(57)【要約】本発明は、ＩκＢのＩＫＫ−βリン酸化の阻害に関連する疾患を治療するための特定の化合物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式：
【化１】
2006510676.tif 000004
を有する５−（４−フルオロ−フェニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−カルボン酸アミド。
【請求項２】
病的ＮＦ−κＢ活性化により特徴づけられる疾患の治療法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項１記載の化合物を投与することにより病的活性化を阻害することを含む方法。
【請求項３】
疾患が炎症または組織修復障害である請求項２記載の方法。
【請求項４】
疾患が、炎症および組織修復障害、特に関節リウマチ、炎症性腸管疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎、骨粗鬆症および線維症、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射（ＵＶ）誘発の皮膚損傷を含む皮膚病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎を含む自己免疫疾患、組織および器官拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病を含む癌、カへキシー、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むある種のウイルス感染に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張失調症からなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記疾患が皮膚病である請求項３記載の方法。
【請求項６】
疾患が、乾癬、アトピー性皮膚炎、およびＵＶにより誘発される皮膚損傷からなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項７】
疾患が、自己免疫疾患；組織および器官拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、骨関節炎、骨粗鬆症、および毛細血管拡張失調症からなる群から選択される請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が自己免疫疾患である請求項３記載の方法。
【請求項９】
自己免疫疾患が全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、または強直性脊椎炎、糖尿病である請求項３記載の方法。
【請求項１０】
疾患が癌および／またはカヘキシーである請求項３記載の方法。
【請求項１１】
癌がホジキン病である請求項３記載の方法。
【請求項１２】
疾患が感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むある種のウイルス感染症に付随する炎症である請求項３記載の方法。
【請求項１３】
疾患がＡＩＤＳである請求項３記載の方法。
【請求項１４】
疾患が成人呼吸窮迫症候群である請求項３記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患がＣＯＰＤである請求項３記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が喘息である請求項３記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が関節リウマチである請求項３記載の方法。
【請求項１８】
ＮＦ−κＢおよびチェックポイントキナーゼの二重阻害がある請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、アミノチオフェン化合物を用いた転写因子ＮＦ−κＢ（核因子−κＢ）の病的活性化を阻害する方法に関する。かかる方法は、ＮＦ−κＢの活性化が関与する疾患の治療において特に有用である。さらに詳細には、これらの方法は、ＮＦ−κＢ二量体のその後の分解および活性化を防止するＩκＢ（阻害タンパク質κＢ）のＩＫＫ−β（ＩκＢキナーゼ−β、ＩＫＫ−２としても知られる）リン酸化の阻害に用いることができる。かかる方法は、炎症および組織修復障害；特に関節リウマチ、炎症性腸管疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎；骨粗鬆症および線維症；乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）により引き起こされる皮膚損傷をはじめとする皮膚病；全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎をはじめとする自己免疫疾患、組織および器官拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病をはじめとする癌、カへキシー、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）をはじめとするある種のウイルス性感染症に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張失調症をはじめとするＮＦ−κＢ活性化に関連する様々な疾患の治療において有用である。
【０００２】
（従来技術）
急性および慢性炎症性疾患に関与するメディエーターの科学的理解における最近の進歩は、効果的な治療法の探索において新しい方法をもたらした。伝統的な方法は、特異的抗体、レセプター拮抗物質、または酵素阻害剤の使用など直接標的介入を包含する。様々なメディエーターの転写および翻訳に関与する調節機構の解明における最近の飛躍的前進は、遺伝子転写のレベルでの治療法への関心の増大につながっている。
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）は、ポリペプチドのＲｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーの様々な組み合わせからなる密接に関連した二量体転写因子複合体のファミリーに属する。このファミリーは哺乳動物における５の別個の遺伝子産物：ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０／ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ４９／ｐ１００）、ｃ−Ｒｅｌ、およびＲｅｌＢからなり、その全てが異種または同種二量体を形成できる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび二量化ドメインを含有する、極めて相同的な３００個のアミノ酸「Ｒｅｌ相同性ドメイン」を共有する。その先端にある、Ｒｅｌ相同性ドメインのＣ−末端は、ＮＦ−κＢの細胞質から核への輸送に重要な核転座配列である。加えて、ｐ６５およびｃＲｅｌは、そのＣ−末端に強力なトランス活性化ドメインを有する。
【０００３】
ＮＦ−κＢの活性は、タンパク質の阻害剤ＩκＢファミリーのメンバーとの相互作用により調節される。この相互作用は、ＮＦ−κＢタンパク質上の核局在化配列を効率よくブロックし、二量体の核への移動を防止する。様々な刺激が複数のシグナル変換経路であるらしいものによりＮＦ−κＢを活性化する。バクテリア産物（ＬＰＳ）、ある種のウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１）、環境および酸化的ストレスおよびＤＮＡ損傷剤が含まれる。しかしながら、全ての刺激に明らかに共通するのは、ＩκＢのリン酸化およびその後の分解である。ＩκＢは最近同定されたＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β）により２つのＮ−末端セリンでリン酸化される。部位特異的突然変異誘発の研究は、一旦リン酸化されるとタンパク質はユビキチン−プロテアソーム経路により分解されるようになる点で、これらのリン酸化はＮＦ−κＢのその後の活性化に重要であることを示している。ＩκＢなしで、活性ＮＦ−κＢ複合体は核へ転位することができ、ここでこれらは選択的に好ましい遺伝子特異性エンハンサー配列と結合する。ＮＦ−κＢにより調節される遺伝子には、多くのサイトカインおよびケモカイン、細胞接着分子、急性期タンパク質、免疫制御タンパク質、エイコサノイド代謝酵素および抗アポトーシス遺伝子が含まれる。
【０００４】
ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカイン、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭなどの細胞接着分子、および誘導型酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）をはじめとする多数の前炎症性メディエーターの制御された発現において重要な役割を果たすことは周知である。このようなメディエーターは、炎症部位での白血球の補充に関与することが知られており、ｉＮＯＳの場合、ある種の炎症性および自己免疫疾患における器官破壊につながり得る。
ＮＦ−κＢの炎症性障害における重要性は、ＮＦ−κＢが活性化されることが証明されている喘息をはじめとする気道炎症の研究によりさらに強固にされる。この活性化は、これらの障害に特徴的な増大したサイトカイン産生および白血球浸潤の根底にある。加えて、吸入されたステロイドは気道過剰反応性を減少させ、喘息性気道における炎症性応答を抑制する。ＮＦ−κＢのグルココルチコイド阻害に関する最近の知見を考慮して、これらの効果はＮＦ−κＢの阻害により媒介されると推測することができる。
【０００５】
さらに、炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割については、リウマチ様滑膜の研究から明らかにされる。ＮＦ−κＢは通常、不活性な細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織化学的研究により、ＮＦ−κＢは核において存在し、従ってリウマチ様滑膜を含む細胞においては活性であることが示されている。さらに、ＮＦ−κＢはヒト滑膜細胞においてＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βでの刺激に応答して活性化されることが示されている。かかる分布はこの組織に特徴的な増大したサイトカインおよびエイコサノイド産生の基礎になるメカニズムである。Ｒｏｓｈａｋ、Ａ．Ｋ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１、３１４９６−３１５０１（１９９６）参照。ＩＫＫ−βの発現は、関節リウマチの患者の滑膜細胞において示され、遺伝子移入研究により、これらの細胞における刺激された炎症性メディエーター産生におけるＩＫＫ−βの中心的役割が示されている。Ａｕｐｐｅｒｅｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９．１６３：４２７−４３３およびＡｕｐｐｅｒｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００１；１６６：２７０５−１１参照。ごく最近、野生型ＩＫＫ−βアデノウイルス構築物の関節内投与は足の腫脹を引き起こすことが示されているが、主要な負のＩＫＫ−βの関節内投与はラットにおいてアジュバントにより誘発された関節炎を阻害した。Ｔａｋら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ２００１；４４：１８９７−１９０７参照。
【０００６】
ＮＦ−κＢ／ＲｅｌおよびＩκＢタンパク質は、腫瘍形質転換および転移においても重要な役割を果たすようである。ファミリーメンバーは、過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子再配列または転座の結果としてインビトロおよびインビボの細胞形質転換と関連する。加えて、これらのタンパク質をコード化する遺伝子の再配列および／または増幅は、あるヒトリンパ性腫瘍の２０〜２５％において見られる。さらに、ＮＦ−κＢは、腫瘍形成ラスにより活性化され、ヒト腫瘍における最も一般的な異常およびＮＦ−κＢの活性化の阻害はラスによる細胞形質転換を阻害する。加えて、アポトーシスの制御におけるＮＦ−κＢの役割が報告されており、腫瘍細胞増殖の制御におけるこの転写因子の役割を強化する。ＴＮＦ、電離放射線およびＤＮＡ損傷剤はすべてＮＦ−κＢを活性化することが示されており、これはいくつかの抗アポトーシスタンパク質の増加調節された発現につながる。反対に、ＮＦ−κＢの阻害は、数種の腫瘍細胞においてこれらの物質によるアポトーシスキリングを向上させることが示されている。このことは、化学療法に対して耐性の腫瘍細胞の主なメカニズムを表すようであるので、ＮＦ−κＢ活性化の阻害剤は単独の薬剤または補助治療のいずれかとして有用な化学療法剤である。最近の報告では、骨格細胞分化の阻害剤ならびにサイトカインにより誘発される筋肉消耗の調節剤としてＮＦ−κＢが関与するとされ（Ｇｕｔｔｒｉｄｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ；２０００；２８９：２３６３−２３６５）、このことは新規癌治療法としてのＮＦ−κＢ阻害剤の可能性を支持する。
【０００７】
いくつかのＮＦ−κＢ阻害剤は、Ｃ．Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５），１１６３−１１７４（１９９８）、Ｒ．Ｗ．Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１，４１３−４１９（１９９８）、Ｊ．Ｗ．Ｐｉｅｒｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１０９６−２１１０３（１９９７）に記載されている。
海洋天然産物であるヒメニアルジシンはＮＦ−κＢを阻害することが知られている。Ｒｏｓｈａｋ，Ａ．，ら、ＪＰＥＴ，２８３，９５５−９６１（１９９７）。Ｂｒｅｔｏｎ，Ｊ．ＪおよびＣｈａｂｏｔ−Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃ．，ＪＰＥＴ，２８２，４５９−４６６（１９９７）。
【０００８】
さらに、特許出願は、ＩＫＫ−２またはＩＫＫ複合体の阻害剤を開示している。ＷＯ２００２４６１７１、ＷＯ２００１９８２９０、ＷＯ２００１６８６４８、ＥＰ１１３４２２１、ＤＥ１９８０７９９３、ＥＰ１２０９１５８、ＷＯ２００１３０７７４、ＤＥ１９９２８４２４、ＷＯ２００１００６１０、ＷＯ２００２２４６７９、ＷＯ２００２２４６９３、ＷＯ２００２４４１５３、ＷＯ２００２２８８６０、ＷＯ２００２６０３８６、ＷＯ２００２４１８４３、およびＷＯ２００２６２８０４参照。ウレイドチオフェンを包含する特許出願はＷＯ２００１５８８９０およびＷＯ２００２３０３５３を包含する。ＰＳ−１１４５はＩＫＫ−２阻害剤であることが証明された。ＪＢＣ２００２，１９，１６６３９−１６６４７参照。スタウロスポリン、クエルセチン、Ｋ２５２ａおよびＫ２５２ｂなどの天然産物は、ＩＫＫ−β阻害剤であることが示されている。Ｐｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．およびＬｉ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，３２６５５−３２６６１（１９９９）およびＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉ，Ｄ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７４，２２０−２２８（１９９９）参照。
【０００９】
（発明の要約）
本発明は、新規化合物および活性化転写因子ＮＦ−κＢを阻害するためのその使用を含む。
本発明の一の目的は、転写因子ＮＦ−κＢの活性を変更することにより治療的に緩和される疾患の治療法を提供することである。
従って、第一の態様において、本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物を提供する。
もう一つ別の態様において、本発明は疾患の治療法であって、ＩＫＫ−βによりＩκＢのリン酸化およびその後の分解を阻害することにより病状を治療的に緩和することができる方法を提供する。
さらにもう一つ別の態様において、本発明は疾患の治療法であって、ＮＦ−κＢの病的活性化を阻害することにより病状を治療的に緩和できる方法を提供する。
【００１０】
特定の態様において、本発明は、炎症および組織修復障害、特に関節リウマチ、炎症性腸管疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎、骨粗鬆症および線維症、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）により引き起こされる皮膚損傷をはじめとする皮膚病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎をはじめとする自己免疫疾患、組織および器官拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病をはじめとする癌、カへキシー、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）をはじめとするある種のウイルス感染症に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張失調症をはじめとするＮＦ−κＢの活性化に関連する様々な疾患の治療法を提供する。
【００１１】
（発明の開示）
本発明の化合物は以下の式（Ｉ）で示される：
【化１】
2006510676.tif 000002
式１の化合物は５−（４−フルオロ−フェニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−カルボン酸アミドとして表すこともできる。
【００１２】
本発明はさらに、ＮＦ−κＢの活性化と関連する疾患の治療法であって、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、炎症性および組織修復障害をはじめとするＮＦ−κＢの活性化に関連する様々な疾患、特に関節リウマチ、炎症性腸管疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎、骨粗鬆症および線維症、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）により引き起こされる皮膚損傷をはじめとする皮膚病；全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎をはじめとする自己免疫疾患、組織および器官拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病をはじめとする癌、カへキシー、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）をはじめとするある種のウイルス感染症に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群、および毛細血管拡張失調症の治療法を提供する。
【００１３】
定義
本発明は、本発明の化合物の全ての水和物、溶媒和物、複合体およびプロドラッグを包含する。プロドラッグは、式Ｉの活性な親医薬をインビボで放出する任意の共有結合した化合物である。
【００１４】
調製法
本発明の式Ｉの化合物は、以下のスキーム１に示す方法により都合よく調製することができる：
【化２】
2006510676.tif 000003
【００１５】
本発明において用いられる出発物質は、商業的に入手可能であるか、または当業者に周知の慣例法により調製され、標準的参考文献、例えばｔｈｅ  ＣＯＭＰＥＮＤＩＵＭ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ、第Ｉ−ＶＩ巻（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版）において見いだすことができる。
本発明は、式Ｉの化合物および医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。従って、式Ｉの化合物は医薬の製造において用いることができる。以下に記載するようにして調製される式Ｉの化合物の医薬組成物は、非経口投与用溶液または凍結乾燥粉末として処方することができる。粉末は、使用前に適当な希釈剤または他の医薬的に許容される担体を添加することにより復元することができる。液体処方は緩衝化等張水溶液であってもよい。適当な希釈剤の例は、等張生理食塩水、標準的水中５％デキストロースまたは緩衝化酢酸ナトリウムまたはアンモニウム溶液である。このような処方は非経口投与に特に適しているが、経口投与に使用することもでき、または吸入用計量吸入器またはネブライザー中に含めることもできる。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムなどの賦形剤を添加することが望ましい。
【００１６】
別法として、本発明の化合物は経口投与用にカプセル化、錠剤化あるいはエマルジョンまたはシロップに調製することができる。組成物を促進または安定化するために、あるいは組成物の調製を促進するために、医薬的に許容される固体または液体担体を添加することができる。固体担体は、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンを包含する。液体担体は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、食塩水および水を包含する。担体は、徐放性物質、例えばグリセリルモノステラレートまたはグリセリルジステアレートを単独またはワックスと共に含むことができる。固体担体の量は様々であるが、好ましくは投与単位あたり約２０ｍｇから約１ｇの間である。医薬製剤は、錠剤形については、粉砕、混合、顆粒化、および必要ならば圧縮；またはハードゼラチンカプセル形については粉砕、混合および充填を含む慣例の製薬技術にしたがって製造される。液体担体を用いる場合、製剤はシロップ、エリキシル、エマルジョンあるいは水性または非水性懸濁液の形態である。このような液体処方は、直接経口投与してもよいし、あるいはソフトゼラチンカプセル中に充填してもよい。
【００１７】
吸入用の典型的な組成物は、乾燥粉末、溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態である。投与は、例えば、乾燥粉末吸入器（例えば、単位用量または多剤吸入器、例えば米国特許第５５９０６４５号に記載されているもの）によるか、または噴霧によるか、または加圧エアゾルの形態であってもよい。乾燥粉末組成物は、典型的には担体、例えばラクトース、トレハロースまたはデンプンを用いる。噴霧用組成物は典型的にはビヒクルとして水を使用する。加圧エアゾルは典型的にはプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタンまたはさらに好ましくは１，１，１，２−テトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパンまたはその混合物を使用する。加圧エアゾル処方は、賦形剤を含まないか、または界面活性剤および／または補助溶剤（例えばエタノール）を包含する賦形剤を使用してもよい溶液（おそらくはエタノールなどの可溶化剤を使用する）または懸濁液の形態であってもよい。乾燥粉末組成物および懸濁液エアゾル組成物において、活性成分は好ましくは吸入に適した大きさのものである（典型的には２０ミクロン未満、例えば１〜１０、特に１〜５ミクロンの質量中央径（ＭＭＤ）を有する）。例えばマイクロ化により活性成分のサイズを減少させることが必要である可能性がある。
【００１８】
加圧エアゾル組成物は一般にバルブ、特に計量バルブを備えた容器中に充填される。容器は所望によりプラスチック材料、例えばＷＯ９６／３２１５０に記載されているようなフルオロカーボンポリマーでコートしてもよい。容器は、口腔送達に適用されるアクチュエーター中に取り付けられる。
鼻送達用の典型的な組成物は、吸入について既に記載したもの、および水などの不活性ビヒクル（所望により緩衝液、抗菌剤、等張性調整剤および粘度調整剤との組み合わせ）中溶液または懸濁液の形態であって、鼻ポンプにより投与することができる形態の非加圧組成物をさらに包含する。
直腸投与に関して、本発明の化合物はカカオ脂、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールなどの賦形剤と組み合わせ、坐剤に成形することもできる。
【００１９】
本発明の方法は、式Ｉの化合物の局所、吸入および結腸内投与を包含する。局所投与とは、本発明の化合物の、表皮、口腔への外部投与、およびかかる化合物を耳、眼および鼻中に滴下することをはじめとする非全身性投与を意味し、ここにおいて該化合物は著しく血流中に侵入しない。全身性投与とは、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。局所投与で治療または予防効果を得るのに必要な本発明の化合物（以下、活性成分と称する）の量は、もちろん選択された化合物、治療される状態の性質および重さ、および治療を受けている動物によって変わるが、最終的に医師の判断による。
活性成分を原料化学物質として単独で投与することが可能であるが、医薬処方として提供することが好ましい。活性成分は局所投与については処方の０．０１〜５．０重量％を構成する。
【００２０】
獣医学的および人間の医学的用途の両方について、本発明の局所処方は１以上の許容できる担体および所望により任意の他の治療成分と共に活性成分を含む。担体は、処方の他の成分と適合性であり、受容者に対して有害でないという意味で「許容でき」なければならない。
局所投与に適した処方は、リニメント、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなどの、治療が必要な部位へ皮膚を介して浸透するために適した液体または半液体製剤、および眼、耳または鼻への投与に適した滴剤を包含する。
【００２１】
本発明の滴剤は、無菌水性または油性溶液または懸濁液を含み、殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存料の適当な水溶液（好ましくは界面活性剤を含む）中に活性成分を溶解させることにより調製することができる。結果として得られる溶液は次いで濾過により清澄化し、適当な容器に移し、これを次いで密封し、加圧滅菌または９０〜１００℃で半時間維持することにより殺菌する。別法として、濾過により溶液を殺菌し、無菌技術により容器に移すことができる。滴剤に含めるのに適した殺菌および殺真菌剤の例は、硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、ベンザルコニウムクロリド（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒は、グリセロール、希釈アルコールおよびプロピレングリコールを含んでもよい。
【００２２】
本発明のローションは、皮膚または眼への適用に適したものを包含する。眼用ローションは、所望により殺菌剤を含んでもよい無菌水性溶液を含むことができ、滴剤の調製法と類似した方法により調製することができる。皮膚への適用に適したローションまたはリニメントは、乾燥を促進し、皮膚を冷却するための薬剤、例えばアルコールまたはアセトン、および／または保湿剤、例えばグリセロールまたは油、例えばヒマシ油または落花生油を含むこともできる。
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは外部適用のための活性成分の半固体処方である。これらは、活性成分を微粉砕または粉末化された形態において、単独あるいは水性または非水性流体中溶液または懸濁液の形態で、適当な機械の助けを借りて、グリースまたは非グリース基剤と混合することにより製造できる。基剤は、炭化水素、例えば固形、軟質または流動パラフィン、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸、粘漿剤、アーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然源の油、羊毛脂またはその誘導体、または脂肪酸、例えばステアリン酸またはオレイン酸を、プロピレングリコールまたはマクロゴールなどのアルコールと共に含むことができる。処方は、任意の適当な界面活性剤、例えばアニオン性、カチオン性または非イオン性界面活性剤、例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を組み入れることができる。懸濁化剤、例えば天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質、例えば珪質性シリカ、および他の成分、例えばラノリンを含むこともできる。
【００２３】
（発明の有用性）
式Ｉの化合物は、ＩκＢのＩＫＫ−ベータキナーゼリン酸化の阻害剤として有用であり、したがってＮＦ−κＢの活性化の阻害剤である。本発明の方法は、前記化合物の医薬組成物および処方を包含する前記化合物の組成物および処方を利用する。
本発明は特に不適当なＮＦ−κＢ活性化と関連する疾患の治療法であって、それを必要とする動物、特に哺乳動物、最も詳細にはヒトに式Ｉの化合物を投与することを含む方法を提供する。本発明は特に、炎症性および組織修復障害、特に関節リウマチ、炎症性腸管疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎、骨粗鬆症および線維症；乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線（ＵＶ）により引き起こされる皮膚損傷をはじめとする皮膚病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎をはじめとする自己免疫疾患、組織および器官拒絶反応、アルツハイマー病、発作、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病をはじめとする癌、カへキシー、感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）はじめとするある種のウイルス感染症に伴う炎症、成人呼吸窮迫症候群および毛細血管拡張失調症の治療法を提供する。
【００２４】
急性治療のために、式Ｉの化合物の非経口投与が有用である。化合物の５％水または標準塩溶液中デキストロース中の静脈内注入液、または適当な賦形剤を含む類似の処方が最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。典型的には、非経口投与量は、ＩＫＫ−ベータ、従ってＮＦ−κＢの活性化を阻害するために有効な濃度に血漿中薬剤の濃度を維持するように、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ；好ましくは０．１から２０ｍｇ／kgの間である。化合物は、約０．４〜約８０ｍｇ／ｋｇ／日の合計一日量を達成するための量で一日につき１〜４回投与される。治療上有効な本発明の方法において用いられる化合物の正確な量およびかかる化合物が最もよく投与される経路は、薬剤の血中濃度と治療効果を得るために必要な濃度を比較することにより当業者によって容易に決定される。
【００２５】
式Ｉの化合物は、薬剤濃度が、ＩＫＫ−ベータおよびＮＦ−κＢの活性化を阻害するため、または本明細書において開示されている任意の他の治療効果を達成するために十分であるように患者に経口投与することもできる。典型的には、化合物を含有する医薬組成物は、患者の状態と一致した方法で約０．１〜約５０ｍｇ／kgの間の経口用量で投与される。好ましくは、経口投与量は約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇである。
式Ｉの化合物は、薬剤の濃度がＩＫＫ−ベータおよびＮＦ−κＢの活性化を阻害するかまたは本明細書において開示される任意の他の治療効果を達成するために十分である様な方法で患者に局所投与することもできる。典型的には、化合物を含有する医薬組成物は約０．０１％〜約５％ｗ／ｗの間の局所処方で投与される。
本発明の化合物を本発明に従って投与した場合に許容できない毒物学的作用は予想されない。
【００２６】
本明細書において記載される化合物がＮＦ−κＢの活性化を阻害する能力は、ＩＫＫ−βによるＩκＢ−αのＮ−末端フラグメントのリン酸化を阻害する能力において明らかに証明される。この化合物は、前炎症刺激（例えば、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ等）での細胞の活性化によりヒト単球および他の哺乳動物細胞におけるＩκＢ−αの分解およびＮＦ−κＢの核転座もブロックする。加えて、この化合物は、ＬＰＳ−刺激されたヒト単球および刺激されたヒト一次滑膜線維芽細胞からの前炎症メディエーター産生を阻害する。疾患の治療における本発明のＮＦ−κＢ阻害剤の有用性は、様々な疾患におけるＮＦ−κＢ活性化の重要性に基づく。加えて、式Ｉの化合物はラットおよびマウスなどの臨床前種において経口的に生物利用可能であることが証明されている。式Ｉの化合物のインビボ特性は、匹敵するＩＫＫ−２阻害活性を保持しつつ、４’−Ｆ基が欠失した類似体よりも試験された臨床前種において著しく向上されたＤＭＰＫ特性を示した。
【００２７】
ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカイン（Ｍｕｋａｉｄａら、１９９０；ＬｉｂｅｒｍａｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９９０；Ｍａｔｓｕｓａｋａら、１９９３）、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭなどの細胞接着分子（Ｍａｒｕｉら、１９９３；Ｋａｗａｉら、１９９５；ＬｅｄｅｂｕｒおよびＰａｒｋｓ、１９９５）および誘導型酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）（Ｘｉｅら、１９９４；Ａｄｃｏｃｋら、１９９４）（完全な文献の引用箇所はこの節の最後に記載）をはじめとする多数の前炎症性メディエーターの制御された発現において重要な役割を果たす。このようなメディエーターは炎症の部位での白血球の補充に関与することが知られており、ｉＮＯＳの場合にはある種の炎症性および自己免疫疾患における器官破壊に至る可能性がある（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓら、１９９３；Ｋｌｅｅｍａｎｎら、１９９３）。
【００２８】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの重要な役割についての証拠は、喘息患者の研究において得られる。軽症のアトピー性喘息患者から得た気管支バイオプシーは、健常な非アトピー対照からのバイオプシーと比較すると、活性化されたＮＦ−κＢ、全ＮＦ−κＢ、およびＮＦ−κＢ調節サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαについての粘膜下組織染色において細胞数の有意な増大を示す。さらに、ＮＦ−κＢ免疫反応性を発現する血管の割合（％）は、バイオプシー検体の上皮におけるＩＬ−８免疫活性と同様に増大する（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８）。したがって、ＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生の阻害は、この化合物により示されているように、気道炎症において有用であることが予想される。
【００２９】
最近の研究は、ＮＦ−κＢが炎症性腸管疾患（ＩＢＤ）の病理発生においても重要な役割を果たし得ることを示唆している。クローン病および潰瘍性結腸炎の患者からの結腸バイオプシー検体において活性化されたＮＦ−κＢがみられる（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８；Ｒｏｇｌｅｒら、１９９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９９８）。活性化は、炎症を起こしている粘膜で顕著であるが、炎症を起こしていない粘膜においては顕著でなく（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８；Ｒｏｇｌｅｒら、１９９８）、同じ部位における増大したＩＬ−８ｍＲＮＡ発現と関連する（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８）。さらに、コルチコステロイド治療は腸管ＮＦ−κＢ活性化を強力に阻害し、結腸炎症を軽減する（Ａｒｄｉｔｅら、１９９８；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９９８）。ここでも、ＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生の阻害は、この化合物により示されるように炎症性腸管疾患において有用であることが予想される。
【００３０】
胃腸管炎症の動物モデルは、ＮＦ−κＢが結腸炎症の重要なレギュレーターであることをさらに支持する。ｐ６５が活性化複合体の主成分であるマウスにおいて２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘発性大腸炎における粘膜固有層マクロファージにおいて、増大したＮＦ−κＢ活性が観察される（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９６；ＮｅｕｒａｔｈおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９７）。ｐ６５アンチセンスの局所投与は、毒性の徴候がない治療された動物において確立された結腸炎の徴候を排除する（Ｎｅｕｒａｔｈら、１９９６；ＮｅｕｒａｔｈおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９７）。従って、ＮＦ−κＢの小分子阻害剤はＩＢＤの治療において有用であることが予想される。
【００３１】
炎症性障害におけるＮＦ−κＢの役割は、リウマチ様滑膜の研究から明らかになる。ＮＦ−κＢは通常、不活性な細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織化学的研究により、ＮＦ−κＢは核において存在し、従ってヒトリウマチ様滑膜を含む細胞（Ｈａｎｄｅｌら、１９９５；Ｍａｒｏｋら、１９９６；Ｓｉｏｕｄら、１９９８）および疾患の動物モデル（Ｔｓａｏら、１９９７）において活性であることが示されている。染色はＡ型滑膜細胞および血管内皮細胞と関連する（Ｍａｒｏｋら、１９９６）。さらに、ＮＦ−κＢの構成的活性化が、培養された滑膜細胞（Ｒｏｓｈａｋら、１９９６；Ｍｉｙａｚａｗａら、１９９８）およびＩＬ−１βまたはＴＮＦαで刺激された滑膜細胞培養物（Ｒｏｓｈａｋら、１９９６；Ｆｕｊｉｓａｗａら、１９９６；Ｒｏｓｈａｋら、１９９７）においてみられる。したがって、ＮＦ−κＢの活性化は、炎症を起こした滑膜に特徴的な増大したサイトカイン産生および白血球浸潤の根底にある。この化合物がＮＦ−κＢを阻害し、従って、これらの細胞による前炎症性メディエーター（例えばサイトカインおよびプロスタノイド）の産生を阻害する能力は、関節リウマチにおいて有用であることが予想される。
【００３２】
生物学的検定
所定の薬理学的効果を得るために必要な化合物の濃度を決定するためのいくつかの生物学的検定のうちの一つにおいて本発明の化合物を試験することができる。
ＮＦ−κＢ活性は、核におけるＮＦ−κＢタンパク質の存在を評価するために電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において測定することもできる。興味のある細胞を１×１０６／ｍＬの密度まで培養する。細胞を遠心分離により収穫し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋のないＰＢＳ中で洗浄し、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含むＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁させる。化合物のＮＦ−κＢの活性化に対する効果を調べるために、細胞懸濁液を様々な濃度の薬剤またはビヒクル（ＤＭＳＯ、０．１％）で、３０分間３７℃で処理した後、ＴＮＦ−α（５．０ｎｇ／ｍＬ）でさらに１５分間刺激する。細胞および核抽出物を次のようにして調製する。簡単にいうと、インキュベーション期間の最後に細胞（１×１０７細胞）をＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳ中で２回洗浄する。得られる細胞ペレットを２０ｕＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）および０．１％ＮＰ−４０）中に再懸濁させ、氷上で１０分間インキュベートする。３５００ｒｐｍで１０分間４℃でミクロ遠心分離することにより核をペレット化する。得られる上清を細胞抽出物として集め、核ペレットを１５ｕＬの緩衝液Ｃ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５％グリセロール、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））中に再懸濁させる。懸濁液を４℃で２０分間穏やかに撹拌し、次いで１４０００ｒｐｍで１０分間４℃でミクロ遠心分離する。上清を集め、緩衝液Ｄ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０％グリセロール、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ）で６０ｕＬに希釈する。全てのサンプルを分析するまで−８０℃で保存する。抽出物のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、１９７６）にしたがってＢｉｏＲａｄ試薬を用いて測定する。
【００３３】
化合物の転写因子活性化に対する効果を、前記のような処置された細胞から得られる核抽出物を用いて電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において評価する。二本鎖ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［ｇ−３２］ＡＴＰで標識する。結合混合物（２５ｕＬ）は、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオトレイトール、１０％グリセロール、０．３ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン、および１ｕｇポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）を含有する。結合混合物（１０ｕｇ核抽出タンパク質）を２０分間室温で０．５ｎｇの３２Ｐ標識されたオリゴヌクレオチド（５００００〜１０００００ｃｐｍ）と共に、標識されていない拮抗物質の存在下または不在下でインキュベートし、その後、１Ｘ  Ｔｒｉｓ−ボレート／ＥＤＴＡ中で調製された４％ポリアクリルアミドゲル上に混合物をロードし、２００Ｖで２時間電気泳動させる。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、結合反応の検出のためにフィルムに暴露する。
【００３４】
ＩκＢのリン酸化に対する化合物の効果をウエスタンブロットにおいてモニターすることができる。細胞抽出物を、１０％ゲル（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、タンパク質をニトロセルロースシート（Ｈｙｂｏｎｄｔｍ−ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移す。ＩκＢαまたはＩκＢβに対するポリクローナルウサギ抗体を用い、続いてペルオキシダーゼ接合ロバ抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いてイムノブロット検定を行う。エンハンスト・ケミルミネッセンス（ＥＣＬ）アッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて免疫反応性バンドを検出する。
【００３５】
ＩκＢキナーゼについてのアッセイを次のようにして行う：ＩＫＫ−αをヘキサヒスチジン標識されたタンパク質としてバクロウイルスに感染した昆虫細胞において発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラム上で精製した。様々な濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクルおよび必要ならばＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含有するアッセイ緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．７、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ  β−グリセロホスフェート、１０ｍＭ  ＮａＦ、１０ｍＭ  ＰＮＰＰ、０．３ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭベンズアミジン、２μＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１ｕｇ／ｍＬロイペプチン、１ｕｇ／ｍＬペプスタチン、１ｍＭ  ＤＴＴ）中５０ｎｇの精製されたタンパク質を用いてキナーゼ活性を評価した。２００ｎｇのＩκＢ−ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を合計体積５０ｕＬで添加することにより反応を開始させた。反応を１時間、３０℃で進行させ、その後、ＥＤＴＡを最終濃度２０ｍＭになるように添加することにより反応を停止させた。ホスホ−ＩκＢ−α（Ｓｅｒ３２）抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＥｕ３＋−標識抗ウサギＩｇＧ（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いた解離強化ランタニド蛍光イムノアッセイ（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によりキナーゼ活性を決定した。ＶＩＣＴＯＲ１４２０マルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で、標準的ヨーロピウムプロトコル（励起３４０ｎｍ、発光６１５ｎｍ；４００ｕｓｅｃの遅延後４００μｓ間蛍光を測定）を用いてプレートを読みとった。データは蛍光（ｃｐｓ）単位として表す。
【００３６】
ＩＫＫ−βをＧＳＴ−標識タンパク質として発現させ、その活性を９６穴シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）において評価した。簡単に説明すると、ＩＫＫ−βを、様々な濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクル、２４０ｎＭ  ＡＴＰおよび２００ｎＣｉ［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（１０ｍＣｉ／ｍＬ、２０００Ｃｉ／ミリモル；ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で前記のようなアッセイ緩衝液中で希釈した（最終濃度２０ｎＭ）。１５〜４６のＩκＢ−α（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を含むビオチニル化ペプチドを最終濃度２．４μＭ、最終体積５０ｕＬになるように添加することにより反応を開始した。サンプルを１時間３０℃でインキュベートし、続いて０．２ｍｇのストレプトアビジン−コートされたＳＰＡ  ＰＶＴビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含有する１５０ｕＬのストップ緩衝液（ＰＢＳｗ／ｏ  Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加した。サンプルを混合し、１０分間室温でインキュベートし、遠心分離し（１０００ｘｇ、２分）、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔで測定した。
【００３７】
加えて、ＩＫＫ−βまたはＩＫＫ−α活性は、３８４穴マイクロタイタープレートにおいて時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を用いた組み換えＧＳＴ−ＩκＢαのリン酸化により測定される。簡単に説明すると、ＩＫＫ−βまたはＩＫＫ−αをアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０１％ｗ／ｖＢＳＡを含有）中で最終濃度５ｎＭまで希釈する。これを様々な濃度の化合物またはＤＭＳＯビヒクルに添加し、２５ｎＭのＧＳＴ−ＩκＢαおよび１μＭのＡＴＰのアッセイ緩衝液中溶液を添加して体積を３０ｕＬにすることにより、反応を開始する。３０分間周囲温度でインキュベートした後、５０ｍＭ  ｐＨ７．４のＥＤＴＡ（１５ｕＬ）を添加することにより反応を停止させる。ＬＡＮＣＥヨーロピウムキレート標識された特異的抗ホスホセリンモノクローナル抗体を最終濃度０．５ｎＭで（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによる細胞シグナル化技術）、およびアロフィコシアニン標識された抗ＧＳＴ抗体（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を最終濃度０．５ｎＭで添加して、最終体積６０μｌにすることによりリン酸化生成物の検出を行った。少なくとも３０分間周囲温度でさらにインキュベートした後、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ蛍光光度計でシグナルを読みとった。
【００３８】
ＩＫＫ−β阻害剤の一次滑膜繊維芽細胞メディエーター産生に対する影響を次のようにして評価した。ヒトＲＳＦの一次培養物を、前記のような関節リウマチの成人患者から得た滑膜の酵素消化により得た（Ｒｏｓｈａｋら、１９９６ｂ）。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有するアール（Ｅａｒｌ）の最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ２で細胞を培養した。さらに均一なＢ型繊維芽細胞集団を得るために４〜９継代で培養物を使用した。一部の実験については、繊維芽細胞を５×１０４細胞／ｍＬで１６ｍｍ（直径）２４穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に５×１０４細胞／ｍＬでプレートした。細胞（７０−８０％コンフルエンス）をＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に表示された時間暴露した。ＤＭＳＯビヒクル（１％）中薬剤を、ＩＬ−１の添加の１５分前に細胞培養物に添加した。異なるドナーから得た滑膜細胞を用いて実験を３〜４回行った。ＲＳＦ細胞抽出物を既に記載されているようにして処理された細胞から調製した。簡単に説明すると、ヒトＲＳＦをトリプシン／ＥＤＴＡにより除去し、洗浄し、遠心分離により収穫した。細胞抽出物を前記のようにして調製した（Ｄｉｇｎａｍら、１９８３；Ｏｓｂｏｒｎら、１９８９）。簡単にいうと、インキュベーション期間の最後に、細胞（１×１０７細胞）をＣａ２＋およびＭｇ２＋のないＰＢＳ中で２回洗浄した。得られる細胞ペレットを２０ｕＬの緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ）中に再懸濁させた。
【００３９】
ＩＫＫ−β阻害のヒト単球刺激エイコサノイドおよびサイトカイン産生に対する効果を次にようにして評価した。単球をヘパリン化全血から既に記載されているような二重勾配遠心法により単離した。単離された単球リッチなＰＢＭＣを次いで２４穴培養プレートに２×１０６細胞／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）中２時間接着させて、単球集団をさらに濃縮した。培地を次いで除去し、細胞をＲＰＭＩ１６４０で１回洗浄し、１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＢＳを穴に添加した。試験化合物を穴に添加し、最終ビヒクル濃度を０．０５％ＤＭＳＯにした。２００ｎｇ／ｍＬのエンドトキシン（ＬＰＳ；イー・コリ血清型０２６：Ｂ６）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．）の添加により単球を活性化し、２４時間インキュベートした。無細胞上清をＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−α（ＳＢでＥＩＡを展開）、ＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）ならびにＩＬ−８およびＩＬ−６（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）について分析した。細胞の生存可能性をトリパンブルー排除法により決定した。
【００４０】
ＩＫＫ−β阻害剤のホルボールエステルにより誘発された炎症に対する影響を次のようにして評価した。ホルボールエステル（ＰＭＡ）をＢａｌｂ／ｃマウスの外耳に経皮適用することにより誘発される炎症性応答は、多因子炎症性細胞浸潤および表皮の炎症性変化を調べるための有用なモデルであることが証明された。炎症病巣の強度は、好中球浸潤により支配され、これはミエロペルオキシダーゼ、好中球中に存在するアズール顆粒酵素の組織濃度の測定により容易に定量化できる。加えて、炎症性反応の全体的な強度は、耳の厚さの測定により測定することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６匹／群）に治療薬またはビヒクルを投与し、続いてＰＭＡ（４ｕｇ／耳）を投与した。マウスを４時間後に殺し、耳の熱さを測定し、ＮＦ−κＢの活性化をＩκＢαウェスタンまたはＥＭＳＡ分析によりモニターした。
【００４１】
ラットのカラギーナンにより誘発される足浮腫に対するＩＫＫ−β阻害剤の効果を次のようにして評価した：オスＬｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ−  Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を飼育し、食餌および水を自由に取らせ、各実験について２００−２７５ｇの間の体重であった。化合物またはビヒクル（０．５％トラガカント（経口）または１０％ＤＭＳＯ、５％ＤＭＡ、３０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（腹腔内））をカラギーナン注射の３０分〜１時間前に投与した。浮腫は、１％カラギーナンの無菌ｄＨ２Ｏ中溶液（０．０５ｍｌ／足）を右後足の足底表面に注射することにより誘発した。化合物またはビヒクルの投与前に足の太さを測定し、再び３時間測定して、足体積の変化を測定した。ラットをＣＯ２吸入により安楽死させ、右後足を除去し、直ちに液体窒素中で凍結させ、分析のために−８０℃で保存した。
【００４２】
ＩＫＫ−２阻害剤のマウスコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける効果を決定するために、処置群あたり１２匹のオスＤＢＡ／１マウス（２０〜２２グラム）を０日に、２００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲンを含有する合計体積１００ｕＬの完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）で免疫化した。２１日に、マウスを、２００ｕｇのウシＩＩ型コラーゲンを含有する１００ｕＬのリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で追加免疫した（１００ｕＬのコラーゲン／ＣＦＡまたはコラーゲン／ＰＢＳを尾に皮下注射した）。ビヒクル中ＩＫＫ−２阻害剤、またはビヒクル単独を１日から４０日まで、１日に２回、腹腔内投与した（症状は２５〜２８日に始まって、顕著である）。２つの追加の処置群は正の対照ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（Ｅｎｂｒｅｌ）（４ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、１日おき）、およびｅｔａｎｅｒｃｅｐｔビヒクル（ＰＢＳ）を含んでいた。マウスを５０日間ずっと臨床症状について毎日採点し（以下参照）、足の太さを測定した。実験期間中採点した処置群あたり１２匹のマウスに加えて、疾患中の数時点で、前記のように処置されたサテライトマウス（処置群あたり３〜５匹）を用いて足におけるサイトカイ／ケモカインレベルおよびｐ６５レベル、リンパ節を抜き取ることによりリンパ節抗原リコール反応を枯渇させることによりエクスビボ抗原リコール反応を測定した。
【００４３】
関節炎の誘発
パラフィン油中に懸濁させた０．７５ｍｇのマイコバクテリウム・ブチリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を６〜８週令のオスＬｅｗｉｓラット（１６０〜１８０ｇ）の尾の根元に１回注射することによりＡＩＡを誘発する。１６および／または２０日に後足体積を水置換法により測定する。試験化合物を適当なビヒクル中で均質化させ、適当な経路で投与する。対照動物にはビヒクル単独を投与した。２回投与プロトコル：アジュバント注射の日に開始される予防投与および炎症が確立して１０日に開始される治療投与を通常使用する。
臨床採点
各脚を次の基準に基づいて０〜４の範囲で採点した：
０＝炎症無し
１＝１本の足指が膨張
２＝数本の足指が膨張し、足が軽く膨張
３＝数本の足指が膨張し、足が中程度に膨張
４＝全部の足指が膨張し、足がひどく膨張
【００４４】
総論
それぞれＢｒｕｋｅｒ  ＡＭ２５０、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＲＸ３００またはＢｒｕｋｅｒ  ＡＣ４００分光光度計のいずれかを使用して、２５０、３００または４００ＭＨｚのいずれかで核磁気共鳴スペクトルを記録した。ＣＤＣｌ３は重水素化クロロホルムであり、ＤＭＳＯ−ｄ６は６重水素化ジメチルスルホキシドであり、ＣＤ３ＯＤは四重水素化メタノールである。化学シフトは内部標準のテトラメチルシランから１００万分の値でダウンフィールドの値（ｄ）で報告する。ＮＭＲデータの略語は次の通りである：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項、ｄｄ＝二重項の二重項、ｄｔ＝三重項の二重項、ａｐｐ＝みかけ、ｂｒ＝ブロード。Ｊはヘルツで測定されたＮＭＲカップリング定数を示す。連続波赤外吸収（ＩＲ）スペクトルはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ６８３赤外分光光度計で記録し、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルをＮｉｃｏｌｅｔ  Ｉｍｐａｃｔ４００Ｄ赤外分光光度計で記録した。ＩＲおよびＦＴＩＲスペクトルを透過方式で記録し、バンド位置を波数の逆数（ｃｍ−１）で報告する。質量スペクトルは、ＶＧ７０ＦＥ、ＰＥ  Ｓｙｘ  ＡＰＩ  ＩＩＩまたはＶＧ  ＺＡＢ  ＨＦ装置で、高速原子衝撃（ＦＡＢ）またはエレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化技術を用いて得られた。元素分析は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４０Ｃ元素分析器を用いて得られた。融点はＴｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖｅｒ融点装置を用いて測定し、校正しない。温度はすべて摂氏度で記録する。
【００４５】
薄層クロマトグラフィーにはＡｎａｌｔｅｃｈシリカゲルＧＦおよびＥ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０Ｆ−２５４薄層プレートを使用した。フラッシュおよび重力クロマトグラフィーはどちらもＥ．Ｍｅｒｃｋ  Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０（２３０〜４００メッシュ）シリカゲル上で行った。
表示されている場合は、材料をＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲから購入した。
【００４６】
実施例
以下の実施例において、温度は摂氏（℃）である。特に記載しない限り、全ての出発物質は商業的供給源から入手した。さらに工夫することなく、当業者らは前記載事項を用いて本発明の最大限活用することができると考えられる。この実施例は本発明を説明するためのものであって、その範囲を制限するものではない。請求の範囲には本発明者らに保留されるものを記載する。
【００４７】
実施例１
５−（４−フルオロ−フェニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−カルボン酸アミドの調製
ａ  （４−フルオロ−フェニル）−アセトアルデヒドの調製
４−フルオロフェニルエチルアルコール（１１０ｇ、１８４．８ミリモル）の乾燥ＤＭＳＯ（８００ｍＬ）中撹拌溶液に、トリエチルアミン（２２０ｍＬ、１５８９．２ミリモル）を滴下した。Ｎ２下撹拌しながら温度を１５℃に維持した。ピリジン三酸化硫黄（２５３ｇ、１５８９．２ミリモル）の乾燥ＤＭＳＯ（９００ｍＬ）中溶液を、温度を２５℃より低く維持しながら反応物に滴下した。得られた混合物を１５℃で１．５時間撹拌した。この後、混合物がｐＨ４．３になるまで１Ｎ  ＨＣｌ（水性）を注意深く添加した。反応混合物をＭＴＢＥで抽出し、有機層を乾燥させ、蒸発させて、４−フルオロフェニルアセトアルデヒド（１１０．８ｇ）を黄色油状物として抽出した。
【００４８】
ｂ  ２−アミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−３−カルボン酸アミドの調製
Ａ．Ｃ．Ｇｏｕｄｉｅ、米国特許第３，９６３，７５０号に記載されているのと同様の手順で、４−フルオロフェニルアセトアルデヒド（１１０．８ｇ）の乾燥ＤＭＦ（３５０ｍＬ）中溶液を２−シアノアセトアミド（６５．９ｇ、７８４．８ミリモル）および硫黄（２５．２ｇ、７８４．８ミリモル）で処理した。結果としての発熱を制御するために氷浴を使用して、トリエチルアミン（７９．４ｇ、７８４．８ミリモル）を反応に滴下した。反応物を室温で２２時間（一夜）撹拌した。反応混合物を次いで氷水中に注ぎ、酢酸エチルを添加した。形成されたエマルジョンおよび界面の不溶物質を濾過し、一夜乾燥して、黄色固体の２−アミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−３−カルボン酸アミドを得た（７７．４ｇ）。ＬＣ  ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｅ２３７。
【００４９】
ｃ  ５−（４−フルオロ−フェニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−カルボン酸アミド
温度を５℃より低く維持しながら、２−アミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−３−カルボン酸アミド（７７．４ｇ、３２７．５ミリモル）のジクロロメタン（１，３００ｍＬ）中懸濁液に、０℃でクロロスルホニルイソシアネート（４７．７ｇ、３３７ミリモル）を０．５時間かけて滴下した。混合物を０℃で１時間撹拌後、温度を室温まで上昇させた（ｈｐｌｃ分析は反応の完了を示した）。水（８００ｍＬ）を添加し（温度を２０℃より低く維持）、固体を濾過し、真空下、３０℃で乾燥させた。エタノールから再結晶して、６４．３ｇの５−（４−フルオロ−フェニル）−２−ウレイド−チオフェン−３−カルボン酸アミドを得た。ＬＣ  ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｅ２８０。
【００５０】
本明細書に記載する特許および特許出願を包含するが、これらに限定されない全ての刊行物を個々の開示がそれぞれ完全に開示されているように本発明の一部として参照する。  前記載事項は好ましい態様を包含する本発明を完全に開示する。本明細書に具体的に開示した態様の修正および改良は請求の範囲内に含まれる。さらに努力することなく、当業者らは前記載事項を用いて本発明を最大限に活用することができる。従って、本明細書の実施例は単に例示的であって、本発明の範囲を何ら制限するものではない。占有権または優先権が主張される本発明の態様は以下のように定義される。
【国際調査報告】
2006510676.tif 000005