(57)【要約】本発明は、図１に示されるように、酵素活性を調節する化合物を同定するための「係留」の使用に関する。本発明は、目的の標的部位の外側の標的に結合されているエクステンダーの使用に依存する、係留の形態に関する。エクステンダーは、目的の部位の外側の標的に接着しているので、目的の部位内の構造的混乱または機能的混乱の可能性が最小にされる。さらに、標的変異体は、構造的完全性および機能的完全性について、機能的スクリーニングを使用して、評価され得る。
2006506947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）目的の部位の外側に位置する反応性求核試薬を有する標的を提供する工程；
ｂ）該標的をエクステンダーと接触させ、それによって標的−エクステンダー複合体を形成する工程であって、該エクステンダーは、求核試薬と第１の共有結合を形成する第１の官能基および第２の共有結合を形成し得る第２の官能基を含む、工程；
ｃ）該標的−エクステンダー複合体を、第２の官能基と第２の共有結合を形成し得る基を有する候補リガンドと接触させる工程；
ｄ）該標的−エクステンダー複合体と該候補リガンドとの間で第２の共有結合を形成し、それによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
ｅ）該標的−エクステンダー−リガンド結合体中に存在する候補リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記反応性求核性試薬がチオールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下：
ａ）標的を提供する工程であって、該標的は、目的の部位の内側に位置する第１の反応性求核試薬、および目的の部位の外側に位置する第２の反応性求核試薬を有する、工程；
ｂ）該標的をエクステンダーと接触させて、これによって、標的−エクステンダー複合体を形成する工程であって、該エクステンダーは、第１の官能基および潜在的な第２の官能基、切断可能なリンカーならびに結合決定部分を含み、ここで、該第１の官能基は、第２の反応性求核試薬と第１の共有結合を形成し、そして該結合決定部分は、目的の部位に結合する、工程；
ｃ）第２の官能基を露出させて、目的の部位から結合決定部分を解放することによって、エクステンダーを、切断可能なリンカーにおいて切断し、これによって、改変された標的−エクステンダー複合体を形成する工程；
ｄ）該改変された標的−エクステンダー複合体を、候補リガンドと接触させる工程であって、該候補リガンドは、第２の官能基と第２の共有結合を形成し得る基を含む、工程；
ｅ）第２の共有結合を、改変された標的−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間に形成し、これによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
ｆ）該標的−エクステンダー−リガンド結合体に存在する候補リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記第１および第２の反応性求核性試薬が、各々、チオールである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下：
ａ）活性部位の外に位置した反応性チオールを有するＰＴＰを提供する工程；
ｂ）ＰＴＰをエクステンダーと接触させ、それによりＰＴＰエクステンダー複合体を形成し、ここで該エクステンダーが、反応性チオールと共有結合を形成する第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む、工程；
ｃ）該ＰＴＰエクステンダー複合体を第２の官能基とジスルフィド結合を形成し得る基を含む候補リガンドと接触させる工程；
ｄ）該ＰＴＰエクステンダー複合体と該候補リガンドとの間のジスルフィド結合を形成し、それによりＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
ｅ）該ＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体中に存在している候補リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
前記標的上の反応性チオールが、天然に存在するタンパク質配列の一部分であるシステインに由来する、天然に存在する−ＳＨである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的上の反応性チオールが、天然に存在するアミノ酸の変わりに使用された突然変異誘発のシステインに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記反応性チオールが、ジスルフィドとしてマスクされている、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記反応性チオールと第１官能基との間の共有結合が、不可逆的な共有結合である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応性チオールと第１官能基との間の共有結合が、可逆的な共有結合である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的−エクステンダー複合体が、還元剤の存在下で候補リガンドと接触される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記還元剤が、以下：システイン、システアミン、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオエリトリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、トリス−（２−カルボキシエチル−ホスフィン）のようなホスフィン、および水素化ホウ素ナトリウムからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記エクステンダーが、以下：
【化１】
2006506947.tif 000077
からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
以下：
ａ）活性部位を有するＰＴＰ、活性部位に位置するシステインおよび活性部位の外側に位置する反応性チオールを提供する工程；
ｂ）ＰＴＰをエクステンダーに接触させて、それによりＰＴＰエクステンダー複合体を形成する工程であって、該エクステンダーが、第１の官能基および潜在的な第２の官能基、切断可能リンカー、ならびにホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む結合決定部分を含み、ここで第１の官能基が、反応性チオールとの第１の共有結合を形成し、該結合決定部分が活性部位と結合する、工程；
ｃ）エクステンダーを該切断可能リンカーにおいて切断させて、それにより第２の官能基を露出させ、該活性部位から結合決定部分を放出することによって、改変されたＰＴＰ−エクステンダー複合体を形成する工程；
ｄ）改変されたＰＴＰエクステンダー複合体を、第２の官能基との第２の共有結合を形成し得る基を含む候補リガンドと接触させる工程；
ｅ）改変されたＰＴＰ−エクステンダー複合体と該候補リガンドとの間の第２の共有結合を形成し、それによりＰＴＰ−エクステンダー−リガンド複合体を形成する工程；ならびに
ｆ）該ＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体において存在している候補リガンドを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記標的上の反応性チオールが、天然に存在するタンパク質配列の部分であるシステイン由来の天然に存在する−ＳＨである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的上の反応性チオールが、変異誘発を使用して天然に存在するアミノ酸を置換したシステイン由来である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応性チオールが、ジスルフィドとしてマスクされている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記反応性チオールと前記第１官能基との間の共有結合が、不可逆的な共有結合である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記反応性チオールと前記第１官能基との間の共有結合が、可逆的な共有結合である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的−エクステンダー複合体が、還元剤の存在下で候補リガンドと接触される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記還元剤が、以下：システイン、システアミン、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオエリトリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、トリス−（２−カルボキシエチル−ホスフィン）のようなホスフィン、および水素化ホウ素ナトリウムからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の方法であって、前記エクステンダーが、式：
【化２】
2006506947.tif 000078
であり、ここで、Ａは、以下：
【化３】
2006506947.tif 000079
からなる群より選択され、ｎは、１〜５であり；ｍは、２〜５であり；そして、Ｘが、ハライドである、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、Ａが、以下：
【化４】
2006506947.tif 000080
からなる群より選択され、ｎおよびｍは、独立して２または３であり；そして、Ｘが、ブロミドである、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
薬物発見プロセスは、通常は、化合物ライブラリーの大規模な機能的スクリーニングで始まり、後の医薬化学的最適化のための、適度の親和性のリード化合物を同定する。しかし、目的の標的すべてが、このようなスクリーニングに従うわけではない。いくつかの場合において、高スループットスクリーニングに従うアッセイが、利用できない。別の場合において、標的は、複数の結合様式を有し得、その結果、このようなスクリーニングの任意の結果が、不明瞭であり、解釈が困難である。また別の場合において、高スループットなアッセイのためのアッセイ条件は、それらがアーティファクトとなる傾向があるような条件である。結果として、必ずしも機能的スクリーニングに依存しない、リガンド発見のための代替的方法が、必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、酵素活性を調節する化合物を同定するための「係留」の使用に関する。
【０００３】
他に定義しない限り、本明細書中で使用される技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。参考文献（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４）、ならびにＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９２））は、当業者に、本出願で使用される用語の多くについての一般的なガイドを提供する。
【０００４】
本発明の１つの局面において、化合物が提供される。他に明示的または暗黙的に示さない限り、これらの化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、またはそれらの混合物の形態であり得る。二重結合を含む化合物の場合、他に示さない限り、これらの二重結合は、ＺもしくはＥまたはそれらの混合物のいずれかであり得る。
【０００５】
（定義）
本明細書中で使用される用語の定義としては、以下が挙げられる：
用語「脂肪族」または「非置換脂肪族」とは、直鎖状、分枝鎖状、環式、または多環式の炭化水素をいい、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、シクロアルキル部分、シクロアルケニル部分、およびシクロアルキニル部分を含む。
【０００６】
用語「アルキル」または「非置換アルキル」とは、飽和炭化水素をいう。
【０００７】
用語「アルケニル」または「非置換アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素をいう。
【０００８】
用語「アルキニル」または「非置換アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素をいう。
【０００９】
用語「芳香族」または「非置換芳香族」とは、少なくとも１つのアリール基を有する部分をいう。この用語はまた、脂肪族で改変されたアリール（例えば、アルキルアリールなど）を含む。
【００１０】
用語「アリール」または「非置換アリール」とは、少なくとも１つの芳香族環を有する、単環式または多環式の不飽和部分をいう。この用語は、少なくとも１つの芳香族環内に１つ以上のヘテロ原子を含むヘテロアリールを含む。芳香族の例示的な例としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル（ｉｓｏｏｘａｚｏｌｙ）、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなどが挙げられる。
【００１１】
部分を改変するために使用される場合の用語「置換」とは、少なくとも１つの水素原子が、別の基によって置換される、部分の置換バージョンをいう。別の基としては、脂肪族；アリール、アルキルアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨ２Ｃｌ；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−ＯＲＸ；−Ｃ（Ｏ）ＲＸ；−ＣＯＯＲＸ；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＸ）２；−ＯＣ（Ｏ）ＲＸ；−ＯＣＯＯＲＸ；−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＸ）２；−Ｎ（ＲＸ）２；−Ｓ（Ｏ）２ＲＸ；および−ＮＲＸＣ（Ｏ）ＲＸ（ＲＸの各出現は、独立して、水素、置換脂肪族、非置換脂肪族、置換アリール、または非置換アリールである）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、部分上の隣接する基における置換は、一つになって環式基を形成し得る。
【００１２】
用語「リガンド候補」または「候補リガンド」とは、標的酵素上の相補的または適合性の反応性基と共有結合を形成し得る反応性基を有するか、または有するように改変された化合物を言う。リガンド候補または標的酵素のいずれかにある反応性基は、例えば保護基によってマスクされ得る。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、語句「保護されたチオール」または「マスクされたチオール」とは、ある基または分子と反応させられて、共有結合を形成し、それによって、その反応性が小さくされるチオールを言い、このチオールは、脱保護されて、遊離チオールが再生され得る。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、語句「可逆的共有結合」とは、好ましくは標的を変性させない条件下で、破壊され得る共有結合を言う。例としては、ジスルフィド、シッフ塩基、チオエステル、配位錯体、ボロン酸エステルなどが挙げられるが、限定はされない。
【００１５】
語句「反応性基」は、存在する場合、適合性または相補的な反応性基との共有結合が作製され得る部位を提供する、化学的な基または部分である。例示的な例は、別の−ＳＨまたは−ＳＳ−と反応して、ジスルフィドを形成し得る−ＳＨ；活性化された−ＣＯＯＨと反応して、アミドを形成し得る−ＮＨ２；アルデヒドまたはケトンと反応して、シッフ塩基を形成し得る−ＮＨ２などである。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、語句「反応性求核試薬」とは、標的酵素を変性も損傷もさせない条件下で、別の分子上の適合性の官能基と共有結合を形成し得る求核試薬をいう。最も適切な求核試薬は、チオール、アルコール、およびアミンである。
【００１７】
語句「目的の部位」とは、リガンドが結合し得る標的酵素上の任意の部位をいう。
【００１８】
（係留方法）
係留は、標的上の反応性基と潜在的リガンド上の相補的反応性基との間での共有結合の形成に依存する、リガンド同定の方法である。この係留方法は、米国特許第６，３３５，１５５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ０２／４２７７３号；米国出願番号１０／１２１，２１６（タイトル「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＬＩＧＡＮＤ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」、発明者  Ｄａｎｉｅｌ  Ｅｒｌａｎｓｏｎ、Ａｎｄｒｅｗ  Ｂｒａｉｓｔｅｄ、およびＪａｍｅｓ  Ｗｅｌｌｓ（ＰＣＴ公開第ＵＳ０２／１３０６１号に対応する））；およびＥｒｌａｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：９３６７−９３７２（２０００）に記載される（これらはすべて、参考として援用される）。結果として生じる共有結合複合体は、標的−リガンド結合体と呼ばれる。共有結合は、標的（例えば、天然または非天然のシステイン）上の所定の部位で形成されるので、この方法によって同定されるリガンドについては、化学量論および結合位置は既知である。
【００１９】
一旦形成されると、標的−リガンド結合体のリガンド部分は、多くの方法を使用して同定され得る。好ましい実施形態において、質量分析法が使用される。質量分析法は、質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて分子を検出し、それらのサイズに基づいて分子を解明し得る（Ｙａｔｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５−８（２０００）で総説される）。標的−リガンドは、質量分析機において直接的に、または検出前に断片化されて、検出され得る。あるいは、化合物は、質量分析分光光度計内で遊離され得、その後、同定される。さらに、質量分析法は、単独か、あるいは標的に共有結合した化合物を検出または同定するための他の手段と組み合わせて使用され得る。質量分析技術のさらなる記載としては、ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＳｉｕｚｄａｋ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：７０７−７１５（１９９６）；Ｃｈｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７８２７−７８３５（１９９６）；Ｓｉｕｄｚａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１２９０−１１２９７（１９９４）；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５９９Ｒ−６５１Ｒ（１９９６）；Ｗｕら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：６５３−６５７（１９９７）；ならびにＬｏｏら、Ａｍ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：３１９−３２５（１９９６）が挙げられる。
【００２０】
あるいは、標的−化合物結合体は、他の手段を使用して同定され得る。例えば、反応混合物の成分を分離し、共有結合する分子を同定する能力を増強するために、種々のクロマトグラフ技術（例えば、液体クロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーなど）を使用し得る。このようなクロマトグラフ技術は、質量分析法と組み合わせてか、または質量分析法とは別個に、使用され得る。また、（蛍光的に、放射活性的に、または別のように）標識されたプローブを、遊離化合物に結合させて、上記の技術のいずれかを使用したその同定を容易にし得る。なお別の実施形態において、新しい結合の形成により、標識プローブが遊離され得、次いで、それがモニタリングされ得る。単純な機能的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたは酵素的アッセイ）もまた、アッセイが測定するものにとって必須の領域で結合が発生する場合に、結合を検出するために使用され得る。標的分子に結合した有機化合物を同定するための用途を見出し得る他の技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、キャピラリー電気泳動、Ｘ線結晶学などが挙げられる。これらはすべて、当業者にとって周知である。
【００２１】
（本発明）
本発明は、目的の標的部位の外側の標的に結合されているエクステンダーの使用に依存する、係留の形態に関する。エクステンダーは、目的の部位の外側の標的に接着しているので、目的の部位内の構造的混乱または機能的混乱の可能性が最小にされる。さらに、標的変異体は、構造的完全性および機能的完全性について、機能的スクリーニングを使用して、評価され得る。
【００２２】
本発明の１つの局面において、以下を包含する方法が提供される：
目的の部位の外側に位置する反応性求核試薬を有する標的を提供する工程；
この標的を、エクステンダーと接触させ、これによって標的−エクステンダー複合体を形成する工程であって、このエクステンダーは、求核試薬と第１の共有結合を形成する第１の官能基および第２の共有結合を形成し得る第２の官能基を含む、工程；
この標的−エクステンダー複合体を、第２の官能基と第２の共有結合を形成し得る基を有する候補リガンドと接触させる工程；
この標的−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間で第２の共有結合を形成し、これによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；および
この標的−エクステンダー−リガンド結合体中に存在する候補リガンドを同定する工程。
【００２３】
１つの実施形態において、標的は、反応性求核試薬として−ＯＨを含み、エクステンダーは、標的上の反応性求核試薬と共有結合を形成し得る第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む。別の実施形態において、標的上の反応性求核試薬は、天然に存在するタンパク質配列の一部であるセリン、スレオニン、またはチロシン由来の−ＯＨである。別の実施形態において、標的上の反応性求核試薬は、操作された−ＯＨ基であり、ここで、変異誘発が、セリン、スレオニン、またはチロシンに対して、天然に存在するアミノ酸を変異させるために使用された。別の実施形態において、エクステンダーの第１の官能基は、ホウ酸であり、第２の官能基は、−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。マスクされたジスルフィドの例示は、式−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１のチオエステルまたは式−ＳＳＲ１のジスルフィドである。ここで、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ１０の非置換脂肪族、Ｃ１〜Ｃ１０の置換脂肪族、非置換芳香族、または置換芳香族である。１つの実施形態において、マスクされたジスルフィドは、式−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１のチオエステルであり、ここで、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルである。別の実施形態において、マスクされたチオールは、式−ＳＳＲ２Ｒ３のジスルフィドであり、ここで、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルであり、Ｒ３は、ＮＨ２、ＯＨ、またはＣＯＯＨである。別の実施形態において、マスクされたチオールは、式−ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨのジスルフィドである。また別の実施形態において、マスクされたチオールは、式−ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２のジスルフィドである。
【００２４】
別の実施形態において、標的は、反応性求核試薬として−ＳＨを含み、エクステンダーは、標的上の反応性求核試薬と共有結合を形成し得る第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む。１つの実施形態において、標的上の反応性求核試薬は、天然に存在するタンパク質配列の一部であるシステイン由来の天然に存在する−ＳＨである。別の実施形態において、標的上の反応性求核試薬は、操作された−ＳＨ基であり、ここで、変異誘発が、システインに対して、天然に存在するアミノ酸を変異させるために使用された。
【００２５】
別の実施形態において、標的タンパク質は、反応性求核試薬として、ジスルフィドの形態のマスクされた−ＳＨを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールがジスルフィドとしてマスクされている、システインを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールが別のシステインとのジスルフィド結合としてマスクされている、システインを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールがグルタチオンとのジスルフィド結合としてマスクされている、システインを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールが式−ＳＳＲ１（Ｒ１は、既に述べた通りである）のジスルフィドとしてマスクされている、システインを有する。
【００２６】
別の実施形態において、第１の官能基、第２の官能基、またはそれらの両方は、それぞれ独立して、−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。マスクされたチオールの例示的な例は、式−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１のチオエステルまたは式−ＳＳＲ１のジスルフィドである。ここで、Ｒ１は、既に述べた通りである。この実施形態において、標的とエクステンダーとの間で形成される供給結合は、ジスルフィド結合であり、従って、可逆性の共有結合である。本方法の１つのバリエーションにおいて、標的は、標的−エクステンダー複合体を１つ以上の候補リガンドと接触させる前に、エクステンダーと接触させられる。別のバリエーションにおいて、標的は、エクステンダーおよび１つ以上の候補リガンドを含むプールと接触させられる。
【００２７】
本発明の別の局面において、以下を包含する方法が提供される：
目的の部位の外側に位置する反応性チオールを有する標的を提供する工程；
この標的を、エクステンダーと接触させ、これによって標的−エクステンダー複合体を形成する工程であって、このエクステンダーは、反応性チオールと第１の共有結合を形成する第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む、工程；
この標的−エクステンダー複合体を、第２の官能基とジスルフィド結合を形成し得る基を有する候補リガンドと接触させる工程；
この標的−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間でジスルフィド結合を形成し、これによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；および
この標的−エクステンダー−リガンド結合体中に存在する候補リガンドを同定する工程。
【００２８】
１つの実施形態において、標的上の反応性チオールは、天然に存在するタンパク質配列の一部であるシステイン由来の天然に存在する−ＳＨである。別の実施形態において、標的上の反応性チオールは、操作された−ＳＨ基であり、ここで、システインに対して、変異誘発が、天然に存在するアミノ酸を変異させるために使用された。
【００２９】
別の実施形態において、標的タンパク質は、反応性チオールとして、ジスルフィドの形態のマスクされた−ＳＨを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールがジスルフィドとしてマスクされている、システインを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールが別のシステインとのジスルフィド結合としてマスクされている、システインを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールがグルタチオンとのジスルフィド結合としてマスクされている、システインを有する。別の実施形態において、標的タンパク質は、チオールが式−ＳＳＲ１（Ｒ１は、既に述べた通りである）のジスルフィドとしてマスクされている、システインを有する。
【００３０】
別の実施形態において、反応性チオールと第１の官能基との間の共有結合は、不可逆的な共有結合である。別の実施形態では、反応性チオールと第１の官能基との間の共有結合は、可逆的な共有結合である。
【００３１】
別の実施形態において、第２の官能基は、マスクされたチオールであり、本方法はさらに、標的−エクステンダー複合体を形成した後で、第２の官能基を脱マスク化する工程を包含する。別の実施形態において、第２の官能基は、チオエステルであり、本方法はさらに、チオエステルをチオールに変換することによって、チオエステルを脱マスク化する工程を包含する。
【００３２】
別の実施形態において、標的−エクステンダー複合体は、還元剤の存在下で、候補リガンドと接触させられる。適切な還元剤の例示的な例としては、システイン、システアミン、ジチオトレイトール、ジチオエリトリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロプリオン酸（３−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ホスフィン（例えば、トリス−（２−カルボキシエチル−ホスフィン）（「ＴＣＥＰ」））または水素化ホウ素ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、還元剤は、２−メルカプトエタノールである。別の実施形態において、還元剤は、システアミンである。別の実施形態において、還元剤は、グルタチオンである。別の実施形態において、還元剤は、システインである。
【００３３】
別の実施形態において、第１の官能基は、標的を変性させない条件下で、標的の反応性チオールと不可逆的な共有結合を形成し得る基であり、第２の官能基は、−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。適切な基についての特に包括的な議論が、Ｐｏｗｅｒｓら、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １０２：４６３９−４７５０（２００２）に見出される（これは、本明細書中で参考として援用される）。１つの実施形態において、第１の官能基は、ＳＮ２様の付加を受け得る基である。このようなエクステンダーの例示的な例としては、以下が挙げられる：
（ｉ）α−ハロ酸、例えば以下
【００３４】
【化５】
2006506947.tif 000003
；
（ｉｉ）フルオロホスフェート、例えば以下
【００３５】
【化６】
2006506947.tif 000004
；
（ｉｉｉ）エポキシド、例えば以下
【００３６】
【化７】
2006506947.tif 000005
；
（ｉｖ）アジリジン、例えば以下
【００３７】
【化８】
2006506947.tif 000006
；
（ｖ）チイラン（ｔｈｉｉｒａｎｅ）、例えば以下
【００３８】
【化９】
2006506947.tif 000007
；
（ｖｉ）ハロメチルケトン／アミド、例えば以下
【００３９】
【化１０】
2006506947.tif 000008
ここで、
【００４０】
【化１１】
2006506947.tif 000009
およびＲは、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ２０の非置換脂肪族、Ｃ１〜Ｃ２０の置換脂肪族、非置換アリール、および置換アリールである；Ｒ’は、Ｈ、−ＳＲ１であり、ここで、Ｒ１は、既に定義した通りであり；そして、Ｘは、脱離基である。その例示的な例としては、ハロゲン、Ｎ２、ＯＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ａｒ２、−ＮＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、−（Ｃ＝Ｏ）Ｒ、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒおよび−ＳＲが挙げられる。
【００４１】
別の実施形態において、第１の官能基は、ＳＮアリール様の付加を受け得る機である。適切な基の例示的な例としては、７−ハロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚａｏｌｅ）、およびオルト／パラでニトロ置換された、以下のようなハロベンゼンが挙げられる。
【００４２】
【化１２】
2006506947.tif 000010
ここで、Ｒ’およびＸは、既に定義した通りである。
【００４３】
別の実施形態において、第１の官能基は、Ｍｉｃｈａｅｌ型の付加を受け得る。適切な機の代表的な例としては、電子吸引系（例えば、カルボニル、イミン、キニン、ＣＮ、ＮＯ２、−Ｓ（＝Ｏ）−、およびビニルスルホン）に隣接する二重結合または三重結合を含む、任意の部分が挙げられる。このようなこのようなエクステンダーの代表的な例としては、以下が挙げられる：
【００４４】
【化１３】
2006506947.tif 000011
図１Ａは、目的の部位の外側の標的に結合されるエクステンダーを使用する、係留の１つの実施形態を示す。示されるように、目的の部位（円形のくぼみとして示される）の外側に位置する反応性の基（この場合、チオール）を有する標的が提供される。第１の官能基（Ｘ）および第２の官能基（この場合、ＳＲ’−、チオールまたはマスクされたチオールであり、ここで、Ｒ’は、Ｈ、ＳＲ１、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１である）を有するエクステンダー（楕円によって示される）が、標的の反応性機と第１の官能基との間の共有結合を介して標的に結合され、これによって、標的−エクステンダー複合体を形成する。第２の官能基は、候補リガンドとの標的−エクステンダー複合体の接触によって、目的の部位をプローブするために使用される。候補リガンドが、目的の部位に対する親和性を保有する場合、第２の共有結合が、標的−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間に形成され、これによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する。目的の部位に対する結合親和性を有するリガンドは、得られる標的−エクステンダー−リガンド結合体を分析することによって、同定される。
【００４５】
一旦、リガンドが目的の部位について同定されると、このリガンドは、次に、隣接する部位が存在する状況において、この隣接する部位をプローブするために使用され得る。このような場合、隣接する部位は、引き続く回の係留における新たな目的の部位になる。
【００４６】
伸長された係留方法においてリガンド結合情報を使用するための１つのアプローチが、図１Ｂに示される。示されるように、もとのエクステンダーは、既知のリガンド情報の観点で改変される。この情報は、以前の係留実験または他の公知の方法から生じ得る。改変されたエクステンダーは、主として、結合決定部分（円によって示される）、リガンド（または候補リガンド）の一部の組み込み、もとの目的の部位に対する結合親和性を有すること、および必要に応じて、第２の官能基の位置によって、もとのエクステンダーとは異なる。もとのエクステンダーの場合と同様に、改変されたエクステンダーは、目的の部位の外側の反応性基と共有結合を形成する、第１の官能基を有する。第２の官能基は、この官能基がもとの目的の部位（円形のくぼみによって示される）に隣接する部位（矩形の窪みによって示される）をプローブするための位置にくるように位置する。次いで、改変されたエクステンダーは、先に議論されたものと類似の様式で使用される。一旦、第２の結合決定部分（矩形によって示される）が同定されると、第１の結合決定部分および第２の結合決定部分が、複合化合物に合わされる。見られ得るように、もとのエクステンダー（楕円によって示される）は、複合化合物に組み込まれる必要がない。
【００４７】
本発明の別の局面において、標的が反応性の求核試薬を目的の部位内に含み、そしてこの求核試薬を保存することが有利である場合に使用するための、係留方法が提供される。代表的に、この第１の反応性求核試薬は、活性部位の残基であり、そしてこの残基を落とすこと（この残基を不活性なアミノ酸に変異すること）は、酵素機能を保存することと適合性ではない。以前の方法の場合と同様に、目的の部位の外側の反応性求核試薬（第２の反応性求核試薬）は、係留のために使用される。目的の部位の外側の第２の反応性求核試薬を介して標的に結合されたエクステンダーが使用される。このエクステンダーは、第１の反応性求核試薬の代わりの第２の反応性求核試薬に結合する。なぜなら、このエクステンダーはまた、目的の部位に特異的な結合決定部分を含むからである。この結合決定部分は、一時的な栓として機能し、これは引き続いて切断されて、潜在的な官能基を明らかにする。次いで、係留が、先に議論されたように、潜在的な官能基を使用して進行し、新たな栓されていない目的の部位を調査する。
【００４８】
従って、この方法は、以下を包含する：
ａ）標的を提供する工程であって、この標的は、目的の部位の内側に位置する第１の反応性求核試薬、および目的の部位の外側に位置する第２の反応性求核試薬を有する、工程；
ｂ）この標的をエクステンダーと接触させて、これによって、標的−エクステンダー複合体を形成する工程であって、このエクステンダーは、第１の官能基および潜在的な第２の官能基、切断可能なリンカーならびに結合決定部分を含み、ここで、この第１の官能基は、第２の反応性求核試薬と第１の共有結合を形成し、そしてこの結合決定部分は、目的の部位に結合する、工程；
ｃ）第２の官能基を露出させて、目的の部位から結合決定部分を解放することによって、エクステンダーを、切断可能なリンカーにおいて切断し、これによって、改変された標的−エクステンダー複合体を形成する工程；
ｄ）改変された標的−エクステンダー複合体を、候補リガンドと接触させる工程であって、この候補リガンドは、第２の官能基と第２の共有結合を形成し得る基を含む、工程；
ｅ）第２の共有結合を、改変された標的−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間に形成し、これによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
ｆ）標的−エクステンダー−リガンド結合体に存在する候補リガンドを同定する工程。
【００４９】
１つの実施形態において、第１の反応性求核試薬は、−ＯＨであり、そして第２の反応性求核試薬は、−ＳＨである。別の実施形態において、第１の反応性求核試薬は、−ＳＨであり、そして第２の反応性求核試薬は、−ＯＨである。別の実施形態において、第１の反応性求核試薬と第２の反応性求核試薬との両方が、各々−ＯＨである。別の実施形態において、第１の反応性求核試薬と第２の反応性求核試薬との両方が、各々−ＳＨである。
【００５０】
別の実施形態において、エクステンダーは、以下を含む：ａ）標的上の第２の反応性求核試薬と不可逆共有結合を形成し得る、第１の官能基；およびｂ）ジスルフィド結合を形成し得る、潜在的な第２の官能基。
【００５１】
図２は、この形態の係留の１つの実施形態を示し、ここで、標的は、目的の部位における第１の反応性求核試薬、および目的の部位の外側の第２の反応性求得核試薬を含む。示されるように、目的の部位（円形のくぼみとして示される）、目的の部位における第１の反応性求核試薬（図示せず）、および目的の部位の外側に位置する第２の反応性求核試薬（この場合、チオール）を有する標的が、提供される。第１の官能基（Ｘ）、潜在的な第２の官能基、切断可能なリンカー、および結合決定部分（点を有する円）を有するエクステンダー
【００５２】
【化１４】
2006506947.tif 000012
は、標的の反応性基と第１の官能基との間の共有結合を介して標的に結合され、これによって、標的−エクステンダー複合体を形成する。このエクステンダーは、引き続いて切断されて、改変された標的−エクステンダー複合体を形成し、第２の官能基を明らかにし、そして目的の部位から結合決定部分を放出する。次いで、第２の官能基を使用して係留が実施され、目的の部位がプローブされる。改変された標的−エクステンダー複合体は、１つ以上の候補リガンドと接触される。候補リガンドが目的の部位に対して親和性を保有する場合、第２の共有結合が、改変された標的−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間に形成され、これによって、標的−エクステンダー−リガンド結合体を形成する。目的の部位に対する結合親和性を有するリガンドは、得られた標的−エクステンダー−リガンド結合体を分析することによって、同定される。
【００５３】
一般に、変異されて反応性求核試薬を提供するべき残基は、溶媒アクセス可能である。溶媒アクセス可能性は、構造モデルから、標準的な数値的方法（Ｌｅｅ，Ｂ．＆  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１）；Ｓｈｒａｋｅ，Ａ．およびＲｕｐｌｅｙ，Ｔ．Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９：３５１−３７１（１９７３））または分析方法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７０９−７１３（１９８３）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９（１９８４））を使用して、計算され得る。例えば、潜在的なシステイン改変体は、炭素−β（Ｃβ）または硫黄−γ（Ｓγ）の合わせた表面積が、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓの方法（Ｌｅｅ，Ｂ．およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１））によって計算される場合に、約２０Å２より大きい場合に、溶媒アクセス可能であるとみなされる。この値は、Ｃｒｅａｍｅｒら（Ｃｒｅａｍｅｒ，Ｔ．Ｐ．ら．Ｂｉｏｃｈｅ，ｍｉｓｔｙ  ３４：１６２４５−１６２５０（１９９５））によって記載されるようなシステイン側鎖にアクセス可能な理論的表面積の約３３％に相当する。
【００５４】
変異されて反応性求核試薬を提供するべき残基が、骨格原子との水素結合に関与しないか、または最大でも、１つのみの水素結合を介して骨格と相互作用することもまた好ましい。側鎖が、他の側鎖との複数（１より大）の水素結合に関与する野生型残基もまた、さほど好ましくない。全ての標準的な回転異性体（−６０°、６０°、または１８０°のχ１角度）が、任意の他の残基のＮ原子、Ｃα原子、Ｃ原子、Ｏ原子、またはＣβ原子との好ましくない立体接触を導入し得る改変体もまた、さほど好ましくない。好ましくない接触とは、関与する原子のファンデルワールス半径の合計の８０％未満の原子間距離として定義される。
【００５５】
他の好ましい改変体は、所望の求核性残基に変異される場合に、目的の部位に対するベクトルを提供するコンホメーションを保有する改変体である。例えば、システインに対する残基を変異させる場合、このシステインは、Ｃｙｓ−ＳＳＲを含むように係留される場合に、Ｒの原子を目的の部位のほうへと指向する許容可能なコンホメーションを保有するべきである。２つの一般的な手順が、好ましい改変体を同定するために使用され得る。第１の手順において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ｍ．ら．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２３５−２４２（２０００））における独特の構造（Ｈｏｂｏｈｍ，Ｕ．ら．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４０９−４１７（１９９２））からなる検索がなされて、ジスルフィド結合したシステインを位置ｊにおいて含む構造フラグメントを同定し、ここで、このフラグメントの残基ｊ−１、ｊ、およびｊ＋１の骨格原子は、標的分子の残基ｉ−１，ｉ、およびｉ＋１の骨格原子と、０．７５平方オングストローム未満のＲＭＳＤで重なり得る。残基ｉ（システインに変異される場合）のＣβ原子よりも目的の部位の任意の原子により近い位置ｊに、システインにジスルフィド結合する残基のＣβ原子を配置するフラグメントが同定される場合、位置ｉは、好ましいとみなされる。代替の手順において、位置ｉにおける残基は、システインに計算的に「変異」され、ジスルフィド結合を介してＳ−メチル基でキャップされ（その結果、側鎖は−ＣＨ２ＳＳＣＨ３である）、そしてシステインについて標準的な回転異性体コンホメーションに配置される。この残基は、Ｓ−メチル基のメチル炭素をこの残基のＣβ原子よりも目的の部位の近くに配置する、少なくとも１つの回転異性体で置換され得る場合、システイン変異のための適切な候補であるとみなされる。
【００５６】
反応性求核試薬を提供する残基を付加することに加えて、反応性基を保有する１つ以上の天然に存在する残基を検出することが望ましくあり得る。例えば、反応性システインが、他のアミノ酸（例えば、アラニン）で置き換えられ得る。
【００５７】
種々の組換え技術、化学技術、合成技術、および／または他の技術が、係留において使用するために標的を改変するために使用され得る。このような技術としては、例えば、標的ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異誘発（その結果、この核酸配列は、異なる数のシステイン残基を有するポリペプチドをコードする）が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用する部位特異的変異誘発は、例えば、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５号、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１５章（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９１）に記載されている。他の部位特異的変異誘発技術もまた、当該分野において周知であり、そして例えば、以下の刊行物に記載されている：Ａｕｓｕｂｅｌら，前出，第８章；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，ＤＮＡ  ３：４７９−４８８（１９８４）；Ｚｏｌｌｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）；Ｂｒａｋｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：４６４２−４６４６（１９８４）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｕｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７），Ａｄｅｌｍａｎら，ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）；ならびにＣａｒｔｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）。カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｇｅｎｅ，３４：３１５［１９８５］）および制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５［１９８６］）もまた使用され得る。
【００５８】
１つより多いアミノ酸置換を有するアミノ酸配列改変体が、いくつかの様式のうちの１つで作製され得る。これらのアミノ酸が、ポリペプチド鎖において一緒に近くに位置する場合、これらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して、同時に変異され得る。しかし、これらのアミノ酸が互いからいくらかの距離をおいて位置する（例えば、１０より多いアミノ酸によって分離される）場合、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することは、より困難である。代わりに、２つの代替的方法のうちの１つが使用され得る。第１の方法において、別のオリゴヌクレオチドが、置換されるべき各アミノ酸に対して作製される。次いで、これらのオリゴヌクレオチドは、同時に一本鎖テンプレートＤＮＡにアニーリングされ、そしてこのテンプレートから合成されたＤＮＡの第２の鎖は、所望のアミノ酸置換の全てをコードする。代替の方法は、所望の変異体を産生するために、２回以上の変異誘発を包含する。
【００５９】
標的上の反応性基とエクステンダーとの間、標的−エクステンダー複合体とリガンドとの間、または２つのリガンドの間に、可逆的または不可逆的な共有結合を形成するための合成方法は、当該分野において周知であり、そして基本的な教科書（例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｉｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第４版，１９９２）に記載されている。アルデヒドとケトンとアミンとの間の還元的アミノ化は、例えば、Ｍａｒｃｈら（前出）、８９８−９００頁に記載されている；アミンを調製するための代替的方法は、１２７６頁に記載されている；ヒドラゾンおよびヒドラゾン誘導体（例えば、セミカルバゾン）を得るためのアルデヒドとケトンとヒドラジド誘導体との間の反応は、９０４−９０６頁に記載されている；アミド結合の形成は、１２７５頁に記載されている；尿素の形成は、１２９９頁に記載されている；チオカルバメートの形成は、８９２頁に記載されている；カルバメートの形成は、１２８０頁に記載されている；スルホンアミドの形成は、１２９６頁に記載されている；チオエーテルの形成は、１２９７頁に記載されている；ジスルフィドの形成は、１２８４頁に記載されている；エーテルの形成は、１２８５頁に記載されている；エステルの形成は、１２８１頁に記載されている；エポキシドに対する付加は、３６８頁に記載されている；アジリジンに対する付加は、３６８頁に記載されている；アセタールおよびケタールの形成は、１２６９頁に記載されている；カーボネートの形成は、３９２頁に記載されている。決定部分の形成は、１２６４頁に記載されている；アルケンの複分解は、１１４６−１１４８頁に記載されている（Ｇｒｕｉｂｂｓら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：４４６−４５３［１９９５］もまた参照のこと）；遷移金属により触媒される、アリールハライドおよびスルホネートと、アルカンおよびアセチレンとのカップリングは、例えば、Ｈｅｃｋ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，７１７−１７８頁に記載されている；アリールハライドとスルホネートの、有機金属試薬（例えば、オルガノボロン試薬）との反応は、６６２頁（Ｍｉｙａｕｒａら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２４５７［１９９５］もまた参照のこと）に記載され値得る；有機スズ、および有機亜鉛試薬、オキサゾリジンの形成（Ｅｄｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２８：７１１９−７１２２［１９９７］）；チアゾリジンの形成（Ｐａｔｅｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．３６：２２２７−２２３０［１９９５］）；イミドエステルを介してアミンを結合させることによって、アミジン基を介して結合したアミン（Ｄａｖｉｅｓら，Ｃａｎａｄｉａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｃ５０：４１６−４２２［１９７２］）など。
【００６０】
（ＰＴＰ）
説明の目的で、上記方法は、重要なクラスの標的である、タンパク質チロシンホスファターゼ（「ＰＴＰ」）に適用される。これらの方法は、ＰＴＰと共に使用するために特にあつらえられた、より一般的な伸長した係留方法の観点で記載される。
【００６１】
チロシンリン酸化は、可逆的かつ動的であり、そしてリン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質との間の平衡は、タンパク質チロシンキナーゼ（「ＰＴＫ」）（これは、リン酸基の付加を触媒する）およびタンパク質チロシンホスファターゼ（「ＰＴＰ」）（これは、付加されたリン酸基の逆活性または除去を触媒する）の逆の活性によって支配される。最近の研究は、チロシンリン酸化が、正常な細胞から細胞への伝達、細胞周期、細胞成長および増殖、細胞移動、分化、遺伝子転写、免疫応答、イオンチャンネル、代謝、および生存を制御する際に必須であることを示す。その結果、ＰＴＰは、薬物発見の努力のための目標になっている。なぜなら、タンパク質中のリン酸化チロシンおよび非リン酸化チロシンの、経路における欠損またはレベルの不均衡が、多くのヒト疾患（例えば、癌、糖尿病、慢性関節リウマチおよび高血圧症）に寄与するからである。
【００６２】
ＰＴＰの特質は、ＰＴＰシグネチャーモチーフ（Ｈ／Ｖ）Ｃ（Ｘ）５Ｒ（Ｓ／Ｔ）の存在であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸残基である。Ｚｈａｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：４１６−４２３（２００１）；およびＺｈａｎｇ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ４２：２０９−２３４（２００２）を参照のこと。ＰＴＰシグネチャーモチーフは、触媒性ＰＴＰドメインの活性部位における重要なループ（ＰＴＰループまたはＰループと称される）において見出され、そして３つの必須の触媒性残基のうちの２つ（システインおよびアルギニン）を含む。第三の触媒性残基は、アスパラギン酸であり、そしてＷＰＤループ（可撓性ループとしてもまた公知）において見出される。さらに、全てのＰＴＰは、金属イオンの存在なしでｐ−ニトロフェニルホスフェートを加水分解するそれらの能力、バナジン酸塩に対する感受性、およびオカダ酸に対する非感受性によって、特徴付けられる。
【００６３】
ＰＴＰは、３つのサブファミリーに分類され得る：１）チロシン特異的ホスファターゼ；２）二重特異性ホスファターゼ；および３）低分子量ホスファターゼ。チロシン特異的ＰＴＰは、さらに、２つの郡に分割され得る：ａ）レセプター型ＰＴＰおよびｂ）非レセプター型ＰＴＰ。レセプター型ＰＴＰは、一般に、細胞外の推定リガンド結合ドメイン、単一の膜貫通領域、および１つまたは２つの細胞質ＰＴＰドメインを有する。触媒性ドメインは、ＰＴＰドメインと称される。表１は、レセプター型ＰＴＰの代表的な例、適応症、および特定のレセプターＰＴＰがさらに詳細に記載されている参考文献を含む。
【００６４】
【表１】
2006506947.tif 000013
非レセプター型ＰＴＰは、単一の触媒性ドメインおよび種々のアミノ末端伸長またはカルボキシ末端伸長を含む。これらの伸長は、ＳＨ２ドメイン、ＰＤＺドメイン、および細胞外リガンド結合ドメインを含む。表２は、非レセプター型ＰＴＰの代表的な例、適応症、および特定のＰＴＰがさらに詳細に記載されている参考文献を含む。
【００６５】
【表２】
2006506947.tif 000014
ＰＴＰ、二重特異的ＰＴＰおよび低分子量ホスファターゼの他の２つのサブファミリーは、チロシン特異的ＰＴＰのように文献中で良く特徴付けされていない。その名前が含意するように、二重特異的ＰＴＰは、ホスホチロシン含有タンパク質およびホスホセリンまたはホスホトレオニン含有タンパク質の両方からリン酸を除去し得る。二重特異的ＰＴＰの例示的な例としては、Ｃｄｃ２５Ａ、ＰＴＥＮ、およびＭＡＰキナーゼホスファターゼが挙げられる。最後に、低分子量ホスファターゼは、それらが一般にＰＴＰドメインのみを含むために、そう名付けられている。
【００６６】
続く方法は、特定のＰＴＰ、ＰＴＰ−１Ｂを参照して記載されるが、ＰＴＰの全ての３つのサブファミリーのＰＴＰドメイン（およそ２３０残基から形成される）の３次元構造が、著しく同様であるという事実に起因して、これらの方法は、一般に全てのＰＴＰに適用可能である。ＰＴＰドメインの構造的類似性は、アミノ酸配列のバリエーションおよびチロシン特異的ＰＴＰと二重特異的ＰＴＰとの間の基質特異性における違いの観点において、特筆すべきである。現在までに既知のＰＴＰのＰＴＰドメインの構造的アラインメントを提供する特に有用な出版物は、本明細書中に参考として組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：７１１７−７１３６（２００１）である。
【００６７】
簡潔には、ＰＴＰドメインの全ては、α−ヘリックスによって両側の側面に隣接した高度にねじれた混合したβシートから構成される。驚くべきことではなく、ＰＴＰドメインの活性部位は、ＰＴＰ中で最も保存されており、ｐＴｙｒ結合ポケットを顕著に特徴付ける。ＰＴＰドメインが活性部位を含むために、これはときどき触媒的ドメインと言われる。機能および全体の構造におけるＰＴＰの多様性は、ＰＴＰドメインにしばしば隣接するＮ末端およびＣ末端において見出される多様な非触媒的調節ドメインおよび標的ドメインの存在の結果である。
【００６８】
本発明の１つの局面において、エクステンダーを使用する一般的な方法が、ＰＴＰの活性部位に結合するリガンドを同定するために提供される。１つの実施形態において、本方法は、反応性チオールとして活性部位システイン（例えば、ＰＴＰ−１ＢにおけるＣ２１５）を使用し、以下を包含する：
ａ）活性部位チオールを有するＰＴＰを提供する工程；
ｂ）ＰＴＰをエクステンダーと接触させ、それによりＰＴＰ−エクステンダー複合体を形成する工程であって、ここでエクステンダーが、活性部位チオールとの共有結合を形成する第１の官能基およびジスルフィド結合を形成可能である第２の官能基を含む；
ｃ）ＰＴＰ−エクステンダー複合体を、第２の官能基とジスルフィド結合を形成し得る基を含む候補リガンドと接触させる工程；
ｄ）ＰＴＰ−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間のジスルフィド結合を形成し、それによりＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
ｅ）ＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体中に存在する候補リガンドを同定する工程。
【００６９】
１つの実施形態において、ＰＴＰは、還元剤の存在下で候補リガンドと接触される。適切な還元剤の例示的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：システイン、システアミン、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオエリトリトール、グルタチオン、２−メルカプトエタノール、３−メルカプトプロピオン酸、トリス−（２−カルボキシエチル−ホスフィン）（「ＴＣＥＰ」）のようなホスフィン、または水素化ホウ素ナトリウム。１つの実施形態において、還元剤は、２−メルカプトエタノールである。別の実施形態において、還元剤はシステアミンである。別の実施形態において、還元剤はグルタチオンである。別の実施形態において、還元剤はシステインである。
【００７０】
別の実施形態において、候補リガンドは−ＳＨ基を有する。別の実施形態において、候補リガンドはマスクされたチオールを有する。別の実施形態において、候補リガンドは式−ＳＳＲ１のジスルフィドの形態においてマスクされたチオールを有し、ここでＲ１は、非置換Ｃ１−Ｃ１０脂肪族、置換Ｃ１−Ｃ１０脂肪族、非置換芳香族または置換芳香族である。別の実施形態において、候補リガンドは、式−ＳＳＲ２Ｒ３のジスルフィドとして、マスクされたチオールを有し、ここでＲ２は、Ｃ１−Ｃ５アルキル（好ましくは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）であり、Ｒ３は、ＮＨ２、ＯＨまたはＣＯＯＨである。別の実施形態において、候補リガンドは式−ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＯＨのジスルフィドとしてマスクされたチオールを有する。さらに別の実施形態において、候補リガンドは式−ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２のジスルフィドとしてマスクされたチオールを有する。候補リガンドの例示的な例としては、以下が挙げられる：
【００７１】
【化１５】
2006506947.tif 000015
。
【００７２】
別の実施形態において、このエクステンダーは、上記のような第１の官能基および第２の官能基を包含し、活性部位に対する固有の結合親和性を有する結合決定部分を含む。結合決定部分が第１の官能基および第２の官能基を既に含まない場合、この要素はこれらの官能基を含むように改変され得る。１つの方法において、連結が結合決定部分Ｒｃを同定するために使用され、この要素は続いて、第１の官能基および第２の官能基を含むように改変される。別の方法において、結合決定部分は、標的の公知の基体またはそのフラグメントから得られる。
【００７３】
別の実施形態において、エクステンダーは、上記のような第１の官能基および第２の官能基を包含し、結合決定部分としてホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む。ホスホチロシン模倣物は、例えばＢｕｒｋｅら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，６０：３２−４４（２００１）において記載され、これは参考として本明細書中で援用される。別の実施形態において、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物は、以下からなる群より選択される：
【００７４】
【化１６】
2006506947.tif 000016
。
【００７５】
別の実施形態において、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物は、以下からなる群より選択される：
【００７６】
【化１７】
2006506947.tif 000017
。
【００７７】
別の実施形態において、エクステンダーの第１の官能基および第２の官能基は、各々独立して−ＳＨまたはマスクされた−ＳＨである。マスクされたチオールの例示的な例は、式−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１のチオエステルまたは式−ＳＳＲ１のジスルフィドであり、ここでＲ１は、以前に記載されている。この実施形態において、標的とエクステンダーとの間で形成される共有結合は、ジスルフィド結合であり、従って可逆的な共有結合である。この方法の１つのバリエーションにおいて、標的は、エクステンダーと接触され、その後標的−エクステンダー複合体が１つ以上の候補リガンドと接触される。別のバリエーションにおいて、標的は、エクステンダーおよび１つ以上のリガンドを含むプールと接触される。
【００７８】
別の実施形態において、エクステンダーは、候補リガンドと共有結合を形成し得るマスクされたチオールをさらに含むアルキル化剤を含む。１つの方法において、このアルキル化剤は、ハロメチルケトンまたはハロメチルアセトアミドである。クロロメチルケトンの例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【００７９】
【化１８】
2006506947.tif 000018
ここでｎは、１〜５であり、より好ましくは１〜３である。別の方法において、このアルキル化剤は、クロロメチルケトンである。別の方法において、このアルキル化剤は、クロロメチルアセトアミドである。クロロメチルアセトアミドエクステンダーの例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
【００８０】
【化１９】
2006506947.tif 000019
。
【００８１】
これらのクロロメチルケトンおよびクロロメチルアセトアミドは、第１の官能基および第２の官能基を含むエクステンダーの例である。これらのエクステンダーを作る方法は、実施例１〜８に記載される。
【００８２】
スキーム１は、ＰＴＰと結合するリガンドを誘導するこのようなエクステンダーを使用するための１つの方法を例示する。
【００８３】
【化２０】
2006506947.tif 000020
示されるように、このエクステンダーを使用して、活性部位であるチオールを改変し、そしてマスクされた第２の官能基、マスクされたチオールが、脱保護される。次いで、ＰＴＰエクステンダー複合体は、連結実験において使用され、候補リガンドのライブラリと接触される。ＰＴＰ−１Ｂを有するエクステンダーを用いる連結方法の１つの実施形態が、実施例９にさらに記載される。連結は、ホスホチロシン結合部位（ここに活性部位チオールが存在する）に隣接する部位に特異的な結合決定部分Ｒを同定する。結果として、ＰＴＰの活性部位インヒビターである結合体化合物は、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を同定された結合決定部分Ｒと結合させることによって作製され得る。ジスルフィド結合が一般的に安定でないために、これらの結合は、結合体化合物を作製するときに代表的に置換される。
【００８４】
スキーム２は、第１の官能基がフェニル環の外に位置してホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物の重なりを助けるエクステンダーを用いる結合体化合物を作製するための方法のバリエーションを例示する。
【００８５】
【化２１】
2006506947.tif 000021
１つのこのような結合体化合物の合成が、実施例１０にさらに記載される。
【００８６】
本発明の別の局面において、エクステンダーストラテジーが、活性部位において共有結合を形成することなく用いられ、本発明における可能性のある構造的再構成を最小化する。上に記載された方法のように、このエクステンダーは、反応性チオールと共有結合を形成し得る第１の官能基、およびジスルフィドを形成し得る第２の官能基を含む。
【００８７】
この方法は第１に、ＰＴＰにおける反応性チオールの位置において上記の方法と異なる。活性部位チオールを用いる代わりに、活性部位の外に位置する反応性チオールが、用いられる。必要に応じて、このエクステンダーは、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物をさらに含む。
【００８８】
従って、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）活性部位の外に位置した反応性チオールを有するＰＴＰを提供する工程；
ｂ）ＰＴＰをエクステンダーと接触させ、それによりＰＴＰエクステンダー複合体を形成し、ここでこのエクステンダーが、反応性チオールと共有結合を形成する第１の官能基およびジスルフィド結合を形成し得る第２の官能基を含む；
ｃ）ＰＴＰエクステンダー複合体を第２の官能基と共有結合を形成し得る基を含む候補リガンドと接触させる工程；
ｄ）ＰＴＰエクステンダー複合体と候補リガンドとの間のジスルフィド結合を形成し、それによりＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
ｅ）ＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体中に存在している候補リガンドを同定する工程。
【００８９】
エクステンダーがホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む実施形態において、共有結合が、反応性チオール（活性部位の外に位置される）と第１の官能基との間に形成され、これによりＰＴＰ−エクステンダー複合体を形成する。共有結合は、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物が活性部位と結合するために、活性部位システイン（例えば、ＰＴＰ−１ＢにおけるＣ２１５）の間に形成されず、従って、活性部位チオールと第１の官能基との間の共有結合を妨げる。従って、第２の官能基を用いる結合実験は、ＰＴＰにおけるホスホチロシン結合部位に隣接する部位に結合するリガンドを同定する。
【００９０】
１つの実施形態において、ＰＴＰは、ヒトＰＴＰ−１ＢにおけるＲ４７に対応する位置にて天然に存在するアミノ酸の代わりにシステインを含む。図３は、ヒトＴＣ−ＰＴＰおよびヒトＬＡＲと整列されたヒトＰＴＰ−１Ｂの最初の２９８残基を示す。見られ得るように、ヒトＴＣ−ＰＴＰにおいて対応する残基はまた、アルギニンであり、ヒトＬＡＲにおいては、アラニンである。他のＰＴＰにおいて対応する残基は、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：７１１７−７１３６（２００１）において開示される構造的アラインメントを用いて同定され得る。
【００９１】
標的が活性部位の外に、１つ以上の天然に存在するシステインを含む場合、これらのシステインは、アラニン、セリン、またはバリンのような別の残基に変異されて、二重標識の可能性を除き得る。例えば、ＰＴＰ−１Ｂは、２つのこのようなシステイン、Ｃ３２およびＣ９２を含み、これらＣ３２およびＣ９２は、これらが別のアミノ酸に変異されて所望されない標識を防ぐ連結実験において十分反応性であった。好ましい実施形態において、Ｃ３２はセリンに変異され、Ｃ９２はアラニンに変異される。ヒトＰＴＰ−１Ｂのクローニングおよびそのシステイン変異体は、実施例１１および１２それぞれにおいてさらに記載される。
【００９２】
別の実施形態において、エクステンダーは、以下の式：
【００９３】
【化２２】
2006506947.tif 000022
であり、ここでＡは、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む部分であり、Ｌ１はリンカーであり、Ｘはハライドであり、または隣接する炭素原子と結合しており、この炭素原子は、炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合している。第１の官能基は、Ｘであり、第２の官能基は、Ａにも位置し得るが、一般的にＬ１に位置する。別の実施形態において、Ａは、以下からなる群より選択される：
【００９４】
【化２３】
2006506947.tif 000023
。
【００９５】
別の実施形態において、Ａは、以下からなる群より選択される：
【００９６】
【化２４】
2006506947.tif 000024
。
【００９７】
このような例示的な実施形態としては、以下が挙げられる：
【００９８】
【化２５】
2006506947.tif 000025
。
【００９９】
これらの型のエクステンダーを作製するための例示的な方法が、実施例１３〜２０に記載される。
【０１００】
スキーム１および２によって概説されるような同様の方法を使用して、これらのエクステンダーを使用する結合体化合物を作製し得る。スキーム３は、このような方法についての１つの実施形態を例示する。
【０１０１】
【化２６】
2006506947.tif 000026
見られ得るように、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物が、結合決定部分Ｒと結合し、これは連結から同定される。活性部位の外側と結合するエクステンダーの部分は、結合体化合物から脱離される。このようなストラテジーを使用して誘導された結合体化合物の例示的な例は、実施例２１〜２５においてさらに記載される。
【０１０２】
本発明の別の局面において、新規なホスホチロシン模倣物を同定する方法が、提供される。この方法は、活性部位システインおよび活性部位の外側に位置する反応性チオールを有するＰＴＰ、ならびに反応性チオールと共有結合を形成し得る第１の官能基潜在的な第２の官能基を有する切断可能リンカー、およびホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む部分を含むエクステンダーを使用する。ＰＴＰがエクステンダーと接触する場合、共有結合が、反応性チオールと第１の官能基との間に形成され、それによりＰＴＰ−エクステンダー複合体を形成する。共有結合は、活性部位システインの間では形成されない（例えば、ＰＴＰ−１ＢにおけるＣ２１５）。なぜなら、ホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物が、活性部位と結合して一時的な栓として働き、従って活性部位チオールと第１の官能基との間の共有結合の形成を妨げるためである。次いで、切断されたリンカーは、切断されて第２の官能基を露出し、それによりホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を放出し、第２の官能基が連結実験に使用されてＰＴＰにおけるホスホチロシン結合部位に結合する新規なリガンドを同定する。
【０１０３】
従って、この方法は以下の工程を包含する：
ａ）活性部位を有するＰＴＰ、活性部位に位置するシステインおよび活性部位の外側に位置する反応性チオールを提供する工程；
ｂ）ＰＴＰをエクステンダーに接触させて、それによりＰＴＰエクステンダー複合体を形成する工程であって、このエクステンダーが、第１の官能基および潜在的な第２の官能基、切断可能リンカー、ならびにホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む結合決定部分を含み、ここで第１の官能基が、反応性チオールとの第１の共有結合を形成し、結合決定部分が活性部位と結合する、工程；
ｃ）エクステンダーを切断可能リンカーにて切断させて、それにより第２の官能基を露出させ、活性部位から結合決定部分を放出することによって、改変されたＰＴＰ−エクステンダー複合体を形成する工程；
ｄ）改変されたＰＴＰエクステンダー複合体を、第２の官能基との第２の共有結合を形成し得る基を含む候補リガンドと接触させる工程；
ｅ）改変されたＰＴＰ−エクステンダー複合体と候補リガンドとの間に第２の共有結合を形成し、それによりＰＴＰ−エクステンダー−リガンド複合体を形成する工程；ならびに
ｆ）ＰＴＰ−エクステンダー−リガンド結合体において存在している候補リガンドを同定する工程。
【０１０４】
１つの実施形態において、エクステンダーは、以下の式の化合物を含む：
【０１０５】
【化２７】
2006506947.tif 000027
ここでＡはホスホチロシンまたはホスホチロシン模倣物を含む部分であり、Ｌは切断可能なリンカーであり、そしてＸはハライドである。別の実施形態において、エクステンダーは、以下の式の化合物を含む：
【０１０６】
【化２８】
2006506947.tif 000028
ここでＡは、以下からなる群より選択される：
【０１０７】
【化２９】
2006506947.tif 000029
ｎは１〜５であり；ｍは２〜５であり、Ｘはハライドである。別の実施形態において、Ａは以下からなる群より選択される：
【０１０８】
【化３０】
2006506947.tif 000030
ｎおよびｍは、独立して２または３であり、そしてＸはブロミドである。実施例２６および２７は、２つの例示的なエクステンダー
【０１０９】
【化３１】
2006506947.tif 000031
の合成を記載する。後者のエクステンダーを、連結実験において使用して、新規なホスホチロシン模倣物を同定した。
【０１１０】
本発明の別の局面において、新規ホスホチロシン模倣物が提供される。一実施形態いおいて、このホスホチロシン模倣物は、以下：
【０１１１】
【化３２】
2006506947.tif 000032
の部分を含む。
【０１１２】
別の実施形態において、このホスホチロシン模倣物は、以下：
【０１１３】
【化３３】
2006506947.tif 000033
の部分を含む。
【０１１４】
別の実施形態において、このホスホチロシン模倣物は、以下：
【０１１５】
【化３４】
2006506947.tif 000034
の部分を含む。
【０１１６】
本明細書全体を通して引用される全ての参考文献は、明示的に、本明細書中に参考として援用される。本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されてきたが、種々の変更が行われ得、特定の状況に本発明を適合させるように等価物で置換され得ることが当業者により理解されるべきである。全てのこのような変更および改変は、本発明の範囲内である。
【０１１７】
本発明は、以下の非限定的実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
本実施例は、以下の化合物：
【０１１９】
【化３５】
2006506947.tif 000035
の合成を記載する。この化合物を、スキームＡに従って生成した。
【０１２０】
【化３６】
2006506947.tif 000036
市販のα−ブロモ−ｐ−トルイル酸（０．５１３ｇ、２．３９ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍｌ）中で１６時間にわたり、チオ酢酸カリウム（０．２７ｇ、２．３６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（０．３３ｇ、２．３９ｍｍｏｌ）と反応させ、次いで、１００ｍｌ  酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を注ぎ、３×５０ｍｌの１Ｍ  硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、白色の皮膜状物質になるまでエバポレートした（０．４８４ｇ、２．３ｍｍｏｌ、９８％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２１１（Ｍ＋Ｈ））。
【０１２１】
この酸を、１０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、氷−水浴中で冷却し、４−メチルモルホリン（ＮＭＭ、０．２６ｍｌ、２．３７ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（ＩＢＣＦ、０．３ｍｌ、２．３１ｍｍｏｌ）で処理した。この反応系を２０分進めて、その後、媒体の硝子フリットを通して濾過し、得られた固体を、５ｍｌのＴＨＦでリンスした。合わせた桃色の濾液を、すり合わせ硝子ジョイントなしで丸底フラスコに入れて、氷水浴中で冷却した。その間、ジアゾメタンを、１１ｍｌのジエチルエーテルを氷−水浴中で冷却し、３．２ｍｌの４０％  水酸化カリウムを添加し、その後１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン（１ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を添加することによって調製した。この溶液を、４５分間撹拌し、次いで、ジアザメタンのエーテル層を、注意深く、上記のカーボネート溶液にデカントした。この反応混合物を、室温までゆっくりと加温し、窒素下で２日間攪拌し、その後、氷上で再び冷却した。ジオキサン（１ｍｌ、４ｍｍｏｌ）中の４Ｍ  ＨＣｌの溶液を添加し、この反応系を８０分間進めた。次いで、残ったジアゾメタンを、酢酸（１ｍｌ）でクエンチし、この反応系に、１００ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、２×５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２×５０ｍｌの１Ｍ  硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。その残渣を逆相クロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を淡黄色液体（０．０７ｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１３％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２４３（Ｍ＋Ｈ））として得た。
【０１２２】
（実施例２）
本実施例は、以下の化合物：
【０１２３】
【化３７】
2006506947.tif 000037
の合成を記載する。
【０１２４】
この化合物を、α−ブロモ−ｐ−トルイル酸の代わりに４−（２−ブロモエチル）安息香酸を使用したことを除いて、実施例１の方法を使用して生成した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２５７（Ｍ＋Ｈ））。
【０１２５】
（実施例３）
本実施例は、以下の化合物：
【０１２６】
【化３８】
2006506947.tif 000038
の合成を記載する。この化合物を、スキームＢに従って生成した。
【０１２７】
【化３９】
2006506947.tif 000039
この化合物を、市販の４−アミノベンジルアルコール（１．９ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）で出発し、これを、２０ｍｌのｐ−ジオキサン、１０ｍｌの水、および１０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム中で、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカーボネート（３．６ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）と反応させて生成した。この反応系を、室温で一晩進め、その際に２０ｍｌの水を添加した。この反応混合物を、３×４０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出し、次いで、その合わせた有機物を、４０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムおよび２×５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、茶褐色の液体になるまで濃縮し、この液体を、７０：３０のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、淡黄色の液体（２．７ｇ、１２ｍｍｏｌ、７９％、ＭＳ  ｍ／ｚ＝２４６（Ｍ＋Ｎａ））を得た。
【０１２８】
得られたベンジルアルコール（０．９２９ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中に溶解し、氷−水浴中で冷却し、トリエチルアミン（０．７ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ）およびメタンスルホニルクロリド（０．３５ｍｌ、４．５２ｍｍｏｌ）で処理した。３時間後、この反応系に１００ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、３×５０ｍｌの１Ｍ  硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、黄色の皮膜状物質になるまでエバポレートした（０．８５９ｇ、２．９ｍｍｏｌ、６９％）。これを、２．５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に再溶解し、次いで、チオ酢酸カリウム（０．３５ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）を添加し、続いて、さらに２．５ｍｌの乾燥ＤＭＦを添加した。この反応系を、１４時間、激しく撹拌し、次いで、１００ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、３×５０ｍｌの１Ｍ  硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、淡褐色の固体になるまでエバポレートし、この固体を、９０：１０のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、淡赤褐色の固体を得た（０．３８５ｇ、１．３７ｍｍｏｌ、４７％、ＭＳ  ｍ／ｚ＝３０４（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１２９】
得られたチオエステル（０．３７９ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を、１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中に溶解し、氷−水浴中で冷却し、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸で処理した。この反応系を、３０分間氷上で進め、その時点で、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。次いで、その残渣を１０ｍｌの乾燥ピリジン中に再溶解し、クロロ酢酸無水物（０．４４８ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）で処理した。この反応系を、室温で１時間進め、次いで、１０ｍｌの水でクエンチした。次いで、この反応系に、１００ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、２×５０ｍｌの飽和硫酸水素ナトリウム、２×５０ｍｌの１Ｍ  重炭酸ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまでエバポレートした。その残渣を、７０：３０のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を生成色の固体として得た（０．１９４ｇ、０．７５３ｍｍｏｌ、５６％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２８０（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１３０】
（実施例４）
本実施例は、以下の化合物：
【０１３１】
【化４０】
2006506947.tif 000040
の合成を記載する。
【０１３２】
この化合物を、４−アミノベンジルアルコールの代わりに４−アミノフェネチルアルコールを使用したことを除いて、実施例３の方法を用いて生成した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２９４（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１３３】
（実施例５）
本実施例は、以下の化合物：
【０１３４】
【化４１】
2006506947.tif 000041
の合成を記載する。
【０１３５】
この化合物を、４−アミノベンジルアルコールの代わりに３−アミノベンジルアルコールを使用したことを除いて、実施例３の方法を用いて生成した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２５８（Ｍ＋Ｈ））。
【０１３６】
（実施例６）
本実施例は、以下の化合物：
【０１３７】
【化４２】
2006506947.tif 000042
の合成を記載する。この化合物を、スキームＣに従って生成した（ここでｎ＝３である）。
【０１３８】
【化４３】
2006506947.tif 000043
この化合物を、市販のγ−チオブチロラクトン（１．０１ｇ、９．８９ｍｍｏｌ）で出発して、これを水（１０ｍｌ）およびＴＨＦ（１５ｍｌ）中に溶解し、窒素を分散させて生成した。固体の水酸化カリウム（１．７３ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を添加し、この反応系を室温で２．５時間進めた。次いで、この反応系を氷−水浴中で冷却し、無水酢酸（５ｍｌ、５３ｍｍｏｌ）を添加した。この反応系を、氷上で１時間攪拌し、次いで、１００ｍｌの１Ｎ  ＨＣ１を注いだ。この混合物を、３×３０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出し、次いで、合わせた有機物を、５０ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌおよび５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去した。得られた液体を、１：１のＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用いるシリカゲルのクロマトグラフィーに供して、Ｓ−アセチル酸を得た（０．７４２ｇ、４．６ｍｍｏｌ、４６％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝１８５（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１３９】
上記の得られた酸を、実施例１のスキームＡ（ここで、得られた酸を、α−ブロモ−ｐ−トルイル酸の代わりに使用した）に記載されるように、クロロメチルケトンに変換し、その最終産物を、９０：１０のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いてシリカゲルで精製して、標題化合物を得た（０．３１４ｇ、１．６１ｍｍｏｌ、３５％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２１７（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１４０】
（実施例７）
本実施例は、以下の化合物：
【０１４１】
【化４４】
2006506947.tif 000044
の合成を記載する。
【０１４２】
この化合物を、α−ブロモ−ｐ−トルイル酸の代わりに３−メルカプトプロピオン酸を使用して、実施例１のスキームＡに記載されるように生成した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２０３（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１４３】
（実施例８）
本実施例は、以下の化合物：
【０１４４】
【化４５】
2006506947.tif 000045
の合成を記載する。
【０１４５】
この化合物を、市販の１，３−ジクロロアセトン（１．１７７ｇ、９．２７ｍｍｏｌ）と、ＴＨＦ（２０ｍｌ）中のチオ酢酸（０．７ｍｌ、９．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．４ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）とを氷−水浴中で反応させることによって合成した。この反応系を、１時間進め、次いで、５０ｍｌのＥｔＯＡｃを注ぎ、３×３５ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムおよび３５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、黄色液体を得、これを、最初に８０：２０のヘキサン：ＥｔＯＡｃ、次いで９０：１０のヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーを使用して、２回精製した。次いで、最も純粋な画分を減圧下で、標題化合物からなる淡黄色の液体になるまで濃縮した（０．１８７ｇ、１．１２ｍｍｏｌ、１２％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝１６７（Ｍ＋Ｈ））。
【０１４６】
（実施例９）
本実施例は、ＰＴＰ−１Ｂ−エクステンダー複合体または改変ＰＴＰ−１Ｂ−エクステンダー複合体（一般に、「タンパク質」といわれる）を使用する係留実験の一実施形態を記載する。
【０１４７】
タンパク質濃度を５μＭに調節し、β−メルカプトエタノール（「β−ＭＥ」）をその濃度が１ｍＭになるように添加した。次いで、そのタンパク質／β−ＭＥ溶液を、ＤＭＳＯ（最終、各５０μＭ  モノフォア）中に溶解したモノフォア（ｍｏｎｏｐｈｏｒｅ）ライブラリープールとともに１時間インキュベートし、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ＬＣＱまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＡＰＩ  Ｑｓｔａｒ  Ｐｕｌｓａｒ  ＩのいずれかでＬＣ／ＭＳ分析に供した。Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアパッケージ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ）またはＡｎａｌｙｓｔ  ＱＳソフトウェアパッケージ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）のいずれかを使用して、スペクトルを逆重畳した。相対的ピーク高を使用して、結合システアミンと結合体化したタンパク質の画分およびリガンド候補物ヒットをおよそ定量した。ヒットを生じた個々のリガンド候補物を、質量により同定し、５０μＭにて、個々に５μＭのタンパク質、１ｍＭのβ−ＭＥとともに１時間インキュベートし、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。
【０１４８】
Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ＬＣＱに関しては、サンプルを、５０％の溶媒Ａ（水／０．０５％  ＴＦＡ）／５０％の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ／０．０５％  ＴＦＡ）においてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ５、３００Å、５ｍｍ、５０×２ｍｍカラムに流速０．７ｍｌ／分で注入し（Ｇｉｌｓｏｎ  ２１５オートサンプラーおよびＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム）、５％の溶媒Ａ（水／０．０５％  ＴＦＡ）／９５％の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ／０．０５％  ＴＦＡ）への０．７５分にわたる直線勾配、続いて、９５％の溶媒Ａ／５％の溶媒Ｂへの０．２５分にわたる直線勾配にに供し、次いで、９５％の溶媒Ａで１分間保持した。
【０１４９】
ＡＰＩ  Ｑｓｔａｒ  Ｐｕｌｓａｒ  Ｉに関しては、サンプルを、９０％の溶媒Ａ（水／０．１％  蟻酸）／１０％の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ／０．１％  蟻酸）において、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ５，３００Å、５ｍｍ、５０×２ｍｍカラムに、ｔ−スプリットから２５μＬ／分まで注入し（ＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  ＰＡＬ  ＳｙｓｔｅｍｓオートサンプラーおよびＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム）、１０％の溶媒Ａ（水／０．１％  ＦＡ）／９０％の溶媒Ｂ（ＣＨ３ＣＮ／０．１％  ＦＡ）への０．６０分にわたる直線勾配に供し、１．７０分間保持し、次いで、９０％の溶媒Ａ／１０％の溶媒Ｂへの０．２０分にわたる直線勾配に供し、次いで、９０％の溶媒Ａで０．８０分間保持した。
【０１５０】
（実施例１０）
本実施例は、以下の化合物：
【０１５１】
【化４６】
2006506947.tif 000046
の合成を記載する。この化合物を、スキームＤに従って生成した。
【０１５２】
【化４７】
2006506947.tif 000047
３−カルボキシプロピルジスルフィドのｔ−ブチルエステルを、Ｗｒｉｇｈｔらの方法（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｗ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｄａｖｉｄ  Ｌ．Ｈａｇｅｍｅａｎ，Ａｎｎ  Ｓ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌｅｓｔｅｒ  Ｄ．ＭｃＣｌｕｒｅ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３８（４２）７３４５−７３４８（１９９７））を用いて合成した。このジスルフィド（１２２ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）を、水素化ホウ素ナトリウム（１７ｍｇ、０．４４９ｍｍｏｌ）で、３ｍｌのＴＨＦおよび０．５ｍｌのメタノール中、窒素下で５分間還元した。次に、そのジフルオロホスホニルベンジルクロリド（２００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、Ｃａｐｌａｎらの方法（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１，３  ４２１−４３７（２０００））に従って合成した）を、１ｍｌのＴＨＦ中で添加した。この反応系を、周囲温度で１時間攪拌し、その時点で、水酸化ナトリウム（０．０７ｍｌの１０Ｎ  水溶液、０．７ｍｍｏｌ）およびさらに水素化ホウ素ナトリウム（３８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、１ｍｌのメタノールとともに添加した。この反応系を、窒素下で３日間進め、次いで、１００ｍｌの酢酸エチルを注ぎ、２×５０ｍｌの１Ｍ  硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、その溶媒を減圧下で除去して、２１８ｍｇの不純物ガムを得た（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝４４７（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１５３】
この物質（２０８ｍｇ）を、１０ｍｌのＤＣＭに懸濁し、氷−水浴中で冷却し、１０ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加した。この反応系を、７５分間攪拌し、次いで、溶媒を減圧下で除去した。次いで、その物質を、３ｍｌの乾燥ジクロロメタン中に再懸濁し、さらに１ｍｌのＤＣＭとともに、（クロロメチレン）ジメチルアンモニウムクロリド（７１ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応系を周囲温度で４５分間攪拌し、その時点で、５−アミノ−２−ヒドロキシ−３−スルホ安息香酸（Ｃ０１２５０４、１２８ｍｇ、０．５４９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（０．５ｍｌ、２．８７ｍｍｏｌ）を添加した。この反応系を、一晩進め、その時点で、７０ｍｌの１Ｎ  ＨＣ１（水溶液）を注ぎ、３×３０ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。その水相をエバポレートすると、生成物が現れた（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５８４（Ｍ＋Ｈ））。これを、１５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中に懸濁し、ブロモトリメチルシラン（５．５ｍｌ、４２ｍｍｏｌ）を添加した。１４時間後、この反応物を乾燥するまでエバポレートして、逆相ＨＰＬＣにより精製し、生成色の固体として標題化合物を得た（８．１ｍｇ、（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５５６（Ｍ＋Ｈ））。
【０１５４】
（実施例１１）
（ＰＴＰ−１Ｂのクローニング）
ＰＴＰ−１Ｂ（登録番号ＳＷＳ  Ｐ１８０３１）は、小胞体（ＥＲ）に結合するＣ−末端ドメインおよび細胞質に面するホスファターゼドメインを有するチロシンホスファターゼである。脱リン酸化するこのタンパク質は、小胞によってこの位置に輸送される。ＰＴＰ−１Ｂの活性は、セリンに対するリン酸化およびタンパク質分解によって調節される。ＰＴＰ−１Ｂは、インスリンシグナル伝達の負の調節物質であり、インターフェロン刺激に対する細胞応答において役割を果たす。このホスファターゼは、生物のレプチンに対する感受性を減少させることによって、肥満において役割を果たし得、これによって、食欲を増加させる。さらに、ＰＴＰ−１Ｂは、細胞増殖の制御において役割を果たす。ＰＴＰ−１Ｂの結晶構造は、解明されている［１ＰＴＹ、Ｐｕｉｕｓ，Ｙ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１３４２０−１３４２５（１９９７）］。
【０１５５】
全長ヒトＰＴＰ−１Ｂは、４３５アミノ酸長であり；そのホスファターゼドメインは、最初の２９８アミノ酸を含む。そのホスファターゼドメインを含むＰＴＰ−１Ｂの短縮された部分は、十分に活性であるので、種々の短縮化バージョンのＰＴＰ−１Ｂがしばしば使用される。ヒトＰＴＰ−１Ｂの最初の３２１アミノ酸をコードするｃＤＮＡは、ヒト胎児心臓総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離された。ＰＴＰ−１Ｂ  ｃＤＮＡ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ３１７２４．１、Ｃｈｅｒｎｏｆｆ，Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２７３５−２７３９（１９９０）］のヌクレオチド９１〜１１４に対応するオリゴヌクレオチドプライマー（正方向）およびヌクレオチド１０３０〜１０５３に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（逆方向）を合成し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ＤＮＡを生成するために使用した。
正方向  ＧＣＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧ    配列番号１
逆方向  ＧＣＧＡＣＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧＴＴＴ    配列番号２
正方向プライマーは、ＮｄｅＩ制限部位を最初のＡＴＧコドンにおいて組み込んでおり、逆方向プライマーは、ＵＡＡ終止コドン、続いて、ヌクレオチド１０５３の後ろにＥｃｏＲＩ制限部位を挿入する。ｃＤＮＡを制限ヌクレアーゼＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、標準的な分子生物学的技術を用いてｐＲＳＥＴｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。その単離されたｃＤＮＡの同一性を、ＤＮＡ配列分析により確認した（方法論は、以降の段落で概説される）。
【０１５６】
アミノ酸残基１〜２９８をコードするより短いｃＤＮＡであるＰＴＰ−１Ｂ  ２９８を、正方向および逆方向２のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、上記のクローンを、テンプレートとしてポリメラーゼ連鎖反応において生成した。
逆方向２  ＴＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＣＣＴＣＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣ    配列番号３。
【０１５７】
（実施例１２）
（ＰＴＰ−１Ｂ変異体）
ＰＴＰ−１Ｂ（アミノ酸１〜３２１）、ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８（アミノ酸１〜２９８）およびＰＴＰ−１Ｂ  ２９８−２Ｍ（Ｃｙｓ３２およびＣｙｓ９２が、それぞれＳｅｒおよびＡｌａに変更されている）の部位指向性変異体を、一本鎖ＤＮＡ法（Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５の改変法）によって調製した。２９８−２Ｍを、以下のオリゴヌクレオチドを用いて生成した：
Ｃ３２Ｓ  ＣＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴＣＡＣＴ    配列番号４
Ｃ９２Ａ  ＣＣＡＡＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＴＴＡＧＧＣＡＡ    配列番号５。
【０１５８】
Ｒ４７Ｃ変異体を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて生成した：
Ｒ４７Ｃ  ＧＧＧＡＣＴＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧＴＡＣＣＴＡＴＴＴＣＧ    配列番号６。
【０１５９】
オリゴヌクレオチドを、所望の変異およびその変異の各側に１２塩基の隣接配列を含むように設計した。ＰＴＰ−１Ｂ／ｐＲＳＥＴ、ＰＴＰ−１Ｂ  ２９８／ｐＲＳＥＴおよびＰＴＰ−１Ｂ  ２９８−２Ｍ／ｐＲＳＥＴプラスミドの一本鎖形態を、二本鎖プラスミドをＣＪ２３６細胞株へ形質転換することにより調製した（１μｌの二本鎖プラスミドＤＮＡ、２μｌの５×ＫＣＭ塩、７μｌの水、１０μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯ、コンピテントＣＪ２３６細胞；氷上で２０分間、続いて、２５℃で１０分間インキュベートした；１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ／寒天に配置し、３７℃で一晩インキュベートした）。次いで、ＣＪ２３６細胞の単一のコロニーを、１００ｍｌの２ＹＴ培地中で対数増殖期中期まで増殖させた；次いで、５μｌのＶＣＳヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、その混合物を、３７℃で一晩インキュベートした。一本鎖ＤＮＡを、ファージの沈澱により上清から単離した（１／５容量の２０％  ＰＥＧ８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ；１２Ｋで１５分間遠心分離する）。次いで、一本鎖ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ一本鎖ＤＮＡキットを用いてファージから単離した。
【０１６０】
部位特異的変異誘発を、以下のように達成した。オリゴヌクレオチドを、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に溶解して、１０ＯＤの濃度にし、そしてその５’末端をリン酸化した（２μｌのオリゴヌクレオチド、２μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、２μｌの１０×Ｔｒｉｓ−塩化マグネシウム緩衝液、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１２．５μｌの水、０．５μｌのＴ４  ＰＮＫ；３７℃で３０分間インキュベートする）。次いで、リン酸化したオリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡテンプレートにアニーリングさせた（２μｌの一本鎖プラスミド、０．６μｌのオリゴヌクレオチド、６．４μｌの水；９４℃で２分間加熱し、室温までゆっくりと冷却する）。次いで、二本鎖ＤＮＡを、アニールしたオリゴヌクレオチド／テンプレートから分離した（２μｌの１０×ＴＭ緩衝液、２μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ、０．５μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ、４．６μｌの水、０．４μｌのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加する；室温で２時間インキュベートする）。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１  ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、この二本鎖ＤＮＡで形質転換し（５μｌの二本鎖ＤＮＡ、５μｌの５×ＫＣＭ、１５μｌの水、２５μｌのＰＥＧ−ＤＭＳＯコンピテント細胞；氷上で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ／寒天上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。各プレート由来の約４つのコロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌの２ＹＴに接種した；これらの培養物を、３７℃で１８〜２４時間増殖させた。次いで、プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用してこれらの培養物から単離した。これらのプラスミドを配列決定して、所望の変異を含むクローンを決定した。
【０１６１】
変異体タンパク質を、以下のように発現させた。ＰＴＰ−１Ｂクローンを、ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し（１μｌの二本鎖ＤＮＡ、２μｌの５×ＫＣＭ、７μｌの水、１０μｌのＤＭＳＯコンピテント細胞；４℃で２０分間、室温で１０分間インキュベートする）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ／寒天上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。２つのシングルコロニーをプレートまたはこれらの変異体の凍結グリセロールストックから取り、そして５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む１００ｍｌの２ＹＴ中に接種し、そして３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物由来の５０ｍｌを、１．５Ｌの２ＹＴ／カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）に添加し、そして対数増殖期後期（６００ｎｍでの吸光度、約０．８〜０．９）になるまで、３〜４時間３７℃でインキュベートした。この時点で、タンパク質発現を、最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧの添加によって誘導した。培養物を３７℃でさらに４時間インキュベートし、次いで、細胞を、遠心分離（７Ｋｒｐｍ、７分間）によって回収し、そして−２０℃で凍結した。
【０１６２】
ＰＴＰ−１Ｂタンパク質を、以下に記載されるように、凍結細胞ペレットから精製した。まず、細胞を、１００ｍｌの緩衝液（２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０％グリセロール緩衝液を含む）において、ミクロフリューダイザ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）で溶解させ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ［Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  １１０Ｓ］を３回通過させる）、そして封入体を、遠心分離（１０Ｋｒｐｍ、１０分間）によって除去した。全てのＰＴＰ−１Ｂ変異体の精製を、４℃で実施した。遠心分離由来の上清を、０．４５μｍの酢酸セルロースを介して濾過し（この材料のうち５μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した）、そして緩衝液Ａ（２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール）中で平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅファストフローカラム（直径２．５ｃｍ×長さ１４ｃｍ）に、４ｍｌ／分で充填した。
【０１６３】
次いで、このタンパク質を、０〜５０％の緩衝液Ｂ勾配を使用して、６０分間にわたって溶出した（緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール、１Ｍ  ＮａＣｌ）。収率および純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験し、必要に応じて、ＰＴＰ−１Ｂを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によってさらに精製した。タンパク質に、１．４Ｍの最終濃度に到達するまで、硫酸アンモニウムを供給した。このタンパク質溶液を濾過し、そして緩衝液Ａ２（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で、４ｍｌ／分でＨＩＣカラムに充填した。タンパク質を、０〜１００％の緩衝液Ｂ勾配で、３０分かけて溶出した（緩衝液Ｂ２：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール）。最後に、精製タンパク質を、適切なアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％グリセロール）中に、４℃で透析した。収率は、変異体毎に変動したが、代表的には、３〜２０ｍｇ／培養物１Ｌの範囲内であった。
【０１６４】
（実施例１３）
この実施例は、以下の化合物
【０１６５】
【化４８】
2006506947.tif 000048
の合成を記載する。この化合物は、スキームＥに従って作製した。
【０１６６】
【化４９】
2006506947.tif 000049
市販の２−（４−アミノフェニル）−エチルアミン（０．６９ｍｌ、５．２４ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌ  ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（２．６４ｇ、５．１９ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）およびトリエチルアミン（０．７５ｍｌ、５．４ｍｍｏｌ）と、３０分間反応させた。この反応に、８０ｍｌのＤＣＭを入れ、２×５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして溶媒を減圧下で除去して、生成物を定量的に得た（（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５５２（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１６７】
これを、Ｍｏｓｈｅｒ（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｓ．ＮｉｍｉｔｚおよびＨａｒｒｙ  Ｓ．Ｍｏｓｈｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８１  ４６  ２１１−２１３）によって記載されるオキサラメート化（ｏｘａｌａｍａｔｉｎｇ）試薬を使用して、オキサラメート（ｏｘａｌａｍａｔｅ）に転換し、白色発泡体を得た（３．０ｇ、４．６１ｍｍｏｌ、８９％、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝６８０（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１６８】
Ｆｍｏｃ保護基を、１６時間反応させることによって、ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のジエチルアミン（２０ｍｌ、１９３ｍｍｏｌ）で除去し、この時点で、反応系をエバポレートして乾燥させ、９５：５  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０．１Ｍ  アンモニア）を用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、アミンを、灰白色の発泡体として得た（１．５５ｇ、３．５５ｍｍｏｌ、７８％、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝４３６（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１６９】
活性化アクリルアミドを、スキームＦに従って合成した。
【０１７０】
【化５０】
2006506947.tif 000050
アクリル酸（０．５ｍｌ、７．２９ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌ  ＤＣＭ中の（クロロメチレン）ジメチルアンモニウムクロライド（１．１２ｇ、８．７５ｍｍｏｌ）と２５分間反応させ、その後、β−アラニン−ＯｔＢｕ−ヒドロクロリド（１．６ｇ、８．８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（３．０ｍｌ、１７．２ｍｍｏｌ）を添加した。１５分後、この反応系に、ＤＣＭ（６０ｍｌ）を入れ、２×５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２×５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして溶媒を減圧下で除去して、生成物（１．０７ｇ、５．３６ｍｍｏｌ、７３％、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２２２（Ｍ＋Ｎａ））を得た。次いで、これを、２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中に再溶解し、氷水浴中で冷却し、そして２０ｍｌのトリフルオロ酢酸と３０分間反応させた。次いで、この反応混合物をエバポレートして乾燥させ、ＤＭＦ（５ｍｌ）中に再溶解し、そしてピリジン（１．２ｍｌ、１４．８ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェニルトリフルオロ酢酸（１ｍｌ、５．８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応を４０分間進行させ、次いで、ＥｔＯＡｃ（７５ｍｌ）を入れ、２×２５ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２×２５ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレートして乾燥させ、そして６０：４０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、白色結晶固体（０．７９９ｇ、２．５８ｍｍｏｌ、５２％、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝３１０（Ｍ＋Ｈ））を生じた。
【０１７１】
活性化アクリルアミド（１９９ｍｇ、０．６４４ｍｍｏｌ）を、５ｍｌ  ＤＣＭ中のアミン（２８２ｍｇ、０．６４８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１４ｍｌ、０．８０４ｍｍｏｌ）と１４時間反応させ、この時点で、この反応系に５０ｍｌのＥｔＯＡｃを入れ、２×２５ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２５ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレートして乾燥させ、そして９５：５  ＤＣＭ：ＭｅＯＨを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、無色樹脂（２８８ｍｇ、０．５１４ｍｍｏｌ、７９％（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５６１（Ｍ＋Ｈ））を得た。
【０１７２】
この物質を、１０ｍｌ  ＤＣＭ中に溶解させ、氷水浴中で冷却し、そしてトリフルオロ酢酸（１０ｍｌ）で脱保護した。次いで、この反応系を氷水浴から取り出し、そして室温で４０分間攪拌させ、その後エバポレートして乾燥させ、そして逆相ＨＰＬＣを用いて精製して、白色固体として表題化合物（４７ｍｇ、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝４４９（Ｍ＋Ｈ））を得た
（実施例１４）
この実施例は、以下の化合物
【０１７３】
【化５１】
2006506947.tif 000051
の合成を記載する。
【０１７４】
この化合物を、アクリルアミドリンカーの代わりにジスルフィドリンカーを使用したことを除いて、実施例１３の方法を使用して作製した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５４４（Ｍ＋Ｈ））。
【０１７５】
（実施例１５）
この実施例は、以下の化合物
【０１７６】
【化５２】
2006506947.tif 000052
の合成を記載する。
【０１７７】
この化合物を、アシルアミドリンカーの代わりにブロコアセトアミド（ｂｒｏｃｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）リンカーを使用したことを除いて、実施例３の方法を使用して作製した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝４８９（Ｍ＋Ｈ））。
【０１７８】
（実施例１６）
この実施例は、以下の化合物
【０１７９】
【化５３】
2006506947.tif 000053
の合成を記載する。この化合物は、スキームＧに従って作製した。
【０１８０】
【化５４】
2006506947.tif 000054
市販のＢｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ（４−ニトロ）−ＯＨ（２．０５ｇ、６．６１ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）を、３０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解し、氷水浴中で冷却し、そしてＮ−メチルモルホリン（０．７４ｍｌ、６．７３ｍｍｏｌ）およびイソブチルクロロホルメート（０．８６ｍｌ、６．６３ｍｍｏｌ）と反応させた。この反応系を、氷上で２０分間攪拌し、次いで、中間ガラスフリットを介して濾過し、そして沈殿物を、２×５ｍｌのＴＨＦでリンスした。次いで、合わせた濾液を氷浴中で再度冷却し、そして７ｍｌのメタノールと共に、ホウ化水素ナトリウム（１．２５ｇ、３３ｍｍｏｌ）で還元した。この反応を、１０分間進行させ、５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム（水溶液）でクエンチし、そして１００ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。次いで、有機物を５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて、生成物アルコール（１．８２ｇ、６．１５ｍｍｏｌ、９３％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝３１９（Ｍ＋Ｎａ））を得た。
【０１８１】
このアルコールを、４０ｍｌのＤＣＭ中に懸濁し、氷水浴中で冷却し、そして２５ｍｌのトリフルオロ酢酸で処理した。この反応系を室温まで温め、そして２５分間進行させ、次いで、エバポレートして乾燥させた。次いで、この物質を２０ｍｌのＤＣＭ中に再懸濁し、そしてさらに２０ｍｌのＤＣＭと共に、トリエルアミン（２．６ｍｌ、１８．７ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（３．１８ｇ、６．２５ｍｍｏｌ）と反応させた。この反応を４０分間進行させ、次いで、６０ｍｌのＤＣＭを入れ、５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で溶媒を除去した。その残渣を、９５：５  ＤＣＭ：ＭｅＯＨを使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、生成物を得た（２．０５ｇ、３．４８ｍｍｏｌ、５７％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝６１２（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１８２】
このアルコールを、５０ｍｌのＤＣＭ中に溶解し、氷水浴中で冷却し、そしてトリエチルアミン（０．５６ｍｌ、４．０２ｍｍｏｌ）および塩化メタンスルホニル（０．３ｍｌ、３．８８ｍｍｏｌ）で処理した。この反応を、氷上で３０分間進行させ、その後、５０ｍｌのＤＣＭを入れ、５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして減圧下で溶媒を除去して、黄色固体を得た。これを、１０ｍｌのＤＭＦ中に溶解し、そしてチオ酢酸カリウム（０．４２ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）および１０ｍｌのさらなるＤＭＦで処理した。この反応を１８時間進行させ、その後、１００ｍｌのＥｔＯＡｃを入れ、２×５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２×５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、エバポレートして乾燥させ、そして７０：３０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、チオエステルを黄色固体として得た（０．５８８ｇ、０．９０８ｍｍｏｌ、２６％、２工程、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝６７０（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１８３】
そのニトロ基を、５ｍｌのメタノール中に上記化合物（０．４６４ｇ、０．７１６ｍｍｏｌ）を溶解させ、氷水浴中で冷却し、そしてさらに１５ｍｌのメタノールと共に、塩化アンモニウム（０．７７３ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）および亜鉛粉（０．２４４ｇ、３．７３ｍｍｏｌ）を添加することによって、選択的に還元した。この反応系を、室温までゆっくりと温め、そして窒素下で一晩進行させ、この時点で、セライトを介して濾過し、そしてエバポレートした。その残渣を１００ｍｌのＥｔＯＡｃ中に再溶解させ、３×５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして、黄色発泡体を得た（０．４３ｇ、０．６９６ｍｍｏｌ、９７％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝６１８（Ｍ＋Ｈ））。
【０１８４】
このキサラメート（ｘａｌａｍａｔｅ）を、スキームＥに記載されるように導入し、そして最初に７０：３０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用い、次いで５０：５０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いるフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、淡黄色発泡体として生成物を得た（０．２８０ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、５４％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝７６８（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１８５】
このシステアミンべースのチオスルホネートを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５０ｍｌ、７０４ｍｍｏｌ）中にＮ−Ｂｏｃ−システアミン（２５．７ｇ、１４５ｍｍｏｌ）を溶解させ、７０℃で空気に開放して４日間加熱することによって合成した。次いで、この反応系に３００ｍｌのＥｔＯＡｃを入れ、３×１００ｍｌの水、１００ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて、白色固体としてジスルフィドを得た（２５ｇ、７１ｍｍｏｌ、９８％）。これを、４００ｍｌのＤＣＭ中に溶解させ、氷水浴中でこの反応系を冷却し、そしてメタ−クロロ−ペルオキシ安息香酸（７７％のＡｌｄｒｉｃｈから市販される物質６４ｇ、２８６ｍｍｏｌ）を、一部ずつ、１５分かけて添加することによって、チオスルホネートに酸化した。沈殿が形成された際に、さらに２００ｍｌのＤＣＭもまた添加した。３時間後、この反応系をガラスフリットを介して濾過し、そして沈殿物を３×５０ｍｌのＤＣＭで洗浄した。合わせた濾液を、２×１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２×１００ｍｌの５０％飽和炭酸水素ナトリウム、１００ｍｌの水および１００ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして、粘性の黄色シロップにし、これを一週間の過程にわたってゆっくりと凝固させて、硬質の結晶固体を得た（１４．７ｇ、３８．２ｍｍｏｌ、５４％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝４０７（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１８６】
これ（０．２７２ｇ、０．３６５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのエタノールに溶解させ、そして上記のチオスルホネートを添加することによって、チオエステルをジスルフィドに転換した。次いでこれを窒素下でスパージングし、そしてヒドロキシルアミン（０．１ｍｌ、１．６３ｍｍｏｌ、水中５０％）を添加した。この反応を３時間進行させ、その時点で、これにＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）を入れ、３×２５ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させ、そして７０：３０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、灰白色の発泡体を得た（０．１７９ｇ、０．２０４ｍｍｏｌ、５６％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝９０１（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１８７】
Ｆｍｏｃ基を、この物質を５ｍｌのＤＣＭに溶解させ、そしてこれをジエチルアミン（５ｍｌ、４８ｍｍｏｌ）と１５時間反応させることによって除去した。次いで、この反応系をエバポレートして乾燥させ、そして９５：５  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（０．１Ｍアンモニア）を用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。アミンを、灰白色発泡体として得た（０．１１７ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、８９％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝６５７（Ｍ＋Ｈ））。
【０１８８】
このアミン（０．１１４ｇ、０．１７４ｍｍｏｌ）を、ジイソプロピルエチルアミン（０．０５ｍｌ、０．２８７ｍｍｏｌ）を有するＤＣＭ（５ｍｌ）中の前記（スキームＥ）のアクリルアミド活性エステル（０．０６７ｇ、０．２１７ｍｍｏｌ）に、６９時間にわたってカップリングさせた。次いで、この反応系に５０ｍｌのＥｔＯＡｃを入れ、２×２５ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２×２５ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム、２５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させ、そして９５：５  ＤＣＭ：ＭｅＯＨを用いたシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製して、生成物を定量的に得た（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝７８２（Ｍ＋Ｈ））。
【０１８９】
これをＤＣＭ（１０ｍｌ）中に溶解させ、氷水浴中で冷却し、そして１０ｍｌのトリフルオロ酢酸を添加することによって、この物質を全体的に脱保護した。次いで、この反応系を室温まで温め、そして３５分間進行させ、その後エバポレートして乾燥させ、そして逆相ＨＰＬＣによって精製して、白色固体として表題化合物を得た（０．０３９ｇ、０．０５６ｍｍｏｌ、３２％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５６９（Ｍ＋Ｈ））。
【０１９０】
（実施例１７）
この実施例は、以下の化合物
【０１９１】
【化５５】
2006506947.tif 000055
の合成を記載する。
【０１９２】
この化合物を、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−ニトロ）−ＯＨのＳ−エナンチオマーを使用したこと以外、実施例１６の方法を使用して作製した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５６９（Ｍ＋Ｈ））。
【０１９３】
（実施例１８）
この実施例は、以下の化合物
【０１９４】
【化５６】
2006506947.tif 000056
の合成を記載する。この化合物は、スキームＨに従って作製した。
【０１９５】
【化５７】
2006506947.tif 000057
この方法は、以下のこと以外、実施例１３の方法に類似である。Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ（４−ニトロ）−ＣＨ２ＯＨを、ＥＤＣカップリングを使用して、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨと結合体化させた。これを、２０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中にＢｏｃ−Ｓｅｒ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１．７５ｇ、６．７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（０．９９ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１．４ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を溶解させることによって行った。次いで、新たに脱保護したＨ２Ｎ−Ｐｈｅ（４−ニトロ）−ＣＨ２ＯＨを、１０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に溶解させ、そしてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３．７ｍｌ、２１．２ｍｍｏｌ）を添加した。このアミン溶液を、さらに１０ｍｌの乾燥ＤＭＦと共に活性化酸溶液に添加し、そしてこの反応系を、周囲温度で４０分間攪拌させた。次いで、この反応系に１００ｍｌのＥｔＯＡｃを入れ、２×５０ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２×５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍｌの飽和塩化ナトリウムでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させて生成物を得、これを、さらに濾過することなく使用した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝４６２（Ｍ＋Ｎａ））。
【０１９６】
この分子のブロモアセトアミド部分を、以下のように構築した。Ｈ−β−Ａｌａ−ＯｔＢｕ（１．０１ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）を、４０ｍｌの乾燥ＤＣＭに溶解させ、氷水浴中で冷却し、次いで、ＤＩＥＡ（２．０ｍｌ、１１．５ｍｍｏｌ）およびブロモアセチルブロマイド（０．４９ｍｌ、５．６３ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの反応を、氷上で３０分間進行させた。次いで、この反応系に６０ｍｌのＤＣＭを入れ、２×５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムおよび５０ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させた。得られた生成物を、６０：４０  ヘキサン：ＥｔＯＡｃを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、淡黄色の液体を得た（１．１９８ｇ、４．５ｍｍｏｌ、８１％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２８８（Ｍ＋Ｎａ））。ｔ−ブチル保護基を、２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中にエステルを溶解させ、氷水浴中でこの反応系を冷却し、そして２０ｍｌのＴＦＡを添加することによって除去した。この反応系を３０分間攪拌させ、次いでエバポレートして乾燥させて、淡黄褐色のシロップとして遊離酸を得、これを、さらに精製せずに使用した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２１２（Ｍ＋Ｈ））。
【０１９７】
オキサラメート官能基の導入後、セリンのＢｏｃ基を、周囲温度で２０分間にわたって、ニート蟻酸（４ｍｌ）でペプチド（９７ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）を処理することによって、選択的に除去した。次いで、蟻酸をロータリーエバポレーションによって除去した。その間に、ブロモアセトアミド含有酸フラグメントを、これ（８９ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）を２ｍｌの乾燥ＤＣＭに溶解させ、Ｖｉｌｌｓｍｅｉｅｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（４６ｍｇ、０．３５９ｍｍｏｌ）およびさらに３ｍｌのＤＣＭを添加し、そしてこの反応を５分間進行させることによって、活性化した。次いで、ＤＣＭ中に再溶解させた新たに脱保護されたペプチドを、ＤＩＥＡ（０．２ｍｌ、１．１５ｍｍｏｌ）と共に添加した。このカップリング反応を、１０分間だけ進行させ、次いでエバポレートして乾燥させ、５０ｍｌのＥｔＯＡｃ中に再溶解させ、２×２５ｍｌの１Ｍ硫酸水素ナトリウム、２×２５ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２５ｍｌのブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートして乾燥させた。この生成物を、最初に８０：２０  ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを用い、次いで純粋ＥｔＯＡｃを用い、最後に９５：５  ＤＣＭ：ＭｅＯＨを用いたフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製した。純粋生成物を、淡黄色発泡体として得た（２０ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、１８％、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝６８９（Ｍ＋Ｈ））。
【０１９８】
この物質を１０ｍｌの乾燥ＤＣＭに溶解し、１０ｍｌのＴＦＡで処理した。１．７５時間反応を進行させ、この時点で、これをエバポレートして乾燥させ、逆相ＨＰＬＣにより生成物を精製して、白色固体としてＳＰ−５８９９を得た（３．６ｍｇ，０．００６２ｍｍｏｌ，２１％，ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５７７（Ｍ＋Ｈ））。
【０１９９】
（実施例１９）
本実施例は、以下の化合物：
【０２００】
【化５８】
2006506947.tif 000058
の合成を記載する。
【０２０１】
この化合物を実施例１６の方法を使用して作製したが、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−ニトロ）−ＯＨのＳ−エナンチオマーを使用したことを除く（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５７７（Ｍ＋Ｈ））。
【０２０２】
（実施例２０）
本実施例は、以下の化合物：
【０２０３】
【化５９】
2006506947.tif 000059
の合成を記載する。これをスキームＩに従って作製した。
【０２０４】
【化６０】
2006506947.tif 000060
２−シアノメチル安息香酸メチルエステル（６．０３ｇ，３４．４ｍｍｏｌ）を氷水浴中で冷却し、これに、濃硫酸（２５ｍｌ）および７０％硝酸（３ｍｌ）を加えた。氷上で４０分間反応を進行させ、この時点において、これを氷（５０ｇ）に注ぎ、水（５０ｍｌ）およびＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）を流し込んだ。この混合物を氷上で激しく攪拌し、次いで、中間ガラスフリットを介して濾過した。この沈殿物を、２×２５ｍｌ  ＥｔＯＡｃで洗浄し、減圧下で乾燥して、灰白色固体を得た（１．９６ｇ，８．２４ｍｍｏｌ，２４％，ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２６１（Ｍ＋Ｎａ））。これをさらに精製することなく使用した。
【０２０５】
ニトロベンゼン化合物（１．８９ｇ，７．９３ｍｍｏｌ）をテフロン（登録商標）キャップをしたガラス「ボンベ」に移し、１Ｍのボランメチルスルフィド錯体のＴＨＦ溶液を加えた（３２ｍｌ、６４ｍｍｏｌ）。このボンベを密閉し、６５℃まで１４時間加熱した。次いで、このボンベを氷水浴中で冷却し、注意深く開き、そして、メタノール（１０ｍｌ）および濃ＨＣｌ（１０ｍｌ）で非常に注意深く反応をクエンチした。次いで、溶液を６５℃まで３０分間加熱し、その時点の後、１Ｎ  ＮａＯＨ（１４０ｍｌ）により酸を中和して、混合物を４×３０ｍｌ  ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を３×５０ｍｌ  １Ｎ  ＮａＯＨおよび５０ｍｌ飽和ＮａＣｌでリンスして、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、乾燥するまでエバポレートして、橙色液体としてアミノアルコールを得た（１００％，ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝１９７（Ｍ＋Ｈ））。実施例１７の化合物について記載されたような対応する方法を用いて、残りの工程を実行して、表題化合物を得た（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５７７（Ｍ＋Ｈ））。
【０２０６】
（実施例２１）
本実施例は、以下の化合物：
【０２０７】
【化６１】
2006506947.tif 000061
の合成を記載する。これをスキームＪに従って作製した。
【０２０８】
【化６２】
2006506947.tif 000062
ａ）Ｂｏｃ−４−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン（５．０ｇ，１６．１１ｍｍｏｌ）を７５ｍＬ  ＴＨＦ中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃まで冷却した。Ｎ−メチルモルホリン（１．８１ｍＬ、１６．４３ｍｍｏｌ）を加え、続いて、イソブチルクロロホルメート（ＩＣＢＦ）（２．１１ｍＬ、１６．２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を０℃で１５分間攪拌し、次いで、粗いガラスフリット漏斗を通して濾過した。水素化ホウ素ナトリウム（３．０４ｇ，８０．３９ｍｍｏｌ）を濾液に加え、この溶液を０℃で２０分間攪拌した。反応物に１００ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４を流し込み、３×３０ｍＬ  ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を３０ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、３０ｍＬ  飽和ＮａＣＯ３、３０ｍＬ  ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣を１０ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、そして１０ｍＬ  ＴＦＡを加えた。溶液を１時間攪拌し、その時点で、溶媒を減圧下で除去して、定量的な収率で化合物Ｉを得た（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝１９７（Ｍ＋Ｈ））。これをさらに精製することなく使用した。
【０２０９】
ｂ）化合物Ｉ（２．９８ｇ，１５．１９ｍｍｏｌ）を１５ｍＬ  ＤＭＦに溶解し、ＤＩＥＡ（１３．２３ｍＬ，７５．９５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を、７５ｍＬ  ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｏ−（ｔ−ブチルエステル）−Ｌ−セリン（４．３６ｇ，１６．７１ｍｍｏｌ）、塩酸１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．４９ｇ，１８．２３ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２．４６ｇ，１８．２３ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。この溶液を周囲の温度で１時間攪拌し、この時点で、これに２００ｍＬ  ＥｔＯＡｃを流し込み、２×５０ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、２×５０ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ３、５０ｍＬブラインでリンスし、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下で除去することで、化合物ＩＩを得た（５．７３ｇ，１３．０４ｍｍｏｌ，８６％，ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝４６２（Ｍ＋Ｎａ））。これをさらに精製することなく使用した。
【０２１０】
ｃ）化合物ＩＩ（５．７３ｇ，１３．０４ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ  ＭｅＯＨに溶解し、炭素担持パラジウム（２．７７ｇ，１．３０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を水素バルーン下周囲の温度で４時間攪拌した。この反応物をセライトを通して濾過し、溶媒を減圧下で除去して、化合物ＩＩＩを得た（４．１１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ，収率７７％，ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝４１０（Ｍ＋１））。これをさらに精製することなく使用した。
【０２１１】
ｄ）化合物ＩＩＩ（４．１１ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）を３０ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、２０ｍＬ  ＤＣＭ中のイミダゾール−１−イル−オキソ−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．９７ｇ，１０．０４ｍｍｏｌ）と混合した。反応物を周囲の温度で１５時間攪拌し、この時点で、ＤＣＭを減圧下で除去し、残渣を５０ｍＬ  ＥｔＯＡｃに溶解した。反応物を２×１０ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、２×１０ｍＬ  飽和ＮａＨＣＯ３、１０ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去して、化合物ＩＶを得た（４．６８ｇ，８．７０ｍｍｏｌ，８７％，ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝５６０（Ｍ＋Ｎａ））。これをさらに精製することなく使用した。
【０２１２】
ｅ）化合物ＩＶ（１．０ｇ，１．８６ｍｍｏｌ）を２ｍＬ  ＭｅＯＨに溶解し、２ｍＬの水中の水酸化リチウム（０．０４５ｇ，１．８６ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を０．５時間攪拌し、次いで、３０ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４を流し込み、３×１０ｍＬ  ＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を１５ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、１５ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去した。次いで、粗残渣を５ｍＬ  ４：１  ベンゼン：ＭｅＯＨに溶解し、（トリメチルシリル）ジアゾメタン（０．２２９ｍＬ，０．４５７ｍｍｏｌ）を滴下した。溶媒を除去し、残渣を１０ｍＬ  ＤＣＭに再溶解した。１ｍＬ  ＴＦＡを加え、溶液を周囲の温度で１０分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、定量的な収率で化合物Ｖを得た（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝３９６（Ｍ＋Ｈ））。これをさらに精製することなく使用した。
【０２１３】
ｆ）化合物Ｖ（０．１５７ｇ，０．３９８ｍｍｏｌ）を２ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、そして、トリエチルアミン（ＴＥＡ）（０．１６６ｍＬ，１．１９ｍｍｏｌ）を加え、続いて、無水酢酸（０．０３８ｍＬ，０．３９８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応物を周囲の温度で１時間攪拌し、２０ｍＬ  ＥｔＯＡｃを流し込み、２×５ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、２×５ｍＬ  飽和ＮａＨＣＯ３、５ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去して、化合物ＶＩ（０．１２７ｇ，０．２９０ｍｍｏｌ，７３％）、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝４６０（Ｍ＋Ｎａ）。これをさらに精製することなく使用した。
【０２１４】
ｇ）化合物ＶＩ（０．１２７ｇ，０．２９０ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、２．５ｍＬ  ＴＦＡを加え、反応物を周囲の温度で３時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を２．５ｍＬ  ＭｅＯＨに再溶解した。２．５ｍＬの水中の水酸化リチウム（０．０１４ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１時間攪拌した。溶媒を除去し、粗残渣を逆相予備ＨＰＬＣにより精製し、化合物ＶＩＩを得た（０．００７ｇ，０．０１９ｍｍｏｌ，７％）、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝３６８（Ｍ＋１）。
【０２１５】
（実施例２２）
本実施例は、以下の化合物：
【０２１６】
【化６３】
2006506947.tif 000063
の合成を記載する。これをスキームＫに従って作製した。
【０２１７】
【化６４】
2006506947.tif 000064
ａ）化合物Ｉの代わりにＮ−１−Ｆｍｏｃ−１，３−ジアミノプロパンＨＣｌから出発し、Ｂｏｃ−Ｏ−（ｔ−ブチルエーテル）−Ｌ−セリンの代わりにＢｏｃ−４−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニンを使用したことを除いて、化合物ＶＩＩＩを実施例２１ｂの方法に従って調製し、続いて、ＴＦＡを脱保護した（実施例２１ａ）（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝５２５（Ｍ＋Ｎａ））。
【０２１８】
ｂ）化合物ＩＸを実施例２１ｂ、ｅ（ＴＦＡ脱保護のみ）、ｆ、ｃ、およびｄの方法に従い、化合物ＶＩＩＩを処理することによって調製した。次いで、得られた残渣を５ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、５ｍＬ  ジエチルアミン（ＤＥＡ）を加えた。この溶液を周囲の温度で１６時間攪拌し、減圧下で溶媒を除去し、  ９：１  ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ中２Ｍ  ＮＨ３を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより残渣を精製し、化合物ＩＸを得た（０．１７３ｇ，０．３０６ｍｍｏｌ，収率３８％）、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝５５０（Ｍ＋１）。
【０２１９】
ｃ）Ｂｏｃ−Ｏ−（ｔ−ブチルエーテル）−Ｌ−セリンの代わりに２−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−４−カルボン酸から出発したことを除いて、実施例２１ｂの方法に従って化合物ＩＸを処理し、続いて、ＴＦＡ脱保護および２１ｈのＨＰＬＣ精製部分により化合物Ｘを調製した、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝６９３（Ｍ＋Ｈ）。
【０２２０】
（実施例２３）
本実施例は、以下の化合物：
【０２２１】
【化６５】
2006506947.tif 000065
の合成を記載する。これをスキームＬに従って作製した。
【０２２２】
【化６６】
2006506947.tif 000066
ａ）Ｎ−１−Ｆｍｏｃ−１，３−ジアミノプロパンＨＣＬの代わりにＮ−１−Ｆｍｏｃ−１，４−ジアミノブタンＨＣＬから出発したことを除いて、化合物ＸＩを実施例２２ａ−ｂの方法に従って調製した。ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ  ５６４（Ｍ＋Ｈ）。
【０２２３】
ｂ）化合物ＸＩ（０．１７３ｇ，０．３０７ｍｍｏｌ）を１ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、ＤＩＥＡ（０．０４３ｍＬ，０．３０７ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を１ｍＬ  ＤＣＭに溶解させた４−ビフェニルスルホニルクロリド（０．０７８ｇ，０．３０７ｍｍｏｌ）に加えた。この混合物を周囲の温度で０．５時間攪拌し、この時点で、この混合物に２０ｍＬ  ＤＣＭを流し込み、２×５ｍＬ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、５ｍＬのブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を除去した。残渣を２ｍＬ  ＤＣＭに溶解し、２ｍＬ  ＴＦＡを加え、反応物を０．５時間攪拌した。溶媒を除去し、逆相予備ＨＰＬＣにより粗残渣を精製して、化合物ＸＩＩを得た（０．０２５ｇ，０．０３７ｍｍｏｌ，１２％）、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝６６８（Ｍ＋１）。
【０２２４】
（実施例２４）
本実施例は、以下の化合物：
【０２２５】
【化６７】
2006506947.tif 000067
の合成を記載する。
【０２２６】
Ｎ−１−Ｆｍｏｃ−１，３−ジアミノプロピオン酸ＨＣｌの代わりにβ−アラニンベンジルエステル−ｐ−トルエンスルホネートから出発したことを除いて、この化合物を実施例２２の方法に本質的に従って調製した、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝６８０（Ｍ＋Ｈ）。
【０２２７】
（実施例２５）
本実施例は、以下の化合物：
【０２２８】
【化６８】
2006506947.tif 000068
の合成を記載する。
【０２２９】
６−（２−アミノ−１，３−チアゾール−４−イル）−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−２−オンの代わりに塩酸４−フェニル−Ｍ−アニシジンから出発したことを除いて、この化合物を実施例２４の方法に従って調製した、ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｅ＝６３４（Ｍ＋Ｈ）。
【０２３０】
（実施例２６）
本実施例は、以下の化合物：
【０２３１】
【化６９】
2006506947.tif 000069
の合成を記載する。これをスキームＭおよび以下の手順に従って合成した。
【０２３２】
【化７０】
2006506947.tif 000070
市販の４−アミノ安息香酸（２．２４ｇ，１６．３ｍｍｏｌ）を窒素下でジクロロメタン（「ＤＣＭ」、４０ｍｌ）に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＥＡ」，２．９ｍｌ，１６．６ｍｍｏｌ）を攪拌しながら加えた。２０分後、ほとんどの固体は溶解し、オキサラメート化試薬（ｏｘａｌａｍａｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）を加えた（例えば、Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｓ．ＮｉｍｉｔｚおよびＨａｒｒｙ  Ｓ．Ｍｏｓｈｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６：２１１−２１３（１９８１）を参照のこと）。１時間後、この反応物を６０ｍＬ  ＤＣＭで希釈し、３×５０ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４および５０ｍｌのブラインでリンスし、乾燥するまでエバポレートして、灰白色固体を得た（３．３４ｇ，１２．６ｍｍｏｌ，７７％）、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝２８８（Ｍ＋Ｎａ）。
【０２３３】
この酸（０．４４０ｇ，１．６６ｍｍｏｌ）を、塩酸１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（「ＥＤＣ」，０．３２８ｇ，１．７１ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（「ＨＯＢＴ」，０．２２５ｇ，１．７１ｍｍｏｌ）と混合し、そして、乾燥ジメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」，５ｍｌ）に溶解し、室温で攪拌した。その間、β−アラニンを乾燥ＤＣＭ（１０ｍｌ）に懸濁し、そして、ＤＩＥＡ（１．４ｍｌ，８．０ｍｍｏｌ）および塩化トリメチルシリル（「ＴＭＳＣｌ」，１．０ｍｌ，７．９ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を５０℃で１時間還流して、均質な金色の溶液を得た。これを５ｍｌのさらなるＤＭＦとともに活性化された酸に加えた。反応を３０分間進行させ、この時点において、１００ｍｌ  ＥｔＯＡｃを流し込み、５０ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４および５０ｍｌのブラインで４回リンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾燥するまでエバポレートして、そして、９５：５：１  ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含んだ画分をトルエンから同時蒸発させ、酢酸を除去し、乾燥して、生成物および残余のＨＯＢＴからなる白色固体を得た（０．４６５ｇ，１．３８ｍｍｏｌ，８３％）、（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝３３７（Ｍ＋Ｈ）。
【０２３４】
チオールを、３−アミノプロピルブロミドヒドロブロミド（３．９８ｇ，１８．２ｍｍｏｌ）をＢＯＣ無水物（４．０１ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）と混合し、水（２５ｍｌ）中にその混合物を溶解し、そして水中１Ｎ  ＮａＯＨ（１８ｍｌ）を添加することによって合成した。１８時間攪拌した後、この反応物を、１００ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出し、そして有機層を３×５０ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４および５０ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、そして乾固するまでエバポレートして、淡黄色のシロップとして生成物ブロミド（３．９８ｇ，１６．７ｍｍｏｌ，９２％，（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ  ＝２６０／２６２（Ｍ＋Ｎａ））を得た。この物質（０．９５８ｇ，４．０２ｍｍｏｌ）を、５ｍｌ乾燥ＤＭＦに溶解し、チオ酢酸カリウム（０．４８４ｇ，４．２４ｍｍｏｌ）およびさらに５ｍｌのＤＭＦで処理し、そして２日間にわたって窒素下で反応させた。次いで、これにヒドロキシアミン（水中の５０％、１ｍｌ，１６．３ｍｍｏｌ）を添加し、そしてこの反応を２時間、続行した。このとき、この反応物を８０ｍｌ  ＥｔＯＡｃに浸け、２×４０ｍｌ飽和重炭酸ナトリウム、２×４０ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、および４０ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、そして乾固するまでエバポレートして淡黄色のシロップとして、チオール：ジスルフィドの１：２混合物（０．７１９ｇ，３．７６ｍｍｏｌ，９３％，（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ  ＝  ４０３（Ｍ＋Ｎａ）  ）を得た。これ（０．４９９ｍｇ，１．３１ｍｍｏｌ）を、５ｍｌメタノール中に溶解し、そして３ｍｌ  １Ｍ  ＮａＯＨ水溶液中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリドをさらなる５ｍｌメタノールと一緒に添加することによって、遊離チオールに完全に還元した。窒素下で１時間攪拌した後、この反応物を、５０ｍｌのＥｔＯＡｃに浸し、２×２５ｍｌ飽和重炭酸ナトリウム、２５ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、および２５ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして乾固するまでエバポレートし、ほぼ無色の油状物として生成物チオール（０．４６６ｇ，２．４４ｍｍｏｌ，９３％，（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ  ＝  ２１４（Ｍ＋Ｎａ））を得た。
【０２３５】
このチオールを、以下の通りに酸に結合体化した。最初に、この酸（２６８ｍｇ，０．７９６ｍｍｏｌ）を、ＥＤＣ（１６２ｍｇ，０．８４５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（１０８ｍｇ，７９９ｍｍｏｌ）と混合し、そして５ｍｌ乾燥ＤＭＦに溶解した。このチオール（１６０ｍｇ，０．８３６ｍｍｏｌ）を、さらに３ｍｌ乾燥ＤＭＦと一緒に添加した。最後に、ＤＩＥＡ（０．３ｍｌ，１．７２ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応を４５分間続行した。次いで、この反応物を、５０ｍｌ  ＥｔＯＡｃに浸し、２×２５ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４、２×２５ｍｌ飽和重炭酸ナトリウム、および２５ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、乾固するまでエバポレートし、そして５０：５０  ＥｔＯＡｃ：ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色泡状物として純粋なチオエステル（１８６ｍｇ，０．３６５ｍｍｏｌ，４６％，（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ＝５１０（Ｍ＋Ｈ））を得た。
【０２３６】
この物質（５８ｍｇ，０．１１４ｍｍｏｌ）を、４ｍｌ乾燥ＤＣＭに溶解し、そしてＴＦＡ（４ｍｌ）を添加した。反応物を室温で３０分間にわたって攪拌し、乾固するまでエバポレートした。次いで、この物質を３ｍｌ乾燥ＴＨＦおよびブロモアセチルブロミド（０．０３ｍｌ，０．３４５ｍｍｏｌ）中に再懸濁し、そしてＤＩＥＡ（０．１ｍｌ，０．５７４ｍｍｏｌ）、続いて３ｍｌ乾燥ＤＭＦを添加した。３０分間攪拌した後、反応物を、５０ｍｌ  ＥｔＯＡｃに浸し、３×２５ｍｌ  １Ｍ  ＮａＨＳＯ４および２５ｍｌブラインでリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、乾固するまでエバポレートし、そして逆相クロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物（５．２ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ，１０％，（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ  ＝４９６／４９８（Ｍ＋Ｎａ））を得た。
（実施例２７）
本実施例は、以下の化合物：
【０２３７】
【化７１】
2006506947.tif 000071
の合成を記載する。
【０２３８】
この化合物を、
【０２３９】
【化７２】
2006506947.tif 000072
の代わりにチオールとして市販のＮ−ＢＯＣ−システアミンを使用したことを除いて、実施例３の手順に従って合成した（ＥＳ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ  ＝  ４６０／４６２（Ｍ＋Ｈ））。
（実施例２８）
本実施例は、合成が実施例２７に記載されたエクステンダーにより、ＰＴＰ−１ＢのＲ４７Ｃ変異体を改変するための手順を記載する。このエクステンダーは、第１の官能基、潜在的な第２の官能基により切断可能なリンカーおよびホスホチロシン模倣物を含む。
【０２４０】
新たに調製したか、または新たに解凍（−８０℃から）したＰＴＰ−１Ｂ  Ｒ４７Ｃのアリコート（２×１．８ｍｌ，１．７ｍｇ／ｍｌ）を、０．０２ｍｌの新たに調製したか、または新たに解凍した１Ｍ  ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）により処理し、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ４ｍｌ  ５０００ＭＷＣＯユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で濃縮し、そして、Ｎａｐ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中へ交換した。この溶液（１ｍｌ）にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の０．０２ｍｌの２５ｍＭ  エクステンダーを加え、それにより、ＰＴＰ−１Ｂ−エクステンダー複合体を形成した。この溶液を注意深く、しかし完全に混合し、次いで、簡単に遠心分離して、いずれの沈殿物もペレットにした。反応を１５分間進行させた。１５分後、過剰なエクステンダーを０．０１ｍｌの１Ｍ  ＤＴＴによりクエンチし、そしてチオエステルを１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中の０．１ｍｌの０．５Ｍ  塩酸ヒドロキシアミンにより脱保護（これにより、第２の官能基であるチオールを露出する）し、それにより、改変されたＰＴＰ−１Ｂ−エクステンダー複合体を形成した。脱保護を少なくとも５時間進行させ、その後、さらに０．０２ｍｌの１Ｍ  ＤＴＴを加え、この溶液をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−４ｍｌ  ５０００ＭＷＣＯユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で濃縮し、次いで、Ｎａｐ−５により、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ８緩衝液へと精製した。得られたタンパク質を図４に示されるように清浄かつ定量的に改変した。
（実施例２９）
本実施例は、ＰＴＰ−１Ｂの活性を測定するための２つの代表的なアッセイを記載する。
【０２４１】
ｐＮＰＰアッセイ：このアッセイは、全反応用量が１００μｌでｐＨ７の５ｍＭ  パラ−ニトロフェニル−ホスフェート（ｐＮＰＰ）基質を用いて実施される。７５０ｎｇのＰＴＰの添加の際に、この反応物を１５分間にわたって測定し（ＯＤ４０５−ＯＤ６５５）、そして５分および１５分での割合を使用してＩＣ５０を決定する。化合物を３倍希釈物を使用し、７つの濃縮物において試験する。１ｍＭ  ｐＮＰＰをスクリーニングに使用する。古典的なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ速度論に従って競合的阻害を検証するために、ＶｍａｘおよびＫｍを決定する。
【０２４２】
インスリンレセプターキナーゼ（ＩＲＫ）ペプチドアッセイ：ＩＲＫペプチドは、インスリンレセプターキナーゼ活性ループの三リン酸化セグメントに対応する。このアッセイを１００μＭ  ペプチド、０．５ｐｍｏｌのＰＴＰ−１Ｂタンパク質を使用し、ｐＨ７で１５分間、室温で実施する。マラカイトグリーン試薬（３：１  マラカイトグリーン：モリブデン酸アンモニウム、０．５％のＴｗｅｅｎ２０からなる）を加え、この混合物を室温で３０分間インキュベートする。６５５ｎｍでの吸光度を測定する。化合物を３倍希釈物を使用して７つの濃縮物において試験する。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
【図１】図１は、係留方法の１つの実施形態の概略的例示である。
【図２】図２は、係留方法の別の実施形態の概略的例示である。
【図３】図３は、ＰＴＰ−１Ｂ（配列番号７）の最初の２９８残基とＴＣ−ＰＴＰ（配列番号８）およびＬＡＲ（配列番号９）の対応する残基とのアラインメントの１つの実施形態である。３つのＰＴＰはすべて、この酵素のヒトバージョンである。
【図４】図４は、第１の官能基を含むエクステンダー、潜在的な第２の官能基を有する切断可能リンカーおよびリン酸化チロシン模倣物によって改変されたＰＴＰ−１ＢのＲ４７Ｃ変異体の質量スペクトルである。図４Ａは、ＰＴＰ−１ＢのＲ４７変異体のついてのスペクトルである。図４Ｂは、（残基４７および第１の官能基上の）チオール間で共有結合が形成されるエクステンダーで改変されている、ＰＴＰ−１ＢのＲ４７変異体のついてのスペクトルである。この複合体は、ＰＴＰ−１Ｂ−エクステンダー複合体といわれる。図４Ｃは、切断可能リンカーが切断され、それによって第２の官能基（この場合は、チオール）が曝され、リン酸化チロシン模倣物が放出される場合のスペクトルである。この複合体は、改変ＰＴＰ−１Ｂ−エクステンダー複合体といわれる。
【配列表】
2006506947.tif 000073
2006506947.tif 000074
2006506947.tif 000075
2006506947.tif 000076
【図１】
2006506947.tif 000081
【図２】
2006506947.tif 000082
【図３】
2006506947.tif 000083
【図４】
2006506947.tif 000084
【国際調査報告】
2006506947.tif 000085
2006506947.tif 000086