(57)【要約】抗原に免疫応答を生成するアデノウイルスベクターが、提供される。このベクターは、分泌性ポリペチドをコードしている転写単位を含み、このポリペチドは、ＣＤ４０リガンドの上流の腫瘍抗原の上流に分泌性シグナル配列を含み、このＣＤ４０リガンドは、ＣＤ４０Ｌを分泌性にする膜貫通ドメインの全てまたは実質的に全てを欠失している。また、有効量の本発明のベクターを投与することによって、腫瘍抗原を発現している細胞に対して免疫応答を生成する方法が、提供される。有効量の本発明のベクターを投与することによって、個人の腫瘍抗原を発現している癌に対して免疫応答を生成する方法が、更に提供される。また更に、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質をコードする、有効量の本発明のベクターを投与することによって、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）による感染に対して免疫を生成する方法が、提供される。生成される免疫は、長期間持続する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍抗原に対して免疫を生成するためのアデノウイルス発現ベクターであって、
前記ベクターは、ポリペチドをコードしている転写単位を含み、
前記ポリペチドは、アミノ末端から、分泌性シグナル配列、腫瘍抗原、およびＣＤ４０リガンドを含み、
前記腫瘍抗原は、ＣＤ４０リガンドと異なり、
前記ＣＤ４０リガンドは、ＣＤ４０Ｌを分泌性にしている膜貫通領域の全てまたは実質的に全てを欠失している、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項２】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記腫瘍抗原がヒト腫瘍抗原である、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項３】
請求項２記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質である、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項４】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記転写単位が前記腫瘍抗原および前記ＣＤ４０リガンドの間のリンカーをコードする、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項５】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ベクターが前記転写単位の転写を制御するヒトサイトメガロウイルスプロモータまたはエンハンサを含む、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項６】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ＣＤ４０リガンドがヒトＣＤ４０リガンドである、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項７】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ＣＤ４０リガンドが細胞質内ドメインを欠失している、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項８】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ベクターが前記膜貫通領域のいずれかの末端から６以下の残基を含むＣＤ４０Ｌをコードする、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項９】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ベクターがＣＤ４０リガンドの前記膜貫通領域をコードしない、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項１０】
請求項６記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ＣＤ４０リガンドが４７−２６１番目の残基を含む、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項１１】
請求項６記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ＣＤ４０リガンドが１−２３番目および４７−２６１番目の残基を含む、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１記載のアデノウイルス発現ベクターにおいて、
前記ベクターが正常なヒト細胞において、非−複製状態にされる、アデノウイルス発現ベクター。
【請求項１３】
腫瘍抗原を発現している細胞に対して個人の免疫応答を生成する方法であって、
前記個人に有効量の請求項１記載の前記アデノウイルス発現ベクターを投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法において、
前記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質である、方法。
【請求項１５】
請求項１３記載の方法において、
前記ＣＤ４０リガンドがヒトＣＤ４０リガンドである、方法。
【請求項１６】
請求項１３記載の方法において、
前記癌細胞が子宮頸癌細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、
前記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質である、方法。
【請求項１８】
請求項１３記載の方法において、
前記投与が繰り返される、方法。
【請求項１９】
請求項１３記載の方法において、
前記免疫応答が前記腫瘍関連抗原に対して細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１３記載の方法において、
前記ベクターは、投与後に細胞によって取り込まれ、次にこれは前記転写単位によってコードされる融合タンパク質を分泌する、方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、
前記融合タンパク質がＣＤ４０リガンド細胞外ドメインの相互作用によるホモトリマを形成する、方法。
【請求項２２】
腫瘍抗原を発現する癌を有する個人を治療する方法であって、
前記個人に有効量の請求項１記載の前記アデノウイルス発現ベクターを投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、
前記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質である、方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、
前記ＣＤ４０リガンドがヒトＣＤ４０リガンドである、方法。
【請求項２５】
請求項２２記載の方法において、
前記癌が子宮頸癌である、方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、
前記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスのＥ７タンパク質である、方法。
【請求項２７】
請求項２２記載の方法において、
前記投与が繰り返される、方法。
【請求項２８】
請求項２２記載の方法において、
前記免疫応答が前記腫瘍関連抗原に対して細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法。
【請求項２９】
請求項２２記載の方法において、
前記ベクターは、投与後に細胞によって取り込まれ、次にこれは前記転写単位によってコードされる融合タンパク質を分泌する、方法。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、
前記融合タンパク質がＣＤ４０リガンド細胞外ドメインの相互作用によるホモトリマを形成する、方法。
【請求項３１】
ヒト乳頭腫ウイルスによる感染に対して被検者の免疫を生成する方法であって、
前記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスの前記Ｅ６またはＥ７タンパク質である、有効量の請求項１記載の前記アデノウイルス発現ベクターを前記個人に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法において、
前記ＣＤ４０リガンドがヒトＣＤ４０リガンドである、方法。
【請求項３３】
請求項３１記載の方法において、
前記投与が繰り返される、方法。
【請求項３４】
請求項３１記載の方法において、
前記免疫応答がヒト乳頭腫ウイルスに対して細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ４０リガンドの分泌可能な形態に融合された抗原を発現するアデノウイルスベクターを用いて、抗原発現している細胞に対して免疫を獲得することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景の以下の説明は、単に本発明を理解する際に読者を手助けするために提供されるものであり、本発明に対する従来技術を記載または構成すると解する余地はない。
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化、それに続く関連抗原を有する抗原提示細胞のローディングは、癌細胞に対するＴ細胞依存性の免疫応答の生成において、必要なステップである。一旦活性化されて、腫瘍抗原をロードされると、Ｔ細胞に対して抗原（ａｇｓ）を提示するために、ＤＣは局部リンパ節（ＬＮ）に移動する。きわめて一般に、これらのＡＰＣは、腫瘍抗原を認識する能力があるＴ細胞クローンの最適の活性化および増大のために必要である表面活性化分子を不十分な量しか発現しない（１）。未成熟なＴ細胞に対する抗原（ａｇ）提示は、ＡＰＣの表面上での共刺激分子の発現がない場合には、Ｔ細胞の抗原反応不顕性につながる（２）。さらに、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の助けを伴わないＤＣによる交差提示も、局所のＬＮにおけるＡｇ  特異的なＴ細胞の末梢性欠損を引き起こす（３）。対照的に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の助けがある場合には、Ｔ細胞の交差を引き起こすためにＤＣはそれらの機能的な能力を変え、エフェクタＴ細胞のクローン増殖を引き起こす（４）。このＣＤ４＋  Ｔ細胞の助けは、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）相互作用に置き換えられてもよい（５）。ＣＤ４０Ｌは、３３ｋＤａのＩＩ型膜タンパク質であり、そして、ＴＣＲの活性化の後でＣＤ４＋  Ｔ細胞で一過性に発現される腫瘍壊死因子遺伝子ファミリのメンバーである（６）。
【０００４】
ＤＣが生体内で抗腫瘍免疫応答を発生させる能力を有することは、多数の動物の腫瘍モデルにおいて、実証されている（７，８）。しかしながら、ＤＣにより媒介される免疫の誘導は、大きな治療上のチャレンジを意味する。ＤＣを分離して、活性化するために用いられるこの方法は、資源集約的であって、通常の医療に適用することは難しい。加えて、Ｔ細胞を刺激するために第２のリンパ系器官にこれらのＤＣを引きつけるために、抗原提示細胞が適当な接着分子およびケモカインレセプタを発現することを確実にすることは難しい（９−１４）。
【発明の開示】
【０００５】
一つの態様では、本発明は、抗原に対して免疫を発生させるアデノウイルス発現ベクターを提供する。ベクターは、アミノ末端側から分泌シグナル配列、次に腫瘍抗原、次にＣＤ４０リガンドを含むポリペチドをコードしている転写単位を含み、ＣＤ４０リガンドは、膜貫通領域の全てまたは実質的に全てを欠落しており、ＣＤ４０リガンドは、分泌可能となっている。腫瘍抗原−ＣＤ４０リガンド融合タンパク質が、融合タンパク質が細胞から分泌されるようにする細胞区画を標的とするように、分泌シグナル配列は機能する。
【０００６】
一実施形態において、上記腫瘍抗原は、ヒト腫瘍抗原である。他の実施形態では、上記ヒト腫瘍抗原は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質である。
【０００７】
一部の実施形態において、上記転写単位は、腫瘍抗原およびＣＤ４０リガンド間のリンカーをコードする配列を含む。適切なリンカーは、長さおよび構成において、変化してもよい。
【０００８】
他の実施形態では、上記アデノウイルス発現ベクターは、以下を含む：転写単位の転写を制御するヒトサイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサ。
【０００９】
さらに他の実施例では、上記ＣＤ４０リガンドは、ヒトＣＤ４０リガンドである。
【００１０】
さらに別の実施形態では、機能的な膜貫通領域を欠いている上記ＣＤ４０リガンドは、上記膜貫通領域の１０％未満しか含んでいないか、または膜貫通領域を含まないものである。
【００１１】
別の態様においては、本発明は、上記腫瘍抗原をコードする上記発明に係るベクターを有効量投与することによって、腫瘍抗原を発現している細胞に対して個人の免疫応答を発生させる方法を提供する。
【００１２】
一実施形態において、上記腫瘍抗原は、ヒト腫瘍抗原である。他の実施形態では、上記ヒト腫瘍抗原は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質である。
【００１３】
さらに別の実施形態では、上記細胞は、癌細胞である。他の実施形態では、上記癌細胞は、子宮頸癌細胞である。
【００１４】
さらに他の実施形態では、上記方法によって、上記腫瘍関連抗原に対して細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔ細胞が生成される。他の実施形態では、上記ベクターは投与の後に細胞によって取り込まれ、次にその細胞は上記転写単位によってコードされる融合タンパク質を分泌する。
【００１５】
さらに他の態様では、本発明は、腫瘍抗原を発現する癌を有する個人を治療する方法を提供する。上記方法は、腫瘍抗原をコードする本発明に係る発現ベクターを有効量個人に投与するステップを含む。
【００１６】
一実施形態において、上記腫瘍抗原は、ヒト腫瘍抗原である。他の実施形態では、上記ヒト腫瘍抗原は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）のＥ７タンパク質である。
【００１７】
さらに別の実施形態では、上記細胞は、癌細胞である。他の実施形態では、上記癌細胞は、子宮頸癌細胞である。
【００１８】
さらに他の実施形態では、上記方法によって、上記腫瘍関連抗原に対して細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔ細胞が生成される。他の実施形態では、上記ベクターは投与の後に細胞によって取り込まれ、次にその細胞は上記転写単位によってコードされる融合タンパク質を分泌する。
【００１９】
更なる態様において、本発明は、上記腫瘍抗原がヒト乳頭腫ウイルスのＥ６またはＥ７タンパク質である本発明アデノウイルス発現ベクターの有効量を個人に投与するステップを含む、ヒト乳頭腫ウイルスによる感染症に対して被験者の中で免疫を発生させる方法を提供する。
【００２０】
上記方法において、上記ベクターは、好ましくは皮下に投与され、上記免疫応答を増進するように以降の時間に与えられてもよい。上記腫瘍抗原を発現している細胞に対する免疫は、長い持続性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ＤＣ活性化および腫瘍抗原ローディングを改良するために、上記膜貫通領域が削除されたＣＤ４０リガンドに融合した、ハイリスク型ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）由来の上記腫瘍性タンパク質Ｅ７の分泌可能な形態をコードしている組換え型アデノウイルスを用いた免疫化戦略が開発された。この構築物はＣＤ４０リガンドから細胞質内および膜貫通領域を削除することによって、分泌可能となるように設計された。そして、ＣＤ４０リガンドはＥ７をコードしているＤＮＡおよびシグナル配列をコードしているＤＮＡより下流に位置づけられた。
【００２２】
本願明細書において、用いられるように、「アデノウイルス発現ベクター」という用語は、そのゲノムに挿入されるポリペチドをコードする外来性ＤＮＡを含む任意のアデノウイルスベクターを指す。任意の欠陥のある必須遺伝子がトランスにおいて、提供される場合、ベクターは自己複製可能であり、パッケージ可能でなければならない。アデノウイルスベクターは、望ましくは、ウイルスＤＮＡの複製を維持するために必要な各々の末端反復の少なくとも一部（好ましくは上記完全なＩＴＲ配列の少なくとも９０％）およびウイルスキャプシドに上記ゲノムを格納するために必要なＤＮＡを含む。多くの適切なアデノウイルスベクターは、従来技術において、記載されている。すなわち、米国特許番号  ６，４４０，９４４である。複製欠陥のあるＥ１欠失ベクターおよび特別のパッケージング細胞系については、米国特許番号６，０４０，１７４を参照のこと。好適なアデノウイルス発現ベクターは、正常細胞において、複製欠陥があるものである。
【００２３】
上記アデノウイルス発現ベクターと関連して本願明細書において、用いられる「転写単位」という用語は、一本鎖の連続するメッセンジャーＲＮＡ鎖としてＲＮＡポリメラーゼにより転写され、転写の開始および終了のシグナルを含むある範囲のＤＮＡを意味する。例えば、本発明の転写単位は、５’から３’へと、分泌シグナル配列、ＨＰＶ由来の上記Ｅ７タンパク質、および自身の膜貫通領域を伴わないＣＤ４０リガンドをコードする核酸である。転写単位は、プロモータのような転写および／または翻訳発現調節要素および選択的に任意の上流または下流のエンハンサ要素と操作可能な結合をしている。有用なプロモータ／エンハンサは、上記サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型初期プロモータ／エンハンサである（米国特許番号５，８４９、５２２、および６，２１８、１４０を参照のこと）。
【００２４】
本願明細書において、用いる「分泌シグナル配列」（別名「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」）という用語は、ポリペチドのＮ末端で合成され、上記ポリペチドを小胞体に向かわせる、約２０〜３０のアミノ酸を含む短いペプチド配列（一般に疎水性であることが認められている）を指す。分泌シグナル配列は、通常、上記小胞体への上記ポリペチドの移行に応じて切断される。真核生物分泌シグナル配列は、上記アデノウイルス発現ベクターの上記外因性遺伝子産物の分泌を導く上で好ましい。上記の種々の適切な配列は、周知の技術であって、ヒト成長ホルモン、免疫グロブリンカッパ鎖、などの分泌シグナル配列を含む。
【００２５】
本願明細書において、用いられる「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）という用語は、腫瘍細胞に存在するタンパク質、胎児期生物の正常細胞に存在するタンパク質（腫瘍胎児性抗原）、選択された器官における発生後に存在するタンパク質、または腫瘍細胞の場合よりずっと低い濃度ではあるが多くの正常細胞に存在するタンパク質を指す。種々のＴＡＡは、既に説明されている。対照的に、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）（別名「腫瘍特異移植抗原」またはＴＳＴＡ）は、非腫瘍細胞に存在しないタンパク質を指す。感染しているウイルスが細胞を不死化させ、ウイルス抗原を発現させるようにした場合、ＴＳＡは通常発生する。ウイルスにより誘発されないＴＳＡは、Ｂ細胞リンパ腫上の免疫グロブリンまたはＴ細胞リンパ腫上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のイディオタイプであってもよい。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、ＴＳＡより一般的である。
【００２６】
ＴＡＡおよびＴＳＡのいずれも、本発明のアデノウイルス発現ベクターワクチンの免疫学的な標的であり得る。別途示されない限り、「腫瘍抗原」という用語は、本願明細書において、ＴＡＡおよびＴＳＡをひとまとめにして指すために用いられる。好適な腫瘍抗原は、ＨＰＶのＥ６またはＥ７タンパク質である。これらの抗原は、好ましくはＨＰＶ１６型由来である。
【００２７】
本願明細書において、アデノウイルスベクターの転写単位に関して用いた「リンカー」という用語は、腫瘍抗原のカルボキシ末端および（機能的な膜貫通領域を欠く）ＣＤ４０リガンドのアミノ末端の間の一つ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーの構成および長さは、周知の技術である方法に従って決定することができ、効力を試験することができる。リンカーは通常、約３〜約１５のアミノ酸長であり、好ましくは、約５〜約１０のアミノ酸長さであり、しかしながら、より長くまたはより短いリンカーが用いられてもよく、またはリンカーは完全に省かれてもよい。
【００２８】
本願明細書において、用いる「ＣＤ４０リガンド」という用語は、そのＮ末端で細胞外または細胞質内のドメイン、膜貫通領域、そのＣ末端で細胞外のドメインを有しているＩＩ型膜ポリペチドを指す。ＣＤ４０Ｌは、分子の腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであって、ＴＮＦ５という名称を持っている。特に明記しない限り、本願明細書において、完全長ＣＤ４０Ｌは「ＣＤ４０Ｌ」「ｗｔＣＤ４０Ｌ」または「ｗｔＴｍＣＤ４０Ｌ」として示される。本願明細書において、細胞質内ドメインが欠失したＣＤ４０Ｌの形態は「ΔＣｔＣＤ４０Ｌ」として示される。本願明細書において、膜貫通領域が欠失したＣＤ４０Ｌの形態は「ΔＴｍＣＤ４０」として示される。本願明細書において、細胞質内ドメインおよび膜貫通領域がともに欠失したＣＤ４０Ｌの形態は「ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ」として示される。マウスおよびヒト由来のＣＤ４０Ｌのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、周知の技術であって、例えば、米国特許番号５，９６２，４０６（アーミテージその他著）において、見つけることができる。
【００２９】
マウスのＣＤ４０Ｌ（ｍＣＤ４０Ｌ）は、長さの２６０のアミノ酸である。ｍＣＤ４０Ｌの細胞質内（ｃｔ）ドメインはおおまかに位置１から２２に及び、膜貫通領域はおおまかに位置２３から４６に及び、細胞外のドメインはおおまかに位置４７から２６０に及ぶ。
【００３０】
ヒトＣＤ４０Ｌ（ｈＣＤ４０Ｌ）は、長さの２６１のアミノ酸である。ｈＣＤ４０Ｌの細胞質内ドメインはおおまかに位置１から２２に及び、膜貫通領域はおおまかに位置２３から４６に及び、細胞外のドメインはおおまかに位置４７から２６１に及ぶ。
【００３１】
本願明細書において、用いられる「ＣＤ４０リガンドは、ＣＤ４０リガンドを分泌可能にしている膜貫通領域の全てまたは実質的に全てを欠落している」というフレーズは、細胞から分泌され得るＣＤ４０リガンドの組換型の形態を指す。長さの約２４のアミノ酸を含んでいるＣＤ４０Ｌの膜貫通領域は、細胞膜の中でＣＤ４０リガンドを係留するように機能する。膜貫通領域の全てが欠失したＣＤ４０Ｌは、残基２３−４６を欠いているＣＤ４０リガンドである。実質的に膜貫通領域の全てをはずしているＣＤ４０リガンドは、膜貫通領域の一端における配列の６残基以下、好ましくは膜貫通領域の一端における配列の約４残基以下、さらにより好ましくは膜貫通領域の一端における配列の約２残基以下、最も好ましくは膜貫通領域の一端における１残基以下を含むものである。このように、ＣＤ４０Ｌを分泌可能にしている膜貫通領域の実質的に全てを欠いているＣＤ４０Ｌは、ドメインの一端における配列の６残基以下しか含まないものである。たとえばＣＤ４０Ｌは、細胞外のドメインおよび場合によっては細胞質内ドメインに加えて、ＣＤ４０Ｌの膜貫通領域に位置づけられるアミノ酸４１−４６または２３−２８しか含まない。
【００３２】
機能的な膜貫通領域を欠いているＣＤ４０Ｌは、全てまたは一部の細胞質内ドメインを依然として含んでもよいと理解されるべきである。同様に、機能的な膜貫通領域を欠いているＣＤ４０Ｌは、細胞外のドメインの全てまたは実質部分を含んでもよい。
【００３３】
ここで使用しているように、本発明のアデノウイルスベクターは、腫瘍関連抗原に対する免疫を誘導するために、ワクチンとして投与することができる。薬学的に受け入れられるキャリアによって、適切であるように、ウイルスベクターは調製されてもよい。したがって、ウイルスベクターは、薬剤または医薬品組成物の製造において、用いられてもよい。本発明のウイルスベクターは、非経口投与の溶液または凍結乾燥粉末として調製されてもよい。粉末は、使用する前に好適な希釈液または他の薬学的に受け入れられるキャリアの添加によって、再構成されてもよい。液状製剤は、緩衝液処理を行われた、等張性の、水性の溶液であってもよい。粉末は、乾燥形態において、吹き付けられてもよい。好適な希釈剤の例は、通常の等張性の塩の水溶液、標準５％デキストロース水溶液、または緩衝液処理を行われた酢酸ナトリウムもしくはアンモニウム溶液である。上記の製剤は、特に非経口投与に好適であるが、内服のために使用されてもよく、または吸入法のための計量された投与量の吸入器または噴霧器に含まれてもよい。賦形剤（例えばポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、など）を加えることは、望ましいだろう。
【００３４】
あるいは、ウイルスベクターは、経口投与のために調製されてもよい。薬学的に許容できる固体または液体担体は、組成物を改良または安定化するために、またはウイルスベクターの調製を容易にするために加えられてもよい。固体担体は、澱粉、乳糖、硫酸カルシウム無水物、テラアルバ、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天もしくはゼラチンを含む。液体担体は、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、生理的食塩水及び水を含む。担体は、また、以下を含んでもよい：すなわち、確立された分離物質（例えばモノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアリン酸）を単独でまたはワックスと一緒に含んでもよい。固体担体の量は変化するが、好ましくは、投与単位につき約２０ｍｇ〜約１ｇの間にある。液体担体を用いる場合、製剤はシロップ、エリキシル、乳剤または水性または非水性懸濁剤の形態にされてもよい。
【００３５】
本発明のウイルスベクターは、他の医学的に有用な薬または生物学的因子を含むように調製されてもよい。ウイルスベクターは、同様に、疾患のために有用な他剤または生物学的因子の投与または発明化合物が標的とされるという状態との関連において、投与されてもよい。
【００３６】
本願明細書において、使用するように、「有効量」というフレーズは、その受容者の免疫応答を発生させるのに十分な高い濃度を実現するのに十分な投与量を指す。任意の特定の対象のための特定の効果的服用レベルは、治療されている疾患、疾患の重症度、特定化合物の活性、投与経路、ウイルスベクターの除去の率、治療の期間、ウイルスベクターと共に組み合わせてあるいは一緒に使用される薬、年齢、体重、性別、食事、およびその対象の公衆衛生、および医学および科学において、周知である類似の要因を含む種々の要因に左右される。「治療上有効量」を決定する際に考慮されるさまざまな一般の要件は、当業者に知られており、例えば、Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ，  ｅｄｓ．  ，  Ｇｏｏｄｍａｎ  Ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  ：  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  
Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  ｅｄ．  ，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０、  およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈｅｄ．  ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．  ，  １９９０に記載されている。アデノウイルスベクターの投与のために、投与ごとの粒子の範囲は、一般的に例えば約１×１０の７乗から１×１０の１１乗であり、好ましくは、１×１０の８乗から５×１０の１乗であり、さらにより好ましくは、５×１０の８乗から２×１０の１乗である。ウイルスベクターは、たとえば血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下などにおいて、非経口的に投与されてもよい。投与は、また、経口的でもよく、経鼻的でもよく、浣腸でもよく、経皮的でもよく、またはエアゾールによる吸入性でもよい。ウイルスベクターは、巨丸剤として投与されてもよく、またはゆっくりと注入されてもよい。ベクターは、好ましくは皮下に投与される。
【００３７】
細胞免疫反応の強力な刺激であり、ＨＰＶにより形質転換された組織から発生する腫瘍集団のすべての細胞に発現されることが示されたという理由から、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）から誘導されるＥ７タンパク質は例示的なＴＡＡに選ばれた。ＨＰＶは、皮膚および生殖器の種々の上皮性の病変を引き起こす可能性がある。生殖器のＨＰＶに関係のある病気は、世界の女性の間の癌死の第２の主因を構成する。これらは、性器いぼ、頸部上皮内の新生物形成（ＣＩＮ）および頸部癌を含む。一般に高度ＣＩＮおよび子宮頸癌と関連するＨＰＶの型は、ＨＰＶ１６型である。大多数の子宮頸癌は、非構造的なＨＰＶ１６に由来する遺伝子産物であるＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する。ＨＰＶにより誘発された頸部癌モデルにおいて、Ｅ６／Ｅ７腫瘍性タンパク質は悪性表現型の維持のために必要であり、それらの発現はＨＰＶ１６の形質転換能と関連がある（１５−１６）。従って、Ｅ６およびＥ７は、治療上のワクチン接種のために選択すべき標的を表す（１７−１９）。
【００３８】
本願明細書における結果は、このベクターの皮下注射が以下の結果につながることを示す。
１）  注射針路を取り囲んでいる細胞の局所感染、
２）  ベクターが注入された細胞からの１０日の期間にわたる、Ｅ７／ＣＤ４０Ｌのキメラの膜貫通領域を欠く融合タンパク質の分泌、
３）  ＡＰＣおよびＥ７の提示の活性化を導く、ＡＰＣへの融合タンパク質の結合、
４）  局部リンパ節に対する、ロードされ、活性化されたＡＰＣの移動、
および
５）腫瘍関連抗原を担持している細胞系統への、Ｔ細胞に依存する全身の免疫系の進化、これは１年を超える期間に及ぶ。
【００３９】
抗原提示細胞（樹状細胞）による腫瘍細胞の個々の集団に対して特異的な細胞障害性Ｔ細胞リンパ球の生成は、共刺激分子の発現の活性化に左右される。これが起こる可能性があるメカニズムのうちの１つは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞リンパ球の形質膜上のＣＤ４０リガンドを樹状細胞上のＣＤ４０レセプタに結合することである。この活性化後に、樹状細胞は、領域リンパ節に、または腫瘍関連抗原から誘導されるペプチドの提示が、腫瘍関連抗原を認識する能力があるＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球クローンの活性化および増大を誘発する脾臓に移動する。
【００４０】
腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原を認識することができ、これらの抗原を担持している腫瘍細胞を死滅に導く、上記のＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球の進化は、多くの要因により制限される。１つの要因は、腫瘍関連抗原の腫瘍細胞から抗原提示細胞への移動が低水準であることである。もう一つは、腫瘍細胞を認識して、死滅させる能力がある腫瘍抗原特異的なＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球の持続的な活性化および増大のために必要である抗原提示細胞上の共刺激分子を誘導できないことである。
【００４１】
抗原提示細胞上のＣＤ４０レセプタに結合する抗体は、抗原提示細胞の共刺激分子の発現を活性化できる。ＣＤ４０リガンド転写単位を担持するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ｗｔ  Ｔｍ  ＣＤ４０Ｌ）による抗原提示細胞（樹状細胞または腫瘍細胞それ自身のいずれか）の試験管内の感染は、同様に抗原提示細胞または腫瘍細胞（結晶）上の共刺激分子発現を活性化するために使用されてきた。これらの樹状細胞の腫瘍小結節への注射、または照射を受けたＡｄ−ｗｔ  Ｔｍ  ＣＤ４０Ｌに感染した腫瘍細胞の腫瘍小結節を担持する免疫能力のあるマウス宿主への注射は、腫瘍小結節の退縮および生存率の上昇につながり得る。
【００４２】
さらに、腫瘍抗原特異的なＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球の生体内での生成は、腫瘍抗原ペプチド断片との、または腫瘍細胞自体との、または腫瘍関連抗原をコードする転写単位を担持するアデノウイルスベクターとのインキュベーションによる腫瘍関連抗原を有する抗原提示細胞の試験管内の「ローディング」、そしてそれに続く抗原をロードされた抗原提示細胞の注射により行うことができる。
【００４３】
腫瘍抗原ＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球に依存する、腫瘍関連抗原に対する全身の免疫応答を発生させるより効率的な方法を開発するために、免疫担当性動物の皮下空間のタンパク質の持続的解放（抗原提示細胞において共刺激分子の発現を活性化することができ、同時に１０日の期間にわたり抗原提示細胞の細胞内領域に腫瘍関連抗原を分配することができる）が、腫瘍関連抗原を担持している腫瘍細胞に対してきわめて強力なＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球反応を導く可能性があると仮定した。
【００４４】
この仮説を検証するために選ばれた融合タンパク質転写単位は、ＣＤ４０リガンドのアミノ末端側に結合されている腫瘍関連抗原（ヒト乳頭腫ウイルスＥ７形質転換タンパク質）を具備していた。このタンパク質は細胞から分泌されるように設計されており、その細胞の中では、そのタンパク質は、ＣＤ４０リガンドの膜貫通および細胞質内ドメインを欠失させ、そしてヒト成長ホルモンのシグナルドメインを融合タンパク質遺伝子のＥ７腫瘍抗原部分のアミノ末端側に結合させることによって、作られている。腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンド融合タンパク質（Ａｄ  Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）のこの分泌形態をコードしている転写単位を担持したアデノウイルスベクターの皮下注射は、被検者の皮下空間でアデノウイルス感染細胞を生成するために選ばれた。
【００４５】
ベクターの皮下注射の部位の近くで感染している細胞は、最高１０−１４日（大部分のアデノウイルスベクター感染細胞が導入遺伝子のタンパク質生成物を生産する時間）の間、腫瘍抗原／ＣＤ４０リガンド分泌タンパク質を放出すると推測された。注射部位の感染細胞の近くの抗原提示細胞（例えばＤＣ）はＥ７腫瘍関連抗原を受け入れ、そのＥ７腫瘍関連抗原は、プロテオゾームにおいて、消化され、生じたＥ７ペプチドは、小胞体に移動し、ここでクラスＩ  ＭＨＣ分子と結合する。最終的には、ＤＣは、その表面において、クラスＩＭＨＣ分子の中で、Ｅ７腫瘍関連抗原を提示する。活性化され、腫瘍抗原をロードされた抗原提示細胞は、リンパ球を担持している付随的な器官（例えば局部リンパ節または脾臓）に移動する。腫瘍抗原／ＣＤ４０リガンド融合分泌タンパク質の２週間の持続的放出の間に、腫瘍関連抗原を担持した細胞を認識して死滅させる能力があるＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球は、活性化されて抗原をロードされた樹状細胞の存在により、リンパ節および脾臓において、増えるであろう。ベクター感染細胞からの持続的放出による腫瘍抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞の増大および刺激の持続的性質は、非−分泌性である腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンドを担持したベクターを使用して可能な場合より、規模の大きい免疫応答を生成すると考えられる。分泌可能な形態のＥ７／ＣＤ４０Ｌの放出の間起こる現象の概略は、図１に示される。融合タンパク質の恒常的な放出および局部リンパ節へのＥ７ペプチドを担持している活性化ＤＣのその結果としての持続的侵入は、Ｅ７単独またはＣＤ４０Ｌ単独を発現するベクターまたはＣＤ４０Ｌが分泌可能でないＥ７／ＣＤ４０リガンド転写を発現するベクターの注射より、強力なかつ永続的なＴ細胞に依存するＥ７陽性腫瘍細胞に対する全身の免疫応答を生成する、さらに効果的な生体内での方法を提供すると考えられる。
【００４６】
本願明細書に記載されている実験の結果は、これらの仮説を検証するために設計されており、全ての予測を確認した。分泌性の形態のＥ７腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンドタンパク質を担持する、複製能の無いアデノウイルスベクターの皮下注射は、Ｅ７腫瘍関連抗原を担持する癌細胞に対して、ＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球に依存するきわめて強くかつ長い耐久性のある全身の免疫応答を誘発した。実際、実験結果は、分泌性の形態の腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンド融合タンパク質を発現するベクターは、非分泌性の形態のＥ７腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンド融合タンパク質を発現するベクターの皮下注射より非常に強力である免疫応答を生成したことを示した。腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンド分泌性融合タンパク質をコードしているベクターの皮下注射が、Ｅ７腫瘍関連抗原またはＣＤ４０リガンド（分泌性または非−分泌性の）だけコードしている転写単位を担持するベクターの皮下注射後に生ずる場合より、非常に強力な免疫応答を生じることは、これらの実験結果から明白である。
【００４７】
さらに、融合タンパク質の局所的放出が抗原提示細胞の活性化、およびリンパ球を担持している付随的な器官に対するそれらの移動を生じることが示された。最終的に、本願明細書では、Ｅ７腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンド分泌性転写単位を担持しているアデノウイルスベクターの皮下注射により生成される免疫学的抵抗性は、腫瘍関連抗原を担持している細胞に特異的であり、そしてベクター注射の後に最高１年間の長い耐久性を有することが実証された。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、分泌される形態のＣＤ４０リガンドに腫瘍関連抗原を結合する本発明方法は、両方の抗原提示細胞を同時に活性化できるタンパク質を作成し、そして、抗原提示細胞または細胞障害性Ｔ細胞リンパ球の試験管内の生成にともなう浪費およびロジスティックな問題を避けつつ、生体内でそれらに抗原をロードすると考えられる。
【００４８】
第２の利点は、活性化および抗原ローディングのために、分泌された腫瘍関連抗原／ＣＤ４０リガンド融合タンパク質を使用することが、抗原提示細胞への選択的結合および抗原提示細胞の細胞内領域への抗原の輸送という結果になる可能性があるということである。これは、腫瘍関連抗原を発現している腫瘍細胞に対して強力な細胞障害性Ｔ細胞リンパ球反応を生成するために、抗原提示細胞の形質膜上で腫瘍関連ペプチドの充分な密度が実現されるように、抗原提示細胞としばしば一緒に存在する対象の細胞内領域に充分な腫瘍抗原を分配する課題を解決する。
【００４９】
第３の利点は、分泌されたタンパク質の中のＣＤ４０リガンドの存在が、抗原提示細胞上の共刺激抗原発現を活性化する可能性があるということであり、このようにして当初のＣＤ４  Ｔ細胞リンパ球の助けとは関係なく活性化を行うことができる。
【００５０】
ウイルス融合タンパク質転写単位の分泌性性質の第４の利点は、活性化および抗原をロードしている融合タンパク質が１０日の期間にわたり抗原提示細胞によって、占められる空間に持続的放出される可能性があるということである。これは、観察される免疫応答の強さおよびその持続性を部分的に説明しうる。
【００５１】
融合タンパク質の腫瘍関連抗原としてＨＰＶ  Ｅ７タンパク質を利用するという判断は、いくつかの要因によって、動機を与えられた。第１のものは、Ｅ７タンパク質が形質転換性を有し、ＨＰＶ悪性変換細胞の継続した増殖にとって重要であることが示されたということである。Ｅ７のこの性質は、集団の細胞の全てではないとしてもほとんどが抗原を担持することを保証する。さらに、腫瘍関連抗原としてのＤＮＡウイルス形質転換タンパク質の選択は、この実験を分泌性融合転写単位の値の検定に関して明確にするように計画された。ＨＰＶ  Ｅ７を本発明のベクターの腫瘍関連抗原として選択することの別の重要な理由は、ＨＰＶの感染している頸部上皮の感染および増殖を予防するためＥ７の能力を評価することである。そのようなベクターがＨＰＶ感染細胞に対して免疫応答を生成することができれば、そのような反応が生成される個人はヒト乳頭腫ウイルスの感染に対する免疫および抵抗性があるだろう。
【００５２】
ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染は、感染を除去するのに十分でない自然宿主免疫応答を誘発する。この１つの理由は、１００以上の遺伝子型のＨＰＶがあるということであり、その各々は、他のＨＰＶ遺伝子型に接触した個人によって、ウイルスが検出されることを免れさせるユニークなアミノ酸配列およびそれ故ユニークなエピトープを有しうる。第２の理由は、細胞免疫反応をＨＰＶ感染細胞に開始することができない少数の個人がいるということである。そのような個人は、頸部異形成におよび浸潤性子宮頸癌に至る慢性ＨＰＶ感染が生ずる人でありうる。さらに、ヒト子宮頸癌の６０％は、ＨＰＶ  １６遺伝子型による感染に関係がある。子宮頸癌の症例の９５％までは、ＨＰＶ感染に起因している。全世界の女性の間の癌死の第２の主因は、ＨＰＶに関連する悪性腫瘍である。世界の新興国において、ＨＰＶに関連する悪性腫瘍は、２５〜３５歳の間の女性の間で主要な死因に相当する。
【００５３】
ＨＰＶ感染に対する免疫を獲得するように、ＨＰＶ感染細胞に対する免疫応答を増幅することを目的として、いくつかの方法が試みられてきた。治療上のペプチド、およびタンパク質ベースのワクチン（１５）、ＤＮＡ（１６）、およびウイルスベクターベースのワクチン（１７）、改変された腫瘍細胞（１８）、および樹状細胞ベースのワクチン（１９）は、全て以前研究されて、動物モデルにおけるヒトＨＰＶに関連した腫瘍に対する免疫応答を生成することが報告されている。これらの過去の研究は、タンパク質によって、ロードされるＤＣ、腫瘍細胞にと融合したＤＣ、および腫瘍により誘導されるＲＮＡまたはウイルスベクターによって、形質導入されたＤＣを含め、ＤＣの種々の標本は、有効な抗腫瘍免疫を刺激できることを示した（２０、２１、２２）。現在のところ、ＭＡＲＴ−１遺伝子に変更を加えられたＤＣの試験管内でのＣＤ４０リガンド活性化は、ＣＤ８  Ｔ細胞リンパ球に媒介される、メラノーマ細胞に対する免疫を促進できる（２３）。ＣＤ４０リガンドを形質導入された腫瘍の注射は、確立したＭＣＡ２０５脳腫瘍細胞系列に対して、治療効果を示した（２４）。これらの研究は、抗原によって、ロードされ、同時に活性化されたＤＣが、強力な感染防御免疫を提供できることを示した。
【００５４】
組換型アデノウイルスベクターは、ＤＮＡワクチンのそれより高い遺伝子導入の効率を得る潜在的に優れた方法を提供する。腫瘍関連抗原をコードしているアデノウイルスベクターは、同様に、耐性が発生したものも含めて、そのような抗原に対して防御する細胞性および体液性の免疫を誘発できる。
【００５５】
複製欠陥があるアデノウイルスベクター（本願明細書においては、分泌性の形態のＣＤ４０リガンドに結合されている腫瘍抗原（Ｅ７）から構成される融合タンパク質の継続的な局部的な放出を生成するために用いられる）はＤＣの成熟を促進し、そして、有効な抗原特異性免疫の成熟を促進した。分泌性Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ構造が、Ｅ７陽腫瘍細胞に対する細胞免疫反応の効力を非常に増進することを実証された。Ａｄ  Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターの皮下注射は強力なＥ７特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞性免疫を誘発し、それはＥ７腫瘍関連抗原を発現する癌細胞の転移を妨げる可能性があった。
【００５６】
いかなる理論にも束縛されることを望まないが、腫瘍抗原／分泌性ＣＤ４０Ｌをコードしているベクターの注射後のＥ７特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞活性の観察された増進に対する考えうるメカニズムは、ベクター感染細胞からの融合タンパク質の皮下放出により生成される皮膚にのみ存在するＡＰＣの増進された活性化および移動である。抗原を投与することによる抗原によるＤＣのローディングの方式とは対照的に、Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌタンパク質の分泌物は、皮下空間の皮膚繊維芽細胞または他の細胞によって、局部的なＡＰＣをより効果的に活性化およびロードしているかもしれず、これが全身のＴ細胞免疫を活性化するのに有効であるかもしれない。
【００５７】
ＡｄＥ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターによって、潜在的に抗原特異性ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性の強化に影響を及ぼしているもう一つの要因は、全長Ｅ７タンパク質の腫瘍関連抗原としての使用である。一部の研究者は、ＨＰＶ細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびヘルパーＴリンパ球エピトープ、またはＨＰＶ１６株のＥ７ペプチドから誘導されるＣＴＬエピトープ単独のいずれかに基づくワクチンにより達成される免疫応答を比較した。結果は、Ｅ７特異的なＣＤ８＋反応は、ただＣＴＬエピトープだけに基づくワクチンに対するより、ＨＰＶエピトープおよびヘルパーＴｈエピトープに基づくワクチンに対する方が非常に大きかったことを示した（１５）。
【００５８】
要約すると、本所見は、（分泌性の形態のＣＤ４０Ｌである）ΔＴｍＣＤ４０Ｌを腫瘍関連抗原に結合させると、生体内で増強された抗原−特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性を導くことができることを示す。
【００５９】
以下の実施例は、本発明を例示するのに役立つ。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【００６０】
１．  アデノウイルス発現ベクターの構造
アデノウイルスベクターの転写単位（Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）は、シグナル分泌性配列およびその下流に、膜貫通または細胞質内ドメインのない細胞外のドメインを含んだＣＤ４０リガンドの断片にリンカーを介して結合されたＨＰＶ１６  型のＥ７遺伝子をコードした。Ｅ７は十分に小さかったために、生得の野生型ＣＤ４０リガンドの三量体のホモトリマ配列の自然な集合を崩壊させなかった。融合タンパク質は、Ｅ７タンパク質のアミノ末端側へのシグナル配列の付加によって、およびＣＤ４０リガンドの膜貫通および細胞質のドメインの削除によって、ベクター感染細胞から分泌されるように設計された。
【００６１】
転写単位は、アデノウイルスベクター主鎖のＥ１遺伝子領域に導入された。アデノウイルスベクター粒子がＨＥＫ  ２９３細胞において、生成されたあと、ベクターＤＮＡは塩化セシウム勾配遠心により精製された。アデノウイルスベクターのシグナルペプチドの存在は、制限酵素分析法によって、およびＤＮＡ塩基配列決定により確認された。
【００６２】
Ａｄ−Ｅ７−ΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−Ｅ７−ｗｔＴｍＣＤ４０Ｌ  Ａｄ−ΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−ｗｔＴｍＣＤ４０ＬおよびＡｄ−ＧＦＰ−ΔＴｍＣＤ４０Ｌを含んでいる異なる転写単位を有するアデノウイルスベクターが、構成された（材料および方法を参照のこと）（ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質を指す）。
【００６３】
２．  アデノウイルスベクター転写単位の無細胞発現
試験管内の細胞フリーな転写／翻訳系は、アデノウイルスベクターを含んでいる転写単位が正しい分子量のタンパク質をコードすることを確認するために使用された。表Ｉにまとめられた結果は、ＰＣＲにより生成された相補ＤＮＡをテンプレートとして使用して試験管内の転写／翻訳反応によって、できるタンパク質は、以下の分子量（Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは３２ｋＤａであり、Ｅ７−ｗｔＣＤ４０Ｌは３９ｋＤａであり、ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは２２ｋＤａである）によって、予想したように移動したことを示す。
【００６４】
３．  組換型アデノウイルスにより感染している細胞２９３のタンパク質のウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析は、異なるアデノウイルスベクターに感染した細胞において、発現されるタンパク質を評価するために使用された。表Ｉにまとめられる結果は、ベクター感染細胞において、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクター、Ａｄ−ｗｔＴｍＣＤ４０Ｌベクター、Ａｄ−ＧＦＰ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクター、Ａｄ−ｗｔＴｍＣＤ４０ＬおよびＡｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターから生産されるタンパク質の分子量は、それぞれ：３２ｋＤａ、３５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３９ｋＤａおよび２２ｋＤａであることを示す。これらのデータは、転写単位が構造的に正しいこと、およびベクターＤＮＡがいずれの場合においても転写されることができて、ウエスタンブロットにおいて、検出充分なレベルでタンパク質に翻訳され得ることを証明する。
表Ｉ：ウイルスベクター翻訳産物の分子量
ベクター                                細胞フリーな        ウェスタン
転写翻訳の          による
分子量              分子量
Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ      ３２ｋＤａ          ３２ｋＤａ
Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ                  ３９ｋＤａ          ３２ｋＤａ
Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ            ２２ｋＤａ          ２２ｋＤａ
Ａｄ−ＣＤ４０Ｌ                        ３７ｋＤａ          ３７ｋＤａ
Ａｄ−ＧＦＰ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ     測定せず           ５０ｋＤａ
【００６５】
４．  ＤＣの活性化の効率についてのアデノウイルス発現ベクターの比較
さまざまなアデノウイルスベクターは、ＤＣ細胞の活性化の効率について比較された。このために、結果として標的細胞（２９３細胞）の１００％近くが感染する状態の下で、骨髄由来のＤＣが、試験管内で各々のベクターに接触させられた。４８時間後に、細胞は、活性化標識ＣＤ８０およびＣＤ５４に対する抗体と反応して、蛍光活性化セルソータにおいて、評価された。分泌性ＣＤ４０Ｌ転写単位（Ｅ７／ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０Ｌ）を担持しているベクターに暴露されたＤＣ上のＣＤ８０、ＣＤ５４活性化標識に対して陽性の細胞のパーセンテージは、非−分泌性のＣＤ４０Ｌ転写単位（ｗｔＴｍＣＤ４０ＬまたはＥ７／ｗｔＴＭＣＤ４０Ｌ）、またはＴａｂｌｅＩＩ．に後述するようなＡｄ−ＧＦＰのベクターを有するベクターに暴露されたＤＣの場合と比べて、はるかに上だった。
表ＩＩ：ＤＣ上の活性化標識の発現
パーセント           パーセント
ＣＤ８０＋           ＣＤ５４＋
ＡｄＥ７−ｗｔＣＤ４０Ｌ         １５．２７％          １７．６６％
ＡｄＥ７−ＴｍＣＤ４０Ｌ         ４０．４％            ３８．６％
ＡｄＧＦＰ                       ４．６３％            ３．８７％
これらの結果は、分泌性ＣＤ４０Ｌ転写単位を有するアデノウイルスベクターが試験管内でＤＣを活性化する際に、非−分泌性転写単位を担持しているベクターより非常に効率的なことを示す。
【００６６】
５．  アデノウイルス発現ベクターによって、感染しているＤＣからのインターロイキン−１２のおよびＩＦＮ−γサイトカインの放出の比較
サイトカインであるインターロイキン−１２およびＩＦＮ−γの放出で測定されるＤＣの活性化は、さまざまなアデノウイルスベクター転写単位について決定された。
Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬおよびＡｄ−Ｅ７−ＣＤ４０ＬベクターにＤＣを暴露すると、インターロイキン−１２の産生の誘導のレベルにおける統計学的に有意の違いが、観察された（Ｐ＜０．０００１）。詳しくは、１８±４ｐｇ／２×１０の５乗ｃｅｌｌ／ｍｌ／２４ｈおよび  ８８±２９ｐｇ／２×１０の５乗ｃｅｌｌ／ｍｌ／４８ｈのインターロイキン−１２が、ＡｄＥ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターに暴露させられたＤＣにより産生され、一方で、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０ＬベクターにＤＣを暴露すると、０ｐｇ／２×ｌ０の５乗ｃｅｌｌ／ｍｌ／２４ｈおよび７ｐｇ／２×ｌ０ｃｅｌｌ／ｍｌ／４８ｈのインターロイキン−１２が産生された。
【００６７】
同様に、最初の２４時間にＡｄ−ＣＤ４０Ｌベクター（１８６±９ｐｇ）に暴露したＤＣと比較して、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクター（３３５の±２９ｐｇ）に暴露したＤＣにより放出されるＩＦＮ−γの量には、統計学的に有意の違いがあった（Ｐ＜０．０００１）。しかしながら、４８時間目では、分泌性または非−分泌性Ｅ７／ＣＤ４０Ｌ転写単位を含んでいるベクターに暴露されたＤＣにより生産されるインターロイキン−１２の水準の間に有意差はなかった。
【００６８】
これらのデータは、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターが、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌベクターまたは他の対照ベクターよりも、ＤＣからのサイトカインの放出を誘発する効率が高いことを示す。さらに、分泌された腫瘍抗原／ＣＤ４０リガンド複合体は、サイトカイン放出を生じさせるために、樹状細胞上のＣＤ４０レセプタと関わるはずであるため、これらの結果は、Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ融合タンパク質が、そのＣ末端側で機能する三量体分子を形成してＣＤ４０レセプタと関わることを示唆する。
【００６９】
６．  アデノウイルス発現ベクターにより生じた癌免疫の判定
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥ７陽性のＴＣ−１細胞系統の定着の防止のためのＡｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターの有効性を評価するために、１×１０の８乗のプラーク形成単位の各々のベクターが、マウスに皮下注射された。７日後に、同じベクターのリピート（ブースト）投与量が、与えられた。最後のワクチン接種の１週後に、５×１０の５乗のＴＣ−１細胞は、ベクター注射部位とは異なる部位において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背中の皮下に注射された。Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクター注射後、全てのマウスは、腫瘍チャレンジ後の１０８日目で腫瘍フリーであった。これに対して、Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、  Ａｄ−ＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌによる注射の後、全ての（５／５）マウスは、腫瘍チャレンジの後の１５日以内に腫瘍を生じ、４２日目に全て死んでしまった。
【００７０】
腫瘍成長の抑制に関係するエフェクター細胞の類型を特徴づけるために、マウスは、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌによるワクチン接種の前に、抗体処置によって、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を枯渇させられた。抗体処置は、Ｔ細胞部分集合の厳密な枯渇を保証するために、ＴＣ−１チャレンジの後でさえ続けた。ＴＣ−１腫瘍がＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇させられたマウスにおいて、成長することが観察された。このことは、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の存在がＡｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌにより誘発される抗癌効果にとって重要なことを示唆する。
【００７１】
７．  アデノウイルス発現ベクターにより発現される融合タンパク質のＤＣ結合
ベクター注射の部位の近傍領域において、分泌性Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌタンパク質がＤＣに結合するかどうか調べるために、図１のモデルのように予測した上で、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターの皮内注射の部位の皮膚は切断され、これらの切片をＣＤ４０Ｌ、ＤＣ標識ＣＤ８０およびＭＨＣ−ＩＩに対する抗体で二重染色した。二重染色の広範囲にわたる分布は、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬおよびＡｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターによって、ワクチン接種をされたマウス由来の表皮において、観察された。これらの結果は、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌの注射後における、ＤＣの表面への可溶性Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌタンパク質の結合を示した。対照的に、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０ＬおよびＡｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌベクターの注射後に、ワクチン接種をされたマウスにおいて、ベクター注射の３日後には、表皮にはほんの少数の陽性細胞だけしか観察されなかった。これらの結果は、分泌性形態のＥ７／ＣＤ４０Ｌを担持しているベクターの注射は、シグナルペプチドを含まず膜貫通領域を有するＥ７／ＣＤ４０Ｌタンパク質の場合より、ＤＣに結合するタンパク質を生成する際の効率が非常に優れていることを示す。分泌された形態のタンパク質をコードするＥ７／ΔＴｍＣＤ４０Ｌ転写単位を担持しているベクターを使用することにより、感染したＤＣからずっとより大きい集団のＤＣへのベクターの影響が増幅するように見える。結果は、分泌性形態のＥ７／ＣＤ４０Ｌタンパク質を担持しているベクターの注射が、非−分泌性形態のこのタンパク質を担持しているベクターの注射に比べて、Ｅ７によって、ロードされる活性化ＤＣの非常に高い水準を生成することを示唆する。この予測は、次の切片において、直接調べられた。
【００７２】
８．  アデノウイルス発現ベクターを使用しているワクチン接種によって、誘導した試験管内および生体内でのＤＣの移動の評価
ＣＤ４０レセプタに対するＣＤ４０リガンドの結合、腫瘍抗原／ＣＤ４０リガンド−ＣＤ４０受容体複合体の内部移行、およびそれ以降の腫瘍抗原ペプチドの消化および処理の後に、ＤＣは、付随的なリンパ系器官−局部リンパ節に移動して成熟したＤＣになる。その場所において、活性化／抗原ロードされたＤＣは、腫瘍関連抗原ペプチドを提示することができて、ナイーブＣＤ４ヘルパーＴ細胞を刺激することができて、腫瘍関連抗原を担持する癌細胞に対して選択的に毒性であるＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）を増幅できる。
【００７３】
ＡｄＥ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターの注射が、生体内で局部リンパ節へのＤＣのそのような移動を誘発したかどうか調べるために、骨髄細胞から試験管内で誘導されたＤＣは、超生体染料ＣＦＳＡによって、ラベルされて、それから、１００％の感染性を引き起こす条件（１００  ＭＯＩ）の下で、ベクターＡｄ−Ｅ７−ＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬおよびＡｄ−ＣＤ４０Ｌに暴露された。染料ロードされた感染したＤＣは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に注射された。これらの注射の３日後に、マウスは殺され、そして、いずれの側の腋窩リンパ節も収穫されて、染料ロードされたＤＣの存在を調査した。分泌性Ｅ７／ＣＤ４０Ｌ転写単位を担持しているＣＦＤＡ  ＳＥ染色されたＤＣは、局部リンパ節において、観察された、一方、Ｅ７／ＣＤ４０Ｌ転写単位を担持しているＣＦＤＡ  ＳＥ染色されたＤＣは、局部リンパ節において、観察されなかった。
【００７４】
９．  アデノウイルス発現ベクターの以下の投与により誘発される免疫応答の評価
ＣＤ８＋  Ｔ細胞リンパ球は、感染性または腫瘍細胞に対する防御免疫応答に関係している。Ｅ７特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞が、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬベクターによるＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下注射により誘発されたかどうか検討された。ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答は、細胞毒性アッセイ、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを利用して、抗原特異性ＣＴＬの検出を用いて評価された。
【００７５】
マウスは、以下のベクターを有する皮下注射を２回投与された：
（１）  Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、
（２）  Ａｄ−ＣＤ４０Ｌ、
（３）  Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ、
（４）  Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、および
（５）  ネガティブコントロール。
ベクター注入されたマウス由来の脾臓細胞は脾臓細胞１に対してＴＣ−１細胞２５の比率で、４８時間、ＴＣ−１細胞へ露出することにより刺激された。再刺激された脾臓細胞は、それから、インターフェロンγまたはインターロイキン−４のいずれかに対する抗体で被覆された９６セルのニトロセルロースフィルタープレートにおいて、平板培養された。食塩水によるウェルの洗浄後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイが実施された。ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、分泌性Ｅ７／ＣＤ４０Ｌタンパク質を担持しているベクターの皮下注射が、非−分泌性Ｅ７／ＣＤ４０Ｌ転写単位または他の対照ベクターを担持しているベクターの注射後の場合より大きな程度まで、脾臓のＩＦＮ−γによって検出可能なＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬを有意に増やすことを示した。同様に、Ｔ１−ｔｙｐｅサイトカインＩＦＮ−γを生産している細胞の頻度（１１７±１０．６１）は、Ｔｈ２サイトカイン、例えばインターロイキン−４を分泌できる脾細胞の頻度（２２．３±３．６８）より有意に高かった。これらのデータは、Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターワクチン接種がＴｈ２免疫応答よりむしろＴｈ１を刺激することを示す。
【００７６】
Ｅ７抗原を担持している癌細胞に対して特異的に毒性を有するＣＤ８  Ｔ細胞リンパ球エフェクタ細胞が、分泌性Ｅ７／ＣＤ４０Ｌベクターを担持しているベクターのＣ５７ＢＬ／６マウスへの注射後に生成されたかどうかを決定するために、ベクターの皮下注射を２回投与された動物から得られた脾細胞は、再刺激のために５日間、マイトマイシンＣ処理されたＴＣ−１細胞と一緒に、試験管内でインキューベートされた。再刺激されたエフェクタ細胞は、４時間、ＴＣ−１または対照標的細胞と一緒に混合され、ＬＤＨの放出が測定された。Ａｄ−Ｅ７−ΔＴｍ  ＣＤ４０Ｌベクターを注射されたマウスからの脾細胞がＴＣ−１標的細胞の９０％を溶解したことが観察された。外見上わかる細胞溶解は、Ｅ７抗原を担持しない、関連性はないが同系のＥＬ−４細胞について観察されなかった。ＴＣ−１に対する細胞毒性の水準は、Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌベクターが注射されたマウスから採取された脾細胞を用いた場合に、あらかじめＡｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌベクターを注射したマウス由来の脾細胞の場合よりも高かった。
【００７７】
１０．  材料および方法
ａ）マウス
６から８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｈａｒｌａｎから購入された。
【００７８】
ｂ）細胞系統
Ｃ５７ＢＬ／６と同系のＴＣ−１の腫瘍は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７遺伝子によって、不死化されて、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子（２５）によって、形質転換された。ＴＣ−１は、低水準のＥ６およびＥ７を発現し、腫瘍の発生性が高い。１０％の二酸化炭素と一緒に、３７℃で、ＴＣ−１は、１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００  Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ナトリウムピルベート、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ  １６４０において、成長させた。
【００７９】
ｃ）組換型アデノウイルスの生産
ヒト成長ホルモン遺伝子由来のシグナルペプチドをコードしているＤＮＡ、その下流に完全長の１６型のＨＰＶのＥ７タンパク質をコードしているＤＮＡ、その下流にΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌを含んだ転写単位が生成された。ヒト成長ホルモンシグナル配列ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（シングルレターアミノ酸コード）（配列番号：１）をコードしているＤＮＡは、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＮｏｔｌ突端を有する全長２６アミノ酸のヒト成長ホルモン配列を生成するために、リン酸化されたオリゴヌクレオチド（配列番号：２および３）をアニールすることにより調製された。
成長ホルモンシグナル上方の鎖（コード配列は小文字で示す）：
５’−ＧＡＴＣＴ  ＣＣＡＣＣ  ａｔｇ  ｇｃｔ  ａｃａ  ｇｇｃ  ｔｃｃ  ｃ
ｇｇ  ａｃｇ  ｔｃｃ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ｃｔｇ  ｇｃｔ  ｔｔｔ  ｇｇｃ  ｃｔｇ  ｃｔｃ  ｔｇｃ  ｃｔｇ  ｃｃｃ  ｔｇｇ  ｃｔｔ  ｃａａ  ｇａｇ  ｇｇｃ  ａｇｔ    ｇｃｃ  ＧＧＣ  −３’  （配列番号：２）
成長ホルモンシグナル下方の鎖：
３’−Ａ  ＧＧＴＧＧ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＣＣＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  Ｔ
ＧＣ  ＡＧＧ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＡＡＡ  ＣＣＧ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＧＡＣ  ＧＧＧ  ＡＣＣ  ＧＡＡ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＣＧＧ  ＣＣＧＣＣＧＧ  −５’  （配列番号：３）
【００８０】
合成ヒト成長ホルモンシグナル配列は、上記の上下のオリゴ鎖をアニールすることにより調製された。オリゴは、５０μｌ  Ｈ2０（約３ｍｇ／ｍｌ）に溶かされた。各々１μｌのオリゴ（上下の鎖）は、４８μｌアニーリングバッファ（１００ｍＭの酢酸カリウム、３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．４および２ｍＭのＭｇ−酢酸塩）に加えられ、９５°Ｃで４分、７０°Ｃで１０分インキューベートし、約４°Ｃまでゆっくりと冷やされた。アニールされたＤＮＡは、通常の条件下でＴ４  ＰＮＫ（ポリヌクレオチドキナーゼ）を用いてリン酸化された。
【００８１】
Ｂｇｌ  ＩＩおよびＮｏｔ  Ｉの突端を有するヒト成長ホルモンシグナル配列が、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ７−Ｃｔ  ＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列を有さない）に、Ｂｇｌ  ＩＩおよびＮｏｔ  Ｉにより挿入され、ｐｓｈｕｔｔｌｅ−ヒト成長ホルモン／Ｅ７−Ｃｔ  ＴｍＣＤ４０Ｌを得た。
【００８２】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ７−ｃｔ  ＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列を有さない）は、以下の通りに調製された：プラスミドｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌは、ＡＴＣＣから購入された。一対のＰＣＲプライマ（配列番号：４および５）は、マウスＣＤ４０リガンドの位置５２〜２６０を増幅して（すなわち、細胞質内および膜貫通領域なしで）、アンプリコンの５’末端にリンカー（「＋スペーサー」として示される）をコードしている配列を含むように設計されている。
マウスΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサフォワードプライマ（ＭＣＤ４０ＬＳＰＦ）（ＣＤ４０Ｌの配列は小文字で示す）
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡａａｇｇｔｃｇａａｇａｇｇａａｇｔａ−３’（配列番号：４）
マウスＣＤ４０Ｌリバースプライマ（ＭＣＤ４０ＬＲ）
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＣＡＣＴＡＡＧＣＣＡＡ−３’（配列番号：５）
【００８３】
フォワードプライマＭＣＤ４０ＬＳＰＦは、腫瘍抗原および転写単位のＣＤ４０リガンド（ｍＣＤ４０Ｌ）の間に位置する１０の残基スペーサ（ＦＥＮＤＡＱＡＰＫＳ、シングルレターコード、配列番号：６）をコードした。フォワードおよびリバースのプライマ（配列番号４および５）およびテンプレートとしてのプラスミドｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌを用いて実行されたＰＣＲは、ＰＣＲ断片「スペース＋  Ｃｔ  ＴＭＣＤ４０Ｌ」を生成し、そして、それはＨｉｎｄ  ＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）およびＸｈｏ  Ｉ（ＣＴＣＧＡＧ）による制限エンドヌクレアーゼ消化の後、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶに挿入された（１３）。このベクターは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ  Ｃｔ  ＴｍＣＤ４０Ｌと称される。切断型でなく完全長ＣＤ４０Ｌをコードしたことを除いては、他の点では同じベクターを構築した。このベクターは、マウスのＣＤ４０Ｌの開始コドンにアニールしたＣＤ４０フォワードプライマを用いて作られた。このベクターは、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＤ４０Ｌ（シグナル配列を有さない）と称される。
【００８４】
ＣＤ４０リガンド配列の上流にＨＰＶ−１６  Ｅ７を含むようにｐＳｈｕｔｔｌｅ  Ｃｔ  ＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列を有さない）を改変することは、以下の通りに達成された：
全長ＨＰＶ−１６  Ｅ７タンパク質をコードしている配列は、ＨＰＶウイルスゲノムから以下のプライマを用いてＰＣＲ増幅によって、得られた：
ＨＰＶ  １６  Ｅ  ７フォワードプライマ（配列番号：７）
５’−ＡＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡ−３’
ＨＰＶ  Ｅ７リバースプライマ（配列番号：８）
５−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴ−３’
結果として生じるアンプリコンは、５’末端Ｎｏｔ  Ｉおよび３’末端Ｘｈｏ  １制限サイトを有するＤＮＡをコードしているＨＰＶ  １６  Ｅ  ７であった。Ｅ７  ＤＮＡは、Ｎｏｔ  Ｉ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）およびＸｈｏ  Ｉ（ＣＴＣＧＡＧ）を用いて、ＣＭＶプロモータおよびΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ配列のスペーサのすぐ５’側の間で、ｐＳｈｕｔｔｌｅΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌに挿入された。プラスミドは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（シグナル配列を有さない）と称されており、すでに記載されているＨＧＨ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌを生成するように、Ｅ７の上流にあるヒト成長ホルモンシグナル配列の挿入のために用いられた。このように、転写単位ＨＧＨ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは、ヒト成長ホルモン分泌性シグナル、その下流の完全長１６型ＨＰＶ  Ｅ７、その下流の（ＦＥＮＤＡＱＡＰＫＳ、配列番号：９）を有する１０アミノ酸のリンカー、その下流のマウスのＣＤ４０リガンド残基５２−２６０をコードする。
【００８５】
上記と類似の方法は、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＤ４０Ｌ（シグナル配列を有さない）に、完全長ＣＤ４０の上流のＥ７をコードしているＤＮＡを挿入するために用いられた。
【００８６】
同じように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子は、ＣＭＶプロモータの下流に、およびｍΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬまたはｍＣＤ４０Ｌ（野生型ＣＤ４０Ｌ）の上流に、および複製不全なアデノウイルスベクターに挿入された。これらのベクターは、対照として用いられた。他のアデノウイルスベクターは、それぞれ、ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨＣＤ４０Ｌを作成するために、それぞれ、ＣＭＶプロモータと、ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬのΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬまたはｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＤ４０ＬのＣＤ４０ＬをコードしているＤＮＡの５’側との間に、ヒト成長ホルモンシグナル配列をコードしているＤＮＡを挿入することにより作成された。
【００８７】
完全長の１６型のＨＰＶのＥ７タンパク質（「Ｋ／Ｅ７」）をコードしているＤＮＡの上流でマウス免疫グロブリンＧカッパ鎖遺伝子のシグナル配列をコードしているＤＮＡを含んだ転写単位は、ＨＰＶ１６プラスミドおよび以下のプライマを用いるＰＣＲによって、生成した：
５’−ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ｃｔｃ  ｃｔｇ  ｃｔａ  ｔｇｇ  ｇｔａ  ｃｔｇ  ｃｔｇ−３’  （配列番号：１０）
５’−  ＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＴＧＧ  ＧＴＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ｔｇｇ  ｇｔｔ  ｃｃａ  ｇｇｔ  ｔｃ−３’  （配列番号：１１）
５’−  ＴＧ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ｇｇｔ  ｔｃｃ  ａｃｔ  ｇｇｔ  ｇａｃ  ａｔｇ  ｃａｔ  ｇ−３’  （配列番号：１２）
５’−    ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  Ｇ  ＡＴ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＡＣ−３’  （配列番号：１３）および
５’−  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  Ｃ  −３．’  （配列番号：１４）
上流のカッパシグナル配列を有するＫ／Ｅ７は、４ラウンドのＰＣＲ増幅（１回目のラウンド：プライマ４  ＋  ５、  ２回目のラウンド：プライマ３を加える、  ３回目のラウンド：プライマ２を加える、  ４回目のラウンド：プライマ１を加える）により生成された。Ｋ／Ｅ７をコードしているＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ−Ｋ／Ｅ７を形成しているｐｃＤＮＡ（登録商標）３．１  ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン、サンディエゴ、ＣＡ）にクローニングされた。
【００８８】
膜貫通および細胞質のドメインが欠失した（ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）マウスＣＤ４０リガンドを含んだＤＮＡフラグメントは、以下のＰＣＲプライマを用いてマウスＣＤ４０リガンド相補ＤＮＡプラスミド（ｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０Ｌ、  ＡＴＣＣ）から生成された：
５’−ＣＣＧ  ＣＴＣＧＡＧ  ａａｃ  ｇａｃ  ｇｃａ  ｃａａ  ｇｃａ  ｃｃａ  ａａａ  ａｇｃ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＧＴＡ  ＡＡＣ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号：１５）および
５’−ＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＡＧｔｃｔａｇａＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号：１６）（高信頼性ＰＣＲキット、Ｒｏｃｈｅ）
断片ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは、Ｘｂａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素により消化されて、その後、ｐｃＤＮＡ−Ｅ７にライゲーションされた。Ｋ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ断は、ｐｃＤＮＡベクターから切り出されて、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉ部位を用いてｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドに挿入された（ｐＳｈｕｔｔｌｅ  Ｋ／Ｅ７−ＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ）。このように、Ｋ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ断片は、カッパ鎖分泌性シグナル、その下流の完全長の１６型のＨＰＶのＥ７、その下流の１０アミノ酸のリンカー（ＬＱＮＤＡＱＡＰＫＳ、配列番号：１７）、その下流のマウスのＣＤ４０リガンド残基５２−２６０を含む。
【００８９】
完全長マウスＣＤ４０Ｌの上流にＥ７を有する融合タンパク質をコードしているアデノウイルスベクターは、完全長マウスＣＤ４０Ｌを増幅するためのプライマを用いて作られた。以下のプライマが、用いられた：
５’−ＧＡＧＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＴＡＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＧＣＣＡＡＣＣＴＴＣＣＣ−３’（配列番号：１８）
５’−ＣＣＧＣＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧ−３’（配列番号：１９）
増幅されたＤＮＡは、最初にＸｂａ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素により、ｐＣＤＮＡ３にサブクローニングされた。完全長ＣＤ４０Ｌ遺伝子またはΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｂａ  Ｉ部位を有するｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドに、方向を決めてクローニングされた。Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌをコードしているアデノウイルス発現ベクターを構成するための方式の概要は、図２および図３に示される。
【００９０】
組換型アデノウイルスベクターは、ＡｄＥａｓｙベクター系（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて生成された。手短に言えば、結果として得られるプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨ／ＣＤ４０Ｌ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨ／Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨ／ＧＦＰ、ｐＳｈｕｔｔｌｅＨＧＨ／ＧＦＰ−ＣＤ４０ＬおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＨＧＨ／Ｅ７は、Ｐｍｅ  Ｉによって線状にされ、ｐＡｄＥａｓｙ−１（ウイルスＤＮＡプラスミド）と共に大腸菌株ＢＪ５１８３に共−形質転換された。組換え体は、カナマイシンにより選択されて、制限酵素分析法によって、スクリーニングされた。組換型アデノウイルス構築物は、それからその逆位末端反復（ＩＴＲ）を露出させるためにＰａｃ  Ｉにより切断されて、ウイルス粒子を生産するために、２９３Ａ細胞に形質導入された。組換型アデノウイルスの力価は、組織培養感染性用量（ＴＣＩＤ５０）法により決定された。
【００９１】
ヒトＣＤ４０リガンド相補ＤＮＡテンプレートを用いてヒトΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサを増幅するためのプライマは、後述の通りである。
ヒトΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ＋スペーサのフォワードプライマ（ＨＣＤ４０ＬＳＰＦ）（ＣＤ４０Ｌ配列は小文字で示す）：
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＣＡｃａｔａｇａａｇｇｔｔｇｇａｃａａｇ−３’（配列番号：２０）
ヒトＣＤ４０Ｌリバースプライマ（ＨＣＤ４０ＬＲ）
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：２１）
これらのプライマは、ヒトＣＤ４０Ｌの４７−２６１をコードするΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ  ＋スペーサを増幅する。フォワードプライマＭＣＤ４０ＬＳＰＦは、腫瘍抗原および転写単位のＣＤ４０リガンド（ｈＣＤ４０Ｌ）の間に位置する１０残基のスペーサ（ＦＥＮＤＡＱＡＰＫＳ、シングルレターコード、配列番号：９）をコードしている。フォワードおよびリバースのプライマ（配列番号２０および２１）およびテンプレートとしてのプラスミドｐＤＣ４０６−ｈＣＤ４０Ｌを用いて実行されたＰＣＲは、ＰＣＲフラグメント「スペース＋ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ヒト）」を結果として生成し、それは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）およびＸｈｏ  Ｉ（ＣＴＣＧＡＧ）による制限酵素消化の後、プラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶに挿入される（１３）。このベクターは、ｐＳｈｕｔｔｌｅΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ヒト）と称される。ヒトＣＤ４０リガンド配列の上流にＨＰＶ−１６  Ｅ７を含むようにするｐＳｈｕｔｔｌｅΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ヒト）の改変は、ベクターをコードしているマウスのＣＤ４０リガンドに対して上に述べたようにして、本質的には達成された。結果として生じるプラスミドは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ヒト）（シグナル配列を有さない）と称されて、ＨＧＨ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ヒト）を生成するために、Ｅ７の上流にヒト成長ホルモンシグナル配列を挿入するために用いられる。このように、転写単位ＨＧＨ／Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（ヒト）は、ヒト成長ホルモン分泌性シグナル、その下流の完全長１６型ＨＰＶ  Ｅ７、その下流の１０アミノ酸（ＦＥＮＤＡＱＡＰＫＳ、配列番号：９）のリンカー、その下流のヒトのＣＤ４０リガンド残基４７−２６１をコードする。
【００９２】
ｄ）アデノウイルスベクター転写単位の試験管内の発現
ＲＩＬＬ（Ｐｒｏｔｅｇｅ  Ｃｏｒｐ．のＴＮＴキット）の一対になった試験管内の転写翻訳系は、以下のベクターの合成のために用いられた：Ａｄ−Ｅ７−ＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−Ｅ７−ｗｔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−ｗｔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−Ｅ７。各々２μｇのプラスミドＤＮＡまたはＰＣＲにより生成された鋳型ＤＮＡは、２５μｌのＲＰＬ、２μｌのＴＮＴ反応バッファ、１μｌ  のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、メチオニンを含まない１μｌのアミノ酸混合（１ｍＭ）、４μｌ  の［３５Ｓ］−メチオニンおよび１μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／μｌ）を含む５０μｌの反応混合物に加えられた。反応は、１時間、３０℃で、インキュベーションすることによって、完了した。各々１５μｌの［３５Ｓ］標識された産物は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動されて、終夜Ｘ線フィルムに暴露された。
【００９３】
ｅ）ウエスタンブロット分析法
ＭＯＩ４０でアデノウイルスベクターによって、感染した２９３細胞から誘導された細胞可溶化物は、１０％還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分別されて、ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ−Ｐメンブレン（ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ）に転写された。室温で、２時間、５％の脱脂乳によるブロッキングの後、メンブレンは、終夜２％のウシ血清アルブミンの存在下で、ＴＢＳ−Ｔバッファ（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ［ｐＨ  ７．６］、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  ツイーン２０）中で特異的なマウスＣＤ４０リガンド（ｍＣＤ４０Ｌ）に対する抗体によって、プローブされた。ＴＢＳ−Ｔバッファによる４回洗浄の後、ブロットは、１時間、ヤギ抗ハムスターアルカリホスファターゼと結合した抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキューベートされた。免疫反応性バンドは、ＰｒｏｔｏＢｌｏｔ  ＩＩ  ＡＰシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用いることにより、メンブレン上で視覚化された。
【００９４】
ｆ）ＤＣのフローサイトメトリ分析法
ＡＰＣまたはＤＣの表面分子の発現量を定量化するために、試験細胞は、標識された抗体による免疫染色の前に、氷上で３０分間、ＣＤ８０、ＣＤ５４およびＣＤ１１ｃ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するＦＩＴＣ−またはＰＥ結合抗マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）で染色された。ＡＰＣは、Ｆｃ−γレセプタにｍＡｂｓが非特異的に結合することを避けるために、最初にＦｃ−γ阻止抗体（抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２抗体）とともにインキューベートされる。細胞は、それから二回洗浄されて、４％のパラホルムアルデヒド中で固定されて、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎフローサイトメータ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｐｕｒ）を用いて分析された。
【００９５】
ｇ）Ａｄ−ｍＣＤ４０Ｌにより修飾されたＤＣのサイトカイン生産
ＤＣは、以下のアデノウイルスベクターに感染し（Ａｄ  Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、ＡｄｍＣＤ４０Ｌ、ＡｄＥ７−ＣＤ４０Ｌ、ＡｄＧＦＰ、ＡｄＧＦＰ−ｍＣＤ４０Ｌ、ＡｄＥ７またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）をＭＯＩ  １００で）、２４ウェル中で２×１０の５乗ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平板培養された。３７℃での２４時間のインキュベーションの後、上澄み液（１ｍｌ）は、収穫されて、破片を除去するために遠心分離された。培地に放出されるマウスのインターロイキン−１２またはＩＦＮ−γの水準は、それぞれマウスインターロイキン−１２のｐ７０またはＩＦＮ−γ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により評価された。
【００９６】
ｈ）ＤＣの移動のアッセイ
ＤＣの試験管内の移動を研究するために用いられるプロトコルは、Ｒｏｍａｎｉその他（２１）によって、用いられたものと同様であった。手短に言えば、マウスの耳の皮膚は、背面および腹面の片方ずつに分割された、背面の片方は、６ウェルの二重のチャンバの組織培養プレート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｎｏ  ３４１４，  Ｃｏｓｔａｒ）の内側チャンバの底部メンブレン上で培養された。外側のチャンバは、１×１０の８乗のベクター分子によって、ロードされた。外側のチャンバはそれから培地で満たされ、ベクター分子が下部から皮膚を浸すことができるようになった。皮膚の表皮の一部は、このように空気に暴露された。培養組織は、３日間３７℃でインキューベートされた。皮膚から培地に移植したＤＣの数は、血球計数器の下で計数された。
【００９７】
ＤＣの生体内での移動実験は、以下の通りに実行された。骨髄誘導ＤＣがＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦによって、６日間培養された後で、それらはＣＦＤＡ  ＳＥ  ｓｕｐｒｅｖｉｔａｌ染料でロードされた。手短に言えば、ＤＣは、３７℃で１５分間、１０μｌのＣＦＤＡ  ＳＥによって、インキューベートされた。樹状細胞は、それからペレット化されて、新鮮な予熱された培地の中で３０分間再懸濁された。細胞は、ＭＯＩ  ２００で各々の組換型アデノウイルスベクターと一緒に混合された。ベクターは、それから試験マウスの左側腹部に注射された。３日後に、ＤＣのための注射部位の領域を排液させている腋窩リンパ節は取り除かれ、凍結組織切片が作られて、免疫蛍光顕微鏡において、観察された。
【００９８】
ｉ）免疫組織化学的染色
ワクチン接種をされたマウスは、ＡｄＥ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、ＡｄＥ７−ＣＤ４０Ｌ、ＡｄＥ７−ＣＤ４０Ｌベクターワクチン接種の３日後に殺された。ベクター皮下注射の部位の皮膚は、生検を行われて、Ｏｃｔ溶液に包埋されて、５  ｕｍ切片に切られた。スライドは、ラット抗ＭＨＣ−ＩＩ抗体、ラット抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ラット抗ＣＤ８０ポリクローナル抗体（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともにインキューベートされた。この後に、ビオチン化されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（１：２００希釈度）、アビジン−ビオチン複合体（１：１００希釈度、  Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）への露出を行った。染色されたスライドは、それから載置されて、蛍光顕微鏡の下で検査された。
【００９９】
ｊ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるサイトカインプロフィール
免疫マウスにおけるＥ７特異的なエフェクターＴ細胞の存在は、前述したのと同様に（２６，２７）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、評価された。手短に言えば、各々の異なるベクターによって、ワクチン接種をされたマウスから得られた脾細胞は、ＴＣ−１細胞系統を有する培養組織（応答因子−対−刺激因子比率２５：１）によって、１０  Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２の存在下で４８時間、試験管内で再刺激された。再刺激された脾細胞は、それから９６ウェル  ニトロセルロースフィルタープレート（１００マイクロリットルあたり５×１０の４乗の細胞）において、平板培養された。ウェルは、ラット抗マウス抗ＩＦＮ−抗体または抗ＩＬ−４抗体でプレコートされていた。３７℃／５％二酸化炭素での２４時間のインキュベーションの後、プレートは、それからＰＢＳにより洗浄され、サイトカインを生産している脾臓細胞の存在は、ビオチン化ヤギ抗ラット二次抗体による４℃でのインキュベーションにより検出され、続いて１００マイクロリットル／ウェルのワサビペルオキシダーゼアビジンＤ、１５０マイクロリットル／ウェルの要時調製された基質バッファ（合計５０ｍｌ  ０．０５ｍｏｌ／Ｌのナトリウム酢酸緩衝液中の０．４ｍｇ／ｍｌの３−アミノ−９−エチルカルバゾール）および２０マイクロリットルの３０％Ｈ2０2により処理された。ＩＦＮを生産している細胞またはＩＬ−４を生産している細胞と一致している染色されたスポットは、解剖顕微鏡の下で数え上げられた。
【０１００】
ｋ）細胞毒性アッセイ
これらの研究のために、マウスは、以下のベクターの皮下注射によって、ワクチン接種を受けた：Ａｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（分泌性ＣＤ４０リガンド）、Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ（分泌性ＣＤ４０リガンド）、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ（非−分泌性ＣＤ４０Ｌ）、Ａｄ−ＣＤ４０Ｌ（非−分泌性リガンド）およびＡｄ−Ｅ７。ベクターは、皮下注射として０日目および７日目に注射された。対照として、ＰＢＳが、０日目および７日目に、皮下に注射された（対照マウス）。これらの（ベクターを注射された、またはＰＢＳを注射された）マウスの脾臓由来の単核細胞が、細胞毒性研究のためのエフェクター細胞の起源として用いられた。脾細胞懸濁液の部分標本は、それからマイトマイシンＣにより処理されたＴＣ−１細胞によって、１０％のＦＢＳ、５０Ｍの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルベートおよび非必須アミノ酸を補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で、細胞培養条件の下で５日間、共−インキューベートされた。細胞毒性アッセイを実行するために、５×１０の３乗のＴＣ−１腫瘍細胞（標的細胞）は、５％のＦＢＳを含んでいる培地で、３７℃で４時間、１００：１のエフェクタ／標的比率で、刺激された脾臓の単核細胞（エフェクター細胞）と一緒にインキューベートされた。インキュベーションの終わりに、単核細胞媒介性細胞障害反応は、非放射性細胞毒性アッセイキットを用いて定量された。培養液上清の中に放出されたＬＤＨは、ＥＬＩＳＡプレート読取装置で測定された。
データは、以下のように算出された：
％  細胞毒性＝（ＥＸＲ  ＥＳＲ  ＴＳＲ  ＋ＣＭＢ／ＴＭＲ  ＴＳＲ  ＶＣ  ＋ＣＭＢ）１００
ここで、ＥＸＲは、実験的なＬＤＨ放出量であり、ＥＳＲは、エフェクター細胞の自発的なＬＤＨ放出量であり、ＴＳＲは、標的細胞の自発的なＬＤＨ放出量であり、ＴＭＲは、標的細胞の最大ＬＤＨ放出量であり、ＶＣは、体積の修正量であり、そして、ＣＭＢは、培地のＬＤＨのバックグラウンド量である。統計：Ｓｔｕｄｅｎｔの不対のｔ検定は、増殖および細胞毒性アッセイにおけるさまざまなグループの違いを判定するために用いられた。統計的有意差は、０．０１の水準で判定された。
【０１０１】
ｌ）マウスモデルにおける生体内での有効性実験
マウス（グループあたり５匹または１０匹）は、１×１０の８乗  ＰＦＵ  のＡｄ−Ｅ７−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−Ｅ７、Ａｄ−Ｅ７−ＣＤ４０Ｌ、Ａｄ−ΔＣｔΔＴｍＣＤ４０ＬまたはＡｄ−ＣＤ４０Ｌベクターによる皮下注射によって、ワクチン接種をされた。１週後に、マウスは、最初のワクチン接種と同じアデノウイルスベクターの処方計画によって、ブーストされた。最後のワクチン接種の１週後に、マウスは、右脚における５×１０の５乗  ＴＣ−１細胞／マウスの皮下注射によって、チャレンジされて、それから、週に２回観察された。
【０１０２】
ドナー脾細胞は、腫瘍のないドナーＣ５７ＢＬ／６マウスから収穫されて、完全Ｔ細胞を濃縮するために磁気カラムを通した。上記のように、腫瘍成長は測定された。
【０１０３】
ｍ）統計
全てのパラメータは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、または変量分析を用いて分析され、それに続いて、事後の分析法として、多重比較のためのＳｃｈｅｆｆｅの手法を用いられた。示される全てのデータは、平均（Ｓ．  Ｅ．）についての平均±Ｓ．  Ｅ．として提示される。
【０１０４】
１１．  参考：
文献１．  Ｓｈｏｒｔｍａｎ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｃａｕｘ  Ｃ．  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｎａｔｕｒｅ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ
１５：４０９−４１９，  １９９７．
文献２．  Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ  Ｋ，  Ｇｒａｕｌｉｃｈ  Ｅ，  Ｋｕｂｓｃｈ  Ｓ，  Ｋｎｏｐ  Ｊ，  Ｅｎｋ  ＡＨ．  ＣＤ４（＋）  ａｎｄ  ＣＤ８（＋）  ａｎｅｒｇｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０−ｔｒｅａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｌｏｏｄ  ９９：  ２４６８−２４７６，  ２００２．
文献３．  Ｋｕｓｕｈａｒａ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｅ  Ｋ，  Ｅｄｅｌｂａｕｍ  Ｄ，  Ｌｏｆｔｕｓ  Ｊ，  Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ａ，  Ｍａｔｓｕｅ  Ｈ．  Ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＣＤ９５Ｌ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  （ＤＣ）：  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｋｉｌｌｅｒ  ＤＣ−ＤＣ  ｈｙｂｒｉｄｓ  ａｎｄ  ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＤＯ１１．１０  ｍｉｃｅ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：１０３５−１０４３，  ２００２．
文献４．  Ｇｕｎｚｅｒ  Ｍ，  Ｊａｎｉｃｈ  Ｓ，  Ｖａｒｇａ  Ｇ，  Ｇｒａｂｂｅ  Ｓ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：２９１−３０２，  ２００１．
文献５．  Ｌｕｆｔ  Ｔ，  Ｌｕｅｔｊｅｎｓ  Ｐ，  Ｈｏｃｈｒｅｉｎ  Ｈ，  Ｔｏｙ  Ｔ，  Ｍａｓｔｅｒｍａｎ  ＫＡ，  Ｒｉｚｋａｌｌａ  Ｍ，  Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ  Ｃ，  Ｓｈｏｒｔｍａｎ  Ｋ，  Ｃｅｂｏｎ  Ｊ，  ａｎｄ  Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ  Ｅ．  ＩＦＮ−ａｌｐｈａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：３６７−３８０，  ２００２．
文献６．  Ｓｋｏｖ  Ｓ，  Ｂｏｎｙｈａｄｉ  Ｍ，  Ｏｄｕｍ  Ｎ，  ａｎｄ  Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ  ＪＡ．  ＩＬ−２  ａｎｄ  ＩＬ−１５  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＣＤ１５４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：  ３５００−３５０５，  ２０００．
文献７．  Ｐａｇｌｉａ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｌｏａｄｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｉｍｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  （ｓｅｅ  ｃｏｍｍｅｎｔｓ）．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：  ３１７−３２２，  １９９６．
文献８．  Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ，  Ｂ７  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ  １−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８３：  ８７−９７，  １９９６．
文献９．  Ｆｏｎｇ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｖｉａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｒｏｕｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：  ４２５４−４２５９，  ２００１．
文献１０．  Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ  Ｓ，  Ｅｎｇｌｅｍａｎ  ＥＧ．  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ８５：  ９５５−９６１，  １９９０．
文献１１．  Ｈｓｕ  ＦＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２：  ５２−５８，  １９９６．
文献１２．  Ｎｅｓｔｌｅ  ＦＯ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−  ｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ４：  ３２８−３３２，  １９９８．
文献１３．  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ−Ａ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｒｉａｌ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３８：  ７３−７８，  １９９９．
文献１４．  Ｄｈｏｄａｐｋａｒ  ＭＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：  １７３−１８０，  １９９９．
文献１５．  Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ  Ｓ，  Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ｍｏｔａ  ＳＣ，  Ｎｏｕｔａ  Ｊ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍ，  Ｌｉｐｆｏｒｄ  ＧＢ，  Ｏｆｆｒｉｎｇａ  Ｒ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ，  ａｎｄ  Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ：  ３５０−３５８，  ２００２．
文献１６．  Ｌｉｕ  Ｗ，  Ｇａｏ  Ｆ，  Ｚｈａｏ  Ｋ，  Ｚｈａｏ  Ｗ，  Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｇ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｆｒａｚｅｒ  Ｉ．  Ｃｏｄｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｅ７  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５：  ３０１−３４３，  ２００２．
文献１７．  Ｌａｍｉｋａｎｒａ  Ａ，  Ｐａｎ  ＺＫ，  Ｉｓａａｃｓ  ＳＮ，  Ｗｕ  ＴＣ，  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｙ．  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  （ＨＰＶ−１６）  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＨＰＶ−１６  Ｅ７  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＤ８（＋）  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈａｔ  ｈｏｍｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｉｔｅ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ：  ９６５４−９６６４，  ２００１．
文献１８．  Ｓｔａｎｌｅｙ  ＭＡ．  Ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ４：１５−２２，  ２００２．
文献１９．  Ｒｕｄｏｌｆ  ＭＰ，  Ｆａｕｓｃｈ  ＳＣ，  Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ＤＭ，  Ｋａｓｔ  ＷＭ．  Ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−１６  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：  ５９１７−５９２４，  ２００１．
文献２０．  Ｂｅｌｌ  Ｄ，  Ｙｏｕｎｇ  ＪＷ，  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７２：  ２５５−３２４，  １９９９．
文献２１．  Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＭ，  Ｌｅｖｙ  Ｒ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．  ５０：  ５０７−５２９，  １９９９．
文献２２．  Ｐａｌｕｃｋａ  Ｋ，  Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９：１２−２５，  １９９９．
文献２３．  Ｒｉｂａｓ  Ａ，  Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ＬＨ，  Ａｍａｒｎａｎｉ  ＳＮ，  Ｄｉｓｓｅｔｔｅ  ＶＢ，  Ｋｉｍ  Ｄ，  Ｍｅｎｇ  ＷＳ，  Ｍｉｒａｎｄａ  ＧＡ，  Ｗａｎｇ  ＨＪ，  ＭｃＢｒｉｄｅ  ＷＨ，  Ｇｌａｓｐｙ  ＪＡ，  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｏｕ  ＪＳ．  ＣＤ４０  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：  ８７８７−８７９３，  ２００１．
文献２４．  Ｂｒｏｄｅｒ  Ｈ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ａ，  Ｏｄｅｓａ  ＳＫ，  Ｋｅｒｍｅｎ  Ｔ，  ａｎｄ  Ｌｉａｕ  ＬＭ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｆｏｃｕｓ  ９：１−８，２０００．
文献２５．  Ｃｒｏｏｋ  Ｔ，  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ＪＰ，  Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｌ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ  Ｌ．  Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＰＶ−１６  Ｅ７  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ＨＰＶ−１６  ｐｌｕｓ  ＥＪ−ｒａｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ８：  ５１３−５１９，  １９８９．
文献２６．  Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｍ，  Ｊｉｎ  Ｘ，  Ｒａｍｒａｔｎａｍ  Ｂ，  Ｏｇｇ  ＧＳ，  Ｅｎｇｅｌｍａｙｅｒ  Ｊ，  Ｄｅｍｏｉｔｉｅ  ＭＡ，  ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  ＡＪ，  Ｃｏｘ  ＷＩ，  Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ，  Ｎｉｘｏｎ  Ｄ，  ａｎｄ  Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｎ．  Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ａｓｓａｙ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＨＩＶ−１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ＡＩＤＳ  １３：７６７−７７７，  １９９９．
文献２７．  Ｒｉｎｉｎｓｌａｎｄ  ＦＨ，  Ｈｅｌｍｓ  Ｔ，  Ａｓａａｄ  ＲＪ，  Ｂｏｅｈｍ  ＢＯ，  ａｎｄ  Ｔａｒｙ−Ｌｅｈｍａｎｎ  Ｍ．  Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４０：１４３−１５５，  ２０００．
【０１０５】
本明細書において、言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。個々の刊行物が詳細におよび個々に開示されてが引用により組み込まれる場合と同じ程度に、全ての特許および刊行物は本願明細書に引用により組み込まれる。
【０１０６】
本願明細書における例証的に記載されている本発明は、本願明細書における特に開示されないけれども、いずれかの単数または複数の要素、単数または複数の限定がない状態で適切に実施されてもよい。このように、例えば、本願明細書における各例において、「含む」、「本質的に〜からなる」および「からなる」という用語のいずれかが、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。使用された用語および表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、そのような用語および表現には記載され図示されている本特徴の均等物またはその部分を除外する意図はなく、逆に、本発明の特許請求の範囲内でさまざまな変形が可能であることが認められる。このように、本発明が好ましい実施態様および任意の特徴によって、特に開示されたが、本願明細書における開示される本発想の修正変更が当業者によって、用いられてもよく、そのような修正変更が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【０１０７】
他の実施形態は、以下の請求項の範囲内で記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】分泌可能な腫瘍抗原／ＣＤ４０Ｌベクターの皮下注射に続く事象のモデルを示す。活性化に関して皮下空間での注射後に起こると想定されるステップは、腫瘍抗原をロードするステップと、局部リンパ節に移動するステップと、上記腫瘍抗原を担持している細胞に特異的であるＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞を活性化するステップと、免疫応答のような全身のＴ細胞に依性するＴｈ１を誘導するステップとである。
【図２】Ｅ７−ＡＣｔＡＴｍＣＤ４０Ｌをコードしているアデノウイルス発現ベクターを構築する概要を示す。
【図３】Ｅ７−ＡＣｔＡＴｍＣＤ４０Ｌをコードしているアデノウイルス発現ベクターを構築する概要を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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