(57)【要約】構造Ｉを有する化合物は、細胞死（アポトーシス）を誘導するためおよび免疫抑制において有用である。構造Ｉにおいて、Ｒ１はＨもしくはＲであり、Ｒは、低級アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアレニルから選択されるか、または、Ｒ１はＲ２と一緒になってＯ（オキソ）であり；Ｒ２はＯＨであるか、または、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯ（オキソ）であり；ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６は、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、およびＣＲＯＨから選択され；Ｒ１、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも一つが、Ｒであり；かつＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの少なくとも一つが、ＣＨ２である。【化１】2006513209.tif 000018
2006513209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ｉを有する化合物：
【化１】
2006513209.tif 000015
であって、ここで：
Ｒ１はＨもしくはＲであり、Ｒは、低級のアルキル、アルケニル、アルキニル、およびアレニルから選択されるか、または、Ｒ１はＲ２と一緒になってＯ（オキソ）であり；
Ｒ２はＯＨであるか、または、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯ（オキソ）であり；
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６は、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、およびＣＲＯＨから選択され；
Ｒ１、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも一つが、Ｒであり；かつ
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの少なくとも一つが、ＣＨ２である、化合物。
【請求項２】
Ｒが、メチル、アリル、および２−プロピニルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒがメチルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１がＲ２と一緒になってオキソであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの一方がＣＲＯＨであり、そして他方がＣＨ２である、化合物。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＯＨであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの一方がＣＲＯＨであり、そして他方がＣＨ２である、化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＲであり、かつＲ２がＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６の各々がＣＨ２である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒがメチルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
免疫抑制に影響を与える方法であって、該方法が、そのような処置を必要とする被験体に、薬学的に受容可能なビヒクル中の、構造Ｉを有する化合物：
【化２】
2006513209.tif 000016
の有効量を投与する工程を包含し、ここで：
Ｒ１はＨもしくはＲであり、Ｒは、低級アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアレニルから選択されるか、または、Ｒ１はＲ２と一緒になってＯ（オキソ）であり；
Ｒ２はＯＨであるか、または、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯ（オキソ）であり；
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６は、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、およびＣＲＯＨから選択され；
Ｒ１、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも一つが、Ｒであり；かつ
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの少なくとも一つが、ＣＨ２である、方法。
【請求項１０】
細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、該方法が、該細胞に、構造Ｉを有する化合物：
【化３】
2006513209.tif 000017
の有効量を接触させる工程を包含し、ここで：
Ｒ１はＨもしくはＲであり、Ｒは、低級アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアレニルから選択されるか、または、Ｒ１はＲ２と一緒になってＯ（オキソ）であり；
Ｒ２はＯＨであるか、または、Ｒ１およびＲ２は一緒になってＯ（オキソ）であり；
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６は、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、およびＣＲＯＨから選択され；
Ｒ１、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも一つが、Ｒであり；かつ
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの少なくとも一つが、ＣＨ２である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫抑制剤、抗炎症剤および抗癌剤として有用な化合物に関する。
【０００２】
【表１】
2006513209.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
免疫抑制剤は、自己免疫疾患の処置、および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の処置を含む移植拒絶反応の処置もしくは防止において、広く使用されている。一般的な免疫抑制剤としては、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロホスファミド、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、ビンクリスチン、およびシクロスポリンＡが挙げられる。一般に、これらの薬物はいずれも完全に効果的というわけではなく、そしてほとんどは、重篤な毒性により限定される。例えば、シクロスポリンＡは、広く使用される薬剤であるが、腎臓に対して非常に毒性である。さらに、効果的な処置のために必要とされる用量は、種々の日和見感染侵入物に対する患者の感受性を上昇させ得る。
【０００４】
漢方植物体Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ（ＴＷ）由来の多くの化合物が、例えば、自己免疫疾患の処置において、および移植された骨髄細胞がレシピエントの細胞を攻撃する状態である対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の処置を含む、移植拒絶反応の処置もしくは防止において、免疫抑制活性を有するとして同定されている。例えば、共有に係る米国特許第６，１５０，５３９号（高い水溶性を有するトリプトライド（ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）プロドラッグ）、同第５，９６２，５１６号（免疫抑制化合物および免疫抑制方法）、同第５，８４３，４５２号（免疫療法組成物および免疫療法）、同第５，７５９，５５０号（異種移植片拒絶反応を抑制するための方法）、同第５，６６３，３３５号（免疫抑制化合物および免疫抑制方法）、ならびに同第５，６４８，３７６号（免疫抑制ジテルペン化合物）、ならびにそれらに引用される参考文献を参照。このような化合物はまた、抗癌活性を示すと報告されている。例えば、Ｋｕｐｃｈａｎら、１９７２年、１９７７年、ならびに同時係属中でかつ共有に係る、２００１年１月１９日に出願され、２００２年７月２５日に米国出願番号２００２／９９０５１として公開された米国出願番号０９／７６６，１５６を参照。これは本明細書中に参考として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
一つの局面において、本発明は、免疫抑制治療、抗炎症治療および抗癌治療のために有用な化合物を提供する。この化合物は、式Ｉ：
【０００６】
【化４】
2006513209.tif 000004
により示されるトリプトライドの誘導体であり、ここで、
Ｒ１はＨもしくはＲであり、Ｒは、低級のアルキル、アルケニル、アルキニル、およびアレニルから選択されるか、または、Ｒ１はＲ２と一緒になってＯ（オキソ）であり；
Ｒ２はＯＨであるか、または、Ｒ１と一緒になってＯ（オキソ）であり；
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６は、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、およびＣＲＯＨから選択され；
Ｒ１、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも一つが、Ｒであり；かつ
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの少なくとも一つが、ＣＨ２である。
【０００７】
選択される実施形態において、Ｒは、メチル、アリル、および２−プロピニルから選択され；一つの実施形態において、Ｒはメチルである。Ｃ２もしくはＣ１６が改変されたトリプトニド（ｔｒｉｐｔｏｎｉｄｅ）を含む一つの実施形態において、Ｒ１はＲ２と一緒になってオキソであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの一方がＣＲＯＨであり、そして他方がＣＨ２である。Ｃ２もしくはＣ１６が改変されたトリプトライドを含む別の実施形態において、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＯＨであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの一方がＣＲＯＨであり、そして他方がＣＨ２である。
【０００８】
Ｃ１４が改変されたトリプトライドを含むさらなる実施形態において、Ｒ１はＲであり、そしてＲ２はＯＨである。このような化合物はまた、Ｃ２もしくはＣ１６のいずれかを改変され得る；一つの実施形態において、これらの位置のいずれもが、改変されない；すなわち、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６の各々が、ＣＨ２である。Ｒがメチルである場合、この実施形態は、本明細書中でＰＧ６７０として表わされる化合物を含む。
【０００９】
別の局面において、本発明は、免疫抑制をもたらす方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする被験体に、薬学的に受容可能なビヒクル中の、上記に記載の任意の特定の実施形態も含め、上記に記載の構造Ｉを有する化合物の有効量を投与する工程を包含する。本発明はまた、細胞においてアポトーシスを誘導する方法を提供し、この方法は、細胞に、上記に記載の任意の特定の実施形態も含め、上記に記載の構造Ｉを有する化合物の有効量を接触させる工程により行われる。特に、この化合物は、本明細書中でＰＧ６７０として表わされる化合物であり得る。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の目的および性質は、添付の図面と合わせて以下の発明の詳細な説明を読む場合、より完全に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、別に示さなければ、以下の意味を有する。
【００１２】
「アルキル」とは、炭素および水素を含む、完全に飽和された非環式の一価の基をいい、これは、環式、分枝鎖もしくは直鎖であり得る。アルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、およびイソプロピルである。好ましくは、アルキル基は、１個〜８個の炭素原子を有する。「低級アルキル」とは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル、およびイソペンチルにより例示される、１個〜６個の炭素原子のアルキル基、代表的には１個〜４個の炭素原子のアルキル基をいう。
【００１３】
「アルケニル」とは、炭素および水素を含む、一価もしくは二価の不飽和基、好ましくは、一価の不飽和基をいい、これらは、環式、分枝鎖もしくは直鎖であり得る。好ましくは、アルケニル基は、１個〜８個の炭素原子を有する。「低級アルケニル」とは、１個〜６個、代表的には１個〜４個の炭素原子を有するアルケニル基をいう。
【００１４】
「アルキニル」とは、炭素および水素を含み、かつ少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する、一価もしくは二価の不飽和基、好ましくは一価の不飽和基をいう。好ましくは、アルキニル基は、１個〜８個の炭素原子を有する。「低級アルキニル」とは、１個〜６個、代表的には１個〜４個の炭素原子を有するアルキニル基をいう。
【００１５】
「アレニル」とは、−ＣＨ＝Ｃ＝ＣＨ２部分を含む置換基をいう。
【００１６】
用語「薬学的に受容可能な塩」とは、アルカリ金属陽イオンおよびアルカリ土類金属陽イオン（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、バリウムおよびカルシウム）；アンモニウム；もしくは有機陽イオン（例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウム、ビス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム、フェニルエチルベンジルアンモニウム、ジベンジルエチレンジアンモニウムなど）のような、有機陽イオンおよび無機陽イオンを有するカルボン酸塩を包含する。上記の用語により含まれる他の陽イオンとしては、プロカイン、キニーネおよびＮ−メチルグルコサミンのプロトン化形態、ならびにグリジン、オルニチン、ヒスチジン、フェニルグリジン、リジン、およびアルギニンのような塩基性アミノ酸のプロトン化形態が挙げられる。
【００１７】
この用語はまた、アミノ基のような塩基性基との標準の酸−塩基反応により形成され、有機酸もしくは無機酸由来の対イオンを有する塩も包含する。このような対イオンとしては、クロライド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、スクシネート、シトレート、ラクテート、マレエート、フマレート、パルミテート、コレート、グルタメート、グルタレート、タートレート、ステアレート、サリチレート、メタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ソルベート、ピクレート、ベンゾエート、シナメートなどが挙げられる。
【００１８】
本開示の目的のために、以下の番号付けスキームが、トリプトライドおよびトリプトライド誘導体のために使用される：
【００１９】
【化５】
2006513209.tif 000005
（ＩＩ．トリプトライド誘導体）
本発明の化合物は、本明細書中でさらに記載されるように、炭素求核試薬のカルボニル基への付加による、Ｃ２、Ｃ１４および／もしくはＣ１６のアルキル化の結果として得られる、トリプトライドの誘導体である。本発明の化合物は、トリプトライド、トリプジオライド（ｔｒｉｐｄｉｏｌｉｄｅ）もしくは１６−ヒドロキシトリプトライドから調製され得る。トリプトライドは、漢方植物体Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ（ＴＷ）の根の木質部もしくは他の公知の供給源から得られ得る。ＴＷ植物体は、中国の福建省および他の南部の省において見出される；ＴＷ植物体の材料は、通常、中国でもしくは米国の商業的な供給源を介して得られ得る。トリプトライド、トリプジオライドおよび１６−ヒドロキシトリプトライドを調製するための方法は、当該分野において公知であり、例えば、Ｋｕｐｃｈａｎら（１９７２、１９７７）；Ｌｉｐｓｋｙら（１９９４）；Ｐｕら（１９９０）；およびＭａら（１９９２）に記載されている。
【００２０】
本発明の化合物は、以下の式Ｉ：
【００２１】
【化６】
2006513209.tif 000006
により示され、ここで：
Ｒ１はＨもしくはＲであり、Ｒは、低級のアルキル、アルケニル、アルキニル、およびアレニルから選択されるか、または、Ｒ１はＲ２と一緒になってＯ（オキソ）であり；
Ｒ２はＯＨであるか、または、Ｒ１とＲ２とは一緒になってＯ（オキソ）であり；
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６は、ＣＨ２、ＣＨＯＨ、およびＣＲＯＨから選択され；
Ｒ１、Ｒ５およびＲ６のうちの少なくとも一つが、Ｒであり；かつ
ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの少なくとも一つが、ＣＨ２である。
【００２２】
選択される実施形態において、Ｒは、メチル、アリル、および２−プロピニルから選択される；一つの実施形態において、Ｒはメチルである。Ｃ２もしくはＣ１６が改変されたトリプトニドを含む一つの実施形態において、Ｒ１は、Ｒ２と一緒になってオキソであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの一方がＣＲＯＨであり、そして他方がＣＨ２である。Ｃ２もしくはＣ１６が改変されたトリプトライドを含む別の実施形態において、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＯＨであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６のうちの一方がＣＲＯＨであり、そして他方がＣＨ２である。
【００２３】
Ｃ１４が改変されたトリプトライドを含むさらなる実施形態において、Ｒ１はＲであり、そしてＲ２はＯＨである。このような化合物はまた、Ｃ２もしくはＣ１６のいずれかで改変され得る；一つの実施形態において、これらの部位のいずれも、改変されない；すなわち、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６の各々は、ＣＨ２である。Ｒがメチルである場合、この実施形態は、本明細書中でＰＧ６７０として表わされる化合物を含む。
【００２４】
好ましくは、ＣＲ３Ｒ５もしくはＣＲ４Ｒ６のいずれかが、ＣＨＯＨもしくはＣＲＯＨである場合、Ｃ２もしくはＣ１４の立体化学は、各々、ヒドロキシル基が、紙の平面の上に記載されるものである。
【００２５】
式Ｉの化合物は、公知の化合物であるトリプトライド、トリプジオライド、および１６−ヒドロキシトリプトライドから、一つ以上のヒドロキシル基のケト基もしくはアルデヒド基への酸化、それに続く有機リチウムハライド試薬もしくは有機マグネシウムハライド（グリニャール）試薬のような炭素求核試薬による反応によって、調製され得る。アルコールの選択的な酸化のために適切な酸化試薬および酸化プロセスの記載は、Ｍ．Ｈｕｄｌｉｃｋｙ、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＡＣＳ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  Ｓｅｒｉｅｓ  １８６、１９９０）、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ（第２版、Ｗｉｌｅｙ、１９９９）、もしくはＪ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、Ｗｉｌｅｙ、１９９２）のような参考文献中に提供される。強酸条件もしくは強塩基条件は、回避されるべきである。必要であれば、所望される生成物は、例えば、ＨＰＬＣを用いて、任意の副生成物から単離される。いくつかの例が以下に与えられる。
【００２６】
スキーム１において、トリプトライドのＣ１４での二級アルコールは、例えば、三酸化クロム−ピリジン錯体、ＣｒＯ２Ｃｌ２／アルミナ、もしくは匹敵する酸化試薬を用いて、（トリプトニドとして公知の）ケトンに酸化される。メチルリチウム（ＣＨ３Ｌｉ）による反応は、１４−Ｃ−メチルトリプトライドを与える。この化合物の調製および特徴付けは、実施例１にさらに記載される。
【００２７】
【化７】
2006513209.tif 000007
上記のスキーム１において、Ｃ１４での両方の立体化学が示され、そして以下のスキームにおいては、反応部位の立体化学は示されない。しかし、キラル中心が生成される反応（すなわち、Ｃ１４およびＣ２での付加）において、分子の「下の」付加の結果として生じる生成物（すなわち、スキーム１の左の生成物のような）が、通常、主生成物である。この生成物はまた、以下の実施例１にも示される。
【００２８】
スキーム２において、トリプジオライドの両方の二級アルコールが、上記に記載の酸化剤を用いて、ケトンに酸化される。アリルリチウム（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２Ｌｉ）との反応は、両方のケトンの反応によるジオール（ａ）、および障害の少ないケトンのみの反応の結果物であるケトール（ｂ）の両方を与える。
【００２９】
【化８】
2006513209.tif 000008
スキーム３において、トリプジオライドのＣ２での障害の少ないアルコールは、上記に記載されるような試薬の化学量論量を用いて、温和な条件下でケトンに酸化される。アリルリチウムとの反応は、Ｃ２での三級アルコールを与える。
【００３０】
【化９】
2006513209.tif 000009
スキーム４において、１６−ヒドロキシトリプトライドの二級アルコールおよび一級アルコールは、アルデヒド生成物をさらに酸化することのない試薬（例えば、ＤＭＳＯ、クロロクロム酸ピリジニウム（コーリー試薬）、もしくは硝酸セリウムアンモニウム）により酸化され、ケト−アルデヒド中間体を与える。この化合物は、２−プロピニルリチウム（ＣＨ≡ＣＣＨ２Ｌｉ）と反応して、ジオール（ｃ）および障害の少ないアルデヒドのみの反応の結果物であるケトール（ｄ）の両方を与える。
【００３１】
【化１０】
2006513209.tif 000010
スキーム５において、１６−ヒドロキシトリプトライドの一級アルコールのみが、例えば、ＲｕＣｌ２（ＰＰｈ３）３；（Ｍｅ３ＳｉＯ）２／触媒のＲｕＣｌ２（ＰＰｈ３）３；ＤＭＳＯ／ＣｌＣＯＣＯＣｌ／Ｅｔ３Ｎ；もしくはＤＭＳＯ／ピリミジン・ＳＯ３／ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（上記に引用されるＬａｒｏｃｋを参照）のような選択的酸化剤を用いて酸化される。２−プロピニルリチウムとの反応は、示されるようにジオールを与える。
【００３２】
【化１１】
2006513209.tif 000011
以下のスキーム６に示すように、有機金属２−プロピニル試薬との（この場合は、トリプトニドの）反応はまた、再配置されたアレニル生成物も生成し得る。
【００３３】
【化１２】
2006513209.tif 000012
本明細書中に記載される方法はまた、１４Ｃ含有炭素求核試薬を用いることにより、同位体標識された化合物の調製のためにも使用され得る。
【００３４】
（ＩＩＩ．治療組成物）
本発明のトリプトライド誘導体を含有する処方物は、錠剤、カプセル剤、散剤、徐放性処方物、液剤、懸濁剤、乳化剤、軟膏剤、ローション剤、もしくはエアロゾル剤のような、固体形態、半固体形態、凍結乾燥粉末形態、もしくは液体投与量形態を、好ましくは、正確な投与量の単純な投与のために適切な単位投与量形態において取り得る。組成物は、代表的に、従来の薬学的キャリアもしくは賦形剤を含有し、そしてさらに、他の医薬物質、キャリア、もしくは補助剤を含有し得る。
【００３５】
好ましくは、組成物は、約０．５重量％〜７５重量％が本発明の化合物であり、残りは、適切な薬学的賦形剤から構成される。経口投与のために、このような賦形剤としては、薬学的階級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。所望される場合は、組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、もしくは緩衝剤のような、少量の毒性のない補助的な物質も含有し得る。
【００３６】
組成物は、経口で、経皮的にもしくは例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、もしくは筋内注射のような非経口で、被験体に投与され得る。経口液体調製物での使用のために、組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、もしくはシロップとして調製され得、水もしくは通常の生理食塩水中での水和のために適切な、液体形態もしくは乾燥形態のいずれかで供給される。非経口投与のために、非経口投与のための注射可能な組成物は、代表的に、滅菌生理食塩水のような静脈内に適切な溶液中に、トリプトライド誘導体を含有する。
【００３７】
液体組成物は、例えば、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール、もしくはエタノールのような薬学的に受容可能なキャリア中への、トリプトライド誘導体（約０．５％〜約２０％）および必要に応じた薬学的補助剤の溶解もしくは分散により調製され、溶液もしくは懸濁液を形成し得る。本発明の化合物の高度な水溶性は、例えば、腹腔内注入による水溶液中での投与のために、それらを特に有利にする。水溶液が好ましいが、本発明に従う組成物はまた、脂質（例えば、トリグリセリド、リン脂質、もしくは「ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬＴＭ」のようなポリエトキシル化ヒマシ油）、リポソーム懸濁液、もしくは水性乳液における懸濁物としても処方され得る。
【００３８】
化合物はまた、好ましくは、呼吸可能な大きさの、固体もしくは液体のいずれかのエアロゾル粒子の形態で、吸入によっても投与され得る。このような粒子は、吸入に際して口および喉頭を通過し、そして気管支および肺の肺胞に入るために十分小さい。通常、約１μｍ〜１０μｍの大きさにわたる粒子、そして好ましくは、約５μｍより小さい大きさの粒子が、呼吸可能である。吸入のための液体組成物は、滅菌した発熱物質を含まない生理食塩水溶液もしくは滅菌した発熱物質を含まない水のような、水性のキャリア中に分散される、活性な物質を含有する。所望されるなら、組成物は、組成物の噴霧およびエアロゾル形成を補助するためのプロペラントと混合され得る。
【００３９】
このような投与量形態の調製のための方法は、公知であるか、もしくは当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、１９９５）参照。投与されるべき組成物は、被験体における免疫抑制もしくは標的とされた細胞におけるアポトーシスをもたらすための効果的な量で、ある量の選択された化合物を含有する。
【００４０】
例えば、Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａら（２０００）に記載されるように、薬学的物質の分配係数もしくはｌｏｇＰは、経口バイオアベイラビリティーを含め、種々の投与経路についてのその適合性に影響を与え得る。本明細書中に記載される化合物は、親化合物であるトリプトライドよりも高いｌｏｇＰの計算値を有し（表を参照）、このことは、これらの化合物を経口アベイラビリティーについて、より良い候補物とする（表に示される化合物は、Ｒ２がＯＨであり、ＣＲ３Ｒ５およびＣＲ４Ｒ６の両方がＣＨ２であり、そしてＲ１が示されたとおりである式Ｉの化合物である。上記に記載されるように、これらの化合物のＣ１４での立体化学は、その結果、ヒドロキシル基が紙の平面の上に記載されるものである）。
【００４１】
【表２】
2006513209.tif 000013
（ＩＶ．免疫調節処置および抗炎症処置）
免疫制御の異常は、広く種々の自己免疫疾患および慢性炎症疾患において存在することが示されており、これらとしては、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、炎症性腸疾患、胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、多発性硬化症ならびにクローン病、潰瘍性大腸炎、水疱性類天疱瘡、サルコイドーシス、乾癬、魚鱗癬、グレーヴズ眼症および喘息のような他の障害が挙げられる。これらの状態の各々の根本的な病因は、全く異なり得るが、これらは、共通して、種々の自己抗体および自己反応性リンパ球の出現を有する。このような自己反応性は、部分的には、正常な免疫系が作動する恒常性制御の損失に起因し得る。
【００４２】
同様に、骨髄移植もしくは器官移植に続いて、宿主のリンパ球は、外来組織の抗原を認識し、そして移植片拒絶反応を引き起こす抗体を産生し始める。
【００４３】
自己免疫プロセスもしくは拒絶反応プロセスの一つの最終的な結果は、炎症細胞およびそれらが放出する媒介物質により引き起こされる、組織破壊である。ＮＳＡＩＤのような抗炎症剤は、主に、これらの媒介物質の効果もしくは分泌を妨害することによって作用するが、この疾患の免疫的な根本を改変することはしない。一方、シクロホスファミドのような細胞傷害性物質は、正常応答および自己免疫応答の両方が遮断されるような非特異的な様式において作用する。実際、このような非特異的な免疫抑制剤により処置される患者は、彼らが自己免疫疾患により死亡するのと同じくらい、感染症によって死亡し得る。
【００４４】
本発明の組成物は、例えば、免疫抑制治療において、自己免疫疾患の処置、移植拒絶反応の防止、または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の処置もしくは防止においてと同様に、トリプトライドおよびそのプロドラッグおよび他の誘導体が有効を証明された適用において、有用である。例えば、本明細書中で参考として援用される、共有に係る米国特許第６，１５０，５３９号参照。トリプトライドおよび本誘導体はまた、外傷性炎症のような他の炎症状態の処置のために、および雄の生殖能力の低下において有用である。
【００４５】
この方法は、不適合なヒトのドナー由来の固形器官移植片、組織移植片、もしくは細胞移植片の拒絶反応を阻害し、それゆえ移植片の生存および機能、そしてレシピエントの生存を助長するために有用である。この使用としては、（心臓、腎臓および肝臓のような）固形器官移植片、（皮膚、腸、膵臓、生殖腺、骨、および軟骨のような）組織移植片、ならびに（膵臓、脳組織および神経組織、筋、皮膚、骨、軟骨ならびに肝臓に由来する細胞のような）細胞移植片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
この方法はまた、異種移植片（異種間の）の拒絶反応を阻害するため；すなわち、構成が天然の移植片であろうと、またはヒトの遺伝子、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドもしくは他の非天然の、外因性の分子を発現するように生物工学を施された（遺伝子操作された）移植片であろうと、または動物の天然の遺伝子、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチドもしくは他の正常に発現される分子の発現を欠如させるために生物工学を施された移植片であろうと、非ヒト動物由来の固形器官移植片、組織移植片、もしくは細胞移植片の拒絶反応の防止において有用である。本発明はまた、このような非ヒト動物由来の固形器官移植片、組織移植片、もしくは細胞移植片の生存を助長するための、上記に記載された組成物の使用も含む。
【００４７】
別の局面において、本発明は、適合もしくは非適合の骨髄、脾臓細胞、胎児組織、臍帯血、または動員された幹細胞もしくは別に収集された幹細胞のレシピエントへの移植の結果として生じる対宿主性移植片病の、処置もしくは防止の方法を含む。用量は、経口もしくは非経口で与えられて、好ましくは、０．２５〜２ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲、好ましくは０．５〜１ｍｇ／ｋｇ体重／日である。
【００４８】
自己免疫疾患または自己免疫症状の発現を有する疾患（例えば、アディソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、グレーヴズ病、ギヤン−バレー症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、原発性胆汁性肝硬変、慢性関節リウマチおよびブドウ膜炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、Ｉ型糖尿病、乾癬、および種々のアレルギー）の処置方法もまた、含まれる。自己免疫状態の処置において、患者は、周期に基づいて組成物を与えられる（例えば、症状を軽減し、そして患者の快適性を改善するために十分な投与量レベルで、一週間につき１〜２回）。慢性関節リウマチの処置のために、特に、組成物は、静脈内注射によりもしくは罹患した関節への直接の注射により、投与され得る。患者は、患者におけるこの疾患症状の発病後、数週間にわたって、少なくとも２４時間の繰り返される間隔で処置され得る。
【００４９】
インビボにおける化合物の免疫抑制活性は、当該分野において公知の確立された動物モデルの使用により評価され得る。このようなアッセイは、免疫抑制化合物の相対的な有効性を評価するため、そして免疫抑制処置のための適切な投与量を見積もるために使用され得る。これらのアッセイとしては、例えば、ＯｎｏおよびＬｉｎｄｓｅｙ（１９６９）により記載される、同種移植片についての良く特徴付けられたラットモデル系が挙げられ、この系において、移植された心臓は、同種異系のレシピエント動物の腹部大動脈血管に連結され、そして移植された心臓の生存率は、レシピエント動物におけるこの心臓の拍動能力により、測定される。レシピエント動物が異種のものである異種移植片モデルは、Ｗａｎｇ（１９９１）およびＭｕｒａｓｅ（１９９３）により記載される。ＧＶＨＤに対する有効性を評価するためのモデルは、正常Ｆ１マウスへの親の脾臓細胞の注射を含む；このマウスは、巨脾腫および免疫抑制により特徴付けられるＧＶＨＤ症候群を発達させる（Ｋｏｒｎｇｏｌｄ、１９７８；Ｇｌｅｉｃｈｍａｎｎ、１９８４）。単一細胞懸濁液が、個々の脾臓から調製され、そしてマイトジェン応答の程度を分析するために、コンカナバリンＡの存在下および非存在下で、マイクロウェル培養物が確立される。
【００５０】
移植拒絶反応における治療のために、この方法は、特に、心臓、腎臓、肝臓、細胞、および骨髄移植片の拒絶反応の処置のために意図され、そしてまた、ＧＶＨＤの処置においても使用され得る。この処置は、外科的移植手術法の直前もしくは直後のいずれかに、代表的に手術前後に開始され、そして毎日の投与レジメンで、少なくとも数週間の期間、急性移植拒絶反応のために継続される。処置期間の間、患者は、例えば、同種異系のリンパ球を含む混合リンパ球反応によって、もしくは移植組織の生体組織検査を行うことによって、免疫抑制レベルについて定期的に試験され得る。
【００５１】
さらに、この組成物は、移植片拒絶反応を防ぐために、もしくは後期移植片拒絶反応の急性エピソードの処置において、慢性的に投与され得る。上記のように、投与される用量は、好ましくは、一日あたり１〜２５ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、非経口投与にはより少ない量、そして経口投与にはより多い量が好ましい。それらの用量は、患者の応答、および処置の期間にわたる、患者の感染抵抗能力に依存して、適切に上昇もしくは減少され得る。
【００５２】
また、本発明の範囲内には、式Ｉの化合物および一つ以上の従来の免疫抑制剤を含む、組み合わせ治療もある。これらの本発明の範囲内の免疫抑制剤としては、ＩＭＵＲＥＫＴＭ（アザチオプリンナトリウム）、ブレキナール（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）ナトリウム（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ  ｓｏｄｉｕｍ）、ＳＰＡＮＩＤＩＮＴＭ（グスペリムス（ｇｕｓｐｅｒｉｍｕｓ）三塩酸塩、また、デオキシスパガリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）としても公知）、ミゾリビン（ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ）（また、ブレディニン（ｂｒｅｄｉｎｉｎ）としても公知）、ＣＥＬＬＣＥＰＴＴＭ（ミコフェノール酸モフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ））、ＮＥＯＲＡＬＴＭ（シクロスポリンＡ；商標ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥＴＭの下、異なる処方物としても市場に出ている）、ＰＲＯＧＲＡＦＴＭ（タクロリムス、ＦＫ−５０６としてもまた公知）、ＲＡＰＩＭＭＵＮＥＴＭ（シロリムス、また、ラパマイシンとしても公知）、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）（また、ＨＷＡ−４８６としても公知）、ＺＥＮＡＰＡＭＴＭ、プレドニゾロンおよびその誘導体のようなグルココルチコイド、オルソクローン（ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）（ＯＫＴ３）のような抗体、ならびにチモグロブリンのような抗胸腺細胞グロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。この化合物は、免疫抑制処置のための上記で考察したような別の免疫抑制薬物と一緒に、同時に投与された場合の増強剤として有用である。上記のような従来の免疫抑制薬物は、したがって、その化合物が単独で投与される場合よりも実質的に少ない量（例えば、標準用量の２０％〜５０％）で投与され得る。あるいは、トリプトライド誘導体および免疫抑制薬物は、単独で使用される薬物およびトリプトライド誘導体により得られる効果の合計から推測されるかもしくは得られる量よりも、結果として生じる免疫抑制が大きくなるような量で、投与される。代表的に、免疫抑制薬物および増強剤は、少なくとも２週間の期間にわたって定期的間隔で、投与される。
【００５３】
本発明の組成物および方法はまた、内因性症状発現および外因性症状発現の両方の、喘息のような炎症状態の処置にとっても有用である。喘息の処置のためには、組成物は、好ましくは吸入を介して投与されるが、任意の従来の投与経路も有用であり得る。この組成物およびこの方法はまた、他の炎症状態の処置のためにも有用であり得、これらとしては、外傷性炎症、ライム病における炎症、乾癬、慢性気管支炎（慢性感染性肺疾患）、慢性副鼻腔炎、敗血症関連急性呼吸促迫症候群、バーチェット病、肺性サルコイドーシス、天疱瘡、天疱瘡様炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００５４】
本発明の組成物はまた、従来の抗炎症薬物との組み合わせでも投与され得、薬物もしくは投与される薬物の量は、それ自体では、適切な炎症の抑制もしくは阻害を誘導する効果はない。
【００５５】
投与される用量は、好ましくは、一日あたり１〜２５ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であり、非経口投与にはより少ない量が好ましく、そして経口投与にはより多い量が好ましい。最適な投与量は、当該分野において公知の方法にしたがって、慣例的な実験により決定され得る。
【００５６】
（Ｖ．抗癌処置）
トリプトライド誘導体は、癌の処置において有効性が示されている。例えば、共有に係る米国特許第６，６２０，８４３号を参照（これは、本明細書中に参考として援用され、ＨＴ−２９ヒト結腸癌細胞株の腫瘍異種移植片を用いた研究において、腫瘍増殖の阻害における５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１と比較したトリプトライド誘導体の強い効力を記載する）。トリプトライド誘導体（１４−コハク酸トリプトライド）は、５−ＦＵおよびＣＰＴ−１１よりも有意に大きい程度まで、腫瘍の増殖を強力に阻害し、そして腫瘍の退行を誘導した。
【００５７】
本発明は、したがって、癌を処置するための上記に記載の組成物の使用を含み、これらの癌としては、（セルトリ細胞、生殖細胞、発達中のもしくはより成熟した精原細胞、精子細胞もしくは精母細胞および栄養細胞、卵巣の生殖細胞および他の細胞のような）生殖組織由来の細胞に関する癌、（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫のような）リンパ系もしくは免疫系に関する癌、造血系に関する癌、ならびに皮膚および胃腸管のような）上皮に関する癌、固形器官に関する癌、神経系に関する癌、ならびに筋骨格組織に関する癌が挙げられる。トリプトライド誘導体は、種々の癌細胞タイプの処置のために有用であり得、これらの癌としては、乳腫瘍、結腸腫瘍、小細胞肺腫瘍、大細胞肺腫瘍、前立腺腫瘍、悪性黒色腫、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、膵臓腫瘍、食道（ｅｓｏｐｈｏｇｅａｌ）腫瘍、胃腫瘍、卵巣腫瘍、頚部腫瘍またはリンパ腫の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。乳腫瘍、結腸腫瘍、肺腫瘍、および前立腺腫瘍の処置が、特に意図される。白血病の処置もまた、意図される。組成物は、上記に記載のような任意の従来の投与経路によって、癌および／もしくは白血病を患う患者に投与され得る。
【００５８】
この方法は、腫瘍の増殖の速度を緩めるため、腫瘍増殖を防ぐため、腫瘍の部分的な退行を誘導するため、および完全な消失点まで腫瘍の完全な退行を誘導するために有用である。この方法はまた、固形腫瘍由来の転移の増殖の防止においても有用である。
【００５９】
本発明の組成物はまた、単独の治療として、または被験体において抗癌効果を有することが設計されない、補助的な処置もしくは治療の処置と一緒に、投与され得る。この方法はまた、一つ以上の従来の抗癌薬物もしくは生物学的タンパク質薬剤との組み合わせで、本発明の組成物を投与する工程を包含し、薬物もしくは薬剤の量は、それ自体では、癌増殖の適切な抑制を誘導する効果はなく、組成物は、被験体において所望される抗癌効果を有する効果的な量で投与される。このような抗癌薬物としては、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、５−フルオロウラシル、ヒドロキシ尿素、ジェムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、パクリタキセル、タキソテール（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、およびビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）が挙げられる。抗癌生物学的タンパク質薬剤としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、他のＴＮＦ関連もしくはＴＲＡＩＬ関連リガンドおよび因子、インターフェロン、インターロイキン−２、他のインターロイキン、他のサイトカイン、ケモカイン、および因子、腫瘍関連分子もしくはレセプターの抗体（例えば、抗ＨＥＲ２抗体）、およびこれらの薬剤と反応もしくは結合する薬剤（例えば、レセプターのＴＮＦスーパーファミリーのメンバー、他のレセプター、レセプターアンタゴニスト、およびこれらの薬剤に特異的な抗体）が挙げられる。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、いかなる方法においても本発明を限定することを意図しない
（実施例１．１４−Ｃ−メチルトリプトライド（ＰＧ６７０）の調製）
【００６１】
【化１３】
2006513209.tif 000014
−７８℃のＴＨＦ（５ｍｌ）中のトリプトニドＰＧ４９２（６０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、０．４５ｍｌのメチルリチウム（エチルエーテル中１．４Ｍの溶液、０．６３ｍｍｏｌ、３．７当量）を窒素存在下で添加した。溶液を−７８℃で２時間４５分、そして続いて室温で２時間攪拌し、このとき出発物質がＴＬＣ上で消失した。酢酸（１ｍｌ）をゆっくりと添加した。溶液を続いて真空中で濃縮した。粗製生成物をジクロロメタン（３ｍｌ）に溶解し、そしてシリカゲルのパッドを通過させ、シリカゲルのパッドを続いて酢酸エチル（８０ｍｌ）中の５％メタノールで洗浄した。溶媒を除去した後、７８ｍｇの粗製生成物を得た。これをアセトニトリル（０．６ｍｌ）に溶解し、そしてろ過した。生成物混合物を、Ｅｃｏｎｏｓｉｌ  Ｃ１８（５μ）の１０×２５０ｍｍカラムおよびＡｌｌｔｉｍａ  Ｃ１８（５μ）のガードカラムカートリッジ（７．５×４．６ｍｍ）（どちらもＡｌｌｔｅｃｈから）を用いて、移動相にＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ  ４０／６０を用い、流速２．０ｍｌ／分でＨＰＬＣで分離した。保持時間３２．１３分の６番目のピークを収集し、そして真空中で濃縮した。生成物は、ｍ／ｚ  ３７４であった（７．９ｍｇ、収率：１２．６％）。
【００６２】
構造をＮＭＲにより証明した。Ｈ１ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝４．６８（２Ｈ，ｓ，１９−ＣＨ２）、３．９５（１Ｈ，ｄ，１１−ＣＨ）、３．５０（１Ｈ，ｄ，１２−ＣＨ）、３．４９（１Ｈ，ｓ，１４−ＯＨ）、３．３９（１Ｈ，ｄ，７−ＣＨ）、２．６９（１Ｈ，ｍ，５−ＣＨ）、２．４６（１Ｈ，ｍ，１５−ＣＨ）、２．３３（１Ｈ，ｍ，２−ＣＨｂ）、２．１２（１Ｈ，ｍ，６−ＣＨｂ）、１．９７（１Ｈ，ｍ，６−ＣＨａ）、１．５７（１Ｈ，ｄｄ，１−ＣＨｂ）、１．３８（１Ｈ，ｍ，２−ＣＨａ）、１．２２（１Ｈ，ｍ，１−ＣＨａ）、１．１４（３Ｈ，ｓ，１４−ＣＨ３もしくは２０−ＣＨ３）、１．０９（３Ｈ，ｄ，１７−ＣＨ３）、１．０８（３Ｈ，ｓ，２０−ＣＨ３もしくは１４−ＣＨ３）、０．８１（３Ｈ，ｄ，１６−ＣＨ３）ｐｐｍ。
【００６３】
（実施例２：アポトーシスアッセイ）
（Ａ．化合物のヒト血清とのインキュベーション）
プールされたヒト血清を、−８０℃にてアリコートに分けて保存した。１．５ｍｌ微量遠心管において、試験化合物を２０ｍＭとなるように、融解したヒト血清に添加し、そして水浴中、３７℃で４８時間インキュベートした。生物学的アッセイのための希釈まで、試験サンプルを氷上に置いた。コントロールは、ヒト血清ではなく、完全組織培養培地（５％熱不活性化ウシ胎児血清、１％ＨＥＰＥＳ、１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１％グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地）においてインキュベートされた化合物からなっていた。
【００６４】
（Ｂ．Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアポトーシスアッセイ）
（Ａ節において記載されるようにヒト血清においてインキュベートされた）試験サンプルを、完全組織培養培地中に希釈して１ｍＭにした。アリコートをマイクロカルチャープレート中に置き、そして連続的な希釈液を調製した結果、最終濃度は、片対数的に増加する２ｎＭ〜６，０００ｎＭの範囲を含んだ。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから得られた♯ＴＩＢ−１５２）の指数関数的に増殖する培養物由来の細胞を収集し、遠心により一度洗浄して完全組織培養培地に希釈し、そして１×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。１００μｌの容量のＪｕｒｋａｔ細胞（１×１０５細胞）を、１００μｌの希釈された化合物を含むウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベートした。
【００６５】
２４時間後、プレートを遠心して細胞をペレットにし、そして細胞をＰＢＳ中の２％熱不活性化ウシ胎児血清によって２回洗浄した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖアッセイ手順（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）に従って、各ウェルに５００μｌの結合緩衝液を添加した。次に、５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合体（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加し、続いて５分間、暗所でインキュベートした。いくつかのアッセイにおいて、壊死細胞を確認するために、ヨウ化プロピジウム（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）をこの段階で添加した。ウェルの内容物を個々に試験管に移し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてアポトーシスを分析した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合陽性の細胞は、アポトーシス細胞であると考えられ、そしてアポトーシス細胞のパーセントとしてデータを計算した。
【００６６】
データを、アポトーシス細胞のパーセントに対する血清中でインキュベートされた化合物の濃度としてプロットした。ＰＧ４９０（トリプトライド）および溶媒コントロールと比較したＰＧ６７０（１４−メチルトリプトライド）の結果を図１に与える。
【００６７】
（Ｃ．ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼアポトーシスアッセイ）
このアッセイにおいて、試験サンプルを、上記のＡ節に記載のように調製し、そしてＢ節に記載のように希釈する。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球細胞を、またもＢ節に記載のように添加し、そしてプレートを、３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベートする。２４時間後、プレートを遠心して細胞をペレットにし、そして細胞をＰＢＳにより洗浄する。細胞をホルムアルデヒド中で固定し、洗浄し、エタノール処理し、洗浄し、そして酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）およびフルオレセイン標識デオキシウリジン（ｄＵＴＰ）とともにインキュベートする。このプロセスは、アポトーシスのＤＮＡ断片化相の間にニックの入ったＤＮＡ分子の３’末端の標識を可能にする（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識；ＴＵＮＥＬ標識）。細胞を洗浄し、リボヌクレアーゼで処理し、洗浄し、そして無傷のアポトーシス細胞を区別するために、ヨウ化プロピジウムを含む培地に再懸濁する。アッセイウェルの内容物を、個々に試験管に移し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてアポトーシスレベルを分析する。Ｆｌ−ｄＵＴＰ陽性の細胞は、アポトーシス細胞であると考えられる。
【００６８】
（実施例３：ＩＬ−２産生アッセイ）
試験サンプルを、実施例２Ａに記載のように、ヒト血清中でインキュベートし、完全組織培養培地に希釈して１ｍＭにした。アリコートを、抗ＣＤ３抗体（Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ−２産生を刺激するために使用される）でコーティングされたマイクロカルチャープレート中に置き、そして連続的な希釈液を調製した結果、最終濃度は、対数的に増加する０．００１ｎＭ〜１０，０００ｎＭの範囲を含んだ。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから得られた♯ＴＩＢ−１５２）の指数関数的に増殖する培養物由来の細胞を収集し、遠心により一度洗浄して完全組織培養培地に希釈し、そして２×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。５０μｌの容量のＪｕｒｋａｔ細胞（１×１０５細胞）を、１００μｌの希釈された化合物を含むウェルに添加し、５０μｌのＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを３７℃で５％ＣＯ２インキュベーターにおいてインキュベートした。２４時間後、プレートを遠心して細胞をペレットにし、１５０μｌの上清を各ウェルから取り出し、そしてそのサンプルを−２０℃で保存した。保存された上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）、抗ＩＬ−２捕捉抗体に連結されたＬｕｍｉｎｅｘマイクロスフェア、および蛍光色素連結された抗ＩＬ−２検出抗体を用いてヒトＩＬ−２濃度について分析した。データは、ＩＬ−２のｎｇ／ｍｌとして表わされた。
【００６９】
データを、ＩＬ−２濃度に対する血清中でインキュベートされた化合物の濃度としてプロットした。ＰＧ４９０（トリプトライド）および溶媒コントロールと比較したＰＧ６７０（１４−メチルトリプトライド）の結果を図２に与える。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、トリプトライドと比較した、本発明の化合物（ＰＧ６７０）による、Ｊｕｒｋａｔ細胞における用量依存的なアポトーシスの誘導を示す（実施例２Ｂ）。
【図２】図２は、トリプトライドと比較した、本発明の化合物（ＰＧ６７０）による、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ−２産生の阻害を示す（実施例３）。
【図１】
2006513209.tif 000019
【図２】
2006513209.tif 000020
【国際調査報告】
2006513209.tif 000021