(57)【要約】以下のステップ：（ａ）２−プロパノールを包含する、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の水溶液の調製、（ｂ）ステップ（ａ）で調製された溶液をインキュベーションしての、前記ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶化、および（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された結晶の単離、を包含するＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するため、１つの方法を提供する。ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するための、結晶化剤としての２−プロパノールの新規使用もまた提供する。加えて、該方法により得ることのできる結晶、および該結晶を包含する医薬組成物を提供する。該結晶は薬剤として、このような薬剤の製造のため、およびヒトを含む哺乳類を治療する方法において有用である。
2006513986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）２−プロパノールを包含する、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の水溶液であって、２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比が０．５未満であり、亜鉛イオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比が０．００３未満であるような、前記溶液を調製し、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した溶液をインキュベーションして、前記ＧＨまたはその機能的誘導体を結晶化させ、および
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された結晶を単離する、
ことを包含する、ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造する方法。
【請求項２】
前記２−プロパノールが、多くても２５％ｖ/ｖの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２−プロパノールが、５−２５％ｖ/ｖの範囲の濃度で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記２−プロパノールが、１６−２０％ｖ/ｖの範囲の濃度で存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２−プロパノールが、１８−２０％ｖ/ｖの範囲の濃度で存在する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）で調製される溶液がまた、リン酸ナトリウム/カリウム、クエン酸、リン酸ナトリウム/カリウムおよびクエン酸を組み合わせたもの、ならびにＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ から選択されるバッファーを包含する、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記バッファーがリン酸ナトリウム/カリウムである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バッファーが１０ｍＭより高い濃度で存在する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記バッファーが２０ｍＭ−０．８Ｍの濃度範囲で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バッファーが２０ｍＭ−０．１Ｍの濃度範囲で存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）で調製される溶液を約６．２より低いｐＨに調整する、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）で調製される溶液を５．５−６．２の範囲のｐＨに調整する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ａ）で調製される溶液を５．５−５．７の範囲のｐＨに調整する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）で調製される溶液を約７．０より高いｐＨに調整する、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＨまたはその機能的誘導体が、ステップ（ａ）で調製される溶液中で０．１ｍｇ/ｍｌ以上の濃度で存在する、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＨまたはその機能的誘導体の前記濃度が１ｍｇ/ｍｌ以上である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＨまたはその機能的誘導体の前記濃度が１−２０ｍｇ/ｍｌの範囲である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＧＨまたはその機能的誘導体の前記濃度が１２−１８ｍｇ/ｍｌの範囲である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＨがヒトＧＨである、請求項１−１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体の前記モル比が０．２未満である、請求項１−１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体の前記モル比が０．１未満である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体の前記モル比が０．００３未満である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）の前記溶液において、２価無機カチオンの濃度が約０．３ｍＭより低い、請求項１−２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）の前記溶液において、２価無機カチオンの濃度が約０．１ｍＭより低い、請求項２３項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ａ）の前記溶液が実質的に２価無機カチオンを含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）の前記溶液において、亜鉛イオンの濃度が約０．００２ｍＭより低い、請求項１−２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）の前記溶液が実質的に亜鉛イオンを含まない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するための結晶化剤としての、２−プロパノールの使用。
【請求項２９】
成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を包含する水溶液からＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するための、前記水溶液における２−プロパノールの使用であって、前記溶液は２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比  ０．５未満、および亜鉛イオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比  ０．００３未満を有するものとする、前記使用。
【請求項３０】
請求項１−２７のいずれか１項に記載の方法により得ることのできる、ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶。
【請求項３１】
請求項３０に記載の成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶の治療有効量、およびそれに関する適切な医薬担体を包含する医薬組成物。
【請求項３２】
前記組成物が注射用の懸濁液である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記組成物がデポ製剤である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記組成物が乾燥製剤である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
薬剤として使用するための、請求項３０に記載の成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶。
【請求項３６】
成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を必要とする、ヒトを含む哺乳類の治療用薬剤の製造のための、請求項３０に記載のＧＨまたはその機能的誘導体の結晶の使用。
【請求項３７】
成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を必要とするヒトを含む哺乳類を治療する方法であって、請求項３０に記載のＧＨまたはその機能的誘導体の結晶の治療有効量を、このような治療を必要とする前記哺乳類に投与することを包含する前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶を製造するための新規方法に関する。本発明はまた、前記方法により得ることのできる成長ホルモンの結晶、およびこのような結晶を含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
成長ホルモンは一般に、ヒトを含む動物の成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、魚類の成長ホルモンおよびブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）をいう。
【０００３】
ｈＧＨは１９１のアミノ酸の単鎖からなるタンパク質である。この分子は２つのジスルフィド架橋により架橋結合されており、モノマーの形は２２ｋＤａの分子量を有する。しかし下垂体のヒト成長ホルモンは均質ではない。例えば同一遺伝子から産生される、より小さな２０ｋＤａのｈＧＨ変異体もまた公知である。妊娠中に胎盤により発現される “塩基性ｈＧＨ”変異体（ｈＧＨ−Ｖ）は、別個の遺伝子の産生物であるもう１つの類似体である。２２ｋＤａのｈＧＨと同様に、この変異体も１９１のアミノ酸からなるが、分子全体の様々な位置で１３のアミノ酸残基が異なる。例えばBewley T A et al, Adv Enzymol 42: 73-166, 1975 およびFrankenne F et al, J Clin Endocrin and Metabol 66: 1171-80, 1988 を参照のこと。
【０００４】
組換えｈＧＨ（２２ｋＤａ）はここ数年間に、市販により入手できるようになった。ヒトの組織から調製される産生物は感染性物質、例えばクロイツフェルトヤコブ病の原因となる物質を含有する可能性があるため、この組換え型の方が下垂体由来の産生物より好まれている。
【０００５】
治療上有用な組換えｈＧＨ調製剤が市販されている：認可されたものとして、例えばGenotropin（登録商標）, Pharmacia およびＮ末端に付加的なメチオニン残基を有する類似体、例えばSomatonorm（登録商標）がある。
【０００６】
ｈＧＨは、下垂体機能低下性小人症またはターナー症候群の患者において、線形的な成長を刺激するために使用されるが、他の適用もまた示唆されている。
タンパク質の安定性は一般に医薬工業における１つの問題点である。様々な乾燥方法、例えば凍結乾燥でタンパク質を乾燥することにより、この問題はしばしば解決されてきた。このタンパク質はその後、乾燥した形で分配、貯蔵された。患者は必然的に、使用前に溶媒中にこの乾燥したタンパク質を溶かさなければならないが、このことは不利な点でありもちろん患者にとっては不便である。凍結乾燥の方法はコストおよび時間のかかる工程である。成長ホルモン、例えばｈＧＨを毎日注射する必要のある患者にとって、そして特に患者が小児の場合、この製品が取り扱い、投与、および注射するのに容易であることは重要である。凍結乾燥したｈＧＨを溶かすには、慎重さと注意深さを必要とするため、好ましくは避けるべきであろう。
【０００７】
成長ホルモンを製造するもう1つの方法は結晶化による。成長ホルモンの結晶は、様々な新規ホルモン製剤、例えば注射可能な懸濁液、様々なタイプのインプラントおよび局所製剤のために使用することができる。
【０００８】
ＧＨの適切な結晶を得るための様々な試みが行われてきた。Jones et al, Bio /Technology 5: 499-500, 1987 は、ポリエチレングリコールおよびβ−グルコシドを含有する溶液からハンギング・ドロップ技術を用いて、組換えヒト成長ホルモンを結晶化した。
【０００９】
Borisova et al, Doklady Biochemistry 301/1-6: 207-210, 1988 は、ｈＧＨではなくヒトＤｅｓ−Ｐｈｅｎ１−ソマトトロピンを、付加物を含むアセトン中にてハンギング・ドロップ技術を用いて結晶化した。
【００１０】
Clarkson et al, J Mol Biol 208: 719-721, 1989 は、様々な結晶化の方法を報告している。これらの方法には、バッファー中にエタノール、メタノールまたはアセトンを用いたハンギング・ドロップ技術、およびパラアルデヒドを用いたバッチ式による技術を含む。
【００１１】
Novo Nordisk A/S のＵＳ  ５  ７８０  ５９９において、化学的に安定で生物学的に活性な成長ホルモンのカチオン結晶を生産する方法が開示されている。この方法は以下のステップ：ＧＨの溶液にｐＨ５および８の間で２価無機カチオンを添加、０℃−３０℃の温度で結晶を成長させること、および結晶の単離、を包含する。得られる結晶は常に２価無機カチオンを含む。好ましい２価無機カチオンはＺｎ２＋である。好ましくは有機溶媒をカチオンと共に加える。実験は有機溶媒のアセトンおよびエタノールに関して行われているが、２−プロパノールもまた２価無機カチオンと合わせての適切な有機溶媒であることが、手短に提案されている。
【００１２】
Kabi Pharmacia ABのＷＯ  ９４/１０１９２において、ＧＨの結晶を製造するための方法が開示されているが、この方法は芳香族アルコール、例えばベンジルアルコールの使用を伴う。
【００１３】
ｈＧＨを投与するより良い方法が市場で求められている。ｈＧＨの結晶は、バッファーを共に含み、保存剤を含む場合も含まない場合もある懸濁液または注射可能な水溶液にて使用することができる。これらはまたデポ製剤中に、例えば油性または水性の懸濁液として、またはインプラントとして使用し、それにより薬剤の徐放性を提供することができる。結晶が十分に大きい場合には粉末として使用し、例えば創傷部表面に塗布することができる。
【００１４】
このため工業的スケールでＧＨの結晶を得る新規で再現性のある方法が必要とされている。ＧＨの結晶の生産のための新規で発明的な方法を、本特許出願において提示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶を製造するための新規方法を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００１６】
実施する上で丈夫で技術的にシンプルなこのような方法を提供することもまた、本発明の１つの目的である。
医薬的に受容可能な条件を使用するこのような方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００１７】
高収率を有するこのような方法を提供することが、本発明の１つの目的である。
以下の記述から明らかになる様々な目的のため、本発明はその最も広範囲な側面において、以下のステップを包含する、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶を製造するための新規方法を提供する：すなわち（ａ）２−プロパノールを包含する、ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液を調製し、（ｂ）ステップ（ａ）で調製される溶液をインキュベーションして、前記ＧＨまたはその機能的誘導体を結晶化させ、（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された結晶を単離する。
【００１８】
本発明による特定の方法において、前記２−プロパノールは多くても２５％ｖ/ｖの濃度で存在する。好ましくは前記２−プロパノールは５−２５％ｖ/ｖの範囲、より好ましくは１６−２０％ｖ/ｖの範囲、さらにより好ましくは１８−２０％ｖ/ｖの範囲の濃度で存在する。
【００１９】
本発明による１つの方法において、ステップ（ａ）で調製される溶液はまた、リン酸ナトリウム/カリウム、クエン酸、リン酸ナトリウム/カリウムおよびクエン酸を組み合わせたもの、およびＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌ から選択されるバッファーを包含する。本発明によるより好ましい方法において、前記バッファーはリン酸ナトリウム/カリウムである。
【００２０】
バッファーは１０ｍＭより高い濃度で存在することが好ましい。バッファーは１０ｍＭ−０．８Ｍ、好ましくは２０ｍＭ−０．８Ｍ、より好ましくは２０ｍＭ−０．１Ｍの濃度範囲で存在することが特に好ましい。
【００２１】
本発明による特定の方法において、ステップ（ａ）で調製される溶液は、約６．２より低いｐＨに調整する。本発明による好ましい方法において、ステップ（ａ）で調製される溶液は、ｐＨ５．５−６．２の範囲、好ましくは５．５−５．７の範囲に調整する。
【００２２】
本発明によるもう１つの方法において、ステップ（ａ）で調製される溶液はｐＨ約７．０より高い値に、好ましくは７．０−９．０の範囲に調整する。
本発明による１つの方法において、前記ＧＨまたはその機能的誘導体は、ステップ（ａ）で調製される溶液中に０．１ｍｇ/ｍｌ以上、好ましくは１ｍｇ/ｍｌ以上の濃度で存在する。本発明による好ましい方法において、ＧＨまたはその機能的誘導体の前記濃度は０．１−２０ｍｇ/ｍｌの範囲、好ましくは１−２０ｍｇ/ｍｌ、より好ましくは１２−１８ｍｇ/ｍｌの範囲とする。
【００２３】
本発明による特定の方法において、前記ＧＨはヒトＧＨである。
本発明による特定の方法において、ステップ（ａ）の前記溶液における２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比は、０．５未満であり、亜鉛イオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比は０．００３未満である。
【００２４】
本発明による好ましい方法において、２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比は、０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．００３未満である。
【００２５】
本発明による特定の方法において、ステップ（ａ）の前記溶液における２価無機カチオンの濃度は約０．３ｍＭより低く、好ましくは約０．１ｍＭより低い。本発明による好ましい方法において、ステップ（ａ）の前記溶液は２価無機カチオンを実質的に含まない。
【００２６】
本発明による１つの方法において、ステップ（ａ）の前記溶液における亜鉛イオンの濃度は約０．００２ｍＭより低い。本発明による好ましい方法において、ステップ（ａ）の前記溶液は亜鉛イオンを実質的に含まない。
【００２７】
さらに本発明は、ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するための結晶化剤(crystallizing agent)としての、２−プロパノールの新規使用を提供する。
成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を包含する水溶液から、ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するための、前記水溶液における２−プロパノールの使用を提供する。本発明による好ましい使用において前記溶液は、２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比  ０．５未満、および亜鉛イオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比  ０．００３未満を有する。
【００２８】
本発明はまた、本発明による方法により得ることのできるＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を提供する。
加えて本発明は、本発明による成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶の治療有効量、およびそれに関する適切な医薬担体を包含する医薬組成物を提供する。本発明による好ましい組成物において、前記組成物は注射用の懸濁液である。本発明によるもう１つの好ましい組成物において、前記組成物はデポ製剤である。本発明によるなおもう１つの好ましい組成物において、前記組成物は乾燥製剤である。
【００２９】
本発明は、薬剤として使用するための本発明による成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶を提供する。
本発明はまた、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を必要とする、ヒトを含む哺乳類の治療用薬剤を製造するための、本発明によるＧＨまたはその機能的誘導体の結晶の新規使用を提供する。
【００３０】
最後に本発明は、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を必要とするヒトを含む哺乳類を治療する方法を提供するが、その方法は、本発明によるＧＨまたはその機能的誘導体の結晶の治療有効量を、このような治療を必要とする前記哺乳類に投与することを包含するものとする。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は全体として、２−プロパノールがＧＨまたはその機能的誘導体を溶液から結晶化するための特に適切な結晶化剤である、という発見に基づく。
【００３２】
“成長ホルモン”および“ＧＨ”という用語は、一般にヒト成長ホルモンを含む動物の成長ホルモンをいう。ＧＨは天然の材料、または組換えの材料のいずれに由来してもよい。ＧＨは組換えＧＨ（ｒＧＨ）であることが好ましい。ＧＨの例として、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、サケ、マスおよびマグロ由来のＧＨを含む魚類の成長ホルモン、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、ならびにヒツジ成長ホルモンを含む。ＧＨはｈＧＨであることが好ましい。
【００３３】
成長ホルモンの“機能的誘導体”という用語はこれにより、自然に発生するおよび操作された類似体または変異体の双方を含むことを意味する。自然に発生する類似体または変異体の例として同一遺伝子から産生される２０ｋＤａのｈＧＨ変異体を含み、そして妊娠中に胎盤により発現される “塩基性ｈＧＨ”変異体（ｈＧＨ−Ｖ）は、別個の遺伝子の産生物であるもう１つの類似体である。操作された類似体または変異体として、遺伝子工学および組換え技術により産生されたＧＨ突然変異体、ならびに化学的にまたは酵素により修飾されたＧＨを含む。
【００３４】
“結晶化”という用語は、規則的、反復的な形での分子の凝集により結晶が形成される、分子の過飽和溶液中で起こる周知の現象をいう。分子のよりランダムな凝集が起こると、アモルファスの沈殿が得られる。具体的にはタンパク質、例えばＧＨ、の結晶化は、ＧＨの過飽和溶液、すなわちＧＨの濃度が飽和点を上回っている溶液中で起こる。この状態はいくつかの方法、例えば溶媒の温度を下げること、または溶媒に結晶化剤を添加することにより達成することができる。
【００３５】
一般的な用語においてタンパク質の結晶化は、精製の方法、タンパク質の均質性の確立、安定な貯蔵の方法として、およびＸ線結晶学によるタンパク質の３次元構造決定のための出発点として有用である。
【００３６】
タンパク質が大きなサイズであるため、大きな結晶を得ることが望ましい場合には特に、結晶はむしろゆっくり成長する傾向がある。
使用する特定の結晶化の方法は、溶媒および結晶化剤の性質、ならびに利用できるタンパク質の量を含むいくつかの因子により左右される。ほとんどの場合、最も適切な方法および特異的な条件は現在の理論的知識からは明らかではなく、実験的に確立、至適化しなければならない。
【００３７】
多量のタンパク質を利用できる場合、結晶化はバッチにより行うことができる。手短には適切な結晶化剤を所望のタンパク質の溶液に加え、それにより過飽和溶液を達成する。
結晶化はまた分、時間、日のオーダーの期間にわたり結晶化剤の濃度を増加することにより、溶媒条件のより漸次的変化を通して達成することもできる。この条件を達成する２つの基本的な方法は、透析に基づいたシステムおよび拡散に基づいたシステムによる。
【００３８】
透析に基づいたシステムでは、透析膜がタンパク質および結晶化剤の溶液を結晶化剤の溶液から分離するが、この場合結晶化剤の溶液は、タンパク質の溶液より高濃度の結晶化剤を有するものとする。透析を通じて、タンパク質溶液は過飽和になる。
【００３９】
拡散に基づいたシステム、例えば“ハンギング・ドロップ”法および“シッティング・ドロップ”法では、検討するタンパク質を含有するサンプルおよび貯蔵容器間での揮発性種の蒸気拡散を通して、タンパク質は過飽和の状態に至る。サンプル中および貯蔵容器間の蒸気圧が等しくなるまで、拡散は継続する。
【００４０】
“ハンギング・ドロップ”法では、典型的には５−３０μｌのタンパク質サンプルの液滴を、カバースライドグラス上に置く。液滴がぶら下がっているスライドグラスがチャンバーの天井部分を構成するように、貯蔵容器の試薬溶液を含有するチャンバーの一番上にスライドグラスを設置する。チャンバーを十分に密封する。試薬溶液は典型的には結晶化剤および非揮発性種、例えば塩およびバッファーを包含するが、液滴もまた非揮発性種の一部を含有することが非常に重要である。平衡に達するように、液滴およびチャンバー内の蒸気圧が等しくなるまで液滴から揮発性種が蒸発し、液滴中のタンパク質および非揮発性種の濃度の増加をもたらす。
【００４１】
典型的には少量、例えば１−３０μｌ、のタンパク質溶液を、少量、例えば１−３０μｌ、の試薬溶液と混合する、ただしこの試薬溶液は貯蔵容器の溶液と同一とする。液滴中の試薬の濃度がチャンバー内の濃度とほぼ等しくなると、平衡に達する。したがって液滴の最終的な容積は、液滴中の試薬溶液の最初の容積とほぼ等しい。
【００４２】
“シッティング・ドロップ”法の原理は、液滴がカバーグラスの代わりにドロップホルダー上に置かれることを除いて、“ハンギング・ドロップ”法と同じである。より多くの結晶が望ましい場合、この方法は“ハンギング・ドロップ”法より大きな容積を使用することができる。
【００４３】
イソプロピルアルコールとしても知られている２−プロパノールは無色の液体であり、水およびほとんどの有機液体と混和できる。２−プロパノールは医薬的に受容可能な溶媒である。この溶媒は揮発性であり、したがって簡単な乾燥法で生成物から除去することができる。最後に２−プロパノールは高価ではなく、ユーザーにもなじみがある。
【００４４】
“試薬”という用語は一般に、バッファー、塩および結晶化剤を含む、結晶化の方法において使用されるあらゆる化学種をいう。“結晶化剤”という用語は、結晶化を引き起こす特定の成分をいう。
【００４５】
本発明の態様は、以下のステップを包含する成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶を製造するための方法を提供する：すなわち
（ａ）２−プロパノールを包含する、ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液を調製し、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した溶液をインキュベーションして、前記ＧＨまたはその機能的誘導体を結晶化させ、および
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された結晶を単離する。
【００４６】
ステップ（ａ）の調製は、バッチでの結晶化、透析に基づいた結晶化、拡散に基づいた結晶化、例えば“ハンギング・ドロップ”による結晶化および“シッティング・ドロップ”による結晶化、またはその他のいかなる適切な結晶化法を伴ってもよい。
【００４７】
したがってステップ（ａ）は、２-プロパノールを包含する溶液の適切な容積を、ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液と混合することを単に伴ってもよい。得られる溶液はバッチによるの結晶の生成に使用することができる。透析または拡散に基づいた結晶化の方法を使用する場合、ステップ（ａ）は、２−プロパノールを包含する貯蔵容器の溶液の適切な容積を、ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液に混合することを伴ってもよい。ステップ（ａ）はまた、例えばバッファーを含む、または他の適切な物質を該溶液に添加することによる、該溶液のｐＨの調整を伴ってもよい。
【００４８】
ステップ（ｂ）のインキュベーションは、ステップ（ａ）で調製される過飽和溶液から結晶を形成させることを伴う。当業者に公知のいくつかの結晶化の方法がある。実験室スケールでは“ハンギング・ドロップ”法および“シッティング・ドロップ”法が通常好ましい。工業スケールでは、結晶を得るために溶液をインキュベーションする最も便利な方法は、単純に溶液を一定時間放置することである。所望によりインキュベーションには、温度を下げること、緩やかに撹拌すること、または他のルーチーンの製造法を包含してもよい。
【００４９】
例として本発明による方法は、窒素雰囲気下、プロペラで撹拌する容器中で行ってもよい。この方法を開始してから室温で１２時間維持する。その後温度を次の１２時間で６℃まで線形的に下げる。
【００５０】
ステップ（ｃ）の単離は、ステップ（ｂ）で調製した結晶をあらゆる適切な方法で集めることを伴う。この方法は当業者によく知られている。より多くの結晶を得るため、可能であれば残っている溶液をさらにインキュベーションしてもよい。溶液中に残っているＧＨはまた、再利用してさらなる結晶化のサイクルを行ってもよい。
【００５１】
本発明による方法により、ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を得ることができる。これらに限定されるわけではないが、得られる結晶は棒状としてよいが、結晶サイズおよびより詳細な構造は多様である。収率、例えば結晶化したＧＨ−対−全体のＧＨの比率は、典型的には７０％以上、しばしば９０−９５％の高さとなる。
【００５２】
ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液は、２５％（ｖ/ｖ）より高濃度ではない２−プロパノールを包含するように調製することを意図するものとする。２−プロパノールの濃度は５−２５％ｖ/ｖの範囲内であることが好ましい。高収率および/または大きな結晶を達成するためには、２−プロパノールの濃度は１５−２０％または１６−２０％ｖ/ｖ、より好ましくは１８−２０％ｖ/ｖの範囲内であることが好ましい。特に好ましい２−プロパノールの濃度は２０％ｖ/ｖである。
【００５３】
本発明の態様において、ステップ（ａ）のＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液の調製は、前記溶液中にバッファーを含めることをさらに伴う。バッファーは一般に、医薬的に受容可能なバッファーから選択される。適切なバッファーの例は、リン酸ナトリウム/カリウム、クエン酸、リン酸ナトリウム/カリウムおよびクエン酸を組み合わせたもの、ならびにＢｉｓＴｒｉｓ−ＨＣｌである。本発明の好ましい態様においてバッファーはリン酸バッファーである。バッファーを含めることで、この過程を通しての溶液の適切なｐＨの維持が促進される。バッファーの濃度は、結晶化の方法を逆に妨げることなく適切な緩衝効果を提供するように選択する。典型的にはバッファーの濃度は１０ｍＭ以上である。好ましい態様において、バッファーの濃度は１０ｍＭから０．８Ｍ、または２０ｍＭから０．８Ｍ、好ましくは２０ｍＭから０．１Ｍの範囲である。
【００５４】
本発明の方法のもう１つの態様において、ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液は、得られるｐＨが約６．２より低い値に調整されるように調製する。一般に水/２−プロパノール溶液中のＧＨの溶解度はｐＨ６．５で最大値を有する、ということができる。この値よりｐＨが低くなると、２−プロパノール存在下でのＧＨの溶解度は減少する。したがって好ましい態様においてＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液は、得られるｐＨが５．５から６．２、好ましくは５．５から５．７の範囲内に調整されるように調製する。本発明による方法において６．５より十分に高いｐＨを使用してもよいこともまた意図するものとする。したがって好ましい態様において、ＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液は、得られるｐＨが７．０以上、例えば７．０−９．０の範囲に調整されるように調製する。
【００５５】
特に好ましい態様においてステップ（ａ）で調製される溶液は、０．０１−０．７Ｍリン酸バッファー、例えば０．１Ｍリン酸バッファーにおいて、およそ５．６のｐＨに調製する。
【００５６】
本発明による方法の態様において、ステップ（ｂ）のインキュベーションは室温またはそれより低い温度で行う。得られる結晶の質は１５−２０℃でより良質であるが、収率はより低温、例えば６℃位でより高い。実際には使用する温度は、これら２つの因子を折衷したものになる。温度はまた、実験を通して変化させてもよい。例として、この方法は一定時間  例えば１２時間、より高温  例えば１５-２５℃で開始し、その後一定時間  例えば１２時間かけて６℃まで線形的に温度を下げることができる。適切な総インキュベーション時間は１２時間−９６時間、好ましくは２４−４８時間である。
【００５７】
本発明の方法の態様において、ステップ（ａ）のＧＨまたはその機能的誘導体の水溶液の調製には、最初のＧＨ濃度を０．１ｍｇ/ｍｌ以上、例えば０．１から２０ｍｇ/ｍｌの範囲とする溶液を調製することを伴う。典型的には最初のＧＨ濃度は１ｍｇ/ｍｌ以上、例えば１から２０ｍｇ/ｍｌ、より好ましくは１２から１８ｍｇ/ｍｌとする。いずれかのＧＨの機能的誘導体の重量または溶解度が、ネイティブのＧＨの値とかなり異なる場合には、これらの値をそれに応じて容易に変更できることは、理解されるだろう。本発明による方法の好ましい態様において、ＧＨは天然の材料、または好ましくは組換えの材料に由来するヒトＧＨである。
【００５８】
本発明による方法において、ステップ（ａ）の水溶液中のカチオンの存在が結晶の質を低下させる、または結晶の形成を妨げることさえあることが発見された。特にＺｎ２＋イオンは結晶の形成を妨げることに特に効果がある。この発見は、Ｚｎ２＋イオンの存在がＧＨ結晶形成に有益な効果を有するとする、ＵＳ  ５，７８０，５９９が教示していることと著しい対照をなす。
【００５９】
したがって本発明による方法の好ましい態様において、ステップ（ａ）の溶液における２価無機カチオンの濃度は０．３ｍＭより低い、好ましくは０．１ｍＭ未満より低い。好ましい態様においてステップ（ａ）の溶液は２価無機カチオンを含まない。
【００６０】
２価無機カチオンを除外するという所望はまた、ステップ（ａ）の水溶液における２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比として表してもよい。好ましい態様において該モル比は、０．５未満、好ましくは０．２未満である。より好ましい態様において、該モル比は０．１未満、好ましくは０，００３未満である。
【００６１】
上で考察したように、ステップ（ａ）の水溶液において亜鉛イオンの低濃度を維持することが特に望ましい。したがって本発明による方法の好ましい態様において、Ｚｎ２＋の濃度はステップ（ａ）の溶液において０．００２ｍＭより低い。好ましい態様においてステップ（ａ）の溶液は２価亜鉛イオンを含まない。
【００６２】
Ｚｎ２＋を除外するという所望はまた、ステップ（ａ）の水溶液におけるＺｎ２＋−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比として表してもよい。好ましい態様において該モル比は、０．００３未満である。
【００６３】
亜鉛イオンおよび他の２価無機イオンに関する “含まない”という用語は、このようなイオンを意図的に添加しなかった状態、すなわちこれらのイオンの濃度が、通常の水において自然に発生するその濃度以下である状態をいう。
【００６４】
“モル比”という用語は２つの種間のモルの関係をいう。本発明において溶液中の２価無機カチオン、例えばＺｎ２＋、−対−ＧＨのモル比は、ＧＨの結晶が液相から析出する場合には変化（増加）するものとしてよいことは、理解されるだろう。
【００６５】
溶液中の２価無機カチオンの有効性をキレート剤、例えばＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの使用により低減させてもよいことは知られている。これらの剤は２価無機カチオンと複合体を形成し、溶液中のカチオンの有効濃度を低下させることになる。さらにリン酸バッファーおよびクエン酸バッファーを含むある種のバッファーは、キレート特性を有する。したがって本発明においてキレート剤の使用を通して、水溶液中の２価無機カチオンの望ましくない高濃度の効果を低減させてもよいことを意図するものとする。したがって溶液中にキレート剤を組み合わせることで、Ｚｎ２＋を含む２価無機カチオンが取り込まれると予測される。それでもやはりこれらの化合物を排除し、Ｚｎ２＋を含む２価無機カチオンの使用を単純に回避、または制限することが好ましい。
【００６６】
明確にするため、請求項で特定する濃度およびモル比は、結晶化直前の水溶液の状態をいうことを強調すべきであろう。工業的製造に都合のよいバッチの結晶化において、結晶化させるタンパク質、および結晶化剤を含むあらゆる試薬の濃度およびモル比は、溶液の調製の結果として定まる。
【００６７】
しかし拡散に基づいたシステムにおいて、所望のタンパク質を含有して調製される溶液における対応する濃度および比率は、貯蔵容器の溶液との平衡の後で変化するものである。それにもかかわらず、あらゆる揮発性種は拡散し、液滴および貯蔵容器の溶液間で平衡に達するという周知の事実から、得られる濃度および比率は容易に予測することができる。したがって最終的な容積は非揮発性種により決定されることになる。実際にこのことは、結晶化直前の水溶液の濃度およびモル比は、液滴の組成およびスタート時の容積、ならびに貯蔵容器の溶液の組成を含む実験の設定に固有であることを意味する。同様に透析に基づいたシステムにおいて、結晶化直前の水溶液中の対応する濃度およびモル比は、実験の設定に固有である規定される。
【００６８】
結晶化が進行すると、溶解し得るＧＨの濃度は明らかに減少することになる。
本発明は上述の方法に限定されると考えるべきではない。もう１つの側面により本発明は、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を包含する水溶液から、ＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を製造するための、前記水溶液における２−プロパノールの新規使用を提供する。
【００６９】
先に述べたように得られる結晶の特徴および収率は、２−プロパノールおよびＧＨまたはその機能的誘導体の濃度、バッファーおよび２価無機カチオン  特にＺｎ２＋の存在および濃度、ｐＨならびに温度を含む、いくつかのパラメータによりさらに影響を受ける。特にステップ（ａ）の溶液は、２価無機カチオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比  ０．５未満、および亜鉛イオン−対−ＧＨまたはその機能的誘導体のモル比  ０．２未満を有することが好ましい。
【００７０】
あるいはステップ（ａ）の溶液中において、２価無機カチオンの濃度が約０．３ｍＭより低く、亜鉛イオンの濃度が約０．００２ｍＭより低いことが好ましい。溶液が２価無機カチオン、特に亜鉛イオン、を実質的に含まないことが、特に好ましい。
【００７１】
本発明のさらなる態様は、本発明による方法で製造されるＧＨまたはその機能的誘導体の結晶を提供する。限定するわけではないが、得られる結晶は棒状としてよいが、結晶のサイズおよびより詳細な構造は多様である。該結晶は、ヒトを含む哺乳類の治療における薬剤として有用であるとしてよい。所望により該結晶は、ＧＨまたはその機能的誘導体を必要とするヒトと含む哺乳類の治療用薬剤の製造のために有用であるとしてよい。
【００７２】
得られる結晶は医薬的目的に有用であることを意図するものとする。したがって本発明の態様は、本発明による成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体の結晶の治療有効量、およびそれに関する適切な医薬担体を包含する医薬組成物を提供する。該組成物は、局所、経鼻、経肺、経口、直腸から、および非経口の投与を含む、いくつかの公知の投与剤形のいずれに適していてもよい。これに限定することなく、該組成物は注射用懸濁液、デポ製剤、または使用前に再構成しなければならない、結晶を包含する乾燥製剤としてよい。
【００７３】
ＧＨの組成物に関する適切な医薬担体は、当業者に周知である。
本発明のさらなる態様は、成長ホルモン（ＧＨ）またはその機能的誘導体を必要とする、ヒトを含む哺乳類を治療する方法を提供する。該方法は、該哺乳類へのＧＨまたはその機能的誘導体の結晶の治療有効量の投与を包含する。該投与は以下の経路：局所、経鼻、経肺、経口、直腸から、および非経口、のいずれを経てもよい。好ましい態様において投与は非経口的に行う。
【００７４】
本発明の態様において本方法は、望ましくない不純物を含有するＧＨの溶液からの、ＧＨの精製に有用である。
先に述べたようにNovo Nordisk A/S のＵＳ  ５  ７８０  ５９９において、成長ホルモンのカチオン結晶を生成する方法が開示されている。この方法は以下のステップを包含する：すなわち、ｐＨ５および８の間でのＧＨの溶液への２価無機カチオンの添加、０℃−３０℃の温度で結晶を成長させること、および結晶の単離。得られる結晶は常に２価無機カチオン、好ましくはＺｎ２＋を含む。０．２７ｍＭ  ｈＧＨおよび０．３６ｍＭ  Ｚｎ２＋（Ｚｎ２＋/ｈＧＨのモル比  約１．３４）の溶液のインキュベーションがＧＨの結晶を提供すると記載されている。無機カチオン２＋/ＧＨのモル比が０．５未満ではないこと、またはＺｎ２＋/ＧＨのモル比が０．２未満ではないことが、各々Ｚｎ２＋または２価無機カチオンの適切な濃度を提供することを、さらに示唆している。
【００７５】
本発明による方法において、２−プロパノールをそれ自体で結晶化剤として使用する場合、２価無機カチオンの存在が事実上結晶の形成を妨げる、または製造されるあらゆる結晶の質を低下させることが発見された。以下の実施例６において、０．００２Ｍ  Ｚｎ２＋（［Ｚｎ２＋］/［ｈＧＨ］比  約０．００３）ほどの少量でも、２−プロパノール存在下での結晶化を妨げることが発見された。以下の実施例７において、２−プロパノールを結晶化剤として使用する場合、２価無機カチオンＦｅ２＋（０．２−０．８ｍＭ）、Ｍｇ２＋（４−１０ｍＭ）、およびＣａ２＋（１−３ｍＭ）の存在は、もし存在する場合には、形成される結晶の質を低下させることが発見された。したがって本発明による結晶化溶液におけるこれらのイオンの存在を排除、または制限することが望ましい。モル比は以下の通りであった：Ｆｅ２＋/ＧＨ：０．１８−０．７３、Ｍｇ２＋/ＧＨ：３．７−９．２、Ｃａ２＋/ＧＨ：０．９２−２．８。
【００７６】
ＵＳ  ５  ７８０  ５９９の示唆された態様において、有機溶媒をカチオンと共に加えている。実験は有機溶媒のアセトンおよびエタノールに関して行われているが、２−プロパノールもまた２価無機カチオンと合わせての適切な有機溶媒であることが、手短に提案されている。
【００７７】
本発明による方法において、２−プロパノールはそれ自体で適切な結晶化剤であり、２価無機カチオン、特に亜鉛イオンの存在が、ＧＨまたはその誘導体の得られる結晶の質を低下させることが、実験的に示されている。
【００７８】
したがってＵＳ  ５  ７８０  ５９９は、それ自体で適切な結晶化剤としての２−プロパノールの使用を教示してはいない。反対にＵＳ  ５  ７８０  ５９９は、結晶化剤として高濃度の亜鉛イオンの、所望によりある種の有機溶媒と合わせての使用を教示している。
【００７９】
本発明を実施例により以下にさらに説明することにする。実施例は本発明の範疇を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８０】
実施例
以下において、実施例１−７は結晶のスクリーニングの実験に関し、実施例８−１５はストック結晶バッチの実験に関し、そして実施例１６−２３はＧＨの溶解度の実験に関する。
【００８１】
実施例１  ｈＧＨの調製
結晶スクリーニングに使用するすべてのｈＧＨの材料は、水に対して透析した。得られたサンプルを０．４５μｍセルロースアセテートメンブレンを通して濾過し、存在し得る固体不純物を除去し、微生物の混入を防いだ。得られたｈＧＨ溶液を水で希釈し、所望のタンパク質濃度の溶液を作成した。
【００８２】
実施例２  ２−プロパノール濃度およびｐＨの結晶スクリーニング
２−プロパノールを、ハンギング・ドロップ蒸気拡散技術を用いて、５％から３０％（ｖ/ｖ）の範囲の濃度、および５．３から７．８の範囲のｐＨ値でスクリーニングした。
【００８３】
手短には３３ｍｇ/ｍｌのＧＨを含有するサンプル  ５μｌ、および２０ｍＭ  リン酸−Ｎａ−Ｋ、ｐＨ５．３、５．６、６．０、６．４、７．０、または７．８中に５、１０、２０または３０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する試薬溶液  ５μｌを、円形のシリコン処理したカバースライドグラス上にピペットで取り、混合した。このスライドグラスを２４穴の組織培養ボックスの上に設置し、グリースで密封した。チャンバーは同じ試薬溶液（貯蔵容器の溶液と呼ぶ）を１ｍｌ含有した。平衡後、液滴中の試薬濃度はチャンバー内の濃度とほぼ等しい。したがって液滴の最終容積は、最初にピペットでとった試薬溶液の容積（５μｌ）とほぼ等しく、およそ２０ｍＭ  リン酸Ｎａ/Ｋ、３３ｍｇ/ｍｌ  ＧＨ、および５％から３０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する。
【００８４】
液滴は顕微鏡で頻繁に評価した。いくつかの興味深い対象は、顕微鏡に設置したOlympus デジタルカメラを用いて撮影した。結果を表１に示す。
【００８５】
【表１−１】
2006513986.tif 000003
【００８６】
【表１−２】
2006513986.tif 000004
【００８７】
インキュベーションの４日後アモルファスの沈殿または液層の分離が、ｐＨ５．３および５．６の液滴中に認められた。１１日後、５−２０％  ２−プロパノールを含む液滴中に、アモルファスの沈殿に加えて結晶が観察された。結晶はほとんど非常に小さな針状であった。２０％濃度のｐＨ５．３では棒状も、そしてｐＨ５．６では小さな針状に加えて非常に大きな棒状の結晶が認められた。２０％  ２−プロパノールおよびｐＨ６．０の液滴は、１１日後に数個の結晶しか含有していなかったが、アモルファスの沈殿は認められなかった。
【００８８】
実施例３  ２−プロパノール濃度およびｐＨの結晶スクリーニング
２−プロパノールを、ハンギング・ドロップ蒸気拡散技術を用いて、１４％から２０％（ｖ/ｖ）の範囲の濃度、および５．６から７．０の範囲のｐＨ値でさらにスクリーニングした。
【００８９】
手短には１７ｍｇ/ｍｌ  ＧＨを含有するサンプル  ５μｌ、および０．１Ｍ  リン酸Ｎａ/Ｋ、ｐＨ５．６、６．０、または７．０中に１４、１６、１８または２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する試薬溶液  ５μｌを、実施例２に述べたように混合、処理した。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２−１】
2006513986.tif 000005
【００９１】
【表２−２】
2006513986.tif 000006
【００９２】
インキュベーション１２日後、１８％  ２−プロパノール、ｐＨ５．６の液滴中に短く太い棒状結晶が観察された。インキュベーション１９日後には、１６％  ２−プロパノール、ｐＨ５．６の液滴中に短く太い棒状結晶が認められた。
【００９３】
実施例４  バッファー強度の結晶スクリーニング
リン酸塩を、２−プロパノールとの組み合わせでスクリーニングした。リン酸塩は０．４Ｍから０．７Ｍまでの４つの濃度、および７．０から８．２までの３つのｐＨ値についてスクリーニングした。同じ条件を、１５％および２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールでスクリーニングした。最終的なタンパク質濃度は１７ｍｇ/ｍｌであった。
【００９４】
手短には１７ｍｇ/ｍｌ  ＧＨを含有するサンプル  ５μｌ、および０．４、０．５、０．６または０．７Ｍ  リン酸−Ｎａ−Ｋ、ｐＨ７．０、７．８または８．２中に１５または２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する試薬溶液  ５μｌを、実施例２に述べたように混合、処理した。結果を表３に示す。
【００９５】
【表３−１】
2006513986.tif 000007
【００９６】
【表３−２】
2006513986.tif 000008
【００９７】
【表３−３】
2006513986.tif 000009
【００９８】
２日でアモルファスの沈殿が、０．７Ｍリン酸塩、２０％  ２−プロパノール、ｐＨ７．８およびｐＨ８．２の液滴中に認められた。インキュベーション５日後、針状結晶が１５％  ２−プロパノール、ｐＨ７．８またはｐＨ８．２の液滴中に観察された。０．６Ｍリン酸塩、２０％  ２−プロパノール、ｐＨ７．８およびｐＨ８．２の液滴は、液層の分離および非常に小さな針状結晶を含有していた。インキュベーション２３日後、ほぼすべての液滴が結晶を含有していた。最も高濃度のリン酸塩の液滴は、液層の分離および非常に小さな針状結晶またはアモルファスの沈殿を含有していた。
【００９９】
実施例５  バッファー強度の結晶のスクリーニング
リン酸塩を、２−プロパノールとの組み合わせでスクリーニングした。リン酸塩は０．５Ｍから０．８Ｍまでの４つの濃度、および７．０から８．２までの３つのｐＨ値でスクリーニングした。同じ条件を、１０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含む場合、および２-プロパノールを含まない場合についてスクリーニングした。最終的なタンパク質濃度は１７ｍｇ/ｍｌであった。
【０１００】
手短には１７ｍｇ/ｍｌ  ＧＨを含有するサンプル  ５μｌ、および０．５、０．６、０．７、または０．８Ｍリン酸−Ｎａ−Ｋ、ｐＨ７．０、７．８または８．２中に０または１０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する試薬溶液  ５μｌを、実施例２に述べたように混合、処理した。結果を表４に示す。
【０１０１】
【表４−１】
2006513986.tif 000010
【０１０２】
【表４−２】
2006513986.tif 000011
【０１０３】
２−プロパノールを含む液滴のほとんどに針状結晶が得られた。２−プロパノールを含有しない液滴には、主としてアモルファスの沈殿、よくても非常に小さな針状結晶が形成されただけであった。ｐＨ８．２では２−プロパノールを含む液滴はまた、多くのアモルファス沈殿を含有していた。
【０１０４】
実施例６  ＺｎＣｌ２の結晶スクリーニング
ＺｎＣｌ２を、２−プロパノールとの組み合わせでスクリーニングした。ＺｎＣｌ２は０．００２ｍＭから０．２０ｍＭまでの４つの濃度、および５．６から７．０までの３つのｐＨ値でスクリーニングした。同じ条件を、１０％および１５％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含む場合についてスクリーニングした。２０ｍＭ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを使用してｐＨをコントロールした。
【０１０５】
手短には１７ｍｇ/ｍｌ  ＧＨを含有するサンプル  ５μｌ、および０．１Ｍ  リン酸Ｎａ−Ｋ、ｐＨ５．６、６．０または７．０中に０．００２、０．０１、０．０５または０．２ｍＭＺｎＣｌ２、および１０または１５％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する試薬溶液  ５μｌを、実施例２に述べたように混合、処理した。結果を表５に示す。
【０１０６】
【表５−１】
2006513986.tif 000012
【０１０７】
【表５−２】
2006513986.tif 000013
【０１０８】
【表５−３】
2006513986.tif 000014
【０１０９】
インキュベーション１９日後、ほとんどの液滴はアモルファスの沈殿またはゲルを含有していた。結晶は得られなかった。
このように０．００２ｍＭから０．２０Ｍの範囲の濃度でのＺｎ２＋イオンの存在は、検討した条件での結晶の形成を妨げる。したがって本発明による結晶化溶液におけるこれらのイオンの存在を排除または制限することが望ましい。注目すべきことにＺｎ２＋/ＧＨのモル比は、０．００３−０．２６の範囲であった。
【０１１０】
実施例７  ２価金属イオンの結晶スクリーニング
３つの２価金属イオン、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋を、ｐＨ値５．６および６．０でスクリーニングした。サンプルを、２−プロパノールを含まない場合、または１８％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含む場合についてスクリーニングした。
【０１１１】
手短には２４ｍｇ/ｍｌ  ＧＨを含有するサンプル  ５μｌ、および１０ｍＭ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ５．６もしくは６．０中に、０．２もしくは０．８ｍＭ  Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４、４．０もしくは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、または１．０もしくは３．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１０もしくは１５％（ｖ/ｖ）２−プロパノールを含有する試薬溶液  ５μｌを、実施例２に述べたように混合、処理した。結果を表６に示す。
【０１１２】
【表６−１】
2006513986.tif 000015
【０１１３】
【表６−２】
2006513986.tif 000016
【０１１４】
結晶化剤として単独で使用した２価金属イオンは結晶を生成せず、液相の分離、ゲルまたはアモルファスの沈殿しか観察されなかった。２−プロパノールを共に使用すると棒状または針状結晶が得られたが、液滴のほとんどにはやはりアモルファスの沈殿が存在していた。インキュベーション４１日までの後に結果に変化は認められなかった。
【０１１５】
このように２価無機カチオンＦｅ２＋（０．２−０．８ｍＭ）、Ｍｇ２＋（４−１０ｍＭ）、およびＣａ２＋（１−３ｍＭ）の存在は、もし存在する場合には形成される結晶の質を低下させる。したがって本発明による結晶化溶液中のこれらのイオンの存在を排除または制限することが望ましい。注目すべきことに該モル比は以下のようであった：Ｆｅ２＋/ＧＨ：０．１８−０．７３、Ｍｇ２＋/ＧＨ：３．７−９．２、Ｃａ２＋/ＧＨ：０．９２−２．８。
【０１１６】
実施例８  ２−プロパノールを含む結晶のミニバッチの調製
２−プロパノールのシステムを、数ミリリットルのバッチにて検討した。２つの２−プロパノール濃度  １６および１８％（ｖ/ｖ）、ならびに２つのｐＨ値  ｐＨ５．６およびｐＨ５．８を使用した。タンパク質溶液およびストック結晶化媒質を、最終濃度を達成するように等しい比率で混合した。
【０１１７】
全体として、小さなスケールのバッチの結晶化をシリンジ内で行った。結晶化は、マグネティクスターラーを入れた小さなビーカー内で試薬を混合することにより行った。次にこの混合液をシリンジ内に吸引し、混合液から空気の泡を除き、シリンジをキャップで密封した。シリンジを垂直方向の回転装置（１６ｒｐｍ）にセットした。この緩やかな方法の概念は、空気/液体の界面を最小とし、完全な混合を確実なものとし、沈降物の形成を妨げることである。
【０１１８】
１６％  ２−プロパノール中での結晶化用に、ストックの結晶化媒質は以下の試薬：３２％（ｖ/ｖ）２−プロパノールおよび０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６または５．８、を含有するものとした。１８％  ２−プロパノール中での結晶化用には、ストックの結晶化媒質は以下の試薬：３６％（ｖ/ｖ）２−プロパノールおよび０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６または５．８、を含有するものとした。
【０１１９】
水中（２４．１ｍｇ/ｍｌ）で透析した１．５ｍｌのｈＧＨをピペットでマグネティクスターラーを入れた小さなビーカー中にとった。１．５ｍｌの結晶化ストック試薬を、継続的に撹拌しながら滴下させて加えた。媒質を加えた後、溶液をシリンジ内に吸引し、室温にて垂直方向の回転装置にセットした。
【０１２０】
溶解し得るタンパク質の含有量を翌日決定した。サンプルを観察し、そして形成されたあらゆる結晶を、顕微鏡下でより詳細に検討した。結果を表７に示す。
【０１２１】
【表７】
2006513986.tif 000017
【０１２２】
１６％（ｖ/ｖ）２−プロパノールおよびｐＨ５．６のサンプルは、数時間以内に結晶化し始めた。結晶は両端が鋭くとがった太い棒状であった。すべてのサンプルは翌日には結晶を含有していた。１６％（ｖ/ｖ）２−プロパノールのサンプル中の結晶のほとんどは、太い棒状であった。１６％（ｖ/ｖ）２−プロパノールおよびｐＨ５．８のサンプルもまた、細い棒状結晶およびいくつかのゲルの塊を含有していた。１８％  ２−プロパノールのサンプル中の結晶は主として、細い棒状または針状であった。いくつかの両端のとがった太い棒状結晶もまた観察された。結晶の収率は７１％および９４％の間で変化した。最大の収率は１８％  ２-プロパノール、ｐＨ５．６のサンプルで得られた。最も良質の結晶は、１６％  ２-プロパノール、ｐＨ５．６のサンプルで達成された。
【０１２３】
２−プロパノールは両端の鋭くとがった棒状結晶を生成したが、結晶の太さは結晶化の条件にかなり依存するようである。この結果は、バッチの結晶化を２−プロパノール中で良い収率で行うことができることを示す。
【０１２４】
実施例９  ２−プロパノール中でのストック結晶バッチの調製
ｈＧＨ溶液（２３．７ｍｇ/ｍｌ）１００ｍｌを２５０ｍｌ丸底フラスコに注いだ。チューブマグネティックミキサー（PAM Solutions Ltd Oy）を作動させた。１００ｍｌのストック結晶化媒質（３６％  ２-プロパノール、０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６）を〜２０ｍｌずつ加えた。試薬  ４０ｍｌを加えた後、溶液は沈殿し始めた。残りのストック結晶化媒質を加えた後、沈殿物を顕微鏡で観察した。沈殿物は非常に小さな結晶またはゲルの塊からなっていた。
【０１２５】
翌日、バッチは棒状結晶および結晶凝集塊を含有していた。ゲルの塊は数個のみが観察された。最終的な溶解し得るタンパク質濃度は１．１ｍｇ/ｍｌで、結晶の収率は９１％であった。結晶を沈降させ、透明な母液〜１５０ｍｌを除去することにより、バッチを濃縮した。濃縮された結晶スラリーの総タンパク質濃度は４０．３ｍｇ/ｍｌであった。
【０１２６】
実施例１０  ２−プロパノール中のストック結晶バッチの調製
ｈＧＨ出発材料が２６．３ｍｇ/ｍｌの濃度であり、そして、蠕動ポンプを用いて１．５時間でストック結晶化媒質の添加を行ったことを除いて、ストック結晶バッチを実施例９に述べた方法で調製した。ストック結晶化媒質のおよそ３分の１を加えた時点で、バッチは沈殿し始めた。数時間後バッチを顕微鏡で観察し、ゲルの塊を含有していることを発見した。
【０１２７】
翌日、バッチ中のゲルの塊の大半が細い棒状結晶に変化していた。対物グラス上のゲルの塊は、夜の間に非常に大きな棒状に変化していた。最終的に溶解し得るタンパク質濃度は０．７４ｍｇ/ｍｌで、結晶の収率は９４％であった。結晶を沈降させ、透明母液  〜１００ｍｌを除去することにより、バッチを濃縮した。濃縮された結晶スラリーの総タンパク質濃度は２３．３ｍｇ/ｍｌであった。
【０１２８】
実施例１１  ２−プロパノール中のストック結晶バッチの調製
結晶の収率を上げるため２-プロパノールの濃度を１８％から２０％に上げたことを除いて、実施例１０に述べた方法でストック結晶バッチを調製した。
【０１２９】
ｈＧＨの生の材料（３１．２ｍｇ/ｍｌ）８０ｍｌを２５０ｍｌ丸底反応フラスコに注いだ。８０ｍｌのストック結晶化媒質（４０％  ２-プロパノール、０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６）を数時間かけて蠕動ポンプで加えた。試薬の容量の３分の１を加えた後、溶液は沈殿し始めた。試薬を加えた後数時間で、結晶が顕微鏡で観察され、細い凝集塊の結晶およびいくつかのより大きな棒状結晶を含有することが発見された。翌日、結晶の量が増加していた。最終的な溶解し得るタンパク質濃度は１．３ｍｇ/ｍｌ、結晶の収率は９２％であった。２日後、結晶のスラリーを沈降、および上清の除去により濃縮した。濃縮された結晶スラリーの総タンパク質濃度は５５．６ｍｇ/ｍｌであった。
【０１３０】
実施例１２  低温での２−プロパノール中のバッチの結晶化
２−プロパノール中のバッチの結晶化を、＋２℃で調製した。ｈＧＨの材料  ３０ｍｌを反応フラスコに注ぎ、等量のストック結晶化媒質（３６％  ２-プロパノール、０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６）をゆっくり注ぎながら加えた。添加中にアモルファスまたはゲル様の沈殿が形成された。
【０１３１】
バッチ内の沈殿は次の夜の間に結晶に変化することはなかった。バッチは、結晶の代わりに大きなゲルの粒子を含有していた。溶解し得るタンパク質濃度は０．５４ｍｇ/ｍｌであった。バッチのｐＨは６．２であると測定された。
【０１３２】
実施例１３  低温での２−プロパノール中のバッチの結晶化
２−プロパノール中のバッチの結晶化を、＋８℃で調製した。ｈＧＨの材料  ２０ｍｌを反応フラスコに注ぎ、等量のストック結晶化媒質（３６％  ２-プロパノール、０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６）をゆっくり注ぎながら加えた。添加中にアモルファスまたはゲル様の沈殿物が形成された。
【０１３３】
１日目の夜の後、沈殿はまだゲルのままであった。溶解し得るタンパク質濃度は１．８ｍｇ/ｍｌであった。バッチに、実施例１１のバッチからの結晶スラリー  ２００μｌの種を加えた。２日目の夜の間に、沈殿は棒状結晶に変化した。バッチのｐＨは６．２であると測定された。溶解し得るタンパク質濃度は１．７ｍｇ/ｍｌであった。
【０１３４】
実施例１４  低温での２−プロパノール中のバッチの結晶化
２−プロパノール中のバッチの結晶化を、＋１５℃で調製した。ｈＧＨの材料  ２０ｍｌを反応フラスコに注ぎ、等量のストック結晶化媒質（３６％  ２-プロパノール、０．２Ｍ  リン酸塩、ｐＨ５．６）をゆっくり注ぎながら加えた。添加中にアモルファスまたはゲル様の沈殿物が形成された。
【０１３５】
１日目の夜の後、沈殿はまだゲルのままであった。溶解し得るタンパク質濃度は１．５ｍｇ/ｍｌであった。バッチに、実施例１１のバッチからの結晶スラリー  ２００μｌの種を加えた。２日目の夜の間に、沈殿は細い針状結晶に変化した。バッチのｐＨは６．３であると測定された。溶解し得るタンパク質濃度は０．５ｍｇ/ｍｌであった。
【０１３６】
実施例１５  低下した温度での結晶のインキュベーション
実施例１４において、＋１５℃での２−プロパノール中で調製されたバッチは結晶を生成した。これらの結晶がより低い温度でその形状を変えるかどうかを調べるため、徐々に温度を下げ、顕微鏡で結晶を観察した。結晶は各温度について少なくとも一晩、インキュベーションした。
【０１３７】
温度を低下している間、結晶の形状はそれほど変化しなかった。溶解し得るタンパク質濃度は、検討したすべての温度で非常に低いまま維持された。結果を表８に示す。
【０１３８】
【表８】
2006513986.tif 000018
【０１３９】
２−イソプロパノール中での結晶化は、＋８℃およびより高い温度でも成功した。冷蔵庫の温度で結晶を保存することができるはずである。相図（実施例２３、図５−７）により、より低い温度でさえも結晶化を行うことができるはずである。この場合は２−プロパノール濃度、ｐＨ等のようなその他の条件の簡単な調整が必要となると思われる。
【０１４０】
実施例１６  溶解度の実験のための結晶懸濁液の調製：洗浄による方法
ストック結晶スラリーのアリコートを各実験条件用に洗浄した。実験は１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で行った。結晶スラリー  ８００μｌおよび試薬溶液  ５００μｌをチューブ内で混合した。結晶を遠心し（８８３２  ｇ、１分）、上清を捨てた。試薬溶液  ７５０μｌを加え、結晶をプラスティック棒で懸濁させた。遠心および上清の廃棄を繰り返した。最後に１５００μｌの試薬溶液を加え、結晶を懸濁させた。チューブをサーモスタット付きのチャンバー内に＋２０℃で維持した。サンプルは少なくとも３日間、平衡に達するまでインキュベーションした。
【０１４１】
実施例１７  溶解度の実験のための結晶懸濁液の調製：透析による方法
結晶を実験条件にて透析した。１０ｍｌの試薬溶液をピペットでガラス製のバイアルにとった。１ｍｌの結晶懸濁液をピペットで透析チューブ（ＭＷＣＯ  ６０００−８０００、０．３２ｍｌ/ｃｍ）内にとった。透析チューブの一本の端は結んで閉じ、他方の端はバイアルと、バイアルのふたをするために使用するゴム栓の間に透析チューブを挟むことにより閉じた。バイアルはサーモスタット付きのチャンバー内で＋２０℃にてオービタルシェーカー上で緩やかに撹拌した。透析溶液は４時間後に新しい試薬溶液に取り替えた。サンプルは溶解度が平衡に達するまで、少なくとも３日間インキュベーションした。
【０１４２】
温度実験用に、所望の化学的条件まで透析した結晶スラリーを、小さなガラス製のバイアルに分取しサーモスタット付きのチャンバー内で様々な温度で少なくとも２日間、インキュベーションした。
【０１４３】
実施例１８  溶解度の実験のための結晶懸濁液の調製：希釈による方法
濃縮されたストック結晶スラリーを適切な試薬で希釈し、実験の設定点の試薬条件を達成するようにした。サンプルは平衡に達するよう、少なくとも３日間インキュベーションした。
【０１４４】
実施例１９  ｈＧＨ結晶の溶解度における２−プロパノールの濃度の効果
実施例１６の洗浄による方法、または実施例１７の透析による方法のいずれかを用いて、一連の溶解度の実験を０．１Ｍリン酸塩、５−３０％（ｖ/ｖ）２−プロパノール、ｐＨ５．３−８．０を含有する試薬溶液中で、＋２０℃にて行った。ＧＨ結晶は、様々な試薬溶液中で溶解度が平衡に達するまで行い、得られた溶解し得るｈＧＨの濃度を決定した。すべてのタンパク質のアッセイは、波長２８０ｎｍで吸光度を測定することにより行った。吸光度の値は因子０，７３で割ることにより、乾燥物質の値に変換した。
【０１４５】
結果を表９に示し、図１および３にグラフで表す。
【０１４６】
【表９−１】
2006513986.tif 000019
【０１４７】
【表９−２】
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【０１４８】
２−プロパノール濃度およびｐＨを組み合わせた効果は複雑であった。溶解度の最小値はすべてのｐＨ値でおよそ２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールで認められた。２−プロパノール濃度２０％まで、２−プロパノール濃度の増加によりｈＧＨ結晶の溶解度は減少した。２０％より高い２−プロパノール濃度で、溶解度は再び増加した。３０％の２−プロパノール濃度では、溶解し得るタンパク質濃度は２５％の２−プロパノールの値より低かったが、結晶はゲル細粒に変換しており、したがってこの溶解度は結晶の溶解度とは比較できない。これらの実験の設定点は図から除外した。
【０１４９】
典型的には結晶化剤の濃度が増加すると、タンパク質の溶解度は減少する。しかし２−プロパノールにおいて、溶解度の最小値はおよそ２０％で観察することができた。
実施例２０  ２−プロパノール中のｈＧＨの溶解度におけるリン酸塩濃度の効果
実施例１７の透析による方法を用いて、一連の溶解度の実験を０．４−０．７Ｍリン酸塩、１０％または１５％（ｖ/ｖ）２−プロパノール、ｐＨ５．３または７．８を含有する試薬溶液において、＋２０℃で行った。ＧＨ結晶は、様々な試薬溶液中で溶解度が平衡に達するまで行い、得られた溶解し得るｈＧＨ濃度を決定した。結果を表１０に示し、図２にグラフで表す。
【０１５０】
【表１０】
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【０１５１】
ｈＧＨ結晶の溶解度は、２−プロパノール中のリン酸塩の濃度の増加に伴って減少した。ｐＨ５．３では０．４Ｍおよび０．７Ｍリン酸塩中の溶解度間の変化は小さかった。１０％  ２−プロパノールのｐＨ７．８で溶解度は顕著に減少した。実験後の観察の際、ｐＨ５．３の結晶は大きく十分な結晶形が成長していた。ｐＨ７．８の結晶は変化していた；これらはずっと小さく、結晶の一部とくっついて塊となるゲルが一部認められた。ゲルの形成が溶解度曲線の形に何らかの影響を与えていたと思われる。
【０１５２】
実施例２１  ２−プロパノール中のｈＧＨ結晶の溶解度におけるｐＨの効果
実施例１９で得られたデータはまた、様々な２−プロパノール濃度（５−２５％）でのｈＧＨ結晶の溶解度におけるｐＨ（５．３−８．０）の効果としてグラフで表してもよい。この結果を図３（表９および図１参照）に示す。
【０１５３】
ｈＧＨ結晶の溶解度におけるｐＨの効果は通常とはむしろ異なっていた。ｐＨ６．５で最大値に達するまで、ｐＨ値の増加に伴って溶解度は急激に増加した。最大の溶解度の範囲は、すべてのプロパノール濃度においてほぼｐＨ６．５であった。ｐＨ値７．０および８．０では、溶解度は再びずっと低くなったが、溶解度はまだ十分に高く、直ちに問題にするほどではなかった。結晶は高いｐＨ値でもその形を変えることはなかった。
【０１５４】
ｐＨの全体としての効果は、ｐＨが高くなるとすべての２−プロパノール濃度で溶解度もまた増加する、ということであった。低いｐＨ値では、低い溶解度の範囲がより広くなり、１０％の２−プロパノール濃度でさえも、溶解度は低かった。
【０１５５】
実施例２２  ２−プロパノールと組み合わせてのリン酸塩中のｈＧＨ結晶の溶解度におけるｐＨの効果
実施例１７の透析による方法を用いて、一連の溶解度の実験を０．４または０．７Ｍリン酸塩、１５％（ｖ/ｖ）２−プロパノール、ｐＨ５．３−７．０を含有する試薬溶液中で、＋２０℃にて行った。ＧＨ結晶は、様々な試薬溶液中で溶解度が平衡に達するまで行い、得られた溶解し得るｈＧＨ濃度を決定した。結果を表１１に示し、図４にグラフで表す。
【０１５６】
【表１１】
2006513986.tif 000022
【０１５７】
１５％  ２−プロパノール中の０．４Ｍおよび０．７Ｍリン酸塩中のｈＧＨの結晶の溶解度は、ｐＨ６．２で最大値に達するまで、ｐＨの増加に伴って増加した（図４）。最大値の後、溶解度は再び減少した。０．１Ｍリン酸塩では、最大値は多少より高いｐＨ値であるｐＨ６．５で得られた。この種のタンパク質溶解度曲線は一般的ではない。
【０１５８】
実施例２３  ２−プロパノール中のｈＧＨ結晶の溶解度における温度の効果
実施例１７の透析による方法を用いて、一連の溶解度の実験を０．１Ｍリン酸塩、１０％または２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノール、ｐＨ５．３または５．７を含有する試薬溶液において、２−３０℃の範囲の様々な温度で行った。ＧＨ結晶は、様々な試薬溶液中で溶解度が平衡に達するまで行い、得られた溶解し得るｈＧＨ濃度を決定した。結果を表１２に示し、図５にグラフで表す。
【０１５９】
【表１２】
2006513986.tif 000023
【０１６０】
２−プロパノール中のｈＧＨ結晶の溶解度は、温度の上昇に伴って増加した。ｐＨ５．７では、温度の効果はｐＨ５．３の場合より強く表れた。
実施例２４  ２−プロパノールと組み合わせてのリン酸塩中のｈＧＨ結晶の溶解度における温度の効果
実施例１７の透析による方法を用いて、一連の溶解度の実験を０．４または０．８Ｍリン酸塩、１０％または２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノール、ｐＨ５．７を含有する試薬溶液において、２−３０℃の範囲の様々な温度で行った。ＧＨ結晶は、様々な試薬溶液中で溶解度が平衡に達するまで行い、得られた溶解し得るｈＧＨ濃度を決定した。結果を表１３に示し、図６（１０％  ２−プロパノール）および図７（２０％  ２−プロパノール）にグラフで表す。
【０１６１】
【表１３−１】
2006513986.tif 000024
【０１６２】
【表１３−２】
2006513986.tif 000025
【０１６３】
２−プロパノールを組み合わせてのリン酸塩中のｈＧＨ結晶の溶解度は、温度の上昇に伴って増加した（図６および７）。様々なリン酸塩の濃度間の溶解度の差異は、２０％  ２−プロパノールにおけるよりも１０％  ２−プロパノールにおける方が、より大きかった。０．４および０．８Ｍリン酸塩濃度の２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノール中では、最も高い温度で結晶はゲルに変換した。ゲルの溶解度は結晶の溶解度とは比較できないため、これらの結果は図から除外した。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】図１は、ｈＧＨ結晶の溶解度についての２−プロパノール濃度の効果を示す図である。
【図２】図２は、２−プロパノール中のｈＧＨ結晶の溶解度についてのリン酸塩濃度の効果を示す図である。
【図３】図３は、２−プロパノール中のｈＧＨ結晶の溶解度についてのｐＨの効果を示す図である。
【図４】図４は、２−プロパノールと組み合わせてのリン酸塩中のｈＧＨ結晶の溶解度についてのｐＨの効果を示す図である。
【図５】図５は、２−プロパノール中のｈＧＨ結晶の溶解度についての温度の効果を示す図である。
【図６】図６は、１０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールと組み合わせてのリン酸塩中のｈＧＨ結晶の溶解度についての温度の効果を示す図である。
【図７】図７は、２０％（ｖ/ｖ）２−プロパノールと組み合わせてのリン酸塩中のｈＧＨ結晶の溶解度についての温度の効果を示す図である。
【図１】
2006513986.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2006513986.tif 000034
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