(57)【要約】本発明は、主要な花粉アレルゲンPhl p 4の遺伝子配列を提供することに関する。本発明はまた、低アレルゲン性作用を有する断片、部分配列の新規な組み合わせおよび点突然変異体を包含する。組換えＤＮＡ分子および誘導されたポリペプチド、断片、部分配列の新規な組み合わせおよびバリアントを、花粉アレルギー疾患の療法のために用いることができる。組換え方法により製造されたタンパク質を、花粉アレルギーのインビトロおよびインビボ診断のために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号３および配列番号５からなる群から選択されたヌクレオチド配列に相当する、ＤＮＡ分子。
【請求項２】
位置７０から開始して、オオアワガエリからの主要なアレルゲンPhl p 4の特性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項３】
オオアワガエリからの主要なアレルゲンPhl p 4をコードするヌクレオチド配列に相当する、ＤＮＡ分子。
【請求項４】
ストリンジェントな条件下で請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子とハイブリダイズし、イネ科種のＤＮＡ配列に由来する、ＤＮＡ分子。
【請求項５】
オオアワガエリからの主要なアレルゲンPhl p 4と免疫学的に交差反応し、イネ科種のＤＮＡ配列に由来するポリペプチドをコードする、ＤＮＡ分子。
【請求項６】
４群イネ科アレルゲンの、免疫調節性のＴ細胞反応性の断片をコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の部分配列または部分配列の組み合わせに相当する、ＤＮＡ分子。
【請求項７】
−Phl p 4のアミノ酸１〜２００を有する断片１〜２００、
−Phl p 4のアミノ酸１８５〜５００を有する断片１８５〜５００
からなる群から選択されたPhl p 4断片をコードする、請求項６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
免疫調節性のＴ細胞反応性断片をコードする、請求項１〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列に相当するＤＮＡ分子であって、前記ヌクレオチド配列が、個別のコドンの特異的な変異、欠失または付加により特異的に改変されていることを特徴とする、前記ＤＮＡ分子。
【請求項９】
変異が、対応するポリペプチドの１個、２個以上またはすべてのシステインの他のアミノ酸による置換をもたらすことを特徴とする、請求項８に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含む、発現制御配列に機能的に結合している組換えＤＮＡ発現ベクターまたはクローニングシステム。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ分子または請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主生物体。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主生物体の、培養および培養物からの対応するポリペプチドの単離による、請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ配列によりコードされたポリペプチドの製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ配列によりコードされる、ポリペプチド。
【請求項１４】
医薬としての、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの診断および／または処置のための、請求項１４に記載のポリペプチド少なくとも１種および随意に他の活性成分および／またはアジュバントを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリペプチド少なくとも１種の、イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの診断および／または処置および／またはこのようなアレルギーの防止のための医薬の製造への使用。
【請求項１７】
医薬としての、請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
医薬としての、請求項１０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のＤＮＡ分子少なくとも１種または請求項１８に記載の発現ベクター少なくとも１種、および随意に他の活性成分および／またはアジュバントを含む、イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはこのようなアレルギーの防止のための医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１７に記載のＤＮＡ分子少なくとも１種または請求項１８に記載の発現ベクター少なくとも１種の、イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを有する患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはこのようなアレルギーの防止のための医薬の製造への使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、主要な花粉アレルゲンPhl p 4の遺伝子配列を提供することに関する。本発明はまた、低アレルゲン性(hypoallergenic)作用を有する断片、部分配列の新規な組み合わせおよび点突然変異体を包含する。組換えＤＮＡ分子および誘導されたポリペプチド、断片、部分配列の新規な組み合わせおよびバリアントを、花粉アレルギー疾患の療法のために用いることができる。組換え方法により製造されるタンパク質を、花粉アレルギーのインビトロおよびインビボ診断のために、用いることができる。
【０００２】
１型アレルギーは、世界的に重要である。工業化された国の人口の２０％までは、アレルギー性鼻炎、結膜炎または気管支喘息などの症状を患っている。これらのアレルギーは、種々の起源、例えば植物花粉、ダニ、ネコまたはイヌから放出される、空気中に存在するアレルゲン（エアロアレルゲン(aeroallergen)）により生じる。次に、これらの１型アレルギー患者の４０％までが、花粉アレルゲンとの特異的なＩｇＥ反応性を示す(Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001)。
【０００３】
１型アレルギーを誘発する物質は、タンパク質、糖タンパク質またはポリペプチドである。粘膜を通っての取り込みの後に、これらのアレルゲンは、感作された個体中の肥満細胞の表面に結合したＩｇＥ分子と反応する。２つのＩｇＥ分子が、アレルゲンにより互いに架橋された場合には、エフェクター細胞によるメディエータ（例えばヒスタミン、プロスタグランジン）およびサイトカインの放出ならびにこれにより対応する臨床症状がもたらされる。
【０００４】
個別のアレルゲン分子がアレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する相対的頻度に依存して、主要なアレルゲンと主要でないアレルゲンとの間で、区別がなされる。
【０００５】
オオアワガエリ(Phleum pratense)の場合において、
【表１】
2006510346.tif 000002
が、主要なアレルゲンとして現在までに同定されている。
【０００６】
Phl p 4は、５０〜６０ｋＤａの分子量を有する塩基性糖タンパク質であると述べられている(Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268)。Phl p 4分子は、トリプシン耐性であり(Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198)、７０〜８８％の花粉アレルギー患者は、この分子に対するＩｇＥ抗体を有する。
【表２】
2006510346.tif 000003
関連するイネ科種からの相同分子が、記載されている。
【表３】
2006510346.tif 000004
イネ科のこれらの相同分子は、アレルゲン４群を形成し、これらの分子は、互いに、モノクローナルマウス抗体およびヒトＩｇＥ抗体の両方との、高度な免疫学的交差反応性を有する。
【表４】
2006510346.tif 000005
【０００７】
オオアワガエリの前述の主要なアレルゲン（Ｐｈｌ  ｐ  １、Ｐｈｌ  ｐ  ２／３、Ｐｈｌ  ５ａおよび５ｂ、Ｐｈｌ  ｐ  ６並びにＰｈｌ  ｐ  １３）とは対照的に、Phl p 4の一次構造は、未だ解明されていない。同様に、他のイネ科種由来の４群の分子の完全な配列はない。
【０００８】
Ｎ末端アミノ酸配列の決定は、現在まで、不成功であった。しかし、この原因は、知られていない。Fischer ら(J. Allergy Clin. Immunol., 1996; 98: 189-198)は、Ｎ末端ブロックを推測し、リジルエンドペプチダーゼでの分解の後に内部ペプチドを精製し、この配列：ＩＶＡＬＰＸＧＭＬＫ（配列番号７）を決定することができた。
このペプチドは、ブタクサアレルゲンＡｍｂ  ａ１およびＡｍｂ  ａ２におけるペプチド配列に対する相同性並びにトウモロコシ（Ｚｍ５８．２）、トマト（ｌａｔ  ５９、ｌａｔ  ５６）およびタバコ（Ｇ１０）由来のタンパク質における配列に対する類似性を有する(Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol., 98: 189-198)。ホソムギ(Lolium perenne)について、以下の配列を有するペプチド断片が、塩基性４群アレルゲンについて記載された：ＦＬＥＰＶＬＧＬＩＦＰＡＧＶ（配列番号８）およびＧＬＩＥＦＰＡＧＶ（配列番号９）(Jaggi et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348)。
【０００９】
同様に、カモガヤ(Dactylis glomerata)由来の４群アレルゲンから、酵素的分解によりペプチドが得られ、配列決定された：
【表５】
2006510346.tif 000006
【００１０】
また、亜熱帯性ギョウギシバ(Cynodon dactylon)の４群アレルゲンからタンパク質分解によりペプチドが得られ、配列決定された：
【表６】
2006510346.tif 000007
【００１１】
しかし、Phl p 4および４群アレルゲンについての、これらの記載されたペプチド配列は、現在まで、４群アレルゲンの完全な一次構造の解明をもたらさなかった。
従って、本発明が基づく目的は、Phl p 4の完全なＤＮＡ配列および、Phl p 4アレルゲンをタンパク質として発現し、そのままでまたは改変された形態で、薬理学的に重要な使用に有用とすることができるための、対応する組換えＤＮＡを提供することを含んでいた。
【００１２】
図面のリスト
図１：Phl p 4遺伝子の内部ＤＮＡ配列（配列番号２５）
ゲノムＤＮＡを用いて得られたアンプリコン(amplicon)を、共にイタリック体で示した変性プライマーＮｏ．３０（センス）およびＮｏ．３７（アンチセンス）を用いてクローン化し、配列決定した。示した配列は、６つのクローンからのコンセンサスを表す。この配列から作成された、特異的なセンスプライマーＮｏ．８２を、下線で示す。
【００１３】
図２：Phl p 4遺伝子の核酸配列（配列番号２６）の３’末端
アンプリコンを、特異的なセンスプライマーＮｏ．８２（イタリック体で示す）を用いて得、３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲにおけるアンカープライマーを、オオアワガエリ  ｃＤＮＡを用いて得、配列決定した。示した配列は、３つの配列決定プロセスからのコンセンサスを示し、Phl p 4遺伝子の３’末端から停止コドン（二重下線）までを包含する。アンチセンスプライマーＮｏ．８５およびＮｏ．８６の構築のために用いられる配列範囲を、下線で示す。
【００１４】
図３：Phl p 4アレルゲン（配列番号２）の推定されたアミノ酸配列におけるPhl p 4ペプチドの位置の特定
精製された、および断片化されたPhl p 4アレルゲンのアミノ酸配列から得られたペプチドＰ１〜Ｐ６（配列番号２７〜３２）を、明らかに、核酸配列から誘導されるPhl p 4遺伝子のアミノ酸配列に割り当てることができる。
【００１５】
図４：ｎPhl p 4に特異的なモノクローナル抗体５Ｈ１（ブロットＡ）および３Ｃ４（ブロットＢ）による組換えPhl p 4（rPhl p 4）の同一性の、ウエスタンブロットによる決定
トラック１：rPhl p 4断片１〜２００を含む大腸菌全細胞抽出物
トラック２：rPhl p 4断片１８５〜５００を含む大腸菌全細胞抽出物
トラック３：rPhl p 4を含む大腸菌全細胞抽出物
トラック４：オオアワガエリからの精製されたnPhl p 4
【数１】
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Ｃ末端rPhl p 4断片またはrPhl p 4全長分子の中途終了断片または分解断片
【００１６】
図５：花粉アレルギー患者の血清からのＩｇＥを用いた、組換えPhl p 4（rPhl p 4）の反応性のウエスタンブロットによる決定
完全なPhl p 4遺伝子またはＮ末端断片１〜２００またはＣ末端断片１８５〜５００のいずれかを発現する、形質転換された大腸菌細胞の抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットを、花粉アレルギードナーＡ、ＢまたはＣからの血清を用いてインキュベートし、その後結合したＩｇＥを、アルカリホスファターゼが結合した抗ヒトＩｇＥ抗体により、比色分析で検出した。
トラック１：rPhl p 4断片１〜２００を含む大腸菌全細胞抽出物
トラック２：rPhl p 4断片１８５〜５００を含む大腸菌全細胞抽出物
トラック３：rPhl p 4を含む大腸菌全細胞抽出物
トラック４：オオアワガエリからの精製されたnPhl p 4
【００１７】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列について本明細書中で用いる番号「配列番号」は、明細書に添付された配列プロトコルに対応する。
【００１８】
発明の説明
ここで、本発明は、初めて、見出された単一ヌクレオチド多型(single nucleotide polymorphism (SNP))から生じる３種の優性の配列（配列番号１、３および５）を有する、主要な花粉アレルゲンPhl p 4の遺伝子配列を提供する。
従って、本発明は、配列番号１、配列番号３および配列番号５からなる群から選択されたヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ分子またはオオアワガエリ由来の主要なアレルゲンPhl p 4をコードするヌクレオチド配列に対応するＤＮＡ分子に関する。
【００１９】
本発明はまた、低アレルゲン性作用を有する断片、部分配列の新規な組み合わせおよび点突然変異体を包含する。
従って、本発明はさらに、イネ科の４群アレルゲンの、免疫調節性のＴ細胞反応性の断片をコードする、対応する部分配列、部分配列の組み合わせまたは交換、欠失もしくは付加突然変異体に関する。
【００２０】
他のイネ科種の４群アレルゲンに加えて、１３群アレルゲンはまた、これらが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４群アレルゲンに極めて類似した分子量を示し、生化学的手法により分離するのが困難であるため(Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)、本発明に関連して興味深い。しかし、ここで初めて有用である本発明のタンパク質およびＤＮＡ配列の補助により、４群および１３群が、顕著に異なるアミノ酸配列を有することを、明らかに示すことができる。
【００２１】
天然に存在するアレルゲンのＤＮＡ配列の知識を用いて、ここで、これらのアレルゲンを、アレルギー性疾患の診断および療法において用いることができる組換えタンパク質として、製造することが可能である(Scheiner and Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391)。
【００２２】
アレルギーの有効な治療的な処置のための古典的な方法は、特異的な免疫療法または減感作である(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(6): 336-339, Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562)。この方法では、患者に、天然のアレルゲン抽出物を、用量を増大させて皮下注射する。しかし、この方法では、アレルギー反応またはさらにアナフィラキシーショックの危険がある。これらの危険を最小にするために、アレルゴイドの形態の革新的な製剤を用いる。これらは、未処理の抽出物と比較して、顕著に低下したＩｇＥ反応性、しかし同一のＴ細胞反応性を有する、化学的に修飾されたアレルゲンである(Fiebig, 1995, Allergo J. 4(7): 377-382)。
【００２３】
さらに実質的な療法の最適化が、組換え方法により製造されたアレルゲンを用いて可能である。随意に患者の個別の感作パターンに整合した、組換え方法により製造された高純度のアレルゲンの所定のカクテルを、天然のアレルゲン源からの抽出物と置き換えることができる。その理由は、これらが、種々のアレルゲンに加えて、比較的多数の免疫原性であるが非アレルゲン性である二次的タンパク質を含むからである。
【００２４】
発現産物を用いて信頼性のある減感作をもたらすことができる現実的な展望は、ＩｇＥエピトープが、療法に必須のＴ細胞エピトープを損なわずに特異的に削除される、特異的に変異した組換えアレルゲンにより提供される(Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414)。
【００２５】
アレルギー患者における妨害されたＴＨ細胞平衡に治療的に影響するための他の可能性は、免疫療法的ＤＮＡワクチン接種である。これは、関連するアレルゲンをコードする発現可能なＤＮＡを用いた処置を含む。免疫応答のアレルゲン特異的影響の最初の実験的な根拠は、アレルゲンをコードするＤＮＡの注射により、げっ歯動物において提供された(Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2(5): 540-544)。
【００２６】
従って、本発明はまた、医薬としての、本明細書中に記載したＤＮＡ分子または対応する組換え発現ベクターに関する。
組換え方法により製造された、対応するタンパク質を、花粉アレルギーの療法のために、並びにインビトロおよびインビボ診断のために用いることができる。
【００２７】
組換えアレルゲンの製造のために、クローン化された核酸を、発現ベクターに連結させ、このコンストラクトを、好適な宿主生物体中で発現させる。生化学的精製の後に、この組換えアレルゲンは、確立された方法により、ＩｇＥ抗体の検出に利用できる。
従って、本発明は、さらに、発現制御配列に機能的に結合した、本明細書中に記載したＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターおよび、前述のＤＮＡ分子または前述の発現ベクターで形質転換した宿主生物体に関する。
【００２８】
本発明は、同様に、上記したＤＮＡ分子の少なくとも１種のまたは上記した発現ベクターの少なくとも１種を、イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを患っている患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはこのようなアレルギーの防止のための医薬の製造のために用いることに関する。
【００２９】
既に述べたように、本発明を、特定の免疫療法のための組換えアレルゲンまたは核酸含有製剤における必須の成分として用いることができる。ここで、多くの可能性がある。先ず、不変の一次構造を有するタンパク質は、製剤の構成成分であることができる。第２に、全体の分子のＩｇＥエピトープの特異的な欠失またはＴ細胞エピトープをコードする個別の断片の製造により、低アレルゲン性（アレルゴイド状）形態を、本発明において、不所望な副作用を防止するための療法のために用いることができる。最後に、核酸自体は、真核生物発現ベクターと連結された場合に、直接の適用の際に、療法的な意味においてアレルギー性免疫状態を改変する製剤を提供する。
【００３０】
従って、本発明は、配列番号１、３または５に対応する組換えＤＮＡ分子に関し、ここで、位置１〜６９のヌクレオチド配列は、Phl p 4  Ｎ末端のアミノ酸配列から誘導されている。ここでは、大腸菌において高頻度に出現するコドンを用いた。位置７０からは、ＤＮＡ配列は、オオアワガエリのゲノムおよびｃＤＮＡにおいて同定されているものに一致する。
従って、本発明は、さらに、位置７０で開始し、オオアワガエリの主要なアレルゲンPhl p 4の特性を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、配列番号３および配列番号５によるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関する。
【００３１】
さらに、本発明は、好ましくは医薬としてのこれらの特性を有する、前述のＤＮＡ分子の１つまたは２つ以上によりコードされるポリペプチドに関する。
これらは、特に、配列番号２、配列番号４または配列番号６によるポリペプチドであり、ここで、アミノ酸位置１〜３３は、単離された天然のPhl p 4アレルゲンのＮ末端アミノ酸配列により決定されている。位置２４〜５００は、配列番号１、３および５によるＤＮＡ配列から誘導されていた。位置６、７、８および９における可変アミノ酸は、天然のPhl p 4の種々の製造物のＮ末端タンパク質配列に由来する（表１）。
従って、本発明はまた、請求項１１における宿主生物体の培養およびこの培養物からの対応するポリペプチドの単離による、このタイプのポリペプチドの製造のための方法に関する。
【００３２】
本発明は同様に、上記したポリペプチドの少なくとも１種の、イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーの診断および／または処置およびこのようなアレルギーの防止のための医薬の製造への使用に関する。
【００３３】
ヒトに対するアレルゲンとして作用する、本発明のこれらのポリペプチドまたはタンパク質は、オオアワガエリの花粉粒子中に存在する。他のイネ科種、例えば特にホソムギ、カモガヤ、ナガハグサ(Poa pratensis)、ギョウギシバ、シラゲガヤ(Holcus lanatus)の花粉粒子は、相同アレルゲン分子（４群アレルゲン）を含む。
これらの分子の相同性は、マウスモノクローナル抗体およびまたヒトＩｇＥ抗体の両方とのこれらの免疫学的交差反応性により、実証された。
【００３４】
従って、本発明はまた、Phl p 4  ＤＮＡ配列に対する相同配列、並びに、存在する配列の相同性のために、ストリンジェントな条件の下でPhl p 4  ＤＮＡとハイブリダイズするか、またはPhl p 4に関して免疫学的交差反応性を有する、他のイネ科、例えばホソムギ、カモガヤ、ナガハグサ、ギョウギシバ、シラゲガヤ、コムギ(Triticum aestivum)およびオオムギ(Hordeum vulgare)由来の４群アレルゲンの対応するＤＮＡ分子に関する。
【００３５】
以下の手順に従って、Phl p 4のタンパク質およびＤＮＡ配列を決定した：
天然のアレルゲンPhl p 4を、記載された方法(Fahlbusch et al. 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807, Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)により精製し、単離した。微小量の１３群アレルゲンのマイクロ精製(micropurification)および採取を、Suckら(2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)により記載された方法により、行った。
オオアワガエリから単離されたこのPhl p 4のＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解により決定した。表１に示すＮ末端配列（Ｐ１ａ〜ｆ）を、Phl p 4の種々のバッチを用いて決定した。最初の１５個の位置についてのコンセンサス配列を、以下の配列であると見なす：ＹＦＰＰ’Ｐ’ＡＡＫＥＤＦＬＧＸＬ（配列番号３３）。位置１４は、決定することができない；これは、おそらく、システインにより占有される。異なるバッチにおける位置６、７、８および９における種々のアミノ酸は、アイソフォームの意味における変更を示す。位置４および５は、ヒドロキシプロリン（Ｐ’）により占有され、これは、調製物ｐ１−ａおよび−ｂの分析における特定の分析により、明らかに決定された。
【００３６】
エンドペプチダーゼＧｌｕ−Ｃ(Promega, Heidelberg, Germany)を用いたＳＤＳ変性Phl p 4の処理により、種々のペプチドが得られた。表１に示すアミノ酸配列を、２つのペプチド（Ｐ２およびＰ３）について決定した。２つのペプチド（Ｐ４およびＰ５）を、エンドペプチダーゼＬｙｓ−Ｃ(Roche, Mannheim, Germany)を用いた切断により精製し、配列決定した（表１）。他のペプチド（Ｐ６）は、ＣＮＢｒ切断により単離し、アミノ酸配列を決定した（表１）。
【００３７】
Ｎ末端配列のアミノ酸配列および内部ペプチド２および６を、変性プライマーの構築のための基礎として用いた。アンプリコンを、センスプライマーＮｏ．３０およびアンチセンスプライマーＮｏ．３７（表２）で、オオアワガエリ由来のゲノムＤＮＡを用いて調製した。これらのアンプリコンから得られたクローンを、配列決定し（図１）、特異的なセンスプライマーＮｏ．８２（表２）の構築のために用いた。オオアワガエリ花粉由来の代表的なｍＲＮＡ集団および本発明の特異的なセンスプライマーＮｏ．８２およびアンカープライマーＡＵＡＰ(Life Technologies, Karlsruhe, Germany)から調製したｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲをストリンジェントな条件の下で行った。この約４５０ｋｂのアンプリコンを、配列決定し、Phl p 4遺伝子の３’末端の箇所までの欠失配列を、同定した（図２）。本発明において決定されたこのＣ末端Phl p 4配列に基づいて、特異的なアンチセンスプライマーＮｏ．８５およびＮｏ．８６を、構築した（表２）。Phl p 4ペプチドＰ１−ａ（表１）のＮ末端アミノ酸配列に基づいて、アミノ酸位置２４〜３３（ＬＹＡＫＳＳＰＡＹＰ（配列番号３４））をコードするＤＮＡから誘導された、変性センスプライマーＮｏ．２９を、構築した。
【００３８】
ＰＣＲを、プライマーＮｏ．２９およびＮｏ．８６で、ゲノムオオアワガエリＤＮＡを用いて行った。このＰＣＲ産物を、プライマーＮｏ．２９およびＮｏ．８５での第２のＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ）のための基礎として用いた。アンプリコンを、ベクターｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ(Promega, Heidelberg, Germany)中に挿入し、クローン化し、配列決定した。この配列は、配列番号１、３または５によるＤＮＡ配列のＮ末端または位置７０から計算して、位置２４から開始し、プライマーＮｏ．８５（配列番号１、３または５における位置１４０２）まで伸びており、これは、Phl p 4遺伝子のすでに決定されたＣ末端部分に位置する。これらのデータを用いて、Phl p 4分子の完全なアミノ酸配列を、最初の３３個のアミノ酸位置から構築し、タンパク質配列決定ならびにプライマーＮｏ．２９／Ｎｏ．８５およびＮｏ．８２／アンカープライマーで調製されたクローンから由来し得る、推定のアミノ酸配列（４７７個の位置）により決定することができる。２つのクローンは、これらのヌクレオチド配列の１９７個の位置において重複する。クローンＮｏ．２９／Ｎｏ．８５によりコードされたペプチドは、１０個のアミノ酸位置において、直接アミノ酸配列決定により決定されたPhl p 4のＮ末端配列（位置１〜３３）と重複し、ここで、２つの方法により決定されたアミノ酸は、一致する。
【００３９】
直接決定されたＮ末端アミノ酸および推定のアミノ酸配列に基づく、Phl p 4のアミノ酸配列は、配列番号２、４および６の下で配列プロトコルにおいて列挙された配列に一致する。
【００４０】
ＰＣＲ産物を、特異的なセンスプライマーＮｏ．８８（表２）および特異的なアンチセンスプライマーＮｏ．８６で、共にゲノムを用いて、およびオオアワガエリからのｃＤＮＡを用いて調製し、直接配列決定した。
これにより、ＰＣＲエラーを排除し、遺伝子変異（単一ヌクレオチド多型）を見出すことが可能である。
【００４１】
ＤＮＡ配列配列番号１について見出された単一ヌクレオチド多型を、表３に示す。これらの単一ヌクレオチド多型のいくつかでは、アミノ酸が修飾されている。これらを、表４に示す。さらに、優勢な配列の配列番号２、４および６に関して逸脱するアミノ酸をもたらすＤＮＡクローンを、配列決定した（表５）。これらのアミノ酸変異は、Phl p 4分子のアイソフォームであると見なされるべきである。このようなアイソフォームの存在は、天然のPhl p 4の不均一な等電特性から予測される。現在まで知られているすべての花粉アレルゲンは、このようなアイソフォームを有する。プライマーＮｏ．２９および８６により決定されるＤＮＡ断片が、実際に、天然のPhl p 4アレルゲンと同一のタンパク質をコードするという事実はまた、特に、本発明の組換えPhl p 4分子の推定されたアミノ酸配列における相同ペプチド配列が、天然のPhl p 4の同定された内部ペプチドＰ３、Ｐ４およびＰ５（表１）について見出された（図３）という事実により実証され得る。記載されたPhl p 4アミノ酸配列は、これが、８．９９（配列番号２）、８．８０（配列番号４）または９．１７（配列番号６）の計算された等電点を有し、５００個のアミノ酸からなる塩基性分子であることを示す。定量的なアミノ酸組成を、表６に示す。組換えPhl p 4の計算された分子量は、５５．７６２（配列番号２）、５５．７３４（配列番号４）または５５．６２４（配列番号６）ダルトンである。この計算された分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定された５５ｋＤａの天然のPhl p 4の分子量と、極めて良好に整合する(Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 799-807およびSuck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402)。
【００４２】
５０〜６０ｋＤａの分子量はまた、関連するイネ科種の４群アレルゲンについて記載されている。
【表７】
2006510346.tif 000009
【００４３】
組換えPhl p 4タンパク質の製造のために、Phl p 4をコードする配列番号１、３および／または５によるＤＮＡ配列を、発現ベクター（例えばｐＰｒｏＥｘ、ｐλＣｒｏ、ｐＳＥ３８０）中に挿入した。タンパク質配列決定から知られているＮ末端アミノ酸について、大腸菌の最適化コドンを用いた。
【００４４】
大腸菌への形質転換、発現および種々の分離方法による組換えPhl p 4の精製の後に、得られたタンパク質に、リフォールディングプロセスを施した。
【００４５】
このようにして得られたこのrPhl p 4タンパク質は、天然のPhl p 4と同一の分子量範囲をカバーするＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、単一のバンドを与える。rPhl p 4の免疫学的反応性は、天然のPhl p 4を用いて誘発され、イネ科の相同タンパク質（４群）と交差反応する、マウスモノクローナル抗体５Ｈ１および３Ｃ４との反応により、実証された(Fahlbusch et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic et al., 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10(6): 361-367)（図４）。rPhl p 4は、天然のPhl p 4との実証されたＩｇＥ反応性を有するアレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応する。このＩｇＥ反応性および従ってアレルゲンとしての作用は、共にドット試験、ウエスタンブロットにおいて、およびまたポリスチレンマイクロタイタープレート上でのアレルゲンの吸着の後に実証された。ウエスタンブロットによる検出を、図５に示す。アレルゲン４群反応性花粉アレルギー患者の好塩基球とのrPhl p 4の反応の際に、これらは、活性化マーカーＣＤ  ２０３ｃの増大した発現に刺激される。rPhl p 4によるこの好塩基球活性化は、この分子がまたアレルゲンとして機能的に作用することを、明確に示す。
【００４６】
従って、このrPhl p 4アレルゲンを、花粉アレルギー患者の高度に特異的な診断のために用いることができる。この診断を、インビトロで、特定の抗体（ＩｇＥ、ＩｇＧ１〜４、ＩｇＡ）の検出およびＩｇＥを負荷したエフェクター細胞（例えば血液からの好塩基球）との反応によりインビトロで、または皮膚試験反応および反応器官における誘発によりインビボで、行うことができる。
【００４７】
rPhl p 4の、花粉アレルギー患者のＴリンパ球との反応は、増殖のためのＴリンパ球のアレルゲン特異的刺激ならびに、新たに調製した血液リンパ球中のＴ細胞によるサイトカイン合成、および確立されたnPhl p 4反応性Ｔ細胞株およびクローンにおけるサイトカイン合成の両方により、検出された。
【００４８】
記載したrPhl p 4  ＤＮＡ配列に基づいて、５０〜３５０個のアミノ酸を有するペプチドをコードする部分配列を、発現ベクターにクローン化した。これらの部分配列は、連続的に、rPhl p 4の完全な配列を包含し、少なくとも１２個のアミノ酸の重複がある。発現したペプチドは、Phl p 4断片に一致する。これらのPhl p 4断片は、個別にもしくは混合物として、アレルギー患者のＩｇＥ抗体と反応しないか、または小さい程度に反応するのみであり、従って、これらを、低アレルゲン性と分類することができる。対照的に、これらの断片の混合物は、完全な組換え体または天然のPhl p 4と同様にして、Phl p 4反応性を有する花粉アレルギー患者のＴリンパ球を刺激することができる。
【００４９】
図４は、Phl p 4特異的モノクローナルマウス抗体に結合することによる、アミノ酸１〜２００および１８５〜５００に対応する２種のこのようなPhl p 4断片の特徴づけを、例として示す。Ｃ末端断片１８５〜５００は、モノクローナル抗体５Ｈ１のみと反応する一方、Ｎ末端断片１〜２００は、明らかに、モノクローナル抗体３Ｃ４と反応する。図５から、断片１８５〜５００は、アレルギー患者ＢおよびＣの血清からのＩｇＥと、比較的弱く反応する、即ち、これは、少なくとも患者血清Ｃに対する減少されたＩｇＥ反応性（低アレルゲン性）を有する断片１〜２００よりもアレルゲン性が低いことが明らかである。
【００５０】
従って、本発明はまた、Phl p 4のアミノ酸１〜２００を有する断片１〜２００をコードする、本明細書中に記載したＤＮＡ分子および、Phl p 4のアミノ酸２８５〜５００を有する断片２８５〜５００をコードするＤＮＡ分子に関する。
【００５１】
システインをコードするトリプレットを、部位特異的変異導入により、これらが、他のアミノ酸、好ましくはセリンをコードするように改変した。個々のシステインを置換したバリアントおよび、２つのシステイン残基の種々の組み合わせまたは５つのシステインすべてを修飾したバリアントの両方を、製造した。これらのシステイン点変異体の発現タンパク質は、アレルギー患者のＩｇＥ抗体との反応性は高度に低減したか、またはゼロであったが、これらの患者のＴリンパ球と反応する。従って、本発明はさらに、対応するポリペプチドの１つ、それ以上またはすべてのシステイン残基が、他のアミノ酸により、部位特異的変異導入により置換されている、本明細書中に記載したＤＮＡ分子に関する。
【００５２】
Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドおよび低アレルゲン性点突然変異体（例えばシステイン多型）のポリペプチドに対応する低アレルゲン性断片の免疫調節活性は、花粉アレルギー患者のＴ細胞とのこの反応により実証された。
【００５３】
このような低アレルゲン性断片またはシステインの点突然変異体を、アレルギー患者の減感作のための製剤として用いることができる。その理由は、これらが、等しい有効性を伴ってＴ細胞と反応するが、低減されたかまたは全く存在しないＩｇＥ反応性のために、ＩｇＥを介する副作用が低減するからである。
【００５４】
低アレルゲン性Phl p 4バリアントをコードする核酸またはPhl p 4をコードする未改変ＤＮＡを、ヒト発現ベクターと連結する場合には、これらの構築物を、同様に、免疫療法（ＤＮＡワクチン接種）のための製剤として用いることができる。
【００５５】
最後に、本発明は、上記で記載したＤＮＡ分子少なくとも１種または上記で記載した発現ベクター少なくとも１種および随意に他の活性成分および／またはアジュバントを含む、イネ科の４群アレルゲンが誘発に関与するアレルギーを患っている患者の免疫療法的ＤＮＡワクチン接種および／またはこのようなアレルギーの防止のための医薬組成物に関する。
【００５６】
本発明の他の群の医薬組成物は、ＤＮＡの代わりに、上記したポリペプチド少なくとも１種を含み、前述のアレルギーの診断および／または処置に適する。
【００５７】
本発明の意味における医薬組成物は、活性成分として、本発明のポリペプチドまたは発現ベクターおよび／またはすべての比率での混合物を含む、それぞれの薬学的に使用可能な誘導体を含む。本発明の活性成分を、ここで、少なくとも１種の固体、液体および／または半液体賦形剤またはアジュバントと共に、および随意に１種または２種以上の他の活性成分と組み合わせて、好適な投薬形態とすることができる。
特に好適なアジュバントは、ＣｐＧモチーフを有する免疫賦活性ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドである。
【００５８】
これらの組成物を、ヒト医学または獣医学における治療剤または診断剤として用いることができる。好適な賦形剤は、非経口投与に適し、本発明の活性成分の作用に悪影響を生じない有機または無機物質である。非経口投与に特に適するのは、溶液、好ましくはオイルベース、または水性の溶液、さらに懸濁液、エマルジョンまたはインプラントである。本発明の活性成分を、また、凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を、例えば、注射製剤を製造するために用いることができる。示した組成物を、滅菌し、および／またはこれは、補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調整するための塩、緩衝物質および／または複数の他の活性成分を含むことができる。
さらに、持続放出製剤を、本発明の活性成分の対応する処方により、得ることができる。
【００５９】
従って、本発明はまた、アレルゲン成分が誘発する患者に特異的な感作範囲の同定の一部として、インビトロ診断を改善するのに役立つ。本発明は、同様に、花粉アレルギーの特異的な免疫療法のための顕著に改善された製剤を製造するのに役立つ。
【００６０】
【表８】
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【００６１】
【表９】
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【００６２】
プライマー８２、８５、８６および８８のヌクレオチド配列を、通常の４文字コードで示す。プライマー２９、３０および３７の場合において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  ＤＮＡコードを用いる；文字「Ｎ」は、ここで、イノシンを意味する。
【００６３】
【表１０】
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【００６４】
【表１１】
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【００６５】
【表１２】
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【００６６】
【表１３】
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【００６７】
【表１４】
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【００６８】
【表１５】
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＊［配列番号２によるアミノ酸／配列における位置／逸脱アミノ酸］
【００６９】
【表１６】
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＊  ヒドロキシプロリンを含む
【００７０】
数値を、配列番号２／配列番号４／配列番号６の順序での３つの主要な配列について示す。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】Phl p 4遺伝子の内部ＤＮＡ配列（配列番号２５）を示す図である。
【図２】Phl p 4遺伝子の核酸配列（配列番号２６）の３’末端を示す図である。
【図３】Phl p 4アレルゲン（配列番号２）の推定されたアミノ酸配列中のPhl p 4ペプチドの位置の特定を示す図である。
【図４】nPhl p 4に特異的なモノクローナル抗体５Ｈ１（ブロットＡ）および３Ｃ４（ブロットＢ）による組換えPhl p 4（rPhl p 4）の同一性の、ウエスタンブロットによる決定を示す図である。
【図５】花粉アレルギー患者の血清からのＩｇＥを用いた組換えPhl p 4（rPhl p 4）の反応性の、ウエスタンブロットによる決定を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月28日(2003.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006510346000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月12日(2004.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載のＤＮＡ配列によりコードされる、組換え方法により請求項１２に従って製造されるポリペプチド。
【国際調査報告】
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