(57)【要約】病変部位へ水溶性非ペプチド性低分子医薬品をターゲッティングし、病変部位において当該医薬品を徐放することが可能である水溶性非ペプチド性低分子医薬品含有の乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）ナノ粒子を提供するものである。当該ナノ粒子は、金属イオンと結合することにより疎水化した水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、ＰＬＧＡまたなＰＬＡナノ粒子に封入し、界面活性剤を当該ナノ粒子表面に吸着させたことからなるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属イオンにより疎水化した水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、乳酸−グリコール酸共重合体または乳酸重合体ナノ粒子に封入し、界面活性剤を当該乳酸−グリコール酸共重合体または乳酸重合体ナノ粒子の表面に持たせたことからなることを特徴とするターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子。
【請求項２】
粒子の直径が５０〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項３】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品の分子量が１０００以下であることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項４】
金属イオンが、亜鉛、鉄、銅、ニッケル、ベリリウム、マンガンまたはコバルトのいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項５】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、前記金属イオンにより疎水化されやすいようにリン酸基を有していることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項６】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、前記金属イオンにより疎水化されやすいようにカルボキシル基を有していることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項７】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタノイド、抗微生物薬または抗癌薬であることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項８】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、レシチンまたはポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項１に記載の静脈注射用ナノ粒子。
【請求項９】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品を金属イオンにより疎水化し、乳酸−グリコール酸共重合体または乳酸重合体と共に水溶性有機溶媒に溶解または懸濁させ、界面活性剤を含有する水溶液中に添加することによりナノ粒子の表面に界面活性剤を持たせたことを特徴とするターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
粒子の直径が５０〜３００ｎｍであることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品の分子量が１０００以下であることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
金属イオンが、亜鉛、鉄、銅、ニッケル、ベリリウム、マンガンまたはコバルトのいずれかであることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、前記金属イオンにより疎水化されやすいようにリン酸基を有していることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、前記金属イオンにより疎水化されやすいようにカルボキシル基を有していることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタノイド、抗微生物薬または抗癌薬であることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、レシチンまたはポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項９に記載の静脈注射用ナノ粒子の製造方法。
【請求項１７】
水溶性ステロイドを封入したナノ粒子を有効成分として含有する抗炎症、抗リウマチ剤。
【請求項１８】
水溶性ステロイドが、リン酸ベタメサゾンである請求項１７に記載の抗炎症、抗リウマチ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はターゲッティングと徐放を目的とした、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を封入した静脈注射用ナノ粒子、およびその製造方法に関する。詳細には、病変部位への水溶性非ペプチド性低分子医薬品のターゲッティングと、病変部位での当該薬物の徐放を目的とした、静脈注射用ナノ粒子、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、水溶性低分子医薬品を封入した乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）のマイクロ粒子ないしナノ粒子が、多くの研究者により開発・提案されてきている。例えば、米国特許第４，６５２，４４１号には、生物活性ポリペプチドを含有するＰＬＧＡ等のマイクロカプセルおよびその製法が開示されており、また特表平１０−５１１９５７号公報には、種々の薬物を含有する、血管内投与可能なＰＬＧＡ等のナノ粒子が開示されている。さらに、特開平８−２１７６９１号公報には、水溶性ペプチド性生理活性物質の水不溶性または水難溶性多価金属塩を、ＰＬＧＡ等のマイクロカプセルに封入した徐放性製剤が開示されている。
【０００３】
しかしながらこれらの先行特許においては、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を金属イオンにより疎水化したのちナノ粒子に封入することによりターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子についてはなんら言及も示唆もされていない。
本発明者等も、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）のナノ粒子からなる製剤について、特許出願を行ってきている（特願２００２−１５９１９０）。しかしながら、本発明者等が提案したナノ粒子では、水溶性低分子医薬品のナノ粒子内への封入率は低いものであった。また、エステル化などを行うことにより水溶性低分子医薬品の疎水性を高めた場合には、当該医薬品のナノ粒子内への封入率は向上するものの、封入された薬物の徐放期間が短いものであり、徐放性は十分とはいえないものであった。
したがって本発明は、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を粒子内に封入することができ、かつ、粒子からの当該医薬品の初期バースト現象を抑制し、長期間にわたり医薬品を徐放することが可能であるとともに、病変部位へのターゲッティングが可能である、静脈注射用のナノ粒子を提供することを目的とする。
また、本発明は、かかる静脈注射用のナノ粒子について、医薬品化のための大量調製に適した、簡便なその調製法を提供することを課題とする。
【０００４】
かかる課題を解決するために、本発明者等は、水溶性非ペプチド性低分子医薬品と金属イオンとの相互作用に着目した。すなわち、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、金属イオンと結合させることにより疎水性をもたせることにより、ＰＬＧＡまたはＰＬＡのナノ粒子内への封入を検討した。その結果、金属イオンと結合することにより疎水性を有する水溶性非ペプチド性低分子医薬品は、極めて効率よくＰＬＧＡまたはＰＬＡのナノ粒子内へ封入し得ることを見出した。さらに、得られたナノ粒子は、粒子からの当該医薬品の放出が徐放的であり、かつ、病変部位への集積性が良好であることより、良好なターゲッティングと徐放製剤となり得ることを見出し、本発明を完成させた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
すなわち本発明は、その基本的態様として、金属イオンにより疎水化した水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）または乳酸重合体（ＰＬＡ）ナノ粒子に封入し、界面活性剤を当該ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の表面に持たせたことからなることを特徴とするターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子である。
【０００６】
より具体的な本発明は、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の直径が、５０〜３００ｎｍであることを特徴とする上記した静脈注射用ナノ粒子である。
さらに具体的な本発明は、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子に封入する水溶性非ペプチド性低分子医薬品の分子量が、１０００以下であることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子である。
【０００７】
また、具体的な本発明は、水溶性非ペプチド性低分子医薬品と結合させる金属イオンが、亜鉛、鉄、銅、ニッケル、ベリリウム、マンガンまたはコバルトのいずれかであることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子である。
さらにまた本発明は、具体的には、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子に封入させる水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、分子内にリン酸基またはカルボキシル基を有していることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子である。
【０００８】
より具体的には、本発明は、かかる水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタノイド、抗微生物薬または抗癌薬であることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子である。
さらにまた本発明は、より具体的には、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を封入したＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の表面を被覆する界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、レシチンまたはポリビニルアルコールであることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子である。
【０００９】
また本発明は、別の態様として、上記したターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子の製造方法であり、詳細には、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、金属イオンにより疎水化し、非ペプチド性低分子医薬品を、ＰＬＧＡまたはＰＬＡと共に水溶性有機溶媒に溶解または懸濁させ、界面活性剤を含有する水溶液中に添加することによりＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の表面に界面活性剤を持たせることを特徴とするターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子の製造方法でもある。
【００１０】
より具体的な本発明は、得られるＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の直径が、５０〜３００ｎｍであることを特徴とする上記した静脈注射用ナノ粒子の製造法である。
さらに具体的な本発明は、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子に封入する水溶性非ペプチド性低分子医薬品の分子量が、１０００以下であることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子の製造法である。
【００１１】
また、具体的な本発明は、水溶性非ペプチド性低分子医薬品と結合させる金属イオンが、亜鉛、鉄、銅、ニッケル、ベリリウム、マンガンまたはコバルトのいずれかであることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子の製造法である。
【００１２】
さらにまた本発明は、具体的には、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子に封入させる水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、分子内にリン酸基またはカルボキシル基を有していることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子の製造法である。
【００１３】
より具体的には、本発明は、かかる水溶性非ペプチド性低分子医薬品が、ステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタノイド、抗微生物薬または抗癌薬であることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子の製造法である。
【００１４】
さらにまた本発明は、より具体的には、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を封入したＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の表面を被覆する界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、レシチンまたはポリビニルアルコールであることを特徴とする上記の静脈注射用ナノ粒子の製造法である。
【００１５】
さらにまた本発明は、別の態様として上記で得られたナノ粒子を有効成分として含有する治療剤を提供するものであり、詳細には、水溶性ステロイドを封入したナノ粒子を有効成分として含有する抗炎症、抗リウマチ剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上記したように、本発明は基本的には、生分解性のＰＬＧＡまたはＰＬＡのナノ粒子、そのナノ粒子中に封入された金属イオンと結合した水溶性非ペプチド性低分子医薬品、および当該ナノ粒子表面に持たせた界面活性剤からなる。
すなわち、本発明のターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子は、金属イオンにより疎水化した水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子に封入し、界面活性剤を当該ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子の表面に持たせたことからなるものである。
【００１７】
この場合において、本発明のナノ粒子の直径が５０〜３００ｎｍであることが病変部位に取り込まれやすい好適な範囲であることが判明した。すなわち、粒径が５０ｎｍ未満では粒子が小さすぎて病変部位以外まで取り込まれ、好ましいものではない。また、粒径が３００ｎｍを超える場合には、細胞内皮系に取り込まれてしまい好ましいものではない。
【００１８】
一方、水溶性非ペプチド性低分子医薬品をナノ粒子中に効率よく封入させるためには、当該低分子医薬品を金属イオンと結合させ、医薬品自体を疎水性とすることが一つの特徴である。そのために使用される金属イオンとしては、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオンのいずれかであることが好適である。そのなかでも、亜鉛イオンあるいは鉄イオンが特に好ましい。
したがって、本発明において、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子に封入される水溶性非ペプチド性低分子医薬品は、これらの金属イオンと結合して疎水化され易いよう、分子内にリン酸基またはカルボキシル基を含有するのが好ましい。
また、水溶性非ペプチド性低分子医薬品は、分子量が１，０００以下であることが好適である。
【００１９】
前記水溶性非ペプチド性低分子医薬品としては種々の医薬品を挙げることができるが、なかでも、水溶性のステロイド性抗炎症薬、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタノイド、抗微生物薬あるいは抗癌薬であることが好適である。
【００２０】
より具体的には、ステロイド性抗炎症薬としては、リン酸ベタメサゾン、リン酸デキサメサゾン、リン酸プレドニゾロン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸プレドニゾロン、コハク酸ヒドロコルチゾン等である。
非ステロイド性抗炎症薬としては、ロキソプロフェンナトリウム、ジクロフェナックナトリウム等である。
プロスタノイドとしては、例えばＰＧＥ１であり、また抗微生物薬としては、バンコマイシン、コハク酸クロラムフェニコール、ラタモキセフ、セフピロム、リン酸クリンダマイシン、カルモナム等を挙げることができる。また抗癌薬としては、ビンクリスチン、ビンブラスチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明が提供する静脈注射用ナノ粒子の製造法としては、具体的には以下のようにして行うことができる。すなわち、前記の水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、金属イオンと結合させることにより疎水化させ、ＰＬＧＡまたはＰＬＡと共に水溶性有機溶媒中に溶解または懸濁させ、この溶解液または懸濁液を、界面活性剤を含有する水溶液中に添加し、攪拌することによって調製することができる。
【００２２】
使用する水溶性有機溶媒としては一概に限定できないが、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサンあるいはこれらの混合溶媒が好適である。
また、使用する界面活性剤としては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル類、レシチン、ポリビニルアルコールが好適である。
【００２３】
かくして製造された本発明のナノ粒子は、遠心、ゲル濾過、ファイバー透析あるいは限外濾過により精製した後、基材であるＰＬＧＡあるいはＰＬＡの安定性を考慮して、凍結乾燥して保存するのが好適である。
その際、凍結乾燥した製剤を再懸濁して投与できるようにするために、安定化剤および等張化剤を加えて凍結乾燥させることが好適である。そのような安定化剤および等張化剤としては、ショ糖あるいはトレハロースを挙げることができ、その添加量は、製剤に対して５倍重量以上となるように添加するのがよい。
【００２４】
以上のようにして調製される本発明のナノ粒子は、静脈内に投与することにより、各種の炎症部位・血管病変部位・感染部位・悪性腫瘍組織をターゲッティングし、その部位あるいは組織に効率よく集積する。次いで、その場で粒子中に封入された水溶性非ペプチド性低分子医薬品を持続的に放出し、当該医薬品の生物活性を発揮する。特に本発明のナノ粒子にあっては、粒子内に封入された水溶性非ペプチド性低分子医薬品について、金属イオンの作用により粒子からの初期バースト現象が抑制され、長期間にわたり当該医薬品が徐放されることがまた一つの特徴である。
したがって、このナノ粒子を製剤として利用するためには、ナノ粒子の表面物性・粒径・水溶性非ペプチド性低分子医薬品の封入率および放出挙動などを、目的に応じて制御することが重要である。例えば、ナノ粒子の表面物性は、界面活性剤の種類を変えることにより制御することができる。
【００２５】
さらに、ナノ粒子の粒径も体内動態に大きく影響を及ぼすことより、どの程度の粒径を有するナノ粒子が各病変部位（炎症部位・血管病変部位・感染部位・悪性腫瘍組織）に効率よく取り込まれるかを検討し、その粒径を調整することも重要である。かかる粒子径の調整は、ナノ粒子を調製する際の水相の攪拌速度や、使用する有機溶媒の量、有機溶媒の滴下速度などにより行うことができる。
【００２６】
水溶性非ペプチド性低分子医薬品のＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子中への封入は、当該低分子医薬品の物性が大きく関与する。一般的に、親水性（水溶性）の医薬品の方が疎水性の医薬品に比較し、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子中への封入率は低いものである。したがって本発明においては、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を金属イオンと結合させることにより、当該医薬品に疎水性を付与することが必要である。この疎水性付与は、より具体的には、水溶性非ペプチド性低分子医薬品を金属イオンと結合させ、不溶性の沈澱を形成させることで可能となる。
【００２７】
そのためには、水溶性非ペプチド性低分子医薬品の分子内に、金属イオンと結合し得るリン酸基あるいはカルボキシル基といった官能基を導入することが好ましい。なお、当該医薬品分子内に、金属イオンとにより沈澱形成に関与しない官能基ないし沈澱形成を阻害する官能基がある場合には、かかる官能基を適当な保護基で保護するなどの最適化をはかる必要がある。
さらに、使用する有機溶媒の種類や量、有機溶媒の滴下速度もナノ粒子の粒径の調整に影響を与え、水溶性非ペプチド性低分子医薬品の封入率にも影響を及ぼすことから、その最適化をする必要がある。
【００２８】
また、ナノ粒子を構成する基材となるＰＬＧＡまたはＰＬＡについても、異なる分子量のＰＬＧＡやＰＬＡを使用することで、粒子中に封入された水溶性非ペプチド性低分子医薬品の徐放速度を制御することができる。
なお、本発明により提供されるナノ粒子の評価を行うためには、ＰＫ／ＰＤ（薬物動態や薬理作用）の検討に適したｉｎ  ｖｉｔｒｏあるいは動物（ｉｎ  ｖｉｖｏ）モデルを構築することが重要である。
【００２９】
前記したように、本発明では金属イオンを用い、水溶性非ペプチド性低分子医薬品に疎水性を付与することにより、ＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子内に当該医薬品を高封入することが可能となった。したがって、本発明により、病変部位へ水溶性非ペプチド性低分子医薬品をターゲッティングすることができ、かつ病変部位において、長期にわたる当該医薬品の徐放作用が持続する静脈注射用ナノ粒子が、大量生産化に優位な簡便な方法により製造されるのである。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明を、実施例ならびに試験例にて詳細に説明する。
【００３１】
実施例１：金属イオンによる水溶性非ペプチド性低分子医薬品の沈澱形成
リン酸基を有する水溶性非ペプチド性低分子化合物として、下記表中に記載の化合物を用いた。各化合物を２０ｍＭの濃度で溶解した０．２Ｍ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を、等量の種々の金属イオン水溶液（１００ｍＭ）中に添加し、その際の添加液の濁りを観察した。
その結果を第１表に示した。
【００３２】
第１表：水溶性非ペプチド性低分子化合物の金属イオンによる沈澱の形成
【００３３】
【表１】
2006521367.tif 000002
【００３４】
−：溶解状態、＋：わずかな濁りが観察、＋＋：濁りがあり、＋＋＋：濁りが生じ沈澱が形成
【００３５】
表中の結果から判明するように、リン酸基を有する化合物は、亜鉛、鉄（二価あるいは三価）、銅金属イオンの存在により濁りや沈澱形成が観察された。
また、リン酸ベタメサゾンあるいはリン酸リボフラビンと亜鉛イオンのモル比を代えて沈澱形成量を解析した結果、いずれも亜鉛イオンとのモル比が約１で低分子化合物の沈澱が生じることが判明した。
【００３６】
実施例２：ステロイド封入ＰＬＧＡ／ＰＬＡナノ粒子の製造
種々のステロイドを１００μｌの水中に溶解し、０．５Ｍ酢酸亜鉛水溶液あるいは０．５Ｍ塩酸第一鉄水溶液５００μｌ中に添加した。１２，０００ｒｐｍ／５分間の遠心を行い、上清を除去し、亜鉛−ステロイドあるいは鉄−ステロイドの沈澱を得た。この沈澱物中に、ＰＬＧＡ（和光純薬工業社製）あるいはＰＬＡ（和光純薬工業社製）２０ｍｇを溶解したアセトン、アセトン／アセトニトリル混合液あるいはアセトン／エタノール混合液を５００μｌ添加した。さらに酢酸亜鉛水溶液を添加し、２時間室温で静置後、この溶液（または懸濁液）を４００ｒｐｍで攪拌した。０．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（非イオン性高分子界面活性剤）水溶液中に１ｍｌ／分の速度で２７Ｇのシリンジを通して添加した。得られたナノ粒子は、１〜２時間室温で攪拌しながら放置後、０．４倍量の０．５ＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８）を加え、２０，０００ｇ２０分遠心した。上清を除去した後、水を加え再度遠心によりナノ粒子を洗で浄した。得られたナノ粒子は、２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液中でＰＬＧＡ／ＰＬＡを分解し、ＨＰＬＣにてナノ粒子中のステロイドの量を定量した。また、金属イオンを加えずに調製したナノ粒子を非水溶性ステロイドに関しても同様に定量した。
さらに、リン酸ベタメサゾン５ｍｇを亜鉛により形成させた沈澱を、種々の量のアセトンに溶解し、同様にナノ粒子中に封入されたリン酸ベタメサゾンの量を定量した。
その結果を第２表および第３表に示した。
【００３７】
表２：ＰＬＧＡナノ粒子内へのステロイドの封入
【００３８】
【表２】
2006521367.tif 000003
【００３９】
ＢＤＰ：ベタメサゾンジプロピオネート
ＢＰ：リン酸ベタメサゾン
ＤＰ：リン酸デキサメサゾン
ＨＰ：リン酸ヒドロコルチゾン
【００４０】
第３表：ＰＬＧＡナノ粒子内へのリン酸ベタメサゾンの封入率に及ぼすアセトン量の影響
【００４１】
【表３】
2006521367.tif 000004
【００４２】
注：粒子が凝集し測定不可
【００４３】
第２表に示したように、リン酸ステロイドがナトリウム塩の場合には、全くナノ粒子内に封入されないのに対して、亜鉛あるいは第一鉄イオンの添加によって生じたリン酸ステロイドの沈澱（ＢＰ−Ｚｎ，ＢＰ−Ｆｅ，ＤＰ−Ｚｎ，ＨＰ−Ｚｎ）を用いたことで、顕著にＰＬＧＡナノ粒子内への封入率が増加することが判明した。
また、第３表に示した結果から明らかなように、ＰＬＧＡやリン酸ベタメサゾン量を一定としてその溶媒のアセトン量を変化させたところ、５００μｌ以下ではナノ粒子が凝集してしまったが、７００μｌでは分散安定性が高く、リン酸ベタメサゾンが高濃度封入されたナノ粒子が調製され、それ以上のアセトン量では分散安定性は高いが、徐々に封入率が低くなることが明らかになった。
【００４４】
実施例３：ＰＬＧＡ／ＰＬＡナノ粒子からのステロイドの放出挙動
リン酸ベタメサゾン５ｍｇを１００μｌの水中に溶解し、０．５Ｍ酢酸亜鉛水溶液５００μｌ中に添加した。１２，０００ｒｐｍ／５分間で遠心し、上清を除去し亜鉛−ステロイドの沈澱を得た。この沈澱物中に、分子量の異なる種々のＰＬＧＡあるいはＰＬＡ２０ｍｇを溶解したアセトンを５００μｌ添加した。２時間室温で静置後、この溶液を１，４００ｒｐｍで攪拌した０．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（非イオン性高分子界面活性剤）あるいはレシチン懸濁液中に１ｍｌ／分の速度で２７Ｇシリンジを通して添加した。得られたナノ粒子は、１〜２時間室温で攪拌しながら放置後、ＥＤＴＡを加えた後、限外濾過（アミコン社製：ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ−１０）で濃縮洗浄した。このナノ粒子をＦＢＳ（ウシ胎児血清）／ＰＢＳ（ｖ／ｖ＝１）中にＰＬＧＡ濃度として５００μｇ／ｍＬとなるように懸濁し、所定時間後１／２．５ボリュームの０．５ＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８）を加え、２０，０００ｇで３０分間遠心した。上清を除去した後、水を加えて再度遠心によりナノ粒子を洗浄した。得られたナノ粒子は、２Ｎ−ＮａＯＨ水溶液中でＰＬＧＡ／ＰＬＡを分解し、ＨＰＬＣにてナノ粒子中のステロイド量を定量した。
なお、比較対照として、本発明者等が先に出願（特願２００２−１５９１９０）している方法により調製した疎水性ステロイドのＢＤＰ（ベタメサゾンジプロピオネート）を封入したナノ粒子について同様定量した。
その結果を第４表に示した。
【００４５】
表4  ナノ粒子からのベタメサゾン放出挙動
【００４６】
【表４】
2006521367.tif 000005
【００４７】
＊１：特願２００２−１５９１９０に記載の方法で調整したナノ粒子
＊２：本発明方法により調製したナノ粒子
【００４８】
本発明者等が先に出願（特願２００２−１５９１９０）している方法により調製した疎水性ステロイドのＢＤＰ（ベタメサゾンジプロピオネート）を封入したナノ粒子からは、初期の段階でベタメサゾンが放出され、６日後にはほぼ９割以上のベタメサゾンがナノ粒子から放出されているのに対し、本発明方法により調製したナノ粒子にあっては、初期のバースト放出が著しく抑制されており、さらにその後も徐々にステロイドが放出されていることが判明した。
また、分子量が小さいＰＬＧＡあるいはＰＬＡを用いて調製したナノ粒子の方が、早期にステロイドが放出されており、またＰＬＡを用いて調製したナノ粒子よりもＰＬＧＡを用いて調製したナノ粒子の方がより早くステロイドが放出されていることが判明した。
【００４９】
実施例４：マクロファージに取り込まれたナノ粒子からのステロイドの放出挙動
１０％プロテオースペプトンを１．５ｍｌ腹腔内投与して刺激したマウスの腹腔からマクロファージを採取し、６×１０５ｃｅｌｌｓ／１２ｗｅｌｌで播種し、マクロファージＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）により一晩培養した。培地を交換後、実施例３にしたがって調製したＰＬＧＡナノ粒子またはＰＬＡナノ粒子を添加し、３７℃にて２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳおよび培地で８回洗浄した後、所定時間ごとに培地中に含まれるベタメサゾン量をＥＬＩＳＡ法により定量した。
なお、比較対照として、本発明者等が先に出願（特願２００２−１５９１９０）している方法により調製した疎水性ステロイドのＢＤＰ（ベタメサゾンジプロピオネート）を封入したナノ粒子を添加し、同様検討した。
その結果を第５表に示した。
第５表：ナノ粒子を取り込んだマクロファージからのベタメサゾン放出挙動
【００５０】
【表５】
2006521367.tif 000006
【００５１】
＊１：ＰＬＡ（Ｍｗ１４０００）を用いてナノ粒子を調製（特願２００２−１５９１９０）
＊２：ＰＬＧＡ（Ｍｗ８０００）を用いてナノ粒子を調製
【００５２】
発明者等が先に出願（特願２００２−１５９１９０）している方法により調製した疎水性ステロイドのＢＤＰ（ベタメサゾンジプロピオネート）を封入したナノ粒子からは、初期の段階でベタメサゾンが放出され、２日後には殆どが放出されているのに対し、本発明方法により調製したナノ粒子の場合には、およそ２〜３日後までは０次放出に近い挙動を示し、その後も緩やかに放出され続けることが判明した。
【００５３】
実施例５：ナノ粒子の分散安定性評価
実施例３に従い調製したアセトン溶液を、種々の界面活性剤を溶解した水中に滴下することによりナノ粒子を得た。また、得られたナノ粒子を、濃縮・洗浄・精製し、種々の濃度のショ糖溶液中で凍結乾燥した後、再度水を添加することでナノ粒子の再分散性を光散乱計により評価した。
【００５４】
レシチン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類あるいはポリソルベート類の界面活性剤を含有する水溶液を用いて調製したナノ粒子は、いずれの場合にあっても、ほぼ同じ粒径を有するナノ粒子となり、また界面活性剤の濃度を０．０１〜１％の範囲内で変化させた場合にあっても、ナノ粒子の粒径、分散安定性、リン酸ベタメサゾン封入率に大きな相違は認められなかった。
しかし、ポリビニルアルコール溶液に滴下して調製したナノ粒子では、他の界面活性剤で調製したナノ粒子に比べ粒径が大きくなり、また、リン酸ベタメサゾン封入率も低かった。また、ナノ粒子重量に対し５倍重量以上のショ糖を添加して凍結乾燥処理することにより、凍結乾燥後のナノ粒子の再分散性が維持されることが判明した。
【００５５】
実施例６：ナノ粒子の炎症部位への集積性
Ｌｅｗｉｓ系雄性ラット左後肢足底皮内に、１％カラゲニン含有生理食塩水を１００μｌ投与し、炎症を惹起させた。４時間後に、ローダミンを封入した平均粒径が２００ｎｍあるいは５００ｎｍを有するナノ粒子を尾静脈より単回投与した。投与２時間後に足浮腫を切除し、クリオスタットにより凍結切片を作製し、その組織を蛍光顕微鏡により観察した。
なお、比較対照例として、生理食塩水のみの投与群ならびにローダミンのみの投与群をおいた。
【００５６】
平均粒径が２００ｎｍのナノ粒子を投与した群では、切片組織像の蛍光強度は、対照の生理食塩水のみを投与した群の切片組織像に比較して、著しく増大しており、ナノ粒子が炎症部位に集積していることが判明した。
また、ローダミンのみを投与した群、あるいは平均粒径が５００ｎｍのナノ粒子を投与した群では、炎症部位への集積性は認められなかった。
【００５７】
実施例７：アジュバント関節炎抑制作用
体重１３０〜１６０ｇの７週齢Ｌｅｗｉｓ系ラットを１週間の予備飼育後、エーテル麻酔下にて、６ｍｇ／ｍＬ  Ｍ．Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  Ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ（ＤＩＦＣＯ社製）含有アジュバンドＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ（ＤＩＦＣＯ社製）溶液５０μｌを左後肢足蹠皮内に注射し、関節炎を惹起させた。Ｍ．Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ投与１４日後、左後肢容積を指標に、各実験群間に隔たりがないように分けた一群のラットに、リン酸ベタメサゾンを封入したＰＬＡナノ粒子を単回静脈内投与した。
また、対照として、他の群のラットにリン酸ベタメサゾンあるいはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をそれぞれ単回皮下投与、もしくはリメタゾン（三菱ウェルファーマ社製）を単回静脈内投与した。
関節炎の炎症抑制作用は、薬物投与前、投与後7日間の左後肢容積を水置換法で測定することで解析した。
得られた結果を第６表に示した。
【００５８】
第６表：ナノ粒子によるアジュバント関節炎抑制作用
【００５９】
【表６】
2006521367.tif 000007
【００６０】
＊１：ＰＬＡ（Ｍｗ１４０００）を使用して、リン酸ベタメサゾンを封入したナノ粒子を調製した。リン酸ベタメサゾンとして１００μｇに相当する量を投与。
＊２：リン酸デキサメサゾンに換算して１００μｇに相当する量を投与。
＊３：炎症率は、以下の計算式による。
炎症率（％）＝(測定した足容積−アジュバンド未投与の足容積)／(薬物投与前の足容積−アジュバンド未投与の足容積)×１００
【００６１】
第６表に示したように、すでに臨床的に使用されているステロイド性抗炎症剤であるリメタゾンの投与群では、投与後１日目には、３倍量のリン酸ベタメサゾンを投与した場合と同程度の抗炎症作用を示した。また、その抗炎症作用は、リン酸ベタメサゾンのみを投与した場合と同様に、その後徐々に弱まっていった。これに対して本発明のリン酸ベタメサゾンを封入したＰＬＡナノ粒子の投与群では、投与後１日目でリメタゾンと同程度の強い抗炎症作用を示し、その後７日間にわたり強い抗炎症作用が持続されていた。
【００６２】
実施例８：ＰＧＥ１を封入したＰＬＧＡ／ＰＬＡナノ粒子の調製
１ｍｇのＰＧＥ１を２０μｌのエタノールに溶解し、０．５Ｍ塩化第一（あるいは第二）鉄水溶液８０μｌ中に添加した。１２，０００ｒｐｍ／５分間の遠心を行い、上清を除去して鉄−ＰＧＥ１の沈澱を得た。この沈澱物中に、ＰＬＧＡ（和光純薬工業社製）あるいはＰＬＡ（和光純薬工業社製）を溶解したアセトン溶液を添加した。さらに酢酸亜鉛水溶液を添加し、２時間室温で静置後、この溶液（または懸濁液）を４００ｒｐｍで攪拌した０．５％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８（非イオン性高分子界面活性剤）あるいはレシチン懸濁液中に１ｍｌ／分の速度で２７Ｇシリンジを通して添加した。得られたナノ粒子は、１〜２時間室温で攪拌しながら放置後、０．４倍量の０．５ＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ８）を加え、２０，０００ｇで２０分遠心した。上清を除去した後、水を加え再度遠心によりナノ粒子を洗浄した。得られたナノ粒子は、アセトニトリル中に溶解し、ＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡ法によりＰＧＥ１を定量した。
また、実施例４と同様にマクロファージにＰＧＥ１封入ＰＬＧＡナノ粒子を取り込ませ、所定時間ごとに培地中に含まれるＰＧＥ１量をＥＬＩＳＡ法により定量した。
その結果を第７表に示した。
【００６３】
第７表：ナノ粒子を取り込んだマクロファージからのＰＧＥ１放出挙動
【００６４】
【表７】
2006521367.tif 000008
【００６５】
＊１：ＰＬＧＡ（Ｍｗ８，０００）を用いてナノ粒子を調製
【００６６】
ＰＧＥ１のＰＬＧＡナノ粒子中への封入率は、約０．１ないし１重量％程度であった。また、第７表に示した結果からも判明するように、ステロイド性抗炎症剤であるリン酸ベタメサゾンほどの徐放挙動を示さなかったものの、８日間にわたりＰＧＥ１が放出されつづけていることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上記載したように、本発明により、水溶性非ペプチド性低分子医薬品をＰＬＧＡまたはＰＬＡナノ粒子内に十分量封入することができ、かつ、粒子からの当該医薬品の初期バースト現象を抑制し、長期間にわたり医薬品を徐放することが可能である静脈注射用のナノ粒子が提供される。
本発明により提供される静脈注射用のナノ粒子は、各種の炎症部位・血管病変部位・感染部位・悪性腫瘍組織にターゲッティングし、その部位あるいは組織に効率よく集積する。次いで、その場で粒子中に封入された水溶性非ペプチド性低分子医薬品を、持続的に放出し、当該医薬品の生物活性を発揮することより、その医療上の有用性は多大なものである。
【国際調査報告】
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