(57)【要約】本発明は、医薬活性オルニチン化合物に関するものであり、詳細には製薬上許容されるNα(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン化合物のNδ-アシル誘導体のアンモニウム塩；ならびに１以上のそのようなアンモニウム塩を利用または含む治療方法および医薬組成物に関するものである。本発明によって提供されるアンモニウム塩は、相当するNα(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン化合物の酸性Nδ-アシル誘導体より優れた化学的安定性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式IIによるアンモニウム塩。
【化１】
2006523689.tif 000012
［式中、
R2は、R2の各場合で、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、C1-6アルコキシ、クロロ、フルオロ、ヒドロキシおよび-COOHからなる群から独立に選択される４個以下の基を表し；
R3、R4およびR5は独立に、水素およびC1-6アルキルから選択され；あるいは
NR3R4が一体となって、少なくとも１個の窒素環原子を有する５〜７員複素環を形成しており；
ｘは、０より大きく約４未満の実数である。］
【請求項２】
NR3R4R5がアンモニア、ピペラジン、2-ヒドロキシエチルアンモニウムまたは製薬上許容されるアルカロイドを表す請求項１に記載のアンモニウム塩。
【請求項３】
NR3R4R5がアンモニアを表す請求項１に記載のアンモニウム塩。
【請求項４】
下記式IIIによる請求項１に記載のアンモニウム塩。
【化２】
2006523689.tif 000013
［式中、
R2は、R2の各場合で、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、C1-6アルコキシ、クロロ、フルオロ、ヒドロキシおよび-COOHからなる群から独立に選択される４個以下の基を表し；
R3、R4およびR5は独立に、水素およびC1-6アルキルから選択され；あるいは
NR3R4が一体となって、少なくとも１個の窒素環原子を有する５〜７員複素環を形成しており；
ｘは、０より大きく約４未満の実数である。］
【請求項５】
NR3R4R5がアンモニア、ピペラジン、2-ヒドロキシエチルアンモニウムまたは製薬上許容されるアルカロイドを表す請求項４に記載のアンモニウム塩。
【請求項６】
NR3R4R5がアンモニアを表す請求項４に記載のアンモニウム塩。
【請求項７】
xが約0.5〜3の実数である請求項６に記載のアンモニウム塩。
【請求項８】
xが約1〜約2の実数である請求項６に記載のアンモニウム塩。
【請求項９】
下記式IVによる請求項１に記載のアンモニウム塩。
【化３】
2006523689.tif 000014
［式中、
R3、R4およびR5は独立に、水素およびC1-6アルキルから選択され；あるいは
NR3R4が一体となって、少なくとも１個の窒素環原子を有する５〜７員複素環を形成しており；
ｘは、０より大きく約４未満の実数である。］
【請求項１０】
NR3R4R5がアンモニア、ピペラジン、2-ヒドロキシエチルアンモニウムまたは製薬上許容されるアルカロイドを表す請求項９に記載のアンモニウム塩。
【請求項１１】
NR3R4R5がアンモニアを表す請求項９に記載のアンモニウム塩。
【請求項１２】
xが約0.5〜3の実数である請求項１１に記載のアンモニウム塩。
【請求項１３】
xが約1〜約2の実数である請求項１１に記載のアンモニウム塩。
【請求項１４】
少なくとも約0.5当量の水をさらに含む請求項９に記載のアンモニウム塩。
【請求項１５】
約0.5〜約5当量の水をさらに含む請求項９に記載のアンモニウム塩。
【請求項１６】
下記式によって表されるアンモニウム塩。
【化４】
2006523689.tif 000015
［式中、xは0より大きく約4未満である実数である。］
【請求項１７】
xが約0.5〜3の実数である請求項１６に記載のアンモニウム塩。
【請求項１８】
xが約1〜約2の実数である請求項１６に記載のアンモニウム塩。
【請求項１９】
少なくとも約0.5当量の水をさらに含む請求項１６に記載のアンモニウム塩。
【請求項２０】
約0.5〜約5当量の水をさらに含む請求項１６に記載のアンモニウム塩。
【請求項２１】
前記アンモニウム塩が1μM以下のIC50で、メトトレキセート耐性細胞の増殖を阻害することができる請求項１、４、９または１６のいずれかに記載のアンモニウム塩。
【請求項２２】
前記アンモニウム塩が500nM以下のIC50で、メトトレキセート耐性細胞の増殖を阻害することができる請求項１、４、９または１６のいずれかに記載のアンモニウム塩。
【請求項２３】
前記アンモニウム塩が100nM以下のIC50で、メトトレキセート耐性細胞の増殖を阻害することができる請求項１、４、９または１６のいずれかに記載のアンモニウム塩。
【請求項２４】
前記アンモニウム塩が10nM以下のIC50で、メトトレキセート耐性細胞の増殖を阻害することができる請求項１、４、９または１６のいずれかに記載のアンモニウム塩。
【請求項２５】
前記アンモニウム塩が1nM以下のIC50で、メトトレキセート耐性細胞の増殖を阻害することができる請求項１、４、９または１６のいずれかに記載のアンモニウム塩。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載のアンモニウム塩および製薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
癌を患うか癌を患い易い哺乳動物の治療方法において、該哺乳動物に対して、有効量の請求項１〜２６のいずれかに記載のアンモニウム塩または組成物を投与する段階を有する方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物がヒトである請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所の国立癌研究所からの助成RO1-CA25394下での政府支援を受けて行った。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、医薬活性オルニチン化合物を提供し、詳細にはNα(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン化合物のNδ-アシル誘導体の製薬上許容されるアンモニウム塩に関するものである。本発明の好ましいアンモニウム塩は、遊離酸製剤に相当する優れた化学的安定性を有する。
【背景技術】
【０００３】
Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン(「APA-L-Orn」)は、下記式Ｉによる構造を有する。
【化１】
2006523689.tif 000002
【０００４】
式中、Rは水素である。それは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)およびホリルポリグルタミン酸シンセターゼ(FPGS)の強力な阻害薬であるが、培養での細胞増殖の阻害薬としては比較的不活性であると報告されており、それのアミノ置換プロドラッグ誘導体が、細胞取り込み量が多くなる可能性があることから興味深いものとなり得ることが提案されている(Rosowsky et al., J. Med. Chem., Vol 29, pp 655-660 (1986).)。
【０００５】
式Ｉによる一連の酸性化合物は、米国特許第4767761号に開示されており、式中においてRは安息香酸誘導体、例えば-CO-Ar-COOR1であり、Arは芳香族基であり、R1は水素または炭素原子数１〜５個の低級アルキルである。以下において、そのような化合物は、式Ｉａの酸性化合物と称する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
′761に開示された式Ｉａの酸性化合物は、ヒト細胞系SCC15/R1およびSCC25/R1などのメトトレキセートに対して耐性の腫瘍細胞の増殖に対する顕著に高い阻害活性を示す。式Ｉａの酸性化合物の阻害活性は、APA-L-Ornの他のNδ-アシル誘導体における阻害活性より予想以上に高かった。式Ｉａによる酸性化合物は、粉末として乾燥状態で保存した場合、あるいは約7.5より大きいpH、またはより代表的には約7.5〜9のpHを有するアルカリ性溶液中で保存した場合に、徐々に分解を受ける。さらに、式Ｉａによる酸性化合物は、塩基性添加剤を加えないと水溶液には溶けない。
【０００７】
乾燥製剤で良好な貯蔵寿命を有し、塩基性添加剤を加えなくとも水に容易に溶解可能な式Ｉａによる化合物の新規な製剤を有することが望ましいものと考えられる。特に望ましいのは、メトトレキセート耐性細胞の増殖に対する高い阻害活性を示し、相当する式Ｉａの酸性化合物と比較して安定性が向上した式Ｉａの化合物の製薬上許容される塩であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、新たな種類のNδ-アシル化Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン化合物のアンモニウム塩およびそれを含む治療組成物を発見した。本発明はまた、メトトレキセート耐性細胞の増殖に対する高い阻害活性を示す本発明のアンモニウム塩を癌患者に投与することによって、癌を患うか癌を患い易い患者、特に細胞腫瘍成長、腫瘍増殖または転移を患うかそれを患い易い患者を治療する方法を特徴とする。本発明のアンモニウム塩は、式Ｉａの相当する酸性化合物と比較して、水溶解度および向上した化学的安定性の優れた組合せを有する。
【０００９】
本発明のアンモニウム塩は、優れた化学的安定性を示すことで、本発明のアンモニウム塩は式Ｉａの相当する酸性化合物と比較して長い貯蔵寿命を有する。改善された化学的安定性は、式IIのアンモニウム塩の単離を容易にし、式IIのアンモニウム塩を含む医薬組成物の製剤を容易にし、式IIの純粋なアンモニウム塩および式IIのアンモニウム塩を含む医薬組成物の両方の貯蔵寿命を延長するものである。
【００１０】
本発明は、下記式IIのアンモニウム塩を特徴とする。
【化２】
2006523689.tif 000003
【００１１】
式中、
R2は、R2の各場合で、水素、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C3-8シクロアルキル、C1-6アルコキシ、クロロ、フルオロ、ヒドロキシおよび-COOHからなる群から独立に選択される４個以下の基を表し；
R3、R4およびR5は独立に、水素およびC1-6アルキルから選択され；あるいは
NR3R4が一体となって、少なくとも１個の窒素環原子を有する５〜７員複素環を形成しており；
ｘは、０より大きく約４未満の実数である。
【００１２】
式IIによる好ましいアンモニウム塩には、NR3R4R5がアンモニアすなわちNH3、ピペラジニウム、2-ヒドロキシエチルアンモニウムまたは製薬上許容されるアルカロイドを表す塩などがある。より好ましいものは、NR3R4R5がアンモニアを表す式IIによるアンモニウム塩である。
【００１３】
式IIの好ましい化合物は、メトトレキセートに対して耐性の腫瘍細胞、特に白血病細胞、リンパ芽球、ヒト腫瘍細胞系SCC15/R1およびSCC25/R1などにおける増殖の非常に活性な阻害薬である。
【００１４】
本発明はまた、製薬上許容される担体とともに上記式IIのアンモニウム塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様について、下記で説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
好ましい実施形態において本発明は、下記式IIIによるアンモニウムを特徴とする。
【化３】
2006523689.tif 000004
【００１７】
式中、x、R2、R3、R4およびR5は式IIの塩について定義の通りである。
【００１８】
式IIIによる好ましいアンモニウム塩には、NR3R4R5がアンモニアすなわちNH3、ピペラジニウム、2-ヒドロキシエチルアンモニウムまたは製薬上許容されるアルカロイドを表す塩などがる。より好ましいものは、NR3R4R5がアンモニアを表す式IIIによるアンモニウム塩である。
【００１９】
本発明は、NR3R4R5がアンモニアを表し、xが約4、3.5、3または2.5未満であり、xが約0、0.5または１より大きい式IIまたは式IIIによる好ましいアンモニウム塩を特徴とする。好ましい実施形態では、xは約0.75〜約2.5の実数、より好ましくは約0.8〜約2.4または約0.9〜約2の実数である。より好ましくは、xは約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9または2.0である。
【００２０】
好ましい実施形態では本発明は、下記式IVによるアンモニウム塩を提供する。
【化４】
2006523689.tif 000005
【００２１】
式中、
R3、R4およびR5は独立に、水素およびC1-6アルキルから選択されるか；あるいは
NR3R4が一体となって、少なくとも１個の窒素環原子を有する5〜7員複素環を形成しており；
xは０より大きく約４より小さい実数である。
【００２２】
式IVによる好ましいアンモニウム塩には、NR3R4R5がアンモニアすなわちNH3または製薬上許容されるアルカロイドを表す塩などがある。より好ましいものは、NR3R4R5がアンモニアを表す式IVによるアンモニウム塩である。好ましい実施形態では本発明は、NR3R4R5がアンモニアを表し、アンモニウム塩が１〜２当量のアンモニアを含み、例えば１≦x≦２であり、アンモニウム塩がさらに水和水を含んでいても良い式IVのアンモニウム塩を提供する。
【００２３】
本発明のアンモニウム塩の製造方法
相当するカルボン酸または金属カルボキシレートからアンモニウム塩を形成する全ての好適な方法が、本発明によって提供されるアンモニウム塩の製造に用いるのに想到される。NR3R4R5がNH3である式II、IIIまたはIVのいずれかによるアンモニウム塩の好ましい製造方法には、相当する遊離酸をアンモニウム希水酸化アンモニウム水溶液中で溶媒和させる段階、濾過によって不溶物を除去する段階、および得られた水溶液を凍結乾燥して純粋なアンモニウム塩を得る段階がある。
【００２４】
別の実施形態では本発明は、適切な溶媒中で前記遊離酸を溶媒和する段階および気体もしくは液体としての式NR3R4R5を遊離酸組成物の溶液中に導入して、式II、IIIまたはIVによるアンモニウム塩を溶液から沈殿させる段階を有する式II、IIIまたはIVのいずれかによるアンモニウム塩の製造方法を提供する。代表的には、アミンがアンモニアまたはメチルアミンなどの気体である場合、少なくとも前記気体のアミンを含む気体混合物を溶液に吹き込む。アミンが液体である場合、純粋なアミンまたはアミンの水混和性液体溶液を遊離酸の溶液に導入して、アンモニウム塩形成を誘発する。
【００２５】
本発明の方法での使用に好適な化合物には、あらゆる異なる単一の純粋な異性体ならびに２個以上の異性体の混合物が含まれる。異性体という用語は、ジアステレオマー、エナンチオマー、位置異性体、構造異性体、回転異性体、互変異体などを包含するものである。１以上の立体異性中心を有する化合物、例えばキラル化合物の場合、本発明の方法は、エナンチオマー的に豊富な化合物、ラセミ体またはジアステレオマーの混合物を用いて行うことができる。好ましいエナンチオマー的に豊富な化合物は、50%以上のエナンチオマー過剰を有し、より好ましくは前記化合物は60%、70%、80%、90%、95%、98%または99%あるいはそれ以上のエナンチオマー過剰を有する。好ましい実施形態では、キラルピロリドン化合物の１種類のみのエナンチオマーまたはジアステレオマーを投与する。
【００２６】
やはり上記で記載したように、本発明による投与を受ける代表的な被験者は、哺乳動物、例えば霊長類、特にはヒトである。
【００２７】
式II〜IVによる本発明の他の好ましいアンモニウム塩には、IC50が1μＭ以下でメトトレキセート耐性細胞の増殖を阻害することができるアンモニウム塩などがあり、その場合にメトトレキセート耐性細胞には、マウス白血病細胞またはヒトリンパ芽球などの癌細胞などがある。より好ましくは、本発明のアンモニウム塩は、癌細胞に対して500nM、250nM、100nM、50nM、25nM以下の細胞増殖阻害IC50を有する。最も好ましい化合物は、癌細胞、肉腫細胞その他の新生物細胞に対して25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、2nM、1nM以下の細胞増殖阻害IC50を有する。
【００２８】
本発明の他の好ましいアンモニウム塩は、米国特許第4767761号に開示のNα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-L-オルニチン化合物の相当する酸性N-アシル誘導体が示す細胞増殖阻害とほぼ同等の細胞増殖阻害を示す。
【００２９】
本発明はまた、式II〜IVのいずれかによるアンモニウム塩および製薬上許容される担体を含む医薬組成物をも特徴とする。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、本明細書に開示の癌治療に関する説明書(すなわち、文書シートなどの文書のもの)、例えば癌を患い易いかそれを患っている被験者、さらに好ましくは細胞がメトトレキセートに対して耐性である腫瘍細胞増殖を示す癌を患い易いかそれを患っている被験者の治療に関する説明書とともに包装することもできる。
【００３１】
本発明の好ましい方法には、本明細書に開示のような癌、肉腫および他の新生物細胞などのメトトレキセートに対して耐性の癌または腫瘍細胞増殖を患う被験者(例えば、哺乳動物、特にはヒト)を確認および／または選択する方法が含まれる。
【００３２】
上記で定義の式I、II、III、IVおよびVの化合物などの本発明の化合物の好適なハロゲン置換基またはハライド基には、F、Cl、BrおよびIなどがある。本発明の化合物のアルキル基は好ましくは、1〜約12個の炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する。本明細書で使用する場合、別段の変更がない限り、アルキルという用語は環状基および非環状基の両方を指す。ただし当然のことながら、環状基は少なくとも３個の炭素環員を有する。直鎖または分岐の非環状アルキル基は、通常は環状基より好ましく、特にはイソプロピルおよびt-ブチルなどの分岐基である。本発明の化合物の好ましいアルケニル基は、１以上の不飽和連結基および2〜約12個、より好ましくは2〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは2〜約6個の炭素原子の炭素原子を有する。本明細書で使用されるアルケニルという用語は、環状基および非環状基の両方を指す。ただし、直鎖または分岐の非環状基の方が好ましく、特には分岐基である。本発明の化合物の好ましいアルコキシ基には、１以上の酸素連結基および1〜約12個の炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する基などがある。本発明の化合物の好ましいチオアルキル基には、１以上のチオエーテル連結基および1〜約12炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する基などがある。好ましいアミノアルキル基には、１以上の１級、２級および／または３級アミン基、ならびに1〜約12個の炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する基などがある。好ましいアリールアミノ基には、１個もしくは２個のアリール基で置換されたアミノ基を有する基などがある。好ましいヘテロアリールアミノ基には、１個もしくは２個のヘテロアリール基で置換されたアミノ基を有する基などがある。置換および未置換のモノおよびジアルキルアミノ基が特に好ましく、特別にはその基の各アルキル鎖が1〜約6個の炭素原子を有する。本発明の化合物の好ましいアルキルスルホキシドは１以上のスルホキシド基、より代表的には１個のスルホキシド基、そして1〜約12個の炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する。本発明の化合物の好ましいスルホノアルキル基は、１以上のスルホノ(SO2)基、より代表的には１個または２個のスルホノ基、そして1〜約12個の炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、さらに好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する。本発明の化合物の好ましいアルカノール基には、１以上のカルボニル基、より代表的には１個または２個のカルボニル基、そして1〜約12個の炭素原子、より好ましくは1〜約8個の炭素原子、より好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する基などがある。好ましいアルコキシカルボニルアミノ基には、式-NHCOOR(Rは、1〜約10個の炭素原子、より好ましくは1〜約6個の炭素原子を有する置換または未置換アルキルである)の基などがある。本発明の化合物の好適なヘテロ芳香族基は、１以上のN、OまたはS原子を含み、例えばキノリニル、ピリジル、ピラジニル、インドリル、カルバゾイル、フリル、ピロリル、チエニル、チアゾリル、アミノチアゾリ���(2-アミノチアゾリルなど)、ピラゾリル、オキサゾリル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチアゾリルおよびピリジル(2-ピリジルおよび4-ピリジルなど)などがあり、特にはヒドロキシ、アセテートなどのアルカノール、1〜約8個の炭素原子を有するアルキルアミノカルボニルおよび1〜約8個の炭素原子を有するアルコキシカルボニルなどの部分によって１以上の環部分で置換されたピリジルである。化合物の好適なヘテロ脂環式基は、１以上のN、OまたはS原子を含み、例えばアジリジニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピロリジニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、モルホリニルおよびチオモルホリニルなどがある。
【００３３】
置換R2、R3、R4およびR5基のような本発明の化合物の置換された部分は、「置換されていても」良い。すなわち基は、例えばフッ素、塩素、臭素およびヨウ素などのハロゲン；シアノ；ヒドロキシル；ニトロ；1〜約12個の炭素原子もしくは1〜約6個の炭素原子を有する基などのアルキル基、好ましくはイソプロピルおよびt-ブチルなどの分岐基などの非環状アルキル基；１以上の不飽和連結基および2〜約12個の炭素または2〜約6個の炭素原子を有する基などのアルケニルおよびアルキニル基；１以上のチオエーテル連結基および1〜約12個の炭素原子もしくは1〜約6個の炭素原子を有する部分などのアルキルチオ基；ならびに、本発明の少なくとも好ましい態様では、１以上の酸素連結基および1〜約12個の炭素原子または1〜約6個の炭素原子を有する基を持つアルコキシ基；ならびに１以上のN原子(１級、２級および／または３級N基として存在することができる)および1〜約12個の炭素原子または1〜約6個の炭素原子を有する基などのアミノアルキル基のような１以上の好適な基によって１以上の利用可能な部分で置換されていても良い。
【００３４】
本発明のアンモニウム塩は、従来の無毒性で製薬上許容される担体、補助剤および媒体を含む単位製剤にて、局所、非経口、吸収もしくは噴霧または直腸投与で投与することができる。本発明のアンモニウム塩の１種類の水溶液の非経口投与が特に好ましい。本明細書で使用される非経口という用語には、皮下、皮内、血管(例：静脈または動脈)、筋肉、胸骨内、脊髄、髄腔内などの注射もしくは輸液法のような、注射および注射に類似するものが含まれ、皮下、筋肉および血管注射もしくは輸液が好ましい。
【００３５】
さらに、本発明の化合物および製薬上許容される担体を含む医薬製剤が提供される。本発明の１以上の化合物がは、１以上の無毒性で製薬上許容される担体および／または希釈剤および／または補助剤そして所望に応じて他の有効成分とともに存在していても良い。代表的な医薬組成物は、従来の賦形剤、すなわち活性化合物と有害な反応を行わず、それの投与を受ける対象者に対して有害ではない、所望の投与経路に好適な製薬上許容される有機もしくは無機の担体物質と混合された本発明のアンモニウム塩を含む。好適な製薬上許容される担体には、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール類、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド類およびジグリセリド類、石油エーテル系脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、L-アルギニン、マニトール、ポリビニルピロリドンなどがあるが、これらに限定されるものではない。医薬製剤は、滅菌することができ、所望に応じて補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿展剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤および／または芳香物質などの活性化合物と有害な反応をしないものと混合することができる。
【００３６】
本発明の化合物は、非経口的に、好ましくは無菌で無毒性の発熱物質を含まない媒体中で投与することができる。使用される媒体および濃度に応じて、薬剤は媒体に懸濁または溶解させることができる。有利には、局所麻酔剤、保存剤および緩衝剤などの補助剤を媒体に溶解させることができる。本発明の化合物を含む医薬組成物は、例えば水溶液あるいは本発明のアンモニウム塩の水溶液を凍結乾燥させることによって得られる固体残渣のような乾燥粉末組成物として、非経口用途に好適な形態とすることができる。代表的には非経口用途の場合、無菌水または無菌で製薬上許容される水溶液を、本発明のアンモニウム塩の乾燥粉末組成物を含む真空バイアルに加えてから、投与を行う。
【００３７】
水を加えることによる水系懸濁液の調製に好適な分散性粉体および粒剤は、分散剤もしくは湿展剤、懸濁剤および１以上の保存剤との混合で有効成分を提供する。好適な分散剤もしくは湿展剤および懸濁剤は、すでに前述したものが例として挙げられる。例えば着色剤などの別の賦形剤が存在しても良い。
【００３８】
合成方法
Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン(PT523)、化合物8を、図式１に示した手順に従って製造した。
【００３９】
2,4,5,6-テトラアミノピリミジンとジヒドロキシアセトンとの縮合によって、6-ヒドロキシメチルプテリジン1を得た。化合物1を、ジメチルアセトアミド中にて臭素およびトリフェニルホスフィンで処理して、相当する6-ブロモメチルプテリジンを得た。それをin situにて4-アミノ安息香酸とカップリングさせて、プテロイル安息香酸2を得た。粗生成物の純度は、HPLCによる分析で約85%であった。この化合物はほとんどの溶媒で溶解度が低いため、再結晶による精製は実用的ではないことがわかっている。しかしながら、相当するナトリウムエンは、熱水に可溶であり、冷却すると結晶化した。化合物2は熱水酸化物水溶液中では分解するが、粗生成物を希重炭酸ナトリウムで処理すると、ナトリウム塩が得られ、分解は観察されなかった。希重炭酸塩水溶液からの塩の再結晶によって、生成物純度は93%以上まで上昇した。次に、その精製された塩を、酢酸水溶液で処理することで、酸2に再度変換した。
【００４０】
化合物2のホルミル化は容易に進行し、良好な品質の中間体3が得られた。この取得物をオルニチネート5とカップリングさせて化合物6を得た。それはより良好な溶解特性を有し、カラムクロマトグラフィーによって精製した。非ホルミル類縁体について用いられる反応条件(溶媒としてメタノール-THF)下での化合物6の塩基加水分解では、良好な品質の生成物7は得られなかった。フタルイミドの開環およびメチルエステルの加水分解は容易に進行したが、ホルミル基の開裂は遅く、不完全であった。共溶媒としてTHFに代えてジメチルスルホキシドを用いることで、より良好な結果が得られた。そこで、DMSO-メタノール(1：4)中６当量の塩基を用いると、30〜45分以内に反応が完結した。より短い反応期間では、生成物は少量の未反応N-ホルミル化合物を含有し、反応時間を延長することで、他のいくつかの不純物の形成が認められた。そのため、加水分解段階を複数の少量操作(2〜10g)で実施し、反応の進行を注意深くモニタリングした(HPLC)。
【００４１】
化合物7の均一な10〜15gロットを得るための本発明者らの最初の試みでは、93〜96%純度の生成物の少量バッチ数個を合わせ、希重炭酸塩水溶液に溶かし、酸を加えることで化合物を再沈殿させた。それは、許容されない手順であることがわかっている。多量の不純物が発生し、均一なロットは純度85%のみとなった。本発明者らによる化合物の再精製の試みは不首尾であった。別途手法として本発明者らは、希水酸化アンモニウム中に溶解させた時には化合物7は比較的安定であることを確認した。溶液の凍結乾燥によって、アンモニウム塩8を黄色粉末の形態で得た。存在するとしても、生成物の分解はごく少量であった。
【００４２】
図式１：好ましい式IIのアンモニウム塩の合成
【化５】
2006523689.tif 000006
【００４３】
上記で示した手順を介して、文献法に従って標題化合物を製造した。2,4,5,6-テトラアミノピリミジンをジヒドロキシアセトンと縮合させることで、6-ヒドロキシメチルプテリジン(1)を生成した。それを相当する臭化物に変換し、in situで4-アミノ安息香酸とカップリングさせて、プテロイン酸2を得た。化合物2を還流するギ酸および無水酢酸の混合物中でホルミル化して、ホルミルプテロイン酸3を得た(全体で24%)。
【００４４】
分子の他の部分は、L-オルニチン塩酸塩から製造した。そこで、L-オルニチン塩酸塩を相当する銅錯体に変換し、重炭酸ナトリウムの存在下にカルベトキシフタルイミドとカップリングさせ、次に塩酸で処理して塩酸塩4を形成した。塩化チオニルの存在下に4をメタノールでエステル化することで、オルニチン酸メチル5を得た(全体で43%)。
【００４５】
ホルミルプテロイン酸3とオルニチン酸メチル5との縮合を、混成無水物法(クロルギ酸イソブチルとトリエチルアミン)を用いて行って、化合物6を得た(3から63%)。メタノールおよびジメチルスルホキシドの混合液(4：1)中室温で30分間にわたり2N水酸化ナトリウムで注意深く加水分解することで、中間体6の「PT523」7への変換を行った(90%)。最後に、異なるバッチの7を混合して２つの50〜55gロットとし、それぞれを希水酸化アンモニウムに溶かし、次に凍結乾燥することでアンモニウム塩8に変換した。「PT523」のサンプル55gおよび54g(NH4+塩として、HPLC純度96.5%+)を、ロット番号ML-07G-15およびML-07G-23として2000年1月26日にNCIに輸送した。
【００４６】
実施例
実施例１：4-アミノ-4-デオキシ-6-ヒドロキシメチルプテリジン(1)
硫酸テトラアミノピリミジン(119g、0.5mol)を、塩化バリウム(122g、0.5mol)の水溶液(水2.5L)に80℃で加えた。懸濁液を85〜90℃で15分間攪拌し、冷却して35℃とし、濾過した。合わせた濾液を、効率の良い攪拌機および酸素導入用のフリットガラス管を取り付けた三頸5リットルフラスコに入れた。L-システイン塩酸塩(87.8g、0.5mol)を加え、次に塩化アンモニウム(642g、12mol)および水酸化アンモニウム(63mL、1mol、水1リットルで希釈)を加えた。混合物を酸素下に冷却して0℃とし(アセトン/CO2浴)、ジヒドロキシアセトン２量体(135g、0.75mol)を加えた。反応混合物のpHを調節して6とし(濃NH4OH約4mLで)、冷却浴を外し、混合物を酸素気流下に40時間にわたって高攪拌した。固体1(主として塩酸塩)を濾過によって回収し、水(100mLで2回)およびエタノール(100mL)で洗浄し、100℃で終夜にわたり真空乾燥した。
【００４７】
乾燥させた塩酸塩(114.0g、0.5mol)を、氷酢酸(205mL、3.4mol)を含む熱(75℃)水(2052mL)に加えた。得られた懸濁液を75〜80℃で15分間攪拌した。不溶物を濾過によって除去し、透明濾液をノーリット(Norit)型活性炭で85℃にて5分間処理した。濾過後、混合物を冷却して45℃とし、濃NH4OH(245mL、3.9mol)でpH6に調節した。明黄色沈殿を回収し、水(100mL)、エタノール(100mL)、そして最後に少量のエーテルで洗浄した。生成物を100℃で終夜にわたり真空乾燥して、明黄色固体66.0g(68%)(ロットJK-1-106)を得た。
【００４８】
上記の手順をさらに２回繰り返して、54.0g(56%)(ロットJK-1-108)および60.0g(64%)(ロットJK1-112)を得た。
【００４９】
合わせたロットJK-1-106、JK-1-108およびJK-1-112(179g、0.92mol)を、濃HCl(65mL、0.8mol)を補助的に用いて75℃で10%酢酸水溶液(3.6L、5.99mol)に溶かした。得られた橙赤色溶液をノーリット活性炭(30g)で処理し、濾過し、冷却して40℃とした。溶液を濃NH4OH(435mL、6.9mol)で中和した。明黄色固体を回収し、水(200mLで２回)、エタノール(200mL)およびエーテル(100mL)で洗浄した。生成物を100℃で終夜にて真空乾燥して、明黄色固体163.2g(硫酸テトラアミノピリミジンから57%)、ロットJK-1-114；HPLC純度：96.0%(カラム-プロントシル(prontosil)120-3-C18AQ、4.6×150mm、3.0μ；検出器254nm；移動相-2〜20%アセトニトリル／0.01%TFA水溶液を2分から7分、1mL/分；サンプル-0.5mg/mL、10μL注入)を得た。
【００５０】
実施例2：4-アミノ-4-デオキシプテロイン酸(2)
滴下漏斗、温度計および乾燥管を取り付けた2リットルの三頸丸底フラスコに、トリフェニルホスフィン(216g、0.83mol)および脱水ジメチルアセトアミド(0.66L)を加えた。得られた透明溶液を冷却して5℃とし、温度を8℃以下に維持しながら臭素(132g、0.83mol)を45分間加えた。得られた白色スラリーに、2,4-ジアミノ-6-ヒドロキシメチルプテリジン(53g、0.28mol)を加えた。発熱効果のために温度が35℃まで上昇した。サビ色スラリーが1時間かけて徐々に溶解して、暗赤色溶液となった。混合物を室温で終夜攪拌したところ(約17時間)、暗赤色スラリーが形成された。酸化バリウム(53g、0.35mol)および4-アミノ安息香酸(57g、0.42mol)をそれぞれ高攪拌しながら一気に加えた。発熱効果のために温度が70℃まで上昇し、混合物は15分以内にサビ色スラリーとなった。反応混合物を55±2℃で24±2時間攪拌した。得られた黄褐色スラリーを冷却して20℃とし、CH2Cl2(6.9L)およびMeOH(0.2L)の混合液に投入した。固体を濾過によって単離し、H2O(2.5L)中でスラリーとし、混合物を再度濾過して固体を単離した。固体をMeOH(2.5L)中でスラリーとし、濾過によって単離し、室温で風乾して、粗生成物85g(99%)を褐色様-黄色粉末として得た(ロットBM-02G-54)。
【００５１】
同様にして、追加の1(106g)を２つのロットで処理して、粗2を83g(ロットBM-02G-56)および85g(ロットBM-02G-57)得た。
【００５２】
合わせた粗2(ロットBM-02G-54、-56、-57；250g)をメタノール(10L)中でスラリーとした。混合物を高攪拌しながら30分間加熱還流した。混合物を冷却して25℃とし、濾過し、固体を室温で終夜風乾して(約16時間)、褐色様黄色粉末238g(回収率95%)を得た(ロットBM-02G-58)。
【００５３】
実施例３：Na+塩への変換
段階Ａ：上記の固体(237g、ロットBM-02G-58)を、4%  NaHCO3水溶液(9〜5L)中にて85℃で15〜20分間攪拌した。不溶物を濾過によって単離し、16時間風乾して、褐色固体91g(ロットBM-02G-59A)を得た。濾液をノーリット活性炭(35g)で処理し、熱濾過し(85℃)、終夜で放冷して20〜25℃とした。黄色沈殿を濾過によって単離し、室温で終夜風乾して(約18時間)、褐色様黄色固体109gを得た(ロットBM-02G-59B)。
【００５４】
段階Ｂ：上記からの不溶褐色固体(91g、ロットBM-02G-59A)を4%NaHCO3水溶液(7.1L)中で徐々に加熱して90℃とした。ノーリット活性炭(10g)を溶液に加え、混合物を90℃で15分間攪拌した。活性炭を濾過によって除去し、濾液を終夜にて放冷して20〜25℃とした。(約65℃での活性炭濾過から15分後に黄色固体の沈殿が生じた)。スラリーを濾過し、単離した固体を風乾して、ナトリウム塩としての2を72g得た(ロット番号BM-02G-61)。
【００５５】
実施例３ａ：Na+塩への変換の別法
実施例３の段階Ａおよび段階Ｂを単一の段階に合わせることができ、その場合、実施例２で得られた固体2を4%NaHCO3水溶液中90℃で15〜20分間攪拌する。痕跡量の不溶物を熱濾過によって単離する。次に、濾液をノーリット活性炭(35g)で処理し、熱濾過し(約65℃)、終夜にて放冷して20〜25℃とする。2のナトリウム塩の黄色沈殿を濾過によって単離し、室温で風乾する。
【００５６】
実施例４：Na+塩の再結晶
褐色様黄色取得物(107g、ロットBM-02G-59B)を90℃で、1%重炭酸ナトリウム水溶液(4.1L)に90℃で溶かした。溶液をノーリット活性炭で処理し、90℃で15分間攪拌し、濾過した。生成物は濾過後に直ちに沈殿し始めた。得られたスラリーを放冷して25℃とし、さらに氷で冷却して15℃とした。固体を濾過によって単離し、終夜風乾して、明黄色固体95gを得た(ロットBM-02G-62)。
【００５７】
実施例５：Na+塩の遊離酸(2)への変換
合わせたナトリウム塩(71g、ロットBM-02G-61および94g、ロットBM-02G-62)を、重炭酸ナトリウム(30g)を含む水(18L)に85℃で溶かした。得られた橙赤色溶液を熱濾過して少量の不溶物(乾燥後9.5g)を除去し、それは廃棄した。熱濾液を酢酸(0.1L)でpH4の酸性とした。得られたスラリーを氷水浴で冷却して25℃とした。固体を濾過によって回収し、冷水(0.5L、10℃)で洗浄し、終夜風乾し、70±5℃/30inHgで5時間乾燥させて、化合物2を黄橙赤色固体として117g(46%)得た(ロットBM-02G-63B；HPLC純度：96.9%(カラム-プロントシル120-3-C18AQ、4.6×150mm、3.0μ、検出器254nm；移動相-20%メタノール／10mMTris水溶液、pH8.0(希HClで)、1mL/分；サンプル-0.05mg/mL、10μL注入)。
【００５８】
実施例６：4-アミノ-4-デオキシ-N10-ホルミルプテロイン酸(3)
無水酢酸(510mL、5.4mol)を、濃(96%)ギ酸(2.05L、54.3mol)に一気に加えた。発熱反応が止んだ後(45分)、前記プテロイン酸2(54g、0.17mol)を38℃で導入した。反応混合物を3時間加熱還流した。混合物を減圧下に(約40mmHg)濃縮乾固させた。得られたベージュ固体を、濃水酸化アンモニウム(0.54L、8.4mol)を含む水(3.8L)に取った。懸濁液を加熱して溶解させ(70℃)、少量の不溶物を濾過によって除去し、濾液をロットBM-02G-72と称した。
【００５９】
追加のプテロイン酸2(62g、0.20mol)を上記と同様にしてホルミル化して、ロットBM-02G-73と称される濾液を得た。
【００６０】
上記２つの濾液(BM-02G-72および73)を合わせ、冷却して35とした。混合物を酢酸(0.95L)でpH5.5(pH紙)の酸性とした。得られたスラリーをさらに冷却して20℃とした。固体を濾過によって単離し、終夜風乾した。この取得物を、酢酸(0.26L)を含む水(7.0L)に40±5℃で再懸濁させた。得られた懸濁液を0.5時間高攪拌し、濾過し、固体を水(0.5Lで２回)、エタノール(0.5L)およびエーテル(0.1L)の順に洗浄して、24時間風乾後に3をオフホワイト固体として130g(＞100%)得た。その固体(130g)を、酢酸(0.35L)を含む水(7.0L)中で40±5℃にて4時間スラリー化した。固体を濾過によって単離し、水(1.0L)で洗浄し、36時間風乾した。次に、得られたオフホワイト固体を、70±5℃/30inHgで3時間にわたってさらに乾燥させて、化合物3を175水和物として126g(91%)得た(ロットBM-02G-76、元素分析：C15H13N7O3・1.75H2Oの計算値：C、48.58；H、4.48；N、26.44、実測値：C、48.55；H、4.38；N、26.63.)。
【００６１】
実施例７：Nδ-フタロイル-L-オルニチン塩酸塩(4)
L-オルニチン塩酸塩(100g、0.59mol)を、水酸化ナトリウム(47.4g、1.18mol)を含む水(1.0L)に溶かした。硫酸第二銅・５水和物(74.0g、0.30mol)の水溶液(水1.0L)を上記溶液と混合したところ、深青色となった。重炭酸ナトリウム(59.2g、0.71mol)およびカルボエトキシフタルイミド(148g、0.65mol)を加え、得られた明青色懸濁液を室温で0.5時間攪拌した。沈殿を濾過によって回収し、水(0.3Lで２回)、エタノール(0.3Lで２回)およびエーテル(0.3Lで３回)の順で洗浄し、終夜風乾して、青色固体165gを得た。そのフタロイルオルニチンの銅塩を6N塩酸(825mL)とともに室温で１時間攪拌した。混合物をフリットガラスフィルターを用いて濾過し、濾液がほぼ無色(非常に明るい緑色)となるまで、固体を6N塩酸(1.25L)で洗浄した。粗塩酸塩をフィルター上の吸引乾燥し、64時間風乾して、粗4(123g、70%)を明緑色固体として得た(ロットBM-02G-65A)。濾液を週末の間冷蔵し、より多くの固体を堆積させた。固体を濾過によって単離し、4時間風乾して、追加の明緑色固体4.5g(2.5%)を得た(ロットBM-02G-65B)。
【００６２】
粗Nδ-フタロイル-L-オルニチン塩酸塩(4)(122g、ロットBM-02G-65Aおよび4.5g、BM-02G-65B)を、室温でメタノール(1.3L)に溶かした。その明緑色溶液を、攪拌しながら酢酸エチル(3.5L)で希釈した。沈殿が直ちに生成した。得られたスラリーを30分間攪拌した。固体を濾過によって単離し、酢酸エチル(0.3L)で洗浄し、室温で終夜にわたって風乾して、生成物72g(L-オルニチン塩酸塩から4.1%)を得た(ロットBM-02G-67、融点217〜219℃(分解)。
【００６３】
上記の手順を、L-オルニチン塩酸塩68gおよび130gを原料としてさらに２回繰り返して、精製生成物4を56g(46%)(ロットBM-02G-69)および117g(51%)(ロットBM-02G-84)を得た(融点217〜219℃(分解)；薄層クロマトグラフィー：アナルテク(Analtech)シリカゲルGF：溶離液：酢酸エチル-エタノール-水(7：2：1)；Rf：0.33；コメント：均一)。
【００６４】
実施例８：Nδ-フタロイル-L-オルニチン酸メチル塩酸塩(5)
Nδ-フタロイル-L-オルニチン塩酸塩(4)(126g、0.42mol)のメタノール(2.7L)懸濁液を攪拌しながら、それを冷却して-20℃とし、温度を0℃以下に維持しながら、塩化チオニル(350mL、4.8mol)45分間かけて滴下した。滴下中に白色沈殿が現れた。滴下後、冷却浴を外し、反応混合物を室温で終夜攪拌した(約18時間)。得られた明黄色透明溶液を濃縮して(アスピレータ)乾固させ、残ったメタノールをトルエンとの共蒸留(650mL)によって除去した。残留物を、メタノール(65mL)、酢酸エチル(650mL)およびアセトン(650mL)の混合物で磨砕した。固体を濾過によって回収し、ヘキサンで洗浄し(250mLで２回)、終夜風乾し、55±5℃/30inHgでさらに６時間乾燥させて、純粋な5(123g、94%)を白色粉末として得た(融点195〜197℃、ロットBM-02G-70。元素分析：C14H17N2ClO4の計算値：C53.77；H5.48；N8.96；Cl11.34、実測値：C53.78；H5.44；N8.96；Cl11.37)。
【００６５】
Nδ-フタロイル-L-オルニチン酸塩酸塩(116g)の別のバッチを同様にしてエステル化して、純粋な化合物5を116g(ヘミ水和物として93%)得た(融点：195〜197℃、ロットBM-02G-85。元素分析：C17N2ClO4・0.5H2Oの計算値：C52.26；H5.64；N8.71；Cl11.02、実測値：C52.38；H5.64；N8.66；Cl11.13。薄層クロマトグラフィー：アナルテク・シリカゲルGF：溶離液：メタノール-塩化メチレン(1：9)；Rf0.66；コメント：均一)。
【００６６】
実施例９：Nα-(4アミノ-4-デオキシ-N10-ホルミルプテロイル-Nδ-フタロイル-L-オルニチン酸メチル(6)
クロルギ酸イソブチル(3.9mL、30mmol)を、トリエチルアミン(33.4mL、0.24mol)を含む水和プテロイン酸3(11.0g、30mmol)の脱水DMF(0.4L)懸濁液に加え、混合物を20分間攪拌した。Nδ-フタロイル-L-オルニチン酸メチル塩酸塩(5)(9.4g、30mmol)を加え、混合物を20分間攪拌した。追加のクロルギ酸イソブチル(1.9mL、15mmol)を加えた。10分後、追加のオルニチン酸メチル5(4.7g、15mmol)を導入した。それぞれクロルギ酸イソブチル(1.0mL、8mmol)および化合物5(2.4g、8mmol)を10分間隔で加えて、その手順をさらに２回繰り返した。最後の添加後、混合物を室温で終夜攪拌した。混合物を濃縮して、半固体の橙赤色残留物(約80mL)を得た。得られた残留物を水(0.6L)とともに高攪拌して、黄褐色沈殿を得た。固体を濾過によって単離し、メタノール(0.4L)中でスラリーとした。固体を濾過によって再度回収し、メタノール(0.1L)で洗浄し、２時間風乾して粗生成物6を21g得た。得られた粗生成物を塩化メチレン-メタノール(95：5、110mL)に溶かし、溶液を無希釈の塩化メチレン(2L)中で充填したシリカゲルカラム(440g、5.5×38cm)に負荷した。カラムを塩化メチレン-メタノール(95：5、0.4L)と次に塩化メチレン-メタノール(90：10、3.2L)で溶離した。純粋な生成物を含む分画(それぞれ0.25L)を合わせ、濃縮して乾固させて、明黄色固体12.5gを得た。粗生成物(11.5g)を、DMF(58mL)およびメタノール(58mL)の混合液中で攪拌下に溶解させた。中等度の攪拌を行いながら、熱(70℃)酢酸エチル(575mL)を溶液にゆっくり加えた。透明黄色溶液を冷却して室温とし、終夜にてゆっくり攪拌した。翌日、混合物を２時間にわたり4±2℃まで冷却し、濾過し、風乾し、80±5℃/30inHgで14時間乾燥させて、淡黄色結晶化合物6を11.9g(67%)得た(ロットBM-02G-80；HPLC：96.5%)。NMRスペクトラムは、生成物が前記３種類の結晶化溶媒を約0.2mol%含むことを示していた。その部分溶媒和生成物は、変換に好適であった。
【００６７】
水和した3の第２のバッチ(58g、0.156mol)を、同様にしてクロルギ酸イソブチルおよび化合物5で処理した。DMFの除去後、残留物を水(2.5L)とともに攪拌し、固体を回収し、風乾して、粗生成物6を143g得た。この取得物を上記と同様にしてクロマトグラフィー精製して、精製生成物101gを得た(ロットBM-02G-81)。得られた精製生成物を水(2L)とともに終夜攪拌した。固体を濾過によって単離し、水(0.5L)で洗浄し、40時間風乾して、黄色固体90gを得た(ロットBM-020-87)。
【００６８】
この取得物の一部(5.0g)を、還流塩化メチレン-メタノール(93：7、0.55L)中に溶解させた。シリカゲル(10g)および活性炭(0.2g)を加え、室温まで冷却しながら、混合物を15分間攪拌した。混合物をセライト層(5g)で濾過し、セライト層を塩化メチレン(50mL)で洗浄した。合わせた濾液を濃縮して乾固させ、残留物(4.3g)をDMF(25mL)およびMeOH(25mL)の混合液に、還流下にて(72℃)溶解させた。熱酢酸エチル(70℃、0.25L)をゆっくり加え、攪拌溶液を放冷して室温とした。得られたスラリーを終夜攪拌し、冷却して8℃とし、濾過した。固体を酢酸エチル(25mL)で洗浄し、恒量になるまで室温で風乾して、淡黄色結晶3.8gを得た(ロットBM-02G-89；HPLC：98.8%)。
【００６９】
ロットBM-02G-87の残り(84g)を同様にして精製して、淡黄色結晶63gを得た(ロットBM-02G-92；HPLC：98.0%)。合わせた収量は66.8gであった(72%)。
【００７０】
化合物6の最終バッチを、化合物3  54g(0.15mol)を原料として同様に製造した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー後、固体残留物69g(ロットBM-02G-95A)を純粋な分画から得て、相対的に純度が低い固体25g(ロットBM-02G-95B)を、痕跡量の不純物を含む分画(TLCに基づいて)から得た。残留DMFを除去するため、両方の生成物(BM-02G-95Aおよび95B)を、水(それぞれ2Lおよび1L)中で4時間高攪拌した。固体を濾過によって単離し、水で洗浄し、64時間風乾し、40±5℃/30inHgでさらに5時間乾燥させて、黄色固体66g(ロットBM-020-102A)および22g(ロットBM-02G-102B)をそれぞれ得た。ロットBM-02G-102Bを、下記のようにしてさらに精製した。固体を、塩化メチレン-メタノール(93：7、2.4L)中に還流下にて(約35℃)溶解させた。シリカゲル(44g)および活性炭(1g)を加え、室温まで冷却しながら混合物を30分間攪拌した。混合物を、塩化メチレン(0.25L)中で調製したセライト層(40g)で濾過し、セライトを塩化メチレン-メタノール(93：7、269mL)で洗浄した。合わせた濾液を濃縮して、固体残留物を重量19gで得た。この取得物をロットBM-02G-102A(66g)と合わせ、DMF(435mL)およびメタノール(435mL)の混合液に還流下で溶解させた。熱酢酸エチル(65℃、4.3L)を攪拌しながらゆっくり加え、溶液を放冷して室温とした。加熱を中止してからほぼ15分後に沈殿が開始して、スラリーを得た。スラリーを終夜攪拌し、2時間冷却して5±5℃とした。固体を濾過によって単離し、酢酸エチル(0.25L)で洗浄し、終夜風乾して、結晶黄色固体69gを得た(ロットBM-02G-103(HPLC96.6%))。純度は所望のものより低かったことから(プローブ加水分解実験に基づいて)、そのロットを、上記のように塩化メチレン-メタノール(93：7、7.6L)中にてシリカゲル(138g)および活性炭(2.8g)で再度処理した。得られた固体67gを前記の方法でDMF-MeOH-EtOAc(0.3L-0.3L-3.5L)から再結晶して、化合物6を明黄色結晶固体として50g(56%)得た(ロットBM-02G-105；HPLC：98.9%(カラム-フェノモネックス(Phenomonex)クロマジル(Kromasil)C8、100オングストローム、4.6×250mm、10μ；UV検出器254nm；移動相-10分間かけて26%から62%メタノール／0.01%TFA水溶液、pH2.4(トリエチルアミンで)；サンプル-約1mg/mL.、10μL注入)。薄層クロマトグラフィー：EMセパレーションズ・テクノロジー(Separations Technology)、シリカゲル60F254；溶離液：塩化メチレン-メタノール(9：1)；Rf0.34；コメント：Rf0.24に痕跡量の不純物)。
【００７１】
実施例１０：Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチン(7)
前記オルニチン酸エステル6(9.2g、15.4mmol)のメタノール(36.8mL)およびジメチルスルホキシド(9.2mL)混合液中懸濁液を冷却して10℃とし(氷水浴)、それに反応温度を20℃以下に維持しながら2N水酸化ナトリウム溶液(46mL、92.0mmol)を2分間かけて加えた。添加後、冷浴を外し、混合物を室温で30分間攪拌した。得られた透明黄色様褐色溶液を水(180mL)で希釈し、冷却して10℃とした。1N塩酸(48mL)でpHを約8.5に調節し、溶液を酢酸エチルで抽出した(180mLで３回)。水相を水(370mL)で希釈し、1N酢酸(55mL)でさらに約pH4.7に調節した。得られたゲル様混合物にシードを入れ、室温で30分間攪拌した。固体を濾過によって回収し、水(40mLで４回)、エタノール(40mLで３回)およびエーテル(40mLで３回)で洗浄し、風乾した。固体を25℃/0.1mmHgで終夜にて(約16時間)さらに乾燥させて、黄色粉末としての化合物7を7.8g(88%)得た(ロットML-07G-O1)。薄層クロマトグラフィー：アナルテク・シリカゲルGF；溶離液：CH2Cl2-MeOH-濃NH4OH(5：4：1)；Rf0.68；コメント：若干のテーリング。
【００７２】
同様にして、13のロットで追加の6(116g)を処理して、7を100.6g得た。
【表１】
2006523689.tif 000007
【００７３】
実施例１１：Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチンアンモニウム塩(8)
合わせた遊離酸7すなわちML-07G-07、-08、-09、-10、-11、-12、-13(54.0g、94.1mmol)を水(200mL)に懸濁させた。その懸濁液に、赤色様褐色透明溶液が認められるまで(pH9.0)、5%水酸化アンモニウム溶液(75mL、107mmol)を加えた。溶液をセライト層(5.0g)で濾過し、約30時間凍結乾燥して、標的化合物8を黄色粉末として得た(55.6g)。それを、恒量となるまで空気中にて室温で平衡とした(56.4g；ロットML-07G-15(93%、2.4水和物として))。
【００７４】
同様にして、合わせた遊離酸7すなわちML-07G-01、-06、-17、-18、-19、-20、-21(52.8g、92.1mmol)を処理して、追加の標的化合物8,55.4gを得た(ロットML-07G-23(93%、2.6水和物として))。
【００７５】
物理データおよび分析データ
Nα(4-アミノ-4デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチンアンモニウム塩
ロット番号：ML-07G-15、55g
融点：175℃(分解)より高い
性状：黄色粉末
元素分析：C27H27N9O6・1.5NH3・2.4H2Oの計算値(642.35)
【表２】
2006523689.tif 000008
【００７６】
赤外線スペクトラム：構造と一致
NMRスペクトラム：構造と一致
HPLC純度：97.3%
薄層クロマトグラフィー：アナルテク・シリカゲルGF
【表３】
2006523689.tif 000009
【００７７】
室温での大体の溶解度
水：＞20mg/mL
エタノール：＜1mg/mL
ジメチルホルムアミド：＜1mg/mL
ジメチルスルホキシド：＞10mg/mL。
【００７８】
物理データおよび分析データ
Nα-(4-アミノ-4-デオキシプテロイル)-Nδ-ヘミフタロイル-L-オルニチンアンモニウム塩
ロット番号：ML-07G-23、,54g
融点：175℃(分解)より高い
性状：黄色粉末
元素分析：C27H27N9O6・1.5NH3・2.6H2Oの計算値(645.95)
【表４】
2006523689.tif 000010
【００７９】
赤外線スペクトラム：構造と一致
NMRスペクトラム：構造と一致
HPLC純度：96.5%(添付)
薄層クロマトグラフィー：アナルテク・シリカゲルGF
【表５】
2006523689.tif 000011
【００８０】
室温での大体の溶解度
水：＞20mg/mL
エタノール：＜1mg/mL
ジメチルホルムアミド：＜1mg/mL
ジメチルスルホキシド：＞10mg/mL。
【００８１】
本明細書で開示の参考文献はいずれも、参照によって本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
2006523689.tif 000016
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