(57)【要約】伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、質量分析法を用いて検体から採取した体液のサンプル中におけるポリペプチドを観測することにより診断される。ポリペプチドは、ＴＳＥ感染した検体と非感染の検体とにおいては異なって保有され、その分子量は、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲である。ＴＳＥは、体液のサンプル中におけるポリペプチドの試験量を決定することにより、検体について診断することができる。ポリペプチドは、シスタチンＣ、あるいはヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖から構成される。ヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖は、ウシのヘモグロビンの抗体に対して免疫反応を示す。
2006504977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、
質量分析法によって前記検体から採取した体液のサンプルを配置して該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、
前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する
処理を含み、
前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備える
ことを特徴とする診断方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、前記ＴＳＥ感染した検体の体液においては存在するが、前記ＴＳＥ非感染の検体の体液においては存在せず、体液のサンプルに該ポリペプチドが存在することによりＴＳＥであることが示される
ことを特徴とする請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、前記ＴＳＥ感染した検体の体液においては存在しないが、前記ＴＳＥ非感染の検体の体液においては存在し、体液のサンプルに該ポリペプチドが存在しないことによりＴＳＥであることが示される
ことを特徴とする請求項１に記載の診断方法。
【請求項４】
前記質量分析法は、レーザ吸着／イオン化による質量分析法である
ことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項５】
前記サンプルは、固定化金属アフィニティ−キャプチャ（ＩＭＡＣ）、前記ポリペプチドを結合することのできる疎水性の強陰イオンあるいは弱陽イオンの交換面を有する、プローブあるいはプロテインチップアレイ上にて吸着される
ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、表面活性化レーザ脱着イオン化（ＳＥＬＤＩ）あるいは飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）によって判定される
ことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項７】
前記体液は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、血清、血液、涙、尿あるいは唾液から構成される
ことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項８】
複数のペプチドが前記サンプルにおいて判定される
ことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項９】
前記ＴＳＥは、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）である
ことを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項１０】
前記ＴＳＥは、散発型クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）あるいは変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）である
ことを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項１１】
前記ＴＳＥは、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）である
ことを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項１２】
ＢＳＥあるいはＢＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、
質量分析法によって前記検体から採取した体液のサンプルを配置して該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、
前記試験量がＢＳＥ診断に一致するか否かを判定する
処理を含み、
ポリペプチドは、ＢＳＥ感染した検体の体液とＢＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、
１以上のポリペプチドは、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａの分子量から各々選出され、
前記１以上のポリペプチドが異なって示されることにより、ＢＳＥであることを示唆する
ことを特徴とする診断方法。
【請求項１３】
前記ＴＳＥは、スクラピ−である
ことを特徴とする請求項１から８のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項１４】
ＴＳＥ感染した検体および非感染の検体の体液において異なって保有されるポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、
質量分析法により、診断、予見および治療に応用するために判定することができる
ことを特徴とするポリペプチドの使用。
【請求項１５】
診断、予見および治療に応用するための物質の使用であって、
前記物質は、ＴＳＥ感染した検体および非感染の検体の体液において異なって保有されるポリペプチドを認識し、該ポリペプチドを拘束し、あるいは親和力を有し、
前記ポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法により判定することができる
ことを特徴とする物質の使用。
【請求項１６】
前記物質は、抗体あるいは抗体チップから構成される
ことを特徴とする請求項１５に記載の物質の使用。
【請求項１７】
ＴＳＥを診断する際に使用される分析装置であって、
ＴＳＥ感染した検体および非感染の検体の体液において異なって保有されるポリペプチドを認識し、該ポリペプチドを拘束し、あるいは親和力を有する物質を載置するプレート
を備え、
前記ポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法により判定することができる
ことを特徴とする分析装置。
【請求項１８】
ＴＳＥを診断する際に使用される分析装置であって、
シスタチンＣに固有の抗体を含む位置を有するプレート
を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項１９】
変異型ＣＪＤを診断する際に使用される分析装置であって、
シスタチンＣに固有の抗体を含む位置を有し、変異型ＣＪＤの診断に使用することのできるプレート
を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項２０】
分散型ＣＪＤを診断する際に使用される分析装置であって、
シスタチンＣに固有の抗体を含む位置を有し、分散型ＣＪＤの診断に使用することのできるプレート
を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項２１】
ＢＳＥを診断する際に使用される分析装置であって、
ウシのヘモグロビンに特有な抗体に対して免疫反応を示し、ＢＳＥの診断に使用することのできるヘモグロビン、ヘモグロビン鎖、あるいは切り捨てられた鎖または断片鎖に対する固有の抗体を含む位置を有するプレート
を特徴とする分析装置。
【請求項２２】
ＢＳＥを診断する際に使用される分析装置であって、
（１）ＴＳＥ感染した検体および非感染の検体の体液において異なって保有され、１０００から１０００００の範囲の分子量を備えるポリペプチド、
（２）ＴＳＥ感染した検体および非感染の検体の体液において異なって保有され、各分子量として、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａを有するうちから選出されたポリペプチド、
（３）シスタチンＣ、あるいは
（４）ウシのヘモグロビンに特有な抗体に対して免疫反応を示し、ウシのＴＳＥ感染した検体とウシでない非感染の検体の組織においては異なって保有されるヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖または断片鎖
のうちいずれかに特有の抗体と結合した固体基質
を備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項２３】
ＴＳＥの診断に使用するためのキットであって、
体液のサンプルを受け、質量分析法において配置し、該サンプル中のポリペプチドの試験量を判定するためのプローブと
を備え、
前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染した検体と非感染の検体の体液において異なって保有され、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備える
ことを特徴とするキット。
【請求項２４】
前記プローブは、前記ポリペプチドを吸着するための吸着剤を含有する
ことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
未結合あるいは弱結合の物質を前記プローブから除去するための洗浄手段
を更に備えたことを特徴とする請求項２３あるいは２４に記載のキット。
【請求項２６】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、
質量分析法によって前記検体から採取した体液のサンプルを配置して該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、
前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する
処理を含み、
前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、シスタチンＣから構成される
ことを特徴とする診断方法。
【請求項２７】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、
質量分析法によって前記検体から採取した体液のサンプルを配置して該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、
前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する
処理を含み、
前記ポリペプチドは、シスタチンＣである
ことを特徴とする診断方法。
【請求項２８】
前記体液は、ＣＳＦから構成される
ことを特徴とする請求項２６あるいは２７に記載の診断方法。
【請求項２９】
本発明に係る伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのあるウシの検体における感染の可能性の診断方法であって、
質量分析法によって前記検体から採取した体液のサンプルを配置して該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、
前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する
処理を含み、
前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染したウシの検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン、ヘモグロビン鎖、あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖である
ことを特徴とする診断方法。
【請求項３０】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、
質量分析法によって前記検体から採取した体液のサンプルを配置して該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、
前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する
処理を含み、
前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染したウシの検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン、ヘモグロビン鎖、あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖である
ことを特徴とする診断方法。
【請求項３１】
少なくとも一のポリペプチドの所定のレベルでの使用であって、
前記ポリペプチドは１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法によって体組織における測定や検出が可能であり、ＴＳＥ感染した検体および非感染の検体の体液においては異なっており、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であることあるいはＴＳＥ感染の疑いのある検体においてＴＳＥの可能性や進行を認識するためのマーカとされる
ことを特徴とする使用。
【請求項３２】
前記少なくとも一のポリペプチドは、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００、３１８００Ｄａの分子量を備えるポリペプチドの中から選択される
ことを特徴とする請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記体液は、脳脊髄液、リンパ液、血清、血液、涙、尿あるいは唾液から構成される
ことを特徴とする請求項３１または３２に記載の使用。
【請求項３４】
シスタチンＣの所定のレベルでの使用であって、
前記シスタチンＣは、体組織における測定や検出が可能であり、ＴＳＥ感染した検体およびＴＳＥ非感染の検体においては異なっており、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であることあるいはＴＳＥ感染の疑いのある検体においてＴＳＥの可能性や進行を認識するためのマーカとされる
ことを特徴とする使用。
【請求項３５】
前記レベルは、質量分析法によって測定や検出が可能とされる
ことを特徴とする請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記体組織は、ヒトの検体から構成される
ことを特徴とする請求項３４あるいは３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記体組織は、脳脊髄液から構成される
ことを特徴とする請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
ヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖または断片鎖の所定のレベルでの使用であって、
前記ヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖または断片鎖は、ウシのヘモグロビンに特有な抗体に対して免疫反応を示し、
前記レベルは検体の組織のサンプルにおける測定や検出が可能であり、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示す前記ヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖は、ＴＳＥ感染したウシの検体の体組織とＴＳＥ非感染のウシでない検体の体組織とにおいては異なっており、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であることあるいはＴＳＥ感染の疑いのあるウシの検体においてＴＳＥの可能性や進行を認識するためのマーカとされる
ことを特徴とする使用。
【請求項３９】
前記レベルは、質量分析法によって測定や検出が可能とされる
ことを特徴とする請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記ヘモグロビン、ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖は、質量分析法によって決定される、分子量およそ１５０００Ｄａ、７５００Ｄａあるいは３０００Ｄａを備えている
ことを特徴とする請求項３８あるいは３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記体組織のサンプルは、リンパ液から構成される
ことを特徴とする請求項３８あるいは４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記体組織のサンプルは、生体から採取される
ことを特徴とする請求項３８あるいは４０に記載の使用。
【請求項４３】
ウシ属の動物、あるいは該動物群であって、
請求項３８から４２のいずれか１項に記載の検査によって、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）ではないことを確認される
ことを特徴とするウシ属の動物あるいは該動物群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であること、ＴＳＥの可能性やその進行について確認するのに有効な情報を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、中枢神経系に変性を来す疾患である。ＴＳＥは伝染し、遺伝し、あるいは散発的に発症し、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、致死性家族性不眠症あるいはクールーがヒトにおいて見られるだけでなく、例えば蓄牛の牛海綿状脳症（ＢＳＥ）や羊のスクラピーのように、動物においても見られる。これらの疾患は長期の潜伏期間を有し、失調、精神異常、精神医学でいう障害や死へとつながる。神経病理学的な変化には、脳組織における液胞の変性、アストログリオーシスおよびアミロイド班の形成が含まれる。これらの疾患は、徴候を診断するのが困難である。
【０００３】
ＣＪＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）からは、２次元のポリアクリルアミドのゲル電気泳動［ハリントン、Ｍ．Ｇ．医学ニューイングランドジャーナル、３１５、２７９（１９８６）、シーヒ、Ｇ．、ケニー、Ｋ．、ギブズ、Ｃ．Ｊ．、リー、Ｋ．Ｈ．およびハリントン、Ｍ．Ｂ．医学ニューイングランドジャーナル、３３５、９２４（１９９６）］により、２つのポリペプチド（これは、１４−３−３ポリペプチドとして知られている）が追加的に示されている。これら１４−３−３ポリペプチドのＴＳＥにおける作用は未だ不明のままである。１４−３−３ポリペプチドはＣＪＤの診断評価のための生前検査に使用することができるが、その特異性は低い。
【０００４】
国際公開第９８／２３９６２号および第９８／３２７１０号の明細書、およびＭ．Ｊ．、ベックマン・コールター・ペース・セッター・回報３（２）、１−４（１９９９年６月）において記載されているように、異常な形態をしたプリオンの蛋白質（ＣＪＤと関連する）に対する単一細胞の抗体が、酵素に関連した免疫測定に用いられるが、これらの処理は、未だ完全には開発されていない。
【０００５】
国際公開第０１／６７１０８号は、心臓や脳に蛋白質（Ｈ−ＦＡＢＰあるいはＢ−ＦＡＢＰ）を結合させる脂肪酸が集中していることを体液のサンプルから判定する、ＴＳＥの診断分析に関する。
【０００６】
国際公開第０３／０２３４０６号（２００３年３月２０日発行）には、ＴＳＥ診断を目的とする方法について記載されている。この方法には、ＴＳＥを保有する検体とＴＳＥを保有しない検体とではサンプル中で異なって存在する、ポリペプチドマーカの試験量を決定する処理が含まれている。マーカは質量分析法を用いて体液から決定されることとしてもよい。レーザ脱離による質量分析法が好ましい。
【０００７】
米国特許第６２２５０４７号には、異なる遺伝子地図を作成するための、濃縮液のクロマトグラフィの使用について、特に２つのサンプル間で違いの見られる検体を識別する方法について、記載されている。文献中においては、方法の１つとして特にレーザ脱離による質量分析法が明記されている。
【０００８】
国際公開第０１／２５７９１号には、ポリペプチドマーカの試験量を決定する処理を含む、前立腺癌の診断を助成するための方法について記載されている。ポリペプチドマーカは、前立腺癌患者のサンプルと前立腺癌でない検体のそれとでは異なって表れる。マーカは、質量分析法を用いて決定されてもよく、レーザ脱離による質量分析法が好ましい。
【０００９】
体液あるいは他の体組織のための非侵襲性のＴＳＥマーカ（特に、血液中のＣＪＤやＢＳＥマーカ）の開発やマーカを決定する新規な方法は、臨床医学者が早期診断を確立するのに役立つであろう。本発明は、この問題を解決するものである。
【発明の開示】
【００１０】
本発明によれば、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、前記検体から採取した体液のサンプルを質量分析法にかけて該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する処理を含み、前記ポリペプチドは、ＴＳＥに感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備えた構成とされる。
【００１１】
本発明は、ＴＳＥに感染した検体とＴＳＥ非感染の検体とではその体液において異なって保有され、診断、予見および治療に応用するためのポリペプチドの使用であってもよく、該ポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法によって決定される。
【００１２】
本発明の実施形態においては、分子量は、例えば、以下に述べるように、１０００から３５００未満、あるいは３００００超から１０００００、あるいは３５００から３００００の範囲において選択された所定の値であってもよい。
【００１３】
更に、本発明は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥ感染の疑いのある検体における感染の可能性の診断方法における、およそ１３３５０の分子量を備えたマーカの使用に関する。前記マーカは、シスタチンＣ（スイスプロット・アクセッション番号：Ｐ０１０３４、１２０ＡＡの活性蛋白質、等電点８．７５）であるとされており、神経内分泌基本ポリペプチド、ガンマトレースあるいはポスト・ガンマグロブリンとも呼ばれる。このシステインプロテイナーゼから成る分泌活性抑制剤は、同様の配列および構造上の特徴に基づき、３つの基を含む、蛋白質のスーパーファミリーに属している。この蛋白質は、精巣上体、輸精管、脳、胸腺および卵巣において非常に多く見られ、顎下腺においては低量しか見られない。シスタチンＣは、ＣＪＤ感染者のＣＳＦにおいては異なって示されることが、イムノブロットにより確認されている。シスタチンＣは、以下の配列（配列ＩＤＮｏ．１）を有する先駆物質に由来している。
【００１４】
ｍａｇｐｌｒａｐｌｌ  ｌｌａｉｌａｖａｌａ  ｖｓｐａａｇｓｓｐｇ  ｋｐｐｒｌｖｇｇｐｍ  ｄａｓｖｅｅｅｇｖｒ  ｒａｌｄｆａｖｇｅｙ  ６０
ｎｋａｓｎｄｍｙｈｓ  ｒａｌｑｖｖｒａｒｋ  ｑｉｖａｇｖｎｙｆｌ  ｄｖｅｌｇｒｔｔｃｔ  ｋｔｑｐｎｌｄｎｃｐ  ｆｈｄｑｐｈｌｋｒｋ  １２０
ａｆｃｓｆｑｉｙａｖ  ｐｗｑｇｔｍｔｌｓｋ  ｓｔｃｑｄａ  １４６
また、下に示される配列（配列ＩＤＮｏ．２）をも備える。
【００１５】
ｓｓｐｇｋｐｐｒｌｖ  ｇｇｐｍｄａｓｖｅｅ  ｅｇｖｒｒａｌｄｆａ  ｖｇｅｙｎｋａｓｎｄ  ｍｙｈｓｒａｌｑｖｖ  ｒａｒｋｑｉｖａｇｖ  ６０
ｎｙｆｌｄｖｅｌｇｒ  ｔｔｃｔｋｔｑｐｎｌ  ｄｎｃｐｆｈｄｑｐｈ  ｌｋｒｋａｆｃｓｆｑ  ｉｙａｖｐｗｑｇｔｍ  ｔｌｓｋｓｔｃｑｄａ  １２０
シスタチンＣの突然変異による型（６８番をＬｅｕからＧｌｕに置換したもの）は、アミロイドの特質を備えた物質が堆積することで能動脈壁が肥厚化するという特性を備えた、脳出血の遺伝型と関係があるとこれまで説明されてきた。後にアルツハイマー病が発病する危険性が増大することと関連のある遺伝子型（ＢＢ：ＡｌａをＴｈｒに置換したもの）も存在する。
【００１６】
そこで、本発明によれば、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、前記検体から採取した体液のサンプルを質量分析法にかけて該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する処理を含み、前記ポリペプチドは、ＴＳＥに感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、シスタチンＣであることを特徴とする診断方法が提供される。体液は、脳脊髄液であるのが好ましいが、例えば、全血、リンパ液、漿液、尿あるいはプリオンの蛋白質が蓄積されやすい、扁桃やリンパ節のような他のリンパ網内系の組織であってもよい。
【００１７】
更に、本発明は、質量分析法によって体組織のサンプルにおける測定あるいは検出が可能であり、ＴＳＥ感染した検体と非感染の検体とではその体組織において含まれ方が異なり、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いの強い検体における感染の可能性や進行を示すマーカとしての、シスタチンＣの所定のレベルでの使用についても提供する。
【００１８】
更には、実験により、ＢＳＥ陽性の蓄牛とＢＳＥ陰性の蓄牛とで区別を可能とする主な蛋白質としての、様々なヘモグロビンのイソホームが、レーザ脱離／イオン化による質量分析法を用いて識別、確認された。表面活性化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法においては、およそ３００００、１５０００Ｄａ、７５００Ｄａにおけるピークあるいはクラスタがヘモグロビンを示しており、複合荷電された実際そのままのヘモグロビン分子に対応している。あるいは、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示す、ヘモグロビン鎖やその断片が切り捨てられた変形や断片もあり得る。この結果、ＳＥＬＤＩスペクトルにおけるヘモグロビンのピークあるいはクラスタの有無から、例えばリンパ液や他の体液を用いた検査を行い、蓄牛のＢＳＥを生前に診断する手段とすることができる。
【００１９】
更には、本発明に係る伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのあるウシの検体における感染の可能性を診断する方法は、前記検体から採取した体液のサンプルを質量分析法にかけて該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する処理を含み、前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染したウシの検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖である構成とする。
【００２０】
なお、ここで、「ウシ（bovine）」という表現には、一般的なウシ類、（スクラピーの）羊、および（慢性消耗性疾患の）鹿やエルクも含まれる。
本発明によれば、更に、ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有な抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖または断片鎖の所定のレベルでの使用であって、前記レベルは質量分析法によって検体の組織のサンプルにおける測定や検出が可能であり、前記ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示す前記ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖は、ＴＳＥ感染したウシの検体の体組織とＴＳＥ非感染のウシでない検体の体組織とにおいては異なっており、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であることあるいはＴＳＥ感染の疑いのあるウシの検体においてＴＳＥの可能性や進行を認識ためのマーカとされるような使用が提供される。
【００２１】
上記検査は、１回あるいは間隔をおいて、一体の動物あるいは動物群に対して適用される際に有用であり、実際の伝達性海綿状脳症あるいは最新の伝達性海綿状脳症に感染しているとはそれまで認められなかった動物にとっては、明らかにより有用である。係る動物やその動物に検査を実施する方法もまた、本発明に含まれる。
【００２２】
本発明によれば、更に、ＴＳＥの診断において使用されるための分析装置あるいはキットが提供され、
（１）ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、１０００から１０００００までの範囲の分子量を備えたポリペプチド、
（２）ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａの分子量を備えたポリペプチドのうちから選択されたポリペプチド、
（３）シスタチンＣあるいは
（４）ＴＳＥ感染したウシの検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有される、ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖
のいずれかに特有な抗体と結合した固体基質を含むことを特徴とする。上記の装置あるいはキットは、必要な準備試薬、洗浄試薬、検出試薬およびシグナル生成試薬を含んで構成されることとしてもよい。
【００２３】
また、本発明によれば、ＴＳＥの診断において用いられる分析装置であって、ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、１０００から１０００００までの範囲の分子量を備え、質量分析法によって決定されるポリペプチドを認識し、該ポリペプチドと結合し、あるいは該ポリペプチドに対し親和力を有する物質を含んだ領域を備えたプレート、シスタチンＣに特有な抗体を含んだ領域を備えたプレート、シスタチンＣに特有であり、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の診断において有効な抗体を含んだ領域を備えたプレート、シスタチンＣに特有であり、散発型ＣＪＤの診断において有効な抗体を含んだ領域を備えたプレートのいずれかを備えたことを特徴とする分析装置が提供される。上記装置は、必要な準備試薬、洗浄試薬、検出試薬およびシグナル生成試薬と関連付けられて構成されることとしてもよい。
【００２４】
また、本発明によれば、ＴＳＥの診断に用いられるキットであって、体液のサンプルを受け取り質量分析計にかけて、該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定するためのプローブあるいはプロテインチップアレイを備え、該ポリペプチドは、ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、１０００から１０００００までの範囲の分子量であることを特徴とするキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性を診断する方法を提供する。検体から採取された体液のサンプルは、質量分析法にかけられ、サンプル中にポリペプチドマーカが存在するか否かが判定される。ポリペプチドマーカは、ＴＳＥに感染した検体と非感染の検体とでは体液中に異なって保有されるものである。ポリペプチドマーカは、分子量は１０００から１０００００、好ましくは１０００から３５０００の範囲内であり、マーカの存在、非存在、過少出現あるいは過剰出現によってＴＳＥが示唆される。
【００２６】
この方法は、あらゆるタイプのＴＳＥに対し、ＴＳＥ感染あるいは感染の疑いのあるあらゆるヒトや動物に対し、応用が可能である。この方法は特にＣＪＤの診断に適用でき、特にヒトにおける新規の変異型ＣＪＤ、蓄牛のような反芻動物におけるＢＳＥ、羊におけるスクラピーのように、他の動物におけるＢＳＥと同様の疾患に適用することができる。
【００２７】
ポリペプチドという用語には、例えば炭水化物、ホスファート、サルフェートあるいは他の翻訳後修飾のような非ペプチド残留物の付加によって変更されたペプチドだけでなく、蛋白質および蛋白質断片も含まれる。
【００２８】
サンプルは、プローブ上あるいはプロテインチップアレイ上でポリペプチドと吸着物質との間で結合できる条件の下では、プローブに吸着されてもよい。吸着物質は、金属イオンと化合した金属キレート化合物から構成されるのが好ましく、その金属としては、銅が好ましい。ポリペプチドを検出するよりも前に、プローブあるいはプロテインチップアレイ上の未結合物質あるいは弱結合の物質は洗浄液で除去されるので、サンプル中のポリペプチドは濃縮される。サンプルは、プローブ上、あるいは、ポリペプチドと結合することのできる固定化金属アフィニティ−キャプチャ（immobilised metal affinity capture、ＩＭＡＣ）の界面を有するプロテインチップアレイ上で吸着されるのが好ましい。また、サンプルは、ポリペプチドと結合できる条件下では疎水性かつ強い陰イオンあるいは弱い陽イオンの交換面を備えた、プローブ上で吸着されてもよい。プローブは、数個の吸着壁を有し、分析器に挿入されて、その分析器の読み取りのために各吸着壁は順にイオン化手段（例えばレーザ）に当たる、小板から構成されることとしてもよい。ポリペプチドは、表面活性化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）あるいは飛行時間型質量分析（ＴｏＦ−ＭＳ）によって判定されるのが好ましい。
【００２９】
原理的にはいかなる体液や組織であっても、診断用のサンプルとして用いることができるが、体液としては、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、血清、血液、尿、唾液あるいは涙が好ましい。
【００３０】
本発明の一実施形態としては、ＴＳＥは牛海綿状脳症（ＢＳＥ）である。この場合、ポリペプチドは、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａの分子量を備えることが好ましい。ポリペプチドの存在、非存在、過剰出現あるいは過少出現によってＢＳＥが示唆される。本発明によって、診断を行うために、どんな前述の分子量の値以外の値やそれらの組み合わせであっても、測定に取り組むようになるのが好ましいであろう。
【００３１】
本発明の他の実施形態においては、ＴＳＥはＣＪＤである。
本発明の更なる実施形態においては、ＴＳＥはスクラピーである。
ポリペプチドの分子量の測定あるいはポリペプチド群の分子量の測定は、質量分析法の結果得られる。全ての分子量は、Ｄａで測定される。上記で引用した分子量は、１％の精度、一般的には０．５から１％の精度で測定することができる。０．１％の精度で測定できるのが好ましい。本明細書において、分子量に関して「およそ（about）」とは、上記あるいは以下において値を引用する際に、およそ１％の精度の範囲内、好ましくは０．５％の精度の範囲内、更に好ましくは０．１％の精度の範囲内、の意味である。
【００３２】
本発明はまた、ＴＳＥ感染した検体と非感染の検体とではその体液において異なって保有され、診断、予後および治療への応用のためのポリペプチドの使用であってもよく、そのポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法によって決定される。これには、調製品、および／あるいは、上記のポリペプチドを認識、ポリペプチドと結合あるいは何らかの親和力を有する物質を使用するという概念も含まれる。かかる物質の例としては、抗体や、抗体チップが挙げられる。ここで用いられる「抗体」という語には、多クローン性抗血清、単クローン抗体、Ｆａｂのような抗体の断片、および一般的な誘導抗体が含まれる。抗体はキメラ抗体であってもよいし、あるいは単一の種についての抗体であってもよい。上で「予後」への応用について言及しているが、この概念には、ＴＳＥ経路と同様の判定を行うことや、例えば、上記の体液のサンプル中におけるポリペプチドの量を測定することも含まれる。上で「治療」への応用について言及しているが、この概念には、例えば、上記のポリペプチドを認識する物質、ポリペプチドと結合あるいは親和力を有する物質を準備することや、かかる物質を治療に用いることも含まれる。その物質は、この場合、例えば抗体を薬物と結合させることによって、変更されている。したがって、この物質は、その薬物を動物の治療すべき特定の箇所をターゲットとすることができる。
【００３３】
本発明の方法論は、あらゆるＴＳＥ診断に応用させることができる。体液のサンプルは、感染した検体および非感染の検体から用意される。サンプルは、プローブあるいは各種のサンプルにおけるペプチドの保持力がそれぞれ異なる吸着媒体にその表面を処理され、非結合あるいは結合力の弱い物質を除去するのに洗浄液を任意に用いるようなアレイに応用される。エネルギーを吸着する物質を適宜使用することもできる。しかる後、プローブまたはアレイは、質量分析器に挿入され、様々な機器の設定を用いて各種サンプル／吸着剤の組み合わせから読みが行われる。１組の与えられた条件下での感染したサンプルと非感染のサンプルとの比較によって、１以上のポリペプチドが示される。示されるポリペプチドは、感染したサンプルと非感染のサンプルとでは異なって表されるものである。同一の条件（吸着剤、分析器の設定等）の下で、検体から採取した液体サンプルの検査でこれらポリペプチドが存在するあるいは存在しないことから、検体が感染しているか否かを判定するのに用いることができる。
【００３４】
ここで、ポリペプチドの「存在するあるいは存在しないこと」という表現は、単に感染したサンプルと非感染のサンプルとでは検出される量に違いが見られる、という意に解されるべきである。このように、検査サンプルにおいてポリペプチドが「存在しないこと」には、そのポリペプチドが実際に存在するが、比較用の検査サンプルにおける量よりはごく低量である、という可能性も含んでいる。本発明によれば、診断は、ポリペプチドが存在するか存在しないかに基づいてなすことができ、これには、参照用の検査サンプルと比較してより低量、あるいはより多量のポリペプチドが存在することに基づいて診断することについても含まれる。
【００３５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
＜実施形態１＞
ＢＳＥ感染した蓄牛から採取した体液（脳脊髄液、リンパ液その他）中のポリペプチド
本研究の目的は、ＢＳＥ感染した蓄牛から採取した体液（脳精髄液、リンパ液その他）において、特定のポリペプチドを検出することにあった。サンプルは、表面活性化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法（ＭＳ）技術で分析された。この技術によれば、異なるタイプのリテンテート（retentate）クロマトグラフィを用いてミクロ単位での蛋白質のアフィニティ−キャプチャが実行され、飛行時間型質量分析がなされる。こうして、サイファージェン・バイオシステムズ社（米国カリフォルニア州フリーモント）のＰＢＳII型質量分析器で分析された、与えられたサンプルに特有な蛋白質の分布図に各々応じた、異なる地図が生成される。ピークに現れる違いは、プロテインチップアレイを使ってＢＳＥに感染した蓄牛から採取したリンパ液のサンプル集団と、健康な蓄牛から採取したものとでスペクトルを比較することで識別される。
【００３６】
ＳＥＬＤＩ分析は、金属親和力で特定のポリペプチドを検出するために、未加工のウシのリンパ液サンプル２μｌを用いてなされた。このアプローチにおいては、銅の親和力で蛋白質を捕獲して特定の蛋白質の部分集合をサンプル中から選別するために、固定された銅の親和力アレイ（ＩＭＡＣ−Ｃｕ＋＋）が採用された。プロテインチップアレイおよび固定された金属チップアレイは、ＩＭＡＣ−Ｃｕ＋＋親和力アレイで構成されることとしてもよい。捕獲された蛋白質は、ＰＢＳIIプロテインチップアレイリーダ（サイファージェン・バイオシステムズ社製、米国カリフォルニア州フリーモント）を用いて直接検出された。
【００３７】
以下に示すプロトコルは、クロマトグラフィックＴＥＤ−Ｃｕ（II）プロテインチップアレイを処理し、分析するのに用いられた。ＴＥＤ（tris(Carboxymethyl)ethylenediamine-Cu）とは、ステンレススチール基質の酸化膜で覆ったシリコンで、その表面をコーティングした吸着剤のことである。
【００３８】
・最初に表面に１００ミリモル（ｍＭ）の硫酸銅１０μｌを行き渡らせて装荷し、１５分間湿室で定温放置する。
・その後。チップをイオン除去した水で約１０秒間、２回すばやくすすぎ洗いし、余分な結合していない銅を除去する。
【００３９】
・サンプルに装荷する前に、Ｉ−ＭＡＣ３アレイを、５分間に渡り、０．５モルのＰＢＳ塩化ナトリウム５μｌとで平衡状態にさせる。
・平衡緩衝液を除去した後、３μlの同一の緩衝液を、２μｌのリンパ液を加える前に追加する。チップを２０分間湿室で定温放置する。
【００４０】
・しかる後、サンプルを除去し、表面を３回平衡緩衝液で洗浄する（各回５分ずつ）。
・水での最後のすすぎを２回行う。
【００４１】
・表面は、空気乾燥にしてもよく、続いて、トリフルオロ酢酸である、５０％濃度アセトニトリルで調合された０．５μｌの飽和シナピン酸（ＳＰＡ、サイファージェン・バイオシステム社）に追加する。
【００４２】
・レーザ脱着イオン化飛行時間型質量分析で得られた蛋白質を全面的に分析する前に、チップを再度空気乾燥する。
・プロテインチップアレイを装置に挿入し、正確な検出器の精度、およびレーザがデータ収集を自動的に行えるだけのエネルギーを備えていることを一旦解析する。
【００４３】
・得られたスペクトルを、バイオマークウィザードのソフトウェア（サイファージェン・バイオシステムズ社、米国カリフォルニア州フリーモント）をデルのディメンジョン４１００（Dell Dimension 4100）のパーソナルコンピュータで動かして分析する。多重スペクトルを通じて複数のピークが描かれる。
【００４４】
図１Ａから図１Ｆは、比較研究した結果であり、ＢＳＥと診断された蓄牛および正常な蓄牛から採取したリンパ液から、上記の通りに準備したＩＭＡＣ３プロテインチップアレイを用いて得られたものである。この研究では、２３個のピークが、ＢＳＥ感染した蓄牛から採取したリンパ液において特に異なって表されている。それらの分子量は、それぞれおよそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ（質量精度は、略０．１％である）である。図１には２つのスペクトル図が示されている。それぞれ、正常なサンプル、ＢＳＥのサンプルについての０から１０００００Ｄａの範囲のスペクトル図である。より具体的には、縦方向の矢で示されているように、図１Ａは、およそ１０１０、１１００、１１２５および１３６５についてのピークを示している。図１Ｂは、およそ３６４５および４０３０のピークを示している。図１Ｃは、およそ３８９０、５８２０、７５２０、７６３０および７９８０のピークを示している。図１Ｄは、およそ９９５０、１０２５０、１１６００および１１８００のピークを示している。図１Ｅは、およそ１５０００、１５２００、１５４００、１５６００および１５９００のピークを示している。図１Ｆは、およそ３００００、３１０００および３１８００のピークを示している。
【００４５】
スペクトルＰ１からＰ２０（図１Ａ、図１Ｂ）は英国からのサンプルのバッチに相当し、スペクトル１から２０（図１Ｃから図１Ｆ）は米国からのサンプルのバッチに相当する。サンプルを提供した蓄牛の状態は、下の表１および表２に示される。表１および表２においては、「陰性（Negative）」はＢＳＥに非感染であることを意味し、「陽性（Positive）」はＢＳＥに感染した蓄牛であることを意味する。
【００４６】
【表１】
2006504977.tif 000003
【００４７】
【表２】
2006504977.tif 000004
【００４８】
これらのデータから、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａにおけるピークがリンパ液サンプルとしてＢＳＥの診断に用いることができる、と示される。上記のピークのうちいずれか１つ、あるいはそれらのうちで１以上のピークについての組み合わせをこのように用いることにより、ＢＳＥを診断することもできる。
＜実施形態２＞
ＣＪＤ感染の患者のＣＳＦ中におけるシスタチンＣの確認および増加
ＣＪＤ監視ユニットから入手したＣＳＦサンプル（１００μｌ）（非感染者のみならず散発型あるいは明らかに変異型のＣＪＤに関するもの）が、ＳＥＬＤＩプロテインチップアレイ技術を用いて調査された。ＷＣＸ２（炭水化物官能基との弱陽イオン交換アレイ）、ＳＡＸ２（第４アミン官能基との強陰イオン交換アレイ）およびＩＭＡＣ３（ニトロトリアセテート酸との固定された金属のアフィニティキャプチャアレイ）の表面は、得られたサンプル中の、蛋白質固有の結合の違いを調査するために用いられる。ＣＪＤ症状のある患者のサンプルとＣＪＤではないが同様の症状のある患者のサンプル（非感染、すなわちコントロールによる）とを識別するために、まずコントロール（非感染者）に対して、変異型および散発型患者（ＣＪＤサンプル）のケースについて様々な比較がなされた。研究所および発明者の１４．３．３のサンプルから採取したコントロールと比較された、ＣＪＤと診断された患者についてサンプルのグループ全体については、診断された部分母集団中で区別することなく分析された。これらサンプルの比較は、散発型および／あるいは変異型ＣＪＤのサンプルを、対応するコントロール（非感染）と区別せずに行った。
【００４９】
これにより、本発明においては、分子量がおよそ１３３６５から１３３７０（±０．５％）の知的障害マーカの存在について確認された。このマーカは、金属親和力に加えて陽イオンの特性を示している。
【００５０】
１３３６５から１３３７０のマーカは、陽イオン交換クロマトグラフィを用いて非感染のＣＳＦサンプルを分別することで精製された。そのような分別を目的として設計されているスピンサックス（Spin Sax）カラムは、正味の電荷にしたがって蛋白質を分離するものであり、塩を集中させかつ等電点を低くする緩衝液を用いて、等電点を減少させることにより蛋白質を順次抽出するのに用いられる。ＩＭＡＣ３およびＳＡＸチップを用いて得られた蛋白質の分布図もまた、同様であった。各分別に際し、１３３５０ｍｗのピークを識別するために、蛋白質電気泳動（SDS PAGE）で負荷をかけた。予め青変したコロイド状トリス・トリシンの１次元ゲルが流されて硝酸銀で染色されることで、質量分析法で識別した後に結合の切り出しおよび蒸解ができるようになる。ゲルから摘出した水平方向の結合は、マトリックス支援イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）、タンデム飛行時間型（MALDI-TOF-TOF）（アプライドバイオシステムズ社：衝突を誘導する解離フラグメントの分析によって部分配列の決定することができる）あるいはナノＬＣ・Ｑ−ｔｏｆを用いてのアプローチによって確認される。１３３５０のピークは、シスタチンＣと確認された。
【００５１】
マトリックス支援イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF MS）は、紫外光吸収基質や生体分子が共沈することを利用してナノ秒レーザパルスを照射する技術においては比較的新規である。レーザのエネルギーの凡そは基質で吸収され、その基室により望まぬ生体分子の断片が発生することが防止される。イオン化生体分子は、電場中で加速されて飛行管に突入する。この管内を飛行中の間に、分子は各自の質量電荷比にしたがって分離され、異なるタイミングで検出器に到達する。この方法によれば、各分子は他の分子とは異なるサインを出している。本方法は、蛋白質、ペプチド、オリゴ糖類およびオリゴヌクレオチドのような、分子量４００から３５００００Ｄａの生体分子の検出および生体分子の特性の決定に用いられている。
【００５２】
ＣＳＦがＣＪＤ感染している患者中にシスタチンＣが確認されたことおよびシスタチンＣが増加していることを確かめるため、発明者は、８つのＣＪＤ感染した患者（うち３人は変異型ＣＪＤ、５人は分散型ＣＪＤ）のＣＳＦに対して、８つの精神異常のＣＳＦサンプル上におけるヒトのシスタチンＣに固有な抗体を使用して、ウェスタンブロットによる実験を行った。
【００５３】
図２により、コントロールと比較して検査した８人のＣＪＤ感染患者について、シスタチンがＣＪＤの脳脊髄液のマーカとなり得ることを意味する特定のシグナルが増加していることを、発明者が確認したことが示されている。
＜実施形態３＞
ＢＳＥに感染した蓄牛のリンパ液についてのＳＥＬＤＩ分析
発明者は、先述のＢＳＥプラスとＢＳＥマイナスのリンパ液のサンプルをＳＥＬＤＩ分析によって比較調査を行うことで、数個のハイライト部分の蛋白質の集合は各々異なって表されることを確認した。更に分析を行い、このようなクラスタの一つとして、およそ１５０００Ｄａ付近の質量を備え、ＢＳＥ感染した蓄牛から採取したサンプルに関しては過剰な違いがみられるクラスタを選び出した。ＢＳＥに感染した蓄牛のリンパ液を１次元電気泳動にかけ、標準質量のマーカ蛋白質を用いて決定された、質量１５０００Ｄａの移動する帯域を抽出し、それをトリプシンで蒸解してＭＡＬ：ＤＩ−ＴＯＦの質量分析装置にかけた。この方法によれば、１５０００Ｄａの蛋白質は、ＳＥＬＤＩで分析すると、ウシのヘモグロビン中のイソホームであると推定的な確認がなされた。
【００５４】
これらサンプル中のヘモグロビンの内容を調査し確認するために、発明者は、ウシのヘモグロビンと交叉反応を示すような抗体を探した。他の種から採取されたヘモグロビン（４８７０−３９８０、バイオトレンド−アナワ社）とで交叉反応を示すと予測される、赤血球から採取された天然のヘモグロビンに対して培養されたヒツジの多クローン性抗体だけでなく、ウマやウシのヘモグロビン（Ｊ１６、バイオメダ社）と弱い反応を示す、ヤギの多クローン性抗体の抗人ヘモグロビンについて検査した。ポジティブコントロールとしての、天然の精製されたヒトおよびウシのヘモグロビン（４８７０−４０５６および４８７０−２００２、バイオトレンド−アナワ社）を用いて実験を行った。
【００５５】
図３は、バイオメダ社から入手したヤギの多クローン性抗体について行われた、ウェスタンブロット実験を強調表示した図である。ヒトおよびウシのヘモグロビンで目立ったシグナルがあるのに加え、３個のＢＳＥプラスの検査リンパ液サンプル中の予測された範囲においては、蛋白質レベルが増加していることがまさに認められ得る。第２の抗体について実行されたウェスタンブロット実験では、シグナルは全く認められなかった（データは不図示である）。複数の点が検出されるか否かを見るために、シルバーステインの分析用２次元ゲル、およびＢＳＥマイナスのリンパ液サンプルの２次元ポリフッ化ビニルデン（PVDF）メンバについての免疫検出実験がされた（図４）。図４では広範囲に渡り、予測された領域に４つの点が示されている。２点については、α鎖（１５０５３Ｄａ、等電点（ｐＩ）８．１９）に対応し、残りの２点はβ鎖（１５９５４Ｄａ、等電点７．０２）に対応しているように見受けられる。α鎖は、Ｎ−グリコシレーション、プロテインキナーゼＣリン酸化、カゼインキナーゼIIリン酸化およびＮ−ミリストイル化の４つの変異サイトを備えることが判明しており、β鎖もまた同様にＮ−グリコシレーションサイト（スキャン・プロサイト）の代わりにアミド化サイトを備えていることがわかっていることから、これらのことから、ＳＥＬＤＩスペクトル中ピーク前後の多くの強調部分についてだけでなく、主な分子量においてそのバリエーションが説明される。
【００５６】
更にウシのヘモグロビンのイソホームとしての１５０００Ｄａにおけるクラスタを確認するために、ウシおよびヒトの精製されたヘモグロビンをＳＥＬＤＩのノーマルフェーズで分析した。図５は、両種における類似点について説明するための、両種について得られた全スペクトル図である。図６Ａおよび図６Ｂは、４つの代表的なスペクトルでは、ＩＭＡＣ法においてＢＳＥプラスのリンパ液で見られるヘモグロビンの概観はどのようであるかを示している。これに対し、図６Ｃは、７ｋＤａ未満での違いを強調表示している。これらのスペクトルから、発明者は、ヘモグロビンに対応するウシのリンパ液についてのＳＥＬＤＩでの調査から、１３中５のクラスタが強調されていると結論付けた。
【００５７】
上記で引用した各刊行物は、本文において信頼すべきものとして、ここではある程度参照として組み込まれている。
配列リスト
2006504977.tif 000005
【００５８】
2006504977.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】１Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｂ】１Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｃ】１Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｄ】１Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｅ】１Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｆ】１Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図２】ＣＳＦのサンプルにおけるヒトのシスタチンＣの免疫検出を示す図である。
【図３】リンパ液のサンプルにおけるウシのヘモグロビン検出を示す図である。
【図４】２次元ゲル上および２次元ＰＶＤＦ膜上のＢＳＥリンパ液のサンプルを示す図である。
【図５】レーザ脱離／イオン化質量分析法による、ヒトおよびウシのヘモグロビンのスペクトルを示す図である。
【図６Ａ】６Ａから６Ｃは、レーザ脱離／イオン化質量分析法による、正常なウシおよびＢＳＥ感染したウシのサンプルから採取したリンパ液のスペクトルを示す図である。
【図６Ｂ】６Ａから６Ｃは、レーザ脱離／イオン化質量分析法による、正常なウシおよびＢＳＥ感染したウシのサンプルから採取したリンパ液のスペクトルを示す図である。
【図６Ｃ】６Ａから６Ｃは、レーザ脱離／イオン化質量分析法による、正常なウシおよびＢＳＥ感染したウシのサンプルから採取したリンパ液のスペクトルを示す図である。
【配列表】
2006504977.tif 000007
2006504977.tif 000008
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【図２】
2006504977.tif 000021
【図３】
2006504977.tif 000022
【図４】
2006504977.tif 000023
【図５】
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【図６Ａ】
2006504977.tif 000025
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2006504977.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月21日(2005.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であること、ＴＳＥの可能性やその進行について確認するのに有効な情報を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）は、中枢神経系に変性を来す疾患である。ＴＳＥは伝染し、遺伝し、あるいは散発的に発症し、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、致死性家族性不眠症あるいはクールーがヒトにおいて見られるだけでなく、例えば蓄牛の牛海綿状脳症（ＢＳＥ）や羊のスクラピーのように、動物においても見られる。これらの疾患は長期の潜伏期間を有し、失調、精神異常、精神医学でいう障害や死へとつながる。神経病理学的な変化には、脳組織における液胞の変性、アストログリオーシスおよびアミロイド班の形成が含まれる。これらの疾患は、徴候を診断するのが困難である。
【０００３】
ＣＪＤ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）からは、２次元のポリアクリルアミドのゲル電気泳動［ハリントン、Ｍ．Ｇ．医学ニューイングランドジャーナル、３１５、２７９（１９８６）、シーヒ、Ｇ．、ケニー、Ｋ．、ギブズ、Ｃ．Ｊ．、リー、Ｋ．Ｈ．およびハリントン、Ｍ．Ｂ．医学ニューイングランドジャーナル、３３５、９２４（１９９６）］により、２つのポリペプチド（これは、１４−３−３ポリペプチドとして知られている）が追加的に示されている。これら１４−３−３ポリペプチドのＴＳＥにおける作用は未だ不明のままである。１４−３−３ポリペプチドはＣＪＤの診断評価のための生前検査に使用することができるが、その特異性は低い。
【０００４】
国際公開第９８／２３９６２号および第９８／３２７１０号の明細書、およびＭ．Ｊ．、ベックマン・コールター・ペース・セッター・回報３（２）、１−４（１９９９年６月）において記載されているように、異常な形態をしたプリオンの蛋白質（ＣＪＤと関連する）に対する単一細胞の抗体が、酵素に関連した免疫測定に用いられるが、これらの処理は、未だ完全には開発されていない。
【０００５】
国際公開第０１／６７１０８号は、心臓や脳に蛋白質（Ｈ−ＦＡＢＰあるいはＢ−ＦＡＢＰ）を結合させる脂肪酸が集中していることを体液のサンプルから判定する、ＴＳＥの診断分析に関する。
【０００６】
国際公開第０３／０２３４０６号（２００３年３月２０日発行）には、ＴＳＥ診断を目的とする方法について記載されている。この方法には、ＴＳＥを保有する検体とＴＳＥを保有しない検体とではサンプル中で異なって存在する、ポリペプチドマーカの試験量を決定する処理が含まれている。マーカは質量分析法を用いて体液から決定されることとしてもよい。レーザ脱離による質量分析法が好ましい。
【０００７】
米国特許第６２２５０４７号には、異なる遺伝子地図を作成するための、濃縮液のクロマトグラフィの使用について、特に２つのサンプル間で違いの見られる検体を識別する方法について、記載されている。文献中においては、方法の１つとして特にレーザ脱離による質量分析法が明記されている。
【０００８】
国際公開第０１／２５７９１号には、ポリペプチドマーカの試験量を決定する処理を含む、前立腺癌の診断を助成するための方法について記載されている。ポリペプチドマーカは、前立腺癌患者のサンプルと前立腺癌でない検体のそれとでは異なって表れる。マーカ
は、質量分析法を用いて決定されてもよく、レーザ脱離による質量分析法が好ましい。
【０００９】
体液あるいは他の体組織のための非侵襲性のＴＳＥマーカ（特に、血液中のＣＪＤやＢＳＥマーカ）の開発やマーカを決定する新規な方法は、臨床医学者が早期診断を確立するのに役立つであろう。本発明は、この問題を解決するものである。
【発明の開示】
【００１０】
本発明によれば、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、前記検体から採取した体液のサンプルを質量分析法にかけて該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する処理を含み、前記ポリペプチドは、ＴＳＥに感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備えた構成とされる。
【００１１】
本発明は、ＴＳＥに感染した検体とＴＳＥ非感染の検体とではその体液において異なって保有され、診断、予見および治療に応用するためのポリペプチドの使用であってもよく、該ポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法によって決定される。
【００１２】
本発明の実施形態においては、分子量は、例えば、以下に述べるように、１０００から３５００未満、あるいは３００００超から１０００００、あるいは３５００から３００００の範囲において選択された所定の値であってもよい。
【００１３】
更に、本発明は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥ感染の疑いのある検体における感染の可能性の診断方法における、およそ１３３５０の分子量を備えたマーカの使用に関する。前記マーカは、シスタチンＣ（スイスプロット・アクセッション番号：Ｐ０１０３４、１２０ＡＡの活性蛋白質、等電点８．７５）であるとされており、神経内分泌基本ポリペプチド、ガンマトレースあるいはポスト・ガンマグロブリンとも呼ばれる。このシステインプロテイナーゼから成る分泌活性抑制剤は、同様の配列および構造上の特徴に基づき、３つの基を含む、蛋白質のスーパーファミリーに属している。この蛋白質は、精巣上体、輸精管、脳、胸腺および卵巣において非常に多く見られ、顎下腺においては低量しか見られない。シスタチンＣは、ＣＪＤ感染者のＣＳＦにおいては異なって示されることが、イムノブロットにより確認されている。シスタチンＣは、以下の配列（配列ＩＤＮｏ．１）を有する先駆物質に由来している。
【００１４】
ｍａｇｐｌｒａｐｌｌ  ｌｌａｉｌａｖａｌａ  ｖｓｐａａｇｓｓｐｇ  ｋｐｐｒｌｖｇｇｐｍ  ｄａｓｖｅｅｅｇｖｒ  ｒａｌｄｆａｖｇｅｙ  ６０
ｎｋａｓｎｄｍｙｈｓ  ｒａｌｑｖｖｒａｒｋ  ｑｉｖａｇｖｎｙｆｌ  ｄｖｅｌｇｒｔｔｃｔ  ｋｔｑｐｎｌｄｎｃｐ  ｆｈｄｑｐｈｌｋｒｋ  １２０
ａｆｃｓｆｑｉｙａｖ  ｐｗｑｇｔｍｔｌｓｋ  ｓｔｃｑｄａ  １４６
また、下に示される配列（配列ＩＤＮｏ．２）をも備える。
【００１５】
ｓｓｐｇｋｐｐｒｌｖ  ｇｇｐｍｄａｓｖｅｅ  ｅｇｖｒｒａｌｄｆａ  ｖｇｅｙｎｋａｓｎｄ  ｍｙｈｓｒａｌｑｖｖ  ｒａｒｋｑｉｖａｇｖ  ６０
ｎｙｆｌｄｖｅｌｇｒ  ｔｔｃｔｋｔｑｐｎｌ  ｄｎｃｐｆｈｄｑｐｈ  ｌｋｒｋａｆｃｓｆｑ  ｉｙａｖｐｗｑｇｔｍ  ｔｌｓｋｓｔｃｑｄａ  １２０
シスタチンＣの突然変異による型（６８番をＬｅｕからＧｌｕに置換したもの）は、アミロイドの特質を備えた物質が堆積することで能動脈壁が肥厚化するという特性を備えた、脳出血の遺伝型と関係があるとこれまで説明されてきた。後にアルツハイマー病が発病する危険性が増大することと関連のある遺伝子型（ＢＢ：ＡｌａをＴｈｒに置換したもの
）も存在する。
【００１６】
そこで、本発明によれば、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性の診断方法であって、前記検体から採取した体液のサンプルを質量分析法にかけて該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する処理を含み、前記ポリペプチドは、ＴＳＥに感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、シスタチンＣであることを特徴とする診断方法が提供される。体液は、脳脊髄液であるのが好ましいが、例えば、全血、リンパ液、漿液、尿あるいはプリオンの蛋白質が蓄積されやすい、扁桃やリンパ節のような他のリンパ網内系の組織であってもよい。
【００１７】
更に、本発明は、質量分析法によって体組織のサンプルにおける測定あるいは検出が可能であり、ＴＳＥ感染した検体と非感染の検体とではその体組織において含まれ方が異なり、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いの強い検体における感染の可能性や進行を示すマーカとしての、シスタチンＣの所定のレベルでの使用についても提供する。
【００１８】
更には、実験により、ＢＳＥ陽性の蓄牛とＢＳＥ陰性の蓄牛とで区別を可能とする主な蛋白質としての、様々なヘモグロビンのイソホームが、レーザ脱離／イオン化による質量分析法を用いて識別、確認された。表面活性化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法においては、およそ３００００、１５０００Ｄａ、７５００Ｄａにおけるピークあるいはクラスタがヘモグロビンを示しており、複合荷電された実際そのままのヘモグロビン分子に対応している。あるいは、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示す、ヘモグロビン鎖やその断片が切り捨てられた変形や断片もあり得る。この結果、ＳＥＬＤＩスペクトルにおけるヘモグロビンのピークあるいはクラスタの有無から、例えばリンパ液や他の体液を用いた検査を行い、蓄牛のＢＳＥを生前に診断する手段とすることができる。
【００１９】
更には、本発明に係る伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのあるウシの検体における感染の可能性を診断する方法は、前記検体から採取した体液のサンプルを質量分析法にかけて該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定し、前記試験量がＴＳＥ診断に一致するか否かを判定する処理を含み、前記ポリペプチドは、ＴＳＥ感染したウシの検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖である構成とする。
【００２０】
なお、ここで、「ウシ（bovine）」という表現には、一般的なウシ類、（スクラピーの）羊、および（慢性消耗性疾患の）鹿やエルクも含まれる。
本発明によれば、更に、ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有な抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖または断片鎖の所定のレベルでの使用であって、前記レベルは質量分析法によって検体の組織のサンプルにおける測定や検出が可能であり、前記ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示す前記ヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖は、ＴＳＥ感染したウシの検体の体組織とＴＳＥ非感染のウシでない検体の体組織とにおいては異なっており、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）であることあるいはＴＳＥ感染の疑いのあるウシの検体においてＴＳＥの可能性や進行を認識ためのマーカとされるような使用が提供される。
【００２１】
上記検査は、１回あるいは間隔をおいて、一体の動物あるいは動物群に対して適用される際に有用であり、実際の伝達性海綿状脳症あるいは最新の伝達性海綿状脳症に感染しているとはそれまで認められなかった動物にとっては、明らかにより有用である。係る動物
やその動物に検査を実施する方法もまた、本発明に含まれる。
【００２２】
本発明によれば、更に、ＴＳＥの診断において使用されるための分析装置あるいはキットが提供され、
（１）ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、１０００から１０００００までの範囲の分子量を備えたポリペプチド、
（２）ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａの分子量を備えたポリペプチドのうちから選択されたポリペプチド、
（３）シスタチンＣあるいは
（４）ＴＳＥ感染したウシの検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有される、ヘモグロビン、ウシのヘモグロビンに特有の抗体に対して免疫反応を示すヘモグロビン鎖あるいは切り捨てられた鎖や断片鎖
のいずれかに特有な抗体と結合した固体基質を含むことを特徴とする。上記の装置あるいはキットは、必要な準備試薬、洗浄試薬、検出試薬およびシグナル生成試薬を含んで構成されることとしてもよい。
【００２３】
また、本発明によれば、ＴＳＥの診断において用いられる分析装置であって、ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、１０００から１０００００までの範囲の分子量を備え、質量分析法によって決定されるポリペプチドを認識し、該ポリペプチドと結合し、あるいは該ポリペプチドに対し親和力を有する物質を含んだ領域を備えたプレート、シスタチンＣに特有な抗体を含んだ領域を備えたプレート、シスタチンＣに特有であり、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の診断において有効な抗体を含んだ領域を備えたプレート、シスタチンＣに特有であり、散発型ＣＪＤの診断において有効な抗体を含んだ領域を備えたプレートのいずれかを備えたことを特徴とする分析装置が提供される。上記装置は、必要な準備試薬、洗浄試薬、検出試薬およびシグナル生成試薬と関連付けられて構成されることとしてもよい。
【００２４】
また、本発明によれば、ＴＳＥの診断に用いられるキットであって、体液のサンプルを受け取り質量分析計にかけて、該サンプルにおけるポリペプチドの試験量を決定するためのプローブあるいはプロテインチップアレイを備え、該ポリペプチドは、ＴＳＥ感染した検体の体液とＴＳＥ非感染の検体の体液とにおいては異なって保有され、１０００から１０００００までの範囲の分子量であることを特徴とするキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）あるいはＴＳＥの疑いのある検体における感染の可能性を診断する方法を提供する。検体から採取された体液のサンプルは、質量分析法にかけられ、サンプル中にポリペプチドマーカが存在するか否かが判定される。ポリペプチドマーカは、ＴＳＥに感染した検体と非感染の検体とでは体液中に異なって保有されるものである。ポリペプチドマーカは、分子量は１０００から１０００００、好ましくは１０００から３５０００の範囲内であり、マーカの存在、非存在、過少出現あるいは過剰出現によってＴＳＥが示唆される。
【００２６】
この方法は、あらゆるタイプのＴＳＥに対し、ＴＳＥ感染あるいは感染の疑いのあるあらゆるヒトや動物に対し、応用が可能である。この方法は特にＣＪＤの診断に適用でき、特にヒトにおける新規の変異型ＣＪＤ、蓄牛のような反芻動物におけるＢＳＥ、羊におけるスクラピーのように、他の動物におけるＢＳＥと同様の疾患に適用することができる。
【００２７】
ポリペプチドという用語には、例えば炭水化物、ホスファート、サルフェートあるいは他の翻訳後修飾のような非ペプチド残留物の付加によって変更されたペプチドだけでなく、蛋白質および蛋白質断片も含まれる。
【００２８】
サンプルは、プローブ上あるいはプロテインチップアレイ上でポリペプチドと吸着物質との間で結合できる条件の下では、プローブに吸着されてもよい。吸着物質は、金属イオンと化合した金属キレート化合物から構成されるのが好ましく、その金属としては、銅が好ましい。ポリペプチドを検出するよりも前に、プローブあるいはプロテインチップアレイ上の未結合物質あるいは弱結合の物質は洗浄液で除去されるので、サンプル中のポリペプチドは濃縮される。サンプルは、プローブ上、あるいは、ポリペプチドと結合することのできる固定化金属アフィニティ−キャプチャ（immobilised metal affinity capture、ＩＭＡＣ）の界面を有するプロテインチップアレイ上で吸着されるのが好ましい。また、サンプルは、ポリペプチドと結合できる条件下では疎水性かつ強い陰イオンあるいは弱い陽イオンの交換面を備えた、プローブ上で吸着されてもよい。プローブは、数個の吸着壁を有し、分析器に挿入されて、その分析器の読み取りのために各吸着壁は順にイオン化手段（例えばレーザ）に当たる、小板から構成されることとしてもよい。ポリペプチドは、表面活性化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）あるいは飛行時間型質量分析（ＴｏＦ−ＭＳ）によって判定されるのが好ましい。
【００２９】
原理的にはいかなる体液や組織であっても、診断用のサンプルとして用いることができるが、体液としては、脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、血清、血液、尿、唾液あるいは涙が好ましい。
【００３０】
本発明の一実施形態としては、ＴＳＥは牛海綿状脳症（ＢＳＥ）である。この場合、ポリペプチドは、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａの分子量を備えることが好ましい。ポリペプチドの存在、非存在、過剰出現あるいは過少出現によってＢＳＥが示唆される。本発明によって、診断を行うために、どんな前述の分子量の値以外の値やそれらの組み合わせであっても、測定に取り組むようになるのが好ましいであろう。
【００３１】
本発明の他の実施形態においては、ＴＳＥはＣＪＤである。
本発明の更なる実施形態においては、ＴＳＥはスクラピーである。
ポリペプチドの分子量の測定あるいはポリペプチド群の分子量の測定は、質量分析法の結果得られる。全ての分子量は、Ｄａで測定される。上記で引用した分子量は、１％の精度、一般的には０．５から１％の精度で測定することができる。０．１％の精度で測定できるのが好ましい。本明細書において、分子量に関して「およそ（about）」とは、上記あるいは以下において値を引用する際に、およそ１％の精度の範囲内、好ましくは０．５％の精度の範囲内、更に好ましくは０．１％の精度の範囲内、の意味である。
【００３２】
本発明はまた、ＴＳＥ感染した検体と非感染の検体とではその体液において異なって保有され、診断、予後および治療への応用のためのポリペプチドの使用であってもよく、そのポリペプチドは、３５００から３００００の範囲を除き、１０００から１０００００の範囲の分子量を備え、質量分析法によって決定される。これには、調製品、および／あるいは、上記のポリペプチドを認識、ポリペプチドと結合あるいは何らかの親和力を有する物質を使用するという概念も含まれる。かかる物質の例としては、抗体や、抗体チップが挙げられる。ここで用いられる「抗体」という語には、多クローン性抗血清、単クローン抗体、Ｆａｂのような抗体の断片、および一般的な誘導抗体が含まれる。抗体はキメラ抗
体であってもよいし、あるいは単一の種についての抗体であってもよい。上で「予後」への応用について言及しているが、この概念には、ＴＳＥ経路と同様の判定を行うことや、例えば、上記の体液のサンプル中におけるポリペプチドの量を測定することも含まれる。上で「治療」への応用について言及しているが、この概念には、例えば、上記のポリペプチドを認識する物質、ポリペプチドと結合あるいは親和力を有する物質を準備することや、かかる物質を治療に用いることも含まれる。その物質は、この場合、例えば抗体を薬物と結合させることによって、変更されている。したがって、この物質は、その薬物を動物の治療すべき特定の箇所をターゲットとすることができる。
【００３３】
本発明の方法論は、あらゆるＴＳＥ診断に応用させることができる。体液のサンプルは、感染した検体および非感染の検体から用意される。サンプルは、プローブあるいは各種のサンプルにおけるペプチドの保持力がそれぞれ異なる吸着媒体にその表面を処理され、非結合あるいは結合力の弱い物質を除去するのに洗浄液を任意に用いるようなアレイに応用される。エネルギーを吸着する物質を適宜使用することもできる。しかる後、プローブまたはアレイは、質量分析器に挿入され、様々な機器の設定を用いて各種サンプル／吸着剤の組み合わせから読みが行われる。１組の与えられた条件下での感染したサンプルと非感染のサンプルとの比較によって、１以上のポリペプチドが示される。示されるポリペプチドは、感染したサンプルと非感染のサンプルとでは異なって表されるものである。同一の条件（吸着剤、分析器の設定等）の下で、検体から採取した液体サンプルの検査でこれらポリペプチドが存在するあるいは存在しないことから、検体が感染しているか否かを判定するのに用いることができる。
【００３４】
ここで、ポリペプチドの「存在するあるいは存在しないこと」という表現は、単に感染したサンプルと非感染のサンプルとでは検出される量に違いが見られる、という意に解されるべきである。このように、検査サンプルにおいてポリペプチドが「存在しないこと」には、そのポリペプチドが実際に存在するが、比較用の検査サンプルにおける量よりはごく低量である、という可能性も含んでいる。本発明によれば、診断は、ポリペプチドが存在するか存在しないかに基づいてなすことができ、これには、参照用の検査サンプルと比較してより低量、あるいはより多量のポリペプチドが存在することに基づいて診断することについても含まれる。
【００３５】
以下、本発明の実施形態について説明する。
＜実施形態１＞
ＢＳＥ感染した蓄牛から採取した体液（脳脊髄液、リンパ液その他）中のポリペプチド
本研究の目的は、ＢＳＥ感染した蓄牛から採取した体液（脳精髄液、リンパ液その他）において、特定のポリペプチドを検出することにあった。サンプルは、表面活性化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法（ＭＳ）技術で分析された。この技術によれば、異なるタイプのリテンテート（retentate）クロマトグラフィを用いてミクロ単位での蛋白質のアフィニティ−キャプチャが実行され、飛行時間型質量分析がなされる。こうして、サイファージェン・バイオシステムズ社（米国カリフォルニア州フリーモント）のＰＢＳII型質量分析器で分析された、与えられたサンプルに特有な蛋白質の分布図に各々応じた、異なる地図が生成される。ピークに現れる違いは、プロテインチップアレイを使ってＢＳＥに感染した蓄牛から採取したリンパ液のサンプル集団と、健康な蓄牛から採取したものとでスペクトルを比較することで識別される。
【００３６】
ＳＥＬＤＩ分析は、金属親和力で特定のポリペプチドを検出するために、未加工のウシのリンパ液サンプル２μｌを用いてなされた。このアプローチにおいては、銅の親和力で蛋白質を捕獲して特定の蛋白質の部分集合をサンプル中から選別するために、固定された銅の親和力アレイ（ＩＭＡＣ−Ｃｕ＋＋）が採用された。プロテインチップアレイおよび
固定された金属チップアレイは、ＩＭＡＣ−Ｃｕ＋＋親和力アレイで構成されることとしてもよい。捕獲された蛋白質は、ＰＢＳIIプロテインチップアレイリーダ（サイファージェン・バイオシステムズ社製、米国カリフォルニア州フリーモント）を用いて直接検出された。
【００３７】
以下に示すプロトコルは、クロマトグラフィックＴＥＤ−Ｃｕ（II）プロテインチップアレイを処理し、分析するのに用いられた。ＴＥＤ（tris(Carboxymethyl)ethylenediamine-Cu）とは、ステンレススチール基質の酸化膜で覆ったシリコンで、その表面をコーティングした吸着剤のことである。
【００３８】
・最初に表面に１００ミリモル（ｍＭ）の硫酸銅１０μｌを行き渡らせて装荷し、１５分間湿室で定温放置する。
・その後。チップをイオン除去した水で約１０秒間、２回すばやくすすぎ洗いし、余分な結合していない銅を除去する。
【００３９】
・サンプルに装荷する前に、Ｉ−ＭＡＣ３アレイを、５分間に渡り、０．５モルのＰＢＳ塩化ナトリウム５μｌとで平衡状態にさせる。
・平衡緩衝液を除去した後、３μlの同一の緩衝液を、２μｌのリンパ液を加える前に追加する。チップを２０分間湿室で定温放置する。
【００４０】
・しかる後、サンプルを除去し、表面を３回平衡緩衝液で洗浄する（各回５分ずつ）。
・水での最後のすすぎを２回行う。
【００４１】
・表面は、空気乾燥にしてもよく、続いて、トリフルオロ酢酸である、５０％濃度アセトニトリルで調合された０．５μｌの飽和シナピン酸（ＳＰＡ、サイファージェン・バイオシステム社）に追加する。
【００４２】
・レーザ脱着イオン化飛行時間型質量分析で得られた蛋白質を全面的に分析する前に、チップを再度空気乾燥する。
・プロテインチップアレイを装置に挿入し、正確な検出器の精度、およびレーザがデータ収集を自動的に行えるだけのエネルギーを備えていることを一旦解析する。
【００４３】
・得られたスペクトルを、バイオマークウィザードのソフトウェア（サイファージェン・バイオシステムズ社、米国カリフォルニア州フリーモント）をデルのディメンジョン４１００（Dell Dimension 4100）のパーソナルコンピュータで動かして分析する。多重スペクトルを通じて複数のピークが描かれる。
【００４４】
図１Ａから図１Ｆは、比較研究した結果であり、ＢＳＥと診断された蓄牛および正常な蓄牛から採取したリンパ液から、上記の通りに準備したＩＭＡＣ３プロテインチップアレイを用いて得られたものである。この研究では、２３個のピークが、ＢＳＥ感染した蓄牛から採取したリンパ液において特に異なって表されている。それらの分子量は、それぞれおよそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ（質量精度は、略０．１％である）である。図１には２つのスペクトル図が示されている。それぞれ、正常なサンプル、ＢＳＥのサンプルについての０から１０００００Ｄａの範囲のスペクトル図である。より具体的には、縦方向の矢で示されているように、図１Ａは、およそ１０１０、１１００、１１２５および１３６５についてのピークを示している。図１Ｂは、およそ３６４５および４０３０のピークを示してい
る。図１Ｃは、およそ３８９０、５８２０、７５２０、７６３０および７９８０のピークを示している。図１Ｄは、およそ９９５０、１０２５０、１１６００および１１８００のピークを示している。図１Ｅは、およそ１５０００、１５２００、１５４００、１５６００および１５９００のピークを示している。図１Ｆは、およそ３００００、３１０００および３１８００のピークを示している。
【００４５】
スペクトルＰ１からＰ２０（図１Ａ、図１Ｂ）は英国からのサンプルのバッチに相当し、スペクトル１から２０（図１Ｃから図１Ｆ）は米国からのサンプルのバッチに相当する。サンプルを提供した蓄牛の状態は、下の表１および表２に示される。表１および表２においては、「陰性（Negative）」はＢＳＥに非感染であることを意味し、「陽性（Positive）」はＢＳＥに感染した蓄牛であることを意味する。
【００４６】
【表１】
2006504977.tif 000028
【００４７】
【表２】
2006504977.tif 000029
【００４８】
これらのデータから、およそ１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａにおけるピークがリンパ液サンプルとしてＢＳＥの診断に用いることができる、と示される。上記のピークのうちいずれか１つ、あるいはそれらのうちで１以上のピークについての組み合わせをこのように用いることにより、ＢＳＥを診断することもできる。
＜実施形態２＞
ＣＪＤ感染の患者のＣＳＦ中におけるシスタチンＣの確認および増加
ＣＪＤ監視ユニットから入手したＣＳＦサンプル（１００μｌ）（非感染者のみならず散発型あるいは明らかに変異型のＣＪＤに関するもの）が、ＳＥＬＤＩプロテインチップ
アレイ技術を用いて調査された。ＷＣＸ２（炭水化物官能基との弱陽イオン交換アレイ）、ＳＡＸ２（第４アミン官能基との強陰イオン交換アレイ）およびＩＭＡＣ３（ニトロトリアセテート酸との固定された金属のアフィニティキャプチャアレイ）の表面は、得られたサンプル中の、蛋白質固有の結合の違いを調査するために用いられる。ＣＪＤ症状のある患者のサンプルとＣＪＤではないが同様の症状のある患者のサンプル（非感染、すなわちコントロールによる）とを識別するために、まずコントロール（非感染者）に対して、変異型および散発型患者（ＣＪＤサンプル）のケースについて様々な比較がなされた。研究所および発明者の１４．３．３のサンプルから採取したコントロールと比較された、ＣＪＤと診断された患者についてサンプルのグループ全体については、診断された部分母集団中で区別することなく分析された。これらサンプルの比較は、散発型および／あるいは変異型ＣＪＤのサンプルを、対応するコントロール（非感染）と区別せずに行った。
【００４９】
これにより、本発明においては、分子量がおよそ１３３６５から１３３７０（±０．５％）の知的障害マーカの存在について確認された。このマーカは、金属親和力に加えて陽イオンの特性を示している。
【００５０】
１３３６５から１３３７０のマーカは、陽イオン交換クロマトグラフィを用いて非感染のＣＳＦサンプルを分別することで精製された。そのような分別を目的として設計されているスピンサックス（Spin Sax）カラムは、正味の電荷にしたがって蛋白質を分離するものであり、塩を集中させかつ等電点を低くする緩衝液を用いて、等電点を減少させることにより蛋白質を順次抽出するのに用いられる。ＩＭＡＣ３およびＳＡＸチップを用いて得られた蛋白質の分布図もまた、同様であった。各分別に際し、１３３５０ｍｗのピークを識別するために、蛋白質電気泳動（SDS PAGE）で負荷をかけた。予め青変したコロイド状トリス・トリシンの１次元ゲルが流されて硝酸銀で染色されることで、質量分析法で識別した後に結合の切り出しおよび蒸解ができるようになる。ゲルから摘出した水平方向の結合は、マトリックス支援イオン化飛行時間型（MALDI-TOF）、タンデム飛行時間型（MALDI-TOF-TOF）（アプライドバイオシステムズ社：衝突を誘導する解離フラグメントの分析によって部分配列の決定することができる）あるいはナノＬＣ・Ｑ−ｔｏｆを用いてのアプローチによって確認される。１３３５０のピークは、シスタチンＣと確認された。
【００５１】
マトリックス支援イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF MS）は、紫外光吸収基質や生体分子が共沈することを利用してナノ秒レーザパルスを照射する技術においては比較的新規である。レーザのエネルギーの凡そは基質で吸収され、その基室により望まぬ生体分子の断片が発生することが防止される。イオン化生体分子は、電場中で加速されて飛行管に突入する。この管内を飛行中の間に、分子は各自の質量電荷比にしたがって分離され、異なるタイミングで検出器に到達する。この方法によれば、各分子は他の分子とは異なるサインを出している。本方法は、蛋白質、ペプチド、オリゴ糖類およびオリゴヌクレオチドのような、分子量４００から３５００００Ｄａの生体分子の検出および生体分子の特性の決定に用いられている。
【００５２】
ＣＳＦがＣＪＤ感染している患者中にシスタチンＣが確認されたことおよびシスタチンＣが増加していることを確かめるため、発明者は、８つのＣＪＤ感染した患者（うち３人は変異型ＣＪＤ、５人は分散型ＣＪＤ）のＣＳＦに対して、８つの精神異常のＣＳＦサンプル上におけるヒトのシスタチンＣに固有な抗体を使用して、ウェスタンブロットによる実験を行った。
【００５３】
図２により、コントロールと比較して検査した８人のＣＪＤ感染患者について、シスタチンがＣＪＤの脳脊髄液のマーカとなり得ることを意味する特定のシグナルが増加していることを、発明者が確認したことが示されている。
＜実施形態３＞
ＢＳＥに感染した蓄牛のリンパ液についてのＳＥＬＤＩ分析
発明者は、先述のＢＳＥプラスとＢＳＥマイナスのリンパ液のサンプルをＳＥＬＤＩ分析によって比較調査を行うことで、数個のハイライト部分の蛋白質の集合は各々異なって表されることを確認した。更に分析を行い、このようなクラスタの一つとして、およそ１５０００Ｄａ付近の質量を備え、ＢＳＥ感染した蓄牛から採取したサンプルに関しては過剰な違いがみられるクラスタを選び出した。ＢＳＥに感染した蓄牛のリンパ液を１次元電気泳動にかけ、標準質量のマーカ蛋白質を用いて決定された、質量１５０００Ｄａの移動する帯域を抽出し、それをトリプシンで蒸解してＭＡＬ：ＤＩ−ＴＯＦの質量分析装置にかけた。この方法によれば、１５０００Ｄａの蛋白質は、ＳＥＬＤＩで分析すると、ウシのヘモグロビン中のイソホームであると推定的な確認がなされた。
【００５４】
これらサンプル中のヘモグロビンの内容を調査し確認するために、発明者は、ウシのヘモグロビンと交叉反応を示すような抗体を探した。他の種から採取されたヘモグロビン（４８７０−３９８０、バイオトレンド−アナワ社）とで交叉反応を示すと予測される、赤血球から採取された天然のヘモグロビンに対して培養されたヒツジの多クローン性抗体だけでなく、ウマやウシのヘモグロビン（Ｊ１６、バイオメダ社）と弱い反応を示す、ヤギの多クローン性抗体の抗人ヘモグロビンについて検査した。ポジティブコントロールとしての、天然の精製されたヒトおよびウシのヘモグロビン（４８７０−４０５６および４８７０−２００２、バイオトレンド−アナワ社）を用いて実験を行った。
【００５５】
図３は、バイオメダ社から入手したヤギの多クローン性抗体について行われた、ウェスタンブロット実験を強調表示した図である。ヒトおよびウシのヘモグロビンで目立ったシグナルがあるのに加え、３個のＢＳＥプラスの検査リンパ液サンプル中の予測された範囲においては、蛋白質レベルが増加していることがまさに認められ得る。第２の抗体について実行されたウェスタンブロット実験では、シグナルは全く認められなかった（データは不図示である）。複数の点が検出されるか否かを見るために、シルバーステインの分析用２次元ゲル、およびＢＳＥマイナスのリンパ液サンプルの２次元ポリフッ化ビニルデン（PVDF）メンバについての免疫検出実験がされた（図４）。図４では広範囲に渡り、予測された領域に４つの点が示されている。２点については、α鎖（１５０５３Ｄａ、等電点（ｐＩ）８．１９）に対応し、残りの２点はβ鎖（１５９５４Ｄａ、等電点７．０２）に対応しているように見受けられる。α鎖は、Ｎ−グリコシレーション、プロテインキナーゼＣリン酸化、カゼインキナーゼIIリン酸化およびＮ−ミリストイル化の４つの変異サイトを備えることが判明しており、β鎖もまた同様にＮ−グリコシレーションサイト（スキャン・プロサイト）の代わりにアミド化サイトを備えていることがわかっていることから、これらのことから、ＳＥＬＤＩスペクトル中ピーク前後の多くの強調部分についてだけでなく、主な分子量においてそのバリエーションが説明される。
【００５６】
更にウシのヘモグロビンのイソホームとしての１５０００Ｄａにおけるクラスタを確認するために、ウシおよびヒトの精製されたヘモグロビンをＳＥＬＤＩのノーマルフェーズで分析した。図５は、両種における類似点について説明するための、両種について得られた全スペクトル図である。図６Ａおよび図６Ｂは、４つの代表的なスペクトルでは、ＩＭＡＣ法においてＢＳＥプラスのリンパ液で見られるヘモグロビンの概観はどのようであるかを示している。これに対し、図６Ｃは、７ｋＤａ未満での違いを強調表示している。これらのスペクトルから、発明者は、ヘモグロビンに対応するウシのリンパ液についてのＳＥＬＤＩでの調査から、１３中５のクラスタが強調されていると結論付けた。
【００５７】
上記で引用した各刊行物は、本文において信頼すべきものとして、ここではある程度参照として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】  １Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｂ】  １Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白
質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｃ】  １Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｄ】  １Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｅ】  １Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図１Ｆ】  １Ａから１Ｆは、リンパ液のサンプルのうち、１０１０、１１００、１１２５、１３６５、３６４５、４０３０、３８９０、５８２０、７５２０、７６３０、７９８０、９９５０、１０２５０、１１６００、１１８００、１５０００、１５２００、１５４００、１５６００、１５９００、３００００、３１０００および３１８００Ｄａ蛋白質のピークを強調した、レーザ吸着／イオン化質量分析法による、正常のサンプルおよびＢＳＥ感染体のサンプルにおけるリンパ液のスペクトル図である。
【図２】  ＣＳＦのサンプルにおけるヒトのシスタチンＣの免疫検出を示す図である。
【図３】  リンパ液のサンプルにおけるウシのヘモグロビン検出を示す図である。
【図４】  ２次元ゲル上および２次元ＰＶＤＦ膜上のＢＳＥリンパ液のサンプルを示す図である。
【図５】  レーザ脱離／イオン化質量分析法による、ヒトおよびウシのヘモグロビンのスペクトルを示す図である。
【図６Ａ】  ６Ａから６Ｃは、レーザ脱離／イオン化質量分析法による、正常なウシおよびＢＳＥ感染したウシのサンプルから採取したリンパ液のスペクトルを示す図である。
【図６Ｂ】  ６Ａから６Ｃは、レーザ脱離／イオン化質量分析法による、正常なウシおよびＢＳＥ感染したウシのサンプルから採取したリンパ液のスペクトルを示す図である。
【図６Ｃ】  ６Ａから６Ｃは、レーザ脱離／イオン化質量分析法による、正常なウシおよびＢＳＥ感染したウシのサンプルから採取したリンパ液のスペクトルを示す図である。
【配列表】
配列リスト
＜110＞ プロテオメ  サイエンシス  ピーエルシー
＜120＞ 伝達性海綿状脳症の診断方法
＜130＞ ELEC，023
＜140＞ GB  0306290．8
＜141＞ 2003−03−19
＜15O＞ GB O225245．0
＜151＞ 2002−10−30
＜160＞ 2
＜170＞ パテントイン  バージョン  3．1
＜210＞ 1
＜211＞ 146
＜212＞ PRT
＜213＞ ヒト
＜400＞ 1
Met Ala Gly Pro Leu Arg Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ala Ile Leu Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Ala Ala Gly Ser Ser Pro Gly Lys Pro
20                  25                  30
Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala Ser Val Glu Glu Glu Gly
35                  40                  45
Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly Glu Tyr Asn Lys Ala Ser
50                  55                  60
Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gln Val Val Arg Ala Arg Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ile Val Ala Gly Val Asn Tyr Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg
85                  90                  95
Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gln Pro Asn Leu Asp Asn Cys Pro Phe His
100                 105                 110
Asp Gln Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe Cys Ser Phe Gln Ile Tyr
115                 120                 125
Ala Val Pro Trp Gln Gly Thr Met Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gln
130                 135                 140
Asp Ala
145
＜210＞ 2
＜211＞ 120
＜212＞ PRT
＜213＞ ヒト
＜400＞ 2
Ser Ser Pro Gly Lys Pro Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Glu Glu Glu Gly Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly
20                  25                  30
Glu Tyr Asn Lys Ala Ser Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gln
35                  40                  45
Val Val Arg Ala Arg Lys Gln Ile Val Ala Gly Val Asn Tyr Phe Leu
50                  55                  60
Asp Val Glu Leu Gly Arg Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gln Pro Asn Leu
65                  70                  75                  80
Asp Asn Cys Pro Phe His Asp Gln Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe
85                  90                  95
Cys Ser Phe Gln Ile Tyr Ala Val Pro Trp Gln Gly Thr Met Thr Leu
100                 105                 110
Ser Lys Ser Thr Cys Gln Asp Ala
115                 120
【国際調査報告】
2006504977.tif 000030
2006504977.tif 000031
2006504977.tif 000032
2006504977.tif 000033
2006504977.tif 000034
2006504977.tif 000035