(57)【要約】エレクトロポレーションを使用して、細胞増殖因子をコードする核酸のトランスフェクションによって提供される創傷治癒を増殖する。その方法に対して影響を受けやすい創傷としては、特に、皮膚損傷、筋肉損傷、骨損傷、熱傷、および胃腸吻合が挙げられる。キットは、電極および細胞増殖因子をコードする核酸を含む。本発明の第１の実施形態において、患者の創傷治癒を促進するための方法が提供される。増側因子をコードする核酸が、患者の創傷部位に投与される。そのコードされた増殖因子の発現を増大させるのに十分な量で、その創傷部位に対して電場が印加される。第２の実施形態において、患者の創傷治癒を促進する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における創傷治癒を促進する方法であって、該方法は、以下：
増殖因子をコードする核酸を患者の創傷部位に投与する工程；および
該コードされている増殖因子の発現を増大するのに十分な量で該創傷部位に電場をかける工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記電場が、パルスでかけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１〜１００のパルスが、前記創傷部位においてかけられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記パルスが、１マイクロ秒〜５秒の持続時間である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記電場が、約１０〜約５，０００Ｖ／ｃｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記パルスが、方形波パルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記創傷が、皮膚性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記創傷が、筋肉性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記創傷が、骨性病変である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記創傷が、胃腸吻合である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子−１（ＫＧＦ−１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記増殖因子が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である、請求項１に記載の方法。  
【請求項１３】
前記増殖因子が、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖因子が、低酸素誘導因子１−α（ＨＩＦ１−α）である、請求項１に記載の方法。  
【請求項１５】
前記創傷が、熱傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記電場が、内視鏡を介してかけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記創傷が、衰弱性壊死である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２つの増殖因子をコードする１以上の核酸が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が、プラスミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者は、糖尿病である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記創傷焼痂が、前記核酸を投与する前に外科的に取り除かれる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
患者の創傷治癒を促進する方法であって、該方法は、以下：
患者の創傷部位にＨＩＦ−１αをコードする核酸を投与する工程；および
５００Ｖ／ｃｍと２，０００Ｖ／ｃｍとの間で、１０ミクロ秒と１００ミクロ秒との間の、１と２０との間のパルスを、該創傷部位に印加して、それによって、創傷治癒を刺激する工程；
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記創傷焼痂が、前記核酸を投与する前に外科的に取り除かれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸が、プラスミドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
創傷を処置するためのキットであって、該キットは、以下：
増殖因子をコードする核酸；および
創傷に対して電場を印加する１以上の電極
を備える、キット。
【請求項２６】
前記電極が、使い捨て式である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記電極が、滅菌性である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記電極が、針形状である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記電極が、パドル形状である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記電極が、円盤形状である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
前記電極が、ステンレス鋼である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３２】
前記電極が、金被覆されている、請求項２５に記載のキット。
【請求項３３】
前記電極が、金メッキされている、請求項２５に記載のキット。
【請求項３４】
前記電極が、金端部である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３５】
前記電極が、真鍮である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３６】
前記電極が、核酸で被覆されている、請求項２５に記載のキット。
【請求項３７】
１以上の電極を受けるための再使用可能なハンドルをさらに備える、請求項２６に記載のキット。
【請求項３８】
前記核酸が、１以上の電極とは離れている容器中にある、請求項２５に記載のキット。
【請求項３９】
電場を発生するように配置されたエレクトロポレーターをさらに備える、請求項２５に記載のキット。
【請求項４０】
電気パルスを発生するように配置された、エレクトロポレーターをさらに備える、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮出願番号６０／４７１，８２９（２００３年５月２０日出願）および米国仮出願番号６０／４３７，３９２（２００２年１２月３１日出願）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、創傷治癒に関連する。特に、より迅速であり、そして／または完全である、創傷治癒を促進するような処置に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
増殖因子の外因性の適用は、創傷治癒を改善する可能を秘めていることが示された１〜３。しかし、送達されたペプチドの半減期が短いために、頻繁な投与をする必要性によって、それらの臨床的な効力が制限されてきた。増殖因子をコードするＤＮＡを用いた遺伝子治療は、これらの因子が創傷の中で連続的に産生されることを可能にして、治癒を促進することを可能にし得る。適用およびモニタリングにとってのその利用しやすさ、ならびに必要である場合、その組織を取り除くことが可能であることに起因して、皮膚は、遺伝子治療にとって魅力的で可能性のある標的である４。
【０００４】
ウイルス媒介遺伝子送達方法は、高いトランスフェクション効率を誇るが、その安全性および潜在的な病原性に関して大変な憂慮が存在する５。しかし、非ウイルス性インビボ遺伝子送達法の現在の手段は、依然として、効率が悪く、治療用途でのその価値は限られたものとなっている。裸のＤＮＡアプローチを用いて治療効果を達成するのに必要な、大きなＤＮＡ負荷および適用の反復は、治癒にとっては不利益なものである６。トランスフェクション効率を増大させる効果的な手段によって、臨床的な効果を生じかつ有意にその治療効果を改善するための必要とされる、ＤＮＡ量の低減が可能にされ得る。
【０００５】
エレクトロポレーションが、１９８０年初期以来、インビトロでの細胞に対するＤＮＡの送達にとって、一般的に使用されてきた７。エレクトロポレーションは、細胞膜の透過性を増大させ、そして、高分子の進入を可能にするために、細胞に対して電場を印加することである８。この印加された電場は、膜電位差を増大させ、膜の絶縁耐力をより大きなものにして、荷電したポリヌクレオチドが透過し得るほどの膜欠損を生させる９。この電場の電気泳動効果（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）はまた、組織中のＤＮＡ移動性を増大させえる１０。インビボエレクトロポレーションは、腫瘍に対して直接的に化学療法剤のような薬剤を細胞内送達すること増大させるため、そして、経皮的な薬物送達を増大させるために使用されてきた９。殆どが、インビトロトランスフェクションに使用されているが、エレクトロポレーションは、同様にインビボという設定でも、有益なものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肝臓１１、１２、筋肉１３、１４、腫瘍１５、１６、および皮膚組織１７〜２０でのトランスフェクションの改善が、すべて、エレクトロポレーションを使用して実証された。
【０００７】
しかし、従来の皮膚での実験は、免疫という臨床目的で正常である、創傷のない皮膚上で実施された２１。創傷治癒のための用途において、異常な、損傷のある皮膚でのこの技術の効果は、これまで報告されていない。創傷治癒を改善するための処置方法のために技術における必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明の第１の実施形態において、患者の創傷治癒を促進するための方法が提供される。増側因子をコードする核酸が、患者の創傷部位に投与される。そのコードされた増殖因子の発現を増大させるのに十分な量で、その創傷部位に対して電場が印加される。
【０００９】
第２の実施形態において、患者の創傷治癒を促進する方法が提供される。ＨＩＦ１−αをコードする核酸が、患者の創傷部位に投与される。５００Ｖ／ｃｍと２，０００Ｖ／ｃｍとの間、および１０マイクロ秒と１０００マイクロ秒との間の、１と２０との間のパルスが、その創傷部位に対して電場が印加される。それによって、創傷治癒が、刺激される。
【００１０】
本発明の第３の実施形態は、創傷治癒のためのキットである。そのキットは、増殖因子をコードする核酸、および創傷に対して電場を印加するための１以上の電極を備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
エレクトロポレーションが、身体の創傷部位、またはその近位の細胞によるトランスフェクションの効率を増大することが、本発明者の発見である。少なくとも１つの増殖因子をコードする核酸は、自身の創傷治癒を促進し、エレクトロポレーションはその効果を増大する。
【００１２】
増殖因子をコードする任意の核酸が、使用され得る。適切な増殖因子としては、ケラチノサイト増殖因子−１、血小板由来増殖因子、血管上皮増殖因子、および低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ）１−αが挙げられるがこれらに限定されない。他の適切な増殖因子としては、ヒトＥＧＦ、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ、ヒトエリスロポイエチン、ヒトＧＤＦ−１１、ヒト成長ホルモン放出因子、ヒトＨＧＦ、ヒトＫＧＦ、ヒトＬＣＧＦ、ヒトＬＩＦ、ヒトミオスタチン（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、ヒトオンコスタチン（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ、ヒトＳＣＦ、ヒトトロンボポイエチンおよびヒトＶＥＧＦが挙げられる。使用され得るさらに他のものとしては、以下が挙げられる：ヒト血管形成タンパク質（ヒトＡＣＥ、ヒトアンギオゲニン、ヒトアンギオポイエチン、および  ヒトＡｎｇｉｏｓｔａｔｉｎを含む）；ヒト骨形態形成タンパク質（ヒトＢＭＰ−１３／ＣＤＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−１４／ＣＤＭＰ−１、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、およびヒトＢＭＰ−７を含む）；ヒトコロニー刺激因子（ヒトｆｌｔ３−Ｌｉｇおよび、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ、および  ヒトＭ−ＣＳＦを含む）；ヒト線維芽増殖因子（ヒトＦＧＦ−１０、ヒトＦＧＦ−１６、ヒトＦＧＦ−１７、ヒトＦＧＦ−１８、ヒトＦＧＦ−１９、ヒトＦＧＦ−２０、ヒトＦＧＦ−４、ヒトＦＧＦ−５、ヒトＦＧＦ−６、ヒトＦＧＦ−８、ヒトＦＧＦ−９、ヒト酸性ＦＧＦ、およびヒト塩基性ＦＧＦを含む）；ヒトＩＧＦ（ヒトＩＧＦ−Ｉ、およびヒトＩＧＦ−ＩＩを含む）；ヒトＰＤＧＦ（ヒトＰＤＧＦ（ＡＡホモダイマー）、ヒトＰＤＧＦ（ＡＢヘテロダイマー）、およびヒトＰＤＧＦ（ＢＢホモダイマー）を含む）；ヒトＰＩＧＦ（ヒトＰＩＧＦ−１、およびヒトＰＩＧＦ−２を含む）；ヒト幹細胞増殖因子（ヒトＳＣＧＦ−α、およびヒトＳＣＧＦ−βを含む）；ヒトトランスフォーミング増殖因子（ヒトＴＧＦ−ａｌｐｈａ、およびヒトＴＧＦ−βを含む）。ヒト増殖因子が上に列挙されているが、特に、その患者が非ヒト動物でるとき、非ヒト増殖因子が使用され得る。
【００１３】
増殖因子をコードする核酸は、プラスミドまたはウイルスベクター、または当該分野で知られている他のベクター中に存在し得る。このようなベクターは、周知であり、そして、いずれも、特定の用途に関して選択され得る。本発明の１つの実施形態において、その遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよび増殖因子をコード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターおよび細胞増殖によって活性化されるプロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーターおよびチミジレートシンターゼプロモーター）である。他の好ましいプロモーターとしては、ウイルス感染によって活性化可能であるプロモーター（例えば、α−インターフェロンプロモーターおよびβ−インターフェロンプロモーター）、ならびにホルモン（例えば、エストロゲン）によって活性化可能であるプロモーターが挙げられる。使用され得る他のプロモーターとしては、ＭｏｌｏｎｅｙウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。
【００１４】
別の実施形態において、裸の増殖因子ポリヌクレオチド分子が、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されるように、遺伝子送達ビヒクルとして使用され得る。このような遺伝子送達ビヒクルは、増殖因子のＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで存在し得、特定の実施形態において、死滅したアデノウイルスに連結される。Ｃｕｒｉｅｌら，Ｈｕｆｅｎ．Ｇｅｎｅ．Ｃｈｅｒ．３  ：  １４７−１５４，１９９２。必要に応じて使用され得る他のビヒクルとしては、ＤＮＡリンガンド（Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４  ：  １６９８５−１６９８７，１９８９）、脂質−ＤＮＡの併用物（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４  ：  ７４１３  ７４１７，１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４  ：  ７８５１−７８５５，１９８７）ならびにマイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８  ：  ２７２６−２７３０，１９９１）が挙げられる。
【００１５】
増殖因子遺伝子送達ビヒクルは、必要に応じて、複製起点またはパッケージングシグナルのようなウイルス配列を含み得る。これらのウイルス配列は、アストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択され得る。好ましい実施形態において、その増殖因子遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれの様々な使用が、多くの文献に記載されており、これらの文献としては、例えば、Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３，１９８３，ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：  ６３４９，１９８４，Ｍｉｌｌｅｒら，Ｈｕｓｎａｔｚ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：  ５−１４，１９９０，米国特許番号４，４０５，７１２，同４，８６１，７１９および同４，９８０，２８９ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／０２，４６８、ＷＯ８９／０５，３４９、およびＷＯ９０／０２，８０６が挙げられる。多くのレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが、本発明において使用され得る。この遺伝子送達ビヒクルとしては、例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許番号５，２１９，７４０；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３  ：  ３８６０−３８６４，１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３  ：  ９６２−９６７，１９９３；Ｒａｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，１９９３；Ｔａｋａｍｉｙａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：  ４９３−５０３，１９９２；Ｂａｂａら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５，１９９３（米国特許番号４，７７７，１２７，ＧＢ  ２，２００，６５１，ＥＰ０，３４５，２４２およびＷ０９１／０２８０５）に記載されるようにものが挙げられる。
【００１６】
本発明の増殖因子ポリヌクレオチドはまた、濃縮剤（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と併用されて、遺伝子送達ビヒクルを形成し得る。この濃縮剤は、ポリカチオン（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、およびプトレッシン）であり得る。このような結合を形成するための多くの適切な方法が、当該分野で公知である（例えば、整理番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月３０日出願）を参照のこと）。
【００１７】
代替的な実施形態において、増殖因子ポリヌクレオチドは、リポソームと結合して、遺伝子送達ビヒクルを形成する。リポソームは、小さな、脂質の小胞であって、脂質二重層によって囲まれた、代表的には、球形であるか僅かにつぶれた構造であり、直径にして数百Åである。適切な条件のもとで、リポソームは、細胞の細胞膜と融合し得るか、またはそのリポソームが内在化した細胞内のエンドサイトーシス小胞の膜と融合し得、それによって、その内容物を細胞質に放出し得る。細胞の表面と相互作用する前に、そのリポソーム膜は、その内容物を封鎖し、かつ、例えば、分解酵素から保護する比較的不浸透性の障壁として作用する。さらに、リポソームは、合成構造体であるので、所望の特徴を取り込んだ特別に設計したリポソームが、製造され得る。例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．２３６−２４０，１９７５  （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；  Ｓｚｏｋａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６００：  １，１９８０；  Ｂａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０  ：  ４６４，１９７９  ；  Ｒｉｖｎａｙら，Ｍｅｔｈ．Ｅ７ｉｚｙｍｏＬ  １４９  ：  １１９，１９８７  ；  Ｗａｎｇら，ＰＲＯＧ  ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４  ：７８５１，１９８７，Ｐｌａｎｔら，ＡｎａＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６  ：  ４２０，１９８９，および米国特許第４，７６２，９１５号を参照のこと。リポソームは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、および増殖因子核酸を含む発現構築物（例えば、本発明として開示されたもの）を含む種々の核酸分子をカプセル化し得る。
【００１８】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正荷電）調製物、アニオン性（負荷電）、および中性調製物を包含する。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３〜７４１６，１９８７）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６０７７〜６０８１，１９８９）、および精製転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９〜１０１９２，１９９０）を機能的形態で細胞内送達するのを媒介することが示された。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから、商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの下で入手可能である。また、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５１４８〜５１５２．８７，１９９４も参照のこと。他の市販のリポソームとしては、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明について、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４１９４〜４１９８，１９７８；およびＷＯ９０／１１０９２を参照のこと。
【００１９】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能であるか、またはこれは、容易に入手可能である材料を使用して容易に調製され得る。そのような材料としては、とりわけ、ホスファチジルクロリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの材料はまた、ＤＯＴＭＡ出発材料およびＤＯＴＡＰ出発材料と適切な比で混合され得る。これらの材料を使用してリポソームを生成するための方法は、当該分野で周知である。
【００２０】
１つ以上の増殖因子が、送達される単一の核酸によってコードされ得る。あるいは、別個の核酸が、異なる増殖因子をコードし得る。異なる種類の拡散は、異なる形態であり得る。これらは、異なるプロモーターまたは異なるベクターまたは異なる送達ビヒクルを使用し得る。同様に、同じ増殖因子が、異なる形態の組み合わせにて使用され得る。
【００２１】
本発明に従う処置を受けやすい創傷は、動物の身体の表面にある創傷および内部にある創傷である。そのような創傷としては、皮膚創傷、筋肉創傷、骨損傷、胃腸吻合、褥瘡性潰瘍、胃腸潰瘍、および火傷が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、任意の哺乳動物（ヒト、ウマ、ヒツジ、霊長類（例えば、サル、類人猿、テナガザル、チンパンジー）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、有蹄類（例えば、ウシ）が挙げられる）に適用され得る。
【００２２】
印加される電界は、場の強度が１０〜５，０００Ｖ／ｃｍであり得る。適切な範囲としては、１０〜１００Ｖ／ｃｍ、１００〜５００Ｖ／ｃｍ、５００〜１，０００Ｖ／ｃｍおよび１，０００〜５，０００Ｖ／ｃｍが挙げられる。この電界は、均一であっても、パルスしていてもよい。パルスしている場合、平方波パルスが、必要に応じて使用され得る。処置されるべき損傷が内部損傷である場合、内視鏡が、その損傷に電界を局所送達するために使用され得る。
【００２３】
本発明における使用のための電極は、再使用可能であっても、使い捨て用であってもよい。使い捨てである場合、その電極は、密封した包装中で予め滅菌され得る。その電極は、身体において非反応性かつ非毒性である任意の金属製であり得る。そのような使用のための代表的な金属としては、真鍮、金、ステンレス鋼が挙げられるが、これらに限定されない。卑金属が、貴金属（例えば、金）でコーティングまたはプレーティングされ得る。その電極の形状および大きさは、処置されるべき創傷の大きさおよび身体位置に適合され得る。代表的な電極の形状としては、針、パドル、スパチュラ、直角、鉤、ボールペン、ナイフおよびディスクが挙げられるが、これらに限定されない。アダプターを受容するためのハンドルは、有利なことには、操作者を保護するために絶縁材料製であり得る。拡散は、使い捨て電極上にコーティングされ得、予備包装され得る。
【００２４】
本発明に従うキットは、１つの容器中に一緒に包装された２つ以上の品目である。本発明のキットは、代表的には、少なくとも１つの増殖因子をコードする１つ以上の核酸と、１つ以上の電極を備える。その増殖因子および電極は、それら両方を含む１つの「キット」容器中に、別個に包装され得る。あるいは、その電極は、上記核酸に浸漬または含浸され得、従って別個には包装されない。核酸は、簡便な任意の形態（凍結乾燥形態、凍結形態、または液体形態が挙げられる）で提供され得る。このキットはまた、上記電極を受容するように特に設計された、ハンドルを備え得る。このキットはまた、エレクトロポレーター機器を備え得る。この電極は、予め滅菌され得る。このキットの指示書は、包装挿入物または標識として、紙の形態で提供され得る。あるいは、外部供給源（例えば、インターネットウェブサイト）に対する言及が、提供され得る。あるいは、指示書は、そのキット内に含まれる電子媒体にて提供され得る。
【００２５】
従って、本発明の実施形態が、開示される。開示される実施形態以外の実施形態を用いて本発明を実施し得ることを、当業者は認識する。開示される実施形態は、例示のために提示されるのであり、限定のためには提示されない。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００２６】
本発明者らは、遺伝子発現を増強するためのインビボエレクトロポレーションの能力を評価した。全層皮膚切除創傷を、雌マウスの背部に作製した。ＣＭＶプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼコードプラスミドを、この創傷の辺縁に注射した。プラスミド投与の後、エレクトロポレーションパルスを、注射部位に適用した。パルスパラメーターを、一定範囲の電圧、持続期間、および数にわたって変化させた。動物を、トランスフェクション後に間隔を空けて屠殺し、そのルシフェラーゼ活性を測定した。電気パルスの適用によって、ルシフェラーゼ発現は一貫して増加した。このエレクトロポレーションの影響は、プラスミド用量５０μｇで最も顕著であり、約１０倍の増加が観察された。１７５Ｖ／ｃｍの１００μｓ持続パルス６回が、ルシフェラーゼ活性を増加するのに最も有効であることが見出された。高いパルス数は、より少ない数よりも有効ではない傾向があった。この最適なエレクトロポレーションレジメンは、創傷治癒に対して何の有害な影響も有さなかった。エレクトロポレーションは、トランス遺伝子発現の効率を増加する。エレクトロポレーションは、創傷治癒を増強するために遺伝子治療において一定の役割を有し得る。その後、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＨＩＦ−１αコードプラスミドを、ホモ接合性糖尿病マウスの創傷辺縁に注射した。これは、創傷治癒を加速することが見出された。この増強された治癒は、エレクトロポレーションした動物において、より顕著であった。
【００２７】
（実施例１）
（裸のプラスミドの注射後のルシフェラーゼ活性）
注射していない皮膚組織部位において、ルシフェラーゼ活性の証拠は存在しなかった。０．１μｇプラスミド程度の低いプラスミド投与量で、酵素活性が検出された。注射するプラスミド投与量を増加すると、ルシフェラーゼ活性の量が、試験した５００倍の範囲にわたって５０μｇまで増加された（図１）。
【００２８】
（リポフェクションおよびポリフェクション）
プラスミド溶液に、リポフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）（８０μＬ／ｍｌ）、ＤＭＲＩＥ（１２０μｌ／ｍｌ）、またはＰＥＩ（５：１の比のＰＥＩ−窒素：ＤＮＡ−リン酸）を添加すると、１９μｇの裸のプラスミド注射によって皮膚組織で観察されたルシフェラーゼ活性を、一貫して減少または消滅させた（図２）。最高のルシフェラーゼ活性は、常に、リポフェクションもポリフェクションも伴わない裸のプラスミドを注射した動物において存在した。
【００２９】
（実施例２）
（エレクトロポレーションパラメーター）
（電圧用量応答効果）
注射部位に電気パルスを局所適用すると、注射後２４時間で測定した場合に、トランスフェクション効率を一貫して増加した。注射組織にわたって印加する電圧を増加すると、ルシフェラーゼ活性の増加をもたらした（図３Ａ）。この効果は、より高いプラスミド用量で最も明らかであり、その増加は、１０倍を超えた。１８００Ｖ／ｃｍよりも高い電圧は、電極間の電気パルスのアーク放電を引き起こすか、または動物の皮膚に電気火傷の徴候をいくらか残す傾向があった。
【００３０】
（パルス数の影響）
エレクトロポレーションパルスの数を６回〜１８回に増加すると、トランスフェクション効率の増加を弱めた（図３Ｂ）。
【００３１】
（パルス持続期間の影響）
低電圧長持続期間の一連のパルス（６×２０ｍｓ、４００Ｖ／ｃｍ）は、１０μｇプラスミドでのトランスフェクション効率を増加するのに、高電圧短持続期間のパルス（６×１００μｓ、１７５０Ｖ／ｃｍ）と比較して、特には有効でなかった（図３Ｃ）。このことは、１０μｇプラスミドを用いる骨格筋組織とは対照的である。この骨格組織では、低電圧エレクトロポレーションパラメーターは、トランスフェクション効率の２０倍の増加をもたらした（図３Ｄ）。
【００３２】
（実施例３）
（最適なエレクトロポレーションパラメーターによるプラスミド用量応答効果）
最適なエレクトロポレーションを使用すると、試験した一定範囲のプラスミド用量にわたって、エレクトロポレーションの効果が観察されたが、より高用量のＤＮＡで最も有効であった。５０μｇのＤＮＡを使用すると、エレクトロポレーションは、ルシフェラーゼ活性の大きな増加が生じた。エレクトロポレーションによって、１０μｇのプラスミドは、エレクトロポレーションを用いない５０μｇの裸のプラスミドで達成されたルシフェラーゼ発現と等価なルシフェラーゼ発現を生じた（図４）。
【００３３】
（実施例４）
（トランスフェクションの期間）
皮膚組織のエレクトロポレーションは、プラスミドの単一注入の後のトランスフェクション効率の増大を生じる（図５）。エレクトロポレーションが遺伝子発現の期間に対して何らかの効果を有するか否かを調べるために、動物を、単一のプラスミド注入の後で、１日と３週間の間の様々な間隔で、画像化した（図６）。そのルシフェラーゼ活性は、エレクトロポレーション注入部位において、非エレクトロポレーション部位での活性のおよそ１０倍を超えた（第１日目で、７．７１×１０６＋５．２４×１０６  対６．８２×１０７＋２．２８×１０７であり、ｐ＜０．０１であった）。この増大した活性は、３週間の間隔までの、その実験の期間全体を通して維持された。
【００３４】
（実施例５）
（創傷治癒に対するエレクトロポレーションの効果）
最も効果的なエレクトロポレーション設定（６×１００μｓ；１７５０Ｖ／ｃｍ）の投投与を行った動物およびその投与を行わない動物で、創傷の面積および創傷の損傷強度の両方について、第７日目にて測定すると、これらの創傷パラメータに対して有害な効果を有さない。実際、エレクトロポレーションした創傷が、より開口領域の減少と伸張性強度の増大によって実証されるように、治癒を改善する、僅かに有意でない、傾向が存在する。（図７Ａおよび７Ｂ）。
【００３５】
（実施例６）
（エレクトロポレーションの有無のもとでの、創傷治癒に対するＨＩＦ  １−αプラスミドの効果）
糖尿病マウスを傷つけたときの傷のふちに、ＨＩＰ−１αのための発現ベクターを注入した場合、１０日目で、治癒の増進を示す創傷のサイズにおける有意な低下があった。デジタル画像システムを用いて決定した平均の創傷の面積は、１０５７±２６５ピクセル〜３５１±１０８ピクセルへと低減した（ｐ＝０．０５３）。エレクトロポレーション（６×１００μｓ、１８０００Ｖ／ｃｍ）を加えた場合、創傷治癒の増進においてさらに有意な漸増が、ＨＩＦ−Ｉαとエレクトロポレーションの両方を受けたそれらの動物に、見受けられた。全ての創傷は、１０日目までに、総じて治癒した。その創傷のサイズは、３５１  ±１０８から０に減少した（Ｐ＜０．０５）。
【００３６】
コントロール群において、ＨＩＦ−Ｉα挿入部位を含まないベクターでは、創傷治癒は改善しなかった。空のプラスミドベクターを用いてまたはそれを用いずに、エレクトロポレーションすると、創傷治癒が改善する傾向があった。このとき、１０日目で、柄レクトポレーション処理しない動物に対して、創傷の低減が見出された。１４日目で、破断強度を、測定すると、それらの群の間には有意な差異は存在しなかった（図１０）。
【００３７】
（実施例７）
（材料および方法）
（プラスミド）
ＣＭＶプロモーターおよびルシフェラーゼ導入遺伝子を含むプラスミドｇＷＩＺ−Ｌｕｘを、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から取得した。ＨＩＦ１−α挿入部およびＣＭＶプロモーター−を有するｐＣＥＰ４プラスミドは、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ｓｅｍｅｎｚａ博士（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＭＤ）のご厚意によるものである。プラスミドを、形質転換したＤＨ−Ｓａ細菌の培養の後に、エンドトキシンフリープラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して精製した。プラスミドを、使用するまで２ｍｇ／ｍｌの濃度で−７０℃にて貯蔵した。リポフェクタミンおよびＤＭＲＩＥ−Ｃを、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から取得した。ポリフェクタミン（ＰＥｌ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【００３８】
（プラスミド投与）
雌性の６〜８週齢のＢＡＬＢ−ｃおよびＢＫＳ．Ｃｇ−ｍＬｅｐｒｄｂ／ｄｂ（同型ホモ接合体である糖尿病の）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から取得した。全ての手順は、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された。動物を、０．０２  ｍｌ／ｇ  の１．２５％アベルチン溶液の腹膜内注射で麻酔をかけた。それらの背部の毛を剃り、５ｍｍパンチ生体検査器具を使用して、または、糖尿病マウスの場合には、４ｍｍパンチ生体検査器具を使用して、２つの対称な厚さの切除による傷を、それらの背中の左右の両方につけた。５０μＬの適切な濃度のルシフェラーゼプラスミドを、創傷の各々に、前方および後方の両方から、皮内に注射した。糖尿病の動物においては、５０μＬの媒体中の１０μｇの適切なプラスミドを、両側のふちに、前方および後方の両方から注射した。得られた皮膚の泡状突起は、そのプラスミドの皮内送達を確認して、耐性インクでマークした。創傷は、裸のままにしており、かつ、動物は、個々に収容した。
【００３９】
（エレクトロポレーション）
動物を、方形波エレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（ＥＣＭ  ８３０，ＢＴＸＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、プラスミドを投与して２分以内に注射部位においてエレクトロポレーションを行った。特注設計のピン電極（５ｍｍだけ離れた２列の１０ｍｍ平行針からなる）を使用して、エレクトロポレーション電圧を印加した（図８）。６〜１８の間の方形波パルスを、４００ボルト〜１８００ボルトの間の振れ幅において、１００μｓ〜２０ｍｓの間の持続時間の、１２５ｍｓのパルス間間隔（図９）で与えた。
【００４０】
（インビトロルシフェラーゼアッセイ）
少なくとも２４時間後、動物を屠殺し、２５ｍｍ２の標本を、印を付けた注射部位において切除した。その皮膚組織を、プロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む細胞溶解緩衝液（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中でポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。サンプルを、使用前に、１４，０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離した。各サンプルのルシフェラーゼ活性を、市販のルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて決定した。各サンプル４０μＬを、１００μＬの補因子溶液とともにルミノメーターに入れた（Ｍｏｎｏ  ｌｉｇｈｔ  ３０１０，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。１００μＬのルシフェラーゼ基質を添加し、そのプロトン放出を、次の１０秒にわたって測定した。このようなサンプルのタンパク質濃度を、プロテインアッセイキット（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して決定した。光の出力を、各サンプルのタンパク質濃度に対して正規化し、ルシフェラーゼ活性を、ＲＬＵ／μｇタンパク質として表した。
【００４１】
（インビボルシフェラーゼ画像化）
エレクトロポレーションありおよびなしのルシフェラーゼ発現の過程を評価するために、動物を、インビボルシフェラーゼ画像化システムを用いて分析した。これらの実験において、マウスに創傷を与え、前に記載されるようにプラスミドを注射したが、各動物の右側の注射部位のみを、１２５ｍｓの間隔で、１７５０Ｖ／ｃｍの６つの１００μｓパルスによりエレクトロポレーションを行った。初期のトランスフェクション後の時点で、動物に、Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内投与し、次いで、水中１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンを腹腔内注射した。従来の光学写真を撮った後に、生体発光画像を、冷却電荷結合素子カメラ（ＩＶＩＳ，Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて獲得した。発光画像を、ルシフェリン投与した後、１０分〜４０分の間の間隔で撮った。その間に、発光は、プラトー相にあることが示された。生体発光画像を、各動物の従来の画像の上に重ね、そして発光（バックグラウンド発光に対して較正した）を、画像分析ソフトウェアを（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ，Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）使用して各注射部位に関して計算した。活性を、その注射部位における等しいサイズの目的の領域に対する１秒あたりの総光子として表す。
【００４２】
（創傷治癒の測定）
動物に麻酔をかけ、前に記載したように創傷を与えた。プラスミドは、投与せず、その創傷の半分に、１２５ｍｓ間隔で、１００μｓの持続時間の６つの１７５０  Ｖ／ｃｍ方形波パルスによりエレクトロポレーションを行った。創傷を与えて７日後に動物を屠殺した。その創傷焼痂を、注意深く取り出し、その上皮化していない創傷縁を、正常なアセテートペーパーでその位置をなぞった。画像を６００ｄｐｉでデジタル化し（Ｖｉｓｉｏｎｅｅｒ  Ｐａｐｅｒｐｏｒｔ  ６０００，Ｖｉｓｉｏｎｅｅｒ，Ｆｒｅｍｅｎｔ，ＣＡ）、相称面積を、ＮＩＨ画像に基づく画像分析ソフトウェアを使用して計算した（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）。領域を、ピクセル数として表した。その背部皮膚を、その後、皮筋に対して深く、平面において取り出した。皮膚ストリップを、中間点において創傷を有する、２×０．５ｃｍ鋳型に従って切断した。各ストリップを、特注で製作したテンシオメーターに載せ、牽引力を創傷の完全な破壊が生じるまで、１０ｍｍ／分の速度で付与した。その創傷破断強度を、破損する前に、組織にわたるピーク力をニュートン単位で記録した。第２の一連の実験において、６群のＢＫＳ．Ｃｇ−ｍ  Ｌｅｐｒｄｂ／ｄｂ（ホモ接合性糖尿病）マウスを研究した。それらの群は、コントロール（創傷のみ、プラスミドなし）、エレクトロポレーションのみ（創傷あり、プラスミドなし、および１２５ｍｓ間隔で６回の１００μｓ持続時間の１８００Ｖ／ｃｍ  方形波パルス）、ＨＩＦ１−αについてのプラスミド発現ベクター、８００Ｖ／ｃｍ  エレクトロポレーションあり、およびエレクトロポレーションなし、ならびにＨＩＦ  １−α挿入物なしのプラスミド発現ベクター（ｐＣＥＰ４）ありかつエレクトロポレーションあり、またはＨＩＦ  １−α挿入物なしのプラスミド発現ベクター（ｐＣＥＰ４）ありかつエレクトロポレーションなしを含んでいた。１０日目に、創傷焼痂を注意深く取り出して、その上皮化していない創傷縁を、正常なアセテートペーパーでその位置をなぞった。画像をデジタル化し、相称面席を、第１の一連の実験と同様に計算した。創傷破断強度を１４日目に測定した。
【００４３】
（統計分析）
結果を、平均±ＳＥＭとして表した。群間の平均における差異を、適切な場合、マン−ホイットニー順位合計検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ  Ｔｅｓｔ）により、ステューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて、有意性について分析した。
【００４４】
（実施例８）
（考察）
これらの実験は、皮膚創傷組織におけるエレクトロポレーションが、プラスミドトランスフェクション効率を改善し得ることを実証する。この効果は、より高い用量のプラスミドを創傷に投与し、より高いエレクトロポレーション電圧を付与した場合、１０倍を超え、最大であった。一連の高電圧を用いると、短時間の持続時間パルスが、より低い電圧、より長い持続時間のパルスよりも、効率が優れていることが分かった。そのエレクトロポレーションプロトコールは、創傷治癒に有害でなかった。重要なことには、エレクトロポレーションは、増殖因子である低酸素症誘導因子１−αが本発明者らの糖尿病マウスモデルにおける創傷閉鎖を促進する能力を有意に改善した。ＨＩＦ  １−αプラスミド処置単独で、創傷閉鎖が速められ、その処置された創傷は、１０日で処置されていない創傷の半分未満程度しか開いていない。しかし、エレクトロポレーションを加えると、そのＨＩＦ  １−α処置した創傷は、１０日目までに完全に閉鎖した。このことは、プラスミドトランスフェクションを増強するエレクトロポレーションの治療効力を実証する。
【００４５】
破断強度を、１４日目に試験し、この時点で全ての群における創傷は閉鎖していた。その時点で、群間の破断強度に有意差はなかった。その認められる効果は、創傷治癒適用において、かなり有益であり得る。
【００４６】
遺伝子治療は、広い範囲の遺伝病および後天性疾患の両方を処置する能力を有する。皮膚は、全身処置（例えば、免疫）および局所的治療（創傷治癒の増強を含む）の両方についての遺伝子治療適用においてトランスフェクトされ得る２２。エキソビボ遺伝子治療技術を、創傷治癒の分野において使用した２１，２４が、インビボ技術は、より単純かつ時間浪費が少ないという利点を有し、このことはこの技術を、潜在的な臨床用途により適切にする２５。本発明者らおよび他の研究室における事前の経験によれば、種々の増殖因子をコードするＤＮＡプラスミドを使用すると、動物モデルにおける創傷治癒を改善し得ることが示された２６−２８。インビボ遺伝子治療についての主な障壁は、ＤＮＡ分子が効率的に発現されるような様式で、それらの分子を組織に送達することである２９。そのＤＮＡは、発現されるように、核に達しなければならない。外因性ＤＮＡは、細胞外組織において、または細胞質において隔離される傾向がある３０，３１。ウイルス遺伝子送達は、高いトランスフェクション効率で、特に非分裂性の細胞においてインビボで核進入を達成するという利点を有する。しかし、現在のウイルスメディエーターの安全性および免疫原性に関しては、重大な懸念がある。多くの技術が、皮膚および他の組織の非ウイルストランスフェクション（裸のプラスミド注入３２，３３、局所的適用３４、遺伝子銃３５およびマイクロシーディング（ｍｉｃｒｏｓｅｅｄｉｎｇ）３６を用いた微粒子送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ））について記載されてきた。しかし、これらの技術を用いたインビボトランスフェクション効率は、インビトロトランスフェクション効率よりも数桁の大きさで効率が低いままである。リポフェクションで遺伝子発現を増加させると、無血清組織培養状況においては効率的であるが、組織状況では効率的でない。リポソーム薬剤は、細胞外タンパク質に結合し、実際に、細胞へのＤＮＡ取り込みを妨げる。興味深いことに、リポフェクションは、プラスミドを中空内臓（ｖｉｓｃｉ）（血管３７，３８、肺３９および結腸４０を含む）へ管腔内送達した後に、いくらか有益でありことが示された。しかし、本発明者らは、皮膚において、その使用されるリポソーム薬剤が、裸のプラスミド単独の注入と比較した場合、トランスフェクション効率に対して悪い影響を有することを見出した。以前の報告はまた、リポフェクションまたはポリフェクションが皮膚組織において有益でないかもしれないことを示唆した。皮膚におけるエレクトロポレーションの効果と、他の組織におけるその効果とを比較することは興味深い。筋肉は、インビボエレクトロポレーションのための理想的な標的であるようである。大きなサイズの横紋筋細胞は、電場と好都合に相互作用する特性を与えることが示唆される。比較的低電圧の電場での２ｌｏｇ〜４ｌｏｇのトランスフェクション効率における増大が、横紋筋において達成された１３。皮膚における本発明者らの結果は、比較すると、適度である。本発明者らは、エレクトロポレーションが、皮膚創傷におけるトランスフェクション効率を改善する、単純、安全かつ効率的な手段であることを実証する。高電圧、短時間の持続時間、方形波電���パルスの総称した組織に適用すると、１０倍を超えて遺伝子発現が増強され得る。従って、このアプローチを用いると、プラスミドの用量は、裸のプラスミドで必要とされていた量と比較して、潜在的に、１０分の１に減少し得る。ＤＮＡ適用の用量における減少は、本発明者らが以前に報告した高用量のＤＮＡで認められた創傷治癒に対する有害な影響を減少させる可能性があるので、重要である６。増殖因子をコードする１以上の適切な導入遺伝子と組み合わせて、エレクトロポレーションは、皮膚創傷治癒適用においてかなりの能力を有する。
【００４７】
（参考文献）
【００４８】
【数１−１】
2006516264.tif 000002
【００４９】
【数１−２】
2006516264.tif 000003
【００５０】
【数１−３】
2006516264.tif 000004
【００５１】
【数１−４】
2006516264.tif 000005
【００５２】
【数１−５】
2006516264.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、エレクトロポレーション処理していない皮膚組織におけるルシフェラーゼプラスミド用量曲線を示す。
【図２】図２は、裸のプラスミド注入（１０μｇ）が、リポフェクチンまたはポリフェクチンのいずれかよりも優れていることを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、数種の濃度のプラスミド溶液での、相対的ルシフェラーゼ活性に対するエレクトロポレーション振幅の増大の効果を示す。示された電圧の６パルスを適用する。各々は、１００μｓの持続時間、および１２４ｍｓの間隔であった（＊は、そのエレクトロポレーション処理をしていない群と比較して、ｐ＜０．０５である）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１７５０Ｖ／ｃｍでの６つのパルスが、同じ特性を有する１８パルスよりも効率的であったことを示す（＊は、そのエレクトロポレーション処理をしていない群と比較して、ｐ＜０．０５である）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、高電圧、短い持続期間（１７５０Ｖ／ｃｍ，１００μｓ）  の系列にある、６つのパルスが、持続時間がさらに長いパルス（４００Ｖ／ｃｍ、２０ｍｓ）よりも効果的であることを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、６つの低電圧（２００Ｖ／ｃｍ）、長い持続時間（２０ｍｓ）が、骨格筋組織で、ルシフェラーゼ活性の２０倍の増大を生じたことを示す＊は、そのエレクトロポレーション処理をしていない群と比較して、ｐ＜０．０１である）。
【図４】図４  は、エレクトロポレーションの効率に対するプラスミド負荷量を増大する効果を示す。６×１００μｓ、１７５０Ｖ／ｃｍのパルスは、１２５ｍｓの間隔で与えられる（＊は、そのエレクトロポレーション処理をしていない群と比較して、ｐ＜０．０５である）
【図５】図５は、５０μｇのルシフェラーゼプラスミドの注入の後に、単一のマウスの連続的に取得した生体発光画像を示す。その動物の右側にある創傷のみを、エレクトロポリマーレート処理した。画像を、１日目、７日目、および１４日目にとった。
【図６】図６は、非エレクトロポレーション処理群と比較したときの、エレクトロポレーション処理のある場合およびそれらが無い場合の、単一の裸のプラスミド注入の後の、ルシフェラーゼ活性の時間経過を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、エレクトロポレーション処理した創傷およびエレクトロポレーション処理していない創傷における、７日目の創傷領域を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、エレクトロポレーション処理した創傷およびエレクトロポレーション処理していない創傷における、７日目の破断強度を示す。
【図８】図８は、ピン電極の設計の概略を示す。
【図９】図９は、方形波型のエレクトロポレーションの特徴を示す。
【図１０】図１０は、皮膚創傷の治癒を促進するＨＩＦ−１αプラスミド発現ベクターの能力の効力が、エレクトロポレーションによって増大されたことを示す。＃  Ｐ＝０．０５３  対  コントロール群である。コントロールに対して＊ｐ＜０．０５であり、非エレクトロポレーションに対して＊ｐ＜０．０５である。
【図１】
2006516264.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
2006516264.tif 000021
2006516264.tif 000022
2006516264.tif 000023
2006516264.tif 000024