(57)【要約】本発明は平形支持体およびこの平形支持体上に配置されているプローブ分子（オリゴヌクレオチド）を含むスポットのアレイに関する。各スポットには、プローブ分子と検体溶液によりもたらされた標的分子（ＤＮＡ断片）との間における結合事象のインピーダンス分光検出のためのマイクロ電極装置が付設されている。バイオチップの感度および結合固有の測定効果を高めるために、電極装置が、少なくとも部分的にプローブ分子を含み且つ標的分子にとって透過性の親水性反応層の中に埋め込まれている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）複数の分析位置を形成するマイクロスポットのアレイが使用され、マイクロスポットはＤＮＡ断片の同定すべき標的配列とでハイブリダイゼーション可能な少なくとも１つの固定されたオリゴヌクレオチドをプローブ分子として含み、
ｂ）ＰＣＲ試薬および複数の標的配列を含む検体溶液が、アレイを完全に覆うようにマイクロチップ上にもたらされ、
ｃ）標的配列の増幅のためにアレイが温度サイクルを受け、
ｄ）分析位置の固定されたプローブ分子でのハイブリダイゼーション事象がマイクロ電極装置により検出される
ことを特徴とするヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅および検出方法。
【請求項２】
プローブ分子の共有結合のための結合グループを有する親水性反応層（１４）が使用されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
反応層（１４）としてヒドロゲルが使用されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
結合グループとして、無水マレイン酸および／またはアクリル酸（メタクリル酸）グリシジルを有するアクリルアミドをベースとするラジカル架橋結合可能なヒドロゲルが使用されることを特徴とする請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
半導体層およびこの半導体層に結合された絶縁層（１３）を含むバイオチップが使用され、絶縁層（１３）は半導体層とは反対側の面に電極装置（５）および反応層（１４）を担持することを特徴とする請求項１乃至４の１つに記載の方法。
【請求項６】
半導体層としてシリコン層（１２）が使用されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
標的配列以外において標的ＤＮＡとでハイブリダイゼーションを行なう外部プライマー対を含む検体溶液が使用されることを特徴とする請求項１乃至６の１つに記載の方法。
【請求項８】
異なる標的配列を有する複数のＤＮＡ断片と全ての標的配列の増幅に適した唯一の外部プライマー対とを含んでいる検体溶液が使用されることを特徴とする請求項１乃至７の１つに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのＤＮＡ断片の鎖と協働する外部プライマーを含んでいる検体溶液が使用され、逆鎖の伸長が反応層の内部において、反応層に固定され標的配列とで固有にハイブリダイゼーションを行なう内部プライマーにより行なわれることを特徴とする請求項１乃至７の１つに記載の方法。
【請求項１０】
標的配列とで固有にハイブリダイゼーションを行なう内部プライマー対がマイクロスポット内に固定されている検体溶液が使用されることを特徴とする請求項１乃至７の１つに記載の方法。
【請求項１１】
分析位置を形成するマイクロスポット（４）のアレイを備えたバイオチップを含み、マイクロスポット（４）は親水性反応層（１４）によって覆われていることを特徴とする請求項１乃至１０の１つに記載の方法を実施するための装置。
【請求項１２】
親水性反応層（１４）を有するバイオチップは検体溶液（１８）が通流する容器内に配置されていることを特徴とする請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
バイオチップは基板（２）としてマイクロスポット（４）のための支持体を含むことを特徴とする請求項１１記載の装置。
【請求項１４】
基板（２）は半導体材料、特にシリコン（Ｓｉ）からなり、この基板（２）上に絶縁層（１３）が設けられていることを特徴とする請求項１１記載の装置。
【請求項１５】
バイオチップは、薄膜マイクロ電極（６ａ，７ａ，２４，２５）が内部に固定されている予め製作されたシリコンチップであることを特徴とする請求項１１記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅および検出方法に関する。このような方法は、例えば医用診断においてウィルス性または細菌性ＤＮＡの伝染性の標的配列を見つけ出すのに役立つ。このほかに本発明はこの方法を実施するため装置に関する。
【０００２】
ＰＣＲ（＝Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）中に、検体はサイクリック（周期的）に温度処理を受け、この温度処理時に、ＤＮＡ断片が主としてプライマー対およびポリメラーゼにより複製される。今日、このような分析のために、マイクロチップ上でＰＣＲが行なわれる方法が使用可能であり、このマイクロチップは「ゲルパッド」として形成されたマイクロスポットのアレイを有する（国際公開第０１／３４８４２号パンフレット）。マイクロスポットにおけるハイブリダイゼーションの蛍光分光検出を可能にするために、公知の方法においては検体溶液に標識されたプライマーが添加される。
【０００３】
従来技術から、核酸の増幅および検出方法が知られている。ゲルパッドがマイクロアレイ上に親水性反応層として分離されたマイクロスポットを形成し、ゲルパッド中には同定すべき標的核酸とでハイブリダイゼーションを行なうことができるオリゴヌクレオチドがある。更に、刊行物「“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｅｓ  Ｒｅｓ．”（１９９９）２７（１８）ｅ１９、第１−６頁」から、マイクロアレイ上のゲルパッド内で増幅反応および個別塩基の伸長による検出反応を行なうことが知られている。これに関連して、更にマイクロ電極装置を備えたアレイが開示されている独国特許第１９６１０１１５明細書およびマイクロ電極に接触する固定されたプローブを有するゲルパッドを開示する国際公開第０１／４２５０８号パンフレットを挙げることができる。更に、国際公開第９９／３６５７６号パンフレットはアレイ内にゲルパッドを使用すること並びにその製造方法およびシステムを含み、反応層としていわゆるインテリジェントゲルが製造される。
【０００４】
これに基づいて、本発明の課題は、ＰＣＲの連続監視および特に複数の標的配列または１つの標的配列における複数の突然変異の同時検査が簡単に可能であるヌクレオチド配列の改善された増幅および検出方法を提供することにある。このほかに、特に電気化学的測定を可能にする装置を提供しようとするものである。
【０００５】
この課題は本発明によれば請求項１の方法ステップによって解決される。付属の装置は請求項１１の対象である。実施態様はそれぞれの従属請求項に示されている。
【０００６】
本発明による方法においては、次に従って進行する。
ａ）親水性反応層とその反応層内に埋め込まれたマイクロ電極装置とを含み複数の分析位置を形成するマイクロスポットのアレイを備えたマイクロチップが準備され、反応層はＤＮＡ断片の同定すべき標的配列とでハイブリダイゼーション可能な少なくとも１つの固定されたオリゴヌクレオチドをプローブ分子として含み、
ｂ）複数の標的配列およびＰＣＲ試薬を含む検体溶液が、アレイを完全に覆うようにマイクロチップ上にもたらされ、
ｃ）標的配列の増幅のためにアレイが温度サイクルを受け、
ｄ）分析位置の固定されたプローブ分子でのハイブリダイゼーション事象が分析位置に付設されたマイクロ電極装置により検出される。
【０００７】
この方法において有利な点は、まず、マイクロスポットにおける結合事象つまりハイブリダイゼーション事象が、進行する反応サイクルの中断なしに且つ最小限の装置費用にてＰＣＲの開始から検出されることである。マイクロスポットには互いに独立の電極装置があるので、各分析位置は個別にアドレス指定可能であり、それゆえ特定のプローブ分子もしくは探し出そうとする標的配列と相関関係にある。従って、多数のマイクロスポットにおけるハイブリダイゼーションを簡単に同時に追跡することができる。これに対して光学的読出しは、スポットの僅かの大きさおよび極めて狭いスペースへのスポットの配置のためだけで技術的費用のかかる光学式検出システムを必要とする。多数のマイクロスポットを有するアレイが読出される場合には技術的費用が更に増大する。
【０００８】
マイクロスポットにおいて固定されたプローブ分子とのハイブリダイゼーションによって拘束されたヌクレオチド配列が、それらの部分荷電により、例えばマイクロスポットの内部の導電値または電極装置のインピーダンスのような電気的パラメータを変化させる。従って、マイクロ電極装置を備えたバイオチップからなる本発明装置により電気化学的もしくは電気的評価が可能である。
【０００９】
独国特許第１９６１０１１５号明細書から公知のインピーダンス分光法により読出し可能なバイオチップでは、確かに支持体上に多数のインターディジタル構造の電極装置が存在し、プローブ分子が電極上および電極間に配置された面上に固定されている。この種の結合事象の検出における問題点は、電極構造の寸法が分子寸法とは大きさに関して異なることにある。まだ是認できる技術的費用により、１〜１０μｍ、特に５〜１０μｍの幅、同様の間隔および約０．１〜０．５μｍの厚みを持った電極を作り出すことができる。このような電極装置のインピーダンス分光法により検出可能な電界範囲は、支持体表面もしくは電極装置の存在する平面上に約５〜１０μｍの大きさで広がっている。これに対して、例えば１００個の塩基対を有するプローブ分子は約３０ｎｍすなわち０．３μｍの長さしか持たない。センサ表面もしくは電極の上に固定されたプローブ分子の単分子層内での結合事象の電界への影響もしくは電極装置インピーダンスへの影響は相応に僅かである。
【００１０】
本発明に従って、プローブ分子を含み且つ標的分子が透過可能な親水性反応層内に電極装置が少なくとも部分的に埋め込まれていることによって、反応層内において、単分子層内よりも遥かに多数のプローブ分子もしくは標的配列を集めることができる。その結果は電極装置の電界もしくはインピーダンス分光検出範囲の遥かに大きな影響である。このように構成されたバイオチップは相応に大きな測定感度もしくは感応性を有する。これに対して従来のバイオチップの場合、プローブ分子の僅かな供給のために、標的配列の、ＰＣＲによって得られる濃度上昇は感度上昇をもたらさない。
【００１１】
本発明による方法において使用される反応層は、ＰＣＲを実施するために、約９５℃まで熱的に安定していなければならない。“熱的に安定している”とは、反応層には上述の温度においても、反応層がプローブ分子を係留し、反応層内で標的配列とプローブ分子とのハイブリダイゼーション／変性（溶解）を妨害なく行なわせることができ、反応層がその他の特性をほぼ維持する、という性質を有することを意味する。固定のために、反応層は、プローブ分子が共有結合されている結合グループを有するポリマーを含んでいると好ましい。それによって、標的配列とプローブ分子とからなる結合対が、ＰＣＲの後に続く洗浄プロセス時に反応層内に引きとどめられることが保証される。
【００１２】
特に適した反応層はヒドロゲルからなる。ヒドロゲルは機械的に安定な形の水性の媒体を形成し、この水性の媒体は主に水性の検体との物質交換を可能にする。結合グループとして、無水マレイン酸および／またはアクリル酸（メタクリル酸）グリシジルを有するアクリルアミドをベースとするラジカル架橋結合可能なヒドロゲルが特に適していることが判明した。
【００１３】
他の有利の実施態様ではバイオチップの平形支持体が基板としてシリコン（Ｓｉ）層およびシリコン層に結合された絶縁層を含み、絶縁層はシリコン層とは反対側の面に電極装置および反応層を担持する。このような装置の場合、電極装置の電気的配線はＳｉメモリチップから公知の技術を用いて実現することができる。
【００１４】
提案された方法の特別な利点は、同時検査もしくは多重検査において種々の構成可能性に対して大きな多様性を許容することにある。このことは、とりわけ、ＰＣＲ中に生じたアンプリコンに標識を組み込む必要がないことにある。というのは、ＰＣＲ中に生じたアンプリコンに標識を組み込むことは、とりわけ複雑な検査の場合、標識に必要な物質の間におよび標識に必要な物と同定すべき標的配列との間に願わしくない相互作用を生じる危険性を含んでいるからである。
【００１５】
特許請求の範囲に関連した以下の図面に基づく実施例の説明から本発明の更なる詳細および利点を明らかにする。
図１は平形支持体とマイクロスポットアレイとを含むマイクロチップの簡略化された斜視図を示し、
図２は図１における線ＩＩ−ＩＩに沿った１つのスポットの部分拡大断面図を示し、
図３は１つのスポットに付設されている電極装置の部分図を示し、
図４は４極の電極装置を有するマイクロチップの実施形態を図２に対応して示し、
図５はマイクロチップの電極装置を図３に対応して示し、
図６はＰＣＲ支援分析の第１の方法変形例を明確に説明する概略図を示し、
図７は特殊でないプライマー対の作用を説明する概略図を示し、
図８は第１の方法変形例の変形の概略図を示し、
図９は第２の方法変形例の概略図を示し、
図１０は第３の方法変形例の概略図を示す。
【００１６】
図１が示すように、バイオチップ１と呼ばれる素子は平形支持体２を含み、これの一方の面にスポットアレイ３が設けられている。以下においてスポット４と称するマイクロスポットは固定されたプローブ分子、例えばオリゴヌクレオチドを含んでいる。スポット４上に未知の標的分子を有する検体溶液がもたらされた際に、塩基配列が相応に一致すればプローブ分子への標的分子の結合が起きる。このような結合事象によってひき起こされた特性変化、例えば抵抗率、インピーダンスまたは誘電率の変化は電極装置５にて検出可能である。
【００１７】
内部に電極を植込まれたスポットアレイ３つまりマイクロチップ１によって、オンライン監視を可能にする装置が構成される。このような装置は、図３および図５に示されている種々に形成された電極装置を有する。これに対して図２および図４はこのような装置における固定化および測定の現象を示す。
【００１８】
図２の実施例では２極の電極装置が存在する。これは、例えばホトリソグラフィック法により平形支持体２上に設けられる。電極装置５は、インターディジタル構造の形に形成されている２つの電極６，７を有する。すなわち、各電極は互いに平行に延びる多数の条片状の部分電極６ａ，７ａを含み、これらの部分電極６ａ，７ａはそれぞれ相手方の電極に属する２つの部分電極の間隙内に延びている。部分電極６ａ，７ａは部分電極６ａ，７ａに対して直角方向に延びている同様に条片状の接続導体６ｂ，７ｂによって互いに接続されている。電極６，７はメガヘルツ範囲の高周波の交流電流を印加されている。部分電極６ａ，７ａの幅８は約１μｍであり、それらの高さ９は約１００〜５００ｎｍである。部分電極６ａ，７ａ間には同様に約１μｍの間隔１０が存在する。
【００１９】
平形支持体２は、シリコン層１２およびこのシリコン層１２と電極６，７との間に配置されているポリマーからなる絶縁層１３を含む。結合事象の例えばインピーダンス分光測定に必要な電気的配線および構成部品は、従来のように、シリコン層の相応のトポロジーによって実現され、図２に示されていない。絶縁層１３上には、以下に更に詳しく説明するヒドロゲルからなる反応層１４が設けられている。平形支持体２もしくはシリコン層１２はスポットの範囲に反応層１４を詰めるくぼみを備えていると好ましい（図６、図８乃至１０）。反応層１４つまりヒドロゲル内には、プローブ分子１５が埋め込まれて均一に分布させられている。プローブ分子１５は図２において誇張して象徴的に示されている。３００個の塩基を備えたプローブ分子は約１００ｎｍの長さを有する。従って、プローブ分子の単分子層は、従来のマイクロチップの場合、おそらく、ほぼ図２における線１６に相当する厚みを持つ。このような層は比較的僅かのプローブ分子１５を収容し、従って結合事象もしくはハイブリダイゼーション事象の場合に電極装置の電界に僅かにしか影響を与えることができないことを簡単に窺い知ることができる。これに対して、本発明によるマイクロチップの場合、プローブ分子１５を含み且つ電気力線１７によって貫通される反応範囲が著しく広がり、１０の数乗多いプローブ分子１５のための場所を提供する。このように形成されたスポットアレイ３もしくはスポット４上に検体溶液１８が付着させられると、検体溶液１８の中に含まれた標的分子１９もしくは標的配列は、捕捉分子１５の形の著しく多数の結合相手を見つけ出す。標的分子１９は図２において同様に誇張して象徴的に示されている。
【００２０】
反応層１４は、インピーダンス分光検出範囲が実際上完全に利用されるように設計されもしくは例えば５〜１０μｍの厚みを有すると好ましい。このことは反応層の厚みが約５〜１０μｍである場合に当てはまる。従って、この範囲における捕捉分子１５の相応の濃度において、バイオチップの結合特有の測定効果が著しく高められる。反応層は水性の反応媒体を用立てる。更に、反応層は、反応層の活性に影響を及ぼすことなく、標的分子１９または反応に必要な他の物質、例えばポリメラーゼを反応層内に拡散させることができる。
【００２１】
既に述べたように、本発明によれば、ヒドロゲルが反応層１４として使用される。ヒドロゲルは機械的に安定な形の水性の媒体を形成し、この水性の媒体は同時に水性の周囲内との物質交換を保証する。成分およびそれらの割合に関係する化学的組成の選択によって、水含有量、膨潤挙動、機械的安定性などのヒドロゲルの特性を、広い範囲にわたって変化させることができる。簡単に製造可能であり且つ電極装置５に対しても絶縁層１３に対しても良好な付着性を有するヒドロゲルは、アクリルアミドをベースとするラジカル架橋結合可能なヒドロゲルであり、このヒドロゲルは、変更された捕捉分子に応じてリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）グループを介して共有結合を可能にするコモノマーを含んでいる。ヒドロゲルは、ポリアクリルアミドのモノマー予備段階のほかに、架橋剤、少なくとも１つのラジカル開始剤、反応性リンカーグループを有する少なくとも１つのコモノマー、および場合によっては少なくとも１つの軟化剤を含んでいる。層形成およびそれに続く熱もしくは光による架橋結合の後に、水で膨潤可能なヒドロゲルが得られ、このヒドロゲルはプローブ分子の固定のための反応性リンカーグループを含んでいる。架橋剤としては、メチレンビスアクリルアミドおよび／またはジメチルアクリル酸エステル、例えばジメタクリル酸テトラエチレングリコールが使用される。
【００２２】
架橋剤の濃度の変化によってヒドロゲルの網目幅が調整される。使用されたコモノマーは無水マレイン酸および／またはアクリル酸グリシジル（メタクリル酸グリシジル）を含んでいる。軟化剤としては、モノジエチレングリコールおよび／またはトリエチレングリコールが適している。上述の出発物質は、水と混合可能な有極性溶剤、とりわけジメチルホルムアミドと混ぜ合わされている。溶剤成分の変化によって加工粘性を調整することができる。平形支持体表面並びに電極装置５への付着は、例えばシランをベースとする通常の付着仲介剤を混ぜ合わせることによって強めることができる。
【００２３】
図４および図５には４極の電極装置２０が示されている。電極装置２０は、２つの電流電極２２，２３と２つの電圧もしくはプローブ電極２４，２５とから構成されている。電流電極２２，２３は図２による実施例の電極装置５に対応して配置されて構成されている。プローブ電極２４，２５は同様に条片状であり、蛇行状の二重線として部分電極２２ａ，２３ａの間に存在する間隙を通って延びている。電流電極２２，２３は高周波の交流電流を印加されている。プローブ電極２４，２５には電圧測定器２６が接続され、この電圧測定器により一連のハイブリダイゼーション事象における交番電界の変化が検出可能である。従って、電流電極に依存せずに測定を行なうことができるので、例えば電極容量を高める電流電極の分極が測定に影響することはない。これに対して、２極電極装置の場合、検体溶液もしくは反応層の、測定にとって重要なインピーダンスを決定できるようにするために、測定技術上好ましくない相応に高い測定周波数によって電極容量を小さく保たなければならない。
【００２４】
図６（この図６および図８乃至１０に対してはさらに以下に示す説明文を参照されたい。）に概略的に示された方法変形例では、マイクロチップ１の上に検体溶液１８が付着させられる。検体溶液１８は、標的配列ＺAを有するＤＮＡ断片ＦAと、外部プライマー対と、Ｔａｑ（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（３リン酸デゾキシヌクレオシド）などの如きＰＣＲのために必要な試薬とを含んでいる。標的配列ＺAは、多数の異なる変形で存在し得るもの、例えばウィルスの類型化、例えばＨＩＶまたはＨＰＶである。あらゆる可能な変形（ＺA1，ＺA2など）が少なくとも１つの固有のスポット４Ａ１，４Ａ２などに割り当てられ、それぞれのスポットの反応層１４の内部には唯一のオリゴヌクレオチド型が特殊な標的配列とでハイブリダイゼーションを行なうプローブ分子として固定されている。通常のように温度サイクルを適用して行なわれる標的配列ＺAの増幅（ＰＣＲ）は、専ら易動相１８において行なわれる。とりわけ、図７に示されているように、標的配列ＺAの外側に結合する（ハイブリダイゼーションを行なう）プライマー対が使用される。コピーされた二本鎖すなわち鎖Ｓ+および逆鎖Ｓ-が変性（溶解）時に互いに解放される。通常、鎖Ｓ+（センス鎖）は標的配列の同定に利用される。それに応じてスポット４Ａ１，４Ａ２にオリゴヌクレオチドが固定され、オリゴヌクレオチドが正確にこの鎖とでハイブリダイゼーションを行なう。ＤＮＡ断片ＺA1のみが存在する最も単純な場合、増幅された標的配列ＺA1が、ハイブリダイゼーションによって、相補的な捕捉剤オリゴヌクレオチドＺA1が固定されているスポットに集まる。
【００２５】
図８に示されている方法変形例では、検体溶液１８中に種々の種類のＤＮＡ断片が存在する。例として２つのこのようなＤＮＡ断片すなわちＦA，ＦBが示されている。検体溶液１８中に存在するＤＮＡ断片（群）の１つ又は全ては、図６による方法変形例に従うものである。この場合に異なるグループのスポットが設けられ、各グループにはＤＮＡ断片の変種の類型化が割り当てられている。しかしながら、「完全に」異なるＤＮＡ断片も分析検査の目標である。この場合に原理的には、ＤＮＡ断片ＦA，ＦBにそれぞれ唯一の分析スポット４Ａ，４Ｂを割り当てることで十分である。図６における方法変形例におけると同様に、ここでは検体溶液１８中に外部プライマー対が存在する。この外部プライマー対は、分析すべきＤＮＡ断片ＦA，ＦBの全ての増幅に適しているように選択されている（多重ＰＣＲ）。
【００２６】
他の方法変形例においては、図６および図８に示された捕捉剤オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得るならば、プライマーとして働くことができる。反応層１８がＰＣＲ反応のＤＮＡポリメラーゼおよびテンプレート（群）並びに他の成分にとって透過性である場合、固定されたオリゴヌクレオチドの伸長がハイブリダイゼーションを行った基質の配列に応じて行なわれる。
【００２７】
図９に示されている方法変形例においては、図６または図８による方法変形例に対応した複数の種々のＤＮＡ断片が存在する。例として２つのこのようなＤＮＡ断片すなわちＦA，ＦBが示されている。これまで説明した方法変形例では検体溶液にプライマー対が添加されたのに対して、ここではプライマー対の一方のプライマーのみが易動的であり、溶液中に溶けて存在する。このプライマーは特殊ではなく、すなわち、検体溶液中に存在する全てのＤＮＡ断片ＦA，ＦBにおいて（とりわけセンス鎖における）検証すべき標的配列ＺA，ＺB以外と結合する外部プライマーである。検体溶液の変性後、ＤＮＡ個別鎖が無差別にスポット内へ拡散する。これらのスポットには検体ＤＮＡの標的配列の前に直接的に結合する特殊なオリゴヌクレオチド捕捉剤が固定されている。検体ＤＮＡが相補的な固定されたオリゴヌクレオチド（捕捉剤）に当たる場所でのみ、ハイブリダイゼーションが行なわれる。ＰＣＲの次の伸長ステップにおいては、前もって選択的に検証すべきＤＮＡ断片を捕らえた（結合した）捕捉剤オリゴヌクレオチドの５’端がハイブリダイゼーションを行った鋳型の情報に応じて伸長される。従って、捕捉剤はＤＮＡポリメラーゼ反応に対するプライマーとなる。
【００２８】
最後に述べたことは、標的配列に対して相補的な捕捉剤も存在するようなマイクロスポットにおいてのみ伸長が行なわれ得ることを意味する。図９の図の場合、これは、ＤＮＡ断片ＦAの鎖Ｓ+がスポット４Ａにおいて、ＤＮＡ断片ＦBの鎖Ｓ-がスポット４Ｂにおいて、それぞれ固定されたプライマー／捕捉剤の伸長によってコピーされる。その都度の増幅ステップおよび溶解の後に続く再アニーリングにおいて、もともと存在する標的配列および溶液中に新たに生じた標的配列が相補的な捕捉剤もしくは配列に付加される。前述のＰＣＲサイクルによる標的配列の濃度上昇に基づいて、これらの配列は、まだ伸長されないで元の形で存在する捕捉剤オリゴヌクレオチドにも結合されるので、次のＰＣＲ伸長ステップはこれらにハイブリダイゼーションによって新たに生じたプライマーに付け加えられる。それによって伸長された捕捉剤の濃度はＰＣＲサイクルごとに上昇する。（もとの２０〜３０の塩基に対して）約１００〜３００の塩基だけ伸長された捕捉剤／プライマーのこの濃度上昇は電界変化もしくはインピーダンス変化を生じさせる。この変化は、電極装置５もしくは２０によって測定してＰＣＲ監視（「オンライン」ＰＣＲ）に利用することができる。
【００２９】
図１０による方法変形例においては検体溶液１８中に図６または図８による方法変形例に対応した１つ又は複数のＤＮＡ断片種が存在する。図６および図８による変形例では検体溶液にプライマー対が添加され、図９による変形例では検体溶液にプライマー対（群）の一方のプライマーのみが添加されたのに対して、ここでは検体溶液中に溶けた自由プライマーは存在しない。ここでは伸長反応が個々のマイクロスポット４Ａ，４Ｂなどにおいて行なわれる。他の全ての方法変形例とは違って、ここ（図１０）では、捕捉剤対における標的配列の両ＤＮＡ鎖の固有の検出に必要な両捕捉剤がそれぞれ同じゲルスポット内に固定され、すなわち標的配列においてハイブリダイゼーションを行なう固定された内部の捕捉剤／プライマー対が存在する。プローブの溶解（変性）後に、ＤＮＡ個別鎖が無差別にスポット内に拡散する。鎖ＳA+もしくはＳA-の５’もしくは３’端がスポット４Ａ内のプライマー対の相補的なプライマーでハイブリダイゼーションを行なう。
【００３０】
図１０によればスポット４Ａにおいて、ＤＮＡ断片ＦAのＳ+鎖がＡ+にて示されたプライマーに結合し、ＤＮＡ断片ＦAのＳ-鎖がＡ-にて示されたプライマーに結合する。その際に逆平行鎖Ｓ-もしくはＳ+が形成され、この逆平行鎖はここでは、固定されたプライマーＡ+もしくはＡ-の伸長によって合成されているので同様に固定されている。それに対して、伸長された鎖Ｓ-もしくはＳ+の３’端は自由に可動であり、反応層内での近くに固定されている逆プライマーＡ-もしくはＡ+とでハイブリダイゼーションを行なう。次の増幅ステップでは、それからＳ+もしくはＳ-鎖が生じ、これは、固定されているプライマーＡ+もしくはＡ-の伸長によって形成されているので同様に固定されている。
【００３１】
相応に伸長された捕捉剤の、各ＰＣＲサイクル時に発生する濃度上昇は、既に述べたように、電界変化またはインピーダンス変化を生じさせ、電界変化またはインピーダンス変化を電極装置５もしくは２０によりＰＣＲ監視に利用することができる。それにより、オンラインＰＣＲが可能である。
【００３２】
以上において詳細に説明したヌクレオチド配列の新しい増幅および検出方法のために、図２および図４に代替的に２極または４極装置として説明したようなバイオチップが使用される。
【００３３】
特に図２および図４から、上述の方法に適したバイオチップは、その上に配置される反応層およびそれと接触している検体溶液を含めてこれらの図に枠として示された容器内に配置されている。図６並びに図８乃至図１０に応じて容器は側方に開いているので、検体溶液は反応層に接して通流することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】平形支持体とマイクロスポットアレイとを含むマイクロチップの簡略斜視図
【図２】図１における線ＩＩ−ＩＩに沿った１つのスポットの部分拡大断面図
【図３】１つのスポットに付設されている電極装置の部分図
【図４】４極の電極装置を有するマイクロチップの実施形態を図２に対応して示す概略図
【図５】マイクロチップの電極装置を図３に対応して示す概略図
【図６】ＰＣＲ支援分析の第１の方法変形例を明確に説明する概略図
【図７】特殊でないプライマー対の作用を説明する概略図
【図８】第１の方法変形例の変形を示す概略図
【図９】第２の方法変形例の概略図
【図１０】第３の方法変形例の概略図
【符号の説明】
【００３５】
１        バイオチップ（マイクロチップ）
２        平形支持体
３        スポットアレイ
４        スポット
５        電極装置
６        電極
６ａ      部分電極
６ｂ      接続導体
７        電極
７ａ      部分電極
７ｂ      接続導体
８        部分電極の幅
９        部分電極の高さ
１０        部分電極の間隔
１２        シリコン層
１３        絶縁層
１４        反応層
１５        プローブ分子
１６        線
１７        電気力線
１８        検体溶液
１９        標的分子
２０        電極装置
２２        電流電極
２２ａ      部分電極
２３        電流電極
２３ａ      部分電極
２４        プローブ電極
２５        プローブ電極
２６        電圧測定器
４Ａ，４Ｂ  分析スポット
ＺA，ＺB    標的配列
↑          溶液中におけるプライマー
ｘ          特定でない
Ａ，Ｂ      特定のＤＮＡ断片
⊥          プライマー機能のない固定されたオリゴヌクレオチド
□          固定されたプライマー
Ｆ          ＤＮＡ断片
Ｓ          ＤＮＡ断片の個別鎖
+／-        コード化された／コード化されていない鎖
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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