(57)【要約】本発明は、血液脳関門のいずれかの側の細胞のリソソームへと輸送され得る酵素に結合体化したｐ９７を、リソソーム蓄積症に罹患している患者に投与することにより、リソソーム蓄積症を処置、改善または予防するための組成物および方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の方法は、リソソーム蓄積症を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該組成物は、欠損すると該疾患を引き起こすタンパク質に共有結合されたｐ９７分子を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム蓄積症を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、薬学的組成物を該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該組成物は、欠損すると該疾患を引き起こすタンパク質に共有結合されたｐ９７分子を含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記投与する工程が、静脈内である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｐ９７分子が、ヒトｐ９７である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐ９７分子が、可溶性ｐ９７である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、α−Ｌ−イズロニダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐ９７分子が、５〜２０原子長のリンカーによって前記タンパク質に共有結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーが、ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
結合体が、ｐ９７と前記タンパク質との融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｐ９７分子が、ヒトｐ９７の対応するドメインの配列と９０％同一である配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、治療有効量の結合体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患が、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症、ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシスＩ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ゴーシェ病、球様細胞白質萎縮、クラッベ病、グリコーゲン蓄積病ＩＩ、ポーンプ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型、テイ−サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型、ザントホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質萎縮、ムコリピドーシスＩ型、シアリドーシスＩ／ＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖沈着症Ｉ型、ムコ多糖沈着症ＩＩ型、ハンター症候群、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＡ型、サンフィリポ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＢ型、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＣ型、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＤ型、ムコ多糖沈着症ＩＶＡ型、モルキオ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＶＢ型モルキオ症候群、ムコ多糖沈着症ＶＩ型、ムコ多糖沈着症ＶＩＩ型、スライ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、ニーマン−ピック病Ａ／Ｂ型、ニーマン−ピック病、ニーマン−ピック病Ｃ１型、ニーマン−ピック病Ｃ２型、ピクノディソストーシス、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型、シンドラー病、およびシアル酸蓄積病からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイントランスポーター、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−アクチベーター欠損症、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、複数のスルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、およびシアル酸トランスポーターからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化合物であって、欠損するとリソソーム蓄積症を引き起こすタンパク質に共有結合されたｐ９７分子を含む、化合物。
【請求項１５】
前記タンパク質が、α−Ｌ−イズロニダーゼである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ｐ９７分子が、可溶性ｐ９７である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、前記ｐ９７分子と前記タンパク質との融合タンパク質である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ｐ９７分子が、４〜２０原子長である連結基によって前記タンパク質に共有結合している、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１９】
前記結合体が、血液脳関門を通過し得、かつ、中枢神経系内の細胞のリソソームに侵入し得る、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２０】
前記タンパク質が、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイントランスポーター、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−アクチベーター欠損症、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、複数のスルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、およびシアル酸トランスポーターからなる群より選択される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項２１】
化合物をリソソーム蓄積症の処置における治療活性についてスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
リソソームを有する細胞を、該化合物と接触させる工程であって、ここで、該化合物は、リソソーム蓄積症において欠損したタンパク質に共有結合したｐ９７を含む、工程；および
該リソソームへの該化合物の送達をモニタリングする工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記化合物が、標識されており、そして前記モニタリングする工程が、該標識を検出する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、前記タンパク質を欠損している、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記モニタリングする工程が、リソソーム蓄積物質に対する前記化合物の影響を決定することによる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、血液脳関門によって保護されていない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
治療有効量の化合物および薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物であって、該化合物は、欠損するとリソソーム蓄積症を引き起こすタンパク質に共有結合されたｐ９７分子を含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、単位投薬形式にある、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記タンパク質が、アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイントランスポーター、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−アクチベーター欠損症、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシンＢ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、複数のスルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、およびシアル酸トランスポーターからなる群より選択される、請求項２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２００２年１月１１日出願の米国仮出願第６０／３４７，７５８号の優先権特権を主張する。米国仮出願第６０／３４７，７５８号は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、製剤学の分野に関連し、特に、治療剤または診断剤に結合体化された、ｐ９７タンパク質またはｐ９７ポリペプチドを被験体に導入することによる疾患の処置に関する。特に、本発明は、ｐ９７とリソソーム蓄積症において欠損しているタンパク質との結合体、ならびにこの結合体をリソソーム蓄積症を有する被験体に投与することによる、このような疾患の処置方法、改善方法または予防方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、細胞のリソソーム内の特定酵素の活性が存在しないことまたは低減していることから生じる。多数のこれらの酵素が同定されており、そしてそれらの関連疾患と関連付けられている。一旦、この失われたかまたは欠損した酵素が同定されると、処置は、補充酵素（薬物）を患者の罹患組織に送達するという問題にされ得る。細胞内では、失われた酵素の効果は、細胞内リソソーム内の分解されていない「蓄積物質」の蓄積と見られ得る。この構成は、リソソームを膨潤して変形させ、細胞および組織が損傷することとなる。リソソーム蓄積症は代表的に遺伝的病因を有するので、多くの組織は、問題の酵素を欠く。しかし、異なる組織は、同じ酵素が異なって存在しない。
逆に、どのようにして組織が罹患するかが、失われた酵素の基質をその組織が生成する程度によって、ある程度決定される。逆に、蓄積によって最も苦しむ組織の種類は、どのようにして薬物がその患者に投与されるべきであるかを指示する。静脈内酵素補充治療（ＥＲＴ）はＬＳＤ（例えば、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ）に有益であるが、このような疾患においてリソソームへの治療酵素の送達を増強するための手段は、コストを低減しかつ治療効力を上昇させるに関して有益である。
【０００４】
さらに、血液脳関門（ＢＢＢ）は、血液から脳への多くの因子の自由な移動をブロックする。このために、有利な神経学的影響を提示するＬＳＤ（例えば、ＭＰＳ  ＩＩＩ、ＭＬＤ、ＧＭ１）は、静脈内ＥＲＴに対して応答性であるとは期待されない。このような疾患に関しては、ＢＢＢを越えて罹患細胞のリソソーム内へとこの酵素を送達する方法が非常に望ましい。
【０００５】
１９８０年代初頭には、メラノトランスフェリン（ｍｅｌａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）（ＭＴｆ）またはｐ９７が、正常組織において発現されないかまたはわずかにしか発現されないかのいずれかであって、腫瘍細胞（特に、悪性黒色腫細胞）および胎児組織においてずっと多量に見出される、腫瘍胎児抗原として同定された（Ｗｏｏｄｂｕｒｙら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７７：２１８３−２１８７（１９８０））。より最近では、ヒトＭＴｆが正常組織（汗腺管、肝臓内皮細胞、ならびに脳の内皮および反応性小神経膠細胞を含む）において同定されたというさらなる報告が存在する（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１２：１２２−１２６（１９９６）；およびＲｏｔｈｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，７１２：１１７−１２１（１９９６））。興味深いことに、正常血清は、非常に低レベルの可溶性循環ＭＴｆを含むが、増加した可溶性血清ＭＴｆが、進行したアルツハイマー病を有する患者において見出されている（Ｋｅｎｎａｒｄら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２：１２３０−１２３５（１９９６）；米国特許第５，９８１，１９４号）。
【０００６】
ＭＴｆの生化学的役割および代謝は、解明することが困難であることが証明されている。外観に基づくと、ＭＦｔは、一見、トランスフェリン（Ｔｆ）およびラクトトランスフェリン（ラクトフェリンまたはＬｆ）に類似している。ヒトでは、これらのタンパク質は、３７％〜３９％のアミノ酸配列相同性を共有する。特に、これらのタンパク質の各々は、鉄に可逆的に結合し、そしてそれらのＮ末端鉄結合ドメインは、極めて類似する（Ｂａｋｅｒら，ＴＩＢＳ，１２：３５０−３５３（１９８７））。
【０００７】
しかし、これらのタンパク質の間での機能的類似は確認されていない。まず第１に、ＴｆおよびＬｆとは異なり、ＭＴｆは、膜結合形態および血清可溶性形態の両方で存在する。さらに、ＴｆおよびＬｆとは対照的に、ＭＴｆについての細胞レセプターは同定されていない。血清可溶性Ｔｆは、トランスフェリンレセプター（Ｔｆ−Ｒ）によって媒介されるエネルギー依存性プロセスにおいて細胞に取り込まれることが公知である（Ｃｏｏｋら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，４４：６３−７４）（１９９３））。Ｌｆのインターナリゼーションもまた、レセプター（ｒｃｅｐｔｏｒ）媒介プロセスによって媒介されるようである（Ｆｉｌｌｅｂｅｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（１１）：７０１−７０１７（１９９９））。Ｌｆについての２つの既知のレセプターは、ＬＲＰ−１およびＲＡＧＥであるが、他のレセプターも存在し得る（Ｍｅｌｉｎｇｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６０：７０−７４（１９９５）；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（１３）：９８８２−９８８８（１９９４））。
【０００８】
中枢神経系（例えば、脳、脊髄）に関して、送達を増強するための少なくとも３つの方法が存在する：直接注射、ＢＢＢの透過化、および薬物の改変。直接注射は、脳組織への薬物の注射を含み、血管系を完全にバイパスする。この方法は、頭蓋内注射によって引き起こされる合併症（感染、組織損傷）の危険性を主に被る。この危険性は、患者の生涯にわたって適用される定期的処置レジメンの状況が考えられるとき、一層ひどくなる。制限された数の単一部位注射を用いて、血管（それゆえ、潜在的に薬物）が脳全体に有する透過を一致させることもまた困難である。
【０００９】
第２の方法は、静脈内薬物の付随注射を用いてＢＢＢを損なうことを非特異的に伴う。ＢＢＢの透過化は、化学的に達成される。この方法は、特異性の欠如を被る。ＢＢＢによって必ず排除される、血液中の全ての成分は、この薬物とともに脳に入る。この脳は、これらの条件では無防備なままであり、そして生涯にわたる処置レジメンの過程にわたって、損傷が予想される。
【００１０】
血液によって運ばれる薬物の脳利用可能性を増大させる第３の手段は、損なわれていないＢＢＢを通しての輸送を促進する部分を用いた、薬物の特異的官能基化を伴う。この方法は、特異的ＢＢＢ浸潤および便利な静脈内投与の利点を有する。治療薬剤がこの血液脳関門を越える能力を増大させる方法は、米国特許第６，４５５，４９４号に教示される。米国特許第６，４５５，４９４号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。米国特許第６，４５５，４９４号は、血液脳関門を越えて治療薬物を送達するためのキャリアとしてのｐ９７の使用を開示する。
【００１１】
ｐ９７（メラノトランスフェリン）は、天然に存在するヒトタンパク質である。ｐ９７は、ヒト黒色腫についての細胞表面マーカー（黒色腫関連抗原）であることが見出されて特徴付けられたが、より最近では、他の腫瘍型ならびにヒトの正常な脳組織および肝臓組織においても見出されており、他の身体組織および血清においても微量に見出されている。身体におけるｐ９７の役割は未知であるが、その構造および結合特性に基づいて、これは、細胞への金属イオン（例えば、鉄）の輸送に関与すると考えられる。Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓらは、１９９２年からｐ９７について研究している（米国特許第５，９８１，１９４号）。これらの研究者は、ｐ９７について、アルツハイマー病（ＡＤ）についての診断マーカーとして焦点を当てている。Ｓｙｎａｐｓｅは、ｐ９７の血清レベルが、この疾患の進行に伴って上昇するという知見に基づく、ＡＤについての血液（血清）試験を開発した。この試験の開発の間、ｐ９７が血液から正常個体の脳組織内へと能動輸送されることが見出された。この知見は、分子を血液から、ＢＢＢを越えて脳間質液へと到達させるための潜在的輸送系としてのｐ９７の開発についての起動力であった。
【００１２】
脳内への治療薬剤の成功裏の送達についての重要な事象は、これらの大きな分子を、ＢＢＢを構成する毛細管内皮細胞の強固なネットワークを越えて輸送することである。最近数年の間、インビトロおよび動物モデルの両方において、ｐ９７に化学的に連結された、合成低分子、大きな糖タンパク質酵素、および大きな無機粒子（５ｎｍのコロイド状金粒子）が、ＢＢＢを越えて脳細胞へと輸送され得ることが示されている。ＢＢＢを越えた大きな分子のこのような輸送は、トランスサイトーシスとして公知のプロセスを含む。これは、分子が血液から取り出されて、その他の点でインタクトなＢＢＢの毛細管細胞を通して脳組織へと輸送される機構である。
【００１３】
トランスサイトーシス経路は、毛細管内皮細胞内の他の小胞輸送とは別個であり、そして移行は、輸送物質の変化を伴わずに生じる。トランスサイトーシスは、ＢＢＢ内皮表面でのレセプターによって媒介される細胞型特異的プロセスである。ＢＢＢを越えたｐ９７−結合体（すなわち、高分子に化学的に連結したｐ９７）の輸送は、トランスサイトーシスによって生じる。酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（酵素「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」の一例）に結合体化されたｐ９７は、ＢＢＢを越えて輸送され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＬＳＤの有効処置に関して、治療薬剤（例えば、欠損した酵素、または所望の治療活性もしくは失われた酵素活性を有する、別の酵素もしくはタンパク質）は、罹患した細胞によって取り込まれ、そしてリソソーム（ここで、治療薬剤は、その中に存在する過剰量または有害量の蓄積物質に作用する）へと経路が定められなければならない。出願人は、治療薬剤（ＬＳＤにおいて欠損しているタンパク質または酵素が挙げられる）の送達を細胞のリソソームへと標的化するためのｐ９７タンパク質の使用を含む、ＬＳＤを処置するための、以下の組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、ｐ９７と治療薬剤との結合体（ここで、この薬剤は、ｐ９７またはそのフラグメントもしくは一部分に共有結合されている）が、ＣＮＳ内の細胞およびＣＮＳ外細胞のリソソームへのこの薬剤の送達を増強するための優れたビヒクルであるという知見に関する。それゆえ、第１の局面では、本発明は、細胞のリソソームへの治療薬剤の送達方法を提供する。第２の局面では、本発明は、治療薬剤（これは、リソソーム蓄積症を有する被験体のリソソームにおいて欠損しているタンパク質または酵素である）に共有結合されたｐ９７分子を投与することによって、患者におけるリソソーム蓄積症を処置する方法（例えば、酵素補充治療）を提供する。このようなｐ９７−薬剤結合体は、例えば、リソソームタンパク質欠損が、その疾患状態に寄与する、リソソーム蓄積症（例えば、ＭＰＳ  Ｉ、ＭＰＳ  ＩＩ、ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ａ、ＭＰＳ  ＩＩＩ  Ｂ、異染性白質萎縮症、ゴーシェ病、クラッベ病、ポーンプ病、ＣＬＮ２病、ニーマン−ピック病およびテイ−サックス病）の処置において特に有用である。第３の局面では、本発明は、リソソーム蓄積症において欠損したタンパク質または酵素に共有結合されたｐ９７分子を含む薬学的組成物を提供する。第４の局面では、本発明は、薬剤をリソソームへと送達する際に有用である、ｐ９７結合体を同定するための方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、以下のようなリソソーム蓄積症を処置するために用いられ得る：アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル貯蔵病／ウォルマン病、シスチン蓄積症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー脂肪肉芽腫症／ファーバー病、フコース蓄積症、ガラクトシアリドーシス（Ｇａｌａｃｔｏｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ）Ｉ／ＩＩ型、ゴーシェ病Ｉ／ＩＩ  ＩＩＩ型、ゴーシェ病、球様白質萎縮／クラッベ病、グリコーゲン蓄積病ＩＩ／ポーンプ病、ＧＭ１−ガングリオシドーシスＩ／ＩＩ／ＩＩＩ型、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩ型／テイ−サックス病、ＧＭ２−ガングリオシドーシスＩＩ型ザントホフ病、ＧＭ２−ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスＩ／ＩＩ型、β−マンノシドーシス、異染性白質萎縮、ムコリピドーシスＩ型／シアリドーシスＩ／ＩＩ型ムコリピドーシスＩＩ／ＩＩＩ型Ｉ細胞病、ムコリピドーシスＩＩＩＣ型偽性ハーラーポリジストロフィー、ムコ多糖沈着症Ｉ型、ムコ多糖沈着症ＩＩ型ハンター症候群、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＡ型サンフィリポ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＢ型サンフィリポ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＣ型サンフィリポ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＩＩＤ型サンフィリポ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＶＡ型モルキオ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＶＢ型モルキオ症候群、ムコ多糖沈着症ＶＩ型、ムコ多糖沈着症ＶＩＩ型スライ症候群、ムコ多糖沈着症ＩＸ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ１バッテン病、神経セロイドリポフスチノーシス、ＣＬＮ２バッテン病、ニーマン−ピック病Ａ／Ｂ型ニーマン−ピック病、ニーマン−ピック病Ｃ１型ニーマン−ピック病、ニーマン−ピック病Ｃ２型ニーマン−ピック病、ピクノディソストーシス（Ｐｙｃｎｏｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、シンドラー病Ｉ／ＩＩ型シンドラー病、およびシアル酸蓄積病。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ｐ９７結合体組成物は、単一のｐ９７分子に連結された、約１分子〜約５分子の目的の薬剤を含む。いくつかの実施形態では、１より多くの目的の薬剤が、単一のｐ９７分子に連結され得る。ｐ９７−薬剤の選択的生体分布は、ｐ９７連結薬剤を特定の器官へと選択的に標的化することを増強し得る。
【００１８】
さらに、本発明は、リソソームを含む細胞を、この結合体と接触させ、そしてこの結合体が、このリソソームへとこの薬剤を送達するか否かを決定することによって、リソソーム蓄積症を予防、改善、または処置し得るｐ９７−薬剤結合体を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。この送達は、この結合体を標識し、次いで細胞内でのこの標識の位置をモニタリングもしくは検出すること、またはリソソーム内で見出される蓄積物質の量に対するその結合体の影響を決定することによって、評価され得る。好ましい実施形態では、この薬剤は、リソソーム蓄積症において欠損している、タンパク質または酵素である。別の実施形態では、この細胞は、このｐ９７分子に結合体化された薬剤が欠損している。
【００１９】
いくつかの実施形態では、この方法は、リソソーム蓄積症を処置し、ここで、処置されるべき組織は、血液脳関門によって、循環器系から孤立している（例えば、脳）。１つの実施形態では、本発明は、被験体の血液脳関門を通してこの被験体の細胞のリソソームへと目的の化合物を送達するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：結合体化された薬剤をこの被験体に投与し、それによって、この結合体化剤は、この被験体の血液脳関門を通過し、そしてそれによって、この薬剤が、この被験体の細胞のリソソーム内に入る工程（ここで、この結合体化された薬剤が、リンカーを介してこの薬剤に連結されたメラノトランスフェリンを含む）。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、被験体のリソソーム蓄積症を処置、改善、または予防するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：結合体化された薬剤を被験体に投与し、それによって、この薬剤は、この被験体の末梢細胞（例えば、非ＣＮＳ細胞）のリソソームに入る工程（ここで、この結合体化剤は、リンカーを介して目的の薬剤に連結されたメラノトランスフェリンを含む）。
【００２１】
なお別の実施形態では、本発明は、酵素補充治療の方法を提供し、この方法は、以下を包含する：結合体化剤を、酵素置換治療を必要とする被験体へと投与し、それによって、この結合体化剤は、この被験体の血液脳関門を通過し、それによって、この細胞への損傷を予防または低減するに充分な量のこの酵素が、リソソームへと入る工程（ここで、この結合体化剤は、リンカーを介して酵素へと連結されたメラノトランスフェリンを含み、ここで、この患者の細胞は、この細胞への損傷を予防または低減するには不充分な量のこの酵素を含むリソソームを有する）。
【００２２】
なお別の実施形態では、本発明は、脳において見出される細胞のリソソーム内に酵素が存在しないことに起因するリソソーム蓄積症を罹患する患者を処置するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：この患者に結合体化剤を投与し、それによって、この結合体化剤は、この患者の血液脳関門を通過し、それによって、この細胞への損傷を予防または低減するに充分な量のこの酵素が、このリソソームに入る（ここで、この結合体化剤は、リンカーを介してこの酵素へと連結されたｐ９７を含む）。
【００２３】
なおさらに別の実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症を予防、改善または処置し得る薬剤を同定するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：ｐ９７結合体化剤を細胞へと投与する工程であって、ここで、この酵素が存在しないことにより、このリソソーム蓄積症が引き起こされる、工程；およびこの薬剤が、この細胞に対する損傷を、この結合体化剤がこの細胞に投与されない場合のこの細胞に対する損傷と比較して低減するか否かを決定する工程。特定の実施形態では、この方法は、ハイスループットアッセイである。
【００２４】
さらなる実施形態では、本発明は、結合体化剤を含む新規の組成物を提供し、ここで、この結合体化剤は、リンカーを介して酵素に連結されたｐ９７分子を含み、ここで、この酵素は、ＢＢＢ内に含まれる細胞のリソソームにおいて見出される酵素（例えば、本明細書中に示される酵素）である。この組成物は、適切な薬学的キャリアをさらに含み得る。
【００２５】
さらに、本発明は、この結合体化剤を含むリソソームを提供する。本発明はまた、この結合体化剤を含むリソソームを含む細胞を提供する。好ましくは、この細胞は、血液脳関門によって取り囲まれて見出される細胞である。より好ましくは、この細胞は、ニューロンまたは脳細胞である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ｐ９７−薬剤結合体は、以下のタンパク質のうちの任意の１つを、ｐ９７分子に共有結合された活性薬剤として含む：アスパルチルグルコサミニダーゼ、酸性リパーゼ、システイントランスポーター、Ｌａｍｐ−２、α−ガラクトシダーゼＡ、酸性セラミダーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼＡ、ＧＭ２−アクチベーター欠損症、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、サポシン（ｓａｐｏｓｉｎ）Ｂ、ノイラミニダーゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼホスホトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼγ−サブユニット、Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルＣｏＡ：Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼ、ガラクトース６−スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、複数のスルファターゼ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンＫ、α−ガラクトシダーゼＢ、シアル酸トランスポーター。いくつかの実施形態では、この薬剤は、ヒトまたは哺乳動物の配列、起源または派生物のタンパク質である。ｐ９７タンパク質またはｐ９７フラグメントはまた、ヒトまたは哺乳動物の配列、起源または派生物であり得る。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．緒言）
本発明は一般に、リソソーム蓄積症に罹患した細胞のリソソームへの、リソソーム蓄積症関連薬剤の増強された送達のための、方法および組成物を提供する。本発明は、ＭＴｆまたはｐ９７タンパク質およびそれらのフラグメントが、血液脳関門を越えるトランスサイトーシスを受けるだけでなく、リソソームへも輸送されるという驚くべき知見に関する。その結果、血液脳関門を越えて薬剤を送達するためのビヒクルであることが実証されたｐ９７分子もまた驚くべきことに、タンパク質または酵素の欠損により生じるリソソーム蓄積症の処置のために、欠損したタンパク質または酵素をリソソームへと送達する手段としても特に有用である。
【００２８】
本発明の結合体薬剤は、リソソーム蓄積症の処置において多くの重要な利点を提供する。ＭＴｆまたはｐ９７は、ヒト細胞に種々のレベルで通常見出される天然の化合物である。ｐ９７はヒトの天然のタンパク質であるので、反復注射における使用を治療不応性にする、Ｍａｂ治療の使用については頻繁にそうであるような免疫学的過剰応答性をもたらさないようである。
【００２９】
薬物送達に関して、ｐ９７系は、ＢＢＢを迅速に（１時間以内に）越えることができ、かつ１２時間以内に代謝され、従って、これは、効率的に組織から除去される。これらの特徴は、レセプターの飽和を伴わずに、反復注射の機会を提供する。さらに、ｐ９７は、内因性トランスフェリンと競合しない。内因性トランスフェリンの量は、血清中ｐ９７よりも１０，０００倍多いと見積もられている。従って、トランスフェリンは、治療薬剤をｐ９７へと共有結合するかまたは他の方法で連結することによって治療薬剤を送達する方法と競合しない。タンパク質ｐ９７は、あったとしても、ほとんど毒性を示さない。ｐ９７タンパク質は生分解性であり、長期にわたっては循環しない。このタンパク質は、ＢＢＢを越える実証された能力を有し、そして脳の血管床の内側を覆う内皮細胞へのその親和性に起因して、ｐ９７ベクターは、結合体化された薬剤または他の方法で結合された薬剤を脳組織内に位置するリソソームへと送達するために特に有用である。
【００３０】
（ＩＩ．定義）
他の方法で規定しない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に引用される各刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示と矛盾しない程度に、その全体が参考として援用される。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、複数形の言及を包含することが本明細書で留意される。
【００３２】
ＭＴｆまたはｐ９７としては、膜結合型ｐ９７（すなわち、ＧＰＩアンカーまたは何らかの他のアンカーに結合したｐ９７）、分泌されたｐ９７、可溶性ｐ９７、切断されたｐ９７、ｐ９７の機能的等価物であるｐ９７のアナログ（一般に、それらの対応するアミノ酸配列の４０％、６０％、８０％、９０％または９５％よりも高い相同性を有し、そしてｐ９７の対立遺伝子改変体を含む）、ヒト、マウス、ニワトリおよび／またはウサギのｐ９７、ならびにそれらの誘導体、部分、またはフラグメントが挙げられる。ｐ９７は、酸性塩の形態であっても、塩基性塩の形態であってもよく、またはその中性の形態であってもよい。さらに、個々のアミノ酸残基は、例えば、酸化または還元によって改変され得る。さらに、種々の置換、欠失、または付加がアミノ酸配列または核酸配列に対して行われ得、その正味の影響は、ｐ９７の所望の生物学的活性を保持または改善するものである。例えば、コードの縮重に起因して、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列において、かなりのバリエーションが存在し得る。ｐ９７の完全アミノ酸配列を含め、ｐ９７のさらなる特徴付けは、米国特許第５，９８１，１９４号に見出される。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、ｐ９７フラグメントは、ＭＴｆもしくはＬＲＰ１もしくはＬＲＰ１Ｂレセプターに結合し、かつ血液関門を越えて輸送されるのを可能にするに充分な部分のｐ９７を含む、ｐ９７もしくはその生物学的に等価なアナログの任意の部分；またはリソソームへの薬剤のトランスサイトーシスおよび／もしくは送達におけるｐ９７の所望の生物学的活性を他の点で保持もしくは改善する、ｐ９７もしくはその生物学的に等価なアナログの任意の部分を包含する。
【００３４】
診断薬剤および治療薬剤としてのｐ９７の作製および使用に関するさらなる教示は、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ９３／００２７２号および米国特許第５，９８１，１９４号に見出される。これらの開示は、その全体が、参考として援用される。
【００３５】
「調節する」とは、本明細書中で用いられる場合、増加または減少する（例えば、アンタゴニストまたはアゴニストとして作用する）ことによって改変する能力をいう。
【００３６】
「メラノトランスフェリンレセプター」（「ＭＴｆ−Ｒ」）は、本明細書中で用いられる場合、ＭＴｆに特異的または優先的に結合する、任意の生物学的系をいう。この用語は、Ｌｆおよび／またはβ−アミロイドタンパク質を競合的に結合するレセプターを包含するが、Ｔｆに特異的であるレセプター（例えば、トランスフェリンレセプター（Ｔｆ−Ｒ）（これは、ＯＭＩＭ  ＃＊１９００１０に記載され、そしてこれはまた、ＴＦＲ、ＴＲＦＲおよびＣＤ７１としても公知である））を排除することを意図する。Ｌｆに特異的または優先的に結合することが公知のレセプターは、本明細書中で、「ラクトトランスフェリンレセプター」（Ｌｆ−Ｒ）と呼ばれる。公知のＬｆ−Ｒとしては、ＬＤＬ関連レセプターが挙げられるがこれに限定されない。公知のＬＤＬ関連レセプターは、リポタンパク質レセプター関連タンパク質／α２−マクログロブリンレセプター（「ＬＲＰ１」）である。用語ＭＴｆ−Ｒは特に、ＭＴｆおよびＬｆの両方に特異的に結合するが、Ｔｆには特異的に結合しない、内皮細胞上に見出される他のレセプターを包含する。好ましい実施形態では、ＭＴｆ−Ｒは、ＬＲＰ１である。より好ましい実施形態では、ＭＴｆ−Ｒは、ＬＲＰ１Ｂである。
【００３７】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターファミリーのメンバーとしては、ＬＤＬ−Ｒ（１３２ｋＤａ）；ＬＲＰ／ＬＲＰ１およびＬＲＰ１Ｂ（６００ｋＤａ）；Ｍｅｇａｌｉｎ（（ＬＲＰ２）、６００ｋＤａ）；ＶＬＤＬ−Ｒ（１３０ｋＤａ）；ＥＲ−２（ＬＲＰ−８、１３０ｋＤａ）；Ｍｏｓａｉｃ  ＬＤＬ−Ｒ（ＬＲ１１、２５０ｋＤａ）；および他のメンバー（例えば、ＬＲＰ３、ＬＲＰ６、およびＬＲＰ−７）が挙げられる。ＬＤＬ−Ｒファミリーの特有の特徴としては、細胞表面発現；細胞外リガンド結合ドメイン反復（ＤｘＳＤＥ）；リガンド結合についてのＣａ＋＋の必要性；ＲＡＰおよびＡｐｏＥの認識；ＥＧＦ前駆体相同性ドメイン反復（ＹＷＴＤ）；１回膜貫通領域；細胞質ドメイン（ＦＤＮＰＸＹ）におけるインターナリゼーションシグナル；ならびに種々のリガンドのレセプター媒介エンドサイトーシスが挙げられる。
【００３８】
ＬＲＰとは、低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質およびこのレセプターファミリーのメンバーをいう。ＬＲＰは、フリン（ｆｕｒｉｎ）によって切断されて、非共有結合的に結合されたままの５１５−（α）ｋＤａおよび８５−（β）ｋＤａの２つのサブユニットを生成する、４５２５アミノ酸（６００ｋＤａ）の大きなタンパク質である。ＬＲＰは、肝臓、腎臓、ニューロン、ＣＮＳ、ＢＢＢ、ＳＭＣおよび種々の培養細胞において主に発現される。
【００３９】
ＬＲＰリガンドとは、ＬＲＰに結合することが公知の多数の分子をいう。これらの分子としては、例えば、ラクトフェリン、ＲＡＰ、リポタンパク質リパーゼ、ＡｐｏＥ、第ＶＩＩＩ因子、β−アミロイド前駆体、α２−マクログロブリン、トロンボスポンジン２  ＭＭＰ−２、ＭＰＰ−９−ＴＩＭＰ−１；ｕＰＡ：ＰＡＩ−Ｉ：ｕＰＡＲ；およびｔＰＡ：ＰＡＩ−１：ｕＰＡＲが挙げられる。
【００４０】
ＬＲＰ  １Ｂは、低密度リポタンパク質レセプターファミリーのうちの、近年発見されたメンバーである。６００ｋＤａの多機能性細胞表面レセプター。Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：２８８８９−２８８９６（２００１）を参照のこと。Ｌｉｕら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６９，２７１−２７４（２０００）；およびＬｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，１９６１−１９６７（２０００）もまた参照のこと。このレセプターは、メガリン（ｍｅｇａｌｉｎ）よりもＬＲＰにより密接に関連し、そしてｃＤＮＡレベルで５９％の相同性を共有し、そして推定アミノ酸レベルで５２％の相同性を共有する。ＬＲＰ  １Ｂ遺伝子は、脳、甲状腺および唾液腺において発現される。ＬＲＰ  １Ｂについての公知のリガンドとしては、ＲＡＰ、ｔＰＡ、ＰＡＩ−１が挙げられる。
【００４１】
マウスＬＲＰ１Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ  １４３０２３  ＸＭ  １３０２４１を通してアクセス可能である。ヒトＬＲＰ１Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ  ０１５４５２を通してアクセス可能である。
【００４２】
「リポタンパク質レセプター関連タンパク質／α２−マクログロブリンレセプター」（「ＬＲＰ１」）は、本明細書中で用いられる場合、多機能性レセプターをいう。ＬＤＬレセプターにおいて見出される結合反復と類似する、システインリッチなＡ型結合反復のクラスター形成が、以前は無関係と考えられていた種々のリガンド（活性化α−２−マクログロブリン、アポリポタンパク質Ｅ、リポタンパク質リパーゼ、プラスミノーゲンアクチベーターおよびそれらのインヒビターとの複合体（ＰＡおよびＰＡ／ＰＡＩ−１）、リポタンパク質（ａ）、シュードモナス属対外毒素Ａ、ヒトライノウイルス、Ｌｆならびにいわゆるレセプター関連タンパク質（ＲＡＰ））を結合する能力の分子的基礎であると考えられる。Ｍｅｉｌｉｎｇｅｒら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．，３６０：７０−７４（１９９５）を参照のこと。ＬＲＰＩは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ  １３９１６およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ登録番号Ｑ０７９５４を通してアクセス可能である。ＬＲＰ１遺伝子／タンパク質についての別名としては、以下が挙げられる：低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１［前駆体］、ＬＲＰ、α−２−マクログロブリンレセプター、Ａ２ＭＲ、アポリポタンパク質Ｅレセプター、ＡＰＯＥＲ、ＣＤ９１、ＬＲＰ１またはＡ２ＭＲ。
【００４３】
「ｐ９７結合体」とは、薬剤に共有結合されたｐ９７（またはそのフラグメント）を含む組成物をいう。結合体化は、化学的結合体化である限り、直接的または間接的（すなわち、伸張したリンカーを通して）であり得る。本発明の組成物の一般的構築物は、図３に示される。
【００４４】
この薬剤は、哺乳動物、特にヒトにおけるリソソーム蓄積症の処置において、治療目的または予防目的を提供し得る。
【００４５】
「増加する相対的送達」は、本明細書中で用いられる場合、リソソームにおけるｐ９７結合体化剤の蓄積が、元々の薬剤の蓄積と比較して増加する効果をいう。
【００４６】
「治療指数」とは、最小治療量より多く、かつ受け入れられないほど毒性の量よりも少ない、用量範囲（量および／またはタイミング）をいう
「等価用量」とは、同じ量の活性薬剤を含む用量をいう。
【００４７】
ｐ９７−薬剤結合体は、ｐ９７に連結された１以上の薬剤部分（例えば、１〜１０個または１〜４個または２〜３個の部分）を含み得る。例えば、結合体化反応は、１〜４個以上のα−Ｌ−イズロニダーゼ分子を単一のｐ９７分子へと結合体化させ得る。これらの処方物は、混合物として用いられ得るか、またはこれらは、特定のｐ９７：薬剤（ｍｏｌ：ｍｏｌ）処方物へと精製され得る。当業者は、どの形式およびどのｍｏｌ：ｍｏｌ比が好ましいかを決定し得る。さらに、薬剤の混合物は、蓄積された基質のより完全な分解を促進するために、ｐ９７へと連結され得る。これらのｐ９７−薬剤は、一定範囲のｍｏｌ：ｍｏｌ比からなり得る。これらはまた、精製混合物へと分離され得るか、または凝集物として用いられ得る。
【００４８】
ｐ９７結合体化剤は、ＣＮＳ内またはＣＮＳを含まない細胞のリソソーム内に侵入し得るかまたはリソソーム内に輸送され得るかまたは最終的にリソソーム内に存在し得る。結合体化剤の通過速度は、ＭＴｆレセプターの活性を調節し得る、任意の化合物またはタンパク質によって調節され得る。このようなモジュレーターを同定または決定するための方法は、米国仮特許出願第６０／３０８，００２号および米国特許出願第１０／２０６，４４８号（２００２年７月２５日出願）に開示される。これらの開示は、その全体が参考として援用される。細胞は、リソソーム蓄積症に罹患した、任意の組織または器官系由来であり得る。細胞は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、心臓細胞、骨細胞、肺細胞、脂肪細胞、腎臓細胞または肝臓細胞であり得る。いくつかの実施形態では、この細胞は、好ましくは、ＢＢＢ内に見出される細胞である。いくつかの実施形態では、この細胞は、ニューロンまたは脳細胞である。他の実施形態では、この細胞は、末梢の細胞または全身循環から内皮（例えば、ＢＢＢの内皮）によって隔離されていない細胞である。
【００４９】
この薬剤は、タンパク質もしくは酵素、またはいくらか（実質的に全て）またはこの酵素の全ての活性を依然として保持するような任意のフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、このタンパク質または酵素は、発現も産生もされない場合、または発現もしくは産生が実質的に低減した場合に、リソソーム蓄積症を生じる、タンパク質または酵素である。好ましくは、このタンパク質または酵素は、ヒトまたはマウスに由来するかまたはこれらから入手される。いくつかの実施形態では、ヒトＬＳＤの処置において、ｐ９７−薬剤結合体は、処置されるべき被験体もしくは患者において欠損している、リソソーム蓄積酵素症において欠損している、タンパク質もしくは酵素を含む。このような酵素としては、例えば、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アリールスルファターゼＡ、ガラクトシルセラミダーゼ（Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄａｓｅ）、酸性α−グルコシダーゼ、チオエステラーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、酸性スピンゴミエリナーゼ（Ａｃｉｄ  Ｓｐｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ）、α−ガラクトシダーゼ、または任意の他のリソソーム蓄積酵素が挙げられる。リソソーム蓄積症およびそこで欠損しているタンパク質の表は以下の通りである：
【００５０】
【表１】
2006506317.tif 000002
メラノトランスフェリンまたはｐ９７およびこの薬剤は、互いに直接的または間接的に（すなわち、伸張されたリンカーを介して）結合体化される。このリンカーは、共有結合または事実上任意のアミノ酸配列のペプチドまたはメラノトランスフェリンもしくはｐ９７とこの薬剤とを結合体化し得る任意の分子を含み得る。このリンカーが共有結合またはペプチドであるならば、結合体全体は、融合タンパク質であり得る。このような融合タンパク質は、当業者に公知の組換え遺伝子操作方法によって生成され得る。
【００５１】
本発明によるｐ９７−酵素結合体は、所望により、その安定性または薬理学的特性を増強するために改変（例えば、ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ））され得る。
【００５２】
（ＩＩＩ．組成物およびその調製）
一般に、ｐ９７−結合体は、当該分野で周知の技術を用いて調製され得る。薬剤へのポリペプチド（例えば、ｐ９７）の結合体化または化学的架橋について、多数のアプローチが存在し、そして当業者は、特定の薬剤を結合体化するためにどの方法が最も適切であるかを決定し得る。用いられる方法は、一旦送達されると、ｐ９７がそのレセプターに結合する能力を妨害することなく（好ましくは、ｐ９７単独と比較して、ｐ９７−薬剤の生体分布に影響を与えることなく、そして／またはその薬剤の所望の活性（それは、治療的もしくは予防的などである）を大きく変更することなく）、この薬剤とｐ９７とを、連結し得なければならない。ｐ９７を種々の薬剤に結合体化する好ましい方法は、以下の実施例の節に記載される。複雑な分子をｐ９７へと連結するための特に好ましい方法は、ＳＡＴＡ／スルホ−ＳＭＣＣ架橋反応である（Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ））。
【００５３】
タンパク質とペプチドとを架橋する本発明の方法は、当業者に周知である。数百種の架橋剤が、目的の化合物をｐ９７またはｐ９７を結合する物質と結合体化するために利用可能である（例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，Ｓｈａｎｓ  Ｗｏｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ（１９９１）ならびに米国特許第５，９８１，１９４号およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ０２／１３８４３号および同第ＷＯ  ０１／５９４５９号（これらは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。多くの試薬および架橋剤を用いて、活性な薬剤とｐ９７分子との結合体を調製し得る。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＧＴら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９６）を参照のこと。架橋剤は一般に、利用され得る反応性官能基または治療薬剤に挿入される反応性官能基に基づいて選択される。さらに、反応性基が存在しない場合、光活性化可能な架橋剤が用いられ得る。特定の例では、ｐ９７とこの結合体との間にスペーサーを含むことが所望され得る。１つの実施形態では、ｐ９７とタンパク質治療薬剤とは、ｐ９７におけるスルフヒドリル基の導入によって、そしてカルボキシル基を介してタンパク質化合物に反応性チオール基を含む架橋剤の導入によって、結合体化され得る（ＷａｗｉｚｙｎｃｚａｋおよびＴｈｏｒｐｅ、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ｒａｄｉｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｇｅｌ（編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２８−５５頁（１９８７）；ならびにＢｌａｉｒおよびＧｈｏｓｅ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５９：１２９）。いくつかの実施形態では、このリンカーは、ｐ９７および／またはリンカーからこの薬剤を遊離するように、リソソームの酸性ｐＨにおいて加水分解に対して脆弱である。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、ｐ９７−薬剤結合体は、ｐ９７融合タンパク質である。融合タンパク質は、当該分野で公知の標準的技術を用いて調製され得る。代表的に、ｐ９７またはその一部分をコードするＤＮＡ分子は、タンパク質化合物をコードするＤＮＡ分子に連結される。キメラＤＮＡ構築物は、適切な調節エレメントと共に、発現ベクター中にクローニングされ得、そして適切な宿主中で発現され得る。得られる融合タンパク質は、選択されたタンパク質化合物に対して用いられるｐ９７またはその一部分を含む。
【００５５】
リンカーが用いられる場合、このリンカーは好ましくは、アルキル骨格、アリール骨格および／またはアミノ酸骨格を含むように構築され、かつアミド結合、エーテル結合、エステル結合、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合またはそれらの任意の組み合わせを含む、有機部分である。アミノ酸、エーテルおよびアミド結合成分を含む結合は、生理学的ｐＨ（通常、血清中で７．４）の条件下において適切である。好ましい結合は、血清のｐＨで安定であるが、リソソームのｐＨに曝露された場合に加水分解してこの薬物を遊離する、エステルまたはヒドラゾンを含む結合である。ジスルフィド結合が好ましい。なぜなら、これらは、還元的切断に感受性であるからである。さらに、アミノ酸リンカーは、所望の標的器官またはより好ましくは、このリソソーム自体における特異的酵素による切断に対して感受性であるように設計され得る。例示的なリンカーは、Ｂｌａｔｔｌｅｒら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：１５１７−１５２４；Ｋｉｎｇら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５：５７７４−５７７９；ＳｒｉｎｉｖａｓａｃｈａｒおよびＮｅｖｉｌｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２５０１−２５０９に記載される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、このリンカーは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールである。他の実施形態では、このリンカーは、４〜２０原子長である。他の実施形態では、このリンカーは、Ｏ、Ｎ、またはＳからなる群より独立して選択されるヘテロ原子によって置換され得る炭素鎖原子を有する、１〜３０原子長である。いくつかの実施形態では、１〜４個または５〜１５個のＣ原子は、Ｏ、Ｎ、Ｓから独立して選択されるヘテロ原子で置換される。他の実施形態では、このリンカーは、リソソーム環境に送達された場合に加水分解を受ける（例えば、リソソームのｐＨでの加水分解に感受性であるかまたはリソソーム酵素に接触すると加水分解に感受性である）部分を含む。いくつかの実施形態では、このリンカー基は好ましくは、体液中の結合体の可溶性を増強するために、親水性である。いくつかの実施形態では、このリンカーは、ｐ９７分子もしくはこのタンパク質薬剤を含むか、または他のリソソーム酵素（例えば、標的リソソームにおいて欠損していない酵素またはｐ９７キャリアに結合体化されていないリソソーム酵素）による攻撃を受ける官能基によって、ｐ９７分子もしくはこのタンパク質薬剤に結合される。いくつかの実施形態では、このｐ９７と薬剤とは、アミノ酸もしくはペプチド、脂質、または糖残基を含むリンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、このｐ９７と薬剤とは、合成または翻訳後修飾によって導入される基に連結される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、薬剤−リンカー中間体は、以前に記載されたものと類似するが、例えば、ｐ９７上の遊離アミン基と反応し得る活性なエステル、またはＳＡＴＡ反応もしくは当業者がこれらをｐ９７に結合させ得る他の基を介してｐ９７上に作製された遊離チオールと反応し得るマレイミドのいずれかを含む。
【００５８】
（Ａ．ｐ９７の調製）
本発明の方法および組成物において使用するためのｐ９７ペプチドまたはｐ９７分子は、種々の供給源から入手、単離または調製され得る。
【００５９】
１つの局面では、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、ｐ９７またはその誘導体を調製し得る。１つの実施形態では、ｐ９７をコードするＤＮＡは、ｐ９７配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって入手され得る（一般に、米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，６８３，１９５号；および同第４，８００，１５９号を参照のこと；ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ（編），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）もまた参照のこと）。手短には、ｐ９７を発現する細胞（例えば、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞）由来の二本鎖ＤＮＡは、耐熱性Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的ＤＮＡプライマー（例えば、５’ＧＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＣＧＧ３’（配列番号１）および５’ＴＣＧＣＧＡＧＣＴＴＣＣＴ３’（配列番号２））、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＴＴＰの存在下で加熱することによって変性される。合成が完全である場合、二本鎖ＤＮＡが産生される。このサイクルは、何回も反復されて、ｐ９７  ＤＮＡの階乗の増幅をもたらし得る。次いで、増幅されたｐ９７  ＤＮＡは、以下に記載されるような発現ベクター中に容易に挿入され得る。
【００６０】
あるいは、ｐ９７をコードするＤＮＡは、ＢｒｏｗｎらのＵＫ特許出願第ＧＢ  ２１８８  ６３７号によって記載されるクローニング技術を用いて単離され得る。ｐ９７  ｃＤＮＡをコードする配列を含むクローンは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に、受託番号ＣＲＬ  ８９８５（ＰＭＴｐ９７ｂ）およびＣＲＬ  ９３０４（ｐＳＶｐ９７ａ）で寄託されている。
【００６１】
本発明の１つの実施形態では、ｐ９７の短縮型誘導体が提供される。例えば、部位特異的変異誘発は、ヌクレオチド２２１９を超えたＣ末端疎水性ドメインを欠失させるためにオリゴヌクレオチドＷＪ３１  ５’ＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＣ−３’（配列番号３）を用いて、またはヌクレオチド１１４６〜１１６６の領域にＮｈｅ  Ｉ部位および停止コドンを導入し、それによってまた、Ｎ末端ドメインのみを含む短縮形態のｐ９７を構築するためにオリゴヌクレオチドＷＪ３２  ５’ＣＣＡ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＣＴＡＧＣＧＧＧＧＧＣＡＧ  ３’（配列番号４）を用いて実施され得る。同様に、変異誘発はまた、Ｃ末端ドメインのみが発現されるように、ｐ９７について実施され得る。１つの実施形態では、Ｘｈｏ部位は、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの両方において、オリゴヌクレオチドＷＪ  ５’−ＡＣＡＣＣＡＧＣＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＧ３’（配列番号５）を用いて変異誘発によって挿入され、Ｎ末端ドメインのその後の欠失を可能にする。種々の他の制限酵素（例えば、Ｅｃｏ  ＲＩを含む）もまた、ｐ９７の欠失誘導体または短縮誘導体を構築するために、本発明の状況において利用され得る。
【００６２】
変異は、ネイティブな配列のフラグメントへの、変異したフラグメントの連結を可能にする制限部位が隣接した変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。連結後、得られる再構築配列は、アミノ酸の所望の挿入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。あるいは、上記のように、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発手順を用いて、所望の置換、欠失、または挿入に従って改変された特定のコドンを有する、改変された遺伝子が入手され得る。上記に示される改変を作製する例示的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）によって開示される。
【００６３】
本発明の特に好ましい実施形態では、ｐ９７は、このタンパク質のカルボキシ末端に位置するＧＰＩアンカー配列が欠失した短縮化ｃＤＮＡとして、発現ベクター中にクローニングされる。
【００６４】
手短に述べると、このｐ９７遺伝子は、クローニングされたｐ９７  ｃＤＮＡをテンプレートとして用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製され得る。短縮化ｐ９７は、座標３６〜６０（座標は、ｃＤＮＡ地図に基づく）を含みかつさらにＳｎａ  ＢＩ制限部位を含む５’ＰＣＲプライマーであるＷＪ４７を用いて合成される。ＷＪ４７の配列は、以下である：
【００６５】
【化１】
2006506317.tif 000003
３’プライマーであるＷＪ４８は、座標２１７２〜２１９３を含み、そしてさらに、ＴＧＡ終結コドンおよびＳｎａＢＩ制限部位の両方を含む。ＷＪ４８のＤＮＡ配列は、以下である：
【００６６】
【化２】
2006506317.tif 000004
増幅後、短縮化ｐ９７産物は、ｐＮＵＴΔＨ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ（１９８６）ＰＮＡＳ  ８３：１２６１−１２６５から入手される）中にＳｍａ  Ｉ制限部位にて挿入される。得られるプラスミドの方向は、ベクター配列にアニーリングする第１のプライミングオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲおよび挿入配列にアニーリングする第２のプライミングオリゴヌクレオチドによって決定され得る。あるいは、適切な制限消化が、方向を確認するために実施され得る。増幅された配列の発現は、疎水性ドメインを欠く可溶性ｐ９７タンパク質の産生をもたらす。
【００６７】
上記のように、本発明は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結される、ｐ９７またはその誘導体をコードする、合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントを含む組換え発現ベクターを提供する。適切な調節エレメントは、種々の供給源（細菌遺伝子、真菌遺伝子、ウイルス遺伝子、哺乳動物遺伝子、および昆虫遺伝子を含むがこれらに限定されない）から誘導され得る。適切な調節エレメントの選択は、選択された宿主細胞に依存し、そして当業者によって容易に達成され得る。調節エレメントの例としては、特に、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）が挙げられる。さらに、選択された宿主細胞および用いられるベクターに依存して、他の遺伝的エレメント（例えば、複製起点、さらなるＤＮＡ制限部位、エンハンサー、転写誘導性を付与する配列、および選択的マーカー）が発現ベクター中に組み込まれ得る。
【００６８】
ｐ９７をコードするＤＮＡ配列は、広範な種々の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞（細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、ウイルス細胞、植物細胞、および昆虫細胞を含むがこれらに限定されない）によって発現され得る。外来ＤＮＡを発現するためのこのような細胞を形質転換またはトランスフェクトするための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら，米国特許第４，７０４，３６２号；Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７５：１９２９−１９３３；Ｍｕｒｒａｙら，米国特許第４，８０１，５４２号；Ｕｐｓｈａｌｌら，米国特許第４，９３５，３４９号；Ｈａｇｅｎら，米国特許第４，７８４，９５０号；Ａｘｅｌら，米国特許第４，３９９，２１６号；Ｇｏｅｄｄｅｌら，米国特許第４，７６６，０７５号；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，前出を参照のこと）。
【００６９】
プロモーター、ターミネーター、ならびに適切な種類の発現ベクターを例えば、植物細胞、鳥類細胞、および昆虫細胞に導入するための方法は、当業者によって容易に達成され得る。本発明の特に好ましい実施形態では、ｐ９７は、バキュロウイルス（例えば、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７；Ａｔｋｉｎｓｏｎら（１９９０）Ｐｅｔｉｃ．Ｓｃｉ．２８：２１５−２２４を参照のこと）から発現される。バキュロウイルス（例えば、ＡｃＭＮＰＶ）の使用が特に好ましい。なぜなら、宿主昆虫細胞は、ＧＰＩ切断形態のｐ９７を発現するからである。ｐ９７は、組換えｐ９７を発現する上記の宿主／ベクター系の培養物から調製され得る。組換え産生されたｐ９７は、以下でより詳細に記載されるように、さらに精製され得る。
【００７０】
可溶性形態のｐ９７は、可溶性ｐ９７を含む細胞を、細胞増殖の対数期を通じて培養し、そして上清を収集することによって調製され得る。好ましくは、上清は、細胞が生存力を失う前の時点で収集される。次いで、可溶性ｐ９７は、単離された可溶性ｐ９７を得るために、以下の通りに精製され得る。可溶性ｐ９７の適切な精製方法は、可溶性ｐ９７の親水性特性に基づいて選択され得る。例えば、可溶性ｐ９７は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４  Ｐｈａｓｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎによって容易に入手され得る。
【００７１】
別の実施形態では、ｐ９７は、ＧＰＩアンカーｐ９７を発現するように遺伝子操作された培養ＣＨＯ細胞から単離され得る。ＧＰＩアンカータンパク質は、ＧＰＩアンカーを切断し得る酵素との短時間のインキュベーションによって収集され得る。このような酵素は、当該分野で公知であり（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０）、そして代表例は上記に記載される。切断された可溶性タンパク質は、培地から回収され得、次いでこの細胞は、このタンパク質のさらなる発現のために増殖培地に戻され得る。充分な量のこのタンパク質が得られるまで、増殖と収集とのサイクルが繰り返され得る。特に好ましいＧＰＩ酵素は、ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）である。ホスホリパーゼＣは、細菌供給源（Ｌｏｗ「Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ：Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎｄｅｘ，ＲｉｃｋｗｏｏｄおよびＨａｍｅｓ編．ＩＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＮＹ（１９９１）；Ｋｕｐｅら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１５１−１５５；Ｖｏｌｗｅｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：３１５−３２５を参照のこと）または組換え供給源（Ｋｏｋｅら（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：５１−５８；およびＨｅｎｎｅｒら（１９８６）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３８３）のいずれかから入手され得る。
【００７２】
ｐ９７およびその誘導体（可溶性ｐ９７が挙げられる）は、本明細書中に記載される方法に従って容易に精製され得る。手短には、ｐ９７は、可溶化ｐ９７を含む上清または上記の通りに培養された宿主／ベクター系のいずれかから精製され得る。単独または組み合わせのいずれかで用いられる、種々の精製工程は、ｐ９７を精製するために用いられ得る。例えば、ｐ９７を可溶化することによって得られる上清または上記の通りの宿主／ベクター培養物から得られる上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を用いて、またはタンパク質を「塩析」し、続いて透析することによって、容易に濃縮され得る。さらに、上清または濃縮物は、アフィニティー精製マトリクス（例えば、適切な支持体に結合した抗ｐ９７抗体）に適用され得る。あるいは、アニオン交換樹脂（例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有する、マトリクスまたは基材）が用いられ得る。代表的マトリクスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において通常用いられる他の種類が挙げられる。同様に、種々の不溶性マトリクス（例えば、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基）を利用するカチオン交換体もまた用いられ得る。
【００７３】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有する、シリカゲル）を用いた１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、ｐ９７をさらに精製し得る。
【００７４】
ｐ９７フラグメントはまた、当該分野で周知の改変を行って、上記の技術を用いて精製され得る。例えば、ｐ９７発現ベクターは、発現タンパク質がｐ９７の所望のフラグメントであるように改変され得る。このタンパク質は、発現系から単離され得る（すなわち、細胞から抽出され得る）か、またはこのタンパク質は、発現系の上清中に分泌されるように設計され得、そして上記の技術を用いて単離され得る。あるいは、全長ｐ９７タンパク質が作製され、そして精製され得、次いでｐ９７フラグメントが、所望のフラグメントを作製するように設計された切断反応によって作製され得る。化学的合成は、所望のｐ９７タンパク質またはそのフラグメントを得るための代替経路である。
【００７５】
本発明の状況では、ｐ９７の純度を定義するために用いられる場合、「単離された」または「精製された」とは、天然起源の他のタンパク質も内因性起源の他のタンパク質も実質的に含まず、かつこの産生プロセスに起因する約５質量％未満、好ましくは約１質量％未満のタンパク質夾雑物を含む、タンパク質をいう。ｐ９７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクマシーブルーでの染色によって単一のタンパク質バンドとして検出され得る場合、「単離された」とみなされ得る。
【００７６】
（融合／キメラタンパク質の産生）
本発明のキメラタンパク質は、融合タンパク質全体をコードする単一核酸または１より多くの核酸配列（各々が、キメラタンパク質のドメインをコードし、必要に応じて、これらのドメインを連結するに役立つアミノ酸をコードする）を発現する宿主細胞を用いて産生され得る。これらのキメラタンパク質はまた、化学的合成によって産生され得る。
【００７７】
（Ａ．宿主細胞）
キメラタンパク質を産生するために用いられる宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、または哺乳動物細胞である；哺乳動物細胞としては、ハムスター細胞、サル細胞、チンパンジー細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞およびヒト細胞が挙げられるがこれらに限定されない。これらの宿主細胞は、不死化細胞（細胞株）または非不死化（初代または二次）細胞であり得、そして広範な種々の細胞型（例えば、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、卵巣細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、すなわちＣＨＯ細胞）、内皮細胞、神経膠細胞、神経細胞、血液の構成要素（例えば、リンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞、肝細胞およびこれらの体細胞型の前駆体であるがこれらに限定されない）のうちのいずれかであり得る。
【００７８】
キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んで発現する細胞は、本明細書中で、遺伝子改変された細胞といわれる。キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んで発現する哺乳動物細胞は、遺伝子改変された哺乳動物細胞といわれる。細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの導入は、公知のトランスフェクション法（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リン酸カルシウム沈澱、改変リン酸カルシウム沈澱、カチオン性脂質処理、フォトポリペプチドレーション（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、融合方法論、レセプター媒介移入、またはポリブレン沈澱によってである。あるいは、このＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルスベクターを用いた感染によって導入され得る。キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを発現する細胞（哺乳動物細胞が挙げられる）を産生する方法は、同時係属中の特許出願である米国特許出願第０８／３３４，７９７号（発明の名称「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．ＴｒｅｃｏおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎによる（１９９４年１１月４日出願））；米国特許出願第０８／３３４，４５５号（発明の名称「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｏｒ  Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．ＴｒｅｃｏおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ｗ．Ｈｅａｒｔｌｅｉｎによる（１９９４年１１月４日出願））および米国特許出願第０８／２３１，４３９号（発明の名称「Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｉｎｔｏ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｒ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ａ．Ｔｒｅｃｏ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗ．ＨｅａｒｔｌｅｉｎおよびＲｉｃｈａｒｄ  Ｆ  Ｓｅｌｄｅｎによる（１９９４年４月２０日出願））に記載される。これらの出願の各々の教示は、本明細書中に参考として明らかに援用される。
【００７９】
（Ｂ．核酸構築物）
このキメラタンパク質を発現するために用いられる核酸構築物は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞において染色体外で（エピソームで）発現される核酸構築物、またはレシピエント細胞のゲノム中にランダムにもしくは相同組換えによって、予め選択された標的部位でのいずれかで組み込まれる核酸構築物であり得る。染色体外で発現される構築物は、キメラタンパク質コード配列に加えて、その細胞におけるこのタンパク質の発現に充分な配列、必要に応じて、この構築物の複製に充分な配列を含む。これとしては代表的に、プロモーター、キメラタンパク質コードＤＮＡおよびポリアデニル化部位が挙げられる。このキメラタンパク質をコードするＤＮＡは、その発現が、そのプロモーターの制御下にあるような様式で、この構築物中に配置される。必要に応じて、この構築物は、さらなる構成要素（例えば、以下のうちの１以上）を含み得る：スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下にある選択マーカー遺伝子、および適切なプロモーターの制御下にある増幅可能マーカー遺伝子。
【００８０】
このＤＮＡ構築物が細胞ゲノムに組み込まれる実施形態では、このＤＮＡ構築物は、キメラタンパク質コード核酸配列を含むことのみを必要とする。必要に応じて、このＤＮＡ構築物は、プロモーター配列およびエンハンサー配列、ポリアデニル化部位、スプライス部位、選択マーカーをコードする核酸配列、増幅可能マーカーをコードする核酸配列および／またはそのＤＮＡの組込みをゲノム内の選択された部位に標的化するための、レシピエント細胞内のゲノムＤＮＡに相同なＤＮＡ（標的化ＤＮＡまたはＤＮＡ配列）を含み得る。
【００８１】
（Ｃ．細胞培養法）
キメラタンパク質コードＤＮＡまたはキメラタンパク質コードＲＮＡを含む哺乳動物細胞は、その細胞の増殖およびそのＤＮＡまたはＲＮＡの発現に適切な条件下で培養される。このキメラタンパク質を発現する細胞は、公知の方法および本明細書中に記載の方法を用いて同定され得、そしてこのキメラタンパク質は、キメラタンパク質産生の増幅を用いて、または用いずにのいずれかで、公知の方法および本明細書中にも記載される方法を用いて単離および精製され得る。同定は、例えば、このキメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を示す表現型を提示する遺伝子改変された哺乳動物細胞をスクリーニング（例えば、ＰＣＲスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニング、またはこのキメラタンパク質の発現についてのスクリーニング）することによって実施され得る。キメラタンパク質コードＤＮＡが組み込まれた細胞の選択は、選択マーカーをＤＮＡ構築物中に含め、そして選択マーカー遺伝子を含む、トランスフェクトまたは感染させた細胞を、選択マーカー遺伝子を発現する細胞のみが存在するに適切な条件下で培養することによって達成され得る。導入されたＤＮＡ構築物のさらなる増幅は、遺伝子改変された哺乳動物細胞を、増幅に適切な条件下で培養すること（例えば、増幅可能マーカー遺伝子を含む、遺伝子改変された哺乳動物細胞を、複数コピーのこの増幅可能マーカー遺伝子を含む細胞のみが生存し得る濃度の薬物の存在下で培養すること）によってもたらされ得る。このキメラタンパク質を発現する遺伝子改変された哺乳動物細胞は、発現産物の検出によって、本明細書中に記載される通りに同定され得る。例えば、キャリアがｐ９７であるキメラタンパク質を発現する哺乳動物細胞は、サンドイッチ酵素免疫アッセイによって同定され得る。抗体は、ＬＲＰ部分または活性薬剤部分に対して指向され得る。
【００８２】
（Ｂ．ｐ９７に対する抗体の調製）
本明細書の教示に基づいて、マウスまたはヒトのｐ９７に対する抗体は、多くの用途を有する。この用途としては、ｐ９７の単離および精製のための用途、インビトロおよびインビボの両方でのｐ９７の研究および同定における用途、ならびに潜在的診断剤（例えば、結合体投与量レベルのモニタリング）および治療用途（例えば、ｐ９７結合体用量レベルの調節）が挙げられるがこれらに限定されない。それゆえ、ｐ９７に対する好ましい抗体およびこのような抗体の産生方法を手短に述べることが有用である。
【００８３】
ｐ９７に対して反応性の抗体は、当該分野で周知である。さらなる抗ｐ９７抗体は、本発明によって提供される。抗ｐ９７抗体の代表例としては、以下が挙げられる：Ｌ２３５（ＡＴＣＣ番号ＨＢ  ８４６６；Ｒｅａｌら（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：４４０１−４４１１を参照のこと；Ｆｏｏｄら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４）：３０３４−３０４０），４．１，８．２，９６．５および１１８．１もまた参照のこと（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（２）：５３９−５４６；およびＢｒｏｗｎら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（１）：５３９−５４３を参照のこと）；ならびにＨｙｂＣ（Ｋｅｎｎａｒｄら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２（１１）：１２３０−１２３５）。他のモノクローナル抗体（２Ｃ７および９Ｂ６が挙げられるがこれらに限定されない）が、Ｓｙｎａｐｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．において作製された。マウスｐ９７に対する抗体としては、例えば、マウスｐ９７のフラグメントに対して作製されたウサギ抗ヒトｐ９７ポリクローナル抗体が挙げられる。本発明の状況では、抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２）ならびに組換え産生された結合パートナーを包含することが理解される。抗体は、Ｋａが１０−７Ｍ以上である場合、ｐ９７に対して反応性であることが理解される。
【００８４】
ポリクローナル抗体は、当業者によって種々の温血動物から容易に作製され得る。モノクローナル抗体はまた、従来技術（例えば、米国特許第ＲＥ  ３２，０１１号、同第４，９０２，６１４号；同第４，５４３，４３９号；および同第４，４１１，９９３号を参照のこと；Ｋｅｎｎｅｔｔ，ＭｃＫｅａｒｎ，およびＢｅｃｈｔｏｌ（編）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８０）；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）もまた参照のこと）を用いて容易に作製され得る。好ましい抗体の調製は、以下の実施例の節においてさらに記載される。
【００８５】
（標識）
いくつかの実施形態では、ｐ９７結合体は、その検出を容易にするために標識される。「標識」または「検出可能部分」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、化学的手段、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、本発明における使用に適切な標識としては、例えば、以下が挙げられる：放射性標識（例えば、３２Ｐ）、発蛍光団（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて通常用いられるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、または（例えば、放射性標識をハプテンもしくはペプチドに取り込むことによって）検出可能とされ得るかまたはそのハプテンもしくはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いられ得る、ハプテンおよびタンパク質。
【００８６】
上記のように、用いられるスクリーニングアッセイに依存して、結合体の薬剤部分、リンカー部分またはｐ９７分子部分は標識され得る。用いられる特定の標識または検出可能な基は、それがこの結合体の生物学的活性をおおいに妨害するのでない限り、本発明の重要な局面ではない。この検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の物質であり得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電子的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能な、任意の組成物である。
【００８７】
本発明における使用に適切な標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて通常用いられる他の酵素）、ならびに比色標識（例えば、コロイド状金または着色したガラスもしくはプラスチックのビース（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）。
【００８８】
この標識は、当該分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的または間接的に結合され得る。好ましくは、この標識は、１つの実施形態では、本発明に従って活性薬剤を結合体化するためのイソシアネート試薬を用いて、ｐ９７に対して共有結合される。本発明の１つの局面では、本発明の二官能性イソシアネート試薬を用いて、標識をｐ９７に対して結合体化して、活性薬剤が結合されていない標識ｐ９７結合体を形成し得る。標識ｐ９７結合体は、本発明による標識結合体の合成のための中間体として用いられ得るか、またはｐ９７結合体を検出するために用いられ得る。上記のように、広範な標識が用いられ得、標識の選択は、必要とされる感度、アッセイの所望の成分との結合体化の容易さ、安定性の必要要件、利用可能な計測装置、および処分要件に依存する。非放射性標識はしばしば、間接的手段に結合される。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、この分子に共有結合される。次いで、このリガンドは、固有に検出可能であるかまたはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共有結合するかのいずれかである、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合する。
【００８９】
この結合体はまた、シグナル生成化合物に対して（例えば、酵素または発蛍光団を用いた結合体化によって）直接的に結合体化され得る。標識としての使用に適切な酵素としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒドロラーゼ（特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）（特にペルオキシダーゼ）。標識としての使用に適切な蛍光化合物（すなわち、発蛍光団）としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなど。適切な発蛍光団のさらなる例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エオシン、ＴＲＩＴＣ−アミン、キニーネ、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリトロセイン（ｅｒｙｔｈｒｏｓｃｅｉｎ）、ルテニウム（トリス，ビピリジニウム）、テキサスレッド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、フラビンアデニンジヌクレオチドなど。標識としての使用に適切な化学発光化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン（例えば、ルミノール）。本発明の方法において用いられ得る種々の標識系またはシグナル生成系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【００９０】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、この標識が放射性標識である場合、検出手段としては、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおいてのような写真フィルムが挙げられる。この標識が蛍光標識である場合、これは、この発蛍光団を適切な波長の光で励起し、そして得られる蛍光を検出することによって検出され得る。この蛍光は、電子検出器（例えば、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）または光電子倍増管など）の使用によって視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素に適切な基質を提供い、そして得られる反応産物を検出することによって検出され得る。比色標識または化学発光標識は、その標識に関連した色を観察することによって、単純に検出され得る。本発明の方法における使用に適切な他の標識系および検出系は、当業者に容易に明らかである。このような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断において用いられ得る。
【００９１】
（薬学的組成物、および使用／処置／投与の方法）
本発明の方法を用いて処置、改善または予防され得る疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ムコ多糖沈着症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）、ＭＰＳ  ＩＩ、ＭＰＳ  ＩＩＩＡ、ＭＰＳ  ＩＩＩＢ、異染性白質萎縮（ＭＬＤ）、クラッベ、ポーンプ、ＣＬＮ２、テイ−サックス、ニーマン−ピックＡおよびＢ、ならびに他のリソソーム疾患。各疾患に関して、この結合体化剤は、特定の化合物、タンパク質または酵素を含む。ＭＰＳ  Ｉに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼである。ＭＰＳ  ＩＩに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、イズロネート−２−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＡに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、ヘパランＮ−スルファターゼである。ＭＰＳ  ＩＩＩＢに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。異染性白質萎縮（ＭＬＤ）に関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、アリールスルファターゼＡである。クラッベに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、ガラクトシルセラミダーゼである。ポーンプに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、酸性α−グルコシダーゼである。ＣＬＮに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、チオエステラーゼである。テイ−サックスに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、ヘキソサミニダーゼＡである。ニーマン−ピックＡおよびＢに関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、酸性スフィンゴミエリナーゼである。他の糖原性障害に関与する方法については、好ましい化合物または酵素は、グリコリピドーシス（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）、ムコ多糖症、オリゴ糖症（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）である。
【００９２】
本発明のｐ９７−結合体は、「薬学的に受容可能なキャリア」とともに投与され得る。このようなキャリアは、標準的な薬学的キャリア、緩衝剤および賦形剤（リン酸緩衝化生理食塩水、水、および乳濁液（例えば、水中油型乳濁液または油中水型乳濁液）が挙げられる）、ならびに種々の型の湿潤剤および／またはアジュバントのいずれをも包含する。適切な薬学的キャリアおよびそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，第１９版．１９９５）に記載される。好ましい薬学的キャリアは、活性薬剤の意図される投与形態に依存する。代表的な投与形態は、以下に記載される。
【００９３】
用語「有効量」は、被験体の健康状態、病状、疾患に対して所望の結果を生じるに充分な、または診断目的の、投与量を意味する。この所望の結果は、この投与量のレシピエントの主観的改善または客観的改善を含み得る。
【００９４】
「予防処置」は、疾患の徴候を示さないかまたは疾患のほんの初期の徴候を示す被験体に施される処置であり、ここで、処置は、病状を発症する危険性を低減する目的で施される。本発明の結合体は、予防処置として与えられ得る。
【００９５】
「治療処置」は、病状の徴候を示す被験体に施される処置であり、ここで、処置は、これらの病理学的徴候を低減または除去する目的で施される。これらの徴候は、主観的または客観的であり得る。
【００９６】
用語「組成物」は、例えば、薬学的組成物において、活性成分、およびキャリアを構成する不活性成分を含む産物、ならびにこれらの成分のいずれか２つ以上の組み合わせ、錯体形成もしくは凝集から、またはこれらの成分のうちの１以上の解離から、またはこれらの成分のうちの１以上の他の型の反応もしくは相互作用から、直接的または間接的に生じる任意の産物を包含することが意図される。従って、本発明の薬学的組成物は、本発明のｐ９７−薬剤結合体と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
【００９７】
用語「薬学的組成物」は、被験体（動物またはヒトが挙げられる）における薬学的使用に適切な組成物を示す。薬学的組成物は一般に、有効量のｐ９７−結合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００９８】
この結合体は、種々の経路によって投与され得る。経口用調製物に関して、この結合体は、単独で、または錠剤、散剤、顆粒剤もしくはカプセル剤を作製するに適切な添加物と組み合わせて（例えば、以下とともに）用いられ得る：従来の添加剤（例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたは馬鈴薯澱粉）；結合剤（例えば、微結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、馬鈴薯澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウム）；滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）；および所望により、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および矯味矯臭剤。
【００９９】
このｐ９７−薬剤結合体は、これらを水性または非水性の溶媒（例えば、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール）中に（所望の場合、従来の添加物（例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および保存剤）とともに）溶解、懸濁または乳化することによって、注射用調製物に処方され得る。
【０１００】
このｐ９７−薬剤結合体は、吸入を介して投与されるべきエアゾール処方物において利用され得る。本発明の結合体は、加圧された受容可能なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に処方され得る。
【０１０１】
さらに、このｐ９７−薬剤結合体は、種々の基剤（例えば、乳化基剤または水溶性基剤）と混合することによって坐剤にされ得る。本発明の結合体は、坐剤を介して直腸に投与され得る。坐剤は、体温で融解するが、室温で固体である、ビヒクル（例えば、カカオ脂、カーボワックスおよびポリエチレングリコール）を含み得る。
【０１０２】
経口投与または直腸投与用の単位投薬形態（例えば、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤）のｐ９７−薬剤結合体が提供され得、ここで、各投与量単位（例えば、ティースプーンフル、テーブルスプーンフル、錠剤または坐剤）は、活性薬剤を含む所定量の組成物を含む。同様に、注入投与または静脈内投与用の単位投薬形態は、滅菌水、規定生理食塩水または別の薬学的に受容可能なキャリア中の溶液としての組成物中に結合体を含み得る。用語「単位投薬形態」は、本明細書中で用いられる場合、ヒトおよび動物の被験体用の単位投与量として適切な物理的に別個の単位であって、各単位が、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはビヒクルに関連して所望の効果を生じるに充分な量の算出された所定量の本発明の結合体を含む、単位をいう。本発明の新規単位投薬形態についての詳細は、用いられる特定の結合体および達成されるべき効果、ならびに宿主内の各化合物に関連した薬力学に依存する。
【０１０３】
実用面では、本発明による結合体は、従来の薬剤混合技術による薬学的キャリアと密接に混合された活性成分として組み合わされ得る。このキャリアは、投与が所望される調製物（例えば、経口または非経口（静脈内が挙げられる））の形態に依存して、広範な種々の形態を採り得る。経口投薬形態の組成物を調製する際に、有用な薬学的媒体（例えば、経口液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤）の場合、水、グリコール、油、アルコール、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤など；または経口固体調製物（例えば、散剤、硬質カプセル剤および軟質カプセル剤ならびに錠剤）の場合、キャリア（例えば、澱粉、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など））のいずれもが用いられ得、固体経口調製物が、液体調製物よりも好ましい。
【０１０４】
経皮投与経路に関して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，（Ｇｅｎｎａｒｏら編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９８５）に薬物の経皮投与方法が開示されている。皮膚（ｄｅｒｍａｌ）パッチまたは皮膚（ｓｋｉｎ）パッチは、本発明のｐ９７−薬剤結合体の好ましい経皮送達手段である。パッチは好ましくは、この結合体の吸収を増加させる吸収エンハンサー（例えば、ＤＭＳＯ）を提供する。他の経皮薬物送達方法は、米国特許第５，９６２，０１２号、同第６，２６１，５９５号、および同第６，２６１，５９５号に開示される。これらの各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０１０５】
薬学的に受容可能な賦形剤（例えば、ビヒクル、アジュバント、キャリアまたは希釈剤）は、市販される。さらに、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整薬剤、安定剤、湿潤薬剤など）は、市販される。
【０１０６】
当業者は、用量レベルが、特定の薬剤、症状の重篤度、および副作用に対する被験体の感受性の相関関係にあるものとして変動し得ることを容易に認識する。所定の結合体についての好ましい投与量は、種々の手段によって、当業者により容易に決定され得る。
【０１０７】
これらの局面の各々において、この組成物としては、経口投与、直腸投与、局所投与、非経口投与（皮下、筋肉内、および静脈内が挙げられる）、肺投与（鼻腔吸入またはバッカル吸入）、または経鼻投与に適切な組成物が挙げられるがこれらに限定されないが、任意の所定の場合において最も適切な経路は、部分的に、処置されるべき状態の性質および重篤度、ならびに活性成分の性質に依存する。例示的な投与経路は、経口経路および静脈内経路である。この組成物は、単位投薬形態で便利に提示され得、そして製薬分野で周知のいずれかの方法によって調製され得る。
【０１０８】
実用面では、本発明による結合体は、従来の薬剤混合技術による薬学的キャリアと密接に混合された活性成分として組み合わされ得る。このキャリアは、投与（例えば、経口または非経口（静脈内が挙げられる））が所望される調製物の形態に依存して、広範な種々の形態を採り得る。経口投薬形態の組成物を調製する際に、有用な薬学的媒体（例えば、経口液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシル剤および液剤）の場合、水、グリコール、油、アルコール、矯味矯臭剤、保存剤、着色剤など；または経口固体調製物（例えば、散剤、硬質カプセル剤および軟質カプセル剤ならびに錠剤）の場合、キャリア（例えば、澱粉、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤など））のいずれもが用いられ得、固体経口調製物が、液体調製物よりも好ましい。
【０１０９】
投与が容易であることに起因して、錠剤およびカプセル剤は、最も有利な経口投薬単位形態を提示し、この場合、固体薬学的キャリアが明らかに用いられる。所望の場合、錠剤は、標準的な水性技術または非水性技術によってコーティングされ得る。これらの組成物中での活性薬剤の百分率はもちろん変動し得、そして便利には、その単位の重量の約２パーセント〜約６０パーセントの間であり得る。
【０１１０】
本発明の結合体は、動物、特にヒトにおける治療的介入、予防的介入および診断的介入に有用である。
【０１１１】
本発明の組成物は、ウイルスエンベロープまたは小胞中に封入または結合されて投与され得る。リポソームは、二重層膜から形成された小胞である。適切な小胞としては、単層小胞および多層脂質小胞またはリポソームが挙げられるがこれらに限定されない。このような小胞およびリポソームは、標準的技術（例えば、米国特許第４，３９４，４４８号に記載される技術）を用いて、広範な種々の脂質化合物またはリン脂質化合物（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシドなど）から作製され得る。このような小胞またはリポソームは、結合体を細胞内に投与するために、およびこの結合体を標的器官に送達するために、用いられ得る。目的のｐ９７−組成物の制御放出はまた、カプセル化（例えば、米国特許第５，１８６，９４１号を参照のこと）を用いて達成され得る。
【０１１２】
この結合体を標的細胞、標識組織または標的器官と接触させる任意の投与経路が用いられ得る。この結合体は、末梢または中心に投与され得る。この結合体はまた、静脈内に、または腹腔内に投与され得る。この結合体は、局所的にまたは局部的に投与され得る。
【０１１３】
投与されるべき投与量は、個体の必要性および特徴（年齢、体重、状態の重篤度）、所望の効果、用いられる活性薬剤、ならびに選択された投与経路および処置レジメン）に依存する。ｐ９７−結合体の好ましい投与量は、約０．０２ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約２．５ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり、特に好ましい投与量は、２〜２５０ｐｍｏｌ／ｋｇの範囲であるか；あるいは、ｐ９７結合体の好ましい用量は、０．０２〜２０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。これらの投与量は、各ｐ９７分子に会合している薬剤部分の数によって影響を受ける。さらに、投与量は、投与されるべき薬剤および処置されるべき状態の重篤度に基づいて計算され得る。用量反応相関を決定し、そして個々の患者の治療において用いられる投与量を最適化するための経験的方法および理論的方法は、当業者に周知である。
【０１１４】
本発明のｐ９７−結合体は、例えば、動物、特にヒトにおけるリソソーム蓄積症の処置のための治療介入および予防介入に有用である。本発明の方法は、種々の異なるリソソーム蓄積症の処置において用途を見出す。特定の実施形態では、特に興味深いのは、所望の活性を有する活性薬剤が予め同定されているが、この活性薬剤が標的部位にも、標的領域にも、標的区画にも適切には標的化されていない疾患状態における本発明の方法の使用である。このような活性薬剤を用いて、本発明の方法を用いて、活性薬剤の治療効力および治療指数を増強し得る。
【０１１５】
処置は、結合体の投与に関連した、被験体に対する任意の有益な結果を包含することを意図し、有益な結果としては、疾患となる確率の低減、疾患予防、疾患の進行の遅速化、停止もしくは逆転、または宿主に罹患した疾患状態に関連した症状の改善が挙げられ、ここで、改善または利益は、少なくとも、疾患の重篤度の低下またはその疾患の重篤度もしくは存在を示すパラメーター（例えば、処置されるべき病的状態（例えば、炎症およびそれに関連した疼痛）に関連した、組織損傷、細胞死、過剰量もしくは有害量のリソソーム蓄積物質、症状）の大きさの低下をいうために広義で用いられる。このように、処置はまた、病的状態または少なくともそれらに関連した症状が完全に阻害される（例えば、生じるのが予防される）かまたは停止（例えば、終結）されて、その結果、宿主はもはや病的状態または少なくとも、この病的状態を特徴付ける症状を被らない状況を含むがこれらに限定されない。
【０１１６】
種々の宿主または被験体は、本発明の方法に従って処置され得る。一般に、このような被験体は、「哺乳動物」または「哺乳動物の」であり、ここで、これらの用語は、食肉目（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含め、哺乳綱に属する生物を記載するために広範に用いられる。多くの実施形態では、宿主または被験体は、ヒトである。
【０１１７】
（治療活性について結合体をスクリーニングする方法）
本発明の結合体が、リソソームへの治療薬剤の送達を増加させる能力は、ｐ９７結合体化剤の送達を、コントロール（例えば、非結合体化剤）に対して比較することによってインビトロで評価され得る。好ましい実施形態では、この結合体および薬剤は、インビトロで細胞に投与され、そしてリソソーム内でのこの結合体の局在が決定される。この評価は、標識をこのｐ９７結合体または非結合体化剤に結合体化し、その結果、細胞内でのその局在をより容易に決定および定量し得るようにすることにより、容易にされる。細胞内での化合物の局在をモニタリングするための方法は、当業者に周知であり、そして実施例１および２にさらに例示される。このような方法はまた、米国特許出願第１０／２０６，４４８号（２００２年７月２５日出願、その全体が本明細書中に参考として援用される）に例示される。
【０１１８】
別の機能的アプローチでは、ＬＳＤにおいて欠損している薬剤を有する結合体を、ＬＳＤに罹患した細胞とインビトロで接触させ得、そしてリソソーム内に見出される蓄積物質の量に対するこの結合体の影響が、非結合体化剤の等しい量の影響に対して比較され得る。細胞もしくはリソソームの体積が測定され得るか、または蓄積物質が直接定量され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症を処置する際の治療活性について化合物をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、リソソームを有する細胞を化合物と接触させる工程であって、ここでこの化合物は、リソソーム蓄積症において欠損した酵素に共有結合されたｐ９７を含む、工程；次いで、このリソソームに対するこの化合物の送達をモニタリングする工程による。このモニタリングする工程は、この結合体への標識およびこのリソソーム内でのこの標識の検出によって、またはリソソーム蓄積物質に対するこの化合物の影響（例えば、蓄積物質の量を減少させるか否か）を決定することによって、行われ得る。いくつかの実施形態では、この細胞はヒト細胞である。
【０１２０】
さらなる方法では、当業者に公知でかつ実施例３に例示されるように、臨床試験が行われる。より好ましくは、この結合体は、目的のＬＳＤの動物モデルを提供する試験動物に投与される。このような動物モデルは、当業者に周知である。例えば、本明細書中に参考として援用される、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ  ０１／８３７２２を参照のこと。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の単に例示であることが意図され、限定すると構成されるべきではない。
【実施例】
【０１２２】
（実施例１：ｐ９７の免疫細胞化学的局在決定）
本発明者らの第１セットの実験の焦点は、非結合体化ｐ９７が培養脳細胞中のリソソームに局在することを示すことであった。これは、ｐ９７と、細胞内でのリソソームについてのマーカーとの「共局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）」を示すことによって達成される。リソソームの「共局在」を示すことは、ｐ９７をリソソーム酵素についての適切なビヒクルと確認することに向けての第１工程である。
【０１２３】
ヒトニューロン株を用いて、最初の実験を行った。奇形癌由来の分化したヒトＮＴ２ニューロンは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販される。ヒトニューロン株は、最も適切な系である。なぜなら、研究中のこのｐ９７タンパク質は、ヒト起源のタンパク質であり、そして最終的な標的は、罹患した患者内の神経組織であるからである。
【０１２４】
細胞内でのｐ９７の免疫細胞化学染色を、Ｌ２３５を局在させるフルオレセイン結合体化二次抗体とともにＳｙｎａｐｓｅからのＬ２３５モノクローナルを用いて達成した。抗ｐ９７  Ｌ２３５抗体は、培養培地から取り込まれた物質に加えて、内因性物質（ｐ９７は、正常なニューロン細胞中で発現される）を検出する。マーカーは、細胞小器官特異的蛍光パターン（これに対して、観察されたｐ９７蛍光パターンが比較され得る）を提供するために必要とされる。この２つのパターンの重複は、ｐ９７の特異的細胞内局在を確認する。この目的のために、リソソームプロテアーゼの１種であるカテプシンＬに対する抗体を、免疫蛍光実験においてＬ２３５と組み合わせて用いた。この抗カテプシンＬ抗体は、マウスカテプシンＬのＣ末端ペプチドに対して惹起された。そしてこの抗カテプシンＬ抗体は、ヒトニューロン細胞中のリソソームの強固な染色を示す。テキサスレッド結合体化二次抗体を用いて、抗カテプシンＬ一次抗体を検出した。ヒトＮＴ２ニューロンをガラスのカバースリップ上で増殖させ、そして０．５ｍｇ／ｍｌ  ｐ９７を２時間供給した。次いで、細胞をリンスし、ホルムアルデヒドで固定し、そして透過化処理した。固定した細胞を、一次抗体および二次抗体で共染色（ｃｏ−ｓｔａｉｎ）し、そしてスライドに載せた。細胞をまた、核についての染料であるＤＡＰＩで処理した。スライドを、異なるマーカーを分離する適切なフィルターセットを用いて画像化した。
【０１２５】
（実験方法）
細胞型：ヒトニューロン細胞株を主に用いて、これらの実験を行った。奇形癌由来の分化したヒトＮＴ２ニューロンは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから市販されている。ＣＲＬ１０７４２およびＣＲＬ１０４４２の未成熟皮質ニューロンは、ＡＴＣＣから入手可能である。ＣＲＬ１０７４２（名称ＨＣＮ−２）は、ラスムッセン脳炎を有する患者から開発された。ＣＲＬ１０７４２は、ニューロンマーカーに染まるが、非ニューロンマーカーには染まらない。この細胞株は、化学的化合物および生物学的化合物の評価のためのスクリーニング方法における使用について、米国特許第５，１９６，３１５号によって含まれる。ＣＲＬ１０４４２（名称ＨＣＮ−１Ａ）は、片側性巨大脳髄症に罹患した患者由来の脳皮質ニューロンである。ヒトニューロン株は、現在の調査に最も適切な系である。なぜなら、研究中のｐ９７タンパク質はヒト起源のタンパク質であり、そして最終的な標的は、罹患した患者内のニューロン組織であるからである。ＭＰＳＩ患者由来の線維芽細胞を、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋから元々得られたこの細胞株のＢｉｏＭａｒｉｎストックから入手した。細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で維持した。
【０１２６】
抗体：マウス抗ｐ９７モノクローナルＬ２３５は、親切にも、Ｓｙｎａｐｓｅより提供された。免疫組織化学に適切な希釈を、バックグラウンドシグナルが見えなくなるまで、固定したＤＧ４４細胞に対する抗体の力価測定によって決定した。ウサギ抗カテプシンＬ（Ｍ−１９）抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４と結合体化した、ロバ抗マウス（ＤＡＭ）二次抗体およびヤギ抗ウサギ（ＧＡＲ）二次抗体をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入し、そして製造業者によって推奨される希釈で用いた。
【０１２７】
蛍光プローブ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒタンパク質標識キットを用いて、ｐ９７およびイズロニダーゼを蛍光タグした。蛍光標識したトランスフェリンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販される。Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから市販される、酸性細胞小器官についてのマーカーである。
【０１２８】
機器：固定した細胞の検査を、以下のフィルターセットを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＩＲＢを用いて実施した：Ｌｅｉｃａ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｕｂｅ  Ａ（ＵＶ励起範囲）Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ３４０−３８０／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＬＰ４２５。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８タグを可視化するために用いたＬｅｉｃａ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｕｂｅ  １３（Ｂｌｕｅ励起範囲）Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ４５０−４９０／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＬＰ５１５。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４タグを可視化するために用いたＬｅｉｃａ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｕｂｅ  Ｎ２．１，（緑色の励起範囲）Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＢＰ５１５−５６０／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ＬＰ５９０。
【０１２９】
タンパク質取り込み条件：６ウェルプレート内のカバースリップ上に、取り込み実験の１日前に、細胞を、１ウェルあたり２×１０５細胞と５×１０５細胞との間の密度で播種した。細胞を、無血清ＤＭＥＭ＋１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで３回洗浄した。取り込み用タンパク質を、これらの細胞にＤＭＥＭ＋１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中６０μｇ／ｍｌにて添加し、そして５％  ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター中で、取り込み期間の持続時間にわたってインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、そしてＣＡＬＴＡＧから入手可能な市販のホルムアルデヒドベースの固定剤で固定した。細胞を、７０％エタノール中に浸漬することによって透過化処理した。抗体染色を、ＣＡＬＴＡＧ透過化溶液中で実施した。全ての工程は、ＰＢＳ中での３回の洗浄によって隔てられ、１回目のＰＢＳは、細胞核を染色する０．１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩを含んでいた。カバーガラスを、試験用Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａｎｔｉｆａｄｅに載せた。
【０１３０】
（結果）
図１Ａ〜図１Ｄに示される免疫蛍光画像は、Ｌ２３５および抗カテプシンＬ抗体を用いた、ヒトＮＴ２ニューロンにおける共局在決定実験の結果を示す。図１Ａの「光学顕微鏡」フレームは、ＤＡＰＩの励起波長でのさらなる照射を用いた位相差下で観察された単一の培養ヒトニューロンを示す。核は、青色蛍光シグナルによって示され、このフレームの中心に位置する。この細胞の細胞質は、核から流れて見られ得る。
【０１３１】
「カテプシン染色」フレーム（図１Ｂ）は、カテプシンＬ検出のための励起波長の光での照射下で見た同じ細胞である。カテプシンＬの位置は、赤色蛍光によって同定される。このフレームにおいて見られる点状の外観のシグナルパターンは、リソソームに特有である。
【０１３２】
（図１Ｃ）の「Ｌ２３５染色」フレームは、ｐ９７検出のための励起波長の光でここで照射したこと以外は同じ細胞のフレームである。ｐ９７の位置は、緑色蛍光によって同定される。このフレームは、カテプシンＬ画像において見られ得るのと同じ型の点状リソソーム染色パターンを示す。これらの２つのフレームにおける蛍光パターンの注意深い比較は、これらが一致することを示す。カテプシンＬおよびｐ９７は、細胞内に同様に局在する。
【０１３３】
ｐ９７およびカテプシンＬの共局在の確認を、図１Ｄ（「オーバーレイ」）に示す。これらの２つの蛍光シグナルを合わせることにより、２つの異なる抗体からの赤色光と緑色光との組み合わせである、橙色に着色した点状のパターンを生じる。これらの結果は、ヒト脳皮質組織に由来するＡＴＣＣニューロン株ＣＲＬ  １０７４２においても同じである。
【０１３４】
（実施例２：タグ化されたｐ９７の細胞内蛍光検出）
内因性物質のバックグラウンド内でのエンドサイトーシスを受けた物質の選択的追跡は、第２の検出系の使用を必要とする。この目的のために、細胞に、ｐ９７を供給した。このｐ９７は、蛍光マーカーＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に結合体化されていた。生細胞からのマーカーの蛍光の観察によって、内因性物質の寄与なく、エンドサイトーシスを受けたｐ９７のみに由来するシグナルの同定が可能である。生細胞についてのリソソームマーカーは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４タグ化ｐ９７を用いた共局在決定に必要であった。このようなマーカーは、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎであり、これは、後期エンドソーム（ｌａｔｅ−ｅｎｄｏｓｏｍａｌ）区画およびリソソーム区画の酸性環境に曝露されると蛍光を発するようになる、生存細胞によって取り込まれる色素である。上記で概説した実験と同様に、細胞に、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｐ９７を２時間にわたって供給し、そして洗浄して未結合の物質を除去し、そして生細胞を、異なるマーカーを分解するための適切なフィルターセットを用いて画像化した。
【０１３５】
（実験方法）
実施例１の「実験方法」を参照のこと。
【０１３６】
（結果）
エンドサイトーシスを受けたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−ｐ９７の局在を、生細胞において決定した。細胞を、適切なフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡で直接的に観察した。
【０１３７】
内因性物質のバックグラウンド内での、エンドサイトーシスを受けた物質の選択的追跡は、第２の検出系の使用を必要とする。この目的のために、細胞に、蛍光マーカーＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に結合体化したｐ９７を供給した。生細胞からのマーカーの蛍光の観察によって、内因性物質からの寄与がなく、エンドサイトーシスを受けたｐ９７のみに由来するシグナルの同定が可能である。生細胞についてのリソソームマーカーは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４タグ化ｐ９７を用いた共局在決定に必要であった。このようなマーカーは、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎであり、これは、後期エンドソーム区画およびリソソーム区画の酸性環境に曝露されると蛍光を発するようになる、生存細胞によって取り込まれる色素である。上記で概説した実験と同様に、細胞に、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｐ９７を２時間にわたって供給し、そして洗浄して未結合の物質を除去し、そして生細胞を、異なるマーカーを分解するための適切なフィルターセットを用いて画像化した。
【０１３８】
エンドサイトーシスを受けたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−ｐ９７の局在を、生細胞において決定した。細胞を、適切なフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡で直接観察した（図２Ａ〜図２Ｃ）。「Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−ｐ９７」フレーム（図２Ａ）は、発蛍光団タグ化ｐ９７およびＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎを供給した生きたｈＮＴニューロン細胞を示す。このフレームにおける細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４の励起波長での照射下で観察する。エンドサイトーシスを受けたｐ９７の位置は、赤色蛍光によって同定される。このパターンは点状であり、核の周囲においてである。「Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ」のフレーム（図２Ｂ）は、Ｌｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎの励起波長での光を用いた照射下で見た同じ細胞である。リソソームおよび後期エンドソームを含め、細胞の細胞区画の位置は、緑色蛍光によって同定される。このパターンはまた、点状であり、そして核の周囲においてである。エンドサイトーシスを受けたｐ９７およびＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒ色素の共局在を、第３フレーム（「オーバーレイ」）に示す（図２Ｃ）。これらの２つの蛍光シグナルを合わせることにより、２つの異なる蛍光マーカーからの赤色光と緑色光との組み合わせである、橙色に着色したパターンを生じる。
【０１３９】
上記の実験データ（実施例１〜２）は、ｐ９７がリソソーム内に局在し、そして培養細胞のリソソームの細胞表面から輸送されることを示す。脳細胞リソソームへのｐ９７媒介送達に必要とされるこの２つの主な輸送工程は、生じるようである。Ｓｙｎａｐｓｅは、ｐ９７分子が、ＢＢＢを越えるその「ペイロード」を送達することを示した。本発明者らの結果は、ｐ９７が、培養脳細胞中のリソソームへと輸送されることを示した。まとめると、これらの結果は、ｐ９７が、組換え酵素を、この疾患の神経学的症状発現を罹患するＬＳＤ患者へと送達するに有効な手段であることを示す。
【０１４０】
（実施例３：ＭＰＳ−Ｉ障害を有する患者の処置）
ｐ９７に連結したヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを含む結合体化剤を含む薬学的組成物を、当業者に周知の方法によって調製する。薬学的組成物を静脈内投与することが好ましい。この流体の最終投薬形態は、結合体化剤、規定生理食塩水、リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）および１ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを含む。これらを、規定生理食塩水のバッグ中で調製する。
【０１４１】
（成分組成）
結合体化剤（ｐ９７に連結したα−Ｌ−イズロニダーゼ）  ０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬまたは１２，５００〜５０，０００単位／ｍＬ；
塩化ナトリウム溶液  ＩＶバッグ中１５０ｍＭ、５０〜２５０ｃｃ総体積；
リン酸ナトリウム緩衝液  １０〜５０ｍＭ（ｐＨ５．８）；
ヒトアルブミン  １ｍｇ／ｍＬ。
【０１４２】
白血球および線維芽細胞において正常の１％未満のα−Ｌ−イズロニダーゼレベルを有するＭＰＳ−Ｉ障害の臨床表現型を表すヒト患者を、この研究に含める。全ての患者は、種々の程度の機能的欠陥を有するグリコサミノグリカンの内臓組織および軟組織蓄積のいくらかの臨床的証拠を表す。効力を、経時的に尿のＧＡＧ排出における減少の百分率を測定することによって決定する。ＭＰＳ−Ｉ患者における尿のＧＡＧレベルを、正常な排出値と比較する。未処置のＭＰＳ−Ｉ患者において、広範囲の尿ＧＡＧ値が存在する。この結合体化剤を用いた治療後の未分解のＧＡＧの排出における５０％を超える減少は、治療に対する個体の応答を測定する有効な手段である。ＭＰＳ−Ｉ患者における治療の前後の白血球イズロニダーゼ活性および頬のイズロニダーゼ活性を測定したデータを収集する。肝臓および脾臓の大きさの臨床評価を実施する。なぜなら、これらは、ＭＰＳ−Ｉ患者における成功裏の骨髄移植処置を評価するための、最も広く受け入れられた手段であるからである（Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅら，Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：１３９８（１９９５））。
【０１４３】
（実施例４：薬剤をｐ９７分子へと連結する、方法および組成物）
本発明による結合体および好ましい実施形態としては、以下の式の結合体が挙げられる：
【０１４４】
【化３】
2006506317.tif 000005
ここで、Ａは、活性薬剤であり、そしてＢは、標的化または送達のためのｐ９７分子である；そしてＸ１およびＸ２は、独立してＮまたはＯであり；Ｒは、１〜約３０原子長または１〜５０原子長の、置換されたアルキルもしくは置換されていないアルキルまたは置換されていないヘテロアルキルもしくは置換されたヘテロアルキルであり；そしてｎは、１〜３０である。ｎが１より大きい場合、活性薬剤は、同じであっても異なっていてもよい。異なる場合、活性薬剤は、同じ疾患または状態の処置に有用である。「アルキル」は、以下のとおりのアルカンの二価ラジカルを包含する。このようなリンカーは、米国仮出願第６０／３９５７６２号（０７／１２／２００２出願、そしてその全体が本明細書中に参考として援用される）に教示される。
【０１４５】
さらなる実施形態では、標識Ｌは、式Ｉの化合物に共有結合される。この標識は、活性薬剤部分（ｐ９７部分）または活性薬剤をｐ９７へと連結するリンカーにて、結合体に結合され得る：
【０１４６】
【化４】
2006506317.tif 000006
いくつかの実施形態では、この標識は好ましくは、結合体のｐ９７部分に結合される。
【０１４７】
これらの結合体は、放出能力の利点を有する。本発明によるイソシアネート試薬がヒドロキシ基と反応する場合、これは、それが投与される被験体の身体中で、内因性酵素（例えば、プロテアーゼ）によって加水分解され得るカルバメート結合を形成する。本発明によるこのイソシアネート試薬は、アミノ基と反応して、イソウレア結合を生成する。イソウレア結合もまた、それが投与される被験体の身体中で、内因性酵素によって加水分解され得る。ｐ９７部分への結合によって、この薬剤は、身体内の標的リソソーム区画または部位へと送達され、このプロテアーゼまたは他の内因性酵素は、カルバメート結合またはイソウレア結合を加水分解して、標的部位または区画において、遊離薬物を遊離させる。
【０１４８】
例示的な結合体は、ＰＥＧ化ペプチドおよびタンパク質の当該分野で周知のように、官能基を介してＰＥＧ部分へと共有結合されたｐ９７を含み、このＰＥＧ部分は次いで、カルバメート結合を介して活性薬剤へと連結される。用語活性薬剤としては、ＬＳＤにおいて欠損しているタンパク質または酵素が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、この結合体は、カルバメート基を介してＰＥＧ部分へと共有結合され、このＰＥＧ部分は次いで、カルバメート結合を介して活性薬剤へと連結される。別の実施形態では、この結合体は、カルバメート基を介してＰＥＧ部分へと共有結合され、このＰＥＧ部分は次いで、カルバメート結合を介してアルキル部分またはホモアルキル部分へと結合され、そしてこのアルキル部分またはホモアルキル部分は次いで、カルバメート結合を介して活性薬剤へと結合される。
【０１４９】
これらの結合体はまた、本発明の方法に従って高い効率で合成されるという利点を有する。イソシアネート基とヒドロキシおよびアミノとの間の本発明の反応は、非常に効率的である；そしてその収率は、非常に高い（通常、９０％を超える）。さらに、イソシアネート基とヒドロキシ基またはアミノ基との反応によって形成された新たな結合は、この薬物の水溶性を増大させる。この特性は、実用上重要な特性であり得る。
【０１５０】
（実施例５：リソソーム蓄積症を有する患者の処置）
リソソーム蓄積症において欠損しており、ｐ９７に連結された、ヒト酵素またはタンパク質を含む結合体化剤を含む薬学的組成物を、当業者に周知の方法によって調製する。薬学的組成物を静脈内投与することが好ましい。あるいは、この組成物は、罹患した器官に局所投与され得る。この液体の最終投薬形態は、この結合体化剤、規定生理食塩水、リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）および１ｍｇ／ｍｌのヒトアルブミンを含む。これらを、規定生理食塩水のバッグにおいて調製する。
【０１５１】
（成分組成）
結合体化剤  ０．０２〜２．０ｍｇ／ｍＬ
（ｐ９７に連結されたリソソーム蓄積症タンパク質または酵素）；
塩化ナトリウム溶液  ＩＶバッグ中１５０ｍＭ、５０〜２５０ｃｃの総体積；
リン酸ナトリウム緩衝液  １０〜５０ｍＭ（ｐＨ５．８）；
ヒトアルブミン  １ｍｇ／ｍＬ  。
【０１５２】
リソソーム蓄積症またはリソソーム蓄積障害の臨床的表現型を表すヒト患者は、この特定の疾患または障害において欠損しているタンパク質または酵素を有する結合体を用いて処置されるべきである。全ての患者は、特定のリソソーム蓄積症または特定のリソソーム蓄積障害に関連した、種々の程度の機能的欠陥または悪化した健康状態によって示されるような、リソソームにおける過剰または有害な内臓組織蓄積物質および軟組織蓄積物質のいくらかの臨床的証拠を表す。好ましくは、酵素レベルを患者においてモニタリングして、それらの組織にリソソーム蓄積症タンパク質の活性がないことまたは低下していることを確認する。効力は、経時的に、結合体化した酵素の基質の尿排出の低下百分率を測定することによって決定される。患者における尿基質レベルを、未処置の患者または処置前の同じ患者における、正常な排出値および／または排出レベルと比較する。効力はまた、リソソーム疾患に関連した任意の病状の低減した徴候および症状に従って決定され得る。効力は、基質または蓄積物質が減少した程度を決定するための、細胞および／またはリソソームの組織生検および検査によって決定され得る。効力は、客観的または主観的であり得る機能評価（例えば、疼痛もしくは機能困難性の低減、筋肉強度もしくはスタミナの増加、または心拍出量の増加、運動耐久性、ボディマスもしくは外観の変化）によって決定され得る。この結合体化剤を用いた治療後の分解されていない基質の排出における、２５％または５０％より高い低下は、治療に対する個体の応答を測定する有効な手段である。処置の前、後および間における組織中での対象の結合体化酵素の活性または存在をしたデータを収集し得る。器官サイズの臨床評価を、治療効力を評価する手段として実施し得る（例えば、Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅら，Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：１３９８（１９９５）を参照のこと）。
【０１５３】
本発明を、現在好ましい実施形態を参照して記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、種々の改変が行われ得ることが理解されるべきである。
【０１５４】
全ての刊行物、特許、特許出願およびウェブサイトは、各々の個々の特許、特許出願またはウェブサイトがその全体が参考として援用されると具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、抗カテプシンＬおよびｐ９７に対するＬ２３５モノクローナルを用いて染色したヒトｈＮＴニューロン（ヒト奇形癌由来）を示す（詳細については、実施例１を参照のこと）。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４−ｐ９７およびＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒ  ｇｒｅｅｎを提供した生ニューロンを示す（詳細については、実施例２を参照のこと）。
【図３】記載なし。
【図１】
2006506317.tif 000007
【図２】
2006506317.tif 000008
【図３】
2006506317.tif 000009
【国際調査報告】
2006506317.tif 000010
2006506317.tif 000011
2006506317.tif 000012