(57)【要約】本発明は、微生物内で産生されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
豊富な培地内で微生物を成長させることを含む、微生物中で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法。
【請求項２】
前記微生物が最小培地内で成長させられた場合には有意な６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示さない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記大腸菌がＢ菌株である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記豊富な培地が複合窒素供給源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記豊富な培地が、細胞密度に対する複合窒素供給源の濃度について１：１という比率に細胞成長を維持する能力を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複合窒素供給源がトリプトンである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記複合窒素供給源がペプトンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記複合窒素供給源が酵母エキスである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地がスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記スーパーブロス培地が２倍に濃縮されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、異種ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を形質移入する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドの発現のため大腸菌のＫ菌株変種を発酵することを含む、大腸菌内で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法。
【請求項１４】
前記Ｋ菌株が、同じ条件下で成長させられたＢ菌株と比較した場合に１００倍高いホスホグルコノラクトナーゼ活性を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｋ菌株がＫ−１２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
微生物中にＤＮＡを導入することを含む、微生物内で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法であって、該ＤＮＡが、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すポリペプチドをコードする方法。
【請求項１７】
前記微生物が大腸菌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記シュードモナスが緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡが配列番号７に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡが配列番号７に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素が、配列番号８に対し少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素が、配列番号８に対し少なくとも９５％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡが、配列番号７に記載の配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡが組換えＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡが前記微生物のゲノムＤＮＡに形質転換される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドのグルコノイル化を防止する能力を有する微生物。
【請求項２９】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３０】
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３１】
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡがシュードモナス由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡと少なくとも９０％の配列同一性を有し、シュードモナスではない、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３２】
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡがシュードモナス由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡと少なくとも９５％の配列同一性を有し、シュードモナスではない、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３３】
６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡが、緑膿菌に由来する、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３４】
大腸菌の一菌株である、請求項２８に記載の微生物。
【請求項３５】
大腸菌の一菌株であり、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡが微生物のゲノム内に取込まれている、請求項３１に記載の微生物。
【請求項３６】
配列番号７に記載のポリペプチドに対し少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３７】
配列番号８に対し少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ＤＮＡが６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードする、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ配列が配列番号７に記載されている、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ配列が、緑膿菌由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡに対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項３６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４１】
ヒト−インターロイキン−１８をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号７に記載されているポリヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法による前記ポリペプチドを発現することを含む、ポリペプチド結晶形成を改善する方法。
【請求項４４】
請求項１６に記載の方法による前記ポリペプチドを発現することを含むポリペプチド結晶形成を改善する方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドがグルコノイル化されたポリペプチドと比べて発酵段階で増大した力価収量を示す、成長効率を改善することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドがグルコノイル化されたポリペプチドと比べて発酵段階で増大した力価収量を示す、成長効率を改善することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項４７】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ（「ｐｇｌ」）活性をもつ酵素と共に微生物内のヒトインターロイキンを同時発現させることを含む、ヒトインターロイキンを産生する方法。
【請求項４８】
前記ヒトインターロイキンがＩＬ−１８である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記微生物が大腸菌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｐｇｌが、前記大腸菌のゲノムへと形質転換されるポリヌクレオチドによりコードされている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
豊富な培地の中で成長させられる微生物内でヒトインターロイキンを発現することを含むヒトインターロイキン産生方法。
【請求項５２】
前記ヒトインターロイキンがＩＬ−１８である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物が大腸菌である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記豊富な培地がフィトンペプトンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記豊富な培地がバクト酵母エキスを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
感染性ラムダファージ発現を全く含まない微生物。
【請求項５７】
ラムダファージカプシド構造タンパク質ｇｐＥが欠失又は分断されている、請求項５６に記載の微生物。
【請求項５８】
前記微生物が大腸菌である、請求項５６に記載の微生物。
【請求項５９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む、請求項５６に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学工学の分野に関する。より特定的に言うと、本発明は、ポリペプチドを産生するための発酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）」）は、研究、診断、治療及び工業目的でのタンパク質の発現用として一般的に使用される宿主である。近代の発現系は、高水準の多様なタンパク質を達成する能力を有する（非特許文献１）。
【０００３】
しかしながら、発現されたタンパク質の品質は往々にして、数量と同じ位又はそれ以上に重要である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたタンパク質は、不溶性凝集体として形成されてもよいし、又は、誤って取込まれたアミノ酸を有する（非特許文献２）か又はＮ末端メチオニンを保持していてもよい（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。さらに、例えば酸化（非特許文献６、非特許文献７）又はα−Ｎ−６−ホスホグルコノイル化（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０「ヤン（Ｙａｎ）ら、Ｉ」、非特許文献１１「Ｙａｎ  ら、ＩＩ」）といったような望ましくない翻訳後修飾も発生し得る。
【０００４】
これらの修飾は、発現されたタンパク質の活性、安定性、構造又は免疫原性に不利な影響を与え、ポリペプチド発現用の宿主としての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の有用性を大幅に低減する可能性がある。
【０００５】
ヘキサヒスチジン親和性タグ（「ｈｅｘａ  Ｈｉｓ−ｔａｇ」に融合された複数の組換え型タンパク質のアルファ（α）−Ｎ−６−ホスホグルコノイル化が記述されてきている（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。これらの研究においては、グルコン酸誘導体は、組換え型タンパク質の末端部に付着することが発見された。これらのタンパク質は全て、ｐＥＴベースのベクター（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ））を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢ菌株の中で発現された。報告されている場合には、ＬＢ培地が使用された。付加体は、６−ホスホグルコノラクトン（６−ＰＧＬ）の付加を表わす２５８ダルトン（「Ｄａ」）の、又はリン酸塩の無いグルコノラクトンの存在を表わす１７８Ｄａのポリペプチドと会合させられた追加質量として検出された。ホスホグルコノイル化は、ペントースリン酸シャントの中間体である内因性６−ＰＧＬとの反応を通してＮ末端α−アミノ基において発生すると推測された。＋１７８Ｄａの付加体は、リン酸塩を除去するべく＋２５８Ｄａの付加体に酵素活性が作用した結果となるよう提案された。付加体の形成はＨｉｓタグに隣接するＮ末端におけるアミノ酸配列に特異的であることが示された。
【０００６】
ＸＸがＳＳ、ＳＡ、ＡＳ又はＡＡであるＧＸＸＨＨＨＨのポリペプチド配列は、最もα−Ｎ−６−ホスホグルコノイル化を受けやすく、一方ＳＨＨＨＨＨＨはさほど受けやすくなく、ＰＨＨＨＨＨＨ及びＰＦＨＨＨＨＨＨは、全く修飾されなかった（非特許文献８）。タンパク質上のその他の場所のその他のアミノ酸における修飾は、高レベルの付加されたグルコノラクトンを使用したインビボ又はインビトロ実験では検出されなかった（非特許文献８）。
【０００７】
Ｎ末端ホスホグルコノイル化は、タンパク質の結晶化を阻害することが示された（非特許文献９）が、タンパク質機能、安定性又は免疫原性に対するその効果については、他に比較的わずかしかわかっていない。６−ＰＧＬは、強力な求電子物質であることから、インビボでの糖化反応に関与しうると予想されている（非特許文献１２）。タンパク質の糖化は広く研究されてきており、糖尿病合併症に関連する疾病状態及び加齢において重要な役割を果たすことがわかっている（非特許文献１３）。外因的に添加されたデルタ−グルコノラクトンが、糖尿病の血管合併症における１つの因子でありうる、へモグロビンの糖化をひき起こすことが示されてきた（非特許文献１４）。さらに、Ｌｙｓ３１３のイプシロン−アミノ基におけるアラニンアミノトランスフェラーゼの糖化が、その触媒活性を著しく低下させる（非特許文献１５）。
【０００８】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ（「ｐｇｌ」）は、特に６−ＰＧＬの６−ホスホグルコン酸への加水分解において、ペントース−リン酸経路の必須酵素であることが示されてきた（非特許文献１６）。この酵素をコードする遺伝子は、ヒト（非特許文献１７）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（非特許文献１８）及びトリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）及び熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｓ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）（非特許文献１６）の中で同定されてきた。ｐｇｌ活性は長い間大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で観察されてきた（非特許文献１９「クポール（Ｋｕｐｏｒ）Ｉ」及び非特許文献２０「クポール（Ｋｕｐｏｒ）ＩＩ」）が、この活性をもつ酵素をコードすることを担当する遺伝子配列は全く同定されていない（非特許文献２１）。ペントースリン酸シャントを通した代謝流束を可能にすることに加えて、細胞内部のｐｇｌ活性は、６−ＰＧＬの蓄積及びその結果としての細胞内求核試薬との損傷性反応を防止することが示唆されてきた（非特許文献１６）。Ｎ末端でのタンパク質のホスホグルコノイル化の報告された観察は、経路内で産生された６−ＰＧＬがタンパク質を修飾できるという仮説を裏づけしているが、ｐｇｌ活性の変調が修飾済みタンパク質のレベルに影響を及ぼしうることの報告済みの証拠は全く存在しない。
【０００９】
さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、研究、診断、治療及び工業目的でのタンパク質の発現のために一般的に使用される宿主である（非特許文献２２）。この菌株は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの染色体コピーの発現と問題の組換え型タンパク質上のプラスミドベースのＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモータの使用を組合わせることにより組換え型タンパク質の非常に高い発現レベルを達成することから、商業的に魅力あるものである。従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼはきわめて選択的でかつ活性なＲＮＡポリメラーゼであることから、組換え型タンパク質の転写は非常に高いレベルまで、往々にして宿主細胞の写しが減少するほどにまで蓄積する。
【００１０】
残念なことに、菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）は、検出可能ではあるが、それでも約１０〜２０プラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ）と非常に低い感染性ラムダファージ粒子を放出する（非特許文献２３）。おそらく、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、ラムダｉｎｔ遺伝子内に挿入されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持する欠損ラムダファージＤＥ３での形質導入によりＢＬ２１宿主細胞染色体の中に導入されている（非特許文献２２）。結果としての欠損プロファージは、ｉｎｔ遺伝子の中断に起因して正常に複製できない。ＤＥ３プロファージの染色体切除は、感染性のファージ粒子のパッケージング及び放出に先立つプロファージの複製のための１つの必要条件であり、ｉｎｔ遺伝子の産物により指示される相同的切除組換えによって左右される。本書に記述されている通り、放出された非常に低レベルのファージ粒子は、異常なｉｎｔ独立型ランダムプロファージ切除事象に起因している。低レベルの感染性ファージ粒子の放出は、一部の研究所では受容可能であり得るが、感染性ファージの放出は全て、患者の安全性に対する考慮のためと同時に感染性因子の放出がその他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベースの製造プロセスを危険にさらし得ることから、生物医薬品製造工場では全く受容できない。
【００１１】
【非特許文献１】バネックス（Ｂａｎｅｙｘ）、生物工学の最新情報（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１０：４１１−４２１（１９９９）
【非特許文献２】ボゴシアン（Ｂｏｇｏｓｉａｎ）ら、生物化学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２６４；５３１−５３９（１９８９）
【非特許文献３】シャウドユリ（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ）ら、生物工学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）２８５；１１７９−１１９４（１９９９）
【非特許文献４】バッシレヴァ−アタナッソヴァ（Ｖａｓｓｉｌｅｖａ−Ａｔａｎａｓｓｏｖａ）ら、生物工学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）６９；６３−６７（１９９９）
【非特許文献５】ヤマシタら、タンパク質の発現及び精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１６；４７−５２（１９９９）
【非特許文献６】バーティ（Ｂｅｒｔｉ）ら、タンパク質の発現及び精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＆  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）１１；１１１−１１８（１９９７）
【非特許文献７】コンツ（Ｋｏｎｚ）ら、生物工学の進歩（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ）１４：３９３−４０９（１９９８）
【非特許文献８】ジェオゲーガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：１６９−１８４（１９９９）
【非特許文献９】キム（Ｋｉｍ）ら、アクタ・クリスタログラフィカ、第Ｄ部、生物学的結晶学（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）５７：７５９−７６２（２００１）
【非特許文献１０】ヤン（Ｙａｎ）ら、生物化学・生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）２６２：７９３−８００（１９９９）
【非特許文献１１】ヤン（Ｙａｎ）ら、生物化学・生物物理学研究通信（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）２５９：２７１−２８２（１９９９）
【非特許文献１２】ラキツィス（Ｒａｋｉｔｚｉｓ）及びパパンドレウ（Ｐａｐａｎｄｒｅｏｕ）、化学・生物学的相互作用（Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）１１３：２０５−２１６（１９９８）
【非特許文献１３】ベイン（Ｂａｙｎｅｓ）及びモニア（Ｍｏｎｎｉｅｒ）、加齢、糖尿病及び栄養におけるメイラード反応（Ｔｈｅ  Ｍａｉｌｌａｒｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｇｉｎｇ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、アラン・アール・リス（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８９）
【非特許文献１４】リンゼイ（Ｌｉｎｄｓａｙ）ら、クリニカ・ケミカ・アクタ（Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ）２６３：２３９−２４７（１９９７）
【非特許文献１５】ベラネック（Ｂｅｒａｎｅｋ）ら、分子細胞生物化学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２１８：３５−３９（２００１）
【非特許文献１６】ミクレ（Ｍｉｃｌｅｔ）ら、生物化学報（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：３４８４０−３４８４６（２００１）
【非特許文献１７】コラード（Ｃｏｌｌａｒｄ）ら、エフイービーエス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）４５９：２２３−２２６（１９９９）
【非特許文献１８】ヘイガー（Ｈａｇｅｒ）ら、細菌学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１８２：３９３４−３９４１（２０００）
【非特許文献１９】クポール（Ｋｕｐｏｒ）及びフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ）、細菌学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１００：１２９６−１３０１（１９６９）
【非特許文献２０】クポール（Ｋｕｐｏｒ）及びフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ）、生物化学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２４７：１９０４−１９１０（１９７２）
【非特許文献２１】コードウェル・エス・ジェー（Ｃｏｒｄｗｅｌｌ  Ｓ．Ｊ．）、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．１７２：２６９−２７９（１９９９）
【非特許文献２２】スタディア・エフ・ダブリュー（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．）、及びモファット・ビー・エー（Ｍｏｆｆａｔｔ、Ｂ．Ａ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８６年５月５日；１８９（１）：１１３−１３０
【非特許文献２３】スチュアート・シューマン（Ｓｔｅｗａｒｔ  Ｓｈｕｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９；８９；３４８９−３４９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発酵中のホスホグルコノイル化の発生率が低減した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）といったような微生物内でポリペプチドを発現又は過剰発現するための方法が、大いに必要とされている。さらに、ファージを全く含まないＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞の構築も、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形式での治療用組換え型タンパク質の製造のためにきわめて望ましいと思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、豊富な培地内で微生物を成長させることによって発現されるポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法を提供する。
【００１４】
本発明は同様に、ｐｇｌ活性を示すポリペプチドを微生物内にコードするＤＮＡを導入（例えば形質転換、感染又は形質移入）するステップを含む、微生物により発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法をも提供している。このポリペプチドは、ホスホグルコノラクトナーゼ酵素であり得る。本発明のもう１つの態様においては、ホスホグルコノラクトナーゼ酵素は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む（ただしこれに制限さえるわけではない）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）により産生されたホスホグルコノラクトナーゼ酵素に対し少なくとも９０％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有していてよい。
【００１５】
本発明は同様に、タンパク質のグルコノイル化を防止する能力をもつ微生物をも提供している。１つの実施形態においては、微生物は、ｐｇｌ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含み得る。
【００１６】
本発明は同様に、配列番号７に記載のポリヌクレオチドに対し少なくとも９０％の同一性をもつ単離されたポリヌクレオチドをも提供する。
【００１７】
本発明は同様に、検出可能な感染性ラムダファージ発現を含まない微生物をも提供する。
【００１８】
用語集
「宿主細胞」というのは、単離されたポリヌクレオチド配列により導入された（例えば形質転換、感染又は形質移入された）又はそれによる導入（形質転換、感染又は形質移入）能力をもつ細菌細胞又は微生物細胞を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）細胞である。
【００１９】
当該技術分野において既知の通りの「形質転換された」というのは、外部ＤＮＡ又はＲＮＡの導入を介した又は外部ＤＮＡ又はＲＮＡのその他の任意の安定した導入に対する１つの生体のゲノム又はエピゾームの特異的修飾のことである。
【００２０】
当該技術分野において既知の通りの「形質移入された」というのは、組換えＤＮＡ又はＲＮＡを含む（ただしこれらに制限されない）微生物内への外部ＤＮＡ又はＲＮＡの導入である。
【００２１】
当該技術分野において既知の通りの「同一性」というのは、配列を比較することによって決定されるような、場合に応じて２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野においては、「同一性」は又、その配列ストリング間の整合によって決定される通りの、場合によってポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の間の配列同系性の度合をも意味する。「同一性」は、コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、レスク・エー・エム（Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８８年；バイオコンピューティング：情報科学とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、スミス・ディー・ダブリュー（Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．）編、アカデミープレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９３年；配列データのコンピュータ解析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ１）、グリフィン・エー・エム（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．）及びグリフィン・エイチ・ジー（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマンプレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）１９９４年；分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、フォン・ハインジ・ジー（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．）アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）１９８７年；及び、配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、グリブスコフ・エム（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．）及びドベルー・ジェー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．）編、エム・ストックマンプレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）１９９１年；及び、カリロ・エイチＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．）及びリップマン・ディー（Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ．）、エスアイエーエム応用数学報（ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．）４８：１０７３（１９８８年）内に記述されているものを含む（ただしこれに制限されるわけではない）既知の方法によって、容易に計算可能である。同一性を決定する方法は、テスト対象の配列の間に最大の整合を与えるように設計されている。その上、同一性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラム内で体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（ドベルー・ジェー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１２（１）：３８７（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（アルトシュル・エス・エフ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．）ら、分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０（１９９０年））が含まれるが、これらに制限されるわけではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の供給���から公的に入手可能である（ブラスト・マニュアル（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ）、アルトシュル・エス（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；アルトシュル・エス（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．）ら、分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２１５：４０３−４１０（１９９０年））。周知のスミス・ウォータマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムも同一性を決定するために使用可能である。
【００２２】
ポリペプチド配列比較のためのパラメータには、以下のものが含まれる。
アルゴリズム：ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びブンシェ（Ｗｕｎｓｃｈ）、分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、４８：４４３−４５３（１９７０年）。
比較マトリクス：ヘンティコフ（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２及びヘンティコフ（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２年）。
ギャップ・ペナルティ；１２
ギャップ長ペナルティ；４
これらのパラメータで有用なプログラムはジュネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から「ギャップ」プログラムとして公的に入手可能である。上述のパラメータは、（エンドギャップについてのペナルティ無しと併せて）ペプチド比較のためのデフォルトのパラメータである。
【００２３】
ポリヌクレオチド比較用のパラメータは、以下のものを含む。
アルゴリズム：ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）及びブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、分子生物学報（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）４８：４４３−４５３（１９７０年）
比較マトリクス：整合＝＋１０、不整合＝０
ギャップ・ペナルティ；５０
ギャップ長ペナルティ；３
ジュネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのギャッププログラムとして入手可能。
これらは、核酸比較用デフォルトのパラメータである。
【００２４】
場合によって、ポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「同一性」の好ましい意味は、以下の（１）及び（２）で提供されている。
【００２５】
（１）ポリヌクレオチド実施形態はさらに、配列番号７の基準配列に対し少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含んでおり、ここで前記ポリヌクレオチド配列は配列番号７の基準配列と同一であってもよいし又は基準配列に比べて或る整数の数までのヌクレオチド改変を内含していてよく、前記改変は、少なくとも１つのヌクレオチド欠失、転位及び塩基転換を含む置換、又は挿入から成るグループの中から選択され、前記改変は基準ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位で、又はこれらの末端位置間のいずれかの場所で、基準配列内のヌクレオチドの間で個別か又は基準配列内で１つ以上の隣接基の中のいずれかで点在した形で発生していてよく、又ヌクレオチド改変の前記数は、同一性百分率を定義する整数を１００で除したもので配列番号７のヌクレオチドの合計数を乗じることそして次に配列番号７内の前記合計ヌクレオチド数からその積を減算することによって決定され、或いは又、
【数１】
2006520609.tif 000002
であり、式中、ｎｎはヌクレオチド改変数であり、ｘｎは配列番号７中の合計ヌクレオチド数であり、ｙは９５％については０．９５、９７％については０．９７、又１００％については１．００であり、・は乗算演算子の符号であり、又ここでｘｎ及びｙの非整数積は全て、それをｘｎから減算する前に、最も近い整数に端数は切捨てられる。１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、このコーディング配列内でノンセンス、ミスセンス又はフレームシフト突然変異を作り出し、かくしてかかる改変の後にポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドを改変することができる。
【００２６】
（２）ポリペプチド実施形態はさらに、ポリペプチド基準配列に対する少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９７又は１００％の同一性を有するポリペプチドを含む単離ポリペプチドを含んでおり、ここで前記ポリペプチド配列は基準配列と同一であってもよいし又は基準配列に比べて或る整数の数までのアミノ酸改変を内含していてよく、前記改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、同類置換及び非同類置換を含む置換、又は挿入から成るグループの中から選択され、前記改変は基準ポリペプチド配列のアミノ−又はカルボキシ−末端位で、又はこれらの末端位置間のいずれかの場所で、基準配列内のアミノ酸の間で個別にか又は基準配列内で１つ以上Ｎ隣接基の中のいずれかで点在した形で発生していてよく、又アミノ酸改変の前記数は、同一性百分率を定義する整数を１００で除したものでアミノ酸の合計数を乗じることそして次に前記合計アミノ酸数からその積を減算することによって決定され、或いは又、
【数２】
2006520609.tif 000003
であり、式中、ｎａはアミノ酸改変数であり、Ｘａは配列中の合計アミノ酸数であり、ｙは９５％については、０．９５、９７％については０．９７、又１００％については１．００であり、・は乗算演算子の符号であり、又ここでｘａ及びｙの非整数積は全て、それをｘａから減算する前に、最も近い整数に端数は切り捨てられる。
【００２７】
「単離された」というのは、その天然の状態から「人間の手により」改変されていることすなわち、それが自然の中で発生した場合、そのもとの環境から変更又は除去されているか又はその両方であることを意味する。例えば生体内に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離されない」が、そのポリヌクレオチド又はポリペプチドが１つの細胞内に導入し戻される場合を含めて（ただしこれに制限されるわけではない）、その天然の状態の共存する材料から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離される。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」は一般に、未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡであり得るあらゆるポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」は、制限的意味なく、１本鎖及び２本鎖ＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖領域又は１本鎖、２本鎖及び３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖及び２本鎖ＲＮＡ及び１本鎖及び２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖そしてより標準的には２本鎖又は３本鎖領域又は１本鎖及び２本鎖領域の混合物でありうるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、本書で使用されている通りの「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む３本鎖領域を意味する。かかる領域内のストランドは、同じ分子由来でも異なる分子由来でもよい。領域は、分子のうちの１つ以上のものの全てを内含し得るが、より標準的には分子の一部分の領域のみが関与する。３重らせん領域の分子の１つは、往々にしてオリゴヌクレオチドである。本書で使用されている通り、「ポリヌクレオチド」という語は、同様に１つ以上の修飾された塩基を含む上述の通りのＤＮＡ又はＲＮＡをも内含する。かくして、安定性又はその他の理由で修飾された主鎖をもつＤＮＡ又はＲＮＡは、その語が本書で意図されている通りの「ポリヌクレオチド」である。その上、単に２つの例のみ挙げるだけでもイノシンといったような普通ではない塩基又はトリチル化塩基といった修飾された塩基を含んでいるＤＮＡ又はＲＮＡは、その語が本書で使用される通りのポリヌクレオチドである。当業者にとって既知である数多くの有用な目的に役立つきわめて多様な修飾がＤＮＡ及びＲＮＡに対して行なわれてきたということがわかるだろう。本書で利用されている通りの「ポリヌクレオチド」という語は、化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形のポリヌクレオチドならびに例えば単細胞及び複合細胞といったものを含むウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は同様に、オリゴヌクレオチド」と往々にして呼ばれる短かいポリヌクレオチドをも包含している。
【００２９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合により互いに接合された２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチド又はタンパク質をも意味する。「ポリペプチド」は、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと一般に呼ばれる短鎖及びタンパク質と一般に呼ばれる長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは遺伝子コードされた２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み得る。「ポリペプチド」は、プロセシング及びその他の翻訳後修飾といったような天然のプロセスによってのみならず化学的修飾技術によって修飾されたものを内含する。かかる修飾は、基本的テキストの中及びより詳細なモノグラフ中、ならびに大量の研究文献の中で充分に記述されており、当業者にとっては周知である。同じタイプの修飾は、一定の与えられたポリペプチド内の複数の部位で同じ又は変動するレベルで存在しうるということがわかるだろう。同様に、一定の与えられたポリペプチドは、数多くのタイプの修飾を含み得る。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含めたポリペプチド内のどこにでも発生し得る。修飾には、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビン共有結合付着、ヘム部分の共有結合付着、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付着、脂質又は脂質誘導体の共有結合付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有結合架橋形成、システイン形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化反応、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、水酸化及びＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化といったようにタンパク質に対するアミノ酸のトランスファＲＮＡが媒介する付加及びユビキチン化が含まれる。例えば、タンパク質−構造と分子特性（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）、第２版、ティー・イー・クライトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、ダブリュー・エイチ・フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）及び共同研究者、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９３年）及びウォルド・エフ（Ｗｏｌｄ、Ｆ．）、翻訳後タンパク質修飾：展望と予想（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）、タンパク質の翻訳後共有修飾（ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ）中１−１２頁、ビー・シー・ジョンソン（Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８３年）；セイフター（Ｓｅｉｆｔｅｒ）ら、酵素学的方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１８２：６２６−６４６（１９９０年）及びラッテン（Ｒａｔｔａｎ）ら、タンパク質合成：翻訳後修飾と加齢（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ）、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと。ポリペプチドは、分枝であっても、又は分枝を伴う又は伴わない環状であってもよい。環状、分枝及び分枝環状円形ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果であり得、完全な合成方法によっても作製可能である。
【００３０】
「組換え型発現系」は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生のために宿主細胞又は宿主細胞溶解物へと導入又は形質転換された本発明の発現系又はその一部分又はポリヌクレオチドを意味する。
【００３１】
本書でその語が用いられている通りの「変異体」という語は、それぞれ基準ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるものの不可欠な特性は保持しているポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの標準的変異体は、ヌクレオチド配列においてもう１つの基準ポリヌクレオチドと異なっている。変異体のヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変する場合としない場合がある。ヌクレオチド変化の結果として、以下で論述するように、基準配列によってコードされたポリペプチド内のアミノ酸置換、付加、欠失、融合タンパク質及び切形がもたらされる可能性がある。ポリペプチドの標準的変異体は、アミノ酸配列においてもう一方の基準ポリペプチドと異なっている。一般に、差異は、基準ポリペプチド及び変異体の配列が全体的に密に類似し、数多くの領域で同一であるように制限されている。変異体及び基準ポリペプチドは、任意の組合せでの１つ以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なっていてよい。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによってコード化されたものであってもなくてもよい。本発明は同様に、本発明のポリペプチドの変異体、すなわち同類アミノ酸置換によって対象から変動しかくして１つの残基が同様の特性をもつもう１つの残基によって置換されているポリペプチドをも内含している。標準的なこのような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅの間；Ｓｅｒ及びＴｈｒの間；酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの間；Ａｓｎ及びＧｌｎの間；及び塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの間；又は芳香族残基Ｐｈｅ及びＴｙｒの間のものである。特に好ましいのは、複数の５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２又は１個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失又は付加される変異体である。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体といったような天然に発生するものであってもよいし、又は天然に発生するものとして知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に発生しない変異体は、突然変異誘発技術、直接的合成によって及び当業者にとって既知のその他の組換え型方法によって作ることができる。
【００３２】
「微生物」というのは、（ｉ）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノマイセート（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ストレプトマイセート（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ファンシセラ（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスチュレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトバシルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の成員を含み（ただしこれらに制限されるわけではない）、かつさらにＡ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｄ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｇ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオジーン（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・デュランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、ネイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ネイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎ��ｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コリネバクテリウム・ディプテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、マイコバクテリウム・チュベルキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、アクチノミクテス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｔｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、リステリア・モノシトジーン（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ボルデテラ・ペルチュシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルダテラ・パラペルチュシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプテイカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ヘモフィラス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・エジプティウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、ヘモフィラス・パラインフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、シトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラティア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｓｅｎｓ）、セラティア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ・ディセンテリイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フランシセラ・チュラレンシス（Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・アボルティス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボツリヌス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ���、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、リケッチャ・リケットシイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及びクラミジア・トラコミティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）といった種又は群の成員を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）原核生物、（ｉｉ）アルケバクター（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒ）を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）古細菌及び（ｉｉｉ）原生動物、真菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルベロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の成員及びサッカロマイセス・セリビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓｅａｅ）、クルベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）種の成員を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）単細胞又は糸状真核動物を意味する。
【００３３】
「細菌（の）」というのは、（ｉ）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノマイセート（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ストレプトマイセート（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ファンシセラ（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ）、パスチュレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）、アクチノバシルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトバシルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、リケッチャ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属の成員を含み（ただしこれらに制限されるわけではない）かつさらにＡ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｂ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｃ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｄ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｇ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・フェシウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトコッカス・デュランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｕｒａｎｓ）、ネイセリア・ゴノレ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ネイセリア・メニンギティデイス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇ��ｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コリネバクテリウム・ディプテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、ガルドネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、マイコバクテリウム・テュベルキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、アクチノマイセス・イスラエリイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｔｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、リステリア・モノサイトジン（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ボルデテラ・ペルチュシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルダテラ・パラペルチュシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ヘモフィラズ・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・エジプティウス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、ヘモフィラス・パラインフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィラス・デュクレイイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、シトロバクテル・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｉｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラチア・マクレセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｓｅｎｓ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、シゲラ・ディセンテリイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉｉ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フランシセラ・チュラレンシス（Ｆｒａｎｓｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・アボルティス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｉｓ）、バシルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バシルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ト���ポネーマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、リケッチャ・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及びクラミジア・トラコミティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）といった種又は群の成員を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）原核生物、及びアルケバクター（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒ）を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）古細菌を意味する。
【００３４】
本書で用いられる「異種ポリペプチド」という語は、問題の形質転換された宿主細胞又は微生物によって天然に合成されておらず組換えＤＮＡにより宿主細胞又は微生物内に導入されたポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、形質転換されていない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発生しないインターロイキンの発現のための宿主微生物として作用し得る。異種ポリペプチドは、単離を容易にするために修飾されたポリペプチドを含み得る。
【００３５】
本書で用いられる「親和性タグ」というのは、前記分子に対しもう１つの物質又は分子に対する選択的親和性を与え得る分子と会合されたあらゆる部分を意味する。例えば、カラムのパッキング材料に対する選択的親和性をもつ分子を提供することにより分子の精製を容易にするために親和性タグを使用することができる。親和性タグの制限的意味のない例がｈｉｓタグである。
【００３６】
本書で用いられる「Ｈｉｓタグ」は、ヒスチジンアミノ酸の反復を意味し、工学処理技術を通してポリペプチド内にコードされたその他のアミノ酸を含み得る。標準的にはＨｉｓタグは、少なくとも６つ（「ヘキサ」）のヒスチジン反復を含み、ポリペプチドのＮ末端近くに位置設定される。Ｈｉｓタグは、Ｎｉ−カラム全体にわたる異種ポリペプチドの精製を容易にするために使用可能である。
【００３７】
本書で用いられる「最小培地」というのは、リン酸緩衝液といった緩衝液、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム又は硫酸マンガンといった塩、鉄、亜鉛、銅、コバルト又はモリブデンといった鉱物、グルコース又はグリセロールといった炭素供給源及び硫酸又は硝酸アンモニウムといった窒素供給源を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）化学的に定義された成分を含む細胞成長培地を意味する。一例としてはＭ９培地（キム・ワイエス（Ｋｉｍ  ＹＳ）、ジェーエイチ・セオ（ＪＨ  Ｓｅｏ）及びエイチワイ・チャ（ＨＹ  Ｃｈａ）、酵素及び微生物工学（Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３３（２００３年）；４６０−４６５））がある。
【００３８】
本書で用いられる「豊富な培地」というのは、未定義の成分を含み、緩衝液（例えばリン酸緩衝液）、塩（例えば硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム又は硫酸マンガン）及び例えばグルコース又はグリセロールでありうる炭素供給源などの追加の成分を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）細胞成長培地を意味する。窒素供給源は、酵母エキスといったようなタンパク質加水分解物、食肉加水分解物又は大豆加水分解物で構成され得る。窒素供給源は、１：１以上という複合窒素供給源（１リットルあたりのグラム単位）対最大細胞密度（ＯＤ単位）の比で細胞成長を支持する能力をもつ濃度で提供され得る。豊富な培地の例としては、スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）（アトラス・アール・エム（Ａｔｌａｓ  ＲＭ）、微生物学培地便覧（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｓｄｉａ）；パークス・エル・ディー（Ｐａｒｋｓ  ＬＣ）編；シーアールシー・プレス：フロリダ州ボカラートン（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ）、２８１、５２３、５２９、８５９の各頁）、テリフィックブロス（Ｔｅｒｉｆｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）（アルファバイオサイエンシーズ、米国メリーランド州ボルチモア（Ａｌｐｈａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ  ＵＳＡ））、ターボブロス（Ｔｕｒｂｏ  Ｂｒｏｔｈ）（アテナエンザイムシステムズ、米国メリーランド州ボルチモア（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ  ＵＳＡ））又はハイパーブロス（Ｈｙｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）（アテナエンザイムシステムズ、米国メリーランド州ボルチモア（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ  ＵＳＡ））が含まれる（ただしこれらに制限されるわけではない）。
【００３９】
本書で用いられる「グルコノイル化」というのは、１つのタンパク質に対するグルコン酸誘導体の付着を意味する。グルコノイル化は、６−ホスホグルコノラクトン（６−ＰＧＬ）付加体の形成、アセチル化、ホルミル化、脱ホルミル化、グルコノラクトン化又はグルコン酸誘導体化を含みうる（ただしこれらに制限されるわけではない）。
【００４０】
本書で用いられる「力価収量」というのは、溶液（例えば培養ブロス又は細胞溶解混合物又は緩衝液）中の産物（例えば異種発現されたポリペプチド）の濃度を意味し、通常ｍｇ／Ｌ又はｇ／Ｌとして表現される。力価収量の増加は、２組の定義済みの条件の下で産生された産物の濃度の絶対的又は相対的増加を意味し得る。
【００４１】
本書で用いられる「ｐｇｌ活性」という語は、６−ホスホグルコノラクトン（「ｐｇｌ」）のあらゆる活性を意味する。かかる活性は、６−ＰＧＬから６−ホスホグルコン酸への加水分解を含み得る。有意なｐｇｌ活性は、少なくとも０．２ＩＵ／分／ｇの加水分解活性として定義することができる。
【００４２】
本書で用いられる「ストリンジェント条件」及び「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という語は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、ただし特に好ましくは少なくとも９５％の同一性が配列間に存在する場合にのみハイブリダイゼーションが発生することになることを意味する。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン及び２０マイクログラム／ｍｌの変性された剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートし、その後約６５℃で０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄するというものである。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知であり、その開示全体が参考として本書に内含されているサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（１９８９年）、特にその中の第１１章の中に例示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
なかでも最小培地上での成長、高い細胞密度及び高レベルの異種ポリペプチド発現から生じる細胞ストレスは、異種ポリペプチドのグルコノイル化に貢献するかもしれない。従ってこれらのストレッサーのうちの１つ以上のものを軽減することが、微生物内で発現されるタンパク質のグルコノイル化のレベルに影響を及ぼすかもしれず、今度はそれが所望のポリペプチドの純度及び力価収量に影響する可能性がある。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一部の菌株は、その他のものに比べてｐｇｌ活性レベルが高い可能性があるが、この活性の原因である遺伝子はコードウェル・エス・ジェー（Ｃｏｒｄｗｅｌｌ  Ｓ．Ｊ．）１９９９年、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７２；２６９−２７９の、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で同定されていなかった。その上、ポリペプチドのグルコノイル化は、これらのポリペプチドの構造的判定及び結晶化に影響を及ぼし得る。
【００４４】
本発明は、豊富な培地内で微生物を成長させるステップを含む、微生物中で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法を提供している。本発明のもう１つの態様においては、微生物は、最小培地内で成長させられた場合には有意な６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示さない。微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株であってよい。本発明のもう１つの態様においては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｂ菌株である。本発明のもう１つの態様においては、豊富な培地は、複合窒素供給源を含む。豊富な培地は、細胞密度に対する複合窒素供給源の濃度について１：１という比率に細胞成長を維持する能力を有する。複合窒素供給源は、トリプトン、ペプトン又は酵母エキスであり得る。本発明のもう１つの態様においては、培地はスーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）である。スーパーブロス（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）培地は２倍に濃縮されていてよい。本発明のもう１つの態様においては、微生物は、異種ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を形質移入する。
【００４５】
本発明のもう１つの実施形態においては、ポリペプチドの発現のため大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫ菌株変種を発酵するステップを含む、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止する方法が提供されている。本発明のもう１つの態様においては、Ｋ菌株は、実質的に同じ条件下で成長させられたＢ菌株と比較した場合に少なくとも約１００倍高いホスホグルコノラクトナーゼ活性を示す。本発明のもう１つの態様においては、Ｋ菌株はＫ−１２である。
【００４６】
本発明のもう１つの実施形態においては、微生物中にＤＮＡを導入するステップを含む、微生物内で発現されたポリペプチドのグルコノイル化を防止するための方法において、前記ＤＮＡが、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すポリペプチドをコードする、方法が提供されている。本発明のもう１つの態様においては、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。ＤＮＡは、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡを含む。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり得るシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡに対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性を有する。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡは、配列番号７に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性を有する。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素は、配列番号８に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性をもつアミノ酸配列を有する。６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡは、配列番号７に記載の配列を含む。ＤＮＡは、組換えＤＮＡであってよく、かつ／又は微生物のゲノムＤＮＡに形質転換され得る。
【００４７】
本発明のもう１つの実施形態においては、ポリペプチドのグルコノイル化を防止する能力を有する微生物が提供されている。微生物は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。微生物は、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡを含む。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼ酵素をコードするＤＮＡと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性を有しており、ここで該微生物は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ではない。本発明のもう１つの態様においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する。本発明のもう１つの態様においては、微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一菌株である。本発明のもう１つの態様においては、微生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の一菌株であり、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡは、該微生物のゲノム内に取込まれている。
【００４８】
本発明のもう１つの実施形態においては、配列番号７中に記載されているポリヌクレオチドに対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドが提供されている。本発明のもう１つの態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号８に対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性をもつアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。本発明のもう１つの態様においては、ＤＮＡは、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を示すタンパク質をコードする。本発明のもう１つの態様においては、ＤＮＡ配列は配列番号７に記載されている。本発明のもう１つの態様においては、ＤＮＡ配列は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするＤＮＡに対し相同である、本発明のもう１つの態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、ヒト−インターロイキン１８又はその変異体をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【００４９】
本発明のもう１つの実施形態においては、ポリペプチドのグルコノイル化を削減するため本発明の方法によりポリペプチドを発現するステップを含む、ポリペプチド結晶形成を改善する方法が提供されている。
【００５０】
本発明のもう１つの実施形態においては、微生物内のポリペプチドの成長効率及び発現を改善する方法が提供されている。１つの態様では、ポリペプチドは、グルコノイル化されたポリペプチドと比べて増大した発酵段での力価収量を示す。
【００５１】
本発明のもう１つの実施形態においては、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（「ｐｇｌ」）活性をもつ酵素と共に微生物内のヒトインターロイキンを同時発現させるステップを含む、ヒトインターロイキンを産生する方法が提供されている。１つの態様では、ヒトインターロイキンは、ＩＬ−１８タンパク質又はその変異体である。１つの態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。１つの態様では、ｐｇｌは、制限的な意味なく、ゲノム又はエピゾームへと形質転換することを含め大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へと形質転換又は形質移入されるポリヌクレオチドによりコードされている。
【００５２】
本発明のもう１つの実施形態においては、豊富な培地の中で成長させられる微生物内でヒトインターロイキンを発現するステップを含むヒトインターロイキン産生方法が提供されている。１つの態様では、ヒトインターロイキンはＩＬ−１８タンパク質又はその変異体である。１つの態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。１つの態様では、豊富な培地がフィトンペプトンを含む。１つの態様では、豊富な培地はバクト酵母エキスを含む。
【００５３】
本発明のもう１つの実施形態においては、検出可能な感染性ラムダファージ発現を全く含まない微生物が提供されている。１つの態様では、ラムダファージカプシド構造タンパク質ｇｐＥは微生物内で欠失又は分断されている。タンパク質の欠失又は分断は、複数の制限的ではない要領で達成可能である。タンパク質をコードする遺伝子を、微生物から部分的又は完全に除去することができる。タンパク質をコードする遺伝子を、点突然変異又はランダム突然変異といった制限的意味のない技術により遺伝子的に修飾することが可能である。その構造又は機能を分断するべくタンパク質を化学的又は酵素的に分割又は修飾することもできる。遺伝子発現を調節するプロモータを分断又は欠失させて、遺伝子発現を削除又は低減させることもできる。タンパク質の構造又は機能を達成するために、溶液の条件又は温度を調節することが可能である。１つの態様では、微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。もう１つの態様では、微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。
【００５４】
以下の例は、本発明のさまざまな態様を例示している。これらの例は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１
主要ラムダファージカプシド構造タンパク質ｇｐＥをノックアウトすることにより検出可能な感染性ラムダファージ発現を含まない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株の改良型菌株を作り出した。この菌株を、本書で提示されている実施例の中で使用した。
【００５６】
ｇｐＥコーディング領域の４１３塩基対内部フラグメントを、
5' AGCTGGCCATTGCTCAGGTCGAAG 3'    （配列番号１）
5' GTACTGTCCGGAATACACGACGATG 3'    （配列番号２）
というプライマ対及び鋳型としてのＢＬ２１（ＤＥ３）染色体ＤＮＡを用いて、ＰＣＲ増幅した。結果として得られたフラグメントは以下の通りである。
AGCTGGCCAT TGCTCAGGTC GAAGAGATGC AGGCAGTTTC TGCCGTGCTT AAGGGCAAAT  
ACACCATGAC CGGTGAAGCC TTCGATCCGG TTGAGGTGGA TATGGGCCGC AGTGAGGAGA  
ATAACATCAC GCAGTCCGGC GGCACGGAGT GGAGCAAGCG TGACAAGTCC ACGTATGACC  
CGACCGACGA TATCGAAGCC TACGCGCTGA ACGCCAGCGG TGTGGTGAAT ATCATCGTGT  
TCGATCCGAA AGGCTGGGCG CTGTTCCGTT CCTTCAAAGC CGTCAAGGAG AAGCTGGATA  
CCCGTCGTGG CTCTAATTCC GAGCTGGAGA CAGCGGTGAA AGACCTGGGC AAAGCGGTGT  
CCTATAAGGG GATGTATGGC GATGTGGCCA TCGTCGTGTA TTCCGGACAG TAC
（配列番号３）
【００５７】
ＰＣＲ増幅産物をＴＡクローニングし、配列を標準的な技術を用いて確認した。次に、クローニングされたｇｐＥ配列内に太字で示されている中央にあるＥｃｏＲＶ部位の中に、クロラムフェニコール耐性遺伝子の機能的コピーを導入した。その後、クロラムフェニコールで中断したｇｐＥフラグメント構成体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主菌株ＢＬ２１内に常駐するラムダ（ＤＥ３）ｇｐＥ遺伝子の遺伝的ノックアウトのための線状相同的組換えノックアウトベクターとして使用した。このノックアウトベクターは、本書に記述されたベクターが使用されたという点を除いて、キリル・エー・ダッセンコ（Ｋｉｒｉｌｌ  Ａ．Ｄａｔｓｅｎｋｏ）及びバリー・ワーナー（Ｂａｒｒｙ  Ｗａｎｎｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００；９７；６６４０−６６４５によって記述されている通りに宿主細胞内に導入された。推定上のｇｐＥノックアウトは、６μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下で成長する能力により予備的に同定され、その後ＰＣＲ分析により確認された。ＢＬ２１（ＤＥ３）の１つのかかるｇｐＥノックアウトは、バンクに寄託され、ＥＣＣ−０２３というＧＳＫ呼称が与えられた。
【００５８】
非常に高感度のプラーク検定において感応性ファージ粒子の存在について、ＥＣＣ−０２３をテストした。表１に示されているように、親ＢＬ２１（ＤＥ３）は、そのように誘発されていない場合、約２０ｐｆｕというかろうじて検出可能な量しかファージを発現しなかったが、遺伝子損傷（ＵＶ照射）に対するＳＯＳ応答によって誘発された場合、ほぼ３ケタ大きい量を発現した。しかしながら、ｇｐＥノックアウト誘導体ＥＣＣ−０２３は、ＳＯＳ応答を誘発するべく処理された場合でも、感染性ファージの徴候を全く生み出さなかった。データから、ＢＬ２１（ＤＥ３）誘導体ＥＣＣ−０２３が検出可能な感染性ファージ粒子を全く生み出さず、従って生物医薬品製造に適した宿主細胞菌株であることがわかる。
【００５９】
【表１】
2006520609.tif 000004
【００６０】
実施例２
この実施例は、豊富な培地中で細胞を培養することにより、最小培地と比較した場合に、Ｈｉｓタグ付けされたタンパク質の６−ＰＧＬ付加体の形成を妨げることができるということを示している。
【００６１】
Ｈｅｘａ−ｈｉｓ−ＦａｂＺのための遺伝子をコードするプラスミドｐＥＴ２８ＦａｂＺＳａで形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１．０のＯＤ６００が達成されるまで３７℃でＭＣＪＫ（最小培地）又はＭＣＪＫＬＢ（豊富な培地）内で成長させた。ＭＣＪＫ及びＭＣＪＫＪＢのための培地組成は表２に記述されている。
【００６２】
【表２】
2006520609.tif 000005
【００６３】
最終濃度１ｍＭとなるまでイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加し、収獲するまで４時間にわたり３７℃に細胞を維持した。１０分間１６，０００×ｇで遠心分離により細胞を収集し、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍＬのリゾチーム及び２５Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で穏やかに撹拌することでこれを溶解させた。１０分間１６，０００×ｇで遠心分離により細胞残屑を除去し、組換え型タンパク質を、メーカーの推奨事項（カリフォルニア州バレンシアのキアゲン社（Ｑｕｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従ってバッチモードでＮｉ−ＮＴＡ樹脂で可溶性抽出物から精製した。ＬＣ／ＭＳ分析によりグルコノラクトン修飾の存在について異種タンパク質を分析した。
【００６４】
表３に示されている通りに最小培地（ＭＣＪＫ）内で培養を実施する場合、合計組換え型タンパク質の３４％のレベルで、ＭＧＳＳＨ４Ｈｉｓタグ異種ポリペプチドをグルコノイル化する。培地を酵母エキス及びトリプトンで補完又は富化させる場合、グルコノイル化されたタンパク質は、同じく表３に示されているように、検出可能ではない。かくして、より豊富な培地を使用することで、６−ＰＧＬ付加体の形成を防止することができる。
【００６５】
【表３】
2006520609.tif 000006
【００６６】
実施例３
この実施例は、組換え型ＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔとしても知られている）の内部リジン残基が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された場合にグルコノイル化された状態になり得るということを実証している。ヒトＧｒｏ−ベータ−ＴのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列は、その全体が参考として本書に内含されている国際特許出願公開国際公開第９２／００３２７号パンフレット（１９９２年１月９日）ならびに米国特許第６，０４２，８２１号明細書及び米国特許第第６，４１３，５１０号明細書の中で提供されている。
【００６７】
定量的高生産性逆相検定を用いて、ＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）の産生中の異種タンパク質の蓄積を日常的に監視した。産物関連変異体の形成を日常的に監視する手段を提供するべく、高性能エレクトロスプレー飛行時間（「ＥＳＩ−ＴＯＦ」形質量分析計とこの分離をインタフェースした。
【００６８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主内で発現された場合に、２つのユニークな産物修飾が観察された。質量スペクトルの解析が、７，５４２Ｄａでの未変性産物に比べて、＋１７８Ｄａ及び＋２５８Ｄａの質量シフトを示すものとして変異体を特徴づけした。
【００６９】
これらの発酵に由来する産物を、精製手順に通過させた。微量の産物変異体を解像する能力をもつ高解像度の逆相検定を用いて仕掛り標本を特徴づけした。液体クロマトグラフィ質量分析（「ＬＣＭＳ」）を用いた分析により、新しい産物変異体が＋２５８Ｄａ（保持時間約１４．８分）及び＋１７８Ｄａ（保持時間約１５．２Ｄａ）の質量シフトを示すことが確認された。
【００７０】
公開されている文献は、これらの＋２５８Ｄａ及び＋１７８Ｄａの質量シフトが、Ｎ末端残基に対する６−ＰＧＬ又はグルコノラクトンの添加の結果得られたヘキサＨｉｓタグで発現されたタンパク質の中で以前に観察されていたということを示した。ＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）はヘキサＨｉｓタグを使用して発現されなかった。さらに、分子はいかなるヒスチジン富有領域も示していない。種が産物関連のものであることを確認するため、各々の変異体を単離し、Ｎ−末端配列決定に付した。配列決定は、適正な産物配列を確認し、ヘキサＨｉｓタグが全く存在しないことを保証した。
【００７１】
変異体をトリプシン消化及びペプチド地図作製に付した。製品基準を用いて生成されたペプチド地図との比較は、４５．８分（ｍ／ｚ１０９４）で溶出する第１のピークと４６．５分（ｍ／ｚ１１７４）で溶出する第２のピークという２つの新しいピークをトリプシン地図内で明らかにした。新しいペプチドを単離し、Ｎ末端配列決定に付し、この配列決定は両方が同じ配列（ＮＩＱＳＶＫＶＫ（配列番号４１）を有することを示した。配列相同性及び８０Ｄａの質量差の存在は、種がリン酸化の存在によってのみ異なっていることを示唆していた。
【００７２】
ＬＣＭＳ質量分光分析をｍ／ｚ１１７４でのピークに対し実施した。ＭＳ／ＭＳ実験はピークがＮＩＱＳＶＫＶＫ（配列番号４）の配列を有することを確認した。さらに、ｙ３、ｙ４、ｙ５及びｙ６を含むｙ３から出発したｙ系列のフラグメントイオンは、２５８Ｄａの質量増加を示した。しかしながら、ｙ２イオンは２５８Ｄａの質量増加を示さなかった。このデータは、修飾が２５８Ｄａの質量増加を伴ってリジン（配列中２３番目）上にあることを示した。
【００７３】
観察された修飾が、産物のグルコノイル化に起因したことを確認するため、反応性Ｌ−グルコノ−１，５−ラクトン又はガラクトン酸を利用したインビトロ反応が開発された。以前の研究作業は、これらの種がヘキサＨｉｓタグに対するグルコノイル種の添加を誘発する能力を有することを示していた（グオックヘガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ）ら）。
【００７４】
精製したＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）をｐＨ８．０でＴＲＩＳ緩衝液へと緩衝液交換した。４５０ｍＭの濃度までＬ−グルコノ−１，５−ラクトン又はガラクトン酸を添加し、２０分間室温で標本をインキュベートした。両方のラクトン共、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での発現中に見られたものと同じ＋１７８ＤａのＣＸＣケモカイン修飾を誘発した。
【００７５】
実施例４
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現された組換え型ヒトインターロイキン（ヒトＩＬ−１８）の内部リジン残基のグルコノイル化を例示している。
【００７６】
６−ＰＧＬ付加体についてインターロイキン産物をスクリーニングするために、ＥＳＩ−ＴＯＦ質量分析法と組合わされた高解像度の逆相ＨＰＬＣを利用した。Ｂ菌株で発現されたインターロイキンの分析は、＋１７８Ｄａという質量差を示す産物関連の種を生成した。タンパク質は、ヘキサＨｉｓタグ無しで発現されたことから、ＣＸＣケモカインで観察された通り（実施例３参照）修飾は内部リジン残基において発生している確率が高かった。
【００７７】
インターロイキン分子の高解像度逆相ＨＰＬＣ分析により、ＲＴ２１．０、２２．０、２３．０分で＋１７８Ｄａの質量シフトを示す多数の産物種及び＋２５８Ｄａのシフト（ＲＴ約２７．５分）を示す付加的な微量の種を同定することができた。
【００７８】
インターロイキンのインビトロ修飾は、同様に、先行実施例において記述されている通り、ｐＨ８．０でＬ−グルコノ−１，５−ラクトンで評価された。この反応も又、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢ菌株内でインターロイキンが発現された時点で見られたものと同じ＋１７８Ｄａの修飾を生成した。
【００７９】
実施例５
この実施例は、豊富な培地内で細胞を培養することにより組換え型タンパク質の内部リジン残基のグルコノイル化又はＰＧＬ付加体の形成が妨げられることを示している。この研究において３つの供給バッチ発酵プロセスが比較された。発酵ラン間の差異は、産生段階の間に使用されたバッチ培地と供給物の組成にあった。プロセスＩの発酵では豊富な培地が使用され、一方第２及び第３のバッチ（プロセスＩＩ及びＩＩＩ）は最小培地で実施された。プロセスＩ及びＩＩにおいて、供給培地としてグリセロールが使用され、一方プロセスＩＩＩでは、グルコースが用いられた。
【００８０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中で組換え型インターロイキンを産生するための発酵プロセスは、１５リットルの発酵装置の中で供給−バッチモードで実施された。発酵はバッチプロセスとして開始された。表４に示されているように、２．８Ｌ入りのフラスコ内でＰＹＥ培地１０００ｍｌ中に０．５ｍＬのグリセロール保存培養を無菌状態で移送することによって接種材料を調製した。
【００８１】
【表４】
2006520609.tif 000007
【００８２】
培養を回転式振とう機の上で２７．５℃で一晩成長させた。その後、５Ｌのバッチ培地の入った発酵装置内に振とうフラスコ培養を移した。産生培地は、塩、アミノ酸及び硫酸カナマイシンから成る。さらに、豊富な培地を、表５に示されているような高濃度の酵母エキスとフィトンペプトンで補完する。
【００８３】
【表５】
2006520609.tif 000008
【００８４】
各培地のｐＨを、水酸化アンモニウムを用いて約７．３に維持した。温度を約２７．５℃に制御した。供給培地、グリセロール又はデキストロースを別々に滅菌し、シリコーンゴム管類を用いて発酵装置にこれらを無菌状態で連結した。
【００８５】
供給培地の補給は、培養中の初期バッチ量が使い果たされた時点で開始された。ポーラログラフ酸素電極が、発酵装置内の溶解酸素張力を監視した。２０％を超える一定の溶存酸素分圧を保つため、炭素供給速度をカスケードモードで制御した。曝気を１０ｓｌｐｍに、圧力を７．０ｐｓｉｇの過剰圧力に維持した。発酵の実施当初から終了時まで８００ｒｐｍという攪拌速度を使用した。約４０単位のＯＤ５５０で、１００ｍＬの１ｍＭのＩＰＴＧを培養中に注入して組換え型遺伝子発現を誘発した。
【００８６】
ＩＰＴＧ添加から２４時間後に収集した標本の逆相ＨＰＬＣ分析は、産物中のグルコノラクトンレベルの低下を示した。プロセスＩにおける６−ＰＧＬ付加体の不在及びプロセスＩＩ及びＩＩＩにおけるその存在は、グリセロール炭素源ではなく豊富な培地を使用することが６−ＰＧＬ付加体の削除の原因であったということを表わしている。表６は、該分析の結果を要約している。
【００８７】
【表６】
2006520609.tif 000009
【００８８】
実施例６
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＫ−１２菌株がＢ菌株よりも１００倍高いｐｇｌ活性を有することを示している。
【００８９】
親菌株としてＢＬ１２（ＤＥ３）をもつ２つの異なる菌株ＥＣＣ００５及びＥＣＯ６８０及びＫ−１２遺伝子型に由来する２つの他の菌株ＥＣＯ７０６及びＡＴＧ３９９５の抽出物の中で、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を測定した。
【００９０】
菌株を培養するために、１ＬのＰＹＥ培地＋１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２Ｌ入りの振とうフラスコに、凍結バイアルから０．４ｍＬの細胞懸濁液を接種した。インキュベーションは、６時間又は７．５時間２２０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で行なった。標本を指示された時点で取り上げ、５５０ｎｍで光学密度を測定し、ペレットを収集してｐｇｌ活性を測定した。ｐｇｌ活性を測定するためのインビトロ検定の詳細が以下に提示されている。
【００９１】
ｐｇｌ活性を、細胞を含まない抽出物の中で３４０ｎｍ、２５℃で螢光光度法によって検定した。細胞を含まない抽出物を、以前に記述されたように（マイトラ（Ｍａｉｔｒａ）及びロボ（Ｌｏｂｏ）、生物化学報（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２４６；４７５−４８８（１９７１年））、５ｍＭのＥＤＴＡ及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有するｐＨ７．３の５０ｍＭのＨＥＰＥＳという基本的に同じ再懸濁緩衝液を用いて調製したが、細胞は音波処理（２０秒、５サイクル）によって破断させた。
【００９２】
幾分かの修正を加えて、以前に公開された方法（シンハ（Ｓｈｉｎｈａ）及びメイトラ（Ｍａｉｔｒａ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９２年；１３８；１８６５−１８７３）を用いてｐｇｌを検定した。該検定は、２５ｍＭ−ＫＣｌ及び１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２を含有するｐＨ６．５の１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液の中で、５０μＭのグルコース−６−ホスフェート、０．５ｍＭ−ＮＡＤＰ＋及び１単位のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを含有する１ｍＬの混合物を予備インキュベートすることから成っていた。反応がひとたび安定期に達した時点で、ひき続き２単位の６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼを添加し、その結果、予備インキュベーションステップ中に形成された６−ＰＧＬの自然発生的加水分解に起因して吸収度がゆっくりと増大した。細胞を含まない抽出物を添加した時点での螢光の著しい増分がある場合、それはホスホグルコノラクトナーゼ活性のせいである。全てのｐｇｌ活性は、細胞を含まない抽出物の添加の後の吸収度の増加の線形範囲内で推定された。
【００９３】
酵素活性は、６−ＰＧＬの自然発生的加水分解速度を減算することによって推定された。酵素活性は、合計タンパク質１ｍｇ１分あたりのｍｍｏｌ  ＮＡＤＰＨで表現された。合計タンパク質は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質検定（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国イリノイ州（ＵＳＡ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ））によって決定された。
【００９４】
親としてＫ−１２遺伝子型をベースとしている菌株においては、Ｂ菌株に比べ１００倍高い活性が検出された。
【００９５】
表７は、２つの菌株バックグラウンドについての酵素検定の結果を要約している。
【００９６】
【表７】
2006520609.tif 000010
【００９７】
実施例７
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１菌株内で異種ポリペプチド、ＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔとしても知られている）を発現させた結果として６−ＰＧＬアダクトがもたらされる一方、Ｋ−１２菌株内で同じポリペプチドを発現させると内部リジンのグルコノイル化が妨げられる、ということを示している。
【００９８】
ＣＸＣケモカインを組換えにより発現するように構築された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の異なる４つの菌株を用いて、１０回の発酵ランを実施した。この実施例は、各々の宿主細胞バックグラウンドをもつ２つの発現系を用いることにより組換え型タンパク質の６−ＰＧＬ付加体の形成の有無に対する宿主バックグラウンド対プロモータ系の効果を実証している。表８は、使用された菌株について記述している。
【００９９】
【表８】
2006520609.tif 000011
【０１００】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でＣＸＣケモカイン（Ｇｒｏ−ベータ−Ｔ）を産生するための発酵は、１５リットル入りの発酵装置内で供給バッチモードで実施した。バッチプロセスとして発酵を開始した。５００ｍＬ入りバッフル付きフラスコ内の１００ｍＬのＰＹＥ培地中に０．７５ｍＬのグリセロール保存培養を無菌状態で移すことにより、接種材料を調製した。回転式振とう機上で３２．０℃で７時間培養を成長させた。振とうしたフラスコ培養を次に１．０ＬのＰＹＥ培地と混合し、８．０Ｌのバッチ培地の入った発酵装置内に移した。産生培地は、塩及びプロモータに応じてカルベニシリンか又は硫酸カナマイシンのいずれかで構成されていた。表９中に、シード拡張用の培養組成が提供されており、表１０には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＣＸＣケモカインの産生のための培地処方が提供されている。
【０１０１】
【表９】
2006520609.tif 000012
【０１０２】
【表１０】
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【０１０３】
各培地のｐＨは、水酸化アンモニウムを用いて約７．０に維持した。温度を約３２．０℃に制御し、誘発時に約３７．５℃まで上昇させた。供給培地及びデキストロースを別々に滅菌し、シリコーンゴム管類を用いて発酵装置に無菌状態で連結した。
【０１０４】
供給培地の補給は、培養中の初期バッチ量が使い果たされた時点で開始された。ポーラログラフ酸素電極が、発酵装置内の溶解酸素張力を監視した。約２５％を超える一定の溶解酸素張力を保つため、炭素供給速度をカスケードモードで制御した。曝気を約１０ｓｌｐｍに、圧力を約７．０ｐｓｉｇの過剰圧力に維持した。始めに約４００ｒｐｍという攪拌速度を用い、約２５％の溶解酸素張力を維持するべく必要に応じてこれを増大させた。約１４単位のＯＤ５５０で、１００ｍＬの１．０ｍＭのＩＰＴＧを培養中に注入するか又は温度を３７．５℃まで上昇させて組換え型遺伝子発現を誘発した。
【０１０５】
Ｋ−１２宿主バックグラウンドを用いて実施した発酵はいずれも、組換えにより発現されたポリペプチド上の検出可能な６−ＰＧＬ付加体の形成を有しておらず、一方Ｔ７プロモータと合わせてＢ菌株を用いて実施したものは全て、組換えにより発現されたポリペプチド上の検出可能な６−ＰＧＬ付加体の形成の存在を示した。Ｂ菌株及びｐＬプロモータを用いた３回の実施は、検出可能な付加体の形成を有していなかった。これらのデータは、例えばＫ−１２といったｐｇｌ活性を有する宿主菌株内で組換え体タンパク質を発現することにより、この修飾を受ける可能性のある組換え型タンパク質内での６−ＰＧＬ付加体の形成を妨げ得ることを実証している。実施例３を参照のこと。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｂ及びＫ−１２菌株中で発現されたＣＸＣケモカイン内での６−ＰＧＬ付加体の形成の存在は、表１１中で各発酵について提示されている。
【０１０６】
【表１１】
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【０１０７】
実施例８
この実施例は、Ｋ−１２菌株内で異種ポリペプチド、ヒトインターロイキン（ヒトＩＬ−１８）を発現させることにより内部リジンの６−ホスホグルコノイル化が妨げられることになるのに対して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１菌株内での同じポリペプチドの発現が結果として６−ＰＧＬ付加体の形成をもたらすということを示している。
【０１０８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＫ−１２菌株は、ヒトインターロイキン（ＩＬ−１８）を発現するように構築された。実施例で記述された通りに最小培地内で培養を成長させた。実施例で記述された方法を用いて、培地全体を通してさまざまな時点で６−ＰＧＬでの産物修飾についての監視を行なった。
【０１０９】
結果は、修飾された産物に対する未修飾産物のピーク面積比として表現されている。数字が大きくなればなるほど、グルコノイル化された産物の割合は小さくなる。ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株内のグルコノイル化の範囲がＫ−１２菌株内よりも著しく大きいことは明白である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢ及びＫ−１２菌株内で発現されたヒトインターロイキン（ＩＬ−１８）のホスホグルコノイル化が表１２に要約されている。
【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】
実施例９
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞内での異種ｐｇｌの過剰発現が６−ＰＧＬからその産物６−ホスホグルコネートへの代謝変換の増大を導きかくして付加体の形成に利用可能な６−ＰＧＬのプールが削減される、ということを示している。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌ遺伝子が、複製ベースのプラスミドのｃｏｌＥ１起源と相容性のあるプラスミドベースの誘発可能な発現ベクターヘとクローニングされ、工学処理され、かくして２つの異なるプラスミドは同じ宿主細胞内に維持され得ることになる。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌの誘発可能な発現レベルは、内因性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）代謝経路とは独立してかつ問題の組換え型タンパク質の誘発可能な発現とは独立した形で、意のままに調節可能である。従って、６−ＰＧＬのプールが付加体の形成に必要とされるレベルより低く、ただし宿主細胞資源が実質的な影響を受ける程に至らずに減少するような形で、組換え型ｐｇｌ発現を調節することができる。従って、非常に高い発現レベルを提供するべく、所望の組換え型タンパク質のレベルを別途調節することが可能である。
【０１１２】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌのクローニング
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌを以下のようにクローニングした。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ、１２３０１の米国標準培養収集機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１，Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２−１７７６）：緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）菌株ＡＴＣＣ２７８５３から入手した。５’及び３’ＰＣＲ増幅プライマは、開始コドンＡＴＧのすぐ上流側の領域を含め、ｐｇｌ遺伝子全体のＰＣＲ増幅を指示するように設計され合成された。センス及びアンチセンス増幅プライマの配列はそれぞれ以下のとおりである。
5' GGCCTCGAGCTCGGTGGCCCTGGTGGCCC 3'    (配列番号４)
及び
5' GCCCTCGAGTCCGCCACTCAGGGGTACCAAT 3'    (配列番号５)
太字の配列は、その後のクローニングステップを可能にするため遺伝子内に導入されたＸｈｏｌ部位を表わしている。
【０１１３】
さらに、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）遺伝子は、ＧＣをきわめて豊富に有しており、通常の増幅条件下ではＰＣＲ増幅しない。ＰＣＲ増幅には、ＧＣ富有鋳型、特定的には米国カリフォルニア州パロアルトのＢＤバイオサイエンスクロンテック社のアドバンテージ−ＧＣｃＤＮＡポリメラーゼミックス、カタログ番号８４１９−１（Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ｃＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ｃａｔ．８４１９−１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ：ＵＳＡ）について最適化されているＰＣＲ増幅条件を使用することが必要である、ということが発見された。ポリペプチド配列番号８をコードする対応するｐｇｌＤＮＡ配列（配列番号７）は、３０秒間９４℃とそれに続く１．５分間６８℃の２５サイクルの後、全緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細胞からＰＣＲ増幅された。このとき、３分間６８℃で単一のインキュベーションにより、増幅を完了した。アガロースゲル電気泳動及び米国カリフォルニア州バレンシア、キアゲン社（カタログ番号２８７０４）のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ｃａｔ．２８７０４、Ｑｉａｇｅｎ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ；ＵＳＡ）上のカラムクロマトグラフィにより、ＰＣＲ産物を単離した。水中に増幅したゲル精製されたｐｇｌＤＮＡを溶出させ、米国カリフォルニア州カールスバッド、インビトロゲン社（カタログ番号Ｋ４５５０−４０）のＴＯＰＯＴＡクローニング（登録商標）キット（ｃａｔ．Ｋ４５５０−４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ；ＵＳＡ）を用いてクローニングベクターｐＣＲ２．１へと直ちにクローニングさせ、米国カリフォルニア州カールスバッド、インビトロゲン社（カタログ番号Ｃ４０４０−０６）のＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学コンピーテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｃａｔ．Ｃ４０４０−０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＵＳＡ）へと形質転換させた。結果としてのａｍｐｒコロニーを、産物のＥｃｏＲＩ消化と電気泳動によりインサートについてスクリーニングした。配列確認済みインサートをＸｈｏｌ消化によりクローニングベクターから解放させ、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。米国ペンシルバニア州キングオブプルシャ、グラクソ・スミス・クライン社の（バイオカタログ７３５５３２）ｐＥＣＯ−１発現ベクターＤＮＡ（Ｂｉｏ  Ｃａｔ７３５５２，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ；Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ；ＵＳＡ）をＳａｌｌで切断し、米国マサチューセッツ州ビバリー、ニューイングランドバイオラボ社（カタログ番号ＭＯ２２９０Ｓ）の子牛腸内アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（ｃａｔ  Ｍ０２９０Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ：Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ＵＳＡ）で処理し、次に、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。基本的にメーカーにより記述されている通りにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｘｈｏｌ消化されたインサート及びＳａｌｌ処理されたｐＥＣＯ−１をライゲートした（米国マサチューセッツ州ビバリー、ニューイングランドバイオラボ社（カタログ番号Ｍ０２０２Ｓ）（ｃａｔ．Ｍ０２０２Ｓ；Ｎｅｗ  ��ｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；ＵＳＡ））。メーカーにより記述されている通りにＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０化学的コンピーテント・大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に２マイクロリットル（２μｌ）のライゲーション反応を形質転換した（カタログ番号Ｃ４０４０−０６、米国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロゲン社、（ａｔ．Ｃ４０４０−０６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；ＵＳＡ））。ＰＣＲにより正しい配向でのｐｇｌインサートの存在についてコロニーをスクリーニングした。以下で記すように、クローンｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃｌ２−１３をさらなる研究用に選択した。
【０１１４】
結果としての構成体はｐＡＣＹＣ１８４プラスミド主鎖に基づいており、以下の遺伝的機能的要素を含む。（１）ｃｏｌＥ１−型ｏｒｉ要素と共に異種プラスミドと同じ宿主細胞内でのプラスミドエピソーム維持を可能にするｐ１５Ａｏｒｉ；（２）クロラムフェニコールｒ選択性マーカー；（３）多重クローニング部位の上流側のテトラサイクリン誘発性プロモータ；（４）全長緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｐｇｌ遺伝子。
【０１１５】
さらなる研究のため、ヒトインターロイキンを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内に上述の通りに最終構成体ｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃｌ２−１３を形質転換した。ｐＥＣＯ−ｌｐｇｌｃｌ２−１３配列のＤＮＡ配列は配列番号９として提示され、ｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃｌ２−１３の制限地図は図１に提示されている。
【０１１６】
実施例３に記述した通りに培養を実施した。６−ＰＧＬ付加体についての分析は、実施例４中に記述されている通りに実施した。ホスホグルコノラクトナーゼ活性は、実施例６に記述した通りに測定した。研究の中で検査したヒトインターロイキン（ＩＬ−１８）を発現する付加的な菌株には、ｐＥＣＯ−１ｐｇｌｃｌ２−１３無しのＢＬ２１（ＤＥ３）及びＫ−１２が含まれる。ｐｇｌプラスミドを伴う菌株は、２０ｎｇ／ｍＬでのアンヒドロテトラサイクリンの添加を伴って又は伴わずに検査された。ｐｇｌを発現する細胞内の６−ＰＧＬ付加体の形成の有無は、以下に示される通りの表１３にまとめられている。
【０１１７】
【表１３】
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【０１１８】
実施例１０
ヒトインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、腎細胞癌及び悪性黒色種の治療のための抗癌剤として開発されつつある免疫調節性サイトカインである。ヒト及びマウスのＩＬ−１８についての記述は、本書にその全体が参考として内含されている以下の米国特許で提示されている：米国特許第６，５８２，６８９号明細書、米国特許第５，９１４，２５３号明細書、米国特許第５，８７９，９４２号明細書、米国特許第５，９１２，３２４号明細書、米国特許第５，９１４，２５３号明細書、米国特許第６，０６０，２８３号明細書、米国特許第６，０８７，１１６号明細書及び米国特許第６，２１４，５８４号明細書。ＩＬ−１８は、免疫系を刺激し、Ｆａｓ誘発された腫瘍細胞死及び細胞媒介型免疫を促進するものと考えられている。ＩＬ−１８のポリペプチド配列（配列番号１０）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）の中で産生され得る。それは、ｐｒｏ−ＩＬ１８についてのポリヌクレオチド配列（配列番号１１）から発現され得、この配列はさらに同じ細胞内で同時発現されるプロセシング酵素カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５により成熟ＩＬ−１８へとさらにプロセシングされる。
【０１１９】
グラム陰性菌緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼは、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株内にクローニングされた。この菌株内のＩＬ−１８の産生は、所望の産物の収量の直接的増加を結果としてもたらすように検出可能な付加体の形成が全く存在しない状態でＩＬ−１８を産生する。その上、ｐｇｌ欠損の補正も同じく、特定生産性の１０％を上回る増加を結果としてもたらした。かくして、この修飾された産生菌株の使用による産物の品質及び特定生産性の改善の組合わさった効果は、発酵段での力価収量の２５％を上回る増大の形で現われた。付加体の形成の削除は、精製プロセスに対する直接的なプラスの影響を有し全体的プロセス収量をさらに増大させることになると予想される。
【０１２０】
実施例１１
ＩＬ−１８のグルコノイル化を、ｐｇｌの同時発現を伴って及びこれを伴わずにＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内で産生されたＩＬ−１８についてのＨＰＬＣ分析によって監視した。精製されたＩＬ−１８から約２分後に溶出するショルダーピークとして、付加体の形成を検出した。ＩＬ−１８が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＢＬ２１ＤＥ３（ｐｇｌマイナス）内で発現されここから精製された場合、ＩＬ−１８についての主ピーク面積（すなわち、検出可能なグルコノイル付加体の形成を全くもたないＩＬ−１８についてのピークの面積）は約５６％であった。一方、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐｇｌプラス）細胞中のＩＬ−１８の発現及び精製は、約８８％の主ピーク面積を生成し、高解像度ＨＰＬＣ検定”に基づいていかなる付加体の形成も示さなかった。
【０１２１】
実施例１２
ｐｒｏ−ＩＬ−１８（配列番号１１）、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５（配列番号１２）をコードするポリヌクレオチドを含む２つのベクターが作り出された。その両方が、Ｔ７プロモータを用いてポリペプチド産生が誘発されるｐＥＴベクターであった。１つのベクターは同様に、ｐｒｏ−ＩＬ−１８と同じプロモータによって誘発された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（配列番号７）からのｐｇｌをコードするポリヌクレオチドをも含んでいた。ｐｒｏ−ＩＬ−１８及びカスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５を含むｐＥＴベクターの配列全体が配列番号１３中に提示されている。このベクターの制限地図が図２に提示されている。ｐｒｏ−ＩＬ−１８、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）５及びｐｇｌを含むｐＥＴベクターの配列全体は、配列番号１４に提示されている。このベクターの制限地図が３に提示されている。これらのベクターを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内にＩＬ−１８が発現された場合、回収可能なＩＬ−１８の量は、ｐａｇ無しでのＩＬ−１８の発現と比べてポリペプチドがｐｇｌと同時発現された場合に大幅に増大した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内の各々の発現ベクターから得た回収済みＩＬ−１８の量は、表１４に提示されている。
【０１２２】
【表１４】
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【０１２３】
本明細書中で引用された特許及び特許出願を含め（ただしこれらは制限されることはない）全ての刊行物及び参考文献は、各々の個別刊行物又は参考文献があたかも完全に本書に参考として内含されるものとして特定的かつ個別に指示されているかのごとく、その全体が本書に参考として内含されている。本出願が優先権を請求するあらゆる特許出願が同様に、刊行物及び参考文献について上述した要領でその全体が参考として本書に内含される。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ベクターｐＥＣＯ−１−ｐｇｌ−２−１３の制限酵素地図を示す。
【図２】ベクターｐＥＣＯ−１−ｐｇｌ−２−１３についてのポリヌクレオチド配列を示す（配列番号９）。
【図３】ベクターｐＥＴ２８ＰｒｏｌＬ１８Ｃａｓｐ５の制限酵素地図を示す。
【図４】ベクターｐＥＴ２８ＰｒｏｌＬ１８Ｃａｓｐ５についてのポリヌクレオチド配列を示す（配列番号１３）。
【図５】ベクターｐＥＴ２８ｐｒｏｌＬ１８ｃａｓｐ５＋ｐｇｌの制限酵素地図を示す。
【図６】ベクターｐＥＴ２８ｐｒｏｌＬ１８ｃａｓｐ５＋ｐｇｌについてのポリヌクレオチド配列を示す（配列番号１４）。
【図７】ポリヌクレオチド配列、配列番号７を示す。
【図８】ポリペプチド配列、配列番号８を示す。
【配列表】
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【図１】
2006520609.tif 000032
【図２】
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2006520609.tif 000034
【図３】
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【図４】
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2006520609.tif 000037
2006520609.tif 000038
【図５】
2006520609.tif 000039
【図６】
2006520609.tif 000040
2006520609.tif 000041
2006520609.tif 000042
2006520609.tif 000043
【図７】
2006520609.tif 000044
【図８】
2006520609.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月1日(2005.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006520609000001.app
【国際調査報告】
2006520609.tif 000046
2006520609.tif 000047
2006520609.tif 000048