(57)【要約】【課題】            顕微鏡観察対象物の周囲を適切に考慮し、短時間で結果を提供可能な、顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法及びソフトウェアを提供すること。【解決手段】        顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法において、ａ）少なくとも１つの顕微鏡対象物（４０）の対象物データを撮像ないし生成するステップ、ｂ）ただ１つのパラメータに依存する評価された（１つの）ＰＳＦの影響の下で、見込まれた（１つの）画像を求めるステップ、ｃ）前記撮像ないし生成された画像データと、前記評価されたＰＳＦにより計算された画像データとを比較するステップ、ｄ）比較の結果が悪い場合、同様に１つの実験的パラメータにおいてのみ変化される（１つの）新たなＰＳＦを求めるステップ、ｅ）前記計算された対象物データと前記撮像ないし生成された対象物データとの間で十分な一致が達成されるまで前記ステップｂ〜ｄを繰返し実行するステップを有することを特徴とする。
2006504114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法において、
ａ）少なくとも１つの顕微鏡対象物（４０）の対象物データを撮像ないし生成するステップ、
ｂ）ただ１つのパラメータに依存する評価された（１つの）ＰＳＦの影響の下で、見込まれた（１つの）画像を求めるステップ、
ｃ）前記撮像ないし生成された画像データと、前記評価されたＰＳＦにより計算された画像データとを比較するステップ、
ｄ）比較の結果が悪い場合、同様に１つの実験的パラメータにおいてのみ変化される（１つの）新たなＰＳＦを求めるステップ、
ｅ）前記計算された対象物データと前記撮像ないし生成された対象物データとの間で十分な一致が達成されるまで前記ステップｂ〜ｄを繰返し実行するステップ
を有すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記ただ１つのパラメータは、顕微鏡（１）の対物レンズ（２０）と前記対象物（４０）の上方の領域との間における該対象物（４０）の周囲の光学的特性が考慮されること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象物（４０）を包囲する前記周囲は、前記対物レンズ（２０）の光軸（２１）に対し垂直に配される複数の層を有する層システムから構成されること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の層は、対象物支持体（１３）の厚さ、前記対象物（４０）の大きさ又は厚さ、カバーガラス（４３）の厚さ、液浸媒体（４７）の層厚、及び前記対象物（４０）と該カバーガラス（４３）との間隔を含むこと
を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の層の各々は、個別のパラメータとして、当該層の厚さと屈折率とを有すること
を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ただ１つの可変パラメータが、１つの層システムの複数の層の個別のパラメータを関数的に代表すること
を特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記層システムの複数の層の各々が、適切な値の補正値Ｃｒによって十分良好に近似されること、及び
次いで、前記層システムの全体が、個々の前記Ｃｒの和に等しい１つの補正値Ｃｒによって十分良好に記述可能であること
を特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｃｒ＝ｄ×Δｎ又はＣｒ＝Δｄ×Δｎであり、ｄは１つの層の厚さ、ｎは当該１つの層の屈折率であること
を特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記パラメータにより、前記対象物支持体（１３）の厚さの変動、前記液浸媒体の温度及び屈折率の変動又は生理学的溶液の温度及び屈折率の変動、及び前記カバーガラスの厚さが補償されること
を特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法を計算機（２６）に実行させるデータ記録媒体上のソフトウエアにおいて、
ａ）（複数の）顕微鏡対象物の対象物データを撮像ないし生成するステップ、
ｂ）ただ１つのパラメータに依存する評価された（１つの）ＰＳＦの影響の下で、予想される（１つの）画像を求めるステップ、
ｃ）前記撮像ないし生成された画像データと、前記推定されたＰＳＦにより計算された画像データとを比較するステップ、
ｄ）比較の結果が悪い場合、同様に１つの実験的パラメータにおいてのみ変化される（１つの）新たなＰＳＦを求めるステップ、
ｅ）前記計算された対象物データと前記撮像ないし生成された対象物データとの間で十分な一致が達成されるまで前記ステップｂ〜ｄを繰返し実行するステップ
を有すること
を特徴とするソフトウエア。
【請求項１１】
前記ただ１つのパラメータは、顕微鏡（１）の対物レンズ（２０）と前記対象物（４０）の上方の領域との間の該対象物（４０）の周囲の光学的特性が考慮されること、及び
前記光学的特性は、前記計算機（２６）に入力されること
を特徴とする請求項１０に記載のソフトウエア。
【請求項１２】
前記パラメータによって、対象物支持体（１３）の厚さ、液浸媒体の温度及び屈折率又は生理的溶液の温度及び屈折率、及びカバーガラスの厚さに依存する層システムの複数の層の変動が補償されること
を特徴とする請求項１１に記載のソフトウエア。
【請求項１３】
前記層システム中の複数の層の各々が、適切な値の補正値Ｃｒによって十分良好に近似されること、及び
次いで、前記層システムの全体が、個々の前記Ｃｒの和に等しい１つの補正値Ｃｒによって十分良好に記述可能であること
を特徴とする請求項１１に記載のソフトウエア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡画像の導入されたブラインド・デコンボリューション方法に関する。
【０００２】
更に、本発明は、顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法を計算機に実行させるデータ記録媒体上のソフトウエアに関する。
【背景技術】
【０００３】
対象物の画像は対象物自体と結像システムの装置関数に依存する。局所的空間内の装置関数は、点像（強度分布）関数（Punktbildfunktion）と呼ばれるが、これは英語では“Point Spread Function”といい、“ＰＳＦ”と略称される。局所的周波数空間では、ＰＳＦをフーリエ変換した関数は、“Optical Transfer Function（光学的伝達関数）”と呼ばれ、“ＯＴＦ”と略称される。本書においては、以下、専ら略称ＰＳＦ及びＯＴＦを用いる。
【０００４】
厳密にいえば、対象物も像空間も（ｘ−、ｙ−、及びｚ−座標による）３次元と考えれば、定置の結像システムにおけるＰＳＦは、６座標の関数である。
【０００５】
しかしながら、一般的には、ＰＳＦは（例えば最良フォーカスの点（複数）及び面（複数）に対する）相対座標のみに依存し、従って対象物ないし画像野内のすべての点に対して同じ経過を有すると考えられる。これにより、ＯＴＦによって問題を数値的に処理するためにより効果的に機能する可能性が開かれる。
【０００６】
ここで考察する３次元対象物の高分解能顕微鏡検査の場合、結像を行う対物レンズの（像面に関する）対象物側焦点深度は非常に小さいため、３次元構造を完全に検出するためには、対象物及び対物レンズをｚ方向に互いに対し相対的に移動しなければならず、多数の水平「断面」において相応の数の画像を撮像し（１つの「画像積層体（スタック画像）」を生成し）なければならない。
【０００７】
尤も、（１つの）完全な画像積層体が存在する場合は、種々の数学的方法によって、各層間の「クロストーク（Uebersprechen）」を検出し、続いてそのデータから「減算」し、これによりｘ方向及びｙ方向における理論的に可能な解像度を再び得ることも、ｚ方向の解像度も格段に改善することも可能となる。この方法は、通常、デコンボリューションと称される。
【０００８】
【非特許文献１】M.J. Booth, M.A.A. Neil and T. Wilson,“Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media”, Journal of Microscopy, 192(2), 90-8, (1998)
【非特許文献２】C.J.R. Sheppard and P. Toeroek,“Effects of the specimen refractive index on confocal imaging”, Journal of Microscopy, 185(3), 366-74, (1997)
【非特許文献３】D. Kundur and D. Hatzinakos,“Blind Image Deconvolution: An Algorithmic Approach to Practical Image Restoration”, IEEE Signal Processing Magazine, 43-64, (1996)
【非特許文献４】Thiebaut and J.M. Conan,“Strict a priori constraints for maximum-likelihood blind deconvolution”, J. Opt. Soc. Am. A, 12(3), 485-92, (1995)
【非特許文献５】J. A. Conchello and Q. Yu,“Parametric blind deconvolution of fluorescence microscope images: Preliminary results” in Three-Dimensional microscopy: image acquisition and processing, C. J. Cogswell, G. S. Kino, and T. Wilson, editors, Proceedings of the SPIE 2655, 164-74, (1996)
【非特許文献６】J. Markham and J. A. Conchello,“Parametric blind deconvolution of microscopic images: Further results”, in Three-dimensional and multidimensional microscopy: Image Acquisition and Processing V, C. J. Cogswell, J. A. Conchello, J. M. Lerner, T. Lu, and T. Wilson, chairs/editors, Proc. SPIE; volume 3261, 38-49, (1998)
【非特許文献７】S. F. Gibson and F. Lanni,“Experimental test of an analytical model of aberration in an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy”, J. Opt. Soc. Am. A, 8(10), 1601-13, (1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、デコンボリューションを行うためには、特に高性能というわけではないが非常に単純な幾つかの方法を除いて、「クロストーク」と「汚れ（Verschmierung）」の程度をそれぞれ表わすＰＳＦの正確な知識が通常必要である。残念なことに、ＰＳＦは、実際上、しばしば不完全にしか知ることができない幾つかの実験（的）パラメータに敏感に（大きく）依存する。これらのパラメータは、とりわけ液浸媒体の光学的特性であり、例えば温度及び濃度と共に変化する液浸媒体の屈折率ｎや、液浸媒体の光学的厚さｄである。このため、試料に対する焦点深度への妨害的な依存関係もまた生じ得る（非特許文献１、非特許文献２参照）。
【００１０】
デコンボリューションのためＰＳＦを求めるために、従来技術では、種々の方法が使用される。その一例として理論的ＰＳＦがあるが、これは、ＰＳＦが、対物レンズないし顕微鏡全体の（場合により極度に単純化された）モデルから計算されるものである。理論的ＰＳＦを使用する場合の問題点は、多くの場合、基礎となるモデルが過度に単純であること、即ち対物レンズ及び／又は対象物包埋部のパラメータないし対象物周囲環境は、そのすべてが考慮されるわけではないということである。実際上、対物レンズ自体は一応良好であって単純に記述することができる（現代の対物レンズは十分に理想的である）ことがわかっているが、これに対して対象物包埋部のパラメータないし対象物周囲を十分に良好に定義することないし一定に維持することは比較的困難である。問題となるのは、試料が厚い場合、部分的に未知の特性を有する溶液内の生細胞の場合等である。
【００１１】
従来技術の別の一手段は、現実の（できるだけ代表的な）包埋部及び周囲の、点として理想化された微視的（顕微鏡的）パーティクル（微粒子）（いわゆる「ビーズ」）の画像積層体からＰＳＦを導出することである。ＰＳＦの測定は、大掛かりなものとなるにもかかわらず、前記の問題を不完全にしか解決しない。この場合、互いに相反する種々の要求間で妥協点を見出さなければならない：（系統誤差を含まない）真のＰＳＦをできるだけ正確に求めるためには微小な大きさのビーズが必要となるが、このため測定信号もまた微小なものとなり、更に取り扱いも困難となる。また、ｘ、ｙ、ｚ方向に広がるＰＳＦの領域に第２のビーズ又は他の異物が存在しないことを保証しなければならない。このようにして測定されたＰＳＦが複数の画像積層体のデコンボリューションに使用される場合、測定中のノイズ又は更には振動によるＰＳＦの誤差が系統的態様ですべての画像積層体に影響を及ぼすことが考慮されなければならない。同様のことが、ＰＳＦを記録する際の諸条件が個々の画像積層体（スタック画像）に対する諸条件と十分に対応するか否かが不確実であることに対しても当てはまる。
【００１２】
更なる一手段は、画像積層体の「冗長性」を利用して未知のＰＳＦと対象物とを同時に復元（再構成）することである（いわゆる「ブラインド・デコンボリューション」）。一義的な結果を得るためには、勿論、対象物及びＰＳＦに対する種々の予情報及び制限ないし条件（「アプリオリないし事前（予）情報」及び「制約（constraints）」）が有効であると仮定しなければならない。これには、例えば、対象物強度値が負ではあり得ないこと、ＰＳＦが光学系の開口数に相応して「帯域制限」されていなければならないことが含まれ、さらにＰＳＦと場合により対象物の両方が有限の広がりを有し、所定の対称性を有するという（単純な）仮定も含まれる（これについては非特許文献３、非特許文献４参照）。市販のコンピュータプログラム（例えばAutoquant社ＵＳＡの“Autodeblur”）は、画像材料が適切である場合、部分的にはもっともらしい結果を達成する。非専門家には分かり難いアルゴリズム、大きな計算コスト（時間コスト）、及びその際あり得るアーチファクトのため、とくにこのアプローチが広く受け入れられることがこれまで妨げられてきた。使用されるアルゴリズムは、原理的にも光学的意味で「ブラインド」である。即ち、このアルゴリズムは、原理的に、正の（ポジティブな）信号と帯域制限された更なる正の「応答関数」との畳み込みに関する任意の問題に適用され得るが、このアルゴリズムは、結像システムの幾何光学的特性（特異性）について付加的仮定を行わず、従って顕微鏡結像に関する特別な「知見」を備えていない。
【００１３】
「ブラインド・デコンボリューション」の一特殊形態として、パラメトリックに導入されたブラインド・デコンボリューションがある（非特許文献５、非特許文献６参照）。デコンボリューションのこの形式は、完全にパラメトリックなデコンボリューションと純粋なブラインド・デコンボリューションとの組合せと考えることができる。これにはＰＳＦの物理的モデルが含まれる（非特許文献７参照）。この問題は、ＰＳＦのパラメータ化によって原理的に処理される。というのは、これにより簡単に、上述の予情報及び条件を（いわば「自動的に」）考慮することができるからである。そのため、理論的ＰＳＦを特徴付けるために、例えば全部で約１４のパラメータが使用されるが、そのうちの７つのパラメータは、対象物に対する周囲条件を記述すべき実験（的）パラメータである。これに加えて、種々異なる次数（Ordnung）の開口収差（誤差）（Oeffnungsfehlern）に応じたパラメータ化も使用可能となる。しかしながら、この場合、低次の項（Terme）のみへ制限されるためＰＳＦのシミュレーション（Nachbildung）がとりわけアパーチャが大きい場合には不正確になり得るか、或いは高次に至るまで多数の独立項が使用できるが、これら項同士の実際には生起する結合（Verkopplung）は認識されない。
【００１４】
それゆえ、本発明の第１の課題は、対象物の周囲を適切に考慮し、短時間で結果を提供するような、顕微鏡画像の導入されたブラインド・デコンボリューション方法を提供することである。
【００１５】
本発明の第２の課題は、対象物の周囲を考慮し、短時間で結果を提供し、及び種々異なる顕微鏡システムにおいて迅速に使用可能であるような、顕微鏡画像の導入されたブラインド・デコンボリューションのためのソフトウエア（プログラム）を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記第１の課題は、請求項１に記載の各ステップを有する方法によって解決される。即ち、本発明の第１の視点の顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法において、ａ）少なくとも１つの顕微鏡対象物の対象物データを撮像ないし生成するステップ、ｂ）ただ１つのパラメータに依存する評価（推定）された（１つの）ＰＳＦの影響の下で、見込まれた（期待された）（１つの）画像を求めるステップ、ｃ）前記撮像ないし生成された画像データと、前記評価（推定）されたＰＳＦにより計算された画像データとを比較するステップ、ｄ）比較の結果が悪い場合、同様に１つの実験（的）パラメータにおいてのみ変化される（１つの）新たなＰＳＦを求めるステップ、ｅ）前記計算された対象物データと前記撮像ないし生成された対象物データとの間で十分な一致が達成されるまで前記ステップｂ〜ｄを繰返し実行するステップを有することを特徴とする（形態１・基本構成１）。
【００１７】
上記第２の課題は、請求項１１の特徴を含むソフトウエア（プログラム）により解決される。即ち、本発明の第２の視点の、顕微鏡画像のブラインド・デコンボリューション方法を計算機に実行させるデータ記録媒体上のソフトウエアにおいて、ａ）（複数の）顕微鏡対象物の対象物データを撮像ないし生成するステップ、ｂ）ただ１つのパラメータに依存する評価（推定）された（１つの）ＰＳＦの影響の下で、見込まれた（予期された）（１つの）画像を求めるステップ、ｃ）前記撮像ないし生成された画像データと、前記推定されたＰＳＦにより計算された画像データとを比較するステップ、ｄ）比較の結果が悪い場合、同様に１つの実験的パラメータにおいてのみ変化される（１つの）新たなＰＳＦを求めるステップ、ｅ）前記計算された対象物データと前記撮像ないし生成された対象物データとの間で十分な一致が達成されるまで前記ステップｂ〜ｄを繰返し実行するステップを有することを特徴とする（形態１１・基本構成２）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の方法及びソフトウエア（プログラム）の利点は、デコンボリューションが高速であること、及びアーチファクトのないことである。対物レンズのデータ、ないし対物レンズ及びビーム路に存在する光学要素のデータは、十分良好に既知である。従って、許容されるべきＰＳＦを求めるためのこれらパラメータは一定である。その結果、光学的に可能なＰＳＦは１次元のみの小さな下位空間（Unterraum）に限定される。この方策により、計算時間もアーチファクトも大幅な減少が期待できる。ＰＳＦを求める際には、対象物と対物レンズとの間の周囲を考慮したただ１つのパラメータだけが変化される。この場合、このパラメータは、当該周囲に配される媒体の既存（既知）の屈折率を含み、更に温度変化もまた同時に取り入れることができる。
【００１９】
本発明の対象を概略的に図示したが、以下図面を用いて説明する。
【実施例】
【００２０】
ブラインド・デコンボリューションのためには、とりわけ異なる屈折率ｎを有する複数の平行層による波面収差を考慮しなければならない。ここで、例えば異なる複数の液浸媒体及びカバーガラス（複数）から構成され、種々異なる屈折率ｎｊと、１種類の厚さｄｊとを有する、顕微鏡対物レンズ２０（図１２参照）の光軸２１に対して垂直なＮ個の平行層からなるシステムを仮定する。平行ないし垂直に配されていない層は、コマ収差を引き起こすが、ここでは検討しない。というのは、これにより実際に見込まれるべき収差が十分に障害となることは確かに予想はされるが、上述の「指数不整合（index mismatch）」による収差と比べると数オーダー小さいと予想されるからである。
【００２１】
更に、出発点として、設計（ないし設定）条件（Designfall）、即ちｎ（複数）とｄ（複数）の完全に特定の組合せに対して（近似的に）理想的結像を達成する理想光学系（対物レンズ＋鏡筒レンズ等）を仮定する。ここで、厚さがｄで設計指数がｎ１の所定の複数の層の１つ（又は当該層の一部分のみ）を指数がｎ２の１つの層によって置換する場合を考察する。そのような変化を「総和」することにより、任意の特性を有する複数の平行層の考え得るすべての場合を導き出すことができる。従って、例えばカバーガラスの純粋な厚さの変化は、カバーガラスの指数ｎｄを有する１つの層によって指数がｎｊの液浸媒体の一部を置換することに相当する。
【００２２】
これにより引き起こされる波面変化ｗについては、以下に掲げる単純ではあるが正確な式が文献中に見出される（例えばToeroek et al.参照）：
ｗ＝ｄ（ｃｏｓ（α２）ｎ２−ｃｏｓ（α１）ｎ１                      式１
ここに、ｗ及びｄは（真空中における）λで規定され、ｎ１及びｎ２は何れも屈折率であり、α１及びα２は２つの媒体における光軸２１に対する光線の角度（なす角）である。これらの角度は、一定の「幾何学的」アパーチャＧＡ、即ち
ＧＡ＝ｓｉｎ（α）＝ＮＡ/ｎ                                式２
の光線を前提にすれば（実用上はこれの方が寧ろ重要である）、より簡単に規定できる。というのは、この値は、複数の平行層を通過する際に変化しないからである。
【００２３】
そして、
ｓｉｎ（α１）＝ＧＡ×ｓｉｎ（α２）＝ＧＡ×（ｎ１/ｎ２）＝ｓｉｎ（α１）×（ｎ２／ｎ１）                                                      式３
及び
ｃｏｓ（αｊ）＝（１−ｓｉｎ２（αｊ））１／２                  式４
である。
【００２４】
ここで注意すべきことは、上記の式は厚さｄに線形的に依存することである。即ち、引き起こされる収差は、それぞれの（各層の）絶対的厚さに依存せず、常に同じ（相対的）「経過」ないし同じ「ゾーン特性（Zonenverhalten）」を示す。或いは換言すると、当該引き起こされる収差は、所定のアパーチャに対しては、低次及び高次の球面収差の完全に特定の組合せから形成される。勿論、ｎ１及びｎ２相互の任意の各組合せに対してとりわけ当てはまる。
【００２５】
種々異なる光学厚さによる一定の位相シフトは通常は重要ではない。従って波面変形が微小のアパーチャに対してゼロであるように、即ち、
ｗ＝ｄ×（（ｃｏｓ（α２）−１）×ｎ２−ｃｏｓ（α１）×ｎ１）      式５
となるように、波面変形を定義するとより適切である。
【００２６】
例えば、実用上重要なグリセリン液浸におけるＤＩＮカバーガラス（ｎ１＝１．４６０、ｎ２＝１．５２４）の場合に対して、λでの波面収差ｗの後続の経過が、５０λのカバーガラス厚さｄ（ないしは厚さ誤差Δｄ！）に対して見られる。これはほぼ、６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃ Ｃｏｒｒ対物レンズの最大予定調節範囲±３０μｍに相当する：
【００２７】
図１は、６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃ Ｃｏｒｒ対物レンズにおけるカバーガラスの厚さ誤差５０λに対する「真の」波面収差を示す。尤も、この曲線１００は、「半分の真実（halbe Wahrheit）」しか示していない。上記の収差は、一定の位相収差（誤差）に加えてデフォーカス項、即ち最も鮮鋭な画像の位置の付加的ないし変化層の導入によりさらに変化する。古典的には、フォーカス位置は、しばしばいわゆる近軸焦点により定義され、この位置では、２次収差項はすべて、微小な（verschwindende）アパーチャに対してゼロである。この場合、デフォーカス自体の作用は、波面の２次変化としてのみ近似される。上記の場合に対して、以下の近似が得られる：
ｗ＝ｄ×（（ｃｏｓ（α２）−１）×ｎ２−（ｃｏｓ（α１）−１）×ｎ１）
−ｄ（ｎ２−ｎ１）×ｓｉｎ２（α１／２）
【００２８】
この式から、比較的簡単に、より高次のデフォーカスも正しく考慮されたより良好な補正を導出することができる。（これについての詳細は以下を参照）。
【００２９】
ｗ＝ｄ×（（ｃｏｓ（α２）−１）×ｎ２−（ｃｏｓ（α１）−１）×ｎ１）
−ｄ（ｎ２−ｎ１）×（１−ｃｏｓ（α１））
【００３０】
これにより、６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃ、近軸焦点におけるカバーガラス厚の誤差５０λに対する波面収差の上記例に対する、図２に示した収差経過（曲線）２００が得られる。このグラフ（曲線）は、「指数不整合」補正はそもそもＧＡ凡そ０．４から漸く作用し始めること、及び主として高次の収差が作用することを明確に示している。
【００３１】
アパーチャが大きい場合、瞳中心の周りでの２次及びより高次の項の最小化もまた最早意味を持たない。最良の結像は、残留デフォーカス項が瞳全体にわたって「伝達（媒介）される（vermittelt）」場合にのみ達成される。尤も、このため、「最良フォーカス」で生じた収差は、（＋，−）符号の値を有するだけでなく、ゼロを中心に発振するようになる。以下参照。
【００３２】
微小な指数差Δｎに対する「汎用式」（Universelle Formel）が存在する。小さな（正確には無限小の）指数差Δｎに対しては、波面収差についての近似式が得られる。この近似式は厚さｄに比例するだけでなく、指数差Δｎにも比例する。境界移行（屈折率の異なる２つの物質間の境界）（Grenzuebergang）では再び一定の位相の減算後に次式が得られる。
ｗ＝（ｄ×Δｎ）×（ｃｏｓ（α１）−１＋ｓｉｎ２（α１）／ｃｏｓ（α１））
【００３３】
この近似式は厚さと指数誤差の積（及び間接的には屈折率ｎ１）にだけ依存し、最早他のパラメータには依存しない。この積を以下、Ｃｏｒｒ値（補正値）Ｃｒと称し、
Ｃｒ＝ｄ×Δｎ
又は、場合により
Ｃｒ＝Δｄ×Δｎ
とする。
【００３４】
従って、前記グリセリンにおける可変カバーガラス補正の場合は、Ｃｏｒｒ値は、凡そ  Ｃｒ＝５０×（１．５２４−１．４６０）＝３．２（λ）
に相当する。
【００３５】
ここで、（近似的に）１つのパラメータのみによって、例えばカバーガラスの厚さ誤差も液浸媒体の温度又は濃度も記述・補正できることが明確となる。
【００３６】
上述の近似式に対してのみ初めて当てはまる重要なポイントは、この近似式によって、任意の複雑な層シーケンスも、単に個々のＣｏｒｒ値の和Ｃｒｔｏｔ＝ΣＣｒｊに相当するただ１つの等価層ないし１つの収差により記述可能となるということである。
【００３７】
図３に、「汎用」式とデフォーカスを含む「正確な」式との間におけるＡＰＯ６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃ Ｃｏｒｒに対する計算例の比較を示す。上記の式により、上述の実際的な例における「汎用」近似解の質を検査することができる。正確な結果（曲線３００）をＣｒ＝３．２に対する近似解（曲線３０１）と比較すると、焦点位置のズレがすでに補償されているとしても、一見したところ、一致は十分なものではなく、瞳縁部では最大凡そλ／２の偏差がある。Ｃｒ＝３．２に対する波面近似（曲線３０１）とＣｒ＝２．４に対する波面近似（曲線３０２）とは、ほぼ完全に等しい曲線である。
【００３８】
しかしながら、上記の近似式は、達成可能な最良のものではない。上記の例で近似式は原理的に過大な収差を予測するということがまず認識されるべきである。実用上、結像が最良となるよう対物レンズをＣｏｒｒ（補正）リングで手動調整する場合であっても、計画的に導入される「ブラインド・デコンボリューション」の場合であっても、試料包埋部の正確な光学的パラメータは未知であり、従って最適のＣｒ値は「試行」によってのみ見出される。数値としてのＣｒ値はまったく意味がない。ここでもまた、まさにＣｒ＝２．４というややより小さな値が、その他の点では変化されていないモデルにおいて、正確な解に対しほぼ完全な一致をつくりだしていることが明白となる。
【００３９】
図４に、「最良フォーカス」における残留収差の比較を示す。この図から、ズレ（偏差）がさらにやや改善されていることを見出すことができる。これは、上記の波面収差と同じように６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃにおける「最良フォーカス」で計算され、曲線４００で描かれている。Ｃｒ＝３．２に対する波面近似解は曲線４０１で、Ｃｒ＝２．４に対する波面近似解は曲線４０２で描かれている。後者の２つの曲線はほぼ完全に重なっている。Ｃｒ＝３．２による近似解を直接適用すると（すでに伝達（媒介）された）波面収差＞０．２λが生じるが、残留収差（誤差）は最適Ｃｏｒｒ値によってこの値の１／２０に低減され得るため、実用上は無視し得る。近軸焦点におけるストレール値（強度）（Strehl-Wert）は、依然として大きい非対称のｚ応答における最大７４％から、十分に対称的な応答における実用上完全といえる９９．６％に改善される。
【００４０】
この場合も、この近似は実用上任意の複層システムに適用することができるが、その際１より多い（２以上の）パラメータの変化は必要ないということを最後に再度強調しておく。この変化されるべき１つのパラメータは、１つの層システムを構成する複数の層の個々（個別）のパラメータの関数的（機能的）代表（funktionelle Repraesentanz）である。（複数の）部分層の各々がＣｒの適切な値によって十分に良好に近似できる場合、システム全体もＣｒｓ（複数）の（総）和に等しい（１つの）Ｃｒにより十分に良好に記述することができる。というのは、個々の近似（解）は、上記「汎用関数」の種々のスケーリングされた結像に過ぎないからである。
【００４１】
従って、ここで考察するＰＳＦ（図５から図１１）は、（ｘ、ｙ、ｚ）の関数である。本発明の目的の観点では、ＰＳＦは（ｘ、ｙ）について対称であると仮定され、とりわけｚの依存性が考察される。すなわち顕微鏡システムにより規定される光軸の方向で考察される。
【００４２】
図５に、例として「理想」ＰＳＦを示す。強度Ｉは、顕微鏡システムのｚにおける（光軸に沿った）推移に対してプロットされている。この図では、フォーカス（点ないし面）において大きな強度が得られるが、この強度はＰＳＦの顕著な対称的ピーク２として現れている。フォーカスから離れるように（両方の方向に）推移すると、小さな副（２次）極大値２ａが発生するが、最終的にはノイズに埋もれる。
【００４３】
図６に、対象物を包囲する媒体の屈折率が小さく変化する（ズレる）ことにより発生したＰＳＦを示す。この撹乱によって、乱されたＰＳＦのピーク３ははっきりと非対称になっていることを明確に見出すことができる。同様に、副ピーク３ａもよりシャープに現れている。
【００４４】
図６に示したＰＳＦの変化は、本発明の補正によって除去される。補正されたＰＳＦのピーク４（図７参照）には乱れはなく、再び対称形を示している。本発明の補正は、対象物包埋部の光学的作用がただ１つのパラメータにより記述されるように行われる。一般的には、対象物包埋部は、多数のパラメータにより記述される。これらのパラメータは：対象物支持体の屈折率、カバーガラスの屈折率、試料を包囲する媒体の屈折率、使用される液浸流体（媒体）の屈折率、温度等であり得る。本発明の技術的思想は、これら種々異なるパラメータを１つのパラメータに統合して、対象物の「仮想包埋（部）」を記述することである。結像への影響は、図７から分るように、図６のＰＳＦに対して非常に良好な近似（接近）である。
【００４５】
図８に、屈折率の小さなズレ（変化）によりＰＳＦにより大きな影響が生じている様子を示す。ピーク５の非対称は一層甚だしい。この非対称性は、本発明の方法により、簡単かつ迅速に除去される（図９）。１つのパラメータによる補正によって、ＰＳＦのピーク６は再び対称的形態となり、強度の（理想強度への）等化（Angleichung）も示すようになる。
【００４６】
対象物の周囲にある１つの薄層の屈折率が大きく変化した（ズレた）場合についての様子を図１０に示す。ピーク７は、大きな撹乱とはっきりとした非対称化を被る。この撹乱も、図１１に示すように、本発明の方法によって除去することができる。ピーク８は、ほぼ対称的な形態を有する。
【００４７】
ＰＳＦを逆算（Rueckrechnung）するのに１つのパラメータのみを変化させるという本発明の方法による上記のような結果に基づき、顕微鏡対物レンズには「補正フレーム（Korrektionsfassung）」が設けられる。これにより、所定の限界内で、ガラス厚、媒体の温度及び屈折率の変動もまた「同時」に「補正」ないし補償することができる。この単純かつただ１つの光学要素をビーム路中で変化する装置によって、いわゆる仮想包埋（部）を機械的方法で補正することができる。これは、光学用語でいうところの「開口収差（誤差）」又は「球面収差」の補正に該当するが、これらの収差では、対物レンズの「瞳」での位相波面が、４次及びそれより高次の回転対称関数により撹乱される（「収差が生じる」）。
【００４８】
大きいアパーチャ（ないしは大きい開口角）を利用する顕微鏡検査では、一般的な光学に関する文献で行われる近似とは異なり、４次よりも高次の収差項もまたＰＳＦの補正のために考慮しなければならない。このズレ（偏差）の種々異なる値に対し、瞳における位相収差に、それぞれ１つの、完全に特定の一義的な経過が生じる。換言すれば、（アパーチャが既知の対物レンズに対し）４次及びそれより高次の項の全く特定の組合せ（複数）のみがこの問題に関して重要であるということを意味する。
【００４９】
ただ１つの自由パラメータのみが生じるという上述の関係からありふれた（trivial）ＰＳＦが得られるのでは断じてないことを図５〜図１１は示している。図５〜図１１は、シミュレーション計算の結果である。即ち、図５〜図１１は、夫々３つの異なる状況（図６、図８、及び図１０参照）における光学的誤差（収差）の適正化を示している。この誤差適正化から生じるＰＳＦにより、ＰＳＦの復元（再構成）後、１つのパラメータの変化によってほぼ理想的な関係が得られる。
【００５０】
図１２に、本発明の方法を実施するための顕微鏡システム１の概略図を示す。顕微鏡システム１は、顕微鏡テーブルないしステージ（載物台）１２を備える顕微鏡１０を含む。顕微鏡テーブル１２は、観察ないし検査されるべき試料１４が載置される対象物支持体１３を受容するために用いられる。対象物支持体１３としては、例えばガラス製対象物支持体又はペトリシャーレを使用することができる。
【００５１】
図示の顕微鏡１０は、顕微鏡テーブル１２及び試料１４の下方に照明装置が配置される透過光型顕微鏡である。照明システムは、ランプハウジング１６内に光源１５を有し、この光源１５から光軸１７を備える照明ビーム路が発する。照明ビーム路は、照明光学系１８及びコンデンサレンズ１９を介し、顕微鏡台１２に配置された試料１４を伴う対象物支持体１３に下方から向けられる。
【００５２】
試料１４を通過する光は、顕微鏡テーブル１２及び試料１４の上方に配置される顕微鏡１０の対物レンズ２０に達する。対物レンズ２０は、照明システムの光軸１７とアライメント（整列）される光軸２１を規定する。顕微鏡１０は、複数の対物レンズ２０並びに対物レンズ交換装置（レボルバないしターレット）を有し得るが、これらについては簡略化のため図示していない。図示の実施例では位置固定の顕微鏡ステージ１２が使用される（英語ではfixed stage microscopeという）ので、試料１４に対する照明光のフォーカシングは、対物レンズ２０の高さ調節によって行われる。顕微鏡１０内部では、光は、図示しないレンズ（複数）及びミラーを介して顕微鏡１０の少なくとも１つの接眼レンズ２２に導かれ、操作者は、接眼レンズ２２を介して顕微鏡テーブル１２に載置された試料１４を観察することができる。
【００５３】
更に、顕微鏡１０には、試料１４の画像を撮像するカメラ２３が設けられる。その都度調節された照明の光は、光学要素３１を介して少なくとも１つの接眼レンズ２２に到達する。即ち図示の実施例では任意の種類の照明を利用することができる。
【００５４】
カメラ２３によって撮像された画像は、計算機（コンピュータ）２６と接続されたモニタ２５に表示される。計算機２６、カメラ２３及びモニタ２５から構成されるシステムは、例えばフィルタ（位置）調節装置又は顕微鏡１０のためのオートフォーカス装置（不図示）のような動力駆動型顕微鏡機能を制御するために使用することも可能である。更に、計算機は、撮像された画像データに基づいて、当該撮像された画像データのパラメータのデコンボリューションを相応に行う本発明の方法を実行するのに利用される。
【００５５】
図１３に、顕微鏡対物レンズの模式図と、対象物４０を包囲する周囲、とりわけ試料４２と対物レンズ２０との間で種々異なる屈折率を有する複数の平坦な光学（的）層の典型的な構造を示す。試料４２自体は、この実施例では、所定の底部４６を備える対象物支持体１３、培養液４４、及びカバーガラス４３から構成される。底部４６及びカバーガラス４３の層の厚さは縮尺通りには記載していないが、典型的な厚さは２００μｍである。対象物の典型的な大きさは１０μｍである。顕微鏡検査で生理学的溶液が使用される場合、当該溶液は、通常、ペトリシャーレに入れられる。ペトリシャーレの底部は、対象物支持体１３の底部４６をなす。底部４６及びカバーガラス４３の全作用厚ではなく、対象物４０とカバーガラス４３との間の距離のみが生理学的媒体内の光学的作用層として作用する。従って、この層の厚さは試料内における対象物４０の正確な位置に依存し、対象物４０内ではこれは一定と見なすことができる。対物レンズ２０とカバーガラス４３との間には、屈折率ｎ２を有する液浸媒体４７が配される。同様に、カバーガラス４３の屈折率はｎ３、培養液又は生理学的媒体の屈折率はｎ４、及び対象物支持体１３の屈折率はｎ５である。
【００５６】
種々異なる複数の層のこれら特徴的パラメータは、実験（的）パラメータと称される。というのは、これらは特別の実験に依存するからである。これとは反対に、対物レンズ２０及び顕微鏡のビーム路にある付加的光学要素の特徴は固定的なパラメータ、いわゆる設計（ないし設定）パラメータである。設計パラメータは利用者には十分既知であり、例えば固定的パラメータとして顕微鏡システム１の計算機２６に記憶することができる。図９に示したモデルは、（光軸を中心とした対称性を仮定した場合）６つのパラメータを有する。所与の複数の層から対物レンズ２０の正確なＰＳＦをこの特別な状況で計算するためには、複数の層すべてを高精度で計算に使用しなければならないであろう。しかしながら、そのようなことは目的ではない。本発明では、設計パラメータ（複数）によって定められる理想ＰＳＦからの可能なズレ（偏差）を記述することが重要なのである。非常に良好な近似には、１つのパラメータを計算的に変化させることで十分である。付加情報として、結像ビーム円錐体の最大開口角が必要である。理想的な場合では、この角度も設計パラメータであり、ｓｉｎ（開口角）＝ＮＡ／ｎ２が成り立つ。ここに、ＮＡは対物レンズ２０の開口数であり、液浸媒体の公称（nominal）屈折率ｎ２も設定パラメータである。実用上ｎ４＜ｎ２であることがよくあるが、この場合、最大開口角はｎ２/ｎ４だけ減じられる。しかしながら、この値は、上記のビーム全体計算とは異なり、あまり影響を及ぼさないので、この場合使用される層（オイル、ガラス、水等）に対する公称値を採用することができる。
【００５７】
図１４に、本発明の方法のブロック図を示す。「ブラインド・デコンボリューション」アルゴリズム（プログラム）の原理的機能は、予情報の枠内で可能なすべてのＰＳＦ（複数）及び対象物（複数）を、これにより計算された断層画像（複数）と測定された画像積層体との最良の一致が見出されるまで変化させることであると理解されるべきである。この場合、このために必要な計算時間と場合によってあり得るアーチファクトの強度が、パラメータの数及び変動幅によって大きく増大することは明らかである。
【００５８】
本発明によれば、第１のステップ５０において、対象物４０の画像が撮像される。第１のステップでは、必ずしも対象物の撮像された画像を問題とする必要はない。利用者が見込む（予期する）ものが、利用者によって採用されることも可能である。第２のステップ５２において、１次元空間内のＰＳＦの評価（推定：Schaetzung）５４の影響の下で、対象物の見込まれるべき（予期されるべき）画像が計算される。これに続いて、第３のステップ５６において、対象物の計算された画像と対象物の撮像された画像との比較が実行される。このステップでは、イテレーションの中断ないし続行を可能にする種々異なるアルゴリズムが影響する。所定の基準（複数）に従い評価されるべき一致が不十分であることが確認された場合、第４のステップ５８で、対象物の新たな評価（推定）が行われ、１パラメータのＰＳＦが求められる。そして、対象物のこの新たな評価（推定）及び１パラメータのＰＳＦは、再び見込まれる（予期される）画像の計算に影響を及ぼす（ステップ５２）。そして、所定時点において又は所定回数のイテレーション後に比較がポジティブとされると、計算された画像はモニタ２５において表示可能となる。アルゴリズムの実行は、観察された画像のノイズをどのように評価するか、及び新たな評価（推定）をどのように実行するかという観点から種々異なる。
【００５９】
一般的な数学的及び物理的制限を対象物関数（Objektfunktion）ないし中断基準（Abbruchkriterium）に適用することは、使用される対物レンズ２０（設計パラメータは既知）のＰＳＦにより求められる。装置内部において可能なＰＳＦの１パラメータの記述及び変化（最適化）により、高速で信頼性のあるデコンボリューションが可能となる。
【００６０】
従って、デコンボリューションの際に、いくつかのパラメータが未知であるためＰＳＦを不正確にしか既知ではないものとして仮定しなければならない場合、任意のないし一般的にのみ制限された（正の（ポジティブな）及び帯域制限された）ＰＳＦ（複数）を許容することは、対物レンズの品質が良好で、光学的に可能なＰＳＦが１つの小さな１次元だけの下位空間に制限されていれば、意味のあることではない（問題はない；nicht 
sinnvoll）。このようにして、計算時間の大幅な縮減もアーチファクトの大幅な減少も見込む（予期する）ことができる。
【００６１】
とりわけ前記の下位空間は、対物レンズ２０に配設可能な補正フレームの回転に相応して生ずるＰＳＦ（複数）の下位空間と全く同一である。このため、所与の対物レンズの補正領域をコンピュータでの「画像処理」により擬似的に「拡大」すること、又は更には補正機能を有しない対物レンズを追加的にこの特性について「拡張」することも可能となる。反対に、利用者により機械的補正フレームが正常に調節されている場合の探査空間（Suchraum）を、モニタ２５上での最良の画像印象又はコントラストに対する視覚的制御の下で更に制限することも勿論可能である。
【００６２】
１パラメータのデコンボリューションの結果は、生理学的媒体に包埋された３次元顕微鏡検査対象物の画像を生成するために、計算機２６によりモニタ２５に表示される。
【００６３】
本発明は、特別な一実施例に関して説明した。しかしながら、特許請求の範囲の保護範囲を逸脱しない範囲において変更及び変形することは勿論可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃ Ｃｏｒｒ．対物レンズの場合のカバーガラスの厚さ誤差５０λについての「真の」波面収差。
【図２】６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃの場合のカバーガラスの厚さ誤差５０λについてのある波面収差に関する収差経過。
【図３】「汎用」公式と、デフォーカスを含む「厳密」公式との間で、ＡＰＯ ６３ｘ／１．３０ Ｇｌｙｃ Ｃｏｒｒ．に関する計算例の比較。
【図４】「最良焦点」における残留収差の比較。
【図５】理想ＰＳＦの一例。
【図６】対象物を包囲する媒体の屈折率の小さなズレに影響を受けたＰＳＦの一例。
【図７】図２のＰＳＦに対し実行された補償後のＰＳＦの一例。
【図８】対象物を包囲する媒体の屈折率の小さなズレにより図２の場合よりも大きく影響を受けたＰＳＦの一例。
【図９】図４からのＰＳＦに対し実行された補償後のＰＳＦの一例。
【図１０】対象物の周囲の１つの薄層に生じた屈折率の大きなズレにより大きな撹乱が引き起こされた場合のＰＳＦの一例。
【図１１】図４からのＰＳＦに対し実行された補償後のＰＳＦの一例。
【図１２】本発明の方法を実施するための顕微鏡システムの概略図。
【図１３】顕微鏡対物レンズ、及び対象物を包囲する周囲、とりわけ試料と対物レンズとの間において種々異なる屈折率を有する複数の平坦な光学層の典型的構造の模式図。
【図１４】本発明の方法のブロック図の一例。
【符号の説明】
【００６５】
１    顕微鏡
１３  対象物支持体
２０  対物レンズ
２１  対物レンズ２０の光軸
２６  計算機
４０  対象物
４２  試料
４３  カバーガラス
４４  培養液
４６  底部（支持体１３の）
４７  液浸媒体
【図１】
2006504114.tif 000003
【図２】
2006504114.tif 000004
【図３】
2006504114.tif 000005
【図４】
2006504114.tif 000006
【図５】
2006504114.tif 000007
【図６】
2006504114.tif 000008
【図７】
2006504114.tif 000009
【図８】
2006504114.tif 000010
【図９】
2006504114.tif 000011
【図１０】
2006504114.tif 000012
【図１１】
2006504114.tif 000013
【図１２】
2006504114.tif 000014
【図１３】
2006504114.tif 000015
【図１４】
2006504114.tif 000016
【国際調査報告】
2006504114.tif 000017
2006504114.tif 000018
2006504114.tif 000019
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