(57)【要約】本発明は、インターフェロン、特にＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂを投与することを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を治療または阻害するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療する方法であって、有効量のインターフェロンを患者に投与することを含み、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである方法。
【請求項２】
前記インターフェロンが組換え体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インターフェロンが組換えによって大腸菌中で産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記インターフェロンが組換えによって哺乳動物細胞中で産生される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記インターフェロンと組み合わせて追加の抗ウイルス剤を投与することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記追加の抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療するための有効量のインターフェロンの使用であって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである使用。
【請求項８】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療するための医薬品の製造における有効量のインターフェロンの使用であって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである使用。
【請求項９】
前記インターフェロンが組換え体である、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記インターフェロンが組換えによって大腸菌中で産生される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記インターフェロンが組換えによって哺乳動物細胞中で産生される、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記インターフェロンを追加の抗ウイルス剤と組み合わせて使用する、請求項７から１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記追加の抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染し得る細胞にインターフェロンを投与することを含むＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害する方法であって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである方法。
【請求項１５】
前記インターフェロンが組換え体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記インターフェロンが組換えによって大腸菌中で産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インターフェロンが組換えによって哺乳動物細胞中で産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が患者中に存在する、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞である、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞がＶＥＲＯ６細胞、末梢血白血球またはＴＨＰ−１単球である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記インターフェロンと組み合わせて追加の抗ウイルス剤を前記細胞に投与することをさらに含む、請求項１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記追加の抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害するためのインターフェロンの使用であって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである使用。
【請求項２４】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害するための医薬品の製造におけるインターフェロンの使用であって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである使用。
【請求項２５】
前記インターフェロンが組換え体である、請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記インターフェロンが組換えによって大腸菌中で産生される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記インターフェロンが組換えによって哺乳動物細胞中で産生される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２８】
前記細胞が患者中に存在する、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞である、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記細胞がＶＥＲＯ６細胞、末梢血白血球またはＴＨＰ−１単球である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記インターフェロンを追加の抗ウイルス剤と組み合わせて使用する、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記追加の抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療するためにインターフェロンを使用するためのインターフェロンおよび使用説明書を備えるキットであって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂであるキット。
【請求項３４】
ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害するためにインターフェロンを使用するためのインターフェロンおよび使用説明書を備えるキットであって、該インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂであるキット。
【請求項３５】
前記インターフェロンが組換え体である、請求項３３または３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記インターフェロンが組換えによって大腸菌中で産生される、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記インターフェロンが組換えによって哺乳動物細胞中で産生される、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
追加の抗ウイルス剤をさら備える、請求項３３から３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記追加の抗ウイルス剤がリバビリンである、請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、参照によって本明細書に組み込まれた２００３年６月９日に出願された米国仮出願第６０／４７６，６１１号からの、優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
[0002]本発明は概して、ウイルス感染、および特にＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の治療に関する。
【０００３】
発明の背景
[0003]重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）（１、２）は、新たに同定されたヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）（３、４）によって引き起こされる感染病である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶは３０ｋｂの一本鎖のプラス（＋）鎖ＲＮＡゲノムを有しており、１４個の考えられるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしている。
【０００４】
[0004]ＳＡＲＳの症状は３８℃を超える熱、および他の症状、例えば頭痛、全体的な不快感、発症時の身体の痛みおよび適度な呼吸器症状などを含む。約１０パーセント〜２０パーセントの患者は下痢症状を有する。２〜７日後、ＳＡＲＳ患者は乾咳を発症する可能性がある。大部分の患者は肺炎を発症する。ＳＡＲＳは接触伝染性が高い感染病であり、１５〜２０％の死亡率を有する。現在、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を治療するための有効な薬剤は存在しない（５）。
【０００５】
[0005]ＳＡＲＳ−ＣｏＶ複製の機構に対する一層の眼識を得るため、標的型抗ウイルス療法およびワクチンを開発するための、集中的な努力が現在進行中である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する有効かつ安全なワクチンおよび化学療法剤の開発は、しかしながら年月を要する可能性がある。近年の流行病は、感染患者の臨床的管理および治療に関する知識が欠如していることを示している。リバビリン（６〜１２）、オセルタミビア（８〜１０）、ホスカルネット（８）、静脈内免疫グロブリン（８）、および他の物質が、患者を治療するために使用されてきている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験からの予備的結果は、リバビリンに感受性がある他のウイルスを阻害するリバビリン濃度は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの複製または細胞から細胞への広がりを阻害しないことを示す（５）。しかしながら、米疾病対策センター（Ｕ．Ｓ．Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は、他のコロナウイルス単離体に対する抗ウイルス剤のさらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、および対照試験においてリバビリンまたは追加の抗ウイルス剤で治療した患者の臨床結果に関するさらなる情報が必要とされると結論付けた（５）。
【０００６】
発明の概要
[0006]本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害するための、様々なインターフェロンの方法および使用に関する。したがって一態様では、本発明は、ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療する方法であって、有効量のインターフェロンを患者に投与することを含み、インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである方法を提供する。本発明は、ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療するための有効量のインターフェロンの使用、およびＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療するための医薬品の製造における有効量のインターフェロンの使用であって、インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである使用も提供する。
【０００７】
[0007]他の態様では本発明は、ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害する方法であって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染し得る細胞にインターフェロンを投与することを含み、インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである方法を提供する。本発明は、ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害するためのインターフェロンの使用、およびＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を阻害するための医薬品の製造におけるインターフェロンの使用であって、インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである使用も提供する。
【０００８】
[0008]本発明は、本発明の方法を実施する際に使用するためのキットも提供する。様々な態様において、ＳＡＲＳ−コロナウイルス感染を治療するため、またはＳＡＲＳ−コロナウイルスを阻害するためにインターフェロンを使用するための、インターフェロンおよび使用説明書を備えるキットであって、インターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂであるキットを提供する。
【０００９】
[0009]本発明の他の態様および特徴は、本発明の特定の実施形態の以下の説明および添付の図面の総説によって、当業者に明らかとなるであろう。
【００１０】
実施形態の詳細な説明
[0015]本発明は、いくつかのインターフェロン（ＩＦＮ）亜型は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ  Ｃｏ−Ｖ）による感染を阻害するという発見に関する。
【００１１】
[0016]インターフェロンは、ウイルス感染および腫瘍の進行と闘うために宿主生物によって生成されるタンパク質の１クラスである。ウイルスによって感染されると、宿主細胞はインターフェロンを合成および分泌し、次いでこれは健康な細胞上の受容体と結合し、このような細胞中の抗ウイルス応答機構を誘導する。インターフェロンの生物学的応答性は、特定の表面細胞受容体とのその相互作用によって仲介され、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化および２’５’−オリゴアデニル酸合成酵素およびタンパク質キナーゼＰＫＲ（２４）などのインターフェロン刺激応答性遺伝子産物の生成をもたらす。インターフェロンの抗ウイルス活性は、感染細胞に対する直接的な影響によって、あるいは誘導される免疫応答によって仲介される（２３）。
【００１２】
[0017]本発明者は、いくつかのインターフェロン亜型、特にインターフェロンがＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαおよびＩＦＮβ−１ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶｅｒｏＥ６細胞におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害することを発見している。これらの結果は、様々なＩＦＮを使用してＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害することができ、したがってこれらはＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染した個体の治療において有用であることを示す。
【００１３】
[0018]したがって本発明は、有効量のインターフェロンを患者に投与することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を治療する方法を提供する。本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染し得る細胞にインターフェロンを投与することを含む、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害する方法も提供する。
【００１４】
[0019]ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の「治療」は、感染の根絶、緩和または改良、感染の程度の低下、ならびに感染の進行または拡大の予防または遅延だけには限られないが、これらを含めた有益な結果または望ましい結果を得るための手法を指す。当業者によって理解されるように、患者における感染状態を改善する一方で、治療によって影響されるいかなる利点も上回る、治療患者に対する悪影響を治療がもたらす場合、結果は有益または望ましいものではない可能性がある。
【００１５】
[0020]当該インターフェロンは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害することができるインターフェロンである。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの阻害またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の阻害は、患者またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、それによってＳＡＲＳを引き起こすための細胞中へのＳＡＲＳ−ＣｏＶによる侵入を予防するかまたは減少させる、あるいは感染細胞から非感染細胞へのＳＡＲＳ−ＣｏＶの広がりを予防するかまたは減少させて、それによって感染個体またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ内において存在する感染を延長させる、あるいは感染細胞内でＳＡＲＳ−ＣｏＶが複製するのを妨げる、特定のインターフェロンの能力を指す。その用語を本明細書で使用するようにインターフェロンは、完全長インターフェロン、および完全長インターフェロンの阻害活性を維持する完全長インターフェロンの断片を含む。当業者は、例えば実施例中に記載したのと同様に、完全長インターフェロンの断片が、標的細胞中での抗ウイルス応答性を含めた阻害活性を維持することができるかどうかを、決定することができるであろう。
【００１６】
[0021]当該インターフェロンは、インターフェロンを通常生成する細胞群、例えば白血球またはリンパ芽球細胞から単離および精製したインターフェロンであってよい。あるいはインターフェロンは、クローニングおよび発現系中でのインターフェロン遺伝子の発現によって生成される、例えば、大腸菌または哺乳動物細胞培養物中での組換えによる生成、および引き続いての発現したインターフェロンの精製により生成される組換えインターフェロンであってよい。組換えタンパク質発現の技法は当分野で知られており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）中に記載されている。臨床的使用に認められているインターフェロンは市販されており、組換えインターフェロンおよび天然供給源から単離したインターフェロンを含む。このような市販のインターフェロンには、Ｒｏｆｅｒｏｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）、Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（商標）（Ｇｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）、Ａｌｆｅｒｏｎ（商標）（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｙｘ）、Ｒｅｂｉｆ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）およびＭｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（商標）（Ｖｉｒａｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ）がある。
【００１７】
[0022]いくつかの実施形態では、インターフェロンはＩＦＮα−ｎ１、ＩＦＮα−ｎ３、ヒト白血球ＩＦＮαまたはＩＦＮβ−１ｂである。
【００１８】
[0023]細胞はＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染し得る１つまたは複数の細胞であってよく、ＳＡＲＳ−ＣｏＶはこのような細胞に感染することができ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに既に感染している細胞を含むことを意味する。このような１つまたは複数の細胞は患者中に存在してよく、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞、例えば単離細胞、または細胞群または細胞培養物の一部分である細胞であってよい。ＳＡＲＳ−ＣｏＶによって感染し得る細胞には、上皮細胞、マクロファージを含めた血液細胞、および心臓、肝臓、腎臓、または目の細胞がある。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染し得る細胞の同定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を増殖させ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを使用する標準的なプラークアッセイを実施することによって行うことができる。あるいは細胞サンプルを、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染されることが知られているか、あるいはその疑いがある個体から採取することができ、例えば、患者から単離した特定の細胞型におけるウイルスゲノムの存在を検出するためのＰＣＲ増幅法を使用することによって、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在に関して試験することができる。
【００１９】
[0024]細胞はヒト細胞、例えば末梢血白血球またはＴＨＰ−１単球細胞であってよく、あるいは細胞は他種に由来してよく、この場合細胞はＳＡＲＳ−ＣｏＶによって感染し得る細胞、例えばＶＥＲＯ６細胞である。
【００２０】
[0025]細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞であるとき、ウイルスによる細胞の感染を予防するようにＳＡＲＳ−ＣｏＶに対して細胞を暴露する前に、あるいはＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する暴露後に、あるいはＳＡＲＳ−ＣｏＶと共に、増殖培地にインターフェロンを加えることによって投与を行うことができる。
【００２１】
[0026]患者はヒトを含めた任意の動物であってよい。特定の実施形態では、患者はヒトである。
【００２２】
[0027]投与の標準的な方法を使用して、インターフェロンを患者に投与することができる。様々な実施形態において、インターフェロンは経口投与、非経口投与あるいは当分野で知られている任意の標準的な方法を含めて全身に投与する。
【００２３】
[0028]患者に投与するとき、インターフェロンの有効量は、感染を改良する、感染の広がりを緩和、改善、軽減、改良、安定化、防止する、感染の進行を緩やかにするまたは遅延させる、または感染を治療するのに充分な期間に必要とされる量である。例えばそれは、ウイルス負荷を低下させるか排除する効果、あるいはＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染する細胞数を低下または安定化させる効果、またはＳＡＲＳ−ＣｏＶの複製および／または増殖を阻害する効果、または感染細胞から非感染細胞へのウイルスの広がりを防止するか緩やかにする効果を得るのに充分な量であってよい。
【００２４】
[0029]患者に投与される有効量は、インターフェロンの薬力学的性質、投与の形式、患者の年齢、健康状態および体重、疾患状態の性質および程度、治療の頻度、および存在する場合は同時治療の型、ならびにインターフェロン調製物のタンパク質活性などの、多くの要因に応じて変わる可能性がある。
【００２５】
[0030]当業者は、前述の要因に基づいて適切な量を決定することができる。患者の臨床的応答に応じて、必要に応じて調節することができる適切な量でインターフェロンを最初に投与することができる。インターフェロンの有効量は経験によって決定することができ、安全に投与することができるインターフェロンの最大量、および望ましい結果を生み出すインターフェロンの最小量に依存する。
【００２６】
[0031]投与されるインターフェロンの濃度は、投与される特定の型または亜型のインターフェロンの能力、ならびにインターフェロンの供給源およびグリコシル化の量に応じて変わるであろう。例えば、ＩＦＮαのいくつかの亜型に関しては、その量はヒト患者への投与に関して、１週間に３回約３〜５百万ＩＵから１日当たり約５百万ＩＵまで変わる可能性がある。ＩＦＮβ亜型に関しては、約３〜６百万ＩＵの用量を１週間に３回投与することができる。皮下経路によって投与されるインターフェロンの血漿レベルは短い半減期に相当して、通常低い。それらの作用機構を鑑みると、絶対的な血清レベルは、２’５’−オリゴアデニル酸合成酵素などの細胞産物の誘導と比較して、インターフェロンの生物学的活性の指標として意味あるものではない可能性がある。
【００２７】
[0032]有効量のインターフェロンは、初期の治療養生法の効果に応じて繰り返し与えることができる。いかなる応答を監視しながら、典型的には投与を定期的に与える。選択した投与スケジュールおよび経路に従い、前に示した用量より少ないまたは多い用量を与えることができることは、当業者によって理解されるであろう。
【００２８】
[0033]インターフェロンは単独で、あるいは追加の抗ウイルス剤と組み合わせて投与することができる。追加の抗ウイルス剤は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに感染した個体に投与すると抗ウイルス作用を示すいかなる物質であってよい。例えば追加の抗ウイルス剤は、ヌクレオシド類似体、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、または受容体アンタゴニストであってよい。
【００２９】
[0034]例えば一実施形態では、インターフェロンをリバビリンと組み合わせて投与する。リバビリンはヌクレオシド類似体であり、以下の実施例で述べるように、比較的高濃度のリバビリン（０．５〜５ｍｇ／ｍＬ）であるが、試験したすべてのウイルス負荷において阻害活性を観察した。しかしながら、ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する阻害作用を実証するために必要とされたリバビリンの濃度は、観察されたわずかな細胞毒性をもたらした。これらの結果は、リバビリンは単独ではＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の治療に適さないことを示すが、リバビリンは低用量で他の治療剤と組み合わせて使用してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、リバビリンはインターフェロンと組み合わせて投与することができる。いくつかの実施形態では、インターフェロンと組み合わせてヒト被験体に投与するリバビリンの用量は、１日当たり約６００ｍｇと約１２００ｍｇの間であり、この用量はＣ型肝炎に対する併用療法として有効であることが示されてきている、例えば参照によって本明細書に組み込まれた米国特許第６，６８５，９３１号を参照のこと。
【００３０】
[0035]「と組み合わせて」は、インターフェロンと追加の抗ウイルス剤の同時または逐次投与を指す。同時に投与するとき、インターフェロンと追加の抗ウイルス剤は、同じ賦形剤形または剤形で一緒に投与することができ、あるいは別個の賦形剤形または剤形で投与することができ、ただし同時に投与することができる。逐次的に投与するとき、インターフェロンの投与は、多数の投与で与える場合、追加の抗ウイルス剤の１回または複数回の投与のタイミングと、その２つを共通の治療スケジュールの工程内で投与して、望ましい併用治療効果を得るように重複させることができる。インターフェロンと追加の抗ウイルス剤の投与の経路は、異なる賦形剤形または剤形で同時に投与しようと、あるいは逐次的に投与しようと、同じであるかあるいは異なっていてよい。
【００３１】
[0036]インターフェロンは単独で、あるいは薬剤として許容可能な担体と組み合わせて投与することができ、その比率はインターフェロンの溶解度および化学的性質、選択した投与の経路および標準的な薬剤慣習によって決定される。
【００３２】
[0037]投与を容易にするために、インターフェロンは医薬組成物中に成分として配合することができる。したがって一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適した生物学的に適合性がある形の、インターフェロンおよび薬剤として許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
[0038]医薬組成物は、前に記載したようなリバビリンを含めた他のウイルス剤をさらに含むことができる。
【００３４】
[0039]医薬組成物は、薬剤として許容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、および様々な適合性がある担体を通常含むことができる。あらゆる送達形用に、組換えウイルスを生理塩溶液中に配合することができる。
【００３５】
[0040]薬剤として許容可能な担体の比率および同一性は、選択した投与の経路、活性タンパク質との適合性および標準的な薬剤慣習によって決定される。一般に医薬組成物は、インターフェロンの生物学的活性を著しくは害さないであろう要素と共に配合される。
【００３６】
[0041]医薬組成物は、有効量の活性物質を薬剤として許容可能な賦形剤との混合物中に組み合わせるような、患者への投与に適した薬剤として許容可能な組成物の知られている調製法によって調製することができる。適切な賦形剤は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、ＵＳＡ１９８５）中に記載されている。これに基づくと、組成物は独占的にではないが、適切なｐＨを有し生理的流体と等張である緩衝溶液中に含まれる、インターフェロンおよび１つまたは複数の薬剤として許容可能な賦形剤または担体の溶液を含む。
【００３７】
[0042]医薬組成物は、当業者によって理解されるように、選択した投与の経路に応じて様々な形で患者に投与することができる。本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与することができる。非経口的投与には、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経皮、鼻腔、肺内、クモ膜下、直腸および局所の投与形式がある。非経口的投与は、選択した期間にわたる連続的注入によるものであってよい。
【００３８】
[0043]医薬組成物は、例えば不活性希釈剤または吸収性担体と共に経口的に投与することができ、あるいは医薬組成物は硬質または軟質の殻のゼラチンカプセル中に封入することができ、あるいは医薬組成物は錠剤に圧縮することができ、あるいは医薬組成物は食品と共に直接取り込ませることができる。経口治療投与用に、インターフェロンは賦形剤と共に取り込ませることができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形で使用することができる。
【００３９】
[0044]医薬組成物は、非経口的あるいは腹腔内に投与することもできる。インターフェロンの溶液は、生理的に適切な緩衝液中で調製することができる。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含むが、それがインターフェロンタンパク質を不活性化させることはないであろう。当業者は、適切な配合物の調製の仕方を知っていると思われる。適切な配合物を選択および調製するための従来の手順および成分は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中、および１９９９年に公開されたＴｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ２４ＮＦ１９）中に記載されている。
【００４０】
[0045]注射用途に適した医薬組成物の形には、滅菌済み水溶液または分散液、および滅菌済み注射溶液または分散液の即席調製用の滅菌済み粉末がある。いずれの場合も、その形は滅菌済みでなければならず、容易な注射性が存在する程度に流動的でなければならない。
【００４１】
[0046]使用する医薬組成物の用量は、感染の重度および段階、年齢、身体条件、大きさおよび体重、治療の期間、同時抗ウイルス療法の性質（存在する場合）、具体的な投与経路、および医療実践者の知識および専門知識内にある他の同様の要因を含めた個々の患者のパラメータに依存する。これらの要因は当業者に知られており、最小限の通常の実験で扱うことができる。
【００４２】
[0047]インターフェロン、またはインターフェロンを含む医薬組成物は、キットとしてパッケージ化することができ、本発明は一態様において、インターフェロン、およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を治療するためにインターフェロンを使用するための使用説明書、またはＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害するためにインターフェロンを使用するための使用説明書を備えるキットを提供する。一実施形態では、キットは追加の抗ウイルス剤、例えばリバビリン、ならびにインターフェロンおよび追加の抗ウイルス剤を同時または逐次投与するための使用説明書をさらに含むことができる。
【００４３】
[0048]本発明は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を治療するためのインターフェロンの使用、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を治療するための医薬品の製造におけるインターフェロンの使用、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害するためのインターフェロンの使用、およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染を阻害するための医薬品の製造におけるインターフェロンの使用を含めた、インターフェロンの様々な使用も企図する。
【００４４】
[0049]本明細書で言及するすべての参照文献は、参照によって組み込まれている。
【００４５】
実施例
[0050]この試験の目的は、一群の現在利用可能な抗ウイルス剤が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ活性を示すかどうかを調べることであった。細胞変性終点（ＣＰＥ）を使用する細胞系アッセイを、ＶｅｒｏＥ６細胞を使用して設定し、これらの抗ウイルス化合物をスクリーニングした。ＳＡＲＳ−ＣｏＶは、アフリカミドリザルの腎臓細胞系ＶｅｒｏＥ６細胞に感染することが示されてきている（３）。末梢血白血球およびＴＨＰ−１単球細胞系と共に、以下の方法を使用することができるとも企図される。最初のスクリーニングの後、プラーク減少アッセイを続けて、陽性の結果を示す化合物の５０％有効濃度（ＥＣ５０）を測定した。これらの実験は市販の抗ウイルス剤の素早いスクリーニングを可能にし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性の証拠を有する抗ウイルス剤を臨床試験に迅速に移す、何故ならヒトにおける安全性および薬物動態情報は、他の疾患徴候用に既に利用可能であるからである。ウイルス感染の治療における臨床用途に認められている合計１９の薬剤を試験しており、これらは現在市販されている主要な抗ウイルス薬物群由来の代表的な化合物：ヌクレオシド類似体、インターフェロン、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤およびノイラミニダーゼ阻害剤である。
【００４６】
[0051]材料および方法
【００４７】
[0052]薬剤の選択および調製：ＳＡＲＳを治療するために使用することができると思われる薬剤物質を迅速に同定するために、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、異型肺炎の病因因子に対する抗ウイルス薬剤の集合を試験した。考えられる分子標的の広範囲のスペクトルを調べるために、コロナウイルスに対して活性があることが予想されない物質を含めた、全薬剤範囲の市販の抗ウイルス剤を含めることを我々は決定した。ここに提供した抗ウイルス剤に関する情報は処方箋の情報シートから、あるいは製造者とのコミュニケーションから入手した。
【００４８】
[0053]ヌクレオシド類似体は１つの多様な化合物群であり；一般にそれらは、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼまたは他の酵素を阻害し、核酸合成に干渉する。この試験では、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）などのＤＮＡウイルスを標的とする選択した化合物は、アシクロビル、ガンシクロビル、およびホスカルネットであった。リバビリンはある範囲のＤＮＡおよびＲＮＡウイルスに対する活性を有しており；異なる細胞系では、ＥＣ５０は１〜１００μｇ／ｍｌの範囲である。抗レトロウイルス（ＨＩＶ）剤は、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を含む。試験した選択ＨＩＶヌクレオシドＲＴ阻害剤はジドブジンおよびラミブジンであり、一方試験したＨＩＶプロテアーゼ阻害剤はインジナビル、ネルフィナビル、およびサクイナビルであった。試験した第３群の抗ウイルス剤はノイラミニダーゼ阻害剤であり；両方共に市販の調製物である、ザナミビルおよびオセルタミビルをこの試験で使用した。インターフェロンは、試験した次の主要な群の抗ウイルス剤であった。インターフェロンαの様々な亜型（２ａ、２ｂ、ｎ１、およびｎ３、ヒト白血球）およびβ（１ａおよび１ｂ）を使用した。アマンタジン、古い抗ウイルス化合物も試験した。異なる用語、すなわち５０％有効濃度（ＥＣ５０）、９５％有効濃度（ＥＣ９５）、５０％有効用量（ＥＤ５０）、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）９５％阻害濃度（ＩＣ９５）、および最小阻害濃度（ＭＩＣ）を使用して抗ウイルス活性を表している。表１は、いくつかのウイルスに対する個々の抗ウイルス剤の活性の範囲を示す。
【００４９】
【表１】
2006527268.tif 000002
【００５０】
[0054]１０倍希釈の薬剤を試験して、他のウイルス−宿主組合せに関して製造者によって報告されたのと同様に、前述の広範囲の濃度および以下の阻害用量をカバーした。水性注射液中に既に存在した化合物は、ハンクス緩衝生理食塩水溶液を使用することによって体積を調節した。可溶性活性成分を有する錠剤およびカプセル配合物に関しては、適切な場合は常に外被を除去し、調製物は乳鉢および乳棒ですり潰した。中身は水に溶かし、攪拌し、３，０００ｇで後に遠心分離した。必要とした体積を上清からピペットで採取し、それに応じて希釈した。活性成分が水に不溶であるとき（ネルフィナビルおよびサクイナビル）、中身はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし；希釈液中のＤＭＳＯの最終濃度が１％を超えないことが確実となるように注意を払った。プラークアッセイ用に、以下に示した増殖培地を使用することによって５倍希釈の薬剤を調製した。
【００５１】
[0055]ＳＡＲＳ−ＣｏＶの生成および感染：ＶｅｒｏＥ６細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、７５ｃｍの２つの細胞培養フラスコ中、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を補った培地１９９（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からなる増殖培地中で増殖させた。以前に塩基配列決定した（１４）、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ２００３ＶＡ２７７４（シンガポールでのＳＡＲＳ患者からの単離体）を、ＶｅｒｏＥ６細胞中で増殖させた。簡潔には、２ｍＬのストックウイルスをＶｅｒｏＥ６細胞の集密的な単層に加え、１時間５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートし；５％のＦＣＳを補った１３ｍＬの培地１９９を次いで加えた。培養物は５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートし、上清を４８時間後に採取し；７５％を超える培養物において、倒立顕微鏡を用いてそれぞれのウェル中でＣＰＥの阻害（３＋）を観察した。上清は２，５００ｒｐｍで清澄化し、次いで等分試料に分け、クリオバイアル中に置き、使用するまで−８０℃で保存した。
【００５２】
[0056]ウイルスの処理および力価測定：すべてのウイルス培養およびアッセイは、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１５）中の生物学的安全性で設定された条件に従い、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて生物学的安全性レベル３の研究室内で行った。凍結培養上清中のウイルス力価は、プラークアッセイを使用することによって測定した。簡潔には、１００μＬのウイルスの１０倍連続希釈液を２連で、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏＥ６細胞の単層に加えた。５％ＣＯ２中での３７℃における１時間のインキュベーションの後、ウイルス接種原を吸引し、５％のＦＣＳを補った培地１９９を含む１ｍＬのカルボキシメチルセルロース上層を、それぞれのウェルに加えた。４日間のインキュベーションの後、細胞は１０％のホルマリンで固定し、２％のクリスタルバイオレットで染色した。プラークは肉眼で観察し、１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ｍＬ）中のウイルス力価を計算した。
【００５３】
[0057]細胞変性終点アッセイ：使用したプロトコルはＡｌ−Ｊａｂｒｉら（１６）から適合させたものであり、すべての薬剤は４連で試験した。簡潔には、１００μＬの薬剤の１０倍連続希釈液を１００μＬのＶｅｒｏＥ６細胞と共にインキュベートし、９６ウェルプレート中においてウェル当たり２０，０００個の細胞の最終細胞数を得た。細胞と共に一晩インキュベートしたインターフェロン以外は、インキュベーション時間は５％ＣＯ２中で３７℃において１時間であった。１０，０００ＰＦＵ／ウェルの濃度で１０マイクロリットルのウイルスを、次いで試験ウェルのそれぞれに加えた。プレートは３日間５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートし、ＣＰＥに関して毎日観察した。終点は、４連のウェルで１００％のＣＰＥを阻害した薬剤希釈点（ＣＩＡ１００）であった。細胞毒性を測定するために、１００μＬの薬剤の１０倍連続希釈液を１００μＬのＶｅｒｏＥ６細胞と共にインキュベートし、ウイルス攻撃なしで、９６ウェルプレート中においてウェル当たり２０，０００個の細胞の最終細胞数を得た。次いでプレートは３日間５％ＣＯ２中で３７℃においてインキュベートし、倒立顕微鏡を使用することによって毒性作用に関して調べた。
【００５４】
[0058]プラーク減少アッセイ：トリプシン処理したＶｅｒｏＥ６細胞を増殖培地に再懸濁させ、２４ウェルプレート中の４連のウェルにおいてインターフェロン（連続５倍希釈）と共にプレインキュベートした。翌日、培地を吸引し、１００μＬのウイルスを１００ＰＦＵ／ウェルの力価でそれぞれのウェルに加えた。１時間のインキュベーションの後、ウイルス接種原を吸引し、維持培地および適切な濃度のインターフェロンを含むカルボキシメチルセルロース上層を加えた。４日間のインキュベーションの後、前に記載したのと同様にプレートを固定し染色した。プラークの数を次いで肉眼で数え、それぞれのウェル中で５０％のプラークを阻害する薬剤の濃度（ＩＣ５０）を測定した。結果はマイクロソフトエクセルでプロットし、３次の多項式を使用してデータを近似しＩＣ５０およびＩＣ９５の値を推定した。
【００５５】
[0059]結果
【００５６】
[0060]ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染の細胞系アッセイ：ＳＡＲＳ患者の呼吸系サンプルに本来由来する高力価の感染性ＳＡＲＳ−ＣｏＶを、ＶｅｒｏＥ６細胞において増殖させた。ＶｅｒｏＥ６におけるＳＡＲＳ−ＣｏＶのＣＰＥは、感染後２４時間以内で明らかであった（図１）。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染細胞は、円形細胞の外見および単層の破壊によって特徴付けられるＣＰＥを示す。
【００５７】
[0061]抗ウイルス剤の活性：１９個の抗ウイルス剤の集合を、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＣＰＥ阻害アッセイで試験した（表２）。試験した薬剤の組は、７個のインターフェロン、５個のヌクレオシド類似体、３個のプロテアーゼ阻害剤、２個のＲＴ阻害剤、および２個のノイラミニダーゼ阻害剤を含んでいた。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
[0062]１０４ＰＦＵ／ウェルの非常に強力なウイルス攻撃および高い感染多重度（ＭＯＩ＝０．５）比率を使用すると、最初のスクリーニングにおいて７個のインターフェロンの４個に関してＣＰＥの完全な阻害を観察した。ＣＩＡ１００として表した完全な阻害を、５，０００ＩＵ／ｍＬでインターフェロンβ−１ｂ（ベータフェロン）に関して、５，０００ＩＵ／ｍＬでインターフェロンα−ｎ３（アルフェロン）に関して、２５０，０００ＩＵ／ｍＬでインターフェロンα−ｎ１（ウェルフェロン）に関して、および５００，０００ＩＵ／ｍＬでヒト白血球インターフェロンα（マルチフェロン）に関して観察した。リバビリンも、５，０００ＩＵ／ｍＬでＣＰＥを完全に阻害した（表３）。他の薬剤はいずれも、試験した薬剤の最高濃度においてさえＣＰＥの完全な阻害を示さなかった（表２）。Ｒｅｂｉｆ（ＩＦＮ−β−１ａ）は２５０，０００ＩＵ／ｍＬでＣＰＥのわずかな阻害を示したが、その阻害はスクリーニングした１０，０００ＰＦＵ／ウェルのウイルス負荷において完全ではなかった。同様に、Ｒｏｆｅｒｏｎ（ＩＦＮ−α−２ａ）は、５０，０００ＩＵ／ｍＬでわずかな不完全な阻害を示した。
【００６０】
[0063]このスクリーニングにおいて抗ＳＡＲＳ−ＣｏＶ活性を確認するための基準はＣＰＥの１００％阻害に設定したので、かつ高用量のインターフェロンは重度の臨床上の副作用をもたらす可能性があるので、最初のスクリーニングから完全な阻害を示したインターフェロン、すなわちウェルフェロン、マルチフェロン、ベータフェロン、およびアルフェロンにおいてのみ、さらなる評価を行うことを我々は選択した。主なスクリーニングの結果に基づいて、４個の活性インターフェロンおよびリバビリンを、２つの弱度のウイルス攻撃、１０３および１０２ＰＦＵ／ウェルで再度試験した。４個の薬剤すべてが、阻害作用を再度示したが、ＣＩＡ１００はウイルス負荷に依存していた（表３）。最も低いウイルス負荷では、ＣＩＡ１００は、インターフェロンβ−１ｂ（ベータフェロン）とヒト白血球インターフェロンα（マルチフェロン）の両方に関して５ＩＵ／ｍＬ；インターフェロンα−ｎ３（アルフェロン）およびインターフェロンα−ｎ１（ウェルフェロン）に関して、それぞれ５０ＩＵ／ｍＬおよび２５０ＩＵ／ｍＬであった。阻害濃度またはその近辺において、インターフェロンの細胞毒性は観察しなかった。リバビリンは、高濃度の薬剤、０．５〜５ｍｇ／ｍＬのみではあったが、３つのウイルス負荷すべてにおいて阻害活性を示した。高濃度のリバビリン（０．２〜１ｍｇ／ｍＬ）では、他の細胞型に関して報告されたのと同様に、細胞毒性作用をＶｅｒｏＥ６細胞において観察した（１７、１８）。このように我々は、リバビリンはＳＡＲＳ−ＣｏＶに対する唯一の治療剤として不活性であると考える。
【００６１】
【表３】
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【００６２】
[0064]１００ＰＦＵのＳＡＲＳ−ＣｏＶ（ＭＯＩ＝０．０００５）を用いるプラーク減少アッセイ形式を行って、ＣＰＥの阻害に関して最大の効力を示した３つの化合物、ベータフェロン、アルフェロン、およびマルチフェロンに関するＩＣ５０を測定した。インターフェロンα−ｎ１（ウェルフェロン）を試験するための追加の供給源は入手可能ではなかった、何故ならこの薬剤の生産は中断されていたからである。５倍希釈の薬剤と共に１５時間、細胞をプレインキュベートした。３日間で発達したウイルス誘導型プラークを計数して、様々な濃度での薬剤の阻害作用を測定した。３つすべてのインターフェロン調製物が、このアッセイでＳＡＲＳ−ＣｏＶプラーク形成の用量依存的な阻害を示した（図２〜４）。試験したＩＦＮのそれぞれに関して、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの細胞変性作用の１００％阻害（ＣＩＡ１００）を得るために必要とされた量は、ウイルス負荷と共に変化した（表３）。ＩＣ５０およびＩＣ９５はそれぞれ、ベータフェロンに関して０．２および８ＩＵ／ｍＬ（図３）、アルフェロンに関して０．８および２００ＩＵ／ｍＬ（図２）、ならびにマルチフェロンに関して２および４４ＩＵ／ｍＬであると測定した（図４）。
【００６３】
[0065]当業者によって理解されるように、本明細書に記載した例示的な実施形態に対する多くの変更形態が考えられる。本発明はむしろ、特許請求の範囲によって定義するように、その範囲内にすべてのこのような変更形態を含むと考えられる。
【００６４】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
本発明の実施形態を、単なる例によって例示する図面では、以下の通りである。
【図１】ＳＡＲＳ−ＣｏＶの細胞変性作用を実証する、（ａ）非感染状態あるいは（ｂ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染したＶｅｒｏＥ６細胞の写真の図である。
【図２】プラーク減少アッセイによって測定した、インターフェロンα−ｎ３に関する用量反応曲線を示す線グラフの図である。
【図３】プラーク減少アッセイによって測定した、インターフェロンβ−１ｂに関する用量反応曲線を示す線グラフの図である；および
【図４】プラーク減少アッセイによって測定した、ヒト白血球インターフェロンαに関する用量反応曲線を示す線グラフの図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2006527268.tif 000010
2006527268.tif 000011