(57)【要約】本発明は、デンプン生合成促進タンパク質の発現によって、植物（好ましくはジャガイモ植物）でのアミロース含量を増加させる方法に関する。本発明は更に、ジャガイモ植物（好ましくは塊茎）において当該ポリペプチドを発現する発現カセット、当該ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物、ならびに、特に天然デンプン以外のファインケミカルを製造するための前記トランスジェニック植物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物においてデンプンの産生を増加させる方法であって、少なくとも１つのデンプン生合成促進タンパク質の発現または活性が増強されている植物を栽培することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記デンプンが高アミロース含量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミロースの産生が増加することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法がデンプン生合成促進タンパク質の過剰発現を含んでなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、配列番号２または４、あるいはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって前記配列から誘導され、かつ配列番号２または４に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％の同一性を有するタンパク質からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
デンプン生合成促進タンパク質が、
a）配列番号１または３の核酸配列に対して少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸配列、
b）配列番号１または３のヌクレオチド配列を含む核酸配列の少なくとも30ヌクレオチドの断片を含む核酸配列、
c）配列番号２または４のアミノ酸配列に対して少なくとも約60％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列、および
d）配列番号２または４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、配列番号２または４のアミノ酸配列の少なくとも10個連続したアミノ酸残基を含む該断片をコードする核酸配列、
からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
デンプン生合成促進タンパク質が配列番号１または配列番号３に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
活性の欠損または減少が、
a）前記タンパク質をコードする遺伝子のノックアウト、
b）前記遺伝子のコード領域、非コード領域または調節領域に突然変異が導入される、前記タンパク質をコードする遺伝子の突然変異誘発、
c）前記タンパク質をコードするRNAの少なくとも一部に相補的である、アンチセンスRNAの発現、
からなる群より選択される方法によって達成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１もしくは３を過剰発現する植物、またはデンプン生合成促進活性が増大している植物を、該植物が増加した量のアミロース型デンプンを産生する条件下で栽培することによる、アミロース型デンプンの産生方法。
【請求項１０】
前記植物がソラナム（Solanum）属に属する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物がジャガイモ（Solanum tuberosum）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
デンプン生合成促進タンパク質をコードする配列番号１の核酸配列。
【請求項１３】
デンプン生合成促進タンパク質をコードする配列番号３の核酸配列。
【請求項１４】
デンプン生合成促進活性を有する配列番号２のアミノ酸配列。
【請求項１５】
デンプン生合成促進活性を有する配列番号４のアミノ酸配列。
【請求項１６】
調節配列と共に、
a）配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも60％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸配列、
b）配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸配列の少なくとも30ヌクレオチドの断片を含む核酸配列、
c）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも約60％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列、および
d）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片であって、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも10個連続したアミノ酸残基を含む該断片をコードする核酸配列、
からなる群より選択される核酸配列を含んでなり、前記調節配列が植物において前記核酸配列の発現を仲介することができる、トランスジェニック発現カセット。
【請求項１７】
前記調節配列が前記核酸配列に対して異種のプロモーター配列である、請求項１６に記載のトランスジェニック発現カセット。
【請求項１８】
前記調節配列が塊茎特異的プロモーター配列である、請求項１６に記載のトランスジェニック発現カセット。
【請求項１９】
前記核酸配列が前記プロモーター配列に対してアンチセンスもしくはセンス方向に配置されている、請求項１６、１７または１８に記載のトランスジェニック発現カセット。
【請求項２０】
前記核酸配列が配列番号２または配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のトランスジェニック発現カセット。
【請求項２１】
前記核酸分子が配列番号１または配列番号３に記載されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のトランスジェニック発現カセット。
【請求項２２】
前記核酸配列が配列番号２または配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する変異体をコードする、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のトランスジェニック発現カセット。
【請求項２３】
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の発現カセットによって形質転換されたトランスジェニック宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞がソラナム（Solanum）属に属する、請求項２３に記載のトランスジェニック宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の発現カセットを含むトランスジェニック植物。
【請求項２６】
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の発現カセットを含むトランスジェニックジャガイモ植物。
【請求項２７】
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の発現カセットを含むトランスジェニックジャガイモ植物、植物部分、種子または塊茎。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなデンプン生合成促進タンパク質、デンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸、野生型と比較してアミロース生合成が増加している遺伝的改変植物を栽培することによる高効率でのアミロースの産生方法、遺伝的改変植物それ自体、ならびに少なくとも１つのデンプン生合成促進タンパク質を過剰発現するこれらのトランスジェニック植物のアミロース産生のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デンプンは植物の主要な貯蔵炭水化物であり、主に種子および塊茎に蓄積され、その後こうした種類の器管を形成する植物の繁殖組織となる。デンプンはまた、日周性に基づいて蓄積され、デンプンは緑色組織において光合成産物から作られ、その後、夜間にエネルギーとして代謝される。貯蔵デンプンは集合して半結晶性の顆粒になる。アミロペクチンおよびアミロースはデンプンの２つの構成分子である。アミロペクチンはα-1,6結合で連結された直鎖状α-1,4グルカン鎖から成る枝分かれ分子である。アミロースは基本的に直鎖状α-1,4グルカン鎖から成る。
【０００３】
デンプンは食品産業だけでなく技術産業においても多くの用途に利用される。デンプン製造加工業に利用される主要作物はトウモロコシとジャガイモである。ジャガイモについては、高デンプン含量のために品種改良された特定の品種がデンプン生産に利用される。これは、デンプン含量および収率がデンプン加工業にとって重要な経済上の駆動力であることを意味する。生産された乾燥デンプンの大部分は紙の製造に利用される。デンプン成分の規格および必要条件は用途によって異なり、デンプンは用途にとって望ましい特性を備えるように何度も化学的に修飾される。異なる品質のデンプンを得るための別の方法は、デンプン生合成における突然変異を利用することであり、より最近ではデンプンへと至る経路の遺伝的改変を利用することである。最初の主な改変は、２つのデンプン成分であるアミロペクチンとアミロースの産生を様々な品種に分離することであった。トウモロコシでは、Waxyつまり「アミロースフリー」品種がアミロペクチン型デンプンのみを含む一方で、「アミロース増量型」のような高アミロース遺伝子型も存在している。
【０００４】
アミロースデンプンはフィルム形成剤としてのまたは膨張製品のためのいくつかの潜在的な産業上の用途を持つ。高アミロースデンプンは、ジャガイモや他のデンプン含有植物においてデンプン分枝酵素の阻害によって達成され得る。これは同時に、アミロペクチンの枝分かれの減少または排除をもたらし、それによりアミロース画分の増加を引き起こす。
【０００５】
US 5,856,467は、アミロペクチン型デンプンの形成を抑制するためのジャガイモの遺伝子工学的操作による改変を記載する。この特許文献はジャガイモにおけるデンプン分枝酵素の形成をコードする遺伝子（SBE遺伝子）の発現を様々な程度に阻害するアンチセンス構築物を記載し、前記アンチセンス構築物は塊茎特異的プロモーター、転写開始点、およびアンチセンス方向に挿入されたSBE遺伝子の第一エクソンを含む。
【０００６】
US 6,169,226は、ジャガイモの第二のデンプン分枝酵素（SBE II）のアミノ酸配列およびそれらの断片ならびに対応する単離されたDNA配列に関する。この特許文献は、トランスジェニックジャガイモの作出およびアミロース型デンプンの産生のためのこれらのトランスジェニックジャガイモの使用を記載する。
【０００７】
WO 97/20040およびWO 98/20145は、適切なプロモーターとセンスまたはアンチセンス方向で機能的に連結された核酸配列（相同な遺伝子がSBE I またはSBE II活性を有するポリペプチドをコードする）を植物細胞に導入することによって、植物細胞のアミロペクチン/アミロースデンプン含量を変化させる方法を記載する。
【０００８】
アミロース過剰産生の副作用はジャガイモでの総デンプン含量の減少である。この減少はアミロース画分が増加するにつれてより顕著になる。
【０００９】
アミロペクチンおよびアミロース産生用の基本的な酵素は、直鎖状α-1,4グルカン鎖を作るデンプン合成酵素と、α-1,4グルカン鎖を分断して、それらをα-1,6結合で再結合する分枝酵素である。いくつかの他の酵素が、脱分枝酵素のように、デンプンの構造および組成に影響を及ぼすと思われるが、初期にはデンプン合成酵素とデンプン分枝酵素の発現に影響を及ぼす方向が中心となる。これは、どの酵素がデンプン合成のどの特徴に重要であるかについての徹底的な分析へと導いた。しかし、アミロース、アミロペクチンを問わず、どのように植物におけるデンプンの合成が開始されるかは、まったく確認されなかった。
【００１０】
デンプン生合成の開始に関する提案がいくつかの科学論文の主題になっている。なぜならば、人為的ではないin vitro条件下でデンプン合成酵素にプライマー非依存性の機能があると考えるには無理があったからである。プライマー非依存性の機能とは、唯一の開始点および構成単位としてADP-グルコースを用いた新たなα-1,4グルカン鎖の形成を意味する。提案された１つの経路は、マルトオリゴ糖の存在がデンプン合成酵素による更なるグルコース単位の付加のためのプライマーとして機能するというものであったが、濃度がデンプン合成の基盤を提供するのに十分であるのか、さらにこれらのマルトオリゴ糖が色素体中でどのように形成されるのか、については討論されている。
【００１１】
デンプンは植物においてエネルギー貯蔵分子として合成される。デンプン生合成に関与する酵素については多くのことが知られているものの、デンプン分子の合成開始は未解決のままである。哺乳動物および酵母では、デンプンによく似たエネルギー貯蔵分子であるグリコーゲンが合成される。それぞれの分子の合成のための酵素的段階は類似している。グリコーゲン生合成では、この分子の合成開始が知られており、グリコゲニンという酵素によって合成される。グリコゲニンはそれ自身の上で約8個のグルコース分子の線状鎖を重合させる自己グルコシル化酵素である。グリコーゲン分子へのグルコース取り込みの継続を触媒する酵素が機能するためには、約8個のグルコース残基のプライマーが必要である。
【００１２】
Chengら、1995, Mol. and Cell. Biol. 6632-6640は、２つの酵母タンパク質をウサギの筋肉グリコゲニンと比較している。
【００１３】
Roachら、1997, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Vol 57は、自己グリコシル化開始タンパク質およびそれらのグリコーゲン生合成における役割を記載している。
【００１４】
Muら、1997, Journal of Biological Chemistry 272 (44), 27589-27597は、哺乳動物グリコゲニンを酵母およびC. elegansグリコゲニンと比較している。
【００１５】
デンプン量にとって重要な要因が検討されてきており、特にジャガイモでは、基質供給の増加、生合成活性の増加、もしくは基質転用経路の遮断の領域における様々な酵素活性の過剰発現または阻害によってデンプンの形成および含量を増加させるために多くのイニシアティブが取られてきたが、これまでのところ、これは商業上の応用を伴わない限られた成功を収めたにすぎず、いくつかの科学出版物しかもたらさなかった。
【００１６】
Regierer, B.ら、Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants（デンプンの含量および収率がトランスジェニック植物においてアデニル酸プールを変更した結果として増加する）. Nat Biotechnol. 20(12):1256-60, (2002)を参照のこと。
【００１７】
Sweetlove, LJら、Starch synthesis in transgenic potato tubers with increased 3-phosphoglyceric acid content as a consequence of increased 6-phosphofructokinase activity（増大した6-ホスホフルクトキナーゼ活性の結果として3-ホスホグリセリン酸含量が増加したトランスジェニックジャガイモ塊茎におけるデンプン合成）. Planta 213(3):478-82 (2001)を参照のこと。
【００１８】
Veramendi, Jら、Antisense repression of hexokinase 1 leads to an overaccumulation of starch in leaves of transgenic potato plants but not to significant changes in tuber carbohydrate metabolism（ヘキソキナーゼ1のアンチセンス抑制はトランスジェニックジャガイモ植物の葉におけるデンプンの過剰蓄積をもたらすが、塊茎の炭水化物代謝を顕著に変化させない）. Plant Physiol. 121(1):123-34 (1999)を参照のこと。
【００１９】
Geigenberger, Pら、Overexpression of pyrophosphatase leads to increased sucrose degradation and starch synthesis, increased activities of enzymes for sucrose-starch interconversions, and increased levels of nucleotides in growing potato tubers（ピロホスファターゼの過剰発現は、スクロース分解およびデンプン合成の増加、スクロース-デンプン相互変換酵素の活性増加、ならびに生育しつつあるジャガイモ塊茎中のヌクレオチドレベルの増加をもたらす）. Planta. 205(3):428-37(1998)を参照のこと。
【００２０】
Sweetlove, LJら、Starch metabolism in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased ADPglucose pyrophosphorylase（ADPグルコースピロホスホリラーゼが増大しているトランスジェニックジャガイモ(Solanum tuberosum)の塊茎におけるデンプン代謝）. Biochem J. 320 (2):493-8 (1996)を参照のこと。
【００２１】
他の研究では、動物でのグリコーゲン産生を開始する生物学的機能に見かけ上類似した機能が検討された。その後、あるクラスの遺伝子が数種の植物から単離され、それは自己グリコシル化酵素として機能して、植物でのデンプン生合成のためのプライマーを提供する植物のグリコゲニン相当物であると考えられて、アミロゲニンという名称を与えられた（WO94/04693; Sing, D.ら、β-Glucosylarginin: a new glucose-protein bond in a self-glucosylating protein from sweet corn, FEBS Letters 376:61-64, (1995)）。これらの遺伝子は、グリコゲニンをコードする遺伝子に対して構造上の観点から類似性を持っておらず、あとでデンプン生合成における機能を持たず、むしろ細胞壁の形成に重要であることが決定された（Bocca, S.Nら、Molecular cloning and characterization of the enzyme UDP-glucose: protein transglucosylase from potato. Plant Physiology and Biochemistry 37(11):809-819(1999)を参照のこと）。
【００２２】
WO 98/50553は、植物グリコゲニンまたは水ストレスタンパク質をコードする核酸断片を記載する。WO 98/50553はまた、植物グリコゲニンの全体または一部をセンスもしくはアンチセンス方向でコードするキメラ遺伝子の構築物に関し、キメラ遺伝子の発現は、結果として形質転換宿主細胞における変化したレベルの植物グリコゲニンの産生をもたらす。
【００２３】
このように、多くの酵素および経路が植物において研究されてきたが、どのようにデンプン形成が開始されるか、ならびに、何がデンプン含量を決定するかに関する疑問は、いまだに未解決のままである。
【００２４】
アミロースは多くの用途を持つ商業的に重要なデンプン生成物であるが、残念なことに、トランスジェニックジャガイモ植物でのアミロース含量の増加は、デンプン含量の顕著な減少と関連している（図１参照）。
【００２５】
トランスジェニック高アミロースジャガイモ系統の解析は、これらの系統に過剰の可溶性糖質が存在することを示す（図２参照）。これは、これらのトランスジェニック系統でのデンプン生合成が、利用可能な糖質の取り込みに十分には効率的でないことを示唆する。
【００２６】
アミロースデンプンは天然のデンプンと比較して非常に少ない還元末端から成る。従って、アミロース生合成を更に促進し、過剰の利用可能なグルコース残基を取り込むことができ、しかも多量にアミロースを産生する植物におけるデンプン含量の減少を埋め合わせることができる遺伝子を同定することは、商業的に重要である。
【発明の開示】
【００２７】
本発明は、形質転換植物においてデンプン生合成を促進する遺伝子の過剰発現による、アミロース生合成の収率の向上を目的とする。
【００２８】
本発明は、デンプン産生を促進するタンパク質をコードする遺伝子を記載する。
【００２９】
本発明は、新規のデンプン生合成を促進する酵素をコードするジャガイモ由来の核酸、配列番号1および3を記載する。
【００３０】
実施例１は、配列番号1または3の核酸配列が、自己グリコシル化タンパク質Glg1pおよびGlg2pのノックアウト突然変異を含む酵母細胞において、失われたグリコゲニン機能を補完できることを記載する。
【００３１】
ジャガイモにおける配列番号1または3の２つの遺伝子の阻害および過剰発現のために、遺伝子構築物が作製された。過剰発現されたまたは阻害された酵素活性を有するトランスジェニック系統を、デンプン含量に対する該遺伝子の影響について解析した。
【００３２】
両遺伝子を、植物プロモーターエレメントの下流にセンスおよびアンチセンス方向で挿入すると、形質転換バイナリーベクターpHS1、pHS2、pHS3およびpHS4が得られる（図３〜７参照）。
【００３３】
実施例2に記載されるような形質転換方法に従って、アンチセンス構築物をジャガイモ植物品種PrevalentおよびProducentに形質転換し、センス構築物をジャガイモ品種Desireeおよびトランスジェニック植物AM99-2003に形質転換した。トランスジェニック植物AM99-2003は実施例3に記載するとおりに作製された。
【００３４】
PrevalentおよびProducentは約20％のデンプン含量を持つデンプン品種である。Desireeは約16％のデンプン含量を持つジャガイモ品種であり、AM99-2003は約13％のデンプンすなわちアミロース含量を持つトランスジェニック高アミロース系統である。
【００３５】
推定遺伝子はSolanum tuberosum（Prevalent品種）の塊茎特異的cDNAライブラリーから単離された。このライブラリーはlambdaZAP directional kit (Stratagene)から作製された。
【００３６】
単離された両cDNAは、個別の遺伝子の完全長クローンであり、StGH1およびStGH2と命名された（核酸配列については配列番号1および配列番号3を参照のこと）。
【００３７】
pHS1
StGH1遺伝子由来の1300bp PCR断片を、gbssプロモーターにより駆動されるアンチセンス方向に構築した。PCR断片をそのクローニングベクターpCR4-TOPO（Invitrogen）からEcoRI（平滑化）およびXbaIによって切り出した。その断片を、バイナリーベクターpHo3.1に基づくpGPTV-kan（Becker, D.ら、Plant Molecular Biology 20:1195-1197(1992)）のgbssプロモーター（WO 92/11376）とnosターミネーターの間に、SalI（平滑化）およびXbaI部位でライゲーションした。バイナリーベクターはまた、nosプロモーターにより駆動される選択マーカーとしてnptIIを含む（Herrera, L.ら、1983）。構築物はpHS1と命名された（詳細は図３aおよび図４を参照のこと）。
【００３８】
pHS2
StGH2の2300bp完全長cDNAクローンを、クローニングベクターpBluescript（Statagene）からXbaIおよびXhoIによって切り出した。その遺伝子を、アンチセンス方向にバイナリーベクターpHo3.1のgbssプロモーターとnosターミネーターの間にXbaIおよびSalIでライゲーションした。pHS1において見られるように、ベクターは選択システムとしてnptIIを有する。ベクターはpHS2と命名された（詳細は図３bおよび図５を参照のこと）。
【００３９】
pHS3
完全長StGH1 cDNA（1780bp）を、宿主ベクターpBluescriptからEcoRI（平滑化）およびBglIIによって切り出し、gbssプロモーターおよびnosターミネーターを有するpUC19を含むpUCgbssprom（3886bp）のBamHIおよびSmaI部位にライゲーションした。そのプラスミドはpUCGH1と命名された。
【００４０】
gbssプロモーター、StGH1遺伝子およびnosターミネーターを含む断片を、EcoRI（平滑化）およびHindIII（2980bp）によってpUCGH1から除去し、PstI（平滑化）およびHindIIIで開環化されたpSUN1（WO 02/00900）にライゲーションした。そのプラスミドはpSUNGH1と命名された。
【００４１】
nosプロモーター（Herrera-Estrella, L.ら、Nature 303:209-213(1983)を参照）およびOCSターミネーター（Wesley, S.V.ら、Plant J. 27(6):581-590(2001)）とともにArabidopsis thaliana由来のAHAS耐性遺伝子（Sathasivan, K.ら、Plant Physiology 97(1991), 1044-1050）を含む3600bp断片を、SmaI部位でpSUNGH1（9000bp）にライゲーションした。ベクターはpHS3と命名された（詳細は図３cおよび図６を参照のこと）。
【００４２】
pHS4
gbssプロモーターおよびnosターミネーターをEcoRIおよびHindIIIによってpBR322にライゲーションした。プロモーターとターミネーターの間に、EcoRI-HincII完全長遺伝子pStGH2をXbaI部位でクローニングした。3366bpのプロモーター-遺伝子-ターミネーター合成物を、EcoRI（部分消化）およびEcoRVを用いて切り出し、pSUN1にEcoRI-EcoRV でライゲーションし、pSUNGH2と命名した。AHAS遺伝子（Arabidopsis thaliana）、nos プロモーターおよびOCSターミネーターを含むXbaI断片を、XbaI（部分消化）を用いて開環化したpSUNGH2にライゲーションした。AHAS遺伝子は選択マーカーとして用いられる。構築物はpHS4と命名された（詳細は図３dおよび図７を参照のこと）。
【００４３】
実施例２は、天然のデンプンもしくは高アミロース型デンプンを産生する異なるジャガイモ植物品種の、pHS1、pHS2、pHS3またはpHS4による形質転換のための一般的な方法を記載する。
【００４４】
StGH1およびStGH2遺伝子は、実施例４および６に記載されるように、ジャガイモ植物品種PrevalentおよびProducentにおいて、植物調節エレメントに関してアンチセンス方向の遺伝子による形質転換によってダウンレギュレートされた。２つの遺伝子のダウンレギュレーションは、それらの親品種と比較して、トランスジェニック系統において該遺伝子の発現を50〜95％程度減少させた（実施例７および表３を参照のこと）。遺伝子発現の減少が確認された、pHS1およびpHS2によって形質転換されたトランスジェニック系統は、それらの親品種と比較して7〜11％の乾燥物の減少を示す（実施例８および表５を参照のこと）。
【００４５】
塊茎特異的プロモーターgbssによって駆動されるStGH1およびStGH2遺伝子は、実施例５に記載されるように、ジャガイモにおいて過剰発現された。突然変異AHAS遺伝子は、イマザモックス除草剤に耐性をもたらす選択マーカーとして使用された。その親系統と比較してデンプン含量の40％減少を示すトランスジェニック高アミロース系統であるDesireeおよびAM99-2003の、２つのジャガイモ品種が形質転換された。StGH1およびStGH2を過剰発現するトランスジェニック系統を、実施例６に記載されるように選択した。遺伝子発現レベルはリアルタイムPCRによって解析された（実施例７および表３を参照のこと）。遺伝子StGH1およびStGH2の過剰発現は、それらの親系統と比較して2〜10倍の遺伝子発現の増加を引き起こした。更にStGH1およびStGH2を過剰発現している系統は、実施例８および表５に記載されるように、36％までの乾燥物の増加を示した。
【００４６】
アミロース型デンプンを産生するトランスジェニックジャガイモ植物でのStGH1およびStGH2の過剰発現は、乾燥物含量の増加を引き起こし、これは、アミロペクチンが産生されないのでアミロース含量の増加を意味する（実施例８〜１２を参照のこと）。
【００４７】
RNA干渉（RNAi）は細胞内への二本鎖RNA（dsRNA）の導入によって機能し、相同RNAの分解を引き起こす。dsRNAは、Dicer と呼ばれるリボヌクレアーゼによって21〜25ヌクレオチドの低分子干渉RNA（siRNA）に切断される。siRNAはタンパク質複合体と結合し、RNA誘導性サイレンシング複合体RISCを形成する。RISCは、ATP によって生じるsiRNAの巻き戻しにより活性化され、それは相同転写産物に結合し、mRNAを切断して、遺伝子サイレンシングを引き起こす（Mc Manus MTおよびSharp PA., Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Rev Genet 3:737-747(2002); Dillin A., The specifics of small interfering RNA specificity. Proc Natl Acad Sci USA 100(11):6289-6291 (2003); Tuschl T., Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol 20:446-448 (2002)を参照のこと）。
【００４８】
高アミロース系統の作製は、アンチセンス構築物pHAbe12A よりもRNAi構築物pHAS3（図２３）およびpHAS8b（図２０）を用いた場合、より効果的であった。例えばpHAS8bおよびpHAS3を用いた場合に作製される全トランスジェニックシュートのうち高アミロース系統の頻度は、作製される全トランスジェニックシュートの約1％の高アミロース系統の頻度と比較して、25％以上である（実施例１５〜１７を参照のこと）。
【００４９】
高アミロースジャガイモ作出のために使用されるRNAi構築物pHAS8b（図２０）およびpHAS3（図２３）（配列番号２４）は、逆方向でタンデムにクローニングされたbe1およびbe2断片（配列番号１９）を含む。その構築物は逆方向反復配列間に位置して使用されるスペーサーのみが異なっており、pHAS8bではbe2プロモーターの断片が使用され（配列番号１８）、一方、pHAS3ではpBluescript由来のクローニング残基が使用された（配列番号２３）。RNAi構築物は分枝酵素遺伝子の効果的なダウンレギュレーションをもたらした。
【００５０】
更に、それぞれbe1およびbe2遺伝子の断片は、より短くてもまたはより長くてもよく、分枝酵素遺伝子の他の部分を標的としてもよい。be1およびbe2のRNAiのためのより短い断片は、配列番号２１および２２に記載される。
【００５１】
本発明のデンプン生合成促進タンパク質は、配列番号２もしくは４のアミノ酸配列を含み、または配列番号２もしくは４から誘導された配列を含むタンパク質であって、配列番号２もしくは４の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、更に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％同一であり、かつデンプン生合成促進タンパク質の特性を有するタンパク質を含む。このデンプン生合成促進タンパク質はまた、例えばアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失による、配列番号２または４からの人為的変異によっても作製されうる。
【００５２】
このようなタンパク質は、非トランスジェニック植物もしくはトランスジェニック植物においてアミロースまたはアミロペクチンの産生を増加するために使用され得る。
【００５３】
本明細書において「置換」という用語は、１個以上のアミノ酸を１個以上のアミノ酸によって置き換えることを意味する。例えばGluのAspによる置換、GlnのAsnによる置換、ValのIleによる置換、LeuのIleによる置換、SerのThrによる置換のように、置換されるアミノ酸がもとのアミノ酸と類似した特性を有する「保存的」置換の実施が好まれる。
【００５４】
「欠失」は、１個のアミノ酸または複数個のアミノ酸を直接結合によって置き換えることである。欠失のための好ましい位置は、ポリペプチド末端および個々のタンパク質ドメイン間の連結部である。
【００５５】
「挿入」は、直接結合が形式上は１個以上のアミノ酸によって置き換えられる、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の挿入である。
【００５６】
２つのタンパク質間の「同一性」は、それぞれの場合においてタンパク質の完全長にわたるアミノ酸の同一性を意味し、特に、Clustal W 法（Thompson, JDら、Nucleic Acid Research, 22 (22):4673-4680, 1994）を用いた、Informax社（USA）のVector NTI Suite 7.1ソフトウェアを用いた、以下のパラメーターセットによる比較によって計算された同一性を意味する。すなわち、マルチプルアラインメントのパラメーターは以下のとおりである：
Gap opening penalty                  15
Gap extension penalty                6.66
Gap separation penalty range         8
Gap separation penalty               on 
% identity for alignment delay       40
Residue specific gaps                on
Hydrophilic residue gap              off
Transition weighing                  0
【００５７】
ペアワイズアラインメントのパラメーターは以下のとおりである：
FAST algorithm                        off 
K-tuple size                          2 
Gap penalty                           5 
Window size                           4 
Number of best diagonals              4 
【００５８】
従って、配列番号２または４の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％同一であるタンパク質とは、その配列を配列番号２または４の配列と比較した際、特に上記のプログラムアルゴリズムに従って上記のパラメーターセットを用いて、少なくとも50％同一であるタンパク質を意味する。
【００５９】
本発明のデンプン生合成促進タンパク質をコードする遺伝子の更なる天然の例は、例えば、ゲノム配列が知られている様々な生物（特に植物）において、特に上記のプログラムアルゴリズムに従って上記のパラメーターセットを用いて、データベースからのアミノ酸配列または対応する逆翻訳核酸配列と配列番号２もしくは４の配列との同一性を比較することによって、容易に見出すことができる。
【００６０】
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の完全なゲノム配列では、５つの推定コード配列が、エクソン/イントロン境界の検索および配列番号２または４の逆翻訳配列との比較によって推定され得る。
【００６１】
Arabidopsis thalianaの次の核酸配列、すなわち配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１および配列番号１３は本発明の実施の際に使用できる可能性があり、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２および配列番号１４のデンプン生合成促進タンパク質をコードしている。
【００６２】
更に、次の核酸配列またはESTs、すなわち、GenBank由来のトマトESTs: AW216407、BE450055、BF097262、BE450557、BF097173、GenBank由来のコムギESTs: BJ292476、BJ278875、BJ283925、BE442966、CA666180、BQ483228、GenBank由来のトウモロコシEST: BG319971、GenBank由来のイネESTs: AL606633、CA752890、BI813265は、デンプン生合成促進タンパク質をコードする遺伝子を植物から同定およびクローニングするために使用され得る。
【００６３】
デンプン生合成促進タンパク質および対応する遺伝子の天然の例は更に、そのゲノム配列が知られていない様々な生物（特に植物）において、例えば配列番号１もしくは配列番号３の核酸配列、または配列番号５、７、９、１１もしくは１３のいずれか、または上述のEST配列のいずれかから、それ自体公知の方法でのハイブリダイゼーション法によって、容易に見出すことができる。
【００６４】
ハイブリダイゼーションは、穏やかな（低ストリンジェンシー）条件下または、好ましくは、厳格な（高ストリンジェンシー）条件下で実施されうる。
【００６５】
このようなハイブリダイゼーション条件は、特に、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.によるMolecular Cloning (A Laboratory Manual), 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57ページに、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００６６】
一例として、洗浄ステップの間の条件は、（2X SSC、50℃による）低ストリンジェンシーを用いた条件、および（0.2X SSC、50℃、好ましくは65℃による）高ストリンジェンシーを用いた条件によって制限される条件の範囲から選択されうる（20X SSC: 0.3 M クエン酸ナトリウム、3 M 塩化ナトリウム、pH 7.0）。
【００６７】
更に、洗浄ステップにおいては、室温22℃での穏やかな条件から65℃での厳格な条件へと温度を上昇させることができる。
【００６８】
塩濃度と温度の両方のパラメーターは同時に変化させてもよく、２つのパラメーターのうち１つを一定に保ち、他方のみを変化させることも可能である。ハイブリダイゼーションの際に、例えば、ホルムアミドまたはSDSのような変性剤を使用することも可能である。50％ホルムアミドの存在下では、ハイブリダイゼーションを42℃で行うことが好ましい。
【００６９】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップのいくつかの典型的な条件は、下記に記載される。すなわち、
（1）ハイブリダイゼーション条件には、例えば、
（i）4X SSCで65℃、または
（ii）6X SSCで45℃、または
（iii）6X SSCで68℃、100 mg/mlの変性魚類精子DNA、または
（iV）6X SSC、0.5％SDS、100 mg/mlの変性断片化サケ精子DNAで68℃、または
（v）6X SSC、0.5％SDS、100 mg/mlの変性断片化サケ精子DNA、50％ホルムアミドで42℃、または
（vi）50％ホルムアミド、4X SSCで42℃、または
（vii）50％（vol/vol）ホルムアミド、0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、50 mMリン酸ナトリウムバッファーpH 6.5、750 mM NaCl、75 mMクエン酸ナトリウムで42℃、または
（viii）2Xまたは4X SSCで50℃（穏やかな条件）、または
（ix）30〜40％ホルムアミド、2Xまたは4X SSCで42℃（穏やかな条件）を用いる。
【００７０】
（2）10分毎の洗浄ステップには、例えば、
（i）0.015 M NaCl/0.0015 Mクエン酸ナトリウム/0.1％SDSで50℃、または
（ii）0.1X SSCで65℃、または
（iii）0.1X SSC、0.5% SDSで68℃、または
（iv）0.1X SSC、0.5% SDS、50％ホルムアミドで42℃、または
（v）0.2X SSC、0.1% SDSで42℃、または
（vi）2X SSCで65℃（穏やかな条件）を用いる。
【００７１】
デンプン生合成促進活性を有する好ましいタンパク質は、植物、シアノバクテリア、コケ類、藻類由来のタンパク質であり、特に好ましくは植物由来である。特に好ましいタンパク質は配列番号２または４のアミノ酸配列を有する。
【００７２】
例えば、そのタンパク質を植物において発現させようとする場合には、前記植物のコドン使用頻度に従って、その遺伝子の逆翻訳および再合成のために前記植物のコドン使用頻度を用いることは、しばしば有利である。
【００７３】
本発明は更に、本発明のデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸に関する。本明細書に記載されるすべての核酸は、例えば、RNA配列、DNA配列またはcDNA配列でありうる。
【００７４】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝子コードに従ったポリペプチド配列の逆翻訳によって得ることができる。その場合、生物特異的なコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるそれらのコドンを使用することが好ましい。コドン使用頻度は、対象の生物の他の既知の遺伝子のコンピューター解析に基づいて容易に決定することができる。
【００７５】
デンプン生合成促進タンパク質をコードするすべての上述の遺伝子は更に、それ自体公知の方法でヌクレオチド構成単位から化学合成によって、例えば、二重らせんの個々の重複する相補的核酸構成単位の断片縮合によって作製され得る。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホルアミダイト法に従った公知の方法で実施されうる（Voet, Voet, 第２版, Wiley Press New York, 896-897ページ）。合成オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびDNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いたギャップの埋め込みおよびライゲーション反応、ならびに一般的なクローニング方法は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される。
【００７６】
この機能をコードする遺伝子は、植物染色体に組み込んで、発現の際に、デンプン/アミロース生合成が起こる細胞内小器官である色素体に局在化させるために輸送ペプチドを利用することができ、または、直接色素体ゲノムに組み込んで、それによって局在化シグナルの必要性を克服してもよい。遺伝子は構成的にまたは器官特異的に発現しうる。貯蔵デンプンが蓄積される器官において高度の発現を達成するため、器官特異的な発現のために、ジャガイモでは塊茎特異的発現のプロモーターが好ましく、一方トウモロコシまたはコムギのような穀物では胚乳特異的発現が好ましい。色素体ゲノムに形質転換する場合、その細胞内小器官に適した特異的調節エレメントが利用される。
【００７７】
本発明の遺伝子は、同一の遺伝子構築物上に配置することができるか、または同時形質転換もしくは超迅速形質転換（super transformation）によって導入して組み合わすことのできる他の遺伝子とともに使用されうる。本発明の遺伝子と組み合わせることが興味深い遺伝子および形質は、除草剤耐性、疾患および害虫耐性もしくはストレス耐性などの農業的つまりインプット形質であるが、デンプン構造の改変または収率などのアウトプット形質であってもよい。本発明に記載される遺伝子とともに使用される遺伝子および形質は、改変された植物種に存在しない機能を付加するため、または既に存在する機能を過剰発現させるため、またはアンチセンス、RNAiもしくは抗体の使用によって機能を阻害するためであり得る。
【００７８】
本発明は、ジャガイモ塊茎においてデンプンまたはアミロースを増加させるために使用できるが、ジャガイモに限定されず、例えばトウモロコシ、キャッサバ、コムギ、オオムギ、オートムギおよびイネなどの他のデンプンを産生し貯蔵する植物に応用できるであろう。
【００７９】
記載する発明は、α-1,4グルカン鎖の非還元末端の数がα-1,6分岐の形成の減少または除去のために著しく減少する種々の植物において、アミロース含量の増加に伴うデンプン含量の低下を解消するのに特に適している。アミロペクチンは、グリコーゲンと同様に、多糖の産生にとって非常に効率のよい構造をしている。なぜなら、それは非常に分岐しており、従ってデンプン合成のために利用可能な多くの点としての非還元末端があるからである。主にアミロースから成るデンプンは分岐をほとんど含まないので、生合成能が低下している。アミロペクチンの産生がない場合にデンプン生合成を促進するために、本発明に記載されるような遺伝子の発現は、例えばデンプン生合成能の源としてアミロペクチンに代わることによって、デンプン合成能の喪失を軽減または排除できる新たなプライマーを形成することができる。この状況を更に説明すると、通常のジャガイモデンプンにおける分岐の程度は約3.1％であるが、高アミロースデンプンでは、アミロース含量に応じて0.3〜1.0％である。この分岐およびデンプン含量の減少は、更にグルコースおよびフルクトース含量の増加と関連している。
【００８０】
アミロース含量の増加およびそれによる固形物含量の増加はまた、フライドポテト、ポテトチップスおよび他のジャガイモ製品などの様々な用途における加工特性にとって都合が良い。固形物含量の増加に加えて、本発明の配列番号１または３の挿入遺伝子は、結果として過剰な糖をα-1,4グルカン鎖へと変換させ、それによってフライドポテト製品の褐変、メイラード反応（アミノ酸が遊離の糖と反応する）を低下させる。
【００８１】
更に、
（i）記載した活性を有する植物由来の遺伝子はどれも、アミロース含量および固形物の増加のために使用することができる；
（ii）当該遺伝子は、植物において機能的な任意の調節プロモーターエレメントによって制御することができる；
（iii）あらゆる品種のデンプン産生作物を、記載した遺伝子で形質転換することができる；
（iv）あらゆる植物形質転換方法が使用可能である；
（v）記載した遺伝子の挿入のために、バイナリーベクターを使用することができる；
（vi）記載した遺伝子は、他の任意の望ましいトランスジェニック挿入形質と組み合わせることができる。
【００８２】
本発明は更に、野生型または既にアミロース型デンプンを産生している遺伝的改変植物と比較して、増加したアミロース生合成活性を有する植物を栽培することによる、アミロースの産生方法に関する。ここで前記タンパク質は、配列番号２または４のアミノ酸配列、あるいはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこれらの配列の１つから誘導され、かつ配列番号２または４の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％同一である配列を含んでなる。
【００８３】
野生型またはトランスジェニック系統と比較して増加したアミロース生合成活性とは、形成されるアミロースの量が、野生型またはトランスジェニック系統と比較して、デンプン生合成促進タンパク質によって増加することを意味する。
【００８４】
このデンプンまたはアミロース生合成活性における増加は、野生型またはトランスジェニック系統のタンパク質活性の、好ましくは少なくとも5％、更に好ましくは少なくとも10％、更に好ましくは少なくとも20％、更に好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも100％、いっそう好ましくは少なくとも200％、特に少なくとも500％である。
【００８５】
「野生型」とは、遺伝的に改変されていない対応する出発植物を意味する。この植物は好ましくはジャガイモ（Solanum tuberosum）である。
【００８６】
状況に応じて、「植物」という用語は、野生型の出発植物または遺伝的に改変された出発植物を意味する。
【００８７】
「トランスジェニック植物」あるいは「遺伝的改変植物」は、植物が、植物種にとって外来または内在性でありうる付加的な挿入遺伝子断片を含むことを意味し、適切なプロモーターに対してセンスおよび/またはアンチセンス方向の付加的な遺伝子または付加的な遺伝子断片は、以下のポリペプチドに対応し、かつ以下の酵素活性を示す：デンプン分枝酵素I、デンプン分枝酵素IIおよび/または配列番号１もしくは３に規定される、またはその少なくとも60％配列同一性を有するポリヌクレオチドにより規定されるデンプン生合成促進タンパク質。
【００８８】
「アミロース型デンプン」とは、デンプンのアミロース含量が野生型植物、特に野生型ジャガイモ植物によって産生されるデンプンのアミロース含量と比較して増加していることを意味する。
【００８９】
デンプンまたはアミロース生合成活性は、様々な方法で増加させることができ、例えば、翻訳およびタンパク質レベルで阻害制御機構を排除することによって、または野生型もしくはトランスジェニック植物と比較してデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって、例えば、アクチベーターを介してデンプン生合成促進タンパク質をコードする遺伝子を誘導することにより、または植物にデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸を導入することにより、行うことができる。
【００９０】
本発明に従って、デンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることはまた、植物、特にジャガイモ植物に内在する内因性デンプン生合成促進タンパク質の発現を操作することも意味しうる。これは、例えば、デンプン生合成促進タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターDNA配列を改変することによって達成されうる。デンプン生合成促進タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の発現率の改変または好ましくは増加を引き起こすこのような改変は、DNA配列を欠失または挿入することによって行われうる。
【００９１】
外因性刺激を適用することによって、１つ以上の内在性デンプン生合成促進タンパク質の発現を改変することもまた可能である。これは、特定の生理的状態によって、すなわち、外来物質を適用することによって行われうる。
【００９２】
更に、デンプン生合成促進タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の発現の改変または増加は、改変した調節タンパク質もしくは非形質転換植物には存在しない調節タンパク質の相互作用によって達成することが可能である。
【００９３】
好ましい実施形態では、デンプン生合成促進タンパク質活性は、デンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって、野生型またはトランスジェニック植物と比較して増加し、前記デンプン生合成促進タンパク質は、配列番号２または４のアミノ酸配列、あるいはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によって前記配列から誘導され、かつ配列番号２または４の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％同一である配列を含んでなる。
【００９４】
イントロンを含む、真核生物由来のデンプン生合成促進タンパク質をコードするゲノム核酸配列の場合には、もし宿主生物が対応するデンプン生合成促進タンパク質を発現できないかまたは発現可能にできないならば、好ましくは対応するcDNAのように既にプロセッシングされた核酸配列が使用されるべきである。
【００９５】
この好ましい実施形態では、従って、本発明のトランスジェニック植物は、野生型またはトランスジェニック植物と比較して、デンプン生合成促進タンパク質をコードする少なくとも１つの更なる遺伝子を含む。この好ましい実施形態では、本発明の遺伝的改変植物は結果的に、デンプン生合成促進タンパク質をコードする少なくとも１つの内因性または外因性のトランスジェニック核酸を有する。
【００９６】
適切な好ましい核酸は上記のとおりである。特に好ましい実施形態では、配列番号１または３の配列を含む核酸が植物に導入される。
【００９７】
本発明によると、生物は、野生型として、または遺伝的改変によって、デンプンまたはアミロースを産生する能力がある、好ましくは真核生物、例えば、酵母、藻類、コケ類、菌類または植物などを意味する。好ましい生物は、例えば、野生型でもデンプンまたはアミロース型デンプンを産生することができる植物のような、光合成活性を持つ生物である。
【００９８】
特に好ましい生物はジャガイモ植物である。
【００９９】
本発明は更に、配列番号２または４のアミノ酸配列、あるいはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導された、配列番号２または４の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％同一であり、かつデンプン生合成促進活性を有する配列を含むタンパク質の使用に関する。
【０１００】
本発明は更に、配列番号１もしくは３の核酸、または植物においてデンプン生合成促進活性を有するタンパク質をコードする配列番号５、７、９、１１もしくは１３の配列のうちの１つの使用に関する。
【０１０１】
トランスジェニック生物、特にトランスジェニック植物は、好ましくは、出発生物、特に植物を、前記生物での転写および翻訳を保証する１つ以上の調節シグナルに機能的に連結されたデンプン生合成促進タンパク質をコードする上述の核酸を含む核酸構築物を用いて形質転換することによって作出される。
【０１０２】
コードする核酸配列が生物、特に植物での転写および翻訳を保証する１つ以上の調節シグナルに機能的に連結されているこれらの核酸構築物はまた、本明細書の下記において発現カセットと呼ばれる。
【０１０３】
従って、本発明は更に、核酸構築物、特に、発現カセットとして機能する核酸構築物に関し、それらは生物、特に植物での転写および翻訳を保証する１つ以上の調節シグナルに機能的に連結されているデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸を含む。
【０１０４】
調節シグナルは、好ましくは生物、特に植物での転写および翻訳を保証する１つ以上のプロモーターを含む。
【０１０５】
発現カセットは、調節シグナル、すなわち、宿主細胞においてコード配列の発現を制御する調節核酸配列を含む。好ましい実施形態によれば、発現カセットは上流、すなわち、コード配列の5'末端にプロモーターを、下流、すなわち、3'末端にポリアデニル化シグナルを含み、適切な場合には、間に配置される少なくとも１つの上述遺伝子のコード配列に機能的に連結される更なる調節エレメントを含む。機能的に連結とは、プロモーター、コード配列、ターミネーター、および適宜に、更なる調節エレメントの、それぞれの調節エレメントがコード配列の発現において適切にその機能を果たすような、連続的配置を意味する。
【０１０６】
用いる生物が植物である場合、本発明の核酸構築物および発現カセットは好ましくは色素体への局在化を保証する色素体輸送ペプチドをコードする核酸を含む。
【０１０７】
植物のための好ましい核酸構築物、発現カセットおよびベクター、ならびにトランスジェニック植物を作製する方法、ならびにまたトランスジェニック植物自体も、下記の実施例２から６に記載される。
【０１０８】
機能的な連結にとって好適な配列は、限定するものではないが、アミロプラストまたは葉緑体のような色素体への細胞内局在化を保証するターゲティング配列であるが、また、アポプラスト、液胞、ミトコンドリア、小胞体（ER）、核内、エライオプラストまたは他の区画内へのターゲティング配列も意味し、タバコモザイクウイルス5'-リーダー配列（Gallieら、Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711）などの翻訳エンハンサーも意味しうる。
【０１０９】
発現カセットの適切なプロモーターは、原則的に植物において外来遺伝子の発現を制御できる任意のプロモーターである。
【０１１０】
「構成的」プロモーターは、多くの、好ましくはすべての組織において、植物発達の比較的長期間、好ましくは植物発達全体に渡って発現を保証するプロモーターを意味する。
【０１１１】
特に、植物由来のプロモーターまたは植物ウイルスに由来するプロモーターを使用することが好ましい。特に、CaMV カリフラワーモザイクウイルスの35S転写産物のプロモーター（Franckら(1980) Cell 21:285-294; Odellら(1985) Nature 313:810-812; Shewmakerら(1985) Virology 140:281-288; Gardnerら(1986) Plant Mol Biol 6:221-228）または19S CaMVプロモーター（US 5,352,605; WO 84/02913; Benfeyら(1989) EMBO J 8:2195-2202）が好ましい。
【０１１２】
別の適切な構成的プロモーターは、ルビスコ小サブユニット（SSU）プロモーター（US 4,962,028）、レグミンBプロモーター（GenBank Acc. No. X03677）、アグロバクテリウムノパリン合成酵素プロモーター、TRダブルプロモーター、アグロバクテリウム OCS（オクトピン合成酵素）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorf Sら(1995) Plant Mol Biol 29:637-649）、ユビキチン1プロモーター（Christensenら(1992) Plant Mol Biol 18:675-689; Bruceら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696）、Smasプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（US 5,683,439）、液胞ATPアーゼサブユニットのプロモーターまたは高プロリンコムギタンパク質のプロモーター（WO 91/13991）、Pnitプロモーター（Y07648.L, Hillebrandら(1998), Plant. Mol. Biol. 36, 89-99, Hillebrandら(1996), Gene, 170, 197-200）および、植物での構成的発現が当業者に知られている遺伝子の他のプロモーターである。
【０１１３】
発現カセットはまた、植物において特定の時期にデンプン生合成促進タンパク質遺伝子の発現を制御するために使用しうる、化学的誘導性プロモーター（総説: Gatzら(1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108）を含みうる。例えば、PRP1プロモーター（Wardら(1993) Plant Mol Biol 22:361-366）、サリチル酸誘導性プロモーター（WO 95/19443）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（EP 0 388 186）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら(1992) Plant J 2:397-404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（EP 0 335 528）およびエタノールまたはシクロヘキサノン誘導性プロモーター（WO 93/21334）などの、この種のプロモーターは同様に使用されうる。
【０１１４】
適切なプロモーターの更なる例は、例えば、トマト由来の果実熟成特異的プロモーター（WO 94/21794, EP 409 625）のような果実熟成特異的プロモーターである。個々の組織は本来、発達特異的に形成されるので、発達依存的プロモーターは一部に組織特異的プロモーターを含む。
【０１１５】
更に、例えば、デンプンもしくはアミロースまたはその前駆体の生合成が起こる植物の組織あるいは部位における発現を保証するプロモーターは、特に好ましい。例えば、葉、茎、根、種子および塊茎に対して特異性を有するプロモーターが好ましい。
【０１１６】
種子特異的プロモーターは、例えば、ファゼオリンプロモーター（US 5,504,200; Bustos MMら(1989) Plant Cell 1(9):839-53）、2Sアルブミン遺伝子のプロモーター（Joseffson LGら(1987) J Biol Chem 262:12196-12201）、レグミンプロモーター（Shirsat Aら(1989) Mol Gen Genet 215(2): 326-331）、USP（未知種子タンパク質）プロモーター（Baumlein Hら(1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67）、ナピン遺伝子のプロモーター（US 5,608,152; Stalberg Kら(1996) L Planta 199:515-519）、スクロース結合タンパク質プロモーター（WO 00/26388）およびレグミンB4プロモーター（LeB4; Baumlein Hら(1991) Mol Gen Genet 225: 121-128; Baeumleinら(1992) Plant Journal 2(2):233-9; Fiedler Uら(1995) Biotechnology (NY) 13(10):1090f）、Arabidopsisオレオシンプロモーター（WO 98/45461）、Brassica Bce4プロモーター（WO 91/13980）およびビシリンプロモーター（Weschkeら1988, Biochem. Physiol. Pflanzen 183, 233-242; Baumlein Hら(1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67）である。
【０１１７】
更なる適切な種子特異的プロモーターは、高分子量グルテニン（HMWG）、グリアジン、分枝酵素、ADPグルコースピロホスファターゼ（AGPase）およびデンプン合成酵素をコードする遺伝子のプロモーターである。例えばトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネ等のような単子葉植物において種子特異的発現を可能にするプロモーターは更に好ましい。lpt2もしくはlpt1遺伝子のプロモーター（WO 95/15389, WO 95/23230）またはWO 99/16890に記載されるプロモーター（ホルデイン遺伝子、グルテリン遺伝子、オリジン(oryzin)遺伝子、プロラミン遺伝子、グリアジン遺伝子、グルテリン遺伝子、ゼイン遺伝子、カシリン(kasirin)遺伝子およびセカリン遺伝子のプロモーター）を有利に用いることも可能である。
【０１１８】
塊茎、貯蔵根または根特異的プロモーターの例は、パタチンプロモータークラスI（B33）、ジャガイモカテプシンDインヒビタープロモーターおよびEP-A 0 921 191に記載されるようなジャガイモ顆粒結合性デンプン合成酵素（GBSS）プロモーターである。
【０１１９】
葉特異的プロモーターの例は、ジャガイモ由来の細胞質FBPアーゼプロモーター（WO 97/05900）、ルビスコ（リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ）SSU（小サブユニット）プロモーターおよびジャガイモST-LSIプロモーター（Stockhausら(1989) EMBO J 8:2445-2451）である。
【０１２０】
植物での発現に適した更なるプロモーターが記載されている（Rogersら(1987) Meth in Enzymol 153:253-277; Schardlら(1987) Gene 61:1-11; Bergerら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406）。
【０１２１】
ジャガイモ植物でのデンプンおよびアミロース生合成の部位はアミロプラストである。従って、デンプン生合成促進タンパク質をコードする本発明の配列番号１または３の核酸の遺伝子産物のアミロプラスト特異的なターゲティングおよび活性が望ましい。
【０１２２】
発現はまた、組織特異的に植物のすべての部分で起こりうる。
【０１２３】
更なる好ましい実施形態は、従って、配列番号１または３の核酸の塊茎特異的発現に関する。
【０１２４】
加えて、デンプン生合成促進タンパク質をコードする遺伝子の構成的発現が有利である。しかし、一方で、この遺伝子の誘導性発現もまた望ましい。
【０１２５】
発現カセットは好ましくは、例えば、T. Maniatis, E.F. FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ならびにT.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)ならびにAusubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)に記載されるような、よく知られている組み換えおよびクローニング技術に従って、適切なプロモーターを、デンプン生合成促進タンパク質をコードする上述の核酸に、ならびに好ましくは、プロモーターおよび核酸配列の間に挿入されたアミロプラスト特異的輸送ペプチドをコードする核酸に、ならびにまたポリアデニル化シグナルに融合することによって作製される。
【０１２６】
アミロプラストへのターゲティングを保証する核酸配列の挿入は特に好ましい。
【０１２７】
核酸配列がデンプン生合成促進タンパク質融合タンパク質をコードし、融合タンパク質の一部がポリペプチドの転移を制御する輸送ペプチドである、発現カセットの使用もまた可能である。デンプン生合成促進タンパク質のアミロプラスト内への転移後、デンプン生合成促進タンパク質部分が酵素的に切断されるアミロプラスト特異的輸送ペプチドが好ましい。
【０１２８】
タバコ（Nicotiana tabacum）色素体トランスケトラーゼに由来する輸送ペプチド、または別の輸送ペプチド（例えば、ルビスコ小サブユニットもしくはフェレドキシンNADP酸化還元酵素およびまたイソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ-2の輸送ペプチド）またはその機能的同等物に由来する輸送ペプチドは特に好ましい。
【０１２９】
色素体輸送ペプチドの更なる例は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の色素体イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ-2（IPP-2）の輸送ペプチドおよびエンドウマメ由来のリブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（rbcS）の輸送ペプチドである（Guerineau, F, Woolston, S, Brooks, L, Mullineaux, P (1988) An expression cassette for targeting foreign proteins into the chloroplasts. Nucl. Acids Res. 16: 11380）。
【０１３０】
植物デンプン生合成促進タンパク質をコードする本発明の植物遺伝子は、色素体輸送ペプチドをコードする核酸配列を既に含んでいてもよい。この場合には、更なる輸送ペプチドは必要とされない。例えば、本発明のデンプン生合成促進タンパク質のSolanum tuberosumの配列番号１または３の配列は、既に輸送ペプチド配列を含む。
【０１３１】
本発明の核酸は、合成的に調製されても、または自然界で得られても、または合成核酸および天然核酸成分の混成物で構成されてもよく、また様々な生物の様々な異種遺伝子断片で構成されてもよい。
【０１３２】
上述のように、植物に好まれるコドンを含む合成ヌクレオチド配列が好ましい。植物に好まれるコドンは、タンパク質の中で最も高い頻度を有する、関心のある植物種の大部分で発現するコドンから決定されうる。
【０１３３】
発現カセットを作製する場合、便宜上、正しい方向で読まれ得る、正しい読み枠を備えるヌクレオチド配列を得るために様々なDNA断片を操作することが可能である。DNA断片は、アダプターまたはリンカーを前記断片に付加することによって互いに連結されうる。
【０１３４】
適切な制限切断部位を提供する、または余分なDNAもしくは制限切断部位を除去する操作を使用することもまた可能である。挿入、欠失または、例えば、転位および塩基転換のような置換が適切である場合、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーションが使用され得る。
【０１３５】
好ましいポリアデニル化シグナルは、植物において機能的なポリアデニル化シグナルであり、基本的にAgrobacterium tumefaciens由来のT-DNAポリアデニル化シグナル、特にT-DNA遺伝子3（オクトピン合成酵素）もしくはOCSターミネーター、Ti plasmid pTiACH5の完全な配列（Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846(1984)）または機能的同等物に相当するものによって例示される。
【０１３６】
本発明は更に、野生型でデンプンもしくはアミロースを産生することができる植物、例えばジャガイモ植物においてデンプンもしくはアミロースを増加させるための、配列番号１または３の核酸の使用に関する（実施例２〜１３を参照のこと）。
【０１３７】
本発明は、植物、特にジャガイモ植物における配列番号１または配列番号３の核酸配列の過剰発現に限定されない。
【０１３８】
植物における配列番号１および３の両核酸配列の過剰発現は、アミロース生合成の促進のために使用される（実施例１４〜１６を参照のこと）。配列番号１および配列番号３の核酸を含む構築物はまた、植物においてデンプン含量またはアミロペクチン含量を増加させるためにも使用される。これらの構築物は、それぞれ１つのプロモーターによって駆動される同一のT-DNA上に作製することができる。これらの構築物はまた、タンデムに同一のプロモーターによって駆動される同一のT-DNA上にも作製することができる。これらの構築物はまた、同時に（同時形質転換）または異なる形質転換事象において、２つ以上の構築物を用いて形質転換され得る。
【０１３９】
上述のタンパク質および核酸は、トランスジェニック植物においてデンプンまたはアミロースを産生するために使用されうる。
【０１４０】
生物、特に植物のゲノム内への外来遺伝子の導入は、形質転換と呼ばれる。
【０１４１】
この目的で、植物を形質転換するための、および植物組織または植物細胞から植物を再生するためのそれ自体公知の方法は、特に植物において一過性の形質転換もしくは安定な形質転換のために、例えば実施例２に記載されるように使用される。
【０１４２】
植物の形質転換のための適切な方法は、ポリエチレングリコール誘導性のDNA取り込みによるプロトプラスト形質転換、粒子射撃法としても知られている遺伝子銃を用いたパーティクルガン法、エレクトロポレーション、DNAを含む溶液中での乾燥した胚の培養、マイクロインジェクションおよび上述のアグロバクテリウムを介した遺伝子導入である。前記方法は、例えば、S.D. KungおよびR. Wuによって編集されたTransgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Academic Press (1993), 128-143 におけるB. Jenesら、Techniques for Gene Transfer、ならびにPotrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225に記載される。
【０１４３】
発現されるべき構築物は、好ましくは、例えばpBin19（Bevanら、Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711）または好ましくはpSUN2（WO 02/00900）のような、Agrobacterium tumefaciensの形質転換に適したベクターにクローニングされる。
【０１４４】
従って、本発明は更に、上述の核酸、核酸構築物または発現カセットを含むベクターに関する。
【０１４５】
発現カセットによって形質転換されたアグロバクテリウムは、植物の形質転換のための公知の方法において、例えばアグロバクテリウム溶液に傷つけられた葉または葉の切片を浸し、その後それらを適切な培地で培養することによって使用され得る。
【０１４６】
植物のほかに、発現カセットはまた、細菌、特にシアノバクテリア、コケ類、酵母、糸状菌類および藻類の形質転換のために使用され得る。
【０１４７】
本明細書の下記においてトランスジェニック植物とも呼ばれる遺伝的改変植物は、好ましくは、デンプン生合成促進タンパク質を発現する融合発現カセットを、Agrobacterium tumefaciensの形質転換に適切なベクター、例えばpBin19内にクローニングすることによって作製される。
【０１４８】
このようなベクターにより形質転換されたアグロバクテリウムは、その後、植物、特に作物の形質転換のための公知の方法において、例えば、アグロバクテリウム溶液に傷つけられた葉または葉の切片を浸し、その後それらを適切な培地で培養することによって使用されうる。
【０１４９】
アグロバクテリウムによる植物の形質転換は、特に、F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, S.D. KungおよびR. Wu編, Academic Press, 1993, 15-38ページに記述される。発現カセットに組み込まれたデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の発現のための遺伝子を含むトランスジェニック植物は、傷つけられた葉または葉の切片の形質転換細胞から公知の方法で再生することができる。
【０１５０】
宿主植物は、組み換えベクター内に発現カセットを挿入として組み込むことによって、デンプン生合成促進タンパク質をコードする配列番号１または３の核酸で形質転換されるが、そのベクターDNAは付加的な機能的調節シグナル、例えば複製または組み込みのための配列を含む。適切なベクターは、特にMethods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press), 6/7章、71-119ページ (1993)に記述されている。
【０１５１】
一例として、植物発現カセットは35sプロモーターを有する形質転換ベクターpBin-19の誘導体に組み込まれる（Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)）。
【０１５２】
上記の組み換えおよびクローニング技術を用いて、発現カセットを、例えば大腸菌における遺伝物質の維持および増殖に適するベクター中にクローニングすることが可能である。適切なクローニングベクターは、特に、pBR322、pUC系、M13mp系、pBluescriptおよびpACYC184である。大腸菌とアグロバクテリウムの両方において複製できるバイナリーベクターは特に適している。
【０１５３】
従って、本発明は更に、遺伝的改変植物を作製するため、または植物、植物細胞、植物組織もしくは植物の一部を形質転換するための、上述の核酸あるいは上述の核酸構築物、特に発現カセットの使用に関する。
【０１５４】
その使用は好ましくは、植物、塊茎もしくは植物の他の部分のデンプンまたはアミロース含量を増加させることを目的とする。
【０１５５】
その使用は最も好ましくは、野生型もしくはトランスジェニックジャガイモ植物および特に野生型もしくはトランスジェニックジャガイモ植物の塊茎のデンプンまたはアミロース含量を増加させることを目的とする。
【０１５６】
従って、本発明は更に、上述の核酸または上述の核酸構築物を出発生物のゲノムに導入することによって遺伝的改変植物を作出する方法に関する。
【０１５７】
本発明は更に、遺伝的改変生物、野生型またはトランスジェニック植物と比較してデンプン生合成促進タンパク質の活性を増加させる遺伝子改変、および配列番号２または４のアミノ酸配列あるいはアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によってこの配列から誘導された、配列番号２または４の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50％同一である配列を含むデンプン生合成促進タンパク質に関する。
【０１５８】
上述のように、デンプン生合成促進タンパク質の活性は、好ましくはデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって、野生型またはトランスジェニック植物と比べて増加する。
【０１５９】
更に好ましい実施形態では、デンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の遺伝子発現は、上述のように、デンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の生物への導入、従ってデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸の過剰発現によって増加される。
【０１６０】
このようなトランスジェニック植物、それらの繁殖物およびそれらの植物細胞、植物組織、植物部分または塊茎は、本発明の更なる対象である。
【０１６１】
増加したデンプンまたはアミロース含量を有し、ヒトおよび動物に消費され得る本発明の遺伝的改変植物はまた、例えば直接またはそれ自体公知の加工後に、食料もしくは飼料としてまたは食料や飼料のサプリメントとして使用することができる。遺伝的改変植物は更に、前記植物のデンプンもしくはアミロース含有抽出物を製造するため、および/または食料や飼料のサプリメントを製造するために使用される。
【０１６２】
本発明は更に以下に関する。すなわち、
I. 配列番号１または３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
II. 配列番号１または３の少なくとも30個連続した塩基を含むポリヌクレオチド；
III. 配列番号１または３に対して少なくとも60％の配列同一性を有するポリヌクレオチド（ここで、配列同一性％はコード配列全体に基づくものである）；
IV. 配列番号１または３に対して少なくとも60％の配列同一性を有するポリヌクレオチド（ここで、配列同一性％はコード配列全体に基づくものである）；
V. 配列番号１または３に記載されるポリヌクレオチド配列から誘導される、またはゲノム配列から誘導されるハイブリダイゼーションプローブに対して、ストリンジェント条件下および2X SSC、50℃での洗浄により選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド；
VI. Vのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド；
VII. デンプンまたはアミロース生合成促進ポリヌクレオチドがSolanum tuberosumに由来する、Iのポリヌクレオチド；
VIII. 植物細胞での過剰発現後にデンプンまたはアミロース含量を増加させるポリペプチドをコードする、Iのポリヌクレオチド；
IX. 植物細胞での発現後にデンプンまたはアミロース含量を減少させるアンチセンス方向のIのポリヌクレオチド；
X. 少なくとも１つのIのポリヌクレオチドを含むベクター；
XI. プロモーターに機能的に連結された少なくとも１つのIのポリヌクレオチドを含む発現カセット（ここで、該ポリヌクレオチドはセンスまたはアンチセンス方向である）；
XII. 少なくとも１つのXの発現カセットを導入した宿主細胞；
XIII. 植物細胞であるXIの宿主細胞；
XIV. 少なくとも１つのXIの発現カセットを含むトランスジェニック植物；
XV. 植物がSolanum tuberosumである、XIIIのトランスジェニック植物；
XVI. XIVのトランスジェニック植物由来の塊茎；
XVII. 以下から成る群より選択されるメンバーを含む単離されたタンパク質：
a）配列番号２または４の少なくとも10個連続したアミノ酸を含むポリペプチド；
b）植物デンプン生合成促進タンパク質であるポリペプチド；
c）配列番号２または４に対して少なくとも55％の配列同一性を有し、かつデンプン生合成促進タンパク質と共通する少なくとも１つのエピトープを有するポリペプチド（ここで、配列同一性は配列全体に基づくものである）；
d）配列番号１または３より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
e）配列番号２または４のポリペプチド；
XVIII. ポリペプチドが触媒活性を有するXVIIのタンパク質；
XIX. XVIIIのタンパク質をコードするリボ核酸配列；
【０１６３】
XX. 植物でのデンプン生合成促進タンパク質のレベルを調節する方法であって、
a）プロモーターに機能的に連結されたデンプン生合成促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって植物細胞を安定に形質転換すること（ここで、該ポリヌクレオチドはセンスまたはアンチセンス方向である）、
b）該植物細胞を、該ポリヌクレオチドを発現できる再生植物を作出するための植物生育条件下で、該植物でのデンプン生合成促進タンパク質のレベルを調節するのに十分な時間にわたり生育させること、を含む方法；
XXI. デンプン生合成促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドが配列番号１または３より選択される、XXの方法；
XXII. 植物がSolanum tuberosumである、XXの方法；
XXIII. デンプン生合成促進タンパク質の活性が増加する、XXの方法；
XXIV. 植物でのデンプンまたはアミロースのレベルを調節する方法であって、
a）プロモーターに機能的に連結されたデンプン生合成促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって植物細胞を安定に形質転換すること（ここで、該ポリヌクレオチドはセンスまたはアンチセンス方向である）、
b）該植物細胞を、該ポリヌクレオチドを発現できる再生植物を作出するための植物生育条件下で、該植物でのデンプン生合成促進タンパク質のレベルを調節するのに十分な時間にわたり生育させること、を含む方法；
XXV. 植物でのデンプンまたはアミロースのレベルを調節する方法であって、
a）プロモーターに機能的に連結されたデンプン生合成促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって植物細胞を安定に形質転換すること（ここで、該ポリヌクレオチドはセンスまたはアンチセンス方向である）、
b）該植物細胞を、該ポリヌクレオチドを発現できる再生植物を作出するための植物生育条件下で、該植物でのデンプン生合成促進タンパク質のレベルを調節するのに十分な時間にわたり生育させること、を含む方法；
XXVI. デンプン生合成促進タンパク質をコードするポリヌクレオチドが配列番号１または３より選択される、XXIVの方法。
【０１６４】
本明細書で用いられるいくつかの用語を、ここで定義する：
「酵素活性/活性アッセイ」：酵素活性という用語は、基質を生成物に変換する酵素の能力を表す。この状況において、酵素の天然の基質および天然の基質の合成修飾類似体の両方が使用され得る。酵素活性は、規定された時間の関数として、生成物の増加、出発物質の減少、特定の補因子の減少もしくは増加、または前記パラメーターの少なくとも２つの組合せにより、活性アッセイとして知られているもので測定され得る。
【０１６５】
本明細書において「機能的同等物」とは、デンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸配列またはデンプン生合成促進タンパク質をコードする核酸配列の一部と標準条件下でハイブリダイズし、かつ細胞もしくは生物において酵素的に活性のある植物デンプン生合成促進タンパク質の発現をもたらすことができる核酸配列を表す。
【０１６６】
ハイブリダイゼーションのためには、当業者に公知の方法で他の関連遺伝子と比較することによって決定することができる、例えば保存されたまたは他の領域の、長さ10〜50bp、好ましくは15〜40bpの短いオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。あるいはまた、ハイブリダイゼーションのために本発明の核酸のより長い断片または完全配列を使用することも可能である。これらの標準条件は、用いる核酸、すなわちオリゴヌクレオチド、より長い断片もしくは完全配列によって、またはいずれの種類の核酸、すなわちDNAもしくはRNAがハイブリダイゼーションに用いられるかによって、異なる。こうして、例えば、DNA：DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA：RNAハイブリッドのそれより約10℃低い。適切なハイブリダイゼーション条件は上述されている。
【０１６７】
機能的同等物は更にまた、特に、植物デンプン生合成促進タンパク質の関連核酸配列の天然または人為的な突然変異、および細胞もしくは生物において酵素的に活性のある植物デンプン生合成促進タンパク質の発現を可能にする他の生物由来のそれらのホモログを意味するものとして理解される。
【０１６８】
従って、本発明の範囲はまた、例えば、デンプン生合成促進タンパク質の核酸配列の改変によって得られるヌクレオチド配列にまで及ぶ。このような改変の目的は、例えば、制限酵素のための更なる切断部位の挿入、余分なDNAの除去、または更なる配列の付加であり得る。前記核酸配列によってコードされるタンパク質は、逸脱した核酸配列であるにもかかわらず、なお望ましい機能を維持しているべきである。
【０１６９】
機能的同等物という用語はまた、当該核酸配列によってコードされるタンパク質を表しうる。この場合、機能的同等物という用語は、そのアミノ酸配列がデンプン生合成促進タンパク質のそれと特定の割合まで同一であるタンパク質を表す。
【０１７０】
機能的同等物は従って、本明細書に記述される配列の天然に存在する変異体、また人為的な、例えば化学的に合成された、コドン使用頻度に適合した核酸配列、またはそれらに由来するアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
一般的に、(対応する核酸配列によってコードされる)当該アミノ酸配列とは無関係に、機能的同等物は、いずれの場合にも、デンプン生合成促進タンパク質の酵素活性を有すると言える。
【０１７２】
「レポーター遺伝子」は容易に定量できるタンパク質をコードする。これらの遺伝子を用いた、形質転換効率の評価または発現部位もしくは発現時間の評価は、成長、蛍光、化学発光、生物発光もしくは耐性アッセイによって、あるいは（内色素の）光度測定または酵素活性によって行われ得る。この状況において特に非常に好ましいのは、「緑色蛍光タンパク質」（GFP）（Gerdes HHおよびKaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1):44-47; Chui WLら、Curr. Biol. 1996, 6:325-330; Leffel SMら、Biotechniques. 23(5):912-8, 1997）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ（Giacomin, Plant Sci. 1996, 116:59-72; Scikantha, J. Bact. 1996, 178:121; Millarら、Plant Mol. Biol. Rep. 1992 10:324-414）、ならびにルシフェラーゼ遺伝子、一般にβ-ガラクトシダーゼまたはβ-グルクロニダーゼ（Jeffersonら、EMBO J. 1987, 6, 3901-3907）、Ura3遺伝子、Ilv2遺伝子、2-デオキシグルコース-6-リン酸ホスファターゼ遺伝子、β-ラクタマーゼ遺伝子、ネオミシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、またはBASTA（=グルフォシネート）耐性遺伝子などのレポータータンパク質（Schenborn E, Groskreutz D. Mol. Biotechnol. 1999; 13(1):29-44）である。
【０１７３】
「顕著に増加する」：酵素活性に関して、候補化合物とともにインキュベートされない酵素の活性と比較して、候補化合物とともにインキュベートされた酵素の酵素活性の増加を意味するものとして理解され、それは測定誤差の範囲外である。
【０１７４】
「基質」：基質は、酵素のその本来の機能によって認識される化合物であり、酵素が触媒する反応により生成物に変換される化合物である。
【０１７５】
好ましくは、植物デンプン生合成促進タンパク質は、
a）配列番号１もしくは３に示される核酸配列、または
b）遺伝コードの縮重により、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列から逆翻訳によって推定され得る核酸配列、または
c）遺伝コードの縮重により、配列番号２もしくは４に対して少なくとも50％の同一性を有する、配列番号２もしくは４に示されるアミノ酸配列の機能的同等物から逆翻訳によって推定され得る核酸配列、
を含む核酸配列によってコードされる。
【０１７６】
c）に記載される配列番号２または４の機能的同等物は、配列番号２または４に対して少なくとも50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、好ましくは少なくとも58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、および70％、より好ましくは71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、最も好ましくは少なくとも86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％の同一性を有する。
【０１７７】
デンプン生産に使用されるジャガイモ品種ならびに高アミロース含量を有する遺伝子型は、デンプン生合成促進タンパク質の過剰発現のために、記載されるような遺伝子構築物および実施例１７における遺伝子構築物によって形質転換される。ジャガイモ植物でのStGH1またはStGH2の過剰発現は、出発植物と比較してトランスジェニック植物のデンプンもしくはアミロース含量の増加を引き起こすであろう。トランスジェニック系統でのデンプン含量の増加は、表９において見ることができる。その系統はまた、温室内で生育させた場合、収穫重量の増加を示し（表６）、従ってデンプン収率の増加をもたらす。
【実施例】
【０１７８】
実施例１
酵母における相補性試験
酵母は、グリコーゲン合成の開始のためのプライマーをもたらす、２つの自己グリコシル化タンパク質Glg1pおよびGlg2pを含んでいる。酵母においてグリコーゲン合成が起こるためには、どちらか一方の遺伝子が機能する必要がある。両方の遺伝子にノックアウト突然変異を有する酵母菌株CC9は、従ってこの特定の生合成機能に関してヌル突然変異体であり、それゆえにグリコーゲンを産生することができない（Cheng, C.ら、Molecular and Cellular Biology (1995), 6632-6640）。CC9菌株でのグリコーゲン生合成を回復させることによってそれらの機能を確認するために、単離されたジャガイモ遺伝子による相補性実験の基礎としてCC9を使用した。ジャガイモ遺伝子を酵母プラスミドpRS414（Stratagene）にクローニングし、Gal1、Adh1およびGlg2pプロモーターなどの様々な酵母の制御エレメントにより発現させた。LiClおよびエレクトロポレーション（Multiporator, Eppendorf）を用いて、得られたプラスミドによってCC9を形質転換した。適切な培地プレート上で増殖する形質転換酵母コロニーを、ヨウ素溶液に浸すことによってスクリーニングした。グリコーゲンを産生する野生型酵母はヨウ素によって赤褐色に染色されるが、ヌル突然変異体CC9は染色されない。ジャガイモ遺伝子StGH1およびStGH2を発現しているCC9は、その単離された遺伝子が酵母においてグリコゲニン機能を相補する場合、すなわち望ましい機能を有する場合、赤褐色に染色されるであろう。
【０１７９】
実施例２
形質転換方法
in vitroで繁殖させたジャガイモ植物からの完全に展開した葉を、対角に2〜4片に切断し、MCプレート上で2〜3日間23〜24℃で前培養する。
【０１８０】
pHS1、pHS2、pHS3、pHS4、pHASHS2、pHASHS4、pHASHS5、pHASHS6、pHASHS7またはpHASHS8を含むAgrobacterium tumefaciens菌株LBA4404を、100μgリファンピシンおよび25μg/mlカナマイシンを含むYEB培地で一晩、28℃で持続的に振とうしながら（200 rpm）生育させる。
【０１８１】
アグロバクテリウム培養物は、MS10培地で1:20に希釈することによって感染のために準備する。葉の外植片を8〜10分間細菌溶液中で感染させ、その後、ろ紙上で5〜20秒間水分を除去する。葉の切片をMS300プレート上に置き、穏やかな光のもとで23〜24℃にて2日間共培養する。葉の切片の共培養後に、葉の切片を、細菌の増殖を抑制するために400g/l クラフォランを含むM400プレートに移す。4〜5日後、外植片を、400g/l クラフォランを添加した選択培地MS400に移す。pHS1およびpHS2で形質転換した外植片については、培地中に50μMカナマイシンを添加し、pHS3、pHS4、pHASHS2、pHASHS4、pHASHS5、pHASHS6、pHASHS7およびpHASHS8で形質転換した外植片については、培地に0.5Mイマザモックスを添加した。
【０１８２】
葉の切片を２週間毎に新しいMS 400選択培地に移す。再生した推定トランスジェニックシュートを採集し、シュートの伸長のために200g/lクラフォランを含むMS30プレート上で培養する。
【０１８３】
シュートが3〜5 cmの長さになった時、1〜2 cmを切断し、マイクロチューバー培地上で暗所25℃にて生育させる。2〜5週間後、マイクロチューバー（microtuber：器内増殖塊茎）が形成される。
【０１８４】
2006521099.tif 000002
【０１８５】
実施例３
トランスジェニック植物AM 99-2003
高アミロースジャガイモ系統は、２つのデンプン分枝酵素、デンプン分枝酵素1（SBE1）およびデンプン分枝酵素2（SBE2）を標的とする、例えばアンチセンス、RNAiまたは抗体技術を用いることによって作出することができる。
【０１８６】
親系統Dinamoでのデンプン分枝酵素活性の阻害によって、高アミロースジャガイモ系統AM99-2003を作出する。アンチセンス方向でgbss プロモーターによって駆動されるSBE1およびSBE2の構築物によって、形質転換を行う。
【０１８７】
EcoRVとSpeIとの間にSbe1の3’末端の 1620bp断片を含むpBluescriptを、SpeI（平滑化）およびXbaIを用いて開環し、Sbe2の3’末端の1243bpのSstI（平滑化）およびXbaI断片とライゲーションする。Sbe2ならびにSbe1の合成物をEcoRVおよびXbaIによって切り出しし、SmaIおよびXbaIで開環したバイナリーベクターpHo3.1（図８を参照）にライゲーションする。最終的なベクターをpHAbe12Aと命名する（図９および配列番号１５の核酸配列を参照のこと）。pHo3.1は、pGPTVKanのHindIII部位にクローニングされた987bp gbssプロモーターの付加を伴うpGPTVKan（Becker, D.ら、Plant Molecular Biology 20 (1992), 1195-1197）に基づいており、uidA遺伝子はSmaIおよびSstIによって欠失される。 
親系統Dinamoを、実施例２に記載されるように構築物pHAbe12Aで形質転換する。
【０１８８】
実施例４
アンチセンスによるジャガイモでのStGH1およびStGH2遺伝子のダウンレギュレーション
植物調節エレメントに関してアンチセンス方向での遺伝子による形質転換によって、StGH1およびStGH2遺伝子をジャガイモにおいてダウンレギュレーションした。それぞれのアンチセンス遺伝子を塊茎特異的gbssプロモーターによって駆動されるバイナリーベクターにクローニングした。抗生物質カナマイシンに対する耐性をもたらすNptIIを選択マーカーとして用いた。２つの品種PrevalentおよびProducentを形質転換した。ジャガイモの形質転換に用いられる標準的なカナマイシン濃度である50μMカナマイシンでシュートを選択した（Ooms, Gら、Theoretical and Applied Genetics 73:744-750 (1987)および Tavazza, R.ら、Plant Science 59 (1988), 175-181）。
【０１８９】
実施例５
ジャガイモでのStGH1およびStGH2遺伝子の過剰発現
塊茎特異的プロモーターgbssによって駆動されるStGH1およびStGH2遺伝子をジャガイモにおいて過剰発現させた。突然変異AHAS遺伝子をイマザモックス除草剤に耐性をもたらす選択マーカーとして使用した。２つのジャガイモ品種DesireeおよびAM99-2003（その親系統と比較して、デンプン含量が40％減少しているトランスジェニック高アミロース系統）を形質転換した。
【０１９０】
実施例６
トランスジェニック系統の選択
非トランスジェニックの混入をPCRスクリーニング法によって同定し廃棄した。DNeasy 96 Plantプロトコール（Qiagen）に従ってDNAを抽出した。96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、10〜15 mgの葉組織を各ウェルに5mmのスチール球とともに入れ、その時、各ウェルは個々の１つのシュートに相当した。均質化する前にプレートをN2（l）中で凍結させた。Mixermill300において30Hzで1分間、均質化を行った。抽出プロトコールの最後にDNAを75μl H2Oに溶出した。
【０１９１】
形質転換が成功した系統を選択するため、nptIIおよびAHASに特異的なプライマーを、それぞれ246 bp断片、509 bpの断片の増幅に用いた。
【０１９２】
Npt2_for:  5’-AGCAAGGTGAGATGACAGGAGATC-3’
Npt2_rev:  5’CAGACAATCGGCTGCTCTGATG-3’
AHAS1_frw: 5’-AACAACAACATCTTCTTCGATC-3’
AHAS1_rev: 5’-TAACGAGATTTGTAGCTCCG-3’
【０１９３】
抽出したDNAを用いてPCR反応を準備し、以下のように実施した。すなわち、
反応: 
10x PCR混合物                    2,0μl
フォワードプライマー（25μM）    0,4μl
リバースプライマー（25μM）      0,4μl
dNTPs（10mM）                    0,4μl
RedTAQ（Sigma）                  1,0μl
鋳型（約20ng/μl）               4,0μl
H2O                               11,8μl
【０１９４】
PCRプログラム:
94℃    30秒
59℃    30秒  x29サイクル
72℃    30秒
72℃    7分
8℃     保持
【０１９５】
実施例７
遺伝子発現解析
StGH1およびStGH2遺伝子の遺伝子発現レベルを、トランスジェニックジャガイモ系統においてリアルタイムPCR（ABI prism 7900HT, Applied Biosystems）によって解析した。リアルタイムPCRにより、遺伝子発現の変化をRNA発現レベルに関して解析することができる。pHS1ならびにpHS2トランスジェニック系統については、StGH1およびStGH2のセンスRNAとアンチセンスRNAの両方の発現を測定したが、pHS3ならびにpHS4トランスジェニック系統では、StGH1およびStGH2 mRNA発現の変化を解析した。
【０１９６】
pHS1ならびにpHS2の目標はそれぞれStGH1およびStGH2の転写産物レベルを減少させることであるが、pHS3ならびにpHS4の目標はそれぞれの遺伝子の転写産物レベルを増加させることである。
【０１９７】
トランスジェニックジャガイモ系統および親品種のマイクロチューバーからInvisorb Spin Plant-RNA mini kit（Invitek）を用いてRNAを単離した。250 ngの全RNAを用いて25μlの全反応容量でTaqMan逆転写試薬（Applied Biosystems）により逆転写反応を行った。それぞれの遺伝子の内因性の発現とアンチセンスRNA発現との区別を可能にするために、別々の特異的なプライマー（表１参照）を設計し、逆転写反応に用いた。
【表１】
2006521099.tif 000003
【０１９８】
5μlの逆転写反応を、特異的配列検出プライマーTaqMan MGBプローブ（表２参照）およびUMM mastermix（Applied Biosystems）とともに３回反復解析に用い、供給業者の使用説明書に従ったリアルタイムPCRによって測定した。
【表２】
2006521099.tif 000004
【０１９９】
２つの遺伝子のダウンレギュレーションは、それらの親品種と比較して、トランスジェニック系統での遺伝子発現を50〜95％程度減少させた。
【０２００】
２つの遺伝子の過剰発現は、それらの親品種と比較して、トランスジェニック系統での遺伝子発現を2〜10倍増加させた。
【表３】
2006521099.tif 000005
【０２０１】
実施例８
乾燥物解析
遺伝子のダウンレギュレーションまたは過剰発現を示すpHS1、pHS2、pHS3およびpHS4で形質転換したトランスジェニック系統由来のマイクロチューバーにおいて、乾燥物を解析した。デンプンは通常ジャガイモ塊茎の乾燥物の80％以上に寄与するため、デンプン含量の増加または減少はまた乾燥物含量にも影響を及ぼすだろう。
【０２０２】
各系統の２つのマイクロチューバーを、それらが成熟に達した時に採取した。成熟マイクロチューバーについて60℃での72時間の乾燥前と乾燥後に重さを量って乾燥物を計算した。比較のため、（圃場で栽培した場合）13〜28％のデンプン含量を有する品種Dinamo、Desiree、Prevalent、ProducentおよびP737由来のマイクロチューバーを用いた。マイクロチューバーのデンプン含量は圃場で栽培した塊茎のデンプン含量ほど高くはない。しかし、乾燥物含量はマイクロチューバーにおいて容易に比較することができ、その値は圃場で栽培した塊茎で測定されるデンプン含量とよく相関する。表４に、10個以上のマイクロチューバーについて計算された様々な品種での平均乾燥物を示す。
【表４】
2006521099.tif 000006
【０２０３】
今までのところ、遺伝子発現の減少が確認された各pHS1およびpHS2の１つが乾燥物について解析されている。これら２つはそれらの親品種と比較して7％および11％の乾燥物の減少をもたらす。
【０２０４】
pHS3系統については、9つの確認された過剰発現系統のうち8つが、最大36％までの乾燥物の増加を示す。表５を参照のこと。
【表５】
2006521099.tif 000007
【０２０５】
実施例９
デンプン含量の分析
デンプン含量の分析のために、Megazyme Inter-ational Ireland Ltd.（Bray, Co.Wicklow, Ireland）からの総デンプン検定法（AOAC法996.1; AACC法76.13; ICC標準法No. 168）を供給業者の使用説明書に従って使用した。
【０２０６】
pHS1、pHS2、pHS3およびpHS4で形質転換したすべてのトランスジェニック系統由来のマイクロチューバーについて、デンプン含量を分析した。マイクロチューバーが成熟に達した時、それらを採取した。成熟したマイクロチューバーを破砕し、マルトサッカライドおよび遊離グルコース残基をエタノールで洗い流した。高アミロースクローンのような、難消化性デンプンを高レベルで含むサンプルの完全な可溶化を確実にするために、マイクロチューバーのデンプンをDMSOで処理した。
【０２０７】
サンプルを標準的な分光学的定量法によって分析した。トランスジェニック系統を、デンプン含量が8％〜30％の範囲にあることが知られているジャガイモ品種と比較した。その結果は、種々のトランスジェニック系統の遺伝的改変に関連したデンプン含量の変化を示す。
【０２０８】
実施例１０
温室試験
温室で栽培したpHS3およびpHS4トランスジェニック系統ならびにそれらの親品種について、収穫重量および乾燥物含量を測定した。温室で栽培した10鉢からの収穫重量を測定した（表６を参照のこと）。
【表６】
2006521099.tif 000008
【０２０９】
収穫重量は、トランスジェニック系統では、それらの親品種と比較して最大43％まで増加した。その結果は、StGH1およびStGH2の過剰発現が総収穫重量の増加を引き起こすことを示す。
【０２１０】
温室で栽培した系統を乾燥物含量について分析した。各系統の３つの塊茎の薄片を凍結乾燥機で72時間乾燥させ、乾燥の前後で秤量した。乾燥物の結果は表７に示してあり、３回の分析の平均値を示す。
【表７】
2006521099.tif 000009
【０２１１】
StGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現するトランスジェニック系統の解析は、そのそれぞれの親系統と比較して乾燥物含量の増加を示す。表７に見られるように、乾燥物はStGH1遺伝子を過剰発現する系統において最大26％まで増加する。AM99-2003を親系統として使用する場合は、乾燥物の増加がより顕著である。これは、AM99-2003が高アミロース形質の結果として多量の利用可能な糖を含んでいるという事実による（図２を参照のこと）。StGH2を過剰発現する系統においても、乾燥物が増加する。この増加はまた、この場合においてもAM99-2003を親系統として使用する場合に、より高くなる。StGH2を過剰発現する系統は、最大10％までの乾燥物の増加をもたらす。
【０２１２】
実施例１１
トランスジェニックジャガイモ系統の圃場試験
実施例５〜１０に記載されるようなトランスジェニック系統を、デンプン生産のために用いた親系統および他の品種に関して農業的性能を判定するために、圃場試験で検査する。デンプン含量（デンプン加工に用いられる作物にとって重要な農業上の主要因である）は、いくつかの異なる方法で測定することができる。
【０２１３】
塊茎の水中秤量は水桶中の目盛りで行われる。標準的な方法に従ってデンプン含量を測定した。5 kgのジャガイモを測定に使用し、デンプン含量を次式に従って計算する。すなわち、デンプン含量（％）＝（ジャガイモの密度−1.01506）/ 0.0046051。デンプン含量の増加はサンプルの密度の増加に関連する。塊茎中のデンプンの増加は乾燥物含量に関連するが、乾燥物含量は、組織生重量を、105℃のオーブンで16時間かけて徹底的に水分を除去した後の組織乾燥重量と比較することによって測定できる。
【０２１４】
デンプン含量はまた、実施例９および１２でデンプン含量の分析について記載するような、酵素的方法によっても測定され得る。
【０２１５】
実施例１２
圃場試験の結果
StGH1またはStGH2を過剰発現する５つの系統を切断物として圃場で栽培した。栽培期間は６月から９月であった。収穫後、その系統を乾燥物含量、デンプン含量および糖含量について分析した（表８〜１０の結果を参照のこと）。
【０２１６】
105℃のファンヒーターオーブン内で16〜18時間かけて15 gのマッシュポテト（ブレンダーで作った）を乾燥させることによって、乾燥物含量を分析した。サンプルを測定前にエクシケーター(exicator)で室温まで冷却した。
【０２１７】
P. AmanらMethods in Carbohydrate Chemistry Vol. X. 1994, 111-115ページに記載された酵素的方法に従い、耐熱性αアミラーゼを用いて、圃場で栽培した塊茎からのデンプン含量を分析した。破砕して乾燥させた塊茎のサンプルをエタノール（80％）で希釈し、耐熱性αアミラーゼおよびアミログルコシダーゼで消化することによって、該サンプルの２回反復分析を行った。グルコースオキシダーゼ反応によってデンプンの量を測定した。
【０２１８】
フルクトース、グルコースおよびスクロースの濃度は、気液クロマトグラフィーを用いて、Georg Fuchsら、Swedish J. Agric. Res.4:49-52, 1974, Quantitative determination of low-molecular carbohydrates in foods by gas-liquid chromatographyに記載された方法によって測定した。
【表８】
2006521099.tif 000010
【０２１９】
表８に見られるように、圃場で栽培したStGH1またはStGH2を過剰発現するトランスジェニック系統は、最大7％までの乾燥物の増加を示す。その系統はまた、表９に見られるようにデンプン含量の増加も示す。最も高い増加は、親系統としてAM99-2003を用いた系統において見られる。これは高アミロース親系統において利用可能な糖によるものである（図２）。
【表９】
2006521099.tif 000011
【０２２０】
更に、親系統としてAM99-2003を用いた系統において糖濃度を分析した。AM99-2003は、高アミロース形質のために、高い割合の利用可能な糖を含んでいる。StGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現する系統では、グルコース濃度が親系統で分析された量の1/3に減少し、スクロースは3/4に減少している（表１０を参照のこと）。StGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現する系統でのより低い糖濃度は、より多くのグルコースおよびスクロースがデンプン生合成に取り込まれ、その結果これらのトランスジェニック系統でのデンプン含量の増加を引き起こしたことを示す。
【表１０】
2006521099.tif 000012
【０２２１】
実施例１３
StGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現する系統の顕微鏡的研究
親系統としてAM99-2003を用いたStGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現するトランスジェニック系統の圃場で栽培した塊茎は、ヨウ素（ルゴール液（6.7g/l KI＋3.3g/l I2）とグリセロール 1:1）を用いてデンプンを染色することによって、デンプン粒の形態について調べた。１片の塊茎を押し潰し、数滴のヨウ素液を添加した。デンプン粒の構造を顕微鏡下で解析した。
【０２２２】
図１０に見られるように、デンプン粒は、高アミロースの親品種AM99-2003では顆粒の内部に向かって崩れている。これとは対照的に、StGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現するトランスジェニック系統のデンプン粒は、より大きく丸い形をしている（図１１および１２を参照のこと）。これは、StGH1またはStGH2遺伝子の過剰発現の結果としての顆粒へのデンプン取り込みの増加によるものである。
【０２２３】
実施例１４
デンプンの合成開始に関連する遺伝子の組合せ発現
StGH1およびStGH2は様々な方法で組み合わせることができる。それらの遺伝子は同一のT-DNA上に組み合わせても、または個別のT-DNA上に位置させてもよい。それらの遺伝子は同時形質転換に使用したり、トランスジェニック系統の交雑によって組み合わせたりすることもできる。
【０２２４】
実施例１５
SBE1およびSBE2の阻害ならびにStGH1またはStGH2の過剰発現のための複合構築物
高いデンプン含量を有する高アミロース系統を作出するための構築物を作製した。StGH1またはStGH2の過剰発現のために、構築物pHASHS2、pHASHS4、pHASHS5およびpHASHS6を作製した。すべてのpHASHS構築物はまた、アンチセンス法またはRNA干渉法（RNAi）によるそれぞれの遺伝子のダウンレギュレーションのために、be1およびbe2の断片を含む。SBE1およびSBE2遺伝子のダウンレギュレーションは、アミロペクチン生合成を阻害し、デンプン生合成をアミロース産生の増加に向かわせる。すべての構築物はバイナリーベクターpSUNAHASmodbに基づく。RNAi構築物はベクターpHAS8bに基づき、アンチセンス構築物はベクターpHAS4bに基づく。
【０２２５】
pHASHS2、pHASHS4、pHASHS5またはpHASHS6で形質転換した植物は、高アミロース系統をもたらした。作出されたトランスジェニック系統におけるデンプン含量は、StGH1またはStGH2遺伝子を過剰発現していない高アミロース系統よりも高かった。デンプン含量は、上述のpHS3およびpHS4系統で見られるものと同じ範囲にあった。
【０２２６】
実施例１６
SBE1およびSBE2の阻害ならびにStGH1およびStGH2の過剰発現のための複合構築物
高いデンプン含量を有する高アミロース系統を作出するための構築物を作製した。１つの植物においてStGH1およびStGH2をともに過剰発現させるために、pHASHS7およびpHASHS8を作製した。すべてのpHASHS構築物はまた、アンチセンス法またはRNA干渉法（RNAi）によるそれぞれの遺伝子のダウンレギュレーションのためにSBE1およびSBE2の断片を含む。SBE1およびSBE2遺伝子のダウンレギュレーションは、アミロペクチン生合成を阻害し、デンプン生合成をアミロース産生の増加に向かわせる。すべての構築物はバイナリーベクターpSUNAHASmodbに基づく。RNAi構築物はベクターpHAS8bに基づき、アンチセンス構築物はベクターpHAS4bに基づく。
【０２２７】
pHASHS7およびpHASHS8で形質転換した植物は、高アミロース系統をもたらした。作出されたトランスジェニック系統におけるデンプン含量は、StGH1およびStGH2遺伝子をともに過剰発現していない高アミロース系統よりも高かった。
【０２２８】
実施例１７
ベクター構築
pSUNAHASmodbの構築
選択マーカーとして突然変異AHAS遺伝子を有するpSUN1に基づくバイナリーベクターを構築した。ｂｋベクターを形質遺伝子の更なるクローニングのために使用した。
【０２２９】
nosプロモーターを含む608 bp断片をpGPTV-kanからHind IIIおよびBglIIによって切り出し、HindIIIおよびBamHIによって開環したpUC19（Invitrogen）にライゲーションした。nosターミネーター（275bp）をpGPTV-kanからSstIおよびEcoRIによって切り出し、SstIおよびEcoRI部位間で上記にライゲーションした。Sathasivanら（1991）によって記載されたAHAS遺伝子（S653N）は、QuikChange Multi Site directed Mutagenesis kit（Stratagene）を用いることにより、制限酵素認識部位HindIII、EcoRV、BamHI、EcoRIおよびSstIを排除して最適化した。更なる制限酵素認識部位KpnIおよびSstIをこの遺伝子の3’および5’末端に付加した。この遺伝子をAtAHASmodと命名した（図２２、配列番号１６）。AtAHASmodをKpnIおよびSstIで切断し（約2019bp）、KpnI-SstIでnosプロモーターとnosターミネーターの間にライゲーションした。上記合成物をpUC19からHindIII（平滑化）およびEcoRIを用いて切り出し（2900bp）、EcoRIおよびSmaIでpSUN1にライゲーションした。このベクターをpSUNAHASmodbと命名した（図１９を参照のこと）。
【０２３０】
pHAS8bの構築
分枝酵素遺伝子のダウンレギュレーションのためにbe1およびbe2断片（配列番号２０）を含むRNAi構築物pHAS8bを、選択マーカーとして突然変異AHAS遺伝子（配列番号１６）を含むpSUN1に基づくバイナリーベクターpSUNAHASmodb（図１９）に構築した。スペーサーとしてbe2プロモーターの断片を使用した（配列番号１８）。StGH1（配列番号１）およびStGH2（配列番号３）遺伝子による拡張したクローニングのために、このベクターを使用した。
【０２３１】
RNAi420be2be1（配列番号１９）と命名したpBluescript 中のbe2（200bp）およびbe1（200bp）の合成的に製造した400bpの断片を、HindIII（平滑化）およびSalIによって開環した（3331bp）。スペーサーとして使用するために、be2プロモーターの262bp断片（配列番号１８）をBglII（平滑化）およびSalIで消化し、そのベクターにライゲーションし、pMA17と命名した。
【０２３２】
再度400 bp RNAi420be2be1断片を用い、XhoI（平滑化）およびKpnIによって開環したpMA17（3582 bp）に逆方向でライゲーションした。この構築物をpMA18と命名した。pMA18をSpeIおよびKpnIで消化し（1120 bp）、その断片をXbaIおよびKpnIでpUC19 （3924 bp）のgbssプロモーターとnosターミネーターの間にライゲーションした。この構築物をpMA19bと命名した。pMA19bをPvuIIおよびHindIIIで消化し（2390 bp）、SphI（平滑化）とHindIIIの間でバイナリーベクターpSUNAHASmodb（図１９）（8932 bp）にライゲーションした。この構築物をpHAS8bと命名した（図２０を参照のこと）。
【０２３３】
pHAS4bの構築
SBE1およびSBE2のダウンレギュレーションのためにアンチセンス断片を含むベクターpHAS4bを、選択マーカーとして突然変異AHAS遺伝子（配列番号１６）を含むpSUN1に基づくバイナリーベクターpSUNAHASmodb（図１９）に構築した。StGH1およびStGH2遺伝子の拡張したクローニングのために、このベクターを使用した。
【０２３４】
gbssプロモーターおよびnosターミネーターとともにbe1ならびにbe2のアンチセンス断片をpHAbe12A（図９、配列番号１５）からBsrBIおよびHindIIIによって切り出し（4299bp）、SphI（平滑化）およびHindIIIで消化されたpSUNAHASmodb（図１９）（8932bp）にライゲーションした。この構築物をpHAS4bと命名した（図２１を参照のこと）。
【０２３５】
pHASHS5の構築
StGH1遺伝子、gbssプロモーターならびにnosターミネーターをpHS3（図６）から消化し、be1およびbe2の断片を含むRNAi構築物pHAS8b（図２０）にクローニングした。
【０２３６】
StGH1遺伝子、gbssプロモーターならびにnosターミネーターを、pHS3からDraIおよびEcoRVによって切り出した（3160bp）。その断片を、EcoRVによって開環したpHAS8b（11403bp）にライゲーションした。この構築物をpHASHS5と命名した（図１５を参照のこと）。
【０２３７】
pHASHS6の構築
StGH2遺伝子、gbssプロモーターならびにnosターミネーターをpHS4（図７）から消化し、be1およびbe2の断片を含むRNAi構築物pHAS8b（図２０）にクローニングした。
【０２３８】
pHS4をSpeIおよびEcoRIで消化した。2486bp EcoRI-EcoRI断片および1169bp SpeI-EcoRI断片の、２つの断片を更なるクローニングのために回収した。pBluescriptをSpeIおよびEcoRIで消化した。消化したpBluescriptを1169bp（SpeI-EcoRI）断片とライゲーションした。この構築物をpMA15と命名した。
【０２３９】
pMA15をEcoRIで消化し（4127bp）、pHS4由来の2486bp EcoRI-EcoRI断片にライゲーションした。この構築物をpMA16と命名した。3689bp の断片をEcoRVで消化したpMA16から切り出し、EvoRVによって開環したpHAS8b（11403bp）にライゲーションした。この構築物をpHASHS6と命名した（図１６を参照のこと）。
【０２４０】
pHASHS2の構築
StGH1遺伝子、gbssプロモーターならびにnosターミネーターをpHS3（図６）から消化し、be1およびbe2のアンチセンス断片を含むpHAS4b（図２１）にクローニングした。
【０２４１】
pHS3をDraIおよびEcoRVで消化し（3160bp）、EcoRVによって開環したpHAS4b（13224bp）にライゲーションした。この構築物をpHASHS2と命名した（図１３を参照のこと）。
【０２４２】
pHASHS4の構築
StGH2遺伝子、gbssプロモーターならびにnosターミネーターをpHS4（図７）から消化し、be1およびbe2のアンチセンス断片を含むpHAS4b（図２１）にクローニングした。
【０２４３】
3689bp の断片をEcoRVによってpMA16（6613bp）から消化した（pMA16についてはpHASHS3の構築方法を参照のこと）。pHAS4bをEvoRVで消化し（13224bp）、上記の断片とライゲーションした。この構築物をpHASHS4と命名した（図１４を参照のこと）。
【０２４４】
pHASHS7の構築
各遺伝子を阻害するためのbe1およびbe2のアンチセンス断片を２つのアミロース生合成促進遺伝子StGH1およびStGH2とともに含むように、pHASHS7を設計した。
【０２４５】
pMA16（pMA16についてはpHASHS3の構築方法を参照）をEcoRVで消化した。その結果生じた3649bpの断片を、PstI（平滑化）によって開環したpHASHS2（図５）にライゲーションした。この構築物をpHASHS7と命名した（図１７を参照のこと）。
【０２４６】
pHASHS8の構築
スペーサー（配列番号１８または２３）によって連結された、RNAi（配列番号１９〜２２）を用いて各遺伝子を阻害するためのbe1およびbe2の断片を、２つのアミロース生合成促進遺伝子StGH1およびStGH2とともに含むようにpHASHS8を設計した。
【０２４７】
pMA16（pMA16についてはpHASHS3の構築方法を参照）をEcoRVで消化し、PstIによって開環し平滑化したpHASHS5（図１５）にライゲーションした。この構築物をpHASHS8と命名した（図１８を参照のこと）。
【０２４８】
実施例１８
ジャガイモの固形物の増加および加工品質の改善
別の態様では、本発明は、加工ジャガイモ製品のために、または食用ジャガイモ品種として利用されるジャガイモ品種の固形物含量を増加させるために使用されうる。ジャガイモの遺伝子型は、デンプン生合成促進タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現のために、上述のような遺伝子構築物によって形質転換される。このデンプン生合成促進タンパク質は、上述の遺伝子または同一の機能性ドメインを含む他の植物遺伝子から誘導することができる。
【０２４９】
ジャガイモ植物におけるStGH1および/またはStGH2遺伝子の過剰発現は、表７および８に見られるように固形物の増加を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】トランスジェニックジャガイモ植物でのアミロース含量の増加が、デンプン含量の顕著な減少と関連していることを示した図である。
【図２】トランスジェニック高アミロースジャガイモ系統の解析が、これらの系統に過剰の可溶性糖質が存在することを示した図である。
【図３】形質転換バイナリーベクターpHS1、pHS2、pHS3およびpHS4の概略図である。
【図４】バイナリーベクターpHS1の模式図である。
【図５】バイナリーベクターpHS2の模式図である。
【図６】バイナリーベクターpHS3の模式図である。
【図７】バイナリーベクターpHS4の模式図である。
【図８】バイナリーベクターpHo3.1の模式図である。
【図９】ベクターpHAbe12Aの概略図である。
【図１０】高アミロースの親系統AM99-2003ではデンプン粒が顆粒の内部に向かって崩れていることを示す。
【図１１】StGH1遺伝子を過剰発現するトランスジェニック系統ではデンプン粒がより大きく丸い形をしていることを示す。
【図１２】StGH2遺伝子を過剰発現するトランスジェニック系統ではデンプン粒がより大きく丸い形をしていることを示す。
【図１３】構築物pHASHS2の模式図である。
【図１４】構築物pHASHS4の模式図である。
【図１５】構築物pHASHS5の模式図である。
【図１６】構築物pHASHS6の模式図である。
【図１７】構築物pHASHS7の模式図である。
【図１８】構築物pHASHS8の模式図である。
【図１９】構築物pSUNAHASmodbの模式図である。
【図２０】構築物pHAS8bの模式図である。
【図２１】構築物pHAS4bの模式図である。
【図２２】遺伝子AtAHASmodの制限酵素認識部位を示した図である。
【図２３】構築物pHAS3の模式図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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