(57)【要約】本発明は、種々のベースラインの周期的リズム振動について測定されたパラメーターを、結果として生じる種々の周期的なリズム振動について測定された同じパラメーターと比較することによる、神経組織を用いる精神活性物質の検出・特性付け方法に関する。ベースラインの周期的なリズム振動は、コリン作動性相互作用、同時沈着神経組織、または電気刺激をもたらす化学的化合物のような因子によって誘導・刺激される。結果として生じる種々の周期的リズム振動は、神経組織を、精神活性物質を含むかまたは含まない試料組成物に曝露した後に得られる。ベースラインの周期的リズム振動についてのパラメーターと結果として生じる周期的なリズム振動についてのパラメーターとを比較すると、試料組成物を用いて精神活性物質が検出され、特定の精神活性化合物のクラスに属するとして特性付けられ、そして、精神活性化合物のクラスの他のメンバーから区別され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経組織試料を用いて精神活性化合物を検出および特性付けするための方法であって、以下：
ａ）該神経組織試料を誘導因子と接触させることによって誘導される種々のベースラインの周期的なリズム振動からのパラメーターの組み合わせ、および該神経組織試料と候補試料組成物との接触後に生成される種々の結果として生じる周期的なリズム振動からのパラメーターの組み合わせを測定する工程；
ｂ）該種々のベースラインの周期的なリズム振動からの該パラメーターの組み合わせおよび該結果として生じる周期的なリズム振動からの該パラメーターの組み合わせを比較する工程；ならびに
ｃ）該候補試料組成物中の精神活性化合物の存在または非存在を検出し、精神活性化合物が存在する場合、該種々のベースラインの周期的なリズム振動からの該パラメーターの組み合わせと該結果として生じる周期的なリズム振動からのパラメーターの組み合わせとの間の差異に基づいて、該精神活性化合物を特性付ける工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記特性付ける工程が、前記精神活性化合物がメンバーである化合物のクラスを同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定された化合物のクラスと１つ以上の異なる精神活性化合物のクラスとの間の相対的な差異を比較する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記精神活性化合物を、前記化合物のクラスの他のメンバーと区別する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記パラメーターの組み合わせが、周波数および出力を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記比較する工程が、少なくとも２つのパラメーターを比較する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも２つのパラメーターが、周波数および出力である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
神経組織を用いて精神活性化合物を検出および特性付けするための方法であって、以下の工程：
ａ）誘導因子を該神経組織と接触させて、該神経組織を用いて種々のベースラインの周期的なリズム振動を生成する、工程；
ｂ）候補試料組成物を該神経組織と接触させて、該神経組織を用いて種々の結果として生じる周期的なリズム振動を生成する工程；
ｃ）該種々のベースラインからのパラメーターの組み合わせおよび結果として生じる周期的なリズム振動からのパラメーターの組み合わせを検出する工程；および
ｄ）該種々のベースラインからのパラメーターの組み合わせおよび該結果として生じる周期的なリズム振動からのパラメーターの組み合わせを比較して、該候補試料組成物中の該精神活性化合物を検出および特性付けする、工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記誘導因子を前記神経組織から除去する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記パラメーターの組み合わせが、周波数および出力を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記精神活性化合物が、ＡＭＰＡアンタゴニスト、ＡＭＰＡレセプターモジュレーター、抗不安薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗精神病薬、ベンゾジアゼピン、中枢神経系刺激剤、ドーパミン作動性薬剤、ＧＡＢＡアンタゴニスト、催眠薬、および麻酔性鎮痛薬からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記精神活性化合物が、ＡＭＰＡアンタゴニストを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＭＰＡアンタゴニストが、ＣＮＱＸ、ＤＮＱＸ、ＧＹＫＩ  ５２４６６ＨＣｌ、ジョロウグモ毒素、１−ナフチル−アセチルスペルミン、ＮＳ２５７、およびＮＢＱＸからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記精神活性化合物が、ＡＭＰＡレセプターモジュレーターを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＭＰＡレセプターモジュレーターが、アンパカインを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＭＰＡレセプターモジュレーターが、ＣＸ５１６、ＣＸ５４６、ＣＸ５５４、ＣＸ６１４、およびＣＸ６９１からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記精神活性化合物が、ベンゾジアゼピンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベンゾジアゼピンが、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロラゼパート、クロチアゼパム、ジアゼパム、エスタゾラム、エチゾラム、フルジアゼパム、フルマゼニル、フルニトラゼパム、フルラゼパム、フルトラゼパム、ハロキサゾラム、ロラゼパム、メダゼパム、ニメタゼパム、ニトラゼパム、オキサゼパム、オキサゾラム、リルマザホン、テマゼパム、およびトリゾラムからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベンゾジアゼピンが、ジアゼパム、クロルジアゼポキシド、フルラゼパム、およびトリアゾラムからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記精神活性化合物が、ＧＡＢＡアンタゴニストを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＡＢＡアンタゴニストが、ビククリン、β−ヒドラスチン、ピクロトキシン、およびＳＲ−９５５３１（ガバジン）からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＧＡＢＡアンタゴニストがビククリンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＡＢＡアンタゴニストがピクロトキシンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記種々のベースラインの周期的なリズム振動を生成するための誘導因子が、化学的化合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
前記化学的化合物が、コリン作動性アゴニスト、コリンエステラーゼインヒビター、および交感神経アゴニストからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化学的化合物が、コリン作動性アゴニストを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記コリン作動性アゴニストが、アセチルコリン、アレコール、カルバコール、メタコリン、ベタネコール、ムスカリン、およびピロカルピンからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記コリン作動性アゴニストが、カルバコールを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学的化合物が、コリンエステラーゼインヒビターを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記コリンエステラーゼインヒビターが、アンベノニウム、デメカリウム、ジヨードプロピル−フルオロホスフェート、エコチオフェート、エドロホニウム、ヒューペルジンおよびヒューペルジンアナログ、ネオスチグミン、フィゾスチグミン、ならびにピリドスチグミンからなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記コリンエステラーゼインヒビターが、フィゾスチグミンを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学的化合物が、ムスカリン性Ｍ１レセプターに選択的に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記誘導因子が、電気シグナルである、請求項８に記載の方法。
【請求項３４】
前記誘導因子が、同時沈着した神経組織である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、好ましくは、インビトロ神経組織試料上に候補試料を導入する前後の細胞外電圧の周期的なリズム振動を検出することにより、インビトロ神経組織試料を用いて精神活性化合物を検出する方法、およびこれらの方法を実行する装置に関する。細胞外電圧のパラメーターを分析すると、この候補試料を用いて精神活性物質の存在の指標およびその薬理学的活性および組成に関する情報が得られる。さらに、本発明は、このインビトロ試料内の反復神経活性を開始し、その存在を維持する方法を包含する。それに加えて、本発明は、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を促進または模倣する化合物（例えば、カルバコール）を含有する刺激組成物を導入することにより、インビトロ神経組織試料を用いて反復神経活性（例えば、ＥＥＧ）を刺激または開始する方法を包含する。
【０００２】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許出願第１０／３５２，６２９号（２００３年１月２７日に出願され、本明細書中に参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００３】
（連邦政府により支援された研究または開発に関する陳述）
米国政府は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＩＡ  ＡＧ−００５３８  ４５５３６５−２９１７４に関して提供されるように、特許権者が妥当な期間に他者に許諾することを必要とする、本発明において支払い済みの実施権および制限された状況における権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
小哺乳動物の海馬中のリズム活性は、以下の３つの周波数バンドに分類されると記述されている：４〜１０Ｈｚ（θ）、１０〜３０Ｈｚ（β）および３０Ｈｚより上（γ）（Ｔｒａｕｂら、１９９８；最近の論述については、１９９９）。θは、これらのうちで群を抜いて最も研究されているものであり、中でも、運動活性（Ｖａｎｄｅｒｗｏｌｆ，１９６９）および記憶コード化（Ｌａｎｄｆｉｅｌｄら、１９７２；Ｖｅｒｔｅｓ  ａｎｄ  Ｋｏｃｓｉｓ，１９９７）に関する。後者の考えに従うと、θと長期間相乗作用とは密接な関係にあり（Ｌａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｙｎｃｈ，１９８６；Ｌａｒｓｏｎら、１９８６；１９９３）、これは、ある種の記憶形態の推定基質である。高周波リズムの機能的な相関は、最近では、相当に関心が持たれている課題となっている。γ活性は、まず、嗅覚系で分析され（初期の概説について、Ｆｒｅｅｍａｎ，１９７５）、その結果、それによって、臭いの到達前に、臭球、梨状皮質および嗅内皮質の間に、干渉性が生得る（ＫａｙおよびＦｒｅｅｍａｎ，１９９８）。γ範囲に入る活性はまた、手掛かり提示（ｃｕｅ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）中に、視覚皮質に現れ（Ｇｒａｙ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，１９８９）、この場合、細胞を異なる受容野と過渡的に同調させることが提案されている。この仮説によれば、同調により、手掛かりの複数の特徴を干渉性描写に組み立てることができる（概説では、Ｓｉｎｇｅｒ，１９９８）。βリズムは、典型的には、高周波海馬活性の論述において、γ波とは区別されていないが、海馬スライスで、選択的に誘発されている（Ｂｏｄｄｅｋｅら、１９９７）。いずれにしても、皮質終脳での干渉性作動には高周波同調が必須であるという証拠が増加していることで、この周期的なβリズム振動および周期的なγリズム振動の原因となっている経路および神経伝達物質系を同定することの重要性が強調されてきた。
【０００５】
上行コリン作動性突出は、β範囲およびγ範囲にあるものを含めた内生の周期的なリズム振動を促進する。初期の研究（Ｓｔｕｍｐｆ，１９６５）により、コリン作動遮断剤または中隔外傷は、明白な効果がないことが分かったものの、引き続いた研究では、自由に運動しているラットの速波が、コリンエステラーゼ阻害剤であるフィゾスチグミンにより高まり、また、アンタゴニストにより実質的に低下することが示された（Ｌｅｕｎｇ，１９８５）。海馬スライスまたは嗅内スライスのコリン作動刺激は、通常、θ様活性の数秒間ものエピソードを誘発すると記述されているが（Ｋｏｎｏｐａｃｋｉら、１９８７；ＭａｃＶｉｃａｒ  ａｎｄ  Ｔｓｅ，１９８９；Ｄｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｏｎｓｏ，１９９７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｋａｕｅｒ，１９９７）、最近の実験は、それはまた、皮質スライスおよび海馬スライスにおいて、高周波リズム（２０〜４０Ｈｚ）を誘発できることを示す（Ｂｏｄｄｅｋｅら、１９９７；Ｆｉｓａｈｎら、１９９８）。コリン作動性中隔海馬線維は、海馬系の別個の領域を神経支配し（Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｓｈｕｔｅ，１９６７；Ｍｏｓｋｏら、１９７３；Ｆｒｏｔｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒａｎｔｈ，１９８５；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８７）、この場合、それらは、介在神経の亜集団と接触して、主細胞の樹状領域を選択する（Ｍｏｓｋｏら、１９７３；Ｌｙｎｃｈら、１９７８；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、１９８７）。ムスカリン様レセプターを刺激すると、錐体細胞が脱分極し、一部の介在神経からの解離が抑制され、他の介在神経の興奮性が高まる（Ｐｉｔｌｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｇｅｒ，１９９２；Ｂｅｈｒｅｎｄｓ  ａｎｄ  Ｂｒｕｇｇｅｎｃａｔｅ，１９９３）。インビボでの結果およびインビトロでの結果の組合せは、アセチルコリンが、皮質終脳で高周波活性を生じる際に、重要な役割を果たすことを示唆している。
【０００６】
コリン作動的に駆動した高周波リズムが、いかにして、皮質作動に影響を与えるかは、それらが局部的に特殊化しているかどうか、およびそれらがどのように生成されるかに依存している。カルバコール誘発された周期的なリズム振動は、嗅内皮質（Ｄｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｏｎｓｏ，１９９７）および海馬（Ｆｉｓａｈｎら、１９９８）にある制限された部位に起因していることが報告されている。領域特異性に関しては、その答えには、内側嗅領海馬系の広い範囲にわたる体系的なマッピングが必要である。
【０００７】
上記で議論した文献のいずれも、精神活性物質の薬理学的活性の存在の指標についても、その精神活性物質の薬理学的活性の特性付けについても、その精神活性物質の組成物についても、インビトロサンプルを用いて見出された高周波数の周期的なリズム振動の分析を利用しない。さらに、これらの文献のいずれも、自走周期的リズム振動条件（すなわち、周期的リズム振動誘導剤が連続して存在しないで周期的なリズム振動が起こる）下でのこのような分析を利用しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本明細書における本発明の方法は、薬理学的活性を検出し、薬理学的活性を特性付けかつインビトロ神経組織試料を用いて精神活性化合物の組成を決定する方法を包含する。関連した本発明の方法は、その神経組織と、細胞外電位の周期的なリズム振動を刺激する薬剤とを接触させる独立した工程、そして／または神経組織の共に移植したビットを利用する独立した工程、そして／または電気刺激パターンを使用して神経試料を刺激する独立した工程により、反復神経活性を様々に刺激しその始動を刺激する方法である。さらに関連した本発明の方法は、このような刺激組成、材料、組織、または電気刺激パターンを必要に応じて除去するが、それらにより誘導される周期的なリズム振動挙動を保存する工程を包含する。このような技術に続いて、その誘導される周期的なリズム振動挙動に対する精神活性化合物の効果が試験され得る。
【０００９】
一変形例において、インビトロ神経組織試料を用いて精神活性化合物を検出する方法は、この組織試料を用いて周期的なリズム振動を誘発し、次いで、その存在を検出する工程、そしてその誘導剤をおそらく除去すると同時に、その誘発された周期的なリズム振動活性を保存する工程、そしてそれらの周期的なリズム振動のベースライン値を提供する工程を包含する。その検出後、このインビトロ試料は、精神活性化合物の候補試料と接触させられる。この候補試料の導入と同時に（またはそれに引き続いて）、その周期的なリズム振動（例えば、ＥＥＧ波）が、次いで、測定される。その二組の周期的なリズム振動データは、次いで、それぞれ、２つのいわゆる「計算値」を作成するようにされる。次いで、これらの２つの計算値を比較すると、その薬理学的活性が検出でき、その薬理学的活性を特性付けでき、そして（望ましい場合）１種以上の化合物が存在しているなら、その試料を用いて精神活性化合物の組成が決定できる。
【００１０】
これらの種々の周期的なリズム振動は、典型的には、細胞外電圧中で見られるものである。例えば、それらは、θＥＥＧ波、βＥＥＧ波またはγＥＥＧ波であり得る。
【００１１】
標準的な電気生理学的システムを使用することが望ましい。複数電極ディッシュ（「ＭＥＤ」）を使用することもまた望ましく、その結果、この神経試料上の多数の異なる活性部位または活性が低い部位が、同時または順次に試料採取され得る。ＭＥＤを使用すると、空間的関係の測定および計算が可能となる；これらは、神経の周期的なリズム振動値間で測定され計算される。ＭＥＤの複数電極的な性質により、また、所定インビトロ神経試料内での領域特異的効果を決定しそして特性付けることが可能となる。
【００１２】
細胞外電圧の周期的なリズム振動の適当な数学的分析には、前後単一部位測定の振幅および周波数の差を高めるために単一空間点で測定される周期的なリズム振動の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）が挙げられ得る。
【００１３】
同様に、時間の関数としてアレイで得られる細胞外電圧の周期的なリズム振動シーケンスは、電流源密度（ＣＳＤ）解析を受けて、このインビトロ神経組織試料内で、電流流れパターンを生成しそして描写し得る。
【００１４】
本発明のさらに他の部分としては、インビトロ神経組織試料を用いて反復神経活性を刺激または誘発する傾向にある化学的または解剖学的組成物および電気刺激パターンの使用が挙げられる。これらの組成物は、アセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を模倣または促進する化合物であり得る。このような組成物は、本明細書中に記載される手順を使用して、その試料および／または試験化合物の電気生理学的解析の前、その間またはその後に、その組織試料から除去されてもよいし、されなくてもよい。それらは、共に沈着した神経組織であり得る。それらは、コリン模倣化合物であり得る。非常に望ましい化学化合物は、カルバコールである。電気刺激もまた、使用され得る。
【００１５】
別の変形例において、神経組織を用いて精神活性化合物の検出および特性付けのための方法は、１）神経組織試料と誘導剤とを接触させて、その神経組織において種々のベースラインの周期的なリズム振動を生成する工程；２）その神経組織と、候補試料組成物とを接触させて、その神経組織において種々の得られる周期的なリズム振動を生成する工程；３）その種々のベースラインからのパラメーターと得られた周期的なリズム振動からのパラメーターとの組み合わせを検出する工程；４）その種々のベースラインからのパラメーターと得られた周期的なリズム振動からのパラメーターとの組み合わせを比較して、その候補試料組成物中の精神活性化合物を検出および特性付ける工程、を包含する。そのパラメーターの組み合わせは、代表的には２つのパラメーターを含むが、その組み合わせは、２つに限定される必要はなく、そして精神活性化合物の検出および特性付けに必要な比較のために、任意の数のパラメーターを含み得る。さらに、その組のベースラインの周期的なリズム振動を生成するための誘導剤は、望ましい場合、その後除去され得る。その誘導剤は、化合物、共に沈着した神経組織、または電気刺激であり得る。
【００１６】
比較して、その候補試料組成物中の精神活性化合物を検出および特性付けるために有用なパラメーターは、周期的なリズム振動の出力（ｐｏｗｅｒ）および周波数を含むが、任意のパラメーターの組み合わせが使用され得る。好ましい変形例において、その候補試料組成物中の精神活性化合物を検出および特性付けるために使用される方法は、一般に、周波数および出力の二次元アレイを形成して、その精神活性剤を特定の精神活性化合物のクラスに属すると特性付ける工程を包含する。別の好ましい変形例において、その周波数および出力の二次元アレイはまた、一般に、その特定の精神活性化合物を、そのクラス内の他のメンバーから区別することによって、精神活性化合物を特性付ける。
【００１７】
一般に、本発明の手順は、その方法のために電気生理学的技術を利用し、その技術において：１）周期的なリズム振動は、誘導剤を用いて脳組織を用いて誘導され、２）その周期的なリズム振動は、誘導剤が除去された後も継続されている。その方法は、アゴニストおよび／または酵素インヒビターの適用、ならびに自発的に発生する周期的なリズム振動が、その誘導剤を継続して適用しなくても残ったままである組織調製技術を包含する。これらの「薬剤なし」周期的リズム振動は、化合物を検出および特性付ける改善されたアッセイ、ならびに薬物の発見および開発方法を提供し得、ここでその誘導剤の影響は、このような薬剤なし周期的リズム振動の間に行われる特性付け工程および／または検出工程には存在しない。このような方法は、多くの利点を有し、これらの利点としては、その誘導化合物が、試験物品の効果を曖昧にしない傾向があること（なぜなら、このような誘導化合物の継続的注入を必要とする先行技術の方法は、試験物品の効果を曖昧にし得るからである）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の方法は、種々の薬物（例えば、コリン作動性治療剤）の作用機構を解明するにあたって特定の用途が見出され得る。
【００１８】
本発明は、その薬理学的活性を検出し特性付け、そして種々の精神活性試験化合物または精神活性試験組成物を決定する種々の方法を包含する。これらの試験化合物を同定する多数の方法は、本発明の方法の範囲内である。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、好ましくは、インビトロ神経組織試料を用いて細胞外電圧（すなわち、電位）の周期的リズム振動を使用して、精神活性活動または精神活性組成物を検出および／または特性付けするプロセスを包含する。それに加えて、本発明のプロセスは、以下で詳述する特定の薬物（例えば、特定の化学組成物）または電気刺激技術を使用して、これらの周期的なリズム振動を刺激または誘発することを包含する。
【００２０】
標準的方法を用いるか、または神経試料の空間アレイ上でのいずれかでのインビトロ神経組織を用いる細胞外電位の測定は、公知である。例えば、Ｄｕｎｗｉｄｄｉｅら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６：３５３−３６７（１９７８）など、ならびに米国特許第５，５６３，０６７号および第５，８１０，７２５号（各々は、Ｓｕｇｉｈａｒａらの特許である（本明細書中に参考として援用される））で見られるような装置の種々の記述を参照せよ。
【００２１】
（定義）
この記載の目的で、本発明者らは、別段その語句が異なる意味を示さなければ、この節において規定されるように、以下の用語を使用する。
【００２２】
本明細書中で使用する「シンク」との用語は、細胞外媒体から神経要素に吸収される電流をいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「ソース」とは、電流が神経要素内から細胞外媒体へと導入されることをいう。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「海馬」とは、側頭葉の後ろに位置し、ヒトおよび他の動物において記憶形成および想起に関与している終脳の領域をいう。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「海馬スライス」とは、本明細書中で記載される電気生理学的記録デバイスで使用され得る、概して厚みが約１００〜５００μｍの海馬組織の物理的スライスをいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＡ１」、「ＣＡ２」、「ＣＡ３」および「ＣＡ４」は、海馬の４つの領域のうちの１つをいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「樹状突起」とは、神経細胞の細胞体から生じている高度に枝分かれした構造をいう。
【００２８】
（測定装置）
本発明のプロセスと共に好ましく使用される細胞電位測定装置は、「標準的」刺激技術および記録技術ならびに当業者に理解される変形例を含む（１つのこのような装置に関して、Ｄｕｎｗｉｄｄｉｅ  ＴおよびＬｙｎｃｈ  Ｇ（１９７８）Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６：３５３−３６７を参照のこと）。絶縁基板上の複数の微小電極；この微小電極領域の外側のいくつかの領域にこの微小電極を接続する導電性パターン；電気接点（この電気接点は、この導電性パターンの末端に接続される）；絶縁フィルム（この絶縁フィルムは、この導電性パターンの表面を覆う）；およびこの絶縁フィルムの表面にあるこの微小電極を含む領域を取り囲む壁、を採用する装置もまた好ましい。それらの参照電極は、この測定微小電極のインピーダンスよりも比較的低いインピーダンスを有し得る。それらは、この壁により取り囲まれる領域にある複数の位置で、また、しばしば、この微小電極から特定の距離で、設置され得る。この電気接点は、さらに、通常、各参照電極を配線するこの導電パターンとこの導電パターンの末端との間で、接続される。この参照電極を配線するこの導電パターンの表面は、典型的には、絶縁フィルムで覆われている。
【００２９】
典型的には、上記の他電極方法のために、これらの微小電極は、例えば、０．８〜２．２ｍｍ（３００μｍの微小電極ピッチの場合）または０．８〜３．３ｍｍ（４５０μｍの微小電極ピッチの場合）の側面を有する長方形のマトリックス配置で位置している。１つの側面上の５〜１５ｍｍの長方形の４隅に、４個の参照電極が位置する。さらに好ましくは、約１００〜４５０μｍ、好ましくは、１００〜３００μｍの中心ピッチで、８列および８行で、６４個の微小電極が位置している。
【００３０】
好ましくは、これらの微小電極および参照電極は、酸化インジウム−スズ（ＩＴＯ）フィルム上のニッケルメッキ、金メッキおよび白金黒の層から形成される。
【００３１】
この絶縁基板（例えば、ガラス基板）は、殆ど長方形であり得る。この導電性パターンの末端には、複数の電気接点が接続され得、そしてこれらは、好ましくは、この絶縁基板の４側面に設置される。結果として、複数の微小電極および参照電極の配線パターンレイアウトは、簡単である。これらの電気接点のピッチは、比較的に大きくなるように作製され得るので、電気接点を通す外部ユニットとの電気接続もまた、簡単である。
【００３２】
この微小電極領域は、通常、非常に狭い。その試料を顕微鏡で観察するとき、垂直方向および水平方向の両方での位置を区別することは困難である。この顕微鏡による視覚的な認識を、方向、軸および位置で様々にするために、この微小電極領域の近くに位置合わせ微小マークを置くことが望ましい。
【００３３】
このインビトロ神経試料の解剖学的な相関に対して電極位置を決定するために、以下の順序の事象を実行することは、さらに好ましい。アレイがこの試料の重要な領域を覆うことができるように、そのアレイ上にインビトロ神経試料の対照を設置すること、このアレイ上の対照試料の写真を撮ること、対照試料からの応答を記録すること、対照試料と同じ相対位置で、できるだけ正確に、このアレイ上に試験試料を設置すること、このアレイ上の試験試料の写真を撮ること、試験試料からの応答を記録すること、ならびに対照写真と試験写真とを比較すること、および対照応答と試験応答とを比較すること。
【００３４】
当業者に理解される代替方法には、物体認識アルゴリズムを使用すること（この場合、この物体は、このインビトロ神経試料の肉眼解剖学的構造である）、物体認識アルゴリズムデータを比較すること、および対照応答と試験応答とを比較することがある。
【００３５】
最も好ましい細胞電位測定装置は、細胞設置装置から構成され、これは、細胞電位測定電極、電気接点と接触する接触部位、および上下から挟むことにより絶縁基板を固定する電極ホルダーを有する。この細胞電位測定電極は、この細胞設置アセンブリ装置に電気的に接続され得、この試料から発生してこのような各微小電極および参照電極間で測定された電位または電位信号の処理が可能となる。この細胞電位測定アセンブリは、試料神経細胞または試験神経組織を培養する領域（これは、壁により取り囲まれている）を含み得る。それはまた、好ましくは、この壁により取り囲まれた領域で培養される細胞または組織を拡大して光学的に観察するための光学装置を含む。この細胞電位測定装置は、好ましくは、さらに、この光学装置により得られた拡大画像を保存する画像記憶装置を含む。
【００３６】
典型的には、測定ソフトウェアをインストールしたパーソナルコンピュータが含まれ、測定した細胞電位を受容する。このコンピュータおよび細胞設置装置は、典型的には、測定用Ｉ／Ｏ基板を介して接続されている。このＩ／Ｏ基板は、Ａ／Ｄ変換器およびＤ／Ａ変換器を含む。このＡ／Ｄ変換器は、通常、得られた電位を測定し変換するためにある；このＤ／Ａ変換器は、必要なとき、その試料に対する刺激信号のためにある。
【００３７】
このコンピュータにインストールされた測定用ソフトウェアは、刺激信号を与えて刺激信号を形成し、そして得られた検出信号を記録するための条件を設定するソフトウェアを含み得る。このような測定用ソフトウェアを使用することにより、このコンピュータは、細胞に刺激信号を与える手段および細胞から検出される信号を処理する手段を含み得る。このコンピュータはまた、任意の光学観察装置（ＳＩＴカメラおよび画像記録装置）および細胞培養システムを制御し得る。
【００３８】
望ましくは、細胞から検出された細胞外電位は、リアルタイムで表示され得る。それに加えて、記録された自発性の活性、電位または誘導電位は、望ましくは、細胞の顕微鏡画像の上にオーバーレイすることにより、表示される。代替的には、このソフトウェアはまた、画像処理（例えば、フィーチャー認識、エッジ検出またはエッジ増強）アルゴリズム性能を含む。この電位を測定するとき、記録された波形全体は、通常、その神経試料における波形の位置に対応して、視覚的に表示される。
【００３９】
データ分析または処理に関して、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）分析、干渉性分析および相関分析もまた、望ましい。下記で議論する変形例では、電流源密度（ＣＳＤ）解析もまた、非常に望ましい。他の使用可能な機能には、波形識別、一時的なプロフィール表示機能およびトポグラフィー表示機能を使用する、単一スパイク分離機能が挙げられ得る。これらの分析の結果は、この画像記憶装置に保存された神経試料の表示画像の上にオーバーレイすることにより、表示され得る。
【００４０】
このコンピュータから刺激信号が発せられるとき、この刺激信号は、Ｄ／Ａ変換器およびアイソレータを通って、この細胞設置装置に送られる。この細胞設置装置は、細胞電位測定電極を含み、これらは、例えば、マトリックス形状で、ガラス基板上の６４個の微小電極から形成され得、そして微小電極およびそれらの培養流体と接触する神経試料（例えば、細胞または組織のセグメント）を維持する囲壁を有する。好ましくは、この細胞設置装置に送られる刺激信号は、これらの６４個の微小電極のうちの任意の電極に適用され、次いで、この試料に適用される。
【００４１】
各微小電極と参照電位（これは、この培養液の電位である）との間で生じる誘導電位、誘発電位または自然電位は、６４チャンネルの高感度増幅器およびＡ／Ｄ変換器を通って、このコンピュータに入る。この増幅器の増幅率は、例えば、約０．１〜１０ｋＨｚまたは約０．１〜２０Ｈｚの周波数バンドで、例えば、約８０〜１００ｄＢであり得る。しかしながら、ローカットフィルターを使用することにより刺激信号によって誘発された電位を測定する場合、その周波数バンドは、好ましくは、１００Ｈｚ〜４００Ｈｚまたはそれ以上である。
【００４２】
この望ましい装置は、細胞培養システムを含み得、このシステムは、温度制御装置、培養流体循環装置、および供給機（これは、例えば、空気および二酸化炭素の混合ガスを供給する）を有する。この細胞培養システムは、市販のマイクロインキュベーター、温度制御装置およびＣＯ2シリンダーから構成され得る。このマイクロインキュベータは、ペルチェ素子によって、０〜５０℃の温度範囲で制御するのに使用でき、そして３．０ｍｌ／分以下の液体供給速度および１．０リットル／分以下の気体流量に適用できる。また、あるいは、温度制御装置を組み込んだマイクロインキュベータが使用され得る。
【００４３】
（データ測定および分析）
一般に、本明細書中で記述した手順は、細胞外電圧値または細胞外電位値の同時測定、そして好ましくは記録を使用する。このような手順は、神経組織内の単一の部位で起こりうるか、または複数の測定部位で空間的および時間的の両方で起こりうる。その空間アレイにおける測定部位の各々で、これらの信号の周波数および振幅を観察することは、さらに好ましい。神経試料の配置およびその試料中の固有の物理的境界が、光学装置および電子感知装置のいずれかを使用して観察できること、およびこれらのマージンが、全て、選択したコンピュータ内のセンサの位置と相関していることは、よりさらに好ましい。
【００４４】
複数電極方法に関して、この神経試料は、このインビトロ細胞電位測定電極アレイ上に置かれ、その試験中にその生存度を維持するために、当業者に公知の手順が使用される。この神経試料は、もし望ましいなら、培養され得る。実施例に関する典型的な手順が、以下に述べられる。これらの微小電極の各々は、細胞外電圧または細胞外電位のリズム振動について、時間の関数および周波数の関数として、モニターされる。これにより、時間の関数として、周波数および振幅の群の信号が生じる。（例えば、２Ｈｚの）ＤＣに近い領域から３５Ｈｚより高い領域まで、これらの周期的なリズム振動を測定するのが好ましい。これにより、神経リズム活性で見られる典型的な以下の３個の周波数バンドの測定維持が許容される：４〜２０Ｈｚ（θ  ＥＥＧ）、１５〜２５Ｈｚ（β  ＥＥＧ）および３０Ｈｚより高い値（γ  ＥＥＧ）。１０〜５０Ｈｚのさらに高い周波数バンドは、非常に有益である。
【００４５】
（分析）
精神活性化合物または精神活性活動の存在または特性付けに関する重要な情報を提供する１手順は、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）の使用である。ＦＦＴは、種々の異なる領域で使用され、そして通例、スペクトル分析器として公知の装置で、使用される。その測定アレイにおいて特定の測定にＦＦＴを適用すること、およびその結果を、その候補組成物の導入前の同じ位置の特定の測定値と比較することは、精神活性化合物の存在、特性付けまたは薬理学的活性に関して、有益である。具体的には、もし、この候補が、分析される神経試料の領域において精神活性であるなら、そのように分析した信号の比較により、ピークの周波数、振幅またはそれら２つの組合せにおけるシフトが明らかとなり得る。
【００４６】
有益な他のタイプの分析には、電流源密度（ＣＳＤ）解析があり、実施例４および５においてさらに記載される。この分析手順の論述は、例えば、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、「Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  Ａｎｕｒａｎ  Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９７５年３月、３８（２）：３５６−６８）で見られる。この分析手順は、上記装置により測定された電位または電圧を変換し、そしてそれらを、類似の電流の流れ（さらに重要なことには、電流の大きさ）の設定アレイに変換するのに使用される。これらの電流の大きさおよび方向を時間の関数として相関させることにより、電流「シンク」および「ソース」が観察され得る。このような「シンク」および「ソース」の位置は、このインビトロ神経組織試料に添加された精神活性薬剤の存在、特性付けまたは薬理学的活性を決定する際に、有益である。
【００４７】
（周期的なリズム振動の刺激）
本発明者らは、薬理学的／化学的方法、生理学的方法または解剖学的方法により、細胞外電圧または細胞外電位の周期的なリズム振動を多様に刺激（誘発）するのが特定の手順の実施において望ましいことを発見した。薬理学的組成物（例えば、この神経組織中のアセチルコリン、セロトニンまたはカテコールアミンの作用を促進または模倣する１種以上の化合物）を使用し得るが、他の類似の刺激もまた、許容できる。この化学刺激組成物は、カルバコール（ＣＣｈ、カルビルコリンクロライド（ｃａｒｂｙｌ  ｃｈｏｌｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ））のような１種以上のコリン模倣化合物を含み得る。本発明者らは、周期的なリズム振動が開始した後にその刺激組成物を除去すると同時に、その誘導された周期的なリズム振動挙動を保存する（その結果、試験候補精神活性組成物からの結果が混乱しない）ことが、望ましい変形例であることを見出した。
【００４８】
図１および２Ａ〜２Ｂに示され、実施例４にさらに記載されるように、カルバコール（コリン作動性アゴニスト）を神経組織に添加すると、カルバコールを除去（洗い流し）した後にも持続するリズム活性が生じる。カルバコールを、ベースライン記録の少なくとも１０分後に、２０分間の期間にわたって注入した（黒棒で示される）。
【００４９】
コリン作動性アゴニストを含む組成物に加えて、神経組織試料において周期的なリズム振動を刺激するために使用され得る薬理学的／化学的組成物としては、コリンエステラーゼインヒビター（ＡｃｈＥＩ）、および交感神経作用性アゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
コリン作動性アゴニストの例としては、アセチルコリン、アレコール（ａｒｅｃｈｏｌ）、カルバコール、メタコリン、ベタネコール、ムスカリン、およびピロカルピンが挙げられる。
【００５１】
コリンエステラーゼインヒビターの例としては、アンベノニウム、デメカリウム、ジイソプロピルフルオロホスフェート、エコチオフェート、エドロホニウム、ヒューペルジンおよびヒューペルジンアナログ、ネオスチグミン、フィゾスチグミン（ｐｈｙｓｏｔｉｇｍｉｎｅ）、ピリドスチグミンが挙げられる。
【００５２】
交感神経作用性アゴニストの例としては、ドパミンおよびノルエピネフリンが挙げられる。
【００５３】
一般に、周期的リズム振動活性の保存は、コリン作動性相互作用を調節することから得られる。図３および図６、ならびに実施例５の記載は、この概念を支持する。例えば、図３Ｂおよび図６Ａ〜６Ｅにおいて、コリンエステラーゼインヒビター（例えば、フィゾスチグミンおよびヒューペルジンアナログ）が、カルバコールで見られるリズム活性と同様に、神経組織においてリズム活性を誘導することが示される。さらに、ＣＣｈ誘導活性は、アトロピン（コリン作動性アンタゴニスト）によりブロックされる（図３Ｃ）が、ＡＰＶ（ＮＭＤＡアンタゴニスト）によってブロックされない（図３Ａ）。具体的には、そのリズム活性は、アトロピンがコリン作動性ムスカリンアンタゴニストであるので、ムスカリン様相互作用によって調節され得る。より具体的には、そのリズム活性は、Ｍ１ムスカリンレセプターとの相互作用によって調節され得る。図５Ａ〜５Ｂに示され、実施例６にさらに記載されるように、Ｍ１選択的ムスカリン様アンタゴニストであるピレンゼピン（ＰＲＺ）は、ＣＣｈに誘導される周期的なリズム振動に対するブロック効果を有するのに対して、Ｍ２選択的ムスカリン様アンタゴニストであるメトクトラミン（ｍｅｔｈｏｃｔｒａｍｉｎｅ）（ＭＴＣ）は、最小の効果しか有さないか、または、効果を有さない。
【００５４】
一旦、誘導組成物または刺激組成物をインビトロ神経組織試料に添加すると、その周期的なリズム振動の種々のベースライン値が得られる。
【００５５】
（候補試料組成物）
精神活性化合物を含んでもよいしまたは含まなくてもよい候補試料組成物は、この神経組織試料と、好ましくは、例えば、カルバコールによって刺激された種々のベースラインの周期的なリズム振動（細胞外電圧または細胞外電位のアレイ）が測定された後に、接触される。本発明者は、精神活性化合物の導入の前後で、これらの周期的なリズム振動性細胞外電圧から測定されるパラメーターの組み合わせの比較（この比較は、典型的には、それらの周波数および出力の比較を含む）が、精神活性組成物の存在および／または特性付けに関する情報を与えることを発見した。比較の組み合わせは、典型的には、２つのパラメーターを含むが、任意の数の組み合わせが使用され得る。
【００５６】
一変形例において、精神活性組成物の周期的なリズム振動の挙動は、周期的なリズム振動の周波数における変化の関数として、周期的なリズム振動の出力の変化をプロットすることにより特性付けられる。図２７および図３９は、このような二次元プロットの例示である。このプロットは、定性的様式において、誘起された電位における相対的相違が、種々の精神活性化合物を神経組織に添加することによって引き起こされることを示す。これらの相対的相違の観察または定量は、これらの化合物が属し得る種々の一般的精神活性機能群または一般的精神活性化合物クラス（例えば、ベンゾジアゼピン  対  アンパカイン）を同定し、これらの群の特定のメンバー間（例えば、ジアゼパム  対  トリアゾラム）を区別することによって、精神活性化合物の検出および特性付けを可能にする。例えば、図３９に示され、実施例１３〜１６にさらに記載されるように、コントロール（カルバコールに誘導される周期的なリズム振動）に対する比較において、ベンゾジアゼピンは、周期的なリズム振動の出力において増加をもたらし、周期的なリズム振動の周波数において何ら有意な変化をもたらさなかった；アンパカインは、周期的なリズム振動の周波数において増加をもたらし、周期的なリズム振動の出力において減少をもたらした；ＧＡＢＡアンタゴニストは、周期的なリズム振動の出力および周波数において減少をもたらした；そしてＡＭＰＡアンタゴニストは、周期的なリズム振動の出力において減少を示したが、周期的なリズム振動の周波数においては何ら有意な変化を示さなかった。実施例１３においてさらに示されるように、周期的なリズム振動の周波数および／または出力における変化を比較することはまた、ある薬物クラスの中の精神活性化合物を区別することにおいて有用である。
【００５７】
ベースラインの周期的なリズム振動はまた、共に沈着した神経組織により刺激または誘導され得る。実施例１５にさらに記載されるように、コントロール（アセチルコリンエステラーゼインヒビター（ＡｃｈＥＩ）についての海馬中隔共培養物により、およびＳＳＲＩについての海馬縫線共培養物により誘導される周期的なリズム振動）と比較して、ＡｃｈＥＩは、周期的なリズム振動の周波数に有意には影響を及ぼすことなく、出力を増加し（図３１）、ＳＳＲＩは、周期的なリズム振動の出力を減少させ、周期的なリズム振動の周波数をわずかに減少させた（図３３）。
【００５８】
本発明の方法によって検出および特性付けされ得る精神活性剤としては、以下の精神活性化合物のクラスが挙げられるが、これらに限定されない：
１．ＧＡＢＡアンタゴニスト（例えば、ビククリン、β−ヒドラスチン、ピクロトキシン、ＳＲ−９５５３１（ガバジン（Ｇａｂａｚｉｎｅ）））；
２．ＡＭＰＡアンタゴニスト（例えば、ＣＮＱＸ、ＤＮＱＸ、ＧＹＫＩ  ５２４６６ＨＣｌ、ジョロウグモ毒素、１−ナフチル−アセチルスペルミン、ＮＳ２５７、ＮＢＱＸ；
３．ベンゾジアゼピン（一般的に、強力な催眠作用および鎮静作用を有する化学的に類似する向精神薬のグループのいずれか；抗不安薬および催眠薬として主に使用される）（例えば、アルプラゾラム、クロラゼパート、テマゼパム、フルラゼパム、クロルジアゼポキシド（Ｃｈｏｌｒｄｉａｚｅｐｏｘｉｄｅ）、ジアゼパム、オキサゼパム、メダゼパム、ロラゼパム、フルトラゼパム、フルジアゼパム、アルプラゾラム、オキサゾラム、クロチアゼパム、エチゾラム、フルラゼパム、フロキサゾラム（ｈｌｏｘａｚｏｌａｍ）、エスタゾラム、ニトラゼパム、ニメタゼパム、フルニトラゼパム、トリゾラム（ｔｒｉｚｏｌａｍ）、リマザフォン（ｒｉｍａｚａｆｏｎｅ）、フルマゼニル、ブロマゼパムなど）；
４．アンパカイン（ベンゾイルピペリジン薬物（ＢＤＰ）のような；ＡＭＰＡレセプターモジュレーター（例えば、ＣＸ５１６（ＢＤＰ−１２）、ＣＸ５５４（ＢＤＰ−２０）、ＣＸ６１４、ＣＸ６９１）；およびピラセタム様ヌートロピック（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ）（例えば、アニラセタム、ネフィラセタム（ｎｅｆｉｒａｃｅｔａｍ）など）；
５．抗精神病薬（一般的に、例えば、フェノチアジン誘導体、チオキサンテン誘導体、ブチロフェノン誘導体（ドーパミンレセプターアンタゴニスト）、イミノジベンジル誘導体、ジベンゾチアゼピン（Ｄｉｂｅｎｚｏｔｔｈｉａｚｅｐｉｎｅ）誘導体、ベンズアミド誘導体、チエピン（Ｔｈｉｅｐｉｎｅ）誘導体、ベンズイソオキサゾール誘導体（セロトニンおよびドーパミンアンタゴニスト）および具体的には以下のような抗精神病薬：カルバマゼピン、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、ジバルプロエートナトリウム（ｄｉｖａｌｒｏｅｘ  ｓｏｄｉｕｍ）、フルフェナジン、ハロペリドール、炭酸リチウム、炭酸リチウム、クエン酸リチウム、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン（ｏｌａｎｚａｐｉｎｅ）、ペルフェナジン、ピモジド、クエチアピン（ｑｕｅｔｉａｐｉｎｅ）、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン（ｔｈｉｏｔｈｉｘｅｎｅ）、トリフルオペラジン、およびトリフロプルマジン）；
６．抗うつ薬（一般的に、例えば、三環式抗うつ薬および四環式抗うつ薬、選択的セロトニン再取込みインヒビター（ＳＳＩＲ）、セロトニンおよびノルエピネフィリン再取込みインヒビター、およびモノアミン酸化（ｏｘｉｄｉｚｅ）インヒビター、ならびに具体的には以下のような抗うつ薬：アミノケトン、アミトリプチリン、アモキサピン、アムフェブタモン（ｂｕｐｒｏｐｉｏｎ）、ドキセピン、デシプラミン、クロミプラミン、フルオキセチン、フルボキサミン、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェニルピペラジン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシクロプロミン、トラゾドン、チアゾロピリジン、トリミプラミン、およびベンラファキシン；
７．中枢神経系刺激剤（一般的に、例えば、キサンチンおよびアンフェタミン、ならびに具体的には以下のような中枢神経刺激剤：デキストロアンフェタミン、Ｅｐｈｅｄｒａ、Ｅｐｈｅｄｒａ  ｓｉｎｉｃａ、メタンフェタミン、メチルフェニデート、メチルフェニデート、およびペモリン）；
８．鎮痙薬（一般的に、例えば、バルビツレート、オキサゾリジンジオン誘導体、カルボニックアンヒドラーゼインヒビター、ベンゾジアゼピン、およびＧＡＢＡトランスアミナーゼインヒビター；具体的には、例えば、カルバマゼピン、クロバザム、デジナミド、ジバルプロエックスナトリウム、フェルバマート、フルナリジン、フォスフェニトイン、ガバペンチン、ラモトリジン、レベチラセタム、ミダゾラム、ミラセミド、ＭＫ−８０１、オクスカルバゼピン、フェノバルビタール、プリミドン、プロガビド、スチリペントール、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、トピラマート、バルプロ酸、ビガバトリン、およびゾニサミド；
９．抗不安薬（一般的に、例えば、抗ヒスタミン薬、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、β遮断薬、ブスピロン、プロパンジオール、選択的セロトニン再取込みインヒビター（ＳＳＩＲ）、セロトニンレセプターアゴニスト、および三環式抗うつ薬；具体的には、例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロミプラミン、クロラゼパート、ジアゼパム、フルオキセチン、フルボキサミン、ハラゼパム、ロラゼパム、メプロバメート、オキサゼパム、フェノバルビタール、Ｐｉｐｅｒ、Ｐｉｐｅｒ  ｍｅｔｈｙｓｔｉｃｕｍ、プラゼパム、およびプロプラノロール）；
１０．催眠薬（一般的に、催眠薬は、睡眠または催眠に関連する薬物であるか、または求心性拍動を阻害するかもしくは脳の皮質中心における感覚印象の受容を阻害して、部分的または完全な無意識を引き起こすことにより、疼痛に対する無感覚を引き起こす薬剤である）。催眠薬は、一般的に、鎮静薬、鎮痛薬、麻酔薬、および酔わせる物質を含み、そして睡眠を誘導するのに使用された場合、催眠薬（ｓｏｍｎｉｆａｃｉｅｎｔ）および催眠薬（ｓｏｐｏｒｉｆｉｃ）とよばれることもある。具体的な催眠薬としては、脂肪族アルコール、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ、メラトニン、特定の非バルビツレート、Ｐｉｐｅｒ、Ｐｉｐｅｒ  ｍｅｔｈｙｓｔｉｃｕｍ、Ｖａｌｅｒｉａｎａ、およびＶａｌｅｒｉａｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓが挙げられる；
１１．麻酔性鎮痛薬（例えば、オピオイドレセプターアンタゴニストおよび具体的には、例えば、ヘロインおよびモルヒネ）；
１２．ドーパミン作動性薬剤（例えば、アマンタジン、ベンツアトロピン（ｂｅｎｚｔｒｏｐｉｎｅ）、カルビドパ／レボドパ、およびトリへキシフェニジル）。
【実施例】
【００５９】
以下の実施例は、海馬皮質において、コリン作動的に誘発した高周波リズムの起源および局所的変化を検討するために、６４個の部位から同時に記録する標準的刺激および記録装置ならびに／または多電極ディッシュ（ＭＥＤ）の両方を利用した。次いで、これらの周期的なリズム振動に関連したさらなる薬理学的研究および生理学的な研究を行った。
【００６０】
薬物／化学物質を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ジアゼパム、ビククリン、ＣＮＱＸ、２−ヒドロキシサクロフェン）またはＳｉｇｍａ（全ての他の化合物）から購入した。ＣＸ６１４およびＣＸ６９１は、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から得た。全ての薬物を、既知の濃度で適用し、かつ凍結アリコートから毎日調製した。薬物／化学物質を、ＡＰ５を除いて（これは、バッチで適用した）、注入ポンプを用いて注入ラインに添加した。溶液を、実験日に新たに調製した。統計技術および測定技術は、対応のある両側ｔ検定および反復して測定二元配置ＡＮＯＶＡの使用を含んだ。これらの検定を使用して、統計学的有意性を評価した。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。出力スペクトルは、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）における高速フーリエ変換関数を使用して、４００ｍｓ試料採取から予測した。出力を、アゴニスト注入の最後の５分間に対して正規化した。
【００６１】
当業者は、具体的実施形態が例示されかつ記載されているものの、種々の改変および変更が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得ることを認識する。
【００６２】
（実施例１）
（多電極アレイ（ＭＥＤプローブ）の作製）
Ｍｕｌｔｉ−Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ−Ｄｉｓｈ（松下電気産業株式会社、大阪：「ＭＥＤプローブ」）を作製する一般的な手順は、上で記述した。ＭＥＤプローブを作製する手順はまた、Ｏｋａら（１９９９）で記述されている。この装置は、６４個の平面微小電極のアレイを有し、その各々は、５０×５０μｍのサイズを有し、８個×８個のパターンで配列されている。プローブには、２種類の極間距離（１５０μｍ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤ−Ｐ５１５ＡＰ）および４５０μｍ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ：ＭＥＤ−Ｐ５４５ＡＰ））が付いている。
【００６３】
このＭＥＤ表面に対する神経試料スライスの十分な接着性を与えるために、このＭＥＤプローブの表面を、室温で、８時間にわたって、２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）中の０．１％ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ−３１４３）で処理した。このプローブ表面を、無菌蒸留水で３回リンスした。このプローブ（チャンバ）に、次いで、３７℃で、少なくとも１時間にわたって、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地（これは、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ：１６１４１−０７９）および１０％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ：１６０５０−１２２）を含有する）を充填した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地は、ダルベッコ変性イーグル培地およびハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ−１２（ＧＩＢＣＯ：Ｄ／Ｆ−１２培地の１：１混合物  １２４００−０１４）（これらは、Ｎ２栄養剤（ＧＩＢＣＯ：１７５０２−０１４）およびヒドロコルチゾン（２０ｎＭ、Ｓｉｇｍａ、Ｈ０８８８））を補充した）である。
【００６４】
（実施例２）
（海馬スライスの調製）
３〜４週齡のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、国立衛生研究所からのガイドラインとともに、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから認可された動物プロトコルの下で、ハロタンを使用して麻酔した後、断頭することにより屠殺した。脳組織を取り出し、標準的な電気生理学的記録技術のために、３５０μｍの海馬スライスを、振動組織スライサー（Ｌｅｉｃａ：ＶＴ−１０００Ｓ；Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ，ＩＬ）を使用して切り出した。人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）は、解剖のために以下の組成（ｍＭ単位）であった：ＮａＣｌ  １２４、ＫＣｌ  ３、ＫＨ２ＰＯ４  １．２５、ＭｇＳＯ４  ５、ＣａＣｌ２  ３．４、Ｄ−グルコース  １０、ＮａＨＣＯ３  ２６。
【００６５】
次いで、海馬スライスを、境界面記録チャンバに置き、ＣａＣｌ２およびＭｇＳＯ４の濃度をそれぞれ３ｍＭおよび１ｍＭに低下させたことを除いて、上記と同じ組成の酸素化記録ＡＣＳＦを用いて、６０ｍｌ／時間の速度で注入した。加湿９５％  Ｏ２／５％  ＣＯ２を、回復期および記録期全体を通してチャンバにさらに吹き込んだ。スライスを、少なくとも１時間の期間の間に回収した。
【００６６】
複数電極実験のために、１７〜２４日齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、ハロタン（２−ブロモ−２−クロロ−１，１，１−トリフルオロエタン、Ｓｉｇｍａ：Ｂ４３８８）を使用して麻酔した後、断頭することにより屠殺し、その全脳を、注意深く取り出した。その脳を、直ちに、およそ２分間にわたって、以下の組成（ｍＭ単位）の氷冷酸素化調製緩衝液に浸した：１２４  ＮａＣｌ、２６  ＮａＨＣＯ3、１０  グルコース、３  ＫＣｌ、１．２５  ＮａＨ2ＰＯ4、２  ＣａＣｌ2、２  ＭｇＳＯ4。この脳の適当な部分を切り取り、そして振動組織スライサー（Ｌｅｉｃａ：ＶＴ−１０００Ｓ）の氷冷ステージに置いた。このステージを、直ちに、酸素化緩衝液および凍結調製緩衝液の両方で満たした。各組織スライスの厚さは、３５０μｍであった。各スライスを、絵筆でそのブレードから穏やかに取り除き、切り取り、そして直ちに、室温で、１時間にわたって、この酸素化調製緩衝液に浸した。次いで、このＭＥＤプローブの中心に、１個のスライスを置いた。このスライスは、８個×８個のアレイを覆うように、配置した。このスライスを配置した後、このＭＥＤプローブを、直ちに、９５％のＯ2および５％のＣＯ2で満たした箱に置き、そして３２℃で、１時間にわたって、回復させた。
【００６７】
（実施例３）
（電気生理学的な記録）
標準的な電気生理学実験のために、電場電位を、２Ｍ  ＮａＣｌで満たした細胞外記録電極（１〜５ＭΩ）を用いて記録した。自発的活性およびリズム活性の記録のために、電極を、ＣＡ３領域の錐体細胞層に置いた。シェファー側副枝刺激／交連刺激により誘起される興奮シナプス後電位（ＥＳＰ）をモニターするために、記録電極を、ＣＡ１放射線維層に置いた。刺激を、双極性刺激電極（ねじった６４μｍ絶縁ニクロム線）を通じて送り、刺激電流強度を、最大単相応答（０．１〜０．３ｍｓ持続時間、１０〜５０μＡの二相パルス）の５０％未満であった応答を誘発するように設定した。８００ｍｓの試料を３０秒ごとに記録した；刺激を伴う場合、刺激パルスを３０秒毎に送った。安定なベースライン条件を、薬物溶液の注入前に少なくとも１０分間にわたってモニターした。データを差動ＡＣ増幅器（Ａ−Ｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  １７００；Ｃａｒｌｓｂｏｒｇ，ＷＡ）を使用して記録し、５ｋＨｚでデジタル化した。実験を、生理学的温度（３２±２℃）で行った。
【００６８】
スパイク数およびバースト数を、４００ｍｓ時間ウィンドウ内で平滑化時間経過記録の二次導関数における正のピークを、ＭＡＴＬＡＢを再び使用して見出すことによって計算した。５ｍｓ以下の間隔で発生するスパイクは、「バースト」を構成した。スパイクおよびバーストの数を、別段記載しない限り、コリン作動性アゴニスト注入の最後の５分間に対して正規化した。
【００６９】
多電極実験について、このＭＥＤプローブ上のスライスを、３２℃で、小さいＣＯ2インキュベータ（Ａｓａｈｉ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ：モデル４０２０）に置いた。ＭＥＤプローブ上のスライスを回収した後、その培地を、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ−１２混合培地で置き換えた。これらのスライスをその界面に置き、そして加湿した９５％Ｏ2および５％ＣＯ2気体混合物と接触させた。この条件で、それらの応答を２時間より長い間にわたって記録した。
【００７０】
２０ｋＨｚの試料採取速度で、多チャンネル記録システム（松下電器産業株式会社、「ＭＥＤ６４」システム）を使って、６４個の全ての部位での自然電場電位および誘発電場電位を同時に記録した。この誘発応答の場合、利用できる６４個の平面微小電極のうちの１個を、刺激カソードに使用した。そのアイソレータを介したデータ収集ソフトウェアにより、双極定電流パルス（１０〜５０μＡ、０．１ミリ秒）が生じた。この刺激微小電極は、６４配電箱から選択した。測定した電場電位を、次いで、下記のＣＳＤ分析（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら）を使用して、分析にかけた。
【００７１】
（実施例４）
（長期間持続性カルバコール誘導リズム）
この実施例において、カルバコールが長期間持続性リズム活性を神経組織において誘導する能力を示す。図１は、海馬スライスのＣＡ３領域においてコリン作動性アゴニストにより誘導または刺激される長期間持続性のリズム活性、およびそのコリン作動性アゴニストを洗い流した後のこのリズム活性の保存を示す。図１Ａは、コントロールの出力スペクトル（破線）および２０μＭ  ＣＣｈにより誘導された細胞外の周期的なリズム振動（実線）を示す。図１Ｂは、２０μＭ  ＣＣｈの注入前（上）および注入後（下）に細胞外記録の例示のトレースを示す。図１Ｃは、ＣＣｈを洗い流した後の、周期的なリズム振動の持続性を例示する。各点は、β周波数バンドまたはγ周波数バンドの平均正規化出力（平均±ＳＥＭ）を表す。ＣＣｈ（２０μＭ）を、少なくとも１０分間のベースライン記録の後に、２０分間にわたって（黒棒で示される）注入した。
【００７２】
ＣＡ３領域におけるＣＣｈ（２０μＭ）の注入は、βバンドにおける主な周波数（注入の１０〜２０分注入の時点で２７．４±０．２Ｈｚ、ｎ＝２８）およびγ範囲における副次的な周波数（４８．２±０．２Ｈｚ、図１Ａ）を有する速いリズム活性の迅速な出現を引き起こした。β範囲の出力は、注入の間に３０倍を超えて増大した（ｐ＜０．０００１、ｎ＝２８）。ＣＡ３リズムの波形は、図１Ｂに例示される。各サイクルは、大きなスパイクまたはスパイクのバーストで始まり、急な正の電位が続いて、それは徐々に、サイクルが再び始まるまでに減少する。そのスパイク形成（ｓｐｉｋｉｎｇ）活性は、ベースライン条件下ではＣＡ３にほとんど存在しない。リズム活性の増加は、シェファー側副枝刺激／交連突出の刺激に応じて、ＣＡ１領域の先端突起で記録されるＥＰＳＰ領域の振幅の信頼性の高い減少と関連した。
【００７３】
ＣＣｈにより生成されるｆＥＰＳＰの抑制は、洗い流したときに迅速に明らかになった。回復は決して完全ではなかったが、このことは、ＣＣｈの流し混み（ｗａｓｈｉｎ）または洗い流しの時間経過の尺度を与えた。誘発された応答で観察される可逆性の効果とは対照的に、そのリズム活性は、洗い流しの時間後ですら高レベルで持続した。図１Ｃは、１４スライスの群についての洗い流しの間に、β周波数範囲およびγ周波数範囲における正規化出力を示す。５０〜６０分間の洗い流し後のβバンドにおける出力は、前ＣＣｈ期に記録されたものよりも２０倍大きく（ｐ＜０．０００１、ｎ＝１４）、時間と共に減少するという証拠はなかった。３つの場合において、３時間より長い洗い流しの間にわたって記録を続け、その時点で、高レベルのリズム活性がなお存在した。同様の効果が、γ周波数範囲において得られた。
【００７４】
図２はまた、ＣＣｈ洗い流し後のＣＡ３錐体細胞活性レベルにおける持続的増加を示す。図２Ａに認められるように、代表的追跡は、それぞれ「＊」および「＊＊」で示される、スパイクおよびバーストの例を示す。図２Ｂは、一時的なＣＣｈ適用から生じる持続した増加を示すために、時間に対してプロットしたＣＡ３錐体神経のスパイク速度（上）およびバースト速度（下）を示す。ＣＣｈを２０分間にわたって注入した。各点（平均±ＳＥＭ）は、ＣＣｈ注入の最後の５分間に対して正規化した、４００ｍｓ時間ウィンドウ内のスパイク数またはバースト数を表す。
【００７５】
持続性リズムの誘導には、ＣＡ３錐体神経の興奮パターンにおける長期間持続性の変化が伴う。ＣＡ３錐体細胞層において自発的に記録されるスパイク形成およびバースト形成は、ベースライン条件下では比較的少なく、継続しているリズムと同じ時間経過の後に、一時的なＣＣｈ適用後に増大した（図２Ａ）。図２Ｂにおいて、スパイク速度（上部）を、ＣＣｈ注入の最後の５分間の平均速度に対して正規化した。これらの群のデータにおいて認められ得るように、スパイク形成は、注入に伴って約３倍増大し、６０分の洗い流し全体を通してのそのレベルに近いままであった（ｐ＜０．０００１、前ＣＣｈ期  対  ６０分後、ｎ＝１４）。ＣＣｈによって生成されるスパイクの短く高周波数のバーストの増大した数はまた、洗い流し期間全体を通して明らかに変化することなく持続した（図２Ｂ、下部）。全てにおいて、コリン作動性刺激によって誘導されるリズム、およびそれらと関連したスパイク形成活性は、刺激を除去した後数時間にわたってそのままであった。
【００７６】
（実施例５）
（コリン作動性突出における変化は、長期間持続性リズムを担う）
実施例５は、神経組織における周期的なリズム振動の誘導または刺激がコリン作動性相互作用を調節することから生じる可能性が最も高いことを示す。例えば、図３Ａは、周期的なリズム振動活性における長期の増大のＮＭＤＡ非依存性を示す。具体的には、図３Ａは、５つの場合を示し、ここでＣＣｈ注入の開始前に、スライスに、１００μＭ  ＡＰＶ（Ｄ，Ｌ−２−アミノ−５−ホスホペンタン酸（ＮＭＤＡアンタゴニスト）を浴中で１５分間にわたって適用し、２０分間、２０μＭ  ＣＣｈを注入ラインへ注入し、２５分後、ＣＣｈを洗い流した。ＡＰＶ注入の最後およびＡＰＶを洗い流して３０分後のＣＡ１錐体細胞層（差し込み図）を、示す。ＣＣｈを洗い流して５０〜６０分後の平均β出力は、ＣＣｈ単独群についてはピーク効果の７６．０±１．６％であり、ＣＣｈ＋ＡＰＶ群については、１０９．０±４．７％であった（ｐ＜０．０００１）。従って、安定なリズム活性の誘導も発現も、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニストによってブロックされなかったことが示された。
【００７７】
対照的に、図３Ｂは、内因性アセチルコリンレベルの上昇によって引き起こされるリズム活性における長期間の増加を示す。アセチルコリンエステラーゼインヒビターであるフィゾスチグミンを、中程度の濃度（５μＭ）で２０分間にわたって適用した。図３Ｂに示されるように、フィゾスチグミンは、規模がより小さいこと以外は、ＣＣｈによって生成されるものと検出可能であるほどには異ならないリズム活性の増加を引き起こした。そのピーク効果は、再度、β範囲において存在し、γバンドにおいては副次的な増加が存在し、得られた波は、そのアゴニストで認められた同じスパイクオントラフ（ｓｐｉｋｅ−ｏｎ−ｔｒｏｕｇｈ）パターンを有した。ＣＣｈとフィゾスチグミンとの間の１つの顕著な差異は、フィゾスチグミンがｆＥＰＳＰに対して明らかな効果を有さなかったことである。最も重要なことには、増大したリズム活性が、洗い流し期の持続時間全体にわたって顕著に変化することなく持続し；β範囲およびγ範囲の出力は、記録期間の最後にベースライン出力の約３倍であった（ｐ＜０．０００１、ｎ＝５）。
【００７８】
図３Ｃは、βリズムおよびγリズムの維持のためのコリン作動性ムスカリン性レセプターの必要性を具体的に実証する。ムスカリン性アンタゴニストであるアトロピン（ＡＴＲ）を、ＣＣｈ洗い流しの４５分間後に始めて、２０分間にわたって１０μＭの濃度で注入し、リズム時間を安定化させた。ＣＡ１放射線維層からの代表的なＥＰＳＰが、アトロピンの洗い込みおよび洗い流しの間に示される（挿入図）。図３Ｃにおいて観察され得るように、アトロピン適用は、ＣＣｈ誘発性の周期的なリズム振動活性を減少させ、これは、アトロピン洗い流し後に回復されない。
【００７９】
上記のデータは、コリン作動性シナプスが、海馬の生理の天然に存在する局面についての使用依存性の長期継続変化の基礎となることを確立する。その後、同じシナプスが、リズムを駆動する非コリン作動性系における変化を表すかまたは反応を誘発するか否かに関する問題が、生じる。前者の仮説が真である場合、ＣＣｈ（またはフィゾスチグミン）の洗い流し後にコリン作動性伝達をブロックすると、誘発されるリズムに対して顕著な効果を有すると予測される。図３Ｃは、この予測を確認する結果を要約する。ムスカリン性アンタゴニストであるアトロピンを、ＣＣｈ洗い流し後の４５分間後に開始して注入し、長期リズムを安定化させた。明らかなように、アトロピンは、周期的なリズム振動を完全に廃止した。β活性およびγ活性の正規化した出力は、最後の１０分間のアトロピン注入によって、ほぼベースラインレベルまで減少された（βについて、ｐ＜０．０００１、γについて、ｐ＜０．０００１、ｎ＝５）。ＥＰＳＰを、ＣＡ１放射線維層において記録して、スライスの健康をモニターした。これは、アトロピンの洗い込みおよび洗い流しの間（周期的なリズム振動が失われた同じ期間）に強力かつ健康なままであるようであった（図３Ｃ、挿入図）。
【００８０】
コリン作動性アゴニストにより示される周期的なリズム振動活性に対する効果はまた、アセチルコリンエステラーゼインヒビターによっても同様に増強され得る。図６において観察されるように、アセチルコリンエステラーゼインヒビターを、１０分間のベースライン後に３０分間注入した。出力を、２０〜４０Ｈｚの周波数バンド全体にわたって平均し、ベースライン活性に対して正規化した。図６Ａにおいて、カルバメート誘導体であるフィゾスチグミンは、比較的低濃度（２．５μＭ）で安定なコリン作動性リズムを惹起し、β出力を約３倍増加した。図６Ｂにおいて、濃度２．５μＭでのフペルジンアナログであるフペルジンＸ（ＨＵＰ−Ｘ）の注入は、フィゾスチグミンにより生成される出力のリズムと同様の出力のリズムを生じた。図６Ｃにおいて観察されるように、例の痕跡は、アセチルコリンエステラーゼインヒビターにより生成されるリズムの波形および周波数が、カルバコールにより駆動されるリズムとほぼ同一であることを示す。ベースライン条件下で、リズム活性は、全く存在しないかまたはほとんど存在しないことに、留意すべきである。図６Ｄは、フペルジンアナログであるジメチルフペルジンＡ（（−）−ＤＭＨＡ）により生成されるリズムは、濃度依存性であったことを示す。リズムは、高濃度（１０μＭ）については高振幅でありかつ安定に維持されたが、低濃度（２．５μＭ）は、経時的に出力を失うようである弱いリズムを生じた。また、図６Ｅは、フペルジンアナログであるフペルジンＡ（（−）−ＨＡ）の２つの濃度を示す。これらは、継続するコリン作動性リズムを生じる能力に関して試験された。１０μＭの注入は、β出力の安定で長期継続する増加を生じ、一方、２．５μＭ注入後のリズムは、低出力であり、徐々に減少したようであった。
【００８１】
（実施例６）
（リズム活性の長期継続する増加の逆転）
実施例６は、緊張性リズムがアトロピンの洗い流しにより影響を受けないという予期されない知見をさらに分析する。アトロピンの場合のリズム活性の喪失には、アンタゴニストの注入および洗い流しの間に、ＥＰＳＰの大きさの減少を伴わなかった。セロトニン作動性活性化は、海馬のＥＥＧを脱同期化することが報告されている（Ａｓｓａｆ，Ｓ．Ｙ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３：５３９〜５５０（１９７８））。従って、これを使用して、誘発性リズムが、コリン作動性レセプターとは無関係の一過性抑制の後に回復したか否かを決定した。
【００８２】
図３Ｄは、５−ＨＴ注入によって生じたリズム活性の一時的抑制を示す。５−ＨＴ（３０μＭ）を、４５分間のＣＣｈ洗い流しの後に、２０分間注入した。図３Ｄにおいて示されるように、セロトニン（５−ＨＴ，１０μＭ）は、リズム活性の即時逆転を引き起こしたが、アトロピンの結果とは顕著に対照的なことに、このリズムは、アゴニストの洗い流しの際には本質的に変化しないように戻った。
【００８３】
図４は、スパイクおよびバーストの周波数に対するアトロピンおよび５−ＨＴの効果を比較する。スパイクおよびバーストの速度を、最後の５分間のＣＣｈ注入の間の平均速度に対して正規化する。図４Ａは、アトロピン注入の直前、その間、および３０分間後の長期リズムの誘導後にＣＡ３錐体細胞層において記録した、自然発生活性の例を提供する。図４Ｂは、アトロピンの不可逆的効果と対照的なスパイク周波数に対する５−ＨＴの可逆的効果を示す。図４Ｃは、５−ＨＴ適用およびアトロピン適用後の、それぞれ、バースト周波数の継続する増加の回復および回復の欠如を示す。図４Ｄは、５−ＨＴ注入の直前、その間、およびその３０分間後にＣＡ３錐体細胞層において記録した自然発生活性の例示的試料を示す。
【００８４】
５−ＨＴ適用後の長期継続リズムの逆転とその後の回復には、ＣＡ３錐体細胞活性レベルの対応する変化が伴った（図４Ｂ〜Ｄ）。対照的に、アトロピンに起因するリズムの完全な除去には、錐体細胞活性のＣＣｈ誘導性増加の永続的逆転が関係した（図４Ａ〜Ｃ）。これらのデータは、ムスカリン性アンタゴニストによるリズム活性の喪失は、コリン作動性伝達に特有の効果に起因する（すなわち、コリン作動性レセプターの強い活性化は、安定なリズムを誘導する一方、レセプターのブロックは、その安定なリズムを排除する）ことを示唆する。
【００８５】
図５は、コリン作動性可塑性に対する選択的ムスカリン性アンタゴニストの効果を示す。図５Ａにおいて観察されるように、Ｍ２選択的ムスカリン性アンタゴニストであるメトクトラミン（ＭＴＣ）は、長期リズムを排除しない。ＭＴＣ（１０μＭ）を、カルバコールの洗い流し後の４５分間の時点で開始して、２０分間注入した。ＭＴＣ適用は、出力のわずかな減少とその後の回復をもたらした。図５Ｂにおいて、Ｍ１選択的ムスカリン性アンタゴニストであるピレンゼピン（ＰＲＺ）の注入は、アトロピンを用いて観察されたリズムの排除を再現した。２０分間のピレンゼピン（１０μＭ）の注入を、カルバコールの洗い流しの４５分間後に開始した。長期リズムは、そのアンタゴニストの洗い流しの際に回復しなかった。代表的な痕跡は、リズムの喪失が、Ｓｃｈａｆｆｅｒ側副刺激に応答して惹起されたＣＡ１における荒廃とも疲労の徴候とも関連しなかったことを示すために示される（挿入図）。
【００８６】
この結果は、一過性のコリン作動性刺激の期間が、細胞のスパイク速度およびバースト速度の継続する増加と関連する、長期リズムを誘導することを示す。長期リズムが、天然に存在する生理に関係し、比較的短い激しい活性エピソードによって誘発され、誘発因子が除去された後でも（少なくとも３時間）長く残るという点で、緊張性リズムは、長期増強と似ている。リズム活性の継続する増加についてのもっともな説明は、ＣＣｈにより誘導されるバーストパターンから生じるグルタミン酸作動性シナプスにおけるＬＴＰの誘導が、増強された側副接続を介して、リズム活性を維持したというものである。しかし、ＬＴＰを完全に抑制する濃度のＮＭＤＡレセプターアンタゴニストは、安定なリズムの形勢を妨害しなかった。その後の実験は、内因性コリン作動性活性の促進が、安定なリズムの形成もたらす一方で、内因性コリン作動性伝達の拮抗作用が、すでに生じていたリズムを排除したことを示した。すべてにおいて、長期リズムは、おそらくＣＡ３領域において、内因性シナプスによって誘導されかつ発現されるようである。この知見は、海馬へとコリン作動性突出は、可塑的であり、特に、ＬＴＰにおいて見出される変化といくらか似ている使用依存性の変化を経験するという、さらなる結論をもたらす。
【００８７】
長期リズムは、ＣＣｈまたはフィゾスチグミンの存在下での急性の周期的なリズム振動と顕著には異ならないので、長期リズムは、薬物（すなわち、上記の通常の数のコリン作動性レセプターの刺激）により生成される同じ終点に起因する可能性がある。
【００８８】
上記リズムのより驚くべき特徴のうちの１つは、ムスカリン性アンタゴニストへの一過性暴露によってそのリズムが抹消されることである。すなわち、上記リズムは、上記周期的なリズム振動が進行中のコリン作動性活性を反映する場合に予期されるように、上記アンタゴニストによりブロックされるだけでなく、上記アンタゴニストの洗い流しの際に戻らなかった。このことは、上記リズム自体の抑制に起因するものではなかった。なぜなら、非コリン作動性因子は、組織中に存在する場合にのみ上記周期的なリズム振動をブロックしたからである。これらの結果は、正常に満たないコリン作動性活性の期間が、強い活性の期間により誘導される継続する変化を停止することを示唆する。この知見は、長期継続するリズムを表す変化を同定する際に助けとなるはずである。これを超えて、コリン作動性可塑性の潜在的な機能的重要性にとって、可逆性が、重要な意味合いを有する。おそらく、上行性コリン作動性突出と、その前脳の標的との間の接続の強度は、継続的な調整を受け、最も誓い（高／低）活性期間は、それに続く事象について活性を設定するために役立つ。
【００８９】
すべてにおいて、本明細書中のデータは、長期継続する使用依存性の可塑性が、グルタミン酸作動性シナプスに制限されないという証拠を提供する。さらに、これらのデータは、コリン作動性の速いリズムを、神経活性の継続変化（これは、速いリズムの主要な役割と一致する）および一般的に記憶増進処理におけるコリン作動性系に関連付ける。
【００９０】
（実施例７）
（電流源密度（ＣＳＤ）分析）
電流源密度解析のよく研究された方法は、電流ソースおよびシンク（Ｉｍ）の位置および相対的大きさの確認を試みるために、測定した電場電位（φ）に対して、ラプラシアン変換（∇２）を使用する（概説について、Ｈｏｗｌａｎｄら、１９５５；Ｍｉｔｚｄｏｒｆ、１９８５）。
【００９１】
Ｉｍ＝−（σｘ∇２ｘφ＋σｙ∇２ｙφ＋σｚ∇２ｚφ）
ここで、σは、３つの直交する次元の各々の導電性である。この方法は、電気生理学的な測定のために、その全三次元形態では滅多に使用されず（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，１９７３；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＦｒｅｅｍａｎ，１９７５；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＬｌｉｎａｓ，１９７５）、むしろ、一次元に切り詰めた形状が、典型的には、適用される（ＨａｂｅｒｌｙおよびＳｈｅｐｈｅｒｄ，１９７３；ＫｅｔｃｈｕｍおよびＨａｂｅｒｌｙ，１９９３；Ｋｏｌｔａら、１９９６）。しかしながら、一次元電流源密度解析は、二次元またはそれ以上の材料（例えば、脳スライス）で行われ、その結果、その測定軸に対して直交して生じるいかなる電流も、検出されず、得られた一次元結果は、従って、誤解を招くおそれがあり得る。それゆえ、一次元解析では、試料を測定する向きに対して側方で最小限の電流が生じることを確実にするように、注意する。好ましくは、このインビトロ神経試料が脳の海馬領域のスライスであるとき、線形系列の測定の整列は、（先端樹状突起に対して側方の電流が、先端に近位の軸に沿って生じる電流に対して、非常に小さいことが証明されているので、）先端樹状突起の成長方向に平行となるように、行われる。本実施例で使用した技術は、二次元法であり、ここで、等距離アレイにある複数電極から、同時に試料を記録して、このスライスに存在しているアレイの列および行と樹状突起との相対的な配向とは無関係に、このスライスの平面内の任意の方向で、電流流れを連続的に感知することが可能となる。このアレイは、６４個の平面電極から構成されており、各々は、５０×５０μｍのサイズであり、８個×８個のパターンで配列され、１５０μｍまたは４５０μｍの極間距離である（Ｏｋａら、１９９９）。
【００９２】
１００Ｈｚでローパスフィルタリングした後、そのデータを、３×３の重量平均カーネル（０  １／８  ０、１／８  １／２  １／８、０  １／８  ０）で空間的に滑らかにし、その結果を、３×３ラプラシアンカーネル（０  １  ０、１  −４  １、０  １  ０）と絡めて、第二空間導関数の別個の概算値を得る。好ましくは、その培地は、均一なコンダクタンスを備えて、オーム抵抗性であると考えられている。その全相関マトリックスを、考慮した時間ウィンドウ（０〜３秒間）で、全チャンネル（６４）について算定する。このスライス中の単一点に対する電流対時間のプロットは、各時間段階に対する８個×８個の電流源密度を算定することにより、そしてバイニリア補間によって所望位置での値を計算することにより、得られる。電流源密度解析で得ることができる解像度のよく知られた限界は、その電極間距離（試料採取解像度）と、このスライスで生じる電流ソースまたはシンクの半径との間の関係から生じ、そして当業者に認識される。コンピュータグラフィックスインターフェイスの領域で周知の「エイリアシング」現象とは、試料採取点間の距離が、現れる最小現象のサイズよりも大きいときの、偽のデータ「ゴースト」（エイリアス）の出現を意味する。コンピュータスクリーングラフィックスでは、これは、表示する画像に関して、そのスクリーン解像度が不十分であるとき、起こる（図７の左パネル−滑らかな縁部を備えた高解像度画像、図７の中間パネル−比較的に低解像度の画素間距離で試料採取した同じ画像は、高い空間周波数を備えた新たな特徴を有するように見える（ギザギザの階段状））。このスクリーン上での偽画像の出現は、典型的には、その画像のローパスフィルタリングを画像縁部での部分的に陰影を付けた画素の導入と組み合わせた「アンチエイリアシング」により、処理される（図７右）。アンチエイリアシングには、ローパスフィルターが挙げられ、これは、この画像から、偽エイリアス特徴を取り除き、従って、また、（本発明の場合と同様に）、初期画像から、ある程度高い空間周波数ディテールをなくし得る。アレイ試料採取した生理学的データへのアーチファクトの対応電位導入は、同じアンチエイリアス法により排除でき（以下の図８を参照）、それに対応して、このデータに由来の一定の細かい（高い空間周波数）ディテールをなくす。好ましくは、この解析は、完全アンチエイリアスなしで、ローパスフィルタリングを使用する。あるいは、もし、このデータが、電極間試料採取距離だけ解像するには高すぎる空間周波数を伴う現象を含むなら、その結果は、ローパスフィルタリングされて、高周波データも取り除きつつ、偽エイリアスを除去する（図８）。
【００９３】
具体的には、図８は、アンチエイリアスの効果を描写している。その上部パネルは、試料採取したデータの解像度に対して十分なセンサ間間隔がある場合を示している。エイリアスは、非常に高い周波数の特徴として現れる；そのセンサ間の空間周波数の半分（センサ間距離の２倍）をローパスフィルタリングすると、試料採取データの解像度を低下させることなく、全てのエイリアスがなくなる。他方、図８の左下のパネルは、そのセンサ間間隔が試料採取データの解像度に対して不十分であった場合を示している。エイリアスの空間周波数は、このデータに存在している最高周波数と重なり合っている。この左パネルは、半分のセンサ間空間周波数でのローパスフィルタリングが全エイリアスを排除できず、また、このデータの最も細かいディテールの一部を排除することを示している。図８の右手パネルは、それより低い空間周波数でのローパスフィルタリングが、全ての偽エイリアスを排除することに成功し、さらに、試料採取データの解像度を低下させて、測定データに存在し得る高周波数の細かいディテールの多くを排除することを示している。それより低い周波数または高い事象だけが残る。
【００９４】
（実施例８）
（連続二次元電流源密度解析）
海馬スライス調製物におけるＣＡ１領域に求心性のＳｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌの刺激に関連して、二次元電流源密度解析を行った。図９Ａおよび９Ｂは、典型的な実験を図示している。図９Ａは、１５０μｍの電極間空間での８個×８個のＭＥＤ電極アレイ上のスライスの配置を示し、これは、海馬スライスにて、ＣＡ１の先端樹状領域の中心にある。これらの電極は、この電極アレイにて、歯状回顆粒細胞領域のＣＡ１基底樹状突起、ＣＡ１の先端樹状突起および上部ブレードを覆っている。ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＢが媒介する禁止成分を抑制するために、この実験は、５０μＭのピクロトキシンおよび１００μＭの２−ヒドロキシサクロフェンを使用して実行した。図９Ｂは、暗灰色で示した電極（１０）に対する１回の刺激パルスにより誘発された代表的なシナプス後電流（ＥＰＳＣ）を示しており、これは、淡灰色の電極（１２）から測定した。その時間尺度は、このような誘発応答に典型的である。垂直の破線は、全６４個の電極にわたって測定した時間点を示しており、これは、以下の図１０で示す。
【００９５】
図９Ｂは、指定した電極でのシナプス後電流の時間経過および大きさを図示しており、これは、ＣＡ１の先端樹状突起の近接部分である。この電流のシンクおよびソースの方向は、指示したとおりである；初期線維ボレー（約１ミリ秒間続く）後、電流シンクは、約５ミリ秒間にわたって上昇し、次の５ミリ秒で低下し、その後、大体１３ミリ秒で、ベースラインに戻った。それは、電流ソースになって、さらに約１５〜２０ミリ秒間にわたって続き、その後、約３５〜４０ミリ秒で、ベースラインに戻った。このシンクおよびソースの相対的な大きさおよび時間経過は、このような誘発応答に典型的である。
【００９６】
二次元電流源密度解析は、同じ応答の電流ソースおよびシンクの同様な尺度を得るために、実行した。図１０は、図９Ｂで示した誘発応答の連続的な二次元電流源密度解析を図示している。図１０の各パネルは、図９Ｂの垂直の破線で示した選定時間で、このスライスで算定した瞬間的なソースおよびシンクを図示している。このアレイは、図９Ａで示したようにして、このスライス上に配置した；海馬領域ＣＡ１の細胞体層は、各パネルの頂部からの進路の約４分の１で、ほぼ水平の曲線を規定している。これらの点線は、ＣＡ１の細胞体層（上部）および先端樹状領域の最も遠位にある伸長部（下部）を示している。下部にある目盛り棒で見えるように、灰色の電流ニュートラルバックグラウンドに対して、シンクは黒色であり、そしてソースは白色である。
【００９７】
初期線維ボレー（約１ミリ秒間続く）後、ＣＡ１の先端樹状突起での電流シンクは、およそ５ミリ秒間にわたって急速に上昇し（「６ｍｓ」と印したパネルを参照）、引き続いた５ミリ秒で低下し、その後、約１１ミリ秒で消失するが、刺激部位では、特異性を備えたパネルが現れることが観察され得る。約２ミリ秒の暫定期間（この間、電流は、ニュートラルバックグラウンドとは識別不能であった）の後、この先端樹状突起でソースが現れ（「１５ｍｓ」）、これは、さらに約１５〜２０ミリ秒間続いて、その後、およそ３５ｍｓで消失した。単一電極に由来する波形の時間経過および大きさ（図９Ｂ）は、図１０の算定した電流源密度のシンク−ソース系列と密接に対応していることが観察され得る。
【００９８】
二次元電流源密度法により、他の手段では識別困難な電流ソースおよびシンクの空間的様相が明らかになる。その興奮性のシナプス後電流シンクは、Ｓｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ線維（これは、おそらく、初期電流パルス（３ｍｓ〜９ｍｓのパネル）により刺激されている）の領域において、ＣＡ１の先端領域にわたって展開する；次の電流ソースは、ほぼ同じゾーンを占めた（１５ｍｓ〜２７ｍｓのパネル）。この先端樹状突起で生じたシンクおよび次のソースの両方は、ＣＡ１の基底樹状領域（各パネルの上部近く）において、逆極性の電流を伴っていた。それゆえ、その主な誘発応答は、３〜９ミリ秒で生じた電流シンク−ソース双極子として特性付けることができ、そして逆転して、１５〜２７ミリ秒の電流ソース−シンク双極子を形成し得る。このスライスには、それより小さい他の電流が存在していたが、ここでは述べない。
【００９９】
短い休止期間の後、これらの樹状突起には、電流ソースが現れ、その中心は、この電流シンクの中心よりも僅かに遠位にある。この先端ソースは、約５０ミリ秒までに、強まり、拡大し、散逸し、そして消失して、約５０ミリ秒の誘発応答「期間」となる。この先端シンクおよび次の先端ソースの両方は、ＣＡ１の基底樹状突起（各パネルの上部）で現れる逆極性領域を伴い、これは、この先端事象とほぼ同じ時間経過で、成長し散逸する。
【０１００】
ここで記述したように、エイリアスが原因のアーチファクトの導入を防止するために、これらの分析で実行されるアンチエイリアシングは、十分に高い空間周波数で、データ損失を引き起こす。そのフィルタリングは、せいぜい試料採取周波数の半分の空間周波数を伴う現象だけを通す；本実施例では、その電極間距離は、１５０μｍであり、約３００μｍの幅（１５０μｍの半径）よりも小さい電流ソースまたはシンクの測定を防止する。これは、ＣＡ１の海馬領域のサイズについて、構造上の欠陥であり得、この方法では、細かい空間的ディテールが失われると予想される。従って、この方法で測定したＣＳＤの空間解像度を検査することが有益である。
【０１０１】
図１１Ａおよび１１Ｂは、測定領域において重ね合わせられたＣＡ１領域の先端樹状突起の境界を描写している。
【０１０２】
図１１Ａは、（図９Ａおよび図９Ｂに由来の）アレイのスライスおよび位置を示す；右側には、指示した電極での刺激の６ミリ秒後、（図１０に由来の）電極アレイの領域における瞬間的ＣＳＤがある。このアレイの上部は、ＣＡ１の基底樹状突起と一致している；このアレイの上部中心部は、ＣＡ１の先端樹状突起の領域を覆っており、そしてアレイの下部３分の１は、歯状回の上部ブレードを覆っている。その点線は、ＣＡ１の細胞体層（上部）および先端樹状突起領域の最遠位伸長部（下部）を示す。
【０１０３】
図１１Ｂで示すように、その主要測定電流シンク（黒色）は、先端樹状突起が生じる領域だけを占め、その相反電流ソース（白色、上部）は、基底樹状突起の領域でだけ生じた。（この刺激電極に対応している位置では、その算定画像において、電流の不在が現れた；その電極からは記録がなされず、得られたＣＳＤ処理では、ギャップが残った）。単一電極の刺激の６ミリ秒後、連続二次元電流源密度解析により、その生理学的応答を算定した（暗灰色で示した）；この画像は、図１０Ｂからの６ミリ秒フレームのクローズアップである。点線は、ＣＡ１の先端樹状突起領域の限界を示している。その誘発電流シンクの伸長部は、これらの先端樹状突起の限界と密接に対応していることが観察され得る。この刺激電極の部位では、この電流シンクにおいて、見かけホールが生じ、この場所では、記録は実行されず、電流源密度は算定されない。この細胞体層自体では、殆ど電流はなく、電流ソースは、この基底樹状突起で現れる（パネルの上部）。このＣＡ１樹状突起の先端チップでは、殆ど電流はなく（パネルの中間部）、歯状回の顆粒細胞の先端樹状突起では、ある程度弱い電流ソースが生じる。
【０１０４】
算定したシンクの境界は、樹状領域の解剖学的な限界位置とは正確には一致せず、不正確さは、この方法の解像度限界から生じ得ることが、理解され得る。
【０１０５】
（実施例９）
（海馬内のカルバコール誘発β波の分布および電流ソース）
図１２Ａ〜１２Ｅは、海馬スライス内のカルバコール誘発性β波の分布を示す。図１２Ａは、海馬スライスおよびその下にある６４個の電極アレイの顕微鏡写真（「ブロードアレイ」）を含み、記録位置間は、４５０μｍである。海馬およびその下にある皮質の亜領域もまた、見られ得る。図１２Ｂは、このスライスでの海馬の一部と接触している２０個の電極部位でのカルバコール誘発自然活性のスペクトルを示す。各ｘ軸は、１〜１００Ｈｚの対数目盛上にある。活性は、１０〜３０Ｈｚの周波数範囲で見られ、特に、ＣＡ１領域およびＣＡ３領域の先端樹状突起にあり、他の箇所では、活性レベルは低い。その目盛り棒は、５×１０-11Ｖ2である。図１２Ｃで分かるように、そのベースライン活性は、低電圧であり、一般に、活性を欠いており、亜領域間では、信頼できる差はなかった。
【０１０６】
カルバコールの注入に続いて、ＣＡ１領域およびＣＡ３領域（これは、試験した５５個のスライスのうち４１個で、βバンド（１０〜３０Ｈｚ）内かそれに近かった）では、リズム活性が徐々に発生した（一例では、図１２Ｄ）。４１個のスライスのうちの３４個は、ＣＡ１およびＣＡ３の両方の領域で、βバンドの周期的なリズム振動を有していた。残りの７個の場合、ＣＡ１またはＣＡ３のいずれかの領域では、そのθ範囲の上端において、低電圧活性が観察された。ＣＡ１対ＣＡ３の相対的なプロミネンス（ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）は、スライスにわたって一貫していなかった。歯状回では、高周波数の活性もまた見られ、その構造体の外部ウイングよりも内部ウイングにおいて、そうであった（図１２Ｂ、図１２Ｄ）。図１２Ｅは、このアレイの上部左電極でのカルバコール誘発活性のクローズアップを示し、これは、ＣＡ１領域の細胞体層にわたる極性の逆転を示している。図１２Ｅでは、その目盛り棒は、０．１ｍＶ；２５０ミリ秒であった。図１２Ｅのそれより高いゲイン記録で見られ得るように、錐体細胞領域では、その波は、基底樹状突起よりも先端において大きく、典型的には、２個の部位間で位相の逆転があった。
【０１０７】
カルバコール誘発リズムの周波数および分布の定量的分析のために、高速フーリエ変換を使用した。図１２Ｂに図示される例について、スペクトルにおける出力（ｐｏｗｅｒ）の大部分は、２０Ｈｚに明確なピークを伴って、１０Ｈｚと３０Ｈｚとの間に見出された。全てのスライスについての主ＣＡ１周波数の群平均は、１８．８±５．７Ｈｚ（平均±標準偏差）であり、βの場合単独については、１９．２±４．８Ｈｚであった。ＣＡ３についての等価な値は、１６．４±５．７Ｈｚおよび１７．３±４．２Ｈｚであった。ＣＡ３とＣＡ１との差は、統計学的有意に達しなかった。１０〜３０Ｈｚ帯における最大の出力を記録した部位は、ＣＡ３領域およびＣＡ１領域の先端樹状突起、代表的には、より遠位の領域に位置していた。
【０１０８】
図１３Ａに示され得るように、１５０μｍの間隔の空いたアレイ（「濃密アレイ」）は、リズム活性のより細かい空間解像度を与えた。ＣＡ３／ＣＡ１境界上に集中した記録は、遠位から近位への次元において絶対電位の驚くほど急な傾斜を示し、最大の電位は、ＣＡ３ａ領域およびＣＡ３ｂ領域の分子層に対応する別個の領域を占めた（図１３Ｂ）。電位が細胞層境界を横切って逆転することに注目すべきである（例えば、図１３Ｂの左上欄を参照のこと）。少ないがなお実質的な電圧帯がまた、ＣＡ１に存在する。全てのチャンネルについての周波数スペクトルを、図１３Ｃに示す。
【０１０９】
連続２次元電流源密度解析法を行い、これらのコリン作動性誘発周期的リズム振動のソースをさらに規定した。図１４は、図１３に示される濃密アレイの同一の自発的活性の間、任意に選択された開始時間である０から４ミリ秒の間隔で、瞬間的なソース（白）およびシンク（黒；灰色のニュートラルバックグラウンドに対して）を図示する。ＣＡ３およびＣＡ１の顆粒細胞領域および錐体細胞領域の輪郭およびその先端樹状突起の範囲を、この期間に起こる事象の位置を図示するために重ねる。アレイは、歯状回の上部ブレードの一部を含む。各フレームは、電極アレイの領域における瞬間的な計算電流源密度を示す。任意に選択された開始点から、シンクはＣＡ３領域とＣＡ１領域との間の境界の先端樹状突起に現れ、付随するソースは、基底樹状突起における細胞境界層にまたがって現れる。先端ＣＡ１における大きなシンクは、ＣＡ１の基底樹状突起におけるソースを伴う。このシンクおよびその付随する基底ソースは、およそ１２ミリ秒間にわたり増強および拡大し、そして最初に出現しておよそ１６ミリ秒後までにおよそベースラインレベルまで、両方とも減退する。活性がバックグラウンドと区別されない間の短い暫定期間の後、ソースは約２０ミリ秒で先端樹状突起中に現れ、対応するシンクは基底樹状突起に現れる。これらは、およそ２０ミリ秒後までに散逸する前に、拡大および増強し（４０ミリ秒）、この後、先端シンクが再出現し、サイクルを再び開始する。ソース（およびその付随する双極子）は、散逸する前におよそ２０ミリ秒間持続した。１５０μｍの電極間間隔の解像出力の範囲内で、先端ソースは、その中心が、先端ソースの前方に有る、より局所的な（ｍｏｒｅ  ｆｏｃａｌ）先端シンクの中心より遠位に位置しているようであることに注目するべきである。シンク−ソース双極子は、反復し（ｒｅｃｕｒ）そして図１３Ｃに示される周波数プロットを生じ；この反復する先端シンク−ソース双極子のピークからピークまでの時間経過は、約４０ｍｓｅｃであり、約２５Ｈｚの周波数と一致した。
【０１１０】
図１５Ａおよび１５Ｂは、スライスにおけるカルバコールにより誘発される反復周期的リズム振動の代表的な記録を示す。ソース−シンク双極子およびシンク−ソース双極子、ならびにインビトロ神経試料の錐体細胞体層に沿ったソースとシンクとの間の鋭く明確な境界は、１つの先端シンクから先端ソースを通って次の先端シンクまでの潜伏と同様に、多くの実験にわたって繰り返される特徴であった。
【０１１１】
図１５Ａは、幅広（電極間間隔４５０μｍ）のアレイ上の海馬スライスを示す。錐体細胞領域の基底樹状突起応答を測定するために使用される電極は、淡灰色で示され；先端樹状突起応答を測定するために使用される電極は、暗灰色で示される。図１５Ｂは、先端樹状突起領域（黒）および基底樹状突起領域（淡灰色）からの平均応答が、図１５Ａのスライスについて５００ｍｓｅｃ（０．５秒）の経過時間にわたって示されるということを示す。カルバコール誘発（２０μＭ）周期的リズム振動は、この代表的な応答におけるように、全ての試料採取した期間にわたって持続された。平均先端応答および平均基底応答は、極性が逆であり；すなわち、位相が１８０度ずれている。ＣＡ３およびＣＡ１の細胞体層を横切る交互の電流ソース−シンク双極子の持続した出現（１０〜３０Ｈｚ（β）の範囲内）が、スライスの大部分および試料採取した期間の大部分において強く観測された。
【０１１２】
距離が１５０μｍのアレイを使用した以前の電流源密度の例とは反対に、４５０μｍの電極間間隔を有する電極アレイを使用する連続２次元電流源密度解析法を用いて、より大きな面積にわたってシンクとソースとの間のシフトを評価した。生じたエイリアスおよびアンチエイリアシング（図８を参照のこと）は、必然的に解像度のさらなる損失を伴い；４５０μｍの電極間間隔および付随するアンチエイリアシングについては、確実に画像化し得る最小の事象は、４５０μｍ以上の半径（直径９００μｍ以上）を有する事象である。
【０１１３】
図１６は、４２ｍｓｅｃにわたる電流源密度の計算した漸進的変化を示す。各フレームは、幅広（４５０μｍ間隔）アレイでの自発的活性の記録の間の、特定の時点（各フレームの左上の角にミリ秒で示される）における計算された電流源密度を示す。黒は、シンクの最大の大きさを示し；白は、ソースの最大の大きさを示す。錐体細胞領域および顆粒細胞領域の位置を示す。
【０１１４】
任意に選択された時間０ｍｓｅｃで生じ、ＣＡ３領域の先端樹状突起における弱い電流源は、錐体細胞層に中心のある拡散したソースにより取り囲まれる。ＣＡ３領域の先端樹状突起または近位放射線維層における強い局所的シンクは、約６ｍｓｅｃに生じ、それに伴いＣＡ３の細胞層および基底樹状突起層におけるソースも生じる。このシンクが発達し、ＣＡ３ｂ上に中心のある完全に発達したシンク−ソースの関係が、９ｍｓｅｃの時点で明らかになる。このシンクはＣＡ１領域に向って拡大し始める前のおよそ１２ｍｓｅｃを通して存続する。先端ＣＡ３におけるシンクは、およそ１８ｍｓｅｃで散逸し、次いで約３ｍｓｅｃ後にＣＡ１における先端シンクが散逸し、これに伴い明白な細胞体／基底樹状突起ソースが１５ｍｓｅｃで出現した。この時点までにＣＡ３におけるシンク−ソースの関係が崩壊し始めていたことに留意すること。基底ソースは、それに付随する先端シンクとほぼ同時に散逸する。先端ソースは、約２４ｍｓｅｃにＣＡ３において生じ、それに伴い数ミリ秒以内にＣＡ３において弱い基底ソースが生じ；次いで先端ソースは、ＣＡ１における基底シンクを伴って、ＣＡ１に向って拡大する。次いでこれらのソース−シンク対は、約１５〜２０ｍｓｅｃ後に散逸する。このようなサイクルは、このスライスにおいて不規則に繰り返す。波は、約１０ｍｓｅｃ続く強い先端樹状突起シンク、次いでこの期間の約２倍の間続く先端ソースを含んでいた。これらの事象は、ＣＡ３で始まり、そして３〜５ｍｓｅｃ以内にＣＡ１において見られた。要約すると、コリン作動性誘発β範囲リズムは、先端樹状突起に位置し、かつより近位に位置する電流シンクよりも通常より明確な、電流源を有する。
【０１１５】
これらの観察は、比較的短い先端シンクが、より長く持続する先端ソース間に挿入されるということを示した。平均電流の試験は、海馬の錐体細胞細区画にわたるソースおよびシンクの分布が、スライス間で変化することを実証した。事象がＣＡ１に対してＣＡ３に集中する程度の大きな差を伴い、連続する電流ソース密度の解析において、スライス間の変動性がまた存在した。しかし、先端樹状突起についての短い先端シンク−より長い先端ソースの連続は、β範囲の周期的なリズム振動を示す全てのスライスにおいて顕著であった。
【０１１６】
（実施例１０）
（カルバコールは、海馬後部皮質において４０Ｈｚリズムを誘発する）
電極アレイが、海馬自体の錐体細胞領域に沿った海馬後部皮質領域のかなりの部分の下に位置付けされたスライスを精密に調べることにより、カルバコールにより惹起されるリズムが局所的に差異を生じるか否かという疑問に取り組んだ。図１７Ａは、幅広アレイ上の皮質−海馬の顕微鏡写真を示す。目的の２つの部位−−ＣＡ１中の部位（１００）および内側嗅皮質の深層の部位（１０２）を示す。ＣＡ１領域および内側嗅皮質において示された位置からの、カルバコール（５０μＭ）誘発速波を、図１７Ｂと比較した。出力値は、図面に１０-11倍で示す。図１７Ｂに示され得るように、内側嗅の周期的なリズム振動は、海馬からの周期的なリズム振動よりも高い周波数を有する。高速フーリエ変換は、皮質における主要な周波数は、ＣＡ１領域における周波数の約２倍であることを示した。２０Ｈｚ付近にピークを有するリズム活性は、海馬錐体細胞領域の先端樹状突起を通して見出され、一方４０Ｈｚの活性は、内側嗅部位と主に関連した。４０Ｈｚの周期的なリズム振動が、内側嗅（ｍｅｄｉａｌ  ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌ）皮質の深層に中心が有るということもまた観察された（図１７Ｂにおける右上のスペクトル）。海馬と内側嗅皮質との間にある領域は、両方のピークを示した。実際、４０Ｈｚ対２０Ｈｚの相対バランスは、海馬後部皮質に含まれる一連のステップにわたる順序正しい様式で増加するようである。４０Ｈｚ活性を、適切に電極を位置付けされた１５個のスライスの各々において内側嗅皮質の深層で記録した；それにより、これはコリン作動性刺激に対するこの領域の特徴的な応答であるように思われる。全ての記録部位についての結果を、図１７Ｃ（スライスにおける代表的な活性の分布（較正線：０．１ｍＶ，５００ｍｓｅｃ））および図１７Ｄ（スライスにおけるローパス（０〜１００Ｈｚ）フィルターした出力のスペクトル（較正線：２×１０-11Ｖ２））に要約する。
【０１１７】
（実施例１１）
（カルバコール誘導β波に関与する伝達系）
カルバコール誘発高周波数リズムを、２０μＭのアトロピンで完全に消去し、そしてＡＭＰＡレセプターアンタゴニストＣＮＱＸ（２０μＭ）でかなり減少した。ビククリン（１０μＭ）の存在下で、ムスカリン様刺激は、錐体細胞層において高周波スパイクを生じ、そしていくつかの例ではてんかん様放電を生じたが、リズム活性は、存在しなかった。これらの条件下で、カルバコールは、繰り返しバースト挙動および時々の発作を開始した。てんかん様バースト間の間隔は、θ波の期間に近づくこともあった（データは示さず）。これらの発作は、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＫａｕｅｒ（１９９７）により報告される活性に類似していた。
【０１１８】
（実施例１２）
（錐体細胞の順方向活性化は、先端樹状突起においてβ様活性を誘発する）
先端ソースの原因であるＧＡＢＡ作動性細胞がどのように活性化されるかは、周期的なβリズム振動の起源を理解するために明らかに重要である。錐体細胞側副枝が関与する場合、繰り返しスパイクを引き起こすのに十分な順方向刺激は、カルバコール惹起リズムが見出される領域においてβ様活性の出現を生じる。Ｓｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ線維の単一パルス刺激は、典型的には、繰り返しスパイクを引き起こさない。なぜならば、（ｉ）放射線維層における強力なフィードフォワード樹状突起阻害が、興奮性電流の分路を作るからであり、そして（ｉｉ）体細胞周囲（ｐｅｒｉｓｏｍａｔｉｃ）阻害が繰り返し放電を防ぐからである。ＧＡＢＡａレセプタープールを部分的にブロックする濃度のビククリンを、これらの阻害性応答を低減し、それにより順方向刺激に応じて錐体細胞が４〜５回のスパイクを放出することを可能にするために使用した。
【０１１９】
図１８Ａ〜１８Ｄは、ＣＡ３領域の順方向活性化により惹起されるβ様活性の２次元電流源密度解析法を示す。図１８Ａは、ＣＡ３領域に中心のある、海馬スライスに対するアレイ（電極間間隔１５０μｍ）の位置を示す。無地色で示される電極（１０６）において刺激を誘発し、そして取り囲む電極（１０８）において記録した。以下に示すように、図１８Ｂは、ＣＡ３領域の順方向刺激に対する代表的な応答を示す。この応答は、スパイクの小さなバースト、次いで約３０〜４０ｍｓｅｃ持続する正方（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｇｏｉｎｇ）波を示す。矢印は、ピークシンク（５３ｍｓｅｃ）およびピークソース（８３ｍｓｅｃ）を示す。図１８Ｃは、スライスにおける出力スペクトルの分布を示し：最大の応答はＣＡ１の先端樹状突起ならびにＣＡ３の先端および近位の樹状突起にある。フーリエ変換は、この応答についての周波数スペクトルが、１５〜２０Ｈｚおよび１００〜２００Ｈｚにピークを有することを示した（図１８Ｃ）；使用される対数スケールが１〜１０００に及ぶことに留意すること。図１８Ｄは、２つの時点（刺激後５３ｍｓｅｃおよび８３ｍｓｅｃ、矢印で示される）での２次元瞬間電流源密度解析を示す。１５〜２０Ｈｚの成分は、遠位先端樹状突起において顕著であり、そしてカルバコール誘発β波についての分布と同様の分布を有していた。５３ｍｓｅｃにおいて、惹起された電流シンクは、そのピークにあり、そして基底樹状突起における対応するソースと共に、主にＣＡ３の先端樹状突起に現れることが観察され得る。８３ｍｓｅｃにおいて、リバウンドソースピークはまた、基底樹状突起における対応するシンクと共に、ＣＡ３の先端樹状突起に現れることが観察され得る。
【０１２０】
図１８Ｂに記載される型の応答は、ビククリン濃度に感受性であり、そして２０μＭのビククリンでブロックされた。遅くに惹起された応答の電流源密度解析は、錐体細胞層の上約２００〜４００μｍの放射線維層において、門（ｈｉｌｕｓ）付近の刺激部位からＣＡ１に向って延びるソースを示した；これは、細胞体および基底樹状突起における高密度シンクと平行していた（図１８Ｄ）。
【０１２１】
（実施例１３）
（ベンゾジアゼピンの同定および特性付け）
図１９Ａ〜１９Ｃは、カルバコール誘発β波に対するベンゾジアゼピンの効果を示す。図１９Ａ（２０μＭカルバコール単独）と図１９Ｂ（カルバコールおよび３μＭのジアゼパムを用いた同じスライス）の比較において見られ得るように、ベンゾジアゼピンは、周期的なβリズム振動の振幅を顕著に増大させた。フーリエ変換は、増加した振幅にこの波の周波数における有意な変化が伴わないことを示した。リズム活性は、大きく増大され、そして比較的に不活性な領域に広がる（図１９Ａおよび１９Ｂについての較正線：０．２ｍＶ、５００ｍｓｅｃ）。
【０１２２】
図１９Ｃは、海馬内の記録位置についての周波数スペクトルを要約し、そしてジアゼパムの非存在下（黒）および存在下（灰色）での出力スペクトルの重ね合わせを示す。このことは、ジアゼパム（灰色スペクトル）が、周波数が多く変化することなく、２０Ｈｚバンド内でカルバコール単独（黒スペクトル）に対して出力のおよそ３倍の増加を引き起こしたことを示した。さらに、ジアゼパムの添加により、より高い（約４０Ｈｚγ）周波数にピークが加えられる（較正線：５μＶ）。
【０１２３】
さらに、表１は、カルバコール誘発高周波数リズムがジアゼパムの注入の前に存在した８つの実験の結果を要約する。ピーク周波数における出力の増加は、ＣＡ３について３２１±１７０％であり、そしてＣＡ１について２１７±１３７％であった。ジアゼパムのスライス内における効果を、相関させた（ｒ＝０．９３）。ＣＡ３における増加は、ＣＡ１における増加よりも統計学的に大きかった（ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定、両側）。ジアゼパム後の周期的なリズム振動の周波数を、カルバコール単独下で記録された周期的なリズム振動と、スライス全体にわたって相関させた（ＣＡ３：ｒ＝０．８５；ＣＡ１：ｒ＝０．９６）。
【０１２４】
（表１．カルバコール誘発高周波数リズムが、ジアゼパムの注入の前に海馬スライスに存在した８つの実験の要約。ＣＡ３領域およびＣＡ１領域におけるピーク周波数での出力の最大増加パーセントが示される。）
【０１２５】
【表１】
2006516392.tif 000002
示されるように、ベンゾジアゼピンのクラスの化合物のメンバーの適用は、周期的なβリズム振動の振幅を顕著に増大した。図２０Ａ〜Ｃおよび２１Ａ〜Ｃに示される結果について、カルバコール単独ならびにカルバコールおよび２つの型のベンゾジアゼピンを用いたそれぞれの試料について電位を測定した（１つの例は、３μＭのジアゼパム（図２０Ａ〜Ｃ）であり、そして別の例は、２０μＭのフルラゼパム（図２１Ａ〜Ｃ）であった）。
【０１２６】
図２０Ａは、ＭＥＤアレイの頂上に置いた海馬スライスの顕微鏡写真である。同様に、図２１Ａは、ここで使用されるＭＥＤアレイの頂上の海馬スライスの顕微鏡写真である。電極間距離は、４５０μｍであった。両方のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果が（それぞれ図２０Ｂおよび２１Ｂにおける、淡灰色の、バックグラウンドにおける有意な解剖学的境界と共に）示される。そのように解析されたデータは、ベンゾジアゼピン注入データの増加した振幅が、波の周波数における有意な変化を伴わないことを示す。図２０Ｃおよび２１Ｃにおいて見られるように、両方のベンゾジアゼピンは、２０Ｈｚバンド内の出力においておよそ３倍の増加をもたらした。ピーク周波数における出力の増加は、約３００％であった。
【０１２７】
（実施例１４）
（アンパカインの同定および特性付け）
この実施例において、広い間隔のＭＥＤを海馬試料とともに使用した（それぞれ図２２Ａおよび２３Ａに、下に置かれた微小電極とともに示される）。カルバコール単独、その後１０μＭのアンパカインを用いたサンプルについて、再び電位を測定した（図２２Ａ〜ＣにおけるＣＸ６１４および図２３Ａ〜ＣにおけるＣＸ６９１）。両方のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果を、（淡灰色の、バックグラウンドにおける有意な解剖学的境界と共に、そしてデータに相関させて）それぞれ図２２Ｂおよび２３Ｂに示す。得られたデータは、アンパカイン注入データの増加した周波数はまた、波の振幅における有意な変化を伴っていたことを示す。具体的には、図２２Ｃおよび２３Ｃは、特定の選択された記録位置についての周波数スペクトルを要約する。これは、アンパカインが２０Ｈｚバンド（矢印）内の出力の有意な増加をもたらしただけでなく、ピークの１０Ｈｚシフトを生じたこともまた示す。
【０１２８】
アンパカインは、同期性の顕著な減少および１０Ｈｚよりわずかに大きい二次ピークを生じた。得られたデータは、アンパカイン注入データの減少した振幅が、波の周波数におけるわずかに低いシフトを伴うことを示す。構造的に異なるアンパカインの両方が、２０Ｈｚバンド内の出力の有意な減少だけでなく、ピークの１０Ｈｚシフトもまた生じた。示されるように、二次ピークは、アンパカイン前のβリズムのＣＡ１鉤状回局在化と反対に、歯状回およびＣＡ３領域に中心があるようであった。
【０１２９】
（実施例１５）
（ＧＡＢＡアンタゴニストの同定および特性付け）
ＧＡＢＡ作動性レセプターのアンタゴニストは、顕著な減少および複雑なスパイクで中断される脱同期化活性をもたらした。図３４Ａ〜Ｃおよび３５Ａ〜Ｃは、それぞれ、カルバコール誘発β波に対するビククリンおよびピクロトキシンの効果を示す。
【０１３０】
図３４Ａは、ＭＥＤアレイの頂上に置かれた海馬スライスの顕微鏡写真である。同様に、図３５Ａは、そこで使用されるＭＥＤアレイの頂上の海馬スライスの顕微鏡写真である。電極間距離は、４５０μｍであった。カルバコール単独、続いて２つの列挙された型のＧＡＢＡ作動性アンタゴニスト（１０μＭビククリン（図３４Ａ〜Ｃ）および５０μＭのピクロトキシン（図３５Ａ〜Ｃ））を用いた試料について電位を測定した。
【０１３１】
両方のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果を、（淡灰色の、バックグラウンドの有意な解剖学的境界と共に、そしてデータと相関させて）それぞれ図３４Ｃおよび３５Ｃに示す。得られたデータは、アンタゴニスト注入データの振幅が、ＧＡＢＡ作動性アンタゴニストのいずれかの投与後に顕著に減少することを示した。このアンタゴニストは、２０Ｈｚバンド内の出力の有意な減少をもたらしただけでなく、遅い成分（これは、複雑なスパイクからなる）も生じた。これらのスパイクは、ＣＡ１、鉤状回および皮質に中心があるようであった。図３４Ｂおよび３５Ｂは、図３４Ｃおよび３５Ｃからの選択されたデータを示す。
【０１３２】
（実施例１６）
（ＡＭＰＡアンタゴニストの同定および特性づけ）
ＡＭＰＡ型グルタミン酸レセプターの構造的に異なるアンタゴニストは、予めカルバコールで処理されたインビトロの神経試料における同期化された活性の急速な損失を引き起こした。カルバコール単独、およびその後３つの型のグルタミン酸アンタゴニスト（一例は２０μＭのＣＮＱＸ（図３６Ａ〜Ｃ、１つは２０μＭのＤＮＱＸ（図３７Ａ〜Ｃ）および他は１０μＭのＮＢＱＸ（図３８Ａ〜Ｃ））を用いた試料について電位を測定した。各々のデータセットに対する高速フーリエ変換の結果を、（淡灰色で、バックグラウンドにおける有意な解剖学的境界と共に、そしてデータに相関させて）図３６Ｃ、３７Ｃおよび３８Ｃに示す。得られたデータは、アンタゴニスト注入試料の振幅データが有意に減少されたか、および／または消去されたことを示す。これら３つのアンタゴニストは、出力の有意な減少を生じた。図３６Ｂ、３７Ｂおよび３８Ｂは、図３６Ｃ、３７Ｃ、および３８Ｃからの選択されたデータを示す。
【０１３３】
（実施例１７）
（アンパカイン対ベンゾジアゼピン：ラット海馬スライスにおける周期的なβリズム振動を使用する分化）
（方法）
（多電極アレイの調製）
多電極アレイを、実施例１に記載される通りに調製した。
【０１３４】
（海馬スライスの調製）
海馬スライスを、実施例２に記載される通りに調製したが、但し、その調製緩衝液が、０．７５ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含み、その組織スライスが３７５μｍであったことは異なった。
【０１３５】
これらのスライスを、５μＭカルバコール（ＣＣｈ）（ムスカリンレセプターアゴニスト）の存在下で２０分間インキュベートし、その後、ＭＥＤプローブの中心へと移した。このスライスを望ましい方向へと配置した後、ＭＥＤプローブ上にあるこのスライスの写真を撮り、このＭＥＤプローブを、３２℃のインキュベーター中にあるＭＥＤコネクター上配置した。このスライスを、５μＭ  ＣＣＨを含むＡＣＳＦを用いて１ｍｌ／分にて継続的に灌流した。
【０１３６】
（精神活性剤）
トリアゾラム（ＴＺＬ）、クロルジアゼポキシド（ＣＤＰ）、およびフラゼパム（ＦＺＰ）を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＲＢＩ）から購入した。シクロチアジド（ＣＴＺ）を、Ｓｉｇｍａから購入した。ＣＸ５１６およびＣＸ５４６を、Ｃｏｒｔｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得た。各薬物を、５μＭ  ＣＣｈを含むＡＣＳＦ中に、実験当日に溶解した。各精神活性剤の濃度は、少なくとも出力における効果が有意であるのに十分に高かった。
【０１３７】
（電気生理学的記録）
電気生理学的記録の間、ＭＥＤプローブ上のスライスを、３２℃のインキュベーター中に配置した。そのスライスを、境界面に維持し、加湿した９５％  Ｏ２および５％  ＣＯ２混合物を、上から吹かせた。これらの条件下で、電気生理学的応答を、＞２時間にわたって記録した。６４部位すべてにおける自然電場電位を、５ｋＨｚサンプリング速度にて、ＭＥＤ６４システムと同時に記録した。１秒持続期間のサンプルを、３０秒間ごとに記録した。安定なベースライン条件を、少なくとも２０分間モニターした後、上記化学溶液を注入した。
【０１３８】
図２４は、海馬スライスにおけるＣＣｈ誘導性リズム活性に対するＣＸ５４６の影響を示す。図２４Ａは、ＭＥＤプローブ上の海馬スライスの顕微鏡写真である。図２４Ｂは、電場ＣＡ３の先端樹状突起に位置する電極（四角で示す）で記録した、ベースラインおよび薬物洗い込み活性のサンプルを示す。ここで、最大の活性が得られる。
【０１３９】
（統計学および測定）
リズム活性の出力スペクトルを、ＭＥＤ６４  Ｐｅｒｆｏｒｍｅｒ  １．５（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ）における高速フーリエ変換機能を使用して、計算した
図２５において、リズム活性の周波数および出力のサンプルを、経時的にプロットした。上記薬物の効果の統計学的有意性を、最後５分間のベースラインおよび薬物注入についての１０個の応答各々を、６つの（または７つの）実験（スライス）にわたって、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおいて「反復測定２元配置分散分析」を使用して比較することによって、評価した。
【０１４０】
（結果）
データを、ベースライン出力が５０〜４００（１６７±１４．３）μＶ２の範囲内にある３７個の安定な細胞外記録から得た。ベースラインリズム活性の主要成分は、β範囲（２７．７４±０．５６Ｈｚ）内にあった。ベースラインを少なくとも２０分間記録した後、薬物溶液を、同じ流量（１ｍｌ／分）で２０分間継続的に注入した。薬物濃度は、ベンゾジアゼピンについて１０μＭであり、シクロチアジドについては１００μＭであり、アンパカインについては２５０μＭであった（ＣＸ５１６およびＣＸ５４６）。
【０１４１】
図２６は、最後５分間（１０サンプル）のベースラインと、各薬物注入との間の周波数変化および出力変化の割合を示す。出力変化は、１種類の薬物においては類似したが、複数の薬物の種類間では反対であった。ベンゾジアゼピン（すなわち、ＦＺＰ、ＣＤＰ、およびＴＺＬ）は、β範囲出力を、それぞれ、５５±１８％（平均±標準偏差；ｎ＝６）、５５±１３％（ｎ＝６）、および６４±１７％（ｎ＝６）増加した。他方、ＡＭＰＡレセプターモジュレーター（すなわち、ＣＸ５１６、ＣＸ５４６、およびＣＴＺ）は、出力を、それぞれ、３６±７％（ｎ＝７）、６５±７％（ｎ＝６）、および６７±４％（ｎ＝６）減少した。これらすべての出力変化は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０１、反復測定２元配置分散分析）。
【０１４２】
周波数変化は、ベンゾジアゼピン類のうちで異なった。ＦＺＰは、周波数を５．４±２．５％（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６）増加したが、ＣＤＰは、周波数を５．０±２．４％（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６）減少した。ＴＺＬは、周波数を変化させなかった（ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６）。他方、ＡＭＰＡレセプターモジュレーターは、周波数を増加させた。ＣＸ５１６、ＣＸＣ５４６、およびＣＴＺは、周波数を、それぞれ、４．０±２．３％（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝７）、１１±２．５％（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６）、および１３±１．８％（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ、ｎ＝６）増加した。
【０１４３】
図２６は、最後の５分間（１０サンプル）のベースラインと、各薬物注入との間での、周波数変化および出力変化の割合を示す。出力および周波数の両方が、種類間および種類内で薬物を区別するために有用であるので、これらの変化は、図２７において２次元空間（出力軸および周波数軸）にプロットした。このプロットにおいて、ベンゾジアゼピン（灰色）は、ＡＭＰＡレセプターモジュレーター（黒色）から離れている。さらに、ベンゾジアゼピン類のうちの２つ（ＣＤＰおよびＴＺＬ）は、ＦＺＰと比較した場合に互いに類似する（周波数変化が反対方向である）。２つのＡＭＰＡレセプターモジュレーター（ＣＸ５４６およびＣＴＺ）もまた、ＣＸ５１６と比較して、互いに類似する。しかし、これらの差異は、上記レセプターを占有する程度に起因し得る。用量応答実験が、これらの差異をさらに評価するためには必要である。
【０１４４】
図２７は、最後の５分間（１０サンプル）のベースラインと、各薬物注入との間での周波数変化および出力変化の２次元プロットである。
【０１４５】
（実施例１８）
（ラット海馬スライスにおける低周波数バースト活性および周期的なβリズム振動を使用する、５−ＨＴ１Ａレセプターアゴニストアッセイ）
図２８は、ＣＡ３領域の錐体細胞層からの細胞外電場記録の例示的トレースであり、これは、ＣＣｈ（５ｍＭ）が周期的なβリズム振動（２８Ａ）および低周波数バースト活性（０．１〜０．２Ｈｚ、図２８Ｂにおける拡張トレース）を誘導したことを示す。
【０１４６】
この低周波数バースト活性は、５−ＨＴ（３ｍＭおよび１０ｍＭ）ならびにフルオキセチン（１０ｍＭ）を注入することによって可逆的に減少した（図２９）。この効果は、５−ＨＴ１Ａレセプターの活性化によって媒介されることが見出された。なぜなら、選択的５−ＨＴ１ＡレセプターアンタゴニストであるＮ−（２−（４−（２−メトキシフェニル）−１−ピペラジニル）エチル）−Ｎ−（２−ピリジニル）シクロヘキサンカルボキサミド（ＷＡＹ  １００６３５、１ｍＭ）は、５−ＨＴ（１０ｍＭ）によるバースト活性の抑制を逆転した（データは、示さない）からである。
【０１４７】
図２９において、５−ＨＴおよびフルオキセチンは、ＣＣｈ誘導性ネットワークバースト活性の周波数を減少することが示される。図２９Ａにおける上部トレースは、５−ＨＴの効果を示す。下部トレースは、フルオキセチンの効果を示す。図２９Ｂにおける棒グラフは、プールしたデータを示す。
【０１４８】
図３０は、ＣＣｈにより誘導される周期的なβリズム振動もまた、５−ＨＴに対して感受性であることを示す。５−ＨＴは、ＣＣｈ誘導性周期的なβリズム振動の出力を減少する。図３０Ａにおいて、ＣＡ３領域の錐体細胞層からの細胞外電場記録の例示的トレースは、５−ＨＴの効果を示す。図３０Ｂにおける棒グラフは、プールしたデータを示す。
【０１４９】
（実施例１９）
（共培養サンプルを使用するＳＳＲＩおよびコリンエステラーゼインヒビターのアッセイ）
調節性突出（例えば、コリン作動性突出およびセロトニン作動性突出）に影響を与える薬物は、測定するのが困難である。海馬を付着した縫線核または中隔と共培養することを使用すると、それらの間に自然な結合が提供され、コリンエステラーゼインヒビター系に作用する化合物および選択的セロトニン再取込み系に作用する化合物を試験することが可能になる。
【０１５０】
（方法）
（ＭＥＤプローブの調製）
使用前に、ＭＥＤプローブ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ；ＭＥＤ−Ｐ５４５ＡＰ、各電極：５０×５０μｍ、極間距離：４５０μｍ）を、７０％エタノール中に１５分間浸漬し、クリーンベンチ中で乾燥させ、ＵＶ照射で１５分間滅菌した。そのプローブの表面を、０．１％ポリエチレンイミンおよび２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用いて室温で一晩処理した。そのプローブ表面を、乾燥させ、滅菌蒸留水で３回リンスした。最後に、そのプローブに、培養培地を充填し、使用するまで（少なくとも１時間）ＣＯ２インキュベーター中に保存した。その培養培地は、基礎培地Ｅａｇｌｅ（Ｓｉｇｍａ；Ｂ９６３８）およびＥａｒｌｅ平衡化塩溶液（Ｓｉｇｍａ；Ｅ７５１０）の２：１混合物であった。これには、ＮａＣｌ（２０ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（５ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．２ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１．７ｍＭ）、グルコース（４８ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２６．７ｍＭ）；５％ウマ血清（ＧＩＢＣＯ；２６０５０）および１０ｍｌ／ｌペニシリン―ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ；１０３７８）を添加しており、そのｐＨは７．２に調節されていた。
【０１５１】
（脳スライスの解剖）
培養物調製のためのすべての手順を、滅菌ベンチのもとで実行した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、７０％エタノールで滅菌し、麻酔後に断頭することにより屠殺し、全脳を取り出した。その脳を、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、Ｔｒｉｓベース（１０ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）およびＭｇＣｌ２（３ｍＭ）を補充した滅菌氷冷ＭＥＭ（ｐＨ７．２；ＧＩＢＣＯ；６１１００）中にすぐに浸漬した。脳の適切な部分を、手で調整し、残りの脳ブロックを、振動組織スライサー（Ｌｅｉｃａ；ＶＴ１０００Ｓ）の氷冷ステージ上に配置した。中隔部分および縫線部分を、５日齢または６日齢のラットから取得し、海馬部分を、１１日齢ラットから取得した。そのスライスの厚さを、２００μｍに設定した。そのスライスは、ピペットを用いてブレードから穏やかに取得した。各スライスを、適切に整えた。
【０１５２】
（膜上での培養）
１つの海馬スライスおよび１つの中隔スライスまたは縫線スライスを、多孔膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の中心に配置した。この多孔膜は、以前に上記のようにコーティングしていた。この膜上に切片を配置した後、切断切片を取り出し、培養培地をこの膜の下に（約１ｍｌ）添加した。この膜上のスライスを、３４℃のＣＯ２インキュベーター中に保存した。その培地を、１日置きに全容量を交換した。
【０１５３】
電気生理学的記録のために、それらのスライスを、膜を切断することによって取得し、ＭＥＤプローブ上で刺激し、８×８微小電極アレイを覆うように配置した。その後、培養培地を境界面レベルまで（約２５０ｍｌ）添加し、ＭＥＤプローブ上のスライスを、３４℃のＣＯ２インキュベーター中に１時間保存した。インキュベーション後、そのプローブ上のスライスを、インキュベーターから取り出し、より小さいＣＯ２インキュベーター中に３４℃で配置し、ＭＥＤ−６４の記録要素に接続した。その培地は、組成がＮａＣｌ（１２４ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（２６ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（３ｍＭ）、ＮａＨ２ＰＯ４（１．２５ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）およびＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）である滅菌した人口脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で置換した。６４部位すべてにおける自然電場電位を、２０ｋＨｚサンプリング速度にて、マルチチャネル記録システム（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ；ＭＥＤ６４システム）を用いて同時に記録した。
【０１５４】
（ＭＥＤプローブ上での培養）
１つの海馬スライスおよび１つの中隔スライスまたは縫線スライスを、ＭＥＤプローブ（これには、以前に、上記に記載したようにしてコーティングしていた）の中心に配置し、８×８微小電極アレイ上で互いに隣り合うように配置した。ＭＥＤプローブ上に切片を配置した後、切断溶液を除去し、培養培地を、このスライスに境界面レベルまで（約２５０μｌ）添加した。滅菌した蒸留水をプローブの周囲に添加して、湿度を増加させ、ＭＥＤプローブ中の培養培地の過剰乾燥を防止した。ＭＥＤプローブ上のスライスを、３４℃のＣＯ２インキュベーター中で保存した。その培地を、毎日半量ずつ交換した。
【０１５５】
電気生理学的記録のために、そのスライスを含むＭＥＤプローブを、インキュベーターから取り出し、３４℃のより小さいＣＯ２インキュベーター中に配置して、ＭＥＤ−６４の刺激／記録要素に接続した。その培地を、組成がＮａＣｌ（１２４ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（２６ｍＭ）、グルコース（１０ｍＭ）、ＫＣｌ（３ｍＭ）、ＮａＨ２ＰＯ４（１．２５ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）およびＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）である滅菌した人口脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で置換した。６４部位すべてにおける自然電場電位を、２０ｋＨｚサンプリング速度にて、マルチチャネル記録システム（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ；ＭＥＤ６４システム）を用いて同時に記録した。
【０１５６】
（結果）
図３１は、ＭＥＤプローブ上で直接増殖した中隔海馬共培養物にコリンエステラーゼインヒビターを添加することからの結果のグラフ表示である。具体的には、図３１は、中隔海馬共培養物中のコントロールとコリンエステラーゼインヒビター（フィゾスチグミン、１０μｍ）との間の周波数変化および出力変化の２次元プロットである。その振幅および周波数は、個別のデータセット各々に対する高速フーリエ変換の結果であった。この図から観察されるように、フィゾスチグミンは、自然発生リズム活性の出力を増加したが、その周波数には影響を与えなかった。
【０１５７】
図３２は、同じ中隔海馬共培養物におけるスパイクの数におけるフィゾスチグミン（１０μｍ）の影響を示す。アトロピン（１μＭ）は、フィゾスチグミンの影響を完全に逆転した。
【０１５８】
縫線海馬調製物に対するＳＳＲＩの影響が、図３３に示される（出力の減少、周波数のわずかな減少）。図３３は、縫線海馬共培養物におけるコントロールとＳＳＲＩ（フルオキセチン）との間の周波数変化および出力変化の２次元プロットである。この図は、上記膜上で増殖してＭＥＤプローブ上に移されて測定された、縫線海馬共培養物に対するフルオキセチン（２μＭ）により引き起こされる自然発生リズム活性の相対的差異を示す。その振幅および周波数は、個々のデータセット各々に関する高速フーリエ変換の結果であった。
【０１５９】
本願において引用されるすべての刊行物および特許出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。上記の発明は、明確さおよび理解のために、例証および例示として記載されているが、本発明の教示を考慮すれば、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなく本発明に対してなされ得ることが、当業者にとって容易に明らかである。
（参考文献）
【０１６０】
【表２】
2006516392.tif 000003
【０１６１】
【表３】
2006516392.tif 000004
【０１６２】
【表４】
2006516392.tif 000005
【０１６３】
【表５】
2006516392.tif 000006
【０１６４】
【表６】
2006516392.tif 000007
【０１６５】
【表７】
2006516392.tif 000008
【０１６６】
【表８】
2006516392.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
添付の図面は、本発明の原理を例示し、説明する。これらの図面は、本発明の範囲を制限することを意図するのではない。
【図１】図１は、海馬スライスのＣＡ３領域における速い周期的なリズム振動の誘導を示し、そしてコントロールおよびＣＣｈによって誘導される細胞外の周期的なリズム振動の出力スペクトルの例を示す。
【図２】図２は、一時的にＣＣｈを適用した後に、ＣＡ３錐体細胞活性レベルにおける持続性の増加ならびにスパイクおよびバーストを示す。較正：１０ｍｓ、１００μＶ。
【図３】図３は、長持続性リズムに対する薬理学的操作の効果を示す。図３Ａについては、較正：５ｍｓ、４００μＶ。図３Ｃについては、較正：５μｓ、５００μＶ。
【図４】図４は、スパイクおよびバースト周波数に対するアトロピンおよび５−ＨＴの効果を示す。図４Ａについては、較正：２０ｍｓ、１００μＶ。図４ｄについては、較正：２０μｄ、１００μＶ。
【図５】図５は、コリン作動性可塑性に対する選択的ムスカリンアンタゴニストの効果を示す。較正：５ｍｓ、５００μＶ．
【図６−１】図６は、種々のアセチルコリンエステラーゼインヒビターによって海馬スライスにおいて誘導されたβリズム活性を例示する。
【図６−２】図６は、種々のアセチルコリンエステラーゼインヒビターによって海馬スライスにおいて誘導されたβリズム活性を例示する。
【図７】図７は、低解像度で測定された画像を描く際の「エイリアシング」の現象を示す。
【図８】図８は、アンチエイリアシングの効果を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、各々、８×８の検出器アレイ上への海馬スライスの配置、およびそれらの電極の１つにおいて誘起されたシナプス後応答を示す。
【図１０】図１０は、図９Ａおよび９Ｂにおけるスライスの配置から計算された、誘起された応答の連続する二次元電流源密度解析を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、計算された生理学的現象と、既知の解剖的構造とのアラインメントを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、海馬スライスの顕微鏡写真および海馬内のカルバコール誘導β波の分布を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、高密度微小電極アレイで測定した、海馬におけるカルバコール誘導β波を示す。
【図１４】図１４は、図１３Ａに示されるスライスについての、カルバコール誘導活性の電流源密度解析を示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、先端樹状突起および基底樹状突起における、カルバコール誘導反復周期的リズム振動の関係を示す。
【図１６】図１６は、特定の時間にわたる電流源密度の計算された進化を示す。
【図１７−１】図１７は、海馬および皮質における、２つの異なるカルバコール誘導リズムを示す。
【図１７−２】図１７は、海馬および皮質における、２つの異なるカルバコール誘導リズムを示す。
【図１８−１】図１８は、ＣＡ３領域の順方向活性化により誘起された、β様活性の二次元電流源密度解析を示す。
【図１８−２】図１８は、ＣＡ３領域の順方向活性化により誘起された、β様活性の二次元電流源密度解析を示す。
【図１８−３】図１８は、ＣＡ３領域の順方向活性化により誘起された、β様活性の二次元電流源密度解析を示す。
【図１９】図１９は、カルバコール誘導β波に対するベンゾジアゼピンの影響を示す。
【図２０−１】図２０Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するジアゼパムの影響を示す。
【図２０−２】図２０Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するジアゼパムの影響を示す。
【図２１−１】図２１〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するフルラゼパムの影響を示す。
【図２１−２】図２１〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するフルラゼパムの影響を示す。
【図２２−１】図２２Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するアンパカイン（ａｍｐａｋｉｎｅ）（ＣＸ６１４）の影響を示す。
【図２２−２】図２２Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するアンパカイン（ａｍｐａｋｉｎｅ）（ＣＸ６１４）の影響を示す。
【図２３−１】図２３Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するアンパカイカイン（ＣＸ６９１）の影響を示す。
【図２３−２】図２３Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するアンパカイカイン（ＣＸ６９１）の影今日を示す。
【図２４】図２４は、海馬スライスにおけるＣＣｈ誘導リズム活性に対するＣＸ５４６の影響を示す。電極間間隔は、３００μｍである。
【図２５】図２５は、ＣＸ５４６を用いて経時的にプロットしたリズム活性の周波数および出力における試料変化を示す。
【図２６】図２６は、ベンゾジアゼピン、シクロチアジド、およびアンパカインの間の周波数および出力の変化％を示す。
【図２７】図２７は、ベンゾジアゼピン、シクロチアジド、およびアンパカインの間の周波数および出力の変化の二次元プロットを示す。
【図２８】図２８は、５ｍＭ  ＣＣｈとの組織のインキュベーションが、周期的なβリズム振動およびより低い周波数のバースト活性（０．１〜０．２Ｈｚ）を誘導することを実証する。
【図２９−１】図２９は、５−ＨＴおよびフルオキセチンがＣＣｈ誘導ネットワークバースト活性の周波数を減少させることを示す。
【図２９−２】図２９は、５−ＨＴおよびフルオキセチンがＣＣｈ誘導ネットワークバースト活性の周波数を減少させることを示す。
【図３０−１】図３０は、５−ＨＴがＣＣｈ誘導される周期的なβリズム振動の出力を減少させることを実証する。
【図３０−２】図３０は、５−ＨＴがＣＣｈ誘導される周期的なβリズム振動の出力を減少させることを実証する。
【図３１】図３１は、ＭＥＤプローブ上で直接増殖された中隔海馬共培養物へのフィゾスチグミン（コリンエステラーゼインヒビター）の添加によって引き起こされる自発性リズム活性における相対的相違を示す。
【図３２】図３２は、中隔海馬共培養物におけるスパイクの数に対するコリンエステラーゼインヒビター（フィゾスチグミン）の影響を示す。
【図３３】図３３は、海馬縫線共培養物におけるコントロール組織とＳＳＳＲＩ（フルオキセチン）処理組織の間の周波数および出力における変化の二次元プロットである。
【図３４−１】図３４Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するビククリンの影響を示す。
【図３４−２】図３４Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するビククリンの影響を示す。
【図３５−１】図３５Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するピクロトキシンの影響を示す。
【図３５−２】図３５Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するピクロトキシンの影響を示す。
【図３６−１】図３６Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＣＮＱＸの影響を示す。
【図３６−２】図３６Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＣＮＱＸの影響を示す。
【図３７−１】図３７Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＤＮＱＸの影響を示す。
【図３７−２】図３７Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＤＮＱＸの影響を示す。
【図３８−１】図３８Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＮＢＱＸの影響を示す。
【図３８−２】図３８Ａ〜Ｃは、カルバコール誘導β波に対するＮＢＱＸの影響を示す。
【図３９】図３９は、本発明の方法に従う、神経組織への特定のクラスの神経活性剤の添加の前後の周期的なリズム振動のリズムを比較した予測的な結果を広範に示す。
【図１】
2006516392.tif 000010
【図２】
2006516392.tif 000011
【図３】
2006516392.tif 000012
【図４】
2006516392.tif 000013
【図５】
2006516392.tif 000014
【図６−１】
2006516392.tif 000015
【図６−２】
2006516392.tif 000016
【図７】
2006516392.tif 000017
【図８】
2006516392.tif 000018
【図９】
2006516392.tif 000019
【図１０】
2006516392.tif 000020
【図１１】
2006516392.tif 000021
【図１２】
2006516392.tif 000022
【図１２】
2006516392.tif 000023
2006516392.tif 000024
2006516392.tif 000025
2006516392.tif 000026
【図１４】
2006516392.tif 000027
【図１７】
2006516392.tif 000028
【図１８】
2006516392.tif 000029
【図１８】
2006516392.tif 000030
【図１９】
2006516392.tif 000031
【図２０】
2006516392.tif 000032
【図２１】
2006516392.tif 000033
【図２２】
2006516392.tif 000034
【図２３】
2006516392.tif 000035
【図２５】
2006516392.tif 000036
【図２６】
2006516392.tif 000037
【図２７】
2006516392.tif 000038
【図２８】
2006516392.tif 000039
【図２９−１】
2006516392.tif 000040
【図２９−２】
2006516392.tif 000041
【図３０−１】
2006516392.tif 000042
【図３０−２】
2006516392.tif 000043
【図３１】
2006516392.tif 000044
【図３２】
2006516392.tif 000045
【図３３】
2006516392.tif 000046
【図３４】
2006516392.tif 000047
【図３５】
2006516392.tif 000048
【図３６】
2006516392.tif 000049
【図３７】
2006516392.tif 000050
【図３８】
2006516392.tif 000051
【図１５】
2006516392.tif 000052
【図１６】
2006516392.tif 000053
【図１７−１】
2006516392.tif 000054
【図１８−３】
2006516392.tif 000055
【図２０−１】
2006516392.tif 000056
【図２１−１】
2006516392.tif 000057
【図２２−１】
2006516392.tif 000058
【図２３−１】
2006516392.tif 000059
【図２４】
2006516392.tif 000060
【図３４−１】
2006516392.tif 000061
【図３５−１】
2006516392.tif 000062
【図３６−１】
2006516392.tif 000063
【図３７−１】
2006516392.tif 000064
【図３８−１】
2006516392.tif 000065
【図３９】
2006516392.tif 000066
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月16日(2005.9.16)
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経組織試料を用いて候補試料組成物を特性付けするための方法であって、以下：
ａ）該神経組織試料を誘導因子と接触させることによってベースラインの周期的なリズム振動を誘導し、そして該誘導因子の洗浄後、該ベースラインの周期的なリズム振動を維持する、工程；
ｂ）該ベースラインの周期的なリズム振動からの種々のパラメーターおよびその組合せ、ならびに、該神経組織試料を候補試料組成物と接触させた後に生成する、結果として生じる周期的なリズム振動からの種々のパラメーターおよびその組み合わせを測定する、工程；
ｃ）該ベースラインの周期的なリズム振動からの種々のパラメーターおよびその組合せと、結果として生じる周期的なリズム振動からの種々のパラメーターおよびその組み合わせとを比較する、工程；ならびに
ｄ）該ベースラインの周期的なリズム振動からの種々のパラメーターおよびその組合せと、結果として生じる周期的なリズム振動からの種々のパラメーターおよびその組み合わせとの間の差異に基づいて、該候補試料組成物を特性付ける工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記特性付ける工程が、前記精神活性化合物がメンバーである化合物のクラスを同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同定された化合物のクラスと、１つ以上の異なる精神活性化合物のクラスとの間の相対的な差異を比較する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記精神活性化合物を、前記化合物のクラスの他のメンバーと区別する工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記パラメーターの組み合わせが、周波数および出力を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記精神活性化合物が、ＡＭＰＡアンタゴニスト、ＡＭＰＡレセプターモジュレーター、抗不安薬、抗痙攣薬、抗うつ薬、抗精神病薬、ベンゾジアゼピン、中枢神経系刺激剤、ドーパミン作動性薬剤、ＧＡＢＡアンタゴニスト、催眠薬、および麻酔性鎮痛薬からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記精神活性化合物が、ＡＭＰＡアンタゴニストを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＭＰＡアンタゴニストが、ＣＮＱＸ、ＤＮＱＸ、ＧＹＫＩ  ５２４６６ＨＣｌ、ジョロウグモ毒素、１−ナフチル−アセチルスペルミン、ＮＳ２５７、およびＮＢＱＸからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記精神活性化合物が、ＡＭＰＡレセプターモジュレーターを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＭＰＡレセプターモジュレーターが、アンパカインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＭＰＡレセプターモジュレーターが、ＣＸ５１６、ＣＸ５４６、ＣＸ５５４、ＣＸ６１４、およびＣＸ６９１からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記精神活性化合物が、ベンゾジアゼピンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベンゾジアゼピンが、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロラゼパート、クロチアゼパム、ジアゼパム、エスタゾラム、エチゾラム、フルジアゼパム、フルマゼニル、フルニトラゼパム、フルラゼパム、フルトプラゼパム、ハロキサゾラム、ロラゼパム、メダゼパム、ニメタゼパム、ニトラゼパム、オキサゼパム、オキサゾラム、リマザホン、テマゼパム、およびトリゾラムからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベンゾジアゼピンが、ジアゼパム、クロルジアゼポキシド、フルラゼパム、およびトリアゾラムからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記精神活性化合物が、ＧＡＢＡアンタゴニストを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＧＡＢＡアンタゴニストが、ビククリン、β−ヒドラスチン、ピクロトキシン、およびＳＲ−９５５３１（ガバジン）からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＡＢＡアンタゴニストがビククリンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＡＢＡアンタゴニストがピクロトキシンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベースラインの周期的なリズム振動を生成するための誘導因子が、化学的化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学的化合物が、コリン作動性アゴニスト、コリンエステラーゼインヒビター、および交感神経アゴニストからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化学的化合物が、コリン作動性アゴニストを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記コリン作動性アゴニストが、アセチルコリン、アレコール、カルバコール、メタコリン、ベタネコール、ムスカリン、およびピロカルピンからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記コリン作動性アゴニストが、カルバコールを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記化学的化合物が、コリンエステラーゼインヒビターを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記コリンエステラーゼインヒビターが、アンベノニウム、デメカリウム、ジヨードプロピル−フルオロホスフェート、エコチオフェート、エドロホニウム、ヒューペルジンおよびヒューペルジンアナログ、ネオスチグミン、フィゾスチグミン、ならびにピリドスチグミンからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記コリンエステラーゼインヒビターが、フィゾスチグミンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化学的化合物が、ムスカリン性Ｍ１レセプターに選択的に結合する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記誘導因子が、電気的刺激である、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2006516392.tif 000067
2006516392.tif 000068
2006516392.tif 000069