(57)【要約】本発明は、改善された癌細胞特異性と活性を有する転写調節配列およびこれを含む組み換えベクターに係り、さらに詳しくは、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターに関するものである。
2006520585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、転写調節配列。
【請求項２】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、１つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の転写調節配列。
【請求項３】
ｃ−Ｍｙｃ結合部位が、配列番号２、配列番号３または配列番号４よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の転写調節配列。
【請求項４】
Ｓｐ１結合部位が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の転写調節配列。
【請求項５】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターの５'−末端または３'−末端に、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結されることを特徴とする、請求項１に記載の転写調節配列。
【請求項６】
前記転写調節配列が配列番号１３の核酸配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載の転写調節配列。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写調節配列が、ウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項８】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ(adenoviridiae)属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項７に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項９】
前記ウィルスの複製に必要な遺伝子が、アデノウィルスの初期遺伝子であることを特徴とする、請求項７または８に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１０】
前記アデノウィルスの初期遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子であることを特徴とする、請求項９に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１１】
前記アデノウィルスが、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子の欠失しているものであることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１２】
前記組み換えウィルスベクターが、ＫＣＣＭ−１０４７０であることを特徴とする、請求項１１に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項１４】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１５】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項１３に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１６】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのＥ１遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製不能であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１７】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのＥ３遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製可能であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１８】
治療学的トランス遺伝子がＥ１Ａ遺伝子の代わりに導入され、アデノウィルスのＥ１およびＥ３電子が除去されたことを特徴とする、請求項１４に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換え非ウィルスベクター。
【請求項２０】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組み換え非ウィルスベクター。
【請求項２１】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１９または２０に記載の組み換え非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２４】
（ａ）ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項２５】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項２４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２６】
（ａ）ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項２７】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項２６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２８】
（ａ）ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、改善された癌細胞特異性と活性を有する転写調節配列およびこれを含む組み換えベクターに係り、さらに詳しくは、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列、および前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
アデノウィルスは、生体内・外遺伝子伝達効率が高く、細胞分裂状態を問わずに遺伝子の伝達と発現が可能であり、高い力価のウィルスに生産されるうえ、ヒトに癌を誘発しないという様々な利点が浮彫りとなるにつれて、癌を対象疾患とする遺伝子治療にその使用頻度が大きく増加している(Graham, F.L. ‘Adenovirus vectors for high-efficiency gene transfer into mammalian cells.’ Immunol. Today, 2000,21,426-8; Castell, J.V. et al. ‘Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes: analysis of the biochemical functionality of transduce cells.’ Gene Ther., 1997,4,455-64)。癌は、遺伝子療法(gene therapy)で治療する場合、長期的で持続的な治療遺伝子の発現を必要とせず、ウィルスによって誘導される宿主の免疫反応が大きく問題とならないかまたは寧ろ長所になることもある。このため、アデノウィルスが癌治療用遺伝子伝達体として脚光を浴びている。
【０００３】
ところが、既存の癌治療用組み換えアデノウィルスは、大部分が増殖不可能な第１世代ウィルスであって、これらを遺伝子伝達体として用いる場合は、一次感染細胞または極めて一部の周辺細胞にのみ抗癌効果を誘発することができて、臨床的な実用性の面では多くの制約がある(Vile, R.G. et al. ‘Cancer gene therapy: hard lession and new courses.’ Gene Ther., 2000,7,2-8; Paillard, F. Cancer gene therapy annual conference. 1997: trends and news, Hum. Gene Ther., 1998,4,283-6; Lattime, E.C. et al. ‘Selectively replicating viruses as therapeutic agents against cancer.’ in: D.  Kirn (Ed), Gene therapy of cancer, Academic Press, New York, 1999,235-50)。
【０００４】
これを克服することが可能な一方案として、癌細胞でのみ選択的に増殖して癌細胞を殺傷する腫瘍細胞特異増殖および細胞殺傷組み換えアデノウィルスに対する研究がＭｃＣｏｒｍｉｃｋの研究チームによって最初報告され以来、腫瘍細胞特異殺傷アデノウィルスの可能性が多角度から研究されている(Bischoff, J.R. et al. ‘An adenovirus mutant that replicates selectively in P53-deficient human tumor cells.’ Science, 1996,18,274(5286),373-6; Heise, C. et al. ‘ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents.’ Nat. Med., 1997,3(6),639-45)。腫瘍殺傷アデノウィルス伝達体は、一次感染細胞の細胞殺傷のみならず、これによるウィルスの増殖によって周辺の腫瘍細胞も二次的に感染させることになり、その治療効果がドミノ現象の如く広がり続けて治療効果を著しく増大させることができるうえ、周辺の正常細胞では腫瘍殺傷アデノウィルスの増殖が抑制されるのでアデノウィルスに対する毒性を減少させるという長所ももっている。
【０００５】
腫瘍特異的増殖可能アデノウィルスは、大きく２つの方法で開発されている。第１の方法によれば、腫瘍または組織特異的プロモーターを用いて、癌組織内でのみアデノウィルスの複製に必須的な蛋白質Ｅ１Ａの発現を制限することにより、腫瘍特異的増殖機能アデノウィルスを開発することができる。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚの研究チームは、１９９７年に前立腺癌で選択的に発現される前立腺特異抗原(prostate-specific antigen：ＰＳＡ)のプロモーター(promoter)／エンハンサー(enhancer)部位を、Ｅ１Ａ遺伝子のアップストリーム(upstream)に位置した内在プロモーターと置換して挿入することにより、ＰＳＡの発現がたくさん起こる前立腺癌細胞内でのみ選択的にアデノウィルスが複製されるようにすることができることを報告した(Rodriguez, R. et al. ‘Prostate attenuated replication competent adenovirus (ARCA) CN706: a selective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancer cells.’ Cancer Res., 1997,1,57(13),2559-63)。このような前立腺癌特異的増殖可能アデノウィルスＣＮ７０６（Ｃａｙｌｄｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、現在開発した前立腺癌患者を対象として第１相臨床実験が行われている。また、前立腺癌特異的エンハンサー部位をアデノウィルス初期遺伝子Ｅ１Ｂのアップストリームにも挿入してアデノウィルスの２種の初期遺伝子（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）の発現をＰＳＡの発現程度に応じて調節できるようにして、さらに前立腺癌特異的増殖アデノウィルスを開発する研究も行われている(Yu, D.C. et al. ‘Identification of the transcriptional regulatory sequences of human kallikrein 2 and their use in the construction of cyldon virus 764, an attenuated replication competent adenovirus for prostate cancer therapy.’ Cancer Res., 1999,1,59(7),1498-504)。この他にも、ＡＦＰ(alpha-fetorprotein)、 ＣＥＡ(carcinoembryonic antigen)およびＭＵＣ−１のように特定の癌細胞でのみ活性化される遺伝子のプロモーターを用いて腫瘍特異的増殖アデノウィルスを開発している(Kanai, F. et al. ‘Gene therapy for alpha-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Hepatology, 1996,53,963-7; Marshall, J.F. et al. ‘Tissue specific promoters in targeting systemically delivered gene therapy.’ Semin. Oncol., 1996,23,154-8; Osaki, T. et al. ‘Gene therapy for carcinoembryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type specific expression of herpes simplex virus thymidine kinase gene.’ Cancer Res., 1994,54,5258-61; Kurihara, T. et al. ‘Selectivity of a replication-competent adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUC1 antigen.’ J. Clin. Invest., 2000,106,763-71)。
【０００６】
腫瘍特異的増殖アデノウィルスを開発するための第２の方法として、正常細胞ではウィルス複製を活発に起こすのに必須的であるが、癌細胞では必須的ではないアデノウィルス遺伝子の機能を選択的に消失させることにより、腫瘍特異的に増殖が可能なアデノウィルスを開発する方法が試みられている(Whyte, P. et al. ‘Cellular targets for transformation by the adenovirus E1A proteins.’ Cell, 1989,56,67-75; Fueyo, J. et al. ‘A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti-glioma effect in vivo.’ Oncogen., 2000,19,2-12)。１９９６年にＢｉｓｃｈｏｆｆ研究チームは、腫瘍抑制蛋白質ｐ５３と結合してこれを不活性化させる機能をするアデノウィルス初期遺伝子Ｅ１Ｂ５５ｋＤの消失されたアデノウィルスがｐ５３機能の喪失された癌細胞でのみ特異的に増殖することができることを最初に報告した。野生型アデノウィルスが正常細胞を感染させると、感染した細胞は腫瘍抑制蛋白質ｐ５３を活性化させてウィルスの増殖を抑制するが、この際、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ蛋白質がｐ５３蛋白質に結合してｐ５３の機能を抑制する役割をし、これにより野生型アデノウィルスは活発に増殖をして究極的に感染細胞の殺傷を誘導する(Yew, P.R. et al. ‘Adenovirus E1B oncoprotein tethers a transcriptional repression domain to p53.’ Genes, 1994,8,190-202; Dobner, T. et al. ‘Blockage by adenovirus E4 or F6 of transcriptional activation by the p53 tumor suppressor.’ Science, 1996,7,272(5267),1470-3.)。しかし、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の消失された組み換えアデノウィルスが正常細胞を感染させると、これらの細胞に在るｐ５３による非活性化を誘導することができなくてウィルスの増殖が抑制されるが、ｐ５３の機能が抑制されている各種癌細胞では、ウィルスの増殖が活発に起こって究極的に感染細胞の殺傷を誘導する。これに基づいて本発明者が製造した、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の消失された腫瘍特異的殺傷アデノウィルスＹＫＬ−１は、既存の１世代アデノウィルスである複製不能アデノウィルスより形質導入の側面において著しく優れており、多種の人体癌細胞株に対する特異的殺傷能力を持つことが検証された(Lee, H. et al. ‘Oncolytic potential of E1B55kDa-deleted YKL-1 recombinant adenovirus: Correlation with p53 functional status.’ Int. J. Cancer, 2000, 88,454-63)。
【０００７】
ところが、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子は、ｐ５３を不活性化させる機能の他にも、アデノウィルスｍＲＮＡの細胞質への移動およびアデノウィルスの構成蛋白質の合成を促進する重要な機能をするので、効率的なアデノウィルス複製に必須的である。したがって、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の消失された複製可能アデノウィルスは、癌細胞内におけるウィルス増殖が制限されて発生するしかないため、細胞殺傷能が低下し、これによる生体内抗腫瘍効果が減少する。これを補完するために、本発明者は、アポトーシス(apoptosis)抑制役割をするアデノウィルスのＥ１ｂ１９ｋＤの消失されたＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスを製作し、細胞殺傷能が一層増加でき且つ生体内抗腫瘍効果を増大できることを報告した(Kim, J. et al. ‘Evaluation of E1B gene attenuated replicating adenoviruses for cancer gene therapy.’ Cancer Gene Therapy, 2002,9,725-736)。しかし、アデノウィルスの複製を効果的に起こすために再導入したＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子によって、アデノウィルスの増殖による細胞死は増加したが、癌細胞特異的複製能は消失したので、これを対象とする遺伝子治療に利用するためには腫瘍特異性を与える必要性があることが確認された。
【０００８】
ヒトのテロメア逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）は、染色体複製の間にテロメア(telomere)の長さを一定に保つことに関与する酵素テロメラーゼの構成要素であって、細胞老化、癌、細胞不滅に関与するものと知られている(Counter, C.M. et al. ‘Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cell which express telomerase activity.’ EMBO J. 1992,11,1921-29; Kim, N.W. et al. ‘Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.’ Science, 1994,21,66,2011-5; Harley, C.B. et al. ‘Telomeres shorten during aging of human fibroblasts.’ Nature, 1990,345,458-60)。テロメラーゼの活性は、ヒトの場合、卵素と睾丸の生殖細胞およびリンパ球から観察されているが、その他の正常体細胞では観察されていない(Wright, W.E. et al. ‘Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells.’ Dev. Genet. 1996,18,173-9)。したがって、正常体細胞は、制限された回数の細胞分裂後にはテロメアの長さが一定の長さ以下に減少してそれ以上分裂せずに死滅する(Yasumoto, S. et al. ‘Telomerase activity in normal human epithelial cells.’ Oncogene. 1996,13,433-9)。これに対し、癌進行前段階である陽性腫瘍細胞および癌細胞では、テロメラーゼの活性が増加する(Broccoli, D. et al. ‘Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1995,92,9082-6.)。卵素癌においてテロメラーゼの活性増加が最初に報告された以後、血液癌、胃癌、肺癌、肝癌、大腸癌、脳癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌など殆ど全ての人体癌からテロメラーゼの活性増加が観察されている(Counter, C.M. et al. ‘Telomerase activity in human ovarian carcinoma.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1994,91,2900-4; Counter, C.M. et al. ‘Stabilization of short telomeres and telomerase activity accompany immortalization of Epstein-Barr virus-transformed human B lympho-cytes.’ J. Virol., 1994,68,3410-4; Shay, J.W. et al. ‘A survey of telomerase activity in human cancer.’ Eur. J. Cancer, 1997,33,787-91; Harle-Bachor, C. et al. ‘Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes.’ Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA. 1996,93,6476-81)。
【０００９】
テロメラーゼの機能に必須的な役割をするｈＴＥＲＴの発現は、テロメラーゼの活性と関連しおり、最近は、テロメラーゼの発現がｈＴＥＲＴプロメーターの活性、すなわちｈＴＥＲＴのｍＲＮＡの量に応じて調節されることが明らかになった。ｈＴＥＲＴの活性を調節するための最小のプロモーターの大きさは１８１ｂｐであり、野生型ｈＴＥＲＴプロモーターには２つのｃ−Ｍｙｃ結合部位と５つのＳｐ１結合部位が含まれている。正常細胞に比べて癌細胞で著しく高く発現される発癌蛋白質(oncoprotein)ｃ−ＭｙｃおよびＳｐ１と前記結合部位との結合はｈＴＥＲＴのプロモーターを活性化させることが報告された。また、１９９９年、Ｔａｋａｋｕｒａ研究チームは、ｃ−Ｍｙｃの過多発現によってｈＴＥＲＴプロモーターの活性が増加することを観察した(Cerni, C. ‘Telomeres, telomerase, and myc.’ An update. Mutat. Res., 2000,462,31-47; Greenberg, R.A. et al. ‘Telomerase reverse transcriptase gene is a direct target of c-Myc but is not functionally equivalent in cellular transformation.’ Oncogene, 1999,18,1219-26; Takakura, M. et al. ‘Cloning of human telomerase reverse transcriptase gene promoter and identification of proximal core promoter essential for transcriptional activation of hTERT in immortalized and cancer cells.’ Cancer Res., 1999,59,551-9)。
【００１０】
Ｓｈｏｊｉ研究チームは、ｈＴＥＲＴプロモーターを用いて癌細胞特異的遺伝子発現を誘導してカスパーゼ−８(Caspase-8)のようなアポトーシス(apoptosis)を誘導する毒性遺伝子を癌細胞でのみ発現させることができた(Shoji, K. et al. ‘A novel telomerase-specific gene therapy: gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter.’ Human Gene Therapy, 2000,11,1397-406.)。ところが、ｈＴＥＲＴプロモーターのみでは十分な癌細胞特異性を達成するのに限界があった。
【００１１】
〔発明の要約〕
本発明者は、かかる問題点を改善するために、ｈＴＥＲＴプロモーターにｃ−Ｍｙｃ結合部位および／またはＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を製造し、これを導入した組み換えベクター、特に組み換えアデノウィルスベクターを製造するに至った。
【００１２】
一つの観点として、本発明は、ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列に提供する。
【００１３】
他の観点として、本発明は、前記転写調節配列に作動可能に連結された任意の遺伝子を含む組み換えベクターを提供する。
【００１４】
別の観点として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の観点として、本発明は、（ａ）前記組み換えベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００１６】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、ヒトテロメア逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターに、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位(binding site)および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を提供する。本発明は、一つの様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに１つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を提供する。
【００１７】
一般に、転写調節配列(transcriptional regulatory sequence)は、これに作動可能に連結された遺伝子の転写を調節する配列を総称するもので、代表的な例にはプロモーターおよびエンハンサーが含まれる。ところが、本発明の明細書において、転写調節配列は、プロモーターとして用いられることが好ましく、よって前記転写調節配列が任意の遺伝子の転写を調節するためには互いに隣接して位置しなければならない。本発明の実施例において、ｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターは、本発明に係る転写調節配列の一様態として提供される。
【００１８】
本発明では、ｈＴＥＲＴプロモーターとしてヒトゲノム由来の野生型ｈＴＥＲＴプロモーター（配列番号１）を用いることが最も好ましいが、哺乳動物から由来したＴＥＲＴ(telomere reverse transcriptase)プロモーターだけでなく、生物学的機能が維持される範囲内で変異された、人工的に合成されたＴＥＲＴプロモーターも利用できる。用語「生物学的機能が維持される範囲」とは、あるＴＥＲＴプロモーターにＲＮＡポリメラーゼだけでなく、ｃ−Ｍｙｃ発癌蛋白質およびＳｐ１蛋白質が結合でき、これに作動可能に連結された任意の遺伝子の発現を誘導することが可能な状態を意味する。例えば、前記ｈＴＥＲＴプロモーター内に本来含有されたｃ−Ｍｙｃ結合部位またはＳｐ１結合部位は、当業界に公知されているその他のｃ−Ｍｙｃ結合部位またはＳｐ１結合部位と置換できる。
【００１９】
一方、ｈＴＥＲＴプロモーターは、当業界に公知されている方法を用いると容易に製造できるが、例えばヒトのゲノムを鋳型とし、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行い、あるいは自動ＤＮＡ合成器（例えば、バイオサーチ、アプライドバイオシステムＴＭなどから購入可能なもの）を用いれば製造することができる。
【００２０】
前記「ｃ−Ｍｙｃ結合部位」は、ｃ−Ｍｙｃ発癌蛋白質が結合するオリゴヌクレオチドであって、ｃ−Ｍｙｃ結合部位のコンセンサス配列は、ｃａｃｇｔｇ（配列番号２）である。本発明に係る転写調節配列には、ｃ−Ｍｙｃ発癌蛋白質が結合する全ての公知配列が導入できる。そのようなｃ−Ｍｙｃ結合部位は、多数存在し、例えばｃａｃｇｃｇ（配列番号３）、ｃａｔｇｃｇ（配列番号４）などがある。
【００２１】
また、前記「Ｓｐ１結合部位」は、Ｓｐ１発癌蛋白質が結合するオリゴヌクレオチドであって、Ｓｐ１結合部位のコンセンサス配列は、ｇｇｇｃｇｇ（配列番号５）である。本発明に係る転写調節配列には、Ｓｐ１発癌蛋白質が結合する全ての公知配列が導入できる。そのようなＳｐ１結合部位は、多数存在し、例えばｃｃｇｃｃｃ(配列番号６)、ｃｔｃｃｇｃｃｔｃ（配列番号７）、ｃｃｃａｇｃｃｃｃ（配列番号８）、ｇｇｇｃｇｇ（配列番号５）、ｇｇｇｇｃｇｇ（配列番号９）、ｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃ（配列番号１０）などがある。
【００２２】
本発明の明細書で使用された用語「コンセンサス配列(consensus sequence)」とは、同一ではないが関連している多数の配列の定義に用いられるヌクレオチド配列であり、コンセンサス配列のそれぞれの位置は実際配列のその位置で最も頻繁に発見されるヌクレオチドを示す。
【００２３】
本発明に係る転写調節配列において、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列は、ｈＴＥＲＴプロモーターの５−末端または３−末端に連結され、あるいはｈＴＥＲＴプロモーターの生物学的機能が維持される範囲内でｈＴＥＲＴプロモーターの内部に含まれることもある。しかし、本発明においてｃ−Ｍｙｃ結合部位および／またはＳｐ１結合部位を含む核酸配列は、ｈＴＥＲＴプロモーターの３末端に連結されることが好ましい。一方、ｈＴＥＲＴプロモーターとｃ−Ｍｙｃ結合部位および／Ｓｐ１結合部位を含む塩基配列との連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプタ(oligonucleotide adaptor)またはリンカー(linker)を使用する。
【００２４】
本発明に係る転写調節配列は、これに作動可能に連結された任意の遺伝子を癌細胞でのみ特異的に高効率で発現することができるため、癌治療を目的とする遺伝子ビヒクル(vehicle)として、通常用いられるベクターに全て導入できる。ここで、ベクターは、ウィルスベクターおよび非ウィルスベクターを含む。
【００２５】
したがって、本発明は、一つの様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターを提供する。このようなウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に自分を複製することにより、癌細胞を高効率で殺傷することができる。また、本発明は、他の様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターを提供する。
【００２６】
このようなウィルスベクターは、複製不能のものと複製可能のものの両方ともを含む。複製不能組み換えウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に治療学的トランス遺伝子を発現することにより、癌を治療することができるが、これに対し、複製可能組み換えウィルスベクターは、ウィルスの複製による細胞殺傷効果および治療学的トランス遺伝子の発現による細胞殺傷効果が共に誘導されることにより、抗癌効果が倍加できる。さらに、本発明は、別の様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターを提供する。このような非ウィルスベクターは、癌細胞または正常細胞に導入された後、癌細胞でのみ特異的に治療学的トランス遺伝子を発現することにより、癌を治療することができる。
【００２７】
本発明の明細書において、用語「ウィルス」は、「ウィルスベクター」と同一に使用されており、蛋白質合成またはエネルギー生成メカニズムを持っていない絶対的な細胞内寄生物質(obligate intracellular parasite)を総称する。ウィルスゲノムは、脂質膜からなる蛋白質成分のコーティング構造体内に含有されたＲＮＡまたはＤＮＡである。本発明の実施に有用なウィルスの例としては、バキュロビリジアエ(baculoviridiae)、パルボビリジアエ(parvoviridiae)、ピコルノビリジアエ(picornoviridiae)、ヘルペスビリジアエ(herpesviridiae)、ポックスビリジアエ(poxviridiae)、アデノビリジアエ(adenoviridiae)、ピコトルナビリジアエ(picotrnaviridiae)などが挙げられる。用語「組み換えウィルス」は、キメラウィルス（またはマルチマウィルス）、すなわち一つ以上のウィルスサブタイプから由来した相補的なコード配列を用いて作製されたベクターを含む(Feng et al. Nature Biotechnology, 15, 866-870)。
【００２８】
本発明の明細書において、用語「非ウィルスベクター」は、前述したウィルスベクターを除いた、通常遺伝子治療療法で使用される全てのベクターを意味し、そのような例には、真核細胞で発現可能な各種プラスミッドおよびリポソームなどがある。
【００２９】
本発明の明細書において、用語「作動可能に連結された(operably linked)」は、核酸配列間の結合が機能的に連関していることを意味する。任意の核酸配列が作動可能に連結される場合は、任意の核酸配列が他の核酸配列と機能的に関連性を持つように位置している場合である。本発明において、任意の転写調節配列が任意の遺伝子の転写に影響を及ぼす場合、前記転写調節配列が前記遺伝子と作動可能に連結されているという。
【００３０】
本発明の明細書において、用語「ウィルスの複製に必要な遺伝子」はウィルスのゲノムを構成する全ての遺伝子を意味し、これらは初期遺伝子と後期遺伝子に分類される。初期遺伝子は、ウィルス増殖過程の初期、特にウィルスゲノムの複製が開始されるまでの間に発現が始まるウィルス遺伝子であって、ウィルスゲノムの複製に関係する。初期遺伝子中のあるものは、宿主細胞のメカニズムをそのまま利用してその情報がＲＮＡに転写されるが、あるものは初期遺伝子産物の一部が生成されなければ転写されない。このように初期遺伝子の中でも漸進的な情報発現が起こり、特にウィルスの感染後に宿主酵素によって直ちに転写される遺伝子を前初期遺伝子(very early gene)とも呼ぶ。後期遺伝子は、宿主細胞にウィルスが感染するとき、ウィルスゲノムの複製が開始された後に発現されるウィルス遺伝子であって、外殻蛋白質の構造を決定する遺伝子である。
【００３１】
本発明の明細書において、用語「治療学的トランス遺伝子(therapeutic transgene)」は、癌細胞内で発現されて治療学的効果を示すヌクレオチド配列を意味し、腫瘍抑制因子遺伝子、免疫調節遺伝子（サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子、補助刺激因子(costimulatory factor)（Ｂ７.１やＢ７.２などのＴ細胞活性に必要な補助分子）、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親−細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子などを含み、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の明細書において、用語「腫瘍抑制因子遺伝子(tumor suppressor gene)」は、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制することができあるいは細胞死滅を誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。本発明の実施に有用な腫瘍抑制因子遺伝子には、ｐ５３遺伝子、Ｒｂ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al., Nature, 1987, 329,642) 、ＭＭＡＣ−１遺伝子、大腸線種様ポリポーシス蛋白質(adenomatous polyposis coli protein) (Albertsen et al., 米国特許公報ＵＳ５,７８３,６６６号)、欠損した結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１.３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci., 1998, USA 95,3042-3047)、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子およびＶＨＬ遺伝子が含まれる。
【００３３】
本発明の明細書において、用語「抗原性遺伝子(antigenic gene)」は、標的細胞内で発現されて免疫システムで認識できる細胞表面抗原性蛋白質を生産するヌクレオチド配列を意味する。このような抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原(carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ)、ＰＳＡ(prostate specific antigen)、ＡＦＰ(a-feto protein)、ｐ５３(Levine, A. 国際特許出願公開ＷＯ９４／０２１６７号)が含まれる。免疫システムが容易に認識するようにするため、前記抗原性遺伝子をＭＨＣ第Ｉ型抗原に結合させることができる。
【００３４】
本発明の明細書において、用語「細胞毒性遺伝子(cytotoxic gene)」は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００３５】
本発明の明細書において、用語「細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)」は、細胞内で発現されて細胞周期途中で細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合蛋白質遺伝子、サイクリン依存性キナーゼインヒビターをコードする遺伝子（例えばｐ１６、ｐ１５、ｐ１８およびｐ１９）、成長中止特異性ホメオボックス(growth arrest specific homeobox、ＧＡＸ)遺伝子（国際特許出願公開ＷＯ９７／１６４５９号およびＷＯ９６／３０３８５号）などがあり、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明の明細書において、「サイトカイン遺伝子(cytokine)」は、細胞内で発現されてサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。このようなサイトカインの例には、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン（特に、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロンα、β、γ（特に、インターフェロンα−２ｂ）およびインターフェロンα−２α−１のような融合体などが含まれる。
【００３７】
本発明の明細書において、用語「ケモカイン遺伝子(chemokine gene)」は、分裂促進活性、化学走性活性または炎症活性を有する細胞から放出される、構造的に関連性のある低分子量のサイトカイングループを意味する。主に、これらは４つの保存されたシステイン残基を共有する７０〜１００個のアミノ酸残基からなる陽イオン性蛋白質である。これらの蛋白質は、２つのアミノ末端システインの間隔を基準として２つのグループに区分することができる。第１グループでは１つの残基（ｃｙｓ−ｘ−ｃｙｓ）だけ離れており、第２グループでは直接隣接している（ｃｙｓ−ｃｙｓ）。「ｃｙｓ−ｘ−ｃｙｓケモカイン」グループに属する蛋白質は、血小板因子４（ＰＦ４）、血小板基本蛋白質（ＰＢＰ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、黒色腫成長刺激活性蛋白質（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症性蛋白質２（ＭＩＰ−２）、マウスのＭｉｇ（ｍ１１９）、鶏の９Ｅ３（またはｐＣＥＦ−４）、豚の肺胞マクロファージ化学走性因子ＩおよびII（ＡＭＣＦ−Ｉおよび−II）、前駆Ｂ細胞成長促進因子（ＰＢＳＦ）およびＩＰ１０などが例示され、これらに限定されるものではない。「Ｃ−Ｃケモカイン」グループに属する蛋白質は、単核球化学走性蛋白質１（ＭＣＰ−１）、単核球化学走性蛋白質２（ＭＣＰ−２）、単核球化学走性蛋白質３（ＭＣＰ−３）、単核球化学走性蛋白質４（ＭＣＰ−４）、マクロファージ炎症性蛋白質１α（ＭＩＰ−１α）、マクロファージ炎症性蛋白質１β（ＭＩＰ−１β）、マクロファージ炎症性蛋白質１γ（ＭＩＰ−１γ）、マクロファージ炎症性蛋白質３α（ＭＩＰ−３α）、マクロファージ炎症性蛋白質３β（ＭＩＰ−３β）、ケモカイン（ＥＬＣ）、マクロファージ炎症性蛋白質４（ＭＩＰ−４）、マクロファージ炎症性蛋白質５（ＭＩＰ−５）、ＬＤ７８β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＩＳ−エプシロン（ｐ５００）、ＴＡＲＣ(thymus and activation-regulated chemokine)、エオタキシン、Ｉ−３０９、ヒト蛋白質ＨＣＣ−１／ＮＣＣ−２、ヒト蛋白質ＨＣＣ−３、マウス蛋白質Ｃ１０などが例示され、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の明細書において、用語「親−細胞死滅遺伝子(pro-apoptotic gene)」は、発現され、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親−細胞死滅遺伝子の例には、ｐ５３、アデノウィルスＥ３−１１.６Ｋ（Ａｄ２およびＡｄ５由来）またはアデノウィルスＥ３−１０.５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウィルスＥ４遺伝子、Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ｐ５３経路遺伝子、およびカスパーゼをコードする遺伝子が含まれる。
【００３９】
本発明の明細書において、用語「抗−新生血管生成遺伝子(anti-angiogenic gene)」は、発現されて抗−新生血管生成因子を細胞の外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗−新生血管新生因子には、アンギオスタチン、Ｔｉｅ２(PNAS, 1998, 95,8795-800)のような血管内皮成長因子（ＶＥＦＧ）の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【００４０】
上述したように、本発明に係る転写調節配列は、遺伝子ビヒクルとして通常用いられるウィルスベクターまたは非ウィルスベクターに導入できるが、アデノウィルスベクターが遺伝子ビヒクルとして適したものと認識されており、実際、その使用頻度が増加している。よって、本発明に係る転写調節配列は、アデノウィルスベクターに導入することが特に好ましい。したがって、本発明は、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【００４１】
本発明の明細書において、用語「複製可能アデノウィルスベクター」は、複製に必ず必要な遺伝子が保存されたアデノウィルスベクターを意味し、これらは、癌細胞内で自分を複製して細胞を殺傷することにより、癌を治療することができる。別の用語「複製不能アデノウィルスベクター」は、複製に必ず必要な、特に感染の初期段階に必要な遺伝子が除去されたアデノウィルスベクターを意味するが、これらは、主に治療学的トランス遺伝子を含んでおり、癌細胞でこれらを発現することにより癌を治療することができる。ところが、前述したように、本発明は、治療学的トランス遺伝子を含むと共に、複製可能なウィルスベクターを含む。すなわち、本発明の明細書において、複製不能アデノウィルスベクターとは、治療学的トランス遺伝子を含むアデノウィルスベクターの一様態として提供された複製不能アデノウィルスベクターを意味する。
【００４２】
本発明の明細書において、用語「アデノウィルス」は、「アデノウィルスベクター」と同一に使用されており、「アデノビリジアエ」属に属するウィルスを意味する。用語「アデノビリジアエ」は、「マストアデノウィルス(Mastadenovirus)」属の動物性アデノウィルス（ヒト、牛、羊、馬、犬、豚、マウスおよび猿のアデノウィルス亜属を含み、これらに限定されるものではない。）を総体的に呼ぶ。特に、ヒトのアデノウィルスは、Ａ−Ｆ亜属(subgenera)およびこの個々の血清型を含み、Ａ−Ｆ亜属は、ヒトのアデノウィルス第１型、第２型、第３型、第４型、第４ａ型、第５型、第６型、第７型、第８型、第９型、第１０型、第１１型（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）、第１２型、第１３型、第１４型、第１５型、第１６型、第１７型、第１８型、第１９型、第１９ａ型、第２０型、第２１型、第２２型、第２３型、第２４型、第２５型、第２６型、第２７型、第２８型、第２９型、第３０型、第３１型、第３２型、第３３型、第３４型、第３４ａ型、第３５型、第３５ｐ型、第３６型、第３７型、第３８型、第３９型、第４０型、第４１型、第４２型、第４３型、第４４型、第４５型、第４６型、第４７型、第４８型および第９１型を含み、これらに限定されるものではない。本発明の好適な様態におけるアデノウィルスは、ヒトのアデノウィルス第２または第５血清型(serotype)から由来したものである。
【００４３】
アデノウィルスの血清型によって若干の差異はあるが、一般に、アデノウィルスゲノムは、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４を含んだ初期遺伝子と、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５を含んだ後期遺伝子からなっている。初期遺伝子において、Ｅ１Ａ遺伝子は、ウィルス感染し次第（０−２ｈ）、その他のウィルス遺伝子に先立って発現される。Ｅ１Ａ蛋白質は、転写調節因子(transcriptional regulatory factor)として作用し、その他の初期遺伝子の発現に必ず必要である。Ｅ１Ａ遺伝子の欠失は、ウィルスＤＮＡ複製に必要な遺伝子産物が生産できないため、ウィルスの感染が行われない。Ｅ１Ｂ蛋白質は、後期遺伝子ｍＲＮＡを核から細胞質に移動させるのに必須的である。Ｅ１Ｂ発現の欠陥は、ウィルス後期遺伝子の微々たる発現と宿主細胞蛋白質合成の不完全な遮断に繋がる。Ｅ４遺伝子は、多数の転写産物を含んでいるが、Ｅ４転写単位(transcriptional unit)のオープンリーディングフレーム(open reading frame)３および６は、Ｅ１Ｂの５５ｋＤ蛋白質とＥ２Ｆ−１およびＤＲ−１からなる異種二量体(heterodimer)の結合による主要後期転写単位ｍＲＮＡ(late transcriptional unit mRNA)の蓄積を増加させる。オープンリーディングフレーム３および６から由来した蛋白質に欠陥があれば、プラーク(plaque)は、野生型ウィルスのそれより１０−６以下の効率で生産される。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５を含んだ後期遺伝子は、アデノウィルスの構造蛋白質を暗号化している。
【００４４】
初期遺伝子および後期遺伝子はいずれもアデノウィルスの効率的な複製に必要である。したがって、本発明は、一様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの初期遺伝子および後期遺伝子の少なくとも一つに作動可能に連結されたアデノウィルスベクターを含む。初期遺伝子および後期遺伝子の中でも、特に初期遺伝子がウィルスゲノムの複製に関与するので、本発明は、より好適な様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスの初期遺伝子に作動可能に連結されたアデノウィルスベクターを提供する。初期遺伝子の中でも、特にＥ１Ａ遺伝子は、転写因子であって、その結合によってその他のウィルス遺伝子が発現されるので、ウィルスの複製には最も重要な要素であると言える。したがって、本発明は、更に好適な様態として、ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む塩基配列が連結された転写調節配列がアデノウィルスのＥ１Ａ遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【００４５】
本発明に係る転写調節配列がアデノウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターは、ｃ−Ｍｙｃ発癌蛋白質またはＳｐ１蛋白質の存在によってテロメラーゼが活性化された癌細胞内に流入された後、自分を高効率で増殖することにより癌細胞を殺傷する反面、正常細胞に流入されたアデノウィルスベクターは、増殖が殆ど不可能なので、細胞にあまり影響を及ぼさない。
【００４６】
このようにウィルス増殖によって癌細胞を殺傷する組み換えアデノウィルスベクターに関連したより好適な様態は、Ｅ１Ｂ１９ｋＤ遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスベクターを用いる。Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ蛋白質は、強力なアポトーシス(apoptosis)抑制剤であって、アデノウィルスの初期発現遺伝子Ｅ１Ａによって誘導されるアポトーシスを抑制し、ヒトの各種主要細胞においてｐ５３によって誘導されるアポトーシスも抑制する。また、成長因子の除去、放射線治療または抗癌剤によって誘導されるアポトーシスを抑制するにおいても、Ｅ１Ｂ１９ｋＤ蛋白質はＢｃｌ−２と機能的に同じ役割をすることができる。したがって、Ｅ１Ｂ１９ｋＤ遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスは、ウィルス増殖によるアポトーシスだけでなく、感染した細胞内でアポトーシスを共に誘発して効率よく癌細胞を殺傷させ、周囲癌細胞に拡散する効果も卓越である。これにより、前記組み換えアデノウィルスベクターは、癌細胞で特異的に高効率にて増殖して癌細胞のみを選択的に殺傷する能力が一層優れている。
【００４７】
アデノウィルスの増殖による癌細胞の殺傷だけでなく、アデノウィルスベクターに治療学的トランス遺伝子をクローニングし、これを癌細胞で発現させることにより、癌を治療することもできる。したがって、本発明は、ｈＴＥＲＴプロモーターにｃ−Ｍｙｃ結合部位および／またはＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターを提供する。前記治療学的トランス遺伝子は、癌細胞では特異的に高効率にて発現することができるが、正常細胞では発現が不可能なので、細胞毒性や副作用を誘発しない。
【００４８】
通常、治療学的トランス遺伝子は、アデノウィルスのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子の代わりに導入できる。したがって、本発明は、一様態として、前記転写調節配列がアデノウィルスのＥ１遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された複製不可能な組み換えアデノウィルスベクターを提供する。このような組み換えアデノウィルスベクターは、ウィルスの複製に必須的なＥ１遺伝子が欠失しているので、ウィルスの複製は不可能であり、単に治療学的トランス遺伝子の発現によって腫瘍が治療できる。また、本発明は、別の様態として、前記転写調節配列がアデノウィルスのＥ３遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された複製可能な組み換えアデノウィルスベクターを提供する。このような組み換えアデノウィルスベクターは、複製可能なので、アデノウィルスの複製による細胞殺傷効果と治療学的トランス遺伝子の発現による細胞殺傷効果が共に誘導されて抗腫瘍効果が倍加できる。しかし、Ｅ１およびＥ３遺伝子の欠失したアデノウィルスが、他のベクターとは対照的に、相当高い遺伝子伝達効率を有しかつ広いスペクトルの細胞類型でトランス遺伝子を発現するため、好適な様態は、アデノウィルスとして、Ｅ１およびＥ３遺伝子の欠失した複製不能のアデノウィルスベクターを使用することである。したがって、本発明は、前記転写調節配列がＥ１Ａ遺伝子の代わりに導入された治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結され、Ｅ１およびＥ３遺伝子の欠失した組み換えアデノウィルスベクターを提供する。
【００４９】
前述した組み換えベクターを製造するためには、これらを適切な宿主細胞に導入しなければならない。したがって、本発明は、前記組み換えウィルスベクターまたは非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。ベクターを宿主細胞に導入する好適な方法には、例えば、リン酸カルシウム形質転換(calcium phosphate transfection)、ＤＡＥＡ−デキストラン媒介形質転換(DAEA-dextran mediated transfection)、罹患(transvection)、 微量注入(microinjection)、陽イオン脂質−媒介形質転換(cationic lipid-mediated transfection)、 電気穿孔(electroporation)、形質導入(transduction)、 スクレイプローディング(scrape loading)、バリスティック導入(ballistic introduction)あるいは感染(infection)などが含まれる。一方、宿主細胞は組み換えベクターによって選択可能であり、好適な宿主細胞は当業界に公知されている。
【００５０】
本発明において、組み換えアデノウィルスベクターは、ｈＴＥＲＴプロモーターにｃ−Ｍｙｃ結合部位またはＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を含有するシャトルベクターを作製し、前記シャトルベクターをアデノウィルスベクターと遺伝子相同組み換えさせ、これにより得られた組み換えアデノウィルスプラスミドを適切な細胞に形質転換またはトランスフェクトさせることにより生産される。
【００５１】
ｈＴＥＲＴプロモーターにｃ−Ｍｙｃ結合部位またはＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列を含むシャトルベクターを製作するときに使用されるプラスミドは、原核性であれ真核性であれ、公知または市販されているいずれも使用可能である。また、組み換えアデノウィルスを生産するための組み換えプラスミドの宿主細胞も当業者によく知られており、代表的な例としてはＡｄ５のヌクレオチド１−４３４４によって形質転換されたヒト胚腎細胞株２９３（Ｅ１Ａ／Ｂ＋）およびＡｄ５のヌクレオチド７９−５７８９を含有したヒト胚網膜母細胞腫細胞９１１が含まれる。
【００５２】
本発明に係る組み換えウィルスベクターまたは非ウィルスベクターは、様々な癌細胞、特にテロメラーゼが活発に発現される肝癌細胞、肺癌細胞、子宮頚部癌細胞および脳腫瘍細胞を含む癌細胞のみ特異的に高効率で殺傷することができる。したがって、本発明は、これらを活性成分として含む薬剤学的組成物を提供しようとする。
【００５３】
本発明は、（ａ）ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含まれる組み換えウィルスベクターが上述したように様々な癌細胞に対して殺傷効能を示すので、腫瘍と関連した様々な疾病または疾患、例えば胃癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌および子宮頚部癌などの治療に利用できる。
【００５４】
本発明は、（ａ）ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。このような本発明の薬剤学的組成物は、これに含有された組み換えウィルスベクターに導入された治療学的トランス遺伝子が癌細胞内で発現されることにより、例えば、黒色腫、乳癌、肺癌、神経母細胞腫、腎細胞腫、卵巣癌、脳腫瘍、頭頚部腫瘍、卵巣癌および中皮腫などの様々な癌の治療に利用できる。
【００５５】
前述した薬剤学的組成物に関する好適な様態は、ウィルスベクターとしてアデノウィルスベクターを用いることである。したがって、本発明は、（ａ）ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。また、本発明は、（ａ）ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えアデノウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００５６】
本発明は、（ａ）ｈＴＥＲＴプロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および／または一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された非ウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００５７】
本明細書において、用語「治療」は、疾病または疾患の完治、抑制および軽減を意味する。したがって、本明細書において、用語「治療学的有効量」は、前述した薬理学的効果の達成に十分な量を意味する。
【００５８】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分ら以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでもよい。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物は、遺伝子療法で通常用いられる経路によって投与でき、非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与を用いて投与することができる。例えば、卵巣癌において腹腔内投与を行う場合、および肝癌において門脈投与を行う場合には注入方法を採用することができ、乳癌および頭頚部癌の場合には腫瘍マスに直接注射して投与することができ、結腸癌の場合には灌腸に直接注射して投与することができ、膀胱癌の場合にはカテーテル内に直接注射して投与することができる。本発明では、静脈内投与、腹腔内投与または腫瘍内投与が特に好ましい。
【００６０】
本発明の薬剤学的組成物の適合な投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって異なり、普通熟練した医師は、所望の治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物は１×１０５〜１×１０１５ＰＦＵ／ｍＬの組み換えアデノウィルスを含み、通常、組み換えアデノウィルスは約１×１０１０ＰＦＵを二日に１回ずつ２週間にわたって注射する。
【００６１】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施しうる方法によって、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化されることにより、単位容量の形で製造でき、あるいは多容量容器内に内入して製造できる。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形であり、あるいはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。
【００６２】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、単独の療法で利用できるが、他の通常の化学療法または放射療法と共に利用でき、このような並行療法を行う場合には、より効果的に癌治療を行うことができる。本発明の組成物と共に利用できる化学療法剤は、シスプラチ(cisplatin)、 カルボプラチン(carboplatin)、プロカルバジン(procarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、メルファラン(melphalan)、クロラムブシル(chlorambucil)、ブスルファン(busulfan)、ニトロソウレア(nitrosourea)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)、ブレオマイシン(bleomycin)、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン(mitomycin)、エトポシド(etoposide)、タモキシフェン(tamoxifen)、タクソール(taxol)、トランスプラチナム(transplatinum)、５−フルオロウラシル(5-fluorouracil)、ビンクリスチン(vincristin)、ビンブラスチン(vinblastin)およびメトトレキサート(methotrexate)などを含む。本発明の組成物と共に利用できる放射療法は、Ｘ線照射およびγ線照射などである。
【００６３】
本発明の組み換えベクターを含有した薬剤学的組成物は、室温における安定性を増加させ、高い低温貯蔵の必要性を減らし、貯蔵寿命(shelf-life)を延長するために凍結乾燥させることができる。凍結乾燥工程は、凍結、１次乾燥および２次乾燥の連続段階からなる。組成物を凍結させた後、圧力を降下させ、組成物を水蒸気の昇華のために加熱する。２次乾燥段階では、乾燥物から吸収された残余水分を蒸発させる。
【００６４】
一様態として、本発明に係る薬剤学的組成物の凍結乾燥方法は、次の順序とおりである。（１）凍結乾燥顕微鏡分析法を用いて製剤の崩壊温度(collapse temperature)を決定する(Pikal, M. J. et al. Int. J. Pharm., 1990, 62, 165-186)。（２）バイアルを室温下の凍結−乾燥機の棚に置き、以後に−１℃で約３０分間平衡化させる。（３）棚を−５５℃に冷却させ、この温度を２時間維持する。（４）約−３２℃の生成物温度または崩壊温度より５℃低い温度で１次乾燥を行う。（５）３５℃で２次乾燥を行う。チャンバーの圧力を５５〜１２０ｍｍＨｇに調節した後、乾燥を完成する。（６）凍結乾燥機の真空下でバイアルを栓で塞ぎ、凍結乾燥したバイアルをクリンプシールして２℃〜８℃で保存する。
【００６５】
凍結乾燥した製剤には、賦形剤(excipients)および凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)が含まれる。賦形剤は、これらに限定されるものではないが、０.９％ＮａＣｌと１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）または１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）の緩衝液を含む。凍結乾燥保護剤は、凍結および乾燥工程中に生物学的分子を保護し、最終産物に機械性(mechanical support)を与える役割をし、その例としては、ＰＢＳ（ｐＨ７.０）、ＰＢＳ／４％、１２％または１５％トレロースなどを挙げることができる。
【００６６】
（実施例１）
対象癌細胞株と正常細胞株およびこれらの培養
本発明で使用された細胞株は、人体肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２）、脳癌細胞株（Ｕ２５１Ｎ、Ｕ３４３）、肺癌細胞株（Ａ５４９、Ｈ４６０）、子宮頚部癌細胞株（Ｃ３３Ａ、ＨｅＬａ）、乳癌細胞株（ＭＣＦ７）などの癌細胞株と人体正常細胞株（１７３Ｗｅ、ＣＢＨＥＬ、ＭＲＣ５、ＷＩ３８、ＩＭＲ９０、ＢＪ）であり、全てＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)から購入した。前記細胞株はいずれも、１０％の牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ＮＹ）が含有されたＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ＮＹ）を培養液として抗生剤のフェニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ＮＹ）を添加して５％ＣＯ２、３７℃の恒温培養器で培養した。
【００６７】
（実施例２）
本発明で使用された細胞株の内在テロメラーゼの活性度測定
各細胞株の内在テロメラーゼの活性度測定は、ＴＲＡＰＥＺＥ ＥＬＩＳＡ(enzyme linked immunosorbent assay)テロメラーゼ検出キット（Ｏｎｃｏｒ、Ｇａｉｔｈｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を利用し、測定方法は、製造会社の提示方法によって行われた。まず、１×１０６個の細胞を２００Ｌの冷たい細胞溶解用(lysis)溶液で溶解させた後、１０,０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞抽出液を分離し次第、直ちに−８０℃で保管した。細胞抽出液中の蛋白質の濃度は、蛋白分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって定量した後、同量の蛋白質を次のＴＲＡＰ検定(telomeric repeat amplification protocol assay)に利用した。１００ｎｇの細胞抽出液と１０μｌの５×ＴＲＡＰ反応混合物(reaction mix)および２単位のＴａｑポリメラーゼを添加して５０μｌの反応液を作った後、ＴＲＡＰ延長(extension)のために常温で３０分間反応させてからＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒間３３回繰り返し行い、各サンプルのテロメラーゼ活性を調べるために、ＰＣＲ産物をＥＬＩＳＡによって４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで吸光度を測定した。全ての実験は、３回以上繰り返し行い、その平均値を求めた。
【００６８】
図３に示すように、ＭＣＦ−７乳癌細胞株を除いた全ての癌細胞株、すなわち肝癌（Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＫ−Ｈｅｐ１、ＨｅｐＧ２）、肺癌（Ｈ４６０、Ａ５４０９）、子宮頚部癌（Ｃ３３Ａ、ＨｅＬａ）、脳癌（Ｕ２５１Ｎ）ではテロメラーゼ活性が高いが、１７３Ｗｅ、ＢＪ、ＩＭＲ９０、ＷＩ３８のような正常細胞ではその活性が殆ど観察されなかった。
【００６９】
（実施例３）
ｈＴＥＲＴプロモーターおよびｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの製造
ｈＴＥＲＴプロモーターを製造するために、正常胚細胞であるＭＲＣ５細胞株からゲノムＤＮＡ(genomic DNA)を抽出した後、下記のプライマーセットを用いて２つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位が存在するｈＴＥＲＴプロモーターをＰＣＲ増幅した。センスプライマーは、５'−ｃｃｃａａａｇｃｔｔａｇｇｃｃｇａｔｔｃｇａｇａｔｃｔｃｔｃｃ−３'（配列番号１１）であって、クローニング上の便宜のために、ＰｖｕII制限酵素部位を挿入し（下線部分）、アンチセンスプライマーは、５'−ｇａａｔｔｃａａｇｃｔｔ ｃｇｃｇｇｇｇｔｇ ｇｃｃｇｇｇｇｃｃ−３'（配列番号１２）であって、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII制限酵素部位が含まれている（下線部分）。ＭＲＣ５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った後、生成されたサイズ４４７ｂｐの産物をＢｇｌIIとＨｉｎｄIII制限酵素で処理した後、アルカリ性ホスファダーゼ(alkaline phosphatase)酵素を発現するｐＳＥＡＰ−ｂａｓｉｃベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）に挿入してｐＳＥＡＰ−ＴＥＲＴを製造した。
【００７０】
ｈＴＥＲＴプロモーターに１つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位をさらに含ませたｍ−ｈＴＥＲＴプロモーター（配列番号１３：図１）を製造するために、２つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位が存在する野生型ｈＴＥＲＴプロモーターに、１つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位が入っているｈＴＥＲＴプロモーターを結合させた。このため、まず１つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位が含まれたｐＧＬ２−ｈＴＥＲＴベクターをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIで切断した後、同種の制限酵素で処理されたｐＳＥＡＰ−ＴＥＲＴに挿入してｐＳＥＡＰ−ｍＴＥＲＴを製造した。
【００７１】
（実施例４）
組み換えアデノウィルスの製造および生産
Ａ．複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚおよびｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚの製造および生産
ＣＭＶプロモーターによってＬａｃＺ遺伝子の発現が調節されるＥ１アデノウィルスシャトルベクターを製造するために、ＬａｃＺを発現するｐｃＤＮＡ−ｈｙｇｒｏ−ＬａｃＺ（ＣＭＶプロモーターによって調節されるＬａｃＺ）プラスミドからＣＭＶプロモーター、ＬａｃＺおよびｐｏｌＡ部位をＨｉｎｄIIIとＮａｅＩで処理して分離した後、これをＥ１アデノウィルスシャトルベクターｐΔＥ１ＳＰ１Ａに挿入してｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ＣＭＶ−ｌａｚＺシャトルベクターを製造した。
【００７２】
ｈＴＥＲＴプロモーターおよび前記プロモーターにｃ−Ｍｙｃ結合部位およびＳｐ１結合部位を含んだｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによってＬａｃＺの発現が調節されるベクターを製造するために、ｐＳＥＡＰ−ＴＥＲＴとｐＳＥＡＰ−ｍＴＥＲＴプラスミドからＢａｌIIとＥｃｏＲＩを用いてｈＴＥＲＴプロモーターとｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターを分離した後、これらをＢａｍＨＩとＥｃｏｒＩで処理し、ＣＭＶプロモーターの除去されたｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ＬａｃＺに挿入してｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ＴＥＲＴ−ＬａｃＺとｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ｍＴＥＲＴ−ＬａｃＺシャトルベクターをそれぞれ製造した。
【００７３】
製造されたそれぞれのシャトルベクターは、ＸｍｎＩ制限酵素で切断した後、ＢｓｔＢＩ制限酵素で処理して１本鎖になったアデノウィルスｄｌ３２４ＢｓｔＢ１（ＳｗｉｓｓのＦｒｉｂｏｕｒｇｈ大学のＶｅｒｃａ博士から得る）と共に大腸菌ＢＪ５１８３で同時に形質転換させて遺伝子相同組み換えを誘導した。相同組み換えの行われたプラスミドＤＮＡは、ＰａｃＩ制限酵素で処理した後、２９３細胞株に形質転換してｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚおよびｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ組み換えアデノウィルスを生産した（図２Ａ）。組み換えアデノウィルスｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚは、ブダペスト協約の下にＫＣＣＭ(Korean Culture Center of Microorganisms)に２００３年２月２０日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０４７１にて国際寄託された。
【００７４】
Ｂ．複製可能組み換えアデノウィルスＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９およびＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の製造および生産
ｈＴＥＲＴとｍ−ｈＴＥＲＴそれぞれのプロモーターによってアデノウィルスの複製が調節されるアデノウィルスを製造するために、Ｅ１Ｂ１９ｋＤ部位の欠損した複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９を鋳型アデノウィルスプラスミドとして使用した。まず、ｐＳＥＡＰ−ＴＥＲＴとｐＳＥＡＰ−ｍＴＥＲＴからＢｇｌIIとＥｃｏＲＩを用いてｈＴＥＲＴプロモーターとｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターを分離し、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで前処理されたｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ΔＥ１Ｂ１９にそれぞれ挿入してｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ｈＴＥＲＴ−ΔＥ１Ｂ１９とｐΔＥ１ＳＰ１Ａ／ｍＴＥＲＴ−ΔＥ１Ｂ１９シャトルベクターをそれぞれ製造した。
【００７５】
製造されたシャトルベクターは、ＸｍｎＩ制限酵素で処理した後、ＢｓｔＢＩ制限酵素で処理して１本鎖になったＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９と共に大腸菌ＢＪ５１８３で同時に形質転換させて遺伝子相同組み換えを誘導し、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９とＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９複製可能アデノウィルスを製造した（図２Ｂ）。組み換えアデノウィルスの生産、濃縮および力価の決定は２９３細胞株で行った。組み換えアデノウィルスＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９は、ブダペスト協約の下にＫＣＣＭ(Korean Culture Center of Microorganisms)に２００３年２月２０日付で寄託番号ＫＣＣＭ−１０４７０にて国際寄託された。
【００７６】
（実施例５）
複製不能組み換えアデノウィルスの遺伝子発現様相の究明
ｈＴＥＲＴプロモーター及びｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによる遺伝子発現が細胞内テロメラーゼの活性程度と関連があるかを検証するために、標識遺伝子として、ＬａｃＺを発現する複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚおよびｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを用いて様々な癌細胞でのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を評価した。２４−ウェルプレートに２×１０５個の癌細胞（Ｃ３３Ａ、Ｕ２５１Ｎ、ＭＣＦ−７）と正常細胞（ＷＩ３８、１７３Ｗｅ）をそれぞれ分注した後、翌日β−ガラクトシダーゼ(galactosidase)を発現するｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺアデノウィルスをＭＯＩ５０で感染させ、二日後にＸ−ｇａｌ染色を行った。β−ｇａｌの活性は、固定液（１％ホルムアルデヒド、０.２％グルタルアルデヒドｉｎ Ｈ２Ｏ-）で５分間細胞を固定させた後、染色溶液（０.４ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ、４ｍＭフェリシアン化カリウム、４ｍＭフェロシアン化カリウム、２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｉｎ ＰＢＳ）を用いて３７℃で４〜１６時間反応させて観察した。
【００７７】
図４に示すように、ＣＭＶプロモーターの場合は、細胞内のテロメラーゼ活性と関係なく、本発明で用いられた全ての細胞株でＬａｃＺ発現を強く誘導することにより、癌細胞特異性が欠如していることを確認することができた。ところが、癌細胞特異的に遺伝子発現を調節することが可能なｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴの場合は、テロメラーゼ活性の高い細胞株でのみＬａｃＺの発現を誘導することにより、癌細胞特異的活性プロモーターであることを検証することができた。また、ｈＴＥＲＴプロモーターにｃ−Ｍｙｃ結合部位およびＳｐ１結合部位がさらに含まれたｍ−ｈＴＥＲＴの場合は、テロメラーゼ活性の高い細胞株（Ｃ３３Ａ、Ｕ２５１Ｎ）では野生型プロモーターｈＴＥＲＴより高い遺伝子の発現を誘導することができてプロモーターの活性がさらに増加したことを確認し、テロメラーゼ活性の低いいろいろの細胞株（ＭＣＦ−７、１７３Ｗｅ、ＷＩ３８）では、その活性が効果的に減少して癌細胞特異性にも優れることを検証することができた。
【００７８】
本発明で製造したｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによる遺伝子発現効率と癌細胞特異性を定量的に観察するために、ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚおよびｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚアデノウィルスをいろいろの癌細胞株と正常細胞株にそれぞれ様々な濃度の力価で二日間感染させた後、細胞を溶解させてβ−ｇａｌの活性を測定した。２４−ウェルプレートに２×１０５個の癌細胞（Ｈ４６０、Ａ５４９、Ｃ３３Ａ、ＳＫ−Ｈｅｐ１、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｕ３４３、Ｕ２５１Ｎ、ＭＣＦ７）と正常細胞（１７３ＷＥ、ＣＢＨＥＬ、ＭＲＣ５、ＩＭＲ９０、Ｗ１３８、ＢＪ）をそれぞれ分注した後、ここにｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺアデノウィルスをＭＯＩ１０、５０、１００で二日間感染させた後、ＣｈｅｎｇとＢａｌｔｉｍｏｒｅの方法でβ−ｇａｌの活性を測定した(Cheng,G. et al. ‘A co-inducer with TRAF2 of TNF-and CD40L-NK-kappaB activation.’ Genes & Develop., 1996,10,963-973.)。  まず、プレートから培地を除去し、Ｚ緩衝溶液（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ β−メルカプトエタノール）で細胞を分離させた後、１×１０６個の細胞を蛋白質分解抑制剤（２０μｍ ＰＭＳＦ、２０μＭ ＴＬＣＫ、２０μＭ ＴＰＣＫ）が含まれた１００μｌの細胞溶解用緩衝溶液（β−メルカプトエタノールのないＺ緩衝溶液プラス１％ＮＰ−４０）で細胞を溶解させた。細胞溶出液を遠心分離して得た上澄液３０μｌを９６−ウェルプレートにそれぞれ分注し、ここにＯＮＰＧ（ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）４ｍｇを６ｍｌのＺ緩衝溶液に溶かして１２０μｌずつ分注し、３７℃で３０分間反応させた後、４２０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７９】
図５Ａ〜図５Ｏに示すように、ＣＭＶプロモーターによってＬａｃＺの発現が調節される場合、細胞を感染させたウィルスの力価に比例してＬａｃＺの発現が増加することが分かる。特に細胞内テロメラーゼ活性と関係なく、正常細胞株を含んだ全ての細胞株でＬａｃＺの発現を非常に強く誘導した。これとは対照的に、ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの場合は、テロメラーゼ活性の高い癌細胞株、すなわちＭＣＦ−７人体乳癌細胞株を除いた全ての癌細胞株では感染に用いられたウィルスの力価に比例してＬａｃＺの発現を誘導したが、正常癌細胞株ではＭＯＩ１００の高力価でもβ−ｇａｌの活性が殆ど観察されないため、これら２種のプロモーターの癌細胞特異的活性調節能に優れることを確認した。具体的に、ＩＭＲ９０正常細胞株の場合、ＭＯＩ１００でＣＭＶプロモーターによって発現されるＬａｃＺの相対的な量Ｏ.Ｄ.４２０の値は１.７１４であるが、これに対し、ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによって発現されるＬａｃＺの相対的なＯ.Ｄ.４２０値は０.１０１と０.０２５であって、ｈＴＥＲＴプロモーターの場合には約１７倍程度低く、ｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの場合には約６８倍程度低いことが分かる。ＢＪ正常細胞株の場合、ＭＯＩ５００の高濃度のウィルスによって感染した場合、ＣＭＶ、ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによって発現されるＬａｃＺの相対的なＯ.Ｄ.４２０値がそれぞれ０.５４８、０.００１、０.００１であって、ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターが全く活性化されないことが分かる。このようなＬａｃＺ発現の大きい差は、他の正常細胞株である１７３Ｗｅ、ＣＢＨＥＬ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５などからも観察された。一方、テロメラーゼの活性が高いいろいろの癌細胞株では、ｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによって発現されるＬａｃＺの量が、野生型プロモーターのｈＴＥＲＴプロモーターに比べて一層強く誘導されることを確認した。すなわち、ＭＯＩ５０のｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚによって感染したＳＫ−Ｈｅｐ１細胞株で発現されたＬａｃＺの相対的なＯ.Ｄ.４２０値は０.１８２であるが、これに対し、同量の力価でｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚアデノウィルスによって感染した場合には発現されたＬａｃＺの相対的なＯ.Ｄ.４２０値が１.８２であって約１０倍程度強く誘導され、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株でも約１０倍程度（ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ：０.１３５、ｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ：１.３２２）強く誘導された（表１）。このような一連の実施例によって、本発明で製造されたｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターが、野生型プロモーターｈＴＥＲＴに比べて、癌細胞では一層強く遺伝子発現を誘導することができるため一層強いプロモーターであるが、正常細胞株では活性が殆ど起こらないため癌細胞特異性にも優れることを確認することができた。
【００８０】
【表１】
2006520585.tif 000003
【００８１】
（実施例６）
複製可能組み換えアデノウィルスの免疫ブロット分析
複製が癌細胞特異的に起こるかを調べるために、対照群ウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９と共に人体癌細胞株および正常細胞株にそれぞれ感染させた後、アデノウィルスによって発現されるＥ１蛋白質の発現様相を検証した。６−ウェルプレートに３×１０５〜１×１０６個の癌細胞株（Ｃ３３Ａ、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＳＫ−Ｈｅｐ１）および正常細胞株（ＩＭＲ９０、ＭＲＣ５、ＢＪ）をそれぞれ分注した後、翌日Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を、癌細胞はＭＯＩ１で、正常細胞株はＭＯＩ１０でそれぞれ感染させた。ウィルス感染二日後に、感染した細胞を回収して細胞溶解用緩衝溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.５％ ＮＰ−４０、プロテアーゼ抑制剤：ＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ）で細胞を溶解させてＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)電気泳動を行った。電気泳動の後、ゲルにある蛋白質をＰＶＤＦ膜に電気移動(electro transfer)した後、アデノウィルスＥ１Ａ蛋白質を特異的に認知する抗体（ｓｃ−４３０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ., Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ, ＣＡ）を１次抗体として混成化(hybridization)させ、ＨＲＰ(horse radish peroxidase)が結合した２次抗体をさらに混成化させた後、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉ−Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ｓｃ−２０４８；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ., Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ, ＣＡ）を用いて蛋白質の発現様相を究明した。
【００８２】
図６に示すように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９によって感染した場合は、癌細胞と正常細胞の両方ともでウィルスの複製が活発に起こってＥ１蛋白質が高く発現されたが、これに対し、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスによって感染した場合は、テロメラーゼ活性の高い癌細胞でのみ発現され、テロメラーゼ活性の微々な全ての正常細胞株（ＷＩ３８、ＢＪ、ＩＭＲ９０）では全く発現されなかった。このような結果は、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスの複製がｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによって癌細胞特異的に調節されることを意味する。しかし、野生型ｈＴＥＲＴプロモーターによって複製が調節されるＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９の場合は、癌細胞で複製が活発に起こってＥ１蛋白質が高く発現されたが、正常細胞株であるＷ１３８とＢＪ細胞株でもＥ１蛋白質が発現されてＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスに比べて癌細胞特異的複製能が微弱に調節されることが分かった。
【００８３】
（実施例７）
複製可能組み換えアデノウィルスの細胞殺傷能検証
Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９とＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスの癌細胞特異的殺傷能を検証するために、多種の癌細胞株および正常細胞株に対照群複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９と陰性対照群ウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ複製不能アデノウィルスをそれぞれ様々な濃度の力価で感染させて細胞殺傷程度を観察した。２４−ウェルプレートに２〜５×１０４個の多種の癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１、Ｈ４６０、Ｃ３３Ａ、Ｕ２５１Ｎ、Ａ５４９、ＨｅＬａ）と正常細胞株（ＢＪ、ＷＩ３８、ＩＭＲ９０）をそれぞれ分注した後、翌日ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスをＭＯＩ０.０１、０.１、１、１０、１００でそれぞれ感染させた。ＭＯＩ０.０１または０.１で投与したＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスが細胞を殆ど死滅させた時点に全ての培地を除去し、プレートの底に残っている細胞を０.５％クリスタルバイオレット（５０％メタノール）で固定し染色した後、分析した。
【００８４】
図７Ａ〜図７Ｆに示すように、陰性対照群ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ複製不能アデノウィルスで感染した癌細胞では、ウィルス複製が全く起こらなくて細胞殺傷効果が観察されなかったが、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９で感染した大部分の癌細胞株では、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９と殆ど類似の程度で細胞殺傷を誘導して細胞殺傷能(potency)に優れることを確認することができた。ところが、図７Ｇ〜図７Ｉに示すように、正常細胞株であるＢＪ、ＷＩ３８、ＩＭＲ９０では、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９の場合は、癌細胞に対する特異性が全くないＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９と殆ど類似の類準で正常細胞を殺傷させたが、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の場合は、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９に比べて約１００倍程度低い細胞殺傷を示してＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の癌細胞に対する特異性(specificity)に優れることを確認した。
【００８５】
細胞株のテロメラーゼ活性度によるＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９およびＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の細胞殺傷能を定量化するために、ＭＴＴ分析を行った。癌細胞（ＳＫ−Ｈｅｐ１、Ｈ４６０、Ｃ３３Ａ、Ｕ２５１Ｎ、Ａ５４９およびＨｅＬａ）と正常細胞（ＢＪ、ＷＩ３８およびＩＭＲ９０）を２４−ウェルプレートに７０〜９０％の密集度(confluency)でそれぞれ分注した後、翌日ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスを、癌細胞はＭＯＩ１０で、正常細胞はＭＯＩ５０でそれぞれ感染させた。一定の時間間隔でＭＴＴ(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide、２ｍｇ／ｍｌ)溶液２００μｌずつをウェルに添加して４時間３７℃の恒温器で反応させた後、１ｍｌのＤＭＳＯ(dimethyl sulphoxide)を添加し、３７℃で１０分間放置した後、５４０ｎｍで吸光度を測定して細胞の相対的生存率を測定した。
【００８６】
図８Ａ〜図８Ｆに示すように、本発明で使用された全ての癌細胞では、ウィルス感染後に時間が経過するにつれて、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９およびＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９が類似の水準で細胞を最も速く殺傷する反面、図８Ｇ〜図８Ｉに示すように、正常細胞株では、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９およびＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９で感染した場合は、時間が経過するにつれて、細胞生存率が急激に減少するが（細胞生存率５〜２０％）、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９で感染した場合には、感染後９日が経過しても、約９０％以上の細胞が生存することを観察することができた。このような結果により、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の癌細胞特異的殺傷能に優れることを検証した。これはまた、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の場合、対照群複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９および野生型ｈＴＥＲＴによって複製が調節されるＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９より正常細胞における安全性が大幅増加したことを意味する。
【００８７】
（実施例８）
複製可能組み換えアデノウィルスの生体内抗腫瘍効果検証
ｈＴＥＲＴプロモーターによって複製が調節されるアデノウィルスＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９とｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによって複製が調節されるＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスの生体内抗腫瘍効果を比較検証するために、人体子宮癌細胞株をヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９とＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスを陽性対照群ウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９と共に腫瘍内投与した後、腫瘍の大きさを観察した。生後６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で１×１０７個の人体子宮癌細胞株Ｃ３３Ａを注射した後、腫瘍が５０〜８０ｍｍ３程度成長したときに５×１０８ＰＦＵ(plaque forming unit)のＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスを陰性対照群ＰＢＳと共に二日間隔で３回腫瘍に直接注射した後、腫瘍の成長を観察した。腫瘍の容積は、カリパス(capliper)を用いて腫瘍の長軸と短軸を測定した後、次の公式で算出した（腫瘍の容積＝（短軸ｍｍ）２×長軸ｍｍ×０.５２３）。
【００８８】
図９に示すように、陰性対照群ＰＢＳを投与したマウスの場合、ウィルス投与後３２日目には、急激に成長して腫瘍の大きさが４,２３２±２,１８５ｍｍ３であったが、複製可能アデノウィルス（Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９）を投与したマウスの場合は、腫瘍の成長が大きく遅延することを確認することができた。すなわち、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与したマウスの場合、ウィルス投与後３２日目に腫瘍の大きさが４４±３８ｍｍ３であり、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９は２２９±１６８ｍｍ３、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９は１８±２０ｍｍ３程度とはっきりとした抗腫瘍効果を示した（ｐ＜０.０５）。また、ウィルス投与後６０日目には、ＰＢＳを投与した全６匹のマウスが死んでそれ以上腫瘍の成長を測定することができず、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与した場合には、腫瘍の大きさがそれぞれ６２±１０４ｍｍ３、５５０±３６８ｍｍ３、１５±１５ｍｍ３であって、ｍ−ｈＴＥＲＴによって複製が調節されるアデノウィルスＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の場合、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９だけ抗腫瘍効果が優れた（ｐ＜０.０５）。また、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与したマウスの場合、ウィルス投与後１０日頃に５匹のマウス中の２匹で腫瘍が完全に無くなることを観察することができ、２ヶ月が経過しても、腫瘍の再成長は観察されなかった。
【００８９】
（実施例９）
ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの生体内正常組織における活性検証
生体内正常組織でｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの活性を検証するために、ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによって発現が調節されるＬａｃＺ標識遺伝子の挿入された複製不能アデノウィルスｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚとｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを陽性対照群ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚと共にマウスに静脈投与した。生後６〜８週齢のマウスの尾静脈に５×１０１０ＰＦＵのｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚおよびｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚをそれぞれ１００μｌずつ投与してから３日後にマウスから各臓器（肝、心臓、肺、脾臓、腎臓、胃腸、精巣、筋肉）を摘出した。摘出された各組織を４％パラホルムアルデヒド溶液に仕込んだ後、４℃で４〜８時間固定させ、その後スクロース溶液でオーバーナイト(overnight)して脱水させた。脱水した組織は、Ｏ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で凍結薄片した後、８μｌの厚さに切断し、ゼラインのコートされたスライドガラス上に付着させてＸ−ｇａｌ染色を行った。
【００９０】
図１０Ａおよび図１０Ｂに示すように、構成性(constitutive)プロモーターによってＬａｃＺの発現が調節されるアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚを静脈投与した場合、肝組織におけるＬａｃＺ発現が非常に高く起こり、脾臓、胃および腎臓でもＬａｃＺの発現が低く起こることを観察することができた。ところが、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚとｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを投与した場合には、静脈投与後にアデノウィルスが最も多く検出されると知られている器官の肝組織においてＬａｃＺの発現が全く起こらないため、ｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの活性が正常肝細胞で全く起こらないことを確認することができた。脾臓組織では、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを投与した場合がｄｌ−ＣＭＶ−Ｚを投与した場合より一層微弱にＬａｃＺの発現が起こって、脾臓細胞でもｈＴＥＲＴとｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの活性が抑制されることが分かった。胃腸組織では、ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚまたはｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚを投与した場合はＬａｃＺの発現が少量検出されたが、ｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを投与した場合は全くＬａｃＺの発現が観察されておらず、腎臓組織では、ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚを投与した場合は微弱にＬａｃＺの発現が起こったが、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを投与した場合は全くＬａｃＺの発現が観察されていないため、ｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの癌細胞特異性に優れることを確認した。
【００９１】
（実施例１０）
ｈ−ＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの生体内腫瘍組織および正常組織における活性検証
腫瘍組織および正常組織におけるｈＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの活性を比較検証するために、生後６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で１×１０７個の人体子宮癌細胞株Ｃ３３Ａを注射した後、腫瘍が１００ｍｍ３程度成長したとき、５×１０８ＰＦＵ(plaque forming unit)のｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚとｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚアデノウィルスを陽性対照群ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚと共に１回マウスに腫瘍内投与(intratumoral injection)した。ウィルス投与３日後に腫瘍組織および正常組織を摘出した後、前述の方法によってＸ−ｇａｌ染色を行った。
【００９２】
図１１Ａおよび図１１Ｂに示すように、ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚを投与したマウスの場合、腫瘍組織でＬａｃＺの発現が強く誘導されたが、正常組織の肝においてもＬａｃＺの発現が検出された反面、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚを投与したマウスの場合、腫瘍組織ではＬａｃＺが高く発現されるが、正常肝組織では全くＬａｃＺの発現を観察することができなかった。また、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚウィルスは、極めて一部の癌細胞でのみＬａｃＺの発現を誘導したが、ｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚウィルスは、腫瘍組織内の多くの癌細胞でＬａｃＺの発現を誘導してｍＴＥＲＴプロモーターの活性がＴＥＲＴプロモーターに比べて癌細胞で一層強く活性化されることが分かった。
【００９３】
（実施例１１）
癌細胞および正常細胞におけるウィルス生産量の比較
ＴＥＲＴまたはｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターによる癌細胞特異的複製で癌細胞と正常細胞におけるウィルス生産量を比較するために、６−ウェルプレートに３×１０５個の癌細胞（ＨｅＬａ細胞）と正常細胞（ＢＪ細胞）を分注した翌日、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９と陰性対照群として複製不能ウィルスｄｌ−ＣＭＶ−ＺをＭＯＩ１０で４時間感染させ、その後ウィルスの含まれた培地を取り除いて新規の培地で取り替えた後、一定の時間間隔で細胞と培養液を回収した。３回の凍結と解凍を繰り返し行った後、２９３細胞株でｌｉｍｉｔｉｎｇ ｔｉｔｅｒａｔｉｏｎ方法によってウィルス力価を決定した。
【００９４】
図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、ＨｅＬａ細胞株では、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９で感染させた場合には陽性対照群ウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９と類似にウィルスが活発に生成されるが、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９で感染した場合にはウィルスの生産量が著しく低かった。しかし、人体正常細胞株ＢＪでは、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９によって感染した場合、ウィルスが殆ど生産されないため、これらのウィルスの癌細胞特異的複製能を確認することができた。
【００９５】
（実施例１２）
腫瘍組織における複製可能アデノウィルスの複製能分析
生後６〜８週齢のヌードマウスの腹壁に皮下で１×１０７個の人体子宮癌細胞株Ｃ３３Ａを注射した後、腫瘍が約５０〜８０ｍｍ３程度成長したとき、５×１０８ＰＦＵのＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスを直接投与した。ウィルス投与７日後に腫瘍を摘出してパラフィンブロックを製作した後、アデノウィルスのヘキソン部位と選択的に結合する抗体を用いて免疫組織化学(immunohistochemistry)をした。アデノウィルスのヘキソン(hexon)部位と選択的に結合する抗体（ＡＢ１０５６Ｆ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を１次抗体として混成化させた後、ＨＲＰ(horse Radish peroxidase)が結合した２次抗体をさらに混成化させてヘキソンの発現様相を究明した。
【００９６】
図１３に示すように、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９を投与した場合に比べて、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与した腫瘍組織がさらに広い部位からアデノウィルスが検出された。このような実験結果は、癌組織内におけるＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９複製能がＡｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９より活発に起こることを意味する。
【００９７】
（実施例１３）
複製可能アデノウィルスが正常肝組織に及ぼす細胞毒性の分析
人体子宮癌細胞株Ｃ３３Ａをヌードマウスに接種した後、形成された腫瘍にＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスをそれぞれ腫瘍内投与してから７日後にマウスから肝組織を摘出し、ヘマトキシリン・エオシン(hematoxylin & eosin)で染色して組織の状態を検証した。
【００９８】
図１４に示すように、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与したマウスの肝の場合、類似分裂(mitosis)が多く観察され、核が大きくなっており、濃く染色されたことからみて、ウィルスによる核の損傷を確認することができた。また、クッパー細胞(kupffer cell)の増殖、多くの炎症細胞、およびアポトーシス(apoptosis)に進む細胞も観察された。Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与したマウスの肝を見れば、核がやや大きくなっているが、類似分裂の行われる細胞を観察することができず、クッパー細胞もやはり正常的な形をしており、反応性感染(reactive hepatitis)または炎症(inflammation)現象も観察することができなかった。このような結果からみて、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９ウィルスの場合、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９に比べて細胞毒性が著しく低下することを確認することができた。
【００９９】
（実施例１４）
本発明のアデノウィルス投与量および投与経路によるマウスの致死率検証
癌細胞特異的に複製が可能なアデノウィルスＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９と対照群ウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９の生体内投与量による毒性を投与経路別にそれぞれ検証した。
【０１００】
Ａ．静脈内投与による毒性検証
尾静脈内投与によるアデノウィルスの投与による毒性を調べるために、生後６〜８週齢のマウスの尾静脈に１×１０１０、３×１０１０、５×１０１０ＰＦＵのＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９をＰＢＳが１００μｌとなるようにして投与した後、マウスの生存率を調べた（図１５Ａ）。
【０１０１】
Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスをそれぞれ１×１０１０ＰＦＵで全身投与した場合、１０匹のマウスが全てウィルス投与後１５日まで生存し、１×１０１０ＰＦＵのウィルスを静脈から全身投与したときにマウスの致死率が０であることを確認することができた。Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を３×１０１０ＰＦＵで全身投与した場合には、５匹のマウスの中で４匹がウィルス投与後１５日まで生存したが、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与した場合には、５匹のマウスがウィルス投与後８日以内に全て死んだ。このような結果は、癌細胞に対する選択性が欠如しているＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９の場合には、３×１０１０ウィルスの力価では致死率１００％と毒性が確認されたが、癌細胞特異的に活性が調節されるＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の場合には、致死率２０％と毒性が弱化したことを意味する。５×１０１０ＰＦＵの場合、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９ウィルスを投与した全てのマウスがウィルス投与後５日以内に死んで、このような高濃度のウィルスを静脈から全身投与したときには毒性が最も大きいことを確認することができた。
【０１０２】
Ｂ．腹腔内投与による毒性検証
腹腔内投与によるアデノウィルスの投与量による毒性を調べるために、生後６〜８週齢のマウスの腹腔に５×１０１０と１×１０１１ＰＦＵのＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を１ｍｌの量で投与した後、マウスの生存率を調べた（図１５Ｂ）。
【０１０３】
Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスをそれぞれ５×１０１０ＰＦＵで腹腔内投与した場合、１０匹のマウスが全てウィルス投与後１５日まで生存し、５×１０１０ＰＦＵのウィルスを腹腔内投与したときにマウスの致死率が０であることを確認することができた。Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を１×１０１１ＰＦＵで腹腔内投与した場合には、５匹のマウスの中で４匹がウィルス投与後１５日まで生存し、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与した場合には、５匹のマウスの中で３匹がウィルス投与後１５日まで生存した。このような結果は、癌細胞に対する選択性が欠如しているＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９の場合には致死率が４０％であるが、癌細胞特異的に活性が調節されるＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の場合には致死率２０％と毒性がやや弱化したことを意味する。また、５×１０１０ＰＦＵのウィルスをマウスの尾静脈から全身投与した場合には全てのマウスがウィルス投与後５日以内に死んだが、腹腔投与した場合にはマウスの致死率が０であることを確認することができた。これは、アデノウィルスを腹腔に投与することが静脈投与することより安全であることを意味する。
【０１０４】
Ｃ．腫瘍内投与による毒性検証
腫瘍内投与によるアデノウィルスの投与量による毒性を調べるために、生後６〜８週齢のマウスの腹壁にＢ１６Ｆ１０細胞株を接種した後、腫瘍の大きさが約１００ｍｍ３程度成長したとき、Ａｄ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスをそれぞれ５×１０１０と１×１０１１ＰＦＵで腫瘍内投与した（図１５Ｃ）。
【０１０５】
５×１０１０ＰＦＵのウィルスを投与した全２０匹のマウスがウィルス投与後１５日まで生存し、前記ＰＦＵのウィルスを腫瘍内投与したときにマウスの致死率が０であることを確認することができた。Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を１×１０１１ＰＦＵで腫瘍内投与した場合には、投与を受けた１０匹のマウスの中で２匹がウィルス投与後８日目に死んだ。Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与した場合には、投与を受けた１０匹のマウスの中で２匹がウィルス投与後１２日以内に死んだ。したがって、ウィルス投与後１５日を基点としたマウスの致死率は、２種のウィルスを投与した場合に全て２０％であるが、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与したマウスの生存期間がＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与したマウスの生存期間より増加した。
【０１０６】
このような結果をまとめると、癌細胞特異的に複製が起こるＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスを静脈投与または腹腔内投与した場合の致死率が癌細胞に対する選択性が欠如しているＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスの場合に比べて減少し、癌細胞特異的に増殖されるアデノウィルスによる生体内毒性が弱化したことが分かる。また、同じ力価のアデノウィルスを投与した場合、静脈からの全身投与が腹腔内投与または腫瘍内投与より強い毒性を示して高致死率を示すことも分かった。
【０１０７】
(実施例１５)
投与経路別投与量による正常組織に対する毒性比較
癌細胞特異的に複製が可能なアデノウィルスＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９と対照群ウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９の生体内投与容量による正常組織に対する毒性を組織病理学的な素見で検証するために、生後６〜８週齢のマウスに１×１０１０ＰＦＵのＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＰＢＳを尾静脈、腹腔内または腫瘍内投与してから７日経過した後、マウスからいろいろの臓器（腎臓、肝、肺、脾臓）を摘出して凍結薄片した後、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して組織の状態を検証した（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。
【０１０８】
Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスを尾静脈から全身投与した場合、肝門脈の周辺に炎症反応が激しく起こり、クッパー細胞の増殖とアポトーシスに進む細胞も観察された。また、多くの類似分裂が観察され、核が大きくなり、濃く染色されたことからみて、ウィルスによる核の損傷を確認することができた。この他に、リンパ様(lymphoid)小胞体にリンパ球が殆どない特徴を観察することができた。ところが、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９ウィルスを尾静脈から全身投与した肝では、炎症反応が弱く起こり、核がやや肥大になっていたが、類似分裂が進む細胞を観察することができなかった。そして、肝組織外の他の組織では、異常現象が観察されなかった。尾静脈からの全身投与ではなく、腹腔内または腫瘍内に同じ力価のＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスを投与した場合には、当該実施例で摘出した全ての組織の状態が良好であることも確認することができた。このような結果より、アデノウィルスを全身投与した場合は、腹腔内投与した場合より激しい毒性を誘発することが分かり、腫瘍特異的に複製が調節されるＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９アデノウィルスを生体内投与した場合、生体内組織に及ぼす毒性がＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９ウィルスに比べて一層減少することが分かった。
【０１０９】
（実施例１６）
投与経路別投与量による正常組織に対する毒性比較  
これと共に血液分析によって、肝機能に関連したいろいろの酵素（ＧＯＴ、ＧＰＴ、Ｔ−ｂｉｌｉｌｕｂｉｎ）、腎臓機能に関連した酵素（ＢＵＮ、ＣＲＥＡ、尿酸）、全体コレステロールおよび電解質イオン（Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｌ−）の濃度を定量分析した（表２〜表４）。
【０１１０】
Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスを５×１０１０ＰＦＵで尾静脈から全身投与した場合は、ウィルス投与後７日内にマウスが死んで血液分析実験を行うことができなかったが、これに対し、同じ力価のアデノウィルスを腹腔投与または腫瘍内投与した場合は、投与後７日頃には肝毒性が大きく弱化したうえ、腎臓毒性が現れておらず、電解質イオンの濃度も全て正常範囲内にあった。このような結果は、アデノウィルスを腹腔または腫瘍内投与することが静脈投与することより安全であることを意味する。
【０１１１】
アデノウィルスを１×１０１０ＰＦＵで全身投与した場合に発生する肝毒性を比較すると、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与したときには、ＧＯＴとＧＰＴ濃度が著しく大幅増加して分析可能最大値を超過したが、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与したときには、ＧＯＴとＧＰＴ濃度が正常数値より約５〜１６倍増加した。しかし、肝機能を検証することが可能な別の酵素Ｔ−ｂｉｌｉｌｕｂｉｎの場合は、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９を投与したときに大きく増加したが、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与したときには正常範囲にあった。
【０１１２】
また、Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスを５×１０１０ＰＦＵで腹腔内投与した場合、ＧＰＴの濃度が増加したが、Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を投与したマウスではＧＰＴの濃度が正常範囲にあり、これらのアデノウィルスを腫瘍内投与した場合には、ＧＯＴとＴ−ｂｉｌｉｌｕｂｉｎの濃度がＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９アデノウィルスを投与したときに増加した。したがって、このような結果より、癌細胞特異的複製能を有するアデノウィルスによる生体内肝毒性が癌細胞特異性のないアデノウィルスに比べて減少することが分かった。
【０１１３】
【表２】
2006520585.tif 000004
【０１１４】
【表３】
2006520585.tif 000005
【０１１５】
【表４】
2006520585.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明に係る転写調節配列は、癌細胞でのみ特異的であり、高効率で自分と作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導することにより癌細胞のみを選択的に殺傷することができるため、副作用を最小化した抗癌治療剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】本発明に係る転写調節配列の一実施例に係るｍ−ｈＴＥＲＴプロモーターの塩基配列を示す図である。
【図２Ａ】本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスベクターｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚおよびｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚの模式図である。
【図２Ｂ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスベクターＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９およびＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の模式図である。
【図３】本発明で用いられる様々な癌細胞株および正常細胞株の相対的な内在テロメラーゼの活性度を示すグラフである。
【図４】様々な癌細胞株または正常細胞株において本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を示す写真である。
【図５Ａ】癌細胞株（Ｈ４６０）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｂ】癌細胞株（Ａ５４９）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｃ】癌細胞株（Ｃ３３Ａ）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｄ】癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｅ】癌細胞株（ＨｅｐＧ２）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｆ】癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子お発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｇ】癌細胞株（Ｕ３４３）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｈ】癌細胞株（Ｕ２５１Ｎ）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｉ】癌細胞株（ＭＣＦ７）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｊ】正常細胞株（１７３ＷＥ）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｋ】正常細胞株（ＣＢＨＥＬ）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｌ】正常細胞株（ＭＲＣ５）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｍ】正常細胞株（ＩＭＲ９０）で本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｎ】正常細胞株（Ｗ１３８）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図５Ｏ】正常細胞株（ＢＪ）における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ（■）、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚ（○）またはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚ（△）のＬａｃＺ遺伝子の発現様相を定量化したグラフである。
【図６】様々な癌細胞株または正常細胞株における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９のＥ１遺伝子の発現様相を示す図である（１：Ｃ３３Ａ、２：Ａ５４９、３：ＨｅＬａ、４：ＳＫ−Ｈｅｐ１、５：Ｗ１３８、６：ＢＪ、７：ＩＭＲ９０）。
【図７Ａ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。。
【図７Ｂ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ｈ４６０）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｃ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ｃ３３Ａ）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｄ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ｕ２５１Ｎ）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｅ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ａ５４９）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｆ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（ＨｅＬａ）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｇ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株（ＢＪ）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｈ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株（ＷＩ３８）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図７Ｉ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株（ＩＭＲ９０）の殺傷程度を示す図である（１：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、２：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、３：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、４：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ａ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ１）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｂ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ｈ４６０）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｃ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ｃ３３Ａ）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｄ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ｕ２５１Ｎ）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｅ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（Ａ５４９）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｆ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した癌細胞株（ＨｅＬａ）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｇ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株（ＢＪ）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｈ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株（ＷＩ３８）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図８Ｉ】本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスによって感染した正常細胞株（ＩＭＲ９０）の殺傷程度を定量化したグラフである（■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、○：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、□：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図９】腫瘍の形成されたヌードマウスにおける本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの腫瘍殺傷程度を示すグラフである（■：ＰＢＳ、□：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、○：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△：Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９）。
【図１０Ａ】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図１０Ｂ】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図１０Ｃ】様々な生体内正常組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図１１Ａ】生体内癌組織における本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−ＺのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図１１Ｂ】生体内癌組織に本発明に係る複製不能組み換えアデノウィルスｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ、ｄｌ−ＴＥＲＴ−Ｚまたはｄｌ−ｍＴＥＲＴ−Ｚウィルスを腫瘍内投与した後、生体内肝組織でのＬａｃＺ遺伝子の発現様相を示すものである。
【図１２Ａ】ＨｅＬａ癌細胞における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの生産量を示すグラフである。（□：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、○：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９、■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ）。
【図１２Ｂ】ＢＪ正常細胞における本発明に係る複製可能組み換えアデノウィルスの生産量を示すグラフである。（□：Ａｄ−ΔＥ１Ｂ１９、○：Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９、△Ａｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９、■：ｄｌ−ＣＭＶ−Ｚ）。
【図１３】癌組織内における本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９、Ａｄ−ＴＥＲＴ−Δ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の複製能を比較するための免疫組織化学(immunohistochemistry)結果を示すものである。
【図１４】正常肝組織内における本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９の毒性を比較するためのヘマトキシリン・エオジン(Hematoxylin＆Eosin)染色結果を示すものである。
【図１５Ａ】本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を静脈内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図１５Ｂ】本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を腹腔内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図１５Ｃ】本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を腫瘍内投与する場合の投与量によるマウスの生存率グラフである。
【図１６Ａ】本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を静脈内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図１６Ｂ】本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を腹腔内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図１６Ｃ】本発明に係る複製可能アデノウィルスＡｄ−ΔＥ１Ｂ１９またはＡｄ−ｍＴＥＲＴ−Δ１９を腫瘍内投与する場合の投与量による正常組織に対する毒性を示す写真である。
【図１】
2006520585.tif 000007
【図２Ａ】
2006520585.tif 000008
【図２Ｂ】
2006520585.tif 000009
【図３】
2006520585.tif 000010
【図４】
2006520585.tif 000011
【図５Ａ】
2006520585.tif 000012
【図５Ｂ】
2006520585.tif 000013
【図５Ｃ】
2006520585.tif 000014
【図５Ｄ】
2006520585.tif 000015
【図５Ｅ】
2006520585.tif 000016
【図５Ｆ】
2006520585.tif 000017
【図５Ｇ】
2006520585.tif 000018
【図５Ｈ】
2006520585.tif 000019
【図５Ｉ】
2006520585.tif 000020
【図５Ｊ】
2006520585.tif 000021
【図５Ｋ】
2006520585.tif 000022
【図５Ｌ】
2006520585.tif 000023
【図５Ｍ】
2006520585.tif 000024
【図５Ｎ】
2006520585.tif 000025
【図５Ｏ】
2006520585.tif 000026
【図６】
2006520585.tif 000027
2006520585.tif 000028
2006520585.tif 000029
2006520585.tif 000030
2006520585.tif 000031
2006520585.tif 000032
2006520585.tif 000033
2006520585.tif 000034
2006520585.tif 000035
2006520585.tif 000036
【図８Ａ】
2006520585.tif 000037
【図８Ｂ】
2006520585.tif 000038
【図８Ｃ】
2006520585.tif 000039
【図８Ｄ】
2006520585.tif 000040
【図８Ｅ】
2006520585.tif 000041
【図８Ｆ】
2006520585.tif 000042
【図８Ｇ】
2006520585.tif 000043
【図８Ｈ】
2006520585.tif 000044
【図８Ｉ】
2006520585.tif 000045
【図９】
2006520585.tif 000046
【図１０Ａ】
2006520585.tif 000047
【図１０Ｂ】
2006520585.tif 000048
【図１０Ｃ】
2006520585.tif 000049
2006520585.tif 000050
2006520585.tif 000051
【図１２Ａ】
2006520585.tif 000052
【図１２Ｂ】
2006520585.tif 000053
【図１３】
2006520585.tif 000054
【図１４】
2006520585.tif 000055
【図１５Ａ】
2006520585.tif 000056
【図１５Ｂ】
2006520585.tif 000057
【図１５Ｃ】
2006520585.tif 000058
【図１６Ａ】
2006520585.tif 000059
【図１６Ｂ】
2006520585.tif 000060
【図１６Ｃ】
2006520585.tif 000061
【配列表】
2006520585000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月22日(2005.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの野生型テロメア逆転写酵素プロモーターに、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、転写調節配列。
【請求項２】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに、１つのｃ−Ｍｙｃ結合部位および５つのＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結されたことを特徴とする、請求項１に記載の転写調節配列。
【請求項３】
ｃ−Ｍｙｃ結合部位が、配列番号２、配列番号３または配列番号４よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の転写調節配列。
【請求項４】
Ｓｐ１結合部位が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の転写調節配列。
【請求項５】
ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターの５'−末端または３'−末端に、一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結されることを特徴とする、請求項１に記載の転写調節配列。
【請求項６】
前記転写調節配列が配列番号１３の核酸配列を持つことを特徴とする、請求項１に記載の転写調節配列。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写調節配列が、ウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項８】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ(adenoviridiae)属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項７に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項９】
前記ウィルスの複製に必要な遺伝子が、アデノウィルスの初期遺伝子であることを特徴とする、請求項７または８に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１０】
前記アデノウィルスの初期遺伝子が、Ｅ１Ａ遺伝子であることを特徴とする、請求項９に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１１】
前記アデノウィルスが、Ｅ１Ｂ１９ｋＤａ遺伝子の欠失しているものであることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１２】
前記組み換えウィルスベクターが、ＫＣＣＭ−１０４７０であることを特徴とする、請求項１１に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換えウィルスベクター。
【請求項１４】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１５】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項１３に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１６】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのＥ１遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製不能であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１７】
前記治療学的トランス遺伝子がアデノウィルスのＥ３遺伝子の代わりに導入され、前記組み換えウィルスベクターが複製可能であることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１８】
治療学的トランス遺伝子がＥ１Ａ遺伝子の代わりに導入され、アデノウィルスのＥ１およびＥ３電子が除去されたことを特徴とする、請求項１４に記載の組み換えウィルスベクター。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の転写調節配列が、治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結されたことを特徴とする、組み換え非ウィルスベクター。
【請求項２０】
前記治療学的トランス遺伝子が、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞死滅遺伝子および抗−新生血管生成遺伝子よりなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の組み換え非ウィルスベクター。
【請求項２１】
請求項７〜１２のいずれか１項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の組み換えウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１９または２０に記載の組み換え非ウィルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２４】
（ａ）ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列がウィルスの複製に必要な遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項２５】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項２４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２６】
（ａ）ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換えウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【請求項２７】
前記ウィルスベクターが、アデノビリジアエ属から由来したウィルスであることを特徴とする、請求項２６に記載の薬剤学的組成物。
【請求項２８】
（ａ）ヒトのテロメア逆転写酵素プロモーターに一つ以上のｃ−Ｍｙｃ結合部位および一つ以上のＳｐ１結合部位を含む核酸配列が連結された転写調節配列が治療学的トランス遺伝子に作動可能に連結された組み換え非ウィルスベクターの治療学的有効量、および（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む、薬剤学的組成物。
【国際調査報告】
2006520585.tif 000062
2006520585.tif 000063
2006520585.tif 000064
2006520585.tif 000065