(57)【要約】本発明は、生物試料中、微生物、例えば、C型肝炎ウィルスが介在した感染症を、当該微生物及び当該抗原に対して向けられた抗体を同時検出することによって、in vitro検出ための方法、並びに当該方法を行うための試薬及びキットに関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料において、微生物による感染症をin vitroで検出するための方法であって、ここで当該方法は、当該生物試料中に存在する、当該微生物の少なくとも１つの抗原及び当該微生物に対して向けられた抗体を同時検出することを含んで成り、当該方法は：
a)当該生物試料を、当該微生物に対して向けられた捕獲抗体、及び当該微生物に由来する捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)形成された当該抗原−抗体複合体を露出させ、それは任意に、捕獲されている前記微生物の抗原、に対して結合できる標識された検出抗体及び／又は任意に、捕獲されている前記微生物に対して向けられた抗体、に対して結合できる標識された検出抗原をも使用する、
ことを含んで成り；
そして、ここで前記微生物の当該捕獲抗原及び／又は当該標識された検出抗原は、当該微生物の、少なくとも１つのエピトープが無効にされている抗原性断片を含んで成り；
そして、当該捕獲及び／又は検出抗体が、捕獲されている前記抗原の完全であるエピトープ認識する、
方法。
【請求項２】
前記微生物が、ウィルス、細菌及び寄生微生物からなる群から選択されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、C型肝炎ウィルス（HCV）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記捕獲抗原が、HCVのカプシドタンパク質の抗原性断片を含んで成り、ここで少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記捕獲抗原が、HCVの非構造性タンパク質NS3又はNS4の抗原性断片を含んで成る、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物がヒト免疫欠損ウィルス（HIV）である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記HIVがHIV-1及び／又はHIV-2である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記捕獲抗原が、HIVのgagタンパク質の抗原性断片を含んで成り、ここで少なくとも１つのエピトープが無効にされている、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記捕獲抗原がHIVのエンベロープタンパク質の抗原性断片を含んで成る、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記捕獲抗原が無効にしてある少なくとも２つの異なるエピトープ部位を含む、請求項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記捕獲抗原が、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失又は挿入によって無効にしたエピトープ部位を含む、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原を固相上に固定化している、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出抗体を前記混合物に対して、抗原−抗体複合体を形成させた後に加えている、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出抗体及び／又は検出抗原を、前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原と同時に生物試料に対して接触せしめている、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
a)前記生物試料を、固相に対して結合させたHCV捕獲抗体及びHCV捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)固相と液相を分離し；
d)当該固相を、第１番目に、捕獲されているHIV抗原を結合できる標識された検出抗体に、そして第２番目に、捕獲されている抗HIV抗体を結合できる、標識された抗免疫グロブリンもしくは抗イソ型抗体、もしくは標識された検出抗原に接触せしめる、
ことを含んで成り、そして、
前記抗HCV抗体を捕獲するための抗原及び検出するための抗原は、２つのエピトープが無効にされている、HCVのカプシドタンパク質の抗原性断片を含んで成り、
そして前記捕獲及び検出抗体は、当該捕獲されているカプシド抗原の、完全である、前記エピトープの１つ、を各々が認識する、
請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記捕獲抗体及び検出抗体が各々、以下の配列：44LGVR47（配列番号１９）、30IVGGVYL36（配列番号２０）及び29QIVGGV34（配列番号２１）を有するエピトープの群から選択されたエピトープを認識する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
a)前記試料を、固相に対して結合させたHIV捕獲抗体及びHIV捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)固相と液相を分離し；
d)当該固相を、捕獲されているHIV抗原を結合できる標識された検出抗体と、そして捕獲されている抗HIV抗体を結合できる、１又は複数の標識された抗免疫グロブリンもしくは抗イソ型抗体と接触せしめる、
ことを含んで成り、そして、
前記抗HIV抗体を捕獲するための抗原は、少なくともエピトープが無効にされている、HIVのgagタンパク質の抗原性断片を含んで成り、
そして前記捕獲及び検出抗体は、当該捕獲されているカプシド抗原の、完全である、前記エピトープの１つ、を各々が認識する、
請求項６又は７に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記捕獲抗体及び検出抗体が各々、配列QASQEVKNWMTETLL（配列番号２４）のエピトープを認識する、請求項１９に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料を、固相に対して結合させた前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原に対して、少なくとも１種の非イオン型のデタージェントの存在下で接触せしめる、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記非イオン性デタージェントがNP40である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物試料において、微生物による感染症を検出するために使用するキットであって：
−微生物のタンパク質の抗原性断片を含んで成る捕獲又は検出抗原であって、当該断片は、少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある、微生物に対して向けられた抗体に対して結合する能力を保存している、捕獲又は検出抗原；
−前記微生物のタンパク質の、完全である、前記エピトープに対して向けられた抗体、
を含んで成るキット。
【請求項２２】
前記微生物がC型肝炎ウィルス（HCV）である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記抗体が、前記生物試料中に存在するHCV抗原を捕獲するための抗体である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記抗体が、以下の配列：44LGVR47（配列番号１９）、30IVGGVYL36（配列番号２０）、29QIVGGV34（配列番号２１）を有するエピトープの群から選択されたエピトープを認識する、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記微生物がヒト免疫欠損ウィルス（HIV）である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】
前記HIVがHIV-1及び／又はHIV-2である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記抗体が前記生物試料中に存在するHIV抗原を捕獲するための抗体である、請求項２５又は２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記抗体が、配列QASQEVKNWMTETLL（配列番号２４）のエピトープを認識する、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
前記捕獲抗原に加えて、前記生物試料中に存在する前記抗HCV抗体を検出しそして前記捕獲抗原と複合体を形成させる手段をも含んで成る、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
前記捕獲抗原に加えて、前記生物試料中に存在する前記抗HIV抗体を検出しそして前記捕獲抗原と複合体を形成する手段をも含んで成る、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
前記検出の手段が、標識された抗免疫グロブリン又は抗イソ型抗体である、請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原が固相上に固定化された形態で存在する、請求項２３、２４、２９又は３１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３３】
a)HCVタンパク質の抗原性断片を含んで成る捕獲抗原であって、当該断片が少なくとも２つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に、前記生物試料中に存在する可能性がある抗HCV抗体に対して結合する能力を保存している、捕獲抗原；
b)前記HCVタンパク質の完全であるエピトープの１つ対して向けられた捕獲抗体；を含んで成り；
前記捕獲抗原及び前記捕獲抗体は固相上に固定化されており；そして
c1)HCVタンパク質の完全である他のエピトープの対して向けられた標識された検出抗体；及び／又は
c2)任意に、HCVのタンパク質の抗原性断片である標識された検出抗原であって、当該断片は少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも当該同時に、当該生物試料中に存在する可能性がある抗HCV抗体に対して結合する能力を保存している、検出抗原、
を含んで成る、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記標識された検出抗原は、HCVのカプシドタンパク質の断片であり、ここでこの断片の少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされている、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記捕獲抗原が、少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされている断片HCVのカプシドタンパク質の断片を含んで成り、そして前記抗体が、当該カプシドタンパク質の完全であるエピトープ部位を認識する、請求項２２〜２４、２９又は３１〜３３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
a)HIVのタンパク質の抗原性断片を含んで成る捕獲抗原であって、当該断片が少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に、前記生物試料中に存在する可能性がある抗HIV抗体に対して結合する能力を保存している捕獲抗原；
b)前記HIVタンパク質の完全であるエピトープの１つ対して向けられた捕獲抗体；を含んで成り；
前記捕獲抗原及び前記捕獲抗体は固相上に固定化されており；
c1)HIVタンパク質の完全である他のエピトープの対して向けられた標識された検出抗体；
c2)及び／又は任意に、HIVタンパク質の抗原性断片である標識された検出抗原であって、当該断片が少なくとも１つの無効されたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある抗HIV抗体に対して結合する能力を保存している、標識された検出抗原、
を含んで成る、請求項３１に記載のキット。
【請求項３７】
前記捕獲抗原が、HIVのgagタンパク質の抗原性断片を含んで成り、ここで少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされている、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記捕獲抗原が、HIVのgagタンパク質の断片を含んで成り、ここで当該断片の少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされており、そして前記抗体が、当該gagタンパク質の完全であるエピトープ部位を認識する、請求項２５〜２８、３０〜３２又は３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
非イオン型のデタージェントを少なくとも１種含んで成る、請求項２３〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
前記非イオン型のデタージェントがNP40である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
HCVのカプシドタンパク質に由来するペプチド又はポリペプチドであって、少なくとも１つの完全なエピトープ部位及び少なくとも１つの無効にされたエピトープ部位を維持し、従って、当該無効にされたエピトープ部位は抗カプシド抗体によって認識不能にされている、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号４〜１８のいずれか１つの配列を含んで成る、請求項４１に記載のペプチド又はポリペプチド。
【請求項４３】
HIVのgagタンパク質に由来するペプチド又はポリペプチドであって、少なくとも１つの完全なエピトープ部位及び少なくとも１つの無効にされたエピトープ部位を維持し、従って、当該無効にされたエピトープ部位は抗gagタンパク質抗体によって認識不能にされている、ペプチド又はポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号２２の配列を含んで成る、請求項４３に記載のペプチド又はポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染体の、特にウィルス、微生物による感染症のin vitro検出に関連し、詳細には、C型肝炎ウィルス（HCV）による感染症のin vitro検出に関連する。更に正確には、本発明は、感染体の、特にウィルス、微生物の抗原、及び当該感染性微生物に対して向けられた抗体を同時検出するための方法に関連し、並びにそれを行うための試薬とキットにも関連する。更に詳細には、本発明は、HCV抗原及び抗HCV抗体を同時に検出するための方法に関連し、そしてそれを行うための試薬とキットに関連する。
【背景技術】
【０００２】
最初は非A、非B型肝炎に言及された肝炎の形態である、C型肝炎ウィルスによる感染症は、長期に渡り、特に輸血において、確認されてきた関心事となる健康問題であった。
【０００３】
1989年5月31日に刊行された特許出願EP318 261には、ヒトのC型肝炎の原因となる、HCVとよばれる、ウィルスのcDNAの断片のクローニングが記載されている。それにはまた、前記ウィルスの非構造性タンパク質（NS1〜NS5）をコードする5つの遺伝子の配列（HCVの総ゲノムのおよそ78％）、C100-3抗原（NS3-NS4領域の363アミノ酸を含み、そしてスーパーオキシドジスムターゼに対して融合する）が記載されており、そして当該C100-3抗原を使用して抗HCV抗体を検出する方法も記載されている。抗HCV抗体を検出するためのこの「第一生成」方法は、とりわけ、HCVが、現在は世界中でC型肝炎とよばれている非A、非B型肝炎の主たる原因であることを確証可能にする。しかしこの方法では、ウィルスに感染した血清の検出を７０〜８０％超可能にはしない。このような感度の欠如によりいずれの感染症の早期検出が可能にならない。
【０００４】
Okamotoら（1990a）及び1990年9月19日に刊行された特許出願は、HCVウィルスのゲノムの５’末端の配列を記載しており、それは即ち、C型肝炎の原因となるウィルスの構造タンパク質（カプシド、マトリクス、エンベロープ）をコードする遺伝子の配列である。
【０００５】
Okamotoら（1990b）は、抗HCV抗体のERISAによる検出のための標的としてHCVカプシドのアミノ酸39〜74の配列の使用を公にしている。
【０００６】
Hoseinらの記事（1991）には、構造性（カプシド：領域AA1〜120における）及び非構造性（NS3〜NS4：領域AA1200〜1800における）合成ペプチド抗原の使用に基づいて、抗HCV抗体を検出するための免疫アッセイが記載されている。それは、抗HCV抗体の検出における合成ペプチドの利点、及び構造性及び非構造性抗原の組み合わせの利点：組み合わせにより感度が高まりそして早期検出が可能になる、ことを実証している。ここに記載されたアッセイにより、抗体を４〜１０週、より早期に検出することが可能になる。記事は、AIDSウィルスなどの場合のような、主要な免疫優先性エピトープがないことをも示す。
【０００７】
Nasoffら（1991）は、カプシドの最も優先的な免疫反応性エピトープはN末端領域（AA1〜40）に位置しており、そしてこれらのエピトープに対して向けられた抗体は、感染後間もなく出現することに気付いた。
【０００８】
抗HCV抗体を検出するための「第二生成」アッセイ（即ち、構造性及び非構造性キャプチャー抗原の同時使用に基づく）は、前記第一生成アッセイに対して有意な進展を構築する。しかし、それらは依然として感度を欠き：特にHCVで汚染された患者から採取した血清のせいぜい９５〜９８％を検出する。結果として、この検出は依然として十分に速くはなく且つ輸血において感染血液が気付かれぬまま通過することに寄与する。実際に、輸血後のリスクを減らすため、抗体が出現する前にウィルス自身を検出することが必須であり、そして汚染後にはできる限り速く検出することが必須である。このような汚染とセロコンバージョン（即ち、抗体の出現）との間の時間は、「血清学的な空白時間」に言及されている。
【０００９】
様々なチーム（Garsonら（1991）；Shiehら（1991））が、上記方法の感度及び速さの問題を解決するために、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）によってウィルスRNAの検出をすることを提案してきた。実際にこの方法により、HCVによる感染を非常に高感度且つ速く、即ち、ウィルスに対して曝露したわずか数日後、即ち、抗ウィルス抗体の循環が増加する４〜８日前に、検出が可能になる。それは現在、生物流体中でウィルスを検出するために参照となる方法を構成する。
【００１０】
しかし、前記HCVに対して適用されたPCR法は様々な問題に直面するようになった。第一に、それは、RNAを抽出、精製そしてRNAをcDNAへ逆転写する予備段階を行うことを伴い、そしてウィルス物質の部分がこれら予備段階過程で失われる。第二に、それには特異的且つ高価な増幅装置が必要となる。加えて、それは、多数の試料を同時に処理することが不可能であり且つ往々にして汚染が生じる。
【００１１】
HCVによる感染の早期検出を目的とする他の方法は、循環するウィルス抗原（カプシド）を検出することからなる。この抗原は、血清抗HCV抗体の出現の数週間前に現れる。Takahasiら（1992）は、抗体のペアを使用してカプシド抗原を検出するELISA技術を記載している。
【００１２】
しかし、この抗原の検出は多くの場合設定が困難で、その理由は、血液中の検出可能抗原の低力価及び入手可能な免疫試薬の質にある。
【００１３】
Hajime Tokitaら（2000）らは、非常に高い検出感度を与える、「Immuchek F HCV Ag Core Kokusai」として市販されている、モノクローナル抗体のペア（5F11及び5E3）を使用するサンドウィッチ型の免疫アッセイを記載する。この記事の著者は、カプシドタンパク質における突然変異、Thr49Proがアッセイの感度を下げることを強調する。そしてまたカプシド抗原の早期段階での検出を求め、Petersonら（2000）が、試料の前処理を伴なわず、HCVのカプシド抗原を検出するための抗カプシドモノクローナル抗体を使用するERISA技術を開示する。この記事は、三つの独立するアッセイ（PCRによるHCV RNAの検出、及び抗HCV抗体の検出及びELISAによるカプシド抗原の検出）を比較することによって、循環するカプシド抗原が、感染の早期血清反応陰性期の間（即ち、RNAの検出のおよそ１日後）に採取した血液バッグ中で有用に検出されうることを示す。
【００１４】
感染症の期間全体を通してのセロコンバージョンの続く抗体反応の検出の可能性と組み合わさったC型肝炎ウィルスによる感染症の検出の早さは、現在の目標、最も詳細には輸血における目的を維持する。
【００１５】
最初に、血清学的空白時間の期間中のHCV抗原、次いでセロコンバージョン後の患者の血清学的展開を検出するために簡単に実行でき且つマススクリーングの観点から自動化されて良いシンプル、感受性、特異的、再現的で、安価な方法の観点から、抗HCV抗体の検出とHCV抗原の検出を組み合わせることが最も望ましい。
【００１６】
しかし、このことはHCV抗原をアッセイすることに関する干渉の主要な問題；血清中に存在する抗HCV抗体と標識した抗HCV抗体との間での干渉、を有する。従って、ある抗体を検出する目的のために、標的抗原（抗原の同時サンドイッチ検出のために使用される標識された１又は複数の抗体によって認識される抗原と同じエピトープを有するだろう）を固相へ導入することは、固相に対して修復不可能なまで標識された１又は複数の抗体が結合することにつながり、それにより陽性反応を欠くアッセイになる。
【００１７】
このことは、同じ固相上で、抗HCVカプシド抗体及びHCVカプシド抗原を同時に検出するためのシステムに特に当てはまる。従って、抗カプシド抗体を検出する目的で、カプシド抗原（カプシド抗原を検出する目的のために使用される標識された１又は複数の抗HCVカプシド抗体によって認識される抗原と同じエピトープを有するだろうカプシド抗原）を固相へ導入することは、固相に対して標識された１又は複数の抗体が結合することにつながり、それにより陽性反応を欠くアッセイになる。
【００１８】
このような干渉のリスクを回避するために、Chiron.Corpらは、カプシド抗原及び患者の抗NS3／NS4抗体のみを検出するアッセイを行った。このことに関して、Chironは、第１番目に、固相に対して結合させたNS3／4a抗原を使用し、試験される試料の抗HCV抗体を捕獲し、そして第２番目に、結合した抗HCVカプシド抗体（c11-3及びc11-7）を捕獲した。捕獲された抗体を、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体の存在下でSOD（スーパーオキシドジスムターゼ）と融合させた抗原を使用して検出し、しかも、捕獲された抗原をペルオキシダーゼで標識された他のモノクローナル抗体（VII European Congress of the International Society of blood Transfusion−Paris, July 15〜18、2001）を使用して検出した。
【００１９】
干渉問題に直面して、出願EP1020727（Advanced Life Science Institute）は、HCVカプシド抗原と抗HCVカプシド抗体を同時に測定するための方法（"コンボ"型アッセイ）を供し、ここで抗原は、抗カプシド抗体を捕獲及び発見又は検出するために同時に使用されるカプシドエピトープとは異なるカプシドエピトープに対して向けられた抗体によって捕獲及び標識されている。サンドイッチによって抗原を検出するため及び間接アッセイによって抗体を検出するための同時アッセイにおける代表的な例が与えられており、用途は、HCVカプシドのアミノ酸（AA）100〜アミノ酸130の配列のエピトープに対して向けられた第一抗体（捕獲抗体）、及び配列AA40〜50のエピトープに対して向けられた第二抗体（検出抗体）の抗原を検出するために作られており、当該抗体を検出するために、使用される捕獲抗原は、それ自身、配列AA1〜42及びAA66〜80を含む。
【００２０】
しかしながら、この方法は欠点がないわけではなく、詳細には、それが、比較的互いに離れているエピトープであり、そして実際には、マイナーな、比較的免疫原性がないエピトープに対して向けられた抗体の使用を必要とする。それはまた、配列A43〜65の不在により、この最後の配列に対して向けられた抗体を検出せず、それ故感度を欠くという欠点をも有する。
【００２１】
加えて、それはカプシド抗原を捕獲し、そして本発明とは異なり、明らかに異なる、即ち、重なり合っていないカプシドタンパク質の２つの領域（抗体を検出するためにAA1〜42及びAA66〜80並びに抗原を検出するためにAA100〜130）を介して抗カプシド抗体を捕獲する。
【００２２】
特許出願WO01／96875 A2（Chiron）は、とりわけて、デタージェントとしてN−ラウリルサルコジニンを使用する、カプシド及び抗NS3及び抗NS4抗体を同時に検出する方法（「不完全コンボ」、図２）を記載する。他方、それは、図8及び33ページで非常にまとめて、「完全コンボ」アッセイ、即ち、カプシド抗原（サンドイッチによって）と抗HCVカプシド及び抗HCV非構造性タンパク質抗体（二重抗原サンドイッチによって）を同時に検出するためのアッセイを記載する。抗原を捕獲するために、HCVカプシドの巨大N末端部分（AA10〜53）を認識することが知られている、２つの抗体、c11-3及びc11-7を使用し、そして検出するために、HCVカプシドのC末端部分（AA120〜130）を認識することが知られている第三の抗体、c11-14を使用している。抗体を検出するために、使用された捕獲抗原は、複数のエピトープを有する融合抗原（「MEFA12」、出願WO01／96875の表２を参照のこと）であり、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）との融合として、NS3、NS4及びNS5抗原及び数個のHCV系統：突然変異体R47L、AA64〜68及びAA67〜84を担持するAA9〜53の一連のカプシド配列を含む。配列AA54〜63及びAA54〜66はこれら２つの一連の配列に欠ける。
【００２３】
しかし、特許出願WO01／96875A2の「完全コンボ」アッセイの実施は記載されていない。従って、当業者が、図８のコンボアッセイは、提起された問題を満足する、即ち、HCVによる感染をできる限り速く検出するために機能するかどうかを明らか且つ疑いなく確認することは不可能である。いずれにせよ、最良の場合のシナリオにおいても、特許出願WO01／96875A2のコンボは、ミッシング配列AA54〜63及びAA54〜56に対して向けられた全抗体の検出を必然的に失うだろう。感度の損失のリスクが結果として生じるだろう。
【００２４】
特許出願EP1251353A2（Ortho−Clinical Diagnostics）は、カプシドを検出するために同じ抗体を使用する「完全コンボ」アッセイを記載する。しかし、それらの起源又はそれらのエピトープ特異性を特定してはいない。加えて、使用されるデタージェントがBRIJ又はMYRJ型に特定されており、それは見掛け上、Ortho Clinical Diagnosticsによって市販されているカプシド抗原検出キット（例３を参照のこと）のN−ラウリルサルコシンが好適である。抗カプシド抗体は、改変（突然変異誘発によって）されているカプシド抗原：C22KSN▽47、48（アミノ酸47及び48を欠いたカプシド配列AA10〜99を含んで成る、SODとの融合によるタンパク質）又はC22KSR47L（47位でアルギニンをロイシンに置換した、カプシド配列AA10〜99を含んで成る、SODとの融合によるタンパク質）を使用することで検出されている。
【００２５】
特許出願WO03／002749A2（Abbott）はHCVカプシド抗原を検出するための多くの抗原及びアッセイを記載している。「リアルコンボ」に言及される「完全コンボ」アッセイ（図１及び59ページ）のみが、抗カプシド抗体を検出するために、固相中に固定化された、カプシドのアミノ酸１１〜２８に対応するビオチニル化されたペプチドを利用する。カプシドを検出するために、固相におけるAdvanced Life Science Institute t C11〜14（カプシド配列AA45〜50を認識する）の抗体とアクリジンで標識されたC11〜10（カプシド配列AA32〜36を認識する）の組み合わせを使用する。従って、出願WO03／002749A2は、本発明とは異なり、カプシド抗原の捕獲及び抗カプシド抗体の２つの明らかに異なる、即ち、重なり合っていないカプシドサイト（抗体を検出するためにAA11〜28及び抗原を検出するためにAA45〜50）を介する捕獲を行う。
【００２６】
本発明者は、従って、提起された問題を解決するために、代替方法を開発することに尽力した。
【００２７】
HCV抗原及びこの抗原に対して向けられた患者の抗体を同時に検出するための方法は、干渉の問題を回避し、且つPCRに近い検出感度のレベル及び早期の検出を達成し、しかも同時に、患者のセロコンバージョン後の血清学的な展開を追跡可能とすることが発見されている。
【００２８】
本発明者は、この問題を、人工的に異なる抗体を捕獲するために使用される標的抗原の所定のエピトープを構造的修飾することよってよって解決する。このようにして修飾されたエピトープは、次いで無効される。同時に、抗原を捕獲及び／又は検出するために使用される抗体は、それら自身、患者の抗原上に存在する未修飾エピトープを正確に認識するように選択され、従って、それらはもはやこれら同じエピトープを示さない修飾された抗原に対しては結合できない。エピトープはもはや同一ではないので、HCV抗原を捕獲及び／又は検出するために使用された抗体と患者の抗体との間で何ら競合がない。従来技術の所定の数の技術とは対照的に、カプシド抗原の捕獲及び抗カプシド抗体の捕獲はカプシドの単一且つ同じタンパク質領域で生じ、後にあるように、そして所定数の抗カプシド抗体の検出ロスを回避するだろう。
【００２９】
複数のエピトープがカプシドのN末端部分で同定されているので、このタンパク質領域は、カプシド抗原の、そして抗カプシド抗体の両方の非常に高感度な検出を達成するために最も適している。
【００３０】
本発明によって、抗体及び抗原、最も免疫反応性の配列を同時に検出することが可能であり、従って、検出の感度を高めることが可能である。
【００３１】
いうまでもないが、本発明は、C型肝炎ウィルス（HCV）による感染症を検出することのみには限定されない。それはまた、以下に記載したように、任意の感染性微生物（例えば、ウィルスのA、B、C、D又はE型の様々な型の肝炎の原因のウィルス、レトロウィルス、特にヒトのエイズ（HIV-1、HIV-1グループO、HIV-2）又はサルのエイズの原因のレトロウィルス、サイトメガロウィルス（CMV）、フラビウィルス、例えば、デングウィルス、及び細菌、微生物、寄生微生物など）が理由の感染症を検出、及び／又は感染症のモニタリングする方法、試薬及びキットの一般化をすることも包含し、抗原及び抗体の検出を刺激することが所望されている。本明細書中、C型肝炎ウィルス（HCV）について更に詳細に記載された発明は、非常に当業者が容易に理解できる一般的な範囲内である。
【００３２】
定義
用語「C型肝炎ウィルス」又は「HCV」とは、本明細書中、C型肝炎の原因となるウィルスの全ての系統及び全てのタイプ、サブタイプ及びジェノタイプを意味する。本発明の方法は、実際に、その起源及びそのジェノタイプが何であれ、HCVによる全ての感染症を検出することを目的とする。これは特に、ヨーロッパ、米国、及び日本で循環するウィルスの周知のタイプ及びサブタイプ（即ち、６つの主要なジェノタイプ：１，２、３、４、５、及び６並びにそれらのサブタイプ１a、1b、3aなど）を含んで成る。Stuyverら（1994）；Bukh（1995）を参照のこと。
【００３３】
用語「ヒト免疫欠損ウィルス」又は「HIV」とは、ヒトのAIDSの原因となるレトロウィルスの全ての系統及び全てのタイプ、サブタイプ、集団及びジェノタイプを意味する。用語HIVとは詳細にHIV-1（HIV-1グループM、HIV-1グループO）、及びHIV-2及びそれらの変異体を意味する。
【００３４】
本発明の背景において、「生物試料」は、好適に生物流体、例えば、血液、血しょう、血清、尿、脳脊髄流体、唾液などからなる。
【００３５】
用語「抗体」とは、任意の全抗体又は抗体が抗原性化合物の少なくとも１つの抗原決定基に対して結合することを可能にする少なくとも１つの抗原性組み合わせ部位を含んで成るかあるいはそれらからなる抗体の機能的断片を意味する。例えば、抗体断片としては、Fab、Fab’、及びF（ab’）2断片及びscFv（単鎖可変断片）鎖、dsFv（二重鎖可変断片）鎖などを述べることができる。これらの機能的断片は特に遺伝子操作によって獲得できうる。
【００３６】
本発明の背景において使用されるモノクローナル抗体又はモノ特異的ポリクローナル血清の生産物は、常用の技術の結果物であり、その詳細はあとに与えられている。
【００３７】
用語「捕獲抗体」とは、抗体、又は抗体の部分を意味し、好適には、固相に対して結合させられており、生物試料中に存在する微生物の抗原、例えば、HCV又はHIVの抗原を親和性結合によって維持することができる。
【００３８】
生物試料中の抗体及び抗原の存在は、「検出手段」によって明らかになる。抗原の検出に関して、本発明は、詳細に少なくとも１つの「検出抗体」を使用する検出を供する。標識されている検出抗体は、捕獲抗体によって認識されるのとは異なるエピトープ部位を認識すること又はカプシド中にリピートモチーフが存在する理由で同一である部位を認識することにより、親和性結合することによって、捕獲された抗原に対して結合できる。抗体の検出に関して、使用は、特に標識された抗免疫グロブリン又は抗イソタイプ抗体、例えば、抗免疫グロブリンGからなる。
【００３９】
用語「標識」とは、直接標識化（酵素、放射性同位体、蛍光色素、発光化合物などを介する）及び間接標識（例えば、直接標識された抗体又は標識された「親和性ペア」、例えば、限定はされないが標識されたアビジン−ビオチンなどからなる試薬を使用することで）の両方を意味する。
【００４０】
用語「抗原断片」とは、感染した患者中又は免疫化された動物中で、抗体合成を誘導できる、感染性微生物の例えば、C型肝炎ウィルス又はHIVの天然又は組み換えタンパク質の全部又は一部を意味する。それは、詳細に、カプシドタンパク質の全部もしくは一部、又はHCVの非構造性タンパク質、特にNS3及びNS4の全部もしくは一部を意味し、それらが遺伝子操作によって獲得されるかあるいは獲得されないにかかわらない。それはまた、HIVのgag遺伝子によってコードされるタンパク質、詳細には、P25（HIV-1）又はP26（HIV-2）の全部もしくは一部、又はエンベロープ遺伝子によってコードされるタンパク質、詳細にはgp41（HIV-1）もしくはgp36（HIV-2）の全部又は一部を意味する。
【００４１】
用語「捕獲抗原」とは、単離された抗原性断片を意味し、好適には固相に対して結合させられており、微生物に対して向けられた抗体、例えば、抗HCV又は抗HIV抗体によって認識され、そして後者との親和性結合を可能にする。
【００４２】
用語「検出抗原」とは、捕獲抗原などの標識され且つ修飾された抗原（即ち、それは、無効されているエピトープ部位又はエピトープを１以上含む）を意味する。それは、競合によって捕獲された抗原を検出すること又は、「二重抗原サンドイッチ」法（Maioliniら（1978））とも呼ばれる常用の抗原−抗体−抗原サンドイッチ法によって抗体を検出することのいずれかを可能にする。
【００４３】
本発明によれば、捕獲抗原、及び／又は、特に抗原−抗体−抗原サンドイッチによる抗体検出において任意に使用される検出抗原は、無効されているエピトープ部位又はエピトープを１以上含む。「エピトープ部位」又は「エピトープ」とは、抗体によって認識されそしてそれらの特異的結合を可能にするアミノ酸の配列である。
【００４４】
HCVタンパク質に関して、カプシドタンパク質のいくつかのエピトープが同定されている。アミノ酸１６〜アミノ酸４０、及びアミノ酸４４〜アミノ酸４７に位置するエピトープが特に知られている。例えば、Okomotoら（1990）；Nasoffら(1991)；Leathyら（1991）；Takahashiら（1992）；Sallbergら（1992）；及びIshida（1993）を参照のこと。
【００４５】
HCVの非構造性タンパク質の多くのエピトープも当業界で公知である。NS3タンパク質上、アミノ酸1188〜アミノ酸1493（Yangら（1995））、及びアミノ酸1175〜アミノ酸1334（Yangら、（1999））に位置するエピトープ、及びアミノ酸1460〜アミノ酸1532に位置するエピトープ（Clayesら（1995））が知られている。
【００４６】
最も広く知られているNS4エピトープの１つ、エピトープ5-1-1（AA1689〜1760）がCerinoら（1991）中で述べられている。
【００４７】
HIVに関して、いくつかのエピトープも従来技術において記載されている。それらは、詳細に、アミノ酸２９３〜３５０に位置する、HIV-1（グループM）P25タンパク質のエピトープ、そしてまたGnannら（1987）によって記載されたgp41の免疫優占性エピトープ又はその配列の変異体であり；これは再度、詳細に、例えば、上記HIV-1P25のエピトープに配列が相同的なP26タンパク質のエピトープ、又はHIV-2gp36のエピトープ、詳細に、Gnannら（1987）によって記載されたgp36の免疫優占性エピトープ、もしくはこの配列の変異体である。
【００４８】
「無効されている」発現エピトープ部位又はエピトープとは、前記エピトープ部位又はエピトープがその構造（一次、二次、三次及び／又は四次）内で修飾されていることを意味し、その修飾により、この無効されたエピトープを含んで成る捕獲抗原又は検出抗原は、同時に、検出される抗原に対して向けられた捕獲抗体、及び／又は検出抗体に対して結合せず、しかも同時に、生物試料中に存在する可能性がある、微生物に対して向けられた抗体の例えば抗HCV又は抗HIV抗体が、完全な状態を維持する他のエピトープ部位を認識することによって、結合する能力は保存している。従って、捕獲及び／又は検出抗体は、生物試料中に存在する抗原上、「完全形態」、即ち、「無効にされていない」又は「天然」形態にある件のエピトープを特異的に認識するように選択される。本発明の背景において、完全形態にあるエピトープを、無効されたエピトープに対して「相同的」なエピトープともよぶ。
【００４９】
用語「特異的に」とは、それが抗原に対する抗体の特異的認識又は結合に言及される場合、抗体が、他の抗原との実質的な相互作用を何ら伴わずに所定の抗原と相互作用することを意味し、又はもしそれがあるエピトープによる「特異的」認識か疑問であれば、実質上このエピトープの認識を排除することによる。会合定数は108L／mol超が好適である。
【００５０】
捕獲及び検出抗体
本発明中で使用されている抗体は、抗原に対して特異的な抗体であり、そしてこの理由に関して、モノクローナル抗体又モノ特異的ポリクローナル抗体、即ち、たった１つのエピトープのみを特異的に認識する抗体である。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、Kohler及びMilsten（1975）によって記載されたリンパ球融合及びハイブリドーマ培養により獲得できうる。ポリクローナル抗体を調製するための他の方法も公知である（Harlowら（1988））。モノクローナル抗体は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はヒトなど）を免疫化すること及びハイブリドーマをもたらすリンパ球融合技術（Kohler及びMilsten（1975））を使用することで調製されて良い。
【００５２】
この通常の方法に代わる技術が存在する。例えば、ハイブリドーマを使用することでクローン化された核酸の発現によって、モノクローナル抗体を生産することが可能である。抗体cDNAをベクター（それは典型的に線状ファージ（例えば、大腸菌（E.Coli）に対するFUSE5、Scottら、（1990））である）中へとに組み込むことによる、ファージディスプレー技術を使用することで抗体を生産することも可能である。後者は、ライブラリーを構成し、そしてそれらの表層でscFv断片を呈示する。これら抗体ライブラリーを構築するためのプロトコールはMarksら（1991）に記載されている。
【００５３】
ポリクローナル抗体は、通常の手順により、天然のペプチドである抗原に対して免疫化させた動物の血清から獲得できうる。
【００５４】
一般に、ポリペプチド、詳細には組み換えポリペプチド、又はオリゴペプチドが、免疫源として使用されて良い。常用のプロトコールによれば、ウサギは、Benoitら（1982）によって記載された手順に従い、１mg当量のペプチド免疫源で免疫化させる。４週間隔で、動物には２００μgの抗原を与え、そして１０〜１４日後に出血させた。第３回目の注射の後、クロラミンT法によって調製した、ヨウ素により放射性同位体標識されている、抗原性ペプチドに対して結合する抗血清の能力が評価を評価する。次いで、カルボキシメチルセルロース（CMC）からなるイオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製される。次いで、溶離によって回収された抗体分子を当業者に周知の方法、例えば、IgG画分を獲得するためのDEAE Sephadexを使用することによって所望の濃度に調整する。
【００５５】
ポリクローナル血清の特異性を高めるために、抗体は、免疫化のために使用され且つ固相に対して固定化されたペプチド（例えば、限定ではないが、HCVのカプシドペプチドAA16〜44及びAA39〜74）を使用する免疫親和性クロマトグラフィー（又は免疫吸着クロマトグラフィー）によって精製されて良い。抗血清を、固相中に固定化されているペプチドと、当該ペプチドと抗体分子が当該固相中で免疫複合体を形成するために十分な時間に渡り接触せしめる。
【００５６】
従って、本発明者は、更に詳細に、下の表１に示した特異的抗HCV抗体を使用した。
【００５７】
【表１】
2006501151.tif 000002
【００５８】
HIVを検出するためのコンボアッセイに関して、使用される抗体は、好適に以下のペプチド配列の１つ、又は変異体HIV系統の対応する配列、を認識するモノクローナル抗体である。
−配列308QASQEVKNWMTETLL322（配列番号24）のHIV-1グループMのP25タンパク質のエピトープ；
−P26タンパク質のエピトープ、詳細には、配列同定体（配列番号２４）によって描かれたHIV-1 P25のエピトープの配列と相同的な配列のエピトープ、例えば、配列QTDPAVKNWMTQTLL（配列番号２５）を含むエピトープ（HIV-2単離体：ROD）
【００５９】
いうまでもなく、上記抗体に関する記載に対して類似又は同一なエピトープ特異性のモノクローナル抗体を生産MA又は獲得することは、当業者の範囲内であり、それらは本発明を実行するために適している。
【００６０】
捕獲及び／又は検出抗原
本発明において使用される検出抗原は、無効されているエピトープ部位を１以上含む。捕獲抗原と、そして／又は検出抗原と干渉する両方のリスクがある２つの異なる交代が使用される場合、当該抗原上の少なくとも２つの部位を無効することが必須でありうる。この場合、例えば、サンドイッチ型の免疫アッセイのために、捕獲抗原と同じ表層上に固定化されている捕獲抗体を、そして検出抗体を使用する。次いで、捕獲抗体は、それが特異的に、捕獲抗原上の２つの無効されたエピトープのうちの１つに対して相同的な、患者の天然抗原上のエピトープを認識するように選択され、しかも検出抗体は、それが特異的に、捕獲抗原上の２つの無効されたエピトープの他の方に対して相同的な患者の天然抗原上でエピトープを認識する様に選択される。
【００６１】
前記捕獲抗原及び／又は検出抗原は、微生物、詳細には、HCV又はHIVの抗原性タンパク質に由来するエピトープの全部又は一部を真似たペプチドを含んで成る又はから成る。
【００６２】
好適に、それはカプシドタンパク質のペプチドであり、特に、抗原が殆ど確認されない慢性肝炎の場合に抗カプシド抗体の検出が特に有利であり、そして更に確認される抗カプシド抗体が循環する場合に有利である。それはまた１もしくは複数の非構造性タンパク質、例えばNS3及び／もしくはNS4であっても良い。様々な捕獲又は検出抗原も一緒に組み合わされて良い。いくつかの異なる捕獲及び／又は検出抗原を使用するこのような実施態様は、例えば、抗カプシド抗体及びHCVの非構造性タンパク質NS3及び／又はNS4に対する抗体を検出可能にする。抗カプシド抗体と抗NS3抗体の同時検出が特に好適である。本発明は、カプシド抗原、抗カプシド抗体、E1及び／もしくはE2エンベロープ構造タンパク質に対する抗体、E1及び／もしくはE2エンベロープ抗原、及び／又はHCVの非構造性タンパク質NS3及び／又はNS4に対する抗体の同時検出をも含んで成る。具体化されている他の組み合わせも本発明の一部である。
【００６３】
同様に、gag抗原、gagに対する抗体及び／又はAIDSウィルス（HIV-1、HIV-2など）のエンベロープに対する抗体（その配列は、Wain-Hobsonら（1985）；Ratnerら（1985）；Sanchez-Pescadorら（1985）；Guyderら（1987）の記事に刊行されている）の同時検出も本発明の一部である。好適に、検出されるgag抗原は、HIV-1P25タンパク質又はHIV-2P26タンパク質であり、そして求められている抗gag抗体はコレラのタンパク質に対して向けられている。尚好適に、HIV-1及びHIV-2のエンベロープに対する抗体を検出するためのエンベロープ抗原は、HIV-1gp41及びHIV-2gp36である。
【００６４】
類似して、Alconら（2002）によって記載されたNS1抗原の、NS1に対する抗体の検出、又は更にデングウィルスのNS2、NS3及び／もしくはS4に対する抗体の検出との同時検出も本発明の一部である。
【００６５】
適用するための技術は当業者に周知である。
【００６６】
好適に、捕獲及び／又は検出抗原は、一層実用的であるので、当業者に周知の方法によって生産された合成ペプチドである。例として、Merrifield型の合成が、純度、抗原特異性及び不都合な副産物がないこと、及びその使用の簡便さの理由から挙げることができる（Marrifield（1963）；R.C.Shepperd（1971）；Athertonら（1989））。自動合成器として、Milliporeの「9050 Plus Pep Synthesizer」、Perseptiveの「Pioneer」合成装置、ABI（Applied Biosystems Inc.）の「433A」合成装置又はRaininの「Symphony」合成装置などが使用されて良い。ペプチドは、均一相合成によっても獲得できうる。
【００６７】
これらの捕獲及び／又は検出抗原上のエピトープを無効にすることは、様々な方法で行われて良い。エピトープ部位をこのように修飾するために必要な唯一の条件とは、当該捕獲抗原及び／もしくは検出抗原が捕獲抗体及び／もしくは検出抗体に対して結合する可能性はないが、同時に、微生物に対して向けられた抗体、詳細には、生物試料中に存在する可能性のある、抗HCV又は抗HIV抗体に対して結合する能力を保存することである。
【００６８】
標的となる各エピトープ部位において少なくとも１つのアミノ酸、好適には２つのアミノ酸を修飾することは、修飾されないほうのエピトープを不安定化することなく、エピトープを無効するのに十分である。かかる修飾は好適に、例えば、アミノ酸の置換によって、例えば、グリシンではない残基をグリシンもしくはアラニン残基により置換することによって、又はあるクラスのアミノ酸を他のクラスのアミノ酸で置換することによって獲得されうる。極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン又はチロシン）を非極性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステイン）で置換すること、及びその逆が可能である。塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン又はヒスチジン）を酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）で置換すること、及びその逆が可能であるかあるいは、他に側鎖が環を有するアミノ酸（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）を、直線側鎖を有するアミノ酸で置換すること、又はその逆も可能である。１もしくは数個のアミノ酸の欠失、又は１もしくは数個のアミノ酸の挿入は、エピトープにおける、特に非天然アミノ酸において、エピトープを無効することを可能にする。アミノ酸の官能基の修飾、即ち、特に、基OH、NH2又はSHにおける修飾も可能である。
【００６９】
本発明の背景において使用するペプチドの中で、抗原及び抗体の同時検出が望ましい全種類の感染性微生物（例えば、ウィルスであり、様々なタイプの肝炎の原因となるウィルス、AIDS（HIV-1、HIV-2など）の原因となるレトロウィルス、CMVウィルス、デングウィルスなどのウィルス、そしてまた細菌、寄生微生物など）に由来するペプチドを想像することが可能である。
【００７０】
詳細に、且つ包括的な説明により、HCVカプシドペプチド、詳細には、アミノ酸１〜７５、６〜６８及び１〜５３のものが挙げられる。ジェノタイプ１のコンセンサス配列に対応するこれらの配列（サブタイプ１a、1b、1c）が添付の配列リストに与えられており、そしてそれぞれ、配列番号１、２、及び３で記されている。
【００７１】
【化１】
2006501151.tif 000003
【００７２】
同様に、本発明の背景において使用するペプチド又はポリペプチドは、HIVのgagポリペプチド又はエンベロープポリペプチドである。
【００７３】
特に、それはHIV-1P25タンパク質のコンセンサス配列に対応するペプチドであり、その配列は、添付の配列リストで、配列同定体配列番号２３によって規定されている。
【００７４】
【化２】
2006501151.tif 000004
【００７５】
それはまたHIV-1のgp41のエピトープを含んで成るペプチドであって良く、特に配列番号２６〜配列番号３１のペプチドであって良い。
【００７６】
【化３】
2006501151.tif 000005
【００７７】
捕獲及び／又は検出抗原としてのHIV-2のgagポリペプチド又はエンベロープポリペプチドの使用も本発明の一部である。それは特に、下の配列番号３２又は配列番号３３の配列のgp36のポリペプチドである。
【００７８】
【化４】
2006501151.tif 000006
【００７９】
それはHIV-2のP26タンパク質のポリペプチドでもあっても良く、例えば、配列同定体配列番号２３によって描かれたP25タンパク質のポリペプチドに対して配列が相同的なポリペプチドである。
【００８０】
修飾されたペプチド又はポリペプチドであって、捕獲及び／又は検出抗原として使用されるペプチド又はポリペプチドも本発明の一部である。それらは詳細に、修飾されたエピトープ部位を１以上有するカプシドペプチド断片でありうる。従って、本発明の対象は、HCVカプシドタンパク質に由来するペプチド又はポリペプチドであり、少なくとも１つの完全なエピトープ部位及び少なくとも１つの無効されたエピトープ部位を有し、従って、前記無効されたエピトープ部位は、抗カプシド抗体によって認識されることができないように作られている。好適なペプチドは、２、３又は４個のアミノ酸の置換を、特に、アミノ酸２０〜４０からなる部分でそしてアミノ酸４４〜４７からなる部分で示す。以下の突然変異は特に有利且つ好適である。
【００８１】
アミノ酸３４、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号４、「Cap１〜７５（G34-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号４：Cap１〜７５（G34-G44-G47）
【化５】
2006501151.tif 000007
【００８２】
アミノ酸３１、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号５、「Cap１〜７５（G34-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号５：Cap１〜７５（G31-G44-G47）
【化６】
2006501151.tif 000008
【００８３】
アミノ酸３６、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号６、「Cap１〜７５（G36-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号６：Cap１〜７５（G36-G44-G47）
【化７】
2006501151.tif 000009
【００８４】
アミノ酸３４、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号７、「Cap６〜６８（G34-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号７：Cap６〜６８（G34-G44-G47）
【化８】
2006501151.tif 000010
【００８５】
アミノ酸３１、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号８、「Cap６〜６８（G31-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号８：Cap６〜６８（G31-G44-G47）
【化９】
2006501151.tif 000011
【００８６】
アミノ酸３６、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号９、「Cap６〜６８（G36-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号９：Cap６〜６８（G36-G44-G47）
【化１０】
2006501151.tif 000012
【００８７】
アミノ酸３４、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号１０、「Cap１〜５３（G34-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号１０：Cap１〜５３（G34-G44-G47）
【化１１】
2006501151.tif 000013
【００８８】
アミノ酸３１、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号１１、「Cap１〜５３（G31-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号１１：Cap１〜５３（G31-G44-G47）
【化１２】
2006501151.tif 000014
【００８９】
アミノ酸３６、４４、及び４７のグリシン残基での置換（配列番号１２、「Cap１〜５３（G36-G44-G47）に規定されたペプチド」）：
配列番号１２：Cap１〜５３（G36-G44-G47）
【化１３】
2006501151.tif 000015
【００９０】
アミノ酸４５及び４６の欠失：
配列番号１３：Cap１〜７５（G34-del（45-46））
【化１４】
2006501151.tif 000016
【００９１】
骨格長の修飾：
配列番号１４：Cap１〜７５（G34-βA45）
【化１５】
2006501151.tif 000017
式中、βAはβアラニンを示す。
【００９２】
アミノ酸挿入及び突然変異による骨格長の修飾：
配列番号１５：Cap１〜７５（G34-G46-G46’）
【化１６】
2006501151.tif 000018
【００９３】
極性の逆転：
配列番号１６：Cap１〜７５（nL29-G30-G44-G47）
【化１７】
2006501151.tif 000019
式中、nLはノルロイシンを示す。
【００９４】
アミノ酸置換：
配列番号１７：Cap１〜７５（G34-F35-G44-G47）
【化１８】
2006501151.tif 000020
【００９５】
アミノ酸置換：
配列番号１８：Cap１〜７５（G34-hS35-G44-G47）
【化１９】
2006501151.tif 000021
式中、hSはホモセリンを示す。
【００９６】
本発明は、HIVタンパク質のgagタンパク質に由来するペプチド又はポリペプチドであって、少なくとも１つの完全なエピトープ部位及び少なくとも１つの無効されたエピトープ部位を有し、従って、この無効にされたエピトープ部位は同gagタンパク質に対して向けられた抗体によって認識されないようにつくられている、ペプチド又はポリペプチドにも関連する。更に詳細には、前記ポリペプチドは、HIV-1P25タンパク質のコンセンサス配列を含んで成り、そして１、２、３、４又は５個のアミノ酸の置換、詳細にはアミノ酸２９３〜３２２から成る部分での置換を示しうる。好適に、前記修飾されたポリペプチドは、HIV-1（M）P25タンパク質のコンセンサス配列を有し、ここで、アミノ酸２９５、２９８、３１０及び３１２はグリシン残基で置換されており、そしてアミノ酸３１６はフェニルアラニン残基で置換されている。
【００９７】
【化２０】
2006501151.tif 000022
【００９８】
これらのペプチド配列が使用される場合、N末端部位において、アミノ酸をより簡単に結合させ、支持する又は任意の注目の分子を結合させることができるようにするために、アミノ酸C-G-G-（即ち、Cys-Gly-Gly-）を付加することが有利でありうる。ペプチドC-G-G-Cap１〜７５（G34-G44-G47）は、このことに関して特に有利でありうる。
【発明の開示】
【００９９】
検出の方法
本発明は、一般に、in vitroで、生物試料において微生物による感染症を検出するための方法であって、当該方法は、生物試料中に存在する、当該微生物の抗原及び当該微生物に対して向けられた抗体を同時検出することを含んで成り、当該方法は：
a)生物試料を、前記微生物に対して向けられた捕獲抗体、及び当該微生物に由来する捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)形成された当該抗原−抗体複合体を露出させ、それは任意に、捕獲されている前記微生物の抗原に対して結合できる少なくとも１つの標識された検出抗体及び／又は任意に、捕獲されている前記微生物に対して向けられた抗体に対して結合できる標識された検出抗原を使用する、
ことを含んで成り；
そして、ここで前記微生物の当該捕獲抗原は、前記微生物の少なくとも１つのエピトープが無効されている抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成り；
そして、前記捕獲及び／又は検出抗体は、当該捕獲されている抗原の、完全である、エピトープを認識する。
【０１００】
本発明の方法は、単一の抗体／抗原ペアの使用に限定されてはいないと解される。それは、いくつかの異なる捕獲抗体及びいくつかのことなる捕獲抗原を使用することで行われて良い。
【０１０１】
詳細に、従って、本発明は、in vitroで、生物試料においてC型肝炎ウィルス（HCV）による感染症を検出するための方法であって、当該生物試料中に存在する、HCVの抗原及び当該HCVの抗原に対して向けられた抗HCV抗体を同時検出することを含んで成り、当該方法は：
a)生物試料を、抗HCV捕獲抗体及びHCV捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)形成された当該抗原−抗体複合体を露出させ、それは任意に、捕獲されているHCV抗原に対して結合できる標識された検出抗体及び／又は任意に、捕獲されている抗HCV抗体に対して結合できる標識された検出抗原を使用する、
ことを含んで成り、
そして、ここで当該HCV捕獲抗原は、少なくとも１つのエピトープが無効されているHCVの抗原性断片であるかそれを含んで成り；
そして、前記捕獲及び／又は検出抗体は、前記捕獲されている抗原の、完全である、エピトープを認識する。
【０１０２】
本発明は、in vitroで、生物試料においてヒト免疫欠損ウィルス（HIV）による感染症を検出するための方法であって、当該生物試料中に存在する、HIVの抗原及び当該HIVの抗原に対して向けられた抗HIV抗体を同時検出することを含んで成り、当該方法は：
a)生物試料を、抗HIV捕獲抗体及びHIV捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)形成された当該抗原−抗体複合体を露出させ、それは任意に、捕獲されているHIV抗原に対して結合できる標識された検出抗体及び／又は任意に、捕獲されている抗HCV抗体に対して結合できる標識された検出抗原を使用する、
ことを含んで成り、
そして、ここで当該捕獲抗原は、少なくとも１つのエピトープが無効されているHIVの抗原性断片であるかそれを含んで成り；
そして、前記捕獲及び／又は検出抗体は、前記捕獲されている抗原の、完全である、エピトープを認識する。
【０１０３】
好適に、前記方法により、HIV-1の検出、HIV-2の検出、又はHIV-1とHIV-2両方の検出が可能になる。その結果、別な考えによれば、使用されて良いHIV捕獲抗原は、それぞれ、HIV-1捕獲抗原、HIV-2捕獲抗原、並びにHIV-1及びHIV-2捕獲抗原又はHIV-1捕獲抗原の組み合わせ、及びHIV-2捕獲抗原組み合わせであるか、それらを含んで成る。
【０１０４】
生物試料は、任意に前段階で処理されて良いかあるいは捕獲抗原及び捕獲抗体と、検出されるべき抗原の露出を促すような条件下で接触させられる。有利に、前記試料は、変性剤で、検出前に、そして好適にはそれが、使用される抗体と接触させられる前に、処理される。HCVのカプシド、又はHIVのgagタンパク質の検出の場合、この変性剤は特に、非イオン型の１又は複数のデタージェントからなり、それは例えば、Nonidet P-40（NP40）（tert−オクチルフェノキシ ポリ（オキシエチレン）エタノール、IGEPAL CA630ともよばれる）、又は酸溶液である。
【０１０５】
この組み合わせ免疫アッセイは、限定ではない、当業者に周知の様々な形態：固相又は均一相において；１段階又は２段階で；二重サンドイッチ法（２つの抗原及び抗体検出のための重ね合わせ）；又はサンドイッチ法（抗原検出のために）と組み合わせた間接法（抗体検出のために）で行われる。
【０１０６】
好適な実施態様によれば、前記捕獲抗体及び捕獲抗原は固相上に固定化されている。固相は、限定ではないが、例えば、マイクロプレート、詳細には、ポリスチレンマイクロプレート、例えば、Company Nunc、Denmarkによって市販されているものが使用されて良い。固体粒子又はビーズ；常磁性ビーズ、例えば、Dynal又はMerck-Eurolab（商用名Estapor（登録商標））によって市販されているもの、又は他にポリスチレンもしくはポリプロピレンでできているものなども使用されて良い。
【０１０７】
２つの抗体（捕獲抗体及び検出抗体）間でのサンドイッチ型の免疫アッセイ形態は、
生物試料中に存在する抗原を検出するために特に有利であり、従って、抗体は、当該抗体に対して結合する捕獲抗原及び標識された接合体、例えば、標識されたタンパク質Aもしくは標識された免疫グロブリンもしくは抗イソ型抗体を使用することで露出されて良い（通常「間接形態」に言及される形態により）。抗体は、当該抗体に対して結合する捕獲抗原及び標識された抗原を使用することでも有利に検出されて良い（「抗原−抗体−抗原サンドイッチ」又は「二重抗原サンドイッチ」に言及される形態による）。
【０１０８】
競合によって抗原を検出するための免疫アッセイ形態も可能である。免疫アッセイの他の態様も予想され、そしてそれらは当業者に周知である。
【０１０９】
一般に、本発明によれば、捕獲抗体及び検出抗体（特にサンドイッチの場合に使用される）は、それらが、生物試料中に存在する検出されるべき天然の標的抗原（それはエピトープについて完全であり、捕獲抗原上の無効にされたエピトープに対して相同的である）を認識するように、そしてそれらが捕獲抗原上の無効されたエピトープを認識しないように、選択される。
【０１１０】
本発明による、微生物の抗原及び当該微生物に対して向けられた抗体の同時検出であって、詳細には、HCV抗原及び及び抗HCV抗体の同時検出、又は他にHIV抗原及び及び抗HIV抗体の同時検出は、一段階、即ち、生物試料を同時に検出手段に至らしめること、例えば、詳細には、検出抗体又は抗体と、１又は複数の捕獲抗体及び１又は複数の捕獲抗原に同時に接触せしめることによって行われて良い。この場合、抗原を検出するための免疫アッセイ及び抗体を検出するための免疫アッセイは両方とも好適にサンドイッチによって行われている。代わりに、検出手段、例えば、詳細には、１又は複数の検出抗体は、第二段階で、即ち、第一抗原−抗体複合体が形成された後に、この混合物に対して加えられて良い。次いで、これは二段階アッセイとして記載されている。
【０１１１】
上記のように、捕獲抗原は、詳細に、少なくとも１つのエピトープ部位が無効されているHCVカプシドタンパク質の抗原性断片であって良い。捕獲抗原は、HCVの非構造性タンパク質、詳細には、限定ではないが、NS3又はNS4の抗原性断片からなっても良く、ここでも少なくとも１つのエピトープ部位が無効されている。最後に、捕獲抗原は、少なくとも１つのエピトープ部位が無効されている、カプシドタンパク質の抗原性断片の組み合わせ及び少なくとも１つのエピトープ部位も無効されている、及びHCVの非構造性タンパク質、NS3又はNS4の抗原性断片の組み合わせからもなりうる。当業者によって予測されうる全ての変異体は本発明の一部である。
【０１１２】
本発明の好適な実施態様によれば、生物試料においてC型肝炎ウィルス（HCV）による感染症を検出するための方法は：
a)生物試料を、固相に対して結合させられたHCV捕獲抗体及びHCV捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)固相と液相を分離し；
d)当該固層を、捕獲されているHCV抗原を結合できる標識された検出抗体、及び、捕獲されている抗HCV抗体を結合できる１もしくは複数の標識された抗免疫グロブリンもしくは抗イソ型抗体に接触せしめる、
ことを含んで成り、
抗HCV抗体を捕獲するための抗原は、２つのエピトープが無効にされているHCVのカプシドタンパク質の抗原性断片であるかそれを含んで成り、
そして、捕獲されているカプシド抗原の、完全である、エピトープのうちの１つを認識する前記捕獲及び検出抗体、
を含んで成る。
【０１１３】
他の実施態様によれば、本発明は、HIV、例えば、HIV-1又はHIV-2による感染症の検出を可能にする。好適に、当該方法は、HIV-1に由来する捕獲抗原及びHIV-2に由来する捕獲抗原の両方を、抗HIV-1抗体と抗HIV-2抗体の両方を検出できるようにするために含んで成る。従って、この好適な態様によれば、本発明の方法は、平等に、HIV-1及び／又はHIV-2による感染を検出するために使用できうる。
【０１１４】
捕獲抗原は、HIVのgagタンパク質、例えば、HIV-1 P25タンパク質又はHIV-2 P26タンパク質の抗原性断片を含んで成り、ここで少なくとも１つのエピトープ部位は無効にされている。捕獲抗原は、HIVのエンベロープタンパク質、詳細には、限定ではないが、HIV-1 gp41タンパク質の又はHIV-2 gp36の抗原性断片を含んで成る。最後に、捕獲抗原は、HIV-1及びHIV-2のgagタンパク質の抗原性断片の組み合わせ、追加として、ここで適宜、HIV-1エンベロープタンパク質及びHIV-2エンベロープタンパク質の抗原性断片の組み合わせからなりうる。
【０１１５】
本発明の好適な実施態様によれば、生物試料においてヒト免疫欠損ウィルス（HIV）による感染症を検出するための方法は：
a)生物試料を、固相に対して結合させられたHIV捕獲抗体及びHIV捕獲抗原と接触せしめ；
b)この混合物を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートし；
c)固相と液相を分離し；
d)当該固層を、捕獲されているHIV抗原を結合できる標識された検出抗体、及び捕獲されている抗HIV抗体を結合できる１もしくは複数の標識された抗免疫グロブリンもしくは抗イソ型抗体に接触せしめる、
ことを含んで成り、
抗HIV抗体を捕獲するための抗原は、２つのエピトープが無効にされているHIVのカプシドタンパク質の抗原性断片であるかそれを含んで成り、
そして、捕獲されているgag抗原の、完全である、エピトープのうちの１つを認識する前記捕獲及び検出抗体、
を含んで成る。
【０１１６】
好適に、本発明の方法は、HIV-1もしくはHIV-2による感染症、又はHIV-1及びHIV-2による感染症の検出に向けられている。後者の代替によれば、抗HIV抗体を捕獲するための抗原は、HIV-1のgagタンパク質の断片及びHIV-2のgagタンパク質の断片の組み合わせである。
【０１１７】
ELISAアッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は任意の他の検出技術が、形成された抗原−抗体複合体の存在を明らかにするために使用されて良い。同じ型又は複数の型の標識が、第一番目に、感染性微生物抗原、詳細には、HCV又はHIV抗原を、そして第二番目には、感染性微生物対して向けられた抗体、詳細には、抗HCV又は抗HIV抗体を検出するために使用されて良い。
【０１１８】
生物試料における抗原又は抗体の存在の検出は、定量的に完了されて良い。それは例えば、当業者に周知の標準的な技術による、標識により放射されたシグナル（色、蛍光、放射性）を検出することによる。
【０１１９】
キット
本発明の方法に従って、生物試料における、微生物、例えば、C型肝炎ウィルス（HCV）又はヒト免疫欠損ウィルス（HCV）による感染症を検出するために使用するキット及び試薬は、本発明が簡単に実施でき且つ多くの生物学的試料に対して適用できるように提供されて良い。
【０１２０】
従って、本発明の対象は、生物試料における、微生物による感染症を検出するためのキットであり、当該キットは：
−微生物のタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、捕獲又は検出抗原であって、当該断片は、少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある微生物に対して向けられた抗体に対して結合する能力を保存している、捕獲又は検出抗原；
−前記微生物のタンパク質の完全であるエピトープに対して向けられた抗体、
を含んで成る。
【０１２１】
従って、本発明の他の特定の対象は、生物試料において、C型肝炎ウィルス（HCV）による感染症を検出するためのキットであり、当該キットは：
−HCVのタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、捕獲又は検出抗原であって、当該断片は少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある抗HCV抗体に対して結合する能力を保存している、捕獲又は検出抗体；
−HCVのタンパク質の完全であるエピトープに対して向けられた抗体であって、好適に、当該生物試料中に存在する前記HCV抗原を捕獲するための抗体、
を含んで成る。
【０１２２】
従って、本発明の他の対象は、生物試料における、ヒト免疫欠損ウィルス（HIV）による感染症を検出するためのキットであり、当該キットは：
−捕獲又は検出抗原であって、少なくとも１つの無効されたエピトープを含んで成り、しかも当該生物試料中に存在する可能性がある抗HIV抗体に対して結合する能力を保存する、HIVのタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、捕獲又は検出抗原；
−HIVのタンパク質の完全であるエピトープに対して向けられた抗体であって、好適に、当該生物試料中に存在する前記HIV抗原を捕獲するための抗体、
を含んで成る。
【０１２３】
有利に、このキットは、いくつかの捕獲抗原及びいくつかの捕獲抗体を含みうる。
【０１２４】
上記のように、前記捕獲抗体及び前記捕獲抗原は有利に、固相、例えば、マイクロプレート上に固定化された形態で提供されて良い。
【０１２５】
好適なキットは：
a)捕獲抗原であって、少なくとも２つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時当該生物試料中に存在する可能性がある抗HCV抗体に対して結合する能力を保存する、HCVのタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、捕獲抗原；
b)HCVのタンパク質の、完全である、エピトープのうちの１つ対して向けられた抗体、
c1)HCVのタンパク質の、完全である、他のエピトープの対して向けられた標識された検出抗体；
c2)及び／又は任意に、標識された検出抗原であって、少なくとも２つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある抗HCV抗体に対して結合する能力を保存する、HCVのタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、検出抗原、
を含んで成り、
ここで、前記捕獲抗原及び前記捕獲抗体は固相上に固定化されている。
【０１２６】
そしてまた好適に、本発明のキットは：
a)捕獲抗原であって、少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある抗HIV抗体に対して結合する能力を保存する、HIVのタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、捕獲抗原；
b)HIVのタンパク質の、完全である、エピトープのうちの１つ対して向けられた抗体、
c1)HIVのタンパク質の、完全である、他のエピトープの対して向けられた標識された検出抗体；
c2)任意に、標識された検出抗原であって、少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも同時に当該生物試料中に存在する可能性がある抗HIV抗体に対して結合する能力を保存する、HIVのタンパク質の抗原性断片であるかあるいはそれを含んで成る、検出抗原、
を含んで成り、
ここで、前記捕獲抗原及び前記捕獲抗体は固相上に固定化されている。
【０１２７】
キットは、生物試料中に存在する抗体を検出し、そして捕獲抗原、例えば、標識された抗免疫グロブリンもしくは抗イソ型抗体もしくは他に検出抗原との複合体を形成する手段を含んで成りうる。検出抗原は好適に抗原断片、例えば、HCVの又はHIVの抗原断片であり、それは少なくとも１つの無効にされたエピトープを含んで成り、しかも試料中に存在する可能性がある抗体（抗HCV又は抗HIV抗体）に対して結合する能力を保存する。
【０１２８】
キットは、デタージェントをも含んで成って良く、一層詳細には、非イオン性デタージェント、例えばNP40（Sigma）、又は当業者に周知の任意の同等の非イオン性デタージェントを含んで成る。
【０１２９】
上記のように、検出抗原などの捕獲抗原は、特に、HCVのカプシドタンパク質の断片であって良く、ここで当該断片は少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされており、そして次いで捕獲及び／又は検出抗体は、カプシドタンパク質の完全であるピトープ部位を認識するように選択されている。
【０１３０】
詳細に、本発明の対象は、２つ以上の異なるエピトープ部位で突然変異しているHCVのカプシドペプチド、例えば、ペプチド１〜７５（G34-G44-G47）、及び当該ペプチド１〜７５（G34-G44-G47）を認識できないが対応する天然のHCV配列を認識する抗体のペアを含んで成るかあるいはそれからなる試薬の一組のセットである。
【０１３１】
検出される微生物がHIVである場合、検出抗原などの捕獲抗原は、特に、HIVのgagタンパク質の断片であって良く、ここで当該断片は少なくとも１つのエピトープ部位が無効にされており、そして次いで捕獲及び／又は検出抗体は、gagタンパク質の完全であるピトープ部位を認識するように選択されている。
【０１３２】
詳細に、本発明の対象は、１つ以上の異なるエピトープ部位で突然変異しているP25タンパク質のペプチド、例えば、配列番号２２のペプチド、及び配列番号２２のペプチドを認識できないが天然のHIV-1P25タンパク質の配列を認識する抗体のペアを含んで成るかあるいはそれからなる試薬の一組のセットである。
【実施例】
【０１３３】
下の図及び例は本発明の範囲を限定することなく説明する。
【０１３４】
例：C型肝炎ウィルスによる感染症の検出
プロトコール1a及び1bのための材料
抗カプシドモノクローナル抗体ペルオキシダーゼ（「mAb-POD」）接合体：ペルオキシダーゼで標識した抗カプシドモノクローナル抗体、mAb2（表１）を、特許出願EP0752102に記載の方法で調製する。このペルオキシダーゼ標識したmAb2抗体接合体を、第１段階の希釈剤（下に記載した）中で希釈し、当業者に周知の条件下で、高光密度（例えば１．５ユニット超）の十分にドキュメント化された（well-documented）陽性試料を最大限獲得可能なようにする。
【０１３５】
他の抗カプシドモノクローナル抗体、mAb1（表１を参照のこと）も使用され、固相上に固定化されている（下を参照のこと）。
【０１３６】
プロトコール1cのための材料
抗カプシドモノクローナル抗体ペルオキシダーゼ（「mAb-POD」）接合体：ペルオキシダーゼで標識した抗カプシドモノクローナル抗体、mAb1（表１）を、特許出願EP0752102に記載の方法で調製する。このペルオキシダーゼ標識したmAb2抗体接合体を、第１段階の希釈剤（下に記載した）中で希釈し、当業者に周知の条件下で、高光密度（例えば１．５ユニット超）の十分にドキュメント化された陽性試料を最大限獲得可能なようにする。
【０１３７】
他の抗カプシドモノクローナル抗体、抗カプシドモノクローナル抗体mAb3（表１を参照のこと）も使用され、固相上に固定化されている（下を参照のこと）。
【０１３８】
プロトコール1dのための材料
1)抗カプシドモノクローナル抗体ビオチン接合体：ビオチンで標識した抗カプシドモノクローナル抗体、mAb5（表１を参照のこと）を、1966年のGreg.T.Hermansonによる記載のプロトコールに従い調製する。このビオチン標識したmAb5抗体を、第１段階の希釈剤（下に記載した）中で希釈し、当業者に周知の条件下で、高光密度（例えば１．５ユニット超）の十分にドキュメント化された陽性試料を最大限獲得可能なようにする。
【０１３９】
他の抗カプシドモノクローナル抗体、抗カプシドモノクローナル抗体mAb1（表１を参照のこと）も使用され、固相上に固定化されている（下を参照のこと）。
【０１４０】
2)ペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン接合体：1966年のGreg.T.Hermansonによる記載のプロトコールに従い調製したペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンの接合体。プロトコール1dを使用する間、このペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン接合体を、第２段階の希釈剤（下に記載した）中で希釈し、当業者に周知の条件下で、高光密度（例えば１．５ユニット超）の十分にドキュメント化された陽性試料を最大限獲得可能なようにする。
【０１４１】
プロトコール1a、1b、1c及び1dのための共通の材料
１）選択された固相：Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
【０１４２】
２）本発明のプロトコールの第１及び第２段階の希釈剤：
第１段階の希釈剤：トリスNaClバッファー、０.０５M、pH６．７、０.２５％のNP40（tert−オクチルフェノキシ ポリ（オキシエチレン）エタノール−IGEPAL CA 630、Sigma）を補った。
第２段階の希釈剤：クエン酸塩バッファー（５０mM、pH６.７、２０％のグリセロールを含み、そしてペルオキシダーゼ標識した抗ヒトIgG（Fc）マウスポリクローナル抗体接合体（Jackson Immunoresearch Laboratories、USA）を含み、当業者に周知の条件下で、高光密度（例えば１．５ユニット超）の十分にドキュメント化された陽性試料を最大限獲得可能なように希釈する）。
【０１４３】
３）露出溶液：この露出溶液は：
３a）基質バッファー：クエン酸（０．０７５M）と酢酸ナトリウム（０．１M）の溶液（pH４．０、０．０１５％のH2O2及び４％のジメチルスルホキシド（DMSO）（PROLABO）を含む）、及び
３b）発色試薬：テトラメチルベンジジン（TMV、Sigma）（基質バッファー中０．７mMの最終濃度）
からなっている。
【０１４４】
４)停止溶液：１NのH2SO4
【０１４５】
方法：
プロトコール１a：試料（血清又は血しょう）中のC型肝炎ウィルスのカプシド抗原及びそれに対する抗体（抗カプシド及び抗NS-3、NS-4）を同時に検出するためのプロトコール
このアッセイの原理は、抗原を検出するためのサンドイッチ型、及び抗体を検出するための間接型の免疫酵素学的方法に基づく。
【０１４６】
それは、以下の段階に基づいており：
最初にコーティング溶液を：
●HCV抗原の混合物：配列番号４を含んで成る突然変異させたペプチドC−G−G−Cap１〜７５（G34-G44-G47）（カプシド）及び非構造性領域NS3（クローンNS3.1：AA1192〜1492）及びNS4（クローン5-1-1：AA1694〜1735）において選択されたクローンに由来する、大腸菌（Escherichia coli）によって生産された２つの組み換えタンパク質、並びに
●０．５Mトリスバッファー、pH７．４中の抗カプシドモノクローナル抗体（mAb1）
で調製する。
【０１４７】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０１４８】
このマイクロタイタープレートを一晩周囲温度（１８〜２４℃）でインキュベートする。
【０１４９】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース、２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）及び１０mMのEDTAを含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を加えることによって飽和させる。
【０１５０】
ペルオキシダーゼで標識した抗カプシドモノクローナル抗体mAb2を含む第１段階の希釈物１００μlを、そして５０μlの試料（血清又は血しょう）を連続して各杯状体に分配する。
【０１５１】
反応媒質を３７℃で１．５時間に渡りインキュベートする。存在する可能性があるHCVカプシド抗原は、固相のモノクローナル抗体mAb1に対して、そしてペルオキシダーゼで標識された抗カプシドモノクローナル抗体mAb2に対して結合し、従ってこれら２つの抗体とサンドイッチが形成される。類似して、もし抗HCV抗体が存在すれば、それらは固相に対して結合している抗原に対して結合する。
【０１５２】
次いで、プレートを、洗浄液（トリスNaClバッファー、０．０１M、pH７．４、０．１%Tween20を補った）を使用して洗浄（３回）する。
【０１５３】
ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体を含む第２段階の希釈物１００μlを各杯状体に分配する。反応媒質を周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡りインキュベートする。標識した抗ヒトIgG抗体が順に固相上に維持されている特異的抗体に対して結合する。
【０１５４】
次いで、プレートを、洗浄液（トリスNaClバッファー、０．０１M、pH７．４、０．１%Tween20を補った）を使用して洗浄（５回）する。従って、結合しなかった抗ヒトIgG接合体は、取り除かれる。
【０１５５】
１００μlの露出溶液を各杯状体に加える。この反応を、暗中、周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡り展開させる。
【０１５６】
次いで、１００μlの停止溶液を各杯状体に分配する。
【０１５７】
反応が停止した後、光密度を分光光度計により４５０／６２０nmで読む。
【０１５８】
閾値の定義：
閾値を、ROC（Receiver Operating Characteristic）曲線（Berck及びSchultz（1986））を使用することでの特異性及び感度の統計解析の後に決定した。
【０１５９】
特異性研究は健常な個体に由来する１０００の試料に関連し、そして及び感度研究は、市販され入手できるパネル：BBI（Boston Biomedica Company、USA）、Impath（USA）、Serologicals（USA）、Nabi（USA）、ProMedDx（USA）の２００のHCV陽性試料（詳細には、セロコンバージョンの始まり）に関連する。
【０１６０】
閾値を各プレートに関して、前記試験に対して特異的な定数Xで割ることによって、ポジティブコントロールに対して獲得したシグナルから計算する。それは、この例ではおよそ０．２８０OD（optical density）である。
【０１６１】
このプロトコールに示すことができるように、従来技術の方法とは異なり、本発明では、カプシド抗原及び抗カプシド抗体の捕獲を、当該カプシドの単一且つ同じタンパク領域：抗原特異性の領域（AA44〜47）（固定化された抗カプシド抗体（mab1）はそれを介してカプシドタンパク質を捕獲する）を明らかに伴う抗カプシド抗体（AA1〜75）を捕獲する抗原性領域、で行う。従って、本発明によれば、所定数の抗カプシド抗体の検出のロスが最小へと減らされ、従って感度が向上する。
【０１６２】
プロトコール１b：試料（血清又は血しょう）中のC型肝炎ウィルスのカプシド抗原及びそれに対する抗体（抗NS−3、NS−4）を同時に検出するためのプロトコール
このアッセイの原理は、抗原を検出するためのサンドイッチ型、及び抗体を検出するための間接型の免疫酵素学的方法に基づく。
【０１６３】
それは以下の段階に基づいており：
最初にコーティング溶液を：
●HCV抗原の混合物：非構造性領域NS3（クローンNS3.1：AA1192〜1492）及びNS4（クローン5-1-1：AA1694〜1735）において選択されたクローンに由来する、大腸菌（Escherichia coli）によって生産された２つの組み換えタンパク質、並びに
●０．５Mトリスバッファー、pH７．４中の抗カプシドモノクローナル抗体（mAb1）
で調製する。
【０１６４】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０１６５】
以下の段階は、プロトコール１aと同じである。
【０１６６】
プロトコール１c：試料（血清又は血しょう）中のC型肝炎ウィルスのカプシド抗原及びそれに対する抗体（抗カプシド及び抗NS-3、NS-4）を同時に検出するためのプロトコール
このアッセイの原理は、抗原を検出するためのサンドイッチ型、及び抗体を検出するための間接型の免疫酵素学的方法に基づく。
【０１６７】
以下の段階に基づいている：
最初にコーティング溶液を：
●HCV抗原の混合物：配列番号５を含んで成る突然変異させたペプチドC−G−G−Cap１〜７５（G31-G44-G47）（カプシド）もしくは配列番号１１を含んで成る突然変異させたペプチドC−G−G−Cap１〜５３（G31-G44-G47）もしくは配列番号８を含んで成る突然変異させたペプチドC−G−G−Cap６〜６８（G31-G44-G47）（カプシド）並びに非構造性領域NS3（クローンNS3.1：AA1192〜1492）及びNS4（クローン5-1-1：AA1694〜1735）において選択されたクローンに由来する大腸菌によって生産された２つの組み換えタンパク質、及び
●０．５Mトリスバッファー、pH７．４中の抗カプシドモノクローナル抗体（mAb1）
で調製する。
【０１６８】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０１６９】
このマイクロタイタープレートを一晩周囲温度（１８〜２４℃）でインキュベートする。
【０１７０】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース、２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）及び１０mMのEDTAを含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を加えることによって飽和させる。
【０１７１】
ペルオキシダーゼで標識した抗カプシドモノクローナル抗体mAb1を含む第１段階希釈物１００μlを、そして５０μlの試料（血清又は血しょう）を連続して各杯状体に分配する。
【０１７２】
反応媒質を３７℃で１．５時間に渡りインキュベートする。
【０１７３】
存在する可能性があるHCVカプシド抗原は、固相のモノクローナル抗体mAb3に対して、そしてペルオキシダーゼで標識された抗カプシドモノクローナル抗体mAb1に対して結合し、従ってこれら２つの抗体とサンドイッチが形成される。類似して、もし抗HCV抗体が存在すれば、それらは固相に対して結合している抗原に対して結合する。
【０１７４】
これに続く段階は、プロトコール１aと同じである。
【０１７５】
ここでも類似して留意できるように、本発明では、カプシド抗原及び抗カプシド抗体の捕獲を、カプシドの単一且つ同じタンパク領域：抗原特異性の領域（AA29〜34）（固定化された抗カプシド抗体（mab3）はそれを介してカプシド抗原を捕獲する）を明らかに伴う抗カプシド抗体（AA1〜75）を捕獲する抗原性領域、で行う。従って、本発明によれば、所定数の抗カプシド抗体の検出のロスが最小へと減らされ、従って感度が向上する。
【０１７６】
プロトコール１d：試料（血清又は血しょう）中のC型肝炎ウィルスのカプシド抗原及びそれに対する抗体（抗カプシド及び抗NS-3、NS-4）を同時に検出するためのプロトコール
このアッセイの原理は、抗原を検出するためのサンドイッチ型、及び抗体を検出するための間接型の方法に基づく。
【０１７７】
それは以下の段階に基づく：
最初にコーティング溶液を：
●HCV抗原の混合物：配列番号４を含んで成る突然変異させたペプチドC−G−G−Cap１〜７５（G31-G44-G47）（カプシド）もしくは配列番号１５を含んで成る突然変異させたペプチドC-G-G-Cap１〜７５（G31-G44-G47）もしくは配列番号１４を含んで成る突然変異させたペプチドC-G-G-Cap１〜７５（G34-βA45）並びに非構造性領域NS3（クローンNS3.1：AA1192〜1492）及びNS4（クローン5-1-1：AA1694〜1735）において選択されたクローンに由来する、大腸菌によって生産された２つの組み換えタンパク質、並びに
●０．５Mトリスバッファー、pH７．４中の抗カプシドモノクローナル抗体（mAb1）
で調製する。
【０１７８】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０１７９】
このマイクロタイタープレートを一晩周囲温度（１８〜２４℃）でインキュベートする。
【０１８０】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース、２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）及び１０mMのEDTAを含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を加えることによって飽和させる。
【０１８１】
ビオチンで標識した抗カプシドモノクローナル抗体mAb5を含む第１段階希釈物１００μlを、そして５０μlの試料（血清又は血しょう）を連続して各杯状体に入れる。
【０１８２】
反応媒質を３７℃で１．５時間に渡りインキュベートする。
【０１８３】
存在する可能性があるHCVカプシド抗原は、固相のモノクローナル抗体mAb1に対して、そしてペルオキシダーゼで標識された抗カプシドモノクローナル抗体mAb5に対して結合し、従ってこれら２つの抗体とサンドイッチが形成される。
【０１８４】
類似して、もし抗HCV抗体が存在すれば、それらは固相に対して結合させた抗原に対して結合する。
【０１８５】
プレートを、洗浄液（トリスNaClバッファー、０．０１M、pH７．４、０．１%Tween20を補った）を使用して洗浄（３回）する。
【０１８６】
抗ヒトIgG抗体で標識したペルオキシダーゼ及びストレプトアビジンで標識した抗体を含む第２段階希釈物１００μlを各杯状体に分配する。
【０１８７】
反応媒質を周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡りインキュベートする。標識した抗ヒトIgG抗体が順に固相上に維持されている特異的抗体に対して結合し、そしてペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンが、同固相上に維持されたビオチニル化された抗体mAb5に対して結合する。
【０１８８】
これに続く段階は、プロトコール１aと同じである。
【０１８９】
ここでも類似して留意できるように、本発明では、カプシド抗原のそして抗カプシド抗体の捕獲を、当該カプシドの単一且つ同じタンパク領域：抗原特異性の領域（AA44〜47）（固定化された抗カプシド抗体（mab1）はそれを介してカプシドタンパク質を捕獲する）を明らかに伴う抗カプシド抗体（AA1〜75）を捕獲する抗原性領域、で行う。従って、本発明によれば、所定数の抗カプシド抗体の検出のロスが最小へと減らされ、従って感度が向上する。
【０１９０】
実施例１：血清学的空白時間の間での、試料（血清又は血しょう）中のHCVカプシド抗原の検出
抗体検出では陰性で且つ核酸検出（PCR）では陽性の、HCVで汚染された患者から採取して市販されて入手可能なパネル（Impath、USA）において一緒にグループ分けした、血清又は血しょう試料を本発明のプロトコール１aに記載した方法で試験した。
【０１９１】
表２に与えた結果は、PCRによって得られた結果との比較である。
【０１９２】
【表２】
2006501151.tif 000023
【０１９３】
本発明の方法を使用することで獲得した結果は、PCRによって獲得した結果と直接的に一致する。従って、記載の発明は、抗体がまだ存在していなくともカプシド抗原を検出することが可能であり、即ち、血清学的空白時間にあるうちうに採取した試料でも検出可能である。
【０１９４】
実施例２：HCV抗原に対して陰性な試料（血清又は血しょう）中の抗カプシド抗体の検出
血清又は血しょう試料であって、HCVで汚染された患者から採取され、そして市販されて入手可能なパネルで内在的に一緒にクループ分け（grouped together in internal）された、抗体（カプシド）に関して陽性及び抗原（カプシド）に関して陰性な試料を、プロトコール１a及びプロトコール1bに記載の方法で試験した。
【０１９５】
固相上にペプチド１〜７５（G34-G44-G47）（配列番号４を含んで成る）が不在の場合（プロトコール1b）、試験した試料（カプシドに対して特異的）が検出されずその一方、プロトコール1a及び常用の抗体試験ではそれらは陽性であると確認される（表３を参照のこと）。
【０１９６】
【表３】
2006501151.tif 000024
【０１９７】
従って、本発明により、HCVで汚染された患者において、抗カプシド抗体に対して陽性であり且つカプシド抗原に対して陰性である試料を検出することが可能である。
【０１９８】
実施例３：試料（血清又は血しょう）中のカプシド抗原及び抗HCV抗体の同時検出
BBI（Boston Biomedica Company、USA）によって市販されているセロコンバージョンPHV907及びPHV917（即ち、HCVに感染した又はセロコンバージョンの間の２人の患者から採取した２組の血清又は血しょう）の試料の２つのパネルをプロトコール１aにより試験した（表４及び５を参照のこと）。
【０１９９】
【表４】
2006501151.tif 000025
【０２００】
【表５】
2006501151.tif 000026
【０２０１】
表４及び表５において、本発明のプロトコール1aにより、ウィルスRNAの存在に対応する態様（PCR試験）において、抗原に陽性なシグナルが確認され；同様に、セロコンバージョン試料において、抗体及び／又は抗原に対して陽性の、陽性反応が獲得された。このことは、２検出（カプシド抗原及び抗カプシド抗体）が、同時に同じアッセイにおいて干渉することなく機能できることを示す。
【０２０２】
加えて、本発明は、PCRに関連する診断的観点から最も特に価値があり、その理由は、PCRによっては陰性であり、そして抗体に対しては陽性である試料の検出を可能にするからだ。
【０２０３】
実施例４：抗カプシド抗体の検出に関する様々な突然変異させたペプチドの性能の比較
血清又は血しょう試料であって、HCVで汚染された患者から採取され、そして市販されて入手可能なパネルにおいて内在的に一緒にクループ分けされている、抗体（カプシド）に関して陽性及び抗原（カプシド）に関して陰性な試料を、プロトコール１c及びプロトコール1dに記載の方法より試験した（表６及び７を参照のこと）。
【０２０４】
【表６】
2006501151.tif 000027
【０２０５】
【表７】
2006501151.tif 000028
【０２０６】
表６で比較した突然変異ペプチドは、試験した試料に対して非常に類似する性能をしめす。
【０２０７】
他方、ペプチド間での反応の違いを一層印をつけて表７に示している。ペプチド配列番号１５及び配列番号１４は、所定の希釈された抗カプシド試料を検出可能にせず、同試料は、純粋に試験された場合認識された。
【０２０８】
実施例５：カプシド抗原及び抗HCV抗体の同時検出の、診断及び血清学的空白時間の減少に対する影響
８つの市販され入手できるセロコンバージョンパネル（BBI、Boston Biomedia、US）（Impath、US）を本発明（コンボアッセイに言及される）のプロトコール１a（配列番号４を含むペプチドC-G-G-Cap１〜７５（G34-G44-G47）による）、1c（配列番号５を含むペプチドC-G-G-Cap１〜７５（G31-G44-G47）による）及び１d（配列番号４を含むペプチドC-G-G-Cap１〜７５（G34-G44-G47））により試験した。
【０２０９】
表８には、抗原（Elisaアッセイ）又RNA（PCR）の検出によって、そして抗体の検出によって、そしてコンボ（形式１a、１c及び１d）によって、これら様々なセロコンバージョン体上で獲得した結果を与える。８つのセロコンバージョン体のうち４つについて、プロトコール１a、１c及び１dにより、PCRによって検出されるウィルスRNAの出現と矛盾なく、第一陽性試料を検出することが可能になる。抗原の検出と血清学的空白時間の低下に対応する抗体の検出との間の平均日数は、２つのプロトコール１a、1c及び1dについて、３３日である。
【０２１０】
【表８】
2006501151.tif 000029
【０２１１】
実施例６：性能の比較及びセロコンバージョン血清に対する様々な技術の分類
異なる特異性を示す、市販されて入手可能なセロコンバージョンパネル（BBI、Boston Biomedica Campany、USA；Impaht、USA）を本発明のプロトコール１a及び１cで、そして2002年2月に米国においてMDA（Medical Devices Agency）によって生み出されたクラス分けに従う最良な中の１つである１組の市販され入手可能な試験で試験した。この比較は、RNAの検出（PCR試験）に対する検出における日数上の遅延を考慮している。従って、全体平均が最小を示すキットが、早期検出の観点から最も有効である（表９）。
【０２１２】
【表９】
2006501151.tif 000030
【０２１３】
本発明のプロトコール１a、１c及び１dにより生じた結果は、抗体が出現する前の、HCV感染のより早い検出を可能にする（プロトコール１aについて、PCRに対する日数的遅延はたった８日、プロトコール１cについては７．７日、そしてプロトコール１dについては７．４日）である。
【０２１４】
従って、本発明に従い記載された試験は、このクラス分けを最初行い、これは抗体と突然変異させたペプチド（それらは異なる）のペアを使用する３つのプロトコール（１a、１c及び１d）による。
【０２１５】
結論として、本発明のプロトコール１a、１c及び１dにより獲得した結果は、後者によりHCVによる感染症を非常に早く、PCRと非常に近い感度で、有効に検出することが可能になり、しかも同時に、患者のセロコンバージョン後の血清学的な展開を追跡することも可能になる。
【０２１６】
実施例７：３つのコンボプロトコール、１a、１c及び１dの特異性の研究
特異性の研究を血液供与体に由来する血清（Etablissment Francais du Sang、Rungis、France）により行った。様々なプロトコール１a、１c及び１dについて獲得された結果をそれぞれ、表１０、１１及び１２に与えている。
【０２１７】
【表１０】
2006501151.tif 000031
【０２１８】
【表１１】
2006501151.tif 000032
【０２１９】
【表１２】
2006501151.tif 000033
【０２２０】
どのプロトコール（１a、１c又は１d）を使用しても、特異性の観点から良好な性能が確認された。
【０２２１】
この記載全体に渡り記されて良いように、本発明のHCVコンボ試験は、カプシド抗原及び抗カプシド抗体の、カプシドの単一及び同じタンパク質領域に対する、捕獲の長所により、PCRに非常に近く且つ所定の従来技術よりもより良い感度を供することができる。
【０２２２】
この結果は驚異的であり、その理由は、標的カプシドペプチドを修飾する際に、本発明者は、所定の有意な数の抗体の検出がロスされることのリスクを考慮したことにある。
【０２２３】
実施例８：ヒト免疫欠損ウィルス（HIV-1）による感染症の検出
本発明中に記載の方法は、抗原と抗体の同時検出が所望されている、任意の種類の感染性微生物が理由の感染症（例えば、ウィルス、様々なタイプの肝炎の原因となるウィルス、ヒトのエイズ（HIV-1、グループＯ、HIV-2など）又はサルのエイズの原因となるレトロウィルス、サイトメガロウィルス（CMV）、デングウィルスなどのフラビウィルス、そしてまた細菌、寄生微生物など）の検出に対して適用される。
【０２２４】
例８は、ヒト免疫欠損ウィルス（HIV-1）のP25ウィルス抗原（gag）と抗P25抗体の同時検出に対する本発明の適用を示す。
【０２２５】
プロトコールa、b及びcのための共通の材料：
１）選定の固相：Maxisorpマイクロプレート、Nunc（Denmark）。
【０２２６】
２）第１段階の希釈剤：トリスNaClバッファー、０.０５M、pH６．７、０.２５％のNP40（IGEPAL CA 630、Sigma）を補った。
【０２２７】
３）第２段階の希釈剤：トリスNaClバッファー、０.０１M、pH７．４、０.１％のTween20を補った。
【０２２８】
４）露出溶液：この露出溶液は以下のものからなる。
【０２２９】
４a）基質バッファー：クエン酸（０．０７５M）と酢酸ナトリウム（０．１M）の溶液（pH４．０、０．０１５％のH2O2及び４％のジメチルスルホキシド（DMSO）（PROLABO）を含む）、及び
【０２３０】
４b）発色試薬：テトラメチルベンジジン（TMB、Sigma）（基質バッファー中０．７mMの最終濃度）。
【０２３１】
５)停止溶液：１NのH2SO4
【０２３２】
プロトコールa：抗HIV-1P25抗体の検出の材料
以下の配列：
【化２１】
2006501151.tif 000034
に対応し、そしてHIV-1MのP25タンパク質のコンセンサス配列
【化２２】
2006501151.tif 000035
と比較した場合突然変異（G295-G298-G310-G321-F3216）を含んで成る突然変異した合成ペプチド。
【０２３３】
ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG（H+L）ヒツジポリクローナル抗体接合体（Bio−Rad）。この接合体を、第２段階の希釈（上記）で使用する前に希釈し、当業者に周知の条件下、最大限に十分ドキュメント化されたある陽性試料を高光密で獲得するようにした。
【０２３４】
プロトコールb：HIV-1P25抗原の検出のための材料
下のHIV-1MP25タンパク質の配列：
【化２３】
2006501151.tif 000036
を認識する抗P25モノクローナル抗体Pm25。
【０２３５】
ペルオキシダーゼで標識した上記モノクローナル抗体Pm25の接合体。この接合体を、第２段階の希釈（上記）で使用する前に希釈し、当業者に周知の条件下、十分ドキュメント化された陽性試料を高光密で獲得するようにした。
【０２３６】
プロトコールc：抗P25抗体とHIV-1P25抗原の同時（「コンボ」）検出のための材料
下の配列：
【化２４】
2006501151.tif 000037
に対応する突然変異させた合成ペプチド。
【０２３７】
下のHIV-1MP25タンパク質の配列：
【化２５】
2006501151.tif 000038
を認識するモノクローナル抗体Pm25。
【０２３８】
ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG（H+L）ヒツジモノクローナル抗体接合体（Bio-Rad）。
【０２３９】
ペルオキシダーゼで標識した上記モノクローナル抗体Pm25の接合体。
【０２４０】
上記２つの免疫ペルオキシダーゼ接合体を、第２段階の希釈（上記）で使用する前に、希釈し、当業者に周知の条件下、十分にドキュメント化された陽性試料を高光密で獲得するようにした。
【０２４１】
方法：
プロトコールa：抗HIV-1P25抗体の検出
このアッセイの原理は、抗HIV-1P25抗体を検出するための間接型の免疫酵素学的方法に基づく。
【０２４２】
それは以下の段階に基づく：
最初にコーティング溶液をカルボン酸塩バッファー、pH９．６中、：配列番号２２を含んで成る突然変異させたペプチド配列番号２２（G295-G298-G310-G312-F316）
で調製する。
【０２４３】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０２４４】
このマイクロタイタープレートを一晩周囲温度（１８〜２４℃）でインキュベートする。
【０２４５】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース及び２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を加えることによって飽和させる。
【０２４６】
８０μlの第１希釈物をそして２０μlの試料（血清又は血しょう）を連続して各杯状体に分配する。
【０２４７】
反応媒質を３７℃で１時間に渡りインキュベートする。もしHCV抗HIV-1P25抗体が存在すれば、それらは固相に対して結合したペプチドに対して結合する。
【０２４８】
次いで、プレートを、洗浄液（トリスNaClバッファー、０．０１M、pH７．４、０．１%Tween20を補った）を使用して洗浄（３回）する。
【０２４９】
ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG抗体（H+L）を含む第２段階希釈物１００μlを各杯状体に入れる。反応媒質を周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡りインキュベートする。標識した抗ヒトIgG（H+L）抗体が順に、固相上に維持されている特異的抗体に対して結合する。
【０２５０】
次いで、プレートを、洗浄液（トリスNaClバッファー、０．０１M、pH７．４、０．１%Tween20を補った）を使用して洗浄（５回）する。従って、結合しなかった抗ヒトIgG接合体は取り除かれる。
【０２５１】
１００μlの露出溶液を各杯状体に加える。この反応を、暗中、周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡り展開させる。
【０２５２】
次いで、１００μlの停止溶液を各杯状体に加える。
【０２５３】
反応が停止した後、光密度を分光光度計により４５０／６２０nmで読む。
【０２５４】
プロトコールb：HIV-1P25抗原の検出
このアッセイの原理は、HIV-1P25抗原を検出するためのサンドイッチ型の方法に基づく。それは以下の段階に基づいている。
【０２５５】
最初にコーティング溶液を：炭酸塩バッファー、pH９．６中の抗HIV-1P25モノクローナル抗体（Pm25）で調製する。
【０２５６】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０２５７】
以下の段階は、第２段階までプロトコールaと同じである。
【０２５８】
第２段階について、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体Pm25を含む第２段階の希釈液１００μｌを分配する。反応媒質を周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡りインキュベートする。次いで、標識したモノクローナル抗体Pm25が、存在する場合は、固相上に維持されているP25抗原に対して結合する。
【０２５９】
最終段階は、プロトコールaと同じである。
【０２６０】
プロトコールc：試料（血清又は血しょう）中のHIV-1P25抗原及び抗HIV-1P25抗体の同時（「コンボ」）検出
このアッセイの原理は、抗原を検出するためのサンドイッチ型、及び抗体を検出するための間接型の方法に基づく。
【０２６１】
それは以下の段階に基づく：
最初にコーティング溶液を：
●突然変異させたペプチド配列番号２２（G295-G298-G310-G312-F316）及び
●炭酸塩バッファー、pH９．６中の抗P25モノクローナル抗体（Pm25）
で調製する。
【０２６２】
次いで、マイクロタイタープレート（Nunc、Maxisorp）の杯状体を上記溶液により１１０μl／杯状体の割合でコーティングする。
【０２６３】
このマイクロタイタープレートを一晩周囲温度（１８〜２４℃）でインキュベートする。
【０２６４】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース及び２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７）を加えることによって飽和させる。
【０２６５】
８０μlの第１希釈物を、そして２０μlの試料（血清又は血しょう）を連続して各杯状体に入れる。
【０２６６】
反応媒質を３７℃で１時間に渡りインキュベートする。存在する可能性のあるP25抗原が固相のモノクローナル抗体に対して結合する。類似して、もし抗P25抗体が存在すれば、それらは固相に対して結合した抗原性ペプチドに対して結合する。
【０２６７】
以下の段階は、第２段階まで、プロトコール１aと同じである。
【０２６８】
第２段階について、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体Pm25及びペルオキシダーゼで標識した抗ヒトIgG（H+L）抗体を含む第２段階の希釈物１００μlを分配する。反応媒質を周囲温度（１８〜２４℃）で３０分に渡りインキュベートする。次いで、標識したモノクローナル抗体Pm25が固相上に維持されているP25抗原に対して結合する。類似して、標識された抗ヒトIgG（H+L）抗体が、順番に、固相上に維持されている特異的抗体に対して結合する。
【０２６９】
最終段階はプロトコールaと同じである。
【０２７０】
【表１３】
2006501151.tif 000039
【０２７１】
ここでも類似して留意できるように、本発明では、HIV-1P25抗原及び抗HIV-1P25抗体の捕獲を、カプシドの単一且つ同じタンパク領域：抗原特異性の領域（AA308〜322）（固定化された抗P25抗体（Pm25）がそれを介してP25抗原を捕獲する）を明らかに伴う抗P25抗体（AA293〜350）を捕獲する抗原性領域、で行う。
【０２７２】
当業者にはいうまでもなく、例えば、基礎として本発明の例８を使用することで、HIV-1P25（gag）抗原、抗HIV-1P25抗体及びHIV-1のgp41糖タンパク質（エンベロープ）に対して向けられた抗体を同時に検出するための免疫アッセイも容易に行われて良い。抗HIV-1gp41抗体を検出するために、限定ではない例として、それら自身公知である、天然又は組み換えgp41又はJW. Grannらの刊行物（1987）によって記載されたような、gp41の免疫優占的エピトープを含むペプチド、のいずれか全部を使用しても良い。
【０２７３】
HIV-2P26（gag）抗原、抗HIV-2P26抗体及びHIV-2のgp36糖タンパク質（エンベロープ）に対して向けられた抗体を同時に検出するための免疫アッセイも本発明の範囲内である。当業者は、P26抗原を検出するために、公知である抗P26抗体を、そして抗P26抗体を検出するために、例えば、Guyaderらによって公表されたHIV-2配列（1987）に由来しうるP26の抗原性ペプチドを使用しても良い。抗gp36抗体を検出するために、当業者は、限定ではないとして、公知である、天然又は組み換えgp36、又はJW.Gnannらの刊行物（1987）によって記載されたようなgp36の免疫優先的エピトープを含むペプチド、のいずれか全部を使用しても良い。
【０２７４】
当業者は容易に、HIV-1P25抗原、HIV-2P26抗原、抗HIV-1P25抗体、抗HIV-2P26抗体、抗HIV-1gp41抗体及び抗HIV-2gp36抗体の検出を同時に組み合わせる「HIV-1+HIV-2コンボ」免疫アッセイをも行うことができ、それも本発明の範囲内である。
【０２７５】
【表１４】
2006501151.tif 000040
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】本発明以前に使用されていた、固相に対して結合させた捕獲抗体及び未修飾捕獲抗原によるタイプの検出の方法を案図示している。この図案は、患者の抗体と検出抗体の、捕獲抗原に対する結合に関する競合を示している。
【図２】比較として、本発明の実施態様を示す図である。捕獲抗原が突然変異しているので、検出抗体によって認識されることはもはやない。従って、抗体の検出と抗原の検出との間で干渉が生じることはない。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月14日(2005.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース、２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）及び１０mMのEDTAを含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７）を加えることによって飽和させる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース、２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）及び１０mMのEDTAを含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７）を加えることによって飽和させる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース、２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）及び１０mMのEDTAを含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７）を加えることによって飽和させる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４５】
コーティング溶液を取り除いた後、プレートを、０．１%のTween20を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７．４）を使用して洗浄し、そして５%のスクロース及び２５%のスキムミルク（Candida（登録商標）、France、又は他の同等な市販されており入手可能なスキムミルク）を含むリン酸塩バッファー（０．０１M、pH７）を加えることによって飽和させる。
【国際調査報告】
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