(57)【要約】本発明は、エンテロバクターアエロゲネス（ＥＢＡ）を用いた２−フルオロアデニンおよび９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルからのリン酸フルダラビンの製造方法を提供する。ＥＢＡ細胞ペーストの存在下、pH＝７の水溶液中で２−フルオロアデニンを９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルと反応させて、フルダラビンを得る。その後、フルダラビンを無水酢酸で処理し、得られたアセチル誘導体を結晶化させて、フルダラビンに加水分解する。リン酸化、および有機アミンまたは水酸化アンモニウムを用いた精製によって、リン酸フルダラビンを得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）エンテロバクターアエロゲネスの存在下で２−フルオロアデニンを９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルと反応させて、粗フルダラビン（II）：
【化１】
2006521796.tif 000006
を得るステップ；
ｂ）粗フルダラビンを無水酢酸で処理して、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（III）：
【化２】
2006521796.tif 000007
を得るステップ；
ｃ）化合物（III）の加水分解および再結晶化によって、純粋なフルダラビン（II）を得るステップ；
ｄ）フルダラビンをリン酸化して、リン酸フルダラビン（Ｉ）を得るステップ、
を含む、リン酸フルダラビン（Ｉ）：
【化３】
2006521796.tif 000008
の製造方法。
【請求項２】
ステップａ）が、５０〜７０℃に含まれる温度で実行され、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルと２−フルオロアデニンとのモル比が、５：１〜７：１の範囲内である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）からの粗フルダラビンが、透析によって回収される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）が、粗フルダラビンを９０〜１００℃の無水酢酸９〜１１倍容量に溶解することによって実行される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）からの中間体（III）が、メタノールおよび水酸化アンモニウムで加水分解される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ステップｃ）から得られたフルダラビンが、水または水／エタノール混合物から熱結晶化される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ステップｄ）のリン酸化反応が、−１０℃で実行され、得られたリン酸フルダラビンが、０℃の水に沈殿する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
リン酸フルダラビンが、有機アミンまたはＮＨ4ＯＨでの処理と、その後の酸水解によって精製される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
有機アミンが、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ベンジルアミン、トリブチルアミン、ジベンジルアミンおよびジシクロヘキシルアミンからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
有機アミンまたはアンモニアとのリン酸フルダラビンの塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸フルダラビン（Ｉ）の製造方法、特にエンテロバクターアエロゲネス（Enterobacter aerogenes）を用いた２−フルオロアデニンおよび９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルからのリン酸フルダラビンの製造方法に関する。
【０００２】
【化４】
2006521796.tif 000002
【０００３】
技術的背景
フルダラビン（９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン）（II）は、アデノシンデアミナーゼに抵抗性のプリンヌクレオシド代謝拮抗物質であり、白血病の処置に用いられている。
【０００４】
【化５】
2006521796.tif 000003
【０００５】
フルダラビンは、通常、プロドラッグのリン酸フルダラビンとして投与されるが、天然の代謝産物でもある。フルダラビンは、最初、Montgomery（US4,188,378およびUS4,210,745）によって２−アミノアデニンから出発して合成された。方法は、２−アミノアデニンのアセチル化、ベンジル保護されたクロロ糖との反応、アミノ基の脱アセチル化、２−アミノ基のジアゾ化およびフッ素化と、その後の糖残基の脱保護を含むものであった。
【０００６】
リン酸フルダラビンは、従来のリン酸化法、代表的にはリン酸トリメチルおよび塩化ホスホリルでの処理によって、得ることができる。近年になり、高純度のフルダラビン、リン酸フルダラビンおよびその塩を製造する方法が、Tilstam et al.(US6,046,322)によって開示された。
【０００７】
酵素的合成は、ヌクレオシドおよびヌクレオチド誘導体の従来の合成法に代わる有効な方法とみなされた。EP0867516は、ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ活性を有する酵母細胞を用いることによって、糖１−リン酸およびヌクレオシド一リン酸から糖ヌクレオチドを製造する方法を開示している。EP0721511B1は、ヌクレオシドのリン酸化を触媒する能力のある微生物の存在下で、アラビノヌクレオチドをリン酸アリールと反応させることによるリン酸ビダラビンおよびリン酸フルダラビンの合成を開示している。この方法は、精製した酵素を必要とせず特に簡便であるが、ビダラビンおよびフルダラビンを合成できない。
【０００８】
発明の記載
エンテロバクターアエロゲネス（ＥＢＡ）の存在下で２−フルオロアデニンを９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル（Ａｒａ−Ｕ）と反応させることによってフルダラビンを簡便に製造させ得ることが、ここに見出された。
【０００９】
本発明は、スキームに例示された、以下のステップ：
ａ）エンテロバクターアエロゲネスの存在下で２−フルオロアデニンを９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルと反応させて、粗フルダラビン（II）を得るステップ；
ｂ）粗フルダラビンを無水酢酸で処理して、２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（III）とするステップ；
ｃ）中間体（III）の加水分解および再結晶化によって、純粋なフルダラビンを得るステップ；
ｄ）フルダラビンをリン酸化して、リン酸フルダラビン（Ｉ）を得るステップ、
を含むリン酸フルダラビン（Ｉ）の製造方法に関する。
【００１０】
【化６】
2006521796.tif 000004
【００１１】
ステップａ）は、５０〜７０℃に含まれる温度、好ましくは６０℃に加熱し、ＫＯＨペレットでpH７に調整して、２−フルオロアデニン、Ａｒａ−ＵおよびＥＢＡを添加した０．０３〜０．０５Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4溶液中で実施される。溶液中の２−フルオロアデニンの濃度は、０．０２〜０．０３Ｍの範囲内であるが、９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルは、大過剰で用いられ、好ましくは９−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルと２−フルオロアデニンとのモル比が、５：１〜７：１、より好ましくは５．５：１〜６．５：１の範囲内である。ＫＨ2ＰＯ4溶液リットルあたり細胞培養物２〜２．５リットルが用いられる。混合物を６０℃で撹拌し、２５％ＫＯＨ溶液でpHを７に調整して、反応をＨＰＬＣでモニタリングする。反応が完了したら（約２４〜２６時間）、細胞材料を従来の透析で分離し、透過した溶液を回収して、低温で一晩保持する。結晶化したフルダラビンは、１０％  ９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを含有するが、それをステップｂ）およびｃ）によって簡便に除去することができる。
【００１２】
ステップｂ）において、ステップａ）からの粗フルダラビンを無水酢酸９〜１１倍容量、好ましくは１０倍容量に溶解して、反応が完了するまで（約１０〜１２時間）、撹拌しながら９０〜１００℃で反応させる。無水酢酸をアセトンによって同時蒸発（co-evaporated）させて、生成物を水に懸濁させる。
【００１３】
ステップｃ）の加水分解は、メタノールおよび水酸化アンモニウムを用いて実施される。代表的にはステップｂ）からの化合物(III)を、メタノール９〜１１倍容量および２５％ＮＨ4ＯＨ２．５〜３．５倍容量に懸濁させて、加水分解が完了するまで室温で撹拌する（約２０時間；反応の完了は、混合物を３０〜３２℃に穏やかに加温することによって促進することができる）。混合物を１０℃に冷却することによってフルダラビンが沈殿し、水、好ましくはフルダラビンのグラムあたり水５０〜７０ml、またはフルダラビンのグラムあたり水／エタノール混合物（１／１  ｖ／ｖ）３０〜４０mlを用いて更に熱結晶化（hot-crystallise）させる。フルダラビンは、一水和物として回収され、９９％を超えるＨＰＬＣ純度を有している。
【００１４】
フルダラビンのリン酸フルダラビンへの変換（ステップｄ）が、例えばUS4,357,324に開示されたとおりの任意の従来技術によって実施し得たとしても、我々は、反応温度の正確な制御が収率を有意に改善することを見出した。本発明の好ましい実施形態によれば、オキシ塩化リンと、リン酸トリエチルと、フルダラビンとの反応が、−１０℃で実施されて、リン酸フルダラビンが、０℃で水から沈殿する。我々は、意外にも、中等度、即ち５〜６％の水含量であるフルダラビンのリン酸化が、二リン酸塩誘導体の形成を著しく減少させることも見出した。
【００１５】
リン酸フルダラビンは、有機アミンまたはＮＨ4ＯＨとの塩化によって更に精製することができる。リン酸フルダラビンの水溶液または水−有機水溶液を、等量のアミン（好ましくはトリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ベンジルアミン、トリブチルアミン、ジベンジルアミンおよびジシクロヘキシルアミンからなる群から選択される）、またはＮＨ4ＯＨ、代表的には２５％ＮＨ4ＯＨで処理して、得られた塩を希酸、好ましくは希釈した３〜５％ＨＣｌでの酸水解にかける。適切な有機溶剤は、水混和性有機溶剤である。加水分解の前に、リン酸フルダラビンの塩をＮＨ4Ｃｌとの陽イオン交換反応にかけてアンモニウム塩を得、次にそれを加水分解することもできる。この手順は、リン酸フルダラビンがジシクロヘキシルアミンで塩化される場合に特に有利である。有機アミンまたはＮＨ4ＯＨでの処理によるリン酸フルダラビンの精製によって、薬局方解説書（pharmacopoeia specifications）に適う純度の最終生成物が得られる。
【００１６】
リン酸フルダラビンの有機アミンまたはアンモニアとの塩は、新規なものであり、本発明の更なる目的である。特に好ましいのは、ジシクロヘキシルアンモニウム塩である。
【００１７】
要約すると、本発明によって、以下の利点が得られる：純粋な酵素を用いない酵素的合成によってフルダラビンが製造され、それゆえ工業的規模の場合に特に適している；トリアセチル誘導体が高純度および高収率で水に沈殿するため、フルダラビンがアセチル化により９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンから容易に回収および精製され、クロマトグラフィー精製の必要がない；リン酸化ステップでの反応温度を制御することによって、水含量５〜６％のフルダラビンからリン酸フルダラビンを高収率および高純度で得ることができる；最後に、有機アミンまたはＮＨ4ＯＨとの塩化によるリン酸フルダラビンの精製が、生成物の分解（即ち、リン酸フルダラビンが高温で結晶化される場合に生じる不純物ＡおよびＢの形成）を最小限に抑える。
【００１８】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例示するものである。
【００１９】
実施例
実施例１  −  粗９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（II）
水（１３リットル）中のＫＨ2ＰＯ4（１２３ｇ、０．９mol）の溶液を、撹拌しながら６０℃に加熱し、ＫＯＨペレット（１３０ｇ、２．３２mol）でpHを７に調整し、その後Ａｒａ−Ｕ（１４５１ｇ、５．９４mol）、２−フルオロアデニン（１５０ｇ、０．９８mol）およびＥＢＡ（ＡＴＣＣ（登録商標）ｎ°１３０４８）細胞培養物（３０リットル）を添加した。
【００２０】
混合物を６０℃で２４〜２６時間撹拌し、２５％ＫＯＨ溶液でpHを７に調整して、ＨＰＬＣで反応をモニタリングした。
【００２１】
２４〜２６時間後に、細胞材料を５０〜５５℃で透析によって分離し、混合物を水で希釈した。透過した黄色透明溶液を回収してプールし（５０リットル）、０〜５℃で一晩放置した。得られた結晶性沈殿をろ過して、冷水（２リットル）で洗浄した。
【００２２】
生成物を真空下、４５℃で１６時間乾燥させて、粗化合物（II）１１０ｇを得たが、それはＨＰＬＣによって（Ｉ）（９０％）と９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニン（１０％）との混合物であることが示された。
【００２３】
実施例２  −  純粋な９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（II）
９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（II）（３０ｇ、０．０９５mol）を無水酢酸（３００ml）に懸濁させて、撹拌しながら９５℃に加熱した。
【００２４】
７時間後に透明な溶液が得られ、アセチル化が完了するまで９５℃で更に２〜３時間反応させた。
【００２５】
その後、得られた黄色溶液を真空下、４５℃で濃縮して、残渣をアセトン（２×５０ml）によって同時蒸発させて、水（６００ml）に懸濁させた。水懸濁液を室温に冷却して、撹拌しながら１時間放置した。
【００２６】
生成物をろ過によって回収し、水（２×１００ml）で洗浄して、湿性２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン（III）３４ｇを得た。
【００２７】
湿性化合物（III）をメタノール（３００ml）に懸濁させて、２５％ＮＨ4ＯＨ（１００ml）を添加した。混合物を室温で一晩放置し、１９時間後に、出発原料がＨＰＬＣで検出されなくなるまで３時間、３０〜３２℃に加温した。
【００２８】
懸濁液を１時間、１０℃に冷却し、その後、生成物をろ過によって回収して、メタノール−水混合物（２×２５ml、３：１ｖ／ｖ）で洗浄した。生成物を真空下で一晩乾燥させて、フルダラビン（II）１７．５ｇ（ＨＰＬＣ純度  ９８．４％）を得た。
【００２９】
方法Ａ
生成物を水（８７５ml）に懸濁させて、透明溶液が得られるまで９５℃に加熱することによる、化合物（II）（１７．５ｇ、０．０６１mol）の再結晶化も実施した。溶液を室温になるまで放冷し、結晶生成物をろ過し、冷水（２×５０ml）で洗浄し、真空下で一晩乾燥させて、純粋なフルダラビン（II）（ＨＰＬＣ純度  ９９．３％）１５．５ｇを得た。
【００３０】
方法Ｂ
生成物を水／エタノール混合物（１／１、ｖ／ｖ）（１０５０ml）に懸濁させて、透明溶液が得られるまで８０℃に加熱することによる、フルダラビン（II）（３５ｇ、０．１２３mol）の再結晶化も実施した。溶液を室温になるまで放冷し、結晶生成物をろ過し、水／エタノール混合物（２×５０ml）で洗浄し、真空下で一晩乾燥させて、純粋なフルダラビン（II）（ＨＰＬＣ純度  ９９％）３２ｇを得た。
【００３１】
実施例３  −  ９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−２−フルオロアデニン−５’−ホスファート（Ｉ）
方法Ａ
オキシ塩化リン（５ｇ、３ml、０．０３３mol）を、冷リン酸トリエチル（−１０℃、５０ml）に添加し、その溶液を−１０℃で１時間保持し、その後、−１０℃で撹拌しながらフルダラビン（II）（５ｇ、０．０１８mol）を添加した。
【００３２】
約６時間後に反応混合物が明黄色に変化して、均質になった。混合物を−１０℃で一晩保持し、２３時間後にリン酸化が完了した。冷水（２℃）４０mlを添加した後、溶液を０℃で１時間撹拌して、冷塩化メチレン（０℃、１００mlを５０mlずつ２回）で抽出した。
【００３３】
水溶液を真空下、室温で１時間保持して、０℃で２４時間放置した。得られた結晶生成物（Ｉ）をろ過によって回収し、エタノール（２×２０ml）で洗浄した。
【００３４】
生成物を真空下、４０℃で２４時間乾燥させた（収量：５ｇ）。所望なら乾燥を省略して、粗リン酸フルダラビンを直接精製にかけることができる。
【００３５】
方法Ｂ
オキシ塩化リン（１０．７ｇ、６．４ml、０．０７mol）を、冷リン酸トリエチル（−１０℃、５０ml）に添加し、その溶液を−１０℃で１時間保持して、その後、−１０℃で撹拌しながら水含量５〜６％のフルダラビン（II）（５ｇ、０．０１８mol）を添加した。
【００３６】
約２〜３時間後に反応混合物が明黄色に変化して、均質になった。リン酸化が完了するまで、混合物を−１０℃で一晩保持した。冷水（２℃）４０mlを添加した後、溶液を０℃で１時間撹拌して、冷塩化メチレン（０℃、３×５０ml）で抽出した。
【００３７】
水溶液を真空下、室温で１時間保持して、０〜５℃で１〜２時間放置した。得られた結晶生成物（Ｉ）をろ過によって回収し、冷水（３×１０ml）で洗浄した。
【００３８】
生成物を真空下、４０℃で２４時間乾燥させた（収量：４．２ｇ）。所望なら乾燥を省略して、粗リン酸フルダラビンを直接精製にかけることができる。
【００３９】
実施例４  −  有機アミンおよびＮＨ4ＯＨでのリン酸フルダラビンの精製
方法Ａ  −  トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ベンジルアミン、トリブチルアミン、ジベンジルアミンおよびＮＨ4ＯＨでの結晶化
リン酸フルダラビン（５ｇ  −  ０．０１４mol）を、室温で水（４０〜５０ml）に懸濁させて、透明の溶液が得られるまで、アミン（１〜１．１当量）または２５％ＮＨ4ＯＨを滴下した（pH＝４．９〜５．６）。溶液を室温で希塩酸溶液（３〜５％）に滴下して、沈殿を得た。懸濁液を０〜５℃で１〜２時間撹拌して、塩酸の溶液（１０〜１５％）でpHを１．９〜２．１に調整した。沈殿をろ過によって回収し、冷水（１０〜２０ml）で洗浄して、真空下、５０〜６０℃で２４時間乾燥させた。
【００４０】
結果を以下の表に報告する。
【００４１】
【表１】
2006521796.tif 000005
【００４２】
方法Ｂ  −  ジシクロヘキシルアミンでの結晶化
リン酸フルダラビン（３ｇ  −  ０．００８mol）を室温で水（４〜６ml）およびアセトン（１０〜１２ml）に懸濁させた。その後、透明溶液が得られるまで（２〜３時間；pH６．５〜７）、撹拌しながらジシクロヘキシルアミン（１〜１．２当量）を滴下した。更に１５〜３０分間後、沈殿が得られ、混合物を室温で１時間撹拌した。リン酸フルダラビンジシクロヘキシルアンモニウム塩（fludarabine phosphate dicycloammonium salt）をろ過によって回収し、アセトン（３〜６ml）で洗浄した。
【００４３】
湿性生成物を室温で２〜３時間、５％水性ＮＨ4Ｃｌ（６０〜８０ml）に懸濁させた。その後塩化ジシクロヘキシルアンモニウムをろ過によって回収し、リン酸フルダラビンアンモニウム塩の溶液を、室温で希塩酸溶液（３〜５％）に滴下して沈殿を得た。懸濁液を０〜５℃で１〜２時間撹拌して、水性塩酸（１０〜１５％）でpHを１．９〜２．１に調整した。沈殿をろ過によって回収して、冷水（１０〜２０ml）で洗浄した。生成物を真空下で２４時間乾燥させて、リン酸フルダラビン（ＨＰＬＣ純度  ９９．４％）２．１ｇを得た。
【国際調査報告】
2006521796.tif 000009
2006521796.tif 000010
2006521796.tif 000011
2006521796.tif 000012