）及び未変性及び工学処理済み蛍光タンパク質例えば緑色、赤色、青色、黄色、シアン蛍光タンパク質が含まれる。
【００４６】
ＨＣＶ外被タンパク質及びＨＣＶ非構造タンパク質は、アミノ酸１９２−３８３（Ｅ１の場合）、アミノ酸３８４−８０９又は３８４−７４６（それぞれＥ２−ｐ７及びＥ２の場合）、アミノ酸８１０−１０２６（ＮＳ２の場合）、アミノ酸１０２７〜１６５７（ＮＳ３の場合）、アミノ酸１６５８−１７１１（ＮＳ４Ａの場合）、アミノ酸１７１２〜１９７２（ＮＳ４Ｂの場合）、アミノ酸１９７３〜２４２０（ＮＳ５Ａの場合）、及びアミノ酸２４２１〜３０１１（ＮＳ５Ｂの場合）にわたるＨＣＶポリタンパク質領域に対応する。これらのタンパク質終点が近似であること（例えばＥ２のカルボキシ末端は、例えばアミノ酸７３０、７３５、７４０、７４２、７４４、７４５、好ましくは７４６、７４７、７４８、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８０９、８１０、８２０で終結する７３０〜８２０のアミノ酸領域内のどこかに存在し得る）を理解すべきである。
【００４７】
１つの実施形態においては、本発明のＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物は、アミノ酸１９２−３２６にわたるＨＣＶポリタンパク質領域で構成されているＨＣＶ  Ｅ１ペプチド及びアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含んでいるＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドを含む。より詳細には、前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドはさらに、アミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたるＨＣＶポリタンパク質領域、例えばアミノ酸１０７３〜１０８１にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含み得る。前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドはアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶポリタンパク質領域及びアミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含むこともできる。さらなる実施形態においては、本発明のＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物は、配列番号１により定義されるＨＣＶ  Ｅ１ペプチド及び配列番号２により定義されるアミノ酸１１８８〜１４６８にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含むＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドを含む。より詳細には、前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドはさらに、例えば配列番号４により定義されるアミノ酸１０７３〜１０８１にわたるＨＣＶポリタンパク質領域といったような、配列番号３により定義されるアミノ酸１０７１〜１０８４又はその一部分にわたるＨＣＶポリタンパク質領域を含み得る。前記ＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドは、同様に、配列番号２及び配列番号３又は配列番号４により定義されるＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドをも含み得る。特に、かかるＨＣＶ  ＮＳ３ペプチドは配列番号５により定義され得る。
【００４８】
さらなる態様においては、本発明は、そのいずれかが任意の医薬上許容される担体の他に少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチドを含んでおり、前記ＨＣＶペプチドが所望によりスペーサを介してリンクされている、ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物に関する。
【００４９】
さらなる態様においては、本発明は、そのいずれかが任意の医薬上許容される担体の他に少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチドを含んでおり、かつ、
−  前記ＨＣＶペプチドが合成ペプチド又は組換え型ペプチドであり、かつ／又は
−  前記ＨＣＶペプチドの少なくとも１つのシステインが可逆的又は不可逆的に遮断されており、かつ／又は
−  前記ＨＣＶ外被ペプチドの少なくとも１つのシステインがアルキル化されており、かつ／又は
−  前記ＨＣＶ非構造ペプチドの少なくとも１つのシステインがスルホン化されており、かつ／又は
−  前記ＨＣＶ外被ペプチドがウイルス様粒子として前記組成物に添加されている、
ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物に関する。
【００５０】
本発明に従った免役原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物の中に含まれるＨＣＶペプチドは、別々の非リンク型ペプチドとして存在し得る。あるいはまた、前記ＨＣＶペプチドは、所望によりスペーサを介してリンクされていてよい。
【００５１】
前記リンケージは、１つのペプチドのアルファアミノ基及びもう１つのペプチドのアルファカルボキシ基が関与する正規のペプチド結合を介して２つ以上のペプチドがリンクされている、無スペーサ線形融合タンパク質の形をとり得る。
【００５２】
あるいはまた、２つのペプチドをリンクするためにペプチドスペーサが使用される。ペプチドスペーサは、リンクすべきＨＣＶペプチドのいずれが一方に天然にリンクされていないＨＣＶペプチド又は非ＨＣＶペプチドであり得る。このようなスペーサの標準的な例としては、ｎが１〜５の範囲内にあるものとしてＧ４Ｃ（Ｇ４Ｓ）ｎ又は（Ｇ４Ｓ）ｎが考えられる（パーク（Ｐａｒｋ）ら、２００１年、フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）ら、２０００年）。
【００５３】
あるいはまた、前記リンケージは、例えば天然に発生するかつ／又は天然に発生しないシステインの間のジスルフィド結合を介して又は例えば２つ以上のペプチドのうちの少なくとも１つの中に存在する天然に発生する又は天然に発生しないリジンのイプシロンアミノ基が関与するペプチド結合を介して前記２つ以上のペプチドがリンクされている分枝融合タンパク質の形をとっている。
分離したペプチドの組換え型産生及び分枝融合ペプチドの合成的構築を除外することなく合成的手段を介して分枝融合ペプチドを得ることができるということが明らかになるだろう。線形融合ペプチドならびに分離した非リンク型ペプチドは、合成的手段及び／又は組換え型産生を介して得ることができる。
【００５４】
明らかに、本発明に従った免役原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物中に含まれる２つ以上のＨＣＶペプチドは、「担体」、例えば複数のペプチドを共有結合又はイオン結合する能力をもつ活性化された樹脂の粒子といったような非ペプチドスペーサを介してリンクされた状態で発生し得る。
【００５５】
スペーサは同様に、その表面上及び／又は粒子の内部キャビティ内でＨＣＶペプチドを吸収する能力をもつ粒子化合物又は担体をも含んでいる。
【００５６】
ＨＣＶ外被ペプチド又はＨＣＶ非構造ペプチドはいずれも、示されているように、合成由来すなわち有機化学を応用して合成されたものであっても、又組換え由来であってもよい。ＨＣＶペプチドは、組換え型ウイルスの感染を受けた哺乳動物又は昆虫の細胞、酵母細胞又は細菌細胞の中での発現により産生可能である。
【００５７】
より詳細には、前記哺乳動物細胞には、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＲＫ１３細胞、ＭＲＣ−５細胞、チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞及びＰＫ１５細胞が含まれる。
【００５８】
より詳細には、前記昆虫細胞には、Ｓｆ９細胞といったようなＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞が含まれる。
【００５９】
より詳細には、前記組換え型ウイルスには、組換え型ワクシニアウイルス、組換え型アデノウイルス、組換え型バキュロウイルス、組換え型カナリア痘瘡ウイルス、組換え型セムリキ森林熱ウイルス、組換え型アルファウイルス、組換え型アンカラ修飾ウイルス及び組換え型アビポックスウイルスが含まれる。
【００６０】
より詳細には、前記酵母細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍといったＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅといったＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓといったＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａといったＹａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａといったＨａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓといったＰｉｃｈｉａ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａといったＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、又はＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓといったＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓの細胞、又はこれらのいずれかから誘導された突然変異体細胞が含まれる。より詳細には、本発明に従ったＨＣＶペプチド又はその一部分は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ細胞内の発現産物である。
【００６１】
より詳細には、前記細菌細胞には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種の細胞が含まれる。
【００６２】
本明細書に記述されている通りのＨＣＶペプチド又はその一部分の中では、前記ペプチド内に含まれた１つのシステイン残基又は２つ以上のシステイン残基が「可逆的又は不可逆的に遮断」されていてよい。
【００６３】
「不可逆的に遮断されたシステイン」というのは、そのシステインチオール基が化学的又は酵素的手段により不可逆的に防御されているシステインである。特に、化学的手段による「不可逆的防御」又は「不可逆的遮断」は、アルキル化、好ましくは例えば活性ハロゲン、エチレンイミン又はＮ−（ヨードエチル）トリフルオロ−アセトアミドといったようなアルキル化剤を用いた１つのタンパク質内のシステインのアルキル化を意味する。この点において、システインチオール基のアルキル化は、ｎが０、１、２、３又は４であり、Ｒ＝Ｈ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＮＨ２、フェニル又はそのあらゆる誘導体である（ＣＨ２）ｎＲによるチオール−水素の置換を意味するということを理解すべきである。アルキル化は、ＸがＩ、Ｂｒ、Ｃｌ又はＦといったハロゲンである活性ハロゲンＸ（ＣＨ２）ｎＲなどといったような当該技術分野において既知のあらゆる方法によって実施可能である。活性ハロゲンの例としては、ヨウ化メチル、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、及び２−ブロモエチルアミンがある。その他のアルキル化方法には、ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）又はビオチン−ＮＥＭ又はそれらの混合物の使用が含まれる（ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）１９９６年）。本明細書で使用されている「アルキル化剤」という語は、本明細書で記述されるようなアルキル化を実施することのできる化合物を意味する。かかるアルキル化は最終的に、その他のアミノ酸を模倣できる修飾システインを結果としてもたらす。エチレンイミンによるアルキル化は、トリプシンのための新しい開裂部位が導入されるような形でリジンに似た構造を結果としてもたらす（ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）１９９６年）。同様にして、ヨウ化メチルの使用は、結果としてメチオニンに似たアミノ酸をもたらし、一方ヨードアセテート及びヨードアセトアミドの使用は、それぞれグルタミン酸及びグルタミンに似たアミノ酸をもたらす。類推によりこれらのアミノ酸は好ましくはシステインの直接的突然変異において使用される。
【００６４】
「可逆的に遮断されたシステイン」というのは、そのシステインチオール基が可逆的に防御されているシステインのことである。特に本明細書で用いられている「可逆的防御」又は「可逆的遮断」といった語は、システインチオール基に対する修飾作用物質の共有結合、ならびにシステインチオール基のレドックス状態が維持されるような形でのタンパク質の環境の操作（遮へい）を企図している。システインチオール基の可逆的防御は、化学的又は酵素的に実施可能である。
【００６５】
本明細書で使用されている通りの「酵素的手段による可逆的防御」という語は、パルミトイルアシルトランスフェラーゼといったようなチオ−エステル化の触媒として関与するアシル−トランスフェラーゼなどのアシル−トランスフェラーゼといったような酵素によって媒介される可逆的防御を企図している。
【００６６】
本明細書で使用されている通りの「化学的手段による可逆的防御」という語は、以下のものによる可逆的防御を企図している。
【００６７】
１．例えばスルホン化及びチオ−エステル化などによりシステイニルを可逆的に修飾する修飾作用物質による。
スルホン化は、ジスルフィド架橋に関与するチオール又はシステインがＳ−スルホネートへと修飾される反応である。ＲＳＨ→ＲＳ−ＳＯ３−（ダルブル（Ｄａｒｂｒｅ）１９８６）又はＲＳ−ＳＲ→２ＲＳ−ＳＯ３−（亜硫酸との反応（ｓｕｌｆｉｔｏｌｙｓｉｓ）（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９８６年））。スルホン化のための試薬は、例えばＮａ２ＳＯ３又は四チオン酸ナトリウムである。後者のスルホン化用試薬は、１０〜２００ｍＭの濃度、より好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度で使用される。所望により、スルホン化は、例えばＣｕ２＋（１００μＭ−１ｍＭ）又はシステイン（１〜１０ｍＭ）といった触媒作用剤（ｃａｔａｌｙｓａｔｏｒ）の存在下で実施可能である。
【００６８】
反応は、タンパク質変性ならびに未変性条件下で実施可能である（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９８５、１９８６）。
【００６９】
チオエステル結合形成又はチオ−エステル化は、Ｘが好ましくは化合物Ｒ’ＣＯ−Ｘ内のハロゲン化物であるものとして、
ＲＳＨ＋Ｒ’ＣＯＸ→ＲＳ−ＣＯＲ’
により特徴づけされる。
【００７０】
２．例えば重金属特にＺｎ２＋、Ｃｄ２＋、モノ−、ジチオ−、及びジスルフィド化合物（例えばアリール−及びアルキルメタンチオスルホネート、ジチオピリジン、ジチオモルフォリン、ジヒドロリポアミド、エルマン試薬、アルドロチオールＴＭ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））（レイン（Ｒｅｉｎ）ら、１９９６年）、ジチオカルバメート）、又はチオール化剤（例えばグルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システインアミン）などによる、本発明のシステイニルを可逆的に修飾する修飾作用物質による。ジチオカルバメートには、スルフィドリル基と反応する能力を付与するＲ１Ｒ２ＮＣ（Ｓ）ＳＲ３官能基を有する広範な分子クラスが含まれる。チオール含有化合物は、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、そしてさらに一層好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度で使用される。
【００７１】
３．１０μＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは１〜１０ｍＭの濃度範囲での、チオール状態を保存する（安定化する）修飾作用物質、特に例えばＤＴＴ、ジヒドロアスコルビン酸塩、ビタミン及び誘導体、マンニトール、アミノ酸、ペプチド及び誘導体（例えばヒスチジン、エルゴチオネイン、カルノシン、メチオニン）、没食子酸塩、ヒドロキシアニソール、ヒドロキシトルエン、ハイドロキノン、ヒドロキシメチルフェノール及びそれらの誘導体といったような酸化防止物質（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｉａ）の存在による。
【００７２】
４．例えば、（ｉ）金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋）、ＡＴＰといったような共同因子、（ｉｉ）ｐＨ制御（例えば、タンパク質については大部分のケースで、ｐＨ約５又はｐＨは好ましくはチオールｐＫａ−２、例えば逆相クロマトグラフィにより精製されたペプチドについてはｐＨ約２）といったようなチオール安定化条件による。
【００７３】
（１）、（２）、（３）及び（４）に記述されているような可逆的防御の組合せを適用することもできる。
【００７４】
可逆的防御及びチオール安定化化合物は、単量体、重合体又はリポソーム形状で提示され得る。
【００７５】
システイン残基の可逆的防御状態の除去は、例えば以下のものにより、化学的又は酵素的に達成可能である。
−  特に１〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜２００ｍＭの濃度での、特にＤＴＴ、ＤＴＥ、２−メルカプトエタノール、亜ジチオン酸塩、ＳｎＣｌ２、水素化ホウ素ナトリウム、ヒドロキシルアミン、ＴＣＥＰといった還元剤、
−  例えばｐＨの増加によるチオール安定化条件又は作用物質の除去、
−  特に０．０１〜５μＭの濃度、さらに一層詳細には０．１〜５μＭの濃度範囲内のチオエステラーゼ、グルタレドキシン、チオレドキシンなどの酵素、
−  上述の化学的及び／又は酵素的条件の組合せ。
【００７６】
システイン残基の可逆的防御状態の除去は、例えば細胞内又は個体内でインビトロ又はインビボで実施可能である。
【００７７】
本発明に従った還元剤は、例えば「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋などのシステイン残基内の硫黄の還元、システイン残基の脱スルホン化（ＲＳ−ＳＯ３−→ＲＳＨ）を達成するあらゆる作用物質である。酸化防止剤は、チオール状態を保存するか、「Ｓ−Ｓ」形成及び／又は免疫を最小限におさえるあらゆる試薬である。「Ｓ−Ｓ」ジスルフィド架橋の還元は、ジスルフィドをチオール（−ＳＨ）まで還元する化学反応である。特にＨＣＶ外被ペプチドに関しては、ジスルフィド架橋破壊剤及びその方法が、メーテンス（Ｍａｅｒｔｅｎｓ）らにより、国際公開第９６／０４３８５号パンフレット中で開示されている。「Ｓ−Ｓ」還元は（１）酵素カスケード経路又は（２）還元化合物によって得ることができる。チオレドキシン、グルタレドキシンのような酵素は、ジスルフィドのインビボ還元に関与することがわかっており、インビトロで「Ｓ−Ｓ」架橋を還元するのに有効であることも示されてきた。ジスルフィド結合は、ＤＴＴでの反応についての対応する速度定数よりも約１０４倍大きいものである見かけの二次的速度で、ｐＨ７．０の還元されたチオレドキシンにより急速に開裂させられる。還元反応速度は、１ｍＭのＤＴＴ又はジヒドロリポアミドとのタンパク質溶液のプレインキュベーションにより劇的に増大させることができる（ホルムグレン（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）１９７９年）。タンパク質ジスルフィド架橋を還元できるチオール化合物は、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、β−メルカプトエタノール、チオカルバメート、ビス（２−メルカプトエチル）スルホン及びＮ，Ｎ’−ビス（メルカプトアセチル）ヒドラジン及び亜ジチオン酸ナトリウムである。モノクローナル抗体中のジスルフィド架橋の還元に非常に有用であることが示されてきた（サクール（Ｔｈａｋｕｒ）ら、１９９１年）アスコルビン酸塩又は塩化第一スズ（ＳｎＣｌ２）などのチオール基を含まない還元剤も同様に、ＨＣＶタンパク質の還元用に使用することができる。さらに、ｐＨ値の変化もＨＣＶタンパク質のレドックス状態に影響を及ぼし得る。水素化ホウ素ナトリウムでの処理が、ペプチド内のジスルフィド架橋の還元に有効であることが示されてきた（ガイリット（Ｇａｉｌｉｔ）１９９３）。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、低いｐＨでジスルフィドを還元することができる（バーンス（Ｂｕｒｎｓ）ら、１９９１）。セレノールは、還元剤としてＤＴＴ又は水素化ホウ素ナトリウムが用いられた場合、ジスルフィドからチオールへの還元の触媒として作用する。市販のジセレニドであるセレノシステアミンは、触媒の前駆体として使用された（シング及びカッツ（Ｓｉｎｇｈ  ＆  Ｋａｔｓ）、１９９５年）。
【００７８】
「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」、「ウイルス様粒子（ｖｉｒａｌ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」又は「ＶＬＰ」という語は、本明細書では、それ自体で１つ又は２つのＥ１及び／又はＥ２単量体をそれぞれ構成すると考えられているＨＣＶＥ１及び／又はＥ２外被タンパク質の複数の基本単位を含有する詳細性質及び形状の構造として定義づけされている。本発明の粒子が、感染性ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムを持たないものとして定義されていることは、明白でなくてはならない。本発明の粒子は、脂質、洗浄剤、ＨＣＶコアタンパク質又はアジュバント分子を中に取込むことのできる外被タンパク質のシェルから成る、中空であってよい球状の高次粒子であり得る。この高次粒子は、同様にリポソーム又は例えばアポリポタンパク質Ｂといったようなアポリポタンパク質又は低密度リポタンパク質によって、又は特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングするその他のあらゆる手段により封入されていてもよい。この場合、このような中空球状粒子は往々にして「ウイルス様粒子」又はＶＬＰと呼ばれる。あるいはまた、高次粒子は、完全な球体がＨＣＶＥ１又はＥ２外被タンパク質オリゴマ−から成っているか、脂質、洗浄剤、ＨＣＶコアタンパク質又はアジュバント分子を付加的に中に取込むことができるか又は、リポソーム又は例えばアポリポタンパク質Ｂといったアポリポタンパク質、低密度リポタンパク質によって又は例えばアシアロ糖タンパク質などの特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングするその他のあらゆる手段によりそれ自体封入され得る、中実球状構造であり得る。粒子は同様に、通常は丸い（後述の部分参照）形状のものでありかつ通常はＨＣＶ外被タンパク質を単層しか含んでいない（上述の中空又は中実球状構造に比べて）さらに小さい構造から成り得る。このようなさらに小さい粒子の標準的な例は、通常４〜１６の間の少数のＨＣＶ外被タンパク質から成るロゼット様の構造である。後者の詳細な例としては、見かけ上８〜１０個のＥ１単量体を含む本明細書に例示されている通りの０．２％のＣＨＡＰＳ中のＥ１で得られるより小さな粒子がある。かかるロゼット様の構造は、一つの平面内に組織され、通常例えばホイール状といった丸形である。ここでも又、脂質、洗浄剤、ＨＣＶコアタンパク質又はアジュバント分子を付加的に取込むことができ、そうでなければ、より小さい粒子を、リポソーム又は例えばアポリポタンパク質Ｂといったアポリポタンパク質又は低密度リポタンパク質によってか又は特定の器官又は組織に対し前記粒子をターゲティングするその他のあらゆる手段によって封入させてもよい。より小さい粒子は同様に、脂質、洗浄剤、ＨＣＶコアタンパク質又はアジュバント分子を付加的に中に取込むことができるか又は、リポソーム又は例えばアポリポタンパク質Ｂといったアポリポタンパク質又は低密度リポタンパク質によって又は特定の器官又は組織に前記粒子をターゲティングするその他のあらゆる手段によりそれ自体封入され得る、類似のより少数のＨＣＶＥ１又はＥ２外被タンパク質から成る小さな球状又は小球状構造であってもよい。当該技術分野において周知の動的光散乱技術によって測定される通りの以上で定義された粒子のサイズ（すなわち直径）は、通常１〜１００ｎｍの間、より好ましくは２〜７０ｎｍの間にある。ＨＣＶ外被タンパク質のウイルス様粒子は、国際特許出願国際公開第９９／６７２８５号パンフレット、同第０２／０５５５４８号パンフレット及び国際特許出願ＰＣＴ／ＢＥ０２／０００６３号パンフレットの中で記述されてきた。
【００７９】
もう１つの態様においては、本発明は、任意の医薬上許容される担体の他に、
−  異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ外被ペプチド及び少なくとも１つのＨＣＶ非構造ペプチド、又は
−  少なくとも１つのＨＣＶ外被ペプチド及び異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ非構造ペプチド、又は
−  異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ外被ペプチド及び異なるＨＣＶ遺伝子型、サブタイプ又は分離株から誘導された複数のＨＣＶ非構造ペプチド、
を含んでいる、ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物に関する。
【００８０】
現在既知のＨＣＶ型は、ＨＣＶ遺伝子型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を含み、その既知のサブタイプは、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、４ｊ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、５ａ、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ、８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａ及び１１ａのＨＣＶサブタイプを含む。複数のプロトタイプ分離株の完全なゲノムを網羅するｃＤＮＡクローンの配列は決定されており、ＨＣＶ遺伝子型１ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００９６０６）、１ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０１６７８５）、１ｃ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１４８５３）、２ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４７６３９）、２ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３０９０９）、２ｃ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ５０４０９）、２ｋ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０３１６６３）、３ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４６８６６）、３ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ４９３７４）、４ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１１６０４）、５ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０６４４９０）、６ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１２０８３）、６ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８４２６２）、７ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８４２６３）、８ｂ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８４２６４）、９ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８４２６５）、１０ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ６３８２１）及び１１ａ（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ６３８２２）の完全プロトタイプゲノムを含む。新しいＨＣＶ遺伝子型がさらに国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０２／０９７３１号パンフレットの中で記述されている。ＨＣＶ分離株が、ＨＣＶ感染哺乳動物から単離されたＨＣＶ準種とみなされることになる。ＨＣＶ準種には、通常同じＨＣＶ型又はＨＣＶサブタイプの変異体ゲノムをもつ一定数の変異体ウイルスが通常含まれる。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、本発明に従ったＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物の、
−  前記組成物のいずれかに含まれているＨＣＶペプチドに対する液性応答を哺乳動物の体内で誘発するため、及び／又は
−  ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答、及び／又はＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答及び／又はサイトカインの産生増加であり得る、前記組成物のいずれかの中に含まれるＨＣＶペプチドに対する細胞応答を、哺乳動物の体内で誘発するため、及び／又は、
−  ＨＣＶが同種又は異種ＨＣＶであり得る、慢性ＨＣＶ感染に対する哺乳動物の予防的防御のため、及び／又は
−  ＨＣＶが同種又は異種ＨＣＶであり得る、慢性的にＨＣＶに感染した哺乳動物の治療的処置のため、及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物において肝疾患を低減させるため、及び／又は
−  全体イシャク（Ｉｓｈａｋ）評点に従って少なくとも２点だけ慢性ＨＣＶ感染哺乳動物内の肝疾患を低減させるため、及び／又は
−  例えばアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はガンマ−グルタミルペプチダーゼであり得る血清肝酵素のＨＣＶ感染哺乳動物体内の活性レベルを低減させる、ため及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物体内のＨＣＶ  ＲＮＡレベルを低減させるため、又は、
−  ＨＣＶ感染哺乳動物体内の肝線維症の進行を減速させるため、及び／又は
−  ＨＣＶ感染哺乳動物体内の肝線維症を低減させるため、
の使用を含んでいる。
【００８２】
前記哺乳動物は明らかにヒトであり得る。
【００８３】
特に、本発明に従った使用は、哺乳動物又はヒトに対し前記組成物のいずれかを投与することを含む、前述の効果のうちの少なくとも１つを得るための方法である。
【００８４】
エピトープというのは、それに対する免疫応答の惹起に関与する細胞に結合しかつ／又はこれを活性化させる能力をもつ構造を意味する。かくして、エピトープには、Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔ−ヘルパー細胞及びＣＴＬのエピトープが含まれる。エピトープには、立体配座エピトープ及び線形エピトープが含まれる。線形エピトープは、例えば制限された数の全く異なる要素と共に解釈される反復的構造の隣接する要素の制限されたセットである。立体配座エピトープには通常、例えば、このような反復的構造の離れた要素が含まれているが、これらの要素はそれでも、前記反復的構造の３次元折畳みに起因して極く近くにある。このような反復的構造の周知の例としては、隣接する又は離れた要素がアミノ酸であるペプチド又はタンパク質がある。ペプチド−又はタンパク質−エピトープは、例えばＴ細胞レセプタ、Ｂ細胞レセプタ、抗体又はＭＨＣ分子に結合する能力をもつペプチド又はペプチドの一部分又はタンパク質を含む。線形ペプチド−又はタンパク質−エピトープのサイズは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個といったわずかなアミノ酸に制限され得る。エピトープは抗原性であるが、つねに免疫原性であるとは限らない。
【００８５】
Ｔ細胞刺激エピトープというのは、Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、又はＣＴＬ−細胞を刺激する能力をもつエピトープを意味する。Ｔヘルパー細胞刺激エピトープは、そのアミノ酸配列内に（推定上の）Ｔ細胞刺激エピトープを含む（潜在的抗原性）ポリペプチドに向かってのＣＤ４＋Ｔ細胞増殖応答とも呼ばれるリンパ増殖性応答を監視することによって選択され得る。前記リンパ増殖性応答は、Ｔ細胞刺激活性についてテストすべき変動する濃度のペプチドでの患者の血清からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインビトロ刺激を含むＴヘルパー検定及びＰＢＭＣにより取上げられた放射線認識されたチミジンの量の計数により測定可能である。増殖は、刺激指数（対照培養の平均ｃｐｍあたりの抗原刺激された培養の平均ｃｐｍ）が１を超える、好ましくは２を超える、より好ましくは３を超える場合に陽性とみなされる。ＣＴＬ刺激エピトープは、５１Ｃｒ放出を用いる、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答とも呼ばれる細胞毒性細胞の溶解活性を測定する細胞毒性Ｔリンパ球又は細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイによって選択可能である。例えばＥＬＩＳｐｏｔアッセイによりサイトカイン産生を測定することによって、細胞媒介型応答を査定することもできる（例えばフジハシ（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ）ら、１９９３年を参照のこと）。Ｔｈ１−様応答の特徴は、例えばＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γの産生／分泌である。Ｔｈ２−様応答の特徴は、例えばＩＬ−４の産生／分泌である。
【００８６】
「同種ＨＣＶによる感染に対する予防的防御」というのは、ＨＣＶ抗原（複数も可）が由来するＨＣＶ遺伝子型、サブタイプまたは単離体と全く同じ遺伝子型、サブタイプまたは単離体の抗原投与ＨＣＶウイルスに対して得られる防御を意味する。組成物には例えば、共に特定のＨＣＶ１ｂ型分離株から誘導されているＨＣＶ外被ペプチド及びＨＣＶ非構造タンパク質のペプチドが含まれる。「同種ＨＣＶ」はこの場合、同じ特定のＨＣＶ１ｂ型分離株となる。「１つの組成物中のＨＣＶペプチドに対し同種のＨＣＶの治療的措置」という文脈中の「同種の」も同様に解釈されなくてはならない。
【００８７】
「異種ＨＣＶによる感染に対する予防的防御」というのは、ＨＣＶ抗原（複数も可）が由来するＨＣＶ遺伝子型、サブタイプまたは単離体とは別の遺伝子型、サブタイプまたは単離体の抗原投与ＨＣＶウイルスに対して得られる防御を意味する。組成物には例えば、共にＨＣＶ１ｂ型分離株から誘導されているＨＣＶ外被ペプチド及びＨＣＶ非構造タンパク質のペプチドが含まれる。「異種ＨＣＶ」はこの場合、抗原がそこから誘導された１ｂ型分離株、１ａ型ＨＣＶウイルス又は７型ＨＣＶウイルスとは充分異なるＨＣＶ１ｂ型分離株となる。この特定の状況下で用いられる「充分に異なる」というのは、アミノ酸レベルで少なくとも２％、３％又は４％の差異と理解されるべきである。「１つの組成物中のＨＣＶペプチドに対し異種のＨＣＶの治療的措置」という文脈中の「異種の」も同様に解釈されなくてはならない。
【００８８】
「肝疾患」という語は、この状況下では、炎症、線維症、肝硬変、壊死、壊死−炎症及び肝細胞ガンを含めた、Ｃ型肝炎ウイルスでの感染によりひき起こされた肝臓のあらゆる異常な状態を意味する。
【００８９】
「肝疾患を低減させる」というのは、肝疾患状態のあらゆる安定化又は低減を意味する。肝疾患は、例えばノーデル（Ｋｎｏｄｅｌｌ）評定システム（ノーデル（Ｋｎｏｄｅｌｌ）ら、１９８１年）又はイシャク（Ｉｓｈａｋ）が適合させたノーデル評定システム（イシャク（Ｉｓｈａｋ）ら、１９９５年）によって決定可能である。この評点の２点低減は、いくつかの研究で治療的に有益な効果として受入れられている（例えばシフマン（Ｓｈｉｆｆｍａｎ）１９９９の表２に示されているような１９９６年以降に発表された研究を参照のこと）。
【００９０】
「肝線維症の進行を減速させる」というのは、肝線維症の通常予想される進行のあらゆる減速、停止又は復帰を意味する。肝繊維症の進行は、例えばメダヴィア（Ｍｅｔａｖｉｒ）評定システムにより決定可能である。このシステムに従った肝線維症の通常予想される進行とは、未治療の慢性ＨＣＶ患者の年間約０．１３３のメタヴィア評点の増加として公表された（ポイナール（Ｐｏｙｎａｒｄ）ら、１９９７年）。「肝線維症を低減させる」というのは、肝線維症の通常予想される進行のあらゆる減速を含むものとされている。
【００９１】
イシャク（Ｉｓｈａｋ）評定システム（ノーデル（Ｋｎｏｄｅｌｌ）ら、１９８１年の評定システムの修正である。イシャク（Ｉｓｈａｋ）ら、１９９５年）又はメダヴィア（Ｍｅｔａｖｉｒ）評定システム（ベドッサ（Ｂｅｄｏｓｓａ）及びポイナール（Ｐｏｙｎａｒｄ）１９９６年）に従って、肝線維症及び炎症を評定することができる。イシャク評点は、炎症の等級付け用として０〜１８、線維症／肝硬変の病期分類用として０〜６の範囲を有する。イシャク炎症及び線維症評点の合計は、広く用いられている組織学的活性指数（ＨＡＩ：ノーデル（Ｋｎｏｄｅｌｌ）ら、１９８１）に最も近い。メタヴィア評点は、炎症の等級付け用として０〜３、線維症／肝硬変の病期分類用として０〜４の範囲を有する。未治療患者におけるメタヴィア評点の全体的進行速度は、年あたり０．１３３と推定される（ポイナール（Ｐｏｙｎａｒｄ）ら、１９９７）。
【００９２】
本発明のその他の態様は、本発明に従ったＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、予防用ＨＣＶワクチン組成物及び／又は治療用ＨＣＶワクチン組成物及びＤＮＡワクチンを投与することを含む、ＨＣＶナイーブな又はＨＣＶ感染した哺乳動物にワクチン接種を行なう方法に関する。
【００９３】
上述の通りの免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物はさらに、１つの抗原の発現を実施する能力をもつＤＮＡベクターを含み得る。特に本発明に関連して、ＨＣＶ免疫原性組成物、ＨＣＶワクチン組成物、治療用ＨＣＶワクチン組成物又は予防用ＨＣＶワクチン組成物はさらに、１つ以上のＨＣＶ外被ペプチド及び／又は１つ以上のＨＣＶ非構造ペプチドの発現を実施する能力をもつＤＮＡベクターを含み得る。あるいはまた、本発明のタンパク質又はペプチドベースの免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物を、ＤＮＡベクターベースの免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物（「ＤＮＡワクチン」とも呼ばれる）と組合せて使用することもできる。かかる組合せには、例えば、ワクチン接種がＤＮＡベクターベースの免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物を投与することによって開始され、その後続いて本発明のタンパク質又はペプチドベースの免疫原性組成物、ワクチン組成物、治療用ワクチン組成物又は予防用ワクチン組成物が投与される、ＤＮＡ−初回免疫・タンパク質−追加免疫ワクチン接種スキームが含まれる。特にＤＮＡベクターは、１つ以上のＨＣＶ抗原を発現する能力を有する。
【００９４】
「ＤＮＡベクター」というのは、免役応答を惹起及び／又は増強させるのに有用なペプチドのうちの１つ以上のものについての読取り枠を含むあらゆるＤＮＡ担体を意味する。一般に、前記読取り枠は、プロモーター及びターミネータといった転写調節要素に操作可能な形でリンクされ、該読取り枠によりコードされたペプチドの発現を可能にしている。「ＤＮＡベクター」という語は、裸のプラスミドＤＮＡ、医薬上許容される担体と共に処方されたプラスミドＤＮＡ、（例えば上述のもののような）組換え型ウイルス又は適切な医薬上許容される担体と共に処方された組換え型ウイルスを含むものとされている。
【００９５】
本明細書で使用されている、「転写調節要素」という語は、必須調節要素を含み、かくして、生きた脊椎動物細胞内に導入された時点でポリヌクレオチドによりコードされた翻訳産物を産生するべく細胞機構を導くことができるヌクレオチド配列を意味している。
【００９６】
「操作可能な形でリンクされた」という語は、成分がそれらの通常の機能を実施するべく構成された並置を意味する。かくしてヌクレオチド配列に操作可能な形でリンクされた転写調節要素は、このヌクレオチド配列の発現をもたらす能力を有する。当業者であれば、異なる転写プロモーター、ターミネータ、担体ベクター又は特異的配列をうまく使用することができるということがわかるだろう。
【００９７】
「医薬上許容される担体」又は「医薬上許容されるアジュバント」は、それ自体では組成物を受理する個体にとって有害な抗体の産生を誘発せず防御を惹起することもないあらゆる適切な賦形剤、希釈剤、担体及び／又はアジュバントである。好ましくは、医薬上許容される担体又はアジュバントは、抗原によって惹起される免役応答を増強する。適切な担体又はアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｉａ）は、標準的に、以下の非網羅的リストの中に含まれている化合物のうちの１つ以上のものを含む。
−  タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子といった大型でゆっくりと代謝する巨大分子、
−  水酸化アルミニウム、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと組合されたアルミニウム（国際特許出願国際公開第９３／１９７８０号パンフレット参照）又はリン酸アルミニウム（国際特許出願国際公開第９３／２４１４８号パンフレット参照）、
−  Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（米国特許第４，６０６，９１８号明細書参照）、Ｎ−アセチル−ノルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン、
−  ２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョン中にモノホスホリル脂質Ａ（すなわち解毒済み内毒系）、トレハロース−６，６−ジミコレート及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩ（米国モンタナ州ハミルトンのイムノケムリサーチ（株）（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ，ＵＳＡ））。３つの成分ＭＰＬ、ＴＤＭ又はＣＷＳのいずれも単独又は２つずつ組合せた形で使用可能である。ＭＰＬは同様に、ＲＣ−５２９と呼ばれるその合成類似体又はその他の任意のアミノ−アルキルグルコサミニド（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）４−ホスフェートによっても置換され得る（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、１９９９年、パーシング（Ｐｅｒｓｉｎｇ）ら、２００２）、
−  スチミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（米国マサチューセッツ州ウースターのケンブリッジバイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＳＡＦ−１（シンテックス（Ｓｙｎｔｅｘ））といったようなアジュバント、
−  ＩＳＳ（ダイナバックス（Ｄｙｎａｖａｘ））又はＣｐＧ（コーレイファーマソティカルズ（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）といったような細菌ＤＮＡベースのアジュバント、
−  代謝性油及びサポニン又は代謝性油、サポニン及びステロールを含んでいる水中油型エマルジョンをさらに補足され得る（例えば国際特許出願国際公開第９５／１７２１０号パンフレット、同第９７／０１６４０号パンフレット及び同第９８５６４１４号パンフレットを参照）か又は、サイトカインをさらに補足され得る（国際特許出願国際公開第９８／５７６５９号パンフレット参照）、ＱＳ２１と３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａ（国際特許出願国際公開第９４／００１５３号パンフレット）の間の組合せといったようなアジュバント、
−  ＭＦ−５９（カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）又はポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］ベースのアジュバント（ウイルスリサーチ・インスティチュート（Ｖｉｖｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）といったようなアジュバント、
−  オプチバックス（Ｏｐｔｉｖａｘ）（ヴァクセル（Ｖａｘｃｅｌ）、サイトクス（Ｃｙｔｈｘ））といったブロック共重合体ベースのアジュバント又はアルガムリン及びガンマイヌリン（Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＧａｍｍａＩｎｕｌｉｎ）（アヌテック（Ａｎｕｔｅｃｈ））といったイヌリンベースのアジュバント、
−  完全又は不完全フロイントアジュバント（それぞれＣＦＡ又はＩＦＡ）又はゲルブ（Ｇｅｒｂｕ）調製物（ゲルブバイオテクニック（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）。完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）は、ヒト以外の利用分野及び研究目的でも使用可能であり得るということを理解すべきである。
−  クイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）といったようなサポニン、ＱＳ２１、ＱＳ７又はＱＳ１７といったような精製サポニン、β−エシン又はジギトニン、
−  ［プリン−プリン−ＣＧ−ピリミジン−ピリミジン］オリゴヌクレオチドといったような未メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド。免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、例えばリードル（Ｒｉｅｄｌ）ら（２００２年）により記述されているようなカチオン性ペプチドと組合せることも可能である、
−  例えばクイルＡ（Ｑｕｉｌ  Ａ）（ＩＳＣＯＭＳ）といったサポニンと合わせた免疫刺激性複合体、
−  本質的に非毒性で非治療性である、水、食塩水、グリゼロール、エタノール、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、防腐剤といったような賦形剤及び希釈剤、
−  例えば１〜１０％又は２．５〜５％の濃度の、スクアラン、スクアレン、エイコサン、テトラテトラコンタン、グリセロール、ラッカセイ油、植物油といったような、生体分解性及び／又は生体適合性油、
−  ビタミンＣ（アスコルビン酸又はその塩又はエステル）、ビタミンＥ（トコフェロール）又はビタミンＡといったようなビタミン、
−  カロチノイド又は天然又は合成フラボノイド、
−  セレンといったような微量元素。
【００９８】
上述のアジュバントのいずれも３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａを含んでおり、前記３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリル脂質Ａは、小さい粒子を形成していてよい（国際特許出願国際公開第９４／２１２９４号パンフレットを参照のこと）。
【００９９】
典型的には、ワクチン組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注入物質として調製される。注入は、皮下、筋内、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、皮内、表皮内注入であってよい。その他のタイプの投与には、移植、座薬、経口接種、腸溶性適用、吸入、エアゾール適用、又は鼻腔用スプレー又は液滴が含まれる。注入に先立ち液体ビヒクル上で溶解又はその中で懸濁させるのに適した固体形態も同様に調製可能である。調製物は同様に、アジュバント効果を増強するためにリポソーム内で乳化又はその中に封入することもできる。ポリペプチドをその中に取込むことも可能である。
【実施例】
【０１００】
実施例１．酵母中のＨＣＶＥ１ｓの産生
ＨＣＶＥ１ｓタンパク質（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６：配列番号１）を、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＲＢ１１細胞内で発現された前駆体タンパク質から精製した。前記前駆体タンパク質は、ニワトリリゾチームリーダー（ＣＬ）、ｈｉｓ−タグ（Ｈ６）及びリジン（Ｋ）を成熟ＨＣＶ  Ｅ１ｓタンパク質（ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１ｓ）のＮ末端に含んでいた。
【０１０１】
シャットルベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１ｓ（図１中に概略的に描かれている）の構築が、国際特許出願国際公開第０２／０８６１００号パンフレットの実施例５中で記述されている。
【０１０２】
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１ｓでのＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＲＢ１１の形質転換及び形質転換体の選択が、国際特許出願国際公開第０２／０８６１００号パンフレットの実施例６に記述されている。
【０１０３】
国際特許出願国際公開第０２／０８６１００号パンフレットの実施例１４には、ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１ｓで形質転換されたＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによるＨＣＶ  Ｅ１ｓタンパク質の発現のための発酵条件が記述されている。
【０１０４】
ｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１で形質転換されたＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ  ＲＢ１１内で発現されたＨ６−Ｋ−Ｅ１ｓ前駆体タンパク質からの（ヨードアセトアミドでアルキル化された）成熟ＨＣＶＥ１ｓの、Ｈ６−Ｋ−タグ除去を含めた精製については、国際特許出願国際公開第０２／０８６１００号パンフレットの実施例１８で記述されている（部分的に国際特許出願国際公開第０２／０８６１００号パンフレットの実施例１７を再度参照）。
【０１０５】
精製ＨＣＶＥ１ｓタンパク質（４００μｇ／ｍＬの濃度、ヨードアセトアミドでアルキル化されている）を用いたＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタイン中のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成については、国際特許出願国際公開第０２／０８６１００号パンフレットの実施例２０の中で記述されている。
【０１０６】
実施例２：ＨＣＶＥ１ｓワクチン組成物の処方
出発材料は、（４００μｇ／ｍｌのＥ１ｓ濃度で、ＰＢＳ、０．５％（ｗ／ｖ）ベタイン中の）実施例１で記述されたように得られたＨＣＶＥ１ｓウイルス様粒子の組成物であった。等体積のこのＥ１ｓＶＬＰ−組成物及びアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）１．３％（スーパーフォス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）、デンマーク）を混合した。結果として得られた混合物を、最終的にさらに１９体積の０．９％ＮａＣｌで希釈して、０．０６５％のアルヒドロゲル及び２０μｇ／ｍＬのＥ１ｓ濃度の、ミョウバンでアジュバントとしたＥ１ｓを得た。
【０１０７】
実施例３．Ｖｅｒｏ細胞からのＥ１ｓの産生
ＨＣＶＥ１ｓタンパク質（ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、実施例１で記述したものと同じ成熟Ｅ１ｓ）を、組換え型ワクシニアウイルスＨＣＶ１１Ｂを用いてＶｅｒｏ細胞内で発現させた。このワクシニアウイルスは基本的にｖｖＨＣＶ１１Ａ（米国特許第６，１５０，１３４号明細書で記述されているもの）と同一であるが、ＲＫ１３からＶｅｒｏ細胞へと継代されてきた。Ｅ１ｓタンパク質を、システインのためのアルキル化剤としてヨードアセトアミド（Ｎ−エチルマレイミドの代りに）を用いて、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９９／０４３４２号（国際公開第９９／６７２８５号パンフレット）の実施例９に従って修正されてはいるものの基本的には米国特許第６，１５０，１３４号明細書の実施例５に記述されている通りに（レンティルクロマトグラフィ、還元−アルキル化及びサイズ排除クロマトグラフィを用いて）精製した。精製後、３％のエンピゲン（Ｅｍｐｉｇｅｎ）−ＢＢを、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９９／０４３４２号（国際公開第９９／６７２８５号パンフレット）の実施例１に記述されている通りにサイズ排除クロマトグラフィによって３％のベタインと交換した。このプロセスにより、ウイルス様粒子としてのＥｌｓの回収が可能である。最後に、４００μｇ／ｍＬというＥ１ｓ濃度及び０．５％のベタインを含むＰＢＳに対し材料を脱塩した。このＥ１ｓを、等体積のアルヒドロゲル１．３％（スペルフォス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）、デンマーク）と混合し、最後に、１９体積の０．９％のＮａＣｌでさらに希釈して２０μｇのＥ１ｓ／ｍＬ及び０．０６５％のアルヒドロゲルの濃度で、ミョウバンをアジュバントとしたＥ１ｓを得た。
【０１０８】
実施例４  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内でのＮＳ３の産生
ＨＣＶＮＳ３−ＴＮタンパク質（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９９／０４３４２号（国際公開第９９／６７２８５号パンフレット、配列番号５）の実施例７ａに記述されているようにアミノ酸１１６７〜１１８０がアミノ酸１０７１〜１０８４で置換されアミノ酸１１６６がメチオニンへと突然変異させられたＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１６６〜１４６８、配列番号５）をＥ．ｃｏｌｉ内で発現させた。システインのための変性剤としてスルホン化を用いて、基本的に国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９９／０４３４２号（国際公開第９９／６７２８５号パンフレット）の実施例７ｂに記述されている通りに、タンパク質を精製した。最後に、材料を、１．３ｍｇ／ｍＬのＮＳ３−ＴＮタンパク質濃度及び６Ｍの尿素を含有するｐＨ７．５のＰＢＳに対し脱塩させた。このＮＳ３を、０．９％のＮａＣｌで４００μｇ／ｍＬまで希釈した後、等体積のアルヒドロゲル１．３％（スペルフォス（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ）、デンマーク）と混合し、最後に、１９体積の０．９％のＮａＣｌでさらに希釈して２０μｇのＮＳ３／ｍＬ及び０．０６５％のアルヒドロゲルの濃度で、ミョウバンをアジュバントとしたＮＳ３を得た。
【０１０９】
実施例５．アカゲザルにおける免疫原性研究
動物の収容、維持及び世話は、全ての関連する指針及び規定要件に適合したものであった。
【０１１０】
８匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）の右上肢に用量１０μｇのＮＳ３−ＴＮを筋内ワクチン接種した。これらの動物の半数に同様に、Ｖｅｒｏ細胞からの用量１０μｇのＥ１ｓをワクチン接種し、もう半分は酵母からの１０μｇのＥ１ｓを受けた。Ｅ１ｓワクチンは、上左肢に投与した。実施例１〜３に記述されている通り、全てのタンパク質はミョウバン上で処方した。動物は、０、３及び９週目に免疫化を受け、３回目の免疫化から２週間後（すなわち１１週目）に免役応答を査定した。
【０１１１】
抗体力価
抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。血清標本の階段希釈を、社内標準（１０００ｍＵ／ｍＬのＥ１ｓ抗体を有するものとして定義されたこの社内標準は、高い抗外被力価に基づいて選択されたＨＣＶ慢性担体からの３つの血清の混合物である）と比較した。このアッセイの検出限界は５ｍＵ／ｍｌである。
【０１１２】
全ての動物は、免疫化のために用いられたタンパク質に対する抗体応答を開始させた。ｌｏｇ（ｍＵ／ｍＬ）＋／−ＳＤ（標準偏差）で表わした抗体レベルは、酵母及びＶｅｒｏ由来のＥ１ｓで免疫化された動物の両方について、高レベルの抗Ｅ１ｓ抗体を伴う担体に基づいた標準の中に見出されるレベルと類似していた。酵母（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）から得たＥ１ｓ及び哺乳動物（Ｖｅｒｏ）細胞系統から得たＥ１ｓでのこれらの結果の類似性は、両方の分子の間の生化学パラメータの大きな差異を考慮すると、驚くべきものである。酵母Ｅ１ｓタンパク質は、異なる形でグリコシル化された形態のＥ１ｓの梯子から成り、一方Ｖｅｒｏ由来のＥ１ｓは、均一的にグリコシル化された単一のタンパク質バンドから成る（図２に示されている）。全体に、Ｖｅｒｏ細胞由来のＥ１ｓで得られた応答より高い応答を誘発する酵母由来のＥ１ｓの傾向さえ存在する。
【０１１３】
【表１】
2006516955.tif 000002
【０１１４】
ＮＳ３に対する抗体応答は、類似の要領で決定された。ｌｏｇ（ｍＵ／ｍＬ）＋／−ＳＤとして表わされた２．７４＋／−０．３２（ｎ＝８）の平均力価が達成され、これは、ここでも、慢性担体内で観察されたＮＳ３応答と同様であり、これは、ＮＳ３タンパク質が免疫原性であることを示している。
【０１１５】
Ｔ細胞の免疫性
合計体積２００μＬでウェルあたり４×１０５個の細胞という濃度で０週目又は１１週目に抜きとられた血液から単離させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５％のＣＯ２を含有する加湿した雰囲気内で３７℃で９０時間、ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍＬ、正の対照）、又は酵母Ｅ１ｓで免疫化された動物については組換え型酵母Ｅ１ｓ、又はＶｅｒｏ−Ｅ１ｓで免疫化された動物についてはＶｅｒｏ−Ｅ１ｓ、又はＮＳ３タンパク質（全て５μｇ／ｍＬで）、又は培地単独（負の対照）のいずれかと共に、Ｕ字形の９６ウェルのマイクロタイタープレートの中の完全ＲＰＭＩ−１６４０倍地の中で培養した。マイトジェン及び抗原誘発された増殖応答の両方について最も適切なインキュベーション時間を立証するために一連の実験を実施した。（３Ｈ−チミジン摂取のための時間を含め）９０時間の細胞培養が、マイトジェン刺激ならびに抗原誘発された応答にとって充分であることがわかった。最後の１８時間、細胞をウェルあたり２μＣｉ（３Ｈ−ＴＲＫ７５８）のチミジンでパルス処理した。その後、ガラス繊維のフィルター上で培養を収獲し、パッカードトップカウンター（ダイレクトベータカウンター）内で同時に計数することによって標識摂取を決定する。
【０１１６】
結果は、外被抗原と共に培養された細胞の中に取込まれたチミジンと抗原無しで培養された細胞のものの比率である刺激指数（ＳＩ）として表わされている。３より大きい刺激指数が、陽性シグナルとみなされる。全ての動物は、実際ＣｏＡに対し満足のいく形で反応しており、アッセイ内で使用された細胞の質を証明した。図３に示されている結果から、Ｅ１ｓについて、８匹の動物のうち７匹が、０週目には無かったはっきりした抗原特異的増殖を１１週目に有していたという結論を下すことができる。ＮＳ３については、８匹の動物全てがこのような応答を実際に開始した（図４）。Ｅ１ｓ及びＮＳ３の両方についてのＴ細胞増殖の高いレベルは、使用されたミョウバン−アジュバントが主として液性免役応答を刺激するものとして知られていることから、驚くべきものであった。このことは明らかに、同じ単一の個体内でＴ細胞を刺激する上でのＥ１ｓ及びＮＳ３の両方の高い免疫原性潜在能力を実証している。
【０１１７】
さらに、両抗原の交差反応性を実証するために、Ｅ１ｓで免疫化された全ての動物からのＰＢＭＣが酵母由来のＥ１ｓ及びＶｅｒｏ細胞由来のＥ１ｓで再刺激された対照実験が実施された。この実験（結果は図５に提示されている）は、８匹のＥ１ｓ免疫化された動物のうちの実に７匹がＥ１ｓに対する高いＴ細胞応答を開始したこと、そして、７匹の動物の全てが、ワクチン接種のために使用された抗原の如何に関わらず、酵母及びＶｅｒｏ由来のＥ１ｓ材料の両方に対し反応したことを確認した。
【０１１８】
これは、同じアジュバント上で処方され単一の動物において投与されたＨＣＶ外被抗原及びＨＣＶ非構造抗原の組合せの、高等哺乳動物種において高い特異的免役応答を結果としてもたらした最初の実証である。この組合せを使用した場合、免疫系の液性及び細胞性の両方の区画が活性化された。酵母及び哺乳動物細胞に由来するＥ１ｓ間に見られたような優れた交差反応性は、両方の材料の生物学的等価性を裏づけるものであり、両方の産物の間の生物物理学的レベル上の多大な差異に基づいて考えれば驚くべきことである。従って、酵母Ｅ１は、（国際公開第０２／０５５５４８号パンフレットとして公示された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０２／００２１９号パンフレットの中で記述されているように）抗原投与感染の時点でチンパンジーにおける慢性疾患に対する防御免役応答を誘発するものとして知られる哺乳動物−Ｅ１ｓに置換されることができるはずである。ＮＳ３、そしてより詳細には、Ｅ１ｓと同じアジュバントと共に処方されたＮＳ３が有意なＴ細胞応答を誘発するということを実証すると、Ｅ１ｓをＮＳ３と組合わせることでＨＣＶ特異的免役応答の幅が広がり、ＨＣＶ感染をさらに一層効率良く制御する上で一助となるということが明確に示されることになる。
【０１１９】
実施例６．Ｅ１ｓとＮＳ３の組合せによるワクチン接種を受けたチンパンジーの予防用防御免疫化
動物の収容、維持及び世話は、全ての関連する指針及び規定要件に適合したものであった。
【０１２０】
ミョウバン上でＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＥ１ｓ及びＥ．ｃｏｌｉ由来のＮＳ３−ＴＮを処方し、４０μｇのＥ１ｓ／ｍＬ又はＮＳ３／ｍＬ及び０．１３％のミョウバンの最終的処方を生成した。１．２５ｍＬのＥ１ｓ（左上肢）及び１．２５ｍＬのＮＳ３（右上肢）で３匹のチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）を筋内で免疫化した。４匹目のチンパンジーを、両方の上肢で同時に、０．１３％のミョウバンのみから成る１．２５ｍＬのプラシーボで免疫化した。０、４、８及び２０週目に免疫化を実施した。最終的に、Ｒ．パーセル（Ｐｕｒｃｅｌｌ）博士（メリーランド州ベセズダのＮＩＨ、肝炎ウイルス課）により提供された１００ＣＩＤ５０（チンパンジー感染用量の）接種材料Ｊ４．９１で２４週目に動物に抗原投与した。抗原投与を受けたチンパンジーの血清中のウイルス血症レベルは、抗原投与後１２ヵ月間ロッシュモニターＨＣＶ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＨＣＶ）を用いて分析される。検知不能なウイルス血症しかない動物は、完全防御済み動物として分類され、抗原投与から６ヵ月以内にウイルス血症が消散し続く６ヵ月以内にウイルスＲＮＡの跳返り現象がなかった動物は、急性消散動物として分類され、一方６ヵ月後になおウイルス血症を有する動物は、慢性感染動物として分類される。
【０１２１】
これら４匹のチンパンジーについての免疫化計画が完了した後、Ｅ１及びＮＳ３に対する抗体力価を決定した。Ｅ１については、酵母及びＶｅｒｏ由来の両方に対する抗体力価をＥＬＩＳＡを用いて決定した。ＮＳ３抗体については、スルホン化タンパク質及び脱スルホン化タンパク質の両方に対する抗体力価をＥＬＩＳＡを用いて決定した。ＥＬＩＳＡプレートのコーティング時間（３７℃で１時間、３μｇ／ｍｌのＮＳ３）中５ｍＭのＤＴＴと共にスルホン化されたＮＳ３をインキュベートすることによって、脱スルホン化を実施した。アッセイのバックグラウンドより２倍高いＯＤをなおも生成する血清の希釈として、力価を規定した。結果は、表２にまとめられている。
【０１２２】
酵母又はＶｅｒｏからのＥ１を用いた滴定の結果は、非常に類似していた。さらに重要なことに、力価は、本研究の４匹のチンパンジーについてと同じアッセイを用いてそれからのいくつかの標本が再度滴定された（国際特許出願国際公開第０２／０５５５４８号パンフレットの実施例１５に記述されている通りの）Ｅ１−Ｖｅｒｏで免疫化したチンパンジーにおいて得られた力価ときわめて類似していた。この研究におけるチンパンジーがわずか４回の免疫化しか受けておらず、一方履歴対照動物（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ａｎｉｍａｌ）が６回の免疫化を受けていることを考慮すると、このことは、酵母由来のＥ１がＶｅｒｏ由来のＥ１に比べ同等かさらにはそれより優れた免疫原性を有することを再度確認するものである。
【０１２３】
驚くべきことに、脱スルホン化されたタンパク質で測定されたＮＳ３応答は、スルホン化されたタンパク質で測定されたものよりもはるかに高いものであった。この結果は、ＮＳ３が免疫応答の誘発に先立ってインビボで脱スルホン化されていることを表わすため、重要なものである。特にＴ細胞応答については、Ｔ細胞がスルホン化されていない未変性ＮＳ３を認識できなくてはならないことから、これは非常に重要であり得る。
【０１２４】
【表２−１】
2006516955.tif 000003
【表２−２】
2006516955.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ベクターｐＦＰＭＴ−ＣＬ−Ｈ６−Ｋ−Ｅ１ｓの概略的マップ。
【図２】Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  Ｅ１ａ（レーン１）及びＶｅｒｏ細胞（レーン２）により産生されたＨＣＶＥ１ｓタンパク質のウェスタンブロット分析。分子量マーカー（レーン３）のサイズは、右側に示されている（ｋＤａ）。Ｅ１特異的マウスモノクローナル抗体ＩＧＨ２０１（国際公開第９９／５０３０１号パンフレット参照）は、Ｅ１タンパク質の検出のために用いられた。
【図３】０週目（黒色棒）又は１１週目（斜線棒）に観察されたＥ１ｓ特異的Ｔ細胞刺激。Ｔ細胞刺激は、Ｘ軸に示されたアカゲザルについてのＹ軸上の刺激指数（ＳＩ）として表現されている。動物１〜４には、ＮＳ３及びＶｅｒｏ  Ｅ１ｓがワクチン接種され、単離されたＰＢＭＣはインビトロでＶｅｒｏ  Ｅ１ｓで再刺激された。動物５〜８は、ＮＳ３及び酵母Ｅ１ｓでのワクチン接種を受け、単離されたＰＢＭＣは、インビトロで酵母Ｅ１ｓで再刺激された。
【図４】０週目（黒色棒）又は１１週目（斜線棒）に観察されたＮＳ３特異的Ｔ細胞刺激。Ｔ細胞刺激は、Ｘ軸に示されたアカゲザルについてのＹ軸上の刺激指数（ＳＩ）として表現されている。動物１〜８には、ＮＳ３がワクチン接種された。動物１〜４は同様に、Ｖｅｒｏ  Ｅ１ｓでのワクチン接種を受けた。動物５〜８は同様に酵母Ｅ１ｓでのワクチン接種も受けた。
【図５】Ｘ軸に示されたアカゲザルについてのＹ軸上の刺激指数（ＳＩ）として表現されたＥ１ｓ特異的Ｔ細胞刺激。動物１〜４には、ＮＳ３及びＶｅｒｏ  Ｅ１ｓがワクチン接種され、単離されたＰＢＭＣはインビトロでＶｅｒｏ  Ｅ１ｓ（斜線棒）又は酵母Ｅ１ｓ（黒色棒）で再刺激された。動物５〜８は、ＮＳ３及び酵母Ｅ１ｓでのワクチン接種を受け、単離されたＰＢＭＣは、インビトロでＶｅｒｏ  Ｅ１ｓ（斜線棒）又は酵母Ｅ１ｓ（黒色棒）で再刺激された。
【０１２６】
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１０．  Ｆｏｒｎｓ，Ｘ．、Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｕ．、Ｔｏｂｉｎ，Ｇ．Ｊ．、Ｍｕｓｈａｈｗａｒ，Ｉ．Ｋ．、Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．、及びＢｕｋｈ，Ｊ．（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７、１９９２−２００２
１１．  Ｆｏｒｎｓ，Ｘ．、Ｐａｙｅｔｔｅ，Ｐ．Ｊ．、Ｍａ，Ｘ．、Ｓａｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｗ．、Ｅｄｅｒ，Ｇ．、Ｍｕｓｈａｈｗａｒ，Ｉ．Ｋ．、Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ．、Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．、Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｕ．、Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．、及びＢｕｋｈ，Ｊ．（２０００年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２、６１８−６２５
１２．  Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｅ．、ＭｃＣｕｂｒｅｙ，Ｊ．Ａ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｄｅｌａｔｔｅ，Ｓ．、Ｒａｍａｇｅ，Ｊ．、Ｋｉｓｅｒ，Ｍ．、Ｋｕｃｅｒａ，Ｇ．Ｌ．、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｒ．Ｌ．、Ｂｅｒａｎ，Ｍ．、Ｔａｇｇｅ，Ｅ．Ｐ．、Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、及びＨｏｇｇｅ，Ｄ．Ｅ．（２０００年）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４、５７６−５８５
１３．  Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ，Ｋ．、ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．、Ｂｅａｇｌｅｙ，Ｋ．Ｗ．、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ａ．、Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｍ．、及びＫｉｙｏｎｏ，Ｈ．（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｅｓ  １６０、１８１−１８９
１４．  Ｇａｉｌｉｔ，Ｊ．（１９９３年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４、３３４−３３５
１５．  Ｇｏｓｅｒｔ，Ｒ．及びＭｏｒａｄｐｏｕｒ，Ｄ．（２００２年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６、７５７−７６０
１６．  Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．、Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ，Ｃ．、Ｌｉｎ，Ｃ．、Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．、及びＲｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９３年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、１３８５−１３９５
１７．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
１８．  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａ．（１９７９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４、９６２７−９６３２
１９．  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．、Ｃｈｏｏ，Ｑ．Ｌ．、Ｋｕｏ，Ｇ．、Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．、Ｒａｌｓｔｏｎ，Ｒ．、Ｕｒｄｅａ，Ｍ．、Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．、Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｌ．、及び（１９９５年）Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｔａｋａｍａｔｓｕ  Ｓｙｍｐ．２５、２３７−２４３
２０．  Ｈｕ，Ｇ．Ｊ．、Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｙ．、Ｈａｎ，Ｄ．Ｓ．、Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．、及びＳｈｉｈ，Ｊ．Ｗ．（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７、３１６０−３１７０
２１．  Ｉｓｈａｋ，Ｋ．、Ｂａｐｔｉｓｔａ，Ａ．、Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｌ．、Ｃａｌｌｅａ，Ｆ．、Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔｅ，Ｊ．、Ｇｕｄａｔ，Ｆ．、Ｄｅｎｋ，Ｈ．、Ｄｅｓｍｅｔ，Ｖ．、Ｋｏｒｂ，Ｇ．、ＭａｃＳｗｅｅｎ，Ｒ．Ｎ．、及び（１９９５年）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２２、６９６−６９９
２２．  Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．、Ｒｏｓａ，Ｄ．、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｙ．、Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ．、Ｈａｒａｄａ，Ｈ．、Ｗｙａｔｔ，Ｃ．、Ｋｉｙｏｓａｗａ，Ｋ．、Ａｉｚａｋｉ，Ｈ．、Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｙ．、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．、Ａｂｒｉｇｎａｎｉ，Ｓ．、及びＭｉｙａｍｕｒａ，Ｔ．（１９９８年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８、１１１７−１１２０
２３．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．、Ｓｏｗｅｌｌ，Ｃ．Ｇ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．、Ｌｉｖｅｓａｙ，Ｍ．Ｔ．、Ｋｅｅｇａｎ，Ｄ．Ｓ．、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｕｌｒｉｃｈ，Ｊ．Ｔ．、Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｒ．、Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．、及びＢｒｏｏｋｓｈｉｒｅ，Ｖ．Ｇ．（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ９、２２７３−２２７８
２４．  Ｋｎｏｄｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．、Ｉｓｈａｋ，Ｋ．Ｇ．、Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ｃ．、Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｓ．、Ｃｒａｉｇ，Ｒ．、Ｋａｐｌｏｗｉｔｚ，Ｎ．、Ｋｉｅｒｎａｎ，Ｔ．Ｗ．、及びＷｏｌｌｍａｎ，Ｊ．（１９８１年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １、４３１−４３５
２５．  Ｋｏｚｉｅｌ，Ｍ．Ｊ．及びＬｉａｎｇ，Ｔ．Ｊ．（１９９７年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１２、１４１０−１４１４
２６．  Ｋｕｍａｒ，Ｎ．、Ｋｅｌｌａ，Ｄ．、及びＫｉｎｓｅｌｌａ，Ｊ．Ｅ．（１９８５年）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１、２５１−２６３
２７．  Ｋｕｍａｒ，Ｎ．、Ｋｅｌｌａ，Ｄ．、及びＫｉｎｓｅｌｌａ，Ｊ．Ｅ．（１９８６年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．２８、５８６−５９２
２８．  Ｌａｕｅｒ，Ｇ．Ｍ．及びＷａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．（２００１年）Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４５、４１−５２
２９．  Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉａｓ  ｄｅ  Ｃｅｒｉｏ  ＡＬ、Ｃａｓａｒｅｓ，Ｎ．、Ｌａｓａｒｔｅ，Ｊ．Ｊ．、Ｓａｒｏｂｅ，Ｐ．、Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｄｉａｖｉｌｌａ，Ｌ．Ａ．、Ｒｕｉｚ，Ｍ．、Ｐｒｉｅｔｏ，Ｊ．、及びＢｏｒｒａｓ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｆ．（１９９９年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１、２０２５−２０３４
３０．  Ｍａｎｎｓ，Ｍ．Ｐ．、ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｃ．、Ｒｕｓｔｇｉ，Ｖ．Ｋ．、Ｓｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．、Ｒｅｉｎｄｏｌｌａｒ，Ｒ．、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｚ．Ｄ．、Ｋｏｕｒｙ，Ｋ．、Ｌｉｎｇ，Ｍ．、及びＡｌｂｒｅｃｈｔ，Ｊ．Ｋ．（２００１年）Ｌａｎｃｅｔ  ３５８、９５８−９６５
３１．  Ｍｉｓｓａｌｅ，Ｇ．、Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．、Ｌａｍｏｎａｃａ，Ｖ．、Ｖａｌｌｉ，Ａ．、Ｍａｓｓａｒｉ，Ｍ．、Ｍｏｒｉ，Ｃ．、Ｒｕｍｉ，Ｍ．Ｇ．、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．、Ｆｉａｃｃａｄｏｒｉ，Ｆ．、及びＦｅｒｒａｒｉ，Ｃ．（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９８、７０６−７１４
３２．  Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．、Ｋｗｏｎ，Ｈ．Ｗ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｋ．、Ｋｉｍ，Ｉ．Ｈ．、Ａｈｎ，Ｋ．、Ｃｈｏｉ，Ｅ．Ｊ．、Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．、及びＣｈｏｅ，Ｍ．（２００１年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  １２、３９８−４０２
３３．  Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｄ．、Ｃｏｌｅｒ，Ｒ．、Ｌａｃｙ，Ｍ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．、Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．、Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ，Ｒ．、及びＲｅｅｄ，Ｓ．（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０、Ｓ３２
３４．  Ｐｏｙｎａｒｄ，Ｔ．、Ｂｅｄｏｓｓａ，Ｐ．、及びＯｐｏｌｏｎ，  Ｐ．（１９９７）Ｌａｎｃｅｔ  ３４９、８２５−８３２
３５．  Ｒｅｉｎ，Ａ．、Ｏｔｔ，Ｄ．Ｅ．、Ｍｉｒｒｏ，Ｊ．、Ａｒｔｈｕｒ，  Ｌ．Ｏ．、Ｒｉｃｅ，Ｗ．、及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０、４９６６−４９７２
３６．  Ｒｉｅｄｌ，Ｐ．、Ｂｕｓｃｈｌｅ，Ｍ．、Ｒｅｉｍａｎｎ，Ｊ．、及びＳｃｈｉｒｍｂｅｃｋ，Ｒ．（２００２年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２、１７０９−１７１６
３７．  Ｓｈｉｆｆｍａｎ，Ｍ．Ｌ．（１９９９年）Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５、２７−４３
３８．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．Ｋ．、Ｈｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．、Ｉｗａｍｏｔｏ，Ａ．、Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．、Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．、及びＹｏｓｈｉｋｕｒａ，Ｈ．（１９９４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８、１４９４−１５００
３９．  Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ，Ｋ．、Ｔａｎｊｉ，Ｙ．、Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ，Ｙ．、Ｋｏｍｏｄａ，Ｙ．、Ｋａｔｏ，Ｎ．、及びＨｉｊｉｋａｔａ，Ｍ．（１９９５年）Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２２、８７−９２
４０．  Ｓｈｉｒａｉ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｍ．、Ａｒｉｃｈｉ，Ｔ．、Ｍａｓａｋｉ，Ｔ．、Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｍ．、Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．、Ｎａｋａｚａｗａ，Ｔ．、Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｓ．Ｍ．、及びＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．（１９９６年）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７３、２４−３１
４１．  Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．及びＫａｔｓ，Ｌ．（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２、８６−９１
４２．  Ｓｏｎｇ，Ｍ．Ｋ．、Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．、Ｓｕｈ，Ｙ．Ｓ．、Ｌｅｅ，Ｋ．Ｊ．、及びＳｕｎｇ，Ｙ．Ｃ．（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、２９２０−２９２５
４３．  Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．、ＤｅＦｕｌｖｉｏ，Ｊ．、Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｍ．Ｄ．、及びＰａｒｋ，Ｃ．Ｈ．（１９９１年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄ．Ａｐｐｌ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｂ  １８、２２７−２３３
４４．  Ｘｕ，Ｚ．、Ｃｈｏｉ，Ｊ．、Ｙｅｎ，Ｔ．Ｓ．、Ｌｕ，Ｗ．、Ｓｔｒｏｈｅｃｋｅｒ，Ａ．、Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊａｎ，Ｓ．、Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．、Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．Ｊ．、及びＯｕ，Ｊ．（２００１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０、３８４０−３８４８
【配列表】
2006516955.tif 000005
2006516955.tif 000006
2006516955.tif 000007
2006516955.tif 000008
2006516955.tif 000009
【図１】
2006516955.tif 000010
【図２】
2006516955.tif 000011
【図３】
2006516955.tif 000012
【図４】
2006516955.tif 000013
【図５】
2006516955.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月8日(2005.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006516955000001.app
【国際調査報告】
2006516955.tif 000015
2006516955.tif 000016
2006516955.tif 000017
2006516955.tif 000018