(57)【要約】多細胞生物（例えば、動物）の標的細胞ゲノムへの外因性核酸の相同組換え方法を提供する。本発明の方法では、線状化エンドヌクレアーゼ部位（例えば、リコンビナーゼ認識部位）および相同組換え組み込みエレメントを含むターゲティングベクターを、多細胞生物の標的細胞がターゲティングベクターを取り込むように、例えば、全身投与または局所投与によって多細胞生物と接触させる。ターゲティングベクターは、相同組換え事象前の何らかの時点で（例えば、多細胞生物との接触前または接触後）線状化エンドヌクレアーゼ（例えば、リコンビナーゼ）によって線状化されたものである。標的細胞による取り込み後、組み込みエレメントは、線状化ターゲティングベクター由来の標的細胞ゲノムへ相同組換えされる。本方法の実施において使用するためのターゲティングベクター、システム、およびキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多細胞生物の標的ゲノムへの外因性核酸の相同組換え法であって、
（a）標的ゲノムが相同組換えされる配列に隣接する外因性核酸を含む相同組換え組み込みエレメントと、
（b）線状化エンドヌクレアーゼ部位のためのエンドヌクレアーゼの存在下で該エンドヌクレアーゼによって切断されて線状化ベクターが得られる線状化エンドヌクレアーゼ認識部位
とを含む有効量の組み込みベクターを、該組み込みベクターが該エンドヌクレアーゼによって切断されて該組み込みエレメントにより該標的ゲノムが相同組換えされる線状化ベクターが産生されるような条件下で、多細胞生物に投与する段階を含む、方法。
【請求項２】
組み込みベクターが、多細胞生物への投与前にエンドヌクレアーゼによって線状化される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
組み込みベクターが、多細胞生物への投与後にエンドヌクレアーゼによって線状化される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
エンドヌクレアーゼが制限酵素である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
制限酵素がSspIである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
エンドヌクレアーゼがリコンビナーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
リコンビナーゼがトランスポザーゼである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
エンドヌクレアーゼまたはそのコード配列を含む核酸を多細胞生物に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
エンドヌクレアーゼのコード配列を含む核酸を多細胞生物に投与する段階をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
コード配列が組み込みベクター上に存在しない、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
コード配列が組み込みベクター上に存在する、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
組み込みベクターが血管内に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
多細胞生物が動物である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
動物が昆虫である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
動物が脊椎動物である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物が哺乳動物である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
脊椎動物の標的ゲノムへの外因性核酸の相同組換え法であって、
（a）標的ゲノムが相同組換えされる配列に隣接する外因性核酸を含む相同組換え組み込みエレメントと、
（b）線状化エンドヌクレアーゼ認識部位を認識する線状化エンドヌクレアーゼとの接触の際に該エンドヌクレアーゼによって切断されて線状化組み込みベクターが得られる線状化エンドヌクレアーゼ認識部位
とを含む有効量の環状組み込みベクターを脊椎動物に投与する段階であって、
該線状化エンドヌクレアーゼが該脊椎動物に対して内因性でないエンドヌクレアーゼであり、該環状組み込みベクターが該エンドヌクレアーゼによって切断されて該組み込みエレメントにより該標的ゲノムが相同組換えされる線状化組み込みベクターが産生される段階を含む、方法。
【請求項１８】
脊椎動物が、投与段階前に線状化エンドヌクレアーゼを発現する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
エンドヌクレアーゼまたはそのコード配列を含む核酸を脊椎動物に投与する段階をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
線状化エンドヌクレアーゼのコード配列を含む核酸を脊椎動物に投与する段階をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
コード配列が環状組み込みベクター上に存在しない、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
コード配列が環状組み込みベクター上に存在する、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
脊椎動物が哺乳動物である、請求項17記載の方法。
【請求項２４】
ベクターが血管内に投与される、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
（a）リコンビナーゼによって切断される単一のリコンビナーゼ認識部位と、
（b）相同組換えされる配列に隣接した外因性核酸を含む相同組換え組み込みエレメント
とを含む、環状核酸組み込みベクター。
【請求項２６】
リコンビナーゼがトランスポザーゼである、請求項25記載のベクター。
【請求項２７】
トランスポザーゼがショウジョウバエPエレメントトランスポザーゼである、請求項25記載のベクター。
【請求項２８】
リコンビナーゼのコード配列をさらに含む、請求項25記載のベクター。
【請求項２９】
コード配列が組み込みエレメント中に存在しない、請求項28記載のベクター。
【請求項３０】
組み込みエレメントが発現カセットを含む、請求項25記載のベクター。
【請求項３１】
多細胞生物の標的細胞ゲノムへの外因性核酸の相同組換えシステムであって、
（a）（i）リコンビナーゼによって切断される単一のリコンビナーゼ認識部位と、
（ii）相同組換えされる配列に隣接した外因性核酸を含む組み込みエレメント
とを含むターゲティングベクター、および
（b）リコンビナーゼまたはそのコード配列を含む核酸
を含むシステム。
【請求項３２】
リコンビナーゼを含む、請求項31記載のシステム。
【請求項３３】
リコンビナーゼをコードする核酸を含む、請求項31記載のシステム。
【請求項３４】
核酸がターゲティングベクター上に存在する、請求項33記載のシステム。
【請求項３５】
核酸がターゲティングベクターから離れたベクター上に存在する、請求項33記載のシステム。
【請求項３６】
多細胞生物の標的細胞ゲノムへの外因性核酸の相同組換え用キットであって、
（a）（i）リコンビナーゼによって切断されるリコンビナーゼ認識部位と、
（ii）相同組換えされる配列に隣接した外因性核酸を含む相同組換え組み込みエレメント
とを含むターゲティングベクター、および
（b）リコンビナーゼまたはそのコード配列を含む核酸
を含むキット。
【請求項３７】
リコンビナーゼを含む、請求項36記載のキット。
【請求項３８】
リコンビナーゼをコードする核酸を含む、請求項36記載のキット。
【請求項３９】
核酸がターゲティングベクター上に存在する、請求項38記載のキット。
【請求項４０】
核酸がターゲティングベクターから離れたベクター上に存在する、請求項38記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
米国特許法第119条（e）に従って、本出願は、2002年4月30日提出の米国特許仮出願第60/377,026号および2002年7月18日提出の米国特許仮出願第60/396,992号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）の出願日の優先権を主張する。
【０００２】
緒言
発明の分野
本発明の分野は、核酸組み込み、より詳細には、相同組換えである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多細胞生物における方向性のあるゲノム修飾を促進する試薬および方法は、実験遺伝学、ヒト治療、および農業のための強力なツールボックスを構成する。使用されるゲノム修飾のための1つのストラテジーは、外因性DNAにより標的細胞中のその対応する染色体部位が相同組換えされる遺伝子ターゲティングによる細胞ゲノムの直接的変化である。遺伝子ターゲティングテクノロジーは、移入された遺伝子がその正常な染色体遺伝子座に存在し、それにより細胞への遺伝子移入の代替法に関連する主要な問題（例えば、遺伝子サイレンシング、挿入変異、異所性遺伝子発現、および安定性の欠如）が回避されるという利点を有する。
【０００４】
しかし、哺乳動物細胞では、非常に低い頻度（通常、10-6/細胞の範囲）でしか相同ターゲティング事象が達成されない。さらに、100倍〜1000倍の非相同事象のバックグラウンドに対して相同ターゲティングが起こる（Capecchi 1989 Science 244:1288-1292）。首尾の良い産物のターゲティング率の選択またはスクリーニングのために多くの手順が考案されているが、好ましい事象の絶対頻度の低さにより非常に制限されたままである。したがって、少なくとも哺乳動物細胞のための現在の遺伝子ターゲティングテクノロジーは、単離細胞または組織培養で成長した細胞への線状化ベクターの投与に依存する。このような細胞を使用してトランスジェニック動物を作製し、潜在的に移植治療に使用することができる。特化された細胞型が必要であることが、この遺伝子ターゲティングアプローチの有用性を非常に制限している。
【０００５】
より有効な形質転換ベクターが産生され続けているが、主な理由として細胞中と比較して動物全体に対して操作された場合にその複雑性が劇的に異なるので、これらは主に細胞投与用である。
【０００６】
したがって、新規の形質転換ベクターの開発に関心が持たれ続けている。相同組換えを介したインタクトな多細胞生物中の細胞ゲノムへの外因性DNAの安定な部位特異的組み込みが行われるベクターの開発が特に意図される。
【０００７】
関連文献
対象となる引例には、米国特許第6,291,243号；同第5,719,055号、および同第4,670,388号；ならびにRong and Golic（Science,288:2013-2012000）；Rouetら、（Proc.Natl.Acad.Sci.91:6064-6068,1994）；Segalら、（Proc.Natl.Acad.Sci.92:806-810,1995）が含まれる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
外因性核酸による多細胞生物（例えば、動物）の標的細胞ゲノムの相同組換え方法を提供する。本発明の方法では、線状化エンドヌクレアーゼ部位（例えば、リコンビナーゼ認識部位）および相同組換え組み込みエレメントを含むターゲティングベクターを、多細胞生物の標的細胞がターゲティングベクターを取り込むように、例えば全身投与または局所投与を介して多細胞生物と接触させる。ターゲティングベクターは、本来、投与前（例えば、エンドヌクレアーゼでのインビトロ処理）または多細胞生物に移入することができるか既に存在する細胞外または細胞内流動物中のエンドヌクレアーゼによる多細胞生物への侵入時のいずれかで線状化エンドヌクレアーゼ（例えば、リコンビナーゼ）によって線状化される環状ターゲティングベクターである。線状化ターゲティングベクター由来の組み込みエレメントにより標的細胞ゲノムが相同組換えされる。本発明の方法の実施で使用するためのターゲティングベクター、システム、およびキットも提供する。
【０００９】
定義
「ベクター」とは、二本鎖染色体外核酸であり、クローニング送達体および発現送達体ならびにウイルスベクターが含まれる。「ベクター」は、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」とは、標的細胞に遺伝子配列を導入することができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語には、クローニング送達体、発現送達体、および組み込みベクターが含まれる。「環状」ベクターとは、環状核酸から作製されたベクターを意味し、超らせんまたは弛緩形態であり得る。環状ベクターは、線状ベクターまたは線状化ベクターではない。
【００１０】
「外因性核酸」とは、本発明の方法の実施前に、標的細胞の外側に存在する核酸である。一定の態様では、外因性核酸は、標的細胞のゲノム中に存在しない連続配列を有するものである。他の態様では、外因性核酸は、標的細胞のゲノム中で見出される連続配列を有する。
【００１１】
「標的部位」とは、外因性核酸の組み込みが望ましいゲノム内の所定の位置である。
【００１２】
「相同配列」とは、組み込みのための「標的部位」と同一の配列を示す配列である。
【００１３】
「相同組換え」とは、組み込みエレメントの相同隣接配列と標的ゲノムの標的部位との間の配列同一性レベルが十分に高い（例えば、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％（100％配列同一を含む））ことによって促進される機構による標的ゲノムが相同組換えされる配列に隣接した外因性核酸（nucleic）を含む組み込みエレメントの組み込みである。相同組換えにより、組み込みエレメントの相同隣接配列を含む組み込みエレメントが標的ゲノム部位に挿入される。
【００１４】
「遺伝子ターゲティング」とは、相同組換えによる標的ゲノムの特異的標的部位への外因性核酸の部位特異的組み込みを示す。
【００１５】
「対象となる核酸フラグメント」とは、ゲノムへの挿入に適合した任意の核酸フラグメントを意味する。対象となる核酸フラグメントの適切な例には、プロモーターエレメント、治療遺伝子、マーカー遺伝子、調節遺伝子、形質産生フラグメント、および遺伝子を破壊するための核酸エレメントなどが含まれる。さらに、対象となる核酸フラグメントは、対象となる遺伝子/コード配列の発現を誘導することができる任意の核酸構築物を含む「発現カセット」であり得る。対象となる核酸フラグメントはまた、一旦標的部位に組み込まれると標的部位周辺の遺伝子発現を破壊する、「破壊」核酸であり得る（例えば、破壊核酸は遺伝子のコード配列を変化させるか、遺伝子の転写、スプライシング、または翻訳を妨害するか、それ自体が破壊的（例えば、アンチセンス）核酸を発現することができる）。
【００１６】
細胞の形質転換方法は、当技術分野において周知である。「形質転換された」とは、外来核酸（通常、DNA）の取り込みに起因する細胞の変化を意味する。用語「形質転換」の使用は、任意の特定の方法への外来核酸の移入に制限されることを意図しない。適切な方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、抱合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃テクノロジー、リン酸カルシウム沈殿、および直接微量注入などが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の型および形質転換の環境（すなわち、インビトロ、エキソビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法の一般的考察を、Ausubel,ら、Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley＆Sons,1995に見出すことができる。
【００１７】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそのアナログのいずれか）のポリマー形態をいう。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し、既知または未知の任意の機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、伝令RNA（mRNA）、運搬RNA、リボゾームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子は、線状または環状であり得る。
【００１８】
ポリヌクレオチドは、典型的には、4つのヌクレオチド塩基:アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、およびチミジン（T）（ポリヌクレオチドがRNAの場合にはチミジン（T）がウラシル（U）となる）の特異的配列から構成される。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示を、中央演算処理装置を有するコンピュータのデータベースに入力し、機能的ゲノム学および相同検索などの生物情報学への適用のために使用することができる。
【００１９】
「コード配列」または選択したポリペプチドを「コードする」配列は、例えば、適切な調節配列（または「調節エレメント」）の調節下に置かれた場合にインビボでポリペプチドに転写（DNAの場合）および翻訳（mRNAの場合）される核酸分子である。コード配列の境界を、典型的には、5’（アミノ）末端の開始コドンおよび3’（カルボキシ）末端の翻訳終始コドンによって決定する。コード配列には、ウイルス由来のcDNA、原核生物または真核生物mRNA、ウイルスまたは真核生物DNA由来のゲノムDNA配列、およびさらに合成DNA配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写末端配列を、コード配列の3’に位置付けることができる。他の「調節エレメント」をコード配列に結合することもできる。ポリペプチドをコードするDNA配列を、所望のポリペプチドコード配列のDNAコピーを示すために選択細胞によって好まれるコドンの使用による選択細胞での発現のために至適化することができる。
【００２０】
「によってコードされる」とは、ポリペプチド配列またはその一部が、核酸配列によってコードされたポリペプチド由来の少なくとも3〜5個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも15〜20個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする核酸配列をいう。配列によってコードされたポリペプチドと免疫学的に同一のポリペプチド配列も含まれる。
【００２１】
「操作可能に連結された」は、このように説明された成分がその通常の機能を発揮するように構成されているエレメントの配置をいう。したがって、コード配列（例えば、レポーター発現カセット）に操作可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にコード配列を発現することができる。プロモーターまたは他の調節エレメントは、その発現を指示する機能を果たす限り、コード配列と連続する必要はない。例えば、翻訳されないが転写される介在配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は依然としてコード配列に「操作可能に連結された」と見なすことができる。
【００２２】
「核酸構築物」とは、天然では共に見出されない1つまたは複数の機能単位を含むように構築された核酸配列を意味する。例には、環状、線状、二本鎖、染色体外のDNA分子（プラスミド）、コスミド（λファージ由来のCOS配列を含むプラスミド）、および非天然核酸配列を含むウイルスゲノムなどが含まれる。
【００２３】
核酸およびアミノ酸「配列同一性」の決定技術もまた当技術分野において公知である。典型的には、このような技術には、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列の決定および/またはこれらによってコードされるアミノ酸配列の決定、ならびにこれらの配列と第2のヌクレオチドまたはアミノ酸配列との比較が含まれる。一般に、「同一性」は、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド同士またはアミノ酸同士の一致をいう。2つまたはそれ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、その「同一率」の決定によって比較することができる。2つの配列（核酸またはアミノ酸配列のいずれか）の同一率は、2つの配列アラインメント間の正確な適合数/短い方の配列の長さ×100である。核酸配列の適切なアラインメントは、Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489（1981）の局所的相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムを、Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff ed.,5 suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USAによって開発され、Gribskov,Nucl.Acids Res.14（6）:6745-6763（1986）によって標準化されたスコア行列の使用によってアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一率の決定のためのこのアルゴリズムの実施例は、Genetics Computer Group（Madison,WI）の「BestFit」ユーティリティアプリケーションによって得られる。この方法のデフォルトパラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual,Version 8（1995）（Genetics Computer Group,Madison,WIから利用可能）に記載されている。本発明の文脈での同一率の好ましい確立方法は、University of Edinburghが著作権を有し、John F.Collins and Shane S.Sturrokが開発し、IntelliGenetics,Inc.（Mountain View,CA）が販売しているMPSRCHプログラムパッケージを使用することである。このパッケージプログラムから、スコア表のデフォルトパラメータ（例えば、ギャップオープンペナルティ12、ギャップ伸長ペナルティ1、およびギャップ6）を使用する場合、Smith-Watermanアルゴリズムを使用することができる。作成されたデータから、「適合」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一率または類似率を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当技術分野において公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムはデフォルトパラメータと共に使用するBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPを、以下のデフォルトパラメータを使用して使用することができる。遺伝コード＝標準、フィルター＝なし、鎖＝両方、カットオフ＝60、期待値＝10、行列＝BLOSUM62、記載＝50配列、分類＝HIGH SCORE、データベース＝非冗長、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS translations＋Swissprotein＋Spupdate＋PIR。これらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスで見出すことができる。http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
【００２４】
または、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリッド形成およびその後の一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、ならびに消化されたフラグメントのサイズ決定によって相同性を決定することができる。2つのDNAまたは2つのポリペプチド配列は、上記方法を使用して決定した場合に配列が定義した長さの分子と少なくとも約80％〜85％、好ましくは少なくとも約85％〜90％、より好ましくは少なくとも約90％〜95％、最も好ましくは少なくとも約95％〜98％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される、「実質的に相同な」は、特定のDNAまたはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列もいう。実質的に相同なDNA配列を、例えば、その特定のシステムについて定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリッド形成実験で同定することができる。適切なハイブリッド形成条件の定義づけは、当業者の範囲内である。例えば、Sambrookら、前記；DNA Cloning,前記；Nucleic Acid Hybridization,前記を参照のこと。
【００２５】
本明細書中に記載のように、2つの核酸フラグメントは、「選択的にハイブリッド形成する」と見なされる。2つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリッド形成事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリッド形成を少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリッド形成の阻害を、当技術分野において周知のハイブリッド形成アッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、または溶液ハイブリッド形成など）を使用して評価することができる（Sambrook,ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,（1989）Cold Spring Harbor,N.Y.を参照のこと）。種々の選択性を使用して（例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまでの範囲の条件を使用して）、このようなアッセイを行うことができる。低ストリンジェンシー条件を使用する場合、非特異的結合の有無を、非特異的結合事象の非存在下で二次プローブが標的とハイブリッド形成しないような部分的な配列同一性をも欠く二次プローブ（例えば、標的分子と約30％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価することができる。
【００２６】
ハイブリッド形成ベースの検出システムを使用する場合、標的核酸配列と相補的な核酸プローブを選択し、その後プローブと標的配列が互いに「選択的にハイブリッド形成」して（つまり、結合する）ハイブリッド分子を形成する適切な条件を選択する。「中程度にストリンジェントな」条件下で標的配列と選択的にハイブリッド形成することができる核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブ配列と少なくとも約70％の配列同一性を有する少なくとも約10〜14個のヌクレオチド長の標的核酸配列を検出可能な条件下でハイブリッド形成する。ストリンジェントなハイブリッド形成条件により、典型的には、選択された核酸プローブ配列と約90〜95％超の配列同一性を有する少なくとも約10〜14個のヌクレオチド長の標的核酸配列を検出可能である。プローブおよび標的が特定の配列同一度を有する場合、プローブ/標的ハイブリッド形成に有用なハイブリッド形成条件を当技術分野において公知のように決定することができる（例えば、Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach,editors B.D.Hames and S.J.Higgins,（1985）Oxford；Washington,DC；IRL Pressを参照のこと）。
【００２７】
ハイブリッド形成についてのストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子の変化によって、特定のストリンジェンシーを確立するために多数の等価な条件を使用することができることが当技術分野において周知である。プローブおよび標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリッド形成溶液成分の濃度、ハイブリッド形成溶液中の遮断薬（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリッド形成反応温度および時間パラメータならびに洗浄条件の変化。特定のハイブリッド形成条件組を、当該分野の標準的な方法にしたがって選択する（例えば、Sambrook,ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,（1989）Cold Spring Harbor,N.Y.を参照のこと）。ストリンジェントなハイブリッド条件の例は、50℃またはそれ以上および0.1×SSC（15mM塩化ナトリウム/1.5mMクエン酸ナトリウム）でのハイブリッド形成である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件の別の例は、50％ホルムアミド、5×SSC（150m MNaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×Denhardt溶液、10％硫酸デキストラン、および20mg/ml変性剪断精子DNAを含む溶液中での42℃で一晩のインキュベーションおよびその後の約65℃の0.1×SSCでのフィルターの洗浄である。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、少なくとも上記の代表的条件ほどのストリンジェンシーであるハイブリッド条件であり、上記の特定のストリンジェンシー条件と少なくとも約80％のストリンジェンシー、典型的には少なくとも約90％のストリンジェンシーである場合、条件は少なくともストリンジェンシーと見なされる。他のストリンジェントなハイブリッド条件が当技術分野において公知であり、本発明のこの特定の態様の核酸の同定に使用することもできる。
【００２８】
第1のポリヌクレオチドは、第2のポリヌクレオチド領域、そのcDNA、もしくは相補物と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を有するか、上記の配列同一性を示す場合、第2のポリヌクレオチドに「由来する」。
【００２９】
第1のポリヌクレオチドは、（i）第2のポリヌクレオチド由来の第1のポリヌクレオチドによってコードされるか、（ii）上記の第2のポリペプチドと配列同一性を示す場合、第2のポリペプチドに「由来する」。
【００３０】
「実質的に精製された」は、一般に、物質が存在するサンプル中に大部分を占めるような物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物）の単離をいう。典型的には、サンプル中で、実質的に精製された成分は、サンプルの50％、好ましくは80％〜85％、より好ましくは90〜95％を含む。対象となるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの精製技術は当技術分野において周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、および密度による沈殿が含まれる。
【００３１】
「エンドヌクレアーゼ」とは、二本鎖核酸基質の特定の配列の二本鎖を破壊するヌクレオチドのDNA鎖中の内部（例えば、DNA鎖の5’末端や3’末端ではない）共有結合を切断することができる任意の分子を意味し、特定の配列を「エンドヌクレアーゼ部位」と称する。「エンドヌクレアーゼ」は、DNアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、ニッカーゼなど）またはリコンビナーゼ（例えば、トランスポザーゼ、レソルバーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼなど）であり得る。
【００３２】
「制限エンドヌクレアーゼ」は、二本鎖核酸分子の部位特異的（すなわち、特定のDNA配列での）切断を媒介する酵素ファミリーのメンバーである。対象となる制限エンドヌクレアーゼは、少なくとも8塩基対長の特定のDNA配列を認識して切断を媒介するいわゆる「レアカッティング（rare cutting）」制限エンドヌクレアーゼである。レアカッティング制限エンドヌクレアーゼは、Lamberら（Mutat Res.1999；433:159-68）；Belfordら（Nucleic Acids Res 1997；25:3379-88）およびJasin,1996（Trends Genet.12:244-228）で考察されている。18bpの非パリンドローム配列を認識するI-SceIエンドヌクレアーゼ（Dujon,Gene 1989 92-119）、キメラI-SceIヌクレアーゼ（Bibikovaら、Mol.Cell.Bio.2001 21:289-287）、およびサッカロマイセス・セレビジエのHOエンドヌクレアーゼ（NCBIアクセッション番号X90957によってコードされる）が特に興味深い。
【００３３】
「リコンビナーゼ」は、リコンビナーゼによって認識される特異的DNA配列間の部位特異的組換えを媒介する酵素ファミリーのメンバーである（Esposito,D.,and Scocca,J.J.,Nucleic Acids Research 25,3605-3614（1997）；Nunes-Duby,S.E.,ら、Nucleic Acids Research 26,391-406（1998）；Stark,W.M.,ら、Trends in Genetics 8,432-439（1992）；Sadowski,1993 FASEB J 7:760-767）。リコンビナーゼは、レソルバーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、およびトランスポザーゼであり得る。
【００３４】
具体的な態様の説明
多細胞生物（例えば、動物）の標的細胞ゲノムへの外因性核酸の相同組換え方法を提供する。本発明の方法では、線状化エンドヌクレアーゼ部位（例えば、リコンビナーゼ認識部位）および相同組換え組み込みエレメントを含むターゲティングベクターを、多細胞生物の標的細胞がターゲティングベクターを取り込むように、多細胞生物と接触させる（例えば、全身投与または局所投与を介して）。ターゲティングベクターは、標的細胞に供給された線状化エンドヌクレアーゼ（例えば、リコンビナーゼ）によって線状化された最初は環状のターゲティングベクターであるものである。線状化ターゲティングベクター由来の組み込みエレメントにより、標的細胞ゲノムを相同組換えする。本発明の方法の実施で使用するためのターゲティングベクター、システム、およびキットも提供する。
【００３５】
本発明をさらに説明する前に、特定の態様の変形形態を得ることができ、これらが依然として本発明の範囲内に含まれるので、本発明は下記の本発明の特定の態様に制限されないと理解すべきである。使用したテクノロジーは特定の態様の説明を目的とし、本発明の制限を意図しないことも理解すべきである。代わりに、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立される。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス段階を本発明の目的、精神、および範囲に適合させるために多数の修正形態を得ることができる。全てのこのような修正形態は、本明細書で構成される特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【００３６】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、他で明確に示さない限り、単数形「1つの(a、an)」、および「その(the)」は、複数形を含む。逆に、特許請求の範囲を、任意の随意的要素を排除するように作成することができることが意図される。この記述は、クレイム要素の引用と関連するか、「負の」制限の使用によって、「単に(solely)」および「のみ(only)」などの排他的用語の使用のための先行事項の基本として役立つことが意図される。
【００３７】
値の範囲が提供されている場合、それぞれの間の値（他で明確に示さない限り下限単位の1/10）この範囲の上限と下限との間、および任意の他の記載の範囲または記載の範囲の間の値は本発明の範囲内に含まれることが理解される。これらの小さい方の範囲の上限および下限を、独立して小さいほうの範囲に含めることができ、これも本発明の範囲内に含まれ、記載の範囲内の任意の特に排除された限度に供する。記載の範囲は一方または両方の限度を含み、いずれかまたは両方の含まれる限度を排除する範囲も本発明に含まれる。また、本明細書中に記載の本発明の変形形態の任意の随意的特徴を記載し、独立してか本明細書中に記載の任意の1つまたは複数の特徴と組み合わせて請求することができることが意図される。
【００３８】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。本明細書中に記載のものと類似または等価な任意の方法、デバイス、および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料をここに記載する。
【００３９】
本明細書中に記載の全ての既存の主題（例えば、刊行物、特許、特許出願、およびハードウェア）は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。本出願の出願日前の開示のために好ましい事項が単独で提供される。本発明が先行発明によってこのような材料に先行する権利がないと解釈されない。
【００４０】
上記でまとめるように、本発明は、外因性核酸による多細胞生物の標的細胞ゲノムの相同組換え方法ならびに本発明の方法の実施で使用するためのキットおよびシステムを提供する。本発明のさらなる説明では、最初により詳細に方法を説明し、その後本発明の方法の実施で使用するための本発明のシステムおよびキットならびにその成分を概説する。
【００４１】
本発明の遺伝子ターゲティングベクターの使用方法
上記の本発明のベクターは、標的細胞（例えば、植物、動物（例えば、哺乳動物を含む脊椎動物）などの多細胞生物中に存在する標的細胞）のゲノムへの外因性核酸の移入および安定な組み込みが望ましい種々の適用で使用される。本発明のベクターは、特に、外因性核酸による動物（昆虫、脊椎動物などを含む）の標的細胞ゲノムの相同組換えを介した部位特異的組み込みで適用される。一定の態様では、本発明のベクターを使用することができる動物は脊椎動物であり、多数の態様では、動物は哺乳動物である。したがって、多数の態様では、脊椎動物（特に、鳥類および海生動物（例えば、ニワトリおよびゼブラフィッシュなど）、哺乳動物（マウス、有蹄動物、ブタ、ヒツジ、ウマ、ラット、イヌ、ネコ、サル、およびヒトなどが含まれる））をターゲティングするための本発明のベクターの使用が特に興味深い。
【００４２】
本発明の方法では、本発明のターゲティングベクターを、ターゲティングベクターが細胞によって取り込まれるか内在化するのに十分な条件下で標的細胞と接触させる。相同組換え事象前に最初に環状のターゲティングベクターを線状化し、ベクターの組み込みエレメントを相同組換えによって標的細胞のゲノムに挿入する。
【００４３】
ターゲティングベクター
上記のように、本発明の方法で使用されるターゲティングベクターは環状ベクター、より詳細には環状二本鎖DNAベクター（すなわち、プラスミド）である。環状ターゲティングベクターのサイズは変化することができ、全体のサイズは少なくとも約100塩基対、時々少なくとも約1000塩基対、時々少なくとも約3kbであってよく、一定の態様では、サイズは300kbまたはそれ以上ほどであってよいが、一般に、約30kbを超えず、しばしば約15kbを超えない。本発明のターゲティングベクターは、以下の2つのエレメントを含むベクターである。（a）線状化エンドヌクレアーゼ部位および（b）相同組換え組み込みエレメント。一定の態様では、ターゲティングベクターは、線状化エンドヌクレアーゼコード配列などの1つまたは複数のさらなるエレメントを含み得る。
【００４４】
線状化エンドヌクレアーゼ部位
本発明のターゲティングベクターは、線状化エンドヌクレアーゼ部位を含む。線状化エンドヌクレアーゼ部位は、エンドヌクレアーゼによって認識される（すなわち、エンドヌクレアーゼによって切断される）ヌクレオチド残基の部位またはドメインであり、エンドヌクレアーゼが酵素的に前記部位で二本鎖を切断し、それにより環状ターゲティングベクターが線状化される。線状化エンドヌクレアーゼ部位はパリンドロームであっても非パリンドロームであってもよく、しばしば少なくとも約4ヌクレオチド長、時々少なくとも約16ヌクレオチド長、時々少なくとも約24ヌクレオチド長であり、この長さは少なくとも約50ヌクレオチドまたはそれ以上であり得るが、典型的には約600ヌクレオチド長を超えない。線状化エンドヌクレアーゼ部位は、一般に、標的細胞ゲノム中で見出されないか、切断された場合に不都合な結果が得られないように細胞内で修復されるように数コピーが存在するか、本発明の方法の実施によって標的細胞ゲノムが有意に切断されないように細胞部位（例えば、DNA構造（メチル化など）、結合タンパク質など）が保護されているものである。
【００４５】
ある態様では、本発明のベクターの特徴は、線状化エンドヌクレアーゼ部位が標的細胞に対して内因性であるエンドヌクレアーゼによって選択的に認識されないことである。言い換えれば、標的細胞はそのゲノム中に線状化エンドヌクレアーゼのコード配列を内因的に含まない。したがって、線状化エンドヌクレアーゼ部位は、標的細胞の種と異なる種に対して内因性の線状化エンドヌクレアーゼによって認識されるものである。このような標準的な分類基準（国立衛生研究所から提供されている分類表の開発に使用された基準など）で分類する場合、任意の2つの所与の生物は異なる種であると見なされる。線状化エンドヌクレアーゼがデザイン対象の標的細胞に対して内因的でない線状化エンドヌクレアーゼによって認識されるにもかかわらず、一定の態様では、以下にさらに詳述するように、標的細胞を線状化エンドヌクレアーゼを発現するように操作した。本発明のこの特徴の別の考察方法は、ターゲティングベクター中に存在するその標的部位を認識する線状化エンドヌクレアーゼが標的細胞の野生型生物中で見出されないことである。
【００４６】
以下にさらに詳述するように、「エンド-アウト（ends-out）」または「エンドイン（ends-in）」ターゲティングスキームでターゲティングベクターを使用すべきであるかどうかに依って、線状化エンドヌクレアーゼ部位はターゲティングエレメントの内側または外側に存在することができる。「エンド-アウト」および「エンド-イン」ターゲティングスキームは当業者に公知であり、Rong and Golic,Science（2000）288:20132018で概説されている。したがって、一定の態様では、線状化エンドヌクレアーゼ部位は組み込みエレメントの内側に存在する。さらに他の態様では、線状化エンドヌクレアーゼ部位は組み込みエレメントの外側に存在する。これらの態様では、線状化エンドヌクレアーゼ部位が標的化ゲノムに組み込まれないことが望ましい場合、線状エンドヌクレアーゼ部位がベクター上の組み込みエレメントの外側（すなわち、ベクター上の組み込みエレメントの5’または3’）に位置付けられるようにエンド-アウトアプローチを使用する。
【００４７】
対象となる特定のエンドヌクレアーゼが上記のレアカット酵素（例えば、I-Sce-1、I-Ssp-1など）である場合、線状化エンドヌクレアーゼ部位は制限エンドヌクレアーゼによって認識されるものであり得るが、一定の態様では、リコンビナーゼがレソルバーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、またはトランスポザーゼであり得る場合、部位はリコンビナーゼによって認識される。対象となるリコンビナーゼおよびトランスポザーゼの例は、例えば、バクテリオファージP1由来のCre-loxシステム、サッカロマイセス・セレビジエのFLP-FRTシステム、チゴサッカロミセス・ロキシ（Zygosaccharomyces rouxii）のR-RSシステム、バクテリオファージMuのGin-gixシステム、キイロショウジョウバエのPエレメントトランスポザーゼ/Pフットシステム、φC31 att部位/インテグラーゼシステムである。エンドヌクレアーゼがリコンビナーゼであり、且つエンドヌクレアーゼ部位がトランスポゾンの境界を作製する末端反復である場合、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ部位は、いくつかの公知の転位エレメント（例えば、ショウジョウバエのhobo、copia、gypsyエレメント、植物のAc/Dc、En/Spm、Tamシステム、線虫（C.elegans）の任意のTcエレメント、サッカロマイセス・セレビジエのTYエレメント、種々の高等真核生物のマリナーおよびマリナー様（例えば、Sleeping Beauty）エレメント、大腸菌の任意のTnおよびISS転位エレメントなど）の任意の1つ由来のものであり得る。エンドヌクレアーゼがリコンビナーゼであり、且つエンドヌクレアーゼ部位がエンドヌクレアーゼによって認識される組換え部位（例えば、att部位、認識配列など）である場合、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ部位は、バクテリオファージ（λ、φC31、γδバクテリオファージattシステムなど）の内の1つ、転位エレメント、ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）、または他のシステムに由来し得る。これらの例およびエンドヌクレアーゼの定義が与えられた場合、当業者は本発明での使用ために他の制限エンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、およびトランスポザーゼを容易に同定することができる。これらのエンドヌクレアーゼの切断部位（例えば、I-SceIおよびloxP部位、Pフット、LTR、att部位など）は当技術分野において十分に説明されている（Marshallら、TIG 1992 8:432-439；Hallet and Sherrattら、FEMS Mic.Reviews 21 1999 157-178；Sadowskiら、FASEB J,1993 7:760-767）。
【００４８】
任意の事象では、多細胞生物への投与前または投与後にベクターを任意の上記方法などによって線状化する。線状化ベクターは、相同組換えを開始するための細胞における重要なシグナル伝達事象である。
【００４９】
組み込みエレメント
線状化エンドヌクレアーゼ部位に加えて、本発明のターゲティングベクターはまた、ベクターが使用されるようにデザインされた標的細胞ゲノムを用いて相同組換えされる配列に隣接した外因性ヌクレオチドまたは核酸（すなわち、標的細胞ゲノムへの組み込みが望まれる核酸）から作製された相同組換え組み込みエレメントを含む。上記で考察されるように、相同隣接配列は標的ゲノム中の標的部位に対して配列同一性を示し、ベクターの組み込みエレメントと標的部位との間の相同組換えを容易にして標的細胞ゲノムに組み込みエレメントが挿入される。隣接相同配列の長さを変化させることができ、長さは、典型的には、少なくとも約500塩基対、通常、少なくとも約500塩基対、より通常には少なくとも約1kbであり、一定の態様では、長さは、少なくとも約30kbまたはそれ以上であるが、時々約10kbを超えず、時々約3kbを超えない。
【００５０】
相同組換えされる隣接配列は、ゲノムに挿入すべき外因性核酸であり、外因性核酸が少なくとも約1nt長であり、多数の態様では、外因性核酸は少なくとも2またはそれ以上のnt長であり、一定の態様では、外因性核酸は少なくとも約100nt長、時々少なくとも約1,000nt長であり、外因性核酸は30kgまたはそれ以上もの長さであり得るが、時々約3,000nt長を越えない。一定の態様では、対象となる核酸フラグメントが形質発現（trait-producing）核酸であり得る場合、外因性核酸には、発現カセット、発現調節核酸、治療遺伝子、および発現破壊核酸などが含まれる。
【００５１】
選択的成分
上記のように、本発明のベクターはまた、ターゲティングベクターがデザインされた特定の適用またはプロトコールに依存して、多数の選択成分を含み得る。以下により詳細に記載するように、本発明の方法の実施では、ターゲティングベクターに加えて、相同組換えを介した標的ゲノムへのターゲティングベクターの組み込みを媒介するためのエンドヌクレアーゼが存在するように、本発明のシステムのエンドヌクレアーゼ成分（例えば、タンパク質またはこれをコードする核酸）も標的細胞に移入する。線状化エンドヌクレアーゼを、ポリペプチドまたは所望のエンドヌクレアーゼ活性を有する産物をコードする核酸として標的細胞に移入することができる。これらの後者の態様では、ターゲティングベクターから離れたベクター中の核酸を標的細胞に移入することができるか、所望のエンドヌクレアーゼ活性をコードする核酸がターゲティングベクター自体に存在することができる。したがって、これら後者の態様では、ターゲティングベクターは、ベクター上の線状化エンドヌクレアーゼ部位を認識するエンドヌクレアーゼをコードするドメインをさらに含む。エンドヌクレアーゼコード核酸を化学合成するか、従来の組換えDNA法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ライブラリースクリーニングなど）によって核酸を保有する宿主から単離し、発現用のターゲティングベクターにクローン化することができる。このようなヌクレオチドを、使用前に修飾する（例えば、制限部位を除去するため、コドン使用頻度を変化させるため、調節領域を変化させるため、イントロンを付加/除去するためなど）ことができると理解される。
【００５２】
上記のように、線状化エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼであってよく、リコンビナーゼはレソルバーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、またはトランスポザーゼであり得る。対象となるリコンビナーゼシステムおよびトランスポザーゼシステムの例は、例えば、バクテリオファージP1由来のCre-loxシステム、サッカロマイセス・セレビジエのFLP-FRTシステム、チゴサッカロミセス・ロキシのR-RSシステム、バクテリオファージMuのGin-gixシステム、キイロショウジョウバエのPエレメントトランスポザーゼ/Pフットシステム、φC31 att部位/インテグラーゼシステムである。エンドヌクレアーゼがリコンビナーゼであり、且つエンドヌクレアーゼ部位がトランスポゾンの境界を作成する末端反復である場合、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ部位は、いくつかの公知の転位エレメント（例えば、ショウジョウバエのhobo、copia、gypsyエレメント、植物のAc/Dc、En/Spm、Tamシステム、線虫の任意のTcエレメント、サッカロマイセス・セレビジエのTYエレメント、種々の高等真核生物のマリナーおよびマリナー様（例えば、Sleeping Beauty）エレメント、大腸菌の任意のTnおよびISS転位エレメントなど）の任意の1つ由来のものであり得る。エンドヌクレアーゼがリコンビナーゼであり、且つエンドヌクレアーゼ部位がエンドヌクレアーゼによって認識される組換え部位（例えば、att部位、認識配列など）である場合、エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ部位は、バクテリオファージ（λ、φC31、γδバクテリオファージattシステムなど）の内の１つ、転位エレメント、ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなど）、または他のシステムに由来し得る。従って、一定の態様では、ターゲティングベクターは、上記の線状化エンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。さらに、一定の態様は、エンドヌクレアーゼが既に多細胞生物（天然の遺伝子または遺伝子操作された生物）のゲノム中に存在するシステムを使用することができる。
【００５３】
さらなる選択的成分
ある態様では、対象となる核酸フラグメントとして遺伝子ターゲティングベクター中に選択マーカーがさらに含まれる。選択マーカーにより、ベクターが組み込まれていない細胞よりも遺伝子ターゲティングベクターが組み込まれた細胞を選択可能である。
【００５４】
ベクターの構築
本発明のベクターを、標準的な制限酵素切断方法、ライゲーション、および分子クローニングによって産生することができる。本発明のベクターの1つの構築方法は、以下の段階を含む。第1に、所望の成分ヌクレオチド配列を含む精製核酸フラグメントおよび外来配列を、最初の起源由来の制限エンドヌクレアーゼで切断する。次いで、従来の分離方法（例えば、アガロースゲル電気泳動）を使用して、所望のヌクレオチド配列を含むフラグメントを、異なるサイズの望ましくないフラグメントから分離する。所望のフラグメントをゲルから切り出し、適切な配置で互いにライゲーションして所望の配列（例えば、上記の本発明のベクターの種々のエレメントに対応する配列）を含む環状核酸またはプラスミドを産生する。所望の場合、次いで、このようにして構築した環状分子を原核生物宿主（例えば、大腸菌）中で増幅させる。これらの段階に関連する切断、プラスミド構築、細胞形質転換、およびプラスミド産生の手順は、当業者に周知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販されている。（例えば、R.Wu,Ed.,Methods in Enzymology,Vol.68,Academic Press,N.Y.（1979）；T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）；Catalog 1982-83,New England Biolabs,Inc.；Catalog 1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc.を参照のこと）。
【００５５】
ターゲティングベクターの標的細胞への接触
上記でまとめたように、本発明の方法の実施では、本発明のターゲティングベクターを、細胞によってターゲティングベクターが内在化されるようにそのゲノムを修飾される標的細胞と接触させる。ターゲティングベクターの内在化の際（いくつかの点でターゲティングベクターを適切な線状化エンドヌクレアーゼによって線状化する）、組み込みエレメントにより標的細胞ゲノムが相同組換えを起こす。
【００５６】
任意の従来のプロトコールを使用して、ターゲティングベクターを標的細胞に接触させることができる。これらの態様では、標的細胞が多細胞生物（例えば、動物）の一部として存在する場合、典型的には、ターゲティングベクターを多細胞生物（例えば、動物全体）に投与（例えば、注射、食餌など）し、投与は全身または局所（例えば、多細胞生物の特定の組織および/または器官に直接に投与する）であり得る。
【００５７】
ターゲティングベクターを、ベクターをインビボ、インビトロ、またはエキソビボで移入することができる任意の従来のプロトコールを使用して動物細胞に移入することができる。本発明のベクターの送達で適用されるインビボプロトコールには、ベクターの細胞または組織特異的送達のために特異的細胞型にターゲティングすることができる脂質ベースの（例えば、リポソーム）送達体を介した送達が含まれる。このような方法を開示した特許には、以下が含まれる。米国特許第5,877,302号；同第5,840,710号；同第5,830,430号；および同第5,827,703号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）。他のインビボ送達システムも使用することができ、以下が含まれる。キャリアとしてのポリリジンベースのペプチド（ターゲティング部分で修飾してもしなくても良い）の使用、微量注入、およびエレクトロポレーションなど。（Brooks,A.I.,ら1998,J.neurosci.Methods V.80 p:137-47；Muramatsu,T.,Nakamura,A.,and H.M.Park 1998,Int.J.Mol.Med.V.1p:55-62）。対象となる一定の態様では、ウイルスベースの核酸移入ベクターを使用しない。使用することができる複数の異なる型のベクターおよび送達体のために、多数の異なる経路で投与することができ、代表的な投与経路には、経口、局所、動脈内、静脈内、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、結膜内などが含まれる。特定の投与様式は、少なくとも一部はベクターのために使用された送達体の性質に依存する。多数の態様では、ベクターを、水ベースの送達体（例えば、生理食塩水）を使用して血管内（例えば、動脈内または静脈内）に投与する。
【００５８】
動物に移入されるベクター核酸の量は、外因性核酸のゲノムへの望ましい組み込みに十分である。したがって、ターゲティングベクター核酸の移入量により十分なコピー数の外因性核酸が得られるはずである。使用される特定の移入またはトランスフェクションプロトコールの効率に依存して、動物へのベクター核酸の移入量は変化する。
【００５９】
上記のように、ターゲティングベクターを、最初環状のターゲティングベクターを線状するためのエンドヌクレアーゼ部位のベクターの切断に十分な条件下（すなわち、ベクター線状化条件）で標的細胞に移入し、このような条件は多数の方法で得られ、このような条件には、多細胞生物への投与前に最初環状のターゲティングベクターが線状化される状況および最初環状のターゲティングベクターを多細胞生物に投与する（最初に環状の形態でその後インビボで線状化される）（例えば、標的細胞中で線状化エンドヌクレアーゼを発現するように操作された宿主の使用または線状化エンドヌクレアーゼまたはそれによるコード配列の細胞または細胞を含む宿主への同時投与（ベクターの投与前、投与後、または同時に同時投与することができる）による）状況が含まれる。
【００６０】
したがって、最初環状のターゲティングベクターがインビボで線状化されるこれらの後者の態様では、ターゲティングベクターの線状化および相同組換えを介した標的ゲノムへの組み込みエレメントの組み込みを媒介するために、本発明のシステムのエンドヌクレアーゼ成分（例えば、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸）は標的細胞中に存在する。上記のように、線状化エンドヌクレアーゼを発現するために宿主を予め操作することができるか、線状化エンドヌクレアーゼを標的細胞に投与することができる。ポリペプチドとして線状化エンドヌクレアーゼ活性が得られる場合、任意の従来のポリペプチド/タンパク質移入プロトコールを使用することができる。細胞への機能的タンパク質の移入方法は、当技術分野において周知である。または、エンドヌクレアーゼをコードする核酸（nucleic）を、細胞の形質転換に使用する発現ベクターに含めることができる。エンドヌクレアーゼコード核酸を化学合成するか、従来の組換えDNA法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ライブラリースクリーニングなど）によって核酸を保有する宿主から単離し、発現用の適切なベクターにクローン化することができる。このようなヌクレオチドを、使用前に修飾する（例えば、制限部位を除去するため、コドン使用頻度を変化させるため、調節領域を変化させるため、イントロンを付加/除去するためなど）ことができると理解される。
【００６１】
上述のように、本方法により、標的細胞ゲノムに相同組換え組み込みエレメントが組み込まれる。
【００６２】
上記組み込み方法を使用して、広範な種々の外因性核酸を標的細胞に安定に組み込むことができる。多数の態様では、外因性核酸中に存在するヌクレオチド配列は、標的細胞のゲノム中に見出されない配列である（すなわち、標的細胞に対して異種である）。他の態様では、外因性核酸配列は、実際に標的細胞中に存在するものである。
【００６３】
上記のように、本発明のシステムを、種々の標的細胞と共に使用することができ、多数の態様では、標的細胞は非細菌標的細胞であり、しばしば植物および動物標的細胞（例えば、昆虫細胞、脊椎動物細胞、特に鳥類細胞（例えば、ニワトリ細胞）、哺乳動物細胞（マウス、ブタ、有蹄動物、ヒツジ、ウマ、ラット、イヌ、ネコ、サル、およびヒトの細胞などが含まれる））を含む真核生物標的細胞である。
【００６４】
有用性
本発明の方法は、標的細胞への外因性核酸の部位特異的組み込みが望ましい種々の適用で使用される。本発明のベクターおよび方法が使用される適用には、研究への適用、ポリペプチド合成への適用、および治療への適用が含まれる。これらの代表的な各適用カテゴリーを、以下に個別にさらに詳細に記載する。
【００６５】
研究への適用
本発明の方法が使用される研究への適用例には、特定の遺伝子を特徴付けるようにデザインされた適用が含まれる。このような適用では、1）対象となる遺伝子またはコード配列を標的細胞に挿入するため、2）一部または全部の遺伝子を欠失させるため、または3）1つまたは複数の特定のヌクレオチドを遺伝子中の異なるヌクレオチドに置換するためのいずれかにベクターを使用し、動物の表現型に対する効果が認められる。この様式では、遺伝子の活性および遺伝子によってコードされた産物の性質に関する情報を予想することができる。
【００６６】
細胞中で対象となる遺伝子が発現され（過剰発現および/または誤発現が含まれる）、この変異発現パターンの効果が認められるモデルを産生するために本発明のベクターを使用することもできる。したがって、当技術分野において公知の種々の異なる条件のためのモデルとして使用することができる特別にデザインされたトランスジェニック動物、ノックアウト動物、またはノックイン動物の有効且つ迅速な産生のために本発明の方法および組成物を使用することができる。
【００６７】
ポリペプチド合成への適用
上記の研究への適用に加えて、本発明の方法およびベクターはまた、ポリペプチド（例えば、対象となるタンパク質）の合成で使用される。このような適用では、不可欠および/または所望の発現調節配列（例えば、プロモーターなど）（すなわち、発現モジュール）と組み合わせた対象となるポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクターを、ポリペプチド発現のための発現宿主としての機能を果たす標的細胞に移入する。移入およびその後の標的細胞ゲノムへの安定な組み込み後、ターゲティングされた宿主細胞を組み込み遺伝子の発現に十分な条件下で維持する。一旦形質転換されると、タンパク質を発現する宿主を調製し、その後タンパク質を精製して組成物を含む所望のタンパク質を産生する。任意の都合の良いタンパク質精製手順を使用することができ、適切なタンパク質精製方法は、Guide to Protein Purification（Deuthser ed.）（Academic Press,1990）に記載されている。例えば、タンパク質を発現する発現宿主から溶解物を調製し、HPLC、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィなどを使用して精製することができる。
【００６８】
インビボタンパク質産生
本発明の組換え細胞は、組換え細胞系集団、組換え初代または二次細胞集団、組換えクローン細胞株または細胞系、組換え異種細胞株または細胞系、および前記の4つの組換え細胞カテゴリーの1つの少なくとも1つの代表的細胞が存在する細胞混合物として有用である。1）治療タンパク質（例えば、個体の生理学的所要量と比較して存在しないか過少産生されるか、個体での使用が欠損しているか不十分であるか不適切であるタンパク質；酵素機能または輸送機能などの新規機能を有するタンパク質）または2）治療核酸（例えば、遺伝子発現を阻害するか内在性酵素活性を有するRNA）のいずれかである治療産物の送達に応答する異常または望ましくない病態を有する個体の治療のための送達システムでこのような細胞を使用することができる。治療タンパク質もしくは核酸を得るための本発明の方法では、組換え初代細胞、クローン細胞株、または異種細胞株を異常または望ましくない病態を治療または予防すべき個体に生理学的に関連するレベルでタンパク質または外因性DNAを発現するか提供するために十分な量および適切な経路で投与する。代表的な対象となる治療タンパク質には、第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセルブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α1-抗トリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、フェニルアラニン水素化酵素、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インターロイキン、サイトカイン、および小ペプチドなど（上記タンパク質がヒトタンパク質である場合）が含まれるが、これらに限定されない。または、上記ベクターシステムを、例えば、適切なシステムまたは局所投与経路を介して生物に直接投与し、ベクター成分が1つまたは複数の標的細胞に侵入し、例えば、治療目的（例えば、本発明の方法の実施前に発現されない治療タンパク質の発現）を達成するためにターゲティングされたゲノムドメインの転写を調整する。生理学的に関連するレベルは、産物が体内で正常に産生されるレベルまたは異常もしくは望ましくない病態の改善に近づけるレベルである。例えば、hGH、hEPO、ヒトインスリノトロピン（insulinotropin）、hGM-CSF、hG-CSF、ヒトα-インターフェロン、またはヒトFSHβを治療のためにヒトに全身送達することができる。したがって、本発明のベクターシステムは治療への適用に使用され、例えば、遺伝子治療への適用で実施することができるので、方法およびベクターはゲノムドメイン（例えば、標的細胞の治療タンパク質をコードするもの）の転写調整に使用される。本発明のベクターを使用して、広範な種々の治療タンパク質の転写を調整することができる。
【００６９】
インビトロタンパク質産生
本発明のヒトまたは非ヒト種由来の組換え細胞をインビトロタンパク質産生に使用することもできる。タンパク質が発現される当技術分野において公知の条件下で細胞を維持する。記載の方法を使用して発現したタンパク質を、所望のタンパク質を精製するために細胞溶解物または細胞上清から精製することができる。本方法に従って作製したタンパク質には、当技術分野において公知の従来の薬学的経路（例えば、経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮下）によってヒトまたは非ヒト動物に送達することができる治療タンパク質が含まれる。このようなタンパク質には、hGH、hEPO、およびヒトインスリノトロピン、hGM-CSF、hG-CSF、FSHβ、またはα-インターフェロンが含まれる。これらの細胞は、不死化細胞、初代細胞、または二次細胞であり得る。非ヒトタンパク質が治療または商業的に有用であるタンパク質産生の目的に非ヒト細胞が有利である場合、他の種由来の細胞の使用が望ましい（例えば、サケカルシトニン産生のためのサケ由来の細胞の使用、ブタインスリン産生のためのブタ由来の細胞の使用、およびウシ成長ホルモン産生のためのウシ細胞の使用）。
【００７０】
したがって、本発明の方法は、ポリペプチド（例えば、対象となるタンパク質）の合成で適用される。このような適用では、対象となるポリペプチドのための転写調整単位を含むベクターを、ポリペプチド発現のための発現宿主として機能を果たす標的細胞に移入する。移入およびその後の標的細胞ゲノムへの安定な組み込み後、ターゲティングされた宿主細胞を、新規に組み込まれた転写調整単位に新たに操作可能に連結された遺伝子の発現に十分な条件下で維持する。一旦形質転換されると、タンパク質を発現する宿主を調製し、その後タンパク質を精製して組成物を含む所望のタンパク質を産生する。任意の都合の良いタンパク質精製手順を使用することができ、適切なタンパク質精製方法は、Guide to Protein Purification（Deuthser ed.）（Academic Press,1990）に記載されている。例えば、タンパク質を発現する発現宿主から溶解物を調製し、HPLC、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、およびアフィニティクロマトグラフィなどを使用して精製することができる。
【００７１】
治療への適用
本発明のベクターは、治療への適用でも使用され、方法およびベクターを使用して治療核酸（例えば、遺伝子またはそのタンパク質/因子コード配列）を標的細胞のゲノムに安定に組み込む（すなわち、遺伝子治療への適用）。本発明のベクターを使用して、広範な種々の治療核酸を送達させることができる。遺伝子欠損ベースの疾患の治療で使用するための特定の治療遺伝子には、以下の産物をコードする遺伝子が含まれる。第VIII因子、第IX因子、β-グロビン、低密度リポタンパク質受容体、アデノシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、グルコセルブロシダーゼ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、α1-抗トリプシン、CD-18、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、フェニルアラニン水素化酵素、分岐鎖α-ケト酸デヒドロゲナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、グルコース6-ホスファターゼ、α-L-フコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、ガラクトース1-リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、インターロイキン、サイトカイン、および小ペプチドなど。
【００７２】
上記タンパク質リストは、哺乳動物タンパク質、多数の態様ではヒトタンパク質をいい、上記タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は一般に当業者に公知である。本発明のベクターを介して送達させることができる癌治療遺伝子には、リンパ球の抗腫瘍活性を増強する遺伝子、発現産物が腫瘍細胞の免疫原性を増強する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素遺伝子、自殺遺伝子、多剤耐性遺伝子、およびアンチセンス配列などが含まれる。
【００７３】
本発明の遺伝子ターゲティングベクターの動物への直接投与は、多数の治療用途を有し、疾患または病態に関連する変異遺伝子配列の修正、内因性遺伝子の活性化、有毒内因性遺伝子の破壊、外因性遺伝子の移入などが含まれる。当業者は、この遺伝子ターゲティングシステムの多数の有用性を認識する。
【００７４】
システム
本発明の方法の実施で使用するためのシステムも提供する。本発明のシステムには、上記の最小ターゲティングベクターが含まれる。ターゲティングベクターにより線状化エンドヌクレアーゼ活性が得られない場合、本発明のシステムには、典型的には、線状化エンドヌクレアーゼ活性の供給源（例えば、所望の活性を有するポリペプチドまたは所望のエンドヌクレアーゼ活性を有する産物をコードする核酸）が含まれる。
【００７５】
キット
本発明の方法の実施で使用するためのキットも提供する。本発明のキットは、少なくとも上記のターゲティングベクターおよび対応するエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼコード核酸を含み、この後者の成分はターゲティングベクターから離れた成分であってもそうでなくてもよい。本発明のキットは、さらに、本発明で使用される他の成分（例えば、緩衝液、送達体など）を含み得る。
【００７６】
キットの種々の成分は、個別のコンテナ中に存在し得るか、所望ならば一定の適合可能な成分を1つのコンテナに予め組み合わせることができる。
【００７７】
上記成分に加えて、本発明のキットは、本発明を実施するための説明書をさらに含む。これらの説明書は、種々の形態で本発明のキット中に存在することができ、その1つまたは複数がキット中に存在し得る。これらの説明書が存在し得る1つの形態は、適切な媒体または被印刷物（例えば、情報が印刷された紙切れ、キット中の包装、添付文書など）上の印刷された情報として存在し得る。さらに別の手段は、情報が記録されたコンピュータ読取可能媒体（例えば、ディスケット、CDなど）である。存在し得るさらに別の手段は、離れたサイトの情報にアクセスするためにインターネットを介して使用することができるウェブサイトアドレスである。任意の都合の良い手段がキットに存在し得る。
【００７８】
以下の実施例は例示のために提供され、本発明を決して制限しない。
【００７９】
実施例
以下の実施例は、当業者にどのようにして本発明を作製および使用するかを完全に開示および説明し、発明者が発明と見なす範囲を制限することや以下の実験が実施した全実験または唯一の実験であることを示すことを意図しない。使用した数字（例えば、量、温度など）は確実に正確であるように努めたが、いくらかの実験の誤差および偏差が含まれるはずである。他で示さない限り、パーツ（parts）は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気または大気付近である。
【００８０】
ベクターの構築
下記のDNAベクターのための出発材料は当業者に容易に利用可能である（例えば、Casper4およびPエレメントトランスポザーゼプラスミド（Flybase）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）ラットゲノムDNA（ATCCから入手可能であり、そのウェブサイトアドレスは「atcc」の前に「www.」後に「.org」がつく）、ホエイ結合タンパク質（WAP）マウスゲノムDNA（これもATCC（www.atcc.org）から入手可能である）、Sleeping Beauty DNA（ミネソタ大学）（例えば、関連配列情報については米国特許第6,489,458号（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと）、および1つのPI-SCEI切断部位を有するプラスミド（New England Biolabs））。Casper4は、非ショウジョウバエ種のゲノムに組み込まれないので、相同組み込み試験で使用することができるか、標準的な制限消化およびクローニング手順（1つのPフット切断部位の遊離）を使用してベクターから1つのPフットを欠失することができる。種々の種に組み込まれないSleeping Beautyエレメントに関しては、1つのフットを欠失させなければならない。各フット（トランスポザーゼ認識配列）が同一であるので、いずれかを除去することができる。Pエレメントベクター、Sleeping Beautyベクター、またはプラスミドを含むPI-SCEI1切断部位は、下記のように標準的な分子生物学手順を使用してこれにクローン化された所望のWAPまたはODC DNAを有する。本発明のベクターを、標準的な制限酵素切断法、ライゲーション法、および分子クローニング法によって産生することができる。
【００８１】
本発明のベクターの1つの構築プロトコールは、以下の段階を含む。第1に、所望の成分ヌクレオチド配列を含む精製核酸フラグメントおよび外来配列を、最初の起源由来の制限エンドヌクレアーゼで切断する。次いで、従来の分離方法（例えば、アガロースゲル電気泳動）を使用して、所望のヌクレオチド配列を含むフラグメントを、異なるサイズの望ましくないフラグメントから分離する。所望のフラグメントをゲルから切り出し、適切な配置で互いにライゲーションして所望の配列（例えば、上記の本発明のベクターの種々のエレメントに対応する配列）を含む環状核酸またはプラスミドを産生する。所望の場合、次いで、このようにして構築した環状分子を原核生物宿主（例えば、大腸菌）中で増幅させる。これらの段階に関連する切断、プラスミド構築、細胞形質転換、およびプラスミド産生の手順は、当業者に周知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販されている。（例えば、R.Wu,Ed.,Methods in Enzymology,Vol.68,Academic Press,N.Y.（1979）；T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）；Catalog 1982-83,New England Biolabs,Inc.；Catalog 1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc.を参照のこと）。
【００８２】
実施例1
環状遺伝子ターゲティングベクターを使用したラットのオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子の遺伝子ターゲティング
このストラテジーが成功することを証明するために、環状遺伝子ターゲティングベクターを構築した。環状ベクターは、1つのショウジョウバエPエレメントトランスポザーゼ切断部位（Pフット）および変化したラットゲノムDNAフラグメントを含んでいた。その全配列が公知であり且つ市販されているので、ラットオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子（odc）を選択した。ベクター組み込みをアッセイするために、ベクターのodc遺伝子中に3つの小欠失を作製した。小欠失は、遺伝子の5’末端、3’末端、および中央領域に存在していた。修飾odc遺伝子の代わりに大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子を含む1つのコントロールベクターも作製した。このコントロールベクターは、ラットゲノムと有意に相同な公知の配列を含んでいなかった。ラットに50μgの環状odc/Pフット遺伝子ターゲティングベクターおよび10μgのPエレメントトランスポザーゼをコードするプラスミドDNAおよび環状ネガティブコントロールプラスミドを同時注射した。3週間後、ラットを屠殺し、ラット由来のゲノムDNAを種々の組織（そのいくつかには肝臓および腸が含まれる）から調製した。DNA（特に、Pフットおよび中程度のodc欠損を増幅するプライマーおよびコントロール）をPCR分析に供した。
【００８３】
Pフットまたはβ-ガラクトシダーゼ特異的プライマーを使用してコントロールを投与したラット由来の種々のゲノムDNAサンプルのPCRにより産物は得られないので、コントロールベクターの検出可能なゲノム組み込みは起こらなかった。修飾odc遺伝子を含む遺伝子ターゲティングベクターを投与したラット由来の種々のゲノムDNAサンプルのPCRにより、修飾odc遺伝子がラットゲノムに組み込まれたことが明らかとなった。さらに、これらのサンプル中のPフット特異的プライマーを使用して増幅を検出することができず、相同組換え機構によってodc遺伝子が組み込まれたことが示唆される。図1に示すように、相同組換えの証拠をさらに得た。
【００８４】
線状化ODCベクターおよび通常のゲノムODC遺伝子の略図を図1に示す。ODCベクターへのそのクローニング前に3つの小欠失を有するようにODC遺伝子を操作し、これらの欠失はゲノムODC遺伝子中の縦線によって示す。ゲノムDNAを上記ODCベクターを注射したラット組織から単離した。プライマー2および3と共にPCRを使用して、種々の組織中のODCベクターの組み込みについてゲノムDNAを試験した。PCR反応により、500bp長の強力な正常のゲノムODC遺伝子バンドが検出された。しかし、そのいくつかの子孫を含む注射動物のみに由来する多数の組織（例えば、脳、精巣、卵巣、尾、肝臓、肺、心臓、腸、脾臓）では、200bp長のさらなるバンドが検出された（ODCベクターのバンドサイズ）。ODCベクターの存在を示すバンドを示すDNAサンプルを、PフットDNAを特異的に検出するPCRプライマーを使用して試験した。PCR分析により、PフットDNAの存在は検出されなかった。この所見により、ODCベクターがラットゲノムDNAに無作為に組み込まれず、そうでなければPCRフット配列も検出可能であることが示唆される。最後に、サンプルに対して行ったプライマー1および3を使用したPCRは、注射されたラット由来のサンプルでは、ODC遺伝子の正常（ゲノム）形態および欠失（ODCベクター）形態の両方が存在することを示した。遺伝子の欠失形態がPCR増幅される唯一の方法は、ODCベクターが相同様式でODCゲノム遺伝子に組み込まれたかどうかである。
【００８５】
実施例2
環状遺伝子ターゲティングベクターを使用したマウスのホエイ結合タンパク質（WAP）遺伝子の遺伝子ターゲティング
このストラテジーもマウスで成功することを証明するために、環状遺伝子ターゲティングベクターを構築する。環状ベクターは、1つのショウジョウバエPエレメントトランスポザーゼ切断部位（Pフット）および変化したマウスゲノムDNAのフラグメントを含む。その全配列が公知であるので、マウスホエイ結合タンパク質遺伝子（WAP）を選択する。ベクターの組み込みをアッセイするために、ベクターのWAP遺伝子中に2つの小欠失を作製する。小欠失は、遺伝子の5’末端および3’末端に存在する。構成性に活性なマウスプロモーターを含む大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子を、修飾WAP遺伝子の中央にクローン化する。マウスに10μgの環状WAP遺伝子ターゲティングベクターおよび2μgのPエレメントトランスポザーゼをコードするプラスミドDNAおよび環状ネガティブコントロールプラスミドを同時注射した。3ヶ月後、注射動物およびその子孫由来の種々の組織（例えば、血液、肝臓、肺、腎臓）からゲノムDNAを調製した。DNA（特に、Pフット、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、およびWAP遺伝子とβ-ガラクトシダーゼ遺伝子の両方を増幅するプライマー）をPCR分析に供した。
【００８６】
Pフットまたはβ-ガラクトシダーゼ特異的プライマーを使用してコントロールを投与したマウス由来の種々のゲノムDNAサンプルのPCRにより産物は得られず、コントロールベクターの検出可能なゲノム組み込みは起こらないことが示された。WAP遺伝子ターゲティングベクターおよびコントロールを投与したマウス由来の種々のゲノムDNAサンプルのPCRにより、β-ガラクトシダーゼ遺伝子がゲノムに組み込まれてマウスゲノム中のWAPゲノム遺伝子中に存在することが示された。最後に、β-ガラクトシダーゼ遺伝子の発現を試験し、全ての組織中で発現が見出される。
【００８７】
実施例3
WAPベクターを以下のように修飾する。β-ガラクトシダーゼ遺伝子を除去し、WAP遺伝子の中央に小欠失を作製し、PフットDNA配列を欠失させる。このベクターを、DNAを制限エンドヌクレアーゼSspIに供することによって線状化する。この線状DNAをマウスに注射し、実施例2と同様に分析する。注射動物および遺伝的に変化したWAP遺伝子を有する子孫中の全ての試験組織中のWAP遺伝子にDNAが相同的に組み込まれる。
【００８８】
実施例4
マウス肥満症変異体に、対応する変異遺伝子の通常の形態を含む10μgの組み込みベクターおよび1μgのトランスポザーゼDNAを同時注射した。1週間に1回の注射を全部で10回注射した。または、遺伝子を含まないコントロールベクターも変異マウスに注射した。5週間後、コントロールマウスは平均して15％の体重増加を示した（マウスあたり約8gの体重増加）。通常の肥満遺伝子配列を含む組み込みベクターを注射したマウスは、平均して10％の体重増加を示した（マウスあたり約5gの体重増加）。組み込みベクターが肥満遺伝子のエクソン14〜17（およびこの領域にイントロンも含む）に対応するゲノムDNAを含んでいたので、相同組み込みのみによりマウスの肥満が治癒する。すなわち、遺伝子の小フラグメントのみを含み、且つプロモーターや翻訳開始部位などを含まないので、通常の肥満遺伝子フラグメントでは無作為に組み込まれた場合に表現型をレスキューすることができない。肥満マウスの変異は、エクソン15と16との間で起こることが公知である。これは、相同組み込みが起こるだけでなく生理学的応答を得るのに十分であることを示す。さらに、この特定の肥満遺伝子は脳で産生される必要があるので、このことは、このテクノロジーが血液脳関門を通過することができることを証明する。
【００８９】
実施例5
Pエレメントベースのベクターの代替物
実施例3と同一の欠損WAP遺伝子を有するベクターを構築した（上記を参照のこと）。今回は、ベクター骨格は、a）Sleeping Beautyまたはb）他のレアDNA切断酵素（例えば、PI-SCE1）のいずれかの1切断部位を含んでいた。切断酵素（1μgのSleeping Beauty酵素のDNAおよび約5単位のNew England BiolabsのPI-SCE1）をコードするDNAと共に10μgのこれらのDNAをマウスに注射した。1週間間隔で注射した10回の注射後、1ヶ月間マウスにさらなる手順を施さなかった。次いで、マウスを屠殺し、各組織/器官を採取し、ゲノムDNAをそれぞれ個別のサンプルから調製した。これらのストラテジーを使用して相同組み込みが認められたが、その組み込み頻度はPエレメントベースのベクターで認められたものよりはるかに低かった。これはおそらくSleeping Beautyによって有効に切断されなかったためである。また、PI-SCE1について、注射時に切断することができるか、患者の細胞侵入能力が減少するか、おそらく酵素使用量が不十分であった。
【００９０】
実施例6
環状遺伝子ターゲティングベクターを使用したヒトの遺伝子治療
このストラテジーがヒトで成功することを証明するために、環状遺伝子ターゲティングベクターを構築する。環状ベクターは、1つのショウジョウバエPエレメントトランスポザーゼ切断部位（Pフット）および通常のヒトβ-グロビンゲノム遺伝子フラグメントを含む。その全配列が公知であり且つ鎌状赤血球貧血の原因であるので、ヒトβ-グロビン遺伝子を選択する。
【００９１】
選択されたβ-グロビン遺伝子の変異に起因する鎌状赤血球貧血患者に、4mgのPエレメントトランスポザーゼ発現プラスミドと共に20mgの環状遺伝子ターゲティングベクターを投与する。3週間毎のβ-グロビンターゲティング構築物の投与後、形態学的に正常な血球の存在を決定するために血液形態学試験を行う。さらに、末梢血サンプルから単離したゲノムDNAに対するDNA分析により、β-グロビン遺伝子が遺伝子ターゲティングベクターによって修復されることが決定された。最後に、鎌状赤血球貧血症状の軽減が報告される。
【００９２】
上記結果および考察から、本発明が多細胞生物の標的細胞ゲノムへの外因性核酸の部位特異的組み込みに効率的且つ非常に有効な試薬および方法を提供することが明らかである。この機構は相同組換えであるので、無作為な組み込みの問題が回避される。さらに、本発明は、相同組換え効率の有意な増大を提供する。したがって、本発明は、当技術分野に有意に貢献する。
【００９３】
本明細書中で引用された全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が具体的且つ個別に参照として組み入れられることが示されるかのように、参照として本明細書に組み入れられる。任意の刊行物の引用は、出願日以前の開示のためであり、本発明が先行発明によってこのような刊行物に先行する権利がないと解釈されるべきでない。
【００９４】
理解を明確にする目的で図面および実施例によっていくらか詳細に上記発明を記載しているが、本発明の技術に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく一定の変形形態および修正形態を得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】実施例の項で使用した線状化ODCベクターおよび通常のODC遺伝子の略図である。
【図１】
2006504402.tif 000002
【国際調査報告】
2006504402.tif 000003