(57)【要約】制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーションのような、核酸分子の部位特異的組換え並びに末端―末端連結又はリンクを組み合わせて使用することによって、核酸分子をクローニングかつ発現させるための組換えＤＮＡベクターおよび方法。これらのＤＮＡ、ベクターおよび方法を使用すると、インビトロおよびインビボの両方において様々なＤＮＡセグメントを挿入する、置換する、および伝達させることができる。さらに、これらのリンカーを使用して対象の遺伝子を発現ベクター内に１工程でクローニングするために使用できるリンカー分子および方法も開示する。リンカー配列はクローニングのためのアダプター配列、並びに翻訳効率を増加させるための真核生物および原核生物リボソーム結合部位を含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親分子１が対象の核酸フラグメントを含み、そして、親分子２が対象の前記核酸フラグメントの転写、翻訳もしくは複製に影響を及ぼすことのできる少なくとも１つの機能エレメントを含む、対象の核酸フラグメントを親分子１から親分子２へ伝達させるための方法、若しくは、親分子２が対象の核酸フラグメントを含み、親分子１が対象の前記核酸フラグメントの転写、翻訳もしくは複製に影響を及ぼすことのできる少なくとも１つの機能エレメントを含む、対象の核酸フラグメントを親分子２から親分子１へ伝達させるための方法であって、
親分子１は直鎖状もしくは環状であり、そして、親分子２は直鎖状もしくは環状であり；
親分子１が第１組換え部位を含み、親分子２は第２組換え部位を含み；
親分子１が直鎖状である場合は第１連結可能末端（ＪＥ１）を含み、そして環状である場合は第１連結可能末端に転換できる第１領域（ＣＳ１）を含み；そして  
親分子２が直鎖状である場合は第２連結可能末端（ＪＥ２）を含み、そして環状である場合は第２連結可能末端に転換できる第２領域（ＣＳ２）を含んでおり；
前記方法が
（１）親分子１と親分子２とをインビトロで混合する工程と；
（２）（ａ）前記第１および第２組換え部位との間の部位特異的組換え、又は、（ｂ）（ｉ）前記第１および第２連結可能末端を連結する工程、若しくは（ｉｉ）最初に、１以上の連結可能末端内に転換できる１以上の領域を転換させ、次に連結可能末端を連結させる工程、のいずれかによって、対象の前記核酸分子および少なくとも１つの機能エレメントを含む中間体分子を形成する工程と；そして
（３）対象の前記核酸分子と少なくとも１つの前記機能エレメントを含む環状産物ベクターを形成するために、（ａ）前記第１および第２連結可能末端を連結させる工程、または（ｂ）前記第１および第２組換え部位間での部位特異的組換えのいずれかによって前記中間体を各々処理する工程、を含む方法。
【請求項２】
２つの組換え部位間での１の組換え反応からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、親分子がいずれも直鎖状であり、そして、前記方法が（１）最初に、連結した中間体分子を形成するために２つの親分子を連結し、次に連結した中間体分子に分子内組換えを受けることを許容する工程；若しくは、（２）最初に、２つの直鎖状中間体分子を形成するために２つの親分子に組換えを受けることを許容させ、次に２つの直鎖状中間体分子における一方の上で、２つの連結可能末端を連結する工程とからなる方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記２つの親分子のうち少なくとも一方が環状であり、そして前記方法が（１）前記２つの親分子が部位特異的組換えを受けることを許容する工程と、（２）前記ＣＳ１もしくはＣＳ２またはその両方を連結可能末端に転換する工程と、そして（３）前記連結可能末端を連結する工程とからなる方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記２つの親分子のうち少なくとも一方が環状であり、そして前記方法が（１）前記ＣＳ１もしくはＣＳ２またはその両方を連結可能末端に転換させて２つの直鎖状中間体分子を形成する工程と、（２）前記２つの直鎖状中間体分子が部位特異的組換えを受けることを許容する工程と、そして（３）前記連結可能末端を連結する工程とからなる方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記２つの親分子のうち少なくとも一方が環状であり、そして、前記方法が（１）前記ＣＳ１もしくはＣＳ２またはその両方を連結可能末端に転換させて２つの直鎖状中間体分子を形成する工程と、（２）前記連結可能末端を連結する工程と、そして（３）前記２つの直鎖状中間体分子が部位特異的組換えを受けることを許容する工程とからなる方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、（１）前記部位特異的組換え工程と、（２）１以上の連結可能末端に転換できる１以上の前記領域を転換させる工程と、そして（３）前記連結可能末端を連結する工程とのうちの少なくとも２つのための全試薬が１つの反応容器へ一緒に添加される方法。
【請求項８】
ＪＥ１もしくはＪＥ２以外の直鎖状親分子または中間体の１の末端が不活化されて前記連結反応によって連結することのできない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＪＥ１もしくはＪＥ２以外の直鎖状親分子または中間体の１の末端が脱リン酸化によって不活化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能エレメントが、プロモーター、選択マーカー、複製起点、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、Ｃ−末端、Ｎ−末端タグ、およびプロテアーゼ切断部位からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記連結可能末端が、少なくとも１つの制限酵素を用いた切断により産生した末端、平滑末端、相補的もしくは実質的に相補的な一本鎖塩基を備えるパートナー連結可能末端へアニールするために十分な長さの突出している一本鎖５’および３’塩基を備える末端、または、適当なパートナー連結可能末端へ前記末端を連結できる共有結合的に付着したタンパク質を含む末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え部位が、ａｔｔＢ（ｗｔ）、ａｔｔＰ（ｗｔ）、ａｔｔＬ（ｗｔ）、ａｔｔＲ（ｗｔ）、ｌｏｘＰ（ｗｔ）、ｆｒｔ（ｗｔ）またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換え部位が、ａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２、ａｔｔＢ３、ａｔｔＰｌ、ａｔｔＰ２、ａｔｔＰ３、ａｔｔＬｌ、ａｔｔＬ２、ａｔｔＬ３、ａｔｔＲｌ、ａｔｔＲ２、またはａｔｔＲ３からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１以上の宿主細胞を目的環状産物ベクターと接触させる工程；および
前記環状産物ベクターを含む宿主細胞を選択する工程、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
産物ベクターにおいて、前記核酸フラグメントが前記機能エレメントの下流にあり、そして、組換え認識部位が前記機能エレメントの下流および前記核酸フラグメントの上流に位置していない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの前記機能エレメントが翻訳シグナルであり、前記核酸フラグメントがポリペプチドをコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記産物ベクターにおける翻訳シグナルおよび最初に翻訳されたＡＴＧコドンが１２以下のヌクレオチドにより分離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、親分子１および親分子２の両方が直鎖状であり、親分子１が対象の前記核酸フラグメントを含み、親分子２が少なくとも１つの前記機能エレメントを含み、そして
親分子１および親分子２が最初に、前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でインキュベートされ、それにより２つの末端を有し、そして、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの機能エレメントを含む直鎖状組換え産物分子が産生され、前記直鎖状組換え産物分子の前記２つの末端は前記第１連結可能末端および第２連結可能末端であり；そして、
前記直鎖状組換え産物分子が前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件で少なくとも１つのライゲーションタンパク質の存在下でインキュベートされ、それにより前記環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、親分子１および親分子２の両方が直鎖状であり、親分子１が対象の前記核酸フラグメントを含み、親分子２が少なくとも１つの機能エレメントを含み、および
親分子１および親分子２が最初に、前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件下でインキュベートされ、それにより前記第１および第２組換え部位、および、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの機能エレメントを含む直鎖状連結産物が産生され；そして、
直鎖状連結産物分子が前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でインキュベートされ、それにより環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法であって、親分子１が直鎖状であり、そして、親分子２が環状であり、親分子１が対象の前記核酸フラグメントを含み、親分子２が少なくとも１つの機能エレメントを含み、そして、
親分子１および親分子２が最初に、前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でインキュベートされ、それにより２つの末端を有し、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの前記機能エレメントを含む、直鎖状組換え産物分子が産生され、前記直鎖状組換え産物分子における前記２つの末端の一方は前記第１連結可能末端であり；そして、
前記直鎖状組換え産物が第２連結可能末端に転換できる領域が前記第２連結可能末端に転換することを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの制限酵素の存在下でさらにインキュベートされ、それにより２つの末端を有し、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの前記機能エレメントを含む直鎖状消化産物が産生され、前記直鎖状組換え産物分子の２つの末端は前記第１連結可能末端および第２連結可能末端であり；そして、
前記直鎖状消化産物分子が前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件下でインキュベートされ、それにより前記環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、親分子１が直鎖状であり、そして、親分子２が環状であり、親分子１が対象の前記核酸フラグメントを含み、そして、親分子２が対象の前記核酸フラグメントを発現させるために適当な少なくとも１つの機能エレメントを含み、そして、
親分子２が最初に、第２連結可能末端に転換できる前記領域が、前記第２連結可能末端に転換させることを生じさせるために十分な条件下で少なくとも１つの制限酵素の存在下でインキュベートされ、それにより第２連結可能末端を有する直鎖状消化産物が産生され、
前記直鎖状消化産物および親分子１が次に前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件下でインキュベートされ、それにより対象の前記核酸フラグメント、少なくとも１つの前記機能エレメント、および前記第１および第２組換え部位を含む直鎖状ライゲーション産物が産生され、
前記直鎖状ライゲーション産物は前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でさらにインキュベートされ、それにより前記環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、親分子１が環状であり、そして対象の前記核酸フラグメントを含み、そして、親分子２が直鎖状であり、そして第２連結可能末端および少なくとも１つの機能エレメントを含み、そして、
前記第１および第２ベクターが最初に、前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でインキュベートされ、それにより２つの末端を有し、そして、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの前記機能エレメントを含む直鎖状組換え産物分子が産生され、前記直鎖状組換え産物分子における前記２つの末端のうち一方は前記第２連結可能末端であり；そして
前記直鎖状組換え産物が前記第１連結可能末端に転換できる前記第１領域を生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの制限酵素の存在下でさらにインキュベートされ、それにより２つの末端を有し、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの前記機能エレメントを含む直鎖状消化産物が産生され、前記直鎖状組換え産物分子の前記２つの末端は前記第１連結可能末端および前記第２連結可能末端であり；そして、
前記直鎖状消化産物分子が前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件下でインキュベートされ、それにより前記環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、親分子１が直鎖状であり、そして、親分子２が環状であり、ここで、親分子２が対象の前記核酸フラグメントを含み、親分子１が少なくとも１つの機能エレメントを含み、そして、
親分子２が最初に、第２連結可能末端に転換できる領域を生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの制限酵素の存在下でインキュベートされ、それにより第２連結可能末端を有する直鎖状消化産物が産生され、
前記直鎖状消化産物および親分子１が次に前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件下でインキュベートされ、それにより対象の前記核酸フラグメント、少なくとも１つの前記機能エレメント、および前記第１および第２組換え部位を含む直鎖状ライゲーション産物が産生され、
前記直鎖状ライゲーション産物が前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でさらにインキュベートされ、それにより前記環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法であって、親分子１および親分子２の両方が環状であり、そして、親分子１および親分子２が最初に、前記第１および第２組換え部位の組換えを生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの組換えタンパク質の存在下でインキュベートされ、それにより対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの前記機能エレメント、および各々前記第１および第２連結可能末端に転換できる前記第１および第２領域を含む環状組換え産物分子が産生され；
前記環状組換え産物が第１連結可能末端に転換できる前記第1領域、および、第２連結可能末端に転換できる第２領域を生じさせるために十分な条件で少なくとも１つの制限酵素の存在下でさらにインキュベートされ、それにより２つの末端を有し、対象の前記核酸フラグメントおよび少なくとも１つの前記機能エレメントを含む直鎖状消化産物が産生され、前記直鎖状組換え産物分子の前記２つの末端は前記第１連結可能末端および前記第２連結可能末端であり；そして
前記直鎖状消化産物分子が前記第１および第２連結可能末端の連結を生じさせるために十分な条件下でインキュベートされ、それにより前記環状産物ベクターが産生される方法。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号１１からなる群から選択される配列を含む核酸分子。
【請求項２６】
配列番号３を含み、ＮＮＮが非−終結コドンを表す、請求項２５に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２７】
ＮＮＮがＧＣＧまたはＧＧＴである、請求項２６に記載のオリゴヌクレオチド分子。
【請求項２８】
対象の核酸フラグメントを増幅させる方法であって、前記核酸フラグメントの５’末端配列および３’末端配列が知られており、前記方法が：
前記核酸フラグメントの５’末端配列のすぐ上流にリンクした配列番号１もしくは配列番号３を含む第１ＰＣＲプライマーと、前記核酸フラグメントの相補鎖の５’末端配列のすぐ上流にリンクした配列番号２を含む第２プライマーとを提供する工程と、
ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させるために適当な条件下で前記第１および第２プライマーを使用して前記核酸分子を増幅させて、第１増幅産物を生産する工程、を含む方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の対象の核酸フラグメントを増幅させる方法であって、さらに、
配列番号１もしくは配列番号３を含む第３プライマーおよび配列番号２を含む第４プライマーを提供する工程と、
前記第３および第４プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応による増幅のために適当な条件下で前記最初に増幅させた増幅産物を増幅させ、前記第１および第２リンカー配列に隣接する前記最初に増幅させた増幅産物を含む第２増幅産物を産生する工程、を含む方法。
【請求項３０】
前記第１、第２、第３および第４プライマーが、前記第１増幅産物が産生される前に１つの反応容器へ一緒に添加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の前記第２増幅産物をレシーバーベクター内へ組み込む工程を含む、対象の核酸フラグメントを発現させることのできるベクターを産生する方法。
【請求項３２】
レシーバーベクターが、プロモーター、複製起点、陽性選択マーカー遺伝子、および、陰性選択マーカー遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１ＰＣＲプライマーが配列番号３を含み、ここで、ＮＮＮが非−終結コドンを表す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＮＮがＣＧＴまたはＧＣＧである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法により親分子１から親分子２へ対象核酸フラグメントを伝達させるためのキットであって、該キットが少なくとも親分子１および親分子２を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。より詳細には、本発明は、エンドヌクレアーゼ制限消化およびライゲーション等のような、部位特異的組換え、及び、連結反応を組み合わせることによって、核酸分子をクローニングかつ発現させるための組換えＤＮＡベクターおよび方法を提供する。これらのＤＮＡ、ベクターおよび方法を使用すると、インビトロおよびインビボの両方において様々なＤＮＡセグメントを挿入する、置換する、および、伝達させることができる。
【０００２】
本発明は、対象遺伝子を発現できる発現ベクター等の、供与分子および受容分子の両方から所望のエレメントを含有する核酸分子を産生する目的で、１つの分子もしくはベクター（遺伝子ドナー）から別の分子もしくはベクター（遺伝子受容体（レシーバー））へ対象のＤＮＡを伝達するために、制限酵素消化およびライゲーションのような、遺伝子部位特異的組換え、及び、核酸分子を消化して連結するための技術をいずれも利用するクローニングストラテジーを開示する。
【背景技術】
【０００３】
近年のゲノム科学技術における進歩は、ＤＮＡもしくは遺伝子レベルでの生体についての膨大な量の豊富な情報を創出してきた。生命工学分野の当業者が現在直面している課題は、これらのＤＮＡまたは推定遺伝子の機能を解明することであるが、このためには多くの場合、これらの遺伝子に関するタンパク質レベルでの試験が必要とされる。通常、機能的ゲノム科学研究にはｃＤＮＡクローンの生成およびその後のシーケンシングが含まれるが、これらのクローンについてのタンパク質もしくはアミノ酸レベルでの詳細な機能的および／または構造的試験はしばしば適当な系においてこれらの遺伝子もしくはＤＮＡインサートを十分な量および安定性形態で発現させる工程を含んでいる。しかしこれらのｃＤＮＡクローンは、タンパク質を発現させるためには適切ではないことが多く、これらのクローン中のｃＤＮＡインサートを適当な発現ベクターへサブクローニングする必要が生じる。試験する必要のあるクローン数が絶対的に多いので、伝統的クローニング法およびサブクローニング法は、個別サブクローニングが必要とされる上にそれらの効率が低いために明らかに適切ではない。そこで現在では、ゲノム科学研究プロジェクトからのｃＤＮＡクローン等の１つのベクター（しばしば「ドナーベクター」と呼ばれる）から適切に適合する発現ベクター（「アクセプターベクター」）への迅速、精密かつ指向性の遺伝子伝達を可能にする技術に対する切迫した要求がますます高まっている。好ましくは、この方法およびアクセプターベクターは、（１）個別の、しばしば厄介で時間を消費するサブクローニングストラテジーを排除し、（２）数百個の遺伝子の迅速なスクリーニングを一度に、そして（３）様々な宿主生物または細胞系において行うことを許容しなければならない。さらに、新規の方法およびベクターは、情報科学および自動制御装置を使用する広範囲のゲノムに関する試験に適合しなければならない。
【０００４】
部位特異的組換え系、または制限エンドヌクレアーゼ消化およびその後のライゲーションを利用するストラテジーおよび市販製品は、先行技術において既に存在する。制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーションは、分子生物学および生物工学において長年に渡り使用されており、十分に確立した技術である。同様に、組換え工程および関連タンパク質は当業者にはよく知られており、様々な生物由来の極めて多数の組換え系が報告されている。例えば、ランディ  エイ（Ｌａｎｄｙ  Ａ．），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７；エイブレムスキー（Ａｂｒｅｍｓｋｉ）ら，１９８６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：３９１；ヘス（Ｈｏｅｓｓ）ら，１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：２２８７；キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ），１９９２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７４９５；キャン（Ｑｉａｎ）ら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７７９４；アラキ（Ａｒａｋｉ）ら，１９９２，Ｂｉｏｌ．２２５：２５；メーサー（Ｍａｅｓｅｒ）ら，１９９１，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０：１７０−１７６を参照。
【０００５】
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中でタンパク質を産生するＤＮＡセグメントを構築するためのλファージの酵素的部位特異的組換えおよび野生型組換え部位ａｔｔＢおよびａｔｔＰの使用は、米国特許第４，６７３，６４０号に開示された。インビボのλ組換え系を備えるプロモーターに隣接する野生型ａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位間の分子内組換えは、ハサン（Ｈａｓａｎ）ら（１９８７，Ｇｅｎｅ  ５６：１４５−１５１）によって記載されている。
【０００６】
パラツォッロ（Ｐａｌａｚｚｏｌｏ）ら，１９９０，Ｇｅｎｅ  ８８：２５−３６は、クローン化ＤＮＡ配列の外側で野生型ｌｏｘＰ部位間に位置するバクテリオファージλアームを有するλファージベクターを開示している。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する大腸菌細胞は、これらのファージベクターによって形質転換され、結果としてｌｏｘＰ部位間の組換えおよびクローン化ｃＤＮＡを含むプラスミドレプリコンのインビボでの切り出しが生じる。
【０００７】
選択可能なマーカーを有する発現ベクター内へ部分ゲノムＤＮＡを挿入する方法は、ポスファイ（Ｐｏｓｆａｉ）ら（１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３９２−２３９８）に記載された。マーカーは２つの野生型ｆｒｔ認識配列に隣接し、細胞中のＦＬＰリコンビナーゼはベクターを規定部位（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｉｔｅ）でゲノム内に組み込む。
【０００８】
米国特許第５，４３４，０６６号は、部位間のインビボ組換えのために２つのｌｏｘＰ部位を含有するＤＮＡに対するＣｒｅ等の部位特異的リコンビナーゼの使用を開示している。
【０００９】
ウォーターハウス（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１（９）：２２６５（１９９３））は、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＰ  ５１１部位間での組換えを使用して、様々なファージベクター中での特定抗体の軽鎖および重鎖をクローニングするインビボ法を開示している。Ｃｒｅタンパク質は宿主細胞内で２つの親分子（１つのプラスミド、１つのファージ）上に作用し、平衡状態にある４種の産物：２種の相違する共組換え体（ｌｏｘＰまたはｌｏｘＰ  ５１１部位のどちらかでの組換えによって産生する）、および２種の娘分子を産生するが、そのうちの１種が目的産物であった。
【００１０】
シュレイク（Ｓｃｈｌａｋｅ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：１２７４６−１２７５１（１９９４））は、各々が野生型およびスペーサー突然変異ＦＲＴ組換え部位によって隣接している規定の染色体位置で発現カセットを交換するためのインビボ法を開示している。二重逆数クロスオーバー（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）は、部位特異的組換えのためにこのＦＬＰ／ＦＲＴ系を使用することにより培養哺乳類細胞において媒介された。
【００１１】
レプリコン間で遺伝情報を伝達させるためには、トランスポザーゼファミリーの酵素もまた使用されてきた。トランスボゾンは構造的に可変性であり、単一または化合物であると記載されているが、典型的には逆位配向に構築されたＤＮＡ配列に隣接するリコンビナーゼ遺伝子をコードする。トランスボゾンの組み込みは、ランダム、または高度に特異的な可能性がある。レプリコン間のＤＮＡセグメントのインビボ移動へは、高度に部位特異的であるＴｎ７等の代表的物質が適用されてきた（ラックロウ（Ｌｕｃｋｌｏｗ）ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：４５６６−４５７９（１９９３））。
【００１２】
ディヴァイン（Ｄｅｖｉｎｅ）ら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２（１９９４））は、酵母ＴＹ１ウイルス様粒子のインテグラーゼを利用する系を開示している。対象ＤＮＡセグメントは、標準方法を使用してトランスボゾン様エレメントＴＹ１の末端間でクローニングされる。ＴＹ１インテグラーゼの存在下では、結果として生じるエレメントが第２標的ＤＮＡ分子内へランダムに組み込まれる。
【００１３】
ファーマー（Ｆａｒｍｅｒ）らの米国特許第６，４１０，３１７  Ｂ１号は、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用して発現ベクターを産生する方法を開示している。この系では、制限エンドヌクレアーゼ消化およびライゲーションによって、対象遺伝子が「ドナーベクター」のポリリンカー部位、またはマルチクローニング部位（「ＭＣＳ」）内に挿入される。ＭＣＳは、同一方向に配向されたバクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼの特異的認識部位である２つのｌｏｘＰ部位に隣接している。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で、ドナーベクターの対象遺伝子は、対象遺伝子が挿入される１つのｌｏｘＰ部位を含有する「アクセプター」もしくは受容（レシーバー）ベクターへ伝達させられる。アクセプターベクターは一般に、適当なプロモーター、適当な１種以上のマーカー遺伝子、適当なペプチドタグ、および複製起点等の発現ベクターが必要とする様々な他のエレメントをさらに含有する。そこでアクセプターベクターは、多くの発現系で発現するために適合すると開示されている所望の発現ベクターに転換される。
【００１４】
ハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）らへの米国特許第６，２７７，６０８  Ｂ１号は、少なくとも１つのリコンビナーゼ、１つのインサートドナーおよび１つのベクタードナーの系を使用する代替ストラテジーを開示している。インサートドナーは２つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含有しており、それらは各々固有のリコンビナーゼによって認識されるが、相互の組換えが生じることはない。同様に、ベクタードナーもまた同じ２種のリコンビナーゼによって認識される２つの部位特異的リコンビナーゼ認識部位を含有する。インサートドナー上の１つのリコンビナーゼに対する認識部位はベクタードナー上の同じリコンビナーゼに対する認識部位と組み換えることができ、そして同様に、他のリコンビナーゼに対する認識部位はそのリコンビナーゼに対する認識部位と組み換えることができる。１つのリコンビナーゼの存在下では、２つのドナー分子が組換えにより環状共組換え体を形成し、これは第２リコンビナーゼの存在下では１つは所望の発現ベクターであり、もう１つは副産物である、２つの環状分子に解離する。ハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）らにおいて実証された特異的リコンビナーゼ／認識部位系は、バクテリオファージλ由来のよく知られているインテグラーゼ／ａｔｔ系である（例えば、ランディ（Ｌａｎｄｙ），１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７を参照）。
【００１５】
国際特許出願第０２／４６３７２号（チェストナット（Ｃｈｅｓｔｎｕｔ）ら，２００２）は、複数の組換え部位および／または複数のトポイソメラーゼ認識部位を有するベクターを使用して２つ以上の相違する核酸分子を同時にクローニングする方法を開示している。公開された米国特許出願第２００３０１２４５５５号（ブラッシュ（Ｂｒａｓｃｈ）ら）は、対象の、詳細にはｃＤＮＡライブラリー上の核酸分子の集団を１つまたは２つの組換え部位を有するベクターにクローニングする方法を開示している。この方法は、２つ以上の組換え工程および複数の組換え部位を必要とする。しかし部位特異的組換えを利用するこれらのクローニング法は、所望の１つ以上のＤＮＡセグメントもしくは１つ以上のインサートを含有するドナーベクターの最初の構築、およびその後の１つ以上のセグメントを発現させるための、第２の所望の発現ベクター内への１つ以上のセグメントの伝達を必要とする。
【００１６】
さらに、上記の方法の一部では、対象ＤＮＡは部位特異的組換えによってアクセプターベクターへ伝達させられる。発現ベクターのプロモーターおよび他の調節エレメントは、常に新しく形成された１つ以上の組換え認識部位の片側（上流）に配置され、他方対象インサート配列もしくはＤＮＡは常に同じ組換え認識部位の他方の側（下流）上にある。その結果として、１つ以上の組換え認識部位のヌクレオチドはプロモーター（および／または他の発現シグナル）と対象ＤＮＡのコーディング配列との中間に配置され、同様に発現して、発現産物中で追加の、そして望ましくないアミノ酸残基を生じさせる可能性がある。例えば、インテグラーゼ／ａｔｔクローニング系では、インサートＤＮＡから発現したタンパク質はタグペプチドをコードするＤＮＡ配列とインサートＤＮＡに隣接するａｔｔ部位のＤＮＡ配列発現の結果として少なくとも８アミノ酸からなる余剰のフラグメント（ｅｘｔｒａ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を含有している。一部の場合には、これらの余剰のアミノ酸（ｅｘｔｒａ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）は、タンパク質発現の効率、並びに発現したタンパク質の構造および機能に影響を及ぼす可能性があるので、望ましくない。それらは、タンパク質の正確な折畳みおよび／または立体配置にさらに影響を及ぼし、そして研究者らにとって極めて重要な問題である融合タンパク質の生化学的および生物理学的特性に影響を及ぼす、もしくは変化させることがある。
【００１７】
先行技術の組換えクローニング法のまた別の望ましくない側面は、クローニング工程のために長いオリゴヌクレオチドプライマーを合成する必要に関連する。対象遺伝子は、常にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅させ、次にベクターにクローニングする必要がある。ＰＣＲプライマーは、３’末端での遺伝子特異的配列に加えて、リコンビナーゼ／認識部位を含有する５’末端でのリンカー配列を含有するように工学的に作製されている。これらのリンカー配列は、その後の部位特異的組換え反応を可能にするために適合する。これらのリンカー配列はしばしば数十ヌクレオチドの長さであり、それらの合成を行うにはクローニングに相当に多額の費用を追加する必要が生じる。さらに、プライマーが長いほど、化学合成中に導入されるプライマーの誤差確率が高くなる。
【００１８】
上記に記載した組換えクローニング法の一部では、１つのベクターから他のベクターへインサートＤＮＡを交換するために、組換え反応のためのインビボ工程が必要とされる。インビボ組換えは、細胞のＤＮＡ組換え修復機構のために相同的組換えを含む極めて複雑なプロセスであり、これらの組換えクローニングによってインサートＤＮＡによって伝えられる遺伝情報が変化する可能性があるという高いリスクがある。
【００１９】
さらに、上記の組換えクローニングおよびサブクローニングのアプローチは全部が、発現ベクター中に発現シグナルおよび対象ＤＮＡを配置するために少なくとも２つの別個のクローニング工程を必要とする。
【００２０】
このため、クローニングおよびシャトルクローニングもしくはサブクローニングのためのまた別の改良された方法およびベクターに対する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の１つの目的は、伝統的クローニング法よりも改良されたクローニング法を提供することである。本発明は、部位特異的組換えを使用する伝統的クローニング法および先行方法が必要とする多数の工程を回避する単純なクローニング法を提供する。下記の詳細な説明で明白になるように、本発明の方法は連結可能末端が平滑末端であるか付着末端であるかとは無関係に、核酸フラグメントを所望の方向でクローニングすることを可能にする。さらに、非可逆的に連結可能末端の使用は、１つの反応容器で多数の反応（組換え、消化およびライゲーション）を実施することもさらに可能にする。
【００２２】
特には大腸菌等の原核生物において使用する目的で発現ベクターを構築するために、先行技術の組換えクローニング法は少なくとも２種の組換えクローニングベクターおよび２回以上の組換え工程を必要とする。先行技術の組換え法は、リボソーム結合部位（例えば、原核生物のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ配列および真核生物のためのコザック配列）を必要とするために不十分である。これは、ベクター内ではプロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が組換え部位の上流に位置しており、遺伝子をベクター内に挿入する組換え後には、形成された組換え部位がＲＢＳとコーディング配列の開始コドンＡＴＧとの間隔を効率的な翻訳のためには遠すぎるほど離れさせるためである。これは組換え部位（ａｔｔＢおよびｌｏｘＰ等）のサイズがたとえ短い場合でさえ同様である。
【００２３】
本発明は、ＲＢＳおよびＲＢＳとコーディング配列の開始コドンとの間で必要なスペーサー配列を含む適当なリンカー配列（例、配列番号３）を提供する。これらのリンカー配列は、対象核酸フラグメントおよび／または適当なベクターに組み込まれる。ベクターが適当なプロモーター（例、大腸菌宿主のためのＴ７）の下流でアダプターを含有する場合は、本発明の連結反応（下記で記載する）は、開始コドンＡＴＧがＲＢＳから適当な距離を置いており、結果として形質転換のために直接使用でき、高い効率で対象フラグメントを発現する発現ベクターを生じさせるような位置に対象フラグメントを配置するであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、部位特異的組換えと核酸分子連結反応、特にはライゲーションとの組み合わせを使用して新規のクローニング法を提供することによって上記の先行技術の欠点を克服する。本発明によると、対象の核酸分子又はフラグメントを親分子１から親分子２へ伝達させるものであって、親分子１が対象の前記核酸分子又はフラグメントを含み、親分子２が対象の前記核酸分子又はフラグメントの転写、翻訳もしくは複製に影響を及ぼすことのできる少なくとも１つの機能エレメントを含み、若しくは、対象の核酸分子又はフラグメントを親分子２から親分子１へ伝達させるためには、親分子２が対象の核酸分子又はフラグメントを含み、親分子１が対象の前記核酸分子又はフラグメントの転写、翻訳もしくは複製に影響を及ぼすことのできる少なくとも１つの機能エレメントを含む、このとき親分子１が直鎖状もしくは環状であり、そして、親分子２は直鎖状もしくは環状であり、；親分子１は第１組換え部位を含み、そして親分子２は第２組換え部位を含み；親分子１は直鎖状である場合は第１連結可能末端を含み、そして環状である場合は第１連結可能末端に転換できる第１領域を含み；そして、親分子２が直鎖状である場合は第２連結可能末端を含み、そして環状である場合は第２連結可能末端に転換できる領域を含む方法が提供されるが、前記方法は親分子１と親分子２とをインビトロで混合する工程と；（ａ）前記第１および第２組換え部位間の部位特異的組換え、または（ｂ）（ｉ）前記第１および第２連結可能末端を連結する工程、もしくは（ｉｉ）最初に、１以上の連結可能末端に転換できる１以上の領域を転換させ、次に連結可能末端を連結させる工程のいずれかによって、対象の前記核酸分子もしくはフラグメントおよび少なくとも１つの機能エレメントを含む中間体分子を形成する工程と；そして、対象の前記核酸分子もしくはフラグメントと少なくとも１つの機能エレメントを含む環状産物ベクターを形成するために、（ａ）前記第１および第２連結可能末端を連結させる工程、または（ｂ）前記第１および第２組換え部位間での部位特異的組換えの、いずれかによって前記中間体を各々処理する工程、を含む。最初に、組換え工程が行われ、その後に制限酵素切断およびライゲーション工程または連結工程が行われてよい。これとは逆に、連結工程が組換え工程に先行して行われてもよい。組換え工程と連結工程との組み合わせは、対象の前記核酸分子もしくはフラグメントを直接的に伝達させ、クローニング工程を単純化する。
【００２５】
さらに、特異的リンカー、これらのリンカーを含むＰＣＲプライマー、並びにこれらのリンカーを使用するネステッドＰＣＲ法を含むＰＣＲ法が開示される。詳細には、これらのプライマーは多数のクローニング目的のために適当な特異的制限エンドヌクレアーゼ部位、並びに原核生物および真核生物翻訳シグナルを含有する。上記に要約した本発明の方法を使用することによるＰＣＲ増幅産物およびプライマーは、対象遺伝子（ＰＣＲ産物）の翻訳シグナルおよびコーディング領域の極めて近位にあるために、１工程で発現ベクターに伝達することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
図面の簡単な説明
図１ａは、１つの親分子が環状で組換え部位（ＲＳ１）および切断部位（ＣＳ１）を含有しており、もう１つの親分子が直鎖状で組換え部位（ＲＳ２）および連結可能末端（ＪＥ２）を含有している、本発明の１の実施形態を示した図である。組換え部位（ＲＳ１およびＲＳ２）間での組換え後に直鎖状中間体が形成され、これは次に適当な１種以上の制限酵素によってＣＳ１で切断されて２つの娘中間体が形成される。これら２つの娘中間体のうち１つだけが所望のセグメントＡおよびＤ、並びに２つの連結可能末端であるＪＥ１およびＪＥ２を含んでいる。これらの２つの連結可能末端は、最終的に連結して環状の目的産物を産生する。親分子のＣＳ１での切断が２つの連結可能末端を産生し、もう１つの親分子が２つの連結可能末端を含んでいる場合は、この図における直鎖状副産物が環状であってよいことに留意されたい。
【００２７】
図１ｂは、親分子がいずれも環状である本発明のまた別の実施形態を示した図である。組換え部位（ＲＳ１およびＲＳ２）間での組換え後に環状中間体が形成され、これは次に適当な１種以上の制限酵素によってＣＳ１およびＣＳ２で切断されて２つの直鎖状娘中間体が形成される。これら２つの娘中間体のうち１つだけが所望のセグメントＡおよびＤ、並びに２つの連結可能末端であるＪＥ１およびＪＥ２を含んでいる。これらの２つの連結可能末端は、最終的に連結して環状の目的産物を産生する。環状中間体のＣＳ１およびＣＳ２での切断が、２つの分子内の適合する連結可能末端を各々が備える直鎖状娘中間体である２つの直鎖状娘中間体を産生する場合は、この図における直鎖状副産物が環状であってよいことに留意されたい。
【００２８】
図１ｃは、親分子がいずれも直鎖状である本発明のまた別の実施形態を示した図である。各親分子は１つの組換え部位および１つの連結可能末端を含んでいる。この図には２つの経路が図示されている。１）組換え部位（ＲＳ１およびＲＳ２）間の組換え後、２つの直鎖状中間体が形成される。これら２つの娘中間体のうち１つだけが所望のセグメントＡおよびＤ、並びに２つの連結可能末端であるＪＥ１およびＪＥ２を含んでいる。これらの２つの連結可能末端は、最終的に結合して環状の目的産物を産生する。２）第１親分子のＪＥ１および第２親分子のＪＥ２との間の連結反応後に、１つの直鎖状中間体が形成される。中間体のＲＳ１とＲＳ２との間の組換えは、所望のセグメントＡおよびＢを備える環状の目的産物を生じさせる。
【００２９】
図２は、図１ｃの詳細な実施形態を示した図である。第１親分子は２つの連結可能末端を含んでいる。組換え部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲ、並びにリコンビナーゼタンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓを使用することによって。親分子のその他の構成要素もまた図示されている。ＲＥ＝制限部位、１／２  ＲＥ＝他の適合する、もしくはパートナーの半分と連結すると適当な制限エンドヌクレアーゼによって認識できる完全ＲＥを形成する制限酵素認識部位の半分。
【００３０】
図３は、図２に示した実施形態をさらにより詳細に示した図である。
【００３１】
図４は、Ｃｒｅを備えるｌｏｘＰ部位を使用した図２の実施例を示した図である。
【００３２】
図５は、図１ｃに示した１の実施形態の詳細を示した図である。１つの環状親分子（ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ）は切断部位で１つ以上の制限酵素によって切断され、２つの連結可能末端を備える直鎖状親分子を産生する。ＣＤＳ＝対象のコーディング配列、もしくは遺伝子、ＮＳ＝陰性選択マーカー、ＭＳ＝選択マーカー、ＪＳ＝連結部位。
【００３３】
図６は、図５のより詳細な実施例を示した図である。ＫｐｎＩの２つのｌ／２ＲＥ部位のライゲーションは１つの連結部位（ＪＳ）を備える直鎖状中間体を形成し、その後にリコンビナーゼタンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓによるａｔｔＲおよびａｔｔＬ部位間での組換えが行われ、結果として環状の目的産物が生じる。
【００３４】
図７は、ｌｏｘＰおよびＣｒｅを使用する、図５のより詳細な実施例を示した図である。
【００３５】
図８は、切断および連結反応が１工程で行われる、図１ａの詳細な実施例を示した図である。組換え反応後に、１つ以上の適当な制限酵素によるＣＳ部位での切断は、連結可能末端ＪＥ１と適合してそれに連結する連結可能部位を生成し、環状の目的産物を形成する。ＣＳの切断から生成したＪＥ３とＪＥ２とは適合しない。
【００３６】
図９は、組換えのためにはａｔｔＲ／ａｔｔＬおよびＩｎｔ／ＩＨＦ／Ｘｉｓを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび連結反応のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図８のより詳細な実施例を示した図である。Ｘｈｏ部位の切断は、１／２  ＳａｌＩ部位と適合してそれに連結する連結可能部位（ｌ／２  ＸｈｏＩ）を生成し、環状の目的産物を形成する。１／２  ＳａｌＩ部位への１／２  ＸｈｏＩ部位の連結が新規の連結部位（１／２  Ｘｈｏおよび１／２  Ｓａｌ）を形成することに留意されたい。新しく形成された部位はＸｈｏ制限酵素によって切断できないので、切断およびライゲーション反応は１工程で実施できる。
【００３７】
図１０は、組換えのためにＬｏｘ／Ｃｒｅを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび結合のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図８のより詳細な実施例を示した図である。Ｘｈｏ部位の切断は、１／２  ＳａｌＩ部位と適合してそれに連結する連結可能部（ｌ／２  ＸｈｏＩ）を生成し、環状の目的産物を形成する。
【００３８】
図１１は、親分子の１つが環状であり、もう１つが直鎖状であり、そして切断および連結反応を組換え工程の前に一緒に行うことができる本発明の１つの実施形態を示した図である。ＣＳ１＝切断部位、ＪＥ１＝連結可能末端１；１種以上の適当な制限酵素によるＣＳ１部位の切断は、ＪＥ１部位と適合してそれに連結する１つの連結可能末端を生成し、切断／連結反応において１つ以上の同一の制限酵素によって切断できない娘中間体内の連結部位（ＪＳ）を形成する。娘中間体の、ＲＳ１およびＲＳ２である２つの組換え部位間の組換え反応は、環状の目的産物を形成する。
【００３９】
図１２は、組換えのためにａｔｔＲ／ａｔｔＬおよびＩｎｔ／ＩＨＦ／Ｘｉｓを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび連結反応のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図１１のより詳細な実施例を示した図である。
【００４０】
図１３は、組換えのためにＬｏｘ／Ｃｒｅを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび連結反応のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図１１のより詳細な実施例を示した図である。
【００４１】
図１４は、組換えのためにａｔｔＢ／ａｔｔＰを使用する、図１ｂに示した方法の１の実施例を示した図である。切断およびライゲーション反応は１工程または２工程で行われてよいことに留意されたい。
【００４２】
図１５は、組換えのためにｌｏｘＰ／Ｃｒｅを使用する、図１ｂに示した方法の１の実施例を示した図である。切断およびライゲーション反応が１工程または２工程で行われてよいことに留意されたい。図１４および１５では、目的産物はそれが選択可能なマーカーであるＫａｎを有していることによって選択できる。
【００４３】
図１６は、大腸菌翻訳エレメント、リボソーム結合部位（ＲＢ）が一方の末端では制限酵素ＸｈｏＩに対する認識部位および他方の末端ではａｔｔＢ部位に隣接したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）のコーディング配列の上流に位置している、図１ａに示した方法のさらにまた別の実施例を示した図である。ＩＨＦおよびＩｎｔタンパク質によるａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位間の組換えに引き続いての切断およびライゲーション反応は、環状の目的産物、大腸菌のために適当なβ−ｇａｌのための発現ベクターを形成する。
【００４４】
図１７は、コーディング配列がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）であり、そして組換え系がｌｏｘＰ−Ｃｒｅである、図１ａに示した方法のさらにまた別の実施例を示した図である。
【００４５】
図１８は、本発明のリンカー配列を含むＰＣＲプライマーを使用する、ネステッドＰＣＲ法を示した略図である。
【００４６】
図１９は、ｐＤｅｌｉｖｅｒ００１およびｐＤｅｌｉｖｅｒ００２の略図である。
【００４７】
図２０は、ｐＤｅｌｉｖｅｒ００１ｘおよびｐＤｅｌｉｖｅｒ００２ｘの略図である。
【００４８】
図２１は、ｐＤｅｌｉｖｅｒ００５およびｐＤｅｌｉｖｅｒ００６の略図である。
【００４９】
図２２は、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００３およびｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００４の略図である。
【００５０】
図２３は、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００５およびｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００６の略図である。
【００５１】
図２４は、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００７の略図である。
【００５２】
図２５は、ｐＤｅｌｉｖｅｒ００８の略図、並びにＭＣＳ、プロモーターおよびリンカー配列の詳細である。
【００５３】
図２６は、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００の略図である。
【００５４】
以下では、図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。図１は、本発明による方法の１の実施形態を示しており、２つの開始ＤＮＡ分子（以後、「親分子」と称する）は環状であっても直鎖状であってもよい。説明するために、２つの親分子は各々送達分子および受容分子と称する。
【００５５】
送達分子は２つのセグメントであるＡおよびＢを含んでいる。送達分子が環状である場合、ＡおよびＢは部位特異的組換え部位であるＲＳ１、および少なくとも１つの第１連結可能末端（「ＪＥ１」）に転換できる第１領域（「連結可能末端部位」もしくは「切断部位」）（「ＣＳ１」）によって分離される。送達分子が直鎖状である場合、ＡおよびＢはＲＳ１によって分離され、そして直鎖状分子における２つの末端のうち、１つはＡに隣接するＪＥ１である。
【００５６】
同様に、受容分子は２つのセグメントであるＣおよびＤを含んでいる。受容分子が環状である場合、ＣおよびＤは部位特異的組換え部位であるＲＳ２、および少なくとも１つの第２連結可能末端（「ＪＥ２」）に転換できる第２領域（「ＣＳ２」）によって分離される。受容分子が直鎖状である場合、ＣおよびＤはＲＳ２によって分離され、そして直鎖状分子における２つの末端のうち、１つはＤに隣接するＪＥ２である。
【００５７】
目的は、送達分子の一部分、例えばセグメントＡを受容分子内へ伝達させ、受容分子上のセグメント（例、セグメントＣ）を置換し、それによりＡおよびＤを含む「産物分子」を作製することである。例えば、Ａは対象のいずれか他のポリヌクレオチドの遺伝子もしくは部分遺伝子であってよく、そしてＤは発現シグナルおよび／または選択マーカーおよび他の所望のエレメントを含有しており、そしてこのように産生した産物分子は発現ベクターである。
【００５８】
部位特異的リコンビナーゼは、典型的には４種の活性を有する：（１）１つもしくは２つの特異的ＤＮＡ配列の認識；（２）１つ以上の特異的ＤＮＡ配列の切断；（３）鎖置換に関係するＤＮＡトポイソメラーゼ活性；および（４）ＤＮＡの切断した鎖を再シール形成するＤＮＡリガーゼ活性。ザウアー（Ｓａｕｅｒ），１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７を参照。保存的部位特異的組換えは、両方のパートナーに対する高度の特異性によって相同組換えおよび遺伝子転位から区別される。鎖置換機構には、ＤＮＡ合成の不在下での特異的ＤＮＡ配列の切断および再連結が含まれる（ランディ（Ｌａｎｄｙ），１９８９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４９）。
【００５９】
産物分子には、親分子、１つ以上の副産物、および１つ以上の中間体を含む他のすべての分子に対して、ＡＤを選択するのが望ましいことが多い。
【００６０】
遺伝子クローニングにおける当業者は、選択およびその後のクローニング工程を促進するために、セグメントＤが発現シグナルに加えて、１種以上の薬物耐性マーカー、１つ以上の複製起点、Ｈｉｓ６、ＧＳＴ等の発現タグ、および／またはＤＮＡマッピングもしくはシーケンシングのための特殊エレメントおよび認識配列を含んでいてよいことを直ちに認識するであろう。
【００６１】
クローニングの当業者は、多数の選択可能なマーカーを容易に入手できることを知っているであろう。それらには（１）毒性化合物に対する耐性を提供する（例、抗生物質）；（２）さもなければレシピエント細胞中に存在していない（例、栄養要求性マーカー）；（３）他の遺伝子産物の活性を抑制する；および（４）容易に同定できる（例えば、β−ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等、および細胞表面タンパク質等の表現型マーカー）産物をコードするＤＮＡセグメントまたはポリヌクレオチドもしくは遺伝子が含まれるが、それらに限定されない。選択可能なマーカーは、アンチセンスヌクレオチド；基質を改変する産物に結合するＤＮＡフラグメント（例、制限エンドヌクレアーゼ）；所望の分子を単離するために使用できるＤＮＡセグメント（例、特異的タンパク質連結部位）；およびさもなければ非機能的（例、ＰＣＲ増幅のために）である可能性がある特異的ヌクレオチド配列をコードするＤＮＡセグメントを含むがそれらに限定されないポリヌクレオチドフラグメント自体であってよい。実際の選択工程は、例えば混合物からの１種以上の目的産物の濃縮、または同定によるように、多数のよく知られている方法のいずれかによってで良い。
【００６２】
図１ａ〜１ｃを参照して、上記の一般実施形態をより詳細に説明する。図１ａは、送達分子が環状であり、受容分子が直鎖状である一般的方法を描出している。部位特異的組換え反応は、２つの末端を有し、それらの末端の１つがＪＥ２である直鎖状中間体分子を産生する。組換え反応の結果として、ＲＳ１およびＲＳ２はＲＳ３およびＲＳ４（２つの「産物組換え部位」）となる。中間体分子は切断反応によって切断されて２つ以上の娘中間体を産生する。１つの娘中間体は産物組換え部位ＲＳ３によって分離されたセグメントＡおよびセグメントＤを含み、そしてその２つの末端はＪＥ１およびＪＥ２である。最終連結反応はＡＤ娘中間体を環状化して目的環状産物分子を産生する。
【００６３】
切断反応および連結反応は同一反応混合物中で行われてよい、またはそれらは別個に実施されてもよい。例えば、連結末端（ＪＥ）が２種の相違する制限酵素によって産生する場合には、２つのＪＥが適合することが可能であり、それらが結合した後でも、新しく生成した領域もしくは部位はもはや２種のオリジナル制限酵素のいずれによっても認識されず、そして再び切断することができない。この場合は、消化およびライゲーションは同一反応チューブ中で発生してよい。図１４および１５並びに下記の考察はこれらの状況を実証している。同様に、親分子の１つが直鎖状でその末端が脱リン酸化によって処理されている場合は、セルフライゲーションが不可能であるために切断およびライゲーションが１工程で発生することを可能にする。
【００６４】
図１ａにおける描出は、さらに送達分子が直鎖状で受容分子が環状である状況にも当てはまる。
【００６５】
図１ｂは、親分子がいずれも環状である本発明の一般的方法を示している。送達分子はＡ、Ｂ、ＲＳ１およびＣＳ１を含んでいるが、他方受容分子はＣ、Ｄ、ＲＳ２およびＣＳ２を含んでいる。組換え反応は、Ａ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、ＣＳ１およびＣＳ２並びに２つの産物組換え部位ＲＳ３およびＲＳ４を含む環状中間体分子を産生する。ＣＳ１およびＣＳ２での中間体分子の切断は娘中間体ＡＤおよびＣＢを産生し、ＡＤの２つの末端はＪＥ１およびＪＥ２である。連結反応は、目的環状産物分子ＡＤを産生する。切断反応および連結反応は、同一反応混合物中で行われてよい、またはそれらは別個に実施されてもよい。副産物分子ＣＢは直鎖状であっても環状であってもよい。
【００６６】
親分子の１つが組換えの前に切断される場合は、この方法が図１ａに描出した方法と同等であることは認識されるであろう。
【００６７】
図１ｃは、親分子がいずれも直鎖状である本発明の一般的方法を示している。送達分子はＡ、Ｂ、ＲＳ１およびＪＥ１を含んでいるが、他方送達分子はＣ、Ｄ、ＲＳ２およびＪＥ２を含んでいる。１つの実施形態では、組換え反応が２つの直鎖状中間体分子を産生し、その１つはＡ、Ｄ、ＪＥ１、ＪＥ２、および産物組換え部位であるＲＳ３を含んでおり、他方もう１つはＣ、ＢおよびＲＳ４を含む副産物である。ＡおよびＤ等を含む中間体分子の結合は、環状産物分子ＡＤを産生する。あるいはまた別の実施形態では、２つの親分子の連結反応はＣ、ＲＳ２、Ｄ、Ａ、ＲＳ１およびＢを含む直鎖状中間体分子を産生する。ＲＳ１とＲＳ２との間の組換え反応は、Ａ、Ｄ、およびＲＳ３を含む目的環状産物分子を産生する。この図におけるＪＳ３は、ＪＥ１およびＪＥ２が結合した場合に結果として生じる領域を描出している。切断反応および連結反応は同一反応混合物中で行われてよい、またはそれらは別個に実施されてもよい。副産物分子ＣＢは直鎖状であっても環状であってもよい。
【００６８】
図１ｂに描出した環状親分子の両方が組換えの前に切断される場合は、この方法が図１ｃに描出した方法と同等であることは認識されるであろう。
【００６９】
本明細書の開示で使用した「連結可能末端」は、インビボまたはインビトロで同一または相違するＤＮＡ分子のどちらかの「パートナー末端」へ結合して一方もしくは両方の鎖上で標準的な５’−３’ホスホジエステル共有結合を形成できるＤＮＡ分子の末端である。上記で説明した図では、ＪＥ１およびＪＥ２はパートナー末端である。
【００７０】
１つの実施形態では、連結可能末端は制限酵素を用いた切断によって産生した二本鎖ＤＮＡ分子の末端である。この場合のパートナー末端は、切断により産生した他方の末端、または１つ以上の相違するＤＮＡ配列を認識する相違するがまだ「適合する」制限酵素を用いて切断することにより産生した、またはさもなければ一般に当技術分野においてよく知られている多数の方法の１つによって合成された適合する末端であってよい。
【００７１】
また別の実施形態では、連結可能末端は相補的もしくは実質的相補的な一本鎖塩基を備えるパートナーの連結可能末端へアニールするために十分な長さの突出している一本鎖５’もしくは３’塩基を備えるＤＮＡ末端である（「長い付着末端」）。
【００７２】
また別の実施形態では、連結可能末端は、適当なパートナーの連結可能末端へ結合できる、共有結合的に付着したタンパク質を備える二本鎖ＤＮＡ分子の末端である。例えば、トポイソメラーゼ分子もしくはトポイソメラーゼ活性を備える分子は、１本の鎖において特異的ホスホジエステル骨格を切断させ、切断した鎖の３リン酸とそのタンパク質のチロシル残基との間で共有結合を形成することができる。ＤＮＡとタンパク質との間のホスホ−チロシル結合は、他の分子の５’ヒドロキシル基または同一分子の他方の末端によって攻撃されてタンパク質を放出し、２つの分子もしくは同一分子の両端を結合させることができる。例えば、シューマン（Ｓｈｕｍａｎ），１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０１０４−１０１０８、およびシューマン（Ｓｈｕｍａｎ），１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３２６７８−３２６８４を参照。しかしトポイソメラーゼの使用は、実際的には厄介な可能性がある。例えば、送達分子の一方または両方が環状である場合は、直鎖状中間体分子を単離して、その末端の一方へ付着したトポイソメラーゼ分子を連結可能末端に転換させなければならない。したがって、本発明の好ましい実施形態はトポイソメラーゼへ共有結合的にリンクした末端以外の連結可能末端を利用する。
【００７３】
本発明のために適合する好ましい連結可能末端は、「非可逆的に連結可能末端」である。「非可逆的に連結可能末端」は、他の連結可能末端へ結合した後には、連結可能末端がその連結可能末端を作製するために使用された１種以上の同一酵素によって切断できないことを意味する。例えば、第１連結可能末端を作製するためには制限エンドヌクレアーゼが使用され、この連結可能末端は第２連結可能末端と結合される。この結合（例、ライゲーション）によって再構築された領域は、第１連結可能末端を作製するために使用された制限酵素によって認識することができない。非可逆的に連結可能末端を使用すると、切断反応および連結反応を同一反応容器内で実施することが可能になる。これはさらに、本発明の方法を「１工程」方法で実施することを可能にする、すなわち組換え、切断、結合すべてが１つの反応容器内で行われることを可能にする。
【００７４】
エンドヌクレアーゼがＤＮＡ分子を消化または切断すると、２つの末端が作製され、これらの２つの末端が適合性であり、再びライゲーションしてオリジナルの制限認識部位を再構築できることはよく知られている。連結可能末端は、工学技術によりそれらが再びライゲーションし直せるように作製できるが、しかし新しく形成された部位は連結可能末端を作製するために使用されたオリジナルのヌクレアーゼによっては認識されない。例えば、一方の連結可能末端をＳｍａＩによって、そして他方に末端をＸｍｎＩによって作製すると、適合性であるが非可逆的である２つの連結可能末端を作製できる。これらの２つの末端がライゲーションされると、ＳｍａＩまたはＸｍｎＩのどちらかによって認識される部位は構成されない。当技術分野においては、ＧＣＯＲＩおよびＭｆｅＩ等の多数の対の制限エンドヌクレアーゼが存在する。２つの平滑末端もまた、本発明による「非可逆的な連結可能末端」である。
【００７５】
本発明による「連結可能末端部位」または「切断部位」または「連結可能末端に転換できる領域」は、少なくとも１つの連結可能末端に転換できる核酸分子のセグメントである。１つの実施形態では、連結可能末端部位は制限酵素にとって認識部位である。また別の実施形態では、連結可能末端部位は一方または両方の鎖上で、トポイソメラーゼ分子またはトポイソメラーゼ活性を備える分子によって切断可能な配列である。
【００７６】
１つの好ましい実施形態では、送達分子中の対象の核酸分子もしくはフラグメントのヌクレオチド配列が知られており、そのような連結可能末端部位を全く含有していないので、それにより切断部位が連結可能末端に転換されると対象の核酸分子もしくはフラグメント内での不注意な切断もしくは消化が回避される。
【００７７】
部位特異的組換えタンパク質は、２つ以上の特異的部位で分子内および分子間部位特異的組換えを実施する。一部の細菌もしくはウイルス内に存在する部位特異的リコンビナーゼは切断活性およびライゲーション活性をいずれも有しており、一部の場合には関連するタンパク質と一緒に、ＤＮＡの特異的配列（組換え部位）を認識し、１つ以上の組換え部位に接する、もしくはそれらに隣接するＤＮＡセグメントに置換する。
【００７８】
１つの好ましい実施形態では、本発明に適合する組換え部位およびリコンビナーゼは、バクテリオファージλ（ランディ（Ｌａｎｄｙ），１９９３、上記）、バクテリオファージＰｌ（ヘス（Ｈｏｅｓｓ）ら，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、編集：Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；第９０−１０９頁）、およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μ環状プラスミド（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら，１９８２，Ｃｅｌｌ  ２９：２２７−２３４）の組換え系であるが、それらに限定されない。これらの系に対する組換え反応（各々、インテグラーゼ／ａｔｔ部位、Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ部位およびＦＬＰ／ＦＲＴ部位）は細胞無含有系（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ−ｓｙｓｔｅｍ）中で機能的である。例えば、インテグラーゼ／ａｔｔ系もしくはそれらの誘導体（下記に列挙する）は、Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓタンパク質により触媒される組換えのために送達分子または受容分子中で使用できよう。
【００７９】
野生型ａｔｔＢは下記の配列を有しており：
ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号２２）
その対応する野生型ａｔｔＰ配列は：
ＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣ（配列番号８）である。
【００８０】
野生型ａｔｔＬ配列は：
ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＣ（配列番号９）であり、
その対応する野生型ａｔｔＲ配列は：
ＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＧＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡ（配列番号１０）である。
【００８１】
対象遺伝子のＰＣＲ増幅およびクローニング
例えばｐＵＣ、ｐＧｅｍ、ｐＢｌｕｓｓｃｒｉｐｔ等のよく知られた、いくつかのベクターにおけるｃＤＮＡライブラリー内のｃＤＮＡクローンのように、極めて多数の発現遺伝子がクローニングされている。これらのクローン化配列の多くはシーケンシングされている。これらのクローニングおよびシーケンシングについて最もよく知られている大規模な取り組みはヒトゲノムプロジェクトである。現在は、これらのｃＤＮＡまたは遺伝子を、これら対象の前記ｃＤＮＡまたは対象遺伝子の機能を分析できるように  特定化したクローニングベクターへサブクローニングする必要がある。しかしサブクローニングは極めて多大な時間を消費する上に高額の費用を必要とする活動であり、さらにゲノム科学もしくはプロテオミクスの研究および開発に取り組むために大規模サブクローニングを必要とする場合は、実質的資源を費やす必要があるであろう。
【００８２】
サブクローニングを行うことについては多くの理由がある。例えば、対象遺伝子が、その配列情報から完全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）等のコーディング配列であると考えられる場合は、遺伝子を発現させ、そしてその発現産物、ほとんどの場合はタンパク質を様々な生物中または様々な条件下で試験するのが望ましいであろう。遺伝子はさらにまた、一部の修飾産物（欠失変異体、融合タンパク質およびタグ付きタンパク質等）を産生して試験できるように操作する必要が生じることがある。
【００８３】
多くのサブクローニングアプローチについては、最初に対象遺伝子は本質的に２つの部分を含有するプライマーを用いてＰＣＲまたは関連技術を使用してその起源から増幅させられる。プライマーの３’末端は対象遺伝子にとって特異的であり、対象遺伝子が特異的に増幅されることを保証するために長さが約２０塩基対である。プライマーの５’末端は、通常はリンカー／アダプター配列と呼ばれる配列を含んでいる。リンカー／アダプター配列は、増幅したフラグメントとベクターとの連結を促進する追加の配列である、制限エンドヌクレアーゼ認識部位および／または特異的組換え部位のような。これらの部位は、増幅した対象遺伝子を翻訳のために適当な方向かつフレーム内で特異的ベクターの適当な部分に挿入することができる。
【００８４】
組換えＤＮＡ分子クローニングでは、アダプター／リンカーの長さは多くの場合、特にアダプターが長い組換え認識部位を含有している場合は相当に長い。多くのリンカーの長さは５０塩基を超える。そのような長いアダプター／リンカーには２つの問題がある。最初に、特に多数の遺伝子をスクリーニングかつ試験する必要がある場合は、各対象遺伝子に対してそのような長いアダプター／リンカーを含有するプライマーを合成するには多額の費用がかかる。より重要なことには、大多数の発現ベクターは挿入される遺伝子の発現のために転写シグナルおよび翻訳シグナルの両方を含有しているので、対象遺伝子の挿入後には、その遺伝子の実際のコーディング領域はこれらのアダプター／リンカー配列によって分離されるであろう。しかし開始コドン（ＡＴＧ）と、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ配列（原核生物に対して）およびコザック配列（真核生物に対して）のようなリボソーム結合部位等の翻訳シグナル配列との間隔が増すにつれて、翻訳効率は劇的に減少する。その結果、介在するアダプター／リンカー配列の存在は発現効率の急激な減少を引き起こす。
【００８５】
したがって好ましい実施形態では、本発明は制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびリボソーム結合部位の両方を含むリンカー配列をさらに提供する。詳細には、本発明によるアダプター配列は：
５’−ｇ  ｇａａ  ｇｇａ  ｇｔｔ  ｃｇａ  ａｃｃ  ａｔｇ−３’（配列番号１）を含む。
【００８６】
当業者は、配列番号１が制限エンドヌクレアーゼＸｍｎＩに対する特異的認識部位（すなわち、ｇａａＮＮＮＮｔｔｃ）およびＮｓｐＶに対する部位（ｔｔｃｇａａ）を含むことを認識するであろう。さらに、配列番号１は、開始コドン（ＡＴＧ）のすぐ上流にＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ配列（ｇａａｇｇａｇ）、およびコザック配列（ＡＣＣ）を含有する。
【００８７】
配列番号１がプライマーの一部として使用される場合は、リコンビナーゼもしくは１つ以上の制限酵素に対する認識部位等の追加のリンカー配列をその５’末端に追加することができ、そして対象の遺伝子もしくは部分遺伝子の第２コドンから始まる約２０塩基を配列番号１の３’末端へ追加することができる。下記でより詳細に説明するように、配列番号１を含むプライマーを使用すると従来型ＰＣＲ法で特異的配列を増幅させることができる、またはネステッドＰＣＲのための２組のＰＣＲプライマー設計に使用できるが、その場合には配列番号１は２種のネステッドプライマーの主要な重複領域であろう。
【００８８】
本発明は、
５’−ｔ  ｇｃｇ  ｇｃｃ  ｇｃａ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ｃｔａ−３’（配列番号２）
の配列を有するまた別のアダプターをさらに提供する。
【００８９】
当業者は、配列番号２が制限エンドヌクレアーゼＥａｇＩ（ｃｇｇｃｃｇ）、ＮｏｔＩ（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）およびＸｈｏＩ（ｃｔｃｇａｇ）に対する特異的認識部位を含むことを認識するであろう。配列番号２がプライマーの一部として使用される場合は、対象の遺伝子、部分遺伝子もしくはいずれかのポリヌクレオチドの３’末端にある約２０塩基を配列番号２の３’末端へ追加することができる。
【００９０】
１つの実施形態では、本発明は第１プライマーおよび第２プライマーを使用して対象遺伝子をクローニングする方法を提供する。第１プライマーは、その第２コドンから始まる対象遺伝子の配列に相補的である十分な数の追加のヌクレオチドに結合した配列番号１を含んでいる。第２プライマーは、最終コドンから始まる対象遺伝子の配列に相補的である十分な数の追加のヌクレオチドに結合した配列番号２を含んでいる。ポリメラーゼ連鎖反応を実施する当業者は、「十分な数」によって、プライマーが対象遺伝子の特異的増幅を可能にすることを意味することを認識するであろう。一般に、この数は１０〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基、より好ましくは１８〜３５塩基、いっそうより好ましくは２０〜３０塩基である。
【００９１】
１つの好ましい実施形態では、本発明は上記の第１および第２プライマー、並びに第３および第４プライマーを使用するネステッドＰＣＲ法をさらに提供する。この方法によると、第３ＰＣＲプライマーはその３’末端で第１プライマーの５’末端と同一である十分な数のヌクレオチド、並びにその５’末端で追加のアダプター／リンカー部位であるヌクレオチド配列を含んでいる。第４ＰＣＲプライマーは、その３’末端で第２プライマーの５’末端と同一である十分な数のヌクレオチド、並びにその５’末端で追加のアダプター／リンカー部位であるヌクレオチド配列を含んでいる。第３および第４プライマー上の追加のリンカー／アダプター部位は、追加の制限エンドヌクレアーゼ消化部位もしくは部位特異的組換え部位、またはその両方であってよい。これらの追加の部位は、ネステッドＰＣＲ反応の最終産物が、制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼライゲーションもしくは部位特異的組換え、またはその両方によってクローニングベクター等の別の分子内に組み込まれることを可能にするであろう。
【００９２】
１つの実施形態では、最初に対象遺伝子は第１および第２プライマーを用いて増幅させられてよい。この増幅の完了後、あるいはほんの数サイクル後、第３および第４プライマーを用いて増幅産物をさらに増幅させることができる。当業者はさらに、全４種のプライマーを同時に追加することができ、そして増幅中に追加の試薬を添加する必要なくネステッド増幅法を実施できることも認識するであろう。
【００９３】
当業者は、各所与のクローニングベクターに対して第３および第４プライマーが同一であり、このために遺伝子がプライマー１および２によって増幅させられた場合、またはプライマー３および４の３’末端に相補的である末端を含有する場合は、それらを大量に合成していずれかの遺伝子をクローニングするために使用できることを直ちに認識するであろう。したがって、各特定の対象遺伝子に対して第１および第２プライマーを合成する必要しかない。先行技術の方法とは相違して、第１および第２プライマーは完全なアダプター／リンカー配列を有している必要はないので、それらは実質的により短い可能性があり、特に大規模スクリーニングの活動において実質的な費用節約をもたらすであろう。
【００９４】
さらにクローニングベクターでは、対象遺伝子は開始コドンのすぐ上流に原核生物リボソーム結合部位および／または真核生物リボソーム結合部位を有することになり、結果として生じる発現ベクターは原核生物系および真核生物系の両方において高い効率で対象遺伝子を発現できることを保証する。
【００９５】
あるいは、上記の配列番号１は配列番号３：
５’−ｇ  ａａｇ  ｇａａ  ｔｔｃ  ＮＮＮ  ａｃｅ  ａｔｇ−３’（配列番号３）、
（式中、ＮＮＮは終止コドン以外のいずれか３つのヌクレオチドであってよい）で置換することができる。配列番号３は、Ｓｈｉｎｅ−ＤａｌｇａｎｏおよびＫｏｚａｋ配列に加えて、ＸｍｎＩに対する認識部位（ｇａａＮＮＮＮｔｔｃ）およびＥｃｏＲＩに対する認識部位（ｇａａｔｔｃ）を含有する。トリプレットＮＮＮは追加の認識部位を工学技術によりプライマーを設計することを許容し、プライマーにいっそうより大きな汎用性を与える。例えば、ＮＮＮ＝ＧＧＴである場合はＫｐｎＩ部位（ｇｇｔａｃｃ）が作製され、そしてＮＮＮ＝ＧＣＧである場合はＮｒｕＩ部位が作製される。
【００９６】
上記のリンカー配列は特異的ＲＢＳ、すなわちＳｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｎｏ配列、並びにＲＢＳとコーディング配列の開始コドンとの間に必要なスペーサー配列を含んでいる。これらのリンカー配列は、対象核酸フラグメントおよび／または適当なベクター内に組み込まれる。ベクターが適当なプロモーター（例、大腸菌宿主に対するＴ７）の下流でアダプターを含有する場合は、本発明の連結反応（下記に記載する）は、開始コドンＡＴＧがＲＢＳから適当な距離をあけるような位置に対象フラグメントを配置するであろう。結果として形質転換のために直接使用でき、高効率で対象フラグメントを発現する発現ベクターを生じさせる。
【００９７】
これらのリンカー配列は、組換えクローニング法を使用して効率的な発現ベクターを作製するためにも適合する。組換え部位はアダプターの上流で結合され、そして結合できる組換え部位の上流で適当なプロモーターを含有するベクターが提供される。対象遺伝子の５’末端での組換えによって、たった１つのベクターを用いて大腸菌中で天然タンパク質を産生するために使用できる発現ベクタークローンが入手される。
【００９８】
１つの好ましい実施形態では、プライマー３および４のための追加のアダプター／リンカー配列は、ａｔｔ組換え部位、例えば野生型ａｔｔＢ部位の１本鎖の配列、ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡＮ（配列番号４）、または、
ＴＣＡＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＶＮ（配列番号２３）
（式中、ＮはＡ、Ｃ、ＴおよびＧのいずれか１つであり、ＶはＡ、Ｃ、ＧのいずれかであるがＴではない）を含んでいてよい。例えば、オリゴヌクレオチドは５’−ＡＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＴＧＡＮｇａａｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａｔｇ−３’（配列番号１１）の配列、または
５’−ＴＣＡＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＶＮｇａａｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａｔｇ−３’（配列番号２４）
を有する、組み合わされた配列番号４および配列番号３であってよい。
またはプライマー３および４のための追加のアダプター／リンカー配列はａｔｔＢの変異形であるａｔｔＢ１：
５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴ−３’（配列番号５）、
またはａｔｔＢ２：
５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ（配列番号６）、
またはａｔｔＢｌｘ：
５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴ（配列番号７）
であってよい。
【００９９】
アダプターは、下記の野生型組換え部位ａｔｔＰ、ａｔｔＬもしくはａｔｔＲの部分配列であってもよい。
【０１００】
増幅後にクローニングベクターを用いてＰＣＲ産物を組み換えることができ、対象遺伝子が適当な配向および正しい翻訳フレーム内で挿入されるように、そして初期翻訳終結シグナルが遺伝子もしくは部分遺伝子のベクター内への挿入の結果として生じないように部位を配置することに注意を払わなければならない。
【０１０１】
配列番号１は開始コドンＡＴＧを含有しているが、それが他の遺伝子（タグ配列Ｈｉｓ６もしくはＧＳＴ等）へ融合すると、上流リンカー配列もまた翻訳されるであろう。この場合は、連結が、配列番号１における３’末端でのＡＴＧが対象の遺伝子もしくは部分遺伝子に対するコーディングコドンである適当なフレーム内にあることを保証するために注意を払わなければならない。適当なインフレーム融合は、野生型ａｔｔＢ配列は各鎖内にオープンリーディングフレームを１つしか含有していないので重要である。上記の配列番号４および配列番号２３では、例えば追加のヌクレオチドＮおよびＶＮが各々、配列番号１１のアダプター／リンカーにおける配列番号３および融合産物における配列番号２４のインフレームでの融合を保証するために追加される。
【０１０２】
本発明はさらに、サブクローニングを必要とせずに、リボソーム結合部位およびアダプター／リンカー配列を含有する上記のＰＣＲプライマーを使用して発現ベクターを製造する方法をさらに提供する。この態様は、先行技術における現在の組換えクローニング法より優れた本発明の有益な改良を表している。上記のプライマー３および４を使用する増幅産物はアダプター／リンカー配列を含有するので、当業者にはよく知られている方法を使用して、制限酵素消化に続くライゲーションによって、または部位特異的組換えによって、プライマー３および４の同一配列の一部もしくは全部が適当な領域内に存在するレシーバーベクターにクローニングすることができる。コーディング配列の開始コドンのすぐ近位にあるリボソーム結合部位が工学的に作製されるので、翻訳効率は高く、そしてベクターは原核生物系および真核生物系のどちらにおいても使用できる点で汎用性でもある。
【０１０３】
図１６を参照すると、上記の１工程発現ベクター構築法がβ−ガラクオシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）を使用して実証されている。上記のＰＣＲプライマーを使用すると、５’末端では適当なリボソーム結合部位（ＲＢ）およびＸｈｏＩ認識部位を含むリンカー配列に、３’末端ではＩｎｔおよびＩＨＦタンパク質に対するａｔｔＢ部位に隣接したβ−ｇａｌを含むＰＣＲ産物が産生される。このレシーバーベクターは、ＳａｌＩに対する制限部位、適合性のａｔｔＰ部位、および適切に配置されたプロモーター（Ｔ７）、転写終結シグナル（Ｔ７  ｔｅｒｍ）、複製起点（Ｏｒｉ）、および選択マーカーを含んでいる。
【０１０４】
適当な選択マーカーには、Ｋａｎ、ＣｍＲ、ｃｃｄＢおよびＤｐｎＩ等の抗生物質耐性遺伝子および毒性遺伝子が含まれる。これらはすべて当技術分野においてよく知られており、当業者であれば容易に利用できる。例えば、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ），１９９６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１：３２０−３２３（１９９６年、８月）を参照。
【０１０５】
ＰＣＲ産物およびレシーバーベクターをＩｎｔおよびＩＨＦの存在下の適当な条件下で一緒に培養すると、部位特異的組換え反応が発生し、直鎖状中間体が生じる。この直鎖状中間体は次にＸｈｏＩおよびＳａｌＩを用いて消化され、続いてＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションが行われ、大腸菌中でβ−ｇａｌタンパク質を発現させるために適当である産物ベクターが産生される。産物ベクター上にＫａｎ遺伝子が存在するために、この産物ベクターを含有するクローンは容易に選択することができる。
【０１０６】
以下では、本発明を実施例により例示する。以下の実施例は本発明および組成物を例示するために役立つが、決して本発明を限定するものではないことは理解されるであろう。
【実施例】
【０１０７】
実施例１．様々なｐＤｅｌｉｖｅｒおよびｐＲｅｃｅｉｖｅｒベクターの略図
様々なｐＤｅｌｉｖｅｒおよびｐＲｅｃｅｉｖｅｒベクターを図１９〜２６に描出した。図１９はｐＤｅｌｉｖｅｒ００１およびｐＤｅｌｉｖｅｒ００２の略図である。図２０はｐＤｅｌｉｖｅｒ００１ｘおよびｐＤｅｌｉｖｅｒ００２ｘの略図である。図２１はｐＤｅｌｉｖｅｒ００５およびｐＤｅｌｉｖｅｒ００６の略図である。図２２はｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００３およびｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００４の略図である。図２３はｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００５およびｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００６の略図である。図２４はｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００７の略図である。図２５はｐＤｅｌｉｖｅｒ００８の略図、並びにＭＣＳ、プロモーターおよびリンカー配列の詳細である。図２６はｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００の略図である。
【０１０８】
実施例２．ｐＤｅｌｉｖｅｒおよびｐＲｅｃｅｉｖｅｒベクターの構築
ｐＤｅｌｉｖｅｒベクター
【０１０９】
本実施例におけるｐＤｅｌｉｖｅｒベクターは：
−  １つの組換え部位、
−  少なくとも１つの連結可能末端を産生するために１以上の制限酵素によって切断できるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）、
−  １つは化学耐性分子およびもう１つは毒性分子をコードする、２つの選択マーカー遺伝子、および
−  １つの複製起点、を含む。
【０１１０】
対象の遺伝子もしくは部分遺伝子がｐＤｅｌｉｖｅｒに適切に含有されている場合は、この対象の遺伝子もしくは部分遺伝子を含有するあらゆる数のプラスミド発現構築体／ベクターを迅速に構築することができる。発現構築体の１つの例は、下記に記載するｐＲｅｃｅｉｖｅｒである。
【０１１１】
制限酵素ＤｐｎＩは、Ａがｄａｍメチラーゼによってメチル化された場合にのみ配列ＧＡＴＣを認識してその配列を切断する。分子クローニングにおいて最も一般的に使用される大腸菌のｄａｍ＋菌株（ＤＨ５α菌株を含む）中でのＤｐｎＩの発現は、この細胞の染色体が多数の断片に切り刻まれるために致死性である。しかしｄａｍ−大腸菌株に対しては、染色体がＤｐｎＩ切断に対して免疫性であるのでＤｐｎＩは非侵害性である。このため、ＤｐｎＩをコードする遺伝子は陰性選択マーカーとして使用できる。
【０１１２】
本実施例のｐＤｅｌｉｖｅｒを生成するために使用したプラスミド骨格はｐＵＣｌ９プラスミドであった。そこで、ｐＤｅｌｉｖｅｒの複製起点および１つの選択可能なマーカー遺伝子は、各々ｐＵＣ複製起点およびｐＵＣアンピシリン耐性遺伝子であった。その他の選択マーカー、ＭＣＳと組換え部位との間に位置するＤｐｎＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、λファージの野生型ａｔｔＰを前記骨格にクローニングした。よく知られている標準クローニング法を用いて、ｐＵＣ１９ベクターを使用して下記のとおりにｐＤｅｌｉｖｅｒ００１を生成した。
【０１１３】
ｐＵＣ１９はＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩを用いて消化し、部分ＬａｃＺ遺伝子を含有する領域（editon）を取り除いた。残りのフラグメント内に１つの二本鎖ＤＮＡフラグメント、ｂｌａプロモーターをライゲーションし、下記に列挙する２種のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物のＤＮＡフラグメントは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションする前にＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩを用いて切断した：
ｂｌａプライマー（フォワード）：
５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１２）
ｂｌａプライマー（リバース）：
５’−ＣＣＧＣＡＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡ−３’（配列番号１３）
【０１１４】
ライゲーションかつ選択した環状プラスミド（ｐＵＣｌ９−ｂｌａ）は、ｂｌａプロモーターの下流に位置するようにＤｐｎＩエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子によってＬａｃＺ遺伝子の残りの部分と置換するためにＥｃｏ０１０９ＩおよびＮｄｅＩを用いて切断した。ＤｐｎＩをコードする遺伝子は、鋳型としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ  ６７４９４）由来のＤｐｎＩ遺伝子を含有するプラスミドおよび下記の２種のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅させた：
ＤｐｎＩプライマー（フォワード）：
５’−ｇｇｔｔｇｃａｔａｔｇｇａａｔｔａｃａｃｔｔｔａａｔｔｔａｇａａ−３’（配列番号１４）
ＤｐｎＩプライマー（リバース）：
５’−ａａｃｇａｇｇｇｃｃｔｔｃａｔａａｔｔｔｃｃｇａｔａｃｔｔｔｃｃｔｃ−３’（配列番号１５）
【０１１５】
ＰＣＲ産物はＥｃｏ０１０９ＩおよびＮｄｅＩを用いて切断し、Ｅｃｏ０１０９ＩおよびＮｄｅＩを用いて消化したｐＵＣ１１９−ｂｌａへライゲーションした。このライゲーション反応をｄａｍ−大腸菌株ＳＣＳ  １１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、プラスミド（ｐＵＣ１９−ｂｌａ−ＤｐｎＩ）を産生した。
【０１１６】
ｐＵＣ１９−ｂｌａ−ＤｐｎＩをＡａｔＩＩおよびＥｃｏ０１０９Ｉによって切断して組換え部位、λａｔｔＰ（野生型）へライゲーションし、これを鋳型としてのλファージゲノムＤＮＡおよび下記の２種のプライマーによって増幅させ、その後にＡａｔＩＩおよびＥｃｏ０１０９Ｉを用いる消化を実施した：
ａｔｔＰプライマー（フォワード）：
５’−ＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴ−３’（配列番号１６）
ａｔｔＰプライマー（リバース）：
５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴ−３’（配列番号１７）
【０１１７】
ライゲーション反応の産物はｄａｍ−大腸菌株ＳＣＳ１１０に形質転換した。結果として生じたプラスミドはｐＤｅｌｉｖｅｒ００１と命名した。
【０１１８】
当業者は、類似のストラテジーに従うと例えば組換え部位、野生型ｌｏｘＰを含有するｐＤｅｌｉｖｅｒベクターのような他のｐＤｅｌｉｖｅｒベクターを生成できることを認識するであろう。
【０１１９】
ｐＲｅｃｅｉｖｅｒベクター
遺伝子産物を発現させるためには一般に受容分子が使用されるが、それはプロモーター配列の下流にあり、ＭＣＳを通しての転写を指示するように配向された適当なＭＣＳを含有している。対象の遺伝子もしくは部分遺伝子を送達分子から受容分子へ正確な配向で単純かつ効率的に伝達させるために、λファージのａｔｔ部位またはｌｏｘＰ部位等の配列特異的組換え部位を受容分子における１以上の転写終結配列の上流に挿入することができる。
【０１２０】
オープンリーディングフレームがｐＲｅｃｅｉｖｅｒ上のＭＳＣを通して維持されるように、そしてｐＲｅｃｅｉｖｅｒ上のＭＣＳ内のリーディングフレームがｐＤｅｌｉｖｅｒ分子上の対応するＭＣＳ内で見いだされるリーディングフレームとインフレームであるように、ＭＣＳを正しいリーディングフレーム内に配置するために注意を払わなければならない。これは、対象の遺伝子もしくは部分遺伝子が正しいフレーム内に翻訳されることを保証するであろう。さらに、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ上にＭＣＳを含む配列およびドナー内に含有されたＭＣＳは、あらゆるインフレーム終結コドンの導入を回避するように設計した。
【０１２１】
受容分子は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、プロテインＬ、ポリヒスチジントラクト（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｆｌａｇタグ、緑色蛍光タンパク質等を含むがそれらに限定されない親和性ドメインもしくは配列タグ等のタンパク質ドメインをコードすることができる。これらのドメインは、対象の遺伝子もしくは部分遺伝子の翻訳産物の同定および／または精製を容易にする。
【０１２２】
以下では適当なｐＲｅｃｅｉｖｅｒベクターの作製を例示するために１つの発現ベクターを修飾する方法を提供する。Ｎｏｖａｇｅｎ社（ウィスコンシン州マディソン）から入手したｐＥＴ２８ａ発現ベクターをＸｈｏＩによって切断し、クレノウフラグメントを挿入し、次にＳａｌＩを用いて切断し、続いて子ウシ小腸アルカリホスファターゼ処理を実施した。ｐＤｅｌｉｖｅｒ００２はＡａｔＩＩによって切断し、クレノウフラグメントを挿入し、ＳａｌＩを用いて切断し、ｂｌａの上流でのＭＣＳおよびＤｐｎＩ遺伝子の３’末端でのｌｏｘＰに各々隣接したｂｌａプロモーターＤｐｎＩ遺伝子を含有するフラグメントを生成した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションし、ｄａｍ−大腸菌株ＳＣＳ１１０に形質転換した後に、受容分子、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００４を選択した。
【０１２３】
本発明によってよく知られている分子クローニング法を使用すると、あらゆるベクターを使用して本発明のベクターを構築することができる。詳細には、当技術分野において知られており市販で入手できるベクターを使用してＭＣＳ配列および部位特異的組換え部位を含むｐＤｅｌｉｖｅｒおよびＲｅｃｅｉｖｅｒベクターを作製することができる。
【０１２４】
実施例３．本発明のクローニング系（以下では「ＲｅｃＪｏｉｎ系」と称する）を用いたインビトロ遺伝子クローニング
インテグラーゼは、ナッシュ  エイチ・エイ（Ｎａｓｈ  Ｈ．Ａ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １００：２１０−２１６（１９８３）によって記載されたとおりに入手できる。ＩＨＦは、フィルトウィッツ  エム（Ｆｉｌｕｔｏｗｉｃｚ  Ｍ．）ら，Ｇｅｎｅ  １４７：１４９−１５０（１９９４）によって記載されたとおりに入手できる。
【０１２５】
１）ＰＣＲによって増幅させたｌａｃＺ遺伝子のクローニング
今度はＰＣＲによって増幅させたＤＮＡフラグメントを規定とおりにクローニングかつ試験したが、詳細には対象ＤＮＡフラグメント内では切断しない所望の１種以上の制限酵素にとって適合する５’末端配列を備えるプライマーを研究者らが設計するためにコーディング配列の予測を可能にする広範囲のバイオインフォーマティクスの情報およびツールを利用した。
【０１２６】
ｌａｃＺ遺伝子を使用して本発明のクローニング法を試験した。鋳型として、ｐＧＥＭ（登録商標）β−ｇａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）並びに５’末端でＳｍａＩ部位を含有するフォワードプライマーおよび野生型ａｔｔＢ組換え部位を含有するリバースプライマーの２種のプライマーを使用するＰＣＲによってｌａｃＺ遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅させた：
ＬａｃＺプライマー（フォワード）：
５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＣＣａｔｇｔｔｇｃａｇａｔｃｃａｔｇｃａｃｇｔａａａ−３’（配列番号１８）
ＬａｃＺプライマー（リバース）：
５’−ＧＧＧＧＴＣＡＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴｃｔａｔｔｔｔｔｇａｃａｃｃａｇａｃｃａａｃｔ−３’（配列番号１９）
【０１２７】
λファージ組込み系のａｔｔＢ部位は小さく（２５ｂｐ）、一部の配列柔軟性（flexibility）を有する（ナッシュ  エイチ・エイ（Ｎａｓｈ  Ｈ．Ａ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４０４９−４０５３（１９８７）。野生型２５塩基のａｔｔＢ部位は２本の鎖に対して１つのオープンリーディングフレームを有しており、このため対象遺伝子の特異的配列も含んでいるプライマーの５’末端の一部として適合する可能性がある。
【０１２８】
市販で入手できるキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製したＰＣＲ産物および１００ｎｇのｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００８を２５℃で４５分間、２０μｌのａｔｔＢ×ａｔｔＰ組換え反応ミックス（５０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭスペルミジン、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０％グリセロール、Ｉｎｔ（４０ｎｇ）およびＩＨＦ（８．０ｎｇ））中でインキュベートした。６５℃で１０分間加熱して氷水上で５分間保持した後、１４μＬの組換え反応液を１．０μＬのＰｍｅＩ（５ユニット）およびＳｍａＩ（５ユニット）、２．０μＬの１０ｘ消化バッファーと一緒に３７℃で５０分間インキュベートし、その後に１．０μＬのＴ４のリガーゼ（２０ユニット）および１μＬのＡＴＰ（２０ｍＭ）を添加し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。２．０μＬを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。発現させた後、カンタミン、ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド）および６０μｇ／ｍＬ  カナマイシンＬＢ上層寒天プレートを用いてＬＢ上にアリコートを塗布し、３７℃で１８時間インキュベートした。ＲｅｃＪｏｉｎクローニングミックス形質転換のプレート中では、約１５２，０００個の青色コロニーが観察された。Ｉｎｔ、ＩＨＦ、制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼを含まない同一ミックスを含有している対照プレート中では青色コロニーは見いだされなかった（備考：実際には２もしくは１００μＬの形質転換液を蒔いたが、コロニー数は形質転換反応液全体（１．０ｍＬ）を蒔いたと見なして計算した）。
【０１２９】
２）ホタルルシフェラーゼのクローニング
ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）遺伝子を使用して、本発明の送達分子から受容分子へのＯＲＦの伝達について試験した。
【０１３０】
ａ）ｐＤｅｌｉｖｅｒベクター内へのＬｕｃ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のクローニング
鋳型としてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）並びにＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩを含有するフォワードプライマーおよび野生型ａｔｔＢ組換え部位を含有するリバースプライマーの２種のプライマーを使用するＰＣＲによってＬｕｃ遺伝子のＯＲＦを増幅させた：
Ｌｕｃプライマー（フォワード）：
５’−ＡＡＧＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣａｔｇｇａａｇａｃｇｃｃａａａａａｃａｔａａａ−３’（配列番号２０）
Ｌｕｃプライマー（リバース）：
５’−ＧＧＧＧＴＣＡＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴｃｔａｃａｃｇｇｃｇａｔｃｔｔｔｃｃｇｃｃｃｔ−３’（配列番号２１）
【０１３１】
Ｑｉａｇｅｎ社製キットを用いて精製したＰＣＲ産物のフラグメントおよび１００ｎｇのｐＤｅｌｉｖｅｒ００１ｘは、２５℃で４５分間、２０μｌのａｔｔＢ×ａｔｔＰ組換え反応ミックス（５０ｍＭ  トリスＨＣ１（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭスペルミジン、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０％グリセロール、Ｉｎｔ（４０ｎｇ）およびＩＨＦ（８．０ｎｇ））中でインキュベートした。６５℃で１０分間加熱して氷水上で５分間保持した後、１４μＬの組換え反応液を１．０μＬのＸｍｎＩ（５ユニット）およびＳｍａＩ（５ユニット）、２．０μＬの１０ｘ消化バッファーと一緒に３７℃で５０分間インキュベートし、その後に１．０μＬ  Ｔ４のリガーゼ（３０ユニット）および１μＬのＡＴＰ（２０ｍＭ）を添加し、さらに２５℃で３０分間インキュベートした。２．０μＬを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。アリコートは１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗布し、３７℃で１８時間インキュベートした。５０μＬの形質転換液につきプレート上で数百個のコロニーが観察された。Ｑａｉｇｅｎ社製キットを用いて、Ｌｕｃ遺伝子のＯＲＦを含有するプラスミド（ｐＤｅｌｉｖｅｒ−ｌｕｃと称した）を精製した。一部の実験については、ｐＤｅｌｉｖｅｒ−ｌｕｃは子ウシ小腸アルカリホスファターゼ処理を行った、または行わないＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて直鎖状化した。
【０１３２】
ｂ）Ｌｕｃ遺伝子のＯＲＦの哺乳類発現ベクターへの伝達
ＭｆｅＩ（その認識部位はＭＣＳ内にある）を用いた切断によって１つのａｔｔＲ（野生型）を含むｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００ｘを直鎖状化し、子ウシ小腸アルカリホスファターゼを用いて処理した。直鎖状化したｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００ｘプラスミド（１００ｎｇ）はＥｃｏＲＩを用いて直鎖状化して子ウシ小腸アルカリホスファターゼ処理を実施していないｐＤｅｌｉｖｅｒ−Ｌｕｃと混合し、２５℃で４５分間、２０μＬのａｔｔＬ×ａｔｔＲ組換え反応ミックス（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭスペルミジン、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０％グリセロール、Ｉｎｔ（４０ｎｇ）、ＩＨＦ（８．０ｎｇ）およびＸｉｓ（４．０ｎｇ））中のａｔｔＬおよびａｔｔＲ組換え反応液中でインキュベートした。６５℃で１０分間加熱して氷水上で５分間保持した。１２．５μＬの組換え反応液を１．０μＬ  Ｔ４のリガーゼ（３０ユニット）、１．５μＬの１０Ｘ  Ｔ４ライゲーションバッファーおよびインキュベーションと一緒に２５℃で３０分間インキュベートした。２．０μＬを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。アリコートは６０μｇ／ｍＬ  カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗布し、３７℃で１８時間インキュベートした。２０μＬの形質転換液に対してプレート上で数百個のコロニーが観察された。Ｌｕｃ遺伝子のＯＲＦを含有するプラスミドは哺乳類トランスフェクションアッセイ用のＱｉａｇｅｎ社製キットによって精製した。このプラスミドはｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００ｘ−Ｌｕｃと命名した。
【０１３３】
実施例４．ルシフェラーゼ活性の発現レベル
ＲｅｃＪｏｉｎ（商標）ベクター（すなわち、送達ベクターおよびレシーバーベクター）を用いて達成できる発現レベルを評価するために、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒリポフェクションキットを使用して哺乳類細胞（例、ＣＯＳ−７細胞）中へｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００ｘ−Ｌｕｃプラスミドを導入した。これらの細胞を次に４８時間培養し、その後採取し、Ｐｒｏｍｅｇａ社のルシフェラーゼアッセイシステムキットを製造業者の指示にしたがって使用してルシフェラーゼ活性について評価した。ルシフェラーゼ活性は、高レベル発現からバックグラウンドレベルまで数桁に渡り変動した。これらの結果は他の市販で入手できるベクターを使用して入手された結果と匹敵していた。
【０１３４】
本明細書の上記で言及したすべての参考文献および特許文書は参照して組み込まれ、本開示の一部と見なされなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１ａ】１つの親分子が環状で組換え部位（ＲＳ１）および切断部位（ＣＳ１）を含有しており、もう１つの親分子が直鎖状で組換え部位（ＲＳ２）および連結可能末端（ＪＥ２）を含有している、本発明の１の実施形態を示した図であり、組換え部位（ＲＳ１およびＲＳ２）間での組換え後に直鎖状中間体が形成され、これは次に適当な１種以上の制限酵素によってＣＳ１で切断されて２つの娘中間体が形成され、そして、これら２つの娘中間体のうち、１つだけが所望のセグメントＡおよびＤ、並びに２つの連結可能末端であるＪＥ１およびＪＥ２を含んでおり、また、これらの２つの連結可能末端は、最終的に連結して環状の目的産物を産生することを示す図（親分子のＣＳ１での切断が２つの連結可能末端を産生し、もう１つの親分子が２つの連結可能末端を含んでいる場合は、この図における直鎖状副産物が環状であってよいことに留意されたい）
【図１ｂ】親分子がいずれも環状である本発明のまた別の実施形態を示した図であり、組換え部位（ＲＳ１およびＲＳ２）間での組換え後に環状中間体が形成され、これは次に適当な１種以上の制限酵素によってＣＳ１およびＣＳ２で切断されて２つの直鎖状娘中間体が形成され、そして、これら２つの娘中間体のうち、１つだけが所望のセグメントＡおよびＤ、並びに２つの連結可能末端であるＪＥ１およびＪＥ２を含んでいる、また、これらの２つの連結可能末端は、最終的に連結して環状の目的産物を産生することを示す図（環状中間体のＣＳ１およびＣＳ２での切断が、２つの分子内の適合する連結可能末端を各々が備える直鎖状娘中間体である２つの直鎖状娘中間体を産生する場合は、この図における直鎖状副産物が環状であってよいことに留意されたい）
【図１ｃ】親分子がいずれも直鎖状である本発明のまた別の実施形態を示した図であり、各親分子は１つの組換え部位および１つの連結可能末端を含んでおり、２つの経路、１）組換え部位（ＲＳ１およびＲＳ２）間の組換え後、２つの直鎖状中間体が形成され、これら２つの娘中間体のうち、１つだけが所望のセグメントＡおよびＤ、並びに２つの連結可能末端であるＪＥ１およびＪＥ２を含み、これらの２つの連結可能末端は、最終的に結合して環状の目的産物を産生、そして、２）第１親分子のＪＥ１および第２親分子のＪＥ２との間の連結反応後に、１つの直鎖状中間体が形成され、中間体のＲＳ１とＲＳ２との間の組換えは、所望のセグメントＡおよびＢを備える環状の目的産物を生じさせる、を示す図
【図２】図１ｃの詳細な実施形態を示した図であり、第１親分子は２つの連結可能末端を含み、組換え部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲ、並びにリコンビナーゼタンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦ、およびＸｉｓを使用することによって、親分子のその他の構成要素もまた図示されており、ＲＥ＝制限部位、１／２  ＲＥ＝他の適合する、もしくはパートナーの半分と連結すると適当な制限エンドヌクレアーゼによって認識できる完全ＲＥを形成する制限酵素認識部位の半分を示す図
【図３】図２に示した実施形態をさらにより詳細に示した図
【図４】Ｃｒｅを備えるｌｏｘＰ部位を使用した図２の実施例を示した図
【図５】図１ｃに示した１の実施形態の詳細を示した図であり、１つの環状親分子（ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ）は切断部位で１つ以上の制限酵素によって切断され、２つの連結可能末端を備える直鎖状親分子を産生し、ＣＤＳ＝対象のコーディング配列、もしくは遺伝子、ＮＳ＝陰性選択マーカー、ＭＳ＝選択マーカー、ＪＳ＝連結部位を示す図
【図６】図５のより詳細な実施例を示した図であり、ＫｐｎＩの２つのｌ／２ＲＥ部位のライゲーションは１つの連結部位（ＪＳ）を備える直鎖状中間体を形成し、その後にリコンビナーゼタンパク質Ｉｎｔ、ＩＨＦおよびＸｉｓによるａｔｔＲおよびａｔｔＬ部位間での組換えが行われ、結果として環状の目的産物が生じることを示す図
【図７】ｌｏｘＰおよびＣｒｅを使用する、図５のより詳細な実施例を示した図
【図８】切断および連結反応が１工程で行われる、図１ａの詳細な実施例を示した図であり、組換え反応後に、１つ以上の適当な制限酵素によるＣＳ部位での切断は、連結可能末端ＪＥ１と適合してそれに連結する連結可能部位を生成し、環状の目的産物を形成し、ＣＳの切断から生成したＪＥ３とＪＥ２とは適合しないことを示す図
【図９】組換えのためにはａｔｔＲ／ａｔｔＬおよびＩｎｔ／ＩＨＦ／Ｘｉｓを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび連結反応のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図８のより詳細な実施例を示した図であり、Ｘｈｏ部位の切断は、１／２  ＳａｌＩ部位と適合してそれに連結する連結可能部位（ｌ／２  ＸｈｏＩ）を生成し、環状の目的産物を形成し、１／２  ＳａｌＩ部位への１／２  ＸｈｏＩ部位の連結が新規の連結部位（１／２  Ｘｈｏおよび１／２  Ｓａｌ）を形成することに留意されたい、新しく形成された部位はＸｈｏ制限酵素によって切断できないので、切断およびライゲーション反応は１工程で実施できることを示す図
【図１０】組換えのためにＬｏｘ／Ｃｒｅを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび結合のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図８のより詳細な実施例を示した図であり、Ｘｈｏ部位の切断は、１／２  ＳａｌＩ部位と適合してそれに連結する連結可能部（ｌ／２  ＸｈｏＩ）を生成し、環状の目的産物を形成することを示す図
【図１１】親分子の１つが環状であり、もう１つが直鎖状であり、そして切断および連結反応を組換え工程の前に一緒に行うことができる本発明の１つの実施形態を示した図であり、ＣＳ１＝切断部位、ＪＥ１＝連結可能末端１；１種以上の適当な制限酵素によるＣＳ１部位の切断は、ＪＥ１部位と適合してそれに連結する１つの連結可能末端を生成し、切断／連結反応において１つ以上の同一の制限酵素によって切断できない娘中間体内の連結部位（ＪＳ）を形成し、娘中間体の、ＲＳ１およびＲＳ２である２つの組換え部位間の組換え反応は、環状の目的産物を形成することを示す図
【図１２】組換えのためにａｔｔＲ／ａｔｔＬおよびＩｎｔ／ＩＨＦ／Ｘｉｓを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび連結反応のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図１１のより詳細な実施例を示した図
【図１３】組換えのためにＬｏｘ／Ｃｒｅを使用し、切断のためにはＸｈｏＩおよび連結反応のためにはＤＮＡリガーゼを使用する、図１１のより詳細な実施例を示した図
【図１４】組換えのためにａｔｔＢ／ａｔｔＰを使用する、図１ｂに示した方法の１の実施例（切断およびライゲーション反応は１工程または２工程で行われてよいことに留意されたい）を示した図
【図１５】組換えのためにｌｏｘＰ／Ｃｒｅを使用する、図１ｂに示した方法の１の実施例を示した図であり、切断およびライゲーション反応が１工程または２工程で行われてよいことに留意されたい、図１４および１５では、目的産物はそれが選択可能なマーカーであるＫａｎを有していることによって選択できることを示す図
【図１６】大腸菌翻訳エレメント、リボソーム結合部位（ＲＢ）が一方の末端では制限酵素ＸｈｏＩに対する認識部位および他方の末端ではａｔｔＢ部位に隣接したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）のコーディング配列の上流に位置している、図１ａに示した方法のさらにまた別の実施例を示した図であり、ＩＨＦおよびＩｎｔタンパク質によるａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位間の組換えに引き続いての切断およびライゲーション反応は、環状の目的産物、大腸菌のために適当なβ−ｇａｌのための発現ベクターを形成することを示す図
【図１７】コーディング配列がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）であり、そして組換え系がｌｏｘＰ−Ｃｒｅである、図１ａに示した方法のさらにまた別の実施例を示した図
【図１８】本発明のリンカー配列を含むＰＣＲプライマーを使用する、ネステッドＰＣＲ法を示した略図
【図１９】ｐＤｅｌｉｖｅｒ００１およびｐＤｅｌｉｖｅｒ００２の略図
【図２０】ｐＤｅｌｉｖｅｒ００１ｘおよびｐＤｅｌｉｖｅｒ００２ｘの略図
【図２１】ｐＤｅｌｉｖｅｒ００５およびｐＤｅｌｉｖｅｒ００６の略図
【図２２】ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００３およびｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００４の略図
【図２３】ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００５およびｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００６の略図
【図２４】ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ００７の略図
【図２５】ｐＤｅｌｉｖｅｒ００８の略図、並びにＭＣＳ、プロモーターおよびリンカー配列の詳細を示す図
【図２６】ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ１００の略図
【図１ａ】
2006506972.tif 000002
【図１ｂ】
2006506972.tif 000003
【図１ｃ】
2006506972.tif 000004
【図２】
2006506972.tif 000005
【図３】
2006506972.tif 000006
【図４】
2006506972.tif 000007
【図５】
2006506972.tif 000008
【図６】
2006506972.tif 000009
【図７】
2006506972.tif 000010
【図８】
2006506972.tif 000011
【図９】
2006506972.tif 000012
【図１０】
2006506972.tif 000013
【図１１】
2006506972.tif 000014
【図１２】
2006506972.tif 000015
【図１３】
2006506972.tif 000016
【図１４】
2006506972.tif 000017
【図１５】
2006506972.tif 000018
【図１６】
2006506972.tif 000019
【図１７】
2006506972.tif 000020
【図１８】
2006506972.tif 000021
【図１９】
2006506972.tif 000022
【図２０】
2006506972.tif 000023
【図２１】
2006506972.tif 000024
【図２２】
2006506972.tif 000025
【図２３】
2006506972.tif 000026
【図２４】
2006506972.tif 000027
【図２５】
2006506972.tif 000028
【図２６】
2006506972.tif 000029
【国際調査報告】
2006506972.tif 000030
2006506972.tif 000031
2006506972.tif 000032