(57)【要約】【課題】  従来の多層凹状体組込み装置を使用した試験の場合、細胞を染色したり蛍光標識したりすることが必要とされ、実験に余分なステップ及び余分なコストを付加してしまうことであった。【解決手段】  本発明は、広くは上部試験槽１１４、下部試験槽１１６、膜１０６、センサー１２０を含む多層凹状体組込み装置１００ａと、その使用方法に関する。前述のセンサー１２０は、上部試験槽１１４から膜１０６を通過して下部試験槽１１６へ進んだ対象物１２２（例えば、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチド、炭水化物）を、標識フリーの方法で検出するためのものであり、下部試験槽１１６の面１１２上に存在する前述の対象物１２２に起因する屈折率の変化を測定することにより行われる。
2006505278.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層凹状体組込み装置であって、
上部試験槽と、
下部試験槽と、
前記上部試験槽と前記下部試験槽との間に配置された膜と、
前記下部試験槽の面上に存在する対象物に起因する屈折率変化を測定することで前記上部試験槽から前記膜を通して前記下部試験槽に達した対象物を検出するセンサーと、
を含むことを特徴とする多層凹状体組込み装置。
【請求項２】
前記対象物は、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチドまたは炭水化物であることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項３】
前記センサーは、前記膜を通過した対象物の移動容量を評価するために使用されることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項４】
前記センサーは、前記膜上にある対象物の付着容量を評価するために使用されることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項５】
前記膜が、ポリエステル膜またはポリカーボネート膜であることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項６】
前記膜が、０．１μｍから１２μｍの範囲の細孔を有する微孔性膜であることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項７】
前記膜が、生物学的要素、タンパク質、生体膜または細胞で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項８】
前記下部試験槽の前記面が、当該面で前記対象物の捕獲及び集結を助ける少なくとも一つの物質で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項９】
前記下部試験槽の前記面が、抗体または他の結合タンパク質を含む捕獲試薬で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１０】
前記下部試験槽の前記面が、疎水性、親水性または帯電した界面化学を含む捕獲試薬で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１１】
前記センサーが、グレーティング型平面導波路センサーであることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１２】
前記グレーティング型平面導波路センサーが、対象物を検出するために角度探測法を利用していることを特徴とする請求項１１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１３】
前記グレーティング型平面導波路センサーが、対象物を検出するためにスペクトル探測法を利用していることを特徴とする請求項１１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１４】
前記センサーが、グレーティング型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１５】
前記センサーが、プリズム型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１６】
複数個の前記多層凹状体組込み装置がマイクロプレートの複数個の凹部を形成することを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１７】
前記下部試験槽が、前記上部試験槽と比較して浅いことを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１８】
前記センサーが、前記膜に接触していることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状体組込み装置。
【請求項１９】
多層凹状体組込み装置の使用方法であって、
前記多層凹状体組込み装置の上部試験槽中に対象物を配するステップと、
前記対象物を前記上部試験槽から前記多層凹状体組込み装置の膜を介して下部試験槽に移動させるステップと、
前記下部試験槽の面上に存在する前記対象物に起因する屈折率変化を測定するセンサーを使用して前記下部試験槽の面上にある前記対象物を検出するステップと、
を備えていることを特徴とする多層凹状体組込み装置を使用する方法。
【請求項２０】
前記対象物が、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチドまたは炭水化物であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記センサーが、前記膜を通過した対象物の移動容量を評価するために使用されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記センサーが、前記膜上の対象物の付着容量を評価するために使用されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記膜が、ポリエステル膜またはポリカーボネート膜であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記膜が、０．１μｍから１２μｍの範囲の細孔を有する微孔性膜であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記膜が、生物学的要素、タンパク質、生体膜または細胞で被覆されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記下部試験槽の前記面が、下部試験槽の面で前記対象物の捕獲及び集結を助ける少なくとも一つの物質で被覆されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記下部試験槽の前記面が、抗体または他の結合タンパク質を含む捕獲試薬で被覆されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記下部試験槽の前記面が、疎水性、親水性または帯電した界面化学を含む捕獲試薬で被覆されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記センサーが、グレーティング型平面導波路センサーであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記グレーティング型平面導波路センサーが、対象物を検出するために角度探測法を利用していることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記グレーティング型平面導波路センサーが、対象物を検出するためにスペクトル探測法を利用していることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記センサーが、グレーティング型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記センサーが、プリズム型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
複数個の前記多層凹状体組込み装置がマイクロプレートの複数個の凹部を形成することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記下部試験槽が、前記上部試験槽と比較して浅いことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記センサーが、前記膜に接触していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
複数個の凹部を含む構造と、前記凹部の各々が多層凹状体組込み装置の形状であるマイクロプレートであって、前記多層凹状体組込み装置は、
上部試験槽と、
下部試験槽と、
前記上部試験槽と前記下部試験槽の間に配置された膜と、
前記下部試験槽の面上に存在する対象物に起因する屈折率変化を測定することにより前記上部試験槽から前記膜を通過して前記下部試験槽に到達した対象物を検出するセンサーと、
を含むことを特徴とする多層凹状体組込み装置を含むマイクロプレート。
【請求項３８】
前記対象物が、細胞、分子、薬剤、化合物、核酸、ペプチドまたは炭水化物であることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【請求項３９】
前記センサーが、前記膜を通過した対象物の移動容量を評価するために使用されることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【請求項４０】
前記センサーが、前記膜上の対象物の付着容量を評価するために使用されることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【請求項４１】
前記センサーが、多様な試験を行うために使用されることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【請求項４２】
前記センサーが、グレーティング型平面導波路センサーであることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【請求項４３】
前記センサーが、グレーティング型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【請求項４４】
前記センサーが、プリズム型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項３７に記載のマイクロプレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは上部試験槽、下部試験槽、膜、センサーを含む多層凹状体組込み装置と、その使用方法に関する。前述のセンサーは、上部試験槽から膜を介して下部試験槽へ達した対象物（例えば、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチド、炭水化物）を、標識フリーの方法で検出するためのものであり、下部試験槽の面上に存在する前述の対象物に起因する屈折率の変化を測定することにより行われる。
【背景技術】
【０００２】
創薬開発を通じて、全ての新薬のおよそ３９％が、吸着、分布、代謝、排せつ（ＡＤＭＥパラメーター）の問題のために、臨床研究に失敗している。従って、研究者がこれらの研究を行い、前述のＡＤＭＥパラメーターを効率的、便利且つ安価な方法において生体外で評価することを可能にする装置を所有することが望ましい。多層凹状体組込み装置は、比較的に扱いやすく且つ低コストであるという理由から、前述の研究を行うために頻繁に使用されている。従来の多層凹状体組込み装置は、膜によって下部試験槽と隔てられている上部試験槽を含んでいる。従来の多層凹状体組込み装置は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（BD Biosciences）からＭｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｐｌａｔｅｓというブランド名で、コーニング社（Corning,Inc.）からはＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓというブランド名で販売されている。今日、上述の多層凹状体組込み装置は、主に二つの用途において研究者に使用されている。
【０００３】
第１の用途は、細胞移動試験に関する。このような研究において、細胞は多層凹状体組込み装置の上部試験槽に入れられた後、膜を介して下部試験槽に移動することが可能になる。その後、細胞は試験に先立って行われる蛍光標識を使用して、または試験の終わりに細胞染色を行うことにより検出される。その後、定量化は染色細胞のカウントまたは下部試験槽中または膜上の蛍光を測定することによりなされる。例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社は、上部試験槽中の標識された細胞からの干渉を受けること無く、下部試験槽中の蛍光標識された細胞の検出を可能にするＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔＴＭ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋＴＭ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔを設計している。従来の多層凹状体組込み装置を使用した細胞移動試験の実施に伴う主な不利な点は、細胞を染色したり蛍光標識したりすることが必要とされ、実験に余分なステップ及び余分なコストを付加してしまうことである。
【０００４】
第２の用途は、薬剤吸着試験に関する。薬剤吸着試験は、生体膜または模型膜の向こう側への一つまたはそれ以上の薬剤の浸透性を測定するために行われるものである。または、薬剤吸着試験では、固体基板（例えば、膜または支持フィルター）上に成長させたＣａｃｏ２またはＭＤＣＫ細胞単層（または他の適当な細胞株）の向こう側への一つまたはそれ以上の薬剤の浸透性を測定することができ、密着結合で隔てられることができる。下部試験槽の薬剤定量化に使用される代表的な検出方法は、（１）質量分析法に続く液体クロマトグラフィー（ＬＣ/ＭＳ）、（2）紫外可視分光光度法、とを含む。上述の（ＬＣ/ＭＳ）方法は多重化し易いという利点を有しているが、処理量が低いという不利な点をも有している。紫外可視分光光度法の不利な点は、研究される各薬剤のために、全領域が記録される必要があるので処理量が低いということである。ＬＣ/ＭＳ方法と紫外可視分光光度法の他の不利な点は、両者ともに終点試験であるということである。
【０００５】
従って、従来の多層凹状体組込み装置の前述の短所及び他の短所に対処できる新しいタイプの多層凹状体組込み装置が以前から必要とされていた。上述のニーズ及び他のニーズは、本発明の多層凹状体組込み装置により満たされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
＜発明の簡単な説明＞
本発明は、上部試験槽、下部試験槽、膜、センサーを含む多層凹状体組込み装置とその使用方法に関する。前述のセンサーは、上部試験槽から膜を通過して下部試験槽へ進んだ対象物（例えば、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチド、炭水化物）を、標識フリーの方法で検出するためのものであり、下部試験槽の面上にある前述の対象物に起因する屈折率の変化を測定することにより行われる。多層凹状体組込み装置は、例えば細胞移動試験や薬剤浸透性試験を含む多種多様な試験を行うために使用されることができる。更に、多層凹状体組込み装置はマイクロプレートの凹部を形成したり、マイクロプレートの凹部に組み込まれたりすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本出願は、米国特許出願第１０／２９０,００１（出願日：２００２年１１月７日）に基づく優先権の利益を主張するものであり、その内容は本出願に援用される。
【０００８】
図１から図１１を参照すると、本発明に基づいて、多層凹状体組込み装置の幾つかの異なる実施例１００ａ、１００ｂ、１００ｃ、及び多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃの使用方法１１００が開示されている。多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、細胞移動試験及び薬剤浸透性試験を行うために使用されることが説明されているが、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃの使用は、前述の調査に限定されるものではないことが理解されるべきである。それどころか、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは薬剤溶解性調査、ウイルス検出調査、タンパク分泌物調査を含む多種多様な調査を行うために使用することができる。従って、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃ及び多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃの使用方法１１００は限定された方法であると解釈されるべきではない。図１Ａ〜図1Ｆは、本発明に基づく多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃの３つの異なる実施例の、３組の分解斜視図と断面側面図を含んでいる。各々の多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、保持部品１０４を分離して支持するハンガー１０２を有する。保持部品１０４は、膜１０６を分離して支持する。ハンガー１０２は、培養皿１１０中の凹部１０８の周縁からぶら下がり得るように構成され、配置される。
【０００９】
図のように培養皿１１０は、１つだけの凹部１０８を有するのではなく、当然のことながら６個、１２個、２４個または他の数の凹部１０８を有することができる。（例えば、図１０のマイクロプレート１０００を参照。）同様に当然のことながら、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは多様なサイズ及び形状で構成されることができ、それでも尚、本発明の範囲内であると考えることができる。例えば、図１Ａと図１Ｂに示されているように、ハンガー１０２は保持部品１０４と膜１０６を、培養皿１１０の面１１２から遠くに離して支持しても良い。または図１Ｃと図１Ｄに示されているように、ハンガー１０２は保持部品１０４と膜１０６を、培養皿１１０の面１１２と比較的に近接するように支持しても良い。または、図１Ｅと図１Ｆに示されているように、培養皿１１０は凹部１０８中に上方に伸びた柱１１８を有していても良く、この場合に柱１１８は膜１０６に比較的に近接していても良いし接触してさえいても良い。
【００１０】
多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、更に対象物（例えば、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチド、炭水化物）を標識フリーの方法、または独立した方法で検出するセンサー１２０を含む。前述の対象物は、上部試験槽１１４中では溶液中で沈殿し、膜１０６を介して下部試験槽中に到達することが可能になる。特に、センサー１２０は下部試験槽の面１１２上、または面１１２近辺に配された対象物１２２を検出する。上部試験槽１１４は、ハンガー１０２の内側と膜１０６の上側の領域とによって定義される。また、下部試験槽１１６はハンガー１０２の外側と、膜１０６の下側ではあるが凹部１０８の内壁の内側の領域とによって定義される。
【００１１】
センサー１２０は、面１１２上またはその近辺にある対象物１２２の存在に起因する屈折率変化を測定することにより、下部試験槽１１６中の対象物１２２の存在を標識フリーまたは独立した方法で検出する。例えば、センサー１２０は、対象物１２２が面１１２上に存在しないときに屈折率値を測定し、その後、対象物１２２が面１１２上に存在するときに、もう一つの屈折率値を測定する。上述の屈折率測定値の差異は、対象物１２２の面１１２上への存在を示すものである。更に、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、面１１２上にある対象物１２２の量または質量を測定するために使用されることができる。幾つかの異なるタイプのセンサー１２０が、図３〜図７を参照して以下に説明されている。
【００１２】
図２を参照すると、細胞１２２ａの移動容量を評価するために使用される多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。基本的に、多層凹状体組込み装置１００ａとその中に組み込まれるセンサー１２０は、細胞１２２ａの移動容量を評価するために標識フリー検出技術を使用する。上述の評価を行う為に、センサー１２０は、細胞１２２ａが上部試験槽１１４から膜１０６を通過して移動し下部試験槽１１６の面１１２上に集中するようになる前後の下部試験槽１１６の面１１２上の屈折率を測定する。屈折率変化は、細胞１２２ａの存在を指し示すものである。上述の方法により細胞１２２ａの移動容量を評価する多層凹状体組込み装置１００ａの機能は、従来の多層凹状体組込み装置を超えて顕著な改善をもたらす。その理由は、従来の多層凹状体組込み装置では、移動容量を評価する為に細胞は染色されたり蛍光標識されたりしなくてはいけなかったからである。
【００１３】
上記のように、多層凹状体組込み装置１００ａは、ハンガー１０２と膜１０６の周囲または内側の領域で定義される上部試験槽１１４と下部試験槽１１６を含む。膜１０６は、０．１μｍから１２．０μｍのような広範囲の細孔径を有する、ポリエステル、ポリカーボネートまたは他の多孔性物質から作られることができる。更に、膜１０６はＣａｃｏ２細胞またはＭＤＣＫ細胞２０２（当然の事ながら、不死化細胞株または一次細胞も使用され得る。）及び生化学層（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、増殖因子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質）の一方または双方で被覆されてもよい。
【００１４】
細胞移動試験を行う為に、研究者は液剤とともに細胞１２２ａを上部試験槽１１４に配することにより、細胞１２２ａが細胞単分子層２０２及び（もしあれば）生化学/タンパク質コーティング２０３の一方または双方と膜１０６を介して、下部試験槽１１６中に移動することを可能にする。細胞単分子層２０２及び（もしあれば）生化学/タンパク質コーティング２０３の一方または双方と膜１０６を通過して移動後、細胞１２２ａは重力によって下部試験槽１１６の面１１２上に落下する。面１１２は、細胞１２２ａの捕獲と集中を助けるように、特定の界面化学コーティング２０４で被覆してもよい。例えば、界面化学コーティング２０４は疎水性、親水性または帯電した界面化学を含むことができ、多様な試験を可能にし、異なる表面抗原を有する細胞１２２ａの検出をも可能にする抗体または抗体の混合物のような捕獲試薬であることもできる。その後、細胞１２２ａの存在に起因する屈折率の変化を検出するセンサー１２０を使用することにより、細胞１２２ａは下部試験槽１１６の面１１２上で検出される。多層凹状体組込み装置１００ａで使用され得る幾つかの異なるタイプのセンサーが、図３〜図７を参照して以下により詳細に説明されている。
【００１５】
図３を参照すると、グレーティング型平面導波路センサー１２０ａを中に組み込んでいる多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。基本的に、グレーティング型平面導波路センサー１２０ａは光学バイオセンサーであり、下部試験槽１１６の面１１２上の細胞１２２ａの存在を検出するために、光の屈折特性と結合特性を利用する。
【００１６】
図のように、グレーティング型平面導波路センサー１２０ａは、界面化学コーティング２０４が無い場合には細胞１２２ａが接触する面１１２を形成する導波路３０２を含む。導波路３０２は、Ｔａ２Ｏ５、ＴｉＯ２、ＴｉＯ２-ＳｉＯ２、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｓｉ３Ｎ４、ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ、酸化スカンジウムまたはその混合物のような金属酸化物型物質から作られることが望ましい。導波路３０２より小さい屈折率を有する基板３０４は、導波路３０２と隣接し且つ導波路３０２の下方に配されている。基板３０４はガラスまたはポリカーボネートのようなプラスチックから作られることが望ましい。屈折グレーティング３０６は、プラスチックにエンボス加工したり、プラスチックにマイクロレプリカ加工したり、ガラスにエッチング加工したり、または他の最先端の方法で基板３０４内部に作られ、その後導波路３０２で覆われる。特に、屈折グレーティング３０６は、光源３０９により基板３０４上に照射された光３０８を内部連結し、その後、光３１０を検出器３１２に外部連結させるように位置決めされる。面１１２上の細胞１２２ａの存在に起因する導波路３０２の屈折率変化は、検出器３１２で外部連結された光３１０の変化をみることにより検出できる。グレーティング型平面導波路センサー１２０ａは、例えば、角度探測法（angular interrogation approach）やスペクトル探測法（spectral interrogation approach）を含む幾つかの異なる方法を用いて機能させることができ、両者ともに図４と図５に対して以下に説明されている。
【００１７】
図４を参照すると、移動した細胞１２２ａを検出するために、角度探測法を利用しているグレーティング型平面導波路センサー１２０ａ’が中に組み込まれている多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。この方法では、屈折グレーティング３０６’は一つの個別の内部連結グレーティング４０２と二つの不連続な外部連結グレーティング４０４ａと４０４ｂを含む。屈折グレーティング３０６’は、面１１２の全部または（図のように）面１１２の一部のみを覆うことができる。屈折グレーティング３０６’、特に内部連結グレーティング４０２は、基板３０４と連携し光源３０９により基板上に照射される光３０８ａを内部連結するように位置決めされる。外部連結グレーティング４０４ａと４０４ｂは、その後、各々が検出器３１２ａと３１２ｂによりモニターされる光３１０ａと３１０ｂを外部連結する。面１１２上の細胞１２２ａの存在に起因する導波路３０２の屈折率変化は、検出器３１２ａと３１２ｂで外部連結した光３１０ａと３１０ｂの変化をみることにより検出される。また注目すべきは、角度探測は内部連結機能と外部連結機能の両方をただ一つのグレーティングで行わせることもできることである。更に他の方法では、角度探測は一つの内部連結グレーティングと一つのみの外部連結グレーティングで行うことができる。図５を参照すると、移動した細胞１２２ａを検出するために、スペクトル探測法を利用しているグレーティング型平面導波路センサー１２０ａ’’が中に組み込まれている多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。この方法では、屈折グレーティング３０６’’は面１１２の全てまたは（図のように）面１１２の一部分のみを覆うことができる。屈折グレーティング３０６’’は基板３０４と連携し、基板３０４上に照射される光５０４を内部連結するように位置決めされる。例えば、光５０４は広帯域源５０８（wideband source)（例えば、多チャンネル広帯域源５０８）に接続されたファイバー５０６から放射されることができる。屈折グレーティング３０６’’は、その後ファイバー５１４を経由して分光計５１６に接続している検出器５１２（例えば、多チャンネル読み取りヘッド５１２）に光５１０を外部連結する。面１１２上の細胞１２２ａの存在に起因する導波路３０２の屈折率変化は、検出器５１２で外部連結した光５１０の波長変化をみることにより検出することができる。特に、分光計５１６は、移動した細胞１２２ａが存在する前の測定波長５１８と、移動した細胞１２２ａの存在後の測定波長５２０に差異がある時、面１１２上の細胞１２２ａの存在を検出することができる。この波長５１８と５２０との差異はグラフ５２２に示されている。当然のことながら、スペクトル探測法は画像化やアレイ上の不連続スポットの検出に敏感に反応する。
【００１８】
図６を参照すると、移動した細胞１２２ａを検出するために使用されるグレーティング型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー１２０ｂが中に組み込まれている多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。基本的に、グレーティング型ＳＰＲセンサー１２０ｂは、下部試験槽１１６の面１１２上の細胞１２２ａの存在を検出するために、表面プラズモン共鳴現象と光の屈折特性利用するバイオセンサーである。
【００１９】
図のようなグレーティング型ＳＰＲセンサー１２０ｂは、金のような貴金属で被覆された支持層３０２（例えば導波路３０２）を含む。面１１２を形成する（もしあれば）界面化学コーティング２０４は、貴金属６０２と支持層３０２の上方に配置される。貴金属６０２と屈折グレーティング３０６は、面１１２の全部または面１１２の一部のみを覆うことができる。屈折グレーティング３０６は、光源６０６から屈折グレーティング３０６上に照射された光６０４を内部結合するように位置決めされる。外部結合した光６０８は、その後検出器６１０（例えばＣＣＤカメラ６１０）でモニターされる。面での屈折率変化と面１１２上の細胞１２２ａの存在に起因した貴金属６０２により発生されるプラズモンが、検出器６１０で外部結合した光６０８での変化をみることにより検出される。当然のことながら、この検出方法はスペクトル探測法であり、画像化やアレイ上の不連続スポットの検出に敏感に反応する。
【００２０】
図７を参照すると、移動した細胞１２２ａを検出するために使用されるプリズム型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー１２０ｃが中に組み込まれている多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。グレーティング型ＳＰＲセンサー１２０ｂのように、プリズム型ＳＰＲセンサー１２０ｃは、下部試験槽１１６の面１１２上の細胞１２２ａの存在を検出するために、エバネッセント波現象と光の屈折特性を利用する光学バイオセンサーである。しかし、プリズム型ＳＰＲセンサー１２０ｃは、グレーティング型ＳＰＲセンサー１２０ｂの時に使用する屈折グレーティング３０６の代わりに、プリズム７０２を使用する。
【００２１】
図のように、プリズム型ＳＰＲセンサー１２０ｃは、金のような貴金属６０２で被覆された支持層３０２を含む。面１１２を形成する（もしあれば）界面化学コーティング２０４は、貴金属６０２と支持層３０２の上方に配置される。光源７０４は、基板３０４の底部に接触しているプリズム７０２に、光７０６を内部結合するように位置決めされる。外部連結した光７０８、その後検出器７１０によってモニターされる。面１１２の最上部の極めて近辺部の屈折率変化と、面１１２上の細胞１２２ａに起因する貴金属６０２内で発生したプラズモンが、検出器７１０で外部連結光７０８の変化をみることにより検出される。特に、面１１２から反射され面１１２上の細胞の量または質量に依存する角度である反射光７０８に鋭い影がある時、検出器７１０は面１１２上の細胞１２２ａの存在を検出する。グラフ７１４に示されているように、細胞１２２ａが面１１２に移動し、面１１２上の質量が変化する時に、角度がＩからＩＩにシフトする。このような共鳴角度での変化が、グラフ７１６に示されているように（質量変化に比例した）共鳴信号対時間のプロットとして、非破壊的且つリアルタイムでモニターされる。
【００２２】
図８を参照すると、薬剤８００（例えば化合物８００）の吸着または浸透性を評価するために使用される多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。基本的に、多層凹状体組込み装置１００ａと、その中に組み込まれたセンサー１２０は、薬剤８００の吸着を評価するために標識フリー検出技術を使用し、これは膜１０６上に配される生体コーティング２０３の有り無し両方の場合において、生体膜/模型膜（図示せず）または細胞単分子層２０２を通過する薬剤８００の浸透性を測定することにより行われる。上記を行うために、薬剤８００が上部試験槽１１４から膜１０６を通過して移動し、面１１２上に集結するようになる前後において、センサー１２０は下部試験槽１１６の面１１２上の屈折率を測定する。上述のように、面１１２（例えば疎水性、親水性または帯電した面１１２）での薬剤８００の捕獲及び集結を助ける捕獲試薬を有する、または有していない界面化学コーティング２０４で、面１１２は被覆されることができる。例えば、界面化学コーティング２０４は、タンパク質との結合（重要なＡＤＭＥ特性）が同時に評価できるように、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質であることができる。他の例では、界面化学コーティング２０４は、薬剤８００の潜在毒性または薬物間相互作用を評価するために使用されるＣＹＰ４５０酵素のようなタンパク質であることができる。他の界面化学コーティング２０４は抗体、アプタマー、血漿タンパク及び他のタンパク質コーティングまたは、例えば細胞、タンパク質、核酸、炭水化物のような捕獲試薬を含む。更に、薬剤吸着作用調査は、薬剤８００の細胞２０２及び生体コーティング２０３及び膜１０６の一方または双方との結合を測定することにより行われ、その場合にセンサー１２０は、通常図１Ｆで示されているように膜１０６の近くに配置される。繰り返しを避ける為、薬剤８００の吸着作用を評価するために使用される多層凹状体組込み装置１００ａと他の色々なセンサー１２０との構成は、図３〜図７を参照して既に上述されている為、この項での詳細な説明はしないものとする。
【００２３】
図９を参照すると、多様な構成で多様な薬剤９００ａ、９００ｂ、９００ｃ（例えば化合物９００ａ、９００ｂ、９００ｃ）の吸着または浸透性を評価するために使用される多層凹状体組込み装置１００ａの断面側面図である。この実施例の多層凹状体組込み装置１００ａは、図８に関する前述の多層凹状体組込み装置１００ａと同構造及び同タイプのセンサー１２０を有する。しかし、この実施例の多層凹状体組込み装置１００ａは、多様な試験で使用することができる。その理由は、面１１２が抗体９０２（または、他の捕獲試薬または界面化学）の配列を有する界面化学コーティング２０４で被覆されている為、明確に薬剤９００ａ、９００ｂ、９００ｃまたは薬剤９００ａ、９００ｂ、９００ｃの混合物を検出することができるからである。通常は、配列中に配置される抗体９０２または他の対象物（例えば、捕獲試薬、界面化学、タンパク質、核酸）はおよそ直径１５０μｍでおよそ２２０μｍピッチを有する水玉模様を有する。（面１１２の拡大上面図を参照）
図１０Ａと１０Ｂを参照すると、図１Ａと図１Ｂに示された多層凹状体組込み装置１００ａを多数組み込んだマクロプレート１０００の斜視図と断面側面図である。マイクロプレート１０００は、各々が多層凹状体組込み装置１００ａの形状を有する凹部１００２の配列を含む。凹部１００２は、広くは、相互に垂直な横列と縦列のマトリクスで配置される。例えば、マイクロプレート１０００は４ｘ６（２４個の凹部）、８ｘ１２（９６個の凹部）、１６ｘ２４（３８４個の凹部）の寸法を有する凹部１００２のマトリクスを含むことができる。図に示されたマイクロプレート１０００は、９６個の凹部１００２を含んでいる。
【００２４】
図１１を参照すると、多層凹状体組込み装置１００ａを使用する為のより好ましい方法１１００のステップを図示したフローチャートである。多層凹状体組込み装置１００ａが細胞移動試験、薬剤浸透性試験を行うために使用されることがここに説明されているが、多層凹状体組込み装置の使用は上述の調査に限定されるものではないことが理解されるべきである。その代わりに、多層凹状体組込み装置１００ａは、薬剤溶解性調査、ウイルス検出調査、タンパク分泌物調査を含む多種多様の調査を行うために使用されることができる。
【００２５】
ステップ１１０２で始まり、多層凹状体組込み装置１００ａは対象物１２２（例えば細胞１２２ａ、分子、タンパク質、薬剤８００、薬剤９００ａ、９００ｂ、９００ｃ、化合物）を上部試験槽１１４中に液剤とともに配することにより準備される。もちろん、例えば細胞２０２及び生体コーティング２０３の一方または双方を含む膜１０６が、ステップ１１０２を行う前に既に準備されていると仮定する。ステップ１１０４で、対象物１２２は上部試験槽１１４から、（もしあれば）生化学コーティング２０２と膜１０６を通り下部試験槽１１６に移動することが可能になる。前述のように、膜１０６は０．１μｍから１２．０μｍのような広範囲の細孔サイズを有する、ポリエステル、ポリカーボネートまたは他の多孔性物質であることができる。ステップ１１０６では、重力または遠心分離、吸引、電場、磁場などの助力を受けて面１１２上に落下した対象物１２２が、面１１２上に存在する対象物１２２に起因する屈折率変化を測定するセンサー１２０によって、標識フリーの方法で検出される。前述のように、センサー１２０は、対象物１２２が面１１２上にない時の屈折率値と、対象物１２２が面１１２上にあるときの屈折率値とを測定することにより、面１１２上の対象物１２２の存在を検出する。上述の測定屈折率値の差異が、対象物１２２が面１１２上に存在することを指し示すものである。更には、多層凹状体組込み装置１００ａを、面１１２上の対象物１２２の量または質量を測定することにも使用することができる。幾つかの異なるタイプの代表的なセンサー１２０が、図３〜図７を参照して説明されている。
【００２６】
図２〜図１１は多層凹状体組込み装置１００ａを示しているが、当然のことながら、例えば前述の多層凹状体組込み装置１００ｂ、１００ｃを含む異なる構成を有する多層凹状体組込み装置が、ここで使用されることができる。更に、本発明で使用される異なるタイプのセンサー１２０についてのより詳細な議論として、引例が「薬剤発見における光学バイオセンサー」（Optical Biosensors in Drug Discovery)という表題でＭ．Ａ．ＣｏｏｐｅｒによってNature Reviews Drug Discovery（Vol.1,pp.515-28,July,2002)に発表されている。
【００２７】
下記の事項は、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃの利点と用途である。
【００２８】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、例えば癌の腫瘍浸潤、アンジオネシス（angionesis）の内皮細胞移動、炎症の化学誘引を含む広範囲の試験を調査するために使用することができる。
【００２９】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、高処理能力スクリーニング用途で、鉛（lead）化合物のＡＤＭＥパラメーターの生体外評価を可能にする。
【００３０】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、薬剤発見の鉛（lead）最適化段階の間の高処理能力方法を使用した対象物１２２の溶解性評価を可能にする。
【００３１】
●細胞移動試験で使用される多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、蛍光染料で細胞を標識する必要性を省略し、細胞移動のリアルタイム測定を提供する。
【００３２】
●薬剤浸透性試験で使用される多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、処理能力の向上につながり、薬剤浸透性のリアルタイム測定を提供する。
【００３３】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは薬剤溶解性調査に使用されることができる。この用途では、多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃはハンガー１０２と膜１０６が有無に関わらず使用されることができる。例えば、対象物１２２（例えば化合物）は異なる濃度及びｐＨでの溶液中に薄められ、その溶解度は面１１２での屈折率変化または面１１２の近辺部での屈折率変化がリアルタイムで評価される。
【００３４】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、対象物１２２の標識フリー検出を可能にする、例えば光学的方法、温度または電気化学検出のようなＳＰＲ、ＳＰＲイメージング、屈折グレーティング結合または他の直接的方法を使用することができる。
【００３５】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、下部試験槽１１６の面１１２の面全部または面１１２の一部分のみを覆うような屈折グレーティングを組み込むことができる。
【００３６】
●多層凹状体組込み装置１００ａ、１００ｂ、１００ｃは、以下のような他の調査でも使用されることができる。
【００３７】
○薬剤溶解性調査
○滴定、移動またはウイルス生産モニタリングに限定されないウイルス調査
○バクテリアまたは他の細菌の為の細菌学調査
○タンパク分泌物検出調査
○生体外受精研究における一次細胞移動と分化
○ＡＤＭＥ−Ｔｏｘ、遺伝子治療、タンパク質産生、調合薬ＱＣ、診断学、食品安全テスト、環境、細菌戦争の病原体のような高処理能力調査
本発明の幾つかの実施例が添付図で図示され、前述のより詳細な説明で説明されているが、本発明は開示された実施例に限定されるものではなく、本発明の精神から外れることの無い多くの再構成、修正、置換が可能であり、請求項で定義されていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】本発明に基づく多層凹状体組込み装置の第１の実施例の分解斜視図である。
【図１Ｂ】本発明に基づく多層凹状体組込み装置の第１の実施例の断面側面図である。
【図１Ｃ】本発明に基づく多層凹状体組込み装置の第２の実施例の分解斜視図である。
【図１Ｄ】本発明に基づく多層凹状体組込み装置の第２の実施例の断面側面図である。
【図１Ｅ】本発明に基づく多層凹状体組込み装置の第３の実施例の分解斜視図である。
【図１Ｆ】本発明に基づく多層凹状体組込み装置の第３の実施例の断面側面図である。
【図２】細胞の移動容量を評価する為に使用される図1Ａ及び図1Ｂに示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図３】移動した細胞を検出する為に使用されるグレーティング型平面導波路センサーを更に詳細に図示した、図２に示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図４】移動した細胞を検出する為に角度探測法を利用するグレーティング型平面導波路センサーを更に詳細に図示した、図２に示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図５】移動した細胞を検出する為にスペクトル探測法を利用するグレーティング型平面導波路センサーを更に詳細に図示した、図２に示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図６】移動した細胞を検出する為に使用されるグレーティング型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーを更に詳細に図示した、図２に示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図７】移動した細胞を検出する為に使用されるプリズム型表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーを更に詳細に図示した、図２に示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図８】薬剤の吸着または浸透性を評価する為に使用される図１Ａ及び図１Ｂに示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図９】多様な薬剤の吸着または浸透性を、多重構成で評価する為に使用される図1Ａ及び図1Ｂに示された多層凹状体組込み装置の断面側面図である。
【図１０Ａ】図１Ａと図１Ｂに示された多層凹状体組込み装置を多数組み込んだマイクロプレートの斜視図である。
【図１０Ｂ】図１Ａと図１Ｂに示された多層凹状体組込み装置を多数組み込んだマイクロプレートの断面側面図である。
【図１１】本発明に基づく多層凹状体組込み装置を使用するより好ましい方法のステップを図示したフローチャートである。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月28日(2005.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多層凹状部材組込み装置であって、
上部試験槽と、
下部試験槽と、
前記上部試験槽と前記下部試験槽との間に配置された膜と、
前記下部試験槽の面上に存在する対象物に起因する屈折率変化を測定することで前記上部試験槽から前記膜を通して前記下部試験槽に達した対象物を検出するセンサーと、
を含むことを特徴とする多層凹状部材組込み装置。
【請求項２】
前記対象物は、細胞、分子、タンパク質、薬剤、化合物、核酸、ペプチドまたは炭水化物であることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項３】
前記膜が、ポリエステル膜またはポリカーボネート膜であることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項４】
前記膜が、０．１μｍから１２μｍの範囲の細孔を有する微孔性膜であることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項５】
前記膜が、生物学的要素、タンパク質、生体膜または細胞で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項６】
前記下部試験槽の前記面が、当該面で前記対象物の捕獲及び集結を助ける少なくとも一つの物質で被覆されていることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項７】
前記センサーが、グレーティング型平面導波路センサーであることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項８】
前記センサーが、グレーティング型表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項９】
前記下部試験槽が、前記上部試験槽と比較して浅いことを特徴とする請求項１に記載の多層凹状部材組込み装置。
【請求項１０】
多層凹状部材組込み装置の使用方法であって、
前記多層凹状部材組込み装置の上部試験槽中に対象物を配するステップと、
前記対象物を前記上部試験槽から前記多層凹状部材組込み装置の膜を介して下部試験槽に移動させるステップと、
前記下部試験槽の面上に存在する前記対象物に起因する屈折率変化を測定するセンサーを使用して前記下部試験槽の面上にある前記対象物を検出するステップと、
を備えていることを特徴とする多層凹状部材組込み装置を使用する方法。
【国際調査報告】
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