(57)【要約】ＭＵＣ１タンパク質の開裂の後に細胞表面上に残っているＭＵＣ１細胞外断片上に存在する、ＭＵＣ−Ｈ上のエピトープに特異的な、抗体およびペプチドリガンドを本明細書で記述している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｈｅｄＭＵＣ１上には存在しないが、ＭＵＣ１の任意の細胞表面発現形態上で発現している、ＭＵＣ１上のエピトープに特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンド。
【請求項２】
ｓｈｅｄＭＵＣ１上に存在しない、ＭＵＣ１上の細胞表面エピトープに特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンド。
【請求項３】
ｓｈｅｄＭＵＣ１上には存在せず、全長非クリップＭＵＣ１タンパク質の部分の場合の、ＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅ上に存在しない、ＭＵＣ１上のエピトープに特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンド。
【請求項４】
ＭＵＣ１タンパク質の細胞外領域のＣ−末端６５アミノ酸に特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンド。
【請求項５】
前記ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない、請求項１に記載の単離ポリペプチドリガンド。
【請求項６】
前記ポリペプチドリガンドが、ペプチドリガンドである、請求項１に記載の単離ポリペプチドリガンド。
【請求項７】
前記ポリペプチドリガンドが、足場ペプチド、直鎖ペプチド、または環状ペプチドである、請求項６に記載の単離ポリペプチドリガンド。
【請求項８】
前記ポリペプチドリガンドが抗体である、請求項１に記載の単離ポリペプチドリガンド。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号：２からなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、原型免疫グロブリンである、請求項８に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、機能的部分と共役している、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
前記機能的部分が、薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号：２に対する結合に関して、請求項９に記載の抗体と競合可能である、単離抗体。
【請求項１５】
配列番号：２および配列番号：１間の複合体に対する結合に関して、請求項９に記載の抗体と競合可能である、単離抗体。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号：２のＮ−末端５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１７】
配列番号：２からなるポリペプチドに特異的に結合する、単離非抗体ポリペプチドリガンド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない、請求項１７に記載の単離非抗体ポリペプチドリガンド。
【請求項１９】
前記リガンドが、配列番号：２の最初の５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１７に記載の単離非抗体ポリペプチドリガンド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドリガンドが、機能的部分に共役している、請求項１７に記載の単離非抗体ポリペプチドリガンド。
【請求項２１】
前記機能的部分が、薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体である、請求項１７に記載の単離非抗体ポリペプチドリガンド。
【請求項２２】
試料中のＭＵＣ１−Ｈを検出する方法であって、
（ａ）試料を提供すること、
（ｂ）（ａ）の試料と、ＭＵＣ１−Ｈを含むポリペプチドへ特異的に結合するポリペプチドリガンドを、前記ポリペプチドリガンドのＭＵＣ１−Ｈへの結合を許容する条件下で、接触させること、および
（ｃ）前記ポリペプチドリガンドの、試料中のＭＵＣ１−Ｈとの結合を検出し、この結合の検出が、試料中のＭＵＣ１−Ｈの存在を示唆すること、
を含み、これによって試料中のＭＵＣ１−Ｈを検出する、方法。
【請求項２３】
ＭＵＣ１−Ｈに特異的なポリペプチドリガンドを同定する方法であって、以下の
（ａ）候補ＭＵＣ１−Ｈ結合ポリペプチドを発現しているファージを含む、ファージライブラリーを提供すること、
（ｂ）前記ファージライブラリーを、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質と接触させること、および
（ｃ）ＭＵＣ１−Ｈタンパク質のファージへの結合を検出すること、
を含み、これによって、ＭＵＣ１−Ｈに特異的なポリペプチドリガンドを同定する、方法。
【請求項２４】
細胞を殺す方法であって、以下の
（ａ）細胞を提供すること、
（ｂ）（ａ）の細胞と、ＭＵＣ１−Ｈを含むポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドを、前記ポリペプチドリガンドのＭＵＣ１−Ｈへの結合を許容する条件下で、接触させること、
を含み、これによって細胞を殺す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術背景）
ＭＵＣ１は、４００ｋＤ以上の分子量を持つ、多くの上皮細胞、例えば乳房(breast)、卵巣、膀胱、肺の先端表面上に発現した、膜貫通型糖タンパク質である（Ｚｏｔｔｅｒ，Ｓ．ら，（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｖ．１１−１２：５６−１０１；  Ｗｉｎｔｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．Ｍ．ら（１９９９）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４７：１０６３−７４）。ＭＵＣ１遺伝子は、クロモソーム１ｑ２１−２４上に局在し（Ｓｗａｌｌｏｗ，Ｄ．Ｍ．ら（１９８７）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：８２−４）、７つのエキソンを含む（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｃ．Ａ．ら，（１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７３：１０１９−２９）。ＭＵＣ１タンパク質は３つの部分、大きな細胞外領域、膜貫通領域（Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６１７１−７）、および細胞質テール、からなる。このタンパク質は、２つの形態、膜糖タンパク質またはｓｈｅｄ形態で存在しうる。タンパク質のｓｈｅｄ形態への変換に際して、細胞外領域が、おそらく、カリクレイン様セリンプロテアーゼによって細胞表面で開裂され、膜の細胞外表面上の、短い「スタッブル（ｓｔｕｂｂｌｅ）」タンパク質を後に残す。（ＶＮＴＲ（可変数タンデムリピート（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔ）領域）を含む領域を膜結合領域から外すための）細胞外領域の２つの予想される開裂部位は、Ｐａｒｒｙら（Ｐａｒｒｙ，Ｓ．ら（２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８３：７１５−２０）によって決定されたように、膜貫通領域上流の６５および、おそらく５２アミノ酸である。タンパク質分解部位はそれぞれ、配列ＦＲＰＧとＳＶＶＶの間、および配列ＦＲＥＧとＴＩＮＶの間である。このクリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）の後に、膜貫通部分と細胞外部分の間の連結があることが考えられるが、この連結は未知のままである（Ｐａｒｒｙ，Ｓ．ら（２００１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８３：７１５−２０）。ｓｈｅｄ細胞外ＭＵＣ１は、開裂部位の後ろのＮ−末端部分である（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．ら（１９９０）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：４６３−７３；Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６７：６１７１−６１７７）。細胞外部分は、可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）領域をもち、その繰り返しの数は、個体間で異なり、北ヨーロッパ集団においては、２１および１２５繰り返しの間で異なる（Ｇｅｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．（１９９０）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５２８６−１５２９３）。
【０００２】
細胞外部分は、繰り返し領域の折りたたみによるロッド様(rod-like)の堅い立体構造を持ち、細胞膜の上方に２００〜５００ｎｍ伸びている（Ｈｉｌｋｅｎｓ，Ｊ．（１９９２）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３５９−３６３）。ＭＵＣ１タンデムリピートは、すべての繰り返しが、５つの潜在的なＯ型糖鎖付加部位を持つことから、非常に糖付加されており、ＭＵＣ１の糖質含有量が５０％以上である可能性がある（Ｇｅｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．（１９９０）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５２８６−１５２９３；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｓ．ら，（１９９７）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４７８０−９３；Ｐａｔｔｏｎ，Ｓ．ら（１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２４１：４０７−２３）。腫瘍細胞、例えば上皮の腺癌において、ＭＵＣ１が過剰発現され、正常組織と比較して、異なった糖鎖付加がされ、新規の意味不明なペプチドおよび糖質エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）をさらす。正常組織において、ＭＵＣ１は、細胞の先端部位で発現され、一方、腫瘍組織においては、ＭＵＣ１は、細胞全体で発現される。ｓｈｅｄ形態への開裂に際して、タンデムリピートを含む、ＭＵＣ１の細胞外Ｎ−末端部位がｓｈｅｄされ、膜貫通Ｃ−末端部位を細胞表面に残す。ＭＵＣ１のこのｓｈｅｄ形態と、膜貫通領域および細胞内領域に結合した、残ったＭＵＣ１の細胞外領域（ＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅ）の間の推測される相互作用を経て、ｓｈｅｄ分子は、細胞表面上にしばしば残る可能性があるが、最終的に、未知の機構でｓｈｅｄされる。
【０００３】
ＭＵＣ１タンパク質はまた、ＳＥＡ領域（「ウニ精子タンパク質−エンテロキナーゼ−アグリン」（Ｓｅａ  ｕｒｃｈｉｎ  ｓｐｅｒｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ−Ａｇｒｉｎ）領域）も含む。このタンパク質および他のタンパク質において、この領域は、糖鎖構造を調節または結合すると提案されている（Ｂｏｒｋ，Ｐ．ら（１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．４：１４２１−５）。ＭＵＣ１において、この領域はタンデムリピート領域の後に続き、この後に、膜貫通領域が続く。ＳＥＡ領域が大きな細胞外断片上の糖鎖付加残基と相互作用し、従って、細胞表面上のＭＵＣ−１のｓｈｅｄ形態を維持するのに役立つことが仮定されてきた。ＳＥＡ領域内で、推定上のプロテアーゼ開裂部位がまだ存在する、つまり無傷なＳＥＡ領域（非クリップＭＵＣ１内の）なのか、あるいはＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態との相互作用に関連しうるＳＥＡ領域のクリップＣ−末端部分（ＭＵＣ−Ｓｔｕｂｂｌｅの一部として）かどうかは分かっていない。
【０００４】
多くのＭＵＣ１タンパク質のスプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ）が単離されてきた。これらは、タンデムリピートを欠くスプライスバリアントであり、従って、短いＮ−末端領域、ＳＥＡ領域の大部分、膜貫通領域および細胞内領域からなる。これらには、ＭＵＣ１／Ｘ、ＭＵＣ１／Ｘ／ａｌｔ、ＭＵＣ１／Ｙ、ＭＵＣ１／Ｙ／ａｌｔ、ＭＵＣ１／ＶおよびＭＵＣ１／Ｖ／ａｌｔが含まれ、これらのタンパク質に対する抗体が作製された（Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ、国際特許第ＷＯ  ９６／０３５０２号）。これらのタンパク質は、通常全長タンパク質で見られるタンデムリピートの配列が欠損している。ＭＵＣ１／Ｙは、腫瘍に関連している（Ｂａｒｕｃｈ，Ａ．ら（１９９７）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７１：７４１−９）。ＭＵＣ１／Ｙは、ＭＵＣ１に関して記述されたような酵素開裂部位では開裂しない。Ｈａｒｔｍａｎら（（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８２：２５６−２６７）もまた、ＭＵＣ１／Ｙタンパク質に対するモノクローナル抗体を示しており、ひとつはＭＵＣ１の細胞外領域の３０  Ｎ−末端アミノ酸と反応するもので、他方はＭＵＣ１の細胞外領域の１４  Ｃ−末端アミノ酸に反応するものを含む。しかしながら、これらの抗体は、ＭＵＣ１も認識するために、ＭＵＣ１／Ｙまたはプロテアーゼ開裂後に細胞上に残っている細胞外領域いずれにも特異的ではない。
【０００５】
タンデムリピートの腫瘍関連ペプチドエピトープに対する多くの抗体は、それぞれ特異的に上皮腫瘍に結合する。これらの抗体はまた、しばしば、血清ＭＵＣ１に結合するが、常に同一の程度ではない（Ｎｏｒｕｍ，Ｌ．Ｆ．ら（１９９８）Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．１９（Ｓｕｐｐｌ  １）：１３４−４６）。タンデムリピートに対する抗体は異なる内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）特性を持つ（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，Ｇ．Ａ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４：３２３−８）。ＭＵＣ１のタンデムリピートに対する抗体およびペプチドは、放射免疫シンチグラフィー（ｒａｄｉｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ）およびラジオイムノセラピー（ｒａｄｉｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ）にて成功裡に使用されている。このような治療において、いくつかの抗ＭＵＣ１抗体の効果は、患者の血清中のｓｈｅｄＭＵＣ１に対する抗体の結合によって妨害され、抗体を静脈注射した場合に、問題を引き起こす可能性がある。例えば、抗体の用量は、ほとんどの抗体が血清ＭＵＣ１へ結合し、細胞ＭＵＣ１への結合に有効な抗体を残さないようにしなければならない。さらに、多重エピトープを持つｓｈｅｄＭＵＣ１と、１つまたはそれ以上の結合部位を持つ抗体間の大きな免疫複合体の形成が、肝臓における複合体の蓄積、急速なクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）およびこの変化した薬物動態学に関連する毒性副作用（例えば血清病）を引き起こす可能性がある。抗体を、細胞毒性薬剤または放射アイソトープで標識した場合、そのような影響が、抗体の有効性に害を及ぼす可能性がある。
【０００６】
従って、ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態を認識はしないが、細胞表面上のＭＵＣ１の残りの部分を認識する抗体は、これらの治療障害を引き起こすことがなく、優れた標的化薬剤である可能性がある。
【０００７】
多くの抗ＭＵＣ１抗体のもう一つの不利点は、これらが、細胞表面から比較的遠くに排除されるエピトープを標的としており、補体依存性細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のような天然の抗体仲介免疫エフェクター類（ａｎｔｉｂｏｂｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ）の有効性を減少させることである。従って、細胞表面により近く局在するＭＵＣ１エピトープに対する抗体を用いた腫瘍細胞の標的化が、その抗腫瘍細胞の有効性を劇的に増加させうる。
【０００８】
（本発明の概要）
本発明は、部分的に、本発明者らが、ＭＵＣ１−Ｈとして一緒にグループ化してきた、ＭＵＣ１関連エピトープに特異的に結合するポリペプチドリガンドを提供する。ＭＵＣ１−Ｈに対する抗体は、ＭＵＣ１−ｓｔｕｂｂｌｅまたは可溶性ＭＵＣ１とＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅ複合体間で形成される複合体に関連したエピトープを認識し、従って、ｓｈｅｄＭＵＣ１に対して同等の親和性での結合は欠く。ＭＵＣ１−Ｈは、ｓｈｅｄＭＵＣ１上に存在しないが、ＭＵＣ１の任意の細胞表面発現形態上に存在するエピトープを含む。ＭＵＣ１−Ｈはまた、全長、非クリップＭＵＣ１（またはＭＵＣ１の非クリップスプライスバリアント）にて、隠れているが、ＭＵＣ１の特異的開裂の後、ＭＵＣ１の細胞表面結合残根上（またはＭＵＣ１のスプライスバリアント）にのみ現れるエピトープを含むことから、ＭＵＣ１−Ｈ（ｉｄｄｅｎ（ｈｉｄｄｅｎ「隠れる」））と名付けられている。さらに、ＭＵＣ１−Ｈは、ＭＵＣ−ｓｔｕｂｂｌｅ（おそらく、ＭＵＣ１の選択的スプライシング形態から由来する）と結合したままである、ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態と、ＭＵＣ−ｓｔｕｂｂｌｅそれ自身間で形成されるようなエピトープを含み、このような立体的エピトープは、細胞表面結合ＭＵＣ１上のみに存在し、血清ＭＵＣ１上には存在しない可能性がある。ＭＵＣ１−Ｈ上の隠れたエピトープのほとんどは、ＭＵＣ１の細胞外領域のＣ−末端アミノ酸（ＭＵＣ−Ｓｔｕｂｂｌｅ）内に基づいており、通常、非クリップＭＵＣ１またはＭＵＣ１のスプライスバリアント上の該ポリペプチドリガンドによって検出可能ではない、この配列内で、直線または立体エピトープであり得る。ＭＵＣ−Ｓｔｕｂｂｌｅは、Ｐａｒｒｙらによって定義されたように、ＭＵＣ１の膜貫通領域上流の６５または５２アミノ酸からなり得るが、タンパク質のプロテアーゼ開裂の部位特異性に依存して、この領域内の他のＮ−末端残基にて開始も可能である。例えば、このようなエピトープは、（例えばＳＥＡ領域によってコードされた領域など）ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態との相互作用に関連する、ＭＵＣ−Ｓｔｕｂｂｌｅ上の領域を含みうる。そのようなエピトープが、ｓｈｅｄＭＵＣ１との相互作用によって、通常カバーされることを想定すると、後者の解離に際し、それらは露出されることになる。他のＭＵＣ１−Ｈエピトープは、Ｓｔｕｂｂｌｅとｓｔｕｂｂｌｅ自身の連結部において、クリッピングした後、ＭＵＣ１のＮ−末端領域の複合化によって形成された立体構造的エピトープを含み、そのような場合に、配列は少なくともＭＵＣ１の細胞外領域のＣ−末端６５アミノ酸の部分を含みうる。ＭＵＣ１−Ｈエピトープは、配列番号：２にて列記したような、ＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅの代表的な配列内の、直線または立体構造的配列によって形成されうる。「配列番号：２へのリガンドの結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｔｏ  配列番号：２」）は、配列番号：２の全配列からなる任意のエピトープとのリガンドの相互作用のみでなく、Ｎ−末端の他の開裂部位での開裂によって、より短くなる配列番号：２の断片からなるエピトープとの相互作用も意味する。例えば、配列番号：２の、第１４残基で開始する、５２アミノ酸配列から��るエピトープも含まれる。好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは、抗体である（この語句には、抗原結合断片が含まれる）。他の好ましい実施形態においては、ポリペプチドリガンドが、改変足場（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）ポリペプチドまたはペプチドである。また他の好ましい実施形態において、ペプチド（例えば、６〜２５アミノ酸のポリペプチド）は、環状ペプチドまたは直鎖ペプチドである。ポリペプチドリガンドは、多重鎖タンパク質（例えば少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチドを含む）であり得る。多重鎖タンパク質の例は、抗体である。多くの実施例が、本明細書にて、抗体リガンドに関して開示されている一方で、本発明が、本明細書で提供する、任意のポリペプチドリガンド（例えば抗体および非抗体リガンド）を用いて実施可能であることが理解される。
【０００９】
本発明は、ｓｈｅｄＭＵＣ１上には存在しないが、ＭＵＣ１の任意の細胞表面発現形態上には存在する、ＭＵＣ１上のエピトープに特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンドを特徴とする。前記単離ポリペプチドリガンドは、ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しないようなものであり得る。ポリペプチドリガンドは、ペプチドリガンド、例えば足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）ペプチド、直線ペプチドまたは環状ペプチドであり得る。ポリペプチドリガンドは、抗体であり得る。抗体は、配列番号：２、またはその断片（例えば配列番号：３）からなるポリペプチドに特異的に結合可能であり、または抗体は、そのような抗体と競合する抗体であり得る（例えば、配列番号：２またはその断片（例えば配列番号：３）への結合に関して競合する、または配列番号：２と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する、または、配列番号：３と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する）。抗体は、配列番号：２のＮ−末端５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能であるか、または配列番号：２のＮ−末端３８アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能である。抗体は、ヒト抗体または無傷の免疫グロブリンであり得る。抗体は、機能的部分、例えば薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体に共役可能である。
【００１０】
本発明はまた、ｓｈｅｄＭＵＣ１上には存在せず、全長非クリップＭＵＣ１タンパク質の部の場合に、ＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅ上に存在しない、ＭＵＣ１上のエピトープに結合する、単離ポリペプチドリガンドも特徴とする。単離ポリペプチドリガンドは、前記ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しないようなものであり得る。ポリペプチドリガンドは、ペプチドリガンド、例えば足場ペプチド、直線リガンド、または環状リガンドであり得る。ポリペプチドリガンドは抗体であり得る。抗体は、配列番号：２、またはその断片（例えば配列番号：３）からなるポリペプチドに特異的に結合可能であり、または抗体は、そのような抗体と競合する抗体であり得る（例えば、配列番号：２またはその断片（例えば配列番号：３）への結合に関して競合する、または配列番号：２と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する、または、配列番号：３と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する）。抗体は、配列番号：２のＮ−末端５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能であるか、または配列番号：２のＮ−末端３８アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能である。抗体は、ヒト抗体または無傷の免疫グロブリンであり得る。抗体は、機能的部分、例えば薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体に共役可能である。
【００１１】
本発明は、さらに、ＭＵＣ１タンパク質の細胞外領域のＣ−末端６５アミノ酸に特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンドを特徴とする。単離ポリペプチドリガンドは、前記ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しないようなものであり得る。ポリペプチドリガンドは、ペプチドリガンド、例えば足場ペプチド、直線リガンド、または環状リガンドであり得る。ポリペプチドリガンドは抗体であり得る。抗体は、配列番号：２、またはその断片（例えば配列番号：３）からなるポリペプチドに特異的に結合可能であり、または抗体は、そのような抗体と競合する抗体であり得る（例えば、配列番号：２またはその断片（例えば配列番号：３）への結合に関して競合する、または配列番号：２と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する、または、配列番号：３と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する）。抗体は、配列番号：２のＮ−末端５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能であるか、または配列番号：２のＮ−末端３８アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能である。抗体は、ヒト抗体または無傷の免疫グロブリンであり得る。抗体は、機能的部分、例えば薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体に共役可能である。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、ＭＵＣ１タンパク質の細胞外領域のＣ−末端５２アミノ酸に特異的に結合する、単離ポリペプチドリガンドを特徴とする。単離ポリペプチドリガンドは、前記ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しないようなものであり得る。ポリペプチドリガンドは、ペプチドリガンド、例えば足場ペプチド、直線リガンド、または環状リガンドであり得る。ポリペプチドリガンドは抗体である。抗体は、配列番号：２、またはその断片（例えば配列番号：３）からなるポリペプチドに特異的に結合可能であり、または抗体は、そのような抗体と競合する抗体であり得る（例えば、配列番号：２またはその断片（例えば配列番号：３）への結合に関して競合する、または配列番号：２と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する、または、配列番号：３と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する）。抗体は、配列番号：２のＮ−末端５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能であるか、または配列番号：２のＮ−末端３８アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能である。抗体は、ヒト抗体または無傷の免疫グロブリンであり得る。抗体は、機能的部分、例えば薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体に共役可能である。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、配列番号：２またはその断片からなるポリペプチドに特異的に結合する、単離非抗体リガンドを特徴とする。単離ポリペプチドリガンドは、前記ポリペプチドリガンドが、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しないようなものであり得る。ポリペプチドリガンドは、ペプチドリガンド、例えば足場ペプチド、直線リガンド、または環状リガンドであり得る。ポリペプチドリガンドは抗体であり得る。抗体は、配列番号：２、またはその断片（例えば配列番号：３）からなるポリペプチドに特異的に結合可能であり、または抗体は、そのような抗体と競合する抗体であり得る（例えば、配列番号：２またはその断片（例えば配列番号：３）への結合に関して競合する、または配列番号：２と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する、または、配列番号：３と配列番号：１間の複合体への結合に関して競合する）。抗体は、配列番号：２のＮ−末端５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能であるか、または配列番号：２のＮ−末端３８アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合可能である。抗体は、ヒト抗体または無傷の免疫グロブリンであり得る。抗体は、機能的部分、例えば薬物、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体に共役可能である。
【００１４】
他の態様において、本方法には、試料中のＭＵＣ１−Ｈを検出する方法を特徴とし、そこで、本発明は、（ａ）試料を提供すること、（ｂ）（ａ）の試料と、ＭＵＣ１−Ｈを含むポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドを、前記ポリペプチドリガンドのＭＵＣ１−Ｈへの結合を許容する条件下で、接触させること、および（ｃ）前記ポリペプチドリガンドの、試料中のＭＵＣ１−Ｈとの結合を検出し、この結合の検出が、試料中のＭＵＣ１−Ｈの存在を示唆すること、が含まれ、これによって、試料中のＭＵＣ１−Ｈを検出する。
【００１５】
他の態様において、本発明は、ＭＵＣ１−Ｈに対して特異的なポリペプチドリガンドを同定する方法を特徴とし、そこで、本方法には、（ａ）候補ＭＵＣ１−Ｈ結合ポリペプチドを発現しているファージを含む、ファージライブラリーを提供すること、（ｂ）前記ファージライブラリーを、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質と接触させること、および（ｃ）ＭＵＣ１−Ｈタンパク質のファージへの結合を検出すること、が含まれ、これによって、ＭＵＣ１−Ｈに特異的なポリペプチドリガンドを同定する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、細胞を殺す方法を特徴とし、そこで、本方法には、（ａ）細胞を提供すること、（ｂ）（ａ）の細胞と、ＭＵＣ１−Ｈを含むポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドを、前記ポリペプチドリガンドのＭＵＣ１−Ｈへの結合を許容する条件下で、接触させること、が含まれ、これによって細胞を殺す。
【００１７】
「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」により、ポリペプチドリガンドには、参考文献にて本明細書に組み込まれている、抗細胞質領域抗体である先行技術抗体、またはＷｒｅｓｈｎｅｒ、国際特許第ＷＯ９６／０３５０２号に記載されたようなＭＵＣ／Ｚ、ＭＵＣ／Ｘ、Ｍｕｃ１／Ｘ／ａｌｔ、ＭＵＣ１／Ｙ、ＭＵＣ１／Ｙ／ａｌｔ、ＭＵＣ１／Ｖ、ＭＵＣ１／Ｖ／ａｌｔ、ＭＵＣ１／Ｗ、ＭＵＣ１／Ｗ／ａｌｔ、ＭＵＣ１／ＺまたはＭＵＣ１／Ｚ／ａｌｔに結合する抗体、または、Ｈａｒｔｍａｎら，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８２：２５６−２６７）にて記載された１０Ｄ２／３６抗体、Ｈｉｌｋｅｎｓら（１９９８）Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．１９（ｓｕｐｐｌ  １）：６７−７０）に記載のＭ２９および２３２Ａ抗体が含まれないことを意味する。ＭＵＣ１−Ｈに対する抗体は、これらの公知の抗体によって認識される構造を認識しない。これらの公知の抗体は、ｓｔｕｂｂｌｅ配列内と同様に、原型ＭＵＣ１または全長ＭＵＣ１／Ｙ内に存在するエピトープに結合する。本発明の抗体は、これらの抗体によって定義されたエピトープを認識しない。
【００１８】
ＷｒｅｓｃｈｎｅｒおよびＨａｒｔｍａｎらの先行技術抗体は、少なくとも以下の配列、ＭＵＣ１タンパク質（配列番号：１）、ＭＵＣ１／Ｘタンパク質（配列番号：３）、ＭＵＣ１／Ｘ／ａｌｔタンパク質（配列番号：４）、ＭＵＣ１／Ｙ（配列番号：５）、ＭＵＣ１／Ｙ／ａｌｔタンパク質（配列番号：６）、ＭＵＣ１／Ｖタンパク質（配列番号：７）、ＭＵＣ１／Ｖ／ａｌｔタンパク質（配列番号：８）の１つに結合する。
【００１９】
好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは、ＭＵＣ１タンパク質、またはｓｈｅｄＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない。
【００２０】
本発明は、ＭＵＣ１タンパク質の細胞外領域のＣ−末端６５アミノ酸またはＣ−末端５２アミノ酸内の、ＭＵＣ１−Ｈエピトープに特異的に結合する、精製ポリペプチドリガンドを特徴とする。好ましくは、このリガンドは、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域には結合しない。このリガンドは、プロテアーゼによるＶＮＴＲ領域の解離後のみ、本配列内のエピトープを認識する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号：２からなるポリペプチドに特異的に結合する精製抗体、また、配列番号：２への結合に関してそのような抗体と競合可能である、精製第二抗体をも特徴とする。本発明はまた、全長ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態の開裂によっって現れる立体的エピトープからなるポリペプチドに特異的に結合するが、ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態からなるポリペプチドに結合しない、精製抗体も特徴とする。本発明はまた、配列番号：１（ＭＵＣ１配列）および配列番号：２からの寄与での、立体的エピトープからなるペプチドに特異的に結合するが、配列番号：１からなるポリペプチドには結合しない、精製抗体も特徴とする。本発明はまた、配列番号：２に結合することに関して、上記抗体と競合可能である、精製第二抗体も特徴とする。他の抗体と競合可能である抗体、の関連で「競合する（ｃｏｍｐｅｔｅ  ｗｉｔｈ）」は、細胞結合フローサイトメトリック（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ）解析にて、または特定の試験（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど）において、１０〜１００倍モル過剰（ｍｏｌａｒ  ｅｘｃｅｓｓ）で使用した場合に、少なくとも５０％、ＭＵＣ１−Ｈ特異的抗体の結合を減少可能であることを意味する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号：２の最初の５１アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合する精製抗体を特徴とし、また、配列番号：２の最初の５１アミノ酸からなるポリペプチドのエピトープに特異的に結合する精製抗体をも特徴とする。本発明はまた、配列番号：１および配列番号：２からの寄与での、立体的エピトープからなるポリペプチドに特異的に結合するが、配列番号：１からなるポリペプチドには結合しない、精製抗体を特徴とし、また、配列番号：２の最初の５１アミノ酸への結合に関して、そのような抗体と競合可能な精製第二抗体をも特徴とする。
【００２３】
本発明はまた、配列番号：２からなるポリペプチドに特異的に結合し、好ましくは、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない、単離非抗体ペプチドを特徴とする。本発明はまた、配列番号：２からなるポリペプチドに特異的に結合する単離非抗体ペプチド、およびまた、配列番号：２への結合に関して、そのようなペプチドと競合可能な精製第二非抗体ペプチドを特徴とする。本発明はまた、全長ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態の開裂によって現れた、立体的エピトープからなるポリペプチドに特異的に結合するが、ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態からなるポリペプチドには結合しない、精製非抗体ペプチドも特徴とする。本発明はまた、配列番号：１（ＭＵＣ１配列）および  配列番号：２からの寄与での、立体的エピトープからなるポリペプチドに特異的に結合するが、配列番号：１からなるポリペプチドには結合しない、精製非抗体ペプチドを特徴とする。本発明はまた、配列番号：２への結合に関して、上記抗体およびペプチドと競合可能である、精製第二非抗体ペプチドも特徴とする。
【００２４】
本発明はまた、ＭＵＣ１タンパク質のＣ−末端領域に特異的に結合する、精製ポリペプチドも特徴とし、そこで、前記ポリペプチドは、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない。本発明はまた、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質に特異的に結合する精製ポリペプチドを特徴とし、そこで、前記ポリペプチドは、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない。本発明はまた、配列番号：２の最初の５１または３８アミノ酸からなるポリペプチドに特異的に結合する精製ポリペプチドも特徴とする。本発明はまた、配列番号：１（ＭＵＣ１配列）および  配列番号：２からの寄与での、立体的エピトープからなるポリペプチドに特異的に結合するが、配列番号：１からなるポリペプチドには結合しない、精製ポリペプチドを特徴とし、前記ポリペプチドは、ＭＵＣ１タンパク質のＶＮＴＲ領域に結合しない。本発明はまた、配列番号：２の最初の５１アミノ酸からなるポリペプチドのエピトープに特異的に結合する、精製ポリペプチドを特徴とし、また、配列番号：２の最初の５１または３８アミノ酸への結合に関して、そのようなポリペプチドと競合可能な、精製第二ポリペプチドも特徴とする。
【００２５】
他の態様において、本発明は、試料中のＭＵＣ１−Ｈを検出する方法を特徴とし、本方法は、（ａ）試料を提供すること、（ｂ）（ａ）の試料と、配列番号：２を含むポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドを、前記ポリペプチドリガンドのＭＵＣ１−Ｈへの結合を許容する条件下で、接触させること、および（ｃ）前記ポリペプチドリガンドの、試料中のＭＵＣ１−Ｈとの結合を検出し、この結合の検出が、試料中のＭＵＣ１−Ｈの存在を示唆すること、が含まれ、これによって、試料中のＭＵＣ１−Ｈを検出する。試料中にて検出したＭＵＣ１−Ｈは遊離しているか、生物学的要素、例えば細胞またはファージに付着していてよく、そこでエピトープとして提示されうる。
【００２６】
本発明はまた、ＭＵＣ１−Ｈに特異的なポリペプチドリガンドを同定する方法も特徴とし、（ａ）候補ＭＵＣ１−Ｈ結合ポリペプチドを発現しているファージを含む、ファージライブラリーを提供すること、（ｂ）前記ファージライブラリーを、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質と接触させること、および（ｃ）ＭＵＣ１−Ｈタンパク質のファージへの結合を検出すること、が含まれ、これによって、ＭＵＣ１−Ｈに特異的なポリペプチドリガンドを同定する。試料中にて検出したＭＵＣ１−Ｈは遊離しているか、生物学的要素、例えば細胞またはファージに付着していてよく、そこでエピトープとして提示されうる。
【００２７】
本発明はまた、ＭＵＣ１−またはＭＵＣ１−Ｈ−含有細胞を、細胞と、本発明にしたがったポリペプチドリガンドとを、細胞削除を許容する条件下で接触させることによって、削除または殺害する方法も特徴とする。好ましくは、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施する。
【００２８】
本発明のポリペプチドリガンドは、ペプチドリガンド、例えば足場ペプチド、直線ペプチドまたは環状ペプチドであり得る。ポリペプチドリガンドは抗体であり得る。抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、組換え型抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、無傷の免疫グロブリン、例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭまたはこれらのサブタイプであり得る。抗体は、第二の異なるポリペプチド、治療薬剤、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体であり得る、機能的部位（例えば、生物学的または化学的機能を持つ化合物）に共役可能である。
【００２９】
本発明のポリペプチドリガンドは、機能的部位、例えば、第二の異なるポリペプチド、治療薬剤、細胞毒性薬剤、検出可能部位または固体支持体に共役可能である。
【００３０】
「ＭＵＣ１タンパク質（ＭＵＣ１  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、全長、多様型、高分子量糖タンパク質を意味し、通常、分泌上皮細胞によって発現されるが、悪性乳上皮細胞においては、豊富に発現され、非悪性細胞によって発現されている場合には、Ｏ型糖結合糖側鎖によって、異なって糖付加される傾向にあり、正常のムチン様の特徴を履行している。ＭＵＣ１遺伝子産物は、大きな細胞外領域、膜貫通領域および細胞質テールを含む、膜貫通タンパク質である。細胞外領域は、数の上で約２０〜約１００繰り返しで変動する、２０アミノ酸繰り返しモチーフでの可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）領域を含む。そのようなＭＵＣ１タンパク質の１つは、配列番号：１にて示されている。
【００３１】
「ＭＵＣ１−Ｈ」タンパク質は、ＭＵＣ１ポリペプチド上に発見されたエピトープの集団を意味し、ＭＵＣ１の開裂の後に、細胞表面上に残っているＭＵＣ１−タンパク質またはタンパク質の誘導体内に存在し、ｓｈｅｄＭＵＣ１上、または全長非クリップＭＵＣ１上で存在せず、そして、異なる。エピトープは、ＭＵＣ−１  Ｓｔｕｂｂｌｅ内、またはこれによって部分的に形成されるものを基準としうる。エピトープは、開裂が起こった後、またはＭＵＣ１のクリップＮ−末端領域が細胞表面上から離れた後のみで、露出されうる。ＭＵＣ１−Ｈに相当する代表的なエピトープは、配列番号：２にて、または配列番号：２およびＭＵＣ１のクリップ形態によって形成された複合体にて、または配列番号：２および配列番号：１によって形成された複合体にて存在しうる。
【００３２】
「ＭＵＣ１／Ｘ」は、配列番号：３で示したような、ＭＵＣ１タンパク質のスプライスバリアントを意味する。同様に、「ＭＵＣ１／Ｘ／ａｌｔ」（配列番号：４）、「ＭＵＣ１／Ｙ」（配列番号：５）、「ＭＵＣ１／Ｙ／ａｌｔ」（配列番号：６）、「ＭＵＣ１／Ｖ」（配列番号：７）および「ＭＵＣ１／Ｖ／ａｌｔ」（配列番号：８）もまた、ＭＵＣ１タンパク質のスプライスバリアントである。
【００３３】
「ＶＮＴＲ領域（ＶＮＴＲ  ｒｅｇｉｏｎ）」または同義語「タンデムリピート配列（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ａｒｒａｙ）」は、可変数のタンデムリピートを持つ全長ＭＵＣ１タンパク質の領域を意味する。繰り返しユニットは、一般的に、繰り返し間で多少のばらつきがあるが、２０アミノ酸タンデムリピートユニットＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡである。明確な繰り返しの数は、固体間で異なり、北ヨーロッパ集団においては、２１と１２５繰り返しの間で異なりうる（Ｇｅｎｄｌｅｒ，Ｓ．Ｊ．（１９９０）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１５２８６−１５２９３）。
【００３４】
本明細書で使用するところの、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」または「抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」は、ＭＵＣ１−Ｈに結合している特定のポリペプチドリガンドと接触する分子の部分を意味する。タンパク質またはタンパク質の断片を、宿主を免疫化するために使用する場合、タンパク質の多くの領域は、タンパク質上の該領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産出を誘導し得、これらの領域または構造が、エピトープまたは抗原決定基として呼ばれる。エピトープまたは抗原決定基は、抗体への結合に関して、本来の抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために使用する免疫原）と競合しうる。エピトープは、抗原からの直線配列を本質的に含む、直線、または他の配列によって遺伝子的に分散されているが、ポリペプチドリガンドに対する結合部位にて構造的に一緒に存在する配列を含む立体構造的であり得る。
【００３５】
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、高い親和性および特異性で、ヒトＭＵＣ１−Ｈに結合し、従って、診断、予防または治療薬剤として、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏによって使用されうる。好ましくは、リガンドはＭＵＣ１−Ｈに特異的に結合する。本明細書で使用するところの、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、抗体の特性、つまり（１）ＭＵＣ１−Ｈ、例えばヒトＭＵＣ１−Ｈに、少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和性で、好ましく結合する、および（２）ＭＵＣ１−Ｈ以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カセイン）に対する結合に関するその親和力よりも、少なくとも２倍、５０倍、１００倍またはそれ以上である親和性で、ＭＵＣ１−Ｈ、例えばヒトＭＵＣ１−Ｈに好ましく結合する、抗体の特徴を意味する。
【００３６】
従って、本発明は、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体、抗体断片、およびその薬理学的組成物、ならびにそのような抗体および断片を作製するための核酸、組換え体発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで、ＭＵＣ１−Ｈを検出するため、またはＭＵＣ１−Ｈ発現細胞、例えばＭＵＣ１−Ｈ−発現癌細胞を削除または殺傷するために、本発明の抗体を使用する方法もまた、本発明に含まれる。「削除または殺傷（ａｂｌａｔｅ  ｏｒ  ｋｉｌｌ）」は、細胞が破壊されるまたは非機能的になること、すなわち細胞が完全に破壊されるか、さらなる分裂が不可能になる、または他の細胞の分化のシグナリングが完全に破壊されうることを意味する。
【００３７】
本発明のポリペプチドリガンドは、例えば高い親和性および特異性にて、ＭＵＣ１−Ｈ、好ましくはヒトＭＵＣ１−Ｈと結合して、相互に作用する。例えば、ポリペプチドリガンドは、少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１の親和定数で、ヒトＭＵＣ１−Ｈに結合する。好ましくは、ポリペプチドリガンドは、例えば細胞外ＭＵＣ１−Ｈ、またはＭＵＣ１タンパク質の「ｓｔｕｂｂｌｅ」部分、もっとも好ましくは、細胞外ＭＵＣ１−Ｈ、またはヒトＭＵＣ１タンパク質の「ｓｔｕｂｂｌｅ」部分（例えば配列番号：２）と結合して、相互に作用する。
【００３８】
１つの実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、本明細書で記述した抗体のエピトープのすべてまたは部分に結合する。抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、本明細書で記述した抗体の、ヒトＭＵＣ１−Ｈへの結合を、阻害、例えば競合的に阻害可能である。抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、エピトープ、例えば立体構造的または直線エピトープに結合し得、結合した時にエピトープは、本明細書で記述した抗体の結合を防止する。エピトープは、空間的または機能関連的に非常に近くにあり、例えば直線配列で、または抗体によって認識されたものに対し、構造的に、重複した、または隣接したエピトープがある。１つの実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、ヒトＭＵＣ１（配列番号：１）の約アミノ酸２５３から約アミノ酸３８２の領域内で、全体として、または部分的に局在するエピトープに結合する。好ましくは、エピトープには、ヒトＭＵＣ１のＳＥＡ領域の少なくとも一部分及び／又はＭＵＣ１ポリペプチド上に見つけられたエピトープの集まりが含まれ、ＭＵＣ１ポリペプチドはＭＵＣ１−タンパク質またはＭＵＣ１の開裂の後に細胞表面上に残ったタンパク質の誘導体内に存在し、ｓｈｅｄＭＵＣ１上または全長非クリップＭＵＣ１上に存在しない、ｓｔｕｂｂｌｅ内の領域を認識する、抗体６Ｄ３／１２、１０Ｄ２／３６、２３２ＡまたはＭ２９によって規定されるエピトープと異なる。ＭＵＣ１ポリペプチド上に見られたエピトープの集団が含まれる。そのようなエピトープは、ＭＵＣ−１  Ｓｔｕｂｂｌｅ内に基づくか、部分的にそれによって形成されうる。エピトープは、開裂が起こった後、またはＭＵＣ１のクリップＮ−末端領域が細胞表面より解離した後にのみ露出されうる。ＭＵＣ１−Ｈに相当する典型的なエピトープは、配列番号：２、または配列番号：２および配列番号：１によって形成された複合体に存在しうる。
【００３９】
ヒトＭＵＣ１−Ｈを含むエピトープは、上皮細胞上および多くの腫瘍細胞上で発現される。本発明の抗体は、これらの細胞の細胞表面、とりわけ生細胞の細胞表面に結合する。腫瘍細胞の相異なる遺伝的および構造的構成が、正常上皮細胞に優先して、特定の腫瘍細胞または腫瘍細胞のごく一部でのＭＵＣ１−Ｈエピトープの露出を導きうる。とりわけ腫瘍において、より高いＭＵＣ１発現レベル、異なったプロテアーゼ発現スペクトル、糖付加の異なった量および性質によって、及び／又は改変タンパク質分解開裂パターンおよび非極性発現パターンによって引き起こされる可能性がある。ＶＮＴＲエピトープと比較して、より細胞表面に近いＭＵＣ１−Ｈの存在で、抗ＶＮＴＲ抗体で見られたものより強い抗体Ｆｃ仲介抗腫瘍細胞活性を引き起こすことが予想される。好ましくは、本発明のポリペプチドリガンドもまた、ＭＵＣ１−Ｈと内在化し、抗体、例えば、細胞毒性または標識薬剤と競合する薬剤の細胞内伝達を許容する。従って、本発明のポリペプチドリガンドは、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質を発現する、生正常、良性増殖性、および癌性細胞を標的化するために使用可能である。そのような内在化は、結合ＭＵＣ１タンパク質バリアントの天然の内在化に基づいてよく、またはポリペプチドリガンド上に提供されるシグナルによって、増強または産出されうる。
【００４０】
好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは抗体である。本明細書で使用するところの、語句「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、少なくとも１つ、好ましくは２つの、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）、および少なくとも１つ、好ましくは２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を含むタンパク質を示す。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、語句「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」（「ＣＤＲ」）と呼ぶ超可変の領域にさらに分けられ、語句「フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」（ＦＲ）の、より保存された領域が分散する。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は、正確に規定されてきた（全体として、参考文献を本明細書に組み込んだ。Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照のこと）。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、以下の順番、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ。
【００４１】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖はさらに、すべてのまたは一部の重または軽鎖定常領域を含みえ、これによって、それぞれ重または軽免疫グロブリン鎖を形成し得る。１つの実施形態において、抗体は、２つの重免疫グロブリン鎖および２つの軽免疫グロブリン鎖の四量体であり、そこで、重および軽免疫グロブリン鎖は、例えばジスルフィド結合によって内部連結する。重鎖定常領域は、３つの領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。軽鎖定常領域は、１つの領域、ＣＬからなる。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞）および古典的補体型の第一補体（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への結合を仲介する。語句「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそのサブタイプ）の本来の免疫グロブリンを含み、そこで免疫グロブリンの軽鎖は、カッパまたはラムダ型であり得る。
【００４２】
本明細書で使用するところの、語句「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている、１つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリン「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端における可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣＯＯＨ−末端におけるカッパまたはラムダ定常領域遺伝子によってコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」（約５０ｋＤまたは４４６アミノ酸）は同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記の定常領域遺伝子の１つ、例えばガンマ（約３３０アミノ酸をコードしている）によってコードされている。
【００４３】
語句「抗体」はまた、抗体の抗原結合断片を含む。本明細書で記載するところの語句、抗体の「抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」（または単に「抗体部分（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｏｒｔｉｏｎ）」または「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」）は、ＭＵＣ１−Ｈ（例えばヒトＭＵＣ１−Ｈ）に特異的に結合する能力を保持した、全長抗体の１つまたはそれ以上の断片を意味する。語句、抗体の「抗原結合断片」内に含まれる結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１領域からなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域にて、ジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域からなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ領域からなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つの領域、ＶＬおよびＶＨは、分離した遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を用い、ＶＬおよびＶＨ領域が一価分子（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる：例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）を形成するように対になってできる、単一タンパク質鎖として作成可能である合成リンカーによって、結合可能である。そのような単一鎖抗体もまた、語句、抗体の「抗原結合断片」内に含まれることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらの断片は、本来の抗体と同様の様式での使用のために選別される。
【００４４】
抗体は好ましくは、単一特異的、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。語句「単一特異的抗体（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、特定の標的、例えばエピトープに対する、単一の結合特異性および親和性を表す抗体を意味する。この語句には、本明細書で使用されるところの、単一分子組成物の、その抗体または断片の調製物を意味する、「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「モノクローナル抗体組成物（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」が含まれる。
【００４５】
抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤおよびＩｇＥ、ただし好ましくはＩｇＧ）でありえ、または抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦＶ断片）のみを含みうる。抗体またはその抗原結合断片には、２つの重鎖免疫グロブリンおよび２つの軽鎖免疫グロブリンが含まれ得、または単一鎖抗体であり得る。抗体は、任意に、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンまたはミュー定常領域遺伝子から選択された定常領域を含み得る。好ましい抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体には、本質的にヒト抗体、例えばヒトＩｇＧ１定常領域またはその一部からの重および軽鎖定常領域が含まれる。本明細書で使用するところの、「アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされている、抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を意味する。
【００４６】
好ましい実施形態において、抗体（またはその断片）は、組換え体または改変抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成抗体である。本明細書で使用するところの語句「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」または「改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」ヒト抗体は、宿主細胞内にトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）した組換え体発現ベクターを用いて発現した抗体、組換え体より単離した抗体、コンビナトリアル（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離した抗体のような、組換え体方法によって調製、発現、作製または単離するすべての抗体、または他のＤＮＡ配列へ、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列をスプライシングすることを含む、他の任意の方法によって調製、発現、調製または単離した抗体を含むことが意図される。そのような組換え体抗体には、ヒト化、ＣＤＲ移植、キメラ、脱免疫化、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成抗体を含み、任意に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列から由来した、定常領域が含まれうる。
【００４７】
また、本発明の範囲内は、重複したエピトープと結合するまたは競合的に阻害する抗体、またはその抗原結合断片、および抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体、例えば重複したエピトープと結合または競合的に阻害する抗体の本明細書で開示したＭＵＣ１−Ｈへの結合、単一特異的抗体のＭＵＣ１−Ｈへの結合である。抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体の任意の組み合わせが、本発明の範囲内であり、例えば、ＭＵＣ１−Ｈの異なる領域へ結合する２つまたはそれ以上の抗体、例えばＭＵＣ１−Ｈ上の２つの異なるエピトープに結合する抗体、例えばニ重特異性抗体が範囲内である。
【００４８】
１つの実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体またはその抗原結合断片には、少なくとも１つの軽または重鎖免疫グロブリン（または好ましくは、少なくとも１つの軽鎖免疫グロブリンと、少なくとも１つの重鎖免疫グロブリン）が含まれる。好ましくは、それぞれの免疫グロブリンには、本質的に、それぞれ抗ＭＵＣ１−Ｈ軽または重鎖可変領域からのＣＤＲと同一の、少なくとも１つ、２つ、および好ましくは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）をもつ、軽または重鎖可変領域が含まれる。
【００４９】
他の実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体、またはその抗原結合断片の、軽または重鎖可変フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）には、ヒト軽または重鎖可変フレームワークからの、例えば、ヒト成熟抗原、ヒト生殖細胞系列配列またはコンセンサス配列からの軽または重鎖可変フレームワーク残基からの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、１６または１７のアミノ酸残基が含まれる。１つの実施形態において、ヒト軽鎖可変フレームワークからのアミノ酸残基は、ヒト生殖細胞系列において、同一の位置で見られた残基と同一である。好ましくは、ヒト軽鎖可変フレームワークからのアミノ酸残基が、同一の位置における、ヒト生殖細胞系列にて、もっとも共通の残基である。
【００５０】
本明細書に記述の抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、それのみで使用可能であり、例えば、対象に投与可能であり、非誘導体形態または非共役形態でｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用可能である。他の実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、誘導体化、改変、または他の機能的分子、例えば他のペプチド、タンパク質、アイソトープ、細胞または不溶性支持体に連結可能である。例えば、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、抗体（例えば、もしリガンドが、二重特異性または多重特異性抗体を形成するための抗体の場合）、毒素、放射性同位体、治療的（例えば細胞毒性または細胞増殖抑制性）薬剤または特に一部分などの、１つまたはそれ以上の他の分子的実在物に機能的に連結可能である。例えば、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、放射活性イオン（例えばα−、γ−またはβ−放射体）、例えばヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、リューテリウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、またはビスマス（２１２または２１３Ｂｉ）に連結可能である。
【００５１】
他の態様において、本発明は、組成物、例えば、薬理学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤、および少なくとも１つの本明細書で記述の抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド（例えば、抗体またはその断片）を含む、薬理学的組成物を提供する。１つの実施形態において、組成物、例えば薬理学的組成物には、２つまたはそれ以上の、前述の抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドの連結が含まれる。
【００５２】
他の態様において、本発明は、単独または他の治療的併用、例えば細胞毒性薬剤または標識化薬剤、例えば、本明細書で記載の細胞毒性薬剤または標識化薬剤との組み合わせでの使用のための、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体（またはその断片）、例えば、本明細書で記載の抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体（またはその断片）を含む、癌障害を処置、予防、または検出するための、ＭＵＣ１−Ｈ抗体またはそのような薬剤の組み合わせをどのように使用するかの説明書も含む、キットを特徴とする。
【００５３】
本発明はまた、本明細書で記述の、重鎖および軽鎖免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をコードしている核酸配列も特徴とする。例えば、本発明は、本明細書に記述の抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体分子の、それぞれ重鎖および軽鎖可変領域をコードしている第一および第二核酸を特徴とする。他の態様において、本発明は、本発明の核酸を含む、宿主細胞およびベクターを特徴とする。
【００５４】
他の態様において、本発明は、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体、またはその抗原結合断片を産出する方法を特徴とする。本方法には、重鎖可変領域、例えば本明細書で記載の重鎖可変領域をコードしている第一核酸を提供すること、軽鎖可変領域、例えば本明細書で記載の軽鎖可変領域をコードしている第二核酸を提供すること、および抗原結合タンパク質を形成するための、前記軽および重鎖可変領域のアセンブルを許容する条件下で、宿主細胞内で、第一および第二核酸を発現させること、が含まれる。第一および第二核酸は、連結または非連結可能であり、例えば、それぞれ同一または異なるベクター上に発現可能である。
【００５５】
宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり得る。例えば、哺乳類細胞は、培養細胞または細胞株であり得る。具体例としての哺乳類細胞は、リンパ球細胞株（例えばＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞、形質転換動物からの細胞、例えば乳房上皮細胞が含まれる。例えば、本明細書で記述の抗体をコードしている核酸は、形質転換動物内で発現可能である。１つの実施形態のおいて、核酸を、組織特異的プロモーター（例えば、乳房特異的プロモーター）の制御下におき、抗体を、形質転換動物内に産出する。例えば、抗体分子を、形質転換ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯類のような形質転換動物の乳内にて分泌させる。
【００５６】
本発明はまた、細胞、例えば正常、良性または増殖性細胞（例えば、肺、乳房、腎臓、尿路上皮、大腸、前立腺または肝臓癌及び／又は転移）のような細胞を、治療、例えば削除または殺傷する方法も特徴とする。本発明の方法には、細胞を治療、例えば削除または殺傷するために必要な量で、細胞を抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドと接触させることが含まれる。リガンドには、細胞毒性実在物が含まれうる。本発明の方法は、例えば、疾病、例えば癌（例えば悪性または転移性疾病）または非癌性疾病（例えば、良性または増殖性疾病）を、そのような疾病を治療または予防するのに効果的な量で、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを対象に投与することによって治療または阻止するために使用可能である。
【００５７】
目的の方法は、培養中の細胞上、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで使用可能である。例えば、癌性または転移性細胞（例えば肺、乳房、腎臓、尿路上皮、大腸、前立腺、肺癌または転移細胞）を、培養培地中で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養可能であり、接触段階が、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを培養培地に加えることによって達成される。本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば治療的または予防的）プロトコールの一部として、対象中に存在する細胞（例えば癌性または転移細胞）上で実施可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態に関して、接触段階が、対象中で達成され、リガンドが細胞へ結合し、細胞を治療、例えば殺傷または削除すること両方を許容するのに効果的な条件下で、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを対象に投与することが含まれる。
【００５８】
本発明の方法は、例えば、固形腫瘍、軟組織腫瘍、転移性障害を限定はしないが含む、癌性疾病を治療または阻止するために使用可能である。固形腫瘍の例には、影響を受ける肺、乳房、リンパ、胃腸管（例えば大腸）、および性尿器管（例えば腎臓、尿路上皮細胞）咽頭に影響を及ぼすような多種の臓器系の、悪性腫瘍、例えばサルコーマ、腺癌およびカルシノーマ、ならびにほとんどの大腸癌、腎臓癌、腎臓細胞カルシノーマ、肝臓癌、肺の非小細胞カルシノーマ、小腸の癌および咽頭の癌のような悪性腫瘍を含む腺癌が含まれる。上述した癌の転移性障害もまた、本発明の方法および組成物を用いて治療または阻止可能である。
【００５９】
対象は、哺乳類、例えば霊長類、好ましくはより高次の霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書で記述した疾病、例えば癌を患っているか、そのリスクのある患者）であり得る。
【００６０】
抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体またはその断片、例えば本明細書で記述したような、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体またはその断片は、全身に（例えば経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、鼻腔内、経粘膜、または吸入によって）、局所に、または鼻、のどおよび気管支管のような粘膜に適用することよって、対象に投与可能である。
【００６１】
本発明の方法は、さらに、例えば腫瘍サイズの減少、腫瘍マーカー、例えば癌特異的抗原のレベルの減少、例えば骨スキャンでの、新規障害の発現の減少、新規疾患関連症状の発現の減少、または軟組織量の大きさの減少または安定化、臨床結果の改善に関連した任意のパラメータ、の１つまたはそれ以上の減少に関して、対象をモニタする方法を含みうる。対象は、１つまたはそれ以上の以下の期間でモニタ可能である。処置の開始前、治療の間、治療の１つまたはそれ以上の要素を投与した後。モニタリングは、同様の抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドでのさらなる治療、または追加薬剤による追加治療に関する必要性を評価するために使用可能である。一般的に、上述の、１つまたはそれ以上のパラメータの減少は、対象が改善された状況であることを示す。
【００６２】
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、それによってＭＵＣ１−Ｈ発現細胞を削除または殺傷するための、非共役形態で、それのみで使用可能である。例えば、リガンドが抗体の場合、削除または殺傷は、補体仲介細胞溶解及び／又はエフェクター細胞仲介細胞殺傷のような抗体依存細胞殺傷機構によって仲介されうる。他の実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、ＭＵＣ１−Ｈ発現細胞を殺傷または削除するのに効果的な、基質、例えば細胞毒性薬剤またはその一部に結合可能である。例えば、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、放射活性イオン（例えばα−、γ−またはβ−放射体）、例えばヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、リューテリウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、またはビスマス（２１３Ｂｉ）に連結可能である。本発明の方法および組成物は、他の治療方法との組み合わせで使用可能である。１つの実施形態において、本発明の方法には、細胞毒性薬剤との組み合わせ、および前記疾病を治療するまたは阻止するために効果的な量で、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド、例えば抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体またはその断片を対象に投与することが含まれる。リガンドおよび細胞毒性薬剤は、同時にまたは連続的に投与可能である。他の実施形態において、本発明の方法および組成物は、外科及び／又は放射手順と組み合わせて使用される。
【００６３】
他の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、試料中の（例えば生物学的試料、組織生検、例えば癌性障害）、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質の存在を検出するための方法を特徴とする。目的の方法は、本明細書で記述の疾病、例えば癌性疾病を、評価、例えば診断または病期決定するために使用可能である。本方法には、（ｉ）抗ＭＵＣ１−ＨリガンドとＭＵＣ１−Ｈタンパク質の相互作用が起こることを許容する条件下で、本明細書に記述したように、試料（および任意に、参照、例えば対照、試料）を、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドと接触させること、および（ｉｉ）抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドと、試料（および任意に、参照、例えば  対照、試料）間の複合体の形成を検出すること、が含まれる。複合体の形成は、ＭＵＣ１−Ｈタンパク質の存在することを示し、本明細書で記述の治療のための好適性または必要性を示し得る。例えば、参照試料、例えば対照試料と比較して、試料中の複合体の形成に統計学的に有意な変化がある場合、これは、試料中のＭＵＣ１−Ｈの存在を示す。
【００６４】
さらに他の態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば対象内のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化（ｉｍａｇｉｎｇ））での、ＭＵＣ１−Ｈの存在を検出するための方法を提供する。目的の方法は、本明細書で記述の疾病、例えば癌性疾病を、評価、例えば診断または病期決定するために使用可能である。本方法には、（ｉ）抗ＭＵＣ１−ＨリガンドとＭＵＣ１−Ｈタンパク質の相互作用が起こることを許容する条件下で、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド（例えば抗体またはその抗原結合断片）を対象（および任意に対照対象）に投与すること、（ｉｉ）リガンドおよびＭＵＣ１−Ｈ間の複合体の形成を検出すること、が含まれ、そこで、参照、例えば対照対象または対象の基準線と比べて、対象内での複合体の形成が、統計学的に有意に変化する場合に、これはＭＵＣ１−Ｈの存在を示す。
【００６５】
他の実施形態において、本明細書で記述したような疾病（例えば癌性疾病）を診断する、または病期決定しうるための方法が提供される。本方法には、（ｉ）前記疾病を患っている、またはリスクを持っている対象を同定すること、（ｉｉ）疾病に影響を受けている組織または細胞の試料を得ること、（ｉｉｉ）結合薬剤とＭＵＣ１−Ｈタンパク質の相互作用が起こることを許容する条件下で、前記試料または対照試料を、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドと接触させること、および（ｉｖ）複合体の形成を検出すること、が含まれる。参照試料、例えば対照試料と比較して、試料中の複合体の形成に統計学的に有意な変化がある場合、これは疾病または疾病の病期を示す。
【００６６】
好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法で使用される抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、結合したまたは結合していない結合薬剤の検出を促進するために、直接的または間接的に標識化される。好適な検出可能な基質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、化学発光物質および放射活性物質が含まれる。１つの実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、放射活性イオン、例えばインジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、またはビスマス（２１３Ｂｉ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロージウム（１８８Ｒｈ）、またはリン（３２Ｐ）と結合する。他の実施形態において、リガンドは、ＮＭＲ造影剤と標識化する。
【００６７】
本発明はまた、一連のアミノ酸および核酸配列を含む、ポリペプチドおよび核酸を提供する。
【００６８】
本明細書で使用するところの、語句「本質的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」（または「本質的に相同（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｌｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」）は、第二アミノ酸またはヌクレオチド配列に対して同一または等価（例えば同様の側鎖、例えば保存アミノ酸基質）な十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む、第一アミノ酸またはヌクレオチド配列で、第一および第二アミノ酸またはヌクレオチド配列が同一の活性であるようなものであることを示すため、本明細書で使用する。抗体の場合、第二抗体は、同一の特異性を持ち、少なくとも５０％の親和性を持つ。
【００６９】
本明細書で開示した配列に対して配列類似性または相同性（例えば、少なくとも約８５％配列同一性）を持つ配列もまた、本発明の一部分である。いくつかの実施形態において、配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。あるいは、核酸部分が、選択的ハイブリッド形成条件（例えば非常に厳密なハイブリッド形成条件）下でストランド（ｓｔｒａｎｄ）の相補体にハイブリッド形成しうる場合に、本質的な同一性が存在する。核酸は、全細胞、細胞溶解物または部分的に精製または本質的に純粋な形態にて存在しうる。
【００７０】
２つの配列間の「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」（これらの語句は本明細書で同義的に使用される）の計算は、以下のように実施される。配列を、最適な比較目的のために並べる（例えば、最適配置のために、第一および第二アミノ酸または核酸配列の１つまたは両方に、ギャップを導入することが可能であり、非相同配列は、比較目的のために無視可能である）。好ましい実施形態において、比較目的のために配置した参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは約６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。ついで相当するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列での位置が、第二配列の相当する位置で同一のアミノ酸またはヌクレオチドによって占領されている場合、この分子は、その位置で同一である（本明細書で使用されているように、アミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有されている同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適配置のために導入する必要があるギャップの数、それぞれのギャップの長さを計算に入れる。
【００７１】
２つの配列間の配列の比較と、パーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスいずれかを用いて、また１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ量および１、２、３、４、５または６の長さ量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中のＧＡＰプログラム内に組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを用いて決定される。また他の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、および４０、５０、６０、７０または８０のギャップ量および１、２、３、４、５または６の長さ量を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中で、ＧＡＰプログラムを用いて決定される。特に好ましいパラメータセット（および実施者が、分子が本発明の配列同一性または相同性制限内であるかどうかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかどうかに関して、わからない場合、使用すべきもの）は、ギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４およびフレームシフトギャップペナルティー５での、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスである。
【００７２】
本明細書で使用するところの語句「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」は、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」と同義語であり、適度な数のアミノ酸挿入または欠損も存在しうるが、対象配列が、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換によって参照配列からは異なることを意味する。参照配列に対する相同性または類似性の程度を計算する現在の好ましい方法は、アルゴリズムデフォルト、または計算配列関連性の意義を決定するために推奨されたパラメータを用いる、いずれかの場合での、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡで入手可能）の使用を介したものである。２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４ギャップペナルティーを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７）のアルゴリズムを用いても決定可能である。
【００７３】
本明細書で使用するところの、語句「低厳重さ、中間厳重さ、高厳重さ、または非常に高い厳重さ条件下でハイブリッド形成する（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｌｏｗ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ，  ｍｅｄｉｕｍ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ，  ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ，  ｏｒ  ｖｅｒｙ  ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、ハイブリッド形成および洗浄に対する条件を記述している。ハイブリッド形成反応を実施するためのガイドラインは、そのすべてが、参考文献にて本明細書に組み込まれている、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６で見ることができる。水性および非水性方法が、参考文献にて記述されており、いずれも使用可能である。本明細書で参考にされている特異的ハイブリッド形成条件は以下のようである。（１）約４５℃、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、ついで少なくとも５０℃で０．２×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での２回の洗浄、の低厳重さ条件（洗浄の温度は、低厳重さ条件に関して、５５℃まであげられる）、（２）約４５℃にて６×ＳＳＣ、ついで６０℃にて、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回またはそれ以上の洗浄、の中間厳重さ条件、（３）約４５℃にて６×ＳＳＣ、ついで、６５℃にて０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中１回またはそれ以上の洗浄、の高厳重さ条件、および好ましくは（４）６５℃にて０．５Ｍ  リン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳ、ついで、６５℃にて０．２Ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳでの１回またはそれ以上の洗浄、の非常に高い厳重さ条件。非常に高い厳重さ条件（４）が、好ましい条件であり、他に特定しない限り使用されるべきものである。
【００７４】
本発明の結合薬剤ポリペプチドが、ポリペプチド機能に本質的な影響を持たない、さらなる保存または非必須アミノ酸置換基を持ちうることが理解される。特定の置換基が許容されるか、すなわち、結合活性のような、求めらる生物学的特性に悪影響を与えないかどうかは、Ｂｏｗｉｅら（（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０）にて記述されたように決定されうる。「保存アミノ酸置換基（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を持つアミノ酸残基で置換されるものである。同様の側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーが、本技術分野で定義されてきた。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のアミノ酸が含まれる。
【００７５】
「非必須（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基は、「必須（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）」アミノ酸残基が結果としてそのような変化を引き起こす一方で、生物学的活性を損なうことなしに、またはより好ましくは、本質的に変化することなしに、結合薬剤、例えば抗体の野生型配列から変化しうる残基である。
【００７６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および請求項により、さらに明らかになるであろう。
（詳細な説明）
本明細書では、細胞表面結合ＭＵＣ１上に存在するが、ｓｈｅｄＭＵＣ１上には存在しない、エピトープの集団、ＭＵＣ１−Ｈに対する抗体およびリガンドを記述している。ＭＵＣ１−Ｈに対する抗体およびリガンドは、ＭＵＣ１−ｓｔｕｂｂｌｅ、または可溶性ＭＵＣ１とＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅ複合体間で形成される複合体に関連するエピトープを認識し、従って、ｓｈｅｄＭＵＣ１への等価の親和性をもった結合を欠く。ＭＵＣ−Ｈは、全長、非クリップＭＵＣ１（またはＭＵＣ１の非クリップスプライスバリアント）中に隠れているエピトープを含み、ＭＵＣ１（またはＭＵＣ１のスプライスバリアント）の特異的開裂の後の、ＭＵＣ１の細胞表面結合スタンプ（ｓｔｕｍｐ）上にのみ現れ、従ってＭＵＣ１−Ｈ（ｉｄｄｅｎ（ｈｉｄｄｅｎ（隠れる）））と呼ばれる。さらに、ＭＵＣ１−Ｈは、（おそらくＭＵＣ１の別のスプライシング形態から由来する）ＭＵＣ−ｓｔｕｂｂｌｅに結合したままである、ＭＵＣ１のｓｈｅｄ形態と、ＭＵＣ−ｓｔｕｂｂｌｅそれ自身の間で形成される、そのエピトープを含み、そのような立体的エピトープは、血清ＭＵＣ１上ではなく、細胞表面結合ＭＵＣ１上にのみ存在する可能性が高い。ＭＵＣ１−Ｈ上のほとんどの隠れたエピトープは、ＭＵＣ１の細胞外領域（ＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅ）の、Ｃ−末端６５アミノ酸内に基づき、非クリップＭＵＣ１またはＭＵＣ１のスプライスバリアント上の、該ポリペプチドリガンドによっては通常検出可能ではない、本配列内の直線または立体的エピトープであり得る。そのようなエピトープは、（例えばＳＥＡ領域によってコードされた領域など）ＭＵＣ１のｓｈｅｄｆ形態との相互作用に関与するＭＵＣ−Ｓｔｕｂｂｌｅ上の領域を含みうる。そのようなエピトープは、ｓｈｅｄＭＵＣ１との相互作用によって通常覆い被さっている場合、後者の解離に際し、それらは露出されるようになる。他のＭＵＣ１−Ｈエピトープには、Ｓｔｕｂｂｌｅとの連結部でクリッピングされた後のＭＵＣ１のＮ−末端領域と、ｓｔｕｂｂｌｅそれ自身の複合体によって形成される、立体エピトープが含まれ、そのような場合、本配列は、ＭＵＣ１の細胞外領域のＣ−末端６５アミノ酸の、少なくとも一部分が含まれうる。ＭＵＣ１−Ｈエピトープは、配列番号：２にて列記したような、ＭＵＣ１−Ｓｔｕｂｂｌｅの代表的な配列を持つ、直線または立体配列によって形成されうる。好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは、抗体（本語句には、抗原結合断片が含まれる）である。他の好ましい実施形態において、ポリペプチドリガンドは、改変足場ポリペプチドまたはペプチドである。また他の好ましい実施形態では、ペプチド（例えば６〜２５アミノ酸のポリペプチド）は、環状ペプチドまたは直線ペプチドである。ポリペプチドリガンドは、（例えば、少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチドを含む）多重鎖タンパク質であり得る。多重鎖タンパク質の例は、抗体である。本明細書で記述している多くの例が、抗体リガンドに関して開示されている一方で、本発明が、本明細書で提供するポリペプチドリガンド（例えば、抗体および非抗体リガンド）を用いて実施可能であることが理解される。
【００７７】
本発明は、部分的に、ＭＵＣ１−Ｈに結合するタンパク質を同定するための方法を提供する。多くの場合、同定したタンパク質は、少なくとも部分的に特異的である。
【００７８】
ＭＵＣ１−Ｈにおいて、ＳＥＡ領域は、部分的に開裂し、完全ＭＵＣ１分子と比較して、構造的差違が許容される。
【００７９】
ＭＵＣ１−Ｈにおいて、ＳＥＡ領域は、部分的に開裂し、完全ＭＵＣ１分子と比較して、構造的差違が許容される。
【００８０】
ＭＵＣ１−Ｈエピトープは、ＭＵＣ１とは異なる。治療のために、内在化が、毒性薬剤、放射活性ラベルなどを伝達するために重要であり得る。従って、本発明のポリペプチドリガンドは、好ましくはまた、ＭＵＣ１−Ｈで内在化され、これにより、抗体に共役した薬剤、例えば、細胞毒性または標識化薬剤の細胞内伝達が可能になる。従って、本発明のポリペプチドリガンドは、生正常、良性過形成およびＭＵＣ１−Ｈエピトープを発現している癌性細胞を標的化するために使用可能である。そのような内在化は、結合ＭＵＣ１タンパク質バリアントの通常の内在化に基づいてよく、またはポリペプチドリガンド上で提供されるシグナルによって増強または産出されうる。ＭＵＣ１−Ｈに対する抗体およびペプチドは、従って、研究、診断および治療において、腫瘍を標的とするために使用可能である。
【００８１】
本方法には、ＭＵＣ１−Ｈに結合するタンパク質をコードしているメンバーを同定するために、ライブラリーを提供すること、およびライブラリーをスクリーニングすること、が含まれる。
【００８２】
スクリーニングは、多くの方法で実施可能である。例えば、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーであり得る。ライブラリーは、環状ペプチドライブラリー、例えば、そのすべてが参考文献にて本明細書に組み込まれている、米国特許第６，１９７，５２６Ｂ１で記述されたライブラリーのようなものであり得る。
【００８３】
ＭＵＣ１−Ｈは、タグ化および組換え体発現しうる。ＭＵＣ１−Ｈは、精製され、支持体、例えば常磁性ビーズまたは他の磁気的に反応する粒子に連結しうる。
【００８４】
ＭＵＣ１−Ｈはまた、細胞表面に発現されうる。ディスプレイライブラリーは、ＭＵＣ１−Ｈを発現する細胞上で選別可能である。ディスプレイライブラリーは、例えば、ＭＵＣ１−Ｈを発現している場合のみ、細胞に特異的に結合するメンバーを同定するために選別可能である。
【００８５】
Ａ．ペプチドライブラリー
ＭＵＣ１−Ｈに結合するペプチドリガンドもまた本明細書に含まれる。本明細書で使用するところの語句「ペプチドリガンド（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ）」または「結合分子（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、任意の分子、ポリペプチド、ペプチドミミックまたは形質転換細胞（「トランスフォーマント（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）」を意味し、これらは他の分子、ポリペプチド、ペプチドミミックまたはトランスフォーマントと、結合複合体の形成が可能である。「ＭＵＣ１−Ｈペプチドリガンド（ＭＵＣ１−Ｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄ）」または「ＭＵＣ１−Ｈ結合分子（ＭＵＣ１−Ｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ＭＵＣ１−Ｈと複合体を形成する結合分子である。ＭＵＣ１−Ｈペプチドリガンドの定義にまた含まれるものとしては、特定の結果のために改変された、ポリペプチドのようなものが含まれる。熟慮した改変の特例は、結合部分のクロマトグラフ支持体または他の基質への連結を目的とする、Ｃ−末端またはＮ−末端アミノ酸置換またはポリペプチド鎖延長、およびアミノ酸位置間で、以前のジスルフィド結合よりもより安定な結合の形成を目的とする、例えば反応性の側鎖を持つ天然には存在しないアミノ酸残基のような、ジスルフィド結合を通常形成するシステイン残基の対の置換が含まれる。すべてのそのような改変結合分子もまた、これらが、ＭＵＣ１−Ｈ及び／又はＭＵＣ１−Ｈ様ポリペプチドに結合する能力を保持する限り、本発明にしたがった結合分子と考えられる。
【００８６】
１．結合および放出条件の選択
本発明にしたがったポリペプチド結合分子は、結合および放出を特定的にあらかじめ選ぶ特性を示すＭＵＣ１−Ｈ結合ペプチドを、同定する方法で、ファージディスプレイ技術を用いて同定される。この方法論に従って、２つの溶解条件、すなわち、結合条件と放出条件があらかじめ選ばれる。結合条件は、発見された結合ポリペプチドが、標的ＭＵＣ１−Ｈ（またはＭＵＣ１−Ｈ様ポリペプチド）に結合することが望まれる溶解条件のセットであり、放出条件は、発見された結合ポリペプチドが、ＭＵＣ１−Ｈに結合しない（すなわちＭＵＣ１−Ｈから解離する）ことが望まれる溶解条件のセットである。２つの条件は、条件に到達する容易さ、他の精製段階との適合性、他の親和性培地と比較して、条件間で変化させるコストが低いことなど、実施者の基準を満足させるために選択されうる。好ましくは、２つの溶解条件は、標的タンパク質（ＭＵＣ１−ＨまたはＭＵＣ１−Ｈ様ポリペプチド）の安定性または活性に悪影響を与えることなく、少なくとも１つの溶液パラメータに関して明らかに異なるように選択される。例えば、本明細書で記述した好適な結合ペプチドに関するスクリーニングを実施する場合、結合剤は、エチレングリコール含有緩衝液の存在下で、または低ｐＨ（すなわちｐＨ  ２）の条件下で、またはこれらの条件の組み合わせで、標的より解離するように選択され、これは結合に関して必要な条件とは異なる。有利に変えることが可能な他のパラメータは、結合および溶出緩衝液中の塩、例えばＮａＣｌの濃度である。
【００８７】
２．親結合領域（Ｐａｒｅｎｔａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ）の選択
ＭＵＣ１−Ｈの望む結合および放出に関する、特定の溶解条件を選択することとともに、親結合領域が、望む結合および放出の力を表す、設計された結合分子のための、構造鋳型として利用するために選択される。結合領域は、天然に存在するタンパク質または合成タンパク質、またはタンパク質の領域または領域であってよい。親結合領域は、親結合領域およびＭＵＣ１−Ｈ間の公知の相互作用の理解に基づいて選択されうるが、これは重要ではない。事実、親結合領域は、ＭＵＣ１−Ｈａｔすべてに関して親和性を持つことは最も重要ではなく、その目的は、多数の類似体（「ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）」）を生成可能であり、多数の類似体が、望む結合および放出特性（および選択した任意の他の特性）を示す、１つまたはそれ以上の類似体を含む、構造を提供することである。以上で議論した、結合条件および放出条件は、親結合領域として役立つ実際のポリペプチドの知識、または親結合領域が属するタンパク質または領域のクラスの知識、または完全に独立して、親結合領域の選択の知識にて、選択可能である。同様に、結合及び／又は放出条件は、結合領域およびＭＵＣ１−Ｈ間の公知の相互作用に関して、例えば、１つまたは両方の溶解条件下での相互作用を支持するために選択可能であり、または、そのような公知の相互作用には関せずに、選択可能である。同様に、親結合領域は、結合領域類似体が、結合または放出条件下で不安定である場合、有用な結合分子を得ることができない可能性があることを認識しなければならないが、結合及び／又は放出条件を考慮に入れながら、選択可能である。
【００８８】
親結合領域の性質は、ＭＵＣ１−Ｈ分子に対して試験される誘導ペプチド（類似体）の特性に非常に影響を与える。親結合領域を選択する際、どのように類似体領域が、ＭＵＣ１−Ｈに、提示されるか、すなわち、どの立体配座ＭＵＣ１−Ｈおよび類似体が接触するのか、を考慮することが最も重要である。好ましい実施形態において、例えば、類似体は、両方とも、そのすべてが参考文献にて本明細書に組み込まれている、Ｋａｙら，Ｐｈａｒｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）および米国特許第５，２２３，４０９号（Ｌａｄｎｅｒら）にて記述されたような技術を用いて、類似体をコードしている合成ＤＮＡを、複製可能遺伝的パッケージ内へ挿入することによって合成され、結果として、Ｍ１３ファージのような微生物の表面上に領域をディスプレイする。
【００８９】
ファージディスプレイライブラリーの形成に関して、結合領域鋳型として、体系化されていない、つまり直線ペプチドとは対照的に構造化したポリペプチドを使用することが好ましい。タンパク質内の表面残基の変異は、通常タンパク質の全構造または（大きさ、安定性および変性温度のような）一般的特性にほとんど効果がなく、一方で、同時に、表面残基の変異は、タンパク質の結合特性に深く影響を与える。より強くペプチド区画を拘束するほど、ある特定の標的により結合しなくなる。しかしながら、結合した場合、この結合は、よりきつく、より特異的である可能性がある。従って、親結合領域を選択すること、言い換えれば、ある程度の厳密性を持つフレームワーク内で拘束された、ポリペプチド類似体に関する構造を選択することが好ましい。
【００９０】
好ましくは、領域誘導体のライブラリーを生成するための、鋳型または親領域として使用されるタンパク質領域は、小タンパク質またはポリペプチドであり得る。小タンパク質またはポリペプチドは、大きなタンパク質に対して、いくつかの利点を提示する。第一に、結合部位あたりの質量が減少する。低分子量を持つ、非常に安定なタンパク質領域、例えばＫｕｎｉｔｚ領域（〜７ｋＤａ）、Ｋａｚａｌ領域（〜７ｋＤａ）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａトリプシン阻害剤（ＣＭＴＩ）領域（〜３．５ｋＤａ）、およびエンドセリン（〜２ｋＤａ）は、抗体（１５０ｋＤａ）または単一鎖抗体（３０ｋＤａ）よりも、グラムあたり、非常に高い結合を示しうる。第二に、表面有用性が低いので、非特異的結合の可能性が減少する。第三に、小タンパク質またはポリペプチドは、より大きなタンパク質または固体に関して実施不可能である方法で、固有の拘束部位を持つように、遺伝工学的に改変可能である。例えば、小タンパク質は、（例えばクロマトグラフィーマトリックスに対して）拘束するために好適な部位のみで、リシンのみを持つように改変可能であるが、これは、抗体に関しては実現可能ではない。第四に、拘束されたポリペプチド構造は、１つのフレームワークから他へ、原型のまま、構造領域とともに移動させる場合に、その機能性を保持することがあり得る。例えば、結合領域構造は、（例えば、ファージ上に提示した）ライブラリー内での提示のために使用したフレームワークから、提示フレームワークから削除された、またはクロマトグラフィー基質上で固定された単離タンパク質に変換可能であり得る。
【００９１】
本発明にしたがったポリペプチドの固定化は、例えば、クロマトグラフマトリックス上で、トランスフォーマント宿主細胞から分泌されたＭＵＣ１−Ｈを含む、全血または条件付き培地のような、溶液に対して、十分なＭＵＣ１−Ｈ分離培地を形成するのに、熟慮される。適切な結合領域鋳型を選択することによって、単一遊離（通常ジスルフィド結合を形成する、他のシステインとは対になっていない）システインを持つ結合ポリペプチドが単離可能である。そのようなチオール機能ポリペプチドは、ヨードアセタミド、ヨード酢酸、または同様なα−ヨードカルボン酸基とのチオエーテルによって、基質への非常に安定な固定化のために使用可能である。
【００９２】
同様に、ポリペプチド領域のＣ−末端カルボキシル基は、アルデヒド機能基質または他のアミン反応基質との反応のために、ヒドラジン（−−ＮＨ−−ＮＨ２）に変換しうる。本技術は好ましい。
【００９３】
親結合領域としての使用のために好適であり、以下の有用な情報が入手可能である、多くの小、安定タンパク質領域が存在する。（１）アミノ酸配列、（２）いくつかの相同性領域の配列、（３）３次元構造、及び／又は（４）ｐＨ、温度、塩度、有機溶媒、酸化剤に対する安定性データ。いくつかの例としては、Ｋｕｎｉｔｚ領域（５８アミノ酸、３ジスルフィド結合）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ  トリプシン阻害剤領域（３１アミノ酸、３ジスルフィド結合）、グアニリン（ｇｕａｎｙｌｉｎ）関連領域（１４アミノ酸、２ジスルフィド結合）、グラム陰性細菌からの熱安定性エンテロトキシン（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）ＩＡ関連領域（１８アミノ酸、３ジスルフィド結合）、ＥＧＦ領域（５０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）領域（６０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、真菌炭化水素結合領域（３５アミノ酸、２ジスルフィド結合）、エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）領域（１８アミノ酸、２ジスルフィド結合）、およびストレプトコッカル（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｇ  ＩｇＧ−結合領域（３５アミノ酸、ジスルフィド結合無し）があげられる。これらの、すべてではないが、ほとんどが、構造を維持し、安定化させるジスルフィド結合を含む。親結合領域はまた、公知のタンパク質の相同的であるかまたはない、微小タンパク質の単一ループ（１ジスルフィド）に基づいている。例えば、７〜９アミノ酸の拘束ループを、ＭＵＣ１−ＨおよびＭＵＣ１−Ｈ様ポリペプチド結合分子を単離するための、ライブラリーを形成するために使用した。これらの領域に基づくライブラリー、好ましくは、ファージ上に提示されたライブラリーは、簡単に構築可能であり、本発明にしたがった結合分子の選択のために使用可能である。
【００９４】
３．親結合領域類似体のライブラリーの提供
一旦親結合領域が選択されたならば、潜在的結合分子のライブラリーを、標的、この場合、ＭＵＣ１−Ｈ及び／又はＭＵＣ１−Ｈ様タンパク質に対して、望む結合条件および（任意に）望む溶出（放出）条件下で、スクリーニングするために作製する。ライブラリーは、類似体のシリーズを作ることで作製され、各類似体は、領域のアミノ酸配列において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を持つこと以外は、親結合領域に相当する。アミノ酸置換は、少なくともほとんどの置換に関して、その構造を明らかに変えることなしに、領域の結合特性を変えることが予想される。変異のために選択されるアミノ酸位置（可変アミノ酸位置）は、表面アミノ酸位置、すなわち、領域が、そのもっとも安定な立体配座を取る場合に、領域の外表面（すなわち溶液に露出される表面）上にあらわれる、領域のアミノ酸配列中の位置であることが好ましい。もっとも好ましくは、変異されるアミノ酸位置は、置換の効果を最大化するために、隣接するか、または互いに近くにある。さらに、余計なアミノ酸を、親結合領域の構造内に加えることが可能である。好ましい実施形態において、本質的に、かなりの重大な情報が、ＭＵＣ１−Ｈの他の分子、とりわけ親結合領域との相互作用を考慮して入手可能である場合、結合相互作用に対して必須であるアミノ酸の位置は、類似体ライブラリーを構築する工程で決定および保存されうる（すなわち、結合のために必須のアミノ酸は変異しない）。
【００９５】
類似体ライブラリーを作製する目的は、ＭＵＣ１−Ｈ分子との反応に関する、非常に大きな数の潜在的結合分子を提供することであり、一般的に、ライブラリー中、類似体の数が大きければ大きいほど、先に選択された、または放出に関して望ましい条件下で、ＭＵＣ１−Ｈに結合するおよび放出する、少なくとも１つのライブラリーのメンバーが存在する確率が大きくなる。単一のライブラリーが、すべての設計した類似体を含み得、含まれる配列が、公知であり、ほぼ同一の数で存在するので、特定の鋳型構造にしたがい、特定の位置でのアミノ酸の変化が制限される設計したライブラリーが非常に好ましい。それに反して、アミノ酸配列中のただ６つの位置でのランダム置換は、６０００万類似体を提供し、これは、ファージディスプレイのように強力なスクリーニング技術を使用する場合でさえ、実際の限界を提示し始めるライブラリーサイズである。これよりも大きなライブラリーは、取り扱いに問題をもたらし、例えば、発酵容器は異常な大きさの物が必要であり、さらに重要なのは、調製したライブラリーに提示される、すべての計画したポリペプチド配列の変異が急に減少する傾向にある。従って、変異のために設計されたアミノ酸位置が、類似体の結合特性における置換の効果を最大化するように考慮され、置換において使用するように許容された、または計画されたアミノ酸残基は、例えば、ライブラリーが結合に関して選別されうる溶解条件下で、類似体が結合するようになる可能性のあるということに基づいて、制限される、設計した、またはバイアスのかかったライブラリーを作製することが好ましい。
【００９６】
先に示唆したように、Ｋａｙら，上記、およびＬａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号にて議論された技術は、選択した親結合領域に相当する類似体のライブラリーを調製することにおいて、とりわけ有用であり、その類似体は、標的ＭＵＣ１−Ｈ分子に関して、膨大な数の類似体の大規模スクリーニングに好適な形態で、存在し得る。複製可能な遺伝的パッケージ、およびもっとも好ましいバクテリオファージの使用は、新規で、外因性ＤＮＡ区画を、非ネイティブＤＮＡによってコードされたポリペプチドが、ファージの表面上に現れるように、バクテリオファージのゲノム（または他の増幅可能な遺伝的パッケージ）に導入することを含む、新規のポリペプチド結合物を作製する強力な方法である。挿入したＤＮＡが、配列多様性を含む場合、それぞれの受容ファージが、ＤＮＡによってコードされた鋳型（親）アミノ酸配列の１つのバリアントを提示し、ファージ集団（ライブラリー）は、非常に大きな、異なるが、関連するアミノ酸配列を提示する。
【００９７】
本発明にしたがったＭＵＣ１−Ｈ結合物を得るための、スクリーニング手順において、ファージライブラリーを、通常固体支持体上に固定した、標的ＭＵＣ１−Ｈ分子と接触させ、結合を可能にする。非結合物を結合物より分離する。種々の方法にて、結合したファージをＭＵＣ１−Ｈから解離させ、回収し、増幅する。ファージを、細菌細胞の感染を通して増幅可能であるので、小数の結合ファージでも、結合実在物をコードしている遺伝子配列を明らかにするのに十分である。これらの技術を用いて、集団中２０００万中約１つの結合ファージを回収することが可能である。１０００万〜２０００万またはそれ以上の潜在的結合ポリペプチドをそれぞれ提示している１つまたはそれ以上のライブラリーを、高い親和性のＭＵＣ１−Ｈ結合物を見つけるために、迅速に選別可能である。選別工程を実施しているときに、集団の多様性は、ただ良い結合物が残るまで、すなわち工程が収束するまで各ラウンドで減少する。典型的には、ファージディスプレイライブラリーは、いくつかの非常に関連した結合物（１０００万あたり１０〜５０結合物）を含みうる。収束の指標には、非常に関連した配列の、（ファージ力価によって測定される）増加した結合および回収が含まれる。結合ペプチドの第一組を同定した後、配列情報を使用して、さらなる望む特性を持つ、例えば、特定のフェードストリーム(ｆｅｅｄ  ｓｔｒｅａｍ）において、ＭＵＣ１−Ｈと特定の断片または非常に関連する不純物間の識別をもつ、メンバーに対してバイアスのかかった他のライブラリーを設計可能である。
【００９８】
そのような技術は、膨大な数の潜在的結合分子を選別することを可能にするだけでなく、結合／溶出サイクルを繰り返すこと、および初期の基準を満たす類似体提示パッケージを選別するために、二次的な、バイアスのかかったライブラリーを構築すること、を現実的にする。これらの技術を用いて、類似体のバイアスのかかったライブラリーを、スクリーニング条件下で、強く（すなわち高い親和性で）結合するメンバーを明らかにするために、スクリーニングしうる。
【００９９】
４．ペプチド類似体の合成
以上で概略した手順につづいて、ＭＵＣ１−Ｈ及び／又はＭＵＣ１−Ｈ様ポリペプチドに対するさらなる結合分子を、本明細書で記述したファージディスプレイライブラリーまたは他のファージディスプレイライブラリー、または、潜在的結合分子の集団（例えば、有機化合物、ランダムペプチドライブラリーなどの組み合わせライブラリー）から単離しうる。一旦単離されたなら、任意の個々の結合ペプチドの配列、または任意の結合分子の構造を、解析可能であり、結合物を、公知の方法を用いて、任意の望む量で産出可能である。例えば、その配列がわかっているので、本明細書で記述したポリペプチド結合分子は、化学合成と、それに続くネイティブな立体配座、すなわち正確なジスルフィド結合連結を得るのに適切な酸化条件下での処理によって有利に産出可能しうる。合成は、当業者によく公知の方法論によって実施しうる（Ｋｅｌｌｅｙら，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．，（１９９０）ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１−１９；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （１９８９），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏを参照のこと）。本発明の結合分子は、化学合成によって、または半合成によってのいずれかで作成可能である。化学合成または半合成方法により、天然には存在しないアミノ酸残基を挿入する可能性が許容される。
【０１００】
本発明のポリペプチド結合分子は、好ましくは固相ペプチド合成を用いて調製される（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２）。固相合成は、保護アミノ酸を、好適な樹脂に結合させることによって、予想されるポリペプチドのカルボキシ末端にて始まり、その樹脂とは、後に簡単に開裂する結合を形成するために、Ｃ−末端アミノ酸のカルボキシ基と反応する、例えば、クロロメチル樹脂およびブロモメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ベンズアルデヒド樹脂、またはｔ−アルキルオキシカルボニル−ヒドラジン樹脂のような、ハロメチル樹脂である。α−アミノ保護基を、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばＴＥＡ中で中和した後、合成の次のサイクルに進める準備が出来る。ついで残っているα−アミノ、もし必要なら、側鎖保護アミノ酸を、連続的に、望む順番で、縮合によって連結し、樹脂に連結した中間体化合物を得る。あるいは、いくつかのアミノ酸を、お互いに結合させて、増大固相ポリペプチド鎖へのオリゴペプチドの添加の前にオリゴペプチドを形成させうる。
【０１０１】
２つのアミノ酸、またはアミノ酸とペプチド、またはペプチドとペプチド間の縮合は、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロリン酸］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法）およびウッドワード薬剤Ｋ法のような、通常の縮合法に従って実施可能である。
【０１０２】
ペプチドの化学合成で共通なのは、鎖が完全に組み合わされた後に、最終的に除去されるまでの、種々のアミノ酸部位の反応性側鎖の、好適な保護基での保護である。また、物質がカルボキシル基で反応し、ついで、α−アミノ−保護基を選択的に除去することによってその局所で続く反応が起こる一方での、アミノ酸または断片上のα−アミノ基の保護が一般的である。従って、合成の一段階として、中間体化合物が産出され、つまり側鎖保護基を持つ種々の残基とともに、ポリペプチド鎖中の望む配列中に局在する各アミノ酸残基を含むのが一般的である。ついで、続く精製の望ましい得られた産物を産出するように、これらの保護基を、一般的には同時に除去する。
【０１０３】
α−およびε−アミノ側鎖基を保護するための典型的な保護基の例としては、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ２）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル、アダマチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、ジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）などがあげられる。
【０１０４】
カルボキシ基に関する保護基の例としては、例えば、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（Ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）などがあげられる。アミノ基およびカルボキシル基以外の官能基を持っているアルギニン、システインおよびセリンのような特定のアミノ酸は、特定の要求として、好適な保護基によって保護されることが望ましい。例えば、アルギニン中のグアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）などで保護される。システイン中のチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチル−ベンジル（Ｔｍｂ）などで保護され得、セリン中のヒドロキシル基は、ベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニルなどで保護されうる。
【０１０５】
望むアミノ酸配列が完了した後、中間体ポリペプチドを、樹脂からポリペプチドを開裂させるだけでなく、すべての残っている側鎖保護基をも開裂させる、液体ＨＦおよび１つまたはそれ以上のチオ含有スカベンジャーのような薬剤による処理によって、樹脂支持体から除去する。ＨＦ開裂に続いて、タンパク質配列をエーテルで洗浄し、大容量の希釈酢酸に移し、ｐＨを、水酸化アンモニウムによって約８．０に調整して、撹拌する。ｐＨ調整に際し、ポリペプチドは、その望む立体配座をとる。
【０１０６】
本発明にしたがったポリペプチドはまた、サービスとして、ポリペプチド合成を提供している会社によって、商業的に調製されうる（例えばＢＡＣＨＥＭ  バイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，Ｐａ、クオリティ  コントロールド  バイオケミカルズ社（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，）Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）。
【０１０７】
Ｂ．ディスプレイライブラリー
ディスプレイライブラリーを、ＭＵＣ１−Ｈに結合するタンパク質を同定するために使用する。ディスプレイライブラリーは、構成要素の集合であり、各構成要素には、ペプチド成分をコードまたは同定する、利用可能ポリペプチド成分および復元可能成分が含まれる。ポリペプチド成分は、任意の長さの、例えば、３つのアミノ酸〜３００以上のアミノ酸であり得る。選択において、ライブラリーに各メンバーのポリペプチド成分を、ＭＵＣ１−Ｈにてプローブし、もしポリペプチ成分が、ＭＵＣ１−Ｈに結合する場合、ディスプレイライブラリーメンバーを、典型的には、支持体上での保持によって同定する。
【０１０８】
保持されたディスプレイライブラリーメンバーを、支持体より回収し、解析する。解析には、増幅、および同一または異質の条件下での連続選択が含まれうる。例えば、ポジティブおよびネガティブ選択を交互に実施可能である。解析にはまた、ポリペプチド成分のアミノ酸配列の決定、および詳細な特徴に対する、ポリペプチド成分の精製も含まれうる。
【０１０９】
様々なフォーマットは、ディスプレイライブラリーに関して使用可能である。例には、以下が含まれる。
【０１１０】
１．ファージディスプレイ
１つのフォーマットは、ウイルス、とりわけバクテリオファージを使用する。このフォーマットは、「ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）」と呼ばれる。ペプチド成分は、典型的には、バクテリオファージコートタンパク質に共有結合する。結合は、コートタンパク質に融合するペプチド成分をコードしている核酸を翻訳することで結果として結合となる。結合には、柔軟性のあるペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンの抑制の結果として組み込まれたアミノ酸が含まれうる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｎｅｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７、国際特許第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９１／１７２７１号、第ＷＯ９２／２０７９１号、第ＷＯ９２／１５６７９号、第ＷＯ９３／０１２８８号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／０９６９０号、第ＷＯ９０／０２８０９号、ｄｅ  Ｈａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２１８−３０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８、Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２、Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８、Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０、Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７、Ｒｅｂａｒら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９−４９、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７、およびＢａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２にて記述されている。
【０１１１】
ファージディスプレイシステムは、線状ファージ（ファージｆ１、ｆｄおよびＭ１３）ならびに他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびラムドイドファージ、例えばＳａｎｔｉｎｉ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：１２５−１３５、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９６）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ６：１−６、Ｈｏｕｓｈｍｅｔら，（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３６３−３７０を参照のこと）に関して開発されてきた。線状ファージディスプレイシステムは、典型的には、マイナーなコートタンパク質、遺伝子ＩＩＩタンパク質、および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のような、メジャーなコートタンパク質への融合を用いるが、遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質のような他のコートタンパク質、またはそれらの領域もまた使用されうる（例えば国際特許第ＷＯ００／７１６９４号を参照のこと）。好ましい実施形態において、融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質の領域、例えばアンカー領域または「ｓｔｕｍｐ）」へのものである（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカー領域の記述に関して、米国特許第５，６５８，７２７号を参照のこと）。
【０１１２】
ペプチド成分の価数もまた制御可能である。ペプチド成分をコードしている配列の、完全なファージゲノム内へのクローニングにより、遺伝子ＩＩＩタンパク質のすべての複製物が、ペプチド成分に融合するので、その結果多価ディスプレイとなる。価数の減少のために、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）システムが使用可能である。このシステムにおいて、遺伝子ＩＩＩに融合したペプチド成分をコードしている核酸は、典型的には、７００ヌクレオチド以下の長さのプラスミド上に存在する。プラスミドには、プラスミドを含むバクテリア細胞が、ヘルパーファージ、例えばＭ１３Ｋ０１に感染した場合に、プラスミドがバクテリオファージ内に挿入されるように、複製のファージ複製基点が含まれる。ヘルパーファージは、遺伝子ＩＩＩおよび、ファージの複製およびアセンブルに必要な他のファージ遺伝子のそのままのコピーを提供する。ヘルパーファージは、ヘルパーファージゲノムが、野生型複製基点を持つプラスミドと相対して、ファージプラスミド内に効果的に組み込まれないように、不完全複製基点を持つ。
【０１１３】
ペプチド成分を提示しているバクテリオファージは、標準のファージ準備法、例えば増殖培地からのＰＥＧ沈殿を用いて、増殖および回収可能である。
【０１１４】
個々のディスプレイファージの選別の後、選択されたペプチド成分をコードしている核酸を、選択したファージを用いて細胞を感染させる。個々のコロニーおよびプラークをピックアップし、核酸を単離配列可能である。
【０１１５】
２．細胞に基づくディスプレイ
また他のフォーマットにおいて、ライブラリーは、細胞−ディスプレイライブラリーである。タンパク質は、細胞、例えば真核または原核細胞の表面上に提示される。原核細胞の例には、大腸菌細胞、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞、胞子が含まれる（例えば、Ｌｕら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３６６を参照のこと）。真核生物の例には、酵母（例えば、サッカロマイセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、チゾサッカロマイセス  ポンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ハンセウラ（Ｈａｎｓｅｕｌａ）またはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））が含まれる。酵母表面ディスプレイは、例えばＢｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：５５３−５５７および２００１年１０月１日に出願された、表題「多重鎖真核生物ディスプレイベクターおよびその使用（Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ．」）の米国仮出願特許明細書番号第６０／３２６，３２０号にて記述されている。この明細書は、Ｆａｂ断片のような、免疫グロブリンタンパク質を提示するために使用可能な、酵母ディスプレイシステムを記述しており、また重鎖と軽鎖の組み合わせを産出するためのマッチングの使用を記述している。
【０１１６】
１つの実施形態において、多彩な核酸配列を、酵母ディスプレイのためベクター内にクローン化する。クローニングは、多彩な配列を、領域（または完全な）酵母細胞表面タンパク質、例えばＡｇａ２、Ａｇａ１、Ｆｌｏ１、またはＧａｓ１に結合させる。これらのタンパク質の領域は、膜貫通領域（例えばＦｌｏ１）によって、またはリン脂質二重膜（例えばＧａｓ１）への共有結合によって、多彩な核酸配列によってコードされたポリペプチドをつなぎうる。ベクターは、１つの鎖が酵母表面タンパク質に連結するように、２つのポリペプチド鎖を細胞表面上で発現するように設定しうる。例えば、２つの鎖は、免疫グロブリン鎖であり得る。
【０１１７】
３．リボソームディスプレイ
ＲＮＡおよびＲＮＡによってコードされているポリペプチドを、ＲＮＡを翻訳しているリボソームを安定化させることによって物理的に結合させ、初期のポリペプチドをそのまま接着させておくことが可能である。典型的に、高二価Ｍｇ２＋濃度および低温が使用される。例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２およびＨａｎｅｓら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：１２８７−９２、Ｈａｎｅｓら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４−３０およびＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１９−３５を参照のこと。
【０１１８】
４．ペプチド−核酸融合
他のフォーマットは、ペプチド−核酸融合を使用する。ポリペプチド−核酸融合は、例えばＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２および米国特許第６，２０７，４４６号にて記述されたように、共有結合にて付随したプロマイシン基を含む、ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によって産出可能である。ついでｍＲＮＡを、ＤＮＡに逆転写し、ポリペプチドに架橋する。
【０１１９】
５．他のディスプレイフォーマット
また他のディスプレイフォーマットは、ポリペプチド成分が、ポリペプチドを同定する非核酸タグに結合する、非生物学的ディスプレイである。例えば、タグは、ポリペプチドまたは放射高周波タグを提示しているビーズに結合した化学的タグであり得る（例えば米国特許第５，８７４，２１４号を参照のこと）。
【０１２０】
６．足場
ディスプレイの足場には、抗体（例えば、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、単一領域抗体、ラクダ抗体、およびラクダ化抗体）、Ｔ−細胞受容体、ＭＨＣタンパク質、細胞外領域（例えばフィブロネクチンＩＩＩ型繰り返し、ＥＧＦ繰り返し）、プロテアーゼ阻害剤（例えばＫｕｎｉｔｚ領域、エコチン、ＢＰＴＩ、その他）、ＴＰＲ繰り返し、トリホイル構造、亜鉛フィンガー領域、ＤＮＡ結合タンパク質、特定一量体ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、酵素、例えばプロテアーゼ（特に不活性化プロテアーゼ）、ＲＮａｓｅ、チャペロン、例えばチオレドキシン、およびヒートショックタンパク質、および細胞内シグナル領域（ＳＨ２およびＳＨ３領域など）が含まれうる。
【０１２１】
足場領域を評価するための適切な基準には、（１）アミノ酸配列、（２）いくつかの相同領域の配列、（３）三次元構造、及び／又は（４）ｐＨ、温度、塩度、有機溶媒、酸化物濃度の範囲における安定性データ、が含まれる。１つの実施形態において、足場領域は、小さな、安定タンパク質領域、例えば、１００、７０、５０、４０、または３０アミノ酸以下のタンパク質である。領域には、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が含まれ得、または金属、例えば亜鉛をキレートしうる。
【０１２２】
小足場領域の例には、Ｋｕｎｉｔｚ領域（５８アミノ酸、３ジスルフィド結合）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍａｘｉｍａ  トリプシン阻害剤領域（３１アミノ酸、３スルフィド結合）、グアニリン関連領域（１４アミノ酸、２ジスルフィド結合）、グラム陰性細菌からの熱安定性エンテロトキシンＩＡ関連領域（１８アミノ酸、３ジスルフィド結合）、ＥＧＦ領域（５０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、クリングル領域（６０アミノ酸、３ジスルフィド結合）、真菌炭化水素結合領域（３５アミノ酸、２ジスルフィド結合）、エンドセリン領域（１８アミノ酸、２ジスルフィド結合）、およびストレプトコッカル（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）Ｇ  ＩｇＧ−結合領域（３５アミノ酸、ジスルフィド結合無し）が含まれる。
【０１２３】
小細胞内足場領域の例には、ＳＨ２、ＳＨ３およびＥＶＨ領域が含まれる。一般的に、任意のモジュラー領域、細胞内および細胞外領域を使用可能である。
【０１２４】
足場領域の他の有用な型は、免疫グロブリン（Ｉｇ）領域である。ディスプレイに関する免疫グロブリン領域の使用方法を、以下に記述している（例えば、「抗体ディスプレイライブラリー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」を参照のこと）。
【０１２５】
ディスプレイ技術はまた、リガンド、例えば抗体リガンド、とりわけ標的のエピトープを得るために使用可能である。これは、例えば、特定のエピトープを欠き、エピトープ内で、例えばアラニンで変異された、非標的分子と競合することを用いて実施可能である。そのような非標的分子を、以下で記述するようにネガティブ選択手順にて使用可能である。これは標的へディスプレイライブラリーが結合したときの競合分子として、または例えば標的に特異的でない、ディスプレイライブラリーメンバーを解離する洗浄溶液中に捕獲するための先溶出薬剤として用いられる。
【０１２６】
７．反復選択
１つの好ましい実施形態において、ディスプレイライブラリー技術は、反復モードで使用される。第一ディスプレイライブラリーを、標的に関して、１つまたはそれ以上のリガンドを同定するために使用する。これらの同定されたリガンドを、ついで、第二ディスプレイライブラリーを形成するために変異誘発法（ｍｕｌａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて変化させる。ついでより高い親和性リガンドを、第二ライブラリーから、例えば、より高い厳密度、またはより競合的結合および洗浄条件を用いることによって、選択する。
【０１２７】
いくつかの遂行にて、突然変異誘発は、結合表面にて存在することが公知であるか、あり得る領域を標的化する。例えば同定したリガンドが抗体の場合、突然変異誘発を、本明細書で記述したような、重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に指向することが可能である。さらに、突然変異誘発を、ＣＤＲの近くまたは隣接するフレームワーク領域に指向させることが可能である。抗体の場合、突然変異誘発はまた、例えば、正確な段階的改善をするために、１つまたは数個のＣＤＲに制限することも可能である。同様に、同定したリガンドが酵素の場合、突然変異誘発を、活性部位および周辺に指向させることができる。
【０１２８】
いくつかの突然変異誘発技術の例には、エラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５）、組換え、ランダム開裂を用いるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９−３９１、「核酸シャッフリング（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」、ＲＡＣＨＩＴＴＴＭ（Ｃｏｃｏら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位特異的突然変異誘発（Ｚｏｏｌｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５０４）、カセット式（ｃａｓｓｅｔｔｅ）突然変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および変性オリゴヌクレオチドの挿入（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３２４５）が含まれる。
【０１２９】
反復選択の１つの例において、本明細書で記述した方法は、第一に、少なくとも標的に対して最小の結合特異性または最小活性、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭより大きな、結合に関する平衡解離定数をもって、ＭＵＣ１−Ｈに結合するディスプレイライブラリーからポリペプチドリガンドを同定するために使用される。最初の同定されたポリペプチドリガンドをコードしている核酸配列を、変異の導入に関する、鋳型核酸として使用し、よりいっそう特性を増した（例えば結合親和性、速度論または安定性）第二ポリペプチドリガンドを同定するため使用される。
【０１３０】
８．オフ−レート（Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ）選択
遅い解離速度が、とりわけ、ポリペプチドとその標的間の相互作用に関して、高い親和性の予想であり、本明細書で記述した方法は、標的への結合相互作用に関して、望む速度論解離速度（すなわち減少した速度）を持つリガンドを単離するために使用可能である。
【０１３１】
ディスプレイライブラリーから、遅い解離リガンドに関して選択するために、ライブラリーを、固定化標的に接触させる。ついで固定化標的を、非特異的または弱い結合生物分子を除去する、第一溶液で洗浄する。ついで固定化標的を、遊離標的の飽和量、すなわち粒子に接着しない標的の複製を含む、第二溶液で溶出する。遊離標的は、標的から解離する生物分子に結合する。再結合は、固定化標的の非常に低い濃度と比べて、遊離標的飽和量によって、効果的に防止される。
【０１３２】
第二溶液は、本質的に生理的であるか、または厳重である、溶解条件を持ちうる。典型的には、第二溶液の溶解条件は、第一溶液の溶解条件と同一である。第二溶液の画分を、時間的に適切に回収し、遅延画分から、早期に区別する。より遅い画分には、早期画分中の生物分子よりも、標的からより遅い速度で、解離した生物分子が含まれる。
【０１３３】
さらに、インキュベーションを延長した後でさえ、標的に結合したままの、ディスプレイライブラリーメンバーを回収することが可能である。これらは、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）条件を用いて解離するか、または標的に結合している間に増幅するか、いずれかが可能である。例えば、標的に結合したファージを、バクテリア細胞に接触可能である。
【０１３４】
９．特異性の選択またはスクリーニング
本明細書で記述したディスプレイライブラリースクリーニング法には、非標的分子に結合するディスプレイライブラリーメンバーを廃棄する選択またはスクリーニング工程が含まれうる。非標的分子の例には、（ｉ）全長ＭＵＣ１タンパク質、（ｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘタンパク質、（ｉｉｉ）ＭＵＣ１／Ｘ／ａｌｔタンパク質、（ｉｖ）ＭＵＣ１／Ｙタンパク質、（ｖ）ＭＵＣ１／Ｙ／ａｌｔタンパク質、（ｖｉ）ＭＵＣ１／Ｖタンパク質、（ｖｉｉ）ＭＵＣ１／Ｖ／ａｌｔタンパク質、（ｖｉｉｉ）ＭＵＣ１／Ｗタンパク質、（ｉｘ）ＭＵＣ１／Ｗ／ａｌｔタンパク質、（ｘ）ＭＵＣ１／Ｚタンパク質、または（ｘｉ）ＭＵＣ１／Ｚ／ａｌｔタンパク質が含まれる。
【０１３５】
１つの実施において、「ネガティブ選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる段階を、標的と関連した非標的分子間、および関連するが、相異なる非標的分子間の区別するために使用する。ディスプレイライブラリーまたはそのプールを、非標的分子に接触させる。非標的に結合しない試料のメンバーを回収し、これを次の、標的分子に対する結合に関して、または次のネガティブ選択に関しての、選択で使用する。ネガティブ選択段階は、標的分子に結合するライブラリーメンバーを選択する前、または後であり得る。
【０１３６】
他の実施において、スクリーニング段階を使用する。ディスプレイライブラリーメンバーを、標的分子への結合に関して単離し、それぞれの単離したライブラリーメンバーを、非標的分子（例えば、以上で列記した非標的）への結合のその能力に関して試験する。例えば、ハイスループット（ｈｉｇｎ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）ＥＬＩＳＡスクリーンを使用して、このデータを得ることが可能である。ＥＬＩＳＡスクリーンはまた、標的に対する各ライブラリーメンバーの結合に関して、定量的データを得るために使用可能である。非標的および標的結合データを、（例えばコンピュータおよびソフトウェアを使用して）比較して、標的ＭＨＣ−ペプチド複合体へ特異的に結合するライブラリーメンバーを同定する。
【０１３７】
Ｃ．多様性
ディスプレイライブラリーには、提示されたポリペプチド中の１つまたはそれ以上の位置における変異が含まれる。該位置での変異は、合成または天然であり得る。いくつかのライブラリーに関し、合成および天然両方の多様性が含まれる。
【０１３８】
１．合成多様性
ライブラリーは、人工的に合成した配列から由来する、多様な核酸配列の領域を含む。典型的には、それぞれの該位置で、ヌクレオチドの分布を含む、変性したオリゴヌクレオチド集団から形成される。該配列の含有物は、分布に関してランダムである。合成多様性の変性源の１つの例は、ＮＮＮを含むオリゴヌクレオチドであって、Ｎは、等しい比で、任意の４つのヌクレオチドである。
【０１３９】
合成多様性はまた、例えば、該トリヌクレオチドにおける核酸配列中のコドンの数を、ＮＮＮよりも小さい分布に制限するために、より制約することも可能である。例えば、そのような分布は、コドンのいくつかの位置で、４つよりも少ないヌクレオチドを用いて、制約可能である。さらに、トリヌクレオチド追加技術を用いて、さらに分布を制約できる。
【０１４０】
「トリヌクレオチド追加技術（ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」と呼ばれるものが、例えば、Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３、米国特許第４，７６０，０２５号および第５，８６９，６４４号で記述されている。オリゴヌクレオチドは、一度に１コドン（すなわちトリヌクレオチド）を固相支持体上で合成する。支持体には、多くのオリゴヌクレオチドが平衡して合成されるように、合成に関して、多くの官能基を含む。支持体を、まず、第一部位に関して、コドンの組の混合物を含む溶液に曝露する。ユニットを、さらにユニットが加わらないように保護する。第一の混合物を含む溶液を洗浄して除去し、固相を、第二部位に関してコドンの組を含む第二混合物を、結合した第一ユニットに加えられるように、脱保護する。その工程を、繰り返して、連続して、多重のコドンを組み立てる。トリヌクレオチド追加技術により、該位置で、多くのアミノ酸をコード可能な核酸の合成が可能になる。これらのアミノ酸の頻度は、混合液中のコドンの割合によって制御可能である。さらに、該位置でのアミノ酸の選択は、単一のヌクレオチドの混合物を、合成中に添加する場合のように、コドン表の象限には制限されない。
【０１４１】
２．天然多様性
ライブラリーは、相違する天然に存在する配列に由来する（または異なる天然に存在する配列に基づいて合成される）多様な核酸配列の領域を含みうる。ディスプレイライブラリーに含まれうる天然多様性の例は、免疫細胞に存在する配列多様性である（以下も参照のこと）。核酸は、これらの免疫細胞より調製され、ポリペプチドディスプレイのためのフォーマット内に操作される。天然多様性の他の例は、異なる生物種間の配列の多様性である。例えば、多様な核酸配列を、土壌のような環境試料から増幅し、ディスプレイライブラリーを構築するために使用可能である。
【０１４２】
Ｄ．抗体ディスプレイライブラリー
１つの実施形態において、ディスプレイライブラリーは、それぞれが、免疫グロブリン領域、例えば免疫グロブリン可変領域を含む、ポリペプチドの多様なプールを提示する。ディスプレイライブラリーはとりわけ、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体を同定するために有用である。そのような抗体は、癌のようなヒト疾病を処置するために、治療として使用可能である。抗体の定常およびフレームワーク領域がヒトであるので、これらの治療様抗体は、抗原として、認識および標的化されることが避けられうる。定常領域をまた、ヒト免疫系のエフェクター機能を強化するために最適化する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイ選択工程は、自己抗原に対して抗体を生成する正常なヒト免疫系が、不全性を克服する。
【０１４３】
典型的な抗体ディスプレイライブラリーは、ＶＨ領域とＶＬ領域を含むポリペプチドを提示する。「免疫グロブリン領域（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ）」は、免疫グロブリン分子の可変または定常領域からの領域を意味する。免疫グロブリン領域は、典型的には、約７つのβ鎖からなる２つのβ−シートおよび保存ジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照のこと）。ディスプレイライブラリーは、Ｆａｂ断片（例えば２つのポリペプチド鎖を使用して）、または一本鎖Ｆｖ（例えば単一ポリペプチド鎖を使用して）として抗体を提示可能である。他のフォーマットもまた使用可能である。
【０１４４】
Ｆａｂおよび他のフォーマットの場合のように、提示された抗体は、軽鎖または重鎖の一部として、定常領域を含みうる。１つの実施形態において、各鎖には、例えばＦａｂの場合のように、１つの定常領域が含まれる。他の実施形態においては、さらなる定常領域が提示される。
【０１４５】
抗体ライブラリーは、多くの工程によって構築可能である（例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２１８−３０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０、およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−８を参照のこと）。さらに、各工程の要素を、他の工程のものと結びつけることが可能である。この工程は、変異を単一免疫グロブリン領域（例えば、ＶＨまたはＶＬ）内、または多重免疫グロブリン領域内（例えばＶＨおよびＶＬ）に導入するために使用可能である。変異を、免疫グロブリン可変領域、例えば、１つまたはそれ以上の、重鎖および軽鎖可変領域いずれか、及び／又は両方のそのような領域をしめす、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の領域内に導入可能である。１つの実施形態において、変異を、該領域のすべての３つのＣＤＲ中に導入する。他の好ましい実施形態において、変異を、例えば重鎖可変領域の、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に導入する。任意の組み合わせが、実現可能である。
【０１４６】
１つの工程で、抗体ライブラリーを、核酸の相当する領域に、ＣＤＲｓをコードしている多様なオリゴヌクレオチドを挿入することによって構築する。オリゴヌクレオチドは、単量ヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを用いて合成可能である。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら（（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６）は、トリヌクレオチド合成と、オリゴヌクレオチドを受容するための工学的に改変した制限部位を持つ鋳型を用いて、オリゴヌクレオチドをコードしているＣＤＲを構築するための方法を記述している。
【０１４７】
他の工程において、動物、例えば齧歯類を、ＭＵＣ１−Ｈで免役する。その動物を任意に、抗原でブースト（ｂｏｏｓｔ）して、さらに応答を刺激する。ついで脾臓細胞を動物より単離し、ＶＨ及び／又はＶＬ領域をコードしている核酸を増幅し、ディスプレイライブラリー中での発現のためにクローン化する。
また他の工程にて、抗体ライブラリーは、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）な生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子から増幅した核酸より構築される。増幅した核酸には、ＶＨ及び／又はＶＬ領域をコードしている核酸が含まれる。免疫グロブリン−コード核酸の供給源は、以下で記述している。増幅には、例えば、保存定常領域にアニール（ａｎｎｅａｌ）するプライマーでの、ＰＣＲまたは他の増幅方法が含まれる。
【０１４８】
免疫グロブリン領域をコードしている核酸は、例えばヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダ、または齧歯類の免疫細胞より得ることができる。１つの例において、細胞を、特定の特性で選択する。種々の成熟段階のＢ細胞を選択可能である。他の例において、Ｂ細胞はナイーブである。
【０１４９】
１つの実施形態において、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）を使用して、表面結合ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＧ分子を発現しているＢ細胞を分離する。さらに、ＩｇＧの異なるアイソタイプを発現しているＢ細胞を単離可能である。他の好ましい実施形態において、ＢまたはＴ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養する。細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ）とともに培養することによって、またはマイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ）または他の調節薬剤、例えばＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ２０、酢酸ミリスチン酸ホルボール、細菌リポ多糖類、コンカナバリンＡ（ｃｏｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）、フィトヘムグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）またはヤマゴボウ分裂促進因子（ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ）のようなものを添加することによって刺激することが可能である。
【０１５０】
また他の実施形態において、細胞を、免疫学的疾病、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎、脈管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、または抗リン脂質症候群など、を持つ対象から単離する。対象は、ヒトまたは動物、例えば、ヒト疾患に関する動物モデル、または類似の疾病を持つ動物であり得る。また他の実施形態において、細胞は、ヒト免疫グロブリン座を含む、形質転換非ヒト動物から単離される。
【０１５１】
１つの好ましい実施形態において、細胞が、体細胞超変異のプログラムを活性化した。細胞を、例えば、抗免疫グロブリン、抗ーＣＤ４０、および抗−ＣＤ３８抗体で処理することによって、免疫グロブリン遺伝子の体細胞変異が行われるように刺激可能である（例えばＢｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２２２８）を参照のこと。他の実施形態において、細胞はナイーブである。
【０１５２】
免疫グロブリン可変領域をコードしている核酸は、以下の例示的な方法によって、天然のレパートリーから単離可能である。第一に、ＲＮＡを免疫細胞より単離する。全長（すなわちキャップ）ｍＲＮＡｓを分離する（例えば、子牛腸ホスファターゼと、非キャップＲＮＡｓを分解することによって）。ついでキャップを、タバコ酸ピロホスファターゼによって除去し、逆転写を使用して、ｃＤＮＡｓを産出する。
【０１５３】
第一（アンチセンス）鎖の逆転写を、任意の好適なプライマーで、任意の様式にて実施可能である。例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２１８−３０を参照のこと。プライマー結合領域は、例えば、免疫グロブリンの異なるアイソタイプを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で、一定であり得る。プライマー結合領域はまた、免疫グロブリンの特定のアイソタイプに特異的であり得る。典型的に、プライマーは、少なくとも１つのＣＤＲをコードしている配列に対して、３’である領域に関して特異的である。他の実施形態において、ポリ−ｄＴプライマーを使用してよい（そして、これは重鎖遺伝子に対して好ましい可能性がある）。
【０１５４】
合成配列を、逆転写した鎖の３’末端に結合可能である。合成配列は、逆転写の後、ＰＣＲ増幅の中に、フォワードプライマーの結合に関して、プライマー結合部位として使用可能である。合成配列の使用で、利用可能な多様性を完全に獲得するために、異なるフォワードプライマーのプールを使用することの必要性を未然に防ぎえる。
【０１５５】
ついで、可変領域−コード遺伝子を、例えば１つまたはそれ以上の回数を用いて増幅する。多重回数を用いる場合、忠実度をあげるために、ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを使用可能である。ついで増幅した核酸を、ディスプレイライブラリーベクター内にクローン化する。
【０１５６】
核酸配列を増幅するための任意の方法を、増幅のために使用しうる。多様性を最大化し、しかしバイアス（ｂｉａｓ）をかけない方法が好ましい。多様な技術を、核酸増幅のために使用可能である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４）は、温度を変化させるサイクルを使用して、核酸合成のラウンドを駆動する。転写に基づく方法は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成を用い、核酸を増幅する（米国特許第６，０６６，４５７号、米国特許第６，１３２，９９７号、米国特許第５，７１６，７８５号、Ｓａｒｋａｒら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３３１−３４、Ｓｔｏｆｌｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４９１）。ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号、第５，４０９，８１８号および第５，５５４，５１７号）は、ＤＮＡ試料を増幅するために、転写、逆転写およびＲｎａｓｅＨに基づく分解のサイクルを利用する。また他の増幅方法には、ローリングサイクル増幅（ＲＣＡ、米国特許第５，８５４，０３３号および第６，１４３，４９５号）および鎖置換増幅（ＳＤＡ、米国特許第５，４５５，１６６号および第５，６２４，８２５号）が含まれる。
【０１５７】
Ｅ．第二スクリーニング法
標的に結合する候補ディスプレイライブラリーメンバーを選別した後に、それぞれの候補ディスプレイライブラリーメンバーをさらに解析し、例えば、標的に対するその結合特性をさらに特性化する。各候補ディスプレイライブラリーメンバーを、１つまたはそれ以上の第二スクリーニングアッセイにかけることができる。アッセイは、結合特性、触媒特性、生理学的特性（例えば、細胞毒性、腎臓クリアランス、免疫原性）、構造的特性（例えば、安定性、立体配座、オリゴマー化状態）または他の機能的特性に関してであり得る。同様のアッセイを、繰り返し、ただし、条件を変化させて例えばｐＨ、イオンまたは温度感受性を決定して使用可能である。
【０１５８】
好ましいように、アッセイは、ディスプレイライブラリーメンバーを直接、提示されたポリペプチドをコードしている核酸から産出した組換え体ポリペプチドを、または提示されたペプチドの配列に基づいて合成した合成ペプチドを使用可能である。結合特性に関する例示的なアッセイには、以下が含まれる。
【０１５９】
１．ＥＬＩＳＡ
ディスプレイライブラリーによってコードされたポリペプチドをまた、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、結合特性に関して選別可能である。例えば、各ポリペプチドを、その底表面を標的、例えば限定量の標的でコートした、マイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄し、非特異的結合ポリペプチドを除去する。ついで、プレートに結合したポリペプチドの量を、プレートを、ポリペプチド、例えばポリペプチドのタグまたは定常部分を認識可能な抗体で、プローブすることによって決定する。抗体を、好ましい基質が提供されたときに、比色分析産物を産出する、アルカリホスファターゼのような酵素に連結する。ポリペプチドは、細胞より精製可能であり、例えばフィラメンタスバクテリオファージコートへの融合のような、ディスプレイライブラリーフォーマット中でアッセイ可能である。他のＥＬＩＳＡアッセイのバージョンにおいて、多様な鎖ライブラリーの各ポリペプチドを、マイクロタイタープレートの異なるウェル（ｗｅｌｌ）の表面を覆うために使用する。ついでＥＬＩＳＡを、各ウェルをクエリー（ｑｕｅｒｙ）するために、定常標的分子を用いて進める。
【０１６０】
２．ホモジニアス結合アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ）
候補ポリペプチドの標的との結合相互作用を、ホモジニアスアッセイ、すなわち、アッセイのすべての要素を足した後に、さらなる流体操作が必要のないアッセイを使用して解析可能である。例えば、蛍光共鳴エネルギー転送（ＦＲＥＴ）を、ホモジニアスアッセイとして使用可能である（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら，米国特許第５，６３１，１６９号、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら，米国特許第４，８６８，１０３号を参照のこと）。第二分子が、第一分子の近くに存在する場合に、その放射蛍光エネルギーが、第二分子（例えば標的）上の蛍光団ラベルによって吸収可能であるように、第一分子上の蛍光団ラベル（例えば、画分中で同定された分子）を、選択する。第二分子上の蛍光ラベルは、転送されたエネルギーに吸収される時に、蛍光を発する。ラベル間のエネルギー転送の効率は、分離した分子の距離に関連し、分子間の空間的関係を評価し得る。分子間で結合が起こる状況において、アッセイ内の「アクセプター」分子ラベルの蛍光放射は最大であるべきである。ＦＲＥＴによってモニタリングするために設定された結合事象は、本技術分野でよく公知の、標準の蛍光分析検出方法（例えばフルオリメーターを使用する）を介して、都合よく測定可能である。第一または第二結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作製し、平衡結合定数を推定可能である。
【０１６１】
ホモジニアスアッセイの他の例は、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａ  Ｓｃｒｅｅｎ）（パッカード  バイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）である。アルファスクリーンは、２つの標識化ビーズを使用する。１つのビーズが、レーザーによって励起された場合に、シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）酸素を産出する。もう１つのビーズは、シングレット酸素が、第一ビーズより発散され、これに衝突した場合に、光シグナルを産出する。一方のビーズは、ディスプレイライブラリーメンバーに付着し、他の一方は標的に付着可能である。シグナルは、結合の程度を決定するために測定する。
【０１６２】
ホモジニアスアッセイは、候補ポリペプチドが、ディスプレイライブラリー担体、例えばバクテリオファージに付着する間に実施可能である。
【０１６３】
３．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ディスプレイライブラリーから単離した分子と、標的の結合相互作用は、ＳＰＲを用いて解析可能である。ＳＰＲまたは生物分子相互作用解析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ））は、任意の反応体を標識すること無しに、リアルタイムで、生物特異的相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面における質量の変化（結合事象の指標）は、結果として、表面近くの光の反射指数の変化となる（表面プラズモン共鳴の光学的現象（ＳＰＲ））。屈折度の変化は、検出可能なシグナルを産出し、これは、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として測定される。ＳＰＲを用いるための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号、Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５、Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５で記述されており、また、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって提供されるオンラインリソースで記述されている。
【０１６４】
ＳＰＲからの情報は、生物分子の標的への結合に関する、ＫｏｎおよびＫｏｆｆを含む、平衡解離定数（Ｋｄ）および速度論パラメータの正確で定量的な測定を提供するために使用可能である。そのようなデータは、異なる生物分子を比較するために使用可能である。例えば、多様な鎖のライブラリーから選択した核酸によってコードされたタンパク質を、標的に対して高い親和性を持つ、または低Ｋｏｆｆを持つ個々を同定するために比較可能である。この情報はまた、構造−活性相関（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ）（ＳＡＲ）を進展させるために使用可能でもある。例えば、親タンパク質の飽和バージョンの速度論および平衡結合パラメータを、親タンパク質のパラメータと比較可能である。該位置でのバリアントアミノ酸を、特定の結合パラメータ、例えば高親和性および低Ｋｏｆｆと相関があるように同定可能である。この情報は、（例えば相同性モデリング、エネルギー最小化、または結晶学またはＮＭＲによる構造決定を用いて）構造モデリングと組み合わせることが可能である。結果として、タンパク質とその標的間の物理的相互作用を理解すると、定式化でき、他の設計工程を導くために使用可能となる。
【０１６５】
４．タンパク質配列
ディスプレイライブラリーから同定したポリペプチドを、固体支持体、例えばビーズまたは配列上に固定可能である。タンパク質配列に関して、それぞれのポリペプチドを、支持体の固有のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは、二次元アドレスである。タンパク質配列を以下に記述する（例えば、「診断（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」を参照のこと）。
【０１６６】
５．細胞アッセイ
（例えば、ディスプレイライブラリーまたは他の方法によって先に同定された）候補ポリペプチドライブラリーを、宿主細胞内のライブラリーを形質導入することによって選別可能である。例えば、ライブラリーには、ポリペプチドをコードしている、および例えば、ポリペプチドが細胞内で産出され、細胞より分泌される、または細胞表面に接着するような発現を指向する区画を含む、ベクター核酸配列が含まれうる。細胞を、例えば、細胞表現系または細胞仲介活性の変化によって検出可能なように、ＭＵＣ１−Ｈに対して結合するポリペプチドに関して選別可能である。例えば、ＭＵＣ１−Ｈに結合する抗体の場合、活性は、細胞または補体仲介細胞毒性であり得る。
【０１６７】
他の実施形態において、細胞のライブラリーは、細胞配列の形態である。細胞配列は、同様に、任意の適切な検出可能活性に関して選別可能である。
【０１６８】
Ｆ．リガンド産出
標準の組換え体核酸法を使用して、ＭＵＣ１−Ｈに結合するポリペプチドリガンドを発現可能である。一般的に、ポリペプチドリガンドをコードしている核酸配列を、核酸発現ベクター内にクローン化する。もちろん、タンパク質が多重ポリペプチド鎖を含む場合、各鎖は、発現ベクター、例えば、同一または異なる細胞に発現している、同一または異なるベクター内にクローン化されなければならない。タンパク質が十分小さい、すなわち、タンパク質が５０アミノ酸以下のペプチドの場合、タンパク質は、自動化した有機合成方法を用いて合成可能である。抗体を産出するための方法もまた、以下に提供する。
【０１６９】
ポリペプチドリガンドの発現に関する発現ベクターには、ポリペプチドリガンドまたはその断片をコードしている部分に加えて、例えば、実施可能に対象の核酸に連結したプロモーターを含む、調節配列が含まれうる。多数の好適なベクターおよびプロモーターが、当業者に公知であり、本発明の組換え体構造物を生成するために商業的に入手可能である。以下のベクターが、一例として提供される。細菌：ｐＢｓ、ファージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。真核細胞：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（ストラタジーン）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（ファルマシア）。好ましいライブラリーの１つの好ましいクラスは、ディスプレイライブラリーであり、以下に記述している。
【０１７０】
当業者によく公知の方法を、本発明のポリヌクレオチドおよび適した転写／翻訳対照シグナルを含むベクターを構築するために使用可能である。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え体ＤＮＡ技術、合成技術およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組み換えが含まれる。例えば、技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）にて記述されている。プロモーター領域を、ＣＡＴ（クロラムフェニコール  トランスフェラーゼ）ベクターまたは他のベクターを用いて、選択可能なマーカーにて、望む遺伝子から選択可能である。２つの適したベクターは、ｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７である。特定の名前の細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、およびｔｒｃが含まれる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、前期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来ＬＴＲｓ、マウスメタロチオネイン−Ｉ（ｍｏｕｓｅ  ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ）および種々の本技術分野で公知の組織特異的プロモーターが含まれる。
【０１７１】
一般的に、組換え体発現ベクターは、複製起源、および宿主細胞の形質転換を許容する、選択可能なマーカー、例えば、大腸菌アンピシリン抵抗性遺伝子および（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、およびＴＲＰｌ遺伝子のような）Ｓ．セルビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）栄養素要求株マーカー、および下流構造配列の転写を指向するために、大いに発現した遺伝子から由来するプロモーターを含みうる。そのようなプロモーターは、とりわけ３−ホルホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸ホスファターゼ、またはヒートショックタンパク質などのような、糖分解酵素をコードしているオペロンより誘導可能である。本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始および終了配列、および好ましくは、周辺腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｓｐａｃｅ）または細胞外培地内での、翻訳されたタンパク質の分泌を指向可能であるリーダー配列において、適切な相（ｐｈａｓｅ）にて組み立てられる。任意に、本発明の核酸は、望む特性、例えば安定性を与え、または発現した組換え体産物の精製を単純化する、Ｎ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコード可能である。細菌に関して、有用な発現−ベクターを、本発明のポリヌクレオチドを、好適な翻訳開始および終了シグナルとともに、任意に、機能プロモーターと実施可能なリーディング相内にて、挿入することによって構築する。ベクターには、ベクターの維持を確かにし、望むのならば、宿主内の増幅を提供するために、１つまたはそれ以上の表現系選択可能マーカーおよび複製開始点を含む。形質転換のための、好適な原核生物宿主には、大腸菌、バシルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ  チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の多様な種が含まれが、他もまた、選択の事象として使用可能である。
【０１７２】
限定ではないが代表的な例として、細菌に関して有用な発現ベクターは、よく公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要素を含む、市販で入手可能なプラスミドより由来した選択可能なマーカー、および細菌複製開始点を含みうる。そのような市販のベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（ファルマシア  ファイン  ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）が含まれる。
【０１７３】
本発明はさらに、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供し、そこで核酸は、公知の形質転換、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または感染方法を用いて宿主細胞内に導入されている。例えば、宿主細胞は、多様な鎖から構築されたライブラリーのメンバーを含みうる。宿主細胞は、哺乳類細胞のような真核細胞、酵母細胞のような低級真核宿主細胞でありえ、または宿主細胞は、細菌細胞のような、原核細胞であり得る。組換え構築物の、宿主細胞内への導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクトション、ＤＥＡＥ、デキストラン仲介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）によって達成されうる。
【０１７４】
任意の宿主／ベクター系を、本発明の１つまたはそれ以上の宿主要素を同定するために使用可能である。これらには、制限はしないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞のような真核細胞宿主、ならびに大腸菌、およびＢ．サブチリスのような原核細胞宿主が含まれる。もっとも好ましい細胞は、通常特定のレポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現していないか、または低い天然レベルで、レポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。
【０１７５】
本発明の宿主は、酵母または他の菌類でもあり得る。酵母において、構成または誘導可能プロモーターを含む多くのベクターを使用してよい。概説のために、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３（１９８８）、Ｇｒａｎｔら。（１９８７）「酵母のための発現および分泌ベクター類（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３（１９８６）、Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６７３−６８４（１９８７）、およびＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８２）を参照のこと。
【０１７６】
本発明の宿主はまた、大腸菌のような原核細胞、セラチア  マレスカンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｅｓｃａｎｓ）、バチルス、種々のシュードモナスのようなエンテロバクテリアセス、または他の形質転換、トランスフェクト及び／又は感染可能な原核生物でもあり得る。
【０１７７】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドを含むために、遺伝子工学的に改変した宿主細胞を提供する。例えば、そのような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクションまたは感染方法を用いて宿主細胞内に導入した、本発明の核酸を含んでよい。本発明はまたさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するように、遺伝子工学的に改変した宿主細胞を提供し、そこで、そのようなポリヌクレオチドは、細胞内でのポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞に非相同の調節配列と関連する。
【０１７８】
宿主細胞は、哺乳類細胞のような、より高次の真核宿主細胞、酵母細胞のような、より低級の真核宿主細胞であってよく、または宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であってよい。
【０１７９】
宿主細胞への組み換え構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン仲介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ｅｔら，（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって達成しうる。本発明の１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、（ＯＲＦの場合）単離した断片によってコードされた遺伝子産物を産出するために、従来の様式で使用可能である。
【０１８０】
任意の宿主／ベクター系を、本発明の多様な鎖の１つまたはそれ以上を発現させるために使用可能である。これらには、制限はしないが、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞のような真核細胞宿主、ならびに大腸菌、およびＢ．サブチリスのような原核細胞宿主が含まれる。もっとも好ましい細胞は、通常特定のレポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現していないか、または低い天然レベルで、レポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。成熟タンパク質は、哺乳類細胞、酵母、細菌または他の細胞内で、適切なプロモーターの制御下で発現可能である。細胞を含まない翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物から由来したＲＮＡｓを用いて、そのようなタンパク質を産出するために使用可能である。真核生物および原核生物宿主との使用に関し、好ましいクローニングおよび発現ベクターは、そのすべてが、参考文献にて本明細書に開示されている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）によって記述されている。
【０１８１】
種々の哺乳類細胞培養系もまた、組換え体タンパク質を発現するために使用可能である。
【０１８２】
哺乳類発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）によって記述されたサル腎臓線維芽細胞、および例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株のような、互換性ベクターを発現可能な他の細胞株が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製開始点、好適なプロモーターおよび任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および５’連結非転写配列を含む。
【０１８３】
ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ源から由来したＤＮＡ配列、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を、必要な非転写遺伝的部位を提供するために使用して良い。細菌培養液中で産出した組換え体ポリペプチドおよびタンパク質は、通常、細胞沈殿物からの初期抽出、続く１つまたはそれ以上の塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー段階によって単離する。いくつかの実施形態において、鋳型核酸はまた、ポリペプチドタグ、例えばペンタ−またはヘキサ−ヒスチジンをコードしている。ついで、多様な鎖のライブラリーによってコードされた組換え体ポリペプチドを、親和性クロマトグラフィーを用いて精製可能である。
【０１８４】
タンパク質の発現にて使用する細菌細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的分散、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の使いやすい方法によって破裂させることが出来る。多くの型の細胞が、タンパク質の発現のための好適な宿主細胞として働く。Ｓｃｏｐｅｓ（（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）は、組換え体（および非組換え体）タンパク質を精製するための、多くの一般的な方法を提供している。本方法には、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、選択的沈殿、透析、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。これらの方法は、抗ＭＵＣ１−Ｈポリペプチドリガンドに対する、精製方針を考案するために適用可能である。
【０１８５】
哺乳類宿主細胞には、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換した霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養から由来する細胞株、初代移植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。
【０１８６】
あるいは、酵母のような低級真核生物、または細菌のような原核生物内でタンパク質を産出することも可能であり得る。潜在的に好適な酵母株には、サッカロマイセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、または非相同性タンパク質を発現可能な任意の酵母株が含まれる。潜在的に好適な細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス  サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ  チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または非相同性タンパク質を発現可能な任意の細菌株が含まれる。タンパク質が、酵母または細菌内で作製される場合、機能的タンパク質を得るために、例えば適切な部位のリン酸化または糖付加によって、ここで産出されたタンパク質を改変することが必要であり得る。このような共有結合は、公知の化学的または酵素的方法を用いて実施されうる。本発明の他の実施形態において、細胞および組織を、誘導可能な制御要素の制御下で、本発明のポリヌクレオチドを含む内生遺伝子を発現するように処理してよく、この場合、内生遺伝子の調節配列が、相同組換えによって置換されうる。本明細書で記述したように、異なる遺伝子または遺伝子工学的改変方法によって合成した新規調節配列から単離した調節配列を用いて、遺伝子の存在する調節領域を置換するために、遺伝子標的化を使用可能である。
【０１８７】
そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場接着領域、ネガティブ調節要素、転写開始部位、調節タンパク質結合部位または前記配列の組み合わせからなりうる。あるいは、産出されたＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を与える配列を、ポリアデニル化シグナルを含んで、標的化によって置換、除去、添加、あるいは改変してよい。ｍＲＮＡ安定性要素、スプライス部位、タンパク質のトランスポートまたは分泌特性を増強または改変するためのリーダー配列、またはタンパク質またはＲＮＡ分子の機能または安定性を変化、または改善する他の配列。
【０１８８】
１．抗体産出
いくつかの抗体、例えばＦａｂを、細菌細胞、例えば大腸菌細胞内で産出可能である。例えば、Ｆａｂが、ディスプレイ実在物とバクテリオファージタンパク質（またはその断片）間の抑制可能終止コドンを含む、ファージディスプレイベクター内の配列によってコードされている場合、ベクター核酸を、終止コドンを抑制できない細菌細胞内にシャッフル（ｓｈｕｆｆｌｅ）可能である。この場合、Ｆａｂは遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合せず、培地中に分泌される。
【０１８９】
抗体はまた、真核生物細胞中で産出可能である。１つの実施形態において、抗体（例えばｓｃＦｖ）は、ピッチア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、Ｐｏｗｅｒら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３−３５を参照のこと）、ハンセウラ（Ｈａｎｓｅｕｌａ）またはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中で発現する。
【０１９０】
１つの好ましい実施形態において、抗体を哺乳類細胞中で産出する。クローン抗体またはその抗原結合断片を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞には、（例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１）にて記述された、ＤＨＦＲ選択可能なマーカーで使用した、（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）にて記述された、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞、リンパ系細胞株、例えばＮＳ０ミエローマ細胞、およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞および形質転換動物、例えば形質転換哺乳類からの細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ細胞）、が含まれる。例えば、細胞は哺乳動物上皮細胞である。
【０１９１】
多様化免疫グロブリン領域をコードしている核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞内のベクターの複製を調節する配列（例えば複製開始点）および選択可能なマーカー遺伝子のような、さらなる配列を含んでよい。選択可能マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入される、宿主細胞の選択を可能にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、および第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような、薬剤への抵抗性を与える。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選別／増幅でｄｈｆｒ−宿主細胞内での使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【０１９２】
本発明の抗体、またはその抗原結合部分の組換え体発現に関する例示的な系において、抗体重鎖および抗体軽鎖両方をコードしている組換え体発現ベクターを、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションによって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞内に導入する。組換え体発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ動作可能なように、（例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素のような、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどから由来する）エンハンサー／プロモーター調節要素に連結し、高いレベルの遺伝子の転写が駆動される。組換え体発現ベクターはまた、ＤＨＦＲを含み、これにより、メトトレキサート選別／増幅を用いて、ベクターにトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の選別を可能にする。選別したトランスフォーマント宿主細胞を培養し、抗体重鎖および軽鎖の発現が可能になり、原型の抗体が、培養培地より回収される。標準の分子生物学的技術を使用して、組換え体発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、トランスフォーマントに関して選別し、、宿主細胞を培養し、培養培地より抗体を回収する。例えば、いくつかの抗体を、ＰｒｏｔｅｉｎＡまたはＰｒｏｔｅｉｎＧでのアフィニティークロマトグラフィーによって単離可能である。
【０１９３】
Ｆｃ領域を含む抗体に関して、抗体産出系で、好ましくはＦｃ領域に糖付加して、抗体が合成される。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃ領域は、ＣＨ２領域中のアスパラギン２９７にて糖付加される。このアスパラギンは、ニ分岐型（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ−ｔｙｐｅ）オリゴサッカライドで改変されるための部位である。この糖付加が、Ｆｃγレセプターと補体Ｃ１ｑによって仲介されるエフェクター機能のために要求される（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、好ましくは、アスパラギン２９７に相当する残基に適切に糖付加する、哺乳類発現系中で産出する。Ｆｃ領域はまた、他の真核生物翻訳後修飾を含みうる。
【０１９４】
抗体はまた、形質転換動物によっても産出可能である。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、形質転換動物の哺乳類腺中に抗体を発現する方法を記述している。トランス遺伝子を、乳特異的プロモーターおよび対照抗体および選別のためのシグナル配列をコードしている核酸を含むように構築する。そのような形質転換哺乳動物のメスによって産出された乳は、分泌されたそれに対象の抗体が含まれる。抗体を、乳より精製し、またはある適用では、直接使用する。
【０１９５】
Ｇ．薬理学的組成物
他の態様において、本発明は、組成物、例えば薬理学的に許容可能な組成物を提供し、これは、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド、例えば抗体分子、ＭＵＣ１−Ｈに結合することで同定された、または本明細書で記述した、他のポリペプチドまたはペプチドが含まれ、薬理学的に許容可能な担体とともに処方される。本明細書で使用するところの、語句「薬理学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像化、ならびに治療的組成物のための標識化リガンドを含む。
【０１９６】
本明細書で使用するところの、「薬理学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」には、任意の、そしてすべての溶媒、分散培地、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、生理学的に適合可能な類似のもの、が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または末梢投与（例えば注射または注入による）のために好適である。投与経路に依存して、活性化合物、すなわちポリペプチドリガンドを、物質内にて、酸の活性、および化合物を不活性化する他の天然の条件から、化合物を保護するために、その表面を覆って良い。
【０１９７】
「薬理学的に許容可能な塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｓａｌｔ）」は、親化合物の望む生物学的活性を残しているが、任意の望まない毒性効果を与えない塩を意味する（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。そのような塩の例には、酸添加塩および塩基添加塩が含まれる。酸添加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素、ヨウ化水素、リンなどのような、非毒性無機塩から由来するもの、ならびに、脂肪酸一および二炭酸塩、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪および芳香スルホン酸などのような、非毒性有機酸から由来するものが含まれる。塩基添加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのようなアルカリ土類金属から由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどのような、非毒性有機アミンから由来するものが含まれる。
【０１９８】
本発明の組成物は、種々の形態であり得る。これらには、例えば、液体溶液（例えば注射可能および注入可能溶液）、分散液または懸濁液、タブレット、ピル、粉末、リポソームおよび座剤のような、液体、半固体、固体投与形態が含まれる。好ましい形態は、意図した投与形態および治療適用に依存する。典型的な好ましい組成物は、ヒトの投与のために抗体とともに使用されるものと同一の組成物のような、注射可能または注入可能溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、静脈内注入または注射によって投与される。他の好ましい実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、筋肉内または皮下注射によって投与される。
【０１９９】
本明細書で使用するところの語句「非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「非経口で投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）」は、通常、注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、水晶体内、眼窩内、心臓内、粘膜内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、胸骨内注射および注入が含まれる。
【０２００】
薬理学的組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で、無菌および安定でなければならない。薬理学的組成物をまた、投与に関して、規制および工業標準に合うことを保証するために、試験可能である。例えば、調整品内のエンドトキシンレベルを、ＵＳＰ  ２４／ＮＦ  １９法に従って、（例えばバイオ  ウィットテイカー（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）からのキット、例えば感度０．１２５ＥＵ／ｍＬでのロット＃７Ｌ３７９０を用いた）Ｌｉｍｕｌｕｓ遊走細胞溶解物アッセイを用いて試験可能である。薬理学的組成物の無菌性を、ＵＳＰ  ２４／ＮＦ  １９法に従って、チオグリコレート培地を用いて測定可能である。例えば、調整品を使用して、チオグリコレート培地に接種し、３５℃にて１４またはそれ以上の日数インキュベートする。培地を、微生物の増殖を検出するために、周期的に検査する。
【０２０１】
組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物用量に好適な他の順序化された構造として処方可能である。無菌注射可能溶液は、適切な溶媒中の活性化合物（すなわちリガンド）を、必要な量で、上記で列挙した成分１つまたは組み合わせを含む溶媒中に組み入れ、必要なときに、続いて濾過滅菌することによって調製可能である。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散培地および以上で列記したものからの必要な他の成分を含む無菌賦形剤内に組み込むことによって調製する。無菌注射可能溶液の調製のための、無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分およびすでに滅菌濾過したその溶液からの、任意のさらなる望む成分の粉末を産出する、吸引乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液である場合は、要求された粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持可能である。組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば一ステアリン酸塩およびゼラチンを含めることによって、注射可能組成物の長期の吸収を実施可能である。
【０２０２】
本発明の抗ＭＵＣ１−Ｈポリペプチドリガンドは、多くの適用に関して、好ましい投与経路／様式が、静脈内注射または注入であるけれども、本技術分野で公知の種々の方法によって投与可能である。例えば、治療的適用のために、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを、３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分以下の速度で、静脈内注入によって投与可能であり、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に到達する。投与経路および／様式は、望む結果に依存して変化しうる。特定の実施形態において、活性化合物を、インプラントおよび微小カプセル伝達系のような放出制御処方のような、化合物を急速な放出から守る担体とともに調製しうる。エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコリン酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ酪酸のような、生物分解性、生物適合性ポリマーを、使用可能である。そのような処方の調製のための多くの方法は、特許出願されており、一般的に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０２０３】
ある実施形態において、リガンドは、例えば、不活性希釈液または吸収可能食用担体とともに、経口投与してよい。化合物（および望むのならば他の成分）はまた、硬または軟シェルゼラチンカプセル内に同封、タブレット内に圧縮、または対象の食事に直接含めてもよい。経口治療適用のために、化合物を、賦形剤と組み込み、摂取可能タブレット、バッカルタブレット、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用して良い。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活性化を予防するために、化合物を物質で覆うか、または化合物を物質とともに投与することが必要であり得る。
【０２０４】
薬理学的組成物は、本技術分野で公知の医療用具で投与可能である。例えば、好ましい実施形態において、本発明の薬理学的組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号で開示された器具のような、針を必要としない皮下注射器具で投与可能である。本発明でよく公知のインプラント（ｉｍｐｌａｎｔ）およびモジュール（ｍｏｄｕｌｅ）の例には、制御速度にて、医薬品を分散するための、埋め込み可能マイクロ−注入ポンプを開示している、米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を介して医薬品を投与するための治療器具を開示している、米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度にて、医薬品を伝達するための、医薬品注入ポンプを開示している、米国特許第４，４４７，２３３号、一定の薬物伝達のための、可変フロー埋め込み可能注入器具を開示している、米国特許第４，４４７，２２４号、多重チャンバーコンポーネンツを持つ、浸透圧薬物伝送系を開示している、米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧薬物伝送系を開示している、米国特許第４，４７５，１９６号が含まれる。もちろん、多くの他のそのようなインプラント、伝送系およびモジュールも公知である。
【０２０５】
ある実施形態において、本発明の化合物を、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、正確な分配を保証するために処方可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高い親水性の化合物を排除する。本発明の治療化合物が、（望むならば）ＢＢＢを通過することを保証するために、例えば、リポソーム内に処方可能である。リポソームを製造する方法に関しては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、第５，３７４，５４８号および第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に伝達し、従って、標的化薬物伝達を増強する１つまたはそれ以上の部分を含んで良い（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照のこと）。
【０２０６】
用法を、最適な望む応答（例えば、治療応答）をえるために適合させる。例えば、単一ボーラスを投与してよく、いくつかに分割した用量を、時間をかけて投与してよく、または用量を、治療状況の要件によって示唆されたとき、比例して減少または増加させてよい。投与および用量の均一性を容易にするため、用量ユニット形態にて、非経口組成物を処方することはとくに利点がある。本明細書で使用する、用量ユニット形態は、治療すべき対象に対して、単一用量として好適な物理的に分離したユニットをさし、各ユニットは、望む治療効果を、必要な薬理学的担体と関連して産出するように計算し、先に決定された活性化合物の量を含む。本発明の用量ユニット形態に関する規格は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性の治療に関する、そのような化合物を化合する技術分野における固有の制限によって指向され、それらに直接依存する。
【０２０７】
治療的または予防的に効果的な量の本発明の抗体の、限定はしないが、例示的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体は、３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分以下の速度にて、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または約５〜３０ｍｇ／ｍ２の用量に達するように、静脈内注入によって投与可能である。分子量が、抗体より小さなリガンドに関して、適切な量は比例して小さい可能性がある。用量値は、軽減されるべき状態の型および重症度とともに変化しうる。任意の特定の対象に対して、特定の用法が、個体の必要性および投与している、または組成物の投与を管理している人物の専門の判断に従って、長時間調整すべきであること、および本明細書で列記している用量範囲はただ例であり、請求された組成物の目的または実施を制限する意図はないことが、さらに理解されなければならない。
【０２０８】
本発明の薬理学的組成物は、「治療的に効果的な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「予防的に効果的な量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」の本発明の抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを含んで良い。「治療的に効果的な量」は、望む治療結果を達成するための用法、必要な期間における、効果的な量を意味する。組成物の治療的に効果的な量は、疾患状態、個々の年齢、性別および体重のような因子、個々における望む応答を引き出すための、ポリペプチドリガンドの能力に従って変化する。治療的に効果的な量はまた、治療的に有益な効果が、化合物の毒性または有害な効果より上回るものである。「治療的に効果的な量」は、好ましくは、測定可能パラメータ、例えば腫瘍増殖率を、未処理対象と比較して、少なくとも約２０％まで、より好ましくは少なくとも約４０％まで、またより好ましくは少なくとも約６０％まで、またより好ましくは少なくとも約８０％まで、阻害する。例えば癌のような、測定可能なパラメータを阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍での効果の予測である、動物モデル系中で評価可能である。あるいは、組成物の特性を、阻害、当業者に公知のアッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害のような、阻害する化合物の能力を試験することによって評価可能である。
【０２０９】
「予防的に効果的な量」は、望む予防結果を達成するための用法、および必要な期間における効果的な量を意味する。典型的には、予防用量を、疾患の前、または初期病期で対象にて使用するので、予防的に効果的な量は、治療的に効果的な量よりも小さい可能性がある。
【０２１０】
ＭＵＣ１−Ｈに結合するポリペプチドリガンド、および使用、例えば治療、予防または診断的使用のための説明書を含むキットもまた、本発明の目的の範囲内である。１つの実施形態において、診断適用のための説明書には、ＭＵＣ１−Ｈを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば試料、例えば、癌または腫瘍性疾病を持つ患者からの生検または細胞において、またはｉｎ  ｖｉｖｏで検出するための、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド（例えば、抗体またはその抗原結合断片、または他のポリペプチドまたはペプチド）の使用が含まれる。他の実施形態において、治療適用のための説明書には、癌または腫瘍性疾病をもつ患者における、提示された用量及び／又は投与様式が含まれる。キットはさらに、１つまたはそれ以上の個々の薬理学的調製物中に、必要に応じて処方された、診断または治療剤、例えば本明細書で記述したような診断または治療剤、のような少なくとも１つのさらなる剤、及び／又は１つまたはそれ以上のさらなる抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを含みうる。
【０２１１】
Ｈ．治療
ＭＵＣ１−Ｈに結合し、本明細書で記述された、及び／又は本明細書で詳述された方法によって同定されたポリペプチドリガンドは、治療的および予防的有用性を持つ。例えば、これらのリガンドを、培養中の細胞、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、または対象内、例えばｉｎ  ｖｉｖｏで、癌のような多様な疾病を治療、予防及び／又は診断するために、投与可能である。
【０２１２】
本明細書で使用するところの、語句「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾病、疾患の症状または疾病に向かう傾向を、回復する、治癒する、緩和する、軽減する、変える、救済する、改善する、改良するまたは影響を与える目的で、単独での、または第二薬剤との組み合わせでの、抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体の適用または投与、または対象、例えば疾病（例えば、本明細書で記述したような疾病）、疾病の症状または疾病に向かいやすい傾向をもつ患者からの、単離組織または細胞、例えば細胞株への、薬剤の適用または投与として定義される。細胞を治療することは、疾病、例えば、本明細書で記述するような疾病（例えば癌性疾病）を仲裁するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの、細胞の阻害、削除、殺傷、または、細胞、例えば異常細胞のキャパシティーの削減を意味する。１つの実施形態において、「細胞を治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ）」は、細胞、例えば過剰増殖細胞の活性及び／又は増殖の減少を意味する。そのような減少は、かならずしも、細胞の総削除を意味しないが、細胞の活性または数の、減少、例えば、統計学的に有意な減少を示す。
【０２１３】
本明細書で示すところの、疾病を処置するために効果的な抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドの量、または「治療的に効果的な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、細胞、例えば癌細胞（例えばＭＵＣ１−Ｈ発現癌細胞）を処置することにおいて、または、そのような治療がない状態で予想されるよりも、本明細書で記述したような疾病を患う対象の、回復、緩和、軽減または改善を引き延ばすことにおいて、対象への単一または複数の用量投与にて、効果的である、リガンドの量を意味する。本明細書で使用するところの、新生物の「増殖を阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ）」は、その増殖および転移を、ゆっくりにすること、中断すること、引き留めること、停止することを意味し、必ずしも新生物増殖の総削除を示唆していない。
【０２１４】
本明細書で使用するところの、疾病を予防するために効果的な抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドの量、またはリガンドの「予防的に効果的な量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、疾病、例えば癌の開始または再発の発生を予防するまたは遅延させるのに、対象への単一または複数の用量投与において、効果的である、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド、例えば、本明細書で記述したような抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体の量を意味する。
【０２１５】
例えば、２つの状態間での定量的な差を記述する、語句「減少する（ｉｎｄｕｃｅ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「増強する（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ）」、「上昇させる（ｅｌｅｖａｔｅ）」、「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」などは、２つの状態の間での、差、例えば統計学的に有意な差を意味する。例えば、「ＭＵＣ１−Ｈ発現過剰増殖細胞の増殖を阻害するのに効果的な量（ａｎ  ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＵＣ１−Ｈ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）」は、未処理細胞とは異なる、例えば統計学的に差のある細胞の増殖率を意味する。
【０２１６】
本明細書で使用するところの、語句「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことが意図される。好ましいヒト動物には、異常細胞増殖または細胞分化によって特徴づけられる疾病を持つヒト患者が含まれる。本発明の語句「非ヒト動物（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ａｎｉｍａｌｓ）」には、すべての脊椎動物、例えば（ニワトリ、両生類、は虫類のような）非哺乳動物および非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタなどのような哺乳動物が含まれる。
【０２１７】
１つの実施形態において、対象は、ヒト対象である。あるいは、対象は、本発明の抗体が交差反応する、ＭＵＣ１−Ｈ様抗原を発現している哺乳動物であり得る。本発明のポリペプチドリガンドを、（以下でさらに議論する）治療目的のために、ヒト対象に投与可能である。さらに、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを、獣医目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして、リガンドが結合するＭＵＣ１−Ｈ様抗原を発現している非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）へ投与可能である。後者に関して、そのような動物モデルは、リガンドの治療効果を評価する（例えば投与の用量および時間経過を試験する）ために有用であり得る。
【０２１８】
１つの実施形態において、本発明は、細胞（例えば、非癌性細胞、例えば正常、良性または過形成細胞または癌細胞、例えば悪性細胞、例えば固形癌、軟組織腫瘍、または転移巣から得た細胞（例えば、腎臓、尿路上皮、大腸、直腸、肺、乳房または肝臓癌及び／又は転移からえられた細胞））を治療する（例えば削除するまたは殺す）方法を提供する。本発明の方法には、細胞を処置する、例えば削除する、または殺すのに十分な量で、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド、例えば本明細書で記述の抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体と細胞を接触させる段階が含まれる。
【０２１９】
目的の方法は、培養中の細胞、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにて、使用可能である。例えば、癌または転移細胞（例えば腎臓、尿路上皮、大腸、直腸、肺、乳房、卵巣、前立腺または肝臓癌または転移細胞）を、培養培地中で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて培養可能であり、接触段階で、培養培地に、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを添加することによって達成可能である。本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば治療的または予防的）プロトコールの部分として、対象内で存在する細胞（例えば癌または転移細胞）上で実施可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ実施形態に関して、接触段階は、対象内で実施され、細胞へのリガンドの結合、および細胞の治療の両方、例えば削除または殺傷を可能にするために効果的な条件下で、対象に抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを投与することが含まれる。
【０２２０】
ほとんどのＭＵＣ−Ｈエピトープは、ＭＵＣ１の残余非ｓｈｅｄエピトープ上に存在し、これはｓｈｅｄの際に細胞表面上に残り、ＭＵＣ１の膜質部分の細胞外Ｎ−末端領域であり、ＭＵＣ１の膜貫通部分の直前に局在している。タンパク質のこの部分は、Ｏ型糖鎖結合部位を持たず、予想されるＮ型糖鎖結合部位を１つ持つ。ｓｈｅｄＭＵＣ１の分離によって、ＭＵＣ１の膜貫通部分の新エピトープが、膜結合ＭＵＣ１分子上には存在せず、ＭＵＣ１の他のスプライシングバリアント上にも存在しないように、現れる。いくつかの例において、ＭＵＣ１−Ｈエピトープは、ＭＵＣ１のクリップ形態の成分によって形成される複合体上に存在し、つまりそのようなエピトープは、ｓｈｅｄＭＵＣ１上に存在せず、従って、これを定義に従ってＭＵＣ１−Ｈエピトープとする。正常細胞における先端部の発現と比較して、腫瘍において、ＭＵＣ１が先端ではなく発現するので、ＭＵＣ１−Ｈは、腫瘍関連抗原として構成可能である。ＭＵＣ１−Ｈに対する抗体およびペプチド類は従って、腫瘍特異性および治療的抗体で干渉されうる、血清中にｓｈｅｄされない、ＭＵＣ１−Ｈを示すことが可能である。
【０２２１】
本方法は、癌を処置するために使用可能である。本明細書で使用するところの語句、「癌（ｃａｎｃｅｒ）」、「過剰増殖（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）」、「悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）」、および「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）」は、相互互換的に使用され、これら細胞の急速な増殖または新生物によって特徴づけられる異常状態または条件に関連する。この語句には、侵襲性の組織学的型または病期にかかわらず、すべての型の癌性増殖または発癌経過、転移組織または悪性形質導入細胞、組織、または器官が含まれる。「病理学的過剰増殖（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｆｉｌｅｒａｔｉｖｅ）」細胞は、悪性腫瘍増殖によって特徴づけられる疾患状態において、起こる。
【０２２２】
語句「新生組織形成（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」の一般的な医学的意味は、結果として、正常の増殖対照、例えば新生細胞増殖に対する応答性の欠如としての、「新細胞増殖（ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）」を意味する。「過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）」は、異常に速い増殖速度での細胞を意味する。しかしながら、その含まれるものが、異常な細胞増殖速度を経験している細胞を一般的に意味することが明らかであるので、本明細書で使用するところの、語句新生組織形成と過形成は、相互互換的に使用可能である。新生組織形成と過形成は、良性、前悪性または悪性であり得る、「腫瘍（ｔｕｍｏｒｓ）」が含まれる。
【０２２３】
癌性疾病の例には、限定はしないが、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移巣が含まれる。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍、例えば肺、乳房、リンパ腺、胃腸管（例えば大腸）および泌尿器管（例えば腎臓、尿路上皮細胞）、咽頭、前立腺、卵巣に影響するような、種々の器官の系肉腫、腺癌、癌腫、ならびに、ほとんどの大腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝臓癌、非小細胞肺癌、小腸癌などのような、悪性腫瘍を含む腺癌があげられる。上記の癌の転移巣もまた、本発明の方法および組成物を用いて、治療または予防可能でもある。
【０２２４】
該方法は、肺、乳房、リン腺、胃腸管（例えば大腸）、および泌尿器管、前立腺、卵巣、咽頭でのような種々の器官系の悪性腫瘍、ならびに、ほとんどの癌、腎臓細胞癌腫、前立腺癌及び／又は睾丸腫瘍、非小細胞肺癌、小腸癌および食道癌のような悪性腫瘍を含む腺癌を治療するのに有用であり得る。治療可能な固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、上皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管上皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂肪腺腫癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎臓細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウイルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫が含まれる。
【０２２５】
語句「癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、呼吸器系癌腫、胃腸管系癌腫、泌尿器生殖器系癌腫、精巣腫瘍、乳癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫、黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を意味することが当業者によって認識される。癌腫の例には、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭部頸部、大腸および卵巣の組織から形成されるものが含まれる。本語句はまた、例えば、癌性および肉腫性組織からなる、悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。「癌肉腫（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）」は、腺組織から由来する癌腫、または見分けのつく腺構造からの腫瘍組織を意味する。
【０２２６】
語句「肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）」は、間葉細胞由来の悪性腫瘍を意味することが当業者によって認識される。
【０２２７】
該方法はまた、例えば脊髄、リンパまたは赤血球系統、またはそれらの前駆細胞から出来る、造血起源の過剰増殖／新生組織形成細胞の分化を阻害するために使用可能である。例えば、本発明は、急性プロ骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７にて掲載された）を限定しないが含む、種々の骨髄疾病の治療を含む。該方法によって治療されうるリンパ性悪性腫瘍には、Ｂ−系統ＡＬＬおよびＴ−系統ＡＬＬを含む、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が、限定はしないが含まれる。本発明の治療方法によって意図される、悪性リンパ腫のさらなる形態としては、限定はしないが、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）およびその変異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、巨大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）およびホジキン疾患があげられる。
【０２２８】
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを投与するための方法は、「薬理学的組成物（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」にて記述している。使用する分子の好適な用量は、対象の年齢および体重、および使用する特定の薬剤に依存しうる。リガンドは、例えば天然または病原性薬剤とＭＵＣ１−Ｈ間の、望まない相互作用を阻害、減少させるために、競合剤として使用可能である。
【０２２９】
１つの実施形態において、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを、癌性細胞、および正常、良性過形成および癌性細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、殺すまたは削除するために使用する。リガンドは、それ自身で、または薬剤、例えば細胞毒性薬剤、放射性核種と共役させて使用可能である。この方法には、リガンドのみ、または細胞毒性薬剤に接着させて、そのような治療を必要としている対象に投与することが含まれる。
【０２３０】
語句「細胞毒性薬剤（ｃｙｔｏｔｏｃｉｘ  ａｇｅｎｔ）」および「細胞成長抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」および「抗腫瘍剤（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｇｅｎｔ）」は、本明細書で相互互換的に使用され、過剰増殖細胞、例えば異常な癌細胞の、成長または増幅を阻害する（例えば細胞成長抑制剤）、または殺傷を誘導する特性を持つ薬剤を意味する。癌治療実施形態において、語句「細胞毒性薬剤」は、語句「抗癌（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ）」または「抗腫瘍（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ）」と相互互換的に使用され、新生、とりわけ固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移巣の発達または進展を阻害する薬剤を意味する。
【０２３１】
抗癌剤の非限定例には、例えば、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路を干渉可能な薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射、および（裸の抗体、免疫毒素および放射共役物を含む）他の腫瘍関連抗原に対する抗体が含まれる。特定の型の抗癌剤の例を、以下のように詳細に提供する。抗チューブリン／抗微小管、例えばパクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンオレルビン、タキソテア；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えばトポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、塩酸ピロキサントロン；代謝拮抗物質、例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキサート、ジェムシタビン、アクチビン、アラノシン（ａｌａｎｏｓｉｎｅ）、ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ａｓｐａｒａｔｅ）＝ＰＡＫＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ  ２’−デオキシシチジン、アラ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、窒素マスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール（４−ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）；他の活性機構を介して働く薬剤、例えばジヒドレンペロン（ｄｉｈｙｄｒｏｌｅｎｐｅｒｏｎｅ）、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、およびデシペプチド（ｄｅｓｉｐｅｐｔｉｄｅ）；インターフェロンのような、例えば抗腫瘍効果を増強するための、生物学的応答改変剤；アクチノマイシンＤのようなアポトーシス薬剤、および抗ホルモン、例えばタモキシフェンのような抗エストロゲン、または例えば、４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドのような抗アンドロゲン。
【０２３２】
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、正常上皮細胞を認識するので、リガンドが結合するような細胞は破壊される。あるいは、リガンドは、癌性細胞の周辺の細胞に結合し、それらを殺し、従って、栄養、増殖シグナルなどのために、周辺細胞に依存している可能性のある、癌性細胞を間接的に攻撃する。従って、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド（例えば細胞毒性で改変したもの）は、（癌性細胞それ自身を含む）癌性組織中の細胞を選択的に殺すか、または削除する。
【０２３３】
リガンドは、治療薬剤、放射線を放射する化合物、植物、真菌または細菌由来の分子、生物学的タンパク質およびこれらの混合物を含む、種々の細胞毒性薬剤を伝達するために使用しうる。細胞毒性薬剤は、例えば、本明細書で記述したような、短範囲、高エネルギーα−放射体を含む、短範囲放射線放射体のような、細胞内で活性している細胞毒性薬剤であり得る。
【０２３４】
酵素的に活性な毒素またはその断片の例は、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（シュードモナス  アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの）エキソトキシンＡ、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、特定のアレウリテス  ホルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、特定のジアンチンタンパク質（Ｄｉａｎｔｈｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、フィトラッカ  アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよＰＡＰ−Ｓ）、モロジカ  チャランチア（Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア  オフィチナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、およびエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）である。免疫毒性の酵素的に活性なポリペプチドを調製するための手順は、そのすべてが参考文献によって本明細書にて組み込まれている、国際特許第ＷＯ８４／０３５０８号、第ＷＯ８５／０３５０８号にて、および以下の付随する実施例にて記述されている。抗体に共役可能な細胞毒性部分の例には、アドリアミシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ネオカルジノスタチン（ｎｅｏｃａｒｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、およびプラチナ（ｐｌａｔｉｎｕｍ）が含まれる。
【０２３５】
ポリペプチド毒素の場合、組換え体核酸技術を、リガンド（またはそのポリペプチド要素）および細胞毒素（またはそのポリペプチド要素）を、転写融合物としてコードしている核酸を構築するために使用可能である。ついで組換え体核酸を、例えば細胞内で発現させ、コードされた融合ポリペプチドを単離する。
【０２３６】
ポリペプチドリガンド（例えば抗体）を、細胞毒素薬剤と共役するための手順は、すでに記述されてきた。クロラムブシルを、抗体と共役するための手順は、そのすべてが、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Ｆｌｅｃｈｎｅｒ（１９７３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：７４１−７４５、Ｇｈｏｓｅら（１９７２）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：４９５−４９９、およびＳｚｅｋｅｒｋｅら（１９７２）Ｎｅｏｐｌａｓｍａ，１９：２１１−２１５によって記述されている。ダウノマイシンとアドリアマイシンを抗体に共役させるための手順は、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｅ．ら（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１１７５−１１８１およびＡｒｎｏｎら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ，１：４２９−４４９にて記述されている。抗体−リシン共役物を調製するための手順は、そのすべてが参考文献によって本明細書に記述されている、米国特許第４，４１４，１４８号、およびＯｓａｗａ，Ｔ．ら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ  １：３７３−３８８およびそこで引用された参考文献によって記述されている。カップリングしている手順ははまた、そのすべてが参考文献によって組み込まれている、欧州特許出願第８６３０９５１６．２号にて記述されている。
【０２３７】
正常、良性過形成または癌性細胞を殺すまたは削除するために、第一ポリペプチドリガンドを、プロドラッグ活性剤に極めて近くにある場合にのみ活性化されるプロドラッグと共役させる。プロドラッグ活性剤を、第二ポリペプチドリガンド、好ましくは、標的分子上の非競合結合部位に結合するものに共役させる。２つのポリペプチドリガンドが、競合または非競合結合部位に結合するかどうか、は、従来の競合結合アッセイによって決定可能である。本発明の実施における使用に関する好適な薬物−プロドラッグ対は、Ｂｌａｋｅｌｙら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：３２８７−３２９２にて記述されている。
【０２３８】
あるいは、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、抗エネルギー放射線放射体、例えば、腫瘍部位に局在する場合に、種々の細胞直径の殺傷となる、１３１Ｉ、γ−放射体のような放射性核種と結合可能である。例えば、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ、「癌治療における放射標識抗体の治療的使用の、解析、結果および将来の予想（Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．）、ｐｐ  ３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５を参照のこと）。他の好適な放射性核種には、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔのようなα−放射体、１８６Ｒｅおよび９０Ｙのようなβ−放射体が含まれる。さらに、Ｌｕ１１７もまた、画像化および細胞毒性薬剤両方として使用しうる。
【０２３９】
１３１Ｉ、９０Ｙおよび１７７Ｌｕにて標識化した抗体を用いた放射免疫治療（ＲＩＴ）は、極めて熱心な臨床試験の状況にある。これらの３つの核種の物理学的特性に有意な差違があり、結果として、放射性核種の選択は、腫瘍への最大放射容量を伝達するために、非常に重要である。９０Ｙのより高いベータエネルギー粒子が、大きな腫瘍に対して効果的である可能性がある。１３１Ｉの比較的低いエネルギー粒子が、理想的であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏにて、放射ヨウ化分子の脱ハロゲン化が、抗体の内在化に対して主な不利点である。一方、１７７Ｌｕは、ただ０．２〜０．３ｍｍ範囲の、低エネルギーベータ粒子を持ち、９０Ｙと比較して、骨髄に対して、非常に低い放射容量を伝達する。さらに、より低い物理的半減期（９０Ｙと比較して）のため、腫瘍滞留時間はより高い。結果として、１７７Ｌｕ標識化薬剤のより高い活性（高いｍＣｉ量）を、骨髄に対して比較的低い放射容量で投与可能である。種々の癌の治療において、１７７Ｌｕ標識化抗体の使用を研究している、種々の臨床研究が存在する。（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｔ．ら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１４４７−１４５４、Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９６）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３７：１４９１−１４９６、Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．ら（１９９７）Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６５：９４−１０１）
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、通常の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を介して抗原提示細胞を排除するために、直接ｉｎ  ｖｉｖｏで用いてよい。本発明のポリペプチドリガンドには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３からのＦｃ部分、または補体と結合したＩｇＭの相当する部分などのエフェクター領域に結合する補体が含まれてよい。ある実施形態では、標的細胞集団を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて本発明の結合剤、および適切なエフェクター細胞で処理する。この処理は補体または補体を含む血清を添加することにより補足してよい。さらに、補体タンパク質の結合により、本発明のポリペプチドリガンドで被覆した標的細胞の食作用を向上させることができる。他の実施形態標的では、補体結合エフェクター領域を持つポリペプチドリガンドで被覆した細胞を補体により溶解させる。
【０２４０】
また、本発明は、抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを予防的に用いることに関与する殺菌または除去手段も包括する。例えば、これらの物質を、癌の発達または進行を防ぐ、または遅らせるために用いてよい。
【０２４１】
癌の治療のために本発明の治療的手段を利用することには多くの利点がある。ポリペプチドリガンドはＭＵＣ１−Ｈを特異的に認識するため、その他の組織は残され、高濃度の薬剤が直接、治療を必要とする部位に行き渡る。本発明に従った治療は、臨床的なパラメーターにより効果的に測定することができる。あるいは、これらのパラメーターはそのような治療が採用されるべきときに指し示すために用いてよい。
【０２４２】
本発明の抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドは、癌治療におけるひとつまたはそれ以上の現存する療法と組み合わせて用いてよく、その療法としては手術、放射線療法、および化学療法があげられるが、それらに限定されるものではない。
【０２４３】
I．診断への利用
ＭＵＣ１−Ｈに結合するポリペプチドリガンドおよび本明細書に描写した及び／又は本明細書に詳述した方法類により同定されるポリペプチドリガンドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで診断的、治療的、および予防的に利用可能である。
【０２４４】
ある態様では、本発明によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、組織、例えば癌にかかった組織の生検のような生物学的試料）またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、対象のｉｎ  ｖｉｖｏ画像化）でＭＵＣ１−Ｈの存在を検出する診断手法が得られる。
【０２４５】
本手法には、（ｉ）試料と抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドの接触、（ｉｉ）抗ＭＵＣ１‐Ｈリガンドと試料の複合体構造の検出が含有される。本手法にはまた、参照試料（例えば対照試料）とリガンドの接触、および参照試料と同様にリガンドと試料の複合体構造の広がりの測定も含有されてよい。対照試料または対照患者に関連した試料、または患者における複合体構造における変化、例えば統計学的に有意な変化は、試料中のＭＵＣ１‐Ｈの存在により示される。
【０２４６】
他の手法には、（ｉ）患者への抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドの投与、および（ｉｉ）抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドと患者との複合体構造の検出が含有される。この検出には複合体構造の局在または時間を決定することが含まれる。
【０２４７】
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを検出可能な物質により直接または間接的に標識することにより、結合した、または結合していない抗体の検出を容易にすることができる。適切な検出可能物質としては、様々な酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、および放射線物質があげられる。
【０２４８】
抗ＭＵＣ１−ＨリガンドおよびＭＵＣ１−Ｈの複合体構造は、ＭＵＣ１−Ｈに結合したリガンドか、または結合していないリガンドのどちらかを測定または明視化することにより検出することができる。従来の検出アッセイ、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を利用してよい。抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドの標識に加え、ＭＵＣ１−Ｈの存在についても検出可能な物質で標識した対照と標識していない抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを用いた競合免疫検定を試料内で行なってよい。このアッセイの1つの例では、生物学的試料、標識した対照、およびＭＵＣ１−Ｈ結合剤を混合して、標識していないリガンドに結合した標識対照の数を測定する。試料内のＭＵＣ１−Ｈの数は、ＭＵＣ１−Ｈ結合剤に結合した標識対照の数に反比例する。
【０２４９】
蛍光体および発色団で標識したポリペプチドリガンドを調製することができる。抗体およびその他のタンパク質は、波長約３１０ｎｍまでの光を吸収するので、蛍光部位としては実質波長約３１０ｎｍ以上、好ましくは４００ｎｍ以上の吸収するものを選択する必要がある。様々な適切な蛍光体および発色団がＳｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６２：５２６およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ら（１９７２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：８４３〜８６８に記載されている。ポリペプチドリガンドは、米国特許第３，９４０，４７５号、第４，２８９，７４７号、および第４，３７６，１１０号にて開示されたような従来の手順によって、蛍光発色団によって標識化可能である。以上で記述した多くの望む特性を持つ蛍光の１つの手段は、キサンチン色素（ｘａｎｔｈｅｎｅ  ｄｙｅｓ）であり、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｓ）とローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ）が含まれる。他の蛍光化合物は、ナフチルアミン（ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｎｅｓ）である。蛍光団または発色団でいったん標識したならば、ポリペプチドリガンドを、例えば、（共焦点または解析顕微鏡のような）蛍光顕微鏡を用いて、試料中のＭＵＣ１−Ｈの存在または局在化を検出するために使用可能である。
【０２５０】
１．組織学的解析
免疫組織化学を、本明細書で記述したポリペプチドリガンドを用いて実施可能である。例えば、抗体の場合、抗体を、（精製またはエピトープタグのような）標識でとともに合成可能であり、または例えば、標識または標識結合基と共役することによって、検出標識可能である。例えば、キレーターを抗体に結合可能である。ついで抗体を、組織学的調製物、例えば、顕微鏡スライド上での、組織の固定切片に接触させる。結合のために培養した後、調製物を洗浄して、結合しない抗体を除去する。ついで調製物を、例えば、顕微鏡を用いて解析して、調製物に抗体が結合したかを同定する。
【０２５１】
もちろん、抗体（または他のポリペプチドまたはペプチド）を、結合時に非標識化可能である。結合および洗浄の後、検出可能にするために、抗体を標識する。
【０２５２】
２．タンパク質配列
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドをまた、タンパク質配列上に固定化可能である。タンパク質配列は、診断ツール、例えば、（単離細胞、血液、血清、生検などのような）医学的試料を選別するために、使用可能である。もちろん、タンパク質配列はまた、他のリガンド、例えばＭＵＣ１−Ｈに結合するもの、を含むことが可能である。
【０２５３】
ポリペプチド配列を産出する方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９８９−９９４、Ｌｕｅｋｉｎｇら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１、Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：ｅ３、ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３、国際特許第０１／４０８０３号および第９９／５１７７３Ａ１号にて記述されている。配列のためのポリペプチドは、例えば市販されている自動化機械、例えばジェネティック  マイクロシステムズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ）およびアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｏｒｉｘ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）またはバイオロボティクス（ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からのものを用いて、高速でスポット可能である。配列基質は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改変ガラスであり得る。配列はまた、多孔性マトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは他のポリマーを含みうる。
【０２５４】
例えば、配列は、例えば、上記Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔにて記述されたような、抗体の配列であり得る。ポリペプチドリガンドを産出する細胞を、配列フォーマットで、フィルター上で増殖可能である。ポリペプチド産出を誘導し、発現したポリペプチドを、細胞の局所にてフィルターに固定化する。
【０２５５】
タンパク質配列を、多様性鎖ライブラリーからの、各固定化ポリペプチドへの標的の結合程度を決定するために、標識化標的と接触可能である。標的が標識化されていない場合、サンドイッチ方法を、例えば、標識プローブを用いて、使用して、未標識化標的の結合を検出可能である。
【０２５６】
配列の各アドレスでの結合の程度に関する情報は、例えばコンピュータデータベース内で、プロファイルとして保存可能である。タンパク質配列を、複製で産出可能であり、例えば標的と非標的の結合プロファイルを比較するために使用可能である。従って、タンパク質配列を、１つまたはそれ以上の分子に関連して、望む結合特性を持つ多様性鎖ライブラリーの個々のメンバーを同定するために使用可能である。
【０２５７】
３．ＦＡＣＳ（蛍光細胞分析分離装置（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドを、細胞、例えば試料（例えば患者試料）中の細胞を標識するために使用可能である。リガンドはまた、蛍光化合物に結合する（または結合可能である）。ついで細胞を、蛍光細胞分析分離装置（例えば、ベクトン  ディッキンソン  イムノサイトメトリー  システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な分離装置を用いて、また、米国特許第５，６２７，０３７号、第５，０３０，００２号、および第５，１３７，８０９号も参照のこと）を用いて分離可能である。分離装置を通った細胞として、レーザー光線が、蛍光化合物を励起し、一方、検出器が、通過した細胞を計数し、蛍光を検出することによって、蛍光化合物が、細胞に結合しているかどうかを決定する。各細胞に結合した標識の量を、定量し、解析して、試料を特徴づけることが出来る。
【０２５８】
分離装置はまた、細胞を屈折させ、リガンドに結合しなかった細胞から、リガンドに結合した細胞を分離可能である。分離した細胞を培養し、及び／又は特性化可能である。
【０２５９】
４．Ｉｎ  ｖｉｖｏでの画像化
別の実施形態においては、本発明により、ＭＵＣ１−Ｈを発現した癌にかかった組織の存在を、ｉｎ  ｖｉｖｏで検出する手法が得られる。その手法には（ｉ）対象（例えば、癌または過形成疾患にかかった患者）への、検出可能なマーカーに結合させた抗ＭＵＣ１−Ｈ抗体の投与、（ｉｉ）対象に対し、ＭＵＣ１−Ｈを発現した組織または細胞に対する前述の検出可能なマーカーを検出する方法を行なうことが含有される。例えば、ＮＭＲまたはその他の断層撮影法などにより患者の画像化を行なう。
【０２６０】
本発明に従った診断的画像化に有用な標識の例としては、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１８８Ｒｈなどの放射線標識、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などの蛍光体標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放射断層撮影（“ＰＥＴ”）スキャナーで検出できるような陽電子放射同位体、ルシフェリンなどの化学発光体、および過酸化酸素またはリン酸などの酵素的標識などがあげられる。狭い範囲の検出プローブにより検出可能な同位体などの、狭い範囲の放射線放射体も利用してよい。ポリペプチドリガンドは公知の技術によりそれらの試薬で標識してよい。例えば、抗体の放射線標識技術に関する、Ｗｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒら（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２ー８１６を参照のこと。
【０２６１】
本発明の放射線標識リガンドはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断試験にも利用してよい。同位体標識したリガンドの特異的な活性は半減期、放射性のある標識の同位体の精度、および標識がどのように抗体に組み込まれているか、に依存する。
【０２６２】
ポリペプチドを放射性同位体（例えば１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ）で標識する手法は公知である。例えば、トリチウム標識の手法は米国特許第４，３０２，４３８号に記載されている。ヨウ素標識、トリチウム標識、および３５Ｓ標識の手法は例えば、マウスのモノクローナル抗体に適合させたものでは、例えばＧｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）ｐｏｌｙｐｅｐｕｔｉｄｅ．１２４ー１２６）およびそこに引用されている参考文献に記載されている。抗体などのポリペプチドを標識するその他の手法は、Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５、Ｄａｖｉｄら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４ー１０２１、および米国特許第３，８６７，５１７号よび第４，３７６，１１０号に記載されている。画像化において有用な放射標識元素としては、例えば、１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃがあげられる。抗体をヨウ素標識する手法はＧｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．ら（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９：１１４ー１２３；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９ー３０５；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．ら（１９７１）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８：２８９ー２９７に記載されている。９９ｍＴｃ標識の手法は、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．らｉｎ  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．ら（ｅｄｓ．），Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｓｓｏｎ  １１１ー１２３（１９８２）およびそこで引用されている参考文献に記載されている。抗体を１１１Ｉｎ標識する適切な手法はＨｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．ら（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：１４７ー１５７、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．ら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ３５：５５４−５５７，およびＢｕｃｋｌｅｙ，  Ｒ．Ｇ．ら（１９８４）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．Ｌｅｔｔ．１６６：２０２ー２０４に記載されている。
【０２６３】
放射線標識したリガンドの場合、患者に投与したリガンドは、リガンドが再反応する抗原を持つ腫瘍に局在化し、ガンマカメラまたは放射断層撮影機法などを用いた放射性核種スキャニングなどの公知の技術により検出または“画像化”される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌら「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら，（ｅｄｓ．），ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．６５ー８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと。あるいは、ブルックヘブン国立研究所あるＰｅｔ  VIのような陽電子放射断層撮影スキャナーも、放射線放射陽電子（例えば１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）の検出に用いてよい。
【０２６４】
５．ＭＲＩ対照剤
磁気共鳴画像（ＭＲＩ）ではＮＭＲを利用して生体の内部造形を明視化するが、これは予測、診断、治療、および手術に有効に活用できる。ＭＲＩは明白な利益のために放射性トレーサー混合物を用いずに利用できる。ＭＲＩ技術のいくつかは公開された欧州特許出願ＥＰ‐Ａ‐０  ５０２  ８１４号に要約されている。一般的に、異なる環境におけるプロトンの定数Ｔ１およびＴ２の緩和時間に関する違いを利用して画像を得る。しかしながら、これらの違いから、鮮明な、高度に分析された画像を得るには不十分である。
【０２６５】
これらの緩和時間定数の違いは対照剤により増大させることができる。そのような対照剤の例としては、多くの磁性剤、常磁性剤（最初にＴ１を変更する）および強磁性剤または超常磁性剤（最初にＴ２反応を変更する）があげられる。いくつかの常磁性物質（例えばＦｅ＋３、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）をつけるために（および毒性を弱めるために）キレート団（例えばＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびＮＴＡキレート）をＭＵＣ１−用いてよい。その他の薬剤は例えば直径約１０ｎＭから１０μｍ以下の粒子の状態であってよい。粒子には強磁性、反強磁性、または超強磁性であってよい。粒子としては、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、γ‐Ｆｅ２Ｏ３、フェライト、および遷移元素のその他の磁性鉱物化合物があげられる。磁性粒子にはひとつまたはそれ以上の磁性結晶が、非磁性物質と一緒に、および非磁性物質なしで含まれてよい。非磁性物質としては、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなどの合成または天然ポリマーであってよい。
【０２６６】
抗ＭＵＣ１−Ｈリガンドはまた、ＮＭＲ‐活性１９Ｆ原子、または多数のそのような原子の大部分を含む指示基で標識してもよい。それは（ｉ）実質自然に豊富な全てのフッ素原子は１９Ｆ同位体であり、従って実質全てのフッ素を含む化合物はすべてＮＭＲ‐活性である、（ｉｉ）無水トリフルオロ酢酸のような化学的に活性な多重フッ化化合物の多くは比較的低コストで市販に入手可能であること、および（iii）多くのフッ化化合物は、過フッ素ポリエーテルがヘモグロビン交換として酸素を運ぶために利用されることのように、ヒトにおける利用が医学的に許容可能であるとわかっていることからである。前述の時間インキュベートした後、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４６：７８ー８８に記載のもののひとつのように装置を用いて全身ＭＲＩを行ない、癌組織の位置確認および画像化する。
【０２６７】
ＭＵＣ１−Ｈに結合するポリペプチドリガンドを含むキット、および診断への利用、例えば抗ＭＵＣ１−Ｈリガンド（例えば、抗体または抗原結合断片自体、またはその他のポリペプチドまたはペプチド）を用いて、例えば癌または過形成疾患にかかっている患者由来の生検または細胞の試料についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または、対象を画像化することによりｉｎ  ｖｉｖｏで、ＭＵＣ１−Ｈを検出することに関する使用説明書についても、本発明の範囲に含まれる。本キットにはさらに、標識または付加的な診断薬などの少なくともひとつの付加的な試薬が含まれてよい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの利用では、リガンドは薬理学的組成で考案されてよい。
【０２６８】
下記の発明について下記の例によりさらに説明するが、それらの実施例は本発明をさらに限定するものであると解釈されるべきではない。すべての引例の内容は、係属中の特許明細書および公開された特許であり、本明細書を通して引用されているが、ここで明確にその全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【０２６９】
本発明を特にその好ましい実施形態に関して示し、記載する一方で、形態や詳細における様々な変化が、付記した特許請求の範囲を包含する本発明の範囲から逸脱することなく、ここになされることを、当業者は理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】図１は、ＭＵＣ１アミノ酸配列（配列番号：１）を表している。ＭＵＣ１−Ｈ（「Ｓｔｕｂｂｌｅ」）配列（配列番号：２）は、アミノ酸３１８〜３８２であり、別の開裂部位によって形成された、別のＳｔｕｂｂｌｅタンパク質（配列番号：３）は、全長ＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸３３１〜３８２より広がる（配列番号：１）。
【図２】図２は、ＭＵＣ１／ＸおよびＭＵＣ１／Ｘ／ａｌｔアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：４および配列番号：５）を表している。
【図３】図３は、ＭＵＣ１／ＹおよびＭＵＣ１／Ｙ／ａｌｔアミノ酸配列（それぞれ、配列番号：６および配列番号：７）を表している。
【図４】図４は、ＭＵＣ１／ＶおよびＭＵＣ１／Ｖ／ａｌｔ（それぞれ、配列番号：８および配列番号：９）を表している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2006504630.tif 000018