(57)【要約】虚血後の障害を制限するために、器官にＣＯを放出するために金属カルボニルが使用される。器官には、体外にあるもの、例えば、移植に用いるためのものや、体内若しくは体とは繋がっているものの、血流からは隔離されている、隔離された器官を、用いることができる。かかるカルボニルは、ＣＯの放出の特性及び可溶性を調節するために、好ましくは、例えばアミノ酸等の、ＣＯ以外の１つ又は複数の配位子を有している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体外にある又は隔離された器官を処理する方法であって、かかる器官を、金属カルボニル化合物又はその薬学的に許容し得る塩と少なくとも一つの薬学的に許容し得るキャリヤとを含む組成物に、接触させることを含んでいることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記金属カルボニルが、虚血後の障害を制限するために、利用可能な一酸化炭素（ＣＯ）を作り出す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属カルボニルが、以下の何れかの方法のうちの少なくとも一つにより、ＣＯを利用可能としている請求項１に記載の方法：
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、該組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【請求項４】
前記器官が、体外にある請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記器官が、体内若しくは体と繋がっているものの、血液供給源とは隔離せしめられている請求項１乃至請求項３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触の工程が、前記組成物を用いて前記器官を潅流培養することを含んでいる請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記金属カルボニルが、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ [但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａは原子、若しくはイオン結合、共有結合、或いはＣＯではない配位結合によってＭに結合した基であり、そしてｙ＞１の時、各Ａは、同じか若しくは異なるものである]で表される化合物、又は、そのような化合物の薬学的に許容可能な塩である請求項１乃至請求項６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｍが、遷移金属である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ａが、ハロゲン化物の如き中性若しくは陰イオン性の配位子から選択され、又はルイス塩基から誘導され、そして配位原子として、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、若しくはＣを有するものである請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、ＭはＦｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各ＡはＣＯ以外の配位子であり且つＭに対する単座配位子若しくは多座配位子であり且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、[Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 ]2-及び[ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2]2- の中から選択されるものであり、またＢは、任意であり、且つ、ＣＯ以外の配位子である]で表される請求項１乃至請求項６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
体内若しくは体とは繋がっているものの血液供給源とは隔離されている、隔離された器官の虚血後の障害を制限するために、該隔離された器官を処理する薬剤の製造における金属カルボニル化合物の使用。
【請求項１２】
前記金属カルボニルが、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ [但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、各Ａは、原子、若しくはイオン結合、共有結合、或いはＣＯではない配位結合によって、Ｍに結合した基であり、ｙ＞１の時、各Ａは、同じ若しくは異なるものである]で表される化合物、又は、該化合物の薬学的に許容し得る塩である請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記Ｍが、遷移金属である請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記Ａが、ハロゲン化物のような中性若しくは陰イオン性の配位子から選択され、又はルイス塩基から誘導され、且つ配位原子としてＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、若しくはＣを有するものである請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記金属カルボニル化合物が、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、ＭはＦｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり、且つＭに対する単座配位子若しくは多座配位子であり、そしてアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、[Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 ]2-及び[ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 ]2-の中から選択されるものであり、またＢは、任意であり、且つ、ＣＯ以外の配位子である]で表される請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一酸化炭素を、人間及びその他の哺乳類の、体外にある及び隔離された器官に対して、放出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
移植手術は、現在、患者が障害のある又は機能不全の器官を有している症例において、日常的に行われている。例えば、心臓、肺、肝臓、及び腎臓の移植は、全て、良く知られている。移植手術の際には、患者の器官が取り除かれ、ドナーから供給された器官に交換される。提供された器官を、提供された場所から、移植手術の場所まで輸送することが、しばしば、必要となる。これには、よく、提供された器官の、長距離の輸送が、関わり得る。提供された器官は、運送中は、血液供給源から隔離されることとなるため、虚血障害を被る。いかなる障害も、移植後に、その器官の機能に影響を及ぼす場合があるため、この虚血障害を制限することが、重要である。
【０００３】
現在、原位置（in situ)にある体の器官の、組織又は一部を患者の血液供給源から隔離して手術を行うことも、一般的である。この例としては、心筋保護液によって心臓が停止し、心臓機能を体外の機械的なポンプシステムにて置き換えた場合の心臓弁の交換などがある。この場合、心臓は、患者の血液供給源から隔離される。ここでも、このような方式にて隔離された器官は、虚血障害によって、望ましくない影響を受け得る、という危険性がある。
【０００４】
一酸化炭素（ＣＯ）の有益な生理学的効果について、認識されてきており、数多くの出版物にて、報告されている。この分野において行われた背景技術についての検討は、２００２年１１月２１日に公開された、本発明者らの研究に源を発する、同時係属出願のＷＯ０２／０９２０７５にて、報告されている。
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ  ０２／０９２０７５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
体外にある、及び隔離された器官の、虚血障害 (ischaemic damage) を制限するための方法が求められていることが、理解され得る。本発明の目的は、そのような方法を提供することである。
【０００７】
以下に詳記する実験データによって、例証されているように、本発明者らは、器官組織の虚血障害を減らすために、ＣＯを、体外、又は隔離された器官に放出するために、金属カルボニル化合物を用いることが可能であることを、見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、第一の態様においては、本発明は、器官を、金属カルボニル化合物又はその薬学的に許容し得る塩と少なくとも一つの薬学的に許容し得るキャリヤ (carrier)とを含む組成物に、接触させることを含む、体外にある、又は隔離された器官を処理する方法を、提供する。通常は、かかる金属カルボニルは、虚血後の障害 (post-ischaemic damage) を制限するために、利用可能な一酸化炭素（ＣＯ）を作り出す。
【０００９】
好ましくは、かかる金属カルボニルは、以下の方法のうちの少なくとも一つによって、一酸化炭素（ＣＯ）を利用可能にする。
１）該金属カルボニルの解離により放出されたＣＯが、該組成物中に、溶解形態にて存在している；
２）溶媒又は配位子との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
３）組織、器官又は細胞との接触により、該金属カルボニルがＣＯを放出する；
４）照射により、該金属カルボニルがＣＯを放出する。
【００１０】
本発明が、ここでは、第一に、処理される器官への、一酸化炭素の放出を伴うものであり、そこにおける金属カルボニルが、ＣＯを、生理学的効果のために利用可能とするものであるとして論じられている一方で、金属カルボニルが、ＣＯの放出を伴わずに、直接作用する場合の如き、異なるメカニズムを伴う場合を、除外するものではない。
【００１１】
本発明の方法によって処理される器官は、血液供給源から隔離された器官である。該器官には、体外のもの、例えば、ドナーの体の外にある、提供された器官、又は、患者の体内にあるが、手術の目的で血液供給源から隔離されている、との意味において隔離されたもの等がある。
【００１２】
そのような器官には、例えば、循環器官、呼吸器官、泌尿器官、消化器官、生殖器官、神経系の器官、筋肉又は皮膚切片、若しくは生存細胞を含む人工器官などがある。最も好ましくは、該器官は、心臓、肺、腎臓、又は肝臓である。金属カルボニルを含む組成物への接触は、例えば、入浴又はポンピング等の、該器官を組成物に晒すあらゆる方法にて、達成され得る。好ましくは、体に取り付けられた隔離器官、すなわち、バイパス形成手術を受けた器官には、該組成物が潅流培養される (perfused)。体外にある器官は、該組成物の中に浸されるのが、好ましい。
【００１３】
ここで、「化合物（compound)」という語には、溶解によって発生せしめられた種類も、含まれている。
【００１４】
特定の金属カルボニル化合物は、適切な溶媒に接触させることにより、ＣＯを放出し得る。この溶媒は、該薬剤組成物の構成成分の一部を構成していてもよい。従って、本発明の、この態様においては、該薬剤組成物は、前記金属カルボニルから放出されたＣＯを、溶解した形態にて含有していることになる。前記薬剤の調製中に、該カルボニル化合物が該溶媒に溶解している状態は、そのようにして放出されたＣＯが溶液中に保持されるように制御され得る。これは、解離した構成成分と、解離していないカルボニルとの間に平衡が存在する場合には、促進され得る。
【００１５】
母体のカルボニルから解離した構成成分自身が、更なるＣＯを放出可能な金属カルボニル化合物である場合もある。例えば、［Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2 がＤＭＳＯに溶解している場合、ＣＯは溶液中に遊離し、トリカルボニル及びジカルボニルの錯体の混合物が形成され、これら自身が更にＣＯを放出し得ることがある。
【００１６】
かかる錯体からのＣＯの放出は、溶液中の配位子との反応、例えば、そのような錯体の配位子の一つを置換して、該錯体からのＣＯの損失を導くことによって、刺激され得る。配位子は、硫黄又は窒素を含んだものであり得る。金属カルボニル類のうちの幾つかは、グルタチオンやヒスチジンの如き生物学的配位子に接触させることによって、ＣＯを放出することがある。
【００１７】
本発明の別の態様においては、前記薬剤組成物自身は、解離したＣＯを含有していないものの、適切な溶媒又は媒体に接触させることによってＣＯを放出するように、調製されてもよい。例えば、該組成物は、例えば水、心筋保護液、又はパーフルオロカーボン系の代用血液との接触によってＣＯを放出することの出来る金属カルボニル化合物を、含有することができる。
【００１８】
上記の代わりに、該組成物は、投与の前に水に溶解するようにすることもできる。そのような組成物は、溶液、又は錠剤の如き固体の形態にて、調製されてもよい。それらが、溶液の形態である場合には、通常は、ＣＯの放出が、適切な物質に接触させることによってのみ起きるように、かかる金属カルボニル化合物の解離を幇助しない溶剤中において、調製される。
【００１９】
本発明の別の態様においては、前記薬剤組成物には、組織、器官、若しくは細胞との接触によってＣＯを放出する金属カルボニル化合物を、含めることができる。ある特定の金属カルボニル化合物が、溶液中にはＣＯを放出しないものの、血管内皮のような生理学的な細胞性物質 (cellular material) 若しくは組織には、ＣＯを放出することが可能である、ということが知られている。例えば、［Ｆｅ（ＳＰｈ）2（２，２’−bipyridine）（ＣＯ）2］は、以下に示す如く、溶液中のミオグロビンにＣＯを放出することは無いが、予め萎縮した大動脈環状部の拡張を促進させることが可能である。特定の理論に限定されたくは無いが、ＣＯは、シトクロムのような細胞性成分を介在させることにより、酸化還元反応の結果として、前記のような化合物から放出され得るのである。
【００２０】
しかし、酸化還元が起きなくとも、少なくとも該錯体から最初のＣＯの損失が起きるために、本発明は、ＣＯ放出のメカニズムとしての酸化還元反応に限定されるものではないのである。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、前記金属カルボニル化合物は、照射によってＣＯを放出することができる。この化合物には、例えば溶解したＣＯの溶液を作製する為に、投与の前に照射を行なうことが可能であり、又は、投与の後に原位置にて照射することも可能である。このような組成物は、ＣＯを制御し、局所的に放出することができると考えられる。例えば、この種の薬剤組成物は、手術中に投与することができ、例えば血管拡張を促す場合等、特にＣＯを必要とする箇所に、レーザー、或いは紫外線等のその他の放射エネルギー源による局所的な放射により、ＣＯを放出することができる。
【００２２】
本発明の薬剤組成物は、一般的には、処理の対象物に対して溶解された形態において利用可能となるような方法にて、ＣＯを放出するものである。しかし、ある状況下では、ＣＯは、金属カルボニルから、非溶媒アクセプター分子 (non-solvent acceptor molecule)に対して、直接的に、放出される。
【００２３】
本発明に従う薬剤組成物が、上記作用形態の一つ又はそれ以上によって、ＣＯを放出し得ることは、明白であろう。
【００２４】
概して、金属カルボニル化合物は、遷移金属、好ましくは第６族乃至第１０族の遷移金属の錯体を含んでいる（本明細書では、周期表の族には、ＩＵＰＡＣ命名法に従い、１乃至１８までの番号が付けられている）。少なくとも一つのカルボニル配位子が存在していることが条件である他は、カルボニル配位子の数は限定されていない。好適な金属は、低分子量の遷移金属、中でも特に、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ及びＲｈである。その他に使用し得る二つの金属は、Ｐｄ及びＰｔである。本発明で用いられる金属カルボニル錯体の金属は、概して、酸化状態が低いもの、即ち、０、Ｉ又はIIのものである。好適な金属は、概して、ＦｅII、ＲｕII、ＭｎI、ＣｏII、ＣｏIII 、好ましくは、ＣｏI、ＲｈIII、更に好ましくは、ＲｈI、ＮｉII、ＭｏII、よりも酸化状態が高くないものである。この金属は、放射性核種では無いことが、好ましい。Ｆｅは、哺乳類に多量に存在するため、特に適した金属である。
【００２５】
前記金属カルボニル化合物は、錯体であるとみなされる。なぜなら、それは、金属中心に配位結合したＣＯ基を有しているためである。しかし、該金属は、配位結合以外、例えばイオン又は共有結合によって、その他の基にも結合しても良い。そのため、該金属カルボニル化合物の一部を形成するＣＯ以外の基は、孤立電子対を介して金属中心に配位結合されるという点において、厳密に「配位子」である必要は無いが、ここでは、参照し易くする為に、「配位子」として言及する。
【００２６】
該カルボニル化合物には、好ましくは、少なくとも一つの調節的な配位子を含める。これによって、ＣＯでは無いが、該錯体特有の特性、例えばＣＯを放出する傾向、溶解性、疎水性、安定性、電気化学ポテンシャル等を調節する配位子が意味される。そのため、配位子の適切な選択は、該化合物の性質を調節するために、行なわれる。例えば、有機及び／又は水性溶媒における該化合物の溶解性、細胞膜を通過する能力、特定の溶媒若しくは細胞種類と接触させた際或いは放射時の、ＣＯの放出率を調節することが望ましい。
【００２７】
このような配位子は、一般的に、ハロゲン化物のような中性若しくはアニオン性の配位子であり、又はルイス塩基から誘導され、配位原子としてＮ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、若しくはＣを有するものである。好適な配位原子は、Ｎ、Ｏ、及びＳである。例としては、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド、例えば、グリシン、システイン、プロリン等の天然及び合成アミノ酸とそれらの塩、ＮＥｔ3 並びにＨ2ＮＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2 等のアミン、ｂｉ−２，２’−ピリジル、インドール、ピリミジン並びにシチジン等の芳香族塩基並びにその類似化合物、ビリベルジン並びにビリルビン等のピロール、ＹＣ−１（２−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインダゾール）等の薬物分子、ＥｔＳＨ並びにＰｈＳＨ等のチオール並びにチオレート (thiolates)、塩化物、臭化物並びにヨウ化物、蟻酸塩、酢酸塩並びにシュウ酸塩等のカルボン酸塩、Ｅｔ2Ｏ並びにテトラヒドロフラン等のエーテル、ＥｔＯＨ等のアルコール、及びＭｅＣＮ等のニトリルが含まれるが、それらに限定される訳ではない。特に好適なものは、アミノ酸等の配位結合の配位子で、水溶液中の該カルボニル錯体を安定化させるものである。その他の利用可能な配位子は、ジエン等の共役炭素基である。本発明において有用な金属カルボニル化合物を与え得ることが可能な配位子の一種は、シクロペンタジエニル（Ｃ5Ｈ5）、及び置換シクロペンタジエニルである。置換されたシクロペンタジエニルにおける置換基には、例えば、アルカノール、エーテル若しくはエステル、例えば、−（ＣＨ2）ｎＯＨ［但し、ｎは１乃至４である］、特に、−ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）ｎＯＲ［但し、ｎは１乃至４であり、Ｒは、炭化水素、好適には１乃至４の炭素原子を有するアルキルである］、−（ＣＨ2）ｎＯＯＣＲ［但し、ｎは１乃至４であり、Ｒは、炭素原子、好適には１乃至４の炭素原子を有するアルキルである］等がある。シクロペンタジエニル又は置換シクロペンタジエニルのカルボニル錯体における好適な金属は、Ｆｅである。シクロペンタジエニルカルボニル錯体は、塩化物等のアニオンに会合するカチオンであることが好ましい。
【００２８】
グアニル酸シクラーゼ活性 (guanylate cyclase activity) による刺激を通じて、ＣＯが、少なくとも一部において機能することが示されている。従って、金属カルボニル化合物には、グアニル酸シクラーゼに対するＣＯの影響を調節する配位子が含有されていることが望ましいと言える。例えば、薬品ＹＣ−１（３−（５’−ヒドロキシメチル−２’−フリル）−１−ベンジルインドール）は、ＣＯによるグアニル酸シクラーゼの刺激を強めるものとして考えられている。従って、ＹＣ−１又はその誘導体等の配位子を、金属カルボニル化合物に混合することにより、放出されたＣＯの、生物学的効果を変更又は拡大することができる。
【００２９】
そのような金属カルボニル化合物には、更に、適切な部位でのＣＯの放出を容易にするため、標的となる成分 (targeting moiety) を含めることができる。この標的となる成分は、必要とされた部位でのＣＯの放出を促進させるため、一般的に、特定の目標となる細胞の表面上で、レセプターを結合することが可能である。この標的となる成分は、前記標的となる細胞の表面上に見られるレセプターに結合可能な調節配位子の一部であってもよく、例えば適切なリンカー (linker) によって該錯体につながっている、特定のレセプターに対して向けた抗体のような、別の分子から誘導され得る。
【００３０】
最も好ましい態様によれば、該処理には、活性成分として、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙ  ［但し、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、Ｍは金属であり、Ａは原子、若しくはイオン結合、共有結合、或いは配位結合によりＭに結合した基であり、ｙ＞１の時、各Ａは、同じであっても異なっていても良い]で表される化合物、或いは、該化合物の薬学的に許容し得る塩を含有する、ＣＯを放出するための組成物が、用いられる。一般的には、Ｍは、遷移金属、特に、第６族乃至第１０族のものであり、Ａは、ハロゲン化物又はルイス塩基から誘導され、配位原子として、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ、若しくはＣを有する中性又はアニオン性配位子である。単座配位子、二座配位子、又は多座配位子を、用いてもよい。好適な金属及び配位子についての更なる詳細は、上記に記載されている。該化合物の分子量は、好ましくは１０００未満、例えば８２２以下である。ＣＯを放出する有用な金属カルボニルの幾つかが、図５Ａ乃至図５Ｆに示されている。
【００３１】
かかるカルボニル錯体は、薬学的に許容し得るものであるべきであり、特に、毒性の無い、又は、一回の投与量を考慮した場合の毒性が許容し得るものであるべきである。
【００３２】
最も好ましくは、本処理は、式：Ｍ（ＣＯ）ｘＡｙＢｚ［但し、Ｍは、Ｆｅ、Ｃｏ又はＲｕであり、ｘは少なくとも１であり、ｙは少なくとも１であり、ｚはゼロ又は少なくとも１であり、各Ａは、ＣＯ以外の配位子であり且つＭに対する単座配位子若しくは多座配位子であり且つ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンの如きアミノ酸、[Ｏ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 ]2-及び[ＮＨ（ＣＨ2ＣＯＯ）2 ]2-の中から選択されるものであり、またＢは、任意であって、且つ、ＣＯ以外の配位子であり、そしてｘは、好ましくは３であり、ｙは好ましくは１であり、ｚは好ましくは１である。
【００３３】
ここで用いられる、アミノ酸という用語には、グリシナト（glycinato) のように、酸性水素の損失によって得られる種も含まれる。
【００３４】
また、Ｂｚは、一つ又はそれ以上の、任意の、その他の配位子を意味する。Ｂについては、特に制限は無く、塩化物、臭化物並びにヨウ化物等のハロゲン化物、及び酢酸塩等のカルボン酸塩の配位子を、用いることができる。
【００３５】
Ｍは、Ｆｅ、Ｒｕ、及びＣｏの中から選ばれる。これらの金属は、前記の通り、酸化状態が低いものであることが、好ましい。
【００３６】
本発明で用いられる前記薬剤組成物は、概して、薬学的に許容し得るビヒクル、キャリヤ、緩衝剤、安定剤、又は当業者に公知のその他の材料を含有している。このような材料は、毒性の無いものであるべきであり、活性成分の効力に対して過度に妨げないものにすべきである。その例には、St Thomas 病院液、Euro-Collins 液、Wisconsin 大学液、Celsior 液、リンゲル乳酸塩（Ringer Lactate）液、ブレトシュナイダー（Bretschneider）液、及びパーフルオロカーボンが含まれる。更に詳細な情報は、Nydegger et al, Transplant Immunology, 9 (2002)、p 215-225 に見出すことができる。
【００３７】
かかる組成物は、一般的に、水、石油、動物性若しくは植物性オイル、鉱油、又は合成油等のキャリヤを含んでいる。生理食塩水、ブドウ糖若しくはその他の糖類の溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール、若しくはポリエチレングリコール等のグリコール類を含めることができる。薬学的に許容し得る量のその他の溶媒も、特に組成物に含まれる特定の金属カルボニル化合物を解離させるために必要である場合には、含有させることができる。該組成物は、更に、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素添加食用油脂）；  乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；  非水溶性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、又は分留植物油）；  保存料（例えば、メチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、若しくはソルビン酸）；  及びエネルギー源（例えば、グルコースの如き炭水化物、パルミテートの如き脂肪、若しくは、アミノ酸）の如き薬学的に許容し得る添加物を含むことが出来る。
【００３８】
この処理が行われる温度は、器官が体に付いているものの、血液供給源からは隔離されている場合には、好ましくは１５から３７℃の間であり、体外にある器官に対しては、２から１０℃の間、好ましくは４℃である。
【００３９】
かかる処理にて放出されるＣＯの量は、予防効果のある量であることが好ましい。投与される実際の量、及び、投与の割合並びに時間毎の量は、処理内容の性質及び重症度に左右される。
【００４０】
本発明は、本文にて記載されている如き金属カルボニル化合物を、体外にある、又は隔離された器官が、血液供給源から隔離されている間に、虚血障害を制限する処理のための薬剤を製造するための用法についても提供する。
【００４１】
本願を通して、医学的処理への言及は、人間の処理及び獣医学的な処理の両方を含めることが意図されており、また、薬剤組成物への言及は、人間の処理及び獣医学的処理での使用のための組成物を包含することが、意図されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
試薬及び材料
トリカルボニルジクロロルテニウム（II）二量体、（［Ｒｕ（ＣＯ）3 Ｃｌ2］2）、５−ヒドロキシノニエート (5-hydroxynoneate)（５−ＨＤ）、２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（テトラゾリウム  レッド）、及び全ての他の試薬は、他に明記されていない限り、Sigma社 (Poole, Dorset) から購入した。
【００４３】
Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯ2）（ＣＯＲＭ−３）（８ｍＭ）のストック溶液 (stock solution)は、該化合物を蒸留水に溶解することにより、調製された。ＣＯＲＭ−３の合成については、以下に記す。分解したＣＯＲＭ−３（ｄＣＯＲＭ−３）が、ＣＯＲＭ−３を、Krebs−Henseleit 緩衝剤に溶解し、その溶液を室温にて一晩（１８時間）静置することによって、調製された。２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウム（テトラゾリウムレッド）溶液（３％  ｗ／ｖ）は、隔離された心臓への注入前の各実験的プロトコルの終わりに、Krebs−Henseleit 緩衝剤において、新たに調製された。
【００４４】
全てのデータは、平均値±標準誤差で示してある。分析を行なったグループ間の違いについては、両側検定のt-テスト（Student's two-tailed t-test）による評価を行い、２つを越える処理について比較する場合には、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。結果は、ｐ＜０．０５と、統計的に有意のものであった。
【００４５】
ここにおいて、”ｍＭ ”及び ”μＭ ”は、濃度を示すものである（それぞれ、ミリモル及びマイクロモル）。
【００４６】
ＣＯ放出の検知
ＣＯＲＭ−３又はｄＣＯＲＭ−３からのＣＯの遊離について、以前に記述のある通り[３]、デオキシミオグロビン（デオキシ−Ｍｂ）からＣＯミオグロビン（ＭｂＣＯ）への転化を測定することにより、分光光度法的に評価した。形成されたＭｂＣＯの量は、５４０ｎｍの時の吸光度が用いられた（吸光係数＝１５．４  Ｍ-1ｃｍ-1）。そのようなたんぱく質を、０．０４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解することによって、ミオグロビン溶液（最終濃度：６６μｍｏｌ／Ｌ）を、新しく調製した。ミオグロビンをデオキシ−Ｍｂに転化させるため、各々の読取りの前に、亜ジチオン酸ナトリウム（０．１％）を添加した。
【００４７】
ＣＯＲＭ−３が、蒸留水内において調製され、Ｍｂを含有するリン酸緩衝液に添加せしめられた時、ＭｂＣＯのスペクトル特性が、即座に検知された（図１Ｂ）。反応後に測定されたＭｂＣＯの量から、１モルのＣＯＲＭ−３につき、１モルのＣＯが開放されたことが明らかになった。実際、図１Ｃに示されているように、ＣＯＲＭ−３を４０μＭ添加することによって、３６．４ ± ０．９μＭのＭｂＣＯが形成される結果となった。水に溶解し、室温にて２４時間放置した時、ＣＯＲＭ−３は、ＭｂからＭｂＣＯへの転化（データは示されていない）によって評価された通りの、ＣＯを放出する能力の全てを、保持した。これとは対照的に、Krebs−Henseleit 緩衝剤内で調製されたＣＯＲＭ−３は、時間が経過するにつれて、除々に分解し、ＣＯを放出する能力を失ったことが見出された。図１Ｂ及び図１Ｃに示されている如く、室温にて一晩放置された Krebs−Henseleit 緩衝剤内のＣＯＲＭ−３（ｄＣＯＲＭ−３）は、デオキシ−ＭｂをＭｂＣＯに転化させることができなかった。これらのデータは、水の中で調製せしめられたＣＯＲＭ−３が、比較的安定しており、Krebs−Henseleit 緩衝液やリン酸緩衝液の如き生理的溶液が、この金属カルボニル錯体からのＣＯの放出に助力したことを、明らかにしている。
【００４８】
隔離された心臓の調製
オスの Lewis ラット（３００−３５０ｇ）から隔離された心臓が、我々のグループによって以前に記されたランゲンドルフ (Langendorff) 技術 [４] に従い、潅流培養された。簡潔に言うと、心臓は、３７℃（ｐＨ７．４）で９５％のＯ2及び５％のＣＯ2を吹き込んだ Krebs−Henseleit緩衝液（ｍＭの単位：１１９のＮａＣｌ、４．７のＫＣｌ、２．５のＣａＣｌ2、１．６６のＭｇＳＯ4、２４．９のＮａＨＣＯ3、１．１８のＫＨ2ＰＯ4、５．５５のグルコース、２．００のピルビン酸ナトリウム、０．５のＥＧＴＡ）を用いて、急速に刺激され、そして、１５ｍｌ／分の一定流れで潅流培養された。冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）を、大動脈カニューレに接続した圧力変換器 (Grass Instruments 社, Astromed, RI, USA) によって、連続的に測定した。食塩水で満たしたラテックス製のバルーンを、心房を通じて左心室に挿入し、そしてカテーテルによって、第二の圧力変換器に接続した。このバルーンが膨張せしめられて、１０ｍｍＨｇの最初の拡張終期圧（end-diastolic pressure: ＥＤＰ）を与えた。両方の圧力変換器は、コンピューターに接続され、そしてＢｉｏＰａｃTMの器械によってデータを得、添付の AcqknowledgeTM Software（BIOPAC System Inc.)を用いて分析された。左心室によって発生した左室発生圧力（ＬＶＤＰ）、心拍数（ＨＲ）、最大萎縮（＋ｄｐ／ｄｔ）並びに弛緩率（−ｄｐ／ｄｔ）、ＣＣＰ、及びＥＤＰが、潅流培養を行う期間を通じて、連続的に記録された。
【００４９】
虚血再潅流培養モデル
隔離された心臓は、一定の流れにて、３０分間、平衡となるようにされ、その後、緩衝液の潅流培養を中断することによって、全体的に虚血させた。虚血を起した心臓を、水ジャケット付き (water-jacketed) チャンバ内で、３０分間、３７℃で保持した後、６０分間、再潅流培養した。上記に報告された実験的プロトコルを通じて、全ての血流力学のパラメータを、モニターした。虚血の発生前に１０分間、及び、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）分析のために、再潅流培養の最後の１０分間に、肺動脈から、Krebs 緩衝液が、集められた。再潅流培養の終わりに、組織の生存率を評価するため、テトラゾリウムレッドを用いて、心臓を染色した。追加的な実験においては、虚血の起きた心臓は、再潅流培養の始めの１０分間の間、大動脈カニューレのサイド・アームに接続したシリンジポンプ経由にて、ＣＯＲＭ−３又はｄＣＯＲＭ−３（最終的濃度が１０μＭ）を注入した。ＣＯＲＭ−３にて媒介された心臓保護 (cardioprotection) における、ミトコンドリアのＡＴＰ−依存性カリウムチャンネル（ＫAPT）の潜在的役割について評価するため、対照となる心臓若しくはＣＯＲＭ−３を受けた心臓の虚血の前に、ミトコンドリアのＫAPT 特定の遮断薬である、５−ヒドロキシドデカノエート（５−ＨＤ、最終濃度が５０μＭ）によって、１０分間処理した。
【００５０】
梗塞サイズ及び心筋障害についての確定
組織の生存率を知るため、再潅流培養期間の終わりに、各実験グループからの心臓（ｎ＝５）を、染色した。心臓は、大動脈のカニューレのサイド・アームを通じて、Krebs−Henseleit 緩衝液にテトラゾリウムレッドを入れたもの（３％  ｗ／ｖ）を用いて、３７℃にて、２０分間潅流培養した。テトラゾリウム塩は、生きた心筋の塊を赤く染めたが、前記注入がなされた組織は、染まらず、白く見えた。染色後、心臓は除去され、分析の前に、２％のホルマリン中にて、暗所で保管された。心臓は、注意深く、厚さ２ｍｍの部分に切り分けられ、AGFA Arcus（商標）IIのスキャナーを用いて、コンピューターに読み込
み、合計の虚血サイズを、容積測定（Scion Image（商標）, Scion Corporation, MA, USA)によって、確定した。心筋の障害は、市販されている、Sigma Diagnostic 社 (Poole, Dorset)の分光学的分析の測定キット（ＤＧ１４７−Ａ）を用いて、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）の、潅水への遊離によって測定した。
【００５１】
結果
虚血再潅流培養を受けた心臓の機能的回復に対するＣＯＲＭ−３の潜在的な有益な効果について評価するために、血流力学的、生化学的、及び組織学的パラメータが、測定された。図２Ａ、図２Ｂ、及び図２Ｃに示されているように、再潅流培養においてＣＯＲＭ−３を用いて処理された心臓の、心臓機能は、対照となる心臓（図中に”ＣＯＮ”として示されている）に比べて著しく高かった。６０分間の再潅流培養後、対照の心臓が、ベースラインと比較して、左室発生圧力（ＬＶＤＰ）に、３４％の減少を示したのに対し、ＣＯＲＭ−３の存在下にて再潅流培養がなされた心臓は、このパラメータにおいて、４４％増加した（ｐ＜０．０５、図２Ａ）。ＣＯＲＭ−３が媒体となった、このプラスの（positive) 筋肉萎縮効果は、虚血後の心臓の最大収縮（＋ｄｐ／ｄｔ）及び弛緩（−ｄｐ／ｄｔ）の率について分析する際にも、顕性であった（図２Ｂ及び図２Ｃ参照）。虚血再潅流培養後の対照の心臓に、＋ｄｐ／ｄｔ及び−ｄｐ／ｄｔについての顕著な変化は観察されなかった一方で、ＣＯＲＭ−３の存在下にて再潅流培養された心臓は、＋ｄｐ／ｄｔ（２０９９± ９９から３７２６± ５４２ｍｍＨｇ／ｓ、ｐ＜０．０５）及び−ｄｐ／ｄｔ（１４３２± １４９から２２０７± ２５８ｍｍＨｇ／ｓ、ｐ＜０．０５）の両方に増加が見られた。ＣＯＲＭ−３には、このモデルにおける虚血後の心筋組織の機能不全に特有の、拡張終期圧（ＥＤＰ）及び冠動脈潅流圧（ＣＰＰ）の増加を防ぐ能力もあった。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、対照の心臓が、再潅流培養の終期に、ＥＤＰにおいては３６．９± ８．４ｍｍＨｇ、ＣＰＰにおいては３１．６± ８．８ｍｍＨｇの増加を示したのに対し、ＣＯＲＭ−３は、これらの効果を、著しく減じた（ＥＤＰ及びＣＰＰに対して、それぞれ、３± １．８及び１３± ２．２ｍｍＨｇ；ｐ＜０．０５）。生化学的及び組織学的分析によって、虚血を起した心臓の機能回復の改善に対するＣＯＲＭ−３の有益な効果について、確認された。心臓組織損傷の指標であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の作用は、再潅流培養された対照の心臓の緩衝剤中で高められた（６．５± ２．３から１９．９± ５．３Ｕ／Ｌ）（ｐ＜０．０５、図４Ａ参照）。同様に、再潅流培養期間の終わりに、テトラゾリウムレッドによる心筋組織の染色によって測定された梗塞のサイズは、ＣＯＲＭ−３によって再潅流培養された心臓において、対照と比較した場合（９．５± ２．１％）、著しく（ｐ＜０．０５）減少した（２．３± ０．６％）（図４Ｂ及び図４Ｃ）。測定された全てのパラメータにおいて、ＣＯＲＭ−３によって顕在化せしめられた心臓保護の作用が、再潅流培養の期間内に、この金属カルボニルから遊離したＣＯに帰することができるということに注目するのは、興味深いことである。実際、負の対照であり、ＣＯを放出することができないｄＣＯＲＭ−３（図１Ｂ及び図１Ｃ参照）は、測定された血流力学的、生化学的、及び組織学的パラメータに対しても、いかなる保護効果を促進させることも無かった（図２〜図４参照）。
【００５２】
ＣＯＲＭ−３による心臓保護のメカニズム：  Ｋチャンネルの関与の可能性
カリウムイオン（Ｋ+）は、主たる細胞質及びミトコンドリアのカチオンであり、内膜を横切るＫ+の合計流れは、エネルギー生産（ＡＴＰ）の規則及びカルシウム止血の維持という、何れも細胞の生存に不可欠な内容を含む[１]、ミトコンドリアの活性に対する重大な規制を行う。ＡＴＰに敏感なＫ+チャンネル（ＫATP）は、Ｋ+の流れに対する重要な調節物であり、このチャンネルの開口は、虚血再潅流培養に対する心筋の保護に関係している[１、２、５]。５−ヒドロキシドデカノエート（５−ＨＤ）等の、特定の抑制剤によるＫATPチャンネルの封鎖は、虚血再潅流培養の間に心筋の機能障害及び組織障害を悪化させるものとして示されている[５]。ＣＯは、また、平滑筋細胞内のカルシウム（ＫＣａ）の流れを規制し、脈管の弛緩を媒介する、異なる種類のＫ+チャンネルの開口を活発に行わせるものとして示されている[６、７]。従って、ＣＯＲＭ−３が介在した心筋保護のメカニズムの一部は、ＫATP ミトコンドリアチャンネルの活性を伴い得るとの仮定がなされた。図２、図３、及び図４に示されたデータは、この仮定の確証となる。実際、虚血発生後の再潅流培養中の、心筋の収縮性の保持（ＬＶＤＰ、＋ｄｐ／ｄｔ及び−ｄｐ／ｄｔ）、並びに、心弛緩及び環状動脈圧（ＥＤＰ及びＣＰＰ）の増加防止におけるＣＯＲＭ−３の保護効果は、ＫATP ミトコンドリアチャンネルの抑制剤である５−ＨＤによる、隔離された心臓の前処理によって、完全に破壊された（それぞれ、図２及び図３）。更に、再潅流培養の終わりの時点の緩衝剤中のＣＫの程度、並びに、５−ＨＤ及びＣＯＲＭ−３にて処理された心臓の梗塞サイズの程度は、対照の心臓の場合に類似しており、ＣＯＲＭ−３のみで処理した心臓と比較した場合には、著しく高かった（ｐ＜０．０５）（図４）。このデータは、ＣＯＲＭ−３によって放出せしめられたＣＯが、虚血症状の発現後の心臓の機能を維持するために重要な、ＫATP チャンネルの開口を促し得ることを示している。
【００５３】
合成
図５Ａ〜図５Ｆに示された化合物を得るための合成方法については、ＷＯ  ０２／０９２０７５に開示されており、その内容の全てが、本文中に、参考文献として、組み入れられている。これらのＣＯ放出の化合物は、本発明において有用なものの例である。図５Ａ〜図５ＦにおけるＣＯ放出のデータについては、ＷＯ  ０２／０９２０７５に説明されている。
【００５４】
例として、ＣＯＲＭ−３ Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯ2）の合成について、以下に記す。この製品の純度については、詳細には調査されていない。
【００５５】
Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯ2）[ＭR  ２９４．５]の調製
グリシン錯体。参照番号：ＣＯＲＭ−３
[Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ2］2（０．１２９ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）及びグリシン（０．０３９ｇ，０．５ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（７５ｃｍ3）及びナトリウムエトキシド（０．０３４ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１８時間攪拌することで、反応が起きるようにした。その後、圧力をかけて、この溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾し、過剰の４０−６０軽油を加えた。この黄色の溶液を蒸発させて、薄い黄色の固体（０．１４２ｇ，９６％）を得た。この製品を、密閉ガラス瓶の中で、４℃で保管した。
【００５６】
代替としての、Ｒｕ（ＣＯ）3Ｃｌ（ＮＨ2ＣＨ2ＣＯ2）［ＭR  ２９４．６］の好適な調製
グリシン錯体。参照番号：ＣＯＲＭ−３
［Ｒｕ（ＣＯ）3  Ｃｌ2］2 （０．１２９ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、及びグリシン（０．０３９ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコの中で、窒素下に置いた。メタノール（４０ｃｍ3）及びナトリウムメトキシド（ＭｅＯＨ中０．５Ｍ溶液、１．００ｃｍ3、０．５０ｍｍｏｌ）を加え、１８時間攪拌した。ＨＣｌ（２．０Ｍのジエチルエーテル溶液）を、溶液中の１９８７ｃｍ-1でのＩＲバンド(band) が、ＩＲ分光法によって検知されなくなるまで、少しずつ分割して、添加した。その後、減圧下にて、その溶媒を取り除き、その黄色の残留物を、再度ＴＨＦに溶解して、フィルターで濾過し、過剰の４０−６０軽油を加えた。結果的に得られる沈殿物を、母液をピペットで除去することで隔離し、高度の真空下にて乾燥させた。一度濃縮された母液に対して、同じ作業を繰り返した。この製品の色は、白から薄い黄色の間で異なっており、平均収量：０．１３３ｇ（９０％）にて製造された。
【００５７】
本発明については、上記した模範的な具体例に関連付けて記載してきたが、当業者であれば、ここで開示した内容を得た時に、数多くの同様な修正や変形を加え得ることは、明らかであろう。従って、上記で示した本発明の模範的な具体例は、あくまでも例示的なものであり、本発明を限定するものでは無いことが考慮されるべきである。記載された具体例には、本発明の精神や範囲を逸脱することなく、様々な変更を加えることができるのである。
[参考文献１]  Holmuhamedov EL, Jovanovic S, Dzeja PP, Jovanovic A and Terzic A. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channels modulate cardiac mitochondrial function. Am J Physiol 275: H1567-H1576, 1998.
[参考文献２]  Lawton JS, Hsia PW, McClain LC, Maier GW and Damiano RJ, Jr. Myocardial oxygen consumption in the rabbit heart after ischemia: hyperpolarized arrest with pinacidil versus depolarized hyperkalemic arrest. Circulation 96: II-52, 1997.
[参考文献３]  Motterlini R, Clark JE, Foresti R, Sarathchandra P, Mann BE and Green CJ. Carbon monoxide-releasing molecules: characterization of biochemical and vascular activities. Circ Res 90: E17-E24, 2002.
[参考文献４]  Motterlini R, Samaja M, Tarantola M, Micheletti R and Bianchi G. Functional and metabolic effects of propionyl-L-carnitine in the isolated perfused hypertrophied rat heart. Mol Cell Biochem 116: 139-145, 1992.
[参考文献５]  Wang L, Cherednichenko G, Hernandez L, Halow J, Camacho SA, Figueredo V and Schaefer S. Preconditioning limits mitochondrial Ca2+ during ischemia in rat hearts: role of KATP (channels) . Am J Physiol Heart Circ Physiol 280: H2321-H2328, 2001.
[参考文献６]  Wang R and Wu L. The chemical modification of KCa channels by carbon monoxide in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 272: 8222-8226, 1997.
[参考文献７]  Wu L, Cao K, Lu Y and Wang R. Different mechanisms underlying the stimulation of K(Ca) channels by nitric oxide and carbon monoxide. J Clin Invest 110: 691-700, 2002.
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】トリカルボニルクロロ−（グリシナト）ルテニウム（II）（ＣＯＲＭ−３）の構造を示す図である。
【図１Ｂ】デオキシ−ミオグロビン及びＣＯ−ミオグロビンの吸収スペクトルを示す図である。
【図１Ｃ】ＭｂＣＯの転換を示す図である。
【図２Ａ】隔離され、潅流培養されたラットの心臓に関する、様々な処理の効果を示す図である。
【図２Ｂ】隔離され、潅流培養されたラットの心臓に関する、様々な処理の効果を示す図である。
【図２Ｃ】隔離され、潅流培養されたラットの心臓に関する、様々な処理の効果を示す図である。
【図３Ａ】隔離され、潅流培養されたラットの心臓に関する、様々な処理の効果を示す図である。
【図３Ｂ】隔離され、潅流培養されたラットの心臓に関する、様々な処理の効果を示す図である。
【図４Ａ】組織障害の程度を示す図である。
【図４Ｂ】組織障害の程度を示す図である。
【図４Ｃ】組織障害の程度を示す図である。
【図５Ａ】金属カルボニル化合物を示す図である。
【図５Ｂ】金属カルボニル化合物を示す図である。
【図５Ｃ】金属カルボニル化合物を示す図である。
【図５Ｄ】金属カルボニル化合物を示す図である。
【図５Ｅ】金属カルボニル化合物を示す図である。
【図５Ｆ】金属カルボニル化合物を示す図である。
【図１Ａ】
2006513168.tif 000002
【図１Ｂ】
2006513168.tif 000003
【図１Ｃ】
2006513168.tif 000004
【図２Ａ】
2006513168.tif 000005
【図２Ｂ】
2006513168.tif 000006
【図２Ｃ】
2006513168.tif 000007
【図３Ａ】
2006513168.tif 000008
【図３Ｂ】
2006513168.tif 000009
【図４Ａ】
2006513168.tif 000010
【図４Ｂ】
2006513168.tif 000011
【図４Ｃ】
2006513168.tif 000012
【図５Ａ】
2006513168.tif 000013
【図５Ｂ】
2006513168.tif 000014
【図５Ｃ】
2006513168.tif 000015
【図５Ｄ】
2006513168.tif 000016
【図５Ｅ】
2006513168.tif 000017
【図５Ｆ】
2006513168.tif 000018
【国際調査報告】
2006513168.tif 000019
2006513168.tif 000020
2006513168.tif 000021