(57)【要約】標的ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法であって、ここに、試験化合物が標的ポリペプチドおよび該標的ポリペプチドの基質と組み合わせられ、また、該試験化合物が該標的ポリペプチドの活性を調節するか測定される。該試験化合物は、肥満、糖尿病、インスリン耐性の治療に、またはインスリン分泌の促進に使用される小分子薬剤でありうる。標的ポリペプチドおよび対応する核酸、ならびにその変異体も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子であって、ｎが１〜８５の整数である核酸分子。
【請求項２】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸分子であって、ｎが１〜８５の整数である核酸分子。
【請求項３】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１〜８５の整数であるポリペプチド。
【請求項４】
単離ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、および配列番号１１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項５】
単離ポリペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４４、配列番号１４８、配列番号１５２、および配列番号１５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項６】
単離ポリペプチドが、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項７】
単離ポリペプチドが、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、および配列番号１５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項８】
単離ポリペプチドが、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、および配列番号５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項９】
単離ポリペプチドが、配列番号５６、配列番号５８、および配列番号１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
単離ポリペプチドが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、および配列番号１７０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
標的ポリペプチドの活性を調節する化合物の同定方法であって、以下の：
（ａ）  試験化合物を、標的ポリペプチドおよび標的ポリペプチドの基質と組み合わせること；および
（ｂ）  試験化合物が標的ポリペプチドの活性を調節するかを決定すること；
を含み、ここに、標的ポリペプチドが配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むものである、方法。
【請求項１２】
標的ポリペプチドの活性の阻害剤として標的ポリペプチドの活性を阻害することによって標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
標的ポリペプチドのアンタゴニストとして標的ポリペプチドの活性を阻害することによって標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１４】
標的ポリペプチドの活性の活性化剤として標的ポリペプチドの活性を活性化することによって標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１５】
標的ポリペプチドのアゴニストとして標的ポリペプチドの活性を活性化することによって標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１６】
インスリン分泌の促進剤として標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１７】
インスリン耐性の処置のための治療薬として標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１８】
肥満の処置のための治療薬として標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項１９】
糖尿病の処置のための治療薬として標的ポリペプチドの活性を調節する試験化合物を同定する工程をさらに含む、請求項１１の方法。
【請求項２０】
標的ポリペプチドが単離ポリペプチドである、請求項１１の方法。
【請求項２１】
標的ポリペプチドが、標的ポリペプチドの発現を促進する条件下にて、標的ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えホスト細胞を培養することを含む方法によって生じる、請求項１１の方法。
【請求項２２】
核酸が、以下の：
（ａ）  ｎが１〜８５の整数である配列番号２ｎ−１；
（ｂ）  配列番号２ｎの少なくとも１ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および
（ｃ）  配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
標的ポリペプチドが核酸を含む組み換えベクターの発現によって生じる、請求項１１の方法であって、核酸が配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするものである、方法。
【請求項２４】
哺乳動物培養細胞中にて試験化合物が標的ポリペプチドと組み合わせられる、請求項２３の方法。
【請求項２５】
インビトロにて試験化合物が標的ポリペプチドと組み合わせられる、請求項２３の方法。
【請求項２６】
核酸が、以下の：
（ａ）  ｎが１〜８５の整数である配列番号２ｎ−１；
（ｂ）  配列番号２ｎの少なくとも１ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および
（ｃ）  配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２７】
標的ポリペプチドが内在性の核酸の発現によって生じる、請求項１１の方法であって、内在性の核酸が、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするものである、方法。
【請求項２８】
哺乳動物培養細胞中にて試験化合物が標的ポリペプチドと組み合わせられる、請求項２７の方法。
【請求項２９】
インビトロにて試験化合物が標的ポリペプチドと組み合わせられる、請求項２７の方法。
【請求項３０】
内在性の核酸が、以下の：
（ａ）  ｎが１〜８５の整数である配列番号２ｎ−１；
（ｂ）  配列番号２ｎの少なくとも１ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および
（ｃ）  配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項３１】
標的ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体であって、標的ポリペプチドが配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むものである、抗体。
【請求項３２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項３１の抗体。
【請求項３３】
抗体がヒト化抗体である、請求項３１の抗体。
【請求項３４】
抗体がヒト抗体である、請求項３１の抗体。
【請求項３５】
標的ポリペプチドの異常な発現または異常な生理学的相互作用に関連する病理の処置に使用するための潜在的な治療薬剤の同定方法であって、下記工程：
（ａ）  標的ポリペプチドを発現し、かつ標的ポリペプチドに起因する特性または機能を有する細胞を提供すること；
（ｂ）  候補試験化合物を含む組成物と細胞を接触させること；および
（ｃ）  試験化合物が標的ポリペプチドに起因する特性または機能を変化させるかを決定すること；
を含み、
それによって、試験化合物の存在下で認められた変化が、細胞を試験化合物の不在下で組成物と接触させた際に認められない場合、該試験化合物は潜在的な治療薬剤として同定され；
標的ポリペプチドが配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むものである、方法。
【請求項３６】
標的ポリペプチドと関連する病理の活性または潜伏のモジュレーター、もしくは素因をスクリーニングする方法であって、以下の：
（ａ）  標的ポリペプチドと関連する病理の危険性が増大した試験動物に試験化合物を投与することであって、ここに試験動物が標的ポリペプチドを組み換え的に発現する；
（ｂ）  工程（ａ）の試験化合物の投与後、試験動物において標的ポリペプチドの活性を測定すること；および
（ｃ）  試験動物における標的ポリペプチドの活性を、試験化合物を投与されていない対照動物における標的ポリペプチドの活性と比較することであって、ここに、対照動物に対する試験動物における標的ポリペプチドの活性の変化が、試験化合物が標的ポリペプチドと関連する病理の活性または潜伏のモジュレーター、もしくは素因であることを示す；を含み、ここに、標的ポリペプチドが、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、小分子薬物の標的であり、細胞、組織、器官または生物の生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する新規ポリペプチドに関する。より具体的には、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であるか、またはその特定の生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用の方法は、スクリーニング、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
【０００２】
（背景技術）
肥満および糖尿病は、先進および発展途上世界における公衆衛生上の大きな問題である。アメリカ合衆国の成人の半数以上が体重超過とされる。これには、体重（Ｋｇ）／［身長（ｍ）］２として定義されるボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）値が正常値の上限（２５）を超える者が含まれる。体重超過の一般的な結末は、高脂血症およびインスリン耐性の進行である。この後、二型糖尿病の特徴である高血糖症が起こる。処置しないままでいると、高血糖症は、微小血管疾患、ならびに網膜症、腎臓病、心臓病、末梢神経障害および末梢血管損傷を含む終末器官の損傷を引き起こす。現在、アメリカ合衆国では１６００万人以上の成人が二型糖尿病に罹患し、今日では、学齢期の子供にも、肥満の蔓延の結果として、その状態は広がっている。
【０００３】
糖尿病は、身体が十分にインスリンを放出しないか、インスリンに応答しないために、グルコース（単糖）の血中濃度が異常に高い障害である。血糖（グルコース）値は、１日中変化し、食後上昇し、２時間以内に正常値に戻る。血糖値は、通常、一晩の絶食後の朝で７０ないし１１０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄＬ）血液である。通常、糖または他の炭水化物を含む食物を食べるか飲み物を飲んだ後でも、１２０ないし１４０ｍｇ／ｄＬより低い。
【０００４】
インスリンは膵臓より分泌されるホルモンであり、適当な血糖値の維持に関与する第一実体である。インスリンにより、グルコースが細胞内に輸送され、細胞はエネルギーを生産するか、それを必要とするまでグルコース由来のエネルギーを蓄積できるようになる。飲食後の血糖値の上昇により膵臓が刺激され、インスリンを産生することで、血糖値の大幅な上昇を防ぎ、徐々に下降させる。筋肉はグルコースをエネルギーとして使用するため、身体活動中にも血糖値は減少しうる。
【０００５】
正常な血糖値を維持するための十分なインスリンを身体が産生しない場合、または細胞がインスリンに対して適切に応答しない場合、糖尿病となる。二型糖尿病では、膵臓はインスリンを産生し続け、時には正常値よりもさらに高くなる。しかし、身体はその効果に対して耐性となり、相対インスリン欠乏となる。
【０００６】
糖尿病処置の主たる目的は、できるだけ血糖値を正常の範囲内に維持することである。完全に正常値を維持することは困難であるが、より厳密には、正常の範囲内で維持し、一時的または長期の合併症になりにくくすることは可能である。
【０００７】
従って、インスリン耐性を軽減し、および／またはインスリン分泌を促進する治療薬は、肥満および／または糖尿病の処置において有用であろう。また、かかる治療薬はインスリン耐性、しばしば糖尿病の進行を引き起こす状態の処置に有用であろう。
【０００８】
哺乳動物が正常な状態または状況以外であると診断されるか、その危険性があるとして診断された疾病、病理および他の異常な状態または状況を処置するためには、新しい治療薬剤の同定が重要である。
【０００９】
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳動物のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
【００１０】
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
【００１１】
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
【００１２】
多くの病理学的状態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。加えて、興味の対象となるタンパク質エフェクターの増加または上方調節レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法の必要性がある。
【００１３】
小分子標的は、様々な疾病状態または病理に関係している。これらの標的は、タンパク質、特に標的の機能を変化させ所望の結果を達成するための小分子薬物が作用する酵素タンパク質でありうる。細胞、動物および臨床研究が、様々な生理学的、薬理学的または自然な状態において小分子標的が関与する状態の病因および病原性への遺伝的関与を解明するために実施されうる。これらの研究には、試験および対象群の生物学的試料における、識別的遺伝子発現、タンパク質−タンパク質相互作用、発現遺伝子の大規模な配列解読、および例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）またはスプライス変異体であるがそれらに限定されない遺伝的変異の関連を観察するための、CuraGen Corporationにおけるコア技術を使用した。かかる研究の目的は、結果の予防、処置またはその状態を治癒するための様々な治療的介入のための潜在的な達成手段を同定することである。
【００１４】
哺乳動物が正常な状態または状況以外であると診断されるか、その危険性があるとして診断された疾病、病理および他の異常な状態または状況を処置するためには、新しい治療薬剤の同定が重要である。かかる手順は、少なくとも、病気に冒された組織または器官内で標的成分を同定する工程、および標的の機能特性を調節する候補治療薬剤を同定する工程を含む。標的成分は、疾病または病理に関与するいずれの生体高分子であってもよい。一般に、標的は特定の機能特性を有するポリペプチドまたはタンパク質である。他の高分子のクラスは、核酸、多糖、複合脂質または糖脂質のごとき脂質；さらに、標的はこれらのクラスの高分子のうちの１以上からなる細胞内構造もしくは細胞外構造であってもよい。一旦かかる標的が同定されれば、物質もしくは化合物の大きな集団から好ましい候補治療薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに使用されうる。
【００１５】
多くの場合、かかるスクリーニングアッセイの目的は、小分子候補を同定することである；これは、一般的に、試験される物質の集団を構築するための組み合わせ法の使用によって行われる。ハイスループットスクリーニング法の実行は、化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを用いて実施する際に有利である。
【００１６】
(発明の要約)
本発明は、核酸配列およびそれがコードする新規ポリペプチドを含む。新規核酸およびポリペプチドは、本明細書中でＮＯＶＸ、またはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３等、核酸およびポリペプチドと称する。これらの核酸およびポリペプチド、ならびに誘導体、相同体、類似体およびそのフラグメントは、以後、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）からなる群より選択されるヌクレオチド配列である「ＮＯＶＸ」核酸、または配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群より選択されるポリペプチド配列と総称する。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、ＮＯＶＸアミノ酸の成熟型を含む単離ポリペプチドを提供する。１つの例は、ＮＯＶＸアミノ酸配列の成熟型の変異体であり、ここに、成熟型中のいずれかのアミノ酸が異なるアミノ酸に変化しているが、ただし成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸がそのように変化している。アミノ酸は、例えば、ＮＯＶＸアミノ酸配列、またはＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であってもよく、ここに、選択された配列中のいずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変化しているが、ただし成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸がそのように変化している。本発明は、これらのいずれのフラグメントも含む。別の態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離核酸、またはフラグメント、相同体、類似体もしくはその誘導体も含む。
【００１８】
また、本発明には、天然の対立遺伝子変異体であるポリペプチドが含まれる。１つの実施形態において、これらの対立遺伝子変異体は、ＮＯＶＸ核酸配列と単一ヌクレオチドにて異なる核酸配列の翻訳物であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＮＯＶＸポリペプチドは、ここに記載の変異体ポリペプチドであり、ここに
、選択された配列中の任意のアミノ酸が変化している場合、変化して保存置換を提供する。他の実施形態では、本発明は、試料中のＮＯＶＸポリペプチドの存在または量を決定する方法を開示する。該方法は、試料を提供し；試料を、ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入し；およびポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって試料中のポリペプチドの存在または量を決定する工程を含む。別の実施形態において、本発明は、哺乳動物対象において、ＮＯＶＸポリペプチドの変化したレベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法を提供する。この方法は、第一の哺乳動物対象由来の試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定し；およびこの試料中の該ポリペプチドの量を、該疾患を患っていない、または素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程を含み、ここで該対照試料と比較した場合の、該第一の対象のポリペプチドの発現レベルの変化は、該疾患の存在または素因を指摘する。
【００１９】
さらなる実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドを調節する薬剤の同定方法を含む。この方法は、薬剤にポリペプチドを導入し；および、該薬剤がポリペプチドに結合するか測定する工程を含む。様々な実施形態において、該薬剤は、細胞受容体または下流のエフェクターである。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は、病理の処置における使用のための潜在的治療薬剤を同定する方法を含み、ここで、該病理は、ＮＯＶＸポリペプチドの異常な発現または異常な生理学的相互作用に関係する。該方法は、発明のポリペプチドを発現し該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供し；該細胞を、候補物質を含む組成物と接触させ；および、物質がポリペプチドに帰すべき特性または機能を変化させるか決定する工程を含み、それによってもし物質の存在下観察される変化が、細胞を物質のない組成物と接触させたときに観察されないならば、該物質は、潜在的治療薬剤として同定される。別の態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに連関する病理の活性または潜在モジュレーター、もしくは素因についてのスクリーニング方法を記載する。この方法は、以下の工程：発明のポリペプチドと連関する病理の増加リスクのある試験動物へ試験化合物を投与する工程であって、ここで該試験動物は、発明のポリペプチドを組み換え的に発現する；を含む。この方法は、工程の試験化合物を投与後に、試験動物におけるポリペプチドの活性を測定し；および、試験動物のタンパク質の活性を、ポリペプチドを投与してない対照動物のポリペプチドの活性と比較し、ここで対照動物に対する試験動物におけるポリペプチドの活性の変化は、ＮＯＶＸポリペプチドと連関する病理の潜在または素因のモジュレーターであることを指摘する工程を含む。１つの実施形態において、試験動物は、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、またはプロモーターの制御下にて野生型試験動物に対して増大したレベルで導入遺伝子を発現しうる組み換え試験動物であり、また、該プロモーターは導入遺伝子の元の遺伝子のプロモーターではない。別の態様において、本発明はＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する方法であって、ＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料を、該ポリペプチドに結合する化合物と、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分量にて導入することを含む方法を含む。
【００２１】
哺乳動物が正常な状態または状況以外であると診断されるか、その危険性があるとして診断された疾病、病理および他の異常な状態または状況を処置するためには、新しい治療薬剤の同定が重要である。かかる手順は、少なくとも、病気に冒された組織または器官を標的成分を同定する工程、および標的の機能特性を調節する候補治療薬剤を同定する工程を含む。標的成分は、疾病または病理に関与するいずれの生体高分子であってもよい。通常、標的は特定の機能特性を有するポリペプチドまたはタンパク質である。他の巨大分子のクラスは、核酸、多糖、複合脂質または糖脂質のごとき脂質；さらに、標的はこれらのクラスの高分子のうちの１以上からなる細胞内構造もしくは細胞外構造であってもよい。一旦かかる標的が同定されれば、物質もしくは化合物の大きな集団から好ましい候補治療薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに使用されうる。
【００２２】
多くの場合、かかるスクリーニングアッセイの目的は、小分子候補を同定することである；これは、一般的に、試験される物質の集団を構築するための組み合わせ法の使用によって行われる。ハイスループットスクリーニング法の実行は、化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを用いて実施する際に有利である。
【００２３】
本発明の目的は、候補薬剤同定のためのスクリーニングアッセイにおいて高分子成分とするための標的生体高分子または単離標的生体高分子を組み換え的もしくは内在的に発現する細胞株を提供することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、低分子量の物質または化合物のコンビナトリアルライブラリーより候補薬剤を明確に同定するためのスクリーニングアッセイを提供することである。
【００２５】
この発明のさらなる態様は、疾病、病理、異常な状態または状況の処置において有利な治療用途を有する薬剤を同定するために、様々なインビトロ、エクスビボおよびインビボアッセイのいずれかにおいて候補薬剤を使用することである。
【００２６】
別の態様において、本発明は、疾病と特別な関係を有する標的ポリペプチド（ＮＯＶＸ）を用いて、疾病、病理、異常な状態または状況の処置のための候補治療薬剤としての試験化合物を同定する方法を提供する。この方法は：
（ａ）  試験化合物を標的ポリペプチドおよび標的ポリペプチドの基質と組み合わせること；および
（ｂ）  該試験化合物が該標的ポリペプチドの活性を調節するかを決定すること
を含む。
【００２７】
この方法の１つの実施形態において、化学物質が化合物のコンビナトリアルライブラリーの構成物であり；工程（ａ）における組み合わせは、１つまたはそれ以上の生体高分子の複製サンプルに対して行われ；および、該複製サンプルは、コンビナトリアルライブラリーの少なくとも１つの構成物と接触する。この方法のなおさらなる実施形態において、生体高分子は細胞内に含まれ、そこで機能的に発現する。さらなる実施形態において、化合物の結合は生体高分子の機能を調節し、該調節により化合物が潜在的な治療薬剤であることが同定される。この方法のなおさらなる実施形態において、標的生体高分子はポリペプチドである。
【００２８】
本明細書で使用される「基質」とは、標的ポリペプチドに結合するかそれと相互作用することのできるあらゆる化合物を含み、ペプチド、ポリペプチド、核酸、炭水化物部分、脂質、小分子（例えば、環状ＡＭＰ、ＡＴＰ）、アゴニスト、アンタゴニスト、および阻害剤を含むがそれらに限定されない。
【００２９】
本発明の別の態様において、疾病、病理または異常な状態もしくは症状を処置するための医薬品の同定方法が提供される。該方法は、以下の工程：
（１）  前パラグラフに記載の方法によって、前記疾病、病理、または異常な状態もしくは状況を処置するための候補治療薬剤を同定する工程；
（２）  疾病、病理、または異常な状態もしくは状況と関連する生物学的試料を該候補治療薬剤と接触させる工程；
（３）  該候補が、治療応答に関連する該生物学的試料に対する効果を誘導するかを決定する工程；次いで
（４）  医薬品として、かかる効果を発揮する候補を同定する工程
を含む。
【００３０】
該方法の重要な実施形態において、生物学的試料は、細胞、組織または器官を含み、あるいは非ヒト哺乳動物である。
【００３１】
いくつかの細胞、動物および臨床研究が、様々な生理学的、薬理学的または自然な状態における、これらの状態の病因および病原性への遺伝的関与を解明すべく実施された。これらの研究は、試験および対象群の生物学的試料における、識別的遺伝子発現、タンパク質−タンパク質相互作用、発現遺伝子の大規模な配列解読、および例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）またはスプライス変異体であるがそれらに限定されない遺伝的変異の関連を観察するための、CuraGen Corporationにおけるコア技術を利用した。かかる研究の目的は、結果の予防、処置または肥満および／または糖尿病の状態を治癒させるための様々な治療的介入を同定することである。
【００３２】
本発明は、タンパク質およびポリペプチド、ならびにそれをコードする核酸の、様々な疾病または病理との新規連関を開示する。タンパク質および類似の関連タンパク質は、ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡによってコードされる。いくつかの場合では、タンパク質、ポリペプチドおよびそれらと同種の核酸は、本発明者らによって同定された。さらに、本発明は、開示されるＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する治療用抗体および／または治療用小分子の同定のための様々なスクリーニングにおける、組み換え的に発現したおよび／または内在的に発現したタンパク質の使用を包含する。
【００３３】
本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドをコードする単離核酸、またはフラグメント、相同体、類似体もしくは誘導体も含む。好ましい実施形態において、核酸分子は、天然の対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸は、天然のポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する変異体ポリペプチドをコードする。別の実施形態において、核酸分子は、ＮＯＶＸ核酸配列と単一ヌクレオチドにて異なる。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列の相補物にハイブリダイズする。別の態様において、本発明は、ＮＯＶＸヌクレオチド配列を発現するベクターまたは細胞を提供する。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節するための方法を開示する。該方法は、ＮＯＶＸポリペプチドを発現する細胞試料を、ポリペプチドに結合する化合物と、該ポリペプチドを調節するのに十分な量にて導入する工程を含む。別の実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸアミノ酸配列または成熟型ＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ＮＯＶＸ核酸分子を含み、ここで、選択された配列の成熟型中のいずれかのアミノ酸も別のアミノ酸に変化するが、ただし成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基がそのように変化する。別の実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含み、ここで、選択された配列中で特定されるいずれかのアミノ酸は別のアミノ酸に変化するが、ただし、成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基がそのように変化する。
【００３５】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドまたは少なくとも該ポリペプチドのいずれかの変異体の一部をコードするＮＯＶＸ核酸フラグメントを開示し、ここで選択された配列のいずれかのアミノ酸は別のアミノ酸に変化するが、ただし、配列中の１０％を超えないアミノ酸残基がそのように変化する。別の実施形態において、本発明はＮＯＶＸ核酸分子または天然の対立遺伝子核酸変異体のいずれかの相補物を含む。別の実施形態において、本発明は、変異体ポリペプチドをコードするＮＯＶＸ核酸分子を含み、ここに、該変異体ポリペプチドは天然のポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。別の実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸ核酸分子配列と単一ヌクレオチドにて異なるＮＯＶＸ核酸を開示する。
【００３６】
別の実施形態において、本発明はＮＯＶＸ核酸分子を含み、ここで、ＮＯＶＸヌクレオチド配列中の１またはそれ以上のヌクレオチド配列が別のヌクレオチドに変化するが、ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する。１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸ核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸フラグメント中の１またはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群より選択されるものから別のヌクレオチドに変化しているが、ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化した核酸フラグメントを開示する。別の実施形態において、本発明は、ストリンジェントな条件下で、ＮＯＶＸヌクレオチド配列またはＮＯＶＸヌクレオチド配列の相補物にハイブリダイズする核酸分子を含む。１つの実施形態において、本発明は、コード配列中の１５％を超えないヌクレオチドがＮＯＶＸヌクレオチド配列またはそのフラグメントと異なるように配列が変化した核酸分子を含む。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明は、試料中のＮＯＶＸ核酸分子の存在または量を決定する方法を含む。該方法は、試料を提供し；核酸分子に結合するプローブに試料を導入し；および、核酸分子に結合したプローブの存在または量を決定し、それによって試料中の核酸分子の存在または量を決定する工程を含む。１つの実施形態では、核酸分子の存在または量を、細胞または組織型のマーカーとして使用する。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、第一の哺乳動物対象におけるＮＯＶＸ核酸分子の変化レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法に関する。該方法は、第一の哺乳動物対象由来の試料中の核酸の量を測定し；および、工程（ａ）の試料中の核酸の量を、疾患を患っていないか、または素因がないと知られる第二の哺乳動物対象由来の対照試料中に存在する核酸の量と比較することを含み；ここで対照試料と比較した場合の、第一の対象中に存在する核酸のレベルの変化は、疾患の存在または素因を指摘する。
【００３９】
特に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野に通常の技能を有する業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
【００４０】
本発明の他の特性および利点は以下の詳細な記載および請求項より明らかであろう。
【００４１】
（発明の詳細な記載）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
【００４２】
表１：配列および対応する配列番号
【表１】
2006511237.tif 000002
【表２】
2006511237.tif 000003
【表３】
2006511237.tif 000004
【表４】
2006511237.tif 000005
【００４３】
表１はＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表１の第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００４４】
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、副腎白質ジストロフィー、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、乾癬、皮膚疾患、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、狼瘡、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、癌、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、および種々の異常脂血症、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患および種々の癌、並びに状態例えば移植および受胎能と連関する消耗性障害。
【００４５】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００４６】
表１の第５列で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を、各ＮＯＶＸポリペプチドについての個々のセクション中のヒト配列の同定に関する例にて示す。
【００４７】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表１に掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する小分子の同定用の標的として使用され得る。
【００４８】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を各ＮＯＶＸポリペプチドについての個々のセクション中の発現プロファイルを示す実施例にある。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがん、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。各ＮＯＶＸに関するＳＮＰ分析は、該当する場合、各ＮＯＶＸポリペプチドについての個々のセクション中のＳＮＰ実施例に示される。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００４９】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００５０】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００５１】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）小分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子デリバリー／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００５２】
一つの特定の実施形態では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；および（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００５３】
もう一つの特別な実施形態では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００５４】
なおもう一つの特別な実施形態では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
【００５５】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５６】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００５７】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００５８】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施形態において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５９】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; および Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００６０】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００６１】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施形態では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００６２】
もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得る。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００６３】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００６４】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００６５】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００６６】
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施形態において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００６７】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００６８】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００６９】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００７０】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施形態において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００７１】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００７２】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００７３】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００７４】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００７５】
従って、もう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施形態では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施形態では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００７６】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当該分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００７７】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００７８】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００７９】
第２の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当該分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, および Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００８０】
第３の実施形態では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当該分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００８１】
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該分野内で周知である。
【００８２】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施形態では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に少なくとも約６０％相同であり；より好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００８３】
配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００８４】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野内で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施形態では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８５の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当該分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００８５】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００８６】
一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００８７】
妨害性ＲＮＡ
本発明の１の態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現をＲＮＡ妨害により弱めることができる。当該分野においてよく知られた１のアプローチは、短い妨害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される遺伝子サイレント化であり、該アプローチにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９ないし２５ヌクレオチドの長さのセグメントに対して相補的であり、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、特異的な２本鎖ＮＯＶＸ由来のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、ＮＯＶＸ遺伝子発現産物が標的とされる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８参照（それぞれを参照により本明細書に一体化させる）。標的化される遺伝子はＮＯＶＸ遺伝子であってもよく、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターであってもよい。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターの非限定的な例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子プロモーターに結合する転写因子ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、ならびにＮＯＶＸ調節経路に含まれるポリペプチドである。
【００８８】
本発明の方法によれば、妨害性ＲＮＡを用いてＮＯＶＸ遺伝子発現がサイレント化される。本発明のＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、ショウジョウバエ抽出物（これに限らない）のごとき無細胞系でＮＯＶＸポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることにより、あるいは組み換え型２本鎖ＮＯＶＸ ＲＮＡの転写により、あるいはＮＯＶＸ配列に相同的なヌクレオチド配列を合成することにより、かかるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、Tuschul, Zamire, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197参照（参照により本発明系に一体化させる）。合成する場合、典型的な０．２マイクロモラースケールのＲＮＡ合成により約１ミリグラムのｓｉＲＮＡが得られ、それは２４ウェルの組織培養プレートフォーマットを用いる１０００回のトランスフェクション実験に十分なものである。
【００８９】
最も効率的なサイレント化は、一般的には、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合された２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて観察される。２ヌクレオチドの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性にさらなる小さな貢献をする。特異性に対する貢献は最初に対合した塩基に隣接した未対合ヌクレオチドに局在化される。１の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはリブヌクレオチドである。別の実施形態において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハング中の２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることはリボヌクレオチドの使用として有効であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成費用が安く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性が最も高い。
【００９０】
本発明の企図される組み換え型発現ベクターは、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式でＮＯＶＸ配列に作動可能に連結された近接調節配列を含む発現ベクター中に組み込まれたＮＯＶＸ ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により転写される。センスおよびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイゼーションして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレント化のためのｓｉＲＮＡ構築物を生じる。別法として、２つの構築物を用いて、ｓｉＲＮＡ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作成することもできる。結局、クローン化ＤＮＡは第２の構造を有する構築物をコードするものであり得、単一の転写物は、標的遺伝子（複数も可）由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列を有するものである。この実施形態の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は標的遺伝子のすべてまたは一部に対して相同的である。もう１つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に近接した調節配列は、それらの発現が独立してモジュレーションされ、あるいは時間的または位置的にモジュレーションされうるならば、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００９１】
特別な実施形態において、例えば、より小型の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中にＮＯＶＸ遺伝子鋳型を組み込むことにより、ｓｉＲＮＡは細胞内で転写される。ベクター系の１例はGeneSuppressor(商標)RNA Interference kit （Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターのターミネーションシグナルは５個の連続したチミジンにより定義される。典型的には、転写物を２つ目のウリジンの後ろで開裂させる。この位置での開裂は、発現されたｓｉＲＮＡ中に３’ＵＵオーバーハングを生じさせ、それは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似である。長さ４００ヌクレオチド未満の配列をこれらのプロモーターにより転写させることができ、それゆえ、それらは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを例えば約５０ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中に発現させることに理想的に適したものである。
【００９２】
長時間の発現ノックダウンが必要な場合に、ｓｉＲＮＡベクターは合成ｓｉＲＮＡよりも有利であると考えられる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は安定で、長時間のｍＲＮＡ阻害をこうむるであろう。対照的に、外来性合成ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、典型的には７日以内あるいは１０ラウンドの細胞分裂の間にｍＲＮＡサプレッションから回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長時間の遺伝子サイレント化能は遺伝子治療への適用を可能にしうる。
【００９３】
一般的には、ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより、より長いｄｓＲＮＡから切断される。ＤＩＣＥＲは２本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは細胞タンパク質とともに集合してエンドヌクレアーゼ複合体となる。ショウジョウバエにおけるインビトロでの研究は、ｓｉＲＮＡ／タンパク質複合体（ｓｉＲＮＰ）がその後ＤＩＥＣＲとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含むＲＮＡ誘導サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる第２の酵素複合体に転移されることを示唆している。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ鎖によりコードされる配列を用いて相補的配列のｍＲＮＡを見つけて破壊する。かくしてｓｉＲＮＡはガイドとして作用し、２本のｓｉＲＮＡ鎖の一方に相補的なｍＲＮＡのみを開裂するようにリボヌクレアーゼを制限する。
【００９４】
ｓｉＲＮＡにより標的化されるべきＮＯＶＸ ｍＲＮＡ領域は、一般的には、スタートコドンの５０ないし１００ヌクレオチド下流から開始する所望ＮＯＶＸ配列から選択される。別法として、５’または３’ＵＴＲおよびスタートコドン付近の領域を用いることができるが、一般的には避けられる。なぜならこれらは調節タンパク質結合部位において豊富だからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰまたはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。選択されたｓｉＲＮＡ配列に関する最初のＢＬＡＳＴ相同性サーチを利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行って、ただ１つの遺伝子が標的化されることを確実にする。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識特異性は、ｓｉＲＮＡの対合領域に存在する単一の点突然変異が標的ｍＲＮＡの分解を妨げるに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88参照。それゆえ、所望遺伝子を標的化する場合、ＳＮＰ、多型、対立遺伝子変種または種特異的変化をうまく考慮すべきである。
【００９５】
１の実施形態において、完全なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ実験は正しい負の対照を用いるものである。一般的には、負の対照ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、ゲノムに対して有意な配列相同性を欠いている。典型的には、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、相同性検索を行って、それが他のいすれの遺伝子とも相同性を欠いていることを確認する。
【００９６】
２つの独立したＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンすることができる。このことはサイレント化効果の特異性を制御することを助ける。さらに、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターに関するＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いることにより、２つの独立した遺伝子の発現を同時にノックダウンすることができる。ｓｉＲＮＡ結合タンパク質の利用可能性は標的ｍＲＮＡアクセス可能性よりも限定的であると考えられる。
【００９７】
典型的には、標的化されたＮＯＶＸ領域は、１９個（Ｎ１９）の残基のスペーサー領域により分けられた２個のアデニン（ＡＡ）および２個のチミジン（ＴＴ）である（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）。望ましいスペーサー領域は約３０〜７０％、より好ましくは約５０％のＧ／Ｃ−含量を有する。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列中に存在しない場合、別の標的領域はＡＡ（Ｎ２１）であろう。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、かかる配列が本質的にＮＯＶＸポリヌクレオチド中に存在しないならば、センスｓｉＲＮＡの３’末端のＴＴへの変換を行うことができる。この配列変換の論理的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称な２本鎖を生じさせることである。対称な３’オーバーハングは、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ−開裂ｓｉＲＮＰの適切な等しい割合でｓｉＲＮＰが形成されることを確実ならしめることを助けることができる。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188-200参照（参照により本明細書に一体化させる）。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾が標的化されたｍＲＮＡの認識に影響するとは考えられない。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は標的認識をガイドするからである。
【００９８】
別法として、ＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含まない場合、配列ＮＡ（Ｎ２１）をサーチしてもよい。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を５’（Ｎ１９）ＴＴとして合成してもよい。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡの３’側の大部分のヌクレオチドの配列は特異性に貢献しないからである。アンチセンスまたはリボザイム法とは違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンス化に強く影響するとは考えられない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565参照（参照により本明細書に一体化させる）。
【００９９】
標準的な核酸トランスフェクション法、例えば、OLIGOFECTAMINE Reagent（Invitrogenから市販されている）を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションを行うことができる。一般的には、ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングに関するアッセイをトランスフェクションから約２日後に行う。トランスフェクション試薬の不存在下において、ＮＯＶＸ遺伝子サイレント化は観察されず、野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析が可能であった。特別な実施形態において、２４ウェルプレートの１つのウェルには通常約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で十分である。典型的には、細胞を前日に撒き、約５０％集密になったところでトランスフェクションする。細胞培地および培養条件の選択は等業者が通常行うことであり、細胞タイプの選択により変更されるであろう。トランスフェクションの効率は細胞タイプのみならず細胞の継代数および集密度に依存する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒置かボルテックスか）も重要である。低いトランスフェクション効率はＮＯＶＸサイレント化の不成功の最大の原因である。使用する新たな細胞系に関してトランスフェクション効率を注意深く調べることが必要である。好ましい細胞は哺乳動物由来であり、より好ましくはラットまたはマウスのごときげっ歯類由来であり、最も好ましくはヒト由来である。治療的処置に使用する場合、好ましくは細胞は自己由来のものであるが、非−自己由来の細胞ソースも本発明の範囲内とされる。
【０１００】
対照実験に関し、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはＮＯＶＸサイレント化に影響せず、０．８４μｇのアンチセンス ｓｉＲＮＡは、０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較すると弱いサイレント化効果を有する。対照実験はさらに野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析を可能にする。トランスフェクション効率を制御するために、典型的には通常タンパク質の標的化を行う。例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化あるいはＣＭＶにより駆動されるＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販されている）のトランスフェクションを行う。上例において、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロット、ノーザンブロットあるいはタンパク質発現または遺伝子発現に関する他の類似のアッセイのごとき方法により、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラグメントを翌日に行う。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnologyから得た。
【０１０１】
細胞中の標的化ＮＯＶＸポリヌクレオチドの豊富さおよび半減期（またはターンオーバー）にもよるが、１〜３日後あるいはその後にノックダウン表現型が明らかにされうる。ＮＯＶＸノックダウン表現型が観察されない場合には、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ２本鎖により標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流または下流遺伝子）が効果的に破壊されたかどうかを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションから２日後、全ＲＮＡを調製し、標的特異的プライマーを用いて逆転写し、少なくとも１つのエキソン−エキソンジャンクションを変換するプライマーペアーを用いてＰＣＲ増幅を行ってプレ−ｍＲＮＡの増幅を制御する。非標的化ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも対照として必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇であるが検出できない標的タンパク質の減少は、安定なＮＯＶＸタンパク質の大きなリザーバーが細胞中に存在することを示しうる。標的タンパク質が最終的に枯渇して表現型が明らかにされうるに至るには、十分に長いインターバルでの複数回のトランスフェクションが必要であるかもしれない。複数回のトランスフェクション工程が必要な場合、トランスフェクションから２〜３日後に細胞を分ける。分けた直後に細胞をトランスフェクションしてもよい。
【０１０２】
本発明の治療方法は、増加あるいは逸脱したＮＯＶＸ発現または活性を補正するための治療としてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ構築物を投与することを企図する。上記のごとく、ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメントにプロセッシングするか、あるいはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを合成する。上記のごとく、既知の核酸トランスフェクション法を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与する。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ転写産物を減少またはノックダウンし、そのことはＮＯＶＸポリペプチド生成を減少させ、細胞または組織中のＮＯＶＸポリペプチド活性を低下させる。
【０１０３】
また本発明は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質の存在に関連する疾病または症状の治療方法を包含し、該方法は、分解されるべきタンパク質のｍＲＮＡ（該タンパク質をコードするｍＲＮＡ）を標的化するＲＮＡｉ構築物を個体に投与することを特徴とする。特別なＲＮＡｉ構築物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにプロセッシングされる２本鎖遺伝子転写物を含む。治療により、標的タンパク質が産生されなくなるか、あるいは治療を行わない場合よりも産生の程度が低下する。
【０１０４】
ＮＯＶＸ遺伝子機能が既知表現型と相関関係を有しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料により、ＮＯＶＸ発現レベルを決定するためのリファレンス標準が提供される。説明したアッセイ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を用いて発現レベルを検出する。疾病状態にある哺乳動物、好ましくはヒト対象から細胞または組織の試料を採取する。細胞または組織中への核酸のトランスフェクションに関して説明した方法によりＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与することによってこれらの細胞または組織を処理し、説明したアッセイを用いて対象試料中のＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の変化を観察し、対照試料のものと比較する。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウン法は、治療対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ−）表現型を決定するための迅速法を提供する。かくして、治療対象試料中において観察されたＮＯＶＸ−表現型は、治療中の疾病状態の経過観察のためのマーカーとして役立つ。
【０１０５】
特別な実施形態において、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを治療に用いる。ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡの生成および使用方法は等業者に知られている。方法の例を以下に示す。
【０１０６】
ＲＮＡの生成
ＲＮＡ発現ベクターにおける転写のごとき既知方法を用いてＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンス（ａｓＲＮＡ）を得る。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基の長さである。得られたｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で９５℃にて１分間加熱し、次いで、冷却し、室温で１２ないし１６時間アニーリングさせる。ＲＮＡを沈殿させ、溶解バッファー（下記）中に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＴＢＥバッファー中の２％アガロースゲル中でＲＮＡを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.(1989)参照。
【０１０７】
溶解物の調製
製造者（Ambion）の指示に従って未処理ウサギ網状赤血球溶解物を集める。ｄｓＲＮＡを溶解物中３０℃で１０分間インキュベーションし、次いで、ｍＲＮＡを添加する。その後、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを添加し、さらに６０分インキュベーションを続ける。２本鎖ＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比は約２００：１である。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを放射性標識し（既知方法を用いて）、その安定性をゲル電気泳動によりモニターする。
【０１０８】
同じ条件で平行して行う実験において、３２Ｐ−ＡＴＰを用いて２本鎖ＲＮＡを内部で放射性標識する。２ＸプロテイナーゼＫバッファーにより反応を停止させ、すでに記載されているようにして（Tuschl et al., Genes Dev., 13: 3191-3197）脱タンパク質する。適当なＲＮＡ標準を用いて１５％または１８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により生成物を分析する。ゲルを放射活性についてモニターすることにより、２本鎖ＲＮＡからの１０ないし２５ヌクレオチドのＲＮＡの自然な生成を調べることができる。
【０１０９】
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドを溶出する。これらの２１〜２３量体ＮＯＶＸ転写抑制の有効性を、各アッセイにつき５０ナノモラーの２本鎖２１〜２３量体を用いて上記と同じウサギ網状赤血球を用いてインビトロにてアッセイする。次いで、これらの２１〜２３量体の配列を標準的な核酸配列決定法を用いて決定する。
【０１１０】
ＲＮＡの調製
上で決定された配列に基づいて、Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite（Proligo, Germany）２１を用いてヌクレオチドのＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188-200 (2001)）し、次いで、Sep-Pak C18 cartridge（Waters, Milford, Mass., USA）で精製（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:11658-11668 (1993)）する。
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖をアニーリングバッファー中、９０℃で１分間インキュベーションし、次いで、３７℃で１時間インキュベーションする。
【０１１１】
細胞培養
ＮＯＶＸを規則的に発現させるための当該分野において知られた細胞培養を、標準的条件を用いて行う。トランスフェクションの２４時間前に、約８０％集密において、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新鮮培地で１：５に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４ウェルプレートに移す（５００ｍｌ／ウェル）。市販リポフェクションキットを用いてトランスフェクションを行い、陽性および陰性対照を付して標準的方法を用いてＮＯＶＸ発現をモニターする。陽性対照は本来的にＮＯＶＸを発現する細胞であり、陰性対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。オーバーハング３’を有する塩基対合した２１および２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、溶解物および細胞培養において、効果的な配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する。異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いる。哺乳動物細胞培養の場合のインビトロでのサプレッションに効果的な濃度は２５ｎＭないし１００ｎＭの最終濃度である。このことは、慣用的なアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験に用いる濃度よりも数オーダー低い濃度のｓｉＲＮＡが有効であることを示す。
【０１１２】
上記方法は、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ配列の推論およびかかるｓｉＲＮＡのイオンビトロサプレッションへの使用の両方のための方法を提供する。よく知られたインビボトランスフェクションまたは遺伝子治療トランスフェクション法を用い、同じｓｉＲＮＡを用いてインビボサプレッションを行ってもよい。
【０１１３】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８２の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８２の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【０１１４】
一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【０１１５】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【０１１６】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【０１１７】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【０１１８】
なおもう一つの実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【０１１９】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【０１２０】
１の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜８２の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０１２１】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【０１２２】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【０１２３】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【０１２４】
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当該分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra および Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【０１２５】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と複合し得る。
【０１２６】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【０１２７】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【０１２８】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施形態では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【０１２９】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施形態では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１３０】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【０１３１】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１３２】
一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１３３】
２個またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１３４】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当該分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１３５】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１３６】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施形態では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１３７】
一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１３８】
もう一つの実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１３９】
なおもう一つの実施形態では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１４０】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１４１】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施形態では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１４２】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１４３】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施形態では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１４４】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当該分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１４５】
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１４６】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜８２の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当該分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１４８】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
【０１４９】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１５０】
当該分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１５１】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１５２】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１５３】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１５４】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１５５】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用する。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１５６】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るネズミ骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１５７】
ハイブリドーマ細胞を培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１５８】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１５９】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１６０】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、ネズミ抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なネズミの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の定常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１６１】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterおよび共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワークの残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; および Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１６２】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１６３】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１６４】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１６５】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ；そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１６６】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１６７】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１６８】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当該分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１７０】
二重特異性抗体の作成方法は当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１７１】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の定常ドメインとである。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖定常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１７２】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１７３】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１７４】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントをE.coliから直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントをE.coliから別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１７５】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変ドメイン(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１７６】
３価以上の結合価をもつ抗体も考え得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１７７】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１７８】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) および Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１７９】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１８０】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１８１】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド化合物(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１８２】
もう一つの実施形態では、抗体を、腫瘍をプレターゲティングのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に結合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１８３】
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当該分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１８４】
特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１８５】
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
１実施形態では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の所望のドメインに特異的な抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体または相同体に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１８６】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体は、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な補欠分子団の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１８７】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１８８】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的が、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１８９】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、ある場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から週１回の範囲であり得る。
【０１９０】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995、Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０１９１】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要な二つ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１９２】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１９３】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１９４】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１９５】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１９６】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１９７】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１９８】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１９９】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０２００】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０２０１】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０２０２】
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０２０３】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０２０４】
なおもう一つの実施形態では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０２０５】
もう一つの実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当該分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿プロモーター；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、ネズミのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０２０６】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に作動し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に作動し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０２０７】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０２０８】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０２０９】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０２１０】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得ることが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができ、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０２１１】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施形態では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施形態では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０２１２】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施形態では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子と、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０２１３】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に作動し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持するさらなる動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０２１４】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施形態では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０２１５】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０２１６】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０２１７】
もう一つの実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０２１８】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０２１９】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび油脂のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０２２０】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、油脂、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０２２１】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０２２２】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２２３】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０２２４】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０２２５】
全身的投与はまた、経粘膜または経皮手段により得る。経粘膜または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘膜投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０２２６】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２２７】
一つの実施形態において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２２８】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当該分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０２２９】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２３０】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝症候群Ｘならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響を及ぼすような方法で使用することができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２３１】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０２３２】
一つの実施形態では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当該分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２３３】
本明細書において使用する「小分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当該分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２３４】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当該分野に見出し得る。
【０２３５】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、細菌(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０２３６】
ある実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施形態では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２３７】
もう一つの実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施形態では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２３８】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に作動し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２３９】
なおもう一つの実施形態では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施形態では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２４０】
なおもう一つの実施形態では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施形態では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２４１】
なおもう一つの実施形態では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこで試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２４２】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ) のような非イオン性界面活性剤を挙げ得る。
【０２４３】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固定化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施形態では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物、および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２４４】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当該分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性があるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２４５】
もう一つの実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレーターを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレーターとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２４６】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅にも関与する。
【０２４７】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に作動し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【０２４８】
本発明のさらに別の態様において、標的ポリペプチド（ＮＯＶＸ）の活性を調節する化合物の同定方法が開示され、ここに、該方法は、以下の：（ａ）試験化合物を標的ポリペプチドおよび標的ポリペプチドの基質と組み合わせること；および（ｂ）該試験化合物が該標的ポリペプチドの活性を調節するかを決定することを含み、ここに、該標的ポリペプチドは配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
該方法は、標的ポリペプチドのモジュレーターとして標的ポリペプチドの活性を調節することにより、標的ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する工程をさらに含む。かかるモジュレーターは、ＮＯＶＸ標的ポリペプチドの阻害剤、活性化剤、アンタゴニストまたはアゴニストであり得る。
【０２５０】
該方法は、インスリン分泌の促進剤として、またはインスリン耐性、肥満および／または糖尿病の治療のための治療薬として標的ポリペプチドの活性を調節することにより、標的ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する工程をさらに含む。
【０２５１】
前述の方法において、標的ポリペプチド（ＮＯＶＸ）は、単離ポリペプチドであり得る。
【０２５２】
標的ポリペプチドは、標的ポリペプチドの発現を促進する条件下にて標的ポリペプチドをコードする核酸を含む組み換えホスト細胞を培養することを含む方法によって生産されうる。かかる方法において、核酸は、以下の：（ａ）ｎが１〜８５の整数である配列番号２ｎ−１；（ｂ）配列番号２ｎの少なくとも１ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および、（ｃ）  配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０２５３】
あるいは、標的ポリペプチドは、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含む組み換えベクターの発現によって生じうる。ここで、哺乳動物培養細胞中にて試験化合物は標的ポリペプチドと組み合わせられ得る。また、インビトロにて試験化合物は標的ポリペプチドと組み合わせられ得る。この方法において、該核酸は以下の：（ａ）ｎが１〜８５の整数である配列番号２ｎ−１；（ｂ）配列番号２ｎの少なくとも１ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および、（ｃ）  配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０２５４】
さらに別の実施形態において、標的ポリペプチドは、内在性の核酸の発現によって生じ、ここで、該内在性の核酸は、配列番号２ｎ（ｎは１〜８５の整数である）からなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードする。さらに、哺乳動物培養細胞中にて試験化合物は標的ポリペプチドと組み合わせられ得る。また、インビトロにて試験化合物は標的ポリペプチドと組み合わせられ得る。この方法において、該核酸は、以下の：（ａ）ｎが１〜８５の整数である配列番号２ｎ−１；（ｂ）配列番号２ｎの少なくとも１ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド；および、（ｃ）  配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、配列番号２ｎと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列、配列番号２ｎの少なくとも１ドメインであるアミノ酸配列、または配列番号２ｎの少なくとも１ドメインと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【０２５５】
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２５６】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２５７】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２５８】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らず、増幅プロセスを複雑にしないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２５９】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれか、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２６０】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２６１】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１０００塩基、そしてさらに好ましくは２０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988)を参照されたい。
【０２６２】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２６３】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２６４】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２６５】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２６６】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２６７】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こると見積もられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む一塩基多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２６８】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)の配列のようなコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２０００であろう。
【０２６９】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝症候群Ｘならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２７０】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２７１】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２７２】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜８５の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、またはその一部、例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２７３】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準的な造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２７４】
一つの実施形態では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２７５】
もう一つの実施形態では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２７６】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用説明書をさらに含み得る。
【０２７７】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、前記の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は体液(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２７８】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２７９】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施形態において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配列、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾、の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するように、あるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当該分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２８０】
特定の実施形態では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出して対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２８１】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２８２】
さらに別の実施形態では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失による特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２８３】
他の実施形態では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２８４】
なおもう一つの実施形態において、当該分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２８５】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施形態では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の消化の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施形態では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２８６】
なおもう一つの実施形態では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施形態によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２８７】
他の実施形態では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元できる。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施形態では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２８８】
なおもう一つの実施形態では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施形態では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２８９】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはいくつかの異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２９０】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施形態では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２９１】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２９２】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２９３】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレーターを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表１に要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同体と関連した疾病、障害および状態を含む。
そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型と、外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２９４】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的状態を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的状態(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的状態(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的状態は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２９５】
例示的実施形態として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認された。
【０２９６】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレーターのようなＮＯＶＸモジュレーターで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２９７】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２９８】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または小分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思われるＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２９９】
一つの実施形態において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、小分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０３００】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害のリスクにある(感受性)かまたは障害を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表１に要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同体と関連した疾病、障害および状態を含む。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０３０１】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への非相同挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレーター(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０３０２】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０３０３】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当該分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０３０４】
予防的方法
一つの態様では、ＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０３０５】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または小分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施形態では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施形態では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施形態では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０３０６】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０３０７】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０３０８】
種々の特定の実施形態において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当該分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０３０９】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。障害としては、限定しないが、例えば、前記の疾病、障害および状態を含み、特に、表１に要約するようなＮＯＶＸタンパク質の相同体と関連した疾病、障害および状態を含む。
【０３１０】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、本明細書に挙げられたものを含むが、それらに限定されない疾病、障害、状態等に罹患する対象の処置のための効験を有するであろう。
【０３１１】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０３１２】
NOVXポリペプチド
以下の段落では、本発明のNOVXポリペプチドおよびNOVXポリペプチドのモジュレーターに関するスクリーニング方法を詳細に記載する。
【０３１３】
A.NOV1 -- 細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)
PEPCKの細胞質型アイソフォームは脂肪組織でのグリセロールの新生(glyceroneogenesis)を制御する。グリセロールの新生は、短縮型の糖新生であり、ここでは基質、例えばピルビン酸(pyruvate)、乳酸(lactate)およびアラニンからグリセロール-3-リン酸(glycerol-3-phosphate)が生産される。こうして生産されたグリセロール-3-リン酸はトリグリセリド合成に使用される。グリセロールの新生が脂肪組織でのトリグリセリド蓄積の維持に関して役割を果たすことが最近解明されている。細胞質型PEPCKはまた、糖新生に関する律速酵素であり、この糖新生とは、肝臓でピルビン酸、乳酸およびアラニンからグルコースが生産される経路である。肝臓の糖新生プロセスは2型糖尿病で上方制御され、したがってこの疾患に特徴的な絶食性高血糖(fasting hyperglycemia)に寄与すると考えられる。2型糖尿病の合併性代謝障害、これは増加した肝グルコース生産を含む、についての遺伝的および環境的要因は完全には理解されていない。
【０３１４】
CuraGenのGeneCalling (登録商標)による研究では、細胞質型PEPCKが肥満性AKR対正常C57Blマウスの脂肪組織で上方制御されることが示されている。この結果は、PEPCKの上方制御が肥満表現型に寄与するかもしれないことを示す。この仮説は、遺伝子組換えにより脂肪中で細胞質型PEPCKが過剰発現されると、グリセロールの新生の増加、脂肪細胞(adipocyte, fat cell)のサイズおよび脂肪量の増加、および体重増加に結び付くという事実(Franckhauser S, Munoz S, Pujol A, Casellas A, Riu E, Otaegui P, Su B, Bosch F. Increased fatty acid re-esterification by PEPCK overexpression in adipose tissue leads to obesity without insulin resistance. Diabetes. 2002 Mar;51(3):624-30. PMID: 11872659)によって支持される。さらに、細胞質型PEPCK遺伝子のPPARガンマ結合部位が変異するとPEPCKの活性が減少し、マウスの体脂肪蓄積および体重の増加を伴う(Olswang Y, Cohen H, Papo O, Cassuto H, Croniger CM, Hakimi P, Tilghman SM, Hanson RW, Reshef L. A mutation  in the peroxisome proliferator-activated receptor γ-binding site in the gene for the cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase reduces adipose tissue size and fat content in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Jan 22;99(2):625-30. PMID: 11792850)。したがって、細胞質型PEPCKの発現が減少すると、脂肪組織でのトリグリセリド蓄積が減少し、一方、脂肪中のPEPCK発現が増加すると、マウスの体脂肪量が増加した。
【０３１５】
食餌誘発性肥満症は、カロリー摂取量の増加を原因とする重量増加の進行に関与する経路を研究するための有名なモデルである。マウスを高脂肪性の食餌(〜30-45%脂肪由来カロリー)で12-16週間飼育し、その後、代謝経路の変化に関して組織を分析する。この分析は正常なげっ歯類の食餌で飼育したコントロール動物と比較して行う。CuraGenのGeneCalling (登録商標)によって高脂肪性食餌で飼育されたマウス対正常固形飼料で飼育されたマウス由来の脂肪組織を研究したところ、上に考察する結果と矛盾する結果が得られている。予測に反して、細胞質型PEPCKは、高脂肪性対正常固形飼料飼育マウスの多数の脂肪蓄積箇所で下方制御される。脂肪性PEPCKの下方制御は食餌誘発性肥満症プロトコル経過中の多数の時点で記録された。これらの結果について発明者らは、PEPCKの下方制御はトリグリセリド蓄積を制限するための代償性応答であるかもしれないと解釈する。この仮説を支持して、多数の別の脂肪生合成遺伝子が食餌誘発性肥満症条件下の脂肪組織で下方制御される。この遺伝子には、ジアシルグリセロールトランスフェラーゼ2、モノグリセリドリパーゼ、リポタンパク質リパーゼおよびアクアポリン脂肪が含まれる。
【０３１６】
PEPCK遺伝子の発現が食餌誘発性肥満症対遺伝的肥満症モデルで一致しないことは、この2つのモデルの差異によって説明できるかもしれない。遺伝的肥満症では、その病態生理学は静的であり、その理由はこの肥満症が生体内へ組み込まれているためである。対照的に食餌誘発性肥満症では、体脂肪量の増加は12-16週間にわたって進行し、これは高脂肪性カロリーの増加に起因する。カロリー過負荷への応答は動的であり(CuraGenのGeneCalling (登録商標)による研究で観察される通り)、この応答はエネルギー恒常性および体重を維持するための生体による代償性応答を含む。このようなカロリー過負荷に対する代償性応答は脂肪組織でのPEPCKの下方制御を含むと考えられる。
【０３１７】
CuraGenのGeneCalling (登録商標)による研究ではまた、食餌誘発性肥満症モデルにおいてマウス肝臓で細胞質型PEPCKが上方制御されることが示されている(データは以下に含まれる)。この遺伝子は、正常血糖から高血糖へ遷移中の肥満性マウスで1.8倍上方制御される。このデータは、肝グルコース生産の増加および2型糖尿病の高血糖に関して細胞質型PEPCKが病原性の役割を果たすことを強く支持する。重要な留意点は、2型糖尿病患者の90%以上が肥満性であることである。食餌誘発性肥満症モデルでは、肥満性マウス群はまた、高血糖および、2型糖尿病に特徴的な他の代謝障害を発症する。したがって、細胞質型PEPCKはまた、2型糖尿病に関する治療標的である。
【０３１８】
以下に、ヒト細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)に関する生化学および、肥満症および／または糖尿病を処置する治療用抗体または小分子薬物のスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイをまとめる。
【０３１９】
細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)は、全身のエネルギー恒常性に関する重要な酵素であり、以下の反応を触媒する：
GTP＋オキサロ酢酸＝GDP＋ホスホエノールピルビン酸＋CO2
これは肝臓での糖新生および脂肪組織でのグリセロールの新生についての律速酵素であり、グルコース制限時の脂肪細胞でのグリセロールの新生経路に関与する。脂肪組織でのグリセロールの新生ではグリセロール-3-リン酸が生産される。これはトリグリセリド蓄積の基質である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)活性は、この代謝プロセスを制御する多数のホルモン、例えばグルカゴン、インスリン、および糖質コルチコイド類による影響を受ける。
【０３２０】
データは総じて、ヒト細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)のモジュレーター、例えば阻害剤／アンタゴニストが肥満症および／または糖尿病の処置に有益であろうことを示す。
【０３２１】
さらに、発明者らの結果は、細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)活性のモジュレーター、例えばPEPCKの阻害剤(インヒビター)、活性化剤(アクチベータ)、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０３２２】
発見過程
以下の段落では、細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)のコードタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症(Obesity)および糖尿病(Diabetes)に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計(群)および技術を記載する。
【０３２３】
実施例A1. 遺伝的肥満性マウス対遺伝的痩せマウスの研究
遺伝的肥満性マウス対遺伝的痩せマウスの研究用プロトコルは実施例Q6に開示する。
【０３２４】
まず、マウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK) 1遺伝子(マウス系統AKR、C57BL)の断片が、痩せC57L/Jマウスと比べて肥満性AKRマウスの脂肪組織中で3倍上方制御されることを見出した。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法(実施例Q7に記載)を使用した。約254ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すマウス遺伝子断片がマウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK) 1 cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このマウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK) 1の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフ (electropherographic) のピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表A1に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅(ablated)するものであった。肥満性AKRマウスおよび正常C57L/Jマウスの両者由来のサンプル中で、254 nt長位置のピークが消滅した。
【０３２５】
【表５】
2006511237.tif 000006
【０３２６】
実施例A2. マウス食餌誘発性肥満症研究
マウス食餌誘発性肥満症研究用のプロトコルは実施例Q1に開示する。
【０３２７】
体重および身体組成が相違する多数のマウス系統が同定されている。AKRおよびNZB系統は肥満性であり、SWR、C57BLおよびC57BL/6系統は平均体重性である一方、SM/JおよびCast/Ei系統は痩せ性である。これらの系統由来の主要代謝組織での遺伝子発現差を理解すれば、肥満症に関する病態生理学的基礎が解明される。これらの特定系統のラットを遺伝子発現差の解析用に選択した。この選択は、公開されている遺伝的研究で体重および関連形質に関する量的形質遺伝子座(QTL)が報告されているので行うことができた。組織は、全脳、骨格筋、内臓脂肪、および肝臓を含むものであった。
【０３２８】
臨床集団における肥満症の主原因は過剰のカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘発性肥満症(diet-induced obesity) (DIO)は、40%を超える脂肪含量の高脂肪性食餌での飼育によって動物モデルで模倣する。このDIO研究は、食餌誘発性肥満症の発症および進行に寄与する遺伝子発現の変化を同定するように作成した。さらに、この研究設計は、特定個体で高脂肪性食餌の影響への抵抗能を誘発し、これにより肥満症を予防する因子、の同定を追及するものであった。研究用サンプル群は固形飼料で飼育したコントロールの体重+ 1 S.D.、+ 4 S.D.および+ 7 S.D.を有するものであった。さらに、+ 7 S.D.マウスの生化学的プロファイルによれば、これらの動物が、肥満症にもかかわらず正常な血糖プロファイルを維持するマウスおよび高血糖を示すマウスにさらに層別化されることが示された。被験組織は、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、精巣上体WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(高速単収縮性の骨格筋)およびヒラメ筋(緩徐単収縮性の骨格筋)を含むものであった。これらの組織に関する遺伝子発現プロファイルの差は、肥満症の治療標的として使用可能な遺伝子および経路を示した。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０３２９】
結果
食餌誘発性肥満症の研究では、マウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の遺伝子断片がNgsd7 (正常血糖性、肥満性)対固形飼料飼育マウスの精巣上体脂肪床(efp)で7倍下方制御されることがわかった。この研究では、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。約349ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すマウス遺伝子断片がマウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK) cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このマウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表A2に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。Ngsd7および固形飼料飼育マウスの両者由来のサンプル中で、349 nt長位置のピークが消滅した。さらに、マウス細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子は、Ngsd7 (正常血糖性、肥満性)およびHgsd7 (高血糖性、肥満性)対Sd1または固形飼料飼育マウスの後腹膜脂肪床(rfp)で下方制御される。留意すべきことは、食餌誘発性肥満症モデルにおいて、脂肪中でのこの遺伝子の下方制御は、トリグリセリド蓄積および体脂肪蓄積を制限するための代償性応答であるかもしれないことである。
【０３３０】
【表６】
2006511237.tif 000007
【０３３１】
発明者らのデータはまた、食餌誘発性肥満症の研究において、Ngsd7 (正常血糖性かつ肥満性)対Hgsd7 (高血糖性かつ肥満性)マウスの肝臓で細胞質型PEPCKが1.8倍下方制御されることを示した。次いで、下方制御される遺伝子としてのPEPCKのアイデンティティーをTrapPing技術によって確認した(実施例Q7に開示する)。したがって、PEPCKはHgsd7肝臓対Ngsd7肝臓では上方制御される。それゆえ、PEPCKの上方制御は、正常血糖から高血糖への病理学的変化の間の遷移期に生じる。PEPCKは肝糖新生プロセス(非グルコース基質からのグルコース生産)の速度制御段階であるから、このデータは、PEPCKの上方制御が高血糖症および2型糖尿病への進行に関する決定的な段階であることを示す。
【０３３２】
実施例A3. ヒトPEPCK配列の同定
ヒトPEPCKの配列(受入番号 CG101190-01)は、実験室レベルでcDNA断片をクローニングすることによって得た。このクローニングは、その配列をin silico予測することによって行った。このDNA配列の完全長、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をクローニングした。in silico予測は、CuraGenの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいて行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。ヒト配列(群)を同定するためのプロトコルは実施例Q8に開示する。
【０３３３】
表A3はヒト(CG101190-01)、マウス(PPCC_MOUSE＝Q9Z2V4)およびラット(PPCC_RAT＝P07379)バージョンの細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)のタンパク質配列のアライメント(ClustalW)を示す。表A4はマウス(PPCC_MOUSE＝Q9Z2V4；配列番号174)およびラット(PPCC_RAT＝P07379；配列番号173)バージョンの細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)の配列を示す。
【０３３４】
【表７】
2006511237.tif 000008
【０３３５】
【表８】
2006511237.tif 000009
【０３３６】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV1クローンを解析し、表A6に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０３３７】
【表９】
2006511237.tif 000010
【表１０】
2006511237.tif 000011
【表１１】
2006511237.tif 000012
【表１２】
2006511237.tif 000013
【表１３】
2006511237.tif 000014
【表１４】
2006511237.tif 000015
【０３３８】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表A7に示す配列アライメントが得られる。
【０３３９】
【表１５】
2006511237.tif 000016
【０３４０】
NOV1aタンパク質をさらに解析して、以下の表A8に示す性質を得た。
【０３４１】
【表１６】
2006511237.tif 000017
【表１７】
2006511237.tif 000018
【０３４２】
NOV1aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表A9に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは、特許および特許公開で公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０３４３】
【表１８】
2006511237.tif 000019
【０３４４】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV1aタンパク質は表A10のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０３４５】
【表１９】
2006511237.tif 000020
【０３４６】
PFam解析による予測では、NOV1aタンパク質は表A11に示すドメインを含有する。
【０３４７】
【表２０】
2006511237.tif 000021
【０３４８】
実施例A4. ヒト細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子の変異体およびSNP
変異体配列は本出願に含まれる。変異体配列は一塩基(ヌクレオチド)多型(SNP)を含み得る。場合によってSNPは「cSNP」と称することができ、これはこのSNPを含有するヌクレオチド配列が元々cDNAであることを示す。SNPはいくつかの経路で生じ得る。例えば、SNPは多型部位において1ヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されたことにより生じることがある。このような置換は塩基転位(transition)または塩基転換(transversion)であり得る。SNPはまた、参照アレル(対立遺伝子)と比較してヌクレオチドが欠失するか、あるいはヌクレオチドが挿入されることによって生じ得る。この場合、多型部位は、1アレルが別のアレル中の特定ヌクレオチドに対してギャップを保持する部位である。遺伝子内にSNPが存在すると、このSNPの位置で当該遺伝子がエンコードするアミノ酸が変化することがある。しかしながら、遺伝子内SNPはサイレントであることもあり、これはSNPを含むコドンが遺伝コードの縮重のために不変のアミノ酸をエンコードする場合である。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中にSNPが存在する場合は、タンパク質のアミノ酸配列はいずれも変化しないが、発現パターンの制御が変化することがある。この変化は例えば、時間的発現(temporal expression)、生理学的反応制御、細胞型発現制御、発現強度、転写されたメッセージの安定性の変化である。
【０３４９】
新規SNP同定方法：SNPはCuraGenの私有SNPToolアルゴリズムを用いて配列アセンブリを解析することによって同定する。SNPToolは以下の判定基準を用いてアセンブリ中の変異を同定する：アライメント両端の10塩基対以内のSNPは解析しない；ウィンドウサイズ(視野内の塩基数)は10である；ウィンドウ内のミスマッチ許容数は2である；最小SNP塩基品質(PHREDスコア)は23である；SNPをスコアする最少数の変化は2/アセンブリ位置である。SNPToolはアセンブリを解析して、アセンブリ中のSNP位置、関連する個々の変異体配列、この既定位置でのアセンブリの程度(depth)、推定のアセンブリアレル頻度、およびSNP配列変異を表示する。次いで、配列トレースを選択し、手動検証用の視野に持ち込む。コンセンサスアセンブリ配列を変異体配列変化とともにCuraToolsにインポートし、SNP配列変異に起因するアミノ酸変化候補を同定する。次いで、包括的SNPデータ解析をSNPCallingデータベースにエクスポートする。
【０３５０】
新規SNP確認方法：SNPはPyrosequencingとして既知の実証済みの方法を利用して確認する。Pyrosequencingに関する詳細なプロトコルは：Alderborn et al. Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. (2000). Genome Research. 10, Issue 8, August. 1249-1265に見出せる。
【０３５１】
簡単に言えば、Pyrosequencingはジェノタイピングのリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコルでは、ゲノムDNAサンプルから二本鎖ビオチン標識PCR産物を採取し、これらをストレプトアビジンビーズと結合させる。次いで、これらのビーズを変性させ、一本鎖の結合DNAを得る。SNPの特徴付けは、DNA鎖の伸長時に各dNTPから放出されるピロリン酸(PPi)を間接的な生物発光測定によりアッセイすることに基づく技術を利用して行う。クレノーポリメラーゼ媒介性の塩基取り込みにしたがってPPiが放出されると、これがアデノシン5'-ホスホ硫酸(APS)とともにATPスルフリラーゼの基質として使用されてATPが形成される。続いて、このATPによってルシフェラーゼが作用し、ルシフェリンがそのオキシ誘導体に変換される。続いて発光し、この発光量は、約4塩基まで、付加された塩基数に比例したものになる。この方法の進行を許容するため、過剰のdNTPはアピラーゼによって分解する。アピラーゼを出発反応混合物中にも含ませ、シークエンシング時には少量のdNTPのみが鋳型に付加されるようにする。このプロセスは完全に自動化されていて、96ウェル形式に合わせて作成されており、したがって大型SNPパネルを高速スクリーニングすることが可能である。
【０３５２】
結果
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ様遺伝子CuraGen 受入番号 CG101190-01の新規一塩基多型変異体に関するDNAおよびタンパク質配列を表A12に報告する。変異体は個別に報告するが、任意の組み合わせの全または選択サブセットの変異体もまた含まれる。表A12では、変異塩基および変異アミノ酸残基の位置に下線を付している。総じて、表A12に報告する16変異体が存在する。変異体13374203はヌクレオチド配列の187 bp位置がGからAに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13374204はヌクレオチド配列の322 bp位置がGからAに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13374205はヌクレオチド配列の400 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13374206はヌクレオチド配列の668 bp位置がCからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸184位がLeuからValに変化する。変異体13378862はヌクレオチド配列の868 bp位置がGからAに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸250位がMetからIleに変化する。変異体13380271はヌクレオチド配列の917 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸267位がIleからValに変化する。変異体13378861はヌクレオチド配列の944 bp位置がGからAに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸276位がGluからLysに変化する。変異体13379542はヌクレオチド配列の1258 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13378352はヌクレオチド配列の1339 bp位置がCからAに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸407位がCysから停止コドンに変化する。変異体13375322はヌクレオチド配列の1680 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸521位がLysからArgに変化する。変異体13375321はヌクレオチド配列の1731 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸538位がGluからGlyに変化する。変異体13375320はヌクレオチド配列の1773 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸552位がLeuからProに変化する。変異体13375319はヌクレオチド配列の1848 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸577位がLeuからProに変化する。変異体13375318はヌクレオチド配列の1857 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸580位がIleからThrに変化する。変異体13377375はヌクレオチド配列の1887 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸590位がGluからGlyに変化する。ならびに、変異体13377374はヌクレオチド配列の1929 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸604位がLeuからProに変化する。
【０３５３】
表A12. 受入番号 CG101190-01のヌクレオチド配列(配列番号1)の変異体
【表２１】
2006511237.tif 000022
【０３５４】
【表２２】
2006511237.tif 000023
【表２３】
2006511237.tif 000024
【表２４】
2006511237.tif 000025
【表２５】
2006511237.tif 000026
【表２６】
2006511237.tif 000027
【表２７】
2006511237.tif 000028
【表２８】
2006511237.tif 000029
【表２９】
2006511237.tif 000030
【表３０】
2006511237.tif 000031
【表３１】
2006511237.tif 000032
【表３２】
2006511237.tif 000033
【表３３】
2006511237.tif 000034
【表３４】
2006511237.tif 000035
【表３５】
2006511237.tif 000036
【表３６】
2006511237.tif 000037
【表３７】
2006511237.tif 000038
【表３８】
2006511237.tif 000039
【表３９】
2006511237.tif 000040
【表４０】
2006511237.tif 000041
【表４１】
2006511237.tif 000042
【表４２】
2006511237.tif 000043
【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
2006511237.tif 000054
【０３５５】
実施例A5. ヒト細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子の発現プロファイル
定量的発現解析用プロトコルは実施例Q9に開示する。
【０３５６】
遺伝子CG101190-01の発現は表A14に記載のプライマー-プローブセットAg1769を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表A15、A16、およびA17に示す。
【０３５７】
表A14. プローブ名Ag1769
【表５４】
2006511237.tif 000055
【０３５８】
表A15. パネル1.3D
【表５５】
2006511237.tif 000056
【表５６】
2006511237.tif 000057
【０３５９】
表A16. パネル5島
【表５７】
2006511237.tif 000058
【０３６０】
表A17.一般_スクリーニング_パネル_v1.7
【表５８】
2006511237.tif 000059
【表５９】
2006511237.tif 000060
【０３６１】
パネル1.3D概要：ヒト細胞質型PEPCK遺伝子の発現は肝臓で最大であった(CT＝24.6)。細胞質型PEPCKは脂肪、乳腺、腎臓、大腸、小腸、心臓、および副腎において中〜高レベルで発現された。この発現パターンはGeneCalling (登録商標)の結果および刊行物の報告と一致する。
【０３６２】
パネル5島概要：このパネル上のサンプルのうち、ヒト細胞質型PEPCK遺伝子の発現は小腸で最大であった(CT＝28.3)。また、肝臓、脂肪および膵臓のランゲルハンス島で低レベルの発現が検出された。
【０３６３】
一般_スクリーニング_パネル_v1.7概要：Ag1769この遺伝子の最大発現は、肝臓(CT=23.4)、腎臓(CT=24.6)、脂肪(CT=26.31)、大腸(CT=25.7)、リンパ節(CT=26.7)、および脳下垂体(CT=26.83)で検出された。この遺伝子はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)をエンコードするものである。PEPCKの細胞質型アイソフォームは脂肪組織でのグリセロールの新生を制御する。グリセロールの新生の産物であるグリセロール-3-リン酸はトリグリセリド合成に使用される。細胞質型PEPCKは肥満性AKRの脂肪組織対正常C57Bl脂肪で上方制御されるので、この肥満表現型に寄与するかもしれない。この仮説は、遺伝子組換えにより脂肪中で細胞質型PEPCKが過剰発現されると、グリセロールの新生の増加、脂肪細胞(fat cell)のサイズおよび脂肪量の増加、および体重増加に結び付くという事実(Sun Y, Liu S, Ferguson S, Wang L, Klepcyk P, Yun JS, Friedman JE. Phosphoenolpyruvate carboxykinase over-expression selectively attenuates insulin signaling and hepatic insulin sensitivity in transgenic mice. J Biol Chem. 2002)によって支持される。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満症および糖尿病の処置に有用である。
【０３６４】
実施例A6. 肥満症および／または糖尿病の病因および病原性に関連する経路
PathCallingスクリーニングにより、細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)とスタスミン様4およびヘム制御性開始因子2アルファキナーゼ(HRI)に関する有意なタンパク質-タンパク質相互作用を同定した。PathCalling用プロトコルは実施例Q10に開示する。
【０３６５】
スタスミンは遍在性のリン酸化タンパク質であり、多様な制御経路に関する細胞内中継物として作用すると考えられる(Sobel A. Stathmin: a relay phosphoprotein for multiple signal transduction? Trends Biochem Sci  1991 Aug;16(8):301-5. PMID: 1957351)。HRIもまた、広く発現されていて、脂肪、筋肉および肝臓中では有意な転写レベルを有する。そしてHRIは酸化ストレスによって活性化される(Hwang SY, Kim MK, Kim JC. Cloning of hHRI, human heme-regulated eukaryotic initiation factor 2α kinase: down-regulated in epithelial ovarian cancers. Mol Cell  2000 Oct 31;10(5):584-91 PMID: 11101152)。酸化ストレスは糖尿病と関連付けられている。酸化ストレス条件下では、HRIは細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをリン酸化し、活性化する可能性がある。
【０３６６】
ヒト細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子の作用を阻害すると、その結果、グリセロールの新生、脂肪組織中のトリグリセリド蓄積、脂肪細胞(fat cell)のサイズおよび脂肪量が潜在的に減少し、そして体重が減少するであろう。細胞質型PEPCKの阻害はまた、肝糖新生を減少させ、2型糖尿病の絶食性高血糖を改善するであろう。
【０３６７】
実施例A7. ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのモジュレーターに関するスクリーニングアッセイ
ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)遺伝子を発現する株化細胞の不完全リストは、本明細書中に示すRTQ-PCRの結果から得ることができる。これらの、および他のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。
【０３６８】
PEPCKの阻害剤／アンタゴニストに関するスクリーニングは、in vitroグルコース生産アッセイを使用すれば実行可能であろう。H4IIE細胞を組換え細胞質型PEPCKでトランスフェクトすれば、この細胞をグルコース生産に関して試験できよう。この試験は、Wang JC, Stafford JM, Scott DK, Sutherland C, Granner DK. The molecular physiology of hepatic nuclear factor 3 in the regulation of gluconeogenesis. J Biol Chem 275:14717-21, 2000, PMID: 10799560のMaterials and Methodsに記載されるように行う。
【０３６９】
発明者らの結果は、細胞質型ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(PEPCK)活性のモジュレーター、例えばPEPCKの阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性(insulin resistance)のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０３７０】
B.NOV2 -- トランスケトラーゼ
トランスケトラーゼはチアミン依存性酵素であり、ペントースリン酸経路を解糖系と連結する。ペントースリン酸経路は、ほとんどの組織で活性であり、中間生合成、特にヌクレオチド代謝用の糖リン酸を提供する。ペントース経路はまた、NADPHの形で、細胞用の生合成による還元力を生み出す。トランスケトラーゼは、過剰の糖リン酸を解糖へ向ける経路の分岐に直接関与して、種々の代謝条件下で維持されるべきNADPHの生産を可能にする。ペントースリン酸経路は、脂肪酸の生産およびステロイド合成が生じる部位で特に活性であり、その理由はこれらがNADPHの還元力を必要とするからである(Lewandowski PA, Cameron-Smith D, Jackson CJ, Kultys ER, Collier GR. The role of lipogenesis in the development of obesity and diabetes in Israeli sand rats (Psammomys obesus). J Nutr 1998 Nov;128(11):1984-8. PMID: 9808653; Parks EJ, Krauss RM, Christiansen MP, Neese RA, Hellerstein MK. Effects of a low-fat, high-carbohydrate diet on VLDL-triglyceride assembly, production, and clearance.J Clin Invest. 1999 Oct;104(8):1087-96. PMID: 10525047; Marques-Lopes I, Ansorena D, Astiasaran I, Forga L, Martinez JA. Postprandial de novo lipogenesis and metabolic changes induced by a high-carbohydrate, low-fat meal in lean and overweight men. Am J Clin Nutr. 2001 Feb;73(2):253-61. PMID: 11157321)。
【０３７１】
発明者らは、トランスケトラーゼが種々の体重を有するマウス由来の褐色脂肪組織で下方制御されることを発見した。この種々の体重を有するマウスは、肥満性(固形飼料飼育マウスに対してsd4)から重度肥満性(固形飼料飼育マウスに対してngsd7)および高血糖性、重度肥満性マウス (固形飼料飼育マウスに対してhgsd7+)の範囲にわたり、高脂肪性食餌で飼育した；同一マウス群由来の白色脂肪ではトランスケトラーゼは不変のままであった。このトランスケトラーゼの下方制御は、脂肪酸合成経路および補充経路のいくつかの酵素の下方制御と連動し、この酵素には、ATPクエン酸リアーゼ、脂肪酸延長酵素、およびリンゴ酸酵素、ならびにSREBPが含まれる。この事実は、褐色脂肪中で脂肪酸合成および脂質生合成が下方制御され、これが高脂肪性食餌に対する代償性機構であることを示す。このような代償性機構は白色脂肪には存在しない(Swierczynski J, Goyke E, Wach L, Pankiewicz A, Kochan Z, Adamonis W, Sledzinski Z, Aleksandrowicz Z. Comparative study of the lipogenic potential of human and rat adipose tissue. Metabolism. 2000 May;49(5):594-9. PMID: 10831168; Hellerstein MK. De novo lipogenesis in humans: metabolic and regulatory aspects. Eur J Clin Nutr. 1999 Apr;53 Suppl 1:S53-65. Review. PMID: 10365981)。
【０３７２】
図1は、ヒトトランスケトラーゼに関する生化学および、肥満症および／または糖尿病を処置する治療用抗体または小分子薬物のスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイの概要である。図1は、脂肪酸およびステロイド生合成用のNADPHを生成するペントースリン酸経路を示す。この経路は酸化的第一段階および非酸化的第二段階を有する。非酸化的段階は、ペントースリン酸経路および解糖の間の連結段階である。この経路の反応は細胞質性である。トランスケトラーゼ補助因子はチアミンピロリン酸およびMg2+である(Frank T, Bitsch R, Maiwald J, Stein G. Alteration of thiamine pharmacokinetics by end-stage renal disease (ESRD). Int J Clin Pharmacol Ther 1999 Sep;37(9):449-55; Pietrzak I, Baczyk K. Erythrocyte transketolase activity and guanidino compounds in hemodialysis patients. Kidney Int Suppl 2001 Feb;78:S97-101)。
【０３７３】
図2は、ヒトトランスケトラーゼの発現変化および付随する遺伝子産物の変化が肥満症および／または糖尿病の病因および病原性に関していかに機能するかを示す。この図式には、これらの発見研究の新規知見が刊行物に報告されている内容とともに包含される。ヒトトランスケトラーゼの作用を阻害すると、その結果、肥満症および／または糖尿病の主要な問題であるインスリン抵抗性が減少するであろう。
【０３７４】
したがって、白色脂肪でトランスケトラーゼを阻害することにより褐色脂肪を模倣すると、NADPH量が減少し、脂肪酸合成および脂質生合成用の必要量が不足するかもしれない。脂肪酸合成および脂質生合成に利用可能なNADPHが減少すると、強制的に保存脂肪が利用される可能性がある。ゆえに、トランスケトラーゼのモジュレーター、例えばトランスケトラーゼ用のアンタゴニストまたは阻害剤は、肥満症および／または糖尿病の処置に有益である可能性がある。さらに、トランスケトラーゼの阻害を介してフルクトース-6-リン酸の生産が阻害されると、ヘキソサミン経路が減少する可能性があり、インスリン抵抗性に関しても有益な効果を有する可能性がある。トランスケトラーゼ発現性の株化細胞は、本明細書中に開示するRTQ-PCRの結果から得ることができる。これらの、および他のトランスケトラーゼ発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。
【０３７５】
さらに発明者らの結果は、トランスケトラーゼ活性のモジュレーター、例えばトランスケトラーゼの阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０３７６】
発見過程
以下の段落では、トランスケトラーゼのコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計(群)および技術を記載する。
【０３７７】
肥満症および糖尿病は、先進国および開発途上国世界において、公衆衛生上の主要な課題である。見積もりでは、米国成人人口の半数以上が過体重であり、正常上限(25)を超える肥満度指数(BMI)を有するとされる。ここでBMIの定義は、体重(Kg) / [身長(m)]2である。過体重は一般に、高脂血症およびインスリン抵抗性の発症を招き、その後、II型糖尿病の特徴である高血糖症が発症する。無処置で放置すると、高血糖症は微小血管の疾患および終末器官の損傷を導く。これには、網膜症(retinopathy)、腎疾患、心疾患、末梢神経障害(peripheral neuropathy)および末梢血管障害(peripheral vascular compromise)が含まれる。現在、米国の1600万人を超える成人が2型糖尿病に冒されており、また、学童期の子供の間で肥満症が流行している結果、その症状は今やこの年齢群で猛威をふるうようになっている。
【０３７８】
真性糖尿病(Diabetes mellitus)は、グルコース(単糖)の血中濃度が異常に高い障害であり、その原因は身体が適切にインスリンを放出しないか、あるいは適切にインスリンに応答しないことである。血糖(グルコース)値は一日じゅう変化し、食事の後には上昇し、そして2時間以内に正常値に回復する。血糖値の正常値は、一晩絶食した翌朝には70〜110ミリグラム／血液1デシリットル(mg/dL)の範囲である。糖または他の炭水化物を含有する食物を摂食し、あるいは液状物を飲用した2時間後の血糖値は通常、120〜140 mg/dL未満である。
【０３７９】
インスリンは、膵臓から放出されるホルモンであり、適切な血糖値の維持を担う主要な物質である。インスリンはグルコースを細胞内へ輸送させ、細胞がエネルギーを生産でき、あるいはグルコース由来のエネルギーを必要になるまで保存できるようにする。摂食または飲用後に血糖値が上昇すると、膵臓のインスリン生産が促進されて、それ以上の血糖値上昇が妨げられ、そして血糖値が徐々に低下する。筋肉はグルコースをエネルギーとして使用するため、血糖値はまた、運動中に低下し得る。
【０３８０】
糖尿病は、身体が正常な血糖値を維持するのに十分なインスリンを生産しない場合または細胞がインスリンに対して適切に応答しない場合に生じる。II型真性糖尿病では、膵臓は継続的にインスリンを製造し、その製造は正常レベルより高いことさえある。しかしながら、身体はその作用に対する抵抗性を生じさせ、相対的なインスリン欠乏となる。
【０３８１】
糖尿病処置の主要な目標は、血糖値をできる限り正常範囲内で維持することである。完全に正常な濃度を維持することは困難であるが、血糖値を正常範囲内で維持できる状態に近づくほど、一時的または長期的合併症が発症する可能性は少なくなる。
【０３８２】
したがって、インスリン抵抗性を減少させ、ならびに／あるいはインスリン分泌を増強する治療法は、肥満症および／または糖尿病の処置に有益であろう。さらに、このような治療法は糖尿病の発症を招くことが多い症状であるインスリン抵抗性の処置に有益であろう。
【０３８３】
実施例B1. マウス食餌誘発性肥満症
マウス食餌誘発性肥満症研究用のプロトコルは実施例Q1に開示する。
【０３８４】
臨床集団における肥満症の主原因は過剰のカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘発性肥満症(DIO)は、40%を超える脂肪含量の高脂肪性食餌での飼育によって動物モデル(マウス系統C57BL/6)で模倣する。このDIO研究は、食餌誘発性肥満症の発症および進行に寄与する遺伝子発現の変化を同定するように作成した。さらに、この研究設計は、特定個体で高脂肪性食餌の影響への抵抗能を誘発し、これにより肥満症を予防する因子の同定を追及するものであった。研究用サンプル群は固形飼料で飼育したコントロールの体重+ 1 S.D.、+ 4 S.D.および+ 7 S.D.を有するものであった(以下)。さらに、+ 7 S.D.マウスの生化学的プロファイルによれば、これらの動物が、肥満症にもかかわらず正常な血糖プロファイルを維持するマウスおよび高血糖を示すマウスにさらに層別化されることが示された。被験組織は、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、精巣上体WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(高速単収縮性の骨格筋)およびヒラメ筋(緩徐単収縮性の骨格筋)を含むものであった。これらの組織に関する遺伝子発現プロファイルの差は、肥満症および／または糖尿病の治療標的として使用可能な遺伝子および経路を示した。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０３８５】
結果
まず、マウス(マウス系統C57BL/6)トランスケトラーゼ遺伝子の断片が、高脂肪性食餌飼育マウスの褐色脂肪組織では固形飼料飼育マウスの褐色脂肪と比べて1.7倍下方制御されることがわかった。この高脂肪性食餌飼育マウスは固形飼料飼育マウスと比べて4標準偏差の体重に達する。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。約385ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すヒト遺伝子断片がヒトトランスケトラーゼcDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このヒトトランスケトラーゼの遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表B1に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。固形飼料飼育マウスおよび高脂肪性食餌飼育マウスの両者由来のサンプル中で、385 nt長位置のピークが消滅した。
【０３８６】
【表６０】
2006511237.tif 000061
【０３８７】
実施例B2. ヒトトランスケトラーゼ配列の同定
ヒトトランスケトラーゼの配列(受入番号 CG175387-01)は、実験室レベルでcDNA断片をクローニングすることによって得た。このクローニングは、その配列をin silico予測することによって行った。このDNA配列の完全長、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をクローニングした。in silico予測は、CuraGenの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいて行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。ヒト配列(群)を同定するためのプロトコルは実施例Q8に開示する。
【０３８８】
表B2はヒトトランスケトラーゼ配列(CG175387-01；配列番号8)およびマウストランスケトラーゼ配列(配列番号179)のタンパク質アライメント(ClustalW)を示す。表B3はマウストランスケトラーゼの配列(配列番号179)を示す。
【０３８９】
【表６１】
2006511237.tif 000062
【０３９０】
【表６２】
2006511237.tif 000063
【０３９１】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV2クローンを解析し、表B4に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０３９２】
【表６３】
2006511237.tif 000064
【表６４】
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【表６５】
2006511237.tif 000066
【表６６】
2006511237.tif 000067
【表６７】
2006511237.tif 000068
【表６８】
2006511237.tif 000069
【表６９】
2006511237.tif 000070
【表７０】
2006511237.tif 000071
【表７１】
2006511237.tif 000072
【表７２】
2006511237.tif 000073
【０３９３】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表B5に示す配列アライメントが得られる。
【０３９４】
【表７３】
2006511237.tif 000074
【表７４】
2006511237.tif 000075
【０３９５】
NOV2aタンパク質をさらに解析し、以下の表B6に示す性質を得た。
【０３９６】
【表７５】
2006511237.tif 000076
【表７６】
2006511237.tif 000077
【０３９７】
NOV2aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表B7に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは、特許および特許公開で公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０３９８】
【表７７】
2006511237.tif 000078
【０３９９】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV2aタンパク質は表B8のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０４００】
【表７８】
2006511237.tif 000079
【０４０１】
PFam解析による予測では、NOV2aタンパク質は表B9に示すドメインを含有する。
【０４０２】
【表７９】
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【０４０３】
実施例B3. トランスケトラーゼ遺伝子の変異体およびSNP
変異体配列は本出願に含まれる。変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み得る。場合によってSNPは「cSNP」と称することができ、これはこのSNPを含有するヌクレオチド配列が元々cDNAであることを示す。SNPはいくつかの経路で生じ得る。例えば、SNPは多型部位において1ヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されたことにより生じることがある。このような置換は塩基転位または塩基転換であり得る。SNPはまた、参照アレルと比較してヌクレオチドが欠失するか、あるいはヌクレオチドが挿入されることによって生じ得る。この場合、多型部位は、1アレルが別のアレル中の特定ヌクレオチドに対してギャップを保持する部位である。遺伝子内にSNPが存在すると、このSNPの位置で当該遺伝子がエンコードするアミノ酸が変化することがある。しかしながら、遺伝子内SNPはサイレントであることもあり、これはSNPを含むコドンが遺伝コードの縮重のために不変のアミノ酸をエンコードする場合である。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中にSNPが存在する場合は、タンパク質のアミノ酸配列はいずれも変化しないが、発現パターンの制御が変化することがある。この変化は例えば、時間的発現、生理学的反応制御、細胞型発現制御、発現強度、転写されたメッセージの安定性の変化である。
【０４０４】
新規SNP同定方法：
SNPはCuraGenの私有SNPToolアルゴリズムを用いて配列アセンブリを解析することによって同定する。SNPToolは以下の判定基準を用いてアセンブリ中の変異を同定する：アライメント両端の10塩基対以内のSNPは解析しない；ウィンドウサイズ(視野内の塩基数)は10である；ウィンドウ内のミスマッチ許容数は2である；最小SNP塩基品質(PHREDスコア)は23である；SNPをスコアする最少数の変化は2/アセンブリ位置である。SNPToolはアセンブリを解析して、アセンブリ中のSNP位置、関連する個々の変異体配列、この既定位置でのアセンブリの程度、推定のアセンブリアレル頻度、およびSNP配列変異を表示する。次いで、配列トレースを選択し、手動検証用の視野に持ち込む。コンセンサスアセンブリ配列を変異体配列変化とともにCuraToolsにインポートし、SNP配列変異に起因するアミノ酸変化候補を同定する。次いで、包括的SNPデータ解析をSNPCallingデータベースにエクスポートする。
【０４０５】
新規SNP確認方法：SNPはPyrosequencingとして既知の実証済みの方法を利用して確認する。Pyrosequencingに関する詳細なプロトコルは：Alderborn et al. Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. (2000). Genome Research. 10, Issue 8, August. 1249-1265に見出せる。
【０４０６】
簡単に言えば、Pyrosequencingはジェノタイピングのリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコルでは、ゲノムDNAサンプルから二本鎖ビオチン標識PCR産物を採取し、これらをストレプトアビジンビーズと結合させる。次いで、これらのビーズを変性させ、一本鎖の結合DNAを得る。SNPの特徴付けは、DNA鎖の伸長時に各dNTPから放出されるピロリン酸(PPi)を間接的な生物発光測定によりアッセイすることに基づく技術を利用して行う。クレノーポリメラーゼ媒介性の塩基取り込みにしたがってPPiが放出されると、これがアデノシン5'-ホスホ硫酸(APS)とともにATPスルフリラーゼの基質として使用されてATPが形成される。続いて、このATPによってルシフェラーゼが作用し、ルシフェリンがそのオキシ誘導体に変換される。続いて発光し、この発光量は、約4塩基まで、付加された塩基数に比例したものになる。この方法の進行を許容するため、過剰のdNTPはアピラーゼによって分解する。アピラーゼを出発反応混合物中にも含ませ、シークエンシング時には少量のdNTPのみが鋳型に付加されるようにする。このプロセスは完全に自動化されていて、96ウェル形式に合わせて作成されており、したがって大型SNPパネルを高速スクリーニングすることが可能である。
【０４０７】
結果
トランスケトラーゼ様遺伝子CuraGen 受入番号 CG175387-01の新規一塩基多型変異体に関するDNAおよびタンパク質配列を表B10に報告する。変異体は個別に報告するが、任意の組み合わせの全または選択サブセットの変異体もまた含まれる。表B10では、変異塩基および変異アミノ酸残基の位置に下線を付している。総じて、表B10に報告する22変異体が存在する。変異体13377687はヌクレオチド配列の134 bp位置がGからAに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸19位がAlaからThrに変化する。変異体13377688はヌクレオチド配列の287 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸70位がArgからCysに変化する。変異体13377684はヌクレオチド配列の566 bp位置がGからTに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸163位がValからLeuに変化する。変異体13377689はヌクレオチド配列の651 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸191位がAspからGlyに変化する。変異体13380050はヌクレオチド配列の699 bp位置がAからTに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸207位がGluからValに変化する。変異体13380051はヌクレオチド配列の741 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸221位がValからAlaに変化する。変異体13377683はヌクレオチド配列の747 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸223位がGluからGlyに変化する。変異体13377690はヌクレオチド配列の894 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸272位がGlnからArgに変化する。変異体13377682はヌクレオチド配列の1253 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸392位がPheからLeuに変化する。変異体13380092はヌクレオチド配列の1307 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸410位がIleからValに変化する。変異体13380073はヌクレオチド配列の1441 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13380072はヌクレオチド配列の1519 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13380093はヌクレオチド配列の1529 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸484位がAsnからAspに変化する。変異体13380094はヌクレオチド配列の1550 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸491位がGlnから停止コドンに変化する。変異体13380095はヌクレオチド配列の1603 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13380052はヌクレオチド配列の1645 bp位置がGからTに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13377691はヌクレオチド配列の1683 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸535位がPheからSerに変化する。変異体13380053はヌクレオチド配列の1783 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13377686はヌクレオチド配列の1802 bp位置がGからAに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸575位がAlaからThrに変化する。変異体13380055はヌクレオチド配列の1813 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。変異体13377685はヌクレオチド配列の1832 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸585位がThrからAlaに変化する。ならびに、変異体13380056はヌクレオチド配列の1862 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸595位がSerからGlyに変化する。
【０４０８】
表B10. 受入番号 CG175387-01のヌクレオチド配列(配列番号7)の変異体
【表８０】
2006511237.tif 000081
【０４０９】
【表８１】
2006511237.tif 000082
【表８２】
2006511237.tif 000083
【表８３】
2006511237.tif 000084
【表８４】
2006511237.tif 000085
【表８５】
2006511237.tif 000086
【表８６】
2006511237.tif 000087
【表８７】
2006511237.tif 000088
【表８８】
2006511237.tif 000089
【表８９】
2006511237.tif 000090
【表９０】
2006511237.tif 000091
【表９１】
2006511237.tif 000092
【表９２】
2006511237.tif 000093
【表９３】
2006511237.tif 000094
【表９４】
2006511237.tif 000095
【表９５】
2006511237.tif 000096
【表９６】
2006511237.tif 000097
【表９７】
2006511237.tif 000098
【表９８】
2006511237.tif 000099
【表９９】
2006511237.tif 000100
【表１００】
2006511237.tif 000101
【表１０１】
2006511237.tif 000102
【表１０２】
2006511237.tif 000103
【表１０３】
2006511237.tif 000104
【表１０４】
2006511237.tif 000105
【表１０５】
2006511237.tif 000106
【表１０６】
2006511237.tif 000107
【表１０７】
2006511237.tif 000108
【表１０８】
2006511237.tif 000109
【表１０９】
2006511237.tif 000110
【表１１０】
2006511237.tif 000111
【表１１１】
2006511237.tif 000112
【表１１２】
2006511237.tif 000113
【表１１３】
2006511237.tif 000114
【表１１４】
2006511237.tif 000115
【表１１５】
2006511237.tif 000116
【表１１６】
2006511237.tif 000117
【表１１７】
2006511237.tif 000118
【表１１８】
2006511237.tif 000119
【表１１９】
2006511237.tif 000120
【表１２０】
2006511237.tif 000121
【表１２１】
2006511237.tif 000122
【表１２２】
2006511237.tif 000123
【表１２３】
2006511237.tif 000124
【表１２４】
2006511237.tif 000125
【０４１０】
実施例B4. トランスケトラーゼの発現プロファイル
定量的発現解析用のプロトコルは実施例Q9に開示する。
【０４１１】
遺伝子CG175387-01およびG175387-03の発現は表B12に記載のプライマー-プローブセットAg6328を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表B13、B14およびB15に示す。
【０４１２】
表B12. プローブ名Ag6328
【表１２５】
2006511237.tif 000126
【０４１３】
表B13. 一般スクリーニングパネルv1.5
【表１２６】
2006511237.tif 000127
【表１２７】
2006511237.tif 000128
【０４１４】
表B14. パネル5島
【表１２８】
2006511237.tif 000129
【表１２９】
2006511237.tif 000130
【０４１５】
表B15. 一般_スクリーニング_パネル_v1.6
【表１３０】
2006511237.tif 000131
【表１３１】
2006511237.tif 000132
【０４１６】
一般スクリーニングパネルv1.5概要：トランスケトラーゼはすべての組織で大量に発現される。トランスケトラーゼは脂肪で高度に発現され(CT=27.42)、これが標的組織である。
【０４１７】
パネル5島概要：パネル5Iは胎盤で最大発現を示し、脂肪組織で良好に発現される。これはパネル1.5のデータを支持する。
【０４１８】
一般スクリーニングパネルv1.6概要：(Ag6328)この遺伝子の高度な発現がすべての組織で遍在的に検出された(CT=26-30)。この遍在的発現パターンは、この遺伝子の産物がこれらの、ならびに他の細胞型および組織に関する恒常性プロセスに関与することを示す。
【０４１９】
この遺伝子の発現は、すべての癌細胞株(黒色腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎癌、膵癌、およびCNS癌)で増加し、CT=22-26であった。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、黒色腫(melanoma)、卵巣癌(ovarian cancer)、乳癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、腎癌(renal cancer)、膵癌(pancreatic cancer)、およびCNS癌(CNS cancer)の処置に有用である。さらに、この遺伝子の発現はこれらの癌に関する検出マーカーとして使用可能である。
【０４２０】
この遺伝子は脂肪組織で高度に発現されていた(CT27.42)。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、肥満症および糖尿病の処置に有用である。
【０４２１】
実施例B5. PathCalling (登録商標)
PathCalling (登録商標)スクリーニングでは、トランスケトラーゼ(TKT)が転写因子(TIF1)およびセマフォリンの細胞外ドメイン(CG51896-04、表EB5参照)と相互作用することが示された。両相互作用は種々のライブラリーを用いるスクリーニングプロセスで何度も検出されている。PathCalling (登録商標)技術用のプロトコルは実施例Q10に開示する。
【０４２２】
【表１３２】
2006511237.tif 000133
【０４２３】
実施例B6. トランスケトラーゼのモジュレーターに関するスクリーニングアッセイ
トランスケトラーゼ遺伝子を発現する株化細胞の不完全リストは、本明細書中に示すRTQ-PCRの結果から得ることができる。これらの、および他のトランスケトラーゼ発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。
【０４２４】
トランスケトラーゼのモジュレーターに関するスクリーニングは、上に概説するようにトランスケトラーゼが関与する反応から生成されるNADPHを測定することによって実行してよい。さらにトランスケトラーゼ活性は、Frank et al, High thiamine diphosphate concentrations in erythrocytes can be achieved in dialysis patients by oral administration of benfontiamine, Eur J Clin Pharmacol. 2000 Jun;56(3):251-7)に概説されている方法によって測定可能であろう。
【０４２５】
トランスケトラーゼモジュレーターの有効性に関する機能／機構的アッセイは、3T3-L1マウス脂肪細胞、ヒト脂肪細胞または肝細胞中のTG合成／蓄積に対するトランスケトラーゼ1阻害剤の効果を測定することによって実行可能である。この測定はオイルレッドO (Oil Red O)染色によって行う。あるいは、トランスケトラーゼ1でトランスフェクトした細胞中の処理後TG蓄積から測定を構成することができよう。
【０４２６】
発明者らの結果は、トランスケトラーゼ活性のモジュレーター、例えばトランスケトラーゼの阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０４２７】
C. NOV3 -- 長鎖脂肪酸アシル延長酵素
長鎖脂肪酸アシル延長酵素(LCE)は、マロニル-CoAを2炭素供与体として使用し、炭素数16の脂肪酸であるパルミチン酸を炭素数18の脂肪酸であるステアリン酸に延長する酵素である。この脂肪酸の延長は小胞体で生じ、この場合、2炭素付加ごとに以下の4つの連続反応が必要である：(1)脂肪酸アシル-CoAおよびマロニル-CoA間の縮合、これにより3-ケトアシル-CoAが形成される、(2) NADPHを用いる3-ケトアシル-CoAの還元、これにより3-ヒドロキシアシル-CoAが形成される、(3) 3-ヒドロキシアシル-CoAの脱水、これによりトランス-2-エノイル-CoAが得られる、および(4)トランス-2-エノイル-CoAの還元、これにより飽和アシル-CoAが得られる。LCEは、脂肪酸延長の縮合段階に必須であることが示されており、これは律速段階である。LCEはSREBPによって制御されるが、これは脂肪酸合成および脂質生合成に関する多数の酵素と同様である(Moon YA, Shah NA, Mohapatra S, Warrington JA, Horton JD. Identification of a mammalian long chain fatty acyl elongase regulated by sterol regulatory element-binding protein J Biol Chem 2001 Nov 30;276(48):45358-66. PMID: 11567032)。
【０４２８】
発明者らは、種々の体重を有する高脂肪性食餌飼育マウス由来の褐色脂肪組織中でLCEが下方制御されることを発見した。この種々の体重のマウスは、肥満性(固形飼料飼育マウスに対してsd4)、重度肥満性(固形飼料飼育マウスに対してsd7)、および高血糖性、重度肥満性マウス(固形飼料飼育マウスに対してsd7+)の範囲にわたる。しかしながら、同一マウス群由来の白色脂肪ではLCEは不変のままであった。このLCEの下方制御は、脂肪酸合成経路および補充経路のいくつかの酵素の下方制御と連動し、この酵素には、ATPクエン酸リアーゼ、トランスケトラーゼ、リンゴ酸酵素、およびSREBPが含まれる。この事実は、褐色脂肪中では脂肪酸合成および脂質生合成が下方制御され、これが高脂肪性食餌に対する代償であることを示す。このような代償性機構は白色脂肪には存在しない。刊行物では、長鎖脂肪酸が短鎖脂肪酸より酸化されにくいこと(DeLany JP, Windhauser MM, Champagne CM, Bray GA.Differential oxidation of individual dietary fatty acids in humans. Am J Clin Nutr. 2000 Oct;72(4):905-11. PMID: 11010930)および長鎖脂肪酸のほうが筋肉および肝臓中で保持されやすく、インスリン抵抗性に寄与する可能性があること(Bessesen DH, Vensor SH, Jackman MR. Trafficking of dietary oleic, linolenic, and stearic acids in fasted or fed lean rats.Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000 Jun;278(6):E1124-32. PMID: 10827016)が明らかに示されている。したがって、白色脂肪中でLCEを阻害することによって褐色脂肪を模倣すると、長鎖脂肪酸量が減少し、ゆえに短鎖脂肪酸の脂肪酸酸化をより促進する可能性がある。
【０４２９】
したがって、LCEのモジュレーター、例えばLCEに対するアンタゴニストまたは阻害剤は、肥満症および／または糖尿病の処置に有益である可能性がある。ポテンシャルアッセイを使用して、肥満症および／または糖尿病の処置に有用なヒト長鎖脂肪酸アシル延長酵素関連の治療用抗体または小分子薬物をスクリーニングする。LCEの阻害剤に関するスクリーニングアッセイでは、放射標識マロニル-CoAをパルミチン酸(palmitate)に加えて、放射標識ステアリン酸(stearate)を得、これを分配アッセイによって検出できる。長鎖脂肪酸アシル延長酵素を発現する株化細胞の不完全リストは、本明細書中に示す遺伝子発現差(RTQ-PCR)の結果から得ることができる。これらの、および他の長鎖脂肪酸アシル延長酵素発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。
【０４３０】
さらに、発明者らの結果は、長鎖脂肪酸アシル延長酵素活性のモジュレーター、例えば長鎖脂肪酸アシル延長酵素の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０４３１】
発見過程
以下の段落では、長鎖脂肪酸アシル延長酵素のコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および／または糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計および技術を記載する。
【０４３２】
実施例C1. マウス食餌誘発性肥満症 
マウス食餌誘発性肥満症研究用のプロトコルは実施例Q1に開示する。
【０４３３】
臨床集団における肥満症の主原因は過剰のカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘発性肥満症(DIO)は、40%を超える脂肪含量の高脂肪性食餌での飼育によって動物モデルで模倣する。このDIO研究は、食餌誘発性肥満症の発症および進行に寄与する遺伝子発現の変化を同定するように作成した。さらに、この研究設計は、特定個体で高脂肪性食餌の影響への抵抗能を誘発し、これにより肥満症を予防する因子、の同定を追及するものであった。研究用サンプル群は固形飼料で飼育したコントロールの体重+ 1 S.D.、+ 4 S.D.および+ 7 S.D.を有するものであった。さらに、+ 7 S.D.マウスの生化学的プロファイルによれば、これらの動物が、肥満症にもかかわらず正常な血糖プロファイルを維持するマウスおよび高血糖を示すマウスにさらに層別化されることが示された。被験組織は、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、精巣上体WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(高速単収縮性の骨格筋)およびヒラメ筋(緩徐単収縮性の骨格筋)を含むものであった。これらの組織に関する遺伝子発現プロファイルの差は、肥満症の治療標的として使用可能な遺伝子および経路を示した。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０４３４】
結果
まず、マウス(マウス系統C57BL/6J)長鎖脂肪酸アシル延長酵素(LCE)遺伝子の断片が正常体重マウス(固形飼料で飼育)と比べて高脂肪性食餌で飼育した肥満性マウス(sd4)の褐色脂肪組織で2倍下方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。約285ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すマウス遺伝子断片がマウス長鎖脂肪酸アシル延長酵素cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このマウス長鎖脂肪酸アシル延長酵素の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表C1に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。高脂肪性食餌で飼育した肥満性マウス(sd4)および正常体重マウス(固形飼料で飼育)の両褐色脂肪組織由来のサンプル中で、285 nt長位置のピークが消滅した。さらに、LCEは、正常体重マウス(固形飼料で飼育)と比較して、高脂肪性食餌で飼育した高インスリン性(ngsd7)および高血糖性の肥満性マウスの褐色脂肪組織で下方制御されることがわかった。
【０４３５】
【表１３３】
2006511237.tif 000134
【０４３６】
実施例C2. ヒト長鎖脂肪酸アシル延長酵素配列の同定
ヒト長鎖脂肪酸アシル延長酵素の配列(受入番号 CG180320-01)は、実験室レベルでcDNA断片をクローニングすることによって得た。このクローニングは、その配列をin silico予測することによって行った。このDNA配列の完全長、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をクローニングした。in silico予測は、CuraGenの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいて行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。ヒト配列(群)を同定するためのプロトコルは実施例Q8に開示する。
【０４３７】
表C2は、ヒト長鎖脂肪酸アシル延長酵素のタンパク質配列(CG180320-01；配列番号18)の、マウス長鎖脂肪酸アシル延長酵素(Q920L5；配列番号184)およびラット長鎖脂肪酸アシル延長酵素(Q920L6；配列番号185)に対するタンパク質アライメント(ClustalW)を示す。表C3はマウス長鎖脂肪酸アシル延長酵素(Q920L5；配列番号184)およびラット長鎖脂肪酸アシル延長酵素(Q920L6；配列番号185)の配列を示す。
【０４３８】
【表１３４】
2006511237.tif 000135
【０４３９】
【表１３５】
2006511237.tif 000136
【０４４０】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV3クローンを解析し、表C4に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０４４１】
【表１３６】
2006511237.tif 000137
【表１３７】
2006511237.tif 000138
【表１３８】
2006511237.tif 000139
【表１３９】
2006511237.tif 000140
【表１４０】
2006511237.tif 000141
【表１４１】
2006511237.tif 000142
【表１４２】
2006511237.tif 000143
【表１４３】
2006511237.tif 000144
【表１４４】
2006511237.tif 000145
【表１４５】
2006511237.tif 000146
【表１４６】
2006511237.tif 000147
【表１４７】
2006511237.tif 000148
【０４４２】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表C5に示す配列アライメントが得られる。
【０４４３】
【表１４８】
2006511237.tif 000149
【０４４４】
NOV3aタンパク質をさらに解析し、以下の表C6に示す性質を得た。
【０４４５】
【表１４９】
2006511237.tif 000150
【表１５０】
2006511237.tif 000151
【０４４６】
NOV3aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表C7に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは特許および特許公開に公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０４４７】
【表１５１】
2006511237.tif 000152
【０４４８】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV3aタンパク質は表C8のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０４４９】
【表１５２】
2006511237.tif 000153
【０４５０】
PFam解析による予測では、NOV3aタンパク質は表C9に示すドメインを含有する。
【０４５１】
【表１５３】
2006511237.tif 000154
【０４５２】
実施例C3. ヒト長鎖脂肪酸アシル延長酵素遺伝子の発現プロファイル
定量的発現解析用プロトコルは実施例Q9に開示する。
【０４５３】
遺伝子CG180320-01、CG180320-02、CG180320-03、およびCG180320-04の発現は表C10に記載のプライマー-プローブセットAg6596を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表C11およびC12に示す。
【０４５４】
表C10. プローブ名Ag6596
【表１５４】
2006511237.tif 000155
【０４５５】
表C11. 一般スクリーニングパネルv1.6
【表１５５】
2006511237.tif 000156
【表１５６】
2006511237.tif 000157
【０４５６】
表C12. パネル5島
【表１５７】
2006511237.tif 000158
【表１５８】
2006511237.tif 000159
【０４５７】
一般スクリーニングパネルv1.6概要：(Ag6596)この遺伝子の中程度の発現がすべての組織で遍在的に検出された(CT=28-32)。この遍在的発現パターンは、この遺伝子の産物がこれらの、ならびに他の細胞型および組織に関する恒常性プロセスに関与することを示す。
【０４５８】
この遺伝子の発現は、すべての癌細胞株(黒色腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎癌、大腸癌(colon cancer)、膵癌、およびCNS癌)で増加し、CT=25.5-30であった。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、黒色腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、腎癌、膵癌、およびCNS癌の処置に有用である可能性がある。さらに、この遺伝子の発現はこれらの癌に関する検出マーカーとして使用可能である。
【０４５９】
この遺伝子は脂肪組織で発現されていた(CT=30.98)。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体または小分子薬物の使用は、肥満症および糖尿病の処置に有用である可能性がある。
【０４６０】
パネル5島概要：(Ag6596)この遺伝子の発現は間葉系幹細胞から分化した脂肪中で誘導されていた(ドナー由来ADサンプルをUサンプルと比較；ドナー2 (CT=30.46-30.86対CT=32.18-32.24)およびドナー3 (CT=29.01-30.7対CT=32.84-33.07))。したがって、この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、肥満症および糖尿病の処置に有用であり得る。
【０４６１】
実施例C4. 長鎖脂肪酸アシル延長酵素のモジュレーターに関するスクリーニングアッセイ
長鎖脂肪酸アシル延長酵素を発現する株化細胞の不完全リストは、本明細書中に示す遺伝子発現差(RTQ-PCR)の結果から得ることができる。
【０４６２】
ミクロソーム中の脂肪酸アシル延長反応を測定するための有能な方法は、Nagi et al., Evidence for two separate beta-ketoacyl CoA reductase components of the hepatic microsomal fatty acid chain elongation system in the rat, Biochem Biophys Res Commun. 1989 Dec 29;165(3):1428-34 and Moon et al., Identification of a mammalian long chain fatty acyl elongase regulated by sterol regulatory element-binding protein, J Biol Chem. 2001 Nov 30;276(48):45358-66. Epub 2001 Sep 20に記載されており、この方法の後、放射標識されている脂肪酸をHPLCによって分離する。
【０４６３】
脂肪酸アシル延長酵素のモジュレーター投与の有効性に関する機能／機構的アッセイは、3T3-L1マウス脂肪細胞、ヒト脂肪細胞または肝細胞中のTG合成／蓄積を観察すれば実行可能であろう。この観察はオイルレッドO染色によって行う。あるいは、脂肪酸アシル延長酵素でトランスフェクトした細胞中の処理後TG蓄積から測定を構成することができよう。
【０４６４】
発明者らの結果は、長鎖脂肪酸アシル延長酵素活性のモジュレーター、例えば長鎖脂肪酸アシル延長酵素の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０４６５】
D. NOV4 -- アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2
アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2(ACAA2)は、ミトコンドリアの脂肪酸ベータ酸化に関与する最後の酵素である。脂肪酸酸化は骨格筋および肝臓でのグルコース利用を妨害し、ゆえにインスリン抵抗性および高血糖症を生じさせる可能性があると考えられる(Randle PJ. Regulatory interactions between lipids and carbohydrates: the glucose fatty acid cycle after 35 years. Diabetes Metab. Rev. 1998 14(4), 263-83 PMID: 10095997; Deems RO, Anderson RC, Foley JE. Hypoglycemic effects of a novel fatty acid oxidation inhibitor in rats and monkeys. Am. J. Physiol. 1998 274(2 Pt 2):R524-8; PMID: 9486313)。GeneCalling (登録商標)による研究では、糖尿病性の筋肉でACAA2が有意に上方制御されることが示された。ACAA2はまた、高速単収縮性対緩徐単収縮性の糖尿病性骨格筋で、バナジン酸塩、メトホルミンおよびAICARに応答して下方制御された。これらは低血糖症および糖尿病を改善させる化合物である。GeneCalling (登録商標)のデータは、ACAA2が骨格筋グルコース利用を促進し、そして糖尿病を改善するための良好な標的となる可能性があることを示す。
【０４６６】
ヒトアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2が触媒する反応を以下に示す。
3-オキソアシルCoA＋CoA←→アシルCoA＋アセチルCoA
アセチルCoA→TCA回路
【０４６７】
治療用抗体または小分子薬物に関するスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイは、上に概説した反応におけるNAD+/NADH生産の測定であり、これは隣接のミトコンドリア酵素による3-ヒドロキシアシルCoAから3-オキソアシルCoAへの変換反応と共役するものである。ミトコンドリアチオラーゼに対する一般的阻害剤(4-ブロモクロトン酸)は刊行物に記載されている(Schulz et al., Life Sci. (1987) 40, 1443)。アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2を発現する株化細胞は本明細書中に示すRTQ-PCRの結果から得ることができる。これらの、および他のアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。
【０４６８】
ACAA2はアセチル-CoA生産の最終段階を触媒する。ACAA2基質の蓄積に関しては、3-オキソアシル-CoAについて毒性は報告されておらず、そしてその蓄積により脂肪酸酸化回路に関与する2つの他の酵素の阻害が生じる。ヒトアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の作用を阻害すると、その結果、骨格筋および肝臓での脂肪酸酸化が阻害され、グルコース利用が促進されるであろう。
【０４６９】
アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2 (ACAA2) (3-オキソアシル-CoAチオラーゼ)は肥満／糖尿病性骨格筋で上方制御される。この酵素の発現レベルは、腓腹筋対ヒラメ筋で、バナジン酸塩、AICARおよびメトホルミン処置(これらはすべて筋肉のグルコース利用を改善することが既知である)に応答して下方制御される。ACAA2は脂肪酸ベータ酸化に関与する最後の酵素である。ACAA2を阻害すれば、骨格筋および肝臓での脂肪酸酸化が阻害され、グルコース利用が促進されるであろう。したがって、ACAA2の阻害剤／アンタゴニストは肥満症および／または糖尿病処置用の抗血糖上昇剤として有益であろう。
【０４７０】
さらに発明者らは、ロシグリタゾン処置に対して良好な効果を示し、血糖調節が改善されている動物の糖尿病性骨格筋で、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2 (ACAA2)が下方制御されることを発見した。しかしながら、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の発現は、検出可能な高血糖症の改善を示さない糖尿病性動物では、ロシグリタゾン処置に応答せず、下方制御されないことがわかった。アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の発現は高血糖症と正相関するため、その下方制御がロシグリタゾンの抗糖尿病性効果の原理であるかもしれない。したがって、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のトータル酵素活性を減弱すれば、高血糖症および骨格筋インスリン感受性に対して、ロシグリタゾンの効果と同等の良好な臨床効果を生じさせ、かつ良好な効果を得るに足りるかもしれない。発明者らのデータは、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のアンタゴニストをインスリン抵抗性および糖尿病処置用の治療物質として開発することを支持するものである。
【０４７１】
さらに、発明者らの結果は、ACAA2活性のモジュレーター、例えばACAA2の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０４７２】
発見過程
以下の段落では、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計(群)および技術を記載する。
【０４７３】
実施例D1. マウス食餌誘発性肥満症 
マウス食餌誘発性肥満症研究用のプロトコルは実施例Q1に開示する。
【０４７４】
臨床集団における肥満症の主原因は過剰のカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘発性肥満症(DIO)は、40%を超える脂肪含量の高脂肪性食餌での飼育によって動物モデル(マウス系統C57BL)で模倣する。このDIO研究は、食餌誘発性肥満症の発症および進行に寄与する遺伝子発現の変化を同定するように作成した。さらに、この研究設計は、特定個体で高脂肪性食餌の影響への抵抗能を誘発し、これにより肥満症を予防する因子、の同定を追及するものであった。研究用サンプル群は固形飼料で飼育したコントロールの体重+ 1 S.D.、+ 4 S.D.および+ 7 S.D.を有するものであった。さらに、+ 7 S.D.マウスの生化学的プロファイルによれば、これらの動物が、肥満症にもかかわらず正常な血糖プロファイルを維持するマウスおよび高血糖を示すマウスにさらに層別化されることが示された。被験組織は、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、精巣上体WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(高速単収縮性の骨格筋)およびヒラメ筋(緩徐単収縮性の骨格筋)を含むものであった。これらの組織に関する遺伝子発現プロファイルの差は、肥満症および／または糖尿病の治療標的として使用可能な遺伝子および経路を示した。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０４７５】
結果
まず、マウスアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2遺伝子の断片が正常食餌(固形飼料)で飼育したマウスと比べて高脂肪性食餌で飼育した肥満性、糖尿病性マウス(hgsd7)の筋肉で1.6倍上方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。約380.4ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すマウス遺伝子断片がマウスアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2 cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このマウスアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表D1に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。肥満／糖尿病性マウスおよび正常固形飼料マウスの両者由来のサンプル中で、380.4 nt長位置が消滅した。
【０４７６】
【表１５９】
2006511237.tif 000160
【０４７７】
実施例D2. ラット骨格筋におけるインスリン感受性
ラットインスリン感受性研究用のプロトコルは実施例Q3に開示する。
【０４７８】
インスリン感受性を変化させることが既知である種々の物質でZDFラットを処置した。メトホルミン、バナジン酸塩、およびAICARはインスリンに対する組織応答を増強し、一方、Liposyn (静脈内脂質注入)によって生成する遊離脂肪酸。インスリン感受性を変化させることが既知である種々の物質でZDFラットまたはそのやせ型同腹仔を処置した。メトホルミン、バナジン酸塩、およびAICARはインスリンに対する組織応答を増強し、一方、Liposyn (静脈内脂質注入)処置によって生成する遊離脂肪酸はこの応答を減少させる。以下を含む種々の組織を採取した：腓腹筋およびヒラメ筋、肝臓、後腹膜および精巣上体WAT、およびIBAT。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０４７９】
結果
ラットアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の遺伝子断片は、バナジン酸塩、AICAR およびメトホルミン処置ZDFラットの腓腹筋でヒラメ筋と比べて2.5倍下方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。約353ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すラット遺伝子断片がラットアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2 cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このラットアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表D2に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。腓腹筋およびヒラメ筋の両者由来のサンプル中で、約353 nt長位置のピークが消滅した。
【０４８０】
【表１６０】
2006511237.tif 000161
【０４８１】
実施例D3. マウスTZD応答研究
マウスTZD応答研究用のプロトコルは実施例Q4に開示する。
【０４８２】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPARg)は核ホルモン受容体サブファミリーの転写因子のメンバーであり、代謝制御に関して主要な役割を果たす(Lee CH, Olson P, Evans RM. Minireview: lipid metabolism, metabolic diseases, and peroxisome proliferator-activated receptors.Endocrinology. 2003 Jun;144(6):2201-7. PMID: 12746275)。チアゾリジンジオン(TZD)薬物、例えばロシグリタゾンは、PPARg受容体の合成アゴニストである。ロシグリタゾンは、肥満性、糖尿病性げっ歯類の上昇した血漿グルコース濃度を正常化することができ、またヒトのインスリン非依存性真性糖尿病(noninsulin-dependent diabetes mellitus)処置用の治療物質として非常に有効であることが多い(Doggrell S. Do peroxisome proliferation receptor-γ antagonists have clinical potential as combined antiobesity and antidiabetic drugs? Expert Opin Investig Drugs. 2003 Apr;12(4):713-6., PMID: 12665425; Gurnell M, Savage DB, Chatterjee VK, O'Rahilly S. The metabolic syndrome: peroxisome proliferator-activated receptor gamma and its therapeutic modulation. J Clin Endocrinol Metab. 2003 Jun;88(6):2412-21 PMID: 12788836)。糖尿病性動物はTZD処置に対して特異な応答を示す。この特異な応答の原理を理解するために、発明者らはTZD処置の効果を示した糖尿病性動物およびTZD処置に応答しなかった糖尿病性動物間で遺伝子発現の変化を比較した。雌性db/dbマウスを毎日10 mg/体重kgのロシグリタゾンで7日間処置した。8日目に、このマウスから採血し、血糖値を測定した。処置マウスを、高血糖の有意な減少を示した「応答動物群」および血糖値変化を示さなかった「非応答動物群」のいずれかに分類した。骨格筋および脂肪組織での遺伝子発現を無処置糖尿病性マウスおよび2亜群のTZD処置マウス間で比較した。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０４８３】
結果
まず、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を用いて、マウスアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2遺伝子の断片が、高血糖の改善を示したロシグリタゾン処置糖尿病性マウスの骨格筋で、血糖値が減少しなかったロシグリタゾン処置マウスと比べて1.7倍下方制御されることがわかった。同一断片は、高血糖が改善したTZD処置マウスの骨格筋で、糖尿病性コントロールと比べて1.9倍下方制御されることがわかっている。キャピラリーゲル電気泳動で約252ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すマウス遺伝子断片がマウスアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2 cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このマウスアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表D3に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。これらのデータは、アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2が骨格筋インスリン抵抗性および糖尿病の進行に関与することを示す。
【０４８４】
【表１６１】
2006511237.tif 000162
【０４８５】
実施例D4. ヒトアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2遺伝子配列の同定
ヒトアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2遺伝子の配列(受入番号 CG181387-01)は、実験室レベルでcDNA断片をクローニングすることによって得た。このクローニングは、その配列をin silico予測することによって行った。このDNA配列の完全長、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をクローニングした。in silico予測は、CuraGenの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいて行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。ヒト配列(群)を同定するためのプロトコルは実施例Q8に開示する。
【０４８６】
表D4は、ヒト(CG181387-01；配列番号30)、ラット(P13437； 配列番号192)およびマウス(BC028901；配列番号193)バージョンのアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のタンパク質配列のアライメント(ClustalW)を示す。表D5は、ラット(P13437；配列番号192)およびマウス(BC028901；配列番号193)バージョンのアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のタンパク質配列を示す。
【０４８７】
【表１６２】
2006511237.tif 000163
【０４８８】
【表１６３】
2006511237.tif 000164
【０４８９】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV4クローンを解析し、表D6に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０４９０】
【表１６４】
2006511237.tif 000165
【表１６５】
2006511237.tif 000166
【表１６６】
2006511237.tif 000167
【表１６７】
2006511237.tif 000168
【表１６８】
2006511237.tif 000169
【表１６９】
2006511237.tif 000170
【表１７０】
2006511237.tif 000171
【表１７１】
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【表１７２】
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【表１７３】
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【表１７４】
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【表１７５】
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【表１７６】
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【表１７７】
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【表１７８】
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【表１７９】
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【０４９１】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表D7に示す配列アライメントが得られる。
【０４９２】
【表１８０】
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【表１８１】
2006511237.tif 000182
【０４９３】
NOV4aタンパク質をさらに解析し、以下の表D8に示す性質を得た。
【０４９４】
【表１８２】
2006511237.tif 000183
【表１８３】
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【表１８４】
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【０４９５】
NOV4aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表D9に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは特許および特許公開に公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０４９６】
【表１８５】
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【０４９７】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV4aタンパク質は表D10のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０４９８】
【表１８６】
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【０４９９】
PFam解析による予測では、NOV4aタンパク質は表D11に示すドメインを含有する。
【０５００】
【表１８７】
2006511237.tif 000188
【０５０１】
実施例D5. ヒトアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2遺伝子の変異体およびSNP
変異体配列は本出願に含まれる。変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み得る。場合によってSNPは「cSNP」と称することができ、これはこのSNPを含有するヌクレオチド配列が元々cDNAであることを示す。SNPはいくつかの経路で生じ得る。例えば、SNPは多型部位において1ヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されたことにより生じることがある。このような置換は塩基転位または塩基転換であり得る。SNPはまた、参照アレルと比較してヌクレオチドが欠失するか、あるいはヌクレオチドが挿入されることによって生じ得る。この場合、多型部位は、1アレルが別のアレル中の特定ヌクレオチドに対してギャップを保持する部位である。遺伝子内にSNPが存在すると、このSNPの位置で当該遺伝子がエンコードするアミノ酸が変化することがある。しかしながら、遺伝子内SNPはサイレントであることもあり、これはSNPを含むコドンが遺伝コードの縮重のために不変のアミノ酸をエンコードする場合である。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中にSNPが存在する場合は、タンパク質のアミノ酸配列はいずれも変化しないが、発現パターンの制御が変化することがある。この変化は例えば、時間的発現、生理学的反応制御、細胞型発現制御、発現強度、転写されたメッセージの安定性の変化である。
【０５０２】
新規SNP同定方法：SNPはCuraGenの私有SNPToolアルゴリズムを用いて配列アセンブリを解析することによって同定する。SNPToolは以下の判定基準を用いてアセンブリ中の変異を同定する：アライメント両端の10塩基対以内のSNPは解析しない；ウィンドウサイズ(視野内の塩基数)は10である；ウィンドウ内のミスマッチ許容数は2である；最小SNP塩基品質(PHREDスコア)は23である；SNPをスコアする最少数の変化は2/アセンブリ位置である。SNPToolはアセンブリを解析して、アセンブリ中のSNP位置、関連する個々の変異体配列、この既定位置でのアセンブリの程度、推定のアセンブリアレル頻度、およびSNP配列変異を表示する。次いで、配列トレースを選択し、手動検証用の視野に持ち込む。コンセンサスアセンブリ配列を変異体配列変化とともにCuraToolsにインポートし、SNP配列変異に起因するアミノ酸変化候補を同定する。次いで、包括的SNPデータ解析をSNPCallingデータベースにエクスポートする。
【０５０３】
新規SNP確認方法：SNPはPyrosequencingとして既知の実証済みの方法を利用して確認する。Pyrosequencingに関する詳細なプロトコルは：Alderborn et al. Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. (2000). Genome Research. 10, Issue 8, August. 1249-1265に見出せる。
【０５０４】
簡単に言えば、Pyrosequencingはジェノタイピングのリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコルでは、ゲノムDNAサンプルから二本鎖ビオチン標識PCR産物を採取し、これらをストレプトアビジンビーズと結合させる。次いで、これらのビーズを変性させ、一本鎖の結合DNAを得る。SNPの特徴付けは、DNA鎖の伸長時に各dNTPから放出されるピロリン酸(PPi)を間接的な生物発光測定によりアッセイすることに基づく技術を利用して行う。クレノーポリメラーゼ媒介性の塩基取り込みにしたがってPPiが放出されると、これがアデノシン5'-ホスホ硫酸(APS)とともにATPスルフリラーゼの基質として使用されてATPが形成される。続いて、このATPによってルシフェラーゼが作用し、ルシフェリンがそのオキシ誘導体に変換される。続いて発光し、この発光量は、約4塩基まで、付加された塩基数に比例したものになる。この方法の進行を許容するため、過剰のdNTPはアピラーゼによって分解する。アピラーゼを出発反応混合物中にも含ませ、シークエンシング時には少量のdNTPのみが鋳型に付加されるようにする。このプロセスは完全に自動化されていて、96ウェル形式に合わせて作成されており、したがって大型SNPパネルを高速スクリーニングすることが可能である。
【０５０５】
結果
アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2様遺伝子CuraGen 受入番号 CG181387-01の新規一塩基多型変異体のDNAおよびタンパク質配列を表D10に報告する。変異体は個別に報告するが、任意の組み合わせの全または選択サブセットの変異体もまた含まれる。表D10では、変異塩基および変異アミノ酸残基の位置に下線を付している。総じて、表D10に報告する6変異体が存在する。変異体13380063はヌクレオチド配列の697 bp位置がAからGに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸217位がMetからValに変化する。変異体13380064はヌクレオチド配列の1250 bp位置がAからGに変化したSNPであり、このSNPはアミノ酸コード領域中ではないため、タンパク質配列の変化を生じない。変異体13380065はヌクレオチド配列の1451 bp位置がAからGに変化したSNPであり、このSNPはアミノ酸コード領域中ではないため、タンパク質配列の変化を生じない。変異体13380066はヌクレオチド配列の1466 bp位置がCからTに変化したSNPであり、このSNPはアミノ酸コード領域中ではないため、タンパク質配列の変化を生じない。変異体13380067はヌクレオチド配列の1525 bp位置がAからCに変化したSNPであり、このSNPはアミノ酸コード領域中ではないため、タンパク質配列の変化を生じない。ならびに、変異体13380068はヌクレオチド配列の1550 bp位置がTからCに変化したSNPであり、このSNPはアミノ酸コード領域中ではないため、タンパク質配列の変化を生じない。
【０５０６】
表D10. ヌクレオチド配列受入番号 CG181387-01 (配列番号29)の変異体
【表１８８】
2006511237.tif 000189
【０５０７】
【表１８９】
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【表１９０】
2006511237.tif 000191
【表１９１】
2006511237.tif 000192
【表１９２】
2006511237.tif 000193
【表１９３】
2006511237.tif 000194
【表１９４】
2006511237.tif 000195
【０５０８】
実施例D6. ヒトアセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2遺伝子の発現プロファイル
定量的発現解析用プロトコルは実施例Q9に開示する。
【０５０９】
遺伝子CG181387-01およびCG181387-02の発現は表D13に記載のプライマー-プローブセットAg6643を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表D14およびD15に示す。
【０５１０】
表D13. プローブ名Ag6643
【表１９５】
2006511237.tif 000196
【０５１１】
表D14. 一般スクリーニングパネルv1.6
【表１９６】
2006511237.tif 000197
【表１９７】
2006511237.tif 000198
【０５１２】
表D15. パネル5島
【表１９８】
2006511237.tif 000199
【０５１３】
一般スクリーニングパネルv1.6概要：Ag6643この遺伝子の最大発現は胃癌KATO III細胞株で検出された(CT=24.2)。また、膵癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌(prostate cancer)、黒色腫および脳癌(brain cancer)由来の癌細胞株のクラスタ中では、この遺伝子の中〜高レベルの発現が観察された。したがって、この遺伝子の発現はこれらの癌の存在を検出するマーカーとして使用可能であろう。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、膵癌、胃癌、大腸癌、肺癌、肝癌、腎癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌(squamous cell carcinoma)、黒色腫および脳癌の処置に有用である可能性がある。
【０５１４】
この遺伝子は、代謝または内分泌機能を有する組織のうち、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、脳下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管で中〜高レベルで発現されていた。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満症および糖尿病の処置に有用である可能性がある。
【０５１５】
さらに、この遺伝子は、検査した中枢神経系のすべての領域、例えば扁桃体、海馬、黒質、視床、小脳、大脳皮質、および脊髄で中レベルで発現されていた。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、中枢神経系障害、例えばアルツハイマー病(Alzheimer's disease)、パーキンソン病(Parkinson's disease)、てんかん(epilepsy)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、統合失調症(schizophrenia)およびうつ病(depression)の処置に有用である可能性がある。
【０５１６】
パネル5島概要：Ag6643この遺伝子の最大発現は分化型脂肪で検出された(CT=28.2)。分化途上および完全分化型の脂肪組織では、この遺伝子の高度発現が観察され、さらにまた、島細胞、骨格筋、小腸および心臓では、この遺伝子の中レベルの発現が検出された。
【０５１７】
実施例D7. アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のモジュレーターに関するアッセイ
アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のモジュレーターに関するスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイの1つは、エノールおよびキレート型アセトアセチル-CoAの減少にしたがうアセトアセチル-CoA分解を測定することである。この測定は、刊行物に記載される通り305 nmの吸光測定による光学的アッセイによって行う(Berndt H, Schlegel HG. Kinetics and properties of β-ketothiolase from Clostridium pasteurianum. Arch Microbiol. 1975 Mar 12;103(1):21-30, PMID: 240336)。
【０５１８】
アセチル補酵素Aアシルトランスフェラーゼ2のモジュレーターに関するスクリーニングに使用してよい別のポテンシャルアッセイは、隣接するミトコンドリア酵素による3-ヒドロキシアシルCoAから3-オキソアシルCoAへの変換反応と共役する反応におけるNAD+/NADH生産の測定である(Barycki JJ, O'Brien LK, Bratt JM, Zhang R, Sanishvili R, Strauss AW, Banaszak LJ. Biochemical characterization and crystal structure determination of human heart short chain L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase provide insights into catalytic mechanism. Biochemistry. 1999 May 4;38(18):5786-98. PMID: 10231530)。
【０５１９】
発明者らの結果は、ACAA2活性のモジュレーター、例えばACAA2の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０５２０】
E.  NOV5 -- ホスホグリセリン酸ムターゼ2
ホスホグリセリン酸ムターゼは二量体の酵素であり、種々の組織中、種々の割合の緩徐移動性(PGM2)アイソザイムおよび高速移動性脳(PGM1)アイソザイムを含有する。これらのアイソザイムは別の遺伝子によってエンコードされている。PGM1は遍在発現性のアイソザイムであり、脳内で最も高度に発現されている。対照的に、PGM2は骨格筋で特異的に発現されている。ホスホグリセリン酸ムターゼは、解糖の第二段階(グリセルアルデヒド3-リン酸からピルビン酸への変換)に関与する酵素である。PGM2が完全に欠損すると、軽い筋障害(myopathy)および運動不耐性(exercise intolerance)を伴う筋肉表現型が生じる(Tsujino S, Shanske S, Sakoda S, Fenichel G, DiMauro S. The molecular genetic basis of muscle phosphoglycerate mutase (PGAM) deficiency. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52(3):472-7 PMID: 8447317)。この表現型は糖尿病／肥満性症状においてエネルギー消費を促進する可能性がある。
【０５２１】
発明者らは、解糖の第二段階に関与するほとんどの酵素が糖尿病性骨格筋で上方制御されることを見出している。この知見は、糖尿病／肥満性患者由来の骨格筋で、解糖系酵素活性が増加し、ならびに酸化系酵素活性が減少することを示す刊行物記載のデータと一致する(Simoneau JA, Kelley DE. Altered glycolytic and oxidative capacities of skeletal muscle contribute to insulin resistance in NIDDM. (1997) J. Appl. Physiol. 83(1):166-71 PMID: 9216960)。解糖／酸化稼働量の均衡が崩れると、脂質含量が増加し、その結果、骨格筋でインスリン抵抗性が発症する可能性がある。
【０５２２】
発明者らの発現差を示す(GeneCalling (登録商標))データは、非糖尿病性動物と比べて糖尿病性動物のヒラメ筋でPGM1が上方制御されることを示す。PGM1は、解糖型筋線維中で酸化型筋線維中より高度に発現していることがわかった。RTQ-PCRの結果は、PGM2が筋組織で特異的に発現され、ならびに妊娠糖尿病(Gestational Diabetes)患者由来のインスリン抵抗性骨格筋で上方制御されることを示す。発明者らの研究で検出されたPGM1およびPGM2両者の上方制御は、糖尿病性症状に関して報告されている解糖型筋肉稼働量の増加に寄与するであろう。
【０５２３】
図3は、ヒトホスホグリセリン酸ムターゼ2の発現変化および付随する遺伝子産物が肥満症および／または糖尿病の病因および病原性に関していかに機能するかを示す。この図式には、発明者らの研究の新規知見が刊行物に報告されている内容とともに包含される。
【０５２４】
図4は、ヒトホスホグリセリン酸ムターゼ2に関する生化学および、肥満症および／または糖尿病を処置する治療用抗体または小分子薬物のスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイの概要である。2,3-ビスホスホグリセリン酸(2,3-biphosphoglycerate)の存在下で、ホスホグリセリン酸ムターゼは3-ホスホグリセリン酸および2-ホスホグリセリン酸間の相互変換、すなわちグリセルアルデヒド-3-リン酸からピルビン酸への変換の第三段階：
3-ホスホグリセリン酸←→2-ホスホグリセリン酸
を触媒する。
【０５２５】
解糖の活性化は、糖尿病性骨格筋での解糖系稼働量を不均衡に増加させ、そしてインスリン抵抗性の発症に寄与し得る。PGM2は骨格筋で特異的に発現するため、これを阻害すると、エネルギー均衡が回復し、他の組織での解糖には最小の影響しか与えずに酸化型筋肉表現型を促進する可能性がある。ヒトホスホグリセリン酸ムターゼ2の作用を阻害すると、その結果、肥満症および／または糖尿病の主要な問題であるインスリン抵抗性が減少するであろう。したがって、PGM2のアンタゴニストまたは阻害剤を用いて、肥満症および／または糖尿病を処置してよい。
【０５２６】
ホスホグリセリン酸ムターゼ2を発現する株化細胞は、本明細書中に記載のRTQ-PCRの結果に記載するものである。これらの、および他のホスホグリセリン酸ムターゼ2発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。ホスホグリセリン酸ムターゼ活性を測定するためのアッセイおよびPGM2用の選択的阻害剤は刊行物に記載されている(例えば、White MF, Fothergill-Gilmore LA.Development of a mutagenesis, expression and purification system for yeast phosphoglycerate mutase. Investigation of the role of active-site His181.Eur J Biochem. 1992 Jul 15;207(2):709-14. PMID: 1386023, Rigden DJ, Walter RA, Phillips SE, Fothergill-Gilmore LA.Polyanionic inhibitors of phosphoglycerate mutase: combined structural and biochemical analysis.J Mol Biol. 1999 Jun 18;289(4):691-9. PMID: 10369755を参照のこと)。
【０５２７】
さらに、発明者らの結果は、ホスホグリセリン酸ムターゼ2活性のモジュレーター、例えばホスホグリセリン酸ムターゼ2の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０５２８】
発見過程
食餌誘発性肥満症研究でPGM1アイソフォームが制御不全であることは、ホスホグリセリン酸ムターゼ活性が骨格筋中で増加すると、インスリン抵抗性および糖尿病の発症に寄与する可能性があることを示す。発現性データに基づき、発明者らは、PGM2、すなわちホスホグリセリン酸ムターゼの主要な骨格筋アイソフォームCG186640-02のコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体を提唱する。下記のGeneCalling (登録商標)による研究でPGM1遺伝子が制御不全であることは、ホスホグリセリン酸ムターゼアイソフォーム2に関する疾患原理を支持する。
【０５２９】
以下の段落では、ホスホグリセリン酸ムターゼ2のコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計(群)および技術を記載する。
【０５３０】
実施例E1. マウス食餌誘発性肥満症
マウス食餌誘発性肥満症研究用のプロトコルは実施例Q1に開示する。
【０５３１】
臨床集団における肥満症の主原因は過剰のカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘発性肥満症(DIO)は、40%を超える脂肪含量の高脂肪性食餌での飼育によって動物モデル(マウス系統C57BL/6J)で模倣する。このDIO研究は、食餌誘発性肥満症の発症および進行に寄与する遺伝子発現の変化を同定するように作成した。さらに、この研究設計は、特定個体で高脂肪性食餌の影響への抵抗能を誘発し、これにより肥満症を予防する因子、の同定を追及するものであった。研究用サンプル群は固形飼料で飼育したコントロールの体重+ 1 S.D.、+ 4 S.D.および+ 7 S.D.を有するものであった。さらに、+ 7 S.D.マウスの生化学的プロファイルによれば、これらの動物が、肥満症にもかかわらず正常な血糖プロファイルを維持するマウスおよび高血糖を示すマウスにさらに層別化されることが示された。被験組織は、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、精巣上体WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(高速単収縮性の骨格筋)およびヒラメ筋(緩徐単収縮性の骨格筋)を含むものであった。これらの組織に関する遺伝子発現プロファイルの差は、肥満症の治療標的として使用可能な遺伝子および経路を示した。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)に関するプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０５３２】
結果
まず、マウスホスホグリセリン酸ムターゼ1遺伝子の断片が、正常血糖性(sd1、正常コントロール)マウスと比べて高血糖性(hgsd7、糖尿病性)マウスのヒラメ筋で2.7倍上方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した(表E1はPGM1およびPGM2タンパク質配列のアライメントを示し、表E2には、PGM1タンパク質配列が別個に示される)。約153ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すマウス遺伝子断片がマウスホスホグリセリン酸ムターゼ1 cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。マウスホスホグリセリン酸ムターゼ1の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表E3に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。高血糖性および正常血糖性マウスの両者由来のサンプル中で、153 nt長位置のピークが消滅した。マウスホスホグリセリン酸ムターゼ1の遺伝子断片はまた、肥満性高血糖性マウスの(解糖型)腓腹筋線維で緩徐単収縮性(酸化型)筋線維と比べて約2倍上方制御されることがわかった。これらのデータは、ホスホグリセリン酸ムターゼが糖尿病／肥満症の発症に関与する可能性があり、ならびにその調節、例えば阻害がこれらの疾患の処置に有益である可能性があることを示す。
【０５３３】
【表１９９】
2006511237.tif 000200
【０５３４】
【表２００】
2006511237.tif 000201
【０５３５】
【表２０１】
2006511237.tif 000202
【０５３６】
実施例E2. ホスホグリセリン酸ムターゼ2のヒト配列の同定
ヒトホスホグリセリン酸ムターゼ2の配列(受入番号 CG186640-02)は、実験室レベルでcDNA断片をクローニングすることによって得た。このクローニングは、その配列をin silico予測することによって行った。このDNA配列の完全長、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をクローニングした。in silico予測は、CuraGenの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいて行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。
【０５３７】
表E4は、ヒト(CG186640-02；配列番号46)、ラット(M31835；配列番号199)およびマウス(AF029843；BC010750；配列番号200)バージョンのホスホグリセリン酸ムターゼ2のタンパク質配列のアライメント(ClustalW)を示す。表E5は、ラット(M31835；配列番号199)およびマウス(AF029843；BC010750；配列番号200)バージョンのホスホグリセリン酸ムターゼ2の配列を示す。
【０５３８】
【表２０２】
2006511237.tif 000203
【０５３９】
【表２０３】
2006511237.tif 000204
【０５４０】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV5クローンを解析し、表E6に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０５４１】
【表２０４】
2006511237.tif 000205
【表２０５】
2006511237.tif 000206
【表２０６】
2006511237.tif 000207
【表２０７】
2006511237.tif 000208
【表２０８】
2006511237.tif 000209
【表２０９】
2006511237.tif 000210
【表２１０】
2006511237.tif 000211
【表２１１】
2006511237.tif 000212
【表２１２】
2006511237.tif 000213
【表２１３】
2006511237.tif 000214
【０５４２】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表E7に示す配列アライメントが得られる。
【０５４３】
【表２１４】
2006511237.tif 000215
【０５４４】
NOV5aタンパク質をさらに解析し、以下の表E8に示す性質を得た。
【０５４５】
【表２１５】
2006511237.tif 000216
【表２１６】
2006511237.tif 000217
【０５４６】
NOV5aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表E9に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは特許および特許公開に公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０５４７】
【表２１７】
2006511237.tif 000218
【０５４８】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV5aタンパク質は表E10のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０５４９】
【表２１８】
2006511237.tif 000219
【０５５０】
PFam解析による予測では、NOV5aタンパク質は表E11に示すドメインを含有する。
【０５５１】
【表２１９】
2006511237.tif 000220
【０５５２】
実施例E3. ヒトホスホグリセリン酸ムターゼ2 (PGM2)およびヒトホスホグリセリン酸ムターゼ1 (PGM1)遺伝子の発現プロファイル
定量的発現解析用プロトコルは実施例Q9に開示する。
【０５５３】
遺伝子CG186640-02 (PGM2)およびCG115294-01 (PGM1)の発現は表E12およびE13に記載のプライマー-プローブセットAg2379およびAg6474を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表E14およびE15に示す。Ag2379およびAg6474は、それぞれCG115294-01およびCG186640-02に特異的である。
【０５５４】
表E12. プローブ名Ag2379
【表２２０】
2006511237.tif 000221
【０５５５】
表E13. プローブ名Ag6474
【表２２１】
2006511237.tif 000222
【０５５６】
表E14. 一般_スクリーニング_パネル_v1.6
【表２２２】
2006511237.tif 000223
【表２２３】
2006511237.tif 000224
【０５５７】
表E15. パネル5島
【表２２４】
2006511237.tif 000225
【表２２５】
2006511237.tif 000226
【０５５８】
一般スクリーニングパネルv1.6概要：PGM2は骨格筋で特異的に発現されていて、これは刊行物記載のデータと一致する。PGM1は遍在的に発現されていて、その発現は小脳ではPGM2と比べて高く(CT=26.8対29.5)、対照的に骨格筋ではPGM2より低い(CT=32.2対26.6)。PGM2は骨格筋で特異的に発現するため、その薬物であれば、予め骨格筋を標的とするであろうし、他の組織、特に脳および膵島での解糖を有意に妨害しないであろうことに想到する。
【０５５９】
パネル5島概要：パネル5Iでは、PGM2は骨格筋でのみ発現されていて、これはパネル1.4の発現パターンと一致する。PGM2はさらに、糖尿病性筋肉(患者12)中では、非糖尿病性骨格筋(患者7、患者9、患者11)と比べて有意に上方制御される。これらの結果は、ホスホグリセリン酸ムターゼレベル／活性の増加が糖尿病の発症に寄与する可能性があるという仮説をさらに支持する。したがって、PGM2阻害は糖尿病の処置に有益である可能性がある。PGM1はより広く発現されていて、島細胞では高度に発現されている(Bayer患者1)。
【０５６０】
実施例E4. ホスホグリセリン酸ムターゼ2のモジュレーターに関するアッセイ
ホスホグリセリン酸ムターゼ2のモジュレーターに関するスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイの1つは、グリセリン酸-3-リン酸の生産を測定することであり、このグリセリン酸-3-リン酸はホスホグリセリン酸ムターゼが触媒する以下の反応で形成される：
2-ホスホ-D-グリセリン酸＋2,3-ジホスホグリセリン酸<=>3-ホスホ-D-グリセリン酸＋2,3-ジホスホグリセリン酸
【０５６１】
グリセリン酸-3-リン酸の生産は、ホスホグリセリン酸キナーゼおよびグリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素と共役する反応によって測定できよう。この測定は、Rosa R, Blouquit Y, Calvin MC, Prome D, Prome JC, Rosa J. Isolation, characterization, and structure of a mutant 89 Arg----Cys bisphosphoglycerate mutase. Implication of the active site in the mutation. J Biol Chem. 1989 May 15;264(14):7837-43; PMID: 2542247に記載されている。
【０５６２】
発明者らの結果は、ホスホグリセリン酸ムターゼ2活性のモジュレーター、例えばホスホグリセリン酸ムターゼ2の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０５６３】
F. NOV6 -- アデノシンA1受容体
アデノシンA1受容体(Adora1)は多数の細胞型の原形質膜に見られるGタンパク質共役受容体である。Adora1は心臓の収縮性、脂肪組織の脂肪分解、腎臓における糸球体の濾過および尿細管糸球体のフィードバック、ならびに神経系の交感神経および副交感神経活性に関与していると考えられる(Fredholm BB, IJzerman AP, Jacobson KA, Klotz KN, Linden J, International Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine receptors.  Pharmacol Rev. 2001 Dec;53(4):527-52. Review.  PMID: 11734617)。この受容体は、アデノシンA1、A2A、A2BおよびA3受容体からなるアデノシン受容体ファミリーのメンバーである。アデノシンはこれらの受容体の好ましい内因性リガンドである。しかしながら、これらのアデノシン受容体は高度に相同的なわけではなく、A1およびA2B受容体間で見られる同一性パーセント(タンパク質レベルで56%配列同一性)が最大である。配列同一性が低レベルであることは、A2Bを除き、すべてのアデノシン受容体に対して選択的アゴニストおよびアンタゴニストが同定されている事実によって説明される。なおA2Bは選択的アンタゴニストを欠いている(Fredholm BB, IJzerman AP, Jacobson KA, Klotz KN, Linden J, International Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine receptors.  Pharmacol Rev. 2001 Dec;53(4):527-52. Review.  PMID: 11734617)。
【０５６４】
アデノシンはこの受容体ファミリーの主要なアゴニストである。正常症状下では、アデノシンは種々の細胞型の細胞内、ならびに種々の組織区画の細胞外で継続して形成されている。任意の細胞型または組織区画中、アデノシンの継続的合成および崩壊は生理学的環境に応じて相違し、そしてこの相違に伴って当然、アデノシン受容体に関する生物学は複雑になり、ならびに組織および細胞型特異的である。Adora1アゴニストに応答しないアデノシンA1受容体ノックアウトマウスが報告されている(Johansson B, Halldner L, Dunwiddie TV, Masino SA, Poelchen W, Gimenez-Llort L, Escorihuela RM, Fernandez-Teruel A, Wiesenfeld-Hallin Z, Xu XJ, Hardemark A, Betsholtz C, Herlenius E, Fredholm BB. Hyperalgesia, anxiety, and decreased hypoxic neuroprotection in mice lacking the adenosine A1 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 31;98(16):9407-12. PMID: 11470917)。このマウスは生存可能、繁殖性であり、そしていかなる重度の障害をも有さなかった。仮説では、Adora1は心血管機能に関して重要であるとされるが、動脈圧および心拍数はA1受容体ノックアウトおよび野生型マウス間で区別できなかった(Johansson et. al.)。現在まで、正常生理機能に関するアデノシンA1受容体の役割についての知見は未完である。
【０５６５】
A1受容体の組織分布は、選択的放射性リガンドを用いて研究されている(Fredholm et.al.)。その高度発現は、脳(皮質、小脳、海馬)、脊髄の後角、眼および副腎で報告されている(Fredholm et.al.)。中間レベルのAdora1は、他の脳領域、骨格筋、肝臓、腎臓、脂肪組織、唾液腺、食道、大腸および精巣で報告された。現在、これらすべての諸細胞型に関するAdora1の明確な役割は未知である。
【０５６６】
インスリン分泌性ベータ細胞は膵臓のランゲルハンス島に位置する。インスリン分泌は単離した膵臓をグルコースで灌流しながら測定できる(生理学的シグナル)。アデノシンの構造的アナログを用いて単離ラット膵臓を灌流すると、インスリン分泌の減少が生じている(Hillaire-Buys D, Chapal J, Bertrand G, Petit P, Loubatieres-Mariani MM. Purinergic receptors on insulin-secreting cell. Fundam Clin Pharmacol 1994 8(2):117-27. PMID: 8020870)。しかしながら、この結果は、Adora1特異性を明確にするものではなく(その理由はアデノシンがすべてのアデノシン受容体サブタイプに対して作用するからである)、またヒト島細胞に特異的ではなかった。
【０５６７】
アミノフィリンは非選択的であるが強力なアデノシン受容体ファミリーのアンタゴニストである。アミノフィリンを静脈内投与すると、2型糖尿病患者のインスリン分泌を促進した。これはアデノシン受容体ファミリーのアンタゴニストがインスリン分泌の作動に関与する可能性があることを示す(Arias AM, Bisschop PH, Ackerman MT, Nijpels G, Endert E, Romijn JA, Sauerwein HP.  Aminophylline stimulates insulin secretion in patients with Type 2 diabetes mellitus.  Metabolism 2001 Sep;50(9):1030-5. PMID:11555834)。本発明は、インスリン分泌を増強し、かつ血糖を減少させる特異的Adora1アンタゴニストの使用に関する。US 6,407,076は、特定化合物を記載する。この化合物はアデノシンA1受容体のアゴニストであり、脂肪分解の阻害剤として機能し、また、上昇した血糖の低下能を有するかもしれない。
【０５６８】
アデノシンA1受容体はＧαｉファミリーのGタンパク質エフェクター系と共役し、cAMP生産を阻害する(Fredholm et. al.)。サイクリックAMPは神経伝達物質誘発性インスリン分泌の増強剤としてずっと以前から知られている(Harndahl L, Jing XJ, Ivarsson R, Degerman E, Ahren B, Manganiello VC, Renstrom E, Holst LS.  Important role of phosphodiesterase 3B for the stimulatory action of cAMP on pancreatic β-cell exocytosis and release of insulin. J Biol Chem. 2002 Oct 4;277(40):37446-55. PMID: 12169692)。本発明は、(神経伝達物質促進性インスリン分泌ではなく)グルコース促進性インスリン分泌を増強する特異的Adora1アンタゴニストの使用に関する。
【０５６９】
発明者らは、Adora1が広く多様なヒト組織中で発現されており、脳および精巣で最も高レベルの発現が観察されることを示している。発明者らはまた、Adora1がヒト膵島細胞で発現されていることを記録した。
【０５７０】
ヒトの2型糖尿病は、絶食中および食後の循環性遊離脂肪酸の増加、ならびにインスリン分泌障害を特徴とする。仮説では、遊離脂肪酸レベルの増加がインスリン分泌障害の主要な寄与因子である。膵臓のランゲルハンス島は、血糖増加に応答してインスリンを分泌するベータ細胞を有する。ヒトの最も豊富な循環性脂肪酸3つのうちの1つであるオレイン酸(oleate)とともに島細胞をin vitro培養することにより、2型糖尿病に関するベータ細胞の分泌障害を研究する手段が得られる。オレイン酸とともに5日間in vitro培養した島細胞では、グルコース促進性インスリン分泌が有意に不足し、かつAdora1 mRNAが1.9倍上方制御されることを発明者らは発見した。したがって、オレイン酸処理島でのAdora1発現の増加は、島細胞での受容体活性の増加、cAMPレベルの減少、および結果的なインスリン分泌の減少を招く。本発明の好ましい方法は、2型糖尿病の処置に有益であろうアンタゴニストを同定するためにアデノシンA1受容体を使用することである。すなわち本発明は、そのような治療用抗体および／または治療用小分子を同定する種々のスクリーニングに関する、組換え発現タンパク質および／または内因性発現タンパク質の使用を具体化するものである。
【０５７１】
一実施形態では、本発明は、オレイン酸中で培養されたラット島細胞でAdora1 mRNAが特異的に上方制御されることを記載する。オレイン酸中で培養された島では、インスリン分泌が有意に不足する。オレイン酸培養された島でのAdora1上方制御および活性化はインスリン分泌抑制の原因である可能性がある。
【０５７２】
特に本発明は、Adora1タンパク質を診断物質および／または小分子薬物および治療用抗体の標的として使用することに関する。発明者らは、Adora1が広く多様なヒト組織中で発現されており、その発現は脳および精巣で最も高いことを記録した。発明者らはまた、Adora1がヒト膵島細胞で発現されていることを新規に発見した。さらに発明者らは、アデノシンA1受容体mRNAがオレイン酸処理島で1.9倍上方制御されることを発見している。このオレイン酸処理島では、コントロール島と比べてグルコース促進性インスリン分泌が抑制されることが当分野で同定されている。オレイン酸処理島でAdora1の発現が増加すると、島細胞での受容体活性化の増加、cAMPレベルの減少を招き、そして結果的にインスリン分泌が減少する。一側面では、Adora1をアゴニストによって活性化し、細胞のcAMP蓄積を減少させるのが好ましい。したがって、本発明は、(神経伝達物質促進性ではなく)グルコース促進性インスリン分泌の抑制に関してAdora1の活性化が果たす役割を記載する。
【０５７３】
具体的な作用機序に限定されないが、発明者らは、Adora1阻害が2型糖尿病の処置に有益な効果を有する可能性があることを発見した。詳細には、Adora1はいくつかの代謝組織で発現され、これには膵臓のランゲルハンス島が含まれる。よって発明者らは、2mMオレイン酸中で5日間島を培養すると、島細胞Adora1の発現増加が生じることを示した。Adora1発現および／または活性化の増加は、オレイン酸処理島および2型糖尿病患者のインスリン分泌障害に寄与する可能性がある。島細胞でのグルコース促進性インスリン分泌抑制が、膵島細胞のアデノシンA1受容体mRNAの上方制御と相関するという知見は、インスリン分泌およびグルコース恒常性に関するAdora1の役割を示す。したがって、Adora1のアンタゴニストは糖尿病の処置に有用である。本発明の具体的な実施形態では、Adora1はAdora1発現または活性のアンタゴニストをスクリーニングするための標的である。すなわち本発明は、2型糖尿病の処置に有益なアデノシンA1受容体アンタゴニスト 治療用抗体および／または治療用小分子を同定する種々のスクリーニングに関する、組換え発現タンパク質および／または内因性発現タンパク質の使用を具体化するものである。
【０５７４】
さらに、発明者らの結果は、Adora1活性のモジュレーター、例えばAdora1の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０５７５】
発見過程
以下の段落では、アデノシンA1受容体のコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計(群)および技術を記載する。
【０５７６】
実施例F1. ラット膵島研究：
ラット膵島研究用のプロトコルは実施例Q2に開示する。
【０５７７】
ヒトの2型糖尿病の80%以上が肥満症を伴う。早期2型糖尿病に関する重要な臨床目標は、膵臓のベータ細胞由来のインスリン分泌を増加させることである。インスリン分泌を調節可能な多数の物質が、実験的に、ならびに治療状況下で同定されている。これらを単離のラット膵島に適用した場合、遺伝子発現の変化がインスリン分泌と相関し得る。この研究では、急性および慢性の遺伝子発現変化を、それぞれ短期(4時間)および長期(5日間)曝露後の薬剤物質で処理された島に関して検査し、基底状態(11 mMグルコース)と比較した。この物質は、高濃度(25 mM)グルコース、グルコース(11 mM)およびエキセンディン-4 (1 nM)、グルコース(11 mM)およびグリベンクラミド(50 uM)、ならびにグルコース(11 mM)およびオレイン酸(oleate) (2 mM)を含むものであった。肥満症関連性2型糖尿病の特徴は、絶食中および食後の循環性遊離脂肪酸がともに増加することである。仮説では、遊離脂肪酸レベルの増加がこの疾患で観察されるインスリン分泌障害の主要な寄与因子である。ヒトの最も豊富な3つの循環性脂肪酸うちの1つであるオレイン酸を伴って島細胞をin vitro培養し、2型糖尿病に関するベータ細胞の分泌障害を研究する手段を提供する。遺伝子発現差解析、GeneCalling (登録商標)用のプロトコルは実施例Q7に開示する。
【０５７８】
結果
まず、ラットアデノシンA1受容体遺伝子の断片が、オレイン酸処理島細胞由来のサンプル中では、既知のインスリン分泌抑制剤であるオレイン酸への曝露5日後に、グルコースのみで処理した島細胞と比べて1.9倍上方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。約370ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すラット遺伝子断片がラットアデノシンA1受容体cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。ラットアデノシンA1受容体の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表F1に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。オレイン酸処理および基底状態の両島細胞由来のサンプル中で、370 nt長位置のピークが消滅した。
【０５７９】
【表２２６】
2006511237.tif 000227
【０５８０】
さらに、ラットアデノシンA1受容体遺伝子の第二断片が、上と同一のオレイン酸処理島細胞のサンプル中で1.8倍上方制御されることがわかった(オレイン酸に曝露した5日後)。約383.4ヌクレオチド長位置に移動する、この発現差を示すラット遺伝子断片もまた、ラットアデノシンA1受容体cDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。この遺伝子同定は、PCR増幅時にリンカー-アダプター中のプライマーと競合する遺伝子特異的プライマー(表F2に示す)を用いる競合的PCR法によって行った。オレイン酸処理および基底状態の両島細胞由来のサンプル中で、383 nt長位置の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークが消滅した。
【０５８１】
【表２２７】
2006511237.tif 000228
【０５８２】
実施例F2. ヒトアデノシンA1受容体遺伝子配列の同定
ヒトアデノシンA1受容体遺伝子の配列(受入番号 CG58655-01)は、実験室レベルでcDNA断片をクローニングすることによって得た。このクローニングは、その配列をin silico予測することによって行った。このDNA配列の完全長、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をクローニングした。in silico予測は、CuraGenの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいて行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。ヒト配列(群)を同定するためのプロトコルは実施例Q8に開示する。
【０５８３】
表F3は、CG58655-01 (配列番号56)、およびアデノシンA1受容体のラットホモログ(scb_gb-m64299_1；配列番号209)のタンパク質アライメント(ClustalW)を示す。表F4は、アデノシンA1受容体のラットホモログ(scb_gb-m64299_1；配列番号209)のタンパク質配列を示す。
【０５８４】
【表２２８】
2006511237.tif 000229
【０５８５】
【表２２９】
2006511237.tif 000230
【０５８６】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV6クローンを解析し、表F5に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０５８７】
【表２３０】
2006511237.tif 000231
【表２３１】
2006511237.tif 000232
【表２３２】
2006511237.tif 000233
【表２３３】
2006511237.tif 000234
【０５８８】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表F6に示す配列アライメントが得られる。
【０５８９】
【表２３４】
2006511237.tif 000235
【０５９０】
NOV6aタンパク質をさらに解析し、以下の表F7に示す性質を得た。
【０５９１】
【表２３５】
2006511237.tif 000236
【表２３６】
2006511237.tif 000237
【０５９２】
NOV6aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表F8に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは特許および特許公開に公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０５９３】
【表２３７】
2006511237.tif 000238
【０５９４】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV6aタンパク質は表F9のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０５９５】
【表２３８】
2006511237.tif 000239
【０５９６】
PFam解析による予測では、NOV6aタンパク質は表F10に示すドメインを含有する。
【０５９７】
【表２３９】
2006511237.tif 000240
【０５９８】
実施例F3. ヒトアデノシンA1受容体遺伝子の変異体およびSNP
変異体配列は本出願に含まれる。変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み得る。場合によってSNPは「cSNP」と称することができ、これはこのSNPを含有するヌクレオチド配列が元々cDNAであることを示す。SNPはいくつかの経路で生じ得る。例えば、SNPは多型部位において1ヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されたことにより生じることがある。このような置換は塩基転位または塩基転換であり得る。SNPはまた、参照アレルと比較してヌクレオチドが欠失するか、あるいはヌクレオチドが挿入されることによって生じ得る。この場合、多型部位は、1アレルが別のアレル中の特定ヌクレオチドに対してギャップを保持する部位である。遺伝子内にSNPが存在すると、このSNPの位置で当該遺伝子がエンコードするアミノ酸が変化することがある。しかしながら、遺伝子内SNPはサイレントであることもあり、これはSNPを含むコドンが遺伝コードの縮重のために不変のアミノ酸をエンコードする場合である。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中にSNPが存在する場合は、タンパク質のアミノ酸配列はいずれも変化しないが、発現パターンの制御が変化することがある。この変化は例えば、時間的発現、生理学的反応制御、細胞型発現制御、発現強度、転写されたメッセージの安定性の変化である。
【０５９９】
新規SNP同定方法：SNPはCuraGenの私有SNPToolアルゴリズムを用いて配列アセンブリを解析することによって同定する。SNPToolは以下の判定基準を用いてアセンブリ中の変異を同定する：アライメント両端の10塩基対以内のSNPは解析しない；ウィンドウサイズ(視野内の塩基数)は10である；ウィンドウ内のミスマッチ許容数は2である；最小SNP塩基品質(PHREDスコア)は23である；SNPをスコアする最少数の変化は2/アセンブリ位置である。SNPToolはアセンブリを解析して、アセンブリ中のSNP位置、関連する個々の変異体配列、この既定位置でのアセンブリの程度、推定のアセンブリアレル頻度、およびSNP配列変異を表示する。次いで、配列トレースを選択し、手動検証用の視野に持ち込む。コンセンサスアセンブリ配列を変異体配列変化とともにCuraToolsにインポートし、SNP配列変異に起因するアミノ酸変化候補を同定する。次いで、包括的SNPデータ解析をSNPCallingデータベースにエクスポートする。
【０６００】
新規SNP確認方法：SNPはPyrosequencingとして既知の実証済みの方法を利用して確認する。Pyrosequencingに関する詳細なプロトコルは：Alderborn et al. Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. (2000). Genome Research. 10, Issue 8, August. 1249-1265に見出せる。
【０６０１】
簡単に言えば、Pyrosequencingはジェノタイピングのリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコルでは、ゲノムDNAサンプルから二本鎖ビオチン標識PCR産物を採取し、これらをストレプトアビジンビーズと結合させる。次いで、これらのビーズを変性させ、一本鎖の結合DNAを得る。SNPの特徴付けは、DNA鎖の伸長時に各dNTPから放出されるピロリン酸(PPi)を間接的な生物発光測定によりアッセイすることに基づく技術を利用して行う。クレノーポリメラーゼ媒介性の塩基取り込みにしたがってPPiが放出されると、これがアデノシン5'-ホスホ硫酸(APS)とともにATPスルフリラーゼの基質として使用されてATPが形成される。続いて、このATPによってルシフェラーゼが作用し、ルシフェリンがそのオキシ誘導体に変換される。続いて発光し、この発光量は、約4塩基まで、付加された塩基数に比例したものになる。この方法の進行を許容するため、過剰のdNTPはアピラーゼによって分解する。アピラーゼを出発反応混合物中にも含ませ、シークエンシング時には少量のdNTPのみが鋳型に付加されるようにする。このプロセスは完全に自動化されていて、96ウェル形式に合わせて作成されており、したがって大型SNPパネルを高速スクリーニングすることが可能である。
【０６０２】
結果
アデノシンA1受容体様遺伝子CuraGen 受入番号 CG58655-01の新規一塩基多型変異体のDNAおよびタンパク質配列を表F11に報告する。変異体は個別に報告するが、任意の組み合わせの全または選択サブセットの変異体もまた含まれる。表F11では、変異塩基および変異アミノ酸残基の位置に下線を付している。総じて、表F11に報告する1変異体が存在する。変異体13381538はヌクレオチド配列の717 bp位置がTからCに変化したSNPであり、この変異によりタンパク質配列のアミノ酸238位がLeuからProに変化する。
【０６０３】
表F11. ヌクレオチド配列受入番号 CG58655-01 (配列番号55)の変異体
【表２４０】
2006511237.tif 000241
【０６０４】
【表２４１】
2006511237.tif 000242
【０６０５】
実施例F4. ヒトアデノシンA1受容体遺伝子(CG58655-01)の発現プロファイル
定量的発現解析用プロトコルは実施例Q9に開示する。
【０６０６】
遺伝子CG58655-01の発現は表F13に記載のプライマー-プローブセットAg6342を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表F14、F15、F16、およびF17に示す。
【０６０７】
表F13. プローブ名Ag6342
【表２４２】
2006511237.tif 000243
【０６０８】
表F14. 一般スクリーニングパネルv1.5
【表２４３】
2006511237.tif 000244
【表２４４】
2006511237.tif 000245
【０６０９】
表F15. 一般スクリーニングパネルv1.7
【表２４５】
2006511237.tif 000246
【表２４６】
2006511237.tif 000247
【０６１０】
表F16. パネル5島
【表２４７】
2006511237.tif 000248
【表２４８】
2006511237.tif 000249
【０６１１】
表F17. ヒト代謝系
【表２４９】
2006511237.tif 000250
【表２５０】
2006511237.tif 000251
【表２５１】
2006511237.tif 000252
【表２５２】
2006511237.tif 000253
【表２５３】
2006511237.tif 000254
【０６１２】
一般スクリーニングパネルv1.7概要：(Ag6342)この遺伝子の最大発現は卵巣癌細胞株IGROV-1で検出された(CT=24)。この遺伝子はいくつかの卵巣癌細胞株では正常な組織と比べて過剰に発現される。この遺伝子はいくつかの腎癌細胞株で正常組織と比べて過剰に発現された。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、腎癌および卵巣癌の処置に有用である可能性がある。
【０６１３】
代謝または内分泌機能を有する組織のうち、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、脳下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管で、この遺伝子が有意に高〜中レベル発現されていた。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満症および糖尿病の処置に有用である。
【０６１４】
ヒト代謝系概要：(Ag6342)この遺伝子の最大発現は糖尿病患者の視床下部で検出された。この遺伝子は糖尿病患者の視床下部で高レベルで発現されている。この遺伝子は、内臓脂肪、骨格筋および膵臓で低レベルで発現されていた。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満症および糖尿病の処置に有用である。
【０６１５】
パネル5島概要：(Ag6342)この遺伝子の発現は分化途上および分化型脂肪細胞で下方制御された。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、肥満症の処置に有用である。本発明にしたがって、このデータはこの受容体サブタイプがヒト島細胞で発現されていること(Bayer患者1)を初めて示すものである。
【０６１６】
実施例F5. アデノシンA1受容体のモジュレーターに関するスクリーニングアッセイ
アデノシンA1受容体の活性化は、Giタンパク質のシグナル伝達を介してcAMP形成の阻害を媒介する。細胞内cAMPの増加がインスリン分泌を増強するのであるから、上記活性化はインスリン分泌と関連している。2型糖尿病はインスリン分泌が非常に少ないことを原因とする。したがって、Adora1のアンタゴニストがあれば、その作用はインスリン分泌を増加させ、すなわちこのアンタゴニストは2型糖尿病の処置に適しているであろう。
【０６１７】
開示されているアデノシンA1受容体の配列は好ましいアイソフォームであるが、任意の他のアイソフォームを同様の目的で使用して構わない。また、種々のアッセイ条件下で、リストアップされるアイソフォームを別のアイソフォームで代替してよいかどうかは条件によることもある。ヒトアデノシンA1受容体をエンコードする、本明細書中に記載のCG58655-01遺伝子は、完全長の物理的クローン(physical clone)の典型を示すものであり、これを発現およびスクリーニング目的で直接使用してよい。
【０６１８】
ヒトAdora1のモジュレーターに関するスクリーニングのためのアッセイは、Adora1を発現する株化細胞の不完全リストを利用して構成できる。このリストは本明細書中に示すRTQ-PCRの結果から得られる。
【０６１９】
アデノシンA1受容体の活性化は、Giタンパク質のシグナル伝達を介してアデニル酸シクラーゼおよびcAMP形成の阻害を媒介する。アデノシンA1受容体の阻害をアッセイするためには、細胞内cAMPの測定が利用できる。サイクリックAMP測定は、Biotrak cAMPアッセイ系(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)を用いて構成できる(Harndahl L, Jing XJ, Ivarsson R, Degerman E, Ahren B, Manganiello VC, Renstrom E, Holst LS.  Important role of phosphodiesterase 3B for the stimulatory action of cAMP on pancreatic β-cell exocytosis and release of insulin. J Biol Chem. 2002 Oct 4;277(40):37446-55. PMID: 12169692)。cAMPが増加すれば、スクリーニング陽性を示すであろう。こうして同定される化合物(群)の効力を評価するために、グルコース促進性インスリン分泌に対するその効果について、本明細書中で使用する分散(dispersed)ラット島を用いてin vitroアッセイすることができ、あるいは既知のげっ歯類2型糖尿病モデルにおける血糖に対する効果に基づきin vivoアッセイすることができる。
【０６２０】
発明者らの結果は、Adora1活性のモジュレーター、例えばAdora1の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０６２１】
G. NOV7 -- 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aリアーゼ(HMG-CoAリアーゼまたはHMG-CoAまたはHL)
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素Aリアーゼは、ケトン体生成の最終段階を触媒する。このケトン体生成は、哺乳類エネルギー代謝の重要な経路である。ヒドロキシメチルグルタル酸尿症(hydroxymethylglutaricaciduria)として既知のHMG-CoAリアーゼ欠損はヒトの常染色体性劣性の先天的欠損であり、低血糖および昏睡の発症を招く。 
【０６２２】
HMG-CoAリアーゼは以下の触媒活性を有する：
(s)-3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA＝アセチル-CoA＋アセトアセテート
【０６２３】
HMG-CoAは、肥満症および／または糖尿病の病因および病原性に関連する生化学的経路に影響する。この図式には、これらの発見研究の新規知見が刊行物に報告されている内容とともに包含される。ヒトHMG CoAリアーゼの作用を阻害すると、その結果、肥満症および／または糖尿病の主要な問題であるインスリン抵抗性が減少するであろう。HMG-CoAリアーゼはHMG-CoAを基質として用いてアセトアセテートおよびアセチル-CoAを生産する。これはケトン体生成およびロイシン代謝の最終段階である。重要なことは、この反応由来のアセチル-CoAはTCA回路だけでなく、脂質生合成経路へもフィードバック可能であることである。
【０６２４】
発明者らは、ミトコンドリアの3-ヒドロキシ-3メチルグルタリル補酵素Aリアーゼ(mHMG-CoAリアーゼ)がトリグリタゾン処置後SHRおよびWKYラットの肝臓で上方制御されることを発見した。mHMG-CoAリアーゼはケトン体生成およびロイシン異化作用の最終段階に関与し、3-ヒドロキシ-メチルグルタリル-CoAをその基質として、アセトアセテート(ケトン体)およびアセチル-CoAを生産する。このプロセスは、肝臓で、特に体重減少時に生じ、脂肪酸酸化およびケトン体生成の両過程で生産されるアセチル-CoA量はTCA回路の許容量を超えることがよくある。さらに、過剰のシトレートはアセチル-CoAを細胞質内へ押し戻し、この場合、アセチル-CoAはコレステロールおよび脂肪酸生合成に使用される。したがって、体重減少時にこの酵素を阻害すると、ケトン体形成およびアセチル-CoAの生成が減速し、ゆえにTCA回路の飽和が予防される可能性がある。
【０６２５】
上記式は、ヒトHMG-CoAリアーゼに関する生化学および、肥満症および／または糖尿病を処置する治療用抗体または小分子薬物のスクリーニングに使用してよいポテンシャルアッセイを概説するものである。HMG-CoAリアーゼを発現する株化細胞は、本明細書中に示すRTQ-PCRの結果から得ることができる。これらの、および他のHMG-CoAリアーゼ発現性株化細胞であれば、スクリーニング目的で使用可能であろう。
【０６２６】
さらに、発明者らの結果は、HMG CoAリアーゼ活性のモジュレーター、例えばHMG CoAリアーゼの阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０６２７】
発見過程
以下の段落では、HMG-CoAリアーゼのコードするタンパク質およびその任意の変異体であって、肥満症および糖尿病に関する診断マーカー、治療用抗体の標的および小分子薬物の標的として適しているタンパク質および変異体の同定に使用する研究設計(群)および技術を記載する。
【０６２８】
実施例G1. インスリン抵抗性研究
インスリン抵抗性研究用のプロトコルは実施例Q5に開示する。
【０６２９】
自然発症高血圧ラット(SHR)は、ヒト代謝症候群X (Metabolic Syndrome X)の特徴を示す系統である。表現型の特徴には、肥満症、高血糖症、高血圧症、異脂肪血症および線維素溶解不全(dysfibrinolysis)が含まれる。成体雄性ラットおよびコントロール系統(Wistar-Kyoto)から組織を取り出し、このSHRおよび種々の抗血糖上昇剤、例えばトログリチゾン(troglitizone)で処置した動物に関して、その病状の原理である遺伝子発現差を同定した。皮下脂肪、内臓脂肪および肝臓を含む組織を研究した。
【０６３０】
まず、ラットHMG-COAリアーゼの遺伝子断片が、コントロールとして0.02% DMSOで処置したWKYラットと比べて、トログリタゾンLD10で処置したWKYラットの肝臓で1.6倍上方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。トログリタゾン処置および無処置WKYコントロールラットに関して、約426.4ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すラット遺伝子断片がラットHMG CoAリアーゼcDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このラットHMG CoAリアーゼの遺伝子断片に対応するクロマトグラフィーのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表G1に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。トログリタゾン処置および無処置WKYコントロールラットの両者由来のサンプル中で、426.4 nt長位置のピークが消滅した。動物モデルでこれらの遺伝子の発現が変化することは、肥満症および／または糖尿病の病原性に関するHMG CoAリアーゼの役割を支持するものである。
【０６３１】
【表２５４】
2006511237.tif 000255
【０６３２】
さらにまず、ラットHMG CoAリアーゼの遺伝子断片が、コントロールとして0.02% DMSOで処置したSHRラットと比べて、トログリタゾンLD10で処置したSHRラットの肝臓で2.6倍上方制御されることがわかった。ここでは、遺伝子発現差を示すCuraGenのGeneCalling (登録商標)法を使用した。トログリタゾン処置および無処置SHRコントロールラットに関して、約48.2ヌクレオチド長位置に移動する、発現差を示すラット遺伝子断片がラットHMG CoAリアーゼcDNAのコンポーネントであることを明確に同定した。競合的PCR法を用いて、この遺伝子評価を確認した。このラットHMG CoAリアーゼの遺伝子断片に対応するクロマトグラフィーのピークは、PCR増幅時に遺伝子特異的プライマー(表G2に示す)がリンカー-アダプター中のプライマーと競合すれば消滅するものであった。トログリタゾン処置および無処置WKYコントロールラットの両者由来のサンプル中で、48.2 nt長位置のピークが消滅した。動物モデルでこれらの遺伝子の発現が変化することは、肥満症および／または糖尿病の病原性に関するHMG CoAリアーゼの役割を支持するものである。
【０６３３】
【表２５５】
2006511237.tif 000256
【０６３４】
実施例G2. ヒトHMG CoAリアーゼ配列の同定
ヒトHMG CoAリアーゼの配列(Acc. No CG96859-03)は、実験室レベルでcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって得た。このスクリーニングにはtwo-hybridアプローチを使用した。完全長のDNA配列、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をシークエンシングした。CuraGen Corporationの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいてin silico予測を行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。ヒト配列(群)を同定するためのプロトコルは実施例Q8に開示する。
【０６３５】
表G3は、CG96859-03 (配列番号60)、公開されている別型の1 aa(アミノ酸)が異なるHMG CoAリアーゼ(P35914；配列番号215)、新規スプライシング型のHMG CoAリアーゼ(CG96859-02；配列番号66)、およびHMG CoAリアーゼのマウス(S65036.1；配列番号216)およびラット(Y10054；配列番号217)オーソログのタンパク質配列のアライメント(ClustalW)を示す。表G4は、公開型のHMG CoAリアーゼ(P35914；配列番号215)、HMG CoAリアーゼのマウス(S65036.1；配列番号216)オーソログ、およびラット(Y10054；配列番号217)オーソログのタンパク質配列を示す。
【０６３６】
【表２５６】
2006511237.tif 000257
【０６３７】
【表２５７】
2006511237.tif 000258
【０６３８】
実験による研究で発現差を示すことが同定されたヒトバージョンのHMG CoAリアーゼに加えて、多種のヒト組織由来および公共データベースの配列由来のcDNAをダイレクトシークエンシングすることによって他の変異体が同定されている。2つのスプライシング(型)変異体がCuraGenで同定されている。この2つの選択的(alternative)スプライシング型はCG96859-02およびCG96859-05である。同定されたすべての変異体のうち、スクリーニング目的で使用すべき好ましい変異体はCG96859-03である。
【０６３９】
実験室レベルでのクローニングは、実施例Q8に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した。NOV7クローンを解析し、表G5に示すヌクレオチド配列およびコードされるポリペプチド配列を得た。
【０６４０】
【表２５８】
2006511237.tif 000259
【表２５９】
2006511237.tif 000260
【表２６０】
2006511237.tif 000261
【表２６１】
2006511237.tif 000262
【表２６２】
2006511237.tif 000263
【表２６３】
2006511237.tif 000264
【表２６４】
2006511237.tif 000265
【表２６５】
2006511237.tif 000266
【表２６６】
2006511237.tif 000267
【表２６７】
2006511237.tif 000268
【表２６８】
2006511237.tif 000269
【表２６９】
2006511237.tif 000270
【表２７０】
2006511237.tif 000271
【表２７１】
2006511237.tif 000272
【表２７２】
2006511237.tif 000273
【表２７３】
2006511237.tif 000274
【表２７４】
2006511237.tif 000275
【表２７５】
2006511237.tif 000276
【表２７６】
2006511237.tif 000277
【表２７７】
2006511237.tif 000278
【０６４１】
上記タンパク質配列のClustalW比較では、以下の表G6に示す配列アライメントが得られる。
【０６４２】
【表２７８】
2006511237.tif 000279
【表２７９】
2006511237.tif 000280
【０６４３】
NOV7aタンパク質をさらに解析し、以下の表G7に示す性質を得た。
【０６４４】
【表２８０】
2006511237.tif 000281
【表２８１】
2006511237.tif 000282
【表２８２】
2006511237.tif 000283
【０６４５】
NOV7aタンパク質をGeneseqデータベースに対して検索し、表G8に示すいくつかの相同タンパク質を得た。このデータベースは特許および特許公開に公開されている配列を含有する私有データベースである。
【０６４６】
【表２８３】
2006511237.tif 000284
【０６４７】
公開配列データベースのBLAST検索では、NOV7aタンパク質は表G9のBLASTPデータに示すタンパク質とホモロジーを有することが見出された。
【０６４８】
【表２８４】
2006511237.tif 000285
【０６４９】
PFam解析による予測では、NOV7aタンパク質は表G10に示すドメインを含有する。
【０６５０】
【表２８５】
2006511237.tif 000286
【０６５１】
実施例G3.  CG96859-03の一塩基多型(SNP)
変異体配列は本出願に含まれる。変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み得る。場合によってSNPは「cSNP」と称することができ、これはこのSNPを含有するヌクレオチド配列が元々cDNAであることを示す。SNPはいくつかの経路で生じ得る。例えば、SNPは多型部位において1ヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されたことにより生じることがある。このような置換は塩基転位または塩基転換であり得る。SNPはまた、参照アレルと比較してヌクレオチドが欠失するか、あるいはヌクレオチドが挿入されることによって生じ得る。この場合、多型部位は、1アレルが別のアレル中の特定ヌクレオチドに対してギャップを保持する部位である。遺伝子内にSNPが存在すると、このSNPの位置で当該遺伝子がエンコードするアミノ酸が変化することがある。しかしながら、遺伝子内SNPはサイレントであることもあり、これはSNPを含むコドンが遺伝コードの縮重のために不変のアミノ酸をエンコードする場合である。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中にSNPが存在する場合は、タンパク質のアミノ酸配列はいずれも変化しないが、発現パターンの制御が変化することがある。この変化は例えば、時間的発現、生理学的反応制御、細胞型発現制御、発現強度、転写されたメッセージの安定性の変化である。
【０６５２】
新規SNP同定方法：SNPはCuraGenの私有SNPToolアルゴリズムを用いて配列アセンブリを解析することによって同定する。SNPToolは以下の判定基準を用いてアセンブリ中の変異を同定する：アライメント両端の10塩基対以内のSNPは解析しない；ウィンドウサイズ(視野内の塩基数)は10である；ウィンドウ内のミスマッチ許容数は2である；最小SNP塩基品質(PHREDスコア)は23である；SNPをスコアする最少数の変化は2/アセンブリ位置である。SNPToolはアセンブリを解析して、アセンブリ中のSNP位置、関連する個々の変異体配列、この既定位置でのアセンブリの程度、推定のアセンブリアレル頻度、およびSNP配列変異を表示する。次いで、配列トレースを選択し、手動検証用の視野に持ち込む。コンセンサスアセンブリ配列を変異体配列変化とともにCuraToolsにインポートし、SNP配列変異に起因するアミノ酸変化候補を同定する。次いで、包括的SNPデータ解析をSNPCallingデータベースにエクスポートする。
【０６５３】
新規SNP確認方法：SNPはPyrosequencingとして既知の実証済みの方法を利用して確認する。Pyrosequencingに関する詳細なプロトコルは：Alderborn et al. Determination of Single Nucleotide Polymorphisms by Real-time Pyrophosphate DNA Sequencing. (2000). Genome Research. 10, Issue 8, August. 1249-1265に見出せる。
【０６５４】
簡単に言えば、Pyrosequencingはジェノタイピングのリアルタイムプライマー伸長プロセスである。このプロトコルでは、ゲノムDNAサンプルから二本鎖ビオチン標識PCR産物を採取し、これらをストレプトアビジンビーズと結合させる。次いで、これらのビーズを変性させ、一本鎖の結合DNAを得る。SNPの特徴付けは、DNA鎖の伸長時に各dNTPから放出されるピロリン酸(PPi)を間接的な生物発光測定によりアッセイすることに基づく技術を利用して行う。クレノーポリメラーゼ媒介性の塩基取り込みにしたがってPPiが放出されると、これがアデノシン5'-ホスホ硫酸(APS)とともにATPスルフリラーゼの基質として使用されてATPが形成される。続いて、このATPによってルシフェラーゼが作用し、ルシフェリンがそのオキシ誘導体に変換される。続いて発光し、この発光量は、約4塩基まで、付加された塩基数に比例したものになる。この方法の進行を許容するため、過剰のdNTPはアピラーゼによって分解する。アピラーゼを出発反応混合物中にも含ませ、シークエンシング時には少量のdNTPのみが鋳型に付加されるようにする。このプロセスは完全に自動化されていて、96ウェル形式に合わせて作成されており、したがって大型SNPパネルを高速スクリーニングすることが可能である。
【０６５５】
結果
ヒロドキシメチルグルタリル-COAリアーゼ様遺伝子CuraGen 受入番号 CG96859-03の新規一塩基多型変異体のDNAおよびタンパク質配列を表G11に報告する。変異体は個別に報告するが、任意の組み合わせの全または選択サブセットの変異体もまた含まれる。表G11では、変異塩基および変異アミノ酸残基の位置に下線を付している。総じて、表G11に報告する1変異体が存在する。変異体13379476はヌクレオチド配列の725 bp位置がCからTに変化したSNPであり、この変異はタンパク質配列の変化を生じない(サイレント)。
【０６５６】
表G11. ヌクレオチド配列受入番号 CG96859-03 (配列番号59)の変異体
【表２８６】
2006511237.tif 000287
【０６５７】
【表２８７】
2006511237.tif 000288
【表２８８】
2006511237.tif 000289
【０６５８】
実施例G4. HMG CoAリアーゼ(CG96859-03)様タンパク質の発現プロファイル
定量的発現解析用プロトコルは実施例Q9に開示する。
【０６５９】
遺伝子CG96859-03の発現は表G13に記載のプライマー-プローブセットAg8471を用いて評価した。RTQ-PCRを実行した結果を表G14に示す。
【０６６０】
表G13. プローブ名Ag8471
【表２８９】
2006511237.tif 000290
【０６６１】
表G14. 一般_スクリーニング_パネル_v1.7
【表２９０】
2006511237.tif 000291
【表２９１】
2006511237.tif 000292
【０６６２】
パネル1、1.1、1.2、および1.3D
パネル1、1.1、1.2および1.3Dは、2コントロールウェル(ゲノムDNAコントロールおよび化学的コントロール)および、94ウェルの培養株化細胞および一次正常組織由来cDNAサンプルを含むものであった。株化細胞は以下を含む癌腫(ca)由来であった：肺癌、小細胞癌(小細胞) (s cell var)、非小細胞癌(non small cell) (non-s またはnon-sm)；乳癌；黒色腫；大腸癌；前立腺癌；神経膠腫(glioma) (glio)、星細胞腫(astrocytoma) (astro)および神経芽細胞腫(neuroblastoma) (neuro)；扁平上皮癌(squam)；卵巣癌；肝癌；腎癌；胃癌および膵癌。これらはthe American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD)から獲得した。以下を含む正常組織を個別の成人または胎児から獲得した：成人および胎児の骨格筋、成人および胎児の心臓、成人および胎児の腎臓、成人および胎児の肝臓、成人および胎児の肺、脳、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、大腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。結果報告では、以下の略語を使用する：転移(met)；胸水(pl. effまたはpl effusion)。ならびに、*は転移から確立されたものであることを示す。
【０６６３】
一般_スクリーニング_パネルv1.4、v1.5、v1.6およびv1.7
パネル1.4、1.5、1.6および1.7は、正常組織サンプルが2〜5人の異なる成人または胎児からプールされたものであったことを除き、上記パネル1、1.1、1.2および1.3Dに関して記載される通りである。
【０６６４】
一般_スクリーニング_パネル_v1.7概要：Ag8471この遺伝子の最大発現は肺癌サンプル中で検出された(CT=26)。この遺伝子は広く発現されている。代謝または内分泌機能を有する組織のうち、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、脳下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および消化管で高〜中レベルで発現されている。この遺伝子、発現タンパク質の治療的調節および／またはこの遺伝子もしくは遺伝子産物を標的とする抗体もしくは小分子薬物の使用は、内分泌／代謝関連疾患、例えば肥満症および糖尿病の処置に有用である。
【０６６５】
実施例G5. HMG CoA リアーゼのモジュレーターに関するスクリーニングアッセイ
HMG CoAリアーゼを発現する株化細胞の不完全リストは、本明細書中に示す遺伝子発現差(RTQ-PCR)の結果から得ることができる。
【０６６６】
HMG-CoAリアーゼの酵素活性を測定する有能な方法には、SteginkおよびCoonのクエン酸シンターゼ共役アッセイ(Stereospecificity and other properties of highly purified β-hydroxy-β-methylglutaryl coenzyme A cleavage enzyme from bovine liver, J Biol Chem. 1968 Oct 25;243(20):5272-9)が含まれ、これはさらにKramerおよびMiziorkoによって修飾されている(Purification and characterization of avian liver 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A lyase, J Biol Chem. 1980 Nov 25;255(22):11023-8)。
【０６６７】
発明者らの結果は、HMG CoAリアーゼ活性のモジュレーター、例えばHMG CoAリアーゼの阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、またはアゴニストが、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性のような障害の処置、ならびにインスリン分泌の増強に有用である可能性があることを示す。
【０６６８】
プロトコル
以下の実施例は、本明細書中に記載の手順、プロトコルおよび技術を説明するものである。
【０６６９】
実施例Q1.マウス食餌誘発性肥満症(DIO)の研究(BP24.02)
概要
臨床集団における肥満症の主原因は過剰のカロリー摂取である。このいわゆる食餌誘発性肥満症(DIO)は、40%を超える脂肪含量の高脂肪性食餌での飼育によって動物モデルで模倣する。このDIO研究は、食餌誘発性肥満症の発症および進行に寄与する遺伝子発現の変化を同定するように作成した。さらに、この研究設計は、特定個体で高脂肪性食餌の影響への抵抗能を誘発し、これにより肥満症を予防する因子、の同定を追及するものであった。
【０６７０】
研究用サンプル群は通常、固形飼料で飼育したコントロールの体重+ 1 S.D.、+ 4 S.D.および+ 7 S.D.を有するものであった。さらに、+ 7 S.D.マウスの生化学的プロファイルによれば、通常、これらの動物が、肥満症にもかかわらず正常な血糖プロファイルを維持するマウスおよび高血糖を示すマウスにさらに層別化されることが示された。被験組織は、視床下部、脳幹、肝臓、後腹膜白色脂肪組織(WAT)、精巣上体WAT、褐色脂肪組織(BAT)、腓腹筋(高速単収縮性の骨格筋)およびヒラメ筋(緩徐単収縮性の骨格筋)を含むものであった。これらの組織に関する遺伝子発現プロファイルの差は、肥満症および／または糖尿病の治療標的として使用可能な遺伝子および経路を示した。
【０６７１】
プロトコル
群当たり3匹の5群のマウスを使用した。単一群中で3匹を超えるマウスを使用した場合があるが、これは当該研究に関して正確なパラメータを保つためである。このような場合でも、組織用には3匹のマウスしか犠牲にしない。群は以下のパラメータに基づいて分類した：
群1. 固形飼料飼育マウス。
群2. 高脂肪性食餌飼育マウス。このマウスは固形飼料飼育マウスを体重で1標準偏差超えるものであった。
群3. 高脂肪性食餌飼育マウス。このマウスは固形飼料飼育マウスを体重で4標準偏差超えるものであった。
群4. 高脂肪性食餌飼育マウス。このマウスは固形飼料飼育マウスを体重で7標準偏差超えるものであり、かつ正常なグルコース濃度を有した。
群5. 高脂肪性食餌飼育マウス。このマウスは固形飼料飼育マウスを体重で7標準偏差超えるものであり、かつ高血糖性であった。
【０６７２】
マウス各群で3匹ずつのマウスを犠牲にし、研究用組織を得た。
【０６７３】
実施例Q2. ラット膵島研究(BP24.03)
概要
早期2型糖尿病に関する重要な臨床目標は、膵臓のベータ細胞由来のインスリン分泌を増加させることである。インスリン分泌を調節可能な多数の物質が、実験的に、ならびに治療状況下で同定されている。これらを単離のラット膵島に適用した場合、遺伝子発現の変化がインスリン分泌と相関し得る。この研究では、急性および慢性の遺伝子発現変化を、それぞれ短期(4時間)および長期(5日間)曝露後の薬剤物質で処理された島に関して検査し、基底状態(11 mMグルコース)と比較した。この物質は、高濃度(25 mM)グルコース、グルコース(11 mM)およびエキセンディン-4 (1 nM)、グルコース(11 mM)およびグリベンクラミド(50 uM)、ならびにグルコース(11 mM)およびオレイン酸(2 mM)を含むものであった。
【０６７４】
プロトコル
すべてのサンプルは単離のラット島であった。これらのサンプルは被験する処理方法のみが相違するものであった。4時間の処理群では以下のサンプルを使用した：
1) 11 mMグルコース
2) 25 mMグルコース
3) 11 mMグルコースおよびJTT 608
4) 11 mMグルコースおよびカルバコール
5) 11 mMグルコースおよびエキセンディン-4
【０６７５】
単離ラット島を11 mMグルコース(基底状態)または25 mMグルコース(増加グルコース)のいずれかで処理した。次いで、追加3セットのラット島を11 mMグルコースおよび、3つの物質：JTT 608、カルバコール、またはエキセンディン-4のうちの1つで処理した。
【０６７６】
5日間処理群では以下のサンプルを使用した：
1) 11 mMグルコース
2) 25 mMグルコース
3) 11 mMグルコースおよび1nMエキセンディン
4) 11 mMグルコースおよび50uMグリベンクラミド
5) 11 mMグルコースおよび2mMオレイン酸
【０６７７】
単離ラット島を11 mMグルコース(基底状態)または25 mMグルコース(増加グルコース)のいずれかで処理した。次いで、追加3セットのラット島を11 mMグルコースおよび、3つの物質：エキセンディン、グリベンクラミド、またはオレイン酸のうちの1つで処理した。
【０６７８】
全10サンプルをそれぞれ2複製群に分けた。この2複製群を遺伝子発現差解析(GeneCalling (登録商標))に付した。
【０６７９】
実施例Q3. ラットインスリン感受性研究(BP24.05)
プロトコル
インスリン感受性を変化させることが既知である種々の物質でZDFラットまたはそのやせ型同腹仔を処置した。メトホルミン、バナジン酸塩、およびAICARはインスリンに対する組織応答を増強し、一方、Liposyn (静脈内脂質注入)処置によって生成する遊離脂肪酸はこの応答を減少させる。以下を含む種々の組織を採取した：腓腹筋およびヒラメ筋、肝臓、後腹膜および精巣上体WAT、およびIBAT。
【０６８０】
腓腹筋およびヒラメ筋のみ、遺伝子発現差解析(GeneCalling (登録商標))処理に付した。
【０６８１】
以下の5群のサンプルを使用した：
1) メトホルミンビヒクル(ビヒクルM)
2) メトホルミン処置ラット
3) AICARおよびバナジン酸塩ビヒクル(ビヒクルAV)
4) AICAR処置ラット
5) バナジン酸塩処置ラット
【０６８２】
処置は4時間行い、処置前後のグルコース値を得た。各サンプルを3通り試験した(5群X 3ラットX 2組織)。
【０６８３】
この研究の第二段階では、ラットに静脈内脂質注入を与えた。この処置は対象ラットのインスリンに対する組織応答を減少させるはずである。
【０６８４】
この研究の静脈内脂質注入段階では、以下の2群を使用した：
1) 脂質注入ビヒクルで処置されたラット。
2) 脂質注入処置ラット。
【０６８５】
各群、3匹のラットを含み(3通りに実施)、そのヒラメ筋および腓腹筋サンプルを遺伝子発現差解析(GeneCalling (登録商標))処理に付した(2群X 3サンプルX 2組織)。
【０６８６】
実施例Q4. マウスTZD応答研究(BP24.07)
概要およびプロトコル
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPARg)は核ホルモン受容体サブファミリーの転写因子のメンバーであり、代謝制御に関して主要な役割を果たす。チアゾリジンジオン(TZD)薬物、例えばロシグリタゾンは、PPARg受容体の合成アゴニストである。ロシグリタゾンは、肥満性、糖尿病性げっ歯類の上昇した血漿グルコース濃度を正常化することができ、またヒトのインスリン非依存性真性糖尿病処置用の治療物質として非常に有効であることが多い。糖尿病性動物はTZD処置に対して特異な応答を示す。この特異な応答の原理を理解するために、発明者らはTZD処置の効果を示した糖尿病性動物およびTZD処置に応答しなかった糖尿病性動物間で遺伝子発現の変化を比較した。雌性db/dbマウスを毎日10 mg/体重kgのロシグリタゾンで7日間処置した。8日目に、このマウスから採血し、血糖値を測定した。処置マウスを、高血糖の有意な減少を示した応答動物群および血糖値変化を示さなかった非応答動物群のいずれかに分類した。骨格筋および脂肪組織での遺伝子発現を無処置糖尿病性マウスおよび2亜群のTZD処置マウス間で比較した。
【０６８７】
遺伝子発現差解析(GeneCalling (登録商標))用に以下の3組織を採取した：肝臓、大腿筋、および子宮白色脂肪。
【０６８８】
以下の3群のサンプルを使用した：
1) ビヒクル処理
2) ロシグリタゾン応答動物
3) ロシグリタゾン非応答動物
【０６８９】
各群は3匹のマウスを有した。総計27サンプルを遺伝子発現差解析(GeneCalling (登録商標))処理に付した。
【０６９０】
実施例Q5. インスリン抵抗性研究(MB.01)
自然発症高血圧ラット(SHR)は、ヒト代謝症候群Xの特徴を示す系統である。表現型の特徴には、肥満症、高血糖症、高血圧症、異脂肪血症および線維素溶解不全が含まれる。成体雄性ラットおよびコントロール系統(Wistar_Kyoto)から組織を取り出し、このSHRおよび種々の抗血糖上昇剤、例えばトログリチゾンで処置した動物に関して、その病状の原理である遺伝子発現差を同定した。皮下脂肪、内臓脂肪、脳、筋肉、および肝臓を含む組織を研究した。各組織を遺伝子発現差解析(GeneCalling (登録商標))用に3通り採取した。
【０６９１】
実施例Q6.  遺伝的肥満性マウス対遺伝的痩せマウス研究(MB.04)
概要
肥満症に関して多数の遺伝的モデルが研究されており、マウスおよびラットでの研究が最も顕著である。しかしながら、少数の原因遺伝子しか同定されていない。ここでは、一組のマウス遺伝的モデルを研究した。その目的は、ホジショナル発現クローニングによってマウスの肥満症に関する遺伝子を同定することである。この遺伝子はヒト肥満症と関連する可能性があるものである。
【０６９２】
プロトコル
7系統のマウスを用いた。これらは、やせの表現型(やせ型)を示すマウス、正常体重マウス、および遺伝的に肥満性のマウスを含むものであった。
【０６９３】
この研究では、以下の系統のマウスを用いた:
1) CAST/EI -やせ型(lean phenotype)
2) SM/J black -やせ型
3) SWR/J -正常型(normal phenotype)
4) C57L/J -正常型
5) C57BL/6J -正常型
6) AKR/J -肥満型(obese phenotype)
7) NZB/BINJ -肥満型
【０６９４】
以下の諸組織を遺伝子発現差解析(GeneCalling(登録商標))処理に付した：脳、肝臓、筋肉、および脂肪。
【０６９５】
サンプルは3通り(すなわち3 CAST/EI マウスからは3脳サンプルを)処理した。総計7系統X 4組織X 3サンプル= 84サンプルを用いた。
【０６９６】
実施例Q7. 発現差を示す遺伝子および遺伝子産物の同定方法(GeneCalling (登録商標))
GeneCalling (登録商標)技術は、CuraGenが独自に開発した、2つまたはそれ以上のサンプル間で遺伝子発現差のプロファイリングを行う方法であり、Shimkets, et al., "Gene expression analysis by transcript profiling coupled to a gene database query" Nature Biotechnology 17:198-803 (1999)に記載されている。GeneCalling (登録商標)技術はまた、米国特許第5,871,697号に開示されている。cDNAは、種々のドナー由来の、多数の組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、および発生状態の典型を示す種々のサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養一次細胞または株化細胞として得た。細胞および株化細胞は、遺伝子発現を制御する生物学的物質または化学物質、例えば成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理されていて構わない。その後、このようにして得られたcDNAを、120対に達するまでの多数の制限酵素を用いて消化し、そして各制限酵素対に特異的なリンカー-アダプター対を適切な末端に連結した。この制限酵素消化により、固有cDNA遺伝子断片の混合物を作成する。リンカー-アダプター配列と相同的なプライマーを用いて限定的(Limited)PCR増幅を実行し、この場合、一方のプライマーをビオチン標識し、他方を蛍光標識する。二重標識されている物質を単離し、蛍光標識されている一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動によって分離した。コンピュータアルゴリズムで実験群およびコントロール群由来のエレクトロフェログラムを各制限酵素消化に関して比較した。この情報および追加の配列由来情報を用いて、発現差を示す各遺伝子断片のアイデンティティーを予測する。この予測には種々の遺伝子データベースを使用する。肥満症および／または糖尿病のモデルまたはそれらの患者で発現変化を示すことがわかった遺伝子断片に関し、通常、アイデンティティーの確認に使用される3つの方法を以下に記載する。
【０６９７】
A). ダイレクトシークエンシング
発現差を示す遺伝子断片を単離し、プラスミド中へクローニングし、シークエンシング(配列決定)する。その後、この配列情報を用いて、この遺伝子断片の一端または両端に対応するオリゴヌクレオチドを設計する。このオリゴヌクレオチドを競合的PCR反応で使用すると、この配列が由来するエレクトロフェログラフのバンドが除去される。
【０６９８】
B). 競合的PCR
競合的PCRでは、目的遺伝子の遺伝子断片に対応するエレクトロフェログラフのピークは、PCR増幅時に(配列決定されたバンドまたは入手可能なデータベースから設計された)遺伝子特異的プライマーがリンカー-アダプター中のプライマーと競合すると消滅する。
【０６９９】
C). 完全またはミスマッチ3'ヌクレオチドを用いるPCR (TraPping)
この方法は競合的PCRアプローチを利用するものであり、ここでは、フランキング制限酵素領域を超えてこの断片の遺伝子特異的領域内へ1または2ヌクレオチド伸長した変性セットのプライマーを使用する。競合的PCRアプローチと同様に、エレクトロフェログラフのバンド消滅を生じさせるプライマーは追加の配列情報を提供する。遺伝子断片のサイズおよび12ヌクレオチドの制限部位由来の配列と併せて、この追加配列データにより、データベース解析にしたがって遺伝子を1つに限定できる。TraPpingは公開されているPCT出願公開番号第WO 01/49886号に開示されている。
【０７００】
実施例Q8. ヒト配列の同定
実験室レベルでのクローニングは以下に概説する1つまたは2以上の方法を用いて実行した：
【０７０１】
SeqCalling(商標）技術：cDNAは、種々のドナー由来の、多数の組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、および発生状態の典型を示す種々のヒトサンプルから得た。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養一次細胞または株化細胞として得た。細胞および株化細胞は、遺伝子発現を制御する生物学的物質または化学物質、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理されていて構わない。その後、このようにして得られたcDNAをCuraGen CorporationのSeqCalling技術を用いてシークエンシングした。この技術は、1999年10月13日出願の米国出願番号第09/417,386 (ならびにPCT出願公開番号：WO 00/40757)、および2000年7月11日出願の09/614,505に完全に開示されている。配列トレースは手作業で評価し、適切であれば編集して修正した。すべてのサンプル由来のcDNA配列を共にアセンブリし、これは公的ヒト配列を含むこともあり、ここではバイオインフォマティクスプログラムを用いて各アセンブリ用のコンセンサス配列を作成した。各アセンブリはCuraGen Corporationのデータベースに加えられている。配列は、別のコンポーネントとの同一性の程度が50 bpにわたって少なくとも95%であった場合に、アセンブリ用のコンポーネントとして加えた。各アセンブリは、遺伝子またはその部分の典型を示すものであり、変異体、例えばスプライシング型一塩基多型(SNP)、挿入、欠失および他の配列バリエーションに関する情報を含む。
【０７０２】
変異体配列もまた本出願に含まれる。変異体配列は一塩基多型(SNP)を含み得る。場合によってSNPは「cSNP」と称することができ、これはこのSNPを含有するヌクレオチド配列が元々cDNAであることを示す。SNPはいくつかの経路で生じ得る。例えば、SNPは多型部位において1ヌクレオチドが別のヌクレオチドで置換されたことにより生じることがある。このような置換は塩基転位または塩基転換であり得る。SNPはまた、参照アレルと比較してヌクレオチドが欠失するか、あるいはヌクレオチドが挿入されることによって生じ得る。この場合、多型部位は、1アレルが別のアレル中の特定ヌクレオチドに対してギャップを保持する部位である。遺伝子内にSNPが存在すると、このSNPの位置で当該遺伝子がエンコードするアミノ酸が変化することがある。遺伝子内SNPはサイレントであることもあり、これはSNPを含むコドンが遺伝コードの縮重のために不変のアミノ酸をエンコードする場合である。遺伝子領域の外側、または遺伝子内のイントロン中にSNPが存在する場合は、タンパク質のアミノ酸配列はいずれも変化しないが、発現パターンの制御が変化することがある。この変化は例えば、時間的発現、生理学的反応制御、細胞型発現制御、発現強度、および転写されたメッセージの安定性の変化である。
【０７０３】
開示されている配列と、ゲノムクローン、公的遺伝子およびESTの共有配列同一性に関連する情報およびCuraGen CorporationのElectronic Northernバイオインフォマティクスツール。
RACE：ポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術、例えばcDNA末端の高速増幅(RACE)を用いて、本発明のcDNAの予測配列を単離し、あるいは完全にした。通常、1つまたは2以上のヒトサンプルから複数のクローンをシークエンシングし、断片についての配列を得た。種々のドナー由来の種々のヒト組織サンプルをRACE反応に使用した。これらの手順によって得られた配列を上記段落に記載のSeqCallingアセンブリプロセスに加えた。
【０７０４】
エキソン連結(Exon Linking)：CG101190-01配列に関するcDNAコーディングはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってクローニングした。このPCRでは、既知のcDNA配列または、本発明のcDNA／タンパク質配列の完全長またはいずれかの部分(1つまたは2以上のエキソン)のin silico予測、に基づいて設計したプライマーを使用した。これらのプライマーを用いて、以下の組織由来の発現性ヒト配列を含有するプールからcDNAを増幅した：副腎、骨髄、脳-扁桃体、脳-小脳、脳-海馬、脳-黒質、脳-視床、全脳、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫- Raji、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管および子宮。
【０７０５】
物理的クローン：エキソン連結によって得た、オープンリーディングフレーム全体を含むPCR産物をInvitrogen製 pCR2.1ベクター内へクローニングし、発現およびスクリーニング目的で使用するクローンを得た。
【０７０６】
実施例Q9. 諸細胞および組織中クローンの定量的発現解析(RTQ-PCR)
種々のNOV遺伝子の定量的発現は、種々の正常および病理由来細胞、株化細胞および組織由来のRNAサンプルを含有するマイクロタイタープレートを使用し、リアルタイム定量的PCR (RTQ-PCR)を用いて評価した。このRTQ-PCRはApplied Biosystems (Foster City, CA) ABI PRISM (登録商標) 7700またはABI PRISM (登録商標) 7900 HT Sequence Detection Systemで実行した。
【０７０７】
すべてのサンプルのRNA完全性は、アガロースゲル電気泳動の視覚評価によって測定した。この視覚評価では、指針として28Sおよび18SリボソームRNA染色強度比(2:1〜2.5:1 28s:18s)、および低分子量RNA(分解産物)の不存在を使用した。ゲノムDNAコンタミネーションを検出するコントロールサンプルでは、逆転写酵素の不存在下でRTQ-PCR反応を実行することを含み、この反応では、単一エキソンの範囲に越えて増幅するように設計したプローブおよびプライマーセットを使用した。
【０７０８】
RNAサンプルは、核酸がエンコードする構成的発現遺伝子(すなわちβ-アクチンおよびGAPDH)を基準にして標準化した。別法では、非標準化RNAサンプルを、Superscript II (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, Catalog No. 18064-147)およびランダムヘキサマーを用いて製造元の指示書通りに一本鎖cDNA(sscDNA)に変換した。20μl容量中10μgまでのトータルRNAを含有する反応物orの規模を大きくし、100μl容量中50μgのトータルRNAを含有させ、これを42℃で60分間インキュベートした。その後、上記核酸を基準にしてsscDNAサンプルを標準化した。
【０７０９】
プローブおよびプライマーは、Applied Biosystems Primer Express Softwareパッケージ(バージョンI、Apple Computer Macintosh Power PC用)または同様のアルゴリズムにしたがって設計し、ここでは標的配列を入力として使用した。プライマーを選択する前に、デフォルト反応条件設定および以下のパラメータを設定した：プライマー濃度250 nM；プライマー融解温度(Tm)範囲58℃-60℃；プライマー至適Tm59℃；最大プライマー差2℃(プローブが5'Gを有さない場合、プローブTmはプライマーTmより10℃高くなければならない)；およびアンプリコンサイズ75 bp〜100 bp。選択プローブおよびプライマーはSynthegen (Houston, TX)によって合成した。プローブをHPLCによって二重精製して、未結合色素を除去し、質量分析によって評価し、レポーターおよびクエンチャー色素がそれぞれこのプローブの５'および3'末端に結合されたことを検証した。これらの最終濃度は：900 nMフォワードおよびリバースプライマー、および200nMプローブであった。
【０７１０】
標準化RNAを96または384ウェルPCRプレート(Applied Biosystems, Foster City, CA)の個々のウェルにスポットした。PCRカクテルは単一遺伝子特異的プローブおよびプライマーセットまたは2つのマルチプレックスプローブおよびプライマーセットを含むものであった。PCR反応はTaqMan (登録商標) One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems, Catalog No. 4313803)を製造元の指示書にしたがって用いて行った。逆転写は48℃で30分間実行し、その後増幅した／PCRサイクル：95℃で10分間、次いで95℃で15秒間の40サイクル、その後60℃で1分間。結果はCT値(既定のサンプルが蛍光の閾値レベルと交差するサイクル)で記録し、対数スケールを用いてプロットした。既定のサンプルおよび最低CT値を有するサンプル間のRNA濃度差は2のデルタCT乗で表される。相対発現パーセントはこのRNA差の逆数に100を掛けたものであった。CT値が28未満であれば高度の発現を示し、28〜32の範囲であれば中程度の発現を示し、32〜35の範囲であれば低度の発現を示し、そして35を超えると発現レベルが低すぎて正確に測定できないことを表す。
【０７１１】
標準化sscDNAをRTQ-PCRによって解析し、ここでは1X TaqMan (登録商標) Universal Master mix (Applied Biosystems; catalog No. 4324020)を製造元の指示書にしたがって使用した。PCR増幅および解析は上記の通り行った。
【０７１２】
パネル1、1.1、1.2、および1.3D
パネル1、1.1、1.2および1.3Dは、2コントロールウェル(ゲノムDNAコントロールおよび化学的コントロール)および、94ウェルの培養株化細胞および一次正常組織由来cDNAサンプルを含むものであった。株化細胞は以下を含む癌腫(ca)由来であった：肺癌、小細胞癌(s cell var)、非小細胞癌(non-s またはnon-sm)；乳癌；黒色腫；大腸癌；前立腺癌；神経膠腫(glio)、星細胞腫(astro)および神経芽細胞腫(neuro)；扁平上皮癌(squam)；卵巣癌；肝癌；腎癌；胃癌および膵癌。これらはthe American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD)から獲得した。以下を含む正常組織を個別の成人または胎児から獲得した：成人および胎児の骨格筋、成人および胎児の心臓、成人および胎児の腎臓、成人および胎児の肝臓、成人および胎児の肺、脳、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、大腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。結果報告では、以下の略語を使用する：転移(met)；胸水(pl. effまたはpl effusion)。ならびに、*は転移から確立されたものであることを示す。
【０７１３】
一般_スクリーニング_パネルv1.4、v1.5、v1.6およびv1.7
パネル1.4、1.5、1.6および1.7は、正常組織サンプルが2〜5人の異なる成人または胎児からプールされたものであったことを除き、上記パネル1、1.1、1.2および1.3Dに関して記載される通りである。
【０７１４】
パネル2D、2.2、2.3および2.4
パネル2D、2.2、2.3および2.4は、2コントロールウェルおよび、the National Cancer InstituteのCooperative Human Tissue Network (CHTN)またはthe National Disease Research Initiative (NDRI)、Ardais (Lexington, MA)またはClinomics BioSciences (Frederick, MD)から入手したヒト外科的検体由来のRNAまたはcDNAを含有する94ウェルを含むものであった。組織はヒト悪性および場合により適合性(matched)の隣接正常組織(NAT)を含むものであった。腫瘍分化等級、ならびに取得サンプルが由来する患者の臨床段階の組織病理学的評価に関する情報は一般に入手可能であった。正常組織RNAおよびcDNAサンプルは、様々な市販供給元、例えばClontech (Palo Alto, CA)、Research GeneticsおよびInvitrogen (Carlsbad, CA)から購入した。
【０７１５】
HASSパネルv 1.0
HASSパネルv1.0は、以下を含む93 cDNAサンプルおよび2コントロールを含むものであった：培養ヒト癌細胞株81サンプル、これらは確立された手順にしたがって種々の期間、血清飢餓、酸性条件(acidosis)および嫌気条件に付されたものである；3ヒト一次細胞；9悪性脳癌(4髄芽腫(medulloblastomas)および5グリア芽細胞腫(neuroblastomas))；および2コントロール。癌細胞株(ATCC)は、推奨される条件を用いて培養した。この癌細胞株は以下を含む：乳癌、前立腺癌、膀胱癌(bladder cancer)、膵癌およびCNS癌。一次ヒト細胞はClonetics (Walkersville, MD)から入手した。悪性脳サンプルはthe Henry Ford Cancer Centerから提供を受けた。
【０７１６】
ARDAISパネルv1.0およびv1.1
ARDAISパネルv1.0およびv1.1は、以下を含む2コントロールおよび22試験用サンプルを含むものであった：ヒト肺腺癌(human lung adenocarcinomas)、肺扁平上皮癌(lung squamous cell carcinomas)、および場合により適合性の隣接正常組織(NAT)。これはArdais (Lexington, MA)から入手した。肺由来の不適合性(unmatched)の悪性および非悪性RNAサンプルは、腫瘍分化等級および段階およびその患者の臨床状態についての総組織病理学的評価とともに、Ardaisから入手した。
【０７１７】
ARDAIS前立腺v1.0
ARDAIS前立腺v1.0パネルは、2コントロールならびに、ヒト前立腺悪性および場合により適合性の隣接正常組織(NAT)の68試験用サンプルを含むものであった。これはArdais (Lexington, MA)から入手した。不適合性の悪性および非悪性前立腺サンプル由来RNAもまた、腫瘍分化等級および段階およびその患者の臨床状態についての総組織病理学的評価とともに、Ardaisから入手した。
【０７１８】
ARDAIS腎臓v1.0
ARDAIS腎臓v1.0パネルは、2コントロールウェルならびに、ヒト腎細胞癌および場合により適合性の隣接正常組織(NAT)の44試験用サンプルを含むものであった。これはArdais (Lexington, MA)から入手した。不適合性の腎細胞癌および正常組織由来RNAもまた、腫瘍分化等級および段階およびその患者の臨床状態についての総組織病理学的評価とともに、Ardaisから入手した。
【０７１９】
ARDAIS乳房v1.0
ARDAIS乳房v1.0パネルは、2コントロールウェルならびに、ヒト乳房悪性および場合により適合性の隣接正常細胞(NAT)の71試験用サンプルを含むものであった。これはArdais (Lexington, MA)から入手した。不適合性の悪性および非悪性乳房サンプル由来RNAもまた、腫瘍分化等級および段階およびその患者の臨床状態についての総組織病理学的評価とともに、Ardaisから入手した。
【０７２０】
パネル3D、3.1および3.2
パネル3D、3.1、および3.2は、2コントロール、培養ヒト癌細胞株の92 cDNAサンプルおよびヒト一次小脳の2サンプルを含むものであった。以下由来の株化細胞(ATCC、National Cancer Institute (NCI)、German tumor cell bank)を推奨される通りに培養した：舌の扁平上皮癌、黒色腫、肉腫(sarcoma)、白血病(leukemia)、リンパ腫(lymphoma)、および類表皮(epidermoid carcinomas)、膀胱、膵臓、腎臓、乳房、前立腺、卵巣、子宮、頚部、胃、大腸、肺およびCNS癌。
【０７２１】
パネル4D、4R、および4.1D
パネル4D、4R、および4.1Dは、2コントロールおよび、炎症症状に関連するヒト株化細胞または組織由来のRNA(パネル4R)またはcDNA (パネル4Dおよび4.1D)の94試験用サンプルを含むものであった。コントロールは正常組織、例えば大腸、肺(Stratagene, La Jolla, CA)、胸腺および腎臓(Clontech, Palo Alto, CA)由来のトータルRNAを含むものであった。硬変性およびループス性腎臓由来のトータルRNAはBioChain Institute, Inc., (Hayward, CA)から入手した。クローン腸性(Crohn's intestinal)および潰瘍性(ulcerative)大腸炎(colitis)サンプルはthe National Disease Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA)から入手した。以下を含む細胞をClonetics (Walkersville, MD)から購入した：アストロサイト、肺線維芽細胞、真皮線維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、末梢気道上皮、気管支上皮、真皮微小血管内皮細胞、肺微小血管内皮細胞、ヒト肺大動脈内皮細胞、およびヒト臍静脈内皮。これらの一次細胞型は、種々のサイトカイン(IL-1ベータ 〜1-5 ng/ml、TNFアルファ 〜5-10 ng/ml、IFNガンマ 〜20-50 ng/ml、IL-4 〜5-10 ng/ml、IL-9 〜5-10 ng/ml、IL-13 5-10 ng/ml)または上記サイトカインの組み合わせとインキュベートすることによって活性化した。飢餓内皮細胞は0.1%血清を伴う基本培地(Clonetics, Walkersville, MD)中で培養した。
【０７２２】
単核細胞はFicollを用いて献血から調製した。LAK細胞は培地[DMEM、5% FCS (Hyclone, Logan, UT)、100 mM非必須アミノ酸(Gibco/Life Technologies, Rockville, MD)、1 mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、メルカプトエタノール5.5 x 10-5 M (Gibco)、および10 mM Hepes (Gibco)]およびインターロイキン2中で4〜6日培養した。細胞は10-20 ng/ml PMAおよび1-2μg/mlイオノマイシン、5-10 ng/ml IL-12、20-50 ng/ml IFNガンマまたは5-10 ng/ml IL-18で6時間活性化した。場合により、単核細胞は〜5 mg/ml PHA (フィトヘマグルチニン)またはPWM (アメリカヤマゴボウマイトジェン；Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)を含む培地中で4-5日間培養した。RNA調製用サンプルは24、48および72時間の時点で採取した。MLR(混合リンパ球培養反応)サンプルは、2ドナーから血液を採取し、Ficollを用いて単核細胞を単離し、そしてこれらを培地中、最終濃度〜2x106細胞/ml で1:1混合することによって得た。RNA調製用MLRサンプルは1-7日の種々の時点で採取した。
【０７２３】
単球は単核細胞から単離した。この単離では、CD14 Miltenyiビーズ、+ve VS選択カラムおよびVario Magnet (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を製造元の指示書にしたがって使用した。単球は、50 ng/ml GMCSFおよび5 ng/ml IL-4を含む培地中で5-7日間培養することによって樹状細胞に分化させた。マクロファージは、〜50 ng/ml 10% AB型ヒト血清(Life technologies, Rockville, MD)またはMCSF (Macrophage colony stimulating factor; R&D, Minneapolis, MN)を含む培地中で単球を5-7日間培養することによって調製した。単球、マクロファージおよび樹状細胞を100 ng/ml リポ多糖(LPS)で6または12-14時間刺激した。樹状細胞はまた、10μg/ml抗-CD40モノクローナル抗体(Pharmingen, San Diego, CA)で6または12-14時間刺激した。
【０７２４】
また、CD4+リンパ球、CD8+リンパ球およびNK細胞を単核細胞から単離した。この単離では、CD4、CD8およびCD56 Miltenyiビーズ、ポジティブVS選択カラムおよびVario Magnet (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を製造元の指示書にしたがって使用した。CD45+RAおよびCD45+RO CD4+リンパ球は、CD8、CD56、CD14およびCD19 Miltenyiビーズおよびポジティブ選択を用いて単核細胞からCD8+、CD56+、CD14+およびCD19+細胞を除去(deplete)することによって単離した。次いでCD45RO Miltenyiビーズを用いて、CD45+RA CD4+リンパ球からCD45+RO CD4+リンパ球を分離した。CD45+RA CD4+、CD45+RO CD4 +およびCD8+リンパ球は培地中106細胞/mlで培養した。この培養は、PBS 中0.5 mg/ml抗-CD28 (Pharmingen, San Diego, CA)および3μg/ml抗-CD3 (OKT3, ATCC)で一晩プレコーティングした培養プレートで行った。6および24時間後、この細胞をRNA調製用に回収した。長期活性化(chronically activated) CD8+リンパ球を調製するため、単離したCD8+リンパ球を抗-CD28、抗-CD3コーティングプレート上で4日間活性化し、その後回収し、IL-2 (1 ng/ml)を含む培地中で増殖させた。これらのCD8+細胞を再度、抗-CD3および抗-CD28結合プレートで4日間活性化し、上記のように増殖させた。二次活性化の6および24時間後および4日間の二次増殖培養後にRNAを単離した。単離したNK細胞は1 ng/ml IL-2を含む培地中で4-6日間培養し、その後RNAを調製した。
【０７２５】
B細胞は、細分してふるいに通した扁桃組織(NDRI)から調製した。扁桃細胞をペレット化し、培地中106細胞/mlで再懸濁した。5μg/ml PWM (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)または〜10μg/ml抗-CD40 (Pharmingen, San Diego, CA)および5-10 ng/ml IL-4を用いて細胞を活性化した。24、48および72時間後、RNA調製用に細胞を回収した。
【０７２６】
一次および二次Th1/Th2およびTr1細胞を調製するために、6ウェルFalconプレートのIL-2 (4 ng/ml)を含む培地中105-106細胞/mlで臍帯血CD4+リンパ球(Poietic Systems, German Town, MD)を培養した(このFalconプレートは、10μg/ml抗-CD28 (Pharmingen)および2μg/ml抗-CD3 (OKT3; ATCC)で一晩プレコーティングされ、その後PBSで2回洗浄されたものであった)。
【０７２７】
Th1表現型の分化を促進するため、IL-12 (5 ng/ml)および抗-IL4 (1μg/ml)を使用した；Th2表現型分化用にはIL-4 (5 ng/ml)および抗-IFNガンマ(1μg/ml)を使用した；ならびにTr1表現型分化用にはIL-10 (5 ng/ml)を使用した。4-5日後、この活性化Th1、Th2およびTr1リンパ球をDMEMで1回洗浄し、IL-2 (1 ng/ml)を含む培地中で4-7日間増殖させた。活性化Th1、Th2およびTr1リンパ球を抗-CD28/CD3および上記サイトカインで5日間再刺激し、この場合、抗-CD95L (1μg/ml)を加えてアポトーシスを予防した。4-5日後、このTh1、Th2およびTr1リンパ球を洗浄し、IL-2を含む培地中で4-7日間増殖させた。活性化Th1およびTh2リンパ球は最大3サイクル維持した。プレート結合抗-CD3および抗-CD28 mAbで二次および三次活性化した6および24時間後、および4日間の二次および三次増殖培養後に、一次および二次Th1、Th2およびTr1からRNAを調製した。
【０７２８】
白血球細胞株Ramos、EOL-1、KU-812はATCCから入手した。EOL-1細胞は、0.1 mM dbcAMPを含む培地中5 x105細胞/mlで8日間培養し、この際、培地を3日毎に交換し、かつ細胞濃度を5 x105細胞/mlに調節することによってさらに分化させた。休止細胞または、PMA (10 ng/ml)およびイオノマイシン(1μg/ml)で6および14時間活性化した細胞からRNAを調製した。休止CCD 1106ケラチノサイト細胞株(ATCC)または、〜5 ng/ml TNFアルファおよび1 ng/ml IL-1ベータで活性化した細胞からRNAを調製した。休止NCI-H292、気道上皮腫瘍細胞株(ATCC)または、5 ng/ml IL-4、5 ng/ml IL-9、5 ng/ml IL-13、および25 ng/ml IFNガンマを含む培地中で6および14時間活性化した細胞からRNAを調製した。
【０７２９】
RNAの調製は、Trizol (Gibco BRL)を用いて約107細胞/mlを溶解し、次いで1/10容量のブロモクロロプロパン(Molecular Research Corporation, Cincinnati, OH)を加え、ボルテックスし、室温で10分間インキュベートし、その後Sorvall SS34ローターにて14,000 rpmで遠心することによって行った。この水相を15 ml Falconチューブに入れ、等容量のイソプロパノールを加え、-20℃で一晩置いた。沈降したRNAを9,000 rpmで15分間遠心沈殿させ、70%エタノールで洗浄した。このペレットを、35 mlバッファー(Promega, Madison, WI)、5μl DTT、7μl RNAsinおよび8μl DNAseを含む300μl RNAse-free水に再溶解し、37℃で30分間インキュベートして、混入ゲノムDNAを除去し、フェノール・クロロホルムで1回抽出し、1/10容量の3 M酢酸ナトリウムおよび2容量の100%エタノールで再沈降させた。このRNAを遠心沈殿させ、RNAse free水に入れ、-80℃で保存した。
【０７３０】
AI_包括的パネル_v1.0
自己免疫(AI)包括的パネルv1.0は、2コントロールおよび、雄性(M)および雌性(F)外科的および死後ヒト組織から単離された89 cDNA試験用サンプルを含むものであった。このヒト組織はthe Backus HospitalおよびClinomics (Frederick, MD)から入手した。組織サンプルは：正常性、隣接性(Adj)；適合性の正常隣接性(適合コントロール)；間接組織(滑膜(Syn)液、滑膜、骨および軟骨、骨関節炎(osteoarthritis) (OA)、関節リウマチ(rheumatoid arthritis) (RA))；乾癬性(psoriatic)；潰瘍性大腸炎大腸；クローン病大腸(Crohns disease colon)；および気腫性(emphysmatic)、喘息性(asthmatic)、アレルギー性(allergic)および慢性閉塞性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease) (COPD)肺を含むものであった。
【０７３１】
肺および一般炎症(PGI)パネルv1.0
肺および一般炎症(PGI)パネルv1.0は、2コントロールおよび、外科的または死後サンプルとして単離された39試験用サンプルを含むものであった。組織サンプルは：Maryland Brain and Tissue Bank, University of Maryland (Baltimore, MD), International Bioresource systems, IBS (Tuscon, AZ)、およびAsterand (Detroit, MI)から入手した5正常肺サンプル、Ardais (Lexington, MA)から入手した5正常隣接腸組織(NAT)、Ardais (Lexington, MA)から入手した潰瘍性大腸炎サンプル(UC)；NDRI, National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)から入手したクローン病大腸；Ardais (Lexington, MA)およびGenomic Collaborative Inc. (Cambridge, MA)から入手した気腫組織サンプル；Maryland Brain and Tissue Bank, University of Maryland (Baltimore, MD)およびGenomic Collaborative Inc (Cambridge, MA)から入手した喘息組織およびArdais (Lexinton, MA)およびGenomic Collaborative (Cambridge, MA)から入手した線維組織を含むものであった。
【０７３２】
細胞性OA/RAパネル
細胞性OA.RAパネルは、2コントロールウェルおよび、cDNAからなる35試験用サンプルを含み、このcDNAはヒト関節およびその炎症症状の典型を示すヒト株化細胞または一次細胞から単離されたトータルRNAから作成されたものであった。細胞型は、正常ヒト骨芽細胞(Nhost) (Clonetics (Cambrex, East Rutherford, NJ)より入手)、ヒト軟骨肉腫SW1353細胞(ATCC (Manossas, VA)より入手)、ヒト線維芽細胞様滑膜細胞(Cell Applications, Inc. (San Diego, CA)より入手)およびMH7A株化細胞(SV40 T抗原で形質転換されたリウマチ線維芽細胞様滑膜細胞) (Riken Cell bank (Tsukuba Science City, Japan)より入手)を含むものであった。これらの細胞型は、種々のサイトカイン(IL-1ベータ 〜1-10 ng/ml、TNFアルファ 〜5-50 ng/ml、またはプロスタグランジンE2 (Nhost細胞用))と1、6、18または24 時間インキュベートすることによって活性化した。これらの細胞はすべて、少なくとも5時間飢餓させ、その対応する〜0.1〜1 % FBS含有基本培地で培養した。
【０７３３】
微小組織OA/RAパネル
OA/RAミニパネルは、2コントロールウェルおよび、cDNAからなる31試験用サンプルを含み、このcDNAはthe University of Calgary (Alberta, Canada)、NDRI (Philadelphia, PA)、およびArdais Corporation (Lexington, MA)から入手した外科的および死後ヒト組織から単離されたトータルRNAから作成されたものであった。関節組織サンプルは、膝再建手術を受けた骨関節炎(osteoarthritic)および関節リウマチ患者由来の滑膜、骨および軟骨、ならびに正常滑膜サンプル(RNAおよび組織)を含む。以下を含む内臓正常組織を2-5人の成人からプールした：副腎、心臓、腎臓、脳、大腸、肺、胃、小腸、骨格筋、および卵巣。
【０７３４】
AI.05軟骨肉腫
AI.05軟骨肉腫(chondrosarcoma)プレートは、SW1353細胞(ATCC)を含むものであった。この細胞は、血清飢餓に付し、MMP (1、3および13)合成を誘導することが既知であるサイトカイン(例えばIL1ベータ)で6および18時間処理したものであった。これらの処理は以下を含むものであった：IL-1ベータ(10 ng/ml)、IL-1ベータ+ TNF-アルファ(50 ng/ml)、IL-1ベータ+オンコスタチン(50 ng/ml)およびPMA (100 ng/ml)。上清を回収し、MMP 1、3および13生産に関して解析した。これらのサンプルから標準的手順を用いてRNAを調製した。
【０７３５】
パネル5Dおよび5I
パネル5Dおよび5Iは、2コントロールおよび、ヒト組織、ヒト膵島細胞、株化細胞、妊娠糖尿病研究(下記)に登録されている患者由来の代謝組織、および脂肪細胞分化の諸段階、例えば分化型(AD)、分化途上(AM)、および未分化型(U；ヒト間葉系幹細胞)由来の細胞から単離されたcDNAを含むものであった。
【０７３６】
妊娠糖尿病研究の被験者は、若年(18-40歳)の、通常の(随意の)帝王切開を経る妊娠糖尿病患者および非患者であるが、それ以外の点では健康な女性であった。子宮壁平滑筋(UT)、内臓(Vis)脂肪、骨格筋(SK)、胎盤(Pl) 大網脂肪(GO脂肪)および皮下(SubQ)脂肪サンプル(1 cc未満)を採取し、滅菌塩水中ですすぎ、ブロットし、液体窒素中で急速凍結した。以下の患者を含むものであった：患者2、過体重性糖尿病性Hispanic、インスリン非依存性；患者7-9、肥満性非糖尿病性Caucasian、30を超える肥満度指数(BMI)を伴う；患者10、過体重性糖尿病性Hispanic、インスリン依存性；患者11、過体重性非糖尿病性African American；および患者12、糖尿病性Hispanic、インスリン依存性。
【０７３７】
分化型脂肪細胞は、誘導性ドナー前駆細胞(Clonetics, Walkersville, MD)から入手した。分化型ヒト間葉系幹細胞(HuMSC)はMark F. Pittenger, et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cell Science Apr 2 1999: 143-147に記載される通り調製した。トリゾールライセートまたは凍結ペレットからmRNAを単離し、sscDNAを作成した。以下のヒト株化細胞(ATCC, NCIまたはGerman tumor cell bank)を含むものであった：腎臓近位曲尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓HepG2癌細胞、心臓一次間質細胞および副腎皮質腺腫細胞。標準的手順を用いて細胞を培養し、RNA抽出し、そしてsscDNAを作成した。
【０７３８】
パネル5Iはまた、膵島(Diabetes Research Institute at the University of Miami School of Medicine)を含有する。
【０７３９】
ヒト代謝系RTQ-PCRパネル
ヒト代謝系RTQ-PCRパネルは、2コントロール(ゲノムDNAコントロールおよび化学コントロール)および、代謝疾患に関連するヒト組織および株化細胞から単離された211 cDNAを含むものであった。このパネルは、肥満症および／または糖尿病の病因および病原性に役割を果たす遺伝子を同定する。妊娠糖尿病研究(上記)から、胎盤(Pl)、子宮壁平滑筋(Ut)、内臓脂肪、骨格筋(Sk)および皮下(SubQ)脂肪を含む代謝組織を得た。このパネルには：患者7および8、肥満性非糖尿病性Caucasian；患者12、糖尿病性Caucasian、BMIは未知、インスリン依存性(処置)；患者13、過体重性糖尿病性Caucasian、インスリン非依存性(無処置)；患者15、肥満性、無処置、糖尿病性Caucasian；患者17および25、無処置糖尿病性Caucasian、正常体重性；患者18、肥満性、無処置、糖尿病性Hispanic；患者19、非糖尿病性Caucasian、正常体重性；患者20、過体重性、処置糖尿病性Caucasian；患者21および23、過体重性非糖尿病性Caucasian；患者22、処置糖尿病性Caucasian、正常体重性；患者23、過体重性非糖尿病性Caucasian；および患者26および27、肥満性、処置、糖尿病性Caucasianが含まれる。
【０７４０】
以下を含む代謝組織からトータルRNAを単離した：視床下部、肝臓、膵臓、膵島、小腸、腰筋、横隔膜筋、内臓(Vis)脂肪、皮下(SubQ)脂肪および大網(Go)、剖検時12 II型糖尿病(Diab)患者および12非糖尿病性被験者(Norm)由来。コントロール糖尿病性および非糖尿病性被験者は、可能であれば、以下の点に関して同等であった：年齢；性別、雄性(M)；雌性(F)；民族性、Caucasian (CC)；Hispanic (HI)；African American (AA)；Asian(AS)；およびBMI、20-25 (Low BM)、26-30 (Med BM)または過体重性(Overwt)、30を超えるBMI (Hi BMI) (肥満性(obese))。
【０７４１】
標準的方法を用いて、株化細胞(ATCC)からRNAを抽出し、ss cDNAを作成した。
【０７４２】
CNSパネル
CNSパネルCNSD.01、CNS神経変性V1.0およびCNS神経変性V2.0は、2コントロールおよび、死後ヒト脳組織から単離された46〜94試験用cDNAサンプル
を含むものであった。この脳組織はthe Harvard Brain Tissue Resource Center (McLean Hospital)から入手した。死後4〜24時間の範囲の間にドナーの頭蓋冠から脳を取り出し、液体窒素蒸気中-80℃で凍結した。
【０７４３】
パネルCNSD.01
パネルCNSD.01は：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病(Huntington's disease)、進行性核上性麻痺(Progressive Supernuclear Palsy) (PSP)、うつ病および正常コントロール由来各2検体を含むものであった。以下を含む組織を採取した：帯状回(Cing Gyr)、側頭極(Temp Pole)、淡蒼球(globus palladus) (Glob palladus)、黒質(Sub Nigra)、一次運動野(primary motor strip) (ブロードマン4野(Brodman Area 4))、頭頂野(ブロードマン7野)、前頭前野(ブロードマン9野)、および後頭野(ブロードマン17野)。いかなる場合でもすべての脳領域の典型が示されるわけではない。
【０７４４】
パネルCNS神経変性V1.0
CNS神経変性V1.0パネルは：6アルツハイマー病(AD)脳および8正常脳を含むものであった。これは、痴呆症がなく、かつアルツハイマー様病状がない(コントロール)か、あるいは痴呆症はないが、重篤なアルツハイマー様病状を明示する(コントロール病理)脳を含み、重篤なアルツハイマー様病状とは特に、以下の0-3段階の評価でレベル3と評価される老人斑の沈着であった；0では斑の症状がなく、3では重度のAD老人斑沈着が観察される。以下を含む組織を採取した：海馬、側頭野(ブロードマン21野)、頭頂野(ブロードマン7野)、後頭野(ブロードマン17野)、上側頭野(Sup Temproal Ctx)および下側頭野(Inf Temproal Ctx)。
【０７４５】
遺伝子発現は、総平均(全実行中のすべてのウェルに関する平均CT値)からウェル平均(特定組織に関するCT平均)を減算して算出したスケーリング因子を用いて標準化した後に解析した。スケーリング後CT値は生CT値+スケーリング因子の解である。
【０７４６】
パネルCNS神経変性V2.0
CNS神経変性V2.0パネルは、16事例のアルツハイマー病(AD)および29正常コントロール(死亡前に痴呆症の症状なし)を含むものであった。これは、痴呆症がなく、かつアルツハイマー様病状がない14コントロール(対照)および、痴呆症はないが、重篤なアルツハイマー様病状を明示する15コントロール(AH3)を含み、重篤なアルツハイマー様病状とは特に、以下の0-3段階の評価でレベル3と評価される老人斑の沈着であった；0では斑の症状がなく、3では重度のAD老人斑沈着が観察される。側頭野(ブロードマン21野)由来の組織は、既定の個体からプールされた下および上側頭野を含むものであった(Inf & Sup Temp Ctx Pool)。
【０７４７】
実施例Q10. PathCalling (登録商標)技術
NOVXの配列は、cDNAライブラリーを実験室レベルでスクリーニングすることによって得た。このスクリーニングはtwo-hybridアプローチによって行った。完全長のDNA配列、またはその配列の部分のいずれか、または両者、を含むcDNA断片群をシークエンシングした。CuraGen Corporationの私有配列データベースまたは公共ヒト配列データベース中で入手可能な配列に基づいてin silico予測を行い、完全長DNA配列、またはそのいずれかの部分を得た。
【０７４８】
実験室レベルでのスクリーニングは、以下の方法を用いて行った。cDNAライブラリーは、種々のドナー由来の、多数の組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、および発生状態の典型を示す種々のヒトサンプルに由来するものであった。サンプルは、全組織、一次細胞または組織培養一次細胞または株化細胞として入手した。細胞および株化細胞は、遺伝子発現を制御する生物学的物質または化学物質、例えば、成長因子、ケモカインまたはステロイドで処理されていて構わない。その後、このようにして得られたcDNAを適切なtwo-hybridベクター内へ方向性を有してクローニングした(Gal4-活性化ドメイン(Gal4-AD)融合物)。次いでこのcDNAライブラリーならびにClontech (Palo Alto, CA)から市販されているcDNAライブラリーをE.coliからCuraGen Corporationが独自に開発した酵母株にトランスファーした(この酵母株は米国特許第6,057,101号および第6,083,693号に開示されており、これらの文献は引用によりその開示内容全体が本明細書中に包含される)。
【０７４９】
CuraGen Corportion私有ヒト配列ライブラリーのGal4結合ドメイン(Gal4-BD)融合物を用いて、多数のGal4-AD融合cDNAライブラリーをスクリーニングし、酵母ハイブリッド二倍体を選択した。この各二倍体中では、Gal4-AD融合物は個別のcDNAを含有する。cDNA挿入境界位置の非特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて各サンプルを増幅した。このPCR産物をシークエンシングした；配列トレースは手作業で評価し、適切であれば編集して修正した。すべてのサンプル由来のcDNA配列を共にアセンブリし、これは公的ヒト配列を含むこともある。このアセンブリでは、バイオインフォマティクスプログラムを用いて各アセンブリに関するコンセンサス配列を作成した。各アセンブリはCuraGen Corporationのデータベースに加えられている。配列は、別のコンポーネントと同一性の程度が50 bpにわたって少なくとも95%であった場合に、アセンブリ用のコンポーネントとして加えた。各アセンブリは、遺伝子またはその部分の典型を示し、そして変異体、例えばスプライシング型一塩基多型(SNP)、挿入、欠失および他の配列バリエーションに関する情報を含む。
【０７５０】
物理的クローン：スクリーニング手順によって得られた、オープンリーディングフレーム全体を含むcDNA断片を、組換えDNAとして、pACT2プラスミド(Clontech)内へクローニングする。このプラスミドはcDNAライブラリーの作成に使用する。この組換えプラスミドを宿主内へ挿入し、スクリーニング手順中に生じた酵母ハイブリッド二倍体によって選択する。このスクリーニングはCuraGen Corporationが独自に開発した酵母株N106'およびYULH(米国特許第6,057,101号および第6,083,693号)の両者を接合することによって行う。
【０７５１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、上記説明は例証を意図するものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲によって規定される。他の側面、利点および修飾は特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０７５２】
【図１】図１は、ペントースリン酸経路の非酸化段階の概略図であり、経路におけるトランスケトラーゼの機能を示す。
【図２】図２は、過剰なクエン酸生成中のＳＲＥＢＰ調節遺伝子の役割を示す概略図である。
【図３】図３は、肥満および／または糖尿病の病因および病原性に関連する代表的な経路を示す概略図である。
【図４】図４は、ピルビン酸合成経路の概略図である。
【図１】
2006511237.tif 000293
【図２】
2006511237.tif 000294
【図３】
2006511237.tif 000295
【図４】
2006511237.tif 000296
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月6日(2005.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006511237000001.app
【国際調査報告】
2006511237.tif 000297
2006511237.tif 000298
2006511237.tif 000299