(57)【要約】本発明は、肺気腫を画定するために、線形平均切片（ＬＭＩ）、表面積対体積比（Ｓ／Ｖ）、および平均枝長さパラメーターを用いた肺形態計測分析のためのコンピューターベースの方法に関する。
2006521854.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析する方法であって、前記方法は、
前記サンプルイメージに大きさにおいて対応する適用されたレチクルイメージを形成し、そして前記サンプルイメージの中で非実質組織に対応する領域を除外する工程、
前記サンプルイメージに前記適用されたレチクルイメージを重ね合わせる工程、
前記適用されたレチクルイメージのいずれの部分が気腔に当たるか、および前記適用されたレチクルイメージのいずれの部分が組織に当たるかに依存する１つ以上のパラメーターを決定する工程、および
前記１つ以上のパラメーターから前記肺サンプルについての表面積対体積比を示しているパラメーターを計算する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記適用されたレチクルイメージが、
実質組織以外の組織に対応している前記サンプルイメージの非実質組織の領域を識別する工程、
前記サンプルイメージに大きさが対応しているフルフレームレチクルイメージを形成する工程、および
前記適用されたレチクルイメージを形成するために、前記非実質組織の領域に対応している領域を前記フルフレームレチクルイメージから取り除く工程、
により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記識別工程が、
所定の大きさより大きい組織の領域について前記サンプルイメージを探索する工程、
所定の大きさより大きい前記組織の領域を非実質組織の領域として分類する工程、
を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記識別工程が、非実質組織の領域として領域を画定するユーザー入力を受け入れる工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記パラメーターが、
組織を横切る前記適用されたレチクルイメージのレチクルラインの数Ｉa、および
気腔の上のレチクルラインの終点の数Ｐa、
の内の１つ以上を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記表面積対体積比が（Ｉa＊２）／Ｐa＊ＬT）の式に比例し、前記式中、ＬTはレチクルラインの長さを表すものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法を実行するためのコンピューター制御用コンピュータープログラムを含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項８】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための装置であって、前記装置は、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法に従って、データ処理操作を実行することを可能とするデータ処理ロジックを含む、装置。
【請求項９】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための方法であって、前記方法は、
実質組織以外の組織に対応している前記サンプルイメージの非実質組織の領域を識別する工程、
組織によって囲まれた気腔の境界領域を実質組織に対応している前記サンプルイメージの領域の中で探索する工程、
前記境界領域について周長値および面積値を測定する工程、および
前記肺サンプルについての表面積対体積比を示すパラメーターを前記周長値および前記面積値から計算する工程、
を含む、方法。
【請求項１０】
前記識別工程が、
所定の大きさより大きい組織の領域について前記サンプルイメージを探索する工程、
所定の大きさより大きい組織の前記領域を非実質組織の領域として分類する工程、
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記識別工程が、非実質組織の領域として領域を画定するユーザー入力を受け入れる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
所定の閾値より小さい面積を有する境界領域を前記計算工程から除外する、請求項９、１０および１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
周長値が、前記計算の基礎とする前記境界領域に対する全体の周長値ＰTであり、前記面積値が、前記計算の基礎とする前記境界領域に対する全体の面積値ＡTである、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面積対体積比が（４＊ＰT）／（π＊ＡT）の式に比例する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法を実行するためのコンピューター制御用コンピュータープログラムを含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１６】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための装置であって、前記装置は、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法に従って、データ処理操作を実行することを可能とするデータ処理ロジックを含む、装置。
【請求項１７】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための方法であって、前記方法は、
大きさで前記サンプルイメージに対応しており、前記サンプルイメージの中で非実質組織に対応する領域を除外する、複数の実質上平行な適用されたラインイメージを形成する工程、
前記サンプルイメージに前記適用されたラインイメージを重ね合わせる工程、
横断線分を形成するために、前記適用されたラインイメージのラインが前記サンプルイメージの中の組織をどこで横断するかを決定する工程、および
前記横断線分の平均長さを示すパラメーターを計算する工程、
を含む、方法。
【請求項１８】
異なった方向に走るラインのさらなる適用されたラインイメージに対して、前記の形成工程、重ねあわせ工程、決定工程および計算工程を繰り返すことをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記異なった方向が実質上直角である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記横断線分の長さの分布を示しているパラメーターを計算することをさらに含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記適用されたラインイメージが、
実質組織以外の組織に対応している前記サンプルイメージの非実質組織の領域を識別する工程、
大きさが前記サンプルイメージに対応しているフルフレームのラインイメージを形成する工程、および
前記適用されたラインイメージが形成されるように、前記フルフレームラインイメージから前記非実質組織の領域に対応している領域を除外する工程、
により形成される、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記識別工程が、
所定の大きさより大きい組織の領域について前記サンプルイメージを探索する工程、
所定の大きさより大きい組織の前記領域を非実質組織の領域として分類する工程、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記識別工程が、非実質組織の領域として領域を画定するユーザー入力を受け入れる工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法を実行するためのコンピューター制御用コンピュータープログラムを含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための装置であって、前記装置は、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法に従って、データ処理操作を実行することを可能とするデータ処理ロジックを含む、装置。
【請求項２６】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための方法であって、前記方法は、
実質組織以外の組織に対応している前記サンプルイメージの非実質組織の領域を識別する工程、
前記肺サンプルの組織の枝の終点に対応している節点を実質組織に対応している前記サンプルイメージの領域の中で探索する工程、
前記肺サンプルの組織の枝の終点における節点間の直線距離を示すパラメーターを計算する工程、および
前記肺サンプルの組織の枝の終点における節点間の前記枝に沿って測定された距離を示すパラメーターを計算する工程、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記識別工程が、
所定の大きさより大きい組織の領域について前記サンプルイメージを探索する工程、
所定の大きさより大きい組織の前記領域を非実質組織の領域として分類する工程、
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記識別工程が、非実質組織の領域として領域を画定するユーザー入力を受け入れる工程を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルイメージの中の組織の領域が前記探索工程の前に薄くされる、請求項２６、２７および２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記探索工程が前記サンプルイメージにコンボリューションを適用することを含む、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
組織の接続していない枝を残すために、前記節点が前記サンプルイメージから除去される、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法を実行するためのコンピューター制御用コンピュータープログラムを含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項３３】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための装置であって、前記装置は、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法に従って、データ処理操作を実行することを可能とするデータ処理ロジックを含む、装置。
【請求項３４】
肺サンプルを表しているサンプルイメージを分析するための方法であって、前記方法は、
線形平均切片（ＬＭＩ）、表面積対体積（Ｓ／Ｖ）比、および平均枝長さの内の２つ以上が計算可能となるように、請求項１、９、１７および２６に記載の方法の内の２つ以上に従ってサンプルイメージを分析する工程、および
前記方法の結果を組み合わせる工程、
を含む方法。
【請求項３５】
添付の表および図を参照として、実質上、本明細書で記載される方法。
【請求項３６】
添付の表を参照として、実質上、本明細書で記載されるコンピュータープログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織形態の自動分析のための方法に関する。特に、本発明の方法は、例えば、肺気腫の検出のための肺組織のコンピューターベースの分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいて、肺の表面積は約１３０ｍ2であり、そしてそれは胸腔の限られた空間（約５〜６リットル）の中に詰め込まれている。内部の肺表面は、その臓器が非常に効率的にガス交換できるように高度に折り込まれた膜であり、約３００，０００，０００個の肺胞の全てが外部の空気に開放されている（１）。機能と肺構造のこの関係は非常に保護されており、呼吸器の機能の変化が、しばしば肺構造に反映される。このため、肺形態計測は、肺疾患および肺機能不全の研究において広く使われた。疾患の例としては、気管支肺異形成症（２）、肺線維症（３）そして肺気腫（４）が挙げられる。
【０００３】
肺気腫は、終末細気管支に対して末梢側の気腔の異常および恒久的な拡大で、明確な線維症なしにその壁の破壊を伴うものとして定義される（５）。気腫性の肺からの薄いスライスの実験は、この定義を反映する（図１）。そして、このようなスライスから観察された気腫の重篤度は、肺胞壁間の平均距離（Ｌｍ）を計算することによって、一般に評価されてきた（６、７）。Ｌｍ値の増加は、言い換えれば、より重度な気腫の特徴である気腔の増大を反映する（８）。
【０００４】
組織の薄いスライスは二次元であるが、サンプルとする微細構造は三次元である。立体化技法は、二次元のスライスでなされた測定から作りだされたこれらの構造の三次元幾何学特性についての推論を可能にする。肺構造形態測定のための種々の立体化技法は、カバリエリ法による体積試算（９）、およびレチクルを使った表面積対体積比の試算（１０）を含んで記述されている。肺胞の数および体積のような構造特定の測定もまた記述されている（１１）。ヒトの気腫はまた検死後の肺の薄片において立体化技法を使って調べられた（１２）。
【０００５】
評価のために可能性のある治療薬に機会を与えた、気腫についての種々の動物モデルが存在する（１３）。そして、形態学技法がこれらのモデルの有効性を扱うために使用された。エラスターゼ（１４）またはパパイン（１５）のようなプロテアーゼに肺をさらすことは、気腫を誘発するための一般的な方法である。タバコにさらされることがヒトに気腫をもたらすことは知られており（１６）、そのため動物モデルでテストされてきた。マウスモデルおよびラットモデルの両方において、気腫性傷害がタバコ煙に対応して観察された（１７、１８）。最近の研究は、マウスでの効果がラットより速く起こり、そして気腫はマウスでは進行性であり得ることを示唆している（１９）。興味深いことに、気腫性傷害形成の発生のための１以上のメカニズムが存在することを指示するラットでのエラスターゼ誘発気腫をタバコ煙が増大させることが示された（２０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
立体化法およびＬｍ測定は、本来は集約的で時間を消費する作業であり、しばしば１切片毎に最高４５分まで時間がかかる（２１）。研究で定期的に使われるために、形態計測技法は、１切片毎に４５分よりずっと速く行えて、そして効率的でなければならないであろう。したがって、改善された形態計測技法のための当分野で要求される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
肺の形態計測での最近の進歩は、コンピューターを使うイメージ分析の応用である（２２、２３）。我々は、自動化可能な改善された形態計測分析を提供するために、多数のパラメーターを使った迅速なコンピューターベースの方法を現在開発したところである。
【０００８】
したがって、本発明に従えば、肺のサンプルを表しているサンプルイメージを分析する方法が提供される。当該方法は、
当該サンプルイメージに大きさが対応する適用されたレチクルイメージを形成する工程および当該サンプルイメージの中で非実質組織に対応する領域を除外する工程、
適用されたレチクルイメージを当該サンプルイメージに重ね合わせる工程、
適用されたレチクルイメージの気腔にかかる部分、および適用されたレチクルイメージの組織の上にかかる部分がどの部分かに依存する１つ以上のパラメーターを決定する工程、および
その１つ以上のパラメーターから肺の当該サンプルについての表面積対体積比を示しているパラメーターを計算する工程、を含む。
【０００９】
「サンプルイメージ」は、イメージアナライザーによって得られ、本明細書で記述される形態計測分析を実行するために使われる肺組織のイメージである。サンプルイメージは、肺全体または肺の一部であってもよい。一般的に、それは、そのときの肺の一部である。サンプルイメージは、都合がいいのは、様々な肺の部分からとられた２つ以上の肺組織のイメージで構成される複合イメージである。
【００１０】
「肺サンプル」は、サンプルイメージを得るために使われる肺の部分である。それは肺切片、組織見本または生検、または肺全体であり得る。そして、インビトロまたはインビボでイメージとすることができる。
【００１１】
「レチクル」は、イメージ領域を複数の区分に分けるグリッド、メッシュまたは他の手段である。そして、それは形において規則的または不規則であり得る。レチクルは、イメージを一連の規則的なサブセクション、例えば正方形に分けるのが都合がよい。
【００１２】
「気腔」は、肺胞内部における空間または肺の中の空気によって満たされた他の空間を意味する。組織区分において、その区分自体に分析されたのと同じくらい空気が存在しているかどうかにかかわらず、空気がインビボで存在するであろう組織の間のすき間をいう。
【００１３】
好都合な実施形態では、適用されるレチクルイメージは、
実質組織以外の組織に対応している当該サンプルイメージの非実質組織の領域を識別する工程、
当該サンプルイメージに大きさが対応しているフルフレームのレチクルイメージを形成する工程、および
当該フルフレームレチクルイメージから当該非実質組織の領域に対応している領域を取り除いて、適用されたレチクルイメージを形成する工程、により形成される。
【００１４】
好ましくは、上記の識別工程は、
所定の大きさより大きい組織領域に対するサンプルイメージを探索する工程、
所定の大きさより大きい当該組織領域を非実質組織領域として分類する工程、を含む。
【００１５】
ユーザーによる入力もまた、識別手順を改善するために利用することができる。
【００１６】
好ましくは、本発明の方法で測定されたパラメーターは、
組織を横切る当該適用されたレチクルイメージのレチクルラインの数Ｉa、
および
気腔上のレチクルラインの末端の数Ｐa、の内の１つ以上を含む。
【００１７】
このことは、表面積対体積比が以下の式に比例しているとして計算できることを意味する。
（Ｉa＊２）／Ｐa＊ＬT）
式中、ＬTは、レチクルラインの長さを表す。
【００１８】
第二の態様では、本発明は、肺サンプルを表すサンプルイメージを分析する方法を提供する。当該方法は、
実質組織以外の組織に対応している当該サンプルイメージの非実質組織領域を識別する工程、
実質組織に対応している当該サンプルイメージの領域の中で、組織によって囲まれた気腔の境界領域を探索する工程、
当該境界領域について周長値および面積値を測る工程、および
当該周長値および当該面積値から当該肺サンプルについての表面積対体積比を示しているパラメーターを計算する工程、を含む。
【００１９】
本発明の前述の態様で説明したように、実質組織を識別することができる。好ましくは、所定の閾値より小さい面積を有する境界領域は、計算段階から除外される。
【００２０】
本発明の第二の態様によれば、周長値は、当該計算が基づく当該境界領域についての全周長値ＰTであり得る。そして、当該面積値は、当該計算が基づく当該境界領域についての全面積値ＡTであり得る。したがって、表面積対体積比は、以下の式に比例しているとして計算することができる。
（４＊ＰT）／（π＊ＡT）
【００２１】
第三の態様では、本発明は、肺サンプルを表すサンプルイメージを分析する方法を提供する。当該方法は、
【００２２】
当該サンプルイメージに大きさが対応する、実質上は複数の平行線である適用されたラインイメージを形成する段階およびサンプルイメージの中で非実質組織に対応する領域を省く工程、
当該サンプルイメージの上に当該適用されたラインイメージを重ねる工程、
横切る線分を形成するために、当該適用されたラインイメージのどのラインが当該サンプルイメージの中の組織を横切っているかを決定する工程、および
当該横切る線分の平均長さを示しているパラメーターを計算する工程を含む。
【００２３】
上記の形成工程、イメージを重ねる工程、決定工程および計算工程は、異なる方向に引かれた線の１つ以上のさらなる適用されたラインイメージに対して繰り返すことができる。例えば、異なる方向は、実質上の直角方向であり得る。
【００２４】
本方法は、当該横切る線分の長さの分布を示すパラメーターを計算する工程をさらに含むことが都合がよい。
【００２５】
好ましくは、上記の適用されたラインイメージは、
実質組織以外の組織に対応しているサンプルイメージの非実質組織領域を識別する工程、
当該サンプルイメージにサイズが対応しているフルフレームのラインイメージを形成する工程、
当該適用されたラインイメージを形成するために、当該フルフレームラインイメージから当該非実質組織に対応している領域を除外する工程
により形成される。
【００２６】
上記で説明したように、実質組織と非実質組織は識別することができる。
【００２７】
本発明の第四の態様では、肺サンプルを表すサンプルイメージを分析する方法が提供される。当該方法は、
実質組織以外の組織に対応しているサンプルイメージの非実質組織領域を識別する工程、
当該実質組織に対応している当該サンプルイメージの領域の中で、当該肺サンプルの組織における枝の末端に対応する節点を探索する工程、
当該肺サンプルの組織における枝の終点における節点の間の直線距離を示しているパラメーターを計算する工程、および
当該肺サンプルの組織における枝の末端における節の間の当該枝に沿って測定された距離を示しているパラメーターを計算する工程、を含む。
【００２８】
上記のように、実質組織と非実質組織は識別することができる。好ましくは、当該サンプルイメージの中の組織の領域は、探索工程の前に薄くされる。
【００２９】
探索工程では、コンボリューションを当該サンプルイメージに適用することを含むことが好都合である。
【００３０】
好ましくは、組織の接続していない枝を残すために、節点は当該サンプルイメージから取り除かれる。
【００３１】
第五の態様に従えば、本発明は、肺サンプルを表すサンプルイメージを分析する方法を提供する。当該方法は
線形平均切片（Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｅａｎ  Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ、ＬＭＩ）、表面積対体積（Ｓ／Ｖ）比、平均枝長さのいずれか２つ以上が計算できるように、上記の本発明の４つの態様のいずれかで説明された方法に従って、当該肺サンプルを分析する工程、および
肺気腫の測定を実現する当該方法の結果を組み合わせる工程を含む。
【００３２】
本発明の第五の態様の方法は、上記の本発明の４つの態様の全てを組み合わせることが有利に働く。
【００３３】
さらに、本発明は、肺サンプルを表すサンプルイメージを分析するための装置であって、本発明の前記の態様に記載された方法に従ってデータ処理操作を行うことが可能なデータ処理ロジックを含む装置だけでなく、本発明の前記の態様に記載された方法を実行するコンピューターを制御するためのコンピュータープログラムを含むコンピュータープログラム製品を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
１．一般的技法
他に定義されなければ、本明細書で使われた全ての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学）により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。標準的な技法が、分子の方法、遺伝子の方法、そして生化学的方法（一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）４ｔｈ  Ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと。これらは、本明細書において参照として組み込まれる。）および化学的方法のために使われる。さらに、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．は、標準的な免疫学技法のために参照される。
【００３５】
２．材料および方法
２．１  動物および気道内注入
ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）（０．５ｍｌ中に６００単位）、または等量体積の生理食塩水（コントロールとして作用）を麻酔のかかった成獣（２５０〜３００ｇ）オスＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの気管にＰｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙマイクロスプレイヤーを使って経口により注入した。そのラットを苦痛の徴候について２４時間モニターした。そして、約２５％をエラスターゼとの反応による重篤性のために犠牲にしなければならなかった。残った動物は、気腫の評価のために２８日後に殺された。
【００３６】
２．２  固定、組織サンプリング、および組織調製
そのラットをナトリウムペントバルビタールの過量投与で殺した（〜０．５ｍｌの０．８Ｍ溶液、腹腔内）。気管、および２０ｃｍＨ2Ｏの肺圧差においてリン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）で膨らんだ肺の挿管の後に、横隔膜を破裂させた。気管を結紮し、肺を胸部から取り除き、そして４℃において４８時間ＰＢＦの中で貯蔵した。左および右の肺を切り離した。そして〜７ｍｍ厚の縦の切片を左の肺葉の中央から切り取った。これをエタノール勾配によって脱水し、そしてＴｉｓｓｕｅＴｅｋプロセッサーを使ってパラフィンワックスの中に埋め込んだ。そのブロックを表面仕上げした後に、４μｍの切片を切り出し、スライドの上に載せた。ワックスをキシレンで除去し、そしてその組織をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００３７】
２．３  技法装置
１０倍の対物レンズを付けたＬｅｉｃａ  ＤＭＲ顕微鏡を肺スライドを見るために使った。イメージを取り込むことができるように、ＪＶＣ３−ＣＣＤカラービデオカメラ（ＲＧＢ−ＰＡＬ）を顕微鏡に装着した。先の電動ステージは、ｘ軸およびｙ軸における視野のナビゲーションをコンピューターによって制御することを可能にした。イメージ取り込みおよび分析は、マイクロソフトＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ４搭載のコンパックＤｅｓｋｐｒｏ  ＥＮシリーズＰＣ（２５６ＭＢのＲＡＭ、６００ＭＨｚのインテルペンティアム（登録商標）ＩＩＩプロセッサー）上でカール−ツァイスＫＳ４００イメージ分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｔｈａｍｅ、英国）によって実行した。
【００３８】
ＫＳ４００ソフトウェアは、ユーザー定義のマクロを書き込むことおよび実行することを可能にするコマンドラインインタプリターを含む。この文で言及されたマクロを添付書類において提示する。
【００３９】
２．４  イメージ取り込み
成獣ラット由来の縦の肺全葉のスライスは、一般的に標準的な顕微鏡スライドの広い領域をカバーする。肺がＰＰＥに晒されて拡大している場合に、特にそうである。肺葉のイメージを「Ｍｏｓｄｅｆｉｎｅ」マクロを使って取り込む（図２）。視野をこれらのポジションに移動することで、走査される領域の４つのコーナー（肺全葉スライス）を画定する。そして、座標を自動的に記録する。コンピューター制御の下で、カメラは、現在の視野のイメージを捉える。それから、次の視野が前の視野に隣接するように、ステージはスライドを動かす。肺葉全体が捉えられるまで、このプロセスはラスター法で続けられる。一般的に、１枚の成獣ラット肺葉スライスについて、１５０〜３００のイメージが捉えられる。カラーイメージというよりグレーイメージが、ハードディスクスペースに保存するためにセーブされる。肺組織は、気腔と比較して黒いように見える（図３）。１０倍対物レンズを使った最終的なスクリーン上の倍率は、約３００倍である。
【００４０】
２．５  ３×３イメージ選択
肺葉のスライスが大きいために、単一の視野が、全体領域の小さい部分を表して、肺葉全体を表していないことがあり得る。この理由から、９つの視野を３×３のフォーメーションで後につなぎ合わせ、分析のための肺葉のより大きい領域を提供する（図４）。それぞれの肺葉について、別のマクロ「３×３ｓｅｌ」を実行することにより、６つの３×３イメージがランダムに選択された。マクロ「３×３ｓｅｌ」は、ランダムにモザイク参照イメージの上の３×３領域にハイライトをかける（図５）。その領域が少なくとも４０％の肺組織をカバーする限り、ユーザーはその領域を受け入れる。作られるべきおよび分析されるべき３×３イメージのアイデンティティーを記録するデータベースが作り出される。
【００４１】
２．６  イメージ処理
「ＲａｔＸ１０ｐｒｏｃ」マクロを実行することによって、３×３作成、分割、非実質組織構成要素の同定およびイメージ保存が１つのプロセスで達成される。しかしながら、このプロセスは、明快にするために以下の個別の構成要素に分解された。
【００４２】
２．６．１  ３×３作成およびイメージセグメンテーション
いずれかの所与の３×３のために、システムは、どの９つのイメージが必要であるか算定し、それらをメモリに入れて、次に９つの個別のイメージから３×３イメージを作る（図４）。イメージが分析され得る前にイメージは２進法のフォーマットとしなければならない。そしてイメージを２進法のイメージに変換するプロセスを記述するために使われた用語がセグメンテーションである。このセグメンテーションは、閾値化するグレーのレベルによって達成される。使われた動的識別機能は、局所のグレーの閾値を設定する。これは、周囲の領域より明るいオブジェクトを探すシステムを可能にする。我々の３×３グレーイメージでこれを達成するために、イメージは最初に変換される（図６）。このセグメンテーション手順は、ユーザー入力を必要としない。よって、同じ機能が全ての３×３イメージに適用される。いくつかのイメージ上に、ノイズがセグメンテーションの間に生成される。そのため、２００ピクセル未満の領域を有するオブジェクトを取り去って、納得のいく２進法イメージとする２進法スクラップ機能を適用する（図７）。
【００４３】
２．６．２  非実質組織の構成要素の同定
肺組織は、肺胞、肺胞管、血管、気道、細気管支および気道管のような多くの要素で構成されている。血管および誘導気管支のような非実質組織の構成要素は、肺の中でランダムに分布していない（２４）。従って、分析に影響を与える可能性を有する。（さらに、大きい気道は、分析的な観点から大きい気腫性領域と区別できないであろう。）これらの理由から、非実質組織の構成要素は分析から除かれる。このプロセスは、２つの段階で達成される。手動工程、次に自動化工程である。
【００４４】
血管および固形組織の他の大きい領域（図７における白の大きい領域）は、それらが占拠する領域の大きさにより自動的に識別することができる。次いで、これらの領域は、オーバーレイを使って緑色で３×３の最上層に投影される（図８）。この自動段階は、組織ベースの構成要素を識別する。しかし、大きい気道は大きい気腔と区別できないので、大きい気道を識別するためには使うことができない。そのため、自動化工程によってピックアップされない他の非実質組織の構成要素は、ユーザーによってデジタルペンを使って手作業で識別される（図９）。分析から除かれる特徴部分は、新しいイメージ（「ｂ」イメージとされる）として保存され、これは緑で前述した識別された構成要素から作られる（図１０）。分析のために選ばれた各３×３から、次の２つのイメージがセーブされる。２進法の形式でオリジナルの肺の構造を含む「ａ」イメージ（図７）、および非実質組織の構成要素を含む「ｂ」イメージ。この方法は、生データ（オリジナルのイメージ）の保存を可能にするが、実質組織を分析可能とするだけである。
【００４５】
この手順は、６つの各３×３イメージについて完遂される。（下に詳述された）分析プロセスは完全に自動化されるので、他のスライドについての３×３イメージ作成プロセスを実行し、分析されたイメージの「バンク」を作り上げることが好ましい。それから、当該分析は、例えば一晩中行なうことができる。
【００４６】
２．７  形態計測分析
我々は、我々自身の新規な方法を実行することに沿って、我々の分析手順に肺形態計測の既存の方法を適応させてきた。我々が調べる４つのパラメーター（レチクルベースのＳ／Ｖ比、周長／面積測定ベースのＳ／Ｖ比、線形平均切片および節点解析）は、マクロ「ｃｍａｌ」によって連続的に分析される。そして、得られたデータは、各スライドに対して自動的に１つのスプレッドシートに保存される。各パラメーターについての記述が下に提供される。
【００４７】
２．７．１  レチクルを使った表面積対体積比
表面積対体積比は、Ｗｅｉｂｅｌレチクルを使ってなされた点計数測定（ｐｏｉｎｔ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）から計算される（図１１）。レチクルは、通常、顕微鏡のアイピースを通して使われるか、または肺切片の顕微鏡写真へ投影される。気腔と組織との間の交差点の数を記録することによって、グリッドテストライン（プローブ）は表面領域を表示する。これらのラインの終点は、体積に対する参照として役に立つ。体積対表面積比（２５）の逆の式を使って、我々は、我々のコンピューター化システムにこの方法論を適合させた。我々は、多数のテストライン／イメージを得るために、我々の３×３イメージの全部にレチクルを重ねることに決めた。Ｗｅｉｂｅｌレチクルは、その終点が規則的な正三角形のグリッドで配置され、結果として菱形グリッド単位となる短いテストライン（長さｄ）で構成されている（図１２）。イメージ上にこのグリッドを構築するために、それぞれのラインの寸法を定義する必要があった。イメージの間の最小の単位は写真要素（ピクセル）である。そして、２分の１のピクセルはスクリーンの上に描くことができないので、ピクセルは整数でなければならない。そのために、ラインの長さｄおよびｄ／２・√３から得られる値（ｙ軸でのライン間の距離、文中でｍとされる）の両方が整数である必要がある。我々は、ｄに対する値として経験的に１５および３０を決定した。それらの値は、ｍに対してそれぞれ１３（１２．９９）および２６（２５．９８）の値を与えた。マクロは、ブランク３×３イメージの左手コーナーのトップにおいてｘ軸でのｄピクセルの長さの線を描き、さらにｄピクセルに沿って動いて、そしてもう１つの線を描く。ｙ位が増加してｍピクセル下がり、そしてスタートのｘ位が０＋ｄ／２になる場合、イメージの右端に達するまで、これは繰り返される。次いで、イメージの右端に達するまで、線は前と同じように描かれる。ｙ位は再び増加してｍピクセル下がり、そしてｘ位はゼロにリセットされる。このプロセス全体の反復の後に、得られたイメージはその時点でＷｅｉｂｅｌレチクルを含む。そして、それは３×３の全部の領域をカバーする。１５ピクセルおよび３０ピクセルの長さの線の両方が使われる。それは、両方が肺胞のような興味ある特徴（×３００倍率において）に対して適当な長さを有するからである。次いで、上記の方法はラインの終わりを表している点を描くために繰り返される。（例えば、ｄ＝１５に対しては、１ピクセルを描く、１３ブランク、１ピクセルを描く、１５ブランク、１ピクセルを描く、１３ブランクなど。）
【００４８】
これらのラインのイメージおよびラインの終点が描かれた途端、それらは以前に特定の３×３のためにセーブされた「ｂ」イメージと統合される。ただ非実質組織の構成要素に触れなかったラインのライン／終点だけが残される（図１３）。これは、「ａ」イメージと重ねられる場合、実質組織だけをカバーするグリッドを残す。これが完了された途端、実質組織をカバーしているラインの数はコンピューターによって自動的に数えられる。このグリッドは「ａ」イメージ（肺、２進法）と統合され、それから組織を横切らない（気腔の位置にある）ラインだけが残される（図１４）。それから残されたラインの数が数えられる。さらに、このプロセスは、ラインの終点について実行される（図１５）。これにより、以下の４つの値が得られる結果となる。実質組織上のライン全体の数（ＩT）、実質組織を横切らないラインの数（Ｉs）、実質組織の上のラインの全体の終点の数（ＰT）、および実質組織の気腔上のラインの終点の数（Ｐa）。
【００４９】
Ｓ／Ｖ比を計算するための式は、以下である。
Ｉa×２／Ｐa×ＬT（２５）
式中、Ｉaは組織を横切るラインの数であり（ＩT−ＩS）、ＬTはグリッド（ｄ）上の個々のラインの長さである。ｃｍ-1でＳ／Ｖ比を得るために、ＬTはピクセルからｃｍに変換される。
【００５０】
２．７．２  周長／面積測定からの表面積対体積比
使ったイメージ分析ソフトウェアの高い能力のために、Ｓ／Ｖ比は、周長および面積測定によってイメージから直接決定することができる。Ｗｅｉｂｅｌによれば、Ｓ／Ｖ比は周長を面積で割ったものの関数である（２５）。周長および面積測定は、それぞれの個別の領域が写実的なディスプレイ（図１６）の上に異なった色で示されるという状態で、自動的に実行される。各面積について周長もまた測定される。そしてこれは、データリストがそれぞれの領域について面積と周長測定を含むという結果になる。「ｂ」イメージは、非実質組織の構成要素が前と同じように測定されるのを防ぐために使われる。ノイズがデータを妨害するのを防ぐために、１００ピクセル未満の面積を有する領域は測定しない。Ｓ／Ｖ比を得るために、次の式が使われる：４×全体周長／π×全体面積。
【００５１】
この方法が有する唯一の欠点は、エッジ効果の影響であろう。領域が完全に観察されないので、イメージのエッジに触れている領域は未知の周長および面積を有する。この筋書きでは、公平なカウンティングフレーム（２６）が実行される。それによってイメージの上端と左に接している領域が数えられ、そしてイメージの下端と右に接している領域が除外される。しかしながら、エラスターゼによって起こされた傷害のために、多くのイメージで、しばしば領域が大きくて、そして除外が、除外されるイメージの大部分という結果になるであろう（図１６）。この理由のために、このアプローチは採用されず、それで全ての領域が含まれた。３×３イメージが大きいために、エッジ効果は分析に最小の効果しか与えなかった。
【００５２】
２．７．３  線形平均切片（ＬＭＩ）
ＬＭＩパラメーターは、気腫性肺組織の分析で使用された最も一般に使われた形態計測パラメーター（Ｌｍ）に類似している。Ｌｍの基礎は、ランダムに肺の切片に重なった既知の長さＬのラインが肺胞間の隔膜をｍ回横切るということである（図１７）。これが多くの回数（Ｎ）で実行されるなら、Ｌｍ＝Ｎ×Ｌ／ｍは、切片の平均の長さを与えている（６）。しかしながら、この方法は切片の長さの分布に関する情報を提供せず、そして肺胞壁の厚さを考慮に入れない。従って、我々はＬｍの原則を使うが、改善された感度を有するさらに完全なデータを提供する方法を考案した。Ｗｅｉｂｅｌレチクルアプローチに関して、ＬＭＩのためのラインを３×３全体に重ね合わせた。最初にｘ方向に１０ピクセル離して、それから「ｂ」イメージと統合した平行線が、ラインがただ実質組織をカバーするだけである状態にしておく（図１８）。それからこの実質組織グリッドは肺３×３（「ａ」イメージ）と統合され、多くの切片（図１９）を含むイメージを生じさせる。１０ピクセルより長い各個別の切片が測定される。そして対応する値は自動的にデータリストに入った。それからグリッドはｙ軸で描かれて、「ｂ」イメージおよび「ａ」イメージと統合し、そして測定を繰り返した。このプロセスは、多くのラインを含むＬＭＩグリッドによって肺イメージが分析されるという結果になる（図２０）。データリストは、一般的に数千の値を含む。この手順は他の３×３のために繰り返される。そしてＬＭＩは測定された全ての値の平均として計算される。そのデータはまた、切片の長さの分布を調べることを可能にする。
【００５３】
２．７．４  節点解析
（上記の方法のいずれかによって決定された）Ｓ／Ｖ比が組織アーキテクチャおよび気腔拡大の変化により影響を受ける。ＬＭＩ測定は気腔測定にのみ由来する。前記の分析パラメーター、節点解析が肺の組織構成要素を調べる。２進法の肺構造イメージ（「ａ」イメージ）は、「ｂ」イメージと最初に統合されて、ただ肺実質だけを残す。それから肺構造は１ピクセルの厚さのラインにまで薄くされるが、肺スケルトン構造を維持して、そしてアーチフェクトを取り去るためにスムージングにされる（図２１）。コンボリューションフィルターを使って、分岐しているポイントが検出されて、次にイメージ上の肺構造の個別の枝だけを残して削除される（図２２）。枝の２つの終点の間の直線距離（節点から節点への距離）および（枝の任意の湾曲を考慮に入れている）実際の枝の長さが測定される。
【００５４】
２．８  統計データ分析
２つのグループ（正常な肺および気腫性肺）の比較が、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン３．０）ソフトウェアを使う、ノンパラメトリック両側（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙグループテストを用いてなされた。引用された手段は、±サンプル標準偏差である。パラメーターの間のノンパラメトリック両側スピアマン順位相関もまた、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使って算定された。
【００５５】
３．結果
各肺葉に対して１つのスライスを分析された３５個の肺葉の合計により調べた（ｎ＝１６生理食塩水、ｎ＝１９  ＰＰＥ）。ＰＰＥの効果は、組織切片上で容易に観察することができる（図２３）。気腔拡大は非常に顕著であって、そして肺胞壁の破壊および薄化を伴っている。これらの観察は、以前に報告されている（１４）。生理食塩水で処理されたのと比較して、ＰＰＥで扱われた肺切片の中の炎症細胞の数の増加については徴候がなかった。
【００５６】
３．１  イメージ分析手順
各肺葉を捉えることには、肺葉の大きさに依存して平均して５〜１０分間を要した。３×３イメージ選択、作成および非実質組織構成要素イメージ作成が各肺葉（６つの３×３）に対して約２０分を必要とした。完全な研究のための３×３を作成し、そしてスライドを受けて２週間以内は保管した。自動化分析は非常に速いことが判明した。それぞれの３×３を分析し、そして４分未満で記録したデータを得た。約１５時間で、研究全体のデータを記録してページ順にそろえた。比較のために、切片から一つのパラメーターの測定のためにとられた時間は４５分であるとして文献で引用されている（２１）。分析された全てのパラメーターは、生理食塩水注入の２８日後に殺したラットとＰＰＥ注入の２８日後に殺した年齢が同じラットとの間に顕著な相違を示した（表１）。
【００５７】
３．２  表面積対体積比
Ｗｅｉｂｅｌレチクル（１５もしくは３０ピクセル長のライン）または周長／面積方法論（図２４）のいずれかを用いた場合、ＰＰＥの注入は、表面積対体積比を顕著に（Ｐ＜０．００１）減少させた。１５ピクセルラインを有するＷｅｉｂｅｌレチクルにより、生理食塩水で処理されたラットでの４０６ｃｍ-1±３３とは対照をなして、ＰＰＥによって処理された２２９ｃｍ-1±２４のラットにおいて平均Ｓ／Ｖ比を得た。３０ピクセルラインを使った場合、ＰＰＥそして生理食塩水に対する値は、それぞれ１５６ｃｍ-1±１６および２６４ｃｍ-1±１９であった。同じグループからの値は、Ｓ／Ｖ比計算の一部であるこの長さに起因してＷｅｉｂｅｌレチクルラインの大きさで異なる（方法参照）。エッジ効果の影響が起こり得るにもかかわらず、周長／面積測定によって決定されたＳ／Ｖ比もまた、２つのグループ間で際立って異なっていた。エラスターゼ処理の結果として、Ｓ／Ｖ比は、生理食塩水処理の１５１７ｃｍ-1±１４１と比較して７９８ｃｍ-1±９６であった。
【００５８】
３．３  線形平均切片（ＬＭＩ）
ＰＰＥの注入は、生理食塩水処理と比較して顕著な増加（ｐ＜０．００１）を平均ＬＭＩにもたらし（図２５）、２つのグループの間に４０μｍの差を生じさせる（表１）。切片長さの分布はプロットされ（図２６）、そしてこれはＰＰＥ注入による気腔の大きさの顕著な変化を説明している。小さい気腔の数の劇的な減少および大きい気腔の増加が起こり、小さい気腔に対する大きい気腔の比の変化を生じさせる。ＰＰＥに晒した肺はまた、生理食塩水で処理された肺に存在していなかった非常に大きい気腔（長さが３５０μｍを超える切片）を有していた。
【００５９】
３．４  節点解析
平均枝長さおよび節点の間の平均距離は、ＰＰＥの注入後に際立って増加した（図２７）。イメージの目視検分では、ＰＰＥ処理された肺において、肺胞のサイズが増加し、そのため、生理食塩水で処理された肺と比較してより長い枝の長さがもたらされることが示された。ＬＭＩと同様に、度数分布曲線（図２８）はＰＰＥの注入後に右側にシフトした。
【００６０】
３．５  パラメーター相関
Ｓ／Ｖ比とＬｍとは反比例する（２７）。そして我々のＬＭＩ方法とのＬｍの類似性のために、我々は測定されたＳ／Ｖ比とＬＭＩとが相関することを予測した。これは、まさにＬＭＩに対するＳ／Ｖ比のそれぞれについて０．９を超えるｒ値を伴う場合（表２）である。（１５ピクセルラインを有する）Ｗｅｉｂｅｌレチクルを使ったＳ／Ｖ比は、この相関を例証するためにＬＭＩに対してプロットされた（図２９）。他のパラメーターについての相関もまた、計算されている（表２）。全ての相関は、高い有意性（ｐ＜０．０００１）を示す。
【００６１】
４．議論
この研究では、我々は正常形態および気腫性形態を示している肺の薄片のコンピューターベースのイメージ分析を実行するために、他者によって記述された肺形態計測技法（６、７、２５）を適合させた。肺形態計測は、本来は労働集約的なプロセスである。しかし、コンピューターオートメーション技法を使うことで、我々は、このような研究から定量的なデータを得るために必要とした時間を大いに減らした。さらに、我々が使用した形態計測パラメーターは、エラスターゼによって引き起こされた気腫モデルにおいて気腫性形態を顕著に検出する。
【００６２】
４．１  イメージ取り込み、プロセシング、および３×３作成
本明細書で記述したモザイク方法論を使ったイメージ取り込みは、いくつかの利点を有する。第一に、それは迅速であり、かかる時間が各肺葉に対して平均して５〜１０分間である。結果として、それは１５０〜３００のフィールドがデジタル方式で取り込まれて、そして保存される。この手順は完全に自動化され、そしてユーザーは、ほとんど訓練を必要としない。第二に、モザイクプロセスは、３×３のようなより大きいイメージを形成するために隣接したフィールドをつなぐことによって、肺組織の大きい領域を分析することを可能にする（それで、より多くの観察がなされた）。前もってモーターを備えているステージは、正確な動き（〜１μｍの精度）を行うことを可能にし、これらの３×３イメージが自動的に作成されることができるようにする。
【００６３】
第三に、これらの３×３イメージが作られて、そして保存された直後に、他の気腫を指示するものが分析され得る場合、それらは、将来において容易に読み出すことができる。これらのパラメーターは、肺胞付着（ＡＡ）または気道寸法変化であろう。そして、それは気腫を指示するものであると考えられる（２８、２９）。薄い肺切片イメージ分析からの非実質組織の構成要素の除外が前に記述され（３０）、そして、気道、血管および気管支の形態計測定量を避けることによって、感度を補助する。分析にこれらの構成要素を含めることは、実質組織に特異的な肺胞破壊および気腔拡大のような、ヒトおよび動物モデル（５、１４）における気腫の特性を示す特徴の発見において妨害となろう。
【００６４】
４．２  肺形態計測−文献値との比較
肺組織研究を通して比較されるいずれの形態計測パラメーターに対しても、最も重要な制御される変数は、膨張である。引用された肺胞寸法および肺体積は、ある特定の圧力（２７）においてのみ特異的である。このために、多くの研究者が、膨張の生理学状態に近い圧力に固定するが、変化をなお経験するであろう。さらに、肺の物理的寸法に影響を与える固定についての異なった方法が存在する。このような比較をするときは、注意しなければならない。研究を比較するときに明白に違うのは、種の違いである。ラットおよびマウスの両方が、気腫の動物モデルで使われる。しかし、マウスは、ラットより小さい肺胞を有し（３１）、所与の圧力においてより低いＬｍ値を有するので、形態計測値を直接比較することができない。
【００６５】
Ｌｍ、Ｓ／Ｖ比、ＡＡおよび破壊インデックス（ＤＩ）（６、１２、２８、３２）を含めた種々の形態計測パラメーターが、薄い肺スライスからの気腫の測定についての文献において引用された。これらの中で、Ｌｍが最も広く受け入れられている。このため、我々は、我々の分析パラメーター（ＬＭＩ）の１つの基礎をこの技法においた。
【００６６】
Ｌｍは肺胞壁の厚さを考慮に入れないので、同じイメージからのＬｍおよびＬＭＩについての値は同一ではないであろう。例えば、４回交差する１００μｍの長さのラインは、２５μｍのＬｍを与えるであろう。しかしながら、ラインの一部が組織に位置するであろうから、ＬＭＩはこれより低いであろう。それで、実際の気腔に位置する長さは、おそらく８０μｍを測定し、結果として２０μｍの平均ＬＭＩとなるであろう。Ｅｓｃｏｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．は、肺胞コード長（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｃｈｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）（２３）と呼ばれる我々のＬＭＩと同様のコンピューターベースの技法を使った。そして、彼らは、従来のＬｍと並行してそれを測定した。肺胞コード長は、同じイメージからのＬｍより実際には低かった。
【００６７】
様々な研究からのＬｍ値を、同じ圧力において固定された肺と比較することは、今なお容易ではない。イメージの倍率は、Ｌｍ決定に影響を与える。Ｌｍ測定は、肺組織のイメージに重ね合わせる顕微鏡アイピースを通して見られる十字照準線の使用によって通常なされる。肺胞壁の厚さと比較してのこれらのラインの相対的な厚さは、倍率に依存している。倍率が低ければ低いほど、それだけラインは厚くなる。これは、異なったＬｍ値が肺の同じ領域から得られるということを招くことがあり得る（７）。これが、我々がＬＭＩおよびＳ／Ｖ比分析におけるグリッドラインを可能な限り薄く（１ピクセルの厚さ）した理由である。
【００６８】
年齢もまた、肺の寸法に顕著な効果を有する。ヒトおよび哺乳動物において、肺胞の寸法（つまりＬｍのような計測）は、年齢とともに増加する。ヒトにおいて、この効果は、「老人性肺」（３３）という用語をもたらした。それは、顕著な気腔拡大を示すが、肺胞破壊がないために気腫とは区別される。ラットにおいては、Ｌｍは、成人期（週齢１６週）と壮年期（週齢５６週）の間で１２μｍも顕著に異なった（３４）。
【００６９】
研究を通してＬｍ値に影響を与えている最終的な要因は、固定、脱水、埋め込みおよび切片法による収縮である。これらの構成要素のための修正ファクターは、肺組織の処理の間に体積または長さを測定することによって計算される。それにより、新しい肺の寸法を見積もることができる（２７）。収縮は、本明細書で報告した研究においては修正されなかった。しかしながら、全てのサンプルが一緒に処理されたので、収縮は一定であろうと想定される。
【００７０】
研究を通していずれの形態計測技法と比較する場合でも、Ｌｍについての上記のような要因は、当然考慮に入れなくてはならない。しかしながら、正確な値が必要とされないので、（正常対気腫性のような）２つのグループの間の形態上の変化の程度は、研究を通して比較することができる。
【００７１】
このため、ＬｍおよびＬＭＩは、（肺胞の薄化が気腫性肺に生じているので、ＬＭＩのグループの間の相違はわずかに大きくなっているにもかかわらず）、異なった治療での気腫の重篤度に近付けるために比較することができる。この研究でのＰＰＥプロトコルは、レチノイン酸によるエラスターゼ誘因の気腫の逆を証明している研究においてＭａｓｓａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．によって使われたものに基づいた（３５）。Ｍａｓｓａｒｏの研究では、我々のＬＭＩと比較して、Ｌｍが７４μｍから９６μｍまで増加した。我々のＬＭＩは、５３μｍから９３μｍまで上昇し、気腫が我々の研究において、より大規模であったことを示唆している。Ｍａｓｓａｒｏの研究における全ての肺葉からの領域と比較して、左の肺葉だけを我々の分析では分析した。ダメージは、この注入法を伴う他の肺の領域より左の肺葉でいっそう顕著であった可能性がある。２つの研究の間のインビボ手順における微妙な相違もまた、注入に影響を与え得るであろう。
【００７２】
Ｗｅｉｂｅｌレチクル法から得られたＳ／Ｖ比と文献で引用されたＳ／Ｖ比との比較をするのは、いっそう難しい。というのは、個々のラインの長さは、得られる値に大きく影響を与えるからである。Ｌｍと同じように、使われた倍率もまた、得られた値に影響を与えるであろう。我々の実験的な手順と同様のラットのエラスターゼ処理に対するＳ／Ｖ比を引用している研究は、文献で見いだすことができなかった。しかしながら、非常にラフなガイドとして、我々が生理食塩水処理のラットに対して得た値（４０６ｃｍ-1および２６４ｃｍ-1）は、肺胞中隔作成の抑制の研究における近い年齢の生理食塩水処理のラットのＳ／Ｖ比からあまり離れていなかった。肺は同じ圧力に膨らませられ、そして我々の研究と同様の方法で固定および処理された。しかし、使われた倍率は、３００倍ではなく１００倍であった（３６）。本研究者たちはまた、この研究で収縮に対する訂正をした。これらのマウスに対するＳ／Ｖ比は、３０５ｃｍ-1であった。別のグループは、少し年齢の高いのラットによること以外はほとんど同じ研究を実施し、６４１ｃｍ-1のＳ／Ｖ比を見積もった（３７）。これらの結果は、この方法を使って得られた絶対値の変化を説明する。
【００７３】
我々が知っている限りでは、周長／面積方法論および節点解析パラメーターを使ったＳ／Ｖ比測定は、エラスターゼ誘因の気腫モデルにおいて他者によって実験されたことはなかったが、適用した場合、上記で議論した他のパラメーターとの優れた一致を示した（表２）。
【００７４】
肺組織スライスの正しい公平なサンプリングが使われ、参照スペース（肺体積）（９、３８、２６）を考慮すれば、本明細書で記述された技法は、動物モデルの気腫の程度を検出および定量化するための正確な定量的なデータを得る目的で迅速な準自動化されたイメージ分析手順を提供する。この手順は、肺機能測定と並行して、気腫の病的特徴を妨害するまたは後退させるように意図された治療薬の評価における使用に適している。
【００７５】
【表１】
2006521854.tif 000003
【００７６】
【表２】
2006521854.tif 000004
【００７７】
文献
【表３Ａ】
2006521854.tif 000005
【表３Ｂ】
2006521854.tif 000006
【表３Ｃ】
2006521854.tif 000007
【表３Ｄ】
2006521854.tif 000008
【００７８】
上記の明細書で言及した全ての出版物および当該出版物で引用された参考文献は、本明細書中で参照として組み込まれる。記述された本発明の方法およびシステムの種々の修正および変更は、本発明の範囲および精神から外れることなしに、当業者には明白であるであろう。本発明は特定の望ましい実施形態に関連して記述されているが、特許請求された本発明が、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解されるべきである。まさに、分子生物学または関連した分野の当業者にとって明らかな発明を実行するための記述された様式の種々の修正は、特許請求の範囲の中にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】気腫性肺と正常な肺とを比較した場合に観察される形態的相違を説明するヒトの肺由来の薄片。薄片から得られるヒトの肺の低出力光学顕微鏡写真。正常な肺（Ａ）が、通常の大きさの肺胞および肺胞管を含むのに対して、気腫性肺（Ｂ）は、ダメージを受けている肺胞および気腔膨張を示す。
【図２】進行中のモザイクマクロを示しているイメージ。イメージがラスター法で取り込まれ、そして各視野が個別にセーブされる。さらに、取り込みの領域全体を示す参照モザイクイメージ（上）が作り出される。一般的に、１５０〜３００個の視野が、イメージが取り込まれる成獣ラットからのスライス全体のために必要とされる。
【図３】モザイクプロセスの間に取り込まれた単一の視野イメージ。
【図４】モザイクプロセスの間に取り込まれた９個のイメージから作り出した３×３イメージ。
【図５】６個の３×３イメージが、参照モザイクイメージを使ってコンピューターによってランダムに選択される。
【図６】反転された３×３イメージ−肺組織はイメージの残りの部分より明るい。
【図７】動的区別セグメンテーションおよびビンスクラップ（ｂｉｎ  ｓｃｒａｐ）の後の３×３  ２進法イメージ。
【図８】血管および他の固形組織の構成要素の自動検出（緑色で示す。参照としてオリジナルの３×３）。
【図９】ユーザーによりデジタルペンを使って、イメージの上に緑色で輪郭を描くことによって、手作業で識別される残っている非実質組織の構成要素。
【図１０】非実質組織の構成要素「ｂ」イメージ。
【図１１】Ｓ／Ｖ比計算のためにＷｅｉｂｅｌによって最初に提案された多目的のテストグリッド（２５）。
【図１２】示された線形寸法を有するＷｅｉｂｅｌレチクル（１０）。
【図１３】「ｂ」イメージと統合した場合のグリッドの一部を示すイメージ−非実質組織構成要素をカバーしているであろうラインを削除している。
【図１４】イメージの統合の後、組織を横切らないラインだけが残される。
【図１５】イメージ統合手順が、ラインの終点を気腔の上に位置する終点だけ残すために繰り返される。
【図１６】結果として面積測定および周長測定が得られる領域決定。
【図１７】肺胞間の隔膜と平行線との交差点の数を数え、そして使ったラインの全体の長さによってこれを割ることによるＬｍの計算（６）。
【図１８】ブランクの３×３上に１０ピクセル離して引かれ、そして実質組織の上に位置するラインのみ残すために「ｂ」イメージと統合された厚さ１ピクセルのライン。
【図１９】肺「ａ」イメージと統合され、肺胞間の切片を生じさせるＬＭＩグリッドイメージ。
【図２０】肺切片上の全ＬＭＩグリッドの重ね合わせ。
【図２１】肺実質のスケルトン状の外観をもたらしている肺構造の薄化。オリジナルの肺２進法イメージ（Ａ）が薄化され、スケルトン構造物（Ｂ）を残してスムージングされる。
【図２２】オリジナルの肺２進法イメージの最上層に重ねられた枝構造（様々な色で示された個々の枝）。
【図２３】肺形態に対するＰＰＥの効果。気腔がＰＰＥ処理（Ｂ）の後に大きく拡大され、正常なラットの肺（Ａ）と比較された気腫性形態をもたらす。
【図２４】一回の生理食塩水またはＰＰＥの注入後および２８日後に調べられた成獣ラットの肺の表面積対体積比。Ｓ／Ｖ比は、Ｗｅｉｂｅｌレチクル（Ａ）または周長／面積ベースの測定（Ｂ）を使うことによって、計算された（方法参照）。
【図２５】線形平均切片（ＬＭＩ）に対するＰＰＥ処理の顕著な効果。
【図２６】ＬＭＩ分析からの切片長さの正規分布。ＰＰＥ処理は、小さい切片の減少および大きい切片の増加をもたらす。
【図２７】節点解析により決定される平均節点−節点距離および平均枝長さに対するＰＰＥ処理の顕著な効果（方法参照）。
【図２８】節点解析からの枝長さの正規分布。ＰＰＥ処理は、小さい枝の減少および大きい枝の増加をもたらす。
【図２９】Ｓ／Ｖ比（１５ピクセルラインを有するＷｅｉｂｅｌレチクル）と調べられた全てのマウスにおけるＬＭＩとの間の関係。Ｓ／Ｖ比は、ＬＭＩに反比例している。
【図３０】コンピューターによって実行された本発明の方法のフローチャート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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