(57)【要約】本発明は、空気−液体表面張力を下げることができる人工リン脂質およびペプチドからなる再構成サーファクタントに関し、より詳細には呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）および肺サーファクタント機能不全に関する他の疾患を処置するための特別なリン脂質混合物および天然ＳＰ−Ｃタンパク質の類似体である人工ペプチドを含んでなる再構成サーファクタントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８０：２０〜６０：４０の重量比の範囲のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）とパルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、またはそれらの混合物とパルミトイルオレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）とからなるリン脂質混合物、ならびにＳＰ−Ｃおよび／もしくはＳＰ−Ｂタンパク質の人工ペプチド類似体を含んでなる再構成サーファクタント。
【請求項２】
人工ペプチドが以下の一般式（Ｉ）
【化１】
2006504635.tif 000005
式中、
Ｘは、Ｉ、Ｌ，ｎＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、オルニチンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｚは、エステルまたはチオエステル結合を介して側鎖にそれぞれ連結された１２〜２２個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されたＳであり；
Ωは、Ｍ、Ｉ、Ｌ、ｎＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ａは、１〜１９の整数であり；
ｂは、１〜１９の整数であり；
ｃは、１〜２１の整数であり；
ｄは、０〜２０の整数であり；
ｅは、０または１であり；
ｆは、０または１であり；
ｎは、０または１であり；
ｍは、０または１であるが、
ただし以下の
−ｎ＋ｍ＞０；
−ｆ＞ｅ、
−（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄは最大２２個のアミノ酸を有する配列である、
ことを条件とする、
を有する請求項１に記載の再構成サーファクタント。
【請求項３】
式（Ｉ）の人工ペプチドにおいて、（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄが１０〜２２個のアミノ酸を有する配列である、請求項２に記載の再構成サーファクタント。
【請求項４】
人工ペプチドが以下の一般式（ＩＩ）：
【化２】
2006504635.tif 000006
［式中、
Ωが、Ｍ、Ｉ、Ｌ、ｎＬからなる群から選択されるアミノ酸であり、そしてセリンは場合によりアシル化され得る］
を有する請求項１に記載の再構成サーファクタント。
【請求項５】
式（ＩＩ）の人工ペプチドにおいて、セリンがパルミトイルでアシル化される請求項４に記載の再構成サーファクタント。
【請求項６】
ペプチドがＳＰ−Ｃ３３である請求項４に記載の再構成サーファクタント。
【請求項７】
リン脂質混合物が６８：３１の重量比のＤＰＰＣおよびＰＯＰＧの混合物であるか、または６８：１５：１６の重量比のＤＰＰＣ、ＰＯＰＧおよびＰＯＰＣの混合物である、請求項１ないし６に記載の再構成サーファクタント。
【請求項８】
ＳＰ−Ｂまたはそれらの活性な類似体、またはポリミキシンを含んでなる請求項１ないし７に記載の再構成サーファクタント。
【請求項９】
ポリミキシンがポリミキシンＢである、請求項１ないし８に記載の再構成サーファクタント。
【請求項１０】
溶液、分散物、懸濁液または乾燥粉末状の請求項１ないし９に記載の再構成サーファクタント。
【請求項１１】
肺サーファクタント欠損症または機能不全に関連する疾患を処置するための請求項１ないし１０に記載の再構成サーファクタントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空気−液体界面で表面張力を下げることができるリン脂質および人工ペプチドからなる再構成サーファクタント（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）に関する。特に本発明は、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）および肺サーファクタント機能不全に関連する他の疾患を処置するための、特定のリン脂質混合物および天然のサーファクタントＳＰ−Ｃタンパク質の人工ペプチド類似体を含んでなる再構成サーファクタントに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺サーファクタントは、内肺胞壁の空気−液体界面で表面張力を下げ、これにより肺が呼気作用の終わりに潰れることを防いでいる。サーファクタント欠損症は、通常、早期児に影響を及ぼし、そして動物の肺から抽出された天然のサーファクタントで効果的に処置できる疾患であるＲＤＳを引き起こす機能不全である。これらサーファクタント調製物の主な成分は、ジ−パルミトイル−ホスファチジル−コリン（ＤＰＰＣ）として通常知られている１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のようなリン脂質およびサーファクタントである疎水性のタンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）である。Ｃ型（Ｃａ２＋依存的）コラーゲン状レクチンであり、そして宿主防御系で主に作用すると考えられている親水性サーファクタントタンパク質ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄは、使用する有機溶媒抽出手法によりサーファクタント調製物に通常は含まれない。動物組織から得られる修飾された天然のサーファクタント調製物が、現在の治療的プラクティスで使用されている。これらの調製物は通常、有機溶媒での抽出で除去される親水性タンパク質を除いた前記成分からなる。
【０００３】
製造および滅菌工程の複雑さ、および免疫反応を誘導する可能性のような動物組織に由来するサーファクタント調製物の欠点から、人工サーファクタントを調製するための試みがなされてきた。
【０００４】
言葉の厳密な意味において、人工サーファクタントはリン脂質のみの混合物またはリン脂質と他の合成脂質との混合物である。再構成サーファクタントは、動物組織から単離されたか、または組換え技術もしくは疎水性タンパク質の合成ペプチド誘導体を介して得られたいずれかの疎水性タンパク質が加えられた人工サーファクタントである。
【０００５】
再構成サーファクタントの特性および活性は、タンパク質／ペプチド成分に大きく依存するだけでなく、リン脂質混合物の組成にも依存する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の説明
今、特別なパルミトイルオレイルリン脂質との混合物中のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）が、天然のサーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ｂの類似体として再構成サーファクタントに通常使用する人工ペプチドの理想的な賦形剤となることが分かった。特に国際公開第００／４７６２３号パンフレットに開示されているＳＰ−Ｃ類似体を、８０：２０〜６０：４０の重量比の範囲のＤＰＰＣおよびパルミトイルオレイルリン脂質（好ましくはパルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、またはＰＯＰＧとパルミトイルオレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との混合物から選択される）と組み合わせて含んでなる再構成サーファクタントは、それらから得られる調製物の表面張力および粘度を下げることが分かった。技術文献に報告された事柄とは対照的に、驚くべきことにパルミチン酸（ＰＡ）の添加は役に立たず、さらに場合によってはインビボでサーファクタントの活性を下げ得ることも分かった。
【０００７】
したがって本発明は、８０：２０〜６０：４０の重量比の範囲のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびパルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、またはそれらの混合物とパルミトイルオレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）から本質的になる混合物、ならびに天然サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ｂの人工ペプチド類似体を含んでなる再構成サーファクタントに関する。本発明のサーファクタントはパルミチン酸を欠いている。
【０００８】
ＤＰＰＣおよびＰＯＰＧの間の重量比が好ましくは７５：２５〜６５：３５の範囲であり、そしてより好ましくは６８：３１である。ＤＰＰＣ：ＰＯＰＧ：ＰＯＰＣ混合物の場合、リン脂質は好ましくは６０：２０：２０または６８：１５：１６の重量比で使用される。
【０００９】
国際公開第８９／０６６５７号、同第９２／２２３１５号および同第９５／３２９９２号パンフレットに記載されているような、天然サーファクタントタンパク質ＳＰ−Ｃおよび／またはＳＰ−Ｂの人工ペプチド類似体を有利に使用することができる。好適であるのは、アミノ酸が１文字暗号で表されている以下の一般式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
2006504635.tif 000002
【００１１】
［式中、
Ｘは、Ｉ、Ｌ，ｎＬ（ノルロイシン）からなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ、Ｗ、Ｆ、Ｙ、オルニチンからなる群から選択されるアミノ酸であり、
Ｚは、エステルまたはチオエステル結合をそれぞれ介して側鎖に連結された１２〜２２個の炭素原子を含むアシル基で場合により置換されたＳであり；
Ωは、Ｍ、Ｉ、Ｌ、ｎＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
ａは、１〜１９の整数であり；
ｂは、１〜１９の整数であり；
ｃは、１〜２１の整数であり；
ｄは、０〜２０の整数であり；
ｅは、０または１であり；
ｆは、０または１であり；
ｎは、０または１であり；
ｍは、０または１であるが、
ただし以下の
−ｎ＋ｍ＞０；
−ｆ＞ｅ、
−（ＸａＢ）ｎ（ＸｂＢ）ｎ（ＸｃＢ）ｍＸｄは最大２２個のアミノ酸、好ましくは１０〜２２個を有する配列である、
ことを条件とする］
を有するＳＰ−Ｃ類似体の使用である。
【００１２】
さらに一層好適であるのは、式（ＩＩ）：
【００１３】
【化２】
2006504635.tif 000003
【００１４】
［式中、
Ωが、Ｍ、Ｉ、Ｌ、ｎＬからなる群から選択され、そしてセリンは場合により、例えばパルミトイルによりアシル化され得る］
のペプチドの使用である。
【００１５】
これから報告する非アシル化形態のペプチド（ＳＰ−Ｃ３３）は、本発明の最も好適なペプチドである。
【００１６】
【化３】
2006504635.tif 000004
【００１７】
式（Ｉ）のペプチドは通常のペプチド合成または国際公開第００／４７６２３号パンフレットに開示された組換え技術により調製することができる。
【００１８】
アシル化ペプチドは、好ましくはペプチドをアシルクロライドと純粋なトリフルオロ酢酸中で室温にて１０時間反応させ、続いて８０％水性エタノールで止めることにより合成される。
【００１９】
表面張力を下げることにおける本発明の再構成サーファクタントの活性は、インビトロおよびインビボの両方で評価した。特にインビボの結果は本発明の再構成サーファクタントが一回呼吸量（ｔｉｄａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）（これは次いで肺拡張能（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｃｐａｃｉｔｙ）の指数となる）を、従来技術で通常使用されているＤＰＰＣ、ＰＧおよびＰＡの混合物で得られるサーファクタントよりも有意に高度に上昇できることを明らかに示す。
【００２０】
本発明の再構成サーファクタントは、ＳＰ−Ｂまたはポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ）、特にＳＰ−Ｂ類似体としてポリミキシンＢを含んでなることができる。
【００２１】
サーファクタントはペプチドおよびリン脂質の溶液または懸濁液を混合することにより、そして続いて混合物を乾燥することにより調製することができる。必要ならば、乾燥した混合物を再懸濁し、分散させ、またはそのままサーファクタント欠乏症の処置が必要な個体に投与することができる。
【００２２】
エーロゾル投与の場合、小サーファクタント粒子を適当な不活性推進薬と合わせることが必要である。安定なサーファクタント溶液／懸濁液の気化または霧状化のような他の投与形も本発明の範囲内である。
【００２３】
以下の実施例は本発明をさらに詳細に具体的に説明する。
［実施例］
実験の章
材料
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、卵のホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、パルミチン酸（ＰＡ）、およびポリミキシンＢ（ＰｘＢ）硫酸を使用して以下の脂質混合物および重量比を調製した：ＤＰＰＣ／ＰＧ／ＰＡ、６８：２２：９；ＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ／ＰＡ、６８：２２：９；ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ、６０：２０：２０；ＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ／ＰＯＰＣ／ＰＡ、５７：１９：１９：５；ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ、６８：１６：１５およびＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ，６８：３１。
【００２４】
ＳＰ−Ｃ３３は国際公開第００／４７６２３号パンフレットに記載されているように合成し、そして精製した。
合成サーファクタントの調製
ペプチド／脂質中、０．０２：１の重量比のＳＰ−Ｃ３３および脂質を、クロロホルム／メタノール  ９８：２（容量／容量）に混合し、溶媒を蒸発させ、そして生成したペプチド／脂質フィルムを続いて８０または３５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度で反復超音波処理により１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で水和した。脈動気泡サーファクトメーター（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ  ｂｕｂｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｔｏｍｅｔｅｒ）での分析に使用するサーファクタントサンプルは塩水で作業濃度（１０ｍｇ／ｍｌサーファクタント）に希釈した。幾つかの実験では、ＰｘＢを加えて脂質濃度２（重量／重量）％の最終濃度とした。ＤＰＰＣ／ＰＧ／ＰＡ（６８：２２：９）中にＳＰ−Ｃ３３を含むサーファクタントは、８０ｍｇ／ｍｌで大変粘稠な懸濁液を提供し、そして実験動物に投与することは難しかった。
【００２５】
２種の周知な修飾された天然サーファクタントであるＣｕｒｏｓｕｒｆ（チェシー製薬：Ｃｈｉｅｓｉ  Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ）およびＳｕｒｖａｎｔａ（アボット；Ａｂｂｏｔｔ）を、製造元の使用説明に従い投与した。Ｃｕｒｏｓｕｒｆは８０ｍｇ／ｍｌに懸濁し、そして２．５ｍｌ／ｋｇ体重を投与した；Ｓｕｒｖａｎｔａは２５ｍｇ／ｍｌに懸濁し、そして４ｍｌ／ｋｇ体重を投与した。
脈動気泡実験
２（重量／重量）％のＰｘＢを含むか、または含まないＳＰ−Ｃ３３サーファクタントの動力学的な表面特性は、脈動気泡サーファクトメーターにより評価した。これらの実験では、サーファクタントを塩水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、そして３７℃で分析した。阻害に対する感度は、４０ｍｇ／ｍｌのアルブミンをサーファクタント懸濁液に加えることにより試験した。周辺の空気と通じる気泡が、約２０μｌのサンプル流体を含むプラスチック製の試験チャンバーで作成された。気泡の半径は４０サイクル／分の速度で最大０．５５から最小０．４０ｍｍまで振動させられ、５０％の循環表面圧縮（ｃｙｃｌｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）に相当した。最小および最大の気泡サイズ（γｍｉｎ、γｍａｘ）の表面張力値を、５分の脈動にわたり記録した。
インビボ実験
サーファクタント混合物は、在胎齢２７日で子宮摘出により得た未熟な新生児ウサギで評価した（出産予定日：３１日）。動物は出生時に気管切開を行い、３７℃で体積記録器の箱に維持し、そして４０呼吸／分および５０％の吸息時間の頻度で、１００％酸素と同時に通気した。処置動物は２．５ｍｌ／ｋｇまたは４ｍｌ／ｋｇの上記サーファクタント調製物を気管カニューレを介して受けた。サーファクタント調製物を受けなかった同腹子を対照として使用した。サーファクタントを点滴注入した後、サーファクタントを肺に分布し易くするために、ピーク圧は最初に１分あたり３５ｃｍＨ２Ｏに上げ、次いで２５ｃｍＨ２Ｏに下げた。次いで動物に２５ｃｍＨ２Ｏのピーク圧で１５分間通気し、その後、圧力を最初に２０ｃｍＨ２Ｏに５分間下げ、次いで１５ｃｍＨ２Ｏに５分間下げ、そして再度２５ｃｍＨ２Ｏに５分間上げた。一回呼吸量は、各体積記録器の箱に連結された呼吸気流計を用いて５分間の間隔で測定した。
【００２６】
確立した通気期間の終わりに、動物を大脳内リドカイン注射により屠殺した。動物の腹を開き、そして横隔膜の位置を気胸証拠について視察した。
【実施例１】
【００２７】
種々の脂質混合物中のＳＰ−Ｃ３３のインビトロ表面活性
ＤＰＰＣ／ＰＧ／ＰＡ（６８：２２：９）、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ（６０：２０：２０）、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ（６８：１６：１５）およびＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ（６８：３１）中の２（重量／重量）％のＳＰ−Ｃ３３の動力学的な表面特性を、脈動気泡サーファクトメーターで評価し、これはすべての混合物について５分の脈動後にγｍｉｘ＜２ｍＭ／ｍを、そしてγｍａｘが４８ｍＮ／ｍであったＤＰＰＣ／ＰＧ／ＰＡ（６８：２２：９）中のＳＰ−Ｃ３３を除き、すべての混合物についてγｍａｘ＜４０ｍＮ／ｍを示した。
【実施例２】
【００２８】
ＰＡ無しでのインビボの最適効果
脂質組成の関係を評価するために、混合物ＤＰＰＣ／ＰＧ／ＰＡ（６８：２２：９）、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ／ＰＡ（６８：２２：９）およびＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ（６８：３１）中のＳＰ−Ｃ３３のインビボ効果を比較した。ＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ（６８：３１）中のＳＰ−Ｃ３３は他の２つの混合物よりも高い効果を示した。このデータにより、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ（６８：３１）中のＳＰ−Ｃ３３で処置した後の一回呼吸量に顕著な増加が示された。それらはまた、ＤＰＰＣおよび酸性脂質含量が一定ならば、ＰＡの存在が処置の効果を下げることも示した。ＳＰ−Ｃ３３に基づくサーファクタントのインビボ活性に及ぼすＰＡの負の効果は、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ（６０：２０：２０）中のＳＰ−Ｃ３３の効果よりもわずかに低いＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ／ＰＡ（５７：１９：１９：５）中のＳＰ−Ｃ３３の効果（１５分の期間にＶＴ＝１２  ２５分の期間にｅＶＴ＝１４）によりさらに確認される。
【国際調査報告】
2006504635.tif 000007
2006504635.tif 000008
2006504635.tif 000009