(57)【要約】本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスのＳ、Ｍ、Ｅ、ＮおよびＵ２７４タンパク質が抗原性であるという発見に基づいた、試料中のＳＡＲＳコロナウイルスに対する抗体の有無を検出する方法に関する。そのような方法は、患者がＳＡＲＳコロナウイルスに感染しているか、または曝露されたかどうかを診断するために使用できる。ＳＡＲＳのＳ、Ｍ、Ｅ、ＮおよびＵ２７４タンパク質に対する抗体をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）に対する抗体の有無を検出するための方法であって、
前記抗体がＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗原と複合体を形成するのに十分な時間および条件で抗原を抗体含有試料と接触させるステップを含み、
前記抗原がＳ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含み、前記抗体と前記タンパク質との間の特異的結合は、前記試料がＳＡＲＳ  ＣｏＶに特異的な抗体を含有することを示す
方法。
【請求項２】
前記抗体含有試料が、検査されるヒトからのものであり、
前記抗体と前記タンパク質との間の特異的結合は、前記ヒトがＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染しているかまたは曝露されたことを示す、
ヒトがＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染しているかまたは曝露されたかどうかを検査するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗原が、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの抗原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原が、
Ｓの４６番目から４８０番目のアミノ酸、
１１１番目から１１８番目のアミノ酸を欠失したＮ、または
Ｕ２７４の１３４番目から２７４番目のアミノ酸
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原が、
１１１番目から１１８番目のアミノ酸を欠失したＮ、または
Ｕ２７４の１３４番目から２７４番目のアミノ酸
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原が、ＮもしくはＵ２７４またはそれらの免疫原性断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、異種タンパク質と融合している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記異種タンパク質が、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原が固定化されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血清である、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記血清が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したかまたは曝露されたヒトから感染後２日から６０日の間に採収される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記血清が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したかまたは曝露されたヒトから感染後２日から１１日の間に採収される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記血清が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したかまたは曝露されたヒトから感染後１６日から６０日の間に採収される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体と前記抗原との前記複合体を検出するステップをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複合体を検出するステップが、前記複合体をヒト抗体に対する抗アイソタイプ抗体と接触させることを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複合体を抗ヒトＩｇＡ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体と接触させることによって前記複合体を検出するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記複合体を抗ヒトＩｇＧ抗体と接触させることによって前記複合体を検出するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記複合体を検出するステップが、酵素、着色色素、蛍光色素、化学発光分子、放射性原子を含有する分子、または重金属を含有する分子によって前記複合体を可視化することを含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素がアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼであり、前記蛍光色素がＦＩＴＣまたはローダミンであり、前記重金属を含有する分子が金コロイド錯体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４タンパク質またはそれらの抗原性断片である抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質に対する単離された抗体。
【請求項２１】
前記抗体が、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４タンパク質またはそれらの抗原性断片に対する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が、
Ｓの４６番目から４８０番目のアミノ酸、
１１１番目から１１８番目のアミノ酸を欠失したＮ、または
Ｕ２７４の１３４番目から２７４番目のアミノ酸
に対する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、
１１１番目から１１８番目のアミノ酸を欠失したＮ、または
Ｕ２７４の１３４番目から２７４番目のアミノ酸
に対する、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
ポリクローナル抗体である、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体である、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
試料中のＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）に対する抗体の有無を検出するための市販用パッケージであって、
（ａ）Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含むＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗原と、
（ｂ）前記試料からの前記抗体と前記抗原との間の複合体を検出するための手段と
を含むパッケージ。
【請求項２７】
ヒトがＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）に感染しているかまたは曝露されたかどうかを検査するための市販用パッケージであって、
（ａ）Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含むＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗原と、
（ｂ）前記抗原と前記抗原に対する抗体との間の複合体を検出するための手段と
を含み、
前記試料が検査される前記ヒトの抗体含有試料である、
パッケージ。
【請求項２８】
前記抗原が、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項２６または２７に記載のパッケージ。
【請求項２９】
前記抗原が、
Ｓの４６番目から４８０番目のアミノ酸、
１１１番目から１１８番目のアミノ酸を欠失したＮ、または
Ｕ２７４の１３４番目から２７４番目のアミノ酸
を含む、請求項２６または２７に記載のパッケージ。
【請求項３０】
前記抗原が、
１１１番目から１１８番目のアミノ酸を欠失したＮ、または
Ｕ２７４の１３４番目から２７４番目のアミノ酸
を含む、請求項２８に記載のパッケージ。
【請求項３１】
前記抗原が、ＮもしくはＵ２７４またはそれらの免疫原性断片を含む、請求項２６または２７に記載のパッケージ。
【請求項３２】
前記タンパク質が異種タンパク質と融合している、請求項２６から３１のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３３】
前記異種タンパク質が、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である、請求項３２に記載のパッケージ。
【請求項３４】
前記抗原が固定化されている、請求項２６から３３のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３５】
前記試料が血清である、請求項２６から３４のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項３６】
前記血清が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したかまたは曝露されたヒトから感染後２日から６０日の間に採収される、請求項３６に記載のパッケージ。
【請求項３７】
前記血清が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したかまたは曝露されたヒトから感染後２日から１１日の間に採収される、請求項３６に記載のパッケージ。
【請求項３８】
前記血清が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したかまたは曝露されたヒトから感染後１６日から６０日の間に採収される、請求項３６に記載のパッケージ。
【請求項３９】
前記複合体を検出するための前記手段が、ヒト抗体に対する抗アイソタイプ抗体を含む、請求項２６から３８のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４０】
前記複合体を検出するための前記手段が、抗ヒトＩｇＡ抗体または抗ヒトＩｇＭ抗体を含む、請求項３７に記載のパッケージ。
【請求項４１】
前記複合体を検出するための前記手段が、抗ヒトＩｇＧ抗体を含む、請求項３８に記載のパッケージ。
【請求項４２】
前記複合体を検出するための前記手段が、酵素、着色色素、蛍光色素、化学発光分子、放射性原子を含有する分子、および重金属を含有する分子からなる群から選択される可視化手段をさらに含む、請求項３９から４１のいずれか一項に記載のパッケージ。
【請求項４３】
前記酵素がアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼであり、前記蛍光色素がＦＩＴＣまたはローダミンであり、前記重金属を含む分子が金コロイド錯体である、請求項４２に記載のパッケージ。
【請求項４４】
ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４タンパク質の有無を検出する方法であって、
Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮおよびＵ２７４からなる群から選択されるタンパク質に対する抗体が抗原と複合体を形成するのに十分な時間および条件で、前記抗体を抗原含有試料と接触させるステップを含み、
前記抗体と前記抗原との間の特異的結合は、前記試料がＳ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４またはそれらの免疫原性断片を含む抗原を含有することを示す
方法。
【請求項４５】
ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＭ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４タンパク質の有無を検出する方法であって、
Ｍ、Ｅ、ＮおよびＵ２７４からなる群から選択されるタンパク質に対する抗体が抗原と複合体を形成するのに十分な時間および条件で、前記抗体を抗原含有試料と接触させるステップを含み、
前記抗体と前記抗原との間の特異的結合は、前記試料がＭ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４またはそれらの免疫原性断片を含む抗原を含有することを示す
方法。
【請求項４６】
前記抗体と前記抗原との前記複合体を検出するステップをさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
ウエスタンイムノブロット、ＥＬＩＳＡ、捕捉ＥＬＩＳＡまたは免疫蛍光アッセイである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記複合体を検出するステップが、酵素、着色色素、蛍光色素、化学発光分子、放射性原子を含有する分子、または重金属を含有する分子によって前記複合体を可視化することを含む、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素がアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼであり、前記蛍光色素がＦＩＴＣまたはローダミンであり、前記重金属を含有する分子が金コロイド錯体である、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
[0001]本出願は、参照により本明細書に組み込まれている２００３年６月１０日に出願した米国仮出願第６０／４７７０５９号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
[0002]本発明は、一般的にはウイルス感染の診断方法に関し、特にＳＡＲＳコロナウイルス感染の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]新たに出現した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、世界的に重大な重症呼吸器病である。感染した患者は、異型肺炎の症状を発症する場合があり、ＳＡＲＳを異型肺炎と早期かつ正確に区別することは、この高度接触伝染性疾病の管理を成功させるために重要である。
【０００４】
[0004]ＳＡＲＳの高度接触伝染性は、高い死亡率と共に、グローバル化の進む世界において破壊的で大きな犠牲をもたらす。世界保健機関（ＷＨＯ）は、２００３年にこのことを即座に認識した。その年にＳＡＲＳの流行が中国広東省の発生地を越えて蔓延し、ＷＨＯの歴史上初めて世界的な警報（ｇｌｏｂａｌ  ａｌｅｒｔ）が発令された。大発生は、８０９８人を上回る人々を襲い、６か月という短期間に２９を超える国と地域に蔓延し、死亡率は１５％に達した。明らかにこの疾患は限られた問題ではなく、公衆健康管理を超えた領域に影響する甚大な結果を有する問題である。２００４年１月のように新たな症例が再び出現しつつあると思われることため、感染した患者を迅速に同定し分離することは相変わらず緊急性を要する。
【０００５】
[0005]多くの国々で、ＳＡＲＳ起炎ウイルスに曝露されたおそれのある人々と接触するリスクを減らすために、ＳＡＲＳ感染国を旅行した者、ＳＡＲＳ患者と直接接触した者、および体温が３８℃を超えている者に厳正な隔離命令が下されている。感染初期における疾患の早期診断は、不必要な隔離を回避し、関係者のストレスを減らし、医師が適切な医療行動および／または治療を決定するのを助けることができるであろう。したがって、ＳＡＲＳ患者をできるだけ早期に、確実性および正確性をもって同定することは極めて重要である。
【０００６】
[0006]ＳＡＲＳの原因因子として新規なコロナウイルスが同定された（非特許文献１〜４）。コロナウイルスは、２７．６〜３１ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを含むエンベロープウイルスである。この新規なＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ  ＣｏＶ）のヌクレオチド配列の分析から、ウイルスゲノムが長さ約３０ｋｂで（非特許文献５および６）、１４個の潜在的オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む（非特許文献５）ことが示された。しかし、この疾患をいかに検出、診断、および治療するかに関してさらに学ぶべきことが残っている。この疾患に対する薬物またはワクチンが入手できていないため、感染患者の迅速な同定および分離が疾患の防除に最も重要である。
【０００７】
[0007]ＳＡＲＳが最初に同定された当初、初期疾患管理は旅行歴、接触歴および症状の発生に頼っていた。その後、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの同定と共に、ＰＣＲの使用によるウイルスＲＮＡ配列の検出に基づくいくつかの診断検査が設計され、現在利用可能である。ＷＨＯは、これらの方法に基づいて症例定義の基準を改訂した。
【０００８】
[0008]しかし、ＰＣＲのための既存のプロトコルには制限がないわけではない。そのような検査は、高感度であるが以下の固有の問題を有する：世界中の科学者および臨床医は患者のどの種の試料（呼吸器試料、唾液、便、血液または結膜液）が最も再現性の高いＲＮＡ調製物を与えるか確信していない；ＲＮＡ抽出プロトコルは簡単ではなく、うまく行われなければウイルスＲＮＡをＤＮＡに転換する逆転写ステップに役に立たないＲＮＡ調製物が生成するおそれがある；いくつかのプライマー対で確認検査を行わなければならないとすると、抽出、逆転写およびＰＣＲの全プロセスに多大な時間がかかりうる。さらに、２００３年８月にカナダで観察されたように、増幅法で偽陽性になる可能性がある。そのときは、他のヒトコロナウイルスに感染した数人の患者が、最初ＰＣＲ法でＳＡＲＳ陽性と検査された。ＰＣＲ検査室での混入は常に懸念事項であり、ＳＡＲＳの場合、混入によって不必要な隔離に至るおそれがある。
【０００９】
[0009]シンガポールで得られた結果は、異なる臨床標本を使用した場合にＰＣＲ診断法によってもたらされた陽性的中率（ＰＰＶ）が、５６．７から８３．８％まで変動したことを示した（Ａ．Ｅ．Ｌｉｎｇ、「ＳＡＲＳ─ｔｈｅ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ」、ＳＡＲＳ研究に関するＷＨＯ会議、シンガポール、シンガポール共和国、２００３年６月１９日で発表。）
【００１０】
[0010]ごく最近の報告では（非特許文献７）、２ヶ所のＷＨＯ  ＳＡＲＳネットワーク研究所の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）プロトコルが評価され、その研究成果からＲＴ−ＰＣＲに同様な欠点があることが確認された。したがって既存のＰＣＲは、陰性の結果が得られた場合にＳＡＲＳウイルスの存在を排除できず、検査室での混入が原因の偽検出の可能性も除外できない（非特許文献６、８および９）。
【００１１】
[0011]間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、ウイルス単離のための古典的組織培養、および診断目的の細胞培養物の電子顕微鏡観察を伴う診断方法は、一般に時間がかかるか、技術的に非常に要求が厳しいかのどちらかの傾向がある。したがって、この疾患を効率的に管理するために代替的な取り組みが重大である。
【００１２】
[0012]ＳＡＲＳの原因因子としての新規なコロナウイルスＳＡＲＳ−ＣｏＶの同定は様々な検査の開発を可能にしたが、ＷＨＯが示唆するように検査室診断用のツールを提供することは相変わらず優先事項である。今のところ検査が抗原に基づくか抗体に基づくかにかかわらず、ＳＡＲＳを診断するための標準化された検査はまだ存在しない。標準化されたパネルを用いて、または多数の臨床標本を用いた試験によって、新しく開発されたキットを検査することは欠点を解決するための有用な情報を提供するであろう。
【００１３】
【非特許文献１】Drosten, C., S. Gunther, W. Preiser, S. van der Werf, H. R. Brodt, S. Becker,H. Rabenau, M. Panning, L. Kolesnikova, R. A. Fouchier, A. Berger, A. M. Burguiere, J. Cinatl, M. Eickmann, N. Escriou, K. Grywna, S. Kramme, J. C. Manuguerra, S. Muller, V. Rickerts, M. Sturmer, S. Vieth, H. D. Klenk, A. D. Osterhaus, H. Sehmitz, and H. W. Doerr. 2003. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 348:1967-1976.
【非特許文献２】Fouchier, R. A., T. Kuiken, M. Schutten, G. van Amerongen, G. J. van Doornum, B. G. van den Hoogen, M. Peiris, W. Lim, K. Stohr, and A. D. Osterhaus. 2003. Aetiology: Koch's postulates fulfilled for SARS virus. Nature 423:240.
【非特許文献３】Ksiazek, T. G., D. Erdman, C. S. Goldsmith, S. R. Zaki, T. Peret, S. Emery, S. Tong, C. Urbani, J. A. Comer, W. Lim, P. E. Rollin, S. F. Dowell, A. E. Ling, C. D. Humphrey, W. J. Shieh, J. Guarner, C. D. Paddock, P. Rota, B. Fields, J. DeRisi, J. Y. Yang, N. Cox, J. M. Hughes, J. W. LeDuc, W. J. Bellini, L. J. Anderson, and SARS Working Group. 2003. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 348:1953-1966.
【非特許文献４】Peiris, J. S., S. T. Lai, L. L. Poon, Y. Guan, L. Y. Yam, W. Lim, J. Nicholls, W. K. Yee, W. W. Yan, M. T. Cheung, V. C. Cheng, K. H. Chan, D. N. Tsang, R. W. Yung, T. K. Ng, K. Y. Yuen, and SARS Study Group. 2003. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet 361:1319-1325.
【非特許文献５】Marra, M. A., S. J. Jones, C. R. Astell, R. A. Holt, A. Brooks-Wilson, Y. S. Sutterfield, J. Khattra, J. K. Asano, S. A. Barber, S. Y. Chan, A. Cloutier, S. M. Coughlin, D. Freeman, N. Girn, O. L. Griffith, S. R. Leach, M. Mayo, H. McDonald, S. B. Montgomery, P. K. Pandoh, A. S. Petrescu, A. G. Robertson, J. E. Schein, A. Siddiqui, D. E. Smailus, J. M. Stott, G. S. Yang, F. Plummer, A. Andonov, H. Artsob, N. Bastien, K. Bernard, T. F. Booth, D. Bowness, M. Czub, M. Drebot, L. Fernando, R. Flick, M. Garbutt, M. Gray, A. Grolla, S. Jones, H. Feldmann, A. Meyers, A. Kabani, Y. Li, S. Normand, U. Stroher, G. A. Tipples, S. Tyler, R. Vogrig, D. Ward, B. Watson, R. C. Brunham, M. Krajden, M. Petric, D. M. Skowronski, C. Upton, and R. L. Roper. 2003. The genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science 300:1399-1404.
【非特許文献６】Rota, P. A., M. S. Oberste, S. S. Monroe, W. A. Nix, R. Campagnoli, J. P. Icenogle, S. Penaranda, B. Bankamp, K. Maher, M. H. Chen, S. Tong, A. Tamin, L. Lowe, M. Frace, J. L. DeRisi, Q. Chen, D. Wang, D. D. Erdman, T. C. Peret, C. Burns, T. G. Ksiazek, P. E. Rollin, A. Sanchez, S. Liffick, B. Holloway, J. Limor, K. McCaustland, M. Olsen-Rasmussen, R. Fouchier, S. Gunther, A. D. Osterhaus, C. Drosten, M. A. Pallansch, L. J. Anderson, and W. J. Bellini. 2003. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science 300:1394-1399.
【非特許文献７】Crofts, N., W. NIaskill, and D. Gust. 1988. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays: a method of data analysis. J. Virol. Methods 22:51-59.
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【非特許文献９】Yam W.C., K. H. Chan, L. L. M. Poon, Y. Guan, K. Yuen, W. H. Seto, and J. S. M. Peiris. 2003. Evaluation of Reverse Transcription-PCR Assay for Rapid Diagnosis of Severe Acute Respiratory Syndrome Associated with a Novel Coronavirus. J. Clin Microbiol. 41: 4521-4524.
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【非特許文献１２】Krokhin, O., Y. Li, A. Andonov, H. Feldmann, R. Flick, S. Jones, U. Stroeher, N. Bastien, K. V. Dasuri, K. Cheng, J. N. Simonsen, H. Perreault, J. Wilkins, W. Ens, F. Plummer, and K. G. Standing. 2003. Mass spectrometric characterization of proteins from the SARS virus: a preliminary report. Mol. Cell. Proteomics 2:346-356.
【非特許文献１３】Ruan, Y. J., C. L. Wei, A. L. Ee, V. B. Vega, H. Thoreau, S. T. Su, J. M. Chia, P. Ng, K. P. Chiu, L. Lim, T. Zhang, C. K. Peng, E. O. Lin, N. M. Lee, S. L. Yee, L. F. Ng, R. E. Chee, L. W. Stanton, P. M. Long, and E. T. Liu. 2003. Comparative full-length genome sequence analysis of 14 SARS coronavirus isolates and common mutations associated with putative origins of infection. Lancet 361:1779-1785.
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【非特許文献１５】Manser, E., H. Y. Huang, T. H. Loo, X. Q. Chen, J. M. Dong, T. Leung, and L. Lim. 1997. Expression of constitutively active PAK reveals effects of the kinase on actin and focal complexes. Mol. Cell. Biol. 17:1129-1143.
【非特許文献１６】Feng, P., S. H. Chan, M. Y. R. Soo, D. X. Liu, M. Guan, E. R Ren, and H. Z. Hu. 2001. Antibody response to Epstein-Barr virus Rta protein in patients with nasopharyngeal carcinoma. Cancer 92:1872-1880.
【非特許文献１７】Pottumarthy, S., A. J. Morris, A. C. Harrison, and V. C. Wells. 1999. Evaluation of the tuberculin gamma interferon assay: potential to replace the Mantoux skin test. J. Clin. Microbiol. 37:3229-3232.
【非特許文献１８】World Health Organization. 2003. Severe acute resiratory syndrome (SARS). Wkly. Epidemiol. Rec. 78: 86-87.
【非特許文献１９】Guan, M., H. Y. Chen, S. Y. Foo, Y. J. Tan, P. Y. Goh and S. H. Wee. 2004. Recombinant protein-based enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic tests for detection of immunoglobulin G antibodies to Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) coronavirus in SARS patients. Clin. Diagn. Lab. Immunol. In press, cd1i0270-03.
【非特許文献２０】Guan, M., H. Y. Chen, T. P. Chow, A. R. Pereira, and P. K. Mun. November 2001. Assay devices and methods of analyte detection. U.S. Patent 6, 316, 205.
【非特許文献２１】Harlow, E. and D. Lane. 1988 Antibodies: a Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, U.S.A.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
[0013]一態様において本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）に対する抗体の有無を検出するための方法であって、抗体がＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗原と複合体を形成するのに十分な時間および条件で、抗原を抗体含有試料と接触させるステップを含み、抗原は、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含み、抗体とタンパク質との間の特異的結合は、試料がＳＡＲＳ  ＣｏＶに特異的な抗体を含有することを示す方法を提供する。本方法は、ヒトがＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染しているか、またはＳＡＲＳ  ＣｏＶに曝露されたかどうかを試験するために使用され得、ここで抗体含有試料は検査されるヒトからのものであり、抗体とタンパク質との間の特異的結合は、そのヒトがＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染しているか、または曝露されたことを示す。
【００１５】
[0014]本発明は、市販用パッケージをも提供する。一態様において、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含むＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗原を含む、試料中のＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）に対する抗体の有無を検出するための市販用パッケージ、ならびに試料からの抗体と抗原との間の複合体を検出するための手段を提供する。
【００１６】
[0015]別の態様において、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４およびそれらの免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質を含むＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗原を含む、ヒトがＳＡＲＳコロナウイルス（ＣｏＶ）に感染しているか、または曝露されたかどうかを検査するための市販用パッケージ、ならびに抗原とその抗原に対する抗体との間の複合体を検出するための手段を提供し、ここで試料は、検査されるヒトの抗体含有試料である。
【００１７】
[0016]別の態様において、本発明は抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質に対する単離された抗体を提供し、ここで抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質は、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、もしくはＵ２７４タンパク質またはそれらの抗原性断片である。
【００１８】
[0017]本発明の抗体は、試料中のＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、またはＵ２７４タンパク質の存在を検出するために使用されうる。このように別の態様において本発明は、ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、またはＵ２７４タンパク質の有無を検出する方法を提供し、その方法は、Ｓ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、およびＵ２７４からなる群から選択されるタンパク質に対する抗体が抗原と複合体を形成するのに十分な時間および条件で、抗体を抗原含有試料と接触させるステップを含み、抗体と抗原との間の特異的結合は、試料がＳ、Ｍ、Ｅ、Ｎ、Ｕ２７４またはそれらの免疫原性断片を含む抗原を含有することを示す。
【００１９】
[0018]本発明の他の態様および特徴は、添付図面と共に本発明の特定の実施形態についての以下の説明をレビューすることで当業者に明白となるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
[0035]ＳＡＲＳ−ＣｏＶの配列から、全てのコロナウイルスで保存されている４つの構造タンパク質のＯＲＦ、すなわちスパイク（Ｓ）、膜（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）、およびヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質が明らかとなる（非特許文献５、６、１０および１１）。Ｓタンパク質は受容体の結合の仲介およびウイルスのインターナリゼーションに必須の役割を演じ、ウイルスの主要な抗原の１つである。ＭおよびＥタンパク質は、ビリオンの集合に必須であり、Ｎタンパク質はウイルスゲノムに結合してヌクレオキャプシドを形成する。
【００２１】
[0036]これらの４つの共有構造タンパク質以外に、他のコロナウイルスのウイルスタンパク質と有意な配列相同性を示さない、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列から予測されるいくつかの独特なＯＲＦが存在する。これらのＯＲＦがウイルスの複製サイクルで機能を果たすタンパク質を発現するかどうかは、まだ決定されていない。
【００２２】
[0037]本発明は、ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｅ、およびＮ構造タンパク質、ならびに予測アミノ酸長２７４を有する、機能未知のタンパク質の１つ（本明細書においてＵ２７４と呼ぶ）が抗原性であり、患者がＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染しているか、またはＳＡＲＳ  ＣｏＶに曝露されたことを示す、患者における抗ＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗体の存在を検出するために使用されうるという発見に関する。
【００２３】
[0038]したがって、一態様において、抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮおよびＵ２７４を用いて患者におけるＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染を診断する方法を提供する。１つまたは複数の抗原性タンパク質を発現させ、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染を検査すべき患者からの生体試料と接触させる。患者がＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染しているか、またはＳＡＲＳ  ＣｏＶに曝露されて、かつウイルスに対する抗体を産生したならば、診断に使用される特定の抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質に対する試料中の抗体は、そのタンパク質と結合する。患者によって産生した抗体を、患者が産生した抗体に対し、かつ検出分子にコンジュゲートする二次抗体を使用して検出できる。
【００２４】
[0039]本明細書に使用する、ＳＡＲＳ  ＣｏＶの「抗原性タンパク質」という用語は、ＳＡＲＳ  ＣｏＶの１つまたは複数のＳ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４タンパク質を指す。「それらの免疫原性断片」または「それらの（その）抗原性断片」という用語は、免疫原性または抗原性であるＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４タンパク質の部分を指し、そのタンパク質断片が１つまたは複数のエピトープを含有することによって、患者に免疫応答を誘発できることを意味する。
【００２５】
[0040] タンパク質の断片および変異体を免疫原として使用することは免疫学の分野において認められた実務である。その理由は、タンパク質に対する免疫応答を誘導するのに必要なのは、タンパク質の小さな（例えば８〜１０個のアミノ酸）免疫原性領域だけであることだからである。病原体の表面露出抗原に対応する様々な短い合成ペプチド、例えばマウス乳腺癌ウイルスの１１残基のペプチド（Ｃａｓｅｙ  ＆  Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９７７）４：１５３９）、セムリキ森林ウイルスの１６残基のペプチド（Ｓｎｉｊｄｅｒｓら、１９９１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５５７〜５６５）、およびイヌパルボウイルスのそれぞれ１５残基の２つの重複するペプチド（Ｌａｎｇｅｖｅｌｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２（１５）：１４７３〜１４８０、１９９４）が、それぞれの病原体に対する有効な抗原であることが示された。
【００２６】
[0041]したがって、本明細書を読んだ当業者には、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４の任意の１つの部分配列が完全長タンパク質に固有であり、かつ本発明により教示されることが容易に明らかとなろう。そのようなポリペプチド断片は、好ましくは少なくとも１２アミノ酸長である。好都合には、それらの断片は少なくとも１５アミノ酸長、好ましくは少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも５５、６０、６５、７０、７５アミノ酸長、最も好ましくは少なくとも８０、８５、９０、９５、１００アミノ酸長である。
【００２７】
[0042]本明細書に使用する「相同である（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」または「相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」は、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４またはその断片のアミノ酸配列と実質的な対応関係を有するタンパク質配列を指す。相同体は、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４またはその断片と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％，９０％、９３％、９６％および９９％相同でありうる。ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター遺伝学コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｋｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７０５）のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅのような配列解析ソフトウェアを用いて相同性を測定する。一致を最大にするためにアミノ酸配列のアラインメントを行う。妥当なアラインメントを得るために配列に人工的にギャップを導入してもよい。最適なアラインメントがいったん作成されたならば、位置の総数に対して、両配列のアミノ酸が同一である全ての位置を記録することによって相同率を定める。
【００２８】
[0043]Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮおよびＵ２７４の任意の１つの部分配列、またはそれに相同な配列、またはそれに相同な部分配列をコードする、適用可能な、３０から６００個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドは、上に概述したパラメータを用い、かつ増幅すべき断片の５’および３’末端の上流および下流の配列に合致するプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅によって検索される。そのような増幅のためのテンプレートポリヌクレオチドは、完全長のＳ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４をコードする完全長ポリヌクレオチド、またはＤＮＡもしくはＲＮＡライブラリーのようなポリヌクレオチドの混合物に含有されるポリヌクレオチドのどちらかである。部分配列を検索するための代替方法として、ハイブリダイゼーションのスクリーニングを上記の条件で、Ｔｍを計算するための式を用いて実施する。３０〜６００個のヌクレオチド断片を検索する場合、（６００／塩基対数で表したポリヌクレオチドサイズ）を控除することによってＴｍを補正し、ストリンジェンシー条件をＴｍより５〜１０℃下のハイブリダイゼーション温度と定義する。２０〜３０の塩基よりも短いオリゴヌクレオチドを得ようとするとき、Ｔｍを計算するための式は、Ｔｍ＝４×（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）となる。例えば、５０％Ｇ＋Ｃの１８個のヌクレオチド断片はおよそ５４℃のＴｍを有するであろう。Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４の任意の１つまたはその相同配列の断片である短いペプチドは、化学合成により直接得られる。
【００２９】
[0044]有用なポリペプチド誘導体、例えばポリペプチド断片は、アミノ酸配列のコンピュータ支援解析を用いて設計される。これによって表面に露出した有望な抗原領域が同定されるであろう（Ｈｕｇｈｅｓら、１９９２．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０（９）：３４９７）。プログラムＳＥＱＳＥＥ（Ｗｉｓｈａｒｔ  ＤＳら、「ＳＥＱＳＥＥ：  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．」Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．１９９４年４月；１０（２）：１２１〜３２）を用いた柔軟性傾向および疎水性傾向の結果に基づくＳ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４の任意の１つに含有されるアミノ酸配列の解析は、有用な免疫原性断片および変異体を選択するための基本として使用できる潜在的Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープを明らかにするために使用できる。この解析は、抗体に認識されそうな外表面の特徴の合理的な組み合わせを使用する。ＮＩＨで開発されたアプローチをエミュレートするアルゴリズムによってＨＬＡ−Ａ０２０１ＭＨＣサブクラスに対する有望なＴ細胞エピトープを明らかにすることができる（Ｐａｒｋｅｒ  ＫＣら、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．」Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９５；１４（１）：３４〜５７）。
【００３０】
[0045]防御性のＴ細胞依存性免疫応答を誘導するエピトープは、ポリペプチドの全長にわたって存在する。しかし、一部のエピトープはポリペプチドの二次構造および三次構造に隠れているおそれがある。そのような隠れたエピトープを明らかにするために、もともとのタンパク質構造の大部分を除き、隠れたエピトープを露出させる大規模内部欠失を作製する。このような内部欠失は、株の間で多様性の高い免疫優性領域を除去するという追加の利点をもたらすこともある。
【００３１】
[0046]ポリペプチド断片および大規模内部欠失を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標準法を用いて構築される（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、１９９４）。そのような方法には標準ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、制限酵素によるクローニングされたＤＮＡ分子の処理、またはＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８）がある。これらの方法の構成要素およびこれらの方法の使用説明書は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのような様々な商業的なソースから容易に入手できる。
【００３２】
[0047]完全長抗原性タンパク質を診断方法に使用できる。しかし、他のコロナウイルスに対して患者により産生した抗体と交差反応する機会を最小にするために、コロナウイルス間で高度には保存されていない当該抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質の抗原性断片を使用することが好ましい。なお、当業者に了解されるのであろうようにタンパク質の発現および取扱いを簡便にするために膜貫通ドメインと予測される当該抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質の部分を欠失させるか、または当該タンパク質の可溶性抗原性断片のみを使用することが有利でありうる。
【００３３】
[0048]興味深いことに、Ｍタンパク質が最も大量に存在する一部のコロナウイルスとは異なり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶではＮが最も大量に存在するタンパク質であるようである（非特許文献６）。本明細書に提示した結果は、Ｎが強い免疫反応を発生させることを示している。
【００３４】
[0049]理論に縛られる意図はないが、感染のある段階でＮはＳＡＲＳ  ＣｏＶまたは感染した患者の細胞から循環系に放出される可能性があり、或いは、Ｎは感染細胞の細胞傷害性殺滅のために抗原提示細胞によって提示される可能性がある。さらに、ＮはＳＡＲＳから患者を防御する体液性免疫応答に貢献している可能性がある。
【００３５】
[0050]Ｎタンパク質について、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されているＳＡＲＳ単離体１８株の配列を比較したところ、２株だけが、下の実施例に記載したクローンとして使用したシンガポール単離体（ＳＩＮ２７７４）の配列と１つのアミノ酸で差異を示した（非特許文献１３）。したがって、Ｎタンパク質は迅速な突然変異を受けないと考えられる。これは、本方法においてＮタンパク質を使用するもう一つの利点である。
【００３６】
[0051]早くて感染２日後、同様に感染後期、例えば感染１６日後においても、患者からＮに対する抗体の存在を検出できる。極めて強い免疫応答と組み合わさった免疫応答の早期誘発によって、ＮはＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染の診断に極めて有用である。
【００３７】
[0052]したがって、様々な好ましい実施形態において、患者における抗ＳＡＲＳ  ＣｏＶ抗体の存在を検出するために使用されるタンパク質は、Ｎまたはその抗原性断片である。Ｎは、完全長Ｎであるか、または１１１〜１１８番目のアミノ酸を欠失したＮを指すＮ（Δ１１１〜１１８）でありうる。１１１〜１１８番目のアミノ酸は、コロナウイルスのＮ相同体にみられる高度に保存された配列である配列ＦＹＹＬＧＴＧＰに対応する。Ｎの免疫原性断片、例えば６９〜４２２番目、１２０〜４２２番目、もしくは１２１〜４２２番目のアミノ酸からなる断片か、またはそれらを含む断片を使用してもよい。
【００３８】
[0053]Ｓは、コロナウイルス表面にみられる花弁状のスパイクを形成する（非特許文献１０、１１）。このタンパク質も高度に免疫原性を有する。Ｓは、多数の膜貫通領域を有する高分子量タンパク質であり、高度にグリコシル化されている。他のコロナウイルスのＳタンパク質に超可変部が現れることから、Ｓタンパク質は超可変部を含むと予測されている（非特許文献１０、１１）。容易な取扱いを保証し、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染した患者に対して陽性と正しく診断する見込みを増やすために、超可変部を含まないＳの細胞外領域を使用することが好ましい場合がある。
【００３９】
[0054]このような実施形態において、完全長Ｓを使用でき、また例えば４６０〜４８０番目のアミノ酸断片からなるか、もしくはその断片を含むＳの断片を使用できる。
【００４０】
[0055]  検査された患者の大部分は、Ｕ２７４のＣ末端（非特許文献５に注釈されたＯＲＦ３、および非特許文献６に注釈されたＸ１に対応するＵ２７４）に対する抗体を有する。Ｕ２７４の免疫反応性は、この新規でユニークなウイルスタンパク質がウイルス中で発現し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの生物発生に関与するタンパク質である見込みが高いことを示している。さらに、潜在的な転写調節配列がＵ２７４コード配列の上流に見出され、このことは、Ｕ２７４がＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染細胞の主要なサブゲノムＲＮＡの１つのための第１のＯＲＦであることを示唆している（非特許文献５および６）。Ｕ２７４は、データベース中のどのタンパク質とも有意な相同性を共有せず、３つの膜貫通領域および大きな内部Ｃ末端ドメインを有して、Ｍと類似したトポロジーを有するようである。タンパク質の可溶性断片を発現させ精製することが簡単であることから、本方法でＵ２７４を使用する場合、Ｕ２７４の膜貫通領域を含まない断片を使用することが好ましい場合がある。
【００４１】
[0056]また、Ｕ２７４はウイルス単離体において少々低レベルの配列変異を実際に示す傾向があり、検討したもののうち単離体５株は（ＳＩＮ２７７４に比べた場合に）１つのアミノ酸置換を示すＵ２７４配列を有し、単離体１株は２つのアミノ酸置換を示すＵ２７４配列を有する（非特許文献１４）。
【００４２】
[0057]このような実施形態において、使用される抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質は、完全長Ｕ２７４でありうるか、または１３４〜２７４番目のアミノ酸断片からなるか、もしくはその断片を含む抗原性断片でありうる。
【００４３】
[0058]今日まで検査された患者のうち、全てがＳＡＲＳ  ＣｏＶのＭおよびＥタンパク質に対する抗体を保有するわけではない。したがって、これらのタンパク質は抗原性であるが、本診断法にはあまり有用でない可能性がある。それは、これらのタンパク質が感染した個体に免疫応答を一貫して誘発するわけではないからである。多様な実施形態において、使用される抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質は、完全長Ｍでありうるか、または９８〜１２１番目のアミノ酸断片からなるか、もしくはその断片を含むＭの抗原性断片でありうる。他の実施形態において、使用される抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質は、完全長Ｅでありうるか、または３８〜７６番目のアミノ酸断片からなるか、もしくはその断片を含むＥの抗原性断片でありうる。
【００４４】
[0059]本方法において、一つまたは複数の抗原性タンパク質が最初に発現され、当技術分野で公知の方法を用いて発現されうる。タンパク質を「発現」させることは、タンパク質またはポリペプチドをコードするＲＮＡテンプレート（通常はｍＲＮＡ）の翻訳によるタンパク質またはポリペプチドの合成を指し、ＲＮＡテンプレートがＤＮＡテンプレートからＲＮＡポリメラーゼ酵素によって転写される転写ステップを含みうる。タンパク質は、細胞のような任意の発現系内または無細胞系内で発現されうる。
【００４５】
[0060]例えば、原核細胞発現系、例えば大腸菌のような細菌、あるいは真核細胞発現系、例えばサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を含めた酵母、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、もしくはＪＥＧ３細胞を含めた哺乳動物細胞、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；ＳＦ９）細胞を含めた昆虫細胞、または植物細胞においてタンパク質を発現させてもよい。
【００４６】
[0061]無細胞発現系にタンパク質を発現させてもよく、そのような系は、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸や、アミノアシルｔＲＮＡ、ＲＮＡテンプレートを含むタンパク質の発現をもたらすのに必要な試薬を含み、さらにＤＮＡテンプレート、ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、ならびに酵素活性に要求される任意の必要な補因子、緩衝剤および塩を含む場合があり、細胞溶解物を含みうる。
【００４７】
[0062]当業者は、適当な発現系に所望のタンパク質またはタンパク質断片をいかにして発現させるかが分かっている。翻訳後に修飾されずかつ可溶性であると予想されるタンパク質については、細菌発現系が好ましい場合がある。しかし、高分子量タンパク質、翻訳後に修飾されるタンパク質、またはｍＲＮＡスプライシングを必要とするタンパク質については、真核細胞系、例えば哺乳動物細胞系が好ましい場合がある。
【００４８】
[0063]一般的に、当技術分野で公知の標準的な手法を用いて、抗原性タンパク質を発現させるために選択した発現系に適合する発現ベクターに、抗原性タンパク質またはタンパク質断片をコードする遺伝子をクローニングする。発現ベクターは、選択された系において発現をもたらすために要求される必要なプロモーターおよび遺伝子シグナルを有する。例えば、発現ベクターは特定の発現系に適合するプロモーターに作動可能に連結したタンパク質をコードする遺伝子を含む場合があり、プラスミドでありうる。例えば細胞は大腸菌細胞の場合があり、発現ベクターは、大腸菌の細胞の仕組みによって遺伝子が転写されＲＮＡが翻訳されるのに必要な調節配列全てに作動可能に連結した、関心対象である抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質をコードする遺伝子を含みうる。関心対象であるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、細胞内の発現が所望通りに制御されて、例えば細胞培養の対数増殖期とタンパク質の発現を同調させることによって発現を最大にする誘導性プロモーターによって駆動されうる。
【００４９】
[0064]精製および使用を容易にするために、タンパク質を融合タンパク質として発現させてもよい。融合タンパク質は、第２のポリペプチドのＮまたはＣ末端に融合した抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質を含有するタンパク質またはポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドを得る簡単な方法は、ポリヌクレオチド配列のフレーム内融合体、すなわちハイブリッド遺伝子の翻訳による。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用される発現ベクターに、融合ポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子を挿入する。あるいは、第２のペプチドをコードするポリヌクレオチドがすでに存在する発現ベクターに、ポリペプチドまたはポリペプチド誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。第２のペプチドは、リガンドもしくは官能基に結合して精製を助けるアフィニティーペプチド配列またはアフィニティータンパク質配列でありうる。例えば第２のペプチドは、Ｎｉ＋２イオンに結合する６つのヒスチジン配列の場合があり、またグルタチオンに結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）でありうる。
【００５０】
[0065]いったん発現されれば、アフィニティーカラムクロマトグラフィーのような標準的な精製法を用いて、例えばＧＳＴ融合タンパク質を精製するためのグルタチオンが結合したクロマトグラフィーカラムを用いて、抗原性タンパク質を精製できる。公知のアフィニティークロマトグラフィー法を用いて、抗原性タンパク質を含有する融合タンパク質を高度に精製でき、その結果、血清学的アッセイに粗ウイルス溶解物を使用することに比べて高い感度と特異性とを有する診断方法がもたらされる。それは、ウイルス溶解物中の細胞成分に対する抗体の存在によって偽陽性が生じうるからである。
【００５１】
[0066]発現された抗原性タンパク質は、そのタンパク質を患者の試料と接触させることによって、その患者がＳＡＲＳ  ＣｏＶに対する抗体を産生したかどうかを決定するために使用される。抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質を認識できる、患者の試料中の患者が産生した抗体は、接触時に抗原性タンパク質と結合し、抗原−一次抗体複合体を形成する。
【００５２】
[0067]抗体と抗原との間の「特異的結合」または抗原に対する抗体の「特異性」は、抗体が抗原内に含有される特定のエピトープを認識し、それと選択的に結合する能力を指す。そのような結合は、抗体の抗原結合部位と抗原のエピトープとの間の相補性によって決定される。相補性は、抗体および抗原それぞれの結合部位内の化学的部分および電荷の空間配置が相互に対を形成することを指す。
【００５３】
[0068]試料は、患者により産生した抗体を含有する任意の試料であり、この抗体は細胞表面に結合した抗体または循環系にある抗体のどちらでもよい。試料は血液、血漿、または血清でありうる。ＳＡＲＳに感染した疑いのある任意の患者から試料を採取し、感染後２日から６０日の間、感染後１６日から６０日の間、または感染後２日から１１日の間に採取できる。「感染後日数」という用語は、患者がＳＡＲＳ  ＣｏＶと接触したか、またはそれにかかった疑いのある時点の後の、日数で表した時間を指す。
【００５４】
[0069]抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質の接触は、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着測定法）のようなイムノアッセイに照らして実施される。患者の試料と接触させる前に、抗原性タンパク質を固体支持体に固定化してもよい。あるいは、抗原性タンパク質を細胞中または細胞表面に発現させてもよい。イムノアッセイ法は当業者に一般に公知であり、イムノアッセイ法にはＥＬＩＳＡ、ウエスタンイムノブロット、免疫蛍光アッセイおよびイムノクロマトグラフィーアッセイがある。
【００５５】
[0070]イムノアッセイの検出限界内に収めるために、患者の試料を希釈する必要がありうる。特定の検査形式において試料の最適の希釈を決定するために試料の段階希釈を実施してもよい。例えば、適当な緩衝液で患者の試料を約１：１０、約１：２０、約１：４０、約１：８０、約１：１６０、約１：３２０、約１：６４０の試料対総体積の比率に希釈できる。
【００５６】
[0071]本明細書において使用する「イムノアッセイ」という用語は、抗原または抗体の存在を決定するための手段として、抗体が特定の抗原と結合する能力を利用する分析法を指す。抗体捕捉イムノアッセイは、被験対象の生体試料中の特定の病原体に対する抗体を検出するために利用される抗原を提供するアッセイである。一般に抗原は、支持体上に固定化され、生体試料中の抗体と結合できる。抗体は生体試料によって提供される。多様な抗体捕捉アッセイにおいて、抗原は生体試料中の抗体と混合され、このように形成された抗原−抗体複合体は、支持体上に固定化された抗原−抗体複合体における抗原または抗体またはその両方に対する第２の抗体によって捕捉される。あるいは、抗原−抗体複合体の形成は溶液状態で測定される。
【００５７】
[0072]直接イムノアッセイ、間接イムノアッセイ、および「サンドイッチ」イムノアッセイを含むがそれに限定されない一連のイムノアッセイ形式はこの定義によって包含されることが考えられる。特に好ましい形式は、サンドイッチ酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。しかし、本発明をこの形式に限定することを意図しない。ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、およびＥＬＩＳＡ法の変法を含むがそれに限定されない他のアッセイ形式を含めた他の形式が本発明の方法に有用であると考えられる。このように、「フロキュレーション」（すなわち抗原−抗体複合体の形成時に生成したコロイド懸濁液）、「凝集反応」（すなわち抗体の曝露に対する細胞または他の物質の凝集）、「粒子凝集」（すなわち抗体の存在下での抗原をコートされた粒子の凝集または抗原の存在下での抗体をコートされた粒子の凝集）、「補体結合」（すなわち抗体−抗原反応法への補体の使用）、ならびに血清学、免疫学、免疫化学、組織化学、および関連分野で通常使用されている他の方法を含めるがそれに限定されない他の抗原−抗体反応形式も本発明に使用できる。
【００５８】
[0073]抗体−抗原複合体の検出をいくつかの方法によって実施できる。ビオチン、酵素、蛍光マーカー、または放射能のような標識を有する可動性抗原を調製でき、この標識を用いて直接検出できる。あるいは、一次抗体を認識する標識された「二次抗体」または「レポーター抗体」を添加して、抗原−抗体−抗体からなる複合体を形成させることができる。さらに、次に適当なレポーター試薬を加えて標識された抗体を検出する。任意の数の追加の抗体を所望により添加できる。酵素、蛍光マーカー、放射能、または重金属複合体を含むがそれに限定されないマーカーでもこれらの抗体を標識できる。抗原または（一次もしくは二次）抗体のどちらかを固体支持体上に固定化できるが、検出可能なシグナルが結合の尺度であることが妨害されることから、標識された構成要素を固定化することはできない。
【００５９】
[0074]本明細書に使用するように「レポーター試薬」という用語は、抗原に結合した抗体の存在を検出できる化合物に関して使用される。例えばレポーター試薬は、酵素の基質に付着した熱量物質（ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）でありうる。抗体および抗原の結合時に、酵素はその基質に作用して発色を引き起こす。他のレポーター試薬には蛍光発生および放射性化合物または分子があるが、それに限定されない。この定義は、検出系の一部としてビオチンおよびアビジン系化合物（例えばニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）およびストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ））を含めるがそれに限定されない化合物の使用も包含する。本発明の一実施形態において、アビジンをコートした固体支持体と共にビオチン化抗体を本発明に使用できる。
【００６０】
[0075]本明細書に使用する「固体支持体」という用語は、抗体、抗原、および他の化合物のような試薬が付着しうる任意の固体材料に関して使用される。例えば、ＥＬＩＳＡ法において、マイクロタイタープレートの穴はしばしば固体支持体を提供する。固体支持体の他の例には、顕微鏡用スライド、カバーガラス、ビーズ、粒子、細胞培養用フラスコ、および他の多くの品目がある。
【００６１】
[0076]Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４に対する抗体を検出するためのキットまたは市販用パッケージは、パッケージされた免疫化学試薬として、少なくとも１つのアッセイに十分な量の抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質、および患者の試料から抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質と抗体との間の複合体を検出するための手段を一般に含む。パッケージされた免疫化学試薬の使用説明書も一般的に含まれる。
【００６２】
[0077]本明細書に使用する「パッケージされた」という用語は、本発明の抗体を一定の限度内に保持できる固体マトリックスまたはガラス、プラスチック、紙、繊維、箔などのような材料を指す場合がある。このように、例えばパッケージは、ミリグラム量の考えられる抗原を入れておくために使用されるガラス製バイアルでありうるし、またマイクログラム量の考えられる抗原が作動的に固定されたマイクロタイタープレートの穴でありうる。あるいは、パッケージは多孔性膜にトラップされたか、または検査ストリップもしくはディップスティックなどに包埋された抗原被覆マイクロ粒子を含みうる。あるいは試料液に接触する膜、検査ストリップ、またはディップスティックなどに抗原を直接コートできる。他の多くの可能性が存在し、当業者はそれらの可能性を容易に認識するであろう。
【００６３】
[0078]使用説明書は、一般的に試薬の濃度、または混合する試薬および試料の相対量、試薬／試料混合物の使用期限、温度、緩衝液の条件などのような少なくとも１つのアッセイ法のパラメータを説明する具体的な表現を含む。
【００６４】
[0079]好ましい実施形態において、本発明のキットは、抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質と抗体との間の複合体の形成をシグナル発生できる標識または表示手段（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｍｅａｎｓ）をさらに含む。
【００６５】
[0080]「標識」または「標識剤」という用語および抗体−抗原複合体を検出するための手段（「表示手段」）は、直接または間接のどちらかで検出可能なシグナルの生成に関与して複合体の存在を表示する分子を指す。本発明の一部である発現したタンパク質、ペプチド、または抗体分子に任意の標識または表示手段を連結させるか、それに組み込むか、別々に使用でき、それらの原子または分子を単独または追加の試薬と共に使用できる。そのような標識はそれ自体で臨床診断化学において周知である。例えば標識または表示手段は、試薬を開裂して着色分子、着色分子、蛍光分子、放射性分子、化学発光分子、または重金属錯体を生成する酵素でありうる。標識または表示手段によって生成されるシグナルを検出する厳密な方法は、当業者に了解されるように使用する標識または表示手段および使用する特定のイムノアッセイ法に依存する。
【００６６】
[0081]標識または表示手段は、抗体または抗原と化学結合しそれらを変性させずに、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤でありうる。適当な蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナトプタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）などのような蛍光色素である。
【００６７】
[0082]好ましい実施形態において標識または表示手段は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどのような酵素である。主要な表示基がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合、受容体−リガンド複合体（免疫反応体）が形成したことを表示するために追加の試薬が必要である。ＨＲＰ用のそのような追加の試薬には、過酸化水素およびジアミノベンジジンまたはテトラメチルベンジジンのような酸化染料前駆体がある。グルコースオキシダーゼに有用な追加の試薬は、２，２−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【００６８】
[0083]放射性元素も有用な標識剤であり、本明細書において例示的に使用される。放射性標識剤の例は、ガンマ線を放射する放射性元素である。１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒのようなそれ自体ガンマ線を放射する元素は、ガンマ線放射性元素表示基の１クラスを代表する。特に好ましいのは１２５Ｉである。有用な標識手段の別の群は、それ自体陽電子を放射する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素である。１１１インジウムまたは３Ｈのようなβ放射体も有用である。
【００６９】
[0084]標識の連結、すなわちペプチドおよびタンパク質の標識は、当技術分野で周知である。例えば、培地の構成要素として提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝性取り込みによって、ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を標識できる。活性化官能基を介したタンパク質の結合体形成またはカップリングの手法は特に実用的である。
【００７０】
[0085]本発明の方法およびキットは、好ましくは別々のパッケージとして「特異的結合剤」も含みうる。特異的結合剤は本発明の抗体もしくは抗原、またはそのような種を含有する複合体と選択的に結合できるが、それ自体は本発明の抗原または抗体ではない。特異的結合剤の例は、二次抗体分子、例えば抗ヒト抗体、補体タンパク質またはその断片、黄色ブドウ球菌タンパク質Ａなどである。好ましくは特異的結合剤は、複合体の一部として存在する場合に抗体または抗原と結合する。
【００７１】
[0086]好ましい実施形態において、特異的結合剤は標識されている。しかし、方法またはキットが未標識の特異的結合剤を含む場合、その特異的結合剤はシグナルを増幅させる増幅手段または試薬として一般的に使用される。これらの実施形態において標識された特異的結合剤は、増幅手段が複合体に結合している場合の増幅手段と特異的に結合できる。
【００７２】
[0087]液体試料または抽出物中の抗Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４抗体の量を検出するための「ＥＬＩＳＡ」形式に本発明のキットを使用できる。「ＥＬＩＳＡ」は、上記のような酵素免疫吸着測定法を指し、このアッセイは固相に結合した抗体または抗原と、酵素−抗原または酵素−抗体結合体とを採用して試料中に存在する抗原の量を検出および定量する。
【００７３】
[0088]多く実施形態において、抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質を固体マトリックスに固着させて固体支持体を形成させることができる。試薬は水性媒質から吸着により固体マトリックスに一般的に固着するが、タンパク質およびペプチドに適用できる当業者に周知である他の様式の固着を使用することもできる。
【００７４】
[0089]有用な固体マトリックスも当技術分野で周知である。そのような材料は水に不溶性であり、そのような材料には、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ピスタカウェイ、ニュージャージー州）からＳＥＰＨＡＤＥＸの商標で入手できる架橋デキストラン；アガロース；直径約１ミクロンから約５ミリメートルのポリスチレンビーズ；シート、ストリップもしくはパドルのようなポリビニルクロリド、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロース系もしくはナイロン系ウェブ；またはポリスチレンもしくはポリビニルクロリド製のようなチューブ、プレートもしくはマイクロタイタープレートの穴がある。
【００７５】
[0090]溶液状態で分散液として、または実質的な乾燥粉末として、例えば凍結乾燥形態で、本明細書に記載した任意の診断系の免疫試薬を提供できる。表示手段が酵素であるとき、酵素の基質も別のパッケージに提供できる。上記のマイクロタイタープレートのような固体支持体および１つまたは複数の緩衝液も、別々にパッケージされた要素として本発明の診断アッセイ系に含めることができる。
【００７６】
[0091]好ましくは抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質は、基質表面にコートまたは吸着されている。関心対象である試料を抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質と接触させ、試料中に存在しうる抗原に対する任意の抗体は抗原と結合する。抗ヒト抗体を抗原／試料と接触させ、抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質に結合している抗体に結合させる。
【００７７】
[0092]使用する二次抗体を、検査される患者と同じ種でない任意の動物から産生できる。このようにマウス抗ヒト抗体を使用でき、また二次抗体はウサギ抗ヒト抗体もしくはヤギ抗ヒト抗体である。抗ヒト抗体は、例えばヒトＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体に対するものでありうる。
【００７８】
[0093]標識を用いて抗ヒト抗体を標識してもよい。標識は、抗ヒト抗体とコンジュゲートまたは結合でき、分析法によって検出されうる任意の実体である。抗ヒト抗体を抗原／試料と接触させる前後に、標識を抗ヒト抗体とコンジュゲートまたは結合させることができる。
【００７９】
[0094]標識の検出は、ヒト抗体が試料中に存在するという表示である。標識を検出できないならば、これはヒト抗体が試料中に存在しないという表示である。試料中での抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質に対するヒト抗体の存在が、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染で生じると推定されることから、ヒト抗体の有無は、ヒトがＳＡＲＳ  ＣｏＶウイルスに曝露されているかまたは曝露されたかどうかの表示である。
【００８０】
[0095]一実施形態において標識は、分析法によって検出できる化学部分（ｍｏｉｅｔｙ）でありうる。その化学部分は、抗ヒト抗体と結合体を形成している。この実施形態において、抗ヒト抗体が抗原／試料と接触する前に、化学部分は一般に抗ヒト抗体にコンジュゲートしている。
【００８１】
[0096]別の実施形態において標識は、分析法によって検出できる化学部分とコンジュゲートした別の抗体であるか、または他の抗体の収集でありうる。この実施形態において、化学部分とコンジュゲートした他の抗体または他の抗体の収集は、抗ヒト抗体が抗原／試料と接触した後に抗ヒト抗体と一般に結合している。
【００８２】
[0097]好ましい実施形態において、本方法は、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間に、さらに好ましくは方法の各ステップの間に洗浄ステップをさらに含む。化学部分がコンジュゲートした抗体が調製された動物種からの約１％正常血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水のような緩衝液を含む洗浄溶液を用いて、洗浄を好ましくは成し遂げる。洗浄溶液に乳化剤も存在してよい。
【００８３】
[0098]分析法によって検出でき、抗体とコンジュゲートできる多様な化学部分を標識に使用できる。例えば、化学部分は蛍光または放射能を発生できる場合がある（Ｆｕｌｌｅｒ  Ｓ．Ａ．、Ｅｖｅｌｅｇｈ  Ｍ．Ｊ．＆  Ｈｕｒｒｅｌｌ  Ｊ．Ｇ．Ｒ．（２０００）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．、Ｂｒｅｎｔ  Ｒ．、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｒ．Ｅ．、Ｍｏｏｒｅ  Ｄ．Ｄ．、Ｓｅｉｄｍａｎ  Ｊ．Ｇ．、Ｓｍｉｔｈ  Ｊ．Ａ．  ＆  Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ．編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．第２巻、１１．１．１〜１１．１．７頁、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと。両者の開示は本明細書によって参照により組み込まれている）。本発明に有用な化学部分の例は、アルカリホスファターゼである。分析法を使用する前に、使用された特定の方法または化学部分に応じて標識を検出するためにさらなる処置が必要となりうる。
【００８４】
[0099]検出法として有用な分析法は、当技術分野で一般に公知である。例えば、比色、電気泳動および放射性標識法を使用できる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州を参照のこと。この開示は本明細書によって参照により組み込まれている）。
【００８５】
[00100]比色法は一般に好ましく、陽性または陰性の検査結果を表示する色変化のスペクトロスコピーまたは目視による検証を採用できる。当業者は、本発明の検出法として他の方法を採用できることを認識している。
【００８６】
[00101]本発明のキットは、標識を検出するための手段をさらに含む場合があり、またそのような手段はキットとは別でありうる。
【００８７】
[00102]Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４に対する抗体の存在を決定することによって、対象におけるＳＡＲＳ  ＣｏＶの存在または過去の存在を決定できる。このように、本発明の方法を、（ウイルスおよび抗体の両方が存在する）急性感染の検出に使用できるだけでなく、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染から回復した対象のような抗体が存在するが検出できるウイルスが存在しない場合にも使用できる。
【００８８】
[00103]ＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染の検出のための日常的な検査室検査のような実地に本発明の方法およびキットを使用でき、ワクチン接種が実施されていない場合、本検査は無症候性ＳＡＲＳ  ＣｏＶ保有者を検出してＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染有病率の現実的な推定値を得ることができる。
【００８９】
[00104]具体的な一実施形態において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡである。抗原性タンパク質ＧＳＴ−Ｎ（Δ１１１〜１１８）および、任意選択で抗原性タンパク質ＧＳＴ−Ｕ２７４（１３４〜２７４）をアッセイプレートに固定化する。患者の血清を固定化抗原性タンパク質と接触させ、上記の標準ＥＬＩＳＡ法にしたがってアッセイプレートを洗浄、ブロッキングおよび洗浄する。患者の血清が（感染後２から１１日の間の）初期感染における患者から採収されたならば、抗原−一次抗体複合体の存在を検出するために、共にホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＡまたは抗ヒトＩｇＭ二次抗体を使用する。患者の血清が（感染後１６から６０日の間の）後期感染または回復期感染における患者から採収されたならば、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしている抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用する。試薬テトラメチルベンジジンを用いて暗条件で呈色反応を発現させ、ＯＤ４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取る。
【００９０】
[00105]本発明のＥＬＩＳＡ法は、特にＧＳＴ−Ｎ（Δ１１１〜１１８）を用い抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用した場合に、少数の偽陽性検査しか生ない特異性と、少数の偽陰性検査しか生まない高感度を兼ね備える。さらに、呈色反応の読み取りのために最小ＯＤカットオフ値を調整できる。このように、偽陽性の可能性を最小にするために低リスク領域でＥＬＩＳＡが用いられる場合、ＥＬＩＳＡに１００％の陽性反応的中度（ＰＰＶ）を有する高いカットオフ値０．４５を定めることが適当でありうる。同様に、ＥＬＩＳＡが高リスク領域で使用される場合、感度増加および高い陰性反応的中度（ＮＰＶ）を有する低いカットオフ値０．２５が望ましく適当でありうる。
【００９１】
[00106]別の特定の実施形態において、イムノアッセイは迅速イムノクロマトグラフィー検査である。抗原性タンパク質、好ましくはＧＳＴ−Ｎ（Δ１１１〜１１８）およびＧＳＴ−Ｕ２７４（１３４〜２７４）をニトロセルロース膜上に別個のラインとなるように独立して固定化する。個々のクロマトグラフィーストリップは一端に金コロイド粒子とコンジュゲートした二次抗体を含み、二次抗体の早期泳動を防止するためのセパレーターを適所に有する。試薬担持パッドはａと離れ、ニトロセルロース膜と離れている。患者血清を膜に添加した上でクロマトグラフィーストリップに放出緩衝液を加え、セパレーターを取り除き、二次抗体が泳動して、ニトロセルロース膜上に形成した抗原−一次抗体複合体と接触できるようにする。コンジュゲートした金粒子を含有する抗原−一次抗体−二次抗体複合体の形成による着色ラインの出現によって、一般的に２〜１５分間で陽性の検査結果を目視できる。
【００９２】
[00107]いったん既製のクロマトグラフィー装置が手に入ったならば、迅速イムノクロマトグラフィー検査は実施にほとんど装備を必要としない。上記のＥＬＩＳＡの場合と同様に迅速イムノクロマトグラフィー検査は、高感度と特異性を兼ね備える。２つのアッセイで得られた結果を比較すると、２つの間で９９．６％というすばらしい一致がみられ、κ統計量１．００および反応性終点に関してＲ２が０．９８８という優れた相関を有した。このように、迅速イムノクロマトグラフィー検査は、使用に専門的訓練を必要としない簡単で迅速な検査であり、ＥＬＩＳＡと同様の診断性能をもたらす。
【００９３】
[00108]迅速イムノクロマトグラフィー検査に、上記のＥＬＩＳＡに使用するものと同じ抗原性タンパク質も適用でき、２つの異なる検査マーカーとして別々に適用できる。元来、新たに開発された迅速イムノクロマトグラフィー検査は、個別の患者の診断に対する表示を提供できるだけでなく、１回の検査で個別の抗原性タンパク質の反応性を検査できることから、本検査は集団診断の詳細も提供しうる。その詳細は、Ｎタンパク質に比べたＵ２７４タンパク質の大きな変動が原因の集団にわたる特定のウイルス変異体の蔓延についての貴重な疫学情報を提供しうる。
【００９４】
[00109]別の特定の実施形態において、イムノアッセイはウエスタンイムノブロットである。一般に抗原性タンパク質は、当技術分野で公知の標準的手法を用いて膜に転写される。迅速イムノクロマトグラフィー検査と同様に、個別の抗原性タンパク質を同じ検査に使用するために別個のバンドに分けて、同時に特定の抗原性タンパク質に対する患者の免疫応答を検出可能にすることができる。膜のストリップは、抗原性タンパク質、好ましくはＧＳＴ−Ｎ（Δ１１１〜１１８）およびＧＳＴ−Ｕ２７４（１３４〜２７４）を含有する。患者血清および抗ヒトコンジュゲート二次抗体を用いた膜のプロービングを標準的なウエスタンブロット法で実施する。上記のように、患者の試料を採収した感染の時点に基づき二次抗体を選択する。二次抗体を酵素アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせることができ、次に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸およびニトロブルーテトラゾリウムを用いた呈色反応を発現させることによって検出を実施する。
【００９５】
[00110]上記のウエスタンイムノブロットアッセイの方は時間がかかり、多数の患者試料の高スループットに容易には適応されない。しかし、別の診断方法を用いて得られた特定の結果を確認するための確認検査として実に有用な場合がある。
【００９６】
[00111]別の態様において、本発明は抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質に対する抗体をも提供する。抗体は、他のコロナウイルス由来抗原と抗体との交差反応性を防止するために、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに独特なＳ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４の領域に好ましくは対するものである。
【００９７】
[00112]本発明の抗体は、抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４の１つに含まれるエピトープに対して特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体のどちらかである。単一特異性抗体は、組換え、例えば（例えばヒト定常部と関連したマウス起源可変部から構成される）キメラ、ヒト化（動物、例えばマウス起源の超可変部を伴うヒト免疫グロブリン定常主鎖）、および／または一本鎖でありうる。ポリクローナルおよび単一特異性抗体の両方が免疫グロブリン断片、例えばＦ（ａｂ）’２またはＦａｂ断片の形態でもありうる。本発明の抗体は任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧまたはＩｇＡであり、ポリクローナル抗体は単一アイソタイプまたはアイソタイプの混合である。
【００９８】
[00113]ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｎ、ＥまたはＵ２７４タンパク質に対する抗体、またはそのホモログもしくは断片は、哺乳動物に前記タンパク質、ホモログまたは断片を含む組成物を免疫することによって産生する。そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を製造する方法は当技術分野で周知である。総説としては「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ編（１９８８）、ならびにＤ．Ｅ．Ｙｅｌｔｏｎら、１９８１．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：６５７〜６８０を参照のこと。モノクローナル抗体については、Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７を参照のこと。
【００９９】
[00114]ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｎ、ＥもしくはＵ２７４タンパク質またはそのホモログもしくは断片に対する本発明の抗体は産生され、標準的な免疫学的アッセイ、例えばウエスタンブロット分析、ドットブロットアッセイ、またはＥＬＩＳＡを用いて同定される（例えばＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ニューヨーク州を参照のこと）。抗体は、生体試料のような試料中の抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４の存在を検出する診断法に使用される。これらの抗体は、ＳＡＲＳ  ＣｏＶのＳ、Ｍ、Ｎ、ＥもしくはＵ２７４タンパク質、またはそのホモログもしくは断片を精製するためのアフィニティークロマトグラフィーにも使用される。
【０１００】
[00115]当業者は、どちらを使用しようと試料の構成要素と、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４タンパク質、またはそのホモログもしくは断片との間、あるいは本発明の抗体と、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４タンパク質、またはそのホモログもしくは断片である標的抗原との間に免疫複合体が形成すること、およびいかなる未結合の材料も免疫複合体の検出前に除去されることを容易に理解する。抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質試薬は、試料、例えば血液試料中の抗Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４抗体の存在を検出するために有用であり、一方、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ  ＣｏＶポリペプチドの存在について胃抽出物または生検のような試料をスクリーニングするために使用されることは言うまでもない。
【０１０１】
[00116]簡単に言えば、モノクローナル抗体を作製するために、抗体を産生する潜在性を有する、抗原を免疫された宿主動物からの体細胞を骨髄腫細胞と融合させ、通常のプロトコルにより２つの細胞のハイブリドーマを形成させる。体細胞はトランスジェニック哺乳動物の脾臓、リンパ節、および末梢血から得られうる。ハイブリドーマの産生に使用できるミエローマ細胞には、ＭＰＣＩＩ−４５．６ＴＧＩ．７、ＮＳＩ−Ａｇ４／１、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ−４−１、Ｐ．ｓｕｂ．３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．ｓｕｂ．１、ＯＦ、およびＳ１９４／５ＸＸ０．ＢＵ．１のようなマウス骨髄腫細胞系；２１０．ＲＣＹ３．Ａｇ１．２．３を含めたラット細胞系；Ｕ−２２６ＡＲおよびＧＭ１５００ＧＴＧＡ１．２を含めた細胞系；ならびにマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら（編）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ「Ｊ．Ｌ．Ｔｕｒｋ（編）Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８１）」がある。
【０１０２】
[00117]ＨＡＴ培地のような選択培地が入った多数の穴に体細胞−骨髄腫細胞ハイブリッドを蒔く。選択培地は他の望ましくない融合細胞ハイブリッドから抗体産生ハイブリドーマを検出することを可能にする。骨髄腫細胞は、細胞の成長のための酵素が発生するのに必要な遺伝子情報を欠くことから、未融合の骨髄腫細胞の成長も選択培地は防止し、骨髄腫細胞はさもなければ無限に分裂を続ける。体細胞から得られるＢリンパ球は、細胞の成長のための酵素の発生に必要な遺伝子情報を有するが、骨髄腫細胞の「不死」品質を欠き、よって選択培地中で短期間しか存続しない。したがって、骨髄腫細胞との融合に成功した体細胞だけが選択培地中で成長する。持ち込まれた細胞はＨＡＴまたは選択培地によって死滅する。
【０１０３】
[00118]多数の穴に成長したハイブリドーマから得られた潜在的抗Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４抗体を検定するためにスクリーニング法が使用される。個別のハイブリドーマが過剰成長して他のハイブリドーマを駆逐するのを阻止するように多数の穴を使用する。潜在的抗Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４抗体を検定するために使用されるスクリーニング法には、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、プラークアッセイ、細胞傷害性アッセイ、ドットイムノバインディングアッセイ、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、および他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイがある。
【０１０４】
[00119]抗Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４抗体について陽性の検査結果を与えるハイブリドーマを培養して維持し、Ｓ、Ｍ、Ｅ、ＮまたはＵ２７４に特異性のモノクローナル抗体を産生させるためにクローニングできる。あるいは、本来の融合のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために用いられる種類の組織適合性動物に所望のハイブリドーマを注射できる。注射された動物は、ハイブリドーマによって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発現する。
【０１０５】
[00120]選ばれたハイブリドーマ細胞によって分泌されるモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロースヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製法によって細胞培養培地または腹水から適当に精製される。
【０１０６】
[00121]患者の試料中または患者から得られたウイルス単離体中の特定の抗原性タンパク質の存在を同定すること、および精製した組換え抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質またはそれらの抗原性断片を検出することを含めた診断法において、抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質またはそれらの抗原性断片の存在を検出するために、本発明により産生された抗体を使用できる。標準的な精製法、例えば免疫沈降にもこれらの抗体を使用できる。公知の方法、例えば上記のような捕捉ＥＬＩＳＡ、ウエスタンイムノブロット、または免疫蛍光アッセイによるイムノアッセイに、本発明によって提供される抗体を使用できる。
【０１０７】
[00122]このように、本発明の抗体を用いて抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質、詳細にはＳ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４またはそれらの抗原性断片を検出する方法を提供する。抗原性ＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質、詳細にはＳ、Ｍ、Ｅ、ＮもしくはＵ２７４またはそれらの抗原性断片に対する一次抗体と試料を、抗体が抗原と複合体を形成するのに十分な時間および条件で接触させる。抗原性タンパク質が試料中に存在するならば、一次抗体は抗原性タンパク質と結合し、抗原−一次抗体複合体を形成し、その複合体は上記の様々な方法、例えば検出分子とコンジュゲートしうる一次抗体に対する二次抗体を使用することによって検出される。
【０１０８】
[00123]本明細書において参照した全ての文書は、参照により完全に組み込まれている。
【実施例】
【０１０９】
[00124]（実施例１：診断マーカーとしてのＳＡＲＳ  ＣｏＶタンパク質の使用）
[00125]材料および方法
[00126]材料：特に述べない限り、本研究に使用した全ての試薬をＳｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。全ての細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナッサス、バージニア州）から購入し、１ｇ／ｌグルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕペニシリン、および５％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、サウスローガン、ユタ州）を含有するダルベッコ変法イーグル培地で５％ＣＯ２中で３７℃で培養した。
【０１１０】
[00127]プラスミドの構築：ほ乳動物細胞に一過性発現させるために使用したベクターは、タンパク質のＮ末端に１つのヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ（非特許文献１５）をタグ付けするためのｐＸＪ４０ＨＡおよびタンパク質のＣ末端に３つのＨＡエピトープをタグ付けするためのｐＸＪ４０−３＿ＨＡであった。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を細菌に発現させるために、遺伝子をＧＳＴと共にｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ウプサラ、スウェーデン）にフレーム内にクローニングした。ＣＨＯ細胞にＳを安定トランスフェクトするために、ＧＢ２３１４３３２に記載されているようにＣ末端に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をタグ付けした完全長Ｓ構築体をｐＭＭＴＣベクターにクローニングした。本研究に使用した構築体の全てを表１に挙げる。
【０１１１】
【表１】
2006527382.tif 000002
【０１１２】
[00128]シンガポールにおけるＳＡＲＳ患者からの単離体であるＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ２００３ＶＡ２７７４を本研究に使用した。様々な遺伝子をクローニングするために、培養物が少なくとも７５％の細胞変性効果を示したときに回収したＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞の培養上清からＱｉａｇｅｎウイルスＲＮＡキット（バレンシア、カリフォルニア州）の使用によってＲＮＡを抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（商標）ＲＮアーゼＨ−逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写を行った。ＨｏｔＳｔａｒ（商標）ポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｔｉｔａｎｉｕｍ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、パロアルト、カリフォルニア州）、またはＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、インディアナ州）のいずれかを用いてＰＣＲを実施した。一部の場合には、シンガポールゲノム研究所（ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）が提供した重複ｃＤＮＡ（ＳＩＮ２７７４単離体；受託番号ＡＹ２８３７９８）を代わりにテンプレートとして使用した。Ｇｅｎｓｅｔ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（シンガポール）は、本研究に使用したプライマーの全てを合成した。Ｔａｑ  ＤｙｅＤｅｏｘｙ（商標）ターミネーターサイクル配列決定キットおよびＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティー、カリフォルニア州）のＤＮＡ自動シーケンサー（モデル３７３）を用いたジデオキシ法によって分子細胞生物学研究所（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）の基盤施設で実施したＤＮＡ配列決定により、本研究に使用した全ての構築体の配列を確認した。
【０１１３】
[00129]哺乳動物細胞の一過性トランスフェクション：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）トランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）で製造業者のプロトコルに従って一過性トランスフェクション実験を実施した。一般的に、直径６ｃｍの皿に約１０６個のＣＯＳ−７細胞を蒔き、少なくとも４ｈ付着させた。ＤＮＡ１〜２μｇをプレート１枚あたりに使用し、細胞を少なくとも１４ｈ放置してから、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）緩衝液中で直接溶解させ、ウエスタンブロット分析に使用した。
【０１１４】
[00130]ＧＳＴ融合タンパク質の発現：ｐＧＥＸ−４Ｔ−１発現構築体を保有する大腸菌（ＢＬ２１／ＤＥ３）細胞の対数増殖培養物（６００ｎｍの吸光度約０．７）に１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって融合タンパク質を合成するように誘導し、その後細胞をさらに３７℃で４ｈまたは３０℃で１２ｈ成長させた。細胞を回収し、０．５％トリトンＸ−１００および１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオリドを含有するＰＢＳに再懸濁し、次に超音波処理機（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．、ファーミンデール、ニューヨーク州）で超音波をかけた。次に、グルタチオン（ＧＳＨ）−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の使用によって、溶解物からＧＳＴ融合タンパク質を精製した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２および０．１％ＳＤＳに溶かした１０ｍＭ還元型ＧＳＨを用いてタンパク質をビーズから溶出させ、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ（商標）アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）の使用によってタンパク質濃度を決定した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでもタンパク質を分離し、４５％メタノールおよび１０％酢酸に溶かした０．２５％クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）で染色した。
【０１１５】
[00131]ウエスタンブロット分析：ウエスタンブロット分析については、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞およそ１０５個またはＧＳＴ融合タンパク質５０ｎｇをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースＨｙｂｏｎｄ  Ｃ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写した。５％脱脂乾燥乳で膜をブロッキングした。ＨＡタグ付きまたはＧＳＴ融合タンパク質の検出のために、抗ＨＡポリクローナル抗体または抗ＧＳＴモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ、カリフォルニア州）のどちらかと共に膜を４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で徹底的に洗浄し、その後適当なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に室温で１ｈインキュベートした。次に膜をＰＢＳＴで徹底的に洗い、強化化学発光法（Ｐｉｅｒｃｅ）によってシグナルの検出を行った。患者の血清については、０．５％トリトンＸ−１００および０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で各試料をまず処理し、次に１％脱脂乾燥乳を含有するＰＢＳＴで１：１５０から１：５００に希釈した。室温で１〜３ｈまたは４℃で一晩インキュベートした後に、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、サンフランシスコ、カリフォルニア州）抗体と共に膜を室温で１ｈインキュベートし、その後上記のように検出した。全ての二次抗体を１：２０００希釈で使用した。７対の血清からの患者血清の量が限られていることから、単一スロットのＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用ゲルでＮ、Ｕ２７４およびＵ１２２とＧＳＴとの３つのＧＳＴ融合タンパク質の混合のウエスタンブロットを行い、ニトロセルロース膜に転写した。膜を幅約０．８ｍｍのストリップとなるように切り、希釈血清３００〜４００μｌで各ストリップをプロービングした。後期の時点の血清については、ストリップを希釈血清と共に室温で１．５ｈインキュベートした。初期時点の血清については、任意のシグナルを検出するためにストリップを血清と共に一晩室温でインキュベートしなければならなかった。二次抗体を室温で１ｈインキュベートした。多数の試料をスクリーニングする場合もこの方法を使用した。
【０１１６】
[00132]ＣＨＯ細胞におけるＳ−ＧＦＰ融合タンパク質の発現および患者血清における抗Ｓ免疫反応性を決定するための免疫蛍光分析：ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を製造業者のプロトコルに従って用いて、ＣＨＯ細胞にｐＭＭＴＣ−Ｓ−ＧＦＰをトランスフェクトした。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で約１週間トランスフェクトされた細胞を選択した。次に、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ、ハルベルクモス、ドイツ）で細胞を分析し、最も強い発現シグナルを有するクローンを釣り上げ１００μＭのＺｎＳＯ４を含有する培地中で成長させた。Ｚｎ２＋イオンは、ｐＭＭＴＣベクターによる遺伝子の発現を増加させる（ＧＢ２３１４３３２参照）。０．０４％ＥＤＴＡで細胞をプレートからはがし、黒色テフロン製メンゼル診断用スライド（Ｍｅｒｃｋ）に蒔き、風乾し、その後約２０℃のアセトン中で約１ｈ固定した。次に、（ＰＢＳで）１：２０、１：４０、１：８０、および１：１６０に希釈した血清と共に細胞を３７℃で１．５ｈインキュベートし、次に、１：２０希釈のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧまたはローダミン（Ｒｈ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１．５ｈインキュベートした。Ｒｈコンジュゲート抗ヒトＩｇＧを使用する場合はＰＢＳで希釈し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ）、またはＩｇＡ（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ、グロストルプ、デンマーク）を使用する場合は、トランスフェクトされた細胞からのＧＦＰ蛍光を遮断する０．０５％エバンスブルー溶液（Ｆｌｕｋａ、ブックス、スイス）で希釈した。次にスライドをＺｅｉｓｓ顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＧｍｂＨ）で観察し、以下のスコアを付けた：＋＋＋非常に強い着色、＋＋中程度の着色、＋弱い着色。
【０１１７】
[00133]ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染患者からの血清の採収：（患者１から６の）最初の６つの血清試料は、患者３の試料を除きプラスマフェレーシスによって入手された。（ｉ）世界保健機関（ＷＨＯ）の基準により以前にＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を証明された患者、（ｉｉ）少なくとも６週間回復期にある患者、（ｉｉｉ）無症候性で研究に参加する意志のある患者にプラスマフェレーシスを行った。患者３から採血し、実験用に血清を分離した。全ての参加者は書面で同意を示し、Ｔａｎ  Ｔｏｃｋ  Ｓｅｎｇ病院倫理委員会の承認が与えられている。第２のセットの血清は、Ｔａｎ  Ｔｏｃｋ  Ｓｅｎｇ病院またはシンガポール総合病院（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）に入院した患者から採収した試料７対からなる。これらの患者は、ＷＨＯ基準により定義される発病時点で入院した。入院日および採血日を表２に示す。最初の試料（セットＡ）を発病後２〜１１日に採収し、第２のセットの試料（セットＢ）を発病後１６〜５４日に採収した。
【０１１８】
【表２】
2006527382.tif 000003
【０１１９】
[00134]最後のセットの血清は、Ｔａｎ  Ｔｏｃｋ  Ｓｅｎｇ病院から退院したＳＡＲＳが疑われる患者６１人から得られた。これらの患者の一部については退院時（発病後３〜４週間）に血清を採取したが、大部分の患者は退院後＞３週間に集められた（発病後から＞６週間）（詳細については表３を参照のこと）。１人の患者（患者Ｐ３Ｌ）については、発病後１１１日（３と１／２か月）に血清試料が採取された。他の患者２人（Ｐ７およびＰ８）からはプラスマフェレーシスで試料を得た。対照血清をＳｉｇｍａから購入し、インフォームドコンセントを与えられた健康ドナーから９９個の血清試料を得た。これらの健康ドナーは、（ｉ）ＳＡＲＳの診断、ＳＡＲＳの疑い、およびＳＡＲＳの自宅隔離命令に服した者との接触を有さず、（ｉｉ）献血前の１週間に発熱、インフルエンザの症状、鼻水、および咽喉炎を有さず、（ｉｉｉ）免疫抑制剤を常用したことがなく、（ｉｖ）重大な内科的疾患を有さず、かつ（ｖ）２００２年１１月以来ＳＡＲＳ感染地域への旅行歴を有さなかった。
【０１２０】
[00135]結果
[00136]ＳＡＲＳが疑わしい患者の血清中のＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムによってコードされるウイルスタンパク質に対するＩｇＧ抗体の検出：ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムによってコードされるウイルスタンパク質のどれが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を検出する血清学的アッセイの開発のための診断用抗原として役立ちうるかを評価するために、我々は発現ベクターに４つの構造タンパク質のうち３つ（Ｅ、Ｍ、およびＮ）をクローニングした。スパイク（Ｓ）タンパク質は、サイズが大きく（約４．７ｋｂｐ）、かつ高度にグリコシル化されていることから、下記のように免疫蛍光法で別に分析した。さらに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのユニークなタンパク質２つ（Ｕ２７４およびＵ１２２）も本研究に含め、これらのタンパク質を以後ＵＸと呼ぶ。ここで、「Ｘ」はタンパク質の予測アミノ酸数を表す。本研究において、我々はＵ２７４のＣ末端親水性領域のみを使用した。それは、その領域がＮ末端に３つの潜在的膜貫通ドメインを有し、これらの疎水性領域が組換えＵ２７４タンパク質の可溶性に影響しうるからである。Ｍａｒｒａおよび共同研究者ら（非特許文献５）が示したように、構造タンパク質およびユニークなタンパク質の位置、ならびにそれらに対応するＯＲＦの数を図１に示す。
【０１２１】
[00137]この一連のＨＡタグ付きタンパク質を一過性トランスフェクションによりＣＯＳ−７細胞に発現させ、回復期の患者３人の血清を用いたウエスタンブロット分析（図２、患者１〜３）で総タンパク質溶解物を分析し、これらの血清が発現したタンパク質に対する任意の抗体を有しているかを決定した。患者１および２についてプラスマフェレーシスを実施し、プラスマフェレーシス生成物をウエスタンブロット分析に使用し、一方で患者３については血清を分析に使用した。
【０１２２】
[00138]患者３人全てがＮタンパク質（ａａ６９〜４２２）に対する抗体を有していたが他の構造タンパク質ＭおよびＥに対する抗体を有さなかった。興味深いことに、患者１および３の血清によってＵ２７４のＣ末端親水性領域（ａａ１３４〜２７４）も検出されたが、患者２の血清では検出されなかった（図２）。対照血清は、Ｎ、Ｕ２７４または他の任意のタンパク質を検出しなかった。Ｕ１２２は３つの血清のどれによっても検出されず、発現していないか、構造タンパク質でないか、十分に抗原性でないおそれが示唆された。
【０１２３】
[00139]細菌に発現させたタンパク質は、大規模生産が簡単で安価であることから、我々は次にＧＳＴ融合タンパク質としてＮおよびＵ２７４を発現させ、それらの患者血清との反応性を検査した。クマシー染色は、ＧＳＴ−Ｎ（ａａ１２０〜４２２）およびＧＳＴ−Ｕ２７４（ａａ１３４〜２７４）がＧＳＨ−セファロースビーズを用いた一段階精製後に＞９０％の純度であることを示した（図３）。ここで使用したＧＳＴ−Ｎ（ａａ１２０〜４２２）タンパク質は、全てのコロナウイルスにみられる高度に保存されたモチーフ（ＦＹＹＬＧＴＧＰ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＮのａａ１１１〜１１８）を含有する（非特許文献１０）Ｎタンパク質のＮ末端部分を欠き、それで他のコロナウイルスに対する抗体と交差反応する可能性が低いと思われる。細菌培養液４００ｍｌから、ＧＳＴ−Ｎ約１０ｍｇおよびＧＳＴ−Ｕ２７４約２ｍｇをそれぞれ得ることができた。ＧＳＴ−Ｕ１２２（ａａ１６〜１１１、Ｎ末端のシグナルペプチドと疎水性Ｃ末端を欠く）およびＧＳＴも発現させて対照として使用した。哺乳動物に発現させたタンパク質と同様に、同じ患者血清３つおよび対照血清１つでＧＳＴ融合タンパク質をプロービングした（図２）。ＣＯＳ−７細胞に発現させたタンパク質に一致して、患者血清３つは全てＧＳＴ−Ｎをはっきりと検出し、患者１および３の血清だけがＧＳＴ−Ｕ２７４を検出した（図４）。ＧＳＴ−Ｕ１２２およびＧＳＴも患者血清３つ全てと何もバックグラウンドを示さず、どのタンパク質とも対照血清の非特異的な結合は存在しなかった（図４）。別の回復期患者３人（患者４〜６）の血清も検査し、それらの血清は、ＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｕ２７４の両方に特異的に反応したが、ＧＳＴ−Ｕ１２２およびＧＳＴとは反応しなかった（図４）。
【０１２４】
[00140]感染後の２時点で得られた７対の血清中のＮおよびＵ２７４タンパク質に対するＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ抗体のプロフィル：患者７人の対になった血清のセットについてもＧＳＴ−ＮおよびＧＳＴ−Ｕ２７４に対する反応性を試験した。これらは感染後の２時点、１つは発病後２〜１１日（セットＡ）に、もう一つは発病後１６〜５４日（セットＢ）に得られた（表２）。７症例全てについて、第２の時点の試料を最初の時点の試料から少なくとも８日後に採取した。図５に示すように、ＧＳＴ−Ｎタンパク質に対する抗ＩｇＧ抗体は、後の時点（セットＢ）の患者血清の７つ全てに存在したが、最初の時点（セットＡ）には存在しなかった。両セットの血清について、希釈血清（１：１５０）と共に室温で１．５ｈ膜をインキュベートした後で、二次抗体（ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ）と共に室温で１ｈインキュベートした。さらに、後の時点の血清７つ全ては、ＧＳＴ−Ｎよりも低レベルであるもののＧＳＴ−Ｕ２７４に対する抗体も含有していた（図５、セットＢ）。
【０１２５】
[00141]我々は、初期時点の血清（セットＡ）についての実験を繰り返したが、希釈した血清と１．５ｈの代わりに室温で一晩ブロットをインキュベートし、３つの異なる二次抗体、すなわち抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、および抗ＩｇＡを使用した。これらの抗体それぞれに対する結果を図６に示す。ＩｇＧについては、試料９Ａおよび１１ＡだけがＧＳＴ−Ｎに対するある程度の反応性を示した。しかし、ＩｇＡについては７つの試料全てがＧＳＴ−Ｎとの反応性を示し、シグナルは試料９Ａおよび１１Ａで特に強かった。ＩｇＭについては、７つの試料全てがＧＳＴ−Ｎと低レベルの反応性を示した。各患者の初期時点の試料は発病後異なる日数で採収されたため、われわれの結果は、発病の早くも２日後までに（患者Ｄ２、試料２Ａ）、Ｎタンパク質に対するＩｇＭおよびＩｇＡ抗体が存在したことを示唆している。発病後９日までに、Ｎに対する非常に高レベルのＩｇＡ抗体が存在し、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体も検出できた（図６、試料９Ａおよび１１Ａ）。ＧＳＴ−Ｕ２７４については、発病後５〜１１日にＩｇＡについての（試料５Ａ、８Ａ、９Ａ、および１１Ａ）、およびＩｇＭについての（試料１１Ａ）いくらかの反応性が観察された。興味深いことに、ＩｇＭを使用した場合に試料１１Ａ（発病後１１日）ではＧＳＴ−Ｕ２７４に対する非常に強力なシグナルが観察され、対応する初期の試料１１ＢについてはＧＳＴ−Ｕ２７４に対するシグナルも強力であった（図５および６）。
【０１２６】
[00142]ＮおよびＵ２７４タンパク質に対する免疫反応性（ＩｇＧ）の感度および特異性の決定：ＮおよびＵ２７４タンパク質に対する免疫反応性の感度および特異性を決定するために、退院したＳＡＲＳの疑いのある患者から別の試料６１個を得て、ウエスタンブロット分析によってＮおよびＵ２７４に対するＩｇＧ抗体の存在を検査した。表３に示すように、発病後３１から１１１日に試料を採取した。（表３の凡例。ａ：ウエスタンブロット分析による決定。＋＋＋、＋＋、＋：それぞれ非常に強い、中程度、弱いシグナルをオートラジオグラフから観察した、−：シグナルを観察せず；ｂ：免疫蛍光法により決定。Ｓタンパク質を安定発現しているＣＨＯ細胞を希釈患者血清（１：４０）の次にＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートし、スライドをＺｅｉｓｓ顕微鏡で観察し、＋＋＋：非常に強い着色、＋＋：中程度の着色、＋：弱い着色のようにスコアを付けた。健康志願者からの血清１００個を同じ希釈で試験し、そのどれも着色を示さなかった；ｃ示した発病後日数に得た試料；ｄ２人の健康な接触者（患者８６８および８７３）の試料も試験した。ｅプラスマフェレーシスによって得た試料；ｆ表２に説明した７対の血清の１つの後の時点。）
【０１２７】
【表３】
2006527382.tif 000004
【０１２８】
[00143]患者２人（Ｐ７およびＰ８）からのプラスマフェレーシス生成物および他の患者５９人の血清を使用した。全ての試料は、Ｎタンパク質に対して強い免疫反応性を示し（１００％）、試料６１個のうち４４個（７２％）はＵ２７４に対して陽性であった（表３）。一般に、Ｕ２７４タンパク質に対して観察されたシグナルはＮタンパク質に対するシグナルよりもずっと低かった。例外は患者７４９および８５９からの試料であり、それらの試料ではＵ２７４およびＮタンパク質に対するシグナルは等しく強力であった。健康ドナーからの別の９９個の試料も検査し、それらのどれもＮおよびＵ２７４と免疫反応性を全く示さなかった。さらに、ＳＡＲＳの疑いのある患者と密接に接触したが、臨床症状を全く発現しなかった患者２人（患者８６８および８７３）の試料も、ＮおよびＵ２７４と全く免疫反応性を示さなかった（表３）。したがって、Ｎタンパク質に対する免疫反応性は、高感度（ＳＡＲＳの疑いのある患者の試料総数８１個の１００％で認められる）かつ高特異性である。
【０１２９】
[00144]免疫蛍光による回復期血清中のＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対するＩｇＧ抗体の検出：Ｓタンパク質のサイズが大きく高度にグリコシル化されていることから、細菌の代わりに哺乳動物細胞にこのタンパク質を発現させることが有利である。それでＳタンパク質のコンホメーションおよび／またはグリコシル化に依存しうる抗体を検出することが可能になる。Ｃ末端にＧＦＰをタグ付けした完全長Ｓ構築体をＣＨＯ細胞に安定トランスフェクトした。抗体を抗生物質で選択後、ＧＦＰの蛍光が表示するように有意なレベルのＳタンパク質を発現しているクローンのプールが得られた（図７）。回復期血清中にＳＡＲＳ−ＣｏＶのＳタンパク質に対するＩｇＧ抗体が存在するかを決定する免疫蛍光染色法にこれらのＣＨＯ細胞を使用した。簡潔には、細胞をアセトンで固定化し、希釈した患者血清と共にインキュベートし、その後Ｒｈコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。
【０１３０】
[00145]図７に示すように、患者１〜６の血清は全て、免疫蛍光によって検出されたようにＳに対するＩｇＧ抗体を含有し、対照血清を使用した場合にシグナルは観察されなかった。高濃度のエバンスブルー溶液（０．０５％）の存在下でＲｈコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体をＦＩＴＣコンジュゲート抗体に交換したことを除いて、残りの試料全てを同様に検査した。これは、Ｒｈで染色された細胞よりもＦＩＴＣで染色した細胞を判定する方がずっと容易であることが理由で、この濃度のエバンスブルー溶液がトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ蛍光を全て遮断するのに十分であった（データは示さず）。
【０１３１】
[00146]表３に示すように、回復期血清（７４試料）の１００％が希釈１：４０でＳに対する免疫反応性を示し、健康ドナーの１００試料は同じ希釈で全くシグナルを示さなかった。検査を行った最低の希釈は１：２０であったが、この濃度で健康ドナーの少数の試料が弱いシグナルを示した。したがって、比較のために１：４０希釈の結果を使用した。さらに高い希釈（１：８０および１：１６０）で、予想通り患者の血清の大部分で弱いシグナルを観察した。具体的には、１：４０希釈で非常に強いシグナル（＋＋＋）を観察した試料４３２、６３３、７８４、８４０、８７８、８９３、３Ｂ、５Ｂ、および８Ｂで、シグナルは希釈が高くなると徐々に減少し、すなわち１：８０で中程度のシグナル（＋＋）が観察され、１：１６０で弱いシグナル（＋）が観察された。初期時点の７試料（表２、セットＡ）も同様に、しかしＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ二次抗体を別々に用いて検査したが、それらのどれも（１：４０希釈で）全く反応性を示さなかった（データ示さず）。
【０１３２】
[00147]（実施例２：ＥＬＩＳＡとイムノクロマトグラフィーアッセイ）
[00148]材料および方法
[00149]組換えタンパク質：組換えタンパク質を得るために使用した材料および方法は、上の実施例１に記載したとおりである。本研究では、ＡＫＴＡ迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｓ−２００ＨＲ１０／３０カラムを用いてＧｓｔ−Ｕ２７４タンパク質をさらに精製した。使用した緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、および１ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有し、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎであり、１ｍｌの画分を採収した。画分１２および１３を合わせ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一晩透析し、少なくとも緩衝液を３回交換した。
【０１３３】
[00150]血清検体：Ｔａｎ  Ｔｏｃｋ  Ｓｅｎｇ病院またはシンガポール総合病院に入院したＳＡＲＳ患者から回復期血清７４試料を採収した。シンガポール共和国、シンガポールの分子細胞生物学研究所で働いている、地域の健康ドナーから対照血清９１試料を得た。全ての標本を同意を得て採収し、患者の試料を症状の開始から１６〜６５日後に採収した。さらに、ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｉｎｃ．（フランクリン、マサチューセッツ州）から購入した健康ドナーの血清１１９個を、追加の健康対照として本研究に含めた。
【０１３４】
[00151]ＥＬＩＳＡ：プレートのコート前に、それぞれ終濃度０．１および０．１５μｇ／ｍｌとなるようにＧｓｔ−ＮおよびＧｓｔＴ−Ｕ２７４タンパク質を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で予備希釈した。すでに記載されたように（非特許文献１６）プレートを調製した。簡潔には、１穴あたり体積１００μｌのタンパク質混合物を入れて一晩（１６〜１８ｈ）室温でインキュベートすることによって９６穴ポリスチレン製マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｎｏ  １Ｂ；Ｔｈｅｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ、フランクリン、マサチューセッツ州）をコートした。ＰＢＳ−トウィーン８０（ＰＢＳＴ）でプレートを５回洗い、トリス系希釈剤２００μｌ（１穴あたり）で非特異的結合部位を室温で１ｈブロッキングした。プレートをもう５回さらに洗浄してから、（ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］およびスキムミルク粉末をそれぞれ１％含有する）トリス系希釈剤２００μｌに入れた血清１０μｌを加えた。次に、プレートを３７℃で３０分間インキュベートしてから、ＰＢＳＴで６回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、１：５００希釈）を１穴あたり１００μｌ加え、この混液を３７℃で３０分間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、酵素基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を１穴あたり１００μｌ加えて呈色を進めた。暗条件で３７℃で１５分間インキュベートした後に、１穴あたり１Ｎ  ＨＣｌを１００μｌ加えることで反応を停止させた。６２０ｎｍの参照フィルターを用いて吸光度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。
【０１３５】
[00152]迅速イムノクロマトグラフィー検査：膜に基づくイムノクロマトグラフィー検査装置は、クロマトグラフィーストリップ、セパレーター、および吸着剤パッドからなり、米国特許第６３１６２０５号に以前に記載されたように全てが１つのカセット内に収容されていた。この参照に詳述されている手順によってクロマトグラフィーストリップを別に調製したが、装置に組み立てる前にわずかな変更を加えた。つまり、ＢｉｏＤｏｔ（アービン、カリフォルニア州）噴霧器で平均孔サイズ８μｍを有するニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ、アナーバー、ミシガン州）に、それぞれ濃度０．１および０．１５ｍｇ／ｍｌのＧｓｔ−ＮおよびＧｓｔ−Ｕ２７４組換え抗原を２本の別々のラインになるように噴霧した。膜を１０分間乾燥させてから、６．７％ＳｔａｂｉｌＣｏａｔ（商標）（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、Ｉｎｃ．）、０．０５％トリトンＸ−１００、および０．５％カゼインを有するＭｉｌｌｉ−Ｑ純水からなるブロッキング緩衝液に１分間浸した。次に、ブロッキング後の膜を３７℃で６０分間乾かしてから、膜の裏打ちに固定した。試薬保持パッドを多孔性マトリックスを用いて調製した。直径２５〜３０ｎｍの金コロイド粒子で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を多孔性マトリックスに噴霧した。次に、この試薬保持パッドを３７℃で２ｈ乾燥させてから装置に組み込んだ。ニトロセルロースストリップの一端に０．１％トリトンＸ−１００で処理した多孔性マトリックスを固定し、同じ膜の裏打ちのもう一端に試薬保持パッドを固定することでクロマトグラフィーカードを調製した。次に、この組立体をサイズおよそ４ｍｍ×５６ｍｍのストリップに切断した。カセットの下半分に吸着剤パッド、次にセパレーター、それから１ユニットのクロマトグラフィーストリップを配置し、最後にカセットの上半分を閉じることでアッセイ装置を組み立てた。さらに、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを有するＭｉｌｌｉ−Ｑ純水（ｐＨ８．０）で試薬放出用洗浄緩衝液も調製した。
【０１３６】
[00153]検査時に、アッセイ装置の標本ウインドウに未希釈の血清試料２５μｌを加えた。試料を横方向に泳動させ、膜の部分を覆わせた。試料がおよそ３０ｓで観察窓のインジケーターに達したときに、試薬放出用洗浄緩衝液３滴を緩衝液ウインドウに加えて、金コロイド標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を放出させた。次に、突き出た端を引っ張ってセパレーターをはずし、クロマトグラフィー要素と吸着剤パッドが接触できるようにした。これで金コロイド標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体はクロマトグラフィーストリップを完全に泳動できるようになった。一般的に２〜１５分で観察ウインドウから結果を読み取れる。対照ラインのみの出現は陰性結果を表示し、一方で陽性結果では対照ラインと検査ラインの一方または両方とが観察ウインドウに現れる（図８）。
【０１３７】
[00154]統計解析：新しい迅速検査による結果と新しいＥＬＩＳＡによる結果との間の一致率を測定するためにκ統計量を使用した。κ統計量の値が、＞０．７５、０．４０〜０．７５、および＜０．４０であることは、それぞれ非常によい一致、よい〜中程度の一致、および悪い一致を表す（非特許文献１７）。ＥＬＩＳＡのデータ解析については、任意のカットオフ値０．４５を選択したが、陽性集団と陰性集団との間の最適の判別の表示をもたらすことができるデルタ値で確認した（非特許文献７）。
【０１３８】
[00155]結果
[00156]ＥＬＩＳＡ：試料の希釈１：２０で検査した場合、ＥＬＩＳＡはＳＡＲＳ患者からの回復期試料の１００％（ｎ＝７４）で、ＯＤ値の平均±標準偏差２．３２±０．５４でＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するＩｇＧ抗体を検出した（表４および図９）。対照的に、健康ドナーの対照血清２１０個から、ＯＤ値の平均±標準偏差０．０５±０．０５（Ｐ＜０．００１）で検査によってわずか１つの初回陽性試料を認めた（図９）。このように、この検査は９８．７％のＰＰＶおよび１００％の陰性反応的中度（ＮＰＶ）をもたらした（表４）。さらに、ＥＬＩＳＡは陽性デルタ５．４および陰性デルタ３．６を与え、陽性と陰性とを非常によく判別することを示した。さらに図１０に示すようにこの新しいＥＬＩＳＡを用いることによって、ＳＡＲＳ患者からの７試料でタイトレーション曲線を得た場合、種々の試料で＞１：４０〜１：６４０の範囲の希釈で反応性の終点を認めた。
【０１３９】
【表４】
2006527382.tif 000005
【０１４０】
[00157]迅速イムノクロマトグラフィー検査。希釈していない試料で検査した場合、迅速検査に使用したＧｓｔ−ＮおよびＧｓｔ−Ｕ２７４タンパク質は、ＳＡＲＳのＷＨＯ基準に合致したＳＡＲＳ患者から得た血清のそれぞれ１００％（４２試料中４２）および８５．７％（４２試料中３６）でＩｇＧ抗体と反応した（表４）。このように、新しい検査に対する総合的な検出率は１００％（４２試料中４２）であった（表４）。迅速検査におけるＧｓｔ−Ｎタンパク質だけが健康対照の血清２１０個のうち２つと交差反応することを認めた。したがって本検査は、検査された集団で特異性、ＰＰＶ、およびＮＰＶをそれぞれ９９．０、９５．３、および１００％有することが示された（表４）。結果を比較した場合、迅速検査およびＥＬＩＳＡはκ統計量１．００で９９．６％と非常によい一致を与えた（表５）。さらに、同じ患者試料７つを用いて（１：８〜１：１２８の範囲の希釈での）迅速検査およびＥＬＩＳＡの反応性終点を比べた場合、非常によい相関（Ｒ２＝  ０．９８８）を認めた（図１１）。
【０１４１】
【表５】
2006527382.tif 000006
【０１４２】
[00158]（実施例３：ＥＬＩＳＡおよびイムノクロマトグラフィーアッセイの評価）
[00159]材料および方法
[00160]血清標本：ＷＨＯの定義（非特許文献１８）により臨床的に疑われるＳＡＲＳを発症し、２００３年３月１８日から５月２４日の間に香港の地方救急病院３か所に入院した患者から血清標本を採収した。これらの患者から総数２２７個の血清試料をＩＦ検査（９）を用いて検査し、＞１：１０〜１：２５６０希釈のＩＦ価を有することを確認した。それに対し、香港で地域的に採収した健康ドナーの血清３８５試料を対照として使用した。さらに、ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒ  Ｉｎｃ．（フランクリン、マサチューセッツ州）から購入した健康ドナーの血清１０６６個を追加の健康対照として研究に含めた。疾患対照のために、様々な以前の研究からのＧｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＧＬＤ、シンガポール）の保管血清試料を使用した。これらにはＳＡＲＳに関係しない発熱（デング熱と確認）またはＳＡＲＳに関係しない呼吸器疾患（結核と確認）を有した患者の５０試料がある。
【０１４３】
[00161]免疫蛍光検査：上の実施例１に記載したようにＩＦ検査を準備し実施した。簡潔には、ＳＡＲＳ  ＣｏＶに感染したＶｅｒｏ細胞の塗抹標本を調製し、アセトンで１０分間固定し、使用まで−８０℃で保存した。使用前に、高力価陽性対照血清試料でＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染細胞を６０〜７０％有する塗抹標本のバッチを確認した。患者試料から１：１０からの２倍希釈系列を調製し、塗抹標本に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。塗抹標本をＰＢＳで２回洗浄してから、フルオレセインイソチオシアネートで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧと共に３７℃で３０分間さらにインキュベートした。研究に含めた弱い陽性の対照に比べて蛍光強度が等しいか、または高いならば、試料を陽性と評価した。
【０１４４】
[00162]ＥＬＩＳＡ：上の実施例２に予め述べたように２つの組換えタンパク質（Ｇｓｔ−ＮおよびＧｓｔ−Ｕ２７４）を利用してシンガポールのＧｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｔｅ  ＬｔｄがＥＬＩＳＡを製造した。提供された説明書に厳密に従ってアッセイを実施した。簡潔には、ＢＳＡおよびスキムミルク粉末を含有するトリス系希釈剤２００μｌ／穴の入ったＥＬＩＳＡプレートに血清１０μｌを加え、３７℃で３０分間インキュベートしてから、ＰＢＳＴで６回洗った。ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５００希釈）を１穴あたり１００μｌ加え３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳＴで６回洗い、１穴あたり酵素の基質であるＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）１００μｌ加えて呈色させた。暗条件で３７℃で１５分間インキュベートした後、１Ｎ  ＨＣｌを１穴あたり１００μｌ加えて反応を停止させた。参照フィルター６２０ｎｍを用いて吸光度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。
【０１４５】
[00163]迅速イムノクロマトグラフィー検査：もう一度、実施例２に予め記載した方法に従ってシンガポールのＧｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄで膜に基づく検査装置を製造した。装置は、クロマトグラフィーストリップ、セパレーターおよび吸着剤パッドからなり、その全てをすでに記載したように１つのカセットに収容した。
【０１４６】
[00164]Ｇｕａｎら（非特許文献１９および２０）の詳細な開示により、クロマトグラフィーストリップに２つのＳＡＲＳ特異的組換えタンパク質Ｇｓｔ−ＮおよびＧｓｔ−Ｕ２７４を別々に沈着させた。被験試料がＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する抗体を含有するならば固定化組換え体の一方または両方に結合し、試薬放出洗浄緩衝液によって固定化組換え体が放出されたときに抗ヒトＩｇＧで標識された固定化金コロイドで形成した免疫複合体を検出できる（非特許文献１９）。
【０１４７】
[00165]製造業者によって提供された説明書に厳密に従ってアッセイも行った（非特許文献１９）。簡潔には、血清試料２５μｌを試料穴に加え、横方向に泳動させ、結果観察ウインドウの膜部分を覆わせる。観察ウインドウの青色インジケーターラインに血清試料の湿った先端が達したときに、試薬放出洗浄緩衝液３滴を第２の穴に加えた。抵抗を感じるまでセパレーターのタブを引いてから、試薬放出洗浄緩衝液の追加の１滴を試料穴に加えた。
【０１４８】
[00166]一般的に２〜１５分間で観察窓から結果を読み取ることができるが、結果を全て１５分の時点で記録した。対照ラインのみが現れた場合に試料を陰性と評価したが、対照ラインと検査ラインの一方または両方とが観察窓にみられたときは陽性と評価した（非特許文献１９）。
【０１４９】
[00167]統計解析：標準偏差の単位で測定したカットオフからの試料集団の平均ＯＤの比の距離として定義されたデルタ値（非特許文献７）をカットオフ値の実証のために計算した。新しい迅速検査の結果と新しいＥＬＩＳＡの結果との一致率を測定するために、κ統計量を使用した。κ統計量＞０．７５、０．４０〜０．７５および＜０．４０は、それぞれ非常によい一致、よい〜中程度の一致、および悪い一致を表す（非特許文献１７）。
【０１５０】
[00168]結果
[00169]ＥＬＩＳＡの評価と実証：表６に示すように、ＯＤ０．４５、ＯＤ０．３０およびＯＤ０．２５での３つのカットオフ値がＥＬＩＳＡの性能を評価する上で適用された。ＯＤ０．４５に定めたカットオフ値で、ＥＬＩＳＡは最高の特異性１００％（３８５試料中３８５）を生成したが、全般的な感度は６０％と低かった（２２７試料中１３６）（表６）。しかし、カットオフ値をＯＤ０．３またはＯＤ０．２５まで下げて調整した場合、性能の向上が得られた。カットオフとしてＯＤ０．２５を有するＥＬＩＳＡは、ＯＤ０．４５の制定よりも全体でほぼ１２％多いＳＡＲＳ関連試料を検出した（表６）。陽性に対しても０．１０に対して０．５３とデルタ値の改善が得られた。補足の検査において、健康対照からの１０６６試料がさらに検査され、平均ＯＤ０．０４３２±０．０７４５が得られた。ＯＤ０．２５は、平均ＯＤ±３ＳＤに等しいことが分かったが、ＯＤ０．４５は平均ＯＤ±５ＳＤに等しかった。ＯＤ０．２５およびＯＤ０．４５という２つのカットオフ値は、補足の健康対照群および呼吸器疾患または熱を患った非ＳＡＲＳ患者の疾患対照群それぞれに９８％対９９．２％、１００％対１００％、および９２％対９８％の同様に高い特異性を生み出した（表６）。
【０１５１】
【表６】
2006527382.tif 000007
【０１５２】
[00170]ＯＤ０．２５に設定したカットオフ値で、ＥＬＩＳＡは、後期回復期の試料だけでなく急性期検体も９５％という高い感度でＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するＩｇＧ抗体を検出した。ＥＬＩＳＡは、臨床症状の開始の１〜１０日後、１１〜２０日後および２１〜３０日後のＳＡＲＳ患者から採収された試料の５８％、７０％、および７５％でＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するＩｇＧ抗体を検出した。ＯＤ０．２５のカットオフ値で得られた特異性は、同じ検査地点で検査された健康対照群で９９．５％（３８５試料中３８３）と高いままであった（表６）。このように検査は、全般的なＰＰＶ９８．８％およびＮＰＶ８５．７％を提供した。ＥＬＩＳＡの性能もＩＦ検査によって発生したＩＦ価とＲ２＝０．９３４２でよく一致することが分かった（図１２）。
【０１５３】
[00171]迅速イムノクロマトグラフィー検査の評価：迅速イムノクロマトグラフィー検査を用いて同じセットの臨床標本を検査した場合、ＥＬＩＳＡと同様の性能が得られた。迅速検査によるＳＡＲＳ関連標本での全般的な検出率は７０．５％（２２７試料中１６０）で、特異性９７．７％（３８５試料中３７６）であった（表７）。臨床症状の開始の１〜１０日後、１１〜２０日後、２１〜３０日後、および３０日後を超えたＳＡＲＳ患者から採収された４群の試料についてのそれぞれの検出率は、５５％、６８％、８１％および７９％であった（表７）。この検査は、２つの結果として生ずるバンドによって別々に表される２つの組換えタンパク質を利用したため、２つのタンパク質の性能も分析した。Ｇｓｔ−Ｎタンパク質単独は、２つのタンパク質の組み合わせによって陽性と分かった１６０試料のうち１５７試料でＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する抗体を検出した（表７）。さらに、Ｇｓｔ−Ｎタンパク質は健康対照からの標本３８５個のうちわずか１つと反応するという、さらに低い交差反応性を表した。対照的に、Ｇｓｔ−Ｕ２７４は、ＳＡＲＳ関連試料全体のわずか８％（２２７試料中１８）を検出したが、健康対照の試料との非特異的反応性の大部分に貢献していた（３８５試料中８）。興味深いことに、Ｇｓｔ−Ｕ２７４によってのみ検出され、Ｇｓｔ−Ｎタンパク質では検出されなかった３つの試料は、臨床症状の開始初期１〜２０日後に患者から採収されたものであった（表７）。したがって検査は、検査された集団でそれぞれ９４．７％および８４．９％のＰＰＶおよびＮＰＶを有することが示された（表７）。追加の検査でもう一度、呼吸器疾患または熱を患った非ＳＡＲＳ患者の疾患対照群で迅速検査をさらに評価し、迅速検査はそれぞれの群の検査された試料のわずか５０試料中３つまたは５０試料中４つとのみ交差反応することが分かった（表７）。結果を比較した場合、迅速検査およびＥＬＩＳＡはκ統計量０．８１で非常によい全般的な一致９２．５％を与えた（表８）。さらに、検査の性能も、免疫蛍光（ＩＦ）検査によって発生したＩＦ価とＲ２＝０．９１８２とよく一致することが分かった（図１２）。
【０１５４】
【表７】
2006527382.tif 000008
【０１５５】
【表８】
2006527382.tif 000009
【０１５６】
[00172]（実施例４：ＳＡＲＳの診断のための確認検査としてのウエスタンブロット）
[00173]材料および方法
[00174]血清標本：Ｔａｎ  Ｔｏｃｋ  Ｓｅｎｇ病院またはシンガポール総合病院に入院したＳＡＲＳ患者から同意を得て回復期血清標本４０個を採取した。ＢｉｏＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒ  Ｉｎｃ．（フランクリン、マサチューセッツ州）から購入した健康ドナーからの血清５０個も健康対照として研究に含めた。非ＳＡＲＳ疾患対照として、以前の研究からのＧｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、シンガポール）の保管血清試料を使用した。これらの血清をＳＡＲＳ大発生前に得ていた。これらには、ＳＡＲＳに関係しない熱（デング熱と確認）を有する患者またはＳＡＲＳに関係しない呼吸器疾患（結核と確認）を患った患者からのそれぞれ５０試料がある。さらに、以前の研究で健康ドナー１０６６試料のスクリーニングから偽陽性と同定された１８試料（Ｇｕａｎら、投稿中）も本研究に含めた。
【０１５７】
[00175]ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス溶解物および組換えタンパク質：ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス溶解物をＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（バッファロー、ニューヨーク州）から購入した。それらはＳＡＲＳ  ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ細胞をスクロース勾配で精製し、トリトンＸ−１００（０．５％）を含有する破壊緩衝液（ＫＣｌ、０．６Ｍ）で処理して得られたものであった。
【０１５８】
[00176]上記のように組換えタンパク質を調製した。簡潔には、大腸菌に全てのタンパク質をＧＳＴ融合タンパク質として発現させたが、ＧＳＨ−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＧＳＴ−Ｎのみを精製した。ＧＳＴ−Ｓ、ＧＳＴ−ＭおよびＧＳＴ−Ｅタンパク質については、タンパク質を洗浄し再懸濁し、最終的に１０％ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルで電気泳動することによってペレット中のそれぞれの不溶性タンパク質の分離を行った。それぞれのＧＳＴ融合タンパク質を含有するゲルストリップを次に切り出し、Ｍｉｎｉ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（商標）セル（ＢｉｏＲａｄ）を用いた溶出に供した。抗ＧＳＴモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、サンタクルーズ 、カリフォルニア州）を用いたウエスタンブロットで結果として生じた融合タンパク質を検出し、クマシーブルーで染色したＰＡＧＥゲルでＢＳＡ標準と比較することによってそれらの濃度を推定した（Ｓｈｅｎら、投稿中）。
【０１５９】
[00177]マウスおよびウサギの抗血清：他（非特許文献２１）に説明されているようにそれぞれの組換えタンパク質を用いてマウスまたはウサギに接種することによって特異的抗血清を作製した。フロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）に乳化させたそれぞれの組換えタンパク質５０μｌをＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種することによって、スパイク、ヌクレオキャプシド、または膜タンパク質に特異的なマウス抗血清を産生させた。一方、フロイントの完全アジュバントにこれも乳化させた精製タンパク質１ｍｇをニュージ−ランド白ウサギに皮下接種することによって、エンベロープ組換えタンパク質に特異的なウサギ抗血清を産生させた。それぞれの精製タンパク質同量であるがフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）に乳化させたものを動物に２週間間隔で８〜１６回追加免疫した。免疫された動物の血清を最終免疫の１０日後に回収し、細胞タンパク質に対する非特異的結合を低減するために哺乳動物細胞培養物に吸着させた。
【０１６０】
[00178]ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）とトランスブロット：３．５％スタッキングゲルを有する１１％分離用ゲルでＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス溶解物の分離を行った。具体的には、３．２％ＳＤＳ、０．５Ｍトリス（ｐＨ６．８）、３２％グリセロール、３．２％２−メルカプトエタノールおよび０．０５％ブロモフェノールブルートラッキング色素からなる変性緩衝液８００μｌに溶かしたＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス溶解物７０μｇを湯浴中で５分間沸騰させた。分子量の決定のために、同じＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの別々の穴（幅８ｍｍ）に、処理された溶解物試料およびレインボー分子マーカーそれぞれ５０μｌをアプライした。他のイムノブロット分析では、処理後の試料（８００μｌ）を分取用の穴（幅１３０ｍｍ）に適用し、トラッキング色素が底部に達するまで一定の電流で電気泳動した。タンク機器（Ｈｏｅｆｆｅｒ、サンフランシスコ、カリフォルニア州）の中で、分離後のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ、ゲルバースハウゼン、ドイツ）に電気的に移動させた。移動後に、Ａｕｔｏｓｌｏｔ（商標）機（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、シンガポール）を用いて膜にヤギ抗ヒトＩｇＧ（試料添加対照として膜１枚あたり１．６μｇ）およびＧＳＴ−Ｎ組換えタンパク質（膜１枚あたり４．３ｎｇ）をさらに沈着させた。次に、５％脱脂粉乳を含有するブロッティング溶液中で膜を４５分間インキュベートしてから、０．５％トウィーン２０を含有するＰＢＳ中で３０分間すすいだ。次に、室温（ＲＴ）で２０分間放置して膜を乾燥させてから、３ｍｍのストリップに切り、使用まで２〜８℃で保存した。
【０１６１】
[00179]ウエスタンイムノブロットアッセイと分析：全てのインキュベーションステップについてロッキングプラットフォームを用いてウエスタンイムノブロットアッセイを室温で実施した。検査時に、膜ストリップをＡｕｔｏＢｌｏｔインキュベーショントレー（Ｇｅｎｅｌａｂｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、シンガポール）に置き、ストリップ１枚あたりＴｒｉｓ系洗浄緩衝液１ｍｌに５分間浸した。緩衝液を吸引除去し、次に５％乾燥粉乳を含有するブロッキング緩衝液１ｍｌに入れたそれぞれの血清１０μｌと共に膜ストリップを１時間インキュベートした。膜ストリップをストリップ１枚あたり１ｍｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、血清の吸引後に１回の洗浄毎に５分間浸漬させた。アルカリホスファターゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ 、メリーランド州）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧの結合体をブロッキング緩衝液で１：１０００に希釈したもの１ｍｌと共に膜ストリップを１時間さらにインキュベートした。インキュベート後に、吸引して結合体を再び除き、膜ストリップをまた３回洗浄した。この後に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の基質溶液と共に膜ストリップを１５分間インキュベートした。その結果生じたタンパク質のバンドをストリップ上のバンドの強度から主観的に分析した。
【０１６２】
[00180]マウスまたはウサギ抗血清を用いたアッセイには、力価の差から各抗血清に特異的な希釈を使用した。具体的には、マウス抗Ｓ抗血清およびウサギ抗Ｅ抗血清には１：１０００希釈を使用し、一方、マウス抗Ｍ抗血清には１：５００希釈を、マウス抗Ｎ抗血清には１：１０００００を使用した。しかし、それぞれの抗血清の検出に採用された、アルカリホスファターゼで標識した抗マウスまたは抗ウサギ抗体のどちらかの結合体を、１：５０００の同じ希釈で使用した。
【０１６３】
[00181]結果
[00182]ウエスタンイムノブロット分析によるＳＡＲＳ  ＣｏＶの免疫反応性タンパク質の同定：標準タンパク質の電気泳動移動度に対する分子量の対数のプロットを外挿することによって、免疫反応性タンパク質のみかけの分子量を推定した（図１３）。強いＳＡＲＳ陽性対照試料（Ｐ８）でアッセイした場合にイムノブロット上にバンドとしてみられる免疫反応性タンパク質には、目立たないもの、拡散したもの、および密集したものがあり、それらはおよそ１５０ｋＤａ、９７ｋＤａ（三重）、４５ｋＤａ（二重）、２８ｋＤａ（三重）、および２４ｋＤａ（拡散）であった（図１３）。特定の組換えタンパク質に対して作製されたマウスまたはウサギ抗血清でイムノブロットを検査した場合、１５０ｋＤａ、４５ｋＤａおよび２４ｋＤａタンパク質は、それぞれスパイク（Ｓ）、ヌクレオキャプシド（Ｎ）およびマトリックス（Ｍ）タンパク質と関連することが分かった（図１４）。さらに、ウサギ抗Ｅ抗血清によると強力にＳＡＲＳ陽性試料と反応しないが、エンベロープ（Ｅ）タンパク質に関連するタンパク質もおよそ１０ｋＤａに位置した（図１４）。
【０１６４】
[00183]様々なタンパク質マーカーおよびウエスタンイムノブロットの性能：ＳＡＲＳ患者または健康もしくは疾患対照からの標本の異なるセットでイムノブロットを検査した場合、ＳＡＲＳ患者からの試料または対照からの試料に特異的な特有のバンド形成パターンが観察された（図１５）。バンドパターンの分析は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＮタンパク質に関連するおよそ４５ｋＤａの２つのタンパク質バンド（ＮｈおよびＮ１）が、ＳＡＲＳ患者の試料の全てと反応することが最も高頻度で起こったことを示した（図１５、表９）。しかし、２つのタンパク質のバンド強度はＳＡＲＳ患者からの試料を伴うときずっと高かったが、ＮｈおよびＮ１の両方がかなり非特異的で、健康または疾患対照からの試料とも反応した（図１５）。例えば、Ｎｈタンパク質は、健康、呼吸器疾患および熱対照の試料のそれぞれ６４％、６８％および５２％と交差反応した（表１０）。実際に、これらのＮ関連タンパク質は、以前にＥＬＩＳＡで偽陽性と認められた１８試料中１５（８３％）と反応した（表１０）。対照的に、Ｓ、ＭおよびＧＳＴ−Ｎ組換えタンパク質はＳＡＲＳ患者の４０試料のうち７８％、７５％および１００％と反応したが、ＥＬＩＳＡによって偽陽性と同定されたものを含めてどの対照とも全く交差反応性を示さなかった（表１０）。他の高度に免疫反応性のタンパク質には９７ｋＤａおよび２８ｋＤａのタンパク質があり、それぞれＳＡＲＳ患者の試料の７８％および７５％と反応するが、対照の少数とのみ交差反応率２％から６％で反応する（表１０）。さらに、およそ６０ｋＤａであるが、分子量の推定のための強いＳＡＲＳ陽性対照を用いたとき現れなかったタンパク質のバンドをパネリング研究で発見した。この６０ｋＤａのタンパク質は、ＳＡＲＳ患者または健康もしくは疾患対照の試料かどうかに関係なく、検査された試料全てのうち一部（１１〜３４％）とかなり無差別に反応した（表１０）。一方、ウサギ抗血清で同定されたＥタンパク質は、本研究で検査されたヒト血清試料のいずれとも免疫反応性を示さなかった（表１０）。
【０１６５】
【表９】
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【０１６６】
【表１０】
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【０１６７】
[00184]免疫反応性タンパク質のバンドパターンのさらなる分析から、ＳＡＲＳ患者と対照との試料を区別する有用な基準が明らかとなった。検査結果をＳＡＲＳ陽性と解釈する必要条件としてＮタンパク質（ＮｈおよびＮ１の両方）およびＳタンパク質の同時検出を定めるとき、４つの全ての対照群に対してイムノブロットは感度７８％および特異性１００％を有することが分かった（表９）。同様に、結果の解釈にＮタンパク質（これもＮｈおよびＮ１の両方）をそれぞれ９７ｋＤａタンパク質、２８ｋＤａタンパク質、Ｍタンパク質またはＧＳＴ−Ｎタンパク質と共に考慮したとき、イムノブロットアッセイは特異性１００％を維持する一方で、それぞれ感度７８％、７５％、７５％および１００％を有することが分かった（表９）。しかし、６０ｋＤａタンパク質およびＥタンパク質は、感度不足が原因でどの組み合わせでも有用性が低いことが分かった（表９）。Ｎタンパク質と、Ｓタンパク質、９７ｋＤａタンパク質、２８ｋＤａタンパク質、およびＭタンパク質を含めた特異的タンパク質の少なくとも１つとを利用した組み合わせ解釈基準は、キットの感度９５％および特異性１００％をもたらした（表１１）。さらに、上記解釈基準にＧＳＴ−Ｎ組換えタンパク質をさらに追加すると、特異性は変わらずに感度が１００％に向上した（表１１）。
【０１６８】
【表１１】
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【０１６９】
[00185]当業者に了解されうるように、本明細書に記載した模範的な実施形態に対する多数の変更が可能である。特許請求の範囲に定義されるように、むしろ本発明はその範囲にそのような変更の全てを包含することを意図する。
【０１７０】
[0019]図では例示だけの目的で本発明の実施形態を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】[0020]構造タンパク質Ｓ、Ｍ、Ｎ、およびＥならびにユニークなタンパク質（ＵＸ）に対応するＯＲＦの構造構成および発現の概略図であり、「Ｘ」はそれぞれのＯＲＦによってコードされるアミノ酸数を表し、対応する注釈付きＯＲＦ１〜１４を示す。
【図２】[0021]患者血清中の様々なＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスタンパク質に対する抗体の存在を実証するウエスタンブロット分析を示す図である。
【図３】[0022]ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で染色した細菌に発現させたＧＳＴ−Ｕ２７４、ＧＳＴ−Ｕ１２２、ＧＳＴ−Ｎ、およびＧＳＴタンパク質を描示す図である。
【図４】[0023]抗ＧＳＴ抗体、対照血清中の抗体、または６つの回復期血清中の抗体を用いたウエスタンブロット分析による細菌に発現させたウイルスタンパク質の検出を例示する図である。
【図５】[0024]一次抗体として感染初期および後期の患者の血清と、二次抗体として抗ヒトＩｇＧとを用いたウエスタンブロットによるＮおよびＵ２７４の検出を示す図である。
【図６】[0025]図５に示す試料のいくつかを用い、二次抗体として抗ヒトＩｇＧ、抗ヒトＩｇＡ、または抗ヒトＩｇＭ抗体を用いたウエスタンブロットを示す図である。
【図７】[0026]Ｓタンパク質を安定発現するＣＨＯ細胞を利用した免疫蛍光法による、患者血清中の抗Ｓ抗体の検出を示す図である。
【図８】[0027]セパレーター（透明のタブ）が「はずれた」（アッセイ後の）位置にあり、感染患者の試料のアッセイ後（左）、または健康対照の試料のアッセイ後（右）のどちらかの、組み立て済みの迅速イムノクロマトグラフィー検査装置の例の写真を示す図であり、上から下にそれぞれ対照、Ｇｓｔ−Ｎ、およびＧｓｔ−Ｕ２７４のラインを示す。
【図９】[0028]ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＳＡＲＳ  ＣｏＶに対するＩｇＧ抗体を検査したＳＡＲＳ患者および健康対照の両方の血清で得られたＯＤ値の点チャートを示す図である。
【図１０】[0029]７つのＳＡＲＳ患者試料の希釈系列を用いたＥＬＩＳＡアッセイで得られたタイトレーション曲線を示す線グラフである。
【図１１】[0030]７つのＳＡＲＳ患者試料で反応性終点が得られた希釈を比べた場合のＥＬＩＳＡと迅速イムノクロマトグラフィー検査との相関を示す図である。
【図１２】[0031]試料の免疫蛍光価に関してＥＬＩＳＡアッセイおよび迅速イムノクロマトグラフィーアッセイの検出百分率の分布を示す図である。
【図１３】[0032]ＳＡＲＳ−ＣｏＶの免疫反応性タンパク質のウエスタンイムノブロットパターンを示す図である。
【図１４】[0033]特異的組換えタンパク質に対する抗体（１：ＳＡＲＳ陽性対照；２：マウス抗スパイクタンパク質抗血清；３：マウス抗ヌクレオキャプシドタンパク質抗血清；４：マウス抗マトリックスタンパク質抗血清；５：ウサギ抗エンベロープタンパク質抗血清）で同定されたＳＡＲＳ−ＣｏＶの免疫反応性タンパク質の位置を実証するウエスタンブロットを示す図である。
【図１５】[0034]血清試料（Ａ：ＳＡＲＳ患者；Ｂ：健康対照；Ｃ：非ＳＡＲＳ熱患者対照；Ｄ：非ＳＡＲＳ呼吸器疾患対照；Ｄ：ＥＬＩＳＡで同定された偽陽性）を用いたＳＡＲＳウエスタンイムノブロットの代表的な免疫反応性パターンを示す図である。
【図３】
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【図８】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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