(57)【要約】【課題】医薬の用途に適した純度の高いヒアルロニダーゼ製剤の調製方法を提供する。【解決手段】好ましい実施態様では、そのプロセスは、最終製品の純度を上げるウイルス濾過ステップの使用を含む。そのプロセスは、現在市販されているヒアルロニダーゼ製剤の純度を高める方法を提供する。その方法は、哺乳類のソースからヒアルロニダーゼを精製するために好ましく使用される。別の実施態様では、開示されている方法は、組換えヒアルロニダーゼを精製するために使用することができる。
2006523461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
羊の精巣から精製されかつヒアルロン酸型のムコ多糖類を加水分解できるヒアルロニダーゼであって、４〜２０％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中での移動度に基づいた分子量がα型では７０〜７４ｋＤａおよびβ型では６０〜６３ｋＤａであり、そして比活性が１．２×１０4〜１．９×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇタンパク質の範囲内にあるヒアルロニダーゼを含有し、そしてチメロサールを含有していない組成物。
【請求項２】
ａ）精巣のソースを提供するステップと、
ｂ）その精巣のソースを抽出して粗製精巣抽出液を調製するステップと、
ｃ）その粗製精巣抽出液を沈澱させて沈澱を生成しその沈澱を懸濁させて粗製精巣懸濁液を生成するステップと、
ｄ）その粗製精巣懸濁液を、食品グレードの透析剤を使って透析して、粗製透析液を調製するステップと、
ｅ）その粗製透析液をイオン交換クロマトグラフィに付して、粗製溶出液を単離するステップと、
ｆ）その粗製溶出液を凍結乾燥して粗製凍結乾燥物を生成するステップと、
ｇ）その粗製凍結乾燥物を懸濁させて粗製製剤を製造するステップと、
ｈ）その粗製製剤をイオン交換クロマトグラフィに付して、精製された溶出液を単離するステップと、
ｉ）その精製された溶出液を、食品グレードの透析剤を使って透析して、精製された透析液を調製するステップと、
ｊ）その精製された透析液のウイルス濾過を実施して、精製された哺乳類のヒアルロニダーゼを調製するステップと
を含んでなる精製された哺乳類ヒアルロニダーゼを調製する方法。
【請求項３】
請求項２の方法で製造した製品。
【請求項４】
哺乳類の眼球の硝子体液から出血血液のクリアランスを加速する方法であって、
前記硝子体液から出血血液のクリアランスを加速するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを、前記硝子体液と接触させるステップを含んでなる方法。
【請求項５】
哺乳類の眼球の障害を治療するために硝子体液の融解を誘発する方法であって、
前記障害が治療されるよう、前記硝子体液を融解するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを、前記哺乳類の眼球の前記硝子体液と接触させるステップを含んでなる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
その方法が非増殖性糖尿病網膜症を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、
その方法が前増殖性糖尿病網膜症を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、
その方法が増殖性糖尿病網膜症を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法において、
その方法が加齢性黄斑変性を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の方法において、
その方法が弱視を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項５に記載の方法において、
その方法が色素性網膜炎を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項５に記載の方法において、
その方法が黄斑孔を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の方法において、
その方法が黄斑滲出症を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項５に記載の方法において、
その方法が類嚢胞黄斑水腫を治療するために実施される
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項５に記載の方法において、
前記融解によって後部硝子体剥離（ＰＶＤ）が達成される
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
緑内障を治療するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる緑内障の治療方法。
【請求項１７】
悪性疾患を治療するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる悪性疾患の治療方法。
【請求項１８】
心筋梗塞を治療するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる心筋梗塞の治療方法。
【請求項１９】
臓器移植後の水腫または炎症を低減するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる臓器移植後の水腫または炎症を低減する方法。
【請求項２０】
角膜瘢痕、混濁化またはかすみ目を治療するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる角膜瘢痕、混濁化またはかすみ目の治療方法。
【請求項２１】
放射線不透過性媒体の拡散を促進するのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる放射線不透過性媒体の拡散を促進する方法。
【請求項２２】
注射された薬剤の吸収と分散を高めるのに有効な少なくとも１国際単位の投与量を提供する量の請求項１に記載のヒアルロニダーゼを投与するステップを含んでなる注射された薬剤の吸収と分散を高める方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の組成物であって、
さらに乳糖とリン酸塩を含有し、溶液の形態にある
ことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の組成物であって、
凍結乾燥された形態にある
ことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この開示内容は、製薬用途に適した哺乳類の精巣ヒアルロニダーゼ製剤の調製方法に関する。好ましい実施態様では、そのプロセスは、羊の精巣からヒアルロニダーゼを精製するのに使用され、最終生成物の純度を高めるためウイルス濾過のステップを使用することを含む。そのプロセスは、現在市販されているヒアルロニダーゼ製剤の純度を高める方法も提供する。その方法は、哺乳類のソースからヒアルロニダーゼを精製するのに好ましく使用される。別の実施態様では、開示されている方法は、組換えヒアルロニダーゼを精製するのに使用することができる。
【０００２】
この出願は、２００３年４月１５日出願の米国仮特許出願第６０／４６３，５１６号の利益を主張するものであり、また、その全体をここに援用する。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロニダーゼは、脊椎動物と無脊椎動物中に等しく発現される、用途の広い種類の酵素である。哺乳類のヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸塩の中の２−アセトアミド−２−デオキシ−ｂ−Ｄ−グルコースとＤ−グルコース残基との間の１，４−結合のランダム加水分解反応を触媒する。
【０００４】
ウシの精巣由来のヒアルロニダーゼは、分子量が６５，０００であると報告されている（Lathrop et al. 1990 J Cell Biol 111:2939）。このウシ精巣ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸ＡとＣ（しかしＢを除く）のエンド−Ｎ−アセチルヘキソサミン結合を加水分解して、主として四糖類の残基を生成する（Ludovig et al. 1961 J Biol Chem 236:333）。
【０００５】
典型的な精製プロトコルは、ヒアルロニダーゼ活性を有する精製溶液を生成する標準のクロマトグラフィ技術の使用を必要とする。Tolksdorf et al., 1949 J Lab Clin Med 34:74およびKass & Seastone, 1944 J Exp Med 79:319に、ヒアルロニダーゼの活性を測定する一般に容認されている検定プロトコルが述べられている。これらの精製プロトコルは、比較的粗製のヒアルロニダーゼ製剤を提供するには充分であった。
【非特許文献１】Lathrop et al. 1990 J Cell Biol 111:2939
【非特許文献２】Ludovig et al. 1961 J Biol Chem 236:333
【非特許文献３】Tolksdorf et al., 1949 J Lab Clin Med 34:74
【非特許文献４】Kass & Seastone, 1944 J Exp Med 79:319
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
医薬の用途に適した純度の高いヒアルロニダーゼ製剤の調製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この発明は、羊の精巣から精製されかつヒアルロン酸型のムコ多糖類を加水分解できるヒアルロニダーゼを提供するものであり、それは、４〜２０％勾配のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中での移動度に基づいた分子量がα型では７０〜７４ｋＤａおよびβ型では６０〜６３ｋＤａであり、そして比活性が１．２×１０4〜１．９×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇタンパク質の範囲内にあるヒアルロニダーゼを含有し、そしてチメロサールを含有していない組成物である。
【０００８】
また、この発明は、精製された哺乳類ヒアルロニダーゼを調製する方法を提供するものであり、その方法は、ａ）精巣のソースを提供するステップと、ｂ）その精巣のソースを抽出して粗製精巣抽出液を調製するステップと、ｃ）その粗製精巣抽出液を沈澱させて沈澱を生成しその沈澱を懸濁させて粗製精巣懸濁液を生成するステップと、ｄ）その粗製精巣懸濁液を、食品グレードの透析剤を使って透析して、粗製透析液を調製するステップと、ｅ）その粗製透析液をイオン交換クロマトグラフィに付して、粗製溶出液を単離するステップと、ｆ）その粗製溶出液を凍結乾燥して粗製凍結乾燥物を生成するステップと、ｇ）その粗製凍結乾燥物を懸濁させて粗製製剤を製造するステップと、ｈ）その粗製製剤をイオン交換クロマトグラフィに付して、精製された溶出液を単離するステップと、ｉ）その精製された溶出液を、食品グレードの透析剤を使って透析して、精製された透析液を調製するステップと、ｊ）その精製された透析液のウイルス濾過を実施して、精製された哺乳類のヒアルロニダーゼを調製するステップとを含んでなる方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
羊ヒアルロニダーゼは、羊の精巣から精製された酵素生成物であり、ヒアルロン酸型のムコ多糖類を加水分解することができる。
【００１０】
アミノ酸配列−α型（配列番号：１）
グリコシル化のコンセンサス部位には、下線を施してある。β型のヒアルロニダーゼを生成する開裂部位は、ウシの配列と相同であり、太字で示し下線を施してある。
羊１      ＬＤＦＲＡＰＰＬＩＳＮＴＳＦＬＷＡＷＮＡＰＡＥＲＣＶＫＩＦＫＬＰＰＤＬＲＬＦＳＶＫＧＳＰＱＫＳＡＴＧ
羊５１    ＱＦＩＴＬＦＹＡＤＲＬＧＹＹＰＨＩＤＥＫＴＧＮＴＶＹＧＧＩＰＱＬＧＮＬＫＮＨＬＥＫＡＫＫＤＩＡＹＹＩ
羊１０１  ＰＮＤＳＶＧＬＡＶＩＤＷＥＮＷＲＰＴＷＡＲＮＷＫＰＫＤＶＹＲＤＥＳＶＥＬＶＬＱＫＮＰＱＬＳＦＰＥＡＳ
羊１５１  ＫＩＡＫＶＤＦＥＴＡＧＫＳＦＭＱＥＴＬＫＬＧＫＬＬＲＰＮＨＬＷＧＹＹＬＦＰＤＣＹＮＨＮＹＮＱＰＴＹＮ
羊２０１  ＧＮＣＳＤＬＥＫＲＲＮＤＤＬＤＷＬＷＫＥＳＴＡＬＦＰＳＶＹＬＮＩＫＬＫＳＴＰＫＡＡＦＹＶＲＮＲＶＱＥ
羊２５１  ＡＩＲＬＳＫＩＡＳＶＥＳＰＬＰＶＦＶＹＨＲＰＶＦＴＤＧＳＳＴＹＬＳＱＧＤＬＶＮＳＶＧＥＩＶＡＬＧＡＳ
羊３０１  ＧＩＩＭＷＧＳＬＮＬＳＬＴＭＱＳＣＭＮＬＧＮＹＬＮＴＴＬＮＰＹＩＩＮＶＴＬＡＡＫＭＣＳＱＶＬＣＨＤＥ
羊３５１  ＧＶＣＴＲＫＱＷＮＳＳＤＹＬＨＬＮＰＭＮＦＡＩＱＴＧＫＧＧＫＹＴＶＰＧＫＶＴＬＥＤＬＱＴＦＳＤＫＦＹ
羊４０１  ＣＳＣＹＡＮＩＮＣＫＫＲＶＤＩＫＮＶＨＳＶＮＶＣＭＡＥＤＩＣＩＥＧＰＶＫＬＱＰＳＤＨＳＳＳＱＮＥＡＳ
羊４５１  ＴＴＴＶＳＳＩＳＰＳＴＴＡＴＴＶＳＰＣＴＰＥＫＱＳＰＥＣＬＫＶＲＣＬＥＡＩＡＮＶＴＱＴＧＣＱＧＶＫＷ
羊５０１  ＫＮＴＳＳＱＳＱＳＳＩＱＮＩＫＮＱＴＴＹ。
【００１１】
分子量
４〜２０％勾配の還元化ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル中の移動度に基づいた分子量は、α型が７０〜７４ｋＤａであり、β型が６０〜６３ｋＤａである（下記のヒアルロニダーゼ内容の検定結果参照）。
【００１２】
同定試験
薬物物質の試料中のヒアルロニダーゼの同定は、ヒアルロニダーゼの酵素活性を実証することに基づいている。
【００１３】
〈活性ＩＤ試験〉
ヒアルロニダーゼの酵素活性の実証は、活性検定結果の非定量的変動(non-quantitative variation of activity assay)によって行う（下記「力価」の項参照）。約０．２ｍｇ／ｍＬの薬物物質の溶液を、ｐＨ６．９０の２０ｍＭリン酸ナトリウム希釈緩衝液で調製する。１６×１２５ｍｍガラス試験管中で、前記薬物物質溶液１ｍＬを、０．５ヒアルロン酸ナトリウム基質溶液１ｍＬと反応させ、次いで３７℃で１０分間インキュベートする。２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬと基質溶液１ｍＬからなるブランク液を同時に調製する。１０分後に、ブランク液と薬物物質溶液の吸光度を６００ｎｍにおいて分光光度計で読み取る。試料液の吸光度をブランク液の吸光度から差し引いて得た価は、薬物物質中にヒアルロニダーゼ活性が存在していれば、０．４より大きい筈である。これは、存在するヒアルロニダーゼは起源が精巣のヒアルロニダーゼであることを示す。というのは、公知の６種の哺乳類ヒアルロニダーゼのうちこの酵素だけが、５．０より高いｐＨで著しい酵素活性を有するからである。
【００１４】
微生物限度試験
大腸菌(E.coli)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、緑膿菌(P.Aeruginosa)またはサルモネラ菌(Salmonella)は、存在しない。総微生物汚染は、１ｇ当たり１０3個未満である。
【００１５】
ｐＨ：脱イオン水１ｍＬ中３ｇの溶液で、ｐＨが５．２〜７．２である。
【００１６】
〔不純物の試験〕
《プロセス関連の不純物》
〈アネキシンＩＩ〉  薬物物質のアネキシンＩＩ含量は、電気泳動含量検定法で測定し、企業内アネキシンＩＩ参照標準の内部標準曲線と対照して定量する。仕様：１ｍｇタンパク質当たり０．２９〜０．５７ｍｇのアネキシンＩＩ。このアネキシンＩＩ参照標準は、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィによって薬物物質から精製した。参照標準の各バッチは、ここに述べる、純度（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）、同定（ウエスタンブロット法）、タンパク質濃度及びアミノ酸含量（アミノ酸分析法）について試験しかつ電気泳動含量検定法で試験することによって、使用の資格が与えられる。
【００１７】
検定法：
アネキシンＩＩの含量は、１２ウエルの４〜２０％勾配トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルで評価する。薬物物質の試料は、最終濃度０．１２ｍｇ／ｍＬで、２Ｘトリス−グリシンＳＤＳ試料調製用緩衝液１０ｍＬ当たり５００μＬの２−メルカプトエタノールを含有する緩衝溶液によって還元し変性する。アネキシンＩＩ参照標準の標準曲線を、７．４２、１４．８４、２９．６８、４４．５２および７４．２μｇ／ｍＬの５種の濃度（それぞれ、Ｓｔｄ１〜５と呼称する）で作成した。これらの液は、２倍の試料調製用緩衝液（上記事項参照）を還元する際に、１：１の比率で希釈する。指定ロットのVitrase（登録商標）完成製品をシステム適正標準として使い、やはり０．１２ｍｇ／ｍＬで調製する。一試料レーンを、広範囲の還元分子量標準の試料に使用する。試料と標準は、全て、下記の順序で、１ウエル当たり１０μＬの容積の試料で負荷する。
【００１８】
2006523461.tif 000003
【００１９】
ＴＳ＝薬物物質の試験試料
ＳＳＳ＝システム適性標準ロット
Ｓｔｄ１〜Ｓｔｄ５＝企業内アネキシンＩＩ参照標準の標準曲線
ＭＷＳ＝広範囲の分子量標準。
【００２０】
ゲルは、一定電圧１２０Ｖで１２０±５分間、またはブロムフェノールブルーのトラッキング染料色素ラインがゲルの底に到達するまで電気泳動させる。実験が完了したとき、ゲルはそのプラスチックカセットから注意深く取り出し、次いでコロイド状クーマシーブルー(Coomassie blue)色素溶液５０ｍＬ中に入れる。ゲルは、ゲルロッカープラットホームで絶えず攪拌しながら１３〜１７時間、染色を続ける。
【００２１】
染色が完了したら、前記ゲルは、ゲルロッカープラットホーム上で脱イオン水中で少なくとも７時間、そのプロセス中に水を何回も変えて使用して脱色素を行う。
【００２２】
脱色素に続いて、そのゲルを走査型レーザ濃度計(scanning laser densitometer)で定量分析する。その濃度計(densitometer)によって、バンド濃度(band density)のヒストグラムを作成し、そのヒストグラムを積分して、ヒストグラム中のその「ピーク」の下の面積を得る。
【００２３】
計算：
１．標準曲線の各アネキシンＩＩ濃度についての前記バンド濃度のピーク面積のデータ点を、それらの理論的濃度に対して、相関係数（ｒ2）値と曲線式を備えたMicrosoft Excelにプロットする。
２．全薬物物質とシステム適性試料中のアネキシンＩＩバンド質量（μｇ単位で）を、定量したバンドピークの面積から計算して、標準曲線から内挿する。
３．３試料（薬物物質またはシステム適性試料）の各セットについてアネキシンＩＩの平均質量を計算する。
４．各試料についてアネキシンＩＩの平均質量を下記式を使って全タンパク質の百分率で表す。
【００２４】
アネキシンＩＩの百分率＝試料中アネキシンＩＩの平均値（μｇ単位で）×１００／負荷された全タンパク質（μｇ単位で）
アネキシンＩＩの含量が１ｍｇのタンパク質当たり０．２９ｍｇと０．５７ｍｇの間であれば、その試料は、要件を満たしている。
【００２５】
システム適性の基準：
この検定から得た結果は、以下の基準が満たされない場合、容認できない。
１．濃度計(densitometer)は、その内部較正チェックに合格しなければならない。
２．アネキシンＩＩのバンドは、ゲル試料レーン１２中で３１ｋＤａと３６．５ｋＤａの分子量標準の間を移動しなければならない。
３．３回試験したシステム適性試料の平均値は、歴史的に求められている価の１５％以内でなければならない。
【００２６】
容認基準：
この検定から得たデータは、以下の基準が満たされない場合、容認できない。
１．標準曲線のｒ2計算値は、≧０．９８でなければならない。
２．３回のデータ点（ＳＳＳとＴＳの試料）について分散の百分率係数(percentage coefficient of variance)は、≦１０％でなければならない。
３．試料についてアネキシンＩＩの計算平均値は、薬物物質について０．０７６〜０．３９μｇの範囲内でなければならない。
μｇの範囲内でなければならない。
【００２７】
〈ＩｇＧフラグメント〉  薬物物質のＩｇＧ重鎖フラグメント（「ＩｇＧ」）含量を、アフィニティカラムを使う高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法とＩｇＧ参照標準曲線で定量する。仕様：≦０．２３ｍｇＩｇＧ／ｍｇタンパク質。
【００２８】
ＩｇＧ参照標準は、プロテインＧクロマトグラフィによって、一段アフィニティ精製法で調製する。ＩｇＧ参照標準の各バッチは、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、同定（ウエスタンブロット法）、濃度（比色タンパク質検定法）及び含量（ＨＰＬＣ法）について試験することによって使用の資格を与えられる。
【００２９】
この方法は、２８０ｎｍに設定された波長可変ＵＶ検出器を備えた標準のＨＰＬＣシステムを利用する。カラムは、４．６×１００ｍｍのＰｏｒｏｓ−Ｇアフィニティカラムに直列に連結された４．６×１００ｍｍのＰｏｒｏｓ−ＯＨプリカラム(pre-column)である。薬物物質の試料は、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを補充した０．０５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ７．２の移動相に負荷する。全てのＩｇＧが前記カラムに保持され、０．１Ｍのグリシン、５％酢酸ｐＨ２．５の溶離緩衝液で取り出される。クロマトグラフィは、全て、周囲温度下で実施した。溶離勾配は、サイクル時間が１０分であり、以下の形を取っている。
【００３０】
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【００３１】
溶媒Ａ＝０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．１５Ｍの塩化ナトリウム
溶媒Ｂ＝０．１Ｍのグリシン、５％酢酸、ｐＨ２，５。
【００３２】
標準、試料および照合試料の調製：
ＩｇＧの含量は、企業内の精製された羊精巣ＩｇＧ参照標準と比較して求める。そのＩｇＧ標準は、溶媒Ａ中、５００、２５０、１２０、６０および３０μｇ／ｍＬの濃度で調製する。このＩｇＧ標準を、１注入当たり１００μＬで前記カラムに負荷する。
【００３３】
１０ｍｇの薬物物質を５ｍＬメスフラスコ内で３．５ｍＬの溶媒Ａに溶解することによって、薬物物質の試料を調製する。これら試料を、短時間混合し次いで少なくとも１２時間、２〜８℃でインキュベートして、完全に溶解する。さらに溶媒Ａを加えて、薬物物質の試料を最終容積５．０ｍＬにして、混合する。試料を、３ｍＬシリンジに取り付けた０．４５μｍのシリンジフィルタで濾過する。全ての薬物物質試料を１００μＬの注入液で分析する。与えられた薬物物質のＩｇＧ含量は、３回別個に重量を測定し、各々ｎ＝２回の注入で分析する。薬物物質の試料は、２〜８℃で３日間まで貯蔵してもよい。
【００３４】
Vitrase（登録商標）の完成製品の照合試料を、２バイアルの内容物を各々０．５ｍＬの溶媒Ａに溶解することによって調製する。短時間攪拌して混合し、次いで少なくとも３０分間静置して完全に溶解させる。前記バイアルの内容物を混ぜ、次いで薬物物質について記載したように濾過する。各照合試料の製剤を、１００μＬ容積を２回注入することによって分析する。照合試料の製剤は、２〜８℃で３日間まで貯蔵することができる。
【００３５】
システムの平衡化：
システムは、溶媒Ａで２０分間平衡化する。すなわち、最初５分間は流量２ｍＬ／分で、次いで１５分間は流量４ｍＬ／分で平衡化する。溶媒Ａを４回１００μＬずつ注入して、ＵＶ信号を確実に安定化させる。
【００３６】
検定法：
安定なベースライン（基準線）が確立されたならば、５種類のＩｇＧ標準濃度の標準曲線を１標準濃度あたり１注入で作成する。続いて、全ての薬物物質試料を注入し、次いで照合試料を注入する。２５０μｇ／ｍＬ（または２５μｇ）のＩｇＧ標準の最後の１対の注入液を使って、保持時間と信号の振幅がクロマトグラフィ試験中に変化しなかったことを確認する。
【００３７】
計算：
試料中のＩｇＧの濃度を求めるため、まず、１標準ごとに標準曲線のピーク面積対注入された理論的質量の線形回帰分析を行って、相関係数（ｒ2）値、勾配及びｙ切片を求める。
注入されたＩｇＧ質量（μｇ）＝（試料のピーク面積−切片）／勾配
ＩｇＧの濃度（μｇ／ｍＬ）＝  注入されたＩｇＧ質量（μｇ）／注入容積（ｍＬ）。
【００３８】
試料のタンパク質濃度を比色タンパク質検定法で測定し、その測定値を使って試料中の全タンパク質１ｍｇあたりのＩｇＧ含量を計算する。
ＩｇＧの濃度（μｇ／ｍＬ）／タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）＝（μｇIgG／μｇprotein）＝ＩｇＧ含量／全試料タンパク質（μｇ）
その含量がタンパク質１ｍｇあたり≦０．２３ｍｇのＩｇＧであれば、要件を満たしている。
【００３９】
相対誤差（％）は、下記式によって計算する（差引き数の絶対値を使用）。
ＲＥ（％）＝１００×［注入１（μｇ）−注入２（μｇ）］／２
ＩｇＧの相対保持時間は、下記式によって計算する。
ＲＲＴ＝ＲＴsample／ＲＴ250μg/mL(or 25μg)standard。
【００４０】
システム適性：
この検定から得た結果は、下記のクロマトグラフィの条件が満たされなければ、容認できない。
１．２５μｇのＩｇＧ標準についての理論的プレートカウントは、≧２３００でなければならない。
２．ＩｇＧについてのピーク保持時間は、４．１７±０．５分以内でなければならず、そして非結合タンパク質は、０．７９±０．５分で溶離しなければならない。
３．負荷から溶離緩衝液へ切り替わる時のベースラインのシフトは、ブランク注入の際に０．００５ＡＵを超えてはならない。
４．２５０μｇ／ｍＬ（または２５μｇ）のＩｇＧ標準の３注入についての変動係数（％）は、≦１０％でなければならない。
【００４１】
容認基準：
この検定から得たデータは、下記基準を満たさなければ、容認できない。
１．標準曲線についてのｒ2値は、≧０．９９でなければならない。
２．全ての試料濃度は、ＩｇＧ標準曲線の範囲内に入らなければならない。
３．２５μｇ標準の各注入量は、２２．５〜２７．５  μｇ（±１０％）の範囲内に入らなければならない。
４．同じ試料のどの二つの注入量についても、相対誤差（％）が≦５％でなければならない。
５．ＩｇＧの相対保持時間は、０．９〜１．１分以内でなければならない。
【００４２】
〈乾燥時の減量〉  １１０℃で一夜乾燥したガラス栓付き秤量びんの風袋を量る。そのびんの中に１５０ｍｇ±１０ｍｇの薬物物質の試料を入れ、次いでそのびんおよびその内容物を正確に秤量する。そのびんを乾燥室に入れ、その乾燥室を２５４ｍｍ（１０インチ）Ｈｇより低く減圧して、蓋は外して乾燥室内に入れたままで、６０℃で２時間±１分間乾燥する。減圧を解除して乾燥室の扉を開き、直ちにふたを戻す。乾燥された容器と試料を、周囲温度まで冷めた後に秤量し、次いで風袋測定で求めた重量を差し引く。乾燥によって失われた原重量の百分率を計算する。乾燥による減量は、原風袋重量の５％を超えてはならない。
【００４３】
《製品に関連する不純物》
〈定量〉
〈ヒアルロニダーゼ含量〉  薬物物質試料のヒアルロニダーゼ含量は、電気泳動法で定量する。ヒアルロニダーゼは、Vitrase（登録商標）完成製品によって提供されるシステム適性試料による企業内ヒアルロニダーゼ参照標準の標準曲線に対照して定量する。仕様：０．１０〜０．２３ｍｇのヒアルロニダーゼ／ｍｇタンパク質。
【００４４】
羊ヒアルロニダーゼの標準は、薬物物質から、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィおよびコンカナバリンＡアフィニティクロマトグラフィによって精製する。参照標準のバッチは、純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、同定（ウエスタンブロット法）、タンパク質濃度およびアミノ酸含量（アミノ酸分析法）について試験することによって、ならびに電気泳動含量検定法で定量する。還元条件下で、羊の精巣ヒアルロニダーゼは、見掛けの質量が約７ｋＤａ異なる一対の別個のバンドとして移動する。両方の形態が全体の酵素活性を保持している。
【００４５】
検定法：
ヒアルロニダーゼ含量は、１２ウエルの４〜２０％勾配のトリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルで評価する。薬物物質の試料は、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬで、２Ｘトリス−グリシンＳＤＳ試料調製用緩衝液１０ｍＬあたり５００μＬの２−メルカプトエタノールを含有する緩衝溶液により還元し変性した。アネキシンＩＩ参照標準の標準曲線を、０．０９２、０．０５０６、０．０２７６、０．０１３８および０．００９２μｇ／ｍＬの五種の濃度（それぞれ、Ｓｔｄ１〜５と呼ぶ）で作成する。これらの液は、２×試料調製用緩衝液（上記参照）で還元する際に１：１の比率で希釈した。指定ロットのVitrase（登録商標）完成製品をシステム適正標準として使い、やはり０．１ｍｇ／ｍＬで調製する。一つの試料レーンを、広範囲の還元分子量標準の試料に使用する。全ての試料と標準は、１ウエルあたり１０μＬの容積の試料で負荷する。
【００４６】
2006523461.tif 000005
【００４７】
ＴＳ＝薬物物質の試験試料
ＳＳＳ＝システム適性標準ロット
Ｓｔｄ１〜Ｓｔｄ５＝企業内アネキシンＩＩ参照標準の標準曲線
ＭＷＳ＝広範囲の分子量標準。
【００４８】
各ゲルは、一定電圧１２０Ｖで１２０±５分間、またはブロムフェノールブルーのトラッキング色素がゲルの底に到達するまで電気泳動させる。実験が完了したとき、ゲルはそのプラスチックカセットから注意深く取り出し、次いでコロイド状クーマシーブルー色素溶液５０ｍＬの中に入れる。ゲルは、ゲルロッカープラットホームで絶えず攪拌しながら１５〜１７時間、染色を続ける。
【００４９】
染色が完了したら、前記ゲルは、ゲルロッカープラットホーム上で脱イオン水中で少なくとも７時間、そのプロセス中に水を何回も変えて使用して脱染色を行う。
【００５０】
脱染色に続いて、そのゲルを走査型レーザ濃度計で定量分析する。
【００５１】
計算：
標準曲線中の各標準の理論的質量値に対照してバンド濃度の全ピーク面積をプロットして、ｒ2値とそのラインについての式とを得る。
【００５２】
各試料中のヒアルロニダーゼバンドの合計の全質量を、試料のバンド濃度のピーク面積および標準曲線からの式を使って計算する。
【００５３】
三つのヒアルロニダーゼ試料からなる各セットのヒアルロニダーゼの平均質量を計算する。
【００５４】
ヒアルロニダーゼの平均質量を下記式によって全タンパク質の百分率で表す。
ヒアルロニダーゼ（％）＝１００×［試料ヒアルロニダーゼの平均量（μｇ）］／負荷された全タンパク質（μｇ）
含量が０．１０〜０．２３ｍｇヒアルロニダーゼ／ｍｇタンパク質であれば、その試料は要件を満たしている。
【００５５】
システム適性の基準：
この検定から得た結果は、以下の基準を満たしていない場合、容認できない。
１．濃度計は、その内部校正検査に合格しなければならない。
２．ヒアルロニダーゼの各バンドは、ゲル試料レーン１中のホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤａ）とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（５５．４ｋＤａ）の分子量標準の間を移動しなければならない。
３．３回試験したシステム適性試料の平均値は、歴史的に求められた値の２標準偏差の範囲内に入らなければならない。
【００５６】
容認基準：
この検定から得たデータは、以下の基準が満たされない場合、容認できない。
１．各標準曲線は、少なくとも５個の点で構成されていなければならない。
２．各標準曲線のｒ2の計算値は≧０．９８でなければならない。
３．三つのデータ点の組の各々についての変動係数（％）は、１５％を超えてはならない。
４．薬物物質試料のヒアルロニダーゼ含量の平均値は、０．０９２〜０．３２μｇの間に入らなければならない。
【００５７】
〈全タンパク質〉  全タンパク質検定法は、溶液中のタンパク質に対するクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の結合に基づいた比色法である。タンパク質は、ウシ血清アルブミンの標準曲線に対して相対的に定量する。仕様：０．５５〜０．８３ｍｇタンパク質／ｍｇ薬物物質。
【００５８】
溶液：
酸性色素濃縮物、標準のウシ血清アルブミンおよび０．９％食塩水を、商業的供給源から入手する。その色素濃縮物を脱イオン水で５：１の比率で希釈し、使用する前に、Whatman−＃１濾紙で濾過する。この５倍希釈の色素溶液は、２〜８℃で貯蔵すれば、１４日間まで安定である。
【００５９】
約１０ｍｇ（±０．５ｍｇ）の薬物物質試料を秤取し、０．９％食塩水で、約１ｍｇ／ｍＬに希釈する。このような薬物物質製剤を少なくとも１２時間静置して、使用する前に完全に溶解していることを保証する。次に、その試料を、緩やかに攪拌して混合し、次いで０．２μｍの酢酸セルロース膜で濾過する。再構成された薬物物質試料溶液は、２〜８℃で貯蔵すると、７日間まで使用してもよい。
【００６０】
検定法：
ウシ血清アルブミンの保存液は、２．０ｍｇ／ｍＬの溶液である。最終濃度が０．９、０．７、０．５、０．３および０．１ｍｇ／ｍＬで容積が５００μＬの各希釈液を、０．９％の食塩水で調製する。前記標準は、毎日新しく調製する。０．９％食塩水だけからなるブランク液も含まれる。全ての試料と標準を、１３×１００ｍｍのガラス試験管３本に各１００μＬずつピペットで採取する。
【００６１】
検定は、希釈色素試薬５．０ｍＬを、各試験管に、２０秒間隔でピペットで入れることによって始める。各添加を行った後、試験管をプラスチック製キャップで蓋をして、短時間攪拌して混合する。その検定液を室温で１０分間インキュベートする。食塩水のブランク液を使って、分光光度計の５９５ｎｍでのブランク測定（較正）を行い、これら試験管は分光光度計のキュベットホルダ内で直接読み取る。１０分間インキュベートした後、試験を始めたときと同じ順序で、すなわち同じ２０秒間隔で試料を読み取る。
【００６２】
計算：
タンパク質の濃度は、５９５ｎｍの吸光度（Ａ595）標準曲線対理論的標準濃度の回帰線から内挿して求める。この検定が報告する範囲は、０．３５〜０．９ｍｇ／ｍＬであるので、この範囲を超える薬物物質試料は、標準曲線の範囲内に入るようにした新しい希釈液で再度検定しなければならない。
【００６３】
薬物物質は、クーマシーブルー色素に対しＢＳＡと同様には応答しないタンパク質（特に、ＩｇＧフラグメント）を含有しているので、この検定法で得た全ての濃度に対して１．２の補正係数を適用する。
【００６４】
薬物物質試料の濃度は、ｍｇタンパク質／ｍｇ薬物物質の単位で報告する。これは、下記式によって、ｍｇ／ｍＬの濃度から計算する。
ｍｇタンパク質／ｍｇ薬物物質＝（ＰＣ×１０ｍＬ）／ＳＷ、
ここに、ＰＣは、ｍｇ／ｍＬ単位でのタンパク質濃度であり、ＳＷは、ｍｇ単位での元の薬物物質試料の重量である。
【００６５】
タンパク質含量が０．５５〜０．８３ｍｇタンパク質／ｍｇ薬物物質であれば、その試料は要件を満たしている。
【００６６】
さらに、変動係数（％ＣＶまたは％ＲＳＤ）は、全ての薬物物質について３回ずつ試験して計算する。
【００６７】
システムの適性：
この検定から得た結果は、下記の基準を満たさなければ、容認できない。
１．分光光度計の較正は、最新の較正でなければならない。
２．ブランクでのベースラインの読み取りは、少なくとも２０秒間、０．００±０．０１ＡＵで安定でなければならない。
【００６８】
認容基準：
この検定から得たデータは、以下の基準が満たされない場合、容認できない。
１．標準曲線についてのｒ2値は、≧０．９８でなければならない。
２．全ての試料は、この検定法の報告範囲が０．３５〜０．９ｍｇ／ｍＬの範囲内に入らなければならない。
３．全薬物物質試料の３回ずつの試験値の％ＣＶ値は、≦１０％でなければならない。
【００６９】
〈力価の検定〉
酵素を一定の期間、基質のヒアルロン酸とともにインキュベートし、次いで分解しなかった基質を、酸性アルブミン溶液と反応させたとき生ずる濁りの濁度で検出するヒアルロニダーゼ活性検定法によって、力価を測定する。濁度は、分光光度計によって６００ｎｍで測定する。ヒアルロニダーゼの活性は、同時に、ＵＳＰのヒアルロニダーゼ標準曲線に対して相対的に定量する。比活性は、上記活性と全タンパク質の検定のからの値を使って計算する。力価の仕様：７．３２×１０3〜１．３７×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇ薬物。比活性の仕様：１．２×１０4〜１．９×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇタンパク質。
【００７０】
溶液：
０．５ｍｇ／ｍＬの基質ヒアルロン酸ナトリウムの溶液を、ｐＨが５．３０〜５．３５の０．３Ｍリン酸ナトリウム溶液で調製する。ＵＳＰのヒアルロニダーゼ標準、薬物物質および照合試料の溶液は、全て、０．４５％の塩化ナトリウムと０．０１％のウシ血清アルブミンを補充したｐＨが６．９０±０．０５の２０ｍＭリン酸ナトリウムの希釈緩衝液で調製する。前記酸性アルブミン溶液は、０．１％のウシ血清アルブミンを含有するｐＨが３．７５±０．０５の２４ｍＭの酢酸ナトリウム溶液である。
【００７１】
ＵＳＰのヒアルロニダーゼ標準溶液は、呼称活性１５ＵＳＰ−Ｕ／ｍＬが得られるように調製する。ＵＳＰヒアルロニダーゼの最新のロットの場合、これは、標準物４５．３ｍｇを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に最終容積２０ｍＬで溶解することを意味する。
【００７２】
薬物物質の試料は、まず、容積１０ｍＬの０．９％食塩水で、約１ｍｇ／ｍＬまで希釈する。この最初の食塩水による希釈液を、さらに、検定すべき特定の薬物物質のロットについて製造業者が発表している活性値に基づいて、約９ＵＳＰ−Ｕ／ｍＬの最終濃度が得られるように希釈する。この二次の希釈は、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で行う。
【００７３】
照合試料は、Vitrase（登録商標）の完成製品の複数ロットから下記の方法で調製する。１バイアルの完成製品を、１０ｍＬのシリンジから送り出される０．９％食塩水５．４ｍＬに溶解する。この溶液を５μｍのフィルタニードルを通して濾過して、その元のバイアルに戻す。この溶液１２５ｍＬを２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で最終容積２５ｍＬに希釈して照合試料を得る。
【００７４】
検定法：
すべての検定法が、１０点の標準曲線、照合試料および薬物物質試験試料で構成されている。その標準曲線は、１６×１２５ｍｍのガラス試験管に入れた最終容積１ｍＬの２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、１．５、３．０、４．５、６．０、７．５、９．０、１０．５、１２．０、１３．５および１５．０ＵＳＰ−Ｕ／ｍＬの濃度で、ＵＳＰヒアルロニダーゼ標準を含んでいる。照合試料は、ガラス試験管にピペットで採取した二次希釈液１ｍＬからなっている。同様に、薬物物質試料は、１ｍＬの容積であり、ピペットで試験管に採取する。典型的には、薬物物質試料は、検定手順の自然変動を考慮して、複数製剤について複数回、ｎ＝２検定／製剤で検定する。標準、照合試料および薬物物質の試料は、全て、短時間攪拌して混合し、次いでプラスティック製蓋で栓をした後、３７〜３８℃の循環湯浴中で５分間、プレインキュベートを行う。
【００７５】
その試験管の蓋を取って、１ｍＬの０．５ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸塩溶液をピペットで採取して試験管に入れ、試験管に再び栓をして、直ちに攪拌し、その試験管を前記湯浴に戻す。その溶液は、発泡を避けるため、比較的低速度で攪拌するように注意しなければならない。検定は、全てが基質溶液を受け取ってしまうまで、３０秒ごとに開始する。３７〜３８℃でのインキュベーション時間は、４５分間である。ｔ＝４５分において、酸性アルブミン溶液１０ｍＬを添加することにより検定物を冷却する。すなわち、試験管の栓を取り、酸性アルブミンを添加し、再び栓をして、ゆっくり逆転させて混合する。これらの検定物は、正確に、開始されたのと同じ順序で冷却し、次いで室温で２０分間静置した後、ｔ＝６５分の時点（それぞれの開始時点に対して）で分光光度計で６００ｎｍで読み取る。６００ｎｍで読み取るため、試験管を先ずゆっくり逆転させて再混合し、次いで試料を使い捨てポリスチレン製４．５ｍＬキュベット中にデカントする。試料は、３０秒ごとに読み取り、プロセスの時間的密集進行(temporal lockstep)を続行する。分光光度計は、脱イオン水を満たしたキュベットで最初にブランク測定をしておく。
【００７６】
注：この検定を通して、これら各イベントの相対的タイミングは、重要である。濁りの発生は、時間に対して非線形であるので、タイミングが不適切であると、タイミングを誤った試料から正しくないまたは不正確な活性を生じる。
【００７７】
計算：
標準曲線は、ＵＳＰ−Ｕ／ｍＬ対６００ｎｍでの吸光度測定値（Ａ600）の三次の多項式関数としてプロットされる。照合試料と薬物物質試料の活性値は、次いでそれら試料のＡ600の価を基に、その標準曲線から内挿して求める。簡単さおよび再現性の目的のため、分析者たちは、スプレッドシートの活性計算表をセットアップして、それにより、生のＡ600データ、標準曲線の式からの多項係数値、質量値（薬物物質試料のみ）ならびに薬物物質および照合試料についての試料希釈係数を入れて、スプレッドシートの各固定セルに予め入ておいた式からこれら試料についての計算活性値を得るのが、最も便利であることに気付くであろう。
【００７８】
活性値が７．３２×１０3〜１．３７×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇ薬物物質の範囲内であれば、その試料は、力価の要件を満たしている。
【００７９】
システムの適性の基準
この検定から得た結果は、下記の基準を満たさなければ、容認できない。
１．分光光度計の較正は、最新の較正でなければならない。
２．ＵＳＰ標準曲線の相関係数（ｒ2値）は、≧０．９９９でなければならない。
３．照合試料の活性値は、完成製品の当該ロットについて歴史的に確立された値の±６％以内に入らなければならない。
４．反復した検定（例えば、照合試料）間の相対誤差（％）は、≦６％でなければならない。
【００８０】
認容基準
この検定から得たデータは、下記の基準を満たさなければ、容認できない。
１．各々の試料検定での測定濃度は、３．０〜１３．５ＵＳＰ単位／ｍＬの範囲内に入らなければならない。
２．反復した検定間の相対誤差（％）は、≦６％でなければならない。
【００８１】
〈比活性〉  比活性は、活性と全タンパク質検定結果の商値として計算される。その比活性が１．２×１０4〜１．９×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇタンパク質の間であれば、その試料は、要件を満たしている。
【００８２】
〈細菌の内毒素〉  薬物物質１ｍｇあたり６０ｅｕ未満。
【００８３】
［ヒアルロニダーゼの調製方法］
この開示事項は、製薬用途に適したヒアルロニダーゼ製剤を調製するプロセスに関する。好ましい実施態様では、このプロセスは、最終製品の安全レベルを高めるためにウイルス濾過ステップを使用することを含んでいる。このプロセスは、現在市販されているヒアルロニダーゼ製剤の純度を高める方法を提供する。その方法は、哺乳類のソースからのヒアルロニダーゼを精製するのに好ましく使用される。別の実施態様では、開示されている方法は、組換えヒアルロニダーゼを精製するのに使用することができる。
【００８４】
［組織のソース］
哺乳類のβグルクロニダーゼ酵素の精製された製剤は、好ましくは、哺乳類精巣から調製される。好ましい哺乳類ソースの例としては、羊、ウシ、ブタおよびウマがある。しかし、どの哺乳類のソースもここに記載の方法で使用することができる。現在、４，６２９種類の現在知られている哺乳類の種がある。目、科、亜科および属を含む分類の階層が、Wilson,D.E.および D.M.Reeder（編）１９９３の「Mammal Species of the World」Smithsonian Insitution Press, 1206 p.（Smithsonian Insitution Press から入手できる）に見られる。なお、この文献をここに援用する。
【００８５】
［ヒアルロニダーゼの抽出］
典型的には、ヒアルロニダーゼを精製する準備ステップは、好ましい哺乳類のソースから精巣を単離するステップである。その精巣は、直ちに処理することができ、または好ましくは後の使用のために冷凍される。冷凍された場合、その精巣は２〜８℃で４０〜４４時間解凍しなければならない。次いで、その精巣を細かく刻んで、濾過して、ヒアルロニダーゼを抽出する。次いで、その単離された物質を、まず、好ましくは１５％の飽和硫酸アンモニウム溶液で沈澱させる。この緩衝液の温度は、好ましくは２〜８℃に維持する。この沈澱ステップのｐＨは、好ましくは３．６０±０．１のｐＨにに維持する。その沈澱を、好ましくは５時間たらず濾過する。濾過を行った後で、その物質のヒアルロニダーゼ活性とタンパク質濃度について検定し、そして全ユニットを計算する。次に、その単離物を第二の塩析(salt cut)または沈澱操作を行う。溶液のｐＨを３．６０±０．１に保持しながら、硫酸アンモニウムを約８５％の飽和度のレベルまで添加する。これらのプロセスが、図１および図２にさらに完全に記述してある。
【００８６】
図３および図４は、ヒアルロニダーゼを哺乳類の精巣から調製する際の第二のステップを詳解する。精製ステップ１（１５／８５）の精製による生成物を解凍し、次に硫酸アンモニウムを３５％飽和度まで添加する。その溶液を攪拌し、次いで濾過する。濾液のｐＨを４．１０±０．２０に調節し、次いで典型的に品質管理分析用として試料を採取する。次いで、その溶液を８５％飽和濃度の硫酸アンモニウム中に入れて、攪拌する。次に、その溶液を濾過し、次いで沈澱（３５／８５沈澱）を集めて貯蔵する。
【００８７】
図５〜図８は、精製プロトコルの第三のステップを詳解する。その３５／８５沈澱は、解凍して再び懸濁させて、その後のプロセスを行う。その溶液を、２０ｍＭリン酸カリウム溶液に対して透析する。次いで、その透析溶液を濾過し、濃縮する。その濃縮液を２〜８℃で一夜保管する。試料は、図５に示すように、典型的に品質管理用として採取する。その濃縮物は、次にＤＥＡＥセファデックス(sephadex)分画を行う。図６に記述するように、画分を集めてヒアルロニダーゼ活性について検定する。選択された画分を合して、８５％飽和の硫酸アンモニウムで沈澱させる。この溶液を攪拌し次に濾過する。沈澱（０／８５）を集めて秤量し、濾過し、次いで透明にする。その溶液を、ＰＥＧ６０００で沈澱させて２０％の濃度にする。この懸濁液を遠心分離して、沈澱を集める。次に、その沈澱を再懸濁させて濾過する。品質管理試験を典型的に実施する。その生成物は、その後のプロセスのために乾燥し貯蔵する。
【００８８】
手順の第四のステップを図９〜図１１に詳解する。生成物をＣＭセファデックスカラムで分画するために溶解する。その試料をそのカラムに注入し、画分を集める。活性画分をプールし、硫酸アンモニウムを８５％飽和度まで加えて沈澱させる。沈澱（０／８５）を集めて秤量する。その試料を２０ｍＭのリン酸カリウムに対して透析する。図１０に詳解するように、次いで、透析液を濾過し、そのｐＨを調整する。
【００８９】
図１１に描写するように、生成物を濾過して、可能性のあるウイルス汚染を除き、凍結乾燥し、そして試験する。
【００９０】
［ヒアルロニダーゼの活性］
ヒアルロニダーゼの活性を濁度検定法を使って測定した。この検定法を使って、最終製品、薬物物質（有効医薬成分（ＡＰＩ））、およびＡＰＩまたは最終製品を製造している過程での中間体のヒアルロニダーゼの活性を求める。ヒアルロニダーゼの活性は、注射用ヒアルロニダーゼについてＵＳＰ２６に記載されている濁度検定法の変法を使用して求める。簡単に述べると、溶解させたヒアルロニダーゼ酵素を、基質のヒアルロン酸と、規定の時間反応させ、次いでその酵素を不活性化し、次に、分解しなかったヒアルロン酸を酸性アルブミン溶液で沈澱させる。起こった懸濁の濁度を、紫外光可視光分光光度計を使って６００ｎｍの吸光度を求めることによって測定する。酵素の活性は、この溶液の濁度に反比例する。定量は、既知の酵素活性を有する基本の(primary)ＵＳＰウシヒアルロニダーゼ標準から、同じ条件下で実験して得た濁度のデータと比較することに基づいている。ヒアルロニダーゼ製剤は、７．３２×１０3〜１．３７×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇの活性を有する。典型的には、ヒアルロニダーゼ製剤は、ｐＨが５．２〜７．２である。
【００９１】
［全タンパク質］
ヒアルロニダーゼ製剤の全タンパク質は、広く容認されているタンパク質濃度検定法で測定する。これら検定法を使用して、製造過程の中間体、有効医薬成分（ＡＰＩ）および最終製品のタンパク質濃度を求める。この検定法は、ブラッドフォードのタンパク質定量法に基づいている。この方法は、タンパク質の各種濃度に比例して色素の色が変化する色素結合検定法である。色素のクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０の酸性溶液の最大吸光度は、この色素がタンパク質に結合すると、４６５ｎｍから５９５ｎｍへシフトする。クーマシーブルー色素は、アミノ酸残基特にアルギニン残基を含有するアミンに本来結合する。個々のタンパク質についての発色は、そのアミノ酸の組成によって決まる。ヒアルロニダーゼ製剤の全タンパク質は、０．５５〜０．８３ｍｇ／ｍｇタンパク質である。この製剤の比活性は、１．２×１０4〜１．９×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇタンパク質の範囲にある。
【００９２】
［水分］
ヒアルロニダーゼ製剤は、典型的には、カールフィッシャ分析法による水分含有量が≦１２％である。この検定法を使用して、U.S.Pharmacopia-25（米国薬局方）に詳述されているようなカールフィッシャ電量分析法を使って製造過程の中間体、有効医薬成分（ＡＰＩ）および最終製品の中に存在する水分の量を求める。なお、その薬局方の全体をここに援用する。カールフィッシャ電量分析法は、塩基とアルコールの存在下で水と二酸化硫黄に対するヨウ素の滴定に基づいている。全ての水が消費されてしまうと、過剰のヨウ素が生成してダブル白金電極で検出される。カールフィッシャ電量計は、注入された試料の水分の重量％を計算して印刷する。あるいはまた、ヒアルロニダーゼ製剤の水分含量は、乾燥により≦５％の重量減である。
【００９３】
［細菌内毒素の濃度と微生物の限度］
ここにに開示されているヒアルロニダーゼ製剤には、細菌内毒素の制限濃度がある。カブトガニ(Limulus)アメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）ゲル化テストを使用して、与えられた試料の細菌内毒素の濃度を求める。このＬＡＬテストは、細菌内毒素がカブトガニ：リムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus)の血液凝固機序に関連する循環細胞由来の溶解物と反応するという観察結果に基づいている。細菌内毒素は、ヒアルロニダーゼ製剤中に≦６０内毒素単位／ｍｇの濃度で存在している。
【００９４】
微生物の限度は、ＵＳＰ６１に記述の検定法を使って求める。この試験は、製品中に存在する生存可能な好気性微生物中に、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌またはサルモネラ菌が含まれていないことを実証するように設計されている。全微生物汚染は、１０3微生物／ｇ未満である。
【００９５】
［最終製品中のアネキシンＩＩとＩｇＧの定量］
ここに開示の方法で使用するヒアルロニダーゼ製剤は、規定濃度のアネキシンＩＩを含有している。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、最終製品、有効医薬成分（ＡＰＩ）および製造過程の凍結乾燥された中間体（ＨＹＯ５Ａ）中のアネキシンＩＩを定量する。精製された溶液の好ましい実施態様は、典型的に、ラクトースその他の緩衝成分のみならず、四種の主要タンパク質成分（αヒアルロニダーゼ、βヒアルロニダーゼ、アネキシンＩＩおよびＩｇＧフラグメント）を含有している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質をその見掛けの分子量に基づいて分離する。この方法には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを作動させ、ゲルをデンシトメトリで走査し、そして ImageQuant（登録商標）デンシトメトリソフトウェアによってアネキシンＩＩを定量する手順が記述されている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で求めたアネキシンＩＩ含量は、０．２９〜０．５７ｍｇアネキシン／ｍｇタンパク質である。
【００９６】
ここに開示の方法で使用するヒアルロニダーゼ製剤は、特定レベルの免疫グロブリンを含有している。薬物物質（有効医薬成分（ＡＰＩ））、製造過程の中間体および最終製品中の「ＩｇＧ」と呼称される免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖フラグメントの量は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で測定した。好ましい実施態様は、数種類のタンパク質、ラクトースおよびリン酸塩緩衝剤を含有する配合物である。その配合物は、ヒアルロニダーゼ（有効成分）および二種類の主な不純物、アネキシンＩＩとＩｇＧを含有している。薬物製品を特徴づけ、製品の仕様を設定し、および工程管理を行うためには、各種の成分の量を求める必要がある。
【００９７】
ＩｇＧを定量するのに使用するＨＰＬＣ手順を以下に考察する。この手順は、固定相に結合されたリガンドに対する対象タンパク質の結合アフィニティに基づいて分離を行うアフィニティカラムを使用する。この手順は、リガンドとしてプロテインＧを利用する。ＨＰＬＣで分離している間、ＩｇＧは、中性ｐＨの緩衝液を使って固定相に結合され、次いで段階的に低ｐＨの緩衝液で溶離する。この溶離ステップで重要な要因は、低いｐＨである。塩が存在すると、非特異的結合が減少する。ＨＰＬＣ分析法で求められるＩｇＧ含量は、およそ≦０．２３ｍｇＩｇＧ／ｍｇタンパク質である。
【００９８】
［ヒアルロニダーゼ含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で求める］
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を走らせて、最終製品、種々の工程中間体および有効医薬成分（ＡＰＩ）中のヒアルロニダーゼタンパク質含量を定量する。好ましい実施態様は、典型的に、ラクトースその他の緩衝成分のみならず、四種の主要タンパク質成分（αヒアルロニダーゼ、βヒアルロニダーゼ、アネキシンＩＩおよび免疫グロブリン（ＩｇＧ）フラグメント）を含有している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、タンパク質をその見掛けの分子量に基づいて分離する。この方法には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを作動させ、ゲルをデンシトメトリで走査し、そしてヒアルロニダーゼを ImageQuant（登録商標）デンシトメトリソフトウェアによって定量する手順が記述されている。典型的には、ヒアルロニダーゼ製剤は、１ｍｇタンパク質あたり０．１〜０．２３ｍｇのヒアルロニダーゼを含有している。ＥＤＴＡの含量は、２３〜３３μｇ／ｍｇである。
【００９９】
［好ましいヒアルロニダーゼ製剤］
ここに開示のヒアルロニダーゼ製剤は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で測定してタンパク質１ｍｇあたりヒアルロニダーゼを典型的には０．１０〜０．２３ｍｇ含有する高度に精製された製剤である。この製剤は、典型的に、比活性が１．２×１０4〜１．９×１０4ＵＳＰ単位／ｍｇタンパク質の範囲であり、そして全タンパク質濃度が０．５５〜０．８３ｍｇ／ｍｇタンパク質である。投与されると、濁度検定法で測定して７．３２ｘ１０3〜１．３７ｘ１０4ＵＳＰ単位／ｍｇであり、ｐＨは５．２〜７．２であり、そしてカール−フィッシャ分析法による水分は≦１２％であるかまたは乾燥による減量が≦５％である。この製剤は、薬物物質１ｍｇあたり≦６０の毒素単位の細菌内毒素を含有している。この組成物は、大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、またはサルモネラ菌を含有せず、そして全微生物汚染は、タンパク質１ｇあたり１０3未満の微生物である。この製剤のその他のタンパク質成分としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法で測定して約０．２９〜０．５７ｍｇアネキシン／ｍｇタンパク質のアネキシン含量、およびＨＰＬＣ分析法で測定してタンパク質１ｍｈあたりおおよそ≦０．２３ｍｇのＩｇＧであるＩｇＧ含量がある。
【実施例１】
【０１００】
［チメロサール、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）およびヒアルロニダーゼ（Wydase（登録商標））のウサギの眼に対する毒性］
あるタイプの酵素は、硝子体液中に出血があった後に硝子体液と接触すると、硝子体液から出血血液が除かれる速度を加速する。
【０１０１】
この点で、眼の硝子体から出血血液が除かれる速度（クリアランス）を加速する一方法が提供され、その方法は、概して、眼の網膜その他の組織に損傷を起こすことなく、硝子体からの出血血液のクリアランスを加速するのに充分な投与量で、ある量のヒアルロニダーゼを硝子体液と接触させるステップを含んでいる。好ましくは、そのヒアルロニダーゼは、チメロサール無しで、眼球の網膜その他の組織に対する中毒性損傷を起こさずに、１ＩＵを超える投与量で、好ましくは１５ＩＵを超える投与量で、そして優位的には７５ＩＵを超える投与量で硝子体中に投与を許容する分子量分布を有するように選択される。この出血除去法は、硝子体切除術その他の外科操作または硝子体液の除去をしないで実施することもできるので、このような硝子体切除術に関連して起こり得る危険や合併症を回避できる。
【０１０２】
これら出血除去酵素の好ましい投与経路は、硝子体に直接、眼内注射する経路である。しかし、その代わりに、出血除去酵素（一種または複数種）は、その酵素を硝子体に充分に分布させて、望まれる出血除去効果を発揮する他のいかなる適切な投与経路（例えば、局所投与経路）でも投与することもできる。
【０１０３】
好ましい注射液剤は、その液剤を実質的に等張性にしかつｐＨが眼に注射するのに適切なｐＨである不活性成分とともに、眼に対する中毒性損傷を起こさずに、１ＩＵを超える投与量で、好ましくは１５ＩＵを超える投与量で、そして優位的には７５ＩＵを超える投与量で硝子体中に投与を許容する分子量分布を有するヒアルロニダーゼを含有していてもよい。この好ましいヒアルロニダーゼ製剤は、チメロサールを欠いている方が好ましい。そのような注射液剤は、最初に凍結乾燥して乾燥状態にし、その後、使用する前に再構成されてもよい。
【０１０４】
米国特許第６，６１０，２９２号および同第６，５５１，５９０号、それらの全体をここにまさに援用するが、のもとに、用語「ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）」は、この明細書で使用する場合、チメロサールを含有せず、かつ電気泳動ゲル（４〜２０％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で求めた分子量が１００，０００を超える画分、５０，０００〜６０，０００の間の画分および２０，０００未満の画分を含有していない、硝子体内注射用のヒアルロニダーゼ液剤を意味する。そのようなヒアルロニダーゼは、羊の精巣から抽出することができ、米国カリフォルニア州サンディエゴ所在の Biozyme Laboratories Limited から市販されており、そのソースは羊のヒアルロニダーゼを単離し精製するためのここに開示のプロセス用の出発材料であり得る。この特定の分子量分布のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）は、他のヒアルロニダーゼ製剤より眼球に対する毒性が少なく、かつ多くの眼科用途において望ましい治療効能を示す。
【０１０５】
下記実施例で述べるように、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）は、眼球または関連する解剖学的構造体に対して有意な毒性を生じることなく、硝子体内出血の除去効果を含む（しかし必ずしもそれに限定されない）望ましい治療効果をまたらす投与レベルで、眼球の後眼房の中へと直接注射することができる。
【０１０６】
体重が１．２ｋｇ〜２．５ｋｇの New Zealand Cross 種の健康なウサギ５２匹（雄２６、雌２６）を、個々に識別用マークを付けて個々に懸垂かご中に収容した。これら動物には、市販のペレット化されたウサギ飼料を毎日与え、かつ水道水を制限なしで与えた。
【０１０７】
これらの動物は、４匹ずつの動物（雄２匹、雌２匹）からなる１３の群に分けた。各群の２匹の動物（雄１匹、雌１匹）を、処置前の眼底撮影およびフルオレセイン血管造影撮影に使うために選択した。
【０１０８】
眼底撮影は、動物を拘束し、次いで視神経、網膜弧および眼底を Kodak Gold ２００ＡＳＡフィルムを装填したＫＯＷＡ（登録商標）ＲＣ−３ Fundus Camera で可視化して、実施した。
【０１０９】
フルオレセイン血管造影撮影は、２％滅菌フルオレセイン溶液１．５ｍｌを辺縁耳静脈(marginal ear vein)経由で注射して行った。注射してから約３０秒後にフルオレセインを可視化して視神経、網膜血管および眼底の位置を特定した。
【０１１０】
翌日、各動物は、３４ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミンと５ｍｇ／ｋｇのキシラジンの混合物を静脈に注射して麻酔した。動物の眼瞼を検眼鏡を使って後退させ、眼球をヨードポビドン洗浄剤で消毒した。
【０１１１】
いずれかの緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）、ＢＳＳ＋チメロサール、ヒアルロニダーゼ（Wydase（登録商標））またはヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の実験処置剤を、３０ゲージで１２．７ｍｍ（０．５インチ）の針を取り付けた１ｃｃツベルクリンシリンジを使って注射して、投与した。この実施例で利用したヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）溶液は、チメロサールを含有しておらず、［表５］に記載の特定の配合であった。
【０１１２】
各動物群に投与された実験処置剤は、［表６］のようであった。
【０１１３】
注射の後のその日（第１日）に、眼底撮影とフルオレセイン血管造影撮影を行った２６匹の動物を、投与前の実験の場合と同じ方法を使って観察した。
【０１１４】
注射の後の第２日に、投与する前と第１日に眼底撮影とフルオレセイン血管造影撮影を受けた１３匹の雄の動物を、眼底撮影に選択されなかった１３匹の雌の動物同様、ペントバルビタールナトリウムをベースにした薬物で安楽死させた。次に、眼球を外科手術で取り出して、ｐＨ７．３７の０．１Ｍリン酸塩緩衝食塩水に２．５％のグルタルアルデヒドを溶解して得た固定溶液中に入れた。
【０１１５】
また別に、無作為に選択した一匹のウサギをペントバルビトールの注射で安楽死させたが、次いでグルタルアルデヒド溶液を左心室に心臓内注射して固定し、摘出された眼球内の組織学的知見に対する固定操作の作用を確認した。
【０１１６】
第７日に、先に眼底撮影と血管造影撮影を行った１３匹の雌ウサギについて、先に述べた方法に従って同じ観察を行った。
【０１１７】
残りの２６匹の動物を、投与後の第７日に上述のようにして安楽死させた。眼球を、第２日に固定した眼球と同じやり方で固定した。また、一匹の無作為に選択したウサギに、先に無作為に選択した動物について上述したのと同じ心臓内グルタルアルデヒド固定手順を行った。
【０１１８】
この実施例で処置した動物の眼球を、処置に関連する毒性の証拠を見つけるために、肉眼でおよび顕微鏡で検査した。各処置群の毒性または非毒性の組織学的証拠の概要を記載した表を、［表１］に示してある。
【０１１９】
まとめると、ＢＢＳで処置した対照群の眼球には、投与後、第２日と第７日に毒性が無かった。
【０１２０】
ＢＢＳ＋チメロサール（０．００７５ｍｇ）で処置した第２群動物の眼球は、第２日には毒性が無かったが、第７日には血液−網膜関門が破壊した証拠を示した。
【０１２１】
ＢＢＳ＋チメロサール（０．００２５ｍｇ）で処置した第３群動物は、投与後、第２日と第７日に、処置に関連したひどい中毒作用を示した。
【０１２２】
１Ｉ．Ｕ．の投与量のWydase（登録商標）で処置した第４群の動物は、第２日と第７日には毒性が無かったが、１５Ｉ．Ｕ．〜１５０Ｉ．Ｕ．の範囲の投与量のWydase（登録商標）で処置した第５〜８群の動物の眼球は、投与後、第２日と第７日に全般的に投与に関連する毒性作用を示した。
【０１２３】
１Ｉ．Ｕ．−１５０Ｉ．Ｕ．の範囲の投与量のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で処置した第９〜１３群の動物の眼球には、投与後の第２日と第７日に毒性作用の証拠は無かった。
【０１２４】
したがって、チメロサールおよびチメロサール含有の Wydase（登録商標）配合物は、試験した投与量で、ウサギの眼球に毒性作用を引き起こすが、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）は、試験した投与量ではこれら動物に毒性作用を全く起こさない、と結論される。
【０１２５】
第７日に行った検査の結果を、［表１］にまとめてある。［表１］に示すように、ＢＳＳ＋チメロサール（０．００７５ｍｇ）および１Ｉ．Ｕ．〜１５０Ｉ．Ｕ．の間の全ての投与量のヒアルロニダーゼ（Wydase（登録商標））で処置されたウサギの眼球に、第７日に有意な毒性作用が観察された。対照的に、１Ｉ．Ｕ．〜１５０Ｉ．Ｕ．の範囲の投与量のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で処置した動物の眼球には、毒性作用が全く観察されなかった。
【実施例２】
【０１２６】
［ウサギの眼球の硝子体内に注射したヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の安全性と効能］
この実施例では、New Zealand Cross 種の健康なウサギ１２匹に、同定用に識別用マークを付けて、個々に懸垂かごの中に収容した。これら動物には、市販のペレット化されたウサギ飼料を毎日与え、かつ水道水を制限なしで与えた。
【０１２７】
これら動物を、各動物３匹ずつの４つの処置群に無作為に分けた。
【０１２８】
初めに、各動物の眼球を、１０％トロピカミド溶液１〜２滴を滴下して散瞳させ、続いて肉眼で検査し、２０ジオプタのレンズを使って倒像眼底検査を行い、次いで眼球の前部の解剖学的構造の細隙灯検査を行って検査した。
【０１２９】
その動物眼球の上記初期検査に続いて、各動物の各眼球の硝子体内に１００μｌまたは１０μｌの血液を注射した。
【０１３０】
第２日に、各処置群の動物に、下記処置計画に従って、ＢＳＳまたはヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を右目の硝子体内に一回注射した。
【０１３１】
2006523461.tif 000006
【０１３２】
この実験に使ったヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）製剤は、先に述べて［表５］に示した好ましい配合の製剤である。
【０１３３】
第３日、５日、７日、１４日および２１日に、各動物の眼球を再び細隙灯で検査して角膜、前眼房および虹彩を評価した。さらに、各動物の眼球を１０％トロピカミド溶液で散瞳させて，網膜を、２０ジオプタのレンズを使って倒像眼底検査法で検査した。
【０１３４】
ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の観察された出血除去の効能を［表２］にまとめてある。全体的に、各処置群の各動物の左の眼（無処置）は、そこに注射された血液の分量により、かすんだ硝子体といくつかの血塊を含有していた。ＢＳＳで処置したＡ群の（対照）動物の右眼も、かすんだ硝子体といくつかの血塊を含有していたが、ヒアルロニダーゼで処置された処置群Ｂ〜Ｄ群の全ての動物の右眼は、透明な硝子体を有し、その硝子体を通して網膜を見ることができた。さらに、処置群Ｂ〜Ｄの全ての動物の右眼の網膜は、正常でかつ処置に関連する毒性がないと見えた。
【０１３５】
この実験の結果は、硝子体中に投与されたヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）が、２５〜７５Ｉ．Ｕ．の一回投与で、処置された動物の眼球から血液が除去される速度を加速するのに有効であったことと、さらにこの実験で行われたそのようなヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の一回投与が、この実験で処置されたウサギの眼球に観察可能な毒性作用を起こさなかったことを示している。
【０１３６】
各投与に続いた観察結果は、首尾一貫しており、［表３」にまとめてある。全体的に、各処置群の各動物の左眼（無処置）は、そこに注射された血液の分量により、硝子体液がかすんでいてかついくつかの血塊があった。ＢＳＳで処置したＡ群の（対照）動物の右眼も、硝子体がかすんでいていくつかの血塊があったが、処置群Ｂ〜Ｅの全ての動物（すなわち、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で処置した動物）の右眼は、硝子体が透明で、その硝子体を通して網膜を見ることができた。さらに、処置群Ｂ〜Ｅの全ての動物の右眼の網膜は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を多数回投与した後でさえ、正常でかつ処置に関連する毒性がないと見えた。
【０１３７】
この実験の結果は、硝子体中に投与されたヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）が、２５〜７５Ｉ．Ｕ．の一回投与を４回行うことによって、血液がウサギの眼球から除去される速度を加速するのに有効であったことと、そのようなヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の複数回投与が、２週間の間隔でヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を４回連続して投与した後でさえ、処置されたウサギの眼球に観察可能な毒性作用を起こさなかったことを示している。
【実施例３】
【０１３８】
［ヒトの眼球の硝子体内に注射されたヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の安全性と効能］
この研究の主目的は、羊の精巣組織由来の高度に精製されたヒアルロニダーゼ抽出物を含有する緩衝塩類溶液を、視覚障害のある眼球の硝子体中に、眼に重い有害作用を何ら引き起こすことなく、注射できるかどうかを、確認することであった。
【０１３９】
〈材料と方法〉
緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）をプラシーボ対照として採用し、これは Allergan Pharmaceuticals（米国カリフォルニア州アーバイン所在）から入手した。このＢＳＳは、０．６４％の塩化ナトリウム、０．０７５％の塩化カリウム、０．０４８％の塩化カルシウム２水和物、０．０３％の塩化マグネシウム６水和物、０．３９％の酢酸ナトリウム３水和物、０．１７％のクエン酸ナトリウム２水和物、ｐＨを７．１〜７．２に調整するのに充分な水酸化ナトリウム／塩酸および注射のための水（ｑ．ｓ．１００％）を含有していた。ＢＳＳまたはヒアルロニダーゼの特定仕様の配合物Ｘ［表７］の３０μｌずつのアリコートを、長さ０．５インチの２９ゲージの針を取り付けた３００μｌマイクロシリンジに充填した。その充填されたシリンジを使って材料を、患者の眼の硝子体中に注射した。
【０１４０】
最初に、視覚障害がある眼を少なくとも一つ有する８名のヒト被験者に、無作為に指定して、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）５０Ｉ．Ｕ．を含有するＢＳＳまたはＢＳＳのみのいずれかの５０μｌ（３：１の比率）を硝子体に投与した。一か月間追跡して、５０Ｉ．Ｕ．の投与量が充分許容されたことを確認した後、６名の視覚障害のある被験者からなる第二の群をこの試験に参加させて、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の高投与量群（１００Ｉ．Ｕ．）またはＢＳＳ対照群（２：１の比率）に、無作為に指定した。
【０１４１】
被検物の安全性を評価するのに使った手順は、試験全体を通して種々の時間間隔をおいて完了したが、これらの手順としては、倒像眼底検査法、眼底撮影法、フルオロセイン血管造影撮影法、網膜電図検査法、外眼検査(external eye examination)、細隙灯生体顕微鏡法、圧平眼圧測定法、厚み測定法(pachymetry)およびオートリフラクション(autorefraction)がある。
【０１４２】
ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）に特異的に関連する有害事象を、賦形剤（ＢＳＳ）／注射手順に起因すると考えられる有害事象と区別できるように、この試験には、プラシーボ対照群を同時に含ませた。そのうえ、被検物は、網膜に隣接して注射されるので、重大な性質の不運な応答として視覚を損なうことがあり得たから、視覚障害のある方の眼だけを処置した。試験の第一相として番号６０１で始まり、第二相として番号７０１で始まるコンピュータ発生によるランダム化法(computer generated randomization scheme)を使って、患者を割り当てて処置した。患者も研究者も、いずれも、硝子体に注射されるのがＢＳＳ賦形剤かヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）／ＢＳＳ溶液かを、全く知らなかった。
【０１４３】
各患者のベースラインを確認した後、被験者に酵素またはプラシーボ対照物のいずれかを注射した。患者は、快適な椅子に座った姿勢にした。局所麻酔薬を１〜２滴、処置すべき眼に局所滴下し、その後、患者に下を見させて、塩酸プロパラカイン眼科溶液に浸漬した滅菌綿棒を、角膜の上方約４〜５ｍｍの強膜上の一領域（上位／１２：００子午線）に１０秒間あてがった。次いで、被検物を、２００μｌのマイクロシリンジに取り付けた２９ゲージの針を通して硝子体の中へ注射した。なお、その針は、上記第二の麻酔薬を塗布した部位に、針の全長まで挿入した。
【０１４４】
〈試験結果〉
統計的有意性は稀にしか得られなかったが、細隙灯生体顕微鏡法のデータは、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）／ＢＳＳ製剤で処置した患者の内のかなり高い比率の患者が、ＢＳＳだけで処置した患者とは対照的に、前区分に病理学的変化を示していることを示唆し、最も目立ったのは、前眼房中に細胞とフレアが存在していることであった。しかし、処置して一ヶ月後の第六回目の受診の後は、細隙灯で評価されるどの変数にも、群間の差は全く観察されなかった。
【０１４５】
ＢＳＳで処置した１名の患者と５０Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）／ＢＳＳを投与された２名の患者は、網膜電図検査法／視覚誘発電位(visual evoked potential)で測定したところ、網膜／皮質の反応が時間の経過とともに低下した。しかし、網膜電図のパターンの変化(alteration)は、常に二面的であって、高投与量（１００Ｉ．Ｕ．）のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）／ＢＳＳに割り当てられた患者の処置された眼にも無処置の眼にもいずれにも起こらず、また、フルオロセイン血管造影撮影試験の結果も、網膜虚血が処置に関係なくどの眼にも存在しなかったことを示している。
【０１４６】
倒像眼底検査試験によって、被検者の眼球の中に融解(liquefaction)が見られ、後部硝子体の剥離(posterior vitreal detachment)（ＰＶＤ）が起こっていることが明らかになった。その硝子体は、被検物を注射するとすぐに、高度の運動性および／または融解を呈することが特徴であったが、このことは、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）含有製剤の場合、予想されることであった。ＢＳＳ対照を注射されたある被検眼球は、融解とＰＶＤを示したが、それらは処置前に存在していたようである。というのは、ＢＳＳは、酵素活性を全く持っておらず、しかもごく少量（３０μｌ）投与されたに過ぎないからである。
【０１４７】
第１群の患者におけるＰＶＤについては、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で処置される６名の患者の内４名（すなわち、６０１、６０２、６０４および６０６番）が、細隙灯顕微鏡法でＰＶＤを示さなかった（［表８］を参照）。処置後に、これらの患者の各々は、ＰＶＤの存在を示した。第２群の患者から得た試験結果は、細隙灯顕微鏡検査法を使用して硝子体を画像化することが困難であるため、余り明らかでなかった。
【０１４８】
早期の前臨床試験において、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を１５０Ｉ．Ｕ．までの各種投与量でウサギの硝子体に注射して、有意な組織病理学的変化がなかった実施例２の試験結果を考慮すると、１５０Ｉ．Ｕ．未満の投与量は、ヒトにおいて十分に許容できるであろうと予想された。この予想と一致して、この試験での視覚障害のある眼球に対するヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）／ＢＳＳの硝子体内投与によって、ほとんど症状を誘発せず、その症状は、全て、各試験群で比較可能な頻度で起こっているので、注射の手順自体に起因すると考えられ、そして処置に関連する有害な後遺症は、比較的穏やかでかつ短期間であった。
【０１４９】
さらに、ヒトの眼球をヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で処置したとろ、観察される後部硝子体剥離の発生率が増大することが観察された。ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体に注入された患者においてＰＶＤの増大が観察されたことは、ここに記述の方法が硝子体液の融解と剥離を誘発するのに有効であることを示している。したがって、この試験の結果は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）が、重篤なまたは長期間の眼球合併症を誘発することなく、ヒトの硝子体に注射できることを示している。
【実施例４】
【０１５０】
［眼球の硝子体からの出血血液のクリアランスを加速するためのヒアルロニダーゼの使用］
以下に述べる実施例では、硝子体中にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を使用して、眼球の硝子体からの出血血液のクリアランス（除去速度）を加速した症例について述べる。使用したヒアルロニダーゼは、上に述べて［表９］に示すチメロサールなしのヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）製剤であった。
【０１５１】
この実験では、硝子体の出血を起こした６名のヒト患者（女性５名、男性１名）にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を５０〜２００Ｉ．Ｕ．の投与量で一回硝子体内に注射して処置した。
【０１５２】
この実験で投与したヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）は、上述し［表９］に示す配合で調製した。
【０１５３】
この実験で処置された患者は、全員が糖尿病網膜症の病歴を持っており、異なる期間の硝子体出血を有していることが分かっていた。各患者において、硝子体中に存在する血液の量は、標準の眼底検査手段では網膜を見ることを妨げるのに充分な量であった。
【０１５４】
各患者は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を一回硝子体中に注射された。４名の患者が５０Ｉ．Ｕ．の投与を受け、１名の患者が７０Ｉ．Ｕ．の投与を受け、そして１名の患者が２００Ｉ．Ｕ．の投与を受けた。
【０１５５】
この実験の観察結果を［表４］にまとめてある。
【０１５６】
この実施例で処置した６名の患者では、出血した硝子体は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体中に一回注射した後、６〜１６日の間に、網膜が硝子体を通して見えるほど充分に透明になった。硝子体がこのように透明になることは、ヒアルロニダーゼによる処置なしでこれら患者に起こると予想されたよりも有意に速く起こったことが自覚で確認された。
【０１５７】
ウサギに高投与量のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を投与したときに観察されたフルオレセインの漏出と異なり、このヒトに基づいた試験において毒性が全く観察されなかったことに注目すべきである。
【実施例５】
【０１５８】
［他の眼科障害を治療するためのヒアルロニダーゼの使用］
ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を、試験的投与量で、硝子体に一回投与するだけでさえ、ある若干種の眼科障害を治療するのに有効である。増殖性糖尿病網膜症、加齢性黄斑変性、弱視、色素性網膜炎、黄斑孔、黄斑滲出および類嚢胞黄斑水腫を含む眼の障害を患っていると先に診断されている患者は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療で、これら障害の臨床症状に改善が見られた。
【０１５９】
ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）は、１Ｉ．Ｕ．またはこれを超える投与量で、眼球に毒性損傷を起こすことなく、硝子体に投与することができるので、硝子体を迅速に融解させるとともに硝子体を網膜および他の組織（例えば、網膜上膜、黄斑）から分離または剥離させるために使用可能である。このように硝子体が融解し剥離すると、網膜その他の組織を硝子体が引っ張る物理的力が最小限になり、硝子体内の液体の自然の回転置換速度が加速される。したがって、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）は、硝子体の融解／分離ならびに／または、眼球の後眼房からおよび／もしくは後眼房に隣接する組織（例えば、網膜もしくは黄斑）からの毒素その他の有害物質（例えば、脈管形成因子、浮腫液など）の加速されたクリアランスによって改善される多くの障害（例えば、増殖性糖尿病網膜症、加齢性黄斑変性、弱視、色素性網膜炎、黄斑孔、黄斑滲出および類嚢胞黄斑水腫）の治療に特に適している。さらにまた、硝子体の融解によって、血管新生を支持するために必要なポリマー化された硝子体の形態にあるマトリックスが除かれると考えられる。したがって、この方法は、網膜に血管が新生する現象を防止または減らすのに有用である。
【０１６０】
さらに、多くの眼科障害は、原因要素として、血液−網膜膜の不安定化を有している。この不安定化によって、脈絡膜毛細血管層の各種成分（例えば、血清成分、脂質、タンパク質）が硝子体腔中に入って網膜表面を損傷する。この不安定化は、血管新生として知られている、硝子体腔への血管の浸潤の前兆である。
【０１６１】
したがって、この方法の実施態様は、眼の損傷もしくは病変から眼の血管新生をもたらすまたは血液−網膜関門に損傷をもたらす哺乳類の眼の各種障害を予防し治療することに向けられている。そのような疾患の例としては、限定されないが、増殖性糖尿病網膜症、加齢性黄斑変性、弱視、色素性網膜炎、黄斑孔、黄斑滲出および類嚢胞黄斑水腫、およびこれらの疾患の臨床症状がヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療に応答するその他の疾患がある。
【実施例６】
【０１６２】
［増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）のヒアルロニダーゼによる治療］
糖尿病網膜症は、労働年齢のアメリカ人の失明の主原因である。網膜症の発生は、糖尿病状態の期間とともに増大し、糖尿病期間が７年間の糖尿病での約５０％の発生レベルから糖尿病期間が２０年を超える糖尿病での約９０％の発生レベルまで増大する。概略７００，０００名のアメリカ人がＰＤＡに冒されていると推定されている。
【０１６３】
糖尿病によって起こる網膜血管の事象には、一部として、慢性高血糖症から起こる微細血管の漏洩と毛細血管の不潅流が含まれている。微細血管の漏洩は、次に、網膜水腫、脂質の滲出および網膜内出血が起こる。毛細血管の不潅流は、網膜内微小血管の異常（ＩＲＭＡ）の形成に至る。これらの異常は、糖尿病が仲介する細動脈変性によって血管新生が阻止された網膜領域に潅流するために形成される動静脈シャントである。
【０１６４】
毛細血管不潅流の領域における低酸素網膜からの血管内皮増殖因子の発現によって、網膜外血管新生が発生すると考えられる。そのような血管新生とそれに関連する線維状成分は、自然に消えるかまたは硝子体の出血もしくは牽引網膜剥離によって悪化する。血管新生は、これら新血管から大量の色素が漏洩することによってフルオレセイン血管造影撮影法で容易にみることができる。というのは、これら新生血管は、網膜血管系のしっかりした内皮接続部分を欠いているからである。網膜低酸素症の領域の障害のある軸索流は、綿状白斑をもたらす。
【０１６５】
増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）は、早い段階では、ほとんど自覚症状が無いので、早期の確認と治療を行うため糖尿病を注意深く検査する必要がある。増殖性糖尿病網膜症は、以下の三つのサブグループに分類できる。すなわち、（１）非増殖性網膜症、（２）前増殖性(preproliferative)網膜症、（３）増殖性網膜症である。各分類の疾患は、特定の形態学的特徴を持っている。非増殖性網膜症の特徴としては、毛細微小血管の障害（微小血管の閉塞と透過性の変化、毛細血管の不潅流、網膜毛細血管の微細動脈瘤、基底膜の肥厚および内部微小血管の異常（ＩＲＭＡ））、網膜内の出血、滲出、および黄斑の変化がある。前増殖性網膜症は、非増殖性網膜症について述べた変化のいずれかまたは全て、および次に挙げる：著しい静脈ビーディング、綿花状滲出物、広汎なＩＲＭＡおよび広汎な網膜虚血によって徴候が示される。増殖性網膜症は、網膜外の血管新生と繊維状組織の増殖、硝子体の変化と出血、黄斑の疾病、および網膜剥離で徴候が示される。
【０１６６】
線維状血管組織の生成は、硝子体が仲介する網膜の損傷をもたらすことが多いので、ＰＤＲの特に重大な合併症である。この線維状血管組織は、後硝子体膜と密な癒着を生じる前網膜膜を形成する可能性がある。これら癒着部分は、硝子体の牽引力を網膜に伝達して網膜剥離をもたらす可能性の元凶である。
【０１６７】
硝子体底部は、通常、隣接する網膜とマルテジアーニ(Martegiani)のリングとして知られている視神経乳頭の外周とに強固に取り付いている。マルテジアーニのリングと硝子体底部の間の他の全ての部位における網膜への硝子体の連結は、はるかに強固さが少ない。網膜からの新血管生成によって、視神経乳頭または眼底中の他の部位から硝子体の中へ伸びる血管ストランドが形成される。これらストランドの収縮によって、部分的なまたは完全な網膜剥離が起こり得る。
【０１６８】
黄斑における網膜剥離は、ＰＤＲの主な合併症である。ＰＤＲから起こる網膜剥離は、殆どが、通孔なしの牽引剥離として始まるが、この疾患のいくぶん後の時点で網膜孔が形成されることにより、破裂性（裂孔原性）になる。この牽引剥離は、硝子体と網膜の異常な癒着、またはそれに続いて起こる線維状バンドの収縮による硝子体の牽引、そして網膜の挙上によって起こる。
【０１６９】
この方法は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体中に注射することによって、前増殖状態および増殖状態のＰＤＲを治療することを意図している。特定の機序に限定されることなく、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の硝子体内注射は、硝子体の液相のクリアランスを促進すると考えられる。硝子体中に注射されたトリチウム化水の中央硝子体から脈絡膜への移行速度は、注射されたヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）によって硝子体のヒアルロン酸が解重合した後に有意に増大した。この方法は、この観察結果を利用して、例えばＰＤＲの存在が原因で硝子体中に漏洩する各種の成長誘発因子および他の血清生成物のクリアランスを促進するために、硝子体を融解させる。この方法のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療は、単独でまたはＰＤＲの他の治療法と組み合わせて実施してもよい、ということもさらに意図している。
【実施例７】
【０１７０】
［非増殖性糖尿病網膜症の治療］
目的：やや重いから重い非増殖性糖尿病網膜症（誘発された後部硝子体剥離（ＰＶＤ）が存在するまたは存在しないＮＰＤＲ）の進行に対するヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の効果を確認すること。
【０１７１】
方法：超音波検査法および遮蔽眼底撮影法で評価した６０名の患者を、４週間後に、食塩水（０．０５ｍｌ）、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）（７５Ｉ．Ｕ．，０．０５  ｍｌ）、ＳＦ６ガス（０．３ｍｌ）またはヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）＋ＳＦ６ガスに無作為に割り当てた。ＰＶＤを１６週間を通して評価し、７フィールドの眼底写真を代理ベースラインとして１２ヵ月後に得た。
【０１７２】
試験結果：治療された全ての眼球のうち、ＰＶＤに関係なく、安定したＥＴＤＲＳスコアを有する眼球は、食塩水が３８％（６／１６）、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）が６７％（１０／１５）、ＳＦ６が４０％（６／１５）、そしてヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）＋ＳＦ６が４３％（６／１４）であった。ＥＴＤＲＳスコアが悪化したのは、食塩水が３８％（６／１６）、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）が１３％（２／１５），ＳＦ６が２０％（３／１５）、そしてヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）＋ＳＦ６が２１％（３／１４）であった。１６週間後までに完全なＰＶＤと安定なＥＴＤＲＳスコアを有する眼の比率は、食塩水が０％（０／１４）、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）が５０％（６／１２）、ＳＦ６が３０％（３／１０）、そしてヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）＋ＳＦ６が４０％（４／１０）であった。全群を通して視力の低下が、最も頻繁に報告された眼の有害な事象であった。
【０１７３】
結論：ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で処置された眼球は、食塩水で処置された眼と比べて安定したＥＴＤＲＳ網膜症スコアを持っていた。食塩水で処理した眼球は、ＥＴＤＲＳスコアが悪化したのと同じ数のものが安定したスコアを持っていた。完全なＰＶＤと安定なＥＴＤＲＳスコアを有する眼球の百分率は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の群が最高であった。これらデータは、ＰＶＤの誘発および／または酵素による硝子体の融解が糖尿病網膜症の進行に影響する性質を有することを示している。
【実施例８】
【０１７４】
［前増殖性糖尿病網膜症の治療］
この実施例では、前増殖性糖尿病網膜症を示す糖尿病患者が、真性糖尿病のこの合併症を、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体内に注射することによって治療された。この治療の目的は、網膜外の新血管生成と線維状組織の増殖、硝子体の変化と出血、黄斑の疾患および網膜剥離で示される増殖性糖尿病網膜症の発生を減らすかまたは防止することである。
【０１７５】
一旦、患者が糖尿病であると診断されると、この疾患に冒されている高い比率の個体がその後に増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）を発生することを考慮して、眼科サーベイランス（監視）を増やして実施する。この増やしたサーベイランスには、硝子体のビーディング、ＩＲＭＡおよび網膜虚血の程度を監視するため定期的な網膜検査およびフルオレセイン血管造影撮影を入れるべきである。
【０１７６】
前増殖性糖尿病網膜症が増殖段階に到達し始めたときに、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療を始める。この段階は、２つ以上の四分円（４分の１区）における静脈ビーディングの存在、１つ以上の四分円におけるＩＲＭＡの存在および／または全ての四分円における小動脈瘤と点状出血の存在と定義する。一旦、これらの徴候が現われたら、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療法を開始する。
【０１７７】
患者は、眼の健康のベースラインを確立するために全眼科検査を受けるべきである。この眼科検査としては、倒像眼底検査法、細隙灯生物顕微鏡法、周辺網膜の検査、眼内圧の測定、視力（裸眼および最良矯正）の症候学的検査、眼底撮影、フルオレセイン血管造影撮影、網膜電図検査法およびＡ走査測定がある。
【０１７８】
予備検査に続いて、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を、患者の冒されている眼の硝子体に注射する。両方の眼が冒されている場合は、それらの眼を別個に治療してもよい。治療すべき眼の硝子体内に、上述の５０Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）眼科溶液５０μｌを注射して、硝子体のヒアルロン酸の解重合を促進し硝子体を融解させる。
【０１７９】
治療を行った後、患者の眼球は、第１日、第２日、第７日、第１５日、第３０日および第６０日に検査されることになる。各検査日に、患者は、硝子体の融解について監視される。加えて、患者は、強膜の凹みの倒像眼底検査によって、後部硝子体の剥離について監視される。最後に、患者の示すＰＤＲの程度を、定期的な網膜検査とフルオロセイン血管造影撮影で連続的に監視して、硝子体のビーディング、ＩＲＭＡおよび網膜虚血の程度を監視する。
【実施例９】
【０１８０】
［増殖性網膜症の治療］
この実施例では、増殖性糖尿病網膜症を示す糖尿病患者を、硝子体中にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射することによって治療する。この治療の目的は、増殖性糖尿病網膜症の程度を低下させること、外網膜の血管新生組織を除いた後にこの疾患がさらに発現するのを防止すること、および網膜剥離が起こる可能性を減らすことである。
【０１８１】
増殖性糖尿病網膜症を示す患者は、血管新生組織の外科手術と組み合わせて、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）法の治療を受けることになる。その増殖は、通常、非常に小さい線維状成分を有する新血管の形成から始まる。新生血管は、血管内皮細胞に分化する原始間葉要素(primitive mesenchymal element)から生ずる。この新しく形成された血管チャネルは、次いで線維性化生を受ける、すなわち、血管芽細胞芽(angioblastic bud)が線維組織へと変形される。
【０１８２】
新生血管は、フルオレセインを漏出するので、増殖が存在することは、血管造影撮影中にとりわけ目立って分かる。新生血管と線維組織は、内境界膜から突き出て、内境界膜と後部硝子体膜の間の界面で樹枝状になる。その線維状血管組織は、後硝子体膜と密な癒着部を生成する網膜前膜を形成し得る。これらの癒着部は、硝子体収縮の後段階において硝子体の牽引力を網膜に伝達することの元凶であるので、極めて重要である。
【０１８３】
ＰＤＲの増殖段階は、以下の特徴のうちの三つ以上が存在することと定義される。すなわち、新生血管、視神経の１円板直径上のまたはその中の新生血管、重篤な新生血管（視神経における１／３円板面積の血管新生または視神経における１／２円板面積の血管新生または他の場所での１／２円板面積の血管新生で定義されるような）、および前網膜または硝子体の出血である。
【０１８４】
増殖段階に入っていると診断されたら、患者は、眼の健康のベースラインを確認するために、全眼科検査を受けることになる。その眼科検査としては、倒像眼底検査法、細隙灯生物顕微鏡法、周辺網膜の検査、眼内圧の測定、視力（裸眼および最良矯正）の症候学的検査、眼底撮影、フルオレセイン血管造影撮影、網膜電図検査法およびＡ走査測定がある。
【０１８５】
予備検査に続いて、患者の冒されている眼球の硝子体中にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射する。両方の眼球が冒されている場合は、それらの眼を別個に治療してもよい。その眼球の硝子体に、５０Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）眼科溶液５０μｌを注射して、硝子体のヒアルロン酸の解重合を促進し、硝子体を融解させる。硝子体の解重合に加えて、網膜のその後の損傷を最小限にするため、血管新生組織も汎網膜光凝固法を使って直接治療する。
【０１８６】
汎網膜光凝固法（ＰＲＰ）は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療法と併用して、ＰＤＲを示す患者の治療に使用することができる。汎網膜光凝固法は、レーザ光凝固法の一形態である。現在、アルゴングリーンレーザ（６１４ｎｍ）、アルゴンブルーグリーンレーザ（４８８ｎｍと５１４ｎｍ）、クリプトンレッドレーザ（６４７ｎｍ）、波長可変色素レーザ、ダイオードレーザおよびキセノンアークレーザなどのレーザーが、網膜外科に使用されている。レーザのエネルギは、色素（メラニン、キサントフィルまたはヘモグロビン）を含む組織に顕著に吸収され、隣接する構造体に熱作用を起こす。クリプトンレッドレーザは、等しいレベルの貫通性を得るにはより多くのエネルギーを要するアルゴンレーザよりも、より良好に核硬化性白内障や硝子体出血を貫通できるので、好ましい治療法である。
【０１８７】
レーザ網膜外科で使用されるパラメータは、光凝固法の目的に応じて変更してもよい。長期間の治療を行い大きいスポットサイズを生じる低電力に設定のレーザは、小血管に対して凝固作用がある。焦点レーザ光凝固法は、小動脈瘤の漏出を停止させるため糖尿病に使用される。レーザスポットを、直接に小動脈瘤を覆って配置して、その動脈瘤を僅かに白色化させて閉鎖する。レーザは、網膜の浮腫状領域を覆って格子状に当てると、微小血管の漏出を減らすことができる。より高いエネルギレベルでは、レーザで組織を切除することが可能である。汎網膜光凝固法は、眼球の中で組織を破壊し、虚血組織の量を減らすことにより、効果的であると考えられる。合流(confluent)レーザスポットを新生血管膜に使って、異常血管を取り除くこともできる。
【０１８８】
この方法は、特定の治療順序を要求しないと解すべきである。一実施態様では、患者は、先ずヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で治療され、次いでレーザで治療される。別の実施態様では、患者は、先ずレーザによる治療を受け、次にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で治療される。
【０１８９】
治療の後、患者の眼球は、第１日、第２日、第７日、第１５日、第３０日および第６０日に検査されることになる。各検査日に、患者は、硝子体の融解について監視される。さらに加えて、患者は、強膜の窪みの倒像眼底検査を使って、後部硝子体の剥離について監視される。最後に、患者が示すＰＤＲの程度を、静脈のビーディング、ＩＲＭＡ、網膜虚血、血管新生および硝子体出血の程度を監視するために、定期的な網膜検査およびフルオロセイン血管造影撮影によって連続的に監視する。硝子体の新しい新重合(neopolymerization)または不完全な解重合の徴候があれば、上述したような治療を患者に繰り返し行うことになる。
【実施例１０】
【０１９０】
［ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による加齢性黄斑変性の治療］
この方法は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の治療における利用も意図している。加齢性黄斑変性は、しばしば両側に起こる徐々に視力が低下する疾患である。これは、成人における法的盲の最も普通の原因である。それは、おそらく、脈絡膜毛細血管または輸入網膜血管の老化および血管病が原因で起こると思われる。ＡＭＤには、基本的に「乾」と「湿」の２種のタイプがある。
【０１９１】
ＡＭＤの根底にある異常は、ブルック膜および網膜の色素上皮（ＲＰＥ）のレベルに退行変化(involutional change)が発生することである。そのような変化の特徴的な病変は、ドルース(druse)である。臨床によると、ドルーセン(drusen)（druse の複数形）は、ＲＰＥのレベルに、小さい黄白色の沈着物として現れる。ドルーセンは、硬層ドルーセン、軟層ドルーセンまたは基底層ドルーセンとして分類し得る。
【０１９２】
この方法は、湿潤型および乾燥型のＡＭＤの治療と予防の両方に向けられている。この疾患の湿潤型では、その症状は、脈絡膜毛細血管が冒されていると考えられる。脈絡膜毛細血管は、眼球に血管を新生させる働きがある脈絡膜の要素である。脈絡膜毛細血管は、色素上皮に大部分の栄養を供給する豊富な毛細管ネットワークと網膜の外層からなっている。脈絡膜毛細血管の損傷は、最終的に、黄斑変性の原因である血管新生の合併症に至ると考えられる。
【０１９３】
乾燥型では、非円板状黄斑変性は、下に存在する脈絡膜毛細血管の部分的なまたは全体な閉塞から起こる。検眼鏡検査で、網膜の色素上皮の変性と通孔形成を観察することができる。また、カルシウムのキレート化合物またはタンパク質性物質などの物質の色素上皮の下の沈着物も観察することができる。乾燥型のＡＭＤでは、網膜の二次変化が一般には徐々に起こり、視力が徐々に失われる。しかし、患者のある％の者は、重篤な視力の損失に至る。
【０１９４】
この方法は、硝子体の融解によって乾燥型ＡＭＤを治療し黄斑変性を予防することへの利用を意図している。硝子体の融解によって、後に黄斑変性になる沈着物質を網膜から除く速度が高めることを意図している。
【０１９５】
湿潤型のＡＭＤは、最も頻繁に、脈絡膜毛細血管の機能不全から起こり、その後、色素上皮の下に血管新生が起こる。血管新生は、また、血管が損傷したため起こった不十分な酸素供給に適応し網膜に血管が生成して起こると考えられる。血管新生は、また、色素上皮と知覚網膜の剥離などのいくつかの他の障害を起こすこともある得る。典型的には、この疾患は、通常、６０歳後に始まり、男女両方に等しく現れ、かつこの疾患を示す患者の両眼に現れる。
【０１９６】
おそらく、加齢性黄斑変性の最も重大な合併症は、新血管が増殖する眼球のブルック膜に欠陥が発生することである。この上皮の血管新生によって、網膜の中および下に滲出沈着物が生成することになり得る。この血管新生は、硝子体の中への出血をもたらし、その出血によって網膜の杆体および錐体の変性ならびに嚢形黄斑浮腫に至ることがある（以下で考察する）。不可逆性の視力損失をもたらす黄斑通孔が形成されることもある。
【０１９７】
患者の１０％だけがＡＭＤに冒されるが、ＡＭＤの血管新生合併症が、重篤な視力損失の症例の圧倒的大部分を占めている。危険因子としては、加齢、軟層ドルーセン、非地理的萎縮、家族歴、遠視および網膜色素上皮の剥離がある。ＡＭＤにおける脈絡膜の血管新生の症状としては、変形視症、傍中心暗点または低下した中心視覚がある。検眼鏡検査による知見としては、網膜下の液体、血液、滲出液、ＲＰＥの剥離、嚢胞性網膜変化または網膜の下の灰緑色の血管新生膜の存在がある。フルオレセイン血管造影撮影法は、しばしば効果的な診断法である。この診断手続中、病巣の境界のぼやけまたは未確認ソースからの漏出と見られる、網膜の下の空間における色素の進行性蓄積は、この疾患の指標である。フルオレセイン血管造影撮影で描かれる脈絡膜の血管新生膜の他の要素としては、高くなった遮断蛍光(elevated blocked fluorescenece)、平らな遮断蛍光(flat blocked fluorescence)、血液および円板形の瘢痕がある。
【０１９８】
血管新生ＡＭＤをこのように理解すると、古典的な脈絡膜の血管新生が、迅速な視力の悪化に最も強く関連している病巣の要素であることを示唆している。したがって、ＡＭＤの治療は、病巣の全ての新生血管と線維状血管の要素を網羅して行わなければならない。現在、治療は、古典的な血管新生が明確に画した境界を有していて、光凝固が有益であることが分かったときに、指示されるだけである。
【０１９９】
小窩外(extrafoveal)脈絡膜血管新生（中心窩から≧２００μｍ）を有する眼球は、アルゴンレーザによる光凝固法で、５年目の重篤な視力損失の発生（＄６ライン）が６４％から４６％まで低下した。通常、治療後の１年のうちに、レーザで治療した眼球の１／２に血管新生が再発した。血管新生が再発したときは、常に重篤な視力損失が付随していた。
【０２００】
小窩の近くに脈絡膜血管新生（中心窩から１〜１９９μｍ）を有する眼球は、クリプトンレーザによる光凝固法で、１年目で重篤な視力損失の発生が４５％から３１％まで低下したが、５年目では非治療群と治療群の間の差はそれほど明瞭でなかった。
【０２０１】
レーザによる治療は、依然としてＡＭＤを治療するために必須の治療法であるが、この発明の治療法は、血管新生の再発を減らすことによって、レーザによる治療の価値を高めるであろう。
【０２０２】
［加齢性黄斑変性の治療］
この実施例では、加齢性黄斑変性を示す患者を、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体中に注射することによって治療する。この治療の目的は、血管新生、黄斑の疾患および網膜の損傷の発生を減らしまたは防止することである。
【０２０３】
患者が６０歳に達したならば、ＡＭＤの存在を検出するため眼科の監視を増やす。この増やした監視には、網膜下の液、血液、滲出液、ＲＰＥの剥離、嚢胞性網膜の変化の存在、または網膜の下の灰緑色の血管新生膜の存在を監視するための定期的な網膜の検査とフルオレイン血管造影撮影を含めねばならない。
【０２０４】
ＡＭＤが診断されたならば、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療法を、光凝固法などの他の治療法と併用してまたは併用せずに開始する。治療の第一ステップとして、患者は、眼の健康のベースラインを確認するため、全眼科検査を受けねばならない。その眼科検査としては、倒像眼底検査法、細隙灯生物顕微鏡法、周辺網膜の検査、眼内圧の測定、視覚（裸眼または最良矯正）の症候学的検査、眼底撮影、フルオレセイン血管造影撮影、網膜電図検査法およびＡ走査測定がある。
【０２０５】
予備検査に続いて、ＡＭＤを示す患者の冒されている眼球の硝子体中にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射する。両方の眼が冒されている場合は、それらの眼を別個に治療してもよい。治療すべき眼球の硝子体に、５０Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）眼科溶液５０μｌ（上述）を注射して、硝子体のヒアルロン酸の解重合を促進し、硝子体を融解させる。
【０２０６】
ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射された眼球をレーザによる光凝固法で治療することが必要なこともある。ＡＭＤを治療するときは、実施例８と９に記述したレーザ治療法のプロトコルを踏襲しなければならない。別の実施態様では、この発明の方法の酵素による治療を行う前に光凝固法を行う。
【０２０７】
治療を行った後、患者の眼を第１日、第２日、第７日、第１５日、第３０日および第６０日に検査することになる。再発の可能性があるので、患者は、その後、再び一か月ごとに定期検査を行わねばならない。各検査日に、患者は硝子体の融解について監視される。さらに加えて、患者は、強膜のくぼみの倒像眼底検査法を使って後部硝子体の剥離を監視される。最後に、患者が示すＡＭＤの程度を、定期的な網膜検査とフルオロセイン血管造影撮影によって連続的に監視して、網膜下の液、血液、滲出液、ＲＰＥの剥離、嚢胞性網膜の変化の存在または網膜の下の灰緑色の血管新生膜の存在を監視する。血管新生が再発した徴候が観察されたときは、追加のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）および／またはレーザによる治療が必要であり得る。
【０２０８】
以下の実施例は、光凝固法を使用しなくても、この方法の効能があることを実証する。
【０２０９】
［ヒアルロニダーゼの硝子体内への注射後の、黄斑変性の症状の改善］
一人の７９歳を超える男性のヒトが患者として現れ、加齢性黄斑変性の病歴を持ち、右眼の裸眼視力が２０：４００であった。この患者の右眼の硝子体に、１００Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を一回注射した。左眼は、未処置のままであった。
【０２１０】
この患者を、投与後繰返し検査したところ、左眼（未処置）の視力は変化しなかったが、右眼（処置済み）の視力は以下のように改善されたことが観察された。
【０２１１】
2006523461.tif 000007
【０２１２】
この実験では、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の有害作用は、認められなかった。
【実施例１１】
【０２１３】
［ヒアルロニダーゼによる弱視の治療］
用語「弱視(amblyopia)」は、ギリシャ語由来の用語であり、弱い視力を意味する（amblys＝弱い、ops＝眼）。劣った視力は、脳の視覚野の異常な発達によって起こり、この異常発達は、視覚の早期発達時期における異常な視覚の刺激が原因である。弱視に付随する病状は、眼球に特有のものではなく、むしろ、外側膝状体核や有線皮質を含む脳の視覚野内に存在している。この異常な発達は、以下の三つの機序によって起こる。すなわち、（１）パターンのゆがみと呼ばれるぼやけた網膜像、（２）皮質の抑圧、または（３）皮質の抑圧＋パターンのゆがみである。この発明の方法は、主として媒体の混濁で起こるパターンのゆがみに関係している。より具体的に述べると、この発明の方法は、硝子体混濁の問題に取り組んだものである。
【０２１４】
弱視の視力は、通常、視力の少なくとも２本のスネレン(Snellen)線の差と定義されている。弱視を治療するのに決定的で重要なことは、早期検出と早期介入である。硝子体混濁で起こる弱視を治療する方策は、明瞭な視覚が得られるように硝子体の混濁を変化させることによって鮮明な網膜画像を提供することである。
【０２１５】
この実施例では、硝子体混濁が原因の弱視を示す患者を、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体中に注射することによって治療した。この治療の目的は、硝子体内の液体の交換速度を高めることによって、硝子体の混濁を減らすことであった。
【０２１６】
一人の弱視の病歴を有する４０歳の女性のヒトが患者として現れ、右眼の裸眼視力が２０：４００で、その目の矯正視力が２０：２００であった。彼女の右眼の硝子体中に、１００Ｉ．Ｕ．投与量のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を一回投与した。他方の眼は、未処置のままであった。
【０２１７】
この患者を、投与後、繰返し検査したところ、左眼（未処置）の視力は変化しないままであったが、右眼（処置済み）の視力は以下のように改善されたことが観察された。
【０２１８】
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【０２１９】
この患者に、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）の有害な作用は観察されなかった。
【実施例１２】
【０２２０】
［ヒアルロニダーゼによる色素性網膜炎の治療］
色素性網膜炎（ＲＰ）は、視野が狭窄された両側性夜盲症および網膜電図の異常を特徴とする進行性の網膜変性の一群の遺伝性障害に与えられた名称である。早期症状としては、暗順応が困難なことと網膜中央帯視野の喪失がある。この疾患が進行すると、視野の喪失が進行して、典型的には、中心視野が小さく残り、やがて中央視野も冒される。この疾患の過程の早期に、類嚢胞黄斑水腫、黄斑萎縮、または後嚢下白内障の発生によって、中心視力も冒される。ＲＰは、光変換に重要な光受容体の外側セグメント中に、少なくとも一種のタンパク質が異常生成することを共通の特徴とする変種の疾病群を表す。
【０２２１】
ＲＰの一つの臨床結果は、中心窩周囲毛細血管の血液−網膜関門および視神経乳頭の不安定化である。この不安定化は、フルオレセイン色素を漏出させ、これは血管造影撮影で観察される。この漏出に加えて、外側表皮層中の小嚢胞として液体の蓄積が起こり観察されることもある。これらの液体が充満した嚢胞は、結局破裂して、網膜層を損傷することもある。この発明の方法は、小嚢胞に蓄積する組織液の除去を加速することによって、ＲＰが関連する網膜の損傷を治療することを意図している。
【０２２２】
一人の５９歳の男性のヒトが患者として現れ、色素性網膜炎の病歴を持っていた。彼の左眼は、裸眼視力が２０：４００で、矯正視力も２０：４００であった。この患者の左眼の硝子体に１００Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を一回注射した。他方の眼は、未処置のままであった。
【０２２３】
ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を投与後、この患者を繰り返し検査したところ、患者の右眼（未処置）の視力は変化なしのままであったが、患者の左眼（処置済み）の視力は下記のように改善されたことが観察された。
【０２２４】
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【０２２５】
試験結果は、被験者の目視能力に有意な改善があったことを実証しており、裸眼視力（２０：４００から２０：８０へ改善）と最良矯正視力（２０：４００から２０：４０へ改善）の両方に関して改善があった。また、処置期間中、被験者の眼内圧に変化が見られたが、その眼内圧は、注射の時点から約２週間後にはベースラインのレベルまで戻るようであった。これらの試験結果は、一名の患者から得たものであるが、今後の試験を充分保証すると期待できるようである。
【実施例１３】
【０２２６】
［ヒアルロニダーゼによる黄斑孔の治療］
黄斑の破裂すなわち爆発的開口は、黄斑孔として知られている。興味深いことに、この症状は、通常、５０歳代(sixth dacade)から７０歳代(eighth dacade)にかけての女性に、または、閃光による損傷、太陽光による損傷、強膜のねじれなどの外傷の後に、または、ブドウ膜腫の眼に起こる。症状としては、変形視症と視力低下がある。
【０２２７】
黄斑孔の形成は、後部硝子体の共同腔(synergetic cavity)内の液体の運動が関与して後部皮質性硝子体(posterior cortical vitreous)によって誘発される網膜表面を横切る接線方向牽引力が原因と考えられている。後部硝子体の栓状沈澱腔(syneresis cavity)が、黄斑孔を示す患者の大部分に存在している。後部硝子体のゲルが網膜表面から後退したとき、二つの表面の間に出来る間隙の領域内で、硝子体液の動きが網膜の表面に対して負の相互作用をするからであろうと考えられる。後部硝子体の栓状沈澱腔の空間内での硝子体液の接線方向運動は、網膜の引裂きを促進して、黄斑孔を形成するに至ると考えられる。
【０２２８】
この発明の方法は、黄斑孔の形成をもたらす症状を排除するように硝子体を解重合するためにヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を使用することを意図している。硝子体が解重合されると、後部硝子体の栓状沈澱腔は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）に媒介されて硝子体が再構成される結果として排除される。この空腔の排除によって、硝子体と網膜の間の液体が硝子体腔の回りを自由に移動することができるようになり、そうでなければ網膜表面に対して向かうであろういかなる有害な力をも消散させる。
【０２２９】
黄斑孔形成の早期徴候を示す患者は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体中に注射することによって治療される。治療すべき患者は、黄斑孔を形成する前の各種徴候を示す。これらの徴候としては、黄色の中心窩のスポットまたはリングが関与している中心窩のくぼみの喪失がある。中心窩は、黄斑孔の形成された領域が薄くなり始めて、その病巣は赤みを帯びる。この段階でのフルオレセイン血管造影撮影結果は、正常に見えるかまたは弱い高蛍光(hyperfluorescence)を示すことがある。偏心した充分に厚い裂開部分の出現は、この疾患の早期段階が先に進行したことを意味する。これらの徴候が観察されたときに、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療を開始する。
【０２３０】
この発明の方法のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）による治療は、黄斑孔が生成していると診断されたときに開始する。患者は、眼の健康のベースラインを確認するため、全眼科検査を受けることになる。その眼科検査としては、倒像眼底検査法、細隙灯生物顕微鏡法、周辺網膜の検査、眼内圧の測定、視力（裸眼または最良矯正）の症候学的検査、眼底撮影、フルオレセイン血管造影撮影、網膜電図検査法およびＡ走査測定がある。
【０２３１】
上記予備検査に続いて、患者の冒された眼の硝子体中にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射する。両眼が冒されている場合は、別個に治療してもよい。治療すべき眼には、上記の５０Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）眼科溶液５０μｌを硝子体中に注射して、硝子体のヒアルロン酸の解重合を促進し、硝子体を融解させる。
【０２３２】
治療後、患者の眼は、第１日、第２日、第７日、第１５日、第３０日および第６０日に検査することになる。各検査日に、患者を硝子体の融解について監視する。治療の過程を監視するのに特に有効な方法と考えられるフルオレセイン血管造影撮影法も実施する。さらに加えて、患者を、強膜のくぼみの倒像眼底検査を使用して、後部硝子体の剥離について監視する。
【実施例１４】
【０２３３】
［ヒアルロニダーゼによる黄斑滲出症の治療］
黄斑の滲出液は、血液−網膜関門を通り抜けて黄斑を通過し硝子体房の中へ浸透する物質である。これには、軟滲出液と硬滲出液の２種類がある。この軟滲出液は、実際は滲出液ではなく、虚血性損傷部位または梗塞部位の球状に膨張した神経線維層中の神経節細胞軸索のクラスタである。硬滲出液は、通常、背後にある網膜症の微細血管の変化が原因で滲出する。硬滲出液は、黄色でかつ蝋状であり、黄斑の周りに円形に堆積することが多い。硬滲出液は、漏出血管からの血清成分の滲出に由来するか、または網膜内の変性しつつある神経要素の脂質生成物に由来する脂質とタンパク質性物質からなっている。硬滲出液の吸着は、主としてマクロファージの再吸収に媒介されるが、滲出は網膜の血管がない領域内の外側網状層に生じることが多いので、そのプロセスの速度は遅いと思われる。この発明の方法は、網膜の不安定化から起こる滲出液蓄積の程度を下げるのに特に有用である。というのは、硝子体をヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で解重合すると、硝子体の水性成分の代謝回転速度が高められるからである。
【０２３４】
黄斑滲出液を示す患者は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射する治療法で治療する。患者は、眼の健康のベースラインを確認するため、全眼科検査を受けることになる。その眼科検査としては、倒像眼底検査法、細隙灯生物顕微鏡法、周辺網膜の検査、眼内圧の測定、視力（裸眼または最良矯正）の症候学的検査、眼底撮影、フルオレセイン血管造影撮影、網膜電図検査法およびＡ走査測定がある。
【０２３５】
上記予備検査に続いて、患者の冒された眼の硝子体中にヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を注射する。両眼が冒されている場合は、別個に治療してもよい。治療すべき眼には、上記の５０Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）眼科溶液５０μｌを硝子体中に注射して、硝子体のヒアルロン酸の解重合を促進し、硝子体を融解させる。
【０２３６】
治療後、患者の眼は、第１日、第２日、第７日、第１５日、第３０日および第６０日に検査することになる。各検査日に、患者を硝子体の融解について監視する。治療の過程を監視するのに特に有効な方法と考えられるフルオレセイン血管造影撮影法も実施する。さらに加えて、患者を、強膜のくぼみの倒像眼底検査を使用して、後部硝子体の剥離について監視する。
【実施例１５】
【０２３７】
［類嚢胞黄斑水腫の治療］
類嚢胞黄斑水腫は、さまざまな群の病因から起こる一般的な眼の異常である。この症状の大部分の原因は、外側網状層の微小嚢胞中に蓄積する漏出液体をもたらす、中心窩周囲の毛細血管の血液−網膜関門および視神経乳頭の障害に由来する。この領域は、網膜の比較的薄くかつ血管新生の少ない領域にある。臨床によると、類嚢胞黄斑水腫は、フルオロセイン血管造影撮影法で検査すると、ハニカム型の外観を示す。この水腫が進行すると、外側網状層が破裂して、層状通孔を生成する。この通孔は、網膜の内層に限定されたり、または最終的に完全な黄斑孔まで進行たりすることがある。
【０２３８】
この発明の方法は、ヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）で硝子体を解重合することによって、類嚢胞黄斑水腫を治療して黄斑孔の生成を防止することを意図している。
【０２３９】
類嚢胞黄斑水腫の徴候を示す患者は、実施例１３と１４に記述したようにヒアルロニダーゼ（ＡＣＳ）を硝子体中に注射することによって治療する。
【実施例１６】
【０２４０】
［ヒアルロニダーゼのその他の薬理学的使用］
ヒアルロニダーゼは、これまで長年にわたって治療に使用されてきた。その立証済みの多様な作用は、主として細胞間の結合組織に起こり、この組織内のヒアルロン酸の分解が主原因であると考えられる。この作用の治療上有用な結果、すなわち、細胞間セメント質の粘度の低下および膜と血管の透過性の増大は、その「拡散作用」に基づいている。流体および／または放射線不透過性媒体を投与した後にヒアルロニダーゼが透過性を高める作用が、治療上意義のあるところである。
【０２４１】
［ヒアルロニダーゼ−その拡散作用］：
・  細胞間セメント質の粘度を低下させる
・  膜と血管の透過性を増大する
→  皮内、皮下、真皮内、静脈内または筋肉内の経路で注射すると、空間的変化過程(spatial processes)を高めて、一時的な加速(temporal acceleration)を引き起こす。
［結果］：溶液、懸濁液、乳濁液が周囲の組織の中へ拡散し浸透するのを改善する。
【０２４２】
ヒアルロニダーゼは、大容積の投薬が溶液、懸濁液または乳濁液の形態でなされたときでも、注射された薬物（抗生物質、細胞増殖抑制剤、局所麻酔薬、化学療法剤、抗ウイルス剤など）の組織による吸収を加速し高める。
【０２４３】
ヒアルロニダーゼは、整形外科、外科、眼科、内科、腫瘍科、婦人科、皮膚科などで長年にわたって使用され成功している。
【０２４４】
ヒアルロニダーゼの実験的使用は、多数の医学分野で試験された。この物質は、各種の適応症と治療に臨床で投与されてきている。
【０２４５】
［眼科／眼球周囲麻酔と眼球後麻酔］：  眼科は、現在、ヒアルロニダーゼの各種適応症の重要でかつずいぶん論文が報告されている分野である（Farr C.他、１９９７、Wien Med Wschr、１４７：１〜８）。
【０２４６】
ヒアルロン酸は、眼科の手術中（例えば、白内障の手術中）に、例えば、眼球の前眼房を無傷に保持するため、またはレンズを移植中に角膜内皮を保護するために、しばしば適用される。これは、眼内圧の上昇をもたらす。
【０２４７】
測定結果は、眼球の前眼房にヒアルロニダーゼを導入すると、手術後に眼内圧を効果的に低下させることができることを示している。
【０２４８】
ヒアルロニダーゼは、広角緑内障を治療するため線維柱帯切除術を受けた患者の眼内圧を下げるのに有効であることも分かっている（３００Ｉ．Ｕ．の投与量を結膜下注射で投与した）。著者者らは、ヒアルロニダーゼが合併症の数を減らしかつ線維柱帯切除術の予後を改善すると結論した。ヒアルロニダーゼは、リドカインおよびブピバカインなど局所麻酔薬（アドレナリンとともに、またはなしで）と併用したとき、白内障の手術の際の眼球後および眼球周囲の麻酔にも有用である。眼球の局所麻酔でのヒアルロニダーゼの効果は、古く１９４９年に報告された。その後の研究では、患者の眼球後麻酔に、プロカイン＋アドレナリン＋ヒアルロニダーゼの併用効果が研究された。
【０２４９】
眼筋の失動の改善が主観的評価で観察された。麻酔の作用のヒアルロニダーゼによる改善は、眼窩が最適の注射部位であるためである。
【０２５０】
各５０名の患者からなる複数群での、ヒアルロニダーゼありとヒアルロニダーゼなしのブピバカイン対リドカインの二重盲比較試験で、研究者らは、ヒアルロニダーゼありの群に、有意に多数の完全麻酔された患者を観察した。誘発された筋肉遮断が手術全体を通して持続したので、これら患者は誰も追加の麻酔薬を必要としないことも分かった。これらの知見は、その後の試験で明確に確認された。
【０２５１】
ヒアルロニダーゼを併用した局所麻酔の効果の開始については、１９９０年に研究された。研究者らは、酵素の補助剤を麻酔薬とともに注射された全ての患者において、外科手術に必要な麻酔効果が注射後５分以内に起こったことを発見した。一方、対照群では、麻酔薬の追加の投与量が必要で、かつ麻酔効果の開始はそれより遅く始まった。
【０２５２】
局所麻酔にヒアルロニダーゼを追加すると、外科手術の条件が改善された。ヒアルロニダーゼは、老年性白内障の手術における眼球後麻酔にリドカインとノルアドレナリンに加えると、非常に効果的であることが分かった。
【０２５３】
一つの臨床試験では、７５Ｉ．Ｕ．のヒアルロニダーゼを０．７５％のブピバカインと２％のメピバカインに加えたところ、眼球の運動遮断、無痛覚および緊張低下が改善されるに至った。
【０２５４】
斜視切開術にヒアルロニダーゼを使用する試験は、ヒアルロニダーゼを補なった場合、メピバカインとリドカインの充分な麻酔効果を達成できることを実証した。小容積のヒアルロニダーゼでさえも、所望の拡散作用を示した。
【０２５５】
眼球後麻酔に関する知見は、全般的に、眼球周囲および結膜下の麻酔にも当てはまる。局所麻酔にヒアルロニダーゼを併用すると、信頼性の高い眼筋の遮断が達成されて、手術条件が改善される。
【０２５６】
ヒアルロニダーゼの局所麻酔に対する効果は、別の有望な無作為の対照を加えた二重盲検試験で、再び試験した。この試験も、ヒアルロニダーゼの追加によって追加の効果が得られることを示した。
【０２５７】
これらの結果は、老人性白内障の患者８０名に、１５０ＩＵのヒアルロニダーゼを麻酔に対する補助剤として投与したときに、確認された。彼らの結果は、２５０ＩＵのヒアルロニダーゼを投与した７０名の患者からなる別のグループにおいて後日確認された。
【０２５８】
研究者らは、リドカイン／ブピバカインとヒアルロニダーゼを併用して使用する間に、眼球内の循環が変化することを実証した。彼等は、眼球の拍動容積が有意に低下し、かつ眼球内圧が有意に低下することを検出した。
【０２５９】
１５０ＩＵのヒアルロニダーゼを加えた局所麻酔は、白内障の手術に対する信頼性のある選択肢であることが証明された。
【０２６０】
眼球周囲の麻酔について、研究者らは、目的領域の痛みを除くため、２％のリドカイン、０．５％のブピバカインおよび１５５０ＩＵのヒアルロニダーゼの混合物を体温まで暖めることを推薦した。別の研究では、２種類の濃度のヒアルロニダーゼを、眼球周囲の麻酔に対する補助剤として使用した。３つのグループに、０ＩＵか５０ＩＵか１５０ＩＵかのヒアルロニダーゼ補助剤を投与して、麻酔作用の開始、無痛覚および失動を評価した。５０ＩＵと１５０ＩＵのヒアルロニダーゼのグループの間に統計的有意差は検出できなかった。著者らは、ヒアルロニダーゼを加えることは、合併症を全くもたらさないと結論した。
【０２６１】
他の著者らは、眼球周囲麻酔と眼球後麻酔の試験結果を比較した後で、ヒアルロニダーゼを加えることは、両方の場合に有用である、ヒアルロニダーゼは、硝子体が眼球の後眼房中に隆起するのを防止するのに極めて効果的であり、そして背後からの力(vis a tergo)の発生を有意に減らすと結論した。
【０２６２】
ヒアルロニダーゼは、リドカインとブピバカインが眼球周囲空間内に一層迅速に拡散することを可能にする。
【０２６３】
白内障の手術を行う前に投与された局所麻酔薬の注射圧を、５０名の患者において二重盲検試験法で測定した。この試験によって、１％のエチドカイン、０．５％のブピバカインおよび５０ＩＵのヒアルロニダーゼの投与で外眼筋の有意な（充分な）失動を達成することができるという結論が得られた。
【０２６４】
［緑内障］：  ヒアルロニダーゼは、緑内障の治療または眼内圧の改善に有効である。
【０２６５】
［局所麻酔薬との併用］：  ヒアルロニダーゼを局所麻酔薬、例えば、プロカインまたはリドカインと併用すると、麻酔作用の開始がより速くなり、鎮痛領域が拡大し、そして手術後の痛みが有意に減少した。
【０２６６】
一つの試験では、プロカインとヒアルロニダーゼを併用して皮下注射した後の麻酔領域が、プロカインのみの場合の殆ど２倍であることが分かった。この試験は、また、ヒアルロニダーゼとプロカイン／アドレナリンを組み合わせた製剤を投与した後の麻酔の持続が、麻酔作用の６倍の延長になることも実証した。
【０２６７】
ヒアルロニダーゼの添加ありまたはなしの場合のブピバカイン＋アドレナリンの腋窩腕神経叢の遮断に対する作用を、二重盲検法で比較した。ヒアルロニダーゼは、麻酔の起こる時間にも、この神経叢の不適切な遮断の発生にも、ブピバカインの血漿中濃度にも影響しなかった。この試験は、麻酔の持続が短縮されることを実証した。
【０２６８】
［整形外科，支持歩行器官の疾患］：  これまで長年にわたって、ヒアルロニダーゼは、支持歩行器官の各種疾患、例えば、滑液鞘、周囲の結合組織およびこれら領域の多様な炎症（捻髪音性腱周囲炎(paratendinitis crepitans)、上腕肩甲関節周囲炎(humeroscapular periarthritis)、上腕骨外上顆炎(humeral epicondylitis)、脛骨顆炎(tibial condylitis)、橈骨茎突炎(radial styloititis)など）の急性症状を治療するのに使用して成功している。ヒアルロニダーゼによる治療をできるだけ早く開始すれば、たとえ冒された四肢が固定できなくても、良好な治療結果が通常達成できる（特に、運動または理学療法を併用して）。研究者らは、１９６８年に急性捻髪音性腱鞘炎(acute tendovaginitis crepitans)の患者をヒアルロニダーゼで治療して成功している。
【０２６９】
腱周囲炎および上腕肩甲関節周囲炎を治療するためヒアルロニダーゼ（３００ＩＵ）とビタミンＢ１２を注射する併用療法が報告されている。外上顆炎と腱鞘炎を治療する際のヒアルロニダーゼの効能を、合計５３名の患者で試験した。ヒアルロニダーゼ１５００〜３０００単位を毎日静脈注射したところ、症状が減退しまたは愁訴が明らかに除かれた。
【０２７０】
他の試験からの知見が、腱周囲炎、上腕骨外上顆炎、上腕肩甲関節周囲炎および橈骨と尺骨の茎突炎に対する同じ治療が成功したことを示しており、この試験では、殆どの症例に２日ごとにヒアルロニダーゼ３０００ＩＵを投与した。
【０２７１】
ヒアルロニダーゼは、主として膝関節症の患者の関節症を治療するため、メフェネシンと併用して成功した。慢性症例での成功率は、特に印象的であった。
【０２７２】
ベヒテレフ病の患者にヒアルロニダーゼを静脈投与したところ、作用が長期間継続したという知見は、治療上非常に重要である。平均１５００〜９０００ＩＵのヒアルロニダーゼを３日ごとに静脈内投与したところ、被検患者の可動性が増大した。
【０２７３】
その作用モードについて、研究者らは、間葉代謝が増大しために起こる骨外にカルシウムが沈着するプロセス中に、結合組織マトリックスに堆積するムコ多糖類を、ヒアルロニダーゼが解重合すると考えている。カルシウ塩が存在していると、それらは、カルシウムが第三リン酸カルシウムとして存在しない限り解重合されることができる。これは、骨外のカルシウム沈着を抑制することができる。可撓性（例えば、冒された脊髄分節の）の改善は、すでに形成された結合構造が弛むことから起こると推定される解重合が原因であろう。ヒアルロニダーゼは、真皮の組成と構造に影響することができ、そしてプロテオグリカンの再合成を促進することができると考えられる。顆上骨折の合併症として起こることが多い関節硬直の治療において、ヒアルロニダーゼを先にまたは同時に投与すると、患者を症状からより迅速に解放することができる。
【０２７４】
［悪性疾患の治療］：  ヒアルロニダーゼは、悪性腫瘍の化学療法に対する補助剤として使用すると、腫瘍細胞および腫瘍細胞集合体の周りのヒアルロン酸含有領域を溶解できるので、より高濃度の細胞増殖抑制剤が所望の標的領域で効力を発揮することができる。さらに、ヒアルロニダーゼは、例えば、免疫適格細胞（「ナチュラルキラー細胞」）と抗原を腫瘍表面上で直接接触させることによって、免疫防衛プロセスを関連して高めることができると思われる。
【０２７５】
悪性疾患（全身的血液疾患、乳癌、脳転移、神経膠腫、ＥＮＴ領域の扁平上皮細胞癌、肺と結腸の腺癌および膀胱癌）の治療に対するヒアルロニダーゼ（静脈内、筋肉内および膀胱内の投与）の有用性は、各種臨床試験の課題である。散発的な症例では、ヒアルロニダーゼは、その高投与量を、細胞増殖抑制剤を投与する前に投与すると、細胞増殖抑制剤に対する応答速度が増大することが分かった。ヒアルロニダーゼを補助剤として、悪性の血液疾患に冒されている治療効果が上がりにくい患者に使用すると、患者の化学療法に対する応答を改善することができる。
【０２７６】
腫瘍学上、ヒアルロニダーゼは、ドキソルビシンおよびアドリアマイシンなどの細胞増殖抑制剤に補助剤として投与すると、特に有用であることが証明されている。この酵素は、ドキソルビシンの細胞中への透過を改善し、さして乳癌におけるアドリアマイシンの活性を増大する。
【０２７７】
頭部および頸部の進行した扁平上皮細胞癌を治療するためのシスプラチン、ビンデシン、ヒアルロニダーゼおよび放射線治療の併用投与は、非常に有効であることが分かった。すなわち、癌患者に、迅速な寛解が見られ、そして細胞増殖抑制治療法の許容度の改善が観察された。
【０２７８】
ヒアルロニダーゼは、乳癌の癒着関連の多細胞薬剤抵抗性を低下させた。この作用機序は、細胞接触に依存する増殖阻害の低下と細胞増殖抑制剤に対する細胞の感作に基づいている。
【０２７９】
［腫瘍を治療する際のヒアルロニダーゼ］：
・  ヒアルロニダーゼは、全身的血液疾患、乳癌、脳転移、神経膠腫、耳、鼻および喉の領域の扁平上皮細胞癌、肺と結腸の腺癌ならびに膀胱癌などの悪性疾患の治療に使用される細胞増殖抑制剤の作用を増大する
・  臨床試験で、ヒアルロニダーゼは、各種腫瘍の増殖を停止させる（寛解させる）ことが分かった
・  ヒアルロニダーゼは、細胞増殖抑制剤を投与する前に、膀胱に点滴投与すると、治療効果を上げにくい患者が細胞増殖抑制剤に良好に応答する
・  ヒアルロニダーゼは、被験者の健康および腫瘍患者の生命の質を改善できる。
【０２８０】
［皮膚科］：  研究者らは、ヒアルロニダーゼが、例えば、最も重要な特徴がコラーゲンフラグメントの変位(displacement)である全血管結合組織系の全身的障害である進行性強皮症などのある種の皮膚科疾患に有用であると結論している。病的機構として重大なことは、強皮症で起こる組織形態学的な皮膚の変化が、酸性ムコ多糖類（ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン）を豊富に含有している皮膚水腫で始まることである。組織病理学的試験と化学試験は、基質の一部が、コラーゲン繊維中のセメントとして生成することを示している。したがって、酸性ムコ多糖類、可溶性コラーゲンおよびポリマーコラーゲンが強皮症の元凶であると考えられる。
【０２８１】
研究者らは、ケロイドや限局性強皮症などの一次疾患に冒されている患者に高投与量のヒアルロニダーゼを静脈内に投与する治療法に関するその後の知見を発表した。ヒアルロニダーゼは、両方の疾患に対して良好な結果を達成した。同じことが、進行性強皮症に当てはまるが、関節の作用的可撓性の増大は、永久的なものではなかった。したがって、進行性強皮症を治療するため、高投与量のヒアルロニダーゼを静脈中に投与することは、硬化症の古い領域に対する効果が実証できなかったので、補助投薬としてのみ推奨された。選択した投与経路を評価したところ、皮膚の冒された領域にヒアルロニダーゼを局所投与しての治療は、成功に至らなかった。静脈内への注射または注入だけが、殆どの患者において、最低限、症状を改善した。
【０２８２】
［心筋梗塞の治療］：  急性心筋梗塞を治療するのにヒアルロニダーゼを使用することは、１９５９年に初めて記述された。研究論文は、新しい心筋梗塞の早期すなわち急性期（梗塞が始まってから２〜４時間）にヒアルロニダーゼを投与すると、心臓における壊死領域の大きさを減らすことができることを示している。
【０２８３】
研究者らは、梗塞の大きさを小さくする薬剤、例えば、β遮断剤、硝酸塩、カルシウム拮抗剤などを試験した。ヒアルロニダーゼは、ともに投与されたストレプトキナーゼなどの血栓溶解薬に対して好ましい作用を有していることが分かった。これは、ヒアルロニダーゼが酸素ラジカルを閉じ込める性能に起因するようである。
【０２８４】
統計の専門家がメタ分析を実施して、ヒアルロニダーゼおよび心筋梗塞の大きさを小さくする可能性を有する他の心臓血管作用薬の役割を研究した。
【０２８５】
統計の専門家は、補助剤のヒアルロニダーゼが、死亡率を１５〜２０％低下させたことを見出した。
【０２８６】
研究者らは、急性の心筋梗塞を治療するのに使う従来の薬剤（硝酸塩、β受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬）に加えてヒアルロニダーゼを使用することも推薦した。
【０２８７】
データに差があり、場合によっては、矛盾した知見があるにもかかわらず、心筋梗塞を治療するのにヒアルロニダーゼを使うことが、最終的に立証され確認されたようである。
【０２８８】
［種々の適応症］：  もう一つの適応症は、粘膜下線維症の治療である。１０年間にわたる１５０名の患者との経験で、ヒアルロニダーゼとデキサメタゾンを併用すると、殆どの症例において、長期間にわたって症状を低減できることが分かった。
【０２８９】
キモトリプシン、ヒアルロニダーゼおよびデキサメタゾンを局所注射しても、優れた治療結果が得られることが報告された。しかし、治療効果が上がりにくい患者には、外科切除法を実施した。
【０２９０】
口内粘膜下線維症に冒された３２６名の患者を無作為に２群に分けて、ステロイドとヒアルロニダーゼ、または局所のビタミンＡステロイドと経口鉄製剤のいずれかで治療した。ステロイドとヒアルロニダーゼによる治療は、余り問題がないことが分かった。
【０２９１】
ヒアルロニダーゼは、毛髪の移植および頭皮の治療と美容外科手術にも使用されている。ヒアルロニダーゼは、局所麻酔薬の拡散を改善するのに有効であることが見出された。
【０２９２】
外科手術後の手術後癒着を防止するためにヒアルロニダーゼを使用することも、報告されている。
【０２９３】
脳膿瘍の場合、主として危険性の高い患者の水腫を除くために、ヒアルロニダーゼを、デキサメタゾンと併用したり、または抗生物質と併用したりした。
【０２９４】
ヒアルロニダーゼは、局所投与された薬剤の吸収を改善すること、およびビンカアルカロイドの静脈内注射で治療されている患者において皮膚壊死が進行する危険を低減することが分かった。
【０２９５】
血管外に遊出した化学療法剤に対する解毒剤としてヒアルロニダーゼを使うことも記述されている。ヒアルロニダーゼは、ビンカアルカロイドまたはエトポシドなどのエピポドフィロトキシンに対する解毒剤として使える少数の解毒剤の内の一つである。
【０２９６】
婦人科がヒアルロニダーゼのもう一つの適用領域である。ヒアルロニダーゼは、分娩の娩出段階の前に会陰部に注射すると、初産の母親の産道の硬さを柔軟にして、しばしば会陰切開の必要性をなくすことが見出された
ヒアルロニダーゼは、粘性の関節滲出物と胸膜滲出物を部分的におよび完全に吸引し易くするためにも有用であり、すなわち、ヒアルロニダーゼは、これら滲出物を融解する。ヒアルロニダーゼは、各種起源の水腫の治療および関節炎の関節の変化の治療にも使用される。
【０２９７】
ヒアルロニダーゼは、角膜形成術、角膜の瘢痕、不透明化およびかすみ、ならびに離層させる必要がある角膜のための治療剤である。
【０２９８】
ヒアルロニダーゼは、従来の機械的硝子体切除術の代替物または付属物として使用することができる。
【０２９９】
ヒアルロニダーゼは、網膜剥離を起こさせるためにも有用である。
【０３００】
ヒアルロニダーゼは、皮下注入するため注射された他の薬剤の吸収と分散を高める補助剤として、および放射線不透過剤の吸収を改善するための皮下尿路造影撮影法の補助剤として指摘されている。
【０３０１】
［まとめ］：  ヒアルロニダーゼの立証された多様な活性は、主として細胞間の結合組織に生じる。この作用は、明らかに、前記組織中のヒアルロン酸の分解反応に起因している。この作用の治療上有用な結果（細胞間セメントの粘度の低下、膜や血管の透過性の増大）は、「拡散作用」によって起こる。
【０３０２】
液剤および／または放射線不透過性媒体を投与した後に生じる、ヒアルロニダーゼが関連する拡散の向上と透過性の増大は、治療の面で重要な意味を持つ。ヒアルロニダーゼは、大容積の薬物（抗生物質、細胞分裂抑制剤、局所麻酔薬など）が溶液、懸濁液または乳濁液の形態で注射されたときでさえも、組織によるこれら薬物の吸収を加速し増大することができる。迅速に作用し始める必要がある症例において、ある種の薬剤が静脈に投与できないときは、ヒアルロニダーゼを「前注射(pre-injection)」すると、薬剤の皮下または筋肉内の投与量の血流中への吸収を加速（２００〜３００％）することができ、このことは、内科にとって特に重要である。
【０３０３】
支持・歩行系統の障害を治療におけるヒアルロニダーゼの効能は、ヒアルロニダーゼのいわゆる「柔軟にする作用」によるものである。
【０３０４】
ヒアルロニダーゼは、早期に、特に追加の運動および／または理学療法と組み合わせて投与すると、その「消炎」作用によって、滑液鞘および周囲の結合組織を冒す急性症状（捻髪音性腱周囲炎、上腕肩甲関節周囲炎、上腕骨外上顆炎、脛骨顆炎、橈骨茎突炎など）を抑制できる。
【０３０５】
関節硬直（例えば、顆上骨折による）も成功裡に治療することができる。
【０３０６】
ヒアルロニダーゼは、その拡散能力によって、どのような起源の外傷後の血腫または水腫の治療にも利用できるし、整形外科における関節および胸膜の滲出物の融解にも利用することもできる。
【０３０７】
ヒアルロニダーゼは、移植臓器拒絶反応を防止する際の抗水腫剤および抗炎症剤として有用であると指摘されている。ヒアルロニダーゼは、損傷した組織中のヒアルロナンを分解するので、臨床前の実験で、前記役割に役立っていることが分かった。独特の水結合性を有するグルコサミノグリカンであるヒアルロナンは、ある種の移植臓器の中へ水を引き込んで水腫を起こす。これによって、臓器の機能が損われ、移植臓器が損傷して拒絶されることにつながることもある。ヒアルロナンは、水を引きつけることに加えて、免疫系のある種の細胞を引きつけるので、炎症反応を開始する手段になり得る。試験によって、ヒアルロニダーゼによる治療が、臓器移植を行った後の水腫と炎症を減らすのに使用できることが確認されている。
【０３０８】
ヒアルロニダーゼをプロカインなどの局所麻酔薬を投与する前に投与（「前注射」）すると、その麻酔薬の作用の開始がより早くなり、麻酔領域がより大きくなり、そして手順の完了後の痛みが有意により弱くなる。
【０３０９】
ヒアルロニダーゼと局所麻酔薬の最適で効果的な組合せが、現在、特に眼科でそしてとりわけ白内障の手術に、広く使用されている。眼球後麻酔および眼球周囲麻酔を行うためのある種の局所麻酔剤（プロカイン、リドカイン、ブピバカインなど）とともにヒアルロニダーゼを手術の前に投与することは、各種の眼科手術に有用である。ヒアルロニダーゼは、麻酔薬の作用開始を加速し、眼筋の信頼性の高い遮断を起こして、それにより手術のための優れた条件をつくる。ヒアルロニダーゼは、アドレナリンなどの昇圧薬と併用すると、治療領域の麻酔の持続を延長して、局所麻酔の急速な低下を防止する。ヒアルロニダーゼは、また、眼科の手術中にヒアルロン酸ナトリウムなどの粘弾性物質を投与することが原因で起こる手術後の眼内圧の上昇を治療するのにも有用である。
【０３１０】
ヒアルロニダーゼは、また、皮膚科、すなわち結合組織系を冒しその変性を特徴とする選択された皮膚の障害（強皮症、ケロイド形成、乾癬、慢性静脈瘤潰瘍など）にも広く使用される。
【０３１１】
ヒアルロニダーゼは、婦人科、すなわち会陰切開を防止することにも有用である。
【０３１２】
ヒアルロニダーゼが心筋梗塞を治療するのに有効であることは、実証済みである。
【０３１３】
最も最近の臨床試験で、ヒアルロニダーゼが、癌（骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、乳癌（付随する脳転移もある）、脳リンパ腫、神経膠腫、耳、鼻および喉の領域の扁平上皮細胞癌、ならびに膀胱癌）に冒されている患者の化学療法の補助剤として有用であることが分かっている。ヒアルロニダーゼは、細胞増殖抑制剤に対する患者の応答を増大するのみならず、患者の全般的な主観的健康感と寛解速度を劇的に改善する。
【０３１４】
この治療の主役の有用性の予備的証拠は、結腸癌、肺の腺癌、気管支癌、副腎腫、胃、膵臓および卵巣の癌、骨髄肉腫、ならびに神経腫にも見出されている。異なるタイプの腫瘍において、ヒアルロニダーゼの投与が腫瘍増殖の一時的停止を誘起することが見出され、そしてヒアルロニダーゼ治療効果が上がりにくい患者の細胞増殖抑制剤に対する応答を改善した。さらに、ヒアルロニダーゼは、免疫系を刺激すると考えられる。ヒアルロニダーゼを、悪性腫瘍の化学療法の補助剤として投与した後の肯定的な知見は、ヒアルロニダーゼが、いつの日か、抗腫瘍化学療法の可能性を拡大して治療結果を改善できるかも知れないと、期待させる理由になっている。
【０３１５】
毒性学の観点から、およびヒアルロニダーゼの各種用途に関する広範囲の利用可能なデータに照らして、ヒトにヒアルロニダーゼを使用することを禁止する理由は全くない。
【０３１６】
ヒアルロニダーゼの一回投与量の投与でも、または長期間の投与でも、急性毒性試験において臓器の重大な病理学的変化は全く検出されなかった。
【０３１７】
しかし、ヒアルロニダーゼは、単独で使用してもまたは他の物質と混合しても、実際は抗原性であるということを常に覚えていなければならない。これらの作用は、ヒアルロニダーゼを単離するのに使用する方法が複雑なため、完全に取り除くことは決してできない。したがって、医薬の用途に適切なヒアルロニダーゼ製剤が要望されており、その要望をここ開示の、羊のヒアルロニダーゼを単離し精製する方法が満たしている。
【０３１８】
ヒアルロニダーゼに関する肯定的な臨床の知見に照らして、ヒアルロニダーゼは、現在および将来の医療の新しい領域において治療上有用な薬剤になる見込みのある、治療上、万能の酵素であると結論することができる。
【実施例１７】
【０３１９】
［注射用ヒアルロニダーゼ］
ヒアルロニダーゼを拡散剤として使うこの実施例では、以下に列挙した不活性成分とともに高減圧下で固体状態に脱水された注射用のヒアルロニダーゼを、滅菌された、保存剤なしの(nonpreserved)、白色、無臭、不定形の固体として提供する。その製品は、使用する前に塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）で再構成することになる。
【０３２０】
６２００ＵＳＰ単位の各バイアルに、５ｍｇの乳糖、１．９２ｍｇの二塩基性リン酸カリウムおよび１．２２ｍｇの一塩基性リン酸カリウムが入っている。
【０３２１】
ＵＳＰ／ＮＦヒアルロニダーゼ単位は、濁度低下（ＴＲ）単位に相当し、０．８１国際単位（ＩＵ）に等しい。
【０３２２】
再構成された溶液は、透明無色であり、ｐＨが約６．７で浸透圧モル濃度が２９０〜３１０ｍＯｓｍ（ミリオスモル）である。
【０３２３】
注射用ヒアルロニダーゼは、バイアルに６．２ｍＬの溶液を添加することによって、バイアル内で１０００単位／ｍＬの塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）の濃度に再構成されることになる。投与する前に、その再構成された溶液は、さらに、所望の濃度、通常１５０単位／ｍＬまで希釈する（下記表参照）。得られた溶液は、調製後直ちに使用しなければならない。
【０３２４】
１ｍＬのシリンジと５μｍのフィルタニードルが、注射用ヒアルロニダーゼのキットに提供される。上述したような注射用ヒアルロニダーゼの再構成に続いて、５μｍのフィルタニードルを１ｍＬのシリンジに取り付ける。注射用ヒアルロニダーゼの所望量を前記シリンジ中に引き入れ、下記表に従って希釈する。フィルタニードルを外して、意図した注射用に適切な針を取り付ける。
【０３２５】
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【０３２６】
【表１】
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【０３２７】
【表２】
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【０３２８】
【表３】
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【０３２９】
【表４】
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【０３３０】
【表５】
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【０３３１】
【表６】
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【０３３２】
【表７】
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【０３３３】
【表８】
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【０３３４】
【表９】
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【０３３５】
若干の現在好ましい実施態様と実施例のみを参照しながらこの発明を上記に説明したこと、およびこの発明が物理的形態を取り得るかまたは実施され得るあらゆる実施態様を網羅して説明しようと努力が払われていないことを、当業者は理解するであろう。事実、上記に記述した具体的な実施態様および実施例は、この発明の意図する精神および範囲から逸脱することなく、様々に変形することもできる。したがって、上記に対する全てのそのような妥当な変形は、前掲の請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３３６】
【図１】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図２】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図３】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図４】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図５】図５ａと図５ｂの関係を示す。
【図５ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図５ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図６】図６ａと図６ｂの関係を示す。
【図６ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図６ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図７】図７ａと図７ｂの関係を示す。
【図７ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図７ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図８】図８ａと図８ｂの関係を示す。
【図８ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図８ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図９】図９ａと図９ｂの関係を示す。
【図９ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図９ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図９ｃ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図１０】図１０ａと図１０ｂと図１０ｃの関係を示す。
【図１０ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図１０ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図１０ｃ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図１１】図１１ａと図１１ｂと図１１ｃの関係を示す。
【図１１ａ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図１１ｂ】記述されたヒアルロニダーゼの調製法の流れ図を示す。
【図１２ａ】標準についての典型的なクロマトグラムを示す。
【図１２ｂ】試料についての典型的なクロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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