(57)【要約】本発明は、表面上に、膜タンパク質を含む生体膜の物理的に安定なアレイを製造する方法、および製造により得られた製品を提供する。本発明の方法は、基体を提供し；この基体を、（１）水／空気の界面を通しての取出しおよび洗浄と乾燥のプロトコル中の脂質スポットの安定性を向上させる、または（２）標識された標的の、バックグラウンド表面への非特異的結合を最小にし、膜アレイ中のプローブ・レセプタへの高特異的結合を生じる、もしくは（３）その両方を生じる材料でコーティングすることによって、極性表面または反応性表面のいずれかを形成し；基体上に生体膜マイクロスポットのアレイを付着させる各工程を有してなる。本発明の方法はさらに、表面上の生体膜を安定化させるために可溶性タンパク質を含む試薬を塗布する工程をさらに有してもよい。これらの性質を体現した基体表面に安定した様式で関連する生体膜マイクロスポットを有する製品も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持基体を提供し、
前記支持基体上に極性表面または反応性表面のいずれかを形成し、
生体膜の溶液を提供し、
前記支持基体上に生体膜マイクロスポットのアレイを付着させる、
各工程を有してなる、表面に生体膜アレイを製造する方法であって、
前記マイクロスポットが所定の位置に留まり、液体または空気の環境のいずれかもしくはその両方で生体機能を維持するように、該マイクロスポットが前記支持基体の表面に安定な様式で付けられていることを特徴とする方法。
【請求項２】
支持基体、該支持基体上に付着した生体膜マイクロスポットのアレイ、および前記支持基体上の極性表面または反応性表面のいずれかを有してなる、生体膜アレイのための製品であって、
前記マイクロスポットが所定の位置に留まり、液体または空気の環境のいずれかもしくはその両方で生体機能を維持するように、該マイクロスポットが前記支持基体の表面に安定な様式で付けられていることを特徴とする製品。
【請求項３】
前記極性表面または反応性表面が、
（１）水／空気の界面を通しての取出し、洗浄および乾燥のプロトコル中の脂質スポットの安定性を向上させる；または
（２）前記表面に標識標的の非特異的結合を最小にし、前記膜アレイ中のプローブ受容体への特異的結合を高くさせるのいずれか；もしくは
（３）その両方を満たす；
材料で前記基体を被覆し、
前記基体上の生体膜マイクロスポットのアレイを付着させることにより形成されることを特徴とする請求項１または２記載の発明。
【請求項４】
１）親水性または荷電ポリマー、または
２）前記支持基体上の生体膜内の標的膜タンパク質または他の機能的分子の結合領域に干渉しない水溶性タンパク質、
いずれかを含む、前記支持基体上の生体膜を安定化させるための試薬をさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の発明。
【請求項５】
前記支持基体上のタンパク質が互いに密接に凝集して前記生体膜マイクロスポットの周りに少なくとも一層を形成し、それによって、生体膜アレイを安定化させることを特徴とする請求項１から４いずれか１項記載の発明。
【請求項６】
前記基体が、約５°から約８０°、好ましくは約１５°から約６０°、より好ましくは約２５°から約４５°に及ぶ水接触角を与える材料により被覆されていることを特徴とする請求項１、３から５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記基体が、約０°から約２５°に及ぶ水接触角を与える材料により被覆されていることを特徴とする請求項１から５いずれか１項記載の発明。
【請求項８】
前記基体が、シラン、チオール、生体または合成ポリマーからなる選択される材料により被覆され、１）前記材料がシランである場合、該シランがγアミノプロピルシランを含むアミン官能基を有し、２）前記材料がチオールである場合、該チオールが、疎水性部位と親水性部位を有してなるか、または前記材料がアルキルチオールである場合、該アルキルチオールが少なくとも一つの極性部位を有し、３）前記材料がポリマーである場合、該ポリマーが、ポリ−エチレンイミンまたはポリ−リジンいずれかを含むアミン官能部位を有することを特徴とする請求項１から７いずれか１項記載の発明。
【請求項９】
共有結合したリンカー部位を有する単層または多層いずれかを有してなるコーティング材料により所定の表面を修飾する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記反応性表面が、１）チオール反応性基または他の求電子性基、２）小麦胚凝集素、抗Ｇタンパク質抗体または抗ヒス抗体から選択される結合官能部位または分子、もしくは３）グリシドキシ基、イソシアナート基、無水物基、またはＮＨＳエステル基の内の少なくとも一つを含むアミン反応性基、を有することを特徴とする請求項１から９いずれか１項記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００１年５月１４日に出願された米国特許出願第０９／８５４７８６号および２００１年１０月９日に出願された米国特許出願第０９／９７４４１５号を参照している、２００２年１１月２０日に出願された米国特許出願第１０／３００９５４号の優先権を主張するものである。これらの内容をここに引用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、生体膜アレイ、並びにその製造方法および使用方法に関する。特に、本発明は、基体上の膜タンパク質および膜アレイを安定化させるための表面化学性質および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体膜アレイ、特に、膜−タンパク質アレイの製造は、固定化状態におけるタンパク質の正確に折り畳まれた構造の維持に関連する難点、およびこれらの固定化されたタンパク質に標的が非特異的に結合する傾向のために難しい。薬物標的の大部分は膜結合タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役レセプタ、イオンチャネルなど）であるので、膜結合タンパク質に対するハイスループット・スクリーニングのための器具を開発することが奨励される。膜タンパク質は、脂質と結合するときに、折り畳まれた構造を維持し、したがって、そのようなタンパク質のアレイを形成するために、膜の結合を支持する表面を最初に開発することが重要である。支持された二層脂質膜と称される、固体支持体に吸着された二層脂質膜は、生体膜の構造的かつ機能的役割を模倣できる（非特許文献１〜６参照のこと）。これらのハイブリッド表面は、天然の生体膜に観察された側方の流動性の特徴を維持しながら、黒色脂質膜の脆性を克服するために開発された。
【０００４】
脂質膜と結合するための表面は、五つの範疇に大ざっぱに分類できる：（１）疎水性表面（例えば、末端メチル基を有する自己組織化単層膜）；（２）親水性表面（例えば、ベアガラスまたは他の無機表面）；（３）二層脂質膜と結合する疎水性と親水性両方の部分を含有する、両親媒性アンカー分子を有するハイブリッド表面；（４）「ポリマー・クッション」を有する表面；および（５）生体膜中の特定の分子に特異的に結合する官能部分を有する表面。脂質単層膜の吸着を支持する疎水性表面は、膜貫通タンパク質を組み込むために使用できないので、実用性が限られている（非特許文献５）。他方で、二層脂質膜と結合する親水性表面は、吸着水の層よりも厚さが薄い（約１０Å、約１ｎｍ）膜外領域を持つ膜貫通タンパク質を組み込むためだけに使用できるので、これも実用性が限られている（非特許文献３および７）。これとは対照的に、両親媒性アンカー分子を有するハイブリッド表面は、様々な膜貫通タンパク質を組み込む潜在能力を示す（非特許文献４および６）。両親媒性アンカー分子は、アンカー分子の親水性部分の長さにより決定される距離だけ、基体表面からずれて脂質二層膜に結合できる。「ポリマー・クッション」を有する表面は、ポリマー・マトリクスによって硬質基体表面からずれて支持された脂質二層膜を形成し、変形可能である。柔軟性両親媒性テザー(tether)またはポリマー・クッションを有するものなどの変形可能な表面は、様々な膜貫通タンパク質を固定化するのに使用できる。官能部分を有する表面は、生体膜の固定化を方向付けることができ、膜中のレセプタの方向を調節する能力を示し、このことは転じて、結合アッセイにおける潜在的に高い特異性を生じることができる。
【０００５】
膜アレイを製造する方法により、多数の薬物の候補に対する多数の標的のハイスループット・スクリーニングが可能になるであろう。膜アレイは、二つの一般的な手法を使用することにより得られる。第一の手法によれば、膜結合領域と非結合領域を有する、パターンの形成された基体表面を、膜または膜タンパク質を含有する溶液と共にインキュベートする。この第一の手法の実例において、酸化チタンは脂質の吸着に抵抗するので、ガラス基体上に酸化チタンのマス目を形成することができる（非特許文献８および９）。しかしながら、このプロセスには、プリンタと脂質結合領域との間で注意深い位置合せが必要であるので、この第一の手法は、異なる膜組成物をプリントする必要のあるマイクロアレイ用途にはうまく適していない。各々の囲いに入った脂質結合領域に空間的にアドレスするためにマイクロピペット法が用いられてきた（非特許文献１０）。しかしながら、これらの方法は扱いづらい。
【０００６】
第二の手法によれば、パターンの形成されていない膜結合表面上に膜または膜タンパク質の溶液をプリントする。パターンの形成されていない表面に膜をプリントすることにより膜アレイを製造するためには、膜分子が非プリント区域に側方に拡散せずに、プリントされた脂質分子、膜または膜組込タンパク質を、プリント済み区域に制限する必要がある。この空間的制限は、二つの異なる手段により行われる：（１）共有結合または親和性による固定化（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン、Ｎｉ−ヒスチジン）；および（２）非共有結合固定化。細胞膜内の分子の側方拡散は、天然のすなわち実際の生体膜の基本的性質であるので、膜全体の共有結合固定化は、生体模倣の支持された膜の製造には望ましくない。偶然に、脂質分子間の強力な分子間相互作用により、自己制限膨張に至り、プリントされた膜のプリント済み区域への非共有結合制限が可能になる。Boxer等は、ホスファチジル・コリン（ＰＣ）により「インク付けされた」ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプを用いたマイクロコンタクト・プリント法によって、ガラス表面に脂質のパターンを形成できることを実証した。Boxer等は、脂質がスタンプされた領域に側方に制限されるのは、プリントされた元の区域の約１０６％までのＰＣ膜の自己制限膨張のためであると考えた（非特許文献１１）。しかしながら、Boxer等により用いられた方法にはいくつかの制限がある。第一に、Boxerとその共同研究者は、水中に浸漬された表面への脂質のスタンピングを行った（非特許文献１１）。第二に、Boxerとその共同研究者により用いられたベアガラス基板上に吸着された脂質は、空気と水との界面を通って取り出されたときに自発的に脱離された（非特許文献１０）。Cremer等は、特許文献１において、平面支持構造体を保持するために水中に沈められたままである、空間的にアドレスされた脂質二層膜アレイの使用を提案している。そのようなアレイは、周囲空気の雰囲気におけるプロセスに耐える必要があるので、そのような系は、粗野なハイスループットのマイクロアレイベースのアッセイにとっては実際的ではないであろう。
【特許文献１】国際公開第０１／２０３３０号パンフレット
【非特許文献１】Sackmann,E. Science 1996, 271, 43-48
【非特許文献２】Bieri,C. et al., Nature Biotech., 1999, 17, 1105-1108
【非特許文献３】Groves,J.T. et al., Science 1997, 275, 651-653
【非特許文献４】Lang,H. et al., Langmuir 1994, 10, 197-210
【非特許文献５】Plant,A.L. et al., Langmuir 1999, 15, 5218-5135
【非特許文献６】Raguse,B. et al., Langmuir 1998, 14, 648-659
【非特許文献７】Groves,J.T. et al., Langmuir 1998, 14, 3347-3350
【非特許文献８】Boxer,S.G. et al., Science 1997, 275, 651-653
【非特許文献９】Boxer,S.G. et al., Langmuir 1998, 14, 3347-3350
【非特許文献１０】Cremer,P.S. et al., J.Am.Chem.Soc. 1999, 121, 8130-8131
【非特許文献１１】Hovis,J. et al., Langmuir 2000, 16, 894-897
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、水性環境だけでなく、周囲湿度または制御された湿度での空気に曝露される環境において、製造したり、使用したり、貯蔵できる、基体の表面に付けられた複数の生体膜マイクロスポットを有してなるアレイを提供することによって、従来技術のアレイに関連する問題や欠点を克服する。本発明は、一部は、様々な表面上に生体膜アレイを調製し、製造する方法に関する。この方法は、支持基体を提供し；支持基体上に極性表面または反応性表面（すなわち、アミンまたはチオールもしくは他の反応性部分、および膜タンパク質または脂質膜中に組み込まれる他のエフェクタのための結合部位を提供する共有結合または反応性表面）のいずれかを形成し；膜タンパク質を有する生体膜を含む生体分子の溶液を提供し；支持基体上に生体膜マイクロスポットのアレイを付着させる各工程を有してなり、マイクロスポットが支持基体の表面に安定な様式で付けられている。それゆえ、マイクロスポットは、所定の位置に留まり、液体または空気環境のいずれか、もしくはその両方で生体機能を維持する。生体膜の付着は、周囲湿度または調整された湿度いずれかの条件下でのプリントにより行われる。極性表面および反応性表面の両方は、（１）水／空気の界面を通っての取出しおよび洗浄と乾燥のプロトコル中の脂質スポットの安定性を向上させる、または（２）標識された標的の、バックグラウンド表面への非特異的結合を最小にし、膜アレイ中のプローブ・レセプタへの高特異的結合を生じる、もしくは（３）その両方を生じる材料で基体をコーティングすることによって形成できる。
【０００８】
支持体の表面と脂質二層との間の小麦胚凝集素層などの、生体膜内の生体分子に特異的に結合する官能基を有するコーティングを塗布することにより、反応性表面を形成できるであろう。このようにして得られた生体膜アレイは、空気の疎水効果のために、分解に対して耐性がある。特定の状況において本発明の方法は、タンパク質を含んでよい試薬を施して、各マイクロスポット内の生体膜（例えば、脂質および膜タンパク質結合脂質）を安定化させる工程をさらに含む。この方法は、膜溶液にじみなどの、現在利用できる技法に関連する損失なく、きれいに規則正しい様式で生体膜のプリントまたは他の付着を可能にする。本発明はまた、ここに記載した方法により調製した生体膜アレイのための製品または基体、およびキットまたはアセンブリにも関する。
【０００９】
本発明によれば、支持体上の生体膜のアレイまたはマイクロアレイを安定化するために用いられる試薬は、標的膜タンパク質の結合領域または表面にアレイが形成された膜内の他の官能性分子に干渉しない水溶性タンパク質を含有してもよい。例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質は、ベアガラス、マイカ、金、シランおよびアルキルチオールの自己組織化単層膜、またはポリマー・グラフト結合表面などの基体に非特異的に結合できる。基体に結合したタンパク質は、互いに密接に凝集してマイクロアレイ内の膜のマイクロスポットの周りに単層を形成し、それによって、膜マイクロアレイ全体を安定化させる傾向にある。この試薬は、カルボキシメチルデキストランなどの、親水性ポリマーまたは正か負に荷電したポリマーいずれかを含んでもよい。
【００１０】
生体膜のマイクロスポットが膜結合タンパク質を有してなっていることが好ましい。膜結合タンパク質が、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、Ｇタンパク質、イオンチャネル、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼまたは受容体チロシンキナーゼであることが最も好ましい。
【００１１】
生体膜のマイクロスポットがＧＰＣＲを有してなる特定の実施の形態について、このＧＰＣＲは、所望の領域、すなわち、細胞外または細胞内の領域が溶液に面するように、アレイの用途に応じて方向付けられていてもよい。例えば、配位子のスクリーニングに関する用途については、ＧＰＣＲを、溶液に面する細胞外領域に関して方向付けることが好ましい。官能アッセイを含む用途については、溶液に面する細胞内領域に関して方向付けることが好ましい。所望の方向付けは、以下詳細に論じる基体表面修飾技法を用いて行うことができる。
【００１２】
別の実施の形態において、マイクロスポット内に含まれるＧＰＣＲは、ＧＰＣＲの一つまたはいくつかの関連する亜族の膜を含む。これらのアレイは、「族特異的アレイ」と称される。さらに、あるＧＰＣＲは、腫瘍組織を含む特定の組織タイプ内に高度に発現される。この情報を用いて、同様の組織分布（組織特異的アレイ）または同様の生理的／薬理的役割（機能特異的アレイ）を有するＧＰＣＲのアレイを形成する。
【００１３】
本発明のアレイに使用するための基体は、ガラス、シリコン、金属または高分子材料を有してなっていて差し支えない。基体は、チップ、スライドまたはマイクロプレートとして構成することができる。
【００１４】
特定の実施の形態において、基体の表面はコーティングされている。コーティングは、基体について生体膜マイクロスポットの結合性を向上させる材料である。ある実施の形態において、コーティング材料は、約５°から約８０°の範囲の水接触角を与える。好ましいコーティング材料は、約１５°から約６０°の範囲の水接触角を与える。最も好ましいコーティング材料は、約２５°から約４５°の範囲の水接触角を与える。
【００１５】
このコーティング材料はシラン、チオールまたはポリマー（生体または合成）であって差し支えない。材料がチオールである場合、基体は金被覆表面を有してなることが好ましい。チオールが疎水性部位と親水性部位を有することが好ましい。チオールが、アミン部位を有するチオアルキル化合物であることが最も好ましい。
【００１６】
コーティング材料がシランである場合、基体がガラスからなることが好ましい。シランが、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、リン酸基、スルフォン酸基、イソシアナート基、グリシドキシ基、チオール基、またはアミノ基を含む末端部位を有することが好ましい。好ましいシランコーティング材料はアミン官能基を有するシランである。最も好ましいシランコーティング材料はγ−アミノプロピルシラン（ＧＡＰＳ）である。
【００１７】
コーティング材料がポリマーである場合、コーティングは、「ポリマー・クッション」と称されるゆるく凝集したポリマー層を形成してもよい。ポリマーは、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、およびポリ−Ｄ−リジンなどのアミン官能部位を有することが好ましい。あるいは、イソチオシアネート、ＮＨＳエステル、エポキシド、および無水物などのアミン反応性官能部位を有する表面をさらに、一つより多くアミン基を有する分子（例えば、１，６−ヘキサンジアミン）で修飾して、アミン担持表面を形成しても差し支えない。同様に、チオール反応性基およびカルボン酸反応性基などの他の反応性基を有する表面を、これらの化学基の内の一つと反応する基および少なくとも一つのアミン基の両方を含有する分子で修飾して、アミン担持表面を形成しても差し支えない。
【００１８】
別の実施の形態において、コーティング材料は、誘導体化された単層（またはいくつかの単層）、共有結合したリンカー部位を有する多層(multilayer or polylayer)である。単層がチオアルキル化合物またはシラン化合物を有してなることが最も好ましい。シランまたはチオール誘導体化表面を、一種類以上の試薬（例えば、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）などの陽イオンポリマー、またはグルタルアルデヒド）で修飾して、共有結合または非共有結合いずれかの形成によって膜を固定化できるようにしても差し支えない。
【００１９】
本発明の方法およびアレイデバイスの追加の特徴および利点が以下の詳細な説明に開示されている。先の概要および以下の詳細な説明と実施例の両方は、本発明の単なる例示であり、特許請求の範囲に記載された本発明を理解するための概要を与えることを意図したものであると理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、基体上の生体膜アレイの付着と安定性を調節するための様々な表面の化学的性質を具体化する。特定の表面の化学的性質を改良することにより、本発明は、生体膜マイクロアレイの安定性を改善するための異なるタイプの表面を開発し、以前のアレイに関連する問題と欠点を克服することができた。一部には、本発明は、ここに引用する米国特許出願公開第２００２／００１９０１５号および同第２００２／００９４５４４号の各明細書に記載された研究から発展したものである。
【００２１】
本発明の生体膜−タンパク質アレイは、極性表面または反応性表面のいずれかを有する基体に結びつけられる。いくつかの要因が、膜タンパク質アレイ（特に、Ｇタンパク質結合受容体アレイについて）のスポットサイズ、均一性、安定性、官能性および配位子結合特異性と薬理的配位子結合アッセイにおけるそれらの使用に著しく影響を与える。これらの要因としては、プリント条件、プリント用インク組成、表面の化学的性質、バイオアッセイ条件、および受容体の品質が挙げられる。これらの要因の中でも、表面の化学的性質が、膜タンパク質アレイの品質とバイオアッセイの可能性を決定する上で重要な役割を果たす。脂質分子および表面上に固定化された膜タンパク質結合脂質の構造と性質は、表面の化学的性質に強く依存する。それゆえ、いくつかの表面の化学的性質を、これらの化学種を固定化するために設計した。
【００２２】
理想的には、膜タンパク質アレイの基体として使用すべき表面は以下の性質を有するべきである：（１）マイクロスポットのサイズは、調節可能であり、したがって、所望の密度のスポットを有するアレイを製造できる；（２）プリントされた膜のマイクロスポットは、バイオアッセイの前後で所定のまたは設計された位置に制限される；（３）各マイクロスポットの内の膜結合タンパク質は、生物学的機能を維持し、同種アッセイにおいて示されるものと同様の特異性および親和性を示す；（４）生体膜のプリントされたマイクロスポットは、物理的に安定であり、バイオアッセイの過程での表面からの除去に対して耐性である。この過程には、結合緩衝液とのインキュベーション、異なる媒質による濯ぎ、乾燥、または取扱い中の空気へのマイクロスポットの曝露などの様々な調製と取扱処理が含まれるであろう；（５）標的分子の非特異的結合は最小である；（６）プリントされた膜内の脂質は、生体膜の固有の生理的に重要な性質である、側方への流動性を維持する。化合物スクリーニングアッセイなどの用途のための支持膜マイクロスポット内の広範囲流動性を維持する重要性は不明であるが、アッセイとアレイの性能を妥協せずに広範囲流動性を維持する能力は好都合であると推測できる；（７）表面にある生体膜は、付着および固定化プロセス中に制御できないようにまたは所定の許容範囲を超えて広がらない。本発明は、これらの課題にうまく対処している。
【００２３】
本発明の生体膜のアレイを製造するには、様々な技法を用いてよい。例えば、本発明のアレイは、マイクロスタンプ法（米国特許第５７３１１５２号明細書）、ＰＤＭＳスタンプ（ホービス(Hovis)２０００）、毛管分配デバイス（米国特許第５８０７５２２号明細書）、マイクロピペットデバイス（米国特許第５６０１９８０号明細書）を用いたマイクロコンタクトプリント法、およびＤＮＡおよび／またはタンパク質マイクロアレイの製造に広く用いられている中実ピン(solid pin)プリント法やクイル・ピン(quill pin)プリント法などの任意の従来のプリント技法を用いて製造することができる。
【００２４】
本発明のアレイにおいて、複数の生体膜プローブスポットは固体支持体の表面に付けられている。マイクロスポットは、基体の表面に安定した様式で結びつけられている。ここで用いているように、「安定した様式で付けられる」という表現は、結合および／または洗浄の条件下で基体に対してそれらの位置を維持しているマイクロスポットを称する。すなわち、マイクロスポットは所定の位置のままにあり、各マイクロスポット内の生体膜は、空気と水との界面を通して取り出されたときに生物学的機能を維持している。それゆえ、それらのスポットを構成する生体膜は、基体の表面と安定な様式で共有結合または非共有結合することができる。共有結合の例としては、生体膜スポット内に共存するプローブタンパク質または他の非プローブタンパク質と、基体の表面上に存在する官能基との間に形成される共有結合が挙げられ、この場合、官能基は、天然に生じたものであるか、導入されたコーティング材料の一員として、例えば、アミン反応性基、またはチオール反応性基、もしくは他の求電子反応性基として存在するかのいずれかである。別の実例において、膜タンパク質またはＧＰＣＲのヒスチジン標識突然変異を用いてマイクロアレイを製造しても差し支えなく、この場合、膜タンパク質のヒスチジン標識は、キレート結合によりＮｉ担持表面に結合できる。非共有結合の例としては、非特異的物理的吸着、静電に基づく結合（例えば、イオン、イオン対相互作用）、疎水性相互作用、水素結合相互作用、表面水和力等、並びに固定化された結合パートナーと膜結合タンパク質との特異的相互作用に基づく特異的結合が挙げられる。特異的結合誘発固定化の例としては、抗体抗原相互作用、包括的配位子受容体結合、レクチン糖類部位相互作用などが挙げられる。一例は、マイクロスポット内の膜タンパク質の細胞外領域のグリコシル化残基を特異的に認識し結合できる、小麦胚凝集素を有する表面を使用することである。別の例は、ヒスチジン標識または生体膜マイクロスポット内の膜タンパク質突然変異体の任意の他の「標識」に結合できる抗ヒスチジン標識抗体または任意の他の抗「標識」抗体を有する表面を使用することである。これらの標識膜タンパク質突然変異体は、最新技術の手法により製造できる。また、ＧＰＣＲの生体膜中に存在する特定のＧタンパク質に選択的に結合する抗Ｇタンパク質抗体を有する表面を、ＧＰＣＲアレイの製造のために使用することができる。この抗体と特定のＧタンパク質との間の結合は、膜調製品中の特定のＧタンパク質のみに結合するＧＰＣＲのある個体群の質を高めることができる。
【００２５】
本発明のアレイは、必要に応じて、プローブマイクロスポットを有してなる基体の全体または一部にコーティング材料をさらに有していてもよい。コーティング材料が、基体に関する生体膜マイクロスポットの親和性を向上させることが好ましい。ある実施の形態において、コーティング材料は、約５°から約８０°の水接触角を与える。好ましいコーティング材料は、約１５°から約６０°の水接触角を与える。最も好ましいコーティング材料は、約２５°から約４５°の水接触角を与える。２５〜３５または４５°の水接触角を有する処理済み基体を高密度アレイに用いてもよい。約５°から３０または３５°の水接触角を有する基体を低密度アレイに用いてもよい。
【００２６】
セクションＩ  ポリマー・グラフト結合表面上の生体膜アレイ
脂質二層膜に付けられる膜タンパク質は一般に、脂質二層膜を超えて延在する領域（いわゆる、膜外領域）を有してなる。生体膜を固体表面上に固定化した後、これらの膜外領域は、タンパク質と固体表面との間の物理的接触のために異常に折り畳まれることがある。膜貫通タンパク質のそのような活性の損失を防ぐために、ポリマー・クッション（表面グラフト結合層または親水性ポリマーの膜）が、二層膜（および付けられたタンパク質）と固体支持体との間のスペーサとして用いられることが多い。これらのポリマー・クッションは、脂質と表面との間に十分な水和層を与えるだけでなく、変形可能でもある。表面と脂質二層膜との間の水和層が厚いほど、膜タンパク質をよりうまく自然な環境に組み入れ、その機能性を維持させることができる。ポリマー・クッション表面は、生体膜の固定化およびバイオセンサ検出における用途に使用できる。しかしながら、親水性ポリマー表面は、我々の知る限りでは、膜タンパク質アレイの製造には使用されていない。
【００２７】
本発明の特定の実施の形態を、親水性ポリマーに関して説明する。ポリマーは、アミノ酸、エチレンイミンなどの複数のモノマーユニットからなる分子を含んでいる。親水性ポリマーの例としては、ポリ−リジン、ポリ−ヒスチジン、ポリ−エチレンイミン、またはＤＥＡＥ−デキストランなどの正に荷電したポリマーが挙げられる。あるいは、親水性ポリマーは、ポリ（エチルオキサゾリン−ｃｏ−エチレンイミン−ｃｏ−ペンタデカニルオキサゾリン）などのリポポリマーであってもよい。他の実施の形態において、親水性ポリマーは、無水マレイン酸などの反応性ポリマー、またはポリ−グルタミン酸などの負に荷電したポリマーである。親水性ポリマーは天然のポリマーであっても差し支えない。さらに別の実施の形態によれば、親水性ポリマーは、上述したタイプのポリマー複数の混合物である。アミン担持ポリマーを用いて、生体膜マイクロアレイを製造するために基体を被覆することが最も好ましい。
【００２８】
ある実施の形態において、ピン−プリント技法を用いて生体膜マイクロアレイを製造するために、親水性ポリマーの層が物理的に吸着された表面が用いられる。ポリマーコーティングは、固体基体表面上にポリマー層を付着させるためのパルス・プラズマによるような最新技術の手法を用いて施してもよい。ポリマーコーティングにより、「ポリマー・クッション」と称されるゆるく密集したポリマー層が形成されるであろう。
【００２９】
別の実施の形態において、イソチオシアネート、ＮＨＳエステル、エポキシド、および無水物などのアミン反応性官能部位を有する表面を、複数のアミン基を有する分子（例えば、１，６−ヘキサンジアミン）で修飾して、アミン担持表面を形成することができる。別の修飾の例は、１，６−ヘキサンジアミンを、ポリ（無水マレイン酸−ｃｏ−ブチルビニルエーテル）を有する表面と反応させて、アミン官能性を持つポリマーグラフト結合表面を形成することである。同様に、チオール反応性基およびカルボン酸反応性基などの他の反応性基を有する表面を、少なくとも一つのアミン基を有するように修飾しても差し支えない。
【００３０】
代わりの実施の形態において、コーティング材料は、誘導体化単層（または複数の単層）、共有結合したリンカー部位を有する多層である。単層は、チオアルキル化合物またはシラン化合物を有してなることが最も好ましい。シランまたはチオール誘導体化表面を一つ以上の試薬（例えば、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）などの陽イオンポリマー、またはグルタルアルデヒド）でさらに修飾して、膜の固定化を可能にできることが好ましい。
【００３１】
０°から３０°の水接触角を有する、ポリマーの層が物理的に吸着したかまたは共有グラフト結合した表面が、生体膜の低密度マイクロアレイの製造に好ましい。ここで用いている「低密度マイクロアレイ」という用語は、５００μｍより大きい直径を持ち、互いから５００μｍより離れている多数のマイクロスポットを有するマイクロアレイを称する。２５°から８０°（最も好ましくは、２５°から４５°）の水接触角を有する、ポリマーの層が物理的に吸着したかまたは共有グラフト結合した表面が、生体膜マイクロアレイの製造に好ましい。
【００３２】
具体例
ニューロテンシン受容体亜型１（ヒト、ＮＴＲ１）を、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス(Perkin Elmer Life Science)（マサチューセッツ州、ボストン）社から購入し、緩衝液中の膜関連懸濁液として受け取った。プリントは、吸引と分配がプログラム可能なソフトウェアを備えたクイル・ピンプリンタ（カーテシアン・テクノロジーズ(Cartesian・Technologies)モデルＰＳ５０００）を用いて行った。プリント後、アレイを１時間に亘り室温で湿度チャンバ内においてインキュベートし、次いで、配位子結合実験に用いた。ニューロテンシンの不在下または存在下のいずれかの結合緩衝液中の二つの異なる結合溶液、２ｎＭ  ＢＴ−ＮＴを用いて、蛍光標識ニューロテンシン（２ｎＭ  ＢＴ−ＮＴ）の全結合、および４μＭの非標識ニューロテンシンの存在下でのＢＴ−ＮＴの結合の特異的阻害を調査した。結合緩衝液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡを含有していた。結合のためのインキュベーション時間は１時間であった。インキュベーション後、スライドを濯ぎ、乾燥させ、Ｇｅｎｉｐｉｘスキャナを用いて調査した。
【００３３】
ガラススライドを室温で３０分間に亘り０．１×ＰＢＳ緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌのポリマー（ポリ−リジン、４６ｋＤａ、またはポリエチレンイミン、５０ｋＤａ）を含有する３ｍｌの溶液と共にインキュベートし、次いで、水で濯ぎ、窒素雰囲気下で乾燥させることによりこのスライドを被覆した。二つの具体例が図１Ａおよび１Ｂに示されている。ポリマーグラフト結合表面は、予測したように親水性であった。具体的には、ポリ−リジンの表面は約１０°の水接触角を有し、ポリエチレンイミンの表面は１１°の水接触角を有した。テレケム・クイル・ピン(Telechem quill pin)ＣＭＰ５を用いて、ＧＰＣＲアレイを製造した。ＧＰＣＲマイクロスポットの直径は約１ｍｍであり、これらの表面が、膜タンパク質の低密度アレイの製造に適していることが示された。標識されていない過剰のニューロテンシンの競合結合により示されたＢＴ−ＮＴの結合特異性は、両方の表面について約９０％であった。
【００３４】
セクションII  反応性表面上の生体膜アレイ
繰り返し言うと、細胞膜内の分子の側方の拡散は天然の生体膜の基本的性質であるので、膜全体の共有結合による固定化は、生体膜マイクロアレイの製造には望ましくない。しかしながら、ＧＰＣＲの細胞膜調製において、多くの他の膜タンパク質は脂質膜（例えば、膜結合Ｇタンパク質、アデニリルシクラーゼ、および受容体チロシンキナーゼ）と結びつけられる。
【００３５】
本発明によれば、ＧＰＣＲ膜調製品は、関心のある受容体の活性を著しく損なわずに、共有結合相互作用により反応性表面上に固定化できる。反応性表面は結合官能部位または分子を有する。生体膜内の関心のあるプローブタンパク質または他の非プローブタンパク質と、基体の表面上に存在する官能基との間に形成される共有結合により、生体膜のアレイが反応性表面に形成されることが好ましい。この官能基は、アミン反応性基、またはチオール反応性基、もしくは任意の他の反応性基であってよい。あるいは、膜タンパク質またはＧＰＣＲのヒスチジン標識突然変異を用いてマイクロアレイを製造することができ、ここで、膜タンパク質のヒスチジン標識はキレート結合によりＮｉ担持表面に結合できる。
【００３６】
ある実施の形態によれば、反応性官能基を有するコーティング材料は、シラン、チオール、ジスルフィド、またはポリマーであってよい。コーティング材料がシランである場合、基体はガラスを有してなる。シランは、例えば、グリシドキシ基、イソシアナート基、またはチオール基を含む末端部位を有する。あるいは、さらに修飾して反応性にすることができる官能基を有するシランを使用しても差し支えない。例えば、カルボキシル基を有するシランを用いて、基体の表面を被覆し、その後、標準的なＮＨＳエステルにより活性化して、アミン反応性表面を形成する。コーティング材料がチオールである場合、基体は金を有してなる。チオールが、例えば、チオール基またはイソシアナート基を含む末端部位を有することが好ましい。チオールがカルボキシル基または他の官能性末端基を有する場合、チオール修飾表面をさらに活性化させて、標準的な共役化学的性質を用いて反応性表面を形成することができる。コーティングは、反応性基有するポリマーの使用を含んでもよい。例えば、ポリ（無水マレイン酸−ｃｏ−ブチルビニルエーテル）などの無水マレイン酸を有するコポリマーを用いて、基体の表面を被覆することができる。
【００３７】
具体例
ニューロテンシン受容体亜型１（ヒト、ＮＴＲ１）を、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス（マサチューセッツ州、ボストン）社から購入し、緩衝液中の膜関連懸濁液として受け取った。プリントは、吸引と分配がプログラム可能なソフトウェアを備えたクイル・ピンプリンタ（カーテシアン・テクノロジーズ・モデルＰＳ５０００）を用いて行った。プリント後、アレイを１時間に亘り室温で湿度チャンバ内においてインキュベートし、次いで、配位子結合実験に用いた。ニューロテンシンの不在下または存在下のいずれかの結合緩衝液中の二つの異なる結合溶液、２ｎＭ  ＢＴ−ＮＴを用いて、蛍光標識ニューロテンシン（２ｎＭ  ＢＴ−ＮＴ）の全結合、および４μＭの非標識ニューロテンシンの存在下でのＢＴ−ＮＴの結合の特異的阻害を調査した。結合緩衝液は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＢＳＡを含有していた。結合のためのインキュベーション時間は１時間であった。インキュベーション後、スライドを濯ぎ、乾燥させ、蛍光スキャナーにおいて画像化した。
【００３８】
ガラススライドを室温で３０分間に亘り２％の３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（エトキシシラン）または２％の３−メルカプトプロピルトリメトキシシランを含有する３ｍｌのエタノール溶液とインキュベートし、その後、エタノールと水で濯ぎ、窒素雰囲気下で乾燥させることによりこのスライドを被覆した。二つの具体例が図２に示されている。二つの反応性表面は、予測どおり、どちらかと言うと疎水性であった。エポキシシランの表面は約２０°の水接触角を有し、チオールシランの表面は約２４°の水接触角を有した。テレケム・クイル・ピンＣＭＰ５を用いて、ＧＰＣＲアレイを製造した。ＧＰＣＲマイクロスポットの直径は約２５０μｍであった。未標識の過剰のニューロテンシンの競合結合により示されるＢＴ−ＮＴの結合特異性は、二つの異なる反応性表面上で約７５〜９０％であったが、全結合信号は比較的低かった。
【００３９】
セクションIII  適切な表面特性を有する表面上の生体膜マイクロアレイ
ＤＮＡアレイや他のタンパク質アレイとは異なり、ＧＰＣＲを含む膜タンパク質のアレイには、関心の標的および関連する脂質分子の両方の固定化が必要なだけでなく、「正しい」固定化も必要である。例えば、表面上にアレイ状に形成されたタンパク質関連脂質分子は、表面に沿って動き回る自由を維持すべきである。表面と脂質二層膜との間の水和層は、膜タンパク質の細胞外領域が異常に折り畳まれるのを防ぐために十分に厚いべきである。さらに、ＧＰＣＲアレイについて、受容体Ｇタンパク質複合体は、表面上にアレイに形成された後に保護されるべきである。他方で、マイクロアレイを用いた任意の強力なバイオアッセイについて、マイクロスポットは、機械的に安定であり、プリントされた位置に制限されたままであるべきである。ＧＰＣＲアレイを含む膜タンパク質アレイの性能は、表面の化学的性質、膜内容物の品質、プリントの品質、およびバイオアッセイの条件を含む多数の要因に依存する。これらの要因の中でも、表面の化学的性質は、膜タンパク質アレイの品質およびバイオアッセイの可能性を決定する上で重要な役割を果たす。表面上に固定化した脂質分子および膜タンパク質関連脂質の構造および性質は、表面の化学的性質による。
【００４０】
これまで考えられた表面の中で、アミン担持表面が最良の品質の膜タンパク質結合マイクロアレイを提供してきた。脂質と膜タンパク質とを結合させるための任意の所定の表面をスクリーニングし、特徴付ける方法が重要である。
【００４１】
ある実施の形態において、本発明は、生体膜マイクロアレイを製造するための適切な表面の化学的性質をスクリーニングし、選択する方法に関する。別の実施の形態において、本発明は、潜在的な表面の重要な性質に関し、これは、生体膜マイクロアレイのための表面の適性を判定する。
【００４２】
ある方法によれば、水接触角の測定を用いて、アミン担持表面の疎水性を調査する。疎水性には、固定化反応速度論、生体膜のスポットの広がる程度と機械的安定性、およびバイオアッセイの実行中の標識プローブタンパク質または配位子の非特異的結合に劇的な影響がある。固体の基体を適切な疎水性を与える材料で被覆することが好ましい。ある実施の形態において、コーティング材料は、約５°から約８０°に及ぶ水接触角を与える。好ましいコーティング材料は、約１５°から約６０°に及ぶ水接触角を与える。より好ましいコーティング材料は、約２５°または３５°から約４０°または４５°に及ぶ水接触角を与え、この場合、その表面は、中から高密度の膜タンパク質マイクロアレイを製造するのに適している。他の実施の形態において、０°または５°から２５°の水接触角を与えるコーティング材料が、低密度アレイにとって好ましい。ここに一般に用いられる「低密度」は、約１００〜１１０マイクロスポット毎ｃｍ2より少ない密度を称する。特別な実施の形態において、９６、３８４または１５３６のウェルなどの任意の所定のマイクロプレートフォーマットにおいて、ウェル当たり一つのスポットの膜タンパク質が形成されることが好ましい。
【００４３】
別の方法において、脂質の安定性の測定を用いて、表面が、ある回数だけ水／空気の界面を通して取り出された前後で、表面上の一連の脂質スポットのモルホロジーを調査する。脂質スポットの安定性は、表面上の生体膜マイクロアレイの機械的安定性、およびそれによって、生体膜マイクロアレイのための表面の適性についての信頼できる情報を与える。表面を、水／空気の界面を通しての取出しと洗浄および乾燥に対して脂質スポットの安定性を向上させる材料で被覆することが好ましい。
【００４４】
さらに別の方法において、配位子結合特異性を調査して、基体上の生体膜アレイの固定化を評価する。膜タンパク質マイクロアレイの品質および機能性は、適切な表面の化学的性質により調節できる。標識標的のバックグラウンドへの非特異的結合を最小にし、マイクロアレイ内のプローブ受容体への特異的結合を高める材料で被覆された表面が好ましい。
【００４５】
上述した三種類の方法の任意の組合せを用いて、生体膜マイクロアレイのための適切な表面の化学的性質をスクリーニングし、選択することが最も好ましい。図３および４は、アミン担持表面について、接触角、脂質の安定性およびアレイ内の膜受容体への脂質の結合の中での相関関係を示す具体例を示している。表１は、他の具体例の結果を要約している。
【表１】
2006506642.tif 000002
【００４６】
ある実施の形態によれば、コーティング材料は、誘導体化単層または共有結合したリンカー部位を有する多層である。例えば、長鎖炭化水素部位を有してなる単層コーティングは、以下に限られないが、例えば、チオール（例えば、チオアルキル）基、基体への化学結合または物理化学結合を生じるジスルフィド基またはシラン基を有していてよい。単層の基体への付着は、非共有結合相互作用または共有結合反応により行ってもよい。
【００４７】
基体への付着後、その層は、少なくとも一つの反応性官能基を有する。コーティング上の反応性官能基の例としては、以下に限られないが、カルボキシル基、イソシアナート基、ハロゲン基、アミン基またはヒドロキシル基が挙げられる。ある実施の形態において、コーティング上のこれらの反応性官能基は、コーティング上の対応する活性化した官能基に対する標準的な化学的技法（例えば、カルボキシル基の無水物または酸ハロゲン化物への転化など）により活性化してもよい。基体上のコーティングの活性化された官能基は、以下に限られないが、リンカー化合物の末端アミノ基への共有結合のための、無水物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは他の一般的な活性化エステルまたは酸ハロゲン化物であってよい。別の実施の形態において、コーティング上の活性化された官能基は、以下に限られないが、リンカー化合物の末端ヒドロキシル基と結合するための無水物誘導体；リンカー化合物の酸化糖類残基に結合するためのヒドラジン誘導体；またはリンカー化合物のチオール基に共有結合するためのマレイミド誘導体であってよい。誘導体化されたコーティングを製造するために、コーティング層上の少なくとも一つの末端カルボキシル基を無水物基に最初に活性化し、次いで、リンカー化合物と反応させる。
【００４８】
あるいは、コーティング上の反応性官能基を、活性化された官能基、例えば、以下に限られないが、
を有するリンカー化合物と反応させてもよい。
【００４９】
アミン基、チオール基、アルケン基、アクリル酸基、無水物基、エステル基、酸ハロゲン化物基、イソシアナート基、ヒドラジン基、マレイミド基およびヒドロキシル基。
【００５０】
スペーサ領域は、以下に限られないが、オリゴ／ポリエーテル、オリゴ／ポリペプチド、オリゴ／ポリアミド、オリゴ／ポリアミン、オリゴ／ポリエステル、オリゴ／多糖類、ポリオール、多荷電種またはそれらの任意の他の組合せからなっていてよい。例としては、以下に限られないが、エチレングリコール、ペプチド、グリセロール、エタノールアミン、セリン、イノシトールなどのオリゴマーが挙げられ、これは、膜がリンカー部位の膜付着領域に自由に付着するようなものである。スペーサ領域は、本質的に親水性であろう。ある好ましい実施の形態において、スペーサは、ｎが２から２５までであるｎ個のオキシエチレン基を有する。最も好ましい実施の形態において、スペーサは１０個のオキシエチレン基を有する。好ましい実施の形態において、リンカー化合物の膜付着領域または「疎水性テール」は、直鎖または枝分れ鎖アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、アラアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアルキニル、ヘテロアルケニル、ヘテロアリール、またはヘテロアラアルキルを持ち、疎水性または両親媒性である。好ましい実施の形態において、膜付着領域は、Ｃ10からＣ25の直鎖または枝分れ鎖のアルキルまたはヘテロアルキル疎水性テールを有してなる。最も好ましい実施の形態において、疎水性テールは、Ｃ18などの、Ｃ10からＣ20の直鎖または枝分れ鎖のアルキル断片を有してなる。
【００５１】
別の実施の形態において、リンカー化合物は、一方の端部に末端官能基を、別の端部にスペーサ、リンカー／膜付着領域および親水性基を有する。リンカー化合物の一方の端部での親水性基は、単独基または多数の親水性基の直鎖または枝分れ鎖であってよい。例えば、以下に限られないが、単独のヒドロキシル基または多数のエチレングリコールユニットの鎖であってよい。
【００５２】
さらに別の実施の形態において、「誘導体化単層」は、シランにより修飾されたアルカンチオールの自己組織化単層（ＳＡＭ）である。アルカンチオールは、
ことが好ましい。  
表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）、マトリックス支援レーザーイオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）および電気化学法を含む標識を使用しない検出技法のための基体。
【００５３】
具体例
方法１：接触角測定
異なるロットからのＣＭＴ  ＧＡＰＳスライドを、受け取った状態で使用した。競合他社からのアミン担持スライド、キセノポア社(Xenopore Inc.)からのＸｅｎｏｓｌｉｄｅ  Ａスライド、シグマ(Sigma)社からのＳｔａｒｓｏｆｔスライド（アミノシラン表面）、クローンテック社(Clontech)からのＤＮＡレディー・スライド、テルケム社(Telchem)からのアミノシランスライドを、受け取った状態で使用した。トリアミン表面は、清浄なガラススライドを、標準的なシラン化工程を用いて、３−（２−（２−アミノエチルアミノ）−エチルアミノ）プロピルトリメチルオキシシランでシラン化することにより形成した。アミン担持金表面は、１時間（ＭＵＡＭ−Ａｕｌｈ）または２４時間（ＭＵＡＭ−ＡｕｌＤ）に亘り１１−メルカプトウンデシルアミン（ＭＵＡＭ）のＳＡＭを形成することにより製造した。
【００５４】
水接触角の測定は、実験した二枚のスライドのそれぞれについて異なる４カ所で行った（図４参照）。
【００５５】
方法２：脂質スポット安定性
脂質が安定に結合している表面が、膜アレイを製造するのに好ましい。表面上の脂質安定性を評価するために、蛍光標識脂質をドープした合成脂質の小胞を含有する溶液を付着させることにより、異なるサイズのいくつかの脂質スポットを形成した。音波処理後に、ＤＬＰＣおよび２％（モル）のテキサスレッド−ＤＰＨＥを含有する脂質溶液を用いて、異なる
脂質スポットを形成した。  
脂質スポットの蛍光強度を調べるために、蛍光スキャナを用いて画像化した。スポットの蛍光強度が強くかつ均一である場合に、脂質スポットは安定である。
【００５６】
方法３：受容体−配位子結合
ヒトニューロテンシン亜型１（ＮＴＲ１）およびβ−アドレノレセプタ亜型１（β１）を、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンシズ社（マサチューセッツ州ボストン所在）から購入し、緩衝液中の膜関連懸濁液として受け取った。プリントは、プログラム可能な吸引および分配に関するソフトウェアを備えたクイル・ピン・プリンタ（カーテシアン・テクノロジーズ・モデルＰＳ５０００）を用いて行った。プリント後、アレイを、１時間に亘り室温で湿潤チャンバ内でインキュベートし、次いで、配位子結合実験に用いた。
【００５７】
図３Ａ〜Ｃは、疎水性、脂質スポット安定性および配位子結合特異性に関して、二枚の異なるＧＡＰＳスライドを比較したものである。図４Ａ〜Ｃは、疎水性および脂質結合特異性に関して、三枚の異なるアミン担持表面を比較したものである。これらの結果により、表面が同じ材料で被覆されている場合でさえ、疎水性、脂質スポット安定性および配位子結合特異性並びにアレイの性能の間に相関関係が存在するこしとが示されている。
【００５８】
セクションIV  水溶性タンパク質により安定化された生体膜マイクロアレイ
本発明の別の態様は、一般の水溶性タンパク質を含有する試薬を用いて、脂質および膜タンパク質関連脂質マイクロアレイを安定化させる方法に関する。一般のタンパク質としては、標的膜タンパク質または他の
の結合領域と緩衝しない任意の水溶性タンパク質が挙げられるであろう。
【００５９】
本発明によれば、これらのタンパク質は、脂質および／または脂質／膜タンパク質スポットを取り囲む緻密な層を形成するために用いられる。これらのタンパク質層は、生体膜マイクロアレイが空気にさらされるリスクを著しく減少させ、濯ぎおよび洗浄工程中に水／空気界面を通して膜マイクロアレイが取り出されるときに流体力学的力により生じる生体膜への損傷を最小にする。さらに、タンパク質は、通常は損傷を受けやすい生体膜マイクロスポットの縁を取り囲むことにより、疎水性脂質二層を安定化し、しっかりと固定するように働くであろう。図５は、この概念を示す概略図である。
【００６０】
具体例
脂質マイクロアレイを、直接プリント技法（例えば、クイル・ピン）またはスライド表面への手作業によるスポット法いずれかを用いて生成し、湿潤チャンバ内において室温でインキュベートした。その後、脂質マイクロアレイを、一般のタンパク質（約０．０１％から約１％）の有無にかかわらずに緩衝液により被覆し、１０分間に亘りインキュベートした。次いで、脂質アレイを緩衝液で濯いで、未結合タンパク質を除去した。
【００６１】
脂質アレイの安定性を評価するために、プリントしたスライドを水／空気の界面に通して数回取り出し、次いで、蛍光顕微鏡またはスキャナ内で画像化した。脂質／タンパク質アレイの機能性を評価するために、蛍光染料標識プローブ分子を溶液中に導入し、その後、濯いで未結合分子を除去し、乾燥させ、画像化した。
【００６２】
１％（モル）のテキサスレッド−ＤＨＰＥまたは２％のビオチン−ｘ−ＤＨＰＥいずれかを含有する脂質のアレイをベアガラス・スライド、コーニングＧＡＰＳスライドおよびＢｒｉｊ−ＭＨＡ−金表面にプリントした。各スライドには、二つの４×４アレイがあった。一方のアレイを
緩衝液で被覆した。  
表面。これらの観察により、吸着されたＢＳＡ分子が、プリントされた脂質アレイの機械的安定性を増加させることが示唆される。
【００６３】
ストレプトアビジンのビオチン分子への特異的結合をモデル系として用いて、脂質アレイの接近性および／または機能性へのＢＳＡ吸着の影響を調べた。１枚のコーニングＧＡＰＳスライドに、ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ／２％ビオチン−ｘ−ＤＨＰＥの７つの５×５アレイをプリントした（データは示さず）。インキュベート後、ｃｙ３−ストレプトアビジンを添加する前に、３組の脂質アレイをＴＲ−ＢＳＡと予めインキュベートした。第２組の３つのアレイを、Ｃｙ３−ストレプトアビジンと共にＴＲ−ＢＳＡとインキュベートし、一つのアレイを、Ｃｙ３−ストレプトアビジンの溶液により被覆した。３０分後、これらのスライドを濯ぎ、乾燥させ、画像化した。ｃｙ５チャネル信号を用いてＴＲ−ＢＳＡの吸着をモニタし、ｃｙ３チャネル信号を用いてｃｙ３−ストレプトアビジンの結合をモニタした。これらの結果は、脂質スポットへのＢＳＡの非特異的結合が最小量であるが、ＢＳＡの存在（０．０１％〜１％の濃度）により結合の特異性が著しく減少しないことを示している。それと同時に、ＢＳＡの存在により、ほとんどの場合でバックグラウンドレベルが減少する。
【００６４】
本発明を、具体例により一般的と詳細に説明してきた。本発明は、具体的に開示された実施の形態に必ずしも制限されず、本発明の範囲内で用いられるであろう、現在公知の、または開発される他の同等成分を含む、特許請求の範囲またはそれらの同等物により定義された本発明の範囲から逸脱せずに変更および改変を行ってもよいことが、当業者には明らかである。したがって、そのような変更が本発明の範囲から逸脱しない限りは、その変更は、本発明に含まれると考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１Ａおよび１ＢはＧＰＣＲアレイの蛍光画像を示しており、ここで、ヒトニューロテンシン受容体亜型Ｉ（ＮＴＲ１）のアレイが、親水性ポリマー比較ガラススライド上にプリントされ、標識付けられていないニューロテンシン（４μＭ）の不在下と存在下での蛍光標識付けられた配位子ニューロテンシン（２ｎＭ、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ−ＮＴ、ＢＴ−ＮＴ）と共にインキュベートされた。図１Ａは、ポリエチレンイミン被覆ガラススライド上のＮＴＲ１を示し、図１Ｂは、ポリ−リジン被覆ガラススライド上のＮＴＲ１アレイを示している。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、図１Ａおよび１Ｂのアレイのように調製されたＧＰＣＲアレイの蛍光画像を示している。図２Ａは、エポキシシラン被覆ガラススライド上のＮＴＲ１アレイを示しており、一方で図２Ｂはチオールシラン被覆ガラススライド上のＮＴＲ１アレイを示している。
【図３】図３は、二種類の異なるＧＡＰＳ被覆スライドの比較を示している。図３Ａは、それぞれの水接触角を示している。図３Ｂは、水／空気の界面を１０回通過させた後のＧＡＰＳ被覆表面上の、４％（モル）テキサスレッド−ＤＨＰＥがドープされたＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ（モル比で４：１）のそれぞれの蛍光画像を示している。図３Ｃは、２０μＭのＣＧＰ１２１７７の不在下または存在下いずれかでの５ｎＭのＢｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ−ＣＧＰ１２１７７の結合後のベタールＧＰＣＲアレイの蛍光画像を示している。
【図４】図４は、三種類の異なるアミン担持表面の比較を示している。図４Ａは、それぞれの水接触角を示している。図４Ｂは、４μＭのニューロテンシン（ＮＴ）の不在下または存在下いずれかでの２ｎＭのＢｏｄｉｐｙ−ＴＭＲ−ニューロテンシン（ＢＴ−ＮＴ）の結合後のニューロテンシン受容体亜型１（ＮＴＲ１）アレイのそれぞれの蛍光画像を示している。
【図５】図５は、生体膜マイクロアレイの安定化における、ウシ血清アルブミンなどの実施の形態による水溶性タンパク質の使用の説明図を示している。
【図６】図６は、ＢＳＡの存在が、水／空気の界面からの取出し、溶液による濯ぎおよび乾燥に対する脂質アレイの安定性を著しく増加させることを示している。二組の４×４アレイのＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ／２％ビオチン−ｘ−ＤＨＰＥをＢｒｉｊ−ＭＨＡ−金スライド上にプリントした。上の組の画像は、０．１％のＢＳＡを含有する緩衝液に曝し、下の組は緩衝液のみに曝した。１０分後、ｃｙ３−ストレプトアビジンを導入し、さらに１０分に亘りインキュベートした。その後、スライドを濯ぎ、緩衝液の下で画像化し（左）、水／空気の界面を５回通過させ、緩衝液の下で画像化し（中央）、最後に乾燥させ、再度画像化した（右）。緩衝液は、１０ｍＭのリン酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ2を含有し、ｐＨ７．４であった。
【図１】
2006506642.tif 000003
【図２】
2006506642.tif 000004
【図３】
2006506642.tif 000005
【図４】
2006506642.tif 000006
【図５】
2006506642.tif 000007
【図６】
2006506642.tif 000008
【国際調査報告】
2006506642.tif 000009
2006506642.tif 000010
2006506642.tif 000011