(57)【要約】本発明は、１０〜１０００μｍの平均粒径を有し、ａ）２０℃で少なくとも１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー５〜６０質量％、ｂ）リガンドの求核性基とのポリマー類似の反応において共有結合することができる付加的な官能基を有するビニル重合性モノマー１〜４０質量％、ｃ）重合性のエチレン性不飽和基を２つ以上有する架橋性でラジカル重合性の親水性モノマー１０〜４０質量％およびｄ）２０℃で最大１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー１０〜６０質量％なるコポリマーを含有し、その際、モノマーａ）〜ｄ）は通常、合計して１００％であるマクロ孔質プラスチックビーズ材料に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜１０００μｍの平均粒径を有し、
ａ）２０℃で少なくとも１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー５〜６０質量％、
ｂ）リガンドの求核性基との反応において共有結合することができる付加的な官能基を有するビニル重合性モノマー１〜４０質量％、
ｃ）重合性のエチレン性不飽和基を２つ以上有する架橋性でラジカル重合性の親水性モノマー１０〜４０質量％
からなるコポリマーを含有するマクロ孔質プラスチックビーズ材料において、さらに
ｄ）２０℃で最大１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー１０〜６０質量％が含有されており、その際、モノマーａ）〜ｄ）は通常、合計して１００％であることを特徴とする、マクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項２】
多孔度が、テトラヒドロフラン中での逆相サイズ排除クロマトグラフィーにより測定して０．３〜０．９のＫＰＳ１０値であることにより特徴付けられている、請求項１記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項３】
水中での膨潤指数が１〜１．５である、請求項１または２記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項４】
モノマーａ）としてメトキシポリエチレングリコールメタクリレートおよびメチルメタクリレートがコポリマー中に含有されている、請求項１から３までのいずれか１項記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項５】
カンジダ−アンタクティカからのリパーゼを固定した後に少なくとも１５０［Ｕ／ｇ］のトリブチリン−加水分解活性が得られる、請求項１から４までのいずれか１項記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項６】
カンジダ−アンタクティカからのリパーゼを固定した後に少なくとも８０［Ｕ／ｇ］のフェニルエチルアセテート−加水分解活性が得られる、請求項１から４までのいずれか１項記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項７】
カンジダ−アンタクティカからのリパーゼを固定した後に少なくとも１００［Ｕ／ｇ］のフェニルエタノール−ラセミ体分割活性が得られる、請求項１から４までのいずれか１項記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料。
【請求項８】
懸濁重合による、請求項１から７までのいずれか１項記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料の製造方法。
【請求項９】
アミノ酸、ペプチド、蛋白質、特に酵素または抗体、核酸または多糖類のようなリガンドを共有結合するための請求項１から７までのいずれか１項記載のマクロ孔質プラスチックビーズ材料の使用。
【請求項１０】
リパーゼを固定化するための請求項９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は架橋した（メタ）アクリレートプラスチックからなるコポリマーを含有するポリマー担体系の分野および特にマクロ孔質プラスチックビーズ材料に関する。
【０００２】
従来技術
架橋した（メタ）アクリレートプラスチックからなるコポリマーを含有するポリマー担体系はたとえばＥＰ−Ａ０３２８７６７、ＥＰ−Ａ４２４１３０、ＥＰ−Ａ５７９９２８またはＷＯ９９／３３９６４から公知である。
【０００３】
ＷＯ９９／４０１２２（ＤＥ−Ａ１９８０４５１８）はモノマー相の逆懸濁重合により、ビーズ状の架橋した親水性の、求核性基を有するリガンドに対して結合活性なコポリマーを製造する方法に関する。該発明はさらに該方法により得られ、ペニシリンアミダーゼに対して高い結合能を有し、かつ低い膨潤指数を有する担体ポリマー材料ならびにその使用に関する。
【０００４】
架橋した（メタ）アクリレートプラスチックからなるコポリマーは次のモノマーの逆懸濁重合により得られる：
ａ）室温で少なくとも１０％の水溶液を形成するビニル基を有するラジカル重合性の親水性モノマー５〜４０質量％、
ｂ）ビニル基および重合体類似の反応においてリガンドの求核性基と共有結合することができる付加的な官能基を有するラジカル重合性モノマー３０〜５０質量％、
ｃ）エチレン性不飽和の重合性基を２つ以上有する架橋性でラジカル重合性の親水性モノマー２０〜６０質量％。
【０００５】
該コポリマーは種々のタイプの酵素のための担体材料として適切である。
【０００６】
課題および解決方法
ＷＯ９９／４０１２２から出発して、特に比較的疎水性の基質を反応させることができる酵素のため、有利にはリパーゼのための効果的な担体材料として適切な別のマクロ孔質プラスチックビーズ材料が提供されるべきである。その際、ＷＯ９９／４０１２２により公知の材料の有利な特性、たとえばその低い膨潤指数はできる限り損なわれるべきではない。さらに、リパーゼの結合後に試験系、たとえばトリブチリン−加水分解、トリアセチン−加水分解、フェニルエチルアセテート−加水分解および／またはフェニルエチルアセテート−合成において比較的高い活性を示すマクロ孔質プラスチックビーズ材料が提供されるべきである。
【０００７】
上記課題は、１０〜１０００μｍの平均粒径を有し、
ａ）２０℃で少なくとも１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー５〜６０質量％、
ｂ）リガンドの求核性基との反応において共有結合することができる付加的な官能基を有するビニル重合性モノマー１〜４０質量％、
ｃ）重合性のエチレン性不飽和基を２つ以上有する架橋性でラジカル重合性の親水性モノマー１０〜４０質量％
からなるコポリマーを含有するマクロ孔質プラスチックビーズ材料において、さらに
ｄ）２０℃で最大１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー１０〜６０質量％が含有されており、その際、モノマーａ）〜ｄ）は通常、合計して１００％であることを特徴とする、マクロ孔質プラスチックビーズ材料により解決される。
【０００８】
発明の実施
平均粒径Ｖ５０
マクロ孔質プラスチックビーズ材料は１０〜１０００、有利には５０〜６００、特に有利には１００〜５００、特に２００〜４００μｍの平均粒径Ｖ５０を有する。
【０００９】
平均粒径Ｖ５０の測定はたとえば粒子分析装置により行うことができる。この場合、通常、１０３〜１０６粒子の粒子濃度を有する試料に湿潤助剤として若干の界面活性剤を添加し、かつさらに測定前に粒子の分離のため、超音波により処理する。
【００１０】
多孔度
マクロ孔質プラスチックビーズ材料は、たとえばテトラヒドロフラン中での逆相サイズ排除クロマトグラフィーにより測定可能なＫＰＳ１０値０．３〜０．９、特に０．３５〜０．６により特徴付けることができる多孔度を有していてよい。
【００１１】
水中での膨潤指数
マクロ孔質プラスチックビーズ材料は１〜１．５、特に１．０５〜１．２の水中での膨潤指数を有していてよい。
【００１２】
モノマー組成
コポリマーは本発明によればモノマーのタイプａ）〜ｄ）のラジカル重合した単位からなり、該単位は前記の量比で存在しており、かつ通常、合計して１００質量％である。その際、疎水性基質の反応のための特性は実質的に個々のモノマーの選択および該モノマーの量的な割合により決定される。特に比較的親水性のモノマータイプａ）と、比較的疎水性のモノマータイプｄ）とのバランスは疎水性基質の反応に重要な影響を与えるようである。
【００１３】
酵素に関する結合特性は特にモノマーのタイプｂ）の選択および割合によって影響される。モノマーのタイプｃ）は架橋剤としてプラスチックビーズのサイズおよび多孔度に影響を与える。サイズおよび多孔度はふたたび酵素に関する結合能および結合した状態での該酵素の触媒挙動に影響を与える。
【００１４】
コポリマーはわずかな割合で別のビニル重合性モノマーを含有していてもよく、その際、個々の場合において該コポリマーの実質的な特性は該モノマーによって必ずしも損なわれるものではないことは当業者にとって明らかである。しかしコポリマーは通常、ラジカル重合した単位の１００％までがモノマーａ）〜ｄ）からなる。
【００１５】
モノマーａ）
モノマーａ）として２０℃で少なくとも１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー５〜６０質量％、有利には１０〜５０質量％がコポリマー中に含有されている。
【００１６】
モノマーａ）として特にアクリルアミドおよび／またはメタクリルアミド、重合性不飽和カルボン酸のヒドロキシアルキルエステル、たとえばヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレートが適切である。さらにたとえばＮ−ビニルピロリドン、メチルメタクリレートまたは３−アリルオキシ−１，２−プロパンジオールが適切である。有利であるのはメチルメタクリレートおよびメトキシポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＰＥＧＭＡ）、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）、特にメトキシポリエチレングリコールメタクリレート３５０（ＭＰＥＧＭＡ３５０）およびポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）である。
【００１７】
良好な結果は特に、メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、たとえばＭＰＥＧＭＡ３５０およびメチルメタクリレートが同時にコポリマー中に含有されている場合に得られる。両方のモノマーは合計してたとえば３０〜４５質量％含有されていてもよい。
【００１８】
モノマーｂ）
モノマーｂ）として、リガンドの求核性基との反応において共有結合することができる付加的な官能基、有利にはオキシラン基（エポキシ基）を有するビニル重合性モノマー１〜４０質量％、有利には１０〜３０質量％が含有されていてもよい。
【００１９】
リガンドとは有利には生物学的に活性な分子、特に高分子、たとえばアミノ酸、ペプチド、蛋白質、特に酵素、たとえばリパーゼ、あるいはまた核酸または多糖類であると理解すべきである。リガンドがその生物学的活性を維持しながら結合するために特にオキシラン基が適切である。
【００２０】
適切なモノマーｂ）はグリシジルメタクリレートおよび／またはアリルグリシジルエーテルおよび／またはビニルアズラクトンである。
【００２１】
グリシジルメタクリレートが有利であり、特に１５〜２５質量％の量が有利である。
【００２２】
モノマーｃ）
モノマーｃ）として、重合性のエチレン性不飽和基を２つ以上有する架橋性でラジカル重合性の親水性モノマーが１０〜４０質量％、有利には２０〜３５質量％含有されている。
【００２３】
たとえば親水性ジ（メタ）アクリレート、たとえばエチレングリコールジ（メタ）アクリレートおよびポリエチレンオキシド−ジ（メタ）アクリレートが適切である。適切なモノマーｃ）はさらにＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミドまたはＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−メタクリルアミドである。
【００２４】
有利なモノマーｃ）は１，４−ブタンジオールジメタクリレートである。
【００２５】
モノマーｄ）
モノマーｄ）として２０℃で最大１％の水溶性を有するビニル重合性モノマー１０〜６０質量％、有利には１０〜３０質量％が含有されている。
【００２６】
適切なモノマーｄ）はたとえばイソブチルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、ベンジルメタクリレートおよび２−エチルヘキシルメタクリレートである。
【００２７】
製造方法
コポリマーからなるマクロ孔質プラスチックビーズ材料は自体公知の方法で懸濁重合（真珠重合）により製造することができる。この場合、特に分散剤(distributor)、たとえば沈降水酸化アルミニウムを含有する水相を撹拌反応器中に装入する。引き続きモノマーを、有機相、たとえばシクロヘキサン中の重合防止剤、たとえば過酸化ジラウリルと共に添加する。その際、該相を撹拌下で分散させ、その際、モノマーの重合をたとえば６０〜８０℃の温度範囲で行うことができる。マクロ孔質プラスチックビーズ材料は濾過および乾燥によりバッチから取得することができる。
【００２８】
コポリマー／試験系の変種
カンジダ−アンタクティカ(Candida antarctica)からの酵素であるリパーゼが固定されたコポリマーの変種は次の試験系において良好な結果を有する。酵素の固定化はたとえばマクロ孔質プラスチックビーズ材料を市販の酵素溶液（たとえばNovozym  （Ｒ）  525F）と共に水溶液中で１〜２日間、室温で培養することにより行うことができる。引き続き酵素と結合したプラスチックビーズ材料を洗浄および乾燥させる。こうして得られた固定化物を次の試験系において試験することができる。
【００２９】
トリブチリンの加水分解（水性系および水溶性基質）
マクロ孔質プラスチックビーズ材料およびカンジダ−アンタクティカからのリパーゼからなる固定化物はたとえば少なくとも１５０［Ｕ／ｇ］、有利には少なくとも３００［Ｕ／ｇ］、特に少なくとも５００［Ｕ／ｇ］のトリブチリン−加水分解活性を有する。
【００３０】
トリアセチンの加水分解（水性系、水不溶性基質）
マクロ孔質プラスチックビーズ材料およびカンジダ−アンタクティカからのリパーゼからなる固定化物はたとえば少なくとも５０［Ｕ／ｇ］、有利には少なくとも１００［Ｕ／ｇ］、特に少なくとも１５０［Ｕ／ｇ］のトリアセチン−加水分解活性を有する。
【００３１】
１−フェニルエチルアセテートの加水分解によるラセミ体分割（水性系、水不溶性基質）
マクロ孔質プラスチックビーズ材料およびカンジダ−アンタクティカからのリパーゼからなる固定化物はたとえば少なくとも８０［Ｕ／ｇ］、有利には少なくとも１００［Ｕ／ｇ］、特に少なくとも１５０［Ｕ／ｇ］のフェニルエチルアセテート−加水分解活性を有する。
【００３２】
エステル交換反応による１−フェニルエタノールのラセミ体分割（非水性系）
コポリマーおよびカンジダ−アンタクティカからのリパーゼからなる固定化物はたとえば少なくとも１００［Ｕ／ｇ］、有利には少なくとも１２０［Ｕ／ｇ］、特に少なくとも１８０［Ｕ／ｇ］のフェニルエタノール−ラセミ体分割活性を有する。
【００３３】
使用
マクロ孔質プラスチックビーズ材料はペプチド、蛋白質、核酸または多糖類の固定化のために、有利にはリゾプス、アスペルギルス、ムコール、アルカリゲネス、カンジダ、シュードモナス、テルモミセス(Thermomyces)、クロモバクテリウム、ブタ膵臓からのリパーゼの固定化のために、ならびにストレプトマイシスおよびアクチノマヅラからのホスホリパーゼの固定化のために、ならびにブタ肝臓および橙皮からのエステラーゼの固定化のために使用することができる。
【００３４】
本発明によるマクロ孔質プラスチックビーズ材料は、撹拌反応器または貫流反応器中で存在するオキシラン基によりリガンドを共有結合するための担体材料として使用することができる。これはたとえば濃縮液から蛋白質、特に酵素を、その生物学的活性を維持しながら共有結合により付加することにより行うことができる。さらにペプチド、アミノ酸、リピド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子の求核性化合物または有機金属化合物を担体ビーズのオキシラン基と反応させることもできる。
【００３５】
リガンドにより負荷されたポリマービーズは自体公知の方法でキラルな物質、たとえばアミノ酸（ｄ−フェニルアラニン、ｐ−ヒドロキシ−ｄ−フェニルアラニン、Ｉ−ｔ−ロイシン）または医薬、たとえばβ−ラクタム抗生物質、イブプロフェンを立体特異的に合成するために使用することができる。
【００３６】
もう１つの適用分野はファインケミカルまたは化学合成のためのベース製品（たとえばリンゴ酸）の合成である。ポリマービーズは吸着クロマトグラフィーまたはゲル透過クロマトグラフィーのための分離技術においても使用することができる。特異的な吸着のためにポリマービーズを抗血清からの免疫グロブリン画分またはモノクローナル抗体により負荷することができる。もう１つの使用分野として酵素または抗体により負荷した担体ポリマーの、病原物質もしくは毒性物質を全血から除去する体外治療における吸着剤としての使用が挙げられる。
【００３７】
実施例
１．コポリマー変種の例
【００３８】
【表１】
2006504816.tif 000002
【００３９】
例１：コポリマー変種１３の製造方法
相比：
水：モノマー（＋溶剤）＝２：１（これは変更可能である）、たとえば１：１または１：２。
【００４０】
モノマー：溶剤＝２：１（これは変更可能である）、たとえば１：１または１：２。
【００４１】
全ての水量［８１０ｇ］および硫酸アルミニウム［５．４ｇ］を、熱電対、浴サーモスタット、還流冷却器、窒素導入管を備えた２Ｌの撹拌反応器中に撹拌下および窒素導入下で装入し、かつ７０℃に加熱する。前記の内部温度に達したら、水酸化アルミニウムを沈澱させるためにソーダ溶液［２４ｇ］を一度に添加する。引き続き補助分散剤Ｃ１５−パラフィンスルホネート、Ｎａ塩およびポリエチレングリコール５０００／６０００［それぞれ０．０５ｇ］の添加を行う。水相のｐＨ値は約５．５である。その後、
イソブチルメタクリレート７４ｇ、
メチルメタクリレート７４ｇ、
グリシジルメタクリレート５４ｇ、
１，４−ブタンジオールジメタクリレート６７．５ｇ
ならびに
ジラウロイルペルオキシド５．４ｇ
をシクロヘキサン１３５ｇ中に溶解して添加する。その後の２０分で内部温度は７０℃から７２℃に上昇する。最高温度の後、７０℃でさらに２時間、後加熱する。引き続き４０℃に冷却し、かつ５０％の硫酸１０ｍｌで酸性にする。該バッチをさらに冷却し、素焼吸込フィルタ（布製濾過器）上に排出し、かつ脱イオン水５Ｌで洗浄する。湿ったビーズを流動床乾燥器中５０〜６０℃で９０分間乾燥させる。
【００４２】
例２：コポリマー変種６０のための製造方法
全ての水量［８１０ｇ］および硫酸アルミニウム［５．４ｇ］を、熱電対、浴サーモスタット、還流冷却器、窒素導入管を備えた２Ｌの撹拌反応器中に撹拌下および窒素導入下で装入し、かつ７０℃に加熱する。前記の内部温度に達したら、水酸化アルミニウムを沈澱させるためにソーダ溶液［２４ｇ］を一度に添加する。引き続き補助分散剤Ｃ１５−パラフィンスルホネート、Ｎａ塩およびポリエチレングリコール５０００／６０００［それぞれ０．０５ｇ］の添加を行う。水相のｐＨ値は約５．５である。その後、
イソブチルメタクリレート５４ｇ、
メチルメタクリレート５４ｇ、
グリシジルメタクリレート５４ｇ、
１，４−ブタンジオールジメタクリレート６７．５ｇ
メトキシポリエチレングリコールメタクリレート４０．５ｇ
ならびに
ジラウロイルペルオキシド５．４ｇ
をシクロヘキサン１３５ｇ中に溶解して添加する。その後の２０分で内部温度は７０℃から７２℃に上昇する。最高温度の後、７０℃でさらに２時間、後加熱する。引き続き４０℃に冷却し、かつ５０％の硫酸１０ｍｌで酸性にする。該バッチをさらに冷却し、素焼吸込フィルタ（布製濾過器）上に排出し、かつ脱イオン水５Ｌで洗浄する。湿ったビーズを流動床乾燥器中５０〜６０℃で９０分間乾燥させる。
【００４３】
例３：コポリマー変種のポリマー分析
【００４４】
【表２】
2006504816.tif 000003
【００４５】
平均粒径Ｖ５０の測定：
平均粒径をＬ．Ｏ．Ｔ．ＧｍｂＨ社のＣＩＳ１粒子分析装置により測定する。試料の準備：粒子の濃度が１０３〜１０６になるまで試料を４００ｍｌのガラスビーカーに添加する。次いで湿潤助剤としての界面活性剤を数滴、試料に添加する。次いで脱塩水３５０ｍｌで満たす。得られる懸濁液を超音波で約１分間処理し、かつ次いでＣＩＳ１装置、測定範囲５〜６００μｍで測定する。
【００４６】
分配係数ＫＰＳ１０の測定：
逆相サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、使用されるプローブ分子が到達できる細孔容量の割合を測定する。こうして得られる分配係数は試料の多孔度のための尺度である。Ｍｅｒｃｋ  Ｓｕｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅガラス製カラム３００×１０ｍｍをＴＨＦおよびテトラクロロエチレンを用いる平衡密度(balanced density)の原理によってビーズポリマーで満たす。次いでカラムを充填し、かつＴＨＦ１５０ｍｌを流速１５ｍｌ／分で供給することにより平衡化する。その後、カラムを閉鎖し、かつさらにテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５０ｍｌを１０ｍｌ／分の流速で供給する。この場合、＞２０バールの圧力を回避すべきである。というのも、その場合、カラムが著しく圧縮され、かつ適切なカラムの充填が達成されないからである。次いでプローブ分子を順次、カラムに添加し、かつ０．２ｍｌ／分の流速で溶離する。排除限界値をｏ−ジクロロベンゼンおよびポリスチレン６７７００００（分子量６７７００００ダルトン）により測定し、プローブ分子としてポリスチレン１０２００（分子量１０２００ダルトン）を使用する。
【００４７】
分配係数は溶出体積から次のとおりに計算される：
ＫＰＳ１０＝ＶＥ（ＰＳ１０２００）−ＶＥ（ＰＳ６７７００００）／ＶＥ（ｐ−ジクロロベンゼン）−ＶＥ（ＰＳ６７７００００）
その際：
ＫＰＳ１０＝ポリスチレン１０２００に関する分配係数、
ＶＥ（ＰＳ１０２００）＝プローブ分子ポリスチレン１０２００の溶出体積、
ＶＥ（ＰＳ６７７００００）＝排除マーカーポリスチレン６７７００００の溶出体積、
ＶＥ（ｏ−ジクロロベンゼン）＝排除マーカーｏ−ジクロロベンゼンの溶出体積。
【００４８】
膨潤指数の測定：
担体３ｇを０．５ｍｌの目盛を有する２５ｍｌのメスシリンダーに秤量する。メスシリンダーを軽くたたいて表面を均し、かつ充填体積ＶＴをｍｌで記録する。次いで０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ８０の溶液９ｍｌを限外濾過水に添加し、かつメスシリンダーを密閉する。１時間以内にメスシリンダーを４回、１５分間の間隔で強力に振とうする。その後、壁に付着しているビーズを、限外濾過水中の０．０１％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ８０溶液２〜３ｍｌで洗い落とす。メスシリンダーを２時間放置し、次いで沈澱した材料と浮遊した材料との体積を読みとり、かつ加算してＶＱとする。膨潤指数はＶＱ／ＶＴの比率として定義される。
【００４９】
例４：固定化法：
方法Ｍ２：
酵素溶液Ｎｏｖｏｚｙｍ５２５Ｆ  ４ｍｌを蒸留水中のｔ−アミルアルコールの１０体積％溶液１６ｍｌに添加する。この溶液を乾燥した担体２ｇに添加する。バッチを２０℃で１．５日間、振とうする。次いでビーズをガラスフリットＰｏｒ２上ですすぎ、かつ蒸留水５０ｍｌで６回洗浄する。最後のすすぎの後、強力に吸引する。乾燥器中、乾燥ゲル上で乾燥させる。
【００５０】
方法Ｍ３：
酵素溶液Ｎｏｖｏｚｙｍ５２５Ｆ  ４ｍｌおよび純水６ｍｌを混合する。混合物を乾燥した担体２ｇに添加する。振とうし、次いで室温で１．５日間、反転させながら振とうする。次いでビーズをガラスフリットＰｏｒ２上ですすぎ、かつ蒸留水で５０ｍｌで３回および０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５  ５０ｍｌで３回洗浄する。最後の洗浄の後、強力に吸引し、かつ乾燥器中、乾燥ゲル上で乾燥させる。
【００５１】
方法Ｍ３−ａＭＥＫ：
酵素溶液Ｎｏｖｏｚｙｍ５２５Ｆ  ４ｍｌおよび純水６ｍｌを混合する。混合物を乾燥した担体２ｇに添加する。回転させながら振とうし、次いで室温で１．５日間、反転させながら振とうする。次いでビーズをガラスフリットＰｏｒ２上ですすぎ、かつ蒸留水５０ｍｌで６回洗浄する。乾燥のために強力に吸引し、かつガラスフリット上でメチルエチルケトン（ＭＥＫ）５０ｍｌを６回用いてクロマトグラフィーにより洗浄し、次いで、乾燥のために吸引する（約３０分）。ＭＥＫの代わりにその他の、部分的に、または完全に水と混和可能な溶剤、たとえばＴＨＦ、ｔ−アミルアルコール、イソプロパノール、アセトンを使用することもできる。
【００５２】
方法Ｍ４：
酵素溶液Ｎｏｖｏｚｙｍ５２５Ｆ  ４ｍｌおよび１ＭのＫＰＰ  ｐＨ７．５  ６ｍｌを混合する。混合物を乾燥した担体２ｇに添加する。回転させながら振とうし、次いで２３℃で１．５日間、放置する。次いでビーズをガラスフリットＰｏｒ２上ですすぎ、かつ蒸留水５０ｍｌで３回および０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５  ５０ｍｌで３回洗浄する。最後のすすぎの後、強力に吸引する。乾燥器中、乾燥ゲル上で乾燥させる。
【００５３】
例５：活性試験：
５．１  トリブチリンの加水分解
活性試験において酪酸の遊離を１ＭのＮａＯＨ溶液を用いた滴定により一定のｐＨ条件下で測定する。
【００５４】
装置：
ｐＨスタット滴定装置、たとえばＭｅｔｔｌｅｒ  ＤＬ５０
１００ｍｌガラス容器（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏの標準容器に類似）
ｐＨ電極ＤＧ−１１１−ＳＣ
１０ｍｌのビュレット
Ｍｅｔｔｌｅｒのプロペラ撹拌機、速度８０％
バッチサイズ：
緩衝液ｐＨ７．０、Ｆｕｌｋａ  ８２５７１  ４８．５ｍｌ
トリブチリン（１００ｍＭ）５ミリモル
酵素固定化物５０ｍｇ
実施：
トリブチリン１．４７ｍｌ（５ミリモル）を０．５Ｍのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０  ４８．５ｍｌ中で、室温でプロペラ撹拌機を用いて５分間乳化させた。エマルションのｐＨ値を１Ｍの水酸化ナトリウム溶液の添加によりｐＨ７．０に調整した（前滴定）。引き続き、固定化物５０ｍｇを添加し、これにより反応が開始される。接続された滴定装置は加水分解時間に依存するアルカリ液の消費を記録する。曲線の直線的な勾配から酵素の活性を測定する。使用される酵素量あたりｍｌ／分で記載される、ここから得られる値からＵ／ｇ固定化物として活性を直接算出することができる。
【００５５】
５．２  トリアセチンの加水分解
活性試験において酢酸の遊離を一定のｐＨ条件下で０．１ＭのＮａＯＨ溶液を用いた滴定により測定する。
【００５６】
装置：
ｐＨスタット滴定装置、たとえばＳｃｈｏｔｔ  Ｔｉｔｒｏｌｉｎｅ  Ａｌｐｈａ
１００ｍｌダブルジャケットのガラス容器
サーモスタット制御可能な水浴
撹拌スタンド放射計ＴＴＡ８０
ｐＨ電極Ｓｃｈｏｔｔ  Ｂｌｕｅ  Ｌｉｎｅ
１０ｍｌのビュレット
バッチサイズ：
０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０  １６ｍｌ
トリアセチンＭｅｒｃｋ  Ｎｏ．１０８２３８  ４００μｌ
酵素固定化物１００ｍｇ
実施：
反応容器を２５℃に温度調節する。０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０  １６ｍｌを装入し、試験すべき固定化物１００ｍｇを添加する。次いで撹拌を開始する。トリアセチン４００μｌの添加により反応を開始する。接続されている滴定装置は加水分解時間に依存するアルカリ液の消費を記録する。曲線の直線的な勾配により酵素の活性を測定する。使用される酵素量あたり、ｍｌＮａＯＨ／分で記載される、ここから得られる値からＵ／ｇ固定化物として活性を直接算出することができる。
【００５７】
５．３  フェニルエチルアセテートの加水分解
活性試験において（±）−１−フェニルエチルアセテートからの酢酸の遊離を一定のｐＨ条件下で１ＭのＮａＯＨ溶液を使用して滴定することにより測定する。
【００５８】
装置：
ｐＨスタット滴定装置、たとえばＭｅｔｔｌｅｒ  ＤＬ５０
２５ｍｌのガラス製半微量容器（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏの標準容器）
微小ｐＨ電極Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｎ  ６０００  Ａ
５ｍｌのビュレット
Ｍｅｔｔｌｅｒのマイクロプロペラ撹拌機、速度１００％
バッチサイズ：
緩衝液ｐＨ７．０、Ｆｕｌｋａ  ８２５７１  １９．２ｍｌ
（±）−１−フェニルエチルアセテート（２５０ｍＭ）５ミリモル
酵素固定化物１００ｍｇ
実施：
（±）−１−フェニルエチルアセテート８００μｌ（５ミリモル）を０．５Ｍのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０  １９．２ｍｌ中に、マイクロプロペラ撹拌機を用いて室温で５分間乳化させた。エマルションのｐＨ値を、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液の添加によりｐＨ７．０に調整する（前滴定）。引き続き固定化物１００ｍｇを添加し、このことにより反応が開始される。接続されている滴定装置は加水分解時間に依存するアルカリ液の消費を記録する。曲線の直線的な勾配により酵素の活性を測定する。使用される酵素量あたり、ｍｌ／分で記載される、ここから得られる値から活性をＵ／ｇ固定化物として直接算出することができる。
【００５９】
アセテートの約５０％が反応した後、反応を中断し、酵素を濾別し、かつメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）により後洗浄した。加水分解物をＭＴＢＥで３回抽出し、かつ合した有機相をＭｇＳＯ４により乾燥させ、かつ溶剤を回転蒸発器より濃縮する。残留物中でＨＰＬＣを用いてキラルなカラム（Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ）により反応率ならびにエダクトおよび生成物に関するエナンチオマー過剰を測定する。ＨＰＬＣ法：
床：ヘキサン：ｔ−ブタノール９８．０：２．０
流量０．５ｍｌ／分＞１．０ｍｌ／分
検出２５４ｎｍ
カラムの炉の温度２０℃
（±）−１−フェニルエチルアセテート（Ｒ）または（Ｓ）Ｒｔ＝１１．１分；Ｒｔ＝１１．９分
フェニルアセトンＲｔ＝１４．９分
（±）−１−フェニルエタノール（Ｒ）または（Ｓ）Ｒｔ＝２５．６分；Ｒｔ＝３９．１分
５．４フェニルエチルアセテートの合成
酢酸ビニルを用いた（±）−１−フェニルエタノールの（Ｒ）−１−フェニルエチルアセテートへのエステル化を測定する。反応の進行をＨＰＬＣにより測定する。その際、（Ｒ）−１−フェニルエチルアセテートの合成および（Ｒ）−１−フェニルエタノールの低減を観察する。次いで合成曲線の上昇から酵素の特異的活性を算出する。
【００６０】
装置：
２５ｍｌおよび１０ｍｌのねじ蓋式ガラス容器
Ｉｋａ  軌道振とう装置(orbital shaker)（５００ｒｐｍ）
バッチサイズ：
ＭＴＢＥ２０ｍｌまたは８ｍｌ
（±）−１−フェニルエタノール２ミリモルまたは０．８ミリモル
酢酸ビニル６ミリモルまたは２．４ミリモル
酵素固定化物５０ｍｇ
実施：
（±）−１−フェニルエタノール０．８ミリモルおよび酢酸ビニル２．４ミリモルを、軌道振とう装置上の１０ｍｌのねじ蓋式ガラス容器中、反応温度４０℃でＭＴＢＥ８ｍｌ中、５００ｒｐｍで振とうした。１０分間の定義された時間間隔で最初の１時間までに試料２０μｌを採取し、アセトニトリル４００μｌを添加し、かつＨＰＬＣカラムにより分析した。酵素活性を測定するための反応率をＲＰ−１８−ＨＰＬＣカラムにより測定した（カラムＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  ＲＰ−１８（２５０ｍｍ×５μｍ）、水：アセトニトリル５０：５０；流量０．５ｍｌ；２５４ｎｍ；ＲＴ）。エナンチオマー過剰をＨＰＬＣを用いてキラルな相により測定した（Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＤ−Ｈ）。ＨＰＬＣ法は上記を参照のこと。
【００６１】
例６：固定化物の活性
【００６２】
【表３】
2006504816.tif 000004
【００６３】
右の２つの欄は次のことが該当する：生成物のエナンチオマー純度は全ての場合において＞９９％ｅｅである。
【００６４】
【表４】
2006504816.tif 000005
【００６５】
右の２つの欄は次のことが該当する：生成物のエナンチオマー純度は全ての場合において＞９９％ｅｅである。
【００６６】
【表５】
2006504816.tif 000006
【００６７】
右の２つの欄は次のことが該当する：生成物のエナンチオマー純度は全ての場合において＞９９％ｅｅである。
【００６８】
ポリマーＡ：
メタクリルアミド  １０質量％
グリシジルメタクリレート  ２０質量％
アリルグリシジルエーテル  ２０質量％
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスメタクリルアミド  ５０質量％
からなる市販のマクロ孔質の架橋したプラスチックビーズ材料。
【００６９】
ポリマーＢ：
メタクリルアミド  ３０質量％
グリシジルメタクリレート  ２０質量％
アリルグリシジルエーテル  ２０質量％
Ｎ，Ｎ′−メチレンビスメタクリルアミド  ３０質量％
からなる市販のマクロ孔質の架橋したプラスチックビーズ材料。
【００７０】
ポリマーＣはモノマー組成においてポリマーＡに相応するが、しかし、より低い膨潤指数（＜１．５）を有する（製造はＤＥ−Ａ１９８０４５１８による）。
【国際調査報告】
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