(57)【要約】遺伝子改変植物を制御する方法であって、（ａ）  遺伝子改変植物を提供すること、ここで前記遺伝子改変植物の細胞は異種核酸を含有し、前記遺伝子改変植物は目的細胞プロセスに関して不活性である、（ｂ）  前記異種核酸を含有する細胞へ無細胞組成物に由来するポリペプチドを直接導入することによって前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることを含み、前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように前記ポリペプチド及び前記異種核酸は互いに適用されている、前記方法。
2006506082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変植物を制御する方法であって、
（ａ）  遺伝子改変植物を提供すること、ここで、前記遺伝子改変植物の細胞は異種核酸を含有し、前記遺伝子改変植物は目的細胞プロセスに関して不活性である、
（ｂ）  前記異種核酸を含有する細胞へ無細胞組成物由来のポリペプチドを直接導入することによって前記目的細胞プロセスのスイッチを入れること、
を含み、ここで、前記ポリペプチド及び前記異種核酸は前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように互いに適応されている、前記方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）の直接導入することを、前記植物の少なくとも一部へ粒子銃、前記ポリペプチドを適用することにより、又は前記植物の組織へ前記ポリペプチドを含有する溶液を注入することにより行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、前記異種核酸を含有する細胞へ前記ポリペプチドを直接導入することを可能にする膜移行配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜移行配列が共有結合的に前記ポリペプチドに結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記膜移行配列が非共有結合的に前記ポリペプチドに結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることは、前記異種核酸からの若しくは前記異種核酸に関係するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の形成を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子改変植物の細胞が、前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、又は前記タンパク質によって制御される前記追加の異種核酸を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ、又は前記タンパク質が、前記植物の他の細胞へ伝播可能である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記目的細胞プロセスが、前記異種核酸から又はそのＲＮＡ発現産物からの発現可能なオペロンの形成を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的細胞プロセスが、前記異種核酸又はそのＲＮＡ発現産物からの発現可能なアンプリコンの形成を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記発現可能なアンプリコンが目的遺伝子を発現可能である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現可能なアンプリコンが、前記植物内で細胞間移行又は浸透移行可能である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、前記植物の１つの細胞を出て他の細胞に入る能力を前記タンパク質に付与するタンパク質部分を含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質部分が以下の群：ウイルス移行タンパク質、ウイルス外被タンパク質、植物又は動物の転写因子、植物又は動物のペプチド細胞間メッセンジャー、前記タンパク質に前記能力を付与可能な人工ペプチド、から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、前記異種核酸を含有する細胞内で前記タンパク質の発現を制御可能である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が前記追加の異種核酸を制御する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的細胞プロセスが、前記追加の異種核酸からのＲＮＡ若しくはタンパク質発現産物、オペロン、又はアンプリコンの形成を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質及び前記ポリペプチドが、前記タンパク質及び前記ポリペプチドが共同して存在する場合にのみ、前記目的細胞プロセスのスイッチを入れる所定の機能を共同して産生する、請求項６〜８又は１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質及び前記ポリペプチドが、インテイン介在トランススプライシング又はインテイン介在親和性相互作用によって前記所定の機能を共同して産生する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質及び前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド及び前記タンパク質に融合したロイシン・ジッパー断片によって介在される親和性相互作用により前記所定の機能を共同して産生する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質及び前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド及び前記タンパク質に融合した２量体化剤断片によって介在される親和性相互作用により前記所定の機能を共同して産生する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記親和性相互作用が、ラパマイシン又はラパマイシンアナログのような２量体化剤によって調節される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、
（ｉ）  酵素活性、又は
（ｉｉ）  前記異種核酸又は前記異種核酸の発現産物への結合親和性、
によって前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、部位特異的リコンビナーゼ、フリッパーゼ、リゾルベース、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、レプリカーゼ、及びポリメラーゼから成る群より選択される酵素の酵素活性を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド又は前記細胞プロセスのスイッチを入れることが可能な前記ポリペプチドの部分をコードする核酸を導入することなく、工程（ｂ）で導入される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記植物が、核ゲノムに安定に組み込まれた前記異種核酸を含有するトランスジェニック植物である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記植物が、プラスチドゲノムに安定に組み込まれた前記異種核酸を含有するトランスジェニック植物である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記植物が高等作物である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
その細胞内に異種核酸を含有する遺伝子改変植物であって、前記植物は目的細胞プロセスに関して不活性であり、前記異種核酸を含有する細胞へポリペプチドを直接導入することにより前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることができるように前記異種核酸が適応され、前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように前記ポリペプチド及び前記異種核酸が互いに適応されている、前記遺伝子改変植物。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか１項に定義されるような特徴を更に有する、請求項２９に記載の遺伝子改変植物。
【請求項３１】
遺伝子改変植物内で目的細胞プロセスを制御するシステムであって、請求項２９又は３０に定義されるような植物、及び前記目的細胞プロセスのスイッチを入れるためのポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように前記植物及び前記ポリペプチドは互いに適用されている、前記システム。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法によって得られる、又は得ることが可能な植物。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の前記ポリペプチドを含有する細胞に由来する無細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外部より適用されるポリペプチドのような外部シグナルによって植物の目的細胞プロセスを制御する方法に関する。更に、本発明は、前記方法に適用された、一過性に又は安定に遺伝子改変された植物、及び本発明の方法により制御されている遺伝子改変植物に関する。更に、本発明は、暗号化された外部シグナルで目的細胞プロセスを制御することによって遺伝子改変植物において産物を産生する方法に関する。本発明の方法は、一過性に又は安定に遺伝子改変された植物におけるトランス遺伝子発現の選択的制御を可能にするものであり、それによって植物においてこれまで機能不能であった目的細胞プロセスのスイッチを所定の時間に選択的に入れることができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
植物の制御可能なトランス遺伝子発現システム
植物バイオテクノロジーの主要な問題の１つは、トランス遺伝子発現に対して信頼できる制御を達成することである。植物の遺伝子発現に対する厳重な制御は、例えば生分解プラスチック（Ｎａｗｒａｔｈ、Ｐｏｉｒｉｅｒ＆Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１、１２７６０−１２７６４；Ｊｏｈｎ＆Ｋｅｌｌｅｒ、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３、１２７６８−１２７７３；ＵＳ６１０３９５６；ＵＳ５６５０５５５）又はタンパク質毒素（ＵＳ６１４００７５）のように、トランス遺伝子発現の下流産物が増殖抑制性又は毒性であるかどうかが最も重要である。植物において遺伝子発現を制御する既存の技術は、通常、組織特異的且つ誘導性のプロモーターに基づいているが、実際にはそれら全てが、誘導していないときであっても基底の発現活性に悩まされている。即ち、それらは「漏出性」である。組織特異的プロモーター（ＵＳ０５９５５３６１；ＷＯ０９８２８４３１）は強力な手段であるが、それらの使用は、例えば不稔性植物の産生（ＷＯ９８３９４６２）又は種子における目的遺伝子の発現（ＷＯ０００６８３８８；ＵＳ０５６０８１５２）など、非常に特定の応用分野に制限されている。誘導性プロモーターはその誘導条件によって２つのカテゴリーに分類することができる：非生物要因によって誘導されるもの（温度、光、化学物質）と、生物要因、例えば病原体又は害虫の感染によって誘導され得るものである。第１のカテゴリーの例は、熱誘導性プロモーター（ＵＳ０５１８７２８７）及び低温誘導性プロモーター（ＵＳ０５８４７１０２）、銅誘導性システム（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０、４５６７−４５７１）、ステロイド誘導性システム（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５）、エタノール誘導性システム（Ｃａｄｄｉｃｋら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６、１７７−１８０；ＷＯ０９３２１３３４）、並びにテトラサイクリン誘導性システム（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５、５５９−５６９）である。植物の化学誘導性システムの分野における最近の発展の１つは、グルココルチコイド  デキサメサゾンによってスイッチを入れ、テトラサイクリンによってスイッチを切ることができるキメラプロモーターである（Ｂｏｈｎｅｒら、１９９９、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９、８７−９５）。化学誘導性システムの総説として：Ｚｕｏ＆Ｃｈｕａ（２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１、１４６−１５１）を参照されたい。誘導性プロモーターの他の例は、植物において病原性関連（ＰＲ）遺伝子の発現を制御するプロモーターである。これらのプロモーターは、病原体感染に応答した植物シグナル伝達経路の重要な成分であるサリチル酸で、又はＰＲ遺伝子発現（ＵＳ０５９４２６６２）の誘因となり得る他の化学化合物（ベンゾ−１，２，３−チアジアゾール又はイソニコチン酸）で植物を処理することによって誘導することができる。
【０００３】
ウイルス感染によって提供されるウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼを用いる制御可能なトランス遺伝子発現システムに関する報告がある（例えばＵＳ６０９３５５４；ＵＳ５９１９７０５を参照されたい）。これらのシステムにおいて、組換え植物ＤＮＡ配列は、ウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼに認識されるウイルスゲノム由来のヌクレオチド配列を含む。これらシステムの有効性は、ウイルスポリメラーゼがトランスに機能を提供する能力が低いこと、及びＲＮＡ増幅以外のプロセスを制御できないことにより、限定されたものである。別の方法は、遺伝子改変植物のある生化学的プロセスのスイッチをコードする異種核酸を提供する遺伝子改変ウイルスを用いることによって、トランスジェニック植物において目的プロセスを誘発することである（ＷＯ０２０６８６６４）。
【０００４】
上記システムは、所望のトランス遺伝子発現パターンを得る機会として非常に興味深いが、誘導剤（銅）又はそのアナログ（ステロイド誘導性システムの場合はブラシノステロイド）が残存発現を引き起こすのに十分なレベルで植物組織に存在し得るため、発現パターンを厳格に制御できない。更に、抗生物質やステロイドを化学誘導物質として使用することは、大規模な適用には望ましいことではなく、経済的にも実現不可能である。ＰＲ遺伝子又はウイルスＲＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをトランス遺伝子制御手段として用いる場合、偶然の病原体感染又はストレスが発現を引き起こし得るため、トランス遺伝子発現を厳格に制御する必要性も満たされない。組織又は器官特異的プロモーターは、発現を特定の器官又は特定の植物の発育段階に制限するが、自在にトランス遺伝子のスイッチを入れることはできないため、非常に狭い応用範囲に制限される。ＷＯ０２／０６８６６４に記載されるような組換えウイルススイッは、こうした問題の全てに取り組むものであるが、ウイルスベクター中の異種核酸は組換え可能であるため、厳格な環境保護要件を保証するものではない。
【０００５】
ウイルス遺伝子又はウイルスＲＮＡの変異型の発現によるウイルス耐性植物の設計について記載した特許出願を含めた豊富な文献がある（例えばＵＳ５７９２９２６；ＵＳ６０４０４９６）。しかしながら、問題のウイルスとトランスジェニックウイルスＲＮＡ又はＤＮＡとのあいだの組換えによって新規ウイルスが形成される可能性により、そのような植物の使用には環境リスクが伴う（Ａｄａｉｒ＆Ｋｅａｍｅｙ、２０００、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ、１４５、１８６７−１８８３）。
【０００６】
Ｈｏｏｙｋａａｓ及び同僚は（２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０、９７９−９８２；ＷＯ０１／８９２８３）、アグロバクテリウムを介在してリコンビナーゼを植物細胞へ移行させるための、Ｃｒｅリコンビナーゼとｖｉｒ遺伝子断片との翻訳融合物の使用について記載している。Ｃｒｅが介在する植物内組換え事象は選択可能な表現型を生ずる。Ｃｒｅリコンビナーゼの移行が、植物細胞内で目的プロセスを誘発するスイッチとして移行したタンパク質を最初に使用したものである。しかしながら、移行はＤＮＡの移入を必ずしも伴うものではないにもかかわらず、植物病原性遺伝子改変微生物（アグロバクテリウム）はタンパク質Ｃｒｅリコンビナーゼのスイッチを入れる完全なコード配列を有するため、このアプローチは高レベルの安全性を保障するものではない。更に、目的プロセスはスイッチタンパク質を受容した細胞でのみ誘発され得る。細胞の大きな集団を処理する場合、全細胞数に対するスイッチタンパク質を受容した細胞の割合は非常に小さなものである。したがって、Ｈｏｏｙｋａａｓの方法は、植物全体に適用することができない。むしろ、その有用性は組織培養又は細胞培養における細胞に限定されている。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、全植物において目的細胞プロセスのスイッチを入れる方法を提供するものである。本発明の他の目的は、植物において目的細胞プロセスのスイッチを入れる環境面で安全な方法を提供することであり、細胞プロセスのスイッチは所定の時間に選択的に入れることができる。本発明の他の目的は、トランスジェニック植物において産物を産生する方法を提供するものであり、産物の産生は、植物が所望の段階まで成長した後に選択的にスイッチを入れることができる。それにより、前記細胞プロセスに必要な遺伝物質及び制御機能をコードした遺伝物質はいずれも環境に伝播しないため、このプロセスは環境面で安全である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
上記目的は、遺伝子改変植物を制御する方法によって達成され、前記方法は、
（ａ）  遺伝子改変植物を提供すること、ここで、前記遺伝子改変植物の細胞は異種核酸を含有し、前記遺伝子改変植物は目的細胞プロセスに関して不活性である、
（ｂ）  前記異種核酸を含有する細胞へ無細胞組成物由来のポリペプチドを直接導入することによって前記目的細胞プロセスのスイッチを入れること、
を含み、ここで、前記ポリペプチド及び前記異種核酸は前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように互いに適応されている。
【０００９】
また、本発明は、本発明の方法によって得られる、又は得ることが可能な遺伝子改変植物又はその部分を提供するものである。前記植物の好ましい部分は葉及び種子である。種子が植物の部分の最も好ましい例である。
【００１０】
また、本発明は、その細胞内に異種核酸を含有する遺伝子改変植物を提供するものであり、前記植物は目的細胞プロセスに関して不活性であり、前記異種核酸を含有する細胞へポリペプチドを直接導入することにより前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることができるように前記異種核酸は適用され、前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように前記ポリペプチド及び前記異種核酸は互いに適用されている。
【００１１】
更に、本発明は、遺伝子改変植物において目的細胞プロセスを制御するシステムを提供するものであり、前記システムは、上で定義したような植物、及び遺伝子改変植物において前記目的細胞プロセスのスイッチを入れるためのポリペプチドを含み、前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように前記植物及び前記ポリペプチドは互いに適用されている。
【００１２】
本発明は、前記異種核酸を含有する細胞へポリペプチドを直接導入することにより植物の目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能である。前記ポリペプチドを直接導入することとは、前記導入が、前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドの機能性部分をコードする核酸を前記植物へ適用することを含まないことを意味する。前記ポリペプチドの部分は、本発明の細胞プロセスのスイッチを入れることが可能な場合、機能性である。前記ポリペプチドを前記植物へ直接適用することにより、植物は前記目的細胞プロセスのスイッチを入れ得る遺伝物質と接触しないため、本発明によって非常に高レベルの生物学的安全性が達成される。代わりに、前記細胞プロセスの少なくとも１つの必要な成分がポリペプチドとして植物へ提供され、前記ポリペプチドをコードする遺伝物質は提供されない。本発明の主要な利点は、目的細胞プロセスに必要な遺伝物質及び前記ポリペプチドをコードする遺伝物質がいずれも前記植物の子孫へ移入され得ず、さもなければ環境に共に伝播し得ないことである。
【００１３】
Ｈｏｏｙｋａａｓの方法（２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９０、９７９−９８２；ＷＯ０１／８９２８３）は、植物細胞の目的細胞プロセスのスイッチを入れることを可能にし、スイッチタンパク質は病原性細菌を用いて導入される。この方法は細胞培養に限定されるため（実験室規模）、スイッチタンパク質をコードするアグロバクテリアの使用による生物学的安全性に対する懸念は生じない。本発明は、植物全体に有効であり、同時に、温室又は農場のように大規模で使用する場合であっても環境面で安全な、目的細胞プロセスを制御する方法を初めて提供するものである。
【００１４】
本発明の方法の工程（ａ）では、遺伝子改変植物が提供される。高等植物、特に高等作物が好ましい。前記植物は、前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることに関与する異種核酸を前記植物の細胞が含有するように遺伝子改変されている。多くの場合、前記異種核酸は発現されるべきタンパク質をコードすることができる。工程（ａ）で提供される前記植物は、トランスジェニック植物であることができ、前記植物のほとんど又は全ての細胞は前記細胞のゲノムに安定に組み込まれた前記異種核酸を含有する。前記異種核酸は、核ゲノムに、又はミトコンドリア若しくは好ましくはプラスチドのようなオルガネラのゲノムに安定に組み込まれることができる。前記異種核酸のプラスチドゲノムへの組み込みは、生物学的安全性の面で有利である。本発明の方法は、トランスジェニック植物で実施することが好ましい。しかしながら、あるいは、前記植物は一過性に改変され、及び／又は前記異種核酸は細胞の分画に存在し、他の細胞には存在しなくともよい。一過性に改変された植物中の異種核酸は、細胞の前記分画のゲノムに安定に組み込まれても、エピソームに存在してもよい。前記植物の細胞の分画への前記異種核酸の組み込みは、例えば、ウイルス形質移入又はアグロバクテリウム介在形質転換を用いて前記生物に一過性に形質移入することによって達成することができる。いずれの場合も、工程（ａ）で提供される遺伝子改変植物は、工程（ｂ）を実施する前、目的細胞プロセスに関して不活性である。
【００１５】
本発明の方法の工程（ｂ）では、前記ポリペプチドは無細胞組成物から前記異種核酸を含有する前記細胞の少なくともいくつかへ導入される。前記植物がトランスジェニックである場合、前記ポリペプチドは、原則として植物のどの部分にも又はどの細胞にも適用することができる。前記植物の細胞の分画のみが前記異種核酸を含有する場合、目的細胞プロセスのスイッチを入れるための前記異種核酸を含有する細胞に前記ポリペプチドが到達できるように、前記ポリペプチドは植物に適用される。上記のように、前記ポリペプチドは無細胞組成物から前記植物の細胞へ直接導入される。無細胞組成物は、前記ポリペプチドをコードする核酸を複製し得る生存細胞を含有しない。前記無細胞組成物は生存細胞を含有しないことが好ましい。無細胞組成物は、細胞（例えば前記ポリペプチドの発現に用いる細菌細胞のような細胞）を溶解して得られる細胞抽出物でよい。但し、前記ポリペプチドをコードする核酸を複製し得る生存細胞が前記組成物中に含まれないことを条件とする。無細胞組成物の他の例は、前記ポリペプチドの溶液、好ましくは緩衝化水溶液であり、又は固体若しくは乾燥した状態の前記ポリペプチドである。但し、上で定義したような生存細胞を含まないことを条件とする。
【００１６】
直接導入は、（ｉ）  粒子（微粒子）銃、（ｉｉ）  前記植物の少なくとも一部への前記ポリペプチドの適用、又は（ｉｉｉ）  前記ポリペプチドを含有する溶液を前記植物の組織に注入することによって行なうことができる。（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の方法では、前記ポリペプチドは典型的には植物の部分へ適用される液体、好ましくは水性の無細胞組成物（又は溶液）に含有される。そのような組成物は、例えば、ポリペプチドを含有する前記組成物を前記植物に噴霧することによって適用することができる。更に、前記組成物は、（ｉｉｉ）にしたがって注入することができる。
【００１７】
（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の方法のために、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドが前記植物の細胞内へ入ることを可能にする膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことが好ましい。前記膜移行配列は前記ポリペプチドに共有結合的に結合しても非共有結合的に結合してもよい。好ましくは、共有結合的に前記ポリペプチドに結合している。前記膜移行配列は、前記生物の細胞の形質膜を通過する能力を前記ポリペプチドに付与するペプチドであることができる。そのような膜移行配列の多くは当該技術分野において公知である。それらは塩基性アミノ酸、特にアルギニンを含むことが多い。膜移行配列のサイズは大きく変化することができるが、典型的には３〜１００アミノ酸、好ましくは５〜６０アミノ酸であることができる。前記ポリペプチドは標準のタンパク質発現技術により、例えば大腸菌中で産生することができる。前記ポリペプチドの発現後の精製は、行なうことが好ましく、特に、前記ポリペプチドをコードする核酸の分解物を除去することが好ましい。核酸は除去しても加水分解により分解してもよく、好ましくはＤＮａｓｅ又はリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）のような酵素によって触媒されて分解される。更に又は追加として、クロマトグラフ技術を用いて前記ポリペプチドから核酸を除去してもよい。前記ポリペプチドは、例えば前記ポリペプチドを含有する液体組成物、好ましくは水溶液を前記植物に噴霧することにより植物に適用することができる。前記ポリペプチドが植物の細胞に入るのを促進するための方策、特に植物細胞壁及び／又は外部植物層を通過するのを可能にする方策を採ることが好ましい。そのような方策の例は、例えば機械的な引っかき傷によって植物表面の部分にわずかに傷をつけることである。他の例は、植物細胞壁を弱め又は穴を開けるセルロース分解酵素の使用である。
【００１８】
目的細胞プロセスのスイッチを入れること（工程（ｂ））には、無細胞組成物に由来する前記ポリペプチドを、前記異種核酸を含有する細胞へ直接導入することを必要とする。前記ポリペプチド及び前記異種核酸は、前記ポリペプチドが前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能なように互いに適用されている。
【００１９】
前記目的細胞プロセスに関し、特に限定はなく、本発明は非常に広く適用可能である。前記目的細胞プロセスは、前記異種核酸若しくは前記異種核酸に関係するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質であっても又はそれらを含むものでもよい。前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ又は前記タンパク質の形成を達成する可能性は数多くある。前記ポリペプチドは、例えば、前記異種核酸、例えばプロモーターへの結合活性を有するセグメントを含むことができる。したがって、前記セグメントは、例えば前記異種核酸の転写を誘導する転写因子として作用し、前記ＲＮＡ及び／又は前記タンパク質の形成を誘発することができる。
【００２０】
前記ポリペプチドは、前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ又は前記タンパク質の形成を誘発可能な酵素活性を有するセグメントを有することが好ましい。そのような活性の例は、部位特異的リコンビナーゼ、フリッパーゼ、リゾルベース、インテグラーゼ、ポリメラーゼ、又はトランスポザーゼの活性のようなＤＮＡ又はＲＮＡの修飾活性である。前記酵素活性は、前記異種核酸を修飾して、例えば組換えにより、前記タンパク質の発現を生ずることができる。前記ポリペプチドがポリメラーゼ活性を有する態様では、前記セグメントは前記異種核酸のプロモーターに作用するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり得る。前記プロモーターは前記植物の生来のポリメラーゼによって認識されないことが好ましい。そのようなプロモーター−ポリメラーゼシステムの例は、Ｔ７プロモーター−Ｔ７ポリメラーゼのような、細菌、ウイルス、又はバクテリオファージのプロモーター−ポリメラーゼシステムである。
【００２１】
更に、前記前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることは、前記異種核酸からの若しくは前記異種核酸に関係するＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の形成を含むことができる。例として、前記異種核酸からの又は前記異種核酸のＲＮＡ発現産物からの発現可能オペロンの形成が挙げられる。
【００２２】
前記異種核酸（又は以下で説明するの前記追加の核酸）の配列部分は、前記タンパク質の作用によって転写プロモーターに機能可能に連結することができ、これは、例えば前記目的タンパク質をコードする配列又はＲＮＡアンプリコンをプロモーターと機能可能に連結させることによって、前記追加の異種核酸からの目的タンパク質の発現又はＲＮＡ−ウイルスアンプリコンの転写のスイッチを入れることを可能にする。この態様を実施するための方法がいくつかある。１つの選択肢は、前記（追加の）異種核酸において、ＲＮＡアンプリコン及びプロモーターをコードする配列を、それらのあいだの機能可能な連結を妨げる配列ブロックによって分離することである。前記配列ブロックは、前記ブロックが前記組換え部位を認識するリコンビナーゼによって切断されるように、組換え部位に隣接することができる。それにより、ＲＮＡアンプリコンをコードする配列を転写するための機能可能な連結が確立し、発現スイッチを入れることができる。他の選択肢は、転写に必要な配列の一部（例えばプロモーター又はプロモーター部分）を反対方向に有し、組換え部位に隣接することである。好適なリコンビナーゼを（例えば前記ポリペプチドとともに）提供することにより、前記配列部分を反転させて正しい方向に戻し、機能可能な連結を確立できる。
【００２３】
更に、前記ＤＮＡ、前記ＲＮＡ又は前記タンパク質は、前記植物の他の細胞へ伝播であることができる（例えばＤＮＡ又はＲＮＡウイルスベクター）。そのような細胞プロセスの重要な例は、発現可能アンプリコンの前記異種核酸又は前記異種核酸のＲＮＡ発現産物からの形成である。前記アンプリコンは、それが活性化され又は形成される細胞内で増幅可能である（増幅ベクター）。前記アンプリコンは、前記目的細胞プロセスにおいて発現すべき目的遺伝子を含有する発現可能アンプリコンであり得る。更に、前記アンプリコンは、本発明の植物において細胞間移行又は浸透移行可能であり得る。アンプリコンは植物のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに基づいたものであり得る。トバモウイルスのような植物ＲＮＡウイルスが好ましい。前記タンパク質の増幅特性は伝播可能であり（以下を参照されたい）、前記アンプリコンは相乗的に行動することができ、したがって前記植物のかなりの部分に伝播する非常に強力な目的細胞プロセスを可能にする（例えば前記アンプリコンから目的タンパク質の非常に強力な発現を生ずる）。トバモウイルスをベースとしたアンプリコンの遺伝子操作は当該技術分野に公知である（例えばＤａｗｓｏｎら、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７２、２８５−２９３；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０、８１−９４を参照されたい；総説として、「植物ウイルスによる遺伝子操作」、１９９２、Ｗｉｌｓｏｎ及びＤａｖｉｅｓ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい）。
【００２４】
本発明の主要な態様では、前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることは、前記異種核酸からのタンパク質の形成を包含し、前記タンパク質は植物内を伝播可能であり、即ち、それが形成された前記植物の１つの細胞を出て他の細胞に入ることが可能である（このようなタンパク質は、本明細書において「タンパク質スイッチ」ともいう）。他の細胞では、前記タンパク質は、特に追加の異種核酸を制御することによって、目的細胞プロセスのスイッチを入れることができる（以下を参照されたい）。１つの細胞を出て他の細胞に入ることとは、好ましくは前記植物又はその部分における細胞間移行又は浸透移行を含む。前記タンパク質（本明細書において「タンパク質スイッチ」ともいう）は、前記タンパク質スイッチが１つの細胞を出て他の細胞に入るのを可能にするタンパク質部分を含有することが好ましい。前記タンパク質部分はウイルス移行タンパク質又はウイルス外被タンパク質のドメインでもよい。更に、前記タンパク質部分は、細胞間移行又は浸透移行が可能な植物若しくは動物の転写因子、又は植物若しくは動物の転写因子のドメインであってもよい。更に、前記タンパク質部分は、植物若しくは動物のペプチド細胞間メッセンジャー、又は植物若しくは動物のペプチド細胞間メッセンジャードメインであってもよい。更に、前記タンパク質部分は、細胞間移行又は浸透移行可能な人工ペプチドでもよい。しかしながら、前記タンパク質部分は、ウイルス移行タンパク質若しくはウイルス外被タンパク質、又はウイルス移行タンパク質若しくはウイルス外被タンパク質のドメインであるか、あるいはそれを含むことが好ましい。
【００２５】
伝播可能な前記タンパク質が前記異種核酸を含有する他の細胞へ入る場合、前記異種核酸からの前記タンパク質の発現のスイッチを入れる（誘導する）ことが可能であることが好ましい。このタンパク質（タンパク質スイッチ）を使用することにより、本発明の方法は、前記植物において外部より前記ポリペプチドを提供されたスイッチシグナルを増幅し、伝播させることが可能である。特に、前記ポリペプチドが最初に到達する細胞数が少ない場合、スイッチシグナルは前記植物内の更なる細胞へ効率的に運ばれる。前記タンパク質が前記異種核酸からのその発現を制御できる多くの方法がある。これらの方法は、上記工程（ｂ）の前記ポリペプチドに使用できるものに相当する。
【００２６】
それ自身の発現を制御する能力とは別に、タンパク質は目的細胞プロセスのスイッチを入れる能力を有することが好ましい。細胞プロセスのスイッチを入れることが好ましいが、スイッチが入れられた細胞プロセスの最終結果が植物の細胞におけるプロセスを抑制すること又はスイッチを切ることでもよいことは当業者に明らかである。前記目的細胞プロセスのスイッチを入れることが可能であるためには、前記タンパク質は、前記細胞プロセスを制御可能なセグメントを有することができる。前記セグメントは、前記目的細胞プロセスに必要な核酸（特に前記追加の異種核酸）を制御する結合活性又は酵素活性を有することができる。本発明の方法では、前記細胞プロセスのスイッチを入れることは、前記異種核酸からのそれ自身の発現を制御することと同じように達成することができる。この目的のために、前記タンパク質は前記細胞プロセスを制御するセグメント及び前記タンパク質の発現を引き起こすセグメントを有することができ、前記２つのセグメントの制御メカニズムは異なっていてよい。２つの制御メカニズムは類似又は同一であることが好ましく、前記タンパク質の１つのセグメントは、前記細胞プロセスのスイッチを入れるため及び前記タンパク質の発現を制御するために十分なものであり得る。したがって、簡便にするために、前記タンパク質は、前記１つのセグメント、及び前記タンパク質に前記植物の１つの細胞を出て他の細胞に入る能力を付与する部分を含有することが最も好ましい。
【００２７】
本発明では、本発明の前記ポリペプチドは、同一のスイッチ機能を前記タンパク質スイッチとして有することができる。例えば、前記タンパク質スイッチと同一の酵素活性を有することができる。前記ポリペプチドは外部より適用され、それが入る細胞において目的細胞プロセスのスイッチを入れることができる。前記タンパク質スイッチは、好ましくは前記ポリペプチドのスイッチ機能に応答して、前記遺伝子改変植物の細胞内で産生される。次いで、前記タンパク質スイッチは、前記植物の細胞内で産生された後、それが産生された細胞及び／又は前記植物の他の細胞において目的細胞プロセスのスイッチを入れることができる。前記ポリペプチド及び前記タンパク質スイッチが同一の関連する酵素活性によってスイッチ機能を発揮する場合、前記ポリペプチドが好ましくは膜移行配列を有し、一方で前記タンパク質スイッチが好ましくは前記タンパク質スイッチに１つの細胞を出て他の細胞に入る能力を付与するタンパク質部分を有する点において、それらは異なっていてよい。
【００２８】
前記目的細胞プロセスは、上記のように、前記細胞プロセスが制御される前記植物の細胞において追加の異種核酸の存在を必要とすることができる。前記追加の異種核酸は、前記植物の全ての細胞又は細胞の分画に存在することができる。前記生物の細胞の核ゲノム又はオルガネラゲノムに安定に組み込まれてもよい。本発明の前記異種核酸に関して言及したことは、前記追加の異種核酸にも一般に適用される。前記植物は、前記追加の異種核酸及び前記異種核酸に関してトランスジェニックであることが好ましい。
【００２９】
前記追加の異種核酸は、例えば、植物において伝播可能なタンパク質を形成するために前記異種核酸が用いる場合に使用されるであろう。したがって、伝播タンパク質は、前記追加の異種核酸にコードされる目的細胞プロセスのスイッチを入れることができる。図８は、そのような態様を図解したものである。前記追加の異種核酸からスイッチを入れることができる目的細胞プロセスは、前記異種核酸に関連して言及されたものに相当する。
【００３０】
本発明の更なる重要な態様において、前記異種核酸に由来するタンパク質及び前記直接導入されるポリペプチドは、前記タンパク質及び前記ポリペプチドがともに存在する場合にのみ、いっしょになって所定の機能を産生し、前記目的細胞プロセスのスイッチを入れる（図３参照）。前記タンパク質及び前記ポリペプチドは、インテイン介在トランススプライシング又はインテイン介在親和性相互作用によって、いっしょになって前記所定の機能を産生することが好ましい。したがって、前記所定の機能は、本発明の細胞プロセスのスイッチを入れることができる。前記所定の機能は、前記タンパク質について上記のものと同様に、例えば、前記追加の異種核酸に作用し得る結合活性又は酵素活性であり得る。この態様の重要な利点は、異種核酸で遺伝子改変された工程（ａ）で提供される植物は、本発明の前記細胞プロセスのスイッチを入れるのに必要とされる全ての成分を含有するわけではないことである。したがって、前記植物は、目的の機能性細胞プロセスに関する遺伝情報を子孫又は他の生物に移すことができない。
【００３１】
しかしながら、スイッチが入れられた目的細胞プロセスは、本明細書に記載するように、全植物に影響を及ぼす必要はない。むしろ、前記目的細胞プロセスは、葉又は種子のような前記植物の部分に限定されてよい。種子における目的細胞プロセスは種子における目的タンパク質の産生であり得る。それによって目的タンパク質を慣用の方法で容易に回収し、前記種子に貯蔵することができる。しかしながら、目的細胞プロセスは前記植物の実質的な部分に影響を及ぼすことが好ましい。前記細胞プロセスのスイッチが入れられる植物の部分は、とりわけ前記ポリペプチドの適用場所に依存する。一般に、前記目的細胞プロセスは、前記ポリペプチドの適用場所近傍で最強であり、前記場所からの距離が増すにつれて減少してよい。前記減少は一般に異方性であり、前記ポリペプチドが適用された前記植物の組織の構造に依存してよい。例えば、目的細胞プロセスのスイッチが入れられ（例えば目的遺伝子の発現スイッチが入れられる）、前記ポリペプチドが植物の葉の分画へ適用される場合、前記目的細胞プロセスは典型的には、前記葉の前記分画内及び前記葉の前記分画近傍で生ずる。前記目的細胞プロセスは前記葉の主要な部分で生ずることが好ましい。前記目的細胞プロセスは苗条及び他の葉においても生ずることがより好ましい。前記目的細胞プロセスは前記植物の主要な部分で生ずることが最も好ましい。前記目的細胞プロセス（例えば目的遺伝子の発現）の範囲は、例えば細胞の種類又は組織の種類により、前記植物内で変化することができる。前記ポリペプチドの適用は、通常、植物表面の一点に限定されないことは明らかである。前記ポリペプチドは前記植物のいくつかの部分へ適用されることが好ましい（更に以下を参照されたい）。
【００３２】
本発明の細胞プロセスは、植物の細胞における多工程生合成経路のような目的生化学的カスケード全体を含み、又はそれを生ずることができる。目的の細胞プロセス又は生化学的カスケードは、前記ポリペプチドに曝露する前は植物において機能可能ではない。本発明の方法は、これまで達成できなかった技術的正確性及び環境安全性をもって目的の細胞プロセス又は生化学的カスケードに対する制御を提供することができる。それにより、一般的にはバイオテクノロジーにおいて、特に植物バイオテクノロジーにおいて、植物における基本的なトランス遺伝子発現活性のような慣用技術では解決できなかった問題を解決するために、特に有毒物質又は生分解ポリマーを産生する場合に、新規適用が可能である。更に、本発明による正確な制御は、例えば、植物が植物の増殖を遅延させる基底の発現活性を負担することがなく、植物が目的細胞プロセスの実施に最も好適である場合、トランスジェニック植物を所望の段階まで増殖させることが可能である。いったん植物に目的細胞プロセスを効率的に実施する準備ができると、目的プロセスのスイッチが入り、高率で実施することができる。したがって、本発明の方法は、多細胞生物、特にトランスジェニック植物の増殖段階と産生段階とを安全に切り離すことが可能である。更に、複数の目的の細胞プロセス又は生化学的カスケードのための多成分システムを設計することが可能であり、それにより１以上の所望のプロセス又はカスケードのスイッチを選択的に入れることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明の基礎は、植物の細胞へ入ることが可能なポリペプチドの使用であり、前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドの機能性部分をコードする核酸を前記細胞へ送達することなく目的細胞プロセスのスイッチを入れるものである。好ましくは、目的細胞プロセスのスイッチを入れることには、それ自身の発現を引き起こすことが可能なタンパク質の形成が含まれる。本発明の方法の一般原理を、図１〜図９に概略的に示す。
【００３４】
「スイッチ」機能のためのタンパク質の選択
前記タンパク質スイッチに関して本明細書に記載されるのと同一のスイッチ機能を前記ポリペプチドのスイッチ機能に使用することができ、逆もまた同様である。本発明の前記タンパク質（タンパク質スイッチ）によって不可逆的に誘発できる目的細胞プロセスは数え切れないほどある。タンパク質スイッチ（図２でＡＢと示す）は、例えば、多くのさまざまな方法で目的トランス遺伝子の発現を制御できる（図２でＣと表す）。例えば、ＤＮＡの組換え又は転写、ＲＮＡのプロセシング又は翻訳、タンパク質翻訳後修飾（図２）などを誘発することができる。更に、タンパク質スイッチは、植物細胞への送達により前記ポリペプチドによって活性化されることができ、その後、スイッチとして機能することができる（図３）。タンパク質スイッチの選択は、前記植物において制御されるべき細胞プロセスの設計／選択に依存することは明らかである。前記細胞プロセスは、細胞内の核酸の再構成又は修飾により制御することができ、特にスイッチを入れることができる。その際、前記タンパク質は、前記タンパク質が侵入する細胞に存在する。そのような場合、タンパク質スイッチは、部位特異的エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メチラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、ポリメラーゼなどのようなＤＮＡ又はＲＮＡの修飾酵素を含むことができる。
【００３５】
本発明で意図する他の態様には、ＤＮＡ制限消化及び／又はＤＮＡ複製のような反応を誘発することが含まれる。制限消化によって誘発され得る生化学的カスケードの例は２成分システムであり、ここで、複製オリジンを含有し、核ゲノムに組み込まれているＤＮＡ配列を、タンパク質スイッチとして働く切断頻度の小さい制限酵素によって特異的に切断し、常染色体性に複製するプラスミドに変換し、カスケードを誘発する。
【００３６】
本発明の細胞プロセスを効率的に誘発する装置として用いることができる、ＲＮＡ分子に影響を及ぼす反応が数多くある。これらには、とりわけＲＮＡの複製、逆転写、編集、サイレンシング、又は翻訳のような反応が含まれる。例えば、いかにして部位特異的リコンビナーゼ、インテグラーゼ又はトランスポザーゼが、ＤＮＡの切断、反転、又は細胞、特に植物細胞への挿入によって目的プロセスを誘発することができるかを詳細に記載する先行技術は豊富にある（Ｚｕｏ、Ｍｏｌｌｅｒ＆Ｃｈｕａ、２００１、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９、１５７−１６１；Ｈｏｆｆ、Ｓｃｈｎｏｒｒ＆Ｍｕｎｄｙ、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４５、４１−４９；ＵＳ５２２５３４１；ＷＯ９９１１８０７；ＷＯ９９２５８５５；ＵＳ５９２５８０８；ＵＳ６１１０７３６；ＷＯ０１４０４９２；ＷＯ０１３６５９５）。バクテリオファージ及び酵母由来の部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼは、ＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで並びに植物及び動物で操作するために広く使用されている。本発明での使用に好ましいリコンビナーゼ−組換え部位は、以下の通りである：Ｃｒｅリコンビナーゼ−ＬｏｘＰ組換え部位、ＦＬＰリコンビナーゼ−ＦＲＴ組換え部位、Ｒリコンビナーゼ−ＲＳ組換え部位、ａｔｔＰ／ａｔｔＢ部位を認識するファージＣ３１インテグラーゼなど。トランスポゾンは、植物において遺伝子機能を発見するために広く使用されている。本発明での使用に好ましいトランスポゾンシステムには、Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ／Ｓｐｍ、「マリナー」ファミリーに属するトランスポゾンなどが含まれる。
【００３７】
異種転写因子及びＲＮＡポリメラーゼも本発明のタンパク質スイッチに使用することができる。例えば、Ｔ７プロモーターの制御下にあるトランス遺伝子を有する植物の細胞へのＴ７ポリメラーゼの送達は、そのようなトランス遺伝子の発現を誘導することができる。
【００３８】
バクテリオファージプロモーター（例えばＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｋ１１）の制御下にある植物トランス遺伝子（例えば本発明の追加の異種核酸）を植物の細胞へ送達された対応のＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼで発現させることは、本発明で意図するタンパク質スイッチの開発のための別の有効なアプローチであり得る。別の有用なアプローチは、活性化に異種の又は遺伝子操作された転写因子を必要とする異種プロモーター又はキメラプロモーター又は他の人工プロモーターの使用であり得る。異種転写因子は、前記転写因子が認識可能なプロモーターの制御下で目的トランス遺伝子の発現を誘導するために使用することもできる。そのような転写因子の例は、とりわけ酵母ＭＴ（メタロチオネイン）プロモーター中の特定配列に結合する酵母の金属応答性ＡＣＥ１転写因子（Ｍｅｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０、４５６７−４５７１）、融合した６−ジンクフィンガータンパク質２Ｃ７及び単純ヘルペスウイルスＶＰ１６転写因子活性化ドメインを有する転写因子のように配列特異的ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインを有するさまざまなキメラ転写因子（Ｏｒｄｉｚ、Ｂａｒｂａｓ＆Ｂｅａｃｈｙ、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９、１３２９０−１３２９５）、全長４３４リプレッサー及びＶＰ１６転写アクチベーターのＣ末端８０アミノ酸を有する転写因子（Ｗｉｌｄｅら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４、３８１−３８８）、ステロイド誘導性システムに用いられる転写因子（Ａｏｙａｍａ＆Ｃｈｕａ、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１１、６０５−６１２；ＭｃＮｅｌｌｉｓら、１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４、２４７−２５７；ＵＳ０６０６３９８５）又はテトラサイクリン誘導性システムに用いられる転写因子（Ｗｅｉｎｍａｎｎら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５、５５９−５６９）である。場合により、トランス遺伝子発現のための既存の誘導性システムを使用することができる。あるいは、転写因子を活性状態にするのにリガンド活性化誘導物質を必要としないように、異種転写因子を改変することができる。キメラ転写因子は、高度に配列特異的なＤＮＡ結合ドメインと高率の活性化ドメインとの組み合わせを可能にし、そのような因子を植物細胞へ送達した後で最大の所望の効果を可能にするため、本発明での使用に有利であろう。
【００３９】
本発明で意図される他のタンパク質スイッチは、異種核酸の１種以上の発現産物の翻訳後修飾に依拠することができ、発現産物の活性化をもたらすことができる。ポリペプチドの折り畳み、オリゴマー形成、標的シグナルの除去、プロ酵素から酵素への変換、酵素活性のブロックなどのような工程を制御することにより操作できるタンパク質スイッチについて多くの実施可能性がある。例えば、部位特異的プロテアーゼを植物の細胞へ送達することにより、遺伝子操作された宿主が特異的にプロ酵素を切断して活性酵素に変換する場合、標的モチーフを切断又は修飾する宿主の能力によってある産物が特定の細胞成分を標的とする場合、又は特異的結合配列の除去によってある産物が特異的に起動する場合、目的細胞プロセスを誘発することができる。翻訳融合タンパク質の切断は、ウイルス部位特異的プロテアーゼに認識されるペプチド配列を介して又は触媒ペプチドを介して達成することができる（Ｄｏｌｊａら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０２０８−１０２１２；Ｇｏｐｉｎａｔｈら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、１５９−１７３；ＵＳ５１６２６０１；ＵＳ５７６６８８５；ＵＳ５４９１０７６）。本発明に適用可能な部位特異的プロテアーゼの他の例は、哺乳動物のエンテロキナーゼ、例えば配列ＤＤＤＫ−Ｉを認識し（Ｋｉｔａｍｏｔｏら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１、７５８８−７５９２）、Ｌｙｓ−Ｉｌｅ結合を特異的に切断するヒトエンテロキナーゼ軽鎖；Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチド間のタンパク質分解を触媒するが切断部位の認識には４アミノ酸を必要とするＨｃ−Ｐｒｏのようなウイルスプロテアーゼ（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＪＣ＆Ｈｅｒｎｄｏｎ  ＫＬ、１９９２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８７、３０８−３１５）；セムリキ森林熱ウイルスの部位特異的プロテアーゼ（Ｖａｓｉｌｊｅｖａら、２００１、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６、３０７８６−３０７９３）；及びポリユビキチンプロセシングに関与するプロテアーゼ、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ（Ｏｓａｖａら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２８３、６２７−６３３）である。
【００４０】
前記ポリペプチドの植物細胞への直接導入
ａ）微粒子銃（粒子銃）
前記ポリペプチドを前記植物の細胞へ直接導入する（直接送達）ためにさまざまな方法を用いることができる。最も単純なのは植物組織との機械的相互作用により直接送達することである。例えば、ポリペプチドで被覆した粒子の微粒子銃により、前記ポリペプチドを植物細胞へ送達することができる。プロトコールは、植物形質転換プロトコールの中でＤＮＡ送達について記載されたものと同様であることができる（ＵＳ０５１００７９２；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１）。しかしながら、ＤＮＡの代わりに、前記ポリペプチドを用いて粒子を被覆してもよい。前記ポリペプチドの活性を保存するために適度に穏やかな粒子被覆法を使用する微粒子銃法に関する記載がある（Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｓｍｉｔｈ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ、１９９３、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７、４８３−５０９）。原則として、マイクロインジェクション（ＷＯ０９２０９６９６；ＷＯ０９４００５８３Ａ１；ＥＰ１７５９６６Ｂ１）、又はリポソーム介在送達（総説として：Ｆｒａｌｅｙ＆Ｐａｐａｈａｄｉｏｐｏｕｌｏｓ、１９８２、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６、１７１−１９１を参照されたい）などの他の植物形質転換法も用いることができる。
【００４１】
ｂ）膜移行アミノ酸配列の使用
目的ポリペプチドは、膜移行配列との共有結合的融合又は非共有結合的相互作用により前記植物の標的細胞へ外部より適用することができる。天然及び合成の膜移行配列（ＭＴＳ）について多くの例が当該技術分野で公知である。それらは、細胞膜透過性を増加させるために、ペプチド薬物及び治療タンパク質との融合物として広く使用されている。ＭＴＳは単純なアミノ酸反復配列、例えば１１個のアルギニンＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲを含有する陽イオン性ペプチドであり得る（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１、６０００−６００７）。他の陽イオン性ＭＴＳは長さ２７アミノ酸のトランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬ  ＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡ  ＡＬＡＫＫＩＬ）である（Ｐｏｏｇａら、１９９８、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１２、６７−７７）。そのようなペプチドが、細胞への浸透のために、細胞質に面している脂質単層が陰イオン性リン脂質を含有する細胞の形質膜の非対称性を利用することは大いにあり得る（Ｂｕｃｋｌａｎｄ＆Ｗｉｌｔｏｎ、２０００、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ／Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ、１４８３、１９９−２１６）。ある種のタンパク質は、形質膜を通る細胞内への能動移行を可能にするサブユニットも含有する。そのようなドメインに属するのは、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ４９−５７の塩基性ドメイン（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（Ｗｅｎｄｅｒら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３００３−１３００８）、アンテナペディア４３−５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲ  ＲＭＫＷＫＫ）（Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、１０４４４−１０４５０）、カポジ線維芽細胞増殖因子のＭＴＳ（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬ  ＬＡＬＬＡＰ）（Ｌｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１４２５５−１４２５８）；ＶＰ２２  ＭＴＳ（Ｂｅｎｎｅｔ、Ｄｕｌｂｙ＆Ｇｕｙ、２００２、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、２０；Ｌａｉら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１１２９７−３０２）；キイロショウジョウバエの節足らずタンパク質及びエングレイルドタンパク質由来のホメオドメイン（Ｈａｎら、２０００、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  １０、７２８−７３２）である。これらの正に荷電したＭＴＳは全て、それ自身により、及びＧＦＰ（Ｚｈａｏら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５４、１３７−１４５；Ｈａｎら、２０００、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ、１０、７２８−７３２）、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｐｅｉｔｚら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４４８９−４４９４）のような他のタンパク質との融合物として、エネルギー非依存的様式で細胞への侵入を達成可能であることが示された。しかしながら、細胞へのタンパク質輸送には融合は必ずしも必要ではない。ＧＦＰ、ｂ−Ｇａｌ、又は全長特異的抗体のようなさまざまな種類のタンパク質との非共有結合的疎水性相互作用によって複合体を形成可能な、Ｐｅｐ−１を有する２１残基ペプチドが設計された（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）。これらの複合体は、細胞膜を効率的に浸透可能である（Ｍｏｒｒｉｓら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９、１１７３−１１７６）。ＭＴＳの列挙を継続することは可能であるが、一般に、合成又は天然のアルギニンに富んだペプチドは本発明の実施に役立つことができる（Ｆｕｔａｋｉら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、５８３６−５８４０）。
【００４２】
植物と動物の細胞膜あいだで、その一般構築と物理化学特性に影響を及ぼす本質的な構造上の差異はないため、ＭＴＳと本発明の前記ポリペプチドとの前記融合物は、植物細胞に浸透させるために効率的に用いることもできる。しかしながら、動物細胞とは異なり、植物細胞は堅い細胞壁を有する（Ｖａｒｎｅｒ＆Ｌｉｎｎ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５６、２３１−２３９；Ｍｉｎｏｒｓｋｙ、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１２８、３４５−５３）。この障害物は、単純な技術を用いることで克服することができる。例えば、ＭＴＳを有する前記ポリペプチドを含有する（例えば粗製の）タンパク質抽出物を植物アポプラストへ注入することによって、前記ポリペプチドの植物細胞への移行を容易にする。細胞壁を克服し、植物細胞の細胞膜へ到達するための他のアプローチは、その多くが市販されている細胞溶解酵素を適用することであり得る。いったん前記ポリペプチドを含有する組成物へ添加すると、前記酵素は細胞壁を除去し又は弱めるのに役立つが、細胞膜は無傷のまま、前記ＭＴＳを含有する前記ポリペプチドによる浸透に曝露させる。細菌及びカビ由来の前記細胞溶解酵素は、工業規模で長い間市販されており（例えばトリコデルマ・ハルジアナムの「オノズカ」Ｒ−１０酵素調整品など）、植物プロトプラストを入手するための植物細胞組織培養において広く使用されている（Ｓｉｄｏｒｏｖ＆Ｇｌｅｂａ、１９７９、Ｔｓｉｔｏｌｏｇｉａ、２１、４４１−４４６；Ｇｌｅｂａ＆Ｇｌｅｂａ、１９７８、Ｔｓｉｔｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１２、４５８−４６９；Ｇｈｏｓｈら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２、１−１０；Ｂｏｙｅｒ、Ｚａｃｃｏｍｅｒ＆Ｈａｅｎｎｉ、１９９３、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４、１９１１−１９１７；Ｈｉｌｂｒｉｃｈｔ、Ｓａｌａｍｉｎｉ＆Ｂａｒｔｅｌｓ、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３１、２９３−３０３）。細胞溶解酵素を用いるアプローチは、本発明の大規模な適用に可能性を有する。細胞溶解酵素と細胞透過性ポリペプチドとの混合物は、遺伝子改変植物又はその部分へ噴霧することができる。セルラーゼは、細胞膜を膜透過性ポリペプチドにとって接近可能にすることができる。細胞内に移行すると、前記ポリペプチドは植物内で前記目的細胞プロセス及び前記タンパク質の発現を誘発することができる。
【００４３】
前記ポリペプチドの上記送達法に加えて、タンパク質スイッチの植物内での有効な伝播は、好ましくは前記植物内での増殖目的に用いられる。更に、方法全体を安全にするために、異種核酸に対する厳密な制御が必要とされる。
【００４４】
これらの課題に取り組むために、本明細書において、タンパク質スイッチをコードするトランス遺伝子の分離を制御するための「スプリット遺伝子」（又は「スプリットタンパク質」）アプローチの使用について提案する。この態様では、活性（機能性）タンパク質スイッチは、インテイン介在タンパク質トランススプライシング（図４Ａ及び図５Ａ）によって、又は親和性相互作用（図４Ｂ及び図５Ｂ）によって組み立てられる。この場合、タンパク質スイッチは連続したＤＮＡ配列をコードせず、その使用は非常によく制御することができる。そのような活性タンパク質スイッチは、例えば、前記ポリペプチド、及び前記植物の細胞内で（例えば異種核酸から）発現するタンパク質から、インテイン介在タンパク質トランススプライシング又は親和性相互作用によって組み立てられることができる。前記異種核酸から発現したタンパク質及び前記ポリペプチドは、タンパク質及び前記ポリペプチドがともに存在する場合にのみ前記目的細胞プロセスのスイッチを入れる所定の機能をいっしょになって産生することができる。前記異種核酸から発現したタンパク質は、例えば構成的に発現することができ、前記ポリペプチドを適用することによって目的プロセスのスイッチをいれることができる。あるいは、前記異種核酸から発現したタンパク質は、調節されたプロモーター（例えば化学的誘導性プロモーター）の制御下にあることができ、目的プロセスの「２重」制御、即ち調節されたプロモーターの誘導及び前記ポリペプチドの導入による制御を可能にする。重要なことは、これらの態様は特別優れた生物学的安全性を有するということである。インテイン介在タンパク質トランススプライシング及び親和性相互作用について次に記載する。
【００４５】
その活性の回復を伴うタンパク質のインテイン介在トランススプライシングは、当該技術分野で公知であり、多くの出版物に詳細に記載されている。タンパク質親和性相互作用及び／又はトランススプライシングは、遺伝子操作されたインテインを用いることによって達成することができる（図４−Ａ）。インテインは、タンパク質前駆体にインフレームで組み込まれ、タンパク質の成熟過程で切除されるタンパク質配列として最初に同定された（Ｐｅｒｌｅｒら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、１１２５−１１２７；Ｐｅｒｌｅｒ，Ｆ．Ｂ．１９９８、Ｃｅｌｌ、９２，１−４）。自己スプライシング反応を実施するのに必要な全ての情報及び触媒基は、インテイン及び２つのフランキングアミノ酸に存在する。タンパク質スプライシングの化学的メカニズムは、Ｐｅｒｌｅｒ及び同僚によって（１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１、２９２−２９９）、並びにＳｈａｏ＆Ｋｅｎｔによって（１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４、１８７−１９４）記載されている。インテインは通常Ｎ端及びＣ端のスプライシング領域並びに中央のホーミングエンドヌクレアーゼ領域又は小さなリンカー領域から成る。１００を超えるインテインがこれまで公知となり、真核生物、古細菌及び真正細菌を含めたさまざまな生物の核ゲノム及び／又はオルガネラゲノム分布している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ）。インテインはトランススプライシング可能であることが示されている。中央のホーミングエンドヌクレアーゼ領域を除去してもインテインの自己スプライシングに何も作用しない。このことはトランススプライシングシステムの設計を可能にする。このシステムでは、インテインのＮ端及びＣ端断片が別個の断片として共発現し、エクステイン（インテインによっていっしょに連結するタンパク質断片）と融合すると、トランススプライシングをｉｎ  ｖｉｖｏで実施できる（Ｓｈｉｎｇｌｅｄｅｃｋｅｒら、１９９８、Ｇｅｎｅ、２０７、１８７−１９５）。結核菌ＲｅｃＡインテインのＮ端及びＣ端セグメントを用いて、タンパク質トランススプライシングがｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じ得ることも証明された（Ｍｉｌｌｓら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、３５４３−３５４８）。この現象は、シネコシスティス種株ＰＣＣ６８０３のＤｎａＥタンパク質に関しても同定された（Ｗｕら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、９２２６−９２３１）。反対ＤＮＡ鎖に７００ｋｂｐ以上離れて位置する２つの異なる遺伝子がこのタンパク質をコードする。大腸菌細胞で試験したとき、これらの遺伝子にコードされた２つのインテイン配列が分離したミニインテインを再構築し、タンパク質トランススプライシング活性を介在可能であることも示された。同一起源のインテイン（シネコシスティス種株ＰＣＣ６８０３由来のＤｎａＥインテイン）を用いて、２つの連結していない断片から機能性の除草剤耐性アセト乳酸シンターゼＩＩを（Ｓｕｎら、２００１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７、１０２５−２９）、及び５−エノールピルビルシキメ���ト−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ｃｈｅｎら、２００１、Ｇｅｎｅ、２６３、３９−４８）を大腸菌で作製した。
【００４６】
タンパク質断片のトランススプライシング（エクステイン間の共有結合形成を含む）は、スプリットタンパク質の元の機能を回復するのに必ずしも必要ではない。多くの場合、ペプチド結合を形成しないタンパク質部分間の親和性相互作用は、タンパク質機能を回復するのに十分である（図４Ｂ）。このアプローチは、２以上の機能性ドメインを有するタンパク質を用いた最も成功したものである（インテイン介在トランススプライシングの場合のように）。この場合、ドメインは、２つの転写ベクター間のコード配列を分離することによって互いに離すことができ、タンパク質介在親和性相互作用によっていっしょになることができる（図５Ｂ）。タンパク質ドメインは、相互作用するインテインを使用することなく相互作用することができる。タンパク質分解感受性リンカー領域によって接続された２つの構造ドメインから成るＩＳ１０トランスポザーゼの再構築活性の例がある（Ｋｗｏｎ、Ｃｈａｌｍｅｒｓ＆Ｋｌｅｃｋｎｅｒ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、８２３４−８２３８）。各ドメインは、別個にトランスポザーゼ機能を提供できない。しかしながら、いっしょに加えられると、リンカー領域に接続していなくても、移動を提供することができる。ペプチド結合を形成することなく、単離断片から機能性タンパク質を再構築する例が他にも数多くある。機能性インスリン受容体結合部位の効率的な組み立ては、非機能性断片を単純に混合することによって達成された（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、２００２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７、１８３４０−１８３４５）。２つの不活性ペプチド断片の単純な混合による活性タンパク質の再構築は、ロイシンデヒドロゲナーゼ（Ｏｉｋａｗａら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０、１１７７−１１８２）、Ｃａ２＋−結合タンパク質カルビンディンＤ２８ｋ（Ｂｅｒｇｇａｒｄら、２０００、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９、２０９４−２１０８；Ｂｅｒｇｇａｒｄら、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４０、１２５７−１２６４）、シロイヌナズナ発生レギュレーターＣＯＰ１（Ｓｔａｃｅｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４、９７９−９９０）、ドーパミンＤ受容体（Ｓｃａｒｓｅｌｌｉら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９７、２９１−２９６）、ミクロプラスミノーゲン（Ｄｅ  Ｌｏｓ  Ｓａｎｔｏｓ、Ｗａｎｇ＆Ｒｅｉｃｈ、１９９７、Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２１２、７６−８３）、及びその他多くについて示された。
【００４７】
ロイシン・ジッパードメインは、いったん目的タンパク質と融合するとタンパク質ヘテロダイマーを形成することに関し、特に興味深い（Ｒｉｅｃｋｅｒ＆Ｈｕ、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８、２８２−２９６；Ｌｉｕ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｅｔｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２、１０７−１２１）。興味深い例は、低分子によるタンパク質−タンパク質相互作用の制御である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼは、２つの不活性断片に分離されている場合、２つの不活性断片間のヘテロダイマー化により活性相補性を誘発する低分子ラパマイシンの存在下で、そのリコンビナーゼ活性を１００％回復できるように遺伝子操作された（Ｊｕｌｌｉｅｎら、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１、ｅ１３１）。ラパマイシン及び好ましくは非毒性のアナログを条件付タンパク質スプライシングに用いることもできる。この場合、それらはトランススプライシング反応を誘発する（Ｍｏｏｔｚら、２００３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、１０５６１−１０５６９）。ラパマイシン又はラパマイシンアナログのような低分子によるタンパク質−タンパク質相互作用の制御に関し、同様のアプローチがいくつかの文献に記載されている（Ａｍａｒａら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、１０６１８−１０６２３；Ｐｏｌｌｏｃｋら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３２２１−１３２２６；Ｐｏｌｌｏｃｋら、２００２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、７２９−７３３）。不活性タンパク質断片からの活性なホモダイマー又はヘテロダイマーの組み立てにデキサメサゾン及びメトトレキセートのような他の多くの化学２量体化剤を用いることができる（総説として：Ｐｏｌｌｏｃｋ＆Ｃｌａｃｋｓｏｎ、２００２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３、４５９−４６７を参照されたい）。
【００４８】
親和性相互作用は、天然の相互作用タンパク質ドメインを用いることによって又はそのようなドメインを２ハイブリッド（Ｆｉｅｌｄｓ＆Ｓｏｎ、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４０、２４５−２４６；Ｃｈｉｅｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、９５７８−９５８２；酵母プロトコールハンドブック、クローンテックラボラトリーズ社、２０００）若しくはファージディスプレイシステムで同定することによって効率的に操作されることができる。例えば、ファージディスプレイを用いて５〜１２量体オリゴペプチドを目的タンパク質断片への高親和性により選択することができる。そのようなシステムのいくつかが現在市販されている。ファージディスプレイは、短い可変の５〜１２量体オリゴペプチドをバクテリオファージの外被タンパク質に挿入する選択技術である。この可変オリゴペプチドをコードする配列がバクテリオファージ外被タンパク質の対応する遺伝子に含まれる。通常、７量体ファージディスプレイライブラリーは、可変オリゴペプチド中に７量体アミノ酸のさまざまな組み合わせをもつ少なくとも１０９の独立したクローンを有する。ファージディスプレイは、バクテリオファージと目的タンパク質との親和性複合体を作製するために用いられてきており、「パニング」と呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法によって所定の標的タンパク質に対するペプチドリガンドの迅速な同定を可能にする（Ｐａｒｍｌｅｙ、Ｓｍｉｔｈ、１９８８、Ｇｅｎｅ、７３、３０５−３１８；Ｃｏｒｔｅｓｅら、１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６、７３−８０）。パニング処置の後で作製されるファージ−タンパク質複合体は解離することができ、標的タンパク質に対する親和性を有するファージが増幅できる。通常、高親和性を有するバクテリロファージを得るには、３回のパニングサイクルが必要である。３ラウンド後、ゲノムＤＮＡの可変領域を配列決定することにより、個々のクローンを特定することができる。前記システムは、短い相互作用オリゴペプチドを同定し、タンパク質断片をいっしょにするための親和性タグとしてそれらを使用するために、効率的に採用することができる。
【００４９】
他のアプローチには、ロイシンに富んだ反復配列（Ｋｏｂｅ＆Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１９、４１５−４２１；Ｋｏｂｅ＆Ｋａｊａｖａ、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１１、７２５−７３２）、ジンクフィンガー（Ｇｒｏｓｓｌｅｙ、Ｍｅｒｉｋａ＆Ｏｒｋｉｎ、１９９５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、２４４８−２４５６）、アンキリン反復配列（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｂｒｏｗｎ＆ＭｃＫｎｉｇｈｔ、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３、７６２−７６８）、クロモドメイン（Ｐａｒｏ＆Ｈｏｇｎｅｓｓ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、２６３−２６７；Ｓｉｎｇｈら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９、７８９−７９３）、及びタンパク質−タンパク質相互作用に関与する多くのその他のもののような天然の相互作用ドメインの使用が含まれる。しかしながら、タンパク質−タンパク質相互作用において原動力となる融合を含有する遺伝子操作されたタンパク質断片だけでなく、内在タンパク質も包含する可能性は考慮することができない。
【００５０】
遺伝子発現のような目的細胞プロセスのスイッチを入れるためにタンパク質−タンパク質相互作用を包含することにより、とりわけ以下の利点を有する：第１に、目的機能は、誘導されていない状態がゼロレベルであり、非特異的な漏出性がないことを特徴とする高度に特異的なタンパク質−タンパク質又はタンパク質−核酸の相互作用の結果であるため、システムを高度に特異的にすることができる。これは、本質的に特異性が低く、常にある程度の漏出性を示す低分子に基づいたスイッチのような先行技術のシステムとは反対である。第２に、前記タンパク質スイッチ又はその断片（あるいは前記ポリペプチド又はその断片）は、前記ポリペプチドをコードする核酸ベクターを用いることなく、植物の細胞へ直接送達することができ、したがって前記ポリペプチドの正確な用量を可能にする。これは、前記タンパク質スイッチ（又は前記ポリペプチド）の植物の細胞への直接送達を、細胞において必要なプロセスを誘発するための低分子の使用に匹敵したものにする。第３に、このシステムは、問題の生物が目的タンパク質の発現に必要である完全な遺伝情報を含有しないことを可能にするため、目的タンパク質に関する完全な遺伝情報を（直鎖核酸又は前記核酸の断片の形態で）含有する先行技術のシステムよりも、本質的に環境面で安全である。分子生物学のセントラルドグマによれば、生物システムは、タンパク質を核酸に逆翻訳することはできない。したがって、生体による機能性形質の発現に十分な遺伝情報の「逆操作」は不可能である。第４に、このシステムは、システムの不当な使用を禁止するために用いられる特異的ロックを提供する。前記ポリペプチド又は前記ポリペプチド断片を発現する生物からの粗製タンパク質抽出物成分として前記ポリペプチドを使用することにより、事実上、前記抽出物の活性成分の同定を非常に困難にする。
【００５１】
目的細胞プロセスを誘発するための植物内でのタンパク質スイッチの伝播
ここで、外部より適用されるポリペプチドが到達できる植物の細胞数が少ないという問題を克服するために、１つのアプローチを提供する：前記ポリペプチドは、細胞間移行又は浸透移行可能な細胞内タンパク質スイッチ分子の形成をもたらすことができる。更に、前記ポリペプチドは、目的遺伝子又はその部分を発現し、前記植物において細胞間移行又は浸透移行可能な、ウイルスをベースとしたベクター（アンプリコン）の形成をもたらすか又は引き起こすことができる。こららのアプローチでは、ウイルスベクター若しくはタンパク質スイッチ分子のいずれか、又は両方の移行は、前記植物のかなりの部分、及び遺伝子改変植物のほぼ全てに対して、細胞プロセス及び／又は生化学的カスケードの伝播をもたらすことができる。
【００５２】
本発明の実施例１では、タンパク質スイッチは、ウイルスベクターの前駆体ベクターをウイルスベクターに変換するためのインテグラーゼｐｈｉＣ３１を含有する。ウイルスベクターは増幅、細胞間移行及び浸透移行が可能である。ｐＩＣＨＧＦＰｉｎｖのａｔｔＰ及びａｔｔＢ部位間でのインテグラーゼ介在組換え（図７Ａ）は、前記部位に隣接したＤＮＡ断片の反転、並びに目的遺伝子（ＧＦＰ）の増幅及び発現を可能にするウイルスベクターの形成をもたらす（図７Ｂ）。これは、ベクター増幅及び浸透移行に必要なウイルス成分（３’ＮＴＲ：３’非翻訳領域；ＣＰ：外被タンパク質）を、この実施例におけるアクチン２プロモーターのように問題の植物において活性なプロモーターに対してセンスの方向に配置した結果として達成することができる。したがって、他のウイルスベクター成分（例えばＲｄＲｐ及びＣＰ）とともに、アクチン２プロモーターによって駆動される転写により、増幅、細胞間移行及び浸透移行が可能なＲＮＡウイルスベクターを形成するｃＤＮＡを形成することができる。場合により、前記ベクターは、ＣＰ（外被タンパク質）遺伝子を除去することによって更に修飾することができる。ＣＰ遺伝子を欠失するそのようなベクターは依然として細胞間移行が可能であろう。植物中で非ウイルス遺伝子を発現させるための植物ウイルスをベースとした発現システムの構築は、いくつかの文献（Ｄａｗｓｏｎら、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７２、２８５−２９３；Ｂｒｉｓｓｏｎら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１１８、６５９；ＭａｃＦａｒｌａｎｅ＆Ｐｏｐｏｖｉｃｈ、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、２９−３５；Ｇｏｐｉｎａｔｈら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、１５９−１７３；Ｖｏｉｎｎｅｔら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１４１４７−１４１５２）及び総説（Ｐｏｒｔａ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５、２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０、８１−９４）に記載されており、当業者であれば容易に実施することができる。ウイルスベクターをベースとした発現システムは、植物の核トランス遺伝子と比較して、顕著に高収率のトランス遺伝子産物を与える。例えば、トランス遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルは、ウイルスベクターから発現した場合、全細胞内植物タンパク質含量の５〜１０％に達することができる（Ｋｕｍａｇａｉら、２０００、Ｇｅｎｅ、２４５、１６９−１７４；Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄら、１９９９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５５、３１２−３２３）。ＲＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスに比べて高発現レベルを与えるため、最も好適である。植物におけるトランス遺伝子物質の全体発現に好適なウイルスベクターについて記載した公開特許がいくつかある（ＵＳ５３１６９３１；ＵＳ５５８９３６７；ＵＳ５８６６７８５）。一般に、これらのベクターは、ウイルスタンパク質との翻訳融合物として（ＵＳ５４９１０７６；ＵＳ５９７７４３８）、追加のサブゲノムプロモーターから（ＵＳ５４６６７８８；ＵＳ５６７０３５��；ＵＳ５８６６７８５）、又は独立したタンパク質翻訳のためにＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列を用いてポリシストロン性ウイルスＲＮＡから（ドイツ国特許出願ＤＥ１００４９５８７）、外来遺伝子を発現できる。最初のアプローチ−組換えタンパク質とウイルス構造タンパク質との翻訳融合物（Ｈａｍａｍｏｔｏら、１９９３、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１、９３０−９３２；Ｇｏｐｉｎａｔｈら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、１５９−１７３；ＪＰ６１６９７８９；ＵＳ５９７７４３８）は、かなりの収率の組換えタンパク質産物を与える。しかしながら、このアプローチの有用性は、組換えタンパク質をウイルスタンパク質と容易に分離できないため、限定されている。このアプローチの代替物は、ウイルス性部位特異的プロテアーゼに認識されるペプチド配列、又は触媒ペプチドを介した翻訳融合物を採用する（Ｄｏｌｊａら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０２０８−１０２１２；Ｇｏｐｉｎａｔｈら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、１５９−１７３；ＵＳ５１６２６０１；ＵＳ５７６６８８５；ＵＳ５４９１０７６）。異種サブゲノムプロモーターに基づいて構築されたウイルスベクターを利用する発現プロセスは、今までで最も高レベルのタンパク質産生を提供する（ＵＳ５３１６９３１）。ウイルスベクター及びその他多くの最も重大な不利益は、増幅すべきＤＮＡのサイズに関するその限定された能力である。通常、安定な構築物は、１ｋｂ以下のインサートを収容する。植物の機能ゲノミクスのある分野では、Ｇ．ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（ＷＯ９９３６５１）が、植物ｃＤＮＡライブラリーを発現させるために、内在遺伝子のサイレンシングを目的としてＴＭＶをベースとしたウイルスベクターを使用したことについて記載したように、これはさほど重要な限定ではないかもしれない。ヘルペスウイルスを使用する２成分増幅システムはわずかによい能力を与えることができる（ＵＳ５８８９１９１）。植物ゲノムに安定に組み込まれる発現カセットに基づいた他のシステムは、ウイルスベクターをベースとしたアンプリコンの発現を駆動する強力な３５Ｓプロモーターを含有する。これらのシステムは通常翻訳後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）に付される（Ａｎｇｅｌｌ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、１９９７、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６、３６７５−３６８４）。ＰＴＧＳサプレッサーの使用は、このようなサイレンシングを克服するのに必要である（ＷＯ０１３８５１２）。そのようなシステムによって目的タンパク質の大規模産生を達成するには、サイレンスアンプリコンを有する植物と、ＰＴＧＳサプレッサー源を有する植物とのあいだで交配を実施する必要がある（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５）。明らかに、そのようなシステムは、トランス遺伝子の発現に対する柔軟性も厳重な制御もなく、植物の成長及び発生を傷つけないタンパク質の産生に制限されている。
【００５３】
我々のシステムは、上記ウイルスベクターシステムの限定、特に発現すべき遺伝子のサイズに関する限定された能力及び発現を制御する上での柔軟性の欠如を克服することを可能にする。本発明では、ウイルスベクター前駆体（プロベクターともいう）がトランスジェニック植物の各細胞に存在することが好ましい。大きい遺伝子（１ｋｂ以上）を発現する場合、タンパク質スイッチの移行はウイルスベクターの移行よりも好ましい。ウイルスベクターは細胞内で効率的に増幅することができ、ウイルスベクターのインサートサイズは細胞間移行及び浸透移行の能力にほとんど影響を及ぼす。したがって、宿主植物の多くの細胞又はほとんど全ての細胞に対し、ウイルスベクターを活性化できる移行可能タンパク質スイッチを提供することにより、上記問題を解決するであろう。更に、全てではないにしてもほとんどの宿主植物の細胞においてそのようなウイルスベクターの増幅スイッチを入れることが可能な効率的なスイッチ機能を有するシステムを提供するために、細胞間移行/浸透移行可能なタンパク質スイッチが本発明に使用される。
【００５４】
この目的のために、タンパク質スイッチは、前記タンパク質の細胞間移行及び／又は浸透移行を可能にするタンパク質部分を含有してもよい。細胞間輸送可能なそうしたタンパク質部分の例は、当該技術分野で公知である。植物転写因子、防御関連タンパク質及びウイルスタンパク質が原形質連絡を通してできることを示す証拠がある（総説として：Ｊａｃｋｓｏｎ＆Ｈａｋｅ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７、４９５−５００；Ｄｉｎｇ、Ｂ．１９９８、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８、２７９−３１０；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＲＡ．２０００、Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ、５８、ＰＥ２；Ｇｏｌｚ＆Ｈｕｄｓｏｎ、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１４、Ｓ２７７−Ｓ２８８）。キュウリモザイクウイルスの３ａ移行タンパク質とＧＦＰとの融合物が原形質連絡を介して隣接細胞へ輸送できることが示された（Ｉｔａｙａら、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１４、２０７１−２０８３）。そのような融合物も、師部を通るトランスジェニック台木から非トランスジェニック接ぎ穂への移行を示した。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の移行タンパク質Ｐ３０は、原形質連絡を通して細胞間を輸送し、原形質連絡サイズに影響を及ぼすことにより、そのような移行に関して特定されていない他の多くの高分子の移行を容易にする（Ｃｉｔｏｖｓｋｙら、１９９９、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ  Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．３５４、６３７−６４３；Ｄｉｎｇ、Ｉｔａｙａ＆Ｗｏｏ、１９９９、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９０、２５１−３１６）。Ｐ３０：ＧＦＰ融合物は、生理的条件とは無関係に細胞間の移行を示したが、非標的化ＧＦＰは、植物細胞の生理的状態に大いに依存して原形質連絡を通して拡散した（Ｃｒａｗｆｏｒｄ＆Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２５、１８０２−１８１２）。ＧＦＰと転写因子ｋｎｏｔｔｅｄ１との融合物も、細胞間輸送能を示した。ＧＦＰ：ＫＮ１融合タンパク質は、タバコ植物の葉の内部組織から表皮へ、表皮細胞間の、及び茎頂分裂組織への移行を証明した（Ｋｉｍら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９、４１０３−４１０８）。原形質連絡はそのような輸送に重要な役割を果たす。そしてその生理学的状態及び構造はそうした輸送効率に重要である。例えば、単純な原形質連絡は、タバコの葉が発育する際に、タンパク質の非特異的輸送を可能にするが、枝分かれしたものはできない（Ｏｐａｒｋａら、１９９９、Ｃｅｌｌ、９８、５−８）。タンパク質を含めた高分子の輸送を可能にすることは、植物ウイルスが細胞間伝播のために利用した原形質連絡の正常な機能であるように見える（Ｆｕｊｉｗａｒａら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、５、１７８３−１７９４）。一般に、原形質連絡及び師部が情報高分子（タンパク質及び核酸）の輸送及び送達に重要な役割を果たすことは明らかである（Ｒｕｉｚ−Ｍｅｄｒａｎｏら、２００１、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ、４、２０２−２０９）。カボチャ・マキシマ（maxima）及びトウゴマ由来の師部ｓａｐタンパク質は、原形質連絡を通した細胞間輸送能を有する（Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎら���１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４、１４１５０−１４１５５）。
【００５５】
図８は、本発明のタンパク質スイッチの細胞間移行を達成する可能性を概略的に示す。外部より送達されるタンパク質スイッチ（即ち前記ポリペプチド）及び細胞内で合成されたタンパク質スイッチは、移行シグナル又は輸送シグナルに対する同一の又は異なるタンパク質セグメントの融合物であり得る。我々の実験では（図８）、同一タンパク質セグメント、例えばリコンビナーゼが、細胞膜透過性のために膜移行シグナル（ＭＴＳ）と融合して本発明の前記ポリペプチドを形成するか、又は細胞間輸送を提供するタンパク質部分（ＴＰ）と融合して前記タンパク質スイッチを形成する。小さいタンパク質（ＧＦＰ及びそれより小さい）に関し、単純な拡散によって高率に細胞間移行可能であり得るため、ＴＰとの融合は必要ないように思われる。しかしながら、より大きいタンパク質スイッチに関しては、ＴＰ又はその活性断片との融合は有益である。細胞間輸送に関与する全てのタンパク質の中で、ウイルスタンパク質が最も研究されていることは明らかである。それらはタンパク質スイッチに包含される最も好ましい候補である。図８に示すように、外部より送達されるポリペプチドは、同一酵素活性を有するが、細胞間輸送可能であるタンパク質スイッチ（リコンビナーゼ：ＴＰ）をコードするトランス遺伝子の発現を誘発することができる。輸送可能な前記タンパク質スイッチは、影響を受けた全ての細胞内でタンパク質スイッチの発現を誘発することができ、連鎖反応を表す。前記タンパク質スイッチの細胞内における利用可能性は、ＤＮＡ再構成によって細胞内で目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現を誘発するための必須条件であり、ウイルスベクターをベースとしたアンプリコン形成を引き起こす。そのようなアンプリコンから発現する目的遺伝子のサイズは、アンプリコンの安定性及び細胞間移行はこのシステムでは不要であるため、効率的ＧＯＩ発現のための限定要因ではない：ウイルスプロベクターは各植物細胞に存在することができ、タンパク質スイッチの伝播はこれらの細胞のそれぞれにおいて目的遺伝子発現を誘発することができる。しかしながら、アンプリコンの伝播は効率的なＧＯＩ発現に貢献することが好ましい。
【００５６】
本明細書において意図されるタンパク質スイッチシステムの最終目的は、植物産生システムにおける目的細胞プロセス又は目的生化学反応カスケードのいつでも使える制御である。生化学的カスケードは、最終的に特定の目的産物、効果又は形質を生ずる宿主産生システムにおける生化学反応の連鎖である。
【００５７】
本明細書に記載されるアプローチは、多目的で、漏出性について保証付きであることに加えて、効率的な産生制御法を提供するものである。上記２成分プロセスは、本質的に「キーロック」システムであり、企業はタンパク質スイッチ成分を販売することにより効率的に産生へのアクセスを制御することができる。
【００５８】
本発明での使用に好ましい植物には、あらゆる植物種が含まれ、農学的及び園芸学的に重要な種が好ましい。本発明に使用される一般作物には、アルファルファ、大麦、マメ、アブラナ、カウピー、ワタ、トウモロコシ、クローバー、ハス、ヒラマメ、ルビナス、キビ、エンバク、エンドウ、ラッカセイ、コメ、ライ麦、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、大豆、サトウモロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、小麦、フジ、及びナッツ植物が含まれる。本発明を実施するのに好ましい植物種には、イネ科、キク科、ナス科及びバラ科の代表種が含まれる。ナス科が好ましい。
【００５９】
更に、上で特定したものに加えて本発明に使用される好ましい種は、以下の属：シロイヌナズチ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ラッカセイ、クサスギカズラ、オオカミナスビ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、スズメノチャヒキ、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、アカザ、キクニガナ、ミカン、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ニンジン、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オヒシバ、ウシノケグサ、イチゴ、フクロソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、オオムギ、ヒヨス、サツマイモ、アキノノゲン、ヒラマメ、ユリ、アマ、ドクムギ、ミヤコグサ、トマト、ハナハッカ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、イネ、キビ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、エンドウ、インゲン、アワガエリ、イチゴツナキ、サクラ、キンポウゲ、ダイコン、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、ライムギ、セネシオ、エノコログサ、シロガラシ、ナス、モロコシ、イヌシバ、カカオ、シャジクソウ、レイリョウコウ、コムギ、ソラマメ、ササゲ、ブドウ、トウモロコシと、Olyreae科、Pharoideae科からの植物とその他の多くの種である。
【００６０】
本発明の範囲内では、食物または飼料連鎖内に含まれない植物種は、医薬及び技術的タンパク質産生に特に好ましい。これらの中で、タバコ種は十分に開発された発現ベクター（特にウイルスベクター）システムで容易に形質転換及び培養ができるため、最も好ましい。
【００６１】
目的細胞プロセスとして発現され、本発明を用いて単離され得る目的遺伝子、それらの断片(機能性又は非機能性)及びそれらの人工誘導体には、限定されるものではないが：デンプン修飾酵素（デンプンシンターゼ、デンプンリン酸化酵素、脱分枝酵素、デンプン分枝酵素、デンプン分枝酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプンシンターゼ）、スクロースリン酸シンターゼ、スクロースホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ、グリコーゲンシンターゼ、ペクチンエステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミンシンターゼ、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ/インテグラー（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼｐｈｉＣ３１、又はこれらの活性断片若しくは変異体）、イソペンテニルトランスフェラーゼ、Ｓｃａ  Ｍ５（大豆カルモジュリン）、鞘翅類型の毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン共役酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖を代謝する酵素、スーパーオキシドジスムターゼ、プロテアーゼの不活性プロ酵素型、植物タンパク質毒素、繊維産生植物において繊維を改変させる形質、バチルス・スリンギエンシス由来の鞘翅類活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、デルタエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシン等）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、Acidothermus celluloticus由来Ｅ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シンナモイルアルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸シンターゼ、サイトキニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、大腸菌の無機ピロホスファターゼ、種子の貯蔵タンパク質、エルウィニア・ヘルビコーラ  リコペンシンターゼ、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭコードタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシ酪酸）シンターゼ、アシルキャリヤータンパク質、ナピン、ＥＡ９、非高等植物フィトエンシンターゼ、ｐＴＯＭ５コードタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、プラスチドのピルビン酸リン酸ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通孔タンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベンシンターゼ、フェノールを水酸化することが可能な酵素、カテコールジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコン酸（chloromuconate）シクロイソメラーゼ、アントラニル酸シンターゼ、Brassica ＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース１，６−ビスホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ  ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポリウイルス外被タンパク質、ＣＭＶ外被タンパク質、ＴＭＶ外被タンパク質、ルテオウイルスレプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、突然変異体ジェミニウイルスレプリカーゼ、Umbellularia californica Ｃ１２：０選好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１��：０選好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選好性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物シンターゼＡ因子、植物シンターゼＢ因子、Ｄ６−デサチュラーゼ、植物細胞における脂肪酸のペルオキシゾームｂ−酸化に酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシアセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を与えるＤＰＨＳ酵素、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄモノオキシゲナーゼ、アセト酢酸シンターゼ又はアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼ等が含まれる細菌又はファージの他の多くの酵素が含まれる。
【００６２】
本発明は、分子農業、並びに工業用酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ等）及び繊維タンパク質（コラーゲン、クモ絹糸タンパク質等）を含めた商業的に価値が有り医薬的にも重要なタンパク質の精製目的にも用いることができる。ヒト又は動物のいかなる健常タンパク質も、本発明のアプローチにおいて記載したものを用いて発現させ、精製することができる。そのような目的タンパク質の例には、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体Ｔ細胞受容体など）、病原微生物由来のものを含めた抗原、コロニー刺激因子、リラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含めたポリペプチドホルモン、サイトカイン及びそれらの受容体、インターフェロン、増殖因子及び凝固因子、酵素活性のあるリソソーム酵素、線維溶解ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、並びに上記タンパク質の融合物、突然変異型及び合成誘導体のような機能保存タンパク質が含まれる。
【実施例１】
【００６３】
植物ゲノムに安定に組み込まれたプロベクター部分から増殖ベクターを組み立てるための、タンパク質スイッチによって誘発される部位特異的ＤＮＡ組換えの使用
２つのプロベクター部分を有するＴ−ＤＮＡをもつ２元ベクターｐＩＣＨＦＰｉｎｖ（図７）を、標準の分子生物学技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２、分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク）を用いて設計した。プロベクター配列並びに構築物及び機能の基本原理に関する記載は、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／０３４７６（ＷＯ０２０８８３６９）及びＤＥ１０１２１２８３に詳細に記載されている。ベクターは、形質転換マーカー（ＮＰＴＩＩ遺伝子）、シロイヌナズナアクチン２遺伝子の植物プロモーター（Ａｎら、１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１０、１０７−１２１）に先行されたＴＭＶの５’端を有し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、及びサブゲノムプロモーターが後に続く移行タンパク質（ＭＰ）を含有する。ベクターは、目的遺伝子（ＧＦＰ）、浸透移行を提供するウイルス外被タンパク質（ＣＰ）、及びウイルスベクターの３’−非翻訳領域（３’ＮＴＲ）を含有する、プロベクターの３’末端も含有する。３’プロベクターは、２つの転写終結シグナルとともに、ファージインテグラーゼｐｈｉＣ３１に認識される組換え部位によって隣接される（Ｔｈｏｍａｓｏｎ、Ｃａｌｅｎｄａｒ＆Ｏｗ、２００１、Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２６５、１０３１−１０３８）。
【００６４】
ｐＩＣＨＧＦＰｉｎｖのＴ−ＤＮＡを含有するトランスジェニックタバコ・ベンサミアナ植物は、Ｈｏｒｓｃｈら（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２９−１３１）に記載されるように、葉ディスクをアグロバクテリウム介在形質転換することによって得た。葉ディスクを、目的構築物で形質転換したアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１とともに３０分間インキュベートした。選択物質を含まない培地（ＭＳ培地  ０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／ｌ  ＢＡＰ）で３日間インキュベーション後、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加した同一ＭＳ培地で形質転換体の選択を行なった。アグロバクテリウムの成長を抑えるため、培地に３００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び３００ｍｇ／Ｌセフォタキシムも添加した。再生物をホルモン添加はしていないが同一濃度の選択物質を含む選択ＭＳ培地でインキュベートし、発根を誘導した。分離Ｔ２集団におけるトランス遺伝子の存在を、ＰＣＲ解析で確認した。
【００６５】
選択した膜移行シグナル（ＭＴＳ）に融合した細胞透過性インテグラーゼ又はリコンビナーゼを産生するために、プロベクターシステム（ＷＯ０２０８８３６９）のための構築物セットを、標準の分子生物学技術にしたがって作製した（図９を参照されたい）。インテグラーゼｐｈｉＣ３１をＮ．ベンサミアナの葉で産生させ、前記インテグラーゼをＨＩＶ−Ｔａｔ４８−６０のＭＴＳ（Ｗｅｎｄｅｒら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３００３−１３００８）、又はカポジ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ＭＴＳ（Ｌｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１４２５５−１４２５８）と融合させた。感染したＮ．ベンサミアナの葉からの粗製タンパク質抽出物を、ｐＩＣＨＧＦＰｉｎｖのＴ−ＤＮＡで形質転換したトランスジェニック植物の処置に用いた。植物細胞壁の透過を容易にするために、いくつかの実験ではインテグラーゼを含有する粗製タンパク質抽出物へ細胞溶解酵素を添加した。０、００１％セルラーゼ  オノズカＲ−１０（Ｓｅｒｖａ）を用いてＭＴＳ−インテグラーゼ融合物の植物細胞への送達効率を高めた。
【００６６】
トランスジェニック植物の葉を細胞透過性インテグラーゼに曝露することにより、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位のあいだに部位特異的組換えを引き起こす。そのような組換えは３’プロベクターの逆転をもたらし、ウイルスアンプリコンの完全ｃＤＮＡをアクチン２プロモーターの制御下に作製する（図７Ｂ）。ＧＦＰを発現するＴＭＶをベースとしたＲＮＡアンプリコンは、細胞間移行及び浸透移行することができる。Ｎ．ベンサミアナ植物中でのＧＦＰ発現は、ＵＶランプを用いることにより、又はライカ立体蛍光顕微鏡システム下（４５０〜４９０ｎｍで励起、５００〜５５０ｎｍで発光）で植物組織を解析することにより容易に検出することができる。実験に用いたｓＧＦＰは、青色光及びＵＶ光で励起させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は本発明の方法のスキームである。
【図２】図２は本発明の方法の概略図であり、ポリペプチドは活性（機能性）タンパク質（ＡＢ）であり、Ｃは異種ＤＮＡ及びその発現産物（ＲＮＡ又はタンパク質）を示す。ＲＮＡはリボソームに結合した状態で示されている。植物の細胞では、活性タンパク質（ＡＢ）は、目的細胞プロセスのスイッチを入れるために、（１）前記異種核酸、（２）ＲＮＡ発現産物、又は（３）前記異種核酸のタンパク質発現産物と相互作用することができる。
【図３】図３は本発明の方法の概略図であり、前記ポリペプチドは非機能性タンパク質（ＡＢ）であり、植物細胞への直接導入後、異種核酸Ｃにコードされる因子の影響下で活性化型Ａ’Ｂ’に変換される。Ｄは、タンパク質Ａ’Ｂ’の標的とされ、これにより目的細胞プロセスのスイッチが入る追加の異種核酸（又はそのＲＮＡ若しくはタンパク質発現産物）を示す。前記活性化型Ａ’Ｂ’への変換は、例えば、Ｃの発現産物の酵素活性によって又はインテイン介在トランススプライシングによって生ずることができる。
【図４】図４は、植物細胞において不活性タンパク質断片から活性タンパク質スイッチが生ずる態様を示すスキームである。Ａ：タンパク質断片のインテイン介在トランススプライシングによる活性タンパク質スイッチの産生。Ｂ：タンパク質断片の親和性結合による活性タンパク質スイッチの産生。
【図５】図５は、インテイン介在トランススプライシング（図５Ａ）又は親和性相互作用（図５Ｂ）による非機能性タンパク質断片Ａ及びＢからの機能性タンパク質（ＡＢ）の組み立てを示すスキームである。断片Ａは細胞に取り込まれる本発明のポリペプチドである。断片Ｂは内部で異種核酸から発現する。
【図６】図６は、細胞間輸送及び他の細胞でそれ自身の発現を引き起こすことが可能なタンパク質スイッチを介して目的細胞プロセスのスイッチが入ることを示す一般的スキームである。ＰＳはタンパク質スイッチを意味し、ＴＰは細胞間輸送（即ち、１つの細胞を出て他の細胞へ入ること）が可能な輸送タンパク質を意味し、ＰＳ：ＴＰはＰＳ−ＴＰ融合タンパク質を意味し、ｈＮＡは追加の異種核酸を意味する。（Ａ）はＰＳ：ＴＰをコードする異種核酸及び追加の異種核酸ｈＮＡを表す。外部ポリペプチドは導入されていない。したがって、タンパク質スイッチは発現しておらず、目的細胞プロセスのスイッチは入っていない。（Ｂ）  タンパク質スイッチＰＳ：ＴＰの発現を引き起こす外部（細胞透過性）ポリペプチドが導入されている。タンパク質スイッチは、それが発現した細胞においてｈＮＡに作用することによって細胞プロセスを制御することができる。更に、タンパク質スイッチは、前記外部より導入されたポリペプチドによって誘発された細胞を出て、他の細胞へ入ることができる。他の細胞では、タンパク質スイッチは、ｈＮＡに作用することによって、それ自身の発現を誘導し、細胞プロセスを制御することもできる。（Ｃ）は、２つのタンパク質スイッチ：ＰＳ１及びＰＳ２をコードする異種核酸を表す。ＰＳ１の発現は外部より適用されるシグナル（本発明のポリペプチド）によって引き起こされ、ＰＳ１：ＴＰを生ずる。上記のように、ＰＳ１：ＴＰは他の細胞へ伝播し、ＰＳ２の発現を活性化することができる。ＰＳ２は次にｈＮＡに作用することによって細胞プロセスを制御することができる。
【図７】図７は、（Ａ）非機能性のＴＭＶをベースとしたプロベクターを含有する構築物ｐＩＣＨＧＦＰｉｎｖ及び（Ｂ）インテグラーゼ−介在組換えで生ずる前記構築物の機能性誘導体を表す。下部の矢印は、（Ｂ）に示す構築物から形成され得るＲＮＡ及びサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡをその方向と共に示す。ｓｇｐはサブゲノムプロモーターを意味する。
【図８】図８は、本発明の方法を概略的に示すものであり、細胞透過性ポリペプチド（ＭＴＳ：リコンビナーゼ）は標的細胞内で組換え事象を誘発し、異種核酸（リコンビナーゼをコードする構築物：ＴＰ）から、細胞間輸送可能なタンパク質スイッチ（リコンビナーゼ：ＴＰ）の形成を生ずる。タンパク質スイッチは更に組換え事象を誘発することができ、植物ウイルスをベースとしたプロベクター（本発明の追加の異種核酸）の再構成をもたらし、目的遺伝子（ＧＯＩ）の発現を生ずる。ＭＴＳ：膜移行配列；ＴＰ：細胞間輸送可能なタンパク質；ＳＭ：選択可能マーカー；ＲＳ：部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ／インテグラーゼによって認識される組換え部位；ｔｅｒ１及びｔｅｒ２：転写終結領域；ＰＲＯＭ：植物において活性なプロモーター；ＲｄＲｐ：ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ：移行タンパク質；３’ＮＴＲ：植物ＲＮＡウイルスの３’非翻訳領域。矢印はコード配列及び調節配列の方向を示す。
【図９】図９は、膜移行シグナル（ＭＴＳ）に融合したインテグラーゼｐｈｉＣ３１タンパク質を産生するベクターを示す。ベクターｐＩＣＨ１３１８０及びｐＩＣＨ１３１９０は、ＴＭＶをベースとしたベクターの５’端を、選択したＭＴＳとともに含有し、インテグラーゼｐｈｉＣ３１をコードするＴＭＶをベースとしたベクターの３’端を、そのＣ末端に核移行シグナル（ＮＬＳ）とともに含有するベクター（ｐＩＣＨ１３５９１）との部位特異的組換え介在組み立てのために設計されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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