(57)【要約】本発明は、ＥＧＦＲ陽性の癌に関連する予後判定マーカーに関する。特に、本発明は、ＥＧＦＲを発現する癌のパラフィン包埋された固定組織サンプルにおける、遺伝子発現の分子的特徴付けに基づく予後判定法に関する。この方法は、患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があるかどうかを、医師が予測することを可能にする。本発明の１つの方法は、予後判定法であり、（ａ）患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルを、ＣＤ４４ｖ３；ＣＤ４４ｖ６；ＤＲ５；ＧＲＯ１；ＫＲＴ１７；およびＬＡＭＣ２からなる群から選択される少なくとも一遺伝子のＲＮＡ転写物またはそれらの産物の発現レベルの定量分析に供する工程、ならびに（ｂ）該遺伝子もしくはそれらの産物の正規化された発現レベルが規定の発現閾値より高く上昇した場合、該患者を、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があると同定する工程を包含する。
2006506093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予後判定法であって、以下：
（ａ）患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルを、ＣＤ４４ｖ３；ＣＤ４４ｖ６；ＤＲ５；ＧＲＯ１；ＫＲＴ１７；およびＬＡＭＣ２からなる群から選択される少なくとも一遺伝子のＲＮＡ転写物またはそれらの産物の発現レベルの定量分析に供する工程、ならびに
（ｂ）該遺伝子もしくはそれらの産物の正規化された発現レベルが規定の発現閾値より高く上昇した場合、該患者を、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があると同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＬＡＭＣ２のＲＮＡ転写物の発現レベルが規定の発現閾値より高く上昇した場合、前記患者が、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があると同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが、二以上のハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ転写物またはその産物の平均レベルに対して正規化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｃｙｐ１、アルブミン、アクチン、チューブリン、シクロフィリンヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ）、Ｌ３２、２８Ｓ、および１８Ｓからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、検出限界を超えて存在する全ての遺伝子の全体的遺伝子発現分析に供せられる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルが、全てのアッセイされる遺伝子もしくはそれらの一部のＲＮＡ転写物またはその産物の平均シグナルに対して正規化される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ転写物のレベルが、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定され、かつ前記シグナルがＣｔ値である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アッセイされる遺伝子が、少なくとも５０種の癌関連遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アッセイされる遺伝子が、少なくとも１００種の癌関連遺伝子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）サンプル、または新鮮組織サンプルもしくは凍結組織サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが、細針生検、コア生検、または他の型の生検由来の組織サンプルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記定量分析が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記定量分析が、前記遺伝子の産物を定量することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記産物が、免疫組織化学によるか、またはプロテオミクス技術により定量される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＥＧＦＲ発現性の癌が、頭部癌および頸部癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、ならびに非小細胞肺癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が、頭部癌および頸部癌、または結腸癌からなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があるかどうかの記述を含む報告を準備する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があるかどうかの記述を含む報告を準備する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＧＦＲ発現性の頭部癌もしくは頸部癌と診断された患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する尤度を予測するための方法であって、該方法は、該患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルにおける、一種以上の予後判定用のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の正規化されたレベルを決定する工程を包含し、ここで、該予後判定用転写物は、
【化１】
2006506093.tif 000034
からなる群から選択される一種以上の遺伝子の転写物であり、ここで、
【化２】
2006506093.tif 000035
もしくはその対応する遺伝子産物の一種以上の、規定された閾値発現レベルより上の発現は、該患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があることを示し、そして、
ＣＤ４４；ＣＤ８２；ＣＧＡ；ＣＴＳＬ；ＥＧＦＲｄ２７；ＩＧＦＢＰ３；ｐ２７；Ｐ５３；ＲＢ１；ＴＩＭＰ２；およびＹＢ−１、もしくはその対応する遺伝子産物の一種より上の、規定された閾値発現レベル以上の発現は、該患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があることを示す、方法。
【請求項２１】
前記予後判定用転写物もしくはそれらの発現産物のうち少なくとも二種の、正規化されたレベルを決定する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記予後判定用転写物もしくはそれらの発現産物のうち少なくとも五種の、正規化されたレベルを決定する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記予後判定用転写物もしくはそれらの発現産物の全ての、正規化されたレベルを決定する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルが、組織サンプルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織が、固定されてパラフィン包埋されているか、または新鮮であるか、または凍結されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織が、細針生検、コア生検、または他の型の生検に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があるかどうかの記述を含む報告を準備する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があるかどうかの記述を含む報告を準備する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
患者を有効量のＥＧＦＲインヒビターによって処置する工程を包含する方法であって、該患者は、ＥＧＦＲ発現性の頭部癌もしくは頸部癌と診断され、かつ該癌において、ＣＤ４４；ＣＤ８２；ＣＧＡ；ＣＴＳＬ；ＥＧＦＲｄ２７；ＩＧＦＢＰ３；ｐ２７；Ｐ５３；ＲＢ１；ＴＩＭＰ２；およびＹＢ−１遺伝子の、一種以上のＲＮＡ転写物もしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現の上昇を有すると決定されるか、または該癌において、
【化３】
2006506093.tif 000036
の、一種以上のＲＮＡ転写物もしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現の低下を有すると決定される患者であり、ここで、各遺伝子について、正規化された発現の上昇または低下は、規定の発現閾値によって規定される、方法。
【請求項３０】
前記患者が、前記ＲＮＡ転写物もしくは前記対応する遺伝子産物の全ての正規化された発現の上昇もしくは低下を有すると決定されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＥＧＦＲ発現性の結腸癌と診断された患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する尤度を予測する方法であって、該方法は、該患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルにおける、一種以上の予後判定用のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の正規化されたレベルを決定する工程を包含し、ここで、該予後判定用転写物は、
【化４】
2006506093.tif 000037
からなる群から選択される一種以上の遺伝子の転写物であり、ここで、
【化５】
2006506093.tif 000038
もしくはその対応する遺伝子産物の一種以上の正規化されたレベルは、規定の発現閾値レより上である場合、該患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があることを示し、そして、
【化６】
2006506093.tif 000039
もしくはその対応する遺伝子産物の１種以上の正規化されたレベルは、規定の発現閾値より上である場合、該患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があることを示す、方法。
【請求項３２】
前記予後判定用転写物もしくはそれらの発現産物のうち少なくとも二種の、正規化されたレベルを決定する工程を包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記予後判定用転写物もしくはそれらの発現産物のうち少なくとも五種の、正規化されたレベルを決定する工程を包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記予後判定用転写物もしくはそれらの発現産物の全ての、正規化されたレベルを決定する工程を包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが、組織サンプルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記組織が、固定されてパラフィン包埋されているか、または新鮮であるか、または凍結されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組織が、細針生検、コア生検、または他の型の生検に由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があるかどうかの記述を含む報告を準備する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があるかどうかの記述を含む報告を準備する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
患者を有効量のＥＧＦＲインヒビターによって処置する工程を包含する方法であって、該患者は、ＥＧＦＲ発現性の結腸癌と診断され、かつ該癌において、
【化７】
2006506093.tif 000040
の、一種以上のＲＮＡ転写物もしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現の上昇を有すると決定されるか、または、
【化８】
2006506093.tif 000041
の、一種以上のＲＮＡ転写物もしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現の減少を有すると決定される患者であり、ここで、各遺伝子において、正規化された発現の上昇または低下は、規定の発現閾値に対して決定される、方法。
【請求項４１】
【化９】
2006506093.tif 000042
の遺伝子に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドが、固体表面上に固定されている、アレイ。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡである、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４３】
前記ｃＤＮＡが、約５００〜約５０００塩基である、請求項４２に記載のアレイ。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドである、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４５】
前記オリゴヌクレオチドが、約２０〜約８０塩基長である、請求項４４に記載のアレイ。
【請求項４６】
約３３０，０００オリゴヌクレオチドを含む、請求項４５に記載のアレイ。
【請求項４７】
前記固体表面が、ガラスである、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４８】
以下の遺伝子：ＣＤ４４ｖ３；ＣＤ４４ｖ６；ＤＲ５；ＧＲＯ１；ＫＲＴ１７；ＬＡＭＣ２に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項４９】
以下の遺伝子：
【化１０】
2006506093.tif 000043
に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項５０】
以下の遺伝子：
【化１１】
2006506093.tif 000044
に対してハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、アレイ。
【請求項５１】
請求項１、請求項２０、および請求項３１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、以下：
（ａ）前記固定されてパラフィン包埋された組織標本を、約５６℃〜約７０℃の温度で、溶解緩衝液中において、プロテアーゼ存在下で、予め脱蝋することなくインキュベートして、溶解溶液を作製する工程；
（ｂ）前記蝋が固化する温度まで、該溶解溶液を冷却する工程；および、
（ｃ）該溶解溶液から核酸を単離する工程、
を包含する手順によって、前記組織からＲＮＡが単離される、方法。
【請求項５２】
請求項１、請求項２０および請求項３０のいずれか１項に記載の方法を実施するに適切なキットであって、（１）抽出緩衝液／試薬、およびプロトコール；（２）逆転写緩衝液／試薬、およびプロトコール；ならびに（３）ｑＰＣＲ緩衝液／試薬、およびプロトコールの一つ以上を備える、キット。
【請求項５３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、表５Ａおよび５Ｂに列挙される遺伝子の増幅のための方法であって、表５Ａおよび５Ｂに列挙されるアンプリコンならびに表６Ａ−６Ｆに列挙される対応するプライマー−プローブセットを用いることによって、該ＰＣＲを実施する工程を包含する、方法。
【請求項５４】
表６Ａ−６Ｆに列挙される、ＰＣＲプライマー−プローブセット。
【請求項５５】
表５Ａおよび５Ｂに列挙されるＰＣＲアンプリコン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ＥＧＦＲ陽性の癌から得られた組織サンプルの遺伝子発現プロファイリングに関する。より具体的には、本発明は、ＥＧＦＲ発現性の癌のパラフィン包埋された固定組織サンプルにおける、遺伝子発現の分子的特徴付けに基づく診断法、予後判定法および予測法を提供する。この方法は、患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があるかどうかを、医師が予測することを可能にする。加えて、本発明は、このような所見に基づく処置方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
癌専門医は、多くの、彼らに利用可能な処置の選択肢（「医療の標準」として特徴づけられる、化学療法薬の異なる組合せを含む）、および多くの、特定の癌に関して効能の表示（ｌａｂｅｌ  ｃｌａｉｍ）がないが、その癌における効能の証拠がある癌薬物を有する。よい処置結果の最大尤度は、患者が、最適な利用可能な癌の処置に割り当てられること、およびこの割り当てが、診断に続いて直ちに行われることを必要とする。
【０００３】
現在、臨床的手法に使用される診断試験は、単一検体であり、したがって何十もの異なるマーカー間の公知の関係の潜在値を捕捉しない。さらに、診断試験は、しばしば免疫組織化学に頼り、定量的でない。この方法は、しばしば、異なる実験室において、部分的に異なる結果をもたらす。なぜなら、試薬が規格化されておらず、かつ部分的には、解釈が主観的であり、容易に定量化し得ないからである。ＲＮＡベースの試験は、時間に伴うＲＮＡの分解のため、そして分析のため患者から新鮮な組織サンプルを得るのが困難という事実のため、それほど頻繁に使用されてこなかった。固定されパラフィン包埋された組織は、より容易に入手可能であり、そして固定された組織においてＲＮＡを検出するための方法が確立されている。しかし、これらの方法は、代表的に、少量の材料由来の多数の遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の研究を可能にしない。したがって伝統的に、固定組織は、タンパク質の免疫組織化学的検出以外には、稀にしか使用されていなかった。
【０００４】
近年、いくつかのグループが、マイクロアレイ遺伝子発現分析による種々の癌の型の分類に関連する研究を公開した（例えば、Ｇｏｌｕｂら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−５３７（１９９９）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１３７９０−１３７９５（２００１）；Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ３１６−Ｓ３２２（２００１）；Ｒａｎｉａｓｗａｉｎｙら、Ｐｒｏｅ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１５１４９−１５１５４（２００１）を参照のこと）。遺伝子の発現パターンに基づくヒト乳癌の特定の分類もまた、報告されている（Ｍａｒｔｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２２３２−２２３８（２０００）；Ｗｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１４６２−１１４６７（２００１）；Ｓｏｒｌｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１０８６９−１０８７４（２００１）；Ｙａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８３７５−８３８０（２００１））。しかし、これらの研究は、種々の型の癌（乳癌を含む）の既に確立された分類を改善もしく精緻化することに主に焦点を合わせており、一般的に、癌治療の臨床的結果を改善するための処置計画に対する知見に関連しない。
【０００５】
現代の分子生物学および生化学は、その活性が、腫瘍細胞の挙動、分化の状態、ならびに特定の治療薬に対する感受性および抵抗性に影響する、１００を超える遺伝子を明らかにしたが、いくつかの例外を除いて、これらの遺伝子の状態は、薬物処置についての臨床的決定を慣習的に行うという目的のために利用されてこなかった。一つの注目すべき例外は、乳癌におけるエストロゲンレセプター（ＥＲ）タンパク質発現を使用して、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）による処置へと患者を選択することである。別の例外的な例は、乳癌におけるＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）タンパク質発現を使用して、Ｈｅｒ２アンタゴニスト薬Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）による患者を選択することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年の進歩にもかかわらず、癌処置についての挑戦は、依然として、病理学的に別個の腫瘍型に対する特異的処置レジメンを標的とし、かつ結果を最適化するために腫瘍処置を個別化することである。ゆえに、種々の処置の選択肢に対する患者の反応についての予測的情報を同時に提供する試験に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応したかまたは反応しなかった（抵抗性を示した）ヒト患者の、ＥＧＦＲ発現性の頭部癌および頸部癌または結腸癌から得られた組織サンプルにおける、遺伝子発現の第ＩＩ相臨床研究の知見に基づく。
【０００８】
このような知見に基づいて、一つの局面において、本発明は、ＥＧＦＲ発現性の癌と診断された患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する尤度を、予測するための方法に関し、この患者から得られたＥＧＦＲ発現性の癌細胞を含むサンプルにおける、一種以上の予後判定用ＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の発現レベルを決定する工程を、包含する。ここで、この予後判定用転写物は、
【０００９】
【化１２】
2006506093.tif 000003
からなる群から選択される一種以上の遺伝子の転写物であり、ここで、（ａ）この患者は、
【００１０】
【化１３】
2006506093.tif 000004
もしくはその産物のいずれかの正規化されたレベルが、規定の閾値より上に上昇する場合、ＥＧＦＲインヒビターによる処置から利益を受ける可能性があり、そして（ｂ）この患者は、
【００１１】
【化１４】
2006506093.tif 000005
もしくはその産物のいずれかの正規化されたレベルが、規定の閾値より上に上昇する場合、ＥＧＦＲインヒビターによる処置から利益を受ける可能性がある。
【００１２】
別の局面において、本発明は、予後判定法に関し、この方法は、以下：
（ａ）患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルを、ＣＤ４４ｖ３；ＣＤ４４ｖ６；ＤＲ５；ＧＲＯ１；ＫＲＴ１７；およびＬＡＭＣ２遺伝子からなる群から選択される、少なくとも一種の遺伝子のＲＮＡ転写物かまたはそれらの産物の発現レベルの定量分析に供する工程、ならびに、
（ｂ）このような遺伝子もしくはそれらの産物の発現レベルが、規定の発現閾値より上に上昇した場合、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があるとして、該患者を同定する工程、
を包含する。特定の実施形態において、遺伝子はＬＡＭＣ２である。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、ＥＧＲ発現性の頭部癌および頸部癌と診断された患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する尤度を、予測するための方法に関し、この方法は、このような患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルにおける、一種以上のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の発現レベルを決定する工程を包含する。ここで、この予後判定用転写物は、
【００１４】
【化１５】
2006506093.tif 000006
からなる群から選択される、一種以上の遺伝子の転写物であり、ここで、（ａ）
【００１５】
【化１６】
2006506093.tif 000007
もしくはその対応する遺伝子産物の一種以上の、規定された閾値発現レベル以上の正規化された発現は、この患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があることを表し、そして（ｂ）
【００１６】
【化１７】
2006506093.tif 000008
もしくはその対応する遺伝子産物の一種以上の、規定された閾値発現レベル以上の発現は、この患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があることを表す。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、ＥＧＦＲ発現性結腸癌と診断された患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する尤度を予測する方法に関し、この方法は、この患者から得られたＥＧＦＲ発現性癌細胞を含むサンプルにおける、一種以上の予後判定用のＲＮＡ転写物もしくはそれらの産物の発現レベルを決定する工程を包含し、ここで、この予後判定用転写物は、
【００１８】
【化１８】
2006506093.tif 000009
からなる群から選択される一種以上の遺伝子の転写物であり、ここで、
【００１９】
【化１９】
2006506093.tif 000010
もしくはその対応する遺伝子産物の一種以上の発現の、規定された閾値発現より上への上昇は、この患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に抵抗性を示す可能性があることを表し、そして、
【００２０】
【化２０】
2006506093.tif 000011
もしくはその対応する遺伝子産物の一種以上の発現の、規定された閾値発現より上への上昇は、この患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置によく反応する可能性があることを表す。
【００２１】
別の局面において、本発明は、ＥＧＦＲ発現性の癌と診断され、かつその癌において、
【００２２】
【化２１】
2006506093.tif 000012
のＲＮＡ転写物の一種以上もしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現を上昇したと決定される患者を、有効量のＥＧＦＲインヒビターによって処置する工程を包含する方法に関する。ここで、ＲＮＡ転写物レベルの増加は、規定の発現閾値によって規定される。
【００２３】
なお別の局面において、本発明は、ＥＧＦＲ発現性の頭部癌もしくは頸部癌と診断され、かつその癌において、
【００２４】
【化２２】
2006506093.tif 000013
のＲＮＡ転写物の一種以上もしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現を上昇したと決定される患者を、有効量のＥＧＦＲインヒビターによって処置する工程を包含する方法に、関する。ここで、正規化されたＲＮＡ転写物レベルの上昇は、規定の発現閾値によって規定される。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、ＥＧＦＲ発現性の結腸癌と診断され、かつその癌において、
【００２６】
【化２３】
2006506093.tif 000014
のＲＮＡ転写物の一種以上かもしくはその対応する遺伝子産物の、正規化された発現を上昇したと決定される患者を、有効量のＥＧＦＲインヒビターによって処置する工程を包含する方法に関する。ここで、正規化されたＲＮＡ転写物レベルの上昇は、規定の発現閾値によって規定される。
【００２７】
本発明はさらに、（ａ）以下の遺伝子：
【００２８】
【化２４】
2006506093.tif 000015
に対してハイブリダイズされるポリヌクレオチド；（ｂ）固体表面上に固定された、以下の遺伝子：ＣＤ４４ｖ３；ＣＤ４４ｖ６；ＤＲ５；ＧＲＯＩ；ＫＲＴ１７；およびＬＡＭＣ２に対してハイブリダイズされるポリヌクレオチドを含むアレイ；（ｃ）固体表面上に固定された、以下の遺伝子：
【００２９】
【化２５】
2006506093.tif 000016
に対してハイブリダイズされるポリヌクレオチドを含むアレイ；または（ｄ）固体表面上に固定化された、以下の遺伝子：
【００３０】
【化２６】
2006506093.tif 000017
に対してハイブリダイズされるポリヌクレオチドを含むアレイ、を含むアレイに関する。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、固定され、パラフィン包埋された組織標本から、以下：
（ａ）この固定され、パラフィン包埋された組織標本を、約５６℃〜約７０℃の温度で、溶解緩衝液中において、プロテアーゼ存在下で、予め脱蝋することなくインキュベートして、溶解溶液を作製する工程；
（ｂ）蝋が固化する温度まで、この溶解溶液を冷却する工程；および、
（ｃ）この溶解溶液から核酸を単離する工程、
を包含する手順によって、ＲＮＡが単離される方法に関する。
【００３２】
異なる局面において、本発明は、本発明の遺伝子発現分析法を実施するのに適切な、（１）抽出緩衝液／試薬、およびプロトコール；（２）逆転写緩衝液／試薬、およびプロトコール；ならびに、（３）ｑＰＣＲ緩衝液／試薬、およびプロトコールの一つ以上を含むキットに関する。
【００３３】
さらなる局面において、本発明は、表５Ａおよび５Ｂに列挙されるアンプリコンならびに表６Ａ−６Ｆに列挙される対応するプライマー−プローブセットを用いて、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）反応によって、表５Ａおよび５Ｂに列挙される遺伝子のｍＲＮＡ産物のレベルを測定するための方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない場合、本明細書中において使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版），Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（第４版），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、当業者に、本出願に使用される用語に対する一般的な指針を提供する。
【００３５】
当業者は、本明細書において記載されるものと類似するかもしくは等価である多くの方法および材料（これらは、本発明の実施に使用され得る）を認識する。実際、本発明は、記載される方法および材料に決して限定されない。本発明の目的のため、以下の用語が、下記に規定される。
【００３６】
用語「マイクロアレイ」とは、基材上における、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチド、の規則正しい配列を指す。
【００３７】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単数もしくは複数で用いられる場合、一般的に、任意のポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシヌクレオチドを指す。これらは、非改変のＲＮＡもしくはＲＮＡ、または改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡである。したがって、例えば、本明細書中に規定されるようなポリヌクレオチドとしては、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡ、一本鎖もしくは二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（これらは、一本鎖であり得るか、またはより代表的に、二本鎖であり得るかもしくは一本鎖および二本鎖領域を含み得る）、が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同じ分子に由来し得るかまたは異なる分子に由来し得る。この領域は、一以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、いくつかの分子の領域のみに関与する。三重らせん領域の分子の一つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」とは、特にｃＤＮＡを含む。この用語は、一以上の塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性のためかもしくは他の理由のために改変された主鎖を有するＤＮＡもしくはＲＮＡは、本明細書中で意図される用語としての「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常でない塩基（例えば、イノシン）、もしくは改変された塩基（例えば、トリチウム化された塩基）を含むＤＮＡもしくはＲＮＡは、本明細書中で規定されるような用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般的に、用語「ポリヌクレオチド」は、未改変ポリヌクレオチドの、全ての化学的、酵素的および／または代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞（単純細胞および複雑細胞を含む）に特有の、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００３８】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短いポリヌクレオチド（単鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）を指す。オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド）は、しばしば、化学的方法（例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置）によって合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法（インビトロ組み換えＤＮＡ介在性技術を含む）によって、および細胞および生体におけるＤＮＡの発現によって行われ得る。
【００３９】
用語「差次的に発現される遺伝子」、「差次的遺伝子発現」およびそれらの同義語は、交換可能に使用されて、その発現が、疾患（特に癌、例えば、乳癌）に罹患する被験体において、正常もしくはコントロール被験体における発現に対してより高いかもしくはより低いレベルに活性化される遺伝子を指す。この用語はまた、その発現が、同じ疾患の異なる段階で、より高いかもしくはより低いレベルに活性化される遺伝子を含む。差次的に発現される遺伝子が、核酸レベルもしくはタンパク質レベルで、活性化されるかもしくは阻害されるかのいずれかであり得るか、または代替的スプライシングに供されて異なるポリヌクレオチド産物をもたらし得ることが、また理解される。このような差は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変化、ポリペプチドの表面発現、分泌もしくは他の分離によって証明され得る。差次的遺伝子発現は、２以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間での発現の比較、または二以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物の発現の比率の比較、または、同じ遺伝子の、二種の差次的に処理された産物の比較（正常被験体と疾患（特に、癌）に罹患する被験体との間の差、もしくは同じ疾患の種々の段階の間）でさえも、含み得る。差次的発現としては、例えば、正常および疾患細胞の間か、または異なる疾患事象もしくは疾患段階を被っている細胞の間での、遺伝子またはその発現産物における、時間的または細胞の発現パターンの、定量的および定性的な差が挙げられる。この発明の目的においては、正常および疾患被験体においてか、もしくは疾患被験体における疾患の進行の種々の段階において、所定の遺伝子の発現の間に、少なくとも約二倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の差が存在する場合、「差次的遺伝子発現」が存在するとみなされる。
【００４０】
遺伝子転写物もしくは遺伝子発現産物に関する用語「正規化された」とは、基準遺伝子のセットの転写物／産物の平均レベルに対する転写物もしくは遺伝子発現産物のレベルを指す。ここで、基準遺伝子は、患者、組織、もしくは処置にわたるそれらの最小変動に基づいて選択される（「ハウスキーピング遺伝子」）か、または基準遺伝子は、試験された遺伝子の総計であるかのいずれかである。後者の場合、これは一般に「全体正規化（ｇｌｏｂａｌ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれ、試験された遺伝子の総数が比較的大きいこと、好ましくは５０より大きいことが、重要である。特に、ＲＮＡ転写物に関する用語「正規化された」とは、基準遺伝子のセットの転写物レベルの平均に対する転写物のレベルを指す。より特別には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲによって測定されるようなＲＮＡ転写物の平均レベルとは、Ｃｔ値マイナス基準遺伝子転写物のセットの平均Ｃｔ値を指す。
【００４１】
用語「発現閾値」および「規定された発現閾値」は、交換可能に使用されて、問題にされる遺伝子もしくは遺伝子産物のレベルを指し、この値以上では、遺伝子もしくは遺伝子産物は、薬物（この場合、ＥＧＦＲインヒビター薬）に対する患者の反応もしくは抵抗性に関するマーカーとして働く。閾値は、以下の実施例１および２に記載されるような臨床研究から、実験的に規定される。発現閾値は、（例えば、薬物に対する全ての反応物を検出するための）最大感受性に関してか、または（例えば、薬物に対する唯一の反応物を検出するための）最大選択性に関してか、または最小誤差に関して選択され得る。
【００４２】
用語「遺伝子増幅」とは、遺伝子もしくは遺伝子フラグメントの複数のコピーが、特定の細胞もしくは細胞株で形成されるプロセスを指す。複製領域（一続きの増幅されるＤＮＡ）は、しばしば、「アンプリコン」と呼ばれる。通常、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量（すなわち、遺伝子発現のレベル）はまた、発現される特定の遺伝子から作られるコピーの数に比例して増加する。
【００４３】
用語「診断」は、分子的もしくは病理学的な状態（ｓｔａｔｅ）、疾患または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を同定すること（例えば、頭部および頸部の癌、結腸癌、または他の型の癌の分子的サブタイプの同定）を指すために、本明細書中で使用される。用語「予後判定」は、癌に起因する死もしくは新生物疾患（例えば、乳癌、もしくは頭部および頸部の癌）の進行（再発、転移の広がり、および薬物抵抗性を含む）の尤度の予測を指すために、本明細書中で使用される。用語「予測」は、患者が、好適にかもしくは非好適にかのいずれかで、薬物もしくは薬物のセットに反応する尤度、そしてこれらの反応の程度、または原発性腫瘍の外科的除去および／もしくは化学療法に続いて、特定の期間、癌が再発することなく患者が生存する尤度を参照するために、本明細書中で使用される。本発明の予測法は、任意の特定の患者に対する適切な処置様式を選択することによって処置決定を行うために、臨床的に使用され得る。本発明の予測法は、患者が、処置レジメン（例えば、外科的介入、所定の薬物もしくは薬物の組み合わせによる化学療法、および／または放射線療法）に好適に反応する可能性があるかどうか、あるいは外科手術、および／または化学療法もしくは他の処置様式終了の後、患者の長期生存の可能性があるかどうかを予測する、有益な手段である。
【００４４】
用語「長期生存」は、外科手術もしくは他の処置の後、少なくとも５年間、より好ましくは、少なくとも８年間、最も好ましくは、少なくとも１０年間の生存を指すために、本明細書中で使用される。
【００４５】
本発明に従って使用される場合、特定の薬物もしくは処置選択肢に対して「抵抗性が増大する」という用語は、標準用量の薬物または標準的処置プロトコールに対する反応が低下することを意味する。
【００４６】
本発明に従って使用される場合、特定の薬物もしくは処置選択肢に対して「感受性が低下する」という用語は、標準用量の薬物または標準的処置プロトコールに対する反応が低下することを意味する。ここで、反応の低下は、薬物の用量または処置の強度を上昇させることによって（少なくとも部分的に）補償され得る。
【００４７】
「患者の反応」は、患者に対する利点を示す任意の指標を用いて評価され得る。これらの指標としては、以下：（１）ある程度の、腫瘍増殖の阻害（増殖の鈍化および増殖の完全な停止）；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍の大きさの減少；（４）近接する末梢器官および／もしくは末梢組織への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、鈍化、もしくは完全な停止）；（５）転移の阻害（すなわち、減少、鈍化、もしくは完全な停止）；（６）抗腫瘍免疫応答の増強（腫瘍の退行もしくは排除が起こり得るが、必ずしもその必要はない）；（７）腫瘍に関連する一以上の症状の、ある程度の軽減；（８）処置語の生存期間の延長；ならびに／または（９）処置後の所定の時点での死亡率の減少、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
用語「処置」とは、治療処置と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置との両方を指す。その目的は、標的される病的状態もしくは障害を、予防または低下（より軽く）させることである。処置の必要な人々としては、既にその障害を有する人々、およびその障害を有し易い人々またはその障害を予防されるべき人々が挙げられる。腫瘍（例えば、癌）の処置において、治療剤は、腫瘍細胞の病原性を直接的に減少し得るか、または腫瘍細胞を、他の治療剤による処置（例えば、放射線および／または化学療法）に対してより感受性にする。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」とは、新生物細胞の成長および増殖の全て（悪性もしくは良性）、ならびに前癌性および癌性の細胞および組織の全てを指す。
【００５０】
用語「癌」および「癌性」とは、代表的に、無秩序な細増増殖によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例としては、乳癌、結腸癌、肺がん、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭部および頸部の癌、そして脳の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
癌の「病態」としては、患者の健康を損ねる全ての現象が挙げられる。この病態としては、異常な、もしくは制御できない細胞増殖、転移、近接する細胞の正常機能の妨害、異常なレベルでのサイトカインもしくは他の分泌性産物の放出、炎症性反応もしくは免疫応答の抑制もしくは悪化、新生物形成、前癌状態、悪性腫瘍、周辺もしくは離れた組織もしくは器官（例えば、リンパ節など）への浸潤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「ＥＧＦＲインヒビター」とは、ネイティブな上皮細胞成長因子（ＥＧＦＲ）の生物学的機能を阻害する能力を有する分子を指す。加えて、用語「インヒビター」は、ＥＧＦＲの生物学的役割に関して定義される。本明細書における好ましいインヒビターは、ＥＧＦＲと特異的に相互作用（例えば、結合）するが、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の他のメンバーと相互作用することによってＥＧＦＲの生物学的活性を阻害する分子もまた、特別にこの定義に含まれる。ＥＧＦＲインヒビターによって阻害される好ましいＥＧＦＲの生物学的活性は、腫瘍の発生、増殖または伝播に関連する。
【００５３】
用語「ハウスキーピング遺伝子」とは、その活性が細胞機能の維持に必須であるタンパク質をコードする遺伝子群である。これらの遺伝子は、代表的に、全ての細胞型で同様に発現される。ハウスキーピング遺伝子としては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、Ｃｙｐｌ、アルブミン、アクチン（例えば、β−アクチン）、チューブリン、シクロフィリン、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｉｎｅ）、ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｓｏｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＨＲＰＴ）、Ｌ３２、２８Ｓ、および１８Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
（Ｂ．詳細説明）
本発明の実行は、他に示されない限り、（組み換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学の従来技術を利用する。これらの技術は、当該分野の技術の範囲内である。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、以下である：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（編）、１９８７）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（編）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ（編）、１９８７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９８７）；および「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら（編）、１９９４）。
【００５５】
（１．遺伝子発現プロファイリング）
一般的に、遺伝子発現プロファイリングの方法は、二つの大きな群に分けられ得る：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法である。最も一般に使用される、サンプル中のｍＲＮＡ発現の定量のための当該分野で公知の方法としては、ノーザンブロッティングおよびインサイチュハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ＆Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−８５４（１９９２））；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））が挙げられる。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖もしくはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識し得る抗体が利用され得る。配列決定ベースの遺伝子発現分析の代表的な方法としては、遺伝子発現連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ＳＡＧＥ）、および超並列配列情報決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析が挙げられる。
【００５６】
（２．逆転者ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
上記に列挙された技術のうち、最も感受性が高くかつ最も柔軟性のある定量法は、ＲＴ−ＰＣＲである。この方法は、異なるサンプル集団において、正常および腫瘍組織において、薬物処置の有無による、ｍＲＮＡレベルの比較に使用されて、遺伝子発現のパターンを特徴付け得、近縁関係にあるｍＲＮＡを区別し得、そしてＲＮＡの構造を分析し得る。
【００５７】
第一の工程は、標的組織からのｍＲＮＡの単離である。この開始材料は、代表的に、ヒト腫瘍もしくは腫瘍細胞株およびそれらに対応する正常組織および細胞株からそれぞれ単離された、全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、乳、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、甲状腺、精巣、卵巣、子宮、頭部および頸部等を含む種々の原発性腫瘍、腫瘍または腫瘍細胞株から、健康なドナー由来のプールされたＤＮＡとともに単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が、原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結組織サンプルからか、またはパラフィン包埋されて固定された（例えば、ホルマリン固定された）、保管組織サンプルから抽出され得る。
【００５８】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当該分野で周知であり、分子生物学の標準的な教科書（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）が挙げられる）に開示される。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ，ＬａｂＩｎｖｅｓｔ．５６：Ａ６７（１９８７）、ならびにＤｅＳａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：４２０４４（１９９５）に開示される。特に、ＲＮＡ単離は、製造企業（例えば、キアゲン）からの精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを用いて、製造者の指示書に従って行われ得る。例えば、培養細胞からの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ミニ−カラムを用いて単離され得る。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＢｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織サンプルからの全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離され得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離され得る。
【００５９】
ＲＮＡはＰＣＲの鋳型として働き得ないため、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第一の工程は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写と、それに続くＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅である。二つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血球ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写工程は、発現プロファイリングの環境および目的に依存して、代表的に、特異的プライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを用いて準備する。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示書に従って逆転写され得る。次いで、得られたｃＤＮＡは、その後のＰＣＲ反応において鋳型として使用され得る。
【００６０】
ＰＣＲ工程は、種々の熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、代表的に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する。この酵素は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠く。したがって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、代表的に、ＴａｑポリメラーゼもしくはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合するハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有するあらゆる酵素は使用され得ない。二つのオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲ反応に特有のアンプリコンを生成するために使用される。二つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するため、第三のオリゴヌクレオチドもしくはプローブが設計される。このプローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長されず、そしてレポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素によって標識される。レポーター色素からのあらゆるレーザー誘起放射は、二つの色素が、プローブ上にある場合のように共に近接して位置する場合、クエンチング色素によってクエンチされる。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存性様式でプローブを切断する。得られたプローブフラグメントは、溶液中に解離して、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアのクエンチング作用から解放される。レポーター色素の一分子は、各々の新しい合成された分子ごとに遊離される。クエンチされないレポーター色素の検出は、データの定量的解釈の基礎を提供する。
【００６１】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、市販の機器、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、などを用いて行われ得る。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼ処理は、リアルタイム定量ＰＣＲデバイス上（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ）で実行される。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上で、９６ウェル形式でサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘起放射シグナルは、９６ウェルすべてに関して、リアルタイムで光ファイバーケーブルを通じて集められ、そしてＣＣＤで検出される。このシステムは、装置を作動させるため、およびデータを解析するためのソフトウェアを備える。
【００６２】
５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔまたは閾値サイクルとして表される。上記で考察されるように、蛍光値は、各サイクルの間に記録され、増幅反応におけるその時点での増幅産物の量を表す。蛍光シグナルが最初に統計的に有意であるとして記録された時点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【００６３】
誤差およびサンプル間の変動の硬化を最小化するため、ＲＴ−ＰＣＲは、通常、内部標準を用いて実行される。理想的内部標準は、種々の組織の間で一定のレベルで発現され、外部処置によって影響されない。遺伝子発現パターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００６４】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変形は、リアルタイム定量ＰＣＲである。この技術は、二重標識蛍光性（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を通じて、ＰＣＲ産物の蓄積を測定する。リアルタイムＰＣＲは、定量競合ＰＣＲ（各標的配列に対する内部競合物を正規化のために使用する）と定量比較ＰＣＲ（サンプル内に含まれる正規化用（ｎｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ）遺伝子もしくはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を用いる）との両方に適合する。さらなる詳細については、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【００６５】
本発明の一つの局面に従って、ＰＣＲプライマーおよびプローブは、増幅されるべき遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいて設計される。この実施形態において、プライマー／プローブ設計における第一の工程は、遺伝子内でイントロン配列を描写することである。これは、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２）によって開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴのような公共で利用可能なソフトウェアによってかまたはＢＬＡＳＴソフトウェア（その変形を含む）によって行われ得る。その後の工程は、よく確立されたＰＣＲプライマーおよびプローブ設計法に従う。
【００６６】
非特異的シグナルを避けるため、プライマーおよびプローブを設計する際、イントロン内の反復配列をマスクすることが重要である。これは、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅを通じてオンラインで利用可能なＲｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いることによって、容易に達成され得る。このプログラムは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復配列がマスクされる問題の配列を返す。次いで、マスクされるイントロン配列は、市販の、もしくは公共で利用可能なプライマー／プローブ設計パッケージ（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  ＲｏｚｅｎおよびＨｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００），Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．：Ｋｒａｗｅｔｚ  Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ  Ｓ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ３６５−３８６））を用いて、プライマーおよびプローブを設計するために使用される。
【００６７】
ＰＣＲプライマー設計において最も重要な因子としては、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含量（特に相補的プライマー配列および３’−末端配列）が挙げられる。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般的に１７〜３０塩基長であり、約２０％〜約８０％（例えば、約５０％〜約６０％）のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０℃〜８０℃の間のＴｍ（例えば、約５０℃〜７０℃）が、代表的に好ましい。
【００６８】
ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計のためのさらなる指針に関しては、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ」：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１；ならびにＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｅ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）、を参照のこと。これらの開示の全ては、本明細書によって、明確に参考として援用される。
【００６９】
（３．マイクロアレイ）
差次的遺伝子発現はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定され得るかまたは確認され得る。したがって、乳癌関連遺伝子の発現プロファイリングは、マイクロアレイ技術を用いて、新鮮もしくはパラフィン包埋された腫瘍組織のいずれかにおいて測定され得る。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）は、マイクロチップ基材上に平板化されるか、またはアレイ化される。次いで、アレイ化された配列は、目的の細胞もしくは組織由来の特異的ＤＮＡプローブにハイブリダイズされる。ＲＴ−ＰＣＲ法と同じく、ｍＲＮＡの供給源は、代表的に、ヒト腫瘍もしくは腫瘍細胞株、およびそれらに対応する正常組織もしくは細胞株から単離された、全ＲＮＡである。したがって、ＲＮＡは、種々の原発性腫瘍もしくは腫瘍細胞株から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が、原発性腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結組織サンプルからか、または毎日の臨床業務において慣習的に調製されて保存される、保管されたパラフィン包埋され、固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織サンプルから抽出され得る。
【００７０】
マイクロアレイ技術の特別な実施例において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅されたインサートは、高密度アレイにおける基材に適用される。好ましくは、少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列が、その基材に適用される。マイクロチップ上に各々１０，０００エレメントが固定化されるマイクロアレイ化された遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適する。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取り込みを通じて作製される。チップに適用される標識されたｃＤＮＡプローブは、アレイ上の各ＤＮＡスポットに、特異的にハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するためのストリンジェントな洗浄の後、このチップは、共焦点レーザー顕微鏡によってか、またはＣＣＤカメラのような別の検出法によって走査される。各アレイ化されたエレメントのハイブリダイゼーションの定量化は、対応するｍＲＮＡの存在量を評価することを可能にする。二つのＲＮＡ供給源から作製されて、二色の蛍光を用いて別々に標識されたｃＤＮＡプローブは、一組になってアレイにハイブリダイズする。各特定された遺伝子に対応する二つの供給源由来の転写物の相対存在量は、同時に決定される。ハイブリダイゼーションの小規模化は、多数の遺伝子に関する発現パターンの簡易的かつ迅速な評価をもたらす。このような方法が、細胞当たり数コピーで発現する数の少ない転写物の検出に要求される感度を有すること、および少なくとも約二倍の発現レベルの差を、再現性をもって検出することが示された（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析は、市販の機器によって、製造者のプロトコールにしたがって実行され得る。例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を用いることによって、実行され得る。
【００７１】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ法の開発は、癌分類の分子マーカーについての系統的な検索、および種々の癌の型における結果の予測を可能にする。
【００７２】
（４．遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ））
遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に対する個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに、多数の遺伝子転写物の同時かつ定量的な分析を可能にする。第一に、短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が作製され、このタグは各転写物の独特な位置から得られる場合、転写物を一意的に同定するに十分な情報を含む。次いで、多くの転写物は、一緒に連結されて長い連続的分子を形成する。この分子は、複数のタグの独自性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を同時に示す配列であり得る。任意の転写物集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定することによって、かつ各タグに対応する遺伝子を同定することによって、定量的に評価され得る。さらなる詳細は、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７）を参照のこと。
【００７３】
（５．ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術）
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）技術は、検出に質量分析計を用いた、自動化されたハイスループットな遺伝子発現分析法である。この方法により、ＲＮＡの単離、逆転写およびＰＣＲ増幅に続いて、ｃＤＮＡは、プライマー伸長に供される。ｃＤＮＡ由来のプライマー伸長産物は、精製され、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳサンプル調製に必要な成分が予めローディングされたチップアレイ上に分配（ｄｉｐｅｎｓｅ）される。反応物中に存在する種々のｃＤＮＡは、得られた質量スペクトルのピーク領域を分析することによって定量化される。
【００７４】
（６．超並列配列情報決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析）
この方法（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０−６３４（２０００）によって記載される）は、非ゲルベースの配列情報決定（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と個々の直径５μｍのマイクロビーズ上での数百万の鋳型のインビトロクローニングとを組み合わせた配列決定アプローチである。第一に、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリが、インビトロクローニングによって構築される。続いて、フローセル中において、高密度で、鋳型を含むマイクロビーズの平面状アレイが組み立てられる（代表的に３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２）。各マイクロビーズ上のクローン化された鋳型の遊離端は、ＤＮＡフラグメントの分離を必要としない蛍光ベースの配列情報決定法を用いて、同時に分析される。この方法が、同時かつ正確に、一度の操作で、酵母ＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子の配列情報を提供することが示された。
【００７５】
（７．免疫組織化学）
免疫組織化学法もまた、本発明の病原マーカーの発現レベルの検出に適する。したがって、抗体もしくは抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、そして最も好ましくは各マーカーに特異的なモノクローナル抗体が、発現を検出するために使用される。抗体は、抗体自身の直接標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンのようなハプテン標識、または西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼのような酵素）によって検出され得る。あるいは、非標識一次抗体が、標識二次抗体（抗血清、ポリクローナル抗血清もしくは一次抗体に特異的なモノクローナル抗体）とともに使用され得る。免疫組織化学プロトコールおよびキットは、当該分野で周知であり、市販されている。
【００７６】
（８．プロテオミクス）
用語「プロテオーム」は、ある時点でサンプル（例えば、組織、生体、もしくは細胞培養物）中に存在するタンパク質全体として定義される。プロテオミクスとしては、とりわけ、サンプル中のタンパク質発現の全体的変化の研究が挙げられる（これはまた、発現プロテオミクスとも称される）。プロテオミクスは、代表的に、以下の工程を包含する：（１）２次元ゲル電気泳動によるサンプル中に個々のタンパク質の分離（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）；（２）ゲルから回収された個々のタンパク質の同定（例えば、質量分析もしくはＮ末端配列決定）、および（３）バイオインフォマティクスを用いたデータ分析。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現プロファイリング法の補完に役立ち、単独および他の方法と組み合わせて使用されて、本発明の病原マーカーの産生を検出し得る。
【００７７】
（９．得られた組織標本からの核酸の単離にかんする改良法）
本発明の方法の第一工程では、全ＲＮＡが、目的の供給源材料（固定され、パラフィン包埋された標本を含む）から抽出され、酵素アッセイにおける基質として作用するに十分に精製される。全ＲＮＡの抽出は、当該分野で公知の任意の方法で行われ得る一方、特定の実施形態においては、本発明は、保管された、固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）標本からの核酸の単離のための改良法に頼る。
【００７８】
ｍＲＮＡ種の測定レベルは、細胞および組織の生理学的もしくは病理学的状態を規定するために有用である。ＲＴ−ＰＣＲ（上記で考察）は、この「遺伝子発現プロファイリング」のための、最も感度の高い、再現性のある、定量法の一つである。パラフィン包埋され、ホルマリン固定された組織は、このような研究のために最も広範に利用可能な材料である。いくつかの研究室は、固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）をＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡの供給源としてうまく使用することが可能であることを示した（Ｓｔａｎｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：３０４−３０８（１９９１）；Ｓｔａｎｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８６：２３−２６（１９９８）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ  １：１３９１（１９８９）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４３：４９９−５０４（１９９９）；Ｆｉｎｋｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：４４８−４５３（１９９３）；Ｇｏｌｄｓｗｏｒｔｈｙら、Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ  ２５：８６−９１（１９９９）；ＳｔａｎｔａおよびＢｏｎｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：２７１−  ２７６（１９９８）；Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔら、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：Ｂ２７（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ；Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−４２９（２００１））。このことは、遺伝子発現プロファイリングが、最も一般的に利用可能なヒト生検標本の供給源で実行されること、したがって新しい価値ある診断情報および治療情報をもたらし得ることを可能にする。
【００７９】
最も広範に使用されるプロトコールは、核酸（ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡ）抽出前に、パラフィンブロック中の組織を脱蝋するため、有害な有機溶媒、例えば、キシレン、もしくはオクタン（Ｆｉｎｋｅら、上記）を用いる。不可避的な有機溶媒除去工程（例えば、エタノールを用いる）および再水和工程が続くが、これは、複数の操作、およびプロトコールの実質的全時間の追加（数日までに及び得る）を必要とする。ＦＰＥＴからのＲＮＡ抽出のための市販のキットおよびプロトコール［ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）；Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）］は、脱パラフィン化にキシレンを使用する。この手順では、代表的に、キシレンによるインキュベーションに続いて、複数回の遠心分離およびエタノール緩衝液の交換、およびインキュベーションを必要とする。
【００８０】
本発明で使用され得る方法は、遺伝子発現測定のために十分にインタクトな核酸、特にＲＮＡを提供する、改良された核酸抽出プロトコールを提供する。この改良された核酸抽出プロトコールにおける重要な工程は、何らかの有機溶媒を使用しない脱蝋の実行である。これによって、有機溶媒の除去に関わる複数の操作の必要性がなくなり、プロトコールの全時間が実質的に減少する。改良法によると、蝋（例えば、パラフィン）は、組織を溶解させかつタンパク質を水和させる溶解緩衝液中で６５℃〜７５℃でインキュベーションし、続いて冷却して蝋を凝固させることによって、蝋に包埋された組織サンプルから除去される。
【００８１】
図２は、蝋を除去するためにキシレンを用いる代表的な市販品の方法と比較した、本明細書中で使用される改良された核酸抽出プロトコールのフローチャートである。これらのプロセスにおける個々の工程およびプロセス全体に必要な時間が図表に示される。示されるように、市販のプロセスは、本発明の方法を実行するのに使用される改良プロセスよりも、約５０％多くの時間を必要とする。
【００８２】
溶解緩衝液は、細胞溶解に関して公知の任意の緩衝液であり得る。しかし、本発明において、ポリアデニル化ｍＲＮＡを選択的に精製するオリゴｄＴベースの方法は、ＲＮＡを単離するために使用されないのが好ましい、なぜなら、ｍＲＮＡ分子の大部分がフラグメント化されることが予測され、したがってインタクトなポリアデニル化末端を有さず、その後の分析アッセイのために回収されないかもしくは利用され得ないからである。他方、多くの標準的核酸精製スキームが使用され得る。これらとしては、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）抽出および有機溶媒抽出、ガラスビーズもしくはフィルターを用いた抽出、塩析および沈殿ベースの方法、または生物学的供給源から全ＲＮＡもしくは全核酸を回収するための、当該分野で公知の任意の方法が挙げられる。
【００８３】
溶解緩衝液は、例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、もしくはＡｍｂｉｏｎから市販されている。好ましい溶解緩衝液の群は、代表的に、尿素、プロティナーゼＫ、もしくは他のプロテアーゼを含む。プロティナーゼＫは、高品質の損傷のないＤＮＡもしくはＲＮＡの単離に非常に有用である。なぜなら、ほとんどの哺乳動物ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅは、この酵素で、特に０．％〜１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で、迅速に不活性化されるからである。これは、ＤＮＡよりも分解に感受性の高いＲＮＡの場合に、特に重要である。ＤＮａｓｅが、活性に金属イオンを必要とし、ゆえにＥＤＴＡのようなキレート剤によって容易に不活性化され得る一方、ＲＮａｓｅには、同様の補助因子が存在しない。
【００８４】
蝋の冷却と結果として起こる凝固は、全核酸からの蝋の分離を容易し、核酸は、例えばイソプロパノールによって、都合よく沈殿され得る。さらなる処理は、意図された目的に依存する。ＲＮＡ分析の提唱された方法が、抽出物中でＤＮＡの汚染によって偏向される場合、このＲＮＡ抽出物は、精製後、特異的にＤＮＡを除去し一方でＲＮＡを保存するために、例えばＤＮａｓｅによって、さらに処理され得る。例えば、目的が、その後のＲＴ−ＰＣＲ増幅のための高品質のＲＮＡを単離することである場合、核酸沈殿に続いて、ＤＮＡが、通常ＤＮａｓｅ処理によって、除去される。しかし、ＤＮＡは、核酸単離の種々の段階で、ＤＮａｓｅもしくは当該分野で公知の他の技術によって除去され得る。
【００８５】
上記で考察された改良された核酸抽出の利点が、保管された、パラフィン包埋された組織サンプルからのＲＮＡ単離に関して最も明白である一方、有機溶媒の使用を包含しない本発明の蝋除去工程は、全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）もしくはＤＮＡのみの抽出のための任意の従来のプロトコールにも含まれ得る。
【００８６】
加熱を用い、続いて冷却してパラフィンを除去することによって、この改良プロセスは、貴重な処理時間を節約し、かつ一連の操作をなくし、これらによって核酸の収量を増加させ得る。
【００８７】
（１０．逆転写の５’−多重化遺伝子特異的プライミング）
ＲＴ−ＰＣＲは、第一の工程として、試験ＲＮＡ集団の逆転写を必要とする。最も一般的に使用される逆転写用のプライマーは、オリゴｄＴであり、これはＲＮＡがインタクトである場合によく機能する。しかしこのプライマーは、ＦＰＥ組織での場合のようにＲＮＡが高度にフラグメント化される場合には、有効ではない。
【００８８】
本発明は、遺伝子特異的プライマーの使用を包含する。このプライマーは、長さおよそ２０塩基であり、約５８℃と約６０℃との間の最適Ｔｍを有する。これらのプライマーはまた、ＰＣＲのＤＮＡ増幅を駆動する逆プライマーとして働く。
【００８９】
代替のアプローチは、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしてのランダムヘキサマーの使用に基づく。しかし、発明者らは、遺伝子特異的プライマーの多重度を用いる方法が、ランダムヘキサマーを用いる公知のアプローチよりも優れていることを実験的に示した。
【００９０】
（１１．正規化の方針）
本発明の重要な局面は、ＥＧＦＲ発現性の癌組織によるある遺伝子の発現の測定を使用して、患者がＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する可能性についての情報を提供することである。この目的のために、アッセイされたＲＮＡの量の差および使用されたＲＮＡの質の変動性を補正（正規化）することが必要である。したがって、アッセイは、代表的に、公知のハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐｌ）を含む特定の正規化用遺伝子の発現を測定して、取り込む。あるいは、または加えて、正規化は、全てのアッセイされた遺伝子もしくはそれらの大部分の平均値または中央値（ＲＴ−ＰＣＲの場合、Ｃｔ）に基づき得る（全体正規化アプローチ）。遺伝子ごとの基準においては、測定され、正規化された患者の腫瘍ｍＲＮＡの量は、同じ型の癌組織（例えば、頭部および頸部の癌、結腸癌など）の基準セットで見出される量と比較される。この基準セットの癌組織の数（Ｎ）は、異なる基準セットが、（全体として）確実に本質的に同じように挙動するよう十分に大きくあるべきである。この条件が満たされる場合、特定のセットに存在する個々の癌組織の独自性は、アッセイされた遺伝子の層大量に優位な影響を及ぼさない。通常、癌組織の基準セットは、少なくとも約３０、好ましくは少なくとも約４０の異なるＦＰＥ癌組織標本からなる。他に記述されない限り、各ｍＲＮＡ／試験された腫瘍／患者についての正規化された発現レベルは、基準セットで測定された発現レベルのパーセンテージとして表現される。より具体的には、十分に大きな数（例えば、４０）の腫瘍の基準セットは、各ｍＲＮＡ標本の正規化されたレベルの分布を生じる。分析されるべき特定の腫瘍サンプルで測定されたレベルは、この範囲のあるパーセンタイル（当該分野で公知の方法で決定され得る）に入る。これ以降、常に明示されるわけではないが、他に記述されない限り、遺伝子の発現レベルへの言及は、基準セットに対して正規化された発現とする。
【００９１】
（１２．ＥＧＦＲインヒビター）
上皮細胞成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）ファミリー（ＥＧＦＲ、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ３およびｅｒｂ−Ｂ４を含む）は、上皮性悪性腫瘍においてしばしば活性化される成長因子レセプターのファミリーである。したがって、上皮細胞成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）は、いくつかの腫瘍型（例えば、卵巣癌、膵臓癌、非小細胞性肺癌、乳癌、結腸癌、ならびに頭部および頸部の癌を含む）において活性化されることが公知である。いくつかのＥＧＦＲインヒビター（例えば、ＺＤ１８３９（ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）またはイレッサとしても公知である）；およびＯＳＩ７７４（エルロチニブ（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、ＴａｒｃｅｖａＴＭ））は、ＥＧＦＲ発現性の癌の処置のための有望な薬物候補である。
【００９２】
イレッサ、低分子量合成キナゾリンは、ＥＧＦＲのＡＴＰ結合部位、成長促進レセプターチロシンキナーゼを競合的に阻害し、非小細胞性肺癌の処置のための第ＩＩＩ相臨床治験をされている。別のＥＧＦＲインヒビター、［ａｇｒ］シアノ−［ｂｇｒ］メチル−Ｎ−［（トリフルオロメトキシ）フェニル］−プロペンアミド（ＬＦＭ−Ａ１２）は、ＥＧＦＲ陽性ヒト乳癌細胞の増殖および侵襲性を阻害することを示された。
【００９３】
セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）は、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ−依存性細胞増殖をブロックするモノクローナル抗体である。これは、現在、治験の第ＩＩＩ相で試験されている。
【００９４】
ＴａｒｃｅｖａＴＭは、進行性卵巣癌、ならびに非小細胞性肺癌ならびに頭部および頸部の癌を有する患者において、抗癌活性の有望な効能を示した。
【００９５】
本発明は、ＥＧＦＲ陽性腫瘍が、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する可能性があるかどうかを予測するための価値のある手段を提供する。
【００９６】
最近の刊行物は、胃腸（例えば、結腸）の癌におけるＥＧＦＲの関与、およびその発現と低い生存率との関連性をさらに確認する。例えば、Ｋｈｏｒａｎａら、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ  ２２：３−１７（２００３）を参照のこと。
【００９７】
列挙したＥＧＦＲインヒビターの例は低分子量有機分子であるが、本発明の知見は、他のＥＧＦＲインヒビター（抗ＥＧＦＲ抗体、アンチセンス分子、低分子ペプチドなどを含むが、限定ではない）に同様に適用可能である。
【００９８】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定的な実施例から明らかになる。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
（頭部および頸部の腫瘍における遺伝子発現の第ＩＩ相研究）
ＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応したかあるいは反応しなかった頭部癌および頸部癌の患者の、パラフィン包埋され、固定された組織サンプルにおける遺伝子発現を分子的に特徴付けることを主な目的として、遺伝子発現研究を計画し、実施した。結果は、５種類の異なるＥＧＦＲインヒビター薬の使用に基づく。
【０１００】
研究計画
頭部癌および頸部癌と診断された１４人の患者から得られた、パラフィン包埋されてホルマリン固定された頭部および頸部腫瘍組織において、分子アッセイを行った。適切な腫瘍組織の量を示した材料および方法の章で記載されるような組織病理学的評価を実施した場合のみ、患者を研究に含めた
（材料および方法）
各代表的な腫瘍ブロックを、標準的組織病理学によって、診断、組織の量の半定量的評価、および腫瘍の類別に関して特徴付けた。全部で６切片（各１０ミクロン厚）を調製し、Ｃｏｓｔａｒ  Ｂｒａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  Ｔｕｂｅ（ポリプロピレン、１．７ｍＬチューブ、透明；各チューブに３切片）に配置した。腫瘍が、全標本領域の３０％未満を構成する場合、そのサンプルを、全体的な顕微解剖によって、病理学者がおおまかに切断し、その腫瘍組織をＣｏｓｔａｒチューブに直接投入した。
【０１０１】
外科的手技の一部として一つ以上の腫瘍ブロックを得た場合、全ての腫瘍ブロックを、上記の記載と同じ特徴付けに供し、病理を最も代表するブロックを分析に用いた。
【０１０２】
（遺伝子発現分析）
固定され、パラフィン包埋された組織サンプルからｍＲＮＡを抽出し、精製して、上記のように遺伝子発現分析のために調製した。
【０１０３】
定量的遺伝子発現の分子アッセイを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって行った。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＴＭは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上で、３８４ウェル形式でサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘起蛍光シグナルを、３８４ウェル全てについて、光ファイバーケーブルを通じてリアルタイムで集め、ＣＣＤカメラで検出する。このシステムは、装置の実行およびデータ分析のためのソフトウェアを備える。
【０１０４】
（分析および結果）
１８５個の癌関連遺伝子および７個の基準遺伝子について腫瘍組織を分析した。各患者についての閾値サイクル（Ｃｔ）値を、特定の患者に関する全ての遺伝子の平均に基づいて正規化した。臨床結果データは、全患者で利用可能であった。
【０１０５】
結果を、反応性もしくは無反応性のいずれかとして分類した。この結果を、二つの異なる基準（部分反応、臨床的利益）を用いて、反応に関して分析した。後者の基準は、部分反応もしくは完全反応を安定疾患（最低３ヶ月）と組み合わせる。この研究では、完全反応はなく、部分反応の四つの症例および疾患安定化の二つの症例があった。
【０１０６】
発明者らは、遺伝子発現と部分反応との間の関係を、ロジスティック回帰によって評価し、そして以下の遺伝子を有意（ｐ＜０．１５）と同定し、添付の表１に示した。ロジスティックモデルは、部分反応者かまたはそうでないかのいずれかであるとする、被験体の確率（Ｐｒ）を予測する手段を提供する。以下の方程式は、反応の発現閾値を規定する。
Ｐｒ（反応）＝１／（１＋ｅ切片＋傾き×基準正規化Ｃｔ）、および、
Ｐｒ（無反応）＝１−Ｐｒ（反応）。
【０１０７】
表１において、用語「陰性」とは、遺伝子のより多くの発現が、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に反応する尤度を低下させることを示し、そして「陽性」とは、遺伝子の発現の上昇が、ＥＧＦＲインヒビターへの反応の尤度を上昇させることを示す。臨床的利益基準を用いた、頭部癌および頸部癌の患者のデータからの結果を、表２に示す。
【０１０８】
全体的に、以下の遺伝子の発現の上昇は、ＥＧＦＲインヒビター処置に対する頭部癌および頸部癌の抵抗性と相関した：
【０１０９】
【化２７】
2006506093.tif 000018
；そして、以下の遺伝子の発現の増加は、ＥＧＦＲインヒビター処置に対する頭部癌および頸部癌の反応と相関した：ＣＤ４４；ＣＤ８２；ＣＧＡ；ＣＴＳＬ；ＥＧＦＲｄ２７；ＩＧＦＢＰ３；ｐ２７；Ｐ５３；ＲＢ１；ＴＩＭＰ２；およびＹＢ−１。
【０１１０】
（実施例２）
（結腸癌における遺伝子発現の第ＩＩ相研究）
実施例１に記載した頭部癌および頸部癌の患者の研究と同様の研究において、ＥＧＦＲインヒビターに対する結腸癌の反応の尤度の上昇および低下と相関する遺伝子発現マーカーを探索した。サンプル調製および取扱い、ならびに遺伝子発現およびデータの分析を、実施例１と同様に行った。
【０１１１】
１９２個の遺伝子のアッセイを用いて、２３人の結腸腺癌患者を全て研究した。１９２個中１８８個は、検出限界以上に発現した。病理学的および臨床的反応の両方を評価した。ＥＧＦＲインヒビターによる処置に続いて、３人の患者を、部分反応を有すると決定し、５人を、安定疾患を有すると決定し、そして１５人を、進行性疾患であると決定した。
【０１１２】
表３は、部分反応基準を用いて得られた結果を示す。
【０１１３】
臨床的利益基準を用いた結腸癌患者データの分析からの結果を表４に示す。
【０１１４】
全体的に、以下の遺伝子の発現の増加は、ＥＧＦＲインヒビター処置に対する結腸癌の抵抗性と相関した：
【０１１５】
【化２８】
2006506093.tif 000019
そして、以下の遺伝子の発現の増加は、ＥＧＦＲインヒビター処置に対する結腸癌の感受性と相関した：
ＣＤ４４；ＣＤ８２；ＣＧＡ；ＣＴＳＬ；ＥＧＦＲｄ２７；ＩＧＦＢＰ３；ｐ２７；Ｐ５３；ＲＢ１；ＴＩＭＰ２；およびＹＢ−１。
【０１１６】
最後に、以下の遺伝子の発現の増加が、頭部癌および頸部癌ならびに結腸癌の両方において、ＥＧＦＲインヒビター処置に対する抵抗性と相関するということは、注目に値する：ＣＤ４４ｖ３；ＣＤ４４ｖ６；ＤＲ５；ＧＲＯ１；ＫＲＴ１７；ＬＡＭＣ２。
【０１１７】
同様の実験で、ＥＧＦＲ陽性の頭部癌および頸部癌におけるＬＡＭＣ２、Ｂ−カテニン、Ｂａｘ、ＧＲＯ１、Ｆａｓ、またはＩＴＧＡ３の発現の上昇を、ＥＧＦＲインヒビターによる処置に対して患者が十分に反応する可能性がないという指標であると決定した。一方、ＥＧＦＲ陽性の頭部癌および頸部癌におけるＹＢ−１、ＰＴＥＮ、ＣＴＳＬ、Ｐ５３、ＳＴＡＴ３、ＩＴＧＢ３、ＩＧＦＢＰ３、ＲＰＬＰＯまたはｐ２７の発現の上昇を、ＥＧＦＲインヒビター処置に対して患者が反応する可能性があるという指標であると決定定した。
【０１１８】
別のセットの同様の実験において、ＥＧＦＲ発現性の結腸癌における以下の遺伝子の発現の上昇は、処置への陽性反応と相関した：ＢＡＫ；ＢＣＬ２；ＢＲＡＦ；ＢＲＫ；ＣＣＮＤ３；ＣＤ９；ＥＲ２；ＥＲＢＢ４；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ１；ＦＲＰ１。ＥＧＦＲ発現性の結腸癌における以下の遺伝子の発現の上昇は、処置への抵抗性と相関した：ＡＰＮ；ＣＡ９；ＣＣＮＤ１；ＣＤＣ２５Ｂ；ＣＤ１３４；ＬＡＭＣ２；ＰＤＧＦＢ；ＣＤ４４ｖ６；ＣＹＰ１；ＤＲ５；ＧＡＰＤＨ；ＩＧＦＢＰ２；ＰＬＡＵＲ；ＲＡＳＳＦ１；ＵＰＡ。
【０１１９】
本明細書を通じて引用された全ての参考文献は、本明細書において、明確に、参考として援用される。
【０１２０】
本発明は、特定の実施例を参照して説明されるが、これは、限定ではない。改変および変更が、本発明の精神から逸脱することなく可能である。そのような改変および変更の全ては、当業者にとって明らかであり、明確に、本発明の範囲内である。本明細書において開示される特定の実施例は、頭部および頸部の癌ならびに結腸癌に関するが、本発明の方法は、一般的に、全てのＥＦＧＲ発現性の癌に適用可能でありかつ拡張され得る。そしてこのような全体的方法が、本発明の範囲内であることは、明確に意図される。
【０１２１】
【表１−１】
2006506093.tif 000020
【０１２２】
【表１−２】
2006506093.tif 000021
【０１２３】
【表２】
2006506093.tif 000022
【０１２４】
【表３】
2006506093.tif 000023
【０１２５】
【表４】
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【０１２６】
【表５Ａ−５Ｂ−１】
2006506093.tif 000025
【０１２７】
【表５Ａ−５Ｂ−２】
2006506093.tif 000026
【０１２８】
【表５Ａ−５Ｂ−３】
2006506093.tif 000027
【０１２９】
【表６Ａ−６Ｆ−１】
2006506093.tif 000028
【０１３０】
【表６Ａ−６Ｆ−２】
2006506093.tif 000029
【０１３１】
【表６Ａ−６Ｆ−３】
2006506093.tif 000030
【０１３２】
【表６Ａ−６Ｆ−４】
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【０１３３】
【表６Ａ−６Ｆ−５】
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【０１３４】
【表６Ａ−６Ｆ−６】
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、遺伝子発現を測定するための本発明のプロセスの、作業の流れ全体を示す図表である。この図において、ＦＰＥＴは、「固定パラフィン包埋組織」を表し、そして「ＲＴ−ＰＣＲ」は、「逆転写ＰＣＲ」を表す。ＲＮＡ濃度は、市販のＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ試薬およびプロトコールを用いることによって、決定される。
【図２】図２は、代表的な市販品の方法のフローチャートと並行する、本発明に従うＲＮＡ抽出法の工程を示す、フローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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