(57)【要約】１分子あたり鉄イオンを２つ以上含まない純粋なラクトフェリンポリペプチド、又はポリペプチドとそれらの断片の混合物である。このポリペプチド又は混合物は骨格成長を刺激して骨吸収を妨げる。そしてまた、骨に関連した疾患を前記ポリペプチド又は前記混合物で治療する方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害する、１分子あたり金属イオンを２つ以下含む純粋なラクトフェリンポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む、請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項２に記載のラクトフェリンポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項３に記載のラクトフェリンポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項５に記載のラクトフェリンポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド及びその断片を含んで成る混合物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項７に記載の混合物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項８に記載の混合物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項９に記載の混合物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項７に記載の混合物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項１１に記載の混合物。
【請求項１３】
前記混合物が請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチドの加水分解物を含んで成る、請求項７に記載の混合物。
【請求項１４】
請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチドを含んで成る医薬組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項１４に記載の栄養補助組成物（nutraceutical composition）。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項１４に記載の栄養補助組成物。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項１６に記載の栄養補助組成物。
【請求項１８】
請求項７に記載の混合物を含んで成る栄養補助組成物。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項１８に記載の栄養補助組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項１９に記載の栄養補助組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項２０に記載の栄養補助組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項７に記載の混合物及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチドを必要とする対象者に対して有効な量で投与することを含んで成る、骨に関連した疾患を治療する方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項７に記載の混合物を必要とする対象者に対して有効な量で投与することを含んで成る、骨に関連した疾患を治療する方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが１分子あたり金属イオンを２つ含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが鉄イオンを含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本願は、２００２年４月３日に提出されたニュージーランド出願番号第581,121号の優先権を主張し、その内容は本明細書中参照によって組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
背景
ラクトフェリンは大部分の外分泌流体、例えば、涙、胆汁、気管支粘液、胃腸流体、子宮頚と膣の粘液、精液流体、及び乳の中に存在する８０kDの鉄結合性糖タンパク質である。循環する多形核好中球の二次特異的粒子の主要な成分である。ラクトフェリンの最も豊富な源は、哺乳類の乳及び初乳である。
【０００３】
ラクトフェリンは２〜７μg/mlの濃度で循環する。それは多数の仮想生物学的役割、例えば、鉄代謝、免疫機能、及び胚発生の調節を有する。ラクトフェリンはある範囲の病原体、例えば、グラム陽性及びグラム陰性細菌、酵母、及び真菌に対する抗微生物活性を有する。ラクトフェリンの抗細菌効果は、それが、病原体の増殖に欠かすことができない鉄を結合することができる能力に基づいている。ラクトフェリンはいくつかのウィルスの複製をも阻害し、そして脂質（細菌膜上のリポ多糖類の成分）に対して結合することによって、いくつかの細菌の抗生物質及びリゾチームに対する感受性を高める。
【発明の開示】
【０００４】
概要
本発明は、骨格成長を刺激して骨吸収を阻害することができるラクトフェリンペプチドに関連する。
【０００５】
詳細に、本発明は、１分子あたり鉄分子を２以下（即ち、０、１又は好適に２）含む純粋なラクトフェリンポリペプチドを特徴とする。「純粋な」ポリペプチドは、他の生物学的なマクロ分子を含まず且つ乾燥重量で６５％以上（例えば、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％）純粋なポリペプチドである。ポリペプチドの純度は、任意の適切な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はHPLC分析によって測定できうる。ラクトフェリンペプチドは、天然に生じるポリペプチド、組み換えポリペプチド、又は合成ポリペプチドであって良い。野生型ラクトフェリンポリペプチドの変異体（例えば、２以上（例えば、４、６、８、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００）のアミノ酸を含む野生型ラクトフェリンポリペプチドの断片、又はあるラクトフェリンポリペプチドプチ配列を含む組み換えタンパク質）であって、野生型ラクトフェリンポリペプチドの生物活性を維持する変異体は本発明の範囲内である。本発明のラクトフェリンポリペプチドは、哺乳類、例えば、ヒト又はウシの乳由来である。ポリペプチドに対して結合した金属イオンは、鉄イオン（天然に生じるラクトフェリンポリペプチドにおける場合のように）、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンでありうる。
【０００６】
本発明のラクトフェリンポリペプチドは、骨格成長を刺激し（例えば、骨芽細胞及び軟骨細胞の増殖を促すことによって）且つ骨吸収を阻害する（例えば、破骨細胞の成長を阻害することによって）。本発明のラクトフェリンポリペプチドの調製物（例えば、ウシ乳から単離したラクトフェリン）は、例えば、全分子が２つの鉄イオンを結合している単一種のポリペプチドを含むことができる。それはまた、異なる種のポリペプチドを含むことをもでき、それは例えば、いくつかの分子は鉄イオンと結合しておらず、他の分子がそれぞれ１または２個の鉄と結合する；いくつかの分子はそれぞれ鉄イオンと結合しそして他の分子はそれぞれ銅イオンと結合する；いくつかの分子はそれぞれ０、１又は２個の金属イオンを含む生物活性を有するラクトフェリンポリペプチド（完全長又は完全長よりも短い）でありそして他のものは当該ポリペプチドの断片（同じ又は異なる）である；又は全ての分子がそれぞれ０、１、又は２個の金属イオンを含む完全長ラクトフェリンポリペプチドの断片（同じ又は異なる）である、異なる種のポリペプチドである。例えば、完全長ラクトフェリンポリペプチドと完全長ラクトフェリンポリペプチドの様々な断片の混合物は、加水分解物、例えば、完全長ラクトフェリンポリペプチドのプロテイナーゼ消化などの部分消化物から調製されうる。さもなくば、それは、完全長ラクトフェリンポリペプチドと完全長ラクトフェリンポリペプチドの様々な断片（例えば、合成断片）を混合することによって調製できうる。他方、完全長ラクトフェリンポリペプチドの様々な断片の混合物は、完全長ラクトフェリンポリペプチドの完全消化（即ち、消化後に完全長ラクトフェリンポリペプチドは残っていない）によって、又は完全長ラクトフェリンポリペプチドの様々な断片を混合することによって調製できうる。
【０００７】
本発明は、更に、ミルク、ジュース、ソフトドリンク、スナックバー又は食事サプリメントでありうる、栄養補助組成物（nutraceutical composition）を特徴とする。栄養補助組成物は、本発明のラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドと当該ポリペプチドの断片との混合物を天然に存在するよりも多量に含む。ラクトフェリンは、骨芽細胞及び軟骨細胞の増殖を促し且つ破骨細胞成長を阻害することが発見されている。従って、本発明の栄養補助組成物は、骨粗鬆症及びリュウマチ又は変形性関節症などの骨疾患を予防しそして治療するために有用である。前記栄養補助組成物は、更に適量の他の骨増強因子、例えば、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK2、又はこれらの混合物を含むことができる。
【０００８】
加えて、本発明は、本発明のラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドとポリペプチドの断片の混合物と医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を特徴とする。任意に、前記医薬組成物は、他の骨増強因子をも含む。本発明は、上記ラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドとポリペプチドの断片の混合物を、骨疾患を予防及び治療するための医薬を製造するために使用することをも包含する。
【０００９】
本発明は、骨に関連した疾患を予防及び治療する（例えば、骨格成長を促し、そして骨吸収を阻害することによる）方法を供する。本法は、対象者に対して、本発明のラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドと当該ポリペプチドの断片の混合物を有効な量投与することを含む。本法は更に、対象者に対して有効量の他の骨増強剤を同時投与することも含みうる。
【００１０】
本発明の詳細は以下に伴う説明に開示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
詳細な説明
本発明は、ラクトフェリンが骨芽細胞及び軟骨細胞の増殖を刺激し、そして破骨細胞増殖を阻害するという予期せぬ発見に基づいている。従って、それは骨疾患を予防及び治療するために有用である。
【００１２】
本発明のラクトフェリンポリペプチドは、金属イオンを１分子あたり２個以下含む純粋なポリペプチドである。詳細に、ラクトフェリンの調製物に関する鉄/ラクトフェリン比の測定値は、０〜２.５の範囲でありうる。それは、天然の源（例えんば、哺乳類乳）から単離されうる、又は当業界で周知の遺伝子操作もしくは化学合成技術を使用することで生産されて良い。以下は、ラクトフェリンをウシの乳から単離するための方法の例である。
【００１３】
新鮮な乳（７L、pH６.５）を、ミリQ水中平衡化したS Sepharose Fast Flowの３００mlカラムに、４℃において５ml/分の流速で通過させる。結合しなかったタンパク質を２．５床体積（bed volume）の水に通して洗浄し、そして結合したタンパク質を段階的におよそ２．５床体積のそれぞれ０.１M、０.３５M、及び１.０Mの塩化ナトリウムで溶出させる。１Mの塩化ナトリウム中で目立たないピンクのバンドとして溶出するラクトフェリンを単一画分として回収して、ミリQ水で透析してしかる後に凍結乾燥する。この凍結乾燥した粉末を２５mMのリン酸ナトリウム緩衝剤、pH６.５に溶かし、そして上記緩衝剤中で１Mに至る塩化ナトリウム勾配を伴うS Shepharose Fast Flow上、流速３ml/分で再度クロマトグラフィーに委ねる。ゲル電気泳動及び逆相HPLCによって測定した場合、純度が十分なラクトフェリンを含む画分を組み合わせて、透析し、そして凍結乾燥する。ラクトフェリンの最終精製を、８０mMリン酸二ナトリム（pH８．６、０．１５Mの塩化カリウムを含む）中Sephacryl300上でのゲルろ過によって達成する。選定の画分を組み合わせ、ミリQ水で透析し、そして凍結乾燥させた。この調製物の純度は、HPLC分析によって示された場合９５％超であり、そしてスペクトル比（２８０nm/４６５nm）の値はラクトフェリンの鉄飽和形態の約１９未満である。
【００１４】
鉄飽和は、２：１分子過剰の５mM鉄ニトリロ三酢酸（Foley及びBates（1987）Analytical Biochemistry vol.162、pp.296〜300）を５０mMのトリス（pH、7.8、１０mMの重炭酸ナトリウムを含む）中の精製ラクトフェリンの１％溶液に対して添加することによって達成される。過剰の鉄ニトリロ三酢酸を、４℃、合計２０時間に渡る１００体積のミリQ水（２回交換した）での透析によって取り除く。次いで、荷鉄（load）（ホロ）ラクトフェリンを凍結乾燥する。
【００１５】
鉄欠乏（アポ）ラクトフェリンを、水中高純度ラクトフェリン試料の１％溶液を３０体積の０.１Mクエン酸(pH２.３、５００mg/Lの二ナトリウムEDTAを含む)に対して４℃で３０時間に渡り透析すること(Massons及びHeremans(1966) Peptides of the Biological Fluid vol.14 pp.115〜124)によって調製する。次いで、クエン酸塩及びEDTAを、３０体積のミリQ水(１回交換した)に対する透析によって取り除き、そして無色溶液を凍結乾燥させる。
【００１６】
本発明のラクトフェリンポリペプチドは、鉄イオン（天然に生じるラクトフェリンポリペプチドのように）又は非鉄金属イオン（例えば、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオン）を含みうる。例えば、ウシ乳から単離されたラクトフェリンは、鉄イオンを減らし、次いで他の種類の金属イオンを荷することができる。例えば、銅を荷することは、上記の鉄を荷するための方法と同じ方法により達成できうる。例えば、ラクトフェリンに他の金属イオンを負荷するために、Ainscoughら（1979、Inorganica Chimica Acta33、pp.149〜153）の方法が使用できうる。
【００１７】
本発明のラクトフェリンポリペプチドの調製において、ポリペプチドは、単一の種又は、異なる種であって良い。例えば、ポリペプチドが、それぞれ異なる数の金属イオンもしくは異なる種の金属イオンを含む；又はポリペプチドの長さが多彩、例えば、あるものは完全長ポリペプチドでありそしてあるものは断片であって良く、そして当該断片はそれぞれ完全長ポリペプチドの特定の部分を示す。かかる調製物は、天然の源からかあるいは様々なラクトフェリンポリペプチド種を混合することによって獲得できうる。例えば、異なる長さのラクトフェリンポリペプチドの混合物は、完全長ラクトフェリンポリペプチドのプロテイナーゼ消化（完全又は部分）によって調製できうる。消化の程度は、当業界で公知の方法、例えば、プロテイナーゼの量又はインキュベーションの時間を操作することによって調節されて良い。完全消化により、完全長ラクトフェリンポリペプチドの様々な断片の混合物が生産され；部分消化により完全長ラクトフェリンポリペプチドと様々な断片の混合物が生産される。
【００１８】
上記のラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドと当該ポリペプチドの断片の混合物は、骨に関連した疾患を予防及び治療するための本発明の医薬組成物を調製するために使用されている。かかる疾患としては、骨粗鬆症、リューマチ又は変形性関節症、肝骨異形成異常症（hepatic osteodystrophy）、骨軟化症、リケッチャ（Rickets）、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨ジストロフィー、骨硬化症、骨減少症、繊維成長不完全骨髄症（fibrogenesis imperfecta ossium）、二次超パラシロイジスム（secondry hyaperparathyrodism）、ヒポパラシロイジスム（hypoparathyrodism）、超パラシロイジスム、慢性腎疾患、サルコイドーシス、グルココルチコイド誘導骨粗鬆症、突発性高カルシウム血症、パジェット病、及び骨形成不完全症が挙げられるがそれらに限定はされない。栄養補助組成物は、食事サプリメント（例えば、カプセル、ミニバッグ、又は錠剤）又は食品（例えば、ミルク、ジュース、ソフトドリンク、ハーブティーバッグ、又は菓子類）でありうる。前記組成物は、他の栄養素、例えば、タンパク質、炭水化物、ビタミン、鉱物、又はアミノ酸であっても良い。前記組成物は、経口使用に適した形態、例えば、錠剤、硬又は軟カプセル、水性もしくは油性懸濁、もしくはシロップの形態；又は比経口使用に適した形態、例えば、水性プロピレングリコール溶液、又は緩衝水溶液の形態であって良い。栄養補助組成物中での活性成分の量は、大まかに、対象者の特異的な要請に依存する。この量とは、当業者によって認識されている様に、投与経路、及び他の骨増強因子の共使用の可能性に依存する。
【００１９】
医薬組成物であって、有効な量のラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドと当該ポリペプチドの断片の混合物、及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物も本発明の範囲内である。前記医薬組成物は、骨に関連した疾患を予防及び治療するために使用できうる。医薬組成物は更に有効な量の他の骨増強因子を含んでも良い。医薬的に許容できる担体としては、溶媒、分散媒体、コーティング、抗生物質及び抗真菌剤、及び等張及び吸収遅延剤が挙げられる。「有効な量」とは、治療効果を供するのに必要とされる量である。動物とヒトに対する投与量の相互関係（mg/m3体表層に基づく）は、Freireichら（1966）Cancer Chemother.Rep.vol.50：p.219に記載されている。体表層はおおよそ、対象者の身長と体重によって測定できうる（例えば、Scientific Tables、Geigy Pharmaceuticals、Ardley、New York、1970、p537を参照のこと）。有効投与量は、当業者によって認識されているように、投与の経路、使用する賦形剤などにも依存する。
【００２０】
本発明のラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドと当該ポリペプチドの断片の混合物は、常用の方法を使用することで様々な投与経路のための投与形態へと処方できうる。例えば、それは、カプセル、ゲルシール、又は経口投与のための錠剤として処方されて良い。カプセルは、任意の標準的な医薬的に許容できる物質、例えば、ゼラチン又はセルロースを含んで良い。錠剤は、常用の手順に従って処方されてよく、それは、ラクトフェリンポリペプチドの混合物又は当該ポリペプチドとポリペプチドの断片の混合物を固体状担体又は潤滑剤ともに圧縮することによる。固体状担体の例としては、デンプン及び糖ベントナイトが挙げられる。ラクトフェリンポリペプチド又は当該ポリペプチドと当該ポリペプチドの断片の混合物も、ハードシェル錠剤の形態にかあるいは結合剤、例えば、ラクトース又はマンニトール、常用の充填剤、及び錠剤化因子を含むカプセルの形態において投与されても良い。医薬組成物は、非経口経路を介して投与されて良い。非経口投与形態の例としては、水溶液、等張食塩水又は５％グルコース活性剤、又は医薬的に許容できる賦形剤である。シクロデキストリン、又は他の当業者に周知の賦形剤も治療剤デリバリーのための医薬賦形剤として使用できうる。
【００２１】
本発明の組成物の効率は、in vitro及びin vivoで評価されて良い。例えば、下の例を参照のこと。簡潔に、組成物は、in vivoで骨芽細胞及び軟骨細胞増殖を促すその能力を試験されて良い。in vivo研究のために、組成物は動物（例えば、マウス）中へと注射され、そしてその骨組織に対する効果が評価される。結果に基づいて、適切な損傷範囲及び投与経路が決定されうる。
【００２２】
下の特定の例は、単なる例示として構築されており、そして本発明をいかなる目的においても限定はしない。更なる努力なしに、当業者は、本明細書中の記載に基づき、本発明を完全に利用することができるだろう。本明細書中に引用された全刊行物は、その全体を参照によって組み込まれている。
【００２３】
ラクトフェリンはラット一次骨芽細胞の増殖を促す
骨芽細胞を、Loweら（Loweら（1991）Jurnal of Bone and Mineral Reserch vol.6 pp.1277〜1283）による従来の記載のように２０日胎児ラット頭蓋冠からコラーゲナーゼ消化によって単離した。頭蓋冠を無菌的に切開し、そして前頭部及び頭頂部の骨を骨膜から剥ぎ取った。縫合組織を含まない骨の中心部分のみを回収した。頭蓋冠を、３mMのEDTAを含むリン酸緩衝塩類液（PBS）（pH７.４）中で１５分に渡り２度、３７℃にて水浴中撹拌しながら処理した。PBS中で一度洗浄した後、頭蓋冠を３mlの１mg/mlコラーゲナーゼで３７℃、７分に渡り２度処理した。消化物Ｉ及びIIから上清を捨てた後、頭蓋冠を更に２度、３mlの２mg/mlコラーゲナーゼ（３０分、３７℃）で処理した。消化物III 及びIVの上清をプール、遠心し、そして細胞を、１０％ウシ胎児血清（FCS）を伴うDulbeccoの改変Eagle培地（DME）中で洗浄して、DME/１０％FCS中で懸濁せしめ、そして７５cm３フラスコに置いた。細胞を５％CO２及び９５％空気中３７℃でインキュベートした。５〜６日でコンフルエントな状態になり、このときに細胞を二次培養した。トリプシンEDTA（０.０５％/０.５３mM）を使用してトリプシン処理した後、細胞を、５％FCSを伴う最小必須培地（MEM）中ですすぎ、そして新鮮培地中で再懸濁せしめ、２４ウェルプレート中５×１０４細胞/ml（０.５ml細胞懸濁/ウェル、即ち、１.４×１０４細胞/cm2）で播いた。これらの細胞の骨芽細胞様特性を、高レベルのアルカリフォスファターゼ活性及びオステオカルシン生産（Grootら（1985）、Cell Biol. Int. Res. vol.9、p528によって記載された）及びパラチロイドホルモン及びプロスタグラジンに対する感受性アデニル酸シクラーゼ反応（Hermann-Erleeら（1986）Ninth International Conference on calcium regulating hormons and bone matabolism、p.409）を証明することによって確認した。
【００２４】
増殖研究（細胞計測及びチミジン導入）を、活発に増殖している細胞及び活発に増殖していない細胞集団の両方において行った。活発に増殖する細胞を生み出すために、亜コンフルエント（sub confluent）集団（二次培養後２４時間）を、１％FCS及びラクトフェリン試料を含む新鮮MEM中に置いた。活発に増殖しない細胞を生み出すために、亜コンフルエント集団を０.１％ウシ血清アルブミン+ラクトフェリン試料を伴う血清培地中に置いた。細胞数を、上記のようにして調製したラクトフェリン試料（即ち、精製ラクトフェリン、ハロラクトフェリン、及びアポラクトフェリン）の添加後、６、２４及び４８時間で分析した。細胞数の測定を、当該細胞をトリプシン/EDTA（０.０５％/０.５３mM）に対して３７℃で約５分に渡り曝すことによってウェルからはがして、測定した。計測を血球計算計チャンバー中で行った。活発に増殖する細胞及び活発に増殖しない細胞中への[３H]チミジンの組み込みを、インキュベーションする２時間前及び最後に細胞に[３H]チミジンをパルス注入（１μCi/ウェル）することによって評価した。細胞を、冷チミジンを含有MEM中で洗浄し、しかる後に１０％トリクロロ酢酸を添加することによって実験を６、２４、又は４８時間で終えた。沈殿物を２度エタノール：エーテル（３:１）で洗浄し、そして室温でウェルを乾燥させた。残留物を５５℃で３０分に渡り２M KOH中に溶かし、そして１M HClで中和させ、そしてアリコートを放射活性について計測した。細胞計測及びチミジン組み込みの両方に関して、各時点での実験を、６以上のウェルからなる実験集団を使用し４回以上異なる時に行った。
【００２５】
精製ラクトフェリン試料の細胞分裂有誘起反応は、骨芽細胞増殖速度が著しく増加すること（即ち、増殖する細胞のDNA中へのチミジンの導入増加）によって示されている様に、非常に強力であることが分かった。上で確認された有力な骨芽細胞反応は、骨芽細胞分裂誘起が十分に確認されているインスリン様増殖因子（IFG-1）に匹敵する。同じ骨芽細胞培養系において、IGF-1は、コントロールの１．２５倍の最大効果を示し、その一方で、ラクトフェリンの効果は、コントロールの試験した最大投与量（１０μg/ml）の２．２６倍であった。
【００２６】
ラクトフェリンは軟骨細胞の増殖を促す
軟骨細胞を、無菌条件下でヒツジの頚骨及び大腿骨表層から軟骨組織（完全深切片（full depth slices））を取り出すことによって単離した。切片を、５％FBS（v/v）及び抗生物質（アンピシリン５０g/L、ストレプトマイシン５０g/L及びネオマイシン１００g/L）を伴うDulbeccoの改変Eagle培地（DME）中に置いてスカルペルベレード（scalpelblade）で微細に砕いた。組織を取り除き、そして３７℃で最初にプロナーゼ（０.８％（w/v）、９０分）、次にコラゲナーゼ（０.１％（w/v）、１８時間）と共にインキュベートし、消化を完全にした。細胞を消化物から、遠心（１３００rpmで１０分）、DME/５％FBS中で再懸濁せしめ、９０Fm孔サイズのナイロンメッシュスクリーンを通して、未消化物を全て取り除き、そして再遠心して単離した。次いで、細胞を２度同じ培地で洗浄して再懸濁静せしめDME/１０％FBSを含む７５cm2フラスコ中に播き、そして５％CO２/９５％空気中３７℃でインキュベートした。７日でコンフルエントな状態になり、このときに細胞を二次培養した。トリプシンEDTA（０.０５％/０.５３mM）を使用してトリプシン処理した後、細胞を、DME/５％FBS中ですすぎ、そして新鮮培地中で再懸濁せしめ、２４ウェルプレート中（５×１０４細胞/mL、０.５mL/ウェル）に播いた。チミジン導入の測定を、上記の骨芽細胞様培養のための増殖停止させた細胞集団において行った。ラクトフェリンは０.１μg/ml超の濃度で軟骨細胞増殖を促すことが分かった。
【００２７】
ラクトフェリンは、器官培養において、骨芽細胞の増殖を促す
新生マウス器官培養を、従来記載された（Cornishら（1988）、Am J Physiol vol.274、E827〜E833）ように行った。素早く２日齢新生オスマウスに放射性同位体標識した45Caを皮下注射した。３日後、頭蓋冠を切り出して０.１％ウシ血清アルブミン/培地199が入っているペトリ皿における網状格子上に置いた。ラクトフェリンを加え、そして頭蓋冠を４８時間に渡りインキュベートした。インキュベーション終了時間の４時間前に、[3H]-チミジンを加えた。実験を終結させ、そして45Ca放出及びチミジンとり込みを測定した。ラクトフェリンは、それは骨芽細胞系統の細胞の増殖を反映するDNA合成を刺激することが分かった。
【００２８】
骨芽細胞におけるMAPキナーゼを介するラクトフェリンシグナル
この方法は、従来記載されている（Greyら、（2001）Endocrinology vol.142、pp.1098〜1106）。特別に、上記のようにして調製したラット一次骨芽細胞を、６ウェル組織培養プレートにMEM５％FCS中、初期密度５×１０４細胞/mlで播いて、８０〜９０％のコンフルエントな状態に増殖させた。一晩、血清飢餓にした後、細胞を室温で、MEM/０．１％BSA中ラクトフェリンで処理した。ラクトフェリン誘導p42/44MAPキナーゼリン酸化によるシグナル伝達を阻害する物質の効果を特定するために計画した実験にて、細胞に対してラクトフェリンを加える３０分前に阻害物質を加える前処理をした。所定の時間に渡り処理した後、処理培地を吸引し、細胞を水冷PBSで洗浄し、そしてプロテアーゼとフォスファターゼ阻害物質（１mMのPMSF、１μg/mlのペプタイン、１０μg/mlのルーペプチン、１０μg/mlのアプロチニン、1mMナトリウムバンデート、５００mMのNaF）を含む氷冷HNTG溶解緩衝剤（５０mMのHEPES、pH７.５、１５０mMのNaCl、１％トリトン、１０％グリセロール、１.５mMのMgCl2、１mMのEDTA）中で剥がした。溶解物を素早くボルテックス掛けして、４℃、１３，０００rpmで遠心し、そして分析する迄−７０℃で保存した。細胞溶出物のタンパク質含量を、DCタンパク質アッセイ（BioRad、Hercules、CA）を使用することで測定した。等しい量の全細胞溶出物（３０〜５０μg）を８％SDS-PAGEに委ね、ニトロセルロースメンブレンに移し、そして抗フォスフォp42/44MAPキナーゼ抗体（１：１０００）により４℃で１晩免疫ブロットした。タンパク質ローディングのコントロールとして、同じフィルターをストリッピングして総p42/44MAPキナーゼに対する抗体（１：４００）で再度標識した。HRP結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間に渡り行い、そしてメンブレンをELCによって分析した。免疫ブロットを３回以上繰り返した。ラクトフェリンは、骨芽細胞中でp42/44MAPキナーゼのリン酸化を誘導することが投与量及び温度依存性態様において、１〜１００μg/mlの濃度で発見した。
【００２９】
ラクトフェリンは骨成長をin vivoで刺激する
この研究で使用したマウスモデルは、従来記載されている（Cornishら、（1993）Endocriology vol.132、pp.1359〜1366）。ラクトフェリンの注射（０mg、０.０４mg、０.４mg及び４mg）を５日に渡り毎日与え、そして動物を１週間後に犠牲にした。骨形成を、新たに形成された骨を蛍光標識することによって測定した。骨吸収及び骨密度の指標を、常用の光学顕微鏡によって、画像解析ソフトウェアの力を借りて決定した。成体マウスにおけるラクトフェリンの局所注射をすることで、頭蓋冠骨成長の増加がもたらされ、それはたった５回の注射後の骨の領域における有意な増加である。そして動物を１週間後に犠牲にした。骨形成を、新たに形成された骨を蛍光標識することによって特定した。
【実施例】
【００３０】
適用１
１４〜１７％の固体（フルーツの添加有無）の規定のヨーグルトを以下のようにして調製できうる。
【００３１】
培地加熱スキムミルク粉末（１０９〜１５２g）及びALACO安定化剤（１００g）を５０℃の水およそ８８０ml中で再構築した。次いで、無水脂肪乳（２０g）を加えて、３０分に渡り混合した。次いで混合物を６０℃に加熱し２００barでホモジナイズし、そして９０℃で低温殺菌した。４０〜４２℃に冷却した後、スターター混合物及び凍結乾燥させた上記タンパク質調製物（純度９５％のラクトフェリンを最大で５０mg含む又はそんなに高純度ではない精製源に由来する当量のラクトフェリンを含む）を加えた。もし所望されれば、新鮮なフルーツもこの時点で加えられて良い。次いで、この混合物を容器に詰め、４０℃でpHが４.２〜４.４になる迄インキュベートし、そして送風クーラー中で凍結させた。
【００３２】
規定の同じヨーグルトを調製するための代わりの方法とは、規定量のラクトフェリン又は投与率として規定量のものを混合し乾燥ミルク固体へと、当該固体をヨーグルトの処方に用いる前に入れることによる。
【００３３】
適用２
スキムミルク又は全乳粉末とカルシウム及び凍結乾燥したラクトフェリン調製物の乾燥混合物を、乳製品ベースの製剤又は組成物として与えることができ、それらは、機能性食品として又は機能性食品成分として使用されて良い。かかる組成物は、還元乳（reconstituted milk）、粉乳成分、乳製品デザート、機能性食品、チーズもしくはバターもしくは飲料、及び栄養補助食品又は栄養補助食品のいずれかとして使用されて良い。乾燥成分を、粉乳：カルシウム：活性ラクトフェリン因子が、９０：９.５：０.５〜９４：５.９５：０．０００１の割合で混合することで、かかる使用のために適切な組成物が提供される。
【００３４】
適用３
粉乳、カルシウム、及びラクトフェリンリッチ成分の混合組成物を、骨健康機能性食品、骨健康食品成分としてかあるいは、ある範囲の健康食品中、骨健康栄養のデリバリーのための食品成分として使用されて良い。
【００３５】
かかる組成物に関して、組成物のカルシウム及びタンパク質含量は、必要とされた、許容できる栄養限界に調整される必要がある。商業上入手可能な成分粉乳は典型的に、粉末１００gあたりカルシウムを３００〜９００mgそれらの源に応じて含む。カルシウムの源は、粉末に対して、混合する場合、活性成分の最大で３重量％の程度で加えられて良い。商業上入手可能な成分ミルク又は乳製品ベースのタンパク質粉末のタンパク質量は、成分の種類、その製造方法、及びその使用目的に依存して多彩である。成分粉乳は典型的に、タンパク質を１２〜９２％含む。例は、商業的に入手可能なスキムミルク及び全乳粉末、食品等級のカゼイン、カゼイン塩、乳タンパク質濃縮粉末、噴霧乾燥した限外ろ過した又はマイクロフィルトレーションしたリテンテート粉末、及び乳タンパク質単離産物である。ラクトフェリンリッチ調製物を、タンパク質とカルシウム混合物中に組み込み、健康食品及びドリンク中での成分として使用されて良い栄養乳粉末を与えることができる。かかる混合物は、ヨーグルト及びヨーグルトドリンク、及び酸飲料、成分粉乳混合物、低温殺菌液体状乳製品、UHTミルク製品、培養乳製品、酸性化乳飲料、乳-穀類組み合わせ製品、麦芽乳、乳-ダイズ組み合わせ製品の調製において使用するために適切な成分を提供する。かかる使用のために、混合物は組成物を有し、このカルシウム含量は、０．００１％〜３．５％（w/w）であり、タンパク質組成は、２％〜９２％であり、そして骨芽細胞増殖因子としてのラクトフェリンを０．０００００１％〜５．５％の量で加えている。
【００３６】
他の実施態様
本明細書中で開示した全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わされて良い。本明細書中で開示されたそれぞれの特徴は、任意の他の、同じ働きをする、同等の又は類似目的の特徴により置き換えられて良い。従って、他に断りがない限り、本明細書中で開示された特徴は、一般的な一連の同等又は類似する特徴を例示するのに他ならない。
【００３７】
上記の説明から、当業者は、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、本発明の本質的な特徴を容易に確認でき、本発明を様々な用途及び条件に対して適用させるために、様々に変化及び改良を加えることができる。従って、他の実施態様も本発明請求の範囲の範囲内である。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月30日(2004.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害し、１分子あたり金属イオンを２つ以下含む純粋なラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項２】
前記ポリペプチド又はその断片が１分子あたり金属イオンを２つ含む、請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項３】
前記ポリペプチド又はその断片が鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項１又は２に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項４】
前記ポリペプチド又はその断片が鉄イオンを含む、請求項３に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチドとその断片を含んで成る混合物。
【請求項６】
前記混合物が請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチドの加水分解物を含んで成る、請求項５に記載の混合物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片を含んで成る栄養補助組成物。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の混合物を含んで成る医薬助組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の混合物及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片を必要とする対象者に対して有効な量で投与することを含んで成る、骨に関連した疾患を治療する方法。
【請求項１２】
請求項５又は６に記載の混合物を必要とする対象者に対して有効な量で投与することを含んで成る、骨に関連した疾患を治療する方法。
【請求項１３】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の組成物を必要とする対象者に対して有効な量で投与することを含んで成る、骨に関連した疾患を治療する方法。
【請求項１４】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害するための製剤の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンペプチド又はその断片の使用。
【請求項１５】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害するための製剤の製造における請求項５又は６に記載の混合物の使用。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンペプチドもしくはその断片又は請求項５もしくは６に記載の混合物の、骨に関連した疾患を治療するための製剤の製造における使用。
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月7日(2004.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害する１分子あたり金属イオンを２つ以下含む純粋なラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項２】
前記ポリペプチド又はその断片が１分子あたり金属イオンを２つ含む、請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項３】
前記ポリペプチド又はその断片が金属イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項１又は２に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項４】
前記ポリペプチド又はその断片が鉄イオンを含む、請求項３に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチドを含んで成る混合物。
【請求項６】
前記混合物が請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチドの加水分解物を含んで成る、請求項５に記載の混合物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片を含んで成る栄養補助組成物（neutraceutical composition）。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の混合物を含んで成る栄養補助組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の混合物及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項１１】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害するための製剤の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンペプチド又はその断片の使用。
【請求項１２】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害するための製剤の製造における請求項５又は６に記載の混合物の使用。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンペプチドもしくはその断片又は請求項５もしくは６に記載の混合物の、骨に関連した疾患を治療するための製剤の製造における使用。
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月29日(2005.7.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害する１分子あたり金属イオンを２つ以下含む純粋なラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項２】
前記ポリペプチド又はその断片が１分子あたり金属イオンを２つ含む、請求項１に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項３】
前記ポリペプチド又はその断片が鉄イオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオンを含む、請求項１又は２に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項４】
前記ポリペプチド又はその断片が鉄イオンを含む、請求項３に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド及びその断片を含んで成る混合物。
【請求項６】
前記混合物が請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチドの加水分解物を含んで成る、請求項５に記載の混合物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片を含んで成る栄養補助組成物（neutraceutical composition）。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の混合物を含んで成る栄養補助組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンポリペプチド又はその断片及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の混合物及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項１１】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害するための製剤の製造における請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンペプチド又はその断片の使用。
【請求項１２】
骨格成長を刺激し且つ骨吸収を阻害するための製剤の製造における請求項５又は６に記載の混合物の使用。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のラクトフェリンペプチドもしくはその断片又は請求項５もしくは６に記載の混合物の、骨に関連した疾患を治療するための製剤の製造における使用。
【国際調査報告】
2006501143.tif 000002
2006501143.tif 000003
2006501143.tif 000004
2006501143.tif 000005
2006501143.tif 000006