(57)【要約】本発明は、ヒト血小板の表面上で局在化されている免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＦ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）と示されると共に、血小板の凝集、分泌、血小板の拡散および細胞接着を行うと決められた細胞接着分子（ＣＡＭ）を提供する。クローニングされたＦ１１Ｒ  ｃＤＮＡおよび全長Ｆ１１Ｒ  ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列が提供される。血栓症、心臓発作、脳卒中および、血栓形成を含む他の臨床的疾患を予防および治療するためのＦ１１Ｒ拮抗薬および方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号７に示される配列によりコードされる単離された血小板膜糖蛋白。
【請求項２】
請求項１に記載の糖蛋白および相応する担体を含む組成物。
【請求項３】
単離されたＦ１１Ｒ−拮抗薬化合物。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する配列を含んでなる単離されたＦ１１Ｒ−拮抗薬化合物。
【請求項５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する配列を含んでなる単離されたＦ１１Ｒ−拮抗薬化合物。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の単離されたＦ１１Ｒ−拮抗薬を含んでなる薬剤組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の薬剤組成物の有効量を投与することを含んでなる、それを必要としている患者において、血栓形成を治療または予防する方法。
【請求項８】
ＳＶＴＶＨＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶＫＬＳＣ（配列番号１）を含んでなる単離されたＦ１１Ｒ拮抗薬。
【請求項９】
ＫＳＶＴＲＥＤＴＧＴＹＴＣ（配列番号４）を含んでなる単離されたＦ１１Ｒ拮抗薬。
【請求項１０】
請求項４〜５、８または９のいずれかに記載の拮抗薬化合物に対する抗体。
【請求項１１】
治療有効量の請求項４〜５、８または９のいずれかに記載の化合物および製薬的に許容される担体を被験体に投与することを含んでなる、被験体におけるＦ１１Ｒ媒介疾患を治療する方法。
【請求項１２】
前記Ｆ１１Ｒ媒介疾患が血栓症、心臓発作および脳卒中である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｆ１１Ｒ拮抗薬の投与により血小板の内皮細胞への接着を阻害することを含んでなる、Ｆ１１Ｒ媒介疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白およびペプチド化学、並びに結晶学および有機化学に関する。本発明は、細胞接着分子（ＣＡＭ）およびそのフラグメント、より詳しくは、Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）として示されるＣＡＭ、またはそのポリペプチドフラグメントに関する。本発明はまた、Ｆ１１Ｒ拮抗薬に、ならびに、血栓症、心臓発作、脳卒中および血栓形成を含む他の臨床的疾患の予防および治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脈管系は、無傷で損傷をうけていない状態での、通常の生理的条件下に有する動的代謝器官であると認識される（Ｋａｒｓａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｈｏｆｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）２０００；ｐｐ．１７７０−８２）。血管の露出（管腔）表面の内側を覆う内皮細胞（ＥＣ）は、通常、血栓形成性でない。すなわち、健康なＥＣは、循環する血小板を引き付けないし結合しない（Ｃｉｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９８，９１：３５２７−６１；Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９９，８２：９６２−７０）。内皮細胞の生理的機能は、流れる血液に対する表面を血小板の接着および凝固を抑制する高度に血栓抵抗性をもつようにすることにより、血流を促進することであることが良く知られている（Ｃｉｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．）。しかしながら、炎症条件下において、ＥＣの非血栓形成性表面が、サイトカインへの露出後、プロトロンビン性の表面へと変換され（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．；Ｄｉｑｕｅｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９５，７４：７７８−８３）、その結果、凝集促進活性および血栓症への素因が生じる（Ｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．；Ｄａｒｄｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｒｏｌ．２０００，１０９：５１２−８；Ａｎｄｒｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００，９６：３３２２−８）。実際、サイトカインで刺激されたＥＣへの、刺激されていない血小板の接着、蓄積および補充が報告されており、これらの研究は、これらのプロセスにおける、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１；Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｏｋｅ  １９９５，２７：７０９−１１）；βインテグリン（Ｂｏｍｂｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９９８，１８７：３２９−３９）、フォン−ウィルブランド因子（Ｄａｒｄｉｋ，ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｄｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）、および組織因子（Ｖｅｒｈｅｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００，９６：４２１６−２１）を示している。すなわち、炎症条件下において、サイトカインは結果として刺激されていない血小板が接着するというＥＣにおける変化を引き起こす。近年、炎症性血栓症の病因における潜在的な引き金となる役割を示唆する特性を有するＩｇスーパーファミリーの新規接着蛋白が記載されている。この蛋白は、最初に、ヒト血小板の表面上で確認され、Ｆ１１受容体と名づけられ（Ｆ１１Ｒ；Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９０，２６５：１００４２−８；Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９５，３１１：１５５−６２）、次に、ネズミ内皮および上皮細胞の表面上で確認され、ＪＡＭと名づけられた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８，１４２：１１７−２７．）。
【０００３】
ヒト血小板Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの表面にある糖蛋白（コア蛋白：２９ｋＤａにおいて３２および３５ｋＤ）メンバーである。Ｆ１１Ｒは、最初、血小板分泌およびそれに続く凝集を引き起こす、強力な刺激性モノクローナル抗体Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１の標的として発見された（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．；Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１９８８，１１１：６１８−２６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５，３１１：４０１−６；Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｖ．Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １１９５：１２４１−３；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９７，９０：１０，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｐａｒｔ  ２，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １５，２９９６ａ．；Ｓｏｂｏｃｋａ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，１９９８：ＳＵＮＹ  Ｄｏｗｎｓｔａｔｅ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ，Ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  Ｊｕｎｅ  １０，１９９８；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｓｅｐｔ．１５，１９９８；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０００，９５：２６００−９；Ｂａｂｉｎｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００２，８７：７１２−２１）。その初期のＦ１１への結合に続いてＭ．Ａｂ．Ｆ１１により誘発される血小板分泌および凝集のためのシグナル伝達メカニズムは以下のものを含む：ＦｃγＲＩＩへのＦ１１の架橋結合（Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．）、特定のＰＫＣアイソザイムの活性化および転位（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）、ＰＫＣの活性化によるＦ１１Ｒのリン酸化（Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．）、生理的作用薬トロンビンおよびコラーゲンによるならびにＭ．Ａｂ．Ｆ１１それ自体による血小板凝集の誘発に続くＦ１１Ｒのリン酸化（Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｓｏｂｏｃｋａ；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｂａｂｉｎｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．）、およびミオシン軽鎖およびプレクストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）のリン酸化、それにより生じる、それぞれの、形態変化および顆粒分泌（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）。分泌に続いて、結果的にこのシグナル伝達経路は、本来もっているフィブリノーゲン受容体が活性化され、血小板凝集する（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９０）。精製されたＦ１１Ｒの長さの３０％を成す部分的アミノ酸配列が１９９５年に報告された（Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．）。血小板Ｆ１１Ｒについて全長ｃＤＮＡをクローニングすると、それが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである細胞接着分子（ＣＡＭ）であることが分かった（Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｓｏｂｏｃｋａ；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＣＡＭのように、Ｆ１１Ｒが血小板、内皮細胞および上皮細胞の接着の基礎を成す機構に関与する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【０００４】
分泌につながるシグナル伝達を誘発する受容体としてのその役割に加えて、Ｆ１１Ｒが、血小板接着に含まれるＣＡＭとしても役立つという結論は、ネズミ内皮細胞において見られる蛋白である接合接着分子（ＪＡＭ）と呼ばれる接着分子とヒト血小板Ｆ１１Ｒとの間で見られる高度の配列類似性により支持される（Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．）。ネズミＪＡＭ配列と、ヒト血小板Ｆ１１Ｒの先に報告された配列（Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．）との比較により、ＪＡＭの、Ｆ１１ＲのＮ−末端（２３アミノ酸）およびＦ１１Ｒの二つの消化された生成物との７０％を超える類似性が示された。さらに、ヒト血小板Ｆ１１Ｒコア蛋白とネズミＪＡＭ蛋白の両方が、単一の膜貫通型領域と、その細胞外領域における２対のシステイン残基を含み、それらにより、特徴的なＩｇ様骨格構造（ｆｏｌｄ）を形成している細胞内ジスルフィド架橋が形成されることが分かった。今では、ＪＡＭと呼ばれる蛋白（Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ；Ｏｚａｋｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９，１６３：５５３−７；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，３６：１１７５−８８；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，１１３：２３６３−７４；Ｇｕｐｔａ，ｅｔ  ａｌ．ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ２０００，５０：５１−６；Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１，１１４：５３９−４７）が、ヒトＦ１１Ｒのネズミ相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であることが充分に確立されている（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９９０；Ｎａｉｋ，ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ．１９８８；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．；Ｋｏｒｎｅｃｋｉ，ｅｔ  ａｌ  １９９５；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｓｏｂｏｃｋａ；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｂａｂｉｎｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．）。ＪＡＭは、マウス内皮および上皮細胞の細胞内接合部に局在化されていた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．）。同様に、血小板抗体Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１が、培養されたヒト臍静脈内皮細胞の細胞内接合部に存在するＦ１１Ｒ分子を認識することが分かった（Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．，ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｓｏｂｏｃｋａ，ｅｔ  ａｌ．ＸＶＩＩＩ  ＩＳＴＨ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｊｕｌｙ，２００１，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ，Ａｂｓ＃；Ｐ１９０２）。この発明者ら（Ｂａｂｉｎｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．）の近年の研究により、Ｆ１１Ｒの二つの領域が、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１による血小板凝集および血小板のＭ．Ａｂ．Ｆ１１への接着の誘発に重要であると決められた。現在のところ、内皮細胞への血小板の接着を含む生理的および病態生理的プロセスにおけるＦ１１Ｒの役割は未だ知られていない。発明者は、Ｆ１１ＲのＮ−末端およびＦ１１Ｒの第１のＩｇ骨格構造が、内皮細胞への血小板の接着に重要な蛋白配列を含むこと、および、組換え可溶性Ｆ１１ＲおよびＦ１１Ｒ−ペプチドが、サイトカイン処理ＥＣへの血小板の接着の約６０％を阻害し、これは、血小板−内皮細胞相互反応にＦ１１Ｒが含まれ、病的条件下に血栓症を引き起こすことを割り出した。
【０００５】
（本発明の概要）
本発明は、Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）（配列番号６（ＳＥＱ  ＮＯ：６））の全長ｃＤＮＡ配列、およびコードされたＦ１１Ｒアミノ酸配列（配列番号７（ＳＥＱ  ＮＯ：７））を提供する。本発明は、ペプチド拮抗薬を含むＦ１１Ｒ拮抗薬も提供する。
【０００６】
本発明は、血栓症、心臓発作、脳卒中および、血栓形成を含む全ての他の臨床的疾患などのＦ１１Ｒ媒介疾患を治療するための方法および組成物に関する。本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて少なくとも一つのＦ１１Ｒ媒介生物活性を阻害、抑制または停止させる少なくとも一つのＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドを含む特定の組成物を提供する。
【０００７】
本発明の前記Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドのいずれかをコードする核酸分子、そのような核酸分子のいずれかを含む発現ベクター、並びに、そのようなヌクレオチド配列またはベクターを含む関連する宿主細胞も、本発明において意図される。
【０００８】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、本発明のＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドに対して生じる抗体に関する。
【０００９】
好ましくは、本発明の抗体は、その配列が、哺乳動物Ｆ１１Ｒまたは接合接着分子（ＪＡＭ）蛋白の対応する配列に一致するＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドに対して生じる。本発明の抗体は、Ｆ１１Ｒの活性を拮抗または中和することができる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が本発明により意図される。そのような抗体としては、例えば、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１がある。
【００１０】
本発明のこれらのおよび他の実施形態は、ここでの開示を考慮すると、当業者に明らかである。
【００１１】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、Ｆ１１Ｒ拮抗薬に関する。「Ｆ１１Ｒ拮抗薬」は、標的、例えば、別の細胞上のＦ１１ＲへのＦ１１Ｒの相互作用または結合を干渉、阻害またはそうでなければ防止することにより、少なくとも一つのＦ１１Ｒ媒介生物活性を阻害、抑制または停止させる分子を意味する。
【００１２】
本発明によれば、Ｆ１１Ｒから誘導されるまたはＦ１１Ｒに対応する新規Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドを単離し合成した。これらのペプチドは、Ｆ１１Ｒに選択的に結合し、例えば、哺乳動物の内皮細胞への血小板の接着に関与するＦ１１Ｒ媒介生物活性を阻害する能力を含むＦ１１Ｒ拮抗特性を有する。本発明のペプチドは、好ましくは、天然ヒトＦ１１受容体の特定部分に対応し、その変異体を含み、したがって、ヒトに投与された場合非免疫原性である。
【００１３】
本発明のＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドは、実質的に、ヒトＦ１１ＲのＮ−末端または第１のＩｇ領域のアミノ酸に対応する。
【００１４】
本発明の好ましいＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドは、Ｆ１１Ｒ構造のＮ−末端ペプチドの配列：ＳＶＴＶＨＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶＫＬＳＣ（配列番号１(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１)）である。
【００１５】
本発明のもう一つの好ましいＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドは、Ｆ１１Ｒ構造の第１のＩｇ骨格構造の配列：ＫＳＶＴＲＥＤＴＧＴＹＴＣ（配列番号４（ＳＥＱ  ＮＯ：４）である。
【００１６】
哺乳動物、特にヒトにおいてＦ１１Ｒ拮抗薬活性を維持するこれらのペプチドの相同体、類似体およびフラグメントも、本発明により意図される。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、本発明により意図されるＦ１１Ｒ拮抗薬を用いてＦ１１Ｒにより、内皮細胞への血小板の相互作用または結合を干渉、阻害または他の方法で防止する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、ヒトを含む動物において、血栓症、心臓発作、脳卒中および、血栓形成を含む全ての他の臨床的疾患のようなＦ１１Ｒ媒介疾患を治療するための組成物も提供し、そのような疾患を治療する方法を含む。この組成物は、少なくとも一つのＦ１１Ｒ拮抗薬、好ましくは、少なくとも一つの本発明によるＦ１１Ｒペプチド拮抗薬を、製薬的に許容される担体と混合して含む。
【００１９】
本発明によれば、蛋白Ｆ１１Ｒは、炎症性内皮細胞への血小板の接着において重要な役割を果たす。本発明は、Ｆ１１Ｒの活性が、血管中における血小板斑の形成の開始に、および血栓の形成に重要であることを確認した。すなわち、Ｆ１１Ｒの作用を阻害する任意の薬剤、つまり化学物質または薬物（ここで、集合的にＦ１１Ｒ拮抗薬）は、循環系での血栓形成の有力な阻害薬として作用する。従って、本発明は、血栓症、心臓発作、脳卒中、免疫性血小板減少症、輸血後紫斑病、急性および慢性免疫性血小板減少症、血小板機能の後天性疾患、骨髄増殖性疾患、尿毒症、肝臓疾患、心肺バイパス、種々のタイプの血栓症、炎症性血栓症、末梢静脈血栓症、冠状動脈血栓症および他の動脈血栓症、アテローム性動脈硬化症、脈管形成疾患、癌の成長および転移、および血栓形成を含む全ての他のヒト疾患の予防および治療に有用な薬剤としてのＦ１１Ｒ拮抗薬を提供する。
【００２０】
本発明の一つの態様は、内皮細胞への血小板の接着を防止し、血小板凝集を阻害する、「Ｆ１１Ｒ拮抗薬」ともよばれる化合物を確認する方法に関する。
【００２１】
「化合物」という用語は、ペプチドなどの有機化合物ならびに、イオンキレート形成剤
などの無機化合物との両方を含むと解される。抗体、例えば、Ｆ１１Ｒに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、つまりそのような抗体ならびに単一鎖抗Ｆ１１Ｒ抗体などのＦａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２フラグメントはまた、本方法で使用可能な化合物として考案されうる。
【００２２】
他の好ましい化合物は、Ｆ１１Ｒの既知の配列、つまり前記各配列（すなわち配列番号１〜７）、およびそれらの配列の組み合わせから誘導することができる化学的化合物を含む。これらには、線形配列、環式配列、ペプチドのアニーリング（好ましくは配列番号１および４）、および標準的ペプチド化学技術を用いる他の可能な誘導体がある。一つの実施形態において、本発明は、その構造がペプチド１および４（配列番号１および４）の相互作用に基づき、成熟ヒト血小板Ｆ１１Ｒの結合部位を形成する化合物を意図する。
【００２３】
ここで用いられる、化合物の機能的部位の「模倣」または「ペプチド模倣」は、化合物の機能的部位の機能活性に必要な蛋白またはペプチド配列の化学的構造が、機能的部位の構造を模倣する他の化学的構造で置換された化合物を意味する。本発明により意図されるペプチド模倣の例には、Ｆ１１Ｒ分子の結合部位と立体的に相互作用する残基を有する部分を含む化合物（例えば、小さな有機分子）がある。「残基」は、例えば、アミド結合によりペプチド中に組み込まれたアミノ酸を意味する。ペプチド模倣を設計する手段は当業者において知られている。例えば、Ｆａｒｍｅｒ，Ｐ．Ｓ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｅ．Ｊ．Ａｒｉｅｎｓ，ｅｄ）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１１９−１４３；Ｂａｌｌ  Ｊ．Ｂ．ａｎｄ  Ａｌｅｗｏｏｄ，Ｐ．Ｆ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ３：５５，Ｍｏｒｇａｎ  Ｂ．Ａ．ａｎｄ  Ｇａｎｏｒ，Ｊ．Ａ．（１９８５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２４：２４３  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  Ｒ．Ｍ．（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ：１０：２７０を参照されたい。これらを、参照としてここに組み込む。一つの実施形態において、本発明は、例えば図１に示されるようにＦ１１Ｒの結合部位に結合、拮抗、作用薬として作用、抑制、促進、阻害、または他の方法で機能的に相互作用するために、通常の知識を有する化学者により従来法により合成することができる全ての模倣化合物を限定されることなく含む、本発明のＦ１１Ｒ分子の既知の三次元構造に基づいて設計することができる全てのペプチド模倣を意図する。
【００２４】
本発明の最も好ましい化合物は、血小板上のモノクローナル抗体Ｆ１１（「Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１」）結合部位に似るように作られたペプチドである。
【００２５】
「Ｆ１１Ｒ」は、刺激性Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１用の標的としてのヒト血小板の表面における受容体蛋白である。「Ｆ１１Ｒ」は、接合接着分子（ＪＡＭ）と呼ばれるネズミ蛋白のヒト相同分子種（ｈｕｍａｎ  ｏｒｔｈｏｌｏｇ）とも呼ばれる。「Ｆ１１Ｒ」を、ヒト血小板と内皮細胞との両方における、２つのＩｇ骨格構造からなる細胞外可溶性領域、膜貫通型領域および短い細胞質部分を含む背骨構造全体として図１に示す。
【００２６】
「Ｆ１１Ｒ拮抗薬」および「Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチド」は、さらに、第１のＩｇ骨格構造（Ｉｇ  ｆｏｌｄ）においてＮ−末端２３アミノ酸領域および１３アミノ酸領域により形成されるポケットに結合することができる任意の化合物を意味する。そのような結合により、Ｆ１１Ｒの作用が抑制され、すなわち、図１〜２に示すように、立体のポケットを介したＦ１１Ｒ媒介トランス−同種相互作用での血小板および内皮細胞の配置を阻害し、その結果、血小板凝集または血栓症、心臓発作、脳卒中、および血栓形成を含む全ての他のヒト疾患を予防または治療することができる。「Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチド」は、例えば、内皮細胞への血小板の結合または相互作用を干渉または他の方法で防止し、それにより血小板凝集を阻害することにより、少なくとも一つのＦ１１Ｒ媒介生物活性を阻害、抑制または停止させるペプチドも意味する。
【００２７】
本発明によれば、Ｆ１１Ｒの２つのペプチド配列、すなわち、Ｎ−末端ＳＶＴＶＨＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶＫＬＳＣ（配列番号１）に対応する配列、および第１のＩｇ骨格構造配列ＫＳＶＴＲＥＤＴＧＴＹＴＣ（配列番号４）が決められた。本発明のペプチド配列は、内皮細胞への血小板の接着を阻害し、血小板凝集を阻害する。
【００２８】
ここで用いられる「ペプチド」は、隣接アミノ酸残基のα−アミノ基およびカルボキシ基との間のペプチド結合により互いに結合したアミノ酸残基の線状列を意味する。「合成ペプチド」という用語は、ペプチド結合により互いに結合したアミノ酸残基の化学的に誘導された鎖を意味することが意図される。「合成ペプチド」という用語は、本発明により組換え技術により生成されたペプチドも意味すると意図される。本発明によれば、好ましいＦ１１Ｒ拮抗薬は、ペプチド（ここで、「Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチド」と呼ばれる）および抗体を含む。さらに、ここで提供される新規ペプチドの類似体、相同体およびフラグメントが、「Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチド」という用語の範囲に含まれる。
【００２９】
「相同体」は、全蛋白（すなわち、成熟蛋白）水準においてヒトＦ１１Ｒに実質的に相同である他の哺乳動物種のＦ１１Ｒ蛋白からの対応するペプチドを意味するが、そのような相同性ペプチドはＦ１１Ｒ拮抗薬活性を維持することが条件とされる。
【００３０】
「類似体」は、一または二以上のアミノ酸変異により異なるペプチドを意味し、その変異、例えば、アミノ酸残基の置換、付加または欠失は、関連するペプチドのＦ１１Ｒ拮抗薬特性を失わない。すなわち、類似体は、ここで提供されるペプチドに実質的に同一のアミノ酸配列を有すると共に一または二以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的に置換されているペプチドを含み得る。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの非極性（疎水性）残基の他の残基への置換を含む。同様に、本発明は、アルギニンおよびリシン間、グルタミンおよびアスパラギン間、ならびにグリシンおよびセリン間などの一つの極性（親水性）残基の置換を意図する。さらに、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基の他の残基への置換、または、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような一つの酸性残基の他の残基への置換も考えられる。非保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リシンなどの極性（親水性）残基への置換、および／または、極性残基の非極性残基への置換を含む。
【００３１】
「保存的置換」という語句は、ペプチドが、従来法により測定される必要なＦ１１Ｒ拮抗薬阻害特性を保持する限り、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基を使用することも含む。類似体は、さらなるアミノ酸の存在、またはＦ１１Ｒ媒介生物活性に影響を与えない一または二以上のアミノ酸の欠失も含む。例えば、被験体ペプチドの類似体は、Ｎ−またはＣ−末端システインを含み得、それにより、所望により、そのペプチドは担体蛋白、例えば、アルブミンに共有結合することができる。そのような結合は、血液からのペプチドの除去を最少化し、ペプチドの蛋白分解も防止すると考えられる。さらに、本発明の目的のために、Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むペプチドも、「保存的置換」という用語に含まれる。そのようなＤ−異性体の存在は、蛋白分解活性およびペプチドの除去を最少化するのを助けることができる。
【００３２】
「フラグメント」という用語は、配列番号１〜５および７に示す任意のペプチドよりも短いアミノ酸配列を有する任意の被験体ペプチドを意味し、このフラグメントは被験体ペプチドのＦ１１Ｒ媒介拮抗薬活性を維持する。
【００３３】
本発明の実施には、特記しない限り、充分に当該分野の技術範囲内である、合成有機化学、蛋白化学、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来技術が用いられる。これらの技術は、例えば、ペプチド合成、ペプチドの組換え生成およびペプチドの突然変異と組み合わされて適用される。そのような技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．Ｋ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，２ｄ  ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９０），Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），Ｈｏｕｓｅ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，２ｄ  ｅｄ．，（Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌ．，１９７２）を参照されたい。
【００３４】
本発明のペプチド、相同体、類似体およびそのフラグメントは、多くの既知の技術により合成してもよい。例えば、最初にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｉｎ  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）に記載された固相合成技術を用いてペプチドを調製することができる。他のペプチド合成技術を、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，２ｄ  Ｅｄ．，（１９７６）や、当業者が容易に利用することができるその他の参考文献に見ることができる。ポリペプチド合成技術の要約を、Ｊ．Ｓｔｕａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，（１９８４）において見ることができる。ペプチドは、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．ＩＩ．３ｄ  Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，ｐ．１０５−２３７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６）に記載の溶液法により合成することもできる。異なるペプチド合成において用いるための適当な保護基が、前記文献ならびに、Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）に記載されている。本発明のペプチドは、Ｆ１１Ｒ分子のより大きい部分からまたはＦ１１Ｒ分子の全体から、化学的または酵素的解裂により調製することもできる。
【００３５】
さらに、本発明のペプチドを、組換えＤＮＡ技術により調製してもよい（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照のこと）。当業者は、本発明の組換えペプチドを提供するために広範囲の発現系を用いることができることを理解している。用いられる正確な宿主細胞は本発明に重要ではない。Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドを、原核宿主（例えば、大腸菌）または真核宿主（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ１、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３およびＪＥＧ３細胞、または節足動物、例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞）において生成することができる。そのような細胞は、例えば、バージニア州マナッサス在Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できる。発現媒介物のトランスフェクションおよび選択の方法は、選択される宿主系による。形質転換およびトランスフェクションの方法が、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前記に記載されており、発現媒介物は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｐ．Ｈ．Ｐｏｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８５），Ｓｕｐｐ．１９８７に提供されているものから選択することができる。
【００３６】
蛋白を形成するために用いられるアミノ酸の大部分に関し、コード化ヌクレオチドトリプレット（コドン）の二種以上が、特定のアミノ酸残基をコードすることができる。遺伝子コードのこの特性は、過剰なものと知られている。従って、多くの異なるヌクレオチド配列が、特別の被験体Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドをコードすることができる。本発明は、本発明のペプチドを酵素的または化学的に解裂することができる被験体ペプチドまたは被験体キメラペプチドをコードする、すなわち、発現することができる遺伝子を定義するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはセグメントも意図する。
【００３７】
本発明のペプチドをコードするＤＮＡ分子を、化学的技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法により合成することができる。化学的ＤＮＡ合成技術を用いて、天然アミノ酸配列のコードする塩基を置換することにより、ペプチド配列において所望の修飾を設けることができる。前記ＤＮＡ分子のリボ核酸等価物も用いてよい。
【００３８】
被験体ポリペプチドまたは被験体キメラポリペプチド用のコード化配列を定義するＤＮＡ分子を複製および発現することができるベクターを含む核酸分子も意図される。
【００３９】
本発明のペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相技術などの従来技術により化学的に合成される。一般に、この方法は、伸長しているペプチド鎖に一または二以上のアミノ酸残基を連続的に付加することを含む。通常、第１のアミノ酸残基のアミノ基またはカルボキシル基が、適当な選択的に除去可能な保護基により保護される。異なる選択的に除去可能な保護基が、リシンなどの反応性側鎖基を含むアミノ酸のために利用される。
【００４０】
固相合成の好ましい方法は、保護されたまたは誘導されたアミノ酸を、その非保護カルボキシル基またはアミノ基を介して不活性固体支持体に付着させることを必要とする。したがってアミノまたはカルボキシル基の保護基を、選択的に除去し、適当に保護された相補性（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列における次のアミノ酸を、固体支持体に既に付着している残基とのアミド結合を形成するのに適した条件下に混合し反応させる。かようにアミノカルボキシル基の保護基を、この新しく添加されたアミノ酸残基から除去し、次に、（適当に保護された）次のアミノ酸を添加等する。全ての望ましいアミノ酸が適切な配列中で結合した後、固体支持体を含む任意の残りの末端および側鎖基保護基が、順次または同時に除去され、最終的なペプチドが得られる。凍結乾燥されたオリゴペプチドを、２回蒸留Ｈ２Ｏに２ｍｇ／ｍｌの濃度で保存溶液として懸濁させ、続いて、実験のためにＭ１９９−ＨＰＳ中に希釈する。本発明のペプチドの観察された特性に一致して、本発明のペプチドを、少なくとも一つのＦ１１Ｒ媒介生物活性を阻害、抑制または停止させるために用いることができる。Ｆ１１Ｒは、血小板凝集および内皮細胞への血小板の接着に関連した生化学的事象において機能する。従って、本発明は、内皮細胞に対する血小板のつながりを阻害、干渉または他の方法により防止し、それにより、例えば血栓症などのＦ１１Ｒ細胞の関連した疾患を効果的に治療または予防する方法を意図する。
【００４１】
例えば、血栓症、心臓発作および脳卒中のようなＦ１１Ｒ媒介疾患は、Ｆ１１Ｒ依存性であり、したがって、Ｆ１１Ｒ拮抗薬、好ましくは、本発明のＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドで治療することができる。他のＦ１１Ｒ関連疾患も本発明により意図される。
【００４２】
本発明のもう一つの実施形態において、一または二以上のＦ１１Ｒ拮抗薬、例えば、Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドまたは抗体が、薬剤組成物に含まれる。
【００４３】
好ましくは、少なくとも一つのＦ１１Ｒ媒介生物活性を阻害、抑制または停止させるために、本発明のＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチドを含む組成物が静脈内投与される。静脈内投与するとき、ペプチド組成物を、担体および／またはアジュバントなどの他の成分と組み合わせることができる。ペプチドを、ペプチドの除去を最少化するために、アルブミンなどの蛋白担体に共有結合することもできる。他の成分が製薬的に許容できるものでなくてはならないこと、意図する投与に効果的でなくてはならないこと、および組成物の活性成分の活性を低下させられないということを除いて、他の成分の性質は限定されない。本発明により意図される他の抗炎症性成分の例は、限定はされないが、抗Ｆ１１Ｒ抗体、ＮＳＡＩＤＳ、ステロイドまたはシクロスポリン−Ａを含む。Ｆ１１Ｒ拮抗薬と一緒に用いた場合、これらの薬剤は、単独で用いる場合よりも少ない投与量で用いることができる。
【００４４】
注射に適した製薬型には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射性溶液または分散液を短時間で調製するための滅菌粉末がある。全ての場合において、最終的溶液型は、無菌および流体でなくてはならない。典型的担体には、例えば、水緩衝水溶液（すなわち、生物適合性緩衝液）、エタノール；グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール、それらの適当な混合物、界面活性剤または植物油を含む溶媒または分散媒体がある。限定はされないが、濾過または、抗菌剤もしくは抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタン、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールの添加を含む、当該分野で理解されている任意の技術により滅菌を達成することができる。さらに、糖または塩化ナトリウムのような等張剤を、被験体組成物に組みこむことができる。
【００４５】
被験体ペプチドを含む滅菌注射性溶液の生成は、先に列挙した種々の成分と共に適当な溶媒中にこれらの化合物を必要量混入し、必要な場合、その後に滅菌、好ましくは濾過滅菌することにより達成される。滅菌粉末を得るために、前記溶液を、必要により真空乾燥または凍結乾燥する。
【００４６】
本発明のペプチドを経口投与するとき、有効量のペプチドを含むその薬剤組成物は、同化できる食用の担体や同様なものとしての不活性希釈剤も含むことができ、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに含まれる、圧縮して錠剤にする、またはエリキシル、懸濁液、シロップ等に含ませることができる。
【００４７】
したがって、この被験体ペプチドは、便利で効果的な投与に関し、製薬的に有効な量において、治療に有効な量での適当な製薬的に許容できる担体と共に配合される。
【００４８】
このペプチドは、好ましくは、投与当たり少なくとも約５０ｍｇ、より好ましくは、投与あたり約５００ｍｇ〜約１ｇの量で投与すべきである。本発明のペプチド組成物は最終的に血流から除去されるので、組成物の再投与が指示され、それが好ましい。
【００４９】
ペプチドは、投与組成物に適合した方法で、および治療的に効果的である量で投与することができる。全身投与量は、患者の年齢、体重および症状に、および投与経路に依存する。例えば、成人のヒトへの投与に関し適した投与量は、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇから体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇに及ぶ。
【００５０】
ここで用いられる製薬的に許容される担体は、任意の全ての溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤等を含む。そのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野でよく知れらている。本発明のペプチドと組み合わせて用いられる製薬的に許容される担体は、投与方式に従って変化する。例えば、組成物は、懸濁液、エリキシルおよび溶液のなどの経口液体組成物用の適当な担体中で調製することができる。液体経口投与用の組成物は、任意の通常の製薬媒体、例えば、水、油、アルコール、着香料、防腐剤、着色剤等を含む。経口固体製剤（カプセルおよび錠剤）の場合、澱粉、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、バインダー、崩壊剤等のような担体を用いることができる。さらに、リポソームおよびミクロエマルジョンのような担体を用いることができる。
【００５１】
本発明のさらなる態様において、本発明の薬剤組成物が、Ｆ１１Ｒ媒介病理疾患の治療のために用いられる。すなわち、本発明は、治療有効量の本発明の薬剤組成物を投与することにより、被験体におけるＦ１１Ｒ媒介疾患を治療する方法を提供する。
【００５２】
「治療有効量」という用語は、Ｆ１１Ｒ媒介疾患を治療するのに必要な投与量を意味する。
【００５３】
「Ｆ１１Ｒ媒介疾患」は、Ｆ１１Ｒ分子の関与を必要とする症状の病理疾患、発症、進行または持続を意味する。特に、本発明により意図されるＦ１１Ｒ媒介疾患は、血栓症、心臓発作および脳卒中を含む。
【００５４】
「治療」または「治療する」という用語は、発症の予防または、発症を遅延、進行を遅延または症状を改善するように、Ｆ１１Ｒ活性を効果的に阻害、抑制または停止することを意味する。
【００５５】
「被験体」という用語は任意の哺乳動物被験体を意味する。好ましくは、被験体はヒトである。
【００５６】
本発明は、このように、本発明で意図されるＦ１１Ｒ拮抗薬を用いることにより、血小板と内皮細胞の相互作用または結合を干渉、阻害または他の方法で防止する方法を提供する。
【００５７】
本発明のＦ１１Ｒ拮抗薬ペプチド（または、相同体、類似体またはフラグメント）を用いて、本発明において有用な単鎖抗体（ＳＡｂ）またはヒト化モノクローナル抗体を産生させることができる。ペプチドを、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載のように、ＫＬＨなどの担体蛋白に結合させることができる。ＫＬＨ−拮抗薬ペプチドを、フロイントアジュバントと混合し、モルモット、ラット、ロバ等に注射する、または好ましくはウサギに注射する。抗体を、ペプチド抗原親和クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００５８】
単鎖抗体（ＳＡｂ）は、短ペプチドリンカーを用いて重鎖および軽鎖の種々の領域を一緒に融合し、それにより、単分子上で抗原結合部位を再構成することにより作製される。そのような単鎖抗体可変フラグメント（Ｆｖｓ）は、要すれば、免疫グロブリン分子の重鎖の定常領域の全体または一部に融合させることができる。ＳＡｂの使用により、宿主細胞に２以上の遺伝子構造体を導入する際の技術的困難が避けられる。単鎖抗体およびその生成方法は当該分野で知られている。例えば、Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８６１５；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９４９１；Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号；およびＣａｐｏｎらの米国特許第５，３５９，０４６号を参照されたい。
【００５９】
モノクローナル抗体は、Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドおよび標準的ハイブリドーマ技術を用いて調製することができる（例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと）。たとえば、Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチド（相同体、類似体またはそのフラグメント）へのモノクローナル抗体を、Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドの精製されたまたは部分的に精製された製剤での免疫処置により、Ｂａｌｂ／Ｃまたは他のマウスの類似の菌株において発生させることができる。マウスの脾臓を除去し、そのリンパ球をマウス骨髄腫細胞系に融合させることができる。既知の技術により雑種をスクリーニングした後、Ｆ１１Ｒ拮抗薬ペプチドに対する抗体を生成する安定な雑種を単離する。モノクローナル抗体を、Ｆ１１Ｒの生物活性、例えば、血小板凝集を阻害するその性能について試験することができる。一旦生成されると、モノクローナル抗体を、ウエスタンブロットまたは免疫沈降分析（前述のＡｕｓｕｂｅｌらが記載の方法）により特定のＦ１１Ｒの認識について試験する。Ｆ１１Ｒ／血小板凝集を拮抗する抗体は、本発明において有用な拮抗薬であると考えられる。
【００６０】
本発明のモノクローナル抗体をヒト化して、ヒトで用いるために免疫原性を低下させることができる。一つの手段は、ヒト免疫グロブリンの定常領域に結合しているネズミｍＡｂの初期の可変領域を有するマウス−ヒトキメラ抗体を作ることである。これらを生成するためのキメラ抗体およびその生成方法は当該分野において知られている。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの欧州特許出願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日公開）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉらの欧州特許出願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎらの欧州特許出願第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらの国際出願ＷＯ８６／０１５３３（１９８６年３月１３日公開）；Ｋｕｄｏらの欧州特許出願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日公開）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの国際出願公開♯ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）を参照されたい。これらの参考文献を、参照としてここに組み込む。一般に、ネズミｍＡｂのＨおよびＬ鎖抗原結合性領域をコードするＤＮＡセグメントを、ｍＡｂ生成性ハイブリドーマ細胞からクローンすることができ、それを次に、ヒト免疫グロブリンのＣＨおよびＣＬ領域をそれぞれコードするＤＮＡセグメントに結合して、ネズミ−ヒトキメラ免疫グロブリンコード化遺伝子を生成することができる。
【００６１】
本発明を、さらに、本発明の範囲を制限することを意図しない以下の特定の実施例により説明する。
【実施例１】
【００６２】
ヒト血小板。（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１００４２−１００４８，参照としてここに組み込む）に詳細に説明するように、全血を採血して抗凝固剤ＡＣＤ（ｐＨ４．６）中に入れた。血小板を洗い、分画遠心分離により単離し、アピラーゼ、ヘパリンおよびＰＧＥ１（同上）の存在下で１１．９ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ７．３５）で緩衝したタイロード−アルブミン（Ｔｙｒｏｄｅ−ａｌｂｕｍｉｎ）（０．３５％）溶液中に再懸濁した。最終的血小板懸濁液は、いかなる阻害剤も含まなかった。血小板凝集を、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｌｕｍｉ−Ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ（ペンシルバニア州ヘイバータウン在Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ  Ｃｏｒｐ．製）において測定した。血小板凝集の可能性を、各々が血小板凝集を誘発しない閾下濃度で２つの血小板作用薬の混合物を添加することにより測定した。これらの実験において、採血の日に各ドナーについて、血小板凝集を引き起こした各作用薬の最低濃度を決めた。
【００６３】
免疫ブロット。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ニトロセルロースストリップ上への転移蛋白の免疫ブロット、およびＥＣＬ化学発光を用いる検出を、詳説（同上）したように行った。
【００６４】
抗体。モノクローナル抗体Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１（ＩｇＧ１アイソタイプ）を、前述（同上）のように親和精製した。ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド在）からヒスチジン抗体を得た。
【００６５】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｆ１１Ｒの構築。７２６塩基対フラグメント（ヌクレオチド−６〜＋７２０）を、前方へのプライマー［ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＧＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＧ（配列番号８（ＳＥＱ  ＮＯ：８））］および逆プライマー［ＣＣＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＴ（配列番号９（ＳＥＱ  ＮＯ：９））］（太字の塩基はＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌ部位を示す）をそれぞれ利用して、テンプレートとしてヒトＦ１１受容体ｃＤＮＡを用いてＰＣＲにより増幅（Ｓｏｂｏｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ，９０（１０）：Ｓｕｐｐ．１，Ｐａｒｔ  ２，２９９６ａ、参照としてここに組み込む）した。このＰＣＲフラグメントは、Ｆ１１Ｒのアミノ酸ｓｅｒ−１〜ａｓｎ−２０８をコードし、Ｃ−末端膜貫通型および細胞質領域を排除する。７２６塩基対ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌを用いて、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ｃ（カリフォルニア州カールスバッド在Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）中にサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆ１１Ｒを得た。このプラスミド中のＦ１１Ｒの転写は、ＣＭＶ即座−初期プロモーター（ＣＭＶ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下に行われる。構造体ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆ１１Ｒを、ＣＯＳ−７細胞の発現研究において、使用前に配列形成および細かく制限マッピングすることにより検証した。
【００６６】
組換えＤＮＡ法。大腸菌形質転換、プラスミドＤＮＡ単離、制限分析、アガロースゲルからのＤＮＡの抽出、およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（＋）Ｃベクターへの挿入部のライゲーションを、既述のように行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９，参照としてここに組み込む）。プラスミドを、Ｑｉａｐｒｅｐカラム（カリフォルニア州バレンシア在Ｑｉａｇｅｎ製）を用いて、大腸菌ＤＨ５α（ニューヨーク州グランドアイランド在Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）から単離した。ＤＮＡ制限フラグメントを、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ製）で分離した。ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ２４００ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。ＤＮＡ配列決定は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（カリフォルニア州フォスターシティー在）製のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＫｉｔおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３７７ＤＮＡ  Ｓｑｕｅｎｃｅｒを用いて、ＰＣＲサイクル配列決定により行った。配列データのコンピューター分析を、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈリリース３．２を用いて行った。
【００６７】
ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション。ＣＯＳ−７細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ  Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ製）および１％抗真菌剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を３７℃／５％ＣＯ２で用いて培養させた。７５ｍｍフラスコに入れた細胞（密集度約５０％）を、１日後にトランスフェクションのために用いた。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｆ１１Ｒ（１０μｇ）を、ＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）３０μｌを用いて細胞中にトランスフェクトした。細胞を、７ｍＬ完全培地中で３７℃／５％ＣＯ２に維持した。細胞を、対照としてＦｕＧＥＮＥ−６単独でも処理した。全ＲＮＡを単離（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ製）し、その後のＲＴ−ＰＣＲのために用いた。逆転写（Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ製）のためにＲＮＡ（２μｇ）を用いた。反応混合物の半分を用いて、先に詳説（Ｓｏｂｏｃｋａ、前記書）したように特定のＦ１１Ｒプライマーを用いて、３５サイクルＰＣＲでＦ１１Ｒを増幅した。ＰＣＲサイクルは以下のようであった：９４℃で５分間、続いて、９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で２分および９４℃で２分を３５サイクル。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆ１１Ｒトランスフェクトした細胞からのみ、７２６−ｂｐフラグメントが得られた。トランスフェクトの７２時間後に集められた調整培地を貯留し、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１免疫親和カラムを２回通過させた。親和カラムの洗浄後、結合したｓＦ１１Ｒを、５０ｍＭジメチルアミン（ｐＨ１１．５）を用いて溶離し、フラクションを集めて１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に入れ、直ちに、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で透析した。ｓＦ１１Ｒ溶液を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（マサチューセッツ州ベッドフォード）により５倍に濃縮し、−２０℃で凍結貯蔵した。
【００６８】
Ｆ１１Ｒペプチドの合成。５種のＦ１１Ｒペプチド（純度９５％）を合成した（マサチューセッツ州フィッツブルク在Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｉｎｃ．製）。これらのペプチド中のアミノ酸の配列および、Ｆ１１Ｒ分子内でのその位置を表に示す。これらの体積を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＤＥ質量分析により決めた。
【表１】
2006516255.tif 000002
【００６９】
固定化マトリクスへの血小板接着。Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）蛋白アッセイ（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８４：１８９−１９１、参照としてここに組み込む）を用いる細胞誘導蛋白の決定に基づく接着性アッセイを、固定化Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１への血小板の接着について用いた。９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏ（商標）Ｐｌａｔｅ、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）Ｓｕｒｆａｃｅ、平底）のウエルに、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１の１ｍｇ／ｍｌ溶液１５０ｍｌを４℃で一晩インキュベートした。ウエルを吸引し、洗浄し、ＴＢＳ／１％ＢＳＡにより３７℃で１時間処理し、ＴＢＳ／０．１ｍＭ  ＭｎＣｌ２／０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２で洗った。単離した血小板懸濁液（１００μｌ）（３×１０８／ｍｌ）を添加し、プレートを３７℃で９０分間インキュベートした。付着血小板をＢＣＡ１００μｌで直接溶解することにより、合計の血小板結合蛋白を決めた。血小板を３７℃で２時間インキュベートし、吸光度（５９５ｎｍ）を決めた（バージニア州チャンティリー在Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）。
【００７０】
ヒトｓＦ１１Ｒの３Ｄ構造。マウス組換えＪＡＭ（Ｋｏｓｔｒｅｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｈｅ  Ｅｍｂｏ  Ｊ．２０：４３９１−４３９８、参照としてここに組み込む）の外側領域の結晶構造をテンプレートとして用いて、成熟ヒト血小板Ｆ１１Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ２０７９０７）の配列（Ｓｏｂｏｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：２６００−２６０９、参照としてここに組み込む）に基づくヒト組換えｓＦ１１Ｒの３Ｄモデルを発生させた。
【実施例２】
【００７１】
組換えｓＦ１１Ｒの調製および使用。その配列（Ｓｏｂｏｃｋａ、２０００）に基づいて組み立てられたＦ１１Ｒ蛋白の外側領域の模式的モデルを図１に示す。分泌された組換えＦ１１Ｒ蛋白（ｓＦ１１Ｒ）を、成熟Ｆ１１Ｒ分子の細胞外部分（アミノ酸ｓｅｒ−１〜ａｓｎ−２０８）のみを含むＣＯＳ−７細胞中で調製した。ＣＯＳ−７細胞中の組換えｓＦ１１Ｒの転写を、ＲＴ−ＰＣＲにより決めた。７２６塩基対フラグメントが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆ１１Ｒ形質転換細胞中のみで検出された（Ｂａｂｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ  ８７：７１２−７２１、参照としてここに組み込む）。ＣＯＳ−７細胞中でのｓＦ１１Ｒの発現を決めるために、トランスフェクトした細胞から得られた調整培地を、ポリクローナル抗Ｆ１１Ｒ抗体およびモノクローナルＭ．Ａｂ．Ｆ１１の両方を用いて免疫ブロットにより試験した。ｓＦ１１Ｒポリペプチドを、これらの２つの別々のＦ１１Ｒ分泌性クローンから得られたＦ１１Ｒ  ＣＯＳ−７調整培地中で検出し、Ｆｕｇｅｎｅ６（擬トランスフェクト）のみで処理したＣＯＳ−７細胞またはプラスミドを欠くＦ１１Ｒ  ＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞は、ｓＦ１１Ｒを分泌しなかった。ｓＦ１１Ｒ蛋白を加工して、ヒスチジンｔａｇ配列を含ませ、実際、これを、抗Ｈｉｓ抗体により確認した。Ｈｉｓ  ｔａｇを含む対照蛋白（Ｐｏｓｉｔｏｐｅ、５３ｋＤ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ製）の使用により、この同一性を確認した。最後に、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１免疫親和クロマトグラフィーを用いてＣＯＳ−７細胞培地からｓＦ１１Ｒを精製した。精製されたｓＦ１１Ｒは、血小板刺激性モノクローナル抗体Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１および、Ｎ−末端アミノ酸ｓｅｒ−１〜ｃｙｓ−２３に対するポリクローナルＦ１１Ｒ抗体の両方により確認された。詳説した結果は、トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞がｓＦ１１Ｒを合成するのみならず分泌もすることを示している。
【実施例３】
【００７２】
特定のＦ１１Ｒペプチドの阻害効果。Ｆ１１Ｒの公開された配列に従う合成ペプチドを調製し、（Ｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１１：１５５−１６２、参照としてここに組み込む）（表１も参照）し、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１誘発血小板凝集に含まれる領域の確認のために用いた。図３Ａに示すように、ペプチド１（配列番号１）（５０μＭ）が、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１誘発血小板凝集を完全に阻害し、１２時間後に試験したときにも凝集は起こらなかった。これに対して、Ｆ１１Ｒ配列（表１参照）から誘導されたペプチド２（配列番号２（ＳＥＱ  ＮＯ：２））、３（配列番号３（ＳＥＱ  ＮＯ：３））または５（配列番号５（ＳＥＱ  ＮＯ：５））（パネルＣに示す）５０〜５００ｍＭの添加は、阻害効果を有さなかった。一方、ペプチド１に加えて、ペプチド４（配列番号３）（５０μＭ）は、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１誘発血小板凝集を完全に阻害することができた（図３、パネルＢ）。
【実施例４】
【００７３】
Ｆ１１Ｒによる作用薬誘発血小板凝集の増強。低い非凝集性（閾下）濃度の生理作用薬ＡＤＰ、コラーゲンまたはトロンビンの存在で、非凝集性濃度のＭ．Ａｂ．Ｆ１１と共に添加したときに血小板凝集を引き起こすことができる（Ｓｏｂｏｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）；Ｓｏｂｏｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，ＳＵＮＹ  Ｄｏｗｎｓｔａｔｅ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ  ６／１０／９８，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ９／１５／９８；Ｓｏｂｏｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００１，ｓｕｐｒａ，参照としてここに組み込む）。作用薬誘発凝集へのＭ．Ａｂ．Ｆ１１のそのような増強効果を、図２に示す。それぞれ閾下濃度のＡＤＰ（０．５ｍＭ）またはＭ．Ａｂ．Ｆ１１（０．３ｍｇ／ｍｌ）を別々に血小板懸濁液に添加したとき、凝集は起こらなかった（パネルＢ）。しかしながら、閾下濃度のＡＤＰを、閾下濃度のＭ．Ａｂ．Ｆ１１と共に添加すると、顕著な凝集反応が観察され、増強効果を反映していた（各パネルにおける「Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１＋ＡＤＰ」追跡、を参照）。トロンビンを用いて同様の増強効果が観察された（データを示さず）。図２のパネルＢおよびＣに示すように、Ｆ１１Ｒペプチド１（配列番号１）またはペプチド４（配列番号４）５０μＭの添加により、ＡＤＰ誘発血小板凝集のＭ．Ａｂ．Ｆ１１による増強を完全に阻害した。これらの２つのペプチドと対照的に、ペプチド３（配列番号３）（パネルＤに示す）は、閾下濃度のＭ．Ａｂ．Ｆ１１によりＡＤＰ誘発血小板凝集の増強を阻害しなかった。Ｆ１１Ｒペプチド２（配列番号２）および５（配列番号５）による阻害の欠如は、ペプチド３（配列番号３）について図２Ｄに示すのと同様であった。
【実施例５】
【００７４】
Ｆ１１Ｒペプチドがコラーゲン誘発血小板凝集の増強を阻害する。非凝集性濃度のコラーゲン（０．５μｇ／ｍｌ）により誘発される血小板凝集のＭ．Ａｂ．Ｆ１１誘発増強に対するＦ１１Ｒペプチドの効果も試験した。これらの結果を図４に示す。ここで用いた閾下濃度のコラーゲンおよびＭ．Ａｂ．Ｆ１１を、各血液ドナーについて別々に調べた。図４のパネルＡは、選択された濃度の各作用薬が、単独で添加したときに血小板凝集を誘発することができなかったことを示している。しかしながら、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１の添加の直後にコラーゲンを添加すると、完全な血小板凝集が容易に引き起こされる。コラーゲン誘発血小板凝集のＭ．Ａｂ．Ｆ１１による増強作用が、パネルＢに示されるようにＦ１１Ｒペプチド１（配列番号１）により完全に阻害され得、ならびに、パネルＣに示されるようにペプチド４（配列番号４）によっても阻害され得るが、ペプチド５（配列番号５）（パネルＣにも示す）によってもペプチド３（配列番号３）（パネルＤに示す）によっても阻害されなかった。ｓＦ１１Ｒ（１μｇ／ｍｌ）を血小板懸濁液に添加すると、ＡＤＰおよびコラーゲンの両方により誘発される血小板凝集のＭ．Ａｂ．Ｆ１１による増強作用が完全に阻害され、結果は、図２および４におけるペプチド１（配列番号１）および４（配列番号４）についての結果と同じであった。
【実施例６】
【００７５】
２つの特定のＦ１１Ｒペプチドが、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１への血小板の接着を阻害する。表１に示す配列を有する５つのペプチドを、固定化Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１（１５０ｎｇ／ウエル）への血小板の接着へのそれらの効果についても試験した。図５の左側の棒は、ペプチドを添加せずに測定した対照の接着性を示す。５０μＭで添加されたペプチド１（配列番号１）は、固定化Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１への血小板の接着を約６０％阻害し、ペプチド１（配列番号１）５００μＭを用いると、７０％の阻害が観察された。５０μＭで添加されたペプチド４（配列番号４）は、同様の濃度で添加されたペプチド１（配列番号１）と比べて非常に僅かな阻害（１０％）しか示さなかった。しかしながら、ペプチド４（配列番号４）５００μＭは、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１への血小板の接着を約７０％阻害し、同じ濃度でのペプチド１（配列番号１）で観察された値に近かった。一方、５００μＭ（またはそれ以上）のペプチド２、３または５を添加すると、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１への血小板接着があまり阻害されなかった。
【実施例７】
【００７６】
組換えヒト血小板Ｆ１１Ｒの三次元構造。血小板阻害性ペプチド１および４の配列により占められる２つの領域を強調するヒト血小板Ｆ１１Ｒの三次元構造モデルを、図１に示す。このモデル化から、分子（ペプチド１（配列番号１）を配列を含む）のＮ−末端部分が、第１のＩｇ−骨格構造（ペプチド４（配列番号４）の配列を含む）の周囲にループを形成して、逆平行に配されたペプチド１および４の両方の配列を含む「活性ポケット」を形成する。データは、これらの２つの領域が、血小板凝集、増強およびこの免疫原性作用薬によるおよびそこへの接着を少なくとも部分的に誘発させる原因となる分子の重要な部位を含むことを示している。したがって、この「活性ポケット」は、Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｓｕｐｒａ）のため、および、Ｆ１１Ｒ分子の同種相互作用のための立体特異的結合部位を構成する（Ｋｏｒｎｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｆ１１Ｒ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ，ＸＶ１１１ｔｈ  １５ｔｈ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｊｕｌｙ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ  ２００１；Ａｂｓ＃；５４９４２、参照としてここに組み込む）。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】成熟ヒト血小板Ｆ１１Ｒの外側領域の三次元構造を示す。ヒト組換えＦ１１Ｒ蛋白（Ｆ１１Ｒ）の２つのＩｇ様骨格構造を、ヒトＦ１１Ｒと約７０％の相同性を共有するマウスＪＡＭのテンプレートに基づいて背骨構造として示す。
【図２】Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１によるＡＤＰ誘発血小板凝集の増強が、Ｆ１１Ｒペプチド（配列番号１および配列番号４）により阻害されることを示す。図２Ａは、閾下水準のＭ．Ａｂ．Ｆ１１（０．３μｇ／ｍｌ）およびＡＤＰ（０．５μＭ）を用いる凝集の大きな増強を示す。ＡＤＰまたはＭ．Ａｂ．Ｆ１１単独では凝集しない。図２Ｂは、閾下濃度のＭ．Ａｂ．Ｆ１１（０．３μｇ／ｍｌ）が、血小板凝集を誘発しないことを示す。しかしながら、ＡＤＰ（０．５μＭ）＋Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１は、強い凝集を引き起こす。図２Ｃは、Ｆ１１Ｒペプチド（配列番号１）による凝集の増強の阻害を示す。Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１（０．３μｇ／ｍｌ）の添加前に約３０秒間血小板で予備インキュベートされ、続いて、ＡＤＰ（０．５μＭ）を添加した配列番号１（５０μＭ）は、凝集を阻害した。対照：配列番号１の不存在下における凝集。図２Ｄは、Ｆ１１Ｒペプチド（配列番号４）により凝集の増強の阻害を示す。Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１（０．３μｇ／ｍｌ）の添加前に約４２秒間血小板で予備インキュベートされ、続いて、ＡＤＰ（０．５μＭ）を添加した配列番号４は、凝集を阻害した。対照：配列番号４の不存在下における凝集。図２Ｅは、ペプチド２、３または５（それぞれ、配列番号２、３または５）の存在下において阻害されないことを示す。
【図３】Ｆ１１ＲペプチドによるＭ．Ａｂ．Ｆ１１誘発血小板凝集の阻害（図３Ａ）を示す；５０μＭのＦ１１Ｒペプチド（配列番号１）による、および５０μＭのＦ１１Ｒペプチド（配列番号４）によるＭ．Ａｂ．Ｆ１１（２．４５μｇ／ｍｌ）誘発血小板凝集の阻害（図３Ｂ）を示す。対照：図３Ｃは、Ｆ１１Ｒ（配列番号２）（５００μＭ）によるＭ．Ａｂ．Ｆ１１（２．４５μｇ／ｍｌ）誘発血小板凝集の阻害の欠如を示す。
【図４】Ｍ．Ａｂ．Ｆ１１によるコラーゲン誘発血小板凝集の増強が、Ｆ１１Ｒペプチド（配列番号１および４）により阻害されることを示す。
【図５】Ｆ１１Ｒペプチド（配列番号１および４）による接着の阻害を示す。
【図６】Ｆ１１Ｒ  ｃＤＮＡ配列（全長）（配列番号６）を提供する。
【図７】Ｆ１１Ｒアミノ酸配列（配列番号７）を提供する。
【図１】
2006516255.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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