(57)【要約】本発明は、一般に、タンパク質−タンパク質相互作用を調整するリガンドを同定する方法に関する。より詳しくは、本発明は、標的分子の安定性を組織選択的な手法で変更する能力に基づき、補助調節因子依存性の標的分子のアゴニストまたはアンタゴニストを決定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）前記標的分子の安定性を変更する１組のリガンドを提供する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、前記標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組からのリガンドおよび前記１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子からの補助調節因子の存在下での前記標的分子の安定性のさらなる変更は、このリガンドが前記組織選択的な補助調節因子の存在下で前記標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかどうかを示し、それにより前記標的分子に対する前記リガンドの組織選択性を決定することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記標的分子の安定性を変更する前記１組のリガンドを提供する工程が、多数の異なるリガンドの１つまたは複数をこの標的分子の安定性を変更するその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多数の異なるリガンドの１つまたは複数の前記スクリーニングが、
（ａ）前記標的分子を１つまたは複数のリガンドと多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を処理して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記各入れ物について前記標的分子のアンフォールディング曲線を作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）前記多数の異なるリガンドがいずれも存在しない場合の前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記リガンドのいずれかが前記標的分子の安定性を変更するかどうかを決定する工程とを含み、安定性の変更は前記アンフォールディング曲線の変化によって示されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記スクリーニング工程がさらに、
（ａ）前記標的分子および前記１組の分子の１つまたは複数を前記補助調節因子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれの前記標的分子を処理して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記各入れ物について前記標的分子のアンフォールディング曲線を作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）（１）前記１組の前記リガンドがいずれも存在しない場合および／または（２）前記補助調節因子が存在しない場合の前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記１組の前記リガンドのいずれかが前記標的分子の安定性をさらに変更するかどうかを決定する工程とを含み、安定性のさらなる変更は前記アンフォールディング曲線のさらなる変化によって示されることを特徴とする請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つまたは複数の補助調節因子が補助活性化因子および／またはコリプレッサーを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記１組のリガンドの１つまたは複数が補助活性化因子の存在下でさらに前記標的分子の安定性を変更し、それによりこのリガンドをこの補助活性化因子の存在下で前記標的分子のアゴニストとして同定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１組の分子の１つまたは複数がコリプレッサーの存在下でさらに前記標的分子の安定性を変更し、それによりこのリガンドをこのコリプレッサーの存在下で前記標的分子のアンタゴニストとして同定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記アンタゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組のリガンドを提供する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、前記標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組からのリガンドおよび前記１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子からの補助調節因子の存在下での前記標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトは、このリガンドが前記組織選択的な補助調節因子の存在下で前記標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかどうかを示し、それにより前記標的分子に対するこのリガンドの組織選択性を決定することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる前記１組のリガンドを提供する工程が、多数の異なるリガンドの１つまたは複数をこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多数の異なるリガンドの１つまたは複数の前記スクリーニングが、さらに
（ａ）前記標的分子を前記多数の異なるリガンドの１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を加熱して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記加熱から生じる前記標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）温度の関数としての前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を、各入れ物について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）前記多数の異なるリガンドがいずれも存在しない場合の前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なるリガンドのいずれかが前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記スクリーニング工程がさらに、
（ａ）前記標的分子および前記１組のリガンドの１つまたは複数を前記補助調節因子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を加熱して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記加熱から生じた前記標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を前記各入れ物において測定する工程と、
（ｄ）温度の関数としての前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を、各入れ物について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）（１）前記１組の前記リガンドがいずれも存在しない場合および／または（２）前記補助調節因子が存在しない場合の前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記１組の前記分子のいずれかが前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする請求項１０または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の補助調節因子が補助活性化因子および／またはコリプレッサーを含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記１組のリガンドの１つまたは複数が補助活性化因子の存在下でさらに前記標的分子の安定性を変更し、それによりこのリガンドをこの補助活性化因子の存在下で前記標的分子のアゴニストとして同定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記アゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コリプレッサーの存在下で、前記１組のリガンドの１つまたは複数がさらに前記標的分子の安定性を変更し、それによりこのリガンドをこのコリプレッサーの存在下で前記標的分子のアンタゴニストとして同定することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記アンタゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
補助活性化因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）前記標的分子の安定性を変更する１組のリガンドを提供する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、前記標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組の中からのリガンドおよび前記１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子からの補助活性化因子の存在下で前記標的分子の安定性のさらなる変更が起こらないことは、このリガンドは前記組織選択的な補助活性化因子の存在下で前記標的分子のアンタゴニストであることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記標的分子の安定性を変更する前記１組のリガンドを提供する工程が、多数の異なるリガンドの１つまたは複数をこの標的分子の安定性を変更するその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
多数の異なるリガンドの１つまたは複数の前記スクリーニングが、
（ａ）前記標的分子を１つまたは複数のリガンドと多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を処理して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記各入れ物について前記標的分子のアンフォールディング曲線を作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）前記多数の異なるリガンドがいずれも存在しない場合のこの標的分子のアンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記リガンドのいずれかが前記標的分子の安定性を変更するかどうかを決定する工程とを含み、安定性の変更は前記アンフォールディング曲線の変化によって示されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記スクリーニング工程がさらに、
（ａ）前記標的分子および前記１組の分子の１つまたは複数を前記補助活性化因子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を処理して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記各入れ物について前記標的分子のアンフォールディング曲線を作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）（１）前記１組の前記リガンドがいずれも存在しない場合および／または（２）前記補助活性化因子が存在しない場合の前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記１組の前記リガンドのいずれかが前記標的分子の安定性をさらに変更するかどうかを決定する工程とを含み、安定性のさらなる変更は前記アンフォールディング曲線のさらなる変化によって示されることを特徴とする請求項１９または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンタゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
補助活性化因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組のリガンドを提供する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、前記標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組の中からのリガンドおよび前記１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子からの補助活性化因子の存在下で前記標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトが起こらないことは、このリガンドが前記標的分子のアンタゴニストであることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる前記１組のリガンドを提供する工程が、多数の異なるリガンドの１つまたは複数をこの標的分子のアンフォールディング曲線をシフトさせるその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
多数の異なるリガンドの１つまたは複数の前記スクリーニングが、さらに、
（ａ）前記標的分子を前記多数の異なるリガンドの１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を加熱して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記加熱から生じる前記標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を測定するする工程と、
（ｄ）温度の関数としての前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を、各入れ物について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）前記多数の異なるリガンドがいずれも存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なるリガンドのいずれかが前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記スクリーニング工程がさらに、
（ａ）前記標的分子および前記１組のリガンドの１つまたは複数を前記補助活性化因子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を加熱して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記加熱から生じる前記標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）温度の関数としての前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を、各入れ物について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他の熱アンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）（１）前記１組の前記リガンドがいずれも存在しない場合および／または（２）前記補助活性化因子が存在しない場合の前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記１組の前記リガンドのいずれかが前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする請求項２４または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アンタゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
コリプレッサー依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）前記標的分子の安定性を変更する１組のリガンドを提供する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、前記標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組の中からのリガンドおよび前記１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子からのコリプレッサーの存在下で前記標的分子の安定性のさらなる変更が起こらないことは、このリガンドが前記組織選択的コリプレッサーの存在下で前記標的分子のアゴニストであることを示すことを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記標的分子の安定性を変更する前記１組のリガンドを提供する工程が、多数の異なるリガンドの１つまたは複数をこの標的分子の安定性を変更するその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
多数の異なるリガンドの１つまたは複数の前記スクリーニングが、
（ａ）前記標的分子を１つまたは複数のリガンドと多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を処理して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定するする工程と、
（ｄ）前記各入れ物について前記標的分子のアンフォールディング曲線を作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）前記多数の異なるリガンドがいずれも存在しない場合のこの標的分子のアンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記リガンドのいずれかが前記標的分子の安定性を変更するかどうかを決定する工程とを含み、安定性の変更は前記アンフォールディング曲線の変化によって示されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記スクリーニング工程がさらに、
（ａ）前記標的分子および前記１組の分子の１つまたは複数を前記補助調節因子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を処理して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記各入れ物について前記標的分子のアンフォールディング曲線を作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）（１）前記１組の前記リガンドがいずれも存在しない場合および／または（２）前記コリプレッサーが存在しない場合の前記標的分子のアンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記１組の前記リガンドのいずれかが前記標的分子の安定性をさらに変更するかどうかを決定する工程とを含み、安定性のさらなる変更は前記アンフォールディング曲線のさらなる変化によって示されることを特徴とする請求項２９または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
コリプレッサー依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組のリガンドを提供する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、前記標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組の中からのリガンドおよび前記１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子からのコリプレッサーの存在下で前記標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトが起こらないことは、このリガンドは前記標的分子のアゴニストであることを示すことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる前記１組のリガンドを提供する工程が、多数の異なるリガンドの１つまたは複数をこの標的分子のアンフォールディング曲線をシフトさせるその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
多数の異なるリガンドの１つまたは複数の前記スクリーニングが、さらに、
（ａ）前記標的分子を前記多数の異なるリガンドの１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物中のそれぞれ中の前記標的分子を加熱して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記加熱から生じる前記標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）温度の関数としての前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を、各入れ物について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）前記多数の異なるリガンドがいずれも存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なるリガンドのいずれかが前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記スクリーニング工程がさらに、
（ａ）前記標的分子および前記１組のリガンドの１つまたは複数を前記補助調節因子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の入れ物のそれぞれ中の前記標的分子を加熱して前記標的分子をアンフォールディングさせる工程と、
（ｃ）前記各入れ物において前記加熱から生じる前記標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）温度の関数としての前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を、各入れ物について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記アンフォールディング曲線の各々を、
（ｉ）他のアンフォールディング曲線の各々と、および／または
（ｉｉ）（１）前記１組の前記リガンドがいずれも存在しない場合および／または（２）前記コリプレッサーが存在しない場合の前記標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較する工程と、
（ｆ）前記１組の前記リガンドのいずれかが前記標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるかどうかを決定する工程とを含むことを特徴とする請求項３４または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アゴニストが部分アゴニストであることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
未知の機能を有する補助調節因子依存性標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）未知の機能を有する標的分子の熱アンフォールディング曲線を変更する１組のリガンドを提供する工程であって、前記１組のリガンドは生物学的機能を共有する受容体の熱アンフォールディング曲線を変更する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらに変更するその能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組の中からのリガンドおよび前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子の存在下での前記標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなる変更は、このリガンドが前記補助調節因子の存在下で前記標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示すことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記標的分子の熱アンフォールディング曲線を変更する前記１組のリガンドを提供する工程は、生物学的な機能を共有する受容体の熱アンフォールディング曲線を変更する１つまたは複数の群のリガンドを、この標的分子の熱アンフォールディング曲線を変更するその能力についてスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
補助活性化因子の存在下である場合、前記リガンドが前記標的分子の部分アゴニストであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
コリプレッサーの存在下である場合、前記リガンドが前記標的分子の部分アゴニストであることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
未知の機能を有する補助調節因子依存性標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法であって、
（ａ）未知の機能を有する標的分子の安定性を変更する１組のリガンドを提供する工程であって、前記１組のリガンドが生物機能を共有する受容体の安定性を変更する工程と、
（ｂ）前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを、１つまたは複数の補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更するその能力についてスクリーニングする工程とを含み、
前記１組の中からのリガンドおよび前記１つまたは複数の補助調節因子からの補助調節因子の存在下での前記標的分子の安定性のさらなる変更は、この分子が前記補助調節因子の存在下で前記標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示すことを特徴とする方法。
【請求項４４】
前記標的分子の安定性を変更する前記１組の分子を提供する工程は、生物学的な機能を共有する受容体の安定性を変更する１つまたは複数の群のリガンドを、この標的分子の安定性を変更するその能力についてスクリーニングすることを含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
補助活性化因子の存在下である場合、前記リガンドが前記標的分子の部分アゴニストであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
コリプレッサーの存在下である場合、前記リガンドが前記標的分子の部分アゴニストであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的分子がアンドロゲン受容体、糖質コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ＧＰＣＲ、ＮＦ−кＢ、ステロイド受容体補助活性化因子（ｓｒｃ）およびＪａｃから選択されることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記標的分子が核内受容体であることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記標的分子がＧ−タンパク質結合受容体であることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記標的分子がエストロゲン受容体であることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記標的分子がＥＲ−αであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記標的分子がＥＲ−βであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記標的分子がＰＰＡＲ−γであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記標的分子がチロシンキナーゼであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記標的分子がＮＦ−кＢであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記補助調節因子の１つまたは複数がＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３から選択されることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記補助調節因子がＧｓα、Ｇｉα、Ｇｔα、Ｇｑα、Ｇｏα、Ｇｑα、ＩкＢ、ＳＨ２およびＳＯＣＳから選択されることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記リガンドがステロイドであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記リガンドが非ステロイドリガンドであることを特徴とする請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、その親和性がリガンドまたはアロステリック調節因子によってモジュレートされるタンパク質−タンパク質相互作用のためのリガンドを同定する方法に関する。より詳しくは、本発明は、補助調節因子の存在下で受容体の安定性を変更するリガンドの能力に基づき、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれている、２００２年７月２４日出願の米国特許仮出願第６０／３９８，０２３号と、２００２年９月２７日出願の米国特許仮出願第６０／４１３，８６６号および第６０／４１３，８４３号への優先権の利益を主張する。
【０００３】
シグナル伝達および遺伝子発現の中心テーマは、タンパク質−タンパク質モジュラー領域の構造性または誘導性の相互作用である。これらの相互作用を強化することができるリガンドについての知識は、生物学的事象の根底にある分子機序の性質および疾患治療のための治療手段の開発に関する情報を提供する。リガンドの同定のための既存の方法は厄介であり、特に機能が未知のタンパク質の場合は制限される。
【０００４】
核内受容体は、複製、増殖分化および脂質と糖のホメオスタシスを含む細胞機能を制御している転写因子のスーパーファミリーのメンバーである。その機能は、多様な１組のリガンド（生体異物、ホルモン、脂質、その他公知および未発見のリガンド）によって調節される。現在まで、４８種の核内受容体が同定されており、そのうちの２８種は公知のリガンドであり、残りの２０種はオーファンとして分類されている。受容体の生物学は複雑で組織特異的（非特許文献１）であり、その分子作用機構はリガンドに独立な様式または依存した様式でこれらの受容体の機能をモジュレートする、補助調節因子と呼ばれるアクセサリータンパク質の優先的補充に関連していると思われる。適当な補助調節因子の補充は、遺伝子転写または抑制をもたらす。
【０００５】
パンベラ（Ｐａｎｖｅｒａ）はエストロゲン受容体サブタイプβのためのアンタゴニストリガンドからアゴニストを区別するための試薬を提供しており、公的に補助活性化因子タンパク質の優先補充に関するデータを提示した。例えば、非特許文献２、３参照。パンベラ社の試薬は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づく検定で使われる。
【０００６】
同じくＦＲＥＴに基づく他の核内受容体（ＥＲ−α、ＥＲＲおよびＰＰＡＲファミリー）のための類似した検定に関する刊行物がある。例えば、非特許文献４、５参照。また、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を使って類似した実験が行われた。例えば、非特許文献６、７参照。
【０００７】
読み出した情報が遺伝子発現である細胞検定が存在する。例えば、非特許文献８、９参照。例えば、Ｋａｒｏ−Ｂｉｏは、核内ホルモン受容体に対するアンタゴニストリガンドからのアゴニストリガンドの区別のための配座感受性（conformational sensitive）ペプチドプローブを含む遺伝子発現読み出し検定法を開発した。例えば、非特許文献１０、１１参照。
【０００８】
Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄらは、エストラジオール存在下におけるＥＲ−α受容体の熱安定性を報告している（非特許文献１２）。しかし、この参照文献はある分子をＥＲ−α受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして同定することは教示していない。
【０００９】
上で述べた技術にはいくつかの欠点がある。例えば、核内受容体、遺伝子発現読み出し情報検定および細胞ベースの検定の分析において、同定されたリガンドまたは補助調節因子が、シグナル伝達または遺伝子活性化／抑制検定読み出し情報を生み出すことができる他のタンパク質を介してではなく、直接に関心のある受容体と相互作用することを検証するためにはカウンタースクリーンが必要である。さらに、細胞読み出し技術は弱いリガンド（一般的に、親和性が１μＭより大きい化合物が同定されるのは稀である）を同定する上での感受性が十分ではなく、細胞浸透率プロフィールの良好な化合物だけにしか適用できない。他の市販のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定法は競合置換検定を確立するためにリガンドについての知識を必要とするか、またはそれらをＦＲＥＴベースの補助調節因子検定を検証するためのツールとして利用する必要がある。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５５８５２７７号明細書
【特許文献２】米国特許第５６７９５８２号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００１／０００３６４８号明細書
【特許文献４】米国特許第６０２０１４１号明細書
【特許文献５】米国特許第６０３６９２０号明細書
【特許文献６】米国特許第６２９１１９１号明細書
【特許文献７】米国特許第６２６８２１８号明細書
【特許文献８】米国特許第６２３２０８５号明細書
【特許文献９】米国特許第６２６８１５８号明細書
【特許文献１０】米国特許第６２１４２９３号明細書
【特許文献１１】米国特許第６２９１１９２号明細書
【特許文献１２】米国特許第６３０３３２２号明細書
【非特許文献１】Shang & Brown, Science 295: 2465-2468, 2002
【非特許文献２】Bolger et al., Environmental Health Perspectives 106: 1-7 (1998)
【非特許文献３】Panvera corporate presentation presented at the Orphan Receptor Meeting San Diego (June 2002)
【非特許文献４】Zhou et al., Molecular Endocrinology 12: 1594-1604 (1998)
【非特許文献５】Coward et al., 98: 8880-8884, (2001)
【非特許文献６】Cheskis et al., J. Biological Chemistry 11384-11391 (1997)
【非特許文献７】Wong et al.; Biochemistry 40: 6756-6765 (2001)
【非特許文献８】Camp et al., Diabetes 49: 539-547 (2001)
【非特許文献９】Kraichely et al., Endocrinology, 141: 3534-3545, (2000)
【非特許文献１０】Paige et al., PNAS 96: 3999-4004 (1999)
【非特許文献１１】Presentation by Karo-Bio at the Orphan Receptor Meeting, San Diego (June 2002)
【非特許文献１２】Greenfield et al., Biochemistry 40: 6446-6652 (2001)
【非特許文献１３】Aranda and Pascual, Physiological Reviews 81: 1269-1304 (2001)
【非特許文献１４】Collingwood et al., Journal of Molecular Endocrinology 23: 255-275 (1999)
【非特許文献１５】Robyr et al., Molecular Endocrinology 23: 329-347 (2000)
【非特許文献１６】Lee et al., Cellular and Molecular Life Sciences 58: 289-297 (2001)
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【非特許文献２８】Lee, J. W., et al., Cell. Mol. Life Sci. 58: 289-297 (2001)
【非特許文献２９】Rosenfeld, M.G. & Glass, C. K., J. Biol. Chem. 276: 36865-36868 (2001)
【非特許文献３０】Xu et al., Nat. Acad. Sci. USA 97: 6379-6384 (2000)
【非特許文献３１】Misiti, S., et al., Endocrinology 140: 1957-1960 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、補助調節因子依存性受容体に対するリガンドの迅速かつハイスループットな同定、さらに補助調節因子存在下でのそれらの受容体に対する影響の、特に組織選択的または遺伝子選択的な方法による同定を容易にする、正確で、信頼できる技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、これらのニーズの１つまたは複数を満たすものである。本発明は、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法を提供する。この方法では、標的分子の安定性を変更する１組のリガンドを提供し、このリガンドの１つまたは複数を、この標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更するその能力についてスクリーニングすることを含む。この組の１つのリガンドおよび補助調節因子の存在下での標的分子の安定性のさらなる変更は、このリガンドは組織選択的な補助調節因子存在下で標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示し、それにより標的分子に対するリガンドの組織選択性が決定される。
【００１３】
本発明は、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する他の方法を提供するものである。この方法は、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組のリガンドを提供すること、および、この組のリガンドの１つまたは複数を、この標的分子に対する１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるその能力についてスクリーニングすることを含む。この組の１つのリガンドおよび補助調節因子の存在下での標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトは、このリガンドは組織選択的な補助調節因子存在下で標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示し、それによりこの標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する。
【００１４】
本発明の方法の有利な点は、遺伝子発現読み出しおよび細胞ベースの検定も、検定を確立するための公知のリガンドの使用も、いずれも不必要なことである。そのような直接的方法で情報を生み出すことができれば、所望の特性を有する医薬品の発見、治療仮説のテスト、オーファン受容体の解読が可能になる。
【００１５】
単離および／または精製されたタンパク質およびペプチドの単一の統一された検定での使用により、タンパク質−タンパク質相互作用の調整に関与するリガンドを同定することができるので、生物反応を予測することができる。単にリガンドが同定されるだけでなく、標的タンパク質に対する内在性親和性を計算することもでき、これを用いると生物学的活性との相関を調べることができる。生み出された情報を用いて医薬品の薬理学および組織特異性を予測するか決定し、またオーファン受容体に対するリガンドを同定することができ、これらは次に治療仮説のテストのためにこれらのタンパク質の生物学を解読するための手段として用いることができる。より詳しくは、本発明は組織選択的な医薬品の先導的発見、すなわち関心の組織に依存したアゴニストおよびアンタゴニストを、遺伝子選択的な医薬品の先導的発見と共に提供する。
【００１６】
本発明の方法によって生み出されたデータはカウンタースクリーニングを必要としないが、それはタンパク質などの標的分子の融解温度の変化は、巨大分子およびリガンドの関心のタンパク質に対する結合エネルギーの熱力学的連関の直接の結果であるからである。さらに、標的分子へのリガンドの親和性はより感度が良い（ｐＭからｍＭの親和性が測定される）。さらに、本発明は細胞浸透性の悪い化合物によって制限されない。また、上記のように、本発明は検定を確立するために公知のリガンドを必要とせず、オーファン受容体の解読に非常に強力な手段となっている。
【００１７】
以下、添付の図を参照にして本発明のさらなる特徴および利点を詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下の説明では、生化学および薬理学の当業者に公知の様々な用語および方法に言及する。そのような公知の用語および方法を記載している刊行物その他は、参照により完全に本明細書に組み込まれている。
【００１９】
本発明の実施形態において、この標的分子の安定性を変更する分子に基づいて、補助調節因子依存性標的分子（これはアンフォールディングすることができる）に対するリガンドの組織選択性の決定方法が提供される。標的分子の安定性を変更するリガンドは、この標的分子および１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下で、この標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングすることができる。標的分子の安定性がさらに変更されるか否かは、リガンドが組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示す。この情報に基づき、標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定することができる。
【００２０】
本発明の他の実施形態において、熱変化によって標的分子のアンフォールディングに関与する補助調節因子依存性標的分子に対するリガンドの組織選択性の決定方法が提供される。標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるリガンドは、この標的分子および１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下で、この標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。標的分子の熱アンフォールディング曲線がさらにシフトされるか否かは、リガンドが組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示す。この情報に基づき、標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定することができる。
【００２１】
標的分子に対するリガンドの「組織特異性」または「組織選択性」という用語は、通常、特定の組織の標的分子に対して、リガンドが有する影響、例えば、リガンドが特定の組織の標的分子に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかを指す。標的分子に対するリガンドの影響は、例えば関心の組織によって発現されるか、さもなければそこに存在する補助調節因子の個性（identity）、性質およびレベルによって制御されるかもしれない。
【００２２】
用語「標的分子」は、ペプチド、タンパク質、核酸および他の受容体を包含する。この用語は、酵素および酵素ではないタンパク質を包含する。この用語は、単量体および多量体のタンパク質を包含する。多量体のタンパク質は、ホモメリックでもヘテロメリックでもよい。この用語は、少なくとも２つのヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドを含む核酸を包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖または三本鎖でよい。この用語は、合成オリゴヌクレオチド、組換えＤＮＡ分子の一部または染色体ＤＮＡの一部である核酸を包含する。
【００２３】
用語「標的分子」は、フォールディング、コイル化およびねじれにより二次構造、三次構造、または四次構造をとることができるペプチド、タンパク質および他の受容体の一部も包含する。
【００２４】
標的分子は、コファクター、コエンザイム、接合団、脂質、オリゴ糖またはホスフェート基を含むが、これらに限定されない置換基で置換されてもよい。用語「標的分子」と「受容体」は同意である。
【００２５】
より詳しくは、本発明で利用される標的分子は、補助調節因子依存性である。「補助調節因子依存性」とは、標的分子が少なくとも１つのリガンドと結合すること、および少なくとも１つの補助調節因子と結合することができることを意味する。さらに、標的分子の活性は、リガンド依存性で機能するにしろ、非依存性で機能するにしろ、少なくとも部分的には補助調節因子に依存性である。補助調節因子依存性標的分子には、核内受容体が含まれるが、それには限定されない。
【００２６】
核内受容体およびそれに関連する補助調節因子の役割が非特許文献１３、１４、１５および１６に記載されている。これらの文献は、参照によりその全体を本明細書に取り込む。
【００２７】
さらに、補助調節因子依存性標的分子は、ヒトを含むがそれには限定されない脊椎動物、ならびに昆虫を含むがそれには限定されない無脊椎動物を包含する。
【００２８】
実例として、昆虫は何百もの核内受容体を含み、それに対するリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストとして同定することができる。脊椎動物、線虫類および節足動物に存在する核内受容体の議論については、非特許文献１７、１８参照のこと。これらの文献は、参照によりその全体を本明細書に取り込む。
【００２９】
用語「タンパク質」は、完全長またはポリペプチド断片を含む。用語「ペプチド」は、タンパク質断片、合成体またはペプチドライブラリーに由来するものを指す。本明細書で使用されているように、用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は同意である。
【００３０】
用語「補助調節因子（co-regulator）」は、リガンド依存的にまたは非依存的な様式で標的分子を調整する、ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸（それらは限定されない）、およびペプチドを含めた任意の構造の化学化合物を指す。この用語は、天然型、合成および仮想分子を指す。より具体的には、この用語はリガンド依存性または非依存性の方法で標的分子を調整する天然型または合成のペプチドまたはポリペプチド／タンパク質を指す。この用語は、天然配列またはファージディスプレイライブラリーに由来するペプチドを包含する。このペプチドは、天然タンパク質の断片でもよい。より具体的には、この用語は補助活性化因子およびコリプレッサーを指す。
【００３１】
用語「補助活性化因子（co-activator）」は、標的分子と結合して標的分子の活性化または活性の増加を引き起こす分子を指している。本発明の実施形態では、この用語は標的分子と結合して遺伝子転写を誘発するかシグナリング機能（例えばシグナル伝達）を誘発する分子を指す。
【００３２】
用語「コリプレッサー（co-repressor）」は、標的分子と結合して標的分子の不活性化または活性の低下を引き起こす分子を指している。本発明の実施形態では、この用語は標的分子と結合して遺伝子転写を抑制するかシグナリング機能（例えばシグナル伝達）を抑制する分子を指す。
【００３３】
用語「アゴニスト」は、標的分子と結合して標的分子への結合のために補助活性化因子を誘導するかまたは補充する分子を指す。
【００３４】
本発明の実施形態では、用語「アゴニスト」は、核内受容体と結合して補助活性化因子を補充する分子を指す。これらの実施形態では、この用語はより具体的には、補助活性化因子との直接相互作用を促進する核内受容体において配座の変化を誘発することによって遺伝子発現を変える分子を指す。
【００３５】
用語「アンタゴニスト」は、標的分子と結合して標的分子への結合のためにコリプレッサーを誘導するかまたは補充する分子を指す。
【００３６】
本発明の実施形態では、用語「アンタゴニスト」は、核内受容体と結合してコリプレッサーを補充する分子を指す。これらの実施形態では、この用語はより具体的には、コリプレッサーとの直接相互作用を促進する核内受容体において配座の変化を誘発することによって遺伝子発現を変える分子を指す。
【００３７】
用語「部分アゴニスト」は、標的分子と結合し、標的分子への結合のために補助活性化因子およびコリプレッサーを誘導するかまたは補充する能力を有する分子を指す。この用語はコリプレッサーよりも強く補助活性化因子を補充する分子、コリプレッサーとほぼ同じ親和性で補助活性化因子を補充する分子、および／または補助活性化因子よりも強くコリプレッサーを補充する分子を含み得ることを理解されたい。部分アゴニズムの概念を以下でさらに議論する。
【００３８】
用語「リガンド」は、補助調節因子のような追加の化合物の存在下または非存在下で、標的分子への結合について試験される化合物を指す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（これらに限定されない）のような核酸、およびペプチドを含めた任意の構造の化学化合物を包含する。この用語は、天然型、合成および仮想分子を指す。この用語は、化合物またはコンビナトリアルライブラリー中の化合物を含む。用語「リガンド」と「分子」は同意である。
【００３９】
用語「組織選択的な補助調節因子」または「組織特異的補助調節因子」は、他の組織よりも標的分子と相互作用することができる特定の組織で優先してまたは選択的に発現されるかさもなければそこに存在する補助調節因子を指す。
【００４０】
用語「多数の分子」、「多数の化合物」または「多数の入れ物」は、少なくとも２つの分子、化合物または入れ物を指す。
【００４１】
用語「機能」は、例えばタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのような標的分子の生物学的機能を指す。
【００４２】
「熱アンフォールディング曲線」は、タンパク質または核酸のアンフォールディングと関連した温度の関数としての物理的変化のグラフである。
【００４３】
用語「結合する」および「結合」は、２つ以上の分子の間の相互作用を指す。より具体的には、この用語はリガンドと標的分子の間、または補助調節因子と標的分子の間、またはリガンド、標的分子と補助調節因子の間の、非共有結合のような相互作用を指す。
【００４４】
用語「安定性の変更」は、１つまたは複数のリガンドによって結合された標的タンパク質に所定程度の物理的変化を起こすのに必要な圧の量、熱量、洗剤の濃度、または変性剤の濃度を、リガンドの非存在下で標的タンパク質に同程度の物理的変化を起こすのに必要な圧の量、熱量、洗剤の濃度、または変性剤の濃度と関連させた変化を指す。安定性の変更は、安定性の増加または減少として示すことができる。リガンドによる標的分子の安定性の変更は、このリガンドがこの標的分子と結合することを示す。
【００４５】
用語「さらなる安定性の変更」は、標的分子および１つまたは複数の追加の分子の安定性を変更することが知られている分子の存在下で、この標的分子の安定性の追加の変更を指す。より具体的には、この１つまたは複数の追加の分子は補助調節因子でよい。
【００４６】
用語「アンフォールディング」は、アミノ酸側鎖の結晶秩序、二次、三次または四次タンパク質構造のような構造の欠失を指す。タンパク質のような標的分子は、変性剤（例えば尿素、グアニジウム塩酸塩またはチオ琥珀酸グアニジウム）、洗剤での処理によって、標的分子を圧で処理することにより、標的分子を熱することにより、または他のいかなる適当な変化によってもアンフォールディングすることができる。
【００４７】
用語「物理的変化」は、光または熱の形のエネルギーの放出、光または熱の形のエネルギーの吸収、濁度の変化および光の偏光特性の変化を含む。具体的には、この用語は蛍光発光、蛍光エネルギー転移、紫外線または可視光の吸収、赤外分光法または他の分光学的方法によって測定可能な変化、光の偏光性質の変化、蛍光発光の偏光性質の変化、蛍光の経時変化速度（すなわち蛍光寿命）の変化、蛍光異方性の変化、蛍光共鳴エネルギー転移の変化、濁度の変化および酵素活性の変化を指す。好ましくは、この用語は蛍光を指し、より好ましくは蛍光発光を指す。蛍光発光はタンパク質に内在性であるか、または蛍光リポーター分子によることもある。タンパク質のアンフォールディングをモニターする蛍光技術の使用は、当業者に周知である。例えば、非特許文献１９参照。
【００４８】
「アンフォールディング曲線」は、タンパク質のアンフォールディングと関連した、温度、変性剤濃度および圧力などのパラメータの関数としての物理的変化のグラフである。
【００４９】
用語「熱安定性の変更」は、１つまたは複数のリガンドと結合した標的タンパク質に所定程度の物理的変化を起こすのに必要な熱エネルギー量を、リガンドの非存在下で標的タンパク質に同程度の物理的変化を起こすのに必要な熱エネルギー量と関連させた変化を指す。熱安定性の変更は、熱安定性の増加または減少として示すことができる。リガンドによる標的分子の熱安定性の変更は、このリガンドがこの標的分子と結合することを示す。
【００５０】
用語「熱アンフォールディング曲線のシフト」は、リガンドがない場合の標的分子の熱アンフォールディング曲線に対する、リガンドに結合している標的分子の熱アンフォールディング曲線のシフトを指す。
【００５１】
用語「熱アンフォールディング曲線のさらなるシフト」は、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが周知の分子および１つまたは複数の追加の分子の存在下で、この標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトを指す。より具体的には、この１つまたは複数の追加の分子は補助調節因子でよい。
【００５２】
用語「標的分子を接触させる」は、広義には標的分子をその結合についてスクリーニングするべき分子の入った溶液に入れることを指す。より狭義には、接触させるとは標的分子およびその結合についてスクリーニングするべき分子の溶液の回転、攪拌、振盪または振動を指す。より具体的には、接触させるとは標的分子とその結合についてスクリーニングするべき分子との混合を指す。混合は、例えばピペットチップにより吸い込みと吐き出しを繰り返すことにより行うことができる。好ましくは、接触させるとは標的分子とその結合についてスクリーニングするべき分子の間の結合の平衡化を指す。接触は入れ物内で起こるか、または、標的分子およびスクリーニングするべき分子を入れ物に入れる前に起こる。
【００５３】
用語「入れ物」は、結合を試験すべき受容体および分子を入れることのできるいかなる容器またはチャンバを指す。用語「入れ物」は、反応管（例えば試験管、マイクロチューブ、バイアル、キュベット、その他）を包含する。本発明の実施形態では、用語「入れ物」は、マルチウェルマイクロプレートまたはマイクロタイタープレートのウェルを指す。
【００５４】
本発明の実施形態では、標的分子と結合するリガンドは、１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下で標的分子と結合する能力についてスクリーニングすることができる。用語「スクリーニング」は、通常、変性またはアンフォールディングすることのできる標的分子と結合する能力について分子または化合物を試験することを指す。スクリーニングプロセスは繰り返し、すなわち反復プロセスであって、分子がアンフォールディング検定でタンパク質への結合について試験されるものであり得る。
【００５５】
上で述べたように、本発明の実施形態に従って、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性は、この標的分子の安定性の変更に基づいて同定することができる。標的分子の安定性を変更するリガンドは、１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングすることができる。
【００５６】
一実施形態では、スクリーニングを行うためには、標的分子の安定性を変更する１つまたは複数のリガンド（例えば１組の）は、この標的分子および１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子と多数の入れ物のそれぞれの内で接触させることができる。次に、各入れ物内の標的分子を処理して標的分子をアンフォールディングすることができる。標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化は測定することができる。次に、各入れ物の標的分子のアンフォールディング曲線を作成することができる。各アンフォールディング曲線は、（１）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または（２）（ｉ）その組の分子のいずれも存在しない場合、および／または（ｉｉ）補助調節因子が存在しない場合のこの標的分子のアンフォールディング曲線と比較することができる。
【００５７】
作成されたデータに基づき、スクリーニングされたリガンドが組織選択性補助調節因子の存在下でさらにこの標的分子の安定性を変更するかどうかを決定することができ、それはリガンドが組織選択的な補助調節因子の存在下で標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを示す。標的分子の安定性のさらなる変更は、標的分子のアンフォールディング曲線のさらなる変化によって示される。
【００５８】
本発明の他の実施形態では、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性は、熱安定性を変更する分子の解析、より詳細には標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子の解析により決定することができる。標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるリガンドは、１つまたは複数の補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。
【００５９】
本発明の一実施形態において、標的分子を１つまたは複数の組織選択的補助調節因子と標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１つまたは複数の（例えば、１組の）リガンドとを、多数の入れ物のそれぞれの中で接触させることによってスクリーニングが行える。多数の入れ物を加熱し、標的分子の熱アンフォールディング曲線と関連する温度関数としての物理的変化を、各入れ物について測定することができる。次に、温度関数としての標的分子の熱アンフォールディング曲線を作成することができる。作成された熱アンフォールディング曲線は、（１）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または（２）（ｉ）その組の分子のいずれも存在しない場合、および／または（ｉｉ）補助調節因子が存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較することができる。
【００６０】
スクリーニング法の実施形態では、入れ物はある範囲の温度条件で間隔をおいて加熱することができる。多数の入れ物は、同時に加熱することができる。標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化は、各加熱の後に測定することができる。この方法の別の実施形態では、入れ物は連続法で加熱することができる。
【００６１】
本発明の実施形態では、標的分子の熱アンフォールディング曲線を作成する際に、熱アンフォールディング曲線は、各入れ物の標的分子につき温度の関数としてプロットすることができる。
【００６２】
本発明の一実施形態において、熱アンフォールディング曲線の比較は、各アンフォールディング曲線の中心点温度、Ｔｍを比較することによって達成することができる。「中心点温度Ｔｍ」は、熱アンフォールディング曲線の温度中心点である。Ｔｍは当業者に周知の方法で容易に測定することができる。例えば、非特許文献２０および２１参照。
【００６３】
例えば、各熱アンフォールディング曲線のＴｍを割り出して、（１）他の熱アンフォールディング曲線で得られたＴｍと、および／または（２）（ｉ）その組の分子のいずれも存在しない場合、および／または（ｉｉ）補助調節因子が存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線で得られたＴｍと比較することもできる。
【００６４】
別法で、または追加で、熱アンフォールディング曲線の全体を、コンピューター分析ツールを使って同様に他の熱アンフォールディング曲線の全体と比較することができる。例えば、各熱アンフォールディング曲線の全体は、（１）他のアンフォールディング曲線と、および／または（２）入れ物内に（ｉ）その組の分子のいずれも存在しない場合、および／または（ｉｉ）補助調節因子が存在しない場合のその標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較することができる。
【００６５】
作成されたデータに基づき、スクリーニングされた分子のいずれかが補助調節因子の存在下でさらにこの標的分子の熱アンフォールディングをシフトさせるかどうかを決定することができ、それはある分子が組織選択的な補助調節因子の存在下で標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを同定する。このようにして、標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定することができる。
【００６６】
リガンドが標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる、および／またはさらにシフトさせるかどうかを決定することに関与する本発明の方法は、分子が標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるおよび／またはさらにシフトさせるかどうかを決定することに関与しない方法、例えばタンパク質分解への感受性、タンパク質による表面結合、タンパク質による抗体結合、タンパク質の分子シャペロン結合、固定化リガンドへの差結合（differential bonding）およびタンパク質凝集の検定のような方法とは異なる。このような検定方法は、当業者には良く知られている。例えば、特許文献１および２参照。これらの特許（特許文献１および２）に記載の取り組み方法は、その結合を試験する分子の存在下および非存在下でタンパク質のフォールディングおよび／またはアンフォールディングの程度を比較することを含む。これらの取り組み方法は、標的分子に結合するリガンドのいずれかが標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうかの決定を含まない。
【００６７】
上で述べたように、標的分子の安定性を変更するリガンドは、組織選択的な補助調節因子の存在下で標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングすることができる。例えば、標的分子の安定性を変更することが公知のリガンドは、補助活性化因子および／またはコリプレッサーを含めた、標的分子に対する一群の同定された組織選択性補助調節因子に対してスクリーニングすることができる。便宜上、標的分子の安定性を変更することが公知のリガンドは、「１組（a set）」の分子と呼ぶ。
【００６８】
標的分子および前記１組の中のリガンドのみの場合と比較して、１組の中の１つのリガンドおよび標的分子の組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子の安定性がさらに変更されるならば、このことは前記１組の中のリガンドは前記組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子のアゴニストであることを示す。このように、補助活性化因子を発現する組織では、リガンドは標的分子のアゴニストのように作用できることが決定できる。
【００６９】
標的分子および前記１組の中のリガンドのみの場合と比較して、１組の中の１つのリガンドおよび標的分子の組織選択性コリプレッサーの存在下で標的分子の安定性がさらに変更されるならば、このことは前記１組の中のリガンドは前記組織選択性コリプレッサーの存在下で標的分子のアンタゴニストであることを示す。このように、コリプレッサーを発現する組織では、リガンドは標的分子に対してアンタゴニストのように作用できることが決定できる。
【００７０】
同様に、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるリガンドは、組織選択性補助調節因子の存在下で標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。例えば、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが公知のリガンドは、補助活性化因子および／またはコリプレッサーを含めた、標的分子に対する一群の同定された組織選択性補助調節因子に対してスクリーニングすることができる。便宜上、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが公知のリガンドは、「１組」の分子と呼ぶ。
【００７１】
標的分子および１組の中のリガンドのみの場合と比較して、１組の中の１つのリガンドおよび標的分子の組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子の熱アンフォールディング曲線がさらにシフトされるならば、このことは前記１組の中のリガンドは前記組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子のアゴニストであることを示す。このように、補助活性化因子を発現する組織では、リガンドは標的分子に対してアゴニストのように作用できることが決定できる。
【００７２】
標的分子および１組の中のリガンドのみの場合と比較して、１組の中の１つのリガンドおよび標的分子の組織選択性コリプレッサーの存在下で標的分子の熱アンフォールディング曲線がさらにシフトされるならば、このことは前記１組の中のリガンドは前記組織選択性コリプレッサーの存在下で標的分子のアンタゴニストであることを示す。このように、コリプレッサーを発現する組織では、リガンドは標的分子に対してアンタゴニストのように作用できることが決定できる。
【００７３】
本発明は、標的分子の安定性のさらなる変更の欠如および／または標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトの欠如に基づき、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法も提供する。
【００７４】
「標的分子の安定性のさらなる変更の欠如」または「標的分子の安定性のさらなる変更が起こらないこと」は、（標的分子および１組の中のリガンドの場合と比較して）１組の中の１つのリガンドおよび補助調節因子の両方の存在下で標的分子の安定性のさらなる変更は微々たるものであるかまたは皆無であることを意味する。
【００７５】
「標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトの欠如」または「標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなる変更が起こらないこと」は、（標的分子および１組の中のリガンドの場合と比較して）１組の中の１つのリガンドおよび補助調節因子の存在下で標的分子の熱アンフォールディング曲線のシフトのさらなる変化は微々たるものであるかまたは皆無であることを意味する。
【００７６】
本発明の実施形態において、ある組織において補助調節因子依存性の標的分子に対してリガンドがアンタゴニストのように作用するかどうかは、組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子の安定性のさらなる変更の欠如および／または標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトの欠如に基づいて同定することができる。本発明の他の実施形態において、ある組織において補助調節因子依存性の標的分子に対してリガンドがアゴニストのように作用するかどうかは、組織選択性コリプレッサーの存在下で標的分子の安定性のさらなる変更の欠如および／または標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトの欠如に基づいて同定することができる。
【００７７】
リガンドがある組織において補助調節因子依存性の標的分子に対してアンタゴニストのように作用することは、標的分子の安定性を変更する１組の中の１つまたは複数のリガンドを、組織選択的な１つまたは複数の補助活性化因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングすることにより決定できる。前記１組のリガンドを標的分子の安定性をさらに変更する効果についてスクリーニングするための方法は、上に記載されている。前記１組の１つのリガンドおよび組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子の安定性のさらなる変更が起こらないならば、このことはそのような組のリガンドは補助活性化因子を発現する組織において標的分子に対してアンタゴニストのように作用することを示す。
【００７８】
アンタゴニストは、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組の中の１つまたは複数のリガンドを、１つまたは複数の補助活性化因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることにより同定することもできる。１組の中の１つまたは複数のリガンドを標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするための方法は、上に記載されている。１組の１つのリガンドおよび組織選択性補助活性化因子の存在下で標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトが起こらないならば、このことはそのような組のリガンドは補助活性化因子を発現する組織において標的分子に対してアンタゴニストのように作用することを示す。
【００７９】
リガンドがある組織において補助調節因子依存性の標的分子に対してアゴニストのように作用することは、標的分子の安定性を変更する１組の中の１つまたは複数のリガンドを、組織選択的な１つまたは複数のコリプレッサーの存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングすることにより決定できる。前記１組のリガンドを標的分子の安定性をさらに変更する効果についてスクリーニングするための方法は、上に記載されている。前記１組の１つの分子および組織選択性コリプレッサーの存在下で標的分子の安定性のさらなる変更が起こらないならば、このことはそのような組のリガンドはコリプレッサーを発現する組織において標的分子に対してアゴニストのように作用することを示す。
【００８０】
あるリガンドがアゴニストのように作用することは、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組の中の１つまたは複数のリガンドを、１つまたは複数のコリプレッサーの存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることにより同定することもできる。前記１組の中の１つまたは複数のリガンドを標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングするための方法は、上に記載されている。前記１組の１つのリガンドおよびコリプレッサーの存在下で標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトが起こらないならば、このことはそのような組のリガンドはコリプレッサーを発現する組織において標的分子に対してアゴニストのように作用することを示す。
【００８１】
本発明を利用して補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する能力は、組織選択性補助調節因子の存在下で標的分子のアゴニストまたはアンタゴニストとしてリガンドを同定する本発明の能力に基づく。
【００８２】
実例として、１つの特定の組織、例えば組織１は特定の補助調節因子、例えば補助調節因子１を発現することができる。第２の特定の組織、例えば組織２は補助調節因子１を発現しないか、またはそれを異なるレベル、すなわち低いレベルで発現する。本発明の方法によりあるリガンドが補助調節因子１の存在下で標的分子のアゴニストであると決定されたならば、そのリガンドは組織１では標的分子をアゴナイズするが組織２ではそうしないことが予想されるが、その理由は補助調節因子１は組織１では活性であるが組織２では実質的に不活性であるからである。
【００８３】
他の実例として、１つの特定の組織、例えば組織３は特定の補助調節因子、例えば補助調節因子３を発現することができる。他の組織、例えば組織４は補助調節因子３および他の補助調節因子、例えば補助調節因子４を発現する。本発明の方法によりあるリガンドが補助調節因子３の存在下で標的分子のアゴニストであるが、補助調節因子４の存在下では標的分子のアンタゴニストであると決定されたならば、そのリガンドは組織３ではアゴニストとして、組織４では部分アゴニストとして作用すると予想される。
【００８４】
本発明の方法の利用により、これらの具体例の様々な組合せまたはバリエーションを想像することができる。例えば、本発明の方法を用いて、例えば一部の組織に対してはアゴニストであるが他の組織に対してはアンタゴニストであるリガンド、一部の組織に対しては部分アゴニストであるが他の組織に対してはアゴニストであるリガンド、一部の組織に対してはアンタゴニストであるが他の組織に対しては部分アゴニストであるリガンドを決定することができる。
【００８５】
リガンドの生物学的反応は、存在する特異的な補助調節因子およびそのレベルに組織特異的に依存するかもしれない。リガンドをアゴニスト、アンタゴニストまたは部分アゴニストとして特定することは適当な三次複合体（リガンド、標的分子および補助調節因子）の形成に依存性し、組織特異的であるかもしれない。本発明の方法を用いて標的分子に対する組織選択的なリガンドの影響を同定することができる（例えば、アゴニスト、アンタゴニストまたは部分アゴニストを同定することができる）。本発明は特定の組織に対する薬用リードリガンドのｉｎ  ｖｉｖｏ薬効の予測に特に有用であり、すなわち関心の組織に応じてアゴニストおよびアンタゴニストに関する組織選択的なリード（lead）の発見に有用である。
【００８６】
標的分子の安定性を変更し、および／または熱アンフォールディング曲線をシフトさせることが公知のリガンドを提供し、このようなリガンドをこの標的分子の安定性をさらに変更し、および／または熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることにより、補助調節因子依存性の標的分子に対するリガンドの組織選択性を決定する方法が上で記載されている。本発明は、そのようなリガンドを提供する方法と共にそれらの組織選択性の同定方法も包含する。そのような方法は、受容体と結合するリガンドが未知であるオーファン受容体に対するそのようなリガンドを同定する際に特に役立つ。
【００８７】
標的分子の安定性を変更し、および／またはその熱アンフォールディング曲線をシフトさせるリガンド（便宜上、上では「１組」と呼ばれている）は、多数の異なる分子をスクリーニングすることにより得られる。例えば、標的分子の安定性を変更するリガンドは、多数の異なる分子の１つまたは複数をこの標的分子の安定性を変更する能力についてスクリーニングすることにより得られる。同様に、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる分子は、多数の異なる分子の１つまたは複数をこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることにより得られる。本発明の実施形態では、スクリーニングすることができる分子の数は約１０００から１００万の範囲である。
【００８８】
分子は、標的分子の安定性を変更する能力について、上で記載したリガンドの組織選択性を決定するスクリーニング法と類似の方法でスクリーニングされうる。例えば、標的分子は多数の異なる分子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させることができる。多数の入れ物のそれぞれの標的分子を処理して、アンフォールディングすることができる。標的分子のアンフォールディングと関連する物理的変化を測定することができる。各入れ物の標的分子のアンフォールディング曲線を作成することができる。これらのアンフォールディング曲線は、それぞれ（１）他のアンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または（２）多数の異なる分子がいずれも存在しない場合のこの標的分子のアンフォールディング曲線と比較することができる。
【００８９】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングされた分子のいずれかが標的分子の安定性を変更するかどうかを決定することができる。標的分子の安定性の変更は、標的分子のアンフォールディング曲線の変化によって示される。ある分子が標的分子の安定性を変更するならば、その分子は標的分子に対する組織選択性を決定するために上述の方法によってスクリーニングすることができる。
【００９０】
同様に、分子は、標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力について、前記組織選択性を決定するスクリーニング法と類似の方法でスクリーニングされうる。例えば、標的分子は多数の異なる分子の１つまたは複数と、多数の入れ物の各々の中で接触させることができる。この入れ物を加熱して、標的分子の熱アンフォールディングと関連する物理的変化を各入れ物で測定することができる。標的分子の熱アンフォールディング曲線を、温度関数として各入れ物について作成することができる。
【００９１】
これらの熱アンフォールディング曲線は、（１）他の熱アンフォールディング曲線のそれぞれと、および／または（２）多数の異なる分子がいずれも存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較することができる。本発明の実施形態では、各熱アンフォールディング曲線のＴｍが同定され、（１）他の熱アンフォールディング曲線に対して得られたＴｍと、および／または（２）多数の異なる分子がいずれも存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線に対して得られたＴｍと比較することもできる。あるいは、各熱アンフォールディング曲線の全体は、（１）他のアンフォールディング曲線と、および／または（２）多数の異なる分子がいずれも存在しない場合のこの標的分子の熱アンフォールディング曲線と比較することができる。
【００９２】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングされた分子のいずれかが標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるかどうか決定することができる。ある分子が標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせるならば、その分子は標的分子に対する組織選択性を決定するために上述の方法によってスクリーニングすることができる。
【００９３】
前記したように、本発明の方法は、受容体と結合するリガンドが未知であるオーファン受容体に対するリガンドを同定する際に特に役立つ。同様に、本発明は未知の機能を有する標的分子のアゴニストおよびアンタゴニストを組織選択的な方法で同定するための方法を提供する。
【００９４】
本発明の一実施形態では、未知の機能を有する標的分子の安定性を変更する１組のリガンドが提供される。この１組のリガンドは、生物学的な機能を共有する受容体の安定性を変更する。標的分子の安定性を変更する１組のリガンドは、生物学的な機能を共有する受容体の安定性を変更する１つまたは複数の群の分子を、この標的分子の安定性を変更する能力についてスクリーニングすることにより提供されうる。そのような１組のリガンドを提供する方法が特許文献３にさらに詳細に記載されている。この文献は、参照によりその全体を本明細書に取り込む。
【００９５】
１組の中の１つまたは複数のリガンドは、１つまたは複数の組織選択的な補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更する能力についてスクリーニングすることができる。上で詳細に述べたように、前記１組の１つの分子および組織選択性補助調節因子の存在下での標的分子の安定性のさらなる変更は、その分子が組織選択的に標的分子に対してアゴニストのように作用するかまたはアンタゴニストのように作用するかを示す。本発明の実施形態は、また、標的分子の安定性のさらなる変更の欠如に基づく組織選択的な方法によるアゴニストおよびアンタゴニストリガンドの同定を含む。
【００９６】
本発明の他の実施形態では、未知の機能を有する標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組のリガンドが提供される。この１組のリガンドは、生物学的な機能を共有する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる。標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組のリガンドは、生物学的な機能を共有する受容体の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１つまたは複数の群の分子を、この標的分子の熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力についてスクリーニングすることにより得られる。そのような１組の分子を提供する方法も特許文献３にさらに詳細に記載されている。
【００９７】
１組の中の１つまたは複数の分子は、１つまたは複数の補助調節因子の存在下でこの標的分子の熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせる能力についてスクリーニングすることができる。上で詳細に述べたように、前記１組の１つの分子および組織選択性補助調節因子の存在下での標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトは、その分子が組織選択的に標的分子に対してアゴニストのように作用するかまたはアンタゴニストのように作用するかを示す。本発明の実施形態は、また、標的分子の熱アンフォールディング曲線のさらなるシフトの欠如に基づく組織選択的な方法によるアゴニストおよびアンタゴニストリガンドの同定を含む。
【００９８】
本発明の実施形態では、マイクロプレート熱シフト検定は、リガンドを同定してそのようなリガンドを補助調節因子依存性標的分子の組織選択的なアゴニストまたはアンタゴニストと同定するために特に有用な手段である。マイクロプレート熱シフト検定は、標的受容体の熱安定性に対する１つまたは複数の分子の影響を検定するための直接的且つ定量的な技術である。
【００９９】
マイクロプレート熱シフト検定の理論、概念および用途、ならびにマイクロプレート熱シフト検定の実践に役立つ装置が特許文献４〜１２に記載されている。これらは、参照によりその全体を本明細書に取り込む。これらの参照文献で述べられているマイクロプレート熱シフト検定を用いて上述のスクリーニング法を実行することができる。
【０１００】
マイクロプレート熱シフト検定は、リガンド結合能に関する熱力学的に読み出した情報を提供する。この検定は、各々の機能的に活性な標的分子が各標的分子に特有でその安定化エネルギーを表す温度で協同して融解する、高度に組織化された構造であるという事実に依存する。ある分子が標的分子と結合するとき、この標的分子はリガンド結合能に比例した量で安定化し、こうして中心点温度はより高い温度へ移行する。
【０１０１】
熱シフト検定結合は、結合をモニタリングするために放射性標識化合物も、蛍光も、その他の嫌色素性標識も必要としないので、その使用には多くの利点がある。この検定は生体分子の熱アンフォールディング、つまりすべてではないにしても多くの薬剤標的生体分子に内在性の一般的な物理化学プロセスを利用する。一般的な適用性により新規治療用受容体タンパク質が利用できるようになるたびに新しい検定を発明する必要がなくなるので、一般的適用性はこの検定の重要な側面である。
【０１０２】
さらに熱シフト検定を用いると、Ｔｍおよびリガンド結合能の比例性のために、１０マイクロモル超から１ナノモル未満までのリガンド結合能を単一ウェルの実験で測定することができる。従って、熱シフト検定を用いて標的分子単独に対するリガンド結合能、および／または補助調節因子存在下のリガンド結合能を定量的に検出することができる。
【０１０３】
さらに、熱シフト検定はＴｍの変化に基づく定量的な方法により、リガンドと標的分子間およびリガンド、標的分子と補助調節因子間での組織選択的なアゴニストおよびアンタゴニスト（ならびに部分アゴニスト）の同定に用いることができる。マイクロプレート熱シフト検定を用いて、単一の標的分子上の複合的なリガンド結合事象を標的分子の融解温度のインクリメンタルまたは付加的な上昇として測定することができる。
【０１０４】
本発明は、リガンドの同定、および組織選択的な手法による核内受容体におけるアゴニストまたはアンタゴニストとしてのそのようなリガンドの同定に特に有用である。例えば、本発明を用いて、核内受容体リガンドに対する結合能を測定してｉｎ  ｖｉｖｏ効能を予測し、リガンドがアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを同定して生物学的反応を予測し、オーファン受容体に対するリガンドを同定して生物学的な機能を発見し、および補助調節因子の優先的補充を分析することによって組織特異性を決定することができる。
【０１０５】
例えば、本発明を用いて、ＥＲ−αおよびＥＲ−βのリガンド結合領域、つまりエストロゲン受容体ファミリーの２つのサブタイプと相互作用するリガンドを同定することができる。これらの領域は、２つの公知の結合部位を含み、１つはエストロゲン様化合物のためのもので他は補助調節因子タンパク質のためのものである。本発明の化合物は、エストロゲン受容体と相互作用するリガンドを同定するために用いることができる。これらのリガンドはリガンドの固有の親和性に比例する、観測できる受容体の安定性の増加をもたらす。
【０１０６】
核内受容体のリガンド結合領域および補助調節因子タンパク質は、大腸菌（Escherichia coli）における標準の組換え方法を使用して発現することができる。補助調節因子ペプチドは、標準の方法を使って合成できる。精製された関心のタンパク質の融解温度は、小分子リガンドの非存在下および存在下でマイクロプレート熱シフト検定で測定することができる。
【０１０７】
関心の標的分子を安定させる分子が提供される。そのような小分子は、上述したマイクロプレート熱シフト検定でスクリーニングすることによって得られる。スクリーニングにおける小分子の数は約１０００から１００万の範囲である。これらの小分子は天然物でも合成物でもよい。
【０１０８】
一旦１組の小分子が関心のタンパク質を安定させることが確認されたならば、これらの分子はタンパク質またはペプチド断片一群のような補助調節因子に対してスクリーニングしてタンパク質の熱安定性に対する影響を測定することができる。相乗効果が観察されるならば、その化合物はアゴニストまたはアンタゴニストとして分類することができる。リガンドおよび補助調節因子の平衡定数を計算して、それを生物学的反応と関連付けする。
【０１０９】
生物学的な機能をオーファン受容体に割り当てるために、速度制限段階はツール化合物の生成である。一群の化合物に対して関心の受容体でスクリーニングし、上述の方法によって関心の受容体を安定させるリガンドを同定することができる。一旦リガンドが同定されたならば、同定されたリガンドがアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを決定するために上述の方法により補助調節因子に対してスクリーニングすることができ、最大の応答を生じる好ましい補助調節因子を同定することができる。
【０１１０】
例えばウェスタンブロット分析で同定された関心の受容体を含む細胞系は、同定されたリガンドで処理することができる。リガンド処理された細胞系は、次にＤＮＡチップで遺伝子発現の分布を測定し、未処理の細胞系に対して比較することができる。同定されたリガンドがアゴニストであるならば、未処理の細胞系に対して比較したときいくつかの遺伝子がアップレギュレーションされることになろう。同定されたリガンドがアンタゴニストであるならば、未処理の細胞系に対して比較したときいくつかの遺伝子がダウンレギュレーションされることになろう。この情報が生成されれば、受容体の生物学的な機能を同定することができる。この情報は、化学情報科学および生物情報科学と組み合わせることにより、治療仮説を構築する際に、また疾患治療について試験する際にも役立つ。（例えば、非特許文献２２参照。これは参照によりその全体を本明細書に取り込む。）。
【０１１１】
本発明は、遺伝子特異性を決定するための上述のスクリーニング法の使用も包含する。
【０１１２】
「遺伝子特異的な」、「遺伝子特異性」、「遺伝子選択的な」または「遺伝子選択性」は、標的分子（例えば、核内受容体など）と相互作用して特定の遺伝子の転写を活性化するかまたは抑制する特異的な補助調節因子の補充に基づいて、特定の遺伝子の発現または抑制を標的にできることを意味する。
【０１１３】
例えば、標的分子の安定性の変更および／または熱アンフォールディング曲線のシフトに基づいて補助調節因子依存性標的分子のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は上で詳述した。実例として、本発明を用いることにより、標的分子の安定性を変更しおよび／またはその熱アンフォールディング曲線をシフトさせる１組の分子を提供し、この１組の分子の１つまたは複数を、特定の補助調節因子の存在下でこの標的分子の安定性をさらに変更しおよび／またはその熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるその能力についてスクリーニングすることにより、特定の補助調節因子の存在下であるリガンドがこの標的分子のアゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを決定できる。
【０１１４】
特定の補助調節因子の存在下でリガンドが標的分子のアゴニストまたはアンタゴニストであるとの決定に基づき、標的分子に対するリガンドの遺伝子特異性を決定できる。例えば、特定の遺伝子、例えば「遺伝子Ａ」は、存在するか組織によって発現される特定の補助活性化因子、例えば「補助活性化因子Ａ」と標的分子が相互作用するときに産生される。第２の遺伝子、例えば「遺伝子Ｂ」は、存在するかまたは組織で発現される第２の補助活性化因子、例えば「補助活性化因子Ｂ」と標的分子が相互作用するときに産生される。
【０１１５】
遺伝子Ａまたは遺伝子Ｂの一方の生産を、他方を実質的に刺激することなく刺激したいならば、本発明を使用して、補助活性化因子の一方が存在し且つ他方が実質的に存在せずに、リガンドが標的分子の安定性をさらに変更しおよび／またはその熱アンフォールディング曲線をさらにシフトさせるかを決定できる（このようにして、リガンドをその補助活性化因子のアゴニストとして同定する）。このように、あるリガンドが特定の遺伝子の産生を選択的に行うことができるかどうかを決定することができる。
【０１１６】
核内受容体のリガンド結合領域、リガンドおよびこの領域と相互作用する補助調節因子が記載されているけれども、本発明はさらなる調節因子の存在下、および最終的にはＤＮＡの存在下で完全長タンパク質まで広げることができる。
【０１１７】
さらに、データ分析の方法および熱力学的原理は、その親和性がリガンドまたはアロステリック調節因子によって調節されるいかなるタンパク質−タンパク質相互作用にも使用できることを強調したい。例には、それらには限定されないが、アゴニストリガンドをアンタゴニストリガンドと区別するためのＧタンパク質とのＧＰＣＲの相互作用、ＳＨ２領域とタンパク質チロシンキナーゼのリン酸化された形態との会合に拮抗する化合物を識別すること、酵素のオリゴマー状態に影響を及ぼすことによってＰＫＡホロエンザイムをアゴナイズするか拮抗する化合物を同定すること、ＮＦ−кＢとＩкＢとの会合を促進するか抑制する化合物を識別すること、または転写因子のオリゴマー形成を促進するか抑制する化合物がある。
【０１１８】
また、これらの研究はタンパク質−タンパク質相互作用に限定されず、関心のタンパク質と優先的に相互作用するタンパク質領域を表す短い線状配列をペプチドが示す、タンパク質−ペプチド相互作用にも使うことができる。
【０１１９】
組織特異性および部分アゴニズムのさらなる考察
遺伝子の活性化または抑制は、単一の組織に限定されるかもしれない。したがって、遺伝子特異的な応答のためには補助活性化因子および補助調節因子のファミリーの中での識別が必要である。そのようなものが、褐色脂肪組織だけに存在して核内受容体ＰＰＡＲ−γおよび補助活性化因子ＰＧＣ−１を必要とする脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ１）の転写の例である。（非特許文献２３）。
【０１２０】
しかし、褐色脂肪組織内でＰＰＡＲ−γによって活性化されたすべての遺伝子がＰＧＣ−１によって媒介されるとは限らない（非特許文献２４〜２６）。１組の遺伝子を部分的に活性化するか抑制する１組の核内受容体リガンドが存在し、これらは、ペルオキシソーム、増殖因子活性化核内受容体ファミリー（ＰＰＡＲ）のメンバーを活性化するリガンドのような部分アゴニストと称される。（非特許文献８）。
【０１２１】
部分アゴニズムの分子基礎は明確に理解されていないが、３つの機構の１つで解釈することができる。ｉ）リガンドは補助活性化因子に対する親和性の減少を伴う受容体の配座変化を誘発する、ｉｉ）与えられた組織における特異的補助活性化因子の欠如は生物学的反応を低下させる、またはｉｉｉ）補助活性化因子およびコリプレッサーの相対的発現レベルはリガンドに占められたかまたはリガンドを有しない核内受容体と競合する。したがって核内受容体の上でリガンドによって誘発された生物学的反応は、与えられた補助調節因子に対する組織特異性という点に関して、および、与えられた組織に存在する与えられた補助活性化因子およびコリプレッサータンパク質の相対レベルに関して制御することができる。
【０１２２】
発明のさらなる実施形態
受容体、例えば核内受容体は、リガンドがない場合でも生物学的な機能を発揮することができる。この機能は補助調節因子と相互作用するその能力に依存して、ある機能の抑制または活性化かもしれない。
【０１２３】
リガンドがない場合に遺伝子発現を活性化する受容体は、適切な親和性で補助活性化因子タンパク質と相互に作用する。そのような受容体は本質的に活性であると言えるかもしれない。対照的に、リガンドがない場合に遺伝子発現を抑制する受容体は、適切な親和性でコリプレッサータンパク質と相互に作用する。そのような受容体はリプレッサーと称される。
【０１２４】
本発明の方法の使用により、リガンドの非存在下で一群の補助調節因子に対して受容体をスクリーニングして受容体の天然の状態を組織特異的に決定することができる。
【０１２５】
例えば、本発明の方法を用い、上述の方法により、リガンドの非存在下で受容体の安定性を変更しおよび／またはその熱アンフォールディング曲線をシフトさせる能力に関して、一群の補助活性化因子および／またはコリプレッサーをスクリーニングすることができる。補助活性化因子の存在下で受容体の安定性が変更されるかまたは受容体の熱アンフォールディング曲線がシフトされたならば、この受容体は前記補助活性化因子の存在下で本質的に活性であると結論することができる。コリプレッサーの存在下で受容体の安定性が変更されるかまたは受容体の熱アンフォールディング曲線がシフトされたならば、この受容体は前記コリプレッサーの存在下でリガンドのないその状態においてリプレッサーであると結論することができる。
【０１２６】
本発明を利用して受容体の天然の状態を組織選択的に決定する能力は、組織選択性補助調節因子の存在下で受容体の安定性かまたは熱アンフォールディング曲線が影響されるかを同定する本発明の能力に基づく。
【０１２７】
実例として、１つの特定の組織、例えば組織１は特定の補助調節因子、例えば補助調節因子１を発現することができる。第２の特定の組織、例えば組織２は補助調節因子１を発現しないか、またはそれを異なるレベル、すなわち低いレベルで発現する。補助調節因子１の存在下である受容体の安定性が変更されるかまたはこの受容体の熱アンフォールディング曲線がシフトされたならば、その受容体は組織１では本質的に活性であるが組織２ではそうではないことが予想されるが、それは補助調節因子１は組織１では活性であるが組織２では実質的に不活性であるからである。
【０１２８】
以上本発明を一般的に説明したが、本発明は、以下の具体的な実施例を参照してよりよいに理解されるであろうが、この実施例は、例示の目的でのみ本明細書に含まれており、特記しない限り、限定することを意図するものでない。
【実施例】
【０１２９】
核内受容体の実験結果
上で示したように、核内受容体の生物学的反応は、ＤＮＡ結合および補助調節因子のような適当な補助的転写因子の補充によって媒介される。例えば、非特許文献２７〜２９参照。補助調節因子は、遺伝子発現を活性化（補助活性化因子）するか抑制（コリプレッサー）する。リガンドは、核内受容体に結合すると補助調節因子タンパク質の優先的補充をもたらす配座変化を誘発する。アゴニストリガンドの場合、補助活性化因子が補充されて遺伝子活性化をもたらす。アンタゴニストリガンドの場合、コリプレッサーが補充されて遺伝子抑制をもたらす。
【０１３０】
補助活性化因子の存在下で予想されるアゴニスト反応対アンタゴニスト反応の実験結果を図１および２に示す。アゴニストリガンドの場合、補助活性化因子タンパク質／ペプチドの存在下で予測されるのは受容体の安定性の増加（図１）であり、アンタゴニストではさらなる安定化は観察されない（図２）。
【０１３１】
（実施例１）
下に示す表１は、４つの公知のアゴニストおよび３つの公知のアンタゴニスト集団の研究のために、補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−３の存在下、補助活性化因子ＳＲＣ−１およびＳＲＣ−３の配列に由来する２つの補助活性化因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２およびＳＲＣ３−ＮＲ２存在下、およびコリプレッサーＮＣｏＲ−１に由来するコリプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１の存在下で得られたＥＲ−αおよびＥＲ−βのデータをまとめたものである。
【０１３２】
すべての実験におけるＥＲ−αおよびＥＲ−βの濃度は８μＭであり、リガンド濃度は２０μＭであり、ＳＲＣ−３は１１μＭ、補助調節因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２、ＳＲＣ３−ＮＲ２およびＮＣｏＲ−１は１００μＭの濃度であった。実験は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝ｐＨ７．９、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ中、および２５μＭダポキシルスルホンアミドまたはＡＮＳ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）の存在下で行った。
【０１３３】
最終濃度の２倍の２μＬのリガンド溶液をマイクロピペットで３８４穴ブラックウォールグライナープレートに分注した。その後、タンパク質色素溶液の２μＬを３８４穴プレートのリガンド溶液の上に分注した。タンパク質−色素およびリガンド溶液の混合を確実にするためにプレートをスピンし、次に１μＬのシリコンオイルを重層して試料を加熱する間の蒸発を予防した。データはＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ機器で収集し（例えば、特許文献４〜１２参照）、非線形の最小二乗適合ソフトウェアを使って分析した。下にリストした結果は、４つの実験の平均である。補助調節因子の値は、受容体−リガンドΔＴｍ値からのＴｍ安定化の変化を表す。
【０１３４】
【表１】
2006504079.tif 000002
【０１３５】
上記の結果から、補助活性化因子タンパク質／ペプチド存在下、およびエストロゲン様化合物の存在下でのカウンタースクリーニングから、さらなる安定化が両方の受容体で観察された。このように、文献と同様にこれらの化合物はアゴニストのような行動をとる。タモキシフェンおよびＩＣＩ化合物は公知のアンタゴニストであり、それらは補助活性化因子をとり入れる能力を有しない。このことも文献と一致している。
【０１３６】
また、補助活性化因子ＳＲＣ−３はＥＲ−βよりもＥＲ−αによって優先的に補充される。したがって、これらのエストロゲン様化合物は、ＳＲＣ−３存在下ではＥＲ−βよりもＥＲ−αを含む細胞系でより高い生物学的反応を有することが予測される。
【０１３７】
さらに、エストロゲン受容体はコリプレッサーペプチドをとり入れる能力を有しないので、生物学的な視点からは遺伝子抑制はリガンド依存的に起こることが予測される。
【０１３８】
（実施例２）
ＥＲ−αを一群のステロイド様リガンドに対してスクリーニングして、リガンドおよびこの受容体がオーファン受容体として分類された場合のＥＲ−αの機能（例えば、特許文献３参照）を決定する本発明の方法の能力を検証した。ＥＲ−αと相互作用することが公知のリガンドは、受容体の安定性の増加をもたらすものと決定される（下線を引いた化合物対下線を引いていない化合物）。
【０１３９】
すべての実験におけるＥＲ−αの濃度は８μＭであり、リガンド濃度は２０μＭであった。実験は、２５ｍＭリン酸ｐＨ８．０、２００ｎＭのＮａＣｌ、１０％グリセリン中、および２５μＭダポキシルスルホンアミド色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）の存在下で行った。
【０１４０】
最終濃度の２倍の２μＬのリガンド溶液をマイクロピペットで３８４穴ブラックウォールグライナープレートに分注した。その後、タンパク質色素溶液の２μＬを３８４穴プレートのリガンド溶液の上に分注した。タンパク質−色素およびリガンド溶液の混合を確実にするためにプレートをスピンし、次に１μＬのシリコンオイルを重層して試料を加熱する間の蒸発を予防した。データはＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ機器で収集し（例えば、特許文献４〜１２参照）、非線形の最小二乗適合ソフトウェアを使って分析した。下記表２にリストした結果は、４つの実験の平均である。
【０１４１】
【表２】
2006504079.tif 000003
【０１４２】
ＥＲ−αがオーファン受容体であったならば、データはこの受容体がエストロゲン受容体ファミリーのメンバーであると解釈されたであろう。実施例１の場合のように受容体と結合する同定されたリガンドが一群の補助調節因子に対してスクリーニングされていたならば、β−エストラジオール、エストロン、１７−α−エチレンエストラジオールおよび２−メトキシエストラジオールはこの受容体のアゴニストであるが４−ヒドロキシタモキシフェンはアンタゴニストである。このデータセットは、オーファン受容体のリガンドの同定のためのマイクロプレート熱シフト検定の有用性を示す。
【０１４３】
（実施例３）
本発明を使って分析できる他のタンパク質−タンパク質相互作用の例を下記表３に例示する。
【０１４４】
【表３】
2006504079.tif 000004
【０１４５】
本発明の様々な実施形態には、それには限定されないが上の実施例が含まれる。実施例の一般的性質は、関心のタンパク質、相互作用するタンパク質またはペプチドパートナー（補助調節因子、例えば補助活性化因子もしくはコリプレッサー）、および組織選択的な形式で相互作用を強化することができる（アゴニスト）か、または抑制することができる（アンタゴニスト）リガンドを含む。
【０１４６】
（実施例４）
ステロイド受容体補助活性化因子ファミリー（ＳＲＣ）は、ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３と命名された３つのメンバーから成る。ＳＲＣ−３は、組織特異的に発現され、主に乳腺、卵母細胞、平滑筋、肝細胞および膣上皮に存在する（非特許文献３０）。他方、ＳＲＣ−１は心筋および新皮質で高度に発現されるが、ＳＲＣ−３はそれらの組織では見られない（非特許文献３１）。ＳＲＣ−３は乳腺細胞で発現されるがＳＲＣ−１はそうではない（非特許文献１）。ステロイド応答性の４つの組織における器官成長の減少がＳＲＣ１またはＳＲＣ２欠損マウスで観察されたが、ＳＲＣ３ノックアウトマウスはホルモンのシグナリング経路に欠陥があった。これらのデータは、これらの補助活性化因子が機能上の特異性を有することを示す。
【０１４７】
下記表４は、補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３の存在下、ならびに７つのリガンドの存在下で、ＥＲ−αおよびＥＲ−βに対して得られたデータの概要である。すべての実験におけるＥＲ−αの濃度は８μＭ、リガンド濃度は４０μＭであり、ＳＲＣ−１およびＳＲＣ−３は２０μＭの濃度であった。実験は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ中、および２５μＭダポキシルスルホンアミドまたはＡＮＳ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲから入手可能）の存在下で行った。
【０１４８】
最終濃度の２倍の２μＬのリガンド溶液をマイクロピペットで３８４穴ブラックウォールグライナープレートに分注した。その後、タンパク質色素溶液の２μＬを３８４穴プレートのリガンド溶液の上に分注した。タンパク質−色素およびリガンド溶液の混合を確実にするためにプレートをスピンし、次に１μＬのシリコンオイルを重層して試料を加熱する間の蒸発を予防した。データはＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ機器上で収集し、集められたデータは非線形のマルカルトアルゴリズムを使用するソフトウェアを用いて解析した。報告されている結果は、４つの実験の平均である。補助調節因子の値は、受容体−リガンドΔＴｍ値からのＴｍ安定化の変化を表す。
【０１４９】
【表４】
2006504079.tif 000005
【０１５０】
図３はＥＲ−αリガンドの存在下における補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３の結合定数Ｋａを例示する。図４はＥＲ−βリガンドの存在下における補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３の結合定数Ｋａを例示する。結合定数は、観測された核内受容体の誘導されたリガンドおよび補助調節因子安定化から計算された。アゴニスト存在下でのＳＲＣ−３の結合定数は、平均して５倍から２０倍ＳＲＣ−１より高い。アゴニスト存在下で観察されたＳＲＣ−１の結合定数は、アンタゴニストの存在下における補助活性化因子のそれと同等かまたは２倍高い。
【０１５１】
表４および図３と４から、以下の結論を導くことができる。
【０１５２】
ａ）補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３の存在下、ならびにエストロゲン様化合物の存在下でカウンタースクリーニングすると、両受容体でさらなる安定化が観察される。実験結果に基づく結論は、これらの化合物は、ＥＲ−βとＳＲＣ−１の相互作用を除いてＥＲ−αおよびＥＲ−βのアゴニストのような作用をするということである。
【０１５３】
ｂ）タモキシフェン、４−ＯＨ−タモキシフェンおよびＩＣＩ−１８２，７８０は公知のアンタゴニストであり、それらは補助活性化因子を補充する能力をほとんど有しない（このことは文献と一致する）。
【０１５４】
ｃ）ＥＲ−αのための補助活性化因子の優先的補充の順序は、ＳＲＣ−３＞ＳＲＣ−２＞ＳＲＣ−１であるが、エストラジオールリガンドは例外でＳＲＣ−３およびＳＲＣ−２の相互作用が同等の強さである。
【０１５５】
ｄ）ＥＲ−βのための補助活性化因子の優先的補充の順序は、ＳＲＣ−３＝ＳＲＣ−２＞ＳＲＣ−１である。
【０１５６】
ｅ）ＥＲ−αおよびＥＲ−βの両方に関して、ＳＲＣ−１およびＳＲＣ−３に対するアンタゴニストと同様に、アゴニストはＳＲＣ−１を等しく補充する。
【０１５７】
ｆ）エストラジオールリガンドは、三重複合体の以下の関係において、ＳＲＣ−１存在下よりもＳＲＣ−３およびＳＲＣ−２の存在下でアゴニストとして強力である、ＥＲ−α：アゴニスト：ＳＲＣ−３対ＥＲ−α：アンタゴニスト：ＳＲＣ−１、ＥＲ−β：アゴニスト：ＳＲＣ−３対ＥＲ−β：アンタゴニスト：ＳＲＣ−１、ＥＲ−α：アゴニスト：ＳＲＣ−２対ＥＲ−α：アンタゴニスト：ＳＲＣ−１、ＥＲ−β：アゴニスト：ＳＲＣ−２対ＥＲ−β：アンタゴニスト：ＳＲＣ−１。
【０１５８】
ｇ）ＳＲＣ−３およびＳＲＣ−２はＥＲ−βアゴニスト複合体よりもＥＲ−αアゴニスト複合体によって優先して補充される。
【０１５９】
ｈ）平均すると、ＥＲ−αアゴニストは、アンタゴニストリガンドの有無に関係なく受容体よりも２０〜１００倍高くＳＲＣファミリーの補助活性化因子を補充するが、ＥＲ−βに関しては親和性の強化は５倍に過ぎない。
【０１６０】
ＥＲ−αアゴニストリガンドはＳＲＣ−１よりもＳＲＣ−３の補充を好む。この観察から予測されることは、これらのアゴニストはＳＲＣ−３が存在する組織でより効率的に遺伝子を活性化することである。タモキシフェンおよび４−ＯＨ−タモキシフェンはＥＲ−αの公知のアンタゴニストでありＳＲＣ−１に対するアゴニストのように効率的にＳＲＣ−３およびＳＲＣ−１を補充するので、これらのアゴニストリガンドはＳＲＣ−１を発現するがＳＲＣ−３を発現しない組織では生物学的応答を有しないことが予測される。
【０１６１】
アゴニストエストロン存在下のＥＲ−αは、他のアゴニストリガンドよりも弱くＳＲＣ−３と結合する。このリガンドは、他のアゴニストリガンドと比較して、ＳＲＣ−３が存在する組織ではＥＲ−αの部分アゴニストであるかもしれないことが予測される。アゴニストで占有された受容体およびリガンドを含まない受容体の補助活性化因子に対する親和性の相違は、ＥＲ−βがほとんど影響を受けないのに対してＥＲ−αの生物学的活性はリガンドの内因性濃度によってより強く調節されることを意味する。したがって、アゴニストリガンドの差別的生物学的反応は、適当な三重複合体の形成、リガンドで占有された受容体の補助調節因子に対する親和性、およびタンパク質および内在性リガンドの関連した濃度に高度に依存するようになる。
【０１６２】
（実施例５）
部分アゴニストは、受容体が完全に占有された状態でも最大下応答を生じるリガンドである。また、部分アゴニストは完全なアゴニストに拮抗して、それ自身の刺激された生物学的応答のレベルまで下げる。これに関する分子基礎は分かっていないが、補助活性化因子およびコリプレッサーの相対的な発現量およびそれらの補助調節因子に対する相対的親和性に依存するとも考えられている。
【０１６３】
図５で例示したスキームの実験的な仮説に基づくと、部分アゴニストは核内受容体に配座変化を誘導して異なる親和性を有する補助活性化因子またはコリプレッサーを補充することができる。これらの親和性の比率は生物学的応答が観察されるかどうかに従う。
【０１６４】
例えば、あるリガンドが補助活性化因子の相互作用を強化してコリプレッサーの相互作用を弱めるならば、それは部分アゴニストの生物学的応答を有する。あるリガンドが補助活性化因子の相互作用を強化してコリプレッサーの結合を排除するならば、それはアゴニストとなる。あるリガンドが補助活性化因子とコリプレッサーの結合に等しく影響するならば、生物学的応答は起こらない。
【０１６５】
下記表５は、補助活性化因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２およびコリプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１の存在下、ならびにリガンドの存在下で得られたＰＰＡＲ−γのデータの概要である。
【０１６６】
すべての実験でＰＰＡＲ−γの濃度は８μＭ、リガンド濃度は４０μＭ、ＳＲＣ−２−ＮＲ２およびＮｃｏＲ−１ペプチドは２００μＭの濃度であった。補助活性化因子ペプチドＳＲＣ−２−ＮＲ２は補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−２の配列に由来し、コリプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１はコリプレッサータンパク質ＮＣｏＲ−１に由来した。
【０１６７】
実験は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ中、および５０μＭダポキシル−２−アミノ−エチルスルホンアミドの存在下で行った。最終濃度の２倍の２μＬのリガンド溶液をマイクロピペットで３８４穴ブラックウォールグライナープレートに分注した。その後、タンパク質色素溶液の２μＬを３８４穴プレートのリガンド溶液の上に分注した。タンパク質−色素およびリガンド溶液の混合を確実にするためにプレートをスピンし、次に１μＬのシリコンオイルを重層して試料を加熱する間の蒸発を予防した。データはＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ機器上で収集し、集められたデータは非線形のマルカルトアルゴリズムを使用するソフトウェアで解析した。報告されている結果は、４つの実験の平均である。
【０１６８】
【表５】
2006504079.tif 000006
【０１６９】
図６Ａは、ＰＰＡＲ−γリガンドの非存在下および存在下における補助活性化因子ペプチドＳＲＣ−１−ＮＲ２の結合定数の計算結果を例示する。図６Ｂは、ＰＰＡＲ−γリガンドの非存在下および存在下におけるコリプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１の結合定数の計算結果を例示する。図６Ｃは、受容体が活性化された配座をとる統計的確率の計算結果を例示する。
【０１７０】
表５および図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃから、以下の結論を導くことができる。
【０１７１】
ａ）すべてのリガンドは、補助活性化因子およびコリプレッサーペプチドの補充に差別的に影響を及ぼす。
【０１７２】
ｂ）トログリタゾンおよびロジグリタゾンの存在下で、ＰＰＡＲ−γは遊離の受容体より効率的に、または他のリガンドの存在下よりも効率的に補助活性化因子ペプチドを補充する（図６Ａ）。
【０１７３】
ｃ）リガンドを含まない受容体よりも効率的にコリプレッサーペプチドを補充する化合物はない。
【０１７４】
ｄ）トログリタゾンは最も劇的に補助活性化因子ペプチドの補充に影響を及ぼし、ロジグリタゾンはそれに次ぐ。ロジグリタゾンはコリプレッサーペプチドの結合に関してより劇的な効果を有する。換言すると、両方のリガンドは補助活性化因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２に対する結合能を増やし、コリプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１に対する親和性を減少させる。ペプチドに対する親和性から、受容体が与えられたリガンドに対してアゴニストの状態にある統計的確率を計算することができる（アゴニスト状態の確率＝（ＳＲＣ１−ＮＲ２のＫａ）／（ＳＲＣ１−ＮＲ２のＫａ＋ＮｃｏＲ１−ＮＲ１のＫａ）。ＰＰＡＲ−γ：ロジグリタゾン複合体のアゴニスト状態の相対的統計的確率は７０％であるが、ＰＰＡＲ−γ：トログリタゾン複合体に対しては２５％である。この実施例における他のすべてのＰＰＡＲ−γ：リガンド複合体は１０％未満である。
【０１７５】
（実施例６）
図６Ｃおよび表６から、受容体がアゴニスト状態である統計的確率は、リガンドの効力の強力な予測因子となることが分かる。ロジグリタゾンはＰＰＡＲ−γの完全アゴニストであることが公知であり、他方トログリタゾンはＰＰＡＲ−γの公知の部分アゴニストである。他のすべてのリガンドはアンタゴニストであると予測されている。
【０１７６】
本明細書で述べたすべての出版物および特許は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０１７７】
前述の発明は明瞭さおよび理解の目的のために若干詳細に述べたが、本発明の真の範囲および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変更を加えることができることを、当業者はこの開示の解釈から認めるであろう。
【０１７８】
【表６】
2006504079.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】補助活性化因子の存在下でのアゴニストリガンドの同定について予想される実験結果を示す図である。
【図２】補助活性化因子の存在下でのアンタゴニストリガンドの同定について予想される実験結果を示す図である。
【図３】ＥＲ−αリガンドの存在下における補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３の結合定数Ｋａを示す図である。
【図４】ＥＲ−βリガンドの存在下における補助活性化因子タンパク質ＳＲＣ−１、ＳＲＣ−２およびＳＲＣ−３の結合定数Ｋａを示す図である。
【図５】部分アゴニストの同定について予想される実験結果を示す図である。
【図６Ａ】ＰＰＡＲ−γリガンドの非存在下および存在下における補助活性化因子ペプチドＳＲＣ−２−ＮＲ２に対して計算された結合定数を示す図である。
【図６Ｂ】ＰＰＡＲ−γリガンドの非存在下および存在下におけるコリプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１に対して計算された結合定数を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ａおよび６Ｂからの補助活性化因子およびコリプレッサーペプチドに対する計算された親和性の比を示す図である。
【図１】
2006504079.tif 000008
【図２】
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【図３】
2006504079.tif 000010
【図４】
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【図５】
2006504079.tif 000012
【図６Ａ】
2006504079.tif 000013
【図６Ｂ】
2006504079.tif 000014
【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
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