(57)【要約】本発明は、インテグリンαｖβ６に結合するモノクローナル抗体ｍＢＬＡ３および他の等価の抗体を提供する。本発明はまた、癌関連抗原インテグリンαｖβ６の種々のヒト癌に関する同定および特徴付け、ならびにこれらのヒト癌の診断方法および処置方法を、提供する。本発明は、インテグリンのβ６サブユニットに結合する抗体およびポリペプチド、ならびにインテグリンのβ６サブユニットに結合するこれらの抗体およびポリペプチドの製造方法および使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＡＴＣＣ第ＰＴＡ−３７７５号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体ｍＢＬＡ３の、β６インテグリンサブユニットへの優先的結合を、競合的に阻害する抗体。
【請求項２】
受託番号ＡＴＣＣ第ＰＴＡ−３７７５号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体ｍＢＬＡ３。
【請求項３】
請求項２に記載の抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖および重鎖の可変領域に由来する可変領域、ならびにヒト抗体の軽鎖および重鎖の定常領域に由来する定常領域を含む、キメラ抗体。
【請求項４】
請求項２に記載の抗体ｍＢＬＡ３の、ヒト化抗体。
【請求項５】
治療薬剤に結合されている、請求項１、請求項３または請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
プロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合される、請求項１、請求項３または請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
宿主細胞株（ＡＴＣＣ番号第ＰＴＡ−３７７５号）またはその子孫。
【請求項８】
受託番号ＡＴＣＣ第ＰＴＡ−３７７５号を有する宿主細胞もしくはその子孫によって産生された抗体ｍＢＬＡ３によって結合されるか、または該抗体ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体によって結合される、β６インテグリンサブユニットの複合体。
【請求項９】
前記β６インテグリンサブユニットが、癌細胞上にある、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記癌細胞が、乳癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１２】
前記癌細胞が、肺癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１３】
前記癌細胞が、甲状腺癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１４】
前記癌細胞が、膵臓癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１５】
前記癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１６】
前記癌細胞が、腎臓癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１７】
前記癌細胞が、食道癌細胞である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１８】
請求項９に記載の複合体であって、前記抗体ｍＢＬＡ３または該抗体ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する前記抗体が、治療薬剤に結合している、複合体。
【請求項１９】
請求項９に記載の複合体であって、前記抗体ｍＢＬＡ３または該抗体ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する前記抗体が、プロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合している、複合体。
【請求項２０】
請求項１、請求項３または請求項４に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項５に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項６に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体を含む、癌細胞を検出するためのキット。
【請求項２４】
請求項１、請求項３および請求項４のいずれか１項に記載の抗体を含む、癌細胞の増殖を阻害するためのキット。
【請求項２５】
前記抗体が、治療薬剤に結合している、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗体が、プロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合している、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
請求項２に記載の抗体を産生するための方法であって、該方法は、請求項２に記載の抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現する工程、および該抗体を精製する工程を包含する、方法。
【請求項２８】
個体における癌細胞の存在または非存在を検出する方法であって、該方法は、該個体由来の細胞を、請求項１、請求項２、請求項３または請求項４に記載の抗体と接触させる工程、ならびに該癌細胞由来のβ６インテグリンサブユニットと該抗体との複合体を、存在する場合に検出する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記検出される癌細胞が、乳癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出される癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出される癌細胞が、肺癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出される癌細胞が、膵臓癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出される癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出される癌細胞が、食道癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出される癌細胞が、甲状腺癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出される癌細胞が、腎臓癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌細胞が、転移性癌細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
個体における癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、有効量の請求項２０に記載の組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３９】
前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
個体における癌細胞に治療薬剤を送達する方法であって、該方法は、有効量の請求項２１に記載の組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
個体における癌細胞にプロドラッグ活性化酵素を送達する方法であって、該方法は、有効量の請求項２２に記載の組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４３】
前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３７２，２７７号（２００２年４月１２日出願）および米国仮特許出願第６０／３７３，２７４号（２００２年４月１６日出願）の利益を主張し、これらはその全体において参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、癌生物学および免疫治療の分野における。より具体的には、種々のヒト癌に存在する、インテグリンα−ｖ−β−６に結合するモノクローナル抗体ｍＢＬＡ３のような抗体の発見、そのような癌の診断方法および／または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫治療あるいは治療目的の抗体の使用は、近年癌を治療するために用いられている。受動免疫治療には、癌治療におけるモノクローナル抗体の使用などが含まれる。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第６版（２００１）２０章ｐ．４９５〜５０８を参照のこと。これらの抗体は、細胞の増殖の直接阻害または生存の直接阻害、および生体の免疫系の天然の細胞殺傷活性を補充するその能力の双方により、固有の治療生物活性を有し得る。これらの薬物は、単独であるいは放射線または化学治療薬剤と併用して投与され得る。Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、それぞれリンパ腫の治療および乳癌の治療に認可されており、そのような治療法の二つの例である。あるいは、抗体は、抗体結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）をつくるために使用され得、そこで抗体は毒性剤と結合し、腫瘍と特異的に結合することにより、この薬物を腫瘍に導く。Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）は、白血病処置に使用される認可された抗体結合体の一例である。癌細胞に結合し、診断および治療に利用される可能性のあるモノクローナル抗体は、刊行物において開示されている。例えば、特にいくつかの標的タンパク質の分子量を開示する以下の特許出願を参照のこと。米国特許第６，０５４，５６１号（２００ｋＤ  ｃ−ｅｒｂＢ−２（Ｈｅｒ２）、および４０〜２００ｋＤの大きさのその他の未知の抗原）および米国特許第５，６５６，４４４号（５０ｋＤおよび５５ｋＤ、腫瘍胎児タンパク質）。臨床試験における抗体の例および／または固形腫瘍の治療に認可されている抗体の例としては、以下が挙げられる：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（抗原：１８０ｋＤ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、Ｐａｎｏｒｅｘ（抗原：４０〜５０ｋＤ、Ｅｐ−ＣＡＭ）、ＨＭＦＧ１（抗原＞２００ｋＤ、ＨＭＷ  ムチン）、Ｃ２２５（抗原：１５０ｋＤおよび１７０ｋＤ、ＥＧＦレセプター）、Ｃａｍｐａｔｈ（抗原：２１〜２８ｋＤ、ＣＤ５２）、およびＲｉｔｕｘａｎ（抗原：３５ｋＤ、ＣＤ２０）。
【０００４】
別の免疫治療のタイプは、能動免疫治療すなわちワクチン接種であり、ここで、抗原の発現を導く特定の癌またはＤＮＡ構築物において存在する抗原は、次いで、個体に免疫反応を引き起こす、すなわち、個体がそれ自体の癌に対する抗体を活発に産生するように誘導する。能動免疫は、受動免疫治療または受動免疫毒素ほど頻繁に用いられていない。
【０００５】
インテグリンα−ｖ−β−６（αｖβ６）は、癌に関連することが報告されている。例えば、以下を参照のこと：Ｊ．Ｍ．Ｂｒｅｕｓｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２２４１−２２５１（１９９５）；Ｋ．Ａｒｉｈｉｒｏら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：１９−２６（２０００）；Ｍ．Ａｇｒｅｚら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：９０−９７（１９９９）；Ｍ．Ｂｕｓｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：５７９０−５７９６（１９９２）；Ｊ．Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｄ  ２６：６３−８（１９９７）；Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：２１０１−７（１９９４）；Ｍ．Ａｇｒｅｚら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：５４７−５６（１９９４）；およびＲ．Ｂ．Ｄｉｘｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４２）：２５９７６−２５９８０（１９９６）；Ｎ．Ａｈｍｅｄら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５０（１０）：１３７１−８０（２００２）。インテグリンαｖβ６に対するいくつかのモノクローナル抗体が作製されている。例えば、米国特許第６，３１６，６０１号；Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：２１０２−７（１９９４）；Ａ．Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６９４０−６９４８（１９９４）；Ｊ．Ｍ．Ｂｒｅｕｓｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２２４１−２２５１（１９９５）；Ｋ  Ａｒｉｈｉｒｏら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ７：１９−２６（２０００）；およびＪ．Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｅｄ．２６：６３−８（１９９７）。αｖ−インテグリンに対するその他のモノクローナル抗体は、開示されている。例えば、Ｍｉｔｊａｎｓら（米国特許第５，９８５，２７８号）を参照のこと。その他のモノクローナル抗体は、β６インテグリンについて開示されている。例えば、Ｈｕａｎｇら（米国特許第６，３１６，６０１号）を参照のこと。
【０００６】
インテグリンは、細胞表面接着分子のスーパーファミリーであり、細胞外基質および他の細胞への細胞の接着を制御する。インテグリンは細胞移動、細胞増殖および細胞分化に重要な役割を有する。インテグリンは、サブユニットであるαとβの二つの１型膜貫通糖タンパク質から成るヘテロダイマーである。現在、８つの報告されたβサブユニットおよび１６のαサブユニットが存在し、２２の公知のインテグリン対に組み合わされる。これらのヘテロダイマー接着分子の各々は異なったリガンド結合プロフィールおよび異なった細胞内／細胞間のシグナル伝達機能を有する。具体的に、αｖサブユニットはβ１、β３、β５およびβ６サブユニットと結合し得る。
【０００７】
インテグリンαｖβ６に対するモノクローナル抗体は開示されているが、癌増殖阻害特性を有することが示されている抗体は、存在するとしても、ほとんど開示されていない。αｖβ６に対する抗体、好ましくは、癌増殖阻害特性を有する、より制限されたβ６サブユニットを標的にする、αｖβ６に対する抗体が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本明細書中に開示される発明は、β６インテグリンサブユニットに結合する抗体に関し、これは、種々のヒト癌において発現する。従って、１つの局面において、本発明は、β６インテグリンサブユニットに優先的に結合する抗体またはポリペプチドである（抗体であってもなくてもよい）。１つの実施形態において、この抗体またはこのポリペプチドは、標的抗原（β６インテグリンサブユニット）の変性後も免疫学的に活性であり続ける。別の実施形態において、この抗体またはこのポリペプチドは、非還元標的抗原（β６インテグリンサブユニット）に対してのみ免疫学的に活性である。
【０００９】
別の局面において、本発明は、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３であり、これは、特許受託番号ＰＴＡ−３７７５でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託される宿主細胞株により産生される。この抗体ｍＢＬＡ３は、非還元型でのみネイティブのβ６インテグリンサブユニットおよび変性のβ６インテグリンサブユニットに結合する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体またはポリペプチドである（抗体であってもなくてもよい）。いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するβ６インテグリンサブユニット上のエピトープと同じエピトープに優先的に結合する抗体またはポリペプチドである。ｍＢＬＡ３が結合するβ６インテグリンサブユニット上のエピトープは、ジスルフィド結合依存性である。
【００１１】
別の局面において、本発明は抗体ｍＢＬＡ３のフラグメントまたは領域を含む抗体である。１つの実施形態において、このフラグメントは、抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖である。別の実施形態において、このフラグメントは、抗体ｍＢＬＡ３の重鎖である。なお、別の実施形態において、このフラグメントは、抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖および／または重鎖からの１つ以上の可変領域を含む。なお別の実施形態において、このフラグメントは、抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖および／または重鎖からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００１２】
別の局面において、本発明は、以下のいずれかを包含するポリペプチドを提供する（抗体であってもなくてもよい）：ａ）抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖または重鎖からの１つ以上のＣＤＲ、ｂ）抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖からの３つのＣＤＲ、ｃ）抗体ｍＢＬＡ３の重鎖からの３つのＣＤＲ、ｄ）抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖からの３つのＣＤＲおよび重鎖からの３つのＣＤＲ、ｅ）抗体ｍＢＬＡ３の軽鎖可変領域、ｆ）抗体ｍＢＬＡ３の重鎖可変領域。
【００１３】
別の局面において、本発明は、ｍＢＬＡ３由来のヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上のＣＤＲを含む。別の局面において、本発明は、ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害するヒト化抗体を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、抗体ｍＢＬＡ３と同じエピトープに結合する。一般に、本発明のヒト化抗体は抗体ｍＢＬＡ３のＣＤＲと同じか、および／またはこれに由来する、１つ以上（１、２、３，４、５、６）のＣＤＲを含む。他の局面において、本発明は、ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害するヒト抗体を提供する。いくつかの実施形態において、ヒト抗体は、β６インテグリンサブユニット上の抗体ｍＢＬＡ３が結合するエピトープと同じエピトープに結合する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＢＬＡ３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来する可変領域ならびにヒト抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域に由来する定常領域を含むキメラ抗体である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドは、治療薬剤（例えば、放射性部分）に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドは、プロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合する。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３を産生する宿主細胞（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７５）である。
【００１７】
別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣの受託番号ＰＴＡ−３７７５の宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体ｍＢＬＡ３をコードする単離されたポリヌクレオチドである。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される抗体（抗体フラグメントを含む）のいずれかおよび任意の他のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、β６インテグリンサブユニットのエピトープに特異的な抗体に結合されるβ６インテグリンサブユニットを含む単離された複合体である。１つの実施形態において、抗体はｍＢＬＡ３である。なお別の局面において、本発明は、β６インテグリンサブユニットのエピトープに特異的な抗体に結合されるインテグリンαｖβ６を含む単離された複合体である。１つの実施形態において、抗体はｍＢＬＡ３である。
【００１９】
なお別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかに結合されるβ６インテグリンサブユニットを含む複合体である。いくつかの実施形態において、β６インテグリンサブユニットは、αｖインテグリンサブユニットに関連する。いくつかの実施形態において、β６インテグリンサブユニットは、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、食道癌細胞、甲状腺癌細胞、腎臓癌細胞または卵巣癌細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、癌細胞は、転移性である。いくつかの実施形態において、抗体は、ｍＢＬＡ３であるか、またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体ｍＢＬＡ３またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体は、治療薬剤（例えば、放射性部分）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体ｍＢＬＡ３またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体は、プロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するエピトープと同じエピトープに優先的に結合する。いくつかの実施形態において、上述の複合体は、単離される。
【００２０】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかに結合されるβ６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞の複合体である。いくつかの実施形態において、β６インテグリンサブユニットは、αｖインテグリンサブユニットに関連する。いくつかの実施形態において、β６インテグリンサブユニットは、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、食道癌細胞、甲状腺癌細胞、腎臓癌細胞または卵巣癌細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、癌細胞は、転移性である。いくつかの実施形態において、抗体は、ｍＢＬＡ３であるかまたはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体ｍＢＬＡ３またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体は、治療薬剤（例えば、放射性部分）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体ｍＢＬＡ３またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体は、プロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体ｍＢＬＡ３が優先的に結合するエピトープと同じエピトープに優先的に結合する。いくつかの実施形態において、上述の複合体は、単離される。
【００２１】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれかに結合される、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するβ６インテグリンサブユニット上のエピトープの複合体である。いくつかの実施形態において、β６インテグリンサブユニットは、αｖインテグリンサブユニットに関連する。いくつかの実施形態において、β６インテグリンサブユニットは、乳癌細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、食道癌細胞、甲状腺癌細胞、腎臓癌細胞または卵巣癌細胞上に存在する。いくつかの実施形態において、癌細胞は、転移性である。いくつかの実施形態において、抗体は、ｍＢＬＡ３であるかまたはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体ｍＢＬＡ３またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体は、治療薬剤（例えば、放射性部分）に結合する。いくつかの実施形態において、抗体ｍＢＬＡ３またはｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体は、プロドラッグを活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体ｍＢＬＡ３が優先的に結合する同じエピトープに優先的に結合する。いくつかの実施形態において、上述の複合体は、単離される。
【００２２】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド（抗体ｍＢＬＡ３のような抗体のいずれかを含む）またはポリヌクレオチドのいずれかを含有する薬学的組成物であり、この薬学的組成物は、抗体ｍＢＬＡ３、治療薬剤に結合する抗体ｍＢＬＡ３、抗体ｍＢＬＡ３のフラグメントを含む抗体、抗体ｍＢＬＡ３のヒト化抗体、抗体ｍＢＬＡ３の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、もしくは抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の特性を有するヒト抗体、または治療薬剤（例えば、放射性部分）またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合される本明細書中に記載される抗体のいずれかおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含有する。
【００２３】
なお別の局面において、本発明は、非癌細胞より癌細胞に対して高い親和性を有するモノクローナル抗体を産生する方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）インタクトなヒト胎児膀胱細胞（ＨＦＢ）により宿主哺乳動物を免疫化する工程；（ｂ）哺乳動物からリンパ球を得る工程；（ｃ）リンパ球（ｂ）と骨髄腫細胞株とを融合させ、ハイブリドーマを産生する工程；（ｄ）（ｃ）のハイブリドーマを培養して、モノクローナル抗体を産生する工程；（ｅ）抗体をスクリーニングして、癌細胞または癌細胞株に結合するが、非癌細胞もしくは非癌細胞株には結合しない、または正常細胞により低いレベルで結合するか、または異なる様式で結合する抗体のみを選択する工程。
【００２４】
別の局面において、本発明は、抗体ｍＢＬＡ３を産生する方法であり、この方法は、抗体ｍＢＬＡ３の産生を可能にする条件下で宿主細胞（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７７５）またはその子孫を培養する工程、および抗体ｍＢＬＡ３を精製する工程を包含する。他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体の産生を可能にする条件下で抗体を産生するハイブリドーマを培養することにより産生される。次いで、この抗体は、精製または単離され得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、適切な細胞において抗体（単一の軽鎖もしくは重鎖として別々に発現され得るか、または軽鎖および重鎖の双方が１つのベクターから発現される）抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを発現させることにより、本明細書中に記載される抗体（またはポリペプチド）のいずれかを産生し、その後、一般に目的の抗体またはポリペプチドを回収および／または単離する方法を、提供する。
【００２６】
別の局面において、本明細書中に記載される抗体ｍＢＬＡ３または任意のβ６インテグリンサブユニット結合部分（ポリペプチドであり、このポリペプチドとしては種々の抗体および抗体誘導体が挙げられるがそれらに限定されない）を用いて個体の細胞からβ６インテグリンサブユニットを検出することにより、本発明は、個体において癌を診断する（例えば、有無を検出または同定する）方法である。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌および卵巣癌である。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞からのβ６インテグリンサブユニットのレベル（または、いくつかの実施形態においては、存在もしくは非存在）を検出する。β６インテグリンサブユニットの存在は、β６インテグリンサブユニットとβ６インテグリンサブユニット結合部分との間の複合体を検出することにより検出される。本明細書中で使用される用語「検出」は、コントロールに言及するかもしくは言及しない、質的検出および／または量的検出レベルの（測定）を含む。
【００２７】
なお別の局面において、本発明は、個体由来の細胞から抗原β６インテグリンサブユニットを検出することにより、個体において、前立腺癌を診断する（例えば、存在もしくは非存在を検出または同定する）方法である。これらの実施形態について、任意の抗体（またはβ６インテグリンサブユニットに結合する部分）が使用され得る。１つの実施形態において、細胞からのβ６インテグリンサブユニットは、本明細書中に記載される抗体ｍＢＬＡ３または任意のβ６インテグリンサブユニット結合部分（ポリペプチドであり、このポリペプチドとしては種々の抗体および抗体誘導体が挙げられるがそれらに限定されない）により検出される。いくつかの実施形態において、前立腺癌は、転移性である。
【００２８】
なお別の局面において、本発明は、個体由来の細胞から抗原β６インテグリンサブユニットを検出することにより、個体において、転移性癌を診断する方法である。いくつかの実施形態において、転移性癌は、転移性乳癌、転移性前立腺癌、転移性腎臓癌、転移性甲状腺癌、転移性食道癌または転移性卵巣癌である。いくつかの実施形態において、抗原β６インテグリンサブユニットは、本明細書中に記載される抗体ｍＢＬＡ３または任意のβ６インテグリンサブユニット結合部分（ポリペプチドであり、このポリペプチドとしては種々の抗体および抗体誘導体が挙げられるがそれらに限定されない）により結合される抗原β６インテグリンサブユニットの複合体を検出することにより検出される。
【００２９】
別の局面において、本発明は、癌細胞の増殖を低下させるのに十分なβ６インテグリンサブユニットに結合する抗体を含有する有効量の組成物を投与することにより、癌を処理する方法である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗体ｍＢＬＡ３であるか、または本明細書中に記載される抗体（ポリペプチドを含む）もしくはポリヌクレオチドの実施形態のいずれかであり、これらの実施形態としては、治療薬剤に関連する抗体ｍＢＬＡ３、抗体ｍＢＬＡ３のフラグメントまたは領域を含む抗体、ヒト化抗体、（一般に、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上のＣＤＲを含むが、必ずしも含まなくてもよい）抗体ｍＢＬＡ３の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の特性を有するヒト抗体、治療薬剤（例えば、放射性部分）に結合される本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれか、またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合される本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれか（この抗体またはポリペプチドはプロドラッグとの併用により投与される）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌または卵巣癌である。
【００３０】
なお別の局面において、本発明は、β６インテグリンサブユニットに結合する抗体を含有する有効量の組成物を個体に投与することにより、個体において、癌細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する方法である。いくつかの実施形態において、抗体は抗体ｍＢＬＡ３であるか、または本明細書中に記載される抗体（ポリペプチドを含む）もしくはポリヌクレオチドの実施形態のいずれかであり、これらの実施例としては、治療薬剤に関連する抗体ｍＢＬＡ３、抗体ｍＢＬＡ３のフラグメントまたは領域を含む抗体、ヒト化抗体（抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上のＣＤＲを含むが、必ずしも含まなくてもよい）、抗体ｍＢＬＡ３の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の特性を有するヒト抗体、治療薬剤（例えば、放射性部分）に結合される本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれか、またはプロドラッグを活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合される本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれか（この抗体またはポリペプチドはプロドラッグとの併用により投与される）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌または卵巣癌である。
【００３１】
なお別の局面において、本発明は、癌を有する個体における転移進行を遅らせる方法であり、この方法は、β６インテグリンサブユニットに特異的に結合する有効量抗体を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、抗体は抗体ｍＢＬＡ３または本明細書中に記載される抗体（ポリペプチドを含む）もしくはポリヌクレオチドの実施形態のいずれかであり、これらの実施例としては、治療薬剤に関連する抗体ｍＢＬＡ３、抗体ｍＢＬＡ３のフラグメントまたは領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般に、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上のＣＤＲを含むが、必ずしも含まなくてもよい）、抗体ｍＢＬＡ３の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の特性を有するヒト抗体、治療薬剤（例えば、放射性分子）に結合される本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれか、またはプロドラッグを活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合される本明細書中に記載される抗体またはポリペプチドのいずれか（この抗体またはポリペプチドはプロドラッグとの併用により投与される）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌または卵巣癌である。
【００３２】
別の局面において、本発明は、有効量の抗体をまたはプロドラッグを活性抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素個体に投与することにより、治療薬剤（例えば、毒素または放射性部分）またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素を送達する方法である。この抗体は、本明細書中に記載されるβ６インテグリンサブユニットまたは任意のβ６インテグリンサブユニット結合部分（ポリペプチドであり、このポリペプチドとしては抗体または抗体誘導体が挙げられるがそれらに限定されない）に特異的に結合し、これらのβ６インテグリンサブユニット結合部分は、治療薬剤（例えば、化学治療薬剤、毒素または放射性部分）に結合する。プロドラッグ活性化酵素に結合されるβ６インテグリンサブユニット結合部分は、有効量のプロドラッグと併用して個体に投与される。β６インテグリンサブユニット結合部分としては、ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するのと同じβ６インテグリンサブユニット上のエピトープに優先的に結合する抗体、抗体ｍＢＬＡ３、抗体ｍＢＬＡ３のフラグメントもしくは領域を含む抗体、ヒト化抗体（一般に、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上のＣＤＲを含むが、必ずしも含まなくてもよい）、抗体ｍＢＬＡ３の可変領域由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域由来の定常領域を含むキメラ抗体、または抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の特性を有するヒト抗体が挙げられるがそれらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌細胞は、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、食道癌、甲状腺癌、腎臓癌または卵巣癌からの細胞である。
【００３３】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される１つ以上の組成物を含むキットを提供する。これらのキットは、一般に適した包装で適切な使用説明書と共に提供され、本明細書中に記載される方法のいずれかについて有用である。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インテグリンのβ６サブユニットに結合する抗体およびポリペプチド、ならびにインテグリンのβ６サブユニットに結合するこれらの抗体およびポリペプチドの製造方法および使用方法を提供する。β６インテグリンサブユニットは、種々のヒト癌において存在することが示されており、その発現は、種々のヒト癌において増加する。本明細書中に記載される抗体は、β６インテグリンサブユニットに結合する。本発明は、β６インテグリンサブユニットの発現に関連する種々のヒト癌の診断方法および処理方法をさらに提供する。
【００３５】
（Ｉ．一般的技術）
本発明の実施は、特に示さない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を利用し、これらは、当業者の技術の範囲内である。そのような技術は、以下のような文献において十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら、編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ、編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ、編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ、編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；および  Ｃ���ｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら、編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）。
【００３６】
（ＩＩ．定義）
「抗体」は、免疫グロブリン分子であり、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位経由で、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような特定の標的に結合可能である。本明細書中で使用されるように、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、そのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の改変された立体配置も包含する。
【００３７】
「モノクローナル抗体」とは、同質な抗体集団をいい、ここで、モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関与するアミノ酸（天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸）から成る。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原性部位に指向する。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体および全長のモノクローナル抗体のみならず、そのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要な特異性および抗原と結合する能力の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された配置も包含する。抗体の供給源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）の点で限定されることは意図されない。
【００３８】
「ヒト化」抗体とは、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有し、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子の免疫グロブリン構造を残存する分子をいう。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合される完全な可変ドメインまたは可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域に移植される相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのどちらかを含み得る。抗原結合部位は、野生型であり得るか、または１つ以上のアミノ酸置換により改変され得る；例えば、ヒト免疫グロブリンにさらにより似るように改変される。ヒト化抗体のいくつかの形は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの全ての６つのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変更された１つ以上（１、２、３、４、５、６）のＣＤＲを有し、それは、ｍＢＬＡ３からの１つ以上のＣＤＲ「に由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる。
【００３９】
「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの１つの部分が、特定の種に由来する抗体または特定のクラスに属する抗体における対応する配列と相同であり、一方、鎖の残りのセグメントが、別の抗体における対応する配列と相同である抗体をいう。代表的に、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖の双方の可変領域は、１種の哺乳動物に由来する抗体の可変領域を模倣し、一方、定常部分は、別の種の哺乳動物に由来する抗体における配列と相同である。そのようなキメラ形態に対する１つの明確な利点は、例えば、可変領域が、都合よく現在公知の供給源に由来し得、非ヒト宿主生物から容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を用いて、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせ得ることである。可変領域は、調製の容易さの利点を有し、その特異性はその供給源の影響を受けないが、ヒトである定常領域は、非ヒト供給源由来の定常領域より、抗体が注射されるときに、ヒト被験体からの免疫応答を誘発しにくい。しかし、その定義は、この特定の例に限定されない。
【００４０】
エピトープであるものに関する用語「免疫学的に活性である」、または「免疫学的に活性なままである」とは、異なる条件下で、例えば、エピトープが、還元されているおよび変性している条件に供された後に、エピトープと結合する抗体（例えば、ｍＢＬＡ３）の能力をいう。
【００４１】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書中で同義的に使用される）エピトープは、当業者に周知の用語であり、そのような特異的な結合または優先的な結合を決定する方法はまた、当業者に周知である。分子は、代替の細胞または物質よりも特定の細胞または物質に、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間および／またはより高い親和性で、反応するかまたは結合する場合に、「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すと言われている。抗体は、他の物質と結合するよりも、より高い親和性および結合活性で、より迅速に、および／またはより長い持続時間で結合する場合に、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、β６インテグリンサブユニットエピトープと特異的にまたは優先的に結合する抗体は、他のβ６インテグリンサブユニットエピトープまたは非β６インテグリンサブユニットエピトープと結合するよりも、より高い親和性および結合活性で、より迅速に、および／またはより長い持続時間で、このβ６インテグリンサブユニットエピトープと結合する抗体である。この定義を読むことにより、例えば、第一の標的と特異的にまたは優先的に結合する抗体（部分またはエピトープ）が、第二の標的と、特異的にまたは優先的に結合してもしなくてもよいこともまた理解される。このように、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、排他的な結合を（含み得るが）必ずしも要しない。一般に、結合への言及は、優先的な結合を意味するが、必ずしも意味する必要はない。
【００４２】
本明細書中で使用されるように、用語「ｍＢＬＡ３」、「抗体ｍＢＬＡ３」および「モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３」とは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７７５の宿主細胞またはその子孫により産生された免疫グロブリンをいうために、同義的に使用される。ｍＢＬＡ３の作成および特徴づけは、実施例に記載される。異なる生物学的機能は、ｍＢＬＡ３に関連し、これらの機能としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：β６インテグリンサブユニットと結合する能力；ネイティブのβ６インテグリンサブユニットまたは変性したβ６インテグリンサブユニットと結合する能力；β６インテグリンサブユニットエピトープと結合する能力（ジスルフィド結合依存性である）；大腸癌細胞のようなβ６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞の増殖を阻害する能力；β６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞を有する個体において転移の進行を遅らせる能力；毒素、放射性化合物もしくは放射性部分のような治療薬剤、またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素をβ６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞に送達する能力。本明細書中で考察されるように、本発明のポリペプチド（抗体を含む）は、これらの特性のうちのどれか１つ以上を有し得る。
【００４３】
「ｍＢＬＡ３等価抗体」または「ｍＢＬＡ３等価ポリペプチド」とは、例えば、結合特異性のような、ｍＢＬＡ３に関連する１つ以上の生物学的機能を有する抗体またはポリペプチドをいう。
【００４４】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」とは、本明細書中で同義的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直線状または分枝状であり得、改変アミノ酸を含み得、非アミノ酸により中断され得る。この用語は、天然にまたは介入により改変されているアミノ酸ポリマーも包含する。（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または、標識成分との結合のような任意の他の操作または改変）。また、この定義内に包含されるものの例としては、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上のアナログを含むポリペプチド、および当業者に公知の他の改変が挙げられる。本発明のポリペプチドは、抗体に基づくため、このポリペプチドは、単鎖または結合鎖として存在し得ることが理解される。
【００４５】
抗体の「可変領域」とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域のどちらか１つまたは組み合わせをいう。
【００４６】
抗体の「定常領域」とは、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域のどちらか１つまたは組み合わせをいう。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋」とは、物質が、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染されていない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、より好ましくは少なくとも９８％純粋、より好ましくは少なくとも９９％純粋、またはそれ以上の純粋なことをいう。
【００４８】
「宿主細胞」としては、ポリヌクレオチド挿入物の取り込みのためのベクターのレシピエントであり得るかまたはそのレシピエントである、個々の細胞または細胞培養が挙げられる。宿主細胞としては、単一の宿主細胞の子孫が挙げられ、その子孫は、天然の変異、偶然の変異、または故意の変異に起因して、元の親細胞と（形態またはゲノムＤＮＡ補体において）必ずしも完全に同一とは限らない。宿主細胞としては、本発明のポリヌクレオチドによりインビボでトランスフェクトされた細胞が挙げられる。
【００４９】
抗体、薬物、または薬学的組成物の「有効量」は、以下のような臨床結果を含む有益な結果または所望の結果をもたらすのに十分な量である；腫瘍の大きさの縮小（癌（例えば、乳癌または前立腺癌）の状況）、癌細胞の増殖阻止、疾患に起因する１つ以上の症状の軽減、疾患を患っている人々の生活の質の向上、疾患を処置するために必要な他の医薬品の用量の減少、標的化などによる別の医薬品の効果の亢進、疾患の進行の遅延、および／または個体の生存の延長。有効量は、１回以上の投与において投与され得る。本発明の目的のために、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、直接的かまたは間接的に、癌細胞の増殖を減少させる（または、癌細胞を破壊する）のに十分な量、ならびに癌細胞の転移の進行または増殖を、減少および／または遅延させるのに十分な量である。癌の臨床状況において理解される場合、薬物、化合物、または薬学的組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と組み合わせて達成されても達成されなくてもよい。このように、「有効量」は、１つ以上の治療薬剤を投与する状況において考えられ得、単一薬剤は、１つ以上の他の薬物と組み合わせて、所望の結果が達成され得るかまたは達成される場合に、有効量で投与されるとみなされ得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「と組み合わせて」とは、別の処置様式に加える１つの処置様式の投与をいい、例としては、同じ個体にへの、プロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に連結されるβ６インテグリンサブユニット結合部分の投与に加えた、プロドラッグの個体への投与が挙げられる。このような場合、「と組み合わせて」とは、個体への、他の処置様式の投与前、投与中または投与後の、１つの処置様式の投与をいう。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「処置」または「処置する」とは、好ましくは臨床結果を含む、有益な結果または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、それらに限定されない：癌細胞の増殖の減少（または、癌細胞の破壊）、癌において見出された癌細胞の転移の減少、腫瘍の大きさの縮小、疾患に起因する症状の軽減、疾患を患っている人々の生活の質の向上、疾患を処置するために必要な他の医薬品の用量の減少、疾患の進行の遅延、および／または個体の生存の延長。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「転移の進行を遅延させること」は、転移の進行を、延期させること、阻止すること、遅らせること（ｓｌｏｗ）、遅延させること（ｒｅｔａｒｄ）、安定させること、および／または延期することを意味する。この遅延は、処置されている癌および／または個体の病歴に応じて、時間の長さが変わり得る。当業者に明らかであるように、十分な遅延または有意な遅延は、実際において、個体において転移が発生しないための予防を含み得る。
【００５３】
「生物学的サンプル」は、個体から得られる種々のサンプル型を包含し、診断的アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて使用され得る。この定義は、生物学的供給源の血液および他の液体サンプル、生検標本もしくは組織培養物またはそれ由来の細胞およびその子孫のような固形組織サンプルを包む。また、この定義は、獲得後に任意の方法で操作されたサンプルを含み、その任意の方法の例としては、試薬による処理、タンパク質もしくはポリヌクレオチドのような特定成分の可溶化もしくは富化、または薄切目的のための半固形マトリックスもしくは固形マトリックスへの包理が挙げられる。用語「生物学的サンプル」は、臨床サンプルを含み、そして、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体、および細胞サンプルを含む。
【００５４】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜、スポーツ動物、ペット（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長動物、マウスおよびラットが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５５】
「毒素」または「細胞毒素」とは、細胞内部に有害な応答をもたらす任意の物質をいう。例えば、癌細胞に関する毒素は、癌細胞に対する有害（ａｄｖｅｒｓｅ）な作用、ときに悪影響（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｅｆｆｅｃｔ）、を有し得る。毒素の例としては、ラジオアイソトープ、カリケアミシン、およびメイタンシノイドが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「因子（ａｇｅｎｔ）」とは、生物学的化合物、薬学的化合物、または化学的化合物をいう。非限定的な例としては、単純な有機分子、単純な無機分子、錯体有機分子もしくは錯体無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントが挙げられる。種々の化合物が、合成され得、例としては、低分子およびオリゴマー（例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチド）、ならびに種々のコア構造に基づく合成有機化合物が挙げられる。さらに、種々の天然供給源は、植物抽出物または動物抽出物などのようなスクリーニング用の化合物を提供し得る。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「治療薬剤」は、治療（本明細書では、一般に、癌の状況において）に有用な任意の薬物を意味し、それらとしては、抗腫瘍薬物、毒素または細胞毒素、細胞毒素薬剤、および放射性薬剤が挙げられる。
【００５８】
用語「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してより細胞毒素が少なく、酵素的に活性であるかまたはより活性な型に変換されることが可能な、薬学的に活性な物質の、前駆体または誘導体をいう。
【００５９】
「活性な免疫応答」とは、宿主哺乳動物への静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、またはアジュバントを用いるかもしくは用いない他の投与様式による、抗原またはその抗原をコードするＤＮＡベクターの投与に応答して、抗原に対して指向されたインビボでの抗体の、発生および進行中の産生をいう。活性な免疫応答はまた、細胞性免疫応答のような、免疫応答の他の局面も含み得る。
【００６０】
（ＩＩＩ．組成物および組成物を作製する方法）
本発明は、抗体（ｍＢＬＡ３、およびｍＢＬＡ３等価抗体またはｍＢＬＡ３等価ポリペプチド（ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体を含むか、または、いくつかの実施形態において、この抗体は、ｍＢＬＡ３が優先的に結合する際に、β６インテグリンサブユニット上の同一のエピトープと結合する）を含む）を包含する。本発明はさらに、組成物を包含し、それらとしてはβ６インテグリンサブユニットに結合する、本明細書中に記載される抗体、ポリペプチドおよびタンパク質を含有する薬学的組成物、ならびにβ６インテグリンサブユニットに結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含有する薬学的組成物が挙げられる。本明細書中で使用される場合、組成物は、β６インテグリンサブユニットに結合する１つ以上の抗体、ポリペプチドおよび／もしくはタンパク質、ならびに／またはβ６インテグリンサブユニットに結合する１つ以上の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、当業者に周知の緩衝液を含む薬学的に受容可能な賦形剤のような適切な賦形剤を含有し得る。
【００６１】
本発明の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、さらに、任意の（１つ以上の）以下の判定基準により識別され、特徴づけられる：（ａ）β６インテグリンサブユニットと結合する能力；（ｂ）ｍＢＬＡ３とβ６インテグリンサブユニットとの優先的な結合を競合阻害する能力であって、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するβ６インテグリンサブユニットエピトープに優先的に結合する能力を含み、この結合は、抗原の変性と関係があるか、または関係がない、ジスルフィド結合である；（ｃ）乳癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、食道癌細胞、甲状腺癌細胞または腎臓癌細胞のような、癌細胞上のβ６インテグリンサブユニットに結合する能力；（ｄ）大腸癌細胞のような、β６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する能力；（ｅ）β６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞を有する個体における転移の進行を遅らせる能力；（ｆ）毒素もしくは放射性部分のような治療薬剤、またはプロドラッグをβ６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞に対して活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素を送達する能力。
【００６２】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７７５を有する宿主細胞またはその子孫により産生される抗体ｍＢＬＡ３である。本発明はまた、ｍＢＬＡ３およびｍＢＬＡ３等価抗体またはポリペプチドフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含有する融合タンパク質、ヒト化抗体の種々の形成、ならびに必要な特異性の認識部位である抗原（β６インテグリンサブユニット）を含むｍＢＬＡ３の他の任意の改変された配置を包含する。本発明はまた、１つ以上のｍＢＬＡ３の生物学的特性を示すヒト抗体を提供する。ｍＢＬＡ３の等価抗体（ヒト化抗体およびヒト抗体を含む）、ｍＢＬＡ３のポリペプチドフラグメント、およびこれらの任意のフラグメントを含むポリペプチドは、上述の６つの判定基準のうちのいずれか（１つ以上）により確認され、特徴づけられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明のβ６インテグリンサブユニットに結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、β６インテグリンサブユニットとのｍＢＬＡ３の優先的結合を競合的に阻害する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質である。いくつかの実施形態において、抗体、ポリペプチドおよびタンパク質は、抗体ｍＢＬＡ３が優先的に結合する際に、β６インテグリンサブユニット上の同一のエピトープに優先的に結合する。
【００６４】
従って、本発明は、以下のいずれか（または、以下のいずれかを含有する薬学的組成物を含む組成物）を提供する：（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７７５を有する宿主細胞またはその子孫により産生される抗体ｍＢＬＡ３；（ｂ）抗体ｍＢＬＡ３のヒト化形態；（ｃ）抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の軽鎖および／または重鎖の可変領域を含む抗体；（ｄ）抗体ｍＢＬＡ３の重鎖および軽鎖の可変領域に相同な可変領域またはそれに由来する可変領域、ならびにヒト抗体の重鎖および軽鎖の定常領域に相同な定常領域またはそれに由来する定常領域を含むキメラ抗体；（ｅ）ｍＢＬＡ３の１つ以上（少なくとも、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲを含む抗体；（ｆ）ｍＢＬＡ３の重鎖および／または軽鎖を含む抗体；（ｇ）ｍＢＬＡ３と等価であるヒト抗体。この抗体のヒト化型は、ｍＢＬＡ３、すなわちＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７７５を有する宿主細胞により産生される抗体と同一なＣＤＲを有してもよく、または有さなくてもよい。ＣＤＲ領域の決定は、当業者に周知である。いくつかの実施形態において、本発明は、ｍＢＬＡ３、すなわちＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７７５を有する宿主細胞により産生される抗体の、少なくとも１つのＣＤＲ、少なくとも２つのＣＤＲ、少なくとも３つのＣＤＲ、少なくとも４つのＣＤＲ、もしくは少なくとも５つのＣＤＲに実質的に相同である（または、いくつかの実施形態において、ｍＢＬＡ３の６つ全てのＣＤＲに実質的に相同であるかもしくはｍＢＬＡ３に由来する）、少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体を提供する。他の実施形態は、ｍＢＬＡ３の、またはｍＢＬＡ３に由来する、少なくとも２つのＣＤＲ、少なくとも３つのＣＤＲ、少なくとも４つのＣＤＲ、少なくとも５つのＣＤＲ、または少なくとも６つのＣＤＲに実質的に相同である、少なくとも２つのＣＤＲ、少なくとも３つのＣＤＲ、少なくとも４つのＣＤＲ、少なくとも５つのＣＤＲ、もしくは少なくとも６つのＣＤＲを有する抗体、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７７５を有する宿主細胞により産生される抗体を包含する。本発明の目的のために、活性の程度はｍＢＬＡ３と比べて変動し得る（より大きくてもよくまたはより小さくてもよい）が、結合特異性および／または総合的な活性（癌細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／もしくは増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の減少、癌細胞におけるアポトーシス細胞死の誘発、転移の進行の遅延、ならびに／または緩和的な処理に関してであり得る）は、一般に保持されることが理解される。本発明はまた、これらの抗体のいずれかを作製する方法を提供する。抗体を作製する方法は、当業者に公知であり、本明細書中に記載される。
【００６５】
本発明はまた、本発明の抗体（例えばｍＢＬＡ３）のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、抗体ｍＢＬＡ３の１つ以上の軽鎖および／または重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ｍＢＬＡ３の１つ以上の軽鎖および／または重鎖のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ｍＢＬＡ３の軽鎖および／または重鎖の３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、以下のいくつかを有するｍＢＬＡ３のアミノ酸配列を含む：ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも５個連続するアミノ酸、ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも８個連続するアミノ酸、ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも約１０個連続するアミノ酸、ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも約１５個連続するアミノ酸、ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも約２０個連続するアミノ酸、ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも約２５個連続するアミノ酸、ｍＢＬＡ３の配列の少なくとも約３０個連続するアミノ酸、ここで、このアミノ酸のうち少なくとも３つは、ｍＢＬＡ３の可変領域に由来する。１つの実施形態において、可変領域は、ｍＢＬＡ３の軽鎖に由来する。別の実施形態において、可変領域は、ｍＢＬＡ３の重鎖に由来する。別の実施形態において、５個（またはそれ以上）連続するアミノ酸は、ｍＢＬＡ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する。
【００６６】
抗体は、ポリクローナル（例えば、同質ではない）またはモノクローナルであり得る。モノクローナル抗体を作製する方法は、当業者に公知である。採用され得る１つの方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７（１９７５））またはその改変方法である。一般に、マウスまたはラットは、免疫化に使用されるが、他の動物も、使用され得る。免疫原は、初代細胞、培養細胞株、癌細胞、核酸、組織またはペプチドであり得るが、それらに限定されない。１つの実施形態において、ヒト胎児膀胱細胞が、使用される。ヒト胎児膀胱細胞を単離および培養する方法は、実施例１に詳述されている。例えば、ヒト胎児膀胱細胞のような、免疫原として使用される細胞は、その免疫原としての使用の前の期間（少なくとも２４時間）、培養され得る。細胞（例えば、ヒト胎児膀胱細胞）は、それ自体で、または、Ｒｉｂｉのような非変性化アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用され得る。一般に、細胞（例えば、ヒト胎児膀胱細胞）は、免疫原として使用される場合、インタクトなままであるべきであり、好ましくは、生存可能なままであるべきである。インタクトな細胞は、免疫化した動物によって、破裂細胞より抗原をより良く検出可能にし得る。変性化アジュバントまたはＦｒｅｕｄのアジュバントなどの粗い（ｈａｒｓｈ）アジュバントの使用は、ヒト胎児膀胱細胞を破裂させ得ることにより、弱める。免疫原は、隔週または毎週のような定期的間隔で多回投与され得るか、または動物の（例えば、組織組換えにおいて）生存度を維持するような方法で投与され得る。実施例２は、ｍＢＬＡ３を作成するために使用される方法を記載し、β６インテグリンサブユニットに結合する他のモノクローナル抗体を作製するために使用され得る。
【００６７】
１つの実施形態において、β６インテグリンサブユニットに結合するモノクローナル抗体は、β６インテグリンサブユニットを発現または過剰発現する宿主細胞または免疫原として癌細胞を発現するβ６インテグリンサブユニットを用いることによって得られる。別の実施形態において、全長β６インテグリンサブユニットまたはβ６インテグリンサブユニットの任意のフラグメントは、免疫原として使用される。
【００６８】
抗体応答をモニタリングするために、小さな生物学的サンプル（例えば、血液）は、動物から入手し得、免疫原に対する抗体力価を試験され得る。脾臓および／またはいくつかの大リンパ節は、除去され得、単一細胞内に解離され得る。所望の場合、脾臓細胞は、抗原で十分にコーティングされたプレートまたはウェルに、細胞懸濁液を適用することにより（非特異的接着細胞の除去後に）スクリーニングされ得る。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、プレートに結合し、他の懸濁液で洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞または全ての解離された脾臓細胞は、骨髄腫細胞と融合され得る（例えば、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからのもの）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、脾臓またはリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマを形成するために使用され得る。ハイブリドーマは、次いで、選択培地（例えば、ヒポキサンチン培地、アミノプテリン培地、チミジン培地、さもなければ「ＨＡＴ培地」として公知の培地）において培養される。得られたハイブリドーマは、次いで、限界希釈によりプレートされ、ＦＡＣＳまたは免疫組織化学（ＩＨＣスクリーニング）を用いて、免疫原（例えば、ＨＦＢ細胞の表面、癌細胞株の表面、胎児膀胱切片など）に特異的に結合する抗体の作製についてアッセイされる。選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、次いで、インビトロ（例えば、組織培養ボトルまたはホローファイバーリアクターにおいて）またはインビボ（例えば、マウスの腹水において）のどちらかで培養される。実施例は、抗体ｍＢＬＡ３を得るために利用される方法およびスクリーニングするために利用される方法についてのさらなる詳細を提供する。ハイブリドーマを抗体ｍＢＬＡ３を生成する条件下で培養する方法およびその抗体を精製する方法は、当該分野で公知であり、実施例２および実施例３にさらに詳述されている。
【００６９】
上述のモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、抗体ｍＢＬＡ３が優先的に結合するβ６インテグリンサブユニットにおける同じエピトープに優先的に結合する抗体を作製するために選択され得る。そのような抗体を選択する方法は、当該分野で公知である。例えば、結合競合アッセイは、抗体がｍＢＬＡ３と同じエピトープに結合するかどうか決定するために使用され得る。β６インテグリンサブユニットへの結合についての、抗体のｍＢＬＡ３との競合は、抗体が、ｍＢＬＡ３が結合するエピトープに優先的に結合することを示唆する。結合競合アッセイは、当該分野で周知であり、１つの方法が、実施例７に詳述されている。抗体が、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するエピトープに優先的に結合することの別の示唆は、抗体が、ネイティブのβ６インテグリンサブユニットおよび変性のβ６インテグリンサブユニットの両方に結合し、その抗体が結合するエピトープが、ジスルフィド結合依存性であることである。また、抗体ｍＢＬＡ３が優先的に結合するβ６インテグリンサブユニットにおけるエピトープに優先的に結合するポリペプチドは、同様の方法を用いて試験および同定され得る。
【００７０】
細胞融合技術に代わる別の技術として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞は、本発明の対象のモノクローナル抗体を作製するために使用され得る。ハイブリドーマは、必要に応じて、増殖およびサブクローン化され、上清は、抗免疫原活性について従来のアッセイ手順により（例えば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなど）アッセイされる。
【００７１】
別の代替技術において、抗体は、組換え的に作製され得る。組換え抗体を作製する方法は、当該分野で周知である。モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３および他の同様の抗体は、配列決定され得、インビトロで組換え的に作製され得る。１つの実施形態において、ｍＢＬＡ３は、配列決定され、次いで、ポリヌクレオチド配列は、発現または伝播のためにベクター内にクローン化される。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター内に維持され得、次いで、宿主細胞は、その後の使用目的のために、増殖および凍結され得る。別の代替技術において、抗体は、ファージディスプレイ技術により、組換え的に作製され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；同第６，２６５，１５０号；およびＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３〜４５５を参照のこと。
【００７２】
抗体ｍＢＬＡ３または他の任意の目的の抗体もしくはタンパク質は、当業者に周知のＥｄｍａｎ分解による配列決定に供され得る。質量分析またはＥｄｍａｎ分解から得られたペプチド情報は、目的のタンパク質をクローン化するために使用されるプローブまたはプライマーを設計するために使用され得る。
【００７３】
目的のタンパク質をクローン化する代替方法は、目的の抗体またはタンパク質を発現する細胞に対してβ６インテグリンサブユニットを用いる「パニング」による。この「パニング」手順は、目的の抗体またはタンパク質を発現する組織または細胞からｃＤＮＡライブラリを得、第２細胞型においてｃＤＮＡを過剰発現させ、β６インテグリンサブユニットへの特異的結合についてその第２細胞型のトランスフェクトされた細胞をスクリーニングすることにより、実施される。「パニング」により細胞表面タンパク質についてコードする哺乳動物遺伝子のクローニングにおいて使用される方法の詳細は、当該分野で見い出され得る。例えば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、８５７３〜８５７７（１９８７）ならびにＳｔｅｐｈａｎ，Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１〜５８５４（１９９９）を参照のこと。
【００７４】
ｃＤＮＡは、当該分野における標準方法に従って、特定の細胞型からｍＲＮＡを逆転写することにより得られ得る。具体的には、ｍＲＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上述）に記載の手順に従って種々の溶菌酵素もしくは化学溶液を用いて単離され得、または、製造者（例えば、Ｑｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により提供される付随的指示に従って市販の核酸結合樹脂により抽出され得る。次いで、合成されたｃＤＮＡは、発現ベクター内に導入され、第２型の細胞において目的の抗体またはタンパク質が産生される。発現ベクターが、エピソームまたは染色体ＤＮＡの組み込まれた部分のどちらかとして、宿主細胞において複製可能でなければならないことが暗示される。適切な発現ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミドが挙げられるが、それらに限定されない。
【００７５】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは他の物質を利用するトランスフェクション、微粒子銃、リポフェクション、および感染（例えば、そこで、ベクターは、ワクシニアウイルスのような感染因子である）を含む、多数の適切な手段のいずれかにより宿主細胞内に導入され得る。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、しばしば宿主細胞の特徴に依存する。
【００７６】
異種ＤＮＡを過剰発現できる任意の宿主細胞は、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために、使用され得る。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、存在するならば、宿主細胞における対応する内因性の目的の抗体またはタンパク質より、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルで、ｃＤＮＡを発現する。β６インテグリンサブユニットとの特異的結合についての宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳにより実施される。目的の抗体またはタンパク質が過剰発現される細胞は、同定され得る。
【００７７】
本発明は、ｍＢＬＡ３のような本発明の抗体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の手順により作製され得る。このポリペプチドは、抗体のタンパク分解性分解もしくは他の分解、上述のような組換え方法（すなわち、単一ポリペプチドもしくは融合ポリペプチド）、または化学合成により、作製され得る。抗体のポリペプチド、特に、アミノ酸が約５０個までのより短いポリペプチドは、化学合成により都合よく作製される。化学合成の方法は、当該分野で公知であり、市販されている。例えば、ｍＢＬＡ３ポリペプチドは、固相方法を利用する自動ポリペプチドシンセサイザーにより作製され得る。
【００７８】
また、本発明は、ｍＢＬＡ３のような、本発明の抗体の単鎖可変領域フラグメント（「ｓｃＦｖ」）を含む。単鎖可変領域フラグメントは、短結合ペプチドを用いて、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を結合することにより、作製される（Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６）。結合ペプチドの一例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１）であり、これは、１つの可変領域のカルボキシ末端と他の可変領域のアミノ末端との間の約３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーは、設計され、使用されている（Ｂｉｒｄら（１９８８））。また、リンカーは、薬物の付着または固体支持体への付着のような、付加的機能のために改変され得る。単鎖改変体は、組換え的にまたは合成的に、作製され得る。ｓｃＦｖの合成生成のために、自動シンセサイザーが、使用され得る。ｓｃＦｖの組換え作製のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドは、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物のような真核生物の細胞、またはＥ．ｃｏｌｉのような原核生物の細胞のどちらかの、適切な宿主細胞内に導入され得る。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの結紮のような、慣習的な操作により作製され得る。得られたｓｃＦｖは、当該分野で公知の標準のタンパク質精製技術を用いて、単離され得る。
【００７９】
本発明は、抗体ｍＢＬＡ３のような抗体に対する改変を含み、この抗体は、特性に有意に影響しないｍＢＬＡ３の機能的に等価な抗体およびポリペプチド、および増大した活性または減少した活性を有する改変体に有意な影響を及ぼさないを含む。ポリペプチドの改変は、当該分野における慣用的な実施であり、本明細書中で詳細に記載される必要はない。改変ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、有意に有害に機能活性を変えないアミノ酸の１つ以上の欠失もしくは付加を有するポリペプチド、または化学的アナログの使用を有するポリペプチドが挙げられる。別の１つのアミノ酸残基に保存的に置換され得るアミノ酸残基としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／スレオニン；リシン／アルギニン；およびフェニルアラニン／トライシン（ｔｒｙｏｓｉｎｅ）。また、これらのポリペプチドとしては、グリコシル化ポリペプチドおよび非グリコシル化ポリペプチド、ならびに、例えば、異なる糖によるグリコシル化、アセチル化およびリン酸化のような、他の翻訳後改変を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は、保存的であり、すなわち、置換されたアミノ酸は、元のアミノ酸と同様の化学特性を所有する。そのような保存的置換は、当該分野で公知であり、実施例は、上記に提供されている。アミノ酸改変は、１つ以上のアミノ酸を変更または改変することから、可変領域のような領域の完全な再設計まで及び得る。可変領域の変更は、結合親和性および／または結合特異性を変え得る。改変の他の方法は、当該分野で公知の結合技術の使用を含み、その例としては、酵素的手段、酸化的置換およびキレート化が挙げられるが、それらに限定されない。改変は、例えば、ラジオイムノアッセイ用の放射性部分の付着のような、イムノアッセイ用の標識の付着のために、使用され得る。改変されたｍＢＬＡ３ポリペプチドは、当該分野において確立された手順を用いて作製され、当該分野で公知の標準アッセイを用いてスクリーニングされ得、そのいくつかは下記および実施例に記載される。
【００８０】
また、本発明は、ｍＢＬＡ３のような、本発明の抗体からの１つ以上のフラグメントまたは領域を含む融合タンパク質を包含する。１つの実施形態において、可変軽鎖領域の少なくとも１０個連続するアミノ酸および可変重鎖領域の少なくとも１０個連続するアミノ酸を含む融合タンパク質が、提供される。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、異種性免疫グロブリン定常領域を含む。別の実施形態において、融合ポリペプチドは、ｍＢＬＡ３の、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む。本発明の目的のために、ｍＢＬＡ３融合タンパク質は、１つ以上のｍＢＬＡ３ポリペプチドおよび、例えば、異種配列または別の領域からの相同配列が天然の分子において付着されない別のアミノ酸配列を含む。ｍＢＬＡ３ポリペプチドは、例えば、合成的にまたは組換え的に、当業者に公知の方法により作製され得る。
【００８１】
別の実施形態において、重鎖および／または軽鎖が融合タンパク質であるｍＢＬＡ３キメラが、提供される。いくつかの実施形態において、鎖の定常ドメインは、特定の種および／またはクラスからのものであり、可変領域は、異なる種および／またはクラスからのものである。例えば、キメラ抗体（いくつかの実施形態における）は、定常領域がヒト供給源に由来し、可変領域がｍＢＬＡ３に相同または由来する（すなわち、ネズミ）のものである。また、（いくつかの実施形態において）ＣＤＲ領域がｍＢＬＡ３アミノ酸配列を含む一方で、フレームワーク領域がヒト配列に由来する、ヒト化可変領域を有する抗体は、本発明の範囲内で体化される。ヒト化抗体の他の形態は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載される。キメラの機能的フラグメントも、体化される。一例は、ヒト化Ｆａｂフラグメントであり、これは、ヒトヒンジ領域、ヒト第一定常領域、ヒトκ軽鎖定常領域またはヒトκ重鎖定常領域、ならびにｍＢＬＡ３からの軽鎖および／または重鎖の可変領域を含む。次いで、ヒト化ｍＢＬＡ３Ｆａｂフラグメントが、Ｆａｂダイマーを形成するために作製され得る。代表的に、本発明のｍＢＬＡ３融合タンパク質およびｍＢＬＡ３キメラは、本明細書中に記載される組換え方法を用いてそれらをコードする発現するポリヌクレオチドを調製することにより作製されるが、当業者に公知の他の手段でも調製され得、その例として、化学合成が挙げられる。例えば、米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第６，３３１，４１５号を参照のこと。
【００８２】
また、本発明は、ヒト化抗体を包含する。ｍＢＬＡ３または他の等価の抗体のような抗体のポリヌクレオチド配列は、「ヒト化」抗体を作製するための遺伝子操作、または抗体の親和性もしくは他の特性を向上させるための遺伝子操作のために、使用され得る。抗体のヒト化における一般的原則には、抗体の抗原結合部分の基本配列を保持する一方で、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換することが含まれる。これらは、モノクローナル抗体をヒト化する４つの一般的工程である。これらは、以下のとおりである：（１）開始抗体軽可変ドメインおよび開始抗体重可変ドメインのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列を決定すること、（２）ヒト化抗体を設計すること、すなわち、ヒト化プロセス中にどの抗体フレームワーク領域を使用するか決定すること、（３）実際のヒト化方法論／ヒト化技術、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および処置で使用される場合に、免疫応答を避けるために、ヒト定常領域により似せるよう設計され得る。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照のこと。
【００８３】
非ヒト免疫グロブリン由来の抗原結合部位を含む多くの「ヒト化」抗体分子が記載されており、例としては、げっ歯類Ｖ領域または改変されたげっ歯類Ｖ領域、およびヒト定常領域に融合される関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体が挙げられる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９（１９９１）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４２２０〜４２２４（１９８９），Ｓｈａｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４〜４５３８（１９８７）、およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：３５７７〜３５８３（１９８７）を参照のこと。他の引用文献は、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合前に、ヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に移植されたげっ歯類ＣＤＲを記載する。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２〜５２５（１９８６）を参照のこと。別の引用文献は、組換え的に張られたげっ歯類フレームワーク領域により支持されるげっ歯類ＣＤＲを記載する。例えば、ヨーロッパ特許公報第５１９，５９６号を参照のこと。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるそれらの部分の治療的適用の持続時間および有効性を限定するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望まれない免疫応答を、最小限にするよう設計されている。利用され得る抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：２４７１〜２４７６（１９９１）により、ならびに米国特許第６，１８０，３７７号；同第６，０５４，２９７号；同第５，９９７，８６７号；同第５，８６６，６９２号；同第６，２１０，６７１号；同第６，３５０，８６１号；およびＰＣＴ  ＷＯ０１／２７１６０において、開示される。
【００８４】
なお別の代替において、完全ヒト抗体は、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように設計されている市販で入手可能なマウスを使用することにより、得られ得る。より望ましい免疫応答（例えば、完全ヒト抗体）またはより強い免疫応答を生じるように設計されているトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体の作製のために使用され得る。そのような技術の例としては、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）からのＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  ＭｏｕｓｅＴＭが挙げられる。
【００８５】
また、本発明は、放射性部分、毒素（例えば、カリケアミシン）もしくは化学療法分子のような治療薬剤、またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素、あるいはリポソームもしくは化学療法化合物を含む他のベシクル（または、これらの抗体またはポリペプチドを含有する組成物）に、結合される（例えば、連結される）、ｍＢＬＡ３、またはｍＢＬＡ３に等価な抗体もしくはポリペプチドを、提供する。この組成物は、個体に投与されるときに、これらの薬物を、抗体またはポリペプチドにより認識されるβ６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞に対する標的化し得、次いで、例えば、癌細胞を除去し得（癌細胞の数を減らし得）、そして／または癌細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および／もしくは増殖（ｇｒｏｗｔｈ）を抑制し得る。簡単にするために、これらの方法が、本明細書中に記載されるβ６インテグリンサブユニット結合実施形態のいずれかに適用されるという理解の下で、参照は、一般に、ｍＢＬＡ３または抗体に対してなされる。一般に、これらの結合とは、本明細書中に記載されるような、これらの化合物の連結をいう。この連結（一般に、少なくとも、投与のために近接した集合を成すこれらの化合物を固定している）は、後述のとおり、多数の方法で、達成され得る。
【００８６】
本発明の放射性部分または放射性分子は、癌細胞を破壊する際に有効な任意のラジオアイソトープを含む。この例としては、コバルト６０およびＸ線が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、ラジオアイソトープの混合物を代表的に示す、ウラニウム、ラジウムおよびトリウムのような、天然に存在する放射性元素は、放射性部分の適切な例である。
【００８７】
本発明の毒素としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシン、ならびにその類似体または相同体が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８８】
本発明の抗体またはポリペプチドは、放射性部分もしくは放射性分子、毒素、他の治療薬剤、またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、あるいはリポソーム、または治療薬剤を共有結合的にまたは非共有結合的に、直接的にまたは間接的に、含む他のベシクルに、結合（連結）され得る。この抗体は、抗体がその標的β６インテグリンサブユニットに結合する限り、放射性分子、毒素、治療分子、またはプロドラッグ活性化酵素に、抗体に沿った任意の位置で連結され得る。
【００８９】
毒素または治療薬剤は、適切なモノクローナル抗体に、直接的にまたは間接的に、結合され得る（例えば、共有結合的に結合され得る）（例えば、リンカー基を介して、または、二者択一的に、米国特許第５，５５２，３９１号に記載されているプラットフォーム分子のような、適切な結合部位を有する連結している分子を介して）。本発明の毒素および治療薬剤は、当該分野において公知の方法を用いて、特定の標的化タンパク質に直接的に結合され得る。例えば、薬物と抗体との間の直接反応は、他の置換基と反応できる置換基をそれぞれが所有するときに可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基のような求核基は、無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と反応し得る一方で、良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【００９０】
抗体またはポリペプチドはまた、マイクロキャリア経由で、治療薬剤に連結され得る。マイクロキャリアとは、水に不溶な、大きさが、約１５０μｍ未満、約１２０μｍ未満または約１００μｍ未満の、より一般には約５０〜６０μｍ未満の、好ましくは約１０μｍ未満、約５μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満または約１．５μｍ未満の、生分解性粒子または非生分解性粒子をいう。マイクロキャリアは、大きさが、約１μｍ未満の、好ましくは約５００ｎｍ未満の、マイクロキャリアである、「ナノキャリア（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）」を含む。そのような粒子は、当該分野において公知である。固相マイクロキャリアは、生体適合性天然発生ポリマー、合成ポリマーまたは合成コポリマーから形成される粒子であり得、当該分野において公知の他の生分解性物質と同様に、アガロースまたは架橋アガロースから形成されるマイクロキャリアを含んでも良いし除外しても良い。生分解性固相マイクロキャリアは、哺乳動物の生理学的条件下で、分解性（例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、およびそのコポリマー）または腐食性（例えば、ポリ（３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）のようなオルトエステル）もしくはセバシン酸のポリ（無水物）のようなポリ（無水物））であるポリマーから形成され得る。マイクロキャリアはまた、リポソーム、抗原のないイスコム（ｉｓｃｏｍ）（コレステロールおよびリン脂質ならびにアジュバント活性サポニンの安定複合体である、免疫刺激複合体）、または液相マイクロキャリアが生分解性である場合に水中油乳濁液または油中水乳濁液において見出される液滴またはミセルのような液相（例えば、油性または液性）であり得る。代表的に、生分解性液相マイクロキャリアは、生分解性油を取り込み、そのうちの多くは、当該分野において公知であり、スクアレンおよび植物油が挙げられる。マイクロキャリアは、代表的に、形が球状であるが、球形から逸脱しているマイクロキャリアもまた、容認され得る（例えば、楕円体、桿状体等）。その不溶性の性質（水に関して）に起因して、マイクロキャリアは、水および水性（水様）溶液から濾過可能である。
【００９１】
本発明の抗体結合体またはポリペプチド結合体は、毒物または治療薬剤に結合することができる基および抗体に結合することができる基の双方を含む、２官能リンカーを含み得る。リンカーは、結合能との干渉を避けるために、抗体を薬物から遠ざけるためのスペーサーとして、機能し得る。リンカーは、開裂性または非開裂性であり得る。リンカーはまた、薬物または抗体における置換基の化学反応性を高めるために役立ち得るため、結合効率を上昇させる。化学反応性の上昇はまた、薬物の使用、または、他の方法では不可能であるはずの、薬物上の官能基の使用を促進する。２官能リンカーは、当該分野において公知の手段により、抗体に結合され得る。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような、活性なエステル部分を含むリンカーは、抗体内のリシン残基にアミド結合を介して結合するために、使用され得る。別の実施例において、求核アミンまたはヒドラジン残基を含むリンカーは、抗体炭水化物残基の解糖酸化により作製されたアルデヒド基に結合され得る。これらの直接的な結合方法に加えて、リンカーは、アミノデキストランのような中間キャリアを用いて、間接的に抗体に結合され得る。これらの実施形態において、改変された結合は、リシン、炭水化物または中間キャリアのいずれかの経由である。１つの実施形態において、リンカーは、タンパク質内の遊離チオール残基に部位選択的に結合される。タンパク質上のチオール基への選択的結合に適している部分は、当該分野において周知である。その例としては、ジスルフィド化合物、α−ハロカルボニル化合物およびハロカルボキシル化合物、ならびにマレイミドが挙げられる。求核アミンの機能が、α−ハロカルボニル基またはカルボキシル基と同じ分子内に存在するときに、ポテンシャルが、アミンの分子内アルキル化を経て起こる環化について存在する。この問題を防ぐ方法は、当業者に周知であり、例えば、アミンおよびα−ハロの機能が、アリール基またはトランスアルケンのような、固い基により分離される分子の調製により、望まれない環化を立体化学的に好まれないものにする。例えば、ジスルフィド部分を介するメイタンシノイドと抗体の結合体の調製については、米国特許第６，４４１，１６３号を参照のこと。
【００９２】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、当該分野において公知の任意の方法により、放射性部分または放射性分子に結合（連結）され得る。放射標識抗体に関する方法の考察については、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＴ」、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９５）を参照のこと。
【００９３】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、プロドラッグを活性な抗癌剤に変換する薬物（プロドラッグ活性化酵素を含む）に連結され得る。例えば、本発明の抗体（またはポリペプチド）は、抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）を活性癌薬剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合（連結）させることにより、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ治療（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＤＥＰＴ）において使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【００９４】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素構成要素は、プロドラッグをそのより活性な細胞毒性型に変換するような方法で、プロドラッグに作用することができる任意の酵素を含む。
【００９５】
本発明の方法において有用な酵素としては、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒素５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびカテプシンＬ）のようなプロテアーゼ；Ｄアミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤアラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬剤に変換するのに有用なβガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；βラクタムにより誘導体化された薬物を遊離薬剤に変換するのに有用なβラクタマーゼ；ならびにフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基によりそのアミン窒素で誘導体化された薬物を遊離薬剤にそれぞれ変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼが挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、当該分野において「アブザイム」としても知られている、酵素活性を有する抗体は、本発明のプロドラッグを遊離活性薬剤に変換するために使用され得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７〜４５８（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １（２）：１１８〜２９（２００１）；米国特許第６，３６８，８３９号；同第５，６５８，７５３号を参照のこと）。抗体アブザイム結合体は、アブザイムの腫瘍細胞集合への送達のために、本明細書中で記載されるように調製され得る。
【００９６】
本発明の酵素は、上述のヘテロ２官能架橋試薬の使用のような当該分野において周知の技術により、抗体に共有結合的に結合し得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜６０８（１９８４）を参照のこと）。
【００９７】
プロドラッグ活性化酵素に連結された、本発明の抗体またはポリペプチドは、酵素により活性な抗癌剤に変換されるプロドラッグとの結合において使用され得る。例えば、Ｄ．Ｅ．Ｖ．Ｗｉｌｍａｎ、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、１４、ｐｐ．３７５〜３８２（６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｂｅｌｆａｓｔ  １９８６）およびＶ．Ｊ．Ｓｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、」Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｒ．Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（編）、ｐｐ．２４７〜２６７（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照のこと。本発明のプロドラッグとしては、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修正プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、必要に応じて置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは必要に応じて置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン、および、結合体の酵素によってより活性な遊離細胞毒に変換され得る他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、それらに限定されない。本発明で使用するためにプロドラッグ型に誘導体化され得る細胞毒の例としては、エトポシド、テニポシド、アドリアマイシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、ミトマイシン、シス−白金、シス−白金アナログ、ブレオマイシン、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）（米国特許第４，６７５，１８７号）、５−フルオロウラシル、メルファラン、および他の関連するナイトロジェンマスタードが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９８】
本発明の抗体（またはポリペプチド）は、蛍光性分子、放射性分子または当該分野において公知の任意の他の標識のような、標識化薬剤（または、「標識」と呼ばれる）に連結され得る。標識は、当該分野において公知であり、一般にシグナルを（直接的にまたは間接的にのいずれかで）提供する。
【００９９】
β６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞の増殖を阻害する能力、β６インテグリンサブユニットを発現する癌を有する個体における転移の進行を遅らせる能力、あるいは、毒素もしくは放射性化合物のような治療薬剤またはプロドラッグを活性な抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素をβ６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞に送達する能力のような、本発明の抗体またはポリペプチドの能力は、当該分野において公知の方法を用いて試験され得、そのいくつかは実施例において記載される。
【０１００】
また、本発明は、抗体ｍＢＬＡ３もしくはｍＢＬＡ３等価抗体（本開示が明らかにするように、本明細書中に記載される全ての抗体を含む）またはポリペプチドを含む組成物（薬学的組成物を含む）および治療薬剤を提供する。
【０１０１】
（ＩＶ．モノクローナル抗体をスクリーニングする方法）
β６インテグリンサブユニットに結合するモノクローナル抗体をスクリーニングするために、いくつかの方法が使用され得る。「結合」とは、免疫学的に関連する結合、すなわち、免疫グロブリン分子がコードされる抗原（またはエピトープ）に特異的な結合のことを言うことが理解される。これは、免疫グロブリンが、非特異的な標的に対して非常に高い濃度で使用される場合に起こり得る、非特異的な結合のことは言わない。スクリーニングに使用され得る１つの方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。標準的な免疫組織化学技術は、当業者に公知である。例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＤ．Ｂａｒｎｅｓ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，第５７巻，第１８章および第１９章，ｐｐ．３１４−３５０，１９９８）参照。生物学的サンプル（例えば組織）は、生検、剖検（ａｕｔｏｐｓｉｅｓ）、または剖検（ｎｅｃｒｏｐｓｉｅｓ）から得られ得る。β６インテグリンサブユニットが癌細胞上のみに存在するか否かを確かめるため、ｍＢＬＡ３が、癌を有する個体由来の組織上におけるβ６インテグリンサブユニットの存在を検出するために使用され得、他方、癌にかかっている個体由来の非癌組織、または、癌を有さない個体由来の組織が、コントロールとして使用される。該組織は、凍結させる間の損傷を防ぐ、固形物質、または半固形の物質（例えばアガロースゲルまたはＯＣＴ）に埋め込まれ得、次いで染色のために薄切される。異なる器官由来の癌、および、異なる程度の癌が、モノクローナル抗体をスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングの目的で使用され得る組織の例としては、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられるが、これらに限定されない。スクリーニングの目的で使用され得る異なる癌の型の例としては、癌腫、腺癌、肉腫、腺肉腫、リンパ腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
さらに別の代替物として、ＳＫ−Ｏｖ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ７７）、ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  １６１）、Ｃａｏｖ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ７５）、ＬｎＣａｐ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０）、ＣＯＬＯ  ２０５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２２２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  １８５）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １４６９）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ３０）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ５８）、ＨＴ−２９（ＨＴＢ−３８）、Ｈ９（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１７６）、ＳＷ  ４８０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２２８）、ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １６８２）、Ｃａｐａｎ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ７９）、ＣＦＰＡＣ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １９１８）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９９７）、ＨＦ−７００Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  １４７）、ＥＳ−２（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９７８）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １４３５）、ＥＮＤ（成体の子宮内膜から培養されたヒトの線維芽細胞）、Ｄｕ−１４５（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１）、Ｒａｖ  ＣＡ１３０（Ｒａｖｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．で開発された専売の肺癌株）、Ｒａｖ９９２６（専売の膵臓癌細胞株）、ＳＵ．８６．８６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８３７）、およびＺＲ７−５１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５００）などの癌細胞株、ならびに、それぞれの組織からの正常な細胞が、癌組織に特異的なモノクローナル抗体をスクリーニングするために使用され得る。異なる器官（卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、大動脈の平滑筋、および内皮細胞が挙げられるが、それらに限定されない）からの正常な組織に由来する１次細胞培養または継代の少ない（ｌｏｗ  ｐａｓｓａｇｅ）細胞培養が、陰性コントロールとして使用され得る。ＷＯ  ０１／４３８６９に記載されるように、癌細胞または非癌細胞は、スライドガラスまたはカバーガラス上、あるいはプラスチック表面上で培養され得るか、またはＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭ内で調製され得、組織に関して上で記載されるように、ＩＨＣを使用して抗体の結合についてスクリーニングされる。あるいは、細胞は、非タンパク分解性の手段を使用して増殖表面から除去され得、遠心分離してペレットにされ、次いで包埋されて、前述のようにＩＨＣ分析用の組織として処理される。別の代替法においては、単一の細胞が、一次抗体と共にインキュベートされ、二次「レポーター」抗体が蛍光分子へ結合され、次いで蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）機械を使用して分析されることにより、スクリーニングされ得る。
【０１０３】
いくつかの異なる検出システムが、抗体の組織切片への結合を検出するために利用され得る。代表的に、免疫組織化学は、一次抗体の組織への結合に関与し、次に、一次抗体に由来する種に対して反応性を有する二次抗体が生成され、検出可能なマーカーへ結合される（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはジアミノベンゼジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｄｉｎｅ）（ＤＡＢ）など）。使用され得る１つの代替的な方法は、ポリクローナル鏡像相補抗体すなわちポリＭＩＣＡである。ポリＭＩＣＡ（ポリクローナル鏡像相補抗体）の技術は、Ｄ．Ｃ．ＭａｎｇｈａｍおよびＰ．Ｇ．Ｉｓａａｃｓｏｎ（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９９）３５（２）：１２９−３３）によって記載されており、一次抗体（例えばｍＢＬＡ３など）の正常の組織および癌組織への結合を試験するために使用され得る。何種類かのポリＭＩＣＡＴＭ検出キットが、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  ４０７３  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｂ２９  ６ＡＴ  Ｅｎｇｌａｎｄ）から市販されている。製品番号ＨＫ００４．Ｄは、ＤＡＢクロマゲン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）を使用するポリＭＩＣＡＴＭ検出キットである。製品番号ＨＫ００４．Ａは、ＡＥＣクロマゲンを使用するポリＭＩＣＡＴＭ検出キットである。あるいは、一次抗体は、検出可能なマーカーを用いて直接標識され得る。
【０１０４】
適切な抗体について選択するための、ＩＨＣスクリーニングにおける最初の工程は、マウス内で産生させた一次抗体（例えばｍＢＬＡ３）の１つ以上の免疫原（例えば細胞または組織のサンプル）への結合である。１つの実施形態において、組織のサンプルは、異なる器官に由来する凍結組織切片である。細胞または組織のサンプルは、癌性であってもなくても、どちらでもよい。
【０１０５】
凍結した組織は、当業者に公知の多数の方法のうちいずれかによって、固定化されるか、または固定化されずに、調製、薄切され、ＩＨＣが実行される。例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１２：２６４−２７７（１９９９）およびＳｔｅｐｈａｎら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５８４１−５４（１９９９）を参照。
【０１０６】
β６インテグリンサブユニットに結合するモノクローナル抗体は、癌細胞または癌組織に結合するようにスクリーニングされるが、正常な細胞または組織には同じ程度に結合しないように選択される。１つ以上の癌の型上に発現される抗原に結合するが、正常な細胞には結合しないモノクローナル抗体も選択される。ｍＢＬＡ３は、多数の異なる癌上に存在する抗原に結合するが、正常な組織への結合には限界を有する抗体の例である。ブダペスト条約に従い、ｍＢＬＡ３を生成するハイブリドーマは、２００１年１０月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ  ２０１１０−２２０９）へ、ＰＴＡ−３７７５の特許受託名で寄託されている。
【０１０７】
（Ｖ．ｍＢＬＡ３を特徴づける方法）
ｍＢＬＡ３を特徴づけるために、いくつかの方法が使用される。１つの方法は、それが結合するエピトープを同定することである。エピトープのマッピングは、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５，８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ，オランダ）など、様々な販売元から市販されている。エピトープのマッピングは、ｍＢＬＡ３が結合する配列を決定するために使用され得る。エピトープは、直鎖状のエピトープであり得、すなわち一本鎖のアミノ酸に含有され得るか、または、一本鎖に必ずしも含まれるとは限らないアミノ酸の３次元的な相互作用により形成される高次構造的なエピトープであり得る。多様な長さのペプチド（例えば、少なくとも４〜６個のアミノ酸の長さ）が、単離または合成され得（例えば遺伝子組み換え的に）、ｍＢＬＡ３との結合アッセイに使用される。ｍＢＬＡ３が結合するエピトープは、β６インテグリンサブユニットの細胞外配列に由来する重複ペプチドを使用し、ｍＢＬＡ３による結合を決定することにより、系統的なスクリーニングで決定され得る。
【０１０８】
ｍＢＬＡ３を特徴づけるために使用され得るさらに別の方法は、同じ抗原、すなわちβ６インテグリンサブユニットに結合することが公知の他の抗体を用いて、ｍＢＬＡ３が他の抗体と同じエピトープに結合するか否かを決定する、競合アッセイの使用である。β６インテグリンサブユニットに対する抗体で市販されているものの例は、Ｒ６Ｇ９、１０Ｄ５およびＥ７Ｐ６である。競合アッセイは、当業者には周知である。この手順は、実施例７において更に詳しく記載される。ｍＢＬＡ３は、それが結合する組織、癌の型、または腫瘍の型によって更に特徴づけられ得る。
【０１０９】
ｍＢＬＡ３を特徴づける別の方法は、それが結合する抗原によるものである。ｍＢＬＡ３は、多様なヒトの癌に由来する細胞可溶化物を用いて、ウエスタンブロットにおいて使用された。当業者に公知であるように、ウエスタンブロット法は、細胞可溶化物および／または細胞の画分を、変性ゲルまたは非変性ゲル上で泳動すること、タンパク質をニトロセルロース紙に移すこと、および、ブロットを抗体（例えばｍＢＬＡ３）でプローブして、どのタンパク質が抗体に結合されているかを見ること、を包含し得る。この手順は、実施例４において更に詳しく述べられる。ｍＢＬＡ３が結合したバンドは、実施例５および６に記載のように、単離され、質量分析を用いて更に分析された。ｍＢＬＡ３が結合する抗原は、特にαｖβ６インテグリンに関して、インテグリンのβ６サブユニットであることが見出された。ｍＢＬＡ３の結合は、本明細書においてはαｖβ６への結合として示されているが、本発明は、αｖβ６インテグリンのみへの結合に限定されない。β６サブユニットを含む任意のインテグリンもまた、ｍＢＬＡ３によって認識され得るので、スクリーニング、診断、および処置の目的のために有用である。
【０１１０】
（ＶＩ．ｍＢＬＡ３、β６インテグリンサブユニットに結合するｍＢＬＡ３等価抗体またはｍＢＬＡ３等価ポリペプチドを使用して癌を診断する方法）
モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３、およびβ６インテグリンサブユニットに結合する等価抗体またはｍＢＬＡ３のポリペプチド誘導体（本明細書に開示された方法によって作製される）が、診断の目的で、種々の組織（卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられるが、これらに限定されない）における癌細胞の存在または非存在を同定するために使用され得る。単純にするために、これらの方法は、一般にｍＢＬＡ３または抗体にしか言及しないが、本明細書に記載される任意のβ６インテグリンサブユニットの結合実施形態に当てはまることを理解する。検出は、一般的β６インテグリンサブユニットに結合する、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと細胞を接触させること、および、β６インテグリンサブユニットと、β６インテグリンサブユニットに特異的に結合する抗体（例えば、ｍＢＬＡ３、ｍＢＬＡ３のヒト化抗体、ヒト抗体、またはその他の任意のβ６インテグリンサブユニット結合部分）との間の複合体の形成を包含する。このような複合体の形成は、インビトロでもインビボでも行なわれ得る。理論に縛られることなく、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３は、β６サブユニットの細胞外ドメインを通じてβ６インテグリンサブユニットに結合し得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、細胞からβ６インテグリンサブユニットを検出することにより、前立腺癌細胞の存在または非存在を検出するための方法が提供される。前立腺癌細胞に由来するβ６インテグリンサブユニットは、β６インテグリンサブユニットｍＲＮＡの検出、および、β６インテグリンサブユニットタンパク質の検出を含む任意の方法を使用して検出され得るが、これらの方法に限定されない。本明細書に記載されるような、任意のβ６インテグリンサブユニット結合部分が使用され得る（例えば、ｍＢＬＡ３、ｍＢＬＡ３等価抗体（ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的な結合を競合的に阻害する））。本明細書に使用されるように、検出には、質的な、および／または量的な検出が含まれ得、そして、癌細胞におけるβ６インテグリンサブユニットの発現のレベルの上昇について、測定されたレベルを正常な前立腺細胞と比較することが包含し得る。
【０１１２】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載された任意の抗体またはポリペプチドを使用した癌の診断を補助する方法を提供する。本明細書において使用されるように、「診断を補助する」方法とは、これらの方法が、癌の分類、または性質に関して臨床的な決定をする際に補助することを意味し、確定診断に関して、結論的であってもなくてもよい。従って、癌の診断を補助する方法は、個体からの生物学的サンプルにおけるβ６インテグリンサブユニットのレベルを検出する工程、および／または、該サンプルにおけるβ６インテグリンサブユニットの発現のレベルを決定する工程を含み得る。
【０１１３】
診断に抗体を使用する１つの方法は、抗体を標識部分（例えば、蛍光剤、放射性薬剤、または放射線不透過性薬剤）に結合し、個体に抗体を投与し、そしてエックス線またはその他の画像化機械を使用して、抗原を発現している癌細胞表面における標識された抗体の局在を視覚化することによる、インビボでの腫瘍画像化法である。抗体は、生理学的条件において結合を促進する濃度で投与される。標識部分は、当技術分野において公知である。
【０１１４】
その他の方法においては、癌細胞は除去され、当技術分野において周知の方法（例えば、凍結した化合物への包埋、凍結、および薄切（固定してまたは固定せずに）；固定およびパラフィン包埋（抗原の回収および対比染色の種々の方法を行なうか、または行なわない））によって、組織は、免疫組織化学のために調製される。モノクローナル抗体はまた、異なる発達段階における癌細胞を同定するためにも使用され得る。抗体はまた、どの個体の腫瘍がその表面上で所定のレベルで抗原を発現する（従って、この抗体は、その抗原に対して指向された抗体を用いる免疫療法の候補である）かを測定するためにも使用され得る。
【０１１５】
抗原を認識する抗体（またはポリペプチド）はまた、体液中の生きている癌細胞、または死にかけている癌細胞から放出あるいは分泌された抗原を検出するための診断上の免疫測定法を作製するためにも使用され得る。体液としては、血液、唾液、尿、肺の液体、または腹水が含まれるが、これらに限定されない。実施例においてさらに詳細に論じられるように、ｍＢＬＡ３は、組織から得られた異なる段階の癌の多様な形態に結合し得る。この組織としては、乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺、食道、甲状腺、および腎臓が挙げられるが、これらに限定されない。診断の目的でｍＢＬＡ３を使用する方法は、与えられた処置に最も強い反応性の腫瘍、癌を有する個体の予後、腫瘍のサブタイプまたは転移性疾患の起源、および疾患の進行または処置への反応を決定するために、任意の形態の抗癌処置（例えば化学療法または放射線治療など）の前後両方において有用である。
【０１１６】
（ＶＩＩ．治療上の目的で、ｍＢＬＡ３、ｍＢＬＡ３等価抗体またはポリペプチドを使用する方法）
モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３、ならびに、本明細書に開示された方法により作製された等価抗体（およびその他の本発明のポリペプチド実施形態と同様）は、種々の組織に癌（卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓の癌が挙げられるが、これらに限定されない）を有する個体において、治療上の目的で使用され得る。いくつかの実施形態において、（前立腺癌細胞が抗体またはポリペプチドに結合する場合、）癌は前立腺癌である。これらの治療上の方法はまた、前述の結合された実施形態にも適用される。単純にするために、通常はｍＢＬＡ３または抗体に言及するが、これらの方法は、本明細書に記載された任意のβ６インテグリンサブユニット結合実施形態に適用され、結合実施形態を含む本明細書に記載されるヒト化抗体およびヒト抗体を含むが、これらに限定されないことが理解される。ｍＢＬＡ３を用いた治療は、上述のようにインビトロおよびインビボの両方において複合体の形成に関与し得る。１つの実施形態において、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３は、実施例１２および実施例１３に示されるように、癌細胞（例えば結腸癌細胞など）に結合し、その増殖を減じ得る。抗体は、生理学的な（例えばインビボ）条件において結合を促進する濃度で投与されることが理解される。別の実施形態において、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３は、単独で、癌細胞に結合し、アポトーシスによる細胞死を誘導し得る。別の実施形態においては、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３は、癌細胞に結合し、転移の進行を遅らせ得る。別の実施形態においては、モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３は、癌細胞に結合し、治療薬剤（例えば毒素、または放射性化合物など）、または、プロドラッグを癌細胞上のｍＢＬＡ３に結合される活性抗癌薬物に変える薬剤（プロドラッグ活性化酵素を含むがこれらに限定されない）を送達し得る。薬剤（例えばプロドラッグ活性化酵素など）に結合された抗体は、プロドラッグと併用して個体に投与される。一般的に、これらの実施形態においては、効果的な量（治療薬剤を標的癌細胞へ送達するのに十分な量、または、プロドラッグを十分な量の活性抗癌薬物に変えるプロドラッグ活性化酵素を送達するのに十分な量）が、個体に投与される。さらに別の実施形態においては、癌を有する個体に対し、本発明の抗体を用いて緩和処置が施される。癌個体の緩和処置は、疾患の有害な症状、または、癌の進行に直接影響を及ぼさずに疾患に与えられる他の処置から生じる医原性の症状を処置すること、あるいは減少させることに関与する。これには、痛みの緩和、栄養補給、性機能障害、心理的苦悩、鬱病、疲労、精神障害、吐き気、嘔吐などのための処置が含まれる。
【０１１７】
本発明はまた、β６インテグリンサブユニットに結合する任意の抗体またはその他の実施形態を使用して、癌を処置し、癌細胞（乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺、食道、甲状腺、腎臓、および卵巣の癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない）の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する方法を提供する。本発明の処置方法は、細胞表面上でβ６インテグリンサブユニットを発現する任意の癌に適用される。β６インテグリンサブユニットに結合する抗体について記載されている。例えば、米国特許第６，３１６，６０１号を参照のこと。癌細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する際の抗体の活性を試験する方法は、当技術分野において公知であり、実施例１２および実施例１３において詳しく記載される。
【０１１８】
本発明はまた、ｍＢＬＡ３抗体もしくはｍＢＬＡ３等価抗体またはポリペプチド（例えば、ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的な結合を競合的に阻害する抗体など）を使用して、癌細胞（例えば前立腺、肺、乳房、結腸、卵巣、膵臓、腎臓、卵巣の癌細胞など）の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、抗体は、ｍＢＬＡ３が優先的に結合するのと同じエピトープに、優先的に結合する。
【０１１９】
さらに別の実施形態において、ｍＢＬＡ３または本明細書に記載された任意のβ６インテグリンサブユニット実施形態は、癌細胞を発現するβ６インテグリンサブユニットに結合し、β６インテグリンサブユニットを発現する癌細胞に対する活性免疫反応を誘導し得る。いくつかの場合において、活性免疫応答は、癌細胞の死を引き起こし得る（例えば、癌細胞に結合するｍＢＬＡ３がアポトーシスによる細胞死を誘導する）か、あるいは、癌細胞の増殖を阻害（例えば、細胞周期の進行をブロックする）し得る。その他の場合においては、ｍＢＬＡ３または本明細書中に記載された任意のβ６インテグリンサブユニット抗体は、癌細胞に結合し得、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）は、ｍＢＬＡ３が結合する癌細胞を除去し得る。従って、本発明は、本明細書中に記載された任意の組成物の投与を包含する、免疫応答を刺激する方法を提供する。
【０１２０】
いくつかの場合において、ｍＢＬＡ３結合はまた、細胞性免疫応答および体液性免疫反応の両方を活性化し、より多くのナチュラルキラー細胞を補充し、あるいは、癌細胞を破壊する個体の免疫システムを更に活性化させるサイトカイン（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなど）の産生を増加させ得る。さらに別の実施形態において、ｍＢＬＡ３は、癌細胞に結合し得、マクロファージまたはその他の食細胞は、癌細胞をオプソニン化し得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載された任意の組成物の投与を包含する受動免疫を与える方法を提供する。
【０１２２】
本発明は、例えばβ６統合サブユニット発現癌細胞などのβ６統合サブユニット発現細胞に対し、本明細書に記載された任意の組成物（結合体を含む）を送達する方法を提供する。これらの方法は、本明細書中に記載された組成物（結合体を含む）の個体への投与を伴う。抗体ｍＢＬＡ３、および、本明細書中に開示された方法により産生された等価抗体（ならびに本発明のその他のポリペプチド実施形態）は、放射性部分または放射性分子、毒素（例えばカリケアミシン）、化学療法的分子、プロドラッグを活性抗癌薬物に変えるプロドラッグ活性化酵素、リポソーム、あるいは、化学療法的化合物を含有するその他の小胞に結合され（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）得るかまたは結合され（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）得、これらの化合物を、抗体によって認識された抗原を含む癌細胞を標的化するために、個体に投与され、それにより、癌細胞を除去し得る。さらに別の実施形態において、癌を有する個体は、ｍＢＬＡ３を用いた緩和処置が与えられる。さらに別の実施形態において、抗体は、転移の進行を遅らせるために、抗原を発現する癌を外科的に除去する際に、アジュバント療法として使用され得る。抗体はまた、腫瘍のサイズを減じるために、抗原を発現する腫瘍を有する個体において、外科手術前にも投与され得（ネオアジュバント療法）、これにより、外科手術を可能にし、あるいは単純化し、外科手術中に組織を残しておき（ｓｐａｒｅ）、そして／または、生じる醜い跡を減じる。
【０１２３】
例えば、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、および必要な特異性のβ６インテグリンサブユニット認識部位を含む任意の他の改変されたｍＢＬＡ３立体配置などの、ｍＢＬＡ３および等価抗体またはフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）の種々の処方物が、投与のために使用され得る。いくつかの実施形態において、ｍＢＬＡ３抗体またはそれらのｍＢＬＡ３の種々の処方物が、適切に投与される。他の実施形態において、ｍＢＬＡ３またはそれらのｍＢＬＡ３の種々の処方物（本明細書中に記載される任意の組成物実施形態を含む）、および薬学的に受容可能な賦形剤は、投与され、種々の処方物であり得る。薬学的に受容可能な賦形剤は、当技術分野において公知であり、薬理学的に効果的な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態または粘性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）を与え得、希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤としては、分解防止剤、湿潤剤ならびに乳化剤、浸透圧を変えるための塩、封入剤、緩衝液、および皮膚浸透エンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。非経口の薬物および非経口ではない薬物の送達のための賦形剤および処方物については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に記載されている。
【０１２４】
一般的に、これらの薬剤は、注射による投与（例えば腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、など）のために処方されるが、その他の投与形態（例えば経口的投与、粘膜投与、など）もまた使用され得る。従って、ｍＢＬＡ３抗体およびそれらの対価物は、好ましくは、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液などの薬学的に受容可能なビヒクルと混ぜ合わされる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および頻度は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。一般的に、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１００μｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約２５０μｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約７５０μｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約３ｍｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約５ｍｇ、体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０ｍｇ、が投与される。
【０１２５】
半減期などの実験に基づいた考慮は、一般に用量の決定に寄与する。ヒト化抗体または完全なヒト抗体などの、ヒト免疫システムとの適合性を有する抗体は、抗体の半減期を延長するため、および、抗体が宿主の免疫システムによって攻撃されるのを防止するために使用され得る。投与の頻度は、治療の経路にあわせて決定および調整され得、癌細胞の数を減らすか、癌細胞の減少を維持させるか、癌細胞の増殖を減らすか、または、転移の進行を遅らせるか、に基づく。癌細胞の存在は、当業者に公知の多数の方法、あるいは本明細書中で考慮された方法（例えば免疫組織化学、あるいは、生検または生物学的サンプルのフローサイトメトリーによる検出）によって同定され得る。あるいは、ｍＢＬＡ３抗体の徐放性の連続的放出処方物が適し得る。徐放性の放出を達成するための種々の処方物およびデバイスは当技術分野において公知である。
【０１２６】
１つの実施形態において、ｍＢＬＡ３抗体の用量は、１回以上の投与が与えられている個体において実験に基づいて決定され得る。個体において、ｍＢＬＡ３の用量が増加される。ｍＢＬＡ３またはその他の等価抗体の効力を評価するために、特定の癌疾患状態のマーカーが追跡され得る。このマーカーとしては、触診または視覚での観察を通した腫瘍のサイズの直接的な測定、Ｘ線またはその他の画像技術による腫瘍のサイズの間接的な測定、直接の腫瘍生検によって、および腫瘍サンプルの顕微鏡検査によって評価されるような改善、間接的な腫瘍マーカー（例えば前立腺癌用のＰＳＡなど）の測定、痛みまたは麻痺の減少、話す能力、視覚、呼吸、またはその他における腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増進、または、承認された試験によって測定されるような生活の質の上昇あるいは生存期間の延長を含む。用量が、個体、癌の型、癌の段階、癌が個体において他の場所へ転移し始めているか否か、および、過去使用された処置ならびに現在併用される処置に依存して変化することは、当業者にとって明らかである。
【０１２７】
その他の処方物は、リポソームなどのキャリアが挙げられるがこれらに限定されない、当技術分野において公知の適切な送達形態を含む。例えば、Ｍａｈａｔｏら，（１９９７）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１４：８５３−８５９参照。リポソーム製剤としては、サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、多層状ベシクル、および単層ベシクルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、１つより多い抗体が存在し得る。この抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。このような組成物は、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、癌腫、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性の、異なる抗体を含有し得る。ｍＢＬＡ３抗体は、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられるがこれらに限定されない器官における癌、腺癌、肉腫、または腺肉腫に対して反応性の１つ以上の抗体と混合され得る。抗体の混合物は、当技術分野においてしばしば示されるように、より広範囲の個体の集団の処置において特に有用であり得る。
【０１２９】
疾患の評価が、画像方法および適切なマーカーのモニタリングなどの当技術分野における標準的な方法を使用して行われる。
【０１３０】
（ＶＩＩＩ．β６インテグリンサブユニットに結合する本発明の抗体およびポリペプチドを含むキット）
本発明はまた、診断および／または治療における使用のために、β６インテグリンサブユニットに結合する抗体または本明細書中に記載される任意の組成物を含むキットも提供する。従って、キットは、β６インテグリンサブユニットに優先的に結合し得るか、そして／または、β６インテグリンサブユニットとの複合物を形成し得る抗体を含む（例えば、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、食道、甲状腺、腎臓、または卵巣の癌細胞を検出するのに有用である）。いくつかの実施形態において、キットは、抗体ｍＢＬＡ３、または、ｍＢＬＡ３のβ６インテグリンサブユニットへの優先的な結合を競合的に阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態において、キットは、抗体ｍＢＬＡ３、あるいは、治療薬剤、プロドラッグ活性化酵素、または標識剤に結合されたβ６インテグリンサブユニットへのｍＢＬＡ３の優先的な結合を競合的に阻害する抗体を含む。これらのキットは更に、指示、および／あるいは、この抗体または本明細書中に記載された任意の抗体実施形態またはポリペプチド実施形態を治療薬剤、プロドラッグ活性化酵素、または標識剤に結合するための試薬を含み得る。いくつかの局面において、抗体（例えばモノクローナル、ポリクローナル、ヒト、ヒト化など）のβ６インテグリンサブユニットへの結合は、個体における癌診断のために使用される（例えば、癌細胞の存在もしくは非存在を検出するためのキット、および、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、食道、甲状腺、腎臓、または卵巣の癌細胞の存在もしくは非存在を検出するためのキット）。その他の局面において、キットは、例えば、癌を有する、または癌の家族歴を有する個体を処置するために使用され得る。癌を有する個体を処置するためのキットは、結腸の癌細胞などの癌細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害するためのキット、および／あるいは、治療薬剤またはプロドラッグ活性化酵素を癌細胞へ送達するためのキットを含むが、これらに限定されない。本発明のキットは、適切に包装され、さらなる構成要素を必要に応じて提供し得、このさらなる構成要素は、例えば、本発明の抗体と組み合わせて使用されるプロドラッグ、ならびにβ６インテグリンサブユニットに対する結合を決定するための緩衝液および指示（例えば、捕捉試薬、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、および説明の情報）である。指示は、本明細書中に記載されるアッセイを含むがこれらに限定されない、抗原結合の任意の測定のためであり得る。その他の実施形態において、指示は、本明細書中に記載の任意の方法のためであり得、以下を含む：結腸の癌細胞などの癌細胞の増殖（ｇｒｏｗ）および／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害するための指示；治療薬剤またはプロドラッグ活性化酵素を癌細胞に送達するための指示（プロドラッグを使用するための指示を含む）。いくつかの実施形態において、上述の試薬は、同じ個体における長期の測定または複数の個体における測定を可能にするなど、複数の測定が成され得るように供給される。抗体の結合を検出するための任意の適切な手段（標識された抗ヒト抗体（この標識は酵素であり得る）、フルオロフ���ア、化学発光物質放射性同位元素、または補酵素）が、使用され得る（そしてキットにおいて提供され得る）。一般的に、使用される標識は酵素である。
【０１３１】
以下の実施例は、例として提供されるが、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１  免疫原としてのヒト胎児膀胱細胞の調製）
妊娠週齢が１４〜２１週のヒトの胎児の膀胱を、カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ  ＣｏｕｎｔｙのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。膀胱を、調達し、濡らした氷上の組織培地に入れ、研究室に輸送した。到着後すぐに、膀胱を、２０ｍｌの冷ＰＢＳで３回洗浄した。解剖用顕微鏡の下で、膀胱から、膀胱の周りの余分な組織を取り除き、膀胱を冷ＰＢＳでさらに２回洗浄した。
【０１３３】
膀胱を、１００ｍｍの乾燥した培養シャーレ内において、カミソリの刃を用いて、１ｍｍのキューブ状に細切れにした。１０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  カタログ番号２２６００）を加えた。組織片を、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで事前にコーティングした５ｍｌのピペットによって、１５ｍｌの遠心管に移した。次に組織片を、１０００×ｇで５分間、遠心分離した。ペレットを、６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地内で再懸濁した。組織を、以下の増殖因子（各々１ミリリットルの培養中の最終濃度）を含有する３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で、６ウェルプレート内で培養した：１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５μｇ／ｍｌのビタミンＥ、２５μｇ／ｍｌのアプロチニン、３ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン、１０ｎｇ／ｍｌのＫＧＦ、５ｎＭのヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）（ＨＲＧ）、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（細胞培養の最初の２日間で加えられる）。注射の３日前に、トリプシン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  カタログ番号２５３００−０５４）を、最終濃度が０．０５％となるように加えて、線維芽細胞を取り除いた。
【０１３４】
これらの培養条件下で、ヒト胎児膀胱細胞（ＨＦＢ）を、組織培養容器のプラスチックに付着させ、単層として培養した。培養物を、はじめに細胞をトリプシン処理して組織培養容器から離脱させ、次に、５日目から７日目まで毎日、分割比１〜５で、同じ培地中で細胞を移植することにより、継代された。細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで洗浄し、最低２４時間は、上述のように無血清培地中で増殖し、その後、収集して注射した。
【０１３５】
細胞を収集するために、細胞を、カルシウムおよびマグネシウム非含有ハンクス生理食塩水で１回リンスし、ハンクス生理食塩水中０．０２％  ＥＤＴＡに中で、３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、優しくタッピングすることにより、培地表面から離脱させた。細胞懸濁液を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿させた。上清を除去し、細胞を、適切な非変性アジュバントを含有する血清非含有培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）内で再懸濁した。
【０１３６】
（実施例２  モノクローナル抗体の産生）
培養の１１〜１６日目のＨＦＢ細胞を使用して、モノクローナル抗体を産生した。マウス１匹当たり約１０６個のＨＦＢ細胞を、週１回、Ｂａｌｂ／ｃマウスの足蹠から注射した。非変性アジュバント（例えばＲｉｂｉ）を使用した。週１回注射の６週間後、各免疫化動物の尾から少量の血液を採取し、ＦＡＣＳ分析を用いて、ＨＦＢに対する抗体価を試験した。抗体価が少なくとも１：２０００に達したとき、マウスをＣＯ２チャンバ内で屠殺し、次いで頚椎を脱臼させた。ハイブリドーマの調製のためにリンパ節を収集した。
【０１３７】
マウスから得られた最も高い抗体価を有するリンパ球を、３５％ポリエチレングリコール４０００を使用して、マウスの骨髄腫株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。融合後１０日目に、ハイブリドーマの上清を、ＨＦＢに特異的なモノクローナル抗体の存在について、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってスクリーニングした。各ハイブリドーマから得た調整済みの培地を、ＨＦＢ細胞のアリコートを用いて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞のサンプルを洗浄し、０．１ｍｌの希釈剤中に再懸濁し、１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣが結合したヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ希釈剤中で再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて分析した。ハイブリドーマのクローンを、更なる拡張、クローニング、およびＦＡＣＳにより評価されるＨＦＢ細胞表面への結合に基づく特徴づけのために選択した。１００個のハイブリドーマクローンが、この第１スクリーニングにおいて陽性であることが見出された。
【０１３８】
陽性のハイブリドーマを、正常な組織切片への反応について、さらにスクリーニングした。膀胱および前立腺の組織切片において陽性、かつ、腎臓および皮膚の組織切片において陰性の、染色したハイブリドーマクローンを採取した。ｍＢＬＡ３と呼ばれるモノクローナル抗体を作るハイブリドーマを選択した。ブダペスト条約に従い、ｍＢＬＡ３を産生するハイブリドーマを、２００１年１０月１０日に、ＰＴＡ−３７７５の特許受託名で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８）に寄託した。
【０１３９】
（実施例３  ｍＢＬＡ３の精製）
モノクローナル抗体を、タンパク質−Ｇアフィニティークロマトグラフィー  を使用して、組織培養物の上清から精製した。抗体の精製工程について以下の物質を使用した：ハイブリドーマの組織培養物上清、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（Ｇ）ＩｇＧ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１０１１  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１００９）、濃ＨＣｌ（ｐＨ調製のため）、Ｃｏｒｎｉｎｇ  １リットル  ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、０．２２μｍのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３１０９８，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧｒａｄｉＦｒａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、タンパク質−Ｇセファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＃１７−０６１８−０２）、ストリッピング緩衝液（３Ｍ  ＫＳＣＮ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．８））、およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）３Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ９．０）。
【０１４０】
ｍＢＬＡ３抗体を精製するために、上清の容量を測定し、同じ容量の結合緩衝液を上清に加えた。混合物を、室温と平衡させた。上清を、０．２２μｍのフィルターを通して浄化した。上清を、ＧｒａｄｉＦｒａｃシステムを使用してタンパク質Ｇカラムにロードした。カラムを、５〜１０カラム容量分の結合緩衝液で洗浄した。モノクローナル抗体を、溶出緩衝液で溶出し、そして２ｍｌの画分を回収した。画分のＯＤ２８０値を得、モノクローナル抗体を含有する画分をプールした。溶出したモノクローナル抗体の画分を、１／２０容量の３Ｍ  Ｔｒｉｓの添加によって中和した。サンプルを、１×ＰＢＳ中で４℃で透析した（少なくとも３時間に１回の緩衝液の交換を３回行なった）。精製モノクローナル抗体を、フィルター滅菌し（０．２ｕＭ）、２〜８℃で貯蔵した。
【０１４１】
ハイブリドーマの上清からのｍＢＬＡ３モノクローナル抗体の精製後、ＨＦＢ細胞への結合を再試験した。細胞のサンプルを、実施例４に記載したように調製し、種々の濃度の精製抗体と共にインキュベートした。インキュベート後、細胞を洗浄し、０．１ｍｌの希釈剤中に再懸濁し、１μｇのＦＩＴＣが結合したヤギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントと共に、３０分間、４℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、０．５  ｍｌのＦＡＣＳ希釈剤中に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。ＦＡＣＳｃａｎヒストグラムにおいて右側にシフトすることは、精製抗体がまだＨＦＢ細胞に結合することを示した。
【０１４２】
（実施例４  ｍＢＬＡ３が結合する抗原の同定および特徴づけ）
細胞ペレット（ヘマトクリット値約２５μｌの膵臓腫瘍細胞株ＣＦＰＡＣ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９１８）またはＳＵ．８６．８６（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１８３７））が、最初に細胞を水中で０．５ｍｌまで希釈し、次いで凍結および融解を３回行なうことによって溶解した。溶液を、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞膜フラグメントを含有する、得られたペレットを、５０μｌのＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で再懸濁した。サンプルを、８０℃で５分間加熱し、次いで１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、いかなる不溶性の物質も除去した。ｍＢＬＡ３の抗原を発現し、精製に使用され得るその他の細胞株としては、Ｄｕ−１４５、ＨＴ−２９、または、表３に示されるように、ｍＢＬＡ３に結合するその他の細胞株が挙げられる。
【０１４３】
サンプルを、製造業者の指示に従い、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＳＤＳポリアクリルアミドの非変性勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。１０マイクロリットルの膜サンプルを、ポリアクリルアミドゲルの１レーンに適用した。予め染色した分子量のマーカーＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ゲル上の分子量を評価するために使用した。ゲルタンパク質が、１４．４ｇ／ｌのグリシン、３  ｇ／ｌのＴｒｉｓ  Ｂａｓｅ、１０％のメタノール、および０．０５％  ＳＤＳのトランスファー緩衝液を使用して、ニトロセルロース膜にトランスファーした。膜をブロックし、抗体ｍＢＬＡ３を用いてプローブし（０．５ｕｇ／ｍｌの濃度で）、製造業者の指示に従い、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｋｉｔ−ＡｎｔｉＭｏｕｓｅを使用して展開した。膵臓腫瘍細胞の膜サンプルにおいて、１つの顕著なバンドが、約１２０ｋＤａ（＋／−１０％）で移動するのが観察された。従って、ｍＢＬＡ３抗体は、この分子量マーカーシステムを用いたウエスタンブロット分析に基づき、約１２０ｋＤａの分子量を有する膵臓腫瘍細胞内のタンパク質上の抗原を認識する。
【０１４４】
ｍＢＬＡ３の抗原を更に特徴づけるために、細胞表面タンパク質のビオチン化、免疫沈降およびウエスタンブロットの技術を使用した。乳癌細胞ＳＫＢＲ３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３０）を、１７５ｃｍ２の培養シャーレ上で、コンフルエンシーまで増殖させた。コンフルエントな単層を、ハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ＋、炭酸水素ナトリウムまたはフェノールレッド非含有、ｌ０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝化（ｐＨ  ７．４）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た）で３回洗浄し、２００μｇのスルフォ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）で３０分間、室温でビオチン化した。細胞をＨＢＳＳ＋含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でさらに３回洗浄し、ＨＢＳＳ＋含有０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．４）中で、１５分間室温でインキュベートした。細胞を最後にＨＢＳＳ＋で３回洗浄し、溶解緩衝液（ＨＢＳＳ＋含有２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％アジ化ナトリウム、および５ｍｌの溶解緩衝液当たり１錠のＥＤＴＡ非含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉプロテアーゼカクテル（ＥＤＴＡ非含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉプロテアーゼカクテルを、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。その他の化学薬品はすべて、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た））中で、５分間氷上でインキュベートすることにより溶解した。細胞を、溶解緩衝液中で傷つけ、溶解物を回収した。溶解物を、４℃で１時間、２４，０００×ｇの遠心分離によって精製した。精製した溶解物を、最初に、５μｌのマウスＩｇＧ／ＢＳＡ結合（１ｍｇ／ｍｌ）ＣＮＢｒ  ４ＭＢセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で２時間、４℃で前処理した。マウスＩｇＧ／ＢＳＡビーズを除去し、次に前処理した溶解物を、５μｌのｍＢＬＡ３が結合したＣＮＢｒ  ４ＭＢセファロースビーズ（１ｍｇ／ｍｌで結合）で２時間、４℃でインキュベートした。ｍＢＬＡ３ビーズを、２時間のインキュベーション後、除去した。マウスＩｇＧ／ＢＳＡビーズおよびｍＢＬＡ３ビーズの両方を、１ｍｌの溶解緩衝液で独立に３回洗浄し、次に１ｍｌのＨＢＳＳ＋で３回洗浄した。洗浄したビーズを、３０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加え、９９℃で５分間沸騰させることによって溶出した。サンプルを、４〜２０％  Ｎｏｖｅｘ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離し、０．２μｍのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にトランスファーし、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）によって視覚化するか、または、ブロット当たり５μｇのｍＢＬＡ３を用いてウエスタンブロットした。ｍＢＬＡ３によって単離された、ビオチン化細胞表面のタンパク質を検出するために、ニトロセルロースを、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンで染色した。ニトロセルロースを最初に、ブロッキング緩衝液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）含有リン酸緩衝生理食塩水内の５％の無脂肪ドライミルク、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で１時間ブロックした。ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを、ＰＢＳＴ内に１μｇ／ｍｌで希釈し、３０分間、室温でニトロセルロースに露出した。ニトロセルロースを、ＤＡＢ基質で着色する前に、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ｍＢＬＡ３でウエスタンブロットを行なうために、ニトロセルロースを、同様にブロッキング緩衝液中で１時間ブロックした。次にニトロセルロースを、ブロッキング緩衝液中に希釈した１ｍｌの５μｇ／ｍｌ  ｍＢＬＡ３含有プラスチック袋内（加熱密封された）でインキュベートした。ニトロセルロースを、ＰＢＳＴで３回洗浄し、次に、１０ｍｌの１μｇ／ｍｌ  ＨＲＰ結合ロバ抗マウスＩｇＧ（重鎖および軽鎖特異的であり、ウシ、ニワトリ、ヤギ、モルモット、シリアンハムスター、ウマ、ヒト、ウサギ、ヒツジの血清タンパク質に対して交差吸着する）で、１時間、室温でインキュベートした。ニトロセルロースを最後に、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＤＡＢ基質を用いて発色させることにより視覚化した。
【０１４５】
分子量１２０ｋＤａの細胞表面のタンパク質を、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを使用して同定した。同じ分子量のタンパク質はまた、ｍＢＬＡ３によるウエスタンブロット法によっても認識された。
【０１４６】
ｍＢＬＡ３が結合する抗原もまた、以下の方法を使用して同定および特徴づけした。ＳＫＢＲ３細胞を、１７５ｃｍ２のフラスコ内でコンフルエンシーまで増殖した。ＳＫＢＲ３細胞が入った、少なくとも８つの１７５ｃｍ２のフラスコ（総量で少なくとも１４００ｃｍ２の細胞等価物））を、精製のために配分した。１４００ｃｍ２のうち１７５ｃｍ２、または総細胞の等価物の約１２．５％を、ＨＢＳＳ＋（カルシウム、マグネシウム、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡化塩溶液（ｐＨ  ７．２））中の４００ｍｇ／１７５ｃｍ２のスルフォ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いて、フラスコ内において３０分間、室温でビオチン化した。反応を、ｐＨ  ８．０の１Ｍ  Ｔｒｉｓを加えて、最終濃度を１００ｍＭとすることによってクエンチした。次いですべてのＳＫＢＲ３細胞を、ＨＢＳＳ＋で洗浄し、次に、１７５ｃｍ２の細胞の等価物について、１ｍｌの溶解緩衝液（ＨＢＳＳ＋含有２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５ｍｌ当たり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ−Ｍｉｎｉ（ＥＤＴＡ非含有）プロテアーゼカクテル、２ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ＭｉｎｉおよびＰＭＳＦはＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより得た）、および０．０３％  ＮａＮ３）を用いて、フラスコ内で溶解した。溶解物を回収し、１３，０００×ｇで４５分間、４℃で精製した。精製した溶解物を、１ｍｌのマウスＩｇＧ／ＢＳＡカラム（１ｍｇのマウスＩｇＧおよび１ｍｇのＢＳＡが、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した１ｍｌの活性化ＣＮＢｒ  ６ＭＢビーズに結合した）を使用して予め吸収させた（ｐｒｅ−ａｂｓｏｒｂｅｄ）（２時間、４℃）。次いで予め吸収させた溶解物を、５μｌ／秒以下の流速で、室温で、１ｍｌのｍＢＬＡ３カラムを通過させた（１ｍｇのｍＢＬＡ３が、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した１ｍｌの活性化ＣＮＢｒ  ６ＭＢビーズに結合された）。両方のカラムを、１５カラム分の容量の溶解緩衝液で洗浄し、次に１５カラム分の容量のＨＢＳＳ＋で、室温で洗浄した。洗浄したカラムを、５カラム分の容量の０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で溶出した。各カラムの容量（１ｍｌ）を独立に加え、溶出液を１ｍｌの画分に回収し、Ｆｌ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５とラベルを貼り、Ｆ１とＦ２との間で、３０分間、室温でのインキュベーションが生じた。サンプルの濃縮の前に、Ｆ１をＦ４とプールし、Ｆ１＋４のラベルを貼った。一方、Ｆ２をＦ３とプールし、Ｆ２＋３のラベルを貼った。Ｆ１＋４およびＦ２＋３を、予めリンスしたＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、最終的な容量が＞４００μｌとなるまで独立に濃縮した。次いで、濃縮した容量を、予めリンスしたＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、最終容量が２０μｌ以下に至るまでさらに濃縮した。
【０１４７】
各濃縮溶出液の５％を、還元条件下（２０ｍＭのＤＴＴで還元）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た４−２０％  ｔｒｉｓ−グリシン勾配ゲル）上で電気泳動し、ニトロセルロース上にトランスファーした。次いでブロットを、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０  （ＴＰＢＳ）および５％の無脂肪ドライミルク含有ＰＢＳ中で、１時間、室温でブロックした。ブロットを、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンを使用して、ＴＰＢＳ中で３０分間、室温で分離した。次いでビオチン化したタンパク質が、ＤＡＢを使用して視覚化した。ｍＢＬＡ３  Ｆ２＋３を、１３０ｋＤａ以下の分子量の範囲において、強力な１つのバンドを示した。このバンドは、マウスＩｇＧ／ＢＳＡのＦｌ＋４およびＦ２＋３の条件と比較した場合、独特であった。ｍＢＬＡ３  Ｆｌ＋４は、類似の、しかし非常に短いバンドを示した。このタンパク質を、Ａｇ−ＢＬＡ３と名づけた。
【０１４８】
ｍＢＬＡ３の濃縮溶出液の残りを、還元性の条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた４−２０％  トリス−グリシン勾配ゲル）上で電気泳動し、Ｇｅｌ−Ｃｏｄｅゲル染色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）を使用して、染色を用いて分離した。上述のウエスタンブロットで観察された１３０ｋＤａ以下の独特のバンドの場所において、本発明者は、お互いの５ｋＤａ以下以内に２つのくっきりしたバンドを隠す、１３０ｋＤａ以下の独特のあいまいな「バンド」が観察された。ウエスタンブロット法で使用した酵素的展開によって与えられたシグナルの増幅は、時々近接して移動する二重バンドを隠し得るので、両方のバンドを切り出し、サンプルを２つの近接に泳動するタンパク質であるとメモし、抗原の同定に使用した。
【０１４９】
（実施例５  質量分析のための、ｍＢＬＡ３の抗原の単離）
精製された抗体ｍＢＬＡ３を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ３０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ番号４２０８）を使用して、約１ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。約１ｍｇのｍＢＬＡ３を、製造業者の指示に従い、０．３５ｇの臭化シアン−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  カタログ番号１７−０４３０−０１）に、共有結合的に結合させた。新鮮に増殖させたＲａｖ９９２６細胞（２×１０９個以下の細胞）を、スピナーフラスコから収集した。細胞を、遠心分離によってペレットにし、次いで、１００μｌのプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ８３４０）を含有する、総量で１５ｍＬの脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）中で再懸濁した。
【０１５０】
細胞懸濁液を、−８０℃で凍結し、次いで融解した。この工程を、５サイクル繰り返し、細胞を破壊した。細胞膜を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心分離機内において、１４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃での遠心分離によって収集した。
【０１５１】
細胞膜のペレットを、２％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ界面活性剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  カタログ番号３２４６９０）および５０μｌ  Ｓｉｇｍａ  プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する２ｍｌのハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ，ＧｉｂｃｏＢＲＬ  カタログ番号１４１７５−０７９）、ｐＨ  ７．０中で再懸濁した。次いで細胞膜調製物を、一晩４℃で回転板上に置いた。
【０１５２】
細胞膜調製物を、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢの最終的な濃度が１％になるまでＨＢＳＳを用いて希釈した。不溶性の細胞残屑を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心分離機内において、１４，０００ｒｐｍで１５分間、４℃での遠心分離によって除去した。水溶性の膜タンパク質を含有する上清を収集し、アフィニティー精製において使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１５３】
細胞膜の抽出物を解凍し、次いで以前に調製したｍＢＬＡ３−アフィニティーゲルと混合し、２時間４℃で回転した。インキュベーション後、アフィニティーゲルを以下の通りにしっかり洗浄した：血清および添加剤非含有ＨＢＳＳ＋１．０％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで５回→血清および添加剤非含有ＨＢＳＳ＋０．５％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで３回→血清および添加剤非含有ＨＢＳＳ＋０．２５％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで３回→血清および添加剤非含有ＨＢＳＳ＋０．１２５％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢで２回→血清および添加剤非含有ＨＢＳＳのみで２回→ｄＨ２Ｏ中０．５Ｍ  ＮａＣｌで１回→ＰＢＳで１回。
【０１５４】
各洗浄液は、５．０ｍＬから成る（１．５ｍｌである０．５Ｍ  ＮａＣｌ洗浄を除く）。次いで抗原を、ｄＨ２Ｏ中１．５ｍｌの２％酢酸で２分間、アフィニティーゲルから溶出した。０．５Ｍ  ＮａＣｌ洗浄液および酸で溶出した抗原を得、各サンプル容量を、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｓａｖａｎｔ  カタログ番号ＩＳＳ１１０）を使用して、中程度の加熱で、２．５時間以下で、１００μｌ以下まで減らした。
【０１５５】
次いでサンプルを沈殿し、４００μＬのメタノールおよび１００μＬのクロロホルムの添加によって抽出した。サンプルをボルテックスし、次いで３００μｌのｄＨ２Ｏを加え、静かに混合した。サンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロ遠心分離機内において、１４，０００ｒｐｍで４分間、室温で遠心分離した。タンパク質を、液相の境界に局在するので、最上層のほとんどは捨てた。４００μｌのメタノールを、サンプルの残りに加え、静かに混合した。サンプルを再び１４，０００ｒｐｍで４分間、室温で遠心分離した。上清を捨て、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用してサンプルを完全に乾燥させた。
【０１５６】
乾燥サンプルを、電気泳動のための調製において、２８μｌの１×ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＮＰ００７）を加えることにより再構成した。サンプルを、１０分間、７５℃まで加熱し、次いでマイクロ遠心分離機内で遠心分離し、ボルテックスして混合した。２５μｌの各サンプルを、ｐｒｅ−ｃａｓｔ  ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＮＰ０３２２）上の１つのレーン内にロードし、引き続き抗原を同定した。２μｌを、ウエスタンブロットによる分析のために、別のレーンにロードした。適切な分子量標準物質もまた、アフィニティー樹脂でのインキュベーション前および後の細胞膜タンパク質抽出物サンプルと同様、ゲル上にロードした。電気泳動を、製造業者の指示に従って実施した。ゲルを、１０％酢酸を含有する５０％メタノール中で３０分間固定し、次いで、製造業者の指示に従い、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＬＣ６０２５）を使用して染色した。ゲルの固定しない部分を、ウエスタンブロットのために、再び製造業者の指示に従い、ニトロセルロースシート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＬＣ２０００）上にトランスファーした。次いでブロットを、ｍＢＬＡ３を用いてプローブし、ウエスタンブロットキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号ＷＢ７１０３）を使用して展開し、抗原認識を確認した。
【０１５７】
ＮｕＰＡＧＥゲル由来の染色タンパク質バンドを、清潔な外科用メスを用いて切り出し、清潔なＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れた。切り出したバンドを、質量分析によるタンパク質同定に使用するまで、−２０℃で貯蔵した。    
【０１５８】
（実施例６  ＭＡＬＤＩ質量分析）
ｍＢＬＡ３が結合する抗原を、実施例４および５に記載のように単離し、ＭＡＬＤＩ質量分析に供した。免疫アフィニティーカラムの溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、バンドを切り出して、抽出した。ゲル片を、代表的に「ゲルにおいて（ｉｎ  ｇｅｌ）」において消化した（Ｇｈａｒａｈｄａｇｈｉ，Ｆ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｒ．，Ｍｅａｇｈｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｉｍａｉ，Ｂ．Ｓ．およびＭｉｓｃｈｅ，Ｓ．Ｍ．（１９９９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０，６０１−６０５）。抽出されたペプチドを、Ｋｒａｔｏｓ，ＡＸＩＭＡ  ＣＦＲ上で、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）によって分析した。ペプチドの質量を、１００ｐｐｍ内で測定し、カーブフィールドリフレクトロン（ｃｕｒｖｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）によるイオンゲート時間（ａ  ｔｉｍｅ  ｉｏｎ  ｇａｔｅ）を、ポストソース分解（ＰＳＤ）を介して、ペプチドの単離および断片化のために使用した。研究を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｃｌａｕｓｅｒ  Ｋ．Ｒ．，Ｂａｋｅｒ  Ｐ．Ｒ．およびＢｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ａ．Ｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第７１巻，１４，２８７１−（１９９９））のＭＳＦｉｔおよびＭＳＴａｇを用いて行った。２つの主要なタンパク質にマッチする配列が得られ、これらのタンパク質は、インテグリンサブユニットαｖおよびインテグリンサブユニットβ６であった。
【０１５９】
（実施例７  ｍＢＬＡ３が結合するインテグリンαｖβ６のサブユニットの同定）
ｍＢＬＡ３がαｖサブユニットまたはβ６サブユニット、あるいは両方のいずれに結合するのかを測定するために、精製ｍＢＬＡ３抗原を、ＳＤＳゲル内で電気泳動によって分画し、ニトロセルロース膜上にトランスファーした。膜を、ｍＢＬＡ３、ヤギ抗αｖインテグリンＣ末端ペプチド（Ｑ−２０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号ｓｃ−６６１７）、マウス抗インテグリンβ６クローンＲ６Ｇ９（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＡＢ２０７５Ｚ）、マウス抗インテグリンαｖβ６クローン１０Ｄ５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＡＢ２０７７Ｚ）、および、マウス抗インテグリンβ６クローンＣＳβ６（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＭＡＢ２０７６Ｚ）を用いて、ウエスタンブロット法によってプローブした。結果は、ｍＢＬＡ３が、Ｑ−２０によって認識されたαｖサブユニットよりも約５〜１０ｋＤ小さい１つのタンパク質バンドを認識することを示した。従って、ｍＢＬＡ３はインテグリンβ６サブユニットに結合したが、インテグリンαｖサブユニットには結合しなかった。しかし、モノクローナル抗体クローン１０Ｄ５、Ｒ６Ｇ９およびＣＳβ６は、ウエスタンブロット上で、αｖバンドもβ６バンドも認識しなかったが、これは、それらの抗体がウエスタンブロット上で働かないという公表された結果に一致する。ｍＢＬＡ３抗原がインテグリンβ６であることを更に確認するために、インテグリンβ６を、抗β６抗体クローンＣＳβ６を使用してＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解物から免疫沈降し、Ｒ６Ｇ９を、ＳＤＳゲル内で電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移した。これらの膜を、ｍＢＬＡ３を用いてウエスタンブロットによりプローブした。再び、ｍＢＬＡ３は、β６に対応するタンパク質のバンドを認識した。さらに、ｍＢＬＡ３は、ウエスタンブロット上で、β６インテグリンの非還元形態のみを認識する。β−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを用いたβ６インテグリンサブユニットの還元は、ｍＢＬＡ３の結合を破壊した。
【０１６０】
ｍＢＬＡ３が、β６サブユニット以外のインテグリンに交差反応するか否かを測定するために、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ２２８）、ＳＫ−Ｏｖ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ７７）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ５８）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３０）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ  ３８）、およびＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１９９７）の細胞株を増殖し、１０％の胎仔ウシ血清で補充したＦ１２／ＤＭＥＭ培地中で、組織培養処理された９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  カタログ番号３５４０７５）内で、コンフルーエンスまで増殖させた。細胞を組織培養培地で洗浄し、次いで、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）中に５μｇ／ｍｌのｍＢＬＡ３を添加して、または添加せず、１時間、室温でインキュベートした。細胞を、次いで、１ウェル当たり１００μｌのＨＢＳＳで３回洗浄し、次に、１ウェル当たり５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ロバ抗ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖特異的抗体で、ＨＢＳＳ中に希釈した０．８μｇ／ｍｌの濃度で、３０分間、室温でインキュベートした。細胞を、最後に、ＨＢＳＳで３回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質（ＫＰＬ  カタログ番号５０−６５−００および５０−７６−０１）中で５分間インキュベートし、１ウェル当たり１００μｌの１μリン酸を加えることによって停止した。展開したプレートを、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍで読み取った。結果を図１に示した。これらの細胞株におけるｍＢＬＡ３の結合パターンは、特異的αｖβ６抗体の結合パターンに類似していたが、特異的αｖβ６抗体の結合パターンとは異なった。ＳＷ４８０（αｌ、α２、α３、α６、αｖおよびβ１を発現するが、β６および  β３は発現しない、公知の細胞株。Ｋｏｒｅｔｚ  Ｋ．ら  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４２５：２２９−３６参照）においても、ＳＫＯＶ−３細胞株（αｌ、α２、α３、α５、α６、αｖ、β１およびβ３を発現するが、β６を発現しない公知の細胞株。Ｃａｎｎｉｓｔｒａ  ＳＡら，Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ５８：２１６−２５参照）においても、ｍＢＬＡ３の特異的な結合は、存在しなかった。種々のレベルでインテグリンβ６を発現したＳＫ−ＢＲ−３細胞株、ＨＴ−２９細胞株およびＨＰＡＦ  ＩＩ細胞株に対するｍＢＬＡ３の特異的な結合があったが、これは特異的なαｖβ６について得られた結果に一致した。従って、ｍＢＬＡ３は、インテグリンβ６サブユニット特異的モノクローナル抗体である。
【０１６１】
ｍＢＬＡ３は、市販されているその他の抗体によって認識されなかったβ６インテグリンサブユニット上のエピトープに結合した。証拠の１つは、ｍＢＬＡ３非還元ＳＤＳ変性β６サブユニットに結合したが、既存のモノクローナル抗体のいずれもが結合しなかったことである。別の証拠は、競合的アッセイである。このアッセイにおいて、ＨＴ−２９細胞株を増殖させて、１０％の胎仔ウシ血清で補充したＦ１２／ＤＭＥＭ内において、９６ウェルの組織培養処理されたプレート内にコンフルーエンスまで増殖させた。細胞を、組織培養培地で洗浄し、次いで、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するハンクス平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ）内中で、０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ｍＢＬＡ３を添加して、または添加せず、１０μｇ／ｍｌの非標識化ｍＢＬＡ３、非標識化Ｒ６Ｇ９、非標識化１０Ｄ５、非標識化Ｅ７Ｐ６あるいは非特異的なマウスＩｇＧを添加して、または添加しないで、１時間、室温でインキュベートした。細胞を、次いで、ウェル当たり１００μｌのＨＢＳＳで３回洗浄し、次に、ウェル当たり５０μｌのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（２μｇ／ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で３０分間、室温でインキュベートした。細胞を、最後に、ＨＢＳＳでで３回洗浄し、１００μｌ  ＴＭＢ基質（ＫＰＬ  カタログ番号５０−６５−００および５０−７６−０１）で、５分間インキュベートし、ウェル当たり１００μｌの１μリン酸の添加によって停止した。展開したプレートを、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍで読み取った。結果を図２に示した。ｍＢＬＡ３とその他の入手可能な抗αｖβ６抗体との間に、競合は観察されなかった。同様のアッセイを、ｍＢＬＡ３精製インテグリンαｖβ６について、プレートＥＬＩＳＡフォーマット中で行った（図３）。再び、ｍＢＬＡ３とその他の入手可能な抗αｖβ６抗体との間に、競合は観察されなかった。これらのデータは、ｍＢＬＡ３が、その他の入手可能な抗αｖβ６抗体と異なり、インテグリンのβ６サブユニット上のエピトープに結合することを示す。
【０１６２】
（実施例８  フィブロネクチンへの細胞接着の阻害）
９６ウェルプレートの適切なウェルを、フィブロネクチン（０．５μｇ／ウェル）で、１時間、室温でコーティングした。これを除去し、プレート全体を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを用いて、３７℃で３０分間ブロックした。これを除去し、抗体を、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の適切なウェルに加えた。ＳＫＢＲ３細胞を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて、ストック組織培養シャーレから取り除いた。細胞を遠心分離し、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２中に再懸濁した。１．５×１０４細胞を各ウェルに加えられるように密度を調整した。３７℃で１時間後、シャーレを、ペーパータオル上におき、培地および未接着細胞を除去し、ウェル当たり１００μｌのＰＢＳでゆっくり洗浄し、再度ペーパータオル上においた。接着して残っている細胞を、固定剤を含有するクリスタルバイオレットで１０分間染色した。これを完全に洗浄し、プレートを乾燥させた後、光学濃度を、プレート読み取り装置上で、５４０で読み取った。図４に示すように、ｍＢＬＡ３は、ＳＫＢＲ３のフィブロネクチンへの接着を阻害する。
【０１６３】
（実施例９  ｍＢＬＡ３抗体の、腫瘍を有する組織への結合についての免疫組織化学）
凍結組織サンプルを、ＯＣＴ化合物内に包埋し、ドライアイスを用いてイソペンタン内ですばやく凍結した。凍結切片を、Ｌｅｉｃａ  ３０５０  ＣＭマイクロトームを用いて、５μｍの厚さで薄切し、解凍してスライドガラス上に乗せた。切片を、エタノールを用いて、−２０℃で固定し、室温で一晩、空気乾燥した。固定した切片を、使用するまで、−８０℃で保存した。免疫組織化学のために、組織の切片を回収し、まずブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、５％  正常ヤギ血清、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で３０分間、室温でインキュベートし、次いで、ブロッキング緩衝液（１μｇ／ｍｌ）中で希釈したｍＢＬＡ３およびコントロールモノクローナル抗体を用いて、１２０分間インキュベートした。次いで切片を、ブロッキング緩衝液を用いて３回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０５）および０．００３％  過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｈ１００９）中ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼ結合体、および、ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｄ５６３７）で検出した。染色したスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、Ｎｉｋｏｎの顕微鏡を用いて調べた。
【０１６４】
図５は、中程度に分化した肺腺癌および潤滑性乳管腺癌におけるｍＢＬＡ３抗体の特異的な結合（茶色）を示す。凍結腫瘍サンプルを、ＯＣＴに包埋し、６μｍで薄切し、エタノールで固定した。免疫組織化学を、凍結切片について、前述の通りに実行した。細胞核を、ヘマトキシリンを用いて対比染色した（薄青）。組織内のすべての癌細胞が、ｍＢＬＡ３を結合する細胞表面抗原について陽性であった。
【０１６５】
いくつかの場合において、パラフィン包埋したホルムアルデヒド固定組織を、適切な抗原回収方法を用いた後、免疫組織化学に使用した。このような抗原回収方法の１つは、ＭａｎｇｈａｍおよびＩｓａａｃｓｏｎ，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３５：１２９−３３（１９９９）に記載されている。抗原回収および／または検出のその他の方法は、当業者によって使用され得る。凍結組織と、または、適切な場合は、固定組織と抗原の回収およびｐｏｌｙＭＩＣＡ検出とを用いて実行された同様の実験から、結果が得られた。種々の正常組織および癌組織に対する、ｍＢＬＡ３の結合を、評価した。すべての場合において、コントロール固定組織における抗体の結合は、凍結組織の場合と相関した。この２つがコントロールにおいてマッチしなかった場合にのみ、凍結組織から得られた結果を使用した。便宜上、表１は、５つの異なる供給源に由来する凍結腫瘍組織を使用した、ｍＢＬＡ３を有する５つの主な腫瘍型を代表する原発性腫瘍サンプルの染色に関する、結果の組み合わせを示す。各腫瘍型について、ｍＢＬＡ３の抗原、すなわちβ６インテグリンサブユニットに陽性を示した腫瘍の数、および、試験されたこのような腫瘍の総数を示す（＋／総数）。ｍＢＬＡ３を結合する腫瘍のパーセンテージも示す。
【０１６６】
【表１】
2006506323.tif 000002
表２は、固定腫瘍組織、あるいは凍結腫瘍組織を使用した、ｍＢＬＡ３を有する７つの転移性腫瘍型の染色の、合成した結果を示す。各腫瘍型について、ｍＢＬＡ３の抗原に対して陽性を示した腫瘍の数、および、試験されたこのような腫瘍の総数を示す（＋／総数）。ｍＢＬＡ３を結合する腫瘍のパーセンテージも示す。表２に示されるように、ｍＢＬＡ３は、試験された転移性腫瘍型の約９２％に結合した。この結果は、表１と比較すると、ｍＢＬＡ３の結合が、転移性腫瘍のマーカーとして使用され得ることを示唆した。
【０１６７】
【表２】
2006506323.tif 000003
（実施例１０  ＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭから得た免疫細胞化学の結果）
モノクローナル抗体ｍＢＬＡ３を、異なる型の組織に由来する種々の細胞株  との反応性を試験するために使用した。異なる樹立細胞株に由来する細胞を、プロテアーゼを使用せずに増殖表面から除去し、圧縮し、ＯＣＴ化合物に包埋した。細胞を凍結し、薄切し、次いで、標準的なＩＨＣプロトコルを使用して染色した。ＣｅｌｌＡｒｒａｙＴＭの技術は、ＷＯ０１／４３８６９に記載されている。ＣｅｌｌＡｒｒａｙの結合実験から得られた結果を、表３にまとめる。
【０１６８】
【表３】
2006506323.tif 000004
（実施例１１  正常な組織に対するｍＢＬＡ３の結合）
外科的な切除によって得られた正常な組織を、凍結し、腫瘍組織と共にマウントした。凍結切片を、Ｌｅｉｃａ  ３０５０  ＣＭマイクロトームを用いて厚さ５μｍに薄切し、ｖｅｃｔａｂｏｕｎｄコートしたスライド上に解凍マウントした。切片を、エタノールを用いて２０℃で固定し、室温で一晩、空気乾燥した。主要な抗体ｍＢＬＡ３を、１〜１００の希釈率で使用した（最終濃度は１μｇ／ｍｌ）。組織の切片を回収し、はじめにブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、５％  正常ヤギ血清、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で、室温で３０分間インキュベートし、次いで、ｍＢＬＡ３およびブロッキング緩衝液中に希釈したコントロールモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を用いて、１２０分間、インキュベートした。次いで切片を、ブロッキング緩衝液で３回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０５）および０．００３％  過酸化水素（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｈ１００９）中の、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２−ペルオキシダーゼ結合体、および、ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｄ５６３７）を用いて検出した。染色したスライドを、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、正常な皮膚に対するｍＢＬＡ３の結合を測定するために、Ｎｉｋｏｎの顕微鏡下で、ｐｏｌｙＭＩＣＡＴＭ検出キットを使用して調べた。ｍＢＬＡ３を有する正常組織の染色の結果を、表４に示す。表５は、ｍＢＬＡ３抗原に陽性を示す個々の腫瘍および正常な組織の免疫組織化学的染色の強度の総括を示す。
【０１６９】
【表４】
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【０１７０】
【表５】
2006506323.tif 000006
（実施例１２  ＨＴ−２９大腸癌腫細胞およびＨＰＡＦ−ＩＩ膵臓腺癌細胞の細胞増殖に対するｍＢＬＡ３の効果）
単層として増殖させた場合にインビトロでの細胞数を減少させる抗体の能力は、種々の量のテスト用精製抗体またはコントロール用精製抗体の存在下、あるいは非存在下で増殖させた細胞の単層を使用して、評価され得る。また、細胞数の変化は、ＭＴＴを使用して評価され得る。ＭＴＴは、ミトコンドリアの酵素の活性を測定し、関連する生存可能な細胞数と相関する、染料である。所定の細胞をプレート培養し、９６ウェルプレート内で、１０％の胎仔ウシ血清で補充されたＦ１２／ＤＭＥＭ（１：１）増殖培養培地中で増殖した。以下の細胞株を、９６ウェルシャーレ３枚分のウェル内で、以下の濃度でプレート培養した：ＨＴ−２９およびＨＰＡＦ−ＩＩ、ウェル当たり１０，０００個の細胞）。プレート後すぐに、ｍＢＬＡ３を、異なる最終濃度（０〜５０μｇ／ｍｌの範囲）で、培地に加えた。細胞を、加湿したインキュベーター内で、空気中５％のＣＯ２で、３７℃で４日間インキュベートした。アッセイの最後に、ＭＴＴを、ＰＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、１：１０の希釈度で、ウェルに直接加えた。プレートを、またインキュベートに戻して４時間置いた。インキュベート後、培地を除去し、１００μｌのＤＭＳＯを加えてＭＴＴ沈降物を可溶化した。プレートを、プレート読み取り装置上で、５４０で読み取った。
【０１７１】
最初の実験は、ｍＢＬＡ３が、用量依存的様式で、ＨＴ−２９大腸癌腫細胞の増殖を阻害することを示した。しかし、追加的な実験では、この結果を繰り返すことができなかった。ｍＢＬＡ３はまた、最終濃度が５０μｇ／ｍｌの場合において、ＨＰＡＦ−ＩＩ膵臓腺癌細胞の増殖を阻害しなかった。
【０１７２】
（実施例１３  インビボでのヒト腫瘍異種移植に対する抗体活性）
ヒトの腫瘍に対するｍＢＬＡ３の阻害効果を、ヒトの腫瘍の異種移植を有するマウスに抗体を注射することにより試験した。特に、ＨＴ２９細胞（ヒトの結腸癌腫株）を、１０％の胎仔ウシ血清で補充したＦ１２／ＤＭＥＭ培地中で増殖させた。細胞をプレートから除去し、ペレットにし、１００，０００個の細胞を、５０μｌの中和されたタイプ１ラットテールコラーゲンに再懸濁した。細胞／コラーゲンの混合物を、１５分間、３７℃におき、次いで、増殖培養培地を満たし、一晩培養した（Ｗａｎｇら，２００  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６０：６００８−６０１７参照）。次いで細胞を、成熟オス胸腺欠損（ＢＡＬＢ−ｎｕ／ｎｕ）マウスの腎臓莢膜の下にグラフトした（１つの腎臓にはＨＴ２９を用いた）。細胞の移植片を、７日間増殖させた。７、１０、１３日目に、動物に、体重１ｋｇ当たり５０ｍｇのｍＢＬＡ３を、腹腔内に注射した。コントロール用の動物には、生理食塩水を注射した。２０日目に（最初の注射から１３日目に）、動物を屠殺し、取り出された細胞移植片を、パラホルムアルデヒド固定し、上述のように薄切するために、パラフィン包埋した。
【０１７３】
無処置コントロールは、大きく異常な黄色の腫瘍の塊の、肝臓への浸潤を示した（図６）。ｍＢＬＡ３で処理したグラフトは、いくらかのアポトーシスおよび壊死の部分を有する、より小さく圧縮された腫瘍の塊を示し、グラフト内の細胞は、無処置コントロールの動物とかなり異なる形態を示した（図６および図７）。処置動物においては、腫瘍全体を、隣接する肝臓から容易に分離し得たが、無処置動物においては、分離し得なかった。実際、無処置コントロールにおける腫瘍は、肝臓に浸潤したのが、切片において見られ得た（図７）。これらの結果は、ｍＢＬＡ３抗体が、無処置コントロール動物における未分化型浸潤性腫瘍と比較すると、より良い分化およびより少ない浸潤性表現型を有する、腫瘍の塊の減少を引き起こす活性があることを示した。これらの結果は、ｍＢＬＡ３のインテグリンαｖβ６への結合が、腫瘍細胞を阻害および／または殺傷するために十分であることを示唆した。
【０１７４】
（実施例１４  癌細胞に対するｍＢＬＡ３および毒素結合抗マウスＩｇＧの効果）
Ｍａｂ−ＺＡＰ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）結合抗マウスＩｇＧであり、タンパク質合成を阻害する毒素である。この毒素は、細胞膜に対して不透過性である。モノクローナル抗体が、内在性細胞表面抗原に結合される場合、毒素結合体は、結合されたモノクローナル抗体に結合し得、内在化され得、最終的に細胞を殺傷し得る。毒性活性の実証のための内在化に依存して、Ｍａｂ−ＺＡＰは、所定の表面抗原が、細胞毒性効果を発現するための内在化に依存する任意の毒素に対して、適切な標的としての役割を果たすか否かを評価するのに役立ち得る。従って、Ｍａｂ−ＺＡＰは、このような内在化依存性毒素（たとえば、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、およびカリチケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ））のためのモデルとして寄与する。
【０１７５】
ｍＢＬＡ３およびサポリン結合抗マウスＩｇＧの腫瘍細胞による内在化、ならびに、サポリンの内在化後に腫瘍細胞を殺傷する効果を試験するために、ヒト前立腺癌細胞、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０）および２２ＲＶ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２５０５）；ヒト結腸癌細胞、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３８）；ヒト乳癌細胞、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ３０）を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてストックフラスコから取り出し、遠心分離した。細胞を、１ｍｌ当たり５０，０００個の割合で、適切な培地中に再懸濁し、９６ウェルプレート内に、ウェル当たり１００μｌをプレートした。抗体ｍＢＬＡ３を、１０×の濃度で、適切なウェルに直ちに加え、最終濃度を１０μｇ／ｍｌとした。１５分後、室温で、Ｍａｂ−ＺＡＰ（カタログ番号ＩＴ−０４，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を、適切なウェルに１０×の濃度で加え、最終濃度を０．００１ｐＭ〜１０４ｐＭとした。４日間の増殖後、ＭＴＴを、３７℃で４時間加えた（ストック５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ、ウェルにおいて１：１０の希釈）。次いで、すべてのウェルから培地を除去し、ウェル当たり１００μｌのＤＭＳＯを加えた。プレートを静かに旋回し、青色のＭＴＴ沈殿物を可溶化し、プレートを、プレート読み取り装置を用いて、５４０ｎｍで読み取った。
【０１７６】
Ｍａｂ−ＺＡＰを、０．００１〜１０４ｐＭ加えた場合、ｍＢＬＡ３非存在下の染色の場合に比較して、ｍＢＬＡ３存在下でのヒトの結腸癌細胞ＨＴ２９およびヒトの乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３におけるＭＴＴ染色において、減少は見られなかった。このことは、ｍＢＬＡ３およびＭａｂ−ＺＡＰが、これらの条件下において、これらの癌細胞の増殖を阻害しなかったことを示している。
【０１７７】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例証する目的のためだけに記載され、それらに照らした種々の改変または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲に包含されるべきであることが理解される。本明細書中で挙げられた全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々独立の刊行物、特許または特許出願が、独自にかつ個別に参考として援用されることを示されるのと同じ程度に、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、ｍＢＬＡ３、抗−αｖβ６、またはαｖβ３を用いた、生細胞ＥＬＩＳＡを示す。ＳＷ４８０は、αＶを発現するが、β３サブユニットまたはβ６サブユニットを発現しない。ＳＫＯＶ３およびＳＫＭＥＳは、αｖβ３を発現するが、β６を発現しない。ＳＫＢＲ３およびＨＴ−２９は、αｖβ６を発現するが、β３を発現しない。
【図２】図２は、ＨＴ−２９細胞またはＳＫＯＶ３細胞における結合についての抗体競合を示す。Ｒ６Ｇ９（抗−β６）、Ｅ７Ｐ６（抗−αｖβ６）、および１０Ｄ５（抗−αｖβ６）を、１０μｇ／ｍｌで使用し、ｍＢＬＡ３を、１μｇ／ｍｌで使用した。
【図３】図３は、精製インテグリンαｖβ６における結合についての抗体競合を示す。Ｒ６Ｇ９（抗−β６）、Ｅ７Ｐ６（抗−αｖβ６）、および１０Ｄ５（抗−αｖβ６）を、１０μｇ／ｍｌで使用し、ｍＢＬＡ３を、１μｇ／ｍｌで使用した。
【図４】図４は、ＳＫＢＲ３のフィブロネクチンへの結合に対するｍＢＬＡ３の効果を示す。
【図５】図５は、免疫組織化学の顕微鏡写真であり、ｍＢＬＡ３抗体の中程度に分化した肺腺癌および潤滑性乳腺管癌における特定の結合を示す。凍結腫瘍サンプルは、ＯＣＴ中に包理し、６μｍで等切し、エタノールで固定した。凍結切片について、免疫組織化学を実施例９に記載されるように実施した。細胞核を、ヘマトキシリンで対比染色した。
【図６】図６は、ｍＢＬＡ３の、胸腺欠損マウスからのＨＴ２９ヒト腫瘍異種移植片に対する効果を示すインサイチュの写真である（生理食塩水（コントロール、下）またはｍＢＬＡ３（上）による処置後１３日）。
【図７】図７は、図６に示したヒトＨＴ２９腫瘍の異種移植片の切片を低倍率および高倍率で示した。上パネル（低倍率）は、肝臓（矢印）に侵入するコントロールＨＴ２９腫瘍および周囲の健全な肝組織を示す。処置した腫瘍は、コントロールの低分化型の攻撃的な癌細胞と比較して、緻密かつ高分化型である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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