(57)【要約】本発明は、ＣＤＩ−２７（ＥｒｂＢ２依存的細胞運動のメディエーター故にＭｅｍｏと命名された）および細胞運動におけるその役割に基いている。本発明は、細胞移動、特に例えばＥＧＦ−Ｒからのシグナルにより誘導される後期細胞移動の阻害方法を提供する。また、細胞運動性の調節で使用され得る阻害剤および他の分子、例えばＭｅｍｏ結合相手を同定および使用するのに関連した方法および材料も提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の移動能力の調節方法であって、細胞におけるＭＥＭＯ、またはＭＥＭＯ相同体の活性の調節を含み、ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである方法。
【請求項２】
細胞の後期移動段階の実行能力を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞の後期移動段階の実行能力を、初期移動段階の実施能力よりも優先的に調節する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
調節が阻害である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞の移動能力が、移動誘導シグナルに応答したものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
移動誘導シグナルがＥｒｂＢ２受容体からのシグナルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
移動誘導シグナルが、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２受容体または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体からのシグナルである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
移動誘導シグナルが、当該受容体とリガンドの接触から生じる、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
活性の阻害が、細胞におけるＭＥＭＯまたはＭＥＭＯ相同体のダウンレギュレーションにより誘発される、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ダウンレギュレーションがｓｉＲＮＡにより誘発される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
活性の阻害が、細胞におけるＭＥＭＯまたはＭＥＭＯ相同体と結合相手との相互作用を阻害することにより誘発される、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
結合相手がＥｒｂＢ２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
結合相手がｓｈｃである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
相互作用の阻害が、抗体または抗体フラグメントから選択される阻害剤により誘発される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞移動を調節する物質の同定方法であって、物質が、ＭＥＭＯ、またはその変異型またはそれらのフラグメントから選択されるＭＥＭＯポリペプチドに結合し、および／またはその活性を調節するか否かを測定することを含む方法。
【請求項１６】
調節が阻害である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
阻害が、初期移動段階よりも後期移動段階を優先的とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）ＭＥＭＯまたは細胞移動を介助する能力を有するＭＥＭＯの変異型を発現する細胞を、試験物質と接触させ、そして
（ii）細胞においてＭＥＭＯまたはその変異型の活性を阻害する物質を同定する
段階を含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）試験物質の存在および非存在下、ＭＥＭＯポリペプチドを結合相手と接触させ、
（ii）試験物質の存在が、ＭＥＭＯポリペプチドおよびその結合相手との間の相互作用を阻害するか否かを測定する
段階を含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＥＭＯポリペプチドおよびその結合相手の一方を、検出可能な標識で標識し、他方を固体支持体に固定化する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）ＭＥＭＯポリペプチド、その結合相手およびレポーター遺伝子構築物を発現し得る細胞を準備し、
（ii）細胞を試験物質と接触させ、
それによって、試験物質によるＭＥＭＯポリペプチドおよびその結合相手間の結合阻害が、レポーター遺伝子の発現の低減化として観察され得る請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＥＭＯの変異型またはフラグメントが、細胞移動を介助する能力を有する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＭＥＭＯのフラグメントが、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０またはそれ以上の大きさのアミノ酸である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
結合相手が、請求項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法により提供される、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
結合相手が上流因子である、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
上流因子がＥｒｂＢ２またはそのフラグメントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）Ｙ１２２７に対応するリン酸化残基を含む、ＥｒｂＢ２またはそのフラグメントであるＥｒｂＢ２ポリペプチドを準備し、
（ii）試験物質の存在下および非存在下においてＥｒｂＢ２ポリペプチドをＭＥＭＯポリペプチドと接触させ、
（iii）試験物質の存在または非存在のいずれの場合に、ＥｒｂＢ２ポリペプチドおよびＭＥＭＯポリペプチド間の相互作用が阻害されるかを測定する
段階を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階（iii）が、試験物質が、ＥｒｂＢ２ポリペプチドによるＭＥＭＯポリペプチドの化学的修飾を阻害するか否かを測定することにより実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
段階（iii）が、試験物質が、ＭＥＭＯおよびＥｒｂＢ２ポリペプチド間の物理的会合を阻害するか否かを測定することにより実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上流因子がｓｈｃまたはそのフラグメントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
物質が、移動誘導シグナルに応答した細胞の移動を阻害することを確認する段階をさらに含む、請求項１５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を含む単離ＭＥＭＯポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１のＭＥＭＯポリペプチドの変異型であり、それと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％アミノ酸配列相同性を有する、単離ポリペプチド。
【請求項３４】
細胞移動を介助する能力を有する請求項３３に記載の変異型である単離ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか１項のポリペプチドをコードするＭＥＭＯポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むベクター。
【請求項３６】
ＭＥＭＯポリヌクレオチド配列が添付配列表Ｉに示されたものである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
上記核酸に機能し得るように結合されたプロモーターを含む発現ベクターである、請求項３５または請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
ポリペプチドの製造方法であって、ポリペプチドをコードする当該核酸をベクターにより発現させる条件下において、請求項３７に記載の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項３９】
請求項３２〜３４のいずれか１項の異種ポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３６または請求項３７に記載のＭＥＭＯポリヌクレオチドと相補的であるポリヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項４１】
ＭＥＭＯ、ＭＥＭＯ相同体またはそのフラグメントをコードするＲＮＡ配列を含み、ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである、２本鎖ＲＮＡ。
【請求項４２】
２０〜２５ｂｐから成るｓｉＲＮＡ二重らせんである、請求項４１に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項４３】
ＭＥＭＯまたはＭＥＭＯ相同体またはそのフラグメントをコードするＲＮＡ配列が、添付配列表Ｉに示されたＭＥＭＯポリヌクレオチド配列の４６０〜４８０位に対応する、請求項４２に記載のｓｉＲＮＡ二重らせん。
【請求項４４】
請求項４１〜４３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ二重らせんをコードするベクター。
【請求項４５】
請求項４２または請求項４３のｓｉＲＮＡ二重らせんの製造方法であって、請求項４４のベクターを宿主細胞へ導入し、細胞においてベクターからの転写を誘発または可能にすることを含む方法。
【請求項４６】
請求項４２または請求項４３のｓｉＲＮＡ二重らせんの製造方法であって、
（ｉ）ｓｉＲＮＡ二重らせんのセンス配列をコードするベクター、および
（ii）ｓｉＲＮＡ二重らせんのアンチセンス配列をコードするベクター
を、宿主細胞へ導入し、細胞においてベクターからの転写を誘発または可能にすることを含む方法。
【請求項４７】
細胞の移動能力が阻害されたトランスジェニック非ヒト哺乳類の製造方法であって、そのＭＥＭＯ相同体の遺伝子座へ傷害(lesion)を組込むことを含む方法であり、ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである方法。
【請求項４８】
ＭＥＭＯ相同体の発現が、そこでの細胞の移動能力を調節するように修飾されており、ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４９】
ＭＥＭＯへ特異的に結合する単離抗体であって、ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである抗体。
【請求項５０】
ＭＥＭＯの結合相手の同定方法であって、
（ｉ）ＭＥＭＯ、その変異型またはフラグメントから選択されるＭＥＭＯポリペプチドを準備し、
（ii）ＭＥＭＯポリペプチドを推定されるＭＥＭＯの結合相手と接触させ、
（iii）ＭＥＭＯの結合相手がＭＥＭＯポリペプチドに結合できるか否かを測定する
ことを含み、
ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである方法。
【請求項５１】
ＭＥＭＯの変異型またはフラグメントが細胞移動を介助する能力を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＭＥＭＯのフラグメントが、少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０残基またはそれ以上の大きさのアミノ酸である、請求項４０または請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＭＥＭＯポリペプチドが活性型で提供される、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ＭＥＭＯポリペプチドを固体支持体に固定化し、固定化ＭＥＭＯポリペプチドを推定されるＭＥＭＯの結合相手と接触させる、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
固定化ＭＥＭＯポリペプチドを、
（ｉ）推定される多様な結合相手を含む試料と接触させ、
（ii）未結合物質を洗い流し、
（iii）固定化ＭＥＭＯポリペプチドに結合した物質を解離させ、そして
（iv）次いで固定化ＭＥＭＯポリペプチドに結合したタンパク質の同一性を評価する
請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＭＥＭＯポリペプチド、およびその推定される結合相手、およびレポーター遺伝子構築物を発現し得る細胞を準備することを含み、ＭＥＭＯポリペプチドおよびその結合相手との間の結合がレポーター遺伝子発現により観察され得る、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
細胞移動メディエーターの同定方法であって、請求項５０〜５６のいずれか１項に記載の方法を実施し、ＭＥＭＯ結合相手が細胞移動メディエーターであることを確認することを含む方法。
【請求項５８】
ＭＥＭＯの結合相手が細胞移動の初期段階よりも後期段階の特異的メディエーターである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
（ｉ）ＭＥＭＯの結合相手の活性が調節される細胞を準備し、
（ii）上記調節が初期段階移動事象に影響を与えるか否かを検出し、
（iii）上記調節が後期段階移動事象に影響を与えるか否かを検出する
段階を含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
調節が阻害である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
ＭＥＭＯの結合相手が、ＥｒｂＢ２残基Ｙ１２０１またはＹ１２２７からのシグナル伝達に必要とされるか否かを測定する段階を含む、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ｉ）ＥｒＢ２−誘導細胞移動シグナリングが、Ｙ１２０１ではなくＹ１２２７により伝達される第一細胞を準備し、
ii）ＥｒｂＢ２−誘導細胞移動シグナリングが、Ｙ１２２７ではなくＹ１２０１により伝達される第二細胞を準備し、
iii）上記細胞において興味の対象であるＭＥＭＯの結合相手の活性を阻害する
段階を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
細胞運動の制御が望まれる病気に罹患した患者の処置を目的とする医薬の製造方法であって、
医薬としてＭＥＭＯ活性の阻害剤を処方することを含み、
ＭＥＭＯが添付配列表Ｉに示されたアミノ酸配列を有するものである方法。
【請求項６４】
細胞運動の制御が望まれる病気に罹患した患者の処置で使用されるＭＥＭＯ活性の阻害剤。
【請求項６５】
細胞運動の制御が望まれる病気に罹患した患者の処置を目的とする医薬の製造におけるＭＥＭＯ活性の阻害剤の使用。
【請求項６６】
阻害剤が請求項１６〜３１のいずれか１項の方法により提供される、請求項６３〜６５のいずれか１項記載の方法、阻害剤または使用。
【請求項６７】
処置が癌の転移および／または血管新生を阻止することである、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法、阻害剤または使用。
【請求項６８】
処置が請求項４〜１４のいずれかに記載の方法の使用を含み、その方法が、細胞においてＭＥＭＯ、またはＭＥＭＯ相同体の活性を阻害することにより患者における細胞の移動能力を阻害することを含む、請求項６３〜６６のいずれか１項に記載の方法、阻害剤または使用。
【請求項６９】
細胞が、腫瘍細胞または癌または他の転移性疾患に関係した他の細胞である、請求項６８に記載の方法、阻害剤または使用。
【請求項７０】
細胞運動性の促進が望まれる病気に罹患した患者の処置を目的とする方法であって、細胞においてＭＥＭＯ、またはＭＥＭＯ相同体の活性を促進することにより、患者における細胞の移動能力を促進することを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
創傷治癒の促進のための請求項７０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ受容体により調節される細胞運動性に関連した物質および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２遺伝子は、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーの一員である１８５ｋＤａの膜貫通型受容体チロシンキナーゼをコードする。ヘレグリン（ＨＲＧ）は、この受容体の天然リガンドである。
【０００３】
ＥｒｂＢ２は、胸部および卵巣を含む多様な起源のヒト腫瘍において過剰発現されることが多い１,２。臨床試験が示すところでは、腫瘍でのＥｒｂＢ２発現が改変されている癌患者は進行性の転移性疾患に罹っている傾向があり、これは予後が不良であることを予測するパラメーターとの関連性を示している３。臨床データに一致して、マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列の制御下で活性化Ｎｅｕを発現するトランスジェニックマウスは、転移性乳房腫瘍を発現する４−６。インビトロ試験のデータは、Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２が、癌細胞運動性および細胞外マトリックスの浸潤において重要な役割を演じるという証拠を提供する７−１０。しかしながら、ＥｒｂＢ２依存的細胞運動性および転移形成の根底にある分子的基礎については、依然としてほとんど解明されていない。
【０００４】
他のリガンドが結合したＥｒｂＢ構成員と二量体を形成することを介したＥｒｂＢ２の活性化により、細胞質尾部におけるチロシン残基はリン酸化される１１,１２。Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２の自己リン酸化部位にはかなりの機能的重複性のあることが知られている１３。既知５部位のうち少なくとも４部位は、独立してシグナルの変換を伝達し得、互いに機能的に置き換えられ得る。より新しい研究は、活性化Ｎｅｕタンパク質では、チロシン１１４４部位が転移刺激においてある一定の役割を有しており、チロシン１２２７部位は関与していないようであることを示唆している４。
【０００５】
ＥｒｂＢ２ホスホチロシンは、ＳｈｃおよびＧｒｂ２アダプター分子１３,１４およびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）１５のｐ８５サブユニットのようなＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）またはホスホチロシン結合（ＰＴＢ）ドメインを含む分子に対して高親和性結合部位を提供する。これらのドッキングタンパク質は、例えばＲａｓ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＰＩ３Ｋ経路１６−１９の活性化を介して増殖性、形質転換性または移動性シグナルを細胞核へ変換するもので、これらの経路は両方とも、ラメリポジウムおよびアクチンストレス繊維の形成を含む２０,２１、細胞移動に関連した種々のプロセスを調節する。また、ｐ３８キナーゼおよびｃ−Ｓｒｃが、フォーカルアドヒージョンタンパク質２２,２３の燐酸化を介してアクチン再構成を誘導するという証拠もある。
【０００６】
分子レベルにおいて、いくつかの初期の試験は、Ｔｙｒ１１４４がＧｒｂ２およびＴｙｒ１２０１と結合し、１２２７および１２５３がＳｈｃアダプターと結合することを示した（Ricci et al.、１９９５、Oncogene、１１、１５１９−１５２９）。さらに最近では、Ｃｒｋは、Ｔｙｒ１２０１と結合することが見出された（Dankort et al.、２００１、J Biol Chem. ２７６(４２)：３８９２１−８）。これらの経路は全て、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路へ入ると考えられている。
【０００７】
Badache et al.は、ＡＡＣＲオンラインの２００３プロシーディングズで公表された、要約において有効な細胞移動の調節におけるＥｒｂＢ２のＹ１２０１およびＹ１２２７の役割を検討した。
【発明の開示】
【０００８】
本発明者らは、細胞移動事象の重要なメディエーターとしてのＭＥＭＯ（ＥｒｂＢ２誘導細胞運動性のメディエーター、mediator of ErbB2-induced cell motility）としてここでは知られているタンパク質の特性確認をした。
【０００９】
従って、本発明は、細胞移動の新たに同定されたメディエーターおよびその調節方法、例えばＭＥＭＯの活性の阻害を含む移動阻害の方法に関するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、ＭＥＭＯに結合するかまたはその活性を調節する因子、特にＭＥＭＯを阻害する因子を同定するための試験方法、および関連した物質および方法に関するものである。
【００１１】
これまでにＭＥＭＯポリペプチドに起因するとされる機能は無かった。発明者らが検索したところ、その核酸配列が、Lai et al.、２０００、Genome Research １０：７０３−７１３においてＣＧＩ−２７と同定されたものに相当することが示された。この証拠資料は、予測されたタンパク質配列を仮定的タンパク質に過ぎないものとして同定した。さらに、その配列は、その潜在的役割に関して情報を全く提供していない。驚くべきことに、タンパク質は、ホスホチロシンに結合することが知られている、ＳＨ２またはＰＴＢドメインを含まない。
【００１２】
本発明者らは、ＭＥＭＯが、ＥｒｂＢ２シグナリング、特にＥｒｂＢ２のＹ１２２７からのシグナリングのメディエーターであることを明らかにした。ｓｉＲＮＡを用いてＭＥＭＯの活性の低減化により、この部位のリン酸化時、ＥｒｂＢ２の１２０１位におけるＰｈｅ残基ではなく１２２７位にチロシンを有する細胞においてヘレグリン惹起移動の低減化がもたらされた。かかる低減化は、１２０１位にチロシン残基および１２２７位にＰｈｅを有する細胞では全く見出されない。これは、例えばＳｈｃおよびＣｒｋのダウンレギュレーション時に見られる作用と対照的であり、これらの活性のいずれかの低減化により両細胞型の運動性が阻害される。
【００１３】
さらに、本発明者らは、ＭＥＭＯの活性を阻害することにより、チロシンキナーゼ受容体の下流で作用するシグナリング分子についての以前には観察されなかった細胞応答が誘発されることを見出した。例えばＳｈｃ、ＣｒｋまたはホスホリパーゼＣγ１などの因子がダウンレギュレーションまたは阻害されたとき、細胞では移動過程の予備的な形態学的変化すら起こり得ない。対照的に、ＭＥＭＯが阻害されたとき、細胞は最初の形態学的変化を受け得るが、依然として持続した細胞運動性を示すことはできない。
【００１４】
従って、ＭＥＭＯはＹ１２２７下流の後期作用経路で作用すると考えられる。
【００１５】
ＭＥＭＯ依存的経路は、有用な治療標的であり得ると考えられる。特に、それは、好ましい実施態様において、以前には移動に関係しているとされ、多くの他の細胞過程、例えば増殖、分化、炎症および生存の調節に関与していることが知られている経路よりもさらに特異的な細胞運動性の調節剤についての基礎を提供すると考えられる。
【００１６】
驚くべきことに、使用された実験条件下では、野生型ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕを発現する細胞におけるＭＥＭＯ活性の低減化により、ヘレグリン惹起細胞移動が５０％低減化された。機能的重複性がＥｒｂＢ２のチロシン自己リン酸化部位で観察されたことから、これは予想外であり、ＭＥＭＯが作用する経路が、単独または他（例、Ｙ１２０１リン酸化により開始される経路）と組み合わせた形での有用な治療標的であり得ることを示唆している。
【００１７】
以下、これらおよび本発明の他の局面をより詳細に検討する。
第一実施態様において、本発明は、ＭＥＭＯの活性を調節、例えば阻害することを含む、細胞移動を調節、例えば阻害する方法を提供する。例えば、阻害は、例えば腫瘍細胞または癌または転移性疾患に関係した細胞において、移動誘導シグナルに応答して起こる細胞移動についてのものであり得る。
【００１８】
細胞「移動」または「運動性」は、細胞骨格の再構築に基いた一連の形態学的変化として見なされ得る。移動誘導シグナルを受信後、細胞は、ラメリポジウム形成を含む多様な変化を受ける。最初、ラメリポジウムは全方向に伸長し、その後アクチンストレス繊維の形成を反映する、より極性の強い組織を示す。これに続いて、焦点接着を介した基体の接合部が形成され、次いで基体に対して細胞全体が動く。細胞移動または運動性は、全体としてのこのプロセスをいい、そして特に基体に対する、その周辺環境における一つの場所から別の場所への細胞の運動であるその結果をいう。
【００１９】
本明細書で使用されている細胞移動の阻害とは、特記しない場合、細胞運動過程のいずれかの段階が、当該阻害がなければ、細胞が当該段階を行う原因となるシグナル（本明細書では「移動誘導シグナル」として知られている）を細胞が受けたときに、その段階が完了されないように、阻害されることを言う。これの結果は、細胞の運動の阻害である。例えば、運動は、さらに緩慢な速度でまたはさらに短い期間であり得るか、または少なくとも細胞によっては全く起こらない場合もあり得る。
【００２０】
移動誘導シグナルは、例えばＥｒｂＢ２受容体から受信されるシグナルであり得る。さらに、本発明者らはまた、ＭＥＭＯのダウンレギュレーションは、ＦＧＦ２またはＥＧＦにより刺激された細胞における後期段階移動に影響を与えることを見出した。従って、移動誘導シグナルはまた、他のチロシンキナーゼ受容体、例えば線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２または上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体から受けたシグナルであり得る。シグナルは、例えば受容体の過剰発現および／または構成的活性の結果として、構成的に受信され得る。別法として、受容体をリガンド、例えばヘレグリン、ＥＧＦ、アンフィレグリン、ＴＧＦアルファ、ＥＧＦ、または人工的リガンドと接触したときに、シグナルは受信され得る。
【００２１】
ＭＥＭＯの「活性」の阻害は、この局面では広範に使用されており、シグナルに応じて正に運動性を調節する経路におけるＭＥＭＯの有効性が、例えばＭＥＭＯをダウンレギュレーションするか、または経路の他の構成員、例えばその結合相手との正の相互作用を阻害することにより低減化されるあらゆる状況を包含するものとする。
【００２２】
好ましくは、阻害は、それが他の因子、例えば移動に関係しない因子の活性を目に見えて阻害することはないという意味でＭＥＭＯに特異的である。好ましくは、阻害は、さらに下記で説明されているように初期段階移動のメディエーターである因子の活性にあまり影響を及ぼさない。最も好ましくは、それは、ＭＥＭＯの下流ではない（そしてＭＥＭＯにより活性化されない）因子の活性にはあまり影響を及ぼさない。
【００２３】
例えばＭＥＭＯの活性は、ＭＥＭＯの転写および／または翻訳を阻害することにより阻害され得る。本明細書に記載の実施例では、ｓｉＲＮＡをこの目的に使用したが、特定遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレーションする他の方法、例えばリボザイムの使用も当業者にはよく知られている（例、Jaeger（１９９７）The new world of ribozymes、Curr Opin Struct Biol ７：３２４−３３５、またはGibson & Shillitoe（１９９７）Ribozymes: their functions and strategies from their use、Mol Biotechnol ７：２４２−２５１参照）。
【００２４】
別法として、阻害は翻訳後であり得る。この実施態様では、阻害剤は、例えば小分子、抗体または抗体フラグメントまたはポリペプチドであり得る。ＭＥＭＯに対する抗体の産生および阻害剤の同定方法については、後記で検討する。
【００２５】
特に、阻害剤は、例えば、ＭＥＭＯと、例えば上流または下流因子であり得るその天然の結合相手との結合を阻害し得る。すなわち、これは、これらの因子による、またはこれらの因子のその調節（例、活性化）を阻止し得る。
【００２６】
さらに本発明は、微小管発芽後成長、例えば中心体から細胞皮質または周辺への、微小管のＥｒｂＢ２依存的伸長を調節するＭｅｍｏに基いた方法を提供する。
【００２７】
ＭＥＭＯは、特にＥｒｂＢ２惹起運動性のメディエーターとして本発明者らにより同定された。すなわち、さらなる好ましい実施態様において、ＭＥＭＯの活性は、例えばＥｒｂＢ２、例えばＥｒｂＢ２のリン酸化Ｙ１２２７へのその結合および／またはそれによる活性化を阻害することにより阻害される。
【００２８】
この実施態様では、阻害剤は、ＭＥＭＯまたはＥｒｂＢ２に（例えば、ＥｒｂＢ２のＹ１２２７を含むかまたは近い部位に）特異的に結合し、ＥｒｂＢ２のＹ１２２７へのＭＥＭＯ結合および／またはそのリン酸化後の活性化を物理的に阻害する抗体、小分子またはポリペプチドフラグメントであり得る。好ましくは、それはＭＥＭＯに特異的に結合する。上記阻害剤は下記の要領で提供され得る。
【００２９】
上記で検討した細胞骨格再構築は、細胞移動の一評価方法として広範に使用されている。しかしながら、本発明者らは、持続的細胞運動性には影響を与えるが、細胞における初期形態学的変化には影響を与えない後期段階経路を確認した。ＥｒｂＢ２のＹ１２０１／Ｙ１２２７からのシグナリング（すなわちこれらの部位のリン酸化から生じるシグナリング）が阻害されるか、またはＭＥＭＯがダウンレギュレーションされている細胞は、正常なラメリポジウム形成、アクチン細胞骨格組織およびラメリポジウム組織を少なくとも移動誘導シグナルに対する初回応答として示す。しかしながら、一定期間後、これらの細胞性応答は低減化され、細胞移動は阻害される。
【００３０】
すなわち、好ましい実施態様において、活性の阻害は、移動の後期段階を阻害するのに使用されている。好ましくは、活性の阻害は、移動の初期段階よりも優先的に後期段階を阻害するのに使用される。
【００３１】
従って、細胞移動の「後期段階」は、移動誘導シグナルに応答して細胞移動を持続させるのに要求される細胞移動プロセスの一段階である。
【００３２】
本発明者らは、後期段階移動は、新たなタンパク質合成に依存的であることを見出した。従って、ある段階が転写および／または翻訳依存的であるか否かを用いることにより、それが後期段階であるか否かを評価し得る。初期段階移動作用は、新たなタンパク質合成に依存的ではなく、後期段階移動作用はそれに依存的である。
【００３３】
概すれば、後期段階事象は、最初のラメリポジウム形成（すなわち、移動誘導シグナルに応答して観察され得る最も早いラメリポジウム形成の開始）に後続すると考えられている。好ましくは、それらはまた、最初のラメリポジウム組織（すなわち、細胞が移動誘導シグナルを受信した後に観察され得る最も早いラメリポジウム組織の開始）の後に続く。従って、後期段階が阻害されるとき、少なくとも最初のラメリポジウム形成は、一般的に依然として移動誘導シグナルに応じて観察され、好ましくは最初のラメリポジウム組織についても同様である。
【００３４】
従って、細胞移動の「初期段階」は、後期段階に先行する段階である。最初のラメリポジウム形成は、例えば、一般的に初期段階作用であると考えられる。
【００３５】
例えば、後期または初期段階が所定の細胞において阻害されたか否かを評価する適切な一試験は、上記細胞の応答を、新たなタンパク質合成が阻害された第二細胞の応答と比較することであり得る。応答は、移動誘導シグナルに対する応答である。２つの細胞が移動誘導シグナルに対して類似した応答を示す場合、その段階は移動の後期段階として称され得る。しかしながら、新たなタンパク質合成が阻害されている細胞が移動過程のさらなる段階を完了させることができる場合、その段階は初期段階と称され得る。
【００３６】
ある段階が後期であるか初期であるかはまた、視覚化または当業者によく知られている他の技術を用いて、移動誘導シグナル後にそれが起こる時間により評価され、そして下記実施例で立証され得る。本実施例では、移動誘導シグナル後の少なくとも最初の３０分で起こる事象を、初期段階であると考えたが、正確なタイミングは実験条件により異なる。
【００３７】
また、ＭＥＭＯは、初期細胞事象の調節に関係しており、他のプロセス、例えば増殖および生存に関与していることが知られている、先に移動に関係しているとされた因子よりも移動においてさらに特異的に作用すると考えられる。例えば、本発明者らは、ＭＥＭＯに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞が数日間にわたって生存し得、またＭＥＭＯが、ＳＫＢｒ３細胞の増殖に必要とはされないと思われることを見出した。
【００３８】
上記の通り細胞移動の阻害方法（すなわち移動の初期段階よりも優先的に後期段階を阻害する）は、例えば癌における転移および新脈管形成の予防、および炎症（マクロファージおよび免疫系の他細胞の移動により誘発される）の予防における治療的価値を有し得る。またそれは、例えば瘢痕組織蓄積の予防においても有用であり得る。
【００３９】
上記検討は、細胞移動の阻害に焦点を当てたが、本発明はまた、別の局面において、例えば創傷治癒の促進に有用であり得る、細胞移動を促す方法を提供する。上記方法は、細胞に対しＭＥＭＯ（下記で記載されているＭＥＭＯの変異型およびフラグメントを含む）またはＭＥＭＯのアクチベーターを提供することを含み得る。従って、別の局面では、ＭＥＭＯを使用することにより創傷治癒の促進がもたらされる。
【００４０】
上記から明らかな通り、本発明者らは、後期段階細胞移動事象の重要なメディエーターとしてＭＥＭＯを同定した。
【００４１】
すなわち、本発明の一局面では、ＭＥＭＯに結合し、および／またはその活性を調節する物質の同定方法が提供される。好ましくは、試験方法は、ＭＥＭＯに結合し、および／またはその活性を阻害する物質の同定を目的とする。上記物質は処置方法で使用されると考えられる。
【００４２】
さらに好ましくは、上記物質はまた、細胞移動を阻害し、そして例えば移動の阻害が望まれる処置方法において使用され得る。
【００４３】
従って、本方法は、同じ物質が細胞移動を阻害するか、そして特にそれが、下記の通り初期段階細胞移動事象に影響を与えることなく細胞移動を阻害するか否かのさらなる確認段階を含み得る。
【００４４】
当業者が認めるところによると、特記していなければ、本明細書に開示されている本発明の局面および実施態様でポリペプチドまたは核酸についていう場合（例、ＥｒｂＢ２、ＭＥＭＯ）、上記ポリペプチドまたは核酸の変異型（例、誘導体または相同体）も、それらが依然として必要な活性をコードするものであれば同じく使用され得る。例えばＥｒｂＢ２についていう場合、本発明実施態様は、特記していなければ、Ｎｅｕの使用を包含する。概して、上記変異型は、本明細書で特定されている「野生型」または他の配列と実質的に相同的であり、すなわちそれとの配列類似性または同一性を共有している。類似性または同一性は、ヌクレオチド配列および／またはコードされたアミノ酸配列レベルであり得、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、または７０％または８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。配列比較は、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰを用いて実施され得る（Pearson & Lipman、１９８８、Methods in Enzymology １８３：６３−９８参照）。好ましくは、次の要領でデフォルトマトリックスを用いてパラメーターを設定する：Ｇａｐｏｐｅｎ（ギャップにおける第一残基についてのペナルティ）：タンパク質について−１２／ＤＮＡについて−１６；Ｇａｐｅｘｔ（ギャップにおける追加残基についてのペナルティ）：タンパク質について−２／ＤＮＡについて−４；ＫＴＵＰワード長：タンパク質について２／ＤＮＡについて６。類似性についての解析もまた、ハイブリダイゼーションを用いて実施され得る。特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションの達成に要求されるストリンジェンシー条件を計算するための一般式は次の通りである：Ｔｍ＝８１.５℃＋１６.６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０.４１（Ｇ＋Ｃ％）−０.６３（ホルムアミド％）−６００／＃ｂｐ（デュプレックスで）（Molecular Cloning： a Laboratory Manual：第２版、Sambrook et al．、１９８９、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス）。
【００４５】
ＭＥＭＯの好ましいフラグメントおよび変異型は下記の通りであり、特に機能性フラグメントおよび変異型、好ましくは移動事象、さらに好ましくはチロシンキナーゼ誘導事象を介助する能力を保持しているもの、さらに好ましくはＥｒｂＢ２により誘導されるものである。好ましくは、保持されている活性は、初期段階事象を介助するのではなく、後期段階移動事象を介助する能力である。
【００４６】
結合試験は、競合的または非競合的であり得る。
試験法は、当業者にとって常用の適切な対照により実施される。
【００４７】
本局面および他の局面において、推定されるまたは実際の阻害剤または他のモジュレーターは、スクリーニングにかけることが要望されているものであればいかなる供給源からでも提供され得、天然または合成の場合もそうでない場合もあり得、そしてペプチドまたはポリペプチド（例、抗体）または核酸（例、ｓｉＲＮＡ）である場合もそうでない場合もあり得る。治療適用に最も適切な好ましい阻害剤は小分子であり、例えば、当業界でよく知られている（例、Newton（１９９７）Expert Opinion Therapeutic Patents、７（１０）：１１８３−１１９４参照）ようなコンビナトリアルライブラリーからの小分子である。好ましい候補物質は、小分子、例えばステロイド、ベンゾジアゼピンまたはオピエート類に属するものを包含し得る。
【００４８】
一実施態様において、本発明は、ＭＥＭＯを発現する細胞を試験物質と接触させ、細胞においてＭＥＭＯの活性を阻害する物質を同定する段階を含む方法を提供する。
【００４９】
例えば、本発明者らは、ＭＥＭＯが、新たなタンパク質合成（または遺伝子転写）に依存的である移動の後期段階に関与することを見出した。ＭＥＭＯは、後期段階細胞移動に不可欠である特異的な遺伝子セットの転写活性化に寄与し得ると考えられる。従って、本発明の試験法は、上記遺伝子を活性化するＭＥＭＯの能力、およびそのプロセスを阻害する阻害剤の能力を利用することにより実施され得る。
【００５０】
本発明の別の実施態様では、ＭＥＭＯと結合相手の相互作用の阻害を評価する。これは、（ｉ）試験物質の存在および非存在下でＭＥＭＯをその結合相手と接触させ、そして（ii）試験物質の存在がＭＥＭＯおよびその結合相手間の相互作用を阻害するか否かを測定することを含み得る。
【００５１】
ポリペプチドおよび結合相手間の相互作用の評価方法は、当業者に公知の方法のいずれかであり得、本明細書で開示されている。これらの方法のいずれかを用いることにより、試験物質がポリペプチド（この場合ＭＥＭＯ）および結合相手間の相互作用を阻害するか否かを評価し得る。
【００５２】
一実施態様において、試験法は、ＭＥＭＯおよび上流因子、例えばＥｒｂ２、特にＥｒｂＢ２のリン酸化Ｙ１２２７とのその相互作用に基いたものである。
【００５３】
この局面の一実施態様は、
（ｉ）Ｙ１２２７に対応するリン酸化残基を含むＥｒｂＢ２またはそのフラグメントであるポリペプチドを準備し、
（ii）試験物質の存在および非存在下で上記ポリペプチドをＭＥＭＯと接触させ、そして
（iii）試験物質の存在または非存在のいずれの場合に、ポリペプチドおよびＭＥＭＯ間の相互作用が阻害されるかを測定する
段階を含み得る。
【００５４】
ＥｒｂＢ２のＹ１２２７「に対応する」残基は、同じアミノ酸環境にある残基である。特に、それは酸性残基であり、さらに好ましくは、それはホスホチロシン残基である。残基がＥｒｂＢ２のＹ１２２７と同じアミノ酸環境にあるか否かは、例えば興味の対象である残基を含むポリペプチドの部分を、Ｙ１２２７を含むＥｒｂＢ２の部分と並べることにより評価され得る。配列が少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも１０または１６アミノ酸にわたって同一である場合、残基は、対応する環境にあると言うことができる。
【００５５】
好ましくは、フラグメントは、Ｙ１２２７に対応する残基を含むが、他のリン酸化残基（本明細書ではＹＣポリペプチドと称す）は全く含まない。
【００５６】
さらに好ましくは、ＹＣポリペプチドは、Ｙ１２２７以外のリン酸化部位（すなわち、リン酸化され易い残基）を全く含まないフラグメントである。このため、Ｙ１２２７に対応する残基は、他の潜在的リン酸化部位のマスクを必要とせずに、合成中にリン酸化され得る。好ましくは、上記フラグメントは、ＥｒｂＢ２のアミノ酸配列の一部分少なくとも５、好ましくは少なくとも１０または１６アミノ酸長のアミノ酸と同一であり、リン酸化Ｙ１２２７を含むアミノ酸配列を含む。
【００５７】
試験物質がＭＥＭＯおよびＥｒｂＢ２ポリペプチド間の相互作用を阻害するか否かの測定には、ＭＥＭＯの活性化が阻害されるか否かの測定が含まれ得る。例えば、活性化は、化学的修飾（例、リン酸化）を伴い得る。これは、例えばホスホ特異的抗体用いることにより、放射性標識リン酸基の取込を調べることにより、またはホスホペプチドマッピングを用いることにより検出され得る。
【００５８】
別の実施態様において、試験物質がＭＥＭＯおよびＥｒｂＢ２ポリペプチド間の相互作用を阻害するか否かの測定には、ＥｒｂＢ２ポリペプチドおよびＭＥＭＯ間の物理的会合が阻害されるか否かの測定が含まれ得る。これは、後記要領で遂行され得る。
【００５９】
下記で検討している通り、ＭＥＭＯおよびその結合相手間の会合は、「アダプター」分子、例えば参考文献［４］で検討されているものを介して行われ得る。すなわち、別の実施態様では、試験法は、ＭＥＭＯおよびｓｈｃとのその相互作用に基いたものであり、下記実施例に記載されている。
【００６０】
別の実施態様において、相互作用は、ＭＥＭＯおよび下流結合相手間で行なわれ得る。下流結合相手は、例えば下記方法により提供され得る。好ましくは、試験物質がＭＥＭＯおよび下流結合相手間の相互作用を阻害するか否かの測定には、物理的相互作用が阻害されるか否かの測定が含まれるが、例えば、上記で検討されている通り、下流因子の活性化が阻害されるか否かの測定も含まれ得る。
【００６１】
本発明試験法は、インビトロで実施され得る。例えば、ＭＥＭＯおよびその結合相手間の物理的会合は、一方を検出可能な標識で標識し、それを固体支持体に固定化しておいた他方と接触させることにより試験され得る。適切な検出可能な標識には、遺伝子組換により製造されたＭＥＭＯおよび／または結合相手へ組込まれ得る３５Ｓ−メチオニンがある。遺伝子組換により製造されたＭＥＭＯおよび／または結合相手はまた、抗体で標識され得るエピトープを含む融合タンパク質として発現され得る。別法として、当業界でよく知られているように例えば放射性標識およびシンチラントを用いることにより、二重標識法も使用され得る。
【００６２】
一般的に、固体支持体に固定化されているタンパク質は、固体支持体に結合させたそのタンパク質に対する抗体を用いて、または自体公知である他の技術により固定化され得る。好ましいインビトロ相互作用は、標識、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはＨｉｓ６を含む融合タンパク質を利用し得る。標識は、例えばグルタチオンアガロースビーズまたはＮｉ−マトリックスのそれぞれにおける親和力相互作用により固定化され得る。
【００６３】
上記タイプのインビトロ試験形式において、推定される阻害剤化合物は、固定化された結合相手に結合する標識したＭＥＭＯまたは結合相手、例えば、場合によりＧＳＴ−結合相手またはＧＳＴ−ＭＥＭＯの量を調節するその能力を測定することにより評価され得る。これは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりグルタチオン−アガロースビーズを分画することにより測定され得る。別法として、ビーズをすすぐことにより、未結合タンパク質を除去し得、例えば適切なシンチレーションカウンターで存在する標識の量を計数することにより、結合したタンパク質の量を測定し得る。
【００６４】
別法として、固体支持体に結合され、ＭＥＭＯまたは結合相手の一方に対して指向した抗体をＧＳＴの代わりに用いて、分子を固体支持体に結合させ得る。ＭＥＭＯおよびその結合相手に対する抗体は、当業界で自体公知の様々な方法、および本明細書で検討した要領で得られる。
【００６５】
別の方法では、ＭＥＭＯおよびその結合相手のうちの一方を、蛍光供与体部分で標識し、他方を、供与体からの放射を低減化させ得るアクセプターで標識し得る。これにより、本発明試験法は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により実施され得る。この方法では、ＭＥＭＯおよびその結合相手が相互作用するとき、供与体の蛍光シグナルが改変される。相互作用を調節する候補モジュレーター化合物の存在により、供与体の未改変蛍光シグナルの量が増加する。
【００６６】
ＦＲＥＴは、当業界で自体公知の技術であるため、正確な供与体およびアクセプター分子およびそれらがＭＥＭＯおよびその結合相手に結合される手段は、文献を参照することにより達成され得る。
【００６７】
適切な蛍光供与体部分は、蛍光性エネルギーを別の蛍光性分子または化合物の一部へ転移させ得るものであり、例えばクマリンおよび関連染料、例えばフルオレセイン、ロドールおよびローダミン、レゾルフィン、シアニン染料、ビマン、アクリジン、イソインドール、ダンシル染料、アミノフタルヒドラジン、例えばルミノールおよびイソルミノール誘導体、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン、およびユーロピウムおよびテルビウム錯体および関連化合物があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６８】
適切なアクセプターには、クマリンおよび関連発蛍光団、キサンテン、例えばフルオレセイン、ロドールおよびローダミン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセン、およびフタロシアニンがあるが、これらに限定されるわけではない。
【００６９】
好ましい供与体はフルオレセインであり、好ましいアクセプターには、ローダミンおよびカルボシアニンがある。英国ドーセットのアルドリッチ・ケミカル・カンパニー・リミテッドから入手され得る、これらのフルオレセインおよびローダミンのイソチオシアネート誘導体を用いることにより、ＭＥＭＯおよびその結合相手が標識され得る。カルボシアニンの結合については、例えば、Guo et al.、J.Biol.Chem.、２７０；２７５６２−８（１９９５）参照。
【００７０】
本発明試験法はまた、インビボでも遂行され得る。かかる試験法は、適切な宿主細胞、例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳類宿主細胞において実施され得る。酵母および哺乳類宿主細胞が特に適切である。
【００７１】
かかる検定法をインビボで実施するため、ＭＥＭＯおよびその結合相手を発現し得る構築物およびレポーター遺伝子構築物が、細胞へ導入され得る。これは、適切な技術、例えばリン酸カルシウム沈降または電気穿孔により遂行され得る。構築物は、一時的にまたは適切なエピソームとして発現されるか、または宿主細胞のゲノムへ組込まれ得る。
【００７２】
インビボ検定法はまた、２−ハイブリッド試験法の形態をとり得る。２−ハイブリッド試験法は、FieldsおよびSong、１９８９、Nature、３４０；２４５−２４６により開示された方法に従って実施され得る。かかる試験法では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および酵母ＧＡＬ４転写因子の転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を、相互作用を研究すべき第一および第二分子にそれぞれ融合させる。興味の対象である２分子が相互作用するときのみ、機能性ＧＡＬ転写因子が修復される。すなわち、分子の相互作用は、レポーター遺伝子の転写を活性化させ得るＧＡＬ４ ＤＮＡ結合部位へ機能し得るように結合されたレポーター遺伝子の使用により測定され得る。他の転写アクチベータードメインもＧＡＬ４ ＴＡＤの代わりに使用され得、例えばウイルス性ＶＰ１６活性化ドメインがある。
【００７３】
一般に、ＭＥＭＯおよびその結合相手は融合タンパク質として発現され、一方はＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、例えば酵母ＧＡＬ４結合ドメインを含む融合タンパク質であり、他方は活性化ドメイン、例えばＧＡＬ４またはＶＰ１６からのものを含む融合タンパク質である。かかる場合、宿主細胞（同じく細菌、酵母、昆虫または哺乳類、特に酵母または哺乳類であり得る）は、ＤＢＤと適合し得るＤＮＡ結合エレメントを含むプロモーターを伴うレポーター遺伝子構築物を担う。
【００７４】
ＭＥＭＯおよびその結合相手およびレポーター遺伝子は、細胞へ導入され、一時的または恒常的に発現され得る。
【００７５】
次いで、ＭＥＭＯおよび／またはその結合相手を、試験物質と接触させると、ＭＥＭＯおよびその結合相手間の結合の阻害は、レポーター遺伝子発現の低減化として観察され得る。
【００７６】
例えば、このスクリーンで同定された阻害剤を用いることにより、上記の通り細胞移動事象が阻害され得る。それらは後記要領で医薬として処方され得る。
【００７７】
実施態様によって、例えばＭＥＭＯおよび下流因子間の相互作用の評価を含む方法では、ＭＥＭＯがその活性型であることが好ましい場合もある。例えば、インビトロ方法の場合、活性化ＭＥＭＯは、ＭＥＭＯの免疫沈降または活性化細胞試料からの標識ＭＥＭＯのアフィニティー精製により提供され得る。細胞は、ヘレグリンにより刺激を加えた細胞であり得る。インビボ方法の場合、それは、例えば、チロシンキナーゼ受容体、例えばＥｒｂＢ２を発現する細胞で、例えば細胞においてチロシンキナーゼ受容体を発現させることによる方法を実施することにより達成され得る。受容体は、リガンドの供給により活性化され得る。別法として、それは構成的に活性であり得る。
【００７８】
本方法は、所望によりさらに機能性試験法を含んでいてもよく、上記で同定されたＭＥＭＯ活性の阻害剤が細胞移動のメディエーターであるか否かが確認され得る。
【００７９】
一実施態様において、本方法は、ＭＥＭＯ活性の阻害剤と細胞を接触させ、阻害剤が細胞運動性を阻害し得ることを確認する段階を含む。例えば、上記で検討した通り、細胞運動性の阻害は、移動誘導シグナルに応答して生じる細胞運動性に関するものであり得る。
【００８０】
この方法で使用される細胞は、構成的に高度の細胞移動を示す細胞、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞であり得る。別法として、本方法では、細胞を因子、例えば細胞移動を刺激するリガンドと接触させ得る。
【００８１】
好ましくは、本方法は、ＥｒｂＢ２誘導細胞移動事象（特にリン酸化Ｙ１２０１またはＹ１２２７により誘導される）の阻害剤の同定を目的とする。この実施態様において、本方法では、細胞をＥｒｂＢ２についてのリガンド、例えば天然リガンドヘレグリンと接触させ得るか、または構成的に活性を示すＥｒｂＢ２を発現する細胞を用い得る。
【００８２】
移動についての適切な試験法は、当業界で公知の試験法のいずれか、例えば、実施例で示されている通り、９６ウェル形式でのトランスウェル型試験法または細胞運動性についてのセロミックス型ハイ・コンテント・スクリーンを用いた細胞運動性の測定であり得る。
【００８３】
好ましくは、本方法は、試験物質が初期段階ではなく（または少なくともそれより優先的に）後期段階の移動事象の阻害剤であるか否かの測定を含む。方法については後記で開示されている。
【００８４】
上記で説明した通り、一実施態様では、これは、細胞移動を阻害するが、最初のラメリポジウム形成を（著しくは）阻害しない物質の同定を含み得る。
【００８５】
従って、本方法は、上記の通り、移動に対する影響について試験し、次いで
（ii）これらの阻害剤の中で、ラメリポジウム形成（これは、器具、例えば細胞拡散用セロミックス・アレイスキャンシステムを用いて細胞拡散を評価することにより測定され得る）には影響を及ぼさない阻害剤についてスクリーニングすることを含み得る。
【００８６】
さらに本発明は、本発明の様々な局面を実施する場合に有用である材料および方法を提供する。
【００８７】
従って、本発明は、ＧｅｎｂａｎｋＡＦ１３２９６１に示されたアミノ酸配列を含む単離ＭＥＭＯポリペプチドを提供する。ヌクレオチド配列および予測される翻訳配列は、本明細書の添付配列表に示されている。
【００８８】
本発明の単離ＭＥＭＯポリペプチドは、上記のものの単離形態であり、それが天然に随伴する物質、例えば細胞においてそれと共に見出される他のポリペプチドを含まないか、または実質的に含まない。ポリペプチドは、天然に、または異種真核生物細胞系により、修飾、例えばグリコシル化され得るか、またはそれらは（例えば原核生物細胞での発現により製造された場合）非グリコシル化形態であり得る。ポリペプチドは、リン酸化および／またはアセチル化され得る。
【００８９】
本発明ポリペプチドはまた実質的精製形態であり得、その場合それは一般的に調製物中にポリペプチドを含むもので、調製物中におけるポリペプチドの９０％より大、例えば９５％、９８％または９９％は本発明ポリペプチドである。
【００９０】
本発明のＭＥＭＯポリペプチドに、例えばヒスチジン残基の付加による修飾を加えてそれらの精製を支援するかまたはシグナル配列の付加による修飾を加えて細胞からのそれらの分泌を促進させ得る。本発明のＭＥＭＯポリペプチドの全部または一部はまた、例えば酵母２ハイブリッド系で使用される融合タンパク質として発現される。
【００９１】
すなわち、前記で検討されている通り、本発明はまた、ＭＥＭＯの変異型であって、例えばそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９９％アミノ酸配列同一性を有する単離ポリペプチドを提供する。好ましくは、変異型は、ＡＦ１３２９６１の配列を有するＭＥＭＯの少なくとも一機能、好ましくは細胞移動、さらに好ましくはチロシンキナーゼ受容体、好ましくはＥｒｂＢ２により誘導される、さらに好ましくはＥｒｂＢ２のＹ１２２７のリン酸化による移動の介助能力を保持する。好ましくは、介助される移動は後期段階であり、初期段階移動ではない。
【００９２】
変異型の語はまた、本明細書で示されているＭＥＭＯ配列の天然に存する対立遺伝子、オーソログおよび他のホモログを包含する。
【００９３】
さらにＡＦ１３２９６１に示されているポリペプチドのフラグメントである単離ポリペプチドが提供され、上記フラグメントは、少なくとも１０、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７５、１００または１５０またはそれ以上の大きさのアミノ酸である。好ましくは、フラグメントは上記のＭＥＭＯの一機能を保持している。
【００９４】
変異型およびフラグメントは、ＭＥＭＯ配列で同定されたＤＵＦ５２ドメインを含み得る。このドメインは、酵母、シー・エレガンス（線虫、C.elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila）およびマウスを含む種において機能が未知の幾つかのタンパク質により共有されている。
【００９５】
本願でＭＥＭＯといえば、これらのフラグメントおよび変異型、および特に機能性フラグメントおよび変異型を包含するものとする。
【００９６】
本発明によるポリペプチドは、免疫原としてまたは特異抗体を得る場合において他の形で使用され得る。抗体は、ポリペプチドの精製および他の操作、診断的スクリーニングおよび治療的状況において有用である。これについては下記でさらに検討する。
【００９７】
本発明によるポリペプチドは、それに結合するか、またはその活性または機能を調節する分子についてのスクリーニングで使用され得る。上記分子は、治療的（おそらく予防的を含む）状況において有用であり得る。これについては下記でさらに検討する。
【００９８】
さらなる局面において、本発明は、上記の通りＭＥＭＯをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドまたはその変異型またはフラグメントを含むベクターを提供する。
【００９９】
ベクターは、組換え体複製可能ベクターであり、適格宿主細胞において核酸を複製するのに使用され得る。すなわち、さらなる実施態様において、本発明は、複製可能ベクターへ本発明ポリヌクレオチドを導入し、ベクターを適格宿主細胞へ導入し、そしてベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによるポリヌクレオチドの製造方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収され得る。適切な宿主細胞は、発現ベクターと関連させて下記に記載されている。
【０１００】
ベクターは、好ましくは上記核酸配列に機能し得るように結合されたプロモーターを含む発現ベクターである。ベクターは、宿主細胞により運ばれ、上記細胞内で発現され得る。発現後、本発明ポリペプチドが採取され得る。
【０１０１】
「機能し得るように結合された」の語は、記載された成分を、意図した方法でそれらを機能させ得る関係であるように並置させている状態をいう。コード配列に「機能し得るように結合された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合し得る条件下で達成されるような形で連結されている。
【０１０２】
適切な調節配列、例えばプロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を適宜含む、適切なベクターが選択または構築され得る。ベクターは、適切なものとしてプラスミド、ウイルス性、例えばファージファージミドまたはバキュロウィルス性コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰＡＣであり得る。ベクターには、遺伝子療法ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスに基くベクター、レトロウイルス（例えばＨＩＶまたはＭＬＶ）またはアルファウイルスベクターがある。
【０１０３】
ベクターは、複製起点、所望による上記ポリヌクレオチド発現用プロモーターおよび所望によるプロモーターのレギュレーターを随伴した形で提供され得る。ベクターは、１個またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌性プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子または哺乳類ベクターについてはネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。ベクターは、インビトロで例えばＲＮＡ製造用に使用されるかまたは宿主細胞のトランスフェクションまたは形質転換に使用され得る。ベクターはまた、インビボで、例えば遺伝子治療方法で使用されるように適合化され得る。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現用の系は、よく知られている。適切な宿主細胞には、細菌性、真核生物細胞、例えば哺乳類および酵母、およびバキュロウィルス系がある。異種ポリペプチド発現用の当業界で利用可能な哺乳類細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞およびその他多くのものがある。
【０１０４】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターが設計される宿主細胞と適合し得るように選択され得る。例えば、酵母プロモーターには、サッカロマイシス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、シゾサッカロマイシス・ポンベ（S.pombe）ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターがある。哺乳類プロモーターには、重金属、例えばカドミウムに応答性を示すメタロチオネインプロモーターがある。ウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０大型Ｔ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターもまた使用され得る。これらのプロモーターは全て当業界では容易に入手できる。
【０１０５】
ベクターは、他の配列、例えば挿入された核酸の発現を駆動するプロモーターまたはエンハンサー、ポリペプチドを融合体として製造させる核酸配列および／または宿主細胞で製造されたポリペプチドを細胞から分泌させるように分泌シグナルをコードする核酸を含み得る。
【０１０６】
本発明ポリペプチドの製造用または遺伝子治療用のベクターには、本発明のミニ遺伝子配列を担うベクターが含まれる。
【０１０７】
さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual：第２版、Sambrook et al.、１９８９、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス参照。例えば核酸構築物の製造、変異導入、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、およびタンパク質の解析についての多くの公知技術およびプロトコールが、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（１９９２）に詳細に記載されている。
【０１０８】
ベクターを、上記要領で適切な宿主細胞へ形質転換させることにより、本発明ポリペプチドが発現され得る。すなわち、さらなる局面において、本発明は、本発明ポリペプチドの製造方法であって、ベクターによりポリペプチドをコードするコード配列を発現させ得る条件下、上記発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養し、発現されたポリペプチドを回収することを含む方法を提供する。ポリペプチドはまた、インビトロ系、例えば網状赤血球ライゼートにおいても発現され得る。
【０１０９】
本発明のさらなる実施態様は、本発明ポリヌクレオチドの複製および発現用ベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を提供する。細胞は、上記ベクターと適合し得るように選択され、例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳類のものであり得る。
【０１１０】
前記内容の大部分は、ＭＥＭＯまたはその変異型をコードする配列を発現させることにより、細胞におけるＭＥＭＯ活性を増加させることに関するものであった。しかしながら、他の局面において、本発明は、例えば転写前または後サイレンシングにより細胞においてＭＥＭＯ活性を低減化させる方法および材料に関するものである。
【０１１１】
すなわち本発明ポリヌクレオチドには、ＭＥＭＯコード配列の補体が含まれるものも包含される。すなわち、ＭＥＭＯはまた、アンチセンス配向で上記ベクターへ挿入されることにより、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを製造させ得る。
【０１１２】
アンチセンスに代わるものは、両センスまたはアンチセンス鎖単独よりも遺伝子サイレンシングにおいてさらに有効であることが見出された２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の使用である（Fire A.et al、Nature、第３９１巻（１９９８））。ｄｓＲＮＡによるサイレンシングは、遺伝子特異的であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれることが多い（同じくFire（１９９９）Trends Genet. １５：３５８−３６３、Sharp（２００１）Genes Dev. １５：４８５−４９０、Hammond et al.（２００１）Nature Rev.Genes ２：１１１０−１１１９および Tuschl（２００１）Chem.Biochem.２：２３９−２４５参照）。
【０１１３】
ＲＮＡ干渉は２段階過程である。まず、ｄｓＲＮＡを細胞内で開裂することにより、５'末端リン酸および３'短オーバーハング（２ｎｔ）を伴う約２１〜２３ｎｔ長の短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生じさせる。ｓｉＲＮＡは、対応するｍＲＮＡ配列を特異的にターゲッティングすることにより破壊させる（Zamore P.D. Nature Structural Biology、８、９、７４６−７５０（２００１））。
【０１１４】
すなわち、一実施態様において、本発明は、例えば「長い」２本鎖ＲＮＡ（例えばダイサー（Dicer）を用いて、ｓｉＲＮＡにプロセッシングされる）であり得る、ＭＥＭＯ−エンコード配列を含む２本鎖ＲＮＡを提供する。これらのＲＮＡ生成物は、例えば慣用的化学合成方法によりインビトロで合成され得る。
【０１１５】
ＲＮＡｉはまた、３'−オーバーハング末端をもつ同一構造の化学合成されたｓｉＲＮＡ二重らせんを用いて効率的に誘導され得る（Zamore PD et al、Cell、１０１、２５−３３（２０００））。合成ｓｉＲＮＡ二重らせんは、広範囲の哺乳類細胞株において内在性および異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示された（Elbashir SM. et al. Nature、４１１、４９４−４９８（２００１））。
【０１１６】
すなわち、２０〜２５ｂｐ、さらに好ましくは２１〜２３ｂｐのＭＥＭＯ配列を含むｓｉＲＮＡ二重らせんは、例えば合成的に製造され、所望により分解を阻止するための保護形態で、本発明の一局面を形成する。
【０１１７】
別法として、ｓｉＲＮＡは、ベクターからインビトロ（採取および使用するため）またはインビボで製造され得る。
【０１１８】
従って、ベクターは、当業界で公知の方法のいずれかで、例えば本明細書で引用されている参考文献（これらについては出典明示により援用する）のいずれかに記載されている要領で、ｓｉＲＮＡを細胞へ導入するのに適切である、ＭＥＭＯをコードする核酸配列（その変異型またはフラグメントをコードする核酸配列を含む）を含み得る。
【０１１９】
一実施態様において、ベクターは、ＲＮＡとして発現されたとき、センスおよびアンチセンス断片が会合して２本鎖ＲＮＡを形成するように、センスおよびアンチセンスの両配向で本発明核酸配列を含み得る。これは、例えば、ダイサーによりインビトロでプロセッシングされることにより、ｓｉＲＮＡを生じさせ得る長い２本鎖ＲＮＡ（例、２３ｎｔより大）（例えばMyers（２００３）Nature Biotechnology ２１：３２４−３２８参照）またはｓｉＲＮＡヘアピン構造であり得る。
【０１２０】
別法として、２本鎖ＲＮＡは、上記の通り、ｓｉＲＮＡ二重らせんを形成する配列を直接的にコードし得る。別の実施態様において、センスおよびアンチセンス配列は異なるベクターで提供される。
【０１２１】
これらのベクターおよびＲＮＡ生成物は、例えば細胞においてＭＥＭＯポリペプチドの新たな生成を阻害するのに有用であり得る。それらは、本明細書で検討されている本発明の様々な実施態様における発現ベクターと同様に使用され得る。
【０１２２】
本発明のさらなる局面は、核酸（例、上記で検討されているベクターのいずれか）を宿主細胞へ導入することを含む方法を提供する。導入は、（特にインビトロ導入の場合）一般的には制限を伴うことなく「形質転換」と称され得、利用可能であればいかなる技術でも使用され得る。真核生物細胞の場合、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム伝達トランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクシニアまたは昆虫細胞の場合バキュロウイルスを用いる形質導入が含まれ得る。細菌細胞の場合、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれ得る。別法として、核酸の直接注入が使用され得る。
【０１２３】
導入後、核酸からの転写および適切な場合発現が誘発または行なわれ得、例えば宿主細胞（細胞は形質転換細胞の子孫である可能性の方が高いが、実際に形質転換された細胞が含まれ得る）を遺伝子発現についての条件下で培養することにより、コードされたポリペプチドまたはＲＮＡ分子が製造される。ポリペプチドが適切なシグナル先導ペプチドに結合された形で発現される場合、それは細胞から培養培地へ分泌され得る。発現による製造後、ポリペプチドは、場合によって、宿主細胞および／または培養培地から単離および／または精製され、それに続いて、要望に応じて例えば１種またはそれ以上の追加成分を含み得る組成物、例えば１種またはそれ以上の医薬上許容される補形薬、賦形剤または担体（例、下記参照）を含む医薬組成物の処方において使用され得る。
【０１２４】
本発明のさらなる局面は、本明細書で開示されている核酸を含む宿主細胞を提供する。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例、染色体）へ組込まれ得る。組込みは、標準技術に従って、ゲノムでの組換えを促す配列を含ませることにより促進され得る。核酸は、細胞内の染色体外ベクターに存し得る。
【０１２５】
別の実施態様において、本発明は、ＭＥＭＯの発現が修飾されるトランスジェニック動物を提供する。
【０１２６】
本発明の別の局面では、ＭＥＭＯ遺伝子の遺伝子座へ傷害(lesion)を組込むことによる、トランスジェニック非ヒト哺乳類、特にげっ歯動物、例えばマウスの製造方法が提供される。
【０１２７】
これは様々な方法で達成され得る。典型的な戦略は、ターゲッティングされた相同的組換えを用いることによる、胚性幹（ＥＳ）細胞における野生型ＭＥＭＯ遺伝子の置換、修飾または欠失である。ターゲッティングベクターを、電気穿孔、リポフェクションまたは顕微注入によりＥＳ細胞へ導入する。少数のＥＳ細胞では、ターゲッティングベクターは、同族染色体ＤＮＡ配列と対合し、ベクターが担う所望の突然変異を相同的組換えによりゲノムへ移入する。スクリーニングまたは濃厚化手順を用いることにより、トランスフェクション細胞を同定し、そしてトランスフェクション細胞をクローン化し、純粋集団として維持する。次に、改変されたＥＳ細胞を、移植前マウス胚の胚盤胞へ注入するかまたは別法として、ＥＳ細胞を２つの胚盤胞間に配置させた凝集キメラを調製し、ＥＳ細胞との融合により単一キメラ胚盤胞を形成させる。キメラ胚盤胞を外科的に養母の子宮へ移し、そこで分娩まで発達を進行させる。生ずる動物は、正常およびドナー細胞のキメラとなる。典型的には、ドナー細胞は、明らかに区別可能な表現型、例えば皮膚の色をもつ動物に由来するため、キメラの子孫は容易に識別される。次いで、子孫を繁殖させ、その子孫を交雑させることにより、ターゲッティングされた突然変異についての異型接合体および同型接合体を生じさせる。トランスジェニック動物の製造については、さらに、Capecchi,M,R,、１９８９、Science ２４４；１２８８−１２９２；ValanciusおよびSmithies、１９９１、Mol.Cell.Biol. １１、１４０２−１４０８；およびHasty et al. １９９１、Nature ３５０、２４３−２４６により記載されており、これらを出典明示により援用する。
【０１２８】
また、ＭＥＭＯのダウンレギュレーションが条件しだいであるトランスジェニック動物も提供される。例えば、このことにより、ＭＥＭＯ遺伝子の傷害が胚致死的である場合でも、動物を発達させ得る。これは、例えば上記発現系の制御下における、ＭＥＭＯの阻害剤、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの供給を必然的に伴い得るもので、阻害剤の発現は、適切な発達段階において条件次第で、例えばそれを誘導可能なプロモーターの制御下に置き、適切な刺激因子を適用することにより誘導され得る。
【０１２９】
遺伝子ターゲッティングにおける相同的組換えを用いることにより、野生型ＭＥＭＯ遺伝子は、具体的に特定された突然変異形態（例、先端切除または１個またはそれ以上の置換を含む）と置換され得る。
【０１３０】
また、本発明を用いることにより、野生型遺伝子を、野生型または他の点で活性を示すＭＥＭＯポリペプチドを発現し得る修飾遺伝子と置換させることができ、その場合、発現は永久的または一時的のいずれかで選択的に遮断され得る。永久的遮断は、シグナルに応じて遺伝子を欠失させる手段を供給することにより達成され得る。かかる手段の一例はｃｒｅ−ｌｏｘ系であり、ファージｌｏｘ部位が導入遺伝子のいずれか一端、または少なくともその充分な範囲の部分間（例、１個またはそれ以上のイントロンのいずれか一端に位置する２個のエキソンにおいて）に提供される。ｃｒｅリコンビナーゼの発現により、２つのｌｏｘ部位間における核酸の切除および環状化が誘発される。発生的または組織限定的にｃｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニック動物、特にマウスの様々な系統が当業界では入手可能である、例えばTsien、Cell、第８７巻（７）：１３１７−１３２６、（１９９６）およびBetz、Current Biology、第６巻（１０）：１３０７−１３１６（１９９６）参照。これらの動物を、本発明ｌｏｘトランスジェニック動物と交雑することにより、ＭＥＭＯ遺伝子の機能を調べることができる。これに代わる制御機構は、細胞へのテトラサイクリンの付加によりプロモーターに結合し、ＭＥＭＯ遺伝子の発現を遮断するように、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｔｅｔからのプロモーターをＭＥＭＯ遺伝子座の制御領域に与えるものである。
【０１３１】
またトランスジェニックターゲッティング技術は、ＭＥＭＯ遺伝子の欠失に使用され得る。ターゲッティングされた遺伝子欠失方法は、Brenner et al、国際公開第９４／２１７８７号（セル・ジェネシス）に記載されており、その開示については出典明示により援用する。
【０１３２】
相同的組換えはまた、検出可能な標識、例えばβ−ガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質に融合させた、融合タンパク質形態での本発明ポリペプチドを発現する「ノック・イン」動物を製造するのに使用され得る。上記トランスジェニック非ヒト哺乳類は、検出可能標識の発現をモニターすることによるＭＥＭＯ遺伝子の時間的および空間的発現の測定方法で使用され得る。
【０１３３】
さらに別の方法は、ＭＥＭＯ遺伝子の発現を担う制御配列のターゲッティングである。
本発明は、上記方法により得られるトランスジェニック非ヒト哺乳類およびそれらの子孫まで拡大される。上記哺乳類は、同型接合性または異型接合性であり得る。上記哺乳類には、マウス、げっ歯動物、ウサギ、ヒツジ、ヤギおよびブタがある。
【０１３４】
トランスジェニック非ヒト哺乳類は、実験的目的のため、例えば細胞移動の調節におけるＭＥＭＯの役割の試験およびＭＥＭＯと他の細胞性因子、特に転移および細胞移動が望ましくない他の場合または細胞移動が望ましいこともあり得る場合、例えば創傷治癒に関与するものとの相互作用をターゲッティングするように設計された治療の開発で使用され得る。「実験的」とは、上記実験が行われる研究施設に適用可能な一般的法律規定のもとで動物実験または試験目的での使用が認められ得ることを意味する。
【０１３５】
上記で検討した通り、本発明以前にＭＥＭＯが機能に関して特性確認されたことはこれまでには無かった。それにもかかわらず、本明細書における開示内容を考えに入れると、ＭＥＭＯのモジュレーター、例えばそれと結合することにより、その相互作用を阻害し得る抗体は、例えば後期段階移動の研究または制御方法において有用であることがわかる。
【０１３６】
すなわち、本発明のさらなる局面は、ＭＥＭＯと特異的に結合できる抗体の産生、これらの抗体自体、および本明細書に開示されている方法におけるそれらの使用に関するものである。
【０１３７】
ＭＥＭＯ抗体は、それが結合できるポリペプチドおよびそれが全くまたは実質的に結合親和力をもたない（例、少なくとも約１０００×劣る結合親和力）同種の他のポリペプチド間の区別を可能にするという意味で特異的である。特異抗体は、他の分子には存在しないかまたは接近できない分子上のエピトープに結合する。
【０１３８】
好ましい本発明抗体は、混入物質を不含有、例えば他のポリペプチドに結合できる抗体を不含有および／または血清成分を不含有であるという意味で、単離されている。モノクローナル抗体も目的によっては好ましいが、ポリクローナル抗体が本発明の範囲内に含まれる。
【０１３９】
抗体は、当業界において標準的である技術を用いて得られる。抗体の産生方法には、本発明ポリペプチドによる哺乳類（例、マウス、ラット、ウサギ）の免疫化が含まれる。当業界で公知の様々な技術のいずれかを用いて免疫化動物から抗体を得、好ましくは興味の対象である抗原への抗体の結合を用いてスクリーニングにかけ得る。例えば、ウエスタン・ブロッティング技術または免疫沈降が使用され得る（Armitage et al. Nature、３５７：８０−８２、１９９２）。
【０１４０】
ペプチドでの哺乳類の免疫化に代わる方法またはそれを補足するものとして、例えば表面上に機能性免疫グロブリン結合ドメインを示すラムダバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを用いて、タンパク質に特異的な抗体を、発現された免疫グロブリン可変ドメインの遺伝子組換的に製造されたライブラリーから入手し得る、例えば国際公開第９２／０１０４７号参照。
【０１４１】
本発明抗体には、多様な方法で修飾が加えられ得る。事実、「抗体」の語は、要求される特異性をもつ結合ドメインを有する結合物質を全て包含するものとしてみなされるべきである。すなわち、本発明は、合成分子および形状が抗原またはエピトープとの結合を可能にする抗体の形状を模倣するものである分子を含め、抗体フラグメント、誘導体、抗体の機能的均等内容物および相同体を包含する。
【０１４２】
抗原または他の結合相手と結合し得る、抗体フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、Ｃ１およびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント、ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント、ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ領域およびＦ（ａｂ'）２フラグメント、およびヒンジ領域がジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである。１本鎖Ｆｖフラグメントもまた含まれる。
【０１４３】
非ヒト供給源からのＣＤＲがヒトフレームワーク領域に移植され、典型的にはフレームワークアミノ酸残基の幾つかが改変されていることにより、親非ヒト抗体よりも免疫原性が低い抗体を提供するヒト化抗体もまた本発明の範囲内に含まれる。
【０１４４】
本発明によるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、遺伝子突然変異または他の変化を受け入れ易いものであり得る。さらに当業者であれば、モノクローナル抗体を組換えＤＮＡ工学の技術にかけることにより、もとの抗体の特異性を保持している他の抗体またはキメラ分子が製造され得ることは容易に理解できるはずである。上記技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常部、または定常部＋フレームワーク領域に導入することを必然的に含み得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ−Ａ−２１８８６３８またはＥＰ−Ａ−０２３９４００参照。キメラ抗体のクローニングおよび発現については、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【０１４５】
所望の結合特性をもつ抗体を生産し得るハイブリドーマは、抗体（抗体フラグメントを含む）をコードする核酸を含み、それらを発現させ得る真核生物または原核生物の宿主細胞であるものとして、本発明の範囲内に含まれる。本発明はまた、抗体の生産方法であって、抗体が産生され、好ましくは分泌される条件下で抗体を生産し得る細胞を増殖させることを含む方法を提供する。
【０１４６】
試料に対する抗体の反応性は、任意の適切な手段により測定され得る。個々のレポーター分子による標識は一つの可能性である。レポーター分子は、直接的または間接的に検出可能な、そして好ましくは測定可能なシグナルを発生し得る。レポーター分子の結合は、直接的または間接的に、例えばペプチド結合を介した共有結合または非共有結合によるものであり得る。ペプチド結合を介した連鎖は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果によるものであり得る。
【０１４７】
一つの有利な方法は、スペクトル分離された吸収または放射特性をもつ個々の蛍光色素、リン光体またはレーザー色素と各抗体の共有結合鎖によるものである。適切な蛍光色素には、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリスリンおよびテキサスレッドがある。適切な色素にはジアミノベンジジンがある。
【０１４８】
他のレポーターには、高分子コロイド状粒子または微粒子物質、例えば着色されているか、磁性または常磁性のラテックスビーズ、および直接的または間接的に検出可能なシグナルを誘発することにより、視覚的に観察されるか、電子的に検出されるかまたは他の方法で記録され得る生物学的または化学的活性成分がある。これらの分子は、例えば発色または変色をもたらすか電気特性の変化を誘発する反応を触媒する酵素であり得る。それらは、エネルギー状態間における電子トランジションの結果、特徴的なスペクトル吸収または放射を生じるように、分子的に励起しうるものであり得る。それらは、バイオセンサーと連係的に使用される化学物質を含み得る。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリ性ホスファターゼ検出系が使用され得る。
【０１４９】
結合の測定方法は本発明の特色ではなく、当業者であれば、その好みおよび一般的知識に従って適切な方法を選択できるはずである。
【０１５０】
本発明による抗体は、例えば検討されている細胞または細胞ライゼートを含む試験試料における、ポリペプチドの存在についてのスクリーニングで使用され得、また例えばそれをコードする核酸からの発現によるポリペプチドの製造後に、本発明ポリペプチドの精製および／または単離において使用され得る。抗体は、それらが結合するポリペプチドの活性を調節し得るため、ポリペプチドが個体において有害な影響を与える場合、治療的状況（予防を含み得る）において有用なものであり得る。
【０１５１】
抗体は、例えば試験試料中における特定物質の存在を測定する際に、抗体の使用説明書を含み得るキットにおいて提供され得る。１種またはそれ以上の他の試薬、例えば標識分子、緩衝液、溶離液（elutant）なども含まれ得る。試薬は、外的環境からそれらを保護する容器、例えば密閉バイアル内に入れられた形で提供され得る。
【０１５２】
本発明者らは、Ｔｙｒ残基１２０１および１２２７が、他のＥｒｂＢ２リン酸化部位と置き換えることができない細胞運動性における独特の機能を有することを示した。表面的には、Ｙ１２０１およびＹ１２２７は、両方とも転写依存的後期段階運動性を介助することから、ＥｒｂＢ２依存的運動性において類似した役割を演じると思われる。しかしながら、本発明者らは、ＭＥＭＯがリン酸化Ｙ１２２７の下流であることを要求されるのであって、Ｙ１２０１ではないことを示した。従って、別の局面において、本発明は、Ｙ１２０１−誘導による移動のメディエーターであって、本開示に照らして見出され得る細胞移動の他のメディエーターに関するものである。好ましくは、これらのメディエーターの阻害がＹ１２２７からの細胞運動シグナリングに影響を与えることがないように、これらのメディエーターはＹ１２２７−誘導による移動のメディエーターではない。さらに好ましくは、それらは後期段階移動事象のメディエーターである。
【０１５３】
本発明はまた、上記方法の一つまたはそれ以上における使用に適切であり得る、ＭＥＭＯの結合相手の提供方法に関するものである。
【０１５４】
一実施態様において、本方法は、
ＭＥＭＯポリペプチドを提供し、
ＭＥＭＯポリペプチドをＭＥＭＯ結合相手と接触させ、
ＭＥＭＯ結合相手がＭＥＭＯポリペプチドに結合できるか否かを測定する
ことを含む。
【０１５５】
繰り返すことになるが、ＭＥＭＯポリペプチドは、上記の通り、ＭＥＭＯの変異型またはフラグメントであり得る。変異型またはフラグメントは、ＭＥＭＯの少なくとも一つの機能、好ましくは移動事象の介助能力、さらに好ましくはチロシンキナーゼ受容体により、さらに好ましくはＥｒｂＢ２により、そして最も好ましくはＥｒｂＢ２のＹ１２２７のリン酸化により誘導される移動事象の介助能力を保持する変異型またはフラグメントであるのが好ましい。好ましくは、移動事象は初期段階ではなく後期段階である。
【０１５６】
ＭＥＭＯの結合相手は、シグナリング経路における上流または下流である結合相手であり得、経路の上流にある因子はＭＥＭＯを調節（例、活性化）し、経路の下流にある因子はＭＥＭＯにより調節（例、活性化）される。
【０１５７】
下流結合相手の同定については、ＭＥＭＯは活性型で提供されるのが好ましい。「活性化された（る）」は、活性を示すのに適切な環境（そして適切な因子を含む）におけるものである（例、膜に存在する）のを意味することは、当業者であれば容易に理解できるはずである。
【０１５８】
この実施態様において、ＭＥＭＯの非活性型は、結合特異性を測定するための対照として使用され得る。活性化ＭＥＭＯの提供方法の例は上記で報告されている。
【０１５９】
これらの結合試験法において、ＭＥＭＯおよびその天然結合相手間の会合は直接的または間接的であり得る。例えば、物理的会合を行わせるのに要求される「アダプター」分子が存在し得る。
【０１６０】
本方法は、インビトロで実施され得る。一実施態様において、ＭＥＭＯポリペプチドは、固体支持体に固定化され得る。これの実施方法については既に記載されている。次いで、固定化ポリペプチドをＭＥＭＯ結合相手と接触させ得る。
【０１６１】
一実施態様では、固定化ポリペプチドを、多様な潜在的結合相手を含む試料と接触させ得る。未結合物質は洗い流され、結合物質については、例えばそれをデタージェント、例えばＳＤＳと接触させることにより解離させ得る。次いで、固定化ポリペプチドに結合したタンパク質の同一性は、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび質量分析法を含む、当業者に公知の方法のいずれかにより評価され得る。
【０１６２】
ＭＥＭＯポリペプチドを、可能性がある唯一の結合相手を含む試料と接触させる場合、ポリペプチドおよび結合相手間の相互作用の試験方法は、実質的に阻害剤の試験方法に関して記載した要領と同様であり得る。例えば、それらは、ポリペプチドおよびその結合相手の一方を検出可能な標識で標識し、そして他方を固定化することを含み得る。次いで、結合の量は、固体支持体に結合した標識の量を測定することにより評価され得る。別法では、前記の通り、蛍光共鳴エネルギー転移が使用され得る。試験化合物が事実上結合相手である場合、供与体の蛍光シグナルが改変される。
【０１６３】
結合相手についての試験法もまた、インビボで、例えば前記の通り酵母２ハイブリッド方法を用いることにより実施され得る。
【０１６４】
ＭＥＭＯポリペプチドは、適切なドメインを伴う融合タンパク質として発現され得、本発明ポリペプチドが会合し得る候補第二ポリペプチドは、適切な対応するドメインを伴う融合タンパク質として製造され得る。別法として、ライブラリー、例えば上記融合タンパク質のファージディスプレーライブラリーは、本発明の融合ポリペプチドによりスクリーニングされ得る。
【０１６５】
この局面の様々な実施態様において、ＭＥＭＯの結合相手の同定方法は、移動事象の特異的メディエーター、さらに好ましくは初期段階事象よりも後期段階事象の特異的メディエーターの同定方法として有用であり得る。
【０１６６】
上記実施態様において、本発明方法は、さらにＭＥＭＯ結合相手が細胞運動または移動事象の特異的メディエーター、さらに好ましくは初期段階事象よりも後期段階事象の特異的メディエーターであることを確認する追加の機能的スクリーニング段階を含み得る。
【０１６７】
本明細書で使用されている細胞運動の「メディエーター」は、シグナルに応じて細胞運動を正に調節するシグナリング経路における天然に存する中間体である。すなわち、後期段階細胞運動のメディエーターは、シグナルに応じて後期段階細胞運動を正に調節する経路の一員である。初期段階ではなく後期段階の細胞移動事象のメディエーターは、後期段階事象を正に調節し、その後期段階経路における活性が、初期事象の著しい阻害を伴うことなく阻害され得る経路の一員である。
【０１６８】
すなわち一実施態様において、上記方法は、
ＭＥＭＯ結合相手の活性が調節されている細胞を提供し、
上記調節が初期段階移動事象に影響を与えるか否かを検出し、および／または
上記調節が後期段階移動事象に影響を与えるか否かを検出する
後続段階を含み得る。
【０１６９】
好ましくは、調節は阻害であり、これらの方法は、後期段階細胞移動事象のＭＥＭＯに基いた特異的阻害剤の同定に使用されたものと類似している。
【０１７０】
一実施態様で、使用された細胞は、外的刺激因子の非存在下において運動性を示し得る。ここで、移動誘導シグナルは、細胞により構成的に提供され得る。上記細胞の一例は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞である。別の実施態様において、シグナルは、例えばチロシンキナーゼ受容体についてのリガンド、例えばＥｒｂＢ２のＦＧＦ２、ＥＧＦ受容体についてのリガンドと細胞を接触させることにより外因的に提供される。
【０１７１】
好ましい実施態様において、本方法は、ＭＥＭＯ結合相手が、ＥｒｂＢ２活性化により誘導される移動事象のメディエーターであるか否かの測定を含む。この実施態様では、運動性誘導シグナルは、ＥｒｂＢ２受容体の活性化により、例えば細胞におけるＥｒｂＢ２の構成的活性化により、またはＥｒｂＢ２のリガンド、例えばヘレグリンと受容体を接触させることにより提供される。
【０１７２】
ＭＥＭＯ結合相手の活性が調節される細胞は、ターゲッティングされた突然変異誘発により、翻訳のダウンレギュレーション（例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを用いる）により、またはＭＥＭＯ結合相手の活性の特異的阻害剤と細胞を接触させることにより提供され得る。
【０１７３】
本願の最も好ましい標的は、ＥｒｂＢ２の過剰発現が癌転移に関係していたことから、ＥｒｂＢ２のＹ１２０１またはＹ１２２７により刺激される後期作用経路である。従って、さらなる実施態様において、本試験方法は、ＭＥＭＯ結合相手の同定に続いて、例えば実施例に記載されているように、結合相手が、Ｙ１２０１またはＹ１２２７リン酸化により誘導される移動事象のメディエーターであるか否かを測定することを含み得る。
【０１７４】
本発明者らはまた、初期段階細胞移動に要求されるメディエーターが、Ｙ１２０１またはＹ１２２７のいずれかの活性化後の有効な移動に必要である（すなわち、それらは総じて移動に必要とされると思われる）ことを観察した。対照的に、「後期段階」メディエーター、または少なくともＥｒｂＢ２の下流に近接して作用するものは、Ｙ１２０１およびＹ１２２７の両方ではなくそのどちらか一方からのシグナル変換に必要とされると思われる。これはまた、ＥｒｂＢ２Ｙ１２０１およびＹ１２２７の下流に介在したシグナリング経路が、先に移動に関与した経路よりも特殊化された役割を有し得ることを示す。
【０１７５】
この観察結果は、所定のメディエーターが、後期段階移動事象の特異的メディエーターであるか否かを確立する択一的方法についての基礎を提供しており、これを確立するのに所望または要求される本明細書で検討した方法のいずれかに適用可能であり得る。
【０１７６】
すなわち、一実施態様において、ＭＥＭＯ結合相手が後期段階移動事象の特異的メディエーターであるか否かの決定方法は、
ＭＥＭＯ結合相手が、ＥｒｂＢ２残基Ｙ１２０１またはＹ１２２７からのシグナル変換に要求されるか否かを測定し、
それがＹ１２０１ではなくＹ１２２７からのシグナル変換に要求される場合に、メディエーターを選択する
段階を含み得る。
【０１７７】
これは、一実施態様において、
ｉ）ＥｒｂＢ２−誘導細胞移動シグナリングがＹ１２０１ではなくＹ１２２７により介助される第一細胞を提供し、
ii）ＥｒｂＢ２−誘導細胞移動シグナリングがＹ１２２７ではなくＹ１２０１により介助される第二細胞を提供し、
iii)上記細胞において興味の対象であるＭＥＭＯ結合相手の活性を阻害し、
iv）上記阻害が、段階ii）ではなく段階ｉ）の細胞における細胞移動を阻害する場合に、ＭＥＭＯ結合相手を選択する
ことにより行われ得る。
【０１７８】
上記の通り、ＥｒｂＢ２−誘導細胞移動シグナリングがＹ１２０１またはＹ１２２７のいずれか一方のみにより誘導される細胞は、他の自己リン酸化部位にあるチロシンがリン酸化を被りにくい残基により置換されたＥｒｂＢ２の一形態を発現する細胞を提供することにより得られる。
【０１７９】
本発明者らは、さらに細胞移動の後期段階事象が、新たなＲＮＡおよびタンパク質合成に依存的であると思われることを見出した。特に、Ｔｙｒ１２０１またはＴｙｒ１２２７におけるＮｅｕ／ＥｒｂＢ２のリン酸化により、転写／翻訳依存的であるそれらの細胞移動段階は活性化した。これが、以前に観察されたことは無かった。この新たな観察結果により、後期段階細胞移動のさらなるメディエーターの同定方法であって、
ｉ）移動誘導シグナルを受けたが、後期段階移動事象の阻害剤とは接触しなかった細胞と
ii）移動誘導シグナルを受けなかったか、または移動誘導シグナルを受け、後期段階移動事象の阻害剤と接触した細胞
におけるｍＲＮＡおよび／またはタンパク質発現を比較することを含む方法が提供される。
【０１８０】
好ましくは、阻害剤は初期段階よりも優先的に後期段階の細胞移動事象に関与するものである。２種の細胞型において異なるレベルで発現されるｍＲＮＡ転写物およびタンパク質が同定され得る。
【０１８１】
移動誘導シグナルは、前記要領で提供され得、好ましくはＥｒｂＢ２についてのリガンドである。
【０１８２】
好ましい実施態様において、後期段階移動事象の阻害剤は、ＭＥＭＯ活性の阻害剤であり、例えば上記方法の一つを用いて提供され得る。
【０１８３】
２細胞におけるタンパク質発現は、当業界で公知のプロテオミクス技術のいずれかを用いて評価され得る（例えば、Resing KA、Ann N Y Acad Sci ２００２年１０月；９７１：６０８−１４、またはMacBeath G. Nat Genet ２００２年１２月；３２、補遺：５２６−３２参照）。
【０１８４】
細胞におけるｍＲＮＡ発現は、当業界で公知のマイクロアレイ技術のいずれかにより評価され得る（例えば、the Affymetrix GeneChip Expression Analysis Technical Manual、Brown P.O および Bottstein D.、Nat Genet １９９９年１月；２１補遺：３３−３７、Lipshutz et al.、Nat Genet １９９９年１月；２１補遺：２０−２４、Harkin DP.；Oncologist ２０００；５（６）：５０１−７、Heller MJ.、Annu Rev Biomed Eng ２００２；４：１２９−５３参照）。データ解析については、例えばSlonim DK.、Nat Genet ２００２年１２月；３２補遺：５０２−８およびButte A.、Nat Rev Drug Discov ２００２年１２月；１（１２）：９５１−６０参照。
【０１８５】
上記方法のいずれかを用いてタンパク質性結合相手を同定する場合、所望ならば、これは、当業者には熟知されている技術を用いて混合物から活性タンパク質としてさらに精製され得、そして本開示を考慮に入れると、メディエーターのさらなる単離は、通常の当業者にとって何ら負担となるものではない。典型的プロトコールは、“Protein Purification − principles and practice”出版社シュプリンガー−フェルラーク、ニューヨーク・インコーポレイテッド（１９８２）、および Harris & Angal（１９８９）“Protein purification methods - a practical approach”出版社 O.U.P. イギリス国、またはそこで引用されている参考文献に示されている。
【０１８６】
メディエーターを得るための典型的プロトコールは、
（ｉ）メディエーターを含む無細胞液の調製後、以下の段階の一つ、好ましくは二つまたはそれ以上の実施（任意の順序で）、
（ii）上清のゲル濾過；
（iii）イオン交換クロマトグラフィー（アニオンまたはカチオン交換）、
（iv）疎水性相互作用クロマトグラフィー
を含み得る。
【０１８７】
各段階において、例えば上記で検討した結合検定法を用いることにより、純度および収率が評価され得る。この手順中または後におけるさらなる特性検定には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（例、ボイジャーＤＥ−ＰＲＯシステムを用いる）および／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれ得る。
【０１８８】
活性画分と会合したタンパク質は、所望によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、完全または部分的に配列決定され得る。配列情報をデータベース上のものと比較することにより、この活性を有し得る配列が同定され得る。
【０１８９】
適切な阻害剤（例、上記で検討した後期段階経路を、例えばそれらの経路内におけるメディエーター、例えば上記で検討した機能的または他の試験法で同定されたものの活性の調節を介して、調節する）は、例えば毒性についてさらに試験した後、医薬に組込まれ得る。これらの例としては上記で検討したｓｉＲＮＡおよび関連ベクターがある。
【０１９０】
また、検討したところによると、本方法では別の実施態様において、ＭＥＭＯ（そのフラグメントまたは変異型を含む）の使用により、細胞移動の促進が有利にはたらく状態（例、創傷治癒の場合）を処置する。従って、下記阻害剤の検討内容が、ＭＥＭＯにも当てはまり得ることは容易に理解できるはずである。
【０１９１】
すなわち、関連性のある方法は、例えば細胞運動性の制御が望まれる病気について、例えば乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌または胃癌を含む腫瘍の処置についての医薬として選択された阻害剤を処方するさらなる段階を含み得る。医薬はまた、内皮細胞の移動を伴う血管新生の処置に使用され得る。これらの病気の処置で使用される上記阻害剤および医薬、およびそれらの使用を含む処置方法は、本発明のさらなる局面を形成する。
【０１９２】
本明細書で使用されている処置の語は、状態またはその症状の予防および防止並びに軽減を含むものとする。
【０１９３】
組成物は、上記成分に加えて、医薬上許容される賦形剤、保存剤、可溶化剤、増粘物質、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、調味料、浸透圧改変用の塩類、緩衝液またはコーティング剤を含み得る。上記材料は、非毒性であり、かつ有効成分の効力を妨げないものとすべきである。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路により異なり得る。技術およびプロトコールの例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”第１６版、Osol,A.（編）、１９８０に記載されている。
【０１９４】
組成物を医薬組成物に処方する場合、その投与は、経腸的（parentally）、例えば経口的、経鼻的(例、鼻スプレー形態で)または直腸的に（例、坐剤形態で）実施され得る。しかしながら、投与はまた、非経腸的（parentally）、例えば筋肉内、静脈内、経皮、皮下、または腹腔内的（例、注射液形態で）に実施され得る。
【０１９５】
すなわち、例えば、医薬組成物が錠剤形態である場合、それは固体担体、例えばゼラチンまたはアジュバントを含み得る。錠剤、コーティング錠剤、糖衣錠およびゼラチン硬カプセルの製造については、活性化合物およびそれらの医薬上許容される酸付加塩は、医薬上不活性の無機または有機賦形剤により加工処理され得る。乳糖、トウモロコシ、澱粉またはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などは、例えば錠剤、糖衣錠およびゼラチン硬カプセル用の上記賦形剤として使用され得る。ソフトゼラチンカプセルに適切な賦形剤は、例えば植物油、蜜蝋、脂肪、半固体および液体ポリオールなどである。組成物が液体医薬処方物形態である場合、それは一般的に液体担体、例えば水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油を含む。生理食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカリド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールもまた含まれ得る。溶液およびシロップ製造用の他の適切な賦形剤は、例えば水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコース、トリハロースなどである。注射溶液用の適切な賦形剤は、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油などである。静脈内、皮膚または皮下注射、または脳へのカテーテル内注入については、有効成分は、発熱物質不含有であり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口上許容される水溶液の形態である。当業界に直接関連した者であれば、例えば、等張性賦形剤、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー液、乳酸加リンガー液を用いて、適切な溶液を調製できるはずである。保存剤、安定剤、緩衝液および／または他の添加物も必要に応じて含まれ得る。
【０１９６】
本明細書で示された他所参照の開示については、本開示を補う上で当業者が必要とし得る場合に出典明示で援用する。
【０１９７】
以下の非限定的な図面および実施例と関連させながら、本発明についてさらなる説明を行う。本発明の他の実施態様も、これらを考慮に入れれば当業者には容易に想到できるものである。
【０１９８】
図面
図１ａは、ヘレグリンシグナリングに対するＴ４７Ｄ乳癌細胞株およびＴ４７Ｄ−５Ｒ癌細胞株の移動応答を示す。
【０１９９】
図１ｂは、Ｎｅｕ、ＮＹＰＤ、ＹＡ、ＹＢ、ＹＣ、ＹＤおよびＹＥタンパク質を表す概略図である。
【０２００】
図１ｃは、ヘレグリンシグナリングに対する、Ｎｅｕ−、ＮＹＰＤ−、ＹＡ−、ＹＢ、ＹＣ−、ＹＤ−およびＹＥ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株の移動応答を示す。
【０２０１】
図２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄは、ＹＣ、リン酸化ＹＣ（ｐＹＣ）、ＹＤまたはリン酸化ＹＤ（ｐＹＤ）ペプチドによりトランスフェクションされたＹＣ−およびＹＤ−発現性細胞のヘレグリン誘導による移動応答を示す。
【０２０２】
図３ａは、時間経過に伴うヘレグリン処置Ｔ４７ＤおよびＮＹＰＤ細胞の形態学的応答を示す。
【０２０３】
図３ｂは、時間経過に伴うヘレグリン処置Ｔ４７ＤおよびＮＹＰＤ細胞におけるＲａｃ活性化の速度論を示す。
【０２０４】
図３ｃは、下記方法を用いて定量した、時間経過に伴うヘレグリン処置Ｔ４７Ｄ細胞におけるラメリポジウム形成の程度を示す。
【０２０５】
図３ｄは、ヘレグリン処置Ｎｅｕ−およびＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株におけるラメリポジウム形成の程度を示す。
【０２０６】
図４ａは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）の存在下および非存在下におけるＮｅｕ−およびＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株のヘレグリン誘導による移動応答を示す。
【０２０７】
図４ｂは、ＣＨＸの存在下または非存在下における時間経過に伴うＮＹＰＤ−、ＹＣ−、ＹＤ−およびＹＥ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株のヘレグリン誘導による移動を示す。
【０２０８】
図５ａは、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８またはＳｒｃ阻害剤の存在下におけるＮｅｕ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞のヘレグリン誘導による移動を示す。
【０２０９】
図５ｂは、時間経過に伴うＮｅｕ−、ＮＹＰＤ−、ＹＡ−、ＹＢ−、ＹＣ−、ＹＤ−およびＹＥ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株におけるＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋおよびｐ３８ＭＡＰＫ経路のヘレグリン誘導による活性化を示す。これらの経路の活性化を、細胞抽出物のウエスタン・ブロッティング、次いでＰ−ＭＡＰＫ、Ｐ−ＰＫＢおよびＰ−ｐ３８抗体による膜のプロービングにより評価した。
【０２１０】
図５ｃは、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８またはＳｒｃ阻害剤の存在下におけるＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株（細胞）のヘレグリン誘導による移動を示す。
【０２１１】
図５ｄは、Ｎｅｕ−およびＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株でのＨＲＧ−誘導によるラメリポジウム形成に対するＭＥＫおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を示す。
【０２１２】
図６ａは、ＹＣ、ｐＹＣ、ＹＤおよびｐＹＤペプチドへのＳｈｃ、ＣｒｋIII、ＰＬＣγおよびＭＥＭＯの結合を示す。これをプルダウン法、次いでそれぞれの抗体によるウエスタン・ブロッティングにより分析した。Ｍｅｍｏ／ＣＧＩ−２７を、ＧＦＰ−Ｍｅｍｏ融合タンパク質を発現する細胞からプルダウンし、抗−ＧＦＰ抗体でプロービングした。全細胞抽出物（Ｗ）についても、ゲル上にローディングした。
【０２１３】
図６ｂは、対照細胞における５分のＨＲＧ刺激後のＭｅｍｏ細胞局在性を示す。抗−Ｍｙｃ抗体を用いて、Ｍｙｃ−Ｍｅｍｏ発現性ＳＫＢｒ３細胞でこれを視覚化した。核をＤＡＰＩで染色した。
【０２１４】
図６ｃは、Ｓｈｃ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後に試験した、ＹＣおよびＹＤ細胞のＨＲＧ−依存的移動を示す。タンパク質抽出物をトランスフェクションの３および４日（３ｄおよび４ｄ）後に集めた。Ｓｈｃ発現に対するＳｈｃ ｓｉＲＮＡの効果は、Ｓｈｃ特異抗体を用いるウエスタン・ブロッティングにより証明された（挿入）。
【０２１５】
図６ｄは、ＰＣＬ阻害剤の非存在または存在下における、ＨＲＧに応答したＹＣ−およびＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞の移動を示す。
【０２１６】
図６ｅは、Ｓｈｃ ｓｉＲＮＡまたはＰＬＣ阻害剤の存在下における、ＮｅｕおよびＮＹＰＤ細胞でのＨＲＧ−依存的ラメリポジウム発芽後成長を示す。
【０２１７】
図７ａは、対照（ＬａｃＺ）またはＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡで処置したＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞のＨＲＧ−依存的移動を示す。ＲＮＡをトランスフェクションの３ｄおよび４ｄ後に集め、Ｍｅｍｏ ｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより測定した（挿入）。
【０２１８】
図７ｂは、Ｎｅｕ−、ＮＹＰＤ−、ＹＣ−およびＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞のＨＲＧ−誘導による移動に対するＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【０２１９】
図７ｃは、対照（ＬａｃＺ）またはＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの存在下における、ＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞でのＨＲＧ−誘導によるラメリポジウム形成を示す。
【０２２０】
図７ｄは、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処置したＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞の移動に対するＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【０２２１】
図７ｅは、Ｍｅｍｏ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＴ４７Ｄ、ＳＫＢｒ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＨＲＧ−依存的移動を示す。
【０２２２】
図７ｆは、ＨＲＧ、ＦＧＦ２、インスリンおよびＥＧＦに応答したＴ４７Ｄ細胞の移動に対するＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【実施例】
【０２２３】
材料および方法
プラスミド構築物、細胞培養、細胞トランスフェクション：
Ｔ４７ＤおよびＳＫＢｒ３乳癌細胞を、１０％胎児ウシ血清（ギブコ・インビトロゲン・アクチエンゲセルシャフト、バーゼル、スイス国）を補ったダルベッコ修飾イーグル培地で培養した。以前に報告された要領に従って２４、ｓｃＦｖ−５Ｒ ｃＤＮＡを発現するｐＢａｂｅに基いたレトロウイルスでＴ４７Ｄ細胞を感染させることにより、Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞を得た。感染した細胞を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ）中で選択し、クローンを生成させ、ＦＡＣＳにより表面ＥｒｂＢ２の非存在について試験した。次いで、ＦｕＧｅｎｅ（ロシュ・ダイアグノスティクス・コーポレーション、インディアナポリス、インディアナ、米国）を用いて、ＮｅｕまたはＮｅｕ付加復帰（add back）突然変異体１３をコードするプラスミドで細胞をトランスフェクションし、１μｇ／ｍｌのプロマイシン（シグマ、セントルイス、ミズーリ、米国）中で選択した。類似量のＮｅｕ受容体を発現する細胞を得るため、Ｎｅｕ特異抗体（オンコジーン、ダルムシュタット、ドイツ国）で表面染色後に細胞を選別した。
【０２２４】
鋳型としてＴ４７Ｄ細胞のｍＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲにより得られた、Ｍｅｍｏ ｃＤＮＡを、まずｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（プロメガ・コーポレーション、マディソン、ウィスコンシン、米国）へクローン化し、次いで、ＧＦＰまたはＭｙｃエピトープを含むｐｃＤＮＡ３−誘導体へサブクローン化することにより、Ｎ−末端標識融合タンパク質、ＧＦＰ−ＭｅｍｏおよびＭｙｃ−Ｍｅｍｏを生成した。構築物を配列解析により確認し、ＦｕＧｅｎｅを用いてＳＫＢｒ細胞へトランスフェクションした。
【０２２５】
移動試験法：
以前に報告された要領３７に従って、８μｍ孔のポリカーボネート膜トランスウェルチャンバー（コーニング・コスター・プロダクツ、アクトン、マサチューセッツ、米国）を用いて、細胞移動を試験した。簡単に述べると、膜の下側を、２５μｇ／ｍｌのラット尾部コラーゲンＩ（ロシュ）でコーティングした。血清非存在細胞を、上部トランスウェルチャンバーにおいて平板培養した。１ｎＭのＨＲＧ−β１（Ｒ ＆ Ｄシステムズ、インコーポレイテッド、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を含有または不含有の培地を、下部チャンバーに加え、細胞を２４時間移動させた。非移動細胞を膜の上部からこすり落とした。移動細胞を、４％ホルムアルデヒドに固定し、０.１％クリスタルバイオレット中で染色した。細胞を１０高倍率視野での顕微鏡下で計数した。移動を、１ｍｍ２当たりの細胞数として表した。場合によっては、細胞を、６０分間ＵＯ１２６ＭＥＫ阻害剤（５０μＭ、プロメガ）、ＬＹ２９４００２ ＰＩ３Ｋ阻害剤（５０μＭ、カルビオケム−ノバビオケム・コーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）、ＳＢ２０３５８０ ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤（２０μＭ、カルビオケム）、Ｓｒｃ阻害剤（２.５μＭ）、Ｕ−７３１２２ ＰＬＣ阻害剤（２μＭ、カルビオケム）、シクロヘキシミド（１０μｇ／ｍｌ、シグマ）または５,６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（２０μｇ／ｍｌ；フルカ・ヘミーＧｍｂＨ、ブックス、スイス国）とプレインキュベーションした。次いで、細胞を計数前に８時間移動させた。
【０２２６】
ウエスタン・ブロット：
細胞を、氷上で５分間、ＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのβ−グリセリンリン酸、２５ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのバナジウム酸ナトリウムおよび１００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）中で溶解させた。ライゼートを、２０分間１４０００ｇでの遠心分離にかけた。タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜（ミリポアＧｍｂＨ、ウィーン、オーストリア国）上でブロッティングし、膜を、５０ｍＭのトリスｐＨ７.５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１０％ウマ血清（ギブコ）でブロッキングした。フィルターを、Ｐ−ｐ４４／４２、Ｐ−Ａｋｔ／ＰＫＢおよびＰ−ｐ３８ＭＡＰＫ（ニューイングランド・バイオラブズ、ビヴァーリー、マサチューセッツ、米国）に対する特異抗体と２時間インキュベーションした。強化化学発光検出システム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、デューベンドルフ、ドイツ国）を用いて、ペルオキシダーゼ結合二次抗体によりタンパク質を視覚化した。
【０２２７】
Ｒａｃ活性検定法：
以前に報告された要領３８に従って、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＰＡＫ−ＣＤ（ＰＡＫ−ＣＲＩＢドメイン）融合タンパク質を用いて、活性Ｒａｃを検出した。簡単に述べると、細胞を、コラーゲン−コーティング皿で平板培養し、氷上で溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ７.４、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１％ＮＰ−４０、１０％グリセリン、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのバナジウム酸ナトリウムおよび１００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）により溶解した。ライゼートを、５分間１４０００ｇでの遠心分離により澄明にした。澄明化したライゼートの一部を取ることにより、全量のＲａｃ１を分析した。澄明化ライゼートを、グルタチオン結合セファロースビーズに結合した細菌製造ＧＳＴ−ＰＡＫ−ＣＤ融合タンパク質とインキュベーションした。融合タンパク質に結合したタンパク質を、抗−Ｒａｃ１抗体（アップステート・バイオテクノロジー、レークプラシッド、ニューヨーク、米国）を用いるウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【０２２８】
免疫蛍光、アクチン染色：
一晩血清非存在にして、２５μｇ／ｍｌラット尾部コラーゲンＩでコーティングしたカバーグラス（ファルコン、ル・ポン・デュ・クライ、フランス国）上で細胞を成長させ、１ｎＭのＨＲＧ−β１により異なる時点で刺激を加えた。細胞を、２０分間リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドに固定し、１０分間０.２％トリトンＸ−１００で透過性にし、２０分間ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミンでブロッキングした後、抗Ｍｙｃ抗体（サンタクルス）およびアレクサ−フルオル５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ（モレキュラー・プローブズ、ライデン、オランダ国）を加えた。ＤＮＡを０.２５ｍｇ／ｍｌのヘキストＮｏ.３３３４２（シグマ）で対比染色した。アクチンを２Ｕ／ｍｌのＴＲＩＴＣ−標識ファロイジン（モレキュラー・プローブズ）で４５分間染色した。ソニー３ＣＣＤカメラに連結させたアキシオスコプ・ツァイス（Axioskop Zeiss）顕微鏡またはデルタビジョンワークステーション（アプライド・プリシジョン、イッサクァ、ワシントン）に連結させたオリンパスＩＸ７０顕微鏡で画像を記録した。
【０２２９】
ラメリポジウムの視覚化および定量：
Ｆ−アクチンをＴＲＩＴＣ標識ファロイジンで視覚化した。
【０２３０】
Cho et al.により報告された方法３９を用いて、ラメリポジウムに局在したタンパク質を特異的に精製した。簡単に述べると、ラット尾部コラーゲンＩで底側をコーティングした３μｍ多孔質ポリカーボネート膜トランスウェルチャンバー（コスター）で細胞を平板培養した。下部チャンバーは、１ｎＭのＨＲＧ−β１を含有または不含有の培地を含んでいた。異なる期間で細胞から孔を通して仮足を伸長させた。上部表面に残存する細胞体を除去し、下部表面に伸びる仮足を溶解した（１００ｍＭのトリスｐＨ７.４、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのバナジウム酸ナトリウムおよび１００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）。バイオ−ラッドＤｃタンパク質アッセイ（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ、ハークリーズ、カリフォルニア、米国）を用いてタンパク質濃度を測定し、結果をｍｇ／ｍｌで表した。この方法を用いることにより、ラメリポジウムが定量され得る。
【０２３１】
ｓｉＲＮＡおよびペプチドトランスフェクション：
オリゴフェクタミン（ギブコ）を製造業者の使用説明書に従って用いることにより、細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。以下の２１量体オリゴリボヌクレオチド対（米国、アラバマ、ハンツビル、キセラゴン・インコーポレイテッドから入手）を使用した：Ｓｈｃ（受入番号ＨＳＵ７３７７）については、ヌクレオチド２３６〜２５６４０、Ｍｅｍｏ（ＣＧＩ−２７、受入番号ＡＦ１３２９６１）については、ヌクレオチド４６０〜４８０および対照ＬａｃＺ（受入番号Ｍ５５０６８）については、ヌクレオチド４２７７〜４２９７。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの３日後細胞を移動検定用に平板培養し、２４時間移動させた。また、トランスフェクションの３および４日後に細胞ライゼートを調製し、特異的な抗Ｓｈｃ抗体（ＢＤトランスダクション・ラボラトリーズ、ハイデルベルク、ドイツ国）を用いるウエスタン・ブロッティングにより分析した。Ｍｅｍｏについては、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ（キアゲン、ケルン、ドイツ国）を用いてｍＲＮＡを抽出し、Ｍｅｍｏ特異的プライマー（ヌクレオチド９０〜１１１へ前進およびヌクレオチド２３５〜２５６へ逆行）を用いて定量的放射性ＰＣＲ４１を実施した。
【０２３２】
使用説明書に従ってチャリオット(Chariot)タンパク質トランスフェクション試薬（アクティブ・モチーフ、リキセンザルト、ベルギー国）を用いることにより、ペプチドを細胞内へ供給した。ＮｅｕのＴｙｒ残基１２０１（ＹＣペプチド）およびＮｅｕのＴｙｒ残基１２２７（ＹＤペプチド）にまたがる１６ａａペプチドを、ネオシステム（ストラスブール、フランス国）からリン酸化および非リン酸化形態で得た。ペプチドトランスフェクションの３０分後、細胞を移動用に平板培養し、２２時間後試験を終了した。
【０２３３】
プルダウン検定法および質量分析法：
リン酸化および非リン酸化ＹＣおよびＹＤペプチドを、無水条件下でアフィ−ゲル１０アガロースビーズ（バイオ−ラッド）にカップリングさせた。カップリングしたビーズを、０.５ｍｇ（ウエスタン・ブロッティング用）または１２ｍｇ（質量分析法用）のＴ４７Ｄ細胞ライゼートとインキュベーションした。ペプチドに結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。質量分析法については、ゲルをクーマシー・ブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。ゲルの各レーンを薄く切り、ＬＣ−ＭＳＭＳ（ＬＣＱデカＸＰ、テルモ・フィニガン）により分析し、ターボ・シーケスト（Turbo Sequest）によりタンパク質を同定した。２個を越えるペプチドおよびペプチドのリン酸化形態への特異的結合により同定されたタンパク質を、さらなる分析用に選択した。サンタクルスからのＣｒｋIIおよびＰＬＣγおよびＢＤトランスダクション・ラボラトリーズからのＳｈｃに対する抗体を用いるウエスタン・ブロッティングにより結合を確認した。Ｍｅｍｏについては、ＧＦＰ−Ｍｅｍｏ融合タンパク質を発現するＳＫＢｒ３細胞からの抽出物においてプルダウン法を実施し、抗ＧＦＰ抗体（サンタクルス）を用いるウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【０２３４】
実験によっては、Ｍｙｃ−Ｍｅｍｏ融合タンパク質を発現するＳＫＢｒ３細胞またはインビトロ翻訳Ｍｙｃ−Ｍｅｍｏを発現する網状赤血球ライゼートから、抗Ｓｈｃ抗体を用いてＳｈｃを免疫枯渇させた、その後プルダウン法を実施した。
【０２３５】
結果
ヘレグリン誘導移動における特異的ＥｒｂＢ２チロシン残基の役割
中レベルの４種のＥｒｂＢ受容体を発現する、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株が、ＥＧＦ関連リガンドに応答した移動についてＥｒｂＢ２活性に依存的であることは以前に示されている８。これをさらに詳細に調べるため、発明者らは、移動における個々のＥｒｂＢ２自己リン酸化部位の役割を研究した。最初、小胞体でヒトＥｒｂＢ２を捕える１本鎖抗体（ｓｃＦｖ−５Ｒ）を発現させ２４、すなわちＥｒｂＢ２表面染色が存在しないことにより確認されたように原形質膜へのその移動を阻害し、リガンド誘導ＥｒｂＢ２活性化を阻止することにより２５、ＥｒｂＢ２をＴ４７Ｄ細胞において機能的に不活化した。ヘレグリンβ１（ＨＲＧ）に応答した野生型およびｓｃＦｖ−５Ｒ−発現性細胞（Ｔ４７Ｄ−５Ｒ）の移動を、ボイデン様チャンバーにおいて測定した。ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４へのＨＲＧ結合により、活性ＥｒｂＢ２含有ヘテロ２量体が形成される。ＨＲＧは、非常に効率的にＴ４７Ｄ細胞の移動を刺激し、Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞は、基礎レベルを越えては移動し得なかったことから（図１ａ）、ＥＧＦ−関連ペプチド誘導による移動におけるＥｒｂＢ２の本質的役割が確認された。
【０２３６】
Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞を、ＷＴ Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２のラット相同体、またはＰｈｅ残基が５つの自己リン酸化部位の各々において置換された変異体Ｎｅｕ（Ｎｅｕ Ｔｙｒリン酸化欠損故にＮＹＰＤと呼ばれる）またはそれぞれＴｙｒ１０２８、Ｔｙｒ１１４４、Ｔｙｒ１２０１、Ｔｙｒ１２２７およびＴｙｒ１２５３に対応する、ＹＡ、ＹＢ、ＹＣ、ＹＤおよびＹＥと呼ばれる（Dankort et alによる命名法１３）、５つ自己リン酸化部位のうちの一つのみを発現するＮｅｕ付加−復帰突然変異体を発現するベクターの受容体として使用した（図１ｂ）。類似レベルのＮｅｕを発現する細胞を選択し、ＨＲＧに応じたそれらの移動を評価した。Ｎｅｕは、ＨＲＧに対するそれらの回復された移動応答により立証されたところによると（図１ｃ）、Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞において有効にＥｒｂＢ２を置換した。対照的に、ＮＹＰＤ−、ＹＡ−、ＹＢ−およびＹＥ−発現性細胞は、ＨＲＧに応答した移動の強力な低減化を示した。当然挙げるべきことは、各Ｎｅｕ突然変異体が、自己リン酸化部位を欠くにもかかわらず、他のＨＲＧ−結合ＥｒｂＢ受容体と相互作用およびトランスホスホリレーションし得ることであり、これは、これらの細胞が、Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞で観察された基礎レベルを超えて移動できることを説明すると思われる（図１ａ）。
【０２３７】
ＹＣ−およびＹＤ−発現性細胞の移動は、Ｎｅｕ発現性細胞の場合と均等内容であったことから（図１ｃ）、これら２つのチロシン残基が、有効な細胞移動に必要とされるシグナリング経路にカップリングしていることが分かる。それらの提案された役割を立証するため、ＹＣまたはＹＤ残基を含むＮｅｕの領域に対応する、チロシンリン酸化または非リン酸化ペプチドを用いることにより、Ｎｅｕへのシグナリング分子の結合について競合させた。ホスホ−ＹＣペプチドによるＹＣ発現性細胞のトランスフェクションにより、ＨＲＧ誘導による移動が阻止され（図２ａ）、非リン酸化ペプチドが移動を妨害することはあまり無かった。同様に、ホスホ−ＹＤペプチドのみ、ＹＤ−発現性細胞の移動を有効に阻害した（図２ｂ）。さらに、ホスホ−ＹＤペプチドは、ＹＣ−発現性細胞の移動を阻害せず（図２ｃ）、逆にホスホ−ＹＣペプチドはＹＤ−発現性細胞の移動に干渉しなかった（図２ｄ）。これらの結果は、細胞移動についてのＹＣまたはＹＤチロシン残基のリン酸化に関する必要性を確認するだけでなく、これら２つのチロシンが異なるシグナリング分子に影響を与えることを示している。
【０２３８】
ＨＲＧはＴ４７ＤおよびＮＹＰＤ細胞において形態形成変化を誘導する
細胞運動性は、アクチン細胞骨格の再構築に基いた一連の形態形成事象として見なされ得る。すなわち、本発明者らは、移動および非移動細胞における細胞形態学および細胞骨格組織のＨＲＧ誘導による変化を分析した。ＨＲＧ処理Ｔ４７Ｄ細胞は、迅速に拡散し、ラッフル膜を形成した。最初、細胞は全方向でラメリポジウムを伸長した後、アクチンストレス繊維の形成に平行する、さらに極性化した組織を示した（図３ａ、上部パネル）。移動が大きく減少しているが（図１ｃ）、ＮＹＰＤ−細胞は、ＨＲＧ処理後にラメリポジウムを伸長および組織しながら、通常の形態形成応答を示した（図３ａ、下方パネル）。ラメリポジウム形成は、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼファミリーの一員２６であるＲａｃの活性化に依存的である。ＨＲＧ−誘導Ｒａｃ活性化の速度論は、Ｔ４７Ｄ−およびＮＹＰＤ−細胞において類似していた。両細胞株とも、活性は一時的であり、ＨＲＧ添加の５分後にピークに達した（図３ｂ）。これらの結果は、形態学的結果と一致しており、Ｔ４７Ｄ−およびＮＹＰＤ−細胞において、ＨＲＧ処理の直後に同等の細胞骨格転位が行なわれることのさらなる証拠を提供する。
【０２３９】
再構築は、細胞運動性についてのリードアウトとして広く使用されている。Ｔ４７ＤおよびＮＹＰＤ細胞におけるＨＲＧ誘発アクチン再構成が本質的に同一であるという事実は、それらが実際に移動に際して示す差異と見かけ上矛盾するものであった。試験条件に起因する変動を最小限にするため、発明者らは、細胞移動測定用にセットした同一デュアルチャンバーにおいてラメリポジウム形成を分析した。Ｔ４７Ｄ細胞は、ラメリポジウムにおける急速な増加を示し、まずＨＲＧ処理の１時間以内では明白であり、次いでプラトーに達し、６時間後に２度目の緩やかな増加を示す（図３ｃ）。初期の時点（４時間まで）中におけるラメリポジウム形成は、Ｎｅｕ細胞およびＮＹＰＤ細胞では類似していたが、後の時点では著しく異なっていた（図３ｄ）。これらの結果は、ＨＲＧに応答して生じる初期の形態学的および分子変化が、移動および非移動細胞において類似していることを確認するものである。さらに、それらはＮＹＰＤ細胞の移動が後の段階で影響を受けることを示唆している。
【０２４０】
ＨＲＧ誘導による移動は、新たなＲＮＡおよびタンパク質合成を必要とする
次の実験において、発明者らは、２４時間の時間経過を通してＮｅｕ−およびＮＹＰＤ−細胞のＨＲＧ−誘導による移動を分析した。Ｎｅｕ細胞はＨＲＧ処理の２時間以内に移動し、細胞数は２４時間経過するまで着実に増加した（図４ａ）。２時間後、ＮＹＰＤ細胞の移動は、Ｎｅｕ細胞の場合と同等であった。しかしながら、その後、それらの移動は非常に低速で増加したことから、ＮＹＰＤ細胞の移動能力が後の時点では遮断されているという仮説が裏付けられた。次に発明者らは、５,６−ジクロロ−１−β−Ｄ−リボフラノシルベンズイミダゾール（ＤＲＢ）、すなわちＲＮＡポリメラーゼIIの阻害剤またはシクロヘキシミドをそれぞれ用いて、有効な長期移動には新たなＲＮＡまたはタンパク質合成が必要とされるという可能性を調べた。ＨＲＧ処理の４時間後に開始して、Ｎｅｕ細胞の移動は、シクロヘキシミド（図４ａ）およびＤＲＢの存在下で強力に遮断された。同様に、ＹＣ−およびＴＤ−細胞の移動は、両阻害剤に対し感受性を示した（図４ｂ）。対照的に、ＮＹＰＤ−およびＹＥ細胞の低い移動レベルは、同処理による影響を受けなかった（図４ａ、４ｂ）。シクロヘキシミドは、Ｎｅｕ細胞の移動速度をＮＹＰＤ細胞の速度まで低減化させた（図４ａ）。これは、ＨＲＧ刺激後、翻訳後事象、例えばリン酸化が、中レベルの移動を誘発し、ＮＹＰＤ細胞には欠けている応答である、有効な長期移動は、主として新たなＲＮＡおよびタンパク質合成に依存的であることを示唆している。
【０２４１】
ＥｒｂＢ２依存的移動に関与するシグナリング経路
本データは、Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、さらに特定すれば、リン酸化ＹＣおよびＹＤ残基が、有効なＨＲＧ誘導細胞移動の非常に重要なメディエーターであることを示している。直接的または間接的に、ＥｒｂＢ２誘導細胞骨格再構築および／または細胞運動性に関係する経路は、以前に同定されている。これらには、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８ＭＡＰＫおよびＳｒｃキナーゼ依存的経路がある２０−２３。Ｎｅｕ細胞で選択的キナーゼ阻害剤を用いることにより、本発明者らは、これらの経路の各々を遮断することにより、ＨＲＧ誘導移動が強力に阻害されることを測定した（図５ａ）。これらの経路の活性化は移動に要求されるが、それで充分なわけではない。事実、ＨＲＧは、Ｎｅｕ細胞におけるのと同様に例えばＮＹＰＤ−またはＹＡ−細胞で有効に各経路を活性化するため（図５ｂ）、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８ＭＡＰＫ（図５ｂ）およびＳｒｃ経路の刺激は、移動と相関関係を示さなかった。以前に述べたところによると、Ｎｅｕ突然変異体は、他のＥｒｂＢ受容体（ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４）をトランスホスホリレーションし得ることから、これは調べられた経路の活性化を説明すると思われる。
【０２４２】
キナーゼ阻害剤はまた、ＮＹＰＤ細胞について観察された低レベルのＨＲＧ誘導移動に対して負の影響を与え、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の遮断は最強の影響を与えた（図５ｃ）。さらに、両阻害剤はまた、ＮｅｕおよびＮＹＰＤ細胞がＨＲＧに応答してラメリポジウムを形成するのを阻止した（図５ｄ）。すなわち、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の活性化は、移動の初期段階に不可欠である。対照的に、本発明者らは、ホスホ−ＹＣまたは−ＹＤが、有効な長期移動を促進する新規シグナリング経路（複数も可）へのリンクを提供することを提案している。
【０２４３】
ＹＣおよびＹＤ残基に結合するシグナリング分子の同定
ＥｒｂＢ２依存的移動を介助するシグナリング経路にホスホ−ＹＣおよびＹＤを連結し得る新規タンパク質について探るため、ＹＣまたはＹＤ残基を含むＮｅｕの領域に対応する、チロシン−リン酸化ペプチドを、アガロースビーズにカップリングし、アフィニティー試薬として用いた。対応する非リン酸化ペプチドを対照として用いた。本発明者らは、高圧液体クロマトグラフィー、タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳＭＳ）により、非リン酸化ペプチドではなくリン酸化ペプチドに特異的に結合したＴ４７Ｄ細胞抽出物からタンパク質の大規模な系統的同定を実施した。
【０２４４】
ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕに結合すると報告されたものもあれば、新規相互作用物質であるものもある、多くのタンパク質が同定された。以前の研究は、アダプター分子ＳｈｃおよびＣｒｋIIが、ホスホ−ＹＤおよび−ＹＣ残基とそれぞれ会合することを示していた１３,２７。本発明者らはまた、ＬＣ−ＭＳＭＳスクリーンにおいてこれら２タンパク質を同定し、さらにＳｈｃが両リン酸化ペプチドと結合することを見出した。さらに、両ＣｒｋIIおよびＣｒｋＩスプライス変異型およびＣｒｋ様タンパク質も、ホスホ−ＹＣペプチドと結合した。これらのＴｙｒ残基のどちらかと相互作用するとはこれまでに報告されたことがないホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）は、ホスホ−ＹＣペプチドと会合することが見出された。最後に、仮定的タンパク質、ＣＧＩ−２７またはｃ２１ｏｒｆ１９様タンパク質は、ホスホ−ＹＤペプチドと特異的に会合した。ＣＧＩ−２７は、配列の３８％（２９７アミノ酸のうち１１３）に及ぶ合計６つの異なるペプチドからの独立した３実験で同定された。各タンパク質の結合特異性を、アフィニティー試薬としてリン酸化および非リン酸化ペプチドを用いた独立した実験、次いでウエスタン分析により確認した（図６ａ）。入手可能な特異抗体が無いＣＧＩ−２７については、ホスホ−ＹＤペプチドへのタンパク質のＧＦＰ標識バージョンの特異的結合が示されている（図６ａ）。
【０２４５】
ＣＧＩ−２７配列の解析は、それがＳＨ２またはＰＴＢホスホチロシン結合ドメインを含まないことを示している。Ｓｈｃもまたホスホ−ＹＤ部位と相互作用するという事実から、Ｓｈｃがホスホ−ＹＤへのＣＧＩ−２７の結合を仲介するという可能性が生じた。免疫沈降実験において、異所発現されたＣＧＩ−２７は、ＳＫＢｒ３細胞においてＳｈｃと相互作用することが見出され、内在性ＣＧＩ−２７およびＥｒｂＢ２は両方とも、Ｓｈｃ免疫沈澱物から検出された（結果は示さず）。興味深いことに、ＥｒｂＢ２活性をＰＫＩ１６６で遮断することにより、Ｓｈｃ免疫沈澱物における受容体レベルは低下したが、ＣＧＩ−２７がＳｈｃと会合する能力には何ら影響が無かったことから、２種のタンパク質の構成的会合が示唆される。これをさらに探るため、Ｍｙｃ−ＣＧＩ−２７を、網状赤血球ライゼートにおいてインビトロで発現させ、結合について試験した。ライゼートからの内在性Ｓｈｃの免疫枯渇により、ホスホ−ＹＤへのＭｙｃ−ＣＧＩ−２７の結合は強力に低減化された。
【０２４６】
興味深いことに、細胞レベルにおいて、ＣＧＩ−２７は、ＨＲＧ処理後、原形質膜および細胞質の別々の領域で補充および蓄積された（図６ｂ）。
【０２４７】
細胞移動におけるホスホＹＣ／ホスホＹＤ−結合タンパク質の役割
次に、同定されたタンパク質を、ＥｒｂＢ２依存的細胞移動におけるそれらの役割について試験した。ＨＲＧ−誘導移動におけるＳｈｃおよびＣｒｋの機能を、小干渉性（ｓｉ）ＲＮＡを用いてそれらの発現を遮断することにより試験した。ＹＣまたはＹＤ細胞の特異的ｓｉＲＮＡトランスフェクションにより、モック−トランスフェクション細胞に対してＳｈｃ（およびＣｒｋ）のレベルは大きく低減化された（図６ｃ、挿入）。対照細胞とは対照的に、ノックダウンＳｈｃ（図６ｃ）またはＣｒｋによるＹＣおよびＹＤ細胞の移動はかなり低減化された。さらに、化学的阻害剤を用いることにより、本発明者らは、ホスホリパーゼＣ活性もまた、両ＹＣ−およびＹＤ−発現性細胞のＨＲＧ誘導移動に必要であることを見出した（図６ｄ）。しかしながら、本実験においては、ＰＬＣγおよびＣｒｋがホスホ−ＹＣと結合しただけであり、この２つが、Ｔ４７Ｄ細胞移動に要求される８、他のタンパク質、例えばインテグリンについてのメディエーターでもあることを示唆している。最後に、Ｓｈｃ（またはＣｒｋII）レベルのｓｉＲＮＡ−介助ノックダウン、またはＰＬＣの阻害により、Ｎｅｕ−およびＮＹＰＤ−細胞が、ＨＲＧに応答してラメリポジウムを形成するのは阻止された（図６ｅ）。これらの結果を考え合わせると、Ｓｈｃ、Ｃｒｋおよび活性ＰＬＣγがＨＲＧ誘導細胞移動に必要とされることが分かる。しかしながら、Ｔ４７Ｄ細胞の移動表現型に関していえば、これらの分子のうち、本発明者らが求めているタンパク質、すなわち、ホスホ−ペプチドの一つのみに結合し（図２）、細胞移動の後期段階には関与するが、ラメリポジウム形成には関与しない（図３および４）ものの特徴を有するものは無い。
【０２４８】
ＣＧＩ−２７は、ＥｒｂＢ２依存的運動性のメディエーターである
特異的ホスホ−ＹＤ結合物質として同定された仮定的タンパク質、ＣＧＩ−２７の機能については現在までのところ知られていない。さらに、その配列は、移動における潜在的役割について何の情報も提供しない。発明者らは、特異的ｓｉＲＮＡを用いてその発現をノックダウンすることにより、ＣＧＩ−２７機能を試験した。定量的ＰＣＲは、ＣＧＩ−２７ ｍＲＮＡ発現が、対照細胞に対してｓｉＲＮＡトランスフェクション細胞では８０％前後低いことを示した（図７ａ、挿入）。重要なことに、ＣＧＩ−２７の喪失により、ＨＲＧに応答したＹＤ細胞の移動が強力に低減化された（図７ａ）。これらおよび以下の結果に基づき、ＣＧＩ−２７は、ＥｒｂＢ２依存的細胞運動性のメディエーター（mediator of ErbB2-dependent cell motility）故にＭｅｍｏと命名された。
【０２４９】
Ｍｅｍｏの発現の阻害は、ＹＣ細胞ではなく、ＹＤ細胞のＨＲＧ−誘導移動に対する強い効果を有していたことから、ＭｅｍｏがＹＤチロシン残基の下流で特異的に作用することが証明された（図７ｂ）。重要なことに、ラメリポジウムのＨＲＧ−誘導形成は、Ｍｅｍｏレベルの低下による影響を受けなかったことから（図７ｃ）、他の同定されたシグナリング分子とは対照的に、Ｍｅｍｏが細胞移動の初期段階には関与しないことが示された。さらに、Ｍｅｍｏ ｓｉＲＮＡは、その移動が本質的に翻訳後事象に依存的である（図４）、ＮＹＰＤ−発現性細胞についてはその移動を遮断しなかった（図７ｂ）。ＹＤ細胞に対するシクロヘキシミド処理およびＭｅｍｏノックダウンの効果を調べると、移動が両方法によりほぼ同程度まで遮断されることおよびそれらの効果が相加的ではないことが明らかにされており（図７ｄ）、Ｍｅｍｏが細胞移動を刺激するのに新たなタンパク質合成に左右されることが示唆された。従って、本発明者らは、Ｍｅｍｏが、細胞骨格アクチン再編成とは関係無く、リン酸化ＹＤを細胞移動の後期段階に結び付けるシグナリング分子であるという証拠を提供した。
【０２５０】
Ｍｅｍｏは、ＥｒｂＢ２依存的微小管発芽後成長に必要とされる
ラメリポジウムの形成は、アクチンフィラメントの形成に依存的である。従って、ｓｉＲＮＡターゲッティングを通してＭｅｍｏの発現を阻害しても、アクチン繊維の形成は阻止されなかった。
【０２５１】
最近の研究は、細胞極性および細胞移動についての微小管細胞骨格の中心的役割を立証している２７。ＨＲＧは、Ｔ４７Ｄ細胞において中心体から細胞周縁部へと微小管の伸長を誘導した。しかしながら、Ｍｅｍｏの発現が阻害されたとき、ＨＲＧにより誘導される微小管のネットワークは、Ｔ４７ＤおよびＳＫＢｒ３細胞で強く低減化された。定量の結果、微小管発芽後成長を示すＴ４７ＤおよびＳＫＢｒ３細胞の数は、Ｍｅｍｏ ｓｉＲＮＡによりトランスフェクションされた細胞における２０％に対して対照細胞では８０％前後低減化されることが示された。興味深いことに、ＨＲＧ刺激に依存的ではない、周辺核微小管ネットワークは、Ｍｅｍｏ発現の減少による影響を受けなかった。このデータは、Ｍｅｍｏが、細胞皮質への微小管のＥｒｂＢ２依存的伸長に必要とされることを示している。
【０２５２】
要約すると、Ｍｅｍｏは、アクチン細胞骨格の再構築に結び付けられる、細胞移動の段階、例えばラメリポジウム形成には関与しない−にもかかわらず、それは、細胞周縁部への微小管ネットワークの伸長に必要とされる。微小管は中心体から成長しており、それらのプラス端は中間(alternate)成長相を通して細胞質を探り、動的不安定性と呼ばれる現象を短くする。微小管力学は、２タイプの分子：微小管端部に結合し、それらを不安定にさせる微小管結合タンパク質、例えばＭＣＡＫ（有糸分裂動原体−結合キネシン）および成長端と結合することによる微小管成長に有利にはたらくプラス端結合タンパク質により調節され得、微小管をそれらの標的指定先へ到達させ得る。ＨＲＧは、動原体から細胞皮質までの微小管の成長を誘発するが、これはＭｅｍｏの非存在下では阻止される。すなわち、Ｍｅｍｏは、微小管脱安定化を阻止するかまたは微小管伸長を促進することにより発芽後成長微小管の安定化および細胞極性の維持を可能にする、細胞外走化性手掛かりおよび微小管細胞骨格間のリンカーであり得る。興味深いことに、Ｍｅｍｏは、中心微小管の組織または維持には必要とされないことから、移動細胞の突出している膜へ向かう最も動的な微小管伸長の安定化におけるＭｅｍｏについての特異的な役割が示されている。微小管はまた、細胞分裂の鍵を握るエレメントである。Ｍｅｍｏが、一般に微小管組織には必要とされないが、ラメリポジウム内での微小管発芽後成長については特異的に要求されるという事実は、ノックダウンＭｅｍｏの発現が乳癌細胞増殖を妨害しない理由を説明し得る。
【０２５３】
Ｔ４７ＤおよびＳＫＢｒ３細胞は両方とも、微小管発芽後成長の非存在下でも極性化ラメリポジウムを伸長させ得る。同様に、ノコダゾール処理細胞は、微小管を成長させないが、依然としてラメリポジウムを形成させ得ることから、微小管発芽後成長が初期アクチン細胞骨格リモデリングには必要とされないことがわかる。しかしながら、我々は、Ｍｅｍｏを欠く細胞において、微小管発芽後成長は阻害されるが、アクチンストレス繊維の量は増大されていると思われ、移動している細胞においてアクチンおよび微小管細胞骨格間で行なわれる動的相互作用が強調されることを観察した。
【０２５４】
Ｍｅｍｏは、乳癌細胞運動性の一般的メディエーターである
本データは、ＭｅｍｏがＹＤ細胞の移動に必要とされることを証明している。Ｎｅｕ発現性細胞（図７ｂ）、および親ＥｒｂＢ２発現性Ｔ４７Ｄ細胞（図７ｅ）のＨＲＧ誘導移動もまた、Ｍｅｍｏ発現に〜５０％依存的であった。すなわち、野生型受容体の状況において、ＹＣ依存的シグナリングは、機能的Ｍｅｍｏの喪失を完全に埋め合わすことはできない。
【０２５５】
ＳＫＢｒ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、実験的乳癌モデルとして使用されることが多い。ＳＫＢｒ３細胞におけるその高い発現性故に、ＥｒｂＢ２は、活性化され、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路の構成的シグナリングを促進する２８、２９。これにもかかわらず、ＳＫＢｒ３細胞は、低い基礎的移動しか示さない。対照的に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、リガンドの非存在下でも高い運動性を有し、動物モデルにおいて転移増殖を示す。ノックダウンＭｅｍｏを伴うＳＫＢｒ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、ＨＲＧ誘導移動の減少を示した（図７ｅ）。またＭｅｍｏ発現における低減化により、これらの細胞におけるオートクリン活性化ＥｒｂＢ２の存在を反映し得る９、３０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の基礎的移動は低下した（図７ｅ）。
【０２５６】
本発明者らはまた、他のチロシンキナーゼ受容体のＭｅｍｏ下流の役割を調べた。線維芽細胞増殖因子（ＥＧＦ）２および程度は低いがインシュリンおよび上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）は、Ｔ４７Ｄ細胞の移動を刺激した（図７ｆ）。ＭｅｍｏのＳｉＲＮＡ−介助ノックダウンは、インシュリン依存的移動には影響を与えなかったが、ＥＧＦ２−およびＥＧＦ−誘導細胞移動を強力に低減化させたことから（図７ｆ）、細胞運動、例えば創傷治癒、血管新生（例、腫瘍増殖において）および炎症におけるＭｅｍｏの広範な役割を示していた。
【０２５７】
参考文献
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【０２５８】
【表１】
2006520597.tif 000003
【表２】
2006520597.tif 000004
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】図１ａは、ヘレグリンシグナリングに対するＴ４７Ｄ乳癌細胞株およびＴ４７Ｄ−５Ｒ癌細胞株の移動応答を示す。  図１ｂは、Ｎｅｕ、ＮＹＰＤ、ＹＡ、ＹＢ、ＹＣ、ＹＤおよびＹＥタンパク質を表す概略図である。  図１ｃは、ヘレグリンシグナリングに対する、Ｎｅｕ−、ＮＹＰＤ−、ＹＡ−、ＹＢ、ＹＣ−、ＹＤ−およびＹＥ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株の移動応答を示す。
【０２６０】
【図２】図２ａ、２ｂ、２ｃおよび２ｄは、ＹＣ、リン酸化ＹＣ（ｐＹＣ）、ＹＤまたはリン酸化ＹＤ（ｐＹＤ）ペプチドによりトランスフェクションされたＹＣ−およびＹＤ−発現性細胞のヘレグリン誘導による移動応答を示す。
【０２６１】
【図３】図３ａは、時間経過に伴うヘレグリン処置Ｔ４７ＤおよびＮＹＰＤ細胞の形態学的応答を示す。  図３ｂは、時間経過に伴うヘレグリン処置Ｔ４７ＤおよびＮＹＰＤ細胞におけるＲａｃ活性化の速度論を示す。  図３ｃは、下記方法を用いて定量した、時間経過に伴うヘレグリン処置Ｔ４７Ｄ細胞におけるラメリポジウム形成の程度を示す。  図３ｄは、ヘレグリン処置Ｎｅｕ−およびＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株におけるラメリポジウム形成の程度を示す。
【０２６２】
【図４】図４ａは、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）の存在下および非存在下におけるＮｅｕ−およびＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株のヘレグリン誘導による移動応答を示す。  図４ｂは、ＣＨＸの存在下または非存在下における時間経過に伴うＮＹＰＤ−、ＹＣ−、ＹＤ−およびＹＥ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株のヘレグリン誘導による移動を示す。
【０２６３】
【図５】図５ａは、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８またはＳｒｃ阻害剤の存在下におけるＮｅｕ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞のヘレグリン誘導による移動を示す。  図５ｂは、時間経過に伴うＮｅｕ−、ＮＹＰＤ−、ＹＡ−、ＹＢ−、ＹＣ−、ＹＤ−およびＹＥ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株におけるＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋおよびｐ３８ＭＡＰＫ経路のヘレグリン誘導による活性化を示す。これらの経路の活性化を、細胞抽出物のウエスタン・ブロッティング、次いでＰ−ＭＡＰＫ、Ｐ−ＰＫＢおよびＰ−ｐ３８抗体による膜のプロービングにより評価した。  図５ｃは、ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ３８またはＳｒｃ阻害剤の存在下におけるＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株（細胞）のヘレグリン誘導による移動を示す。  図５ｄは、Ｎｅｕ−およびＮＹＰＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞株でのＨＲＧ−誘導によるラメリポジウム形成に対するＭＥＫおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を示す。
【０２６４】
【図６】図６ａは、ＹＣ、ｐＹＣ、ＹＤおよびｐＹＤペプチドへのＳｈｃ、ＣｒｋIII、ＰＬＣγおよびＭＥＭＯの結合を示す。これをプルダウン法、次いでそれぞれの抗体によるウエスタン・ブロッティングにより分析した。Ｍｅｍｏ／ＣＧＩ−２７を、ＧＦＰ−Ｍｅｍｏ融合タンパク質を発現する細胞からプルダウンし、抗−ＧＦＰ抗体でプロービングした。全細胞抽出物（Ｗ）についても、ゲル上にローディングした。  図６ｂは、対照細胞における５分のＨＲＧ刺激後のＭｅｍｏ細胞局在性を示す。抗−Ｍｙｃ抗体を用いて、Ｍｙｃ−Ｍｅｍｏ発現性ＳＫＢｒ３細胞でこれを視覚化した。核をＤＡＰＩで染色した。  図６ｃは、Ｓｈｃ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後に試験した、ＹＣおよびＹＤ細胞のＨＲＧ−依存的移動を示す。タンパク質抽出物をトランスフェクションの３および４日（３ｄおよび４ｄ）後に集めた。Ｓｈｃ発現に対するＳｈｃ ｓｉＲＮＡの効果は、Ｓｈｃ特異抗体を用いるウエスタン・ブロッティングにより証明された（挿入）。  図６ｄは、ＰＣＬ阻害剤の非存在または存在下における、ＨＲＧに応答したＹＣ−およびＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞の移動を示す。  図６ｅは、Ｓｈｃ ｓｉＲＮＡまたはＰＬＣ阻害剤の存在下における、ＮｅｕおよびＮＹＰＤ細胞でのＨＲＧ−依存的ラメリポジウム発芽後成長を示す。
【０２６５】
【図７】図７ａは、対照（ＬａｃＺ）またはＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡで処置したＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞のＨＲＧ−依存的移動を示す。ＲＮＡをトランスフェクションの３ｄおよび４ｄ後に集め、Ｍｅｍｏ ｍＲＮＡを定量的ＰＣＲにより測定した（挿入）。  図７ｂは、Ｎｅｕ−、ＮＹＰＤ−、ＹＣ−およびＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞のＨＲＧ−誘導による移動に対するＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの効果を示す。  図７ｃは、対照（ＬａｃＺ）またはＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの存在下における、ＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞でのＨＲＧ−誘導によるラメリポジウム形成を示す。  図７ｄは、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処置したＹＤ−発現性Ｔ４７Ｄ−５Ｒ細胞の移動に対するＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの効果を示す。  図７ｅは、Ｍｅｍｏ ｓｉＲＮＡトランスフェクション後のＴ４７Ｄ、ＳＫＢｒ３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＨＲＧ−依存的移動を示す。  図７ｆは、ＨＲＧ、ＦＧＦ２、インスリンおよびＥＧＦに応答したＴ４７Ｄ細胞の移動に対するＭｅｍｏ ｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図１】
2006520597.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006520597.tif 000011
【図７】
2006520597.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2006520597.tif 000015
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