(57)【要約】創傷に関連する活性酸素種は、カリウムイオン、亜鉛イオン、カルシウムイオン、およびルビジウムイオンからなる群から選択される金属イオンのｐＨ約５〜約７の溶液を用いた創傷の治療において調節される。好ましくは、ｐＨの調整にクエン酸を用いる。創傷で現れるスーパーオキシドアニオンに抽出液を適用することにより、スーパーオキシドアニオン濃度を減少させ、これにより創傷の治療に有効であることが見出された。さらに、本組成を用いる、部分的に厚みのある切り傷および接触熱傷の治療は、これらの創傷の上皮形成を改善することが見出された。本発明の抗酸化活性に加えて、本組成を用いる該創傷の治療は、ヒトＰＭＮによるＲＯＳ生成およびヒト補体活性に対して、阻害効果を産み出し、それ故さらに、慢性創傷管理に有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリウムイオン、亜鉛イオン、カルシウムイオン、およびルビジウムイオンからなる群から選択される金属イオンの医薬的に有効な実質的に中性のｐＨの水溶液を用い、創傷に関連する活性酸素種の中和に効果を発揮するに充分な時間、その創傷に該溶液を適用し、該創傷に関連する活性酸素種に対する溶液の中和作用によって創傷治癒を高める事からなる創傷治癒を増強する方法。
【請求項２】
該溶液のｐＨをクエン酸で調整する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該溶液のｐＨが約５〜約７である、請求項２の方法。
【請求項４】
該溶液が、約３３／ｍＬのスーパーオキシドを除去するＩＣ５０値を示す、請求項１の方法。
【請求項５】
カリウムイオン、亜鉛イオン、カルシウムイオンおよびルビジウムイオンからなる群から選択される金属イオンの医薬的に有効なｐＨが、約５〜約７の水溶液を用い、創傷に該溶液を適用し、それにより該溶液は、刺激された多形核好中球による該創傷に関連する活性酸素種の生成を阻害するか、スーパーオキシドアニオンの除去をするか、多形核好中球の誘引または刺激因子を阻害するか、またはそれらの組合せ、効果を発揮させて、創傷を治癒する事からなる創傷治癒を増強する方法。
【請求項６】
該溶液のｐＨをクエン酸を用いて約５に調整する、請求項５の方法。
【請求項７】
該溶液のｐＨを塩酸を用いて約７に調整する、請求項５の方法。
【請求項８】
該溶液が、カリウムイオン１０〜２０重量部、亜鉛イオン０．００００１〜２０重量部、およびルビジウムイオン約４０重量部まで含む、請求項１の方法。
【請求項９】
該溶液が、ｐＨを約５〜７に調整するために充分な量のクエン酸を含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
カルシウムイオン０．０１〜１０重量部を含む、請求項８の方法。
【請求項１１】
該溶液が、ｐＨを約５〜７に調整するために充分な量のクエン酸を含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
該溶液が、カリウムイオン１０〜２０重量部、亜鉛イオン０．００００１〜２０重量部、およびルビジウムイオン約４０重量部まで含む、請求項５の方法。
【請求項１３】
該溶液が、ｐＨを約５〜約７に調整するのに充分な量のクエン酸を含む、請求項１２の方法。
【請求項１４】
カルシウムイオン０．０１〜１０重量部含む、請求項５の方法。
【請求項１５】
該溶液が、ｐＨを約５〜約７に調整するのに充分な量のクエン酸を含む、請求項５の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００２年１２月２３日に出願された、仮特許出願番号第６０／４３６１９７号に基づく、優先権を主張して出願した本出願である。
（連邦政府の委託研究開発に関する陳述書）
適用無し。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、創傷管理に関連し、特に、褥瘡性潰瘍、火傷等の性質を持つ慢性（非応答）創傷に関連する。
【０００３】
（背景技術）
近年、創傷治癒障害において、フリーラジカルが重要な役割を果たしていることも、明らかになってきている。局所的および慢性的な創傷において、フリーラジカルは、細胞損傷を引き起こす事が知られており、該治癒過程において、阻害因子として機能し得る。慢性創傷において、虚血性の症状は、酵素であるキサンチンデヒドロゲナーゼを、酸素のスーパーオキシドアニオンへの変換を触媒するキサンチンオキシダーゼに変換し得る。スーパーオキシドアニオンは、多形核好中球（ＰＭＮ）の刺激による創床(wound bed)においても生成される。スーパーオキシドアニオンは、組織への毒性を示すフリーラジカルであり、その生成により、さらに毒性のあるヒドロキシルラジカル、および強力で非ラジカル酸化剤である次亜塩素酸を含む、他の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成も生じる。スーパーオキシドアニオンは、創床における、別の炎症細胞のマクロファージで生成されるラジカルである、一酸化窒素と容易に反応し、周辺組織にもっとも有害な影響を与えるペルオキシ亜硝酸を生成する。最終的に、スーパーオキシドアニオンは、上皮性増殖にあまり適さない転換した基質において生じる、該基質分子であるフィブリンおよびフィブロネクチンの交差結合をも引き起こしうる。
【０００４】
（発明の概要）
本発明の一つの態様として、活性酸素種は、金属イオンの合成した組成で治療することにより、調節される創傷と関連する。スーパーオキシドアニオンの徴候を示す創傷への該組成の適用は、該創傷と関連するスーパーオキシドアニオンのレベルの減少を通して、これらの創傷の治療および治癒に有効であることが見出されている。本発明は、特に、慢性創傷の治療および治癒に有効である。さらに、本組成を用いる、部分的に厚みのある切り傷および接触熱傷の治療によって、これらの創傷の上皮形成を改善することが見出されている。
【０００５】
本発明の抗酸化活性に加えて、本組成を用いる創傷の治療は、ヒトＰＭＮによるＲＯＳの生成およびヒト補体活性化に対する阻害効果をもたらし、それ故、さらに慢性創傷管理において、有益である。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
発明に用いた技術および方法
材料
本発明に有用な好ましい組成は、カリウムイオンが１０〜８０重量部、亜鉛イオンが０．００００１〜２０重量部、カルシウムイオンが０．０１〜１０重量部、およびルビジウムイオンが４０重量部までの量である、ｐＨ約５から約７の間の溶液を含む。一つの態様として、該金属イオンは、例えば、塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、水酸化物等を含む、それらのそれぞれの塩から導かれる。該組成のｐＨの調整は、好ましくは、必要に応じて、該溶液にクエン酸を加えて行われる。本目的のために、この組成を本明細書において、時々ＰＨＩ５（クエン酸を用いてｐＨ５に調整された、ポリ水酸化されたイオノーゲン）として引用する。
【０００７】
治療価値は、カルシウムを用いないで、カリウム、亜鉛およびルビジウムイオンを用いて、見出されてきた。しかしながら、カルシウムは、創傷のある種のタイプの治療に有用であり、たとえ特定の創傷に対しては、医薬的に無効であったとしても、本発明の溶液に含めていても、当該特定の創傷を治療する場合の、好適な溶液の有効性に対して弊害とはならない。
【０００８】
ヒト好中球による、ＲＯＳ生成阻害のためのアッセイ（化学発光アッセイ）
多形核好中球（ＰＭＮ）を健常ボランティア（Bloedbank Midden-Nederland、ユトレヒト、オランダ）の静脈血から単離した。白色９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（Costar、Badhoevedorp、オランダ）の中に、試験サンプルを連続的に、最終的には５０μＬになるように希釈した。各ウェルに、５０μＬのＰＭＮ懸濁液（１・１０7細胞／ｍＬ）および５０μＬのルミノール（１２０μＭ）を加えた。ＰＭＮは、オプソニン化ザイモサンＡ（ＯＰＺ；最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を加えることによって、誘発された。化学発光は、Titertek Luminoskan 発光計(TechGenインターナショナル、Zellik、ベルギー）を用いて、３０分間隔で、０．５秒間、２分ごとにモニターした。
【０００９】
ピークレベルは、それらの対応するコントロール（試験サンプル無しで、同一のインキュベーション）との相関で、試験サンプルの活性を計算するのに用いられる。実験は、ＮａＨＣＯ3を用いて、ｐＨ７．３５で緩衝され、細胞凝集を避けるために、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン（ＨＢＳＳ−ゲル）を補充した、Ｈａｎｋ平衡塩溶液（Ｉ−ＩＢＳＳ)で実施した。ＯＰＺは、洗浄した商業用ザイモサンＡと１：１０に希釈したヒトプール血清（ＨＰＳ）を３７℃で、３０分間インキュベートすることにより得た。洗浄後、該オプソニン化した生成物をＨＢＳＳ（最終濃度：０．８ｍｇ／ｍＬ）で再懸濁した。
【００１０】
スーパーオキシドアニオン除去アッセイ
白色９６ウェル平底マイクロタイタープレートに、試験サンプルをリン酸で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）で、連続的に最終量５０μＬまで希釈した。続いて、ヒポキサンチン（５０μＬ；最終濃度１ｍＭ）、および緩衝液またはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、２５μＬ；１０Ｕ／ｍＬ）を加えた。スーパーオキシドアニオン（・Ｏ2）ラジカル生成は、２５μＬのキサンチンオキシダーゼ（１０ｍＵ／ｍＬ）の付加によって開始され、化学発光は、Fluoroskan Ascent FL 発光計(Labsystems、Breda、オランダ）を用いて、１５分間にわたって、０．５秒間、ｍｍごとにモニターした。試験化合物の活性は、ＳＯＤ−阻害可能な部分の化学発光シグナルから計算された。キサンチンオキシダーゼ活性における試験サンプルの直接的な効果を排除するため、尿酸形成は、２９０ｎｍで、分光光度計によって決定した。
【００１１】
ヒト補体活性に対する、溶血アッセイ（古典的経路および代替的経路）
ヒト補体（ＣＰおよびＡＰのそれぞれ）の古典的および代替的経路に対する試験サンプルの阻害活性は、Klerx et al.(Klerx, J.P.A.M.,Beukelman,C.J., Van Dijk,H. et al., Microassay for colorimetric estimation of complement activity in guinea pig, human and mouse serum. J.Immunlol Methods 1983, 63:215-220) に記載されたマイクロアッセイの修正バージョンによって定量した。Ｕ−ウェルマイクロタイタープレート（Greiner Labortechnik, Nortingen, ドイツ）に、試験サンプルを（１）ＶＳＢ−ＣＰ（ベロナール生理食塩水、５ｍＭのベロナール、１５０ｍＭ生理食塩水；ｐＨ７．３５に調製）に最終量が５０μＬ（ＣＰ）になるように、０．１５ｍＭのＣａ2+および０．５ｍＭのＭｇ2+を補ったもの、または（２）上記のベロナール緩衝生理食塩水に、０．５ｍＭのＭｇ2+および０．８ｍＭのＥＧＴＡを補い、最終量１００μＬ（ＡＰ）になるように調製したＶＳＢ−ＡＰに逐次希釈した。続いて、５０μＬ（ＣＰ）または２５μＬ（ＡＰ）の適当なヒトプール血清（ＨＰＳ；健常ドナーから得た）の希釈液を加えて、該プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの感作されたヒツジ赤血球（ＣＰ）または２５μＬのウサギ赤血球（以下参照）を加えた後、該プレートを再度３７℃で１時間、再びインキュベートした。Ａｌｓｅｖｅｒ溶液中のヒツジまたはウサギの血液は、赤血球源として供給される。用いる前に、赤血球は生理食塩水で３回洗浄した。ヒツジ赤血球を希釈した（１：８００）アンボセプターと１０分間インキュベーションすることで感作させ；洗浄後、該感作させた赤血球をＶＳＢ−ＣＰ（４×１０8細胞／ｍＬ）に再懸濁した。ウサギの赤血球をＶＳＢ−ＡＰ（３×１０8細胞／ｍＬ）に懸濁した。最後に、該マイクロタイタープレートを遠心分離（９００×ｇで５分）し、無処置の細胞と残査を沈降させて、５０μＬの上清をウェルに付き２００μＬの水を含んだ９６−ウェル平底マイクロタイタープレートに移した。後者のプレートにおいて、赤血球の溶解によって、放出されるヘモグロビンの量は、上記の自動ＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて、４０５ｎｍで操作し、分光光度計で測定した。コントロールは、水（１００％溶血）、または緩衝液（ＶＳＢ−ＣＰまたはＶＳＢ−ＡＰ；０％溶血）、およびＨＰＳが、加熱で不活性化されたＨＰＳ（５６℃、３０分；試験サンプルの背景色の補正）に置換されたインキュベートで、インキュベートした赤血球の上清を同様に処理することからなる。
【００１２】
細胞毒性の定量
５−カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ；１０ｍｇ／ｍＬ）のアセトンストック溶液を調製し、−２０℃で貯蔵した。使用の前に、このストック溶液は、緩衝液で、１：１０００に希釈した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；１．５ｍｇ）を、２．５％の消光インク、５％ｗ／ｖのＥＤＴＡ、および８ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んだ１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解させた。ＰＭＮは、生体染色法ＣＦＤＡ（１０μｇ／ｍＬ）で、２０℃にて１５分間ラベルし、洗浄して、１０7細胞／ｍＬの濃度になるまで、緩衝液中に再懸濁する。１００μＬのこの細胞懸濁液を、同量に希釈したサンプルと３７℃で１５分間、インキュベートした。続けて、該細胞を洗浄し、生存（緑色に発光）および死滅（赤色に発光）細胞を識別するために、２５μＬのＰＩ／インク溶液で染色した。死滅細胞のパーセントは、蛍光顕微鏡（Fluovert、Leitz、Wetzlar、ドイツ）を用いて、定量した。
【００１３】
結果と考察
創傷に関連する活性酸素種の生成は、いくつか可能な起源から生じている。本発明の溶液は、当該創傷に関連する活性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対して、医薬的に有効な阻害効果を表した。
【００１４】
創傷におけるＲＯＳの一つの源としては、ヒト多形核好中球（ＰＭＮ）の刺激によって、生成する活性酸素種である。ＰＭＮは、例えば、該創傷部を強化し、活性化して、増加する酸素の量を消費し、ＲＯＳに変換する。レスピレイトリー・バーストとして知られる、この過程は、レセプター介在およびレセプター非依存過程の両方によって、活性化される該酵素ＮＡＤＰＨオキシダーゼに依存する。典型的なレセプター依存刺激は、例えば、補体要素であるＣ５ａおよびＣ３ｂ、バクテリア由来走化性トリペプチドであるｆＭＬＰ、およびオプソニン化ザイモサン；長鎖不飽和脂肪酸を含むレセプター依存性刺激等がある。該ＰＭＮの活性化によって、該多成分のＮＡＤＰＨオキシダーゼは、細胞膜に集合する。続いて、該オキシダーゼは、膜の細胞基質側で、ＮＡＤＰＨから電子を膜の反対側で、分子状酸素に移す。これにより、摂取された微生物を含む食胞（細胞内）または細胞外で、スーパーオキシドアニオン（・Ｏ2-）の生成が生じる。形成された該スーパーオキシドアニオンのほとんどは、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）に変換される。後者は、高濃度でのみ、殺菌性があるのに対し、スーパーオキシドアニオン自体は、その制限された膜透過性のためにバクテリアを殺さない。過酸化水素のいずれかは、鉄触媒フェントン反応により、極めて活性の高いヒドロキシルラジカルへと変換される。しかしながら、過酸化水素のほとんどが、ＰＭＮによって生成されることが知られる殺菌性の酸化剤である、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）に変換される。後者の変換は、ハライド（クロリド）イオンの存在下で起こり、活性化されたＰＭＮによって、放出される酵素でもあるミエロパーオキシド（ＭＰＯ）によって触媒される。ファゴリソソームにおいて、細胞内ＲＯＳ［タンパク分解およびリソソーム（顆粒）から放出される他の細胞毒性酵素と一緒になって］は、摂取されたバクテリアを殺して、創傷感染を防ぎ、これらの酸素代謝物の細胞外生成は、組織周辺での有害な効果を有する。
【００１５】
上述の該ＲＯＳに加えて、一酸化窒素（ＮＯ・ 創傷部に存在するマクロファージによって）の生成もまた、注目される。一酸化窒素ラジカルは、容易にスーパーオキシドアニオンと反応し、とても強力で、ヒドロキシルラジカル（上記参照）と同様の性質を有する比較的安定な酸化剤である、ペルオキソ亜硝酸の生成を生じる。
【００１６】
ヒトＰＭＮの刺激によるＲＯＳ生成の阻害に関して、１２±２ｍＬ／ｍＬのＩＣ５０値は、化学発光アッセイを用いて、ＰＨＩ５によって定量した。該ＩＣ５０値は、５０％の阻害を与える試験系におけるサンプル濃度であり；ＩＣ５０値は、２つの異なったドナーからのＰＭＮの２バッチで得られる定量値の平均値±ＳＤ（標準偏差）で表される値である。ＲＯＳ生成のアッセイでの阻害効果は、細胞死によって引き起こされ得るので、該試験サンプルの細胞毒性効果もまた研究された。静止したＰＭＮを、生体染色法のＣＦＤＡ（５−カルボキシフルオレセインジアセテート）でラベルし、ＰＨＩ５でインキュベートした。続いて、死滅細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色した。１００μＬ／ｍＬのＰＨＩ５とのインキュベーションは、コントロール細胞との比較でのＰＭＮに対する細胞毒性効果はいずれも示さない事を見出した。ＰＨＩ５によるＲＯＳ生成の阻害は、ＰＭＮに対する細胞毒性効果のためではないと結論づけた。
【００１７】
上記のように、ＰＭＮの刺激によるスーパーオキシドアニオンの生成に加えて、これらのラジカルは、虚血状態が、酵素であるキサンチンデヒドロゲナーゼを、酸素からスーパーオキシドアニオンへの変換を触媒するキサンチンオキシダーゼに変換し得る慢性創傷においても生じうる。従って、該ＰＭＮまたはキサンチンオキシダーゼを介して、生成されるスーパーオキシドアニオンの除去を含む、抗酸化活性は、慢性創傷の治療において、有益であるとみなされる。ＰＨＩ５は、主にクエン酸の存在のためにスーパーオキシドアニオンの有効なスカベンジャーである事が示された。
【００１８】
ＲＯＳ生成（上記参照）のアッセイで見出された阻害は、スーパーオキシドアニオンの特異な除去によっても、引き起こされうる。オーク樹皮の抽出液（ＯＢＥ）は、ＰＭＮ機能における直接的な効果を持つことを報告している。ＰＨＩ５（ＩＣ５０ １２μＬ／ｍＬ）を用いるスーパーオキシドアニオンスカベンジャーアッセイにおいて、観察される活性の増加は、おそらく大部分は、ＰＨＩ５のクエン酸成分によるスーパーオキシドアニオンの付加的なスカベンジングのためである。従って、ＰＨＩ５は、スーパーオキシドアニオンの除去およびＲＯＳ生成の阻害作用の両方を提供し、創傷管理における本発明の有用性、特に、慢性創傷の管理を強める。
【００１９】
ＰＨＩ５もまた、補体活性の調節のための溶血性アッセイを試験した。補体系のシステムは、非適用体液性免疫の一部分であり、ヒト防御機構における重要な役割を果たしている。補体系は、Ｃ１からＣ９の補体成分を含む、２０以上のタンパク質からなる。古典的、代替的、またはレクチン経路を経由する補体の活性は、最終的に高分子膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成に導く、カスケード様方式における連続的な補体タンパクのタンパク分解開裂を生じ、バクテリア（または、溶血を経由して外来性の赤色血液細胞）の死滅を引き起こす。さらに、小分割生成物を生成し、多くの免疫制御効果を促進する。この点に関して、補体因子Ｃ３ｂは、主に病原性微生物および外来細胞（ザイモサン）が、Ｃ３ｂ（オプソニン化）で覆われて、膜（例えば、ＰＭＮ等）上のＣ３ｂレセプターを有する食細胞が認識し、これらの侵略者を摂取することができ、ＲＯＳを生成することによって、それらを破壊する事ができる、生物学的機能を有する。フラグメントＣ５ａは、ＰＭＮに対する他の活性化剤であり；さらに、これらの食細胞における主要な走化性因子である。
【００２０】
補体活性の阻害は、Ｃ５ａのような補体分割生成物の生成を制限する。上記のように、これによって、創床のＰＭＮの刺激の少ない流入および減少が生じ、それ故、ＲＯＳおよびペルオキシ亜硝酸の細胞外形成を減らし、それによって、組織損傷が減少した。
【００２１】
他の因子が支配する創傷治癒もまた、重要でありうるが（例えば、ＭＭＰ）、ＰＨＩ５は、古典的な経路を経由して、ヒトの補体活性を阻害し、ＰＭＮによって活性化され、ＲＯＳの生成を阻害する。さらに、ＰＨＩ５に関連するクエン酸は、スーパーオキシドアニオンの除去に寄与している事が見出されている。当該ＲＯＳレベルの減少は、創傷管理、特に慢性創傷管理において、本発明の該成分である金属イオンおよびクエン酸を含んだ調製液で観察された有益な効果に寄与する。
【００２２】
先行技術であるオーク樹皮の抽出液と本発明の該合成成分のＩＣ５０値の比較を図１〜３に示した。それらの図は、これら２つの組成物のＩＣ５０値のグラフであって、スーパーオキシドアニオンスカベンジャーアッセイで測定したもの（図１）、化学発光アッセイで測定したもの（図２）、および古典的経路の補体アッセイで測定したもの（図３）である。これらのグラフからわかるように、ＰＨＩ５は、スーパーオキシドの除去およびＰＭＮの阻害（化学発光アッセイ）に関して、天然のオーク樹皮の抽出液（ＯＢＥ）より効果的であり、補体活性の調節に関してのみ、僅かに効果が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、天然のオーク樹皮の抽出液と本発明の合成溶液をスーパーオキシドアニオンスカベンジャーアッセイによって、定量されるＩＣ５０値のグラフの比較である。
【図２】図２は、天然のオーク樹皮の抽出液と本発明の合成溶液を化学発光アッセイによって、定量されるＩＣ５０値のグラフの比較である。
【図３】図３は、天然のオーク樹皮の抽出液と本発明の合成溶液を古典経路の補体アッセイによって、定量されるＩＣ５０値のグラフの比較である。
【図１】
2006511585.tif 000002
【図２】
2006511585.tif 000003
【図３】
2006511585.tif 000004
【国際調査報告】
2006511585.tif 000005