(57)【要約】片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の診断または治療に使用するためのNA-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)の機能セグメントをコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントを含む核酸について記載している。適切な診断キットおよびアゴニスト剤またはアンタゴニスト剤を同定する方法も記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の診断に使用するためのNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)の機能部分または遺伝子調節領域をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントを含む核酸。
【請求項２】
片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の遺伝子治療に使用するためのNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)の機能部分または遺伝子調節領域をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントを含む核酸。
【請求項３】
片頭痛疾患に関連する、第1染色体に位置するヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の少なくとも1つの変異を個体で検出する方法であって、
十分な量の個体DNAを含む試料または培養下で再生産可能な試料を回収するステップと、
前記試料から前記DNAを分離するステップと、
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントまたはそれを調節する領域のセグメントを増幅することができる、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを増幅反応のためのオリゴヌクレオチド対として用いて、前記DNAを指数関数的に増幅するステップと、
健常対照と比較して、少なくとも1つの増幅セグメントの変異を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド対が、
（配列１）
2006506080.tif 000010
である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の全コード部分を増幅することができるオリゴヌクレオチド対を用いて、前記DNAの指数関数的な増幅段階を実施する、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)の遺伝子をコードする全コード部分を増幅する、前記DNAの指数関数的な増幅段階が、次のオリゴヌクレオチド対：
（配列２）
2006506080.tif 000011
の少なくとも1つの使用を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の調節領域を増幅することができるオリゴヌクレオチド対を用いて、前記DNAの指数関数的な増幅段階を実施する、請求項3に記載の方法。
【請求項８】
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の調節領域を増幅する、前記DNAの指数関数的な増幅段階が、次のオリゴヌクレオチド対：
（配列３）
2006506080.tif 000012
の使用を含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
直接シークエンシングまたはSSCP法(一本鎖高次構造多型)(17)DHPLCまたはDGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)(18)を用いて、健常対照と比較して、変異を有する少なくとも1つの増幅セグメントの検出段階を実施する、前記請求項に記載の方法。
【請求項１０】
片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態に関して、請求項3から9の方法を実施するための診断キットであって、
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントであって、前記サブユニットの機能部分または遺伝子調節部分をコードしている前記セグメントの指数関数的な増幅反応のための少なくとも1対のオリゴヌクレオチドと、
罹患していない個体由来の対照DNAと
を含むキット。
【請求項１１】
前記増幅反応のための前記オリゴヌクレオチド対が、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の全コード領域を増幅することができる、請求項10に記載のキット。
【請求項１２】
片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の診断に使用するためのヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)タンパク質またはその機能部分。
【請求項１３】
片頭痛に関連する病態の治療に使用するためのヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)タンパク質またはその機能部分。
【請求項１４】
ヒトNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)または前記サブユニットの機能部分もしくは遺伝子調節部分のアゴニスト剤またはアンタゴニスト剤を同定する方法であって、
(i)細胞系にウアバイン耐性のヒトNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)の変異体アイソフォームの遺伝子をトランスフェクションすることと、
(ii)前記トランスフェクトされた細胞を前記薬剤に適切に曝露することと、
(iii)標識イオンを用いて、イオン輸送に関するNa-Kポンプ活性を測定することと
を含む方法。
【請求項１５】
Na-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)または機能部分のアゴニスト剤またはアンタゴニスト剤を同定する方法であって、
(i)前記薬剤を使用して、Na-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)の変異体アイソフォームを発現するトランスジェニック動物、またはNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子を部分的もしくは完全に欠失したトランスジェニック動物を処理する段階、あるいは
(ii)前記薬剤を使用して、生理条件下、または一時的もしくは永続的なトランスフェクションによりNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)の変異体または正常体を発現する真核細胞系または原核細胞系を処理する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、片頭痛および小児交代性片麻痺などのNa-Kポンプのα2サブユニットに関連する病態の診断および治療手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
片頭痛は頭痛の発作を特徴とし、自律神経機能障害および一過性の神経症状(アウラ)と関連することもある。一般集団における片頭痛の罹患率は12%であり、患者の20%がアウラを伴う(1〜5)。
【０００３】
伝達様式については意見が分かれるが(6)、片頭痛は強い家族集積性を示す(7)。いくつもの集団ベースの研究および双生児に基づく研究により、特にアウラを伴う片頭痛には遺伝因子が関わっていることが示されている(8、9)。家族性片麻痺性片頭痛(FHM)は、アウラおよび片側不全麻痺と共に表れる、日常生活に支障を来すほどの神経学的疾患である。約10000〜50000人に1人が罹患し、常染色体の優性遺伝様式で遺伝する(10)。
【０００４】
FHM1(MIM 141500)に関連し、神経のカルシウムチャンネルタンパク質(CACNA1A)をコードする遺伝子は既に同定されている(11)。PCT特許出願WO98/55647に、染色体1q21〜23の21cM(センチモルガン)という広い領域に関わる片麻痺性片頭痛タイプ2を診断するための間接的な遺伝子型特定方法が記載されている。この疾患に関する遺伝子の同定については全く説明されていないが、2つの候補遺伝子、GIRK3(カリウムチャンネルタンパク質をコードする)およびCACNL1A6(カルシウムチャンネルタンパク質をコードする)が示唆されている。
【特許文献１】PCT特許出願WO98/55647
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の著者は、染色体1q23上に位置するFHM2(MIM 602481)に関連する遺伝子(12)を同定し、Na-K ATPアーゼポンプのα2サブユニット(ATP1A2)の変異がこの疾患に関与することを示した。同定された遺伝子は、既存の技術文書、特に前述の特許出願WO98/55647で示唆されているいかなる遺伝子または領域にも該当していない。著者は同定されたミスセンス変異が主要なイオン輸送系の機能喪失を起こすことを明らかにした。これは、神経疾患における皮質の拡延性抑圧の原因および片頭痛の進行に関連性がある。これは、Na-Kポンプにおける変異が遺伝的疾患に関連することを示す最初のものである。GIRK3およびCACNL1A6の研究では、片頭痛に関与し得るこれらの遺伝子に全く変異が示されなかったことも強調するべきである。
【０００６】
さらに、普通片頭痛の素因として、これらを関連付けるために、前記遺伝子に関連する多型を研究することが可能である。
【０００７】
小児交代性片麻痺(AHC,OMIM 104290)はまれな症候群であり(推定罹患率は1/1000000)、数分から数日間続く、一過性片麻痺または四肢麻痺の早期発症を特徴とする。
【０００８】
増幅に同一のプライマーを用いて全てのエキソンを直接シークエンシングすることにより、ATP1A2遺伝子の変異分析を行った。AHCの家族で疾患と共に分離する、スレオニンからアスパラギンへの置換(T378N)を起こすヘテロ接合変異(1237 C->A)が認められた。この変異は、この家族の非罹患メンバーと250の対照染色体には存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の診断に使用するためのNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)の機能部分または遺伝子調節領域をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントを含む核酸である。
【００１０】
本発明の別の目的は、片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の遺伝子治療に使用するためのNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)の機能部分または遺伝子調節領域をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントを含む核酸である。
【００１１】
本発明の別の目的は、片頭痛疾患または小児交代性片麻痺に関連する、第1染色体に位置するヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の少なくとも1つの変異を個体で検出する方法であって、
十分な量の個体DNAを含む試料または培養下で再生産可能な試料を回収するステップと、
その試料からDNAを分離するステップと、
ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントまたはそれを調節する領域のセグメントを増幅することができる、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを増幅反応のためのオリゴヌクレオチド対として用いて、DNAを指数関数的に増幅するステップと、
健常対照と比較して、少なくとも1つの増幅セグメントの変異を検出するステップとを
含む方法である。好ましくは、オリゴヌクレオチド対が、
（配列1）
2006506080.tif 000002
である。
【００１２】
本発明の方法の一実施形態では、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の全コード部分を増幅することができるオリゴヌクレオチド対を用いて、DNAの指数関数的な増幅段階を実施する。好ましくは、ヒトNA-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の全コード部分を増幅するDNAの指数関数的な増幅段階が、次のオリゴヌクレオチド対： 
（配列2）
2006506080.tif 000003
2006506080.tif 000004
の少なくとも1つの使用を含む。
【００１３】
本発明の方法の一実施形態では、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の調節領域を増幅することができるオリゴヌクレオチド対を用いて、DNAの指数関数的な増幅段階を実施する。好ましくは、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の調節領域を増幅するDNAの指数関数的な増幅段階が、次のオリゴヌクレオチド対の使用を含む。
（配列3）
2006506080.tif 000005
【００１４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、直接シークエンシングまたはSSCP法(一本鎖高次構造多型)(17)DHPLCまたはDGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)(18)または本分野の技術者に知られるその他の方法を用いて、健常対照と比較して、変異を有する少なくとも1つの増幅セグメントの検出段階を実施する。
【００１５】
本発明の別の目的は、片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の診断キットであり、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の少なくとも1つのセグメントであって、そのサブユニットの機能部分または遺伝子調節部分をコードしているそのセグメントの指数関数的な増幅反応のための少なくとも1対のオリゴヌクレオチドと、罹患していない個体由来の対照DNAとを含む。好ましい形態では、その増幅反応のためのオリゴヌクレオチド対が、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子の全コード領域を増幅することができる。
【００１６】
本発明の別の目的は、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)タンパク質、または片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の診断に使用されるその機能部分である。
【００１７】
本発明の別の目的は、ヒトNa-Kポンプのα2サブユニット(ATPアーゼ、ATP1A2)タンパク質、または片頭痛または小児交代性片麻痺に関連する病態の治療に使用されるその機能部分である。
【００１８】
本発明の別の目的は、ヒトNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)またはその機能部分もしくは遺伝子調節部分のアゴニスト剤またはアンタゴニスト剤を同定する方法であって、
(i)細胞系にウアバイン耐性のヒトNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)の変異体アイソフォームの遺伝子をトランスフェクションすること、
(ii)トランスフェクトされた細胞を薬剤に適切に曝露することと、
(iii)標識イオンを用いてイオン輸送に関するNa-Kポンプ活性を測定することと
を含む方法である。
【００１９】
本発明の別の目的は、Na-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)または機能部分のアゴニスト剤またはアンタゴニスト剤を同定する方法であって、
(i)その薬剤を使用して、Na-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)の変異体アイソフォームを発現するトランスジェニック動物、またはNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)をコードする遺伝子を部分的もしくは完全に欠失したトランスジェニック動物を処理する段階、あるいは
(ii)薬剤を使用して、生理条件下、または一時的もしくは永続的なトランスフェクションによりNa-Kポンプ(ATPアーゼ、ATP1A2)の変異体または正常体を発現する真核細胞系または原核細胞系を処理する段階
を含む方法である。
【００２０】
本発明について、限定されない実施例と後述の図を参照して以下に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
[実施例１]
片頭痛
材料および方法
FHM2の家族
トスカーナ州出身であり、FHM(5)と臨床診断されたイタリアの大きな家系(ファミリー1)の22人の被験者、およびシチリア島出身の無関係の家系(ファミリー2)であり、同様の徴候を示す7人を選択した。FHMに小脳徴候が伴うことはなかった。発作の発症は20歳までに起こっていた。その他の特徴は、5人(ファミリー1の3人とファミリー2の2人)における急発作の病歴、およびファミリー1の2人における軽度または中等度の精神薄弱であった。イタリア人集団から無作為に収集した200人の健常者を対照被験者として供試した。
【００２２】
変異のスクリーニング
ATP1A2のmRNA(AC NM_000702)配列をクローンRP11-536C5の対応するゲノム配列と並べて、ヒトATP1A2遺伝子のゲノム機構を決定した。その遺伝子コード領域を増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを表1に示す。異常なD-HPLC(Wave、Transgenomic社、英国クルー)保持パターンを示すPCR産物を、直接シークエンシング(DYEnamic ET Dye Terminatorキット、アマーシャムバイオサイエンス社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)にかけた。
【００２３】
【表１】
2006506080.tif 000006
プライマー対17および19(*)を用いてFHM2に関連する2つの変異を同定した。57℃の均一なアニーリング温度でPCRを設計した。
【００２４】
遺伝子発現調節領域(約3kbであり、さらに2つの部分的重複セグメントに細分されている)の増幅を可能にするオリゴヌクレオチドを表2に示す。
【００２５】
【表２】
2006506080.tif 000007
【００２６】
直接シークエンシングおよびDHPLC(変性高速液体クロマトグラフィー)(16)により、増幅したDNAの分析を行った。
【００２７】
構築体および部位特異的変異誘発
β2(ATP1B2,NM_001678)およびα2をコードする全長cDNAを、IMAGEクローン23453およびDFKZp761D047からそれぞれ得て、発現ベクターpcDNA3.1(インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールズバッド)でサブクローニングした。ATP1A2のcDNAの変異を誘発するために、次に示すQuickChange部位特異的変異誘発キット(ストラタジーン社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ)を使用した。
a)ウアバイン耐性アイソフォームを発現する構築体pA2Ouar-wtを得るためのnt451 A>G(Q116R)およびnt483 A>G(N127D)
b)pA2Ouar-P764を得るためのpA2Ouar-wt上のnt2395 T>C(L764P)
c)pA2Ouar-R887を得るためのpA2Ouar-wt上のnt2763 T>C(W887R)
d)c-myc標識ATP1A2のcDNA。本来の開始コドンを、c-myc標識(ヒトc-myc AC 0907235Aのaa408〜419に該当するaaMAEEQKLISEEDLから成る)で置換することで、発現構築体(pA2Ouar-wt、pA2Ouar-P764、およびpA2Ouar-R887)の変異を誘発し、pA2Ouar-wt-myc、pA2Ouar-P764-mycおよびpA2Ouar-R887-mycを得た。全ての構築体について配列を確認した。
【００２８】
in vitroでの転写および翻訳
20マイクロCi[35S]メチオニン(1000Ci/mmol)の存在下でTNT Coupled Reticulocyte Lysate System(プロメガ社、米国ウィスコンシン州マディソン)を用いて、in vitroでの転写および翻訳を行い、新たに合成されたタンパク質をSDS/PAGE(8%)で分離した。
【００２９】
電気泳動およびウエスタンブロット分析
同量のタンパク質をSDS-PAGE緩衝液(62.5mMトリスHCl pH6.8、2% SDS、10%グリセロール、5% 2-メルカプトエタノール)に再懸濁し、10% SDSポリアクリルアミドゲルにおいて100Vで2時間分離させた。トランスブロットしたニトロセルロース膜を、モノクローナル一次抗体の抗c-myc 9E10(10μg/ml)またはポリクローナル抗体の抗インテグリンβ1と共にインキュベートした後、ホースラデッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体と共にインキュベートした。Enhanced Chemiluminescenceキット(アマーシャムバイオサイエンス社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて、タンパク質バンドを視覚化した。
【００３０】
トランスフェクションおよびウアバイン処理
構築体を、標準的な方法に従い、リン酸カルシウム(HeLa細胞)またはリポフェクタミン(COS-7細胞)(ギブコ、インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールズバッド)によりトランスフェクトした。
【００３１】
12、24、36、48および60時間後に、細胞の生存性をMTT(13)還元試験により測定した。各試験を3反復行い、スチューデントt検定(等分散)により統計分析を行った。
【００３２】
免疫細胞化学研究
トランスフェクション(48時間)後に、COS-7細胞を100%メタノールで固定し、モノクローナル一次抗体の抗c-myc 9E10と共にインキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄し、Alexa Fluor 488コンジュゲート抗マウス二次抗体(モレキュラープローブ社、米国オレゴン州ユージーン)と共にインキュベートした。蛍光封入用培地(DAKO社、デンマーク、グロストラップ)中で細胞にカバーガラスをかけ、エピ蛍光下で視覚化した。
【００３３】
細胞亜分画
COS-7細胞を氷上で0.5M NaCl、10mM NA2CO3、0.1mM PMSF、10μg/mlアプロテニン(Aprotenin)、10μg/mlロイペプチンにより溶解し、ホモジネートし、4℃で20分間、2000gで遠心分離して核および細胞残屑を捨てた。ベックマンTL100超遠心分離機において4℃で40分間、100000gで遠心分離することによって、細胞質画分(上清)から膜画分(沈殿)を分離した。
【００３４】
結果
変異分析
減少したFHM2のクリティカル領域はD1S2635とCASQ1-SNPの間の0.9Mbだけにわたっているが、中枢神経系で発現する、いくつかの位置にある候補遺伝子がこのゲノム域に存在する。我々は、2つのカリウムチャンネル遺伝子、KCNJ9およびKCNJ10、ならびに陰性結果を示すカルセクエストリンをコードするCASQ1遺伝子におけるD-HPLC(変性HPLC)と直接シークエンシングの両方で、FHM2ファミリーの2人の被験者について変異分析を行った。
【００３５】
Na-K ATPアーゼのαサブユニットをコードするATP1A2遺伝子のD-HPLC変異スキャンにより、対照的に、ファミリー1およびファミリー2においてそれぞれエキソン17およびエキソン19に異常な溶出パターンがもたらされた(図1a)。シークエンシング分析により、2つの点変異(図1b、nt2395のTからCおよびnt2763のTからC)の存在が明らかになり、それぞれがファミリーの疾患により分離しており(図1c)、ファミリー1ではロイシンからプロリンへのアミノ酸置換(L764P)、ファミリー2ではトリプトファンからアルギニンへのアミノ酸置換(W887R)を起こしていた。両方のミスセンス変異は、400の対照染色体には無かった。L764およびW887は、進化的に離れた数種由来のαサブユニット間で完全に保存されており(図2)、したがって、FHM2の病原におけるATP1A2変異の原因としての役割が強く示唆される。
【００３６】
Na-Kポンプは、大きな触媒αサブユニットおよび小さな補助βサブユニットで形成されるヘテロ二量体構造である。αサブユニットは、10回膜貫通セグメント(M1〜M10)を有し、形質膜を貫通し(14)、細胞質にアミノ末端およびカルボキシ末端が露出している。この構造は、5つの細胞外および4つの細胞内ループドメインを定めている。L764P変異体およびW887R変異体は、αトポロジー内で異なる局在性を示す。L764PはM4とM5の間の細胞内ループに位置しているが、W887Rは先端M7〜M8ループに局在する(図3)。
【００３７】
損なわれたイオン輸送の機能の証明
様々なタンパク質構造に関するこの2つのアミノ酸置換の機能影響を評価するために、様々なトランスフェクション試験を行った。α2サブユニットおよびβ2サブユニットの全長ヒトcDNAをクローニングした(実験材料および方法のセクションを参照)。両方のサブユニットが活性α-βヘテロ複合体を組み立てるのに必要であるため、その後、全てのトランスフェクション試験を、同等の化学量論量を有するα2構築体およびβ2構築体を同時移入することにより行った。変異体アイソフォームの導入により(すなわち、変異体P764およびR887の全長cDNAの発現により)、細胞形状または増殖速度に顕著な変化は認められなかった(データには示していない)ので、ドミナント・ネガティブ影響を考慮しない。
【００３８】
全ての脊椎動物細胞がNa-K ATPアーゼ活性を持つため、外因性変異体のイオン輸送能力を試験するのにHeLa細胞の内因性Na-Kポンプ活性を抑えた。Na-K ATPアーゼのウアバイン結合部位の一部である最初の細胞外ループの2つのアミノ酸、Q116RおよびN127Dに変異を起こすことによって、ATP1A2構築体の天然のウアバイン感受性を排除するために部位特異的変異誘発を起こした(15)。ウアバイン耐性ATP1A2のcDNA構築体(pA2Ouar-wt)をトランスフェクトされたHeLa細胞は、1μMウアバイン含有培地で生存し、増殖することができるが(図4、パネルb)、偽のトランスフェクト細胞は36〜48時間で死滅する(図4、パネルa)。ヒト細胞系HEK293を用いて、同じ結果を得た。
【００３９】
ウアバイン耐性が陽性であった場合、引き続き、そのpA2Ouar-wt構築体に変異を起こさせ、FHM2変異体L764PおよびW887Rを導入し、対応する構築体pA2Ouar-P764およびpA2Ouar-R887を得た。pA2Ouar-P764およびpA2Ouar-R887をトランスフェクトされたHeLa細胞は、1μMウアバインの処理で生存することができない(図4、パネルdおよびf)ため、L764PおよびW887Rの両方が機能喪失型変異体であることが示唆される。同量の野生型および変異体構築体を同時移入することで得られる、模擬的なヘテロ接合状態では中間的な性質が示された(図4、パネルcおよびe)。両方の変異体ATP1A2アイソフォームで、Na-Kポンプ活性を欠如している細胞に特有の初期の細胞死が示された(図5a)。部位特異的変異誘発による異常タンパク質の産生の可能性を排除するために、in vitroでの転写および翻訳試験ならびに直接シークエンシングにより、wt構築体および変異体構築体を試験した。図5bに示すように、3つの構築体の全てにおいて、予想される112kDaのタンパク質バンドがもたらされ、こうして、変異体ATP1A2のcDNAをトランスフェクトされた時にクローニング産物がウアバインに対するHeLa細胞の敏感性に関与する可能性を排除した。
【００４０】
変異体ATP1A2アイソフォームを細胞膜に送る
我々は2つの変異体アイソフォームの細胞内局在性を調べた。c-mycエピトープをコードする5'タグを付加することで、3つの構築体(pA2Ouar-wt、pA2Ouar-P764、およびpA2Ouar-R887)を操作し、COS-7細胞にトランスフェクトした。図6aは、全てのアイソフォーム、野生型および2つの変異体の両方における細胞膜に対する期待免疫蛍光局在性を示す。細胞亜分画により、膜画分における生理学的場所を確認し(図6b)、対照としてインテグリンβ1サブユニットを検出した。
【００４１】
これらのデータにより、両方のミスセンス変異が、βサブユニットによる組み立てやその複合体の細胞膜への転移に影響を与えずに、単独でNa-Kポンプ活性を阻害するのに十分であることが明らかに示される。
[実施例２]
【００４２】
小児交代性片麻痺
実験材料および方法
構築体および部位特異的変異誘発
α2をコードする全長cDNAを、発現ベクターpcDNA3.1(インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールズバッド)でサブクローニングした。ATP1A2のcDNAの変異を誘発するために、次に示すQuickChange部位特異的変異誘発キット(ストラタジーン社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ)を使用した：ウアバイン耐性アイソフォームを発現する構築体pA2Ouar-wtを得るためのQ116RおよびN127D、pA2Ouar-wt変異型を得るためのpA2Ouar-wt上のT378N。全ての構築体について配列を確認した。
【００４３】
トランスフェクションおよびウアバイン処理
構築体を、標準的な方法に従い、リン酸カルシウム(HeLa細胞)によりトランスフェクトした。
【００４４】
24、48および72時間の1μMウアバインで処理した後に、細胞の生存性をMTT還元試験により測定した。2回の独立した試験を行い、各試験において3反復のデータを得た。
【００４５】
結果
小児交代性片麻痺(AHC、OMIM 104290)はまれな症候群であり(推定罹患率は1/1000000)、数分から数日間続く、一過性片麻痺または四肢麻痺の早期発症を特徴とする。
【００４６】
増幅に使用される同一のプライマーを用いた全てのエキソンの直接シークエンシングにより、ATP1A2遺伝子の変異分析を行った。AHCファミリーの疾患と共に分離し、スレオニンからアスパラギンへの置換(T378N)を起こすヘテロ接合変異(1237 C->A)が認められた。この変異は、この家族の非罹患メンバーおよび250の対照染色体では全く起こらない。
【００４７】
このミスセンス変異は、タンパク質のヒドロラーゼドメインのATPアーゼのリン酸化部位(DKTGTLT、aa374〜380)に局在している。サブユニットトポロジーにおいて、変異を受けた残りは、M4〜M5膜貫通セグメント(M1〜M10、[Hu,2000#7823])内部の大きな細胞内ループに残る。影響を受けた箇所の残りは、脊椎動物から無脊椎動物まで、全ての既知のNa-Kポンプのサブユニットで高度に保存されており、ポンプ活性化における機能的な役割が示唆される。
【００４８】
この変異がもたらした機能的な結果を評価するために、ヒトHeLa細胞でトランスフェクション試験を行った。全ての哺乳類細胞はNa+/K+ ATPアーゼを有するため、ウアバインを用いて内因性ポンプ活性を抑え、ウアバイン耐性に作られたcDNA構築体について内因的にトランスフェクトされた変異体の機能を試験した。部位特異的変異誘発により、ウアバイン耐性をもたらすために第1の細胞外ループに2つのアミノ酸変化(Q116RおよびN127D)およびAHC変異体T378Nを導入した。この構築体をトランスフェクトされたHeLa細胞は、1μMのウアバイン処理により生存しなかった。同量の野生型および変異cDNAをトランスフェクトすることにより得られる、模擬的なヘテロ接合状態は中間的な性質を示した(図7)。
【００４９】
さらに、経時試験で明らかになったが、変異体アイソフォームは、Na+/K+ATPアーゼのポンプ活性を欠如している細胞に特有である急速な死滅率を示す(図8)。
【００５０】
(参考文献)
2006506080.tif 000008
2006506080.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ATP1A2変異体の検出を示す図である。パネルaは、エキソン17(左)および19(右)の正常(青)および変異体(赤)のD-HPLC溶出パターンを示し、パネルbは、対照(上方)および変異型ヘテロ接合体(下方)の直接シークエンシング電気泳動図を示し、パネルcは、2つのFHM2ファミリーの系統図である。
【図２】ATPアーゼの特定の部分のアミノ酸配列を示す図である。Na-K ATPアーゼおよびH-K ATPアーゼの数種のサブユニットにおけるL764(左)およびW887(右)の完全保存を示す。関連するスイスプロット・アクセッション番号を示す。
【図３】ATP1A2タンパク質トポロジーを示す図である。第1のループ上のウアバイン結合部位(M1〜M2。アスタリスクはウアバイン耐性をもたらす変異を受けたアミノ酸を示す。)、最大の細胞内ループ(M4〜M5)および細胞外ループ(M7〜M8)が強調されている。
【図４】トランスフェクトされたHeLa細胞のウアバイン処理を示す図である。パネルaは偽のトランスフェクト細胞(野生型ATP1A2のウアバイン非耐性を発現する構築体を使用)、パネルbはウアバイン耐性野生型ATP1A2のpA2Ouar-wt、パネルdはウアバイン耐性ATP1A2変異体のpA2Ouar-P764、パネルfはウアバイン耐性ATP1A2変異体のpA2Ouar-R887、パネルcはL764Pヘテロ接合状態をシミュレートするためのpA2Ouar-wtとpA2Ouar-P764の1:1混合物、パネルeはW887Rヘテロ接合状態をシミュレートするためのpA2Ouar-wtとpA2Ouar-P887の1:1混合物をトランスフェクトし、1μMウアバインを36時間処理した後に撮影されたHeLa細胞の位相差顕微鏡写真である。ATP1B2を発現する構築体に同時移入することにより全ての試験を行った。
【図５】ウアバイン毒性の経時変化を示す図である。パネルaは、図4に示した偽トランスフェクト細胞、A2-wt(pA2Ouar-wt)、mu-1(pA2Ouar-P764)、het-1(pA2Ouar-wt+pA2Ouar-P764)、mu-2(pA2Ouar-R887)、het-2(pA2Ouar-wt+pA2Ouar-R887)の様々な構築体をトランスフェクトされたHeLa細胞のMTT試験による細胞の生存性を示す。変異体およびシミュレートされたヘテロ接合体は、両方ともA2-wtと顕著に異なる(少なくともP<0.04)。縦線はSDを表わす。パネルbは、ATP1A2タンパク質の予想分子量の112kDaを裏付けているin vitroでの転写および翻訳を示す。
【図６】形質膜における変異体ATP1A2の局在性を示す図である。パネルaは、野生型と変異体アイソフォームの両方の細胞膜局在性を示すための、c-myc誘導体、pA2Ouar-wt-myc、pA2Ouar-P764-mycおよびpA2Ouar-R887-mycのCOS-7細胞における免疫細胞学研究を示す。パネルbは、ATP1A2のc-myc誘導体による細胞膜の共沈降を示す、トランスフェクトされたCOS-7細胞の細胞亜分画であり、s/nは上清、pは沈殿を示す。
【図７】1μMのウアバインで72時間処理した後に撮影した、トランスフェクトされたHeLa細胞の位相差顕微鏡写真である。aはウアバイン非耐性野生型ATP1A2を発現するcDNA構築体を用いたトランスフェクションを示し、bはウアバイン耐性野生型ATP1A2を発現するcDNA構築体を用いたトランスフェクションを示し、cはウアバイン耐性T328NのATP1A2変異体を発現するcDNA構築体を用いたトランスフェクションを示し、dは、ヘテロ接合状態をシミュレートするためのウアバイン耐性野生型ATP1A2とT328NのATP1A2変異体を発現する構築体の1:1混合物を用いたトランスフェクションを示す。
【図８】図7に示されるトランスフェクトされたHeLa細胞のMTT試験で評価された細胞の生存性を示す。Y軸は生存細胞のパーセンテージを表わす。
【図１】
2006506080.tif 000013
【図２】
2006506080.tif 000014
【図３】
2006506080.tif 000015
【図４】
2006506080.tif 000016
【図５】
2006506080.tif 000017
【図６】
2006506080.tif 000018
【図７】
2006506080.tif 000019
【図８】
2006506080.tif 000020
【配列表】
2006506080000001.app
【国際調査報告】
2006506080.tif 000021
2006506080.tif 000022
2006506080.tif 000023