(57)【要約】【課題】改良された基質忍容性と増加した安定性を特徴とするバラ科植物由来のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼを提供すること、また、純粋な光学異性体Ｒ−シアノヒドリン又はＳ−シアノヒドリンの生成における上記リアーゼの使用を提供すること。【解決手段】本発明のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性中心で、ａ）アラニン基をグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、若しくはフェニルアラニンで置換されているか、ｂ）フェニルアラニン基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、若しくはイソロイシンで置換されているか、ｃ）ロイシン基がアラニン、グリシン、バリン、イソロイシン、若しくはフェニルアラニンで置換されているか、ｄ）イソロイシン基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、若しくはフェニルアラニンで置換されていることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改良された基質受容性と、増加した安定性と、を有するバラ科植物由来Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼであって、
前記Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性中心において、
ａ）アラニン残基がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているか、又は、
ｂ）フェニルアラニン残基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで置換されているか、又は、
ｃ）ロイシン残基がアラニン、グリシン、バリン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているか、又は、
ｄ）イソロイシン残基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されていること、
を特徴とするＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項２】
前記Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性中心において、
アラニン残基がグリシン、バリン、若しくはロイシンで置換されているか、又は、
フェニルアラニン残基がアラニン、ロイシン若しくはグリシンで置換されているか、又は、
ロイシン残基がアラニン、グリシン若しくはフェニルアラニンで置換されていること、
を特徴とする請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項３】
スイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、ブラックチェリー（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）、セイヨウバクチノキ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｌａｕｒｏｃｅｒａｓｕｓ）、カタリーナチェリー（Ｐｒｕｎｕｓ  ｌｙｏｎｉｉ）、アプリコット（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｒｍａｎｉａｃａ）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）若しくはリンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ及びこれらの組換えＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ、又は
活性中心に通じる疎水性チャネル内の１つ又は複数の嵩高いアミノ酸残基をより嵩の低いアミノ酸残基に置換している該Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼのトンネル変異体、
の活性中心において前記置換を行うこと、
を特徴とする請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項４】
修飾される前記Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼが、完全な配列の形状又は第一アミノ酸の交換によって修飾された配列の形状若しくは前記第一アミノ酸の欠失により切断された配列の形状、又はさらなるアミノ酸の付加により伸長した配列の形状、であること、
を特徴とする請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項５】
活性中心における前記変異の前に、天然又は植物性のシグナル配列が、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来α接合因子のシグナル配列、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転化酵素、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）キラー毒素シグナル配列、α−アミラーゼ、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の酸ホスファターゼ、インゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）凝集素；  アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来グリコアミラーゼシグナル配列、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来グルコースオキシダーゼシグナル配列、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来Ｓｅｃ１０シグナル配列、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来キラー毒素の２８ｋＤサブユニットのシグナル配列若しくは牛血清アルブミン（ＢＳＡ）シグナル配列、又はこれらの組換えシグナル配列若しくは点変異を有する前記シグナル配列の１つ、で置換されること、
を特徴とする請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項６】
部位特異的突然変異誘発と、それに引き続く、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、又はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）の群に属する微生物での分泌発現により調製されること、
を特徴とする請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項７】
スイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）若しくはブラックチェリー（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）由来の天然Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性中心、又はそれぞれが活性中心に通じる疎水性チャネルに任意に変異を有し得るＰｄＨＮＬ１、ＰａＨＮＬ１、ＰａＨＮＬ２、ＰａＨＮＬ３、ＰａＨＮＬ４若しくはＰａＨＮＬ５の群由来の組換えＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性中心で前記置換を行うこと、
を特徴とする請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項８】
活性中心に通じる疎水性チャネルに任意に変異を有し得る、組換えＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼＰａＨＮＬ５の活性中心において、
ａ）アラニン残基が位置１１１でグリシン、バリン若しくはロイシンで置換されていること、又は、
ｂ）フェニルアラニン残基が位置７２でアラニン若しくはロイシンで置換されていること、又は、
ｃ）ロイシン残基が位置３３１若しくは３４３でアラニン若しくはグリシンで置換されていること、
を特徴とし、
請求項４又は５に記載した変更によりそれに応じて位置を変えることが可能である、
請求項１に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項９】
エナンチオピュアなＲ−シアノヒドリン又はＳ−シアノヒドリンを調製する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼの使用。
【請求項１０】
エナンチオピュアなＲ−シアノヒドリン又はＳ−シアノヒドリンを調製する方法であって、
−１０℃〜＋５０℃及びｐＨ１．８〜ｐＨ７で、
有機溶媒系、水溶液系若しくは二相の系で、又は縣濁液中であるいは希釈せずに、
シアノ基供与体の存在下、
脂肪族、芳香族若しくは複素環式芳香族アルデヒド又はケトンを請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼで変換すること、
を特徴とする方法。
【請求項１１】
エナンチオピュアなＲ−シアノヒドリン又はＳ−シアノヒドリンを調製する方法であって、
嵩高い置換基を有する脂肪族、芳香族若しくは複素環式芳香族アルデヒド又はケトンを、活性中心でアミノ酸のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンのいずれか１つをより小さなアミノ酸残基でそれぞれ置換した請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼで変換すること、
を特徴とし、かつ、
小さな置換基を有する脂肪族、芳香族若しくは複素環式芳香族アルデヒド又はケトンを、活性中心でアミノ酸のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンのいずれか１つをより大きなアミノ酸残基でそれぞれ置換した請求項１〜８のいずれか一項に記載のＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼで変換すること、
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
生体触媒プロセスは化学産業で非常に重要になっている。この点に関し、しばしば存在する酵素であって、キラル又はプロキラル化合物を用いた化学反応で２つの光学異性体の１つを選択的に変換又は形成する酵素の特性を活用できる応用分野において、生物触媒を用いた化学反応の実施が、特に興味を持たれている。
この好ましい酵素特性を利用するのに不可欠な前提条件は、工業的に必要な量が入手可能であること及び十分に高い反応性並びに工業プロセスの実際の条件下における安定性である。
特に関心のあるキラル化合物類はシアノヒドリンである。シアノヒドリンは、例えばα−ヒドロキシ酸、α−ヒドロキシケトン、β−アミノアルコールの合成に重要であり、これらは生物活性物質、例えば薬理的活性成分、ビタミン又はピレスロイド化合物を得るのに使用される。
このシアノヒドリンは、シアン化水素酸を、ケトン又はアルデヒドのカルボニル基に添加することにより調製される。
例えば、ＷＯ９７／０３２０４、ＥＰ０９５１５６１及びＥＰ０９２７７６６に記載されるように、バラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から得られる酵素（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを生成することにより（Ｓ）−シアノヒドリンなどのキラル化合物を工業的に調製することができる。
しかしながら、Ｒ光学異性体が工業利用上重要となる関心の高い化合物は多様である。今日までは、実験室規模でのみ使用できる多くの生成物の調製方法だけが述べられてきた（例えば、ＥＰ０２７６３７５、ＥＰ０３２６０６３、ＥＰ０５４７６５５）。この場合に使用される酵素調製液は、主にバラ科植物、例えばスイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来の植物から得られた。
さらに、今まで使用されてきたＲ−ＨＮＬは、例えば、Ｒ−ＨＮＬの最初の遺伝子としてクローニングされ、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させたリンシード苗（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ；ＬｕＨＮＬ）由来のもの又はＰｈｌｅｂｏｄｉｕｍ  ａｕｒｅｕｒｕｍ由来のＲ−ＨＮＬである。
大規模な工業利用は今日まで実現していない。この根本的な理由は、今日までヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）活性を有するバラ科植物由来の酵素調製液又はリンシード苗由来の調製液を、十分な量、妥当な費用で入手することができず、低ｐＨ値での安定性が低すぎるためであった。
【０００２】
文献に記述される、高い光学純度の生成物を得るために有利な反応パラメータは、低温（例えば、Ｐｅｒｓｓｏｎら、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（７）、９１６〜９２３頁、２００２）、ｐＨ４未満（例えば、Ｋｒａｇｌら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６１３（ｅｎｚｙｍｅ  Ｅｎｇ．１０）、１６７〜１７５頁、１９９０）及び二相系（例えば、ＥＰ０５４７６５５）若しくは縣濁液（例えば、ＥＰ１２３８０９４）の使用である。
残念ながら、ほとんどのＲ−ＨＮＬは、半減期がｐＨ４未満で１時間未満である。
ＥＰ１２２３２２０Ａ１には、Ｒ−ＨＮＬアイソザイム、例えばアイソザイム５（ＰａＨＮＬ５）をコードするスイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｎｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来の遺伝子のクローニングにより調製した組換え酵素及びピキア・パスとリス（Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）における異種発現により調製した組換え酵素が記載されており、これらは、実施例から明らかなように、他の既知のＲ−ＨＮＬに比べて低いｐＨでの安定性が大幅に高められていることによって識別される。
認められた不都合な点は、基質受容性が不十分なことである。なぜなら、例えば組換えＰａＨＮＬ５の存在下において、市販の植物である扁桃仁由来の天然（Ｒ）−ＮＨＬ調製液の存在下よりも極めて低い反応速度で変換する基質があるからである。
【０００３】
それ故、本発明の目的は、第１に、工業規模における技術転換に対して費用効果が高く、十分な規模で提供することが可能であり、基質受容性の改善と安定性の増加を示す、バラ科植物由来Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼを提供することである。
【０００４】
従って、本発明は改良された基質受容性及び増加した安定性を有するバラ科植物由来Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼに関し、Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性中心において、
ａ）アラニン残基がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているか、又は
ｂ）フェニルアラニン残基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで置換されているか、又は
ｃ）ロイシン残基がアラニン、グリシン、バリン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているか、又は
ｄ）イソロイシン残基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されていることを特徴とする。
【０００５】
本発明のＲ−ＨＮＬは、バラ科植物由来Ｒ−ヒドロキシニトリルリアーゼの変異体である。
本発明の変異体を調製するために、最初の基礎原料として、バラ科植物由来の天然Ｒ−ＨＮＬ、例えばスイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来Ｒ−ＨＮＬ（ＰａＨＮＬ）、ブラックチェリー（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）由来Ｒ−ＨＮＬ（ＰｓＨＮＬ）、セイヨウバクチノキ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｌａｕｒｏｃｅｒａｓｕｓ）由来Ｒ−ＨＮＬ、カタリーナチェリー（Ｐｒｕｎｕｓ  ｌｙｏｎｉｉ）由来Ｒ−ＨＮＬ、アプリコット（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｒｍａｎｉａｃａ）由来Ｒ−ＨＮＬ、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ）由来Ｒ−ＨＮＬ、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来Ｒ−ＨＮＬ（ＰｄＨＮＬ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）由来Ｒ−ＨＮＬなど、又は、例えばＥＰ１２２３２２０で開示される組換えＲ−ＨＮＬ及び活性中心に通じる疎水性チャネル内の１つ又は複数の嵩高いアミノ酸残基を、より嵩の低いアミノ酸残基で置換されている、上述のＲ−ＨＮＬのいわゆるトンネル変異体（ｔｕｎｎｅｌ  ｍｕｔａｎｔ）を使用することができる。
【０００６】
好ましく使用される天然Ｒ−ＮＨＬは、スイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来Ｒ−ＨＮＬ（ＰａＨＮＬ）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来Ｒ−ＨＮＬ（ＰｄＨＮＬ）又はブラックチェリー（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）由来Ｒ−ＨＮＬ（ＰｓＨＮＬ）である。
【０００７】
好ましい組換えＲ−ＨＮＬは、セイヨウスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）由来組換えＲＨＮＬ（ＰｄＨＮＬ）であり、特にＰｄＨＮＬ１、及びＥＰ１２２３２２０に記載される組換えＲ−ＨＮＬのＰａＨＮＬ１〜ＰａＨＮＬ５であり、特に好ましいのは組換え体ＰａＨＮＬ５である。
適切なトンネル変異体（ｔｕｎｎｅｌ  ｍｕｔａｎｔ）は、好ましくは天然物又は組換えＲ−ＨＮＬであって、この組換えＲ−ＨＮＬは、好ましくは活性中心に通じる疎水性チャネルの１つの嵩高いアミノ酸残基を、より嵩の低いアミノ酸残基、例えばアラニン、グリシン、バリン若しくはフェニルアラニンなどで置換したものである。
【０００８】
さらに、改良されるＲ−ＨＮＬは、例えば配列の第一アミノ酸の交換、第一アミノ酸の欠失又はＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａなどのさらなるアミノ酸の結合、によって得られる改変された配列の形であってもよい。
さらに、活性中心における変異の前に、天然又は植物性のシグナル配列を、例えばサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来α接合因子のシグナル配列（α−ＭＦ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）転化酵素（ＳＵＣ２）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）キラー毒素シグナル配列、α−アミラーゼ、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、インゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）凝集素（ＰＨＡ−Ｅ）；アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来グリコアミラーゼシグナル配列（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）シグナル配列、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来Ｓｅｃ１０シグナル配列、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来キラー毒素の２８ｋＤサブユニットのシグナル配列、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）シグナル配列などの別のシグナル配列、又はこれらの組換えシグナル配列に交換する可能性がある。このシグナル配列は、さらに点変異を含む可能性がある。
適切なシグナル配列及びその変異体は、例えばＨｅｉｊｎｅ  ＧらのＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２４４（２）、４３９〜４４６頁（１９８９）、ＥＰ１９９１１２１３、ＰａｉｆｅｒらのＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  Ａｐｌｉｃａｄａ  １０（１）、４１〜４６頁（１９９３）、ＲａｅｍａｅｋｅｒｓらのＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６５（１）、３９４〜４０３頁（１９９９）などに記載されている。
【０００９】
好ましくは、植物性のシグナル配列をサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のα接合因子のシグナル配列で置換する。
【００１０】
例えば、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ（ＸＬ）Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社）又はインビトロジェン社若しくはＰｒｏｍｅｇａ社などのキットを使って、製造会社の取扱説明書又は、例えばＡｕｓｕｂｅｌらのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３に記載される他の従来の方法に従って部位特異的突然変異を誘発し、本発明のＲ−ＨＮＬを調製する。
部位特異的突然変異誘発キットは、特異的変異体の調製に使用するために準備された系であり、例えば、カリフォルニア州ラホーヤ（米国）のストラタジーンクローニングシステムズ社から市販されている。
【００１１】
本発明によれば、部位特異的突然変異誘発では、Ｒ−ＨＮＬの活性中心において、
ａ）アラニン残基がグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているか、又は
ｂ）フェニルアラニン残基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンで置換されているか、又は
ｃ）ロイシン残基がアラニン、グリシン、バリン、イソロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているか、又は
ｄ）イソロイシン残基がアラニン、グリシン、バリン、ロイシン若しくはフェニルアラニンで置換されているかのいずれかである。
【００１２】
そこから生じた変異体では、基質結合部位のすぐ近くの活性中心に位置する上述の残基が交換されている。
【００１３】
この点に関して、アラニン残基がグリシン、バリン若しくはロイシンで置換されているか、又はフェニルアラニン残基がアラニン、ロイシン若しくはグリシンで置換されているか、又はロイシン残基がアラニン、グリシン若しくはフェニルアラニンで置換されているかのいずれかが好ましい。
【００１４】
例えば、嵩高いラジカルを有し、又はオルト位若しくはケト位に置換基を有する芳香族アルデヒド又はケトン、あるいは嵩高い脂肪族アルデヒド又はケトンなどの大きな基質の変換のために、好ましくは、アミノ酸のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンの１つを、各ケースのより小さなアミノ酸残基で置換する。従って、例えば、フェニルアラニンをロイシン若しくはアラニンで置換し、又はアラニンをグリシンなどで置換する。
対照的に、例えば、より小さな脂肪族アルデヒド若しくはケトンなどの小さな基質の変換では、好ましくは、アミノ酸のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン又はフェニルアラニンの１つを、各ケースのより大きなアミノ酸残基で置換する。例えば、アラニンをロイシン若しくはバリンで置換し、又はロイシンをフェニルアラニンで置換する。
【００１５】
例えば、ＥＰ１２２３２２０で開示され、任意で活性中心に通じる疎水性チャネルに変異を持つ可能性もある組換えＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼＰａＨＮＬ１〜ＰａＨＮＬ５の変異体が特に好ましい。
【００１６】
活性中心に通じる疎水性チャネルに任意に変異を有することもあり、活性中心において、
ａ）アラニン残基が位置１１１でグリシン、バリン若しくはロイシンで置換されているか、又は、
ｂ）フェニルアラニン残基が位置７２でアラニン若しくはロイシンで置換されているか、又は、
ｃ）ロイシン残基が位置３３１若しくは３４３でアラニン若しくはグリシンで置換されている、組換えＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼＰａＨＮＬ５の変異体が特に好ましい。
ナンバリングは、修飾されていない成熟組換えＲ−ヒドロキシニトリルリアーゼＰａＨＮＬ５の対応位置に基づくが、その位置を上述の配列修飾、例えば配列の切断又は伸長などに従って変更することが可能である。
【００１７】
その後、適切な微生物、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・アノマラ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｏｍａｌａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などで分泌発現を行う。
【００１８】
本発明で生じたＲ−ＨＮＬ変異体を標準法、例えばＤｒｅｖｅｎｙらのＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）９（９）、８０３〜８１５頁、２００１年にならって精製する。
【００１９】
本発明のＲ−ＨＮＬ変異体は、先行技術に比べて増加した反応率のエナンチオピュアなＲ−シアノヒドリン又はＳ−シアノヒドリンの調製にも適し、本発明のＲ−ＨＮＬ変異体はまた、低ｐＨ値における高いｐＨ安定性によって識別される。
【００２０】
従って、本発明はさらに、エナンチオピュアなＲ−シアノヒドリン又はＳ−シアノヒドリンを調製するための本発明のＲ−ＨＮＬ変異体の使用に関する。
【００２１】
特に、本発明のＲ−ＨＮＬ変異体を、基質としての脂肪族及び芳香族アルデヒド並びにケトンと共に使用する。
これに関して、アルデヒドとは、脂肪族、芳香族又は複素環式芳香族アルデヒドを指す。これに関して、脂肪族アルデヒドとは、飽和又は不飽和脂肪族の直鎖、分岐若しくは環状アルデヒドを指す。好ましい脂肪族アルデヒドは、特に２〜３０のＣ原子、好ましくは４〜１８のＣ原子を有し、飽和若しくは一価不飽和若しくは多価不飽和の直鎖又は分岐アルデヒドである。これに関して、アルデヒドはＣ−Ｃ二重結合及びＣ−Ｃ三重結合の両方を有する可能性がある。さらに、脂肪族、芳香族又は複素環式芳香族アルデヒドは、反応条件下で不活性な基、例えばフェニル、フェノキシ若しくはインドリル基などの任意で置換されるアリール又はヘテロアリール基、ハロゲン、ヒドロキシ、ヒドロキシ−Ｃ１〜Ｃ５−アルキル、Ｃ１〜Ｃ５−アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５−アルキルチオ、エーテル、アルコール、カルボキシルエステル、ニトロ若しくはアジド基で、非置換又は置換される可能性がある。
好ましい脂肪族アルデヒドの例は、ブタナール、２−ブテナール、３−フェニルプロパナール、ヒドロキシピバルアルデヒドなどである。
芳香族又は複素環式芳香族アルデヒドの例は、ベンズアルデヒド及び様々に置換されたベンズアルデヒド、例えば、２−クロロベンズアルデヒド、３−クロロベンズアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、３，４−ジフルオロベンズアルデヒド、３−フェノキシベンズアルデヒド、４−フルオロ−３−フェノキシベンズアルデヒド、ヒドロキシベンズアルデヒド、メトキシベンズアルデヒド、さらにフルフラール、メチルフルフラール、アントラセン−９−カルバルデヒド、フラン−３−カルバルデヒド、インドール−３−カルバルデヒド、ナフタレン−１−カルバルデヒド、フタルアルデヒド、ピラゾール−３−カルバルデヒド、ピロール−２−カルバルデヒド、チオフェン−２−カルバルデヒド、イソフタルアルデヒド若しくはピリジンアルデヒド、チエニルアルデヒドなどである。
ケトンは、カルボニル炭素原子が様々な置換基を有する、脂肪族、芳香族又は複素環式芳香族ケトンである。脂肪族ケトンは、飽和又は不飽和の直鎖、分岐若しくは環状ケトンを指す。このケトンは、飽和又は一価不飽和又は多価不飽和である可能性がある。これらを、反応条件下で不活性な基、例えばフェニル若しくはイノリル基などの任意で置換されるアリール又はヘテロアリール基、ハロゲン、エーテル、アルコール、カルボキシルエステル、ニトロ若しくはアジド基で非置換又は置換される可能性がある。
芳香族又は複素環式芳香族ケトンの例は、アセトフェノン、インドリルアセトンなどである。
【００２２】
本発明に適するアルデヒド及びケトンは既知のものであるか、又は従来の方法で調製が可能なものである。
【００２３】
基質は、本発明のＨＮＬの存在下、シアノ基供与体を用いて変換される。シアノ基供与体として、シアン化水素酸、アルカリ金属シアン化物又は一般化学式Ｉのシアノヒドリン
Ｒ１Ｒ２Ｃ（ＯＨ）（ＣＮ）
が適当である。
【００２４】
化学式Ｉ中、Ｒ１及びＲ２は、独立に、互いに水素若しくは非置換の炭化水素基であるか、あるいはＲ１及びＲ２が共に水素ではなく、Ｒ１及びＲ２が共に、４若しくは５のＣ原子を有するアルキレン基である。炭化水素基は、脂肪族又は芳香族であり、好ましくは脂肪族基である。Ｒ１及びＲ２は、好ましくは１〜６のＣ原子を有するアルキル基であり、非常に好ましくは、シアノ基供与体がアセトンシアノヒドリンである。
シアノ基供与体を既知の方法で調製することができる。シアノヒドリン、特にアセトンシアノヒドリンも購入することができる。
使用するシアノ基供与体は、好ましくはシアン化水素酸（ＨＣＮ）、ＫＣＮ、ＮａＣＮ又はアセトンシアノヒドリンであって、特に好ましくはシアン化水素酸である。
さらに、シアン化水素酸を、その塩、例えばＮａＣＮ又はＫＣＮなどの１つから反応の直前にのみ遊離することができ、不希釈又は溶解した形で反応混合液に添加することができる。
【００２５】
変換は、有機溶媒系、水溶液系若しくは二相の系又は縣濁液において、希釈剤を用いずに行うことができる。
本発明のＨＮＬを含む水溶液又は緩衝液は水溶液系として使用される。
この例にはクエン酸Ｎａ緩衝液、リン酸緩衝液などがある。
有機系希釈剤として、水非混和性又はわずかに水混和性の脂肪族又は芳香族である任意にハロゲン化された炭化水素、アルコール、エーテル若しくはエステル、又はその混合物、あるいはその基質自体を使用することができる。好ましくは、メチルターシャリブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル及び酢酸エチル又はその混合物を使用する。
さらに、本発明のＨＮＬは、そのままで存在することができ、又は有機系希釈剤で固定化することができるが、二相系又は固定化していないＨＮＬの縣濁液でも変換を行うことができる。
【００２６】
さらに、−１０℃〜＋５０℃、好ましくは−５〜＋４５℃の温度で変換を行う。
反応混合液のｐＨは、１．８〜７、好ましくは２〜４、特に好ましくは２．５〜３．５とすることができる。
【００２７】
実施例１：スイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来ｐａｈｎ１４遺伝子のクローニング
アメリカザクラ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）のｍｄｌ４遺伝子の配列相同性に基づき遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを調製した。
「Ｈｏｔｓｔａｒ  Ｋｉｔ」（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）のマニュアルに従って、１．２Ｕの「Ｈｏｔｓｔａｒ」ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）と、「鋳型」として５０ｎｇのアーモンドのゲノムＤＮＡ（Ｆａｒｍｇｏｌｄ扁桃仁、バッチ番号Ｌ４５３２、１９９９年に収穫したものから分離）と、各１０ｐｍｏｌのプライマーｍａｎｄｌｐ２ｆ（ｏＢＴ２２０４）及びｍａｎｄｌｐ５ｒ（ｏＢＴ２２０６）と、５μＬのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）混合液とのすべてを１×ＰＣＲ緩衝液に溶解させた５０μＬの混合液の中で、９５℃で１５分間の変性ステップを開始し、引き続きプレ増幅のために１０サイクル（９４℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で１分間）、特異的産物の増幅のためにさらに２０サイクル（９４℃で１分間、６８℃で１分間、７２℃で１分間）と７２℃で５分間の最終インキュベーションを行い、増幅を実施した。このＰＣＲで約２．２ｋｂのサイズ（アガロースゲル電気泳動分析により測定された）のＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ産物は、「Ｑｉａｑｕｉｃｋキット」（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）を用い、付属のマニュアルに従って、アガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲＩ切断部位を介してｐＢＳＳＫ（−）クローニングベクターにクローニングし、「Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、カリフォルニア州、フォスタシティ）を用いて、プライマー歩行法で配列を決定した。ＤＮＡ配列の５’領域及び３’領域から新しいＰＣＲプライマーを得て、新たなＰＣＲに使用した。このために選択した反応混合液は以下の通りである：２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各１０ｐｍｏｌの２種のプライマーｐａｍｈｎｌ４ａ（ｏＢＴ２５４４）及びｐａｍｈｎｌ４ｅ（ｏＢＴ２５４３）、２μＬのｄＮＴＰ混合液（各５ｍＭ）、１×ＨｏｔｓｔａｒＰＣＲ緩衝液及び１．２ＵのＨｏｔｓｔａｒＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）。
９５℃で１５分間のスッテップ後、３０サイクル（９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間）及び７２℃で１５分間の増幅を行った。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）カラムで二度精製し、クローン化ＰＣＲ産物の配列エラーを避けるために直接的に配列を決定した。得られた全長２２３２塩基対のＰＣＲ断片のＤＮＡ配列のエキソンを同定し、ＰａＨＮＬ４アイソザイムのタンパク質配列をコード配列から得た。
【００２８】
ｏＢＴ２２０４  ｍａｎｄｌｐ２ｆ：５’−ＡＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣ−３’
ｏＢＴ２２０６  ｍａｎｄｌｐ５ｒ：５’−ＣＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＣＴＴＡＴＣＣＡＣＧＧ−３’
ｏＢＴ２５４３  ｐａｍｈｎｌ４ｅ：５’−ＡＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＡＧＣＣＡＣＧ−３’
ｏＢＴ２５４４  ｐａｍｈｎｌ４ａ：５’−ＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＣＧＣＴＧＴＡＧＴＧ−３’
【００２９】
実施例２：シグナル配列の置き換え
細胞内部で不完全なプロセスを受けた酵素の蓄積を避けるために、予想される成熟タンパク質（シグナルペプチドと付加されたＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ配列の除去後の分泌タンパク質）のＮ末端として２種の変異体を選択した：
Ａ）野生型配列でも生じる、Ｎ末端アミノ酸がロイシンであるもの。これは、Ｎ−末端規則により、第１の不安定アミノ酸とみなされている（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、９３（２２）、１２１４２〜１２１４９頁、１９９６年）。
Ｂ）Ｎ末端アミノ酸がグルタミン（変異Ｌ１Ｑ）であるもの。これは第３の不安定アミノ酸として記述されている（Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙら、１９９６年）。
【００３０】
ＰＣＲ  Ｉ：
サッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子のシグナル配列を、鋳型ｐＰＩＣＺＢ（インビトロジェン社、カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｖ１９５２０）から高度に増幅した。シグナル配列の３’末端でインビトロジェンプラスミドのＥｃｏＲＩ切断部位が切断されるようにＰＣＲプライマーを構築した。これにより、ＥｃｏＲＩ切断部位を介して、シグナル配列を含む遺伝子構築物全体を、様々なＰｉｃｈｉａ発現ベクターにクローニングすることが可能になった。この目的に使用するプライマー対は、ａｌｐｈａ１１／ａｌｐｈａ２１ａ及びａｌｐｈａ１１／ａｌｐｈａ２１ａＱであった。プライマーａｌｐｈａ１１及びｈｎ１５α２１は、ＥｃｏＲＩ切断部位を含む。プライマーａｌｐｈａ２１ａ及びａｌｐｈａ２１ａＱは、成熟ＰａＨＮＬ５アイソザイムの５’末端をコードするＤＮＡ配列領域も含んだ。プライマーａｌｐｈａ２１ａＱは、予想される成熟分泌タンパク質のＮ末端で変異Ｌ１Ｑをもたらす配列修飾を含んだ。α因子シグナル配列の末端には、Ｋｅｘ２切断部位及びＳｔｅ１３によってプロセシングを受けるＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ配列があった。
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（カリフォルニア州、フォスタシティ）のサーモサイクラーにおいて、５０μＬの混合液（１０ｎｇの鋳型、０．１μＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５μＬのＰＣＲ緩衝液、Ｒｏｃｈｅ社の１ＵのＰｗｏポリメラーゼ）中でＰＣＲを行った。９４℃で２分間の変性ステップ後に３０サイクル（９４℃で３０秒間、６２℃で６０秒間、７２℃で１分３０秒間）の増幅及び７２℃７分間の最終ステップを続けた。
【００３１】
ＰＣＲ  ＩＩ：
ｈｎｌ５遺伝子を、ｈｎｌ５α１１／ｈｎｌ５α２１及びｈｎｌ５α１１Ｑ／ｈｎｌ５α２１のプライマー対を用いて、プラスミドｐＨＩＬＤＰａＨＮＬ５ａ（ＢＴ４２５６）から高度に増幅した。プライマーｈｎｌ５α１１及びｈｎｌ５α１１Ｑは、α因子シグナル配列（上記）を含む断片の３’末端に対応するＤＮＡ配列領域も含んだ。プライマーｈｎｌ５α２１はＥｃｏＲＩ切断部位を含んだ。
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のサーモサイクラーにおいて、５０μＬの混合液（１０ｎｇの鋳型、０．１μＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、５μＬのＰＣＲ緩衝液、Ｒｏｃｈｅ社の１ＵのＰｗｏポリメラーゼ）中でＰＣＲを行った。９４℃で２分間の変性ステップ後に３０サイクル（９４℃で３０秒間、６２℃で６０秒間、７２℃で３分３０秒間）の増幅及び７２℃で７分間の最終ステップを続けた。
【００３２】
オーバーラップ伸長：
ＰＣＲ  Ｉ及びＰＣＲ  ＩＩで得られた各産物の３μＬを鋳型として使用し、同時に、合着産物を得て完成させるためのプライマーとして使用した。伸長反応は、５μＬのＰｗｏＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰ及び１ユニットのＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社、ドイツ、マンハイム）を含む４５μＬの混合液中で行った。この混合液を９４℃で２分間加熱後、サーモサイクラーでインキュベートし、９４℃で３０秒間と７２℃で３分間のサイクルを１０サイクル行った。
【００３３】
ＰＣＲ  ＩＩＩ：
オーバーラップ伸長の産物を、プライマーａｌｐｈａ１１及びｈｎｌ５α２１を用いて増幅した。５μｌのプライマー混合液（３μＬの水と各１μＬのプライマーａｌｐｈａ１１及びｈｎｌ５α２１で、プライマー濃度は５μＭとなる）をオーバーラップ伸長ＰＣＲ混合液に添加し、その産物を２０サイクル（９４℃で３０秒間、６２℃で４５秒間、７２℃で４分間）で増幅した。最後に、７２℃で７分間のインキュベーションを行った。ＰＣＲ産物を、キアゲン社（ドイツ、ヒルデン）のＱｉａｑｕｉｃｋ精製プロトコルにより精製し、ＥｃｏＲＩで切断し、ベクターｐＨＩＬＤ２（インビトロジェン社、カリフォルニア州、サンディエゴ）にクローニングした。
【００３４】
プライマー配列：
ｏＢＴ２８３５  α１１：５’−ｔｃｔｔｃｇａａｇａａｔｔｃａｃｇＡＴＧＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣ−３’
ｏＢＴ２８４１  α２１ａ：５’−ｇａａｇｔａｔｔｇｇｃａａｇＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧ−３’
ｏＢＴ２８４３  α２１ａＱ：５’−ｇａａｇｔａｔｔｇｇｃｔｔｇＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＧ−３
ｏＢＴ２８３７  ｈｎｌ５α１１：５’−ａｇａｇａｇｇｃｔｇａａｇｃｔＣＴＴＧＣＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧ−３’
ｏＢＴ２８４２  ｈｎｌ５α１１Ｑ：５’−ａｇａｇａｇｇｃｔｇａａｇｃｔＣＡＡＧＣＣＡＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＴＧ−３’
ｏＢＴ２８３８  ｈｎｌ５α２１：５’−ａｔｇｇｔａｃｃｇａａｔｔｃＴＣＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＧ−３’
伸長部分を小文字で示す。
【００３５】
生じたプラスミドを、ｐＨＩＬＤＰａＨＮＬ５α（ＢＴ４３３８）及びｐＨＩＬ／ＰａＨＮＬ５α＿Ｌ１Ｑ（ＢＴ４３３９）と呼んだ。インビトロジェンの標準法により、Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓへの形質転換を行った。
【００３６】
滅菌した爪楊枝を用いて、各試験当たり、約２０００の形質転換細胞を深底培養プレート（Ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ）に接種し、活性型の形質転換細胞をスクリーニングするために培養した。
【００３７】
実施例３：Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換細胞の培養及びＰａＨＮＬ５変異体の生成
【００３８】
ａ）深底プレートにおけるミクロ培養
２ｍＬの深底プレート中の２５０μＬのＢＭ０．５Ｇ培地（０．２Ｍリン酸化カリウム、ｐＨ６．０、１３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、５ｇ／Ｌのグリセロール、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン）に形質転換体の単一コロニーを接種し、２８℃、３４０ｒｐｍで振とうした。６０〜７０時間後に、２５０μＬのＢＭＭ２培地（０．２Ｍリン酸化カリウム、ｐＨ６．０、１３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、２０ｍＬ／Ｌのメタノール、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン）を添加することにより、ＡＯＸ１プロモータを介した発現誘導を行った。１０、２４及び４８時間後に、その都度、５０μＬのＢＭＭ１０（０．２Ｍリン酸化カリウム、ｐＨ６．０、１３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、１００ｍＬ／Ｌのメタノール、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン）を添加することにより、さらなるメタノールの添加を行った。
誘導の約７２時間後に細胞を遠沈させ、培養液上清を直接使用し、希釈し、あるいは、酵素活性の測定のために、ザルトリウス社（ドイツ、ゲッティンゲン）のビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）３０ｋＤａ除去メンブレンで限外濾過することにより濃縮した。
【００３９】
ｂ）振とうフラスコにおける「スケールアップ」
バッフル付きの２リットルフラスコ中の２２５ｍＬのＢＭ０．５Ｇ培地（０．２Ｍリン酸化カリウム、ｐＨ６．０、１３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、５ｇ／Ｌのグリセロール、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン）に大量の単一コロニーを接種し、２８℃、１２０ｒｐｍで振とうした。６０〜７０時間後に、２５ｍＬのＢＭＭ１０培地（０．２Ｍリン酸化カリウム、ｐＨ６．０、１３．４ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、１００ｍＬ／Ｌのメタノール、０．８ｍｇ／Ｌのビオチン）を添加することにより、ＡＯＸ１プロモータを介した発現誘導を行った。１０、２４及び４８時間後に、さらに振とうフラスコ（２５０ｍＬ）当たり２．５ｍＬのメタノールを添加した。
【００４０】
誘導の約７２時間後に、細胞を遠沈させ、培養液上清を直接使用し、希釈し、あるいは、酵素活性の測定のために、３０ｋＤａ除去メンブレンで限外濾過することにより濃縮した。
【００４１】
実施例４：部位特異的突然変異誘発
ストラタジーン社のＱｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号  ＃２００５１６）を用いて、１０ｎｇの発現プラスミドｐＨＩＬＤＰａＨＮＬ５α＿Ｌ１Ｑ（α因子シグナル配列を有するＰａＨＮＬ５）を突然変異誘発反応の鋳型として使用した。突然変異誘発用のプライマーは、それぞれ２００ｎｇをこの反応に使用した。以下の温度プログラムを使用した：
Ａ）９５℃で１分間の変性
Ｂ）９５℃で５０秒間、６０℃で５０秒間及び６８℃で２０分間を１８サイクル
Ｃ）６８℃で７分間の伸長。
キットのプロトコルに記載される通りに、鋳型ＤＮＡをＤｐｎＩで消化し、その混合液の２μＬを、形質転換用ウルトラコンピテント大腸菌ＸＬ１０ゴールドセルに記載されている通りに使用した。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製し、配列決定を行った。コーディングＤＮＡを挿入した領域に正しい配列を有する変異体由来のプラスミドを複製し、インビトロジェン社の標準法により、Ｐｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５に形質転換した。
数百のヒスチジン−独立栄養Ｐｉｃｈｉａ形質転換細胞を、上述の通りに深底プレートで培養し、培養液上清の活性を、ラセミ体のマンデロニトリルを用いて９６穴プレートで測定した。その都度、個々の変異体の最も高い酵素活性を有するクローンを、振とうフラスコ試験のために選択した。培養液上清の酵素活性を、基質のマンデロニトリル（ＤＳＭ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、オーストリア、リンツ）を用いて測定した。
【００４２】
以下の突然変異を起こした：
Ａ１１１Ｇ、Ａ１１１Ｌ、Ａ１１１Ｖ、Ｆ７２Ａ、Ｌ３３１Ａ及びＬ３４３Ａ、並びに比較試験としてＶ３１７Ａ及びＶ３１７Ｇ。
【００４３】
部位特異的突然変異誘発のためのＰＣＲプライマー：
ｏＢＴ２９６６  ｏＰａＨＮＬ５Ａ１１１Ｇｆ：
５’−ＧＴＧＧＣＡＣＧＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣ−３’
ｏＢＴ２９６７  ｏＰａＨＮＬ５Ａ１１１Ｇｒ：
５’−ＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＣＧＣＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＧＣＣＡＣ−３’
ｏＢＴ３０８０  ｏＰａＨＮＬ５Ａ１１１Ｌｆ
５’−ＧＣＡＣＧＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣ−３’
ｏＢＴ３０８１  ｏＰａＨＮＬ５Ａ１１１Ｌｒ
５’−ＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＧＣＣＡＣ−３’
ｏＢＴ３０７８  ｏＰａＨＮＬ５Ａ１１１Ｖｆ
５’−ＧＴＧＧＣＡＣＧＡＣＣＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＡＧＡＧＣＴＡＡＣ−３’
ｏＢＴ３０７９  ｏＰａＨＮＬ５Ａ１１１Ｖｒ
５’−ＧＴＴＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＴＡＧＡＣＧＣＡＡＣＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＧＴＣＧＴＧＣＣＡＣ−３’
ｏＢＴ２９８３  ｏＰａＨＮＬ５Ｖ３１７（Ａ，Ｇ）ｆ：
５’−ＴＣＣＡＡＴＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＳＡＡＣＴＧＴＴＴＴＡＧＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＧ−３’
ｏＢＴ２９８４  ｏＰａＨＮＬ５Ｖ３１７（Ａ，Ｇ）ｒ：
５’−ＣＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＡＣＡＧＴＴＳＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＴＴＧＧ−３’
ｏＢＴ３０１７  ｏＰａＨＮＬ５Ｆ７２Ａｆ：
５’−ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＴＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧ−３’
ｏＢＴ３０１８  ｏＰａＨＮＬ５Ｆ７２Ａｒ：
５’−ＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＴＧ−３’
ｏＢＴ３０１９  ｏＰａＨＮＬ５Ｌ３４３Ａｆ：
５’−ＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＴＴＡＧＴＧＣＴＴＴＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＴＣＴＴＡＣＣＣＣＣＴＣ−３’
ｏＢＴ３０２０  ｏＰａＨＮＬ５Ｌ３４３Ａｒ：
５’−ＡＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣ−３’
ｏＢＴ３０２１  ｏＰａＨＮＬ５Ｌ３３１Ａｆ：
５’−ＡＧＴＧＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣ−３’
ｏＢＴ３０２２  ｏＰａＨＮＬ５Ｌ３３１Ａｒ
５’−ＧＧＡＡＡＡＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＣＡＣＴＴＣ−３’
Ｓ＝Ｇ又はＣ
【００４４】
実施例５：「コロニーＰＣＲ」による配列のチェック
Ｐｉｃｈｉａ形質転換の間又は株の選択の間に誤りが起こったかどうかをチェックするために、インテグレートされた突然変異ＨＮＬ５遺伝子をＰＣＲで増幅し、発生した突然変異の領域について配列決定を行った。
【００４５】
この目的で、単一コロニーを０．５ｍＬの水に懸濁し、９５℃で３０分間ボイルした。その後、この混合液を、卓上遠心機において１３５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。その上清の５μＬを突然変異ｈｎｌ５遺伝子のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。５０μＬ容量の完全混合液は、さらに、各０．２ｍＭのプライマーｏＢＴ２９０７及びｏＢＴ２９０８ａ、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×Ｈｏｔｓｔａｒ（キアゲン社）ＰＣＲ緩衝液及び２．５ＵのＨｏｔｓｔａｒＤＮＡポリメラーゼを含んだ。３段階ＰＣＲは、下記のステップの通りに行った：
９５℃で１５分間を１回、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間及び７２℃で２．５分間を３０サイクル、最後に７２℃で１０分間を１回。
ＤＮＡの配列決定のために十分な材料を得るために、増幅後、このＰＣＲ混合液の３μＬを、再増幅用の鋳型として使用した。反応条件は、最初の増幅の場合と同じであった。この再増幅のＰＣＲ産物は、Ｑｕｉｇｅｎ社のＱｉａｑｕｉｃｋ法により二度精製した後、配列決定に使用した。
【００４６】
ｏＢＴ２９０７：５’−ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ−３’
ｏＢＴ２９０８ａ：５’−ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ−３’
【００４７】
ＰａＨＮＬ５変異体を発現する形質転換体を分離し、突然変異領域をコロニーＰＣＲ法による配列決定によりチェックした。
【００４８】
表１は、変異体の各発現株の概要を示す。
【００４９】
【表１】
2006520201.tif 000002
【００５０】
実施例６：スイートアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）酵素変異体の精製及び特徴付け
各発現クローンを有する数種の振とうフラスコ培養を行うことにより、様々な基質を有するそれぞれの変異体の特異的活性を測定した。ザルトリウス社（ドイツ、ゲッティンゲン）の２０ｍＬビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）ＰＥＳ濃縮カラムを用いて、培養液上清を限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）により濃縮し、クロマトグラフィーで精製した。
【００５１】
精製前に、濃縮された培養液上清は、３０ｋＤａ限外濾過遠心分離モジュール（ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）、ザルトリウス社）の中で、結合バッファーＡ（２０ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ５．５）を用いた希釈と濃縮を反復することにより、低塩結合バッファーＡで平衡化し、アマシャムバイオサイエンスＵＫリミテッド（グレートブリテン、バッキンガムシャー州）のＡＫＴＡピュリファイア１０ＦＰＬＣシステムにおけるカラム容量１０ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＱＦＦ）陰イオン交換カラムで精製した。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の異種産生物由来の様々なＰａＨＮＬ５変異体は、以下の勾配プロファイルにより、溶出バッファーＢ（２０ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液＋１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）で溶出した：
洗浄ステップとして、１カラム体積が、すべての非結合タンパク質成分を洗い出すのに理想的であるとわかった。バッファーＢ（溶出バッファー：２０ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）の濃度は、０．５カラム体積で４％に上げ、その後、さらに１カラム体積で４８％に上げた。次のステップで、この場合、１１／２カラム体積を使用して、溶出バッファーＢ濃度を７０％に上げた。
最後に、その濃度は、１カラム体積で最大１００％に上げ、最終的に、さらに１カラム体積放置した（分画しない洗浄ステップ）。
クロマトグラムの評価によりタンパク質（ピーク位置により）を含むはずであるこれらのフラクションは、バイオラッド（カルフォルニア州、ハーキュリーズ）プロテインアッセイ（ブラッドフォード法）を用いてタンパク質含量が測定され、基質のマンデロニトリルを用いて酵素活性が測定された。最も高い活性を有する２〜３のフラクションをプールして、酵素の特徴を分析するのに使用した。バイオラッド（カルフォルニア州、ハーキュリーズ）プロテインアッセイ（ブラッドフォード）を用いて、タンパク質濃度を測定した。キャリブレーション線の作成に使用される標準品は、シグマ社の天然ＰａＨＮＬ（Ｍ−６７８２、Ｌｏｔ  ４１Ｈ４０１６）であった。
培養液上清を、クロスフロー濾過により〜２０倍に濃縮し、その後、クロマトグラフィーで精製した。精製した酵素から試料を得て、ゲル（プロテインゲルＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビスゲル  １ｍｍ×１７ウェル、インビトロジェン社）に直接ロードするか、又は〜５００ｎｇを、エンドグリコシダーゼＨ（＃Ｐ０７０２Ｌ、ＮＥＢ社）で（提供される手順に従って）脱グリコシル化した後、ロードした。使用した標準品は、インビトロジェン社（米国、カールズバッド）の「ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２  Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ」であった。
【００５２】
基質特異性を比較するために、バイオラッドプロテインアッセイ（カルフォルニア州、ハーキュリーズ）を用いて、精製酵素のタンパク質濃度及び培養上清のタンパク質含量を測定し、特異的活性を光度的にラセミ体マンデロニトリルと比較し、ＧＣにより２−クロロベンズアルデヒド、３−クロロベンズアルデヒド及び４−クロロベンズアルデヒドと比較した：
この目的のために、１５ｍｍｏｌの基質を２．１ｍＬのターシャリ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）に溶解させた。０．２５ｍｇの適当なＰａＨＮＬを、最終量が３．７ｍＬになるようにｐＨ３．４の５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／クエン酸緩衝液で希釈し、この緩衝液を再度、ｐＨ３．４に調節した後、２０ｍＬのガラスバイアル瓶の中でＭＴＢＥ中の基質と混合した。この溶液を１０℃に冷却し、シリンジでＨＣＮを１．２ｍＬ添加し、１０℃でマグネチックスタラーにより攪拌して、縣濁液を形成させた。様々な時間で試料を得て、ピリジン及びジクロロメタンの存在下で無水酢酸を用いて誘導体化させ、シクロデキストリンカラム（ＣＰ−Ｃｈｉｒａｓｉｌ−Ｄｅｘ  ＣＢ）においてＧＣで分析するか、又はＨＰＬＣで分析した。
【００５３】
【表２】
2006520201.tif 000003
ｎ．ｄ．  測定されず
ＷＴ：天然植物性のシグナル配列で発現されるＰａＨＮＬ５
αＷＴ：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα接合因子プレプロリーダー（ｐｒｅｐｒｏｌｅａｄｅｒ）、ＥＡＥＡ配列及びＬ１Ｑ変異を有するＰａＨＮＬ５
Ａ１１１Ｇ：付加Ａ１１１Ｇ変異を有するαＷＴ
Ｖ３１７Ｇ：付加Ｖ３１７Ｇ変異を有するαＷＴ（比較試験）
【００５４】
この測定により、基質の（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルを用いたＡ１１１Ｇ変異体の特異的活性が、組換え野生型ＷＴ及びＰａＨＮＬ５のαＷＴアイソザイムに関する活性より約３〜５倍高いことが明らかになった。３−クロロベンズアルデヒドにおける活性も、αＷＴよりもＡ１１１Ｇ変異体で高かった。
【００５５】
実施例７：変異体Ａ１１１Ｇの調製
パイロット変換に十分な量の酵素を、パイロット発酵において、改良クローンＰｉｃｈａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５  ｐＨＩＬＤＰａＨＮＬ５ａｌｐｈａ＿Ｌ１Ｑ、Ａ１１１Ｇ（＝ＢＴ２６２１）から調製した。
２５０ｍＬのＢＭＧ培地をそれぞれ含む（標準インビトロジェンプロトコルに従って）、８個のバッフル付きフラスコ（２Ｌワイドネック）に、細胞株ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）  ＧＳ１１５ｐＨＩＬＤＰａＨＮＬ５ａｌｐｈａ＿Ｌ１Ｑ、Ａ１１１Ｇの単一コロニーを接種し、２８℃で３６時間振とう（１２０ｒｐｍ）した。２０リットルに対応する量の試薬１〜９と脱イオン水で、全体重量を１５ｋｇにし、４０Ｌバイオリアクター（ＭＢＲ社、スイス、オフトリンゲン）に入れた。ｉｎ  ｓｉｔｕ滅菌を行い、滅菌注入ポンプを介して、２８％アンモニアで培地のｐＨをｐＨ５．０に調節した。その後、濾過滅菌した２００ｍＬの「微量元素溶液」（ビタミンＨ−ビオチンと共に）を、注入ボトルを介してバイオリアクターに入れた。発酵が終わるまで、２日ごとに、さらなる２００ｍＬの「微量元素溶液」を添加した。振とうフラスコでの前培養液１．４ｋｇを接種に用いた。発酵槽の初期重量は約１５ｋｇであった。運転温度が２８℃、通気速度が１０〜３０リットル通気／分、攪拌速度が３５０ｒｐｍと７００ｒｐｍの間であり、酸素分圧（ｐＯ２）は飽和濃度の１０％を超える値に維持した。２７時間後、このバイオマスは、細胞湿重量値が１２２．８ｇ／Ｌ、又は細胞乾燥重量（ＣＤＷ）が３０ｇ／Ｌまで増殖した。この時間を超えると、約７０ｇの滅菌グリセロールを１時間に少しずつ添加した。この増殖の直線位相時には、バイオマス濃度を６０時間でＣＤＷ１００ｇ／Ｌの域に到達することが可能であった。
その後、メタノールを添加して発現を誘導することにより第３の段階を始めた。この場合、培養ブロスのメタノール含有量を０．８〜１重量％の値に調節した。発酵中に酸素消費量が上昇するので、その都度、メタノール（０．８〜１重量パーセント）をあらためて添加した。約１２時間ごとに発酵槽から得た試料の培養液上清の活性を光度測定することにより、酵素活性の上昇を追跡した。２１０時間のメタノール誘導後、酵素活性の上昇は非常に小さくなり、４０００ｇで２０分間の遠心分離を二度行うことにより細胞を集め、培養液上清を回収した。遠心分離後の培養液上清の酵素活性は、３．３Ｕ／ｍＬ（ラセミ体マンデロニトリルを用いる標準的なＨＮＬアッセイ）であり、発酵槽１４．３ｋｇからの培養液上清約６．５リットルの産出量全体に対し、約２２０００Ｕの酵素が生産された。
【００５６】
０．２μクロスフロー濾過（ドイツ、ゲッティンゲンのザルトリウス社のＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ  Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０）により、残りの細胞材料から上清を精製した。ザルトリウス３０ｋＤａ  ５０ｃｍ２カットオフモジュールを用いたクロスフロー濾過で濃縮した。このようにして、シアノヒドリン合成におけるパイロット試験のために、２４．５Ｕ／ｍＬ及び５７Ｕ／ｍＬの酵素調製液を調製した。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は培養液上清に自身のタンパク質のいずれもほとんど分泌しないため、このようにして作成及び濃縮された酵素はまた、植物の酵素調製に比べて非常に純粋であった。
【００５７】
以下の試薬が、培養培地を調製するために使用された（リットル当たりの量）：
１．８５％  オルト−リン酸          ３５ｍＬ
２．ＣａＳＯ４                        ０．６８ｇ
３．Ｋ２ＳＯ４                        １８．８ｇ
４．ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              １３．４ｇ
５．ＫＯＨ                          ５．７ｇ
（試薬１から５は分析用品質）
【００５８】
６．グリセロール、工業用品質        ５０ｍＬ
７．脱イオン水、導電率５．５〜９．１μＳ／ｃｍ
８．消泡剤１０％  Ａｃｅｐｏｌ  ８３Ｅ（Ｃａｒｌ  Ｂｅｃｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ社、ドイツ、ハンブルグ）        １ｍＬ
９．２５％  アンモニア、工業用品質  ７０ｇ／Ｌ
【００５９】
微量元素及びビタミンＨ（すべて分析用品質の試薬）：
１０．ビオチン                      ０．８ｍｇ
１１．ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ            ２４．０ｍｇ
１２．ＫＩ                          ０．３２ｍｇ
１３．ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ              １２．０ｍｇ
１４．Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ        ０．２ｍｇ
１５．Ｈ３ＢＯ３                      ０．０８ｍｇ
１６．ＣｏＣｌ２                      ２．０ｍｇ
１７．ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ８０ｍｇ
１８．Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ    ２６０ｍｇ
【００６０】
実施例８：ベンズアルデヒド及び２−クロロベンズアルデヒドを用いた調製変換
リアクターで１５０ｍｍｏｌの基質を変換することにより、調製合成時の酵素特性を分析した。
１５０ｍＭの基質を２１ｍＬのＭＴＢＥで希釈又は溶解した。５ｍｇの「ＰａＨＮＬ５ａｌｐｈａ＿Ｌ１Ｑ、Ａ１１１Ｇ」酵素（Ａ１１１Ｇ変異体）を、容量３７．５ｍＬになるまで、ｐＨ３．４の５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／クエン酸で希釈し、１０％濃度のクエン酸でｐＨ３．４に調節した。この水相を有機相に添加し、１００ｍＬのＳｃｈｍｉｚｏ  ＫＰＧスタラーで５分間攪拌した。温度を１０℃で維持し、１時間、灌流ポンプを用いてＨＣＮを測定した。１０℃、９００ｒｐｍで反応物を攪拌した。試験のために、反応溶液を１４０ｍＬのＭＴＢＥで希釈し、５分間攪拌し、１０分後に相を分離させた。再度、水相をＭＴＢＥ４０ｍＬで抽出した。自然に相分離させた後に、有機相を集め、クエン酸で安定化させ、エバポレートした。上述の通りにＧＣ分析を行った。
７時間後、この変換で９５．７％のｅｅを含む９５．１％の２−クロロベンズアルデヒドシアノヒドリンが産生し、９９％を超える量のｅｅを含む９９％を超えるマンデロニトリルが産生した。
【００６１】
実施例９：低ｐＨにおける酵素安定性
市販の扁桃仁由来の天然ＰａＨＮＬの酵素試料（シグマ社）及びＡ１１１Ｇ変異体を１：７０に希釈した後に、ラセミ体マンデロニトリルを用いた標準的なＨＮＬアッセイにより２８０ｎｍにおける活性の光度測定において、約１００ｍＯＤの増加が期待されるまで、ｐＨ６．５の５０ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液で希釈した。この希釈液の１５０μＬを、適切にｐＨを調節しながら、９００μＬの０．１Ｍのリン酸緩衝液に移し（１：７希釈）、２２℃でインキュベーションした後の様々な時間に、この希釈液の１００μＬを活性測定に使用した（酵素溶液１００μＬ、ｐＨ５．０の１Ｍ  リン酸−クエン酸緩衝液７００μＬ、ｐＨ３．５の３ｍＭ  クエン酸−リン酸緩衝液中の６０ｍＭ  マンデロニトリル２００μＬ）。市販の扁桃仁由来の天然ＰａＨＮＬ（シグマ）と比較した場合における、ｐＨ２．６における変異体ＰａＨＮＬ５  ａｌｐｈａ＿Ｌ１Ｑ、Ａ１１１Ｇ（Ａ１１１Ｇ）のｐＨ安定性は、図１から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】変異体ＰａＨＮＬ５  ａｌｐｈａ＿Ｌ１Ｑ、Ａ１１１Ｇ（Ａ１１１Ｇ）が、市販の扁桃仁由来の天然ＰａＨＮＬに比べて低ｐＨで非常に良好な安定性を示した図である。
【図１】
2006520201.tif 000004
【配列表】
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【国際調査報告】
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2006520201.tif 000007
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