(57)【要約】【課題】  高血圧の遺伝子マーカー・アイソフォームおよび高血圧の徴候としての、９０ｋＤａのアイソフォームの可能性をチェックする。【解決手段】  本発明は、組織、細胞および生物学的流体（特に尿）における１９０ｋＤａ特に９０ｋＤａの、アンギオテンシンＩ転換酵素（ＡＣＥ）のアイソフォームであるタンパク質の同定および定量の方法、このタンパク質に基づく高血圧の遺伝子マーカーおよび徴候因子、動脈高血圧および一次または二次の腎病変の保有者における上記分子マーカーおよび因子の使用、ならびに動脈高血圧における診断、危険性層別および治療的決定において使用するためのキットに関する。
2006510365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織、細胞および生物学的流体中のアンギオテンシンＩ転換酵素のアイソフォームであるタンパク質を同定および定量する方法であって、以下のステップ：
（ａ）生きている生物の新鮮な生物学的流体もしくは濃縮した生物学的流体、細胞または組織のアリコートを採取して、ウェスタン・ブロット法による分析および分離に供するステップ；
（ｂ）分析下のサンプルを、高血圧の遺伝子マーカーおよび６５ｋＤａ、１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのＡＣＥアイソフォームについて以前に確立された標準と比較するステップであって、流体（例えば、新鮮な尿または濃縮した尿）のアリコートは、標準として調製されたＡＣＥアイソフォームおよびＡＣＥ組換え酵素を分析コントロールとして使用する、ステップ；
（ｃ）正常な個体中で１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームの存在を検出し、また高血圧および特徴的な標的器官中の病変を発症する素因を有する個人を特徴付ける９０ｋＤａのアイソフォームの存在を検出するステップ
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）において検出された９０ｋＤａのアイソフォームが高血圧の遺伝子マーカーおよび高血圧の徴候因子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）のクロマトグラフィー分離が、ＡｃＡ４４樹脂および／またはＡｃＡ３４樹脂；Ｃ−１８逆相カラムＣ−１８、質量分析計ならびに１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームの、体性ＡＣＥおよびＮドメインＡＣＥ［９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ］に対する特異的抗体を使用するウェスタン・ブロッティングによって処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的流体が尿であることを特徴とする請求項１，２または３に記載の方法。
【請求項５】
１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有する、アンギオテンシンＩ転換活性を有する２つのピークが、正常血圧の個体の尿中で検出されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
イオン交換クロマトグラフィーが使用されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有する、アンギオテンシンＩ転換活性を有する２つのピークが溶出されるが１７０ｋＤａの形態は検出されないプロフィールが、高血圧の個体の尿中で検出されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アンギオテンシンＩ転換酵素の９０ｋＤａのアイソフォームの可能性を同定する方法であって、以下のステップ：
（ａ）尿を濃縮してＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、前記透析した尿を、ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＡｃＡ−３４カラムでのゲル濾過に供するステップ；
（ｂ）前記画分から２ｍＬを収集して、それらをＡ２８０ｎｍでの吸光度測定ならびにヒプリル−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｌｅｕ−およびＺ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを基質として使用したアンギオテンシンＩの転換活性によってモニタリングするステップ；
（ｃ）ＡＣＥ活性を有するアイソフォーム（１７０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）（ｎ＝２１）、アイソフォーム（１７０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）（ｎ＝１３）、ならびに（９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）（ｎ＝１３）アイソフォームの存在を観察するステップ
を特徴とする方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）において検出されたＡＣＥ活性を有する２つのアイソフォーム（１７０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）（ｎ＝２１）が、正常血圧の親を有する正常血圧の個体由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）において検出された３つのアイソフォーム（１７０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）（ｎ＝１３）が、高血圧の親を有する正常血圧の個体由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）において検出された２つのアイソフォーム（９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）（ｎ＝１３）が、高血圧の親を有する高血圧の個体由来であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記９０ｋＤａのアイソフォームが高血圧の遺伝子マーカーであり、かつ高血圧の徴候因子であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２に従って得られた遺伝子タンパク質に基づく高血圧の遺伝子分子マーカーであって、９０ｋＤａのアイソフォームを基礎とすることを特徴とするマーカー。
【請求項１４】
前記遺伝子マーカーが高血圧の徴候因子として使用されることを特徴とする、請求項１から１２に従って得られた遺伝子マーカーの使用。
【請求項１５】
高血圧および特徴的な標的器官中の病変の発症についての素因の診断において使用されることを特徴とする、請求項１から１２に従って得られた遺伝子マーカーの使用。
【請求項１６】
前記標的器官が心臓、神経系、脈管系および腎臓であることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
動脈高血圧および腎病変の保有者における診断、危険性層別、治療的決定のための分析方法であって、１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームの存在が正常な個体中で検出され、また高血圧および特徴的な標的器官中の病変を発症する素因を有する個体を特徴付ける９０ｋＤａのアイソフォームの存在が検出されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記ステップにおいて検出された９０ｋＤａのアイソフォームが、高血圧の遺伝子マーカーおよび高血圧の徴候因子であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的流体が尿であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１２に従って得られた遺伝子マーカーを含むことを特徴とする診断のためのキット。
【請求項２１】
高血圧の遺伝子マーカーおよび徴候因子を含むことを特徴とする診断のためのキット。
【請求項２２】
動脈高血圧における診断、危険性層別および治療的決定において使用されることを特徴とする、請求項１６および１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織、細胞および生物学的流体（特に尿）中のアンギオテンシンＩ転換酵素（ＡＣＥ）のアイソフォームであるタンパク質、具体的には１９０ｋＤａのＡＣＥ、特に９０ｋＤａのＡＣＥ（高血圧の遺伝子マーカー）および６５ｋＤａのＡＣＥの同定および定量の方法、このタンパク質に基づく分子マーカー、この分子マーカーの使用、動脈高血圧および一次または二次の腎病変の保有者における診断、危険性層別、治療的決定のための分析方法、ならびに診断において使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物生物に２つの系の血管作用性ポリペプチド（昇圧物質および降圧物質）が存在することは、まったく新しい。昇圧物質系を理解するための基本的な基礎であるレニン−アンギオテンシン系は、ＨｏｕｓｓａｙおよびＦａｓｃｉｏｌｏ（１９３７）、ＨｏｕｓｓａｙおよびＴａｑｕｉｎｉ（１９３８）、Ｂｒａｕｎ−Ｍｅｎｅｎｄｅｚ、Ｆａｓｃｉｏｌｏ、ＬｅｌｏｉｒおよびＭｕｎｏｚ（１９３９）ならびにＫｏｈｌｓｔａｅｄｔ、ＨｅｌｍｅｒおよびＰａｇｅ（１９３８）の論文によって確立されている。他方で、降圧剤系であるカリクレイン−キニン系は、１９３０年代に実施されたＦｒｅｙ、ＫｒａｕｔおよびＷｅｒｌｅの論文（Ｆｒｅｙ、ＫｒａｕｔおよびＳｃｈｕｌｔｚ、１９３０；Ｋｒａｕｔら、１９３０；Ｗｅｒｌｅ、１９３６；Ｗｅｒｌｅら、１９３７）ならびにＲｏｃｈａおよびＳｉｌｖａ、ＢｅｒａｌｄｏおよびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９４９）ならびにＰｒａｄｏ、ＢｅｒａｌｄｏおよびＲｏｃｈａおよびＳｉｌｖａ（１９５０）に基づいている。
【０００３】
これら２つの系において、血管作用性ペプチドは、以下の一般的なスキームに従う限定されたタンパク質分解を介して、その血漿タンパク質前駆体へと放出される：
【０００４】
【化１】
2006510365.tif 000003
【０００５】
これら２つの系に関与するプロテアーゼおよび基質の精製および特徴付けについてのいくつかの論文は、活性ペプチドを放出するのに必要ないくつかのステップの解明を可能にした。しかし、後者の生理学的役割およびその異化は、未だ完全には解明されていない。
【０００６】
〔レニン−アンギオテンシン系〕
レニンは、腎糸球体の求心性小動脈から傍糸球体細胞によって産生および貯蔵される酸性プロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．９９．１９）である（Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔら、１９３８；Ｈａｒｔｒｏｆｔ、１９６３およびＴｏｂｉａｎ、１９６０）。この酵素が作用する基質は、Ｎ末端配列の一部が既知である血漿α２−グロブリンであるアンギオテンシノゲン（Ｂｒａｕｎ−Ｍｅｎｅｎｄｅｚら、１９３９；Ｂｕｍｐｕｓら、１９５８；ＳｃｈｗｙｚｅｒおよびＴｕｒｒｉａｎ、１９６０）であり、このＮ末端配列の一部は以下に対応する：Ａｓｐ３−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７−Ｐｈｅ８−Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ１０−Ｌｅｕ１１−Ｖａｌ１２−Ｔｙｒ１３−Ｓｅｒ１４。
【０００７】
レニンがアンギオテンシノゲン分子中のＬｅｕ１０−Ｌｅｕ１１結合を加水分解する場合、それほど強力ではない血管収縮物質であるデカペプチドのアンギオテンシンＩが放出される。Ｓｋｅｇｇｓら（１９５６）によって記載された、転換酵素と称される第２の酵素は、Ｐｈｅ８−Ｈｉｓ９結合を加水分解して、アンギオテンシナーゼによって不活化される薬理学的に活性なオクタペプチドであるアンギオテンシンＩＩを放出することによって役割を果たす。
【０００８】
〔カリクレイン−キニン系〕
カリクレイン−キニン系は、不活性な前駆体であるキニノゲンを加水分解し、キニナーゼによって不活化されるキニンを放出するキニノゲナーゼを含む。
【０００９】
表現キニノゲナーゼは、カリクレイン、トリプシン、ペプシン、いくつかの細菌プロテアーゼおよびヘビ毒などのプロテアーゼを含む（Ｐｒａｄｏ、１９７０；ＲｏｃｈａおよびＳｉｌｖａら、１９４９；ＳｕｚｕｋｉおよびＩｗａｎａｇａ、１９７０）。これらの酵素の中で、カリクレインはこの系に特異的である。カリクレインは、限定されたタンパク質分解によってキニノゲンのキニンを放出するセリン・プロテアーゼであり（Ｎｅｕｒａｔｈ、１９７５）、他のタンパク質に対しては低いタンパク質分解活性を有する。２つの型のカリクレイン（腺性および血漿）が哺乳動物において見出されており、これらのカリクレインは、物理化学的特性および免疫学的特性、キニノゲンおよび合成基質との反応速度、放出されるキニンの型に関して互いに異なり、非常に多様な合成および天然の阻害物質に対して応答する。
【００１０】
他方でキニノゲンは、Ｃ末端中またはＣ末端に隣接してブラジキニン分子を含む酸性糖タンパク質である（Ｐｉｅｒｃｅ、１９６８）。キニノゲンは、腺性カリクレインによって加水分解されてリジル−ブラジキニンを放出し、血漿カリクレインによって加水分解されてブラジキニンを放出する（ＲｏｃｈａおよびＳｉｌｖａ、１９７４）。リジル−ブラジキニンは、血漿中（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９７０）および組織中（Ｈｏｐｓｕら、１９６６ａ、ｂ；Ｂｏｒｇｅｓら、１９７４；Ｐｒａｄｏら、１９７５）に含まれる既存のアミノペプチダーゼによってブラジキニンに転換される。
【００１１】
機能的に異なる２種のキニノゲンが血漿中において記載されている。すなわち、この２種のキニノゲンとは、２種のカリクレイン（血漿および腺性）の基質である高分子量キニノゲンおよび腺性カリクレインについてのみ良好な基質である低分子量キニノゲンである（ＷｅｒｌｅおよびＴｒａｕｔｓｃｈｏｌｄ、１９６３；Ｐｒａｄｏら、１９７１）。
【００１２】
ブラジキニン（ＢＫ＝Ａｒｇ１−Ｐｒｏ２−Ｐｒｏ３−Ｇｌｙ４−Ｐｈｅ５−Ｓｅｒ６−Ｐｒｏ７−Ｐｈｅ８−Ａｒｇ９）、リジル−ブラジキニンおよびメチオニル−リジル−ブラジキニンは、強力な生理薬理病理学的物質であり、低血圧および血管拡張、疼痛、平滑筋の収縮を生じ、血管の透過性および白血球の遊走を増大させる（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９７０；Ｐｉｓａｎｏ、１９７５）。
【００１３】
〔キニンの生理学的役割〕
生物中のキニンの作用は完全には明確でないものの、いくつかの属性は、全身レベルまたは組織レベルのいずれかで、キニンがいくつかの生理学的機能に関与することが示されている。
【００１４】
以下のような異なるプロセスにおけるキニンの媒介が提唱されている：末梢血管拡張および炎症現象における媒介；合成系との相互作用およびプロスタグランジン放出；精子（ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｉｄ）の運動性；腎での流動の調節；ネフロンによるナトリウム再吸収における媒介（Ｗｉｌｈｅｌｍ、１９７３；Ｔｅｒｒａｇｎｏら、１９７５；Ｂａｕｍｇａｒｔｅｎら、１９７０；ＳｃｈｉｌｌおよびＨａｂｅｒｌａｎｄ、１９７４；Ｌｅｖｉｎｓｋｙ、１９７９）。
【００１５】
このプロセスにおいてキニンによって実施される正確な役割を解明するために、その放出を引き起こす機構だけではなく、その異化もまた引き起こす機構を知ることが重要である。
【００１６】
〔キニンの異化〕
キニンの不活化を担う酵素は、キニナーゼとして一般に公知である。この頭文字（ａｃｒｏｎｙｍ）の下には、ＢＫ分子またはその誘導体中の結合を加水分解し得るが、必須ではないがキニンの異化に関与することが必要ではないまたはそのことが判明していない一連のペプチダーゼが含まれる。
【００１７】
キニン系の最初の研究以来このようなクラスの酵素の存在についての観察が実施され、多数の研究者のグループによっていくつかの器官、組織および生理学的液体において記載されている。
【００１８】
〔血漿〕
２つの型のキニナーゼがヒト血漿においてすでに特徴付けられている：キニナーゼＩ（アルギニン・カルボキシペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１２．７）およびキニナーゼＩＩ（ペプチジル−ジペプチダーゼ、Ｅ．Ｃ．３．４．１５．１）。
【００１９】
キニナーゼＩは、Ｃｏｈｎ画分ＩＶから初めて精製されたカルボキシペプチダーゼ型の酵素である（ＥｒｄｏｓおよびＳｌｏａｎｅ、１９６２）。この酵素は、ＢＫのＰｈｅ８−Ａｒｇ９結合を加水分解する。これは元来、その特性からカルボキシペプチダーゼ−Ｎと称され、この特性により膵臓のカルボキシペプチダーゼＢとは異なったものとなっている。その公式名称はアルギニン・カルボキシペプチダーゼであるものの、この酵素は、多数の基質においてアルギニンよりもＣ末端リジンの加水分解を良好に触媒する（Ｏｓｈｉｍａら、１９７５）。
【００２０】
このような酵素の精製および特異性の研究において使用される合成基質の中では、ＨＬＡが挙げられ得る（Ｏｓｈｉｍａら、１９７５）。
【００２１】
血漿において記載されたキニン活性を有する第２の酵素はキニナーゼＩＩであり、これはＰｒｏ７−Ｐｈｅ８結合の加水分解によってＢＫを不活化し、Ｐｈｅ−Ａｒｇジペプチドを放出する（ＹａｎｇおよびＥｒｄｏｓ、１９６７）。
【００２２】
後に、このような酵素が、レニン−アンギオテンシン系のアンギオテンシンＩ転換酵素（ＡＩ）と同一であること（Ｙａｎｇら、１９７０ａおよびＹａｎｇら、１９７０ｂ）、したがって、ＡＩ分子のＰｈｅ８−Ｈｉｓ９結合の加水分解によって役割を果たすことが観察された。このような酵素の特徴の１つは、Ｆｅｒｒｅｉｒａ（１９６５）およびＦｅｒｒｅｉｒａ（１９６６）に記載されるように、この酵素がＢＫ増強ペプチド（ＢＰＰ）によって阻害されることである。
【００２３】
これはまた、ヒト血漿由来のキニナーゼＩおよびキニナーゼＩＩに対する類似の特異性を有する他の動物種の酵素においても記載されている（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９７０）。
【００２４】
〔肺〕
ＢＫ除去に関与する肺に大きな重要性がおかれてきている。文献によって発表された多数の論文は、注入されたＢＫの高い割合に関して、この器官による不活化を記載している（ＦｅｒｒｅｉｒａおよびＶａｎｅ、１９６７；Ｂｉｒｏｎ、１９６８ならびにＤｏｒｅｒら、１９７４）。
【００２５】
キニナーゼＩＩは、ブタの肺（Ｄｏｒｅｒら、１９７２およびＮａｋａｊｉｍａら、１９７３）、ウサギの肺およびラットの肺（Ｓｏｆｆｅｒら、１９７４ならびにＬａｎｚｉｌｌｏおよびＦａｎｂｕｒｇ、１９７４）においてすでに精製されている。
【００２６】
Ｒｙａｎらの研究は、この器官の不活化の機構を解明するのに寄与している。脈管内皮の飲み込み小胞（ｐｙｎｏｃｉｔｏｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）中に存在する酵素キニナーゼＩＩ型によって、ＢＫは不活化されるが、一方でＡＩは循環の間にＡＩＩに転換される。Ｒｙａｎらはまた、ＢＫがＬＢＫ−ＢＫおよびＭＬＢＫよりもかなり容易に加水分解されることを観察した。彼らの理論は、これらのより大きなキニンは小胞へのアクセスがより困難であるということである。Ｒｙａｎらの記述によれば、肺循環の後に見出されるＢＫ加水分解産物は、最初に列挙した酵素の作用だけでなく、内皮細胞の細胞質中に含まれる他の酵素の作用の結果でもある（Ｒｙａｎら、１９６８およびＲｙａｎら、１９７５）。
【００２７】
〔肝臓〕
ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇは、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」のキニン異化の原因を血漿および肺のキニナーゼにほぼ排他的に帰した。しかし、Ｐｒａｄｏら（１９７５）によって実施された研究は、他の器官が弱ったラットにおいて灌流される場合にキニンを不活化し得ることを示している（ここで、肺循環はこの灌流回路から除外される）。該参考論文において肝臓が「ｉｎ  ｓｉｔｕ」で灌流される場合、この器官がＢＫのかなりの量を不活化することが示された。
【００２８】
これらの研究の後、Ｂｏｒｇｅｓら（１９７６）は、「ｉｎ  ｓｉｔｕ」で灌流された肝臓によるＢＫの不活化が、少なくとも２種の酵素（ペプチジル・ジペプチド・ヒドロラーゼおよびＢＫのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６結合を加水分解する第２の酵素）に起因することを観察した。この酵素は、灌流液体中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用することによって灌流した肝臓から除去されたので、膜ペプチダーゼである可能性がある。著者らによれば、この研究で得られたキニン活性は、器官の総ホモジネートの上清中に見出されるキニン活性と比較した場合、非常に低い。
【００２９】
Ｍａｚｚａｃｏｒａｔｔｉ（１９７８）は、この型の調製物、すなわち、ラット由来のホモジナイズした肝臓について研究を行った。ＢＫのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６結合を加水分解する、異なる分子量を有する２種のセリン・プロテアーゼが精製された。
【００３０】
〔脳〕
脳抽出物におけるキニンの代謝が、多数の研究者によって研究されている（Ｉｗａｔａら、１９６９；Ｃａｍａｒｇｏら、１９６９）。
【００３１】
ホモジナイズしたウサギ脳由来のキニナーゼが、Ｃａｍａｒｇｏら（１９７３）、Ｏｌｉｖｅｉｒａら（１９７６）によって体系的に研究されている。２つのチオール−エンドペプチダーゼ（最適ｐＨ７．５）が上清画分から精製された。第１の酵素であるキニナーゼＡは、ＢＫのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６結合を加水分解し、かつ７１ｋＤａの分子量を有する。一方で他方のキニナーゼＢは、キニナーゼＩＩのようにＰｒｏ７−Ｐｈｅ８を加水分解するが、６９００の分子量を有する。予備研究はＡＩのＡＩＩへの転換を示していないので、この酵素は転換酵素（キニナーゼＩＩ）とは異なる。
【００３２】
Ｗｉｌｋ、ＰｉｅｒｃｅおよびＯｒｌｏｗｉｓｋｉ（１９７９）は、上述の酵素とは異なる脳組織由来の２つの酵素を記載した。これらの酵素のうち一方（これはウシ下垂体から抽出された）もまた、ＢＫのＰｈｅ５−Ｓｅｒ６結合を加水分解するが、その分子量（１０００００より大きい）ならびにＮａ＋およびＫ＋によって阻害されることから、キニナーゼＡとは異なる。記載された第２の酵素（これはウサギ脳から抽出された）は、プロリンがカルボキシル基で寄与するペプチド結合の加水分解に特異的である。この酵素はＢＫのＰｒｏ７−Ｐｈｅ８結合を最初に加水分解し、次にＰｒｏ３−Ｇｌｙ４結合を加水分解する。
【００３３】
〔腎臓〕
腎臓のキニナーゼ活性は、血漿または肝臓において見出される活性よりも高い（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９７０）。
【００３４】
この器官において、キニナーゼ活性を有するいくつかの酵素が精製されている。Ｅｒｄｏｓらの研究は、腎臓において３つの異なる酵素を同定した：１つはカルボキシペプチダーゼ型であり、これは、ＢＫのＣ末端アルギニンを放出し、血漿キニナーゼＩのいくつかの特性とは異なる（これが、キニナーゼｐと称される理由である）（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９６６）。別の酵素はＰｒｏ７−Ｐｈｅ８結合を加水分解し（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９６７）、そして第３の酵素はイミドペプチダーゼとして特徴付けられ、Ａｒｇ１−Ｐｒｏ２結合の加水分解によってＢＫを不活化する（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９６６）。
【００３５】
ＫｏｉｄａおよびＷａｌｔｅｒ（１９７６）は、ヒツジの腎臓から、いくつかのペプチドの分子（とりわけＢＫ）中のＰｒｏ−ｘ結合型を加水分解する酵素を精製した。ｘアミノ酸はプロリンではあり得ず、かつその触媒はｘが親油性アミノ酸である場合により速いことが観察された。
【００３６】
腎臓によるキニン異化は、このようなペプチドの不活化部位を同定することを目的とする方法によって研究されている。これらの研究は、脈管ネットワークレベルで生じるＢＫ加水分解の他に、腎皮質細胞に位置する酵素によるキニンの異化が、大きな重要性を有するようであることを示す（ＥｒｄｏｓおよびＹａｎｇ、１９６７）。
【００３７】
キニナーゼ活性は糸球体においては非常に低いが、ＩＩ型キニナーゼは、近位曲尿細管の刷子縁において高い濃度で見出される（Ｈｏｌｌら、１９７６、Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９７）。この発見と一致して、Ｏｐａｒｉｌら（１９７６）は、微量注入されたＢＫの高い割合が近位尿細管において不活化されることを観察した。腎臓におけるキニン産生が遠位尿細管（ここでカリクレインが合成される（Ｏｒｓｔａｖｉｋら、１９７６））の近くで生じるはずであることを考慮すると、この点から他のキニナーゼがネフロンまたは尿細管内流体中に存在するはずであることを提唱することは論理的であるように思われる。
【００３８】
〔尿〕
カルボキシペプチダーゼは、Ｅｒｄｏｓら（１９７８）によってヒト尿において充分特徴付けられている。カルボキシペプチダーゼは、ＢＫのＣ末端アルギニンを放出し、かつ分子量、阻害物質作用および免疫学的特性に関して血漿のカルボキシペプチダーゼとは異なる。しかし、腎臓の酵素との反応速度および阻害の類似性が示されている。
【００３９】
Ｒｙａｎらは１９７８年に、尿中に含まれる３つの酵素を記載した。１つの酵素はＢＫのＰｒｏ７−Ｐｈｅ８結合を加水分解して、ＡＩをＡＩＩに変換する。別の酵素は、６３ｋＤａの分子量を有し、ＢＫのＰｈｅ８−Ａｒｇ９結合を分解し、ＢＰＰ９ａによって阻害されない。
【００４０】
Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏら（１９７８）はまた、Ｒｙａｎによって記載された酵素の中でもとりわけ第３の酵素に類似する、キレート剤によって阻害される２５０ｋＤａの分子量を有するキニナーゼを記載した。この酵素は、Ｃ末端アルギニンを加水分解するが、ＨＬＡ合成基質は加水分解しない。
【００４１】
尿からカルボキシペプチダーゼを精製して特徴付けた研究であるＥｒｄｏｓら、１９７８は例外であるが、すべての研究において、記載された酵素は、部分的にのみ精製かつ／または特徴付けされた。これらの矛盾したデータに起因して、本発明は、ヒト尿においてＡＣＥである異なるキニナーゼ活性を特徴付けることを目的とする。
【００４２】
９１ｋＤａのアンギオテンシンＩ転換酵素の低分子量（ＬＭＷ）形態の１つは、ラット肺ホモジネートからのこのような酵素の調製の間に観察された［Ｌａｎｚｉｌｌｏら、１９７７］。ＡＣＥ由来のＬＭＷ形態はまた、ヒト肺［Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９７８］、ブタ腎臓［Ｎａｇａｍａｔｓｕら、１９８０］およびヒト腎臓［Ｔａｋａｄａら、１９８１］においても観察された。Ｉｗａｔａら（１９８３）およびＹｏｔｓｕｍｏｔｏら（１９８３）は、８６〜９０ｋＤａのＡＣＥ  ＬＭＷが、塩基での処置後にそれぞれウサギ肺およびヒト血漿から獲得され得ることを示した。９０年代に、Ｌａｎｔｚら（１９９１）は、ヒト脳脊髄液において特徴付けられた、１５０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび４０ｋＤａの分子量を有する３つの異なるＡＣＥアイソフォームを記載した。以前に言及したものはすべて体性ＡＣＥと類似である。Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９１、１９９５、２００１は、高血圧患者の尿において、両方ともＮドメインである６５ｋＤａのアイソフォームおよび９０ｋＤａのアイソフォームを記載し、かつ正常人において６５ｋＤａのアイソフォームを記載した。Ｄｅｄｄｉｓｈら（１９９４）は、回腸流体中で、これもまたＡＣＥのＮドメイン・アイソフォームである１０８ｋＤａの分子量を有するＥＣＡを精製した。
【００４３】
ＡＣＥのいくつかのアイソフォームの精製が記載されている［Ｒｙａｎら、１９７８；Ｋｏｋｕｂｏら、１９７８；Ｓｋｉｄｇｅｌら、１９８７；Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９８３、１９８７］。Ｋｏｋｕｂｏら（１９７８）は、正常なヒト尿中に３つの異なる形態のＡＣＥを見出した。２つの形態は、４００ｋＤａを超える高い分子量および２９０ｋＤａの高い分子量を有し、第３の形態は１４０ｋＤａの分子量を有する。Ｒｙａｎら（１９７８）は、２つの形態に分離されたヒト尿中のキニナーゼＩＩを記載した。第１の形態は１７０ｋＤａの体性ＡＣＥと同時にクロマトグラフィーされ、第２の形態は９０ｋＤａの分子量を有するタンパク質と類似であった。Ｃａｓａｒｉｎｉら（１９８３、１９９１、１９９２、１９９５、２００１）は、正常人および高血圧患者のヒト尿において、１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有するＡＣＥを記載し、ラット尿においてもこれらを記載した（Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９８７）。Ａｌｖｅｓら、１９９２もまた、正常人および高血圧患者の尿において、１７０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームを記載した。Ｃｏｓｔａら、１９９３、２０００は、正常人の尿において、１７０ｋＤａ、６５ｋＤａおよび５９ｋＤａの異なる分子量を有するＡＣＥを記載し、そして高血圧患者において５５ｋＤａ、５７ｋＤａおよび９４ｋＤａの分子量を有する腎血管性酵素を記載した。尿中でのＡＣＥ活性は、血漿由来ではないが、腎尿細管由来であり（Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９７）、かつ腎尿細管損傷についての参照として使用され得る。なぜなら、腎臓および上部尿路疾患の感染においてかなりのレベルの増大があるからである［Ｂａｇｇｉｏら、１９８１；Ｋａｔｏら、１９８２］。
【００４４】
１３０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有する、培養物中のメサンギウム細胞の細胞内媒体および細胞外媒体中の２つのＡＣＥアイソフォームもまた最近記載されている（Ａｎｄｒａｄｅら、１９９８）。小児の尿において１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームの存在がなお観察されたが、未熟な小児においては６５ｋＤａのアイソフォームＡＣＥのみが観察され、６５ｋＤａのアイソフォームは、ＡＣＥのＮドメイン部分と類似である。未熟な小児において、出生後１〜３０日間の期間で、これらの１９０ｋＤａのアイソフォームが３０日目にのみ出現することが見出された（Ｈａｔｔｏｒｉら、２０００）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００４５】
本発明に従って、組織、細胞および生物学的流体（特に尿）中のアンギオテンシンＩ転換酵素のアイソフォームであるタンパク質（具体的には１９０ｋＤａのＡＣＥ、特に９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）を同定および定量する方法を実施するために、生きている生物から流体（例えば尿）、組織または細胞を採取するステップで開始して、これらをクロマトグラフィー分離（ＡｃＡ４４樹脂および／またはＡｃＡ３４樹脂；質量分析計における逆相カラムＣ−１８）およびウェスタン・ブロッティング（１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームの、体性ＡＣＥおよびＮドメインＡＣＥ［９０ｋＤａ（高血圧の遺伝子マーカー］および６５ｋＤａ］に対する特異的抗体を使用する）に供する。正常な個体は、１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームを有するが、一方で９０ｋＤａのアイソフォーム（高血圧の遺伝子マーカー）は、高血圧および特徴的な標的器官（心臓、神経系、脈管系および腎臓）中の病変を発症する素因を有する個体を特徴付ける。
【００４６】
本発明の方法では、流体（例えば、新鮮な尿または濃縮した尿）、細胞および組織のアリコートが処理され、高速液体クロマトグラフィーおよび質量分析計による検出（ＨＰＬＣ−ＭＳ）によって、または質量検出器において直接分析され、このとき、このサンプルが分析され、１９０ｋＤａ、９０ｋＤａ（高血圧の遺伝子マーカー）および６５ｋＤａのＡＣＥアイソフォームについての以前に確立された標準と比較される。流体（例えば、新鮮な尿または濃縮した尿）、細胞および組織のアリコートが処理されて、１９０ｋＤａおよびＮドメインＡＣＥ（９０ｋＤａの高血圧の遺伝子マーカーおよび６５ｋＤａ）に対する特異的抗体を使用し、標準として調製されたＡＣＥアイソフォームならびにＥＣＡ組換え酵素をコントロール分析として使用したウェスタン・ブロッティングまたは別の免疫沈降方法によって分析される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明によって提唱される結果に到達するために、ＡＣＥに対する研究が１９８３年に開始され、このとき本態性の（軽度の形態および／または中等度の形態）動脈高血圧患者を、１日用量で経口投与されたカプトプリル（５０ｍｇ〜１５０ｍｇ）を使用した後で分析した。３日間の試験、各日、各６時間の収集持続時間；血液および尿のサンプルを、仰向け位置にした後に最終基準期間（１時間）で収集し、そして試験の終了時（６時間後）に収集した。これらの結果は、カプトプリル投与の１時間後と２時間後との間の期間で酵素活性の５０％阻害を示し、試験の終了時に基準レベルに戻ることを示している。ヒプリル−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ基質を使用して、ＦｒｉｅｄｌａｎｄおよびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎの方法（１９７６）によって酵素活性を測定した。イオン交換クロマトグラフィー分析によって、正常血圧の個体における１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのＡＣＥ中について見出されたプロフィールとは異なる、０．７ｍＳ（９０ｋＤａ）および１．２５ｍＳ（６５ｋＤａ）の伝導率で、アンギオテンシンＩ転換活性を有しかつブラジキニンについて不活化された、収集された尿（６時間後に収集した）の２つのタンパク質のピークが溶出された。これに基づいて、より多数の軽度高血圧患者について試験が展開され、上記で引用したように（Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９１）、アンギオテンシンＩ転換活性を有する２つのタンパク質のピークの存在が見出された。
【００４８】
上記で参照したような研究（ＦＡＰＥＳＰにより助成されたプロジェクト、９５／９１６８−１号）に従って、以下の試験群を組織した：正常な親／正常な子供；正常な親／高血圧の子供；高血圧の親／高血圧の子供および高血圧の親／正常な子供。群（正常な親／高血圧の子供）高血圧の親／高血圧の子供において、子供の尿は２つの９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの形態を示し；正常な親／正常な子供の群において、子供の尿は１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの形態を示し；最後に、高血圧の親／正常な子供において、子供の尿は１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの形態を示し、これら最後の２つの形態はＮドメイン・フラグメントである。
【００４９】
これらの結果から、９０ｋＤａがおそらく高血圧のマーカーであると結論付けた。この知見が遺伝的要因であるか圧力上昇（物理的）に関連するかまたは関連しない別の事実であるかを証明するために、データをラットについて実験モデルにおいて同じプロジェクトで確認した。この目的のために、Ｗｉｓｔａｒラット、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット、Ｌｙｏｎラット、ＳＨＲラット、１Ｒ１ＣラットおよびＤＯＣＡ−ｓａｌｔラットの尿を研究した。結果として、Ｗｉｓｔａｒラット、ＤＯＣＡ−ｓａｌｔラット、１Ｒ１ＣラットおよびＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットは１７０ｋＤａおよび６５ｋＤａの形態を示し；ＳＨＲラットおよびＳＨＲ−ＳＰラットのみが９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの形態を示した。これらの結果は、ヒトについて得られた結果、したがって、９０ｋＤａのＡＣＥアイソフォームが高血圧の遺伝子マーカーであることを確認する（Ｆａｐｅｓｐ  ９７／００１９８−０、Ｍａｒｑｕｅｓ  １９９９）。
【００５０】
１９９７年に、本発明の研究者らは、培養物中のメサンギウム細胞がＡＣＥのＲＮＡｍを発現することを記載した（Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９７）。この酵素は細胞内型（１３６ｋＤａおよび６５ｋＤａ）および分泌型（１３６ｋＤａおよび６５ｋＤａ）で検出され、このことは、これらの細胞の機能におけるアンギオテンシンＩＩの局所的産生の、可能性のある効果を示す（Ｆａｐｅｓｐ  ９５／９１６８−１；Ａｎｄｒａｄｅら、１９９８）。
【００５１】
後に、ＳＨＲのメサンギウム細胞の細胞内および培養培地が、このようなラットの尿中に見出されたのと同じＡＣＥアイソフォームのプロフィール（９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）を示すことが観察された（Ｆａｐｅｓｐ  ９９／０１５３１−１）。したがって、このことは以前の研究の結果を確認する。これらの結果から、本発明の著者らにより、これらのアイソフォームがＷｉｓｔａｒラット（１３６ｋＤａおよび６９ｋＤａ）およびＳＨＲラット（９６ｋＤａおよび６９ｋＤａ）の肺、副腎、心臓、大動脈および肝臓において発現され、腎臓に制限されないことが観察され（Ｒｏｎｃｈｉ、２００２）、このことは、８０ｋＤａ／９０ｋＤａ／９６ｋＤａの高血圧の遺伝子マーカーが種々の組織において発現されることを強調し、したがって、これらのアイソフォームが特定の器官の調節に寄与し得るという結論をもたらすことを強調する（８０ｋＤａまたは９６ｋＤａまたは９０ｋＤａの酵素について言及する場合、糖化プロセスにおける小さい変更を有する同じ酵素であると理解されるべきであることが強調されるべきである）。
【００５２】
本発明は、流体収集物（例えば尿）、組織または生きている生物の細胞で開始し、これらは、クロマトグラフィー分離（樹脂ＡｃＡ４４および／またはＡｃＡ３４；逆相カラムＣ−１８、質量分析計）およびウェスタン・ブロッティング（１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームの、体性ＡＣＥおよびＡＣＥのＮドメイン［９０ｋＤａ（高血圧の遺伝子マーカー）および６５ｋＤａ］に対する特異的抗体を使用する）に供される。１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームは、正常な個体（正常ラット、正常ラット由来の細胞および／または組織）に存在し、一方で９０ｋＤａ（高血圧の遺伝子マーカー）アイソフォームは、高血圧および特徴的な標的器官（心臓、神経系、脈管系および腎臓）中の病変を発症する素因を有するもの（個体または動物など）を特徴付ける。流体（例えば、新鮮な尿または濃縮した尿）、細胞および組織のアリコートが処理され、高速液体クロマトグラフィー法および質量分析計（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を使用することによる検出、または質量検出器中での直接的検出によって分析され、ここでこのサンプルは、１９０ｋＤａ、９０ｋＤａ（高血圧の遺伝子マーカー）および６５ｋＤａのＡＣＥアイソフォームについて確立された標準と比較される。流体（例えば、新鮮な尿または濃縮した尿）、細胞および組織のアリコートが処理され、１９０ｋＤａのＡＣＥおよびＮドメインＡＣＥ（９０ｋＤａ）（高血圧の遺伝子マーカー）および６５ｋＤａに対して特異的な抗体を使用し、標準として調製されたＡＣＥアイソフォームおよび組換えＡＣＥ酵素を分析コントロールとして使用するウェスタン・ブロッティングによって分析される。
【００５３】
〈高血圧のマーカーとしてのＡＣＥアイソフォーム〉
〔ヒト尿によって産生される高血圧の遺伝子マーカーとしてのアンギオテンシンＩ転換酵素のアイソフォーム（９０ｋＤａ、Ｎドメイン）〕
以前の研究に基づいて、本発明の研究者らは、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、正常血圧の個体の尿において、１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有するアンギオテンシンＩ転換活性を有する２つのピークを見出した。高血圧の親の尿を処理する場合、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量においてアンギオテンシンＩ転換活性を有する２つのピークが溶出されるプロフィールが得られ、１９０ｋＤａの形態は検出されなかった（Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２６：１１４５−１１４８、１９９５）。
【００５４】
本発明の目的の１つは、高血圧の遺伝子マーカーおよび高血圧の徴候としての９０ｋＤａのアイソフォームの可能性を確認することにある。
【００５５】
以下の試験群をこの目的のために確立した：
・正常血圧の親を有する正常血圧の個体
・高血圧の親を有する正常血圧の個体
・正常血圧の親を有する高血圧の個体、および
・高血圧の親を有する高血圧の個体。
【００５６】
収集した尿を別々に濃縮し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、次いでＮａＣｌ  １５０ｍＭを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＡｃＡ−３４カラムでのゲル濾過に供した。収集した画分（２ｍＬ）を、２８０ｎｍにおける吸光度を読み取ることによって、そしてヒプリル−Ｌ−Ｈｉｓ−Ｌ−Ｌｅｕ−およびＺ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを基質として使用してアンギオテンシンＩ転換活性によってモニタリングした。以下の結果を得た。正常血圧の親を有する正常血圧の個体は、ＡＣＥ活性を有する２つのアイソフォーム（１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）を示した（ｎ＝２１）；高血圧の親を有する正常血圧の個体は３つのアイソフォーム（１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）を示し（ｎ＝１３）、そして高血圧の親を有する高血圧の個体は２つのアイソフォーム（９０ｋＤａおよび６５ｋＤａ）を示した（ｎ＝１３）。予測されるように、アイソフォームは、正常血圧の親を有する高血圧群を構成するどの個体にも見出されなかった。
【００５７】
１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォーム、正常血圧を示し、かつ研究グループと接触した２人の個体を、４年間モニタリングした。尿中のアイソフォームの検出の４年後、彼らは高血圧になった。したがって、このことは、９０ｋＤａのアイソフォームが実際に高血圧の遺伝子マーカーであることを証明する。
【００５８】
〔結論〕
高血圧の親を有する正常血圧の個体の尿が１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有する３つのＡＣＥアイソフォームを示したことを考慮すると、初期に現れる９０ｋＤａのアイソフォームが、これらの個体が高血圧の個人であり得ることの徴候、したがって高血圧の遺伝子マーカーであることが示される。
【００５９】
〈質量分析およびウェスタン・ブロッティングによる、高血圧の遺伝子マーカーであるＡＣＥアイソフォームの定量および同定〉
〔ヒトの新鮮な尿のウェスタン・ブロッティング〕
プロテアーゼの「プール」（いくつかの阻害物質）の存在下で尿を１回収集し、次いでこの尿を濃縮し、そして１００μｇを７．５％のポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供し、その後ＰＶＤＦメンブレンでウェスタン・ブロッティングし、次いでこれをヒトＡＣＥに対するポリクローナル抗体Ｙ１と共にインキュベートした。レーン１：正常個体の尿、レーン２：ＡＣＥ野生組換え体、レーン３：分泌されたＡＣＥ組換え体、レーン４：高血圧の個体の尿。
【００６０】
〔質量分析器のための投薬〕
生の尿を３０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離し、その後Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）チューブ中で４倍濃縮し、次いで３０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離し、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  １ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した。次いで、これを３０００ｒｐｍで４℃で５分間遠心分離する。次いで、濃縮して透析した尿を得、したがって、調製したサンプルをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した。
【００６１】
ＨＰＬＣシステムにおいて使用した溶媒は、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からなる溶媒Ａであった。Ｎｏｖａ  Ｐａｋ  Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）逆相カラムにおいて、１．５ｍＬ／分の流動で１５分間尿を分離した。これらの条件は、この方法の分解能を改善するためになお標準化される。
【００６２】
〈ラット尿における分泌された高血圧の遺伝子マーカーとしてのアンギオテンシンＩ転換酵素のアイソフォーム（９０ｋＤａ）。ヒト尿での知見（９０ｋＤａのタンパク質についての遺伝子マーカーの断定）を証明するためのプロトコル設計〉
得られたクロマトグラフィー・プロフィールを比較することを目的として、かつ動脈高血圧の遺伝子マーカーとして９０ｋＤａ形態を特徴付ける目的で、同質遺伝子の正常血圧ラット（ＷＫＹおよびＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ）の尿中に存在したＥＣＡアイソフォームを、正常血圧の同質遺伝子の高血圧ラット（ＳＨＲ、ＳＨＲ−ＳＰ、Ｌｙｏｎ）の尿、同質遺伝子の正常血圧の実験的高血圧ラット（１Ｋ１ＣおよびＤＯＣＡ−Ｓａｌｔ）の尿および抗高血圧薬物で処置した同質遺伝子の高血圧ラット（ＳＨＲ＋エナラプリル）の尿においても同定した。
【００６３】
ＷＫＹラットの尿から、ＡＩ転換活性を有する２つのピークがＡｃＡ−４４樹脂でのゲル濾過によって分離された：第１のＷＫ−１は高分子量の酵素（１９０ｋＤａ）に対応し、第２のＷＫ−２は低分子量の酵素（６５ｋＤａ）に対応する。これらのデータをウェスタン・ブロッティングによって確認した。ＳＲＨ群において、クロマトグラフィー・プロフィールは、上述の群（ＷＫ）とは異なる結果を示し、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａではない処置された高血圧患者の尿中に見出されたものと類似の、８０ｋＤａの分子量を有するＳ−１と称されるＡＣＥおよび分子量６５ｋＤａの第２のピークＳ−２が同定された（Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９１）。ラット由来の８０ｋＤａの酵素とヒト尿由来の９０ｋＤａの酵素との間の分子量の差異は、糖化プロセスに起因して生じる（データ示さず）。
【００６４】
腎血管誘導された高血圧モデルである第３の群（１Ｋ１Ｃ）において、クロマトグラフィー・プロフィールは、コントロールとして使用したラット（ＷＫＹ）において見出されたプロフィールと類似であった。この群において、ＡＩ転換活性を有する２つのピークが得られた：第１のピークＣ−１は１９０ｋＤａの酵素に対応し、第２のピークＣ−２は６５ｋＤａの酵素に対応する。
【００６５】
ＡＩ転換活性を有する２つのピークを、ＡｃＡ−４４樹脂でのゲル濾過によってＳＨＲ−ＳＰラットの尿から分離した：ＳＨＲラットの尿中で見出されたものおよび未処置の高血圧患者の尿中でも見出されたピークと類似して、ＳＰ−１と称される第１のピークは８０ｋＤａの酵素に対応し、ＳＰ−２と称される第２のピークは６５ｋＤａの酵素に対応する（Ｃａｓａｒｉｎｉら、１９９１、１９９５）。
【００６６】
他方で、エナラプリルで処置したＳＨＲラットは、圧力が制御下にあるものの、これらのラットが８０ｋＤａのアイソフォームを保有することを示す。この事実は、このアイソフォーム・プロフィールが遺伝的要因に関連していることを示す。
【００６７】
コントロールとして使用したラット（ＤＯＣＡ−Ｓａｌｔモデル）の高血圧処置を投与されていない群において、クロマトグラフィー・プロフィールは、正常血圧のＷＫラットについて見出されたプロフィールと類似であった。ＡＩ転換活性を有する２つのピークが得られた：第１のピークＣＤ−１は１９０ｋＤａの酵素に対応し、第２のピークＣＤ−２は６５ｋＤａの酵素に対応する。
【００６８】
ＤＯＣＡおよび生理食塩水の投与によって誘導された低減された高血圧を有するＤＯＣＡ−Ｓａｌｔモデルは、ＤＯＣＡ−ＳａｌｔおよびＷＫコントロール・ラットにおいて見出されたクロマトグラフィー・プロフィールと類似のプロフィールを示した。ＡＩ転換活性を有する２つのピークが得られた：第１のピークＤ−１は１９０ｋＤａのＥＣＡに対応し、第２のピークＤ−２は６５ｋＤａのＥＣＡに対応する。この結果は、８０ｋＤａの存在が遺伝的要因に関連し、圧力上昇の結果ではないことを示す。
【００６９】
Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ正常血圧ラットの尿におけるゲル濾過の結果は、正常血圧ラットの尿において見出されたプロフィールと類似であった。ＡＣＥ活性を有する２つのピークが得られた：ＢＮ−１は１９０ｋＤａの酵素に対応し、第２のピークＢＮ−２は６５ｋＤａの酵素に対応する。このことは、正常血圧の異なる株が同じクロマトグラフィー・プロフィールを示すことを示している。
【００７０】
ＷＫラット（正常コントロール）、１Ｋ１Ｃラット（実験的高血圧−Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ）、ＤＯＣＡ−Ｓａｌｔラット（コントロール）、ＤＯＣＡ−Ｓａｌｔラット（実験的高血圧）および正常血圧のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットの尿のクロマトグラフィー・プロフィールを、ＳＨＲラット、ＬｙｏｎラットおよびＳＨＲ−ＳＰラット（遺伝的高血圧）の尿と比較すると、基本的な差異は、遺伝的高血圧ラットの尿中の８０ｋＤａのアイソフォームの存在であると断定され得る。８０ｋＤａのアイソフォームが１Ｋ１ＣラットおよびＤＯＣＡ−Ｓａｌｔラット（その高血圧は誘導されたものである（物理的要因））において出現しないことは、この８０ｋＤａのアイソフォームが遺伝的要因に関連するという仮説を補強する。
【００７１】
〔結論〕
見出された結果は、遺伝的に高血圧の素因を有するラットにおいて、８０ｋＤａの形態が１９０ｋＤａの代わりに検出され、結果としてこれが高血圧の早期遺伝子マーカーとして使用されることを示唆する。
【００７２】
〈ラット尿における高血圧の遺伝子マーカーであるアンギオテンシンＩ転換酵素のアイソフォーム（９０ｋＤａ、Ｎドメイン）の分離。ラット尿における高血圧の遺伝子マーカー（９０ｋＤａのタンパク質）の存在を示すためのプロトコル設計。自然発症高血圧（ＳＨＲ）ラットとＢＲＯＷＮ  ＮＯＲＷＡＹ（ＢＮ）ラットとの交雑〉
以前のプロジェクトにおいて、異なる実験モデル（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ、ＳＨＲ、１Ｒ１Ｃ、ＤＯＣＡ−ｓａｌｔコントロール、ＤＯＣＡ−ｓａｌｔ、ＳＨＲ−ＳＰおよびＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ）において、ラットの尿中で低分子量の異なるアイソフォームが特徴付けられた。９０ｋＤａの形態はＳＨＲラットおよびＳＨＲ−ＳＰラットのみにおいて出現することが観察され、このことは、このような形態の存在についての遺伝的要因を示す。このプロジェクトにおいて、１９０ｋＤａ、８０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアンギオテンシンＩ転換酵素アイソフォームの遺伝子伝達、ＳＨＲ種とＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ種との間での交雑および戻し交雑から生じたラットの尿における遺伝型分析および表現型分析が研究される。
【００７３】
〔交雑の素描〕
Ｂｒｏｗｎ  ＮｏｒｗａｙラットとＳＨＲラットとの間の交雑（ＢＮ×ＳＨＲ）を実施し、Ｆ１ＳＢ０１〜Ｆ１ＳＢ０４と称されるヘテロ接合性ラットの群を生じた；この群から２匹の動物（Ｆ１ＳＢ０１およびＦ１ＳＢ０３）（ＳＨＲラット（メス）との戻し交雑を実施するためのオス）を選択した。表現型決定のために、これらの動物の尿を収集して濃縮し、次いでＮａＣｌ  ０．１５Ｍを含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ  ０．０５Ｍ緩衝液（ｐＨ８．０）と共にＡｃＡ−３４ゲル濾過カラム・クロマトグラフィーに供した。２．０ｍｌの画分を２０ｍｌ／時間の流動下で溶出させ、Ａ２８０ｎｍで測定した吸光度および基質としてＺ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ＺＰｈｅＨＬ）を使用したＡＣＥ酵素活性によってモニタリングした。
【００７４】
〔結果〕
親：それぞれ１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの概算された分子量を有する、ＡＣＥ活性を有する２つのピークがＢＮラットの尿から溶出され、これらをＡｃＡ−４４、ＢＮ−１およびＢＮ−２のカラム・クロマトグラフィーに供した。他方で、ＳＨＲラットの尿中に、転換活性を有するがそれぞれ９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの概算された分子量を有する２つのピークが見出された。
【００７５】
Ｆ１において３９匹の動物が生まれ、このうち１００％が１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの３つの酵素形態についてヘテロ接合性であると表現型決定された。戻し交雑から動物が生まれ、そのうち８５％は３つの酵素アイソフォームを示し（ＮＨ群）、１５％は９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの形態を示した（Ｈ群）。
【００７６】
〔結論〕
得られた結果から、９０ｋＤａのアイソフォーム（動脈高血圧の遺伝子マーカー）は、交雑および戻し交雑に起源する世代において存在し続けることが示唆される。
【００７７】
〈Ｗｉｓｔａｒおよび同質遺伝子のＷｉｓｔａｒと比較した、自然発症高血圧のラットの組織（大動脈、副腎、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓）における高血圧の遺伝子マーカーである９０ｋＤａのアイソフォームの発現〉
Ｗｉｓｔａｒにおいて１９０ｋＤａおよび６５ｋＤａが以前の研究において同定されており、そのプロフィールは正常血圧の個体について記載されたプロフィールと類似である。８０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームがＳＨＲラットの尿中で同定されているが、Ｎ末端ＥＣＡフラグメントは、軽い高血圧の個体について見出されたプロフィールを反復する。
【００７８】
ホモジネートをゲル濾過クロマトグラフィーに供し、異なるＷラットおよびＷ１ラットの組織においてＨＨＬ基質に対する活性を有する２つのピークが検出され、１３７ｋＤａおよび９６ｋＤａであるこれらの分子量は、Ｗラットについて言及された分子量と類似である（表Ｉ）。ＳＨＲラットの組織もまた、その概算の分子量が９６ｋＤａおよび６９ｋＤａである、活性を有する２つのピークを示し、このプロフィールは、このラットの尿中に含まれる酵素について見出されたプロフィールに対応した。１３７ｋＤａおよび６９ｋＤａのアイソフォームのタンパク質発現が、Ｗｉｓｔａｒラットおよび同質遺伝子のＷｉｓｔａｒラットから得られた研究したすべての組織においてウェスタン・ブロッティング技術によって観察された。同じ技術を使用して、ＳＨＲラットのすべての組織の９６ｋＤａおよび６９ｋＤａのアイソフォームの発現を確認した（表Ｉ）。得られた結果は、Ｗ組織およびＷＩ組織における６９ｋＤａのアイソフォーム（１３７ｋＤａのアイソフォームに加えて）の発現ならびにＳＨＲラット組織における９６ｋＤａおよび６９ｋＤａのアイソフォームの発現を示し、このことは、Ｎドメイン・アイソフォームの発現、より具体的には９６ｋＤａのアイソフォーム（高血圧の遺伝子マーカー）の発現が尿および／または腎臓に限定されるだけではなく、研究した組織においても局所的に存在するという結論をもたらす。
【００７９】
【表１】
2006510365.tif 000004
【００８０】
〈Ｗｉｓｔａｒラットと比較した自然発症高血圧のラット培養物中のメサンギウム細胞における、高血圧の遺伝子マーカーである９０ｋＤａのアイソフォームの発現〉
糸球体を、ＧｒｅｅｎｓｐｏｎおよびＫｒａｋｏｍｅｒの方法（１９５０）に従ってＷｉｓｔａｒラットおよびＳＨＲラットから単離した。硫酸エーテル雰囲気下にラットを置き、両側性腎摘出に供した。腎臓から被膜を除去し、皮質の巨視的解剖を実施した。皮質を髄質から分離し、次いで断片を、メッシュの開口に従ってサイズが異なる一連の篩（６０メッシュ、１００メッシュおよび２００メッシュ）にかけた。糸球体を３番目の篩の表面から収集し、糸球体から被膜を除去することを目的として（２５×７）の針に通した。被膜除去した糸球体を、Ｎｅｗｂａｕｅｒチャンバを使用して計数し、２０％のウシ胎仔血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ（２．６ｇ）およびグルタミン２ｍＭを補充したＲＰＭＩ  １６４０を使用して、２５ｃｍ２のビンに約３００個の糸球体／ｃｍ２の密度で分割した。この培養ビンをＣＯ２（５％）中で３７℃で維持した。３６時間毎に培地を交換した。約３週間後、メサンギウム細胞の初代培養物をトリプシンに供した。二次培養物を同じ培地中で増殖させた。この手順を３番目の二次培養物まで反復し、ここで細胞を実験のために調製した：メサンギウム細胞（ＭＣ）（３番目の二次培養物）をウシ胎仔血清なしのＲＰＭＩと共に２０時間インキュベートし、さらに、ＭＣおよび培地を別々に収集した。
【００８１】
３番目の二次培養物において収集した培地を、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器中で濃縮した。濃縮した培地（２．０ｍＬ）を、ＮａＣｌ  １５０ｍＭを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＡｃＡ−４４（１．５×１００．８ｃｍのカラム；容量１７８．０ｍＬ）でのゲル濾過に供した。２０ｍＬ／時間の流動下で２．０ｍＬの画分を収集した。１時間に２０ｍＬの流動下で溶出を実施した。２ｍＬの画分を収集し、２８０ｎｍでの吸光度測定によってモニタリングし、その酵素活性をヒプリル−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（ＨＨＬ）を使用することによって定量した。
【００８２】
収集したＣＭを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４  １％およびＰＭＦＳ  ０．５ｍＭを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）４ｍＬで、１時間の機械的攪拌によって４℃で溶解させた。この期間の後に、溶解した細胞を遠心分離し、上清を収集して、３ｋｇｆ／ｃｍ２の窒素圧下でＡｍｉｃｏｎ濃縮器で濃縮した。さらに、２ｍＬをゲル濾過クロマトグラフィーに供した。
【００８３】
ＷｉｓｔａｒラットおよびＳＨＲラットの培養物中のＭＣについて得られた結果は、正常な個体および中程度の高血圧の患者のヒト尿ならびにＷｉｓｔａｒラットおよびＳＨＲラットの尿について得られたのと同じクロマトグラフィー・プロフィールを示し、したがって、腎臓、より具体的には糸球体において、すでに言及した異なるアイソフォームが産生されることを確認する（表ＩＩ）。
【００８４】
【表２】
2006510365.tif 000005
【００８５】
〔最終的な結論〕
高血圧の患者／ＳＨＲのＭＣ／ＳＨＲラットの尿中にのみ９０ｋＤａのＡＣＥが出現することに基づいて、９０ｋＤａのＡＣＥが高血圧の遺伝子マーカーとして重要かつ特異的な役割を有し得ることが示唆される。
【００８６】
親および子供で得られた研究に基づき、１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアイソフォームが高血圧の親由来の正常な個体中に存在することが観察され、このことは、このアイソフォームの分離を示し、したがって、これが高血圧を予測するものとして特徴付けられ得ることを示す。これらのデータを、Ｂｒｏｗｎ  ＮｏｒｗａｙラットとＳＨＲラットとの交雑および戻し交雑において確認した（表ＩＩＩ）。
【００８７】
【表３】
2006510365.tif 000006
【００８８】
〔参考文献〕
・ＬＡＮＺＩＬＬＯ  ＪＪ，ＦＡＮＢＵＲＧ  ＢＬ．Ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４９１：３３９−３４４，１９７７．
・ＮＩＳＨＩＭＵＲＡ  Ｋ，ＹＯＳＨＩＤＡ  Ｎ，ＨＩＷＡＤＡ  Ｋ，ＵＥＤＡ  Ｅ，ＫＯＫＵＢＵ  Ｔ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５２２：２２９−２３７，１９７８．
・ＮＡＧＡＭＡＴＳＵ  Ａ，ＩＮＯＫＵＣＨＩ  ＪＩ，ＳＯＩＤＡ  Ｓ．Ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２８：４５９−４６４，１９８０．
・ＴＡＫＡＤＡ  Ｙ，ＨＩＷＡＴＡ  Ｋ，ＫＯＫＵＢＵ  Ｔ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９０：１３０９−１３１９，１９８１
・ＩＷＡＴＡ  Ｋ，ＢＬＡＣＨＥＲ  Ｒ，ＳＯＦＦＥＲ  ＲＬ，ＬＡＩ  ＣＨＵＮＬＡＷ．Ｒａｂｂｉｔ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ：ｔｈｅ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎａｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ＮＨ４ＯＨ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２２７：１８８−２０１，１９８３．
・ＹＯＴＳＵＭＯＴＯ  Ｈ，ＬＡＮＺＩＬＬＯ  ＪＪ，ＦＡＮＢＵＲＧ  ＢＬ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ９００００  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｏｒ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７４９：１８０−１８４，１９８３．
・ＬＡＮＴＺ  Ｉ，ＮＹＢＥＲＧ  Ｆ，ＴＥＲＥＮＩＵＳ  Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ２３：９４１−９４８，１９９１．
・ＤＥＤＤＩＳＨ  ＰＡ，ＷＡＮＧ  Ｊ，ＭＩＣＨＥＬ  Ｂ，ＭＯＲＲＩＳ  ＰＷ，ＤＡＶＩＤＳＯＮ  ＮＯ，ＳＫＩＤＧＥＬ  ＲＡ，ＥＲＤＯＳ  ＥＧ．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  Ｎ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：７８０７−７８１１，１９９４．
・ＲＹＡＮ  ＪＷ，ＯＺＡ  ＮＢ，ＭＡＲＴＩＮ  ＬＣ，ＰＥＮＡ  ＧＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ−ｋｉｎｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ，ｉｎ  Ｋｉｎｉｎ  ＩＩ（ｖｏｌ  １０），ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｕｊｉ  Ｓ，Ｍｏｒｙｉａ  Ｈ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，Ｐｌｅｎｕｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８，ｐｐ  ３１３−３２３．
・ＫＯＫＵＢＵ  Ｔ，ＫＡＴＯ  Ｉ，ＮＩＳＨＩＭＵＲＡ  Ｋ，ＨＩＷＡＤＡ  Ｋ，ＵＥＤＡ  Ｅ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｕｒｉｎｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ８９：３７５−３７９，１９７８．
・ＳＫＩＤＧＥＬ  ＲＡ，ＷＥＡＲＥ  ＪＡ，ＥＲＤＯＳ  ＥＧ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ｋｉｎｉｎａｓｅ  ＩＩ）．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２：１４５−１５２，１９８７
・ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｃａｏ  ｅ  ｃａｒａｃｔｅｒｉｚａｃａｏ  ｄｅ  ｄｕａｓ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ  ｃｏｍ  ａｔｉｖｉｄａｄｅ  ｃｉｎｉｎａｓｉｃａ  ｅｎｃｏｎｔｒａｄａｓ  ｅｍ  ｕｒｉｎａ  ｈｕｍａｎａ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｃａｏ  ｄｅ  Ｍｅｓｔｒａｄｏ  ａｐｒｅｓｅｎｔａｄａ  ａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄｅ  Ｆｅｄｅｒａｌ  ｄｅ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ，Ｅｓｃｏｌａ  Ｐａｕｌｉｓｔａ  ｄｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ，１９８３．
・ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＲＩＢＥＩＲＯ  ＥＢ，ＳＣＨＯＲ  Ｎ，ＳＩＧＵＬＥＭ  Ｄ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｋｉｄｎｅｙ．Ａｒｑ．Ｂｉｏｌ．Ｔｅｃｎｏｌ．３０（１）：５８，１９８７．
・ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＡＬＶＥＳ  ＫＢ，ＣＯＳＴＡ  ＲＨ，ＰＬＡＶＩＮＩＣ  ＦＬ，ＭＯＲＥＩＲＡ  ＭＥＭ，ＲＯＤＲＩＧＵＥＳ  ＣＩＳ，ＭＡＲＳＯＮ  Ｏ．（１９９１）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｕｒｅｔｉｃ  ｕｐｏｎ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＡＣＥ）ｏｆ  ｅｓｓｅｎｃｉａｌ  ｍｉｌｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＥＰＨ）．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １７（３）：４６３．
・ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＡＬＶＥＳ  ＫＢ，ＡＲＡＵＪＯ  ＭＳ，ＳＴＥＬＬＡ  ＲＣＲ．Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｕｒｉｎｅ  ｗｈｉｃｈ  ｈｙｄｒｏｌｙｚｅ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ．Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ２５：２１９−２２９，１９９２．
・ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＣＡＲＭＯＮＡ  ＡＫ，ＰＬＡＶＩＮＩＫ  ＦＬ，ＪＵＬＩＡＮＯ  Ｌ，ＺＡＮＥＬＬＡ  ＭＴ，ＲＩＢＥＩＲＯ  ＡＢ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｃａ２＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ  ａｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２６（６），ｐａｒｔｅ  ＩＩ，１１４５−１１４８，１９９５．
・ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＰＬＡＶＩＮＩＫ  ＦＬ，ＺＡＮＥＬＬＡ  ＭＴ，ＭＡＲＳＯＮ  Ｏ，ＫＲＩＥＧＥＲ  ＪＥ，ＨＩＲＡＴＡ  Ｉ  Ｙ，ＳＴＥＬＬＡ  ＲＣＲ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｍｉｌｄ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｓｅｍｂｌｅ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３３：７５−８５，２００１．
・ＡＬＶＥＳ  ＫＢ，ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＣＯＳＴＡ  ＲＨ，ＰＬＡＶＩＮＩＣ  ＦＬ，ＰＯＲＴＥＬＡ  ＪＥ  ａｎｄ  ＭＡＲＳＯＮ  Ｏ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ（ＡＣＥ）ｆｒｏｍ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｉｌｄ  ｈｉｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ（ＥＨＰ）ｗｉｔｈ  ｄｉｕｒｅｔｉｃ：ｐａｒｔｉａｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３８／ＩＩＩ：２７０−２７７，１９９２．ＣＯＳＴＡ  ＲＨ，ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＰＯＲＴＥＬＡ  ＪＥ，ＰＬＡＶＩＮＩＫ  ＦＬ，ＡＬＶＥＳ  ＫＢ，ＭＡＲＳＯＮ  Ｏ  Ｅｎｚｉｍａｓ  ｃｏｎｖｅｒｓｏｒａｓ  ｄｅ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎａ  ｅｎ  ｏｒｉｎａ  ｄｅ  ｈｉｐｅｒｔｅｎｓｏｓ  ｒｅｎｏｖａｓｃｕｌａｒｅｓ，ｎｏ  ｔｒａｔａｄｏｓ  ｃｏｎ  ｄｉｕｒｅｔｉｃｏｓ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｙ  ｃａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅｖｉｓｔａ  Ｅｓｐａｎｈｏｌａ  ｄｅ  Ｎｅｆｒｏｌｏｇｉａ  ２３（Ｓ５）：１４−１７，１９９３．
・ＣＯＳＴＡ  ＲＨ，ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ，ＰＬＡＶＮＩＫ  ＦＬ，ＭＡＲＳＯＮ  Ｏ，ＡＬＶＥＳ  ＫＢ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｉ−ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｒｅｎｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４６：２３７−２４６，２０００．
・ＢＡＧＧＩＯ  Ｂ，ＦＡＶＡＲＯ  Ｓ，ＣＡＮＴＡＲＯ  Ｓ，ＢＥＲＴＡＺＺＯ  Ｌ，ＦＵＮＺＩＯ  Ａ，ＢＯＲＳＡＴＴＩ  Ａ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｐｐｅｒ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １０９：２１１−２１８，１９８１．
・ＫＡＴＯ  Ｉ，ＴＡＫＡＴＡ  Ｋ，ＮＩＳＨＩＭＵＲＡ  Ｋ，ＨＩＷＡＤＡ  Ｋ，ＫＯＫＵＢＵ  Ｔ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｃ１ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０：４７３−４７６，１９８２．
・ＡＮＤＲＡＤＥ  ＭＣＣ，ＱＵＩＮＴＯ  ＢＭＲ．，ＣＡＲＭＯＮＡ  ＡＫ，ＲＩＢＡＳ  ＯＳ，ＢＯＩＭ  ＭＡ，ＳＣＨＯＲ  Ｎ，ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １６：２０６３−２０７４，１９９８．
・ＨＡＴＴＯＲＩ  ＭＡ，ＤＥＬ  ＢＥＭ  Ｇ，ＣＡＲＭＯＮＡ  ＡＫ，ＣＡＳＡＲＩＮＩ  ＤＥ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ（ｈｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）ｉｎ  ｕｒｉｎｅ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｌｌ  ｔｅｒｍ  ｉｎｆａｎｔｓ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３５：１２８４−１２９０，２０００．
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ヒト尿のＡｃＡ−３４カラムにおけるゲル・クロマトグラフィー濾過を示す図である。（Ａ）：正常血圧の子供／正常血圧の親（２８０ｎｍで−ＨＨＬ基質に対するＡＣＥ活性），（Ｂ）：正常血圧の子供／高血圧の親（２８０ｎｍで−ＨＨＬ基質に対するＡＣＥ活性），（Ｃ）：高血圧の子供／高血圧の親（２８０ｎｍで−ＨＨＬ基質に対するＡＣＥ活性）。  高血圧の親を有する正常血圧の個人の尿は、１９０ｋＤａ、９０ｋＤａおよび６５ｋＤａの分子量を有する３つのＡＣＥアイソフォームを示し、このことは、９０ｋＤａの未熟アイソフォームが出現することを示し、したがって、これらの個人（個体）が高血圧になり得ることの徴候であること、したがって、高血圧の遺伝子マーカーであることを示す。
【図２Ａ】９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアンギオテンシンＩ転換酵素アイソフォームのＮ末端配列およびＣ末端配列を示す図である。
【図２Ｂ】９０ｋＤａおよび６５ｋＤａのアンギオテンシンＩ転換酵素アイソフォームのＮ末端配列およびＣ末端配列を示す図である。６５ｋＤａの酵素は、４８１番のアミノ酸で終わる。９０ｋＤａの酵素は、６３２番のアミノ酸で終わる。
【図３】新鮮なヒト尿のウェスタン・ブロッティングを示す図である。レーン１：正常人の尿、レーン２：野生ＡＣＥ組換え体、レーン３：分泌されたＡＣＥ組換え体、レーン４：高血圧患者の尿。
【図４】質量分析器による投薬のスキームを示す図である。このスキームは、５つのステップを示す。このスキームは、生の尿で開始し、第２のステップは３０００ｒｐｍの速度および４℃の温度で１０分間の遠心分離である。第３のステップにおいて、尿はＵｌｔｒａｆｒｅｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）チューブ中で４×（４倍）濃縮され、３０００ｒｐｍおよび４℃で５分間遠心分離され、次いで第４のステップに進み、ここで濃縮された尿はｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ  １ｍＭ緩衝液（ｐＨ８．０）での透析を経て、３０００ｒｐｍおよび４℃で５分間遠心分離されて濃縮された尿を生じ、そして透析され、最終的には第５のステップがＨＰＬＣ−ＭＳを生じる。
【図１】
2006510365.tif 000007
【図２Ａ】
2006510365.tif 000008
【図２Ｂ】
2006510365.tif 000009
【図３】
2006510365.tif 000010
【図４】
2006510365.tif 000011
【国際調査報告】
2006510365.tif 000012
2006510365.tif 000013
2006510365.tif 000014