(57)【要約】核酸の感度良い検出および定量のための方法および組成物が提供される。さらに、遺伝子型決定のための方法および組成物が提供される。本発明のプローブにより、一本鎖、二本鎖ポリヌクレオチドおよびピロホスフェート（ＰＰｉ）に関する標的開始増幅が可能になる。ＤＮＡ酵素仲介検出法もまた、一本鎖最終産物の検出のために提供される。
2006504436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖または部分的に二本鎖の核酸を含むプローブ分子であって、前記プローブが、３’末端ブロック部分を含むかまたは含まない、標的相補部分、鋳型部分、少なくとも１つの酵素作用部分を含む、プローブ分子。
【請求項２】
前記一本鎖または部分的二本鎖核酸が直線分子である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記一本鎖または部分的二本鎖核酸が環状分子である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記酵素作用部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
前記酵素作用部分が、ＲＮａｓｅＨ作用配列である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記酵素作用部分が、ヌクレアーゼ消化部位を含み、前記ヌクレアーゼ消化部位が、二本鎖の場合に、前記プローブの反対の鎖を消化することを支持する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記酵素作用部分が、ＲＮａｓｅＨ作用配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、またはＲＮａｓｅＨ作用配列および前記ヌクレアーゼ消化部位の組み合わせ、あるいは前記ヌクレアーゼ消化部位およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、または１つ以上の前記ヌクレアーゼ消化部位の組み合わせを含む、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼ消化部位に、修飾されたヌクレオチドが含まれ、それによってプローブ上の前記消化部位が、ヌクレアーゼ開裂に抵抗性であり、反対の修飾されていない鎖が開裂に感受性である、請求項６に記載のプローブ。
【請求項９】
前記修飾されたヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を含む、請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼ消化部位が、制限酵素認識配列および開裂部位を有する制限部位を含む、請求項６に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記制限部位が、ＩＩＳ型制限酵素部位を含む、請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記ＩＩＳ型制限部位の酵素開裂部位が、標的相補的部位上に位置する、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記ＩＩＳ型制限酵素開裂部位が、ＳＮＰ部位、変異ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチドまたはスプライシング部位に相当する、請求項１２に記載のプローブ。
【請求項１４】
前記ＩＩＳ型制限部位が、ＦｏｋＩ部位である、請求項１１に記載のプローブ。
【請求項１５】
ヘルパープライマーを含み、そこで前記ヘルパープライマーが、少なくとも１つの、前記プローブの一部分に相補的かまたは本質的に相補的な部分を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記ヘルパープライマーが、３’末端ブロッキング部分を含み、それによって、前記ヘ
ルパープライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１７】
前記ヘルパープライマーが、３’末端ブロッキング部分を含まず、それによって、前記ヘルパープライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能である、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１８】
前記ヘルパープライマーが、隣接配列を有するかまたは有さない酵素作用部分に対して、または前記プローブの酵素作用部分の部分に対して相補的な配列を含み、それによって、前記ヘルパープライマーと前記プローブ間のハイブリッド形成によって、酵素作用部分が、二本鎖または部分的二本鎖になる、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１９】
前記ヘルパープライマーが、前記プローブの酵素作用部分の１つに対する３’配列に相補的な３’末端配列を含む、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項２０】
前記ヘルパープライマーがさらに、標的相補部分を含み、そこで、前記ヘルパープライマーに相補的な前記標的領域が、前記プローブに相補的な標的領域に、隣接するか、または本質的に隣接する、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項２１】
前記ヘルパープライマーが、３’および５’標的相補部分を含み、前記プローブに相補的な標的領域が、前記ヘルパープライマーに相補的な標的領域の中間に位置するか、または前記ヘルパープライマーに相補的な標的領域に隣接するかもしくは本質的に隣接する、請求項２０に記載のプローブ。
【請求項２２】
前記標的相補部分が、対象の標的領域に相補的であるか、または本質的に相補的である配列を含み、それによって、前記プローブの前記標的相補部分が、対象の前記標的領域にハイブリッド形成し、二本鎖となり、それによって、１つまたは２つ以上の、前記プローブの酵素作用部分の部分が、部分的または完全に機能的である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記プローブの前記酵素作用部分、前記標的相補部分および前記鋳型部分が、互いに重なり合うか、または１つの部位が、他の部位内に組み込まれる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２４】
前記プローブの前記標的相補部分、および／または前記酵素作用部分、および／または前記鋳型部分が、修飾されたヌクレオチドを含み、それによって修飾されたヌクレオチドが、ヌクレアーゼ開裂に抵抗性である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記プローブの前記標的相補部分、および／または前記酵素作用部分および／または前記鋳型部分が、キメラＲＮＡおよびＤＮＡを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記鋳型部分が、２つの同一の、またはほぼ同一の配列を含み、少なくとも１つの酵素作用部分で分離されている、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの酵素作用部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項２６に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの酵素作用部分が、制限酵素部位を含む、請求項２６に記載のプローブ。
【請求項２９】
前記プローブが環状プローブであって、前記環状プローブが、１つの鋳型部分を含む、請求項３に記載のプローブ。
【請求項３０】
前記プローブが、環状プローブの任意の位置で、または直線プローブの周辺部分配列を有するかまたは有さない５’鋳型部分内で、ＤＮＡ酵素に相補的な、触媒的に不活性なアンチセンス配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ酵素が、１０〜２３ＤＮＡｚｙｍｅである、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ酵素が、８〜１７ＤＮＡｚｙｍｅである、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３３】
前記３’末端ブロック部分が、化学的部分であり、それによって、プローブの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３４】
前記プローブおよび／またはヘルパープライマーの任意の末端が、固体支持体上に接着する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３５】
試料中の対象の標的核酸配列または多重標的核酸配列を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）好適なハイブリッド形成条件下で、以上の請求項の任意の１つにしたがった、プローブまたはプローブの組を、核酸試料と接触させることであって、そこで、前記プローブの標的相補部分、または前記プローブとヘルパープライマー両方の標的相補部分が、標的配列とハイブリッド形成し、二本鎖になり、それによって、１つまたは２つ以上または一部の、前記プローブの酵素作用部分が、部分的または完全に機能的になるステップ；
（ｂ）前記プローブの全ての酵素作用部分を、二本鎖かつ完全に機能的にするステップ；（ｃ）一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）を産生するように、二本鎖酵素作用部分を含む前記プローブを処理するステップ；
（ｄ）前記ＳＳＥＰを遊離プローブにアニールさせ、前記プローブの全ての酵素作用部分を、二本鎖にし、完全に機能的にするステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）と（ｄ）を繰り返すことであって、それによって、前記プローブが、二本鎖または部分的二本鎖形態に変換され、前記ＳＳＥＰの多重コピーが、繰り返し産生されるステップ；および
（ｆ）そのようにして産生された最終産物である、二本鎖最終産物、ＳＳＥＰおよびピロホスフェート（ＰＰｉ）を直接的または間接的に検出するステップ
を含む方法。
【請求項３６】
前記方法が、単一の反応または別々の反応で実施される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的核酸がＲＮＡであり、前記ステップ（ａ）が、酵素作用部分の１つであるＲＮａｓｅ  Ｈ消化部位を、二本鎖および機能的にし、前記ステップ（ｂ）に、ＲＮａｓｅ  ＨによってＲＮＡ鎖を消化し、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型として前記プローブを用いて、部分的に消化された鎖の３’末端を伸長することが含まれ、それによって、前記プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記部分的に消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子によって、鎖置換することが含まれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プローブ上の前記他の酵素作用部分に、制限部位またはＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーター、または制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方が含まれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記酵素作用部分の１つが制限部位であり、前記プローブの標的相補部分上に位置し、前記ステップ（ａ）が、前記制限部位を、二本鎖および完全に機能的にし、前記ステップ（ｂ）が、制限酵素によって、前記制限部位上で、前記プローブの反対鎖を消化し、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型として前記プローブを用い、消化された鎖の３’末端を伸長することを含み、それによって、前記プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
消化された鎖の３’末端の前記伸長がさらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による鎖置換を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記プローブ上の前記他の酵素作用部分が、制限部位またはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、または制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記制限部位が、前記プローブ上の唯一の酵素作用部分である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記酵素作用部分の１つが、ＩＩＳ型制限部位であり、前記ＩＩＳ型制限部位の開裂部位が、前記プローブの標的相補部分上に位置し、前記ＩＩＳ型制限部位の認識部位が、前記プローブの標的相補部分の他の側上に存在し、ステップ（ａ）が、前記プローブの標的相補部分を二本鎖にし、それによって、前記ＩＩＳ型制限部位の機能的開裂部位が形成され、前記ステップ（ｂ）に、ヘルパープライマーを前記プローブへアニーリングし、前記ＩＩＳ型制限部位の前記認識配列が、二本鎖になることが含まれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヘルパープライマーの前記プローブへのアニーリング、および前記ＩＩＳ型制限部位の前記認識配列を二本鎖にすることが、前記ヘルパープライマーを、隣接配列を有するかまたは有さない前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列を直接的にアニーリングさせることを含み、それによって、前記ＩＩＳ制限部位の二本鎖認識配列部位が形成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヘルパープライマーの前記プローブへのアニーリング、および前記ＩＩＳ型制限部位の前記認識配列を二本鎖にすることが、前記ヘルパープライマーの３’末端配列を、前記ＩＩＳ制限認識配列の３’配列に対してアニーリングすること、および、鋳型として前記プローブを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって、前記ヘルパープライマーの３’末端配列を伸長させること、を含み、それによって、前記ＩＩＳ型制限部位の二本鎖認識配列が形成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ステップ（ａ）にて、前記プローブの標的相補部分が、標的配列の遊離３’末端にハイブリダイズし、前記ステップ（ｂ）が、鋳型として前記プローブを用い、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的配列の前記遊離３’末端を伸長することを含み、それによって、前記プローブ上の他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記プローブの前記酵素作用部分に、制限部位が含まれ、前記ステップ（ｃ）に、制限酵素によって、前記制限部位上の前記プローブの反対の鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長し、前記消化と前記伸長を繰り返すこと
が含まれ、それによって、多数のＳＳＥＰ  ＤＮＡのコピーが産生される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
消化された鎖の３’末端の前記伸長に、さらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記プローブの前記酵素作用部分に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれ、前記ステップ（ｃ）に、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用する、ＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写が含まれ、これによって、多数のＳＳＥＰ  ＲＮＡのコピーが産生される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記プローブの前記酵素作用部分が、制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含み、前記ステップ（ｃ）が、制限酵素によって、前記制限部位上の前記プローブの反対の鎖を消化し、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長させる工程、前記消化と前記伸長を繰り返すことを含み、それによって、多数のＳＳＥＰ  ＤＮＡ中のコピーが産生されること、また、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用するＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写を含み、これによって多数のＳＳＥＰ  ＲＮＡのコピーが産生される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
消化された鎖の３’末端の前記伸長に、さらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＳＳＥＰが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、またはＤＮＡおよびＲＮＡ分子両方であり、前記ステップ（ｄ）が、前記ＳＳＥＰを、遊離プローブの配列部位にアニーリングすること、および鋳型として前記遊離プローブを用いて、前記ＳＳＥＰの３’末端を伸長することを含み、それによって、前記プローブのすべての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＳＳＥＰがＲＮＡ分子であり、前記ステップ（ｄ）が、前記ＳＳＥＰを遊離プローブの配列部位にアニーリングすること、ＲＮａｓｅ  Ｈによって前記ＳＳＥＰを消化する工程、および鋳型として前記遊離プローブを用いて、部分的に消化されたＳＳＥＰの３’末端を伸長させることを含み、それによってすべての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
前記プローブが、環状分子であり、前記ＳＳＥＰの配列が、前記プローブに相補的である、１つまたは２つ以上の配列ユニットを含み、ステップ（ｄ）が、前記ＳＳＥＰを、前記遊離プローブの全体または一部にアニーリングさせることを含み、それによって前記酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
前記鋳型部分が、アンチセンスＤＮＡ酵素を含み、前記方法が、多数の、一本鎖機能的センスＤＮＡ酵素酵素のコピーを産生し、一本鎖最終産物の検出の前記ステップ（ｆ）が、反応中に、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＡＮキメラレセプター基質を含めることで、そこで、前記ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質が、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側上に組込まれた、蛍光共鳴エネルギー転移フルオロフォアを含むこと、およびセンスＤＮＡ酵素酵素によって、前記レポーター基質を開裂することを含み、それによって、前記レポーター基質の開裂により、蛍光シグナルの増加が産生される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
試料中の対象の、１つの標的核酸配列または多数の標的核酸配列を検出するために使用するためのキットであって、前記プローブの組、前記ヘルパープライマー、前記検出基質
、前記制限酵素、前記ＲＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮａｓｅ  Ｈ、前記ＤＮＡポリメラーゼ、バッファ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅および検出の分野に関する。特には、本発明は、核酸分子を増幅する（すなわち多数のコピーを作成する）ため、および増幅した配列を検出するための方法、組成物およびキットを提供し、標的開始核酸ポリメライゼーション、連鎖反応カスケードおよびＤＮＡ酵素仲介検出が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
多数の方法が、増幅に基づいた感度のよい核酸検出の実行を可能にするように開発されてきた。これらは２つのクラスに分けられ、標的またはシグナル増幅のいずれかが可能になる。標的増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、自律性配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）が含まれる。シグナル増幅技術には、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、ハイブリッド捕獲、および開裂（インベーダーアッセイ）、およびサロゲートマーカーの増幅による核酸標的の測定が含まれる。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、標的またはシグナル増幅のいずれかを実施する方法である（Ｂｉｒｋｅｎｎｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｓｈａｈｗａｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１１７−１２６（１９９１）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：１９９−２０２（１９９３）、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２  ２１−２７（２００１））。
【０００３】
ＰＣＲ法は、未だに最も広く使用されるＤＮＡ増幅および定量法である。しかしながら、一般的に、ＰＣＲは、本技術分野で周知の、高価なサーマルサイクラーの必要性、汚染の起こりやすさ、定量の難しさ、異なるＤＮＡに関する異なる効率での増幅、および多重化の制限のような多数の制限を受ける。
【０００４】
生物学的試料中の、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡレベルの定量的プロファイリングに関する現在の技術には、ｃＤＮＡアレイ（Ｓｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０６１４−１０６１９（１９９４））、または高密度オリゴヌクレオチドアレイ（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０（１９９６））のいずれかの使用が含まれる。ＳｃｈｅｎａらによるｃＤＮＡアレイの場合、アレイの各要素における、単一分子種の検出には、少なくとも１００，０００結合標的分子の存在が必要である。Ｌｏｃｋｈａｒｔらによって使用されたＤＮＡチップアレイの場合、ハイブリッド形成ＲＮＡに関する検出限界は、２０００分子のオーダーである。
【０００５】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、強力な複合体形質の基礎およびファーマコゲノミックス研究の基礎である。しかしながら、多数のＳＮＰの解析は、相応の単純さ、信頼性、および拡張性の、高価ではないＳＮＰ遺伝子型特定法に対する必要性を強調してきた。一般的に、現在の方法は、ゲノムＤＮＡの前増幅、続く、ＤＮＡ開裂、ライゲーション、一塩基伸長またはハイブリダイゼーションのような対立遺伝子識別法でのＳＮＰ遺伝子型特定が必要である。現在の方法は、費用、間違い、試料ＤＮＡの消費、または拡張性の欠如によって制限される（Ｆａｒｕｑｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２００１）２：４）。したがって、感度良く、定量的である、核酸検出方法に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、低濃度で核酸を検出する方法を提供することが、本開示発明の目的である。
【０００７】
測定したシグナルの数が、試料中の標的配列の量に比例し、異なる標的配列に関して測定したシグナルの比が、試料中に存在する異なる標的配列の量の比に実質的に一致する、試料中に存在する特定の標的核酸配列の量を決定する方法を提供することが、本開示発明の他の目的である。
【０００８】
標的遺伝子要素の個々の対立遺伝子を示している標的核酸配列の存在を検出する方法を提供することが、本開示発明の他の目的である。
【０００９】
ハイスループットＳＮＰ遺伝子型決定、ヌクレオチドメチル化の検出、および異なる遺伝子スプライシングのための方法を提供することが、本開示発明の他の目的である。
【００１０】
ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質の、ＤＮＡ酵素仲介開裂による、最終産物検出の方法を提供することが、本開示発明の他の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
核酸を増幅し、検出するための組成物および方法が開示されている。本発明の方法は、「増幅繰り返し鋳型（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）（ＡＲＴ）」プローブと呼ばれる、特別に設計されたオリゴヌクレオチドプローブを使用する。増幅は、多数のコピーの一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）、二本鎖最終産物およびピロホスフェート（ＰＰｉ）の産生を可能にする、組み合わせた指数関数的および直線的増幅（ＣＥＬＡ）を介して実施される。
【００１２】
ＡＲＴプローブ分子は、標的相補部分、鋳型部分、少なくとも１つの酵素作用部分、および３’末端ブロック部分ありまたはなし、を含む、一本鎖または部分的二本鎖直線または環状核酸である。ＡＲＴプローブは、プローブ二本鎖のいくつかの部分を作り出すヘルパープライマーを含みうる。ＡＲＴプローブは、アンチセンスＤＮＡ酵素またはアンチセンスＲＮＡ変酵素を含んでよい。ＡＲＴプローブは、全ての部分を含まなくてよく、さらなる部分を含んでも良い。
【００１３】
酵素作用部分は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含みうる。酵素作用部分は、ＲＮａｓｅ  Ｈ作用配列を含みうる。酵素作用部分は、ヌクレアーゼ消化部位を含んで良く、これは、二本鎖の場合に、プローブの反対の鎖を消化することを支持する。ヌクレアーゼ消化部位には、修飾されたヌクレオチドが含まれて良く、それによって、プローブ上の消化部位が、ヌクレアーゼ開裂に対して抵抗性であり、反対の修飾されていない鎖が、開列に感受性である。修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含んでよい。
【００１４】
酵素作用部分は、ＲＮａｓｅ  Ｈ作用配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、またはＲＮａｓｅ  Ｈ作用配列およびヌクレアーゼ消化部位の組み合わせ、またはヌクレアーゼ消化部位およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、または１つ以上のヌクレアーゼ消化部位の組み合わせを含んでよい。
【００１５】
ヌクレアーゼ消化部位は、制限酵素認識配列および開裂部位を持つ、制限部位を含んで良い。制限部位は、ＩＩＳ型制限酵素部位を含んで良い。ＩＩＳ型制限部位の酵素開裂部位は、標的相補部分上に位置することが好ましい。ＳＮＰ遺伝子型決定、メチル化解析、およびスプライシング解析に関して、ＩＩＳ型制限酵素開裂部位は、ＳＮＰまたは変異部位、メチル化ヌクレオチド、あるいは遺伝子スプライシング部位に相当することがさらに好ましい。ＩＩＳ型制限部位は、ＦｏｋＩ部位であってよい。
【００１６】
プローブは、ヘルパープライマーを含んで良く、そこで、ヘルパープライマーは、プローブの一部分に相補的、または本質的に相補的な少なくとも１つの部分を含む。ヘルパープライマーは、３’末端ブロッキング部分を含み得、それによって、ヘルパープライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない。ヘルパープライマーは、３’末端ブロッキング部分を含まなくて良く、それによって、ヘルパープライマーの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能である。
【００１７】
ヘルパープライマーには、フランキング配列を有するかまたは有さない、酵素作用部分に相補的な配列、またはプローブの酵素作用部分の一部が含まれ得、そのため、ヘルパープライマーとプローブ間のハイブリッド形成によって、酵素作用部分二本鎖または部分的二本鎖が作られる。ヘルパープライマーは、伸長可能であり且つプローブの酵素作用部分の１つに対する配列３’に相補的である、３’末端配列を含みうる。ヘルパープライマーの３’末端配列は、長さ２〜１５ヌクレオチド、または好ましくは３〜１０ヌクレオチド、またはより好ましくは４〜８ヌクレオチドを含んで良い。
【００１８】
ヘルパープライマーは、さらに、標的相補部分を含んで良く、そこでは、ヘルパープライマーに対して相補的な標的領域が、プローブに対して相補的な標的領域に隣接するか、本質的に隣接する。ヘルパープライマーは、３’および５’標的相補部分を含み得、そこで、プローブに対して相補的な標的領域は、ヘルパープライマーに対して相補的な標的領域の中間に位置し、ヘルパープライマーに対して相補的な標的領域に隣接するか、または本質的に隣接する。
【００１９】
プローブの標的相補部分には、対象の標的領域に相補的か、または本質的に相補的な配列が含まれ得、そこで、プローブの標的相補部分は、対象の標的領域にハイブリダイゼーションし、二本鎖となり、それによって、１つまたは２つ以上の、プローブの酵素作用部分が、部分的または完全に機能的である。
【００２０】
酵素作用部分、標的相補部分およびプローブの鋳型部分は、互いに重なって良く、または他の部分内に１つの部分が埋め込まれて良い。
【００２１】
標的相補部分および／または酵素作用部分および／またはプローブの鋳型部分には、修飾されたヌクレオチドが含まれてよく、それによって、修飾されたヌクレオチドは、ヌクレアーゼ開裂に抵抗性である。いくつかの実施形態において、標的がＲＮＡであり、および／または一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）がＲＮＡであり、そしてＲＮａｓｅＨが反応中で使用される場合、標的相補部分および／または酵素作用部分および／または鋳型部分が、キメラＲＮＡおよびＤＮＡを含むことが好ましい。標的またはＳＳＥＰ  ＲＮＡの、ＡＲＴプローブとのアニーリングの後、標的またはＳＳＥＰ  ＲＮＡが完全に消化されないように、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ部分は、ＲＮａｓｅ  Ｈ開裂に抵抗性であり、一方で、ＲＮＡ／ＤＮＡ部位上のＲＮＡが消化され、この消化されたＲＮＡの３’末端が、伸長開始部位として使用される。ＡＲＴプローブ上のＲＮＡ部分が、任意のヌクレアーゼによって消化されないように、修飾されることもまた好ましい。修飾されたヌクレオチドには、ホスホロチオエート結合が含まれてよい。
【００２２】
プローブの鋳型部分は、同じ方向で、２つの同一またはほぼ同一の配列を含んで良く、そこで、２つの同一またはほぼ同一の配列は、少なくとも１つの、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含みうる酵素作用部分、または制限酵素部位によって分離されうる。環状プローブは、他の部分が組み込まれた、１つの鋳型部分を含みうる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ酵素仲介検出が使用される場合、鋳型部分に、Ｄ
ＮＡ酵素に対して相補的な、触媒的に不活性なアンチセンス配列が含まれることが好ましい。ＤＮＡ酵素が、１０〜２３、または８〜１７ＤＮＡｚｙｍｅでありうることが好ましい。
【００２４】
プローブの３’末端ブロック部分は、化学的部分であってよく、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長不可能なプローブの３’末端が作成される。プローブおよび／またはヘルパープライマーの任意の末端が、固体支持体に接着して良い。
【００２５】
試料中の、対象の標的核酸配列または多重標的核酸配列を検出する方法には、以下の、（ａ）プローブまたはプローブの組を、好適なハイブリッド形成条件下で、核酸試料と接触させるステップであって、そこで、プローブの標的相補部分、またはプローブの標的相補部分とヘルパープライマーが、標的配列にハイブリッド形成し、二本鎖になり、それによって、１つもしくは１つ以上または一部の、プローブの酵素作用部分を、部分的にまたは完全に機能的にするステップ；（ｂ）プローブの全ての酵素作用部分を、二本鎖であり且つ完全に機能的にするステップ；（ｃ）一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）を産生するように、二本鎖酵素作用部分を含むプローブを処理するステップ；（ｄ）ＳＳＥＰを遊離プローブにアニーリングさせ、プローブの全ての酵素作用部分を、二本鎖であり且つ完全に機能的にするステップ；（ｅ）（ｃ）と（ｄ）を繰り返し、それによって、プローブを、二本鎖または部分的二本鎖形態に変換し、ＳＳＥＰの多重コピーを繰り返し産生させるステップ；ならびに（ｆ）そのようにして産生された最終産物である、二本鎖最終産物、ＳＳＥＰ、およびピロホスフェート（ＰＰｉ）を、直接的または間接的に検出するステップ、が含まれる。本方法の全てのステップは、単一反応、または別々の反応で実施して良い。
【００２６】
いくつかの実施形態において、標的核酸がＲＮＡであり、ステップ（ａ）が、酵素作用部分の１つであるＲＮａｓｅＨ消化部位を、二本鎖および機能的にする場合、ステップ（ｂ）には、ＲＮａｓｅＨによってＲＮＡ鎖を消化し、部分的に消化された鎖の３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型としてプローブを使用して伸長させることが含まれ、それによって、プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。プローブ上の他の酵素作用部分には、制限部位またはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、あるいは制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーターの両方が含まれて良い。
【００２７】
さらなる実施形態において、部分的に消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれてよい。
【００２８】
いくつかの実施形態において、酵素作用部分の１つが、制限部位であり、プローブの標的相補部分上に位置し、ステップ（ａ）によって、制限部位二本鎖および完全に機能的になる場合、ステップ（ｂ）には、制限酵素によって、制限部位上で、プローブの反対の鎖を消化すること、およびＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型としてプローブを用いて、消化された鎖の３’末端を伸長すること、が含まれて良く、それによって、プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。前記プローブ上の他の酵素作用部分には、他の制限部位、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、または制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方が含まれうる。あるいは、前記制限部位は、プローブ上の酵素作用部分のみでありうる。さらなる実施形態において、消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれて良い。
【００２９】
いくつかの実施形態において、１つの酵素作用部分が、プローブの標的相補部分上に開裂部位、およびプローブの標的相補部分のいずれかの側上に認識部位を持つ、ＩＩＳ型制限酵素部位であり、ステップ（ａ）が、プローブの標的相補部分を二本鎖にし、それによって、ＩＩＳ型制限部位の機能的開裂部位が形成される場合、ステップ（ｂ）に、ヘルパ
ープライマーをプローブにアニーリングさせること、およびＩＩＳ型制限部位の認識配列を二本鎖にすることが含まれる。１つの実施形態において、ヘルパープライマーをプローブにアニーリングし、ＩＩＳ型制限部位の認識配列を二本鎖にすることに、ヘルパープライマーを、隣接配列を有するかまたは有さないＩＩＳ型制限酵素認識配列に直接アニーリングさせ、それによって、ＩＩＳ型制限部位の二本鎖認識配列が形成されることが含まれる。他の実施形態において、ヘルパープライマーのプローブへのアニーリング、およびＩＩＳ型制限部位の認識配列を二本鎖にすることに、ヘルパープライマーの３’末端配列を、ＩＩＳ型制限認識配列の３’配列にアニーリングさせ、鋳型としてプローブを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって、ヘルパープライマーの３’末端配列を伸長させ、それによって、ＩＩＳ型制限部位の二本鎖認識配列が形成されることが含まれる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、プローブの標的相補的部分が、標的配列の遊離３’末端にハイブリダイズする場合、ステップ（ｂ）に、鋳型として、プローブを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的配列の遊離３’末端を伸長させ、それによって、プローブ上の他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になることが含まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、プローブの酵素作用部分に、制限部位が含まれる場合、ステップ（ｃ）に、制限酵素によって、制限部位上のプローブの反対の鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長させること、および消化と伸長を繰りかえし、それによって、ＳＳＥＰ  ＤＮＡの多重コピーが産生されること、が含まれる。さらなる実施形態において、消化された鎖の３’末端を伸長させることにさらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれうる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、プローブの酵素作用部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む場合、ステップ（ｃ）に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用する、ＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写で、それによってＳＳＥＰ  ＲＮＡの多重コピーが産生されることが含まれる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、プローブの酵素作用部分が、制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含む場合、ステップ（ｃ）には、制限酵素によって、制限部位上のプローブの反対鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長させること、消化と伸長を繰り返すこと、が含まれ、それによって、ＳＳＥＰ
ＤＮＡの多重コピーが産生され、またＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用するＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写が含まれ、ＳＳＥＰ  ＲＮＡの多重コピーが産生される。さらなる実施形態において、消化された鎖の３’末端の伸長には、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による鎖置換が含まれうる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＳＳＥＰが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、またはＤＮＡおよびＲＮＡ分子両方である場合に、ステップ（ｄ）に、遊離プローブの配列部位へＳＳＥＰをアニーリングさせること、および鋳型として遊離プローブを用いて、ＳＳＥＰの３’末端を伸長させること、が含まれ、それによって、プローブのすべての酵素作用部分が、二本鎖で機能的になる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＳＳＥＰがＲＮＡ分子である場合、ステップ（ｄ）には、ＳＳＥＰを遊離プローブの配列部分にアニールさせること、ＲＮａｓｅＨによってＳＳＥＰを消化すること、および鋳型として遊離プローブを用いて、部分的に消化されたＳＳＥＰの３’末端を伸長させること、が含まれ、これによって、すべての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、プローブが環状分子である場合、ＳＳＥＰ  ＲＮＡまた
はＤＮＡの配列に、プローブ対して相補的な、１つまたは２つ以上の配列ユニットが含まれ、ステップ（ｄ）に、ＳＳＥＰを、遊離プローブの全体または部分にアニールすることが含まれ、これによって、酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、鋳型部分が、アンチセンスＤＮＡ酵素を含む場合、本方法によって、一本鎖機能的センスＤＮＡ酵素の多重コピーが産生され、一本鎖最終産物の検出のステップ（ｆ）に、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質を反応に加えること（ここで、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質は、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側上に組み込まれた蛍光共鳴エネルギー転移蛍光プローブを含む）およびセンスＤＮＡ酵素によってレポーター基質を開裂させることが含まれ、それによって、レポーター基質の開裂による蛍光シグナルの増加が現れる。
【００３８】
本発明はまた、対象の標的核酸配列または、多重標的核酸配列を検出するためのキットを提供し、該キットは、プローブの組、ヘルパープライマー、検出基質、制限酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰ、他の試薬および取扱説明書を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
種々のプローブの例を、図１、３、５、７、１１、１３、１４および１５で示している。これらは制限として認識されるべきではなく、本発明の精神および目的から逸脱しない限り、任意の変化を実施して良い。
【００４０】
本発明の方法の例を、以下に概略する（図２）。
【００４１】
直線プローブを用いるＣＥＬＡ反応を、図２Ａにて示しており、環状プローブを用いるＣＥＬＡ反応を図２Ｂにて示している。標的核酸が、ＡＲＴプローブの標的相補部分にハイブリダイズする。酵素作用部分は、標的相補部分上に位置する。酵素作用部分は、二本鎖である場合に、プローブの反対の鎖を消化することを支持する、任意のヌクレアーゼ消化部位でありうる。本実施例において、ヌクレアーゼ消化部位は、制限部位であり、修飾されていても良い。あるいは、ヌクレアーゼ消化部位は、プローブ上のヌクレオチド修飾が必要ない、ニッキング制限酵素部位である。ＡＲＴプローブ上の標的鎖が、制限酵素によって消化される。消化された鎖の３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、もしあれば、下流酵素作用部分が、二本鎖になる。消化および伸長が多数回繰り返され、本工程によって、一本鎖末端産物（ＳＳＥＰ）の多数のコピーが産生される。プローブが直線分子である、図２Ａにて示している反応の例において、ＳＳＥＰは、５’鋳型部分配列と、プローブの標的相補部分配列の部分を含む、プローブの制限部位に対する５’配列に対して相補的である。プローブの３’鋳型部分および５’鋳型部分は、同一またはほぼ同一の配列を含むので、ＳＳＥＰの３’末端は、３’鋳型部分に対して相補的である。ＳＳＥＰは、遊離プローブの３’鋳型部分にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが、繰り返しの消化および伸長を誘発するように形成される。プローブが環状分子である、図２Ｂで示している反応の例において、ＳＳＥＰが、ＡＲＴプローブの全配列に対して相補的である。ＳＳＥＰは、遊離ＡＲＴプローブに、完全にまたは部分的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが、繰り返しの消化および伸長を誘発するように形成される。ＳＳＥＰの３’末端、または消化された鎖の３’末端の伸長が、鎖置換活性を持つかまたは他の鎖置換因子を含む、ＤＮＡポリメラーゼによって達成されうることが好ましい。得られた最終産物である、二本鎖ポリヌクレオチド、ＳＳＲＰおよびＰＰｉをついで、検出に供す。
【００４２】
全ての試薬が単一のチューブ内であるので、全ての上記ステップは同時に生じ得、ステ
ップ間の明確な境界はない。ＳＳＥＰにハイブリダイズしていない、遊離ＡＲＴが存在する限り、増幅は指数関数的なままである。一旦すべてのＡＲＴがＳＳＥＰにハイブリダイズしたならば、増幅は直線的になりうる。反応によって、標識および検出可能な、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰｉが蓄積されうる。
【００４３】
本発明の方法の他の例を、以下に概略する（図４）。
【００４４】
直線プローブを用いるＣＥＬＡ反応を、図４Ａにて示しており、環状プローブを用いるＣＥＬＡ反応を図４Ｂにて示している。標的ＲＮＡ配列が、ＡＲＴプローブの標的相補部分にハイブリダイズする。本例において、プローブの標的相補部分がまた、酵素作用部分であるＲＮａｓｅＨ消化部位である。標的相補部分の３’部分は、ホスホロチオエート結合を含みうるリボヌクレオチドによって作成される。二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上の標的ＲＮＡ鎖が、ＲＮａｓｅＨによって消化され、一方で、二本鎖ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド上の標的ＲＮＡ鎖が、ＲＮａｓｅＨ消化に対して抵抗性である。部分的に消化された標的ＲＮＡ鎖の３’末端がＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、下流酵素作用部分が、もしあれば、二本鎖となる。本例において、前記下流酵素作用部分は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたは制限酵素部位を含みうる。下流酵素作用部分が制限酵素部位である場合、反応の次のステップは、最初の例（図２）で記述したのと同様である。下流酵素作用部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである場合、反応の次のステップは、次の例（図６）で記述したのと同様である。
【００４５】
本発明の方法の他の例を、以下に概略する（図６）。
【００４６】
直線プローブを用いるＣＥＬＡ反応を、図６Ａにて示しており、環状プローブを用いるＣＥＬＡ反応を図６Ｂにて示している。ＡＲＴプローブの酵素作用部分の１つが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列が、ＡＲＴプローブの標的相補部分にハイブリダイズされる。ＡＲＴプローブの二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上の標的鎖が、制限酵素またはＲＮａｓｅＨでありうるヌクレアーゼによって消化される。消化された鎖または部分的に消化された鎖の３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、下流酵素作用部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、二本鎖および完全に機能的になる。ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに作用し、多数のＲＮＡ転写物、すなわちＳＳＥＰ  ＲＮＡ配列のコピーが産生される。図６Ａにて、プローブは直線分子であり、ＳＳＥＰ  ＲＮＡは、プローブの５’標的部位配列に対して相補的である。プローブの３’鋳型部分および５’鋳型部分が、同一またはほぼ同一の配列を含むので、ＳＳＥＰの３’末端は、３’鋳型部分に対して相補的である。ＳＳＥＰが、遊離プローブの３’鋳型部分にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが、ＳＳＥＰ  ＲＮＡの繰り返しの転写を誘発するように形成される。図２Ｂでは、プローブが環状分子であり、ＳＳＥＰが、それぞれがＡＲＴプローブの全配列に対して相補的である、１つまたはそれ以上の配列ユニットを含みうる。ＳＳＥＰ  ＲＮＡは、遊離ＡＲＴプローブに完全、または部分的にアニールし、ＳＳＥＰの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが、繰り返しの消化および伸長を誘発するように形成される。あるいは、ＳＳＥＰ  ＲＮＡが、遊離ＡＲＴプローブに完全に、または部分的にアニールし、ついで、ＲＮａｓｅＨによって部分的に消化され、この部分的に消化されたＳＳＥＰの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが、ＳＳＥＰ  ＲＮＡの繰り返しの転写を誘発するように形成される。もし直線または環状ＡＲＴプローブが、制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含み、反応に、相当する制限酵素およびＲＮＡポリメラーゼが含まれる場合、反応によって、ＳＳＥＰ  ＲＮＡとＳＳＥＰ  ＤＮＡの両方が産生され得、ついでこれらが、繰り返し伸長および消化、および繰り返し転写を誘発し得る。ＳＳＥＰの３’末端または消化された鎖の３’末端の伸長が
、鎖置換活性を持つか、または他の鎖置換因子を含む、ＤＮＡポリメラーゼによって達成されうることが好ましい。ＲＮａｓｅＨ活性部位と、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含む環状ＡＲＴプローブで、反応が、相当するＲＮａｓｅＨとＲＮＡポリメラーゼを含む場合、ＡＲＴプローブの全配列に対して相補的な１つまたはそれ以上の配列を含むＳＳＥＰ  ＲＮＡが、遊離ＡＲＴプローブに完全に、または部分的にアニールし、ついで、ＲＮａｓｅＨによって部分的に消化され、その部分的に消化されたＳＳＥＰの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換活性を持つ場合、鋳型として環状プローブを用いる伸長および鎖置換によって、それぞれが、プローブの全配列に対して相補的である、多数の配列ユニットを含む、長い一本鎖最終産物が産生されうる。長い一本鎖最終産物が、遊離プローブにアニールし、したがって、二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが形成され、ＳＳＥＰ  ＲＮＡの繰り返し転写をひき起こす。ついでＳＳＥＰ  ＲＮＡが、遊離ＡＲＴプローブにアニールし、さらなる鎖伸長、置換および転写を誘発する。得られた最終産物、すなわち二本鎖最終産物、一本鎖最終産物およびＰＰｉをついで検出にかける。
【００４７】
本発明の方法の他の例を以下に概略する（図８）。
【００４８】
直線プローブを用いるＣＥＬＡ反応を、図８Ａにて示しており、環状プローブを用いるＣＥＬＡ反応を図８Ｂにて示している。ＡＲＴプローブが、標的相補部分の３’側（図８Ａ）または標的相補部分の５’側（図８Ｂ）上にその認識部位を持ち、標的相補部分上にその開裂部位を持つ、ＩＩＳ型制限部位を含む。ＩＩＳ型制限酵素の開裂部位は、標的鎖の３’ＳＮＰヌクレオチドに相当し、一方、プローブ上の開裂部位が修飾され、開裂に抵抗性である。左手側上のＡＲＴプローブは、対立遺伝子１の配列にマッチする、標的相補部分を含み、右手側上のＡＲＴプローブは、対立遺伝子２の配列にマッチする、標的相補部分を含む（図８Ａ）。標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、ＡＲＴプローブの標的相補部分に、対立遺伝子特異的にハイブリダイズし、一方、ヘルパー−プライマーは、ＡＲＴプローブと標的配列両方にアニールする。ヘルパープライマーにハイブリダイズした標的領域は、ＡＲＴプローブにハイブリダイズする標的領域に連結するか、または本質的に連結する。ＩＩＳ型制限部位に対する３’配列へハイブリダイズする、ヘルパープライマーの３’末端配列（図８Ａ）は短く、２〜１５ヌクレオチドを含み得、好ましくは３〜１０ヌクレオチドを含み、より好ましくは４〜８ヌクレオチドを含む。図８Ａにおいて、ヘルパー−プライマーの３’末端が、鋳型としてＡＲＴプローブを用いた、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、二本鎖機能的ＩＩＳ型制限認識部位が作成される。図８Ｂにて、二本鎖機能的ＩＩＳ型制限認識部位が、ヘルパープライマーとＡＲＴプローブ間のハイブリダイゼーションによって作成される。ＡＲＴプローブの二本鎖標的相補部分上の標的鎖が、ＩＩＳ型制限酵素（たとえばＦｏｋ  Ｉ）によって消化され、一方でＡＲＴプローブ鎖は、修飾されたヌクレオチドのために、開裂に対して抵抗性である。消化された鎖の３’末端は、鋳型としてＡＲＴプローブを用いる、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。消化と伸長を多数回繰り返し、したがって、多数の一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）のコピーが産生される。図８Ａにおいて、プローブは直線分子であり、ＳＳＥＰは、５’鋳型部分配列とプローブの標的相補部分配列の部分を含む、プローブの制限消化部位に対する５’配列に対して相補的である。プローブの３’鋳型部分および５’鋳型部分は、同一またはほぼ同一の配列を含むので、ＳＳＥＰの３’末端は、３’鋳型部分に対して相補的である。ＳＳＥＰは、遊離プローブの３’鋳型部位にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが形成され、繰り返し消化および伸長を誘発する。図８Ｂにおいて、プローブは環状分子であり、ＳＳＥＰは、ＡＲＴプローブの全配列に対して相補的である。ＳＳＥＰは、遊離ＡＲＴプローブに完全または部分的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが形成され、繰り返し消化および伸長が誘発される。ＳＳＥＰの３’末端、または消化された鎖の３’末端の伸長が、鎖置換活性を持つか、他の鎖置換因子を含む、ＤＮＡポリメ
ラーゼによって実施されうることが好ましい。対立遺伝子−特異的ＡＲＴプローブが、異なる鋳型部分を含むので、したがって、対立遺伝子−特異的ＡＲＴプローブによって産生されたＳＳＥＰは異なり、検出法によって区別可能である。好ましい検出法は、次の例で記述しているＳＳＥＰ  ＤＮＡ酵素の使用である。
【００４９】
一本鎖最終産物−ＳＳＥＰの、ＤＮＡ酵素仲介検出に関する、本発明の方法の例を以下に概説する（図１０）。
【００５０】
ＡＲＴプローブの鋳型部分は、ＤＮＡｚｙｍｅの相補（アンチセンス）配列、たとえば１０〜２３ＤＮＡｚｙｍｅを含む。ＣＥＬＡ反応の間、ＳＳＥＰが、ＤＮＡｚｙｍｅの活性（センス）コピーを含んで産生される。ＤＮＡ酵素は、ＲＮＡまたは、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側上に組み込まれた、蛍光共鳴エネルギー転移蛍光プローブを含む、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質に結合する。本レポーター基質の開裂により、ＳＳＥＰの増幅が成功した指標である、蛍光の増加が産生される。
Ｉ．物質
Ａ．標的配列
ＡＲＴプローブおよびヘルパープライマーへのハイブリダイゼーション、および増幅および検出の開始の対象である、標的配列は、任意の核酸であって良い。標的配列は、任意のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、疾患原因微生物ＤＮＡ、任意のウイルスＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどであってよい。標的配列はまた、化学試薬、種々の酵素および物理的曝露によって処置したＤＮＡおよびＲＮＡでありうる。
Ｂ．増幅繰り返し鋳型（ＡＲＴ）プローブ
増幅繰り返し鋳型（ＡＲＴ）プローブは、一般的に２０〜２０００ヌクレオチド、好ましくは３０〜３００ヌクレオチド、もっとも好ましくは４０〜１５０ヌクレオチドを含む、一本鎖、または部分的二本鎖の直線または環状核酸分子である。ＡＲＴプローブの部分は、ＡＲＴを組み合わせた指数関数的および直線的増幅（ＣＥＬＡ）に対して有用にする特定の機能を持つ。ＡＲＴプローブは、３’末端ブロック部分を有するかまたは有さない、標的相補部分、鋳型部分、酵素作用部分を含んで良い。ＡＲＴプローブは、プローブのいくつかの部分を二本鎖にする、ヘルパープライマーを含んで良い。ＡＲＴプローブは、アンチセンスＤＮＡ酵素またはアンチセンスＲＮＡ酵素を含んで良い。ＡＲＴプローブは、全ての部分を含まなくてよく、さらなる部分を含んで良い。
１．標的相補部分
プローブの標的相補部分は、標的相補部分と標的配列間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する、任意の長さでよい。本目的のために、標的相補部分に関して、９〜９０ヌクレオチドの長さが好ましく、１５〜４０ヌクレオチド長がもっとも好ましい。
【００５１】
プローブの標的相補部分は、対象の標的領域に相補的であるか、または本質的に相補的である。選択した対象の標的領域は、任意の望ましい配列であり、ＳＮＰ部位、変異配列、メチル化配列、スプライシング部位、制限部位、および対象の任意の特定の配列を含みうる。
【００５２】
プローブの標的相補部分は、標的とプローブ間の特定のハイブリダイゼーション後に二本鎖になる。プローブの標的相補部分は、対象の標的領域にハイブリダイズし、それによって、１つもしくは２つ以上、または一部分の、前記プローブの酵素作用部分は、部分的に、または完全に機能的である。いくつかの実施形態において、プローブの標的相補部分にハイブリダイズする標的領域が、プローブの酵素作用部分に作用する、消化試薬によって消化されるか、またはニック化される。他の実施形態において、プローブの標的相補部分は、標的配列の遊離３’末端にハイブリダイズし、鋳型として前記プローブを用いる、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、それによって、プローブ上の他の酵素作用部分が
、二本鎖になり、機能的になる。
２．酵素作用部分
ＡＲＴプローブは、少なくとも１つの酵素作用部分を含む。酵素作用部分は、一般的に以下の特徴を持つ：（ａ）一本鎖の時に、通常非機能的であり、完全に二本鎖であるか、または部分的に二本鎖である場合、完全に、または部分的に機能的になる；（ｂ）核酸二本鎖の１つの鎖の消化、たとえばＲＮａｓｅＨ消化部位の消化を支持するか、または、繰り返し消化および伸長、たとえば制限酵素部位を支持するか、または、繰り返しポリメライゼーションポリメライゼーション、たとえばＲＮＡポリメラーゼプロモーターを支持するかのいずれかである。ＡＲＴプローブは通常、繰り返し消化および伸長を支持する少なくとも１つの酵素作用部分を含むことを必要とし得るか、または消化を支持する１つの酵素作用部分、および繰り返しポリメライゼーションを支持する他の酵素作用部分を含むことを必要とし得る。酵素作用部分は、限定はしないが、制限酵素部位、ＲＮａｓｅＨ消化部位、他のヌクレアーゼ消化部位、およびＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んで良い。酵素作用部分は、ＲＮａｓｅＨ作用配列とＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、またはＲＮａｓｅＨ作用配列とヌクレアーゼ消化部位の組み合わせ、またはヌクレアーゼ消化部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、または１つ以上のヌクレオチド消化部位の組み合わせを含みうる。酵素作用部分は、言及した酵素、または同様の活性を持つ他の酵素に関する配列の任意の他の組み合わせを含んで良い。
【００５３】
酵素作用部分は、プローブの任意の位置、たとえば、標的相補部分内、または標的相補部分のいずれかの側面上、または鋳型部分上に位置して良い。
【００５４】
酵素作用部分が、ヌクレアーゼ消化部位を含む場合、プローブのヌクレアーゼ消化部位上の前記ヌクレオチドを、プローブがヌクレアーゼ消化に抵抗性であり、一方でプローブの反対の鎖が、消化に感受性であるように、修飾されていてもよい。ヌクレオチドをヌクレアーゼ開裂に抵抗性にする、ヌクレオチドの修飾の任意の方法、たとえばヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、メチル化ヌクレオチドを使用可能である。ホスホロチオエート化ヌクレオチドが好ましい。あるいは、酵素作用部分が、制限酵素部位、たとえばＮ．Ｂｐｕ１０Ｉ部位、Ｎ．ＢｓｔＳＥ部位をニック化することを含む場合、プローブ配列上のヌクレオチド修飾は必要でない。
【００５５】
いくつかの実施形態において、酵素作用部分は、制限部位を含む（図１および２）。制限部位は、制限酵素認識配列および開裂部位を持つ。ＡＲＴプローブ上の制限開裂部位は、プローブが、ヌクレアーゼ消化に対して抵抗性であるような、修飾ヌクレオチドを含んで良い。ＡＲＴプローブは、標的相補部分内、または標的相補部分のいずれかの側上に位置しうる、１つまたは２つ以上の制限部位を含んで良い。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ＡＲＴプローブは、１つの酵素作用部分として、ＩＩＳ型制限酵素部位を含む（図１Ｄ、１Ｅ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌおよび図７）。ＩＩＳ型酵素が、制限認識部位から離れたいくつかの塩基を切断するので、開裂部位は、プローブの標的相補部分上に位置可能であり、または位置するのが好ましい。プローブの標的相補部分の開裂部位上のヌクレオチドを、プローブの開裂を阻止するために修飾する。ＳＮＰ遺伝子型決定のために、標的分子上の消化部位もまた、ＳＮＰまたは変異部位であることが好ましく、好ましくは、ＩＩＳ型制限酵素が、ＳＮＰヌクレオチドまたは変位ヌクレオチドの３’で開裂する。ヌクレオチドメチル化の検出のために、標的分子上の消化部位もまたメチル化部位であることが好ましい。
【００５７】
機能的であるために、プローブのＩＩＳ型制限部位は、その認識および開裂部位両方に関して、二本鎖形態に変換されなければならない。ＣＥＬＡ反応の開始の時、標的が、プローブへの特異的なハイブリダイゼーションを介して、増幅を開始する。このハイブリダ
イゼーションにより、ＩＩＳ型制限酵素に対する二本鎖開裂部位が作成される。
【００５８】
この反応の同じステージで、ＩＩＳ型制限認識部位は、以下の方式で二本鎖になる。まず、ＩＩＳ型制限認識配列が、ヘルパープライマーにハイブリダイズし（図１Ｄ、１Ｅ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、図７Ａ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、７Ｇ、７Ｈ、７Ｉ、７Ｊ）、それによって、二本鎖になる。第２に、ヘルパープライマーの標的相補配列が、ＡＲＴプローブのハイブリダイゼーション領域に隣接する、標的領域にハイブリダイズし（図７Ｂ、７Ｅ）、ヘルパープライマーの３’末端配列が、ＩＩＳ型制限認識部位に対する３’配列にアニールする。ヘルパープライマーの３’末端が、鋳型としてプローブを用いる、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、機能的二本鎖ＩＩＳ型制限認識部位が形成される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、標的配列がＲＮＡである場合、ＣＥＬＡ反応の開始時に、標的ＲＮＡが、プローブへの特異的なハイブリダイゼーションを介して増幅を開始する（図３、４）。このハイブリダイゼーションにより、二本鎖特異的リボヌクレアーゼに対する、二本鎖機能的酵素作用部分配列がつくられる。たとえば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖上の標的ＲＮＡ配列が、種々の非特異的部位にて、ＲＮａｓｅＨによって消化されうる。１つの実施形態において、標的相補部分の一部（好ましくは３’部分配列）が、ＲＮＡによってつくられうる（図３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ）。標的ＲＮＡ配列とＡＲＴプローブの標的相補部分間のハイブリダイゼーションによって、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを持つ一部分、およびＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを持つ一部分が形成される。ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッド上の標的ＲＮＡは、ＲＮａｓｅＨ開裂に抵抗性であり、したがって、標的ＲＮＡは、ＲＮａｓｅＨにて完全には消化されない。このアプローチにより、ＲＮＡ配列そのままの一部が残り、消化されたＲＮＡの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。ＡＲＴプローブ上のＲＮＡ部分が、ヌクレアーゼによって消化されないように修飾されることがまた好ましい。修飾されたヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を含んで良い。
【００６０】
いくつかの実施形態において、酵素作用部分の１つが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である（図５、６）。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターの配列と、鋳型部分とプロモーターの配列の間に位置する、転写開始領域を含む。プロモーターは、任意の好適なＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターであってよい。ＲＮＡポリメラーゼの例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６からのポリメラーゼである。好ましくはＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ由来ＲＮＡポリメラーゼであり、とりわけＴ７ポリメラーゼである。プロモーター配列が、一般的に特定のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるので、ＡＲＴプローブのプロモーター部位に対する同起源ポリメラーゼが、転写増幅のために使用されるべきである。プロモーター配列は、プローブ中の何処に位置してもよい。プローブが直線の場合、プロモーターは、標的相補部分にすぐに連結し、ＡＲＴプローブの５’末端に向かって転写を促進する方向となる。
３．鋳型部分
ＡＲＴプローブは、少なくとも１つの鋳型部分を含む。ＡＲＴプローブが直線分子の場合、同一、またはほぼ同一の配列を含む、２つの鋳型部分が好ましい。ＡＲＴが環状分子の場合、全ＡＲＴプローブが鋳型として働き、よって、ＡＲＴプローブが、その中に組み込まれた他の機能的部位を持つ、１つの鋳型を含むと認識可能である。鋳型部分は、任意の望ましい長さを持ちうる。鋳型部分は、ＳＳＥＰの多数のコピーを産生するための鋳型として、およびＳＳＥＰアニーリングのための鋳型として、働く。この目的のために、鋳型部分に関して６〜３００ヌクレオチドの長さが好ましく、鋳型部分１５〜１５０ヌクレオチド長がもっとも好ましい。鋳型部分は、任意の望ましい配列を持ちうる。一般的に、鋳型部分の配列は、核酸試料中の任意の配列に有意に類似しない、または、ＣＥＬＡ反応中の他のＡＲＴプローブの配列に有意に類似しないように、選択可能である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、鋳型部分が、標的相補部分と重複してよい（図１Ｆ、図３Ｃ、３Ｄ、図５Ｂ、５Ｃ）。一般的に、２つの鋳型部分間の直線プローブに関して、少なくとも１つの酵素作用部分が存在し、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたは制限部位を含みうる。ＡＲＴプローブの３’領域中の鋳型部位は、３’鋳型部分としてが好ましく、ＡＲＴプローブの５’末端における鋳型部分が、５’鋳型部分として好ましい。５’鋳型部分は通常、ＡＲＴプローブのもっとも５’末端に位置する。３’鋳型部分は、たとえば標的相補部分のいずれかの側（図１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｇ）上、または標的相補部分内（図１Ｆ）の任意の位置に位置する。
【００６２】
いくつかの実施形態（図１０、図１１）において、ＤＮＡ酵素を、一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）を検出するために使用する時、ＡＲＴプローブが、活性ＤＮＡ酵素に相補的な、触媒的に不活性なアンチセンスＤＮＡ酵素配列、たとえば、１０〜２３ＤＮＡｚｙｍｅ、８〜１７ＤＮＡｚｙｍｅ、または他のＤＮＡｚｙｍｅを含む。プローブが直線分子の場合、アンチセンスＤＮＡ酵素配列が、好ましくは、５’鋳型部分または、周辺部分配列を有するかまたは有しない鋳型部分内に位置する。プローブが環状分子の場合、アンチセンスＤＮＡ酵素配列は、プローブの任意の位置で存在しうる。いくつかの実施形態において、ＳＳＥＰが、ＲＮＡ酵素であると設計されたＲＮＡ分子である場合、ＡＲＴプローブは、プローブの鋳型部分中にアンチセンスＲＮＡ酵素を含みうる。
４．３’末端ブロック部分
ＡＲＴプローブが、ポリメラーゼによって伸長不可能であるように、その３’末端でブロッキング基によってブロックされるか、または環状分子であることが好ましい（図１Ｈ、１Ｉ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、図３Ｆ、図５Ｅ、図７Ｅ、７Ｆ、７Ｇ、７Ｈ、７Ｉ、７Ｊ）。ＡＲＴプローブの３’末端のブロックは、本技術分野で公知の任意の方法によって達成可能である。ブロッキング基は、核酸ポリメラーゼによって触媒される核酸ポリメライゼーションを阻害するために、核酸に加えることが可能な化学部位である。ブロッキング基は、一般的には、ヌクレオチドまたはその誘導体を構成するＡＲＴの３’末端に位置する。ブロッキング基を末端３’ＯＨに連結することによって、３’ＯＨ基は、もはや、ポリメライゼーション反応においてヌクレオシド三リン酸を受容するのに有効ではない。
【００６３】
多数の異なる基を、プローブ配列の３’末端をブロックするために加えることが可能である。そのような基の例には、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカン−ジオール残基、ペプチド核酸、および３’ＯＨを欠くヌクレオチド誘導体（たとえばコルジセピン）が含まれる。
【００６４】
ＡＲＴプローブの３’末端はまた、ＣＥＬＡ反応が、固体支持体上で実施可能なように、ガラススライド、ナイロン膜、プラスチック分子のような、固体支持体に接着しうる。５．ＡＲＴプローブの他の部位
特定の実施形態において、ＡＲＴプローブは、結合しない部位から、標識と結合した産物のアフィニティー分離を可能にする、プライマーの５’または３’末端または内部に組み込まれた１つまたはそれ以上の部位を含みうる。好ましい捕獲部分は、特異的に同起源リガンドと相互作用可能なものである。たとえば、捕獲部分には、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが含まれうる。捕獲基の他の例には、リガンド、レセプター、抗体、ハプテン、酵素、抗体またはアプタマーによって認識可能な化学基が含まれる。捕獲部分は、任意の望ましい基質上に固定化可能である。望ましい基質の例には、たとえば粒子、ビーズ、磁気ビーズ、光学的にトラップされたビーズ、マイクロタイタープレート、ガラススライド、紙、試験細片、ゲル、他のマトリックス、ニトロセルロース、ナイロンが含まれる。たとえば、捕獲部分がビオチンの場合、基質には、ストレプトアビジンが含まれうる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ＡＲＴプローブまたはＡＲＴプローブの組が、固体支持
体上に接着し、好ましくは、ＡＲＴプローブの３’末端が、固体支持体に接着する。固体支持体には、オリゴヌクレオチドが結合可能な、任意の固体物質が含まれうる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニル酢酸、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリケイ酸、ポリカルボン酸、テフロン（登録商標）、フルオロ炭素、ナイロン、シリコーンゴム、ポリ無水物、ポリグルコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフィルメラート、コラーゲン、グルコサミノグリカンおよびポリアミノ酸が含まれる。固体状態基質は、薄膜または膜、ビーズ、ボトル、皿、ファイバー、織り線維、成型ポリマー、粒子および微小粒子を含む、任意の有用な形態を持ちうる。固体支持体の好ましい形態は、ガラススライドである。
【００６６】
固体状態基質上に固定化されたＡＲＴプローブによって、特定の標的分子の捕獲および固体状態検出器上の増幅が可能になる。そのような捕獲によって、遺伝子発現プロファイリングおよび多重標的の検出に関する、便利な方法が提供される。たとえば、多重の異なる標的配列に特異的な、ＡＲＴプローブの３’末端を、それぞれ異なるスポットで、ガラススライド上に固定化可能である。標的配列に特異的な最終産物の増幅は、相当する標的配列が、試料中に存在した、ＡＲＴプローブに相当するスポット上でのみ発生する。
【００６７】
オリゴヌクレオチドの、固体状態基質への固定化に関する方法は、よく確立されている。ＡＲＴプローブを、確立された結合方法を用いて、基質に連結可能である。たとえば、好適な接着方法が、Ｐｅａｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）、およびＫｈｒａｐｋｏら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｍｏｓｋ）（ＵＳＳＲ）２５：７１８−７３０（１９９１）にて記述されている。カゼインコートスライド上での、３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定化の方法が、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３（１９９５）によって記述されている。オリゴヌクレオチドの固体状態基質への接着の好ましい方法が、Ｇｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）によって記述されている。
６．ヘルパープライマー
ＡＲＴプローブは、ヘルパープライマーを含み得、これは、前記プローブの一部に対して相補的であるか、または本質的に相補的である、少なくとも１つの部分を含む（図１Ｄ、１Ｅ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、図７）。ヘルパープライマーは、３’末端ブロッキング部分を含み得、それによって、前記ヘルパープライマーの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない（図１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、７Ａ、７Ｇ）。ヘルパープライマーは、３’末端ブロッキング部分を含まなくてよく、それによって、前記ヘルパープライマーの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能である（図７Ｂ）。
【００６８】
ヘルパープライマーは、フランキング配列を有するかまたは有さない、プローブの酵素作用部分あるいは酵素作用部分の一部に対して相補的な配列を含んで良く、それによって、前記ヘルパープライマーと前記プローブ間のハイブリダイゼーションが、酵素作用部分を、二本鎖、または部分的に二本鎖にする（図１Ｄ、１Ｅ、１Ｊ、１Ｋ、１Ｌ、７Ａ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｆ、７Ｇ、７Ｈ、７Ｉ、７Ｊ）。プローブの酵素作用部分または酵素作用部分の一部に相補的なヘルパープライマー上の配列は、プローブとヘルパープライマー間のハイブリダイゼーションを支持し、酵素作用部分を機能的または部分的に機能的にする、任意の長さであり得る。
【００６９】
ヘルパープライマーは、伸長可能であり、プローブの酵素作用部分の１つに対する３’配列に相補的な、３’配列を含んで良い。ヘルパープライマーとプローブ間のハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼによる、前記ヘルパープライマーの３’末端の伸長によって、酵素作用部分を二本鎖、および完全に機能的、または部分的に機能的にす
る（図７Ｂ、７Ｅ）。プローブの１つの酵素作用部分の３’配列に対して相補的である、ヘルパープライマーの３’末端配列は、２〜１５ヌクレオチド、好ましくは３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは４〜８ヌクレオチドの長さを持つ。
【００７０】
ヘルパープライマーは、さらに、少なくとも１つの標的相補部分を含んで良く、これは、前記プローブに対して相補的な標的領域に連結するか、または本質的に連結する標的領域にハイブリダイゼーションする（図１Ｊ、１Ｋ、７Ａ〜Ｇ）。ヘルパープライマーの標的相補部分は、ヘルパープライマーと標的配列間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションを支持する任意の長さでありうる。本目的のために、ヘルパープライマーの標的相補的部位に関して、９〜６０ヌクレオチドの長さが好ましく、１５〜４０ヌクレオチド長がもっとも好ましい。
【００７１】
ヘルパープライマーは、３’および５’標的相補部分の両方を含んで良い。ＡＲＴプローブに対して相補的な標的領域は、ヘルパープライマーに対して相補的な標的領域の中間に位置し、ヘルパープライマーに対して相補的な標的領域に隣接または本質的に隣接する（図７Ｈ〜Ｊ）。
【００７２】
ヘルパープライマーは、ＡＲＴプローブの任意の部位に対して相補的な他の配列を含みうる（図１Ｋ、１Ｌ）。ヘルパープライマーは、ＡＲＴプローブの任意の部位に対して相補的でない可能性のある、他の配列を含んで良い（図７Ｊ）。
【００７３】
ヘルパープライマーは、ＡＲＴプローブおよび／または標的配列に対して効果的にハイブリダイズする限り、任意の長さをもってよい。ヘルパープライマーは、任意の所望のヌクレオチド修飾を含んで良い。
Ｃ．検出標識
ＣＥＬＡを用いて増幅した核酸の検出および定量を助けるために、検出標識を、増幅核酸に直接組み込むことが可能であり、または検出分子に結合可能である。本明細書で使用するところの、検出標識は、直接または間接的に、増幅核酸に連結可能であり、直接的または間接的いずれかで、測定可能、検出可能なシグナルとなる、任意の分子である。核酸へ挿入するか、または核酸もしくは抗体プローブへ結合するための、多くのそのような標識が、当業者に公知である。ＣＥＬＡでの使用に好適な検出標識の例は、放射活性同位体、蛍光分子、燐光性分子、酵素、抗体およびリガンドである。
【００７４】
好適な蛍光標識の例には、制限はしないが、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。コンビナトリアル多重色コーディングのための好ましい蛍光標識は、ＦＩＴＣとシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光団のそれぞれ吸収および放射極大は、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ、５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ、５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ、５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ、６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ、７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ、７７８ｎｍ）であり、したがって、同時の検出が可能である。蛍光標識は、Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏを含む、種々の市販の供給源から得られる。
【００７５】
標識ヌクレオチドは、合成の間に、ＳＥＬＡの産物内に直接組み込むことが可能である
ので、検出標識の好ましい形態である。増幅ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ内に組み込むことが可能である検出標識には、ＢｒｄＵｒｄ（Ｈｏｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））のようなヌクレオチド類似体、ＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））、およびビオチン（Ｌａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））またはジゴキシゲニンのような好適なハプテン（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２））で修飾したヌクレオチドが含まれる。好適な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡのための、好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）であり、ＲＮＡのための、好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｂｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のために、ｄＵＴＰに連結可能である。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン標識プローブの二次検出のための、アビジンまたは抗−ジゴキシゲニン共役物として入手可能である。
【００７６】
ビオチンのような、増幅核酸に組み込むことが可能な検出標識は、つづいて、本技術分野で周知の感度の良い方法を用いて検出可能である。たとえば、ビオチンは、ビオチンに結合し、続いて、好適な基質（たとえば、化学発光基質ＣＳＰＤ：３−（４−メトキシスピロ−［１，２−ジオキセタン−３−２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１．ｓｕｐ．３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸、二ナトリウム、トロピックス社（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．））の化学発光によって検出される、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役物（トロピックス社）を用いて検出出来る。
【００７７】
増幅ＲＮＡの検出での使用のための好ましい検出標識は、アクリジン−エステル標識ＤＮＡプローブ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．、Ａｒｎｏｌｄら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５８８−１５９４（１９８９）によって記述されたような）である。アクリジン−エステル標識検出プローブによって、ハイブリダイズしないプローブが、アルカリで破壊可能であるので、洗浄なしに、増幅ＲＮＡの検出が可能になる（Ａｒｎｏｌｄら（１９８９））。
【００７８】
これらの検出標識の２つまたはそれ以上を組み合わせる分子もまた、考慮される検出標識である。公知の検出標識のいくつかは、開示したプローブ、タグ、および、開示した方法を用いて増幅した核酸を標識し、検出するための方法と共に使用可能である。検出標識によって産生されたシグナルを検出および測定するための方法も、本技術分野で公知である。たとえば、放射活性同位体は、シンチレーション計数、または直接の視覚化によって検出可能であり、蛍光分子は、蛍光分光光度計によって検出可能であり、燐光性分子は、分光光度計、またはカメラでの直接の視覚化によって検出可能であり、酵素は、酵素によって触媒された反応の産物の検出または視覚化によって検出可能であり、抗体は、その抗体に連結する二次検出標識を検出することによって検出可能である。そのような方法は、増幅および検出の開示方法にて、直接的に使用可能である。本明細書で使用するところの、検出分子は、増幅核酸と相互作用し、１つまたはそれ以上の検出標識が結合する、分子である。
Ｄ．レポーター基質
レポーター基質分子は、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側に組み込まれた蛍光共鳴エネルギー転移蛍光団を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラでありうる（Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ  １９９８，３７，１３３３０−１３３４２）。任意の蛍光団および任意のクエンチャーを、任意の望ましい場所で、レポーター基質に組み
込むことができる。１つの例は、レポーターである６−カルボキシフルオレセイン（ＲＡＭ）が、５’末端に組み込まれ、クエンチャーである６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）または４−（４−ジメチルアミノフェニラゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）が、内部に組み込まれる。３’リン酸基のような、任意のブロッキング部分を、反応の間のＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防止するために、３’末端に加えることができる。このレポーター基質の開裂によって、増幅の成功を示す、蛍光の増加が産生される。
Ｅ．ＤＮＡポリメラーゼ
組み合わせた指数関数的および直線的増幅（ＣＥＬＡ）のために、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖に対して相補的な鎖を置換する、すなわち鎖置換が可能であり、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことが好ましい。鎖置換は、１００ヌクレオチド以上、または５０ヌクレオチド以上であり得る、長い配列を持つＳＳＥＰの多数のコピーの合成をするために必要であり得る。しかしながら、３〜５０ヌクレオチドの範囲内であり得る、短いＳＳＥＰの産生のために、鎖置換は必要ではない可能性がある。存在するならば、５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性は、結果として合成された鎖の分解となる。また、開示した方法での使用のためのＤＮＡポリメラーゼは、非常に前進性であることが好ましい。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージ．ｐｈｉ．２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｌａｎｃｏらに付与された、米国特許第５，１９８，５４３号および第５，００１，０５０号）、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ８４：２４７（１９８９））、ファージ．ｐｈｉ．ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８２８７（１９８７））、ＶＥＮＴ．ＲＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：６２３−６２７（１９７４））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ９７：１３−１９（１９９１））、ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｉｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−２７６（１９９４）、修飾Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１５３３０−１５３３３（１９８７）、Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４４７−６４５８（１９８９）、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ．ＴＭ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ  ホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−１５７（１９９５））、Ｂｃａポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）およびＢｓｔ  ポリメラーゼ（ＮＥＢ）である。．ｐｈｉ．２９およびＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼがもっとも好ましい。
【００７９】
鎖置換は、ヘリカーゼのような鎖置換因子の使用を介して促進可能である。ＤＮＡポリメラーゼが鎖置換因子の存在しない場合に、鎖置換を達成しない場合であっても、鎖置換因子の存在下、鎖置換を達成可能な任意のＤＮＡポリメラーゼが、本開示方法での使用に好適であることが考えられる。ＣＥＬＡで有用な鎖置換因子には、限定はしないが、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１２）：７６４８−７６５３（１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ−結合タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（２）：１１５８−１１６４（１９９４））、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（２）：７１１−７１５（１９９３）、Ｓｋａｌｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２２）：１０６６５−１０６６９（１９９４））、一本鎖ＤＮＡポリメラーゼ結合タンパク質（ＳＳＢ；Ｒｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５））、およびウシ甲状腺ヘリカーゼ（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−１３６３５（１９９２））が含まれる。
Ｅ．ＲＮＡポリメラーゼ
インビトロでの転写を実施可能であり、そのプロモーター配列が同定されてきている任意のＲＮＡポリメラーゼが、本開示ＣＥＬＡ法にて使用可能である。複合体要求なしの、安定ＲＮＡポリメラーゼが好ましい。もっとも好ましいのは、特定のプロモーター配列に非常に特異的である（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｍｅｉｒｅｄｏｒｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：６２２３−６２３６（１９８５））、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｄａｖａｎｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：２０３５−２０３９（１９８４））、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｂｕｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５７７２−５７７８（１９８２））である。この特徴を持つ他のＲＮＡポリメラーゼもまた好ましい。プロモーター配列は、一般的に特定のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるので、ＡＲＴプローブは、使用するＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含むべきである。多くのプロモーター配列が公知であり、プロモーター配列が同定された任意の好適なＲＮＡポリメラーゼを使用可能である。
Ｆ．制限酵素およびリボヌクレアーゼ
本開示方法は、二本鎖核酸の１つの鎖を開裂させるための、制限酵素（また、制限エンドヌクレアーゼとも言う）を使用してよい。他の核酸開裂試薬もまた、使用して良い。好ましい核酸開裂試薬は、核酸分子を、配列特異的様式で開裂するものである。多くの制限酵素が公知であり、本開示法とともに使用可能である。制限酵素は一般的に、認識配列と開裂部位を持つ。
【００８０】
いくつかの実施形態において、プローブにハイブリダイズした標的ＲＮＡの消化が、リボヌクレアーゼで実施される。そのようなリボヌクレアーゼは、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上に見られるＲＮＡ鎖を消化する。本発明の実施に有用なそのようなリボヌクレアーゼの例は、ＲＮａｓｅＨである。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ特異的消化酵素であり、非配列特異的様式にて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに見られるＲＮＡを開裂させる。ＥｘｏＩＩＩおよび逆転写酵素のような、他のリボヌクレアーゼおよび酵素が、ＲＮＡ／ＤＮＡ鎖から、ＲＮＡをニックする、または部分的に消化するために好適であり得る。
【００８１】
以上で記述した物質は、本開示方法を実施するために有用なキットとして、好適な組み合わせで、一緒にパッケージ可能である。
ＩＩ  方法
本発明は、組み合わせた指数関数的および直線的増幅を可能にする、特別に設計されたプローブを提供する。本プローブは、直線物質または環状物質である。
【００８２】
組み合わせた指数関数的および直線的増幅（ＣＥＬＡ）の開始は、標的配列と、ヘルパープライマーを含むＡＲＴプローブ間の特異的ハイブリダイゼーションに依存する。標的配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子の存在下、ＡＲＴプローブの標的相補部分が、標的配列にハイブリダイズし、二本鎖になり、機能的または部分的に機能的な酵素作用部分配列を形成し、標的配列に関して、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能であるようにするか、消化試薬によって消化可能、または部分的に消化可能にし、ついで、消化された鎖の３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、他の機能的な酵素作用部分が作成される。続く繰り返しの重合化によって、多数の一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）のコピーが産生され、ついで遊離ＡＲＴプローブにアニールし、新規伸長を開始し、新規ＳＳＥＰが産生される。
【００８３】
直線的増幅は、個々のＡＲＴプローブが、多数のＳＳＥＰのコピーを産生するときに達成される。指数関数的増幅は、遊離ＡＲＴプローブにアニールし、新規ＳＳＥＰ産生が開始する、ＳＳＥＰの繰り返し複製の間に達成される。反応中に遊離ＡＲＴプローブが存在する場合、反応は、指数関数的および直線的増幅が混合し得、一方で全てのＡＲＴ分子が
ＳＳＥＰにハイブリッド形成し、二本鎖になった後に、直線的増幅が主となる。
【００８４】
本開示法にて、核酸増幅に続き、増幅された二本鎖最終産物、一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）およびピロホスフェート（ＰＰＩ）を、蛍光標識の検出、酵素連結検出システム、マイクロアレイハイブリダイゼーション、キャピラリーおよびゲル電気泳動、蛍光偏光、質量分析、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光検出、電気検出および発光検出のような、任意の従来の検出系を用いて検出および定量可能である。
【００８５】
本発明は、ＤＮＡｚｙｍｅを用いる検出方法も提供する。ＡＲＴプローブは、ＤＮＡｚｙｍｅの相補（アンチセンス）配列を含む。増幅の間、一本鎖最終産物が、反応混合液中に含まれるレポーター基質を開裂する、ＤＮＡｚｙｍｅの活性（センス）コピーを含んで、産生される。
【００８６】
ＣＥＬＡ反応の主要なステップを以下に記述している。全てのステップは、単一反応として、単一チューブ内で達成されてよく、または別々の反応として異なるチューブ中で実施され得る。単一反応形式が好ましい。
【００８７】
Ａ．標的特異的ハイブリダイゼーション
ＡＲＴプローブまたはＡＲＴプローブの組、またはＡＲＴプローブの混合物、およびヘルパープライマーを、標的ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方を含む試料とともに、好適なハイブリダイゼーション条件下でインキュベートし、よって、ＡＲＴプローブまたはヘルパープライマーの標的相補部分中に二本鎖ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが形成され、これによって、プローブの酵素作用部分の１つが、部分的または完全に機能的である。１つの酵素作用部分が、標的相補部分内に位置する、制限部位である場合、ハイブリダイゼーションによって、制限部位が二本鎖になり、したがって機能的になる。１つの酵素活性配列が、その開裂部位が、標的相補部分内に位置する、ＩＩＳ型制限部位である場合、ハイブリダイゼーションにより、制限開裂部位が、二本鎖になり、したがって、ＩＩＳ型制限部位が部分的に機能的になる。１つの酵素活性配列が、標的相補部分と重なるＲＮａｓｅＨ作用配列である場合、ハイブリダイゼーションによって、ＲＮａｓｅＨ作用配列が二本鎖になり、したがって、完全に機能的になる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件により、続く増幅が、標的配列とＡＲＴプローブ間の完全なマッチに依存することが可能になり、対立遺伝子識別が達成され得る。
【００８８】
ＣＥＬＡ反応中で使用する場合、ヘルパープライマーが、標的およびＡＲＴプローブ両方にハイブリダイズし得、したがって、標的とプローブ間の特異的ハイブリダイゼーションを促進する。
【００８９】
Ｂ．プローブの全ての活性部分を二本鎖および完全に機能的にする。
【００９０】
いくつかの実施形態において、標的核酸がＲＮＡの場合、ステップ（Ａ）にて、機能的酵素作用部分であるＲＮａｓｅＨ消化部位が形成される（図３、４）。プローブの全ての他の酵素作用部分を、二本鎖および完全に機能的にするために、本ステップには、ＲＮａｓｅＨによってＲＮＡ鎖を消化すること、およびＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型としてプローブを用いて、消化された鎖の３’末端を伸長させること、が含まれ、それによってプローブ上の全ての他の酵素作用部分が二本鎖および機能的になる。プローブ上の他の酵素作用部分が、制限部位またはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、または制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含んで良い。さらなる実施形態において、部分的に消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による鎖置換が含まれ得る。
【００９１】
ＲＮａｓｅＨは、非配列特異的様式にて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中でみられるＲＮＡを開裂する、ＲＮＡ特異的消化酵素である。ＲＮＡ鎖の完全な消化を防止するために、ＡＲＴの標的相補部分の一部分が、ＲＮＡによって作成され（図３Ｄ）、したがって、ＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが、ＲＮａｓｅＨによる消化に抵抗性である。
【００９２】
いくつかの実施形態において、１つの酵素作用部分が、制限部位であり、ＡＲＴプローブの標的相補部分内に位置する場合、ステップ（Ａ）によって、前記制限部位が完全に機能的になる。全てのプローブの他の酵素作用部分を、二本鎖かつ完全に機能的にするために、本ステップに、前記プローブの反対鎖を消化すること、およびＤＮＡポリメラーゼによって鋳型としてプローブを用いて、消化した鎖の３’末端を伸長させること、が含まれ、それによって、プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖かつ機能的になる。前記プローブ上の他の酵素作用部分が、他の酵素制限部位、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、または制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含みうる。あるいは、前記制限部位が、プローブ上のただ１つの酵素作用部分である。さらなる実施形態において、消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらにＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による鎖置換が含まれうる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、酵素作用部分の１つが、プローブの標的相補部分上のＩＩＳ制限部位の開裂部位、およびプローブの標的相補部分のいずれかの側上の、ＩＳ型制限部位の認識部位を持つ、ＩＩＳ型制限部位である場合で、ステップ（ａ）が、プローブの標的相補部分を二本鎖にし、それによって、ＩＩＳ型制限部位の機能的開裂部位が形成される場合、ステップ（ｂ）に、ヘルパープライマーを、プローブへアニールすること、およびＩＩＳ型制限部位の認識配列を、二本鎖にすること、が含まれる。１つの実施形態において、ヘルパープライマーを、プローブにアニーリングすること、およびＩＩＳ型制限部位の認識配列を二本鎖にすることに、ヘルパープライマーを、フランキング配列を有するかまたは有さないＩＩＳ型制限酵素認識配列に直接アニーリングさせ、それによってＩＩＳ型制限部位の二本鎖認識配列が形成される、ことが含まれる。他の実施形態において、ヘルパープライマーをプローブへアニーリングすること、およびＩＩＳ型制限部位の認識配列を二本鎖にすること、に、ヘルパープライマーの３’末端配列を、ＩＩＳ型制限認識配列の３’配列にアニーリングさせること、および鋳型としてプローブを用いることにより、ＤＮＡポリメラーゼによってヘルパープライマーの３’末端配列を伸長させること、が含まれ、それによって、ＩＩＳ型制限部位の二本鎖認識配列が形成される。
【００９４】
遺伝子型決定のため、とりわけＳＮＰまたはヌクレオチドメチル化の遺伝子型決定のため、標的特異的ＡＲＴプローブ、ヘルパープライマー、およびＩＩＳ型制限酵素を、反応中に含める（図８および図１３）。ＩＩＳ型制限酵素を使用する利点は、解析のための標的配列が、任意の特定の配列、たとえば制限酵素部位を含むと制限される必要が無いことである。ユニバーサル制限酵素を、全ての検出反応で使用可能である。ＩＩＳ型制限酵素部位は、通常、ＡＲＴプローブの標的相補部分のいずれかの側上に位置し（図１Ｄおよび１Ｅ、７Ａ、７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄ）、一方、ＩＩＳ型制限開裂部位は、標的相補部分上に位置する。ＩＩＳ型制限が、ＳＮＰヌクレオチド、変位ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、スプライシング連結ヌクレオチドおよび他の対象の特異的ヌクレオチドの３’を開裂することが望ましい。ＩＩＳ型制限酵素の１つが、ＦｏｋＩでありうる。ＦｏｋＩ制限酵素は、ＡＲＴプローブとヘルパープライマーのアニーリング、またはＡＲＴプローブ鋳型上のヘルパープライマーの伸長によって形成される、オリゴデオキシヌクレオチドアダプター−プライマーとともに、先に決定された部位で、ＤＮＡを開裂する。ＡＲＴの標的相補部分が、標的変性ＤＮＡまたはＲＮＡ上の相補配列を選択し、それとハイブリッド形成し、二本鎖開裂部位を形成する。しかしながら、ＦｏｋＩ酵素が、標的鎖を開裂可能である前に、ＡＲＴ上の一本鎖ＦｏｋＩ認識部位は、機能的な二本鎖ＤＮＡに変換しなければならない。これは、ヘルパープライマーによって達成される。いくつかの実施形態に
おいて、ヘルパープライマーの標的相補部分とＡＲＴプローブが、隣接部位にて、標的とハイブリダイズし、ヘルパープライマーのいくつかの部位とＡＲＴプローブが互いにハイブリダイズする。いくつかのさらなる実施形態において、ヘルパープライマーとＡＲＴプローブが、特定の標的の存在下で、互いにアニールするのみであるように、設計される。ヘルパープライマーが、標的配列の存在下で、ＡＲＴプローブにアニールしたのに続いて、ＤＮＡポリメラーゼが、ＡＲＴプローブの鋳型部分を複写することによって、ヘルパープライマーの３’末端を伸長し、二本鎖機能的ＦｏｋＩ認識部位を産生する（図８および１３）。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＲＴの標的相補部分が、任意の供給源からであって良い、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の遊離３’末端にハイブリダイズし、標的の３’末端が、ＡＲＴプローブを鋳型として直接用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されうる。したがって、すべての機能的酵素作用部分が、標的鎖の消化の必要なしに形成される。
【００９６】
いくつかのＣＥＬＡ反応において、高い特異性が、以下の因子によって達成されうる。第１に、ＡＲＴプローブの標的相補部分と、標的配列間の標的特異的ハイブリダイゼーションにより、第１レベルの特性が提供される。第２に、ヘルパープライマーのＡＲＴプローブへのアニーリング、および／または鋳型としてプローブを用いるヘルパープライマーの３’末端の伸長が、ＡＲＴプローブおよびヘルパープライマー両方を含む、標的配列の存在下でのみ実施されうる。第３に、時折、非標的特異的ハイブリダイゼーションがおこる場合、ＩＩＳ型制限酵素（使用する場合）は、開裂部位のミスマッチを開裂しないか、非効率的に開裂し、連鎖反応は起こらない。最後に、非標的特異的ハイブリダイゼーション、およびＩＩＳ型制限酵素によるミスマッチ開裂が起こる場合、ミスマッチヌクレオチドのために、ニック部位の３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない可能性がある。
【００９７】
Ｃ．一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）を産生するための、二本鎖酵素作用部分を含むプローブの処理
いくつかの実施形態において、プローブの酵素作用部分に、制限部位が含まれる場合、ステップ（ｃ）に、制限酵素によって、制限部位上のプローブの反対の鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長すること、および消化と伸長を繰り返すこと、が含まれ、それによって多数のＳＳＥＰ  ＤＮＡのコピーが産生される。さらなる実施形態において、消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれうる。好適なＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素は、材料の項にて記述している。
【００９８】
いくつかの実施形態において、プローブの酵素作用部分に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる場合、ステップ（ｃ）に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用する、ＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写が含まれ、それによって多数のＳＳＥＰ  ＲＮＡのコピーが産生される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、プローブの酵素作用部分が、制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含む場合、ステップ（ｃ）には、制限酵素によって、制限部位上のプローブの反対の鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長させること、消化および伸長を繰り返すこと、が含まれ、それによって、ＳＳＥＰ  ＤＮＡの多数のコピーが産生され、またＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用するＲＮＡポリメラーゼによる転写が繰り返され、それによって、多数のＳＳＥＰ  ＲＮＡのコピーが産生される。さらなる実施形態において、消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれう
る。
【０１００】
Ｄ．ＳＳＥＰの遊離プローブへのアニーリング、および前記プローブの全ての酵素作用部分を二本鎖および完全に機能的にすること
いくつかの実施形態において、ＳＳＥＰが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡ分子両方である場合、ステップ（ｄ）に、ＳＳＥＰを、遊離プローブの配列部分にアニーリングすること、および鋳型として遊離プローブを用いて、ＳＳＥＰの３’末端を伸長することが含まれ、それによってプローブの全ての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。プローブが直線分子である場合、ＳＳＥＰは、５’鋳型部位配列を含む、プローブの酵素作用部分（たとえば制限部位）の１つに対する５’配列に相補的である。プローブの３’鋳型部分および５’鋳型部分が、同一またはほぼ同一の配列を含むので、ＳＳＥＰの３’末端が、３’鋳型部分に対して相補的である。ＳＳＥＰは、遊離プローブの３’鋳型部分にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが形成され、繰り返し消化および伸長が誘発される。プローブが環状分子である場合、ＳＳＥＰは、ＡＲＴプローブの全配列に対して相補的である。ＳＳＥＰは、遊離ＡＲＴプローブに完全に、または部分的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長し、したがって、二本鎖ＡＲＴプローブが形成され、繰り返し消化および伸長が誘発される。ＳＳＥＰの３’末端または消化された鎖の３’末端の伸長は、鎖置換活性を持つか、または他の鎖置換因子を含むＤＮＡポリメラーゼによって達成されうる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、ＳＳＥＰがＲＮＡ分子である場合、ステップ（ｄ）に、ＳＳＥＰを遊離プローブの配列部位にアニーリングすること、ＲＮａｓｅＨによってＳＳＥＰを消化すること、および鋳型として遊離プローブを用いて、部分的に消化されたＳＳＥＰの３’末端を伸長させること、が含まれ、それによって全ての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、プローブが環状分子である場合、ＳＳＥＰの配列に、プローブの全配列に対して相補的な、１つまたは２つ以上の配列ユニットが含まれ、ステップ（ｄ）に、ＳＳＥＰを、遊離プローブの全体または部分にアニーリングすることが含まれ、それによって、酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる。
【０１０３】
プローブが直線分子の場合、ＳＳＥＰが、プローブの３’鋳型部分にアニールし、したがって連鎖反応を誘発する。プローブの３’鋳型部分にアニーリングするＳＳＥＰの可能性は、異なるプローブの設計に依存して、変化する。ＳＳＥＰが、５’鋳型部分領域から産生されるので、ＳＳＥＰが、３’鋳型部分にアニールするよりも好ましく、遊離ＡＲＴプローブの５’鋳型部分にアニールし得る。しかしながら、３’および５’鋳型部分配列が同一である場合、ＳＳＥＰは、両方の部位に等しくアニールし得る。いくつかの場合、３’鋳型部分にアニールする、小さな割合のＳＳＥＰは、連鎖反応カスケードを誘発するのに十分であり得る。
【０１０４】
プローブが、ただ１つの鋳型部分のみを含む、環状分子である場合、ＳＳＥＰは、全環状ＡＲＴプローブに対して相補的である、１つまたはそれ以上の全ユニットを含み得る。環状ＡＲＴプローブに対する、ＳＳＥＰの完全な相補性のために、ＳＳＥＰが、遊離環状ＡＲＴプローブに即座にアニールし得、効果的に連鎖反応を誘発し得る。
【０１０５】
Ｅ．ステップ（Ｃ）および（Ｄ）の繰り返し。それによって、ＡＲＴプローブが、二本鎖または部分的二本鎖形態に変換され、多数のＳＳＥＰのコピーが繰り返し産生される。
【０１０６】
全ての試薬が単一のチューブ内であるので、全ての上記ステップは、同時に起こり得、ステップ間の明確な境界はない。ステップＣおよびＤが、多数回繰り返される。遊離ＡＲ
Ｔプローブが存在する限り、反応が、組み合わせた指数関数的および直線的増幅として残り得る。いったんすべてのＡＲＴプローブがＳＳＥＰにハイブリッド形成されたなら、直線的増幅が主となり得る。反応により、標識および検出可能な、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰｉが蓄積される。
Ｆ．検出
増幅二本鎖最終産物、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰｉを、任意の従来の検出システムを用いて検出および定量可能である。たとえば、二本鎖ＡＲＴおよび一本鎖ＳＳＥＰを、蛍光検出、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー転移、質量分析、電気検出およびマイクロアレイによって検出可能である。とりわけ、二本鎖ＡＲＴを、二本鎖特異的蛍光色素ＳＹＢＲグリーンに結合させることで検出可能である。本発明において、一本鎖ＳＳＥＰを、以下に概略したように、ＤＮＡｚｙｍｅ仲介開裂によって検出する。産生されたＰＰｉを、ＡＴＰに変換可能であり、得られたＡＴＰ濃度を、ホタルルシフェラーゼにて、検出および定量する（図９）。
【０１０７】
ＣＥＬＡ産物を、蛍光ヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン−含有ヌクレオチドまたはブロモデオキシウリジンのような、標識部分を組み込むことによって検出しうる。
【０１０８】
遺伝子発現プロファイリングに関する１つの実施形態において、マイクロアレイ検出システムが使用可能である。ＣＥＬＡを、異なる増幅繰り返し鋳型（ＡＲＴ）プローブの組を用いて多重化し、ここでそれぞれのＡＲＴプローブが、特異的標的遺伝子に対する結合のために設計された、異なる標的相補部分を持ち、それぞれのＡＲＴプローブがまた、マイクロアレイ上の特定のオリゴヌクレオチドに結合するＳＳＥＰのために設計された、異なる鋳型部分を含む。その標的にハイブリダイズ可能であるそのようなＡＲＴプローブのみが、その特異的ＳＳＥＰを産生する。遺伝子発現プロファイリングに関する他の実施形態において、ＡＲＴプローブをマイクロアレイ上にスポットする。ＣＥＬＡ反応の間、二本鎖ＡＲＴがつくられ、種々の検出システムを用いて、検出および定量可能である。検出システムの１つは、リアルタイムにモニタ可能な、ＳＹＢＲグリーン染色を用いるものである。
【０１０９】
Ｇ．一本鎖最終産物−ＳＳＥＰのＤＮＡｚｙｍｅ仲介検出
本発明はまた、最終産物−一本鎖ＳＳＥＰの検出のための、ＤＮＡｚｙｍｅの使用をする（図１０）。ＡＲＴの鋳型部分には、ＤＮＡ酵素の相補（アンチセンス）配列、たとえば１０〜２３  ＤＮＡｚｙｍｅが含まれる。ＣＥＬＡ反応の間、ＳＳＥＰが、ＤＮＡｚｙｍｅの活性（センス）コピーを含んで産生される。ＤＮＡ酵素は、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側上に組み込まれた、蛍光共鳴エネルギー転移蛍光プローブを含む、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質に結合する。このレポーター基質の開裂によって、ＣＥＬＡ増幅の成功を示す、蛍光の増加が起こる。
【実施例１】
【０１１０】
ＤＮＡおよびＲＮＡ単離。ゲノムＤＮＡを、標準の方法を用いて生存マウスより単離した。全ＲＮＡを、供給業者によって推奨されたように、ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ試薬（バイオジェネシス社（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｌｔｄ））を用いて、マウス胸腺および脾臓から単離した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ｍＲＮＡ単離キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いることによって、全ＲＮＡからさらに精製した。
【０１１１】
オリゴヌクレオチドプローブ：ＡＲＴプローブおよびその標的配列β−アクチン遺伝子を、図１１にて、マップ上で示している。ＡＲＴプローブは、５’−ｄＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣｓＡＡＣＡＡＧＣＣｓＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧｐ−３’である。イタリック体ヌクレオチド
は、ＨｉｎｃＩＩ（２８〜３３）およびＮａｅＩ（３６〜４１）認識部位であり、下線ヌクレオチド（３’および５’末端の１５塩基）が、鋳型配列である。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示す。「ｐ」は、３’リン酸を表している。基質プローブは、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド、５’−ｄＣＣＧＧＡＧＡＣＧａｕＧＣＧＴＣＡｐ−３’であり、下の場合、ＲＮＡ塩基である。６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が、ヌクレオチド７にて組み込まれ、クエンチャー４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）が、５’末端からヌクレオチド１３にて組み込まれる。
【０１１２】
ＣＥＬＡ反応条件は以下の通りである。５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．６、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０００ｎＭ  ＡＲＴプローブ、２００ｎＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１００ユニット  ＨｉｎｃＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ユニット  エキソ−Ｋｌｅｎｏｗ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．１ユニット  ＲＮａｓｅＨ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および示した量のマウスｍＲＮＡ。各試料に関して、ＨｉｎｃＩＩ、ＫｌｅｎｏｗおよびＲＮａｓｅＨ以外のすべての試薬を、微小遠心チューブ中で混合し、試料を、３分間、７０℃にて熱し、ついで室温で平衡化した。ついで酵素を、単一量で加え、反応液を５分間、室温に放置した。ついで反応を、示した時間、３７℃にてインキュベートした。産物をゲル電気泳動または蛍光検出にかけた。
【０１１３】
ＣＥＬＡ実験を、ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡ両方からの、マウスβ−アクチン遺伝子を標的とする、同一のＡＲＴプローブを用いて実施した。５ｎｇのマウスｍＲＮＡ含む試料を、異なる時間点の間、ＣＥＬＡ反応にかけた（図１２Ａ）。二本鎖最終産物が、２０分内に検出可能であり、一本鎖最終産物が６０分内にみられる。異なる量のｍＲＮＡを含む試料を、６０分間、ＣＥＬＡ反応にかけた（図１２Ｂ）。二本鎖産物が、１０ｐｇ  ｍＲＮＡを含む反応中で検出される。
【０１１４】
最終産物の１つである一本鎖分子は、基質を触媒することによって検出された、ＤＮＡｚｙｍｅである（図１１）。ＤＮＡｚｙｍｅ酵素は、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側上に組み込まれた、蛍光共鳴エネルギー転移蛍光プローブを含む、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質に結合する。本レポーター基質の開裂によって、ＣＥＬＡの成功を示す、蛍光の増加となる。
【実施例２】
【０１１５】
オリゴヌクレオチドプローブ：ＡＲＴプローブ、ヘルパープライマーおよびその標的配列を、図１３中のマップ上で示している。ｐ４５０標的遺伝子のＣ対立遺伝子に相当する、ＡＲＴプローブＳＮＰ−Ｇは、５’ＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴｓＴｓＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧｐ３’の配列を持つ。ｐ４５０標的遺伝子のＴ対立遺伝子に相当する、ＡＲＴプローブＳＮＰ−Ａは、５’ＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴｓＴｓＣＴＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧｐ３’の配列を持つ。合成標的オリゴは以下である。ＴＡＲＧＥＴ−Ｃは、５’ＣＣＧＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＧｐ３’の配列を持ち、ＴＡＲＧＥＴ−Ｇは、５’ＣＣＧＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＧｐ３’の配列を持つ。ヘルパープライマーは、５’ＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＡ３’の配列を持つ。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を意味する。「ｐ」は、３’リン酸を示している。
【０１１６】
ＣＥＬＡ反応条件は、以下の通りである。５０ｍＭ  リン酸カリウム、ｐＨ７．６、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０００ｎＭ  
ＡＲＴプローブ、２００ｎＭ  各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５０ユニット  ＦｏｋＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ユニット  エキソ−Ｋｌｅｎｏｗ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０〜１００ｎＭ
ヘルパープライマー、および示した量のヒトＤＮＡまたは標的オリゴ。各試料に関して、ＦｏｋＩ、Ｋｌｅｎｏｗを除く全ての試薬を、微小遠心管内で混合し、試料を９５℃または７０℃にて、３分間、加熱し、ついで、室温で平衡化した。ついで酵素を加え、反応液を５分間、室温に放置した。ついで反応液を３７℃にて示した時間、インキュベートした。産物を、ゲル電気泳動または蛍光検出にかけた。
【０１１７】
他の方法によって先にＳＮＰ遺伝子型決定され、ｐ４５０遺伝子座のＣ対立遺伝子にて同型である、ヒトＤＮＡ試料を、ＣＥＬＡ実験で使用した。ゲル電気泳動によって、５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたときに、３０分の時点で、二本鎖最終産物を検出可能であった。特異性試験によって、ＤＮＡ鋳型またはヘルパープライマーまたはＦｏｋＩまたはＫｌｅｎｏｗいずれかが反応中で欠けた場合に、ＣＥＬＡ反応が起こらなかったことが示された。合成標的オリゴヌクレオチドを、感度試験のために使用し、ＣＥＬＡが、３時間反応中で、わずか０．１ａｍｏｌ標的を検出可能であった。ＳＮＰ遺伝子型決定反応によって、対立遺伝子特異的プローブが、その相当する標的とのみ反応することが示された。
【実施例３】
【０１１８】
オリゴヌクレオチドプローブ：ＡＲＴプローブおよびその標的配列を、図１４にて示している。ＡＲＴ−Ｔ７は、５’ＧＣＣＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＧＣＡＣｓＡｓＵｓＧｓＣｓＣｓＧｓＧＣＡＡＵＧＣＣＧｐ３’の配列を持つ。３’末端の１５ヌクレオチド（４９〜６３）は、ＲＮＡヌクレオチドである。１６〜３３の間の１８ヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列である。３’および５’末端両方の１５ヌクレオチドは、鋳型部分配列である。標的相補部分配列が、３４〜５５の間のヌクレオチドである。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を意味する。「ｐ」が、３’リン酸を示している。
【０１１９】
ＣＥＬＡ反応条件は以下の通りである。１×転写バッファ、１０００ｍＭ  ＡＲＴプローブ、５μＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２ｍＭ各ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、２００ユニット  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、０．１ユニット  ＲＮａｓｅＨ、１ユニット  エキソ−Ｋｌｅｎｏｗ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、および種々の量の標的ＲＮＡ。各試料に関して、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＫｌｅｎｏｗおよびＲＮａｓｅＨを除く全ての試薬を、微小遠心管中で混合し、試料を７０℃にて３分間熱し、ついで、室温にて平衡化した。ついで酵素を加え、反応液を５分間、室温にて放置した。ついで、反応液を、３７℃にて、示唆した時間、インキュベートした。産物をゲル電気泳動または蛍光検出にかけた。
【０１２０】
全マウスＲＮＡを、ＣＥＬＡ実験で、鋳型として使用した。結果によって、全ての成分が反応液中に含まれたときに、ＣＥＬＡが特異的に起こったこと、および１ｎｇ全ＲＮＡ試料中で、標的ＲＮＡが検出されたことが示された。
【実施例４】
【０１２１】
オリゴヌクレオチドプローブ：環状ＡＲＴプローブは、配列５’ｐＧＧＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴｓＴｓＣＴＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＴＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＡ３’を持つ直線オリゴヌクレオチド、および配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＡｐ３’の配列を持つヘルパープライマー間のハイブリダイゼーション、およびライゲーションによってつくられた。全ての他のオリゴヌクレオチドは、実施例２で示したのと同一のものである。
【０１２２】
ＣＥＬＡ反応条件は、実施例２で記述した通りであり、同様の実験を実施した。ＣＥＬＡ反応がうまくいくことを、ゲル電気泳動、および蛍光のリアルタイム検出でモニタした。
【０１２３】
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術用語および科学用語は、本開示発明が属する当業者に一般的に理解されるのと同様の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様または等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験で使用可能であるけれども、好ましい方法、器具および材料は記述したようなものである。本明細書で引用された全ての発行物が、本明細書で参考として援用される。
【０１２４】
本明細書で記述した本発明の特定の実施形態に対する多くの等価なものが、当業者によって認識され得、または日常実験の域を出た実験を用いることなく確定可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、種々の増幅繰り返し鋳型（ＡＲＴ）プローブの例のダイアグラムである。標的配列を、表示されたように示す；プローブの種々の部分、修飾領域およびヘルパープライマーを、最初のいくつかのプローブのダイアグラムで示したように、種々の図で表しており、これらは、残りのプローブダイアグラムで同様の意味を持つと認識されるべきである。
【図２】図２は、ＣＥＬＡ反応の例のダイアグラムである。直線プローブを用いるＣＥＬＡを、図２Ａに示し、環状プローブを用いるＣＥＬＡを、図２Ｂに示している。標的核酸が、ＡＲＴプローブの標的相補部分にハイブリダイズする。ＡＲＴプローブ上の標的鎖がヌクレアーゼによって消化される。消化された鎖が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、それによって、下流酵素作用部分が存在する場合、二本鎖となる。続く繰り返しポリメライゼーションの後、多数のＳＳＥＰのコピーが産生され、ついで遊離ＡＲＴプローブにアニールし、新規ポリメライゼーションが開始され、新規ＳＳＥＰが産生される。得られた最終産物である、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰＩを、ついで検出に供す。
【図３】図３は、種々の増幅繰り返し鋳型（ＡＲＴ）プローブの例のダイアグラムである。標的ＲＮＡ配列およびプローブの種々の部分を、表示されたように示す。
【図４】図４は、ＣＥＬＡ反応の例のダイアグラムである。直線プローブを用いるＣＥＬＡを図４Ａに示し、環状プローブを用いるＣＥＬＡを図４Ｂに示している。標的ＲＮＡ配列が、ＡＲＴプローブの標的相補部分にハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上のＲＮＡ鎖が、ＲＮａｓｅＨによって部分的に消化される。部分的に消化された鎖が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、それによって、下流酵素作用部分が存在する場合、二本鎖になる。続く繰り返しポリメライゼーションの後に、多数のＳＳＥＰのコピーが産生され、ついで遊離ＡＲＴプローブにアニールし、新規ポリメライゼーションが始まり、新規ＳＳＥＰが産生される。得られた最終産物である、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰＩを、ついで検出に供す。
【図５】図５は、種々のＡＲＴプローブの例のダイアグラムである。ＡＲＴプローブは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含む。
【図６】図６は、ＣＥＬＡ反応の例のダイアグラムである。直線プローブを用いるＣＥＬＡを図６Ａに示し、環状プローブを用いるＣＥＬＡを図６Ｂに示している。標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列が、ＡＲＴプローブの標的相補部分にハイブリダイズし、ＡＲＴプローブに、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が含まれる。二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッド上の標的鎖が、酵素的消化によって消化される。ＤＮＡポリメラーゼによって、消化鎖の３’末端が伸長する。一旦プロモーター配列が二本鎖になったならば、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに作用し、多数のＲＮＡ転写物、すなわちＳＳＥＰ  ＲＮＡ配列のコピーが産生され、ついでＡＲＴプローブにアニールし、新規伸長が開始され、新規ＳＳＥＰが産生される。得られた最終産物である、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰＩをついで検出に供す。
【図７】図７は、ＡＲＴプローブの例のダイアグラムである。ＡＲＴプローブは、１つの酵素作用部分として、ＩＩＳ型制限部位を含む。
【図８Ａ】図８は、ＳＮＰ遺伝子型決定のための、ＣＥＬＡ反応の例のダイアグラムである。直線プローブを用いるＣＥＬＡを図８Ａに示している。標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列は、ＡＲＴプローブの標的相補部分に、対立遺伝子特異的にハイブリダイズされ、一方で、ヘルパー−プライマーが、ＡＲＴプローブと、ＡＲＴプローブのハイブリダイゼーション領域に隣接する、標的領域両方にアニールする。図８Ａにて、ヘルパー−プライマーの３’末端が、ＡＲＴプローブを鋳型として使用する、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、したがって、二本鎖機能的ＩＩＳ型制限認識部位が産生される。
【図８Ｂ】図８は、ＳＮＰ遺伝子型決定のための、ＣＥＬＡ反応の例のダイアグラムである。環状プローブを用いるＣＥＬＡを図８Ｂに示している。図８Ｂにて、二本鎖機能的ＩＩＳ型制限認識部位が、ヘルパープライマーとＡＲＴプローブの間のハイブリダイゼーションによって作られる。ＡＲＴプローブの二本鎖標的相補部分上の標的鎖が、ＩＩＳ型制限酵素（たとえば、ＦｏｋＩ）によって消化され、一方で、ＡＲＴプローブ鎖が、修飾ヌクレオチドによって、開裂に抵抗性である。消化された鎖の３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長する。続く繰り返し消化および伸長を介して、多数のＳＳＥＰのコピーが産生され、ついでこれらが遊離ＡＲＴプローブにアニールし、新規伸長、消化が始まり、新規ＳＳＥＰが産生される。得られる最終産物である、二本鎖ポリヌクレオチド、一本鎖ＳＳＥＰおよびＰＰＩを、ついで検出に供す。
【図９】図９は、検出方法の例を示す図である。
【図１０】図１０は、一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）のＤＮＡｚｙｍｅ仲介検出の例のダイアグラムである。ＡＲＴプローブの鋳型部分には、ＤＮＡｚｙｍｅの相補（アンチセンス）配列、たとえば１０〜２３ＤＮＡｚｙｍｅが含まれる。ＣＥＬＡ反応の間、ＳＳＥＰが、ＤＮＡｚｙｍｅの活性（センス）コピーを含んで産生される。ＤＮＡ酵素が、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの鎖上に組込まれた、蛍光共鳴エネルギー転移蛍光プローブを含む、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質に結合する。本レポーター基質の開裂によって、標的開始一本鎖ＳＳＥＰの増幅が成功したことを示す、蛍光の増加が引き起こされる。
【図１１】図１１は、ＡＲＴプローブ配列、その標的配列ベータ−アクチン遺伝子、および反応最終産物の構造を示しているダイアグラムであり、詳細は実施例１にて記述している。イタリック体塩基は、ＨｉｎｃＩＩおよびＮａｅＩ認識部位であり、下線塩基は、鋳型配列である。「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を示している。
【図１２】図１２は、実施例１の反応産物のゲル電気泳動の結果である。
【図１３】図１３は、ＦｏｋＩ部位、ヘルパープライマー配列および標的配列を含む、ＡＲＴプローブ配列を示しているダイアグラムである。詳細は実施例２にて記述している。
【図１４】図１４は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、ＡＲＴプローブ配列、およびその標的配列を示しているダイアグラムである。詳細は、実施例３にて記述している。
【図１５】図１５は、環状ＡＲＴプローブ配列、ヘルパープライマー配列および標的配列を示しているダイアグラムであり、詳細は、実施例４にて記述している。
【図１−１】
2006504436.tif 000003
【図１−２】
2006504436.tif 000004
【図２】
2006504436.tif 000005
【図３】
2006504436.tif 000006
【図４】
2006504436.tif 000007
【図５】
2006504436.tif 000008
【図６】
2006504436.tif 000009
【図７】
2006504436.tif 000010
【図８Ａ−１】
2006504436.tif 000011
【図８Ａ−２】
2006504436.tif 000012
【図８Ｂ】
2006504436.tif 000013
【図９】
2006504436.tif 000014
【図１０−１】
2006504436.tif 000015
【図１０−２】
2006504436.tif 000016
【図１１】
2006504436.tif 000017
【図１３】
2006504436.tif 000018
【図１４】
2006504436.tif 000019
【図１５】
2006504436.tif 000020
【図１２】
2006504436.tif 000021
【配列表】
2006504436000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖または部分的に二本鎖の核酸を含むプローブ分子であって、前記プローブが、３’末端ブロック部分を含むかまたは含まない、標的相補部分、鋳型部分、少なくとも１つの酵素作用部分を含み、前記鋳型部分が、２つの同一またはほぼ同一の配列を含み、前記プローブが直線である場合に、少なくとも１つの酵素作用部分によって分離されている、プローブ分子。
【請求項２】
前記一本鎖または部分的二本鎖核酸が直線分子である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記一本鎖または部分的二本鎖核酸が環状分子である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記プローブが環状プローブであって、前記環状プローブが、１つの鋳型部分を含む、請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
前記酵素作用部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記酵素作用部分が、ＲＮａｓｅＨ作用配列である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
前記酵素作用部分が、ヌクレアーゼ消化部位を含み、前記ヌクレアーゼ消化部位が、二本鎖の場合に、前記プローブの反対の鎖を消化することを支持する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項８】
前記少なくとも１つの酵素作用部分が、制限酵素部位を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項９】
前記酵素作用部分が、ＲＮａｓｅＨ作用配列およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わせ、またはＲＮａｓｅＨ作用配列および前記ヌクレアーゼ消化部位の組み合わせ、あるいは前記ヌクレアーゼ消化部位およびＲＮＡポリメラーゼプロモーターの組み合わ
せ、または１つ以上の前記ヌクレアーゼ消化部位の組み合わせを含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記ヌクレアーゼ消化部位に、修飾されたヌクレオチドが含まれ、それによってプローブ上の前記消化部位が、ヌクレアーゼ開裂に抵抗性であり、反対の修飾されていない鎖が開裂に感受性である、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記修飾されたヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合を含む、請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記ヌクレアーゼ消化部位が、制限酵素認識配列および開裂部位を有する制限部位を含む、請求項７に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記制限部位が、ＩＩＳ型制限酵素部位を含む、請求項１２に記載のプローブ。
【請求項１４】
前記ＩＩＳ型制限部位の酵素開裂部位が、標的相補的部位上に位置する、請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１５】
前記ＩＩＳ型制限酵素開裂部位が、ＳＮＰ部位、変異ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチドまたはスプライシング部位に相当する、請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記ＩＩＳ型制限部位が、ＦｏｋＩ部位である、請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１７】
ヘルパープライマーを含み、そこで前記ヘルパープライマーが、少なくとも１つ、前記プローブの一部分に相補的かまたは本質的に相補的な部分を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１８】
前記ヘルパープライマーが、３’末端ブロッキング部分を含み、それによって、前記ヘルパープライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項１９】
前記ヘルパープライマーが、３’末端ブロッキング部分を含まず、それによって、前記ヘルパープライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能である、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２０】
前記ヘルパープライマーが、フランキング配列を有するかまたは有さない酵素作用部分に対して、または前記プローブの酵素作用部分の部分に対して相補的な配列を含み、それによって、前記ヘルパープライマーと前記プローブ間のハイブリダイゼーションによって、酵素作用部分が、二本鎖または部分的二本鎖になる、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２１】
前記ヘルパープライマーが、前記プローブの酵素作用部分の１つに対する３’配列に相補的な３’末端配列を含む、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２２】
前記ヘルパープライマーがさらに、標的相補部分を含み、そこで、前記ヘルパープライマーに相補的な前記標的領域が、前記プローブに相補的な標的領域に、隣接するか、または本質的に隣接する、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記ヘルパープライマーが、３’および５’標的相補部分を含み、前記プローブに相補的な標的領域が、前記ヘルパープライマーに相補的な標的領域の中間に位置するか、または前記ヘルパープライマーに相補的な標的領域に隣接するかもしくは本質的に隣接する、
請求項２２に記載のプローブ。
【請求項２４】
前記標的相補部分が、対象の標的領域に相補的であるか、または本質的に相補的である配列を含み、それによって、前記プローブの前記標的相補部分が、対象の前記標的領域にハイブリッド形成し、二本鎖となり、それによって、１つまたは２つ以上の、前記プローブの酵素作用部分の部分が、部分的または完全に機能的である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記プローブの前記酵素作用部分、前記標的相補部分および前記鋳型部分が、互いに重なり合うか、または１つの部分が、他の部分内に組み込まれる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記プローブの前記標的相補部分、および／または前記酵素作用部分、および／または前記鋳型部分が、修飾されたヌクレオチドを含み、それによって修飾されたヌクレオチドが、ヌクレアーゼ開裂に抵抗性である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記プローブの前記標的相補部分、および／または前記酵素作用部分および／または前記鋳型部分が、キメラＲＮＡおよびＤＮＡを含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記プローブが、環状プローブの任意の位置で、または直線プローブの周辺部分配列を有するかまたは有さない５’鋳型部分内で、ＤＮＡ酵素に相補的な、触媒的に不活性なアンチセンス配列を含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ酵素が、１０〜２３ＤＮＡｚｙｍｅである、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ酵素が、８〜１７ＤＮＡｚｙｍｅである、請求項２８に記載のプローブ。
【請求項３１】
前記３’末端ブロック部分が、化学的部分であり、それによって、プローブの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能ではない、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３２】
前記プローブおよび／またはヘルパープライマーの任意の末端が、固体支持体上に接着する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３３】
試料中の対象の標的核酸配列または多重標的核酸配列を検出する方法であって、以下のステップ：
（ａ）好適なハイブリダイゼーション条件下で、以上の請求項の任意の１つにしたがった、プローブまたはプローブの組を、核酸試料と接触させるステップであって、そこで、前記プローブの標的相補部分、または前記プローブとヘルパープライマー（存在する場合）両方の標的相補部分が、標的配列とハイブリッド形成して二本鎖になり、それによって、１つまたは２つ以上または一部の、前記プローブの酵素作用部分が、部分的または完全に機能的になるステップ；
（ｂ）前記プローブの全ての酵素作用部分を、二本鎖かつ完全に機能的にするステップ；（ｃ）一本鎖最終産物（ＳＳＥＰ）を産生するように、二本鎖酵素作用部分を含む前記プローブを処理するステップ；
（ｄ）前記ＳＳＥＰを遊離プローブにアニールさせ、前記プローブの全ての酵素作用部分を二本鎖にし且つ完全に機能的にするステップであって、前記遊離プローブは、工程（ａ）で使用されたのと同じプローブであるステップ；
（ｅ）ステップ（ｃ）と（ｄ）を繰り返すステップであって、それによって、前記プローブが、二本鎖または部分的二本鎖形態に変換され、前記ＳＳＥＰの多重コピーが、繰り返し産生されるステップ；および
（ｆ）そのようにして産生された最終産物である、二本鎖最終産物、ＳＳＥＰおよびピロホスフェート（ＰＰｉ）を、直接的または間接的に検出するステップを含む方法。
【請求項３４】
前記方法が、単一の反応または別々の反応で実施される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的核酸がＲＮＡであり、前記ステップ（ａ）が、酵素作用部分の１つであるＲＮａｓｅ  Ｈ消化部位を、二本鎖および機能的にし、前記ステップ（ｂ）に、ＲＮａｓｅ  ＨによってＲＮＡ鎖を消化し、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型として前記プローブを用いて、部分的に消化された鎖の３’末端を伸長することが含まれ、それによって、前記プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記部分的に消化された鎖の３’末端を伸長することに、さらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子によって、鎖置換することが含まれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記プローブ上の前記他の酵素作用部分に、制限部位またはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、または制限酵素とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方が含まれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記酵素作用部分の１つが制限部位であり、前記プローブの標的相補部分上に位置し、前記ステップ（ａ）が、前記制限部位を、二本鎖および完全に機能的にし、前記ステップ（ｂ）が、制限酵素によって、前記制限部位上で、前記プローブの反対鎖を消化すること、およびＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型として前記プローブを用い、消化された鎖の３’末端を伸長することを含み、それによって、前記プローブ上の全ての他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
消化された鎖の３’末端の前記伸長がさらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による鎖置換を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プローブ上の前記他の酵素作用部分が、制限部位またはＲＮＡポリメラーゼプロモーター、または制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記制限部位が、前記プローブ上の唯一の酵素作用部分である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記酵素作用部分の１つが、ＩＩＳ型制限部位であり、前記ＩＩＳ型制限部位の開裂部位が、前記プローブの標的相補部分上に位置し、前記ＩＩＳ型制限部位の認識部位が、前記プローブの標的相補部分の他の側上に存在し、ステップ（ａ）が、前記プローブの標的相補部分が二本鎖にし、それによって、前記ＩＩＳ型制限部位の機能的開裂部位が形成され、前記ステップ（ｂ）が、ヘルパープライマーを前記プローブにアニーリングすること、および前記ＩＩＳ型制限部位の前記認識配列が、二本鎖になることが含まれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヘルパープライマーの前記プローブへのアニーリング、および前記ＩＩＳ型制限部位の前記認識配列を二本鎖にすることが、前記ヘルパープライマーを、フランキング配列を有するかまたは有さない前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列に直接的にアニーリングさせることを含み、それによって、前記ＩＩＳ制限部位の二本鎖認識配列部位が形成される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヘルパープライマーの前記プローブへのアニーリング、および前記ＩＩＳ型制限部位の前記認識配列を二本鎖にすることが、前記ヘルパープライマーの３’末端配列を、前記ＩＩＳ制限認識配列の３’配列に対してアニーリングすること、および、鋳型として前記プローブを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって、前記ヘルパープライマーの３’末端配列を伸長させること、を含み、それによって、前記ＩＩＳ型制限部位の二本鎖認識配列が形成される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ステップ（ａ）にて、前記プローブの標的相補部分が、標的配列の遊離３’末端にハイブリッド形成し、前記ステップ（ｂ）が、鋳型として前記プローブを用い、ＤＮＡポリメラーゼによって、標的配列の前記遊離３’末端を伸長することを含み、それによって、前記プローブ上の他の酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
前記プローブの前記酵素作用部分に、制限部位が含まれ、前記ステップ（ｃ）に、制限酵素によって、前記制限部位上の前記プローブの反対の鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長すること、および前記消化と前記伸長を繰り返すことが含まれ、それによって、多数のＳＳＥＰ  ＤＮＡのコピーが産生される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
消化された鎖の３’末端の前記伸長に、さらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記プローブの前記酵素作用部分に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれ、前記ステップ（ｃ）に、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用する、ＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写が含まれ、これによって、多数のＳＳＥＰ  ＲＮＡのコピーが産生される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
前記プローブの前記酵素作用部分が、制限部位とＲＮＡポリメラーゼプロモーター両方を含み、前記ステップ（ｃ）が、制限酵素によって、前記制限部位上の前記プローブの反対の鎖を消化すること、ＤＮＡポリメラーゼによって、消化された鎖の３’末端を伸長させること、前記消化と前記伸長を繰り返すことを含み、それによって、多数のＳＳＥＰ  ＤＮＡ中のコピーが産生されること、また、前記ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作用するＲＮＡポリメラーゼによる繰り返し転写を含み、これによって多数のＳＳＥＰ  ＲＮＡのコピーが産生される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
消化された鎖の３’末端の前記伸長に、さらに、前記ＤＮＡポリメラーゼまたは他の鎖置換因子による、鎖置換が含まれる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＳＳＥＰが、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、またはＤＮＡおよびＲＮＡ分子両方であり、前記ステップ（ｄ）が、前記ＳＳＥＰを、遊離プローブの配列部位にアニーリングすること、および鋳型として前記遊離プローブを用いて前記ＳＳＥＰの３’末端を伸長することを含み、それによって、前記プローブのすべての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＳＳＲＰがＲＮＡ分子であり、前記ステップ（ｄ）が、前記ＳＳＥＰを遊離プローブの配列部位にアニーリングすること、ＲＮａｓｅ  Ｈによって前記ＳＳＥＰを消化すること、および鋳型として前記遊離プローブを用いて、部分的に消化されたＳＳＥＰの３’末端を伸長させることを含み、それによってすべての酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３３に記載の方法。
【請求項５３】
前記プローブが、環状分子であり、前記ＳＳＥＰの配列が、前記プローブに相補的である、１つまたは２つ以上の配列ユニットを含み、ステップ（ｄ）が、前記ＳＳＥＰを、前記遊離プローブの全体または一部にアニーリングさせることを含み、それによって前記酵素作用部分が、二本鎖および機能的になる、請求項３３に記載の方法。
【請求項５４】
前記鋳型部分が、アンチセンスＤＮＡ酵素を含み、前記方法が、多数の、一本鎖機能的センスＤＮＡ酵素酵素のコピーを産生し、一本鎖最終産物の検出の前記ステップ（ｆ）が、反応中に、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＡＮキメラレセプター基質を含めることで、そこで、前記ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラレポーター基質が、ＤＮＡｚｙｍｅ開裂部位のいずれかの側上に組込まれた蛍光共鳴エネルギー転移蛍光プローブを含むこと、およびセンスＤＮＡ酵素によって前記レポーター基質を開裂することを含み、それによって、前記レポーター基質の開裂により、蛍光シグナルの増加が産生される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５５】
試料中の対象の、１つの標的核酸配列または多数の標的核酸配列を検出するために使用するためのキットであって、請求項１〜３２のいずれか１項で定義したような前記プローブの組、前記ヘルパープライマー、前記検出基質、前記制限酵素、前記ＲＮＡポリメラーゼ、前記ＲＮａｓｅ  Ｈ、前記ＤＮＡポリメラーゼ、バッファ、ｄＮＴＰ、ＮＴＰを含む、キット。
【国際調査報告】
2006504436.tif 000022
2006504436.tif 000023
2006504436.tif 000024