(57)【要約】本発明は、ある化合物が細胞へのウイルス侵入を阻害するかどうかを同定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）ウイルスに感染した患者からウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を取得するステップ；（ｂ）第１細胞中に、（ｉ）ステップ（ａ）の核酸と、（ｉｉ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクターと、を共トランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルス粒子と第２細胞とを該化合物の存在下で接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられたシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を該化合物の不在下で生成されたシグナルの量と比較するステップ、を含み、化合物の存在下で測定したシグナルの量が低下していれば、該化合物が第２細胞へのウイルス侵入を阻害することを示すものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法であって、
（ａ）宿主細胞と患者由来の抗体調製物を接触させるステップであって、該宿主細胞が患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸及び検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むものである、上記ステップ、
（ｂ）宿主細胞により発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ、並びに
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、
を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである、上記方法。
【請求項２】
ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法であって、
（ａ）第１細胞中に、
（ｉ）患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）該ウイルスタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクター
とをトランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたウイルス粒子と患者由来の抗体調製物とを接触させるステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）のウイルス粒子及び抗体調製物と第２細胞とを接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；
（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ；並びに、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、
を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が、感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである、上記方法。
【請求項３】
ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法であって、
（ａ）第１細胞中に、
（ｉ）患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）該ウイルスタンパク質をコードする核酸を含まないウイルス発現ベクター
とをトランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたウイルス粒子と患者由来の抗体調製物とを接触させるステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）のウイルス粒子及び抗体調製物と第２細胞とを接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現し、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むものである、上記ステップ；
（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ；並びに、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、
を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである、上記方法。
【請求項４】
ウイルスタンパク質がエンベロープタンパク質である、請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
ウイルスタンパク質がキャプシドタンパク質である、請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項６】
ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法であって、
（ａ）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸と、
（ｉｉ）該ウイルスタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクター
とを含む第１細胞をインキュベートし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたウイルス粒子と患者由来の抗体調製物とを接触させるステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）のウイルス粒子及び抗体調製物と第２細胞とを接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；
（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ；並びに、
（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、
を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである、上記方法。
【請求項７】
（ｉ）の核酸が（ｉｉ）のウイルス発現ベクターの一部である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）の核酸が第１細胞のゲノムに組み込まれる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
（ｉｉ）のウイルスベクターが第１細胞のゲノムに組み込まれる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）の核酸及び（ｉｉ）のウイルスベクターが第１細胞のゲノムに組み込まれる、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスタンパク質がキャプシドタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスタンパク質がエンベロープタンパク質である、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）の核酸が（ｉｉ）のウイルス発現ベクターの一部である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）の核酸が第１細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
（ｉｉ）のウイルスベクターが第１細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）の核酸及び（ｉｉ）のウイルスベクターが第１細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えウイルスアッセイを用いてウイルス受容体／共受容体の利用能及びウイルス侵入阻害剤を評価するための組成物及び方法に関する。
【０００２】
本出願を通して、各種の刊行物は本文中では著者及び発行年によって記載される。これらの刊行物の完全な引用は、本明細書の末尾にアルファベット順に掲載してある。本明細書に引用する全ての特許、特許出願及び刊行物は、前掲又は後掲にかかわらず、その全体を参考として本明細書に含めるものとする。ここに記載しかつ特許請求する発明の出願日当時に当業者に知られていた技術水準をより詳しく説明するため、これらの刊行物の開示内容をそのまま参考として本出願中に組み入れる。
【背景技術】
【０００３】
ウイルス侵入は抗ウイルス治療にとって魅力的な新しい標的であり、ウイルスの付着又は膜融合を阻止するように設計された約１０種の薬物が現在臨床前又は臨床試験において評価中である（Richman, 1998; PhRMA, 1999; Stephenson, 1999）。エンベロープを持つ動物ウイルスは、ビリオン膜中のウイルスタンパク質（エンベロープタンパク質）と細胞表面タンパク質（ウイルス受容体）間の相互作用によって、宿主細胞に付着し、侵入する。受容体の認識及び結合は表面エンベロープタンパク質によって仲介される。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
したがって、本発明の目的の１つは、ウイルス侵入の阻害剤に対するウイルスの感受性を測定するための迅速で感度のよい表現型アッセイを提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は、多様な起源に由来するウイルスエンベロープタンパク質を含有するウイルス粒子を産生するレトロウイルスベクター系、及びウイルス受容体を発現しかつウイルス複製を許容する細胞系の同定を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、エンベロープ遺伝子をコードする患者由来の核酸断片を受容する能力がある、ウイルスエンベロープのための発現ベクターを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、ＨＩＶ−１ウイルスゲノムの大部分を保有するが、エンベロープ領域の代わりにルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有する、生物学的に安全なベクターを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、ＨＩＶ−１ゲノムの転写調節領域（Ｕ３の３’コピー）を欠失しているウイルス発現ベクターを提供することにより、組換え感染性ＨＩＶ−１が形成される可能性を低減させた表現型アッセイを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、受容体／共受容体指向性（tropism）を同定及び判定することができ、指向性ウイルス株に感染した患者を迅速かつ正確に同定するアッセイを提供することである。
【００１０】
これらの及び他の目的は、本発明に係る、ある化合物に対するウイルスの感受性が改変されたかどうかを調べる方法により達成されうる。該方法は、（ａ）宿主細胞と化合物とを接触させるステップであって、該宿主細胞がウイルス由来の核酸及び指標遺伝子を含み、該指標遺伝子の活性がウイルス由来の核酸の活性により影響を受け、それにより該ウイルス由来の核酸の活性の変化が指標遺伝子の活性の変化をもたらすものであり、該化合物はウイルス由来の核酸又はそれがコードするタンパク質を直接又は間接的に標的とするものである、上記ステップ、並びに（ｂ）上記指標遺伝子の活性を検出するステップ、を含み、上記化合物の不在下における活性と比較した場合の上記化合物と接触させた宿主細胞の上記指標遺伝子の活性の差が、該化合物に対するウイルスの感受性の改変を示すものである。
【００１１】
本発明の１態様において、第１細胞は、ウイルスタンパク質をコードするウイルス由来の核酸、及び、検出可能なシグナルを発する指標核酸を含みかつウイルスタンパク質をコードする核酸を含まないウイルス発現ベクターを含み、それにより第１細胞は、上記ウイルス由来の核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生する。第１細胞は、第２細胞（例えば宿主細胞）と、上記化合物の存在下にて接触させうるが、第２細胞は、ウイルス粒子が結合する細胞表面受容体を発現するものである。一実施形態において、本発明は、ある化合物が細胞へのウイルス侵入を阻害するかどうかを同定する方法を提供し、前記方法は、（ａ）ウイルスに感染した患者からウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を取得するステップ；（ｂ）第１細胞中に、（ｉ）ステップ（ａ）の核酸と、（ｉｉ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクターとをトランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸にコードされるエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルス粒子と第２細胞とを化合物の存在下で接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現する、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられるシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を該化合物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、該化合物の存在下で測定したシグナルの量が低下していれば、該化合物が第２細胞へのウイルス侵入を阻害することを示すものである。
【００１２】
別の態様において、第１細胞は、ウイルスタンパク質をコードするウイルス由来の核酸、及びウイルスタンパク質をコードする核酸を含まないウイルス発現ベクターを含み、それにより第１細胞は、上記ウイルス由来の核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生する。第１細胞は、第２細胞（例えば宿主細胞）と、上記化合物の存在下にて接触させうるが、第２細胞は、ウイルス粒子が結合する細胞表面受容体を発現するものである。さらに、第２細胞は、検出可能なシグナルを発する指標核酸を含む。一実施形態において、指標核酸は第２細胞の核酸に組み込まれる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法を提供し、該方法は、（ａ）宿主細胞と患者由来の抗体調製物を接触させるステップであって、該宿主細胞が患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸及び検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むものである、上記ステップ、（ｂ）宿主細胞により発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ、並びに（ｃ）ステップ（ｂ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法を提供し、該方法は、（ａ）第１細胞中に、（ｉ）患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸と、（ｉｉ）該ウイルスタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクターとをトランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたウイルス粒子と患者由来の抗体調製物とを接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）のウイルス粒子及び抗体調製物と第２細胞とを接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が、感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法を提供し、該方法は、（ａ）第１細胞中に、（ｉ）患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸と、（ｉｉ）該ウイルスタンパク質をコードする核酸を含まないウイルス発現ベクターとをトランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたウイルス粒子と患者由来の抗体調製物とを接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）のウイルス粒子及び抗体調製物と第２細胞とを接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現し、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである。
【００１６】
一実施形態において、ウイルスタンパク質はエンベロープタンパク質である。別の実施形態において、ウイルスタンパク質はキャプシドタンパク質である。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、ウイルスに感染した患者における、感染を阻止可能な抗体応答の発生を検出する方法を提供し、該方法は、（ａ）（ｉ）患者由来のウイルスタンパク質をコードする核酸と、（ｉｉ）該ウイルスタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクターとを含む第１細胞をインキュベートし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるウイルスタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）で産生されたウイルス粒子と患者由来の抗体調製物とを接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）のウイルス粒子及び抗体調製物と第２細胞とを接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられる検出可能なシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を、抗体調製物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、抗体調製物の存在下で測定されたシグナル量の低減は、患者が感染を阻止可能なウイルスタンパク質に対する抗体応答を発生したことを示すものである。一実施形態において、（ｉ）の核酸は（ｉｉ）のウイルス発現ベクターの一部である。別の実施形態において、（ｉ）の核酸は第１細胞のゲノムに組み込まれる。別の実施形態において、（ｉｉ）のウイルスベクターは、第１細胞のゲノムに組み込まれる。別の実施形態において、（ｉ）の核酸及び（ｉｉ）のウイルスベクターが第１細胞のゲノムに組み込まれる。一実施形態において、ウイルスタンパク質はキャプシドタンパク質である。別の実施形態において、ウイルスタンパク質はエンベロープタンパク質である。
【００１８】
図面の説明
図１Ａ：エンベロープ発現ベクター及びウイルス発現ベクターの構造
ＨＩＶエンベロープ発現ベクター（ｐＨＩＶｅｎｖ）を、患者の血漿サンプルから増幅されたエンベロープ配列を取り込むように改変する。符号ａ／ｂ及びｃ／ｄは、ＨＩＶ−１エンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）の５’及び３’末端に位置する制限エンドヌクレアーゼを指す。ＨＩＶ発現ベクター（ｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３）は、エンベロープポリタンパク質以外の全てのＨＩＶタンパク質をコードする。エンベロープ遺伝子の一部を欠失させて指標遺伝子カセットを受け入れるようにした。この場合の指標遺伝子カセットは、抗ウイルス薬の存在又は不在下で複製するウイルスの能力をモニタリングするために使用される「ホタルルシフェラーゼ」である。３’Ｕ３領域を部分的に欠失させて、感染細胞中での５’ＬＴＲからの転写を防止した。この系で産生されたウイルスは複製が１回に限定される。
【００１９】
図１Ｂ：細胞ベースの侵入アッセイ
宿主細胞をｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３で共トランスフェクトすることによって、薬物感受性、共受容体指向性及びウイルス中和試験を実施する。この宿主細胞は、試験ウイルス又は患者サンプル由来のＨＩＶエンベロープ配列で偽タイピングされたＨＩＶ粒子を産生する。トランスフェクション後（約４８時間）にウイルス粒子を採取し、これらのウイルス粒子を用いて、ＨＩＶ受容体（例えばＣＤ４）及び共受容体（例えばＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）を発現する標的細胞に感染させる。感染後（約７２時間）、標的細胞を溶解させて、ルシフェラーゼ活性を測定する。ＨＩＶが標的宿主細胞への感染に成功してルシフェラーゼ活性を生じるためには１回の複製を完遂しなければならない。ウイルスが標的細胞に侵入することができない場合は、ルシフェラーゼ活性は減衰する。このシステムを使用して、侵入阻害剤に対する感受性、受容体及び共受容体指向性、ならびにウイルス中和を評価することができる。
【００２０】
図２：ＨＩＶエンベロープ発現ベクター
ＨＩＶエンベロープ配列を患者サンプルから増幅し、制限エンドヌクレアーゼ部位（５’ａ／ｂ及び３’ｃ／ｄ）を用いて発現ベクターに挿入する。エンベロープの転写はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の極初期遺伝子プロモーターによって駆動する。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル配列（Ａ＋）を使用して、エンベロープＲＮＡをポリアデニル化する。ＣＭＶプロモーターとＨＩＶエンベロープ配列の間に位置するイントロンは、トランスフェクト細胞中でエンベロープｍＲＮＡのレベルが増加するように設計する。ＦＬは、全長エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１）を発現する。ΔＣＴは、ｇｐ４１のＣ末端細胞質テイルドメインを欠失したエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ２１）を発現する。＋ＣＴは、一定のあらかじめ確定されたｇｐ４１細胞質テイルドメインを含むエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１）を発現する。ｇｐ１２０は、一定のあらかじめ確定されたｇｐ４１とともに患者由来のｇｐ１２０タンパク質を発現する。ｇｐ４１は、患者由来のｇｐ４１タンパク質とともに一定のあらかじめ確定されたｇｐ１２０を発現する。
【００２１】
図３Ａ：共受容体指向性スクリーニングアッセイ
この図では、２種の細胞系を使用してアッセイを実施する。一方の細胞系はＣＤ４及びＣＣＲ５を発現する（上部の６パネル）。他方の細胞系はＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現する（下部の６パネル）。ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターでトランスフェクトした細胞に由来する多数の組換えウイルスストックを細胞に感染させることによって、アッセイを実施する。示した例は、９６ウェルプレートにフォーマット化された９６のウイルスの分析を表す。薬物の不在下（薬物なし）、又はＲ５指向性（ＣＣＲ阻害剤）もしくはＸ４指向性（ＣＸＣＲ４阻害剤）ウイルスのいずれかを優先的に阻害する薬物の存在下で、感染を実施する。共受容体指向性は、薬物の存在下及び不在下の両方で、各細胞型において生成されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって評価する（アッセイ結果の解釈については、図３Ｂを参照のこと）。
【００２２】
図３Ｂ：共受容体指向性の判定
この図では、アッセイ結果を解釈するにあたって、ＣＤ４／ＣＣＲ５を発現する細胞（Ｒ５細胞）又はＣＤ４／ＣＸＣＲ４を発現する細胞（Ｘ４細胞）中で感染する（ルシフェラーゼ活性を生成する）各サンプルウイルスの能力を比較する。感染を特異的に阻止する（ルシフェラーゼ活性を阻害する）ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４阻害剤の能力も評価される。Ｘ４指向性ウイルス（緑色パネル）は、Ｘ４細胞に感染するがＲ５細胞には感染しない。Ｘ４細胞の感染はＣＸＣＲ４阻害剤によって阻止される。Ｒ５指向性ウイルス（青色パネル）は、Ｒ５細胞に感染するがＸ４細胞には感染しない。Ｒ５細胞の感染はＣＣＲ５阻害剤によって阻止される。二重指向性又はＸ４／Ｒ５混合物（黄色パネル）は、Ｘ４細胞とＲ５細胞に感染する。Ｒ５細胞の感染はＣＣＲ５阻害剤によって阻止され、Ｘ４細胞の感染はＣＸＣＲ４阻害剤によって阻止される。生存不能ウイルス（赤色パネル）は、Ｘ４細胞又はＲ５細胞のいずれでも複製しない。
【００２３】
図４Ａ：侵入阻害剤に対する感受性の測定：融合阻害剤
この図では、融合阻害剤Ｔ−２０に対する感受性を実証する。ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する細胞を、Ｔ−２０の不在下、及び広範囲にわたるＴ−２０濃度で感染させた（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）。Ｔ−２０の存在下で感染細胞により生成されたルシフェラーゼの量を、Ｔ−２０の不在下で生成されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。Ｒ５指向性、Ｘ４指向性及び二重指向性ウイルスを試験した。薬物感受性は、ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＴ−２０濃度（ＩＣ５０、垂直破線で示す）を決定することによって示される。より低いＩＣ５０値を持つウイルスの方が、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＴ−２０に対して感受性である。ＮＬ４−３：十分に特性決定されたＸ４指向性株；ＪＲＣＳＦ：十分に特性決定されたＲ５指向性株；９１ＵＳ００５．１１：NIHのAIDS Research and Reference Reagent Program （ＡＲＲＲＰ）から入手したＲ５指向性分離株；９２ＨＴ５９３．１：NIH ARRRPから入手した二重指向性（Ｘ４Ｒ５）分離株；９２ＨＴ５９９．２４：NIH ARRRPから入手したＸ４指向性分離株。
【００２４】
図４Ｂ：侵入阻害剤に対する感受性の測定：薬物耐性突然変異
この図では、ｇｐ４１エンベロープタンパク質中の特定の薬物耐性突然変異によって賦与された、融合阻害剤Ｔ−２０に対する感受性の低下を実証する。ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する細胞を、Ｔ−２０の不在下、及び広範囲にわたるＴ−２０濃度で感染させた（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）。Ｔ−２０の存在下で感染細胞により生成されたルシフェラーゼの量を、Ｔ−２０の不在下で生成されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。ｇｐ４１膜貫通エンベロープタンパク質中に１つ又は２つの特定の突然変異を持つ同質遺伝子（isogenic）ウイルスを試験した（図の説明中では赤で強調してある）。薬物感受性は、ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＴ−２０濃度（ＩＣ５０、垂直破線で示す）を決定することによって示される。より低いＩＣ５０値を持つウイルスの方が、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＴ−２０に対して感受性である。  
突然変異なし（野生型配列）：ＧＩＶ
単一突然変異：ＧＩＶ、ＤＩＭ、ＳＩＶ
二重突然変異：ＤＩＭ、ＳＩＭ、ＤＴＶ
【００２５】
図５Ａ：侵入阻害剤に対する感受性の測定：ＣＣＲ５阻害剤
この図では、ＣＣＲ５阻害剤（ｍｅｒｃｋ化合物）に対する感受性を実証する。ＣＤ４及びＣＣＲ５を発現する細胞（Ｒ５細胞）を、ＣＣＲ５阻害剤の不在下、及び広範囲にわたるＣＣＲ５阻害剤濃度で感染させた（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）。ＣＣＲ５阻害剤の存在下で感染細胞により生成されたルシフェラーゼの量を、ＣＣＲ５阻害剤の不在下で生成されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。Ｒ５指向性、Ｘ４指向性及び二重指向性ウイルスを試験した。薬物感受性は、ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＣＣＲ５阻害剤濃度（ＩＣ５０、垂直破線で示す）を決定することによって示される。より低いＩＣ５０値を持つウイルスの方が、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＣＣＲ５阻害剤に対して感受性である。Ｘ４指向性ウイルスはＲ５細胞に感染しなかった。ＮＬ４−３：十分に特性決定されたＸ４指向性株；ＪＲＣＳＦ：十分に特性決定されたＲ５指向性株；９２ＨＴ５９３．１：ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰから入手した二重指向性（Ｘ４Ｒ５）分離株。
【００２６】
図５Ｂ：侵入阻害剤に対する感受性の測定：ＣＸＣＲ４阻害剤
この図では、ＣＸＣＲ４阻害剤（ＡＭＤ３１００）に対する感受性を実証する。ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現する細胞（Ｘ４細胞）を、ＣＸＣＲ４阻害剤の不在下、及び広範囲にわたるＣＸＣＲ４阻害剤濃度で感染させた（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）。ＣＸＣＲ４阻害剤の存在下で感染細胞により生成されたルシフェラーゼの量を、ＣＸＣＲ４阻害剤の不在下で生成されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。Ｒ５指向性、Ｘ４指向性及び二重指向性ウイルスを試験した。薬物感受性は、ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＣＸＣＲ４阻害剤濃度（ＩＣ５０、垂直破線で示す）を決定することによって示される。より低いＩＣ５０値を持つウイルスの方が、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＣＣＲ５阻害剤に対して感受性である。Ｒ５指向性ウイルスはＸ４細胞に感染しなかった。  
ＮＬ４−３：十分に特性決定されたＸ４指向性株；
ＪＲＣＳＦ：十分に特性決定されたＲ５指向性株；
９２ＨＴ５９３．１：ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰから入手した二重指向性（Ｘ４Ｒ５）分離株。
【００２７】
図６：エンベロープ配列の増幅
この図では、全長エンベロープ配列又は細胞質側テイルを欠失したエンベロープ配列に対応する増幅産物が生成されることを実証する。レーン番号はゲルの右側の各番号の隣に示した共受容体指向性に対応する。
【００２８】
図７：標的細胞受容体及び共受容体発現
ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４のいずれかに対する抗体（Ｙ軸上に示す）を使用するＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーティング）アッセイの結果を表す点図表プロットを示す。細胞系はプロットの下に示した共受容体を発現し、ＣＤ４蛍光をＸ軸に沿って示す。抗ＣＸＣＲ４抗体は、対応する共受容体ＣＸＣＲ−４を発現する細胞と最も強く結合する。
【００２９】
図８：共受容体アンタゴニストによる阻害
共受容体アンタゴニストの投与後のＸ４及びＲ５の阻害を示す。
【００３０】
図９：融合阻害剤ペプチド
ウイルス膜と細胞膜との融合の阻害剤であるペプチドについてのＣＸＣＲ４阻害剤のマップ及びアミノ酸配列を示す。
【００３１】
図１０：ウイルス感染性の中和
ウイルスを連続５倍希釈の抗体（血漿）と共にインキュベートし、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４標的細胞の感染に使用した。一連のウイルスサンプル（行）は、マトリックス形式で一連の抗体サンプル（列）に対して試験した。中和値は、ウイルスの感染を５０％阻害するのに必要な血漿（抗体）の希釈（ＩＣ５０）を表す。これより値が大きい場合には、希釈が大きく、従って、抗体の中和力価が高いこととなる。サンプルの採取日は、月／日／年として表す。各血漿サンプルの中和活性はまた２つの基準ウイルス、すなわちＮＬ４−３（Ｘ４研究室株）、ＪＲＣＳＦ（Ｒ５一次単離物）に対して試験した。
【００３２】
本発明は、その特定の特徴において、添付の図面及び実施例を参照して以下の詳細な説明を考慮することでさらに明らかになるであろう。以下の説明では、例えば、限定するものではないが、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−１ウイルス侵入の阻害剤を含めて、ウイルス侵入の阻害剤の同定及び評価に関係した表現型アッセイに関する本発明を実施するための手段及び方法について述べる。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、ある化合物に対するウイルスの感受性が改変されたかどうかを調べる方法を提供し、該方法は、（ａ）宿主細胞と化合物とを接触させるステップであって、該宿主細胞がウイルス由来の核酸及び指標遺伝子を含み、該指標遺伝子の活性がウイルス由来の核酸の活性により影響を受け、それにより該ウイルス由来の核酸の活性の変化が指標遺伝子の活性の変化をもたらすものであり、該化合物はウイルス由来の核酸又はそれがコードするタンパク質を直接又は間接的に標的とするものである、上記ステップ、並びに（ｂ）上記指標遺伝子の活性を検出するステップ、を含み、上記化合物の不在下における活性と比較した場合の上記化合物と接触させた宿主細胞の上記指標遺伝子の活性の差が、該化合物に対するウイルスの感受性の改変を示すものである。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、ある化合物が細胞へのウイルス侵入を阻害するかどうかを同定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）ウイルスに感染した患者からウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を取得するステップ；（ｂ）第１細胞中に、（ｉ）ステップ（ａ）の核酸と、（ｉｉ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクターとを共トランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸にコードされるエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルス粒子と第２細胞とを化合物の存在下で接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞により発せられたシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を該化合物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、化合物の存在下で測定したシグナルの量が低下していれば、該化合物が第２細胞へのウイルス侵入を阻害することを示すものである。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、ある化合物が細胞へのウイルス侵入を阻害するかどうかを同定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）ウイルスに感染した患者からウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を取得するステップ；（ｂ）第１細胞中に、（ｉ）ステップ（ａ）の核酸と、（ｉｉ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含まないウイルス発現ベクターとを共トランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルス粒子と第２細胞とを化合物の存在下で接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現し、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられるシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を該化合物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、化合物の存在下で測定したシグナルの量が低下していれば、該化合物が第２細胞へのウイルス侵入を阻害することを示すものである。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、指標核酸は指標遺伝子を含む。本発明の別の実施形態では、指標遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である。
【００３７】
本発明の一実施形態において、細胞表面受容体はＣＤ４である。本発明の一実施形態において、細胞表面受容体はケモカイン受容体である。本発明の一実施形態において、細胞表面受容体はＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５である。
【００３８】
本発明の一実施形態において、患者はＨＩＶ−１ウイルス、肝炎ウイルス（ＨＣＶもしくはＨＢＶウイルスなど）、又はその他のウイルスに感染している。本発明の一実施形態においては、ステップ（ａ）の核酸は、ｇｐ１２０及びｇｐ４１をコードするＤＮＡを含む。本発明の一実施形態では、ウイルス発現ベクターがＨＩＶ核酸を含む。本発明の一実施形態では、ウイルス発現ベクターがＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含む。本発明の一実施形態では、ウイルス発現ベクターがｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、及びｎｅｆをコードするＤＮＡを含む。
【００３９】
本発明の一実施形態では、第１細胞が哺乳動物細胞である。本発明の一実施形態では、哺乳動物細胞がヒト細胞である。本発明の一実施形態では、ヒト細胞がヒト胚性腎細胞である。本発明の一実施形態では、ヒト胚性腎細胞は２９３細胞である。
【００４０】
本発明の一実施形態では、第２細胞がヒトＴ細胞である。本発明の一実施形態では、第２細胞がヒトＴ細胞白血病細胞系である。本発明の一実施形態では、第２細胞が末梢血単核細胞である。本発明の一実施形態では、第２細胞が星状神経膠腫細胞である。本発明の一実施形態では、星状神経膠腫細胞がＵ８７細胞である。本発明の一実施形態では、第２細胞がヒト骨肉腫細胞である。本発明の一実施形態では、ヒト骨肉腫細胞がＨＴ４細胞である。
【００４１】
本発明の一実施形態では、前記化合物が細胞表面受容体に結合する。本発明の一実施形態では、前記化合物が細胞表面受容体のリガンドである。本発明の一実施形態では、前記化合物が抗体を含む。本発明の一実施形態では、前記化合物が膜融合を阻害する。本発明の一実施形態では、前記化合物がペプチド、ペプチド模倣体、有機分子、又は合成化合物である。本発明の一実施形態では、前記化合物がウイルスエンベロープタンパク質に結合する。
【００４２】
本発明は、本明細書に記載するスクリーニング方法（化合物の同定方法）によって同定された化合物と担体とを混合することを含む、組成物の製造方法を提供する。本発明の一実施形態では、担体は生理食塩水、ポリエチレングリコール、バッファー溶液、デンプン、又は有機溶媒である。
【００４３】
本発明は、細胞へのウイルス感染時に、そのウイルスが結合する細胞表面受容体を同定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）（ｉ）ウイルス核酸と、（ｉｉ）検出可能なシグナルを発する指標核酸と、を含むウイルス粒子を取得するステップ；（ｂ）細胞表面受容体を発現する細胞にステップ（ａ）のウイルス粒子を接触させるステップ；並びに、（ｃ）細胞内で発せられた検出可能なシグナルの量を測定するステップを含み、シグナルの発生は該細胞によって発現される細胞表面受容体にウイルスが結合したことを示すものであり、これによって、その細胞表面受容体を、細胞への感染時にウイルスが結合するものとして同定するものである。
【００４４】
本発明はまた、抗体が細胞へのウイルス侵入を阻害するかどうかを同定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）ウイルスに感染した患者からウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を取得するステップ；（ｂ）第１細胞中に、（ｉ）ステップ（ａ）の核酸と、（ｉｉ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを生成する指標核酸を含むウイルス発現ベクターとを共トランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルス粒子と第２細胞とを抗体の存在下で接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられたシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を該化合物の不在下で発せられたシグナルの量と比較するステップ、を含み、抗体の存在下で測定したシグナルの量が低下していれば、その抗体が第２細胞へのウイルス侵入を阻害することを示すものである。
【００４５】
本発明は、細胞へのウイルス侵入を阻害する化合物に対するウイルスの感受性を判定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）ウイルスに感染した患者からウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸を取得するステップ；（ｂ）第１細胞中に、（ｉ）ステップ（ａ）の核酸と、（ｉｉ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含まず、かつ検出可能なシグナルを発する指標核酸を含むウイルス発現ベクターとを共トランスフェクトし、それにより、第１細胞が患者から取得した核酸によりコードされるエンベロープタンパク質を含むウイルス粒子を産生するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で産生されたウイルス粒子と第２細胞とを該化合物の存在下で接触させるステップであって、第２細胞はこのウイルスが結合する細胞表面受容体を発現するものである、上記ステップ；（ｄ）ウイルス粒子の感染性を判定するために、第２細胞によって発せられたシグナルの量を測定するステップ；並びに、（ｅ）ステップ（ｄ）で測定したシグナルの量を該化合物の不在下で生成されたシグナルの量と比較するステップ、を含み、化合物の存在下で測定したシグナルの量が低下していれば、そのウイルスが該化合物に感受性であることを示すものである。
【００４６】
本発明は、基準ウイルスと比較して細胞へのウイルス侵入を阻害する化合物に対するウイルスの耐性が増大しているか否かを判定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）最初に、例えば上記方法にしたがって、ある化合物に対するウイルスの感受性を判定するステップ；（ｂ）その後２回目に、該化合物に対する該ウイルスの感受性を判定するステップ；並びに、（ｃ）ステップ（ａ）及び（ｂ）で判定した感受性を比較するステップを含み、あとの２回目で感受性が低下していれば、その化合物に対するウイルスの耐性の増大を示すものである。
【００４７】
本発明は、細胞へのウイルス侵入を阻害する化合物に対する耐性を賦与するウイルスの突然変異を同定する方法を提供する。前記方法は、（ａ）該化合物でウイルスを処理する前に、ウイルスの核酸配列又はアミノ酸配列を決定するステップ；（ｂ）該化合物に耐性を示すウイルスを取得するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）で取得した耐性ウイルスの核酸配列又はアミノ酸配列を決定するステップ；並びに、（ｄ）ステップ（ａ）及び（ｃ）の核酸配列又はアミノ酸配列をそれぞれ比較することによって、その化合物に対する耐性を賦与するウイルスの突然変異を同定するステップ、を含む。
【００４８】
本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）で得られるウイルスは、耐性が発生するまで化合物の存在下で増殖させたステップ（ａ）のウイルスである。
【００４９】
本発明の一実施形態において、ステップ（ｂ）で得られるウイルスは、その化合物による処置を受けたことがある患者から単離される。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明は、ウイルス侵入阻害剤に対するＨＩＶ−１の感受性を正確かつ再現可能に測定するための手段及び方法を提供する。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、本発明はまた、ＨＩＶ−１共受容体指向性を正確かつ再現可能に測定するための手段及び方法を提供する。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明は、抗体が介在するＨＩＶ−１中和を正確かつ再現可能に測定するための手段及び方法を提供する。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明は、ウイルスの付着及び侵入過程における各種の確定された又は今のところ未確定のステップを標的とする新規薬物又は新薬物を発見し、最適化し、特性決定するための手段及び方法を提供する。
【００５４】
好ましい実施形態において、本発明は、ウイルスの付着及び侵入過程における各種の確定された又は今のところ未確定のステップを標的とする（予防用又は治療用のいずれかの）ＨＩＶ−１ワクチンを発見し、最適化し、特性決定するための手段及び方法を提供する。
【００５５】
好ましい実施形態において、本発明は、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を変更する、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ４１ＴＭ及びｇｐ１２０ＳＵ）中のアミノ酸置換／突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープ中の特定の突然変異がウイルス侵入阻害剤に対する感受性に及ぼす影響を定量するための手段及び方法を提供する。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ウイルス侵入阻害剤に対して変更された感受性を示す、ウイルスにおける、単独又は組合せの、しばしば観察されるＨＩＶ−１エンベロープのアミノ酸置換／突然変異を決定するための手段及び方法を提供する。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明は、受容体又は共受容体指向性を変更する、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ４１ＴＭ及びｇｐ１２０ＳＵ）中のアミノ酸置換／突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質中の特定の突然変異が受容体又は共受容体指向性に与える影響を定量するための手段及び方法を提供する。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体指向性を示すウイルスにおいて、単独又は組合せで、しばしば観察されるＨＩＶ−１エンベロープのアミノ酸置換／突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明は、抗体が介在する中和を変更するＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ４１ＴＭ及びｇｐ１２０ＳＵ）中のアミノ酸置換／突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質中の特定の突然変異が抗体介在中和に与える影響を定量するための手段及び方法を提供する。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、抗体が介在するウイルス中和を示す、ウイルスにおける、単独又は組合せの、しばしば観察されるＨＩＶ−１エンベロープのアミノ酸置換／突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ＨＩＶ−１を中和することができる、患者サンプルウイルス中にしばしば観察される抗体を同定するための手段及び方法を提供する。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、感染のためにＣＤ４との結合を必要とするウイルスを同定するための手段及び方法を提供する。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、感染のためにＣＤ４との結合を必要としないウイルスを同定するための手段及び方法を提供する。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ＣＤ４非依存性感染を示す患者サンプルの発生率を確認するための手段及び方法を提供する。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、感染のためにＣＤ８との結合を必要とするウイルスを同定するための手段及び方法を提供する。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明は、ＣＤ８依存性感染を示す患者ウイルスの発生率を確認するための手段及び方法をも提供する。
【００７０】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、感染のためにＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合、ＣＣＲ５ケモカイン受容体結合、又はＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５結合のいずれか（二重指向性）を必要とするウイルスを同定するための手段及び方法を提供する。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、感染のためにＣＸＣＲ４ケモカイン受容体結合、ＣＣＲ５ケモカイン受容体結合、又はＣＸＣＲ４もしくはＣＣＲ５結合のいずれか（二重指向性）を必要とするウイルスの発生率を確認するための手段及び方法を提供する。
【００７２】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、（ａ）ウイルス侵入阻害剤に対して変更された感受性、（ｂ）ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５共受容体指向性、及び（ｃ）抗体が介在するウイルス中和、を示す、ウイルスにおける、単独又は組合せの、しばしば観察されるＨＩＶ−１エンベロープのアミノ酸置換／突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。
【００７３】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１の治療の指針として、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用するための手段及び方法を提供する。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明は、抗レトロウイルス薬治療が失敗した患者の治療の指針として、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用するための手段及び方法を提供する。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１に新たに感染した患者の治療の指針として、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用するための手段及び方法を提供する。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１の治療の指針、又は抗レトロウイルス薬治療が失敗した患者の治療の指針として、ＨＩＶ−１共受容体指向性を使用するための手段及び方法を提供する。
【００７７】
好ましい実施形態では、本発明は、ＨＩＶ−１に新たに感染した患者の治療の指針として、ＨＩＶ−１共受容体指向性を使用するための手段及び方法を提供する。
【００７８】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ワクチン接種後の初期防御抗体応答をモニタリングするために、抗体介在ＨＩＶ−１中和を測定するための手段及び方法を提供する。
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ワクチン接種後の初期防御抗体応答をモニタリングするために、抗体介在ＨＩＶ−１中和を測定するための手段及び方法を提供する。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ワクチン接種後の防御抗体応答の持続性をモニタリングするために、抗体介在ＨＩＶ−１中和を経時的に測定するための手段及び方法を提供する。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明はさらに、ワクチン接種の効力及び持続性を最大にするワクチン接種の初回−追加スケジュールを開発して最適化するために、抗体介在ＨＩＶ−１中和を測定するための手段及び方法を提供する。
【００８１】
例えば、ＨＩＶ−１の場合、ＳＵタンパク質（ｇｐ１２０−ＳＵ）が膜貫通エンベロープタンパク質（ｇｐ４１−ＴＭ）としっかり結合しており、これが複合体をウイルス膜に繋ぎ止めている。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１は、エンベロープ遺伝子の未開裂前駆体タンパク質であるｇｐ１６０の開裂によって誘導される。ＨＩＶ−１のその細胞受容体（ＣＤ４）及び共受容体（ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４のいずれか）への結合はＴＭタンパク質のコンホメーションの変化を促進し、その結果、ウイルスと細胞膜の融合と、それに続くウイルスコアの細胞質内への侵入をもたらす（Retroviruses, 1997）。新規なＨＩＶ侵入阻害剤はウイルスエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０／ｇｐ４１）又は宿主タンパク質（ＣＤ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４）のいずれかを標的とするが、ＨＩＶ−１中の耐性関連突然変異の大多数はウイルスエンベロープ遺伝子中に存在すると予想される。例えば、ウイルスが進化する可能性のある一つの方向は、共受容体の利用をシフトすることである。侵入阻止剤は抗レトロウイルス薬の新規なクラスを構成し、現状の多剤耐性ＨＩＶ−１変異体に対して広範な活性を示す可能性が高い。可能性のあるウイルス侵入阻止剤のクラスとして、融合阻害剤、受容体／共受容体アンタゴニスト、及びワクチンがある。
【００８２】
それでもなお、ウイルス侵入の阻害剤は（エンベロープ遺伝子の突然変異によって）薬剤耐性ウイルスを出現させると考えられ、かくして、ＨＩＶのためのプロテアーゼ阻害剤（ＰＲＩ）及び逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩ）治療で観察されるものと同様に、患者の治療が複雑化する。実際、ウイルス侵入を阻止する新薬のＦＤＡ承認には耐性データの評価が要求される。侵入阻止剤に対する感受性を測定する診断アッセイの必要性が、融合阻害剤Ｔ−２０の場合に報告されている。Ｔ−２０の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ継代培養後に、この薬物に対する感受性の低下を示すウイルスが報告されている。現時点で、ウイルス侵入を阻止する薬物に対する感受性を測定することができる好都合な表現型アッセイは利用することができない。結果として、医師は、薬物感受性の問題に取り組むのに必要なツールを持たずに、治療を患者に合わせて組み立てる困難に直面することになる。したがって、感染患者からのウイルス侵入を阻止する薬物に対する感受性を正確に測定するための信頼できるアッセイは、極めて価値があると考えられる。
【００８３】
例えば、最近の世界保健機関（ＷＨＯ）の概算では、世界中で３３００万人を超える人が流行性ＡＩＤＳの病原因子であるＨＩＶ−１に感染していることが示されている。米国では１００万人近くが感染し、現在３０万人が抗ウイルス治療を受けている（CDC, 1999；WHO 1999）。ＡＩＤＳの撲滅は、国家機関、学術研究機関、及び医薬／バイオテクノロジー産業界での前例のない総力を挙げての共通した目標である。ＨＩＶ−１感染の治療のために、１４の抗ウイルス薬がＦＤＡから承認されており（Carpenterら、2000）、２０を超える追加の薬物が現在臨床試験中である（PHRMA, 1999）。承認された薬物は、プロテアーゼ（ＰＲ）又は逆転写酵素（ＲＴ）のいずれかの酵素活性を妨害することによって、ＨＩＶ−１の複製を阻害する。ＰＲ阻害剤（ＰＲＩ）は、ウイルス感染及び複製に必要なウイルスタンパク質の適正な生成を阻止し、一方ＲＴ阻害剤（ＲＴＩ）はウイルスがその遺伝物質を複製するのを阻止する。最適には及ばない効力ゆえに、現在のＰＲＩ及びＲＴＩは、ウイルスの複製を抑制するために、たいていは組み合わせて使用されている（Carpenterら、2000）。
【００８４】
したがって、所望されるのは、以下を評価することができる、迅速かつ正確で安全なウイルスアッセイを提供することである：
ウイルス付着及び侵入の阻害剤（融合、受容体及び共受容体阻害剤を含む）の活性；
ウイルス侵入阻害薬の設計及び治療を促進するための受容体／共受容体へのウイルス指向性；
付着及び侵入の阻害剤に対する患者ウイルスの薬物感受性の変化；ならびに
ウイルスエンベロープタンパク質抗原を使用するワクチン接種に応答して生成されたウイルス中和活性。
【００８５】
本発明の方法は、ウイルス侵入阻害剤に応答し、かつウイルス侵入阻害剤に対する抗ウイルス薬の感受性及び耐性が問題となる場合の、どのようなウイルス性疾患についても使用することができる。これらのウイルスとして限定するわけではないが、例えば他のレンチウイルス（例えばＨＩＶ−２）、他のレトロウイルス（例えばＨＴＬＶ−１及び２）、ヘパドナウイルス（例えばヒトＢ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（例えばヒトＣ型肝炎ウイルス）、ならびにヘルペスウイルス（例えばヒトサイトメガロウイルス）が含まれる。
【００８６】
侵入阻止剤は抗レトロウイルス薬の新規なクラスを構成し、現在の多剤耐性ＨＩＶ−１変異体に対して広範囲の活性を示す可能性が高い。可能性のあるウイルス侵入阻止剤のクラスには、融合阻害剤、受容体／共受容体アンタゴニスト、及びワクチンが含まれる。
【００８７】
融合阻害剤
融合阻害剤と呼ばれる、ＴＭのコンホメーションの変化を競合的に阻害するように設計された化合物は、ＨＩＶ−１複製の強力な阻害剤である。その活性は細胞培養系及びＨＩＶ−１感染患者の両方で実証されている（Wildら、1992；Judiceら、1997；Kilbyら、1998）が、米国ではどの融合阻害剤もまだＨＩＶ−１感染の治療用に承認されていない。このクラス内の薬物、例えばｔ−２０及びｔ−１２４９（Trimeris Inc., USA）、が進展した臨床試験の対象になっている。
【００８８】
受容体／共受容体アンタゴニスト
ＨＩＶ−１がその受容体と相互作用した後に作用する融合阻害剤に加えて、ＨＩＶ−１がＣＤ−４又はその２つの主要な共受容体のいずれかと相互作用するのを阻止する薬物を開発するための努力が進行中である。こうした薬剤がＨＩＶ−１感染を阻害する能力は、細胞培養系及び動物モデルで証明されている。ｇｐ１２０、ＣＤ４、マクロファージ指向性ウイルスにより使用されるＣＣＲ５共受容体（Ｒ５）、又はＴ細胞指向性ウイルスにより使用されるＣＸＣＲ４共受容体（Ｘ４）のいずれかを標的とするリード化合物がすでに同定されている（Allwayら、1993；Reimannら、1995；Babaら、1999；Bridgerら、1999）。
【００８９】
現在米国では、どの共受容体アンタゴニストもＨＩＶ−１感染の治療用に承認されていない。このクラス内の薬物、例えばＰＲＯ  ５４２（Progenics Inc., USA）、５ａ８（Tanox, USA）、ＴＡＫ−７７９（Takeda Inc., Japan）、及びＡＭＤ−３１００（Anormed Inc., Canada）、が臨床前、又は初期段階臨床試験の対象になっている。したがって、指向性ウイルス株（例えばＨＩＶ−１）に感染した患者を迅速かつ正確に同定する、受容体／共受容体指向性を同定及び判定することができるアッセイは、ウイルス侵入阻害剤の設計及び治療を助長すると考えられる。
【００９０】
ワクチン
ワクチンもまた、ヒトの病原性ウイルス感染との闘いの有効な戦略の１つであることが証明され、ＨＩＶ−１感染を防止するためのいくつかのワクチン候補が臨床開発中である。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１がＨＩＶ−１ワクチンのための最も有望な候補であり、臨床試験中のその１１種のワクチン候補の多くがエンベロープに基づいている（PhRMA, 1999）。効果的なエンベロープワクチンはウイルス感染を阻止する中和抗体の産生を誘発するらしいと、一般的に考えられている（Mascolaら、2000）。したがって、こうした中和抗体の効力の信頼性ある測定をし、ウイルスの長期培養を必要としない、感度のよいハイスループットアッセイが緊急に必要とされている。こうしたアッセイは効果的なＡＩＤＳワクチンの探索に多大な貢献を果たすはずである。後期臨床試験が数千に及ぶ多数の患者集団を包括することを考慮すると、これは特に真実である。中和抗体は標的細胞の感染を防止すべきであるから、ウイルス中和アッセイとして役立てるにはエンベロープ受容体アッセイが有益であると見られる。
【００９１】
残念ながら、これらの薬物併用の大部分は、主として薬物耐性ウイルスの出現によって、限られた時間しか有効でない。ＲＴ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩに固有の校正機能の欠損は、高レベルの誤りがちな複製をともなって、ＨＩＶ−１などのウイルスを容易に突然変異させる（Coffin, 1995）。この高突然変異頻度は、有効な長期の薬物治療から逃れるＨＩＶ−１の能力をもたらし、その結果ウイルス負荷リバウンドとなる。１４種全部の承認された薬物及び研究中の多くの化合物について、耐性に関係する突然変異が記載されている（Schinaziら、1999）。結果として、多剤耐性ＨＩＶ−１変異体は、感染患者の治療問題の増加をもたらす。長期の臨床効果を達成するため、ウイルスの複製を最大限に抑制する薬物を選択し、患者のウイルスが耐性を示す薬物を回避することが所望される（DHHs, 2000）。患者のウイルスに対して最も効果的な薬物の選択の際に、長期の結果は医師の指針となりうる薬物耐性試験に依拠することができる。耐性試験の必要性がＤＨＨｓの最近の指針で重視されるようになり（DHHs, 2000）、ＨＩＶ−１感染患者を治療するときには、耐性試験を定期的に使用するように推奨されている。感受性試験も耐性ウイルスを標的とする新薬の開発の一助となり得る。最近のＦＤＡ諮問委員会（１９９９年１１月）は、耐性試験をＨＩＶ−１のための新規抗ウイルス薬の開発で使用することを推奨した。
【００９２】
抗ウイルス薬の感受性を評価するために、いくつかの戦略が適用されてきた。遺伝子型試験では、基礎となるヌクレオチド配列又は遺伝子型の突然変異を分析して、これらの突然変異と薬物耐性との相関性を調べる（Rodriguez-Rosadoら、1999；Schinaziら、1999）。しかし、遺伝子型と表現型の関係は複雑で、簡単に説明されるものではなく、これらの試験の結果は定量的ではない。遺伝子型薬物感受性データの使用は専門家（Baxterら、1999）又はコンピュータアルゴリズムのいずれかによる解釈を必要とし、また必ずしも治療結果の予測となるものではない（Pikettyら、1999）。
【００９３】
表現型薬物感受性アッセイは、ウイルスが薬物の存在下で複製する能力を直接測定及び定量するものである。初期の表現型試験は長期のウイルス培養を必要とし、その結果時間と労力がかかり、そしてハイスループット用に簡単には自動化されなかった（Japourら、1993）。その結果、これらの初期の表現型試験は患者の管理用には実用的でないと考えられた。組換えウイルスアッセイの開発（Shi及びMellors, 1997；Hertogsら、1998）が表現型試験を単純化し、処理量を増大させた。しかし、これらのアッセイの大きな欠点は、４〜８週間という長い所要時間である。さらに最近になって、１回の複製ラウンド中に薬物感受性を測定することができる組換えウイルスアッセイ、及びその他のアッセイが開発され（Zennouら、1998；Petropoulosら、2000）、その結果、所要時間が８〜１０日間への劇的な減少となった。抗レトロウイルス治療が失敗した患者は表現型アッセイの利益を受けることができる。こうしたアッセイは患者の管理にとって魅力的なツールである。なぜならば、これらは薬物感受性の直接的で迅速な測定を提供するからである。
【００９４】
本発明のアッセイは、これらのファミリー内のその他のウイルスによる感染から発生するその他のウイルス感染、ならびに別のウイルスファミリーのウイルスから発生するウイルス感染に使用することができる。その上、本発明の薬物感受性及び耐性試験は、現在では利用できる治療法がないウイルス疾患を治療するための化合物をスクリーニングするのに有用である。
【００９５】
本発明の薬物感受性及び耐性試験で試験することができるウイルスの構造、生活環及び遺伝的要素は当業者が知り得るものである。例えばレトロウイルスの生活環、ならびにレトロウイルスのレスキュー（rescue）及び感染性に必要なウイルス遺伝子を理解することは、本発明の実施にとって有用である。レトロウイルスが感染した細胞は二倍体ＲＮＡゲノムを含有する膜ウイルスを放出する。エンベロープ糖タンパク質（感染の宿主域を決定するのに役立つ）が点在するウイルスは、感染する細胞の原形質膜中の細胞受容体に付着する。受容体に結合後、ウイルスは内部に入り、宿主細胞の細胞質中を通過する間に裸になる。核に向かう途中か核内のいずれかで、ウイルスコア内に所在する逆転写酵素分子が二本鎖ＤＮＡプロウイルスの合成を駆動する。これはｔＲＮＡ分子のゲノムウイルスＲＮＡへの結合によって開始される合成である。二本鎖ＤＮＡプロウイルスは次に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、そこでウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡ及びビリオンゲノムＲＮＡの両方の転写鋳型として機能することができる。これらはウイルスコア粒子中にパッケージされるだろう。感染した細胞から出る途中、コア粒子は細胞質から移動して、新たに感染した細胞の原形質膜の内側に付着し、ウイルスにコードされたエンベロープ糖タンパク質遺伝子産物を含有する膜の通路を選んで出芽する。感染、逆転写、転写、翻訳、ビリオンの組み立て及び出芽のこのサイクルは感染が広がるとともに何度も繰り返される。
【００９６】
このウイルスＲＮＡ、及びその結果としてプロウイルスＤＮＡは、ウイルスの生活環の完結を成功させるのに絶対に必要なシス作用性エレメントをいくつかコードしている。ビリオンＲＮＡはその３’末端にウイルスプロモーターを保有している。アクロバット複製は、ゲノムが逆転写されるように、ウイルスプロモーターをプロウイルスゲノムの５’末端に配置する。ウイルスパッケージ部位は丁度３’から５’レトロウイルスＬＴＲに向かって存在する。レトロウイルスの生活環にはウイルスにコードされたトランス作用性因子の存在を必要とする。ウイルス−ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）−−逆転写酵素もウイルスコア内に含まれていて、これはゲノムＲＮＡを組込み中間体であるプロウイルスＤＮＡに転換することに関与しているという点で、ウイルスの生活環に必要である。ウイルスエンベロープ糖タンパク質ｅｎｖは、未感染細胞へのウイルスの付着及びウイルスの伝播に必要である。組み込まれた親プロウイルスの転写レベルをモジュレートするために作用できる、トランスアクチベーターと称される、転写トランス作用性因子も存在する。典型的には、複製能のある（非欠損）ウイルスはこれらのトランス作用性因子のすべてをコードしている点で、自己保有性である。その欠損性対応物は自己保有性でない。
【００９７】
ヘパドナウイルスなどのＤＮＡウイルスの場合は、その生活環及び感染に必要なウイルス遺伝子を理解することが、本発明の実施にとって有用である。ＨＢＶ侵入の過程は十分確定されていない。ＨＢＶの複製にはＲＮＡ中間体の鋳型が使用される。感染した細胞中で、複製の最初のステップは非対称の弛緩型ＤＮＡ（ｒｃ−ＤＮＡ）の共有結合閉環型ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）への変換である。感染した肝細胞の核内で生じるこの過程には、ＤＮＡプラス鎖合成の完結及びＤＮＡ末端同士の連結が含まれる。第２ステップで、ｃｃｃＤＮＡが宿主ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて、３．５ｋＢのＲＮＡ鋳型（プレゲノム）が生成する。このプレゲノムがウイルスコア中のタンパク質と複合体化する。第３ステップには、ウイルスにコードされたＰタンパク質逆転写酵素を使用するプレゲノムＲＮＡの複写による、第１マイナスセンスＤＮＡ鎖の合成が含まれる。Ｐタンパク質はマイナス鎖ＤＮＡプライマーとしても作用する。最後に、Ｐタンパク質ＤＮＡポリメラーゼ活性及びプライマーとしてウイルスＲＮＡのオリゴマーを使用する、第１ＤＮＡ鎖の複製による、第２プラスセンスＤＮＡ鎖の合成が生じる。プレゲノムは主要な構造コアタンパク質のためのｍＲＮＡも転写する。
【００９８】
設計及び方法
（１）患者由来のエンベロープタンパク質をコードする核酸断片を受容する能力があるウイルスエンベロープタンパク質のための発現ベクターの構築
一実施形態において、トランスフェクトされた細胞中でＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現する能力があるエンベロープ発現ベクターを構築した。同様の発現ベクターについては記載がある。米国特許第５，８３７，４６４号及びPetropoulosら、2000、に記載された、両種指向性マウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）エンベロープタンパク質を発現させるために構築したプラスミド（ｐＡｍｐｈｏＥｎｖ）が挙げられる。ｐＡｍｐｈｏＥｎｖベクターは、トランスフェクト細胞中でＡ−ＭＬＶエンベロープｍＲＮＡを産生するために、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列を使用するものである。ｐＡｍｐｈｏＥｎｖプラスミドは、Ａ−ＭＬＶエンベロープ遺伝子の欠失、ならびにＨＩＶ−１などの多様な分離株に由来するウイルスエンベロープ断片の挿入を可能にできる制限酵素切断部位の導入によって、改変する。ＨＩＶ−１の場合、エンベロープオープンリーディングフレームは約２，６００ヌクレオチドにわたっており、エンベロープポリタンパク質ｇｐ１６０をコードする。ｇｐ１６０ポリタンパク質は細胞フリン様プロテアーゼによって切断されて、２つのサブユニットｇｐ４１及びｇｐ１２０が生成する。ＨＩＶ−１エンベロープ発現ベクターは、以下の段階にしたがって構築することができる。
【００９９】
（ａ）エンベロープ発現ベクター（ｐＡｍｐｈｏＥｎｖ）からのＡ−ＭＬＶエンベロープ核酸配列のマルチクローニングサイトポリリンカーによる置換：
Ａ−ＭＬＶエンベロープ核酸配列をｐＡｍｐｈｏＥｎｖベクターから制限酵素消化によって欠失させることができる。エンベロープ配列の挿入のためのユニークな４つの内部制限部位（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドポリリンカーに連結することによって、消化されたベクターを再環状化することができる。この連結反応物を使用して大腸菌（Escherichia coli）を形質転換し、そして制限マッピング及びＤＮＡ配列決定のそれぞれによって、正しいポリリンカー配列を含有する分子クローンを同定及び確認することができる。複数のユニークなクローニング部位をベクター中に導入することによって、ＨＩＶ−１エンベロープ配列の挿入を容易にすることができる。ポリリンカー内の制限部位は、ＨＩＶ−１エンベロープ配列中でのそれらの存在頻度の低さに基づいて選択することができる（ＬＡＮＬ  ＨＩＶ−１データベース、www.lanl.gov）。このベクターはｐＣＸと称することができる。ｐＣＸベクターの機能性は、蛍ルシフェラーゼなどのリポーター遺伝子又は指標核酸をｐＣＸマルチクローニングサイトに挿入して、トランスフェクト細胞中での指標核酸又はリポーター遺伝子活性からのシグナルを測定することによって、決定することができる。本明細書で使用する「指標核酸」とは、例えば測定し得る波長の色もしくは光などの測定又は認識可能なシグナル、あるいは指標体として使用される特定のＤＮＡ又はＲＮＡ構造物（多数の定量的増幅アッセイのいずれか１つを使用して増幅することができる）の生成を、直接又は反応を介してのいずれかによってもたらす、タンパク質をコードする核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡ構造物を意味する。
【０１００】
（ｂ）ウイルスエンベロープ配列のｐＣＸエンベロープ発現ベクター中への挿入
ＰＣＲ増幅のための突然変異誘発性プライマーを使用して、例えばＨＩＶ−１エンベロープオープンリーディングフレームの開始及び停止コドンに隣接する２つのユニークな制限部位（それぞれａ、ｂ及びｃ、ｄ）を含有するウイルスエンベロープ断片を作製する。エンベロープオープンリーディングフレームのそれぞれの末端への２つのユニークな制限部位の導入は、ｐＣＸベクターのマルチクローニングサイト内に存在するいずれか１つの酵素の内部制限部位を保有しているＨＩＶ−１エンベロープ断片のクローニングの機会を向上させることができる。
【０１０１】
ＨＩＶ−１の場合、エンベロープ遺伝子中に既知の差異を持つ２つの十分に特性決定されたＨＩＶ−１の分子クローンであるＮＬ４−３（シンシチウム誘発性、Ｔ細胞指向性の実験室株）及びＪＲ−ＣＳＦ（非シンシチウム誘発性、マクロファージ指向性の一次分離株）を、ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用することができる。その２，６００ヌクレオチド増幅産物を２つの制限酵素で消化し（各酵素は該断片の一端を切断する；例えばａ及びｃ、又はｂ及びｄ）、その後連結及び大腸菌（Escherichia coli）の形質転換によって、ｐＣＸベクター中に挿入することができる。適切なエンベロープ配列を含有する分子クローンは、制限マッピングによって同定し、ＤＮＡ配列決定によって確認することができる。生成したプラスミドｐＨＩＶｅｎｖ（ＮＬ４−３）及びｐＨＩＶｅｎｖ（ＪＲ−ＣＳＦ）を使用して、トランスフェクト細胞中でＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を発現させることができる（図１Ａ）。ｐＨＩＶｅｎｖベクターなどのエンベロープ発現ベクターの機能性は、トランスフェクト細胞中でのウイルスエンベロープ合成の測定（ウエスタンブロット）、及び偽型エンベロープ欠損レトロウイルスベクターに対するその能力によって、実証することができる。ヒト胚性腎２９３細胞系を使用して、高力価ウイルスストック株が示されている（Petropoulosら、2000）が、本発明はこれらの細胞系に限定されるものではない。患者から取得したウイルスエンベロープタンパク質をコードする核酸のトランスフェクションのための第１細胞として使用する、その他の好適な細胞系としては、本発明を限定するわけではないが、例えば、５．２５；ＨＯＸ；Ｕ８７；ＭＴ２；ＰＭ１；ＣＥＭ；その他が挙げられる。細胞系は最適には１以上の共受容体を発現するように遺伝子工学的に操作されるだろう。
【０１０２】
（ｃ）ウイルスエンベロープ配列のクローニング効率を改善するためのｐＣＸベクターの改変
ウイルスエンベロープ断片のクローニング効率を改善するため、ｐＣＸ発現ベクターは、細菌キラー遺伝子カセット（例えば、細胞死ｂ遺伝子の制御（control of cell death b gene）（ｃｃｄＢ）又はｈｏｋキラー遺伝子ファミリーのメンバー）を大腸菌ｌａｃプロモーターの制御下でマルチクローニングサイト中に挿入することによって、改変することができる（Gerdesら、1990；Bernard及びCouturier, 1992；Bernardら、1993）。この改変されたベクターはｐＣＸｃｃｄＢと称される。ｃｃｄＢキラー遺伝子の転写はＪＭ１０９などのｌａｃｉｑリプレッサーを発現する細菌株中で抑制される。この細菌株又は同等の細菌株を使用して、ｌａｃプロモーターの制御下にあるｃｃｄＢキラー遺伝子を保有するプラスミドを増やすことができる。逆にこの系では、ＤＨ５ａ及びＴｏｐ１０などの、ｌａｃｉｑリプレッサーを過剰発現しない細菌株は、ｃｃｄＢ遺伝子を発現するプラスミドを維持することができない。形質転換体はｃｃｄＢ活性によって死滅されうる。ＤＨ５ａ及びＴｏｐ１０細胞はいくつかの業者から購入することができる（Life Technologies又はInvitrogen）。この選択的クローニング手法を使用して、親発現ベクターをｌａｃｉｑ細菌株中で増殖させる。このベクターを２種の制限酵素で消化する。どちらの酵素もｃｃｄＢ遺伝子カセットを除去し、ＨＩＶ−１の場合には、ＨＩＶ−１エンベロープ配列の挿入に適合する  （ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。ベクターとエンベロープ断片の連結後、ｌａｃｉｑを欠失した細菌株を形質転換する。形質転換後、ウイルスエンベロープインサートでｃｃｄＢキラー遺伝子が置換されているプラスミドを含有する細菌を増殖させることができる。ｃｃｄＢキラー遺伝子を保持しているか又は該遺伝子を再構成するプラスミドを含有する細菌は生存できない。この方法で、形質転換細菌の集団は、ウイルスエンベロープインサートを含有するプラスミドについて富化されるが、ｃｃｄＢ遺伝子を含有する親ベクターは欠失している。このプロジェクトのフェーズＩでの成功のために、ｐＣＸｃｃｄＢベクターの構築は必須ではないが、患者サンプルに由来するＨＩＶ−１エンベロープ配列のクローニング効率を有意に改善するものと期待される。こうして、ウイルス配列の異種性を維持する可能性を高めることができる。ｐＣＸｃｃｄＢベクターの構造は制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって、確認することができる。
【０１０３】
（ｄ）ウイルスエンベロープ配列のｐＣＸｃｃｄＢ発現ベクター中への挿入
ｐＣＸｃｃｄＢベクターの機能性は、ウイルスエンベロープ配列及び不完全消化したｐＣＸｃｃｄＢベクターＤＮＡを含有する連結反応物を供給することによって、評価することができる。細菌の形質転換後、プラスミドＤＮＡを個々の細菌クローンから調製して、ウイルスエンベロープ断片の存在及びｃｃｄＢ配列の不在に関して制限消化によって分析することができる。この手法の実行可能性を、以下の合計１３種の入手可能なＨＩＶ−１クローンからのエンベロープ領域を増幅することによって試験する：ｐＣＲＩＩ−９ｌＵＳ００５．１１、ｐＣＲＩＩ−９１００６．１０、ｐＣＲＩＩ−９２ＵＳ６５７．１、ｐＣＲＩＩ−９２ＵＳ７１１．１４、ｐＣＲＩＩ−９１ＵＳ７１２．４、ｐＣＲＩＩ−９２ＵＳ７１４．１、ｐＣＲＩＩ−９１ＨＴ６５２．１１、ｐＣＲＩＩ−９２ＢＲ０２０．４、ｐＣＲＩＩ−９１ＨＴ６５１．１Ａ、ｐＣＲＩＩ−９２ＨＴ５９３．１、ｐＣＲＩＩ−９２ＨＴ５９４．１０、ｐＣＲＩ９２ＨＴ５９６．４、ｐＣＲＩＩ−９２ＨＴ５９９．２４。これらは、AIDS Research Reagent Reference Program (ARRRP), Rockville、Maryland、より入手可能である。各断片をｐＣＸｃｃｄＢ中に挿入して、生成したｐＨＩＶｅｎｖ発現ベクターの構造を、制限マッピング及び／又はＤＮＡ配列決定によって、確認することができる。各ｐＨＩＶｅｎｖベクターの機能性は、トランスフェクト細胞中でのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質合成の測定（ウエスタンブロット）、及び偽型エンベロープ欠損レトロウイルスベクターに対するそれらの能力によって、証明することができる。
【０１０４】
（２）エンベロープタンパク質をコードする領域の代わりに指標核酸を含む生物安全性（Ｂｉｏ−ｓａｆｅ）ウイルス発現ベクターの構築  
ＰＲ及びＲＴの阻害剤を評価するのに使用される米国特許第５，８３７，４６４号及びPetropoulosら、2000に記載の手段及び方法と同様にして、生物安全性ウイルスベクターを構築し、ウイルス侵入の阻害剤を評価する。本発明のウイルス発現ベクターをエンベロープ発現ベクター（上記）とともに細胞中に共トランスフェクトして、高力価ウイルスストック株を生産することができる。こうしたウイルスストック株を、抗ウイルス薬及び中和抗体などのウイルス侵入阻害剤に対する感受性について、評価することができる。ＨＩＶ−１の場合は、ウイルス発現ベクターを、十分に特性決定されているＨＩＶ−１の感染性分子クローンであるＮＬ４−３から作製することができる。ウイルス遺伝子の発現を制御する５’長末端反復配列（ＬＴＲ）を改変して、トランスフェクト細胞中でのウイルス遺伝子の転写がＣＭＶ前初期プロモーターによって駆動されるようにすることができる（Naviauxら, 1996）。エンベロープ遺伝子の大部分を欠失させることができるが、ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）などの重要な制御エレメント及び補助タンパク質コード領域（ｒｅｖ，ｔａｔ）は残留させる。欠失させたエンベロープ配列の代わりに、ＣＭＶプロモーター−エンハンサー配列の制御下にある蛍ルシフェラーゼリポーター遺伝子カセットなどの指標核酸を挿入する（図１Ｂ及び３）。ウイルス感染は、感染細胞中でのルシフェラーゼ活性を測定することによって、モニターすることができる。ありそうもないが、トランスフェクト細胞中で、レトロウイルスベクターと例えばｐＨＩＶｅｎｖ配列とのプラスミド間組換えが起こって、感染性ＨＩＶ−１の生成をもたらすことが考えられる。生物安全性ベクターを作製するために、ＨＩＶゲノム中にいくつかの遺伝的改変の導入を実施することができる。例えば、重要な制御配列ＲＲＥは残留させたままでの大部分のエンベロープ遺伝子の欠失、そしてまたベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域中の転写エンハンサー配列の欠失を行うことができる（図２）。レトロウイルスゲノムの複製中、ウイルスゲノムの３’末端に位置するＵ３領域は、感染細胞中でプロウイルスの５’ＬＴＲのＵ３領域のための鋳型として作用する。こうしたプロウイルスは５’ＬＴＲのＵ３領域中の強力なプロモーターエレメントを欠失しているので、感染細胞中でレトロウイルスＲＮＡを産生することができない。この自己不活化（ＳＩＮ）ストラテジーは、ＨＩＶ−１などのいくつかのレトロウイルスベクター系で使用されて成功している（Hwangら、1997；Miyoshiら、1998）。本発明のアッセイでは、感染細胞中でのウイルス遺伝子の発現を必要としない。なぜならば、ウイルス感染が、独自の別個のプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ活性の生成などの指標核酸によって生成される検出可能なシグナルによって測定されるからである（図１Ｂ）。エンベロープ配列及び転写エンハンサー領域（Ｕ３）の欠失は、標準的分子クローニング操作法によって達成することができ、各欠失はＤＮＡ配列解析によって立証することができる。
【０１０５】
例えばＨＩＶ−１の場合、ｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３と命名された、このベクターの機能性は、２９３細胞の上記ｐＨＩＶｅｎｖベクターとの共トランスフェクションによって、証明することができる。トランスフェクト細胞中で両方のベクターによって産生されたウイルスタンパク質の効果的なトランス相補性（transcomplementation）は、ウイルス粒子の産生をもたらすことができる。ウイルス粒子を培養上清から回収し、ウエスタンブロット法によって分析することができる。ウイルス力価は、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ、定量的ＰＣＲ又はＴａｑＭａｎアッセイのいずれかを常套的に適用することによって、定量することができる。
【０１０６】
本発明を実施するためには自己不活化ウイルス発現ベクターを産生することは必要でないが、アッセイの再現性及び生物安全性を改善するためには望ましい。
【０１０７】
（３）受容体と共受容体を発現してウイルス感染を支援する好適な細胞系の同定
以前に記載されており、特定のウイルスの感染を支援することが知られている様々な哺乳動物細胞系を評価することができる。ＨＩＶ−１に関する一実施形態について本明細書中で考察するように、アッセイを以下のように実施することができる：（ａ）ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３による第１細胞の共トランスフェクション；（ｂ）トランスフェクション後のウイルスの回収；（ｃ）ウイルス侵入阻害剤の存在下及び不在下の両方でこのウイルスを使用する第２細胞の感染；ならびに（ｄ）感染細胞中のルシフェラーゼ産生の測定。
【０１０８】
表１に、ＨＩＶ−１感染について評価したこうした細胞系の代表的な例を、その細胞系及び関連する受容体／共受容体を含めて掲載する。これらの細胞系のいくつかは一般の細胞保存機関から取得することができる。
【０１０９】
トランスフェクトした２９３細胞培養物から回収したウイルス粒子を使用して、多様な異なる細胞系に感染させることができる。ＨＩＶ−１の場合、ｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターは上述のようにエンベロープ遺伝子及びＵ３プロモーター−エンハンサーの欠失を含んでいるので、このベクターによって産生されるウイルス粒子による許容細胞系の感染は１回の複製に限定される。このことには、（ａ）上述のようにｐＨＩＶｅｎｖベクターによってトランスで生成されたウイルスエンベロープタンパク質により仲介されるウイルスの付着及び侵入、（ｂ）ＲＴによる一本鎖ウイルスＲＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換、ならびに（ｃ）ウイルスＤＮＡの宿主細胞ゲノム中への組込み（プロウイルスの形成）、が含まれる。プロウイルスの組み込み後に感染細胞中で通常起こるＲＮＡポリメラーゼＩＩによるウイルス遺伝子の活発な転写は、ｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクター内の必須のウイルスプロモーター−エンハンサー配列の欠失によって、制限されうる。しかし、この制限は感染細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子発現を妨害することはできない。なぜならば、この遺伝子は内部ＣＭＶプロモーターを使用して、ウイルス遺伝子発現とは無関係に、駆動されるからである（図１Ｂ）。感染後に生成されたルシフェラーゼ活性の量を、ウイルス感染性の尺度として使用することができる。
【０１１０】
宿主細胞へのＨＩＶ−１の付着及び侵入には、主要受容体（ＣＤ４）及びいくつかの共受容体の１つ（最も多くはＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４）との相互作用を必要とする。ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４の各種組合せを発現することが知られている細胞系をスクリーニングすることができる。具体的には、（ａ）ＣＤ４とＣＣＲ５、（ｂ）ＣＤ４とＣＸＣＲ４、ならびに（ｃ）ＣＤ４とＣＣＲ５とＣＸＣＲ４、を発現する、表１に掲載する細胞系が評価される。ＣＤ４受容体のみ、又はＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ４共受容体のいずれかのみを発現する細胞系は、有用な対照として役立ち、かかる細胞系を使用して、ＣＤ４結合を必要としないか又はＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４以外の共受容体を使用するＨＩＶ−１分離株を評価することができる。細胞系の適合性を判定するための重要な規準は、ルシフェラーゼ産生（１０４〜１０６相対光度単位）によって測定されるような感染性でありうる。さらに、細胞系は増殖速度、生存力、安定性及びその他の必要と認められるパラメーターに基づいて評価することができる。細胞系としては、維持が容易であり、また、例えば感染後に大量のルシフェラーゼ活性を生成する細胞系が選択され、これらの細胞系は異なるエンベロープ受容体指向性（例えばＣＤ４／ＣＸＣＲ４及びＣＤ４／ＣＣＲ５）によって感染させることができる。例えばＨＩＶ複製を支援し、かつＨＩＶ−１受容体及び共受容体を発現する、十分に特性決定されたその他の細胞系（例えばＣＥＭ−ＮＫｒ−ＣＣＲ５；公開カテゴリーａ）がARRRPなどの公的保存機関から入手可能である。
【０１１１】
さらに、細胞へのポリブレンの添加による感染の促進などの標準的操作法を使用して、細胞系を増強することができる(Porterら、1998)。例えば、ＨＩＶの場合、本発明で使用するためのその他の可能性のある細胞系を以下によって同定することができる。すなわち、細胞にＨＩＶ−１実験室株を感染させて、組換えウイルスの感染力価を感染性ＨＩＶ−１で得られた力価と比較するか、又は本明細書に記載したウイルス発現プラスミドで細胞を直接トランスフェクトして、ウイルスの産生について評価する。ウイルス転写物の蓄積は定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して調べることができる。その他のウイルスについて好適な細胞系を同様の手法で同定することができる。
【０１１２】
本発明はアッセイ条件を最適化し、自動化を使用することによって患者サンプルのハイスループット検査を可能にする。サンプル調製法を最適化することによって、ウイルスゲノム及びエンベロープＲＮＡを効率的に捕捉することができる。ＲＴ−ＰＣＲ条件を最適化すれば、ＨＩＶ−１エンベロープ配列などの、患者由来のウイルスエンベロープ配列（約２，６００塩基対）の増幅を低ウイルス負荷（約５００コピー／ｍｌ）で可能にすることができる。
【０１１３】
（４）アッセイの有用性の証明
本発明のアッセイの有用性は、以下で得られる結果によって証明される。すなわち、（１）十分に特性決定された阻害剤の存在下でのウイルス侵入の用量依存的阻害を試験する；及び（２）十分に特性決定されたＨＩＶ−１中和抗体の存在下での感染の用量依存的阻害を試験する。
【０１１４】
本発明のウイルス侵入アッセイのための以下の適用例を評価した：
ｉ）ウイルス付着及び侵入阻害剤（融合、受容体及び共受容体阻害剤を含む）によるＨＩＶ−１複製の阻害を検出する；
ｉｉ）ＨＩＶ−１付着及び侵入阻害剤に対する感受性の変化を測定する；そして
ｉｉｉ）ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を標的とするワクチンに応答して産生された抗体の中和活性を検出する。
【０１１５】
好ましい一実施形態において、アッセイを以下のように実施することができる：（ａ）ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターによる第１細胞の共トランスフェクション；（ｂ）トランスフェクション後約４８時間目のウイルスの回収；（ｃ）ウイルス侵入阻害剤の存在及び不在下の両方でのこのウイルスを使用する第２細胞の感染；ならびに（ｄ）感染後約４８〜７２時間のルシフェラーゼの産生の測定。９６ウェルフォーマットを使用する、広範囲のウイルス侵入阻害剤濃度に対してＨＩＶ−１複製の用量依存的阻害を評価することができる。各阻害剤について、適切な濃度範囲を経験的に決定する。データを薬物濃度に対するルシフェラーゼ活性の阻害パーセント（ｌｏｇ１０）としてプロットする。コンピュータソフトウェアを使用してデータ解析を実施する。阻害曲線を使用して、特定の薬物又は抗体について、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定する（図６）。
【０１１６】
十分に特性決定された多様なＨＩＶ−１分離株から誘導したエンベロープタンパク質について、上述のように構築したｐＨＩＶｅｎｖベクターを使用して評価する。エンベロープの共受容体指向性を規定するため、ＨＩＶ−１の場合、ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４及びＣＤ４＋ＣＣＲ５を発現する細胞を使用する感染を上述のように評価する。例えばスルホン化ポリアニオン（硫酸デキストラン及びヘパリン）などの非特異的薬物を含むＨＩＶ−１侵入を阻害することが知られている多様な化合物（表２）を、本発明のアッセイで使用することができる。それぞれＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のための天然のリガンドである、Ｒａｎｔｅｓ及びＳＤＦ−１などのケモカイン（Alkhatibら、1996；Bleulら、1996、参照）も、本発明での使用に好適である。さらに、Ｔ−２０及びＴ１２４９（Trimeris, Inc.）、ＰＲＯ５４２（Progenics）、５ａ８（Tanox）などのウイルス侵入阻害剤を使用して、本発明のアッセイの有用性を評価した。
【０１１７】
標的細胞内での薬物毒性を標準的生存能力又は細胞毒性アッセイを使用して評価する（例えば色素排除、ＭＴＳ、ＡＴＰ）。
【０１１８】
融合阻害剤Ｔ２０に対して低下した感受性を示すＨＩＶ−１突然変異体（Rimskyら、1998）及びエンベロープタンパク質（ｇｐ４１−ＴＭ）内の薬物マップの存在下でこれらのウイルスの複製を可能にする遺伝的決定因子（突然変異）が記載されている。本発明のアッセイで薬物感受性の変化（すなわち耐性）を測定することができることを証明するため、（ａ）これらの突然変異エンベロープ遺伝子を保有するｐＨＩＶｅｎｖベクターを作製し、（ｂ）これらのベクター及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターを使用して、第１細胞を共トランスフェクトし、（ｃ）これらの突然変異エンベロープタンパク質を保有するウイルスを回収し、そして（ｄ）このウイルスをＴ２０の存在下での感染性について試験する。Ｔ２０に対する低下した薬物感受性は、突然変異エンベロープタンパク質を保有するウイルスのＩＣ５０を、規定した薬物耐性突然変異を欠失しているものと比較することによって、評価する。薬物耐性突然変異を持つエンベロープタンパク質を保有するウイルスは、薬物耐性突然変異を欠失しているエンベロープタンパク質を保有するウイルスよりも、高いＩＣ５０値を示すことができる。すなわち、阻害にはより高い薬物濃度を必要とする（図８に示したデータに等しい）。薬物耐性突然変異は、標準的な部位特異的突然変異誘発法を標準プロトコルにしたがって使用して、エンベロープ発現ベクター（ｐＨＩＶｅｎｖ）中に導入することができる（Petropoulosら、2000；Ziermannら、2000）。
【０１１９】
ＨＩＶ−１感染を防御する有効なワクチンは、広範な交差反応性中和抗体によって特徴付けられる強力な体液性免疫応答を誘発しなければならないことが、広く受け入れられている。結果として、ワクチン接種された個体の血清は、免疫原を標的とする高力価の中和抗体の存在について常套的に評価される。最近になって、ＨＩＶ−１／シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）キメラウイルスマカクモデル（ＳＨＩＶ）を使用して、Ｍａｓｃｏｌａ及び共同研究者らは、粘膜チャレンジ後、こうした中和抗体の受動移入がウイルス負荷の低下をもたらすことを示した（Mascolaら、2000）。本発明のアッセイを使用して、ＨＩＶ−１エンベロープ抗原などのエンベロープ抗原を標的とするワクチンに応答して産生される抗体のウイルス中和活性を迅速かつ確実に決定することができる。例えば、本発明のアッセイは、（ａ）十分特性決定された多様なエンベロープタンパク質を発現するｐＨＩＶｅｎｖベクターを作製し、（ｂ）これらのベクター及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターを使用して、第１細胞を共トランスフェクトし、（ｃ）ウイルスを回収して、抗体調製物又はワクチン血清の連続希釈物とともにインキュベートし、（ｄ）これらのウイルスを第２細胞中での感染性について試験する。先に記載したように、また文献に記載されているように、データ解析及びＩＣ５０の決定を行うことができる。ＨＩＶ−１の場合は、異なるＨＩＶ−１遺伝的バックグラウンド（例えばクレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、異なる細胞及び共受容体への指向性（マクロファージ／ＣＣＲ５、Ｔ細胞／ＣＸＣＲ４）、ならびに異なるエンベロープ特性（シンシチウム及び非シンシチウム誘発性、実験室適応増殖物又は一次分離株）を提示するように、ウイルスを選択することができる（表２）。約２０〜１００  ＴＣＩＤ５０／ウェルのウイルス投入量を使用し、必要に応じて調整することによって、アッセイの感度及び再現性を最適化するように、各ウイルスから規定された力価のストック株を調製するのが有益でありうる。抗体調製物は、一次分離株を中和する能力などの機能的な、又は特異的ｇｐ１２０もしくはｇｐ４１エピトープとの結合能力などの物理的な、これまでに開示された中和特性に基づいて、選択することができる（表２）。本発明のアッセイの性能は、科学文献に記載されている従来のウイルス中和アッセイで、これらの十分に特性決定された抗体試薬の活性に対して判定することができる。ＨＩＶ−１感染者の広範な代表グループからの血清を使用して、アッセイ感度を最大にすると同時に細胞毒性を最小にすることができる血清希釈度の適切な範囲を確立することができる。細胞毒性は、標準的な生存能力又は細胞毒性アッセイを使用して、評価することができる（例えば、色素排除、ＭＴＳ、ＡＴＰ）。
【０１２０】
以下の実施例は本発明をさらに例示及び説明するために提供するものであって、いかなる場合にも限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１２１】
ＨＩＶ−１侵入阻害剤に対する表現型薬物感受性の測定
この実施例では、ＨＩＶ−１の付着及び侵入（以後、まとめて侵入という）の阻害剤に対する感受性を正確かつ再現可能に測定するための手段及び方法を提供する。この実施例に基づいて、ＨＩＶ−１侵入阻害剤に対する感受性を測定するための手段及び方法を、限定するわけではないが以下のものなどのその他のウイルスに適用することができる：その他のレンチウイルス（例えばＨＩＶ−２）、その他のレトロウイルス（例えばＨＴＬＶ−１及び２）、ヘパドナウイルス（ヒトＢ型肝炎ウイルス）、フラビウイルス（ヒトＣ型肝炎ウイルス）、ならびにヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス）。この実施例では、さらに侵入阻害剤に対する感受性の変更（増加及び減少）を測定するための手段及び方法を提供する。
【０１２２】
侵入阻害剤に対する感受性の測定は、米国特許第５，８３７，４６４号（国際公開番号  ＷＯ９７／２７３１９）（これは参照として、本明細書中に組み入れる）に記載された表現型薬物感受性及び耐性試験のための手段及び方法を応用して、実施することができる。
【０１２３】
エンベロープ発現ベクターの１例として、患者由来のＨＩＶエンベロープ配列にコードされたエンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）を発現させるために、１つのベクター（ｐＨＩＶｅｎｖ）を設計する（図１）。次にｇｐ１６０を細胞プロテアーゼで切断すると、ＨＩＶ−１ウイルス粒子の表面上のエンベロープタンパク質を構成する表面（ｇｐ１２０ＳＵ）及び膜貫通（ｇｐ４１ＴＭ）サブユニットが得られる。ウイルス発現ベクターの例として、ゲノム及びサブゲノムウイルスＲＮＡならびにエンベロープポリタンパク質以外のすべてのＨＩＶタンパク質を発現させるように、第２ベクター（ｐＨＩＶｌｕｃ又はｐＨＩＶｌｕｃ  Ｕ３のいずれか）を設計する（図１Ａ−１Ｂ）。
【０１２４】
この適用例において、患者由来の核酸断片はＨＩＶ−１エンベロープポリタンパク質（ｇｐ１６０）のコード領域（約２．５ｋＢ）に相当し、次のいずれかを提示する：（ａ）ＨＩＶ感染個体由来のウイルスから単離したウイルスＲＮＡを使用して逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅されたエンベロープ配列、又は（ｂ）親分子クローン（典型的にはＮＬ４−３）の部位特異的突然変異誘発によって導入された特定の突然変異を含んでいる、ＨＩＶ−１の分子クローンから誘導されたエンベロープ配列。
【０１２５】
標準的操作法を使用して、ウイルスＲＮＡの単離を実施した（例えば、RNAgents Total RNA Isolation System, Promega, Madison WI、又はRNAzol, Tel-Test, Friendswood, TX）。ＲＴ−ＰＣＲプロトコルを２段階に分けた。レトロウイルス逆転写酵素［例えばSuperscript II（Invitrogen, Life Technologies）、モロニーＭｕＬＶ逆転写酵素（Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）、又はニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）］を使用して、ウイルスＲＮＡを第１鎖ｃＤＮＡに複写した。次に、以下のポリメラーゼを使用して、ｃＤＮＡを高コピー数へと増幅した：熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ［例えばＴａｑ（Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）、Ｔｔｈ（Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）、ＰｒｉｍｅＺｙｍｅ（Thermus brockianusから単離, Biometra, Gottingen, Germany）］又は「長鎖ＰＣＲ（ｌｏｎｇＰＣＲ）」の実施について記載されたような熱安定性ポリメラーゼの組合せ（Barnes,W.M.,(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91, 2216-2220）［例えば、Expand High Fidelity PCR System（Taq＋Pwo）、（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）又はGeneAmp XL PCR キット（Tth＋Vent）、（Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ）、Advantage-2,（Clontech）］。
【０１２６】
ウイルスＲＮＡの第１鎖ｃＤＮＡへの逆転写のために、オリゴ−ｄＴを使用した。エンベロープＰＣＲプライマー、フォワードプライマーＸｈｏ／Ｐｉｎ及びリバースプライマーＭｌｕ／Ｘｂａ（表３）を使用して、患者由来の核酸断片を増幅した。これらのプライマーは、ｇｐ１６０エンベロープポリタンパク質をコードする約２．５ｋＢエンベロープ遺伝子を増幅し、一方ＰＣＲ増幅産物の５’末端にＸｈｏＩ及びＰｉｎＡＩ認識部位を、そしてＰＣＲ増幅産物の３’末端にＭｌｕＩ及びＸｂａＩ部位を導入するように、設計される。
【０１２７】
患者由来の核酸断片（２．５ｋＢのエンベロープ配列増幅産物）を、米国特許第５，８３７，４６４号（国際公開番号ＷＯ９７／２７３１９）の記載の制限エンドヌクレアーゼ消化、ＤＮＡ連結及び細菌形質転換法を、わずかな変更を加えて、使用して、ＨＩＶ−１エンベロープ発現ベクター中に挿入した。約２．５ｋＢの増幅産物を５’末端でＸｈｏＩもしくはＰｉｎＡＩのいずれか、及び３’末端でＭｌｕＩもしくはＸｂａＩのいずれかにより消化した。得られた消化産物を、ＤＮＡリガーゼを使用して、改変したｐＣＸＡＳ又はｐＣＸＡＴ発現ベクターの５’Ｘｈｏ／ＰｉｎＡＩ及び３’ＭｌｕＩ／ＸｂａＩ部位中に連結した。ｐＣＸＡＳ及びｐＣＸＡＴベクターの構築については、すでに記載されている（基本特許のＣＰＴ中、それは米国特許第５，８３７，４６４号（国際公開番号ＷＯ９７／２７３１９）の実施例６であったと確信する）。改変したｐＣＸＡＳ及びｐＣＸＡＴベクターは、ｐＣＸＡＳ及びｐＣＸＡＴ中に存在するＸｈｏＩ、ＭｌｕＩ及びＸｂａＩ制限部位のほかに、ＰｉｎＡＩ制限部位を含有している。ＰｉｎＡＩ部位はＸｈｏＩとＭｌｕＩ部位の間に部位特異的突然変異誘発によって導入して、４つの部位が５’から３’に向かって以下の順序：ＸｈｏＩ、ＰｉｎＡＩ、ＭｌｕＩ及びＸｂａＩ、で位置するようにした。好ましい実施形態において、２．５ｋＢ増幅産物をＰｉｎＡＩ及びＭｌｕＩで消化し、改変ｐＣＸＡＳ発現ベクターの５’ＰｉｎＡＩ部位及び３’ＭｌｕＩ部位に連結した。連結反応産物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。３０〜３７℃で２４〜３６時間のインキュベーション後、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物から発現ベクタープラスミドＤＮＡを精製した。発現ベクター調製物が所定の患者の血清中に存在するＨＩＶ準種を適切に提示することを確認するため、多数（＞１００）の独立した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体をプールして、ｐＨＩＶｅｎｖプラスミドＤＮＡの調製に使用した。患者ウイルス由来のエンベロープタンパク質の発現を目的として、この手法で組み立てられるベクターをｐＨＩＶｅｎｖと総称する（図１及び３）。
【０１２８】
ゲノムＨＩＶ発現ベクターｐＨＩＶｌｕｃ及びｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３は、ＨＩＶゲノムＲＮＡ及びサブゲノムｍＲＮＡを転写し、かつエンベロープポリタンパク質以外の全ＨＩＶタンパク質を発現するように、設計する（図１Ｂ）。これらのベクターでは、抗ウイルス薬の存在又は不在下でのウイルスの複製能力をモニターするために使用される、機能性指標遺伝子カセット（この場合は「蛍ルシフェラーゼ」）を収容するために、エンベロープ遺伝子の一部が欠失されている。ｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３では、感染細胞における５’ＬＴＲからのウイルスＲＮＡの転写を防止するために、３’Ｕ３領域の一部が欠失されている。
【０１２９】
ＨＩＶ−１侵入阻害剤についての感受性アッセイを実施するにあたって、ヒト胚性腎細胞系２９３で構成されるパッケージ用宿主細胞（Cell Culture Facility, UC San Francisco, SF, CA）、ならびにＣＤ４（ＨＴ４）＋ＣＣＲ５、及びＣＸＣＲ４を発現するヒト骨肉種（ＨＯＳ）細胞系、あるいはＣＤ４とＣＣＲ５又はＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現する星状神経膠腫（Ｕ−８７）細胞系で構成される標的宿主細胞を使用した。
【０１３０】
ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３を使用して、薬物感受性試験を実施した。患者由来の核酸断片にコードされたエンベロープタンパク質を含有する偽型化ＨＩＶ粒子は、パッケージ用宿主細胞（ＨＥＫ  ２９３）を耐性試験ベクターＤＮＡでトランスフェクトすることによって、作製した。トランスフェクション（約４８時間）後ウイルス粒子を回収し、ＨＩＶ受容体（すなわちＣＤ４）及び共受容体（すなわちＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）を発現する標的細胞（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４、又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４もしくはＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）への感染に使用する。感染（約７２時間）後、標的細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定する。標的宿主細胞への感染に成功してルシフェラーゼ活性を生成するためには、ＨＩＶは複製を１回完結しなければならない。感染細胞中で検出されるルシフェラーゼ活性の量を「感染性」の直接の尺度として使用する（図１及び２）。何らかの理由（例えば適切な受容体もしくは共受容体の欠失、阻害性薬物の活性、中和抗体の結合）でウイルスが標的細胞に侵入することができない場合、ルシフェラーゼ活性は減衰する。薬物感受性は、薬物の不在下の感染性を薬物の存在下での感染性と比較することによって評価する。相対的薬物感受性は、「試験」ウイルスの感受性を、ＨＩＶ−１の分子クローン（例えばＮＬ４−３又はＨＸＢ２）由来の十分特性決定された参照ウイルス（野生型）の感受性と比較することによって、定量することができる。
【０１３１】
パッケージ用宿主細胞を直径１０ｃｍの培養皿に播種し、プレーティングの１日後にｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３でトランスフェクトした。トランスフェクションはリン酸カルシウム共沈降操作法を使用して実行した。ＤＮＡ沈降物を含有する細胞培養培地を、トランスフェクション後１〜２４時間目に新鮮な培地と交換した。ウイルス粒子を含有する細胞培養培地は典型的にはトランスフェクション後２日目に回収し、０．４５ｍｍフィルターを通過させた。感染前に、標的細胞を細胞培養培地にプレーティングした。侵入阻害剤は典型的には感染時（場合によっては感染の１日前）に標的細胞に添加した。典型的には、感染の３日後に、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Promega）及び照度計を使用して、標的細胞をルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【０１３２】
一実施形態において、融合阻害薬（Ｔ−２０、ＤＰ１７８とも称されている；Trimeris, Research Triangle Park, NC）に対する感受性を証明した（図６）。ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する標的細胞（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）をＴ−２０の不在下、及び広範囲のＴ−２０濃度範囲（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させた。Ｔ−２０存在下の感染細胞において産生されたルシフェラーゼの量をＴ−２０不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。Ｒ５指向性（ＪＲＣＳＦ、９１ＵＳ００５．１１）、Ｘ４指向性（ＮＬ４−３，９２ＨＴ５９９．２４）及び二重指向性（９２ＨＴ５９３．１）ウイルスを試験した。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＴ−２０濃度（ＩＣ５０、図６中、垂直破線として示す）の決定によって、薬物感受性を定量する。より低いＩＣ５０値を持つウイルスは、高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＴ−２０に対してより感受性である。
【０１３３】
さらに別の実施形態において、多様な侵入阻害剤に対する感受性を測定することができる。これらの阻害剤には、限定するわけではないが、表４（抗ＨＩＶ薬の表）に掲載する薬物及び化合物が含まれる。
【０１３４】
第２の実施形態において、４−（ピペリジン−１−イル）ブタンクラスの化合物に属するＣＣＲ５阻害剤（Dorn,C.P.ら、(2001)；Finke,P.E.ら、(2001)；Merck, West Point, PA）に対する感受性を証明する。ＣＤ４及びＣＣＲ５を発現する標的細胞（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）（Ｒ５細胞）をＣＣＲ５阻害剤の不在下、及び広範囲のＣＣＲ５阻害剤濃度範囲（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させた。ＣＣＲ５阻害剤存在下の感染細胞において産生されたルシフェラーゼの量をＣＣＲ５阻害剤不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。Ｒ５指向性（ＪＲＣＳＦ）、Ｘ４指向性（ＮＬ４−３）及び二重指向性（９２ＨＴ５９３．１）ウイルスを試験した。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＣＣＲ５阻害剤濃度（ＩＣ５０、図８中、垂直破線として示す）の決定によって、薬物感受性を定量した。より低いＩＣ５０値を持つウイルスは、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＣＣＲ５阻害剤に対して感受性である。Ｘ４指向性ウイルスはＵ８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５標的細胞に感染しなかった。
【０１３５】
第３の実施形態において、ＣＸＣＲ４阻害剤（ＡＭＤ３１００；ＡｎｏｒＭＥＤ）に対する感受性を証明した。ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現する標的細胞（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）をＣＸＣＲ４阻害剤の不在下、及び広範囲のＣＸＣＲ４阻害剤濃度範囲（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させた。ＣＸＣＲ４阻害剤存在下の感染細胞において産生されたルシフェラーゼの量をＣＸＣＲ４阻害剤不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。Ｒ５指向性（ＪＲＣＳＦ）、Ｘ４指向性（ＮＬ４−３）及び二重指向性（９２ＨＴ５９３．１）ウイルスを試験した。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＣＸＣＲ４阻害剤濃度（ＩＣ５０、図９中、垂直破線として示す）の決定によって、薬物感受性を定量する。より低いＩＣ５０値を持つウイルスは、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＣＣＲ５阻害剤に対して感受性である。Ｒ５指向性ウイルスはＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４標的細胞に感染しなかった。
【０１３６】
ＣＤ４阻害剤（例えばマウスモノクローナル抗体  ５Ａ８；Tanox, Houston, TX）に対する感受性を測定することができる。ＣＤ４及び共受容体の１つもしくは両方を発現する標的細胞（例えばＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）をＣＤ４阻害薬の不在下、及び広範囲のＣＤ４阻害薬濃度範囲（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させることができる。ＣＤ４阻害剤存在下の感染細胞において産生されたルシフェラーゼの量をＣＤ４阻害剤不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定することができる。Ｒ５指向性（例えばＪＲＣＳＦ）、Ｘ４指向性（例えばＮＬ４−３）及び二重指向性（例えば９２ＨＴ５９３．１）ウイルスを試験することができる。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＣＤ４阻害剤濃度（ＩＣ５０）の決定によって、薬物感受性を定量することができる。より低いＩＣ５０値を持つウイルスは、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＣＤ４阻害剤に対して感受性である。
【実施例２】
【０１３７】
新規なウイルス侵入阻害剤の探索、最適化及び特性決定
一実施形態において、ウイルス侵入アッセイを使用して、ウイルス侵入を阻害する新規化合物／化学物質を同定することができる。ＣＤ４及び共受容体の１つもしくは両方を発現する標的細胞（例えばＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４、又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）を、大量の化学物質ライブラリーのそれぞれのメンバーの存在下で感染させることができる（ハイスループットスクリーニング、ＨＴＳ）。特定の化合物の存在下での感染標的細胞で産生されたルシフェラーゼの量を、その化合物不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ある化合物のウイルス複製を阻害する能力を決定することができる。
【０１３８】
別の実施形態において、ウイルス侵入アッセイを使用して、ＨＴＳで同定されたリード化合物の抗ウイルス活性を最適化することができる。化学的に修飾したリード化合物の誘導体を試験して、増強されたウイルス侵入阻害活性を持つ特定の誘導体を同定することができる。ＣＤ４及び共受容体の１つもしくは両方を発現する標的細胞（例えばＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４、又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）を、阻害剤候補の不在下、及び広範囲にわたる阻害剤候補濃度（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させることができる。候補阻害剤の存在下での感染細胞で産生されたルシフェラーゼの量を、その候補阻害剤不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定することができる。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要な阻害剤候補の濃度（ＩＣ５０）の決定によって、薬物感受性を定量することができる。より低いＩＣ５０値を持つ誘導体化化合物は、より高いＩＣ５０値を持つ誘導体よりも強力な（より強い抗ウイルス活性を持つ）ウイルス侵入阻害剤である。
【０１３９】
さらに別の実施形態において、ウイルス侵入アッセイを使用して、新規ウイルス侵入阻害薬候補の作用機構、及び感受性が異なると見られるある範囲のウイルスに対する抗ウイルス活性を特性決定することができる。ＣＤ４及び共受容体の１つもしくは両方を発現する標的細胞（例えばＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４、又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）を、新規侵入阻害薬候補の不在下、及び広範囲にわたる侵入阻害薬候補濃度（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させることができる。新規侵入阻害剤の存在下での感染細胞で産生されたルシフェラーゼの量を、その新規侵入阻害剤不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定することができる。Ｒ５指向性（例えばＪＲＣＳＦ）、Ｘ４指向性（例えばＮＬ４−３）及び二重指向性（例えば９２ＨＴ５９３．１）ウイルスを試験することができる。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＣＤ４阻害剤の濃度（ＩＣ５０）の決定によって、薬物感受性を定量することができる。
【０１４０】
この新規侵入阻害剤がＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４共受容体を阻止することによって作用するのかどうかを決定するため、またＲ５指向性ウイルスをＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５細胞中で新規阻害剤に対して試験し、Ｘ４指向性ウイルスをＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞中で新規阻害剤に対して試験する。Ｒ５ウイルス感染の阻害はＣＣＲ５共受容体拮抗作用を示し、逆にＸ４ウイルス感染の阻害はＣＸＣＲ４共受容体拮抗作用を示す。Ｒ５及びＸ４ウイルス感染の阻害はＣＤ４拮抗作用又は膜融合の阻害のいずれかを示すものと考えられる。
【０１４１】
同一クラスの、又は別のクラスの他のウイルス侵入阻害剤に対して耐性を示すウイルス、又は低下した感受性を示すウイルスに対する新規阻害剤の活性を特性決定するために、この新規侵入阻害剤を使用するウイルス侵入アッセイで、選択したパネルの薬物耐性ウイルスを試験することができる。パネルには、ＣＣＲ５阻害剤、ＣＸＣＲ４阻害剤、ＣＤ４阻害剤、及び膜融合阻害剤に対して種々のレベルの感受性を持つウイルスが含まれうる。このパネルには、１種以上の侵入阻害剤に対する感受性／耐性の低下に関係した１以上の特異的突然変異があるウイルスも含まれうる。
【実施例３】
【０１４２】
ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を変更するエンベロープのアミノ酸置換／突然変異の同定
この実施例では、ウイルス侵入阻害剤に対して低下した感受性／耐性を賦与するＨＩＶ−１エンベロープ内の突然変異を同定するための手段及び方法を提供する。またこの実施例では、特定のエンベロープ突然変異によって賦与された侵入阻害剤に対する低下した感受性の程度を定量するための手段及び方法を提供する。
【０１４３】
患者サンプルから誘導したエンベロープ配列又は患者サンプルから誘導した個々のクローン、あるいは特定の突然変異を含むように部位特異的突然変異誘発によって遺伝子工学的に操作したエンベロープ配列を、侵入アッセイにおいて試験して、十分特性決定された参照用標準物質（例えばＮＬ４−３、ＨＸＢ２）に基づいて薬物感受性を定量する。
【０１４４】
一実施形態において、長期間にわたる患者サンプル（別の時点で同一の患者から採取したウイルス）に対する感受性を評価する。例えば、侵入阻害剤に対する感受性を、治療開始前、薬物治療による変化の前もしくは後、又は疾病進行のウイルス学的（ＲＮＡコピー数）、免疫学的（ＣＤ４  Ｔ細胞）もしくは臨床的（日和見感染）マーカーの変化の前もしくは後に、測定する。
【０１４５】
患者ＨＩＶサンプルの遺伝子型分析
患者サンプルプール、又は患者プールから誘導したクローンを代表するエンベロープ配列を、広範囲に利用し得るＤＮＡ配列決定法によって分析することができる。本発明の一実施形態において、ウイルスＲＮＡの精製、ＲＴ／ＰＣＲ及びジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター配列決定化学ならびにキャピラリーゲル電気泳動（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して、患者のＨＩＶサンプルの配列を決定する。患者ウイルスプールもしくはクローンのエンベロープ配列を参照配列、その他の患者サンプル、又は入手可能ならば、同一の患者から治療開始前に取得したサンプルと比較する。参照もしくは治療前配列と異なる配列について遺伝子型を試験し、侵入阻害剤に対する感受性の差異に相関させる。
【０１４６】
部位特異的突然変異体の侵入阻害剤に対する感受性
適合性の変化に相関する遺伝子型の変化は、確定された薬物感受性の遺伝的バックグラウンド（例えばＮＬ４−３参照株）に対して特定の突然変異を含有するエンベロープ発現ベクター（ｐＨＩＶｅｎｖ）を構築することによって評価する。突然変異は単独で、及び／又は侵入阻害剤感受性をモジュレートすると考えられるその他の突然変異と組み合わせて、導入することができる。部位特異的突然変異誘発のための広範に利用可能な方法のいずれかを使用して、エンベロープ突然変異をｐＨＩＶｅｎｖベクター中に導入する。本発明の一実施形態において、部位特異的突然変異誘発のために、メガプライマー（mega-primer）ＰＣＲ法を使用する（Sarkar,G. and Summer,S.S., 1990）。特定のエンベロープ突然変異又は突然変異群を含有するｐＨＩＶｅｎｖベクターを、実施例１に記載したウイルス侵入アッセイを使用して試験する。エンベロープ突然変異を含有するウイルスの薬物感受性を、評価中の特定の突然変異をもたない遺伝学的に確定された薬物感受性ウイルスの薬物感受性と比較する。観察された侵入阻害剤感受性の変化は、ｐＨＩＶｅｎｖベクターに導入した特定の突然変異に帰せられる。
【０１４７】
本発明の一実施形態において、ｇｐ４１エンベロープタンパク質中の特定の薬物耐性突然変異によって賦与された、融合阻害剤  Ｔ−２０に対する感受性の低下を証明する（図７）。ＣＤ４、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する細胞に、Ｔ−２０の不在下、及び広範囲にわたるＴ−２０濃度（ｘ軸、ｌｏｇ１０目盛）下で感染させた。Ｔ−２０の存在下での感染細胞で産生されたルシフェラーゼの量を、Ｔ−２０不在下で産生されたルシフェラーゼの量と比較することによって、ウイルス複製の阻害パーセント（ｙ軸）を決定した。ｇｐ４１膜貫通エンベロープタンパク質中に１又は２個の特定の突然変異を含有する同質遺伝子ウイルスを試験した（図の凡例中、赤で強調してある；Rimskyら、J.Virol. 72: 986-993）。ウイルス複製を５０％阻害するのに必要なＴ−２０の濃度（ＩＣ５０、垂直破線として示す）の決定によって、薬物感受性を定量する。より低いＩＣ５０値を持つウイルスは、より高いＩＣ５０値を持つウイルスよりもＴ−２０に感受性である。
【０１４８】
一実施形態において、十分特性決定されたＸ４指向性（ＮＬ４−３）及びＲ５指向性（ＪＲＣＳＦ）ウイルスに薬物耐性突然変異を導入した。ウイルス侵入アッセイを使用して、Ｔ２０感受性を測定した（図７）。試験ウイルスのＩＣ５０を、ＨＩＶ−１のＨＸＢ２株のＩＣ５０で割ることによって、各ウイルスについてのＴ−２０感受性の変化倍数（fold change: FC）を決定した。類似の突然変異ウイルスのＴ−２０感受性が科学文献に報告されている（Rimskyら）。この実施形態では、ｇｐ４１のＧＩＶモチーフ内に１つの突然変異を持つウイルス（ＤＩＶ、ＧＩＭ、ＳＩＶ）は野生型ウイルス（ＧＩＶ）よりもＴ２０に対する感受性が低かった。ＧＩＶモチーフ内に２つの突然変異を持つウイルス（ＤＩＭ、ＳＩＭ、ＤＴＶ）はＧＩＶモチーフ内に１つの突然変異を有するか又は突然変異を持たないウイルスよりもＴ２０に対する感受性が低かった。
【０１４９】
別の実施形態において、侵入阻害剤に対して低下（又は増加）した感受性を賦与しうる突然変異を、感受性及び耐性ウイルスのエンベロープ遺伝子を配列決定することによって、同定する。感受性及び耐性ウイルスの推定アミノ酸配列を比較して、候補薬物耐性突然変異を同定する。特定の突然変異が変更された薬物感受性を賦与する能力は、薬物感受性ウイルス中にその突然変異を導入して、その突然変異ウイルスの感受性をウイルス侵入アッセイで測定することによって、確認又は反証する。ここに示す実施例では、異なるＴ−２０感受性を示すウイルスについて、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１膜貫通エンベロープタンパク質の最初のヘプタド反復配列（heptad repeat）（ＨＲ−１）内のアミノ酸配列の短いストレッチをアライメントする。強調したアミノ酸が、Ｔ−２０に対して低下した感受性を賦与することが知られた突然変異を表す。
【０１５０】
同様の表現型及び遺伝子型分析を使用して、（ａ）ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４阻害剤への感受性を変更する／これに影響する、（ｂ）Ｘ４、Ｒ５及び二重指向性を特定する、そして（ｃ）中和抗体を引き出す、エンベロープアミノ酸配列を同定することができる。
【０１５１】
ある実施形態においては、特定のエンベロープアミノ酸配列／突然変異によって賦与される、共受容体（ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４）阻害剤に対する低下した感受性を証明する。
【０１５２】
別の実施形態においては、特定のエンベロープアミノ酸配列／突然変異によって賦与される、受容体（ＣＤ４）阻害剤に対する低下した感受性を証明する。
【実施例４】
【０１５３】
ＨＩＶ−１共受容体及び受容体指向性の判定
この実施例では、ＨＩＶ−１共受容体指向性を判定するための手段及び方法を提供する。この実施例では、ＨＩＶ−１受容体指向性を判定するための手段及び方法をも提供する。
【０１５４】
一実施形態においては、ＣＣＲ５共受容体を使用するウイルスを同定する。関連する実施形態において、ＣＸＣＲ４共受容体を使用するウイルスを同定する。別の関連する実施形態では、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体を使用するウイルスを同定する。別の関連する実施形態では、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４以外の共受容体を使用するウイルスを同定する。
【０１５５】
別の実施形態において、ＣＤ４受容体を使用するウイルスを同定する。関連する実施形態において、ＣＤ８を使用するウイルスを同定する。別の関連する実施形態では、細胞に感染するためにＣＤ４又はＣＤ８を必要としないウイルスを同定する。
【０１５６】
この実施形態において、２種類の細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、本明細書中ではＲ５細胞とも称する。もう一つの細胞系はＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、本明細書中ではＸ４細胞とも称する。個々の細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃＤＵ３ベクターでトランスフェクトした細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者ウイルス由来の配列を含有し、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態において、９６ウェルプレート中で培養したＲ５及びＸ４標的細胞を使用して、ウイルスを評価する（図３Ａ）。典型的には、Ｒ５及びＸ４細胞を感染の１日前にプレーティングする。各ウイルスストック株による感染を以下の条件で実施する：薬物不在下（薬物不含）、Ｒ５指向性ウイルスを優先的に阻害する薬物（ＣＣＲ阻害剤、例えばピペリジン−１−イルブタン化合物）の阻害濃度存在下、及びＸ４指向性ウイルスを優先的に阻害する薬物（ＣＸＣＲ４阻害剤、例えばＡＭＤ３１００）の阻害濃度存在下。薬物の存在下及び不在下両方での、各細胞型中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、共受容体指向性を評価する。この実施形態において、各ウイルスがＲ５細胞もしくはＸ４細胞に、又はウイルスが二重指向性ならばＸ４及びＲ５細胞の両方に優先的に感染する（ルシフェラーゼ活性を産生する）能力を比較することによって、アッセイの結果を判断する。ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４阻害剤が感染を特異的に阻止する（ルシフェラーゼ活性を阻害する）能力も評価する（図３Ｂ）。この実施形態において、Ｘ４指向性ウイルスはＸ４細胞に感染するが、Ｒ５細胞には感染せず、またＸ４細胞の感染はＣＸＣＲ４阻害剤（ＡＭＤ３１００）によって阻止される。この実施形態において、Ｒ５指向性ウイルスはＲ５細胞に感染するが、Ｘ４細胞には感染せず、またＲ５細胞の感染はＣＣＲ５阻害剤（ピペリジン−１−イルブタン化合物）によって阻止される。この実施形態において、二重指向性ウイルス、又はＸ４及びＲ５指向性ウイルスの混合物はＸ４及びＲ５細胞の両方に感染し、またＲ５細胞の感染はＣＣＲ５阻害剤によって阻止され、Ｘ４細胞の感染はＣＸＣＲ４阻害剤によって阻止される。この実施形態において、非生存性ウイルスはＸ４又はＲ５細胞中のいずれにおいても複製しない（ルシフェラーゼ活性が産生されない）。
【０１５７】
別の実施形態では、３種類以上の細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、本明細書中ではＲ５細胞とも称する。もう一つのの細胞系はＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、本明細書中ではＸ４細胞とも称する。これらに加えた細胞系はＣＤ４とその他の候補ＨＩＶ−１共受容体（限定するわけではないが、ＢＯＮＺＯ、ＢＯＢなど）を発現する。表１を参照されたい。これらの追加の細胞系はその他の候補共受容体を発現するが、ＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４は発現しない。個々の細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターでトランスフェクトした細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者ウイルス由来の配列を含有し、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態では、９６ウェルプレート中で培養した細胞を使用して、ウイルスを評価する。各ウイルスストック株による感染を、Ｒ５細胞、Ｘ４細胞、及びＣＤ４と候補共受容体を発現する細胞系で実施する。各細胞型中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、共受容体指向性を評価する。この実施形態において、各ウイルスがＲ５細胞もしくはＸ４細胞に、又は候補共受容体を発現する細胞系に優先的に感染する（ルシフェラーゼ活性を産生する）能力を比較することによって、アッセイの結果を判断する。この実施形態では、Ｘ４指向性ウイルスはＸ４細胞に感染するが、Ｒ５細胞には感染しない。この実施形態では、Ｒ５指向性ウイルスはＲ５細胞に感染するが、Ｘ４細胞には感染しない。この実施形態では、二重指向性ウイルス、又はＸ４及びＲ５指向性ウイルスの混合物はＸ４及びＲ５細胞の両方に感染する。この実施形態において、（ＣＣＲ５でもＣＸＣＲ４でもない）別の候補共受容体を発現する細胞系の感染は、その別の共受容体への指向性に起因する。この実施形態において、非生存性ウイルスはＸ４又はＲ５細胞中のいずれにおいても複製しない。
【０１５８】
別の実施形態においては、４種類の細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、本明細書中ではＲ５細胞とも称する。第２の細胞系はＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、本明細書中ではＸ４細胞とも称する。第３の細胞系はＣＤ８とＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ８／ＣＣＲ５）、本明細書中ではＣＤ８／Ｒ５細胞とも称する。第４の細胞系はＣＤ８とＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ８／ＣＸＣＲ４）、本明細書中ではＣＤ８／Ｘ４細胞とも称する。個々の細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターでトランスフェクトした細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者ウイルス由来の配列を含有し、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態において、９６ウェルプレート中で培養した細胞を使用して、ウイルスを評価する。各ウイルスストック株による感染を、Ｒ５細胞、Ｘ４細胞、ＣＤ８／Ｒ５細胞及びＣＤ８／Ｘ４細胞中で実施する。各細胞型中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、共受容体指向性を評価する。この実施形態では、各ウイルスがＲ５細胞、Ｘ４細胞、ＣＤ８／Ｒ５細胞又はＣＤ８／Ｘ４細胞に優先的に感染する（ルシフェラーゼ活性を産生する）能力を比較することによって、アッセイの結果を判断する。この実施形態において、ＣＤ４指向性ウイルスはＸ４細胞及び／又はＲ５細胞に感染する。この実施形態において、ＣＤ８指向性ウイルスはＣＤ８／Ｒ５細胞及び／又はＣＤ８／Ｘ４細胞に感染する。この実施形態において、二重指向性（ＣＤ４及びＣＤ８受容体を使用する）ウイルスはＸ４細胞及び／又はＲ５細胞ならびにＣＤ８／Ｘ４及び／又はＣＤ８／Ｒ５細胞に感染する。この実施形態において、ＣＤ８は発現するがＣＤ４は発現しない細胞系の感染は、ＣＤ８受容体への指向性に起因する。この実施形態において、非生存性ウイルスはＸ４又はＲ５細胞中のいずれにおいても複製しない。
【０１５９】
関連するさらに別の実施形態において、２種類の細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５とＣＸＣＲ４を発現する（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）。第２の細胞系はＣＤ８とＣＣＲ５とＣＸＣＲ４を発現する（ＨＯＳ／ＣＤ８／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）。個々の細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターでトランスフェクトした細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者ウイルス由来の配列を含有し、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態において、９６ウェルプレート中で培養した細胞を使用して、ウイルスを評価する。各ウイルスストック株による感染を、ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞及びＨＯＳ／ＣＤ８／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞中で実施する。各細胞型中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、共受容体指向性を評価する。この実施形態では、各ウイルスがＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞又はＨＯＳ／ＣＤ８／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞に優先的に感染する（ルシフェラーゼ活性を産生する）能力を比較することによって、アッセイの結果を判断する。この実施形態において、ＣＤ４指向性ウイルスはＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞に感染するが、ＨＯＳ／ＣＤ８／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞には感染しない。この実施形態において、ＣＤ８指向性ウイルスはＨＯＳ／ＣＤ８／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞には感染するが、ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞には感染しない。この実施形態において、二重指向性（ＣＤ４及びＣＤ８受容体を使用する）ウイルスはＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞及びＨＯＳ／ＣＤ８／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞の両方に感染する。この実施形態において、ＣＤ８は発現するがＣＤ４は発現しない細胞系の感染は、ＣＤ８受容体への指向性に起因する。この実施形態において、非生存性ウイルスはＸ４又はＲ５細胞中のいずれにおいても複製しない。
【０１６０】
別の実施形態において、２種類の細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５とＣＸＣＲ４を発現する（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）。第２の細胞系はＣＣＲ５とＣＸＣＲ４を発現するがＣＤ４又はＣＤ８を発現しない（ＨＯＳ／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）。個々の細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターでトランスフェクトした細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者ウイルス由来の配列を含有し、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態において、９６ウェルプレート中で培養した細胞を使用して、ウイルスを評価する。各ウイルスストック株による感染を、ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞及びＨＯＳ／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞中で実施する。各細胞型中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、ＣＤ４及びＣＤ８非依存性感染を評価する。この実施形態において、各ウイルスがＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞又はＨＯＳ／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞に優先的に感染する（ルシフェラーゼ活性を産生する）能力を比較することによって、アッセイの結果を判断する。この実施形態において、ＣＤ４依存性ウイルスはＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞に感染するが、ＨＯＳ／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞には感染しない。この実施形態において、ＣＤ４非依存性ウイルスはＨＯＳ／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞及びＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞の両方に感染する。この実施形態において、ＣＤ４の発現を欠損している細胞系の感染は、ＣＤ４非依存性感染によるものと解釈される。この実施形態において、非生存性ウイルスはＸ４又はＲ５細胞中のいずれでも複製しない。
【実施例５】
【０１６１】
共受容体及び受容体指向性を変更するＨＩＶ−１エンベロープアミノ酸の置換／突然変異の同定
この実施例では、共受容体指向性（Ｘ４対Ｒ５対Ｘ４／Ｒ５二重）を特定するか変更するＨＩＶ−１エンベロープアミノ酸配列を同定するための手段及び方法を提供する。またこの実施例では、ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５以外の共受容体の利用を特定するＨＩＶ−１エンベロープアミノ酸配列を同定するための手段及び方法を提供する。この実施例はまた、受容体指向性（ＣＤ４対ＣＤ８）を特定するＨＩＶ−１エンベロープ配列を同定するための手段及び方法を提供する。
【０１６２】
実施例４に記載したように、患者サンプル又は患者サンプル由来の個々のクローンから誘導したエンベロープ配列、あるいは特定の突然変異を含むように部位特異的突然変異誘発によって遺伝子操作したエンベロープ配列を侵入アッセイで試験して、共受容体指向性を決定する。
【０１６３】
ある実施形態においては、長期間にわたる患者サンプル（異なる時点で同一の患者から回収したウイルス）の共受容体指向性を評価する。例えば、共受容体指向性を、治療開始前、薬物治療による変化の前後、又は疾病進行のウイルス性マーカー（ＲＮＡコピー数）、免疫学的マーカー（ＣＤ４  Ｔ細胞）もしくは診断マーカー（日和見感染）の変化の前後に評価する。
【０１６４】
別の実施形態において、多数の異なる患者から採取したサンプルについて、共受容体指向性を評価する。さらに別の実施形態において、異なるウイルス及び患者集団に相当する多数の患者から採取したサンプルについて、共受容体指向性を評価する。こうした患者集団として、限定するわけではないが、新たに感染した患者、慢性的に感染した患者、進行した疾患を有する患者、及び抗レトロウイルス治療もしくは免疫治療を受けている患者が含まれる。こうしたウイルス集団として、限定するわけではないが、明確に区別される遺伝的特徴を持つウイルス（クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、抗レトロウイルス薬に感受性があるウイルス、抗レトロウイルス薬への感受性／耐性が低下したウイルスが含まれる。
【０１６５】
患者ＨＩＶサンプルの遺伝子型分析
患者サンプルプール、又は患者プール由来のクローンに相当するエンベロープ配列を、広く利用し得るＤＮＡ配列決定法のいずれかによって、分析することができる。本発明の一実施形態において、ウイルスＲＮＡ精製、ＲＴ／ＰＣＲ及びジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター配列決定化学ならびにキャピラリーゲル電気泳動（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して、患者のＨＩＶサンプルの配列を決定する。患者ウイルスプール又はクローンのエンベロープ配列を参照配列、その他の患者サンプル、又は入手可能ならば、同一の患者から治療開始前に取得したサンプルと比較する。参照配列もしくは治療前配列と異なる配列について遺伝子型を検査し、侵入阻害剤の感受性の差異に相関させる。
【０１６６】
遺伝的に特性決定されたウイルスの共受容体及び受容体指向性
共受容体指向性に相関するエンベロープアミノ酸配列を、確定された遺伝子バックグラウンド（例えばＸ４指向性についてＮＬ４−３、Ｒ５についてＪＲＣＳＦ）に対して特定の突然変異を含むエンベロープ発現ベクター（ｐＨＩＶｅｎｖ）を構築することによって、評価する。突然変異は単独で、及び／又は共受容体の利用性をモジュレートすると考えられるその他の突然変異群と組み合わせて、組み込むことができる。部位特異的突然変異誘発のための広く利用可能な方法のいずれかを使用して、エンベロープ突然変異をｐＨＩＶｅｎｖベクター中に導入することができる。本発明の一実施形態では、部位特異的突然変異誘発のためのメガプライマー（mega-primer）ＰＣＲ法を使用する（Sarkar,G. and Summer,S.S., 1990）。実施例１に記載したウイルス侵入アッセイを使用して、特定のエンベロープ突然変異又は突然変異群を含むｐＨＩＶｅｎｖベクターを試験する。エンベロープ突然変異を含むウイルスの共受容体指向性を、評価中の特定の突然変異を含まない遺伝的に確定されたウイルスの共受容体指向性と比較する。十分特性決定された参照ウイルス中にこの突然変異を導入し、実施例４に記載したウイルス侵入アッセイで突然変異ウイルスの共受容体指向性を評価することによって、特定の突然変異が共受容体指向性を変化させる能力を確認又は反証する。観察された共受容体指向性の変化はｐＨＩＶｅｎｖベクター中に導入された特定の突然変異によるものと考える。
【０１６７】
本発明の一実施形態において、表面エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内のアミノ酸配列を評価することによって、Ｒ５指向性の遺伝的決定基を同定する。多数のＸ４指向性ウイルス及びＲ５指向性ウイルスのアミノ酸配列を比較することによって、評価中のアミノ酸配列を同定する。Ｘ４及びＲ５ウイルス間で一貫性がある差異を評価のために選択する。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内に特定の「Ｒ５候補」突然変異を含む、十分特性決定されたＸ４親クローン（例えばＮＬ４−３、ＨＸＢ２）に基づく同質遺伝子ウイルスを、部位特異的突然変異誘発によって構築し、実施例４に記載したように共受容体指向性について試験する。ＣＤ４とＣＣＲ５（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）又はＣＤ４とＣＸＣＲ４（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）を発現する細胞に、Ｒ５（ピペリジン−１−イルブタン化合物）及びＸ４（ＡＭＤ３１００）阻害剤の不在下、ならびに阻害濃度のＲ５及びＸ４薬物の存在下で、感染させる。Ｘ４指向性ウイルスをＲ５指向性ウイルスに変化させるアミノ酸置換を、Ｒ５指向性の遺伝的決定基として同定する。
【０１６８】
本発明の関連実施形態においては、表面エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内のアミノ酸配列を評価することによって、Ｘ４指向性の遺伝的決定基を同定する。多数のＸ４指向性ウイルス及びＲ５指向性ウイルスのアミノ酸配列を比較することによって、評価中のアミノ酸配列を同定する。Ｘ４及びＲ５ウイルス間での一貫性がある差異を評価のために選択する。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内に特定の「Ｘ４候補」突然変異を含む、十分特性決定されたＲ５親クローン（例えばＪＲＣＳＦ）に基づく同質遺伝子ウイルスを、部位特異的突然変異誘発によって構築し、実施例４に記載したように共受容体指向性について試験する。ＣＤ４とＣＣＲ５（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）又はＣＤ４とＣＸＣＲ４（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）を発現する細胞に、Ｒ５（ピペリジン−１−イルブタン化合物）及びＸ４（ＡＭＤ３１００）阻害剤の不在下、ならびに阻害濃度のＲ５及びＸ４薬物の存在下で、感染させる。Ｘ４指向性ウイルスをＲ５指向性ウイルスに変化させるアミノ酸置換を、Ｒ５指向性の遺伝的決定基として同定する。
【０１６９】
本発明の関連実施形態において、完全ｇｐ１２０表面エンベロープタンパク質内のアミノ酸配列を評価することによって、Ｘ４又はＲ５指向性の遺伝的決定基を同定する。
【０１７０】
本発明の関連実施形態において、膜貫通エンベロープタンパク質ｇｐ４１内のアミノ酸配列を評価することによって、Ｘ４又はＲ５指向性の遺伝的決定基を同定する。
【０１７１】
本発明の関連実施形態において、表面エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内のアミノ酸配列を評価することによって、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４以外の共受容体の使用を特定する遺伝的決定基を同定する。ＣＸＣＲ４又はＣＣＲ５を発現しないが、その他の候補共受容体を発現する細胞で複製する能力があるウイルスのアミノ酸配列を比較することによって、評価中のアミノ酸配列を同定する。これらの非Ｘ４、非Ｒ５ウイルスとＸ４及びＲ５ウイルス間でのアミノ酸配列の一貫性がある差異を評価のために選択する。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内に特定の「非Ｘ４、非Ｒ５候補」突然変異を含む、十分特性決定されたＸ４（例えばＮＬ４−３）又はＲ５親クローン（例えばＪＲＣＳＦ）に基づく同質遺伝子ウイルスを、部位特異的突然変異誘発によって構築し、実施例４に記載したように共受容体指向性について試験する。ＣＤ４とＣＣＲ５（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、ＣＤ４とＣＸＣＲ４（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）及びＣＤ４とその他の候補共受容体（Ｕ−８７／ＣＤ４／Ｘ）を発現する細胞に、Ｒ５（ピペリジン−１−イルブタン化合物）及びＸ４（ＡＭＤ３１００）阻害剤の不在下、ならびに阻害濃度のＲ５及びＸ４薬物の存在下で、感染させる。非Ｘ４、非Ｒ５共受容体に対する指向性を賦与するアミノ酸置換を、その特定の共受容体に対する指向性の遺伝的決定基として同定する。
【０１７２】
本発明の関連実施形態において、完全ｇｐ１２０表面エンベロープタンパク質内のアミノ酸配列を評価することによって、その他の共受容体に対する指向性の遺伝的決定基を同定する。
【０１７３】
本発明の関連実施形態において、膜貫通エンベロープタンパク質ｇｐ４１内のアミノ酸配列を評価することによって、その他の共受容体に対する指向性の遺伝的決定基を同定する。
【０１７４】
本発明の別の実施形態において、表面エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内のアミノ酸配列を評価することによって、ＨＩＶ−１のための受容体として（ＣＤ４に加えて、又はその代わりに）ＣＤ８の使用を特定する遺伝的決定基を同定する。ＣＤ４を発現しないが、ＣＤ８を発現する細胞で複製する能力があるウイルスのアミノ酸配列を比較することによって、評価中のアミノ酸配列を同定する。これらのＣＤ４指向性ウイルスとＣＤ８指向性ウイルス間でのアミノ酸配列の一貫性がある差異を評価のために選択する。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内に特定の「ＣＤ８候補」突然変異を含む、十分特性決定されたＣＤ４指向性（例えばＮＬ４−３、ＪＲＣＳＦ）親クローンに基づく同質遺伝子ウイルスを、部位特異的突然変異誘発によって構築し、実施例４に記載したようにＣＤ８受容体指向性について試験する。ＣＤ４とＣＣＲ５（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、ＣＤ４とＣＸＣＲ４（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、ＣＤ８とＣＣＲ５（例えばＵ−８７／ＣＤ８／ＣＣＲ５）、ＣＤ８とＣＸＣＲ４（例えばＵ−８７／ＣＤ８／ＣＸＣＲ４）を発現する細胞に感染させる。ＣＤ８は発現するがＣＤ４は発現しない細胞中での複製を可能にするアミノ酸置換を、ＣＤ８指向性の遺伝的決定基として同定する。
【０１７５】
本発明の関連実施形態において、完全ｇｐ１２０表面エンベロープタンパク質内のアミノ酸配列を評価することによって、ＣＤ８指向性の遺伝的決定基を同定する。
【０１７６】
本発明の関連実施形態において、膜貫通エンベロープタンパク質ｇｐ４１内のアミノ酸配列を評価することによって、ＣＤ８指向性の遺伝的決定基を同定する。
【実施例６】
【０１７７】
ＨＩＶ−１抗体中和の測定
この実施例では、本明細書中でウイルス中和とも称する、抗体が介在するＨＩＶ−１中和を評価するための手段及び方法を提供する。この実施例では、ＨＩＶ−１感染患者内での抗体のウイルス中和活性を評価するための手段及び方法をも提供する。この実施例では、治療用ワクチン及びワクチン候補を接種した個体又は動物内での抗体のウイルス中和活性を評価するための手段及び方法をも提供する。この実施例では、防御（感染予防又は発病予防）用ワクチン及びワクチン候補を接種した個体又は動物内での抗体のウイルス中和活性を評価するための手段及び方法をも提供する。この実施例では、特定のモノクローナルもしくはポリクローナル抗体の調製物のウイルス中和活性を評価するための手段及び方法をも提供する。
【０１７８】
患者サンプル、又は患者サンプルに由来する個々のクローンから誘導したエンベロープ配列、あるいは部位特異的突然変異誘発によって特定の突然変異を含むように遺伝子操作したエンベロープ配列を侵入アッセイで試験して、抗体介在中和を評価する。
【０１７９】
一実施形態において、長期間にわたる患者サンプル（異なる時点で同一の患者から回収したウイルス）について抗体介在中和を評価する。例えば、ワクチン接種前、ワクチン接種過程中、及びワクチン接種過程完了後に時間を追って、ウイルス中和を評価する。関連する実施形態において、限定するわけではないが、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、及びウシを含む動物の血清を、候補ワクチンの接種前、反復接種中、及び接種過程の完了後に時間を追って、評価する。一実施形態において、ウイルス中和を、予防用ワクチン及びワクチン候補について評価する。別の実施形態において、治療用ワクチンについて、ウイルス中和を評価する。
【０１８０】
別の実施形態において、ウイルス中和を、多数の異なる患者から採取したサンプルについて評価する。別の実施形態において、ウイルス中和を、異なる患者集団及び異なるウイルス集団に相当する多数の患者から採取したサンプルについて評価する。「患者集団」として、限定するわけではないが、以下が含まれる：新たに感染した患者、慢性的に感染した患者、重症ＨＩＶ／ＡＩＤＳ疾病がある患者、疾病が急速に進行している患者、疾病の進行が緩慢な患者（典型的には長期非進行患者と称される）、抗レトロウイルス治療もしくは免疫治療（例えばインターロイキン−２、又はその他のサイトカイン）中の患者、ワクチン接種した患者、及びワクチン接種してない患者。「ウイルス集団」として、限定するわけではないが、以下が含まれる：明確に区別される遺伝的特徴及び地理的起源を持つウイルス（クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、抗レトロウイルス薬に感受性があるウイルス、抗レトロウイルス薬への感受性／耐性が低下したウイルス、一次分離株もしくは細胞培養物中での増殖に適応させた分離株（実験用適応ウイルスと称されることが多い）、合胞体誘発性（ＳＩ）ウイルス、非合胞体誘発性（ＮＳＩ）ウイルス、マクロファージ（Ｍ）指向性ウイルス、Ｔ細胞（Ｔ）指向性ウイルス、ならびに二重指向性（Ｍ及びＴ）ウイルス。
【０１８１】
患者抗体の特性決定（標準ウイルスパネルに対する患者抗体）
この実施形態においては、ＨＩＶ−１受容体ＣＤ４とＨＩＶ−１共受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する標的細胞系（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）を使用して、アッセイを実施する。かかる細胞系はＲ５及びＸ４指向性ウイルスの両方について抗体の中和活性を評価することができる。関連実施形態において、２種類の標的細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、Ｒ５指向性ウイルスを試験するために使用する。もう１つの細胞系はＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、Ｘ４指向性ウイルスを試験するために使用する。個々の標的細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃΔＵ３ベクターでトランスフェクトしたパッケージ用宿主細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。この実施形態において、ｐＨＩＶｅｎｖベクターは特定してかつ十分に特性決定されたウイルスのエンベロープ配列を含み、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。かかるウイルスは「標準ウイルスパネル」（上記ウイルス集団の記載参照）に相当する。標準パネルを構成し得るウイルスとして適当な例のいくつかを、全部ではないが、表４に掲載する。標準ウイルスパネルの１つを使用して、多くの異なる患者及び／又は動物（上記の患者集団の記載参照）から取得した血清の中和抗体活性を比較する。この実施形態において、９６ウェルプレートで培養した標的細胞を使用して、ウイルスを評価する。典型的には、感染の１日前に、ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４について１ウェルあたり５，０００細胞で、又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５及びＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４について１ウェルあたり１０，０００細胞で、標的細胞をプレーティングする。標的細胞の感染の前に、評価中の血清又は抗体調製物とともにウイルスストック株を予備インキュベート（典型的には１時間）する。この血清又は抗体調製物は希釈せずに、又は希釈率を漸増させて（典型的には４〜５回連続して１０倍希釈して）試験する。標的細胞のウイルスストック株での感染を抗体不在下（抗体なし）でも実施する。抗体の存在下及び不在下の両方で、標的細胞中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、ウイルス中和を評価する。この実施形態において、各抗体が標的細胞の感染を阻止する（ルシフェラーゼ活性を低下させるか、又は消失させる）能力を比較することによって、アッセイの結果を解釈する。標的細胞感染を阻止することができる抗体の最大希釈率（最も希釈したもの）（例えば抗体不在下で産生されるルシフェラーゼ活性を５０％低下させることができる最大希釈率）に注目することによって、ウイルス中和活性を定量する。
【０１８２】
患者ＨＩＶ−１の特性決定（標準抗体パネルに対する患者ウイルス）
この実施形態において、ＨＩＶ−１受容体ＣＤ４とＨＩＶ−１共受容体ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する標的細胞系（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）を使用して、アッセイを実施する。かかる細胞系はＲ５及びＸ４指向性ウイルスの両方について抗体の中和活性を評価することができる。関連実施形態において、２種類の標的細胞系を使用してアッセイを実施する。細胞系の１つはＣＤ４とＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、Ｒ５指向性ウイルスを試験するために使用する。もう１つの細胞系はＣＤ４とＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、Ｘ４指向性ウイルスを評価するために使用する。個々の標的細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶｌｕｃもしくはｐＨＩＶｌｕｃＤＵ３ベクターでトランスフェクトしたパッケージ用宿主細胞由来の組換えウイルスストック株を感染させることによって、ウイルス侵入アッセイを実施する。この実施形態において、ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者ウイルス由来のエンベロープ配列を含み、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態において、異なる患者集団（上記患者集団についての記載参照）、及び／又は異なるウイルス集団（上記ウイルス集団についての記載参照）を使用して、ｐＨＩＶｅｎｖベクターを構築する。ｐＨＩＶｅｎｖベクターから誘導した偽型ＨＩＶをウイルス侵入アッセイで評価して、これらがあるパネルの特定してかつ十分に特性決定された抗体調製物による中和に感受性があるかどうかを判定する。かかる抗体は「標準抗体パネル」に相当する。標準パネルを構成し得る抗体として適切な例のいくつかを、全部ではないが、表４に掲載する。この実施形態において、９６ウェルプレートで培養した標的細胞を使用してウイルス中和を評価する。典型的には、感染の１日前に、ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４について１ウェルあたり５，０００細胞で、又はＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５及びＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４について１ウェルあたり１０，０００細胞で、標的細胞をプレーティングする。感染の前に、標準抗体パネル中の各抗体調製物とともに各患者由来のウイルスストック株をインキュベート（典型的には１時間）する。この血清又は抗体調製物は希釈せずに、又は各種希釈率（典型的には４〜５回の連続１０倍希釈）で試験する。標的細胞の各ウイルスストック株での感染を薬物不在下（薬物不含）でも実施する。抗体の存在下及び不在下の両方で、標的細胞中で産生されたルシフェラーゼ活性の量を比較することによって、ウイルス中和を評価する。この実施形態において、各抗体が標的細胞の感染を優先的に阻止する（ルシフェラーゼ活性を低下させるか、又は消失させる）能力を比較することによって、アッセイの結果を解釈する。標的細胞感染を阻止することができる抗体の最大希釈率（最も希釈したもの）（例えば抗体不在下で産生されるルシフェラーゼ活性を５０％低下させることができる最大希釈率）に注目することによって、ウイルス中和活性を定量する。
【０１８３】
患者ＨＩＶ−１の特性決定（患者ウイルス  対  患者抗体）
本実施例は、患者において、中和抗体応答、及び中和応答を回避するウイルス株の進化を検出する方法を提供する。この実施形態では、ＨＩＶ−１受容体ＣＤ４とＨＩＶ−１共受容体であるＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４を発現する標的細胞系（Ｕ８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４又はＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）を用いてアッセイを行う。かかる細胞系は、Ｒ５及びＸ４指向性ウイルスの両方に対する抗体の中和活性を評価することが可能である。関連する実施形態においては、２つの標的細胞系を用いてアッセイを行う。１つの細胞系は、ＣＤ４及びＣＣＲ５を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、Ｒ５指向性ウイルスを試験するために使用する。またもう１つの細胞系は、ＣＤ４及びＣＸＣＲ４を発現し（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、Ｘ４指向性ウイルスを評価するために使用する。ウイルス侵入アッセイは、個々の標的細胞培養物に、ｐＨＩＶｅｎｖ及びｐＨＩＶΔ又はｐＨＩＶΔＤＵ３ベクターでトランスフェクトしたパッケージング用宿主細胞に由来する組換えウイルスストックを感染させることにより行う。この実施形態において、ｐＨＩＶｅｎｖベクターは患者のウイルス由来のエンベロープ配列を含み、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０ＳＵ、ｇｐ４１ＴＭ）を発現する。この実施形態において、種々のウイルス集団を使用してｐＨＩＶｅｎｖベクターを構築する。種々のウイルス集団は、連続（長期）血漿検体から得たもの（すなわち種々の時点で同じ患者から採取したウイルス）である。ｐＨＩＶｅｎｖベクターに由来するシュードタイプＨＩＶをウイルス侵入アッセイで評価し、患者由来の連続血漿検体から得られた抗体パネルによる中和を受けやすいか否かを判定する。従って、この実施形態において、同じ患者がウイルス集団及び抗体の両方の供与源となる。この実施形態において、ウイルスは、例えば９６ウエルプレートで培養した標的細胞を用いて評価する。典型的には、標的細胞は、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４、Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５及びＵ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４細胞系についてはウエルあたり１０，００００細胞でプレートし、又はＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４細胞系についてウエルあたり５，０００細胞でプレートする。標的細胞は感染当日にプレートする。標的細胞の感染の前に、各ウイルスストックを評価対象の血清又は抗体調製物とプレインキュベートする（典型的には１時間）。血清又は抗体調製物は未希釈で又は徐々に希釈率を上げて（典型的には、４〜５回の連続５倍又は１０倍希釈）試験する。各ウイルスストックによる標的細胞の感染はまた、抗体の不在下（抗体なし）で行う。ウイルスの中和は、抗体の存在下及び不在下の両方で、標的細胞で生じたルシフェラーゼ活性量を比較することにより評価する。この実施形態においては、アッセイの結果は、種々の時点における患者からの抗体が、種々の時点における患者由来のシュードタイプウイルスの標的細胞の感染を選択的に妨害する（ルシフェラーゼ活性を低減又は除去する）能力を比較することにより判定する。ウイルス中和活性は、標的細胞の感染を防止することのできる最大抗体希釈率（最大希釈率）を観察することにより定量する（例えば、抗体の不��下で生じるルシフェラーゼ活性を５０％低減する最大希釈率）。従って、この実施形態では、患者において、免疫学的に異なるＨＩＶ株及び中和抗体の応答を経時的に同時に評価するアッセイを行うことが可能となる。
【０１８４】
本方法は、一次ＨＩＶ感染を有する処置を行っていない１４人の患者集団に対して用いた。血漿検体を各患者から２〜４ヶ月間隔で採血した（平均的には１８ヶ月、６〜３９ヶ月の範囲内）。ウイルスを抗体の連続５倍希釈液とインキュベートし、ＣＤ４＋ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４共受容体を発現する標的細胞に感染させた。１４人の患者のうち１２人がウイルスに対して強力な中和抗体応答を示したことが見出された。代表的な患者のデータを図１０に示す。しかしながら、それぞれの連続的な（sequential）ウイルスは、同時に中和抗体応答を常にかつ迅速に回避した。中和力価のピーク（平均１：１４９７希釈、範囲は１：３３９〜１：４６２７）は、ウイルスが現れた数ヵ月後に生じ、応答は数ヶ月、数年間にわたり、その後も上昇を続けた。中和抗体力価は一般的に、同じ患者において後期ウイルスよりも初期ウイルスに対して高い。異種Ｒ５一時ウイルス（ＪＲ−ＣＳＦ）に対する中和応答は弱く、遅延した。Ｘ４  ｌａｂ株（ＮＬ４−３）に対する応答は経時的に上昇したが、患者間の強度は変動した。自己由来ウイルスに対する中和抗体応答の大きさは、平均血漿ＨＩＶ  ＲＮＡ又はＨＩＶ感染の持続期間と相互に関連しなかった。従って、ウイルス中和の回避の割合は顕著であり、これは中和抗体が以前から評価されていないウイルスの進化に対する選択圧のレベルを発揮しうることを示している。これらのデータは自然の歴史及びワクチン開発に重要な関連を有する。
【実施例７】
【０１８５】
中和抗体応答を誘発し、変更し、又は阻止するＨＩＶ−１エンベロープアミノ酸配列の同定
この実施例では、抗体が介在するＨＩＶ−１感染の中和（本明細書中でウイルス中和とも称する）を誘発／促進、変更又は阻止するＨＩＶ−１エンベロープアミノ酸配列を同定するための手段及び方法を提供する。
【０１８６】
実施例６に記載したように、患者サンプル、又は患者サンプルに由来する個々のクローンから誘導したエンベロープ配列、あるいは部位特異的突然変異誘発によって特定の突然変異を含むように遺伝子操作したエンベロープ配列を侵入アッセイで試験して、共受容体指向性を判定する。
【０１８７】
一実施形態において、長期間にわたる患者サンプル（異なる時点で同一の患者から回収したウイルス）について抗体介在中和を評価する。例えば、ワクチン接種前、ワクチン接種過程中、及びワクチン接種過程完了後に時間を追って、ウイルス中和を評価する。一実施形態において、ウイルス中和を予防用ワクチンについて評価する。別の実施形態において、ウイルス中和を治療用ワクチンについて評価する。
【０１８８】
別の実施形態において、ウイルス中和を、多数の異なる患者から採取したサンプルについて評価する。さらに別の実施形態において、ウイルス中和を、異なるウイルス及び患者集団に相当する多数の患者から採取したサンプルについて評価する。こうした患者集団として、限定するわけではないが、以下が含まれる：新たに感染した患者、慢性的に感染した患者、疾病が進行した患者、抗レトロウイルス治療もしくは免疫治療中の患者、ワクチン接種した患者、及びワクチン接種してない患者。かかるウイルス集団として、限定するわけではないが、以下が含まれる：明確に区別される遺伝的特徴を持つウイルス（クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）、抗レトロウイルス薬に感受性があるウイルス、抗レトロウイルス薬への感受性／耐性が低下したウイルス、一次分離株もしくは細胞培養物中での増殖に適応させた分離株（実験用適応ウイルスと称されることが多い）、合胞体合胞体誘発性（ＳＩ）ウイルス、非合胞体誘発性（ＮＳＩ）ウイルス、マクロファージ（Ｍ）指向性ウイルス、Ｔ細胞（Ｔ）指向性ウイルス、ならびに二重指向性（Ｍ及びＴ）ウイルス。
【０１８９】
患者ＨＩＶサンプルの遺伝子型分析
患者サンプルプール、又は患者プール由来のクローンに相当するエンベロープ配列を、広く利用し得るＤＮＡ配列決定法のいずれかによって、分析することができる。本発明の一実施形態において、ウイルスＲＮＡ精製、ＲＴ／ＰＣＲ及びジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター配列決定化学ならびにキャピラリーゲル電気泳動（Applied Biosystems, Foster City, CA）を使用して、患者のＨＩＶサンプルの配列を決定する。患者ウイルスプール又はクローンのエンベロープ配列を参照配列、その他の患者サンプル、又は入手可能ならば、同一の患者から治療開始前に取得したサンプルと比較する。参照配列もしくは治療前配列と異なる配列について遺伝子型を検査し、侵入阻害剤の感受性の差異に相関させる。
【０１９０】
遺伝的に特性決定されたウイルスの抗体介在中和
ウイルス中和に相関するエンベロープアミノ酸配列を、確定された遺伝子型バックグラウンド（例えばＸ４指向性についてＮＬ４−３、Ｒ５指向性についてＪＲＣＳＦ）に対して特異的な突然変異を含むエンベロープ発現ベクター（ｐＨＩＶｅｎｖ）を構築することによって評価する。突然変異は単独で、及び／又はウイルス中和をモジュレートすると考えられるその他の突然変異と組み合わせて、導入することができる。部位特異的突然変異誘発のための広く利用可能な方法のいずれかを使用して、エンベロープ突然変異をｐＨＩＶｅｎｖベクター中に導入することができる。本発明の一実施形態において、部位特異的突然変異誘発のために、メガプライマーＰＣＲ法を使用する（Sarkar,G. and Summer,S.S., 1990）。特定のエンベロープ突然変異又は突然変異群を含むｐＨＩＶｅｎｖベクターを、実施例６に記載したウイルス侵入アッセイを使用して試験する。中和活性を比較するために、特定の抗体調製物（すなわち、十分特性決定されたモノクローナル又はポリクローナル抗体調製物）、ＨＩＶ感染患者からの血清、又はワクチン接種した個体からの血清を選択することができる。エンベロープ突然変異を含むウイルスの抗体中和を、評価中の特定の突然変異を含まない遺伝的に確定されたウイルスの抗体中和と比較する。特定の突然変異が抗体中和を賦与し、変更し、又は阻止する能力を、十分特性決定された参照ウイルス中へその突然変異を導入し、実施例６に記載したウイルス侵入アッセイでその突然変異ウイルスの抗体介在中和を評価することによって、確認又は反証する。観察されたウイルス中和の変化はｐＨＩＶｅｎｖベクター中に導入した特定の突然変異によるものと考える。
【０１９１】
本発明の一実施形態において、表面エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内のアミノ酸配列を評価することによって、ウイルス中和の遺伝的決定基を同定する。各種の十分特性決定された抗体調製物、患者血清、又はワクチン接種した個体からの血清によって中和し得る、又は中和し得ない、多数のウイルスのアミノ酸配列を比較することによって、評価中のアミノ酸配列を同定する。中和し得る、又は中和し得ない、ウイルス間でのＶ３アミノ酸配列の一貫性がある差異を評価のために選択する。エンベロープタンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ内に特定の「ウイルス中和候補」突然変異を含む、十分特性決定された親クローン（例えばＮＬ４−３、ＨＸＢ２、ＪＲＣＳＦ）に基づく同質遺伝子ウイルスを、部位特異的突然変異誘発によって構築し、実施例６に記載したように抗体介在中和について試験する。ＣＤ４とＣＣＲ５（例えばＵ−８７／ＣＤ４／ＣＣＲ５）、ＣＤ４とＣＸＣＲ４（Ｕ−８７／ＣＤ４／ＣＸＣＲ４）、又はＣＤ４とＣＣＲ５とＣＸＣＲ４（ＨＴ４／ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４）を発現する細胞に、感染させる。抗体中和を誘発し、変更し又は阻止する変化をもたらすアミノ酸の置換は、ウイルス中和に重要であると認められる。
【０１９２】
本発明の関連実施形態では、全ｇｐ１２０表面エンベロープタンパク質内のアミノ酸配列を評価することによって、ウイルス中和の遺伝的決定基を同定する。
【０１９３】
本発明の関連実施形態では、膜貫通エンベロープタンパク質ｇｐ４１内のアミノ酸配列を評価することによって、ウイルス中和の遺伝的決定基を同定する。
【実施例８】
【０１９４】
治療決定の指針にするための、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性の測定
本実施例では、ＨＩＶ−１治療の指針にするために、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用するための手段及び方法を提供する。本実施例ではさらに、以前にウイルス侵入阻害剤による抗レトロウイルス治療を受けたことがある患者の治療の指針にするために、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用するための手段及び方法を提供する。本発明はさらに、以前にウイルス侵入阻害剤治療を受けたことがない患者の治療の指針にするために、ウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用するための手段及び方法を提供する。
【０１９５】
一実施形態において、患者ウイルスのウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用して、１種以上のウイルス侵入阻害剤を含む抗レトロウイルス治療計画が失敗した患者の治療の指針にする。治療失敗（ウイルス学的失敗とも称される）は、部分的抑制抗ウイルス治療の結果として、ウイルスが検出可能なレベル（典型的には患者の血漿中で測定される）になるものとして一般的に定義される。方針として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：（ａ）利用可能な薬物治療選択肢の解明、（ｂ）より有効な治療計画の選択、（ｃ）治療患者においてウイルス負荷量が上昇する因果関係の解明（すなわち、低付着性、薬物耐性）、ならびに（ｄ）不活性薬物及び潜在的毒性薬物の使用の低減。この実施形態において、耐性試験用ベクターを患者ウイルスサンプルから誘導し、ウイルス侵入表現型アッセイを使用して、各種のウイルス侵入阻害剤に対する感受性について試験する。ウイルス侵入阻害剤として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：融合阻害剤（例えばＴ−２０、Ｔ−１２４９）、共受容体アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００、ＡＭＤ８６６４、ＴＡＫ７７９、ＰＲＯ５４２、及びピペリジン−１−イルブタン化合物）、ならびにＣＤ４アンタゴニスト（ＭＡｂ  ５Ａ８）。適切な治療法の決定は、ウイルス侵入アッセイ（例えば図４Ｂ参照）、ならびにその他の関連する実験室試験結果及び臨床上の情報に基づくものである。
【０１９６】
別の実施形態では、患者ウイルスのウイルス侵入阻害剤に対する感受性を使用して、１種以上のウイルス侵入阻害剤を含む抗レトロウイルス治療計画で以前治療されたことがない患者の治療の指針にする。方針として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：（ａ）利用可能な薬物治療選択肢の解明、（ｂ）より有効な治療計画の選択、（ｃ）ウイルス侵入阻害剤に対する基底感受性の解明、ならびに（ｄ）不活性薬物及び潜在的毒性薬物の使用の低減。未治療の患者の治療について、ウイルス侵入阻害剤の基底感受性の決定は２つの理由によって重要である。第１に、侵入阻害剤に対するウイルス本来の感受性は大きく異なり得ることである（例えば図４Ａ参照）。第２に、ウイルス侵入阻害剤の使用の増加は、疑いなく薬物耐性変異体の生成をもたらし、これが新たに感染した個体に伝播され得るからである。この実施形態において、耐性試験用ベクターを患者ウイルスサンプルから誘導し、ウイルス侵入表現型アッセイを使用して、各種のウイルス侵入阻害剤に対する感受性について試験する。ウイルス侵入阻害剤として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：融合阻害剤（例えばＴ−２０、Ｔ−１２４９）、共受容体アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００、ＡＭＤ８６６４、ＴＡＫ７７９、ＰＲＯ５４２、及びピペリジン−１−イルブタン化合物）、ならびにＣＤ４アンタゴニスト（ＭＡｂ  ５Ａ８）。適切な治療法の決定は、ウイルス侵入アッセイ、ならびにその他の関連する実験室試験結果及び臨床上の情報に基づくものである。
【実施例９】
【０１９７】
治療決定の指針にするための、ＨＩＶ−１共受容体指向性の測定
本実施例では、ＨＩＶ−１治療の指針にするために、ＨＩＶ−１共受容体（ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４）指向性を使用するための手段及び方法を提供する。本実施例ではさらに、抗レトロウイルス薬治療が失敗した患者の治療の指針にするために、ＨＩＶ−１共受容体指向性を使用するための手段及び方法を提供する。本発明はさらに、新たにＨＩＶ−１に感染した患者の治療の指針にするために、ＨＩＶ−１共受容体指向性を使用するための手段及び方法を提供する。
【０１９８】
本実施例では、ＨＩＶ−１治療の指針にするために、ウイルスＨＩＶ−１共受容体指向性を使用する手段及び方法を提供する。本実施例ではさらに、以前にウイルス侵入阻害剤による抗レトロウイルス治療を受けたことがある患者の治療の指針にするために、ＨＩＶ−１共受容体指向性を使用する手段及び方法を提供する。本発明はさらに、以前にウイルス侵入阻害剤治療を受けたことがない患者の治療の指針にするために、ＨＩＶ−１共受容体指向性を使用する手段及び方法を提供する。
【０１９９】
一実施形態において、患者ウイルスの共受容体指向性を使用して、１種以上の共受容体アンタゴニストを含む抗レトロウイルス治療計画が失敗した患者の治療の指針にする。治療失敗（ウイルス学的失敗とも称される）は、部分的抑制抗ウイルス治療の結果として、ウイルスが検出可能なレベル（典型的には患者の血漿中で測定される）になるものとして一般的に定義される。方針として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：（ａ）治療患者においてウイルス負荷量が上昇する因果関係の解明（すなわち、低付着性、薬物耐性、共受容体指向性の変化）、（ｂ）利用可能な薬物治療選択肢の解明、（ｃ）より有効な治療計画の選択、ならびに（ｄ）不活性薬物及び潜在的毒性薬物の使用の低減。ＣＣＲ５アンタゴニストでの治療を受けている患者の共受容体指向性のモニタリングは、臨床上重要である。なぜならば、薬物圧の結果としてＣＸＣＲ４共受容体指向性に変化することがあるからである。Ｘ４ウイルス（ＣＸＣＲ４共受容体指向性）はＲ５ウイルス（ＣＣＲ５共受容体指向性）に比較して、予後がより悪い傾向がある。この実施形態において、耐性試験用ベクターを患者ウイルスサンプルから誘導し、ウイルス侵入表現型アッセイを使用して、各種の共受容体アンタゴニストに対する感受性について試験する。共受容体アンタゴニストとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：ＡＭＤ３１００、ＡＭＤ８６６４、ＴＡＫ７７９、ＰＲＯ５４２、及びピペリジン−１−イルブタン化合物。適切な治療法の決定は、ウイルス侵入アッセイ（例えば図４Ｂ参照）、ならびにその他の関連する実験室試験結果及び臨床上の情報に基づくものである。
【０２００】
別の実施形態において、患者ウイルスの共受容体指向性を使用して、１種以上の共受容体アンタゴニストを含む抗レトロウイルス治療計画で以前治療されたことがない患者の治療の指針にする。方針として、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：（ａ）基底共受容体指向性の解明、（ｂ）利用可能な薬物治療選択肢の解明、（ｃ）より有効な治療計画の選択、ならびに（ｄ）不活性薬物及び潜在的毒性薬物の使用の低減。基底共受容体指向性を決定することは臨床上の意義において重要である。適切な共受容体アンタゴニスト（Ｒ５対Ｘ４指向性）、又はアンタゴニスト類（二重指向性もしくは混合指向性）による治療は、より強力で持続的な応答をもたらす可能性が高い。この実施形態において、耐性試験用ベクターを患者ウイルスサンプルから誘導し、ウイルス侵入表現型アッセイを使用して、各種のウイルス侵入阻害剤に対する感受性について試験する。共受容体アンタゴニストとして、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：ＡＭＤ３１００、ＡＭＤ８６６４、ＴＡＫ７７９、ＰＲＯ５４２、及びピペリジン−１−イルブタン化合物。適切な治療法の決定は、ウイルス侵入アッセイ、ならびにその他の関連する実験室試験結果及び臨床上の情報に基づくものである。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０２０１】
参考文献
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【０２０２】
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【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１Ａ】エンベロープ発現ベクター及びウイルス発現ベクターの構造を示す。
【図１Ｂ】細胞ベースの侵入アッセイを示す。
【図２】ＨＩＶエンベロープ発現ベクターを示す。
【図３Ａ】共受容体指向性スクリーニングアッセイを示す。
【図３Ｂ】共受容体指向性の判定を示す。
【図４Ａ】侵入阻害剤に対する感受性の測定（融合阻害剤）を示す。
【図４Ｂ】侵入阻害剤に対する感受性の測定（薬物耐性突然変異）を示す。
【図５Ａ】侵入阻害剤に対する感受性の測定（ＣＣＲ５阻害剤）を示す。
【図５Ｂ】侵入阻害剤に対する感受性の測定（ＣＸＣＲ４阻害剤）を示す。
【図６】エンベロープ配列の増幅を示す。
【図７】標的細胞受容体及び共受容体発現を示す。
【図８】共受容体アンタゴニストによる阻害を示す。
【図９】融合阻害剤ペプチドを示す。
【図１０】ウイルス感染性の中和を示す。
【配列表】
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2006506944.tif 000011
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【図１Ａ】
2006506944.tif 000013
【図１Ｂ】
2006506944.tif 000014
【図２】
2006506944.tif 000015
【図３Ａ】
2006506944.tif 000016
【図３Ｂ】
2006506944.tif 000017
【図４Ａ】
2006506944.tif 000018
【図４Ｂ】
2006506944.tif 000019
【図５Ａ】
2006506944.tif 000020
【図５Ｂ】
2006506944.tif 000021
【図６】
2006506944.tif 000022
【図７】
2006506944.tif 000023
【図８】
2006506944.tif 000024
【図９】
2006506944.tif 000025
【図１０】
2006506944.tif 000026
【国際調査報告】
2006506944.tif 000027
2006506944.tif 000028
2006506944.tif 000029