(57)【要約】本発明は新規の植物チミジンキナーゼと遺伝子治療におけるその使用方法に関する。更に詳しくは、本発明は、トマト、マツ、コメまたはシロイヌナズナに由来する新規のチミジンキナーゼを提供する。さらなる実施態様において、本発明は、植物チミジンキナーゼをコードする新規のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター構築物、ポリヌクレオチドまたはベクターを担持する宿主細胞、細胞のプロドラッグへの感作方法、温血動物における病原性物質の阻害方法、植物の生体制御方法、モノホスフェート化物の合成方法、および本発明のチミジンキナーゼを含む薬学的調合物を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、異常細胞増殖を治療するための、植物チミジンキナーゼ及びヌクレオシドアナログＡＺＴの独自の組み合わせを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の植物チミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該単離ポリヌクレオチドが、
ｉ）マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）またはトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｉｉ）ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することのできる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｉｖ）［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（少なくともヌクレオシドアナログ）］の比率が２より小さい、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｖ）発現し、そしてヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が少なくとも５倍減少し、その際該アナログが任意のヌクレオシドアナログである、植物に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、及び
ｖｉ）ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素変種をコードする単離された変異及び(又は)切断ポリヌクレオチドより成る群から選ばれる、上記単離ポリペプチド。
【請求項２】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートが、ＡＺＴモノホスフェートであること、及び(又は)少なくとも１つのヌクレオシドアナログがＡＺＴである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として表されるポリヌクレオチド配列またはその相補鎖とハイブリダイズできる、請求項１記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの全長にわたって判定した場合に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として表されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する、請求項４記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として表されるポリヌクレオチド配列またはその機能的アナログを含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
単離植物チミジンキナーゼ酵素であって、
ｉ）請求項１〜６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離チミジンキナーゼ、
ｉｉ）マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）またはコメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）に由来する、単離植物チミジンキナーゼ酵素、
ｉｉｉ）真核細胞内のヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、単離植物チミジンキナーゼ酵素、
ｉｖ）少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することのできる、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、
ｖ）［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が２より小さい、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、
ｖｉ）発現し、そしてヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が少なくとも５倍減少し、該アナログが任意のヌクレオシドアナログである、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、及び
ｖｉｉ）ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、植物由来の単離された変異及び(又は)切断チミジンキナーゼ酵素変種、
より成る群から選ばれる、上記単離植物チミジンキナーゼ酵素。
【請求項８】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来する、請求項７記載の単離チミジンキナーゼ。
【請求項９】
少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートがＡＺＴモノホスフェートであり、及び(又は)少なくとも１つのヌクレオシドアナログがＡＺＴである、請求項７記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１０】
下記の３つのモチーフ／領域の１種以上を含む、請求項７〜９のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ：
Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ（モチーフＩ）
Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ（モチーフＩＩ）
Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ（モチーフＩＩＩ）
Ｖａｌ  Ａ１  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａ２  Ａ３  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａ４（Ｌｉｄ領域）（式中、Ａ１はＴｈｒおよびＶａｌから選択され、Ａ２はＴｈｒおよびＬｙｓから選択され、Ａ３はＡｌａおよびＳｅｒから選択され、Ａ４はＬｅｕおよびＶａｌから選択される）。
【請求項１１】
表１中で同定される保存性残基のすべてを含む、請求項７〜１０のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列、またはその全長にわたって判定した場合に、これらの配列のいずれかと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７〜１１のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列またはその機能的アナログを含む、請求項７〜１２のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１４】
１〜６０のアミノ酸残基、好ましくは１〜５０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜４０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜３０のアミノ酸残基、さらに好ましくは１〜２６のアミノ酸残基、最も好ましくは１〜２４のアミノ酸残基のオーダーでＣ末端欠失を有する、請求項７〜１３のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１５】
２６アミノ酸残基のＣ末端欠失を有する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する）トマト由来のチミジンキナーゼ酵素である、請求項１４記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１６】
２４アミノ酸残基のＣ末端欠失を有する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有する）シロイヌナズナ由来のチミジンキナーゼ酵素である、請求項１４記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１７】
マツに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項７〜１６のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１８】
トマトに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項７〜１６のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項１９】
コメに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項７〜１６のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項２０】
シロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項７〜１６のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項２１】
シロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項７〜１６のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項２２】
シロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項７〜１６のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項２３】
ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）由来のチミジンキナーゼの作用と比べた場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ１００）を少なくとも３倍減少させる、請求項７〜２２のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ。
【請求項２４】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド及び、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモータを含む、ベクター構築物。
【請求項２５】
ウィルスベクター、特に単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルス関連ウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクターまたはワクシニアウィルスベクターである、請求項２４記載のベクター構築物。
【請求項２６】
請求項２４又は２５記載のベクターを含む感染性ビリオンを産生することのできる、パッケージング細胞株。
【請求項２７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項２４又は２５記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２８】
ヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞またはマウス細胞である、請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項７〜２３のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素及び薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、薬学的調合物。
【請求項３０】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは請求項２４又は２５記載のベクター及び薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、薬学的調合物。
【請求項３１】
請求項２６記載のパッケージング細胞株または請求項２７又は２８記載の宿主細胞及び薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、薬学的調合物。
【請求項３２】
細胞をプロドラッグに対して感作させる方法であって、当該方法が、
（ｉ）該細胞を、該プロドラッグの（細胞毒）薬物への変換を促進する植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクションまたは形質導入する工程及び
（ｉｉ）該プロドラッグを該細胞に運搬する工程を含み、
その際、該細胞が該プロドラッグに対するよりも該（細胞毒）薬物に対して高い感受性を有することを特徴とする、上記方法。
【請求項３３】
植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、請求項１〜６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
プロドラッグがヌクレオシドアナログである、請求項３２又は３３記載の方法。
【請求項３５】
ヌクレオシドアナログがＡＺＴ（３’-アジド-３’-デオキシチミジン)である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
温血動物において病原性物質を阻害する方法であって、該動物に請求項１〜６のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド、または請求項２４〜２５のいずれか１つに記載のベクターを投与することを含む、上記方法。
【請求項３７】
該ポリヌクレオチド配列または該ベクターが生体内に投与される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該病原性物質がウィルス、細菌または寄生虫である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
該病原性物質が腫瘍細胞である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４０】
該病原性物質が自己反応性免疫細胞である、請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項４１】
該温血動物にヌクレオシドアナログを投与する工程をさらに含む、請求項３６〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４２】
該ヌクレオシドアナログがＡＺＴ(３’-アジド-３’-デオキシチミジン)である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化のために、請求項７〜２３のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素を使用する方法。
【請求項４４】
ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化する方法であって、
ｉ）ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、請求項７〜２３のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素を作用させる工程及び、
ｉｉ）リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程を含む、
上記方法。
【請求項４５】
請求項７〜２３のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含む植物の成長を制御または改変する方法であって、当該方法が該植物または植物細胞をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む、上記方法。
【請求項４６】
ヌクレオシドアナログと請求項７〜２３のいずれか１つに記載のチミジンキナーゼ、または前記植物由来のチミジンキナーゼをコードする遺伝子、または前記植物由来チミジンキナーゼをコードする前記遺伝子を含むベクターを、癌治療において、同時、分割または連続投与のための組み合わせとして含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の植物チミジンキナーゼおよび遺伝子治療におけるその使用方法に関する。更に詳しくは、本発明は、トマト、マツ、米またはシロイヌナズナに由来するチミジンキナーゼを提供する。
【０００２】
本発明のさらなる実施態様において、本発明は、植物チミジンキナーゼをコードする新規のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター構築物、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを保持する宿主細胞、細胞のプロドラッグへの感作方法、温血動物における病原物質の阻害方法、植物の生体制御のための方法、モノホスフェート塩の合成方法、および本発明の植物チミジンキナーゼを含む医薬組成物を提供する。
【０００３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明は、異常細胞増殖を治療するための、植物チミジンキナーゼと、ヌクレオシドアナログＡＺＴとの独自の組み合わせを提供する。
【背景技術】
【０００４】
ＤＮＡは、デノボおよびサルベージ経路とによって提供される、４種類のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートから構成さる。デノボ経路のキーとなる酵素はリボヌクレオチドレダクターゼであり、該酵素は、ヌクレオシドジホスフェートの２’−ＯＨ基の還元を触媒する。また、キーとなるサルベージ酵素はデオキシリボヌクレオシドキナーゼであり、該酵素は、デオキシリボヌクレオシドを、対応するデオキシリボヌクレオシドモノホスフェートにリン酸化する。
【０００５】
様々な生物から得られるデオキシリボヌクレオシドキナーゼは、基質特異性、遺伝子発現の調節および細胞局在性に違いがある。哺乳動物細胞においては、重複する特異性を有した４つの酵素、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）および２（ＴＫ２）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）ならびにデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）が存在し、これらの酵素は、プリンおよびピリミジンデオキシリボヌクレオシドをリン酸化する。ＴＫ１およびＴＫ２は、ピリミジン特異的であり、デオキシウリジン（ｄＵｒｄ）およびチミジン（ｄＴｈｄ）をリン酸化し、ＴＫ２はデオキシシチジン（ｄＣｙｄ）もリン酸化する。ｄＣＫは、ｄＣｙｄ、デオキシアデノシン（ｄＡｄｏ）およびデオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）をリン酸化するが、ｄＴｈｄはリン酸化しない。ｄＧＫはｄＧｕｏおよびｄＡｄｏをリン酸化する。ＴＫ１およびｄＣＫは細胞基質内酵素であり、ＴＫ２およびｄＧＫはミトコンドリア内に局在するが、最近の報告ではＴＫ２は細胞質にも局在することが示されている。
【０００６】
粘液腫ウィルス由来のチミジンキナーゼに対する相同性に基づいて、チミジンキナーゼをコードするコメ由来の遺伝子が提案されている［非特許文献1］。しかしながら、部分配列しか単離されておらず、その配列は活性なタンパク質の発現には十分でない。
【０００７】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）から得た２つのゲノムＤＮＡ断片が、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ（アクセッション番号：ＡＡＦ１３０９７およびＢＡＢ０９８２４）における推定チミジンキナーゼとされている。しかしながら、現時点において、植物キナーゼのキャラクタリゼーション、特性、局在性、用途または生物学的機能に向けての実験的研究はまだ達成されていない。
【０００８】
ＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン、ジドブジン、レトロビル（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ（登録商標））は、ＨＩＶ感染の治療において用いられるヌクレオシドアナログである。ヒト細胞におけるその活性化の律速段階は、ＡＺＴ−ジホスフェートへのＡＺＴ−モノホスフェート（ＡＺＴＭＰ）の活性化である。
【０００９】
内在性チミジンモノホスフェートキナーゼ活性を有するヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）を、ＨＩＶ感染の遺伝子治療処置に用いることが示唆されている。ＨＳＶ１−ＴＫは系統発生学的には、ヒトＴＫ２には関連するがヒトＴＫ１には関連しない。ジドブジンの抗ウィルス活性を改善するためにＨＳＶ１−ＴＫを使用することも示唆されており、ＨＳＶ１−ＴＫをＡＺＴと組み合わせて用いることで、形質転換された大腸菌を殺傷できることが示されている。しかしながら、ＡＺＴＭＰのリン酸化は、ヒトにおけるＡＺＴ活性化の律速段階であるとされているために、ヒト癌において、または他のヒト異常細胞増殖関連疾患において使用するための、ＡＺＴとチミジンキナーゼとの効果的な組み合わせを得るための実験は一切行われていない。
【非特許文献１】Hemayet Ullah, Dominique Robertson, and Roger C. Fites: A Gene for Thymidine Kinase in Plants (Accession No. AF066050; Plant gene register PGR99-048) Plant Physiol. 1999 119 1567
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ヌクレオシドアナログを毒性物質に変換するために有用な、またヌクレオシドアナログをモノホスフェート塩に、またヌクレオシドアナログモノホスフェート塩を対応するジホスフェート塩に変換するのに有用な新規の植物チミジンキナーゼを提供することを目的とする。単離植物チミジンキナーゼ遺伝子は、遺伝子を含有し（かつ少なくとも１つのヌクレオシドアナログに暴露された）細胞を選択的に殺すための遺伝子治療において用いることができ、本発明によって提供される単離チミジンキナーゼは、産業上重要なヌクレオシド及び(又は)ヌクレオシドアナログのリン酸化工程のために用いることができる。単離チミジンキナーゼは、酵素を細胞に注入し、細胞を少なくとも１つのヌクレオシドアナログにあてることにより細胞を殺すために用いることもできる。ヌクレオシドアナログ及び(又は)そのモノホスフェートという場合、このヌクレオシドアナログは好ましくはデオキシヌクレオシドアナログ、より好ましくはデオキシリボヌクレオシドアナログ、より好ましくはＡＺＴであるとする。
【００１１】
より詳細には、本発明は、異常細胞増殖を治療するためのチミジンキナーゼとヌクレオシドアナログＡＺＴとの独自の組み合わせを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、第１の実施態様において、本発明は、マツ(Pinus taeda), コメ(Oryza sativa)又はトマト(Lycopersicum esculentum)に由来する植物チミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。これらの直物チミジンキナーゼは、ＡＺＴをリン酸化するのに特に有効であり、特にＡＺＴＭＰなどのヌクレオシドアナログモノホスフェートに対する、予想されていなかった高い内在性モノホスフェートキナーゼ活性を有することがわかった。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを提供し、該チミジンキナーゼ酵素は、ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる。これまで、植物チミジンキナーゼに対してそれほど低いＩＣ５０が報告された例はない。好ましくは、このヌクレオシドアナログはＡＺＴである。
【００１４】
第３の実施態様において、本発明は植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供し、前記チミジンキナーゼ酵素は、少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することができる。好ましくは、アナログモノホスフェートはＡＺＴモノホスフェートである。より好ましくは、前記キナーゼは本質的にチミジンモノホスフェートをリン酸化することができない。内在性モノホスフェートキナーゼ活性は、これまで植物チミジンキナーゼに対しては報告されていない。この活性を有する場合、キナーゼは癌治療などの医療用途や自滅系に対する良好な候補になる。したがって、チミジンモノホスフェートに対するよりも、ＡＺＴモノホスフェートに対して高い基質特異性を有することにより、ＡＺＴモノホスフェートは、より高速でジホスフェートに変換される。
【００１５】
第４の実施態様において、本発明は、植物に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供し、前記チミジンキナーゼ酵素の［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（ＡＺＴ）］比は２より小さい。このような低い比を有するチミジンキナーゼは、公知のチミジンキナーゼよりも、Ｔｈｄに比しＡＺＴのリン酸化に相対的により効率的である。
【００１６】
第５の実施態様において、本発明は植物に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードするヌクレオチドを提供し、前記チミジンキナーゼ酵素は、発現し、そしてヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）と比べた場合、［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が少なくとも５倍減少し、該アナログは任意のヌクレオシドアナログである。このような植物由来のチミジンキナーゼは、癌もしくは他の哺乳動物の異常細胞増殖関連疾患の治療において、または自滅系において、同様の目的に対する従来技術の最の信頼度の高い酵素であるヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼの場合に比べて、より効率的である。
【００１７】
第６の実施態様において、本発明は植物に由来するチミジンキナーゼ酵素変種をコードする単離された変異及び(又は)切断ポリヌクレオチドを提供し、前記チミジンキナーゼ酵素変種は、ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）に比べて、真核または細菌細胞内に形質導入された際に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる。変異及び(又は)切断チミジンキナーゼは、ヌクレオシドアナログに対する基質特異性及び(又は)安定性が改善されている。
【００１８】
第７の実施態様において、本発明は本発明のポリヌクレオチドによって発現されるチミジンキナーゼ酵素、または本発明の変異（及び(又は)切断）ポリヌクレオチドによって発現されるチミジンキナーゼ酵素変種を提供する。
【００１９】
第８の実施態様において、本発明は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana), マツ (Pinus taeda),トマト (Lycopersicum esculentum) 又はコメ (Oryza sativa)に由来する植物チミジンキナーゼ酵素を提供する。
【００２０】
第９の実施態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモータとを含むベクター構築物を提供する。
【００２１】
第１０の実施態様において、本発明は、本発明のベクターを含む感染性ビリオンを産生することのできるパッケージング細胞株を提供する。
【００２２】
第１１の実施態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
第１２の実施態様において、本発明は、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のパッケージング細胞株と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的調合物を提供する。
【００２４】
第１３の実施態様において、本発明は、細胞をプロドラッグに対して感作させる方法を提供し、該方法は、（ｉ）細胞に、前記プロドラッグの（細胞毒）薬物への変換を促進する植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクションまたは形質導入するか、あるいは何らかの方法で細胞内に植物チミジンキナーゼを運搬(deliver)する工程と、（ｉｉ）プロドラッグを前記細胞内に運搬する工程とを含み、前記細胞はプロドラッグよりも（細胞毒）薬物により感受性が高い。
【００２５】
第１４の実施態様において、本発明は、温血動物における病原性物質を阻害する方法を提供し、該方法は、当該動物に本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを投与することを含む。
【００２６】
第１５の実施態様において、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化のための、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素の用途に関する。
【００２７】
第１６の実施態様において、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化方法を提供し、該方法は、（ｉ）前記ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素を作用させる工程と、（ｉｉ）リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程とを含む。
【００２８】
第１７の実施態様において、本発明は、植物の成長を制御または改変する方法に関し、前記植物は、本発明の植物チミンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含み、前記方法は、植物または植物細胞をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む。
【００２９】
さらなる実施態様において、本発明は、ヌクレオシドアナログ、本発明による植物由来チミジンキナーゼもしくは前記植物由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子、または前記植物由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを、癌治療において、同時、分割または連続投与のための組み合わせとして含んだ製品を提供する。
【００３０】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明のチミジンキナーゼ、前記チミジンキナーゼをコードする遺伝子、および前記チミジンキナーゼを発現するベクターおよび宿主細胞の、医療用途に関する。さらに、本発明は前記酵素、遺伝子、ベクターおよび細胞の、ヒトにおける異常細胞増殖関連疾患の治療のための医薬品の調製のための用途、好ましくは前記疾患が癌である場合の用途に関する。
【００３１】
本発明の他の目的は、以下の詳細な説明および実施例から当業者には明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（植物チミジンキナーゼ）
第１の実施態様において、本発明は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素活性を有する新規のタンパク質を提供し、前記タンパク質は植物に由来する。より詳細には、新規の植物チミジンキナーゼ酵素は、種子植物(Spermatophyta),特にマツ (Pinus taeda), トマト (Lycopersicum esculentum), コメ (Oryza sativa), 及び(又は) シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来する。
【００３３】
また、驚くべきことに、シロイヌナズナからは、本明細書中ではＡＴ−ＴＫ１ａおよびＡＴ−ＴＫ１ｂと呼ぶ２つの異なるチミジンキナーゼ酵素を単離できることが分かった。
【００３４】
本発明において、「チミジンキナーゼ」は、実施例３、表５に記載したようなアッセイを用いて、チミジンをリン酸化することができるが、プリンヌクレオシドはリン酸化できない酵素のことをいう。チミジンキナーゼは、デオキシシチジンをリン酸化するものであってもなくてもよい。
【００３５】
本発明のチミジンキナーゼ酵素は、ヌクレオシドアナログ、特にＡＴＺを活性化することにより異常細胞増殖の治療に特に有用である。
【００３６】
トマト、マツ、およびコメのチミジンキナーゼのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８２）マルチプルアミノ酸配列アライメントに基づいて、下記の表１に示すように、３つのモチーフと、いくつかの保存された残基、保存性の高い残基、保存性の低い残基を同定した。表１において、アライメントは、コメＴＫ１のアミノ酸残基番号６５から開始する。これは、最初の６４残基に、他のチミジンキナーゼとのアライメントが見られないためである。
【００３７】
表１
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８２）マルチプルアミノ酸配列アライメント
【００３８】
【表１】
2006504403.tif 000002
【００３９】
−モチーフを示す（モチーフＩ、モチーフＩＩおよびモチーフＩＩＩ）
＊保存された残基を示す。
：保存性の高い残基を示す。
．保存性の低い残基を示す。
【００４０】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、以下の３つのモチーフの１つまたはそれ以上を含む。
Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe (モチーフ I)
Val Ala Gly Leu Asp Gly (モチーフII)
Tyr Met Pro Val Cys Arg (モチーフIII)
別の好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、下記のＬｉｄ領域を含む。
【００４１】
Val A1 Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4（Ｌｉｄ領域）。式中、Ａ１はＴｈｒおよびＶａｌから選択され、Ａ２はＴｈｒおよびＬｙｓから選択され、Ａ３はＡｌａおよびＳｅｒから選択され、Ａ４はＬｅｕおよびＶａｌから選択される。
【００４２】
より好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、表１で同定したすべての保存残基を含む。
【００４３】
ポリペプチドの同一性
より好ましい別の実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として表されるアミノ酸配列、またはＳＥＱ  ＩＤの全長にわたって判定した場合に、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４４】
本発明において、「同一性」とは、アミノ酸配列の相同性の程度の尺度のことをいう。同一性を明らかにするために、最も高度な相同性（一致）が得られるように対象配列のアライニングを行う。これら一般的な原理に基づいて、２つのアミノ酸配列の「同一性百分率」を、国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information (NCBI)）のウェブサイトより入手可能なBLASTPアルゴリズム［Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett.1999 174 247-250］を用いて、またそこに示唆されているデフォルト設定（すなわち、Matrix = Blosum62; Open gap = 11; Extension gap = 1; Penalties gab x_dropoff = 50; Expect = 10; Word size = 3; Filter on）を用いて決定する。BLASTアルゴリズムは、２つのアライニングした配列間の重複する範囲内における配列同一性％を求める。本発明の目的のために、配列同一性の百分率は、少なくとも５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸が重複する範囲において算出され、前記範囲はデフォルト設定下においてBLASTPによって計算される。
【００４５】
このBLASTP比較の結果を表２に示す。
【００４６】
表２
異なる植物を起源とするチミジンキナーゼのタンパク質配列のＢＬＡＳＴＰ比較
【００４７】
【表２】
2006504403.tif 000003
【００４８】
同一性（％）／陽性（％）／比較した断片の長さ
マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）チミジンキナーゼ
トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）チミジンキナーゼ
コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）チミジンキナーゼ
シロイヌナズナ  （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）チミジンキナーゼ（ａ）および（ｂ）
好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、マツに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示した配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を少なくとも有する。
【００４９】
他の好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素はトマトに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４または５のいずれかに示した配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を少なくとも有する。
【００５０】
第３の好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素はコメに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を少なくとも有する。
【００５１】
第４の好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素はシロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９または１１の配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を少なくとも有する。
【００５２】
第５の好ましい実施形態においても、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素はシロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の配列に対して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を少なくとも有する。
【００５３】
変種ポリペプチド
最も好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示されるアミノ酸配列またはその機能的アナログを含む。
【００５４】
本発明において、「機能的アナログ」という用語は、チミジンキナーゼ活性を有するとともに、１種以上のアミノ酸位置において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として示される配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。このような類似ポリペプチドとしては、保存性置換、スプライス変種、アイソフォーム、他の種のホモログ、および多形を含むポリペプチドが含まれる。
【００５５】
本明細書中での定義として、「保存性置換」という用語は、あるアミノ酸残基を、別の生物学的に類似した残基に置換することをいう。保存性置換の例としては、
（ｉ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンなどの１つの非極性または疎水性残基による別のものの置換、特に、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはプロリンによる別のものの置換。
【００５６】
（ｉｉ）セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンまたはシステインなどの１つの中性の（非荷電）極性残基による別のものの置換、特に、リジンからアルギニンへの置換、アスパラギン酸からグルタミンへの置換、またはアスパラギンからグルタミンへの置換。
【００５７】
（ｉｉｉ）リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの正に荷電した残基による別のものの置換。あるいは、
（ｉｖ）アスパラギン酸やグルタミン酸などの負に荷電した残基による別のものの置換。
【００５８】
保存性置換という用語は、置換ポリペプチドに対して産生された抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応する場合には、親アミノ酸残基の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。
【００５９】
この一次アミノ酸配列の改変により、改変前の相手方ポリペプチドと比べて、実質的に同等の活性を有し、親タンパク質の機能的アナログと考えられるタンパク質が得られる。このような改変は、例えば、部位特異的変異による意図的なものであってもよいし、あるいは、偶発的に発生するものであってもよく、スプライス変種、アイソフォーム、他の種からのホモログ、および多形が含まれる。このような機能的アナログも、本発明に従って考慮される。
【００６０】
Ｃ末端欠失
他の実施形態において、本発明は親（野生型）酵素と比べた場合に、Ｃ末端が欠失した植物チミジンキナーゼ酵素を提供する。このような切断された酵素は、例えば部位特異的変異や、実施例に記載したような従来の技術によって得ることができる。
【００６１】
本発明によれば、Ｃ末端欠失によって、野生型酵素に比べて、酵素の特性が改善、特に安定性の向上及び(又は)基質特異性の改善が見られることが分かっている。
【００６２】
より好ましい実施形態において、本発明は、１〜６０のアミノ酸残基、好ましくは１〜５０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜４０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜３０のアミノ酸残基、さらに好ましくは１〜２６のアミノ酸残基、最も好ましくは１〜２４のアミノ酸残基のオーダー(order)でＣ末端欠失を有する、チミジンキナーゼ酵素を提供する。
【００６３】
より好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、２６アミノ酸残基のＣ末端欠失を有するトマト由来のチミジンキナーゼ酵素である。最も好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列を有するチミジンキナーゼ酵素である。
【００６４】
さらに好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、２４アミノ酸残基のＣ末端欠失を有するシロイヌナズナ由来のチミジンキナーゼ酵素である。最も好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有するチミジンキナーゼ酵素である。
【００６５】
Ｎ末端欠失
Ｎ末端欠失、特に、ＡＴ−ＴＫ１ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の、Ｎ末端２２アミノ酸残基の欠失およびＮ末端４５アミノ酸の欠失、またはＮ末端６３アミノ酸の欠失についても考える。これらのアミノ酸は、推定オルガネラシグナルペプチドを構成する。実施例４（表８）で証明されたように、これらのＮ末端アミノ酸の欠失は、ＡＺＴに対するＬＤ１００を減少させる。
【００６６】
植物チミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチド
他の実施態様において、本発明はマツ、トマト、コメまたはシロイヌナズナに由来する植物チミジンキナーゼ酵素、好ましくは上述の植物チミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【００６７】
ハイブリダイゼーションプロトコール
好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２表されるポリヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖とハイブリダイズすることができる。
【００６８】
ハイブリダイゼーションは、少なくとも低いストリンジェンシー条件下、好ましくは中程度または高ストリンジェンシー条件において行うべきである。
【００６９】
低、中程度または高いストリンジェンシー条件下でそれぞれ、ヌクレオチドプローブとホモログＤＮＡまたはＲＮＡ配列との間でのハイブリダイゼーションを判定するための適切な実験条件には、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡを含むフィルタを、５×ＳＳＣ［塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム；Sambrook等; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989を参照のこと］中に１０分間、前含浸させ、５×ＳＳＣ溶液、５×デンハルト溶液［Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｏｐ  ｃｉｔ．を参照］、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性させた超音波破砕サケ精子ＤＮＡ［Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｏｐｃｉｔ．を参照］の中でフィルタをプレハイブリダイゼーションさせ、次いで、１０ｎｇ／ｍＬの濃度のランダムプライム［Feinberg A P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13］、32P-dCTP標識したプローブ（比活性＞１×１０９ｃｐｍ／μｇ）を含む上記と同じ溶液中で１２時間、約４５℃ハイブリダイゼーションさせることを含む。
【００７０】
次にこのフィルタを、少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー条件）において、より好ましくは少なくとも６０℃（中程度のストリンジェンシー条件）において、さらに好ましくは少なくとも６５℃（中程度／高ストリンジェンシー条件）、さらに好ましくは少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー条件）において、さらに好ましくは少なくとも７５℃（超高ストリンジェンシー条件）において、２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ中で３０分間、二度洗浄する。
【００７１】
相補核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの存在を検出するための技術上周知の従来の方法によって、標識してもよい。最も一般的な検出方法は、例えば3H, 125I, 35S, 14C 又は 32Pで標識したプローブをオートラジオグラフィーとともに使用することであり、前記プローブはＸ線フィルムを用いて検出することができる。他の標識としては、標識された抗体に結合するリガンド、フルオロフォア、化学発光物質、酵素、または抗体があげられ、これらは、標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバーとして機能しうる。
【００７２】
ＤＮＡ配列の同一性
他の好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの全長にわたって判定した場合に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として表されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する。本発明のために、配列同一性の百分率は、ＢＬＡＳＴＮが少なくとも１００ヌクレオチドの重複範囲を与えた場合に算出され、該範囲はデフォルト設定において決定される。より好ましくは、重複範囲は少なくとも１５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドである。
【００７３】
本発明において「同一性」とは、ヌクレオチド配列の相同性の程度の尺度のことをいう。同一性を明らかにするために、最も高度な相同性（一致）が得られるように対象配列のアライニングを行う。これら一般的な原理に基づいて、２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「同一性百分率」を、国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information (NCBI)）のウェブサイトより入手可能なＢＬＡＳＴＮアルゴリズム［Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174247-250］を用いて、またそこに示唆されているデフォルト設定（すなわち、Reward for a match = 1; Penalty for a match = -2; Strand option = both strands; Open gap = 5; Extension gap = 2; Penalties bap x_dropoff = 50; Expect = 10; Word size = 11; Filter on）を用いて決定する。BLASTNアルゴリズムは、２つのアライニングしたヌクレオチド配列間の重複する範囲内における配列同一性％を求める。本発明の目的のために、配列同一性の百分率は、少なくとも１００ヌクレオチドの重複領域において算出され、該範囲はデフォルト設定下でBLASTNによって決定される。より好ましくは、重複範囲は少なくとも３００ヌクレオチドである。
【００７４】
このBLASTN比較の結果を表３に示す。
【００７５】
表３
異なる植物起源のチミジンキナーゼのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＤＴＮ比較
【００７６】
【表３】
2006504403.tif 000004
【００７７】
同一性（％）／比較した断片の長さ
＊Ｎ末端とＣ末端断片に分割
◇有意な類似性見られず
マツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）チミジンキナーゼ
トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）チミジンキナーゼ
コメ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）チミジンキナーゼ
シロイヌナズナチミジンキナーゼ（ａ）および（ｂ）
類似ＤＮＡ配列
その最も好ましい実施形態において、本発明の単離ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として表されるポリヌクレオチド配列、またはその機能的アナログを含む。
【００７８】
本発明において、「機能的アナログ」という用語は、保存的に改変されたポリヌクレオチド、および機能的に等価なポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをカバーする。
【００７９】
本発明において、「保存的に改変されたポリヌクレオチド」という用語は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸のことをいうが、あるいは核酸がアミノ酸をコードしない場合には本質的に同一の配列のことをいう。
【００８０】
遺伝コードの縮退のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードしている。例えば、コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧおよびＧＣＵのすべてが、アミノ酸アラニンをコードしている。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、上述の対応するコドンのいずれに変えることができる。このような核酸の変異は「サイレント変異」であり、サイレント変異は、保存的改変変異の一種である。本明細書中のポリペプチドをコードするすべての核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異のこともさしている。当業者であれば、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧを除く）は、機能的の同等の分子を産生するように改変することができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載した各配列に含意される。
【００８１】
発現ベクター
第３の実施態様において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモータとを含む組換え発現ベクターを提供する。
【００８２】
本発明の発現ベクターは、好ましくは真核生物における発現を行うのに適したものである。
【００８３】
より好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはウィルスベクター、特にＩ型単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルス関連ウィルスベクター、レンチウィルスベクター、レトロウィルスベクターまたはワクシニアウィルスベクターである。
【００８４】
パッケージング細胞株
第４の実施態様において、本発明は、感染性ビリオンを産生することのできるパッケージング細胞株を提供し、該細胞株は本発明のベクターを含む。
【００８５】
パッケージング細胞とは、組換えウィルスベクターには欠失しているが感染性組換えウィルスの産生に必要な要素を含んだ細胞のことをいう。パッケージング細胞株の調製方法は従来技術において知られている。
【００８６】
宿主細胞
第５の実施態様において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチド、または本発明の発現ベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、細菌細胞、好ましくは真核細胞、特に哺乳動物細胞、ヒト細胞、卵母細胞または酵母細胞である。
【００８８】
より好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞はヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞、ブタ細胞またはマウス細胞である。
【００８９】
薬学的調合物
第６の実施態様において、本発明は、治療上有効な量の本発明の植物チミジンキナーゼ酵素または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む新規の薬学的調合物に関する。
【００９０】
治療に使用するために、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素は、任意の都合のよい形態で投与できる。好ましい実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素を、１種以上の佐剤、賦形剤、担体及び(又は)希釈剤とともに薬学的調合物に組み込むが、薬学的調合物は技術上周知の従来の方法を用いて当業者によって調製される。
【００９１】
このような薬学的調合物は、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素または植物チミジンキナーゼに対する抗体を含むことができる。組成物は、単独で投与してもよいし、１種以上の他の物質、薬剤またはホルモンと組み合わせて投与できる。
【００９２】
本発明の薬学的調合物は、任意の適切な経路によって投与することができるが、そのような経路としては、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、くも膜下、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下または直腸投与、口腔内、腟内、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄腔内、心室内、大槽内、嚢内、肺内、経粘膜または吸入を介するものが挙げられる。
【００９３】
調合物及び投与方法に関する更に詳しい説明は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA)の最新版中に見出される。
【００９４】
当然、投薬量は、治療される個人の年齢、体重及び病態、並びに投与経路、投与形態及び療法、及び所望の結果に対して慎重に調整されねばならず、更にその正確な投与量は医師の裁量にまかせてよい。  
【００９５】
さらなる実施形態において、本発明の植物チミジンキナーゼは、下記治療方法において説明する細胞株およびベクターを用いて、遺伝子運搬によって投与できる。
【００９６】
したがって、他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクター、または本発明のパッケージング細胞、または本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む薬学的調合物を提供する。
【００９７】
上記のような治療用細胞株を作成するためには、本発明のポリヌクレオチドを、例えばプラスミド、ウィルスまたは他の発現媒体などの発現ベクター中に挿入し、発現制御配列に適合するような条件下でコード配列の発現が達成されるように、ライゲーションによって発現制御配列に機能的に連結できる。
【００９８】
適切な発現制御配列としては、プロモータ、エンハンサー、転写終結因子、開始コドン、イントロンに対するスプライシングシグナル、および停止コドンが挙げられ、これらのすべては、ｍＲＮＡの適切な翻訳を行わせるように、本発明のポリヌクレオチドの適切なリーディングフレーム内に保持される。発現制御配列は、リーダー配列や融合パートナー配列などの追加の要素を含むこともできる。
【００９９】
治療方法
ポリヌクレオチドおよびタンパク質、ポリペプチド、ペプチド断片またはそれらから製造される誘導体、ならびにそのようなタンパク質、ペプチドまたは誘導体に対する抗体に関する本発明は、ヒトを含む動物生体の疾患または疾病を治療または緩和するために用いることができ、前記疾患または疾病は、細胞毒物質の活性に応答する。
【０１００】
疾患、疾病または病状は、特に癌またはウィルス感染でありうる。
【０１０１】
癌細胞は、急激に増殖する細胞であり、隣接する組織を浸潤して転移する能力を有し、したがって必要不可欠な体の部分の機能を侵害して、重篤な病気や死に至らしめる。通常の治療は外科手術、放射線および化学療法、ならびに最近では新奇の治療、遺伝子治療も行われるようになってきた。遺伝子特異的酵素プロドラッグ治療（ＧＤＥＰＴ）において、遺伝子を癌細胞に運搬して、ここで発現させる。その後、対応する酵素は投与されたプロドラッグを活性系の変換して、細胞の増殖の進行を止める。ＧＤＥＰＴ系の一つは、デオキシリボヌクレオシドキナーゼおよび様々なプロドラッグ、ヌクレオシドアナログに基づいている。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドは、特に「自殺遺伝子」、すなわち薬物感受性遺伝子として使用できる。標的細胞へ自殺遺伝子を導入することにより、細胞は、正常細胞に対しての比較的非毒性の化合物または組成物に対して感受性になる。
【０１０３】
したがって、第７の実施態様において、本発明は標的細胞をプロドラッグに対して感作させる方法を提供し、該方法は、
（ｉ）細胞に、前記プロドラッグの（細胞毒）薬物への変換を促進する植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクションまたは形質導入するか、何らかの方法で細胞内に植物チミジンキナーゼを運搬する工程と、（ｉｉ）前記プロドラッグを前記標的細胞内に運搬する工程とを含み、前記標的細胞は前記プロドラッグよりも前記（細胞毒）薬物により感受性が高い。
【０１０４】
標的細胞は、任意の関心のある細胞であってよく、特にヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞、ネコ細胞、ブタ細胞またはマウス細胞であってよい。好ましくは標的細胞はヒト細胞である。
【０１０５】
その最も広義の実施態様において、任意の植物チミジンキナーゼ酵素を用いることができる。しかしながら、好ましい実施形態において、植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、本発明のポリヌクレオチド配列である。
【０１０６】
より好ましい実施形態において、プロドラッグはヌクレオシドアナログである。
【０１０７】
本発明において、本発明に従って使用するのに好ましいヌクレオシドアナログは、アシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−エトキシ］−メチル−グアノシン）、ブシクロビル（９−（３，４−ジヒドロキシブチル）グアニン）、ファムシクロビル（２−［２−（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル］−１，３−プロパンジオールジアセテート）、ガンシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシル−メチル］−グアノシン）、ペンシクロビル、バルシクロビル、トリフルオロチミジン、ＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン）、ＡＩＵ（５’−イオド−５’−アミノ−２’，５’−ジデオキシウリジン）、ａｒａ−Ａ（アデノシン−アラビノシド；ビバラビン）、ａｒａ−Ｃ（シチジン−アラビノシド）、ａｒａ−Ｇ（９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニン）、ａｒａ−Ｔ、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−イオド−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、１−［２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−イオドウラシル、イドクスウリジン（５−イオド−２’デオキシウリジン）、フルダラビン（２−フルオロアデニン９−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシド）、ゲムシタビン、３’−デオキシアデノシン（３−ｄＡ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、２’，３’−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、２’，３’−ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、２−クロロ−２’−デオキシアデノシン（２ＣｄＡ）、５−フルオロデオキシウリジン、ＢＶａｒａＵ（（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＢＶＤＵ（５−ブロモビニル−デオキシウリジン）、ＦＩＡＵ（１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−イオドウラシル）、３ＴＣ（２’−デオキシ−３’−チアシチジン）、ｄＦｄＣゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン）、ｄＦｄＧ（２’，２’−ジフルオロデオキシグアノシン）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）、ｄ４Ｔ（２’，３’ジデヒドロ−３’−デオキシチミジン）、ａｒａ−Ｍ（６−メトキシプリンアラビノヌクレオシド）、ＩｕｄＲ（５−ヨード−２’デオキシウリジン）、ＣａＦｄＡ（２’−クロロ−２’−ａｒａ−フルオロ−デオキシアデノシン）、ａｒａ−Ｕ（１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＦＢＶＡＵ（Ｅ）−５−（２’−ブロモビニル）−１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル、ＦＭＡＵ１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、ＦＬＴ３’−フルオロ−２'−デオキシチミジン、５−Ｂｒ−ｄＵｒｄ５−ブロモデオキシウリジン、５−Ｃｌ−ｄＵｒｄ５−クロロデオキシウリジンまたはｄＦｄＵ２’，２’−ジフルオロデオキシウリジンからなる群より選択される。
【０１０８】
より好ましい実施形態において、本発明に従って用いるヌクレオシドアナログは、ＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン）である。
【０１０９】
本発明のチミジンキナーゼ酵素は、たとえば注射、移植または服用される薬学的調合物を介して、チミジンキナーゼ酵素に反応する病理学的過程を治療するように、直接的に使用できる。
【０１１０】
本発明のポリヌクレオチドは、その相補配列も含めて、本発明のチミジンキナーゼ酵素の発現のために用いることができる。このことは、本発明のタンパク質、ペプチドまたは誘導体を発現する細胞株によって、あるいは本発明のそのようなタンパク質、ペプチドまたは誘導体をコードするウィルスベクターによって、あるいはそのようなタンパク質、ペプチドまたは誘導体を発現する宿主細胞によって達成することができるこ。これらの細胞、ベクターおよび組成物は、細胞毒物質に応答する疾患過程に影響するように標的部位の治療に投与することができる。
【０１１１】
適切な発現ベクターは、単純ヘルペス、アデノウィルス、レンチウィルス、レトロウィルス、またはワクシニアウィルスに由来するウィルスベクターであってもよいし、あるいは様々な細菌によって生産されるプラスミドに由来するものであってもよく、また、全器官または標的とする器官、組織もしくは細胞集団へのヌクレオチド配列の生体内運搬のために用いることができる。他の方法としては、限定はされないが、リポソームトランスフェクション、エレクトロポレーション、核の信号または他の局在化信号を含んだ担体ペプチドによるトランスフェクション、および持続放出系を介しての遺伝子運搬が挙げられる。特異的細胞は、癌細胞に特異的なマーカーなどの細胞表面マーカーによって標的とすることができる。タンパク質およびベクターのいずれの構築物も、細胞表面マーカーを用いて細胞に対して標的化することができる。分割細胞は、分裂中の細胞にのみ感染するレトロウィルスベクターの形質導入により標的化することができる。
【０１１２】
本発明のさらに別の実施態様において、本発明のヌクレオチドに相補的な「アンチセンス」ヌクレオチド配列またはその一部を、チミジンキナーゼ酵素発現を阻害または強化するために用いることができる。
【０１１３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、温血動物における病原性物質を阻害するための方法を提供し、該方法は、前記動物に、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターを投与する工程を含む。
【０１１４】
より好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド配列または発現ベクターは、生体内投与される。
【０１１５】
別の好ましい実施形態において、病原性物質はウィルス、細菌または寄生虫、またはさらに腫瘍細胞である。
【０１１６】
別の好ましい実施形態において、病原性物質は自己反応性免疫細胞である。
【０１１７】
さらにより好ましい実施形態において、本方法は、ヌクレオシドアナログを前記温血動物に投与する工程をさらに含む。
【０１１８】
好ましくは、ヌクレオシドアナログは、上述のものから選択される。
【０１１９】
最も好ましい実施形態において、本発明に従って用いるヌクレオシドアナログは、ＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン）である。
【０１２０】
自殺系
本発明のチミジンキナーゼをコードする遺伝子の最も重要な用途の一つとして、細胞および遺伝子に基づく治療における自殺系としての用途がある。哺乳動物に対するあらゆるタイプの細胞および遺伝子治療において、移植細胞または遺伝子治療によって形質導入された細胞を不可逆的に殺すことのできる系が必要とされる。
【０１２１】
基本的に二つのタイプの細胞に基づいた治療があるが、これらのいずれも、本発明によるチミジンキナーゼに基づいた内蔵型自殺系を有することから利点を受ける。置換細胞治療においては、裸の細胞を対象に移植して、体内での自身の機能を完遂することができなくなった細胞または死細胞を置換する。一旦これらの細胞が移植され、対象の体に完全に一体化されると、外科的手段によってそれらを容易に除去することはできない。本発明のチミジンキナーゼが構造的または誘導的に発現される内蔵型自殺系を有することにより、細胞はＡＺＴなどの治療上有効な量のヌクレオシドアナログを個体に投与することによって殺すことができる。移植された細胞が制御不能に増殖し始めた場合に、ヌクレオシドアナログを投与することができる。また、単にもうこれ以上細胞を置換する必要がなくなったという理由から、あるいは別の経路でそれ以上の治療を行うという理由から、治療を終わりたい場合もある。
【０１２２】
他のタイプの細胞に基づく治療としては、治療用細胞を体内に移植して、一定の場所において、例えば成長因子を分泌させることが挙げられる。このような治療用細胞はカプセル化されている場合が多く、また比較的簡単に体から除去することができるが、この場合も、外科手術を用いずに選択的に細胞を殺すことができるという理由から、自殺系を組み込むことが好ましい。
【０１２３】
生体内遺伝子治療において、同じ考察が置換細胞治療の場合にも当てはまる。自殺遺伝子の組み込みは、治療用遺伝子と、本発明によるチミジンキナーゼの両方を含むウィルスベクターの構築によって達成することができる。好ましくは、治療用遺伝子およびチミジンキナーゼを、随意でそれらをＩＲＥＳ構築物で分離することにより、同一のプロモータの制御下に挿入する。
【０１２４】
移植された細胞が移植前に条件付きで不死化されている場合には、腫瘍遺伝子が移植後に転写を開始させ、移植された細胞が腫瘍形成性になるという危険がある。この状況を抑制する手段が、本発明によって得られる。誘導可能なプロモータの制御下（例えば、Ｔｅｔオン−オフ系、Ｍｘ１プロモータなど）での腫瘍遺伝子による形質導入によって細胞を不死化させるときは必ず、チミジンキナーゼを同じプロモータの制御下にある（あるいはＩＲＥＳ構築物を用いて）ベクター構築物内に挿入する。これにより、腫瘍遺伝子が転写されるたびに、チミジンキナーゼも転写されて、形質導入された腫瘍形成性細胞をＡＺＴなどのヌクレオシドアナログを投与することにより、選択的に殺すことができるようになる。
【０１２５】
ヌクレオシドのリン酸化方法
本発明のチミジンキナーゼ酵素には、治療およびバイオテクノロジー用途を含む様々な利用性が考えられる。
【０１２６】
第８の実施態様において、本発明は、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素を、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化するために用いることに関する。
【０１２７】
好ましい実施形態において、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化するための方法を提供し、該方法は、
ｉ）前記ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素を作用させる工程と、
ｉｉ）リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程とを含む。
【０１２８】
特に、本発明のチミジンキナーゼは、ジデオキシグアノシンをリン酸化するために用いることができる。
【０１２９】
遺伝的に改変した植物
本発明のチミジンキナーゼ酵素は、植物の成長を改変または制御するための方法における利用性も見いだされている。したがって、さらなる実施態様において、本発明は、植物の成長を改変または制御するための方法に関し、前記植物は、本発明の植物チミンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含み、前記方法は、植物または植物細胞をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ、好ましくはＡＺＴに曝露する工程を含む。植物チミジンキナーゼの未知の特性、特に本発明に記載したような特性の発見によって、本発明者らは、ヌクレオシドアナログを除草剤として使用することを企図している。植物チミジンキナーゼは、ヌクレオシドアナログを非常に高速で毒性物質に変換するため、ヌクレオシドアナログは、これらのチミジンキナーゼを天然または異種遺伝子として有する植物に対する除草剤として使用することができる。本発明のチミジンキナーゼを、これらの特性を有するチミジンキナーゼを持たない植物に導入することにより、この植物をヌクレオシドアナログ、特にＡＺＴに対して感受性にする。
【０１３０】
本発明の植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは異種ポリヌクレオチドであり、本発明の方法に供する植物は好ましくは遺伝子組換え植物である。
【０１３１】
したがって、さらなる実施態様において、本発明は、本発明の植物チミジンキナーゼ酵素をコードする発現可能な異種核酸を含む遺伝子組換え植物を提供し、前記異種核酸は、遺伝子組換え植物または該遺伝子組換え植物の原種に導入される。
【０１３２】
遺伝子組換え植物は、例えば本発明の発現ベクターを植物細胞に導入するなどの遺伝的に改変された植物を生成するための既知の技術によって得ることができる。
【０１３３】
任意の植物チミジンキナーゼをノックアウトするか、及び(又は)機能的に他のチミジンキナーゼに置換することもできるが、前記他のキナーゼは特定のヌクレオシドアナログ（例えば、作物中の）を変換することができない。次に、ヌクレオシドアナログは、この遺伝学的に改変された植物の周囲の雑草を殺すために用いることができる。
【０１３４】
本発明によって得られるどの形質転換植物も、従来の繁殖計画、または同一の特性を持つより多くの形質転換植物を産生するための体外繁殖において用いることができ、及び(又は)、同一種または関連種の他の変種に同じ特性を導入するために用いることができる。このような植物も本発明の一部である。形質転換された植物から得られる種子は同じ遺伝的特徴を含むので、これも本発明の一部を構成する。
【０１３５】
図面の簡単な説明
本発明を添付の図面によって更に説明する：
図１は、それぞれＡＴ−ＴＫ１ａ（■）、ＡＴ−ＴＫ１ｂ（●）およびＨＳＶ１−ＴＫ（▼）のｄＴＭＰキナーゼ活性（ＣＰＭ）の経時変化（０〜１２０分）を示す。
【０１３６】
図２は、それぞれＡＴ−ＴＫ１ａ（□）、ＡＴ−ＴＫ１ｂ（○）およびＨＳＶ１−ＴＫ（▽）のＡＺＴモノホスフェートキナーゼ活性（ＣＰＭ）（０〜１２０分）を示す。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は請求の範囲に記載された本発明の範囲を何ら限定することを意図していない。
【０１３８】
本発明は、添付の図面を参照してさらに説明する。
【０１３９】
例１
植物キナーゼを発現するレトロウィルスベクターの構築
植物キナーゼのｃＤＮＡをモロニーマウス白血病（ＭＬＶ）ウィルスに基づくレトロウィルスベクター中にクローニングして、ＴＫ１キナーゼを含む複製欠失組換えレトロウィルスを作成した。
【０１４０】
ＤＮＡ断片を、両側に計画的な制限酵素部位をもつプライマーを用いて、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって増幅した。
【０１４１】
ＡＴ−ＴＫ１ａに基づいたシロイヌナズナ構築物をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断し、トマトＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで切断し、ポリリンカーの上流にＣＭＶプロモータを挿入することにより、プラスミドベクターｐＬＣＸＳＮのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。プラスミドベクターｐＬＣＸＳＮは、ｐＬＸＳＮ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ｃａｔ＃  Ｋ１０６０−Ｂ）に由来するレトロウィルス転移ベクターである。
【０１４２】
ＡｔＴＫ１（ＰＺＧ５３），ＡｔＴＫ１ΔＣ２４（ＰＺＧ５６），ＴｏｍＴＫ１（ＰＺＧ６９）およびＴｏｍＴＫ１ΔＣ２６（ＰＺＧ５９）の４つの構築物が得られた。ｐＬＣＸＳＮ単独とＨＳＶ１−ＴＫを含むベクター（ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニング）を対照として用いた。
【０１４３】
プラスミドをＱｉａｇｅｎプラスミドキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、構築されたプラスミドのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４４】
以下のプライマー配列を用いた。
5’ ccg ctc gag atg gcg act ctc aaa gct tcc ttt ttg 3’ (AT TK1-for; SEQ ID NO: 14);
5’ cgc gga tcc tta gat tgt agc agc aac aca gga ttc 3’ (AT TK1-rev; SEQ ID NO: 15);
5’ cgc gga tcc tta aac aat atg att agt gat gta atg ctt g 3’ (AT TK1 DC; SEQ ID NO: 16);
5’ gga aga tct tta gac aga ttg tcc att aac ata gtg ctg 3’ (T TK1 DC; SEQ ID NO: 17);
5’ gga aga tct tta tgg atc aac tag tgg tga ttc taa g 3’ (T TK1-rev; SEQ ID NO: 18); and
5’ ccg ctc gag atg gct ttt tca tca tct gct aga aac 3’ (T TK1-for; SEQ ID NO: 19).
比較のために、ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）に対する発現プラスミドも構築した。ヒトＨＳＶ１に由来するチミジンキナーゼを、プライマー
5’ tat agg atc cgc cac cat ggc ttc gta ccc cgg c 3’ (HSV1-TK - for; SEQ ID NO: 20); 及び
5’ tat act cga gga ggt cga ctc agt tag cc 3’ (HSV1-TK - rev; SEQ ID NO: 21);
を用いて、また鋳型としてKarreman [Karreman C; Gene1998 218 57-62]によって記載されたプラスミドpCMV-pacTKを用いて増幅した。
【０１４５】
２９３Ｔパッケージング細胞（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１１２６８）を、ＯＰＴＩＭＥＭ  １培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、３７℃で培養した。構築されたｐＬＣＸＳＮプラスミドベクターを、業者によって提供されるプロトコールに従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）を用いてパッケージング細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、トランスフェクト細胞からの培地を回収し、０．４５ｍｍフィルタでろ過し、超遠心分離（５０，０００×ｇ，４℃で９０分）によりペレット状にし、ＴＥＮ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解した。
【０１４６】
ＭＯＩが５の癌細胞株を形質導入するために、ウィルス含有緩衝液を引き続き用いた。
【０１４７】
細胞培養およびレトロウィルス形質導入
グリア芽腫Ｕ−８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）およびグリア芽腫Ｕ−１１８ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１５）細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入した。すべての細胞を、最小必須培地、Ｅ−ＭＥＭ  Ｍ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１２−６１１）中で、１０％（ｖ／ｖ）オーストラリア原産のウシ胎仔血清（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１４−７０１）および１ｍＬ／Ｌのゲンタマイシン（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１７−５１８Ｌ）とともに培養した。細胞を５％ＣＯ２の気相を有した加湿したインキュベータ中、３７℃で培養した。
【０１４８】
細胞株に対して、５μｇ／ｍＬのポリブレンと混合したレトロウィルス含有培地による形質導入を行い、４８時間インキュベートした後、２００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の存在下で３週間連続培養した。
【０１４９】
細胞増殖アッセイ
細胞を１ウェルあたり１５００〜２５００個となるように、ポリ−Ｌ−リジンでコートした９６ウェルプレート上にプレーティングした。２４時間後、ＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン；Ｓｉｇｍａより市販）を添加したところ、ヌクレオシドアナログを含有する培地は変化しなかった。
【０１５０】
細胞生存率を、薬物曝露の５時間後にＸＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）によってアッセイした。
【０１５１】
各実験は４回繰り返して行った。検討した化合物のＩＣ５０値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）（Ｄｙｒｂｅｒｇ  Ｔｒａｄｉｎｇ，Ｋａｒｌｓｌｕｎｄ，デンマーク）を用い、これら実験の平均値として算出し、以下の式に従って計算した。
【０１５２】
ｄＩ＝Ｍａｘ／（１＋（［Ｉ］／ＩＣ５０））
（式中、ｄＩは、ＸＴＴアッセイによって判定される阻害剤濃度における細胞増殖を示し；
Ｍａｘは、ＸＴＴアッセイによって判定される最大細胞増殖であり；
［Ｉ］は、阻害剤濃度を表し、
ＩＣ５０（５０％増殖阻害濃度）は、細胞増殖を５０％阻害する用量を表す。）
AZTに対する感受性が向上した植物キナーゼの発現
非形質導入細胞の感受性と、レトロウィルスベクター単独またはＡＺＴに対する植物キナーゼを含むベクターのいずれかで形質導入された細胞の感受性を判定した。
【０１５３】
細胞毒性（ＩＣ５０）を薬物曝露から５日目に判定した。この測定結果を表４に示す。
【０１５４】
表４
グリア芽腫細胞株のＡＺＴ（ｍＭ）に対する感受性（ＩＣ５０）
５０％の致死率をもたらす濃度を各構築物および親細胞株について示す。感受性増加率は親細胞株と比較したものである。
【０１５５】
【表４】
2006504403.tif 000005
【０１５６】
親細胞株とｐＬＣＸＳＮベクター単独を形質導入した細胞の間での感受性の差異は、１倍未満であった。植物キナーゼを発現したいずれのグリア芽腫細胞株も、ＡＺＴに対する感受性の増加を示した。最も大きい増加は、トマトＴＫ１を発現しているＵ−８７ＭＧ細胞株に対して認められ、非形質導入細胞と比べてＩＣ５０がほぼ２４０倍低下した。
【０１５７】
例２
チミジンキナーゼのクローニング
本実施例では、本発明のトマト、マツ、コメおよびシロイヌナズナチミジンキナーゼをコードする遺伝子の同定の仕方、ならびに、様々なチミジンキナーゼを発現するためのベクターの構築の仕方について説明する。
【０１５８】
ヒトＴＫ１への相同性に基づいて、トマトから得た２つの配列ＡＣＣＮ  ＢＥ４６３２５９およびＡＣＣＮ  ＢＧ１２９１９７（Ｃｌｅｍｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，米国より入手可能）、マツから得た配列ＡＣＣＮ  ＡＷ７５５１３２（Ｄｒ．Ｒｏｓｓ  Ｗｈｅｔｔｅｎ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，米国より入手可能）、およびコメから得た仮想ＴＫ１（ＡＣＣＮ  ＡＦ０６６０５０）との相同性を有するＥＳＴ，ＡＣＣＮ  Ｄ２４９０３（ＭＡＦＦ  ＤＮＡ  Ｂａｎｋ、日本の茨城県つくば市観音台２丁目１−２、３０５−８６０２より入手可能）を、ＮＣＢＩウェブサイトより入手可能な局所ホモロジー検索ツール（ｔＢＬＡＳＴｎ）を用い、標準設定（すなわちＦｉｌｔｅｒ  ｏｎ，Ｅｘｐｅｃｔ＝１０，Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ＝３，Ｍａｔｒｉｘ＝Ｂｌｏｓｕｍ６２，Ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ＝Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ１）を用いて同定した。
【０１５９】
プラスミド由来のプライマーから開始してインサートの配列を決定した。次に、新しく得られた配列データを基にしてプライマーを設計した。ＡＣＣＮ  ＡＵ０６８８８９から得た配列情報と組み合わせたＤ２４９−３におけるインサートの配列から、ＡＦ０６６０５０において報告されているものよりも６４アミノ酸長長いタンパク質に対するＯＲＦが推定された。
【０１６０】
トマトチミジンキナーゼ
トマトチミジンキナーゼのＯＲＦを下記のプライマー、5’ CGC GGA TCC ATG GCT TTT TCA TCA TCT GCT AGA AAC CCA GTT GAC CTG AG 3’ (1MS TOTK1-B; SEQ ID NO: 22)および
5’ CCG GAA TTC TTA TGG ATC AAC TAG TGG TGA TTC TAA G 3’ (2MS TOTK1-E; SEQ ID NO: 23)を用いて、また鋳型としてＡＣＣＮ  ＢＧ１２９１９７を含有するプラスミドを用いてＰＣＲにより増幅した。
【０１６１】
次に、このＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにより切断し、これもＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ＴＫ１と名付けた。
（シロイヌナズナチミジンキナーゼ（ＡＴ−ＴＫ１ａ））
シロイヌナズナ由来のＴＫ１ａのＯＲＦ（アクセッション番号：ＡＡＦ１３０９７）を下記のプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）より増幅した；  5' CGC GGA TCC ATG GCG ACT CTC AAA GCT TCC TTT TTG ATC AAA ACC C 3' (1msAtTK1-B; SEQ ID NO: 24); 及び 
5' CCG GAA TTC TTA GAT TGT AGC AGC AAC ACA GGA TTC AGC 3' (2msAtTK1-E; SEQ ID NO: 25)。
【０１６２】
次に、ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩにより切断し、これもＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ＴＫ１ａと名付けた。
（シロイヌナズナチミジンキナーゼ（ＡＴ−ＴＫ１ｂ））
シロイヌナズナ由来のＴＫ１ａのＯＲＦ（アクセッション番号：ＢＡＢ０９８２４）を以下のような戦略を用いてｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）より増幅した。この場合、ＡＴ−ＴＫ１ｂのいくつかのＮ末端欠失変異体も得られた。
【０１６３】
全長ＯＲＦ（ＡＣＣＮ  ＢＡＢ０９８２４）を、下記のプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）より増幅した。
5’ ATG AGA ACA TTA ATC TCA CCA TCT C 3’ (1mtAtTK1L; SEQ ID NO: 26); 及び      5’ CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC ACT ATG 3’ (2mtAtTK1L; SEQ ID NO: 27)。
【０１６４】
この全長ＰＣＲ産物を、下記のプライマーを用いてＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ突出部を有した断片を増幅するために用いた。
5’ CGC GGA TCC atg aga aca tta atc tca cca tct c 3’ (1mtAtTK1L-B; SEQ ID NO: 28); 及び 
5’ CCG GAA TTC CTA AAG TGA ACT TGC TAC AAC AC 3’ (2mtAtTK1-E; SEQ ID NO: 29)。
【０１６５】
次にＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩによって切断し、同様にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＧＥＸ−２Ｔベクター中にライゲーションした。得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ＴＫ１ｂ（Ｐ６６１）と名付けた。
【０１６６】
同様にしてＮ末端欠失を作成し、ｐＧＥＸ−２Ｔ中にライゲーションした。下記のプライマーを用いて２２アミノ酸のＮ末端欠失を得た。
5’ CGC GGA TCC tcc acc gct ctt cgc ttc tcc 3’(1mtAtTK1I-B; SEQ ID NO: 30); 及び 
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29)。
【０１６７】
得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ΔＮ２２ＴＫ１ｂ（Ｐ６６２）と名付けた。
【０１６８】
下記のプライマーを用いて、４５アミノ酸のＮ末端欠失を得た。
5’ CGC GGA TCC tcc acc aga aag cta caa acg 3’(1mtAtTK1-B; SEQ ID NO: 31); 及び2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29)。
【０１６９】
得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ΔＮ４５ＴＫ１ｂ（Ｐ６６３）と名付けた。
【０１７０】
下記のプライマーを用いて、６３アミノ酸のＮ末端欠失を得た。
5’ CGC GGA TCCcag ccg ctc tcc tcc tca tc 3’ (1mtATTK1S-B; SEQ ID NO: 32); and 
2mtAtTK1-E (SEQ ID NO: 29)。
【０１７１】
得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ΔＮ６３ＴＫ１ｂ（Ｐ６６４）と名付けた。
【０１７２】
コメチミジンキナーゼ
コメ由来のチミジンキナーゼをプライマー
5' CGG GAT CCG GCG GCG GCG GCG GAC AAG TCT CG 3' (1osTK1s-B; SEQ ID NO: 33); 及び 
5' CGG AAT TCT TAC TTG AAA GCA TGG ATA ACC TTG G 3' (2osTK1-E; SEQ ID NO: 34)を用いて、また鋳型としてＤ２４９０３を用いて増幅した。
【０１７３】
次に、ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、同様にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手可能）中にライゲートした。得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｒｉｃｅ−ＴＫ１と名付けた。
【０１７４】
ＨＳＶ１チミジンキナーゼ（対照に使用）
ＨＳＶ１由来のチミジンキナーゼはプライマー
5' CGC GGA TCC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT C 3' (HSV1-for A; SEQ ID NO: 35); 及び 
5' CCG GAA TTC TTA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG 3' (HSV1-rev; SEQ ID NO: 36)を用いて、また鋳型としてKarreman [Karreman C; Gene1998 218 57-62]に記載のプラスミドpCMV-pacTKを用いて増幅した。
【０１７５】
次に、ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、同じくＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にライゲーションした。
【０１７６】
得られたプラスミドをｐＧＥＸ−２Ｔ−ＨＳＶ１−ＴＫと名付けた。
【０１７７】
例３
組換え型チミジンキナーゼの発現と精製
本実施例では、チミジンキナーゼを発現させるための、実施例２で得られたプラスミドによるＫＹ８９５の形質転換の仕方について説明する。
【０１７８】
ＫＹ８９５細胞は、例えばSambrook等. [Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989]に記載されるような標準的な技術を用いて、実施例２の発現プラスミドによって形質転換した。
【０１７９】
形質転換されたＫＹ８９５を、ＯＤ６００ｎｍが０．５〜０．６になるまで、３７℃にてＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）培地中で培養し、ＩＰＴＧを１００μＭとなるように加えることにより、タンパク質発現を誘導した。細胞を２５℃で４時間さらに培養してから、遠心分離により採取した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡ非含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉｇｎｏｓｔｉｃｓより）の存在下、結合緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．３）；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０％グリセロール；および０．１％トリトンＸ−１００）中で超音波破砕した。
【０１８０】
抽出物が４つの天然デオキシリボヌクレオシドをリン酸化することができるかどうかは、デオキシリボヌクレオシドの濃度を１００μＭに固定して調べた。各抽出物における最も高い比活性は、１００％に設定した。括弧内は、１００％に相当する比活性を、ｍＵ／ｍｇの単位で示したものである。
【０１８１】
これらの評価の結果を表５に示す。
【０１８２】
表５ 
２５℃にて０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで４時間誘導したＫＹ８９５細胞の抽出物中のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性
【０１８３】
【表５】
2006504403.tif 000006
【０１８４】
ｎ．ｄ．は、「検出されなかった」ことを表す。
【０１８５】
表中のデータは、すべての酵素がチミジンキナーゼであることを示す。
【０１８６】
抽出物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ、濾過し、カラムに流した。その後、２本の１ｍＬグルタチオン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手可能）を組み合わせ、結合緩衝液Ａ中で平衡化した。試料のローディング後、カラムを４０ｍＬの結合緩衝液Ａで洗浄した。次に、カラムを５ｍＬの（Ａ）中１０ｍＭ  ＡＴＰ／ＭｇＣｌ２で洗浄し、室温で１時間、続いて４℃で３０分間インキュベートした。ＡＴＰ／ＭｇＣｌ２を、１０ｍＬの結合緩衝液Ａで洗浄することにより除去した。
【０１８７】
ＧＳＴ−タグタンパク質を、製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のプロトコールに従ってトロンビン開裂により、ＧＳＴ結合カラム上のＴＫから開裂させる。
【０１８８】
精製されたＴＫの速度定数を、Munch-Petersen 等. [Munch-Petersen B, Knecht W, Lenz C, Sondergaard L, Piskur J: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem.2000 275 6673-6679]  に記載されているようにして求めた。
【０１８９】
速度データは、Knecht等 [Knecht W, Bergjohann U, Gonski S, Kirschbaum B & Loffler M: Functional expression of a fragment of human dihydroorotate dehydrogenase by means of the baculovirus expression vector system and kinetic investigation of the purified recombinant enzyme; Eur. J. Biochem. 1996 240292-301]によって記載されているように、ミカエリス−メンテンの等式ｖ＝Ｖｍａｘ×［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］）またはヒルの等式ｖ＝Ｖｍａｘ×［Ｓ］ｈ／（Ｋ０．５ｈ＋［Ｓ］ｈ）を用いて非線形回帰分析によって評価した。Ｋｍはミカエリス常数であり、Ｋ０．５は、ｖ＝０．５Ｖｍａｘとなる基質濃度［Ｓ］の値であり、ｈはヒル定数[Cornish-Bowden A: Fundamentals of enzyme kinetics; Portland Press Ltd., London, 1995, pp. 33; and Liebecg C: IUBMB Biochemical nomenclature and related documents; Portland Press Ltd., London, 1992]である。
【０１９０】
表６
組換え型（ｒ）植物キナーゼについてのＴｈｄに対する速度と基質濃度の関係
【０１９１】
【表６】
2006504403.tif 000007
【０１９２】
＊Le Breton C: In-vitro study of novel deoxyribonucleoside kinases for gene therapy; B. Sc. Report, 2002, University of Paris VII / Technical University of Denmarkからのデータ
＊＊Kokoris M S and Black M E: Characterization of Herpes Simplex Virus type 1 thymidine kinase mutants engineered for improved ganciclovir or acyclovir activity; Protein Science 2002 112267-2272からのデータ
表７
組換え型植物キナーゼについてのＡＺＴに対する速度と基質濃度の関係
【０１９３】
【表７】
2006504403.tif 000008
【０１９４】
表６および７は、植物ＴＫが、Ｔｈｄよりもより効率的に（ｋｃａｔ／Ｋｍ）ＡＺＴをリン酸化することを実証しており、ＡＺＴよりもはるかに効率的にＴｈｄをリン酸化するｒＨＳＶ１−ＴＫとは対照的である。トマト、シロイヌナズナおよびＨＳＶ１−ＴＫに対する［ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｔｈｄ）］／［ｋｃａｔ／Ｋｍ（ＡＺＴ）］比は以下の通りである。
rTOM-TK1      1.07
rAT-DN45TK1b  0.06
rAT-TK1a             0.08
rHSV1-TK             72.7
例４
ヌクレオシドアナログプレート上での形質転換大腸菌ＫＹ８９５の成長
本実施例では、実施例２に従って得られたプラスミドにより形質転換された宿主細胞が、ヌクレオシドアナログＡＺＴ（３’−アジド−３’−デオキシチミジン）の存在下において、どのようにしてプレート上で成長できるかについて説明する。
【０１９５】
実験は、Knecht 等 [Knecht, W., Munch-Petersen, B. & Piskur, J.: Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster; J. Mol. Biol. 2000 301 827-837]に記載されているようにして行った。
【０１９６】
表８
ＡＺＴ存在下におけるＫＹ８９５細胞の増殖
【０１９７】
【表８】
2006504403.tif 000009
【０１９８】
ｐＧＥＸ−２Ｔは、ベクターでありＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａより市販されている；
ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｄｍ−ｄＮＫは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来の多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターであり、Munch-Petersen 等 [Munch-Petersen B, Knecht W, Lenz C, Sondergaard L, Piskur J: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 6673-6679]Knecht等に記載されている；
ｐＧＥＸ−２Ｔ−Ｂｍ−ｄＮＫは、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を含むベクターであり、Knecht 等 [Knecht W, Ebert Petersen G, Munch-Petersen B, Piskur J: Deoxyribonucleoside kinases belonging to the thymidine kinase 2 (TK2) -like group vary significantly in substrate specificity, kinetics and feed-back regulation ; J. Mol. Biol. 2002 315529-540]によって記載されている；
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ｈｕ  ＴＫ１は、ヒトチミジンキナーゼ（ＴＫ１）をコードする遺伝子を含むベクターであり、Berenstein 等 [Berenstein D, Christensen J F, Kristensen T, Hofbauer R, Munch-Petersen B: Valine, not methionine, is amino acid 106 in human cytosolic thymidine kinase (TK1). Impact on oligomerization, stability, and kinetic properties; J. Biol. Chem. 2000 275(41) 32187-32192]に記載されている。
【０１９９】
表８は、トマトに由来するチミジンキナーゼが、ヌクレオシドアナログＡＺＴとの組み合わせて判定すると最も強力であることを示している。この酵素は、単純ヘルペス由来のものよりも約３０倍の活性を有する。
【０２００】
例５
ＴＫ選択プレート上でのＴＫ活性の試験
本実施例では、実施例２に記載したプラスミドで形質転換したＫＹ８９５細胞を用いたチミジンキナーゼ活性の測定について説明する。
【０２０１】
チミジンキナーゼ活性に対する試験は、Knecht等 [Knecht, W., Munch-Petersen, B. & Piskur, J.: Identification of residues involved in the specificity and regulation of the highly efficient multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster; J. Mol. Biol. 2000 301 827-837]に記載されたように行った。
【０２０２】
ｐＧＥＸ−２Ｔは、対照に用いたAmersham-Pharmaciaより市販されているベクターである。
【０２０３】
Munch-Petersen等 [Munch-Petersen B, Knecht W, Lenz C, Sondergaard L, Piskur J: Functional expression of a multisubstrate deoxyribonucleoside kinase from Drosophila melanogaster and its C-terminal deletion mutants; J. Biol. Chem. 2000 275 6673-6679]に従って、ミバエ科ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）から得た多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼ(pGEX-2T-Dm-dNK)を正の対照として用いた。
【０２０４】
表９
ＴＫ選択プレート上の増殖
【０２０５】
【表９】
2006504403.tif 000010
【０２０６】
＋増殖あり
−増殖なし
ｎ．ｄ．検出されず
本実施例は、すべての酵素がチミジンをリン酸化できることを実証している。
【０２０７】
例６
ヌクレオシドモノホスフェートからヌクレオシドジホスフェートへのリン酸化
モノホスフェートキナーゼ活性は、本質的にMunch-Petersen 等.; J. Biol. Chem. 1998 273 7 3926-3931に記載されているように、チミジンキナーゼによって触媒される反応の生成物を測定することにより調べた。
【０２０８】
簡単に説明すると、チミジンを３０ｎｍｏｌ／分の速度でチミジンモノホスフェートに変換することを触媒する量の酵素（３０ｍＵ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（２２℃）；２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；２．５ｍＭ  ＡＴＰ；１０ｍＭジチオスレイトール；０．５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ；３ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン；および１００μＭ  ３Ｈ−標識基質（１．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の混合液１００μＬ中でインキュベートした。
【０２０９】
５μＬの反応混合液の時間試料を、５μＬの５ｍＭチミジン，ＴＭＰ，ＴＤＰおよびＴＴＰと混合した。この混合液５μＬをポリエチレンイミン−セルロースプレート上にプレーティングし、これを０．５Ｍ  ＬｉＣｌ２中で上昇するように展開させた。ヌクレオシドおよびヌクレオチドを有したスポットをＵＶ光の下で同定し、排除した。
【０２１０】
スポット内の放射活性は、０．１Ｍ  ＨＣｌ中の０．２Ｍ  ＫＣｌによって抽出し、液体シンチレーション計数により判定したところ、１ｐｍｏｌ放射活性ヌクレオシド／チドは８５０ｃｐｍであった。
【０２１１】
組換え型チミジンキナーゼを実施例３に記載したように発現させ、精製した。
【０２１２】
本実験の結果を図１および図２に示す。示した時間（それぞれ１５、３０、６０、９０および１２０分）に得られたｃｐｍは、２．５μＬの反応混合液から得られるＴＤＰスポットにおいて判定した。
【０２１３】
予想通り、ＨＳＶ１−ＴＫはいずれの基質もリン酸化するが、ＡＺＴ−モノホスフェート基質のリン酸化の程度は、チミジン基質に比べて１０倍低かった。しかしながら、驚くべきことに、植物ＴＫ１酵素は、ＴＭＰをリン酸化することができないにもかかわらず、ＡＺＰモノホスフェートをリン酸化することができる。この新しい特性は、どのチミジンキナーゼについてもこれまでに報告されていない。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】図１は、それぞれＡＴ−ＴＫ１ａ（■）、ＡＴ−ＴＫ１ｂ（●）およびＨＳＶ１−ＴＫ（▼）のｄＴＭＰキナーゼ活性（ＣＰＭ）の経時変化（０〜１２０分）を示す。
【図２】図２は、それぞれＡＴ−ＴＫ１ａ（□）、ＡＴ−ＴＫ１ｂ（○）およびＨＳＶ１−ＴＫ（▽）のＡＺＴモノホスフェートキナーゼ活性（ＣＰＭ）（０〜１２０分）を示す。
【配列表】
2006504403.tif 000011
2006504403.tif 000012
2006504403.tif 000013
2006504403.tif 000014
2006504403.tif 000015
2006504403.tif 000016
2006504403.tif 000017
2006504403.tif 000018
2006504403.tif 000019
2006504403.tif 000020
2006504403.tif 000021
2006504403.tif 000022
2006504403.tif 000023
2006504403.tif 000024
2006504403.tif 000025
2006504403.tif 000026
2006504403.tif 000027
2006504403.tif 000028
2006504403.tif 000029
2006504403.tif 000030
2006504403.tif 000031
【図１】
2006504403.tif 000032
【図２】
2006504403.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月9日(2004.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容し得る担体又は希釈剤及び単離ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチド及びプロモータを含むベクター、該ベクターを含む感染性ビリオンを産生することができるパッケージング細胞株、又は該ベクターを含む宿主細胞、植物由来の植物チミジンキナーゼ酵素をコードする該単離ポリヌクレオチドを含む薬学的調合物であって、該単離ポリヌクレオチドが、
ｉ）シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana), マツ (Pinus taeda), コメ (Oryza sativa) 又はトマト (Lycopersicum esculentum)に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｉｉ）ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することのできる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｉｖ）[kcat/Km (Thd)] / [kcat/Km（少なくともヌクレオシドアナログ）］の比率が２より小さい、植物由来のチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、
ｖ）発現し、そしてヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)と比べた場合、[kcat/Km(Thd)] / [kcat/Km（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が少なくとも５倍減少し、その際該アナログが任意のヌクレオシドアナログである、植物に由来するチミジンキナーゼ酵素をコードする単離ポリヌクレオチド、及び
ｖｉ）ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、植物由来のチミジンキナーゼ酵素変種をコードする単離された変異及び(又は)切断ポリヌクレオチドより成る群から選ばれる、上記薬学的調合物。
【請求項２】
少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートが、AZTモノホスフェートであること、及び(又は)少なくとも１つのヌクレオシドアナログがAZT である、請求項１記載の薬学的調合物。
【請求項３】
該ポリヌクレオチドが、少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として表されるポリヌクレオチド配列またはその相補鎖とハイブリダイズできる、請求項１記載の薬学的調合物。
【請求項４】
該ポリヌクレオチドが，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの前兆にわたって判定した場合に，ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として表されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７３％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有する、請求項３記載の薬学的調合物。
【請求項５】
該ポリヌクレオチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として表されるポリヌクレオチド配列またはその機能的アナログを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項６】
薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、及び
ｉ）請求項１〜５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドによってコードされる単離チミジンキナーゼ、
ｉｉ）シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana), マツ (Pinus taeda),トマト (Lycopersicum esculentum) 又はコメ (Oryza sativa)に由来する、単離植物チミジンキナーゼ酵素、
ｉｉｉ）真核細胞内のヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)と比べた場合、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、単離植物チミジンキナーゼ酵素、
ｉｖ）少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートを、チミジンモノホスフェートよりも高度にリン酸化することのできる、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、
ｖ）[kcat/Km (Thd)] / [kcat/Km（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が２より小さい、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、
ｖｉ）発現し、そしてヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)と比べた場合、[kcat/Km(Thd)] / [kcat/Km（少なくとも１つのヌクレオシドアナログ）］の比率が少なくとも５倍減少し、該アナログが任意のヌクレオシドアナログである、植物由来の単離チミジンキナーゼ酵素、及び
ｖｉｉ）ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)と比べた場合、そして真核細胞に形質導入するとすぐに、少なくとも１つのヌクレオシドアナログのＩＣ５０を少なくとも４倍減少させる、植物由来の単離された変異及び(又は)切断チミジンキナーゼ酵素変種、
より成る群から選ばれる単離植物チミジンキナーゼ酵素を含む、薬学的調合物。
【請求項７】
少なくとも１つのヌクレオシドアナログモノホスフェートがAZT モノホスフェートであり、及び(又は)少なくとも１つのヌクレオシドアナログがAZT である、請求項６記載の薬学的調合物。
【請求項８】
該チミジンキナーゼが、下記の３つのモチーフ／領域の１種以上を含む、請求項６又は７記載の薬学的調合物：
Val Ile Gly Ile Asp Glu Ala Gln Phe Phe (モチーフ I)
Val Ala Gly Leu Asp Gly (モチーフ II)
Tyr Met Pro Val Cys Arg (モチーフ III)
Val A1 Lys Leu A2 A3 Arg Cys Glu A4 (Lid 領域)
（式中、A1はThr及び Valから選択され、A2はThr及び Lysから選択され、A3はAla 及びSerから選択され、A4はLeu 及び Valから選択される）。
【請求項９】
該チミジンキナーゼが、表１中で同定される保存性残基のすべてを含む、請求項６〜８のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１０】
該チミジンキナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列、またはその全長にわたって判定した場合に、これらの配列のいずれかと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６〜９のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１１】
該チミジンキナーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のアミノ酸配列またはその機能的アナログを含む、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１２】
該チミジンキナーゼが、１〜６０のアミノ酸残基、好ましくは１〜５０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜４０のアミノ酸残基、より好ましくは１〜３０のアミノ酸残基、さらに好ましくは１〜２６のアミノ酸残基、最も好ましくは１〜２４のアミノ酸残基のオーダーでＣ末端欠失を有する、請求項６〜１１のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１３】
該チミジンキナーゼ酵素が、２６アミノ酸残基のＣ末端欠失を有する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列を有する）トマト由来のチミジンキナーゼ酵素である、請求項１２記載の薬学的調合物。
【請求項１４】
該チミジンキナーゼ酵素が、２４アミノ酸残基のＣ末端欠失を有する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸配列を有する）シロイヌナズナ由来のチミジンキナーゼ酵素である、請求項１２記載の薬学的調合物。
【請求項１５】
該チミジンキナーゼが、マツに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１６】
該チミジンキナーゼが、トマトに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１７】
該チミジンキナーゼが、コメに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１８】
該チミジンキナーゼが、シロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１９】
該チミジンキナーゼが、シロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項２０】
該チミジンキナーゼが、シロイヌナズナに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３として表わされるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の同一性を示す、請求項６〜１２のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項２１】
該チミジンキナーゼが、ヒトＩ型単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV1-TK)由来のチミジンキナーゼの作用と比べた場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ１００）を少なくとも３倍減少させる、請求項６〜２０のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項２２】
細胞をプロドラッグに対して感作させる方法であって、当該方法が、
（ｉ）該細胞を、該プロドラッグの（細胞毒）薬物への変換を促進する植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を用いてトランスフェクションまたは形質導入する工程及び
（ｉｉ）該プロドラッグを該細胞に運搬する工程を含み、
その際、該細胞が該プロドラッグに対するよりも該（細胞毒）薬物に対して高い感受性を有することを特徴とする、上記方法。
【請求項２３】
植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、請求項１〜５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチド配列である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
プロドラッグがヌクレオシドアナログである、請求項２２又は２３記載の方法。
【請求項２５】
ヌクレオシドアナログがAZT（３’-アジド-３’-デオキシチミジン）である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
温血動物において病原性物質を阻害する方法であって，該動物に請求項１〜５のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはベクターを投与することを含む、上記方法。
【請求項２７】
該ポリヌクレオチド配列または該ベクターが生体内に投与される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該病原性物質がウィルス、細菌または寄生虫である、請求項２６又は２７記載の方法。
【請求項２９】
該病原性物質が腫瘍細胞である、請求項２６又は２７記載の方法。
【請求項３０】
該病原性物質が自己反応性免疫細胞である、請求項２６又は２７記載の方法。
【請求項３１】
該温血動物にヌクレオシドアナログを投与する工程をさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
該ヌクレオシドアナログがAZT(３’-アジド-３’-デオキシチミジン)である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ヌクレオシドアナログモノホスフェートのリン酸化のために、請求項６〜２１のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素を使用する方法。
【請求項３４】
ヌクレオシドアナログモノホスフェートをリン酸化する方法であって、
ｉ）ヌクレオシドアナログモノホスフェートに、請求項６〜２１のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素を作用させる工程及び、
ｉｉ）ヌクレオシドアナログジホスフェートを回収する工程を含む、
上記方法。
【請求項３５】
請求項６〜２１のいずれか１つに記載の植物チミジンキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を含む植物の成長を制御または改変する方法であって、当該方法が該植物または植物細胞をヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む、上記方法。
【請求項３６】
ヌクレオシドアナログと請求項６〜２１のいずれか１つに記載のチミジンキナーゼ、または該植物由来のチミジンキナーゼをコードする遺伝子、または該植物由来チミジンキナーゼをコードする該遺伝子を含むベクターを、癌治療において、同時、分割または連続投与のための組み合わせとして含む、製品。
【請求項３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に表わされる配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を示す、植物由来の単離植物チミジンキナーゼ酵素。
【請求項３８】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４又は５のいずれかと、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を示す、植物由来の単離植物チミジンキナーゼ酵素。
【請求項３９】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９又は１１と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を示す、植物由来の単離植物チミジンキナーゼ酵素。
【国際調査報告】
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