(57)【要約】腎細胞癌のサブタイプ中に示差的に発現される遺伝子をそのポリペプチド産物として開示する。本情報を利用して核酸および抗体プローブおよびこれらの遺伝子およびその産物に特異的なこのようなプローブのセットを作成する。ハイブリダイゼーションおよび免疫学的方法を包含するこれらのプローブを用いた方法を用いて、癌のサブタイプに特徴的なこのような遺伝子の示差的な発現に基づいて対象に由来する腎細胞腫瘍試料のサブタイプを決定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記成分：
（ａ）配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号５；および／または配列番号６により表される単離された核酸１、２、３、４または５つ（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；または該配列の少なくとも約１０連続ヌクレオチドを含むこれらのフラグメント、および／または、
（ｂ）配列番号３１；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；および／または配列番号３６により表される単離された核酸１、２、３、４または５つ；または該配列の少なくとも約１０連続ヌクレオチドを含むこれらのフラグメント、および／または、
（ｃ）配列番号６１；配列番号６２；配列番号６４；配列番号６５；および／または配列番号６６により表される単離された核酸１、２、３、４または５つ；または該配列の少なくとも約１０連続ヌクレオチドを含むこれらのフラグメント、および／または、
（ｄ）配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；および／または配列番号９５により表される単離された核酸１、２、３、４または５つ（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；または該配列の少なくとも約１０連続ヌクレオチドを含むこれらのフラグメント、および／または、
（ｅ）配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；および／または配列番号１２５により表される単離された核酸１、２、３、４または５つ；または該配列の少なくとも約１０連続ヌクレオチドを含むこれらのフラグメント、および／または、
（ｆ）配列番号１９４および／または配列番号１９５により表される単離された核酸１つまたは２つ；または該配列の少なくとも約１０連続ヌクレオチドを含むこれらのフラグメント；
を含む、組成物。
【請求項２】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の各々が記載された前記核酸の５つ全てを含み、そして、（ｆ）が前記核酸の両方を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
水溶液の形態の請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
アレイの形態の請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも約９００の核酸を含む請求項５に記載のアレイ。
【請求項６】
核酸プローブ２つ以上のセットを含む組成物であって、その各々が明細胞腎細胞癌（ＣＣ−ＲＣＣ）、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性／膨大細胞腫ＲＣＣ、肉腫様ＲＣＣ、ＴＣＣまたはウィルムス腫において過剰発現されるコーディング配列の部分または全てにハイブリダイズし、その過剰発現がベースライン値との比較に基づくものである、組成物。
【請求項７】
前記ベースライン値が（ｉ）腫瘍組織の採取元である対象、または、（ｉｉ）１または２の健常な個体、に由来する正常な腎組織中の前記コーディング配列の発現である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
アレイの形態である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸１つ以上が、ホスホロチオエート、ホスホリドチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジイミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、３’−アミノプロピル、ホルムアセタールまたはその類縁体から選択される、修飾されたホスフェート骨格少なくとも１つを有するヌクレオチドを含む請求項１または６に記載の組成物。
【請求項１０】
発現された遺伝子を示す試料に由来するポリヌクレオチド１つ以上をアレイの核酸１つ以上に結合させた状態で更に含む請求項５または８に記載のアレイであって、該試料が個体対象の腎臓腫瘍から、正常組織から、または、腫瘍および正常組織の両方に由来する、アレイ。
【請求項１１】
前記アレイの核酸が発現された遺伝子を示す試料に由来するポリヌクレオチド１つ以上に高ストリンジェンシーな条件下にハイブリダイズしている、請求項５または８に記載のアレイであって、該試料が個体対象の腎臓腫瘍から、正常組織から、または、腫瘍および正常組織の両方に由来する、アレイ。
【請求項１３】
前記単離された核酸が哺乳類起源のものである、請求項１または６に記載の組成物。
【請求項１４】
前記単離された核酸がヒト起源のものである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
下記成分：
（ａ）以下の単離されたポリペプチド：配列番号１９６；配列番号１９７；配列番号１９８；配列番号１９９または２００；および／または配列番号２０１の１、２、３、４または５つ、または該ポリペプチドの抗原性フラグメント、および／または、
（ｂ）以下の単離されたポリペプチド：配列番号２２１；配列番号２２２；配列番号２２３；配列番号２２４；および／または配列番号２２５の１、２、３、４または５つ、またはその抗原性フラグメント、および／または、
（ｃ）以下の単離されたポリペプチド：配列番号２４８；配列番号２４９；配列番号２５０；配列番号２５１；および／または配列番号２５２の１、２、３、４または５つ、またはその抗原性フラグメント、および／または、
（ｄ）以下の単離されたポリペプチド：（ｉ）ヌクレオチド配列である配列番号９１（ユビキチンチオエステラーゼ）を含むＯＲＦによりコードされるポリペプチド；（ｉｉ）配列番号２７１または２７２；（ｉｉｉ）配列番号２７３；（ｉｖ）配列番号９４（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓα−１（ＶＩ）コラーゲン）のＯＲＦによりコードされるポリペプチド；および／または（ｖ）配列番号２７４の１、２、３、４または５つ、または該ポリペプチドの抗原性フラグメント、および／または、
（ｅ）以下の核酸：（ｉ）配列番号１２０（ケラチン１４）；（ｉｉ）配列番号１２１（コラーゲンＶＩＩ型、α１）；（ｉｉｉ）配列番号１２２（ケラチン１９）；（ｉｖ）配列番号１２３（プレキシンＢ３）；および（ｖ）配列番号１２５（インテグリンβ４）を含むＯＲＦによりコードされるポリペプチドの１、２、３、４または５つ；またはその抗原性フラグメント、および／または、
（ｆ）核酸である配列１９４（ヘパリンスルフェートプロテオグリカン）および／または配列番号１９５（ＩＧＦＩＩ）によりコードされる単離されたポリペプチド１つまたは２つ；またはその抗原性フラグメント；
を含む、組成物。
【請求項１６】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の各々が記載されたポリペプチドの５つ全てを含み、そして、（ｆ）が前記ポリペプチドの両方を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の組成物のポリペプチドまたはフラグメントに特異的な抗体を含む組成物。
【請求項１８】
アレイの形態の請求項１９に記載の組成物。
【請求項１９】
下記工程：
（ａ）腎臓癌の試料のポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーな条件下で請求項１に記載の組成物の核酸をハイブリダイズさせること；および、
（ｂ）ベースライン値に対して該組成物の該核酸にハイブリダイズした該試料ポリヌクレオチドの量を比較すること；
を含み、ハイブリダイズした試料ポリヌクレオチドの量が該腎腫瘍中のポリヌクレオチドの発現のレベルを示すものである、対象における腎臓癌のサブタイプを決定するための方法。
【請求項２０】
前記核酸組成物がアレイの形態である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法であって、
（ａ）表１に記載された核酸１つ以上へのそのハイブリダイゼーションにより決定した場合に、前記試料ポリヌクレオチドの発現が前記ベースライン値と比較してアップレギュレートされている場合に、腎腫瘍は明細胞ＲＣＣであり；
（ｂ）表２に記載された核酸１つ以上へのそのハイブリダイゼーションにより決定した場合に、該試料ポリヌクレオチドの発現が前記ベースライン値と比較してアップレギュレートされている場合に、該腎腫瘍は乳頭状ＲＣＣであり；
（ｃ）表３に記載された核酸１つ以上へのそのハイブリダイゼーションにより決定した場合に、該試料ポリヌクレオチドの発現が前記ベースライン値と比較してアップレギュレートされている場合に、該腎腫瘍は嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫であり；
（ｄ）表５に記載された核酸１つ以上へのそのハイブリダイゼーションにより決定した場合に、該試料ポリヌクレオチドの発現が前記ベースライン値と比較してアップレギュレートされている場合に、該腎腫瘍は肉腫様ＲＣＣであり；
（ｅ）表６に記載された核酸１つ以上へのそのハイブリダイゼーションにより決定した場合に、該試料ポリヌクレオチドの発現が前記ベースライン値と比較してアップレギュレートされている場合に、該腎腫瘍は移行上皮癌であり；そして、
（ｆ）配列番号１９４または配列番号１９５によって示された核酸１つ以上へのそのハイブリダイゼーションにより反映される、該試料ポリヌクレオチドの発現が前記ベースライン値と比較してアップレギュレートされている場合に、該腎腫瘍はウィルムス腫である；
方法。
【請求項２２】
前記試料ポリヌクレオチドが検出可能な標識により標識されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
下記工程：
（ａ）抗体がポリペプチドに特異的に結合するために有効な条件下で、腎臓癌から得たポリペプチド試料に請求項１７の抗体組成物を接触させること；および、
（ｂ）該結合の量をベースライン値と比較すること、
を含み、
該特異的抗体への該試料ポリペプチドの結合の量が該腎腫瘍におけるポリペプチドの発現のレベルを示すものであり、
該発現のレベルが腎臓癌のサブタイプに特徴的である、
対象における腎臓癌のサブタイプを決定するための、方法。
【請求項２５】
下記成分：
（ａ）請求項１または６の核酸組成物；および、場合により、
（ｂ）試料ポリヌクレオチドへの組成物の核酸のハイブリダイゼーションを促進し、および／または該ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの検出を促進する試薬１つ以上；
を含む、腎臓癌のサブタイプを示す腎腫瘍試料中のポリヌクレオチドの存在および／または量を検出するための、キット。
【請求項２６】
前記核酸組成物がアレイの形態である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
下記成分：
（ａ）請求項１７に記載の抗体組成物；および、場合により、
（ｂ）試料ポリペプチドへの組成物の抗体の結合を促進し、および／または該抗体結合の検出を促進する試薬１つ以上；
を含む、腎臓癌のサブタイプを示す腎腫瘍試料中のポリペプチドの存在および／または量を検出するための、キット。
【請求項２８】
前記核酸組成物がアレイの形態である、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子生物学および医学分野における本発明は、例えば腎臓癌の特定の型の遺伝子発現プロファイリング、および、例えば患者における診断マーカーを発見するためのプロファイルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎細胞癌（ＲＣＣ）は成人の腎臓の最も一般的な悪性疾患であり、全悪性疾患の２％および癌関連死亡例の２％に相当する。ＲＣＣの発生率は増大しており、その増大は腹部画像化操作法のみの使用の増大により説明することはできない（Ｃｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  １９９９；２８１（１７）：１６２８−３１）。
【０００３】
ＲＣＣは臨床病理学的には非均質な疾患であり、伝統的には、ＷＨＯのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｕｍｏｒｓ（Ｍｏｓｔｉｆ，ＦＫ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）に従った形態学的特徴に基づいて、明細胞、顆粒細胞、乳頭状、嫌色素性、紡錘細胞、嚢胞性、および集合管癌腫に細分される。明細胞ＲＣＣ（ＣＣ−ＲＣＣ）は最も一般的な成人の腎新生物であり、全腎新生物の７０％に相当し、近位の細管に原発すると考えられている。乳頭状ＲＣＣは１０〜１５％、嫌色素性ＲＣＣは４〜６％、集合管癌腫は＜１％、そして未分類はＲＣＣの４〜５％に相当する。紡錘細胞ＲＣＣは肉腫様ＲＣＣとも称され、顕著な紡錘細胞の外観を特徴とし、サブグループのハイグレードの端部を示すと考えられている。顆粒細胞ＲＣＣは現在の分類系ではサブタイプとはもはや考えられておらず、世界中で多くの病理学者によりなお使用されている。むしろ顆粒ＲＣＣは他のサブタイプに再分類される場合が多い（Ｓｔｏｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １９９７；８０：９８７−９）。
【０００４】
最近の分子遺伝子学の進歩により、ＲＣＣのサブタイプは異なる遺伝子的異常に関連付けられている。この関連はＲＣＣの分子診断の提案をもたらした（Ｂｕｒｇｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９６；１４９：２０８１−２０８８）。例えば明細胞ＲＣＣの大部分は染色体３の消失およびＶＨＬ遺伝子の不活性化突然変異を有するのに対し、乳頭状ＲＣＣはしばしば染色体３ｑ、７、１２、１６、１７および２０のトリソミーおよびＹ染色体の消失に関連付けられている。これらの部分はまたＭＥＴ突然変異も有している。顕著な乳頭の非存在下であっても、これらの異常な染色体の特徴は乳頭状ＲＣＣの診断の根拠となっている。逆に、これらの遺伝子的特徴を有さない腎臓癌は乳頭状の構造が顕著である場合も乳頭状ＲＣＣとは記載しない（Ｓｔｏｒｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７、前出）。性染色体、染色体１および１４の頻繁な消失は腺房状配置大型好酸球よりなる稀に転移する実体である腎膨大細胞腫において検出されている（Ｐｒｅｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９６；１７：１９９−２０４）。腎腫瘍の正確なサブタイプ決定は予後および患者の治療方法の策定のために重要である。
【０００５】
マイクロアレイ手法は癌の多くの型の伏在する分子機序に洞察を与える。マイクロアレイ手法により得られる遺伝子発現のプロファイルは癌の分子シグニチャーとして機能でき、そして組織学的サブタイプの判別並びに臨床パラメーターに相関する新しい異なるサブタイプの発見のために使用してよい。このような判別は例えば形質転換の機序、細胞型または腫瘍間での攻撃性における非均質性を反映している。例えば、約１００遺伝子が漿液性卵巣癌において粘液性癌腫と比較して示差的に発現されているものとして発見されている（Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；６０（１８）：５００７−１１）。他の試験によれば、急性骨髄性白血病と急性リンパ芽球白血病との間（Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；２８６：５３１−５３７）、ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２突然変異を有する遺伝性の乳癌の間（Ｈｅｄｅｎｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ２００１；３４４：５３９−５４８）、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の陽性肝細胞癌との間（Ｏｋａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；６１：２１２９−３７）および良好と不良の予後を有する瀰漫性大細胞Ｂリンパ腫との間を判別する異なる遺伝子セットが発見されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般的にＲＣＣの診断は組織学的分析により現在は行われている。身体画像化方法、例えば超音波診断法、ＣＴスキャンおよびＸ線もまた使用されている。これらの治療様式種々の型のＲＣＣを十分判別する能力を欠いており、そして、場合によっては時間と労力を要する。ＲＣＣの顕著な非均質性は診断および治療に多大な困難をもたらしている。これが予後を複雑化し、そしてもっとも適切な治療法の選択を妨害している。ＲＣＣの型の示差のための使用可能な診断方法を細くすることができる別の方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の説明）
本発明は特定のサブタイプのＲＣＣ、例えばＣＣ−ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫、肉腫様ＲＣＣ、ＴＣＣまたはウィルムス腫（ＷＴ）の大部分においてベースライン値と比較して発現がアップレギュレートされる遺伝子および遺伝子産物（分子マーカー）の発見に関する。本明細書においては「ベースライン値」という用語は例えばＲＣＣからの試料と同時に、または遺伝子データベースから入手可能な、同一の対象から、または、正常対象の「プール」から得られるもの等の、ＲＣＣまたは正常な腎臓組織の他の型における発現を包含する。例えば、約３０の分子マーカーが、試験した他のサブタイプまたは正常な腎臓組織よりもＣＣ−ＲＣＣにおいて有意により高度に発現されるものとして本明細書においては発見され；約３０のそのような分子マーカーが乳頭状ＲＣＣにおいて発見され；約３０のそのような分子マーカーが嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫ＲＣＣにおいて発見され；約２９のそのような分子マーカーが肉腫様ＲＣＣにおいて発見され；約７４のそのような分子マーカーがＴＣＣにおいて発見され；そして約２のそのような分子マーカーがウィルムス腫において発見される。
【０００８】
これらの分子マーカー（分子シグニチャー）はＲＣＣのこれらのサブタイプの間の判別のための診断的試験のための根拠として機能する。例えば、発現された遺伝子および／またはそれによりコードされるタンパク質に特異的な抗体の１つ以上に相当する核酸プローブを用いて腎腫瘍の試料を分析することにより、どのサブタイプに腫瘍が属するかを決定することができる。この種の試験は特定の選択された遺伝子、発現された配列タグ（ＥＳＴ）、遺伝子フラグメント、ｍＲＮＡおよび本明細書に記載した他のポリヌクレオチドの示差的発現を検出することができる。好ましい実施形態においては、試料は組織（例えばパラフィン包埋ブロックの切片）または組織抽出液（例えば核酸および／またはタンパク質の調製物）である。過剰発現された遺伝子および遺伝子産物はまた治療標的、例えば腎癌のサブタイプの１つにおいて共通して過剰発現される遺伝子または活性が増強されるタンパク質を発見する機能も有する。例えば（１）遺伝子の発現を促進する細胞経路に対して作用することによるなどしてアップレギュレーションを抑制するか、（２）タンパク質産物に対して直接作用するか、または、（３）その遺伝子の産物により媒介される細胞経路における工程をバイパスする薬剤の開発に着目することができる。過剰発現された遺伝子はまた腎腫瘍の異なるサブタイプにより示されることなる代謝過程を説明するための根拠を与え、そして研究用ツールとして使用できる。
【０００９】
本発明の１つの特徴は、
（ａ）表１の配列番号１〜３０により表されるセットに属する単離された核酸少なくとも１、２、５または１０、またはこれらのフラグメントであって、その核酸がＣＣ−ＲＣＣの大部分において過剰発現（アップレギュレート）される遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするもの、および／または、
（ｂ）表２の配列番号３１〜６０により表されるセットに属する単離された核酸少なくとも１、２、５または１０、またはこれらのフラグメントであって、その核酸が乳頭状ＲＣＣの大部分において過剰発現（アップレギュレート）される遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするもの、および／または、
（ｃ）表３の配列番号６１〜９０により表されるセットに属する単離された核酸少なくとも１、２、５または１０、またはこれらのフラグメントであって、その核酸が嫌色素性ＲＣＣの大部分において過剰発現（アップレギュレート）される遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするもの、および／または、
（ｄ）表５の配列番号９１〜１１９により表されるセットに属する単離された核酸少なくとも１、２、５または１０、またはこれらのフラグメントであって、その核酸が肉腫様ＲＣＣの大部分において過剰発現（アップレギュレート）される遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするもの、および／または、
（ｅ）表６の配列番号１２０〜１９３により表されるセットに属する単離された核酸少なくとも１、２、５または１０、またはこれらのフラグメントであって、その核酸がＴＣＣの大部分において過剰発現（アップレギュレート）される遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするもの、および／または、
（ｆ）配列番号１９４および１９５により表されるセットに属する単離された核酸１または２つ、またはこれらのフラグメントであって、その核酸がウィルムス腫の大部分において過剰発現（アップレギュレート）される遺伝子の核酸に特異的にハイブリダイズするもの；
である。
【００１０】
本発明の１つの実施形態において、ＣＣ−ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性／膨大細胞腫ＲＣＣ、肉腫様ＲＣＣ、ＴＣＣまたはウィルムス腫において示差的に過剰発現されることが以前より報告されている遺伝子に相当する核酸配列は上記した組成物から除外される。
【００１１】
上記した組成物中の前記の核酸フラグメントの各々の長さは好ましくは配列の少なくとも約８または少なくとも約１５連続ヌクレオチドである。本明細書においては「好ましくは」という用語は「必須ではない」という意味とする。
【００１２】
前記した核酸（配列番号で表される）は記載されたＲＣＣサブタイプにおいて過剰発現されるポリヌクレオチドを発見（例えばハイブリダイゼーション試験による）するためのプローブとして使用できる。当業者は目的のポリヌクレオチドにやはり特異的にハイブリダイズする核酸の適当なフラグメントを選択することができる。
【００１３】
記載したとおり、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）は、核酸の記載されたセットの各々に属する（それぞれ表１、２、３、５および６に属する）例えば約５、８または１０核酸の上記の組み合わせのいずれかを含んでよい。好ましくはこのようなセット即ち「サブグループ」内の核酸は共通のコア構造、共通の機能または別の特性を共有している。
【００１４】
より詳細には、本発明の組成物の単離された核酸は下記配列群：
（ａ）配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号５；および／または配列番号６（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；および／または、
（ｂ）配列番号３１；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；および／または配列番号３６（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；および／または、
（ｃ）配列番号６１；配列番号６２；配列番号６４；配列番号６５；および／または配列番号６６（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；および／または、
（ｄ）配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；および／または配列番号９５（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；および／または、
（ｅ）配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；および／または配列番号１２５（好ましくは核酸５つ全てが存在する）；および／または、
（ｆ）配列番号１９４および／または配列番号１９５の１つまたは２つ；
および／または上記した配列の何れか１つの少なくとも約８または少なくとも約１５連続ヌクレオチドを含むフラグメント；
の各々により示される核酸の１つ、または２、３、４または５つの何れかの組み合わせを含んでよい。
【００１５】
１つの実施形態において（ｅ）における第５の核酸は配列番号１２４である。
【００１６】
本明細書においては、特段の記載が無い限り単数の表記には複数も含まれるものとする。例えば「ある」フラグメントとは、本明細書においては、１つ以上のフラグメントを意味し、これは例えば２つの異なる核酸のフラグメントを包含することができる。
【００１７】
別の特徴において本発明の組成物は核酸２つ以上のセット（例えばポリヌクレオチドプローブ）を含んでよく、その各々はＣＣ−ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性／膨大細胞腫ＲＣＣ、肉腫様ＲＣＣ、ＴＣＣまたはウィルムス腫において、ベースライン値と比較してアップレギュレート（過剰発現）されるコーディング配列の部分または全部にハイブリダイズする。組成物は例えばこれらの核酸の少なくとも約５つのセット、またはこれらの核酸の少なくとも約１０のセットを含んでよい。
【００１８】
本発明の組成物の核酸において、螺旋構造の１つ以上のホスフェートは、例えばホスホロチオエート、ホスホリドチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジイミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、３’−アミノプロピル、ホルムアセタールまたはその類縁体のように修飾されていてよい。単離された核酸は哺乳類、好ましくはヒト起源のものであってよい。
【００１９】
本発明の１つの実施形態はアレイ、好ましくはマイクロアレイの形態の分子（例えば核酸、タンパク質または抗体）を含む組成物である。アレイに関する詳細は後に記載する。核酸アレイは更にアレイの核酸１つ以上に結合した状態で発現された遺伝子を含む試料に由来するポリヌクレオチド１つ以上を含んでよい。試料は個体対象の腎臓腫瘍から、正常組織から、または両方から得たものであってよい。
１つの実施形態においては、アレイの核酸および発現された遺伝子の試料に由来するポリヌクレオチドは高ストリンジェンシーな条件下における核酸ハイブリダイゼーションに付されている（これにより、試料の特定のポリヌクレオチドに特異的なアレイの核酸がこれらのポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするようにする）。
【００２０】
「単離された」核酸（またはポリペプチド、または抗体）という用語は、本明細書においては、それが天然に存在する形態とは異なる、例えば、緩衝液中、希釈再調製用の乾燥形態、アレイ、キットまたは医薬組成物等の一部としての核酸（またはポリペプチド、または抗体）を意味する。遺伝子に「相当する」または遺伝子に「特異的な」配列とは、その遺伝子の２本鎖形態の鎖の一方と実質的に同様の（例えば高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする）配列を意味する。「特異的に」ハイブリダイズするとは、本明細書においては２成分、例えば発現された遺伝子またはポリヌクレオチドおよび核酸、例えばプローブが相互に選択的に結合し、結合を意図しない他の成分に対しては一般的に結合しないことを意味する。このような特異的な相互作用の条件は当業者が日常的に決定できるものである。
【００２１】
本発明の別の実施形態は抗体または他の選択的結合相手により認識され、それに結合できる大きさおよび構造のものであるポリペプチドを含む組み合わせ（組成物）である。典型的には、組み合わせ（組成物）は下記成分：
（ａ）表１の配列番号１〜３０により表されるセットに属する核酸により各々がコードされる単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｂ）表２の配列番号３１〜６０により表されるセットに属する核酸により各々がコードされる単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｃ）表３の配列番号６１〜９０により表されるセットに属する核酸により各々がコードされる単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｄ）表５の配列番号９１〜１１９により表されるセットに属する核酸により各々がコードされる単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｅ）表６の配列番号１２０〜１９３により表されるセットに属する核酸により各々がコードされる単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｆ）配列番号１９４および１９５により表されるセットに属する核酸により各々がコードされる単離されたポリペプチド少なくとも１または２つ、または該ポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント；
を含む。
【００２２】
上記した組み合わせ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）は、ポリペプチドの記載したセットの各々に属する例えば何れかの約５、８または１０ポリペプチドの何れかの組み合わせを含んでよい。好ましくは、このようなサブグループのポリペプチドは共通のコア構造、共通の機能または別の特性を共有している。
【００２３】
より詳細には、本発明の組成物の単離されたポリペプチドは下記配列セット：
（ａ）配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号５；および／または配列番号６（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｂ）配列番号３１；配列番号３３；配列番号３４；配列番号３５；および／または配列番号３６（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｃ）配列番号６１；配列番号６２；配列番号６４；配列番号６５；および／または配列番号６６（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｄ）配列番号９１；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９４；および／または配列番号９５（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｅ）配列番号１２０；配列番号１２１；配列番号１２２；配列番号１２３；および／または配列番号１２５（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｆ）配列番号１９４および／または配列番号１９５の１つまたは２つ；
および／または上記したポリペプチドの少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原フラグメント；
の各々により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つ、または２、３、４または５つの何れかの組み合わせを含んでよい。
【００２４】
１つの実施形態において（ｅ）における第５のポリペプチドは配列番号１２４のＯＲＦによりコードされる。
【００２５】
当業者は、上記した核酸の何れかのオープンリーディングフレームによりコードされるアミノ酸配列を容易に決定できる。
【００２６】
例えば、本発明の１つの実施形態は下記ポリペプチド：
（ａ）表１の配列番号１９６〜２２０により表されるセットに属する単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチド配列の少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｂ）表２の配列番号２２１〜２４７により表されるセットに属する単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該ポリペプチド配列の少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｃ）表３の配列番号２４８〜２７０により表されるセットに属する単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該配列の少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント、および／または、
（ｄ）表５の配列番号２７１〜２９６により表されるセットに属する単離されたポリペプチド少なくとも１、２、５または１０、または該配列の少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含む抗原性フラグメント；
を含む組み合わせ（組成物）である。
【００２７】
組成物はまた上記した核酸の１つによりコードされるものとして記載されるポリペプチド（例えばｅまたはｆのポリペプチド）の何れかを包含してよい。
【００２８】
上記した（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）は、ポリペプチドの記載したセットの各々に属する例えば何れかの約５、８または１０ポリペプチドの何れかの組み合わせを含んでよい。好ましくは（必須ではないが）、このようなサブグループのポリペプチドは共通のコア構造、共通の機能または別の特性を共有している。
【００２９】
より詳細には、本発明の組成物の単離されたポリペプチドは下記配列セット：
（ａ）配列番号１９６；配列番号１９７；配列番号１９８；配列番号１９９または２００；および／または配列番号２０１（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｂ）配列番号２２１；配列番号２２２；配列番号２２３；配列番号２２４；および／または配列番号２２５（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｃ）配列番号２４８；配列番号２４９；配列番号２５０；配列番号２５１；および／または配列番号２５２（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｄ）配列番号９１（ユビキチンチオールエステラーゼ）；配列番号２７１または２７２；配列番号２７３のＯＲＦによりコードされるポリペプチド；配列番号９４（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓα−１（ＶＩ）コラーゲン）；および／または配列番号２７４のＯＲＦによりコードされるポリペプチド（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）；および／または、
（ｅ）配列番号１２０（ケラチン１４）；または配列番号１２１（コラーゲンＶＩＩ型、α１）；または配列番号１２２（ケラチン１９）；または配列番号１２３（プレキシンＢ３）および／または配列番号１２５（インテグリンβ４）のＯＲＦによりコードされるポリペプチド（好ましくはポリペプチド５つ全てが存在する）［１つの実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１２４（ラットコラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖と同様）のＯＲＦによりコードされる］；および／または、
（ｆ）配列番号１９４（ヘパリンスルフェートプロテオグリカン）および／または配列番号１９５（ＩＧＦＩＩ）によりコードされるポリペプチド；
により表されるポリペプチド、および／または、その抗原フラグメントの１、２、３、４または５つの何れかの組み合わせを含んでよい。このようなフラグメントは上記した配列の少なくとも約８または少なくとも約１２連続アミノ酸を含んでよい。
【００３０】
本発明の別の特徴はポリペプチドと同様の目的のために使用してよい本明細書に記載したポリペプチドに特異的な抗体または抗体の組み合わせを含む組成物である。本明細書においては、ポリペプチドに「特異的な」抗体は、ポリペプチドに選択的に結合し、結合を意図しない他のポリペプチドに対しては一般的に結合しない抗体を包含する。このような特異性のための条件は当業者が従来の方法を用いて日常的に決定できるものである。
【００３１】
本発明の１つの特徴は特異的な相手であるポリペプチドへの自らの結合を可能にする形態におけるこのような抗体の選択された数を含む組成物である。このような組成物は下記成分：
（ａ）表１の配列番号１〜３０により表される核酸によりコードされるポリペプチドに特異的な、またはその抗原性フラグメントに特異的な、単離された抗体少なくとも１、２、５または１０、および／または、
（ｂ）表２の配列番号３１〜６０により表される核酸によりコードされるポリペプチドに特異的な、またはその抗原性フラグメントに特異的な、単離された抗体少なくとも１、２、５または１０、および／または、
（ｃ）表３の配列番号６１〜９０により表される核酸によりコードされるポリペプチドに特異的な、またはその抗原性フラグメントに特異的な、単離された抗体少なくとも１、２、５または１０、および／または、
（ｄ）表５の配列番号９１〜１１９により表される核酸によりコードされるポリペプチドに特異的な、またはその抗原性フラグメントに特異的な、単離された抗体少なくとも１、２、５または１０、および／または、
（ｅ）表６の配列番号１２０〜１９３により表される核酸によりコードされるポリペプチドに特異的な、またはその抗原性フラグメントに特異的な、単離された抗体少なくとも１、２、５または１０、および／または、
（ｆ）配列番号１９４−１９５により表される核酸によりコードされるポリペプチドに特異的な、またはその抗原性フラグメントに特異的な、単離された抗体１または２つ；
を含んでよい。ここでもまたフラグメントは好ましくはポリペプチドの少なくとも約８または約１２連続アミノ酸残基を含む。
【００３２】
上記した組成物の何れかにおける抗体（サブセットを含む）はマイクロアレイ等のアレイの形態で提供してよい。
【００３３】
本発明はまたＲＣＣ腫瘍から得た試料等の試料中の、ポリヌクレオチドまたはこれらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの１つ以上を検出（例えば測定または定量）するための方法に関する。方法は、（ａ）試料への核酸の結合（例えば高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーション）または（ｂ）試料ポリペプチドへの抗体の結合を可能にする条件化の本発明の核酸または抗体の組成物との試料の接触を含む。方法は更に、結合している試料ポリヌクレオチドまたは抗体を検出することを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは試料中において過剰発現（アップレギュレート）され、ＲＣＣの特定のサブタイプを示すものである。即ちポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出によりＲＣＣの特定のサブタイプが発見される。
【００３４】
本発明は下記工程：
（ａ）対象の腎臓癌から得たポリヌクレオチド試料に高ストリンジェンシーな条件下で本発明の核酸組成物をハイブリダイズさせること（試料は組織フラグメントまたは抽出液の形態であってよい）；および、
（ｂ）ハイブリダイゼーションのベースラインと核酸１つ以上にハイブリダイズする試料ポリヌクレオチドの１つ以上の量を比較すること、
を含む対象におけるＲＣＣのサブタイプを決定するための方法を提供する。
【００３５】
ベースライン値は例えば同一の対象から、または、正常対象の「プール」から得られる正常腎臓組織に由来するポリヌクレオチドに高ストリンジェンシーな条件下で核酸組成物をハイブリダイゼーションすることにより得てよい。或は、ベースライン値はこのような値の既存のデータベースから得てよい。
【００３６】
組成物中の核酸にハイブリダイズした試料ポリヌクレオチドの量は一般的には腎腫瘍中のポリヌクレオチドのレベル、即ち発現を反映している。
【００３７】
別の実施形態は下記工程：
（ａ）核酸またはそのフラグメントの少なくとも１つまたは少なくとも２つに高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの対象のＲＣＣ腫瘍組織における発現を調べること、ここで、核酸は本明細書においては腎腫瘍の特定の型において過剰発現またはアップレギュレートされるものとして記載されるものであること；
（ｂ）工程（ａ）において記載した核酸に高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの対象の正常腎組織中の発現を調べること；および、
（ｃ）工程（ａ）における腫瘍組織における発現を工程（ｂ）における正常組織における発現と比較すること；
を含む対象におけるＲＣＣのサブタイプを決定するための方法である。
【００３８】
腎細胞癌のサブタイプを決定するための上記方法の別の実施形態においては、腫瘍に由来する（および場合により正常組織に由来する）ポリヌクレオチドを蛍光標識等の検出可能な標識で標識される。
【００３９】
上記した方法の他の実施形態はＲＣＣサブタイプと診断される特定のＤＮＡ配列の発現の特定のレベル（例えばハイブリダイゼーションの特定のレベルにより表される）の間の関係に基づく。このような関係の例は、下記：
（ｉ）配列１〜３０により表される核酸へのハイブリダイゼーションにより測定される発現が正常腎組織と比較して腫瘍組織において例えば少なくとも５倍、アップレギュレートされている場合に、腎腫瘍はＣＣ−ＲＣＣであり；
（ｉｉ）配列３１〜６０により表される核酸へのハイブリダイゼーションにより測定される発現が正常腎組織と比較して腫瘍組織において例えば少なくとも３倍、アップレギュレートされている場合に、腎腫瘍は乳頭状ＲＣＣであり；
（ｉｉｉ）配列６１〜９０により表される核酸ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより測定される発現が正常腎組織と比較して腫瘍組織において例えば少なくとも５倍、アップレギュレートされている場合に、腎腫瘍は嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫であり；
（ｉｖ）配列９１〜１１９により表される核酸へのハイブリダイゼーションにより測定される発現が正常腎組織と比較して腫瘍組織においてアップレギュレートされている場合に、腎腫瘍は肉腫様ＲＣＣであり；
（ｖ）配列１２０〜１９３により表される核酸へのハイブリダイゼーションにより測定される発現が正常腎組織と比較して腫瘍組織においてアップレギュレートされている場合に、腎腫瘍は移行上皮癌（ＴＣＣ）であり；そして、
（ｖｉ）配列１９４〜１９５により表される核酸へのハイブリダイゼーションにより測定される発現が正常腎組織と比較して腫瘍組織においてアップレギュレートされている場合に、腎腫瘍はウィルムス腫（ＷＴ）である。
【００４０】
本発明の別の特徴は、本明細書において論じるとおりＲＣＣのサブタイプを有する対象の大多数において発現がアップレギュレートされるポリペプチド（タンパク質）産物の１つ以上を検出することを含む、対象におけるＲＣＣのサブタイプを決定するための方法である。このような検出は、ポリペプチドの存在を決定すること、および／またはその量を測定することを包含する。
【００４１】
本発明の別の特徴は下記工程：
（ａ）抗体の少なくとも１つがその特異的な相手であるポリペプチドに特異的に結合するために有効な条件下で、腎臓癌から得たポリペプチド試料に本発明の抗体組成物を接触させること；および、
（ｂ）組成物中の抗体１つ以上への試料中のポリペプチド１つ以上の結合の量をベースライン値と比較すること；
を含む対象におけるＲＣＣのサブタイプを決定するための方法である。試料は組織フラグメントまたは抽出液であってよい。
【００４２】
ベースライン値は例えば同一の対象から、または、正常対象の「プール」から得られる正常腎臓組織に由来するポリペプチド試料に同様の条件下で抗体組成物を接触させることにより得てよい。
【００４３】
抗体組成物中の特異的な抗体に結合した試料ポリペプチドの量は一般的には腎腫瘍中のポリペプチドのレベルを反映している。
【００４４】
例えば、１つの実施形態は下記工程：
（ａ）ＲＣＣ組織またはその抽出液を、下記：
（ｉ）ＣＣ−ＲＣＣ中において比較的過剰発現されるタンパク質に抗体が特異的に結合する条件下における、表１の配列番号１〜３０により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つに特異的な抗体、または、ポリペプチド２つ以上に特異的な抗体、または、ポリペプチドのフラグメントに特異的な抗体；および／または、
（ｉｉ）乳頭状ＲＣＣ中において比較的過剰発現されるタンパク質に抗体が特異的に結合する条件下における、表２の配列番号３１〜６０により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つに特異的な抗体、または、ポリペプチド２つ以上に特異的な抗体、または、ポリペプチドのフラグメントに特異的な抗体；および／または、
（ｉｉｉ）嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫において比較的過剰発現されるタンパク質に抗体が特異的に結合する条件下における、表３の配列番号６１〜９０により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つに特異的な抗体、または、ポリペプチド２つ以上に特異的な抗体、または、ポリペプチドのフラグメントに特異的な抗体；および／または、
（ｉｖ）肉腫様ＲＣＣにおいて比較的過剰発現されるタンパク質に抗体が特異的に結合する条件下における、配列番号９２、９３および／または１０３により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つに特異的な抗体、または、ポリペプチド２つ以上に特異的な抗体、または、ポリペプチドのフラグメントに特異的な抗体；および／または、
（ｖ）ＴＣＣにおいて比較的過剰発現されるタンパク質に抗体が特異的に結合する条件下における、配列番号１２０、１２１、１２２、１２５および／または１２６により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つに特異的な抗体、または、ポリペプチド２つ以上に特異的な抗体、または、ポリペプチドのフラグメントに特異的な抗体；および／または、
（ｖｉ）ウィルムス腫において比較的過剰発現されるタンパク質に抗体が特異的に結合する条件下における、配列番号１９４−１９５により表される核酸によりコードされるポリペプチド１つまたは両方に特異的な抗体、または、ポリペプチドのフラグメントに特異的な抗体；
と接触させること；
（ｂ）該組織または抽出液に結合した抗体を検出または測定すること；
（ｃ）（ａ）（ｉ）−（ａ）（ｖｉ）の該抗体の１つ以上に例えば該対象から、または正常腎臓組織のプールから得られた正常腎臓組織またはその抽出液を接触させること、
（ｄ）該正常腎臓組織または抽出液に結合した抗体を検出または測定すること、および、
（ｅ）工程（ｂ）および（ｄ）における結合の量を比較すること、
を包含する対象におけるＲＣＣのサブタイプを決定するための方法である。
【００４５】
別の実施形態においては、本明細書に記載した抗体組成物の何れか（例えば抗体のサブセット）は上記（ａ）（ｉ）−（ａ）（ｖｉ）に記載した抗体と交換してよい。
【００４６】
ＲＣＣサブタイプを決定するための上記方法のいずれかにおいて、組成物はマイクロアレイ等のアレイの形態であってよい。
【００４７】
本発明の別の特徴は本発明の核酸の組成物（例えばアレイの形態）および場合により被験ポリヌクレオチドへの組成物中の核酸のハイブリダイゼーションを促進するか、または、被験ポリヌクレオチドの検出（例えば蛍光の検出）を促進する試薬１つ以上を含むキットである。キットは本発明の核酸のアレイ、目的の被験ポリヌクレオチドへのアレイ内の核酸のハイブリダイゼーションを実施するための手段、およびハイブリダイゼーションの結果を読み取るための手段を含んでよい。ハイブリダイゼーション結果は蛍光の単位であってよい。
【００４８】
別のキットは本発明の抗体の組成物（例えばアレイの形態）および場合により被験ポリペプチドとの抗体の結合を促進するか、抗体結合の検出を促進する試薬１つ以上を含む。
【００４９】
本発明のキットはハイブリダイゼーションまたは抗体結合を実施するための取扱説明書を含んでよい。
【００５０】
本発明のキットの別の任意の要素は適当な緩衝剤、培地成分等；試験結果を保存および／または評価するためのコンピューターまたはコンピューター読み取り可能な媒体；容器；または包装材料を包含する。適当な対照実験を行うための試薬も包含してよい。キットの試薬は、例えば凍結乾燥された形態または安定化された液体として試薬が安定となる容器中に入れてよい。試薬はまた単回使用の形態、例えば診断用途のための単回反応形態であってよい。
【００５１】
本明細書においては、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡの両方、並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）を指すものとする。核酸およびポリヌクレオチドという用語は特定の数のヌクレオチドに限定する意図はなく、従ってオリゴヌクレオチドと長さにおいて重複する。遺伝子発現分析のための核酸はリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、双方または後述するそれらの類縁体を包含する。プローブは核酸であるか、または核酸を包含してよく、長さは限定されない。好ましい長さは後に記載する。本発明の核酸は２本鎖および部分または完全１本鎖の分子を包含する。好ましい実施形態においては、遺伝子発現のプローブは目的の遺伝子により発現されるｍＲＮＡ標的に相補的な、または対向する鎖に相補的（例えばｍＲＮＡから発生した第１の鎖のｃＤＮＡに相補的な）な１本鎖核酸分子を包含する。
【００５２】
本発明は組織試料またはその抽出液中の目的の標的遺伝子（より一般的にはポリヌクレオチドと称する）をプローブするため、そしてその相対的な発現を測定するために核酸を使用する。好ましい組織は腎腫瘍組織である。発現は腎腫瘍の異なる型または正常な腎組織中の同様の標的の発現と比較する。
【００５３】
本発明の核酸を含む組成物は種々の形態のいずれをとることもできる。例えば単離された核酸の組成物は溶液（例えば水溶液）であることができ、そして目的の試料から得たポリヌクレオチドへの溶液中でのハイブリダイゼーションに付すことができる。溶液ハイブリダイゼーションの方法は当該分野でよく知られている。
【００５４】
或は、核酸はアレイの形態であることができる。本明細書においては「アレイ」という用語は表面上に置かれたアドレスを有するアクセス可能な空間的に分かれた、そして、判別可能な分子の、順序付けられた（例えば幾何学的に順序付けられた）配置を意味する。マクロアレイまたはマイクロアレイとして一般的には記載されるアレイは、「マイクロアレイ」の場合の約５つから９００以上もの多数のプローブにわたる何れかの数の個々のプローブの部位を含むことができる。マクロアレイは直径約３００μｍ以上の試料スポットを含み、そして、既存のゲルおよびブロットスキャナーにより容易に画像化することができる。マイクロアレイ中の試料スポットの大きさは典型的には直径＜２００μｍであり、これらのアレイは通常は数千個のスポットを含む。マイクロアレイは特殊なロボット光学および画像化装置を必要とし、これらは一般的には市販されており、当該分野でよく知られている。
【００５５】
何れかの適当な適合性のある表面を本発明に関連して使用することができる。表面は通常は固体であり、種々の有機または無機の物質またはその組み合わせ、例えばプラスチック、例えばポリプロピレンまたはポリスチレン；セラミック；シリコン；（溶融）シリカ、石英またはガラスであって顕微鏡のスライドガラスまたはカバーガラスの厚みを有するもの；紙、例えば濾紙；ジアゾ化セルロース；ニトロセルロース；ナイロンメンブレン；またはポリアクリルアミドゲルパッドのいずれかにより作成できる。光に対して透過性である基体は光学検出方法と共に使用する場合に有用である。１つの実施形態においては、表面はマルチウェル、例えば組織培養ディッシュ、例えば９６（またはこれより多い）ウェルのマイクロプレートのプラスチック表面である。表面の形状は重要ではない。例えば平板の正方形、長方形または円状の表面；曲面；または三次元の表面、例えばビーズ、粒子、鎖、沈殿物、管、球等であることができる。マイクロ液体装置もまた本発明に包含される。
【００５６】
好ましい実施形態においては、核酸を含む組成物はマイクロアレイの形態である。マイクロアレイは空間的に分割された試料またはプローブ（例えば約１５〜約２０００ヌクレオチド長の既知配列のｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）の整列された配置であり、これにより大量の平行した遺伝子発現分析が可能となる（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０５（６７８８）：８２７−８３６）。プローブは好ましくは固体の基体に固定化されており、そして相補ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズするために使用できる（Ｐｈｉｍｉｓｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９９）２１（上出）：１−６０）。
【００５７】
アレイハイブリダイズ分析の根拠となる概念はワトソンクリック塩基対形成の規則に従った塩基対形成（ハイブリダイゼーション）による。マイクロアレイ技術は、好ましくは蛍光標識による標識、そしてその後のマイクロアレイフォーマット中の固体支持体に固定化されたその相補物へのハイブリダイゼーションにより、分析対象となる試料中に存在する特定の実体および配列の核酸を分割する過程を自動化する。
【００５８】
特定の用途のための物質は必ずしもキット形態において好都合に入手できるわけではない。本発明はＲＣＣ試料の分析および腎腫瘍のサブクラスの決定のために有用であるマイクロアレイを含むアレイを提供する。
【００５９】
ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ「チップ」）は好ましくはガラス上で高速ロボット工学により作成する（ただしナイロンまたは他のプラスチックの基体も使用される）。単一のＤＮＡチップを用いた実験により、数全の遺伝子に関して同時に情報が得られ、伝統的な方法と比較してスループットが劇的に増大する（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６０２５−６０２９）。
【００６０】
２つのＤＮＡマイクロアレイフォーマットが好ましい。
【００６１】
フォーマットＩ：ｃＤＮＡプローブ（例えば５００〜５０００塩基）をロボットによるスポッティングを用いてガラス等の固体の表面に固定化し、個別にまたは混合物としての標的のセットに曝露する。この方法は伝統的には「ＤＮＡマイクロアレイ」と呼ばれている（Ｅｋｉｎｓ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９９９）１７：２１７−２１８）。
【００６２】
フォーマットＩＩ：「天然」のオリゴまたはポリヌクレオチド（２０〜８０塩基のオリゴマー）、オリゴヌクレオチド類縁体であって例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデートまたは３’−アミノプロピル骨格を有するもの、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）であるプローブのアレイ。プローブはインサイチュ（オンチップ）で、または従来の合成とその後のオンチップ固定化のいずれかにより合成してよい。
【００６３】
アレイは（１）検出可能に標識された、好ましくは蛍光標識された試料核酸（典型的にはＤＮＡ）を含む分析対象に曝露し、（２）ハイブリダイズさせ、そして（３）相補配列の実体および／または遍在性を測定する。
【００６４】
【表１】
2006501849.tif 000002
本発明の１つの実施形態は、ピクセルの行がセット１つからの別個のプローブ１つの複製に相当するように、所定の順序で固体表面に固定化されたプローブのセット１つ以上からのｃＤＮＡ少なくとも１つのマトリックスを含む、ＲＣＣのサブタイプの間の判別のために有用なマイクロアレイに関し、そのプローブは配列番号１〜３０により表されるセット；配列番号３１〜６０により表されるセット；配列番号６１〜９０により表されるセット；配列番号９１〜９３により表されるセット；配列番号９４〜９８により表されるセットおよび／または配列番号９９〜１００により表されるセットのいずれかであり、
ここで、各セットのプローブは腎細胞癌（ＲＣＣ）の異なるサブタイプにおいて示差的に発現される核酸配列に相補的であり、その核酸配列は高ストリンジェンシーな条件下でプローブにハイブリダイズする。
【００６５】
原発腫瘍組織の標的核酸の分析のためには、本発明の好ましい分析対象は保存される前の組織生検材料から、または、標準的な培地中で保存および／または培養されてよい原発腫瘍の新鮮凍結腫瘍組織から単離される。発現試験のためには、ポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡを市販のキット、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＯｌｉｇｏｔｅｘまたはＱｉａｇｅｎから入手できるものを用いて単離する。単離されたｍＲＮＡは直接試験されるか、好ましくは標識されたヌクレオチドの存在下にｃＤＮＡに逆転写する。蛍光ｃＤＮＡは一般的には逆転写酵素（例えばＧＩＢＣＯ−ＢＲＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写キット）および蛍光標識をコンジュゲートしたヌクレオチドを用いて合成される。好ましい蛍光標識はｄＵＴＰおよび／またはｄＣＴＰにコンジュゲートしたＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）である。ＰＣＲによる等、標的の増幅の他の任意の方法もまた本発明の方法に包含される。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の方法は、約１５塩基〜完全長ｃＤＮＡ、例えば約２０００塩基の何れかの固定化されたｃＤＮＡプローブを使用する。好ましいプローブは約１００塩基を有する。旨適なハイブリダイゼーション条件（温度、ｐＨ、イオンおよび塩濃度、および、インキュベート時間）は律速段階としての最短プローブの長さにより異なり、そして、当該分野で従来行われている通り、上記したパラメーターを変更することにより連続的に調節することができる。好ましい実施形態においては、本発明のプローブは高ストリンジェンシーな条件下で目的の標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。本明細書においては、「高ストリンジェンシー条件」または「高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」とは、核酸（例えば目的のポリヌクレオチドと核酸プローブ）の間に少なくとも約９５％、好ましくは約９７〜１００％のヌクレオチド相補性（同一性）が存在する場合に、ハイブリダイゼーションが起こる何れかの条件を意味する。しかしながら、所望の目的に応じて、より低い相補性、例えば約９０％、８５％、７５％、５０％等を必要とするハイブリダイゼーション条件を選択することもできる。適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、６ＸＳＳＰＥ−Ｔ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）等の緩衝液中、約１０分〜約少なくとも３時間（好ましい実施形態においては、少なくとも約１５分）、約４℃〜約３７℃の温度で行うハイブリダイゼーションを包含する。
【００６７】
本明細書に記載した幾つかのプローブ配列は遺伝子または遺伝子フラグメントに相補的なｃＤＮＡであり；一部はＥＳＴである。当業者の知る通り、特定の遺伝子について選択されたプローブは完全長のコーディング配列またはその何れかのフラグメントであって少なくとも約８または少なくとも約１５ヌクレオチドを有する。即ち、完全長の配列が既知である場合、医師がその配列の何れかの適切なフラグメントを選択できる。初回の結果が部分配列情報（例えばＥＳＴプローブ）を用いて得られた場合、そして、そのＥＳＴがフラグメントとなる完全長の配列が入手できる（例えばゲノムデータベース中）ようになった場合、当業者は長さが少なくとも約８または少なくとも約１５ヌクレオチドである限り、初回のＥＳＴよりも長いフラグメントを選択できる。
【００６８】
本発明のアレイは、発現を分析すべき遺伝子に対し、何れかの長さ（約１５塩基〜完全なコーディング配列）のハイブリダイズ可能なフラグメントを有する核酸プローブ１つ以上を含む。分析の目的のためには、完全長の配列が既知である必要はなく、その理由は、当業者であれば、所定のＥＳＴの配列および既知のデータマイニング、バイオインフォマティクスおよびＤＮＡ配列決定方法を用いて特段の実験をすることなく完全長の配列を得る方法を知っているからである。
【００６９】
本発明の核酸プローブはネイティブのＤＮＡまたはＲＮＡ分子またはＤＮＡまたはＲＮＡの類縁体であってよい。本発明は何れかの特定のＤＮＡまたはＲＮＡ類縁体の使用に限定されず；むしろ、何れのものも、それが被験試料中の相補ＤＮＡ鎖（またはｍＲＮＡ）に十分ハイブリダイズすることができ、ヌクレアーゼに対する十分な体制および使用するハイブリダイゼーションプロトコルにおいて安定性を有する限り、有用である。ＤＮＡまたはＲＮＡはヌクレオシド間結合を修飾することにより（例えばメチルホスホネートまたはホスホロチオエート）、または、修飾されたヌクレオシドを取り込むことにより（例えば２’−Ｏ−メチルリボースまたは１’−α−アノマー）、後に記載するとおりインビボのヌクレアーゼ分解に対してより耐性としてよい。
【００７０】
核酸は少なくとも１つの修飾された塩基の部分、例えば５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ω−チオウリジン、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、３−メチル−シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシ−カルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル−２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオ−シトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−ｔ−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシルおよび２，６−ジアミノプリンを含んでよい。
【００７１】
核酸は少なくとも１つの修飾された糖部分、例えばアラビノース、２−フルオロウラシル、キシルロースおよびヘキソースを含んでよい。
【００７２】
更に別の実施形態においては、核酸プローブは例えば以下の構造：ホスホロチオエート、ホスホリドチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジイミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、３’−アミノプロピルおよびホルムアセタールまたはこれらの類縁体の１つを有するヌクレオチドから合成された修飾されたホスフェート骨格を含む。
【００７３】
更に別の実施形態においては、核酸プローブは、通常のβ−単位とは逆に、鎖が相互に平行して走っている、相補ＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する、α−アノマーオリゴヌクレオチドである（Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。
【００７４】
核酸プローブ（例えばオリゴヌクレオチド）は別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーショントリガー交差結合剤、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤等にコンジュゲートしてよく、これらは全て当該分野でよく知られている。
【００７５】
本発明の核酸プローブ（オリゴヌクレオチド）は例えば自動ＤＮＡ合成装置（例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から入手できるもの）を用いることにより当該分野において知られた標準的な方法で合成してよい。実施例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）１６：３２０９の方法により合成してよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御多孔性ガラス重合体支持体（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：７４４８−７４５１）を用いることにより調製できる。
【００７６】
本発明はまた目的のポリヌクレオチド標的に対して少なくとも約７５％同一である、または少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％それに相補的なプローブ分子に関する。従来のアルゴリズムを用いて、例えばＬｉｐｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：７２６−７３０，１９８３）またはＭａｒｔｉｎｅｚ／Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：４６２９−４６３４，１９８３）の記載の通り、％相補性を測定することができる。
【００７７】
本発明の核酸は種々の従来の方法のいずれかにより検出してよい。好ましい検出可能な標識は、放射性核種、フルオレッサー、フロロゲン、発色団、クロモゲン、ホスホレッサー、ケミルミネッサーまたはバイオルミネッサーを包含する。フルオレッサーまたはフロロゲンの例は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロドールグリーンまたはテキサスレッドである。
【００７８】
一般的な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンを包含する。最も好ましいものは、後の実施例において記載する標識である。
【００７９】
蛍光団は蛍光を発するためには特定の波長の光により励起されなければならない。例えばＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６を参考にできる。
【００８０】
フルオレセイン、フルオレセイン誘導体およびフルオレセイン様分子、例えばオレゴングリーンＴＭおよびその誘導体、ローダミングリーンＴＭおよびロドールグリーンＴＭは、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステルまたはジクロロトリアジニル反応性基を用いてアミン基にカップリングする。同様に、蛍光団はマレイミド、ヨードアセトアミドおよびアジリジン反応性基を用いてチオールにカップリングしてもよい。窒素上の置換基を有する基本的にはローダミングリーンＴＭ誘導体である長波長ローダミンは、とりわけ最も光安定性のある既知の蛍光標識試薬である。それらのスペクトルは４〜１０のｐＨの変動により影響されず、多くの生物学的用途のためのフルオレセインにはない重要な利点である。このグループはテトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミンおよびテキサスレッドＴＭ誘導体を包含する。他の好ましい蛍光団は紫外線により励起されるものである。例としては、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン（そのメンバーにはダンシルクロリドが含まれる）、ピレンおよびピリジルオキサゾール誘導体が挙げられる。
【００８１】
本発明は腎臓癌の種々のサブタイプにおいて関与が示唆されている重要な経路を推定する場合のマイクロアレイ等のアレイおよび遺伝子発現のより広範な手法のための根拠となる。例えば、本明細書に記載した発現パターンは約７０の腎腫瘍の分析に基づいている、追加の患者試料が分析されるにつれて、より大きいデータベースが発生し、これは種々の型の腎臓癌の間の代謝の相違に関する更に多くの情報を提供する。他の要因、例えば臨床転帰との相関は更なる理解を可能にする。
【００８２】
本発明の別の特徴は、本明細書において考察するとおりＲＣＣのサブタイプの１つに罹患した対象の大半においてその発現がアップレギュレートされるタンパク質産物の１つ以上の存在を検出すること、および／またはその量を定量することを含む、対象におけるＲＣＣのサブタイプを決定するための方法に関する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は本明細書において互換的に使用する。
【００８３】
このようなタンパク質の例は本発明のタンパク質含有組成物の成分として上記したものである。タンパク質は例えば分泌されたタンパク質、外皮である細胞を透過性とすることにより接触可能とした細胞内タンパク質または細胞表面発現タンパク質であることができる。体液中、または好ましくは対象の腎臓から得た組織または細胞の試料中のタンパク質産物の存在または量を測定する。タンパク質産物の量が、正常な対象の体液中、または対象の正常（非癌性）腎臓試料中、または比較対照用の正常値（例えば正常対象のプールより得たもの）と比較して上昇している場合、腎細胞癌の特定のサブタイプの存在が示されている。その過剰発現がＲＣＣの特定のサブタイプを示すタンパク質については本明細書に記載するとおりである。
【００８４】
腎臓試料等の患者試料の調製、および、それに含まれるタンパク質の検出および／または定量の方法は、従来通りであり、当該分野でよく知られている。このような方法の一部は本明細書において記載するとおりである。
【００８５】
特定の好ましい方法においては、タンパク質は免疫学的方法、例えば免疫試験（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光顕微鏡または免疫組織学的方法により検出され、これらの試験方法の全ては全く従来通りである。
【００８６】
種々の抗体のいずれかをこのような方法において使用できる。このような抗体は例えばポリクローナル、モノクローナル（ｍＡｂ）、組み換え、ヒト化または部分ヒト化、１本鎖、Ｆａｂおよびこれらのフラグメントを包含する。抗体は何れかのアイソタイプ、例えばＩｇＭ、種々のＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ１’ＩｇＧ２ａ等であることができ、そしてそれらは抗体を生成する何れかの動物種、例えばヤギ、ウサギ、マウス、ニワトリ等から得られる。ポリペプチドに「特異的な」抗体とは、抗体が、完全長ポリペプチド中、またはそのペプチドフラグメント中のいずれかに存在するアミノ酸またはエピトープの定義された配列を認識することを意味する。
【００８７】
抗体はよく知られた従来の方法に従って調製できる。例えばＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍａｎｓｏｎ，ｅｄ），（Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃ．２．４．１（１９９２）；Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．５．１−２．６．７；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｐａｇｅ７２６（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｕｂ．１９８８）を参考にすることができる。ヒト化または部分ヒト化抗体および抗体フラグメントの調製方法および抗体の精製方法は従来通りである。
【００８８】
免疫組織化学的手法において使用するための抗体の旨適濃度の決定は標準的な方法、即ち適切な組織試料に対して被験抗体を力価測定することにより達成される。当該分野で知られる通り、抗体の調製物は、免疫組織化学においてはＥＩＡおよび他のこのような免疫試験の場合よりも高濃度で使用されるのが一般的である。
【００８９】
本明細書に記載する分子プロファイリング情報は、本明細書に記載した種々の腎臓癌サブタイプに特徴的な分子の改変または撹乱を是正またはバイパスする能力を有するものとして選択される薬剤の発見の目的のために適用することもできる。多くの方法が使用できる。
【００９０】
１つの実施形態においては、ＲＣＣ細胞系統を標準的な方法を用いて腫瘍から作成し、そして本方法を用いてプロファイリングする。好ましい細胞系統はそれらの由来元である原発腫瘍の発現プロファイルを維持したものである。１種または数種のＲＣＣ細胞系統を「一般的」パネルとして使用してよく；或は、または更に加えて、個体対象から得た細胞系統を作成して使用してよい。これらの細胞系統は選択された遺伝子の発現を改変するその能力に関して、好ましくは高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）により化合物をスクリーニングするために使用される。典型的には、種々の商業的入手元から得られる小分子ライブラリをＨＴＳプロトコルにより試験する。
【００９１】
細胞系統の細胞における分子の改変は本明細書に詳述する方法を適用しながらｍＲＮＡレベル（遺伝子発現）において測定できる。或は、選択された遺伝子のタンパク質産物を試験してよい。即ち、分泌された、または細胞表面のタンパク質の場合は、発現は免疫試験または他の免疫学的方法、例えば、酵素免疫試験（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを用いて評価することができる。ＥＩＡは幾つかの参考文献においてより詳細に説明されている（Ｂｕｔｌｅｒ，ＪＥ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｏｌ．１，Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  １９９２，ｐｐ．２０９−２５９；Ｂｕｔｌｅｒ，ＪＥ，”ＥＬＩＳＡ”，ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，ＪＥ（ｅｄ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１）。ＲＩＡはＫｉｒｋｈａｍ  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ（ｅｄｓ），Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅ．＆Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９７０において考察されている。
【００９２】
別の方法においては、標的遺伝子の転写および／または翻訳を特異的に抑制するアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを本発明の方法を用いて特異性および効力についてスクリーニングすることができる。アンチセンス組成物は特定の遺伝子（例えば表１、２、３、５および６中の遺伝子、またはウィルムス腫において発見される遺伝子）がアップレギュレートされる腫瘍を治療するために特に有用である。
【００９３】
本明細書に記載した腎腫瘍の大部分の症例においてアップレギュレートされる遺伝子（表１、２、３、５および６およびウィルムス腫において発見される２遺伝子）のタンパク質産物は、タンパク質が一部の接触可能な体液または組織中において、何らかの試験手段、例えば免疫試験により検出できれば、診断試験の標的となる。
【００９４】
診断標的の１つのクラスは身体内で測定可能な濃度にまで達する分泌タンパク質である。即ち、血漿、血清、尿、唾液、脳髄液等のような体液の試料をスクリーニングされる対象から得る。試料をタンパク質分析対象に関る何れかの既知の試験に付す。或は、その表面上にタンパク質を発現する細胞、例えば血球を、単純な従来の手段により得てよい。タンパク質が受容体または他の細胞表面構造である場合は、それはよく知られた方法、例えばフローサイトメトリー、免疫蛍光分析、免疫細胞化学または免疫組織化学的な方法等により検出し、定量することができる。
【００９５】
好ましい実施形態において、診断は腎腫瘍から得た試料、例えば生検組織、新鮮凍結試料、または、最も好ましい実施形態においては、組織のパラフィン包埋ブロックの切片に対して実施される。これらの試料のタイプの全てを作成する方法は従来通りであり、当該分野でよく知られている。生検材料および新鮮凍結試料は従来の操作法により抽出し、その中に含まれるタンパク質またはポリペプチドを得ることができる。１つの実施形態においては、パラフィン包埋ブロックを切片化し、そしてこのような抽出を行うことなく直接分析する。このようなパラフィンブロックの免疫組織化学的分析を示す例は、実施例１および図３に示す通りである。
【００９６】
好ましくは、検出するべき標的タンパク質に対する抗体または他のタンパク質またはペプチドのリガンドを使用する。遺伝子産物が受容体である別の実施形態においては、受容体に対するペプチド性または小分子のリガンドを検出および定量の根拠として知られた試験において使用してよい。
【００９７】
タンパク質標的、好ましくは抗体に対する適切に標識された結合相手を用いたインビボの方法もまた例えば潜伏している転移病巣を画像化するための診断および予後のため、または、他の種類のインサイチュの評価のために用いてよい。これらの方法は種々のレントゲン、シンチグラフおよび当該分野で知られた他の画像化方法（ＭＲＩ、ＰＥＴ等）を利用する。
【００９８】
適当な検出可能な標識は、放射性、蛍光、フロロゲン、クロモゲンまたは他の化学標識を包含する。ガンマカウンター、シンチレーションカウンターまたはオートライオグラフィーで単純に検出される有用な放射性標識は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび１４Ｃを包含する。
【００９９】
一般的な蛍光標識はフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンを包含する。ダンシル基のような蛍光団は蛍光を発するためには特定の波長の光で励起しなければならない。例えばＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，１９９６を参考にできる。フルオレセイン、フルオレセイン誘導体およびフルオレセイン様分子、例えばオレゴングリーンＴＭおよびその誘導体、ローダミングリーンＴＭおよびロドールグリーンＴＭは、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステルまたはジクロロトリアジニル反応性基を用いてアミン基にカップリングする。蛍光団はまたマレイミド、ヨードアセトアミドおよびアジリジン反応性基を用いてチオールにカップリングしてもよい。長波長ローダミンはテトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミンおよびテキサスレッドＴＭ誘導体を包含する。タンパク質結合相手を誘導するための他の好ましい蛍光団は紫外線により励起されるものである。例としては、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン（そのメンバーにはダンシルクロリドが含まれる）、ピレンおよびピリジルオキサゾール誘導体が挙げられる。
【０１００】
タンパク質（抗体または他のリガンド）はまた蛍光発射金属、例えば１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他のものを用いて検出のために標識することができる。これらの金属は金属キレート化基、例えばジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてタンパク質に結合できる。
【０１０１】
インビボ診断のためには、放射性核種をタンパク質に直接、または、タンパク質に化学的にコンジュゲート、カップリングまたは結合（これらの用語は互換的に使用する）するＤＴＰＡおよびＥＤＴＡのようなキレート化剤を用いて間接的に結合してよい。キレート形成の化学は当該分野でよく知られている。カップリング化学の重要な制限要因は抗体またはリガンドが標的タンパク質に結合するその能力を保持していなければならない点である。多くの参考文献が、有用なキレート化剤の説明を含む大分子に対する金属の鎖体形成のための方法および組成物を開示している。金属は好ましくは検出可能な金属原子、例えば放射性核種であり、そして、タンパク質および他の分子と鎖体形成する。例えば米国特許５，６２７，２８６号、５，６１８，５１３号、５，５６７，４０８号、５，４４３，８１６号および５，５６１，２２０号を参照でき、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
診断性（治療価値）を有する何れかの放射性核種を使用できる。好ましい実施形態においては、放射性核種はγ線発射またはβ線発射の放射性核種、例えばランタニドまたはアクチニド系列の元素から選択されるものである。陽電子発射放射性核種、例えば６８Ｇａまたは６４Ｃｕもまた使用してよい。適当なγ線発射放射性核種は診断用画像化用途に用いられるものを包含する。γ線発射放射性核種は好ましくは１時間〜４０日間、好ましくは１２時間〜３日間の半減期を有する。適当なγ線発射放射性核種には６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１６９Ｙｂおよび１８９Ｒｅが包含される。好ましい放射性核種には（原子番号順に）６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｃａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、１８６Ｒｅおよび２０１Ｔｌである。標識としての陽電子発射放射性金属に関しては研究は限定されているが、特定のタンパク質、例えばトランスフェリンおよびヒト血清アルブミンが６８Ｇａで標識されている。
【０１０３】
ＭＲＩに有用な多くの金属（放射性同位体ではない）には、ガドリニウム、マンガン、銅、鉄、金およびユーロピウムが包含される。ガドリニウムが最も好ましい。用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０１０４】
標識されたタンパク質のインサイチュの検出は対象から組織学的標本を採取し、それを標識検出に適する条件下に顕微鏡で観察することにより行ってよい。広範な種類の組織学的方法（例えば染色操作）のいずれかを変更することによりインサイチュ検出が行えることは当業者の知るとおりである。
【０１０５】
本発明の組成物は診断、予後または研究上の操作において、所望の動物種の適切な細胞、組織、臓器または生物学的試料と共に使用してよい。「生物学的試料」という用語は正常または罹患した対象の身体に由来する何れかの液体または他の物質を意図しており、例えば血液、血清、血漿、リンパ、尿、唾液、涙液、脳髄液、乳汁、羊水、胆汁、腹水、喀痰等を包含する。更にまた用語の意味としては臓器または組織の抽出液または対象から得た何れかの細胞または組織の調製物がインキュベートされていた培地も挙げられる。腎組織由来の試料が好ましい。
【０１０６】
別の診断方法は、ＲＣＣのサブタイプに関連する遺伝子に相補的であり、そのためそれがアップレギュレートされる細胞をこれらの細胞におけるｍＲＮＡとのインサイチュハイブリダイゼーションにより検出するｃＤＮＡを利用する。本発明はアップレギュレートされた遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有する標識されたｃＤＮＡプローブとの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いた細胞中の標的ｍＲＮＡを位置決めするための方法を提供する。ＦＩＳＨの原理は、調製された標本中のＤＮＡまたはＲＮＡが例えば蛍光染料、ビオチンまたはジゴキシゲニンにより非同位体的に標識されたプローブ核酸にハイブリダイズすることである。次にハイブリダイズしたシグナルを蛍光測定により、または、酵素的方法により、例えば蛍光顕微鏡または光学顕微鏡を用いて検出する。検出されたシグナルおよび画像は感光性フィルムに記録できる。
【０１０７】
蛍光プローブの利点はハイブリダイズした画像が強力共焦顕微鏡または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを有する適切な画像分析システムを用いて容易に分析できる。放射性の方法と比較してＦＩＳＨは高い感度を可能にする。位置に関する情報に加えて、ＦＩＳＨは細胞または組織の形態のより良好な観察を可能にする。非放射性の方法であるため、ＦＩＳＨは特定の細胞または組織の型における特定のＤＮＡまたはＲＮＡの位置決めのために広範に用いられるようになった。
【０１０８】
本明細書において有用なインサイチュハイブリダイゼーション方法および調製物はＷｕ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｃｈａｐｔｅｒ  １３，ｐ．２７９−２８９に記載されている。本書籍はその引用文献も含めて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。やはり参照により本明細書に組み込まれる種々のインサイチュハイブリダイゼーションの手法および用途を記載した多くの特許および論文としては、米国特許第５，９１２，１６５号；同第５，９０６，９１９号；同第５，８８５，５３１号；同第５，８８０，４７３号；同第５，８７１，９３２号；同第５，８５６，０９７号；同第５，８３７，４４３号；同第５，８１７，４６２号同第５，７８４，１６２号；同第５，７８３，３８７号；同第５，７５０，３４０号；同第５，７５９，７８１号；同第５，７０７，７９７号；同第５，６７７，１３０号；同第５，６６５，５４０号；同第５，５７１，６７３号；同第５，５６５，３２２号；同第５，５４５，５２４号；同第５，５３８，８６９号；同第５，５０１，９４５号；同第５，２２５，３２６号および同第４，８８８，２７８号である。他の関連の参考文献としては、Ｊｏｗｅｔｔ，Ｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ；５９：６３−８５（１９９９）Ｐｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩ：１５１−１５７（１９８６）；Ｐｉｎｋｅｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３：２９３４−２９３８（１９８６）；Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６４５５−６４６７（１９８７）；Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：４９３７−４９５６（１９８８）；Ｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：４０７７−４０９５（１９８８）；Ｔｅｌｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：６９６６−６９６７（１９８９）；Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４６０１−４６０７（１９８９）；Ｎｅｄｅｒｌｏｆ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １０：２０−２７（１９８９）；  Ｎｅｄｅｒｌｏｆ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：１２６−１３１（１９９０）；Ｓｅｉｂｌ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅ  ３７１：９３９−９５１（Ｏｃｔ．１９９０）；Ｗｉｅｇａｎｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３２３７−３２４１（１９９１）；ＭｃＮｅｉｌ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  Ａｐｐｌ  ８：４１−５８（１９９１）；Ｋｏｍｍｉｎｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：８５−８７（１９９２）；Ｄａｕｗｅｒｓｅ，ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５９３−５９８（１９９２）；Ｒｉｅｄ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１３８８−１３９２（１９９２）；Ｗｉｅｇａｎｔ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅ��ｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．６３：７３−７６（１９９３）；Ｇｌａｓｅｒ，Ｖ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．，１６：１，２６（１９９６）；Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，ＭＲ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１２：３６８−３７５（１９９６）が包含される。
【０１０９】
アップレギュレートされた遺伝子、例えばＤＮＡ配列「Ｘ」が発見されたがそのタンパク質産物「Ｙ」は未知である場合、発現されたＤＮＡ配列Ｘを最初に調べることになる。完全長の遺伝子配列はＣｅｌｅｒａのようなヒトゲノムデータベースにアクセスすることにより得てよい。いずれの場合にも、適切なモチーフのコーディング配列を調べることによりコードされたタンパク質Ｙが分泌タンパク質であるか膜貫通タンパク質であるかがわかる。タンパク質Ｙに対して特異的な抗体が既に入手可能な場合は、タンパク質化学および免疫学的な既知の原理を用いてタンパク質Ｙのペプチドを設計し、合成することができる。目的はタンパク質の表面エピトープに特異的な抗体を提示する免疫原性のペプチドのセットを創生することである。或は、コーディングＤＮＡまたはそのタンパク質が発現クローニング可能であればそのポリペプチドまたはペプチドを生成できる。そのタンパク質またはペプチドを免疫原として用いることにより抗血清の生産のために動物を免疫化でき、または、ｍＡｂを調製できる。次にこれらのポリクローナル血清またはｍＡｂを免疫試験、好ましくはＥＩＡに付すことにより体液または細胞／組織試料中のタンパク質Ｙの存在を検出するか、その濃度を測定することができる。
【０１１０】
上記した薬品発見方法を手掛りに、何れかの特定の腎腫瘍サブタイプにおいて高度に予測可能な方法でアップレギュレートされる遺伝子の知識に基づいて腎腫瘍を治療するために本発明を利用することができる（表１〜３、５および６参照）。推定されたタンパク質産物の性質に基づいて、アップレギュレートされたタンパク質の作用を抑制するか、またはそれに対して、結合、ブロック、除去、或はそのほかにその存在や利用性を減少させる手段を考案することができる。細胞受容体の場合は、アップレギュレートされた受容体を拮抗剤、受容体の可溶性形態または受容体の「模型」のリガンド結合部位（リガンドと競合させるため）に曝露する（Ｇｅｒｓｈｏｎｉ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１９８８，８５：４０８７−９；米国特許５，７７０，５７２号）。
【０１１１】
抗体は分泌されたタンパク質産物またはアップレギュレートされた遺伝子の発現細胞表面産物に結合し、これを不活性化（またはこれと競合）するために対象に投与してよい。
【０１１２】
他の治療方法は高度に特異的な態様でアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドコンストラクトを使用することである。推定アンチセンス配列を選択し、試験し、そして旨適化するための方法は、適切な調節エレメント、例えば強力プロモーター、誘導強力プロモーター等のようなプロモーターに適切なアンチセンス配列を作動可能に連結するための方法のように、日常的なものである。誘導プロモーターは、例えばエストロゲン誘導系を包含する（Ｂｒａｓｅｌｍａｎｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３）９０：１６５７−１６６１）。更にまた、従来の抗生物質であるテトラサイクリンにより駆動されるリプレッシブルな系も知られている（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５５１（１９９２））。種々のアップレギュレートされた遺伝子に特異的なマルチアンチセンスコンストラクトを共に使用することができる。本明細書に記載したアップレギュレートされた遺伝子の配列を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することができる（Ｈａｍｂｏｒ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１２３７−１２４５（１９８８）；Ｈｏｌｔ，ＪＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：４７９４−４７９８（１９８６）；Ｉｚａｎｔ，ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３６：１００７−１０１５（１９８４）；  Ｉｚａｎｔ，ＪＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：３４５−３５２（１９８５）；Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６５８−６６２（１９８７））。アンチセンスオリゴヌクレオチドは約６〜約５０ヌクレオチドの範囲であってよく、そして１００または２００ヌクレオチド以上もの大きいものであってもよい。オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡまたはそのキメラ混合物または誘導体または修飾されたバージョンで、１本鎖または２本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、またはホスフェート骨格（上記）において修飾できる。オリゴヌクレオチドは他の付随する基、例えばペプチド、または細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８４−６５２；ＰＣＴ国際公開公報第８８／０９８１０（１９８８））または血液脳関門（例えばＰＣＴ国際公開公報第８９／１０１３４（１９８８））  を経由する輸送を促進する物質、ハイブリダイゼーショントリガー切断剤（例えばＫｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）またはインターカレーション剤（例えばＺｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ  ５：５３９−５４９）も含んでよい。他の治療方法、例えば本発明の過剰発現遺伝子をコードする核酸を特異的に切断できるリボザイムの使用もまた本発明の意図するものである。このような方法は当該分野で日常的であり、種々の適切なリボザイムの何れかを作成し、使用する方法は当業者の知るとおりである。
【０１１３】
別の治療方法は小型干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）と呼ばれる２本鎖ＲＮＡを用いる。ＲＮＡｉ分子は従来の操作法を用いながら遺伝子発現を抑制するために遺伝子発現を抑制するために使用することができる。干渉性ＲＮＡ分子を作成し、使用する典型的な方法は例えば米国特許６，５０６，５５９号に記載されている。
【０１１４】
アンチセンス分子またはリボザイムのようなオリゴヌクレオチドを腎腫瘍の細胞または組織または目的の他の組織または臓器に導入するか、または、本発明の過剰発現遺伝子の１つ以上の生成または活性を妨害するタンパク質をコードする核酸をそのように導入する遺伝子転移の方法を用いることができる。遺伝子転移およびターゲティングを必要とする治療方法はウィルス媒介遺伝子転移、例えばレトロウィルス（Ｎａｂｅｌ，Ｅ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１３４２（１９８９））、レンチウィルス、組み換えアデノウィルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐ．１６７９，ｏｒ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ；  Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６  ９１９，１９８８，Ｓｔｒａｕｓｓ，ＳＥ，Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＨＳ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４  ｏｒ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を使用する方法を含んでよく、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）もまたヒトの遺伝子療法のために有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１（１９９１）；（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｋｏｔｉｎ，ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２１１−２２１５）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ，ＰＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８４）５１：３２９−３３９）。進歩した効率はプラスミドＤＮＡコンストラクト中のプロモーターエンハンサーエレメントの使用により達成される（Ｐｈｉｌｉｐ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：１６０８７−１６０９０）。
【０１１５】
インビボのウィルス媒介遺伝子転移のほかに、当該分野でよく知られた物理的手段、例えばプラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ｓｕｐｒａ）および当初は植物組織の形質転換において報告された粒子衝突媒介遺伝子転移（Ｋｌｅｉｎ，ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０（１９８７）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：１４５（１９９０））を用いて遺伝子転移を指向することができ、また、インビボ、エクスビボまたはインビトロの哺乳類組織に適用される（Ｙａｎｇ  Ｎ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８（１９９０）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＲＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）；Ｚｅｌｅｎｉｎ，ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．２４４：６５（１９８９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））。更にまた、インビトロの細胞内に遺伝子を転移させるよく知られた手段であるエレクトロポレーションを用いてインビボの組織に本発明のＤＮＡ分子を転移することができる（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，ＡＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｃｔａ  １０８８：１３１（１９９１））。
【０１１６】
遺伝子転移はまた「担体媒介遺伝子転移」を用いて達成することもできる（Ｗｕ，ＣＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）；Ｗｕ，ＧＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）：Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７１２８（１９８３）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１（１９８２）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましい担体はターゲティングされたリポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１０６８（１９８３）；Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，上出）、例えばイムノリポソームであり、これは脂質２層（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，上出）またはポリカチオン、例えばアシアログリコタンパク質／ポリリジン（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，上出）にアシル化されたモノクローナル抗体を取り込むことができる。リポソームは核酸およびウィルス粒子を含む細胞への種々の物質のカプセル化およびデリバリーのために使用されている（Ｆａｌｌｅｒ，ＤＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８４）４９：２６９−２７２）。
【０１１７】
合成のカチオン性脂質を含有する予備形成されたリポソームはポリアニオン製ＤＮＡと安定な複合体を形成する（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＰＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１７）。カチオン性リポソーム、即ち膜融合促進脂質ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）を含有した一部のカチオン性脂質を含むリポソームは、真核細胞内に非相同性遺伝子を効率的に転移させている（Ｒｏｓｅ，ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９１）１０：５２０−５２５）。カチオン性リポソームは、トランスジーンまたはＲＮＡを種々の培養細胞系統にデリバリーすることによりそれらの高レベルの細胞内発現を媒介できる（Ｍａｌｏｎｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）。
【０１１８】
何れかの特定の腎腫瘍サブタイプにおいて高度に予測可能な態様でアップレギュレートされる遺伝子に関する知識に基づいて腎腫瘍の治療をモニタリングするために本発明を利用することもできる。対象の治療の過程の種々の段階で、本明細書に記載するとおり腎臓試料を採取し、分析用に調製し、そして、正常な腎組織中の量と比較した場合にその過剰発現が治療すべき腎腫瘍の型に相関するアップレギュレートされた遺伝子１つ以上の存在および／または量を分析する。治療の成功は正常腎組織により近づくように発現パターンが変化することにより反映される。
【０１１９】
本発明はまた、本発明の核酸またはポリペプチドの組み合わせを、物理的分子ではなく、これらの配列を列挙または他の態様で包含または表示するコンピューター実行型のデータベースにより表示したものに関する。例えば、本発明は本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド等を表示した情報の電子的形態、例えばコンピューター読み取り可能な媒体（例えば磁気的、光学的媒体等）を包含し、そこにこれらの情報を何れかの適当なフォーマット、例えばフラットファイルまたはヒエラルヒーファイルとして保存する。この情報は好ましくは完全長または部分的な配列および情報を操作、検索および共有する電子商取引手段を含む。例えば研究者は、目的の腎臓癌試料により示される発現プロファイルを、本発明の組成物を説明または表示する電子的または他のコンピューター読み取り可能な形態のデータと比較してよく、そしてこれにより評価すべき腎腫瘍のサブタイプを決定してよい。
【０１２０】
本発明を以上の通り一般的に説明したが、これは以下の実施例を参照することにより更に容易に理解することができ、そしてこれらは説明のために記載するものであり、特段の記載が無い限り本発明を限定する意図はない。
【実施例１】
【０１２１】
（対象および腫瘍試料）
合計６９検体の凍結原発腎臓癌（３９明細胞ＲＣＣ、７乳頭状ＲＣＣ、６顆粒細胞ＲＣＣ、５嫌色素性ＲＣＣ、肉腫様ＲＣＣ、２膨大細胞腫、３ＴＣＣおよび５ウィルムス腫）、１検体の転移乳頭状ＲＣＣおよびマッチまたはアンマッチの非癌性腎組織をｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ，ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）より入手した。全組織には臨床結果の情報を伴うか伴わない病理学的報告書が付随していた。試料は解剖した後に試験に付した。各腫瘍試料の一部は術後即座に液体窒素中に凍結されたものであり、−８０℃において保存されている。
【０１２２】
従来の方法を用いて核酸の単離および調製を行った。全ＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ溶液（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ，Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）またはＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて凍結組織から単離した。最初の４５試料については、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡから単離した。残りの２５試料については、全ＲＮＡを終濃度２．５ＭのＬｉＣｌで精製した。ＷＨＯ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓを用いて標本の組織学的評価を行った（Ｍｏｓｔｆｉ，１９９８上出）。ＵＩＣＣ（Ｕｎｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｃｏｎｔｒｅ  ｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ）ＴＮＭ分類およびステージグルーピングを用いた（Ｓｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ，１９９７）。
【実施例２】
【０１２３】
（材料および方法）
（マイクロアレイ設計および操作法）
マイクロアレイは当該分野でよく知られている従来の方法および材料（Ｈｅｇｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０００；２９：５４８−５５６；Ｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９９）３０３：１７９−２０５）に多少の変更を加えて作成した。Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，より購入した細菌ライブラリを、直接ＰＣＲ増幅した１９，９６８ｃＤＮＡの入手元とした。ｃＤＮＡクローンをエタノール沈殿させ、３８４ウェルプレートに移し、これから、自家製のロボット型マイクロアレイ作成装置を用いてアミノシランコーティングスライドガラス上にそれらをプリントした（例えばウェブサイトｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ．ｏｒｇ／ｐｄｆｓ／ＰｒｉｎｔｉｎｇＡｒｒａｙｓ参照）。スライドをＵＶ交差結合の後無水コハク酸を用いて化学的にブロックした。可能な場合は癌を患者マッチの非癌性腎組織に対してハイブリダイズさせた。該当するマッチした非癌性の腎組織が入手できない腫瘍に関しては、５検体の非癌性腎組織から得たＲＮＡを混合してプールし、共通の比較対照とした。最初の４５試料については、腫瘍および比較対照から得た２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡをＣｙ５−ｄＣＴＰおよびＣｙ３−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）の存在下にオリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて逆転写した。残りの２５試料については、腫瘍および比較対照から得た全ＲＮＡ５０μｇを逆転写に使用した。Ｃｙ５−およびＣｙ３−標識ｃＤＮＡプローブをホルムアミド含有プローブハイブリダイゼーション溶液と混合し、５０℃で２０時間予備加温（５０℃）したスライドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、スライドを１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で５分間、次いで０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温（ＲＴ）で５分間、０．２ＸＳＳＣ中ＲＴで５分間２回、そして０．１ＸＳＳＣ中ＲＴで５分間洗浄した。スライドを遠心分離により即座に乾燥し、Ｓｃａｎ  Ａｒｒａｙ  Ｌｉｔｅスキャナーを用いて５３２ｎｍおよび６３５ｎｍの波長でスキャニングした（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＣＡ）。
【０１２４】
（データ分析）
画像はソフトウエアＧｅｎｅｐｉｘＰｒｏ３．０（Ａｘｏｎ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて分析した。ローカルバックグラウンドを全スポットに着き差し引いた。Ｃｙ５またはＣｙ３チャンネルのいずれかにおけるバックグラウンドを差し引いた強度が１５０未満であるスポットは分析から除外した。Ｃｙ５強度のＣｙ３強度に対する比を各スポットにつき計算し、非癌性腎組織に対して相対的な腫瘍ＲＮＡ発現を示すものとした。比は対数変換し（底２）、そしてメジアンの対数変換比がゼロ値となるように規格化した。以下の基準を満たす遺伝子（合計３５６０遺伝子）を包括的なクラスター分析のために選択した。即ち、１）腫瘍の少なくとも７０％において存在する発現値；２）少なくとも２つもにおいて少なくとも２倍変動する発現比；および、３）最大比マイナス最小比の値が２倍より大きいものとした。遺伝子発現比は全試料に渡りメジアン統一した。遺伝子発現の値はＣＬＵＳＴＥＲａｎｄＴＲＥＥＶＩＥＷソフトウエア（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎ，ＵＲＬ  ｒａｎａ．ｌｂｌ．ｇｏｖを有するウェブサイトより入手可能）を用いて操作し、可視化した。相関距離は１−ｒとして計算し、ここでｒはピアソンの順位付けの相関係数を示す（Ｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８，９５：１４８６３−１４８６８）。
【０１２５】
自家性のソフトウエアプログラムＣＩＴを用いて組織学的サブタイプおよび他のものとの間で示差的に発現（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用）される遺伝子を発見した（Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００２，１８：２０５−２０６）。有意に判別できる遺伝子を発見するために、２群に患者を無作為に割り付けることにより１００００個のｔ統計値を計算した（Ｈｅｄｅｎｆａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，上出）。９９．９％の有意差の閾値（ｐ＜０．０１）を用いて患者群ｖｓ無作為の患者グループの間の有意に判別することができる遺伝子を発見した。
【０１２６】
７０腎腫瘍のクラスター分析は以下の通り表記した。即ち、患者のクラスタリング（ピアソン相関を用いる）をは３５６０の選択されたスポットのメジアン統一データよりなる包括的遺伝子発現プロファイルに基づくものとした。列は個々のｃＤＮＡを示し、行は個々の腫瘍試料を示す。各正方形の色は比較対照に対する腫瘍における遺伝子発現のメジアン統一された規格化された比を示す。メジアンより高値の発現レベルは異なる色で示した。色の飽和はメジアンとの相違の程度を示す。腫瘍は２つの概ねのグループにクラスタリングし、１つは原発明細胞ＲＣＣ、もう１つは他の全ての腎腫瘍よりなるものとした。５嫌色素性ＲＣＣおよび２膨大細胞腫は近接してクラスタリングした。８乳頭状ＲＣＣ、５ウィルムス腫または３ＴＣＣの各群は共にクラスタリングした。試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較した場合の腫瘍の各サブタイプにおける最も高度に発現された遺伝子のセットを発見した。
【０１２７】
データはまた３次元（３Ｄ）腫瘍画像としてディスプレイした。腎腫瘍の種々のサブタイプは各々異なる色で表した。５嫌色素性ＲＣＣおよび２膨大細胞腫は共に近接させてクラスタリングした。８乳頭状ＲＣＣ、５ウィルムス腫および３ＴＣＣの各群はそれぞれ共にクラスタリングした。一方の明細胞ＲＣＣはＴｒｅｅＶｉｅｗによる２Ｄクラスタリングの場合よりも散乱が大きいように観察された。結果データが入手できたＣＣ−ＲＣＣに着目しながら全ての腫瘍をディスプレイした。手術後５年より長く生存した患者、および、手術後５年以内に癌で死亡した患者は異なる色で表した。
【０１２８】
（免疫組織化学）
５０腎組織試料、うち良性（ｎ＝１０）、悪性（ｎ＝４０）を免疫組織化学的に分析した。腎腫瘍の内訳は明細胞ＲＣＣ（ｎ＝１０）、乳頭状ＲＣＣ（ｎ＝１０）、嫌色素性ＲＣＣ（ｎ＝１０）、膨大細胞腫、（ｎ＝５）およびＴＣＣ（ｎ＝５）であった。各組織試料の切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、組織学的に評価した。以下のタンパク質、即ちＧＳＴα、メチルアシルラセマーゼ（Ｃｏｒｉｘａ，Ｓｉａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）、炭酸脱水酵素ＩＩおよびケラチン１９（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）  に対する抗体を市販品として入手した。標準的なビオチンアビジン複合体の免疫組織化学的操作を行った。慨すれば、組織切片を一次抗体と共に３０分間２０℃でインキュベートした。次に、スライドをビオチニル化抗マウスＩｇＧまたは抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に２７℃で３０分間インキュベートし、そして抗原抗体複合体をクロモゲンとしてのジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および逆染色剤としてのヘマトキシリンを用いながらアビジンビオチニル化セイヨウワサビパーオキシダーゼ系（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）により検出した。スライドは熟練した泌尿器科の病理学者によりネガまたはポジの何れかとして評価した。
【０１２９】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−α（ＧＳＴ−α、Ｆ−Ｈ）に関する免疫染色をディスプレイした。メチルアシルラセメート、炭酸脱水酵素ＩＩ（ＣＡＩＩ）は正常な腎皮質、明細胞ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣおよび嫌色素性ＲＣＣにおいて示された。強力な免疫反応性は腎近位および遠位の細管に存在し、明細胞ＲＣＣのＧＳＴ−α、乳頭状ＲＣＣのＡＭＡＣＲそして嫌色素性ＲＣＣのＣＡＩＩがみとめられた。
【実施例３】
【０１３０】
（ヒエラルヒークラスタリングによる腎腫瘍の分類）
ヒエラルヒークラスタリング（Ｅｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，上出）を用いて実施例ＩＩに記載したとおり選択された３５６０のｃＤＮＡセットの発現比を用いながらその遺伝子発現プロファイルに基づいて腎腫瘍を分類した。クラスタリングアルゴリズムは発現パターンの同様性により遺伝子および腫瘍の両方をグループ分けする。全３５６０ｃＤＮＡの発現プロファイルに基づく患者の樹形図を図１に示す。樹形図のしたの遺伝子発現パターンは腫瘍の全ての他の型と比較した場合の各サブタイプにおいて統計学的に示差的に発現された１３０９遺伝子に基づいている。２つの概ねのクラスターが発生し、一方は３５明細胞ＲＣＣおよび４顆粒細胞ＲＣＣよりなり、もう一方は腎腫瘍の他の全ての型プラス４明細胞ＲＣＣよりなるものであった。５嫌色素性ＲＣＣおよび２膨大細胞腫は共にクラスタリングされた。他のクラスターには８乳頭状ＲＣＣ、５ウィルムス腫および３ＴＴＣが含まれていた。明細胞ＲＣＣの大きいクラスターには、２つのサブクラスターが存在し、即ち一方は癌で死亡した（Ｅ、図１）全患者（１人を除く）を含み、そして他方は転移の証拠のない癌の生存者（Ｄ、図１）であった。同じ患者に由来する２明細胞ＲＣＣ、１原発腫瘍および転移リンパ節もまた調べた（明細胞４０Ｐ、４０Ｍ）。興味深いことに、同じ患者から得たこれらの２試料は同様の発現パターンを有しており、原発腫瘍と点いつもとの間の遺伝学的関連性を示すものであった（Ｈａｄｄａｄ  ２００２）。試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較して腫瘍の各サブタイプにおいてより高度に発現された遺伝子のセットは図１の未側の異なる色の側部バーにより示した（Ａ：嫌色素性ＲＣＣ、Ｂ：乳頭状ＲＣＣ、Ｃ：ウィルム腫、Ｄ：良好な結果を示した明細胞ＲＣＣ、Ｅ：明細胞ＲＣＣ）。６顆粒細胞ＲＣＣは恐らくは「無作為の」態様で位置し、単一の実体ではないことが示唆された。これらの６例の診断はＲＣＣ診断のためのＵＩＣＣおよびＡＪＣＣの作業グループの推奨より以前に日本において行われた。盲検的な組織学的再評価を熟練した泌尿器科の病理学者により可能な５例に対して実施した。明細胞ＲＣＣ群にクラスタリングされた「顆粒細胞ＲＣＣ１、３および４」は明細胞ＲＣＣとして再分類された。嫌色素性ＲＣＣおよび膨大細胞腫と近接してクラスタリングされた「顆粒細胞２」は嫌色素性ＲＣＣとして再分類された。異なる組織学的特徴を有していた「顆粒細胞５」は遺伝子発現プロファイルによれば何れのＲＣＣ群にもクラスタリングされず、ＲＣＣの新規なサブタイプを示していると考えられる。これらの所見は遺伝子発現により腎新生物をサブ分類することの正確さ、客観性および潜在的な臨床利用性を示すものである。
【０１３１】
次に多次元スケーリング（ＭＤＳ）を用いることにより全ての腫瘍のプロファイルの間の関係を可視化した。ＭＤＳデータの３次元（３Ｄ）可視化によればどのようにして各ＲＣＣサブタイプが例えば嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫、乳頭状ＲＣＣ、ウィルム腫およびＴＣＣにクラスタリングされたかが明らかにされた（図２Ａ）。「顆粒細胞５」は攻撃的な型であり再分類できなかったが、肉腫様ＲＣＣの次に位置させた。最後に不良な結果を有していたＣＣ−ＲＣＣの大部分が一方の側にクラスタリングされ、それらが同様の発現プロファイルを共有していたことを示唆していた（図２Ｂ）。
【実施例４】
【０１３２】
（腎腫瘍の６サブタイプにおける示差的に発現された遺伝子）
３５６０ｃＤＮＡを用いた実施例ＩＩＩに示した包括的なクラスタリング分析では腎腫瘍の６サブタイプの各々が異なる分子シグニチャーを有することを示していた。本実施例においては、これらの判別に寄与する示差的に発現された遺伝子を発見する。
【０１３３】
（ＣＣ−ＲＣＣ）
表１は本明細書において試験した腎腫瘍の他の型よりも明細胞ＲＣＣにおいてより高度に発現される約３０遺伝子を示す。以下に示すものが一部の過剰発現された遺伝子である。
【０１３４】
パーオキシソーム増殖物質活性化受容体ガンマアンギオプロテイン関連（ＰＧＡＲ）はＣＣ−ＲＣＣにおいて最も示差的に発現された（１８．３倍過剰発現）。パーオキシソーム増殖物質活性化受容体ガンマ（ＰＰＡＲγ）は脂肪の分化および全身インスリンシグナリングを調節する。ＰＧＡＲはＰＰＡＲγの標的遺伝子であることがわかっており、そしてＰＧＡＲの発現は脂肪組織および胎盤に優勢に局在化する。更にまた、ホルモン依存性の脂肪細胞の分化はＰＧＡＲ転写産物の早期の誘導と共に起こる（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００；２０：５３４３−５３４９）。本遺伝子および明細胞ＲＣＣに特異的な脂肪分化関連タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現はこれらの細胞の原形質中のコレステロール、コレステロールエステルおよびリン脂質の遍在性に関連していると考えられる（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｒｓｔ  Ｕｒｏｌ  １９８１；１９：１−３）。
【０１３５】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）はＣＣ−ＲＣＣにおいては高度に発現されるが他のＲＣＣサブタイプにおいてはそうではないことがわかっている。
【０１３６】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−αは生体異物および癌原性物質の解毒を触媒することにより細胞を保護する機能を有する。以前の免疫組織化学的試験によれば、正常腎臓、特に近位の細管並びに腎臓癌において強力な発現が明らかにされている。本発明者等は本明細書において、その発現が明細胞ＲＣＣに特異的であり、そして他のＲＣＣサブタイプとの識別におけるマーカーとして使用できることを示す。このことは免疫組織化学的染色により更に確認される（例えば図３および表４参照）。
【０１３７】
発現の増大がＣＣ−ＲＣＣを示す好ましい５遺伝子は上記した通りである。
【０１３８】
（乳頭状ＲＣＣ）
表２は本明細書において試験した腎腫瘍の他の型よりも乳頭状ＲＣＣにおいてより高度に発現される約３０遺伝子を示す。過剰発現された遺伝子は以下に示す通りである。
【０１３９】
α−メチルアシル補酵素Ａラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）。αメチルアシル補酵素Ａラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）遺伝子によりコードされる酵素は分枝鎖脂肪酸分子のパーオキシソームβ酸化において重要な役割を果たす。ＡＭＡＣＲは近年、マイクロアレイ実験による転写レベルおよびタンパク質レベルの両方において前立腺癌において過剰発現されることがわかった（Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ２００２；２８７（１３）：１６６２−７０；Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２；６２（８）：２２２０−６）。免疫組織化学的な別の試験によれば、前立腺癌の症例の９０％超においてＡＭＡＣＲタンパク質は上昇したが、良性の前立腺組織では異なり、ＡＭＡＣＲが前立腺癌に関わる前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）よりも更に特異的なマーカーであることを示唆している（Ｒｕｂｉｎ，２００２，上出；Ｌｕｏ，２００２，上出）。この遺伝子は乳頭状ＲＣＣにおいて５．３倍高値に発現された。更にまた免疫組織化学的分析は、乳頭状ＲＣＣ症例の１００％、ＲＣＣの他のサブタイプの１０％未満における免疫反応性を示している（図３Ｅ−Ｈ）。
【０１４０】
【表１Ａ】
2006501849.tif 000003
ＣＣ−ＲＣＣにおける上位３０の示差的に発現されるｃＤＮＡを列挙する。これらは過剰突然変異試験１００００回により試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較して明細胞ＲＣＣにおいて有意により高度に発現される。倍変化は、試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較した場合にこの倍変化の比較的より高度の発現を明細胞ＲＣＣが有していることを示す。
【０１４１】
グアニンデアミナーゼ（ＧＤＡ）はＤＮＡターンオーバー酵素であり、ＧＤＡをコードする遺伝子は乳頭状ＲＣＣにおいて最も示差的に発現される遺伝子である。ＧＤＡ活性はＲＣＣ  （Ｄｕｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９７；１５（３）：２１２−６）および胃癌（Ｄｕｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，上出）において上昇することがわかっている。ＧＤＡは乳頭状ＲＣＣに関する有用なマーカーである。
【０１４２】
乳頭状ＲＣＣにおいて過剰発現される別の遺伝子はクラウジン−４であり、これは細胞間の堅固な接合構造の必須成分である膜貫通組織特異的クラウジンタンパク質のより大きいファミリーのメンバーである。遺伝子はまた前立腺癌（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１；６１（２１）：７８７８−８１）およびすい臓がん（Ｍｉｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００１；１２１（３）：６７８−８４）においても過剰発現される。アルド−ケト還元酵素ファミリー１のメンバーＣ１（ＡＫＲ１Ｃ１）およびＣ３（ＡＫ１ＲＣ３）である２種のヒトジヒドロジオールデヒドロゲナーゼもまた乳頭状ＲＣＣにおいて高度に発現されている。両者ともヒト前立腺および乳腺（Ｐｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２００１，１７１：１３７−１４９）および非小細胞肺癌（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１，６Ｉ：２７２７−２７３１）においても過剰発現されているが、乳頭状ＲＣＣにおいては以前には報告されていない。
【０１４３】
増大した発現が乳頭状ＣＣ−ＲＣＣを示す好ましい５遺伝子は上述した通りである。
【０１４４】
【表２】
2006501849.tif 000004
乳頭状ＲＣＣにおける上位３０の示差的に発現されるｃＤＮＡを列挙する。これらは過剰突然変異試験１００００回により試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較して乳頭状ＲＣＣにおいて有意により高度に発現される。倍変化は試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較した場合にこの倍変化の比較的より高度の発現を乳頭状ＲＣＣが有していることを示す。
【０１４５】
（嫌色素性ＲＣＣおよび膨大細胞腫）
表３は本明細書において試験した腎腫瘍の他の型よりも嫌色素性ＲＣＣおよび膨大細胞腫においてより高度に発現される約３０遺伝子を示す。
【０１４６】
図１および２は５嫌色素性ＲＣＣおよび２膨大細胞腫が共に緊密してクラスタリングされ、これらの２サブタイプが同様の遺伝子発現パターンを有することを示唆している。嫌色素性ＲＣＣと膨大細胞腫との間の発現プロファイルの同様性は以前より報告されている（Ｙｏｕｎｇ，２００１，上出）。
【０１４７】
嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫は豊富なミトコンドリアを含んでいることがわかっている。ミトコンドリア生物学および酸化的リン酸化に関わる遺伝子は本発明者等の試験において過剰発現されており、嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫に対するこれらの遺伝子発現の高い特異性を示唆している。
【０１４８】
炭酸脱水酵素（ＣＡ）は亜鉛金属酵素のファミリーである。ＣＡＩＸは腎臓癌における低酸素誘導性因子−１により厳密に調節されることがわかっている。ＣＡＩＩヌルマウスは腎尿細管アシドーシス（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８；８５（６）：１９６２−６）および尿酸性化不能（Ｂｒｅｃｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ１９９１；１０６６（２）：２０１−７）を有することがわかっている。ＣＡＩＩは外側髄質の尿細管細胞および皮質髄質接合部において発現されることがＣＡＩＩ欠損マウスへのＣＡＩＩ遺伝子デリバリーにより明らかにされている（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９８；１０１（７）：１３２０−５）。本発明者等の免疫染色は正常腎において上記所見を確認しており、そして全ての嫌色素性ＲＣＣ（１０／１０）および膨大細胞腫（５／５）において更に陽性結果を示した。このマーカーは他の腎腫瘍の小さいサブセットにおけるその発現のため、ＧＳＴ−αやＡＭＡＣＲよりも特異性は低い。
【０１４９】
増大した発現が嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫を示す好ましい５遺伝子は上記したとおりである。
【０１５０】
表５は本明細書において試験した腎腫瘍の他の型よりも肉腫様においてより高度に発現される遺伝子を示す。
【０１５１】
本発明者等は３混合明細胞／肉腫様ＲＣＣおよび２肉腫様ＲＣＣを検討した。示差的に発現された遺伝子にはＳＰＡＲＣ（酸性およびシステインリッチの分泌タンパク質）遺伝子が含まれており、その配列はゲンバンクにアクセッション番号ＡＡ４３６１４２（配列番号９３）として記載されている。ＳＰＡＲＣは細胞増殖および細胞外リモデリングの間の細胞マトリックス相互作用に関連している。血管新生、侵襲および癌転移においても、ＳＰＡＲＣをコードする遺伝子が肉腫様成分を有するＲＣＣにおいて高度に発現されることが関与しているとされている。
【０１５２】
フィブロネクチン（ゲンバンクのアクセッション番号Ｒ６２６１２（配列番号９２））およびコラーゲンＶＩ（ゲンバンクのアクセッション番号Ｈ９９６７６（配列番号１０３））のような細胞外マトリックス化合物をコードする遺伝子もまた本発明者等の試験においては肉腫瘍成分を有するＲＣＣにおいて過剰発現されることがわかっている。ＶＩ型コラーゲンはＲＣＣにおいて広範に分布していることがわかっており、そしてフィブロネクチンは特に低分化の癌において重要な間質成分である（Ｌｏｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  １９９８；１３（３）：７８５−９６）。別の研究によれば、細胞外マトリックス成分、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶの添加によりＲＣＣ細胞系統の侵襲が５〜１０倍増大している。肉腫様成分を有するＲＣＣにおけるこれらの遺伝子の過剰発現は、高い比率の転移および不良の予後を示す肉腫様ＲＣＣの挙動の根底をなすと考えられる。これらの所見は肉腫様ＲＣＣの侵襲および転移の機序を解明すると考えられる。
【０１５３】
（肉腫様ＲＣＣ）
発現の増大が嫌色素性肉腫様ＲＣＣを示す好ましい５遺伝子は上記したとおりである。
【０１５４】
（他の型の腎腫瘍）
（移行上皮癌（ＴＣＣ））
表６は本明細書において試験した腎腫瘍の他の型よりもＴＣＣにおいてより高度に発現される遺伝子を示す。
【０１５５】
腎盂において生じるＴＣＣは全腎臓に渡って侵襲する場合があり、そしてこのため、ＴＣＣをＲＣＣから判別することは困難である。ＴＣＣの新しいマーカーを発見することはその診断に役立つものと考えられる。ケラチン１４（ゲンバンクのアクセッション番号Ｈ４４０５１（配列番号１２０））をコードする遺伝子は通常は扁平上皮細胞の基底細胞中に発現される。ケラチン１４は扁平上皮癌の有用なマーカーであることが提案されている（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２００１；３９（１）：９−１６）。これはまた扁平上皮形態を有するＴＣＣにおいて発現され、扁平上皮の分化の形態学的徴候を有さないＴＣＣにおいても局所的に発現される（Ｈａｒｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９７，５０：１０３２）。ケラチン１４は本発明者等の試験において最も示差的に発現された遺伝子であり、腎臓のＴＣＣの有用なマーカーとして機能すると考えられる。ＴＣＣに高度に特異的な数種の遺伝子は皮膚に関連している。ＶＩＩ型コラーゲン（ゲンバンクのアクセッション番号ＡＡ５９８５０７（配列番号１２１））は例えば付着フィブリルの主要構成成分であり、皮膚の表皮上皮基底膜領域における基底層の下部に存在する（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８６；１０３（４）：１５７７−８６）。ケラチン１９（Ｋ１９）（ゲンバンクのアクセッション番号ＡＡ４６４２５０（配列番号１２２））は発達中の表皮を封入する一過性の表面層である胎児表皮に発見されている（Ｖａｎ  Ｍｕｉｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  ｒｅｓ  １９８７；１７１（２）：３３１−４５）。免疫組織化学によれば、本発明者等は一部の腎尿細管、良性の一過性の上皮およびＴＣＣの５例の１００％においてＫ１９の発現を観察している（表４）。インテグリンβ−４（ゲンバンクのアクセッション番号ＡＡ４８５６６８（配列番号１２５））はヒト表皮において発現されており、基底膜領域とは反対に腹側表面に限局されている。インテグリンβ−４は重層の一過性の上皮において半接着斑と関連して検出されている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌ  １９９１；２（６）：４２７−３８）。Ｌａｄｉｎｉｎ（ゲンバンクのアクセッション番号Ｔ９７７１０（配列番号１２６））は半接着斑の下部に位置する基底細胞に伴っている（Ｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  １９９８；４３２（６）：４８７−５０４）。これより総括すれば、これらの皮膚病変関連遺伝子は腎臓のＴＣＣの特異的マーカーであると考えられる。
【０１５６】
発現の増大がＴＣＣを示す好ましい５遺伝子は上記したとおりである。
【０１５７】
【表３】
2006501849.tif 000005
上位３０の示差的に発現されるｃＤＮＡを列挙する。これらは過剰突然変異試験１００００回により試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較して嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫において有意により高度に発現される。倍変化は試験した腎腫瘍の全ての他の型と比較した場合にこの倍変化の比較的より高度の発現を嫌色素性ＲＣＣ／膨大細胞腫が有していることを示す。
【０１５８】
【表４】
2006501849.tif 000006
【０１５９】
【表５】
2006501849.tif 000007
【０１６０】
【表６−１】
2006501849.tif 000008
【０１６１】
【表６−２】
2006501849.tif 000009
（ウィルムス腫（ＷＴ））
インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）遺伝子（ゲンバンクのアクセッション番号Ｎ７４６２３（配列番号１９５））はＷＴにおいて示差的に発現される遺伝子の１つである。ＩＧＦＩＩは染色体１１ｐ１５上に位置し、これは通常はインプリント」される（父方由来対立遺伝子においてのみ発現される）。ＷＴの遺伝型であるＢｅｃｋｗｉｔｈ−Ｗｉｅｄｅｍａｎ疾患において、一部の患者では構成的にＩＧＦＩＩのインプリンティングが消失する。一部の散在性のＷＴもまたＩＧＦＩＩのインプリンティングを消失し、このことはＷＴにおけるＩＧＦＩＩの高い発現をもたらすと考えられる。
【０１６２】
グリピカン３（ゲンバンクのアクセッション番号ＡＡ７７５８７２（配列番号１９４））はヘパランスルフェートプロテオグリカンであり、通常は胎児の中胚葉組織中に発現される。その破壊により巨人症または過剰成育が起こる。本試験においては、グリピカン３はＷＴにおいて最も示差的に発現される遺伝子であった。ＩＧＦＩＩおよびグリピカン３の高度の発現はＷＴに特異的な特徴であると考えられる。
【０１６３】
上記した説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、そしてその精神および範囲から外れることなく本発明を変更または改変して種々の用途および条件に適合することができる。
【０１６４】
更に検討を行うことなく、当業者は上記説明を用いて本発明をその完全な領域にまで利用することができる。上記において開示した好ましい特定の実施形態は単に説明を目的としており、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１６５】
上記において引用した全ての特許出願、特許および他の出版物の全体の開示および図面に含まれるものは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
本出願は２００２年１０月４日に出願された米国出願６０／４１５，７７５号の出願日の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【配列表】
2006501849000001.app
【国際調査報告】
2006501849.tif 000010
2006501849.tif 000011
2006501849.tif 000012