(57)【要約】本発明は、ガストリン依存性腫瘍を治療するための、免疫原、免疫原性組成物、および方法に関する。免疫原は、免疫原性キャリアと抱合したガストリン受容体免疫模倣ペプチドを含む。免疫原は、ガストリン応答性悪性腫瘍または前悪性腫瘍のガストリン受容体（ＧＲ）に結合する抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導し、それにより増殖刺激ペプチドホルモンが受容体に結合するのを阻止して、腫瘍細胞増殖を阻害する能力を有する。本発明はまた、受動免疫化のための、ガストリン受容体に対する特異的抗体に関する。そのうえさらに、本発明は細胞毒性分子で誘導体化された抗ＧＲ抗体を含む。本発明はまた、本発明の抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、または組織生検からガストリン依存性腫瘍を検出する診断法に関する。能動および受動免疫化は、組み合わせて、ＧＲ、Ｇ１７および／またはＧ１７−Ｇｌｙに対する免疫応答を提供することができる。
2006523607.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン末端で免疫原性キャリアに抱合された、
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＡＡＣ（配列番号２）、
ＣＣＧＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列番号５）、
ＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＣ（配列番号８）、
ＲＤＢＤＬＧＥＡＤＶＷＲＡＳＳＣ（配列番号９）、
ＷＥＲＲＳＧＧＮＷＡＧＤＷＧＤＳＰＦＳＳＣ（配列番号１０）、
ＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１１）、
ＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＳＳＰＰＰＰＣ（配列番号１２）、
ＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１３）、
ＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１４）、
ＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１５）、
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１６）、
ＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＳＳＣ（配列番号１７）、および
ＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１８）、
の合成配列からなる群より選択されるガストリン受容体ペプチドエピトープ（ＧＲＥ）を含む免疫原。
【請求項２】
免疫原性キャリアに抱合された配列番号５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８からなる群より選択されるＧＲＥを含む免疫原。
【請求項３】
免疫原性キャリアに抱合されたＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＣ（配列番号８）からなるＧＲＥを含む免疫原。
【請求項４】
免疫原性キャリアに抱合された配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列からなるＧＲＥを含む免疫原。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原、および薬学的に許容可能なキャリアまたはアジュバントを含む免疫原性組成物。
【請求項６】
配列番号２、５、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、および１８により同定される配列からなる群より選択されるガストリン受容体免疫模倣ペプチドと結合する能力がある抗体。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がマウス抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
請求項７または８に記載の抗体を１つまたは複数含む組成物。
【請求項１０】
配列番号２、５、８〜１７、または１８として同定されるアミノ酸配列からなるガストリン受容体エピトープに特異的である免疫血清または上清から調製される抗体を含む、ガストリン刺激性悪性増殖または前悪性増殖を阻止または治療する組成物。
【請求項１１】
配列番号９または配列番号１０として記載されるアミノ酸配列からなる腫瘍ガストリン受容体エピトープに特異的である免疫血清または上清から調製される抗体を含む、ガストリン刺激性悪性増殖または前悪性増殖を阻止または治療する組成物。
【請求項１２】
前記抗体は細胞毒性物質に抱合される、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細胞毒性物質は、毒素または放射性物質を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記毒素は、コレラ毒素、ジフテリア毒素、またはリシンであり、そして前記放射性物質は、１２５ヨウ素、１３１ヨウ素、９９イットリウム、または１１１インジウムである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
（ｉ）患者から生検標本を得る工程と、
（ｉｉ）該標本を免疫血清または上清から調製した抗ＧＲ抗体に暴露させる工程であって、該抗体は配列番号２、５、８〜１７、または１８として記載されるアミノ酸配列からなるガストリン受容体ペプチドエピトープに特異的である、暴露させる工程と、
（ｉｉｉ）比色法、化学発光（chemiluminescent）法、蛍光法、放射分析法、またはシンチグラフィー法により、結合抗体を検出する工程を含む、生検でガストリン受容体を診断する方法。
【請求項１６】
以下、比色分子、化学発光（chemiluminescent）分子、または放射性分子を含む検出可能な分子と結合した抗ＧＲ抗体の投与、および画像化技法による抗体複合体の画像化を含む、患者のガストリン応答性悪性腫瘍または前悪性腫瘍を検出する方法。
【請求項１７】
（ｉ）化学療法薬または放射性物質を保有するように改変されていてもよい、治療上有効量の動物抗ＧＲＥ１１抗体、ヒト抗ＧＲＥ１１抗体、もしくはヒト化抗ＧＲＥ１１抗体を投与すること、および
（ｉｉ）治療上有効量のガストリンＧ１７免疫原を投与すること、および／または
（ｉｉｉ）治療上有効量の動物抗Ｇ１７抗体、ヒト抗Ｇ１７抗体、もしくはヒト化抗Ｇ１７抗体を投与することを含む、ガストリン応答性腫瘍に罹病している患者を治療する方法。
【請求項１８】
前記抗体は、単独のモノクローナル種または異なるモノクローナル種の混合である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項６に記載の抗体を含有するリポソーム小胞懸濁液を含む、リポソーム組成物。
【請求項２０】
（ｉ）請求項１または２に記載のガストリン受容体エピトープに対する免疫原、および／または
（ｉｉ）請求項６に記載の抗体、および
（ｉｉｉ）５ＦＵ（＋ロイコボリン）、ゲムシタビン、イリノテカン（irinotecan）、タキサン、オキシプラチン（oxiplatin）、カルボプラチン、シスプラチン、カンプトテシン／カンプトサール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ルベテカン（rubitecan）、シクロホスファミド、ドキシルビシン（doxirubicin）、マイトマイシンＣ、エトポシド、およびノスカピンからなる群より選択される化学療法薬、の投与の組み合わせを含む、癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連する出願の相互参照］
本出願は、出願第０９／０７６，３７２号の一部継続出願であり、１９９７年５月１２日に出願された米国仮出願第６０／０４６，２０１号の米国特許法第１１９条第（ｅ）項に基づく優先権を主張する。
【０００２】
［発明の背景］
ガストリンは、テトラトリアコンタガストリン（Ｇ３４）およびヘプタデカガストリン（Ｇ１７）の２種の形で生じるペプチドホルモンであり、幽門洞（stomach antrum）にある、特殊化細胞のＧ細胞により合成および分泌される。ホルモンは循環血液中に分泌されて、胃の特定の細胞、すなわち腸クロム親和性細胞様（ＥＣＬ）細胞および壁細胞に結合し、これが間接的または直接的に胃酸の分泌量（output）に影響を及ぼす。歴史的には、ガストリンホルモンは胃酸分泌の刺激を伴うものとされてきた（Edkins, J. S. 1905)。（本明細書中に記載される参照のための全引用は、特許請求の範囲に先立つ参照の項で提供される。）近年では、ガストリンは胃腸管内で栄養因子として作用する可能性があること（Johnson, L. 1997）、ならびに胃腸管癌（Watson et al. 1989, Dickinson, C. J. 1995）および肺の小細胞癌を始めとする非胃腸管癌（Rehfeld et al. 1989）の成長を促進し得ることの証拠が積み上げられてきた。ガストリンの翻訳後プロセシングにおいて、その５個のカルボキシ末端アミノ酸を介して高親和性でコレシストキニンＢ／ガストリン受容体に結合するのは、「成熟」カルボキシアミド化形である（Kopin et al. 1992）。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（ＧＲ）は、Ｇタンパク質を介して、様々な遺伝子の発現を順に制御する細胞内シグナル伝達経路にカップリングした膜貫通タンパク質である。
【０００３】
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は、ＣＣＫとガストリンの両方に対して等しい親和性を有する７個の膜貫通ドメインを有する、Ｇタンパク質結合受容体のファミリーに属する（Soll et al. 1984）。この受容体は、脳で優勢的に見いだされたことから、ＣＣＫＢ型受容体と名付けられた（Wank et al. 1992）。受容体は、その後、胃の壁細胞およびＥＣＬ細胞の末梢ＣＣＫ／ガストリン受容体（ＧＲ）と同一であることが見いだされた（Nakata et al. 1992）。この受容体は、多数の正常組織（Fourmy et al. 1984, Grider et al. 1990）および腫瘍組織（Singh et al. 1990, Watson et al. 1993）で十分に特性決定されてきており、ラット膵臓腺癌細胞株ＡＲ４２Ｊを用いて広く研究されてきている（Scemama et al. 1987）。ＡＲ４２Ｊ  ＧＲ  ｃＤＮＡは、クローニングおよび配列決定されており、そしてラットとヒト脳とではＧＲのＤＮＡ配列に９０％を超える相同性が、そしてイヌ壁細胞ＧＲ  ｃＤＮＡの配列には８４％を超える相同性があり（Wank, S. A. 1995）、種と種の間でさえ高い配列相同性を実証している。
【０００４】
複数の型の腫瘍、例えば結腸直腸腺癌、胃腺癌、膵臓腺癌、および肝細胞腺癌は、それらの形質膜にＧＲを保有すること、およびそれらが強力な細胞増殖でガストリンに応答することが示されている（Rehfeld, J. F. 1972, Upp et al. 1989 and Watson et al. 1993）。さらに最近では、これらの癌細胞の多くがガストリンの分泌も行い、したがって自律増殖経路に影響を及ぼすことが発見されている（Van-Solinge et al. 1993, Nemeth et al. 1993, Seva et al. 1994 and 1995)。
【０００５】
ペプチドホルモンの、ガストリン１７（Ｇ１７）およびガストリン３４（Ｇ３４）は、正常細胞の細胞膜上のＧＲに結合する。しかしながら、Ｇ１７はガストリン依存性癌細胞の増殖を刺激するが、Ｇ３４は刺激しないことが見いだされている。血清付随Ｇ１７は、特に、腫瘍細胞のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（Watson et al. 1993 and 1996）に媒介される内分泌様式で、結腸直腸腫瘍の成長を刺激する潜在能力を有する。Ｇ１７は、腫瘍細胞のＧＲに対する親和性が、他のガストリンホルモン種に勝って増加する可能性があるため、結腸直腸腺癌の成長を刺激するのに特に関係しているらしい（Rehfeld 1972）。ＧＲは、５６．７％のヒト原発性結腸直腸腫瘍において、高親和性形で発現されることが見いだされた（Upp et al. 1989）。そのような腫瘍によるガストリンペプチド前駆体の内因性産生のため、強力な（potential）オートクラインループもまた存在する可能性があると仮定されている（Van- Solinge et al. 1993 and Nemeth et al. 1993）。得られたＧ１７リガンド／受容体複合体は、細胞機能を調節する二次メッセンジャーを介して、細胞増殖を刺激する（Ulrich et al. 1990）。Ｇ１７のＧＲへの結合は、ホスファチジルイノシトール分解の活性化、タンパク質リン酸化酵素Ｃ活性化および結果として細胞内カルシウムイオン濃度の増加、ならびに分裂促進因子活性化タンパク質リン酸化酵素を介したｃ−ｆｏｓ遺伝子およびｃ−ｊｕｎ遺伝子の導入（これは細胞増殖の調節に関係している）を導く（Todisco et al. 1995）。さらに、ＧＲに結合したガストリンは、続いてチロシンリン酸化酵素、ｐｐｌ２５ＦＡＤＫ（局所接着リン酸化酵素）によるリン酸化の増加を伴い、これもまた、細胞増殖シグナルの伝達の役割を担っている可能性がある（Tanaguchi et al. 1994)。
【０００６】
多数の高親和性ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体アンタゴニストが、多数の試験胃腸管癌で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、治療面で評価されてきた。例えば、グルタミン酸誘導体のプログルミド（Seva et al. 1994; Harrison et al. 1990 and Watson et al. 1991a）、トリプトファンのＮ−アシル誘導体であるベンゾトリプト（Benzotrypt）、アスペルクリン（Aspercillin）誘導体のＬ−３６５，２６０（Bock et al. 1989）、およびＣＣＫのペンタペプチド配列のＣ−末端を模倣した分子であるＣＩ−９８８（Hughes et al. 1990）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方の胃腸管腫瘍成長における外因性ガストリンの影響を効果的に中和することが示されている（Watson et al. and Romani et al. 1994）。しかしながら、これらのアンタゴニストは、重篤な毒性の副作用を有し、かつ、それらは正常細胞の受容体の全ての潜在的リガンド（Ｇ３４およびＣＣＫなど）の作用を遮断するといったように、特異性を欠いている。最近では、ＹＭ０２２（Yuki et al., 1997）およびＹＦ４７６（Takinami et al. , 1997）などの非常に強力かつ選択的なＣＣＫＢ／ガストリン受容体アンタゴニストもまた、記載されている。
【０００７】
プログルミドおよびベンゾトリプトは、前臨床試験で広く評価されている。これらの化合物が有する主な問題は、Ｇ１７と置換するのに必要な比較的高い濃度では、それらの効力が失われることである（Watson et al., 1992a; Watson et al., 1992b）。これにも関わらず、プログルミドおよびベンゾトリプトは、多数の細胞株の基礎増殖およびガストリン刺激増殖を阻害した（Seva et al., 1990; Watson et al., 1991a）。また、プログルミドは、ガストリン感受性マウス結腸腫瘍、ＭＣ２６を保持する異種移植マウスの生存を、対象動物で２５日から、処置動物で３９日まで増加させた。
【０００８】
ＧＲに対するガストリン拮抗性薬剤のこのクラスの低い特異性のため、腫瘍成長の阻害は、ガストリンアンタゴニストで効果的に制御することができない可能性がある。そのうえ、ガストリンを認識して結合する細胞性受容体は、試験したインヒビター全てに結合しなかった（Seva et al. 1994）。したがって、受容体に結合するガストリンの完全な阻害がオートクライン増殖カスケードで起こらない場合には、ガストリンアンタゴニストは、腫瘍成長促進のこの機構を遮断することができない可能性がある。
【０００９】
［発明の概要］
ＧＲを保持する腫瘍を治療するための異なるアプローチは、宿主の免疫系を、ＧＲを標的とすることにより腫瘍を特異的に攻撃するように仕向けることである。
【００１０】
このような背景で、本発明は、ガストリンに対する受容体を発現する、免疫原性組成物および腫瘍を治療する免疫学的方法を提供する。本方法は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原（ＧＲ免疫原）または抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（抗ＧＲ  Ａｂ）を用いた、患者の能動または受動免疫化を含む。免疫原により誘導される抗体は、腫瘍細胞のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（ＧＲ）に対して特異的であり、そして受容体上のガストリンの成長促進効果を遮断する。抗体は、ガストリンペプチドホルモンがガストリン依存性腫瘍細胞のＧＲに結合するのを阻止する。したがって、腫瘍の成長が停止する。さらに、受容体のＮＨ２末端に特異的な抗体は、受容体への結合に際して、内部化されて迅速に腫瘍細胞の細胞質および核中に移動する。この内部化は、細胞を抗体に暴露してから１０秒後もの早さで起こることができ、そしてガストリンホルモン結合と独立して起こる。抗体／受容体複合体のこの迅速な内部化は、次に、アポトーシスまたは自殺を起こすように影響を及ぼされた腫瘍細胞を引き起こす。
【００１１】
本発明の免疫原は、免疫原の免疫模倣部分として、ヒトＧＲ由来の天然または合成ペプチドを含む。受動または能動免疫化が主に細胞外ドメインに対して向けられているものの、生検標本のＧＲ診断手順は、例えば、腫瘍発現突然変異型配列の構造的再配列を同定するように、ＧＲの細胞内ドメインに対して特に向けられた抗体も利用し得る。
【００１２】
したがって、本発明はＧＲ免疫模倣ペプチドエピトープの幅広い補体を提供する。これらのガストリン受容体特異的ペプチドエピトープの頭字語は、以下に記載されるとおり、各種配列間で識別ナンバー（numerical distinction）をつけたＧＲＥである（以前はＧＲＰとされていた）。
【００１３】
免疫原はまた、免疫模倣ペプチドの末端に結合させたスペーサーペプチド配列を含んでもよい。免疫原はまた、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質キャリアと抱合していてもよい。
【００１４】
本発明の１つの実施形態において、ＧＲに対する免疫化法は能動免疫を含み、患者は免疫原で免疫される。ＧＲＥ免疫原は、腫瘍細胞上のＧＲに対する抗体産生を刺激する。ＧＲＥ免疫原により産生された抗体は、腫瘍細胞上のＧＲに結合して、ガストリンペプチドホルモンの受容体への結合を効果的に阻止し、それにより腫瘍細胞区画のオートクライン成長刺激経路を、そして最終的に腫瘍の成長を阻害する。
【００１５】
また、能動免疫は、または受動免疫化もまた、例えば、５−ＦＵ／ロイコボリンを用いる化学療法的治療と組み合わせて投与され得る。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、ＧＲに対する外因性抗体が腫瘍細胞のＧＲに結合するのに十分な濃度で患者に投与され、それによりリガンドが受容体に結合するのを遮断するという点で、治療法は受動免疫化を含む。本発明のこの態様の別の実施形態において、ヒト治療用抗体は、当該技術分野で既知である方法により産生することが可能な、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗ＧＲ抗体は、ＩｇＧ特異的、またはＧＲ特異的リガンド交換マトリクスを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、さらに精製され得る。特異的リガンドは、ＧＲＥ免疫模倣ペプチドに由来する。
【００１７】
また、抗ＧＲ抗体は、腫瘍細胞の殺傷を向上させるために、コレラもしくはジフテリアもしくはリシン毒素などの細胞毒性分子と、または９９イットリウム、１１１インジウム、１２５ヨウ素、および１３１ヨウ素などの放射性核種で標識した放射性分子とさらに抱合されてもよい。抗ＧＲ抗体はまた、リポソームがＧＲ陽性腫瘍を標的とするように、リポソーム表面に結合されてもよい。そのような標的化リポソームは、放射性核種および／または細胞毒性剤を始めとする抗腫瘍剤を含有し得る。また、これらのＧＲ標的化リポソームは、例えばＣＯＸ−２（シクロ−オキシゲナーゼ−２）またはＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合上皮細胞成長因子様成長因子）などの、ガストリンの下流標的に対して向けられた他の薬剤のビヒクルとして働き得る。
【００１８】
本発明はまた、本発明の抗体を用いた、組織生検からのガストリン応答性（ガストリン受容体含有）腫瘍の免疫化学的検出を含む、ガストリン応答性腫瘍を診断する方法を提供する。本発明の特異的抗ＧＲ抗体は、標準免疫化学手順を用いて腫瘍組織中のガストリン受容体を検出するのに、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびフルオレセインなどの化合物を用いる検出系で標識され得る。
【００１９】
本発明はまた、抗ＧＲ抗体を用いた、ガストリン依存性（ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体含有）腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ検出を含む、ガストリン依存性腫瘍を診断する方法を提供する。この方法は、ＧＲ発現腫瘍を保持する患者に静脈内注射を介して有効用量の放射標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を投与すること、および、標準シンチグラフィー走査手順により、腫瘍細胞の細胞膜に結合した抗ＧＲ抗体を有する腫瘍細胞を画像化または検出することを含む。本発明のこの態様において、抗ＧＲ抗体は、９９テクネチウム、１１１インジウム、９０イットリウム、および１３１Ｉなどの検出可能な放射性核種で標識され得る。
【００２０】
［発明の詳細な説明］
本発明の方法は、ヒトを始めとする動物のガストリンホルモン依存性腫瘍の治療に関し、ホルモンの成長促進効果を阻害するために受容体へのホルモンの結合を阻止するように、免疫された患者で腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（ＧＲ）に結合する抗体を産生する抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を患者に投与することを含む。ＧＲ免疫模倣ペプチドは、ＧＲの外部から到達できる部分またはエピトープに対して向けられた抗体を産生するのに有利なように選択される。
【００２１】
より重要なことに、臨床的観点から、免疫原は、迅速に内部化され、細胞質を横切って核に入る受容体／抗ＧＲＥ１抗体複合体を形成する能力がある抗体を産生するように構築される。この反応は、影響を受けた腫瘍細胞が自殺をすること（アポトーシス）の引き金となると思われる。
【００２２】
免疫原は、免疫模倣物（immunomimic）として作用する、ヒトＧＲの天然もしくは合成ペプチドを含む。免疫模倣物として開発されてきた各種の合成ペプチドを表１にまとめる。有効エピトープを含み、ＧＲのアミノ酸配列から開発されたこれらのペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で、腫瘍細胞のＧＲと交差反応性である抗体を誘導する能力がある。例えば、ＧＲＥ１エピトープは、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体配列の５から２１、ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列番号１）までのアミノ酸からなる。ＧＲＥ１は、受容体のアミノ末端領域に由来し、そして細胞膜の細胞外表面上に位置する（図１参照）。ＧＲＥ１１などの他の配列は、ＧＲのアミノ末端を含む。
【００２３】
別の実施形態において、免疫原はエピトープＧＲＥ４を含み、これはＧＲの以下のアミノ酸配列、ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列番号６）か、または合成スペーサーを備えたペプチドであるＧＲＥ４−Ｓｅｒ（配列番号７）からなる。ＧＲＥ４は受容体の第四細胞外ドメインの一部であり、そしてこれもまた形質膜の細胞外表面上にある（図１参照）。
【００２４】
別の実施形態において、免疫原はエピトープＧＲＥ９またはエピトープＧＲＥ１０を含み、腫瘍細胞によりほとんど独占的に発現される胃受容体（ＧＲ）の変異体のアミノ酸配列からなる。例えば、この領域に対して誘導された、抗血清、精製ＩｇＧ、またはモノクローナル抗体が、患者から収集した生検標本で、診断目的で用いられ得る。
【００２５】
表１に列挙されるように、異なるＧＲエピトープを含む各種の合成ペプチドが、ガストリン結合の遮断、およびアポトーシスを導く可能性がある受容体の内部化の能力がある抗ＧＲ抗体を誘導し得る。
【００２６】
【表１】
2006523607.tif 000003
表１：ガストリン受容体免疫模倣ペプチド
【００２７】
例えば、表１にペプチドＧＲＥ１  Ｓｅｒ（配列番号４）を含むように、このスペーサー配列がＧＲＥ１エピトープと組み合わせられる。
【００２８】
合成ペプチドＧＲＥ１１〜ＧＲＥ１５は、ＧＲのＮ末端から残基１（ＧＲＥ１１（すなわちＧＲ１〜２２））、残基２（ＧＲＥ１２）、残基３（ＧＲＥ１３）、残基４（ＧＲＥ１４）、および残基５（ＧＲＥ１５）で始まる配列を含み、全て残基２２で配列が終わる。ＧＲＥ１６は、残基２で始まり残基１２で終わるさらに短いペプチドにカルボキシ末端ＳＳＣスペーサーを保有させたものである。ＧＲＥ１７は残基１１で始まり残基２２で終わるＧＲＥ１のフラグメントである。ＧＲＥ１１Ｓは、ＧＲＥ１１のＳｅｒスペーサー伸長形を示す。
【００２９】
免疫原はまた、免疫模倣ペプチドをタンパク質キャリアから突出させるのに、およびリンパ球受容体に結合するその能力を向上させるのに適した、エクステンションまたはスペーサーペプチドを含んでもよい。適したスペーサーペプチドは、アミノ酸配列ＳＳＰＰＰＰＣ（セリン（Ｓｅｒ）スペーサー、配列表の配列番号３）を含む。しかしながら、例として、表１に示すように、他のスペーサーペプチドもまた適しているだろう。スペーサーペプチドはＧＲ由来ペプチドと免疫学的に関連せず、それゆえ、受容体由来ペプチドの特異的免疫原性を、決定するのではなく、向上させるのに用いられる。
【００３０】
表１に示すように、各種ペプチド免疫原は、スペーサーペプチドを保有するように随意に改変され得る。有効な免疫原性構築物において、合成ペプチドＧＲＥ１は、そのアミノ末端またはそのカルボキシ末端でスペーサーペプチドを保有するように改変され得る。本発明の実施形態によれば、例えば、改変にはＣ末端ＳＳＰＰＰＰＣ（Ｓｅｒスペーサー）もしくはＡＡＣ、またはＮ末端ＣＧＧが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
スペーサーを有した、または有さない免疫模倣ペプチドは、カルボキシ末端で、システイン残基を介して、ジフテリアトキソイドなどのタンパク質キャリアに抱合される。
【００３２】
患者の腫瘍細胞上のＧＲの存在および密度は、標識化抗受容体抗体を腫瘍生検から得られた試料と反応させることにより、決定され得る。抗受容体抗体は、動物を、本発明の免疫原で免疫することにより得ることができる。抗受容体抗体は、放射性トレーサー、色素、または蛍光標識のいずれかで標識される。また、腫瘍細胞のガストリンに対する応答性は、標準技法を用いて、患者の腫瘍生検試料からｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価され得る。抗ＧＲ抗体タグに陽性である腫瘍を有する患者は、本発明の方法による治療の代表的な候補者である。
【００３３】
０．００１〜２ｍｇの範囲の有効投薬量の免疫原性組成物が、胃腸管癌の治療のため患者に投与される。免疫原性組成物の有効投薬量は、有効レベルのＧＲに対する抗体からなる免疫応答を免疫化の１〜３カ月後に患者に惹起できるはずである。患者の免疫化に続いて、腫瘍の存在および大きさを検出するために、超音波および核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）などの標準的な臨床手順により免疫原の有効性がモニタリングされる。受容体に対する抗体の力価レベルもまた、患者から採取された血液試料からモニタリングされてもよい。有効抗体力価を維持するために必要に応じてブースター免疫化が与えられるべきである。ガストリン依存性癌（胃腺癌、肝臓腺癌、膵臓腺癌、および結腸直腸腺癌など）の本方法によるそのような治療は、腫瘍成長の阻害および腫瘍の大きさの減少をもたらすはずである。
【００３４】
本発明のＧＲペプチド免疫原により産生した抗体は、３通りの可能な機構により、ガストリン依存性腫瘍に対して抗栄養効果を有する可能性がある。（ｉ）ガストリンがその受容体に結合することの阻害、（ｉｉ）腫瘍細胞増殖のシグナル伝達経路の分解または分断、（ｉｉｉ）受容体／抗体複合体が内部化して核内に移動した細胞でのアポトーシス（すなわち細胞の自殺）の誘導、および殺傷機構を伴う免疫応答（抗体依存性細胞性細胞毒性または補体媒介溶解またはオプソニン作用（opsonization）など）。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、抗ＧＲ抗体は、ガストリン応答性腫瘍を有する患者に直接投与される。外因性抗体は、腫瘍細胞のＧＲ補体に特異的に結合する。抗体の受容体への結合は、ガストリンの細胞膜中のその受容体への結合を阻止し、それゆえ、ガストリン依存性腫瘍細胞の増殖シグナルが阻害されて腫瘍の成長が停止される。
【００３６】
これらの外因的に産生された抗体は、腫瘍細胞に毒性物質を送達することにより、形質膜上にＧＲを有する腫瘍細胞を殺傷するのにも有用であるかもしれない。例えば、治療に適した抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体は、図１にそれぞれＧＲＥ１およびＧＲＥ４として示される、受容体タンパク質の細胞外ドメイン１および４と反応性のものである。ＧＲＥ１１、ＧＲＥ６、ＧＲＥ９、ＧＲＥ１２、ＧＲＥ１３、またはＧＲＥ１４などのＧＲエピトープに対して産生した抗体は、受容体タンパク質のアミノ酸配列を特異的に認識して結合する。抗体は、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、またはヒトモノクローナル抗体であってもよい。本方法の免疫化での腫瘍成長の阻害は、超音波画像化およびＭＲＩによってもモニタリングされ、そして患者によって必要とされれば繰り返し免疫化が行われる。
【００３７】
抗体はまた、標的受容体に有効に結合するそれらのそのような抗体の反応性フラグメント（すなわち、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂ１）でもあることができ、そして米国特許第５，０２３，０７７号、米国特許第５，４６８，４９４号、米国特許第５，６８８，５０６号、および米国特許第５，６６２，７０２号に開示されるものなどの標準技法により産生されてもよい（これらの開示は本明細書中で参照により援用される）。フラグメントは、当該技術分野で既知のとおり、パパインまたはペプシンでの酵素的消化により産生されてもよい。あるいは、特異的抗原結合フラグメントが、組換えＤＮＡまたは固相ペプチド合成により産生されてもよい。
【００３８】
腫瘍細胞成長を阻止し腫瘍細胞を殺傷する抗体の有効性は、細胞毒性分子への抱合化により向上し得る。細胞毒性分子は、例えば、コレラ毒素、リシン、α−アマニチンなどの毒素、または例えば１２５Ｉもしくは１３１Ｉで標識された放射性分子、あるいは例えば、シトシンアラビノシドもしくは５−フルオロウリジンなどの化学療法薬であり得る。
【００３９】
抗ＧＲＥ抗体は、親和性精製抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であってもよく、細胞毒性分子に抱合した場合に、したがって特異的標的化キャリアタンパク質として作用し得る。抗体は、精製ＩｇＧフラクションとして、またはＦ（ａｂ）２もしくはＦａｂ１フラグメントなどのさらに改変した形で用いられることが理解される。したがって、抗体の結合は、Ｆｃフラグメントと無関係である。抗原結合部分もまた、腫瘍組織の透過の改善、またはもし必要であれば、ヒト血液脳関門の通過さえもできるだろう。
【００４０】
抗ＧＲＥ抗体はさらに、抗癌効果の補助要素のキャリアとして用いることができ、抗癌効果として、タキサン、シスプラチン、オキシプラチン、カンプトテシン／カンプトサール、ルベテカン、シクロホスファミド、ドキシルビシン、マイトマイシンＣ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ノスカピン、カルボプラチン、５−フルオロウリジン、そしてさらにゲムシタビンまたはイリノテカン（irinotecan）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
あるいは、適切なＧＲ含有腫瘍細胞を標的としてこれに実質的な量の抗癌剤を輸送するように、抗ＧＲ抗体は、リポソーム膜に組み込まれ得る。リポソームは、標準技法により調製される（米国特許第４，６９１，００６号を参照）。
【００４２】
各種の型および量の抱合化抗ＧＲＥ ＩｇＧキャリアが、必要性および抗腫瘍効果に基づいて、担当医により治療に選択される。一般に、単位投薬量は、タンパク質が０．０２０ｍｇ〜５００ｍｇの範囲であり、投与の頻度の点から、治療の過程でこの範囲を上回ることが可能である。
【００４３】
１２５Ｉおよび１３１Ｉで放射標識した抗体に加えて、抗ＧＲ抗体はまた、９９テクネチウム、１１１インジウム、および９０イットリウムなどの放射性核種で標識され得る。本発明のこの態様において、抗体は、これらの抗体を患者に投与して、ＧＲ含有腫瘍細胞に結合した抗体を検出することにより、ＧＲ保有腫瘍をｉｎ  ｖｉｖｏで検出および診断するのに有用である。放射標識化抗ＧＲ抗体を腫瘍に到達させた後、注射の約１〜２時間後、先に開示されるとおり、標準的なシンチグラフィー手順を用いて放射性「ホットスポット」を画像化する（「ハリソン内科学（Harrison's Principles of Internal Medicine）」, Isselbacher et al. eds. 13th Ed. 1994)。
【００４４】
患者のガストリン依存性腫瘍の治療のため投与される免疫原を含む組成物は、様々な形であってもよい。これには、例えば、粉末、液状溶液、懸濁液、坐剤、ならびに注射液および輸液などの固体、半固体、および液体剤形が含まれる。適した形は、意図される投与様式および治療用途に依存する。組成物は、本発明の免疫原および適した薬学的に許容可能な構成成分を含み、そして他の薬剤、キャリア、アジュバント、賦形剤などを含んでもよい。適したアジュバントは、ｎｏｒ−ムラミルジペプチド（ｎｏｒ−ＭＤＰ, Peninsula Labs., CA）、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３（Seppic, Inc., Paris, France）などのオイルを含んでもよく、これは標準技法を用いて混合され得る。組成物は、単位用量の形であることが有利である。免疫化のためまたは医薬品として、１回でまたは一定時間をかけて、投与される活性化合物の量は、治療される被検体、投与の様式および形、ならびに治療に当たる医師の判断に依存するだろう。
【００４５】
本発明に従って、受動免疫化のための本発明の抗ＧＲ抗体は、滅菌生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）などの薬学的に許容可能なキャリアを用いて、患者に静脈内投与される。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、ガストリンの結合またはガストリン応答性細胞の活性化を阻害する治療の組み合わせを提供する。詳細には、そのような実施形態は、ガストリン免疫原での免疫化（米国特許第５，４６８，４９４号）とガストリン受容体免疫原での同時免疫化を提供し得る。あるいは、この方法は、抗Ｇ１７抗体などの抗ガストリン抗体ならびに抗ＧＲ抗体での免疫化を組み合わせ得る。これらの抗体は、モノクローナルであることができ、これはヒトまたはヒト化動物抗体であってもよい。そのうえさらに、抗体は、記載されるように、細胞毒性物質で改変され得る。能動免疫化および受動免疫化は、受動免疫化が、能動免疫による抗体力価が十分に高くて効果的である場合には軽減され得る即時有効活性として働くように、有利に組み合わせられ得る。
【００４７】
受動免疫化の一時的な比較的短期間の使用は、経時的な抗抗体免疫拒絶を回避または減少させる助けとなり得る。
【００４８】
それゆえ、プロトコルは、Ｇ１７免疫原を用いるおよびＧＲ免疫原に対する能動免疫化と組み合わせた抗Ｇ１７抗体および抗ＧＲ抗体の初期投与を提供し得る。
【００４９】
ガストリン（例えば、Ｇ１７またはＧ１７−Ｇｌｙ（グリシン伸長−Ｇ１７）など）ならびにＧＲ部分の阻害の組み合わせは、相乗的に、ガストリンに促進される他の成長因子の活性化を阻止し、ならびに免疫化患者または宿主のガストリンシグナルの減少に応答したＧＲ発現の促進を阻止するだろう。
【００５０】
以下に記載されるように、５−フルオロウリジン（５ＦＵ）およびロイコボリンと組み合わせたラットＧＲＥ１エピトープでの能動免疫は、ラットで、ガストリン受容体発現ラット腫瘍ＤＨＤＫ１２の肝臓転移物の壊死を増加させた。
【実施例１】
【００５１】
ＧＲＥ１−ＤＴ抱合体およびＧＲＥ４−ＤＴ抱合体の調製
免疫模倣エピトープを提供するために選択されたＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ペプチドを、標準的な固相ペプチド合成により調製した。免疫原をより特異的免疫応答を誘導する能力があるものにするため、カルボキシ末端にスペーサー配列ＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列番号３）を含有するＧＲＥ１およびＧＲＥ４のそれぞれを合成した。続いて、以下に記載されるように、方法Ａ、方法Ｂ、または方法Ｃのいずれかにより、これらのペプチドを、架橋剤の一端にスクシンイミジルエステルおよび他端にマレイミドを含有するヘテロ二官能性架橋剤を用いて、スペーサーの末端ペプチドアミノ酸残基のシステインを介して、キャリアであるジフテリアトキソイド（「ＤＴ」）上に存在するアミノ基に抱合させた。
【００５２】
方法Ａ：米国特許第５，０２３，０７７号に先に記載されたとおりに、上記のペプチド１または４とキャリアとの結合を以下のように達成する。乾燥ペプチドを３０倍モル過剰のジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）とともに０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させた。溶液を、水分飽和窒素ガス雰囲気下で４時間撹拌した。還元システイン含有ペプチドを、０．２Ｍ酢酸で平衡化したＧ１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにかけてクロマトグラフィーにより他の成分構成成分から分離した。ペプチドを凍結乾燥させて、使用するまで真空下貯蔵した。１０５分子量のキャリアあたり約２５個の遊離アミノ基の活性化を達成するのに十分な割合で、ヘテロ二官能性架橋剤（例えば、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（「ＥＭＣＳ」））を用いた処理により、キャリアを活性化した。ジフテリアトキソイドの具体例では、これは６．１８ｍｇのＥＭＣＳ（純度７５％）を各２０ｍｇのジフテリアトキソイドに加える量になった。
【００５３】
各２０ｍｇ分取したジフテリアトキソイドを１ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．４５）に溶解させることにより、ジフテリアトキソイドの活性化を達成した。ＥＭＣＳの６．１８ｍｇ分取量を０．２ｍｌのジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）中に溶解させた。暗条件下、ＥＭＣＳを、５０マイクロリットル（「μｌ」）の量で、撹拌しながらＤＴに滴下した。暗中での２時間インキュベーション後、混合物を、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＧ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムでクロマトグラフィーにかけた。
【００５４】
暗条件下、ＥＭＣＳ活性化ジフテリアトキソイドを含有する画分を、ＰＭ１０限外濾過膜に通して濃縮した。濃縮物のタンパク質含量を、Ｌｏｗｒｙ法またはＢｒａｄｆｏｒｄ法のいずれかで定量した。活性化キャリアをシステイン−ＨＣｌでインキュベートし、続いて１０ｍＭのＥｌｌｍａｎ試薬５，５’ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）１０ｍＭと反応させることにより、キャリアのＥＭＣＳ含量を定量した。システイン−ＨＣｌを含有するブランク管とシステイン−ＨＣｌおよびキャリアを含有する試料管との間の光学密度の差を、５−チオ−２−ニトロ安息香酸の４１２ｎｍでのモル吸光係数１３．６×１０３を用いてＥＭＣＳ基含量に換算した。
【００５５】
ペプチドの還元システイン含量（−ＳＨ）もまた、Ｅｌｌｍａｎ試薬を用いて定量した。約１ｍｇのペプチドを１ｍｌの窒素ガス飽和水に溶解させ、そしてこの溶液の０．１ｍｌ分取量をＥｌｌｍａｎ試薬と反応させた。５−チオ−２−ニトロ安息香酸のモル吸光係数（１３．６×１０３）を用いて、遊離システイン−ＳＨを計算した。キャリア上の２５個のＥＭＣＳ活性化アミノ基それぞれと反応するのに十分な遊離−ＳＨを含有する量のペプチドを０．１ｍ  ＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ、そして暗条件下、ＥＭＣＳ活性化キャリアに滴下した。ペプチド溶液を全てキャリアに加えた後、混合物を、水分飽和窒素ガス雰囲気下、暗中で一晩インキュベートした。
【００５６】
ＥＭＣＳを介してキャリアに結合したペプチドの抱合体を、０．２Ｍ重炭酸アンモニウムで平衡化したＧ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムにかけてクロマトグラフィーにより、混合物の他の成分から分離した。カラム空隙容量に溶出した抱合体を凍結乾燥させて、使用するまで２０℃で乾燥させて貯蔵した。
【００５７】
得られる抱合体は、重量増加、アミノ酸分析などを始めとする当業者に既知である多数の方法により、ペプチド含量について特性決定することができる。この方法により生成する、スペーサーおよびジフテリアトキソイドとともに構成されるＧＲＥ１抱合体およびＧＲＥ４抱合体は、１００ＫＤ  ＭＷのキャリアあたり５〜３５モルのペプチドという有効ペプチド／キャリア比を有することが確定され、そして全てが試験動物の免疫化の免疫原として適していると判断された。通常、１００ＫＤ  ＭＷのＤＴあたり１０〜３０モルの範囲のペプチドが有効免疫応答を産生した。
【００５８】
方法Ｂ：好適な方法において、ＧＲＥ１ペプチド、ＧＲＥ４ペプチド、またはＤＴにカップリングした任意の他の適したＧＲのペプチド免疫模倣を含む抱合体を、以下のように、室温で調製した。精製ＤＴ（４００ｍｇ）を、窒素ガスを飽和させた２０ｍｌの０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．６）に溶解させて、２０ｍｇ／ｍｌのＤＴ溶液を得た。ＤＴ溶液を、６０ｍｌの暗褐色ガラスボトル（反応容器および濾液貯蔵器として用いる）に入れた。ＥＭＣＳカップリング試薬（１２３．６ｍｇ）を２．０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解させた。ＥＭＣＳ溶液を、連続して撹拌しながら、１５分かけてＤＴ溶液に滴下した。ボトルに蓋をして、混合物を室温でさらに１時間４５分間撹拌し、活性化ＤＴ（Ｍ−ＤＴ）を形成させた。次いで、Ｍ−ＤＴを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＦＣ１０  Ｔｈｉｎ−Ｃｈａｎｎｅｌ  限外濾過システムを用い、取り扱い説明書Ｉ−１１３Ｇに従いＸＭ５０ダイアフロー限外濾過膜を用いてダイアフィルトレーションにより精製した。Ｍ−ＤＴを、４２０ｍｌリン酸緩衝液の容量に対して２回洗浄し、各回２０ｍｌに濃縮し、次いで４２０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．０、０．１ＭのＥＤＴＡ含有）に対して１回洗浄し、２０ｍｌまで溶液を濃縮した。
【００５９】
例えば、ＧＲＥ１−ＤＴ抱合体を作るために、２．０２ｍｌのＭ−ＤＴ溶液（２２．３ｍｇ  Ｍ−ＤＴを含有）を１０ｍｌ暗褐色ガラスバイアルに入れ、次いで１３ｍｇのＧＲＥ１ペプチドをクエン酸緩衝液に溶解させて４０ｍｇ／ｍｌペプチドとして、撹拌しながらＭ−ＤＴ溶液に滴下した。あるいは、ＧＲＥ４−ＤＴ抱合体を作るために、２．２１ｍｌのＭ−ＤＴ溶液（２４．４ｍｇのＭ−ＤＴを含有）を１０ｍｌ暗褐色ガラスバイアルに入れ、次いで１３ｍｇのＧＲＥ４ペプチドをクエン酸緩衝液に溶解させて４０ｍｇ／ｍｌペプチドとして、撹拌しながらＭ−ＤＴ溶液に滴下した。
【００６０】
暗中で一晩、反応を進行させた。各抱合体を、反応容器から取り出して、５００ｍｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液を５回交換して、１２，０００〜１４，０００ＭＷカットオフ透析管で別々に透析した。各抱合体を凍結乾燥した。次いで、抱合体をアミノ酸分析により分析して、それらのペプチド対ＤＴ置換比が、ＧＲＥ１−ＤＴについて１０５ＭＷのＤＴあたり２１．８ペプチド、およびＧＲＥ４−ＤＴについて１０５ＭＷのＤＴあたり２１．１ペプチドであると確定した。
【００６１】
この方法により生成するスペーサー付きＧＲＥ１とスペーサー付きＧＲＥ４およびＤＴの抱合体は、１００ＫＤ  ＭＷのキャリアあたり５〜３５モルのペプチドである有効ペプチド／キャリア比について選択されており、そして全て免疫原として適していると判断される。有効免疫応答を産生するのに有効な比は、１００ＫＤ  ＭＷのＤＴあたり１０〜２５モルの範囲のペプチドである。これらの方法の代わりに、同一出願人に譲渡された米国特許第６，３５９，１１４号に記載されるように、閉鎖系抱合化を用いてもよい。
【００６２】
そのうえさらに、これらの方法例は、他の受容体ペプチド（その多くは本明細書中に開示される）にも同様に適用される。
【００６３】
方法Ｃ：この手順は、免疫原の連続抱合化および精製のための閉鎖系（または細胞毒性ＩｇＧなどタンパク質の他の誘導体化）に言及する。この系は同一出願人に譲渡された米国特許第６，３５９，１１４号に記載され、その開示は本明細書中でその全体が参照により援用される。
【００６４】
免疫原性組成物の調製
スペーサー有りまたは無しでＤＴと抱合したＧＲＥ１またはＧＲＥ４のいずれかを含有する本発明の免疫原を用いて、ウサギを免疫した。免疫原を以下のように調製した：抱合体を０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝食塩水（ｐＨ７．３）に溶解させ、濃度３．７９ｍｇ／ｍｌとした。抱合体溶液を３０：７０（ｗｔ：ｗｔ）の抱合体溶液対Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７０３の比でＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７０３アジュバント（Seppic, Inc.）に加え、次いで、混合物を、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーを用いて８，０００ＲＰＭで３分間ホモジナイズして、１ｍｇ／ｍｌの抱合体を含有する乳濁液を形成した。
【００６５】
免疫化および試料採取
ウサギに、０．１ｍｇのＧＲＥ１−ＤＴまたはＧＲＥ４−ＤＴ抱合体のいずれかからなる０．１ｍｌの免疫原を筋肉内注射した。各ウサギに０週および４週で免疫原を注射した。実験の６週および８週で、各ウサギから血液を採取した。各血液試料から血清を調製して、抗ＧＲ抗体の存在を測定するアッセイに用いるまで、−２０℃で貯蔵した。
【００６６】
酵素結合免疫吸着反応測定法（ＥＬＩＳＡ）
固相ＥＬＩＳＡを用いて、各免疫化ウサギのペプチド１およびペプチド４に対して産生した抗血清の反応または交差反応についてスクリーニングした。ポリスチレン９６ウェルプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ  ＩＩ, Dynatech）を、２５μｌ／ウェルで、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）中１０μｇ／ｍｌの、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合したペプチド１（「ＧＲＥ１−ＢＳＡ」）またはＢＳＡに結合したペプチド４（「ＧＲＥ４−ＢＳＡ」）抗原でコーティングすることによりＥＬＩＳＡを行った。プレートを４℃で一晩インキュベートし、続いて緩衝液中洗浄した。
【００６７】
免疫化ウサギから得られた抗血清を、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ赤血球凝集緩衝液（ｐＨ７．２）中１０−１〜１０−８の範囲で連続的に希釈した。１ウェルあたり２５μｌの試験抗血清を、各試験ペプチドとともに、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを緩衝液で隅々まで洗浄して未結合抗体を全て除去した。各ウェルを、室温で１時間、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ希釈緩衝液中に１：１０００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２５μｌで処理した。プレートを洗浄して未結合抗ウサギ試薬を除去した後、各ウェルを、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ緩衝液液中に１：１０００に希釈したアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート２５μｌとともに、室温で１時間インキュベートした。プレートを隅々まで洗浄して未結合アビジン−アルカリホスファターゼ試薬を除去して、１０％ジエタノールアミン緩衝液（０．０１％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ含有、ｐＨ９．８）中１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（「ＰＮＰＰ」）２５μｌとともにインキュベートした。波長４９０ｎｍでの反応の吸光度が０．８〜１．５の光学密度に達するまで、プレートを展開させた。ウサギにより産生された抗血清の特性を試験するため、ウサギをＤＴでも免疫し、そしてＥＬＩＳＡ試験のため、プレートを抗原としてＤＴでコーティングして、キャリアに対して産生された抗血清の反応性を測定した。
【００６８】
図２は、ＧＲＥ１を用いたＥＬＩＳＡの結果を示し、図３は、抗原としてペプチド４／ＧＲＥ４を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。図２に見られるように、ＥＬＩＳＡの結果は、抗血清の高希釈（１：１００，０００）でさえ抗体がＧＲＥ１に結合することにより示されるように、ペプチド１−スペーサー−ＤＴ抱合体で免疫したウサギがペプチド１に特異的に結合する高い抗体力価を産生したことを示す。同様に、図３は、ペプチド４−スペーサー−ＤＴ抱合体で免疫したウサギが抗ＧＲＥ４抗体の高力価を産生したことを示す。図２および図３に見られるように、各ペプチドに対して免疫されたウサギは低い抗血清濃度で各ペプチドに特異的に結合する抗体を産生した。データは、抗ＧＲＥ１抗体および抗ＧＲＥ４抗体がＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のリガンドＧＲＥ１およびリガンドＧＲＥ４に結合する巨大な能力を有することを示す。データはまた、本抱合体でのウサギの免疫化が、それぞれＧＲＥ１およびＧＲＥ４に対する強力な免疫応答を惹起することも示す。また、ＧＲＥ−１またはＧＲＥ−４抱合体のいずれかで免疫したウサギは見た目も行動も正常で、かつ実験の間どのような疾患の症状も病変も現さなかった。
【実施例２】
【００６９】
方法Ｂを用いた実施例１に記載されるＳｅｒスペーサーを含有するＧＲＥ１−ＤＴペプチドに対してウサギで産生した抗体の特異性を確立するために、以下の実験を行った。一連の試験を行い、ＧＲＥ１−ＤＴでの免疫化により誘導してＧＲＥ１−Ｓｅｒセファロースカラムにかけて免疫吸着により親和性精製したウサギ抗体の特異性を評価した。
【００７０】
阻害ＥＬＩＳＡを用いて、親和性精製した、ＧＲＥ１−Ｓｅｒペプチドの抗体の特異性を評価した。アッセイを以下のように実行した。グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝９．５）中２μｇ／ｍｌの抱合体溶液５０μｌを、４℃で、一晩インキュベーションすることにより、ＧＲＥ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡ抱合体で９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  Ｕ  ｂｏｔｔｏｍ）をコーティングした。親和性精製した抗ＧＲＥ１  Ａｂ（１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で）を各種インヒビター（１：１０希釈シリーズで）と結合させて、室温で１時間インキュベートした。インヒビターには、ＧＲＥ１−Ｓｅｒ、ＧＲＥ１  ＥＰＴ、Ｓｅｒ、ヒトガストリン１７（１−９）−Ｓｅｒスペーサー（ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ）、ＧＲＥ１  ＥＰＴ＋Ｓｅｒ、および緩衝液（インヒビターなし）が含まれた。インキュベーション緩衝液は、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．０２％ＮａＮ３からなった。続く工程でも、ＢＳＡを含まない同じ緩衝液を用いた。９６ウェルプレートを洗浄して未結合ＧＲＥ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡを除き、そしてＡｂ＋インヒビター混合物を添加した（５０μｌ／ウェル）。１時間後、プレートを洗浄してヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼコンジュゲート（Zymed）を添加した（１：２０００希釈）。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄して未結合試薬を除去し、そして５０μｌ／ウェルのｐＮＰＰ基質（Sigma）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、基質緩衝液（ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ２＋１０％ジエタノールアミン＋０．０２％ＮａＮ３）に添加した。６０分のインキュベーションに続いて、ＭＲＸ読み取り機（Dynatech Laboratories）で吸光度を測定した。試料を２回測定し、各濃度について平均を計算した。バックグラウンド結合（親和性精製したウサギ抗ＧｎＲＨ抗体で確立した）を全ての値から差し引いて、試験した各インヒビターについてインヒビター無添加（抗ＧＲＥ１Ａｂ＋緩衝液）に対する阻害％を計算した。阻害％＝（１００）（Ａ未阻害−Ａ阻害）／（Ａ未阻害）、式中Ａ＝吸光度。結果を図４に示す。
【００７１】
図４は、抗体結合の阻害％をインヒビター濃度の関数として示す。図からわかるように、ＧＲＥ１−ＳｅｒペプチドはＧＲＥｌ−Ｓｅｒ−ＢＳＡへの抗体結合を完全に阻害した。約６０％の阻害は、Ｓｅｒスペーサー配列を含まないＧＲＥ１  ＥＰＴペプチドで、およびＧＲＥ１  ＥＰＴ＋Ｓｅｒスペーサーの等モル混合物により達成された。これらのペプチドが完全な阻害をもたらさないことは、抗体の割合がＧＲＥ１配列およびＳｅｒスペーサー配列の両方の要素を含むエピトープ（単数または複数）に特異的であったことを示す。Ｓｅｒスペーサー配列自身による、またはＳｅｒスペーサー（「ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ」、ｈＧ１７のアミノ末端９残基とそれに続くＳｅｒスペーサーからなる）を保持する未関連ペプチドによる阻害はいずれも得られなかった。これらのＥＬＩＳＡの結果は、親和性精製した抗体調製物がＧＲＥ１−Ｓｅｒペプチドに特異的であること、および結合活性の６０％がペプチドのガストリン−受容体エピトープ構成成分に対して向けられていたことを実証する。
【実施例３】
【００７２】
ＡＲ４２Ｊ腫瘍細胞（European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, UK）は、ラット膵臓腺癌に由来し、十分に特性決定されたＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−受容体を有することが既知である。そこで、ＡＲ４２Ｊを放射性リガンド阻害により試験してＧＲの発現およびｈＧ１７の受容体の特異性を確認した。ＡＲ４２Ｊ細胞を、１０％ＦＣＳ（Gemini Bioproducts）、２ｍＭグルタミン（JRH Biosciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（JRH B．）および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Gemini Bioproducts）を補充した完全ＲＰＭＩ  １６４０（Sigma）中、３７℃、７％ＣＯ２で、培養した。細胞を、０．２５％ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを含む１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコ（Falcon Plastics）から回収し、次いで、遠心分離（４００×ｇ、１０分間）によりＰＢＳ（ＥＤＴＡなし）で２回洗浄した。全ての操作中、細胞を０〜４℃に維持した。単独細胞懸濁液を緩衝液で調製して、細胞濃度を１０６個／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を１ｍｌ分取して１２×７５ｍｍ培養管に添加し、次いで細胞を遠心分離して上清を廃棄した。細胞を、ヒトＧ１７（ｈＧ１７）含有、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）含有、またはペプチドを含まないＰＢＳ（０．１ｍｌ／管）に再懸濁させた。ペプチド濃度は、１．０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった。約２６，３００ＣＰＭ（特異的活性、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）が含まれる１２５Ｉ−ｈＧ１７（ＮＥＮ）の０．１ｍｌ分取量を、各管に添加した。管をボルテックスし、次いで１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでγ計数機（Wallac）で計数した。試料を２回測定した。バックグラウンド計数を差し引き、次いで各インヒビターによる１２５Ｉ−ｈＧ１７結合の阻害％を、以下の式を用いて計算した：％阻害＝（１００）（ＣＰＭ未阻害−ＣＰＭ阻害）／ＣＰＭ未阻害）。
【００７３】
放射性リガンド結合阻害試験の結果を図５に示す。これは個別の値の平均（±ＳＥ）で示している。図からわかるように、１２５Ｉ−ｈＧ１７のＡＲ４２Ｊ細胞への結合は、ｈＧ１７により阻害された。阻害の程度は、添加するインヒビターの量とともに、試験したペプチドの最高濃度である、管あたり１μｇのｈＧ１７で３２％の阻害まで増加した。反対に、ＧｎＲＨは２つの試験した最高濃度で阻害をもたらさず（１００ｐｇのＧｎＲＨで得られた６％の阻害は非特異的であると判断された）、ｈＧ１７による阻害がガストリンに特異的であったことを示している。これらの結果により、ＡＲ４２Ｊ腫瘍細胞によるガストリン受容体の細胞表面での発現が確認された。
【実施例４】
【００７４】
ＧＲＥ１−Ｓｅｒ特異的抗体のＡＲ４２Ｊ細胞への結合を免疫蛍光法により評価した。ＡＲ４２Ｊ細胞を先の実施例におけるように増殖させて、１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコからセルスクレーパーで回収し、そして遠心分離（４００×ｇ、７分間）により緩衝液（０．０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）で２回洗浄した。全ての操作中、細胞を０〜４℃に維持した。単独細胞懸濁液を緩衝液で調製して、細胞濃度を１０６個／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を、１．５ｍｌマイクロ管に添加した（１ｍｌ／管）。細胞を遠心分離によりぺレット化して、上清を吸引した。細胞をペプチドインヒビター含有（１．０ｍｇ／ｍｌ）緩衝液（０．１ｍｌ／管）に再懸濁させた。インヒビターには、ＧＲＥ１−Ｓｅｒ、ＧｎＲＨ、ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ、および緩衝液（インヒビターなし）が含まれた。ウサギ抗ＧＲＥ１−Ｓｅｒ（１００μｇ／ｍｌ）、親和性精製したウサギ抗ＤＴ（ネガティブコントロール、１００μｇ／ｍｌ）、マウス抗ＡＲ４２Ｊ抗血清（ポジティブコントロール、１：１００希釈、熱不活性化）、または正常マウス血清を含む抗体を適切な管に添加して内容物を混合した。細胞を、ときどき混合しながら、１時間インキュベートした。次いで、細胞を緩衝液で３回洗浄し、そして１管あたり０．１ｍｌのフルオレセイン標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Antibodies Incorporated）（１：５０に希釈）を添加した。マウス血清で処理した細胞はフルオレセイン−抗マウスＩｇＧ試薬（Zymed）で展開させた。細胞をボルテックスして再懸濁させ、次いで１時間インキュベートした。再度、細胞を３回洗浄し、次いで５０μｌ／管でグリセロール：ＰＢＳ（１：１、ｖ：ｖ）に再懸濁させた。各管の内容物で湿潤マウント（Wet mounts）を調製して、Ｌａｂｏｒｌｕｘ１２蛍光顕微鏡（Leitz）を用いて細胞を評価した。蛍光を０〜４の段階で評価し、ここで０はバックグラウンド蛍光（正常マウス血清で得られる）を表し、４は最大蛍光（マウス抗ＡＲ４２Ｊポジティブコントロール抗血清で得られる）を表す。
【００７５】
蛍光免疫試験の結果を表２に示す。表からわかるように、ペプチドインヒビターなしで抗ＧＲＥ１−Ｓｅｒ抗体で処理したＡＲ４２Ｊ細胞は強く蛍光を発し、抗体が細胞に結合したことを示している。ウサギ抗ＤＴ抗体は蛍光染色をもたらさず、抗ＧＲＥ１−Ｓｅｒ抗体で観測される染色がウサギ免疫グロブリンによる非特異的細胞表面結合の結果ではなかったことを実証している。そのうえ、結合はＧＲＥ１−Ｓｅｒペプチドに特異的であることが示された。ＧＲＥ１−Ｓｅｒの添加は、結合を完全に阻害したが、一方ｈＧ１７（９）−ＳｅｒおよびＧｎＲＨを含む未関連ペプチドは阻害しなかった。ＧＲＥ１エピトープはガストリン受容体配列の残基５〜２１を含むので、抗ＧＲＥ１−Ｓｅｒ抗体がＡＲ４２Ｊ細胞により発現されるガストリン受容体に特異的であったことが結論付けられた。
【００７６】
【表２】
2006523607.tif 000004
【実施例５】
【００７７】
継代数１６〜１８のＡＲ４２Ｊ細胞を、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。全細胞を湿度１００％で５％ＣＯ２の空気中３７℃に維持し、Ｔ７５フラスコ（Falcon, London, UK）中８０％の集密度（conflucency）に増殖および続いて０．０２％ＥＤＴＡで処理して継代させ、付着細胞を懸濁液中に移した。ペプチド１で調製したカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製してある、実施例１に記載されるようにして本発明のＣＣＫ−Ｂ／ガストリンペプチド１受容体免疫原を用いてウサギに産生させた抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ａＧＲ）とともに細胞を、１０秒、３０秒、３０分、および１時間インキュベートした。
【００７８】
標準技法を用いて、細胞を、１％グルタルアルデヒド中で１時間固定化して免疫電子顕微鏡（ImmunoEM）検査用に調製した。細胞懸濁液を２回、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、次いで細胞ぺレットをリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁させた。細胞ぺレットにＬＲ白色プラスチック樹脂を浸潤させた。厚さ７０〜９０ｎｍの極薄切片を切断して、Ｐｉｏｌｏｆｏｒｍコーティングしたニッケル格子に置いた。格子を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma, Poole, Dorset）中に正常ヤギ血清（Dako, High Wycombe, UK）中に置き、室温で３０分間インキュベートした。格子をＰＢＳでリンスし、次いで１％ＢＳＡ中１：５０に希釈した二次抗体の金粒子標識化ヤギ抗ウサギ抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。二次抗体なしで対照実験を行った。最後のＰＢＳ洗浄後、格子を、酢酸ウラニル飽和水溶液で３分間、およびＲｅｙｎｏｌｄクエン酸鉛で３分間、対比染色した。細胞膜上、細胞質中、核膜上、および核内の金粒子を計数した。独立した観測者により２５個の細胞／格子が計数された。対照として、ＡＲ４２Ｊ細胞を抗体に１秒未満暴露させ、そしてＧＲを欠いた肝細胞を用いた。正常ＩｇＧに暴露したＡＲ４２Ｊ細胞もまた、抗ＧＲ抗体の非特異的結合を確定する対照として用いた。これらの実験の結果を表３および図６に示す。
【００７９】
【表３】
2006523607.tif 000005
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫金粒子のＡＲ４２Ｊ細胞内分布
【００８０】
表３および図６に示されるように、ＧＲに結合した免疫金抗体粒子は、腺癌細胞の形質膜、細胞質、核膜、および核マトリックスに局在化し、抗体／受容体複合体が細胞により内部移行していることをさらに実証する。
【００８１】
表３からわかるように、ＧＲのアミノ末端に対して向けられた抗血清を用いる免疫ＥＭ研究は、抗体受容体複合体の１２％が細胞膜に伴い、３６．６％が細胞質内にあり、７．９％が核膜にあり、そして非常に驚くべきことに、４３．５％が細胞核内にあることからも、１時間インキュベーション後、免疫金標識化ＧＲ抗体の分布が迅速に内部移行することを示す。核内の強力なＧＲ免疫反応性領域はクロマチン上に見いだされ、このことはＤＮＡ調節のための特異的結合部位を示唆しているのかもしれない。
【００８２】
図６からわかるように、金ビーズ（免疫金）と結合した抗免疫グロブリンを用いたこれらの電子顕微鏡研究は、腫瘍細胞における抗受容体抗体／受容体複合体の迅速なターンオーバーを明らかにした。これらの試験はまた、抗ＧＲ抗体が腫瘍細胞の核に取り込まれることを実証する。
【実施例６】
【００８３】
腺癌細胞株、すなわちＡＲ４２Ｊ、ＨＣＴ１１６、Ｃ１７０ＨＭ２、ＬｏＶｏ、ＳＴ１６、およびＭＧＬＶＡ１を、実施例３に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させて回収した。３０個のＴ−７５フラスコからの細胞を５ｍｌの均質化緩衝液（１ｍＭの炭酸水素ナトリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、１ｎＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド、４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０μｌのロイぺプチン、１μＭのペプスタチン、５ｎＭのＥＤＴＡ［Sigma］）に懸濁させた。ホモジナイザー中５回の５秒間バーストで均質化を行った。核外膜について、組織細片（tissue debris）を、４℃で、５００ｇで７分間の遠心分離によりぺレット化した。ぺレットを廃棄して、上清を４℃で、５００ｇで遠心分離してさらに細片を除去した。上清を、４℃で、４８，０００ｇで１時間再遠心分離した。核外膜調製物を含むぺレットをＴｒｉｓ／ＮＰ−４０溶液（０．１ＭのＴＲＩＺＭＡ、０．５％のＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ４０［Sigma Chemical］）に懸濁させた。
【００８４】
核膜調製物については、第二均質化緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．４、０．１％のＴＲＩＴＯＮ  １００、０．３２Ｍのスクロース、３ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのスペルミン四塩酸塩、２ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのベンズミヂン（bezamidine）塩酸、３ｍＭのＥＧＴＡアミノアセトニトリル塩酸［Sigma］）中の均質化に続いて、組織細片を、４℃で、４００ｇで１０分間の遠心分離によりぺレット化した。ぺレットを、ＨＰＬＣ水中５５％（０．２Ｍ）スクロースに再懸濁させた。この混合物を、４℃で、６０，０００ｇで１時間回転させた。ぺレットを、ＴＲＩＴＯＮ  １００を含まない均質化緩衝液中０．４％ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ４０で洗浄した。ぺレットを、４℃で、７００ｇで１５分間回転させて、ＴＲＩＴＯＮ  １００を含まない均質化緩衝液に再懸濁させた。
【００８５】
タンパク質含量をＬｏｗｒｙ法により定量した（Pierce製キットを用いて）。１０〜１５μｇのタンパク質を含有する試料をＴｒｉｓ／グリシン緩衝液中の８〜１６％Ｔｒｉｓ／グリシン勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＡＧＥ（Novex R and D systems）にロードして、１２５定電圧、３６ｍＡで９０分間流した。ゲルを１０％氷酢酸中１時間固定化し、そして試料をニトロセルロース膜上にブロッティングした。膜を１％ＢＳＡ中で１時間インキュベートし、続いてＧＲＥ１抗血清（前吸収有りまたは無しで）で１時間インキュベートした。基質としてジアミノ−ベジデン（bezidine）を用いてアビジン：ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法により抗体結合を検出した。ＧＲＥ１（ウサギ抗ＧＲＥｌ抗血清）に対して産生したウサギ抗血清を用いるウエスタンブロット分析の結果を図７および図８に示す。
【００８６】
図７に示されるとおり、タンパク質分子量マーカーは、１１６、６６、４５、および２９ｋＤａのタンパク質を含んだ。ブロットは、１つ（ＡＰ５ＬＶ）を除く研究した全ての腺癌細胞、すなわちＨＣＴ１１６、Ｃ１７０ＨＭ２、ＬｏＶｏ、ＳＴ１６、およびＭＧＬＶＡ１で、約４３ｋＤａに局在化した突出した抗ＧＲＥ１免疫反応性バンドを示す。このタンパク質はＧＲの切断型に相当する。細胞株によっては（ＨＣＴ１１６およびＣ１７０ＨＭ２）６０〜１００ＫＤａの分子量の範囲で、少なくとも３つの他のバンドを示す。データは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体が、腫瘍細胞のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の各種アイソフォームを認識して結合し得ることを示す。
【００８７】
図８は、Ｃ１７０ＨＭ２およびＨＣＴ１１６腺癌細胞の核外膜（ＥＮＭ）および形質膜からのウェスタンブロットを示す。図８に示されるとおり、ＥＮＭ  ＧＲについて試験した腺癌細胞株は、２つの強く染色されたバンド（１つは約４３ＫＤａおよびもう一方は約６６ＫＤａ）の存在を示す。形質膜画分のみが染色された場合、約６６ＫＤａに単独バンドが存在した。したがって、ウェスタンブロット研究は、ＧＲが腺癌腫瘍細胞に存在するという免疫ＥＭの結果を確証するものの、免疫ＥＭ研究はＧＲのアイソフォーム同士を区別できない。データは、本発明の免疫原が受容体の各種アイソフォームを認識して結合し得る抗ＧＲ抗体を惹起し、これはこれらの腫瘍の治療に有利であるだろうということを示す。
【実施例７】
【００８８】
腺癌（the adenocarinoma）細胞株でのＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の発現を検出するため、ＲＴ−ＰＣＲを行ってＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｍＲＮＡを検出した。総ＲＮＡを全細胞株から単離した。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞懸濁液を調製し、そして取り扱い説明書に従ってＳＶ総ＲＮＡ単離システム（Promega）を用いて総ＲＮＡを１〜３×１０６細胞から単離した。一段階ＡｃｃｅｓｓＲＴ−ＰＣＲシステム（Promega）を用いて、ガストリン受容体（McWilliams et al. 1998）とポジティブコントロールとしてβアクチン（１０）との両方に特異的なプライマーで逆転写およびＰＣＲを行った。ＲＴを４８℃で４５分間行い、ＰＣＲは、９４℃で４５秒間、６０℃で９０秒間、６８℃で２分間のサイクルを４０回行い、ガストリン受容体ｍＲＮＡ増幅のためこの過程（round）を２回行った。生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００８９】
全細胞株で行われたＲＴ−ＰＣＲにより、古典型および切断型のガストリン受容体遺伝子で形質移入されたＡＲ４２Ｊ、Ｃ１７０ＨＭ２、ＨｅｐＧ２、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞でのガストリン受容体ｍＲＮＡの存在が確認された。ガストリン受容体ｍＲＮＡは、形質移入されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞で検出されなかった。全細胞株が、βアクチンｍＲＮＡについて陽性であった（表４を参照）。
【００９０】
【表４】
2006523607.tif 000006
細胞株におけるｍＲＮＡについてのβアクチンおよびガストリン受容体のＲＴ−ＰＣＲ
【００９１】
結果は、ＡＲ４２Ｊ、Ｃ１７０ＨＭ２、ＨｅｐＧ２、形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３がβアクチンおよびガストリン受容体ｍＲＮＡについて陽性であり、形質移入されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞はβアクチンｍＲＮＡにのみ陽性であることを示した。
【００９２】
ＲＧ−Ｇ７の取り込み
ロダル・グリーン（rhodal green）標識化ヘプタガストリン（ＲＧ−Ｇ７）の結合および内部移行は、ＡＲ４２Ｊ細胞、ＨｅｐＧ２、およびＣ１７０ＨＭ２細胞で見られた。ガストリンはこれらの細胞の細胞質中に取り込まれた。結合もまた、ガストリン受容体を安定して形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞で見られたが、形質移入されていないＮＩＨ３Ｔ３では見られなかった。形質移入された細胞において、ガストリンは細胞膜に結合するようであった。ガストリン取り込みを示すＡＲ４２Ｊ細胞を固定化して、Ａｌｅｘａ−５４６抱合化ＧＲＥ１抗体を用いてガストリン受容体を染色したところ、ガストリンおよびガストリン受容体の同時発現が見られた。ガストリン受容体は、これらの細胞の膜上および細胞質中で検出された。
【００９３】
形質移入されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞では、ＲＧ−Ｇ７の結合も内部移行も見られなかった。
【００９４】
最初にＲＧ−Ｇ７（緑）とともにインキュベートし、次いで固定化して抗ガストリン受容体抗体、ＧＲＥ１で染色したＡＲ４２Ｊ細胞の共焦点顕微鏡写真を撮った。ガストリンおよびガストリン受容体の同時局在化が見られ、ガストリン受容体だけは１つの細胞の表面で見られるようにして、ガストリンがこれらの細胞の細胞質中に取り込まれたことが観測された。共焦点顕微鏡を用いた細胞の光学的切片により、ガストリンが細胞質中には取り込まれるが、細胞の核には取り込まれないことが確認された。
【００９５】
抗ＧＲＥ１抗体の取り込み
腫瘍細胞株、ＡＲ４２Ｊ、Ｃ１７０ＨＭ２、およびＨｅｐＧ２において、生きた腫瘍細胞への抗ＧＲＥ１抗体の添加は、細胞の細胞質中および核中への抗体の結合および内部移行をもたらした。抗ＧＲＥ１抗体のＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）２フラグメントもまた、これらの腫瘍細胞株からの生きた細胞とともにインキュベートすると、細胞質および核中への取り込みが見られた。これらの細胞株によるＦＩＴＣ結合無関連抗体（ウサギ抗マウスＩｇ、Ｆ（ａｂ）２フラグメント）の取り込みは見られなかった。抗ＧＲＥ１抗体の取り込みは、形質移入されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞でも、正常リンパ球でも見られなかったが、野生型および切断型のヒトガストリン／ＣＣＫ−Ｂ受容体で形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞では見られた。抗ＧＲＥ１抗体は、形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の膜に結合するようであったが、これらの細胞の細胞質または核中には取り込まれなかった。これは、ＧＲを正常に暴露する腫瘍細胞株で見られるものと異なるパターンの取り込みであった。
【００９６】
Ａｌｅｘａ−５４６標識化抗ヒトＧＲＥ１抗体とともにインキュベートしたＡＲ４２Ｊ細胞は、細胞中への抗体取り込みを示した。共焦点を用いた細胞の光学的切片は、細胞の核ならびに細胞質中への抗体取り込みを示した。
【００９７】
ａ）Ｃ１７０ＨＭ２細胞およびｂ）ＨｅｐＧ２細胞に添加された抗ＧＲＥ１抗体は、細胞の細胞質および核内に見られる。
【００９８】
Ａｌｅｘａ−５４６で標識されたＧＲＥ１抗体を用いて得られた免疫染色の特異性および感度は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ガストリン産生腫瘍からの切片を染色することにより確かめられた。ガストリン産生腫瘍の核染色は、蛍光標識した、および未標識のＧＲＥ１抗体の両方で得られた。この染色は、エピトープでの前吸収により消すことが可能である。ローダミンで標識したＧＲＥ１のＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）２フラグメントは、この材料で同じ染色パターンを与えた。この染色はまた、エピトープを用いた抗体の前吸収により消すことが可能である。
【００９９】
ガストリン産生腫瘍（ＦＦＰＥ）を抗ガストリン受容体抗体ＧＲＥ１で染色し、ａ）抗ウサギＡＰにより検出される結合（赤色）は核染色を示し、ｂ）Ａｌｅｘａ−５４６標識化ＧＲＥ１（赤色蛍光）はガストリン産生腫瘍の核染色を示し、バックグラウンドの肝臓には染色がなく、ｃ）抗体のエピトープ前吸収後のＡｌｅｘａ−５４６標識化ＧＲＥ１は染色を消していた。
【０１００】
生きた腫瘍細胞へのＧＲＥ１抗体のＦａｂ１およびＦ（ａｂ）２フラグメントの添加は、ＡＲ４２Ｊ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、およびＣ１７ＯＨＭ２細胞の細胞質および核内にＧＲＥ１を再び示す。
【０１０１】
経時的な細胞内の抗ＧＲＥ１  Ａｂ蓄積を研究して、異なる細胞区画内にどれだけ速く抗体が取り込まれるかを評価した。この一連の実験にＡＲ４２Ｊ細胞を用いた。３７℃または４℃で細胞を抗体とともにインキュベートし、そして上限１時間で、様々な時間後に観測した。３７℃でインキュベートした細胞では、抗ＧＲＥ１  Ａｂは、インキュベーションのわずか５分後に核中に観測された。膜への抗体の結合および細胞を横切る移行は、迅速すぎて観測できなかった。４℃で１５分後、抗体は細胞によっては細胞質中および核中に取り込まれていた。
【０１０２】
したがって、実験は、結腸、膵臓、および肝臓由来の腫瘍細胞株において、ならびにヒトＧＲの古典アイソマーおよび切断されたアイソマーで形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞においても、ガストリンおよびガストリン受容体の内部移行を実証した。
【０１０３】
ガストリンおよび抗ガストリン受容体抗体の内部移行は、ガストリン受容体ｍＲＮＡを含有する細胞でのみ見られ、形質移入されていないＮＩＨ３Ｔ３細胞で、または正常リンパ球では見られず、ＣＣＫ−Ｂ受容体を発現せず、またＧＲ  ｍＲＮＡを活発に発現しなかった。
【０１０４】
共焦点顕微鏡法により、抗ガストリン受容体抗体が腫瘍細胞により内部移行されて細胞の細胞質および核中で検出され得ることを確かめた。この内部移行は迅速かつ特異的である。抗ＧＲＥ１  Ａｂは、３７℃で５分間インキュベーション後にＡＲ４２Ｊ細胞の核中で見られた。内部移行は、ＧＲＥ−１１などの他の抗アミノ末端ＧＲペプチドにより産生された抗体でも観測された。
【０１０５】
ＧＲＥ１抗体のＦ（ａｂ）フラグメントが同様にして内部移行され、無関連抗体の内部移行が同一条件下で検出されなかったことから、内部移行は、Ｆｃ受容体を介していない。したがって、内部移行は特異的である。
【実施例８】
【０１０６】
Ｃ１７０ＨＭ２腺癌細胞をヌードマウスに腹腔内注射して、腫瘍を肝臓で増殖させた。対照マウスにはリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）の輸液を与え、実験マウスには抗ＧＲ抗体の輸液を与えた。１群では、各マウスは、ペプチドエピトープの１種に対して産生されたウサギ抗ＧＲ抗体、すなわちウサギ抗ＧＲＥ１を毎日０．５ｍｇ注入された。２群では、各マウスは、ＧＲＥ４に対して産生されたウサギ抗ＧＲ抗体、すなわちウサギ抗ＧＲＥ４を毎日０．５ｍｇ与えられた。抗体注入後４０日間の間、マウスを観察し、屠殺して、研究のため腫瘍を取り出した。標準技法により、腫瘍の重さ、大きさ、および断面積を評価した。
【０１０７】
結腸直腸腺癌癌細胞株Ｃ１７０ＨＭ２の移植は、処置なしのマウスでは、腫瘍の、腫瘍重量、または腫瘍の大きさ、および腫瘍断面積から確定されるように、巨大な腫瘍塊の迅速な増殖をもたらした。しかしながら、ウサギ抗ＧＲＥ１抗体またはウサギ抗ＧＲＥ４抗体を動物に注入すると、対照と比較して、検出可能な腫瘍をとにかく有する動物数、ならびに検出可能な腫瘍をとにかく有する動物における腫瘍の重さおよび大きさに顕著な減少をもたらした。平均腫瘍重量、平均腫瘍大きさ、または平均腫瘍数を計算した場合に、同じ効果が見られる。
【０１０８】
腫瘍数、重さ、および大きさの中央値を計算することにより、集団内の分布についてのさらなる洞察が得られる。腫瘍増殖の阻害において、ウサギ抗ＧＲＥ１抗体は、一貫して、ウサギ抗ＧＲＥ４抗体よりも有効であった。しかしながら、ウサギ抗ＧＲＥ１抗体およびウサギ抗ＧＲＥ４抗体の両方とも、対照治療と比較して、強力な腫瘍阻害活性を示さなかった。また、以下に示すように、別の研究では、ウサギ抗ＧＲＥ  １１Ｓがウサギ抗ＧＲＥ１と少なくとも同じくらい有効であることが見いだされた。
【実施例９】
【０１０９】
実施例８に記載されるとおりの方法により、ただしより高い初期細胞接種量（innoculum）で、結腸癌細胞株Ｃ１７０ＨＭ２を用いて、ヌードマウスに大量の腫瘍量（burden）を産生した。Ｃ１７０ＨＭ２は、肝臓浸潤性異種移植モデルである。対照マウスおよび実験マウスを、同じく実施例８に記載されるとおりに処置した。
【０１１０】
抗体注入の４０日後、マウスを屠殺して、肝臓腫瘍を取り出し研究した。図１７、図１８、および図１９は、これらの実験結果を示す。図１７は、対照動物および抗ＧＲ抗体処置した動物における、肝臓腫瘍数の平均および中央値を示す。データは、ウサギ抗ＧＲ抗体（「ウサギ＠ＧＲＥ」）が、肝臓で転移性腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることを示す。対照と比較した場合、ウサギ抗ＧＲＥ１を用いたマウス肝臓での平均肝臓腫瘍数にはｐ＝０．００８４（スチューデントＴ検定）、および中央値肝臓腫瘍数には、ｐ＝０．００１６（マン・ホイットニー）の、統計的に有意（ｐ＜．０５）減少が見られる。抗ＧＲＥ４抗体で処置されたマウスもまた、平均肝臓腫瘍数の減少を示した。しかしながら、対照と比較した場合、これらの動物で平均肝臓腫瘍数に差異はなかった。
【０１１１】
図１８は、対照動物と比較した場合、抗ＧＲＥ１抗体および抗ＧＲＥ４抗体に、肝臓転移の腫瘍重量の平均および中央値を減少させる能力もまたあることを示す。図１９のデータは、対照動物と比較した場合、抗ＧＲ処置したマウスで肝臓腫瘍の断面積の平均および中央値にも有意減少があったことを示す。
【０１１２】
データは、ガストリン依存性大腸癌の転移性拡大の主な部位を占める肝臓で、この癌の拡大および増殖を制御するのに抗ＧＲ抗体が有効であることを示す。
【実施例１０】
【０１１３】
本発明者らは、これらの研究を、Ｃ１７０ＨＭ２細胞におけるＧＲＥ１免疫反応性を確かめるために行った。研究の目的は、ＧＲＥ１に対して産生した抗血清の腫瘍局在化を評価すること、およびヌードマウスの肝臓中でのＣ１７０ＨＭ２細胞増殖におけるその治療効果を確定することであった。上記の実施例８および実施例９で記載されるように、Ｃ１７０ＨＭ２細胞をヌードマウスに腹腔内注射した。ＧＲＥ１抗血清はウサギで産生された。抗血清を１２５Ｉで放射標識し、ヌードマウスに、確立されたＣ１７０ＨＭ２異種移植片とともに、尾静脈注射で投与した。対照マウスには、１２５Ｉ放射標識化正常ウサギ血清を与えた。マウスを、１２５Ｉ抗体の単一容量の注射に続いて時間を延ばしながら各時点で終わらせた。組織１グラムあたり１分あたりの計数（ＣＰＭ／ｇ）で放射性を測定し、そして肝臓／肝臓腫瘍比を計算した。
【０１１４】
図２０は、肝臓腫瘍に結合した放射標識化ウサギ抗ＧＲＥ１抗体を対照と対比させて示すグラフである。図からわかるように、対照と比較した場合、より多くのウサギ抗ＧＲＥ１抗体が肝臓腫瘍組織に結合している。図２０はまた、放射標識化正常ウサギ血清および抗ＧＲＥ１抗血清の両方について、ｙ軸の肝臓腫瘍／肝臓比がｘ軸の時間とともに増加することを示している。正常ウサギ血清は、１日目から１の比を達成し５日目まで一定のままであった。このことは、肝臓腫瘍および正常肝臓における放射標識のレベルが等しかったことを示す。ＧＲＥ１抗血清の比は、蓄積されて５日目に指数関数的に２に近付いた。このことは、放射標識化ＧＲＥ１抗血清がＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍内に特に局在化することを示す。したがって、放射標識化ＧＲＥ１抗体は、抗体に結合した放射性核種に応じて、腫瘍の診断画像化に、または腫瘍の放射免疫療法に用いられ得る。
【実施例１１】
【０１１５】
ＧＲＥ１抗血清のＣ１７０ＨＭ２異種移植片における治療効果
Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍異種移植片を、細胞の腹腔内注射により開始した。３種の異なる細胞接種を用いて、３つのレベルの腫瘍量を産生させた。０日目からＧＲＥ１抗血清を尾静脈注射で受動的に投与した。４０日目に治療を終了した。
【０１１６】
腫瘍「取り込み速度」におけるＧＲＥ１抗血清の効果
評価された初期パラメーターは、肝臓中の平均腫瘍数であり、これは図２１に示される。正常ウサギ抗血清処置された対照は、増加する細胞接種の群にまとめられる。図２１からわかるように、対照群において、肝臓あたりの平均腫瘍数は、１〜３であった。ＧＲＥ１抗血清処置群において、肝臓あたりの平均腫瘍数は、３種の細胞接種全てについて１未満であり、３つの実験全てについて有意であった（接種１、ｎ＝１８、ｐ＝０．００３、接種２、ｎ＝１２、ｐ＝０．０００１、および接種３、ｎ＝２０、ｐ＝０．００６８、マン・ホイットニー分析）。
【０１１７】
確立された腫瘍の腫瘍重量におけるＧＲＥ１抗血清の効果
図２２は、３つの増加する細胞接種について、左側のパネルに、正常ウサギ血清処置された対照の平均腫瘍重量を示す。この図はまた、ＧＲＥ１抗血清での処置に続くヌードマウスの平均腫瘍重量も示す。平均肝臓腫瘍重量は、３種の細胞接種全てで６０％減少し、これは３つの実験全てについて有意であった（接種１、ｐ＝０．００１６、接種２、ｐ＝０．００８４、および接種３、ｐ＝０．０００１、マン・ホイットニー分析）。
【０１１８】
ウエスタンブロット法により確定した場合のＣ１７０ＨＭ２異種移植片におけるＧＲＥ１免疫反応性
核外膜タンパク質を、実験物の２／３からのＣ１７０ＨＭ２異種移植片から調製した。ＧＲＥ１抗血清を用いて、これらをウエスタンブロット法により分析した。図２３は、ウエスタンブロット法の写真であり、正常ウサギ血清処置した異種移植片において、２本の免疫反応性バンドが７４および５０ｋＤａに存在し、前者のバンドが最も強力な免疫反応性を示したことを示している。ＧＲＥ１抗血清処置した異種移植片において、２本の免疫反応性バンドと一緒に、対照異種移植片またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した細胞には見られない中間バンドが存在する。５０ｋＤａバンドが最も強力な免疫反応性を示す。このことは、ＧＲＥ１抗血清処置した異種移植片において、より多くの割合のＧＲが内部移行した形で存在する可能性があることを示している。
【０１１９】
Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片の組織学的分析
図２４は、ヌードマウスの肝臓に浸潤するＣ１７０ＨＭ２異種移植片の顕微鏡図を示す。腫瘍は一般に、それが肝臓に浸潤する時に肝細胞を押しつぶす生きた先行縁を有する壊死中心で構成される。ｉｎ  ｓｉｔｕｅハイブリッド形成法により可視化された陽性細胞を用いて、Ｔｕｎｅｌ法によりＣ１７０ＨＭ２腫瘍の生きた先行縁でアポトーシスの程度を測定した。図２５は、アポトーシス細胞が、ＧＲＥ１抗血清処置した異種移植片の生腫瘍細胞に存在したが、正常ウサギ血清処置した腫瘍に存在しなかったことを示す。
【０１２０】
データは、ＣＣＫＢ／ガストリン受容体のアミノ末端エピトープに対して産生された抗血清が選択的に肝臓浸潤性Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍中に局在化することを示す。ＧＲＥ１エピトープの中性化は、確立された腫瘍の腫瘍「取り込み速度」および総腫瘍量の両方に顕著な効果を誘導した。この腫瘍阻害性効果は、（ａ）ＧＲを遮断することにより誘導される全般的な細胞毒性効果、および／または（ｂ）抗体の標的を細胞の核にすることにより、おそらくはアポトーシスをもたらす間接的効果によるものである可能性がある。
【実施例１２】
【０１２１】
ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（ＧＲ）のＧＲＥ−１エピトープの逆合成ペプチド配列免疫模倣物（配列番号５）を、Ｎ末端スペーサーペプチドを介して免疫原性キャリアタンパク質に結合させた。具体的には、合成アミノ酸配列は、ＣＧＧＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列番号５）を含み、下線部分はスペーサー配列を表し、残りはＣＣＫ−Ｂ／ガストリン７ループ受容体のＮ末端部分である５〜２１番アミノ酸を表す。
【０１２２】
ＣＧＧ−（５〜２１）ペプチド免疫原を、適した実験動物で試験して、免疫応答を測定した。
【実施例１３】
【０１２３】
別の合成ＧＲ免疫模倣物であるＧＲＥ１１（配列番号１１）は、ＧＲペプチド配列の１〜２２番アミノ酸を含み、これはペプチドの本来の配列の２２位に位置するＣｙｓ残基を介して免疫原性キャリアと結合している。その配列は、以下のとおりである。ＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＣ（配列番号１１）。
【０１２４】
ＧＲＥ１１エピトープは、ＧＲＥ１（５〜２１）エピトープもまた包含する。
【０１２５】
免疫原性構築物は、ＤＴなどの免疫原性キャリアタンパク質に抱合されたＧＲＥ１１ペプチドを含む。別の実施形態は、改変ＧＲＥ１１  Ｓｅｒスペーサー、ＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬＳＳＰＰＰＰＣ（配列番号１２）を含む。
【０１２６】
免疫化試験ウサギは、抗ＧＲＥ１１ペプチド抗体の誘導を示した。
【０１２７】
試験により、ＧＲＥ−１により一部阻害されながらも、抗ＧＲＥ１１抗体のエピトープＧＲＥ１１へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合が示された。定量免疫蛍光アッセイ試験は、はるかに少ないＧＲＥ６エピトープ（１〜１２アミノ酸）との交差反応性を示した。ＧＲＥ６ペプチドは、Ｎ末端配列：ＭＥＬＬＫＬＮＲＳＶＱＧ（配列番号８）を有する。
【０１２８】
定量免疫蛍光アッセイは、９６ウェル蛍光光度計で読み取られる。
【０１２９】
そのうえさらに、標準免疫蛍光および共焦点顕微鏡法を用いて、培養中の生細胞中への蛍光標識化抗ＧＲＥ１１抗体の取り込みが示された。
【０１３０】
抗ＧＲＥ１１抗体は、細胞質中に、および細胞核中に取り込まれることが見いだされた。抗体は細胞の細胞質および／または核に再配置して、自殺プロセス（すなわちアポトーシス）をもたらしたか誘導したことがさらに発見された。
【０１３１】
ウエスタンブロット法は、ＧＲ＋細胞抽出物のＧＲＥ１バンドに結合した抗ＧＲＥ１１抗体を同定した。
【０１３２】
抗体はまた、ＧＲ＋細胞抽出物をリガンド（すなわちガストリン）アフィニティカラムにかけて親和性精製することにより試験される。次いで、精製ＧＲは、ウエスタンブロット法でＧＲＥ１１抗体に対してプローブされる。バンドが細胞抽出物のものと同一であったことが見いだされた。
【０１３３】
ＧＲ同一性もまた、切り出されたブロッティングバンドのアミノ酸分析およびアミノ末端配列決定により試験される。
【０１３４】
以下に示すとおり、抗ＧＲＥ１１抗体は、抗ＤＴ抗体対照と比較して、ラット膵癌株から改変されたＧＲＥ＋ＡＲ４２Ｊ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することを示した。
【０１３５】
抗ＧＲＥｌ１抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＲＥ＋腫瘍細胞株のアポトーシスを誘導することを示した。
【実施例１４】
【０１３６】
ガストリン受容体（ＧＲ）を発現する細胞への抗体の定量的結合が実証され、そして合成ＧＲＥ１１、ＧＲＥ１、およびＧＲＥ６ペプチドで試された。９６ウェル  蛍光光度計を用いる定量免疫蛍光法は、抗ＧＲＥ１１抗体が、ＧＲＥ１１により、ＧＲＥ１一部が、ＧＲＥ６ではさらに少なくＧＲエピトープとの結合を阻害または阻止されたことを実証した。これらの観測は、以下の方法に基づいてなされた。全ての試料を、ネガティブコントロールであるウサギ抗ジフテリアトキソイド（ＤＴ）ＩｇＧ（１：２０で）、および親和性精製した抗ＧＲＥ１１を含むＦＴＡ緩衝液（ＰＢＳ）で希釈した。
【０１３７】
抗ＧＲＥ１１抗体および対照（ＤＴ）抗体を、湿潤環境下室温で１時間、１：ＧＲＥ１１、２：ＧＲＥ１、３：ＧＲＥ１＋６（１：１混合）、４：ＧＲＥ６（ガストリン受容体の１〜１２アミノ酸）、５：ＧｎＲＨ（ネガティブコントロール）との混合物中でインキュベートした。
【０１３８】
約１０ｍｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２三塩化水素三水和物色素を、ＦＴＡで１：１０００に希釈した。
【０１３９】
Ｈ６９細胞を、ｔフラスコから回収して、遠心分離管中約１０ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ色素と懸濁させた。細胞を１０μｌ分取して血球計数器で計数した。残りの細胞は３０分間氷上に貯蔵した。
【０１４０】
細胞を遠心分離により１回洗浄し、そしてＦＴＡに再懸濁させて５×１０６個／ｍｌにした。
【０１４１】
約２００μｌの細胞懸濁液を、１×１０６個／管で、抗体およびおペプチドとともに、氷上で４５〜５０分間試験した。上清を除去してＦＴＡで洗浄した後、１０％Ｓｉｇｍａ正常ヤギ血清を含有する、ＦＴＡ中１：５０に希釈したヤギα−ウサギＩｇＧのＦＩＴＣ−Ｆ（ａｂ）２２００μｌを各管に添加した。
【０１４２】
細胞をこの第二溶液に再懸濁させ、そして暗中で４５〜５０分間、氷上でインキュベートした。
【０１４３】
細胞を２００μｌのＦＴＡ緩衝液で２回遠心分離し、毎回洗浄緩衝液を吸引して洗浄した。
【０１４４】
２００μｌのＦＴＡを各管に添加し、そして細胞を再懸濁させた。細胞を黒色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの２（duplicate）ウェルに１００μｌ分取量で播き、そして設定したＨｏｅｃｈｓｔ波長で蛍光光度計を用いて読み取り、設定したＦＩＴＣ波長でも読み取った。平均ＦＩＴＣ／Ｈｏｅｃｈｓｔ蛍光比を計算して、抗ＤＴ値（アッセイ基準線）をそれぞれから差し引いた。各ＧＲＥペプチドによる結合の阻害割合を、抗ＧＲＥ−１１抗体処理した細胞についてＧｎＲＨの存在下の結合と相対して、計算した。
【０１４５】
結果：
各ペプチドによる抗体結合の阻害割合は、ＧＲＥ−１１で８４％、ＧＲＥ１で５７％、ＧＲＥ１＋ＧＲＥ６（混合）で４９％、およびＧＲＥ６で４％であった。
【０１４６】
したがって、強力な阻害が、ＧＲＥ１による顕著な阻害とともに、ＧＲＥ−１１で得られた。このことは、ＧＲＥ１１がガストリン受容体と共通したさらなるエピトープを保有し、これはＧＲＥ１およびＧＲＥ６がこの受容体と共有するものに勝ることを示す。このことは、ＧＲＥ−１１配列が抗ガストリン受容体免疫原として驚くほどに有効なペプチドであることを示す。抗ＧＲＥ−１１Ａｂは、以下のようにして、抗ＤＴ  Ａｂと比較して、ＧＲ＋ＡＲ４２Ｊ細胞（ラット、膵癌株）の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することが示されている。
【０１４７】
ＡＲ４２Ｊ細胞を、０．０２５％ＥＤＴＡを用いてサブコンフルエントなＴ７５フラスコから回収して、９６ウェルプレートに播いた（１×１０５個／ｍＬを１００μｌ／ウェル）。細胞培養培地を、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０から調製した。２４時間後、親和性精製した抗ＧＲＥ−１１Ａｂ、またはプロテインＡで精製した正常ウサギＩｇＧを、細胞培養培地中５００μｇ／ｍＬの濃度まで添加した。抗体の存在下で３日間培養後、細胞増殖をＭＴＴアッセイにより評価した。３日間のアッセイで、抗ＧＲＥ−１１抗体がＡＲ４２Ｊ細胞増殖を２５％減少させたことが見いだされた。
【０１４８】
また、抗ＧＲＥ−１１Ａｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧＲ＋腫瘍細胞株のアポトーシスを誘導することも見いだされた。
【０１４９】
ＡＧＳ腫瘍株は、通常、ＧＲの発現レベルが低い。しかしながら、ヒトＧＲで形質移入された株変異体は、高いレベルのＧＲを発現する。この株を、ＡＧＳＣＣＫ−２Ｒと名付ける。ＡＧＳ−ＣＣＫ−２ｒのアポトーシスに対する、親和性精製したウサギ抗ＧＲＥ１１  Ａｂの効果を、対照としてプロテインＡで精製した正常ウサギＩｇＧと比較した。ベクター対照ＡＧＳｖｃ細胞を、さらなる対照として試験した。アポトーシスを、Ｔｕｎｎｅｌ方法により、以下のように測定した。
【０１５０】
ＡＧＳ細胞（ＡＧＳ−ｇｒおよびＡＧＳｖｃ）を、０．０２５％ＥＤＴＡを用いてサブコンフルエントなＴ７５フラスコから回収して、２ｎＭのＬ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中、１ウェルあたり１×１０５個で、２４ウェルプレートに播いた。各ウェルは、直径１３ｍｍの組織培養処理したカバースリップを備えた。２４時間後、培地をＲＰＭＩ＋２ｎＭのＬ−グルタミンおよび１％ＦＢＳおよび試験抗体（５００μｇ／ｍＬのＧＲＥ−１１またはウサギＩｇＧ対照）と交換した。１８時間で、カバースリップに付着した細胞を、４％ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で１０分間、ｉｎ  ｓｉｔｕで固定し、それからＴｄＴ−ＦｒａｇＥＬ（登録商標）ＤＮＡフラグメント化検出キット（Oncogene Research Products、ＱＩＡ３３）で標識した。キットは、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（ＴｄＴ）を、アポトーシスシグナルに応答して産生されたＤＮＡフラグメントのむき出しの３'−ＯＨ末端に結合させることにより、アポトーシス核の検出を可能にする。ＴｄＴは、ビオチン標識化および未標識デオキシヌクレオチドのフラグメントへの付加を触媒し、フラグメントはストレプトアビジン（strepavidin）西洋ワサビペルオキシダーゼ抗ビオチン抗体コンジュゲートを介してＤＡＢ色素源により可視化される。
【０１５１】
細胞をＴＢＳで再水和させて、２０μｇのプロテイナーゼＫで５分間透過処理し、次いで内在ペルオキシダーゼを３％過酸化水素で５分間不活性化した。次いで、細胞を、３７℃で９０分間、ＴｄＴ酵素で処理した。停止溶液で反応を中止させて、ブロッキング緩衝液とともにインキュベートし、それからＨＲＰ抱合化した。メチルグリーン対比染色に続いてＤＡＢを適用した。
【０１５２】
カバースリップをウェルから取り外し、そして標準的な封入剤を用いて、スライドガラスにマウントしてカバーガラスで覆った（coverslipped with glass）。Ｑｗｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Leica, Germany）を用いて画像分析を行い、各処理についてアポトーシス細胞数を評価した。各スライドについて２０倍の対物倍率で、２０を超える読み取りのアポトーシスの平均割合として結果を示す。アポトーシスの基礎割合（base rate）は、ＡＧＳｖｃ細胞で＜１％であった。抗ＧＲＥ−１１抗体での処理は、精製した正常ウサギＩｇＧと比較して、ＡＧＳ−ｇｒ細胞のアポトーシスに２．４倍（ｐ＜０．０５）の顕著な増加を引き起こした。
【０１５３】
結果を分析すると、各群についてのアポトーシス平均割合（±ＳＥ）は、正常ウサギＩｇＧを用いたＡＧＳｖｃで０．３７％±０．０７、抗ＧＲＥ−１１を用いたＡＧＳｖｃで０．８３％±０．１１４、正常ウサギＩｇＧを用いたＡＧＳ−ｇｒで０．８６％＋±０．１４、そして抗ＧＲＥ−１１を用いたＡＧＳ−ｇｒで２．０７％±０．２７あったことが示された。したがって、ガストリン受容体形質移入細胞では抗ＧＲＥ１１抗体によるアポトーシスの顕著な増加が観測されたが、対照細胞では観測されなかった。
【０１５４】
ペプチドＧＲＥ−９およびＧＲＥ−１０は、突然変異ヒトＣＣＫ−２／ガストリン受容体の第三内部ドメインの内部側（internal）スプライスバリアントである。抗ＧＲＥ９抗体または抗ＧＲＥ１０抗体により検出される受容体は、特定の腫瘍細胞に対して独特である可能性がある。
【実施例１５】
【０１５５】
ガストリン受容体に対するモノクローナル抗体を、本発明の免疫原を用いて産生した。
【０１５６】
ＧＲＥ１１（配列番号１１）を含むペプチドを、実施例１３に記載されるようにしてＤＴに結合させ、ＧＲＥ１１−ＤＴ抱合体を生成した。ＧＲＥ１−ＤＴについて実施例１で記載されたようにして、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３を用いて、ＧＲＥ１１−ＤＴ抱合体で免疫原を作製した。０．１ｍｇのＧＲＥ１１−ＤＴ免疫原を腹腔内（ＩＰ）経路で０．１ｍＬ／マウスで注射することにより、成熟ＣＡＦ１株マウスを免疫した。４週間後、マウスに２回目の注射を行った。
【０１５７】
細胞融合の４日前に、ＰＢＳ中０．１ｍｇの抱合体を用いてＩＰ注射でマウスに追加免疫した。融合当日、脾臓を回収して抗体産生細胞源として用い、これを、当業者により実施される標準的なハイブリドーマ法によりマウスＰ３細胞と融合させた。
【０１５８】
２種のアッセイにおける抗体結合に基づいて、ガストリン受容体に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。第一のアッセイでは、細胞培養上清をＧＲＥ１１ペプチドに対する抗体の存在について試験し、そしてＥＬＩＳＡを、ＧＲＥ１１−ＢＳＡが抗ＧＲＥ１１抗体についての抗原標的として働くことを除いて、ＧＲＥ１抗体について実施例１に記載されるもののように行った。この方法により、ＧＲＥ１１ペプチドに対する抗体を産生する細胞を同定した。例えば、融合体＃４４６において、５７６ウェルのうち４１ウェルで抗ＧＲＥ１１ペプチド抗体を産生するハイブリッド細胞が含まれていることが見いだされた。
【０１５９】
次いで、これらの細胞を第二の選択段階にかけ、ここで細胞は受容体陽性細胞上のガストリン受容体に結合する抗体の産生について試験された。免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を用いて抗ガストリン受容体抗体を同定した。
【０１６０】
ＩＦＡについて以下の方法を用いた。ガストリン陽性細胞を、特定の細胞株に推奨される組織培養条件下、当業者に既知である方法により増殖する。そのような細胞株の例として、Ｈ６９、Ｃ１７０ＨＭ２、ＡＧＳ、ヒトガストリン受容体で形質移入されたＡＧＳ、およびヒトガストリン受容体で形質移入されたＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられるだろうが、これらに限定されない。ＩＦＡの前日に、Ｔ１５０フラスコからガストリン受容体陽性細胞を回収した（ガストリン受容体を形質移入されたＡＧＳ細胞など）。１つの細胞懸濁液を調製して細胞を計数した。細胞濃度を、１ｍＬあたり約５０万〜１００万個に調整した。滅菌ぺトリ皿中、１２ウェル培養スライドを細胞懸濁液で溢れさせ、次いで、滅菌条件下、室温で約１時間インキュベートした。スライドを完全ＤＭＥＭ（ダルベッコＭＥＭ）に浸漬し、次いで５％ＣＯ２下、３７℃で一晩インキュベートした。スライドをぺトリ皿から取り出して、ＰＢＳで１〜２分間リンスした。次に、スライドをパラホルムアルデヒド固定液に６０分間浸漬し、次いでＰＢＳで１回ごとに５分間、２回リンスした。過剰のＰＢＳを振り落とし、そしてスライドをＰＢＳ中１％ＢＳＡで溢れさせ、次いで、湿性スライドチャンバー中、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中１％ＢＳＡをデカントして、２５μｌの対照（マウス抗ＧＲＥ１１抗血清、および非特異的ネガティブマウス血清コントロール）および試験試料（ハイブリッド細胞ウェルから（rom）の上清試料）を個別のウェルに添加した。スライドを、湿性スライドチャンバー中、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳで満たした染色ジャーにスライドを５分間入れることで、スライドを洗浄した。これをもう１回繰り返した。スライドを１：４０に希釈したＦＩＴＣヒツジ抗マウスＩｇＧ、Ｍ＆Ａ（Ｈ＋Ｌ）抱合体で溢れさせ、そして湿性スライドチャンバー中、暗中で室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で満たした染色ジャーにスライドを５分間入れることで、スライドを洗浄した。これをもう１回繰り返した。スライドを封入剤で溢れさせ、そして２０×６０ｍｍのカバースリップを各スライドに置いた。個別のウェルを蛍光顕微鏡で見て、スライドの各ウェル中の細胞をモノクローナル抗体による染色について視覚評価した。
【０１６１】
例えば、融合体＃４４６において、細胞膜上のガストリン受容体に結合する抗体を産生することが見いだされたのは、抗ＧＲＥ１１ペプチド抗体を産生する４１のハイブリッドのうち４つのハイブリッドのみであった。次いで、そのようにして抗ガストリン受容体抗体を産生すると同定された細胞を、標準ハイブリドーマ技法で、３回クローニングしてモノクローナル抗ガストリン受容体抗体を産生するモノクローナルハイブリドーマを得た。各クローニングに続いて、ハイブリッド細胞を抗ガストリン受容体モノクローナル抗体産生について上記されるように再試験した。放射免疫測定、細胞標的ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの当業者に既知である適した代替法が、ガストリン受容体に対する特異的高親和性抗体を産生するハイブリッド細胞を同定するために代わりに用いられ得ることに留意されたい。
【０１６２】
別の例として、上述の技法によって、モノクローナル抗ガストリン受容体抗体を分泌する融合体＃４４６および融合体＃４４７からハイブリッド株を産生し、それにしたがって、それぞれ４４６−１、４４６−２、４４６−３、および４４７−１と番号付けられた。
【０１６３】
この方法論は、さらに、ＧＲの細胞外部分において特異的標的を選択するために用いられ得る。
【実施例１６】
【０１６４】
ＧＲに対する免疫化と化学療法との併用治療をラットで試験した。結果を表５に報告する。
【０１６５】
被検体：ラット（ＢＤＩＸ株）
方法：ラット（ＢＤＩＸ株）に、ＧＲＥ１または対照免疫原で７回免疫化を与えた（−４、−３、−２、０、１、４、７週目に注射した）。
【０１６６】
第０週で、全てのラットに１０６ＤＨＤＫ１２ラット腫瘍細胞を注射した。
【０１６７】
群によっては、１週目および５週目に、５ＦＵ／ロイコボリンで処置した。
【０１６８】
１０週で全てのラットを終わらせて腫瘍を評価した。
【０１６９】
【表５】
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【０１７０】
群によっては比較的低い取り込み速度が見いだされた。差異は、測定した各パラメーターについて統計的に有意であった（マン・ホイットニー）。
結果は、以下を示す：
【０１７１】
ＧＲＥ１エピトープでの免疫化は、対照免疫原を与えられたラットと比較して、腫瘍壊死領域を増加させて、腫瘍細胞の増殖およびガストリン受容体発現レベルの両方を減少させた。
【０１７２】
これらの効果は、５ＦＵおよびロイコボリンとの同時処置により顕著に向上した。
【０１７３】
結論：
ＧＲＥ１での免疫化は治療上有効であった。ＧＲＥ１免疫化の化学療法との併用は、単独でのいずれの治療にも勝って、顕著に有効性を向上させた。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体およびその７つの膜貫通ドメインの模式図を示す。
【図１Ｂ】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体およびその７つの膜貫通ドメインの模式図を示す。
【図２】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のＧＲＥ１に対する免疫原で免疫されたウサギで産生される抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイのデータを示す。
【図３】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド４に対する免疫原で免疫されたウサギで産生される抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイのデータを示す。
【図４】ＧＲＥ１−ＤＴ免疫原に対して産生した親和性精製抗体の特異性を評価するために用いた阻害ＥＬＩＳＡから得られたデータを示すグラフである。
【図５】１２５Ｉ−ヒトＧ１７のＡＲ４２Ｊ細胞への結合の、ペプチドインヒビターによる阻害におけるデータを示す棒グラフである。
【図６】免疫金標識化ＡＲ４−２ｊ腫瘍細胞の細胞分布の棒グラフである。
【図７】ＧＲＥ１に対して産生した抗体を用いる、腺癌細胞の核膜からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析の写真である。
【図８】ＧＲＥ１に対して産生した抗体を用いる、腺癌細胞の核外膜および形質膜からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析の写真である。
【図９】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物のＣ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示すプロットグラフである。
【図１０】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物からのＣ１７０ＨＭ２腫瘍の断面積を示すプロットグラフである。
【図１１】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物の平均Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１２】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物のＣ１７０ＨＭ２腫瘍の平均断面積を示す棒グラフである。
【図１３】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物中のＣ１７０ＨＭ２腫瘍の平均数を示す棒グラフである。
【図１４】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物の肝臓転移のＣ１７０ＨＭ２腫瘍重量中央値を示す棒グラフである。
【図１５】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物からのＣ１７０ＨＭ２腫瘍の断面積中央値を示す棒グラフである。
【図１６】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物中のＣ１７０ＨＭ２腫瘍数の中央値を示す棒グラフである。
【図１７】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物中の肝臓Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍数の平均および中央値を示す棒グラフである。
【図１８】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置した動物の肝臓Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量の平均および中央値を示す棒グラフである。
【図１９】対照動物および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体処置した動物のＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍転移の断面積について平均および中央値を示す棒グラフである。
【図２０】対照マウス（正常ウサギ血清）および抗ＧＲＥ１処置したヌードマウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍異種移植片における放射標識化１２５Ｉ−抗体の濃度を示すグラフを示す。
【図２１】対照マウスおよび抗ＧＲＥ１処置したヌードマウスの異種移植肝臓あたりの平均Ｃ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍数を示す棒グラフを示す。
【図２２】対照マウスおよび抗ＧＲＥ１処置したヌードマウスの肝臓異種移植片の平均Ｃ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍重量を示す棒グラフを示す。
【図２３】対照マウスおよび抗ＧＲＥ１処置したヌードマウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍異種移植タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【図２４】対照マウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓異種移植片のヘマトキシリン／エオシン染色切片を示す、光学顕微鏡で撮られた組織学的切片の写真である。
【図２５】ウサギ抗ＧＲＥ１抗体で処置したマウスからのＣ１７０ＨＭ２肝臓異種移植片のヘマトキシリン／エオシン染色切片を示す、光学顕微鏡で撮られた組織学的切片の写真である。以前にＧＲＰと名付けられたペプチドエピトープは、ＧＲＥと改名されている。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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