(57)【要約】本発明は、感染疾患または障害、例えばHIV感染症、AIDS、およびAIDS関連疾患の治療および予防のための組成物および方法の発見に少なくとも一部基づく。特に、本発明は、感染疾患または障害、HIV感染症、AIDS、またはAIDS関連疾患または障害を治療または予防するために、細胞の遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばCCR5遺伝子発現またはタンパク質活性および／または感染因子の遺伝子または配列の遺伝子発現またはタンパク質活性を調節する方法に関する。一つの態様において、細胞遺伝子を標的とするRNA干渉物質を、感染因子の遺伝子または配列を標的とするRNA干渉物質と併用すると、感染因子による感染の持続的な予防が得られる。本発明は、細胞遺伝子、例えばケモカイン受容体、例えばCCR5遺伝子を標的として、それによって標的遺伝子発現細胞における標的遺伝子発現の阻害が起こり、それによって感染因子の侵入を阻害する、例えば標的細胞へのHIV感染症を阻害する、感染症を予防する、および／または確立された感染症における複製を抑制する、新規RNA干渉物質、例えばsiRNA分子の同定に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞遺伝子の発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のsiRNAと、感染因子の遺伝子または配列の発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のsiRNAとを細胞に接触させて、それによって細胞への感染因子の侵入を阻害することを含む、細胞における感染因子の侵入を阻害する方法。
【請求項２】
細胞遺伝子の発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のsiRNAと、感染因子の遺伝子または配列の発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のsiRNAとを被験者に投与して、それによって被験者における感染を予防することを含む、被験者における感染を予防する方法。
【請求項３】
細胞遺伝子の発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のsiRNAと、感染因子の遺伝子または配列の発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のsiRNAとを被験者に投与して、それによって被験者における感染疾患または障害を治療することを含む、被験者における感染疾患または障害を治療する方法。
【請求項４】
細胞遺伝子および／または感染因子の遺伝子または配列の発現または活性が阻害される、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
siRNAの少なくとも一つがウイルス遺伝子に向けられる、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
siRNAの少なくとも一つがケモカイン受容体遺伝子に向けられる、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
siRNAの少なくとも一つがケモカイン受容体遺伝子に向けられ、siRNAの少なくとも一つがウイルス遺伝子に向けられる、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ウイルス遺伝子がp24遺伝子である、請求項5または7に記載の方法。
【請求項９】
siRNAの少なくとも一つがケモカイン受容体遺伝子に向けられる、請求項6または7に記載の方法。
【請求項１０】
siRNAが静脈内投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１１】
siRNAが同時投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１２】
siRNAが連続投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１３】
siRNAが投与前に塩基性ペプチドと混合される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１４】
siRNAが投与前にリポソームに封入される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１５】
siRNAが被験者の粘膜に局所投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１６】
siRNAが1週間に1回投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１７】
siRNAが2週間に1回投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１８】
siRNAが4週間に1回投与される、請求項2または3に記載の方法。
【請求項１９】
感染症がHIV感染症である、請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞がマクロファージである、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
細胞がCD4+ T細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
ケモカイン受容体、またはその断片の発現を阻害するRNA干渉物質を含む組成物。
【請求項２３】
物質がケモカイン受容体またはその断片と相同であるRNAである、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
物質がCCR5遺伝子またはその断片と相同であるRNAである、請求項22記載の組成物。
【請求項２５】
物質が二本鎖の短い干渉RNA（siRNA）である、請求項22記載の組成物。
【請求項２６】
siRNAが長さが約15ヌクレオチド〜約28ヌクレオチドである、請求項25記載の組成物。
【請求項２７】
siRNAの長さが約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドである、請求項25記載の組成物。
【請求項２８】
siRNAの長さが約21ヌクレオチドである、請求項25記載の組成物。
【請求項２９】
siRNAが二本鎖であって、それぞれの鎖に3'突出末端を含む、請求項25記載の組成物。
【請求項３０】
突出末端がそれぞれの鎖に約1〜約6ヌクレオチドを含む、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
突出末端がそれぞれの鎖に約2ヌクレオチドを含む、請求項29記載の組成物。
【請求項３２】
物質が合成siRNAである、請求項22記載の組成物。
【請求項３３】
第一の鎖が配列番号：1の配列を含み、第二の鎖が配列番号：2の配列を含む、請求項25記載の組成物。
【請求項３４】
siRNAがCCR5 mRNAの分解を誘導または調節することができる、請求項25記載の組成物。
【請求項３５】
siRNAが転写サイレンシングによってCCR5を不活化する、請求項25記載の組成物。
【請求項３６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項22記載の組成物。
【請求項３７】
ポリ-Gテールをさらに含む、請求項25記載の組成物。
【請求項３８】
ケモカイン受容体遺伝子と相同であって、ケモカイン受容体遺伝子のRNA干渉を促進することができる短い干渉RNA（siRNA）を含むベクター。
【請求項３９】
ケモカイン受容体遺伝子がCCR5である、請求項38記載のベクター。
【請求項４０】
ケモカイン受容体遺伝子と相同であって、ケモカイン受容体遺伝子のRNA干渉を促進することができるRNAをコードするDNA鋳型を含むベクター。
【請求項４１】
ケモカイン受容体遺伝子がCCR5である、請求項40記載のベクター。
【請求項４２】
レンチウイルスベクターである、請求項40記載のベクター。
【請求項４３】
請求項38または40記載のベクターをトランスフェクトした細胞。
【請求項４４】
ケモカイン受容体遺伝子の遺伝子発現を阻害するsiRNAを被験者に投与して、それによって被験者におけるケモカイン受容体遺伝子の遺伝子発現を阻害することを含む、被験者におけるケモカイン受容体遺伝子の遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項４５】
ケモカイン受容体遺伝子がCCR5である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
ケモカイン受容体遺伝子の遺伝子発現または活性を調節するsiRNAを被験者に投与して、それによって被験者における感染症を予防することを含む、被験者における感染症を予防する方法。
【請求項４７】
感染因子の遺伝子または配列の遺伝子発現または活性を調節するsiRNAを被験者に投与することをさらに含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
感染因子の遺伝子または配列がウイルス遺伝子または配列である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
感染症が、HIV、ポリオウイルス、インフルエンザ、ライノウイルス、エボラウイルス、口蹄疫ウイルス、乳頭腫ウイルス感染症、肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、およびヘルペス（HSV-2）からなる群より選択される、請求項46記載の方法。
【請求項５０】
ケモカイン受容体遺伝子の遺伝子発現を調節するsiRNAを被験者に投与して、それによって被験者における感染症を阻害することを含む、被験者における感染症を治療する方法。
【請求項５１】
感染因子の遺伝子または配列の遺伝子発現または配列を調節するsiRNAを被験者に投与することをさらに含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
感染因子の遺伝子または配列がウイルス遺伝子または配列である、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
感染症が、HIV、ポリオウイルス、インフルエンザ、ライノウイルス、エボラウイルス、口蹄疫ウイルス、乳頭腫ウイルス感染症、肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、およびヘルペス（HSV-2）からなる群より選択される、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
CCR5遺伝子発現を調節するsiRNAを被験者に投与して、それによって被験者におけるCCR5調節免疫応答を調節することを含む、被験者におけるCCR5調節免疫応答を調節する方法。
【請求項５５】
CCR5遺伝子発現を調節するsiRNAを細胞に投与して、それによって細胞への感染因子の侵入を阻害することを含む、CCR5を発現する細胞への感染因子の侵入を阻害する方法。
【請求項５６】
細胞がマクロファージである、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
被験者がヒトである、請求項44、46、50、または54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
siRNAが静脈内投与される、請求項44、46、50、または54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
siRNAが被験者の粘膜に局所投与される、請求項44、46、50、または54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
siRNAが投与前に塩基性ペプチドと混合される、請求項44、46、50、または54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
siRNAが投与前にリポソームに封入される、請求項44、46、50、または54のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、2002年10月29日に出願された米国特許出願第60/422,419号の利益を主張する。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって与えられた助成金番号第AI49792号、第AI145306号、第AI46566号、および第AI42519号の下で少なくとも部分的に政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００３】
発明の背景
ヒトレトロウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（HIV）は、体の免疫系を破壊して、罹患者を日和見感染症、例えば肺炎および特定の癌、例えばカポジ肉腫にかかりやすくする不治の疾患である後天性免疫不全症候群（AIDS）を引き起こす。AIDSは、世界的な大きい健康問題である。HIV/AIDSに関する合同国連プログラム（UNAIDS）は、HIVまたはAIDSに罹患している人が現在3400万人を超えると推定しており、それらの感染者のうち2810万人は貧しいサハラ下アフリカに住んでいる。米国では、約500人に1人がHIVに感染している、またはAIDSを有する。その流行以来、AIDSによる死者は全世界でアメリカ人425,000人を含むほぼ1900万人に達している。AIDSは、世界で最も死亡率の高い成人の感染症としてマラリアおよび結核に取って代わり、全世界での死因の第四位である。
【０００４】
HIVが細胞に侵入する分子メカニズムは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質（env）と二つの標的細胞タンパク質、CD4およびケモカイン受容体との特異的相互作用を必要とする。HIV細胞向性は、特定のケモカイン受容体、すなわち7回膜貫通Gタンパク質共役受容体に対するenvの特異性によって決定される（Steinbergerら（2000）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：805〜10）。ケモカイン受容体の二つの主要なファミリーは、CXCおよびCCケモカインに対するその結合に関してそれぞれ命名されたCXCケモカイン受容体とCCケモカイン受容体（CCR）である。CXCケモカイン受容体は、従来、急性の炎症反応に関連しているが、CCRsは、ほとんどが慢性炎症およびT細胞媒介炎症反応に関連して認められる細胞タイプ：好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびT細胞において発現されている（Nansenら、2002、Blood 99：4）。CCケモカイン受容体5（CCR5）は、主要なマクロファージ細胞株向性（M-向性）HIV株に関する主要な共受容体となる（Dengら（1996）、Nature 381：661）。M-向性株は、感染者における疾患の無症候相に多く存在する（Samsonら（1996）、Nature 382：722）。しかし、最終的にHIVは二重向性となりうる。そのような株は、CD4を有するT細胞上でCXCR4タンパク質を認識することができる。この相のあいだ、HIV-1は、マクロファージとT細胞の双方に感染する可能性がある。さらにその後、ウイルス集団の大部分はその嗜好性をCXCR4受容体へと切り替えて、T-細胞系向性（T-向性）となる可能性がある。T-向性ウイルスは、感染T細胞を容易に破壊して、免疫系の崩壊およびAIDSの発症に関与して、日和見感染症、神経疾患、新生物増殖、および最終的な死に至る。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、感染症を治療または予防するために、例えば、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えば細胞遺伝子発現またはタンパク質活性および／または感染因子の遺伝子または配列の発現またはタンパク質活性を調節することによって、感染疾患または障害、例えばウイルス感染症、例えばHIV感染症を予防および治療するための組成物および方法の発見に少なくとも一部基づいている。一つの態様において、細胞遺伝子はケモカイン受容体である。
【０００６】
本発明の一つの局面において、一つまたはそれ以上の細胞RNA干渉物質の中で、例えばsiRNAを、gag siRNAのような感染因子の遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAと併用すると、相乗効果を示し、感染症および／または複製、例えばHIV感染症および／または複製を長期間、例えば2週間またはそれ以上完全に抑制する。
【０００７】
したがって、本発明は、例えば標的遺伝子または配列を発現する細胞、例えばマクロファージにおける標的遺伝子または配列、例えばCCR5発現の阻害が得られる新規RNA干渉物質、例えばsiRNA分子を提供する。一つの態様において、本発明のRNA干渉物質は、感染、例えばHIV感染症の標的細胞への侵入を阻害して、感染症を予防する。もう一つの態様において、本発明のRNA干渉物質は、確立された感染症、例えばHIV感染症におけるウイルス複製を抑制する。
【０００８】
したがって、一つの局面において、本発明は、RNA干渉（RNAi）または転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を通して、標的遺伝子または配列、例えばCCR5の発現を阻害するRNA干渉物質を含む組成物を提供する。一つの態様において、物質は、標的遺伝子、例えばCCR5遺伝子またはその断片と相同であるRNAである。もう一つの態様において、物質は、標的遺伝子と相同である二本鎖の短い干渉RNA（siRNA）である。さらにもう一つの態様において、siRNAは長さが約19ヌクレオチド〜約28ヌクレオチド、好ましくは約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド、より好ましくは長さが約21ヌクレオチドである。さらなる態様において、siRNAは二本鎖であって、それぞれの鎖に3'突出末端を含む。一つの態様において、突出末端は、それぞれの鎖において約1〜約6ヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれの鎖において約2ヌクレオチドを含む。
【０００９】
好ましい態様において、物質は合成siRNAである。一つの態様において、siRNAは、第一の鎖が配列番号：1の配列を含み、第二の鎖が配列番号：2を含む二本鎖siRNAである。もう一つの態様において、siRNAはmRNA、例えばCCR5 mRNAの分解を誘導または調節することができる。さらにもう一つの態様において、siRNAは、転写後サイレンシングによって標的遺伝子または配列、例えばCCR5を不活化する。さらにもう一つの態様において、siRNAはさらにポリG-テールを含む。
【００１０】
もう一つの局面において、本発明は、標的遺伝子または配列と相同であって、標的遺伝子または配列のRNA干渉を促進することができる短い干渉RNA（siRNA）を含むベクターを提供する。さらにもう一つの局面において、本発明は、標的遺伝子または配列と相同であって、RNA干渉、例えばCCR5 RNA干渉を促進することができるRNAをコードするDNA鋳型を含むベクターを提供する。さらにもう一つの局面において、本発明は、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAを含む、または本発明のRNAをコードするDNA鋳型を含むベクターをトランスフェクトした細胞を提供する。
【００１１】
もう一つの局面において、本発明は、標的遺伝子発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAを被験者に投与することを含む、被験者における遺伝子発現を阻害する、または被験者における免疫応答、例えばケモカイン受容体によって調節される免疫応答、例えばCCR5調節免疫応答を調節する方法を提供する。本発明はまた、CCR5遺伝子発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAを被験者に投与することを含む、被験者における感染疾患または障害を予防または治療する方法を提供する。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、標的遺伝子発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAを細胞に投与することを含む、細胞、例えば標的遺伝子、例えばケモカイン受容体、例えばCCR5を発現する細胞へのウイルスの侵入を阻害する方法も提供する。一つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは静脈内投与される。もう一つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、被験者の粘膜に、例えば殺菌剤として局所投与される。一つの態様において、siRNAは投与前に塩基性ペプチドと混合される。もう一つの態様において、siRNAは、投与前にリポソームに封入される。
【００１３】
なおさらなる局面において、本発明は、細胞の遺伝子発現または活性を調節する一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAと、感染因子の遺伝子または配列の発現または活性、例えばHIV遺伝子発現を調節する一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAとを細胞に投与することを含む、標的遺伝子を発現する細胞、例えばマクロファージへの感染因子の侵入を阻害する方法、または感染症、例えばウイルス感染症を阻害する方法を提供する。もう一つの局面において、本発明は、細胞の遺伝子発現、例えばCCR5遺伝子発現または活性を調節、例えば阻害する一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAと、感染因子の遺伝子または配列の遺伝子発現または活性を調節する、例えば阻害する一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAとを被験者に投与することを含む、被験者における感染症を治療または予防する方法を提供する。一つの態様において、遺伝子発現を調節するRNA干渉物質、例えばsiRNAは、例えばgag遺伝子発現、vif遺伝子発現、またはnef遺伝子発現を調節する。もう一つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは静脈内投与される。RNA干渉物質、例えばsiRNAは同時または連続投与してもよい。さらなる態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、被験者の粘膜に、例えば殺菌剤として局所投与される。RNA干渉物質は、感染因子による感染前、感染時、または感染後に投与してもよい。
【００１４】
本発明の他の特徴および長所は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかとなると思われる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、被験者における感染症、例えばHIV感染症、AIDS、またはAIDS関連疾患もしくは障害を治療または予防するために、例えば、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えば細胞遺伝子発現またはタンパク質活性および／または感染因子によって発現された遺伝子または配列の遺伝子発現またはタンパク質活性を調節することによって、感染疾患または障害、例えばウイルス感染症、例えばHIV感染症を予防および／または治療する組成物および方法の発見に少なくとも一部基づいている。特に、本発明は、感染疾患または障害、例えばウイルスまたは細菌感染症、例えばHIV感染症、AIDS、またはAIDS関連疾患または障害を治療または予防するために、一つまたはそれ以上の細胞標的分子の遺伝子発現またはタンパク質活性、例えばCCR5遺伝子発現またはタンパク質活性を調節する、および／または感染因子の一つまたはそれ以上の標的分子、例えばウイルス標的分子、例えばgag遺伝子の遺伝子発現またはタンパク質活性を調節する組成物および方法に関する。
【００１６】
本発明の一つの局面において、一つまたはそれ以上の細胞RNA干渉物質、例えばsiRNAを、感染因子の遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばp24 siRNAのようなsiRNAと併用すると、相乗効果を示し、感染症および／または複製、例えばHIV感染症および／または複製を長期間にわたって、例えば2週間またはそれ以上有効に抑制することが示されている。したがって、本発明は、例えばケモカイン受容体、例えばCCR5を含む細胞遺伝子を標的とする一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNA分子を、ウイルス遺伝子、例えばp24を含む、例えばHIV遺伝子を標的とする一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNA分子と併用すると、感染症および／または複製、例えばHIV感染症および／または複製を阻害するという発見に基づいている。一つの態様において、感染症および／または複製の阻害は、長期間、例えば2週間またはそれ以上であってもよい。したがって、本発明の一つの態様において、細胞遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAと、感染因子の遺伝子または配列、例えばHIVウイルス遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNAとの併用を用いて、例えばウイルス、例えばHIVによる感染症および／または複製を治療および／または予防する。本発明の方法および組成物は、HIVの治療および予防に限定されず、本明細書に記述する任意の感染疾患または障害の治療および予防を含む。
【００１７】
一つの局面において、本発明は、本明細書に記述の一つまたはそれ以上の治療物質、例えばRNA干渉物質を被験者に投与することによって、被験者における感染疾患または障害を予防する方法を提供する。例えば、本明細書に記述のRNA干渉物質は、例えば性的伝幡感染症（STIs）、例えば肝炎、例えばHBV、HCV、HGV、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、ヘルペス（HSV-2）、他のウイルス感染症および／または細菌感染症のような、微生物によって伝幡される疾患の伝幡を実質的に減少させるための殺菌剤として用いてもよい。例えば、RNA干渉物質は、被験者の粘膜に投与してもよい。感染疾患または障害のリスクを有する被験者は、例えば、感染疾患または障害に関する任意の既知の危険因子によって同定することができる。
【００１８】
本発明はまた、細胞遺伝子または配列、例えばケモカイン受容体遺伝子を標的として、それによって細胞遺伝子発現細胞、例えばマクロファージにおける細胞遺伝子の発現を阻害して、それによって標的細胞への感染因子、例えばウイルス、例えばHIVの侵入を阻害して、感染症を予防する、および確立された感染症、例えばHIV感染症におけるウイルス複製を抑制する新規RNA干渉物質、例えばsiRNA分子の同定に少なくとも部分的に基づいている。
【００１９】
本発明の一つの局面において、マクロファージによって発現される細胞遺伝子、例えばケモカイン受容体、例えばCCR5を標的とするRNA干渉物質、例えばsiRNAは、最終分化した非分裂細胞であるマクロファージ内に、感染因子、例えばウイルス遺伝子、例えばHIVウイルス遺伝子の分子を標的とするように向けられたsiRNAより長期間留まることが判明した。したがって、マクロファージによって発現される遺伝子、例えばCCR5を標的とするsiRNAは、細胞遺伝子、例えばCCR5の持続的なノックダウンにより、感染症、例えばHIV感染症のようなウイルス感染症に対してより長期の保護を提供する。理論に拘束されたくはないが、基質RNA、例えばCCR5が持続的に存在することは、siRNAの細胞内持続にとって必要であり、このように、標的遺伝子、例えばCCR5のRNA干渉およびウイルス、例えばHIVの細胞への侵入の阻害を延長するために必要である可能性があると提唱される。同様に、siRNAの作用は、標的mRNAの存在下であっても分裂細胞株において急激に減少することも示されている。さらに、CCR5は、CCR5の非機能的対立遺伝子のホモ接合発現が、有害な免疫学的結末を有しないが、HIV感染症に対する保護を提供することから、所望の標的となる可能性がある。したがって、非分裂マクロファージによって発現される遺伝子、例えばCCR5は、RNA干渉によって遺伝子発現を阻害するRNA干渉物質、例えばsiRNAにとっての好ましい標的となる。したがって、マクロファージによって発現される遺伝子、例えばCCR5に向けられるRNA干渉物質、例えばsiRNAは、HIV感染症、AIDS、AIDS関連疾患または障害を含む、ウイルス感染症に対して好ましい治療および予防物質となる。本発明のRNA干渉物質は、マクロファージによって発現される分子を標的とするRNA干渉物質に限定されないと理解すべきである。細胞標的には、T細胞、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、および樹状細胞を含むがこれらに限定されない任意の細胞タイプによって発現される分子が含まれる。
【００２０】
本明細書において用いられる「RNA干渉物質」は、RNA干渉（RNAi）によって標的遺伝子またはゲノム配列の発現を妨害または阻害する任意の物質であると定義される。そのようなRNA干渉物質には、標的遺伝子またはゲノム配列と相同であるRNA配列またはその断片を含む核酸分子、短い干渉RNA（siRNA）、およびRNA干渉（RNAi）によって標的遺伝子の発現を妨害または阻害する低分子が含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
「RNA干渉（RNAi）」は、標的遺伝子と同一または高度に類似である配列のRNAを発現または導入することによって、その標的遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）が起こり（Coburn, G, and Cullen, B.（2002）、J. Virology 76（18）：9225を参照されたい）、それによってその標的遺伝子の発現を阻害する、進化的に保存されたプロセスである。一つの態様において、RNAは、二本鎖RNA（dsRNA）である。このプロセスは植物、無脊椎動物、および哺乳類細胞において記述されている。本質的にRNAiは、dsRNA特異的エンドヌクレアーゼであるダイサーによって開始され、これは長いdsRNAをsiRNAと呼ばれる二本鎖断へと前進的に切断することを促進する。siRNAは、標的mRNAを認識して切断するタンパク質複合体に組み入れられる。RNAiはまた、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするために、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉物質を導入することによって開始することができる。本明細書において用いられるように、「標的遺伝子発現の阻害」には、標的遺伝子または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルの如何なる減少も含まれる。減少は、RNA干渉物質によって標的とされていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％もしくはそれ以上であってもよい。
【００２２】
本明細書において「小さい干渉RNA」とも呼ばれる「短い干渉RNA」（siRNA）は、標的遺伝子の発現を阻害するように機能する物質、例えばRNAiであると定義される。siRNAは、化学合成してもよく、インビトロ転写によって産生してもよく、または宿主細胞内で産生してもよい。一つの態様において、siRNAは、長さが約15〜約40ヌクレオチド、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは長さが約19〜約25ヌクレオチド、およびより好ましくは長さが約19、20、21、または22ヌクレオチドである二本鎖RNA（dsRNA）分子であり、それぞれの鎖が約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチドの長さを有する3'および／または5'突出末端を含んでもよい。突出末端の長さは二つの鎖のあいだで無関係であり、すなわち一つの鎖の突出末端の長さは、第二の鎖の突出末端の長さに依存しない。好ましくはsiRNAは、標的メッセンジャーRNA（mRNA）の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）を通してRNA干渉を促進することができる。
【００２３】
もう一つの態様において、siRNAは、小さいヘアピン（ステムループとも呼ばれる）RNA（shRNA）である。一つの態様において、これらのshRNAは、短い（例えば、19〜25ヌクレオチド）アンチセンス鎖からなり、その後に5〜9ヌクレオチドループおよび類似のセンス鎖が続く。または、センス鎖は、ヌクレオチドループ構造の前に存在して、アンチセンス鎖がその後に続いてもよい。これらのshRNAは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスに含まれてもよく、例えばpol III U6プロモーターまたは他のプロモーターから発現させてもよい（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Stewartら（2003）、RNA Apr. 9(4)：493〜501を参照されたい）。
【００２４】
一つの態様において、siRNAは、標的遺伝子における特異的遺伝子変異を標的としてもよい。
【００２５】
標的遺伝子は、遺伝子または感染因子の配列、例えば、ウイルス遺伝子、または細胞遺伝子またはその断片であってもよい。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片と実質的に相同であってもよい。本明細書において用いられるように、「相同である」という用語は、標的のRNA干渉を引き起こすために標的mRNA、またはその断片と実質的に同一である、十分に相補的である、または類似であると定義される。天然のRNA分子の他に、標的配列の発現を阻害または干渉するために適したRNAには、RNA誘導体および類似体が含まれる。siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はないが、例えば化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含み、同様にリボース糖分子がもう一つの糖分子または類似の機能を行う分子の代わりに用いられている分子が含まれる。その上、ヌクレオチド残基間に、ホスホロチオエート結合のような非天然の結合を用いてもよい。RNA鎖は、蛍光体のようなレポーター基の反応性官能基によって誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の末端または複数の末端、典型的にセンス鎖の3'末端で改変される。例えば、3'末端の2'-ヒドロキシルは、多様な基によって容易かつ任意に誘導体化することができる。
【００２６】
他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'O-メチルリボシル誘導体および2'O-フルオロリボシル誘導体のような、改変された糖質部分を有するヌクレオチドを組み入れる。
【００２７】
RNAの骨格も同様に改変してもよい。標的配列の発現を阻害するまたは干渉するために有用な如何なる改変された基本骨格も用いてもよい。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルのようなハロゲン添加基本骨格を組み入れてもよい。基本骨格はまたアルキル化してもよく、例えば7-メチルグアノシンを、グアノシン残基の代わりに組み入れることができる。阻害の成功が得られる非天然基本骨格も同様に組み入れることができる。
【００２８】
感染疾患または障害、またはその症状の開始または発現に関与または関連する任意の細胞分子（本明細書において、「宿主細胞分子」とも呼ばれる）は、本発明の組成物および方法によって調節される可能性がある。例えば、本発明のRNA干渉物質の細胞標的（同様に、本明細書において「宿主細胞標的」とも呼ばれる）には、任意の感染因子もしくはその一部、例えば任意のウイルスもしくは細菌感染因子、または他の感染因子、例えばHIVの、任意の感染因子のライフサイクル、複製、または病原性に関与する任意の細胞または任意の細胞分子への侵入または輸送に関与する任意の細胞分子が含まれるがこれらに限定されない。細胞標的には、細胞受容体および共受容体、例えばケモカイン受容体が含まれる。ケモカイン受容体には、例えばCXCケモカイン受容体およびCCケモカイン受容体（CCR）、例えばCXCR2、CXCR4、CCR8、CCR9、CCR5、CCR4、CCR3、CCR2、およびCCR1が含まれる。他の受容体には、STRL33、US28、V28、gpr1、gpr15、Apj、ChemR23等が含まれる。他の任意の細胞表面分子、例えばCD26、VPAC1等、またはこれらの分子を産生する任意の分子、例えばヘパリン硫酸プロテオグリカン、ガラクトセラミド等を合成する酵素も同様に、細胞標的に含まれる。同様に、RNAポリメラーゼII、N-ミリストイルトランスフェラーゼ、グリコシル化酵素、gp160-プロセシング酵素、リボヌクレオチドレダクターゼ、ポリアミン生合成に関与する酵素、ウイルス出芽に関与するタンパク質等が含まれるがこれらに限定されないウイルスのライフサイクル、例えばHIVライフサイクルに関与する細胞酵素も同様に、細胞標的として含まれる。他の細胞標的には、細胞転写因子、サイトカインおよび二次伝達物質、例えばTNFα、IL-1α、ホスホリパーゼC、タンパク質キナーゼC、細胞内カルシウムの調節に関与するタンパク質、および細胞アクセサリ分子が含まれる。
【００２９】
本明細書において用いられるように、「感染因子の標的分子」または「感染因子の遺伝子または配列」という句には、感染因子のゲノム内に含まれる任意の遺伝子もしくは配列、または例えば、因子による複製、病原性、もしくは感染に関与する因子のライフサイクルのあいだに産生される任意の他の転写物が含まれる。感染因子の標的分子は、感染因子に対して特異的でなければならず、すなわちこれは宿主細胞に通常存在する遺伝子または配列とは異なる配列を有しなければならない。
【００３０】
「感染因子」という用語には、感染することができる任意のウイルス（DNAまたはRNAウイルス）、細菌、真菌または原虫が含まれる。例えば、感染因子には、HIV、CMV、RSV、HSV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー谷脳炎、ポリオウイルス、SARS、インフルエンザ、ライノウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、口蹄疫ウイルス、乳頭腫ウイルス感染症が含まれ、肝炎、例えばHBV、HCV、HGV、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、ヘルペス（HSV-2）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、および／または細菌、真菌、または原虫のような、しかしこれらに限定されない性的に伝幡される疾患が含まれる。したがって、感染因子の標的分子には、感染することができる任意のウイルス（DNAまたはRNAウイルス）、細菌、真菌、または原虫、例えばHIV、CMV、RSV、HSV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー谷脳炎、ポリオウイルス、インフルエンザ、ライノウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、口蹄疫ウイルス、乳頭腫ウイルス感染症が含まれ、肝炎、例えばHBV、HCV、HGV、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、ヘルペス（HSV-2）、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、および／または細菌、真菌、または原虫のような、しかしこれらに限定されない性的に伝幡される疾患に含まれる任意の遺伝子または配列が含まれる。一つの態様において、感染因子の標的分子には、例えばHIVゲノム、例えばp24、他のgagタンパク質p6、p2およびp1を含む任意のウイルスタンパク質をコードする転写物、ポリメラーゼ（p61、p55）、逆転写酵素、RNアーゼH、プロテアーゼ、インテグラーゼ、エンベロープ、tat、rev、nef、vif、vpu、vpx、および／またはtevに含まれる任意の遺伝子または配列が含まれる。
【００３１】
本明細書において用いられるように、細菌感染因子には、グラム陽性およびグラム陰性菌を含む多様な細菌生物が含まれる。例には、淋菌（N. gonorhoeae）および髄膜炎菌（N. meningitidis）を含むナイセリア（Neisseria）種；肺炎球菌（S. pneumoniae）、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、S.アガラクチエ（S. agalactiae）、ミュータンス連鎖球菌（S. mutans）を含む連鎖球菌（Streptococcus）種；B型インフルエンザ菌（H. influenzae）、型別不明インフルエンザ菌（H. influenzae）および軟性下疳菌（H. ducreyi）を含むヘモフィルス（Haemophilus）種；カタル球菌（Branhamella catarrhalis）としても知られるM.カタラーリス（M. catarrhalis）を含むモラクセラ（Moraxella）種；百日咳菌（B. pertussis）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、および気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）を含むボルデテラ（Bordetella）種；結核菌（M. tuberculosis）、ウシ型結核菌（M. bovis）、らい菌（M. leprae）、トリ結核菌（M. avium）、パラ結核菌（M. paratuberculosis）、スメグマ菌（M. smegmatis）を含むマイコバクテリウム（Mycobacterium）種；L.ニューモフィラ（L. pneumophila）を含むレジオネラ（Legionella）種；腸毒性大腸菌、腸出血性大腸菌、腸病原性大腸菌を含む大腸菌種；ビブリオコレラ（V. cholelra）を含むビブリオ（Vibrio）種；ソンネ赤痢菌（S. sonnei）、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）、フレクスナー赤痢菌（flexneri）を含む赤痢菌（Shigella）種；Y.エンテロコリチカ（Y. enterocolitica）、ペスト菌（Y. pestis）、偽結核エルシニア菌（Y. pseudotuberculosis）を含むエルシニア（Yersinia）種；C.ジェジュニ（C. jejuni）およびC.コリ（C. coli）を含むカンピロバクター（Campylobacter）種；ネズミチフス菌（S. typhi）、パラチフス菌（S. paratyphi）、ブタコレラ菌（S. choleraesuis）、腸炎菌（S. enteritidis）を含むサルモネラ（Salmonella）種；リステリア菌（L. monocytogenes）を含むリステリア（Listeria）種；ピロリ菌（H. pylori）を含むヘリコバクター（Helicobacter）種；緑膿菌（P. aeruginosa）を含むシュードモナス（Pseudomonas）種；黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を含むブドウ球菌（Staphylococcus）種；E.フェカーリス（E. faecalis）、E. フェシウム（E. faecium）を含む腸球菌（Enterococcus）種；破傷風菌（C. tetani）、ボツリヌス菌（C. botulinum）、C.ディフィシレ（C. difficile）を含むクロストリジウム（Clostridium）種；炭疽菌（B. anthracis）を含むバチルス（Bacillus）種；ジフテリア菌（C. dyphtheriae）を含むコリネバクテリウム（Corynebacterium）種；B.ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）、B.ガリニー（B. garinii）、B.アフゼリー（B. afzelii）、B.アンデルソニー（B. andersonii）、B.ヘルムシー（B. hermsii）を含むボレリア（Borrelia）種；E.エクイ（E. equi）およびヒト顆粒球エールリッヒア症の起因菌を含むエールリッヒア（Ehrlichia）種；R.リケッチー（R. rickettsii）を含むリケッチア（Rickettsia）種；トラコーマクラミジア（C. trachomatis）、C.ニューモニア（C. neumoniae）、オウム病クラミジア（C. psittaci）を含むクラミジア（Chlamydia）種；L.インテロガンス（L. interrogans）を含むレプトシラ（Leptsira）種；梅毒トレポネーマ（T. pallidum）、T.デンティコラ（T. denticola）、T.ヒオディセンテリエ（T. hyodysenteriae）を含むトレポネーマ（Treponema）が含まれるがこれらに限定されない。好ましい細菌には、リステリア、マイコバクテリア、マイコバクテリア（例えば結核菌）、炭疽���、サルモネラ、およびリステリア菌が含まれるがこれらに限定されない。
【００３２】
本明細書において用いられるように、「感染疾患または障害」という用語は、任意の感染因子による感染症によって引き起こされる、またはそれに関連する任意の疾患、障害、または感染症として定義される。例えば、感染疾患または障害には、ウイルス感染因子、細菌感染因子、真菌感染因子、または原虫感染因子による感染症によって引き起こされるまたは関連する疾患または障害が含まれる。感染疾患または障害の例には、ウイルス感染因子、例えばHIVによって引き起こされる、または関連する疾患または障害、AIDS関連痴呆、カポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、および浸潤性扁平上皮癌のようなAIDS関連癌、AIDS関連疾患または障害、CMV、RSV、HSV、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、マレー谷脳炎、ポリオウイルス、インフルエンザ、ライノウイルス、西ナイルウイルス、エボラウイルス、口蹄疫ウイルス、サイトメガロウイルス（特にヒト）、ロタウイルス、エプスタイン-バーウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、パラミクソウイルス：呼吸合包体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、またはインフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス（例えば、HPV6、11、16、18等）が含まれるがこれらに限定されないウイルス感染症、肝炎、例えばHBV、HCV、HGV、およびヘルペス（HSV-2）のような、しかしこれらに限定されない他の性的伝幡疾患感染症が含まれる。
【００３３】
「AIDS関連疾患または障害」とは、細胞または生物、例えばヒトのHIVウイルス、例えばHIV-1またはHIV-2による感染症によって引き起こされるまたはそれに関連する任意の疾患、障害、または感染症であると定義される。AIDS関連疾患または障害の例には、AIDS関連痴呆、カポジ肉腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経リンパ腫、および浸潤性扁平上皮癌のようなAIDS関連癌、非結核性抗酸菌（MAC）が含まれるがこれらに限定されないAIDS関連感染症、消耗症候群、真菌感染症、消化管症状、肺炎、疲労、発熱、悪心、腎障害、骨格筋障害、またはHIV感染症に関連した他の任意の疾患もしくは障害、またはHIV感染症によって引き起こされた免疫系機能の低下が含まれるがこれらに限定されない。
【００３４】
本明細書において用いられるように、「被験者」という用語には、感染因子による感染に対して感受性がある個体が含まれる。
【００３５】
本発明の様々な局面を、以下の小章においてさらに詳しく説明する。
【００３６】
I．本発明の短い干渉RNA（siRNA）
特に、本発明は、標的遺伝子と相同であり、かつ標的遺伝子または標的配列のRNAiを媒介する、長さが約15〜約40、または約15〜約28ヌクレオチドのsiRNA分子またはshRNA分子に関する。好ましくは、siRNA分子の長さは約19〜約25ヌクレオチドである。より好ましくは、siRNA分子の長さは約19、20、21、または22ヌクレオチドである。本発明のsiRNA分子はまた3'ヒドロキシル基を含みうる。本発明のsiRNA分子は、一本鎖または二本鎖となりうる；そのような分子は、平滑末端にすることができ、または突出末端（例えば、5'、3'）を含みうる。特定の態様において、RNA分子は二本鎖であり、かつ平滑末端であるか、または突出末端を含む。
【００３７】
一つの態様において、RNA分子の少なくとも一つの鎖は、長さが約0〜約6ヌクレオチド（例えば、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチド）の3'突出末端を有する。他の態様において、3'突出末端は、長さが約1〜約5ヌクレオチド、約1〜約3ヌクレオチド、および長さが約2〜約4ヌクレオチドである。一つの態様において、RNA分子は二本鎖であり、一つの鎖が3'突出末端を有し、もう一つの鎖が平滑末端または突出末端を有しうる。RNA分子が二本鎖であり、かつ双方の鎖が突出末端を含む態様において、突出末端の長さは、それぞれの鎖に関して同じまたは異なっていてもよい。特定の態様において、本発明のRNAは、対応のある約19個、20個、21個、または22個のヌクレオチドストランドを含み、RNAの双方の3'末端において約1〜約3、特に約2ヌクレオチドの突出末端を有する。一つの態様において、3'突出末端は、分解に対して安定化することができる。好ましい態様において、RNAは、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含めることによって安定化される。または、改変類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えばウリジン2ヌクレオチド3'突出末端の2'-デオキシチミジンによる置換は許容されて、RNAiの有効性に影響を及ぼさない。2'ヒドロキシルが存在しないことは、組織培養培地における突出末端のヌクレアーゼ抵抗性を有意に増強する。
【００３８】
A．siRNA分子の設計と調製
本発明のshRNA分子を含む合成siRNA分子は、当業者に既知の多くの技術を用いて得ることができる。例えばsiRNA分子は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトまたは通常のDNA/RNAシンセサイザーを用いるような、当技術分野で既知の方法を用いて化学合成または組換えによって産生することができる（例えば、Elbashir, S.M.ら（2001）、Nature 411：494〜498；Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl（2001）、Genes & Development 15：188〜200；Harborth, J.ら（2001）、J. Cell Science 114：4557〜4565；Masters, J.R.ら（2001）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98：8012〜8017；およびTuschl, T.ら（1999）、Genes & Development 13：3191〜3197を参照されたい）。または、プロリゴ（Proligo、ハンブルグ、ドイツ）、ダーマコン・リサーチ（Dharmacon Research、ラファイエット、コロラド州、アメリカ）、ピアスケミカル（Pierce Chemical、ペルビオサイエンスの一部、ロックフォード、イリノイ州、アメリカ）、グレンリサーチ（Glen Research、スターリング、バージニア州、アメリカ）、ケムジーンズ（ChemGenes、アシュランド、マサチューセッツ州、アメリカ）およびクルアケム（Cruachem、グラスゴー、イギリス）が含まれるがこれらに限定されないいくつかの民間のRNA合成供給企業を利用できる。そのため、siRNA分子は、合成することがそれほど難しくなく、RNAiにとって適した量で容易に提供される。
【００３９】
本発明のsiRNA分子の標的領域は、開始コドンの下流の約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチドから始まる、所定の標的遺伝子配列、例えば細胞またはウイルスの標的配列、例えばケモカイン受容体、例えばCCR5、gag遺伝子、例えばp24抗原などから選択されうる。ヌクレオチド配列は、5'または3' UTRsおよび開始コドン近傍領域を含んでもよい。本発明のsiRNA分子を設計する一つの方法は、23ヌクレオチド配列モチーフAA（N19）TT（Nは任意のヌクレオチドとなりうる）を同定すること、およびG/C含有量が少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、または75％である配列を選択することを含む。または、そのような配列が認められない場合、Nが任意のヌクレオチドとなりうるモチーフNA（N21）を用いて検索を拡大してもよい。この状況において、センスsiRNAの3'末端は、センスおよびアンチセンス3'突出末端の配列組成に関して対称的な二本鎖を産生させるようにTTに変換してもよい。次に、アンチセンスsiRNA分子を、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド1位〜21位に対する相補体として合成してもよい。対称的な3' TT突出末端を用いることは、センスおよびアンチセンス標的RNA切断siRNPsの比がほぼ等しい小さい干渉リボヌクレオタンパク質粒子（siRNPs）を確実に形成するために都合がよい可能性がある（Elbashirら（2001）、上記、およびElbashirら（2001）、上記）。NCBI、BLAST、Derwent、およびGenSeqと共にOligoengine（登録商標）のような市販のオリゴ合成企業が含まれるがこれらに限定されない配列データベースの分析を用いて、唯一の遺伝子が確実に標的化されるようにESTライブラリに対してsiRNA配列を選択してもよい。
【００４０】
II．RNA干渉物質の輸送
本発明のRNA干渉物質、例えばsiRNA、または本発明のsiRNAを含むベクターの標的細胞、例えばマクロファージもしくはCD4+ T細胞、または他の造血細胞に取り込ませるための輸送法には、物質、例えばsiRNAを含む組成物の注射、または物質、例えばsiRNAを含む組成物に細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞を直接接触させることが含まれる。ウイルス媒介輸送メカニズムも同様に、Xia, H.ら（2002）、Nat. Biotechnol. 20(10)：1006に記述されるように、物質、例えばsiRNAをインビトロおよびインビボで細胞に輸送するために用いてもよい。本発明のsiRNA分子を標的細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞に導入する他の方法には、燐酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、DEAEデキストラン媒介トラスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔と共に市販の多くのトランスフェクションキット（例えば、インビトロジェン（Invitrogen）社のOLIGOFECTAMINE（登録商標）試薬）が含まれるがこれらに限定されない当技術分野で認識される多様な技術が含まれる（例えば、Sui, G.ら（2002）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99：5515〜5520；Calegari, F.ら（2002）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10月21日、2002年[出版に先立つ電子出版]；J-M Jacque, K.Triques and M. Stevenson（2002）、Nature 418：435〜437；およびElbashir, S.M.ら（2001）、上記を参照されたい）。標的細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞をトランスフェクトする適した方法はまた、Sambrookら（「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第二版、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1989）および他の実験マニュアルに認めることができる。トランスフェクション効率は、細胞タイプ、継代回数、細胞のコンフルエンシーと共にsiRNA-リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒立対攪拌）を含む多くの要因に依存する可能性がある。これらの要因は、当業者によって過度の実験を行うことなく評価および調節することができる。
【００４１】
siRNAは、以下の活性の一つまたはそれ以上を行う成分と共に導入してもよい：細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞によるsiRNA取り込みの増強、一本鎖のアニーリングの阻害、一本鎖の安定化、またはそうでなければ標的細胞への輸送の促進、および標的遺伝子、例えばCCR5の阻害の増加。例えば、標的細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞に取り込ませるためにsiRNAの一つまたはそれ以上の末端にポリ-Gテールを付加してもよい。その上、siRNAは、Capodiciら（（2002）、J. Immunol. 169(9)：5196）に記述されるように、フルオロ誘導体化して標的細胞に輸送してもよい。
【００４２】
RNA干渉物質、例えばsiRNAは、細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞に直接導入してもよく、または生物の体腔、間質腔、もしくは循環中に細胞外に導入してもよく、経口的に導入してもよく、または物質、例えばsiRNAを含む溶液に細胞または生物を浸すことによって導入してもよい。RNA干渉物質、例えばsiRNAは、粘膜への局所応用によって細胞に導入してもよい。血管または血管外循環、血液、またはリンパ系および脳脊髄液も同様に、RNA干渉物質、例えばsiRNAを導入してもよい部位である。
【００４３】
細胞をsiRNAによって処置するさらなる方法は、siRNAによって処置すべき細胞、例えばマクロファージまたはCD4+ T細胞が、既知の方法（例えば、静脈切開または骨髄採取）を用いて個体から得られ、標的遺伝子の阻害を媒介する一つまたはそれ以上のsiRNAが細胞に導入され、これを再度個体に導入するエクスビボ法である。必要であれば、RNAiが起こるために必要な生化学成分も同様に細胞に導入することができる。
【００４４】
もう一つの態様において、RNAは、HIV抵抗性免疫細胞、例えばマクロファージを作製するために骨髄由来幹細胞において発現するように操作してもよい。
【００４５】
本発明のもう一つの局面は、本発明のRNA、例えば細胞遺伝子を標的化する1つまたは複数のsiRNA、および/または感染因子の遺伝子または配列、例えばウイルス遺伝子、例えばCCR5 siRNA、p24 siRNA、またはその両方を標的化する1つまたは複数のsiRNA
をコードする核酸を含むベクター、例えば組換え型発現ベクターに関する。本明細書において用いられるように、「ベクター」という用語は、それが連結しているもう一つの核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これはさらなる核酸セグメントをライゲーションすることができる環状の二本鎖DNAループを指す。もう一つのタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、この場合、さらなる核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）において自律増幅を行うことができる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み入れられて、それによって宿主ゲノムと共に複製される。その上特定のベクターは、それらが機能的に結合する遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」、またはより単純に「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形のベクターであることから、互換的に用いることができる。しかし、本発明には、同等の機能を示すウイルスベクター（例えば、複製欠損、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、そのような他の型の発現ベクターも含まれると意図される。好ましい態様において、レンチウイルスは本発明の一つまたはそれ以上のsiRNA分子を細胞、例えば、マクロファージ、T細胞、樹状細胞、または造血幹細胞に輸送するために用いられる。
【００４６】
発現ベクターにおいて、「機能的に結合した」とは、対象ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節配列に結合していることを意味すると意図される（例えば、インビトロ転写／翻訳系、またはベクターが標的細胞に導入されている場合には標的細胞において）。「調節配列」という用語には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれると意図される。そのような調節配列は、例えばGoeddel：「Gene Expression Technology」、Methods in Enzymology 185、アカデミック出版、サンジエゴ、カリフォルニア州（1990）に記述されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示する配列および特定の宿主細胞に限ってヌクレオチド配列の発現を指示する配列（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、望ましいsiRNAの発現レベル等のような要因に依存しうることは当業者によって認識されるであろう。
【００４７】
本発明の発現ベクターは、それによって本発明のsiRNA分子を産生するために標的細胞に導入することができる。一つの態様において、DNA鋳型、例えば標的遺伝子をコードするDNA鋳型を、RNAポリメラーゼIII（Pol III）の制御下で発現ベクターにライゲーションして、これを標的細胞に輸送してもよい。Pol IIIは、3'末端がチミジン4〜5個の枝において終止することによって定義される、小さい非コード転写物の合成を指示する。発現ベクターは、個々にセンスおよびアンチセンス鎖を発現してもよく、またはヘアピン構造として発現してもよい。ヘアピンRNA（ステムループとも呼ばれる；アンチセンス鎖の後に短い（〜5塩基対）ループが続き、この後にセンス鎖が続く）は、ダイサーによって有効なsiRNAへと内因性に処理されると考えられる。ヘアピン構造を、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターに導入してもよい。したがって、DNA鋳型を用いてインビボで、RNAiを行うsiRNAを合成してもよい（Suiら（2002）、PNAS 99(8)：5515）。
【００４８】
もう一つの態様において、本発明の組成物は、リポソームのような脂質集合体の表面成分として提供される、またはリポソームに封入される。単層または多層となりうるリポソームは、異なるメカニズムによって封入された材料を細胞に導入することができる。例えば、リポソームは、細胞膜と融合させることによってその封入された材料を細胞の細胞質に直接導入することができる。または、リポソームは、酸性の液胞（すなわち、エンドソーム）に区画化されることができ、その内容物をリポソームおよび酸性の液胞から細胞質に放出させる。一つの態様において、本発明は、ホスファチジルコリン（多様な鎖の長さの；例えば卵黄のホスファチジルコチン）、コレステロール、陽イオン脂質、および1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ3-ホスホエタノールアミン-ポリエチレングリコール-2000（DSPE-PEG2000）を含む、本明細書に記述の化合物の脂質集合製剤を特徴とする。この脂質集合体の陽イオン脂質成分は、ジオレイル1,2-ジアシルトリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）のような当技術分野で既知の任意の陽イオン脂質となりうる。もう一つの態様において、ポリエチレングリコール（PEG）を本発明の組成物に共有結合させる。結合したPEGは、任意の分子量となりうるが、好ましくは2000〜50,000ダルトンのあいだである。
【００４９】
本明細書において用いられるように、「標的細胞」という用語は、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAをコードする組換え型発現ベクターを含む、RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNA分子が導入されている細胞を指すと意図される。「標的細胞」および「宿主細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。そのような用語は、特定の被験細胞のみならず、そのような細胞の子孫または可能性がある子孫を指すと理解すべきである。変異または環境的影響のためにその後の世代に特定の改変が起こる可能性があることから、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、それでもなお本明細書において用いられる用語の範囲内に含まれる。好ましくは、標的細胞は哺乳類細胞、例えばヒト細胞である。特に好ましい態様において、これは、マクロファージまたはCD4+ T細胞である。
【００５０】
樹状細胞（DC）およびマクロファージは、環境試料を絶えず採取して、アポトーシス細胞における陰イオンポリマーおよびホスファチジルセリン（PS）取り込みのための特定の受容体を有する、というこれらの細胞の独自の特性を利用して、これらを特異的にターゲティングしてもよい。リポソームに封入されたsiRNAを、DCおよびマクロファージを特異的に標的とする輸送法として用いてもよい。一つの態様において、siRNAに対する脂質の様々な比を利用してもよい。リポソーム組成物はまた、アポトーシス細胞の認識および貪食のために用いられるPS受容体を通しての取り込みを増強するためにPSの様々な濃度を組み入れるように改変してもよい（Fadok, VA.ら、（2000）、Nature 405：85〜90；Fadok, VA. and Chimini, G.（2002）、Semin. Immunol. 13：365〜372；Hoffmann, PRら（2001）、J. Cell Biol. 155：649〜659；Huynh, ML.ら（2002）、J. Clin. Invest. 109：41〜50）。
【００５１】
リポソームを作製するために、燐脂質のクロロホルム／メタノール（90：10）溶液を窒素下で乾燥させて、様々な濃度の二本鎖Cy5-標識siRNAを含むPBSに再浮遊させて、4℃で3時間超音波処理する。リポソームをMDMに加える（Huynh, ML.ら（2002）、J. Clin. Invest. 109：41〜50）。トランスフェクション効率は、一晩培養後に決定して、エピ蛍光顕微鏡によって洗浄して、フローサイトメトリーによって定量する。もう一つの態様において、マクロファージスキャベンジャー受容体を通しての取り込みを増強するために、長さが約5〜10ヌクレオチドのポリGテールをsiRNAのセンス鎖の5'末端に付加してもよい（Srividya, S.ら（2000）、Biochem. Biophys. Res. Commun. 268：772〜777）。
【００５２】
本発明のもう一つの態様において、本発明のRNA干渉物質は、例えば、隣接した塩基性サブユニットを含む担体ポリマーを用いて、担体ポリマーに会合していないRNA干渉物質、例えばsiRNA分子の輸送速度より高い速度で生体膜を超えて輸送また導入してもよい。担体ポリマーを陽イオントランスフェクション物質と共に、またはこれを用いないでRNA干渉物質、例えばsiRNAと併用することによって、担体ポリマーとRNA干渉物質、例えばsiRNAとの会合が起こる。担体ポリマーは、インビトロおよびインビボでRNA干渉物質、例えばsiRNAを生体膜を超えて効率よく輸送する可能性がある。したがって、本発明は、担体ポリマーを用いて、RNA干渉物質、例えばsiRNAを生体膜、例えば核膜を含む細胞膜を超えて輸送する方法を提供する。本発明はまた、担体ポリマーと会合させたRNA干渉物質、例えばsiRNAを含む組成物を提供する。RNA干渉物質と担体ポリマーとの会合に関連して本明細書において用いられる「会合した（associated）」という用語は、RNA干渉物質、例えばsiRNAと担体ポリマー、例えばペプチドポリマーとの、直接結合または間接的結合による、共有結合もしくは化学結合による、または静電結合による会合を指す。
【００５３】
本明細書において用いられるように、「ポリマー」という用語は、共有結合によって結合した二つまたはそれ以上の同一の、または同一でないサブユニットの直線的な鎖を指す。ペプチドは、ペプチド結合によって結合した同一または非同一アミノ酸サブユニットで構成されうるポリマーの一例である。
【００５４】
本明細書において用いられるように、「ペプチド」という用語は、D-もしくはL-アミノ酸の単一の鎖、またはペプチド結合によって結合したD-およびL-アミノ酸の混合物によって構成された化合物を指す。一般的に、ペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸残基を含み、長さがアミノ酸約50個未満である。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって結合した直線状に配置されたアミノ酸からなるが、ペプチドとは対称的に十分に定義された立体配置を有する化合物を指す。タンパク質は、ペプチドとは異なり、一般的にアミノ酸50個またはそれ以上の鎖からなる。
【００５６】
本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」という用語は、一つまたはそれ以上のペプチド結合を含む少なくとも二つのアミノ酸残基のポリマーを指す。「ポリペプチド」は、ポリペプチドが十分に定義された立体配座を有するか否かによらず、ペプチドおよびタンパク質を含む。
【００５７】
一つの態様において、本発明に従う担体ポリマーは、約6〜約25サブユニットまでの長さの短いポリマーを含む。担体は、生体物質単独の輸送速度と比較して、RNA干渉物質の生体膜を超えての輸送速度を増強するために有効である。例としてのポリマー組成物はペプチドであるが、ポリマーは、非ペプチド骨格および／または下記でさらに考察するサブユニットを含んでもよい。
【００５８】
本発明の重要な局面において、本発明の担体ポリマーは、RNA干渉物質がその生物作用を発揮するために膜を超えての輸送を必要とするタイプである場合、細胞またはオルガネラの膜を超えて生体活性物質を輸送するために特に有用である。一般的な問題として、本発明の方法において用いられる担体ポリマーには、好ましくは直線状のサブユニット骨格が含まれる。骨格は通常、炭素、窒素、酸素、硫黄、および燐から選択されるヘテロ原子を含み、骨格鎖の原子の大多数は通常、炭素からなる。それぞれのサブユニットは、末端のグアニジノまたはアミジノ基を含む側鎖部分を含んでもよい。
【００５９】
隣接する側鎖部分との間隔は、通常、サブユニットからサブユニットについて一貫しているが、本発明において用いられるポリマーにはまた、骨格に沿って側鎖間の多様な間隔が含まれてもよい。
【００６０】
側鎖部分は、中心のグアニジノまたはアミジノ炭素原子（それに対してNH2基が結合する）が、好ましくは少なくとも2個のリンカー鎖原子を含む、より好ましくは鎖の原子2〜5個を含む側鎖リンカーによって骨格に結合されるように、中心の炭素原子が骨格から離れた第三から第六鎖原子であるように、骨格から伸長する。鎖の原子は好ましくは、酸素、硫黄、または窒素のような一つまたはそれ以上の他の原子が存在することができるがメチレン炭素原子として提供される。好ましくは、骨格とグアニジノまたはアミジノ基の中心炭素原子との側鎖リンカーは、アルギニン側鎖によって例示されるように、長さが鎖の原子4個である。
【００６１】
本発明の担体ポリマー配列は、例えばグリシン、アラニン、およびシステインのような対応するポリマー含有結合体の膜輸送速度に有意な影響を及ぼさない、一つまたはそれ以上の非グアニジノ／非アミジノサブユニット、またはアミノカプロン酸基のようなリンカーに隣接されうる。同様に、任意の遊離のアミノ末端基を、インビボでのユビキチン化を防止するために、アセチルまたはベンジル基のようなブロッキング基によってキャップすることができる。
【００６２】
本発明の担体ポリマーは、単純な合成スキームによって調製することができる。さらに、担体ポリマーは通常、それらがその作用に関して不均一な混合物より大きい一貫性および再現性を提供するように長さおよび組成が実質的に均一である。
【００６３】
本発明の重要な局面に従って、単一の担体ポリマーとRNA干渉物質、例えばsiRNAとの会合は、結合物に大きい疎水性部分が存在する必要なく、生体膜を超えて物質の取り込み速度を実質的に増強するために十分である。実際に、大きい疎水性部分を結合させることによって、脂質二重層に対する疎水性部分の接着により経膜輸送が有意に妨害または防止される可能性がある。したがって、本発明には、脂質および脂肪酸分子のような大きい疎水性部分を含まない担体ポリマーが含まれる。
【００６４】
一つの態様において、輸送ポリマーは、D-またはL-アミノ酸残基からなる。輸送ポリマーにおいて天然に存在するL-アミノ酸残基を用いることは、切断産物が細胞または生物に対して比較的非毒性であるはずであるという長所を有する。好ましいアミノ酸サブユニットはアルギニン（α-アミノ-デルタ-グアニジ-ノバレリン酸）、およびα-アミノ-ε-アミジノヘキサン酸（等配電子類似体）である。アルギニンにおけるグアニジニウム基は、pKa約12.5を有する。
【００６５】
より一般的に、それぞれのポリマーサブユニットは、（i）pKaが11より大きい、より好ましくは12.5またはそれ以上である、および（ii）その水素添加状態で、その部分に二座特徴を与える共鳴安定化陽電荷を共有する少なくとも二つのジェミナルアミノ基（NH2）を含む、非常に塩基性の側鎖部分を含むことが好ましい。
【００６６】
α-アミノ-β-グアニジノプロピオン酸、α-アミノ-γ-グアニジノ酪酸、またはα-アミノ-ε-グアニジノカプロン酸のような他のアミノ酸も同様に用いることができる（骨格鎖と中心グアニジニウム炭素とのあいだにそれぞれ、リンカー原子2、3、または5個を含む）。
【００６７】
D-アミノ酸はまた輸送ポリマーにおいて用いてもよい。D-アミノ酸のみを含む組成物は、酵素的分解が減少するという長所を有する。しかし、それらは標的細胞内でほぼ無傷のままで留まる可能性がある。そのような安定性は一般的に、ポリマーが結合していても物質が生物学的に活性であれば、問題ではない。結合型が不活性である物質の場合、細胞またはオルガネラにおける物質の放出を促進するために、活性部位で切断可能であるリンカー（例えば、細胞内での酵素または溶媒媒介切断によって）を含めるべきである。
【００６８】
インビボまたはインビトロのいずれかで生体膜を通過することができる任意のペプチド、例えば塩基性ペプチドまたはその断片は、本発明に含まれる。これらのペプチドは、当業者に既知の方法によって合成することができる。例えば、本発明の方法において、生体膜を超えてRNA干渉物質を輸送するための担体ペプチドとして用いてもよいいくつかのペプチドが同定されている。これらのペプチドには、例えばアンテナペディアのホメオドメイン、ショウジョウバエ転写因子（Wangら（1995）、PNAS USA 92：3318〜3322）；NLSドメインを有するまたは有さないカポジ線維芽細胞増殖因子のシグナル配列の疎水性領域を表す断片（Antopolskyら（1999）、Bioconj. Chem. 10：598〜606）；ケイマン・クロコジルス（Caiman crocodylus）のIg(5)軽鎖のシグナルペプチド配列（Chaloinら（1997）、Biochem. Biophys. Res. Comm. 243：601〜608）；HIVエンベロープ糖タンパク質gp4114の融合配列（Morrisら（1997）、Nucleic Acids Res. 25：2730〜2736）；トランポータンA−神経ペプチドガラニンのN末端断片と、膜相互作用ハチ毒ペプチドであるマストポランからなる無キメラ27量体（Lindgrenら（2000）、Bioconjugate Chem. 11：619〜626）；インフルエンザウイルス血液凝集素エンベロープ糖タンパク質に由来するペプチド（Bongartzら、1994、Nucleic Acids Res. 22：468 1 4688）；RGDペプチド；およびヒト1型免疫不全ウイルス（「HIV-1」）に由来するペプチドが含まれる。精製HIV-1 TATタンパク質は、培養において増殖するヒト細胞によって周囲の培地から取り込まれる（A.D. Frankel and C. O. Pabo（1988）、Cell 55：1189〜93）。TATタンパク質は、特定のHIV遺伝子をトランス活性化して、ウイルス複製にとって必須である。完全長のHIV-1 TATタンパク質は、アミノ酸残基86個を有する。HIV tat遺伝子は二つのエキソンを有する。TATアミノ酸1〜72位は、エキソン1によってコードされ、アミノ酸73〜86位はエキソン2によってコードされる。完全長のTATタンパク質は、リジン2個とアルギニン6個とを含む塩基性領域（アミノ酸47〜57位）、およびシステイン残基7個を含むシステインリッチ領域（アミノ酸22〜37位）を特徴とする。塩基性領域（すなわち、アミノ酸47〜57位）は、核の局在にとって重要であると考えられている。Ruben, S.ら、J. Virol. 63：1〜8（1989）；Hauber, J.ら、J. Virol. 63：1181〜1187（1989）；Rudolphら（2003）、278(13)：11411。システインリッチ領域は、インビトロで金属結合二量体の形成を媒介し（Frankel, A.D.ら、Science 240：70〜73（1988）；Frankel, A.Dら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：6297〜6300（1988））、トランス活性化剤としてその活性にとって必須である（Garcia, J.A.ら、EMBO J. 7：3143（1988）；Sadaie, M.R.ら、J. Virol. 63：1（1989））。他の調節タンパク質の場合と同様に、N末端領域は、細胞内プロテアーゼに対する保護に関係する可能性がある（Bachmair, A.ら、Cell 56：1019〜1032（1989））。
【００６９】
本発明の一つの態様において、塩基性ペプチドは、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸47〜57位を含む。もう一つの態様において、塩基性ペプチドは、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸48〜60位を含む。さらにもう一つの態様において、塩基性ペプチドはHIV-1 TATペプチドのアミノ酸49〜57位を含む。さらにもう一つの態様において、塩基性ペプチドはHIV-1 TATペプチドのアミノ酸49〜57、48〜60、または47〜57位を含み、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸22〜36位を含まず、HIV-1 TATペプチドのアミノ酸73〜86位を含まない。さらにもう一つの態様において、下記の表1に示す特定のペプチドを、本発明の方法および組成物における担体ペプチドとして用いてもよい。
【００７０】
【表１】
2006504427.tif 000002
（s）結合のための任意のセリン
斜体＝安定性のために任意のD異性体
【００７１】
他のアルギニンに富む塩基性ペプチドも同様に、本発明に含まれる。例えば、D-アミノ酸およびアルギニン置換TAT（47-60）を含むTAT類似体、HIV-1 Revのようなウイルスタンパク質に由来するRNA結合ペプチド、フロックハウスウイルス外皮タンパク質、癌関連タンパク質c-Fosおよびc-Junのようなロイシンジッパータンパク質のDNA結合配列、ならびに酵母転写因子GCN4は、その全てがいくつかのアルギニン残基を含む（参照として本明細書に組み入れられる、Futakiら（2001）、J. Biol. Chem. 276(8)：5836〜5840、およびFutaki, S.（2002）、Int. J. Pharm. 245(12)：1〜7を参照されたい）。一つの態様において、アルギニンリッチペプチドは、アルギニン残基約4〜約11個を含む。もう一つの態様において、アルギニン残基は隣接する残基である。
【００７２】
アミノ酸以外のサブユニットも同様に、輸送ポリマーを形成するために用いるために選択してもよい。そのようなサブユニットには、ヒドロキシアミノ酸、N-メチルアミノ酸アミノアルデヒド等が含まれてもよいがこれらに限定されず、それによってペプチド結合が減少したポリマーが得られる。選択した骨格の特性に応じて、他のサブユニット型を用いることができる。
【００７３】
側鎖グアニジノおよび／またはアミノ部分を整列させて配置するために、チオエーテルまたはスルホニル基によって結合したアルキル骨格部分、ヒドロキシ酸エステル（アミド結合のエステル結合による置換と同等）、α炭素を窒素に置換してアザ類似体を形成する、カルバメート基を結合させたアルキル骨格部分、ポリエチレンイミン（PEIs）、および二級アミンからなるポリマーが得られるアミノアルデヒドのような多様な骨格型を用いることができる。
【００７４】
より詳細な骨格リストには、N-置換アミド（CONRをCONH結合の代わりに用いる）、エステル（CO2）、ケトメチレン（CONH2）還元、またはメチレンアミノ（CH2NH）、チオアミド（CSNH）、ホスフィン酸塩（PO2RCH2）、ホスホナミデートおよびホスホナミニデートエステル（PO2RNH）、レトロペプチド（NHCO）、トランスアルケン（CR.dbd.CH）、フルオロアルケン（CF.dbd.CH）、ジメチレン（CH22CH2）、チオエーテル（CH2S）、ヒドロキシエチレン（CH(OH)CH2）、メチレンオキシ（CH2O）、テトラゾール（CN24）、レトロチオアミド（NHCS）、レトロ還元（NHCH2）、スルホンアミド（SO2NH）、メチレンスルホンアミド（CHRSO2NH）、レトロスルホンアミド（NHSO2）、およびペプトイド（N-置換グリシン）が含まれ、ならびに例えば、Fletcherら（1998）によって論評され、その論文で引用された参考文献に詳細に説明されるマロネートおよび／またはジェム-ジアミノアルキルサブユニットを有する骨格が含まれる。ペプトイド骨格（N-置換グリシン）も同様に用いることができる。前述の多くの置換によって、αアミノ酸から形成された骨格と比較しておおよそ等配電子のポリマー骨格が得られる。
【００７５】
ポリマーは、当技術分野で既知の任意の方法によって構築される。例としてのペプチドポリマーは、好ましくはペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステムズモデル433）を用いて合成によって産生することができ、または当技術分野で周知の方法によって組換えによって合成することができる。
【００７６】
固相ペプチド合成において、N-メチルおよびヒドロキシアミノ酸を通常のアミノ酸の代わりに用いることができる。しかし、ペプチド結合が減少したポリマーを産生するためは、減少したペプチド結合を含むアミノ酸の二量体を合成する必要がある。そのような二量体は、標準的な固相合成技術を用いてポリマーに組み入れられる。他の合成技術は当技術分野で周知である。
【００７７】
本発明の一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとを、生体膜に接触させる前に混合する。RNA干渉物質と担体ポリマーとを混合することによって、物質と担体との会合が起こる。一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーは間接的にまたは直接的に、例えば共有結合的にまたは化学的に結合されない。したがって、二本鎖を形成するためにリンカーは必要でない。もう一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとは、静電気的結合によって結合される。
【００７８】
用いた発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、ごく小さい分画の細胞のみがsiRNA分子を有効に取り込む可能性があることが知られている。これらの細胞を同定して選択するために、細胞標的に対する抗体を用いて、免疫蛍光を通してトランスフェクション効率を決定することができる。好ましい細胞標的には、ラミンA/Cのような、宿主細胞タイプに存在して、その発現が比較的一定である標的が含まれる。または、CMV促進EGFP発現プラスミド、ルシフェラーゼ、メタロプロテアーゼ、BirA、β-ガラクトシダーゼ等のような細胞マーカーを含むプラスミドとの同時トランスフェクトを用いて、トランスフェクション効率を評価してもよい。siRNA分子をトランスフェクトした細胞は、免疫蛍光、位相差顕微鏡、および蛍光顕微鏡のような通常の技術によって同定することができる。
【００７９】
標的化タンパク質の量および寿命（または代謝回転）に応じて、ノックダウン表現型は、1〜3日後、またはさらに後に明らかとなる可能性がある。表現型を認めない場合、免疫蛍光またはウェスタンブロッティングによってタンパク質の枯渇が観察される可能性がある。タンパク質が3日後でもなおも豊富である場合、細胞は分裂することができ、再トランスフェクションのために新しい24ウェルプレートに移すことができる。
【００８０】
標的タンパク質のノックダウンが認められない場合、標的mRNAがトランスフェクトしたsiRNA二本鎖によって有効に破壊されたか否かを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションの2日後、総RNAを調製して、標的特異的プライマーを用いて逆転写して、プレmRNAの増幅に関して制御するために、少なくとも一つのエキソン-エキソン接合部を含むプライマー対によってPCR増幅することができる。非標的mRNAのRT/PCRも同様に対照として必要である。mRNAを有効に枯渇したが標的タンパク質の減少をなおも検出できない場合、安定なタンパク質の大きい貯蔵庫が細胞に存在する可能性があることを示しているかも知れない。標的タンパク質が、表現型が明白になる可能性がある点まで最終的に枯渇されるまで、十分に長い期間における多数のトランスフェクションが必要であるかも知れない。
【００８１】
本発明のRNA干渉物質にはまた、例えば標的遺伝子の発現を干渉または阻害する小さい分子が含まれる。例えば、そのような低分子には、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約10,000グラム／モル未満である有機または無機化合物（すなわちヘテロ有機および有機金属化合物を含む）、分子量が約5,000グラム／モル未満である有機または無機化合物、分子量が約1,000グラム／モル未満である有機または無機化合物、分子量が約500グラム／モル未満である有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形が含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
特定のRNA干渉物質の用量、例えば、siRNAまたは小分子は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング（PTGS）を行って、それによって標的遺伝子の発現の阻害または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害が起こるために必要な量であろう。標的遺伝子、例えばCCR5またはp24の発現、および標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性またはレベルを決定するためのアッセイは、当技術分野で既知である。例えば、標的遺伝子mRNAのレベルの減少はインサイチューハイブリダイゼーションによって測定してもよい（Montgomeryら（1998）、PNAS USA 95：15502〜15507）、またはノザンブロット分析（Ngoら（1998）、PNAS USA 95：14687〜14692）によって測定してもよい。
【００８３】
III．処置法
本発明は、HIV、AIDSおよびAIDS関連疾患または障害が含まれるがこれらに限定されない感染疾患または障害のリスクを有する（または感受性がある）被験者を治療する予防法と治療法の双方を提供する。本明細書において用いられるように、「治療」または「治療する」とは、感染疾患または障害、感染疾患または障害の症状を治癒する、治癒する、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、改善する、改善する、または影響を及ぼすことを目的として、治療物質（例えば、1つまたは複数のRNA干渉物質、例えばsiRNA）を患者に適用もしくは投与すること、または患者からの単離組織もしくは細胞株に治療物質を適用もしくは投与すること、または感染疾患もしくは障害を引き起こすことができる感染因子に対して接種することであると定義される。
【００８４】
予防的および治療的治療法に関して、そのような治療は、薬学ゲノム学の分野から得られた知識に基づいて、特別に調整または改変してもよい。本明細書において用いられるように「薬学ゲノム学」とは、臨床開発中および市場の薬剤に対する遺伝子のシークエンシング、統計的遺伝学、および遺伝子発現分析のようなゲノム学技術の適用を指す。より詳しく述べると、この用語は、患者の遺伝子が薬剤に対する彼または彼女の反応をどのように決定するかに関する研究を指す（例えば、患者の「薬物反応表現型」または「薬物反応遺伝子型」）。このように、本発明のもう一つの局面は、一つまたはそれ以上のsiRNAによる個々の予防的または治療的治療を調整する方法を提供する。薬学ゲノム学によって、臨床医または医師は、治療から最善の利益を受けるであろう患者に対して予防的または治療的治療を標的とすることができ、毒性の薬物関連副作用を経験するであろう患者の治療を回避することができる。
【００８５】
1．予防法
一つの局面において、本発明は、一つまたはそれ以上の治療物質、例えば本明細書に記述のRNA干渉物質を被験者に投与することによって、被験者における感染疾患または障害を予防する方法を提供する。例えば、本明細書に記述のRNA干渉物質は、例えば性的に伝幡される感染症（STI）、例えば肝炎、例えばHBV、HCV、HGV、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、ヘルペス（HSV-2）、他のウイルス感染症、および／または細菌感染症のような、微生物によって伝幡される疾患の伝幡を実質的に減少させるための殺菌剤として用いてもよい。感染疾患または障害のリスクを有する被験者は、例えば感染疾患または障害に対する任意の既知の危険因子によって同定することができる。
【００８６】
予防物質の投与は、感染疾患または障害が予防される、またはその進行が遅れるように、感染疾患または障害に特徴的な症状が発現する前に起こりうる。本発明のRNA干渉物質の局所投与を含む、本明細書に記述の、または当業者に既知の、本発明の治療物質の如何なる投与様式も、感染疾患または障害の予防的治療のために利用してもよい。
【００８７】
本明細書に記述の活性化合物の製剤（例えば、RNA干渉物質、例えばsiRNA）は、例えばHIVまたは他の性的に伝幡される疾患または感染症のような、ウイルスまたは細菌疾患または障害の伝幡を予防するために、局所適用される予防薬として、例えば粘膜に対する投与のために、例えば経口、膣内、直腸内、または上皮に局所的に投与するために、RNA干渉物質媒介疾患もしくは障害、例えばHIVのようなウイルスまたは細菌疾患または障害、または他の性的に伝幡される疾患もしくは感染症、または他の感染因子、例えばウイルスのリスクを有する被験者に投与してもよい。一つの態様において、RNA干渉物質と担体ポリマーとを含む組成物を、感染因子の曝露前に投与してもよい。インビトロ実験から、導入された二本鎖siRNAによって誘導される抗ウイルス状態が数週間持続しうることが示されている。したがって、一つの態様において、siRNAに基づく殺菌剤は、それぞれの性的接触の前に適用する必要はない。したがって、もう一つの態様において、RNA干渉物質、例えばsiRNAの予防効果は、持続する、例えば少なくとも1週間、好ましくは2週間またはそれ以上持続する。もう一つの態様において、RNA干渉物質を含む組成物は、感染因子に曝露される直前よりむしろ、例えば局所に、週に1回もしくはそれ以上、または月に1回もしくはそれ以上の間隔で投与してもよい。
【００８８】
例えば、本明細書に記述の治療物質は、スプレー、ローション、クリーム、フォーム、ゲル等として、または当技術分野で既知のもしくは本明細書に記述の他の任意の適した輸送法として調製してもよく、この中には例えば、標準的な潤滑剤および／または洗浄剤または他の添加剤が含まれてもよい。一つの態様において、これらの製剤は、性的に伝幡される疾患に対して保護するための障壁法と併用して投与される、またはコンドームもしくは他の障壁保護装置に適用してもよい。
【００８９】
局所適用物質はまた、例えばその全文が本明細書に広く組み入れられる、米国特許第6,302,108号に記述されるように殺精子剤もしくは他の殺菌剤と併用して、またはHIVもしくは他のSTDを予防するために他の予防物質と併用して用いてもよい。化合物はまた、直腸輸送のための坐剤の形（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドのような通常の坐剤基剤と共に）または浣腸の形で調製することができる。
【００９０】
2．治療法
本発明のもう一つの局面は、感染疾患または障害を治療するために、遺伝子発現またはタンパク質活性、例えば細胞遺伝子発現または活性および／または感染因子の遺伝子または配列の発現または活性、例えばウイルス遺伝子発現またはタンパク質活性を調節する方法に関する。したがって、例としての態様において、本発明の調節法は、標的遺伝子または遺伝子の発現が阻害されるように、治療物質（例えば、一つまたはそれ以上のRNA干渉物質、例えばsiRNA、例えば細胞遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のsiRNA、および／または感染因子の遺伝子または配列、例えばウイルス遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のsiRNA）を細胞に接触させることを含む。これらの方法は、インビトロ（例えば、細胞を培養することによって）、またはインビボ（例えば、物質を被験者に投与することによって）で行うことができる。
【００９１】
当業者は、個々の患者における所望の「有効レベル」を得るために、用いる組成物の正確な処方に関して適当な用量、スケジュール、および投与方法を容易に決定することができる。当業者は、適当な患者試料の直接（例えば、分析化学分析）または間接的（例えば、ウイルス感染症の代用指標によって）または分析によって、本発明の化合物の「有効レベル」の適当な指標を容易に決定して用いることができる。
【００９２】
本発明の治療組成物はまた、細胞をエクスビボで投与することができ、例えば細胞を被験者から採取して、本発明のsiRNAを含む組成物を細胞に投与して、細胞を、例えば移植または移植片移植によって被験者に再度導入する。ドナー（すなわち、最終的なレシピエント以外の起源）から得た細胞も同様に用いることができ、これは例えば本発明のsiRNAの細胞への投与後に例えば移植または移植片移植によってレシピエントに適用される。ベクター、例えば遺伝子治療ベクターを用いて、治療物質を細胞に輸送することができる。
【００９３】
本発明の予防または治療的薬学的組成物は、感染疾患または障害を治療的に治療または予防するために用いる場合、本発明に従うベクターと共に他の薬剤を含むことができ、同様に感染疾患または障害を治療または予防するために用いられる他の薬剤と併用して用いることができる。例えば、HIVの場合、本発明の予防的または治療的薬学的組成物はまた、ケモカイン受容体、例えばCCRおよびCXC受容体の発現または活性を調節する他の薬剤と併用して用いることができる。感染疾患または障害、例えばHIV感染症、AIDS、およびAIDS関連疾患を治療または予防するために用いられる薬剤の例には、感染疾患または障害、例えばHIV感染症、AIDS、およびAIDS関連疾患を治療もしくは予防するために、またはその進行を遅らせるために用いることができる抗レトロウイルス治療、例えばプロテアーゼ阻害剤、免疫調節剤、免疫刺激剤、抗生物質、抗原虫剤、抗真菌剤、抗ウイルス化合物、抗癌剤、ならびに他の物質および治療、またはその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。HIV感染症、AIDS、およびAIDS関連疾患を治療または予防するために本発明のsiRNAと併用して用いてもよい特定の薬剤には、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、ラミブジン＋ジドブジン、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビル＋リトナビル、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、セフトリアキソン、セフィキシム、シプロフロキサシン、リファブチン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（IV）、ペンタミジン、ピリメタミン、スルファジアジン、フォリン酸、アシクロビル、シドフォビル、ガンシクロビル、フォルスカーネット、アンフォテリシンB、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ビンブラスチン、エトポシド、ブレオマイシン、およびビンクリスチンが含まれるがこれらに限定されない。
【００９４】
3．薬学ゲノム学
本発明細書に記述の治療物質（例えば、RNA干渉物質、例えばsiRNA、例えば細胞遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のsiRNAおよび／または感染因子の遺伝子または配列を標的とする一つまたはそれ以上のsiRNA）は、感染疾患または障害、例えばHIV、AIDS、およびAIDS関連疾患または障害を治療するために個体に投与することができる。そのような治療と組み合わせて、薬学ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の反応との関係を調べる研究）を考慮してもよい。治療の代謝における差のために、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との関連を変化させることによって、重度の毒性または治療の失敗が起こりうる。このように、医師または臨床医は、本明細書に記述の一つまたはそれ以上の治療物質（例えば、RNA干渉物質、例えば感染疾患または障害）を投与するか否か決定する場合のみならず、siRNAによる治療、例えば感染疾患または障害の治療の用量および／または治療レジメを調節する場合に、関連する薬学ゲノム学研究において得られた知識を適用することを検討してもよい。
【００９５】
薬学ゲノム学は、罹患した人における変化した薬物処置および異常な作用のために薬物に対する反応における臨床的に有意な遺伝性の変化を扱う。例えば、Eichelbaum, M.ら（1996）、Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10〜11)：983〜985、およびLinder, M.W.ら（1997）、Clin. Chem. 43(2)：254〜266を参照されたい。一般的に、二つのタイプの薬学遺伝学状態を区別することができる。すなわち、薬物が体に及ぼす方法を変化させる（薬物作用の変化）唯一の要因として伝搬される遺伝子状態、または体が薬物に作用する方法を変化させる（薬物代謝の変化）唯一の要因として伝搬される遺伝子状態。これらの薬学遺伝学状態は、まれな遺伝子欠損として、または天然に存在する多形のいずれかとして起こりうる。例えば、グルコース-6-燐酸デヒドロゲナーゼ欠損（G6PD）は、主な臨床合併症が酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛剤、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの摂取後の溶血である一般的な遺伝性酵素症である。
【００９６】
「ゲノム全体の関連」として知られる薬物反応を予測する遺伝子を同定するための一つの薬物ゲノム学アプローチは、既知の遺伝子関連マーカー（例えば、そのそれぞれが二つの変種を有するヒトゲノム上の多形または可変部位60,000〜100,000個からなる「双対立遺伝子」遺伝子マーカーマップ）からなるヒト遺伝子の高解像度マップに主に依存する。そのような高解像度遺伝子マップを、特に認められた薬物反応または副作用に関連したマーカーを同定するためにフェーズII/III薬物臨床試験に参加する患者の統計学的に有意な数のそれぞれのゲノムのマップと比較することができる。または、そのような高解像度マップは、ヒトゲノムにおける既知の一塩基多型（SNPs）数千万個の組み合わせから作製することができる。本明細書において用いられるように、「SNP」は、DNAの枝における一ヌクレオチド塩基に起こる一般的な変化である。例えば、SNPは、DNA鋳型の1000塩基毎に1回起こる可能性がある。SNPは、疾患のプロセスに関与する可能性があるが、大多数は疾患に関連しない可能性がある。そのようなSNPsの発生に基づく遺伝子マップを考慮して、個体を、その個々のゲノムにおけるSNPsの特定のパターンに応じて、遺伝子カテゴリーに分類することができる。そのような方法において、治療レジメは、そのような遺伝的に類似の個体において共通である可能性がある形質を考慮に入れて、遺伝的に類似の個体の群に合わせて調整することができる。
【００９７】
または、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を利用して、薬物反応を予測する遺伝子を同定することができる。この方法に従って、薬物標的をコードする遺伝子が既知であれば、その遺伝子の全ての共通の変種は、集団においてかなり容易に同定することができ、遺伝子の一つの型を有することが、もう一つの型を有することと比較して、特定の薬物反応に関連するか否かを決定することができる。
【００９８】
説明的な態様として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および期間の双方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、N-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）およびチトクロームP450酵素CYP2D6およびCYP2C19）の遺伝子多形の発見は、薬物の標準的で安全な用量を摂取後に、数人の患者が予想される薬物効果を得ない理由、または過剰な薬物反応および重篤な毒性を示す理由を提供した。これらの多形は、集団における二つの表現型、すなわち広範な代謝体（EM）および不良な代謝体（PM）において発現される。PMの発生は、集団が異なれば異なる。例えば、CYP2D6をコードする遺伝子は、非常に多形であり、いくつかの変異がPMにおいて同定されているが、その全員に機能的CYP2D6が存在しない。CYP2D6およびCYP2C19の不良代謝体は、標準用量を投与された場合に、過度の薬物反応および副作用をかなり頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、PMは、そのCYP2D6形成代謝物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛作用に関して証明されているように、治療反応を示さない。他の極端は、標準用量には反応しないいわゆる超急速代謝体である。最近、超急速代謝体の分子的基礎は、CYP2D6遺伝子の増幅によると同定されている。
【００９９】
または、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を利用して薬物反応を予測する遺伝子を同定することができる。例えば、薬物を投与された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路のスイッチが入ったか否かの指標を示すことができる。
【０１００】
上記の一つより多い薬物ゲノム学アプローチから生成された情報を用いて、個体の予防的または治療的治療のための適当な用量および治療レジメを決定することができる。この知識を投与または薬物選択に適用すると、有害反応または治療失敗を回避することができ、このように本明細書に記述のように治療的RNA干渉物質（例えば、RNA干渉物質、例えばCCR5 siRNA、p24 siRNA、またはその二つを組み合わせたもののようなsiRNA）によって被験者を治療する場合に、治療的または予防的有効性を増強することができる。
【０１０１】
IV．薬学的組成物
RNA干渉物質、例えば本発明のsiRNAは、投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は典型的に、1つまたは複数のRNA干渉物質、例えば細胞遺伝子または配列を標的化する1つまたは複数のsiRNAのようなsiRNAと、例えば、CCR5 siRNAおよび/または感染物質の遺伝子または配列を標的化する1つまたは複数のsiRNA、例えば、p24 siRNAと、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与に適合性の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれると意図される。薬学的に活性な物質に関してそのような媒体および物質を用いることは、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体または物質が活性化合物と非適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に組成物に組み入れることができる。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性となるように調製される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、膣内、および直腸内投与が含まれる。非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液には以下の成分が含まれうる：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、または燐酸塩のような緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性調節剤。pHは、塩酸、または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整できる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入することができる。
【０１０３】
本明細書に記述の活性化合物の調製物（例えば、RNA干渉物質、例えばsiRNA、例えば感染疾患または障害）を、HIVの性的な伝幡または他の性的に伝幡される疾患を防止するために、例えば粘膜に、例えば膣内または直腸内に投与するために局所適用される予防薬として、微生物感染症のリスクを有する被験者に投与してもよい。
【０１０４】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるべき障壁にとって適当な浸透剤を製剤において用いる。そのような浸透剤は、一般的に当技術分野で既知であり、例えば経粘膜投与のために、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、点鼻スプレー、または坐剤を用いることによって行うことができる。経皮投与の場合、活性化合物を、当技術分野で一般的に既知の軟膏（ointments）、軟膏（salves）、ゲル、またはクリームに調製する。
【０１０５】
一つの態様において、インプラントおよび微量封入輸送系を含む徐放製剤のような、体からの迅速な排泄に対して化合物を保護する担体と共に、活性化合物を調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生体分解性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、アルザ社（Alza Corporation）およびノバファーマシューティカルズインク（Nova Pharmaceuticals, Inc.）から購入することができる。
【０１０６】
リポソーム浮遊液（例えばホスファチジルセリンを含むマクロファージを標的とするリポソームを含む）も同様に、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,522,811号、米国特許第5,643,599号に記述されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。または、本発明の治療物質は、標的細胞、例えば、マクロファージまたはCD4 T細胞に取り込ませるためにsiRNAの一つまたはそれ以上の末端にポリ-Gテールを付加することによって調製してもよい。その上、siRNAは、Capodiciら（2002）、J. Immunol. 169(9)：5196に記述されるように、フルオロ誘導体化して、標的細胞に輸送してもよい。
【０１０７】
注射可能な用途に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製物のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩液、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF、パーシッパニー、ニュージャージー州）、または燐酸緩衝生理食塩液（PBS）が含まれる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなければならず、容易な注入操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適した混合物を含む溶媒または分散媒体となりうる。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の保護は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムのような糖、多価アルコールを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって行うことができる。
【０１０８】
滅菌注射用溶液は、上記の成分の一つまたは成分の組み合わせと共に必要量のsiRNAを適当な溶媒に組み入れて、必要に応じて濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、基礎分散媒体を含む滅菌溶媒に、活性化合物および先に列挙した成分からの必要な他の成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分粉末プラス任意のさらなる所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０９】
経口組成物には一般的に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらは、ゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的に関して、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形で用いることができる。経口組成物はまた、液体担体における化合物が経口適用され、うがいしてはき出すまたは飲み込まれる、マウスウォッシュとして用いるための液体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、トローチ剤等は、任意の以下の成分または類似の特性の化合物を含みうる：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンのような結合剤；デンプンもしくは乳糖のような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローツのような潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素のようなグライダント；蔗糖もしくはサッカリンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料のような着香料。
【０１１０】
吸入投与の場合、化合物は、適した噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形で輸送される。
【０１１１】
投与の容易さおよび用量の均一性のために単位用量剤形で経口または非経口組成物を調製することが特に都合がよい。本明細書において用いられる単位用量型は、それぞれの単位が、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の規定量を含む、治療すべき被験者に関して単位用量として適した物理的に個別の単位を指す。本発明の単位投与剤形の明細は、活性化合物の独自の特徴および得られる特定の治療効果、および個体を治療するためにそのような活性化合物を合成する際の固有の制限によって指示され、それらに直接依存する。
【０１１２】
そのような化合物の毒性および治療効率は、LD50（集団の50％に対して致死である用量）、およびED50（集団の50％において治療的に有効である用量）によって決定することができる。毒性対治療効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50の比で表記することができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いてもよいが、非感染細胞に対する起こりうる障害を最小限にするために、そのような化合物を罹患組織部位に標的化して、それによって副作用を減少させる輸送系を設計するように注意しなければならない。
【０１１３】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いるための用量範囲を処方するために用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を示さないED50が含まれる循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いられる投与剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において用いられる如何なる化合物に関しても、治療的有効量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるように、IC50（すなわち症状の半最大阻害を得る試験化合物の濃度）を含む循環中の血漿濃度範囲を得るために動物モデルにおいて調製してもよい。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１１４】
本明細書において定義されるように、RNA干渉物質の治療的有効量（すなわち、有効量）の範囲は約0.001〜3,000 mg/kg体重、好ましくは約0.01〜2500 mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜2000、約0.1〜1000 mg/kg体重、0.1〜500 mg/kg体重、0.1〜100 mg/kg体重、0.1〜50 mg/kg体重、0.1〜25 mg/kg体重、およびさらにより好ましくは約1〜10 mg/kg、2〜9 mg/kg、3〜8 mg/kg、4〜7 mg/kg、または5〜6 mg/kg体重の範囲である。当業者は、特定の要因が、疾患または障害の重症度、これまでの治療、被験者の全身健康および／または年齢、および存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されない、被験者を有効に治療するために必要な用量に影響を及ぼす可能性があることを認識するであろう。その上、RNA干渉物質の治療的有効量による被験者の治療には、1回治療が含まれうる、または一連の治療が含まれうる。
【０１１５】
好ましい例において、被験者を約0.1〜20 mg/kg体重の範囲のRNA干渉物質によって約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、さらにより好ましくは約4、5、または6週間のあいだ一週間に一回治療する。もう一つの態様において、被験者を毎週1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間もしくはそれ以上に1回治療する。同様に、治療のために用いられるRNA干渉物質の有効量は、特定の治療経過のあいだに増加または減少してもよいと認識されるであろう。用量の変化は、本明細書に記述の診断アッセイの結果に起因し、それらから明らかとなる可能性がある。
【０１１６】
RNA干渉物質、例えばsiRNAの適当な用量は、当業者の医師、獣医師、または研究者の能力範囲内の多くの要因に依存すると理解される。siRNAの用量は、例えば、治療される被験者または試料の同一性、大きさ、および状態に応じて変化して、適用可能であれば組成物が投与される経路、および標的遺伝子、例えば細胞の遺伝子または配列および／または感染因子の遺伝子または配列に対してRNA干渉物質、例えばsiRNAが及ぼすことを医師が望む効果に応じて、変化するであろう。
【０１１７】
例としての用量には、被験者または試料の重量kgあたりRNA干渉物質のミリグラムまたはマイクログラムの量が含まれる（例えば、約1μg/kg〜約5,000 mg/kg、約500 μg/kg〜約5 mg/kg、約100 μg/kg〜約5 mg/kg、または約1μg/kg〜約50 μg/kg）。
【０１１８】
本発明のsiRNA分子は、本明細書に記述のように、および当技術分野で既知のようにベクターに挿入することができる。これらの構築物は、被験者に、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第5,328,470号）、または定位固定注射（例えば、Chenら（1994）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：3054〜3057を参照されたい）によって、被験者に輸送することができる。siRNAベクターの薬学的調製物には、許容される希釈剤におけるsiRNAベクターが含まれ、または遺伝子輸送媒体が抱埋される徐放性マトリクスが含まれうる。または、完全な遺伝子輸送ベクターが組換え型細胞、例えばレトロウイルスベクターから無傷で産生することができる場合、薬学的調製物には、遺伝子輸送システムを産生する一つまたはそれ以上の細胞が含まれうる。
【０１１９】
薬学的組成物は、投与説明書と共に容器、パック、またはディスペンサーに含まれうる。
【０１２０】
本発明は、制限的に解釈してはならない以下の実施例によってさらに説明する。本出願を通して引用された全ての引用文献、特許、および公表された特許出願の内容は、その図面および配列表と共に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２１】
実施例
実施例1  初代培養マクロファージにおける持続的なsiRNA-媒介HIV阻害
合成21〜23ヌクレオチドsiRNA二本鎖は、ヒト細胞株および活性化CD4+ T細胞におけるHIV複製を抑制する（Jacque, J.M.ら（2002）、Nature 418：435〜8；Coburn, G.A. & Cullen, B.R.（2002）、J. Virol. 76：9225〜31；Novina, C.D.ら（2002）、Nat. Med. 8：681〜6；Lee, N.S.ら（2002）、Nat. Biotechnol. 20：500〜5）。しかし、これらの能動的に複製する細胞におけるsiRNAのサイレンシング作用は、約96時間でピークに達するが、その後減少し始め、9日目には完全に失われるが（Novina, C.D.ら（2002）、Nat. Med. 8：681〜6；Tuschl, T.（2002）、Nat. Biotechnol. 20：446〜8）、おそらくこれは、細胞分裂または細胞内での分解によるsiRNAの希釈のためである（Ullu, E.ら（2002）、Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 357：65〜70）。マクロファージは、インビボでHIV-1の重要な貯蔵庫となる最終分化した非分裂細胞である（Sherman, M.P. & Greene, W.C.（2002）、Microbes Infect. 4：67〜73；Meltzer, M.S.ら（1990）、Annu. Rev. Immunol 8：169〜94）。それらはまた、HIVの細胞変性作用に対して比較的免疫があり、感染後長期間生存する（Castro, B.A.ら（1998）、Aids 2、補則1、S17〜27）。このように、より持続的なsiRNA媒介ウイルスサイレンシングを単球由来マクロファージ（MDM）において得ることができるか否かを調べた。
【０１２２】
HIV-1に対するsiRNAによる保護に関するこれまでの報告は、ウイルス遺伝子を標的とするか（Jacque, J.M.ら（2002）、Nature 418：435〜8；Coburn, G.A. & Cullen, B.R（2002）、J. Virol. 76：9225〜31；Novina, C.Dら（2002）、Nat. Med. 8：681〜6）、または細胞受容体CD4を標的としていた（Novina, C.Dら（2002）、Nat. Med. 8：681〜6）。しかし、CD4のターゲティングは、免疫機能におけるその重要性のために実現可能なアプローチではない可能性がある。一方、マクロファージへのウイルス侵入のための主要なHIV共受容体であるCCR5は、機能を喪失させる遺伝子の32 bpホモ接合欠失が有害な免疫学的結末を有しない（Nansen, A.ら（2002）、Blood 99：1237〜45）が、HIV感染症に対する保護を提供する（Liu, R.ら（1996）、Cell 86：367〜77；Samson, M.ら（1996）、Nature 382：722〜5）ことから、より良好な細胞標的となる可能性がある。このように、マクロファージにおけるsiRNAの抗HIV効果を決定するために、CCR5およびウイルスp24遺伝子を標的とする。第一に、Cy5標識p24 siRNAをトランスフェクトすることによって、MDMがsiRNA輸送に感受性があることを確認した。トランスフェクションの24時間後、CD14+マクロファージの84％がフローサイトメトリーによってCy5+であり（図1a）、トランスフェクション効率は、HeLa細胞について認められた効率（〜90％）と同等であった。オリゴフェクタミンの非存在下でCy5+であったのはMDMの＜6％であったことから、siRNAは非特異的貪食によって取り込まれたのではなかった（図1a）。siRNAの抗ウイルス作用を決定するために、MDMをCCR5またはウイルスp24 siRNAに単独または併用してトランスフェクトさせて、2日後にR5（BaL）マクロファージ向性ウイルスをチャレンジした。CCR5またはp24 siRNAのいずれかをトランスフェクトしたMDMの培養上清の無細胞ウイルス粒子産生をp24 ELISAによって定期的に測定したところ、偽トランスフェクトおよびGFP siRNA-トランスフェクト対照と比較して4〜6倍減少したことが判明した（図1b）。さらに、感染後7日目での培養物の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションから、CCR5またはp24 siRNAトランスフェクトMDMにおいてHIV RNAが対応して減少していることが判明した（図1c）。同様に、p24発現のフローサイトメトリー分析によっても、15日までのあいだ、CCR5またはp24 siRNAトランスフェクションによって、対照と比較してp24発現が7倍減少することが示された（図1d）。より重要なことは、双方のsiRNAをトランスフェクトすると、15日間の観察期間全体を通してHIV感染を消失させることができた（図1bおよび1d）。p24とCCR5 siRNAの併用治療は、ほぼおそらくウイルスライフサイクルにおける2段階の中断により、相乗的であり、ウイルス感染症を完全に消失させ、CCR5 siRNAはウイルス侵入を遮断して、p24 siRNAは残っている共受容体を通しての、または受動的に取り込まれることによるウイルスのスリッピングを破壊した。このように、siRNAは、マクロファージにおいてHIVに対する持続的な保護を提供することができる。
【０１２３】
これらの結果は、可能性がある予防的戦略に関するsiRNAの役割を示唆する。この可能性を実現するために、siRNAが感染前に長期間細胞において持続することが重要であるかも知れない。しかし、感染因子の性的伝幡を遮断するためには、罹患した膜におけるsiRNAの誘導または持続がほとんどまたは全くないことが必要であると理解されるであろう。
【０１２４】
細胞におけるsiRNAの持続の問題に取り組むために、非感染MDMにおける内因性のCCR5発現のトランスフェクトCy5標識p24 siRNAおよびCCR5 siRNAによる抑制の寿命を決定した。フローサイトメトリーによって測定した非感染MDMにおける細胞内Cy5-p24 siRNAのレベルは、時間と共に徐々に減少して、トランスフェクション後10日目では検出不能となった（図2a）。対照的に、CCR5 siRNAトランスフェクト細胞におけるCCR5発現は、トランスフェクション後1〜20日のあいだ均一にサイレンシングされたままであった（図2b）。CCR5 mRNAはまた、CCR5 siRNAトランスフェクションの1、4、7、および15日後に行った試料の高感度RT-PCR分析によって示されるように、完全にサイレンシングされた（図2c）。CCR5 mRNAは、これらの培養物ではさらに25回増幅した後でも検出されなかった。細胞内での生存におけるこれらの差がHIV抑制においても反映されるか否かを調べるために、MDMにCCR5 mRNAをトランスフェクトさせて、トランスフェクション後の期間を増加させて感染を開始し、感染の10日後にp24レベルを測定した。対照GFP siRNAと比較してCCR5発現の長期間の抑制と一致して、CCR5 siRNAは、細胞をトランスフェクションの2または15日後に感染させた場合でも同等の保護を提供した（図1d）。一方、p24 siRNAは、トランスフェクションの5日以内に細胞を感染させた場合に最大の保護を提供したが、トランスフェクションと感染との間隔をさらに広げると、保護のレベルは減少した。細胞対ウイルス遺伝子を標的とするsiRNAの寿命が異なる理由は、完全にはわかっていない。理論に拘束されることを意図しないが、細胞遺伝子は持続的に転写されて、siRNAに対する基質を提供するのに対し、ウイルスRNAは感染後に限って利用できる。非分裂MDMにおける細胞およびウイルス遺伝子を標的とする異なる作用は、Cy標識p24 RNAが非感染細胞では7日間までは維持されるに過ぎないという事実と共に、siRNAの細胞内持続には基質RNAの持続的な存在が必要であるかも知れないことを示唆している。この仮説は、感染をトランスフェクションの2日後に行った場合にp24 siRNAがHIVを15日間抑制することができるというこれらの結果によってさらに強められる（図1d）。実際に、siRNAプライミングRNA依存的RNAポリメラーゼ（RdRP）によるsiRNAの自己増幅による持続は、線虫およびショウジョウバエにおいて周知であるが、哺乳類細胞においては示されていなかった（Ketting, R.F.ら（2001）、Genes Dev. 15：2654〜9；Lipardi, C.ら（2001）、Cell 107：297〜307）。
【０１２５】
確立された感染症におけるsiRNAの抗ウイルス能を決定するために、感染したMDMをCCR5またはp24 siRNAをトランスフェクトする前に16日間感染させた。トランスフェクションの前、＞90％のMDMが感染した。ウイルス複製の抑制はトランスフェクション後経時的に進行した。予想されたように、CCR5の遮断は、この状況においてウイルスの複製を有意に減少しなかった。極めて対照的に、p24 siRNAは、15日間の観察を通して、ウイルス複製を＞90％まで減少することができた。これらの結果は、トランスフェクションが感染の5日より前に起こる場合に、p24 siRNAはHIV抵抗性を付与することができないことと対照的である（図1d）。この長期間持続するウイルス抑制は、確立された感染症を有するMDMにおいて得ることができる。その上、これらの結果はまた、siRNAの作用が標的mRNAの持続的な存在下において持続するという考え方を支持する。
【０１２６】
集合的に、これらの結果は、感染症を予防するためおよび確立された感染症におけるウイルス複製を抑制するために、生理的状況においてHIV-1の長期間持続する抑制を得るためにRNAiに基づく治療の実現可能性を初めて証明する。合成siRNAの1回適用は、MDMにおけるHIVに対して長期間持続する保護を提供することができたことは注目すべきである。マクロファージは、インビボでHIVの重要な標的であり、感染したマクロファージの絶対数はCD4 T細胞と比較すると比較的少数であるが、これらの細胞におけるHIV複製の独自の動力学によって、それらは形成可能なウイルス貯蔵所となる（Aquaro, S.ら（2002）、Antiviral Res. 55：209〜25）。マクロファージは、HIVの細胞変性に対して比較的免疫があり、感染後長期間生存することができる。それらは、分離された細胞質液胞においてウイルスを大量に複製し、ウイルス産生の平衡は60日間もの長い間持続する（Castro, B.A.ら（1988）、Aids. 2補則1、S17〜27）。このように、この不応性の貯蔵細胞が、siRNA媒介ウイルス阻害に対して特に感受性があることは重要である。
【０１２７】
非感染細胞においてCCR5およびp24に対するRNAiの寿命が異なること、ならびに非感染および感染細胞におけるp24に対するRNAiの寿命が異なることは、標的mRNAが哺乳類細胞において投入されたsiRNAを持続または増幅することを示唆している。しかし、siRNA効果は、標的mRNAの存在下であっても、分裂する細胞株では急速に低下する（Tuschl, T（2002）、Nat. Biotechnol. 20：446〜8；Sharp, P.A. & Zamore, P.（2000）、Science 287：2431〜3；Sharp, P.A.（2001）、Genes Dev. 15：485〜90；Elbashir, S.M.ら（2001）、Nature 411：494〜8）。細胞分裂によるsiRNAの希釈が標的mRNAの起こりうる利益を妨害するか否か、またはsiRNAが異なる細胞タイプにおいて異なるように作用するか否かは、明確ではない。非分裂MDMは、分析を複雑にする混同する希釈効果が存在しないために、そのような機械的試験に関して理想的な細胞タイプを提供する。
【０１２８】
標的配列の中央において単一のヌクレオチドを置換すると、RNAiに対して抵抗性の変異体ウイルスを出現させることができる（Gitlin, L.ら（2002）、Nature 418：430〜4）。これは、siRNAの併用を用いることと共にウイルスゲノムの高度保存領域を標的とする重要性を強調する。標的化宿主遺伝子はまた、変異を逃れるために比較的抵抗性である可能性がある。siRNAの静脈内注射によるインビボ輸送は、マウスにおいて実現可能であることが示されている（Lewis, D.L.ら（2002）、Nat. Genet.；McCaffrey, A.P.ら（2002）、Nature 418：38〜9）。
【０１２９】
方法
ヒトMDMの調製
ヒト単球を健常ボランティアドナーから調製したバフィーコートから単離した。末梢血単核球をフィコール-ハイパック（ファルマシア社（Pharmacia Corporation）、ピーパック、ニュージャージー州）密度勾配遠心によって調製し、10％熱不活化ヒトAB血清（ナビ（Nabi）、ボカラトン、フロリダ州）、50 U/mlペニシリン、50 μg/mlストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを添加したRPMI 1640培地（BioWhittaker, Inc.、ウォーカーズビル、メリーランド州）において24ウェルプレートにおいて2×106個/mlで播種した。5日間培養した後、暖かい培地によって繰り返し軽く洗浄することによって非接着細胞を除去して、接着細胞をトリプシン処理によって回収した。この方法によって得られた接着細胞の95％以上がCD14+マクロファージであった。
【０１３０】
siRNAの調製
Cy5-標識p24を含む全てのsiRNAは、ダーマコンリサーチ（Dharmacon Research）、ラファイエット、コロラド州が合成した。siRNAのセンスおよびアンチセンス鎖の配列は以下の通りであった。
2006504427.tif 000003
【０１３１】
RNAは、製造元の説明書に従って、脱保護してアニールした。
【０１３２】
siRNAのトランスフェクション
マクロファージに、記述のように1 nmol siRNA二本鎖の存在下または非存在下でオリゴフェクタミン（ギブコ-インビトロジェン（Gibco-Invitrogen）、ロックビル、メリーランド州）をトランスフェクトした。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄してさらなる試験のために用いた。
【０１３３】
フローサイトメトリー
CCR5発現およびHIV-1感染を調べるために、MDMをビオチン結合DCCR5抗体（R & Dシステムズインク（R & D Systems, Inc）、ミネアポリス、ミネソタ州）によって染色した後、アビジン標識ストレプトアビジン-PE（BDファーミンゲン（BD Pharmingen）、サンジエゴ、カリフォルニア州）またはFITC標識Dp24 Mab（ベックマンコールター（Beckman Coulter）、ブレア、カリフォルニア州）によって染色して、セルクエストソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、フランクリンレークス、ニュージャージー州）を備えたFACSキャリバー上でフローサイトメトリーによって分析した。
【０１３４】
HIV-1感染症
MDMに、1ウェルあたりp24 gag抗原50 ngを用いてHIV-1のR5 BAL株を感染させた。表記の時間に、感染したマクロファージにおけるHIV-1複製を、p24発現に関するフローサイトメトリー分析によって評価して、無細胞ウイルス産生を、アライアンスHIV-1 p24 ELISAキット（パーキンエルマーライフサイエンスインク（Perkin Elmer Life Science Inc.,）、ボストン、マサチューセッツ州）を用いてELISAによって上清におけるp24抗原に関して測定した。
【０１３５】
インサイチューハイブリダイゼーション
スライドチャンバーにおいて培養した感染マクロファージをViroTect（商標）HIV-1細胞検出システム（インビリオンインク（Invirion Inc.,）、フランクフルト、ミシガン州）を用いてHIV-1 mRNA発現に関して評価した。細胞を固定して、透過性にして、製造元のプロトコールに従って、FITC標識gagpolオリゴヌクレオチドプローブカクテルとハイブリダイズさせた。細胞を、テキサスレッド-Xファロイジン（モレキュラープローブインク、ユージーン、オレゴン州）によって染色して、エピ蛍光顕微鏡によって分析した。蛍光色素は、励起波長494 nmおよび591 nmで独立して記録した。
【０１３６】
RT-PCR
タックマン逆転写キット（アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて表記の時間にマクロファージ培養物から精製した総RNAからcDNAを合成した。cDNAの少量を、
2006504427.tif 000004
プライマー対を用いてCCR5に関して、および
2006504427.tif 000005
プライマー対を用いてγアクチンに関してPCR増幅した。増幅されたPCR産物を1.2％アガロースゲルにおいて可視化した。
【０１３７】
実施例2  HIV殺菌剤の開発
異性間伝幡は、世界中での新しいHIV感染症の主な原因であり、男性から女性への伝幡はその逆の場合よりはるかに効率的に起こる。HIVの性的伝幡は、無細胞または細胞関連ウイルスが、主に、マクロファージ、樹状細胞（DC）、および活性化Tリンパ球上で発現されるCCR5共受容体を通して細胞に感染する場合に起こる（Alkhatib, G.ら（1996）、Science 272：1955〜1958；Huang, Y.ら（1996）、Nat. Med. 2：1240〜1243；Zhu, T.ら（1996）、J. Virol. 70：3098〜3107）。最近感染したドナーにおいて、CCR5共受容体を用いるHIVの感染は、被験者が双方のタイプのウイルスに曝露される場合においてもCXCR4-を用いるウイルス（＞90％）と比較して大きく多数を占める（Huang, Y.ら（1996）、Nat. Med 2：1240〜1243；Zhu, T.ら（1996）、J. Virol. 70：3098〜3107）。精子は107個/mlもの多くのウイルス粒子を含むが、感染ウイルスの濃度は、約3対数少ない（Dyer, JRら（1996）、J. Virol. Methods 60：161〜170；Gupta, P.ら（1997）、J. Virol. 71：6271〜6275）。その上、精子の感染ウイルスレベルは実質的に、HAARTによってしばしば検出不能レベルまで低下する（Eron, JJ. Jr.ら（2000）、J. Infect. Dis 181：1622〜1628；Barroso, PFら（2000）、Ann. Intern. Med. 133：280〜284）。
【０１３８】
無細胞ウイルスは、細胞関連ウイルスより容易に伝幡される可能性がある（Sodora, DL.ら（1998）、AIDS Res. Hum. Retroviruses 14、補則1、S119〜123）。ヒト膣および子宮頚部組織外植体を用いた研究は、非炎症女性性器上皮粘膜が、無細胞ウイルスまたは感染リンパ球のトランスサイトーシスを防止する堅固な障壁を提供することを示唆している（Greenhead, P.ら（2000）、J. Virol. 74：5577〜5586）。
【０１３９】
性器上皮細胞は、HIV感染症に対して感受性はない。最初に感染した細胞は、膣および子宮膣部の階層化扁平上皮における常在DCであるランゲルハンス細胞（LC）である可能性がある。アカゲザルに対してSIVを膣内適用した初期の研究から、最も初期の感染細胞がT細胞であること（Spira, AI.ら（1996）、J. Exp.Med. 183：215〜225；Zhang, Z.ら（1999）、Science 286：1353〜1357）。調べた最も初期の時点は感染後24時間であり、その時点で活性化および感染LCは上皮の外に遊走しているであろうと示唆された。LCの感染は、感染後より初期の時点で調べた、膣にSIVを曝露されたアカゲザルにおいて示されている（Hu, J.ら（2000）、J. Virol. 74：6087〜6095）。LCはまた、粘膜上皮に関するヒト上皮吸引水疱モデルにおける感染細胞である（Kawamura, T.ら（2000）、J. Exp. Med. 192：1491〜1500）。LCはまた、その突起が粘膜表面に広がる未成熟DCであり、そこでそれらはHIV感染症に対して近づきうる。それらは、外部の環境の試料を採取して、感染性の微生物を含む外来抗原を取り込む上皮の門番である。それらは、細胞表面ウイルスを不活化させるこれらの外植体からの細胞浮遊液のトリプシン処理が、培養したCD4+ T細胞芽球におけるHIV産生に影響を及ぼさないことから、HIVに多量に感染する。その上、これらの培養物からLCを枯渇させると、HIV産生は完全に消失する。LSはCCR5を発現するが、DC-SIGNまたはCXCR4を発現せず、皮膚水疱モデルにおいて、LCのHIV感染はCCR5依存的である。これはRANTESおよび抗CCR5抗体によって阻害されるが、DC-SIGNまたはCXCR4を遮断することによって阻害されない。その上、皮膚外植体感染症は、CXCR4共受容体を用いるウイルス単離体に対して抵抗性である。
【０１４０】
マクロファージおよびT細胞のような他のHIV感受性細胞は、上皮には存在せず、ほとんどの場合感染したLCからに限って感染するようになる。いくつかの報告から、子宮頚部組織培養において、T細胞が急速に直接感染することが示唆されているが（Collins, KB.ら（2000）、Nat. Med. 6：475〜479）、これらの結果は、現在では、上皮の完全性の喪失または生検標本周囲の漏出の人為的な結末であると考えられる（Shattock, RJ.ら（2000）、Nat. Med. 6：607〜608）。しかし、性的伝幡は、粘膜炎症、および性的伝幡疾患との同時感染が存在する場合には大きく増加する（del Mar Pujades Rodriguez, M.ら（2002）、AIDS 16：451〜462；Grosskurth, H.ら（2000）、Lancet 355：1981〜1987）。臓器培養におけるT細胞のインビトロ活性化も同様にHIV感染症を増強する。その上、膣の炎症を引き起こす殺精子剤であるノノキシノール-9を膣内に用いることは、インビトロでそれがHIV感染症を阻害しても、伝幡のリスクの増加に関連する（van Damme, L.ら（2002）、Lancet 360：971〜977）。さらに、月経周期の黄体期にまたは外因性のプロゲステロンにより起こる膣および子宮頚部上皮の薄化は、SIV/SHIV膣内伝幡を増強する（Marx, PA.ら（1996）、Nat. Med. 2：1084〜1089；Smith, SM.ら（2000）、J. Infect. Dis. 182：708〜715）。同時感染、炎症、外傷、またはプロゲステロンによって、上皮の障壁は、破壊または薄化して、おそらく上皮下マクロファージおよびT細胞の直接感染を可能にする。
【０１４１】
伝幡の予防は、流行を制御するための最善の望みである。有効なワクチンが存在しない場合、性的伝幡を予防するための殺菌剤は、HIVの伝幡の制御に実質的に貢献するであろう。HIVに対する殺菌剤は、門番であるLCの感染を予防する必要があり、膣または子宮頚部上皮の炎症または破壊を引き起こさない。理想的には、殺菌剤は、上皮下マクロファージおよびT細胞の感染を阻害する。コンプライアンスは殺菌剤の有効性に対する主要な障害であることから、長期間作用する物質は、性交の直前に適用する必要がある物質と比較して大きい長所を有する。結果は、トランスフェクションしなくとも、二本鎖siRNAをマクロファージおよび活性化Tリンパ球に輸送することができ、デノボ感染のみならず既に感染した細胞におけるウイルス複製を阻害することができる持続的な遺伝子サイレンシングを引き起こすことができることを示している。これらの知見は、二本鎖siRNAが殺菌剤における活性成分として有効であることを示している。殺菌剤に関する主な障害の一つは、それを性的曝露の直前に用いるという必要条件である。インビトロ実験は、導入された二本鎖siRNAによって誘導される抗ウイルス状態が数週間持続しうることを示していることから、siRNAに基づく殺菌剤は、毎回の性交前に適用する必要はない。
【０１４２】
二本鎖siRNAの有効な輸送
HIV感染のリスクがあるまたはHIVに感染した細胞へのsiRNAの有効な輸送は、疾患を予防または治療するためにRNAiを利用する場合の主な障壁である。現在のインビトロ輸送法は、インビボでの使用に容易に適合されない可能性がある。
【０１４３】
トランスフェクションを行わずに、ウイルスの伝幡そのものと同程度に効率的である輸送法が開発されている。塩基性ペプチドは酸性の核酸に結合することから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらを塩基性ペプチドと混合することによって細胞に輸送することができる（Sandgren, S.ら（2002）、J. Biol. Chem. 277：38877〜38883）。siRNAを細胞に導入するためにこの同じアプローチが用いられている。二本鎖siRNAを、転写を活性化することなく融合タンパク質をサイトゾルに輸送することが知られているHIV tatに由来する塩基性ペプチドと混合すると、トランスフェクションがなくともMDMにsiRNAを効率よく導入する（図3）。この方法を利用して、活性化T細胞の50％が形質導入されている。ペプチドsiRNA二本鎖をマウスにインビボで腹腔内注射すると、マクロファージの30〜50％の形質導入に成功した。
【０１４４】
小さいヘアピンRNAをコードするレンチウイルスによる感染による初代培養細胞におけるHIV複製のサイレンシング
小さい改変RNAは、殺菌剤として用いるために好ましいが、他のsiRNA輸送戦略が調べられている。これらの戦略は、細胞内のダイサーによってsiRNAに処理される小さいヘアピンRNA（shRNA）を発現する自己不活化レンチウイルスによる感染を利用する。これらのレンチウイルスは、細胞の染色体へのレンチウイルスの組込み後に安定な抗ウイルス状態を作製する能力を提供する（Qin, XF.ら（2003）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100：183〜188；Stewart, SA.ら（2003）、RNA 9：493〜501）。自己不活化レンチウイルスベクターにおいて、HIV特異的shRNAを産生するために、LTR、rev、gagおよびvif遺伝子におけるHIV配列を標的とする配列を、HIV共受容体CCR5を標的とする配列と共に挿入した。これらのshRNAレンチウイルスの全てを感染させた初代培養単球由来マクロファージは、HIV感染症に対して抵抗性である（図4）。さらに、CD34+造血幹細胞にこれらのレンチウイルスを感染させて、インビトロでマクロファージに分化させると、それらはHIV感染症に対して抵抗性である。
【０１４５】
マウスマクロファージ、樹状細胞、T細胞、女性性器粘膜における二本鎖siRNAによるCCR5をサイレンシングするためのインビトロ輸送戦略の最適化
インビボでsiRNAを治療的に利用するために、ヌクレアーゼに富む生体液および組織において生存するために必要なsiRNAは、好ましい半減期を有し、機能的状態で細胞に輸送される。静脈内注射後の非改変二本鎖siRNAの半減期は、材料のほとんどが腎臓によって急速に排泄されることから、数秒間で測定される。この短い血清半減期は、殺菌剤として局所使用する場合にはさほど問題とはならない可能性があるが、膣における短い半減期は、有効な輸送を妨害するであろう。その上、非改変の裸の二本鎖siRNAは、その貪食特性にもかかわらず、トランスフェクション試薬または他の特殊な輸送法がなければ、インビトロでマクロファージまたは単球由来DCによって効率よく取り込まれない（図3）。上皮LCは、培養DCより未成熟であって、より貪食性が高いが、それらが輸送法を用いなくとも効率よく形質導入される可能性は低い。
【０１４６】
インビトロでCCR5をサイレンシングするマウスsiRNAの同定
マウス造血細胞においてCCR5発現を標的とするsiRNAを開発する。CCR5は、それがHIVの性的伝幡に関与する共受容体であること、ならびにCCR5は、機能的CCR5を欠損する△32変異を有する人が、免疫学的にコンピテントであることから非必須遺伝子であると見なされていることから、これを宿主標的として選択する（Kawamura, T.ら（2003）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA投稿中）。Tuschlのアルゴリズムを用いて、マウスCCR5を標的とする候補二本鎖siRNAを同定して合成する（Elbashir, SM.ら（2002）、Methods 26：199〜213）。好ましくは、AA（またはより好ましいものではないがNA）の後に19ヌクレオチドが続き、その後TTが続く配列（最後の特徴は選択的である）を選択する。候補配列はまた、GC含有量が35〜70％であり、ATG開始部位から下流に少なくとも75ヌクレオチドでなければならない。最終的な特徴は、その配列が例えばblast検索に基づいて他の任意の遺伝子との相同性を欠損することである。Tuschlのアルゴリズムを用いると、配列の大多数は有効にサイレンシングする；試行配列4個のうち、異なる細胞またはウイルス標的10個を標的とする100％成功率が得られている（Novina, C.Dら（2002）、Nat. Med. 8：681〜686；Song, E.ら（2003）、J. Virol. 77：7174〜7181；Song, E.ら（2003）、Nat. Med. 9：347〜351；Fan, Z.ら（2003）、Cell 112：659〜672；Fan, Z.ら（2003）、Nat. Immunol. 4：145〜153）。NCBI参照配列NM_009917（GI番号：31542355、参照として本明細書に組み入れられる；配列番号：11）に、基づいてターゲティングに関して四つの候補マウスCCR5配列が同定されている：
（1）開始コドン450位、センス：
2006504427.tif 000006
；アンチセンス：
2006504427.tif 000007
；
（2）開始コドン823位、センス：
2006504427.tif 000008
；アンチセンス：
2006504427.tif 000009
；
（3）開始コドン958位、センス：
2006504427.tif 000010
；アンチセンス：
2006504427.tif 000011
；
（4）開始コドン992位、センス：
2006504427.tif 000012
；アンチセンス：
2006504427.tif 000013
。
【０１４７】
二本鎖siRNAは、商業的に合成され（ダーマコン）、製造元のプロトコールに従って脱保護されてアニールして、記述のようにオリゴフェクタミンを用いてマウスマクロファージ細胞株RAW 264,7をトランスフェクトすることによってインビトロで試験する（Novina, C.Dら（2002）、Nat.Med 8：681〜686；Song, E.ら（2003）、J. Virol. 77：7174〜7181；Song, E.ら（2003）、Nat. Med. 9：347〜351）。対照細胞は、偽トランスフェクトするか、または無関係な対照siRNA（スクランブルまたはGFP）をトランスフェクトする。トランスフェクション効率を、FITC標識対照siRNAによって同時にトランスフェクトしたウェルにおいて確認する。トランスフェクションの2日後、PE結合マウスCCR5抗体C34-3448（ファーミンゲン）を用いて、サイレンシングをフローサイトメトリー分析によって評価する。CCR5発現を少なくとも60％サイレンシングするsiRNAのそれぞれに関して、サイレンシングの速度論を分析する。次に、RAW264.7細胞においてサイレンシングするsiRNAを、トランスフェクトしたマウスマクロファージ（接着BALB/c脾細胞由来）および骨髄由来樹状細胞（Feng, H.ら（2001）、Blood 97：3505〜3512；Feng, H.ら（2002）、Blood 100：4108〜4115；Feng, H.ら（2003）、Blood 101：245〜252119-121に記述されるようにBALB/cマウスの大腿骨から調製）におけるCCR5のサイレンシングに関して調べる。フローサイトメトリー分析は、非サイレンシング系列特異的マーカー（それぞれ、CD14およびCD11c）と共に、CD80およびCD86のようなこれらの細胞上で発現される他の細胞表面マーカーに関する同時染色によって、サイレンシングした遺伝子CCR5の発現を比較するであろう。標的mRNAの切断およびサイレンシングの特異性は、ケモカイン受容体6個およびハウスキーピング遺伝子2個に関するmRNAを同時に分析する（Alkhatib, G.ら（1996）、Science 272：1955〜1958）mCR-5多プローブ鋳型セット（ファーミンゲン）を用いて、siRNAトランスフェクトならびに対照処置マクロファージおよびDCから調製したRNAを用いて、RNアーゼ保護アッセイ（RPA）によって有効なCCR5 siRNAに関して確認されるであろう。
【０１４８】
siRNAの輸送がマクロファージおよび／またはDCにおいて成功すれば、休止期またはconAによって活性化されているのいずれかであるナイロンウール分離脾臓T細胞を標的として用いて類似の分析を行う。tatペプチドによるT細胞の形質導入が、Cy5-標識siRNAによる活性化ヒトPBMC-由来T細胞の形質導入頻度50％を生じることが実験から示された。
【０１４９】
改変siRNAを用いてインビトロでマウスマクロファージ、DC、およびT細胞におけるCCR5の輸送およびサイレンシング
トランスフェクトしたマウスDCにおいて非改変siRNAとして最も強く最も持続が長いサイレンシングを生じる抗CCR5 siRNA 2個を、先に同定されたように安定性および輸送を増強するためのさらなる改変のために選択する。これらの戦略のそれぞれを、RAW 264.7細胞を用いてインビトロで分析した後、非改変siRNAに関して先に記述したように接着単球、活性化マクロファージ、および骨髄由来DCによる分析を行う。戦略が異なれば細胞の状態に応じて異なる作用を有する可能性があることから、活性化および分化の様々な段階でのこれらの細胞における形質導入およびサイレンシングを評価する。速度論および用量反応実験によって、サイレンシングの強度および持続に関して異なる輸送およびサイレンシング戦略のあいだで定量的比較を行うことができる。形質導入効率は、センス鎖の5'末端が利用可能であるそれらの構築物に関して、組み入れられたCy5-標識siRNAの平均蛍光強度（MFI）を検出および定量するためにフローサイトメトリーを用いて分析する。siRNAの蛍光標識が実現可能ではない場合（5'末端が改変されているために）、形質導入効率はフローサイトメトリーによるCCR5のサイレンシングを測定することによって定量して、イムノブロットによって確認する。フローサイトメトリーは、それが細胞毎の情報を提供して、全ての細胞における無効な輸送（すなわち、サイレンシングおよび非サイレンシング細胞の異なる集団を区別することによって）および無効なサイレンシングを区別することができることから、イムノブロットより好ましい。
【０１５０】
（1）ヌクレアーゼ抵抗性およびインビボ半減期の増強、ならびに（2）マクロファージ、DC、およびT細胞への輸送のターゲティング、を得るために多くのsiRNA改変戦略が評価されている。ヌクレアーゼ抵抗性siRNAは、2'-O-Me基に置換すること、3'および5'末端を逆方向3'-3'-デオキシ塩基性糖によって保護すること、およびいくつかの残基のあいだにホスホロチオエート結合を付加すること（Usman, N. and Blatt, LM. （2000）、J. Clin. Invest. 106：1197〜1202）によって、いくつかのヌクレオチド残基の糖の2'-OHを改変することによって調製することができる。これらの改変は、静脈内または皮下輸送後に任意の既知の毒性を示すことなく、インビトロサイレンシングを妨害することなく、インビボ半減期を増加させる。その上、オリゴヌクレオチドのセンス鎖の5'または3'末端はまた、静脈内半減期をさらに増強するため、または細胞特異的標的化輸送を提供するために、他の化学部分（ポリエチレングリコールのような）に結合させることができる。センス鎖の改変は、遺伝子のサイレンシングを妨害しないであろう。
【０１５１】
siRNAのマクロファージおよびT細胞への効率的な輸送を得るためにトランスフェクションを行わないことは、siRNAを塩基性のtatペプチド（例えば、残基49〜57位：
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）と混合することによって得られている。tatペプチド対siRNAの最適な比率を決定して、ショウジョウバエAntennapedia遺伝子（残基43〜58位；配列番号：20）のもう一つの塩基性ペプチドと比較する（Prochiantz, A.（1996）、Curr. Opin. Neurobiol. 6：629〜634；Moy, P.ら、（1996）、Molecular Biotechnology 6：105〜113；Kim, DT.ら（1997）、J. Immunol. 159：1666〜1668；Suzuki, T.ら（2002）、J. Biol. Chem. 277：2437〜2443）。輸送およびサイレンシングを、ペプチドとsiRNAの混合物と、共有結合したペプチドセンス鎖とのあいだで比較する。センス鎖の5'末端での活性化チオールを、陽イオンペプチドのC-末端に付加したシステイン残基に共有結合させる。これらのペプチドを通してのインターナリゼーションは、エンドサイトーシス経路を迂回して、したがって苛酷なライソゾーム環境における分解の危険性が弱まる。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドをAntennapediaペプチドに共役させると、生物学的有効性のために必要な濃度が1000倍低下する（Allinquant, B.ら（1995）、J.Cell Biol. 128：919〜927）。最近の研究によって、様々亜な細胞株にsiRNAを輸送するためにHIV gp41の融合ドメインに由来するペプチド（MPG）を用いるこのアプローチの実現可能性が証明されている（Simeoni, F.ら（2003）、Nucleic Acids. Res. 31：2717〜2724）。このペプチドは、それがsiRNAを輸送するのみならず、同時にウイルス侵入を遮断するためのHIV融合体阻害剤として作用することから、HIV抗菌剤の目的に関して特に魅力的である。したがって、他のペプチド-siRNA対によるHIV感染症の遮断におけるMPG-siRNAの活性を比較する。
【０１５２】
DCおよびマクロファージを特異的に標的とするいくつかの戦略を、環境の試料を絶えず採取して、アポトーシス細胞における陰イオンポリマーおよびホスファチジルセリン（PS）の取り込みのための特異的受容体を有する、というこれらの細胞の独自の特性を利用して調べる。可溶性siRNAの取り込み効率を、異なる脂質対siRNA比を用いて、リポソームにパッケージングされたsiRNAの効率と比較する。リポソーム組成物はまた、アポトーシス細胞の認識および貪食のために用いられるPS受容体を通しての取り込みを増強するために、様々な濃度のPSを組み入れるように改変される（Fadok, VA.ら（2000）、Nature 405：85〜90；Fadok, VA. and Chimini, G.（2001）、Semin. Immunol. 13：365〜372；Hoffman, PR.ら（2001）、J. Cell. Biol. 155：649〜659；Huynh, ML.ら（2002）、J. Clin. Invest. 109：41〜50）。リポソームを作製するために、燐脂質のクロロホルム／メタノール（90：10）溶液を窒素下で乾燥させて、二本鎖Cy5-標識siRNAの様々な濃度を含むPBSに再浮遊させて、4℃で3時間超音波処理する。播種したMDM（〜105個/ウェル）にリポソームを約1 μM/ウェルで加えて1時間振とうさせる（Huynh, ML.ら（2002）、J. Clin. Invest. 109：41〜50）。一晩培養後、トランスフェクション効率を決定して、エピ蛍光顕微鏡によって洗浄して、フローサイトメトリーによって定量する。トランスフェクション条件は、PS/ホスファチジルコリン（PC）の比、脂質/siRNAの比、および添加した脂質量／細胞105個に関して最適化する。PSリポソームを用いることは、PS受容体によるマクロファージの抱き込みが、TGF-β1分泌を増加させることによって抗炎症反応を促進することから特に適している（Huynh, ML.ら（2002）、J. Clin. Invest. 109：41〜50）。したがって、マクロファージのトランスフェクションに成功すれば、前炎症性サイトカインがサイレンシングされるのみならず、マクロファージは、抗炎症性サイトカインを分泌するように誘導されるであろう。マクロファージスキャベンジャー受容体を通しての取り込みを増強するために、長さが5〜10ヌクレオチドのポリGテールをsiRNAのセンス鎖の5'末端に付加することを含むもう一つの改変を評価する（Srividya, S.ら（2000）、Biochem. Biophys. Res. Commun. 268：772〜777）。
【０１５３】
マウスにおける改変siRNAのインビボ輸送
上記のようにインビトロでDCに最も良好に輸送された改変siRNAを、雌性マウスにおけるさらなる試験のために用いる。改変siRNA（CCR5を標的としない非改変siRNAおよび対照siRNAと共に）を、吸収を増加させるために5〜10分間腹臥で維持した麻酔雌性マウスの膣に導入する。siRNAは、PBSおよび／またはKYゼリーまたは殺精子剤を含むノノキシノール-9のような様々なヒト膣産物と混合して〜50 μg/200 μlの濃度で投与するか、または上記のようにリポソームと共に乳化する。オリゴフェクタミンも同様に、効率的なインビボ輸送のために評価する。さらに、局所輸送が増強されるか否かを決定するために膣にワセリンを詰めて分析する。Cy5-標識siRNAによるこれらの実験に関して、骨髄細胞-GFP-トランスジェニックマウスを用いる（Faust, N.ら（2000）、Blood 96：719〜726）。これらのマウスにおいて、GFPは、全ての骨髄細胞においてライソゾームプロモーターから発現され、これによってHIV伝幡に関して特に対象となる細胞であるマクロファージおよび骨髄DCへの輸送をエピ蛍光顕微鏡によって決定することができる。
【０１５４】
膣処置の後にどの細胞が形質導入されたか否かを決定するために、マウスを1および2日後に屠殺して、子宮、子宮頚部および膣、ならびに排液リンパ節（遊走LCを検出するため）の解剖標本から得た組織切片の場合は蛍光顕微鏡によって、および細胞浮遊液の場合はフローサイトメトリーによってCy5-標識siRNAおよびCCR5発現に関して分析する。組織学的分析に関して、還流後、解剖した臓器をOCT培地に抱埋して液体窒素中で瞬間凍結する。上皮完全性の破壊、炎症性の浸潤、または細胞の壊死／アポトーシスのようなインビボ毒性の兆候を記入する。切片を固定して、CCR5に関して染色すると共に、どの細胞が有効または無効に形質導入されたか否かを決定するために、ケラチノサイト（ケラチン）、マクロファージ（CD14）、およびDC（CD11cおよびMIDC-8）を同定するための細胞特異的マーカー、および／またはCD40、CD80、およびCD86のような、マクロファージとDCの双方において発現されて、成熟後にアップレギュレートされるマーカーに関して染色する。当業者によって容易に決定される、小さいRNAのシグナルを最もよく保存する固定法を選択する。アレクサ結合二次抗体を用いて蛍光強度を最適化する。Tiサファイアツナミレーザー（スペクトラ-フィジックス（Spectra-Physics））によって増強した多光子バイオラッド放射輝度2000レーザースキャン顕微鏡（オリンパスBX50WI）を用いて組織切片を分析する。定量は、レーザーシャープ3.2画像獲得分析ソフトウェアプログラムを用いて行う。組織切片はまた、FITC-標識CCR5オリゴヌクレオチドプローブを用いてインサイチューハイブリダイゼーションによって特異的mRNAに関して分析して、記述のようにエピ蛍光顕微鏡によって分析する（Song, E.ら（2003）、J. Virol. 77：7174〜7181）。個々の細胞は、上記のように、テキサスレッド-Xファロイジンまたは細胞タイプ特異的抗体によって対比染色することによって同定する。タンパク質発現の蛍光分析および遺伝子サイレンシングの転写後メカニズムは、組織および選択された精製細胞タイプから単離されたRNAのノザンブロッティングによって行い、CCR5 mRNAおよびsiRNAに関してプロービングする。
【０１５５】
組織染色実験を補則するために、異なる細胞タイプにおけるサイレンシングの差を同定するために、単細胞浮遊液をフローサイトメトリーおよび免疫組織化学によって分析する。エンドトキシンを含まないコラゲナーゼおよびDNアーゼを用いて、単細胞浮遊液を、個々に採取した組織のそれぞれから調製して、フローサイトメトリーによってCCR5発現に関して分析する。mRNAの正確な定量が必要である場合、リアルタイムPCRプロトコールを開発して、これを用いて免疫磁気的に選択した細胞集団においてCCR5 mRNAを分析する。改変したノザンブロットを用いて、特定の細胞集団におけるsiRNAの発現を分析する。単離の際のsiRNAの損失を回避するために、トリゾール精製siRNAを沈降させて、70％エタノール中で洗浄して、空気乾燥させて、15％TBE-尿素ゲルにおいて分析して、siRNAのセンス鎖をコードする末端標識オリゴヌクレオチドによってプロービングする（Song, E.ら（2003）、J. Virol. 77：7174〜7181）。
【０１５６】
細胞タイプもしくは組織間、または発達の際の異なる細胞間での輸送またはサイレンシングの差（フローサイトメトリーにおける平均蛍光強度によって、またはイムノブロットもしくはノザンブロットの密度／燐造影分析によって定量）を、スチューデントのt-検定によって統計学的有意差に関して分析する。
【０１５７】
ヒト膣上皮のヒト皮膚水疱モデルにおけるCCR5をサイレンシングするためのsiRNA輸送戦略
殺菌剤として用いるためにインビトロでsiRNAの輸送を評価するモデル系は、ヒト膣上皮皮膚水疱モデルである（Kawamura, T.ら（2000）、J. Exp. Med. 192：1491〜1500）。このモデルにおいて、清浄した皮膚に吸引水疱を作製し、これはラミナルシダ（lamina lucida）を分割して上皮のみを含み、直接伝幡に関与するケラチノサイトおよびLCからなる。これらの未成熟なLCは、膣または子宮頚部DCの特性を有し、インビボでLCのように成熟して組織から遊走することができる。上皮を殺菌剤および／またはウイルスによって一定方向に処置してインサイチューで分析する、このモデルは、LCを「成熟させる」ためにほとんど操作を必要とせず、伝幡のパラメータを模倣することが確認されていることから都合がよい。
【０１５８】
ヒト吸引水疱外植体モデル、NCI98を用いて、無傷の上皮におけるsiRNAの輸送およびインサイチューでのLCの遺伝子サイレンシングを評価する。これらの実験は、裸のRNA二本鎖、化学修飾二本鎖、および／または輸送媒体と混合した二本鎖であるsiRNAを用いて行う。試料の変動を減少させるために、CCR5発現または共受容体活性における差を最小限にするために（Kawamura, T.ら（2003）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、投稿中）、△32 CCR5変異を欠損して（a-2359A/G一塩基多型（SNP））、野生型CCR5プロモーターに関してホモ接合であるドナーを選択する。上皮のラミナルシダを通しての水疱形成は、記述されるように健康なヒトボランティアの前部太腿の毛を剃って清浄にした皮膚に適用した熱および真空吸引によって誘導される（Kawamura, Tら（2000）、J. Exp. Med. 192：1491〜1500）。これらの上皮シートは、ケラチノサイトおよびLCを含むが、マクロファージおよびT細胞を欠損する。直径〜1 cm（水疱20個／ドナー）の水疱の上部をはさみで無菌的に切除して、PBSによって軽く洗浄して角質層の面を下にして（インビボにおける薬剤適用を模倣するため）、裸の、改変、または輸送用に調製されたsiRNAを含む水滴50 μlに接触させて置く。反対方向の水疱（基底上皮面を下にした）への輸送効果も同様に比較する。
【０１５９】
全ての候補となるヒト輸送用siRNA調製物を、インビトロでMDMおよび単球由来樹状細胞（MDDC）の輸送、サイレンシング、およびHIVBal感染症からの保護に関して評価する。MDMは、健常なドナーPBMCを24ウェルプレートにおいて2×106個/ウェルで37℃で2時間播種した後に発生する接着細胞である。MDMを洗浄して、1 μM改変siRNAと共に一晩インキュベートする。さらに、活性化マクロファージおよびMDDCを、500 U/ml IL4および／またはTNF-αの存在下または非存在下で20％ヒトAB血清および5 ng/ml GM-CSFを含む培地において7日間インキュベートすることによって調製する（Friedman, RS.ら（2000）、J. Virol. 74：9987〜9993）。IL-4を添加すると、DC様特性を有する細胞への分化を促進するが、TNF-αは、さらなる成熟シグナルを提供する。これらの細胞は、非炎症上皮における上皮LCより成熟しているが、活性化細胞は炎症した性器組織に存在する。これらの実験は、輸送法のいくつかに対する感受性が異なる可能性がある、異なる分化状態のマクロファージおよびDCへの本発明の輸送法を調べるであろう。例えば、塩基性ペプチドによるsiRNA輸送は、GM-CSF活性化マクロファージにおいて有効であるが（図3）、GM-CSF＋IL-4処置MDCCにおいては有効ではなかった。それぞれの構築物に関して、インビトロでサイレンシングすることが知られている非改変CCR5二本鎖siRNAを、スクランブルsiRNAおよび／または対照siRNAと比較する。siRNAは、CCR5をサイレンシングして、マクロファージのHIV感染を阻害することが示されているヒトCCR5標的配列に基づいて合成される
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（Song, E.ら（2003）、J. Virol. 77：7174〜7181）。安定性または細胞内輸送を増強するために、上記のように末端または糖部分での改変によって改変されたCCR5 siRNAを利用してもよい。siRNAは、個々の細胞浮遊液（siRNA処置後のトリプシン処置によって調製）のフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡による細胞内siRNAの検出を容易にするために、アンビオンサイレンサーsiRNA標識キットを用いてCy3またはフルオレセインによってセンス鎖の5'末端で蛍光標識してもよい。センス鎖の5'末端への改変がsiRNAサイレンシング機能を妨害しないことの確認は、CCR5を標的とする対応のある非標識または標識siRNAによって処置したヒトMDMにおけるCCR5発現のMFIを比較することによって、それぞれの構築物に関してインビトロで決定する。オリゴフェクタミンの存在下または非存在下における蛍光標識した裸のsiRNAの輸送を、輸送のための陽性および陰性対照として用いる。これまでに有効であることが証明された配列を用いてp24を標的とする改変siRNAを用いて同様の分析を行う（Novina, C.D.ら（2002）、Nat. Med. 8、681〜686；Song, E.ら（2003）、J. Virol. 77：7174〜7181）。
【０１６０】
先に記述したように、インビトロスクリーニングに合格したsiRNA調製物を、ドナー少なくとも2人から得た水疱1試料あたり2個ずつにおいて分析する。siRNA含有水滴との最大インキュベーション時間、例えばケラチノサイトまたはLCの細胞死を引き起こさない、上皮シートの完全性を破壊しない（低分子色素に対する非浸透性によって決定）、またはLCの表現型特性を変化させない最長時間を選択する。予備的な分析から、これらの外植体におけるLCがその時間以降成熟マーカーCD83を発現し始めることから、この時間が約2時間であることが示されている。
【０１６１】
処置した皮膚水疱を、蛍光標識siRNAに関する固定切片のエピ蛍光顕微鏡によって、ならびにCCR5およびMHCクラスIおよびII、CD80、CD86、CD4、CD83、CD14、またはアイソタイプ対照に関する細胞タイプ特異的抗体に関する免疫組織化学によって、siRNAの輸送およびCCR5のサイレンシングに関してインサイチューで分析する。同時の分析は、培養後1〜3日のあいだに得られた「遊走」LCにおける細胞タイプ特異的抗体およびアイソタイプ対照抗体による蛍光標識siRNAおよびCCR5に関するフローサイトメトリー染色によって、同じパラメータを調べる（Kawamura, Tら（2000）、J. Exp. Med. 192：1491〜1500）。当業者に既知の方法に基づいて、遊走したLCにおけるCCR5 mRNAを定量するためのリアルタイムPCRプロトコールを開発する。
【０１６２】
上記の皮膚水疱モデルは、siRNAの輸送の評価にとって有用である。減少量のmRNAレベルが減少量のCCR5タンパク質に翻訳されるまでには1日を要する可能性があり、これはHIVチャレンジ実験においてCCR5 siRNAサイレンシングを評価するために重要である。これは、初めに細胞内mRNAまたはタンパク質が存在しないgagのようなウイルス標的を評価する場合には、あまり問題にはならない。siRNAを含む水滴上に外植体を覆うことによって、最適に安定化されたp24 siRNA（CCR5 siRNAを含むおよび含まない）と共に37℃で20〜60分間外植体を処置することによって、これらの外植体をチャレンジするプロトコールを開発する。外植体をゆっくり除去して、様々な希釈のHIVBalを含むsiRNAを含む水滴上に覆って、さらに1時間37℃で培養する。外植体を十分に洗浄して、無細胞ウイルスを除去して、20％ヒトAB血清を含む培養液に浮遊させる。LCにおけるHIV感染症を、培養上清（1日毎に採取した）のp24 ELISAによって、p24に関する細胞内染色およびビリオンを可視化するために透過型電子顕微鏡によって評価する（Kawamura, Tら（2000）、J. Exp. Med. 192：1491〜1500）。いくつかの外植体培養物を、感染を増幅するために免疫磁気的陰性選択によって健常ドナーPBMCから得たヒトCD4+ T細胞と共に共培養して、インサイチューで処置したLCによるT細胞へのHIVの伝幡を測定する。外植体におけるLC（およびケラチノサイト）の生存率および分化状態を注意深くモニターする。処置した培養物は全て、偽処置培養物、非感染培養物、スクランブルまたは対照siRNAと共にオリゴフェクタミンによって輸送された非改変siRNAの同時分析を対照とする。さらに、陽性対照には、感染症の有効な阻害剤である100 nMアミノオキシペンタン-RANTESによって処置した試料が含まれる（Kawamura, Tら（2000）、J. Exp. Med. 192：1491〜1500）。
【０１６３】
同等物
当業者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記述の本発明の特定の態様に対する多くの同等物を認識する、または確認することができるであろう。そのような同等物は以下の請求の範囲に含まれると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】CCR5およびp24 siRNAは、MDMsにおけるHIVBaL感染症を予防する。a．MDMsを曝露しないまま、またはCy5標識p24 siRNAと共に24時間インキュベート、またはトランスフェクトして、CD14-FITCによって染色してフローサイトメトリーによって分析した。Cy5+細胞の百分率をそれぞれのパネルに示す。b．MDMsに、偽トランスフェクト（黒い菱形）、またはGFP-（黒四角）、p24-（黒三角）、CCR5-（x）もしくはp24＋CCR5（＊）siRNAをトランスフェクトして、2日後にHIVBaLを表記の日数感染させた。無細胞ウイルス産生をp24 ELISAによって測定した。c．感染の7日後に、フルオレセイン標識プローブ（下のパネル）によってHIV-RNAに関してインサイチューハイブリダイズさせて、テキサスレッド-Xファロイジン（上のパネル）を対比染色したMDMsの蛍光顕微鏡（×200）。d．細胞を感染の15日後にp24-FITCによって染色して、フローサイトメトリーによって調べた。p24+細胞の百分率をそれぞれのパネルに示す。
【図２】MDMsをトランスフェクション後の期間を延長させて感染させた場合、CCR5は持続的で均一な保護を与えるが、p24 siRNAは与えない。a．MDMsにCy5標識p24 siRNAをトランスフェクトさせて、Cy5蛍光を表記の日に測定した。b．GFP-またはCCR5 siRNAトランスフェクトMDMsをCCR5発現に関して経時的に調べた。偽トラスフェクト細胞（白丸）およびsiRNAトランスフェクト細胞（黒丸）のCCR5染色の重層ヒストグラムを示す。c．トランスフェクション後1日目（レーン2および6）、4日目（レーン3および7）、7日目（レーン4および8）、および15日目（レーン5および9）での、偽トランスフェクト細胞（レーン2〜5）、およびCCR5-siRNAトランスフェクト細胞（レーン6〜9）におけるCCR5およびβアクチンmRNA発現に関するRT-PCR（M：分子12量マーカー；レーン1：陰性対照）。d．MDMsにGFP-（上のパネル）、p24-（中央のパネル）、またはCCR5（下のパネル）siRNAをトランスフェクトして、トランスフェクション後表記の時間でHIB-BaLを感染させた。細胞を、フローサイトメトリーによってp24発現に関して感染後10日目に分析した。p24+細胞の百分率をそれぞれのパネルに示す。
【図３】二本鎖siRNAは、トランスフェクションを行わなくともMDMsに効率よく輸送される。蛍光標識されたsiRNAを、オリゴフェクタミンによるトランスフェクションによって、またはsiRNAをtatペプチドと混合することによってヒトMDMsに輸送した。データを、FACS分析のスキャッタープロット対マクロファージマーカー、CD14として、またはCD14+細胞に関してゲートを設定したヒストグラムによって示す。
【図４】初代培養細胞のHIV感染は、小さいヘアピンRNA（shRNA）をコードするレンチウイルスによって有効にサイレンシングされる。HIV LTR、rev、およびgag p24配列を標的とするshRNAをコードするレンチウイルスを感染させた単球由来マクロファージは、HIV感染症から保護されるが、ルシフェラーゼ（LUC）を標的とする対照レンチウイルスを感染させた細胞は保護されない。HIV感染は、p24の細胞内染色によってフローサイトメトリーによって測定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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