(57)【要約】式(Ｉ)：【化１】2006506414.tif 000014[式中、Ｔ、Ｘ、Ｙ、およびＷは、本明細書中で定義した通りである] の新規化合物およびその薬学的に許容される塩およびエナンチオマーおよびラセミ体；その製造方法、それらを含む組成物、および治療におけるその使用を提供する。本化合物は、一酸化窒素合成酵素の阻害剤、およびそれによる炎症性疾患および疼痛の処置もしくは予防に特に有用である。
2006506414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)：
【化１】
2006506414.tif 000009
[式中、
ＴとＷは、独立して、ＣＲ１またはＮを表し；そして
１個を超えるＲ１が存在する場合、それぞれは独立して選択されてよく；
ＸとＲ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＮＯ２、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、またはＮＨＣＨＯを表し；
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されており；
Ｙは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＮＯ２、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、またはＮＨＣＨＯを表し；
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されている]の化合物；またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
ＹがＣＮまたはハロゲンを表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＸとＲ１が、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはＣＦ３を表す、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル；
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−４−クロロ−ベンゾニトリル；
(２Ｓ,４Ｒ)−２−アミノ−４−[[２−クロロ−５−(トリフルオロメチル)フェニル]チオ]−５−チアゾールブタノール；
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−６−(トリフルオロメチル)−３−ピリジンカルボニトリル；  
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−ベンゾニトリル；
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の式(Ｉ)の化合物。
【請求項５】
医薬として使用するための、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、もしくは担体と混合した、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物。
【請求項７】
一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益であるヒトの疾患もしくは状態の処置もしくは予防のための医薬の製造における、請求項１から４の何れか１項に記載の式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項８】
誘導型一酸化窒素合成酵素(inducible nitric oxide synthase)を優先的に阻害する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
炎症性疾患を処置しもしくは予防するための医薬の製造における、請求項１から４の何れか１項に定義した式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１０】
該疾患が炎症性腸疾患である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
該疾患がリウマチ性関節炎である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
該疾患が骨関節炎である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
疼痛を処置しもしくは予防する医薬の製造における、請求項１から４の何れか１項に定義した通りの式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１４】
炎症性疾患を処置しもしくは予防するための医薬の製造における、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせた、請求項１から４の何れか１項に定義の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１５】
一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益であるヒトの疾患もしくは状態を処置しもしくはそのリスクを軽減する方法であって、該疾患もしくは状態に罹患しもしくはそのリスクが増大しているヒトに、請求項１から４の何れか１項に定義した式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で投与することを含む方法。
【請求項１６】
誘導型一酸化窒素合成酵素を優先的に阻害する、請求項１５に記載の処置方法。
【請求項１７】
炎症性疾患に罹患しもしくはそのリスクがあるヒトにおいて、炎症性疾患を処置しまたはそのリスクを軽減する方法であって、該方法が、該ヒトに、請求項１から４の何れか１項に定義した式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で投与することを含む方法。
【請求項１８】
請求項１から４の何れか１項に定義した式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、もしくはラセミ体を製造する方法であって、該方法が、
(ａ) 式(II)：
【化２】
2006506414.tif 000010
[式中、Ｔ、Ｘ、Ｙ、およびＷは、請求項１で定義した通りであり、そして
Ｌ１は脱離基を表す]の化合物を、式(III)：
【化３】
2006506414.tif 000011
の化合物と反応させること；または
(ｂ) 式(IV)：
【化４】
2006506414.tif 000012
[式中、Ｔ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、請求項１で定義した通りである]の化合物を、式(Ｖ)：
【化５】
2006506414.tif 000013
[式中、Ｌ２は脱離基である]の化合物と反応させること；
そして望ましいかもしくは必要ならば、
得られた式(Ｉ)の化合物またはその別の塩を、その薬学的に許容される塩に変換すること；または
式(Ｉ)の化合物の１つを別の式(Ｉ)の化合物に変換すること;
そして望ましいならば
得られた式(Ｉ)の化合物を、その光学異性体に変換すること；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、新規アリールチアゾリルチオアルキルアミン誘導体、その製造方法、それらを含む組成物、および治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
一酸化窒素は、哺乳動物の細胞中で、特定の一酸化窒素合成酵素の作用によって、Ｌ−アルギニンから生成される。これらの酵素は、２つの別個のクラス、すなわち構成型ＮＯＳ(constitutive NOS)(ｃＮＯＳ)と、誘導型ＮＯＳ(inducible NOS)(ｉＮＯＳ)に分類される。現在、２つの構成型ＮＯＳと、１つの誘導型ＮＯＳが、同定されている。構成型ＮＯＳのうち、内皮型酵素(ｅｃＮＯＳ)は、平滑筋弛緩、および血圧と血流の制御に関するが、神経型酵素(ｎｃＮＯＳ)は、神経伝達物質として供給され、各種生物学的機能、例えば大脳の虚血の制御に関すると見られている。誘導型ＮＯＳは、特に炎症性疾患の病状に関与している。従って、これらの酵素の制御は、広く種々の疾患状態の処置において、多くの可能性を提供する(J. E. Macdonald, Ann. Rep. Med. Chem., 1996, 31, 221-230)。
【０００３】
多くの努力が、１個もしくはそれ以上の一酸化窒素合成酵素のアイソフォームの酵素の特定の阻害剤として作用する化合物を同定するための努力に費やされている。治療における該化合物の使用もまた、広く要請されている。
【０００４】
特許明細書 WO 02/090332 は、ＮＯＳ阻害剤として有用な特定のアリールヘテロアルキルアミン誘導体を開示している。該明細書で特に例示されてはいないが、その一般的な範囲に含まれるある種の化合物が、驚く程に有利な性質を有することが見出された。これらの化合物が本明細書の対象である。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の開示
本発明によって、式(Ｉ)：
【化１】
2006506414.tif 000003
[式中、
ＴとＷは、独立して、ＣＲ１またはＮを表し；そして
１個を超えるＲ１が存在する場合、それぞれは独立して選択されてよく；
ＸとＲ１は、独立して、Ｈ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＮＯ２、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、またはＮＨＣＨＯを表し；
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されており；
Ｙは、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ＣＮ、Ｃ≡ＣＨ、ＮＯ２、ＣＨＯ、ＣＯＣＨ３、またはＮＨＣＨＯを表し；
該アルキルもしくはアルコキシは、所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されている]の化合物；またはその薬学的に許容される塩が提供される。
【０００６】
１つの態様において、Ｙは、ＣＮまたはハロゲンを表す。
１つの態様において、ＸとＲ１は、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはＣＦ３を表す。
【０００７】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩は、それらが一酸化窒素合成酵素(ＮＯＳ)の阻害剤であるという利点を有する。特に、式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩は、それらが誘導型一酸化窒素合成酵素(ｉＮＯＳ)のアイソフォームの阻害剤であるという利点を有する。
【０００８】
本発明は、さらに、式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、またはラセミ体を製造する方法を提供する。
本発明によって、医薬として使用するための、式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩もまた提供される。
【０００９】
本発明の別の態様は、一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益である疾患もしくは状態を処置するもしくは予防する医薬の製造における、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００１０】
本発明のより特定的な態様は、炎症性疾患を処置しもしくは予防する医薬の製造における、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
本発明に従って、一酸化窒素合成酵素活性の阻害が有益である疾患もしくは状態を処置する もしくはそのリスクを軽減する方法であって、該疾患もしくは状態に罹患している もしくはそのリスクがあるヒトに、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらに特定的には、また、炎症性疾患に罹患している もしくはそのリスクがあるヒトにおいて炎症性疾患を処置する もしくはそのリスクを軽減する方法であって、該ヒトに、治療上効果的な量の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法が提供される。
【００１２】
本発明の化合物はまた、第２の薬学的に活性な物質と組み合わせて；特にシクロオキシゲナーゼ阻害剤と組み合わせて；さらに特定的には誘導型シクロオキシゲナーゼ(ＣＯＸ−２)のアイソフォームの選択的阻害剤と組み合わせて、有利に用いられ得る。従って、本発明のさらなる態様において、炎症、炎症性疾患、および炎症関連疾患を処置するためのＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせた、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用が提供される。さらにまた、炎症、炎症性疾患、および炎症関連疾患もしくは状態を有しもしくはそのリスクを有するるヒトにおいて、炎症、炎症性疾患、および炎症関連疾患を処置しもしくはそのリスクを軽減する方法であって、該方法が、ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせた、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を、治療上効果的な量で、該ヒトに投与することを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明の特定の化合物は、
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル；
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−４−クロロ−ベンゾニトリル；
(２Ｓ,４Ｒ)−２−アミノ−４−[[２−クロロ−５−(トリフルオロメチル)フェニル]チオ]−５−チアゾールブタノール；
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−６−(トリフルオロメチル)−３−ピリジンカルボニトリル；
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−ベンゾニトリル；
およびその薬学的に許容される塩を含む。
【００１４】
別記しない限り、本明細書中で記載の“Ｃ１−４アルキル”という用語は、１から４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルキルを表す。このような基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、およびｔ−ブチルを含む。
【００１５】
別記しない限り、本明細書中で記載の“Ｃ１−４アルコキシ”という用語は、１から４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖のアルコキシを表す。このような基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、およびｔ−ブトキシを含む。
【００１６】
別記しない限り、本明細書中で記載の“ハロゲン”という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを表す。
“所望により１個以上のフッ素原子によってさらに置換されているＣ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシ”の例は、ＣＨ２Ｆ、ＣＨＦ２、ＣＦ３、ＣＦ３ＣＦ２、ＣＦ３ＣＨ２、ＣＨ２ＦＣＨ２、ＣＨ３ＣＦ２、ＣＦ３ＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＦ３、およびＯＣＨ２ＣＦ３を含む。
【００１７】
本発明によって、我々は、さらに、式(Ｉ)の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エナンチオマー、またはラセミ体を製造する方法であって、
(ａ) 式(II)：
【化２】
2006506414.tif 000004
[式中、Ｔ、Ｘ、Ｙ、およびＷは、式(Ｉ)で定義した通りであり；そして
Ｌ１は脱離基を表す]の化合物を、式(III)：
【化３】
2006506414.tif 000005
の化合物と反応させること；または
(ｂ) 式(IV)：
【化４】
2006506414.tif 000006
[式中、Ｔ、Ｗ、Ｘ、およびＹは、式(Ｉ)で定義した通りである]の化合物を、式(Ｖ)：
【化５】
2006506414.tif 000007
[式中、Ｌ２は脱離基である]の化合物と反応させること；
そして望ましいかまたは必要ならば、
得られた式(Ｉ)の化合物またはその別の塩をその薬学的に許容される塩に変換すること；または
１つの式(Ｉ)の化合物を、別の式(Ｉ)の化合物に変換すること；
そして望ましいならば、
得られた式(Ｉ)の化合物をその光学異性体に変換すること；
を含む方法を提供する。
【００１８】
工程(ａ)において、該反応は、不活性溶媒中で、式(III)の求核剤を、式(II)の求電子剤で処理することによって行われる。適切な脱離基Ｌ１は、スルホネートおよびハライド(特にフルオライドまたはクロライド)を含む。該反応は、一般的に、非求核性塩基、例えば水素化ナトリウムまたは炭酸セシウムの存在下で行われる。適切な有機溶媒は、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、テトラヒドロフラン、およびジメチルスルホキシドである。該反応は、一般的に、０℃から溶媒の沸点の間の温度で行われる。
【００１９】
工程(ｂ)において、式(IV)および式(Ｖ)の反応剤は、適切な不活性溶媒、例えばテトラヒドロフラン中で、例えば Mitsunobu 条件を用いて、相互にカップリングされる。従って、例えば、反応剤は、適切な温度、一般的に０℃および溶媒の沸点の間の温度において、ホスフィン誘導体およびアゾ誘導体で、処理される。適切なホスフィン誘導体は、トリフェニルホスフィンおよびトリブチルホスフィンを含む。適切なアゾ誘導体は、ジエチル アゾジカルボキシレート、ジイソプロピル アゾジカルボキシレート、および１,１'−(アゾジカルボニル)ジピペリジンを含む。適切な脱離基Ｌ２は、ヒドロキシを含む。
【００２０】
あるいは、工程(ｂ)において、反応は、式(IV)の求核剤を、式(Ｖ)の求電子剤で、不活性溶媒中で処理することによって行われる。適切な脱離基Ｌ２は、スルホネートおよびハライド、特にクロライドまたはブロマイドを含む。反応は、一般的に、非求核性塩基、例えば水素化ナトリウムまたは炭酸セシウムの存在下で行われる。適切な有機溶媒は、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン、テトラヒドロフラン、およびジメチルスルホキシドである。反応は、一般的に、０℃から溶媒の沸点の間の温度で行われる。
【００２１】
上記の方法において、アミンまたはヒドロキシルまたは他の潜在的に反応性である基を保護することが、望ましいかもしくは必要であり得ることは、当業者に明らかである。適切な保護基および該基の導入および除去の方法の詳細は、標準的テキストである“Protective Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition (1999) by Greene and Wuts を参照することで見出され得る。
【００２２】
１つの望ましい態様において、アミン基は、カルバメート誘導体、例えばｔ−ブチルオキシカルバメートとして保護される。
別の特に望ましい態様において、式(Ｉ)の化合物のアミンおよびヒドロキシルが、式(VI)中で環状ヘミアミナールとして同時に保護される。
【化６】
2006506414.tif 000008
【００２３】
保護基の使用の特定の例は、実施例の項で示されている。
本発明は、塩の、特に酸付加塩の形態の式(Ｉ)の化合物を含む。適切な塩は、有機酸および無機酸の両方と形成する塩を含む。このような酸付加塩は、通常薬学的に許容されるが、薬学的に許容されない酸の塩は、対象の化合物の製造および精製に有用であり得る。従って、望ましい塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から形成される塩を含む。
【００２４】
式(Ｉ)の化合物の塩は、遊離塩基、またはその塩、エナンチオマー、もしくはラセミ体を、１当量以上の適切な酸と反応させることによって形成され得る。反応は、塩が不溶な溶媒もしくは媒体中で、または塩が可溶な溶媒中で、例えば水、ジオキサン、エタノール、テトラヒドロフラン、またはジエチルエーテル中で、または溶媒の混合物中で行われ、溶媒は、真空でまたは凍結乾燥によって除去され得る。反応はまた、複分解反応であってもよく、またはイオン交換樹脂上で行われてもよい。
【００２５】
中間体化合物は、そのまままたは保護された形態で用いられ得る。保護基およびその除去方法の詳細は、標準的なテキストである“Protective Groups in Organic Synthesis”, 3rd Edition (1999) by Greene and Wuts 参照して見出され得る。
【００２６】
本発明の化合物およびその中間体は、その反応混合物から単離され得るし、必要であれば、標準的な方法を用いることによってさらに精製され得る。
式Ｉの化合物は、エナンチオマーの形態で存在し得る。従って、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、およびその混合物は、本発明の範囲に含まれる。各種光学異性体は、慣用の方法、例えば分別結晶またはＨＰＬＣを用いて、本化合物のラセミ混合物の分割によって単離され得る。
中間体化合物はまた、エナンチオマーの形態で存在することができ、そして精製したエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、または混合物として用いられ得る。
【００２７】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩は動物において薬理学的活性を有するので有用である。特に、本化合物は、一酸化窒素合成酵素の阻害剤として活性である。より特定的には、それらは、誘導型一酸化窒素合成酵素のアイソフォームの阻害剤であり、従って、治療に、例えば抗炎症剤として有用であると予測される。それらはまた、神経型一酸化窒素合成酵素のアイソフォーム(neuronal isoform of the enzyme nitric oxide synthase)の阻害剤としても有用性を有し得る。
【００２８】
本化合物およびその薬学的に許容される塩は、一酸化窒素合成酵素の合成もしくは過剰合成が寄与する部分のある疾患もしくは状態の処置または予防に使用するために適用される。特に、本化合物は、ヒトを含む哺乳動物において、炎症状態の処置に使用するために適応される。
【００２９】
特に付言され得る状態は、
骨関節炎、リウマチ性関節炎、リウマチ性脊椎炎、痛風性関節炎、および他の関節炎状態、炎症性関節；
湿疹、乾癬、皮膚炎、または他の炎症性皮膚状態、例えば日焼け；
ブドウ膜炎、緑内障、および結膜炎を含む炎症性眼状態；
炎症が含まれる肺疾患、例えば喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、ハト飼育者疾患(pigeon fancier's disease)、農夫肺、急性呼吸窮迫症候群；
菌血症、内毒血症(endotoxaemia) (敗血症ショック)、アフタ性潰瘍、歯肉炎、麻痺(pyresis)、疼痛、髄膜炎、および膵炎；
炎症性腸疾患を含む胃腸管の状態、クローン病、萎縮性胃炎、変形性胃炎(gastritis varialoforme)、潰瘍性大腸炎、セリアック病、限局性回腸炎(regional ileitis)、消化性潰瘍形成、過敏性腸症候群、逆流性食道炎、例えば Helicobacter pylori の感染 または非ステロイド性抗炎症剤での処置に起因する胃腸管の損傷；および
炎症を伴う他の疾患；
である。
【００３０】
本化合物はまた、急性疼痛または持続性炎症性疼痛または神経因性疼痛または中枢由来の疼痛の処置および緩和に有用である。
我々は、特に、炎症性腸疾患、リウマチ性関節炎、骨関節炎、慢性閉塞性肺疾患、および疼痛の状態に関心がある。
【００３１】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される塩はまた、上記の疾患に加えて、疾患もしくは状態の処置もしくは予防に有用であり得る。例えば、本化合物は、アテローム性硬化症、嚢胞性線維症、敗血症ショックおよび／または毒素ショックを伴う低血圧の処置において、免疫系機能不全の処置において、臓器移植治療における短期免疫抑制に対するアジュバントとして、糖尿病発病の制御において、糖尿病における膵臓機能の維持において、糖尿病に伴う血管性合併症の処置において、およびサイトカイン(例えばＴＮＦまたはインターロイキン)との併用治療において有用であり得る。
【００３２】
式(Ｉ)の化合物はまた、例えば心停止や卒中の場合における低酸素症、例えば虚血、低酸素症、低血糖、癲癇などの疾患や 外傷(例えば脊髄損傷や頭部損傷)における 神経変性 および／または 神経壊死を含む神経変性疾患、高圧酸素痙攣および毒、痴呆、例えば初老期痴呆や アルツハイマー病や ＡＩＤＳ関連痴呆、シドナム舞踏病、パーキンソン病、トゥーレット症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、筋ジストロフィー、コルサコフ病、大脳血管障害に関する虚弱、睡眠障害、統合失調症、鬱病、疼痛、自閉症、季節性情動障害、時差ぼけ、鬱病、または 月経前症候群(ＰＭＳ)や不安や敗血症ショックに伴う別の症状の処置に有用であり得る。式(Ｉ)の化合物はまた、薬物中毒または薬物抵抗性、例えばアヘン剤やジアゼピンに対する抵抗性の予防や回復、薬物中毒の処置、偏頭痛や他の血管性頭痛、神経因性炎症の処置、胃腸運動障害、癌の処置、および分娩の誘発において、活性を示すと期待され得る。
【００３３】
我々は、特に、卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、偏頭痛、癌、敗血症ショック、および疼痛の状態に関心がある。
【００３４】
予防は、対象の疾患もしくは状態の病歴があるか、またはそうでなければそのリスクが増大していると考えられるヒトの処置に、特に関連があると予測される。特定の疾患もしくは状態にかかるリスクのあるヒトは、一般的に、該疾患もしくは状態の家族の病歴があるヒト、または特に該疾患もしくは状態にかかりやすいと、遺伝子試験もしくはスクリーニングによって特定されたヒトを含む。
【００３５】
上記の治療的適応において、投与される用量は、用いられる化合物、投与方法、および望ましい処置に伴って、当然に変化する。
しかし、一般的に、満足のいく結果は、本化合物が１日当たり１mgから２０００mgの固体の形態の投与形で投与された場合に得られる。
【００３６】
式(Ｉ)の化合物およびその薬学的に許容される誘導体は、それ自身で用いられてもよく、または本化合物もしくは誘導体が薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、もしくは担体と混合した、適切な医薬組成物の形態で用いられてもよい。投与は、経腸(経口、舌下、もしくは直腸)、鼻腔内、吸入、静脈内、局所もしくはその他の非経腸の経路(これらに制限されない)によって行われる。適切な医薬製剤の選択および製造のための慣用の手順は、例えば、“Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs”, M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988 に記載されている。本医薬組成物は、好ましくは、８０％未満の、より好ましくは５０％未満の式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００３７】
本発明によって、我々は、さらに、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤、もしくは担体と混合した、式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。
該成分を混合することを含む、該医薬組成物の製造方法も提供する。
【００３８】
式(Ｉ)の化合物、およびその薬学的に許容される誘導体はまた、いずれかのＣＯＸ阻害剤と組み合わせて、より特定的にはＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせて、有利に用いられ得る。特に望ましいＣＯＸ−２阻害剤は、Celecoxib および MK-966 である。ＮＯＳ阻害剤およびＣＯＸ−２阻害剤は、１回単位用量で投与するために 同じ医薬組成物に一緒に製剤化されるか、またはそれぞれの成分を個別に製剤化し、別個の投与形を同時にもしくは連続して投与するかの何れであってもよい。
【００３９】
本発明は、下記の実施例によって説明されるが、これは本発明を一切制限しない。下記の略号：−ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)、ＤＭＦ(Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド)、ＴＨＦ(テトラヒドロフラン)、ＮＭＰ(Ｎ−メチルピロリジノン)を用いる。
【実施例】
【００４０】
実施例１
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル エタンジオエート
ａ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−ヒドロキシ−２−(２−クロロ−５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル、および(４Ｓ)−４−[(２Ｓ)−２−ヒドロキシ−２−(２−クロロ−５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
ｎ−ブチルリチウム(ヘキサン中２.０Ｍ, ２１.６ml)を、ＴＨＦ(４００ml)中の２−クロロチアゾール(５.４ｇ)の溶液に、−７８℃で窒素雰囲気下で加えた。１５分後、ＴＨＦ(１４０ml)中の(４Ｓ)−２,２−ジメチル−４−(２−オキソエチル)−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル(７.０ｇ)の溶液を滴下し、反応混合物をさらに６０分間撹拌した。次に冷却を中止し、混合物を室温で６０分間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液に注ぎ、生成物をジエチルエーテルで抽出した。合わせた抽出物を塩水で洗浄し、乾燥し(硫酸マグネシウム)、濾過し、蒸発させた。クロマトグラフィー(シリカ, 溶出液として２０％ 酢酸エチル／イソヘキサン)によって精製し、(４Ｓ,２Ｓ)−副題化合物を無色の油状物として得た(５.２ｇ)。
MS APCI +ve m/z 363 [(M+H]+).
1H NMR 400MHz (DMSO-d6, 90℃) 7.49 (1H, s), 5.69 (1H, d), 4.85 (1H, dd), 3.96-3.86 (2H, m), 3.84-3.77 (1H, m), 2.10-1.99 (1H, m), 1.90 (1H, dt), 1.47 (3H, s), 1.40 (12H, s).
【００４１】
さらなる溶出を(４Ｓ,２Ｒ)−副題化合物(５.１ｇ, ４２％)を無色の油状物として得た。
MS APCI +ve m/z 363 ([M+H]+).
1H NMR 400MHz (DMSO-d6, 90℃) 7.49 (1H, s), 5.70 (1H, d), 4.92 (1H, apparent quin.), 4.05-3.98 (1H, m), 3.91-3.84 (2H, m), 2.16-2.07 (1H, m), 1.84 (1H, ddd), 1.48 (3H, s),1.41 (12H, s).
【００４２】
ｂ) (４Ｓ)−４−[(２Ｓ)−２−ヒドロキシ−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
１０％ パラジウム／炭素を、メタノール(１２０ml)中の(４Ｓ,２Ｓ)−実施例１の段階(ａ)の生成物(５.２ｇ)と酢酸ナトリウム(２.９ｇ)に加えた。反応混合物を、５０℃で、５気圧の水素雰囲気下で、１６時間撹拌した。混合物を濾過し、蒸発させた。次に残渣をジクロロメタンに溶解し、再度濾過し、蒸発させ、副題化合物を無色の油状物として得た(４.８ｇ)。
MS APCI +ve m/z 329 ([M+H]+).
1H NMR 400MHz (DMSO-d6, 90℃) 8.90 (1H, d), 7.73 (1H, d), 5.49 (1H, d), 4.94 (1H, dt), 3.93-3.91 (2H, m), 3.85-3.78 (1H, m), 2.09 (1H, ddd), 1.94-1.89 (1H, m), 1.47 (3H, s), 1.41 (3H, s), 1.40 (9H, s).
【００４３】
ｃ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−(ベンゾイルチオ)−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
乾燥ＴＨＦ(１００ml)中のトリフェニルホスフィン(７.９ｇ)の溶液に、０℃で、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(５.９ml)を、５分間滴下した。添加完了後、混合物を２０分間撹拌し、次にＴＨＦ(５０ml)中の実施例１の段階(ｂ)の生成物(４.８ｇ)とチオ安息香酸(３.５ml)の溶液を加えた。冷却浴を除き、撹拌を室温で終夜続けた。混合物を濃縮し、残渣をクロマトグラフィー(シリカ, 溶出液として１０％ ジエチルエーテル／イソヘキサン)によって精製し、副題化合物を黄色の固体として得た(４.４ｇ)。
MS APCI +ve m/z 449 ([M+H]+).
【００４４】
ｄ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(５−クロロ−３−シアノ−２−ピリジニル)チオ]−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
実施例１の段階(ｃ)の生成物(２９０mg)を、メタノール中７Ｍ アンモニア(５ml)で処理し、室温で６時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を乾燥ＤＭＦ(５ml)に溶解し、２,５−ジクロロ−３−ピリジンカルボニトリル(１１２mg)で、次に炭酸セシウム(２１０mg)で、窒素下で処理した。反応混合物を１８時間撹拌し、塩水と酢酸エチルに注ぎ、有機層を分離し、水(２×)で、塩水で洗浄し、乾燥した(硫酸マグネシウム)。溶媒を蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー(シリカ, 溶出液として２５％ 酢酸エチル／ジクロロメタン)によって精製し、副題化合物を粘稠な油状物として得た(１６０mg)。
MS APCI +ve m/z 481 ([M+H]+).
【００４５】
ｅ) ２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−３−ピリジンカルボニトリル エタンジオエート
実施例１の段階(ｄ)の生成物(１６０mg)を、ジオキサン(１ml)とメタノール(１ml)中の４Ｍ ＨＣｌで、１時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ジエチルエーテル(３×)で、次に１当量のエタノール(１０ml)中のシュウ酸で共沸した。澄明な溶液を完全に沈殿するまでジエチルエーテルで処理し、固体を濾過によって集め、ジエチルエーテルで洗浄し、真空で４０℃で２時間乾燥し、表題化合物を明褐色の固体として得た(６０mg)。
MS APCI + ve m/z 341 ([M+H]+).
1H NMR 400MHz (DMSO-d6) 9.07 (1H, s), 8.87 (1H, d), 8.56 (1H, d), 8.07 (2H, bs), 8.00 (1H, s), 5.71 (1H, t), 3.57 (1H, dd), 3.49 (1H, dd), 3.12-3.04 (1H, m), 2.45-2.32 (2H, m).
【００４６】
実施例２
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−４−クロロ−ベンゾニトリル 二塩酸塩
ａ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(５−クロロ−２−シアノフェニル)チオ]−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
実施例１の段階(ｃ)の生成物(２９０mg)を、２−フルオロ−４−クロロベンゾニトリル(１０１mg)と炭酸セシウム(２１１mg)で、実施例１の段階(ｄ)の手順に従って処理し、副題化合物を粘稠な油状物として得た(１６０mg)。
MS APCI +ve m/z 480 ([M+H]+).
【００４７】
ｂ) ２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−４−クロロ−ベンゾニトリル 二塩酸塩
実施例２の段階(ａ)の生成物を、ジオキサン(１ml)とメタノール(１ml)中の４Ｍ ＨＣｌで、１時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、ジエチルエーテル(３×)で共沸し、真空で４０℃で２時間乾燥し、表題化合物を薄黄色の固体として得た(１１３mg)。
MS APCI + ve m/z 340 ([M+H]+).
1H NMR 400MHz (DMSO-d6) 9.05 (1H, s), 8.15 (2H, bs), 7.86 (1H, d), 7.83 (1H, s), 7.81 (1H, d), 7.55 (1H, dd), 5.57 (1H, t), 3.59 (1H, dd), 3.51 (1H, dd), 3.07 (1H, br s), 2.31-2.23 (2H, m).
【００４８】
実施例３
(２Ｓ,４Ｒ)−２−アミノ−４−[[２−クロロ−５−(トリフルオロメチル)フェニル]チオ]−５−チアゾールブタノール塩酸塩
ａ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[[２−クロロ−５−(トリフルオロメチル)フェニル]チオ]−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
実施例１の段階(ｃ)の生成物(１９０mg)を、４−クロロ−３−フルオロベンゾトリフリオリド(８３mg)と炭酸セシウム(１６３mg)で、実施例１の段階(ｄ)の手順に従って処理し、副題化合物を粘稠な油状物として得た(１０５mg)。
MS APCI +ve m/z 523 ([M+H]+).
【００４９】
ｂ) (２Ｓ,４Ｒ)−２−アミノ−４−[[２−クロロ−５−(トリフルオロメチル)フェニル]チオ]−５−チアゾールブタノール塩酸塩
実施例３の段階(ａ)の生成物を、実施例２の段階(ｂ)の手順に従って、表題化合物(５８mg)を、(２Ｓ,４Ｓ)−ジアステレオマーを不純物３０％として含む白色の固体として得た。
MS APCI + ve m/z 383 ([M+H]+).
1H NMR 300MHz (DMSO-d6) 9.04 (1H, s), 8.15 (2H, br s), 7.86 (1H, d), 7.77-7.69 (2H, m), 7.61 (1H, s), 5.54 (1H, t), 3.63-3.55 (1H, m), 3.13-3.01 (2H, m), 2.34-2.19 (2H, m).
【００５０】
実施例４
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−６−(トリフルオロメチル)−３−ピリジンカルボニトリル二塩酸塩
ａ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[[３−シアノ−６−(トリフルオロメチル)−２−ピリジニル]チオ]−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
実施例１の段階(ｃ)の生成物(１９０mg)を、２−クロロ−６−トリフルオロメチル−３−ピリジンカルボニトリル(８６mg)と炭酸セシウム(１６３mg)で、実施例１の段階(ｄ)の手順に従って、副題化合物を粘稠な油状物として得た(１１７mg)。
MS APCI +ve m/z (515 [M+H]+).
【００５１】
ｂ) ２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−６−(トリフルオロメチル)−３−ピリジンカルボニトリル 二塩酸塩
実施例４の段階(ａ)の生成物を、実施例２の段階(ｂ)の手順に従って反応させ、表題化合物を白色の固体として得た(８５mg)。
MS APCI + ve m/z (375 [M+H]+).
1H NMR 300MHz (DMSO-d6) 9.04 (1H, s), 8.57 (1H, d), 8.20 (2H, bs), 7.97 (1H, s), 7.89 (1H, d), 5.68 (1H, t), 3.60-3.56 (1H, m), 3.52 (1H, dd), 3.18-3.09 (1H, m), 2.48-2.41 (2H, m).
【００５２】
実施例５
２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−ベンゾニトリル 二塩酸塩
ａ) (４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(４−クロロ−２−シアノフェニル)チオ]−２−(５−チアゾリル)エチル]−２,２−ジメチル−３−オキサゾリジンカルボン酸, １,１−ジメチルエチル エステル
実施例１の段階(ｃ)の生成物(１９０mg)を、５−クロロ−２−フルオロベンゾニトリル(６５mg)および炭酸セシウム(１６３mg)で、実施例１の段階(ｄ)の手順に従って処理し、副題化合物を粘稠な油状物として得た(１６０mg)。
MS APCI +ve m/z 480 ([M+H]+).
【００５３】
ｂ) ２−[[(１Ｒ,３Ｓ)−３−アミノ−４−ヒドロキシ−１−(５−チアゾリル)ブチル]チオ]−５−クロロ−ベンゾニトリル 二塩酸塩
実施例５の段階(ａ)の生成物を、実施例２の段階(ｂ)の手順に従って反応させ、表題化合物を薄黄色の固体として得た(９７mg)。
MS APCI + ve m/z 340 ([M+H]+).
1H NMR 300MHz (DMSO-d6) 9.04 (1H, s), 8.27 (2H, br s), 8.04 (1H, d), 7.81 (1H, s), 7.77-7.74 (2H, m), 5.58 (1H, t), 3.57 (1H, dd), 3.51 (1H, dd), 3.07-3.00 (1H, m), 2.27 (2H, t).
【００５４】
スクリーン
本発明による化合物の薬理学的活性を、下記のスクリーンで試験した。
スクリーン１
式(Ｉ)の化合物またはその薬学的に許容される塩の活性を、一酸化窒素合成酵素阻害活性において、Foerstermann et al., Eur. J. Pharm., 1992, 225, 161-165 の手順に基づく手順によって、スクリーニングし得る。一酸化窒素合成酵素は、３Ｈ−Ｌ−アルギニンを３Ｈ−Ｌ−シトルリンに変える。３Ｈ−Ｌ−シトルリンは、カチオン交換クロマトグラフィーによって分離して液体シンチレーション計数によって定量化し得る。
【００５５】
誘発後に、酵素を、培養されたマウスのマクロファージ細胞株 J774A-1 (Imperial Cancer Research Fund の研究所から得た)から製造した。J774A-1 細胞を、１０％ ウシ胎児血清、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および抗生物質(１００単位／ml ペニシリン Ｇ、１００mg/ml ストレプトマイシン、および０.２５mg/ml アンホテリシン Ｂ)を加えた ダルベッコ変法イーグル培地(ＤＭＥＭ)中で培養する。細胞を３５mlの培地を含む２２５ｃｍ３フラスコ中で、３７℃で、５％ ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で普通に成長させる。
【００５６】
一酸化窒素合成酵素は、インターフェロン−ｇ(ＩＦＮｇ)およびリポポリサッカライド(ＬＰＳ)に対する応答で、細胞によって産生される。コンフルエントな培養フラスコの培地を除き、１mg/mlのＬＰＳと１０単位／mlのＩＦＮｇを含む２５ml(フラスコ当たり)の新しい培地に置き換える。培養１７〜２０時間後、培養培地のフラスコ表面から細胞のシートをかき取ることによって、細胞の収穫を行う。細胞を遠心分離(１０００Ｇ, １０分間)によって集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ７.５, ２０℃)、１０％(v/v)のグリセロール、０.１％(v/v) Triton-X-100、０.１ｍＭのジチオトレイトール、およびロイペプチン(２mg/ml)、大豆トリプシン阻害剤(１０mg/ml)、アプロチニン(５mg/ml)、およびフッ化 フェニルメチルスルホニル(５０mg/ml)を含むプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む溶液を、細胞のペレットに加えることによってライセートを製造した。
【００５７】
アッセイのために、２５μｌの基質カクテル(５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ７.５, ２０℃)、４００μＭのＮＡＤＰＨ、２０μＭのフラビン アデニン ジヌクレオチド、２０μＭのフラビン モノヌクレオチド、４μＭのテトラヒドロビオプテリン、１２μＭのＬ−アルギニン、および０.０２５ｍＣｉ  Ｌ−[３Ｈ]アルギニン)を、２５μｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の試験化合物の溶液を含む９６ウェル フィルター プレート(孔のサイズ：０.４５μＭ)に加える。反応は、５０μｌの細胞ライセート(上記で製造)を添加することによって始め、１時間室温でインキュベートした後、３ｍＭ ニトロアルギニンと２１ｍＭのＥＤＴＡの水溶液５０μｌを添加することによって終わらせた。
【００５８】
ラベルされたＬ−シトルリンを、ラベルされたＬ−アルギニンから、Dowex AG-50W を用いて分離した。１５０μｌの２５％ Dowex 50W (Ｎａ＋型)の水性のスラリーをアッセイに加え、その後全体を９６ウェルプレートでろ過した。７５μｌのろ液をサンプリングし、固形シンチラント(scintillant)を含む９６ウェルプレートのウェルに加えた。試料を乾燥させた後、Ｌ−シトルリンをシンチレーション計数によって定量した。
【００５９】
典型的な実験において、基礎活性(basal activity)は、試料７５μｌ当たり３００ｄｐｍであり、試薬コントロールでは１９００ｄｐｍに増大する。化合物の活性は、ＩＣ５０(アッセイ中５０％酵素阻害を示す薬物の濃度)として表し、アミノグアニジン[ＩＣ５０(５０％阻害濃度)が１０μＭ]は、手順を確かめるための標準として試験された。化合物は、濃度の範囲で試験され、ＩＣ５０値を得る阻害から計算される。１００μＭで少なくとも２５％まで酵素を阻害する化合物は、活性があるとして分類され、少なくとも１回再試験にかけられる。
【００６０】
上記のスクリーンにおいて、実施例１から５の化合物を試験し、１０μＭ未満のＩＣ５０値を得た。このことは、これらが有用な治療活性を示すと期待されることを示している。
【００６１】
スクリーン２
リコンビナントのヒトのＮＯ合成酵素(ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、およびｎＮＯＳ)を、E. coli 中で発現し、補因子(ＦＡＤ、ＦＭＮ、Ｈ４Ｂ)、プロテアーゼ阻害剤、リゾチウム、および界面活性剤 CHAPS を含む、Hepes 緩衝液(ｐＨ ７.４)中でライセートを製造した。これらの調製物を、適切な希釈で、様々なアイソフォーム(isoform)の阻害を評価するために用いた。Foerstermann et al.9の方法の適応を用いて、ＮＯＳの阻害を、Ｌ−[３Ｈ]−アルギニンからのＬ−[３Ｈ]−シトルリンの形成を測定することによって決定した。酵素アッセイを、３μＭの[３Ｈ]−アルギニン、１ｍＭのＮＡＤＰＨ、およびＮＯＳ活性を維持するのに必要な他の補因子(ＦＡＤ、ＦＭＮ、Ｈ４Ｂ、カルモジュリン、Ｃａ２＋)の存在下で行った。様々なＮＯＳ阻害剤がゆっくりとした結合速度を示すか、または時間依存で酵素を不活性化することが報告されていることから、酵素と阻害剤を、アルギニンを添加して反応を始める前に、ＮＡＤＰＨの存在下で、６０分間プレインキュベートした。アッセイをクエンチする前に、インキュベーションをさらに６０分間続け、９６−ウェル形式での Dowex-50W 樹脂でのクロマトグラフィーによって、[３Ｈ]−シトルリンを未反応の基質から分離した。
【００６２】
上記のスクリーンで、実施例１から５の化合物を試験し、ｉＮＯＳ酵素に対して１０μＭ未満のＩＣ５０値を得た。このことは、これらが有用な治療活性を示すと期待されることを示している。
【００６３】
スクリーン３
化合物はまた、下記のアッセイで示されるように、ヒト型の誘導型一酸化窒素合成酵素に対して活性を示す。
ヒトの結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１(European Collection of Animal Cell Culture - cell line number 90102540 から得られる)を、１０%(v/v) ウシ胎児血清と、２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃で、５％ ＣＯ２中で、決まった方法で成長させた。
【００６４】
一酸化窒素合成酵素を、ヒトのリコンビナント γ−ＩＦＮ(１０００単位／ml)、ＴＮＦ−α(２００U/ml)、ＩＬ−６(２００U/ml)、およびＩＬ−１β(２５０U/ml)を含む培地の添加によって、細胞中で誘発した。３７℃で１８時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を温リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。試験化合物の存在下 および非存在下で、１００μＭのＬ−アルギニンと １００μＭのベラパミル−ＨＣｌを含むＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃／５％ ＣＯ２で、さらに５時間細胞をインキュベートした。
【００６５】
亜硝酸塩の蓄積を、Griess 試薬 (１mlの２.５%(v/v) リン酸中の １０mg/mlのスルファニルアミド、１mgのＮ−(１−ナフチル)エチレンジアミン)を伴う培養培地を等体積混合することによって決定した。化合物の存在下での阻害を、未処理の細胞によって生産される亜硝酸塩のレベルに関して計算した。ＩＣ５０値を、化合物の濃度に対する％阻害の片対数プロットから見積もった。
【００６６】
このスクリーンにおいて、実施例１から５の化合物は、１００μＭ未満のＩＣ５０値を与えた。このことは、これらが有用な治療活性を示すと予期されることを示している。
【国際調査報告】
2006506414.tif 000015
2006506414.tif 000016
2006506414.tif 000017
2006506414.tif 000018
2006506414.tif 000019