(57)【要約】羊膜内炎症を同定することが可能であるバイオマーカーを発見した。単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせは、少なくとも一つのバイオマーカーが、カルグラヌリン、好ましくはカルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである場合、患者の早産の危険性を認定するために使用され得る。特に、このバイオマーカーの濃度は、羊膜内炎症の規模に関連し、したがって早産に関連する。本発明は、羊水サンプル中の羊膜内炎症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための診断アッセイおよびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊水サンプルにおける羊膜内炎症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための診断アッセイであって、該診断アッセイは、以下、
（Ａ）吸着剤を羊水サンプルと混合する工程であって、該吸着剤は、羊膜内炎症に関連する少なくとも一つのバイオマーカーに結合する、工程、次いで
（Ｂ）該バイオマーカーと該吸着剤との間の結合について該混合物をモニタリングする工程、
を含み、該アッセイが、カルグラヌリンである少なくとも一つのバイオマーカーを検出する、診断アッセイ。
【請求項２】
前記吸着剤は、固体基板に固定された抗体である、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項３】
ＥＬＩＳＡ法である、請求項２に記載の診断アッセイ。
【請求項４】
前記固体基板は、プローブである、請求項２に記載の診断アッセイ。
【請求項５】
請求項４に記載の診断アッセイであって、前記バイオマーカーは、レーザー脱離／イオン化質量分析法により検出される、診断アッセイ。
【請求項５】
前記吸着剤は、プローブ上に固定される、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項６】
前記吸着剤は、疎水性吸着剤である、請求項５に記載の診断アッセイ。
【請求項７】
請求項６に記載の診断アッセイであって、前記プローブは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである、診断アッセイ。
【請求項８】
請求項１に記載の診断アッセイであって、該診断アッセイは、羊水の前記サンプル中の少なくとも一つのディフェンシンの存在についてさらに試験する、診断アッセイ。
【請求項９】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項８に記載の診断アッセイ。
【請求項１０】
請求項３に記載の診断アッセイであって、該診断アッセイは、羊水の前記サンプル中の少なくともディフェンシンの存在についてさらに試験する、診断アッセイ。
【請求項１１】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項１０に記載の診断アッセイ。
【請求項１２】
請求項５に記載の診断アッセイであって、該診断アッセイは、羊水の前記サンプル中の少なくともディフェンシンの存在についてさらに試験する、診断アッセイ。
【請求項１３】
請求項１２に記載の診断アッセイであって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、診断アッセイ。
【請求項１４】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡである、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項１５】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＣである、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項１６】
羊水サンプル中の羊膜内炎症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するためのキットであって、該キットは、以下：
少なくとも一つの吸着剤であって、該吸着剤は、羊膜内炎症に関連する少なくとも一つのバイオマーカーに結合する、吸着剤；ならびに
該吸着剤と羊水サンプルとを混合する工程および該サンプルにおける該吸着剤とバイオマーカーとの間の結合について該混合物をモニタリングする工程についての指示書、
を含み、
該キットは、カルグラヌリンを検出する少なくとも一つの吸着剤を含む、キット。
【請求項１７】
前記吸着剤は、固体基板に固定化された抗体である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のキットであって、該キットは、前記固体基板上に固定されたバイオマーカーを検出するために使用される酵素−抗体結合体をさらに含む、キット。
【請求項１９】
前記固体基板は、プローブである、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットであって、該キットの指示書は、レーザー脱離／イオン化質量分析法による分析を明細に記す、キット。
【請求項２１】
前記固体基板は、プローブである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
前記吸着剤は、疎水性吸着剤である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
請求項２２に記載のキットであって、前記プローブは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである、キット。
【請求項２４】
請求項１６に記載のキットであって、該キットは、少なくとも一つのディフェンシンに結合する少なくとも一つの吸着剤をさらに含む、キット。
【請求項２５】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１８に記載のキットであって、該キットは、少なくとも一つのディフェンシンに結合する少なくとも一つの吸着剤をさらに含む、キット。
【請求項２７】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
請求項２０に記載のキットであって、該キットは、ディフェンシンに結合する少なくとも一つの吸着剤をさらに含む、キット。
【請求項２９】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡである、請求項１６に記載のキット。
【請求項３１】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＣである、請求項１６に記載のキット。
【請求項３２】
妊娠中の患者の早産の危険性を認定するための方法であって、該方法は、少なくとも一つのカルグラヌリンのレベルについて該患者に由来する羊水サンプルを分析する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、該方法は、前記少なくとも一つのディフェンシンのレベルについて前記サンプルを分析する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３２に記載の方法であって、前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）である、方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）である、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、方法。
【請求項３６】
妊娠中の患者の早産の危険性を認定する方法であって、該方法は、以下、
（Ａ）該患者に由来する羊水サンプルを質量分光分析に供することにより生じたスペクトルを提供する工程であって、該質量分光分析は、生物学的または化学的に誘導体化されたアフィニティー表面でプロファイリングする工程を含む、工程、ならびに
（Ｂ）パターン認識分析により該スペクトルを配置する工程であって、該パターン認識分析は、該サンプル中のカルグラヌリンの存在を示す少なくとも一つのピークに適合される、工程
を、包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記パターン−認識分析は、ディフェンシンを示す少なくとも一つのピークにさらに適合される、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２  （α−ディフェンシン２）である、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、方法。
【請求項４１】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３６に記載の方法であって、前記化学的に誘導体化されたアフィニティー表面は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである、方法。
【請求項４４】
前記患者は、正常な範囲外に高められた白血球数を有さない、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
早産は、周産期罹病率および周産期死亡率の主要な原因を引き起こす。毎年およそ４．５百万人の未熟児が、世界中で生まれ、新生児の医療がかなり進歩したにもかかわらず、未熟児の死亡率は未だに高い。さらに、生き残った未熟児は、長期のハンディキャップ（発育遅延脳性麻痺、盲目難聴、および慢性肺疾患が挙げられる）の危険性がある。この早産の社会的重荷は、米国において、出生時体重が９００ｇ以下（約２７週）の生き残った未熟児１人あたりの平均経費が、彼らの医療および他の支持療法の費用を超えるという事実により明確に示される。従って、早産の予防は、産科医療および周産期医療に対する最も重要な試みである。その限定的な成功は、早産が、感染、脈管疾患、子宮の過剰な拡張、および慢性的なストレスの様な多様な病理のプロセスにより引き起こされる症候群であるという事実に一部起因する。
【０００２】
子宮内感染は、早産の一般的かつ重要な原因として明らかになっている。子宮内感染は、羊膜腔の微生物の侵襲を有する母親に生じる、全ての早産の少なくとも第三番目の原因である。子宮内感染はしばしば、胎児炎症性反応症候群、分娩の切迫した開始の危険因子、短期新生児の合併症、ならびに長期のハンディキャップ（例えば、脳性麻痺および慢性肺疾患）の発生を伴う胎児の感染を生じる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
感染は早産の原因として関連するという、有力な証拠にもかかわらず、早期分娩の患者の抗生物質処置は、多くの試験において早産または新生児合併症の予防に有効であると証明されていない。有力な説明は、早期分娩を示す多くの患者は、子宮内感染を有さず、そのため抗生物質療法から利益を得られないかもしれないことである。さらに、子宮内感染および胎児の感染自体は、微生物学的に証明された感染の非存在下においてさえ有害な転帰に関連する。従って、無症状子宮内炎症を有する母親の正確なかつ迅速な同定は合理療法の開発よりも急務である。
【０００４】
現在の証拠は、通常は無菌である羊水の分析が、感染および／または炎症の存在または非存在を決定するための最も正確な手段であることを示す。利用可能な試験は、限定された感度および特異性を有するが、標準的な微生物学的技術（例えば、微生物の培養）の結果は、時間がかかりかつ即時対応の決定に利用できない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
これらおよび他の必要性に取り組むために、本発明は、羊水サンプル中の羊膜内炎症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための診断アッセイおよびキットを提供する。この診断アッセイおよびキットは、（Ａ）羊膜内炎症に関連する少なくとも一つのバイオマーカーに結合する吸着剤と羊水サンプルとを混合し、次いで（Ｂ）このバイオマーカーとこの吸着剤との間の結合についてこの混合物をモニタリングする工程を包含する。このアッセイまたはキットは、カルグラヌリン（特にカルグラヌリンＡ、カルグラヌリンＣ）である少なくとも一つのバイオマーカーを検出する。一つの実施形態において、この吸着剤は、固体基板に固定された抗体である。抗体を使用するこのアッセイまたはキットは、ＥＬＩＳＡであり得、ここで使用される酵素−抗体結合体が、バイオマーカーを検出するために固定基板上に固定されている。いくつかの実施形態において、この吸着剤は、プローブ上に固定され、そしてこのバイオマーカーは、レーザー脱離／イオン化質量分析法により検出される。これらの実施形態において、この吸着剤は好ましくは、疎水性吸着剤、より好ましくは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである。好ましい実施形態において、このアッセイおよびキットは、羊水サンプル中の少なくとも一種のディフェンシンの存在について８回さらに試験する。特に、このディフェンシンは、ＨＮＰ−１α−ディフェンシン１またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）であり得る。
【０００６】
本発明は、妊娠患者における早産の危険性を検定するための方法を提供する。この方法は、患者に由来する羊水サンプルを、少なくとも一つのカルグラヌリンのレベルについて分析する工程からなる。好ましくは、この方法はさらに、少なくとも一つのディフェンシンのレベルについてサンプルを分析する工程を包含する。好ましい実施形態において、このカルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣであり、かつこのディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）である。
【０００７】
本発明はさらに、妊娠患者における早産の危険性を検定するための方法を提供する。この方法は、（Ａ）患者に由来する羊水サンプルを、生物学的にまたは化学的に誘導されたアフィニティー上におけるプロファイリングを包含する質量分光分析に供することにより生ずるスペクトルを提供する工程、および（Ｂ）サンプル中のカルグラヌリンの存在を示す少なくとも一つのピークに適合するパターン−認識分析によりこのスペクトルを配置する工程を包含する。好ましいこのパターン−認識分析はさらに、ディフェンシンを示す少なくとも一つのピークに適合する。好ましい実施形態において、このパターン−認識分析は、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣの少なくとも一つおよびＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）の少なくとも一つに適合する。この好ましいアフィニティー表面は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである。この方法は特に、正常範囲を超えて増加した白血球数を有さない患者における早産の危険性を同定するのに有益である。
【０００８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
羊膜内炎症にそれぞれ関連するバイオマーカーが発見された。本文の文脈において、「バイオマーカー」は、有機生体分子であり、特に、羊膜内炎症を有さない「正常な」被験体から得られた比較可能なサンプルと比較した場合、羊膜内炎症を有する被験体から得たサンプル中に差次的に存在する、ポリペプチド、またはタンパク質である。バイオマーカーは、正常な患者のサンプルと比較したとき、羊膜内炎症を有する患者に由来するサンプルにおいて増加したレベルまたは減少したレベルで存在する場合、正常な患者および羊膜内炎症を有する患者に由来するサンプル中にそれぞれ差次的に存在する。
【０００９】
本発明のバイオマーカーは、羊膜内炎症を同定することが可能である。本発明によると、バイオマーカーの少なくなくとも一つがカルグラヌリン（好ましくは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣ）である場合、単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーの組合せ（「バイオマーカープロフィール」）が使用され得る。本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカープロフィールが、患者における早産の危険性を検定するために使用され得る。
【００１０】
従って、本発明は、迅速かつ確実なプロテオームアプローチを提供し、早産を引きこし得る羊膜内炎症を同定する。これが早期分娩における羊水の初めてのプロテオミクスの特徴付けであり、かつ関連する変化の特徴付けおよび定量的検証を可能とするバイオマーカーの詳細な分析である。特に、バイオマーカーの濃度は、目的の生物学的徴候、すなわち、羊膜内炎症および早期分娩の規模に関連する。
【００１１】
妊娠第二期の間、胎児の尿および肺の液体は、羊膜腔への二つの主な流入物である。胎児の炎症を併発した妊娠においてはさらに、この羊水は、好中球を含む。この好中球は、ほとんど胎児のものであり、母親起源の好中球ではない。そしてこの流動物中の炎症性媒介物の濃度から、切迫早期分娩および新生児の有害転帰の可能性が、母親の血液からよりも良く予測される。
【００１２】
本発明のバイオマーカーは、主にディフェンシンおよびカルグラヌリンである。ディフェンシンは、先天性免疫系のタンパク質である。３つの主なヒト好中球ディフェンシン（ＨＮＰ１〜３）は、好中球に特有のファミリーに属し、これらの細胞におけるディフェンシン含有量の９９％を占める。ＨＮＰ−１、ＨＮＰ−２およびＨＮＰ−３は、カチオン性の、トリスルフィド含有殺菌性ペプチドのファミリーに属する。これらディフェンシンの産生および放出は、サイトカインおよび殺菌性産物（例えば、グラム陰性菌の細胞壁の構成成分であるリポ多糖類）により誘導される。
【００１３】
カルグラヌリンは、タンパク質のＳ１００群のメンバーであり、二つの標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＥＦ−ハンド構造モチーフを含むカルシウム結合タンパク質である。カルグラヌリンは、アルツハイマー病、癌、心筋症、乾癬、リウマチ様関節炎、および他の炎症性障害のような疾患に関与し得ることからこれに対する注目が高まった。Ｓ１００  Ａ８（カルグラヌリンＡ）およびＳ１００  Ａ９（カルグラヌリンＢ）は結合し、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し得、これら二量体もまた、殺菌性特性を有する。以下により詳細に記載される、本発明者らにより開発されたアプローチは、バイオマーカー（例えば、カルグラヌリンＣ）の同定を可能にした。カルグラヌリンＣは、早期分娩または羊膜内感染において以前に研究されていない。
【００１４】
本発明は、羊水のプロテオーム分析を包含し、子宮内炎症の強度（すなわち、白血球数と相関する）および臨床結果（すなわち、妊娠期間とＭＲスコアとの間の関係（以下に記載））により決定されるように、炎症性の兆候の規模に相関する半定量的な情報を得る。特に、本発明は、特定のディフェンシンおよびカルグラヌリンのパターンの分析に基づいて、早産の予測のための手段を包含する。本発明により同定されたバイオマーカーのプロフィールは、炎症の存在または非存在を確実に示す。このことは、上に記載したように、羊膜内炎症が、早産、未熟児の短期合併症、ならびに脳性麻痺および慢性肺疾患のような長期の疾患（ｓｑｕｅａｌａｅ）の危険因子であるため最も重要である。
【００１５】
さらに本発明の好ましい実施形態において、このようなプロテオーム分析は、分子微生物学的な技術と組み合わされて、検出された炎症を引き起こす微生物を検出し、それにより抗菌治療法の選択の情報を与える。すなわち、本発明によるプロテオーム分析は、羊膜内炎症を罹患している患者を同定し得、そして所定の患者に由来する羊水サンプルを、従来の方法で試験し、炎症の原因である病原性微生物を同定し得る。従って、この試験データは、同定した微生物に対しておそらく有効である抗菌性レジメンを決定することに役立ち得る。
【００１６】
本発明による、羊水のプロテオーム分析は、切迫早産の危険がある羊膜内炎症を伴う早期分娩の患者を同定する、迅速、簡単かつ確実な手段を提供する。このように同定された、このコホートの患者は、感染の根絶および／または有害転帰に関連する炎症応答を調節するために、特定の介入について試験するために選択され得る。
【００１７】
本発明によるバイオマーカーは、妊娠被験体の二つの群（羊膜内炎症を有する被験体および正常な被験体）に由来する羊水から得られたサンプルの質量スペクトルを比較することにより同定された。この被験体は、標準的な臨床診断により診断された。
【００１８】
これら二つのプールは、広範に希釈して使用され、種々のチップ表面を試験した。このチップ表面は、最適の識別可能な実施のために、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）により製造され、逆相Ｈ４（Ｃ−１６長鎖脂肪族残基を伴う疎水性表面）；ＳＡＸ２（強アニオン交換体）；ＷＣＸ２（第四級アンモニウム、弱カチオン交換体；ＩＭＡＣ（カルボキシレート残基）；金属アフィニティーを含む。Ｈ４チップ表面について、最適化は、アセトニトリル勾配（１０％〜７５％）のさらなる疎水性の洗浄の工程を包含する。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に１０倍に希釈された２μｌの羊水を、２４スポットＨ４アレイのスポット上に配置し、乾燥を避けて加湿ボックス内でインキュベートする手順により、個々のピーク検出および低いシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比のために最適であることが見出された。しかし、以下により詳細に記載されるように、本発明のバイオマーカーの結合に適した結合特性を有する限り他のチップが使用され得る。
【００１９】
従って、本発明の一つの局面によると、羊膜内炎症の診断のためのバイオマーカーの検出は、バイオマーカーと吸着剤との間の結合を可能とする条件の下、患者に由来する羊水サンプルとその表面に吸着剤を有する基板とを接触させる工程を含み、次いでガス相イオン分光法（例えば、質量分析法）により吸着剤に結合したバイオマーカーを検出する。この目標のために利用され得る他の検出パラダイムとしては、最適方法（電気化学方法（ボルタンメトリー技術およびアンペロメトリー技術）、原子間力顕微鏡、および高周波方法（例えば、多極共鳴分光））が挙げられる。顕微鏡検査（共焦点および非共焦点の両方）に加えて、例示的な最適方法は、蛍光、発光、化学発光、吸光度、リフレクタンス、透過率および複屈折指数または屈折指数の検出である（例えば、表面プラスモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、回析格子カプラー導波管法または干渉法）。種々のフォーマットにおける免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）もまた、本発明に基づいて、固体相上に捕捉されたバイオマーカーの検出のために適合され得る（以下を参照）。
【００２０】
本発明において使用するための好ましい質量分析技術は、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）である（例えば、米国特許第５，７１９，０６０号および同上第６，２２５，０４７号（共にＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ）に記載される）。ここで、分析物（ここでは、一以上のバイオマーカー）をエネルギー源に提示するプローブの表面は、分析物分子の脱離／イオン化において活性的な役割を果たす。この文脈中「プローブ」は、イオン化およびガス相イオン分光計（例えば、質量分光計）への導入のために、プローブ界面と結合するためおよび分析物をイオン化するエネルギーに提示するために適合されたデバイスをいう。プローブとしては、代表的に、可撓性または剛性の固体基板が挙げられ、これは分析物が、イオン化エネルギーに提示されるサンプル提示表面を有する。
【００２１】
ＳＥＬＤＩの一つのバージョンは、Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｐｔｕｒｅまたは「ＳＥＡＣ」と呼ばれ、化学選択性表面からなるプローブ（「ＳＥＬＤｌプローブ」）の使用を含む。「化学選択性表面」は、「結合部分」または「捕捉試薬」とも呼ばれる吸着剤あるいは、例えば、共有結合または配位共有結合を形成する反応を通して捕捉試薬に結合することが可能である反応部分のいずれかに結合される表面である。
【００２２】
本明細書中語句「反応部分」は、捕捉試薬と結合することが可能である化学的部分を示す。エポキシドおよびカルボジイミジゾールは、抗体または細胞レセプターのようなポリペプチド捕捉試薬と共有結合するために有用な反応部分である。ニトリロ酢酸およびイミノジ酢酸は、ヒスチジン含有ペプチドと非共有的に相互作用する金属イオンに結合するためのキレート試薬として機能する有用な反応部分である。「反応表面」は、反応部分が結合される表面である。「吸着剤」または「捕捉試薬」は、本発明のバイオマーカーに結合することが可能である任意の物質であり得る。本発明によれば、ＳＥＬＤＩにおいて使用するための適切な吸着剤は、米国特許第６，２２５，０４７号（前出）に記載される。
【００２３】
吸着剤の一つの型は、クロマトグラフィーに代表的に使用される物質である「クロマトグラフィー吸着剤」である。クロマトグラフィー吸着剤としては、例えば、イオン交換物質、金属キレート剤、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、混合様式吸着剤（例えば、疎水性の誘引／静電反発性吸着剤）が挙げられる。「生体特異的吸着剤」は、生体分子（例えば、ヌクレオチド、核酸分子、アミノ酸、ポリペプチド、単糖類、多糖類、脂肪酸、脂質、ステロイドまたはこれらの結合体（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質）を含む吸着剤についての、別のカテゴリーである。特定の例において、この生体特異的吸着剤は、多タンパク質複合体、生体膜またはウイルスのような高分子構造であり得る。例示的な生体特異的吸着剤は、抗体、レセプタータンパク質、および核酸である。生体特異的吸着剤は代表的に、クロマトグラフィーの吸着剤よりも標的分析物に対して高い特異性を有する。
【００２４】
ＳＥＬＤＩの別のバージョンは、プローブ表面（「ＳＥＮＤプローブ」）に化学結合されるエネルギー吸収分子を含むプローブの使用を包含するＳｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｎｅａｔ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ（ＳＥＮＤ）である。語句「エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）」は、レーザー脱離イオン化源からエネルギーを吸収し、その後この分子と接触した分析物分子の脱離およびイオン化に寄与することが可能である分子を示す。ＥＡＭカテゴリーは、ＭＡＬＤＩに使用される分子を含み、しばしば「マトリックス」と呼ばれ、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ）、シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）およびジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ならびにヒドロキシアセト−フェノン誘導体により例示される。このカテゴリーもまた、例えば、米国特許出願第５，７１９，０６０号および同上第６０／３５１，９７１号（２００２年１月２５日出願）により列挙されたような、ＳＥＬＤＩにおいて使用されるＥＡＭを含む。
【００２５】
Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（ＳＥＰＡＲ）と呼ばれるＳＥＬＤＩの別のバージョンは、分析物に共有結合しかつ光（例えば、レーザー光）に曝した後のこの部分における感光性結合の破壊を介してこの分析物を放出し得る表面に結合する部分を有するプローブの使用を含む。例えば、米国特許第５，７１９，０６０号を参照。ＳＥＰＡＲおよびＳＥＬＤＩの他の形態は、本発明に従って、容易に適合され、バイオマーカーまたはバイオマーカープロフィールを検出する。
【００２６】
本発明によるバイオマーカーの検出は、特定の選択条件（例えば、吸着剤または洗浄溶液）を使用することにより増強され得る。語句「洗浄溶液」は、分析物の吸着表面への吸着に影響を及ぼすかもしくは改変するかおよび／またはこの表面から非結合物質を除去するために使用される、薬剤（代表的には溶液）である。洗浄溶液の溶出特性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズム（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｓｍ）の程度、界面活性強度、および温度に依存し得る。
【００２７】
本発明の一つの局面によると、サンプルは、「バイオチップ」により分析される。用語「バイオチップ」は、捕捉試薬（吸着剤）が結合された一般に平面を有する固体基板を示す。しばしば、バイオチップの表面は、複数のアドレス可能な位置を含み、各位置は、そこに結合された捕捉試薬を有する。バイオチップは、プローブ界面に結合するように適合され得、それにより、ガス相イオン分光計、好ましくは質量分光計へ挿入され得るプローブとして機能し得る。あるいは、本発明のバイオチップは、別の基板上へ取り付けられて、分光計へ挿入され得るプローブを形成し得る。
【００２８】
本発明に従う、バイオマーカーの捕捉のための種々のバイオチップは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ），Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ  ＣＴ），Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）、およびＰｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）のような販売元から購入可能である。これらバイオチップの例は、米国特許第６，２２５，０４７号（前出）および同第６，３２９，２０９号（Ｗａｇｎｅｒら）ならびにＰＣＴ公開広報ＷＯ  ９９／５１７７３（ＫｕｉｍｅｌｉｓおよびＷａｇｎｅｒ）およびＷＯ  ００／５６９３４（Ｅｎｇｌｅｒｔら）に記載される。
【００２９】
より具体的には、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより製造されるバイオチップは、アルミニウム基板上にむき出しの形態で提示される表面を有し、この表面に対して、アドレス可能な位置にクロマトグラフィー吸着剤または生体特異的吸着剤が取り付けられる。このむき出しの表面は、二酸化ケイ素により被膜される。
【００３０】
例示的なＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイは、バイオチップＨ４、バイオチップＳＡＸ−２、バイオチップＷＣＸ−２、およびバイオチップＩＭＡＣ−３であり、これらは、ヒドロゲルの形態の官能化架橋化ポリマーを備え、バイオチップの表面に物理学的に取り付けられるか、またはバイオチップの表面にシランを介して共有結合される。Ｈ４バイオチップは、疎水結合のためのイソプロピル官能基を有する。ＳＡＸ−２バイオチップは、アニオン交換のための第四級アンモニウム官能基を有する。ＷＣＸ−２バイオチップは、カチオン交換のためのカルボン酸塩官能基を有する。ＩＭＡＣ−３バイオチップは、キレート化によりＣｕ＋＋およびＮｉ＋＋のような遷移金属イオンを吸着するニトリロ酢酸官能基を有する。これら固定された金属イオンは次に、配位結合によりバイオマーカーの吸着を可能にする。
【００３１】
上記の原則に沿って、吸着剤を有する基板は、バイオマーカーが、この吸着剤に結合するように提示され得るために十分な期間、羊水を含むサンプルと接触する。インキュベーション期間後、この基板を、洗浄し、未結合物質を除去する。任意の適切な洗浄溶液が使用され得、好ましくは、水溶液が使用される。
【００３２】
次いでエネルギー吸収分子は、結合バイオマーカーを伴う基板へ適用される。示されたように、エネルギー吸収分子は、ガス相イオン分光計中のエネルギー源からエネルギーを吸収する分子であり、それによって基板からバイオマーカーの脱離を補助する。例示的なエネルギー吸収分子としては、上に記載したように、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸およびジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。好ましくはシナピン酸が使用される。
【００３３】
基板に結合するバイオマーカーは、ガス相イオン分光計中で検出される。このバイオマーカーは、レーザーのようなイオン化源によってイオン化され、生じたイオンは、イオン光学アセンブリによって回収され、次いで質量分析器が、通過するイオンを分散し、そして分析する。次いで検出器は、質量対電荷の割合へと、検出したイオンの情報を翻訳する。バイオマーカーの検出は、代表的に、シグナル強度の検出を含む。従って、バイオマーカーの量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）と質量（ｍａｓｓ）の両方が、決定され得る。
【００３４】
マーカーの脱離および検出によって生じたデータは、プログラム可能なデジタルコンピューターの使用により分析され得る。このコンピュータープログラムは、データを分析し、検出されたマーカーの数を示し、必要に応じて検出された各バイオマーカーについてのシグナル強度および決定された分子量を示す。データ分析は、バイオマーカーのシグナル強度を決定する工程および予め決定された統計学的分布からはずれるデータを取り除く工程を包含し得る。例えば、観察されたピークは、ある基準に対する各ピークの高さを計算することによって標準化され得る。この基準は、機器および一定尺度に応じてゼロとして設定されたエネルギー吸収分子のような化学薬品によって生じたバックグラウンドノイズであり得る。
【００３５】
コンピューターは、生じたデータを表示のための種々のフォーマットへ変換し得る。標準的なスペクトルが表示され得るが、有用なフォーマットの一つにおいては、スペクトル図からの、ピークの高さおよび質量の情報のみをそのままに、よりきれいな画像を生じ、そしてより容易に見られるようなほぼ同一の分子量を有するバイオマーカーを使用可能にする。別の有用なフォーマットにおいて、二つ以上のスペクトルが、比較され、独特のバイオマーカーを都合よく強調し、このバイオマーカーは、サンプル間でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。これらのフォーマットのいずれかを使用して、当業者はサンプル中に特有のバイオマーカーが存在するか否かを容易に決定し得る。
【００３６】
データを分析するために使用されたソフトウェアは、シグナルの分析にアルゴリズムを適用するコードを含み、シグナルが、本発明によるバイオマーカーに対応するシグナル中にピークを示すか否かを決定する。このソフトウェアはまた、観察されたバイオマーカーピークに関するデータを分類樹またはＡＮＮ分析に供し、羊膜内炎症の診断を示すバイオマーカーのピークまたはバイオマーカーのピークの組み合わせが存在するか否かを決定し得る。
【００３７】
別の局面において、本発明は、羊膜内炎症の診断を補助するためのキットを提供する。このキットは、本発明によるバイオマーカーを検出するために使用される。このキットは、羊膜内炎症の患者に由来するサンプル中に差次的に存在するバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの存在についてスクリーニングする。
【００３８】
一つの実施形態において、このキットは、本発明によるバイオマーカーを結合するのに適している吸着剤をその上に有する基板、および洗浄溶液または洗浄溶液を作製するための指示書を含み、ここで、吸着剤と洗浄溶液との組み合わせは、ガス相イオン分光計を使用してバイオマーカーの検出を可能にする。好ましい実施形態において、このキットは、固定化された金属アフィニティー捕捉チップ（例えば、Ｈ４チップ）を含む。
【００３９】
別の実施形態において、本発明のキットは、その上に吸着剤を備える第一の基板、およびこの第一の基板がプローブを形成するように位置決めされる第二の基板（ガス相イオン分光計へ挿入され得る）を含み得る。別の実施形態において、発明のキットは、分光計へ挿入され得る単一の基板を含み得る。
【００４０】
さらなる実施形態において、このキットは、ラベルまたは別個の挿入物の形態で適切な操作上のパラメーターについての指示を含み得る。例えば、この指示は、どのようにサンプルを回収するか、またどのようにプローブを洗浄するかの情報を消費者に与え得る。
【００４１】
本発明によるバイオマーカーはまた、サンプル中のバイオマーカーの存在を検出するための他の診断アッセイの製品にも有用である。例えば、このアッセイは、「吸着剤」、「結合部分」または「捕捉試薬」として、一以上のバイオマーカーに対する抗体を含み得る（但し、少なくとも一つのバイオマーカーは、カルグラヌリンである）。抗体は、バイオマーカーを含有すると推測されるサンプルと混合され、そしてバイオマーカー−抗体結合についてモニターされる。このバイオマーカーの抗体は、放射活性標識および酵素標識を用いて標識される。好ましい実施形態において、このバイオマーカーの抗体は、固体マトリックス上に固定され、その結果、このバイオマーカー抗体は、サンプル中のバイオマーカーに対して接近可能になる。次いで、このサンプルを、このマトリックスの表面に接触させ、そしてこの表面を、バイオマーカー−抗体結合についてモニターする。
【００４２】
例えば、このバイオマーカーは、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）において検出され得、バイオマーカー抗体は、固相に結合され、そして酵素−抗体結合体は、サンプル中に存在するバイオマーカーを検出および／または定量するために使用される。あるいは、可溶化かつ分離されたバイオマーカーがニトロセルロール紙に結合したウエスタンブロットアッセイが、使用され得る。高度に特異的、安定性の液体結合体と感受性色素基質との組み合わせは、迅速かつ正確なサンプルの同定を可能にする。膜のブロッキングおよび洗浄ならびに抗体の希釈のために必要とされる全ての溶液が提供される。バイオマーカーは、沈殿性基質または検出可能な基質の存在下においてフィルター紙をインキュベートすることによって、酵素または標識結合体化抗免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−Ｉｇ結合体）によって検出される。ウエスタンブロットアッセイは、所望のバイオマーカーについて５０％を越える純度を必要としない利点を有する。ＥＬＩＳＡ技術およびウェエスタンブロット技術の記述は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９８８）の１０章および１１章に見出される。
【００４３】
本発明は、以下の例示的な実施例を参照することによってさらに説明される。
【実施例】
【００４４】
（対象群）
別々の患者に由来する全１１４個の羊水サンプルを本研究において分析した。９０個のサンプルを、診断値を有するプロテオームパターンを確立するために使用し、２４個のサンプルを、試験をするためおよびアルゴリズムを確認するために使用した。羊水を、羊膜腔の微生物学的な状態および／または胎児の肺の成熟度を評価するために実施した羊水穿刺によって得た。期限終了時の患者からサンプルを、選択的な帝王切開時に得た。早期分娩を、子宮収縮（少なくとも１０分間に３回）または妊娠期間の３７週未満における頚管拡張の進行の存在として定義した。膜の早期の早期破水（ＰＲＯＭ）を、膣内の羊水の漏出、ならびにポジティブなシダ状結晶形成およびニトラジン試験の結果を検鏡検査で確認することによって診断した。研究のためのサンプルを、書面によるインフォームドコンセントを得た後Ｗａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認されたＩＲＢプロトコールの下収集した。研究のためのこれらサンプルの利用は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔのＩＲＢによって承認された。好気性細菌、嫌気性細菌および生器のＭｙｃｏｐｌａｓｍａの培養物を、グラム染色し、白血球および赤血球の計数を、収集後直ちに実施した。残りの羊水を、４℃で１０分間、７００ｇで遠心分離し、次いで、分析するまで−８０℃でアリコート中に保存した。
【００４５】
（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析についてのタンパク質プロファイリングプロトコール）
予備的な試験を実施し、タンパク質プロファイリングプロトコールを最適化した。羊水の以下の表Ｉに示すように、二つの極度な「疾患」群および「非疾患」由来するサンプルを使用して、二つのプールを生成した。
【００４６】
これら二つのプールを、広範な希釈率において使用し、最適な、識別能力について、種々のチップ表面を試験した（逆相Ｈ４：Ｃ−１６長鎖脂肪族残基を有する疎水性表面；強アニオン交換体ＳＡＸ２：第四級アンモニウム；弱カチオン交換体ＷＣＸ２：カルボン酸残基；金属アフィニティー：ＩＭＡＣ）。Ｈ４チップ表面について、最適化は、アセトニトリル勾配（１０％〜７５％）のさらなる疎水性の洗浄の工程を包含した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に１０倍に希釈した２μｌの羊水を、２４−スポットＨ４アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の製品）のスポット上に配置し、そして乾燥を避けるために加湿箱内でインキュベートする手順は、個々のピーク検出および弱いシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比に最適であることを、本発明者らは見出した。一時間後、このサンプルを吸引し、そしてこのスポットを、５μｌの２５％アセトニトリル水溶液で個々に三回洗浄し、風乾させ、次いで０．５％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリル中に希釈したマトリックス溶液（エネルギー吸収分子）を用いて覆った。
【００４７】
【表１】
2006511790.tif 000002
各患者に由来する希釈した羊水を、二連のチップへ割り当て、各チップ上の二つのスポットを、２μｌのＰＢＳのみで覆った。このマトリックスを、１μｌのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）の２０％飽和溶液（一組のチップ上）のまたはシナピン酸（ＳＰＡ）の０．５μｌの飽和溶液の二つの連続的な適用（他方の組のチップ上）いずれかから構成した。このチップを風乾させ、次いでＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェア、バージョン２．１ｂおよびバージョン３を使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＩＩ（ＰＢＳＩＩ）ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取った。ＣＨＣＡで覆ったチップを、初めに弱レーザー強度スポットプロトコール（ＣＨＣＡ−ＬＬ：レーザー強度２２０、質量範囲０〜２０，０００Ｄａ、検出器感度６で１０００と１０，０００との間に最適化し、質量焦点３３００  Ｄａ、２０ショット発射、および開始２０位〜８０位までの５位ごとの平均化）、続いて強レーザー強度スポットプロトコール（ＣＨＣＡ−ＨＬ：レーザー強度２４０、検出器の感度１０、２５ショット、２２位〜８２位までの５位ごとに平均化）を使用して分析した。ＳＰＡで覆ったチップを、単一スポットプロトコール（ＳＰＡ：レーザー強度２８５、質量範囲０  Ｄａ〜２００，０００  Ｄａ、２６，５００  Ｄａでの質量焦点を用いて２０，０００  Ｄａ〜９０，０００  Ｄａの間に最適化、検出器の感度１０、および２０ショット発射、２０位〜８０位まで５位ごとに平均化）を用いて分析した。ＰＢＳＩＩ装具を、４つの分子量ペプチドの標準物質（ａｒｇ−８−バソプレッシン、ウシインスリンβ鎖、ヒトインスリンおよびヒルジン）に対して外部からキャリブレーションした。
【００４８】
（バイオマーカーの同定および定量の手順）
目的のピークについての等電点（タンパク質が、実効電荷を有さないｐＨ）を、ＷＣＸ２およびＳＡＸ２チップ上に希釈した羊水をスポットすることによって調べ、ＳＥＬＤＩ分析の前に、付加的なｐＨの溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ＝４、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムｐＨ＝６、５０ｍＭ  ＴｒｉｓｐＨ＝８または５０ｍＭ  炭酸ナトリウムｐＨ  ＝１０）を用いて個々のスポットを洗浄した。緩衝溶液のｐＨが、その等電点より低い場合、タンパク質は、ＷＣＸ２に対して優先的に結合する実効電荷を保有する。緩衝溶液のｐＨが、その等電点を越えている場合、これは、ＳＡＸ２表面に優先的に結合する。従って、目的のタンパク質の等電点は、ピークが、ＳＡＸ２チップおよびＷＣＸ２チップそれぞれに現れる、緩衝溶液のｐＨの間にある。
【００４９】
（ゲル中におけるトリプシン消化）
ＩＤ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を、予め形成した１０〜２０％トリス−トリシンゲル（５−ウェルのゲル、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で実施した。サンプルを、非還元条件下で等量のトリシンローディング緩衝液（ＢｉｏＲａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と一緒に、５分間、羊水を煮沸することによって調製した。ゲルに、１ウェルあたり２０μｌサンプル容量を負荷し、１２０Ｖで泳動し、４０％メタノール／１０％酢酸中０．１％クマシーブルーＲ２５０を用いて１時間染色し、次いで４０％メタノール／１０％酢酸を繰り返し変えることによって脱染色した。低分子量マーカー（Ｕｌｔｒａｌｏｗ  Ｃｏｌｏｒ  マーカー、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）の製品）または質量分光計の分子量標準物の混合物（０．５  ｎｍｏｌのウシチトクロムＣおよび０．５ｎｍｏｌのウシユビキチン、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、羊水サンプルと一緒にゲルへ負荷した。
【００５０】
目的のバンドを、外科用メスを使用して正確に切り出し、切り刻み、次いでゲル中におけるトリプシン消化をペプチドマッピングキット（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒｅｍｏｕｎｔ，ＣＡ）の製品）を使用して実施した。手順の最後に０．４ｍＭ  ＨＣｌ／２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中に０．２μｇの酵素を含有する５０μｌのプロテオーム配列決定グレードトリプシン（Ｓｉｇｍａ）をゲル片を含む各チューブへ添加し、３７℃のオーブン中で１６時間インキュベートした。盲検のゲル片を、このタンパク質のバンドと一緒に処理し、トリプシンの自己溶解から生じる生成物と目的のタンパク質に由来するフラグメントとを区別した。１．５μｌの各消化物を、Ｈ４スポット上で直接に乾燥させ、次いで１μｌの１０％飽和ＣＨＣＡ溶液で覆った後ペプチドマップを、ＰＢＳＩＩ装具中で手動で読んだ。
【００５１】
（ペプチドの溶出）
各バンドに由来する少しのゲル片を、２０μｌの５０％ギ酸／２５％アセトニトリル／１５％イソプロパノール中の音性浴槽内に３０分間置いた。次いでこの溶液を取り除き、真空下でエバポレートした。そして溶出したタンパク質を、１０μｌの水に再懸濁し、この５μｌをＨ４スポット上で乾燥させ、０．５μｌの飽和ＳＰＡ溶液の二つのアプリケーションで覆ってＰＢＳＩＩ装具中で手動で読んだ。
【００５２】
（ゲル染色およびウエスタンブロッティング）
トリシンサンプル緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１：１に希釈した５μｌの羊水を、５分間煮沸し、１６％連続（ＨＮＰ−１〜３について；図４ｂ参照）または１０〜２０％勾配（カルグラヌリンについて；図４ｃ参照）の成形済のトリシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の製品）の下で負荷した。いずれかのゲルを、クマシーブルー（図４ｂ）で染色するか、またはウエスタンブロット（図４ｃ）のためにＰＶＤＦ膜フィルターへ電気泳動的に移した。簡単に言えば、フィルターを、５％ミルクでブロッキングし、次いでカルグラヌリンについてマウスＭａｃ  ３８７モノクローナル抗体（１：１０００希釈；Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）またはウサギポリクローナル抗ＨＮＰ−１〜３抗体（１：１０００希釈；ウサギ抗−ヒトＨＮＰ−１〜３；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）のいずれかを用いて２５℃で１時間インキュベートした。検出を、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合体化二次抗体およびＥＣＬ−キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
【００５３】
（オンチップ免疫アッセイ）
ＰＳ２０アレイ上のスポット（タンパク質の共有結合性の固定化のためのエポキシ−活性化）を、製造者から購入したようにＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌで希釈した２μｌのアフィニティー精製抗体溶液（カルグラヌリン捕捉または抗ヒトＨＮＰ−１〜３のためのＭａｃ  ３８７）と共に１時間インキュベートした。対のチップを、同じ濃度で、適切にマウスＩｇＧまたはウサギＩｇＧでスポットした。非反応性活性部位を、１スポットあたり４μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝９を用いて、室温で２０分間インキュベートすることによってブロッキングした。次いで、チップを、８５０ｍＭまでＮａＣｌを補充しかつ０．０５％までＴｗｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ（結合緩衝液）を用いて洗浄した。５μｌのサンプル（カルグラヌリンについて１：１０〜１：８０、またはＨＮＰ捕捉については１：５００〜１：６４，０００に結合緩衝液中に段階的に希釈した）を、前処理したスポット上でインキュベートした。一時間後、このスポットを、初めに結合緩衝溶液を用いて、次いで１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを用いて力強く洗浄し、風乾させ、適切なマトリックス溶液で覆い、次いでＰＢＳＩＩ系中で読んだ。
【００５４】
（ＥＬＩＳＡ）
羊水中のＨＮＰ−１〜３の濃度を、１９．５ｐｇ／ｍＬの感度を有する商業的に入手可能な酵素−結合体化免疫吸着アッセイ（ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｕｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により測定した。イントラアッセイおよびインターアッセイの変化率は、＜２％であった。
【００５５】
（統計学的分析）
データを、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験を使用して正規性について試験し、そしてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験（ノンパラメトリック）、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定（パラメトリック）、または一方向のＡＮＯＶＡ（多数の群間の比較についてパラメトリック）と比較した。比率間の比較を、Ｆｉｓｈｅｒ直接確立検定を使用して実施した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析、比率間の一致、およびκ計算を、ＭｅｄＣａｌｃ統計学ソフトウェアを使用して実施した（ＭｅｄＣａｌｃ，Ｂｒｏｅｋｓｔｒａａｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
【００５６】
（結果）
（（１）羊水中の「学習」ＳＥＬＤＩタンパク質プロフィール）
本発明者らは初めに９０人の妊娠女性に由来する羊水サンプルを分析した（図１）。７７個を、早期分娩（ｎ＝５０）または早産ＰＲＯＭ（ｎ＝２７）の診断を伴う患者（平均妊娠期間：２９週［９５％  ＣＩ：２８−３０］）から得、１３個は分娩時ではないが、出産予定日の患者（平均妊娠期間：３９週［９５％  ＣＩ：３９−４０］）から得た。第一の工程は、両極端の臨床的特徴および生物学的特徴を有する二つの群（つまり、「疾患」群および「非疾患」群）を生じるためのものであった。未熟児を出産した患者ならびに感染および炎症の証拠を有する患者を、「疾患」群を示すために選択した。感染を、微生物についてポジティブな羊水培養物として定義し、羊膜内炎症を、羊水ＷＢＣ数＞１００細胞／ｍｍ３として定義した。「非疾患」群は、後に問題なく出産予定日新生児を分娩した無傷の膜を有する早期分娩の患者から構成された（早産のコントロール群：ＰＴ−ＣＲＬ）。羊水の回復時の出産予定日の患者は、さらなるコントロール群（出産予定日コントロール群：Ｔ−ＣＲＬ）を示した。臨床的な症状（早期分娩または出産予定日妊娠期間）、早期分娩（＜３７週）、羊水培養物および羊水ＷＢＣ数による患者の分布を、図１に図示する。サブグループの臨床的特徴を、表１に表示する。両極端の「疾患」群および「非疾患」群は、最初の二つのカラムにある。
【００５７】
予備的データを調べることは、ＳＥＬＤＩタンパク質プロフィールのトレーシングの視覚的な検査、そして続く０．３％の質量精度統計値およびバイオマーカー統計値における「バイオマーカーのすばらしい（ｗｉｚａｒｄ）器具」を用いた評価から構成される。この分析は、情報を与えるピークを、三つのｍ／ｚ（質量／電荷の比率）範囲内に集中したことを示した。目的のこれらの範囲は、ＣＨＣＡ−ＬＬスペクトルにおける３３００〜３６００Ｄａの間、ＣＨＣＡ−ＨＬスペクトルにおける３６００〜５０００Ｄａの間およびＳＰＡによる１０，０００〜１４，０００Ｄａの間であった（図２）。これらのゾーンにおける顕著なピークを、手動で選択し、そして各患者に由来するスペクトルを、ピークの同定の正確性について検証した。選択したピークについてのｍ／ｚ値、標準化強度およびシグナル対ノイズの比率（Ｓ／Ｎ）を引き出した。次に、本発明者らは、本発明者らの診断上のプロオームプロファイルについての厳密なフィルター選択物を規定するための段階的なストラテジーを確立した。この判定基準は、以下を含んだ：（１）全てのピークは、「疾患」状態に存在する。従って「非疾患」患者に普通に存在するピークの消滅または減少についての検索よりも「疾患」患者における新しいピークについての検索であった；（２）プロフィールのピークを、少なくとも二つの異なるレーザー強度プロトコールまたはマトリックスプロトコールで検出した；（３）プロフィール中の全てのピークは、「疾患」群と「非疾患」群との間で、少なくともｐ＜０．０００１のレベルで顕著に異なるものであった（標準化強度の対数において）；（４）親のピークのみを、考慮した（個々にイオン化、最低限の酸化）；（５）ピークは、「非疾患」個体におけるベースラインのノイズが、顕著に高められた範囲に生じなかった；そして（６）最終の診断プロフィールは、極度に倹約すべきである。
【００５８】
最初の四つの判定基準を適用した後、可能性のある差次的な値を有する１３個の候補ピークが現れた（図２）。ピークの有無について客観的に記録するために、Ｓ／Ｎ比の評価に取り掛かった。選択のために使用したカットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）は、「非疾患」群にそれぞれ対応する質量についてのＳ／Ｎ比の平均±２の標準偏差であった。次いで、ブール指標を割り当てた：０の値を、ピークが、存在しなかったか、またはカットオフより下にある場合に使用し、そして１の値を、カットオフを超えるピークに割り当てた。ブール指標の合計を、各患者について算定し、Ｍスコア（質量スコア）として参照した。このスコアは、三つの異なるマトリックスプロトコールにおける観察値の合計を示す（例えば、図２における最初の二人の患者は、１２のＭスコアを有するが、３人目および４人目は、それぞれ、０および３のスコアを有する）。
【００５９】
「非疾患」の個体におけるベースラインノイズの範囲に生じなかったピーク（５番目の判定基準）を選択するために、本発明者らは、羊水の代わりにＰＢＳを用いて混合したスポット（ｎ−２０）に由来するスペクトル上の平均質量に一致する１３個で各マトリックスプロトコール（ＣＨＣＡ−ＬＬ、ＣＨＣＡ−ＨＬおよびＳＰＡ）についてのノイズレベルを分析した。本発明者らは、「非疾患」群における平均ノイズレベル（対応するｍ／ｚ値でのＳ／Ｎ）が、ＰＢＳだけを用いたノイズレベルよりも顕著に高い（ｐ＜０．０５）ピークを除去した。この判定基準を、正常な女性のトレーシングにおいて情報を与えるピークと隣接して存在するピークとの重複を最小化するために選択した。このアプローチの別の利点は、目的のピークの客観的な定量的分析および定性的分析が、すぐに可能であり、かつ試験の臨床実行において実質的な障害である「非疾患」サンプルの有効性から独立していることであった。
【００６０】
上に概要を述べたフィルタリングストラテジーの連続的な適用の後、本発明者らは、四つのピークのセットを得た。これは、最終のプロテオームプロフィールを規定した。これら４つのピークの各々についての０値または１値の合計は、ＭＲスコア（質量に限定されたスコア）を算定し、これは０〜４の範囲に及ぶ（ＭＲの算定のために選択されたピークを、図２の円内に示す；初めの二人の患者は、４のＭＲスコアを有し、三番目および四番目の患者は、それぞれ０および２であった）。従って、各患者は、二つのスコア（ＭスコアおよびＭＲスコア）を有した。表ＩＩにおいて、ＭスコアおよびＭＲスコアを構成するピークを、１のブール指標をピークのみに由来するように（つまり、ピークが存在する）、観察した質量を示した。
【００６１】
Ｍプロテオームプロフィールを構成する１３個の最初のピークに加えて、およそ１１．７ｋＤａの明確なピーク（基準またはＲピークとして規定する、図２）が、全ての液体中に存在した。このピークを、ＳＰＡスペクトルのｍ／ｚ軸の迅速な視覚性の方向付けに有用であることが分かった。
【００６２】
「疾患」状態と「非疾患」状態との識別におけるＭスコアおよびＭＲスコアの診断上の実施を試験するために、受動者動作特性曲線分析を実施した。ＭスコアおよびＭＲスコアを、感染の患者および炎症の患者と出産予定日に出産した早期分娩を伴うこれら患者との間の線引きにおいて同様に実施した。これは、ＭＲスコアを構成する４つのピークが、述べた目的（つまり、節約）のために充分であることを示す。出産予定日に出産した早期分娩の全ての患者は、０または１のいずれかのＭＲスコアを有する（図３ａの塗りつぶしていないひし形）。炎症および感染を有する全ての患者（図３ａの塗りつぶした円）は、３または４のＭＲスコアを有した。従って、ＭＲスコア＞２は、これら二つの両極端の臨床状態の区別において１００％の感度および１００％の特異性を有した。
【００６３】
ＭＲスコアが、羊膜内炎症を伴う早産の患者と微生物学的に証明された感染を有する早産の患者とを識別することが可能であるかを決定するために、全ての集団に由来するサンプルを、評価した。２を越えるＭＲスコアは、子宮内炎症の検出において９２．９％（２６／２８）の感度および９１．８％（４５／４９）の特異性を有した（ＲＯＣ曲線下の面積＝０．９４８，ＳＥ＝０．０３１，９５％  ＣＩ：０．８７１〜０．９８５）。二人の患者は、小さいＭＲスコアを伴いＷＢＣ＞１００／ｍｍ３を有した（感染について偽陰性）（図３ａ）。両者は、ネガティブな微生物培養物を有した。妊娠期間の２８週間目で早産ＰＲＯＭを示す患者は、２００  ＷＢＣ／ｍｍ３を有し、９日後時期尚早に出産した。妊娠期の２７週目で示された他の患者は、３７５ＷＢＣ／ｍｍ３を有し、腹部の外傷のために二回目の入院の間に妊娠期の３０週目で出産した。３または４のＭＲスコアを有するＷＢＣ＜１００／ｍｍ３を伴う４人の女性が存在した（炎症について偽陽性）。妊娠期の３０週〜３３週目で早産ＰＲＯＭを示した全ての患者が３日以内に出産し、そしてその全てにおいてＵｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍまたはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｉｎｉｓを羊水から単離した。
【００６４】
２より大きいＭＲスコアは、８６．２％の感度（２５／２９）、８９．６％の特異性（４３／４８）を有する羊膜内感染を同定した（ＲＯＣ曲線の下の面積＝０．８９３、ＳＥ＝０．０４２、９５％  ＣＩ：０．８０２〜０．９５２）（図３ａ）。４人の患者は、微生物について陽性の羊水培養物を有するが、特徴的なプロフィールを示さなかった（つまり、感染について偽陰性：２人の患者は、Ｐ１の存在およびＰ２の存在により２のＭＲスコアの０および２のスコアを有した）。０のＭＲを有する二人の患者は、５ＷＢＣ／ｍｍ３より少ない羊水のＷＢＣ数を有した（羊膜内炎症無し）。一人の患者は、早産ＰＲＯＭを有し妊娠期の３３週目で入院し、分娩誘導の後二日以内に出産した。羊水培養物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅについて陽性であり、２１６０ｇの体重である新生児は、９／９のＡｐｇａｒスコアを有し、合併症は有さなかった。二番目の患者は、早期分娩および無傷の膜を伴い妊娠期の２９週目で入院し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓについてポジティブの羊水培養物を有し、そして３４日後、妊娠期の３４週目で出産した。新生児は、２２６０ｇであり、合併症は有さなかった。これら二人の患者のうちのいずれの一人も、絨毛羊膜炎の組織学的な証拠は有さなかった。明白な偽陰性の結果も示す２のＭＲスコアを有する二人の患者が存在した。両者は、早産ＰＲＯＭを示し、そして羊水の培養物は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓまたはＧａｒｄｅｎｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓについて陽性であったが、羊膜内炎症の証拠は無かった。両患者を、誘導し、そして５日以内に出産させたが、胎盤は、出産時に急性絨毛羊膜炎の証拠を有さなかった。従って、プロテオーム分析の明白な偽陰性のケースは、未熟児の炎症もしくは合併症の臨床的な証拠または組織学的な証拠のいずれも有さなかった。
【００６５】
異常なＭＲスコア（３〜４）および陰性羊水培養物（感染について偽陽性の結果）を有する５人の患者が存在した。５人全てが、１００／ｍｍ３を越える羊水のＷＢＣ数、絨毛羊膜炎の組織学的証拠を有し、そして入院後間もなく未熟児を出産した。従って全ての明白な偽陽性の結果は、異常な結果および急性炎症の組織学的な証拠に関連した。
【００６６】
妊娠期間の生存率分析は、３または４のＭＲスコアを有する患者は、０〜２のＭＲスコアを有する患者よりも出産間隔のためにより短い羊水穿刺を有したことを示した（対数ランクＭａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ試験χ二乗４２．６、ｐ＜０．０００１）。出産間隔のための羊水穿刺の中央値は、３または４のＭＲスコアを有する患者においては１日であったが、０、１または２のＭＲスコアを有する患者については１９日であった（９５％  ＣＩの比率：１８〜２０日）（図３ｂ）。この差は、母親の徴候または胎児の徴候について出産した２６人の患者を、検閲した場合、顕著に高いままであった（０〜２のＭＲスコアを有する患者についての出産間隔までの羊水穿刺の中央値＝３〜４のＭＲスコアについての４３日対２日；対数ランクχ二乗２２．７、ｐ＜０．０００１、比率：２１．５日、Ｃｌ比率９５％：２１〜２２）。
【００６７】
（（２）早期患者の別々の集団におけるＭＲスコアの試験）
本発明者らは、羊水の２４サンプルの別々のセットを盲目的に分析することによってＭＲスコアの性能を試験した。二人の研究者は、液体のバンクから１２個の「疾患」サンプルおよび１２個の「非疾患」サンプルを選択した。疾患患者についての選択の判定基準は、１）無傷の膜を有する早期分娩の診断；２）羊膜内炎症（羊水ＷＢＣ＞１００／ｍｍ３）および急性組織学的絨毛羊膜炎；３）羊水穿刺後間もない自発性早期分娩、である。この集団は、二つの患者のサブグループ（微生物についてポジティブな羊水の培養物を有する６人およびネガティブな羊水の培養物を有する６人）から構成した。コントロールの患者は、早期分娩の診断および無傷の膜を有し、３３週前に羊水中に増大したＷＢＣ、ネガティブな培養物はなく、そして出産予定日に出産した。選択の判定基準を、早期分娩の際に、明白に規定した疾患または非疾患の患者におけるプロフィールを試験するために選択し、そして対照的に他の状態（例えば、癌）において疾患についての真の「最も基準になるもの」は、羊水分析の時点で患者を分類するために有効なものはない。サンプルを無作為にコード化し、そして二人の他の研究者が、記載するようにＳＥＬＤＩ実験を実施し、そして独立して分析しかつスペクトルを記録した。３または４のＭＲスコアは、１００％の感度および特異性を用いて羊膜内炎症の存在を診断した。さらに、全てのサンプルにおけるＲピークの存在に関するＣＨＣＡ−ＬＬプロトコールおよびＳＰＡ  ＳＥＬＤＩプロトコールでのＭＲスコアを構成するピークの有無の迅速な目視評価によって、研究者らは、１００％の感度および特異性を用いて炎症を再び主観的に診断することが可能であった。スコアおよび診断において１００％の評価者間の同意（κ＝１）が存在した。この方法は、微生物学的に証明した羊膜内炎症を有する群を羊膜内炎症およびネガティブな羊水培養物を有する群から区別することはできなかった。従ってプロテオームプロフィールは、感染よりも羊膜内炎症を同定する。
【００６８】
（（３）ＭＲスコアを構成するバイオマーカーの同定）
本発明者らは、Ｐ２およびＰ１が、歯周病の患者に由来する歯肉滲出液中のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって事前に検出した好中球ディフェンシンの抗菌性ペプチドに特有のピークに基づいて、好中球ディフェンシン１および好中球ディフェンシン２（それぞれ、ＨＮＰ−１およびＨＮＰ−２）であり得ると判断した。Ｐ１およびＰ２が、好中球ディフェンシンと一致するのかを決定するために、本発明者らは、一アミノ酸のみによって互いに異なるこの三つのＨＮＰペプチド間を識別しないポリクローナル抗体を使用して、オン−チップ免疫アッセイを用いて行った。
【００６９】
図４ａは、プロファイリングスペクトル中のＰ１ピーク、Ｐ２ピークおよびＰ３ピーク（Ｈ４スポットでの）も、抗−ＨＮＰ−１〜３抗体で事前に被膜したスポット上で検出したが、ＩｇＧ被膜したスポットでは検出しなかったことを図示する。さらに、ペプチドの存在を、クマシー染色したゲル（図４ｂ）およびウエスタンブロッティング（図４ａ−挿入）において適切な質量で「疾患」患者に由来するサンプル中に確認した。
【００７０】
本発明者らは、羊水中のＰ１およびＰ２の平均質量と等量の混合物（各０．５ｎｇ）の三連のスポット上に組換えＨＮＰ−１ペプチドおよび組換えＨＮＰ−２ペプチドをスポットすることによって得たピークの平均質量とを比較することによって決定する質量の正確性を推定した。ＨＮＰ−１およびＨＮＰ−２について観察した質量（羊水中）および算出した質量（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）を、表ＩＩに示す。組換えペプチドを用いた三連のスポットから算出したアッセイ内の変動性は、０．０７％であり、そして単一サンプル（組換えペプチドの混合物）と複合サンプル（羊水）の両方における質量の正確性は、０．２％であった。
【００７１】
【表２】
2006511790.tif 000003
Ｐ７およびＰ８の同定を確立するために、最初に本発明者らは、上記のようなゲル中におけるトリプシン消化を実施した。同時に、切り取ったゲルの小片からインタクトなタンパク質を溶出し、質量分光分析に供することによって、消化されたバンドの正確な質量を決定した。この技術は、切り取ったゲルのバンドが、ＳＥＬＤＩでの目的のピークに実際に対応することを確証した。
【００７２】
インタクトなタンパク質の観察した質量、等電点（表ＩＩ）、およびトリプシンによって生じたペプチドの質量を、検索可能なデータベース：
ＰｒｏＦｏｕｎｄ（ｈｔｔｐ：／／１２９．８５．１９．１９２／ｐｒｏｆｏｕｎｄ＿ｂｉｎ／ＷｅｂＰｒｏＦｏｕｎｄ．ｅｘｅ）、
Ｐｅｐｔｌｄｅｎｔ（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）、および
ＭＳ−Ｆｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｕｃｓｆｈｔｍ１４．０／ｍｓｆｉｔ．ｈｔｍ）
へ入力した。本発明者らが、本発明者らは、Ｐ７をカルグラヌリンＣ（目録番号Ｐ８０５１１）に対応させ、Ｐ８をカルグラヌリンＡ（目録番号Ｐ０５１０９）に対応させカルグラヌリンＡ、その後カルグラヌリンＢおよびカルグラヌリンＣを認識するモノクローナル抗体（１：１０００、Ｍａｃ３８７）を使用してオン−チップ免疫アッセイ（図４ｃ）を用いて実行した。図４ｂおよび図４ｄは、クマシー染色したゲルおよびオン−チップ免疫アッセイに使用した抗体と同じ抗体を使用する従来のウエスタンブロッティングでの目的のバンドを示す。
【００７３】
本発明者らは、本発明による羊水の迅速なＳＥＬＤＩ分析も、羊膜内炎症の程度、胎児の結果の顕著な予後の指標についての定量的な情報を提供し得るのかを決定するために試みた。この情報は現在、炎症よりも感染を診断する迅速な試験（例えば、グラム染色）の結果のような羊水のＷＢＣ数および臨床徴候（母親の発熱、子宮の圧痛、または胎児の頻脈）を除いて、現場の人間には利用できない。
【００７４】
この目的のために、本発明者らは、「学習」段階において研究した７７人の早産患者に由来するＭＲピークの対数−正規化強度を分析した。対数変換後、全てのデータセットのピーク強度が、正規分布であった。予想通り、両極端の「疾患」群と「非疾患」群との間における全ての４つのピークの平均シグナル強度において顕著な違いが存在した（ｐ＜０．００１）（図５）。また出産予定日に出産した早期分娩の患者（ＰＴ−ＣＲＬ）と感染も増大したＷＢＣ数もなく早期に出産した群（これは少なくとも早期に出産の幾人かの患者において、ＷＢＣ数＜１００／ｍｍ３に等しい羊膜内炎症の証拠が存在することを示す）（表Ｉにおける−ＡＦＣ−ＷＢＣ、図５）との間においてピーク強度に顕著な違いがまた存在した。
【００７５】
（（４）出産予定日での羊水のＳＥＬＤＩプロフィール）
出産予定日での羊水の１３サンプルの内の５サンプルが、ＳＥＬＤＩでの検出可能なＰ１ピークおよびＰ２ピークを有した（つまり、Ｓ／Ｎカット−オフより上）（図２ａ）。しかし、可視のＰ７ピークまたはＰ８ピーク（図２ｃ）を示すものはなく、従ってＭＲによって「非疾患」として診断した。この観察は、妊娠年齢が高くなるにつれて羊水中のＨＮＰの高まる利用性と一致する。さらに、羊水中の好中球ディフェンシン（ＨＮＰ−１およびＨＮＰ−２）の存在とカルグラヌリンの存在との間の分離を示し、そして複合的診断試験としてＭＲスコアの値を重要視させる。
【００７６】
ＨＮＰ−１〜３は、先天免疫に含まれる抗菌活性を有するペプチドであり、活性化好中球内のアズール顆粒内に大量に存在する。従って、本発明者らは、ＨＮＰピーク（Ｐ１およびＰ２）の強度が、羊膜腔内における好中球活性の程度を反映すると判断した。なぜなら、これらの細胞が、胎児の炎症の範囲を胎児起源とすると考えられるためである。この仮説を試験するために、本発明者らは初めに、ＳＥＬＤＩによって組換えＨＮＰ−１ペプチドおよび組換えＨＮＰ−２ペプチドの混合物を確実に定量するための本発明の能力を調べた。
【００７７】
２０ｎｇと１μｇ（チップ上のペプチド量）との間に、正規化したピーク強度と用量依存性の関係が存在した（図６ａおよび図６ｂ）。ＨＮＰ−１検出の限界は、５．８  ｆｍｏｌであった。興味深いことに、ＨＮＰ−１の存在下においては、ＨＮＰ−２ピークの強度は、顕著に低くなり、ピークの抑制効果またはこの二つのペプチド間の質量分光計中におけるイオン化能の差のいずれかを示した（図６ａ）。これらの結果は、ＨＮＰ−２（Ｐ１）よりも羊膜内感染のより良い定量的な指標としてＨＮＰ−１（Ｐ２）を同定した。
【００７８】
羊水のような複合サンプルにおける本発明者らの定量的な見積もりの正確性を調べるために、本発明者らはまた、ＥＬＩＳＡによってペプチドの濃度を測定した。このアッセイは、使用した抗体が、この三つのエピトープ上の共通のエピトープを認識するので、全ＨＮＰ−１〜３量を定量する。ＥＬＩＳＡは、ＳＥＬＤＩを用いて見られた群間のＨＮＰ  １〜３の濃度における有意な差を確証した（図６ｃ）。ＥＬＩＳＡによって測定したＨＮＰ量の対数と正規化したピーク強度の対数との間に顕著な線形の相関関係が存在した（Ｐ１についてのｒ２＝０．７０１、Ｐ２についての０．７０３）（図６ｄ）。ＳＥＬＤＩによって見積もったＨＮＰ−１〜３と羊水白血球数（対数ＷＢＣ／ｍｍ３）との間の相関関係は、ＳＥＬＤＩとＥＬＩＳＡによるＨＮＰ−１〜３との間に観察された相関関係よりも弱かった（Ｐ１についてのｒ２＝０．４９１、Ｐ２についてのｒ２＝０．５０１）。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、羊水における「学習」Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）プロフィールについて使用された患者の区分のフローチャートである。
【図２】図２は、「疾患」患者、「非疾患」患者、およびＴ−ＣＲＬ患者の代表的なタンパク質質量分光プロフィールを示し、この患者は、学習段階の間に調査された。Ｍ（Ｐ１−Ｐ１３）およびＭＲスコア（円で囲まれたピーク）を含む識別可能なピークが、目的の三分子重量の領域内に示される（ＣＨＣＡ−ＬＬ実験プロトコールの下３３００〜３５００ダルトン（Ｄａ）（ａ）；ＣＨＣＡ−ＨＬプロトコールの下３５００〜３８００Ｄａ（ｂ）；およびＳＰＡプロトコールの下１０−１４  ｋＤａ（ｃ））。
【図３】図３は、以下のような患者データを示す：（ａ）散布図、早期の患者（ｎ＝７７）から得た羊水サンプルのＭＲスコアと羊膜内炎症状態（ＷＢＣ＞１００細胞／ｍｍ３）または羊膜内感染（ポジティブな羊水培養の結果）から得た羊水サンプルのＭＲスコアとの間の関係性を示す。黒丸は、「疾患」患者を示す。白ひし形は、非疾患群を示す。残りの患者は、白丸により示される。（ｂ）羊水穿刺の後未分娩患者の確率の存在率分析を早期群の患者において実施した。黒四角は、３または４のＭＲスコアを有する患者を示す。白四角は、０〜２のＭＲスコアを有する患者である。
【図４】図４は、オン−チップ抗体捕捉アッセイに基づく、好中球ディフェンシン（ＨＮＰ−１〜３）としてピークＰ１、Ｐ２、およびＰ３を（ａ）、ならびにカルグラヌリンとしてピークＰ７およびＰ８を（ｂ）同定するデータを示す。抗体特異的ピークは、抗体が予め吸着された点（Ａｂ）上であるが、ＩｇＧで予め処理された点上ではない点において、プロフィールトレース（Ｈ４）により同じ質量で区別される。この羊水サンプルは、代表的な「疾患」患者および「非疾患」患者に由来する。サンプルはまた、トリシンゲル上へ負荷され、そしてクマーシーブルー（ｂ）により染色されるか、または、抗体捕捉に使用されるような同一の抗体（抗−ＨＮＰ（ａで挿入）または抗−Ｍａｃ３８７（ｃ））を使用するウエスタンブロット法のために処理される。
【図５】図５は、早期患者（ｎ＝７７）のコホートにおけるＭＲスコア（標準化したピーク強度の対数）を含むピークの定量的分析を示し、このコホートは、羊膜内炎症（＋ＷＢＣ：ＷＢＣ＞１００／ｍｍ３）、または微生物学的に証明された感染（＋ＡＦＣ：ポジティブな羊水培養の結果）の存在または非存在により分類される。線は、この群の平均を示す。
【図６】図６は、Ｈ４点上の等量の組換えＨＮＰ−１と組換えＨＮＰ−２との混合物の定量的分析を示す。（ａ）１μｇ（上）または２ｎｇ（下）のＨＮＰ１−２混合物を適用後得られたＳＥＬＤＩプロフィール。（ｂ）ＳＥＬＤＩトレースの対数標準化ピークの強度対ＨＮＰ−１−２混合物の量を、スポットした。各点は、３点の独立したスポットからの平均およびＳＤを示す。（ｃ）羊膜内炎症（＋ＷＢＣ：ＷＢＣ＞１００／ｍｍ３）または微生物学的に証明された感染（＋ＡＦＣ：ポジティブな羊水培養の結果）の存在または非存在により分類された早期患者（ｎ＝７７）のコホートにおいてＥＬＩＳＡにより測定された羊水ＨＮＰ−１〜３の濃度。線は、群の平均を示す。（ｄ）ＥＬＩＳＡにより測定された羊水におけるＨＮＰ−１〜３量（ｌｏｇ）とＳＥＬＤＩによるＰ２ピーク（ＨＮＰ−１）の対数標準化強度との間の相関。
【図１】
2006511790.tif 000004
【図２】
2006511790.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006511790.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月14日(2005.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊水サンプルにおける羊膜内炎症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための診断アッセイであって、該診断アッセイは、以下、
（Ａ）吸着剤を羊水サンプルと混合する工程であって、該吸着剤は、羊膜内炎症に関連する少なくとも一つのバイオマーカーに結合する、工程、次いで
（Ｂ）該バイオマーカーと該吸着剤との間の結合について該混合物をモニタリングする工程、
を含み、該アッセイがカルグラヌリンである少なくとも一つのバイオマーカーを検出する、診断アッセイ。
【請求項２】
前記吸着剤は、固体基板に固定された抗体である、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項３】
ＥＬＩＳＡ法である、請求項２に記載の診断アッセイ。
【請求項４】
前記固体基板は、プローブである、請求項２に記載の診断アッセイ。
【請求項５】
請求項４に記載の診断アッセイであって、前記バイオマーカーは、レーザー脱離／イオン化質量分析法により検出される、診断アッセイ。
【請求項６】
前記吸着剤は、プローブ上に固定される、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項７】
前記吸着剤は、疎水性吸着剤である、請求項６に記載の診断アッセイ。
【請求項８】
請求項７に記載の診断アッセイであって、前記プローブは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである、診断アッセイ。
【請求項９】
請求項１に記載の診断アッセイであって、該診断アッセイは、羊水の前記サンプル中の少なくとも一つのディフェンシンの存在についてさらに試験する、診断アッセイ。
【請求項１０】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項９に記載の診断アッセイ。
【請求項１１】
請求項３に記載の診断アッセイであって、該診断アッセイは、羊水の前記サンプル中の少なくともディフェンシンの存在についてさらに試験する、診断アッセイ。
【請求項１２】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項１１に記載の診断アッセイ。
【請求項１３】
請求項６に記載の診断アッセイであって、該診断アッセイは、羊水の前記サンプル中の少なくともディフェンシンの存在についてさらに試験する、診断アッセイ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の診断アッセイであって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、診断アッセイ。
【請求項１５】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡである、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項１６】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＣである、請求項１に記載の診断アッセイ。
【請求項１７】
羊水サンプル中の羊膜内炎症を示す少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するためのキットであって、該キットは、以下：
少なくとも一つの吸着剤であって、該吸着剤は、羊膜内炎症に関連する少なくとも一つのバイオマーカーに結合する、吸着剤；ならびに
該吸着剤と羊水サンプルとを混合する工程および該サンプルにおける該吸着剤とバイオマーカーとの間の結合について該混合物をモニタリングする工程についての指示書、
を含み、
該キットは、カルグラヌリンを検出する少なくとも一つの吸着剤を含む、キット。
【請求項１８】
前記吸着剤は、固体基板に固定化された抗体である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１８に記載のキットであって、該キットは、前記固体基板上に固定されたバイオマーカーを検出するために使用される酵素−抗体結合体をさらに含む、キット。
【請求項２０】
前記固体基板は、プローブである、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
請求項２０に記載のキットであって、該キットの指示書は、レーザー脱離／イオン化質量分析法による分析を明細に記す、キット。
【請求項２２】
前記固体基板は、プローブである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２３】
前記吸着剤は、疎水性吸着剤である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項２３に記載のキットであって、前記プローブは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである、キット。
【請求項２５】
請求項１７に記載のキットであって、該キットは、少なくとも一つのディフェンシンに結合する少なくとも一つの吸着剤をさらに含む、キット。
【請求項２６】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
請求項１９に記載のキットであって、該キットは、少なくとも一つのディフェンシンに結合する少なくとも一つの吸着剤をさらに含む、キット。
【請求項２８】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
請求項２１に記載のキットであって、該キットは、ディフェンシンに結合する少なくとも一つの吸着剤をさらに含む、キット。
【請求項３０】
前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡである、請求項１７に記載のキット。
【請求項３２】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＣである、請求項１７に記載のキット。
【請求項３３】
妊娠中の患者の早産の危険性を認定するための方法であって、該方法は、少なくとも一つのカルグラヌリンのレベルについて該患者に由来する羊水サンプルを分析する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、該方法は、前記少なくとも一つのディフェンシンのレベルについて前記サンプルを分析する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）である、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、方法。
【請求項３８】
妊娠中の患者の早産の危険性を認定する方法であって、該方法は、以下、
（Ａ）該患者に由来する羊水サンプルを質量分光分析に供することにより生じたスペクトルを提供する工程であって、該質量分光分析は、生物学的または化学的に誘導体化されたアフィニティー表面でプロファイリングする工程を含む、工程、ならびに
（Ｂ）パターン認識分析により該スペクトルを配置する工程であって、該パターン認識分析は、該サンプル中のカルグラヌリンの存在を示す少なくとも一つのピークに適合される、工程
を、包含する、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記パターン−認識分析は、ディフェンシンを示す少なくとも一つのピークにさらに適合される、方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法であって、前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）またはＨＮＰ−２（α−ディフェンシン２）である、方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、前記ディフェンシンは、ＨＮＰ−１（α−ディフェンシン１）である、方法。
【請求項４３】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記カルグラヌリンは、カルグラヌリンＡまたはカルグラヌリンＣである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３８に記載の方法であって、前記化学的に誘導体化されたアフィニティー表面は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ４プローブまたはＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プローブである、方法。
【請求項４６】
前記患者は、正常な範囲外に高められた白血球数を有さない、請求項３８に記載の方法。
【国際調査報告】
2006511790.tif 000010
2006511790.tif 000011
2006511790.tif 000012
2006511790.tif 000013