(57)【要約】本発明は、ヒトを含むメスの哺乳動物で、排卵頻度およびそれによる生殖能力を調整する組成物および方法を提供する。本発明は、生殖能力の変化に関連するＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子での新規な変異にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、３、または５；
ｂ）ａ）により特定される分子に相補的な配列；
ｃ）ａ）またはｂ）の配列の機能的断片または変種；
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）により特定されるいずれかの分子のアンチセンス配列；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む、単離変異ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、または１７；
ｂ）ａ）により特定される分子に相補的な配列；
ｃ）ａ）またはｂ）により特定されるいずれかの分子のアンチセンス配列；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む、単離変異ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項３】
受容体結合および／または二量化と関連する配列の少なくとも一つのコドンにて一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項４】
この核酸配列によりコードされるポリペプチドで、この変異によりアミノ酸が置換する、請求項３記載の単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項５】
このアミノ酸置換が受容体結合ドメインに存在し、受容体結合を阻害する、請求項４記載の単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項６】
このアミノ酸置換が二量化ドメインに存在し、二量化を阻害する、請求項４記載の単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項７】
受容体結合および／または二量化と関連する少なくとも一のコドン配列にて一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項８】
この核酸配列によりコードされるポリペプチドで、この変異によりアミノ酸が置換する、請求項７記載の単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項９】
このアミノ酸置換が受容体結合ドメインに存在し、受容体結合を阻害する、請求項８記載の単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項１０】
このアミノ酸置換が二量化ドメインに存在し、二量化を阻害する、請求項８記載の単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項１１】
ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法であって、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＢＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号１１または１７の変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９Ｂ配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定する；
という工程を含む方法。
【請求項１２】
ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法であって、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号５の変異ＧＤＦ−９ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定する
という工程を含む方法。
【請求項１３】
ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定するためのマーカーとして、配列番号１１または１７の変異ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的である核酸分子の使用。
【請求項１４】
排卵過多または不妊のどちらかに関連する遺伝子型を所有する哺乳動物のマーカー補助選択法で、請求項１３に記載のマーカーの使用。
【請求項１５】
ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定するためのマーカーとして、配列番号５の変異ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的である核酸分子の使用。
【請求項１６】
排卵過多または不妊のどちらかに関連する遺伝子型を所有する哺乳動物のマーカー補助選択法における、請求項１５に記載のマーカーの使用。
【請求項１７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１１または１７の変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡのどちらかの鎖に特異的にハイブリダイズしうるプローブ。
【請求項１８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号５の変異ＧＤＦ−９ＤＮＡのどちらかの鎖にハイブリダイズしうるプローブ。
【請求項１９】
請求項１または２記載の核酸分子を含む構成物。
【請求項２０】
請求項１または２記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２１】
本明細書に導入した請求項１９または２０記載の構成物またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１記載の宿主細胞を含む細胞系。
【請求項２３】
排卵を調節するために、メスの哺乳動物でＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物活性を改変する方法であって、
ａ）内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂへの部分的免疫応答を誘導し、その生物活性を部分的に減少させ、排卵を促進させること；または
ｂ）内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂへの完全免疫応答を誘導し、その生物活性を実質的に減少させ、不妊を誘導すること；
のどちらかの工程を含む方法。
【請求項２４】
免疫応答が、
ｉ）ＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＤＦ−９の機能的断片または変種；および／または
ｉｉ）ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド、またはＧＤＦ−９Ｂの機能的断片または変種；
を医薬上または獣医学上許容できる担体および／または希釈剤と共に含む抗原性組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより誘導される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
この抗原性組成物が、部分的免疫応答を誘導し、排卵過多を誘導する緩やかな補強剤を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
この抗原性組成物が、完全免疫応答を誘導し、不妊を誘導する強力な補強剤を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
この部分的免疫応答が短期免疫化レジュメにより誘導される、請求項２３から２６のいずれか一に記載の方法。
【請求項２８】
この完全免疫応答が長期免疫化レジュメにより誘導される、請求項２３から２６のいずれか一に記載の方法。
【請求項２９】
この免疫応答が、この抗原性組成物に対して生じる抗体を投与することにより受動的に誘導される、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
部分的免疫応答を誘導し、排卵過多を誘導する短期レジュメにより、この抗体を投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
完全免疫応答を誘導し、不妊を誘導する長期レジュメにより、この抗体を投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
この完全免疫応答が一時的および／または可逆的であり、この誘導した不妊が避妊を含む、請求項２３、２４、２６、２８、２９、および３１のいずれか一に記載の方法。
【請求項３３】
この完全免疫応答およびこの誘導した不妊が永久的である、請求項２３、２４、２６、２８、２９、および３１のいずれか一に記載の方法。
【請求項３４】
排卵過多の哺乳動物を繁殖させる方法であって、
ａ）繁殖の提案のあったメスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定し；
ｂ）繁殖の提案のあったオスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定し；
ｃ）以下の特徴
ｉ）Ａ）配列番号５；または
Ｂ）Ａ）の分子の機能的変種または断片；または
Ｃ）Ａ）またはＢ）の分子に相補的な配列；
を含む、変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列の単一コピー；および／または
ｉｉ）Ａ）配列番号１１または１７；または
Ｂ）Ａ）の分子に相補的な配列
を含む、変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列の単一コピー
を有する子孫をもたらすであろうメスおよびオスの哺乳動物を選択すること
という工程を含む方法。
【請求項３５】
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの単一変異コピーを有するようにこの哺乳動物を選択した、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
大きな排卵頻度を示す遺伝子型を有するメスの哺乳動物を繁殖について選択する方法であって、該遺伝子型が：
１）ａ）配列番号５；または
ｂ）ａ）の分子の機能的変種；または
ｃ）ａ）またはｂ）の分子に相補的な配列；
を含む変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列、および／または
２）ａ）配列番号１１または１７；または
ｂ）ａ）の分子に相補的な配列
を含む変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列
の単一変異コピーを含み、請求項１１および／または１２の方法に従って該哺乳動物を同定し、当該哺乳動物を選択することを含む、方法。
【請求項３７】
選択される哺乳動物がＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの単一変異コピーの両方を有する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
メスの哺乳動物に補助的ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ、またはそのアナログ、あるいはＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂアンタゴニストを投与することにより、黄体機能を修飾する方法。
【請求項３９】
内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の一のコピーがノックアウトされている、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項４０】
ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性を有する蛋白をコードする遺伝子の一のコピーを欠くゲノムを有するトランスジェニックヒツジを含む、請求項３９記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
配列番号２、３、または６からなる群より選択したアミノ酸配列を含む単離変異ＧＤＦ−９ポリペプチド、またはその機能的断片あるいは変種。
【請求項４２】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、または１８からなる群より選択したアミノ酸配列を含む単離変異ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１から１０のいずれか一に記載の単離核酸、または請求項４１あるいは４２に記載の単離ポリペプチド、および医薬上許容できる担体、を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、哺乳動物の排卵機能および排卵頻度を改変する新しい配列に関する。
特に、本発明は、広くは、ＧＤＦ−９遺伝子の新規な変異およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の二の新規な変異に関する。これらの変異は、ヘテロ接合のメスの哺乳動物で排卵頻度を増加させること；またはホモ接合のメスの哺乳動物で不妊を引き起こすことに関係することが見出された。
【０００２】
（背景技術）
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ（ＢＭＰ１５としても知られている）遺伝子は、発育中の卵胞の卵母細胞でのみ発現し、哺乳動物の生殖能力に不可欠な役割を果たす蛋白をコードする。ＧＤＦ−９は、卵胞発育の一次段階から排卵まで卵母細胞で発現する形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリー（McPherronおよびLee、1993）のメンバーである（McGrathら、1995; Laitinenら、1998)。ＧＤＦ−９ＢはＧＤＦ−９に密に関連しており（Dubeら、1998; Laitinenら、1998）、マウスの卵母細胞ではＧＤＦ−９と同時に発現するが、ヒトの一次卵胞ではＧＤＦ−９より少し遅れる。卵巣では、現在、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは、ヒト（Aaltonenら、1999）、齧歯動物（Laitinenら、1998; Dubeら、1998; Jaatinenら、1999）、反芻動物（Bodensteinerら、1999; Bodensteinerら、2000; Gallowayら、2000)、および有袋動物（Eckeryら、2002）で、発育中の卵母細胞にのみ発現することがわかっている。ヒツジでは、ＧＤＦ−９の発現は原始卵胞で見られるが、ＧＤＦ−９Ｂは一次卵胞で発現する（Bodensteinerら、1999; Gallowayら、2000）。
【０００３】
ＧＤＦ−９はマウスで卵胞発生に不可欠な成長因子である。メスのＧＤＦ−９ノックアウトマウス（ＧＤＦ−９−／−）は、卵胞発育を一次段階で遮断されるため、生殖不能である（Dongら、1996）。メスのノックアウトマウス（ＢＭＰ１５−／−）は、生殖能力が少し減少するものの、生殖可能である（Yanら、2001）ので、ＧＤＦ−９Ｂはマウスの卵胞発生に決定的ではないようである。しかし、自然発生の不活化ＧＤＦ−９Ｂ変異の二のコピーを保有するヒツジは、卵胞発育を一次段階で遮断されるため生殖不能である（Gallowayら、2000）ので、ＧＤＦ−９Ｂはヒツジで卵胞発生に不可欠である。
ヒツジでは、ＧＤＦ−９Ｂの一のコピーに不活化変異を保有するヘテロ接合体（そのため、該遺伝子の一のコピーだけが活性蛋白を生成する）は排卵頻度が増加していることも明らかである（Gallowayら、2000）。ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのどちらかがノックアウトなヘテロ接合マウスでは、同様の排卵頻度の増加は観察されていない（Yanら、2001）。マウスのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ両方のダブルノックアウトは、ＧＤＦ−９−／−マウスと同様の表現型のみと生殖不能であるが、ＧＤＦ−９の一の活性コピーを有するＧＤＦ−９Ｂノックアウトマウス（ＢＭＰ１５−／−）はＢＭＰ−／−のメスより生殖能力が低く、これらの遺伝子生成物の相対量もマウスで役割を果たしているのかもしれないということが示される。集合的に、これらの発見は、排卵が高頻度の表現型の種（例えば、マウス、ラット）および排卵が低頻度の表現型の種（例えば、ヒツジ、ヒト）の間のＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの作用に重要な違いがあるということを示す。
【０００４】
ＧＤＦ−９は、ヒト５番染色体およびマウス１１番染色体上のＧＤＦ−９のマップ位置にシンテニーなヒツジの５番染色体領域に位置する（Sadighiら、2002）。ＧＤＦ−９Ｂは、ヒトおよびマウスのＸ染色体上のＧＤＦ−９Ｂのマップ位置（Dubeら、1998; Aaltonenら、1999）にシンテニーな染色体領域のヒツジＸ染色体に位置する（Gallowayら、2000）。
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは、ＴＧＦβファミリーの他のメンバーと同様に、シグナルペプチドを含有するプレプロペプチド、前駆領域、および生物学的活性のあるペプチドであるＣ末端成熟領域としてコードされる。前駆領域からの成熟領域の開裂は、細胞内フリン様プロテアーゼにより実施され、保存的フリンプロテアーゼ開裂部位で生じる。ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーは二量体としての生物学的活性を有し、該ファミリーの他のメンバーで見られる鎖間ジスルフィド共有結合の責任分子であるシステインを含有しないが、これらの分子は二量体としての生物学的活性を有すると考えられる（Gallowayら、2000; Yanら、2001）。しかし、生理学的活性を有する二量体がホモダイマー（ＧＤＦ−９−ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ−ＧＤＦ−９Ｂ）であるかヘテロダイマー（ＧＤＦ−９−ＧＤＦ−９Ｂ）であるか、または全ての三の二量体の形態が役割を果たすのか、ということは明らかでない。上記の模式に基づいて、ＧＤＦ−９ホモダイマーはマウスでより重要な役割を果たすが、ヒツジでは、ＧＤＦ−９Ｂホモダイマーが最も生物活性が強いということが仮定されてきた（Yanら、2001）。ヒツジは単排卵動物（通常、一周期につき一卵子だけ成熟させる）であるが、マウスは複排卵であるという事実に、そのような違いのいずれが関連するのかは明らかでない。明らかに、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの両方が哺乳動物の生殖能力を調節し、維持するのに決定的な役割を果たしており、それらの作用の本質を理解することが治療の開発に不可欠である。
【０００５】
ヒツジのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ
ヒツジのＧＤＦ−９遺伝子は約２．５ｋｂであり、一の１１２６ｂｐのイントロンにより分離される二のエキソンを含有する（Bodensteinerら、1999）。配列をコードする全長は１３５９ヌクレオチドであり、４５３アミノ酸残基のプレプロペプチドをコードする（Genbank accession number AF078545）。３１８残基のプレプロ領域は予測シグナル配列を含み、３１５から３１８番目の残基で、ＲＨＲＲフリンプロテアーゼ開裂部位にて終わる。開裂部位以降の３１９から４５３番目の残基は１３５のアミノ酸成熟活性ペプチドをコードする。ヒツジのＧＤＦ−９成熟ペプチドのアミノ酸配列は、ヒトの成熟ペプチドに９２．８％相同であり、マウスの成熟ペプチドに８７．１％相同である。
ヒツジのＧＤＦ−９Ｂは、以前、本発明者らにより配列決定され（Gallowayら、2000; Genbank accession nos. AF236078, AF236079）、ＧＤＦ−９にかなり似た遺伝子構造を有する。１１７９ヌクレオチドの配列をコードする全長は、二のエキソンに含有され、約５．４ｋｂのイントロンに分離され、３９３アミノ酸残基のプレプロペプチドをコードする。２６８残基のプレプロ領域は予測シグナル配列を含み、２６５から２６８番目の残基で、ＲＲＡＲフリンプロテアーゼ開裂部位にて終わる。開裂部位以降の２６９から３９３番目の残基は、１２５のアミノ酸成熟活性ペプチドをコードする。ヒツジのＧＤＦ−９Ｂ成熟ペプチドのアミノ酸配列は、ヒトの成熟ペプチドに７８．３％相同であり、マウスの成熟ペプチドに７８．６％相同である。
【０００６】
本発明者らは、以前、インバーデールおよびハンナヒツジでの多産への影響は、ＧＤＦ−９Ｂにおける自然発生変異のためであるということを示した（Gallowayら、2000）。インバーデールおよびハンナヒツジの両方は、変異ＧＤＦ−９Ｂのヘテロ接合保因者で排卵頻度が増加したが、メスのホモ接合保因者では、「線状」卵巣で生殖不能である（Davisら、2001）。これらのヒツジでの生殖不能は、卵胞が一次段階以降に発育できないことにより起こる一次卵巣不全のためである。ハンナヒツジは、配列をコードするＧＤＦ−９Ｂの８７１番目のヌクレオチド（成熟ＧＤＦ−９Ｂペプチドコード領域の６７番目のヌクレオチド）で単一のＣからＴへの変異を有し、２９１番目のアミノ酸残基（成熟蛋白の２３番目の残基）のグルタミン酸（Ｑ）の位置に未熟停止コドンを生成する。インバーデールヒツジは、８９６番目のヌクレオチド（成熟ＧＤＦ−９Ｂペプチドコード領域の９２番目のヌクレオチド）で別のＴからＡへの変異を有し、２９９番目の残基（成熟ペプチドの３１番目の残基）でバリン（Ｖ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換する。疎水性のバリンを負に帯電したアスパラギン酸に置換することにより、二量体形成に関係する領域の表面静電位が変化し、二量化が阻害され、それゆえ生物学的活性が失われる（Gallowayら、2000）。
【０００７】
上記のインバーデールおよびハンナ系のヒツジに加えて、ケンブリッジおよびＦ７００ベルクレア血統のヒツジも、高頻度の排卵（Hanrahan、1991）および「線状様」卵巣を有する不妊のメスヒツジの存在（Hanrahan、1991）に証明されるように、多産に影響する遺伝子を保有することがわかっている。
ケンブリッジ種は、九のブリティッシュヒツジ種から多産なものを選択した５４頭のメスヒツジをスクリーニングすることにより、１９６４年にケンブリッジ大学農場で確立された。続いて、スクリーニングした群れの中のメスヒツジを同腹子の多さに基づいて選択した。アイルランドのチーガスクヒツジ研究センターで現在維持されている群れに創立動物を提供するために、最も高頻度に排卵するメスヒツジを１９８４年にこの群れから選択した（Hanrahan、1991）。アイルランドのこの群れの子孫である、１０頭のケンブリッジオスヒツジの子孫を調査したところ、子孫の平均排卵頻度は２．１から４．２回の範囲であった。
【０００８】
ベクレア種は、アイルランドのチーガスクで組み立てられた多産ヒツジの三の母集団を交配させることにより、１９７８年にアイルランドのチーガスクベクレア研究センターで確立された。これらは、フィンガルウェイ、ハイファティリティ、およびレインヒツジであった（Hanrahan、1991）。フィンガルウェイは、フィンニッシュランドレースおよびガルウェイ種の（Ｆ１からの）交配雑種であった；レインは北西ウェールズ原産の品種であり、選択した動物は、ベクレア種を開発する目的でチーガスクにより１９７５年にアイルランドに輸入された；ハイファティリティは、１９６３年および１９６５年の間にアイルランドの農場から集められた、例外的な数の同腹子をもつメスヒツジから１９６０年代にアイルランドで開発された。ベクレアの亜系（Ｆ７００系と呼ばれる）は、例外的に高頻度に排卵するベクレアヒツジに由来した（Hanrahan、1991）。１０頭のベクレアのオスヒツジの子孫は、平均排卵頻度が１．９から４．２回の範囲であった。
本明細書に引用したいずれの特許または特許出願を含む、全ての参考文献は、その出典を明示することにより本明細書の一部とする。いずれの参考文献も従来技術を構成するとは認められない。参考文献に関する記述は、その著者が主張することを示し、出願人は、引用した書類の正確さおよび適当さを吟味する権利を保持する。多くの従来技術の出版物を本明細書に出典しているが、これらの書類のいずれもがニュージーランドまたは他のいずれの国でも該技術の普遍的一般的知識の一部を形成するという認知にこの出典が寄与しない、ということは明らかに理解されるだろう。
【０００９】
「含む」なる用語は、変化しうる管轄下で、排他的または包括的意味のどちらかであってよい、ということが承認される。本明細書の目的では、他に記載がない限り、「含む」なる用語は排他的な意味を有する、つまりそれが直接言及する列挙した成分だけでなく、他の非特異的成分または要素も含むことを意味すると捉えられるだろう。「含まれる」または「含んでいる」なる用語が方法または過程で一またはそれ以上の工程に関連して使用される場合も、この原理は使用されるだろう。
改変生殖能力頻度に連結した、ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９遺伝子の新しい配列変異を提供することが望ましい。
この必要性を達成しようとすること、および／または有用な選択肢を公開することが本発明の目的である。
本発明のさらなる態様および利点は、例示としてのみ与えられる以下の記載から明らかになるだろう。
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、哺乳動物の卵巣機能および排卵頻度を改変する、新規な変異ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子配列に関する。本発明は、広くは、排卵頻度を増加または減少させること、またはメスの哺乳動物で不妊を引き起こすことにおける適用例を有し、さらに、黄体機能の調節を含む。
特に、本発明は該遺伝子のヘテロ接合体で排卵頻度を増加させ、ホモ接合体で不妊を引き起こす、ＧＤＦ−９の新規な変異に関する。
本発明は、ＧＤＦ−９Ｂの二の変異にも関する。これらの変異のどちらか一のヘテロ接合体では、排卵頻度が増加する。ＧＤＦ−９Ｂの両方の変異（各変異は別々のＸ染色体上に存在する）のヘテロ接合体である哺乳動物は不妊である。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、変異ＧＤＦ−９遺伝子のヘテロ接合体およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子変異の一つのヘテロ接合体であるメスの哺乳動物では、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂどちらかでの一の変異だけのヘテロ接合哺乳動物よりもより高頻度に排卵が起こることも認識している。
変異ＧＤＦ−９Ｂおよび／またはＧＤＦ−９遺伝子を保有するヘテロ接合またはホモ接合のメスおよびオスの哺乳動物を同定する試験に、変異遺伝子配列の知識を適用できる。メスの哺乳動物の排卵頻度を増加または減少させるために、またはメスの哺乳動物で不妊を引き起こすか、生殖能力を減少させるためにも、該遺伝子およびそれらの変異の生物学的機能の知識を利用できる。特に、哺乳動物での排卵頻度の増加は、ヘテロ接合体状態を模倣すること、例えば、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性を約５０％減少させることにより誘導されるかもしれない。このことは、内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂを部分的に中和するのに十分抗体を増加させるために、野生型ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ、またはそれらの機能的変種あるいは断片を投与する、部分的または短期能動免疫化レジュメにより達成できる。別法として、部分的または短期受動免疫化レジュメで、この抗体を直接投与してもよい。
【００１２】
生殖能力を減少させるか、不妊を誘導するのに十分排卵頻度を減少させることは、ホモ接合体状態を模倣すること、例えば、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性をほぼゼロに減少させることにより誘導されるかもしれない。このことは、全ての内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂを効果的に中和するのに十分抗体を増加させるために、野生型ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ、またはそれらの機能的変種あるいは断片を投与する、完全または長期能動免疫化レジュメにより達成できる。別法として、完全または長期受動免疫化レジュメで、この抗体を直接投与してもよい。効果が永久的である場合、哺乳動物で不妊が誘導される。効果が可逆的または一時的である場合、避妊効果が誘導される。
本発明は、広くは、上記により特定されるが、以下の記載が例示を与える具体例を含むが、これに限定されないことは、当業者により理解されるだろう。
【００１３】
（図面の簡単な記載）
本発明のさらなる態様は、例示としてのみ与えられる以下の記載および添付した図面から明らかになるだろう。
【００１４】
図１ａは、ヒツジのＧＤＦ−９蛋白の予測されるアミノ酸配列を示す。各列の開始時の数は、完全長未処理蛋白のアミノ酸の位置を示す。括弧中の数は成熟ペプチドのアミノ酸の位置を示す。成熟処理ペプチドのＲＲＨＲフリンプロテアーゼ開裂部位および予測される開始は、灰色で陰影をつけている。黒三角は、遺伝子中の単一イントロンの位置を示す。白三角は、アミノ酸置換に付与するが、不妊の表現型に関連しない変異の位置を示す。不妊に関連する[７８７]変異の位置は、黒色で陰影をつけている。
図１ｂは、アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジの野生型配列と比較してアミノ酸が変化する、四のＧＤＦ−９配列変異のヌクレオチド置換を示す。
【００１５】
図２ａは、ヒツジのＧＤＦ−９Ｂ蛋白の予測されるアミノ酸配列を示す。各列の開始時の数は、完全長未処理蛋白のアミノ酸の位置を示唆する。括弧中の数は成熟ペプチドのアミノ酸の位置を示す。成熟処理ペプチドのＲＲＡＲフリンプロテアーゼ開裂部位および予測される開始は、灰色で陰影をつけている。黒三角は、遺伝子中の単一イントロンの位置を示す。白三角は、単一Ｌｅｕ欠失多型の位置を示す。不妊に関連する[Ｓ１]および[Ｓ２]変異の位置は、黒色で陰影をつけている。
図２ｂは、アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジの野生型配列と比較してアミノ酸が変化する、二のＧＤＦ−９Ｂ配列変異のヌクレオチド置換を示す。
【００１６】
図３ａは、三頭のメスヒツジ９７０４、８７８３、および７８１０と交配した父Ｒ８３０およびそれらの６頭のメスの子孫の遺伝子型および表現型を表す表を示す。各動物の表現型は、不妊をＳ、生殖可能をＦ、またはオスに対してはｎ／ａ（適用できない）として示される。各動物の遺伝子型は、＋＋（Ｘ連鎖[Ｓ１]および[Ｓ２]変異の野生型メス、野生型オスおよびメス[７８７]常染色体変異）、＋Ｙ（Ｘ連鎖[Ｓ１]または[Ｓ２]の野生型オス）として示される。変異の二重コピー保因者は、Ｔ／Ｔ、Ｓ１／Ｓ１、またはＳ２／Ｓ２である。単一コピー保因者は、Ｔ／＋、Ｓ１／＋、またはＳ２／＋である。父Ｒ８３０は、一のコピーを保有できるだけなので、Ｘ連鎖[Ｓ２]にヘミ接合である。
図３ｂは、Ｆ７００ケンブリッジ血統中の遺伝子型および表現型を表す表を示す。血統は、二頭のメスヒツジ９６２１５８および９７６２３４と交配した父９６２１０１、およびそれらの四頭のメスの子孫、およびメスヒツジ８８７４と交配した父９３０１４２およびそれらの一頭のメスの子孫を表す。各動物の表現型は、不妊をＳ、生殖可能をＦ、またはオスに対してはｎ／ａ（適用できない）として示される。各動物の遺伝子型は、＋＋（Ｘ連鎖[Ｓ１]および[Ｓ２]変異の野生型メス、[７８７]常染色体変異の野生型オスおよびメス）、＋Ｙ（Ｘ連鎖[Ｓ１]または[Ｓ２]の野生型オス）として示される。変異の二重コピー保因者は、Ｔ／ＴまたはＳ１／Ｓ１である。単一コピー保因者は、Ｔ／＋またはＳ１／＋である。父は、一のコピーを保有できるだけなので、Ｘ連鎖[Ｓ１]にヘミ接合である。
【００１７】
図４は、アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジで変異の位置を示す野生型ヒツジのＧＤＦ−９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。右の数は、ａｔｇ開始コドンからのヌクレオチドの位置を示す。各列の下の数は、成熟処理活性ペプチドの開始から数えたアミノ酸残基を示す。負の数は、蛋白の前駆領域のアミノ酸を示す。単一イントロンの位置を、配列に挿入した白いボックスで印する。八のヌクレオチド多型の位置をボックスの中に際立って印し、スクエア括弧[]を使用して表１により命名する。ヌクレオチド多型により変化するアミノ酸残基には下線を引く。ＴＡＡ停止コドンは蛋白の最後を示す。
【００１８】
図５は、アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジでの変異の位置を示すヒツジＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。右の数は、ａｔｇ開始コドンからのヌクレオチドの位置を示す。各列の下の数は、成熟処理活性ペプチドの開始から数えたアミノ酸残基を示す。負の数は、蛋白の前駆領域のアミノ酸を示す。単一イントロンの位置を、配列に挿入されたダッシュで印する。四のヌクレオチド多型の位置をボックスの中に際立って印し、スクエア括弧を使用して表１により命名する。ヌクレオチド多型により変化するアミノ酸残基には下線を引く。アステリスク（***）は、以前記録したハンナ（Ｇｌｎから停止コドンへ）およびインバーデール（ＶａｌからＡｓｐコドンへ）の変異の位置を示す。ＴＧＡ停止コドンは、蛋白の最後を示す。
【００１９】
図６は、構造が決定されたＴＧＦβスーパーファミリーメンバーの他のメンバーを有する、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ蛋白配列のアラインメントを示す。フリン処理部位を配列の最初で灰色の立方ブロックとして示す。成熟処理蛋白は４番目のアミノ酸残基の位置で始まる。ジスルフィド結合に関係する保存システイン分子を灰色の陰影で示す。底の数は、アミノ酸の位置の相対的言及を提供するが、保存蛋白領域のアラインメントを可能にするためにギャップを導入したので、各蛋白の本当のアミノ酸残基の数を表さない。アステリスク*は、ＧＤＦ９およびＧＤＦ９Ｂ以外の大部分の他のＴＧＦβファミリーメンバーで存在し、大部分の二量体に存在する鎖間ジスルフィド結合の要因である、保存システインを示す。ボックスで囲んだ文字は、変異体でフェニルアラニンに変化するＧＤＦ９の[７８７]セリン（Ｓ）（該図表で８６番目の位置）、およびイソロイシンに変化するＧＤＦ９Ｂの[Ｓ２]セリン（Ｓ）（該図表で１１８番目の位置）を示す。
【００２０】
図７は、能動免疫化メスヒツジの血漿でのプロゲステロン濃度のパターンの例を示す。免疫化で使用する抗原、およびメスヒツジの同定番号を各グラフの頂点に示す。精管切除したオスヒツジによるマーキングを矢印で示す。０日目は、三週間サンプリング期間の開始に対応する。および、
【００２１】
図８は、黄体退縮の同期化後の、血漿中の平均プロゲステロン濃度を示す。エストルーメイト（つまり、ＰＧＦ２α、矢印）での同期化の４日前に、メスヒツジに１００ｍｌのＫＬＨ、ＧＤＦ９ペプチド、またはＢＭＰ１５ペプチド抗血漿を静脈投与した。
【００２２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、ヒツジのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子での新しい自然発生変異を対象とする。ＧＤＦ−９遺伝子の変異は、排卵頻度の増加、ならびにＧＤＦ−９Ｂでの不活化変異と同様の方法での生殖不能を引き起こすこと、およびＧＤＦ−９はヒツジでの通常の卵巣の卵胞発生を維持するのにも不可欠であることが初めてわかった。さらに、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ両方の変異のヘテロ接合体であるヒツジは、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂだけの変異のヘテロ接合体であるヒツジより排卵頻度が多いということが、いずれの種においても初めてわかった。これらの観察結果は、以下に記載の遺伝子型、表現型、および免疫化データにより支持される。
【００２３】
本発明の第一の態様により、
ａ）配列番号１、３、または５；
ｂ）ａ）により特定される分子に相補的な配列；
ｃ）ａ）またはｂ）の配列の機能的断片または変種；
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）により特定されるいずれかの分子のアンチセンス配列；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む、単離変異ＧＤＦ−９核酸分子を提供される。
【００２４】
本発明は、配列番号２、４、または６からなる群より選択したアミノ酸配列を含む単離変異ＧＤＦ−９ポリペプチド、またはその機能的断片あるいは変種も提供する。
ベルクレアおよびケンブリッジのゲノムＤＮＡのＧＤＦ−９ヌクレオチド配列には八の多型があるが、四だけが、対応するポリペプチドでアミノ酸を置換する。しかし、これらのうち、一のアミノ酸置換だけがコードしたポリペプチドの機能を変化させ、それゆえ、これらのヒツジに見られる妊娠能力頻度において観察される変化に関係するだろうと考えられた。この[７８７]３９５番目の残基でのセリンのフェニルアラニンへの置換により、成熟コード領域の７７番目の残基で、非荷電のイオン化群が非イオン化群と置換される。図１ａ、１ｂ、および４、および表１はこれらのヌクレオチドおよびアミノ酸の変化を説明する。
遺伝子型であり、ＧＤＦ−９[７８７]変異のヘテロ接合体であると見出されたケンブリッジおよびベルクレアのメスヒツジは、観察された変異を有さない対照メスヒツジよりも排卵頻度が有意に増加することと関連した。（表３）。
【００２５】
遺伝子型であり、ＧＤＦ−９[７８７]変異のヘテロ接合体であると見出されたケンブリッジおよびベルクレアのメスヒツジは、不妊であった。
ヒツジでの生殖不能および排卵過多に関連する、ＧＤＦ−９の不活化変異の発見は、ＧＤＦ−９が排卵頻度の増加に重要であることの第一の証拠である。マウスでのＧＤＦ−９のノックアウト変異は生殖不能を引き起こすことはわかっていたが、排卵頻度の増加に対するＧＤＦ−９の影響は記載されていない。本発明により、ＧＤＦ−９成熟ペプチド中の蛋白構造のわずかな乱れが蛋白活性に重大な結果をもたらすことがわかった。
本発明は、
ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、または１７；
ｂ）ａ）により特定される分子に相補的な配列；
ｃ）ａ）またはｂ）により特定されるいずれかの分子のアンチセンス配列；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む、単離変異ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子も提供する。
【００２６】
本発明は、さらに、配列番号８、１０、１２、１４、１６、または１８からなる群より選択したアミノ酸配列を含む単離変異ＧＤＦ−９Ｂポリペプチドを提供する。
ベルクレアおよびケンブリッジのゲノムＤＮＡのＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列に四の多型が位置した。これらの多型のうちの二により、ポリペプチド機能を変化させ、これらのヒツジで見られる生殖能力頻度において観察される変化に関係すると考えられた、対応するポリペプチド配列でアミノ酸が置換した。[Ｓ１]多型により、７１８番目のヌクレオチドでＣがＴへ変化し、２３９番目のアミノ酸残基で、グルタミン酸（Ｑ、ＣＡＧ）の位置に未熟停止コドン（ＴＡＧ）が導入され、予測されるように、ＧＤＦ−９Ｂの機能が完全に失われた。[Ｓ２]多型により、未処理の蛋白の３６７番目の残基でセリンがイソロイシンに置換され、非荷電イオン化群が非イオン化群に置換された。図２および５、および表１はこれらのヌクレオチドおよびアミノ酸の変化を説明する。
【００２７】
遺伝子型であり、ＧＤＦ−９Ｂの[Ｓ１]または[Ｓ２]変異のヘテロ接合体であると見出されたケンブリッジおよびベルクレアのメスヒツジは、観察された変異を有さない対照メスヒツジより排卵頻度が有意に増加することと関連した（表３）。
遺伝子型であり、ＧＤＦ−９Ｂの[Ｓ１]または[Ｓ２]変異のホモ接合体であると見出されたケンブリッジおよびベルクレアのメスヒツジは、不妊であった。
ＧＤＦ−９Ｂのこれらの二の新しい機能的変異は、ヒツジにおける該遺伝子の変異が生殖能力の調節に関連する、という従来研究の発見を支持する（Gallowayら、2000）。ＧＤＦ−９Ｂでの不活化変異により、用量依存性に排卵頻度が増加し、不妊が引き起こされる。[Ｓ２]変異におけるセリンからイソロイシンへの変化、および[Ｓ１]変異での未熟停止コドンは、ＧＤＦ−９Ｂ成熟ペプチド中の蛋白構造の乱れが蛋白活性に重大な結果をもたらすという意見を支持する。
【００２８】
驚くべきことに、ＧＤＦ−９[７８７]変異および、ＧＤＦ９−Ｂの[Ｓ１]または[Ｓ２]変異のうちの一、の両方のヘテロ接合体であるメスヒツジは、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂの変異のヘテロ接合体であるだけの動物より排卵頻度がかなり多い。ケンブリッジヒツジにおけるＧＤＦ−９[７８７]およびＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ１]変異の組み合わせ、およびベルクレアヒツジにおけるＧＤＦ−９［７８７］およびＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ２]変異の組み合わせの影響は、付加的であるように思われる（表３）。
かくして、これらの遺伝子型を模倣できる免疫化レジュメは、メスの哺乳動物の排卵を調整するのに有用であろうということが予想される。例えば、内因性ＧＤＦ−９Ｂおよび／またはＧＤＦ−９の活性を約半分に減少させるレジュメ（活性分子の約５０％だけが発現される、ヘテロ接合動物の場合）は、メスの哺乳動物で排卵を増加させ、生殖能力を向上させるために使用できる。逆に、内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの活性をおよそゼロに減少させる免疫化レジュメ（活性分子が全く発現されない、ホモ接合動物の場合）は、不妊を誘導するために使用できる。
【００２９】
本発明は、さらに、受容体の結合および／または二量化と関連する少なくとも一つのコドンにて一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９核酸分子を提供する。好ましくは、該変異により、核酸分子によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換が生じ、そのアミノ酸置換は、好ましくは、受容体結合部位に存在し、受容体結合を阻害する。別法として、アミノ酸置換が二量化部位に存在し、二量化を阻害してもよい。
本発明は、さらに、受容体の結合および／または二量化と関連する少なくとも一つのコドンにて一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子を提供する。好ましくは、該変異により、核酸分子によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換が生じ、そのアミノ酸置換は、好ましくは、受容体結合部位に存在し、受容体結合を阻害する。別法として、アミノ酸置換が二量化部位に存在し、二量化を阻害してもよい。
【００３０】
二量化および／または受容体結合に関連するヌクレオチド配列の領域を決定するために使用できるアミノ酸配列から、ポリペプチド構造を突き止めるのに適当なプログラムは、当業者により認識されるだろう。適当なコンピュータープログラムの例は、ロックフェラー大学のモデラーおよびスイス蛋白データベースにより開発されたスイスモデルを含む。
ケンブリッジおよびベルクレア種での生殖能力の変化に関連する、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子に見られる変異は、アミノ酸置換のためにコードされるポリペプチドの機能が改変されることに関連することがわかった。他の密に関連するＴＧＦ−β分子で、これらのアミノ酸置換の位置の間で変異を比較することは、ＧＤＦ−９［７８７］の生物学的活性は二量化の阻害のために失われるが、ＧＤＦ−９Ｂ［Ｓ２］変異は受容体結合を阻害することにより生物学的活性を失わせるかもしれない、という仮説を支持する。
【００３１】
受容体結合および二量化部位での他のアミノ酸の変化、または成熟ペプチドの蛋白の折りたたみを阻害する蛋白領域は、当業者により理解されている影響と同様の影響を有し、本発明の範囲内に含まれることが予測される。
本発明は、ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法も提供し、ここで、その方法は、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＢＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号１１または１７の変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９Ｂ配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定する；
という工程を含む。
【００３２】
本発明は、さらに、ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法を提供し、ここで、その方法は、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号５の変異ＧＤＦ−９ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定する；
という工程を含む。
【００３３】
該方法で使用できるプローブおよびプライマーは、本発明の一部も形成する。このプローブおよびプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で変異ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂ遺伝子配列にハイブリダイゼーションできる、本発明の核酸分子の断片を含んでもよい。そのようなプローブおよびプライマーは、変異遺伝子の構造および機能を研究する場合、および、ケンブリッジおよびベルクレアの表現型を発現するヒツジ以外の哺乳動物から該遺伝子のホモ接合体を得るためにも有用である。
本発明による核酸、またはそれらに相補的な配列に基づいて、核酸プローブおよびプライマーを調製できる。「プローブ」は、検出可能な標識または記録分子に付着する既知の配列を有する一本鎖核酸分子を含む。典型的な標識は、放射性同位元素、リガンド、化学ルミネセンス剤、および酵素を含む。そのようなプローブは、それにハイブリダイゼーションすることにより標的ＤＮＡまたはＲＮＡの位置を見つけ、標識するために使用される。
【００３４】
「プライマー」は、短い核酸、好ましくはＤＮＡで、１５またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的標的ＤＮＡ鎖にアニールされ、プライマーおよび標的ＤＮＡ鎖の間でハイブリッドを形成し、その後、ポリメラーゼ、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って延長する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または該分野にて十分認識されている他の核酸増幅法により核酸配列を増幅するために、プライマー対を使用できる。例えば、Ｐｒｉｍｅｒ（Version 0.5（著作権）1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA）のような目的のために企図されたコンピュータープログラムを使用することにより、本発明に従って該核酸配列からＰＣＲプライマー対を導くことができる。
プローブおよびプライマーを調製および使用する方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, vol. 1-3, ed Sambrookら、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989に記載される。
プローブまたはプライマーは溶液中で遊離しているか、または標準的方法により固体の土台に共有結合または非共有結合で付着しうる。
【００３５】
特定の増幅プライマー対を使用して、（例えば、ＰＣＲにより）標的核酸配列を増幅させるためのストリンジェントな条件は、対応する野生型配列（またはその補体）を有するプライマーが結合する標的核酸配列にのみプライマー対がハイブリダイゼーションできる条件である。
核酸ハイブリダイゼーションは、塩濃度、温度、または有機溶媒、さらに、塩基組成物、相補鎖の長さ、およびハイブリダイゼーションする核酸の間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数のような条件に影響され、当業者により容易に理解されるだろう。
プローブまたはプライマーについて言及する場合、「（標的配列に）特異的」なる用語は、プローブまたはプライマーがストリンジェントな条件下で、標的配列を含む、提供されたサンプルの標的配列にのみハイブリダイゼーションすることを示唆する。普通、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６ｘＳＳＣで５５℃である。
【００３６】
別の具体例では、本発明は、ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定するためのマーカーとして、配列番号１１または１７の変異ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的である核酸分子を使用することを提供する。
「どちらかの鎖」なる用語は、言及されている配列番号に示されるＤＮＡ鎖の両方、または配列リストに示されていないが、そこから決定できるその相補鎖をいう。
さらなる具体例では、本発明は、排卵過多または不妊のどちらかに関連する変異ＧＤＦ−９Ｂを保有する哺乳動物のＤＮＡマーカー補助選択法で、上記のマーカーを使用することを提供する。
【００３７】
別の具体例では、本発明は、ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定するためのマーカーとして、配列番号５の変異ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的な核酸分子を使用することを提供する。
本発明は、さらに、排卵過多または不妊のどちらかに関する変異ＧＤＦ−９を保有する哺乳動物のＤＮＡ補助選択法で、上記のマーカーを使用することを提供する。
上記のマーカーおよびマーカー補助選択法は、該動物の排卵過多に関連する個々の動物の配列変種を同定するのに有用である。これらの変種は、必ずしも排卵過多または不妊の形質を直接起こすわけではないが、それらは形質を予測することと十分密に関連するだろう。これらの配列変異体を同定する方法は、該分野にて認識されており、制限酵素断片長の多型（ＲＦＬＰ）、増幅断片長の多型（ＡＦＬＰ）、ＧＤＦ−９遺伝子中の、またはそれに関連するＤＮＡの直接配列決定、または微小付随体多型としても認識されている、変数縦列リピート（ＶＮＴＲ）の同定および特徴づけを含むが、これらに限定されない。かくして、遺伝子マーカーは、排卵過多を有する動物のＤＮＡ選択に有用であるかもしれない。
【００３８】
さらなる具体例では、本発明は、上記のように核酸分子を実質的に含む構造物またはベクターを提供する。
本明細書で使用される際の「構造物」なる用語は、関係する遺伝子を含む、人工的に組み立てた、または単離した核酸分子をいう。一般的に、構造物は、関係する遺伝子および適当な調節配列を含んでもよい。例えば、構造物中に調節配列を含むことは任意であり、そのような配列は、宿主細胞の調節配列が使用されうる場合は必要とされなくてよい、ということが理解されるべきである。構造物なる用語は、ベクターを含むが、それに限定されるものとして解すべきでない。
本明細書で使用される際の「ベクター」なる用語は、クローニングベクターおよび発現ベクターの両方を含む。ベクターは、さまざまな起源に由来する核酸分子を含有する組み換え分子である場合が多い。
【００３９】
「クローニングベクター」なる用語は、ベクターの自己複製能を失うことなく、関係する別の外因性（異種）核酸分子を適当な大きさで組み込むことができるウイルス、プラスミド、またはより高度な有機体の細胞を起源とする、または由来する核酸分子をいう。かくして、少なくとも一の関係する異種核酸分子（例えば、関係する遺伝子）を、その遺伝子を大量に複製できる宿主細胞に導入するために、ベクターを使用できる。
「発現ベクター」は、関係する組み込み遺伝子を転写および翻訳するために必要な調節配列も含有し、そのためその遺伝子の遺伝子生成物を発現できるクローニングベクターをいう。
【００４０】
使用する宿主または宿主細胞により、クローニングベクターを選択してもよい。有用なベクターは、一般的に、以下の特徴：
（ａ）自己複製能；
（ｂ）いずれかの特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を所有すること；および
（ｃ）望ましくは、抗生物質耐性のような、容易に選択できるマーカーを保有する遺伝子；
を有するだろう。
これらの特徴を所有する二の主要な型のベクターは、プラスミドおよび細菌ウイルス（バクテリオファージまたはファージ）である。現在、好ましいベクターは、細菌、昆虫、または哺乳動物のベクターであり、以下：ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ＰＧＥＸ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｌａｍｂｄａＺＡＰ、ｌａｍｂｄａＧＥＭ、ｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐ、ｐＵＢ６／Ｖ５／Ｈｉｓ、ｐＢＣ1、ｐＡＤＴｒａｃｋ−ＣＭＶ、ｐＡｄｅｎｏｖａｔｏｒ、ｐＡｄＥａｓｙ−1、ｐＳＦＶ−ＰＤ、ｐＣＡ３、ｐＢＡＢＥ、ｐＰＩＣ９、ｐＡ０８１５、ｐＥＴおよびｐＳＰシリーズを含んでよい。しかし、このリストは本発明の範囲を限定するものとして解すべきでない。
【００４１】
好ましい発現系の実施例は以下の通りである：
１．  インビトロでの細胞発現系には、ピューロマイシン耐性を与えるｐＥＦＩＲＥＳ−Ｐベクター（Hobbs Sら、1998, Biochem Biophys Res Commun. 252: 368-72）での２９３Ｔ細胞系を使用してよい。二遺伝子の共発現には、抗生物質耐性遺伝子をブレオマイシン耐性に変化させるために、上述のベクターを修飾してよい。別法として、トリシストロン発現ベクターを構成することにより、二遺伝子の共発現および選択遺伝子を達成できる。対応する安定してトランスフェクションした昆虫細胞系、例えば、「ＤＥＳ」ベクター発現系を使用するＳ２細胞系も使用できる；www.invitrogen.com。
２．  トランスジェニック動物の全ての組織でのＧＤＦの発現に関して、一のアプローチは、構成物を作るためにｐＵＢ６／Ｖ５−ＨｉｓＡベクター（www.invitrogen.com）を使用することである。組織特異的発現には、ｐＵＢ６／Ｖ５−ＨｉｓＡベクター中のＵｂｉ−ＣプロモーターをＰＥＰＣＫプロモーターに置換することにより、肝臓および腎臓での発現のためのラットのＰＥＰＣＫ０．６ｋｂプロモーターを構成物に含むことができる。哺乳動物の組織でのＧＤＦ発現には、別のプロモーター系が好ましいだろう。この組織には、一のアプローチは、ＧＤＦを発現させてミルクを出させる、ウシのβ−ラクトグロブリン遺伝子プロモーターおよび／またはウシのαＳ１カゼインプロモーター（例えば、ｐＢＣ１ベクター、www.invitrogen.com）を使用することだろう。トランスジェニック動物での包括的過剰発現には、ＣＭＶ促進βアクチンプロモーター（Okabe Mら、FEBS Letters 407: 313-319, 1997）または修飾ＥＦ１α−プロモーターも使用できる（Taboit-Dameron Fら、Transgenic Research 8: 223-235, 1998）。
【００４２】
アデノウイルス、レトロウイルス、およびアルファウイルスは、他の適当な哺乳動物発現系である。当業者に典型的なアプローチは、（TC Heら、1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 2509-14）に記載のものである。ＧＤＦ発現に関して、構成物を作り、その後ｐＡｄＥａｓｙ−１アデノウイルスプラスミドをＥ．ｃｏｌｉに共形質転換させ、ＣＭＶ−プロモーター起動ＧＤＦ発現カセットを含有する組み換えアデノウイルスゲノムを生成するために、ｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶベクターまたはｐＡｄｅｎｏｖａｔｏｒベクター（www.qbiogene.com）を使用できる。この組み換えアデノウイルスゲノムは、その後、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ウイルスストックを作る。同じ目的（例えば、ＰＣＡ３プラスミドベースの遺伝子転移（www.microbix.com）；またはＣＯＳ−ＴＰＣ法（Miyake Sら、1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93: 1320-4））でも、アデノウイルスを生成する別法を使用できる。
【００４３】
３．  例えば、Lundstromら、Histochem Cell Biol 115: 83-91, 2001に記載のようなｐＳＦＶ−ＰＤベクターを使用して、ＧＤＦを発現する非細胞病原性ＳｅｍｌｉｋｉＦｏｒｅｓｔウイルスを生成できる。さらに、哺乳動物の細胞でＧＤＦを発現させるために、例えば、ｐＢＡＢＥベクターをベースとする、レトロウイルス発現系を使用できる（Morgenstern, JPおよびLand, H, 1990; Nucleic Acids Res 18: 3587-3596）。
４．  酵母細胞（例えば、Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae）は、当業者により十分に確立された別の発現系である（MA Romanosら、1992, Yeast. 8: 423-88）。例えば、ＧＤＦの発現のために、Pichia pastorisでｐＰＩＣ９ベクター（www.invitrogen.com）を使用できる。二遺伝子の共発現には、ｐＡ０８１５ベクター（www.invitrogen.com）が好ましい候補である。
５．  Echerichia coli（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、広範囲に使用されている標準的研究室発現系である。例えば、組み換え哺乳動物ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂを発現するために、ｐＥＴ発現系（www.novagen.com）を使用できる。
【００４４】
本発明のＤＮＡ分子を、複製可能な発現ベクターの適当な対照配列と操作可能に連鎖させて置くことにより発現させてよい。対照配列は、複製の起源、プロモーター、エンハンサー、および他の間の転写終了配列を含んでよい。発現ベクターに含まれる対照配列の選択は、当業者により理解されるように、ＤＮＡを発現させるために使用することを目的とした宿主または宿主細胞の型による。
本明細書で使用される際の「操作可能に連鎖」なる用語またはその文法的変種は、遺伝子発現を可能にするために、遺伝子に関して適当な位置の核酸分子に、関係する遺伝子の発現に必要な調節配列を置くことを意味する。
本明細書で使用される際の「調節配列」なる用語は、関係する核酸分子の発現を可能にする、複製の起源、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、終了暗号などのような、ある核酸配列のことである。
【００４５】
本明細書で使用される際の「発現」なる用語は、広くは、転写およびその後の蛋白への翻訳により、核酸分子を転化する方法をいう。
本明細書で使用される際の「遺伝子」なる用語は、遺伝子生成物（つまり、特異的蛋白）をコードする一連の順序だてられたヌクレオチドを含む核酸分子をいう。本発明で有用な発現ベクターは、発現するためにＤＮＡ配列または断片に操作可能に連鎖する少なくとも一の発現対照配列を含有してよい。対照配列は、クローンＤＮＡ配列の発現を抑制および調節するために、ベクターに挿入される。有用な発現対照配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、酵母の酸性ホスファターゼの解糖プロモーター、例えば、Ｐｈｏ５、酵母のアルファ交配因子プロモーター、およびポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、シミアンウイルス、およびサイトメガロウイルスに由来するプロモーター、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、および、原核および真核細胞およびそれらのウイルスまたはその組み合わせの遺伝子発現を抑制すると認識されている他の配列である。
【００４６】
ベクターの構造で、異種ＤＮＡを組み込むベクターを保有する細菌性クローンを同定できることも利点である。そのようなアッセイは、測定可能な色の変化、抗生物質耐性などを含む。一の好ましいベクターでは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が使用され、クローンはＸ−ガルプレートで青または白の表現型として検出できる。これは選択を容易にする。いったん選択すると、標準的方法を使用して培養からベクターを単離してよい。
使用した宿主次第で、そのような細胞に適当な標準的技術により形質転換およびトランスフェクションが実施される。実質的な細胞壁を含有する原核生物または他の細胞では、カルシウム処理方法（Cohen, S N Proceedings, National Academy of Science, USA 69 2110 （1972））を採用してよい。そのような細胞壁がない哺乳動物の細胞では、GraemeおよびVan Der Eb, Virology 52:546（1978）のリン酸カルシウム沈殿法またはリポソーム試薬が好ましい。
【００４７】
適当なベクターで選択した宿主の形質転換では、宿主細胞を培養することにより、しばしば融合蛋白の形態で、コードされたポリペプチドを生成できる。本発明のポリペプチドを上記のように迅速アッセイにより検出してもよい。その後、ポリペプチドを必要に応じて再構築し、精製する。該分野で認識されているいずれかの方法を使用して、例えば、陰イオン交換樹脂への吸着および溶離により、再構築および精製を達成できる。本発明のポリペプチドを生成する該方法は、本発明のさらなる態様を構成する。
本発明のベクターまたは構成物で形質転換した宿主細胞は、本発明のさらなる態様も形成する。
「宿主細胞」なる用語は、ベクターまたは構成物を含有でき、そのベクターまたは構成物の複製および／または発現を支持する細胞をいう。適当な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞を含んでよいが、それに限定されるべきでない。
【００４８】
本発明は、上記のように実質的に宿主細胞を含む細胞系も提供する。
変異ＧＤＦ−９Ｂおよび／またはＧＤＦ−９遺伝子を保有するヘテロ接合またはホモ接合のメスおよびオスの哺乳動物を同定する試験に、変異遺伝子配列の知識を適用できる。メスの哺乳動物で排卵頻度を増加または減少させるため、またはメスの哺乳動物で不妊または生殖能力の減少を誘導するためにも、遺伝子およびそれらの変異の生物学的機能についてのこの知識を利用できる。特に、ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの「通常」量の半分だけが発現するヘテロ接合状態を模倣することにより、哺乳動物での排卵頻度の増加を誘導してもよい。内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂを部分的に中和するのに十分抗体を増加させるために、野生型ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ、またはその機能的変種あるいは断片を投与する、部分的または短期活性レジュメによりこのことを達成できる。別法として、部分的または短期受動免疫化レジュメでこの抗体を直接投与してもよい。
【００４９】
活性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂが発現されないホモ接合状態を模倣することにより、生殖能力を減少させる、または不妊を誘導するのに十分排卵頻度を減少させることを誘導してもよい。全ての内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂを効果的に中和するために十分抗体を増加させるために、野生型ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ、またはその機能的変種あるいは断片を投与する、完全または長期免疫化レジュメによりこのことを達成できる。別法として、完全または長期受動免疫化レジュメでこの抗体を直接投与してもよい。効果が永久的である場合、哺乳動物で不妊が誘導される。効果が可逆的または一時的である場合、避妊効果が誘導される。
【００５０】
かくして、さらなる態様では、本発明は、排卵を調整するために、メスの哺乳動物でＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物活性を改変する方法であって、
ａ）内因性ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂへの部分的免疫応答を誘導し、部分的にこの生物活性を減少させ、排卵を促進させること；または
ｂ）内因性ＧＤＦ−９Ｂ、またはＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ両方への完全免疫応答を誘導し、実質的にこの生物活性を減少させ、不妊を誘導すること；
のどちらかの工程を含む方法を提供する。
免疫応答は、
ｉ）ＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＤＦ−９の機能的断片または変種；および／または
ｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、および１８から選択したＧＤＦ−９Ｂポリペプチド；
を医薬上または獣医学上許容できる担体および／または賦形剤と共に含む抗原性組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより誘導される。
【００５１】
抗原性組成物は、部分的免疫応答および排卵過多を誘導する補強剤を含んでもよい。
そのような補強剤の例は、ＤＥＡＥ−デキストラン補強剤を含む。
ＤＥＡＥ−デキストランのような補強剤は、動物への投与により部分的免疫応答を誘発するために選択した。
抗原性組成物は、強力な免疫応答を誘導し、生殖能力を減少させる、または不妊を誘導する別の補強剤を含んでもよい。
そのような補強剤の例は、フロイント補強剤を含む。
【００５２】
フロイントのような補強剤は、哺乳動物への投与により強力な免疫応答を誘発させるために投与される。
部分的または強力な免疫化は、上記の抗原性組成物を投与することにより能動的に誘導されるか、または上記の抗原性組成物に対して増加する抗体、または上記の抗生物質を含む抗血清を投与することにより受動的に誘導されるかのどちらかであってよい。
部分的免疫化は、抗原性組成物またはそれに対する抗体を１から２ヶ月のような短期間投与する、短期投与レジュメにより誘導されてもよい。
【００５３】
完全免疫化は、抗原性組成物またはそれに対する抗体を６ヶ月またはそれ以上のような長期間投与する、長期投与レジュメにより誘導されてもよい。
補強剤、抗原性組成物、および投与レジュメの型を、当業者により理解されるように、所望の反応を誘導するために選択した。特に所望の反応は、排卵過多および関連する生殖能力の向上である。そのような方法は、複製効率を向上させる、および／または高等哺乳動物からの多排卵を向上させるのに有用である。
さらなる所望の反応は、排卵頻度の減少および関連する生殖能力の減少である。好ましくは、そのような反応は永久的であり、メスの哺乳動物は不妊となる。この方法は、現在不妊を誘導するために使用される外科的方法の別法を提供し、より非侵襲的であって、手術の場合のような感染などのリスクがない。
【００５４】
誘導される反応が一時的または可逆的である場合、避妊法として該方法を使用してもよい。また、そのような方法は、健康のリスクに関連する、現在使用される避妊法（つまり、プロゲステロンおよび／またはエストロゲンの投与）より有利な点を提供する。さらに、競走馬、グレーハウンドなどのような、メスの哺乳動物で、自然発情周期がそのような哺乳動物の行為を干渉する場合、排卵を止めるために本発明の方法を使用してもよい。そのような効果が一時的または可逆的な場合、哺乳動物はいずれの有害な効果も受けないだろう。
そのような一時的／可逆的効果は、ヒツジで、排卵を阻害するのに十分な期間ＧＤＦ−９Ｂペプチドを投与した後に観察され、投与の中止により、その後妊娠した。
【００５５】
本発明は、さらに、本発明の変異ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド分子を投与することにより所望の反応を誘導することを企図する。そのようなポリペプチド分子は、それらが受容体結合および／または二量化部位に変異を含む場合、不活性であるようだが、そのようなポリペプチドは、十分量投与される場合、内因性ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ結合および／または二量化と競合し、それらの活性を減少させるかもしれない。そのような反応は、内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ活性が部分的に減少する場合、排卵および生殖能力を向上させるだろう。そのような投与により内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ活性が完全に減少する場合、誘導される反応は不妊だろう。
内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の一のコピーがノックアウトされた、トランスジェニック非ヒト哺乳動物も本発明の範囲内である。そのような哺乳動物では、排卵が増加し、生殖能力が向上するだろう。
【００５６】
そのようなトランスジェニック哺乳動物を、既知の方法（Wellsら、1998. Reprod Fertil Dev: 10:615-26; Clark 2002, Methods Mol Biol, 180: 273-87; Cousensら、1994, Mol Reprod Dev. 39:384-91; Chenら、2002, Biol Reprod. 67: 1488-92; Aratら、2001, Mol Repord Dev. 60: 20-6）により生成してもよく、
−配列番号１、またはその機能的断片あるいは変種；および
−配列番号７または１３で、両方ではない；または
−配列番号３、またはその機能的断片あるいは変種；および
−配列番号９または１５で、両方ではなく、本発明に記載のベクターまたは構成物を使用すること；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む少なくとも一の核酸分子を、哺乳動物の遺伝子材料に導入する工程を含んでもよい。
【００５７】
さらなる態様では、本発明は、
ａ）メスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）１）実質的に上記のような、免疫化に効果的な量のＧＤＦ−９ポリペプチドおよび／または免疫化に効果的な量のＧＤＦ−９Ｂポリペプチド；
２）ｉ）実質的に上記のような、ＧＤＦ−９ポリペプチド；および／または
ｉｉ）実質的に上記のような、ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド；
をコードする核酸を対象とするアンチセンス核酸分子：
からなる群より選択した効果的な量の薬剤を、哺乳動物で存在するＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ遺伝子に関して適当に投与すること；
という工程を含む、メスの哺乳動物での排卵頻度を調整する方法を提供する。
【００５８】
さらなる具体例では、本発明は、
ａ）繁殖させようと決めたメスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定すること；
ｂ）繁殖させようと決めたオスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定すること；
ｃ）以下の特徴
ｉ）Ａ）配列番号５；または
Ｂ）Ａ）の分子の機能的変種または断片；または
Ｃ）Ａ）またはＢ）の分子に相補的な配列；
を含む、変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列の単一コピー、および／または
ｉｉ）Ａ）配列番号１１または１７；または
Ｂ）Ａ）の分子に相補的な配列
を含む、変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列の単一コピー
を有する子孫になるだろうメスおよびオスの哺乳動物を選択すること
という工程を含む、排卵過多を有する哺乳動物を繁殖させる方法を提供する。
【００５９】
上記の方法により、繁殖のために選択した哺乳動物は、以下の特徴
ｉ）Ａ）配列番号５；または
Ｂ）Ａ）の分子の機能的変種または断片；または
Ｃ）Ａ）またはＢ）の分子に相補的な配列；
を含む、変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列の単一コピー、および／または
ｉｉ）Ａ）配列番号１１または１７；または
Ｂ）Ａ）の分子に相補的な配列
を含む、変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列の単一コピー：
を有する子孫になるかもしれない。
【００６０】
さらなる具体例において、本発明は、
ｉ）Ａ）配列番号５；または
Ｂ）Ａ）の分子の機能的変種または断片；または
Ｃ）Ａ）またはＢ）の分子に相補的な配列；
を含む、変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列、および／または
ｉｉ）Ａ）配列番号１１または１７；または
Ｂ）Ａ）の分子に相補的な配列
を含む、変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列：
の単一変異コピーのみを所有するメスの哺乳動物を同定する工程を含む、排卵頻度が増加しているかにより繁殖のためのメスの哺乳動物を選択する方法を提供する。
【００６１】
好ましくは、選択した哺乳動物は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの単一変異コピーの両方を有する。
さらなる具体例では、本発明は、
ｉ）Ａ）配列番号２、４、または６；または
Ｂ）Ａ）の配列の機能的断片または変種
からなる群より選択したアミノ酸配列を含む変異ＧＤＦ−９ポリペプチド；および／または
ｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、および１８からなる群より選択したアミノ酸配列を含む変異ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド；
を医薬上または獣医学上許容できる担体および／または賦形剤と共に含む組成物を提供する。
【００６２】
医薬担体を含む医薬組成物の調製は、該分野にて十分認識されており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USAのようなテキストに提示される。
本発明の化合物および組成物をいずれかの適当な経路により投与してもよく、当業者は処理条件に最も適当な経路および投与形を容易に決定できるだろう。投与量は主治医または獣医師に任意であり、処理条件の性質および状態、処理される対象の年齢および一般的健康状態、投与経路、および投与したいずれかの前処置によるだろう。
【００６３】
担体または賦形剤、および他の補形剤は投与経路により、また、当業者は各特定の場合に最も適当な処方を容易に決定できるだろう。
上記のように、本発明のポリペプチドをメスの哺乳動物に直接投与してもよい。
本明細書にて使用される際の「蛋白」または「ポリペプチド」なる用語は、同じ生物学的活性、つまり排卵調整活性を有する断片、変異およびホモ接合体を含む、本発明の核酸分子によりコードされる蛋白をいう。本発明の蛋白またはポリペプチドを自然の起源から単離し、組み換え核酸分子の発現により生成し、または化学的に合成できる。
【００６４】
本発明が、以下：
１．  一またはそれ以上のアミノ酸がその対応するＤ−アミノ酸により置換される化合物。当業者は、標準的方法によりレトロ−逆アミノ酸配列を合成できることを認識するだろう；例えば、Choreo and Goodman, 1993を参照のこと。
２．  代謝分解に耐性のある構造によりペプチド結合が置換される、ペプチド擬晶化合物。例えば、Olsonら、1993を参照のこと。
３．  類似体構造、例えば、ｇｅｍ−ジアミノアルキル群またはアルキルマロニル群により個々のアミノ酸が置換され、それらの電荷を修飾する修飾末端またはアルキル、アシルまたはアミン置換を有する、または有さない、化合物。
を含むが、これに限定されない、ペプチド類似体も含むことは、明らかに理解されるだろう。
そのような別の構造を使用することは、それらが生理学的条件下で分解に耐性があるので、体内で有意に長い半減期を提供できる。
【００６５】
ペプチド類似体の結合合成法および、ペプチドおよびペプチド類似体をスクリーニングする方法は、該分野にて十分認識されている（例えば、Gallopら、1997, Nature Biotechnology, 15: 328-330を参照のこと）。
本明細書の目的では、「ペプチドおよびペプチド類似体」なる用語は、１、２、１、３、１、４またはそれより大規模の置換パターンで分離したアミノおよびカルボキシル末端を有する単位からなる化合物を含む。これは、ＬまたはＤ配置のどちらかの２０の自然発生または「一般的」αアミノ酸；４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、シトルリンおよびオルニチンのような蛋白では普通見られない、生合成で得られる、または「非一般的」アミノ酸；α−メチルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、Ｃα−およびＮ−アルキル化アミノ酸、ホモシステイン、およびホモセリンのような、合成αアミノ酸；および該分野にて認識されている多くの他のものを含む。
【００６６】
β−アラニン、γ−アミノ酪酸、フライディンガーラクタム二環ジペプチド（ＢＴＤ）（Freidingerら、1982, J. Org. Chem 59: 104-109; NagaiおよびSato, 1985, Tetrahedron Lett. 26: 647-650）、アミノ−メチル安息香酸、および該分野にて十分認識されている他のもののような、１、３またはより大規模な置換パターンで分離したアミンおよびカルボキシル機能的群を有する化合物も含む。スタチン様同配体、ヒドロキシエチレン同配体、還元アミド結合同配体、チオアミド同配体、尿素同配体、カルバメート同配体、チオエーテル同配体、ビニル同配体、および該分野にて認識されている他のアミド結合同配体も、本発明の目的に有用である。
「一般的」アミノ酸は、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸塩、アスパラギン、グルタミン酸塩、グルタミン、システイン、メチオニン、アルギニン、リシン、プロリン、セリン、トレオニン、およびヒスチジンからなる群より選択したＬ−アミノ酸である。これらは、それらの慣用的三文字または一文字の省略形により本明細書にて言及される。
【００６７】
「非一般的」アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、ホモ−アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、デヒドロアミノ酸、（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン以外の）芳香族アミノ酸、オルト−、メタ−、またはパラ−アミノ安息香酸、オルニチン、シトルリン、ノルロイシン、α−グルタミン酸、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、およびα−α二置換アミノ酸からなる群より選択した一を含むが、これに制限されない。
さらなる具体例では、本発明は、補助的ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂ、またはその類似体、またはＧＤＦ−９あるいはＧＤＦ−９Ｂ拮抗剤をメスの哺乳動物に投与することにより、黄体機能を修飾する方法を提供する。
本発明は、本発明のポリペプチドを対象とするリガンドも含む。
【００６８】
「リガンド」なる用語は、ポリペプチドまたはペプチドのような別の分子に結合できるいずれかの分子をいい、抗体、細胞表面受容体、またはファージディスプレイ分子を含むが、これに限定されないと解すべきである。
「抗体」なる用語は、本発明のポリペプチドへの結合能を保つ抗体の断片または類似体を含み、Ｆｒ，Ｆ（ａｂ）２断片、ＳｃＦｖ分子などを含むが、これに限定されない。抗体はポリクローナルであってよいが、好ましくは、モノクローナルである。いくつかの具体例では、リガンドはファージディスプレイ分子であってよい。
本発明は、細胞培養、臓器培養、および卵胞蛋白合成または生成を操作するための全ての実験動物で、ＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９／ＧＤＦ−９Ｂを発現させるアデノウイルスベースの遺伝子治療技術も含む。
【００６９】
定義
本明細書を通して、核酸分子は、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい、ということが理解されるべきである。核酸分子は、任意に、一またはそれ以上の合成非自然または改変ヌクレオチド塩基、またはその組み合わせも含んでよい。
上記の「類似体」なる用語は、本来の化合物よりも改良された特徴の生物学的機能を有する化合物をいう（例えば、そのような類似体は、本来の化合物よりも長い半減期を有するかもしれない）。
「拮抗剤」なる用語は、別の化合物の効果を阻害する化合物をいう。本文では、拮抗剤は、精製した抗体、抗体を含有する血清、または、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂを中和する抗体を含有する血漿または血漿プールをいうことができる。
【００７０】
「部分的免疫化」なる用語は、抗原に対して免疫反応を生じさせるのに十分な抗原／抗体で、能動的または受動的に動物を免疫化することをいうが、投与する抗原／抗体の程度および／または投与方法によっては、関係する全ての抗原を効率的に中和する免疫化動物により不十分な抗体が生成される。
「完全免疫化」なる用語は、完全に免疫化した動物の免疫反応をいう。つまり免疫化した動物により生じる反応により、関係する全ての抗原を効率的に中和するのに十分な抗体が生成される。
核酸分子を細胞に挿入する本文で使用される際の「導入」（またはその文法的変種）なる用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸分子をその発現または複製のために原核または真核細胞に組み込む、または移入させるいずれかの方法への言及を含む（例えば、これは、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、自律レプリコン（例えば、プラスミド）に核酸を挿入することを含んでよいが、これに限定されるべきでない）。
【００７１】
本明細書で使用される際の「形質導入」なる用語は、核酸分子の遺伝子情報をウイルスベクターによりある細胞から別の細胞へ移入する方法をいう。
本明細書で使用される際の「トランスフェクション」なる用語は、原核細胞による組み換えＤＮＡの取り込み、組み込み、および発現をいう。
本明細書で使用される際の「形質転換」なる用語は、外因性ＤＮＡをそのゲノムに組み込むことにより、個々の細胞が保有する遺伝子材料を改変する方法をいう。
【００７２】
本明細書で使用される際の「変種」なる用語は、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ（ヌクレオチドおよびペプチド）、またはＢＬＡＳＴＰ（ペプチド）、またはＢＬＡＳＴＸ（ヌクレオチド）により評価されるように、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、図のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と実質的に６０％またはそれ以上相同である、好ましくは、本発明の配列と７５％相同であり、最も好ましくは、９０から９５％相同であることを示す、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列をいう。変種は、一またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、置換、または欠失のような修飾による、本来のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の修飾に起因してもよく、自然発生変種であってもよい。「変種」なる用語は、もし変種がメスの哺乳動物の排卵頻度を修飾できるか、排卵機能を改変できるなら、２ｘＳＳＣで６５℃により特定される標準的ハイブリダイゼーション条件下、または、好ましくは、６ｘＳＳＣで５５℃により特定されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の配列にハイブリダイゼーションする相同配列も含む。そのような変種が所望される場合、本来のＤＮＡのヌクレオチド配列は適当に改変される。この改変は、ＤＮＡ合成、または本来のＤＮＡの修飾、例えば、部位特異的またはカセット突然変異生成により影響されうる。好ましくは、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの一部が配列修飾を必要とする場合、該分野にて標準的な技術を使用して、突然変異生成を特定する部位特異的プライマーが採用される。
【００７３】
核酸の「断片」は、完全長よりも短い核酸の一部であり、以下により特定されるストリンジェントな条件下で、本発明により核酸分子と特異的にハイブリダイゼーションできる少なくとも最小の配列、またはそれに相補的な配列を含む。ポリペプチドの「断片」は、完全長より短いが、哺乳動物の排卵頻度を増加または減少させ、哺乳動物で不妊を引き起こすこと；または黄体の調節を改変すること、のどちらかの生物学的機能をいまだ保つ、ポリペプチドの一部である。それゆえ、本発明による断片は、本発明の核酸またはポリペプチドの生物学的活性の少なくとも一を有する。しかし、本発明のＧＤＦ−９配列の断片の生物学的活性は、変異のヘテロ接合であるメスの哺乳動物で排卵頻度を増加させる変異だけを含むということが理解されるだろう。
【００７４】
「単離した」なる用語は、核酸が自然発生する細胞または有機体の汚染配列から実質的に分離または精製したことを意味するものであって、標準的精製技術により精製した核酸、ならびにＰＣＲ技術を含む組み換え技術により調製した核酸、および化学合成したものを含む。
「排卵の調整」なる用語は、未処理の動物で観察される内因性頻度と比較して、排卵頻度が増加または減少することを意味する。
「ハイブリダイゼーション」またはその文法的変種は、二本鎖分子を形成するために、ＤＮＡの相補的二本鎖、または各ＤＮＡおよびＲＮＡのうちの一を接合させる方法を意味する。
プローブまたはプライマーをいう場合、「（標的配列に）特異的」なる用語は、プローブまたはプライマーがストリンジェントな条件下で、標的配列を含む提供されたサンプル中の標的配列にのみハイブリダイゼーションすることを示唆する。
【００７５】
実施例
本発明を説明する非制限実施例が提供されるだろう。上の記述は例示としてのみ提供され、当業者に認識されている、使用する材料および技術両方の変種は企図されることが理解されるだろう。
【００７６】
方法体系
動物
チーガスク、アテンリーのヒツジ研究センターのケンブリッジおよびベルクレアヒツジの群れで、腹腔鏡を使用して各交配期の初めに排卵頻度を定期的に調べた。交配前に一度、および交配期の最初の交配後に一度試験を行った。これらの群れを確立して以来、このデータを毎年収集してきた。毎年、交配のために使用するオスを少なくとも５頭、群れに自給した。さらに、ガルウェイおよびスコティッシュブラックフェイスメスヒツジ（両方とも少産種である）と交配させることにより、これらの群れのオスヒツジを排卵頻度で子孫試験した。排卵頻度の測定は、The Minister of Health under the Cruelty to Animals Act (1876) EU Directive 86/609/ECの許可の下、腹腔鏡により行った。
不妊のメスヒツジを初めて見つけた時、フリーマーチンである可能性を調べたが、これは確認できなかった（Hanrahan、1991）。１９９０年およびその後数年間に生まれた不妊のケンブリッジメスヒツジ、および１９９３年以降に生まれたＦ７００ベルクレアの不妊のメスの実質的に全てから、ＤＮＡ抽出のために血液サンプルを保管した。１９９２年以降これらの群れの妊娠可能なメスヒツジから収集した、ＤＮＡ抽出のための血液サンプルによりこの材料を補足した。
【００７７】
ＳＡＳのＧＬＭ法を使用する実験単位として、個々の動物で最小スクエア方法により、排卵頻度のデータを分析した。モデルの因子は、メスヒツジ、年齢、記録年、および以下に記載の各変異のコピー数（０または１）であった。
【００７８】
サンプル
冷凍保存軟膜から、または全血液中の白血球細胞から直接のどちらかで、アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジからゲノムＤＮＡを単離した。ヒツジの常染色体微小付随体マーカーＯａｒＨＨ６４（ヒツジの４番染色体）、ＯａｒＣＰ３４（ヒツジの３番染色体）、およびＯａｒＦＣＢ３０４（ヒツジの１９番染色体）で主血統の親を立証した。
【００７９】
配列決定および変異検出
発表されているヒツジの配列（ヒツジのゲノムＧＤＦ−９Ｂエキソン１、ＡＦ２３６０７８；ヒツジのゲノムＧＤＦ−９Ｂエキソン２、ＡＦ２３６０７９；ヒツジのゲノムＧＤＦ−９エキソン１および２、ＡＦ０７８５４５）から設計したプライマーでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ヒツジのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ遺伝子を増幅させた。
【００８０】
使用したＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
ＧＤＦ−９Ｂエキソン１  Ｂ１３：５´−ＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＣＣＣＡＣ−３´
Ｂ２８：５´−ＡＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＡＣＡ−３´
ＧＤＦ−９Ｂエキソン２  Ｂ２５：５´−ＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＣＡＧＧＴＣ−３´
Ｏ４：５´−ＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣ−３´
ＧＤＦ−９エキソン１    Ｇ１：５´−ＧＡＡＴＴＧＡＡＣＣＴＡＧＣＣＣＡＣＣＣＡＣ−３´
Ｇ４：５´−ＡＧＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＧＡＧＧＣ−３´
ＧＤＦ−９エキソン２    Ｇ５：５´−ＡＴＣＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＴＡＡＧＧＣ−３´
Ｇ７：５´−ＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＧＡＣＡＧＧ−３´
生じたＰＣＲ生成物をＡＢＩ３７３シーケンサーで配列決定した。
【００８１】
一本鎖配座多型検出
子孫試験プログラムに関係する９頭のベルクレアオスヒツジ、およびこれらのオスヒツジのうちの３頭の半同胞子孫（ｎ＝５８（それぞれ２９、１７、および１２頭の子孫））、および２頭のケンブリッジオスヒツジで、そのうち１頭を子孫試験したもので、ＳＳＣＰ（一本鎖配座多型）を実施した。さらに、２頭のベルクレアオスヒツジの７頭の純粋種の娘を、関係する５頭の母のうちの４頭とともに試験した。
【００８２】
エキソン２の大部分にわたる三のヌクレオチド断片を分析することにより、ＧＤＦ−９Ｂ遺伝子型を決定した。ＳＳＣＰにより分析した断片は、
３５３ｂｐ、エキソン２  プライマー９Ｂ−３５９  ５´−ＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＣＴＣＴ−３´
プライマー９Ｂ−６９１  ５´−ＣＣＴＣＡＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＣＴＧＣＴ−３´
２７３ｂｐ、エキソン２  プライマー９Ｂ−６６４  ５´−ＧＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＣ−３´
プライマー９Ｂ−９１６  ５´−ＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＣＡＴＣＡＴ−３´
３１２ｂｐ、エキソン２  プライマー９Ｂ−９１５  ５´−ＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＣＴＧＡＡＡＧＴＡＡＣ−３´
プライマー９Ｂ−１２０５  ５´−ＧＧＣＡＡＴＣＡＴＡＣＣＣＴＣＡＴＡＣＴＣＣ−３´
であった。
【００８３】
ヌクレオチド配列ゲンバンク取得番号ＡＦ２３６０７９からプライマーを設計し、プライマーの名前をその配列中のヌクレオチドの位置に対応させた。
エキソン１にわたる五の断片、イントロンの一部およびエキソン２の大部分を分析することにより、ＧＤＦ−９遺伝子型を決定した。ＳＳＣＰにより分析した断片は、
４６２ｂｐ、エキソン１  プライマーＧ９−１７３４  ５´−ＧＡＡＧＡＣＴＧＧＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡＴＧ−３´
プライマーＧ９−２１７５  ５´−ＣＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＣＡＣＣＴ−３´
２９４ｂｐ、イントロン  プライマーＧ９−２６７６  ５´−ＧＴＧＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＡ−３´
プライマーＧ９−２９４７  ５´−ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＣＡ−３´
２９６ｂｐ、エキソン２  プライマーＧ９−３２７０  ５´−ＴＧＧＣＡＴＴＡＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＴＴ−３´
プライマーＧ９−３５４６  ５´−ＣＡＡＧＡＧＧＡＧＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＡ−３´
２０６ｂｐ、エキソン２  プライマーＧ９−３５４３  ５´−ＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴ−３´
プライマーＧ９−３７２８  ５´−ＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＧ−３´
２２１ｂｐ、エキソン２  プライマーＧ９−３９３９  ５´−ＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＴＧＡＡＴＧＴ−３´
プライマーＧ９−４１４０  ５´−ＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＴＴＧＧＣＡＣＴ−３´
【００８４】
ヌクレオチド配列ゲンバンク取得番号ＡＦ０７８５４５からプライマーを設計し、プライマーの名前をその配列中のヌクレオチドの位置に対応させた。
１５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、１．５ｍＭまたは３ｍＭのマグネシウムおよび５５から５８℃のアニール温度で、４０μＬの反応混合物にて３０サイクルで増幅を実施した。９から１５Ｖ／ｃｍ、１５℃で一晩移動させたポリアクリルアミドゲル中のＰＣＲ断片を、ＳＳＣＰにより分析した。
【００８５】
単一ヌクレオチド多型検出アッセイ
ＧＤＦ−９エキソン１で同定される[Ｅ１]多型により、上記のＧ９−１７３４およびＧ９−２１７５プライマーにより生成した４６２ｂｐＰＣＲ断片の２６０番目のヌクレオチドで、ＨｈａＩ制限酵素開裂部位を阻害するＧからＡへのヌクレオチド変化（ＧＣＧＣからＧＣＡＣへ）が生成された。９μｌのＰＣＲ生成物および３ＵのＨｈａＩを１５μｌの最終容量で使用して、６時間３７℃にて分解を実施した。ＨｈａＩで野生型動物からＰＣＲ生成物を制限分解することにより、４６２ｂｐの生成物が（二の内在ＨｈａＩ部位で）５２ｂｐ、１５６ｂｐ、および２５４ｂｐの断片に開裂する。しかし、Ａヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片はこの部位で開裂せず、５２ｂｐおよび４１０ｂｐの断片サイズが見られる。変異のヘテロ接合動物は、四のサイズ（５２ｂｐ、１５６ｂｐ、２５４ｂｐ、および４１０ｂｐ）全ての断片を有する。
配列決定により同定されるＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの残存単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、一般的制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に影響しなかった。ヒツジのＦ７００ベルクレアおよびケンブリッジの群れを介してこれらの多型をスクリーニングするために、制限酵素部位を含有する生成物を故意に生成するために単一ミスマッチを有するプライマーを使用してＰＣＲを実施した。以下に明記するように、適当な制限酵素での分解が、野生型動物からのＰＣＲ生成物またはＳＮＰを含有する動物からのＰＣＲ生成物のどちらかを開裂させるように、アッセイを設計した。生じるバンドシフトは、高率アガロースゲルで分解される。各アッセイでのプライマー配列およびＰＣＲ条件は、以下の通りであった。制限酵素開裂部位を生成するための適当なプライマーで生じたミスマッチには、下線を引いた。
【００８６】
以下の五のアッセイ全てで、９４℃で５分間；９４℃で３０秒間を３５サイクル；（各アッセイに特異的な以下に記載の温度で）４０秒間のアニール段階、および７２℃で３０秒間；その後の７２℃で４分間の最終延長で、増幅を実施した。マグネシウム濃度は１．５ｍＭであった。
１．１６１ｂｐのＰＣＲ生成物を増幅させる、ＧＤＦ−９[３２４]ヌクレオチド変化に使用するプライマーは、
[３２４]−Ｓｆｕ１Ｆ  ５´−ＧＧＡＡＴＡＴＴＣＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧ−３´
[３２４]−Ｓｆｕ３Ｒ  ５´−ＧＡＧＧＧＡＡＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＡＡＧＣＣ−３´
であった。
アニール温度は６３℃であった。
非野生型鎖は、制限酵素ＳｆｕＩにより開裂した。
２．１５８ｂｐのＰＣＲ生成物を増幅させる、ＧＤＦ−９[７１４]ヌクレオチド変化に使用するプライマーは、
[７１４]−Ｔｒｕ１Ｒ  ５´−ＣＡＧＴＡＴＣＧＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＴ−３´
[７１４]−Ｔｒｕ３Ｆ  ５´−ＧＣＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＧＴＣ−３´
であった。
アニーリング温度は６３℃であった。
非野生型鎖は、制限酵素ＭｓｅＩにより開裂した。
【００８７】
３．１３９ｂｐのＰＣＲ生成物を増幅させる、ＧＤＦ−９[７８７]ヌクレオチド変化に使用するプライマーは、
[７８７]−Ｄｄｅ１Ｒ  ５´−ＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡ−３´
[７８７]−Ｄｄｅ３Ｆ  ５´−ＣＴＴＴＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＡＣ−３´
であった。
アニーリング温度は６２℃であった。
野生型鎖は、制限酵素ＤｄｅＩにより開裂した。
４．１４１ｂｐのＰＣＲ生成物を増幅させる、ＧＤＦ−９[Ｓ１]ヌクレオチド変化に使用するプライマーは、
[Ｓ１]−Ｈｉｎｆ１Ｆ  ５´−ＣＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＡＴＴＴＣＡＡＴＧＡＧＡＣ−３´
Ｂ２６  ５´−ＧＡＴＧＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧ−３´
であった。
アニーリング温度は６３℃であった。
野生型鎖は、制限酵素ＨｉｎｆＩにより開裂した。
【００８８】
５．１５３ｂｐのＰＣＲ生成物を増幅させる、ＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ２]ヌクレオチド変化に使用するプライマーは、
[Ｓ２]−Ｄｅｌ１Ｆ  ５´−ＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＡＴＡＡＧＴＡＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＡ−３´
Ｏ４  ５´−ＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＴＡＧＣ−３´
であった。
アニーリング温度は６４℃であった。
野生型鎖は、制限酵素ＤｄｅＩにより開裂した。
【００８９】
ＨｉｎｆＩ[Ｓ１]またはＤｄｅＩ[[７８７]および[Ｓ２]]でのＰＣＲ制限分解により、野生型対立遺伝子から増幅した断片から、より長いプライマーが開裂する（かくして、変異を有する対立遺伝子を含有する動物からの非開裂断片より３０から３５ｂｐ小さい生成物を生成する）。ＳｆｕＩ[３２４]またはＭｓｅＩ[７１４]でのＰＣＲ制限分解により、変異対立遺伝子から増幅した断片から、より長いプライマーが開裂する（かくして、野生型対立遺伝子を含有する動物からの非開裂断片より３０から３５ｂｐ小さい生成物を生成する）。変異のいずれかにヘテロ接合の動物は、両方のサイズの断片を有した。分解断片を４％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。変異の有無でゲルを記録した。ホモ接合、ヘテロ接合、およびネガティブコントロールは各アッセイで含まれた。
【００９０】
免疫化実験
the Animals Ethics Committee at Wallaceville Animal Research Centre in accordance with the 1987 Animal Protection (Codes of Ethical Conduct) Regulations of New Zealandの承認の下で、全ての実験を実施した。免疫化研究で使用される動物（ｎ＝５４）は、５から６歳の経産ロムニーメスヒツジであった。
【００９１】
ヒツジの免疫化のための抗原の生成
ペプチドＫＫＰＬＶＰＡＳＶＮＬＳＥＹＦＣ（ＧＤＦ−９）およびＳＥＶＰＧＰＳＲＥＨＤＧＰＥＳＣ（ＧＤＦ−９Ｂ）を合成し、Macromolecular Resources（Colorado State University, Fort Collins, CO）により、Ｃ末端システイン残基を介してＫＬＨに共役させた。
【００９２】
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂペプチドに対するメスヒツジの長期能動免疫化
一次免疫のために、１ｍｌのフロイント完全補強剤中の０．４ｍｇＫＬＨ（対照、ｎ＝１０）、０．４ｍｇＫＬＨ−ＧＤＦ−９ペプチド共役（ＧＤＦ−９ペプチド；ｎ＝１０）、または０．４ｍｇＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂペプチド共役（ＧＤＦ−９Ｂペプチド；ｎ＝１０）をメスヒツジに注入した（筋注）。その後、１．２５ｍｌＳＴＭで混合した１ｍｌの塩水中の０．２ｍｇＫＬＨ、ＧＤＦ−９ペプチドまたはＧＤＦ−９Ｂペプチドで６ヶ月間、月１回メスヒツジを免疫化した。５回目の注入後、発情周期をモニターするために、マーキング行為を有する、精管切除したオスヒツジをメスヒツジと交配させた。連続する周期での、精管切除したオスヒツジによる最初に観察されたマーキング間の日数として、発情周期の長さを計算した。さらに、血漿プロゲステロン濃度を決定するために、週３回頚静脈を介して血液サンプルを収集した。全ての対象メスヒツジが発情期および各連続する発情周期で観察された時、腹腔鏡により、発情行動を示したメスヒツジの排卵頻度を決定した。さらに、卵巣収集前の３から４週間前に、腹腔鏡により、全てのメスヒツジの排卵頻度を決定した。最終注入のおよそ２週間後、捕獲ボルトを使用してメスヒツジを殺し、全採血した。全てのメスヒツジから収集した血液を、その後の受動免疫化研究で使用した。両卵巣を取り出し、存在する黄体の数を記録し、形態学の実験および卵巣母集団の分析のために、各メスヒツジからの一の卵巣をブワン液で固定した。
【００９３】
ＫＬＨ、ＫＬＨ−ＧＤＦ−９ペプチド、およびＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂペプチドに対するメスヒツジの受動免疫化
各処理群中の何頭かの能動免疫化メスヒツジから得た血漿を混合することにより、ヒツジに処理したＫＬＨ（ｎ＝９）、ＧＤＦ−９ペプチド（ｎ＝７、全て無排卵メスヒツジ）、およびＧＤＦ−９Ｂペプチド（ｎ＝９、全て無排卵ヒツジ）からの抗血漿プールを生成した。プロスタグランジンＦ２α誘導体（エストルーメイト、１２５μｇ）を使用することにより、メスヒツジの発情周期に同時性をもたせた。マーキング行為を弱くする、精管切除したオスヒツジを採用して、発情を検出した。発情周期の４または５日目（発情＝０日目）に、排卵頻度を決定するためにメスヒツジに腹腔鏡を施行し、内在頚静脈カニューレを固定した。後日、内在頚静脈カニューレを介して、ＫＬＨ、ＧＤＦ−９ペプチドまたはＧＤＦ−９Ｂペプチドに対する抗血漿１００ｍｌを、メスヒツジ（各群につきｎ＝４から５）に投与した。卵胞期を誘導するための抗血漿投与後９６時間で、エストルーメイトをもう一度注入し、エストルーメイトの注入後１０日目、およびその後繁殖期が終わる（非実験ヒツジの発情活動がなくなることにより評価した）まで１５から１８日ごとに、腹腔鏡により排卵頻度を決定した。血漿中の抗体滴定濃度およびプロゲステロン濃度を決定するために、抗血漿の注入後５分、１時間、および９６時間、およびその後エストルーメイトの２回目の注入から一週間につき３回、血液サンプルをメスヒツジから収集した。
【００９４】
プロゲステロン濃度の決定
血漿中のプロゲステロン濃度を放射免疫測定（ＲＩＡ）により決定した。変形の相互および内アッセイ共効率は１０％未満であり、アッセイ感度は０．１ｎｇ／ｍｌであった。以下の全てのサンプルで、アッセイ感度は、統計分析で０．１ｎｇ／ｍｌという値を示した。
【００９５】
短期免疫化
ＫＬＨ（Ｎ＝５０）、ＧＤＦ−９ペプチドに共役なＫＬＨ（Ｎ＝３０）、またはＧＤＦ−９Ｂペプチドに共役なＫＬＨ（Ｎ＝３０）で、ロムニーメスヒツジを免疫化した。一ヶ月あけて２度、ＤＥＡＥデキストラン（４％重量／容量）に抗原を投与した。追加抗原免疫化後に初めて観察された発情後に、黄体（ＣＬ）の数を決定した。さらに、これらのメスヒツジから選択した部分母集団（Ｎ＝２６ＫＬＨ、Ｎ＝１５ＧＤＦ−９、Ｎ＝１６ＧＤＦ−９Ｂ）で、次の発情後に存在するＣＬの数も決定した。各メスヒツジにおけるＣＬの平均値をキースクエア分析により分析した。
【００９６】
統計分析
長期能動免疫化したメスヒツジでは、少なくとも一の黄体（ＣＬ）が存在する時に、メスヒツジで観察される全ての黄体の数という方法で、個々のメスヒツジの排卵頻度を計算した（つまり、ＣＬが観察されないものは計算から除外した）。ＫＬＨ−ＧＤＦ−９Ｂ成熟蛋白およびＫＬＨ処理群の間の排卵頻度を比較するために、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験を使用した。十分な数のメスヒツジの排卵がなかったので、他の群はこの比較に含めなかった。全ての対照メスヒツジで発情が観察されるまでに、発情が観察されたメスヒツジの割合を比較するためにキースクエア試験を使用した。さらに、卵巣収集の３から４週間前および卵巣収集時に、卵巣に黄体を有するメスヒツジの割合を比較するために、キースクエア試験を使用した。
卵巣容量、卵胞または卵母細胞の数、または卵胞の直径で、能動免疫化処理の効果を実験する場合、ログ変換によりデータを正規化した後に、各卵胞型でのデータを分析した。適当な場所で動物を封鎖した後、各パラメーターで一方向ＡＮＯＶＡを実施し、最小の有意な違いにより処理群間の違いを決定した。
【００９７】
受動免疫化メスヒツジでは、フィッシャーの精密試験を使用して、各腹腔鏡で黄体を有するメスヒツジの数の違いを決定した。血漿投与後４日目に与えられたエストルーメイトの注入後、２から１９日目のプロゲステロン値に対する領域機能を使用するゲンスタットを使用して、曲線以下の領域を計算した。生じた結果を一方向ＡＮＯＶＡで分析し、対照および処理したメスヒツジの間の違いをフィッシャーのペア比較で決定した。
短期能動免疫化では、両方で観察された黄体の数の平均として、個々のメスヒツジの排卵頻度を計算した。最小スクエア方法の間のＳＡＳ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓの一般的直線モデル方法を使用して、データを分析した。
【００９８】
結果および結果分析
ケンブリッジおよびＦ７００ベルクレア動物での変異の発見
ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂでの変異がこれらの動物での不妊に寄与しているかどうかを決定するために、アイリッシュケンブリッジ（Ｎ＝９）およびＦ７００ベルクレアヒツジ（Ｎ＝１０）の部分集合での両方の遺伝子の完全コード配列で、配列情報を得た。不妊表現型、または不妊動物との血統関係に基づいて、完全長配列決定をするための動物を選んだ。さらに、Ｆ７００ベルクレア血統（２３頭の動物、および３頭のオスヒツジの５８頭の子孫試験娘）、および２頭のケンブリッジオスヒツジでも、上記の配列決定とは独立して、一本鎖配座多型（ＳＳＣＰ）分析により変異検出を実施した。
【００９９】
ＧＤＦ−９での変異
ＧＤＦ−９の配列により、完全コード領域にわたる八の単一ヌクレオチド多型が明らかになった（表１、図４）。ＳＳＣＰにより、配座の違いを含有する遺伝子にわたる五の断片が同定された。これらの違いは、エキソン１での一の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、イントロンでの一のＳＮＰ、およびエキソン２での五のＳＮＰに対応する。オリジナルの変異の命名（スクエア括弧[]中の数、表１）は、ＧＤＦ−９のエキソン１で見られる多型をいう[Ｅ１]を除いて、エキソン２の最初からのヌクレオチドの位置をいう。表１は、（ａ）オリジナルの番号付けシステム、（ｂ）第一ａｔｇから数えた、完全長コード配列でのコードヌクレオチドの位置、（ｃ）関係するコードアミノ酸残基の位置、および（ｄ）（もしあれば、）フリンプロテアーゼ処理部位後の第一アミノ酸から数えた、成熟コード配列中のコード残基の位置、の間の関係を示す。例えば、変異[５８１]は、完全長の未処理蛋白の３２６番目の残基、または処理した成熟ペプチドの８番目の残基、をコードする、変化していないグルタミン酸（Ｇｌｕ）に対応する、ＧＤＦ−９の９７８番目のコードヌクレオチドでのＧからＡへのヌクレオチド置換である。
【０１００】
八の多型のうちの三は、アミノ酸を改変しないヌクレオチド変化である（４７１番目のヌクレオチドの位置での[７４]、４７７番目のヌクレオチドでの[８０]、および９７８番目のヌクレオチドの位置での[５８１]）。五の残りのヌクレオチド変化[３２４]、[５９７]、[７１４]、および[７８７]は、アミノ酸変化を生じた（表１、図１、図４）が、それらのうちの三は、比較的保存的な変化であった。エキソン１での８７番目のアミノ酸残基での[Ｅ１]アルギニンからヒスチジンへの変化は、一の塩基性に帯電したイオン化基を別のものに置換し、フリン処理部位より前の位置で生じたので、成熟蛋白の活性に影響を与えないようであった。未処理蛋白の３３２番目のアミノ酸残基（成熟コード領域の１４番目の残基）での[５９７]バリンからイソロイシンへの変化、および未処理蛋白の３７１番目の残基（成熟コード領域の５３番目の残基）での[７１４]バリンからメチオニンへの変化は、非イオン化基を非イオン化基に置換する。残りの二の変化では、非保存的に置換した。未処理蛋白の２４１番目のアミノ酸残基での[３２４]グルタミン酸からリシンへの変化は、酸性基を塩基性期と置換するが、これは、フリン処理部位より前の位置で生じ、成熟活性コード領域に影響しないようである。しかし、３９５番目の残基での[７８７]セリンからフェニルアラニンへの変化は、成熟コード領域の７７番目の残基で、非荷電イオン化基を非イオン化基に置換する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の変化を、図１および図４で説明する。
【０１０１】
ＧＤＦ−９Ｂでの変異
ケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジのＧＤＦ−９ＢのＤＮＡ配列決定および独立するＳＳＣＰ分析の両方により、完全コード領域にわたる四の多型が明らかになった（表１、図５）。（スクエア括弧[]中の）これらの変異のオリジナルの命名は、特異的に、ロイシン欠失[Ｌｅｕ]、または保存的[４２２]ＴからＣへの変異での、エキソン２の最初からのヌクレオチドの位置をいう。アミノ酸を変化させるＧＤＦ−９Ｂ変異を、[Ｓ１]および[Ｓ２］と命名した。表１は、（ａ）オリジナルの番号付けシステム、（ｂ）第一ａｔｇから数えた、完全長コード配列でのコードヌクレオチドの位置、（ｃ）関係するコードアミノ酸残基の位置、および（ｄ）（もしあれば、）フリンプロテアーゼ処理部位後の第一アミノ酸から数えた、成熟コード配列中のコード残基の位置、の間の関係を示す。例えば、変異[Ｓ２]は、完全長の未処理蛋白の３６７番目のコード残基、または処理した成熟ペプチドの９９番目の残基で、イソロイシン（Ｉｌｅ）残基に変化しているセリン（Ｓｅｒ）残基に対応する、ＧＤＦ−９Ｂの１１００番目のコードヌクレオチドでのＧからＴへのヌクレオチド置換であった。
【０１０２】
これらの四の多型（表１）のうちの第一は、以前記載した予測シグナル配列中のロイシン欠失多型[ｌｅｕ]であり（Gallowayら、2000）、それにより、この位置で二のロイシンコドン（ＣＴＴ）を有するヒツジ、および一だけ有するヒツジがいる。この多型は、インバーデールヒツジでの生殖能力および排卵頻度に関係しないことがわかっている（Gallowayら、2000）。一の他のヌクレオチド変化[４２２]は、アミノ酸を改変しなかった（７４７番目のヌクレオチドの位置）。残りの二のヌクレオチド変化（[Ｓ１]および[Ｓ２]）は、該蛋白で、より決定的な変化をもたらした（図２、図５）。７１８番目のヌクレオチドでの[Ｓ１]ＣからＴへの変化は、未処理の蛋白の２３９番目のアミノ酸残基でグルタミン酸（Ｑ、ＣＡＧ）の位置に未熟停止コドン（ＴＡＧ）を導入し、おそらく、ＧＤＦ−９Ｂ機能は完全に失われた。１１００番目のヌクレオチドでの[Ｓ２]ＧからＴへの変化は、成熟活性蛋白の９９番目のアミノ酸のセリン残基（未処理蛋白の３６７番目の残基）をイソロイシンに変化させ、それにより、非荷電イオン化基を非イオン化基に置換した。ヌクレオチドおよびアミノ酸変化を、図２および図５で説明する。
【０１０３】
より多くの動物での変異のスクリーニング
各ファミリーからの、より少数の動物の一次配列決定により、ＧＤＦ−９での[７４]、[８０]、[３２４]、[７１４]、および[７８７]ヌクレオチド変化、およびＧＤＦ−９Ｂでの[Ｓ１]、[Ｓ２]、および[４２２]変化を同定した。[３２４]、[７１４]、[７８７]（ＧＤＦ−９）、および[Ｓ１]および[Ｓ２]（ＧＤＦ−９Ｂ）で、特異的ＳＮＰを検出するための強制ＲＦＬＰ（制限断片長の多型）アッセイを開発し、これらのアッセイを、より多くの動物で実施した（表２）。その後の、より多くの動物での完全長ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列決定により、Ｆ７００ベルクレアではなく、ケンブリッジヒツジで、ＧＤＦ−９の[５８１]および[５９７]ヌクレオチド変化が明らかになった。独立ＳＳＣＰ分析により、一のオスヒツジでＧＤＦ−９のエキソン１での[Ｅ１]多型が同定され、これはさらなる動物を介してもスクリーニングされた。[Ｅ１]は、このオスヒツジおよびその戻し交配子孫で、野生型対立遺伝子に関連するが、排卵頻度には関連しないことがわかった。
【０１０４】
ホモ接合変異は不妊に関連する
全ての試験した動物での不妊または生殖能力に関連して、これらのヌクレオチド変化それぞれの有無を分析し、ＧＤＦ−９の[７８７]変化およびＧＤＦ−９Ｂの[Ｓ１]および[Ｓ２]変化だけが生殖不能に寄与することが明らかになった。[７８７]にホモ接合であったメスヒツジは不妊であり；[Ｓ１]にホモ接合、または[Ｓ２]にホモ接合であったメスヒツジは不妊であり；[Ｓ１]および[Ｓ２]に同時にヘテロ接合であったメスヒツジ（それにより、Ｘ染色体の両方のコピーは異なるＧＤＦ−９Ｂ変異を保有した）は不妊であった。図３ａおよび図３ｂは、より大規模の動物で見られたものを説明する、少ない血統からのデータを示す。
図３ａはＦ７００ベルクレア血統を説明する。父のＲ８３０は、Ｘ染色体上にＧＤＦ−９Ｂ［Ｓ２］変異、および５番染色体上にＧＤＦ−９[７８７]の単一コピーを保有したが、ＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ１]変異を有さなかった。母の９７０４は、Ｘ染色体上にＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ１]の単一コピーを保有し、それらの二頭のメスの子孫（９３０４５８および９３０４５９）は、両親からＧＤＦ−９Ｂの変異コピーを受け継いだので、不妊であった。母の８７８３は５番染色体上にＧＤＦ−９[７８７]変異の単一コピーを保有し、父のＲ８３０との交配によるメスの子孫は生殖不能であり、ＧＤＦ−９[７８７]変異にホモ接合であった。それらの生殖不能は、ＧＤＦ−９Ｂ変異で説明できない。子孫９３０８１０および９４８３０２は、これらの変異のいずれかにホモ接合でなく、それゆえ、生殖可能であった。三の機能的変異（[Ｓ１]、[Ｓ２]、および[７８７]）全てが、Ｆ７００ベルクレアの群れで見られた（表２）。
【０１０５】
図３ｂは二のケンブリッジ血統を説明する。父の９６２１０１は、Ｘ染色体上にＧＤＦ−９Ｂ［Ｓ１］変異、および５番染色体上にＧＤＦ−９[７８７]の単一コピーを保有したが、ＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ２]変異を有さなかった。母の９６２１５２は、Ｘ染色体上に[Ｓ１]変異の単一コピー、および５番染色体上に[７８７]変異の単一コピーを保有した。それらの二頭のメスの子孫（９９７６３４および９９７６３５）は不妊であり、両親からＧＤＦ−９Ｂ（[Ｓ１]）およびＧＤＦ−９（[７８７]）両方の変異コピーを受け継いだ。母の９７６２３４は[Ｓ１]変異の単一コピーを保有しただけであって、一頭のメスの子孫（９９７５５３）は、両親からＧＤＦ−９Ｂ（[Ｓ１]）の変異コピーを受け継いでおり、不妊であったが、９９７５５２は生殖可能であった。父の９３０１４２はＧＤＦ−９[７８７]変異にホモ接合であり、Ｘ染色体上にＧＤＦ−９Ｂ［Ｓ１］変異を保有したが、母の８８７４は、ＧＤＦ−９[７８７]変異にヘテロ接合なだけであり、ＧＤＦ−９Ｂを保有しなかった。それらの娘（９４８０９３）は、ＧＤＦ−９[７８７]変異の二のコピーを受け継ぎ、父から受け継いだＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ１]変異にもヘテロ接合であったが、不妊であった。[Ｓ２]変異は、ケンブリッジの群れからの、試験したいずれの動物でも見られなかった（表２）。
これらの変化を試験した動物の中に、ＧＤＦ−９[３２４]および[７１４]両方にホモ接合な生殖可能動物が見出され、それゆえ、これらの変化のいずれも、不妊を引き起こすのに十分遺伝子を阻害しないと結論付けた。ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ変異両方にヘテロ接合であった動物も見出され、これらの動物は不妊でなかった。
【０１０６】
活性に対する変異の構造的影響
構造的データは、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性に三の変異（[Ｓ１]、[Ｓ２]、および[７８７]）のそれぞれが及ぼしそうな影響についての情報を提供するかもしれないＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーに利用でき、それゆえ、不妊との関連を説明する。ＴＧＦ−β１（Hinckら、1996）；ＴＧＦ−β２（Daopinら、1992）、ＴＧＦ−β３（Mittlら、1996）、ＢＭＰ７／ＯＰ１（Griffitら、1996）、およびＢＭＰ２（Scheuflerら、1999）で、構造が記録されている。ＢＲＩＡ受容体結合外部位を有するＢＭＰ２（Kirschら、2000）、およびＴβＲ２受容体結合外部位を有するＴＧＦ−β３（Hartら、2002）でも、受容体結合構造が記録されている。
【０１０７】
本発明では、[Ｓ１]変異により、成熟活性蛋白処理部位より前に、ＧＤＦ−９Ｂ蛋白の未熟末端が生じた。かくして、この変異により、翻訳される成熟蛋白がなくなり、ヒツジで生殖不能になるHanna変異（Gallowayら、2000）よりかなり厳しい影響を与えるだろうと予測される。ＧＤＦ−９Ｂ[Ｓ２]変異により、ＴＧＦβスーパーファミリーの大部分のメンバーにわたって保存される非荷電イオン化セリン残基（成熟ＧＤＦ−９Ｂの９９番目の残基）が、非イオン化イソロイシンに変化した（図６）。このセリン（および近くに保存されるロイシン）は、ＢＭＰ２の構造的および部位対象突然変異生成研究により、受容体結合に不可欠であることがわかっている。Ｆ７００ベルクレアヒツジでは、この変異は、おそらく受容体結合に影響することによりＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性を失わせると思われる。ＧＤＦ−９[７８７]変異により、二量化に関係すると思われる分子領域で、非荷電イオン化セリン残基（成熟ＧＤＦ−９の７７番目の残基）が非イオン化フェニルアラニンに変化した。この変化は、成熟ＧＤＦ−９ペプチドの保存ヒスチジン（Ｈ８０）から三残基だけ離れて生じた（図６）。ＢＭＰ７では、この保存ヒスチジンは、ＢＭＰ７二量体（Griffitら、1996）およびＴＧＦβ３（Mittlら、1996）で、対の分子の三残基に水素結合する。ＧＤＦ−９は、ＴＧＦβスーパーファミリーの大部分の他のメンバーで見出される、生物学的活性のある二量体の両方の単量体の間に共有結合を形成する鎖間ジスルフィド結合を欠く。それゆえ、ＧＤＦ−９で、単量体の間の水素結合は二量体の安定性を維持するのにかなり決定的であるので、ＧＤＦ−９[７８７]変異により、おそらく、二量化を阻害することにより生物学的活性が失われるだろう。
【０１０８】
ヘテロ接合動物は排卵過多を有する
アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジは、排卵過多ならび生殖不能である（Hanrahan、1996）。[Ｓ１]、[Ｓ２]、および[７８７]変異の遺伝子型であった、生殖可能なメスヒツジの排卵頻度データを収集した（表３）。ＧＤＦ−９Ｂの変異（[Ｓ１]または[Ｓ２]のどちらか）のヘテロ接合保因者は、インバーデールおよびハンナヒツジで見られたものと同様の排卵過多を示した（Davisら、2001）。ＧＤＦ−９Ｂ変異およびＧＤＦ−９変異の両方のヘテロ接合であった動物では排卵頻度がより多く、この影響は付加的であるようだった。
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂは独立して作用するので、両方の蛋白の組み合わせにより、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのどちらかだけを改変するよりも効率的に排卵機能が改変されるだろうということが、一の動物でのＧＤＦ−９変異およびＧＤＦ−９Ｂ変異両方の付加的影響により示唆される。
【０１０９】
ＧＤＦ−９に対してヒツジを免疫化する影響
上記の遺伝子型影響に加えて、ＧＤＦ−９でのヒツジの長期能動免疫化および短期受動免疫化の両方を実施し、不妊および／または異常黄体機能を引き起こすことがわかった。この発見は、ホモ接合ＧＤＦ−９変異表現型が不妊の一つである、というさらなる証拠を提供する。
ＫＬＨ（対照、ｎ＝９）、またはＧＤＦ−９ペプチドに共役なＫＬＨ（ｎ＝１０）に対してメスヒツジを能動免疫化した。ＧＤＦ−９ペプチドで能動免疫化したメスヒツジは、反復腹腔鏡により証明されるような、周期的発情行動を示さなかった（表４）。高（通常）プロゲステロン濃度は、一または二のサンプルでのみ見られた（図７）。一般的に、ＧＤＦ−９ペプチドに共役なＫＬＨに対する長期免疫化の後、黄体および／または黄体様構造を観察した場合、プロゲステロン濃度は異常であった。さらに、メスヒツジの多くは、腹腔鏡または卵巣収集で、可視洞卵胞を有さなかった。図７は、比較のためにＧＤＦ−９Ｂ／（ＢＭＰ１５）に対して免疫化したメスヒツジのデータも示す。
１００ｍｌのＧＤＦ−９ペプチド抗血漿を使用する受動免疫化により、抗血漿の投与から３０日以内に、異常黄体機能が生じた。抗血漿の投与前に、該群の間に排卵頻度の違いはなかった。卵胞期の誘導の４日前の、ＧＤＦ−９ペプチドに対する抗血漿の投与は、排卵頻度に影響しなかった。しかし、腹腔鏡では、ＧＤＦ−９抗血漿で処理した二の動物の黄体は、通常より小さいようであった。さらに、その後の黄体期での全般的平均プロゲステロン濃度は、対照動物で観察されるものより小さかった（Ｐ＜０．０５）（図８）。これは、二の動物では、通常プロゲステロン濃度の結果であったが、他の三の動物では、黄体融解は通常の時期に生じたが、排卵後のプロゲステロンの上昇は遅れた。図８は、比較のための、ＧＤＦ−９Ｂ／（ＢＭＰ１５）での受動免疫化のデータも示す。
【０１１０】
ＧＤＦ−９免疫化（受動および能動の両方）後の異常黄体機能の発見は、以前に記録されていない。それゆえ、補助的ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ、またはそれらの類似体、またはＧＤＦ−９あるいはＧＤＦ−９Ｂ拮抗剤の投与は、黄体機能を修飾するかもしれないと仮定される。
さらなる実験では、ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂでのヒツジの短期能動免疫化は、これらの遺伝子での変異のヘテロ接合の影響を模倣することがわかった。ＧＤＦ−９ペプチドに共役なＫＬＨ、またはＧＤＦ−９Ｂペプチドに共役なＫＬＨでの、以前の実験よりも緩やかな補強剤を使用する短期免疫化は、黄体（ＣＬ）の数により測定されるように、排卵した動物での排卵頻度を増加させるように作用した（表５）。
排卵過多の（つまり、これらの不活化変異のヘテロ接合保因者でみられるような）影響は、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂのペプチドに対する短期能動免疫化によってもヒツジで誘導されうるという観察は、排卵機能を改変する新しい方法を提供する。
【０１１１】
ＧＤＦ−９Ｂでの免疫化における一時的／可逆的影響
（０．４ｍｇのＧＤＦ−９Ｂペプチド−ＫＬＨ、およびその３０日後の０．２ｍｇのＧＤＦ−９Ｂペプチド−ＫＬＨで）免疫化した３０頭のメスヒツジのうちの４頭は、一過性の生殖不能を示した。二回目の免疫化後、メスヒツジは発情を示さず、それらの卵巣実験で、排卵の証拠を示さなかった（黄体がなかった）。これらのメスヒツジは、３０日後以降、発情を回復し、生殖可能なオスヒツジと置かれた。発情での卵母細胞の放出は、以下に示すように健康であった。４頭のメスヒツジのうちの３頭は、生殖能力を回復したとたんに高排卵を有するので、移植のための受精卵を取り戻すためにフラッシングされた。一のメスヒツジからは受精卵を取り戻せなかったが、他の二のメスヒツジからは発育中の受精卵を取り戻した。さらに、メスヒツジのうちの一からの受精卵は、取り戻すのにはかなり進行していた（およそ１週間で）が、他のメスヒツジからの二の受精卵は、受容者のメスヒツジに移植され、一頭の子ヒツジが誕生した。四番目のメスヒツジは、分娩日まで妊娠を保有でき、二頭の子ヒツジが産まれ、一頭は死産であったが、一頭は生きている。これらの結果により、本発明の方法により誘導される不妊は一時的または可逆的であり、それゆえ、避妊の方法で使用してもよいという証拠が提供される。
【０１１２】
結論
これらの発見により、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの変異はヒツジのケンブリッジおよびベルクレア種で見られる、生殖への影響に関連するという第一の証拠が提供される。これらの遺伝子でのヘテロ接合変異およびホモ接合変異それぞれの存在により、これらの動物での排卵過多および不妊の表現型を説明できる。これらの遺伝子型を模倣するＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物学的活性で変化を誘導できる方法は、それを必要とする哺乳動物で生殖能力を調整するために開発されてきた。
【０１１３】
産業上の用途
本発明は、ヒトを含むメスの哺乳動物で、排卵頻度およびそれによる生殖能力を調整するための組成物および方法を提供する。
【０１１４】
表１
アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアＦ７００群でのＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの配列変形
【０１１５】
【表１】
2006510345.tif 000002
【０１１６】
縦列は、（ａ）各多型に使用したオリジナル命名システム、（ｂ）ヌクレオチド変化、（ｃ）第一ａｔｇ開始コドンから数えた完全長配列のコードヌクレオチドの位置（塩基対（ｂｐ）で）、（ｄ）関係するコードアミノ酸残基の位置（第一Ｍｅｔ残基から始めて）、および（ｅ）（もしあれば、）フリンプロテアーゼ処理部位後の第一アミノ酸から数えた、成熟コード配列内のコード残基の位置、の間の関連を示す。例えば、変異[５８１]は、完全長の未処理蛋白の３２６番目の、または処理した成熟ペプチドの８番目の、未変化グルタミン酸（Ｇｌｕ）コード残基に対応する、ＧＤＦ−９の９７８番目のコードヌクレオチドでのＧからＡへのヌクレオチド置換である。生殖不能および排卵頻度形質に関連する多型は際立っている。
【０１１７】
表２
アイリッシュケンブリッジおよびＦ７００ベルクレアヒツジからのＧＤＦ−９ＢおよびＧＤＦ−９遺伝子でのヌクレオチド変化の遺伝子型分析
示した数は、すぐ下の括弧に示した個々の遺伝子型の総数を有する、与えられた変異の少なくとも一のコピーを保有する個々の数である。特異的ＳＮＰアッセイおよび／または配列決定により遺伝子型を決定した。
*ＧＤＦ−９のエキソン１での[Ｅ１]多型（表１を参照のこと）は、ＳＳＣＰ分析により同定され、上の表で使用した同じセットの動物では試験されなかった。
【０１１８】
【表２】
2006510345.tif 000003
【０１１９】
表３
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ変異の異なる遺伝子型を保有するヒツジの排卵頻度の最小のスクエア方法
【０１２０】
【表３】
2006510345.tif 000004
（ｎ）＝メスのヒツジの数
【０１２１】
表４
最初の腹腔鏡（１回目）時の発情で、ＫＬＨ、ＧＤＦ−９ペプチド、またはＧＤＦ−９Ｂペプチドに対して免疫化したメスヒツジのうち、収集の３から４週間前の腹腔鏡（２回目）時および排卵収集時（３回目）で、可視黄体構造を有する割合
【０１２２】
【表４】
2006510345.tif 000005
*対照（ＫＬＨ）値と異なる値を意味する（Ｐ＜０．０５）
【０１２３】
表５
ＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂでのヒツジの短期免疫化
【０１２４】
【表５】
2006510345.tif 000006
*キー−スクエア分析を使用して、ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ免疫化メスヒツジは、（黄体（ＣＬ）により測定して）ＫＬＨ対照メスヒツジより有意に高い排卵頻度を有する（Ｐ＜０．０１）。
本発明の態様は例示としてのみ記載されるものであって、添付した特許請求から逸脱することなく修飾および追加がなされてもよい、ということが理解されるべきである。
【０１２５】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０１２６】
（原文に記載なし）
【配列表】
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【図１ｂ】
2006510345.tif 000038
2006510345.tif 000039
【図２ｂ】
2006510345.tif 000040
【図３ａ】
2006510345.tif 000041
【図３ｂ】
2006510345.tif 000042
【図４−１】
2006510345.tif 000043
【図４−２】
2006510345.tif 000044
【図５−１】
2006510345.tif 000045
【図５−２】
2006510345.tif 000046
【図６】
2006510345.tif 000047
【図７】
2006510345.tif 000048
【図８】
2006510345.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月31日(2005.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006510345000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月1日(2005.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１、３、または５；
ｂ）ａ）により特定される分子に相補的な配列；
ｃ）ａ）またはｂ）の配列の機能的断片または変種；
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）により特定されるいずれかの分子のアンチセンス配列；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む、単離変異ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号７、９、１１、１３、１５、または１７；
ｂ）ａ）により特定される分子に相補的な配列；
ｃ）ａ）またはｂ）により特定されるいずれかの分子のアンチセンス配列；
からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む、単離変異ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項３】
ヌクレオチド配列の２６０、４７１、４７７、７２１、９７８、９９４、１１１１または１１８４番目の位置にて少なくとも一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項４】
この核酸配列によりコードされるポリペプチドで、この変異によりアミノ酸が置換する、請求項３記載の単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項５】
このアミノ酸置換が受容体結合ドメインに存在し、受容体結合を阻害する、請求項４記載の単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項６】
このアミノ酸置換が二量化ドメインに存在し、二量化を阻害する、請求項４記載の単離ＧＤＦ−９核酸分子。
【請求項７】
配列の７１８、７４７または１１００番目の位置にて少なくとも一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項８】
この核酸配列によりコードされるポリペプチドで、この変異によりアミノ酸が置換する、請求項７記載の単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項９】
このアミノ酸置換が受容体結合ドメインに存在し、受容体結合を阻害する、請求項８記載の単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項１０】
このアミノ酸置換が二量化ドメインに存在し、二量化を阻害する、請求項８記載の単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子。
【請求項１１】
ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法であって、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＢＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号１１または１７の変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９Ｂ配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定し；および
ｖｉｉ）繁殖のために排卵過多と関連する変異を保有する哺乳動物を選択してもよい
という工程を含む方法。
【請求項１２】
ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法であって、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号５の変異ＧＤＦ−９ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定し；および
ｖｉｉ）繁殖のために排卵過多と関連する変異を保有する哺乳動物を選択してもよい
という工程を含む方法。
【請求項１３】
選択した哺乳動物がＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの単一変異コピーの両方を有する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定するためのマーカーとして、配列番号１１または１７の変異ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的である核酸分子の使用。
【請求項１５】
排卵過多または不妊のどちらかに関連する遺伝子型を所有する哺乳動物のマーカー補助選択法で、請求項１４に記載のマーカーの使用。
【請求項１６】
ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定するためのマーカーとして、配列番号５の変異ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的である核酸分子の使用。
【請求項１７】
排卵過多または不妊のどちらかに関連する遺伝子型を所有する哺乳動物のマーカー補助選択法における、請求項１６に記載のマーカーの使用。
【請求項１８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１１または１７の変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡのどちらかの鎖に特異的にハイブリダイズしうるプローブ。
【請求項１９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号５の変異ＧＤＦ−９ＤＮＡのどちらかの鎖にハイブリダイズしうるプローブ。
【請求項２０】
請求項１または２記載の核酸分子を含む構成物。
【請求項２１】
請求項１または２記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２２】
本明細書に導入した請求項２０または２１記載の構成物またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２記載の宿主細胞を含む細胞系。
【請求項２４】
排卵を調節するために、メスの哺乳動物でＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物活性を改変する方法であって、
ａ）内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂへの部分的免疫応答を誘導し、その生物活性を部分的に減少させ、排卵を促進させること；または
ｂ）内因性ＧＤＦ−９ＢまたはＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ両方への完全免疫応答を誘導し、その生物活性を実質的に減少させ、不妊を誘導すること；
のどちらかの工程を含む方法であり、ここで、該免疫応答が、
ｉ）ＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＤＦ−９の機能的断片または変種；および／または
ｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８から選択したＧＤＦ−９Ｂポリペプチド； 
を医薬上または獣医学上許容できる担体および／または希釈剤と共に含む抗原性組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより誘導される、方法。
【請求項２５】
この抗原性組成物が、部分的免疫応答を誘導し、排卵過多を誘導する緩やかな補強剤を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
この抗原性組成物が、完全免疫応答を誘導し、不妊を誘導する強力な補強剤を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
この部分的免疫応答が短期免疫化レジュメにより誘導される、請求項２３から２６のいずれか一に記載の方法。
【請求項２８】
この完全免疫応答が長期免疫化レジュメにより誘導される、請求項２３から２６のいずれか一に記載の方法。
【請求項２９】
この免疫応答が、この抗原性組成物に対して生じる抗体を投与することにより受動的に誘導される、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
部分的免疫応答を誘導し、排卵過多を誘導する短期レジュメにより、この抗体を投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
完全免疫応答を誘導し、不妊を誘導する長期レジュメにより、この抗体を投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
この完全免疫応答が一時的および／または可逆的であり、この誘導した不妊が避妊を含む、請求項２４、２６、２８、２９、および３１のいずれか一に記載の方法。
【請求項３３】
この完全免疫応答およびこの誘導した不妊が永久的である、請求項２４、２６、２８、２９、および３１のいずれか一に記載の方法。
【請求項３４】
排卵過多の哺乳動物を繁殖させる方法であって、
ａ）繁殖の提案のあったメスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定し；
ｂ）繁殖の提案のあったオスの哺乳動物が保有するＧＤＦ−９またはＧＤＦ−９Ｂのヌクレオチド配列を同定し；
ｃ）以下の特徴
ｉ）Ａ）配列番号５；または
Ｂ）Ａ）の分子の機能的変種または断片；または
Ｃ）Ａ）またはＢ）の分子に相補的な配列；
を含む、変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列の単一コピー；および／または
ｉｉ）Ａ）配列番号１１または１７；または
Ｂ）Ａ）の分子に相補的な配列
を含む、変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列の単一コピー
を有する子孫をもたらすであろうメスおよびオスの哺乳動物を選択すること
という工程を含む方法。
【請求項３５】
ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂの単一変異コピーを有するようにこの哺乳動物を選択した、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
メスの哺乳動物に補助的ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂを投与することにより、黄体機能を修飾する方法であって、該ＧＤＦ−９Ｂが配列番号８、１０、１２、１４、１６および１８のポリペプチドから選択される、方法。
【請求項３７】
配列番号２、４または６からなる群より選択したアミノ酸配列を含む単離変異ＧＤＦ−９ポリペプチドあるいはその機能的断片または変種。
【請求項３８】
配列番号８、１０、１２、１４、１６、または１８からなる群より選択したアミノ酸配列を含む単離変異ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド。
【請求項３９】
請求項１から１０のいずれか一に記載の単離核酸、または請求項４１あるいは４２に記載の単離ポリペプチド、および医薬上許容できる担体、を含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明は、さらに、該配列の２６０、４７１、４７７、７２１、９７８、９９４、１１１１または１１８４番目の位置にて少なくとも一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９核酸分子を提供する。好ましくは、該変異により、核酸分子によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換が生じ、そのアミノ酸置換は、好ましくは、受容体結合部位に存在し、受容体結合を阻害する。別法として、アミノ酸置換が二量化部位に存在し、二量化を阻害してもよい。
本発明は、さらに、該配列の７１８、７４７または１１００番目の位置にて少なくとも一の変異を含む、単離ＧＤＦ−９Ｂ核酸分子を提供する。好ましくは、該変異により、核酸分子によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換が生じ、そのアミノ酸置換は、好ましくは、受容体結合部位に存在し、受容体結合を阻害する。別法として、アミノ酸置換が二量化部位に存在し、二量化を阻害してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
受容体結合および二量化部位での他のアミノ酸の変化、または成熟ペプチドの蛋白の折りたたみを阻害する蛋白領域は、当業者により理解されている影響と同様の影響を有し、本発明の範囲内に含まれることが予測される。
本発明は、ＧＤＦ−９Ｂをコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法も提供し、ここで、その方法は、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＢＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号１１または１７の変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＢＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９Ｂ配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定し；および
ｖｉｉ）繁殖のために排卵過多と関連する変異を保有する哺乳動物を選択してもよい
という工程を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明は、さらに、ＧＤＦ−９をコードする変異核酸分子を保有する哺乳動物を同定する方法を提供し、ここで、その方法は、
ｉ）哺乳動物から組織または血液サンプルを得；
ｉｉ）該サンプルからＤＮＡを単離し；および任意に、
ｉｉｉ）工程ｉ）またはｉｉ）で得たＤＮＡからＧＤＦ−９ＤＮＡを単離し；
ｉｖ）配列番号５の変異ＧＤＦ−９ＤＮＡのどちらかの鎖に相補的なプローブでこのＤＮＡを検出し；
ｖ）変異ＧＤＦ−９ＤＮＡの量を増幅させ；
ｖｉ）工程ｖ）で得たＧＤＢ−９配列ＤＮＡが、不妊または排卵過多に関連する変異を保有するかどうかを決定し；および
ｖｉｉ）繁殖のために排卵過多と関連する変異を保有する哺乳動物を選択してもよい
という工程を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
かくして、さらなる態様では、本発明は、排卵を調整するために、メスの哺乳動物でＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂの生物活性を改変する方法であって、
ａ）内因性ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂへの部分的免疫応答を誘導し、部分的にこの生物活性を減少させ、排卵を促進させること；または
ｂ）内因性ＧＤＦ−９Ｂ、またはＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ両方への完全免疫応答を誘導し、実質的にこの生物活性を減少させ、不妊を誘導すること；
のどちらかの工程を含む方法を提供し、
ここで該免疫応答は、
ｉ）ＧＤＦ−９ポリペプチド、またはＧＤＦ−９の機能的断片または変種；および／または
ｉｉ）配列番号８、１０、１２、１４、１６、および１８から選択したＧＤＦ−９Ｂポリペプチド；
を医薬上または獣医学上許容できる担体および／または賦形剤と共に含む抗原性組成物を、それを必要とする哺乳動物に投与することにより誘導される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
本発明は、さらに、本発明の変異ＧＤＦ−９Ｂポリペプチド分子を投与することにより所望の反応を誘導することを企図する。そのようなポリペプチド分子は、それらが受容体結合および／または二量化部位に変異を含む場合、不活性であるようだが、そのようなポリペプチドは、十分量投与される場合、内因性ＧＤＦ−９およびＧＤＦ−９Ｂ結合および／または二量化と競合し、それらの活性を減少させるかもしれない。そのような反応は、内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ活性が部分的に減少する場合、排卵および生殖能力を向上させるだろう。そのような投与により内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ活性が完全に減少する場合、誘導される反応は不妊だろう。
内因性ＧＤＦ−９および／またはＧＤＦ−９Ｂ遺伝子の一のコピーがノックアウトされた、トランスジェニック非ヒト哺乳動物も開示される。そのような哺乳動物では、排卵が増加し、生殖能力が向上するだろう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ｉ）Ａ）配列番号５；または
Ｂ）Ａ）の分子の機能的変種または断片；または
Ｃ）Ａ）またはＢ）の分子に相補的な配列；
を含む、変異ＧＤＦ−９ヌクレオチド配列、および／または
ｉｉ）Ａ）配列番号１１または１７；または
Ｂ）Ａ）の分子に相補的な配列
を含む、変異ＧＤＦ−９Ｂヌクレオチド配列：
の単一変異コピーのみを所有するメスの哺乳動物を同定する工程を含む、排卵頻度が増加しているかにより繁殖のためのメスの哺乳動物を選択する方法も記載される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
短期免疫化
ＫＬＨ（Ｎ＝５０）、ＧＤＦ−９ペプチドに共役なＫＬＨ（Ｎ＝３０）、またはＧＤＦ−９Ｂペプチドに共役なＫＬＨ（Ｎ＝３０）で、ロムニーメスヒツジを免疫化した。一ヶ月あけて２度、ＤＥＡＥデキストラン中の抗原（５％重量／容量）を投与した。追加抗原免疫化後に初めて観察された発情後に、黄体（ＣＬ）の数を決定した。さらに、これらのメスヒツジから選択した部分母集団（Ｎ＝２６ＫＬＨ、Ｎ＝１５ＧＤＦ−９、Ｎ＝１６ＧＤＦ−９Ｂ）で、次の発情後に存在するＣＬの数も決定した。各メスヒツジにおけるＣＬの平均値をキースクエア分析により分析した。
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月12日(2005.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006510345000001.app
【国際調査報告】
2006510345.tif 000050
2006510345.tif 000051
2006510345.tif 000052
2006510345.tif 000053