(57)【要約】本発明は、組換え細胞からの転写調節されるタンパク質の分泌を調節するための組成物及び方法を提供する。より詳細には、本発明は、プレプロインスリンｍＲＮＡ転写産物のナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解を使用して組換え細胞からのヒトインスリンの分泌ダイナミクスを加速するための組成物及び方法を提供する。
2006506044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節されるインスリンタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する核酸であって、ここで、前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が、ナンセンス変異を介さずに転写調節されるインスリンタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有する、前記核酸。
【請求項２】
前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が未熟終結シグナルを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記未熟終結シグナルが、転写調節されるインスリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約３５０−１６５０ヌクレオチド上流に位置する、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約６００−８００ヌクレオチド上流に位置する、請求項３に記載の核酸。
【請求項６】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約７００ヌクレオチド上流に位置する、請求項３に記載の核酸。
【請求項７】
前記追加の核酸配列が、少なくとも１コピーのプレプロインスリンポリヌクレオチドを含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項８】
前記追加の核酸配列が、約２コピーのプレプロインスリンポリヌクレオチドを含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項９】
配列番号２に定義する核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号３に定義する核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】
配列番号４に定義する核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１２】
転写調節されるインスリンタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する異種核酸を含む、単離された哺乳類非β細胞であって、ここで、前記インスリンタンパク質が前記細胞によって分泌され、前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物がナンセンス変異を介さずに転写調節されるインスリンタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有する、前記非β細胞。
【請求項１３】
前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が未熟終結シグナルを含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記未熟終結シグナルが、転写調節されるインスリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記異種核酸が配列番号２に定義する核酸配列を含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１６】
前記異種核酸が配列番号３に定義する核酸配列を含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
前記異種核酸が配列番号４に定義する核酸配列を含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１８】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約３５０−１６５０ヌクレオチド上流に位置する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１９】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約６００−８００ヌクレオチド上流に位置する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２０】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約７００ヌクレオチド上流に位置する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２１】
前記追加の核酸配列が、少なくとも１コピーのプレプロインスリンポリヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２２】
前記追加の核酸配列が、２コピーのプレプロインスリンポリヌクレオチドを含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細胞が肝細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項２５】
治療有効量の、請求項１２に記載の細胞を患者に投与することを含む、その必要のある患者を治療する方法。
【請求項２６】
前記疾患が糖尿病である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
転写調節されるタンパク質の分泌を下方調節するための方法であって、
ａ）異種核酸を細胞に導入すること、ここで、前記核酸が、転写調節されるタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を転写する；及び
ｂ）前記タンパク質が前記細胞によって分泌され、前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物がナンセンス変異を介さずに転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有するように、前記転写調節されるタンパク質をコードする前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する異種核酸を発現させること；
それによって前記タンパク質の分泌を下方調節すること、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
前記転写調節されるタンパク質がインスリンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インスリンがヒトインスリンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記異種核酸がプレプロインスリンをコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が未熟終結シグナルを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記未熟終結シグナルが、転写調節されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写産物の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約３５０−１６５０ヌクレオチド上流に位置する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約６００−８００ヌクレオチド上流に位置する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約７００ヌクレオチド上流に位置する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記追加の核酸配列が、１又はそれ以上のプレプロインスリンタンパク質コード配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞又は真菌細胞から成る群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が動物細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が肝細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が非β細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
請求項２７に記載の方法を用いて産生される細胞。
【請求項４３】
治療有効量の、請求項４２に記載の細胞を患者に投与することを含む、その必要のある患者を治療する方法。
【請求項４４】
前記患者が糖尿病を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
異種核酸を非β細胞に導入することを含む、プレプロインスリンｍＲＮＡの分解を促進することによってインスリンの分泌ダイナミクスを調節する方法であって、ここで、前記異種核酸がプロモーターに作動可能に連結されたプレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドを含有し、及び前記異種核酸から転写されるｍＲＮＡ転写産物が未熟終結シグナルを含有し、それによってプレプロインスリンｍＲＮＡの分解を促進することによりインスリンの分泌ダイナミクスを調節する、前記方法。
【請求項４６】
前記挿入される未熟終結シグナルが、プレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドの終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約３５０−１６５０ヌクレオチド上流に位置する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約６００−８００ヌクレオチド上流に位置する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記終止コドンが前記ポリアデニル化配列の約７００ヌクレオチド上流に位置する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記未熟終結シグナルが、少なくとも１コピーのプレプロインスリンポリヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記未熟終結シグナルが、２コピーのプレプロインスリンポリヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記非β細胞がヒト細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記非β細胞が肝細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４５に記載の方法を用いて産生される細胞。
【請求項５５】
治療有効量の、請求項５４に記載の細胞を患者に投与することを含む、その必要のある患者を治療する方法。
【請求項５６】
前記疾患が糖尿病である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦研究助成への謝意
本発明は、少なくとも一部は、全米科学財団（授与番号ＥＥＣ−９７３１６４３）からの助成金を得て為された。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明の分野は、転写調節されるタンパク質の分泌のダイナミクス及びｍＲＮＡの安定性を調節する手法である。
【０００３】
これらの手法は、インスリン依存性糖尿病についての細胞ベースの治療において有用なツールである、インスリン分泌のダイナミクスを改善するために特に有用である。
【０００４】
背景技術
インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤ）を治療するための細胞ベース療法は、毎日のインスリン注射よりも非侵襲的に血中グルコースレベルのより生理的な調節を提供することができる。細胞供給は、ＩＤＤの治療のための細胞ベース療法を開発する上で決定的に重要な問題を構成している。グルコース応答性インスリン分泌のための非β細胞、特に幹由来の非β細胞の遺伝子工学技術は、インスリン依存性糖尿病のための細胞ベース療法の開発において重要な展望を提供する。生理的刺激に対する応答性は、グルコースによって上方調節され、そしておそらくインスリンによって下方調節されるプロモーターを使用することにより、遺伝子転写レベルで導入される（Ｔｈｕｌｅら、２０００  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：２０５−１４；Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．とＬｉｕ，Ｊ．Ｍ．、２０００  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２；Ｌｅｅら、２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４８３−８；Ｂａｒｒｙら、２００１  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１３１−９；Ｃｈｅｎら、２００１  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：５８４−９０）。
【０００５】
このコンセプトに基づき、グルコース調節性インスリン発現は、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導性糖尿病げっ歯類において実現された（Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．とＬｉｕ，Ｊ．Ｍ．２０００  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２；Ｌｅｅら、２０００  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：４８３−８；Ｂａｒｒｙら、２００１  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１３１−９；Ｃｈｅｎら、２００１  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：５８４−９０）。これらの細胞の大きな利点は、それらが潜在的に自己由来であり、患者からの生検材料として回収されることである。これらの細胞の難点は、転写制御される細胞が緩慢な分泌ダイナミクスを示し、それ故、そのままでは、より高度の糖尿病の動物及びヒトにおいて正常血糖を達成するには適さないと考えられることである。分泌下方調節のダイナミクスを促進するためには、転写が終結した後すぐに翻訳が停止する必要がある。特に重要なのは、分泌下方調節の緩慢なダイナミクスであり、これは結果として、刺激が除かれた後長く細胞がインスリンを分泌することとなり、したがって、これらの細胞を用いる治療は、糖尿病を深刻な病的状態である高インスリン血症及び低血糖症へと逆戻りさせることがある。
【０００６】
プレプロインスリン（ＰＰＩ）  ｍＲＮＡの長期的安定性は分泌下方調節の緩慢化を生じさせることが示唆された（Ｅｆｒａｔ，Ｓ．，１９９８、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１：１４０１−９；Ｄｏｎｇ，Ｈ．とＷｏｏ，Ｓ．Ｌ．，２００１  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１２：４４１−６）。非β細胞におけるＰＰＩ  ｍＲＮＡ半減期に関するこれまでの報告は限られているが、正常及び形質転換β細胞からのデータは、ＰＰＩ  ｍＲＮＡの安定性が分泌下方調節を促進する上での制限因子であることを強く示唆する。単離一次ラット膵島において、ＰＰＩ  ｍＲＮＡの半減期は、高血糖（１７ｍＭ）下で７７時間、低血糖（３．３ｍＭ）下で２９時間と算定された（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１３５８５−９）。βＴＣ−３  インスリノーマでは、転写が停止した後２４時間にわたって最小限のＰＰＩ  ｍＲＮＡ分解しか存在しなかったが（Ｓｃｈｕｐｐｉｎ，Ｇ．Ｔ．とＲｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ｊ．，１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１３：２５９−６８）、一方、ＲＩＮ−５Ｆ  インスリノーマにおけるＰＰＩ  ｍＲＮＡの半減期は、高（２０ｍＭ）血糖下及び低（３ｍＭ）血糖下でそれぞれ５８時間及び２６時間であることが認められた（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１３５８５−９）。
【０００７】
ｍＲＮＡ安定性の調節の問題は現在熱心に検討されている（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｊ．とＢｒｅｗｅｒ，Ｇ．，２００１、Ｇｅｎｅ  ２６５：１１−２３；Ｃｌａｙｔｏｎ，Ｃ．Ｅ．，２００２、Ｅｍｂｏ．Ｊ．２１：１８８１−８；ｖａｎ  Ｈｏｏｆ，Ａ．とＰａｒｋｅｒ，Ｒ．，２００２、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：Ｒ２８５−７）。特にＰＰＩ  ｍＲＮＡに関して、ｍＲＮＡの代謝回転速度を加速するために、アンチセンスＲＮＡの使用（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら、１９９６、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５：Ｓ５５−７）、あるいはサイトカインをコードするもののようないくつかの不安定なｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）にインスリン遺伝子を連結することが考慮されてきた（Ｄｏｎｇ，Ｈ．とＷｏｏ，Ｓ．Ｌ．，２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１２：４４１−６）。しかしながら、これらのシステムは１より多くの構築物の使用を必要とするか、又は完全には成功しないことが示されている。
【０００８】
近年、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡの分解（ＮＭＤ）が、その生物学的及び医学的重要性の故に著しい注目を集めている（Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．とＫｕｌｏｚｉｋ，Ａ．Ｅ．，１９９９、Ｃｅｌｌ  ９６：３０７−１０；Ｗｉｌｕｓｚ，Ｃ．Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．及びＰｅｌｔｚ，Ｓ．Ｗ．，２００１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：２７８１−５；Ｂｙｅｒｓ，Ｐ．Ｈ．，２００２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：３−６；Ｍａｑｕａｔ，Ｌ．Ｅ．，２００２、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２：Ｒ１９６−７）。未熟終止コドンを有する突然変異体のｍＲＮＡはサーベイランス機構によって細胞により検出され、ＮＭＤに供される（Ｌｉ，Ｓ．とＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｆ．，１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８，１３５−４１；Ｐｕｌａｋ，Ｒ．とＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．，１９９３、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７，１８８５−９７）。ＮＭＤはおそらく、インビボで異常なｍＲＮＡを排除するように進化したと考えられる。
【０００９】
一般にタンパク質分泌、および特にインスリン分泌のダイナミクスを調節することの困難さゆえに、組換え細胞からのタンパク質分泌の効率とダイナミクスを改善するための手法が当該技術分野において求められている。
【００１０】
発明の概要
先行技術に関連する１つ又はそれ以上の困難さ又は欠陥を克服することあるいは少なくとも軽減することが、本発明の１つの目的である。それに関して、本発明は、一般に、組換え細胞からのタンパク質分泌のダイナミクスを改善及び調節する組成物及び方法、そして好ましくは、組換え細胞からのインスリン分泌のダイナミクスを調節する組成物及び方法を提供する。本明細書において提供する方法及び組成物は、１つの構築物を使用したタンパク質分泌のダイナミクスの調節を可能にするものであり、それはタンパク質分泌を調節する過程を大きく単純化する。
【００１１】
本明細書において提供する本発明は、転写調節されるタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が、ナンセンス変異を介さずに転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有する、インスリンなどの転写調節タンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する核酸を包含する。好ましい実施形態では、前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物は未熟終結シグナルを含む。好ましくは、前記未熟終結シグナルは、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部分の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む。
【００１２】
本明細書において提供する本発明は、転写調節インスリンタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する異種核酸を含む哺乳類非β細胞をさらに包含し、ここで、前記インスリンタンパク質がその細胞によって分泌され、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が、ナンセンス変異を介さずに転写調節されるインスリンタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有する。好ましい実施形態では、前記非β細胞はヒト肝細胞である。
【００１３】
本発明はさらに、転写調節されるタンパク質の分泌を下方調節するための方法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、ａ）異種核酸を細胞に導入すること、ここで、前記核酸が転写調節されるタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を転写する；及びｂ）前記タンパク質が前記細胞によって分泌され、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物がナンセンス変異を介さずに転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有するように、前記転写調節タンパク質をコードする前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する異種核酸を発現させること；それによって前記タンパク質の分泌を下方調節すること、を含む。本発明は、異種核酸を非β細胞に導入することを含み、ここで、前記異種核酸がプロモーターに作動可能に連結されたプレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドを含有し、及び前記異種核酸から転写されるｍＲＮＡ転写産物が未熟終結シグナルを含有し、それによって、プレプロインスリンｍＲＮＡ転写産物の分解を促進することによりインスリンの分泌ダイナミクスを調節することを含む、プレプロインスリンｍＲＮＡの分解を促進することによってインスリンの分泌ダイナミクスを調節する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、転写調節されるタンパク質はヒトインスリンである。１つの実施形態では、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物は、転写調節されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写産物の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む、未熟終結シグナルを含有する。
【００１４】
発明の詳細な説明
出願人は、転写調節されるインスリンタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する核酸及びこれらの核酸を含む細胞が、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生しない核酸と比較して、組換え細胞からのタンパク質分泌の改善された調節をもたらすことを明らかにした。本発明に包含される方法及び組成物は、１個の構築物を使用したタンパク質分泌のダイナミクスの調節を可能にし、それは、アンチセンス又はＲＮＡ干渉テクノロジーの使用などの他の既知の手法と比較してタンパク質分泌を調節する過程を大きく単純化する。
【００１５】
本明細書において提供する本発明は、インスリンなどの転写調節タンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する核酸を包含し、ここで、前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物が、ナンセンス変異を介さずに転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有する。
【００１６】
本明細書において提供する本発明は、転写調節インスリンタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する異種核酸を含む哺乳類非β細胞をさらに包含し、ここで、インスリンタンパク質が前記細胞によって分泌され、および、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物がナンセンス変異を介さずに転写調節されるインスリンタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有する。好ましい実施形態では、前記非β細胞はヒト肝細胞である。
【００１７】
本発明は、転写調節されるタンパク質の分泌を下方調節するための方法をさらに提供する。１つの実施形態では、前記方法は、ａ）異種核酸を細胞に導入すること、ここで、前記核酸が転写調節されるタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を転写する；及びｂ）前記タンパク質が前記細胞によって分泌され、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物がナンセンス変異を介さずに転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも短い半減期を有するように、前記転写調節タンパク質をコードする前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を産生する異種核酸を発現させること；それによって前記タンパク質の分泌を下方調節すること、を含む。本発明は、異種核酸を非β細胞に導入することを含み、ここで、前記異種核酸がプロモーターに作動可能に連結されたプレプロインスリンをコードするポリヌクレオチドを含有し、及び前記異種核酸から転写されるｍＲＮＡ転写産物が未熟終結シグナルを含有し、それによって、プレプロインスリンｍＲＮＡの分解を促進することによりインスリンの分泌ダイナミクスを調節することを含む、プレプロインスリンｍＲＮＡの分解を促進することによってインスリンの分泌ダイナミクスを調節する方法をさらに提供する。好ましい実施形態では、転写調節されるタンパク質はヒトインスリンである。
【００１８】
上述した組成物及び方法の好ましい実施形態では、前記ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物は未熟終結シグナルを含む。好ましくは、前記未熟終結シグナルは、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む。
【００１９】
特に異なる記載がない限り、本明細書において使用する用語は関連技術分野の当業者による慣例的用法に従って理解されるものとする。下記に述べる用語の定義に加えて、分子生物学における一般的用語の定義は、Ｒｉｅｇｅｒら、１９９１  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，第５版、Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，の合弁会社（１９９８補遺）の中にも見出される。本明細書及び特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」又は「ａｎ」は、使用される文脈に応じて、１又はそれ以上を意味しうる。それ故、例えば「１細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、少なくとも１つの細胞が使用できることを意味しうる。
【００２０】
本発明は、下記の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明及び本明細書に含まれる実施例を参照することによってより容易に理解されうる。しかしながら、本発明の組成物及び方法を開示し説明する前に、本発明が、特定の核酸、特定のポリペプチド、特定の細胞型、特定の宿主細胞、特定の条件、又は特定の方法等に限定されず、それ自体、言うまでもなく変化しうるものであることが了解されるべきであり、またそれらにおける多くの修正及び変更が当業者には明白である。本明細書において使用される用語が、特定の実施例を説明することを目的とするのみであり、限定を意図しないこともまた、了解されるべきである。
【００２１】
本発明は、インスリンなどの、転写調節されるタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を発現する核酸を提供する。好ましい実施形態では、本発明の核酸配列は組換えＤＮＡ手法によって産生される。例えば、転写調節されるポリペプチドをコードする核酸分子をベクターに（下記に述べるように）クローン化し、前記ベクターを宿主細胞に（下記に述べるように）導入して、前記転写調節ポリペプチドを前記宿主細胞において発現させるか、又は前記核酸を前記宿主細胞のゲノムに挿入してもよい。前記転写調節ポリペプチド又は前記転写調節ポリペプチドをコードする核酸を、その後、標準的なポリペプチド精製手法を用いた適切な精製スキームによって前記細胞から単離することができる。あるいは、異種ヌクレオチドの発現レベルを、ノーザンブロット法などの当該技術分野においてよく知られている手法を用いて測定することができる。本発明の目的のために、「組換え核酸」の語は、遺伝子操作によって変化した、再編成された又は修飾されたポリヌクレオチドを指す。その例には、いずれのクローン化ポリヌクレオチド、及び異種配列に連結又は結合されたポリヌクレオチドも含まれる。「組換え」の語は、偶発突然変異などの天然に起こる事象から生じるポリヌクレオチドへの変化を意味しない。
【００２２】
本明細書において使用するとき、「組換え核酸分子」の語は、遺伝子工学手法又は化学合成によるポリヌクレオチドの単離セグメントの人工的操作によって実現される配列の２つの別な方法で分離したセグメントの組合せによって作られるものを意味する。それを行う場合、所望の機能のポリヌクレオチドセグメントを結合させて、所望の機能の組合せを生成しうる。
【００２３】
また、本明細書において使用するとき、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は、直鎖又は分岐鎖、一本鎖又は二本鎖、あるいはそれらのハイブリッドであるＲＮＡ又はＤＮＡを意味する。この語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。これらの語はまた、遺伝子のコード領域の３’及び５’末端の両方に位置する非翻訳配列：遺伝子コード領域の５’末端から上流の少なくとも約１０００ヌクレオチドの配列及び遺伝子コード領域の３’末端から下流の少なくとも約２００ヌクレオチドの配列を包含する。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンその他のようなあまり一般的でない塩基もまた、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ及びリボザイム対合のために使用できる。例えば、ウリジン及びシチジンのＣ−５プロピン類似体を含むポリヌクレオチドは高い親和性でＲＮＡに結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害因子であることが示されている。ホスホジエステル骨格又はＲＮＡのリボース糖部分の２’−ヒドロキシへの修飾などの他の修飾もまた、実施しうる。アンチセンスポリヌクレオチド及びリボザイムは、全体的にリボヌクレオチドからなるか、又は混合されたリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを含みうる。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム調製、ｃＤＮＡ調製、インビトロ合成、ＲＴ−ＰＣＲ、及びインビトロ又はインビボ転写を含む何らかの手段によって産生しうる。
【００２４】
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、転写調節されるタンパク質をコードする異種核酸である。本明細書において使用するとき、「異種核酸（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」の語は、当業者に知られた又は今後開発される組換えＤＮＡ手法を用いて単離され、宿主細胞に導入される核酸を意味する。「単離された」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子（すなわち、他のポリペプチドをコードする配列）から実質的に分離されているものである。好ましくは、「単離された」核酸は、その天然に生じるレプリコンにおいて前記核酸に天然で隣接する配列（すなわち、前記核酸の５’及び３’末端に位置する配列）の一部を含まない。例えば、クローン化された核酸は、ｃＤＮＡ分子と同様に、単離されているとみなされる。様々な実施形態において、単離された転写調節されるポリペプチド又は転写調節されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、核酸が由来する細胞（例えば哺乳類あるいはヒト細胞）のゲノムＤＮＡ内の前記核酸分子に天然で隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含みうる。核酸はまた、それがヒトの介入によって変化しているか、あるいはその天然の部位ではない遺伝子座又は位置に存在する場合、あるいはトランスフェクションによって細胞に導入されている場合にも、単離されているとみなされる。さらに、「単離された」核酸分子は、それが天然に結合している他の細胞物質の一部、あるいは組換え手法によって産生されるときには培養培地、あるいは化学合成されるときには化学的前駆物質又は他の化学物質を含まない状態でありうる。
【００２５】
「単離核酸」の定義から具体的に除外されるのは：天然に生じる染色体（染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｐｒｅａｄｓ）など）、インビトロ核酸調製品として又はトランスフェクト／形質転換宿主細胞の調製品としてのいずれかにて存在する人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー及びｃＤＮＡライブラリーであり、ここで、前記宿主細胞は、インビトロで不均質な調製品であるか又は単一コロニーの不均質なポピュレーションとして培養されるかのいずれかである。また、特定の核酸がベクター分子内の核酸挿入物数の５％未満を構成する上記ライブラリーも、特定して除外される。さらには、全細胞ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡ調製品（機械的にせん断した又は酵素消化した全細胞調製品を含む）も、特定して除外される。さらには、インビトロ調製品として、あるいは本発明の核酸が電気泳動媒質中で異種核酸からさらに分離されていない（例えば、アガロースゲル又はナイロン・ブロットにおいて不均質なバンドポピュレーション（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）から単一バンドを切り出すことによってさらに分離する）、電気泳動によって分離される不均質混合物としてのいずれかとして認められる全細胞調製品も、特定して除外される。
【００２６】
本発明の核酸分子は、標準的な分子生物学的手法及び本明細書において提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、哺乳類プレプロインスリンをコードする核酸分子は、既知のプレプロインスリン配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって単離できる。例えば、ｍＲＮＡは哺乳類細胞から単離でき、ｃＤＮＡは逆転写酵素（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより入手しうるモロニーＭＬＶ逆転写酵素；又はＳｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬより入手しうるＡＭＶ逆転写酵素）を用いて調製することができる。ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、ヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。本発明の核酸分子は、標準ＰＣＲ増幅手法に従ってｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。そのようにして増幅した核酸分子は、適切なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。さらに、対象とするヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成手法によって、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いて、調製することができる。これらのｃＤＮＡは、対象とする核酸をコードする配列（すなわち、プレプロインスリンの「コード領域」）、ならびに５’非翻訳配列及び３’非翻訳配列を含みうる。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、前記異種核酸は、配列番号２に定義する突然変異プレプロインスリンをコードする核酸配列に連結された、配列番号１に定義するイントロンをコードする核酸配列を含む。さらなる好ましい実施形態では、前記異種核酸は、配列番号３に定義する突然変異ＰＰＩの３コピーをコードする核酸配列に連結された、配列番号１に定義する核酸配列を含む。配列番号３に定義する核酸配列に連結された配列番号１に定義する核酸配列を、配列番号４において定義する。他の実施形態では、前記異種核酸配列は、場合によりイントロンに連結された、配列番号３を含む。前記イントロンは、前記核酸配列の上流又は下流に位置しうる。他の実施形態では、前記異種核酸は、配列番号５に定義するポリペプチド、又はそのオーソログ又はホモログをコードする核酸配列を含む。他の実施形態では、前記異種核酸は、野生型インスリンをコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、前記異種核酸は、複数のコピーのヒトプレプロインスリン遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、前記異種核酸は、１又はそれ以上のコピーのヒトプレプロインスリン遺伝子を含む。好ましくは、前記異種核酸が１コピーのヒトプレプロインスリン遺伝子を含む場合、プレプロインスリン遺伝子の終止コドンの後に挿入される及びポリＡ尾部の付加のためのシグナル配列の前に挿入される追加の核酸配列を含む未熟終結シグナルを付加的に含む。別の実施形態では、前記異種核酸は、１コピーのヒトプレプロインスリン遺伝子を含み、そしてヒトプレプロインスリン遺伝子と９０％以上の相同性を有する核酸配列の複数のコピーを含む。フューリン（ｆｕｒｉｎ）突然変異型プレプロインスリン遺伝子を本明細書において述べる実施例において使用したが、野生型プレプロインスリン遺伝子及びそのホモログ及びオーソログの使用もまた本発明に包含される。
【００２８】
本明細書において使用するとき、「遺伝子」は、遺伝の基本的な物理的及び機能的単位である。生化学用語において、遺伝子は、特定の機能性産物（すなわちタンパク質又はＲＮＡ分子）をコードする特定の染色体上の特定の位置に存在するヌクレオチドの順序付けて並べられた配列である。本明細書において使用するとき、遺伝子は、コード配列だけで構成されるのではなく、前記コード配列の転写の制御に関わる隣接ＤＮＡ領域（例えばプロモーター、エンハンサー）及びイントロンを含みうる。
【００２９】
本発明の異種核酸は、転写調節されるタンパク質をコードするナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を転写する。本明細書において使用するとき、「ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物」は、ナンセンス変異を介さないｍＲＮＡ転写産物より短い半減期を有するｍＲＮＡ転写産物を意味する。ｍＲＮＡ転写産物又はｍＲＮＡ転写産物のポピュレーションの半減期を測定する方法は、当業者によく知られている。ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物の半減期は、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解のために、より短い。本明細書において使用するとき、「ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解」の語は、未熟終止コドンを有するか又は終止コドンとポリアデニル化配列との間に異常な長さのヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ転写産物を排除するために働く、細胞内のサーベイランス機構を意味する（総説については、Ｈｅｎｔｚｅ  ＆  Ｋｕｌｏｚｉｋ，１９９９  Ｃｅｌｌ  ９６：３０７−３１０；Ｂｙｅｒｓ，２００２  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：３−６；Ｍａｑｕａｔ，２００２、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１２（６）：Ｒ１９６−７参照）。本明細書において使用するとき「異常な長さ」の語は、終止コドンとポリアデニル化配列との間に挿入されている天然では認められないヌクレオチド配列の長さを意味する。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解は、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物における未熟終結シグナルの存在によって誘導される。好ましくは、前記未熟終結シグナルは、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドン、ポリアデニル化配列、及び前記終止コドンと前記ポリアデニル化配列との間に挿入される追加の核酸配列を含む。本明細書において使用するとき、「未熟終結シグナル」の語は、生じたタンパク質をトランケーションすることを細胞に指示し、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解を誘導する働きをする配列の組合せを意味する。この意味での「未熟」の語の使用は、必ずしも、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドンが変化していること又は上流に移動していることを示さない；それは単に、細胞のサーベイランス機構が、その終止コドンが未熟位置にあると認識することを示すに過ぎない。
【００３１】
好ましい実施形態では、細胞の前記サーベイランス機構は、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドンが、終止コドンとｍＲＮＡの開裂及びポリＡ配列の付加のためのシグナル配列との間に挿入された追加の核酸の存在のゆえに未熟であることを認識する。本明細書において使用するとき、「追加の核酸（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」の語は、天然ではポリＡ配列のすぐ上流には位置しない核酸配列の付加を意味する。１つの実施形態では、前記追加の核酸配列は、１又はそれ以上のコピーのプレプロインスリン遺伝子である。別の実施形態では、前記追加の核酸は、転写調節されるタンパク質をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、前記追加の核酸は、遺伝子のコード領域である。別の実施形態では、前記追加の核酸は、タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列である。さらなる他の実施形態では、前記追加の核酸は、非コード領域である。サイトカイン、ＩＧＦＢＰ−１及び癌原遺伝子からのような、高度に不安定なｍＲＮＡの３’ＵＴＲからのＡＵに富むエレメントは、「追加の核酸」の定義から特定して除外される。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、前記追加の核酸は、約５０−３０００ｂｐ、より好ましくは約２００−２５００ｂｐ、さらに一層好ましくは約３５０−１６５０ｂｐの核酸配列を含む。好ましい実施形態では、前記追加の核酸は、約６００−１０５０ｂｐ、より好ましくは約６００−８００ｂｐ、より好ましくは約７００ｂｐの長さの核酸配列を含む。本発明の他の実施形態では、転写調節されるタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の一部の終止コドンは、ポリアデニル化配列の約５０−３０００ヌクレオチド上流、より好ましくはポリアデニル化配列の約２００−２５００ヌクレオチド上流、より好ましくはポリアデニル化配列の約３５０−１６５０ヌクレオチド上流、より好ましくはポリアデニル化配列の約６００−１０５０ヌクレオチド上流、より好ましくはポリアデニル化配列の約６００−８００ヌクレオチド上流、さらに一層好ましくはポリアデニル化配列の約７００ヌクレオチド上流に位置する。
【００３３】
本発明の核酸は、転写調節されるタンパク質をコードする。本明細書において使用するとき、「タンパク質」の語は「ポリペプチド」の語と同義である。本明細書において使用するとき、「ポリペプチド」の語は、ペプチド結合によって連結された少なくとも４個のアミノ酸の鎖を意味する。前記鎖は、直鎖、分岐鎖、環状又はそれらの組合せでありうる。本明細書において使用するとき、「転写調節されるタンパク質」の語は、その産生が転写のレベルで又はｍＲＮＡの生成のレベルで調節されるタンパク質を意味する。転写調節は、プロモーター、エンハンサー又は他の調節エレメントなどの転写応答エレメントによって制御される。転写応答エレメント内に位置する多くの異なるエレメントはいずれも、独立して遺伝子の転写を活性化又は抑制することができる。例えば、β細胞におけるプレプロインスリンの転写は、グルコースによって活性化され、インスリンによって下方調節される。本発明の組成物及び方法はすべての転写調節されるタンパク質を包含するが、本発明の好ましい実施形態では、前記転写調節タンパク質はインスリンである。より好ましくは、前記転写調節タンパク質はヒトインスリンである。
【００３４】
本発明はまた、キメラ又は融合ポリペプチドを提供する。本明細書において使用するとき、「キメラポリペプチド」又は「融合ポリペプチド」は、転写調節されるタンパク質をコードしないヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は、異なる転写調節タンパク質をコードする核酸配列に連結された転写調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。融合ポリペプチドに関して本明細書において使用するとき、「作動可能に連結された」の語は、転写調節されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列及びそれが連結されているヌクレオチド配列が、両方の配列が使用配列に属する提示された機能を果たすように、互いに融合されていることを示すことが意図されている。転写調節されるタンパク質をコードしない又は異なるタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、転写調節されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。例えば、１つの実施形態では、前記融合ポリペプチドは、転写調節されるタンパク質配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている、ＧＳＴ転写調節タンパク質融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは、組換え転写調節タンパク質の精製を容易にすることができる。別の実施形態では、前記融合ポリペプチドは、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む転写調節タンパク質である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類宿主細胞）では、異種シグナル配列の使用によって、転写調節されるタンパク質の発現及び／又は分泌を高めることができる。別の実施形態では、前記融合ポリペプチドは、ルシフェラーゼのような（但しこれに限定されない）検出可能なシグナルペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された転写調節タンパク質である。
【００３５】
好ましくは、本発明の転写調節されるキメラ又は融合ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ手法によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、従来の手法に従って、例えば、連結のための平滑末端又は付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適宜に付着末端の充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理及び酵素的連結を用いることによって、共にインフレームで連結することができる。別の実施形態では、自動ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の手法によって、融合遺伝子を合成することができる。あるいは、２個の連続する遺伝子フラグメントの間に相補的突出を生じさせるアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実施し、その後それらをアニーリングして再増幅し、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。さらに、既に融合部分（例えばＧＳＴポリペプチド）をコードしている多くの発現ベクターが市販されている。転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドは、融合部分が前記ヌクレオチドにインフレームで連結されるように、そのような発現ベクターにクローン化することができる。
【００３６】
大量の組換えＤＮＡ分子は、適切な宿主細胞における複製によって産生しうる。対象タンパク質をコードする天然又は合成ＤＮＡフラグメントは、原核又は真核細胞、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入されてそこで複製することができる、組換えポリヌクレオチド構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に組み込まれる。一般的に使用される原核生物宿主は、大腸菌の株を含むが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はシュードモナス属菌などの他の原核生物もまた使用しうる。真核宿主細胞は、酵母、糸状菌、動物、植物、昆虫、両生類及び鳥類種を含む。操作の容易さ、発現されたタンパク質を適切にグリコシル化する能力、タンパク質発現の程度と制御、発現されたタンパク質の細胞夾雑物からの精製の容易さなどの因子又は他の因子が宿主細胞の選択に影響する。
【００３７】
本明細書において使用するとき、「組換え宿主細胞」は、本明細書において述べるように、単離又は他の組換えＤＮＡ分子を含むように遺伝的に修飾されたものである。前記ＤＮＡは、リポソーム・デリバリー、エレクトロポレーション又は裸のプラスミドの注入などの（限定を伴わない）様々なプラスミド・デリバリーの方法を含むプラスミドによる形質転換；ウイルスベクターによる形質導入；又はポリマー剤によって媒介されるＤＮＡデリバリーを（限定を伴わずに）含む、特定の細胞型に適切な当該技術分野に知られている何らかの手段によって導入することができる。
【００３８】
本発明は、本発明の核酸を含む細胞及び前記細胞を得るための方法を提供するものであり、ここで、前記核酸は、転写調節されるタンパク質に翻訳されるナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を転写する。本発明の核酸を含む細胞は、タンパク質分泌のダイナミクスの調節に対して改善された制御を有する。本明細書において使用するとき、「タンパク質分泌を調節する」の語は、「分泌ダイナミクスを調節する」の語と交換可能に使用され、ナンセンス変異媒介性ｍＲＮＡ転写産物を転写しない異種核酸を導入したときのタンパク質分泌のレベルと比較して、ナンセンス変異媒介性転写産物を転写する異種核酸の導入によるタンパク質分泌レベルへの統計的に有意の作用を意味する。好ましい実施形態では、本発明の異種核酸の導入は、対象となるタンパク質の分泌のより速い下方調節を導く。好ましくは、タンパク質分泌の下方調節の加速は、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解による、転写調節タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の分解の上昇によるものである。タンパク質分泌のレベルを測定する方法は、当業者によく知られている。
【００３９】
本明細書において述べる転写調節されるタンパク質のフラグメント及び融合ポリペプチドに加えて、本発明は、天然に生じる転写調節されるタンパク質及び転写調節されるタンパク質をコードするヌクレオチド、及び転写調節されるタンパク質をコードする天然に生じるヌクレオチドのホモログ及び類似体を含む。「ホモログ」は、本明細書においては、それぞれ類似の又は実質的に同一のヌクレオチド又はアミノ酸配列を有する２個の核酸又はポリペプチドと定義される。ホモログは、下記で定義するような転写調節されるタンパク質の対立遺伝子変異体、オーソログ、パラログ、アゴニスト及びアンタゴニストを含む。「ホモログ」の語はさらに、遺伝子コードの縮重のために異なり、それ故に同じ転写調節タンパク質分子をコードする核酸分子を包含する。本明細書において使用するとき、「天然に生じる」転写調節されるタンパク質は、天然に生じる転写調節タンパク質のアミノ酸配列を意味する。同様に、転写調節タンパク質をコードする「天然に生じる」単離ヌクレオチドは、天然に生じる核酸配列を意味する。
【００４０】
転写調節されるタンパク質又は転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体及び類似体、オーソログ及びパラログに対応する核酸分子は、ストリンジェント又は中等度のハイブリダイゼーション条件下における標準ハイブリダイゼーション手法に従い、ハイブリダイゼーションプローブを使用して単離することができる。別の実施形態では、突然変異体のコンビナトリアル・ライブラリーをアゴニスト又はアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって、ホモログを同定することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な転写調節タンパク質ホモログのライブラリーを作製するために使用できる様々な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡシンセサイザーにおいて実施でき、そして合成遺伝子は、その後適切な発現ベクターに連結される。縮重遺伝子の使用は、１つの混合物中で、所望の潜在的な転写調節タンパク質配列をコードする配列すべてを提供することを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．，１９８３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、１９８４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８；Ｉｋｅら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７参照。
【００４１】
加えて、転写調節されるタンパク質のホモログのスクリーニング及びその後の選択のための、転写調節タンパク質フラグメントの多様なポピュレーションを作製するために、転写調節タンパク質コード領域のフラグメントのライブラリーが使用できる。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、転写調節タンパク質コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをおよそ１分子につき１回だけニッキングが起こる条件下においてヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、前記ＤＮＡを再生させて異なる切断産物からのセンス／アンチセンス対を含む二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理によって再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去し、そして、生じたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって、作製することができる。この方法により、様々なサイズの転写調節されるタンパク質のＮ末端、Ｃ末端及び内部のフラグメントをコードする発現ライブラリーが得られる。
【００４２】
点突然変異又はトランケーションによって作製したコンビナトリアル・ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選択された特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの手法が当該技術分野において知られている。そのような手法は、転写調節されるタンパク質のホモログのコンビナトリアル突然変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適合させうる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に耐える、最も広く使用されている手法は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化すること、生じたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、及び所望の活性の検出がその産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下においてコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。ライブラリーにおける機能的な突然変異体の率を高める新しい手法である、回帰的全体突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，ＲＥＭ）は、転写調節されるタンパク質のホモログを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ  ＆  Ｙｏｕｒｖａｎ，１９９２，ＰＮＡＳ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、１９９３、Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【００４３】
上述したように、本発明は、転写調節されるタンパク質、転写調節されるタンパク質をコードする核酸及びそれらのホモログと類似体を包含する。２個のアミノ酸配列についてのパーセント配列同一性を決定するために、配列は最適に比較する目的のために整列させられる（例えば、他のポリペプチド又は核酸との最適な整列のために１個のポリペプチドの配列内にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置にあるアミノ酸残基を比較する。１つの配列内の位置が他方の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基で占められているときは、それらの分子はその位置において同一である。同じタイプの比較を２個の核酸配列の間で行うことができる。
【００４４】
２個の配列間のパーセント配列同一性は、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント配列同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。好ましくは、本発明に包含される単離アミノ酸のホモログは、全体のアミノ酸配列と少なくとも約２５−３０％、好ましくは少なくとも３０−４０％、より好ましくは少なくとも約４０−５０％、５０−６０％、６０−７０％、７０−７５％、７５−８０％、８０−８５％、８５−９０％又は９０−９５％、及び最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である。さらに別の実施形態では、本発明に包含される単離アミノ酸のホモログは、核酸配列によってコードされる全体のアミノ酸配列と少なくとも約２５−３０％、好ましくは少なくとも約４０−５０％、より好ましくは少なくとも約５０−６０％、６０−７０％、７０−７５％、７５−８０％、８０−８５％、８５−９０％又は９０−９５％、及び最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である。他の実施形態では、転写調節されるタンパク質のアミノ酸のホモログは、少なくとも１５個の隣接アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも３５個の隣接アミノ酸残基にわたって配列同一性を有する。
【００４５】
本発明の目的のために、２個の核酸又はポリペプチド配列の間のパーセント配列同一性は、米国国立生命工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）において入手可能なプログラム「Ｂｌａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を用いて決定しうる。２個の核酸のパーセント配列同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７で修正された、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムを用いて決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０２−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。所望のパーセント配列同一性を有するヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施する。比較目的のためにギャップを導入したアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に述べられているように使用される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、それぞれのプログラム（ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴ）のデフォールト・パラメータを使用する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／参照。配列同一性を決定するためには、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較するときには、チミジンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドと等価であることは了解されている。
【００４６】
ハイブリダイゼーション手法は、本明細書において教示されるように、対象となる調節配列と十分な相同性を有するポリヌクレオチドを同定するのに有用である。特定のハイブリダイゼーション手法が本発明にとって必須ではない。ハイブリダイゼーション手法には改善が加えられるが、それらは当業者によって容易に適用されうる。
【００４７】
プローブと試料とをハイブリダイゼーション緩衝液中で混合し、アニーリングが起こるまで適切な温度に保持する。その後、膜を洗って余分の物質を除去し、試料と結合プローブ分子を、典型的にはオートラジオグラフィー及び／又は液体シンチレーション計数によって検出し定量する。当該技術分野においてよく知られているように、プローブ分子と核酸試料とが、２つの分子間で強い非共有結合を形成することによってハイブリダイズする場合には、前記プローブと試料とは基本的に同一であるか、あるいは、アニーリングと洗浄段階を高ストリンジェントな条件下で実施する場合には完全に相補的であることが、妥当に推測されうる。プローブの検出標識は、ハイブリダイゼーションが起きたかどうかを判定するための手段を提供する。
【００４８】
本明細書において述べるように単離したクローン化配列の検討のために、様々な度合のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが使用できる。条件がよりストリンジェントになればなるほど、二本鎖形成に要求される相補性はより大きくなる。ストリンジェンシーは、温度、プローブの濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間等によって制御することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．，Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ，１９８７  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．１６９−１７０に述べられているように、当該技術分野においてよく知られた手法によって中等度から高度のストリンジェントな条件下で実施される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは標的ＤＮＡに選択的である。本明細書において使用するとき、「選択的ハイブリダイゼーション」又は「選択的にハイブリダイズする」の語は、他の非標的ＤＮＡ配列と比較して標的ＤＮＡ配列への核酸配列の結合を識別する能力を意味する。
【００４９】
本明細書において使用するとき、ハイブリダイゼーションのための中等度から高度のストリンジェントな条件とは、本明細書において述べる条件と同じか又はほぼ同じ程度のハイブリダイゼーションの特異性の程度を達成する条件である。本明細書において使用するとき、「高度にストリンジェント」又は「高ストリンジェントな条件」の語は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／０．１％ＳＤＳ中にて６８℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて６５℃で洗浄することを含む。本明細書において使用するとき、「中等度にストリンジェント」又は「中ストリンジェントな条件」の語は、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／０．１％ＳＤＳ中にて５５℃でハイブリダイズし、３×ＳＳＣ中にて４２℃で洗浄することを含む。温度及び塩濃度のパラメータは、プローブと標的核酸との間で所望のレベルの配列同一性を達成するように変化させうる。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる手引きについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ；ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ，１９８４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４；又はＴｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，第Ｉ部、第２章、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【００５０】
具体的には、サザンブロットにおける固定化ＤＮＡの３２Ｐ標識遺伝子特異的プローブを用いたハイブリダイゼーションを標準方法によって実施する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。本明細書において使用するとき、「プローブ」は、典型的には標識又はレポーター分子に結合され、他の対象となる配列を同定し単離するために使用される。合成オリゴヌクレオチド又は他のポリヌクレオチドを含むプローブは、天然に生じる又は組換えの一本鎖又は二本鎖核酸から誘導されるか、あるいは化学合成されうる。ポリヌクレオチドプローブは、当該技術分野において知られた方法のいずれかによって、例えばランダムヘキサマー標識、ニックトランスレーション、又はクレノウ・フィルイン反応（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｉｌｌ−ｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、例えばＢｅａｕｃａｇｅ  ＆  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１  Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２に述べられているホスホルアミダイト法、あるいはＭａｔｔｅｕｃｉら、１９８１  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５に従ったトリエステル法によって標識することができ、そして市販の自動オリゴヌクレオチド・シンセイサイザーで実施しうる。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成して、その鎖を適切な条件下で共にアニーリングすることによって、又は適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することによってのいずれかにより、化学合成の一本鎖産物から入手しうる。
【００５１】
一般に、ハイブリダイゼーション及びその後洗浄は、対象とする特定の核酸分子に相同性を有する標的配列の検出を可能にする、中等度から高度のストリンジェントな条件下において実施される。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性ＤＮＡにおいて、ＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より低い２０−２５℃で一晩実施することができる。前記融解温度は次の式によって表される（Ｂｅｌｔｚら、１９８３  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＫ．Ｍｏｌｄａｖｅ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １００：２６６−２８５）。  
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（＋Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／塩基対で表した二本鎖の長さ。
【００５２】
洗浄は、典型的には次のように実施される：１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中にて室温で１５分間を２回（低ストリンジェンシー洗浄）、及び０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中にてＴＭ−２０℃で１５分間を１回（中ストリンジェンシー洗浄）。
【００５３】
オリゴヌクレオチドプローブについては、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ変性ＤＮＡにおいてハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より低い１０−２０℃で一晩実施される。オリゴヌクレオチドプローブについてのＴｍは、次の式：ＴＭ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）によって決定される（Ｓｕｇｇｓら、１９８１  ＩＣＢ−ＵＣＬＡ  Ｓｙｍｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，Ｄ．Ｄ．Ｂｒｏｗｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２３：６８３−６９３）。
【００５４】
洗浄は、典型的には次のように実施される：１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中にて室温で１５分間を２回（低ストリンジェンシー洗浄）、及び１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中にてハイブリダイゼーション温度で１５分間を１回（中ストリンジェンシー洗浄）。
【００５５】
一般に、塩及び／又は温度は、ストリンジェンシーを変えるために変化させうる。塩基長が＞７０程度の標識ＤＮＡフラグメント関しては、次の条件が使用できる：低、１又は２×ＳＳＰＥ、室温；低、１又は２×ＳＳＰＥ、４２℃；中、０．５×又は１×ＳＳＰＥ、６０℃；及び高、０．１×ＳＳＰＥ、６５℃。
【００５６】
これらのホモログの１つのサブセットが対立遺伝子変異体である。本明細書において使用するとき、「対立遺伝子変異体」の語は、転写調節されるタンパク質のアミノ酸配列の変化を導き、そして天然のポピュレーション中に存在する、多型を含むヌクレオチド配列を意味する。そのような天然の対立遺伝子変異は、典型的には、転写調節されるタンパク質又は転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドにおいて１−５％の分散を生じうる。対立遺伝子変異体は、多くの異なる植物又は他の生物において対象となる核酸配列を塩基配列決定することによって同定することができ、これは、ハイブリダイゼーションプローブを使用して、それらの生物において同じ転写調節されるタンパク質又は転写調節されるタンパク質の遺伝子座をコードする単離ヌクレオチドを同定することによって容易に実施できる。天然の対立遺伝子変異の結果であって且つ転写調節されるタンパク質又は転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドの機能的活性を変化させない、あらゆるそのような核酸変異ならびに転写調節されるタンパク質又は転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドにおいて生じるアミノ酸多型又は変異は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００５７】
さらに、類似体、オーソログ及びパラログなどの同じか又は他の種からの転写調節されるタンパク質をコードする核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図される。本明細書において使用するとき、「類似体」の語は、同じか又は類似の機能を有するが、無関係な生物において別個に進化した２個の核酸配列を意味する。本明細書において使用するとき、「オーソログ」の語は、共通の祖先遺伝子から種形成によって進化した、異なる種からの２個の核酸を意味する。通常、オーソログは、同じか又は類似の機能を有するポリペプチドをコードする。同様に本明細書において使用するとき、「パラログ」の語は、ゲノム内での重複によって関連する２個の核酸を意味する。パラログは通常異なる機能を有するが、これらの機能は関連しうる（Ｔａｔｕｓｏｖ，Ｒ．Ｌ．ら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３３８）：６３１−６３７）。天然に生じる転写調節タンパク質の類似体、オーソログ及びパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列の相違によって、又はその両方によって、天然に生じる転写調節タンパク質とは異なりうる。翻訳後修飾は、インビボ及びインビトロでのポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化又はグリコシル化を包含し、そして、そのような修飾は、ポリペプチド合成又はプロセシングの間あるいは単離された修飾酵素を用いる処理後に起こりうる。特に、本発明のオーソログは一般に、天然に生じる転写調節タンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部と少なくとも８０−８５％、より好ましくは８５−９０％又は９０−９５％、及び最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、またさらには９９％の同一性すなわち配列同一性を示し、転写調節されるタンパク質と類似の機能を示す。
【００５８】
ポピュレーション中に存在しうる、転写調節されるタンパク質配列の天然に生じる変異体に加えて、当業者は、突然変異によってヌクレオチド配列に変化を導入し、それによって、転写調節タンパク質の機能的活性を変えることなく、コードされる前記転写調節タンパク質のアミノ酸配列の変化を導きうることをさらに認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換を配列内に作製することができる。「非必須」アミノ酸残基は、転写調節されるタンパク質の１つの野生型配列から、前記転写調節タンパク質の活性を変えることなく変化させうる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基は、転写調節タンパク質の活性に必要である。他のアミノ酸残基は、しかしながら、（例えば、転写調節タンパク質活性を有するドメインにおいて保存されないか又は半保存のみされるもの）活性にとって必須ではないと考えられ、それ故に活性を変えずに変化させやすいと考えられる。
【００５９】
転写調節されるタンパク質をコードする単離核酸分子は、１又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失がコードされるポリペプチドに導入されるように、１又はそれ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失をヌクレオチド配列に導入することによって、作製することができる。突然変異は、部位指定突然変異誘発及びＰＣＲを介した突然変異誘発などの標準的な手法によって、ヌクレオチド配列に導入することができる。好ましくは、１又はそれ以上の予測される非必須アミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換が行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。
【００６０】
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷で極性の側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐鎖型側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、転写調節されるタンパク質内の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、飽和突然変異誘発などによって、転写調節タンパク質コード配列の全部又は一部に沿って突然変異をランダムに導入することができ、生じる突然変異体は、本明細書において述べる転写調節タンパク質活性に関してスクリーニングされ、転写調節タンパク質活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後、コードされるポリペプチドを組換え発現させることができ、前記ポリペプチドの活性を測定することができる。
【００６１】
さらに、転写調節されるタンパク質をコードする最適化された核酸を作製することができる。本明細書において使用するとき、「最適化」の語は、所定の生物におけるその発現を増加させるように、所定の生物におけるその活性を上昇させるように、所定の生物におけるその分泌を増加させるように、遺伝子操作された核酸を意味する。例えば、最適化された核酸を提供するために、遺伝子のＤＮＡ配列は、１）高発現遺伝子によって選択されるコドンを含む；２）ヌクレオチド塩基組成物中に、対象となる生物において実質的に認められる程度のＡ＋Ｔ含量を含む；３）開始配列を形成する；又は４）不安定化、不適切なポリアデニル化、分解、及びＲＮＡの終結を引き起こす、あるいはヘアピン型二次構造又はＲＮＡスプライス部位を形成する；配列を排除するように修飾することができる。
【００６２】
本明細書において使用するとき、「選択コドン使用頻度」は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞が示す選択性を意味する。ある遺伝子における特定のコドンの使用頻度を求めるためには、前記遺伝子におけるそのコドンの出現数を、前記遺伝子において同じアミノ酸を特定するすべてのコドンの総出現数で除する。同様に、宿主細胞が示す選択コドン使用頻度は、前記宿主細胞が発現する多数の遺伝子における選択コドン使用頻度を平均することによって算定できる。この分析は、前記宿主細胞によって高発現される遺伝子に限定されることが好ましい。宿主細胞によって使用されるものからの、合成遺伝子についての選択コドン使用頻度のパーセント偏差は、最初に宿主細胞からの単一コドンの使用頻度のパーセント偏差を決定し、次にすべてのコドンにわたる平均偏差を得ることによって算定される。本明細書において定義するように、この算定はユニーク・コドン（ｕｎｉｑｕｅ  ｃｏｄｏｎｓ）（すなわちＡＴＧ及びＴＧＧ）を含む。一般的に言えば、宿主細胞のものからの、最適化された遺伝子のコドン使用頻度の全体平均偏差は、式：１Ａ＝ｎ＝１Ｚ  Ｘｎ−ＹｎＸｎ×１００Ｚ［式中、Ｘｎ＝宿主細胞におけるコドンｎの使用頻度；Ｙｎ＝合成遺伝子におけるコドンｎの使用頻度；ｎはアミノ酸を特定する個々のコドンを表す；及びコドンの総数はＺである］を用いて算定される。すべてのアミノ酸についてのコドン使用頻度の全体偏差Ａは、好ましくは約２５％未満、より好ましくは約１０％未満であるべきである。
【００６３】
それ故、転写調節されるタンパク質をコードするヌクレオチドは、そのコドン使用の分布頻度が、好ましくは高発現される遺伝子のものから２５％以下、より好ましくは約１０％以下の偏差であるように、最適化することができる。さらに、縮重第三塩基のＧ＋Ｃ含量パーセンテージも考慮すべきである。本発明の最適化された核酸はまた、好ましくは、選択宿主のものに極めて近いＣＧ及びＴＡダブレット回避指数（ＣＧ  ａｎｄ  ＴＡ  ｄｏｕｂｌｅｔ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｉｎｄｉｃｅｓ）を有する。最も好ましくは、これらの指数は宿主のものから約１０−１５％以下の偏差である。
【００６４】
上述した核酸及びポリペプチドに加えて、本発明は、部分（ｍｏｉｅｔｙ）に結合したこれらの核酸及びポリペプチドを包含する。これらの部分は、検出部分、ハイブリダイゼーション部分、精製部分、デリバリー部分、反応部分、結合部分等を含むが、これらに限定されない。部分を有する核酸の典型的な群は、プローブとプライマーである。プローブ及びプライマーは、典型的には、実質的に単離されたオリゴヌクレオチドを含む。前記オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下において配列のセンス鎖の少なくとも約１２個、好ましくは約２５個、より好ましくは約４０、５０又は７５個の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域；アンチセンス配列；又は天然に生じるその突然変異体を含む。ヌクレオチド配列に基づくプライマーは、転写調節されるタンパク質及び転写調節されるタンパク質ホモログをコードするヌクレオチドをクローン化するためのＰＣＲ反応において使用できる。転写調節されるタンパク質をコードするヌクレオチドに基づくプローブは、同じか又は実質的に同一のポリペプチドをコードする転写産物又はゲノム配列を検出するために使用できる。好ましい実施形態では、前記プローブはさらに、それに結合した標識基を含み、例えばその標識基は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子でありうる。そのようなプローブは、細胞の試料において転写調節タンパク質をコードするヌクレオチドのレベルを測定すること、例えばｍＲＮＡレベルを検出すること、又はゲノム遺伝子が突然変異したかどうか若しくは欠失したかどうかを測定することなどによって、転写調節タンパク質を発現する細胞を同定するためのゲノムマーカー試験キットの一部として使用できる。
【００６５】
別の実施形態では、転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドは、５５℃で５×ＳＳＣ中、上記で定義したポリヌクレオチドのいずれかにハイブリダイズする核酸配列を含む。他の実施形態では、転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドは、外来の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むように修飾される。
【００６６】
特に、遺伝子の転写のレベル（遺伝子産物への翻訳に使用できるｍＲＮＡの量の指標）を確認するために有用な方法は、ノーザンブロット法を実施することである。参考文献については、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、１９８８  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。ノーザンブロット法からの情報は、少なくとも部分的には、形質転換された遺伝子の転写の程度を明らかにする。全細胞ＲＮＡは、Ｂｏｒｍａｎｎ，Ｅ．Ｒ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３１７−３２６に述べられているような、すべて当該技術分野においてよく知られているいくつかの方法によって、細胞、組織又は器官から調製することができる。このｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの存在又は相対量を評価するために、ウエスタンブロット法などの標準的な手法が使用されうる。これらの手法は当業者によく知られている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【００６７】
本発明はさらに、上述したような転写調節タンパク質をコードする単離核酸を含む単離組換え発現ベクターを提供し、宿主細胞における前記ベクターの発現は、前記宿主細胞の野生型種と比較して、あるいは、転写調節タンパク質をコードする単離ヌクレオチドの１コピーを含み、前記転写調節タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物の部分の終止コドンとポリアデニル化配列との間に挟まれた追加の核酸配列が存在しない、ベクターを発現している宿主細胞と比較して、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡの安定性の低下及び／又は前記タンパク質の分泌の低下を結果として生じさせる。本明細書において使用するとき、「ベクター」の語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの１つの種類は、付加ＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する、「プラスミド」である。別の種類のベクターは、付加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターを本明細書においては「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ手法における有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用できる。しかしながら、本発明は、等価の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの、他の形態の発現ベクターを包含することが意図されている。
【００６８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現すべき核酸配列に作動可能に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択される１又はそれ以上の調節配列を含みうることを意味する。組換え発現ベクターに関して本明細書において使用するとき、「作動可能に連結された」は、対象となるヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の発現を可能にするように（例えばインビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞に導入されるときは前記宿主細胞において）調節配列（単数又は複数）に連結されていることを意味することが意図されている。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含することが意図されている。そのような調節配列は、例えば、その中の参考文献を含めて、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）及びＧｒｕｂｅｒとＣｒｏｓｂｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより、ＧｌｉｃｋとＴｈｏｍｐｓｏｎ編集、第７章、８９−１０８、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａに記述されている。適切なエンハンサー及び他の発現制御配列については、Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８３）も参照のこと。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、及び特定の宿主細胞においてのみ又は特定の条件下においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するものを包含する。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望するポリペプチドの発現レベル等のような因子に依存しうることは、当業者に認識されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書において述べるように核酸によってコードされる、融合ポリペプチド又はペプチドを含む、ポリペプチド又はペプチド（例えば、転写調節されるタンパク質、転写調節されるタンパク質の突然変異体、融合ポリペプチド等）を産生することができる。
【００６９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核又は真核細胞における転写調節タンパク質の発現用に設計することができる。例えば、転写調節されるタンパク質をコードする遺伝子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母及び他の真菌細胞（Ｒｏｍａｎｏｓ，Ｍ．Ａ．ら、１９９２、Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ：ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら、１９９１、Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉより、Ｊ．Ｗ．Ｂｅｎｎｅｔ  ＆  Ｌ．Ｌ．Ｌａｓｕｒｅ編集、ｐ．３９６−４２８：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；及びｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆  Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．、１９９１、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉより、Ｐｅｂｅｒｄｙ，Ｊ．Ｆ．ら編集、ｐ．１−２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ参照）、藻類（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９、Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（３）：２３９−２５１）、繊毛虫類、多細胞植物細胞（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．とＷｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．，１９８８、Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｌｅａｆ  ａｎｄ  ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ  ｅｘｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．５８３−５８６；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ、第６／７章、Ｓ．７１−１１９（１９９３）；Ｆ．Ｆ．Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ｊｅｎｅｓら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，第１巻、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＫｕｎｇとＲ．Ｗｕ編集、１２８−４３、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４２：２０５−２２５及びそれらの中で引用される参考文献を参照）又は哺乳類細胞において発現しうる。好ましい実施形態では、前記宿主細胞は哺乳類細胞であり、より好ましくはヒト細胞である。１つの好ましい実施形態では、前記ヒト細胞は非β細胞である。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）の中でさらに論じられている。あるいは、前記組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節���列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳されうる。
【００７０】
原核生物におけるポリペプチドの発現は、最も多くは、融合又は非融合ポリペプチドのいずれかの発現を指令する構成的又は誘導的プロモーターを含むベクターを用いて実施される。融合ベクターは、その中にコードされるポリペプチドに、通常は組換えポリペプチドのアミノ末端に対してであるがＣ末端にも、多くのアミノ酸を付加し、あるいは前記ポリペプチド内の適切な領域内に融合される。そのような融合ベクターは、典型的には、３つの目的：組換えポリペプチドの発現を増加させること；２）組換えポリペプチドの溶解度を増大させること；及び３）アフィニティー精製のリガンドとして働くことにより組換えポリペプチドの精製を助けること、に役立つ。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合ポリペプチドの精製後に組換えポリペプチドを融合部分から分離することができるように、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解性開裂部位が導入される。そのような酵素及びそれらのコグネイト（ｃｏｇｎａｔｅ）認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを包含する。
【００７１】
典型的な融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチド又はポリペプチドＡを標的組換えポリペプチドに融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．とＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，１９８８、Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を包含する。１つの実施形態では、転写調節されるタンパク質のコード配列をｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化して、Ｎ末端からＣ末端までに、ＧＳＴ−トロンビン開裂部位−Ｘポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするベクターを作製する。前記融合ポリペプチドは、グルタチオン−アガロース樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。ＧＳＴに融合していない組換え転写調節タンパク質は、トロンビンによる融合ポリペプチドの開裂によって回収することができる。
【００７２】
適切な誘導的非融合大腸菌発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）を包含する。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されるウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存している。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下にあるＴ７  ｇｎ１遺伝子を内包する定住性λプロファージから宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【００７３】
組換えポリペプチド発現を最大化するための１つの戦略は、組換えポリペプチドをタンパク質分解性開裂する能力に損傷を有する宿主細菌において前記ポリペプチドを発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。別の戦略は、各アミノ酸についての個々のコドンがＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの発現のために選択した細菌において選択的に利用されるものであるように、発現ベクターに挿入する核酸の配列を変化させることである（Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変化は、標準的なＤＮＡ合成手法によって実施できる。
【００７４】
別の実施形態では、転写調節されるタンパク質の発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎとＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２、Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を包含する。糸状菌などの他の真菌における使用に適したベクター及びベクター構築方法は、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．＆  Ｐｕｎｔ，Ｐ．Ｊ．、１９９１、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ、Ｊ．Ｆ．Ｐｅｂｅｒｄｙら編集、ｐ．１−２８、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅの中に詳述されているものを包含する。
【００７５】
あるいは、本発明の転写調節されるタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現させることができる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）におけるポリペプチドの発現のために使用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗとＳｕｍｍｅｒｓ，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を包含する。
【００７６】
さらに別の実施形態では、本発明の転写調節タンパク質の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳類細胞において発現させる。哺乳類発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，１９８７、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）を包含する。哺乳類細胞において使用されるとき、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０から誘導される。原核及び真核細胞の両方のための他の適切な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６及び１７章参照。
【００７７】
別の実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において選択的に核酸の発現を指令することができる（例えば、前記核酸を発現するために、組織特異的調節エレメントを使用する）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において知られている。適切な組織特異的プロモーターの非制限的な例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅとＥａｔｏｎ，１９８８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ＆  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ＆  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３、Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば神経フィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ＆  Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９，ＰＮＡＳ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州特許公開広報第２６４，１６６号）を包含する。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスホックスプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ＆  Ｇｒｕｓｓ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びフェトポリペプチドプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ＆  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）もまた包含される。
【００７８】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、使用する発現ベクターとトランスフェクション手法に依存して、細胞の小さな分画だけがそれらのゲノム内に外来ＤＮＡを組み込みうることが知られている。これらの組み込まれる成分を同定し選択するために、一般に、選択マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を対象となる遺伝子と共に宿主細胞に導入する。本明細書において使用するとき、「選択マーカー」の語は、ベクターで形質転換した宿主細胞の生存又は増殖のために必要なタンパク質をコードする遺伝子を意味する。そのようなマーカー遺伝子は、前記宿主細胞に同時導入される別のポリヌクレオチド配列上に含まれうるが、最も多くはクローニングベクター上に含まれる。マーカー遺伝子が導入された宿主細胞だけが、選択条件下で生存及び／又は増殖する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒性物質、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート等に対する耐性を付与する；（ｂ）栄養要求性欠損を補う；又は（ｃ）複合培地からは得られない不可欠の栄養素を供給する；タンパク質をコードする。適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存する；種々の宿主についての適切なマーカーは当該技術分野において知られている。
【００７９】
宿主細胞を形質転換する又はトランスフェクションするための他の適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、及び他の実験室マニュアルに見出される。
【００８０】
別の実施形態では、導入した遺伝子の調節発現を可能にする選択系を含む組換え生物を産生することができる。例えば、転写調節されるタンパク質をコードする遺伝子を、それをｌａｃオペロンの制御下に置くベクター上に含むことは、ＩＰＴＧの存在下でのみ転写調節タンパク質をコードする遺伝子の発現を可能にする。そのような調節系は当該技術分野においてよく知られている。
【００８１】
遺伝子発現は、適時に、細胞又は組織特異的に遺伝子発現を与える適切なプロモーターに作動可能に連結すべきである。本発明の発現カセットにおいて有用なプロモーターは、細胞において転写を開始することができるプロモーターを包含する。
【００８２】
前記プロモーターは、構成的、誘導的、発生段階選択的、細胞型選択的、組織選択的又は器官選択的でありうる。構成的プロモーターは、ほとんどの条件下で活性である。構成的プロモーターの例は、ＣａＭＶ  １９Ｓ及び３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：８１０−８１２）、ｓＸ  ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター（Ｋａｙら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２９９−１３０２）、Ｓｅｐ１プロモーター、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  １８：６７５−６８９）、ｐＥｍｕ（Ｌａｓｔら、１９９１、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）等を包含する。
【００８３】
誘導的プロモーターは、栄養素又は代謝産物、熱又は低温、光、病原体攻撃、嫌気性条件等の存在又は不存在などの、特定の環境条件下で活性である。遺伝子発現が時間特異的に起こることを所望する場合は、化学誘導的プロモーターは特に適切である。発生段階選択的プロモーターは、発生の特定の段階で選択的に発現される。異種の供給源からのＤＮＡ結合ドメイン及び応答エレメント（すなわち、非哺乳類の供給源からのＤＮＡ結合ドメイン）を使用することにより、異種遺伝子発現を制御する上で付加的な柔軟性を得ることができる。
【００８４】
本発明の別の局面は、本発明の異種核酸を導入した宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」の語は、本明細書においては交換可能に使用される。そのような語は、特定の対象細胞を意味するだけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的子孫にも適用されることが了解されている。それ自体、本発明の異種核酸を含むもとの宿主細胞及び子孫細胞の両方がトランスジェニックである。突然変異又は環境的影響のいずれかのために継続する世代においてある種の改変が起こりうるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないことがあるが、それでもなお本明細書において使用するこの用語の範囲内に包含される。宿主細胞はいずれの原核又は真核細胞でもありうる。例えば、転写調節されるタンパク質は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、又は哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞など）、藻類、繊毛虫類、植物細胞、真菌、又はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような他の微生物において発現されうる。同様に、転写調節されるタンパク質をコードする単離ヌクレオチドは、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、又は哺乳類細胞、藻類、繊毛虫類、植物細胞、真菌、又は他の微生物などの、いずれの原核又は真核細胞にも導入することができる。好ましい実施形態では、前記宿主細胞は哺乳類細胞である。他の好ましい実施形態では、前記宿主細胞は非β細胞である。他の好ましい実施形態では、前記宿主細胞は肝細胞である。特に好ましい実施形態では、前記宿主細胞はヒト肝細胞である。他の好ましい実施形態では、前記宿主細胞は自己由来細胞である。他の好ましい実施形態では、前記宿主細胞は不死化細胞系統である。好ましい不死化細胞系統は、肝細胞系、特にヒトＨｅｐＧ２細胞系を包含する。他の適切な宿主細胞及び細胞系統は当業者に知られている。翻訳の未熟終結による遺伝子発現の通常のエラーは不可避であり、ナンセンス突然変異ｍＲＮＡによって生成されるトランケート型のタンパク質は細胞にとって潜在的に毒性であるので、すべての哺乳類細胞は、未熟終止コドン及び宿主のナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解を含むｍＲＮＡを認識するように進化したと考えられる。詳細には、ＮＭＤは、中でも特に、リンパ芽球（Ｒａｊａｖｅｌ，Ｋ．Ｓ．＆  Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｅ．Ｆ．２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１：５５１２−９）、線維芽細胞（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：５２７２−８３）、軟骨細胞（Ｂａｔｅｍａｎ，Ｊ．Ｆ．ら、２００３、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２１７−２５）及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｏ．＆  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：４４２６−３５）において明らかにされた。従って、未熟終止コドンを認識し、ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解を誘導することによって応答する宿主細胞又は細胞系統は、本明細書において述べる本発明の適用のための候補である。
【００８５】
培養物中の真核宿主細胞などの、本発明の宿主細胞は、転写調節されるタンパク質を産生する（すなわち発現させる）ために使用できる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して転写調節タンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態では、前記方法は、（転写調節タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入された、あるいは、野生型又は変化した転写調節タンパク質をコードする遺伝子が導入された）本発明の宿主細胞を、転写調節タンパク質が産生されるまで、適切な培地中で培養することを含む。別の実施形態では、前記方法は、転写調節されるタンパク質をコードする単離異種ヌクレオチドを導入することを含み、結果として前記転写調節タンパク質の分泌の下方調節を生じさせる。
【００８６】
培養物中の真核宿主細胞などの、本発明の宿主細胞は、治療有効量の前記細胞を患者に投与することを含む、その必要のある患者を治療するために使用することができる。好ましい実施形態では、前記細胞は、プレプロインスリンをコードする核酸を含む異種核酸を含む。好ましい実施形態では、前記核酸はヒトインスリンをコードする。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞を用いて治療される患者は糖尿病を有する。さらなる好ましい実施形態では、前記疾患はインスリン依存性糖尿病である。
【００８７】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅及び精製のための標準的な手法；ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ等を含む酵素反応のための標準的な手法；様々な分離手法、ならびにｍＲＮＡ及びタンパク質を分析するための手法は、当業者によって知られており、一般的に使用されるものである。いくつもの標準的な手法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｗｕ編集、１９９３  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８、第Ｉ部；Ｗｕ編集、１９７９  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８；Ｗｕら編集、１９８３  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００及び１０１；ＧｒｏｓｓｍａｎとＭｏｌｄａｖｅ編集、１９８０  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５；Ｍｉｌｌｅｒ編集、１９７２  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＯｌｄとＰｒｉｍｒｏｓｅ，１９８１  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ；ＳｃｈｌｅｉｆとＷｅｎｓｉｎｋ，１９８２  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  第Ｉ及びＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；及びＳｅｔｌｏｗ  ＆  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ  １９７９  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第１−４巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの中に述べられている。略語及び学術用語は、使用される場合、当該分野において標準とみなされており、本明細書において引用するもののような専門誌において一般的に使用される。
【００８８】
本明細書全体を通して、様々な公表文献が参照されている。これらの公表文献及びそれらの公表文献の中で全体として引用される参考文献のすべての開示は、本発明が属する技術分野の状況をより十分に説明にするために、本明細書において参照することにより本明細書に組み込まれる。下記の実施例は本発明の特許請求の範囲を限定することを意図するではなく、ある種の実施形態の例示するためのものである。当業者が行う、例示した方法のいかなる変法も、本発明の範囲内に含まれることが意図されている。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
ＰＰＩ  ｍＲＮＡの遺伝子操作と発現
インスリン発現のためのプラスミド
図１のベクターＡ−Ｅは、ＨｅｐＧ２細胞におけるインスリン発現を体系的に増加させるために構築した５個のプラスミドである。野生型ヒトプレプロインスリンｃＤＮＡ、Ｂ−Ｃ及びＣ−Ａ接合部のフューリン開裂部位を有するフューリン適合性ｃＤＮＡ、ならびにＨｉｓ  Ｂ１０−ｔｏ−Ａｓｐ突然変異（Ｂ１０突然変異）を有するフューリン適合性ｃＤＮＡは、すべてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｇｒｏｓｋｒｅｕｔｚ，Ｃ．Ｍ．ら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６２４１−５参照）の好意により提供された。インスリン発現プラスミドのバックボーンは、プラスミドｐＲＬ／Ｎｕｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の１８２２ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントに由来した。プラスミドｐＧＬ３−対照（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化及びＳＶ４０エンハンサーシグナルの両方を含む５０８ｂｐのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを使用して、ｐＲＬ／Ｎｕｌｌ中のＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを置換し、ＳＶ４０エンハンサーを有するプラスミドを調製した。インスリン遺伝子を発現させるために使用したヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の８８３ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ制限フラグメントから得られた。前記ＣＭＶプロモーターをｐＲＬ／ＮｕｌｌのＢｇｌＩＩ及びＳｐｅＩ部位に結合させてイントロンを有するプラスミドを調製し、あるいは、ＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩ部位に結合させてイントロンを持たないプラスミドを調製した。様々なバージョンのＸｂａＩ／ＸｂａＩプレプロインスリンｃＤＮＡフラグメントを、ＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位を使用して前記バックボーンに連結させた。
【００９０】
プレプロインスリン遺伝子の５’に連結したイントロンは、配列：
【００９１】
【化１】
2006506044.tif 000003
を有する、バックボーン・プラスミドｐＲＬ／Ｎｕｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からの１３７ｂｐのキメライントロンであった。核膜を横切るｍＲＮＡ輸送のためにスプライシングが重要であることが試験で明らかにされており（Ｌｕｏ，Ｍ．−Ｊ．＆  Ｒｅｅｄ，Ｒ．，１９９９  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１４９３７−４２）、そして発現カセット内へのイントロンの組込みは組換え遺伝子発現のレベルを改善しうるので（Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｔ．＆  Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．，１９９０  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：９３７−４７）、前記キメライントロンは、最適スプライシングのためにインスリン発現カセットに含まれている。
【００９２】
Ｔｅｔ応答性インスリン発現プラスミドのバックボーンは、プラスミドｐＲＬ／Ｎｕｌｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の２０７４ｂｐのＸｈｏＩ／ＸｂａＩフラグメントから得られた。テトラサイクリン応答性プロモーターは、プラスミドｐＴＲＥ２ｐｕｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の４４８ｂｐのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限フラグメントから得られた。このプロモーターをｐＲＬ／Ｎｕｌｌのマルチクローニングサイトに挿入した。１コピーのインスリン遺伝子を含む対照プラスミドについては、Ｂ１０突然変異を有するフューリン適合性インスリン遺伝子を含む３６０ｂｐのＸｂａＩ／ＸｂａＩ制限フラグメントを、ＮｈｅＩ及びＸｂａＩ部位を使用してバックボーンに結合した（ベクターＦ）。遺伝子操作されたプラスミドについては、さらなる２コピーのインスリン遺伝子を、同じ頭部−尾部立体配置で、ＸｂａＩ部位により連続的にバックボーンに挿入した（ベクターＧ）。転写後、遺伝子操作したＰＰＩ  ｍＲＮＡは、転写産物の中央の終止コドンと共に、連続する３コピーのインスリン遺伝子を含んだ。翻訳は遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡの中央で停止し、ＮＭＤを誘導すると予想される。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のプラスミド、カタログ番号Ｋ１６２０−Ａ及びＫ１６２１−ＡのＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ制限フラグメントを使用して、それぞれｐＴｅｔ−Ｏｆｆ及びｐＴｅｔ−Ｏｎを調製した。
【００９３】
Ｂ−Ｃ及びＣ−Ａ接合部にフューリン開裂部位を有するＨｉｓ  Ｂ１０−ｔｏ−Ａｓｐ突然変異ヒトＰＰＩ  ｃＤＮＡの配列は、
【００９４】
【化２】
2006506044.tif 000004
である。Ｂ−Ｃ及びＣ−Ａ接合部にフューリン開裂部位を有するＨｉｓ  Ｂ１０−ｔｏ−Ａｓｐ突然変異ヒトＰＰＩ  ｃＤＮＡの３コピーの配列は、
【００９５】
【化３】
2006506044.tif 000005
である。
【００９６】
上述したイントロン  プラス  ３コピーの突然変異ヒトインスリンの配列は、
【００９７】
【化４】
2006506044.tif 000006
である。
【００９８】
配列番号２に定義する突然変異ヒトプレプロインスリンに対応するアミノ酸配列は、
【００９９】
【化５】
2006506044.tif 000007
である。星印（＊）は終止コドンの存在を示す。下線を付したアミノ酸残基は、野生型ヒトプレプロインスリンと比較した突然変異の位置を示す。他の動物種のプレプロインスリン及びインスリンの核酸配列及びアミノ酸配列、及びヒトなどの種内での変異体はよく知られており、公に入手可能である。
【０１００】
細胞培養とトランスフェクション
ＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿大気中３７℃で、１０％ウシ胎児血清、１．１ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム及び１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。約１０６細胞を６穴平板の各々９．６ｃｍ２の穴に接種し、トランスフェクション前に８−１２時間にわたり、２ｍｌの培養培地を与えた。すべてのトランスフェクションは、製造者の指示に従い、ＦＵＧＥＮＥ６試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて実施した。各々の穴について、ＨｅｐＧ２細胞は、プラスミドＤＮＡカクテル（２．１μｇ又は２．２５μｇ）及びＦＵＧＥＮＥ６試薬６μｌを用いて２４時間トランスフェクションした。特に異なる記載がない限り、トランスフェクションした細胞は、回収のためにさらに２４−３６時間、培養培地中でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、試験を実施する前に、インスリン分泌を安定させるために１時間ずつ連続２回、培養培地と共にインキュベートした。
【０１０１】
インスリン発現の体系的な増加
ＨｅｐＧ２細胞は、被験プラスミド（図１、ベクターＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ）２μｇ及び内部標準としてルシフェラーゼ発現のためのプラスミドｐＧＬ３−対照（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．１μｇを用いて、一過性にトランスフェクションした。次に、細胞を培養培地中で１時間インキュベートし、それを、分泌されたインスリンに関して検定するために収集した。ルシフェラーゼアッセイ及び細胞計数のために、コラゲナーゼＩＩ型５ｍｇを添加した０．２５％トリプシン溶液２．５ｍｌを使用して、細胞を分離した。
【０１０２】
アッセイ
内部対照ベクター、ｐＧＬ３−対照からのホタルルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコールに従って使用し、ＬＳ５０００シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて測定した。ヒトインスリン特異的ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キット（ＬＩＮＣＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＩ）によって、分泌されたインスリンを測定した。前記キット中の一次抗体は、プロインスリンと０．２％未満、交差反応する。放射能は、自動ガンマ線計数システム（Ａｕｔｏ−Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）Ｃｏｂｒａ  ＩＩ（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）において測定した。
【０１０３】
細胞内ＰＰＩ  ｍＲＮＡレベルの変化は、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって定量した。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離した；次に、ｃＤＮＡは、鳥類骨髄腫瘍ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成し、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲのための鋳型を調製した。
【０１０４】
ＰＰＩ  ｍＲＮＡ及び内部標準ｔＴＡ（コトランスフェクションしたプラスミドｐＴｅｔ−Ｏｆｆからのテトラサイクリン応答性転写活性化因子）ｍＲＮＡの発現レベルは、別々の試験管において、それぞれ６ＦＡＭ（商標）及びＶＩＣ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で標識したプローブを用いて測定した。プライマー及びプローブ（表１）は、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計した。プレプロインスリンｍＲＮＡ−ＦＡＭ及びｔＴＡ  ｍＲＮＡ−ＶＩＣを測定することにより、試料の調製及びトランスフェクション効率の差から生じる相違を補正することができた。ＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、次の熱サイクル条件を用いて実施した：５０℃で２分間、９５℃で１０分間、及びその後、９５℃で１５秒間とそれに続く６０℃で１分間を４０サイクル。比較閾値サイクル（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（ＣＴ）法（ユーザー情報誌  第２号（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、相対的な遺伝子発現を測定した。ｔＴＡ  ｍＲＮＡシグナルを有するＰＰＩ  ｍＲＮＡを標準化し、時間ゼロの時点での標準化試料レベルに１００の値を割り当てることにより、ＰＰＩ  ｍＲＮＡの相対的数量化を行った。
【０１０５】
【表１】
2006506044.tif 000008
【０１０６】
結果
図１は、インスリン発現を改善するために構築したプラスミドを示す。ＣＭＶプロモーターにより、ベクターＤは、一過性にトランスフェクションしたＨｅｐＧ２肝癌細胞から７２０±１３０ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）のインスリン分泌率を生じた（図２）。これは、遺伝子結合を伴わないフューリン適合性インスリン遺伝子（図１及び２、ベクターＡ）で達成された分泌率よりも３２．０±９．４倍高く、またキメライントロン及びＳＶ４０エンハンサーを有する野生型インスリン遺伝子（図１及び２、ベクターＥ）に比べて２７．５±８．０倍高かった。しかしながら、ＳＶ４０エンハンサーはＴｅｔ応答系と適合性ではないので、Ｔｅｔ応答性インスリン発現に適用したベクターはこの配列を含まないが、Ｂ−Ｃ及びＣ−Ａ接合部及びＢ１０  Ｈｉｓ−ｔｏ−Ａｓｐ突然変異、ならびにキメライントロンを含んでいた。
【０１０７】
対照及び遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡ発現プラスミド（ベクターＦ及びＧ、図１）を、ＨｅｐＧ２細胞においてプラスミドｐＴｅｔ−Ｏｆｆで各々一過性にコトランスフェクションした。遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡの使用は、インスリン発現レベルを、対照構築物の３２０±５５ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）（ｎ＝４）から１０９±４３ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）に、すなわち６６％低下させた。明らかに、遺伝子操作ｍＲＮＡの安定性の低下は、多くの他のナンセンス突然変異において認められているように（Ｌｉ，Ｓ．＆  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｆ．，１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８：１３５−４１；Ｐｕｌａｋ、Ｒ．＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．，１９９３、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．７：１８８５−９７）、細胞内ｍＲＮＡレベルを低下させ、それ故に発現を低下させた。しかしながら、遺伝子操作プラスミド及び対照プラスミドの両方を有する細胞は、ＤＯＸによって同様に調節された。対照プラスミドに関しては、トランスフェクションされた細胞は、ＤＯＸ存在下に比べて不存在下において、２４．８±５．２倍高いｍＲＮＡ発現及び２０．７±３．８倍高いインスリン分泌率を有していた。遺伝子操作プラスミドに関しては、対応する数値は、ＤＯＸの存在下に比べて不存在下において、２０．７±３．９倍高いｍＲＮＡ発現及び１９．２±４．８倍高いインスリン分泌率であった。
【０１０８】
ＮＭＤはＨｅｐＧ２細胞の分泌応答を改善したが、また、細胞内ＰＰＩ  ｍＲＮＡレベルを低下させ、それ故にインスリン発現を低下させた。この問題を改善するために、ＮＭＤを適用する前にインスリン発現を増加させた。ベクターＤ（図１）で一過性にトランスフェクションしたＨｅｐＧ２肝癌細胞は、７２０ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）の率でインスリンを分泌し、これは、βＴＣ−３マウスインスリノーマが示す３８０ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）の基礎インスリン分泌率よりも高い（Ｍｕｋｕｎｄａｎら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１０：１１３−８）。Ｔｅｔ応答性インスリン発現に関しては、ＳＶ４０エンハンサーを適用しなかったが、ＤＯＸ非含有培地中でのＴｅｔ−ＯｆｆトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞からのインスリン分泌は、対照及び遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡを使用したとき、それぞれ、３２０ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）及び１０９ｆｍｏｌｅ／（ｈｒ・１０６細胞）であった。
【０１０９】
（実施例２）
インスリン発現及び分泌のダイナミクス
動的インスリン発現
ＨｅｐＧ２細胞は、プラスミドｐＴｅｔ−Ｏｆｆ（又はｐＴｅｔ−Ｏｎ）２μｇ及び対照又は遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡ発現プラスミド（図１、ベクターＦ及びＧ）０．２５μｇを使用して、一過性にコトランスフェクションした。平行培地中のＴｅｔ−Ｏｆｆトランスフェクションされた細胞は、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）非含有培地又は１μｇ／ｍｌ  ＤＯＸを含む培地中で２４−３６時間インキュベートした。培地を新しいものと交換し、細胞をさらに１時間インキュベートして、その間インスリン分泌を測定した；その後、定量的ｍＲＮＡアッセイのために細胞を溶解させた。インスリン遺伝子下方調節のダイナミクスを検討するため、Ｔｅｔ−Ｏｆｆトランスフェクションされた細胞をＤＯＸ非含有培地から１μｇ／ｍｌ  ＤＯＸ培地に、８時間にわたって切り換えた。１時間ごとに培地を新しくし、インスリンアッセイのために採集した。２時間ごとに、定量的ｍＲＮＡアッセイのために細胞を溶解させた。Ｔｅｔ−Ｏｎ系を用いてインスリン分泌を動的に調節するために、Ｔｅｔ−Ｏｎトランスフェクションされた細胞をＤＯＸ非含有培地から１μｇ／ｍｌ  ＤＯＸ培地に１時間切り換えて、４回洗浄し、ＤＯＸ非含有培地で７時間インキュベートして、これらの段階を反復した。１時間ごとに培地を新しくし、インスリンアッセイのために採集した。
【０１１０】
結果
Ｔｅｔ−Ｏｆｆ発現系を用いて、インスリン遺伝子発現の下方調節を試験した。動的試験において、０時点で１μｇ／ｍｌ  ＤＯＸ含有培地に細胞を暴露することによって、転写を下方調節した（図３）。対照が８時間以上の半減期を有していたのに比べて、遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡはより速い低下を示し、４時間未満の半減期であった。インスリン分泌率の低下も同様の傾向をたどった。従って、遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡから免疫反応性インスリンを合成することができ、また、ｍＲＮＡ及び分泌タンパク質レベルの両方で転写のスイッチを切ったときの下方調節のダイナミクスは、対照に比べて遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡのほうがより迅速である。
【０１１１】
トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞からのインスリン分泌の上方及び下方調節は、ＤＯＸがインスリン遺伝子の発現を誘導する、Ｔｅｔ−Ｏｎ系を用いて試験した。８時間サイクル中１時間の誘導を用いて、遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡからのインスリン産生は転写スイッチに応答した（図４）。他方で、対照ＰＰＩ  ｍＲＮＡからのインスリン産生は、ＤＯＸ非含有培地への７時間の基礎暴露期間中、低下しなかった。
【０１１２】
Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系の特異性及びこの試験で使用した毒性量以下のＤＯＸ濃度（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−９）は、非特異的阻害因子に関する実験と比較して（Ｒｏｓｓ，Ｊ．，１９５５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９，４２３−５０）、ｍＲＮＡ半減期測定の正確さを高める。Ｔｅｔ応答系によってインスリン分泌ダイナミクスを測定する上での１つの懸念は、ＤＯＸの薬物動態である。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系及びその転写リプレッサーであるテトラサイクリンは、６分間という短い半減期を有するスプライシングされたイントロンの安定性を測定するために適用できる（Ｃｌｅｍｅｎｔら、１９９９、ＲＮＡ  ５：２０６−２０）。従って、テトラサイクリンは細胞内へと速やかに拡散し、転写を遮断すると思われる。テトラサイクリンの異性体であり類似体であるＤＯＸは、ＨｅｐＧ２細胞においてインスリン遺伝子発現を調節するときに同様の動態を有すると予想される。しかしながら、細胞内ＤＯＸ濃度の低下という逆の過程は、拡散による流出以外に、ＤＯＸ−タンパク質複合体からのＤＯＸの解離、細胞小器官におけるＤＯＸの分布と蓄積、及びＤＯＸの代謝が起こり、Ｔｅｔ−Ｏｎ系によって示されるインスリン分泌下方調節の遅延に寄与しうるので、より複雑であると考えられる（図４）。代謝性分泌促進物質、例えばグルコースに関して、転写の内因性動態は、特に下方調節過程の間は、分泌の動態により近いであろうと考えられる。
【０１１３】
図４では、Ｔｅｔ−Ｏｎ系を誘導するために２つのＤＯＸ矩形波が適用され、単一コピーのプラスミドからのインスリン分泌の５倍の増加が得られた。同じＴｅｔ−Ｏｎ系で８時間の誘導が実施され、インスリン分泌の約３０倍の増加が得られた。この結果は、Ｔｅｔ−Ｏｎ系の動態を調べるためにルシフェラーゼをレポーターとして使用したＧｏｓｓｅｎら（１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−９）の所見と同様である。１コピーのＰＰＩ  ｍＲＮＡプラスミドの安定性の故に、２回にわたる７時間のＤＯＸ非含有基礎期間中、インスリン分泌率の低下は存在しなかった。しかしながら、２回目の誘導からのインスリン分泌の増加は、１回目よりも有意に低かった。実験を同じ方法で継続した場合、誘導時の分泌速度の付加的な（小さな）上昇がその後の基礎期間中の低下によって相殺されるので、インスリン分泌は、ある程度の最大値に達した後、正味の上昇を示さないと予想される。
【０１１４】
（実施例３）
翻訳の阻害はインスリン分泌ダイナミクスにおけるＮＭＤの役割を示唆する
翻訳阻害試験
Ｔｅｔ−ＯｆｆトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞を１回洗浄し、その後２８μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むＤＯＸ非含有培地に４時間暴露した（Ｒａｊａｖｅｌ，Ｋ．Ｓ．＆  Ｎｅｕｆｅｌｄ，Ｅ．Ｆ．，２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１：５５１２−９）。シクロヘキシミド含有培地の添加の時点を０時点とした。翻訳を再開させるために、細胞を４回洗浄し、その後ＤＯＸ非含有のシクロヘキシミド非含有培地で４時間ずつ連続２回インキュベートした。０、４、８及び１２時間目に、定量的ｍＲＮＡアッセイのために細胞を溶解させた。
【０１１５】
結果
ＮＭＤが実際に遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡの半減期を短縮することに関与しているのかどうかを明らかにするために、対照実験を実施した。正常ｍＲＮＡとナンセンス突然変異体は翻訳によって互いに識別されるので、翻訳の阻害が対照及び遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡのレベルに及ぼす影響を検討した。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ制御下において対照又は遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡで一過性にトランスフェクションしたＨｅｐＧ２肝癌細胞をＤＯＸ非含有培地に保持し、０時点でシクロヘキシミドに暴露した（図５）。０時点での遺伝子操作／対照ＰＰＩ  ｍＲＮＡ比を１００％と定義した。シクロヘキシミド処理の４時間後、この比率は、シクロヘキシミド非含有培養と比較して４９０％に上昇した。シクロヘキシミドを除去して翻訳を再開させたとき、遺伝子操作／対照ＰＰＩ  ｍＲＮＡ比は基線レベル近くへと低下した。
【０１１６】
（実施例４）
介在ＤＮＡ配列の長さのｍＲＮＡ安定性への影響
プラスミド
１コピーのプレプロインスリン遺伝子を有するＴｅｔ応答性プラスミドは、実施例１におけるベクターＦ（図１）と同じである。２、３及び４コピーのプレプロインスリン遺伝子を有するＴｅｔ応答性プラスミドの構築は、プレプロインスリン遺伝子の終止コドンに隣に位置するＸｂａＩ部位を介してベクターＦ内のプレプロインスリン遺伝子の３’末端に１、２又は３コピーのプレプロインスリン遺伝子を連続的に挿入することによって実施した。
【０１１７】
アッセイ
転写レベル、インスリンの分泌、及びインスリン遺伝子発現とインスリン分泌のダイナミクスを実施例１−３で述べたように評価した。
【０１１８】
結果
インスリンの分泌の下方調節は、構築物中のインスリン遺伝子のコピー数に関係する。図６に示すように、Ｔｅｔ−Ｏｎ系からＤＯＸを取り除いたとき、２及び３コピーのプレプロインスリン遺伝子を含む構築物はインスリン分泌の下方調節を示したが、１コピーのプレプロインスリン遺伝子を含む構築物のインスリン分泌は比較的安定なままであった。従って、１コピーより多くのプレプロインスリン遺伝子を含む構築物は、転写の下方調節後、インスリン分泌のより急速な低下を示した。
【０１１９】
図７Ａに示すように、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系を使用して種々のコピー数（１−４）のプレプロインスリン遺伝子を含む構築物によるインスリン分泌の下方調節を評価した。０時点でＤＯＸを加えることにより、転写は下方調節された。１コピーの対照構築物と比較して、複数のコピーのインスリン遺伝子を有する系はすべて、インスリン分泌のより速やかな低下を示す。図７Ｂは、ＤＯＸ誘導の矩形波に細胞を暴露したときのＴｅｔ−Ｏｎ系によるインスリン分泌のダイナミクスを示し、これは、食事後にインスリン遺伝子の転写を刺激する上でのグルコースの作用を模倣する。この試験は、３及び４コピーの系からの応答が非常に類似することを示唆する。３及び４コピーの系からの応答は２コピー系の応答よりもわずかに速いが、２コピー系は１コピー系よりも顕著に速い。さらに、４コピー系は、構築物の大きさゆえにインスリン分泌の下方調節上昇を示したが、３コピー系は実験室においてより操作しやすかった。しかしながら、試験した多数コピー系すべてが１コピー対照と比較してインスリン分泌の下方調節を加速する上で非常に有効であることが、図７Ａ及び７Ｂにおいて示された。
【０１２０】
インスリン分泌のダイナミクスは、１コピー、２コピー、３コピー及び４コピーの構築物を用いて検討した。トランスフェクションされたＨｅｐＧ２肝癌細胞からのインスリン分泌の調節は、実施例２で述べたようにＴｅｔ−Ｏｎ系を用いて評価した。しかしながら、実施例２で述べたように１時間のＤＯＸ誘導を使用するのではなく、２時間のＤＯＸ誘導を使用し、その後６時間の基礎条件下に置いた。図８に示す結果は、多数コピー系からのインスリン分泌がＤＯＸ誘導の矩形波に続いて生じうることを示唆する。他方で、１コピー対照は、ＤＯＸ誘導の矩形波に続いて生じなかった。これらの結果により、１、２又は３コピーのプレプロインスリン遺伝子を終止コドンの下流に置くことはすべて、おそらくその程度は様々であるが、プレプロインスリンｍＲＮＡを不安定化し、インスリン分泌のダイナミクスを改善することが示唆される。
【０１２１】
（実施例５）
介在ＤＮＡ配列の配列を変化させることの役割
プラスミド
プレプロインスリン−ルシフェラーゼ  ハイブリッドｍＲＮＡを作製するために使用したルシフェラーゼ遺伝子は、プラスミドｐＧＬ３−対照（Ｐｒｏｍｅｇａ）に由来した。ルシフェラーゼ遺伝子の５’末端にＳｐｅＩ部位を生成するために、プラスミドｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られる２２６ｂｐのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩアダプターを使用して、ｐＧＬ３−対照内のＳＶ４０プロモーターフラグメントを置換した；次にＳｐｅＩ及びＸｂａＩで消化して、ルシフェラーゼＤＮＡフラグメントを得、その後、ベクターＦ内のプレプロインスリン遺伝子の３’末端のＸｂａＩ部位に連結させた。
【０１２２】
アッセイ
転写レベル、インスリンの分泌、及びインスリン遺伝子発現とインスリン分泌のダイナミクスを実施例１−４で述べたように評価した。
【０１２３】
結果
ナンセンス変異を介したｍＲＮＡ分解を生じさせる試みとして、ルシフェラーゼｃＤＮＡに作動可能に連結したプレプロインスリン遺伝子を含む構築物を使用して、インスリン分泌の下方調節を検討した。多数コピーのプレプロインスリン遺伝子を含む構築物と比較して、このアプローチはまた、プレプロインスリン遺伝子の翻訳終止コドンとポリアデニル化シグナルとの間に間隔を作る。長さ３６０ｂｐのプレプロインスリン遺伝子と比較して、ルシフェラーゼ遺伝子の大きさは１６５０ｂｐである。図９は、プレプロインスリン−ルシフェラーゼ  ハイブリッドｍＲＮＡの下方調節（図９Ａ）とインスリン分泌率（図９Ｂ）が、図３Ａ及び３Ｂに示す３コピー系（黒い四角）のダイナミクスに類似していたことを示す。この結果は、インスリン分泌の速やかな下方調節が、多数コピーのプレプロインスリン遺伝子を含む系に限定されないことを明らかにする。プレプロインスリン遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子などの異なるＤＮＡ配列に連結したとき、図３Ａ及び３Ｂに示す１コピーのインスリン対照構築物（白い丸）と比較して、インスリン発現のより速やかな下方調節が認められた。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、インスリン発現のために使用されるプラスミドの構造の概要図を示す。インスリン発現を増加させるエレメントを評価するために、ベクターＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥを構築した。ベクターＦ及びＧは、それぞれ１コピー及び３コピーのＰＰＩ  ｃＤＮＡを有するＴｅｔ応答性プラスミドである。
【図２】図２は、トランスフェクションしたヒトＨｅｐＧ２肝癌細胞からインスリン発現の体系的上昇を明らかにする。図１（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ）に示す被験ベクター及び内部対照プラスミドｐＧＬ３−対照を用いて、細胞を一過性にコトランスフェクションした。ｐＧＬ３−対照により発現されるルシフェラーゼを使用してインスリン分泌率を標準化し、従って、トランスフェクション効率の変動に関して補正した。ベクターＤ（最も高いインスリン発現ベクター）からの標準化インスリン分泌率に１００の値を割り当てた。実験は各々３穴で実施した。＊、＃及び◆はＰ値＜０．０２を示し、●はＰ値＜０．０４を示す。Ｐ値は、不等分散を仮定して、片側ｔ検定を用いて算定した。棒線は標準偏差を示す。
【図３】図３Ａ及びＢは、対照（白丸）及び遺伝子操作（黒い四角）ＰＰＩ  ｍＲＮＡ発現について、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系を使用したインスリン遺伝子発現の下方調節のダイナミクスを示す。図３ＡはＰＰＩ  ｍＲＮＡの下方調節を示し、図３Ｂはインスリン分泌率の下方調節を示す。ｔＴＡ（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系の成分である、コトランスフェクションされたプラスミドｐＴｅｔ−Ｏｆｆからの、テトラサイクリン応答性転写活性化因子）ｍＲＮＡを、定量的ＰＰＩ  ｍＲＮＡアッセイのための内部標準として使用した。各々の独立した試験において、ＤＯＸ処置なし（ｔ＝０）の試料を基準として選択し、それを１００％に設定することによって、ＰＰＩ  ｍＲＮＡを標準化した；インスリン分泌率は、最高速度を有する試料を基準として選択し、それを１００％に設定することによって標準化した。８時間の下方調節の期間の後、対照及び遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡはそれぞれ６１±８％（Ｐ＜０．００７）及び１４±１０％（Ｐ＜０．００３）に低下し、インスリン分泌率はそれぞれ７５±１２％（Ｐ＜０．０５）及び１７±７％（Ｐ＜０．００２）に低下した。各々の実験は３つの独立した試験を含んだ。棒線は標準偏差を示す。
【図４】図４は、対照（白丸）及び遺伝子操作（黒い四角）ＰＰＩ  ｍＲＮＡ発現に関する、Ｔｅｔ−Ｏｎ系を使用した、トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞からのインスリン分泌の調節を示す。各々の独立した試験において、最高速度を有する試料を基準として選択し、それを１００％に設定することによってインスリン分泌率を標準化した。各々の実験は３つの独立した試験を含んだ。棒線は標準偏差を示す。
【図５】図５は、ＰＰＩ  ｍＲＮＡの安定性への翻訳の影響（ナンセンス変異を介するｍＲＮＡ分解の証拠）を示す。ＨｅｐＧ２肝癌細胞を、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ及び対照又は遺伝子操作ＰＰＩ  ｍＲＮＡ発現プラスミドで一過性にコトランスフェクションした。シクロヘキシミドを翻訳阻害因子として使用した。各々の独立した試験において、ＰＰＩ  ｍＲＮＡ比（遺伝子操作／対照）は、シクロヘキシミド処理なし（ｔ＝０）の試料を１００％に設定して、それに対して標準化した。各々の実験は４つの独立した試験を含んだ。＊及び＃はＰ値＜０．００３を示し、●はＰ値＝０．３６を示す。棒線は標準偏差を示す。
【図６】図６は、構築物を含む対照（１コピー）及び遺伝子操作（２コピー及び３コピー）ＰＰＩに関する、Ｔｅｔ−Ｏｎ系を使用した、トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞からのインスリン分泌の調節を示す。０時点でＤＯＸを除去することにより、転写は下方調節された。各々の独立した試験において、最高速度を有する試料を基準として選択し、それを１００％に設定することによってインスリン分泌率を標準化した。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、インスリン遺伝子発現の下方調節のダイナミクスを示す。図７Ａは、種々のコピー数（１−４）のプレプロインスリン遺伝子によるインスリン分泌の下方調節を評価するために、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系を使用した結果を示す。０時点でＤＯＸを加えることにより、転写は下方調節された。図７Ｂは、１−４コピーのプレプロインスリン遺伝子を含むＴｅｔ−Ｏｎ系でトランスフェクションした細胞をＤＯＸ誘導の矩形波に１時間暴露し、その後７時間基礎状態においたときの、インパルス試験におけるインスリン分泌のダイナミクスを明らかにする。
【図８】図８は、１−４コピーのプレプロインスリン遺伝子を含む構築物を使用するＴｅｔ−Ｏｎ系を用いた、トランスフェクションされたＨｅｐＧ２肝癌細胞からのインスリン分泌の調節を示す。細胞を２時間のＤＯＸ誘導とその後の６時間の基礎状態のサイクルに暴露した。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、プラスミドが多数コピーのプレプロインスリン遺伝子の代わりにプレプロインスリン−ルシフェラーゼｃＤＮＡ構築物を含む場合の、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系を用いたインスリン発現の下方調節のダイナミクスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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