(57)【要約】がん関連遺伝子配列、および誘導アミノ酸配列が、これらがん関連遺伝子の発現についてのそれらの転調に基づく潜在能力のある抗腫瘍薬剤を検定するプロセスと共に開示される。更にここで開示されるのは、開示されたポリペプチドと反応する抗体、および例えば治療薬を送達する目的でｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞を標的とするように抗体を使用するなど、がん疾病を治療する抗体を使用する方法である。更に遺伝子配列を用いる診断法も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん関連遺伝子の活性を転調する薬剤を同定する一つのプロセスであって、
（ａ）一つの試験化合物を、配列識別番号３の配列を持つポリヌクレオチドに対応する遺伝子を発現する一つの細胞に接触させ、
（ｂ）前記接触が起こらない場合と比較した前記遺伝子の発現の差を確認し、ここで前記発現の変化は前記遺伝子の転調を示し、
これにより、がん関連遺伝子の活性を転調する薬剤として前記試験化合物を同定する、
ことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１記載のプロセスであって、ここで前記遺伝子が配列識別番号３の配列を持つことを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項１または２記載のプロセスであって、ここで前記細胞ががん細胞であり、また発現における差が発現の減少であることを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項３記載のプロセスであって、ここで前記がん細胞が乳がん細胞であることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
抗新生物薬を同定する一つのプロセスであって、新生物活性を提示する細胞を、請求項１記載のプロセスを用いてがん関連遺伝子モジュレーターとして最初に同定された化合物に接触させ、前記接触が起こらない場合と比較した前記接触後の前記新生物活性の減少を検出することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項６】
請求項５記載のプロセスであって、ここで前記新生物活性が加速された細胞複製であることを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項５記載のプロセスであって、ここで前記新生物活性の減少が細胞死から生じることを特徴とするプロセス。
【請求項８】
抗新生物薬を同定する一つのプロセスであって、請求項１記載のプロセスに基づき、最初に同定された薬剤有効量をがん疾患を提示する動物に投与し、また前記がん疾患の減少を検出することを特徴とするプロセス。
【請求項９】
細胞のがん状態を確認する一つのプロセスであって、配列識別番号３の配列を持つポリヌクレオチドに対応する遺伝子の前記細胞で発現水準の増加を確認することを含み、ここで既知の非がん性細胞と比較した発現の上昇ががん状態または潜在的がん状態を示すことを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項９記載のプロセスであって、ここで前記発現の上昇が複製数の増加によるものであることを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
配列識別番号４のアミノ酸配列に相同のアミノ酸配列を含む一つの単離ポリペプチドであって、ここで前記アミノ酸配列と配列識別番号４との間のいずれかの差は単に保存アミノ酸置換によるものであり、またここで前記単離ポリペプチドは少なくとも１個の免疫原断片を含むことを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項１２】
配列識別番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする一つの単離ポリペプチド。
【請求項１３】
配列識別番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと反応することを特徴とする一つの抗体。
【請求項１４】
請求項１３記載の抗体であって、ここで前記抗体が組換え抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項１５】
請求項１３記載の抗体であって、ここで前記抗体が合成抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項１３記載の抗体であって、ここで前記抗体がヒト化抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項１７】
請求項１３記載の抗体および１個の細胞傷害薬を含むことを特徴とする一つのイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
請求項１７記載のイムノコンジュゲートであって、ここで前記細胞傷害薬が、カリキアマイシン、メイタンシノイド、アドゼレシン、細胞傷害性タンパク質、タキソール、タキソテール、タキソイドおよびＤＣ１より成るグループから選択される部材であることを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１８記載のイムノコンジュゲートであって、ここで前記カリキアマイシンが、カリキアマイシンγ１ｌ，Ｎ−アセチル・ガンマ・カリキアマシイン・ジメチル・ヒドラジドまたはカリキアマイシンθ１ｌであることを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１８記載のイムノコンジュゲートであって、ここで前記メイタンシノイドが、ＤＭ１であることを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
請求項１８記載のイムノコンジュゲートであって、ここで前記細胞傷害性タンパク質が、リシン、アブリン、ゲロニン、シュードモナス属外毒素またはジフテリア毒素であることを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
請求項１８記載のイムノコンジュゲートであって、ここで前記タキソールが、パクリタキセルであることを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項２３】
請求項１８記載のイムノコンジュゲートであって、ここで前記タキソテールが、ドセタキセルであることを特徴とするイムノコンジュゲート。
【請求項２４】
がんを処置する一つのプロセスであって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのがん細胞を、配列識別番号３の遺伝子配列によりコードされる発現産物に対して活性を持つ薬剤に接触させることを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２５】
請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記薬剤が、請求項１３乃至１６記載の抗体であることを特徴とするプロセス。
【請求項２６】
請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記薬剤が、請求項１７記載のイムノコンジュゲートであることを特徴とするプロセス。
【請求項２７】
請求項１１記載のポリペプチドを含むことを特徴とする一つの免疫原組成物。
【請求項２８】
請求項１２記載のポリペプチドを含むことを特徴とする一つの免疫原組成物。
【請求項２９】
請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記がんが、乳がんであることを特徴とするプロセス。
【請求項３０】
がんに悩む動物のがんを処置するための一つのプロセスであって、請求項１１記載のポリペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を誘出するのに十分な請求項２７記載の免疫原組成物の一定量を、前記動物に投与することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項３１】
がんに悩む動物のがんを処置するための一つのプロセスであって、請求項１２記載のポリペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を誘出するのに十分な請求項２８記載の免疫原組成物の一定量を、前記動物に投与することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項３２】
がん性疾患に悩む動物のがん性疾患を処置するための一つのプロセスであって、請求項８記載のプロセスを用いて抗新生物活性を持つものとして最初に同定された薬剤治療有効量を、前記動物に投与することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項３３】
がんに対して動物を予防する一つのプロセスであって、請求項８記載のプロセスを用いて抗新生物活性を持つものとして最初に同定された薬剤の治療有効量を、がん進行の恐れがある動物に投与することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項３４】
請求項３０，３１，３２または３３に記載のプロセスであって、ここで前記動物がヒトであることを特徴とするプロセス。
【請求項３５】
請求項３０，３１，３２または３３に記載のプロセスであって、ここで前記がんが乳がんであることを特徴とするプロセス。
【請求項３６】
一つの化合物の遺伝子転調活性に関連した試験データを作成する一つの方法であって、
（ａ）ある遺伝子の発現が非がん細胞内よりもがん細胞内で増加し、ポリヌクレオチドが発現されているという条件下で、その遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含有する細胞に、一つの化合物を接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としてポリヌクレオチドの発現における変化を確認し、また、
（ｃ）さもなければ、非がん細胞の場合よりもがん細胞で発現が増加する筈である確認された遺伝子の発現の減少が、遺伝子転調活性を示すという、発現の減少に基づく前記化合物の遺伝子転調活性に関連する試験データを作成する、
以上を含む試験データを作成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年１２月２０日出願された合衆国暫定特許出願連続番号第６０／４３４，９６０号の優先権を主張し、その開示はその全体を引用して、本出願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、シトクロムＰ４５０ファミリーに属する新しい乳房特異的タンパク質ＣＹＰ４Ｚ１，乳がんのスクリーニング，診断，および処置などへの潜在的使用、ならびに小さな有機化合物および他の分子を含む、潜在的抗がん剤のスクリーニングのためのこのようなタンパク質の使用法、および治療薬の開発に関する。
【背景技術】
【０００３】
がん関連遺伝子は、遺伝子が非がん細胞でなく、がん細胞で発現された場合、または正常あるいは非がん細胞とは対照的にがんにおいて過発現、すなわち高水準で発現されるような場合に、遺伝子ががん細胞と正常細胞との間の遺伝的差異を示すという意味で価値がある。とりわけ、がん細胞ではなく正常細胞でのこのような遺伝子の発現、とりわけ組織の同じ型のものの発現は、がん経過での重要な機能を示すことができる。例えば、新規な薬剤に関するスクリーニング検定は、特異的な化合物での処置に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムに基づく標準細胞の応答に基づくものである。このような遺伝子は、更にがんの診断およびがん細胞の同定に有用である。遺伝子活性は、そのような遺伝子でコード化されるＲＮＡｓまたはポリペプチドなどのような遺伝子産物の産生の割合を測定することにより、容易に測定することができる。遺伝子が酵素タンパク質をコード化する場合には、発現の増加または突然変異による活性の変化を含む酵素活性の変化は、新生物活性の一つの徴候である。更に、前記ポリペプチドが抗体、細胞傷害性薬剤で錯体化された抗体、アポトーシス薬物などの特異的薬剤を通して検出または転調に利用できる細胞表面抗原を表している場合には、そのような抗原、またはその発現の増加の存在または不在は、がん疾患の診断または処置に有用である。本発明に従って、がん関連遺伝子は同定され、その推定アミノ酸配列は解決した。このような遺伝子は、乳がん細胞で過発現され、がんの診断、抗がん剤のスクリーニング、およびこのような薬剤を用いるがんの処置で有用であり、とりわけ本遺伝子が、タンパク質と、同じく小有機化合物などのような薬剤と結合する両抗体を含む抗腫瘍剤に速やかな標的を提供する一つの酵素をコード化し、酵素の活性ががんの特性と相関し、かくして薬剤が酵素活性を阻害し、それによりがん疾患を改善し、または予防するのに役立つように酵素の活性を転調するという点で遺伝子は有用である。
【０００４】
このような利点が本発明によりもたらされ、本発明はシトクロムＰ４５０ファミリーに属する新しい乳房特異的タンパク質であるＣＹＰ４Ｚ１を開示し、また乳がんのスクリーニング診断、および処置に対するその潜在的使用法を開示する。
【０００５】
［発明の概要］
本発明に従って、乳がんに特に関連するがん特異的遺伝子、またその反対にがんイニシェーションおよび転移増殖段階ならびに前記遺伝子によるコード化されたポリペプチドを含むその誘導アミノ酸配列（および前記ポリペプチドをコード化するｃＤＮＡ）、ここでポリペプチドがシトクロムＰ４５０オキシダーゼ活性を持つ、これらの段階および配列に伴うがん特異的遺伝子が提供される。
【０００６】
一つの見地において、本発明は、がん関連遺伝子の活性を転調する薬剤を同定する一つのプロセスに関し、前記プロセスは、そのような遺伝子を含む細胞に前記遺伝子の発現を促進する条件下で一つの化合物を接触させ、前記化合物が存在しない場合と比較した前記遺伝子の発現の差を確認し、これによりがん関連遺伝子の活性を転調する薬剤を同定することを含むプロセスに関する。このようなプロセスの各種実施例において、細胞はがん細胞であり、発現の差は発現の減少である。
【０００７】
もう一つの実施例において、本発明は、抗新生物薬剤を同定するプロセスに関し、これは新生物活性を示す細胞を、ここで開示された検定を使用するがん関連遺伝子モジュレーターとして初めて同定された化合物に接触させ、前記接触が行われていない場合と比較した前記接触後の前記新生物活性の減少を検出することを含むプロセスに関する。
【０００８】
本発明は、更に抗新生物薬剤を同定するプロセスに関し、これはがん性疾患を提示する動物に、本発明に基づき開示された一つの検定プロセスに従って、初めて同定された薬剤の有効量を投与し、前記がん疾患の減少を検出することを含むプロセスに関する。
【０００９】
本発明は、更に細胞のがん性状態を確認するプロセスに関し、これは既知の非がん細胞と比較した発現の上昇ががん性状態または潜在的がん性状態を示すがん特異的遺伝子の前記細胞における発現水準の増加を読み取ることを含む。このような発現の上昇は、複製数の増加によるものである。
【００１０】
本発明は、更にここで開示されたポリヌクレオチド転写産物の一つでコードされた単離ポリペプチドに関し、これは配列識別番号４のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明は、更にここで開示されたポリペプチドと反応する抗体に関し、望ましくはポリペプチドは、配列識別番号４のアミノ酸配列を含む。このような抗体は、本源的にはポリクローナル、モノクローナル、組換えまたは合成抗体であってもよい。
【００１２】
このような一実施例では、前記抗体は共有結合または非共有結合の形で細胞傷害薬剤、例えばアポトーシス薬剤と結合する。かくして本発明は、本発明の抗体および細胞傷害薬剤を含むイムノコンジュゲートに関する。
【００１３】
本発明は、更にがんを処置するプロセスに関し、これは、ここで開示されるがん特異的遺伝子配列によりコードされる発現産物に対する活性を持つ薬剤にがん細胞を接触させることを含む。
【００１４】
本発明は、更にここで開示されるポリペプチドを含む免疫原組成物、ならびにこれらのポリペプチドに特異的な抗体を用いて形成された組成物を包含する。
【００１５】
本発明は、更にこのような組成物の使用法に指向する。このような使用法は、がんに悩む動物におけるがんを処置する使用法を含み、これはここで開示された１個またはそれ以上のポリペプチドの免疫原組成物の量を前記動物に投与することを含み、ここでこの量は、本発明のポリペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を引き出すのに十分な量である。
【００１６】
［定義］
「ＣＹＰ４Ｚ１」は、女性の乳房組織で発現され、乳がんで上向き調節、すなわち乳がん細胞に高水準で発現される新しい乳房特異的転写産物である。これはシトクロムＰ４５０オキシダーゼファミリーに属するタンパク質をコードし、従い酵素活性を持つものと予言されている。これが女性乳房組織で高度な特異的発現を行うために、それは細胞基準抗がん免疫療法にとって優れた標的候補となる。
【００１７】
ここで使用されるように、ポリペプチドとの関連で使用される場合の「部分」、「分節」および「断片」という用語は、その配列が、より大きな配列のサブセットを形成するアミノ酸残基などの残基の連続配列を意味する。例えば、あるポリペプチドが一般のエンドペプチターゼ、例えばトリプシンまたはキモトリプシンなどのいずれかでの処理を受けたものとすると、このような処理から生ずるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、分節または断片を表すものとなる。ポリヌクレオチドとの関連で使用された場合には、このような用語は、一般にエンドヌクレアーゼのいずれかで前記ポリヌクレオチドの処理により産生された産物を意味する。
【００１８】
ここで使用されるように、「単離される」という用語は、物質が初めの環境（例えば、自然発生の場合であるなら、自然環境）から取り出されることを意味する。それは組み換えおよびその後の精製で産生することもできる。例えば生体動物内にある自然発生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然系内の共存物質の一部またはすべてから分離される同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチド、例えば組換えで調製されたものは、ベクターの部分であることができ、およびまたはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であることができ、しかもなおそのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないということで単離されている。本発明の一つの実施例では、このような単離され、または精製されたポリペプチドは、本発明を実施するための抗体を生成するために有用であり、また前記抗体が細胞傷害性または細胞溶解性薬剤、例えばアポトーシス薬剤に付着される場合に有用である。
【００１９】
配列に関連する際に「パーセント同一性」または「パーセント同一である」という用語は、記載されまたは特許請求された配列（「基準配列」）と比較できるように、ある配列が整列（「比較配列」）された後に、前記配列が記載または特許請求された配列（前記基準配列）と比較されることを意味する。そこでパーセント同一性は、下記の式で定義される。
パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
ここでＣは、前記基準配列と比較配列の間の列の全長にわたって、これら基準配列と比較配列の間に存在する差の数であり、ここで
（ｉ）比較配列内の対応する整列された塩基またはアミノ酸を持たない基準配列内の各塩基またはアミノ酸、
（ii）基準配列内に存在する各ギャップ、および
(iii)基準配列内に存在して、比較配列内にある整列塩基またはアミノ酸とは異なる整列された塩基またはアミノ酸、
とによって一つの差が構成される。またＲは、比較配列との整列の全長にわたって基準配列内に存在する塩基またはアミノ酸の数であり、基準配列内に生成されたいずれかのギャップも塩基またはアミノ酸の数として計数される。
【００２０】
一つの整列が、比較配列と基準配列との間に存在し、かつこの基準配列に対して前記計数によるパーセント同一性がある特定の最小パーセント同一性にほぼ等しいか、またはそれより大である場合には、前記比較配列は、基準配列に対して特定の最小パーセント同一性を持つことになる。これは、整列が、前記計数されたパーセント同一性が前記特定の最小パーセント同一性よりも少ない所に存在する場合であっても、結果に変わりはない。
【００２１】
従来の技術で知られるように、２個のポリペプチドの間の「類似性」は、１個のポリペプチドのアミノ酸配列とその保存アミノ酸置換体とを、第２のポリペプチドの配列と比較することで判定される。
【００２２】
本発明に従って、「ＤＮＡ分節」または「ＤＮＡ配列」という用語は、少なくとも一度ほぼ純粋な形態で単離されたＤＮＡから誘導されたＤＮＡポリマーを言及するものであり、ここで純粋という意味は、内因的な汚染物質を含まず、またその量と濃度が、前記分節およびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収を通常の生化学的方法、例えばクローニングベクターを使用することにより実行可能であり、ほぼ純粋な形態であることを言う。このような分節は、通常真核細胞遺伝子内に典型的に存在する内部非翻訳配列、すなわちイントロンにより遮断されないオープンリーディングフレームの形で提供される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから下流に存在し、同じものがコード領域の操作または発現に干渉しない所に存在する。
【００２３】
「コード領域」という用語は、自然的なゲノム環境において、自然にまたは正常にコードする遺伝子の部分であり、これは遺伝子の自然発現産物に対してｉｎ  ｖｉｖｏでコードする領域である。このコード領域は正常な、変異された、または改変された遺伝子から、更にまたＤＮＡ配列あるいは遺伝子から、ＤＮＡ合成に通常の知識を有する者により周知の方法ですべて研究室内で合成することができる。
【００２４】
本発明に従って、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを引用する。一般に本発明で提供されるタンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーとから、また一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、かくして微生物、真核細胞またはウイルスオペロンから誘導される調節要素を含む組換え転写単位内で発現することが可能な合成遺伝子が提供される。
【００２５】
「発現産物」という用語は、遺伝コード縮重の結果生じる等量をコードし、かくして同じアミノ酸をコードする遺伝子およびいずれかの核酸配列の自然翻訳産物であるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【００２６】
コード配列に関連した場合の「活性断片」という用語は、その発現産物が完全なコード領域の発現産物と同じ生物的機能または活性を基本的に保持する完全なコード領域以下のものを含む部分を意味する。
【００２７】
「プライマー」という用語は、１個のＤＮＡ鎖と対になってＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボヌクレオチド鎖の合成を開始する遊離３′−ＯＨ末端を提供する短い核酸配列を意味する。
【００２８】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼを結合して転写を開始することに係るＤＮＡの領域を意味する。
【００２９】
「エンハンサー」という用語は、それが存在し、活性である場合には、発現される異なるＤＮＡ配列の発現の増加に影響を与え、これによって前記異なるＤＮＡ配列から形成される発現産物量を増加させるＤＮＡの領域を意味する。
【００３０】
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、終止コドンなしでアミノ酸をコードする一連のトリプレットであって、タンパク質へと（潜在的に）翻訳可能な一つの配列を意味する。
【００３１】
ここで使用されるように、「ＤＮＡ配列」は一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方を含む。かくして特に前後関係が示さない限り、特定の配列はそのような特定配列領域の一本鎖ＤＮＡと、その補体を伴う配列の二重型（デュプレックス）（二対鎖ＤＮＡ）と、そのような配列の補体とを引用する。
【００３２】
ここで使用されるように、「対応する遺伝子」とは、ここで開示されるヌクレオチド配列（すなわち配列識別番号１，２，３および４）の一つでコードされるＲＮＡに対して、少なくとも９０％同一、望ましくは少なくとも９５％同一、もっとも望ましくは９８％同一、およびとりわけすべて同一であるＲＮＡをコードする遺伝子を言及する。このような遺伝子は、ここで開示された配列、望ましくは配列識別番号１，２，３および４のいずれかと同じポリペプチド配列をコードするが、そのようなアミノ酸配列で差を含むこともあり、そのような差は、同一の全三次元構造、従って同一の抗原性が維持される保存アミノ酸置換基に限定される。かくしてアミノ酸配列は、本発明の範囲内にあり、ここでこれらの配列は、配列識別番号５および６の配列を含むポリペプチドと反応する同一の抗体と反感する。「対応する遺伝子」はそのスプライシング変異体を含む。
【００３３】
本開示により同定される遺伝子は、この用語がここで使用されるように「がん関連」遺伝子と見做され、正常細胞（即ち、非がん細胞）でこれらの遺伝子の発現と比較したがん細胞における（例えば発現の上昇率、発現の範囲の上昇あるいは複製数の増加などに起因する）高水準で発現された遺伝子を含み、ここで試験細胞または組織の前記がん状況または状態は、本実施例に記載されているような逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの従来の技術で既知の方法による測定される。特定の実施例では、これはその配列が配列識別番号：１，２，３および４の配列と対応する配列に関する。
【００３４】
ここで使用されるように、「保存アミノ酸置換」という用語は、下記の５グループの一つの中での交換として定義される。
Ｉ．脂肪族、非極性または僅かな極性残基
Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ；
II．負電荷残基およびそのアミド類
Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ；
III．正電荷残基
Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ；
IV．大型脂肪族非極性残基
Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｃｙｓ；
Ｖ．芳香族残基
Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ
【００３５】
［発明の詳細な説明］
本発明は、がん、とりわけ乳がんを処置し診断する方法において、またがん関連遺伝子の活性を減少させ、それによりがん状態を処置するのに有効な薬剤のスクリーニング検定を実行するに際し、がん関連遺伝子のヌクレオチド配列、そのような配列によりコードされるポリペプチドおよびそのようなポリペプチドと反応する抗体を利用するプロセスに関する。
【００３６】
本発明に従って、ＣＹＰ４Ｚ１は、女性の乳房組織で発現され、乳がんで上向き調節、すなわち乳がん細胞で高水準で発現される新しい乳房特異的転写産物である。それはシトクロムＰ４５０オキシダーゼのファミリーに属するタンパク質をコードし、従って、酵素活性を持つものとして予言されている。女性乳房組織でのその高い特異的発現により、これは細胞起原抗がん免疫療法の有用な標的となる。このペプチドは配列識別番号３で示される対応ｃＤＮＡを持つ配列識別番号４で示された配列を持つ。
【００３７】
本出願は、一つのポリヌクレオチド（アクセッション番号ＡＩ６６８６０２（配列識別番号１）およびＡＶ７０００８３−配列識別番号２の２個の既知のＥＳＴ配列を含む）および本発明の方法で有用なそのコードｃＤＮＡ転写産物（配列識別番号３）を持つ一つのポリペプチド（ＣＹＰ４Ｚ１−配列識別番号４）を開示する。
【００３８】
ＣＹＰ４Ｚ１ｃＤＮＡ（乳房特異的ｍＲＮＡからの配列識別番号３）は、ＰＣＲによる広く普及する腫瘍細胞のスクリーニング、および形質移入抗原提示細胞を用いる乳がんの免疫療法で有用である。ＣＹＰ４Ｚ１タンパク質（配列識別番号４）は、抗体により広く普及する腫瘍細胞のスクリーニング、およびＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の誘導のためのタンパク質または関連ペプチドを用いる乳がんの免疫療法のための乳房特異的抗原として有用である。このペプチドの発現および活性は、がん状態のインディケーターとして、また抗腫瘍薬のスクリーニングのために、Ｐ４５０オキシダーゼ活性の測定により決定することができる。
【００３９】
女性乳房組織で特異的に発現される遺伝子のＧＸ２０００，スクリーンで、ＥＳＴ  ＡＩ６６８６０２（９５ｋチップ）が同定された。この発見を支持するものとして、ＡＩ６６８６０２と殆ど同じ配列を表すＥＴＳ  ＡＶ７０００８３が、１３３ｋチップを使用した時に女性乳房組織で特異的に発現される。
【００４０】
エレクトロニツク・ノーザン社は、悪性および非悪性乳房組織標本両方で約８０％の発現の証拠を提供し、発現の中央値水準は、正常組織の１６５ＦＵ（相対蛍光単位）からがん組織では２１３ＦＵまで増加した。注目すべき点は、乳がん組織の画分が、その水準を上回るいくつかの因子の発現を提示したことであった。利用可能なすべての正常組織でのバックグラウンド発現は殆ど検出できなかった。
【００４１】
乳房特異的発現の実験による証拠は、１６個の正常組織（ＢＤクロンテック社）およびＣＹＰ４Ｚ１  ｃＤＮＡ特異的プライマーを提示する多重ハウスキーピング遺伝子標準化ｃＤＮＡパネルを用いて定量的逆転写ＰＣＲにより提供された。発現は乳房で最高（２１．６ａ．ｕ．（任意単位））であり、次いで前立腺（１．７ａ．ｕ．）、精巣（１．６ａ．ｕ．）、肺（１．４ａ．ｕ．）および肝臓（１ａ．ｕ．）と続いた。
【００４２】
更なる実験の証拠が、ＣＹＰ４Ｚ１  ｃＤＮＡを提示する放射線プローブをがんプロファイリングアレー（配列）（ＢＤクロンテック社）にハイブリッド形成することにより提供され、１２の異なる器官に由来する対になった正常／腫瘍組織標本からの２００個以上の標本のｃＤＮＡｓを提示していた。際立っていたのは、殆どすべての乳がん組織標本が、乳がんに由来する３個の転移を含む発現を示していた。
【００４３】
データマイニング（カスタムＥＳＴクラスタリング）および５′−ＲＡＣＥと３′−ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端急速増幅）の組合せを用いて、ＡＩ６６８２０／ＡＶ７０００８３配列は全長ｃＤＮＡに拡張され、シトクロムＰ４５０オキシダーゼのＣＹＰの配列から、当該ＣＹＰ分野の別の研究者は、未だ未確認のヒト相同器官が存在しなければならない、との仮説を提出した。我々が同定したＣＹＰは、マウスとラットのＣＹＰに相同であり、従って我々は、それがまさしく予言されたＣＹＰ４Ｚ１であると結論する。
【００４４】
ここで開示された配列は、配列識別番号３のポリヌクレオチド転写産物を組み込み、前記転写産物からの誘導アミノ酸配列（配列識別番号４）は、化学療法薬剤、前記ポリペプチドに特異的な抗体を含むとりわけ抗がん剤の標的として利用できる。この遺伝子の転写産物は、乳がんに作動し、シトクロムＰ４５０オキシダーゼをコードする。
【００４５】
ここで開示されるがん関連ポリヌクレオチド配列は、その発現が一定の細胞のがん状態を指示する遺伝子配列に対応する。このような配列は、配列識別番号３と事実上同一であり、これはジェンバンクＥＳＴデータベースから同定された転写産物を表し、またがん特異的発現を表示するものである。本発明のポリヌクレオチドは、配列識別番号３の配列に対応するものである。
【００４６】
本発明のプロセスで使用された遺伝子産物としてのヌクレオチドおよびポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチド、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいは合成ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むことができる。
【００４７】
ここで開示されたこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片も、本発明のプロセスを実施するのに有用である。例えば、ポリペプチド（配列識別番号４）の断片、誘導体または類似体は、
（ｉ）１個または、それ以上のアミノ酸残基が、保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（望ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされたもの、またはコードされないもの、または
（ii）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、１個の置換基を含むもの、
または、
（iii）成熟ポリペプチドが、も一つの化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合されたもの、または
（ｉｖ）付加されたアミノ酸が、成熟ポリペプチドと融合され、例えばリーダー配列または分泌配列、あるいは成熟ポリペプチド（ヒスチジンヘキサペプチド）またはプロプロテイン配列の精製に使用される配列である場合、
のいずれかであってもよい。このような断片、誘導体および類似体は、ここでの教示から通常の技術の範囲内にあるものと見做される。
【００４８】
もう一つの見地において、本発明は、精製ポリペプチドを含む単純ポリペプチドに関し、配列識別番号４のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。望ましい実施例では、前記単離ポリペプチドは、配列識別番号４の配列の少なくとも９５％、望ましくは少なくとも９８％、またとりわけその配列と同一である配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明は、更に、活性がポリペプチドの生物活性を留保し、またはそのような活性断片が、がん処置、予防または診断のための特異的標的として有用であるポリペプチドの単離された活性断片を含む。かくして本発明は、配列識別番号４のポリペプチドと反応する（すなわちポリペプチドに選択的であるか、または特異的である）抗体の産生に有用であるように、かくしてその表面にそのようなポリペプチド、または断片を提示する細胞を標的とし、それにより前記抗体および前記抗体と関連する治療薬を対象とするように、ここで開示された配列に十分な相同性を持ついずれかのポリペプチド、またはその断片に関する。
【００４９】
本発明のプロセスを実施するのに有用なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、同じように単離形態または精製形態で得ることができる。更に本発明のプロセスを実施するものとして、ここで開示されたポリペプチドは、がん細胞などのような細胞に存在する表面タンパク質であると考えられている。かくして本発明のプロセスで、正確にどのようにそういうがん関連タンパク質が使用されるのかは、使用される治療アプローチに依存して異なる。例えば受容体などの細胞表面タンパク質は、ここで開示されたポリペプチドに対して精製することのできる細胞傷害性抗体のための望ましい標的である。
【００５０】
本発明は、配列識別番号４のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含むここで開示されたポリヌクレオチド転写産物の１個でコードされる単離ポリペプチドに関し、ここで単離ポリペプチド内のアミノ酸配列と配列識別番号４の配列との間のいずれかの差は、単に保存アミノ酸置換によるものであり、またここで前記単離ポリペプチドは、少なくとも１個の免疫原断片を含む。望ましい実施例において、本発明は、配列識別番号４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する。
【００５１】
ここで開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを調製するのに有用な組換え細胞を産生する方法は、分子生物学の分野に習熟した人には周知のものである。例えば、サムブルック他、分子クローニング；実験室マニュアル、第２版、コールド．スプリング．ハーバー、ニューヨーク（１９８９年）；ウー他、遺伝子バイオテクノロジーにおける方法（ＣＲＣプレス，ニューヨーク，ニューヨーク（１９９７年）；および組換え遺伝子発現プロトコル、分子生物学における方法、第６２条（テュアン編、フマーナ・プレス，タトゥワ、ニュージャーシー、（１９９７年）を参照されたい。これらの開示は、ここで引用例として組み込まれている。
【００５２】
一つの見地において、本発明はがん関連遺伝子を調節する薬剤を同定する一つのプロセスに関し、それは
（ａ）配列識別番号３の配列を持つポリヌクレオチドに対応する遺伝子を発現する一つの細胞に一つの試験化合物を接触させ、
（ｂ）前記増殖が起こらない場合と比較した前記遺伝子の発現の差を確認し、ここで前記発現の前記変化は前記遺伝子の転調を示し、
これによりがん関連電子の活性を転調する薬剤として前記試験化合物を同定する。
【００５３】
このようなプロセスの特異的実施例において、細胞はがん細胞であり、また発現における差は発現の減少である。このようなポリヌクレオチドは、更に配列識別番号３の配列を持つものを含む。
【００５４】
もう一つの見地において、本発明は抗新生物薬を同定する一つのプロセスに関し、それは新生物活性を提示する細胞を、ここで開示された検定プロセスを用いてがん関連遺伝子モジュールとして最初に同定された化合物に接触させ、前記抵触がおこらない場合と比較した前記接触後の前記新生物活性の減少を検出することを含むプロセスに関する。このような新生物活性は、加速された細胞複製、およびまたはがん転移を含み、新生物活性の減少は望ましくは細胞死から生じることもある。
【００５５】
本発明は、更に抗新生物薬を同定する一つのプロセスであって、本発明に基づき開示された一つの検定に基づき最初に同定された薬剤の有効量をがん疾患を提示する動物に投与し、また前記がん疾患の減少を検出することを含むプロセスに関する。
【００５６】
本発明の特異的な実施例において、本発明に有用な遺伝子は、配列識別番号３の配列を持つポリヌクレオチドに対応し、またはここで開示されたｃＤＮＡ（配列識別番号３）の配列を含む遺伝子を含む。
【００５７】
本発明に従って、このような検定は、対象となる遺伝子の活性を確認する方法に依存する。このような検定は、増殖培地で維持され、単一濃度でまたはある範囲の濃度で化合物で処理されるがん細胞系、一次がん細胞、またはがん組織標本を用いるモデル細胞系に有利に依存する。特定回数の処置の後、細胞ＲＮＡｓは処理された細胞または組織から都合よく単離され、このＲＮＡｓは選択された遺伝子の発現を表示する。細胞ＲＮＡは次いで分離され、特異的ＲＮＡ転写産物の存在およびまたは量を検出する微分解析を受け、この転写産物は、次いで標準的手順、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、その他などを用いて、検出目的のために増幅される。特異的ＲＮＡ転写産物の存在または不在、あるいは濃度水準は、これらの測定値から確認される。ここで開示されたポリヌクレオチド配列は、このようなＲＮＡ検出、および遺伝子活性と発現の測定のためのプローブとして容易に利用される。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、随伴調節配列を持つ完全に機能的な遺伝子、あるいは対応ポリペプチドをコードする単なるポリヌクレオチドまたはその活性断片もしくはその類似体を含むことができる。
【００５９】
ここで開示されたポリヌクレオチド配列の発現が、がん状態に特異的であるために、有用な遺伝子転調は下向き転調となり、かくしてここでのスクリーニング検定により同定された抗新生物薬への露出の結果として、がん細胞の対応遺伝子は、薬剤に露出されなかった場合の発現と比較すると、薬剤に露出された場合には低水準で発現される（か、または全く発現されない）。例えば、ここで開示された遺伝子配列（配列識別番号３）は、正常乳房細胞よりも乳がん細胞では高水準で発現される遺伝子と対応する。かくして前記化学薬剤が、発現されるべき試験細胞の遺伝子を、基準となる同じ遺伝子よりも低水準に留める場合には、これは下向き転調を示すものとなり、試験される化学薬剤が抗新生物活性を持つことを示すものとなる。
【００６０】
ここで開示された検定を実施するにあたり、相対的抗新生物活性は、一定の化学薬剤ががん細胞に存在する遺伝子の発現を転調する範囲で確認することができる。かくして、本発明の検定で試験される第２の化学薬剤よりも大きな度合で、がん状態と関連する遺伝子（すなわち配列識別番号３のポリヌクレオチド転写産物に対応する遺伝子）の発現を転調する第１の化学薬剤は、従って前記第２の化学薬剤よりもより高い、またはより望ましい、あるいはより有利な抗新生物活性を持つものと見做される。
【００６１】
測定される遺伝子発現は、ＲＮＡ発現をインジケーターとして使用することで一般に検定される。かくして検定されるＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ、すなわちｍＲＮＡ）の水準が高ければ高いだけ、対応する遺伝子の発現水準も高くなる。かくして遺伝子発現は、絶対的または相対的であるかどうかを問わず、このような遺伝子によりコードされるＲＮＡｓの相対的発現により決定される。
【００６２】
ＲＮＡは、各種の方法により標本から単離され、例えば、カオトロピック試薬（例えばトリゾール）を含むフェノール溶液での溶解を変性と、続くイソプロパノール沈殿、エタノール洗浄、および水溶液での再懸濁；または溶解と変性、に続くキアーゲン樹脂などの固形サポートでの単離および水溶液での再構成；または非フェノール系水溶液での溶解と変性、続くＲＮＡからＤＮＡ鋳型複製への酵素転換、などの方法を含む。
【００６３】
通常本発明のプロセスの適用前に、ここで開示された遺伝子および一連の遺伝子群に対する定常状態ＲＮＡ発現水準が獲得されているであろう。ここで確認される潜在的抗新生物薬により影響を受けるのが、このような発現の定常状態水準である。このような発現の定常状態水準は、感作的、特異的および正確であるいずれの方法によっても容易に決定される。このような方法は、必ずしもしれに限定されないが、例えば、プライマー．エクスプレスソフトウエアなどのいくつかの商業的利用可能なソフトウェアパッケージのいずれかを用いて設計された遺伝子特異的プライマープローブ組合せを持つパーキン−エルマー−７７００配列検出システムを用いるリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；例えば化学発色、蛍光、または電気化学反応ベース検出システムを用いるフィルター、ビード、またはマイクロチップベースアレー、固形支持体ベースハイブリッド形成アレーを含む適切な定量化内部制御を用いる固形支持体ベースハイブリッド形成アレー技術、などの方法を含む。
【００６４】
がん状態を示す遺伝子発現は、一定組織のすべての細胞に特有のものである必要はない。かくしてここで開示された方法は、すべての細胞以下の細胞が完全なパターンを提示する組織内でがん状態の存在を検出するのに有用である。かくして例えば、配列識別番号３の配列に対応する選択された遺伝子は、腫瘍または悪性組織の標本から誘導された細胞の６０％以下で存在するＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかのプローブを用いて検出することができる。特に望ましい実施例において、このような遺伝子パターンは、がん組織から抽出される細胞１００％に存在し、対応する正常非がん組織標本の１００％に存在しないことが見出される。
【００６５】
遺伝子の発現は複製数に関し、発現における変化は、複製数を確認することで測定される。このような遺伝子複製数での変化は、特定の遺伝子配列、とりわけ配列識別番号３の配列でコードされるメッセンジャーＲＮＡの発現での変化を読み取ることで決定される。更に本発明に従って、前記遺伝子はがん開始遺伝子またはがん促進遺伝子である。本発明の方法を実施するに際し、がん促進遺伝子は、直接腫瘍形成または増殖を開始することはしない一方、その発現産物の行為を通じて、さもなければ腫瘍形成およびまたは増殖を減少させる効果を持つ遺伝子または遺伝子発現産物に対して、前記遺伝子が作用するがん状態の進行を指揮し、高め、あるいは促進するように作用する遺伝子である。
【００６６】
配列識別番号３の配列に対応する遺伝子の発現は、一定の細胞に対するがん状態を示すものであるけれども、このような遺伝子の単なる存在は、単独では悪性状態を達成するのに十分であるとは言えず、かくしてそのような遺伝子の発現水準も、がん状態への到達を決定するのに重要な因子となるであろう。かくして培養、または原位置で、一定の細胞、細胞群、または組織へのがん状態の存在を診断する別の手段として、事実上類似の配列を含むここで開示された遺伝子の発現水準を決定することも、必須のものとなる。
【００６７】
ここで開示されたポリペプチドの発現水準は、配列識別番号４に同一、または類似の配列識別を持つポリペプチドなどのような遺伝子配列の尺度となる。
【００６８】
前記の開示に従って、本発明は特異的に試験される細胞のがん状態を決定する方法を熟考し、それは配列識別番号３のヌクレオチド配列にほぼ同一の配列、またはその特徴的な断片、あるいはこれらいずれかのものの補体を含む配列識別番号３のヌクレオチド配列を含む遺伝子の前記細胞における発現水準を決定し、その前記発現を非がん性であると周知である細胞の発現と比較し、これにより前記発現の差は、試験される前記細胞ががん性であることを示す、ということを含む方法を熟考する。
【００６９】
本発明に従って、配列識別番号３の配列をその部分として含む遺伝子の発現は、望ましくはそのようなヌクレオチド配列の断片であるプローブの使用により決定されるけれども、前記プローブは遺伝子の異なる部分から形成され得ることは理解されねばならない。遺伝子の発現は、ここで開示された特異的ヌクレオチド配列以外の遺伝子の部分から転写されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にハイブリッド形成するヌクレオチドプローブの使用により決定することができる。
【００７０】
遺伝子ががんプロセスに関連するものとして評価されてきた各種の異なるコンテクストがあることは注目されねばならない。かくしてある遺伝子はがん遺伝子であり、がんプロセスに直接関連するタンパク質をコードし、それにより動物におけるがんの発生を促進する。加えて他の遺伝子は、一定の細胞または細胞型でがん状態を抑制するのに役立ち、それにより動物内に形成されるがん状態に反作用する。他の遺伝子はがんプロセスまたはがん状態に直接または間接的に単に関連し、がん状態に関連する補助的能力で役立つ。このような型の遺伝子すべては、ここで開示される本発明に基づいて決定されるべきものと見做される。かくして、本発明の前記プロセスによる決定される遺伝子はがん遺伝子であり、また前記プロセスで決定される遺伝子は、がん促進遺伝子であり、後者は生体内、また生体外で、がん状態を促進し、またはがん増殖の進行を速め、さもなければがん細胞の増殖を転調する形で直接または間接でがんプロセスに影響を与える遺伝子を含む。更に加えて、前記プロセスで決定される遺伝子は、がん抑制遺伝子であり、この遺伝子は直接または間接的にがん疾患の開始または進行を抑制するように作用する。このような遺伝子は、その発現が、その自身がん疾患の進行を開始、また促進することに直接関連するいずれか他の遺伝子または遺伝子発現の活性を変更する場合に間接的に作用する。例えば、そのポリペプチドが腫瘍抑制遺伝子、またはその発現産物を抑制するように作用する野生型または突然変異型のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子は、それにより腫瘍増殖を促進するように間接的に作用する。
【００７１】
前に記載の通り、配列識別番号３と同じタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、そのような配列のパーセント同一性に拘りなく、前記配列がどのように別途記載されているか限定されているかに拘らず、前記配列のいずれかまたはすべてに依存する本発明の方法のいずれかにより更に特異的に熟考される。かくしていずれかこのような配列は、本発明に従って開示されたいずれかの方法を実施する際の使用に利用できる。このような配列は、更に配列識別番号３の配列内に存在することで定義されたいずれかのオープンリーディングフレームを含む。
【００７２】
本発明に基づき開示された遺伝子が、配列識別番号３の配列を持つポリヌクレオチドに「対応する」ために、前記遺伝子は、指示された配列をポリヌクレオチドによりコードされ、またハイブリッド形成などによるような相補性であるＲＮＡに少なくとも９０％同一であり、望ましくは、少なくとも９５％同一であり、もっとも望ましくは少なくとも９８％同一であり、またとりわけ全く同一である（自然発生スプライス変異体および対立遺伝子を含む処理された、または処理されない）ＲＮＡをコードする。加えて、配列識別番号３の配列に少なくとも９０％同一である、望ましくはそのような配列に少なくとも約９５％同一である、より望ましくはそのような配列に少なくとも９８％同一であり、また、もっとも望ましくはそのような配列を含む遺伝子が、本発明すべてのプロセスにより特異的に熟考される。このような配列のパーセント同一性に拘らず、これらの配列のいずれかと同じタンパク質をコードする配列は、更にそれらの配列がどのように別途記載されまたは限定されているかに拘らず、いずれかまたはすべての前記配列に依存する本発明のいずれかの方法により特異的に熟考される。本発明のポリヌクレオチド配列は、更にここで定義されるように配列識別番号３の配列内に存在するいずれかのオープンリーディングフレームを含む。
【００７３】
ここで開示された配列は、事実上ゲノムであり、従ってヒト遺伝子などのような現実の遺伝子を表し、あるいはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から誘導されたｃＤＮＡ配列であり、かくして対応するゲノム配列から誘導された隣接エキソン配列を表し、またはそれは本発明のプロセスを実施する目的のために本源的に完全に合成されたものであることができる。当初のＲＮＡ転写産物を最終ｍＲＮＡに形質転換する際に起こる処理の故で、ここで開示される配列は完全ゲノム配列以下のものを表すことがある。それはまたノボソームＲＮＡおよび転移ＲＮＡから誘導される配列を表すこともある。従ってｃＤＮＡ配列を含むここで開示された細胞に存在する（またゲノム配列を表す）遺伝子、およびポリヌクレオチド転写産物は、同一のものであり、あるいはｃＤＮＡｓが全ゲノム配列以下のものを含むようなものとなり得る。このような遺伝子およびｃＤＮＡ配列は、（前記いずれかで定義されたように）それでもなお「対応する配列」と考えられるが、その理由は、これらのいずれもが（処理の異なる段階でスプライス変異体またはＲＮＡｓであるいう考え方に関連して）同一であり、あるいは関連するＲＮＡ配列をコードするためである。このようにして、限定されることのない例のみにより、ＲＮＡ転写物をコードし、それが次いで短いｍＲＮＡに処理される遺伝子は、このような両方のＲＮＡをコードし、従って、ｃＤＮＡ（例えばここで開示された配列に）（ワトソン−クリック相補性ルールを使用する）に相補性である、またはｃＤＮＡによりコードされるＲＮＡをコードする。かくしてここで開示された配列は、がん細胞（ここでは乳がん）に含まれる遺伝子に対応し、またそれが遺伝子によるコードされるＲＮＡと同じ配列を表すか、もしくはそのＲＮＡに相補性であるために、遺伝子活性または発現を決定する目的に使用される。このような遺伝子は、更に本発明の方法で使用される細胞に発生する、異なる対立遺伝子およびスプライス変異体を含み、それは組換え細胞が抗新生物薬剤の検定のために使用され、また、そのような細胞がここで開示されたようにポリヌクレオチドを発現するように操作された場合であり、この細胞は非操作がん細胞で検出されるものより高水準でこのようなポリヌクレオチドを発現するように操作されている細胞を含み、あるいはこのような組換え細胞がそのように行動するように操作された後のみにこのようなポリヌクレオチドを発現する場合である。このような操作は、ここで開示された１個またはそれ以上のポリヌクレオチドがこのような細胞のゲノムに挿入されているかまたは一つのベクターに存在する場合などのような遺伝子操作を含む。
【００７４】
このような細胞、とりわけ哺乳類細胞は、このようなポリペプチドをマスキングし、これにより細胞のがんに係る性質を除去することのできる抗体または他の薬剤で試験するために、細胞の表面にポリペプチドを発現するように操作することができる。このような操作は、細胞の遺伝子補体がポリペプチドを発現するように操作される場合のような遺伝子操作、同じく細胞がその形質膜に本発明のポリペプチドを組み込むように、例えばこの結果を達成するための化学薬剤およびまたは他の薬剤を用いる直接挿入などのような物理的に操作される非遺伝子操作の両方を含む。
【００７５】
前記記載に従って、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖の開始、抑制または促進を含むがんプロセスに影響を与えるそれ自身ポリペプチドまたは小化学物体のいずれかである抗がん剤を含む。前記かん転調薬剤は、遺伝子発現を減少させる効果を持つ。
【００７６】
本発明は、かくして更にがんを処置する方法に関し、それは配列識別番号３のヌクレオチド配列を持つ、またはそれに対応するものなどのようなここで開示された遺伝子またはポリヌクレオチド配列によりコードされる発現産物に対する活性を持つ薬剤にがん細胞を接触させることを含む方法である。本発明は、更にがんを処置するプロセスに関し、それは配列識別番号３に対応する遺伝子またはポリヌクレオチド配列によりコードされる発現産物に対する活性を持つ薬剤にがん細胞を接触させることを含むプロセスである。このような一つの実施例において、がん細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで接触される。もう一つこのような実施例において、前記薬剤は前記発現産物に親和性を持つ。望ましい実施例において、このような薬剤はここで開示された抗体であり、本発明のポリペプチドに特異的であり、またはそれに選択的であり、あるいは別途それと反応する抗体である。望ましい実施例では、発現産物は、配列識別番号４のアミノ酸配列を組み込むポリペプチドである。
【００７７】
本発明は、更にここで開示されたポリペプチドおよび抗体の組成物の使用法に指向される。このような使用法は、がんに悩む動物のがんを処置するプロセスであって、これはその量が本発明のポリペプチド、とりわけ配列識別番号４の配列を組み込むポリペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の産生を引き出すために十分な量である場合、ここで開示された１個またはそれ以上のポリペプチドの免疫原組成物の一定量を前記動物に投与することを含むプロセスである。望ましい実施例において、このように処置される動物はヒト患者である。
【００７８】
ここで開示された遺伝子によりコードされるタンパク質は、がん細胞でその発現、または高められた発現により、例えばある細胞傷害性薬剤と結合された抗体などのような親和性構造を利用する「標的療法」としてのきわめて有用な治療標的を表す。このような方法論では、このような細胞表面分子に対する内因性リガンドあるいは結合パートナーについて、何も知る必要はない、という利点がある。むしろ細胞表面分子（人造ペプチド、代理リガンド、その他を含むことのできる）細胞表面分子を特異的に認識でき、ある薬剤と結合され、細胞死または細胞周期での障害物を誘導できる抗体または等価分子は、これらのタンパク質に治療の保証を与える。かくしてこのようなアプローチは、細胞内タンパク質に対する所謂自殺「弾丸」の使用を含む。例えばモノクローナル抗体は、従来の技術で公知の方法、例えばケーラーおよびミルスティンの方法により容易に産生することができる（ネイチャー，２５６巻、４９５ページ（１９７５年）参照）。
【００７９】
分子生物学と組換え技術の到来により、抗体分子を組換え手段により産生し、これにより抗体のポリペプチド構造に検出される特異的アミノ酸配列をコードする遺伝子配列を生成することが今や可能となっている。これらの抗体は、前記抗体のポリペプチド鎖をコードする遺伝子配列をクローニングするか、または前記ポリペプチド鎖の直接合成のいずれかにより産生することができ、合成鎖のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組立てにより、特異的エピトープと抗原決定基に親和性を持つ活性四量体（Ｈ２Ｌ２）構造を形成することができる。これは異なる種と源からの中和抗体の配列特性を持つ抗体の容易な産生を可能にした。
【００８０】
抗体の源、または抗体がどのように組換え構築されるか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、ウシ、ヤギ、ヒツジなどのトランスジェニック動物を使用し、バイオレアクターで実験室規模または商業規模の大型細胞培養を使用して、またプロセスのどの段階でも何らの生体も利用しない直接化学合成による、などに係ることなく、すべての抗体は類似の全３次元構造を持つ。この構造はしばしばＨ２Ｌ２として与えられ、抗体が一般に２個の軽（Ｌ）アミノ酸鎖と２個の重（Ｈ）アミノ酸鎖を含むという事実で引用される。両鎖は構造相補性抗原標的と相互作用のできる領域（部）を持つ。標的と相互作用する領域は、「可変」部、すなわち「Ｖ」部で引用され、異なる抗原特異性の抗体からアミノ酸配列の差により特徴付けられる。
【００８１】
Ｈ鎖またはＬ鎖のいずれかの可変部は、抗原標的に特異的に結合できるアミノ酸配列を含有する。これらの配列内には「超可変」と呼ばれるより小さな配列があり、その理由は異なる特異性の抗体間でその配列が著しく変動するためである。このような超可変部は、「相補性決定部」すなわち「ＣＤＲ」として引用される。これらのＣＤＲ部は、特定抗原決定基構造に対する抗体の基本的特異性を説明するものとなる。
【００８２】
ＣＤＲｓは可変部内のアミノ酸の非隣接延伸部を表すものとなるが、種に拘ることなく、可変重鎖部および軽鎖部内でのこれらの臨界アミノ酸配列の位置上の配置は、可変鎖のアミノ酸配列内で類似の配置を持つものとして発見された。すべての抗体それぞれの可変重鎖および軽鎖は３ＣＤＲ部を持ち、それぞれの軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖に対して、それぞれは他のものに対し非隣接（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３，Ｈ１，Ｈ２，Ｈ３と名付けられた）であった。受け入れられたＣＤＲ部は、カバット他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）に記載されている。
【００８３】
すべての哺乳類では、抗体ポリペプチドは定常部（すなわち高度保存部）および可変部を含み、後者内にはＣＤＲｓと所謂「フレームワーク部」があり、このフレームワーク部は重鎖または軽鎖の可変部内であるがＣＤＲｓの外側にあるアミノ酸配列で構成されている。
【００８４】
本発明に基づき開示された抗体は、また完全に合成することもでき、ここで抗体のポリペプチド鎖は合成され、受容体であるとしてここで開示されたポリペプチドと結合するように多分最適化されている。このような抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体であり、その構造は完全に四量体であることもでき、あるいは二量体となり単一の重鎖と単一の軽鎖のみを含むこともある。このような抗体は、受容体としてここで開示されたいずれかのポリペプチドと反応でき、または結合することができるＦａｂおよびＦ（ａｂ２）′断片などの断片を含むことができる。
【００８５】
一つの見地において、本発明は、ここで開示されたアミノ酸配列を持つポリペプチド、望ましくは配列識別番号４のアミノ酸配列を持つポリペプチドに対しとりわけ特異的である場合に、これらのポリペプチドと反応するここで記載された免疫グロブリン、または抗体に関する。これらの抗体は、一般に組成物、とりわけ薬剤組成物の形態をとることができる。このようながん細胞の表面部位が何らかの型の果たすべき機能を持つ場合、（すなわちそれらが栄養物および必須物質の細胞への転送を、能動的または受動的に別途促進する表面酵素、またはチャンネル構造、あるいは構造である場合）、このような抗体は、それ自身がん細胞の表面部位と結合し、これによりそれらを動けなくする、という意味で治療価値を持つ。このような栄養物は、細胞の増殖と複製を促進するのに役立ち、このような部位と結合し、そのためそのような活性を妨げる分子は、結合の結果がこれら細胞からの栄養源を除去し、そのため増殖と複製を妨げるということで治療効果を持つことが証明できる。このようにこの結合は、細胞の機能的レパートリーから重要な酵素活性を除去し、細胞の生存能力およびまたは細胞が増殖し転移する能力を妨げるのに役立つ。加えて表面部位と結合することにより、抗体は、増殖、複製および転移を促進するサイトカインその他など環境薬剤と反応することから細胞を予防し、これにより更にこれら細胞のがん状態を軽減し、細胞または影響を受ける細胞群にとって致命的であると立証することさえなくて患者のがん疾患を改善するのに役立つことができる。
【００８６】
更に本発明の方法は、がん細胞が、一つの薬剤とｉｎ  ｖｉｖｏで、またｅｘ  ｖｉｖｏで接触されるプロセスを含み、ここで前記薬剤は、ここで開示されたポリヌクレオチド配列に対応する遺伝子の発現産物に親和性を持つ全分子構造の部分を含み、またはその一部であり、望ましくはここで発現産物が細胞表面構造であり、もっとも望ましくは配列識別番号４に相同であり、またはそれを含むアミノ酸配列を含むような、ここで開示されたポリペプチドである場合である。このような一つの実施例では、前記発現産物に親和性を持つ前記部分は抗体であり、とりわけ前記発現産物がポリペプチドまたはオリゴペプチドであり、あるいはオリゴペプチド部分を含み、もしくはポリペプチドを含む場合の抗体である。
【００８７】
もう一つの見地において、本発明は、更にここで開示されるポリペプチド、望ましくは配列識別番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと反応する抗体に関する。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換えまたはその源が合成である抗体である。このような一つの実施例において、前記抗体は細胞傷害性薬剤、たとえばアポトーシス剤と共有結合または非共有結合で結合している。かくして抗体は、ここで開示されたポリペプチドに同一ではないにせよ、相同のポリペプチドを発現する細胞などのようながん細胞に、結合治療薬剤をガイドする標的ベクターとして作用する。
【００８８】
細胞傷害性薬剤がそれ自身ポリペプチドである場合には、前記ポリペプチドは、抗体のアミノ酸鎖の伸長部を提示する場合などのように、がん細胞の表面標的に特異的な抗体と直接結合することができる。代替的実施例では、このような分子は、長さで５乃至１０個の残基のアミノ酸配列などのような長いもしくは短い期間でリンカー配列を通して共有結合される。細胞傷害性薬剤が、小さな有機化合物またはある種のアポトーシス剤などのある種の小さな有機分子である場合には、これは抗体分子と共有結合され、また疎水性連鎖または静電連鎖を含むその他の型の非共有結合により付着することができる。このような連鎖を形成する方法、とりわけ共有結合連鎖は、通常の技術を有する者にとっては周知である。
【００８９】
ここで開示された抗体は、リポソームなどのようなより大きな構造の標的ベクターとしても役立つ。このような一実施例では、抗体はリシンなどのような細胞傷害性薬剤の貯蔵器官として作用する膜状構造、望ましくはリポソームまたは多分にある種の細胞小器官の部分であり、またはそれらと結合し、あるいは会合する。抗体は次いで前記リポソームを動物内でのがん組織を標的化するように作用し、ここでリポソームは固形腫瘍またはその他の型の新生物の局所限定処置のための細胞傷害性薬剤源を提供する。
【００９０】
本発明は、更にここで開示されたポリペプチドを含む免疫原組成物、並びにこれらポリペプチドに特異的な抗体を使用して形成された組成物を包含する。
【００９１】
調合物を製作する従来の技術で公知の方法は、例えば、レミントン：ザ・サイエンス・アンド・プラクティス・オブ・ファーマシー，（第１９版），Ａ．Ｒ，ゲナーロ編，１９９５年，マック・パブリッシング・カンパニー，イーストン，ペンシリベニア．非経口投与のための調合物は、例えば賦形剤、無菌水、または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物源の油類、または水素添加ナフタレン類を含むことができる。生体適合性、生物分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンポリマーは、化合物の放出を制御するために使用することができる。本発明の作用薬としての他の潜在的に有用な非経口送達システムは、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ、移植可能注入システム、およびリポソームを含む。吸入用調合物は、賦形剤、例えばラクトースを含み、または、例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を含む水溶液であり、あるいは鼻用ドロップの形態でまたはゲルとしての投与のための油性液を含む。投与される治療薬がイムノコンジュゲートである場合には、これらは水性媒体ではいく分不安である化学連鎖を含むことがあり、そのため減圧凍結乾燥粉の形態などのようなより安定した環境で投与の前に貯蔵されねばならない。
【００９２】
このような薬剤は、親和性部分と抗がん活性部分の両方を含む単一分子構造であることができ、ここで前記部分は、分離された時にこのような活性を有する別の分子または分子構造から誘導され、またこのような薬剤は前記部分が１個のより大きな分子構造に結合され、例えば、前記部分が付加物の形態に結合されている。抗がん部分と親和性部分は、単一ポリペプチド、またはポリペプチド状構造の形態にあるように共有結合され、あるいは疎水性または静電性相互作用による場合のように、非共有結合で結合され、この構造は化学の分野で周知の手段により形成されている。選択肢としては、抗がん部分と親和性部分は、同一化学構造の部分として、１個以上の活性を示す単一分子の異なるドメインから形成され、ここで１個の活性は、がん細胞、または腫瘍形成あるいは増殖に対抗するものであり、他の活性は、がんプロセスまたは疾患にかんれんする遺伝子発現により産生する発現産物への親和性である。
【００９３】
本発明の一つの実施例では、タンパク質または他のポリペプチドなどの化学薬剤が、がん細胞の発現産物に親和性を持つ抗体など、がんプロセスに関連する遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質など、望ましくは本発明にもとづき、ここで開示される遺伝子、もっとも望ましくはここで開示されるポリペプチドなどの薬剤に結合される。かくして前記発現産物の存在が、腫瘍の開始およびまたは増殖に必須である場合には、前記薬剤の前記発現産物への結合は、前記腫瘍促進活性を無効にする効果を持つことになるであろう。このような一つの実施例では、前記薬剤は、細胞死を誘導するアポトーシス誘導剤であり、これによりがん細胞を死滅させ、腫瘍増殖を停止させる。
【００９４】
ここで開示された遺伝子のそれと類似したやり方で調節され、従って化学化合物に応答してコーディネートされた方法でその発現を変化させるがん細胞内の他の遺伝子は、一般の代謝、信号送信、生理的または機能的経路内に配置され、そのため、このように一般に調節された遺伝子のグループ（本発明に基づき開示された遺伝子または類似の配列を含むグループ）を解析しまた同定することによって、
（ａ）既知の遺伝子および新規な遺伝子を特異的な経路に割当て、
（ｂ）その機能が既に特徴付けられまたは記載されている遺伝子を持つ経路にグループ化される新規な遺伝子の特異的機能および機能的役割を同定する、
ことができる。例えば１０個の遺伝子のグループを同定することができ、その内の少なくとも１個はコーディネートされたやり方で発現を変更するここで開示された遺伝子であり、ここで開示された配列によりコードされるポリペプチドなどのようなその一つの機能が公知であるならば、他の遺伝子は類似の機能または経路に関与するものとなり、かくしてがん開始またはがん促進プロセスで役割を果すことになる。同じように、もし遺伝子ががん細胞でなく正常細胞に見出され、あるいはがん細胞とは対照的に正常細胞で高水準で発現されることが起こるとすれば、それががんにまたは他の疫病に関与している、という類似の結論が得られるであろう。従って、本発明に基づき開示されたプロセスは、機能を遺伝子に付与する新規な手段、すなわち機能的ゲノミクスの新規な方法、および特異的細胞経路に対する潜在的治療効果を持つ化合物を同定する手段、を同時に提供する。このような化合物は、そのような疾病が既知であり、あるいは影響を受ける特異的細胞経路を伴うように提示されている場合には、がん以外の各種の疾病に対しても同じように治療関連効果を持つことになるであろう。
【００９５】
ここで開示されたポリペプチド、望ましくは配列識別番号４のポリペプチドは、更にワクチンとしての用途を有しており、ここでポリペプチドががん細胞に存在する表面タンパク質を提示する場合には、動物に存在するがん細胞に特異的であり、またがん細胞を分解するように作用する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）を活性化する目的のために、このようなポリペプチドが前記動物、とりわけヒトに投与される。ワクチンとして使用される場合には、このようなポリペプチドは薬剤組成物の形態で存在する。本発明は、更に配列識別番号４のポリペプチドと同一または類似の免疫原性を持ち、それによりがんを進化させる危険のある、またはがんに悩む動物などへの投与後に、同一または類似の免疫原応答を引き出すポリペプチドを採用する。かくして本発明に基づき開示されるポリペプチドは、一般に免疫原組成物としての用途を見出すことになる。
【００９６】
ここで開示されるポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現は、正常組織の場合には、乳がんの成長に向かう素因を示すものとなる。コードされたポリペプチドは、細胞分解性抗体、または細胞分解性薬剤に付着された抗体などの治療分子に対する潜在的に有用な細胞表面標的を提供するものとなる。
【００９７】
本発明は、ここで開示された遺伝子に対応するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに対する抗体の使用法を考慮し、これにより前記抗体は、１個またはそれ以下の細胞傷害性薬剤に対すコンジュゲートとなり、そのため抗体は、固形腫瘍などのようながん活性の領域に対するコンジュゲート化イムノトキシンを標的とするのに役立つ。多くの既知の細胞傷害性薬剤にとって、選択能力の欠除は、悪性腫瘍の処置に際し治療薬としてのこれらの使用法に欠点をもたらした。例えば、毒性サブユニット（Ａ鎖）に結合する結合サブユニット（即ちＢ鎖）より成る２鎖毒素のクラスは、きわめて細胞傷害性である。かくしてヒマの実から分離されたタンパク質であるリシンなどの薬剤は、このような細胞内にあるリボソームを不活性化することにより、きわめて低い濃度で（１０−１１Ｍ以下においてさえ）細胞を死滅させる（例えば、ロード他、リシン：構造、作用の形態、およびいくつかの現在の利用法、Ｆａｓｅｂ  Ｊ，８巻２０１−２０８（１９９４年）；およびブレットラー他、イムノトキシンの完全な潜在能力の認識、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，１巻，５０−５５ページ（１９８９）を参照）。リシンＡ鎖に機能的に類似するタンパク質毒素の単離されたＡ鎖が、（１０−７−１０−６Ｍの濃度範囲で）無傷細胞にほんの微弱な細胞傷害性しか示さない一方で、それらは細胞内では、きわめて有力な細胞傷害性薬剤となる。かくしてジフテリア毒素のＡサブユニットの単一分子は、一旦内部に入ると細胞を死滅させる（ヤマイズミ他、細胞内に導入されたジフテリア毒素断片Ａの１分子は細胞を死滅させることができる。Ｃｅｌｌ，１５巻：２４５−２５０ページ，１９７８年、参照）。
【００９８】
本発明は、細胞毒素を前記細胞に仕向けるがん細胞に存在する抗原に特異的な抗体を使用して、この選択能力の問題を解決する。更に抗体の使用は毒性を減少させるが、それは抗体が腫瘍に到達するまで非毒性であるためであり、また細胞毒素が抗体と結合するために、非標的細胞に損傷を生じることが少ないためである。
【００９９】
加えて、このような抗体のみの使用は、抗体依存性細胞傷害性応答（ＡＤＣＣ）および補体介在細胞溶解メカニズムを通じて、腫瘍に治療効果を与えることができる。
【０１００】
数多くの組換えイムノトキシン（例えは、切形細菌毒素に融合されたがん特異的抗体のＦｖ領域よりなるもの）は公知である（例えば、スマイス他、モノクローナル抗体の使用を伴うクロラムブシルの腫瘍への特異的標的化、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，７６巻，３号：５０３−５１０ページ（１９８６年）；チョウ他、１本鎖Ｆｖ／葉酸コンジュゲートは葉酸受容体陽性腫瘍細胞の効果的な溶解をもたらす，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，８巻，３号：３３８−３４６ページ（１９９７年）を参照）。文献に記載されたように、これらのものは、例えばシュードモナス外毒素の切形バージョンを毒素成分として含んではいるものの、外毒素はそれ自身で正常ヒト細胞に結合せず、しかし細胞傷害性のすべての他の機能を留保しているように修飾される。ここで組換え抗体断片は、タンパク質合成の直接阻害、または随伴するアポトーシスの導入により、死滅されるがん細胞に修飾毒素を仕向ける。抗体断片により認識されない細胞は、それががん抗原を運搬しないため影響を受けない。培養がん細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検定、および動物腫瘍モデルにおいて、数多くの組換えイムノトキシンで良好な活性と特異性とが観察されている。進行中の臨床試験は、有望な前臨床データが実験的がん療法での成功結果と相関している事例を提供する（例えば、Ｕ．ブリクマン，がん療法のための組換え抗体断片とイムノトキシン融合，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ（２０００年）１４巻：２１−２７ページを参照）。
【０１０１】
ヒトにおけるイムノコンジュゲートを採用することについての安全性は確立されてきたが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療結果については、あまり印象的なものは少ない。ヒトのマウスＭａｂｓの臨床的使用がヒト宿主による外部抗グロブリン免疫応答の発展により限定されるために、遺伝子操作キメラヒト−マウスＭＡｂｓが、マウスＦｃ領域をヒト定常部で置換することにより開発された。他の場合では、マウス抗体が齧歯類抗体の可変ドメインのフレームワーク部をそのヒト等価物で置換することにより「ヒト化」された。このようなヒト化および遺伝子操作抗体は、設計により決定される特異性とエフェクター機能を持ち、その特性が自然界では見られないように構造的に配列されることさえ可能である。異なる結合端部を持ち、そのため１個以上の抗原部位と結合できる二重特異性抗体の開発は、がん細胞を標的化するのに有用であることが証明された。かくしてこのような抗体特異性は、細胞毒素または植物毒素、放射性核種または細胞傷害性薬剤およびその他薬剤などのような各種薬剤と化学的結合することで改良されてきた（Ｂ．ボーディ他．）。直接抗新生物処理および化学療法薬剤のがん細胞特異的運搬のための遺伝子操作モノクローナル抗体，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ（２０００年）２月号；６巻（３）：２６１−２７６ページを参照）。またＭ．Ｃ．ガーネット，標的薬剤コンジュゲート：原理と進歩，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．（２００１年１２月１７日）５３巻（２号）：１７１−２１６ページ：ブリンクマン他，がん治療のための組換え免疫毒素，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ，Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２００１年）１巻（４号）：６９３−７０２ページも参照。
【０１０２】
本発明に基づくイムコンジュゲートとしての使用のために特異的に考慮される細胞傷害薬にはカリケアマイシンがあり、これはＭｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ  ｓｓｐ．  Ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓから単離されたきわめて有毒なエネダイン抗生物質で、これはＤＮＡの小さな溝に結合し、二本鎖の破断と細胞死を誘導する（リー他、カリケアマイシン，抗腫瘍抗生物質の新規なファミリー．１．カリケアマイシンｇ１の化学と部分構造，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１０９巻：３４６４−３４６６ページ（１９８７年）；ザイン他，カリケアマイシンガンマ  １Ｉ：二本鎖ＤＮＡ部位を特異的に切断する抗腫瘍抗生物質，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０巻：１１９８−１２０１ページ（１９８８年）を参照）。カリケアマシインの有用な誘導体は、ミロターグと１３８Ｈ１１−Ｃａｍθを含む。ミロターグは、ヒト化抗ＣＤ３３抗体（ＣＤ３３は急性骨髄性白血病を持つ大抵の患者の白血病細胞に見出される）と、Ｎ−アセチルガンマカリケアマイシン・ジメチルヒドラジドのイムノコンジュゲートであり、この後者は（本明細書のいずれかで記載される産生の間にヒトフレームワーク部の抗体への置換によりヒト化できる抗ＣＤ３３の場所で）本発明の抗体に容易に結合できるために、本発明のイムノコンジュゲートを形成するヒト化抗ＣＤ３３抗体のイムノコンジュゲートである（ハマン他，ゲムツズマブ・オゾガマイシン，急性骨髄性白血病処置のための有力かつ選択的な抗−ＣＤ３３抗体−カリケアマイシンコンジュゲート，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１３巻，４７−５８ページ（２００２年）を参照）。１３８Ｈ１１−Ｃａｍθとの使用については、１３８Ｈ１１は、ジスルフィド結合を通じてシータカリケアマイシンと結合される抗γグルタミントランスフェラーゼ抗体であり、培養腎細胞がん細胞に対しｉｎ  ｖｉｔｒｏで有用であることが発見された（ノール他、モノクローナル抗体１３８Ｈ１１とカルケアマイシンθ１ｌの新規なコンジュゲートを用いる実験的腎細胞がんの標的療法，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０巻；６０８９−６０９４ページ（２０００年）参照）。同じ結合が、この細胞傷害性薬剤を本発明の抗体を結合し、これにより乳がん細胞のための標的構造を形成するために利用することができる。
【０１０３】
更に、本発明のイムノコンジュゲートを形成するのに有用なのは、ＤＣ１，すなわちアドゼレシンのジスルフィド含有類似体であり、これはＤＮＡの微小な溝に結合し、次いでアデニン塩基のアルキル化により細胞を死滅させる。アドゼレシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓの微生物発酵から単離された抗腫瘍抗生物質であるＣＣ−１０６５の構造類似体である。この薬剤は、アドゼレシンのジスフィルド結合を通じて抗体と容易に結合される（シャリ他，イムノコンジュゲート形成を通してのＣＣ類似体の選択性および抗腫瘍効率の増強，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５５巻：４０７９−４０８４ページ（１９９５年）を参照）。
【０１０４】
灌木であるＭａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離された高度の細胞傷害性微小管阻害剤であるメイタンシンは、ヒト臨床試験では殆ど価値がないものであったが、その誘導形態であり、抗体への結合を容易にするジスルフィド結合を含み、ＤＭ１と名付けられたものは、１０倍以上もの細胞傷害性を持つまでに高められる（シャリ他，新規なメイタンシノイドを含むイムノコンジュゲート；有望な抗がん剤，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５２巻，１２７−１３１ページ（１９９２年）参照）。これと同じｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、４個までのＤＭ１分子が結合親和性を破壊することなく単一イムノグロブリンに結合できたことを示した。このようなコンジュゲートは、ｎｅｕ／ＨＥＲ２／ｅｒｂＢ−２抗原などの乳がん抗原に対して利用されてきた（ゴールドマッハー他，イミューノジェン，インコーポレイテッド（２００２年）印刷中、参照。またＣ．リュー他，メイタンシノイドの標的送達による大型結腸腫瘍異種移植片の撲滅，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｏ／ＵＳＡ，９３巻，８６１８−８６２３ページ（１９９６年）参照）。例えばリュー他（１９９６年）は、メイタンシノイド細胞毒素ＤＭ１と、ファルマシア社から利用できるマウスＩｇＧ１免疫グロブリンＣ２４２抗体とのイムノコンジュゲートの形成を記載し、それはヒト結腸直腸がんにより変化しやすく発現されるムチン状タンパク質に対する親和性を持つ。後者のイムノコンジュゲートは、シャリ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２巻：１２７−１３１ページ（１９９２年）に基づき調製され、培養結腸がん細胞に対してきわめて高い細胞傷害性であることが発見され、最大寛容用量より十分に低い用量を用いて、皮下ＣＯＬＯ  ２０５ヒト結腸腫瘍異種移植片を持つマウスでｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を示した。
【０１０５】
加えてリシン、アブリン、ゲロニンなどのような植物起原のリボソーム不活性化タンパク質、タンパク質合成を阻害するものなどのような数多くの異なるクラス、および数多くの他のもの、およびシュードモナス外毒素およびジフテリア毒素などのような細菌毒素などを含む各種のタンパク質毒素（細胞傷害性タンパク質）がある。
【０１０６】
もう一つの有用なクラスは、タキソール、タキソテール、およびタキソイドを含むものである。その特異的な例は、パクリタキセル（タキソール）、その類似体ドセタキセル（タキソテール）およびその誘導体である。最初の２個は、数多くの腫瘍を処置するのに使用される際の臨床医薬であり、一方タキソイドは、チューブリンの解重合を阻害することで細胞死を誘導するように作用するものである。このような薬剤は、結合特異性に不利に作用することなくジスルフィド結合を通じて抗体に容易に結合される。
【０１０７】
一つの場合では、シュードモナス外毒素は、抗ＣＤ２２可変断片に融合され、化学療法耐性ヘアリー・セル白血病を持つ患者を処置するため成功裡に使用された（クライトマン他、化学療法耐性ヘアリー・セル白血病での抗ＣＤ２２組換え免疫毒素ＢＬ２２の効果，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４５巻：２４１−２４７ページ（２００１年）参照）。これとは逆に、本発明のがん結合ペプチドは、同一または類似の細胞傷害性コンジュゲートを用いて、固形腫瘍、望ましくは乳房組織の悪性腫瘍のものを標的とする適切な抗原に対し、組換えまたはその他の抗体を用意する機会を提供する。かくして、これまでに使用された多くのイムノコンジュゲートが、がんに結合する一般の抗原部位に対する抗体を使用して形成されてきたのに対して、ここで開示されたペプチドを用いて形成された抗体は、より特異的であり、抗体−細胞傷害性薬剤を特定の組織または器官に仕向けるものであり、かくして更に毒性および他の望ましくない副作用を減少させるものとなる。
【０１０８】
加えて、ここで開示されたがん結合抗原に対して調製された抗体を用いて形成されたイムノコンジュゲートは、いずれの型の化学カップリングによっても形成することができる。従って、選択された細胞傷害性薬剤は、免疫グロブリンと共に、本発明のイムノコンジュゲートを形成するために、静電気結合を含む共有結合または非共有結合を含むいずれの型の化学結合によっても結合することができる。
【０１０９】
イムノコンジュゲートとして使用された場合には、本発明の抗腫瘍薬剤は、ヒト患者などのような動物に最初に投与された場合に比較的非毒性であり（主としてそれはイムノコンジュゲートの安定性に起因するためであり）、しかしコンジュゲート免疫グロブリンによりがん細胞に仕向けられ、そこでは十分な毒性を提示するプロドラッグの一つのクラスを表す。望ましくはここで提示されたものなどのような腫瘍関連、関係、または結合抗原は、これらの抗原に特異的な（モノクローナル、組換え、またはその他の）抗体を標的とするのに役立つ。最終結果は、イムノコンジュゲートの免疫グロブリン部分の結合の後での細胞内での細胞傷害性薬剤の放出となる。
【０１１０】
引用例は、細胞傷害性薬剤の免疫グロブリンへの化学的結合に関する数多くの有用な手順を記載しており、ここで引用されたこのような引用例すべての開示は、その全体を引用してここに組み込まれている。他の報告書としては、ゲティー他，がん治療における免疫毒素：ベンチから臨床まで，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，６３巻：２０９−２３４ページ（１９９４年）；ピータース他，がん治療におけるモノクローナル抗体イムノコンジュゲートの使用法，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，３５３巻：１６９−１７９ページ（１９９４年）；およびＧ．Ａ．ピータース，がん処置のためのモノクローナル抗体への細胞傷害性薬剤の結合，Ｂｉｏｃｏｎｊ  Ｃｈｅｍ，１巻：８９−９５ページ（１９９０年）を参照されたい。
【０１１１】
かくして本発明は、何らかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性を持ち、また抗体への結合に利用できる化学基を所有することが公知である数多くの異なる細胞傷害性薬剤に結合する抗体の創出のためのきわめて有用ながん関連抗原を提供する。
【０１１２】
本発明は更に、そのような薬剤（すわなち、ここで開示された検定手順に基づき同定される治療薬剤）を同定するための開示されたプロセスの一つに基づき、薬剤を同定することを含むこのような産物の同定を促進するための試験データを創出することなどで、産物を産生する一つの方法を含み、ここで前記産物は、前記同定プロセスまたは検定の結果として前記薬剤に関して集められたデータであり、またここで前記データは、前記薬剤の化学特性およびまたは構造およびまたは物性を運搬するのに十分なものである。例えば本発明は、一つの状況を特異的に考案し、これにより本発明の検定の使用者は、望ましい酵素転調活性を持つ化合物をスクリーニングするために本検定を使用し、その化合物を同定した後に、次にその情報（すなわち構造、用量などに関する情報）をもう一人の使用者に伝え、後者は次いで薬剤を再生産するためにその情報を利用し、本発明に基づきその薬剤を治療または研究目的に投与する。例えば、本検定の使用者（使用者１）は、数多くの試験化合物の構造または毒性を知ることなく（例えば数多くのコード番号が使用されている場合には、最初の使用者は前記コード番号で標識された試料を単に与えられているようにして）、それらの試験化合物をスクリーニングし、本発明の１個またはそれ以上の検定プロセスを使用してスクリーニングプロセスを実施し、次いで第２の使用者（使用者２）に、言葉でまたは書状もしくは他のやり方で（例えば対応する結果を示したコード番号などでの）特定の転調活性を持つ化合物を同定するための十分な情報を与える。使用者１から使用者２へのこのような情報の伝達が本発明で特異的に考察される。
【０１１３】
前に記載のものに従って、本発明は、化合物の遺伝子転調活性に関連する試験データを産生する方法に関し、それは
（ａ）その発現が非がん細胞内よりもがん細胞にある時に増加し、またポリヌクレオチドが発現されている条件下にある遺伝子に対応するヌクレオチド配列を含む前記ポリヌクレオチドを含有する細胞に一つの化合物を接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としてのポリヌクレオチドにおける発現の変化を確認し、また
（ｃ）そうでなければ非がん細胞よりもがん細胞内でその発現が増加し、従い遺伝子の転調活性を示している確認された遺伝子の発現の減少に基づいて、前記化合物の遺伝子転調活性に関連する試験データを産生する、
ことを含む方法に関する。
【０１１４】
ここで開示された本発明の手順を実施するに際して、ここで開示された遺伝子およびポリペプチドを使用してイムノコンジュゲートを形成するか、他の抗腫瘍薬剤をスクリーニングするかについて、特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件、その他についてのいずれかの引用は限定を意図したものではなく、議論が提出される特定のコンテキスト内で、通常の知識を有する者が興味があり価値があると認識するようなすべての関連する材料を含むものとして読み取らねばならないことは注目されるべきである。例えば、一つの緩衝液系または培養培地をもう一つのものに置換して、しかも同一ではないにしても類似の結果を達成することはしばしば可能なことである。通常の知識を有する者は、そのような系または方法論について十分な知識を有しており、そのため過度の実験作業をすることなく、ここで開示された方法と手順を用いて彼等の目的に最適に役立たせるようにそのような置換を行うことができる。
【０１１５】
本発明は、これから更に以下の限定されない実施例で記載されるであろう。本実施例の開示を適用するに際し、本発明に基づき開示された方法と異なる他の実施例は、それら自身が関連する技術に習熟した者に間違いなく示唆を与えるであろうということは心に留めて置くべきことである。下記の実施例は、ここで開示された遺伝子の１個または複数のものを使用するものとして同定することができる。
【０１１６】
実施例
抗新生物薬の遺伝子阻害活性の確認
ＳＷ４８０細胞がＬ−グルタミン２ｍＭ（９０％）および胎仔ウシ血清１０％で補充されたライボヴィッツＬ−１５培地で１０５細胞／ｃｍ２の濃度で培養される。細胞は、トリプシン０．２５％、ＥＤＴＡ  ０．０２％の処理で３７℃、２乃至５分後に収集される。トリプシン化細胞は、次いで増殖培地３０ｍｌで希釈され、９６ウエル平板でウエル当り５０，０００細胞（１００μｌ／ウエル）の濃度で平板培養される。次の日に細胞は２４時間化合物緩衝液のみ、または試験される化学薬品を含む化合物緩衝液で処理される。培地は次いで除去され、細胞は溶解され、ＲＮＡがキアーゲン社から得られたＲＮＡｅａｓｙ試薬とプロトコルを用いて回収される。ＲＮＡは定量され、１μｌ内の試薬１０ｎｇが、ＰＣＲ緩衝液１Ｘ，ＲＮＡｓｉｎ，逆転写酵素，ヌクレオシド三リン酸，アンプリタークゴールド，トウィーン２０，グリセロール，親ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および特異的ＰＣＲプライマーならびに基準遺伝子（１８Ｓ  ＲＮＡ）のためのプローブおよび試験遺伝子（遺伝子Ｘ）を含むタクマン反応混合物２４μｌに加えられる。逆転写が次いで４８℃、３０分行われる。試料は次いでパーリン・エルマー７７００配列検出器に適応され、１０分、９５℃で加熱変性される。増幅は、６０℃で１５秒のアニーリング、次いで７２℃で６０秒延長、更に９５℃で３０秒の変性を用いて４０サイクルで行われた。次いでデータファイルが獲得され、このデータは適切な基線ウインドー領域と閾値で分析された。
【０１１７】
標的遺伝子と基準遺伝子の間の量的差が次いで計算され、使用された試料すべてに対する相対発現値が決定された。このようにして、がん特異的遺伝子の活性を効果的かつ選択的に減少させる化学療法薬剤の性能が容易に確認される。もう一つのものと関連して１個の化学薬剤により転調されるように、がん特異的遺伝子の全体発現も決定される。遺伝子活性を減少させる最大の効果を持つ化学薬剤は、かくしてもっとも抗新生物性であると同定される。
【０１１８】
引用例
ウォルター．Ａ．ブレットラーおよびラビ．シャリ：抗がん抗体の治療能力を増強する薬剤：腫瘍活性プロドラッグとしての抗体−薬剤コンジュゲート。Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔ所収−がん化学療法の最前線（イワオ．オジマ，グレゴリー．Ｄ．ヴァイト，カール−ハインツ．アルトマン編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，３１７−３３８ページ（２００１年）。
ダン．Ｌ．ロンゴ，パトリシア．Ｌ．デュフィ，ジョン．Ｇ．グリベン，エレーヌ．Ｓ．ジャフ，ブレンダン．Ｄ．カーティ，バリー．Ｌ．ゴーズ，ジョン．Ｅ．ジャニック，ヴァージニア．Ｍ．ブラマン，ディキシー．エッセルタイン，ワインダム．Ｈ．ウイルソン，ドワイト．カウフマン，ロバート．Ｅ．ヴィッテス，リー．Ｍ．ナドラー，およびウォルター．Ｊ．アーバ：不活性リンパ腫を持つ患者における化学療法と免疫毒素（抗Ｂ４遮断リシン）の組合せ：フェーズＩＩ研究結果。Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．６巻，１４６−１５０ページ（２０００年）。
ウォルター．Ａ．ブレットラーおよびジョン．Ｍ．ランバート：前臨床段階免疫毒素の開発。モノクローナル抗体ベースがん治療（Ｍ．グロースバード編）所収，マーセル．デッカー，インコーポレイテッド，ニューヨーク，ニューヨーク，１−２２ページ（１９９８年）。
ラビ．Ｖ．Ｊ．シャリ：化学療法の標的送達：腫瘍活性化プロドラッグ療法．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，エルセヴィア．サイエンス．Ｂ．Ｖ．，８９−１０４ページ（１９９８年）所収。
デービット．Ｔ．スカデン，デービッド．Ｐ．シェンカイン，ゼール．バーンスタイン，バリー．ラスキー，ジョン．ドワイコ，アニル．トゥルピュール，およびアレキサンドラ．Ｍ．レバイン：ＡＩＤＳ関連非ホジキンリンパ腫を持つ患者への化学療法と組み合わせた免疫毒素。Ｃａｎｃｅｒ  ８３巻，２５８０−２５８７ページ（１９９８年）。
チャンニャン．リューおよびラビ．Ｖ．Ｊ．シャリ：きわめて有力なメイタンシノイドを用いるがんを標的とする抗体送達システムの開発。Ｅｘｐ．Ｏｐｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ６巻，１６９−１７２ページ（１９９７年）。
Ａ．Ｃ．グーレット，ヴィクトル．Ｓ．ゴルトマッヒャー，ジョン．Ｍ．ランバート，Ｃ．バロン，デニス．Ｃ．ロイおよびＥ．クーアッシ：遮断リシンの抗ＣＤ１９モノクローナル抗体へのコンジュゲーションは抗体誘導細胞カルシウムの動員およびＣＤ１９の内在化を増強する。Ｂｌｏｏｄ  ９０巻，２３６４−２３７５ページ（１９９７年）。
チャンニャン．リュー，ジョン．Ｍ．ランバート，ビバリー．Ａ．タイチャー，ウォルター．Ａ．ブレットラー，およびローズマリー．オコンナー：抗Ｂ４遮断リシンと化学療法薬剤の組合せによる多剤耐性ヒトＢ細胞リンパ腫異種移植片の治療。Ｂｌｏｏｄ  ８７巻，３８９２−３８９８ページ（１９９６年）。
ラジーバ．シン，ラーナ．カッツ，ウォルター．Ａ．ブレットラー，およびジョン．Ｍ．ランバート：タンパク質およびペプチドのアミノ基が２−イミノチオランで修飾される際のＮ−置換２イミノチオランの形成。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６巻，１１４−１２５ページ（１９９６年）。
チャンニャン．リュー，Ｂ．ミトラ．タダヨーニ，リザベス．Ａ．ブーレット，クリスティン．Ｍ．マトックス，スーザン．Ｍ．ダー，ウェイン．Ｃ．ウィディスン，ナンシー．Ｌ．ケダーシャ，パメラ．Ｄ．アリニェロ，ヴィクトル．Ｓ．ゴルトマッヒャー，ジョン．Ｍ．ランバート，ウェルター．Ａ．ブレットラー，およびラビ．Ｖ．Ｊ．シャリ：メイタンシノイドの標的送達による大型結腸腫瘍異種移植片の撲滅。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３巻，８６１８−８６２３ページ（１９９６年）。
デニス．Ｃ．ロイ，ソフィー，ウェレット，クリスティーヌ．ル．ウィエ，パメラ．Ｄ．アリニェロ，クロード．ペルローおよびジョン．Ｍ．ランバート：抗神経細胞付着分子免疫毒素を用いる神経芽腫および小細胞肺がんの除去。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８巻，１１３６−１１４５ページ（１９９６年）。
ウォルター．Ａ．ブレットラー，ラビ．Ｖ．Ｊ．シャリおよびジョン．Ｍ．ランバート：イムノコンジュゲート，がん治療薬：実験的および臨床的薬剤（Ｂ．タイヒャー編）所収。フマーナ．プレス，タトワ，ニュージャージー，３７１−３９４ページ（１９９６年）。
マイケル．Ｌ．グロスバード，ジョン．Ｍ．ランバート，ヴィクトル．Ｓ．ゴルトマッヒャー，アーノルド．Ｓ．フリードマン，ジャンヌ．キンセラ，ダニー．Ｐ．デュセロ，スーザン．Ｎ．ラビノー，ローラ．エリジア，フェリス．キャロル，ジェームズ．Ａ．テーラー，ウォルター．Ａ．ブレットラー，キャロル．Ｌ．エプシュタイン，およびリー．Ｍ．ナドラー：抗Ｂ４遮断リシン：Ｂ細胞新生物を有する患者への７日間連続注入のフェーズ  Ｉ  トライアル．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１１巻，７２６−７３７ページ（１９９３年）。
マイケル．Ｌ．グロスバード，ジョン．Ｇ．グリベン，アーノルド．Ｓ．フリードマン，ジョン．Ｍ．ランバート，ジャンヌ．キンセラ，スーザン．Ｎ．ラビノー，ローラ．エリジア，ジェームズ．Ａ．テーラー，ウォルター．Ａ．ブレットラー，キャロル．Ｌ．エプシュタイン，およびリー．Ｍ．ナドラー：Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を持つ患者への自己由来骨髄移植に続く抗Ｂ４遮断リシンでのアジュバント免疫毒素治療。Ｂｌｏｏｄ  ８１巻，２２６３−２２７１ページ（１９９３年）。
スディール．Ａ．シャー，パトリシア．Ｍ．ハローラン，シンシア．Ａ．フェリス，ベス．Ａ．レバイン，リザベス．Ａ．ブーレット，ヴィクトル．Ｓ．ゴルトマッヒャー，およびウォルター．Ａ．ブレットラー：抗Ｂ４遮断リシン免疫毒素は４匹の異なるＳＣＩＤマウス腫瘍モデルで治療効果を示す。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３巻，１３６０−１３６７ページ（１９９３年）。
ラビ．Ｖ．Ｊ．シャリ，ブリジェット．Ａ．マーテル，ジョナサン．Ｌ．グロス，シェリリン．Ｂ．クック，スディール．Ａ．シャー，ウォルター．Ａ．ブレットラー，サラ．Ｊ．マッケンジー，およびヴィクトル．Ｓ．ゴルトマッヒャー：新規なメイタンシノイドを含むイムノコンジュゲート：将来有望な抗がん剤。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２巻，１２７−１３１ページ（１９９２年）。
ジョン．Ｍ．ランバート，ピーター．Ｄ．センター，アニー．ヤウ−ヤン，ウォルター．Ａ．ブレッラー，およびヴィクトル．Ｓ．ゴルトマッヒャー：ヒトリンパ系細胞と反応する精製免疫毒素．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０巻，１２０３５−１２０４１ページ（１９８５年）。
【配列表】
2006511222000001.app
【国際調査報告】
2006511222.tif 000002
2006511222.tif 000003