(57)【要約】本発明は多剤耐性腫瘍の治療においてポモリン酸、その誘導体及びそれらに由来する医薬製剤を抗-悪性腫瘍薬として使用することを記述している。抗-MDR作用を呈する他の薬物に関連して、これ等の物質は抗-MDR作用を発揮するために復帰薬の併用を必要としない。
2006504706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多剤耐性腫瘍の治療に使用することを特徴とする構造式（I）：
【化１】
2006504706.tif 000007
を持つポモリン酸、その異性体及び誘導体。
【請求項２】
十分な量の請求項１に記載のポモリン酸、その異性体又は誘導体と、医薬として受容しうる賦形剤とを含有することを特徴とする多剤耐性腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項３】
医薬賦形剤が全身又は経口投与に受容であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬として受容しうる賦形剤が有機溶剤であり、さらに生理食塩液又はその他の同等の等張溶液で希釈されることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
有機溶剤がジメチルスルフォキシド又はヒトに使用されることが受容されるその他の有機溶剤であり、生理食塩液で希釈されることを特徴とする請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ポモリン酸、その異性体および/又は誘導体が、重量/容積で0.1％から100％の濃度で使用されることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ポモリン酸、その異性体および/又は誘導体が、10 mg/mlから1000 mg/mlの濃度で使用されることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ポモリン酸、その異性体及び/又は誘導体をジメチルスルフォキシド又はその他のヒトに使用する医薬として受容しうる溶剤に溶解する最初の段階と、その後のジメチルスルフォキシドの濃度が1％を超えないように生理食塩液で希釈する段階とを有することを特徴とする多剤耐性腫瘍の治療用の医薬組成物を調製する方法。
【請求項９】
最初の段階の溶解に使用するポモリン酸、その異性体及び/又は誘導体の濃度が10 mg/mlから1000 mg/mlであることを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物を調製する方法。
【請求項１０】
治療上有効な量のポモリン酸、その異性体及び/又は誘導体を投与することを特徴とする多剤耐性腫瘍の治療方法。
【請求項１１】
治療上有効な量のポモリン酸、その異性体及び/又は誘導体を投与することを特徴とする請求項１０に記載の治療方法。
【請求項１２】
0.01 mg/kgから100 mg/kgの治療上有効な量のポモリン酸、その異性体及び/又は誘導体が特徴である請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１３】
多剤耐性腫瘍の治療のための医薬品を調製するためであることを特徴とするポモリン酸、その異性体及び誘導体の使用。
【請求項１４】
多剤耐性腫瘍の治療に使用することを特徴とするポモリン酸、その異性体及び誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多剤耐性腫瘍を治療するための物質、その物質を含有する組成物、その組成物を調製する方法、抗癌剤を調製するためのこの物質の使用、癌の治療のためのこの物質の使用、並びに多剤耐性腫瘍の患者の治療方法に関するものである。
【０００２】
特に本発明は、抗-悪性腫瘍薬としてポモリン酸、その異性体及び誘導体を同定すること、本来的に多剤耐性の腫瘍又は化学療法の結果としてこの耐性を獲得した腫瘍に罹患した患者の治療に使用することに関係する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトの癌の治療は未だ未解決の問題が存在する医学の分野である。医学においてより高い有効性を示しそして種々のタイプの癌を治癒することができる治療が開発されてきたが、これ等の治療はしばしば患者に好ましくない副作用を生じる。
【０００４】
このような問題の結果として、既存の方法に存在する問題を解決する新しい技術の創出が必要とされている。例えば、男性に最も多く男性の最大の死因である前立腺癌は、その病気の状態に応じて外科的に、薬剤（化学療法/ホルモン）を使用して、放射線療法により又はこれ等の療法を組合わせて治療することができる。
【０００５】
多数の既存の療法の中では、化学療法が種々のタイプの癌の治療に最も有望なものである。しかし、一部の薬物には高い有効性があるが、その大多数は重篤な副作用を示すので、長期間の使用又は反復使用ができない。このような理由により、米国特許5,558,866及び米国特許5,867,728は、新しい、毒性の少ない化学療法薬の供給源として、Pittosporaceae科の植物のような種々の植物種から得られた天然物質の使用を提案している。すなわち、腫瘍の治療に対する選択性が高くそのため患者の正常な細胞の代謝に対する影響が少ない薬物である。
【０００６】
今では、癌に対して使用する薬物はいくつかある。その多くは単独で使用されるが、他方では他の薬物又は他の療法と組合わせて使用した場合に高い有効性を示すものもある。
【０００７】
米国特許5,602,184は、転移癌の治療において毒性が殆ど又は全くない化学療法剤である一部のテルペン類の使用を示している。この引用文献は、非環状及び環状モノテルペン、非環状セスキテルペン及び/又は非環状ジテルペンの中から選択したテルペンによる治療は治療された癌細胞の放射線療法に対する感受性を増加することを記述し、治療法の併用は、治療コストを増加させるが、癌治癒のためにより有望な結果を生じる可能性があることを示している。
【０００８】
極く最近の研究として、米国特許5,587,402は、オレンジの皮の油に含まれるモノテルペンであるリモネンでの治療は乳癌、胃癌及び肺癌のような多くのタイプの癌に対して効果があることを示している。しかし、ある用量ではヒトに対して毒性のない化学療法剤と考えられていたが、リモネンは特に高用量でそして短い時間間隔で使用した場合にある好ましくない副作用を示す。この結果として、その発明者らはリモネンを使用せずに、代りにペリルアルコールを使用して白血病の抑制又は緩解を生じる他の方法を提示した。
【０００９】
癌との絶え間ない戦いの中で作り出された多数の化学療法剤が存在するが、一部の癌のある化学療法剤に対する特異的耐性或いは本来的に患者に存在するか又は治療の結果として獲得した現象である多剤耐性の患者の存在により、化学療法の有効性は偏見をもたれている。
【００１０】
多剤耐性（MDR）の現象は、化学構造、作用様式及び細胞標的（cellular target）に関して異なる無関係な多数の化学療法剤の間の交差耐性を伴う。この一群の要因がMDRを多くの腫瘍において見られる化学療法の失敗の主な理由の一つとしている。
【００１１】
MDR現象は、アポトーシスを制御する遺伝子の調節における欠陥、細胞の解毒過程の増加、DNA修復システムの変化、並びにP糖タンパク質（Pgp）、複合抵抗性に関係するタンパク質（MRP）及び肺抵抗性に関係するタンパク質（LRP）のような薬物輸送タンパク質の活性化又は過剰発現により生じる複合的因子によるものである。
【００１２】
MDRにおいて、薬物輸送タンパク質の一部は汲み出しポンプとして機能して、細胞から化学療法剤を除去するので、MDRを示す腫瘍の治療のために今日使用されている方法の一つは、化学療法に伴って、このポンプを逆転させるものを使用することである。米国特許5,541,232は、耐性細胞による薬物蓄積の欠如を予防又は改善することにより、多剤耐性（MDR）の発生を予防しそして既に多剤耐性になった症例における多剤耐性を解消する方法を提示している。特にこの引用文献は、細胞に多剤耐性の発生を誘発する抗-悪性腫瘍/細胞傷害性薬物と併用してMASOPROCOLの投与を記述している。
【００１３】
欧州特許941737は、多剤耐性の問題に触れずに、癌細胞におけるアポトーシスの誘発薬を提示している。化学療法剤の細胞内濃度の減少が癌の治療において細胞のアポトーシスを引き起こす一部の薬物を無効とする主な原因の一つであるので、この製品の主要な点はPgpにより生じる薬物汲み出しを阻害することである。この引用文献にはこのポンプの阻害が癌治療それ自体として記述されているが、汲み出しポンプ阻害薬の使用は多くの場合多剤耐性を示す腫瘍の治療で求められる効果を得るために化学療法剤と併用する必要がある。
【００１４】
米国特許5,916,566のような他の特許は、糖タンパク質P（Pgp）に仲介される薬物に対する耐性をその生体処理を増加させることにより阻害する方法を提示している。引用文献として記述したこの場合では、通常はこれ等の化合物の除去に役立っているP450又はPgpの作用を阻害するために精油が使用されている。
【００１５】
MDR現象は腫瘍の化学療法が成功しない主な原因の一つであること、そして患者の死を回避しながら、このタイプの腫瘍を消滅させることができる化学療法剤はまれであることを考慮すると、抗-MDR作用を有する新しい抗-悪性腫瘍薬の研究は必須になる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の簡単な説明
本発明の最初の態様の一つは、抗-腫瘍剤、特に、多剤耐性を示す腫瘍に対する作用を有する物質としてポモリン酸、その異性体及び誘導体の活性を確認することに存する。
【００１７】
本発明の第二の態様は、ポモリン酸を含有する医薬組成物に存する。
【００１８】
本発明の第三の態様は、ポモリン酸を含有する医薬組成物の調製にある。
【００１９】
本発明の第四の態様は、治療剤としてポモリン酸を使用する多剤耐性を示す癌の治療方法に関する。
【００２０】
本発明の第五の態様は、多剤耐性の癌の治療のための薬剤の調製にポモリン酸を使用することに関する。
【００２１】
本発明の第六のそして最後の態様は、多剤耐性の癌の治療にポモリン酸を使用することに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
卵巣、乳房、肺、結腸及びその他多数の腫瘍のようないずれかの腫瘍のある患者は最終的にMDRになる可能性がある。
【００２３】
MDR現象は糖タンパク質P（MDR-1遺伝子）及び多剤耐性のタンパク質-MRP（MRP-1遺伝子）のような形質膜に発現する輸送タンパク質をコードするMDR遺伝子の過剰発現に関連づけられてきた。これ等の遺伝子の発現は、Pgpについて見られるようなエネルギーを必要とする化学物質の能動的排出機構により又はMRPについて見られるようなこれ等の化合物のグルタチオンとの抱合に依存する機構により生じる細胞内の薬物濃度の減少を伴う。MDR現象に関係するその他の遺伝子もまた、核-細胞質輸送に関与しそしてそれを通じてDNA-結合薬物に対する耐性を付与する肺耐性タンパク質-LRPのような細胞質内小胞で発現するタンパク質をコードする。腫瘍細胞における多剤耐性の現象に対するこれ等のタンパク質の非常に重要な点は、このタイプの耐性を有する癌の治療をするための強力な薬剤において、その化合物の活性を調節可能にすることである。
【００２４】
形質膜におけるPgpの過剰発現により誘発される多剤耐性は、インビボ及びインビトロにおいて、MDR逆転物質、調節物質又は化学感受性物質として知られる種々の疎水性の構造的及び機能的に無関係の物質により解消することができる。これ等の物質は汲み出しポンプを遮断し、細胞内の化学療法剤の蓄積を可能にする。逆転物質として最初に使用された物質は、カルシウムチャネル阻害薬ベラパミル、免疫抑制薬シクロスポリンA及びフェノチアジン、抗マラリア薬、抗生物質などのような他の生物学的システムにおいて活性が知られそしてそれらの間には全く関連がない一群の物質である。
【００２５】
第二及び第三世代の調整薬は、既に製造されそしてその逆転能力について評価がされている。今、これ等の薬物の一部は様々な毒性プロフィールをもつ化学療法剤と併用して患者に使用されている。認められた毒性は逆転薬として使用された薬物の薬理作用に由来するか又はこのタンパク質の生理的役割が不明である一部の正常組織にもPgpが発現しているという事実に由来する。したがって、MDR輸送物質の基質にならずまた逆転薬として機能することができる新しい化学療法剤は薬物治療上非常に高い関心がもたれる。
【００２６】
しかし、利用しうるポンプ逆転物質は全ての種類のMDR腫瘍に有効性を示さない。これは癌（白血病、乳癌、結腸癌、肺癌など）の各タイプが化学療法剤に対し技術的に異なる様式で応答しているためと思われる。
【００２７】
したがって、同じタイプの癌を持つ患者は、元来持っているか又は化学療法剤による患者治療の結果として、最終的にMDR（多剤耐性）表現型を発現することがある。MDR現象はその構造、作用様式及び細胞標的が異なる構造的に無関係の薬物に対する交差耐性を伴うので、既知化学療法剤によるこれ等の患者の治療は全く有効性を失う。この場合にMDR表現型によって活性化される機構を回避するか又は阻止することができる薬物を確認し、それを通じて細胞を殺さなければ、患者は死亡するであろう。
【００２８】
このようにして、抗-MDRの性質を持つ新しい薬物を同定することは、特にこの薬物が輸送タンパク質の基質でないならば、利用可能な化学療法剤に対して耐性を示す患者を治癒する唯一の代替法となりうるので、必ずや臨床的に大きな意義を有するであろう。
【００２９】
本発明は、MDRを発現する腫瘍の治療及びこのタイプの腫瘍を持つ患者の他の薬物又は追加の療法を必要としないもう一つの代替治療のための新しい薬物を提供するものである。
【００３０】
この薬物は腫瘍に直接効果を持っている故に、逆転物質の併用を必要とせず、患者に対して生じうる可能な二次的影響のリスクを減少しそして治療コストを減少させることができる。
【００３１】
本発明の物質は、テルペン、特に植物のような天然資源から得られる又は化学合成により得られるトリテルペンである。
【００３２】
このトリテルペンは、植物の二次代謝に由来するシクロエスクワレノイドとして知られる化合物の大きなファミリーに属す。近年抗菌、抗炎症、抗HIV及びさらに最近では抗腫瘍活性などの多数の生物活性が、このクラスに属する化合物によることが判明した。
【００３３】
抗腫瘍薬のスクリーニングによりこのクラスの物質を調べていたとき、われわれは、かなりの数の生物活性化合物が腫瘍細胞系に対して抗-増殖及び細胞傷害性作用を示すことを観察した；例えば、タキソール、テルペン、Yamagishi e col 1988；Kim e col．1998，2000，Physocarpus intermediusの樹皮から単離したトリテルペノイドであるベツリン酸は神経外胚葉由来の腫瘍におけるアポトーシスを誘発する強力な殺腫瘍薬とされている、Schmidt et al. 1997; Fulda et al., 1997, 1988, 2001及びインビトロ及びインビボにおけるメラノーマに対する作用、Kim et al., 2000; Pisha et al., 1995; Raisova et al., 2001; 及び同じ植物から抽出された他のトリテルペンであるオレアノン酸はインビトロで腫瘍細胞系の増殖を抑制する、Kim et al., 2000, 血管新生，Sohn et al., 1994,及びTPAにより誘発された腫瘍の発生、 Tokuda et al.,1996。  極く最近の研究により、ベツリン酸と同様に、他のトリテルペン類も腫瘍細胞におけるプログラム細胞死の過程を誘発することができることも確立された、Konopleva et al., 2002。
【００３４】
しかし、信じられないことではあるが、非常に多数の研究が既に行われてきたにも関わらず、本発明者らはトリテルペンの中に特にポモリン酸及びその誘導体はこれまでに生物活性が調べられていないことを認識することができた。
【００３５】
したがって、メラノーマ細胞系におけるこのトリテルペンの細胞傷害作用は既に文献、Neto et al., 2000 に記述されていたが、この文献に示されたデータはMDR表現型を示す細胞に対するポモリン酸の細胞傷害性を示している。このことは通常の化学療法に耐性の腫瘍を殺す能力に非常に優れていることを示している。
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【００３６】
上述のように、ポモリン酸は植物由来の分子でありそして文献上よく知られている。
【００３７】
このようにして、ポモリン酸として本発明の活性物質を同定することは、Maillard M, Adwunmi COによる技術の状態で既に存在する磁気共鳴をこの研究に使用すれば容易である。Hostettman K. Tetraplura tetrapleraの果実のトリテルペングリコシド．Phytochemistry 1992, 31(14), 1321-1323: Kakuno T, Shikawa KY, Arihara S. Ilex crenata果実のトリテルペノイドサポニン．Phytochemistry 1992; 31(10, 3553-3557。かくして、本発明にしたがって、ポモリン酸が多剤耐性を示す癌細胞の細胞傷害性に寄与する物質であることを確かめることができる。
【００３８】
したがって、この発明は、抗-MDR性を持ち、癌細胞を除去できそして患者の正常細胞に対しては毒性が殆どないか全くない新しい物質としてポモリン酸、その異性体及び誘導体を提供する。
【実施例】
【００３９】
説明のための実施例
抗-MDR作用を持つ化学療法剤としてポモリン酸、その異性体及び誘導体を得て、その有効性を試験して立証する目的で、以下に示すように多くの試験を実施した。
【００４０】
実施例1：ポモリン酸を得る方法
a.  方法の要約：ポモリン酸は、葉を有機溶剤で連続抽出し、次いでシリカゲル及びアンバーライトカラム中において抽出物を分画することにより得られた。純度はCG/MS, 1H及び13C NMR，融点及び旋光度により分析し、そしてその同定は物理的及びスペクトルデータをMaillard et al., 1992; Kakuno et al., 1992; Mahato et al., 1994により既に記述されているトリテルペンのデータと比較して行った。
【００４１】
b．  方法の詳細：Crysobalanus icaco L.の乾燥及び凍結乾燥葉のメタノール抽出物を連続的にヘキサン、CH2Cl2、AcOEt及びBuOHで分画した。ポモリン酸は、シリカゲルカラムにおける分画その後のヘキサン/酢酸エチル（50％）の混合物中での溶離によりChrysobalanus icaco L.の葉のCH2Cl2分画から得られた。この分画をAmberlite ZAD-2での再クロマトグラフィーを行い、そしてメタノールで溶離して薄層クロマトグラフィーにおいて純粋物質のプロフィールを示す白色固体を生じた。化合物の純度はCG/MS, 1H及び13C NMR，融点及び旋光度により確認した。Maillard et al., 1992; Kakuno et al., 1992; Mahato et al., 1994により既に記述されているトリテルペンの物理的及びスペクトルデータと比較することにより、化合物をポモリン酸として同定した。
【００４２】
実施例2:細胞増殖の阻害の評価
腫瘍は自然に増殖するので、薬物の抗-腫瘍作用を調べる最も一般的方法の一つは、細胞増殖の阻害に関する薬物の効果を評価することである。この試験には感受性又は多剤耐性細胞系を使用することができる。
【００４３】
細胞増殖の阻害は、放射活性チミジン（3H-TdR）の取り込みにより測定される。このために細胞懸濁液180 μl、2ｘ104細胞/ウエルを、96ウエル培養マイクロタイタープレートのウエルに入れ、次いでCO2インキュベーター中37℃で24時間インキュベートした。この後、20 μlのRPMI（対照）又は試験する薬物を100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、10 μg/ml、及び1 μg/mlの濃度で各群4ウエルに加えた。対照に使用される一部のウエルには薬物に使用するのと同じ濃度になるようにDMSOを20 μl加えた。培養終了の8時間前にプレートに放射活性チミジン（1 μCi/ウエル）を加え、そして放射活性をβカウンターで測定した。阻害パーセントはDMSOの存在下における細胞増殖を対照として計算した。
【００４４】
これ等の結果は図１から3に示されており、ポモリン酸は感受性細胞系（K562）及び多剤耐性細胞系（Lucena）の増殖を阻害すること、そしてその効果は用量依存的であることを示している。
【００４５】
実施例3：細胞傷害性の評価
化学療法剤に求められる性質の一つは腫瘍細胞を殺す能力である。この作用は死んだ細胞又は投与後に生き残る細胞の数の定量により評価することができる。DNAの断片化（DNA fragmentation）の測定は、薬物が作用する機序（壊死又はアポトーシス）を指し示す。
【００４６】
ポモリン酸、その異性体及び誘導体の腫瘍細胞を殺す能力の評価は、MTT法によりインビトロで行うことができる。酵素NADHデヒドロゲナーゼによるこの化合物のホルマザンへの還元に基づくMTT法（臭化(3-4,5-ジメチルチアゾール-2イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム）、Mosmann 1983は、投与後に生存する細胞の数を定量化することを可能にする。このために、種々の細胞系の細胞を上記のように処理して、プレートに配分しそして必要な濃度（1，5，10，25，50又は100 μg/ml）の薬物又はDMSOを投与する。48時間後、20 μlのMTT（5 mg/ml）を各ウエルに加えそしてプレートを37℃のインキュベーター中でさらに4時間インキュベートする。遠心分離の後、ホルマザンの結晶をDMSO（200 μl/ウエル）で溶解して570 nmの波長でELISA測定器において吸光度を測定する。細胞生存の阻害パーセントはDMSOを投与した対照細胞を使用して計算する。
【００４７】
図４に示す結果は、ポモリン酸の毒性は用量の増加に従って増大することを示している。これ等の結果は、K562及びLucenal以外の白血病細胞系にもポモリン酸の抗腫瘍作用の有効性を示した。
【００４８】
実施例4：アポトーシス誘発の評価
大多数の化学療法剤はアポトーシスを誘発することにより腫瘍細胞を死に至らしめる。DNAの断片化の測定は薬物が作用する機序（壊死又はアポトーシス）を指し示す。
【００４９】
DNAの断片化に対するポモリン酸の影響はフローサイトメトリーによる細胞周期の分析により調べられた。このために90 μlの細胞（2.5ｘ105細胞/ウエル）を96ウエルプレートに配分し、これに10 μlの培地、DMSO又は被験薬（10、25、50及び100 μg/ml）を加える。所定の時間経過後に細胞を回収し、そして240 gで5分間遠心分離する。ペレットを300□lのHFS溶液（HFS:0.1％Triton x-100，0.1％ クエン酸ナトリウム及び50 μg/ml ヨウ化プロピジウム）に再懸濁し4℃で1時間暗所においてインキュベートする。検体をFL2チャネルを使用してフローサイトメーター（Becton and Dikinson）において測定する。
【００５０】
表１は、ポモリン酸投与が細胞内におけるDNAの断片化を生じさせることを示している。K562 細胞を10，25，50及び100 μg/mlのポモリン酸で18時間処理して、HFS（これはヨウ化プロピジウムを含有）処理により細胞を破壊しそしてDNAの断片化をFACS（フローサイトメトリー）により測定した。値は3回の独立した実験の平均±SDを示す。
【００５１】
【表１】
2006504706.tif 000004
*細胞は薬物希釈により持ち込まれるのと同じ濃度のDMSOで処理した。結果は3回の実験の平均±SDを示す。
【００５２】
表１に記載したDNA断裂は、ポモリン酸の細胞傷害効果がアポトーシス誘発により仲介されていることを実証する。
【００５３】
実施例5：ポモリン酸の逆転作用の評価
ポモリン酸の逆転作用の可能性を、P糖タンパク質（Pgp）を過剰発現するLucena 1細胞系に対するその効果を試験することにより評価した。
【００５４】
表２は、癌の治療に主として使用されている化学療法剤であるビンクリスチンに対するLucena 1細胞の耐性及びK562細胞の感受性を示す。Rumjanek et al.(2001)はその他の化学療法剤にLucena 1が耐性であることを示し、それをMDR細胞系として特徴付けた。
【００５５】
【表２】
2006504706.tif 000005
【００５６】
表３は、シクロスポリンA（CSA）及びベラパミル（VP）のような汲み出しポンプの調節物質の使用によりLucenaの増殖は影響を受けないが、この細胞系に対する化学療法剤ビンクリスチン（VRC）の有効性を保証するためには必要であることを示している。この結果はLucena 1の耐性はPgpにより仲介されていることを示している。
【００５７】
【表３】
2006504706.tif 000006
【００５８】
ポモリン酸がPgp逆転物質として作用するか否かを試験するために、Lucena 1の増殖に及ぼす影響を化学療法剤ビンクリスチンの存在下及び非存在下に評価した。実験計画は実施例1に記述したものと同じであった。
【００５９】
ポモリン酸はビンクリスチンの存在下にLucena 1の増殖を阻害することを示す図２のデータは、表２に示されたCSA及びVPの作用と同様にPgpに対する調節作用を示すことができた。しかし、図３によるとこの酸はビンクリスチンの非存在下にLucena 1を殺すという事実があり、このことは、この酸はPgp基質でないことを示し、調節的役割の可能性はなくそしてMDR細胞に直接作用する効力を示している。
【００６０】
従って、感受性の細胞系に対する抗腫瘍作用に加えて、上記データは強力な抗-MDR薬としてのポモリン酸の可能性を裏付けるものである。この結果はまた、一般的に化学療法剤の副作用を増強する調節薬の使用をポモリン酸による治療は必要としないので、身体に対する好ましくない影響を減少することを明らかにしている。
【００６１】
実施例6：MDR表現型を持つ腫瘍系に対するポモリン酸の作用
ポモリン酸の作用を、白血病系（K562及びHL-60）、肺癌（A549）及び咽喉癌（HEp-2）のような化学療法剤に感受性の細胞、及び白血病由来（Lucena 1）,結腸癌（CaC0-2）及びサルの腎臓癌（MA104）の多剤耐性細胞において評価した。Lucena 1の耐性はPgpの発現によるものであり、他方CaCo-2及びMA104の耐性はPgp 及び他のMDR遺伝子によるものである。
【００６２】
このために180 μlの細胞懸濁（CaCo-2又はMA104）、2ｘ104細胞/ウエルを96ウエルのマイクロタイタープレートのウエルに配分し、そしてこのプレートをCO2インキュベーター中37℃で24時間インキュベートする。この後、細胞を種々の濃度（1，5，10，25，50及び100 μg/ml）の薬物又はDMSOで処理し、さらに48時間インキュベートし、20 μlのMTT（5 mg/ml）で処理して実施例2に記述したように操作した。図６及び7の結果はこの酸で48時間処理した後のCaCo2及びMA104の生存の阻害パーセントを示している。図８はこの細胞系の種々の細胞濃度に対する50 μg/mlのポモリン酸の影響を示す。これ等の結果は、ポモリン酸がPgp 発現細胞を直接殺すことができるのみならず、MDRを誘発することができる他の遺伝子の産物を発現する耐性細胞系にも強力な殺腫瘍作用を発揮することを示している。
【００６３】
結論として、図１はポモリン酸がK562白血病細胞（慢性骨髄性白血病）の増殖を阻害することを示し、そして図２及び3はポモリン酸のLucena 1細胞（MDR細胞系）に対する阻害効果を示す。図２に示されているようにポモリン酸がビンクリスチンの存在下にLucenaの増殖を阻害することから、表２に示されたCSA又はVPの作用に類似したPgp に対する 調節作用が示唆されるであろう。しかし、図３に示されるようにこの酸はビンクリスチンの非存在下にLucena 1を殺すことができることから、この酸はPgp基質ではなく、調節物質の役割の可能性はなく、MDR細胞に対する化学療法剤の作用を示している。
【００６４】
K562に対する作用に加えて、ポモリン酸はHL-60（急性骨髄性白血病）、A549（肺癌）及びHEp-2（咽喉癌）のような他の感受性細胞系、及びCaCo-2（結腸癌）及びMA104（サル腎臓癌）のようなPgp以外の機構によりMDRを生じることができる他の遺伝子を発現する耐性細胞系に対して細胞傷害作用を示す。この二つの耐性細胞系を殺すポモリン酸の能力は図６，７及び8に示されている。
【００６５】
本発明にしたがって、多剤耐性の腫瘍を治療するために適用するには、ポモリン酸、その異性体又は誘導体の治療有効量を経口的に又は全身的に投与する。好ましくは0.01 mg/kg及び100 mg/kg体重の間からなるこの有効量。
【００６６】
本発明に使用される化学的組成物は十分な有効量のポモリン酸、その異性体又は誘導体及び全身投与又は経口投与用の医薬として受容しうる賦形剤を含有する。医薬として受容しうる賦形剤は有機溶剤、さらに生理食塩液又はその他の同等の等張溶液で希釈したものを含む。その溶剤はジメチルスルフォキシド又はヒトに使用することが受容され、生理食塩液で希釈されたその他の有機溶剤でありうる。
【００６７】
この医薬組成物を調製する方法は、最初にジメチルスルフォキシド又はヒトに使用することが医薬として受容されるその他の溶剤に溶解し、その後にジメチルスルフォキシドの濃度が1％を越えないように生理食塩液で希釈してジメチルスルフォキシドの毒作用を除くことからなる。
【００６８】
本発明のこれまでの記述は説明の目的で提示されたものである。さらに、この記述は本発明をここに明らかにした形に限定することは意図しておらず、従って、上記に教示されること及び関連技術の能力又は知識に適合する変法及び修飾は本発明の範囲内に属す。上記の様式は本発明を使用するための既知方法をよりよく説明すること、そしてこの分野の技術者がこの又は他の様式で本発明を利用しそして本発明の特殊な適用又は使用に必要な種々の修飾をして利用できることを意味している。意図するところは、本発明はその変法及び修飾を全て明細書及び請求項に記述された範囲内に包含することである。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１はポモリン酸による白血病細胞系K562の増殖阻害を示す。K562細胞を1，10及び100 □g/mlのポモリン酸で48時間処理した。値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図２】図２はビンクリスチンの存在下におけるポモリン酸により生じた耐性白血病細胞系Lucena 1に対する増殖阻害を示す。Lucena 1細胞を1，10及び100 μg/mlのポモリン酸で48時間処理した。値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図３】図３はビンクリスチンの非存在下におけるポモリン酸により生じた耐性白血病細胞系Lucena 1に対する増殖阻害を示す。Lucena 1細胞を1，10及び100 μg/mlのポモリン酸で48時間処理した。値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図４】図４は同じグラフ中において図２及び３の比較を示し、ビンクリスチンの存在下又は非存在下におけるポモリン酸により生じた耐性白血病細胞系Lucena 1に対する増殖阻害を比較する。Lucena 1細胞を1，10及び100 μg/mlのポモリン酸で48時間処理した値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図５】図５はもう一つの感受性系統である細胞系HL-60に対するポモリン酸の細胞傷害性を示す。HL-60 細胞は1，5，10，25，50及び100 μg/mlのポモリン酸で48時間処理した。値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図６】図６は細胞系Caco-2に対するポモリン酸の細胞傷害性を示す。Caco-2 細胞は1，5，10，25，50及び100 μg/mlのポモリン酸で48時間処理した。値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図７】図７はMa104細胞系に対するポモリン酸の細胞傷害性を示す。Ma104 細胞は1，5，10，25，50及び100 μg/mlのポモリン酸で48時間処理した。値は3回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。
【図８】図８は細胞系Caco-2及びMa104の細胞系の種々の細胞濃度に対するポモリン酸（50 μg/ml）の効果を表す。結果はこの酸を使用して48時間処理した後の生存の阻害パーセントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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