(57)【要約】【課題】ＸＩＩＡ因子の変異体【解決手段】ＸＩＩＡ因子（活性化されたＸＩＩ因子）は血中でさまざまな形態で存在する。異なる形態の測定は、病気若しくは疾患を持っているかまたは持っていると疑われる被験者の、診断、モニタリング、又は病気若しくは疾患の罹病性、進行、または転帰、または病気若しくは疾患の治療の予測に関する情報を提供する。
2006510896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の一種以上のＸＩＩａ因子形態を検出又は測定する方法であって、該方法は、他のＸＩＩａ因子形態群に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出又は測定を可能にする手順を実施することからなる方法。
【請求項２】
他のＸＩＩａ因子形態群に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の測定を可能とする分析手法を用いて、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出又は測定することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
他のＸＩＩａ因子形態群から研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を分離すること、及び、分離されたＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出又は測定することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分離されたＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出又は測定は、請求項２で定義された分析の手法からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合が可能でありならびに所望により他のＸＩＩａ因子形態群にも結合できる標識化抗体と試料を接触させること、他の形態から研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を分離すること、及び研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出又は測定することからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は、物理的、化学的又はその免疫学的特性に基づいて、他のＸＩＩａ因子形態群から分離される、請求項３ないし５のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は、クロマトグラフィー、フローサイトメトリー、又は超遠心分離の手順によって他のＸＩＩａ因子形態群から分離され、所望により分離した物質の酵素活性又は免疫学的特性の評価を追随させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合可能な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって分離され、所望により分離した物質の酵素活性又は免疫学的特性の評価を追随させる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
分離手順はＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が分裂されない状況下で実施される、請求項７又は請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料は体液又は体組織の試料である、請求項１ないし９のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
体液は血液、血漿、又は血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
体液は、尿、脳脊髄液、唾液又は涙液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
研究中のＸＩＩａ因子形態は細胞性ＸＩＩａ因子である、請求項１ないし１２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
研究中のＸＩＩａ因子形態は細胞性ＸＩＩａ因子であり、該細胞性ＸＩＩａ因子は、体液の液相又は組織から細胞、細胞残片、ならびに／又は細胞物質を分離することによって、他のＸＩＩａ因子形態群から分離される、請求項３ないし１２のうちいずれか一項に記載
の方法。
【請求項１５】
細胞、細胞残片、ならびに／又は細胞物質は遠心分離によって分離される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞性ＸＩＩａ因子は、ＸＩＩａ因子の検出又は測定の前に、他のＸＩＩａ因子形態群から分離される、請求項１３ないし１５のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
研究中のＸＩＩａ因子形態は脂質結合ＸＩＩａ因子である、請求項１ないし１２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
研究中のＸＩＩａ因子形態は脂質結合ＸＩＩａ因子であり、該脂質結合ＸＩＩａ因子は、体液又は組織から脂質画分を単離することによって、非脂質結合ＸＩＩａ因子から分離される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
脂質画分はリポタンパク質ならびに／又はその残片からなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
脂質画分はリポタンパク質沈殿剤を用いて沈殿させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脂質結合ＸＩＩａ因子は、脂質結合ＸＩＩａ因子が他のＸＩＩａ因子形態群から分離される前に標識化抗体と接触される、請求項１７ないし２０のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
研究中のＸＩＩａの形態若しくは形態群は、二個以上のＸＩＩａ因子、低親和性結合パートナーと会合したＸＩＩａ因子、ならびに高親和性結合パートナーと会合したＸＩＩａ因子からなる一種以上の複合体である、請求項１ないし１２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
検出又は測定は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が分裂されない状況下で実施される、請求項１ないし２２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
分離段階は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が分裂されない状況下で実施される、請求項１ないし２３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は免疫検定法を用いて検出又は測定される、請求項１ないし２４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
分析は、他のＸＩＩａ因子形態群に対し、優先的に研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出又は測定できる免疫検定法である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
分析は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合できる抗体の使用からなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体はｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、又はＸＩＩａ因子に結合できるポリクローナル抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体は直接的又は間接的に測定できる標識にて標識化されたものである、請求項２７又は請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体は放射能標識化されたものである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
結果として生じた抗原−抗体複合体は直接的に検出又は測定される、請求項２５ないし３０のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
結果として生じた抗体―抗原複合体はフローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴、表面弾性波手法、又は水晶振動子微量天秤法によって検出される、請求項２５ないし３１のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
試料は組織試料であり、ならびに研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は免疫組織学によって検出又は測定される、請求項２５ないし３２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
抗体は捕獲抗体として固相に固定化される、請求項５に従属する場合を除く請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
捕獲抗体として固相に固定化された抗体は、ｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、又はＸＩＩａ因子に結合できるポリクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
捕獲抗体はｍＡｂ２／２１５又はその類似体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
捕獲抗体はｍＡｂ２０１／９又はその類似体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
固相は試料と接触され、ならびに、結果として生じた抗原−抗体複合体はどれでも、請求項２８又は請求項２９で定義された標識化抗体を用いて検出又は測定される、請求項３４ないし３７のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
標識化抗体はｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、又はＸＩＩａ因子に結合できるポリクローナル抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
検出又は測定手順のパラメーターは、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が他のＸＩＩａ因子形態群に対し優先的に検出又は測定されるように調節される、請求項１ないし３９のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
検出又は測定の手順は界面活性剤の不存在下で実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
検出又は測定の手順は界面活性剤の存在下で実施される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
該手順はαＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
該手順はβＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
該手順はβＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
該手順は低親和性結合パートナーに結合したαＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
該手順は低親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可
能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
該手順は低親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
該手順は高親和性結合パートナーに結合したαＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
該手順は高親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
該手順は高親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能にする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
該手順はＸＩＩａ因子の二個以上の分子を内包する分子複合体の、検出又は測定を優先的に可能とする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
該手順は細胞又は細胞由来物質と結合したＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能とする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
該手順は、脂質、リポタンパク質又はその残片と結合したＸＩＩａ因子の検出又は測定を優先的に可能とする、請求項１ないし４２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
免疫検定法は、捕獲抗体がｍＡｂ２／２１５又はその類似体であり、ならびに、標識化抗体がｍＡｂ２／２１５又はその類似体である捕獲分析である、請求項４３ないし５３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は発色分析を用いて検出又は測定される、請求項５ならびにその従属項以外の、請求項１ないし２４のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
試料は、病気若しくは疾患を持っている、病気若しくは疾患を経験している、又は病気若しくは疾患を持っていた後又は治療後であるという被験者から得られる、請求項１ないし５６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
病気若しくは疾患は凝固システムを含んでいる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
病気若しくは疾患は、ヘモ凝固、繊維素溶解、キニン生成、補体活性化、又は血管形成、血管全体ならびに血圧の維持、血管内空間における構造性抗凝固性特徴の維持、又は組織防衛・修復を含んでいる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
病気若しくは疾患は、急性又は慢性の炎症、敗血症ショックを含むあらゆる病因のショック、糖尿病、アレルギー、血栓出血性の病気、敗血症、自然流産、又は腫瘍性疾患であるか又は含んでいる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
病気若しくは疾患は、血管内血液凝固又は血栓塞栓症、心筋梗塞、急性冠不全症候群又は狭心症であるか又は含んでいる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
病気若しくは疾患は血栓症又は狭窄であるか又は含んでいる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
病気若しくは疾患は心筋梗塞又は急性冠不全症候群の疑いがあるか又は含んでいる、請求
項５７に記載の方法。
【請求項６４】
病気若しくは疾患は敗血症であるか又は含んでいる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
治療は治療薬の投与、ならびに／又は外科的処置を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
治療は冠状動脈血管形成術又は血栓溶解である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
被験者から得られた一連の試料が試験される、請求項１ないし６６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
試料は病気若しくは疾患の経過中に得られたものである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
試料は、病気若しくは疾患の治療の間、治療の開始前、ならびに／又は治療の終了後に得られたものである、請求項６６又は請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療についての診断、モニタリング、又は予測の方法であり、該方法は、前記被験者から得られた試料において他のＸＩＩａ因子形態群に優先して一種以上のＸＩＩａ因子形態群を検出又は測定すること、ならびに、前記被験者について得られた結果を、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一の分析を用いて得られた結果と比較することからなる方法。
（ｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／又は転帰に関してモニターされた被験者；
（ｉｉｉ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／又は転帰に関して治療に関しモニターされた被験者；
（ｖ）病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）病気若しくは疾患の発症前、又は、病気若しくは疾患治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期又はより後期のステージにある、又は病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者
【請求項７１】
請求項１ないし５６のうちいずれか一項に記載された方法を用いて、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出又は測定する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
病気若しくは疾患は請求項５８ないし６４のうちいずれか一項に定義された通りである、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
治療は請求項６５又は請求項６６に定義された通りである、請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
【請求項７４】
試料は請求項６７ないし６９のうちいずれか一項に定義された通りである、請求項７０ないし７３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
試料は、心筋梗塞の疑いがある対象者の病院への入院時又は入院後に得られ、ならびにＸＩＩａ因子の特定形態の低レベル値は、二次トロポニン陽性イベントのリスク増加と関連する、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
試料は、心筋梗塞の疑いがある対象者の病院への入院時又は入院後に得られ、、ならびにＸＩＩａ因子の特定形態の高レベル値は、二次トロポニン陽性イベントのリスク増加と関連する、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
試料は、心筋梗塞の疑いがある対象者の病院への入院時又は入院後に得られ、ならびにＸＩＩａ因子の特定形態の低レベル値は、死のリスク増加と関連する、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。
【請求項７８】
試料は、心筋梗塞の疑いがある対象者の病院への入院時又は入院後に得られ、ならびにＸＩＩａ因子の特定形態の高レベル値は、死のリスク増加と関連する、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。
【請求項７９】
ＸＩＩａ因子の特定形態の高レベル値は敗血症と関連する、請求項７０又は請求項７１に記載の方法。
【請求項８０】
病気若しくは疾患又は、病気若しくは疾患の治療を行っている被験者から得られた試料におけるＸＩＩａ因子に対する一連の分析を実施すること、ならびに該病気若しくは疾患又は治療に関連するＸＩＩａ因子レベル値の情報を与える分析を選択することからなる方法。
【請求項８１】
病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療について診断、モニタリング、又は予測に関する情報を与えることに適するＸＩＩａ因子の分析を提供する方法であり、該方法は、病気若しくは疾患を持っているか又は治療を受けている被験者から得られた試料におけるＸＩＩａ因子に対する一連の分析の実施をすること、ならびに、どの分析（群）が診断、モニタリング、又は病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療の予測に関するＸＩＩａ因子レベル値に関する情報を提供するのか決定することからなる方法。
【請求項８２】
病気若しくは疾患を持っている又は治療を受けている被験者から得られた試料におけるＸＩＩａ因子についての結果を、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一分析を用いて得られた結果と比較することからなる、請求項８１に記載の方法。
（ｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／又は転帰に関してモニターされた被験者；
（ｉｉｉ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／又は転帰に関して治療に関しモニターされた被験者；
（ｖ）病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）病気若しくは疾患の発症前、又は、病気若しくは疾患の治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期又はより後期のステージにある、又は病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者
【請求項８３】
該分析は請求項１ないし５６のうちいずれか一項において定義された方法である、請求項８０ないし８２のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
病気若しくは疾患は請求項５８ないし６４のうちいずれか一項において定義された通りである、請求項８０ないし８３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
治療法は請求項６５又は６６で定義された通りである、請求項８０ないし８３のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
試料は請求項６７ないし６９のうちいずれか一項において定義された通りである、請求項８０ないし８５のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
得られた結果はデータベースにまとめられる、請求項８０ないし８６のうちいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
請求項８０ないし８６のうちいずれか一項に記載の方法によって得られた結果を含むデータベース。
【請求項８９】
被験者からの試料におけるＸＩＩａ因子を検出又は測定することからなる方法であって、該試料は尿の試料であることを特徴とする方法。
【請求項９０】
病気若しくは疾患の診断又はモニタリング、又は、病気若しくは疾患の治療のモニタリングの方法であって、該方法は病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の尿中の、ＸＩＩａ因子を検出又は測定することからなる方法。
【請求項９１】
疾患は腎機能、腎疾患又は腎障害、又はその治療法であるか又はそれら含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
被験者から得られた結果を、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一分析を用いて得られた結果と比較することからなる、請求項８９ないし９１のいずれか一項に記載の方法。：
（ｉ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患を持っている被験者であって、損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患の進行ならびに／又は転帰に関してモニターされた被験者；
（ｉｉｉ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患の進行ならびに／又は転帰に関して治療に関しモニターされた被験者；
（ｖ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患の発症前、又は、損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患の治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期又はより後期のステージにある、又は損なわれた腎機能、腎疾患及び腎障害などの病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者
【請求項９３】
分析は請求項１ないし５６のうちいずれか一項に定義された方法であり、試料は尿である、請求項９０ないし９２のいずれか一項に記載の方法。                              
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「接触活性化システム」の構成要素である、XＩＩａ因子に関するものである
。
【背景技術】
【０００２】
ＸＩＩａ因子は、正常な血液中に存在する不活性なチモーゲンである。それは試験管内で高分子量のキニノゲンであるカリクレインならびに陰電荷表面の存在下で、容易に酵素的に活性であるＸＩＩａ因子形態に変換される。試験管内で、ＸＩＩａ因子の二種の形態がこれまでに報告されている。しばしばαＸＩＩａ因子と呼ばれるセリンプロテイナーゼの８０Ｋｄ形態は、２８Ｋｄ軽鎖に結合したジスルフィド結合によって、５２Ｋｄ重鎖を有する。この因子のタンパク質分解は、該重鎖からペプチドを放ち、セリンプロテアーゼ活性を保持するβＸＩＩａ因子である生成物をもたらすが、しかしながら、αＸＩＩａ因子の２８Ｋｄ鎖は前出の５２Ｋｄ重鎖に由来する、小さなペプチド断片とジスルフィド結合する。多くの場合、小さなペプチド断片は約１０００ｄの分子量を持っているが、異なるサイズの断片が試験管内で観測される。
【０００３】
特許文献１はＸＩＩａ因子の免疫検定法を開示する。特許文献１はまた、それらはＸＩＩａ因子に結合するモノクローナル抗体２／２１５ならびに２０１／９を開示し、ならびにそれらの生成手法を開示する。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５はハイブリドーマ２／２１５によって生成され、英国，ソールズベリー  ＳＰ４  ０ＪＧ，ポートンダウンの応用微生物学及び研究のためのＰＨＬＳセンターの生物学部門である欧州動物細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣとして知られる）へ１９９０年１月１６日に寄託ナンバー９００１１６０６で寄託されており、ならびに、モノクローナル抗体２０１／９を生成するハイブリドーマ２０１／９はＥＣＡＣＣへ１９９０年１月１８日に寄託ナンバー９００１１８９３で寄託されている。
【０００４】
ＸＩＩａ因子は生体内で血液凝固の接触システムにかかわっているとして長い間知られている。より最近の研究では、ＸＩＩａ因子はまた繊維素溶解、キニン生成、ならびに補体活性化、血管形成などの他のシステムにもかかわっていることを示している。多くの臨床ならびに実験のデータが蓄積されて、接触システムは血液凝固を超えた範囲に及ぶこと、ならびにそれは血管全体ならびに血圧を維持する役割を果たしていること、内皮細胞のさまざまな機能に影響を与えること、ならびに繊維素溶解のコントロールと血管内空間における構造性抗凝固性特徴の維持にかかわっていることを示唆している。更なる臨床ならびに実験研究は、接触システムは急性あるいは慢性の炎症、異なる病因のショック状態、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固などの血栓出血性の病気、ならびに腫瘍性疾患にかかわっていること示唆している。そのような状態は、敗血症、自然流産ならびに血栓塞栓症を含む。加えて、ＸＩＩａ因子は組織防衛・修復にかかわり得る。ヤロヴァヤら（非特許文献１）は接触システムならびに活性化メカニズム及び生物調整機能の新たな概念に関する最近の論文を著している。
【特許文献１】国際公開第９０／０８８３５号パンフレット
【非特許文献１】ヤロヴァヤ、Ｇ．Ａ、ブロクヒナ、Ｔ．Ｂ．ならびにネシュコヴァ、Ｅ．Ａ．  接触システム．活性化メカニズムと生物調整機能の新たな概念．バイオケミストリー（Ｍｏｓｃ）．２００２  １月；６７（１）：１３−１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は試料における一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定の方法を提供する
ものであり、該方法は他のＸＩＩａ因子形態に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出あるいは測定を可能とする手順を実施することからなる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある一つの実施態様において、本発明の方法は、他のＸＩＩａ因子形態に優先して研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の測定を可能とする分析手法によって、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出あるいは測定することからなる。
【０００７】
他の実施態様において、本発明の方法は、他のＸＩＩａ因子形態から研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を分離すること、ならびに分離されたＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出あるいは測定することからなる。
【０００８】
分離されたＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出あるいは測定は、他のＸＩＩａ因子形態に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の測定を可能にする分析手法により行うことができる。
【０００９】
更なる実施態様において、本発明の方法は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合可能な、また所望により他のＸＩＩａ因子形態にも結合可能な標識化抗体と試料を接触すること、他の形態からの研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を分離すること、ならびに研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出あるいは測定することからなる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療についての診断、モニタリング、又は予測に関する方法をも提供するものであり、該方法は、被験者から得られた試料において、他のＸＩＩａ因子形態に優先して、一種以上のＸＩＩａ因子を検出あるいは測定すること、ならびに、被験者から得られた結果と、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一分析を用いて得られた結果とを比較すること：
（ｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関してモニターされている被験者；
（ｉｉｉ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関して治療に関しモニターされている被験者；（ｖ）病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）病気若しくは疾患の発症前、あるいは、病気若しくは疾患治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期あるいはより後期のステージにある、あるいは病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者。
【００１１】
本発明はさらに、病気若しくは疾患を持っているかあるいは病気若しくは疾患の治療を受けている被験者から得られた試料のＸＩＩａ因子に対する一連の分析の実施、ならびに病気若しくは疾患あるいは治療に関連するＸＩＩａ因子レベル値の情報を与える分析の選択からなる方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療法についての診断、モニタリング、又は予測に関する情報を与えるのに適する、ＸＩＩａ因子の分析を与える方法を提供するものであり、該方法は、病気若しくは疾患を持っているか治療を受け
ている被験者から得られた試料におけるＸＩＩａ因子に対する一連の分析を実施すること、ならびに、どの分析が病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療についての診断、モニタリング、又は予測に関するＸＩＩａ因子レベル値に関する情報を提供するのか決定することからなる方法を提供する。
【００１３】
上記方法は、好ましくは、病気若しくは疾患を持っているかあるいは治療を受けている被験者から得られたサンプルにおけるＸＩＩａ因子から得られた結果と、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一分析を用いて得られた結果とを比較することからなる：
（ｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関してモニターされている被験者；
（ｉｉｉ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関して治療に関しモニターされている被験者；（ｖ）病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）病気若しくは疾患の発症前、あるいは、病気若しくは疾患治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期あるいはより後期のステージにある、あるいは病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、生体中に存在するＸＩＩａ因子の異なる形態に関する仮説の図式的表示を示す。
【図２】図２ａから２ｄは、蛍光検出法を用いたＨＰＬＣトレースを示す：図２ａ、血漿試料のみ；図２ｂ、ＦＩＴＣ標識２／２１５抗体；図２ｃ、ＦＩＴＣ標識２／２１５抗体と培養させた血漿；図２ｄ、図２ａならびに図２ｂで示されたトレースを差し引いた後の図２ｃのトレース。
【図３】図３は、ＨＰＬＣを用いて成分を分離した後の、放射能標識化２／２１５Ｆａｂ断片と培養させた血漿における放射活性を示す。ピーク１ないし５は血漿成分に結合したｍＡｂ２／２１５Ｆａｂの結果であり、ピーク６はｍＡｂ２／２１５Ｆａｂと結合せずに残ったものである。
【図４】図４ａと４ｂは、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に対して、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５ならびに標識化ポリクローナル抗体（ポリクローナル接合体）（図４ａではひし形、図４ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）（図４ａでは四角、図４ｂでは黒色棒）を使用した、マイクロタイタープレートによるＸＩＩａ因子の免疫検定法における、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、洗浄細胞の標準化された応答を示す。
【図５】図５は、アボットラボラトリーズ社のＩＭｘシステムを用いた、細胞性ＸＩＩａ因子の免疫検定法の実施に使用されるプロトコルを示す。
【図６】図６ａと図６ｂは、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に対して、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに標識化ポリクローナル抗体（ポリクローナル接合体）（図６ａではひし形、図６ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）（図６ａでは四角、図６ｂでは黒色棒）を使用した、マイクロタイタープレートによるＸＩＩａ因子の免疫検定法における、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の応答を示す。
【図７】図７ａと図７ｂは、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に対して、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに標識化ｍＡｂ２０１／９（２０１／９接合体）（図７aではひし形、図７ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）（図７ａでは四角、図７ｂでは黒色棒）を使用した、ＩＭｘ装置によるＸＩＩａ因子の免疫検定法における、異なる三試料、濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の応答を示す。
【図８】図８ａと図８ｂは、血漿と培養させたＦＩＴＣ標識化ｍＡｂ２／２１５について得られた、フローサイトメトリーデータを示す。図８ａは標識化抗体の不存在下で血漿について得られたデータを示し、図８ｂは血漿が標識化された抗体とともに培養された時に得られたデータを示す。分布のシフトは標識化２／２１５抗体が血漿の細胞成分に結合したことを示唆している。
【図９】図９は、放射能標識化ｍＡｂ２／２１５の添加によって測定された、８個体の血漿における細胞性ＸＩＩａ因子の含有量を示している。
【図１０】図１０ａと図１０ｂは、ＸＩＩ因子が「完全に欠乏」個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９（図１０aではひし形、図１０ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（図１０ａでは四角、図１０ｂでは黒色棒）を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。
【図１１】図１１ａと図１１ｂはＸＩＩ因子が「完全に欠乏」個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の標準化された応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９（図１１aではひし形、図１１ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（図１１ａでは四角、図１１ｂでは黒色棒）を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。
【図１２】図１２ａと図１２ｂは、正常なボランティアならびにＸＩＩ因子が「完全に欠乏」個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の標準化された応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２／２１５を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。（図１２aではひし形ならびに図１２ｂでは網掛け棒が正常なボランティアからの試料を示し；図１２ａでは四角ならびに図１２ｂでは黒色棒が「ＸＩＩ因子欠乏」個体から得られた試料を示す。）
【図１３】図１３ａ及び図１３ｂは、正常なボランティアならびにＸＩＩ因子が完全に欠乏した個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の標準化された応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。（図１３aではひし形ならびに図１３ｂでは網掛け棒が正常なボランティアからの試料を示し；図１３ａでは四角ならびに図１３ｂでは黒色棒が「ＸＩＩ因子欠乏」個体から得られた試料を示す。）
【図１４】図１４は、放射能標識化２／２１５抗体断片のクエン酸血漿への添加、細胞物質の除去、マンガン／ヘパリン沈殿法を用いたリポタンパク質の沈殿、及び沈殿画分の放射活性の測定によって評価された、１２人の健康なボランティアから得られた、脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度を示す。
【図１５】図１５は、放射能標識化２／２１５抗体断片の全血への添加、それに続く細胞物質の除去、ホスホタングステート沈殿法を用いたリポタンパク質の沈殿、及び沈殿画分の放射活性の測定によって評価された、胸痛によって入院した６４人の患者から得られた、脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度を示す。
【図１６】図１６は、８人のボランティアから得られた、ＥＬＩＳＡ法によって評価された、脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度（５５０ｎｍにおける吸光度として表現）を示す。
【図１７】図１７ａから１７ｄは蛍光検出法を用いたＨＰＬＣトレースを示す：図１７ａ、尿試料のみ；図１７ｂ、ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ２／２１５；図１７ｃ、ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ２／２１５と培養させた尿；図１７ｄ、図１７ａならびに図１７ｂで示されたトレースを差し引いた図１７ｃのトレース。
【図１８】図１８は、ＨＰＬＣを用いて成分を分離した後の、放射能標識化ｍＡｂ２／２１５Ｆａｂ断片と培養させた尿における放射活性を示す。ピーク１は尿中のＸＩＩａ因子と結合したｍＡｂ２／２１５Ｆａｂの結果であり、ピーク２はｍＡｂ２／２１５Ｆａｂと結合せずに残ったものである。
【図１９】図１９は、経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）の直前、直後、５日後における、患者の血漿試料のＸＩＩａ因子濃度を測定するために、二種の異なる免疫検定法を用いて得られた典型的な数値パターンを示す。分析１は試料の培養ステップを含む免疫検定法である。前記分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料の培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。分析２は、接合体としてＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体とともに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５を用いるものであり、試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わない。ひし形で表されたデータポイントは分析１から得られた結果を示し；四角で表されたデータポイントは分析２から得られた結果を示す。
【図２０】図２０は、冠動脈形成（ＰＴＣＡ）の直前、直後、５日後に得られた血漿試料の分析によって得られた、４人の患者（患者Ｓ０２１６、Ｓ０７９４、Ｓ０８１１、ならびにＳ０９０９）から得られた血漿試料中のＸＩＩａ因子の濃度を示す。ＸＩＩａ因子は試料培養ステップを含む免疫検定法により測定された。分析は、試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。網掛け棒はＰＴＣＡ前に得られた数値を示し、斜線棒はＰＴＣＡ後に得られた数値を示し、ならびに黒色棒はＰＴＣＡ５日後に得られた数値を示す。
【図２１】図２１は、血栓溶解治療の直前、直後、５日後に患者から得られた試料のＸＩＩａ因子の濃度を示す。分析１は試料培養ステップを含む免疫検定法である。分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５を、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。分析２は、接合体としてＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いるとともに捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５を用いるものであり、試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わない。ひし形で表されたデータポイントは分析１から得られた結果を示し；四角で表されたデータポイントは分析２から得られた結果を示す。結果は個体から得られる典型的数値パターンである。
【図２２】図２２は、ＰＣＴＡの直前、直後、５日後から得られた試料における、３人の患者（Ｓ０６８４、Ｓ０６８５、ならびにＳ０６９３）のＸＩＩａ因子の濃度を示す。ＸＩＩａ因子は試料培養ステップを含む免疫検定法により測定された。分析は試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。網掛け棒はＰＣＴＡ前に得られた数値を示し、斜線棒はＰＣＴＡ後に得られた数値を示し、ならびに黒色棒はＰＣＴＡ５日後に得られた数値を示す。
【図２３】図２３は、心筋梗塞の疑いや急性冠症候群で入院した患者の初入院後の、入院期間中のトロポニン陽性イベントの反復頻度を示す。トロポニン陽性イベントの反復頻度は、ＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。ＸＩＩａ因子は、試料培養ステップを含む免疫検定法で測定される。分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化された同一の抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。
【図２４】図２４は、図２３の入院期間中の、それぞれ優先的にＸＩＩａ因子の異なる形態を測定する、数種の異なる分析を用いた、トロポニン陽性イベントの反復頻度を示す。これは、ＸＩＩａ因子の特定の形態が臨床的有用性を提供するが他の形態はしないということを実証する。前記分析は試料培養ステップを含む免疫検定法であった。分析ａにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は、点を含んだ明るい棒にて示される。分析ａは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（重炭酸塩バッファー中で１５μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化された同一の抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである（図２３に示されたデータと同様に）。分析ｂにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は暗い棒にて示される。分析ｂは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｃにて優先的に測定されるＸＩＩａ因子形態は斜線の入った明るい棒にて示される。分析ｃは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたβＸＩＩａ因子に対するポリクローナル抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。
【図２５】図２５は、図２３で示された同一患者の、入院日３０日以内の、その後のトロポニン陽性イベントの頻度を示す。トロポニン陽性イベントの反復頻度は、ＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。ＸＩＩａ因子は、試料培養ステップを含む免疫検定法で測定される。分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。暗い棒は致命的でないトロポニン陽性イベントを示し、斜線の明るい棒は致命的なトロポニン陽性イベントを示す。
【図２６】図２６は、図２５と同様に入院日３０日以内の、それぞれ優先的にＸＩＩａ因子の異なる形態を測定する、数種の異なる分析を用いた、その後のトロポニン陽性イベントの頻度を示す。これは、ＸＩＩａ因子の特定の形態が臨床的有用性を提供するが、他の形態はしないということを実証する。分析ｘにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は、点を含む明るい棒にて示される。分析ｘは、ｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたβＸＩＩａ因子に対するポリクローナル抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｙにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は暗い棒にて示される。分析ｙは、ｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたＸＩＩａ因子に対するポリクローナル抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｚにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は斜線の入った明るい棒にて示される。分析ｚは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（重炭酸塩バッファー中で１５μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである（図２５に示されたデータと同様に）。
【図２７】図２７は、図２３ならびに図２５の患者の同一試料を用いた、臨床的エンドポイントとしての死亡頻度を示す。死亡頻度はＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。ＸＩＩａ因子は、試料培養ステップを含む免疫検定法で測定される。分析は、試料培養ステップにおいてトリトン添加をせずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体としてＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。暗い棒は二次トロポニン陽性放出を伴わない心臓死を示し、斜線の明るい棒は二次トロポニン陽性放出ならびに死亡を示す。
【図２８】図２８は図２７と同様に、それぞれ優先的にＸＩＩａ因子の異なる形態を測定する、二種の異なる分析を用いた、臨床的エンドポイントとしての死亡頻度を表す。これは、ＸＩＩａ因子の特定の形態が臨床的優位性を提供するが、他の形態はしないということを実証する。分析ｉにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は、点を含む明るい棒にて示される。分析ｉは、ｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに、接合体としてアルカリホスファターゼで標識化された同一の抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｉｉにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は暗い棒にて示される。分析ｉｉは、試料培養ステップにおいてトリトン添加をせずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてＸＩＩａ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。
【図２９】図２９は、致命的でない心筋梗塞の反復頻度（トロポニン陽性イベント）、ならびに心筋梗塞の疑いで入院した患者の初入院後の、６ヶ月間の心臓死を示す。イベントの反復頻度は脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。明るい棒は致命的でない心筋梗塞を示し、暗い棒は心臓死を示す。
【図３０】図３０は、放射能標識化抗体との培養ならびにＨＰＬＣにより確かめられた、５人の健康なボランティアならびに腎疾患を持っている５個体に対する、尿のβＸＩＩａ因子の濃度を示す。
【図３１】図３１は、マイクロタイタープレート免疫検定法にて得られた吸光度として表現された、５人の健康なボランティアならびに腎疾患を持っている５個体に対する、尿のβＸＩＩａ因子の数値を示す。前記分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
定義
抗体とは、たとえば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2断片、ならびに組換え型、キメラ型及び
ヒト化抗体などの、抗原に結合できるあらゆる抗体断片を含む。
【００１６】
抗体接合体、あるいは検出抗体とは、直接的あるいは間接的に分析できる標識を用いて標識化された抗体を意味する。
【００１７】
捕獲抗体とは、免疫検定法で使用するために、固相に固定化した抗体を意味する。
【００１８】
捕獲分析とは、固相に固定化された捕獲抗体が試料と接触する、免疫検定法を意味する。試料が固定化された抗体に結合することができる抗原からなる場合、ならびに、反応条件が適切である場合、抗原は、固定化された抗体を有する抗原−抗体複合体を形成し、それゆえ固相に「捕獲され」、ならびにその後検出あるいは測定されることが可能である。
【００１９】
細胞とは、他に特定されていない場合、無傷細胞、細胞残片、細胞物質を意味する。
【００２０】
細胞性ＸＩＩａ因子ならびに細胞性ＸＩＩ因子は、それぞれ細胞表面に存在する、あるいは細胞、細胞残片、又は細胞物質に結合した、ＸＩＩａ因子ならびにＸＩＩ因子を意味する。
【００２１】
検出は定性的研究を意味する。
【００２２】
検出ならびに／あるいは測定は定量あるいは半定量的研究を意味する。
【００２３】
ＸＩＩａ因子、あるいは活性化ＸＩＩ因子ともよばれる、とは、チモーゲン（ＸＩＩ因子）の酵素的に活性なあらゆる形態あるいは断片を意味する。
【００２４】
高親和性結合パートナーとは、ＸＩＩａ因子と複合体を形成する分子を意味し、その複合体は、たとえば界面活性剤の添加や、他の種との競合によってなどの簡単な方法では分裂され得ない。
【００２５】
脂質結合ＸＩＩａ因子とは、脂質物質と会合した、たとえば脂質、特にリポタンパク質ならびにその残片に会合している、ＸＩＩａ因子を意味する。
【００２６】
低親和性結合パートナーとは、ＸＩＩａ因子と複合体を形成する分子を意味し、その複合体は、たとえば界面活性剤の添加や、他の種との競合によってなどの簡単な方法で容易に分裂する。
【００２７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５、あるいは抗体２／２１５とも呼ばれる、とは、ハイブリドーマ２／２１５から生成された抗体であり、英国，ソールズベリー  ＳＰ４
０ＪＧ，ポートンダウンの応用微生物学及び研究のためのＰＨＬＳセンターの生物学部門である欧州動物細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣとして知られる）へ１９９０年１月１６日に、寄託ナンバー９００１１６０６で寄託されている。
【００２８】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５類似体とは、実質上ｍＡｂ２／２１５と同様のＸＩＩａ因子結合特性を有する抗体を意味する。
【００２９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９、あるいは抗体２０１／９と呼ばれる、とは、ハイブリドーマ２０１／９から生成された抗体であり、ＥＣＡＣＣへ１９９０年１月１８日に寄託ナンバー９００１２５１２で寄託されている。
【００３０】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９類似体とは、実質上ｍＡｂ抗体２０１／９と同様のＸＩＩａ因子結合特性を有する抗体を意味する。
【００３１】
細胞からなる試料とは、細胞からなる体液試料ならびに単離された細胞の試料双方を意味する。
【００３２】
種ならびに形態とは、ＸＩＩａ因子に関して交換可能に用いられる用語である。
【００３３】
ｕｇならびにｕｌとは、それぞれマイクログラムならびにマイクロリットルを意味する。
【００３４】
尿のＸＩＩａ因子とは、尿中に存在するＸＩＩａ因子を意味する。
【００３５】
ＸＩＩａ因子形態
本発明は、ＸＩＩａ因子（活性化ＸＩＩ因子）が血液中でさまざまな種もしくは形態にて存在しており、異なる種もしくは形態の測定はさまざまな臨床症状に関係する情報を与えるという、われわれの驚くべき観測結果に基づいている。
【００３６】
下記事項にとらわれないが、生体内のさまざまな形態でのＸＩＩａ因子の存在に関連するわれわれの仮説は次の通りである。
ＸＩＩａ因子形態変化は下記事項のどれをも反映しているとみられる：
（ｉ）ＸＩＩａ因子の分子量ならびにペプチド鎖長の変化、そのような変異体はαＸＩＩａ因子、βＩＩａ因子、ならびにγＸＩＩａ因子などである；
（ｉｉ）体液中での、たとえば複合体の形態での、ＸＩＩａ因子の、あるいは（ｉ）に記載のその変異体の二個以上の分子の会合、該ＸＩＩａ因子分子は、細胞物質あるいは脂質物質と結合していない；
（ｉｉｉ）ＸＩＩａ因子あるいは上記（ｉ）に記載のその変異体と、細胞又は細胞残片などの細胞物質あるいは特にリポタンパク質、又はその残片などの脂質との会合；
（ｉｖ）ＸＩＩａ因子あるいは上記（ｉ）に記載のその変異体と、たとえば抑制分子といった高親和性結合タンパク質、又は低親和性結合タンパク質のような、一種以上の他の分子種との会合。
【００３７】
すべてのＸＩＩａ因子形態が、定義された病状に関連する情報を等しく与えることはないということもまた仮定されており、そのため、特定形態を優先的に測定する分析は、たとえば、病気若しくは疾患の診断、予測、又はモニタリング、ならびにその治療法の一種以上に関して、臨床的有用性に改善を与えるものである。
【００３８】
われわれの仮説の図式的表示が図１に示されている。ＸＩＩａ因子の分子量ならびにペプチド鎖配列を反映したＸＩＩａ因子形態における変化は、不活性なチモーゲンＸＩＩ因子の進行性切断に起因する。ＸＩＩ因子は切断を受け、結果としてαＸＩＩａ因子と称され、ならびに図１中で「αＸＩＩａ」として言及される、ジスルフィド結合によって２８Ｋｄ軽鎖に結合した５２Ｋｄ重鎖からなる、８０Ｋｄ活性セリンプロテイナーゼとなる。この因子のタンパク質分解は重鎖からタンパク質を放出し、結果としてβＸＩＩａ因子と称され、ならびに図１中で「βＸＩＩａ」として言及される、セリンプロテアーゼ活性を有する生成物になるが、しかし該生成物においてはαＸＩＩａの２８Ｋｄ鎖は前記の５２Ｋｄ重鎖に由来する小さなペプチド断片にジスルフィド結合している。βＸＩＩａ因子は更なるタンパク分解的切断を受け、結果としてγＸＩＩａ因子と称され、ならびに図１中で「γＩＩａ」として言及される、おおよそ１５Ｋｄの分子量を持つ断片となることが可能である。
【００３９】
αＸＩＩａ、βＸＩＩａ、又はγＸＩＩａ因子のような、変異体形態のＸＩＩａ因子のいずれも、Ｃ１エステラーゼ阻害剤といった抑制剤などの高親和性結合パートナー、ならびに、低親和性結合パートナーなどの他の結合タンパク質といった、他の分子種と会合することができる。ＸＩＩａ因子と、低親和性結合パートナーなどの他の結合タンパク質との結合は可逆的であり得、ならびに阻害タンパク質との会合を妨げ得、ならびにそれゆえＸＩＩａ因子活性の抑制を減少あるいは防止することが仮定される。
【００４０】
αＸＩＩａ、βＸＩＩａ、又はγＸＩＩａ因子のような、変異体形態のＸＩＩａ因子のいずれも、リポタンパク質などの脂質と会合あるいは解離することができ、該脂質は粒子ならびに／あるいは粒子残片の形態にあり得る。αＸＩＩａ、βＸＩＩａ、又はγＸＩＩａ因子のような、変異体形態のＸＩＩａ因子のいずれも、細胞ならびに細胞断片のいずれとも会合あるいは解離することができる。特に細胞、細胞断片、リポタンパク質、ならびにリポタンパク質残片と会合したＸＩＩａ因子の場合においては、個別粒子上にＸＩＩａ因子の一形態のいくつかの分子が存在することができる。そしてさらに、ＸＩＩａ因子形態のいくつかの分子は、同一のあるいは異なる形態にかかわらず、ＸＩＩａ因子分子の複合体として存在することができる。明瞭であるため、そのような複合体は図１には示されない。
【００４１】
図１はさまざまなＸＩＩａ因子形態間の仮定された相互変換を示している。明瞭であるため、細胞又はその残片、ならびにリポタンパク質又はその断片を備えた、βＸＩＩａ因子とγＸＩＩａ因子間の相互作用のいずれも示されていない。
【００４２】
図１で示されたシステムは動的システムであることが仮定される。また、ＸＩＩａ因子の異なる形態は生理学ならびに病理学において異なる役割を果たすこと、ならびにＸＩＩａ因子の特定形態の優先的な測定は、定義されていないＸＩＩａ因子形態の測定と比較して、病気若しくは疾患の診断、予測、またモニタリングならびにその治療法に関する臨床的有用性の改善につながることが仮定される。
【００４３】
細胞性ＸＩＩａ因子
多くの著者がＸＩＩ因子からＸＩＩａ因子への活性化が細胞表面で生じうると示唆しており、ならびにその仮説を立証するデータを提供している。特に、著者達は、ＸＩＩ因子の活性化は細胞、とりわけ内皮細胞上にて、高分子量キニノゲン、プレカリクレインならびにＸＩ因子をも含む、多分子集合体の構築を介して、生ずると示唆している。これらのモデルは、活性化後にＸＩＩａ因子は集合体から解離し、そして長期間細胞表面に残らないことを示唆しており、例としてヤロバヤら（前掲個所）を参照のこと。
【００４４】
本発明は、さまざまな形態でＸＩＩａ因子が存在するという、われわれの驚くべき観察に
基づいたものであり、該形態の一つは、血液中を循環する細胞の表面に、ならびにその残片に、ならびにそれから由来する細胞物質に存在するＸＩＩａ因子である。このＸＩＩａ因子形態は「細胞性ＸＩＩａ因子」と呼ばれている。この観察結果は、上記に記載された、細胞表面上の多分子集合体内での活性化後にＸＩＩａ因子は該集合体から解離して細胞との結合を結けてはいないというこれまでの知見と相反する。
【００４５】
更なる観察は、ＸＩＩａ因子が細胞性である場合、すべてのＸＩＩａ因子エピトープが、ＸＩＩａ因子が細胞性でないときと同様に入手可能であるようにみえるというわけではないことである。たとえば、モノクローナル抗体２／２１５は効果的に細胞性ＸＩＩａ因子ならびに非細胞性ＸＩＩａ因子に結合することができる。しかしながら、モノクローナル抗体２０１／９ならびにβＸＩＩａ因子に対する羊ポリクローナル抗体は、非細胞性ＸＩＩａ因子に対してと同様に細胞性ＸＩＩａ因子に対して効果的に結合できるようにはみえない。
【００４６】
血中で、ＸＩＩａ因子は、特に顆粒球、とりわけ顆粒球の小集団に存在しているようにみえ、該小集団はフローサイトメトリーにおいて他の顆粒球よりもわずかに高い散乱度を示し、そのことは他の小集団との形態の違いを示唆する。これらの観察は臨床的な意義を有している、下記参照。
【００４７】
脂質結合ＸＩＩａ因子
ＸＩＩａ因子がさまざまな形態で存在するというわれわれの驚くべき観察の他の局面は、あるＸＩＩａ因子は、たとえばリポタンパク質またその残片などの脂質と会合し、ならびにこの脂質結合ＸＩＩａ因子の測定はさまざまな臨床症状に関する情報を提供するということである。
【００４８】
尿のＸＩＩａ因子
ＸＩＩａ因子がさまざまな形態で存在するというわれわれの驚くべき観察の更なる局面は、ＸＩＩａ因子は尿中に存在し、ならびに尿のＸＩＩａ因子の測定はさまざまな臨床症状に関する情報を提供するということである。
【００４９】
分子複合体ならびに他の分子種とＸＩＩａ因子との会合
われわれの観察は、ＸＩＩａ因子の二個以上の分子は複合体形態で互いに会合可能であり、ならびにまたＸＩＩａ因子は一種以上の分子種、たとえば抑制分子などの高親和性結合タンパク質、あるいは低親和性結合タンパク質といった、分子種と会合可能であるということを示唆する。ＸＩＩａ因子の分子複合体ならびにＸＩＩａ因子の高親和性結合パートナーとの会合は分裂させるが、低親和性結合パートナーとの会合は分裂させないと予期される界面活性剤の存在下あるいは非存在下で、免疫検定法を実施して得られた結果はまた、分子複合体ならびに結合パートナーとの会合の存在を示唆する。
【００５０】
ＸＩＩａ因子の異なる形態の検出ならびに／あるいは測定
本発明は、試料における一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定の方法を提供し、該方法は他のＸＩＩａ因子形態に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出あるいは測定を可能にする手順を実施することからなる。
【００５１】
ある実施態様においては、本発明の方法は他のＸＩＩａ因子形態に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の測定を可能にする分析手法を用いて、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出あるいは測定することからなる。
【００５２】
他の実施態様においては、本発明の方法は他のＸＩＩａ因子形態から研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を分離すること、ならびに分離されたＸＩＩａ因子形態若しくは形
態群を検出あるいは測定することからなる。
【００５３】
分離されたＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出あるいは測定は、他のＸＩＩａ因子形態に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出できる分析手法によることができる。
【００５４】
更なる実施態様において、本発明の方法は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群と結合可能でありならびに所望により他のＸＩＩａ因子形態とも結合できる標識化抗体と試料を接触すること、他の形態から研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の分離すること、ならびに研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出すること又は測定することからなる。
【００５５】
したがって、本発明によれば、研究中のＸＩＩａ因子がまず他のＸＩＩａ因子から分離され、続いて該ＸＩＩａ因子が測定され得る。ＸＩＩａ因子のための一般的な分析、すなわちＸＩＩａ因子のどんな特定形態にも特異的ではない分析が用いられてもよいが、他のＸＩＩａ因子形態に優先して、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を測定できる分析を用いることが有利であり得る。そのような分析の例は以下に示される。そのような手順は、たとえば、細胞性ＸＩＩａ因子、分子複合体、ならびにＸＩＩａ因子の他の分子種との会合などの検出あるいは測定に用いることができる。
【００５６】
もう一つの方法として、他のＸＩＩａ因子形態に優先して研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を測定できる方法は、異なるＸＩＩａ因子形態の事前分離なしに試料に直接実施され得る。そのような分析の例が以下に示される。そのような分析は試料に直接実施され得る。そのような手順は、たとえば、分子複合体ならびにＸＩＩａ因子の他の分子種との会合の検出あるいは測定に用いられ得る。
【００５７】
更なる別の方法は、ＸＩＩａ因子形態を含む試料を、標識化抗体と接触させ、その後、分離された形態の検出あるいは測定を伴って、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の分離を実施することもできる。そのような手順はたとえば脂質結合ＸＩＩａ因子の検出あるいは測定に使用され得る。
【００５８】
ＸＩＩａ因子形態の分離
ＸＩＩａ因子形態はそれらの物理的、化学的あるいは免疫学的な特性に基づいて分離され得る。そのような分離はすべて、一般に、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が変わらずに維持されるというような条件で実施されなければならず、たとえば、その条件は、複合体あるいは分子会合のいずれも分裂されず、ならびに細胞又は脂質物質などの他の物質に結合しているＸＩＩａ因子のいずれの形態もそれら他の物質から解放されないようなものでなければならない。しかしながら、ある状況では、会合あるいは結合している分子からＸＩＩａ因子の解放が望ましい場合もあり得る。
【００５９】
物理的特性に基づく分離
異なるＸＩＩａ因子形態は、たとえば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）といったクロマトグラフィー法、フローサイトメトリー又は超遠心分離手法を用いて分子量に基づいて分離することができ、その後、分離された物質の分析が行われ得る。
【００６０】
分析は、たとえば分離された形態の免疫検定法の使用、あるいはＳ２３０２（英国、オックスブリッジ、カビ  ダイアグノスティックス社）のような発色基質を用いた酵素測定の使用といった、数種の方法で行うことができる。ＸＩＩａ因子に対する抗体はＨＰＬＣとともに使用され得る。たとえば、標識化抗体は試料と反応させることができ、ならびに結果として生じた混合物はＨＰＬＣ分離に付すことができる。ＸＩＩａ因子の特定形態との
抗体の複合体は、その後、抗体の標識に使用された物質への適切な検出システムを用いて測定することが可能である。
【００６１】
物理的特性に基づく、分子複合体ならびにＸＩＩａ因子の結合パートナーとの会合の分離、とりわけ、他のＸＩＩａ因子形態から、ＸＩＩａ因子の二つ以上の分子からなる分子複合体を分離するための、ならびに高親和性あるいは低親和性結合パートナーと会合しているＸＩＩａ因子形態の分離のための方法のような方法が、有用であり得る。
【００６２】
一般に、ＸＩＩａ因子複合体が分裂されず、ならびにＸＩＩａ因子が結合パートナーから解離されないような条件下で、そのような分離を実施することが好ましい。たとえば、一般に、複合体やいくつかの分子会合を分裂させる傾向がある界面活性剤の存在を避けることが好ましい。しかしながら、ある状況下では、分裂の発生が好ましい場合もある。たとえば、低親和性結合パートナーからのＸＩＩ因子の解放、あるいは高親和性結合パートナーと会合したＸＩＩａ因子から低親和性結合パートナーと会合したＸＩＩａ因子の分離が望まれる場合、界面活性剤などの適切な条件が使用され得、高親和性結合パートナーからではなく、低親和性結合パートナーからのＸＩＩａ因子の解離が達成される。
【００６３】
物理的あるいは化学的特性に基づく、細胞性ＸＩＩａ因子ならびに脂質結合ＸＩＩａ因子の分離
細胞性ならびに脂質結合ＸＩＩａ因子は物理的又は化学的方法、あるいはその組み合わせによって他のＸＩＩａ因子から分離され得る。たとえば、細胞性ＸＩＩａ因子は遠心分離法あるいはフローサイトメトリーによって分離され得る。脂質結合ＸＩＩａ因子は、たとえばリポタンパク質沈殿剤ならびに、一般には遠心分離法によって、あるいは密度層超遠心分離法によって分離され得る。
【００６４】
一般に、ＸＩＩａ因子が細胞性あるいは脂質物質から解離されないような条件下で、分離を行うことが好ましい。たとえば、一般に、界面活性剤の存在を避けることが好ましい。しかしながら、ある状況では、分裂の発生が好ましい場合がある。結合している物質からＸＩＩａ分子が分離することが望ましい場合に、適切な条件が使用され得る。
【００６５】
免疫学的分離
研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に対する優先的な結合を示す抗体を用いた、免疫学的手法を用いて他の形態と分離され得る。たとえば、免疫親和性クロマトグラフィーが実施され得、抗体は適切な固定票に固定化されている。結合あるいは非結合画分における酵素活性の測定はクロマトグラフィーの後に実施され得る。それらの使用において好まれる抗体は、免疫検定法に関連する以下の記載の通りである。
【００６６】
物理的あるいは化学的特性に基づく分離に関する上記の記載の通り、免疫親和性クロマトグラフィーによる分離は、一般に、たとえば複合体あるいは会合が分裂せずならびに結合分子が解放されないといった、ＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が変化せずに維持されるような条件下で実施されるべきである。しかしながら、分裂が望ましい状況が起こることもある。その場合には、適切な条件が使用され得る。
【００６７】
分析の適合性の測定
ＸＩＩａ因子の検出あるいは測定方法は知られており、ならびにアミド分解分析のような発色分析又は、以下により詳細が示されているような、さまざまな免疫学的方法を含む。
【００６８】
分析が実施される前に研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が他のＸＩＩａ因子形態から分離されている場合、異なるＸＩＩａ因子形態を区別しない分析、すなわち「一般的
な」ＸＩＩａ因子の分析が使用され得る。しかしながら、たとえ事前分離ステップの後においても、他の形態と比べて優先的に研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出あるいは測定できる分析の使用が有利であり得る。
【００６９】
分離ステップが実施されない場合には、使用される分析は研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出あるいは測定が可能なものでなくてはならない。ＸＩＩａ因子の検出あるいは測定に適切であると知られる分析は、試料中の望ましいＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の検出あるいは測定の能力を試験されることもある。
【００７０】
たとえば、細胞性ＸＩＩａ因子を含むことが知られる試料を使用して、研究中の分析のために得られた結果は、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に適すると知られる分析を用いて得られた結果と比較される。モノクローナル抗体２／２１５は細胞性ＸＩＩａ因子と効果的に結合することができる。ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を含む免疫検定法は、比較分析として使用することもできる。同様の考慮事項が他のＸＩＩａ因子形態にも当てはまる。
【００７１】
他の手段は、たとえば細胞性ＸＩＩａ因子などの望ましいＸＩＩａ因子形態を含むと知られる試料の一部に、研究中の分析を実施することである。その場合、試料は非細胞性ＸＩＩａ因子を含むべきではない。試料の他の一部は細胞からＸＩＩａ因子を解放する処理がなされ、処理された細胞は単離され、該分析が繰り返され、ならびに二つの分析から得られた結果が比較される。細胞性ＸＩＩａ因子を含む試料に対する分析から得られた結果が、細胞性ＸＩＩａ因子を除去する処置をした試料から得られた結果よりも高い場合、その分析は細胞性ＸＩＩａ因子の検出あるいは測定に適していることを示す。同様の考慮事項が他のＸＩＩａ因子形態にも当てはまる。
【００７２】
一種以上のＸＩＩａ因子形態の分析に関する特異性
ある分析法の他の形態に対する一種以上のＸＩＩ因子形態への特異性は、該分析法の設計によって達成されあるいは改善され得る。該分析法におけるパラメーターは、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群が他のＸＩＩａ因子形態と比べて優先的に検出あるいは測定されるように、調節され得る。
【００７３】
そのような分析法の最適化は、技術的に標準的技法であり、適切な技法は周知であり、たとえば以下の資料を参照されたい：免疫検定法の原理ならびに実践，プリンスＣＰ及びニューマンＤＪ編，ストックトンプレス、１９９１。
【００７４】
免疫検定法の場合において、望ましい特異性を獲得するために調節することが可能なパラメーターは、使用される抗体あるいは抗体の組み合わせの選択；界面活性剤の存否及び選択；ならびに固相にコートされた抗体を含む抗原捕獲分析の場合の、プレートコーティングに使用される条件の、一種以上を含み得る。
【００７５】
たとえば、マイクロタイタープレート免疫検定法の場合、他の形態に対し優先的にＸＩＩａ因子の特定形態を測定するために変えることができる多くのパラメーターが存在する。
【００７６】
一つの例は、捕獲抗体の選択に関するもので、たとえば、ｍＡｂ２／２１５が使用されるか、あるいは、異なるＸＩＩａ因子形態を優先的に検出する、ｍＡｂ２０１／９又はｍＡｂ２／１５択一的使用などがある。
【００７７】
捕獲抗体で固相をコーティングするために使用される溶液の処方もまた、異なるＸＩＩａ因子形態の優先的な測定に作用し、たとえば、処方に含まれる抗体の濃度、ならびにｐＨならびにバッファーの構成成分は重要である。
【００７８】
どの形態が優先的に測定されるかに影響する更なるパラメーターは、抗体と培養する間の試料における、たとえばトリトンなどの界面活性剤の存在あるいは不存在である。界面活性剤の存在は、ＸＩＩａ因子分子複合体などの複合体を分裂させ、ならびに／あるいは前もって細胞ならびに／あるいは脂質に結合したＸＩＩａ因子を解放すると仮定されている。界面活性剤の性質ならびに／あるいは量も、分析に影響し得る。
【００７９】
ＸＩＩａ因子の特定形態の優先的な測定に作用するために操作されうるパラメーターの更なる例は、抗体−抗原複合体の検出に使用される接合体を形成するために標識化される抗体の選択である。
【００８０】
分析パラメーター間に複雑な相互作用が存在すること、たとえば、分析に界面活性剤を組み込む効果は、捕獲抗体、コートされた抗体濃度、コーティングバッファー、ならびに使用される接合体抗体の組み合わせに依存することが留意されるべきである。望ましいＸＩＩａ因子形態の検出と分析に最適な条件は、技術的に一般的な技法にしたがって、さまざまなパラメーターの適切な操作によって決定され得る。
【００８１】
試料と試料調製
試料
異なるＸＩＩａ因子形態の測定は、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液又は涙液、といった体液の試料；あるいは、体液から分離された細胞、すなわち、生体内で存在している液相から実質的に解放された細胞からなる試料；あるいは、組織又は組織試料から得られた細胞からなる試料に対して実施され得る。
【００８２】
試料調製
試料は一般的な技法を用いて得られならびに調製され得、たとえば以下を参照のこと：ヤング，Ｄ．Ｓ．ならびにベルメス，Ｅ．Ｗ．，「試料の採集と加工」，臨床化学のティーツテキストブック  第二版」，バーティス、Ｃ．Ａ．ならびにアシュウッド編、Ｅ．Ｒ．，サウンダース（１９９４）、また、酵素学の手法，Ｈ．ヴァン  ヴナキスならびにＪ．Ｊ．ランゴン（編者），１９８１，７２（Ｂ）；酵素免疫検定法の実践と理論，P  ティ
ッセン，生化学ならびに分子生物学の実験テクニック，Ｒ．Ｊ．バーデンならびにＰ．Ｈ．ヴァン  ニッペンバーグ（編者），エルセビア，１９８５；放射性免疫検定法の手引きと関連テクニック，Ｔ．チャード，同書，第三版，１９８７；ならびに、酵素学の手法、Ｈ．ヴァン  ヴナキスならびにＪ．Ｊ．ロンゴン（編者）１９８１，７４（Ｃ）。
【００８３】
体液
本発明によれば、一種以上のＸＩＩａ因子形態が体液試料内で検出あるいは測定され得る。体液試料は全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液ならびに涙液である。体液試料は、たとえば上記の参考文献に記載されているように、従来の方法によって得られならびに調製され得る。
【００８４】
他の形態に優先して、ＸＩＩａ因子の特定形態の選択的な測定は、以下の分析の項に記載されるのと同様に達成され得る。
【００８５】
細胞性ＸＩＩａ因子
ある実施態様では、本発明は、哺乳類対象から、一般にはヒトから得られた細胞、特に血液あるいは他の体液中を循環する細胞からなる試料におけるＸＩＩａ因子の検出あるいは測定からなる方法を提供する。
【００８６】
細胞性ＸＩＩａ因子の測定は体液試料で実施され得、あるいは細胞性ＸＩＩａ因子の測定
分析よりも前に細胞は全血や血漿などの体液試料から単離され、すなわち、生体中で存在する液相から実質的に解放され得る。あるいは、細胞は組織試料から得られ得る。
【００８７】
使用される分析法が細胞性ならびに非細胞性ＸＩＩａ因子の双方の検出あるいは測定を可能とする場合、細胞からなる試料における分析を実施すると、細胞に結合した被検体ならびに非細胞性被検体の双方が検出あるいは測定される。しかしながら、分析が単離された細胞試料に対して実施される場合、その結果は細胞性検体についてのみとなる。本願において、「細胞からなる試料」という用語は、細胞からなる体液試料と、単離された細胞の試料の双方を意味するために用いられる。
【００８８】
細胞残片ならびに細胞物質などの細胞は、たとえば、上記「ＸＩＩａ因子形態の分離」に記述されているように、単離され得る。たとえば、細胞は遠心分離法ならびに洗浄によって単離され得る。好ましくは、細胞は少なくとも１回、好ましくは、２回以上の遠心分離ならびに洗浄を行う。遠心分離は一般に、細胞が浮遊物から分離できる個々のペレットを成形するのに十分に高いｇ力をもって、実施されるべきである。ペレットは、たとえば、細胞から細胞性ＸＩＩａ因子の解離を起こさないような、細胞性ＸＩＩａ因子に影響を与えない適切な溶剤で洗浄され得る。
たとえば、フォスファターゼ  バッファー  生理食塩水ｐＨ７．４は洗浄に、あるいは検出のための細胞の懸濁に、あるいはＸＩＩａ因子の検出ならびに／あるいは測定に使用され得る。フローサイトメトリーは細胞の単離に使用され得る。
【００８９】
細胞性ＸＩＩａ因子が、分析が実施される前に他のＸＩＩａ因子形態から分離されている場合、細胞性ＸＩＩａ因子と他のＸＩＩａ因子形態とを区別しない分析法、すなわち「一般的な」ＸＩＩａ因子分析法を使用され得る。しかしながら、事前分離ステップの後においても、他の形態と比べて選択的に細胞性ＸＩＩａ因子を検出あるいは測定できる分析を使用することが有利であり得る。
【００９０】
分離ステップが実施されていない場合、用いられる分析は、研究中の細胞性ＸＩＩａ因子の検出あるいは測定が可能なものでなければならない。ＸＩＩａ因子のためのさまざまな分析法が下記に記載される。
【００９１】
組織試料中の、細胞性ＸＩＩａ因子の存在は、免疫組織学的手法を用いて検出され得る。たとえば下記に記述されているような、たとえば蛍光標識のような適切な標識を用いて標識化されたモノクローナル抗体が使用され得る。
【００９２】
ある場合には、ＸＩＩａ因子よりむしろＸＩＩ因子が測定されることもある。
【００９３】
脂質結合ＸＩＩａ因子
本発明は、組織、あるいは、特に、哺乳類対象から、一般にはヒトから得られた体液からなる試料中における、脂質結合ＸＩＩａ因子の検出あるいは測定からなる方法を提供する。
【００９４】
脂質結合ＸＩＩａ因子の測定は、たとえば血液、血漿のような体液試料について実施される。あるいは、脂質画分を体液あるいは組織から単離し、該脂質画分を含むＸＩＩａ因子を測定する。脂質画分は上記「ＸＩＩａ因子形態の分離」項に記載されているように分離され得る。たとえば、リポタンパク質は組織や血漿などの体液から、たとえば沈殿などによって単離され得る。リポタンパク質沈殿のための適切な試薬は公知であり、たとえば塩化ナトリウム、塩化マンガン又はヘパリンを含む試薬、及びタングストリン酸塩を含む試薬を包含する。さまざまな試薬ならびに方法が、デマッカー，Ｐ．Ｎ．Ｍ．ら，臨床化学，４３巻，４号、１９９７、６６３−６６８頁、ならびに、シャーマ，Ａ．ら，臨床化学
，３６巻，３号，１９９０，５２９−５３２頁、に記載される。
【００９５】
血漿のような試料は、細胞成分の除去のために、たとえば１２，０００から１６，０００ｇの中程度から高速スピードで、遠心分離にかけることができる。リポタンパク質は、たとえば塩化ナトリウム、塩化マンガン、ならびにヘパリン（約５００ｍＮ塩化ナトリウム、約２１５ｍＮ塩化マンガン、ならびに約５００Ｕ／ｍｌヘパリン）などの公知のリポタンパク質沈殿剤を用いて、あるいは、タングストリン酸塩沈殿剤（約５００ｍＭタングストリン酸塩と一般には塩化マグネシウムからなる）を用いて、沈殿させ得る。
【００９６】
結果として生じた沈殿物は、たとえば遠心分離によって単離され得る。所望であれば、沈殿物は沈殿剤に再懸濁され、ならびにもう一度単離されることもある。この手順は、所望であれば２回か３回、反復されることもある。洗浄は沈殿ステップの間に実施されることもある。
【００９７】
分析の実施前に、すでに脂質結合ＸＩＩａ因子が他のＸＩＩａ因子形態から分離されている場合、異なるＸＩＩａ因子間を区別しない分析法、すなわち「一般の」ＸＩＩａ分析法が使用され得る。しかしながら、事前分離ステップの後においても、他のＸＩＩａ因子と比べて優先的に脂質結合ＸＩＩａ因子を検出あるいは測定できる分析法を使用することが有利であり得る。
【００９８】
分離ステップが実施されていない場合、使用される分析は脂質ＸＩＩａ因子の検出あるいは分析が可能なものでなければならない。
【００９９】
免疫検定法の場合、リポタンパク質画分は試料が抗体と接触させる前後に単離され得る。抗体接触後に脂質画分を単離することが有利であり得る。
【０１００】
分子複合体ならびにＸＩＩａ因子の他の分子種との会合
分子複合体ならびにＸＩＩａ因子の他の分子種との会合を含む試料、一般に、体液試料は、上記に示した一般的な技法による分析のために調製され得る。
【０１０１】
所望であれば、ＸＩＩａ因子の二個以上の分子あるいは低親和性又は高親和性結合パートナーと会合しているＸＩＩａ因子形態からなる分子複合体は、上記「ＸＩＩａ因子形態の分離」項に記載されたように、ＸＩＩａ因子への分析が実施される前に、分離することができる。たとえば、低親和性結合パートナーに結合したαＸＩＩａ因子、低親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子、低親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子の断片、高親和性結合パートナーに結合したαＸＩＩａ因子、高親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子、ならびに高親和性結合パートナーに結合したβＸＩＩａ因子の断片、が分離され得る。
【０１０２】
ＸＩＩａ因子の二個以上の分子あるいは低親和性又は高親和性結合パートナーに結合しているＸＩＩａ因子形態からなる分子複合体が、分析が実施される前にすでに他のＸＩＩａ因子形態と分離されている場合、該ＸＩＩａ因子形態と他のＸＩＩａ因子形態とを区別しない分析、すなわち、「一般的な」ＸＩＩａ因子分析法が使用され得る。しかしながら、事前分離ステップの後においても、他の形態と比べて優先的に該ＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定ができる分析を用いることが有利であり得る。
【０１０３】
他の形態から優先的に研究中のＸＩＩａ因子の形態若しくは形態群を検出あるいは測定できる分析法は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の分離を先に行うことなく、使用され得る。
【０１０４】
適切な分析法、特に、免疫検定法が以下に記載される。
【０１０５】
免疫検定法
本発明に従い、免疫検定法は、他の形態に優先して一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定に使用され得る。免疫検定法は、本発明によるあらゆる試料に関して用いられ得る。
【０１０６】
一般的な免疫学的手法
免疫検定法の実施手法は周知であり、たとえば以下の例を参照のこと：ヤング，Ｄ．Ｓ．ならびにベルメス，Ｅ．Ｗ．，「試料の採集と加工」，臨床化学のティーツテキストブック  第二版」，バーティス、Ｃ．Ａ．ならびにアシュウッド編、Ｅ．Ｒ．，サウンダース（１９９４）、また、酵素学の手法，Ｈ．ヴァン  ヴナキスならびにＪ．Ｊ．ランゴン（編者），１９８１，７２（Ｂ）；酵素免疫検定法の実践と理論，P  ティッセン，生化学
ならびに分子生物学の実験テクニック，Ｒ．Ｊ．バーデンならびにＰ．Ｈ．ヴァン  ニッペンバーグ（編者），エルセビア，１９８５；放射性免疫検定法の手引きと関連テクニック，Ｔ．チャード，同書，第三版，１９８７；ならびに、酵素学の手法、Ｈ．ヴァン  ヴナキスならびにＪ．Ｊ．ロンゴン（編者）１９８１，７４（Ｃ）。
【０１０７】
定性的ならびに定量的双方の免疫学的検定手法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着分析）、ウェスタンブロット、流体相沈殿分析、被覆粒子分析、競合分析、正、逆、及び同時サンドウィッチ分析などのサンドウィッチ分析、ならびに、固相放射線免疫検定法（ＳＰＲＩＡ）を含む。
【０１０８】
抗原−抗体複合体は、たとえば以下に記載の方法、あるいは標識化抗体によって直接的に検出され得る。
【０１０９】
二重抗体サンドウィッチ分析
本発明に従い使用されるＥＬＩＳＡ形式の例は、いわゆる「二重抗体サンドイッチ」分析であり、該分析においては、一種以上のＸＩＩａ因子形態に結合できる抗体、特にモノクローナル抗体は、プラスチックマイクロタイタープレートのウェル、又は、米国，イリノイ州，アボットパークのアボットラボラトリーズのＩＭｘシステムなどの特許システムで用いられるようなビーズ、粒子などの、プラスチック又は他のポリマー物質といった固相支持体上に固定化される。この抗体は「捕獲抗体」と呼ばれる。試料は固定化された捕獲抗体と接触して培養される。固定化された抗体に結合できるＸＩＩａ因子形態のいずれも、固定化された抗体によって「捕獲」され、それゆえにそれ（ＸＩＩａ因子）自体が固相上に固定化される。固相上に捕獲されたＸＩＩａ因子は、一種以上のＸＩＩａ因子形態に結合できる標識化抗体を用いて検出される。この標識化抗体はしばしば抗体「接合体」と呼ばれる。抗体ならびに／あるいは他の分析条件の注意深い選択によって、他の形態よりもＸＩＩａ因子の一種以上の特定形態を優先的に計測、検出ならびに／あるいは測定するように分析法を最適化することができる。
【０１１０】
標識化抗体
標的抗原の検出あるいは検出ならびに／あるいは測定に使用される標識化抗体は、ポリクローナルあるいはモノクローナルであり得る。抗ヒトポリクローナル抗体のような抗ヒト抗体は、しばしば臨床応用における標識化抗体としての使用において都合がよい。あるいは、研究中のＸＩＩａ因子形態に結合した抗体が使用され得る。そのような抗体は、たとえば、αＸＩＩａ因子の重鎖、βＸＩＩａ因子、あるいはβＸＩＩａ因子の断片に結合することができる。
【０１１１】
標識は直接的あるいは間接的に検出可能であり得る。あらゆる適切な放射性同位体が、12
5Ｉ、131Ｉ、3Ｈもしくは14Ｃなどのβエミッター又はγエミッターなどの直接検出可能
標識として使用され得る。商業使用においては、非放射性標識、一般には酵素標識が好まれる。酵素標識は間接的に検出され得る。酵素標識は、たとえばアルカリホスフォターゼ、又はホースラディッシュパーオキシダーゼのようなパーオキシダーゼである。フェノールフタレインモノホスフェートのような検出可能な光学あるいは蛍光的変化をもたらす基質、もしくは４−メチルアンベリフェリルホスフェートのような蛍光性基質といった、選ばれた酵素のための適切な基質が使用される。あるいは、電気化学的手法を用いて追跡できる、酵素反応が使用されることもある。
【０１１２】
標識化抗体は、抗原−抗体複合体の検出のためにＥＬＩＳＡなどにおいて用いられるか、あるいは抗原との複合体を形成し、該複合体はその後検出される。フローサイトメトリーが検出に使用し得る。
【０１１３】
競合分析
放射能標識化あるいは酵素標識化されている、一種以上のＸＩＩａ因子形態は、一種以上のＸＩＩａ因子形態の測定のための競合分析において使用される。
【０１１４】
ＸＩＩａ因子の免疫検定法
ＸＩＩａ因子の免疫検定法の例は、国際公開第９０／０８８３５号パンフレットに記載された捕獲分析である。優先的に一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定をするために、特に捕獲抗体として、ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を使用することが推奨されている。ポリクローナル抗体あるいは異なるモノクローナル抗体などの異なる抗体が、研究中のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは／ならびに測定に使用され得、あるいは同一の抗体が使用され得る。抗体ならびに／あるいは分析条件の選択ならびに／あるいは操作は、他の形態よりも一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出ならびに／あるいは検出の測定を優先的に可能にする。
【０１１５】
更なる免疫学的検定手法
抗原の検出あるいは測定に関する更なる免疫学的検定手法は、結果として生じた抗原−抗体複合体の直接検出を利用する。そのような方法の例は、表面プラズモン共鳴法、表面弾性波法、ならびに水晶振動子微量天秤法である（スズキ  Ｍ，オザワ  Ｆ，スギモト  Ｗ，アソウ  Ｓ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３７２：３０１−４，２００２；ペアソン  ＪＥ，ケーン  ＪＷ，ペトラキ−カリオティ  Ｉ，ジル  Ａ，ヴァドグマ  Ｐ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ；２２１：８７−９４、１９９８；ウェイシュ
Ｗ，クレイン  Ｃ，フォン  シックフス  Ｍ，フンクリンガー  Ｓ．  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６６８：２０００−４，１９９６；チョウ  ＳＦ，ス  ＷＬ，ウァン  ＪＭ，チェン  ＣＹ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４８：９１３−８、２００２）。
【０１１６】
標識化抗体が抗原と複合体を形成する場合、該複合体はフローサイトメトリーによって検出あるいは測定され得る。
【０１１７】
標準物質ならびにコントロール物質
免疫検定法は一般に基準点として「標準物質」が用いられる。
【０１１８】
一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは検出ならびに／あるいは測定のための分析に適する標準物質は、ＸＩＩａ因子の一種以上の適切な形態を既知量含む溶液から典型的になり得る。あるいは、標準物質は、固相のような支持物質に結合した、ＸＩＩａ因子の適切な一種以上の形態からなり得る。
【０１１９】
標準物質ならびにコントロール物質としての役割として用いた物質は、用いられる分析に
よってさまざまな形態を取ることができる。ある分析形式においては、適切な物質は水溶液に存在することもある。ＸＩＩ因子あるいはその断片は、さまざまなＸＩＩａ因子形態を含む。他の形式において、同一の抗体がＥＬＩＳＡにおいて捕獲ならびに検出（接合体）抗体として使用される場合、たとえば直径３μＭのポリカーボネートビーズのようなビーズの表面にβＸＩＩａ因子を結合することによって、さまざまなＸＩＩａ因子形態を含む多重のＸＩＩ因子分子あるいはその断片を含む構築物を作り出すことが望ましい。
【０１２０】
脂質結合ＸＩＩａ因子の検出あるいは検出ならびに／あるいは測定のための分析に適する標準物質は、脂質結合ＸＩＩａ因子の既知量を含む溶液から典型的になる。あるいは、標準物質は、固相などの非脂質支持物質に結合したＸＩＩａ因子からなり得、あるいはＸＩＩａ因子の水溶液を標準物質として使用され得る。
【０１２１】
尿のＸＩＩａ因子の検出あるいは検出ならびに／あるいは測定のための分析に適する標準物質は、ＸＩＩａ因子の既知量を含む溶液から典型的になる。
【０１２２】
免疫組織学
組織試料におけるＸＩＩａ因子形態若しくは形態群の存在は、免疫組織学的手法を用いて検出することができる。たとえば、蛍光標識のような適切な標識で標識化させた、上記に記載されたモノクローナル抗体を使用することができる。典型的には、標識化抗体は、組織試料と接触ならびに培養され、試薬はその後、形成された抗体−抗原複合体が分裂しない条件下で洗浄除去され、そしてそのような複合体のいずれも検出される。
【０１２３】
発色分析
一つ以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定は、たとえば、ヴィナッツァー  Ｈ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．，１４，１５５−６６，１９７９に記載されたような、発色基質を用いて、その酵素活性を測定することにより実施される。
【０１２４】
この分析法は、一種以上のＸＩＩａ因子形態が他の形態から単離されるステップを含む、上記参照。
【０１２５】
細胞性ＸＩＩａ因子の免疫検定法
細胞は、細胞から細胞性ＸＩＩａ因子の解離を引き起こすことのないような、細胞性ＸＩＩａ因子に影響しない適切な溶剤を用いて、好ましくは少なくとも１回ならび特に２回あるいは３回の遠心分離及び洗浄によって、血液や血漿などの体液から単離することができる。適切な液体は一般に、たとえばホスフェート  バッファー  生理食塩水（ＰＢＳ）をｐＨ７．４にしたようなバッファーである。
【０１２６】
細胞からなる体液試料は洗浄され、高速で遠心分離され、そして「洗浄細胞」を与える適切な液体中に懸濁され得る。高速遠心分離の例は１０分間に１６，０００ｇである。適切な洗浄ならびに懸濁液体の実施例はｐＨ７．４のＰＢＳである。１回以上、たとえば２回あるいは３回あるいはそれ以上の、遠心分離の反復を実施することができる。
【０１２７】
濃細胞血漿は、たとえば血液を高速遠心分離することによって、たとえば１０分間１０００ｇの速度でクエン酸塩添加血液を遠心分離することによって得ることができる。濃細胞血漿に対する更なる遠心分離、たとえば１６，０００ｇでの１０分間の遠心分離などの、高速遠心分離は、希細胞血漿とよばれる上清を与える。
【０１２８】
試料として濃細胞、希細胞、ならびに洗浄細胞を用いた二重抗体サンドイッチ分析に対して、捕獲ならびに検出抗体の双方としてｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を使用する
ことにより、希細胞血漿についての最小応答とともに、洗浄細胞について最大応答が得られる。対照的に、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を使用するとともに、ポリクローナル抗体を検出抗体として使用した際には、濃細胞ならびに希細胞の双方についてかなりの応答が得られ、しかしながら洗浄細胞については最小応答となる。
【０１２９】
更なる免疫検定法ならびにフローサイトメトリー実験は、該結果を確認する。それらの結果は、ＸＩＩａ因子が細胞表面の上に存在する時に、ｍＡｂ２０１／９に結合しているＸＩＩａ因子の上のエピトープは結合能力がより少ないのに対して、ＸＩＩａ因子が細胞性であるときにｍＡｂ２／２１５はＸＩＩａ因子の上でエピトープに結合する、ということを示している。
【０１３０】
脂質結合ＸＩＩａ因子の免疫検定法
免疫検定法はｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体あるいはＦａｂ断片のようなその断片を用いて実施することができる。捕獲分析において、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を使用することが好ましい。異なる抗体、たとえばポリクローナル抗体あるいは異なるモノクローナル抗体、あるいは同じ抗体が、検出に使用され得る。
【０１３１】
放射線免疫検定法のような直接的免疫検定法が使用され得る。その場合、ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体あるいはＦａｂ断片のようなその断片を使用することが好ましい。適切な標識の例は上記に与えられている。
【０１３２】
リポタンパク質画分は試料が抗体と接触する前あるいは後に単離され得る。抗体との接触後にリポタンパク質画分を単離することが有利であり得る。リポタンパク質画分は上記「試料調製」項に記載されたように単離される。
【０１３３】
免疫検定法に変わるものとして、脂質結合ＸＩＩａ因子の検出ならびに／あるいは測定が、ヴィナッツアー  Ｈ．，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．，１４，１５５−６６，１９７９に記載されているような発色基質を用いてその酵素活性を測定することによって実施され得る。これは上記に記載されているような、一種以上の種が他の種から単離される段階を含む。
【０１３４】
※ｆｏｒｍ→ｆｒｏｍ
分子複合体ならびに他の分子種とＸＩＩａ因子の会合に対する免疫検定法
免疫検定法は、他のＸＩＩａ因子形態から分子複合体ならびに他の分子種とＸＩＩａ因子の会合の分離後に、あるいはそのような分離をしない試料において、実施され得る。たとえば、所望であれば、ＸＩＩａ因子の二個以上の分子、あるいは低又は高親和性結合パートナーと会合しているＸＩＩａ因子形態からなる分子複合体は、ＸＩＩａ因子の分析が実施される前に、上記「ＸＩＩａ因子形態の分離」項に記載されているように分離され得る。
たとえば、低親和性結合パートナーに結合しているαＸＩＩａ因子、低親和性結合パートナーに結合しているβＸＩＩａ因子、低親和性結合パートナーに結合しているβＸＩＩａ因子断片、高親和性結合パートナーに結合しているαＸＩＩａ因子、高親和性結合パートナーに結合しているβＸＩＩａ因子、高親和性結合パートナーに結合しているβＸＩＩａ因子断片、などが分離され得る。
【０１３５】
上記に記載されたあらゆる免疫検定法はＸＩＩａ因子の分子複合体ならびに他の分子種との会合の測定に使用され得る。上記に記載されているように、抗体として、とりわけ、捕獲免疫検定法における捕獲抗体として、ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を使用することがしばしば好ましい。検出に使用される標識化抗体は、捕獲されたＸＩＩａ因子形態に結合できなくてはならない。たとえば、標識化抗体はαＸＩＩａ因子の重鎖、βＸＩＩ
ａ因子、あるいはβＸＩＩａ因子の断片に結合することができる。
【０１３６】
尿のＸＩＩａ因子に対する免疫検定法あるいは他の分析
上記に記載されたあらゆる免疫検定法は、他の形態と比較して優先的に、尿中の一種以上のＸＩＩａ因子形態の測定に使用され得る。上記に記載されたように、ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体を抗体として、とりわけ、捕獲免疫検定法における捕獲抗体として使用することが一般に好ましい。
【０１３７】
キット
本発明はさらに本発明の免疫検定法を実施するためのキットを提供し、そのキットは、以下の各々別の容器内にあるか、あるいは区画化されている、以下のものからなる：
（ｉ）一種以上のＸＩＩａ因子形態に結合できるモノクローナル抗体、たとえば、ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体、あるいはｍＡｂ２／２１５又はその類似体と同様あるいは類似のＸＩＩａ因子結合特性を持つ、他のモノクローナル抗体、ならびに
（ｉｉ）一種以上のＸＩＩａ因子形態が（ｉ）で定義されたモノクローナル抗体に結合している場合に、一種以上のＸＩＩａ因子形態に結合できる標識化抗体。
【０１３８】
前記キットは、上記に示したような、免疫検定法を実施するための更なる成分を含み得る。モノクローナル抗体は、固体支持体に固定化され得る。
【０１３９】
本発明によるキットは、たとえば以下のものからなり得る。
ａ）一種以上のＸＩＩａ因子形態に結合できるモノクローナル抗体、たとえば、ｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体、あるいはｍＡｂ２／２１５又はその類似体と同様あるいは類似のＸＩＩａ因子結合特性を持つ、他のモノクローナル抗体、
（ｂ）一種以上のＸＩＩａ因子形態を既知量含む溶液からなる典型的な標準物質、
（ｃ）一種以上のＸＩＩａ因子形態が（ｉ）で定義されたモノクローナル抗体に結合している場合に、一種以上のＸＩＩａ因子形態と反応できる標識化抗体。
【０１４０】
標準物質ならびにコントロール物質としての役割として用いた物質は、用いられる分析によってさまざまな形態を取ることができる。ある分析形式においては、適切な物質は水性溶液に存在することもある。ＸＩＩ因子あるいはその断片は、さまざまなＸＩＩａ因子形態を含む。他の形式において、同一の抗体がＥＬＩＳＡにおいて捕獲ならびに検出（接合体）抗体として使用される場合、たとえば直径３μＭのポリカーボネートビーズのようなビーズの表面にβＸＩＩａ因子を結合することによって、さまざまなＸＩＩａ因子形態のような多重のＸＩＩ因子分子あるいはその断片を含む構築物を作り出すことが望ましい。
【０１４１】
更なる標準物質の例は上記に示されている。あるいは、キットは、競合分析に用いるために、標識化されたＸＩＩａ因子形態からなることもある。
【０１４２】
キットはまた、それぞれ別の容器内にある更なる成分、たとえば、希釈剤、洗浄試薬溶液、ならびに基質溶液などを含む。
【０１４３】
分析デバイス
本発明はまた、本発明の分析法を実施するための適切な分析デバイスをも提供する。「分析デバイス」という用語は、ここで、適切な捕獲抗体を固定化した固相、一般には、メンブレン、シート、ストリップ、コーティング、フィルムあるいは他の層状手段のような層状固相からなる、免疫検定法の実施のための手段を表すために使用される。固定化された抗体は、好ましくは、本願において、「抗原捕獲ゾーン」と呼ばれる、定義されたゾーン内に存在する。
【０１４４】
分析デバイスは、堅い支持体あるいはハウシング内に固相を組み込むことができ、該固相はまた、分析の実施に必要ないくつかあるいはすべての試薬を含むこともできる。試料は一般に、所定の試料適用ゾーンで、たとえば該ゾーン上への試料の注入あるいは滴下によって、あるいは、試料中にデバイスの適当部分を浸すことによって、分析デバイスに適用される。試料適用ゾーンが抗体捕獲ゾーンとは異なる場所の場合、デバイスの配置は一般に、試料中の抗原が抗体捕獲ゾーンに移動するようなものとなる。必須試薬は、それから適切な順番で指定の適用ゾーンへ投入され、該ゾーンは試料適用ゾーンと同一でも同一でなくてもよい。さらに、前記のあるいはいずれかの試薬適用ゾーンが抗体捕獲ゾーンとは異なる場所の場合、デバイスの配置は一般に、試薬が抗体捕獲ゾーンに移動するようなものであり、該ゾーンで形成された抗原−抗体複合体が検出される。免疫検定法に必須なあらゆるあるいはいくつかの試薬は、液体あるいは乾燥形態としてデバイスに組み込むことができる。その場合、デバイスは一般に、異なるデバイスパーツ間の相互作用（該相互作用はデバイス操作の間に自動的に起こり得る、又はデバイスの使用者によってもたらされ得る）が、さまざまな試薬を実施される免疫検定法のための正しい順序でお互いに接触させるように、配置される。
【０１４５】
各種さまざまな分析デバイスが免疫検定法の文献に記載されている。メンブレンデバイスの例は、米国特許第４，６２３，４６１号明細書ならびに第４，６９３，９８４号明細書に記載されている。それらの設計と反応スピードによって、ある分析デバイスは「ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋｓ）」デバイスと呼ばれ、ならびにあるものは「迅速分析」デバイスと呼ばれる。「迅速分析」デバイスは、一般に、試料適用１０分以内で結果を提供する。（典型的なマイクロタイタープレートあるいはビーズ分析は培養ステップを必要とし、ならびに一般に結果を提供するのに少なくとも１時間を要する）。それゆえ、分析デバイスは一般にマイクロタイターやビーズ形式の分析法よりも高価ではあるものの、それらはたとえば緊急治療の場合のように結果が迅速に要求されるような、臨床試験においてとりわけ用いられる。
【０１４６】
分析デバイスは、複雑な実験設備を必要としない、あるいはどんな実験設備でさえも必要とせずに使用できるという特別な利点を持っている。それゆえに、それらは「ポイント・オブ・ケア（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）」テストに使用され、たとえば、緊急治療室で、医者の手術中に、薬局で、あるいはあるケースでは家庭内のテストにおいて使用される。それらは特に、実験設備が少なく、又、遠く離れている地域で特に有用である。
【０１４７】
モノクローナル抗体
本発明は、ｍＡｂ２／２１５ならびに、ＸＩＩａ因子との結合に関してｍＡｂ２／２１５と同様あるいは類似の特性を持つモノクローナル抗体といった、他の形態に優先して、活性化ＸＩＩ因子の一種以上の特定形態と結合できる、モノクローナル抗体の使用に関するものである。
【０１４８】
上術のとおり、ＸＩＩａ因子が細胞性、すなわち、細胞あるいは細胞物質に結合している場合、すべてのＸＩＩａ因子エピトープが、ＸＩＩａ因子が細胞性でない場合と同様に、利用できる訳ではないようである。たとえば、モノクローナル抗体２／２１５は、細胞性ＸＩＩａ因子ならびに非細胞性ＸＩＩａ因子に効果的に結合できる。しかしながら、モノクローナル抗体２０１／９ならびにβＸＩＩａ因子に対する羊ポリクローナル抗体は、非細胞性ＸＩＩａ因子と同様に細胞性ＸＩＩａ因子に効果的に結合できるようにはみえない。
【０１４９】
下記の仮説に拘泥しないが、ｍＡｂ２／２１５は、ＸＩＩａ因子が、たとえば細胞物質、脂質、一個以上の他のＸＩＩａ因子分子、あるいは低又は高親和性結合パートナーとの複合体あるいは会合形態にあるときに利用できるエピトープと、効果的に結合できるようで
ある。
【０１５０】
ＸＩＩａ因子の特定形態に結合性に関してｍＡｂ２／２１５ならびに２０１／９と同様あるいは類似の結合特性を持つモノクローナル抗体は、従来の方法で生成され、望ましい結合特性について従来の方法によって、選別することができる。
たとえば、ＸＩＩａ因子との結合に関してｍＡｂ２／２１５と同様あるいは類似の性質を持つモノクローナル抗体のような、ＸＩＩａ因子の一種以上の特定形態と優先的に結合できるモノクローナル抗体は、それ自体は公知の方法で生成され得る。結果として生じた抗体は望ましい特徴を持つものが選別され得る。
【０１５１】
一般的に、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ＸＩＩ因子チモーゲンと意味のある結合を示さないことが好ましい。ＸＩＩ因子との修正された交差反応性は、たとえば、０．１％以下である。本発明の抗体とＸＩＩ因子との交差反応性の評価において考慮される要素は、たとえ「純」ＸＩＩ因子調製液であってもほぼ必然的に少量のＸＩＩａ因子が混入することである（シルバーバーグ  ならびに  カプラン，Ｂｌｏｏｄ  ６０，１９８２，６４−７０）。国際公開第９０／０８８３５号パンフレットは、ＸＩＩａ因子との修正された交差反応性を評価する詳細な方法を与える。その他に特定されていない場合、「交差反応性」という用語は本願において、修正された交差反応性を意味するために使用される。
【０１５２】
モノクローナル抗体の生成に使用される方法は周知であり、たとえば以下を参照のこと：酵素学の手法，Ｈ．ヴァン  ヴナキス  ならびにＪ．Ｊ．ロンゴン（編者）１９８１，７２（Ｂ）、ならびに、同書，１９８３，９２（Ｅ）。モノクローナル抗体は、たとえば、コーラーならびにミルステインの手法を変更することにより、生成され得る（Ｇ．コーラーならびにＣ．ミルステイン，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５）。
【０１５３】
ここで参考文献に組み入れられる国際公開第９０／０８８３５号パンフレットは、一般論として、αＸＩＩａ因子ならびにβＸＩＩａ因子に結合し、ならびにＸＩＩ因子と０．１％あるいはそれ以下の修正された交差反応性を示す、抗体の生成方法が記載されており、ならびに、ｍＡｂ２／２１５ならびにｍＡｂ２０１／９の生成に関する具体的な詳細を与える。その中に記載された一般的ならびに具体的な方法は、ＸＩＩａ因子との結合に関しｍＡｂ２／２１５あるいはｍＡｂ２０１／９と同様あるいは類似の性質を持つモノクローナル抗体といった、本発明に従う使用に適するモノクローナル抗体の生成に用いることができる。
【０１５４】
モノクローナル抗体の生成に使用される方法は周知であり、たとえば以下を参照のこと：酵素学の手法，Ｈ．ヴァン  ヴナキス  ならびにＪ．Ｊ．ロンゴン（編者）１９８１，７２（Ｂ）、ならびに、同書，１９８３，９２（Ｅ）。モノクローナル抗体は、たとえば、コーラーならびにミルステインの手法を変更することにより、生成され得る（Ｇ．コーラーならびにＣ．ミルステイン，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５）。
モノクローナル抗体の製造に用いられる免疫原はβＸＩＩａ因子であり得る、国際公開第９０／０８８３５号パンフレットを参照。生じたモノクローナル抗体は、たとえばＸＩＩ因子との０．１％以下の修正された交差反応性を持つような、ＸＩＩ因子チモーゲンに意味のある結合を示さないものについて選別され得る。
【０１５５】
生じたモノクローナル抗体は、結合が望ましいＸＩＩａ因子形態、たとえば、細胞性ＸＩＩａ因子、脂質結合ＸＩＩａ因子、あるいはＸＩＩａ因子の他のＸＩＩａ因子分子、あるいは高又は低親和性結合パートナーとの複合体又は会合などとの結合性について選別され得る。
【０１５６】
モノクローナル抗体２／２１５あるいは２０１／９をそれぞれ基準抗体として、ＸＩＩａ因子の特定形態に結合する抗体のスクリーニングに対して使用することが有利であり得る。選択された抗体は、それぞれｍＡｂ２／２１５あるいは２０１／９と同様あるいは類似の、選択されたＸＩＩａ因子形態に対して特異的な結合特性を持ち得る。
【０１５７】
ｍＡｂ２／２１５生成に使用されるハイブリドーマは、マウスの脾臓細胞に由来するものではあるが、本発明はネズミあるいはネズミの一部分由来のハイブリドーマに限定されない。両融合パートナー（脾臓細胞ならびに骨髄腫）はあらゆる適切な動物から得られ得る。組み換え抗体が生成され得る。抗体は、所望の場合には、キメラあるいはヒト化形態に転換され得る。ハイブリドーマは好ましくは試験管中で培養される。
【０１５８】
ポリクローナル抗体
本発明はまた、ポリクローナル抗血清とも呼ばれるポリクローナル抗体を提供し、該抗体は一種以上のＸＩＩａ因子形態と選択的に反応することができる。そのような抗体は標識化され、ならびにＥＬＩＳＡで一種以上の捕獲ＸＩＩａ因子の検出に使用され得る。
【０１５９】
本発明はまた、そのようなポリクローナル抗血清の製造方法を与え、該方法はＸＩＩａ因子、たとえばβＸＩＩａ因子を動物へ投与すること、該動物から血清を得ること、一種以上のＸＩＩａ因子形態との結合性について前期血清をスクリーニングすることからなる。いくつかの場合、ＸＩＩ因子は免疫原として使用することができる。
【０１６０】
本発明はまた、被験者から得られた尿からなる試料におけるＸＩＩa因子を検出あるいは
測定することからなる方法を含んでいる。本発明のこの実施態様において、他の形態と比べて優先的に、一種以上のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群を検出あるいは測定する必要はない。形態を区別しない分析法が使用され得る。そのような分析法は、たとえば、発色分析法あるいは免疫検定法であり得る。免疫検定法は、たとえば国際公開第９０／０８８３５号パンフレットに記載されているものであり得る。
【０１６１】
「一般的な」分析あるいは異なるＸＩＩａ因子形態を区別することができる方法による、尿中のＸＩＩａ因子の分析は、尿中のＸＩＩａ因子の濃度が、特に、多量の蛋白尿が検出されない状態における、腎機能、腎疾患ならびに腎障害の敏感なマーカーであるために、腎機能、腎疾患ならびに腎障害に関する有用な情報を提供する。たとえば、健康な被験者と比べて、被験者の尿中におけるＸＩＩａ因子の高濃度は、損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害のいずれの指標にもなる。尿のＸＩＩａ因子濃度の変化は、症状の悪化あるいは治療法に応えての改善といった、臨床症状の変化の指標となり得る。
【０１６２】
臨床あるいは他の有用性
本発明、特に上記に記載された免疫検定法は、大規模使用に対する自動化装備として容易に使用できる、異なるＸＩＩａ因子形態の検出ならびに／あるいは測定方法を提供する。
【０１６３】
ＸＩＩ因子とその活性化形態、ＸＩＩａ因子は、血液凝固、ならびに、繊維素溶解、捕体カスケード、炎症ならびに血管拡張などの接触相システムとしても知られている、他の接触システムを改善するとみなされており、以下を参照：ヤコブセン  Ｓ．ならびにクリッツ  Ｍ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２９，２５−３６，９６７；クラチ  Ｋ  ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９、１３３０−８  １９８０；ラドクリフ  Ｒ  ら，Ｂｌｏｏｄ，５０，６１１−７，１９７７；ゲブリヒウェット  Ｂ  ら，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，７１，１４５０−６．１９８３；Ｚ  トーシ  ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳＣＩ  ＵＳＡ，８９，１１９６９−７２，１９９２；ワットフォーゲル  ＹＴ  ら，Ｂｌｏｏｄ  ６７，１７３１―７，１９８６；ワットフォーゲル  ＹＴ  ら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，８０，６８６−９１，１９９８；ならびに、シュライバー
ら  ＡＤ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，５２，１４０２−９，１９７３。
【０１６４】
ＸＩＩ因子ならびにその活性形態、ＸＩＩａ因子は、ヘモ凝固に関与し、ならびに血管全体ならびに血圧の維持、内皮細胞の様々な機能への影響、繊維素溶解のコントロール、また血管内空間における構造性抗凝固性特徴の維持に役割をもつために、ＸＩＩａ因子の特定形態の測定は繊維素溶解、補体カスケードならびに血管拡張などを含むそれらシステムの研究において、ならびにまた血栓症ならびに狭窄に関する研究において、有用である。
【０１６５】
臨床ならびに実験的研究は、ＸＩＩａ因子を含む接触システムは急性ならびに慢性の炎症、敗血症ショックを含む異なる病因のショック状態、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固などの血栓出血性の病気、腫瘍性疾患、心血管症状、たとえば心筋梗塞、狭心症ならびに急性冠不全症候群、血管形成、敗血症、自然流産ならびに血栓塞栓症にかかわる。
【０１６６】
ヘモ凝固、血管全体ならびに血圧の維持、繊維素溶解のコントロール、ならびに血管内空間における構造性抗凝固性特徴の維持へのＸＩＩａ因子の関与は、播種性血管内血液凝固などの血栓出血性の病気、腫瘍性疾患、心血管症状、たとえば心筋梗塞、狭心症ならびに急性冠不全症候群、血管形成ならびに血栓塞栓症に関するＸＩＩａ因子の関与に対する、臨床ならびに実験的観測を立証する。
【０１６７】
ＸＩＩａ因子が炎症過程で活性化される／該過程に関与する顆粒球上に存在するというわれわれの驚くべき観察は、ＸＩＩａ因子が急性ならびに慢性の炎症、敗血症などの異なる病因のショック状態、アレルギー、腫瘍性疾患、ならびに敗血症などの炎症を含む様々な状態にかかわるとする、臨床ならびに実験的研究を立証する。
【０１６８】
ＸＩＩａ因子の特異的な形態の検出ならびに／あるいは測定は、それゆえに、病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療についての診断、モニタリング、又は予測などの、接触システムが関与し得ると見られる病気若しくは疾患の臨床ならびに科学的研究において有用である。そのような疾患ならびに病気としては、急性ならびに慢性炎症、異なる病因のショック状態、糖尿病、アレルギー、播種性血管内血液凝固ならびに血栓塞栓症などの血栓出血性の病気、血栓症ならびに狭窄、腫瘍性疾患、心血管症状、たとえば心筋梗塞、狭心症、急性冠不全症候群、血管形成、敗血症ならびに自然流産がある。
【０１６９】
一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出あるいは測定は、それゆえに、病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患についての診断、モニタリング、又は治療の予測を助けるものとして有用であり、それら病気若しくは疾患の場合における一種以上のＸＩＩａ因子形態の量は健康な被験者のものとは異なる。一種以上のＸＩＩａ因子形態の濃度変化は、上記に言及されたあらゆる病気若しくは疾患の指標となり得る。時間経過による被験者における濃度変化は、状態の悪化、治療などに応えての改善といった、状態変化の指標となり得る。「診断、予測ならびにモニタリング」と呼ばれる、診断、モニタリング、あるいは病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患の治療の予測に関する、そのような方法は、本発明の一部分である。
【０１７０】
加えて、尿中のＸＩＩａ因子は腎機能、腎疾患ならびに腎障害に関する敏感なマーカーであり、尿中のＸＩＩａ因子の検出あるいは測定は腎機能、腎疾患ならびに腎障害に関する有用な情報を与える。
【０１７１】
診断、予測ならびにモニタリング
本発明は、病気若しくは疾患を持っているか又は持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、又は転帰、又は病気若しくは疾患についての診断、モニタリング、又は治療の予測をする方法を提供するものであり、該方法は、前記被験者から得られた試料において他のＸＩＩａ因子形態に優先して一種以上のＸＩＩａ因子形態を検出又は測定すること、ならびに、被験者について得られた結果と、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一分析を用いて得られた結果を比較することからなる：
（ｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関してモニターされている被験者；
（ｉｉｉ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関して治療に関しモニターされている被験者；（ｖ）病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）病気若しくは疾患の発症前、あるいは、病気若しくは疾患治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期あるいはより後期のステージにある、あるいは病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者。
【０１７２】
試料は上記に記載されたもののいずれでもよい。たとえば、試料は血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液、唾液あるいは涙液のような、体液試料であり得る。
【０１７３】
本分析は、一種以上の細胞性ＸＩＩａ因子、脂質結合ＸＩＩａ因子ならびに尿のＸＩＩａ因子などの、一種以上の選択された形態であるような、一種以上のＸＩＩａ因子形態の検出ならびに／あるいは検出ならびに／あるいは測定のためのものであり得る。
【０１７４】
上記に記載されたように、ある分析の、他の形態と比較して一種以上のＸＩＩ因子形態に対する特異性は、該分析法の設計によって達成あるいは改善することができる。免疫検定法の場合において、そのような設計は、使用される抗体あるいは抗体の組み合わせの選択；界面活性剤の存否及び選択；ならびに固相にコートされた抗体を含む抗原捕獲分析の場合の、プレートコーティングに使用される条件、の一種以上を含んでもよい、上記参照。
【０１７５】
ＸＩＩａ因子の分析は、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合できる抗体の使用からなる免疫検定法であり得る。そのような分析において、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合できる抗体は、捕獲抗体として固相に固定化される。
【０１７６】
あるいは、又は加えて、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合できる抗体は、直接的あるいは間接的に検出可能な標識を用いて標識化される。
【０１７７】
免疫検定法において、生じた抗体−抗原複合体は、たとえば上記「免疫検定法」項に記載されたように、直接的に測定され得る。
【０１７８】
免疫検定法において、研究中のＸＩＩａ因子形態若しくは形態群に結合できる抗体は、ｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、あるいは、ＸＩＩａ因子ならびに、所望によりＸＩＩ因子にもまた結合できる、ポリクローナル抗体であり得る。
【０１７９】
ｍＡｂ２／２１５又はその類似体、ｍＡｂ２０１／９又はその類似体、あるいは、ＸＩＩａ因子に結合できるポリクローナル抗体が使用される免疫検定法において、抗体は、直接的あるいは間接的に検出可能な標識で標識化され、ならびに／あるいは捕獲抗体として固相に固定化され得る。
【０１８０】
定義された抗体によって捕獲されたあらゆるＸＩＩａ因子は、上記で定義されたような標識化抗体を用いて検出あるいは測定され得る。
【０１８１】
研究中の病気若しくは疾患は、上記「臨床的有用性」項で記載されたもののいずれでもあり得、たとえば、凝固物システムの病気若しくは疾患；ヘモ凝固物、繊維素溶解、キニン生成、補体活性化、あるいは血管形成、血管全体ならびに血圧の維持、血管内空間の構造性抗凝固性特徴の維持、あるいは組織防衛及び修復に関連する症状；急性又は慢性炎症、あらゆる病因のショック状態、糖尿病、アレルギー、血栓出血性の病気、敗血症、自然流産あるいは腫瘍性疾患に関連する症状；ならびに血管内血液凝固あるいは血栓塞栓症、血栓症あるいは狭窄、心筋梗塞、急性冠不全症候群あるいは狭心症に関連する症状、であり得る。
【０１８２】
臨床あるいは病的症状の治療は、治療薬の投与ならびに／あるいは外科的処置を含む得る。たとえば、血栓症あるいは狭窄の治療は、冠状動脈血管形成術ならびに／あるいは血栓溶解を含み得る。
【０１８３】
たとえば、病気若しくは疾患の経過中に得られた試料、ならびに／あるいは、病気若しくは疾患の治療の間ならびに／あるいは治療の開始前に得られた試料などの、被験者から得られた一連の試料を試験することが有利である得る。
【０１８４】
病気若しくは疾患が血栓症あるいは狭窄に関連し得、ならびに／あるいは治療が冠状動脈血管形成術あるいは血栓溶解に関連し得る。本発明の一つの実施態様において、診断、モニタリング、あるいはそのような症状の進行あるいは転帰ならびに治療の予測に対して、使用される免疫検定法は、捕獲抗体がｍＡｂ２／２１５又はその類似体であり、標識化抗体がポリクローナルＸＩＩａ抗因子抗体であり、ならびに、試料の（最初の）培養ステップの間、試料中に界面活性剤（トリトン）が存在しないという、捕獲分析であり得る。ＸＩＩａ因子濃度が血管形成術あるいは血栓溶解処置の前後に測定された場合、処置後のＸＩＩａ因子濃度の増加は、処置の有効性を示すものであることが示されている（実施例１６を参照）。前記分析がＸＩＩａ因子の二個以上の分子からなる分子複合体ならびに／あるいは多重ＸＩＩａ因子分子からなる粒子を測定し得ると考えられる。
【０１８５】
病気若しくは疾患は、心筋の炎症あるいは急性冠不全症候群と疑われることもある。異なるＸＩＩａ因子形態の分析は、そのような症状の進行あるいは転帰の予測について異なる情報を与える。
【０１８６】
本発明の一つの実施態様において、使用される免疫検定法は、捕獲抗体がｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体、標識化抗体がｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体、界面活性剤（トリトン）が試料の（最初の）培養ステップ中に試料中に存在するという捕獲分析である。試料が病院への入院時に得られた場合、２／２１５捕獲抗体２／２１５標識化抗体分析を用いて得られたＸＩＩａ因子形態の低濃度値は、初入院期間内における二次トロポニン陽性イベントのリスク増加の指標となることが指示れた（（実施例１７を参照）。
【０１８７】
本発明のほかの実施態様において、使用される免疫検定法は、捕獲抗体がｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体、ならびに標識化抗体がｍＡｂ２０１／９、ならびに界面活性剤（トリトン）が試料の（最初の）培養ステップ中に試料中に存在するという捕獲分析であり、この分析は他と比べて優先的にＸＩＩａ因子の特定形態を検出する。試料が病院への初入院時に得られた場合、２／２１５捕獲抗体２０１／９標識化抗体分析を用いて得られたＸＩＩａ因子の高濃度値は、入院から３０日以内における二次トロポニン陽性イベントのリスク増加の指標となることが指示れた（実施例１７を参照）。
【０１８８】
本発明の更なる実施態様において、使用される免疫検定法は、捕獲抗体がｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体、標識化抗体がポリクローナルＸＩＩ抗因子抗体、ならびに、界面活性剤（トリトン）が試料の（最初の）培養ステップ中に試料中に存在しないという捕獲分析であり、この分析は他と比べて優先的にＸＩＩａ因子の特定形態を検出する。試料が病院への入院時に得られた場合、２／２１５捕獲抗体ポリクローナルＸＩＩａ抗因子分析を用いて得られたＸＩＩａ因子の、中間的な濃度に比較して高濃度値あるいは低濃度値は、死への高リスクの指標となることが指示れた（（実施例１７を参照）。前記分析は、ＸＩＩａ因子の二個以上の分子からなる分子複合体ならびに／あるいは多重ＸＩＩａ因子分子からなる粒子を測定し得ると考えられている。
【０１８９】
病気若しくは疾患が敗血症であることもある。本発明の一つの実施態様において、試料がｍＡｂ２／２１５あるいはその類似体の使用を含む免疫検定法を用いて分析される場合、ＸＩＩａ因子の特定形態（細胞性ＸＩＩａ因子形態）の濃度増加は、敗血症を示唆することが示されている。この結果は、ＸＩＩａ因子は、炎症過程において活性化／含有される顆粒球上に存在している、というわれわれの驚くべき観察と矛盾がなく、ならびに、ＸＩＩａ因子は炎症を含むさまざまな状態に関係しているというわれわれの仮説を立証するものである。
【０１９０】
以上のように、尿中のＸＩＩａ因子は腎機能、腎疾患ならびに腎障害に対する敏感なマーカーである。本発明は、病気若しくは疾患を持っている被験者の尿中におけるＸＩＩａ因子、特にＸＩＩａ因子濃度は健康な被験者のものとは異なるという、病気若しくは疾患の診断あるいはモニタリングの方法に関係する。
【０１９１】
本発明は病気若しくは疾患の診断あるいはモニタリング、あるいは病気若しくは疾患治療のモニタリングの方法を提供し、該方法は病気若しくは疾患を持っているあるいは持っていると疑われる被験者の尿中における、ＸＩＩａ因子、特にＸＩＩａ因子濃度を検出あるいは測定することからなる。
【０１９２】
たとえば、本発明は、損なわれた腎機能、腎疾患又は腎障害を持っているあるいは持っていると疑われる被験者における、腎機能、腎疾患又は腎障害の診断あるいはモニタリング、あるいは損なわれた腎機能、腎疾患又は腎障害の治療のモニタリングの方法を提供するものであり、該方法は前記被験者から得られた試料中のＸＩＩａ因子を検出あるいは測定することからなる。
【０１９３】
一般に、被験者について得られた結果は、下記の少なくとも一種以上から得られた試料に対する同一の分析法を用いて得られた結果と比較される：
（ｉ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患を持っている被験者であって、損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関してモニターされている被験者；
（ｉｉｉ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関して治療に関しモニターされている被験者；
（ｖ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患の発症前、あるいは、損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期あるいはより後期のステージにある、あるいは損なわれた腎機能、腎疾患ならびに腎障害などの病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者。
【０１９４】
ＸＩＩａ因子は、他の形態と比べて優先的に一種以上のＸＩＩａ因子を検出あるいは測定できる分析によって検出あるいは測定され得、あるいは、ＸＩＩａ因子形態間を区別しない分析手法によって検出あるいは分析され得る。
【０１９５】
臨床的に有用な情報を与える分析の決定
本発明を実施するにあたり、ＸＩＩａ因子のどの特定形態が特定の病気若しくは疾患に関係するかを確認することは不可欠ではない。たとえば病気若しくは疾患の出現、進行又は転帰、あるいは病気若しくは疾患治療の有効性又は転帰などに関して、ＸＩＩａ因子の特定形態が病気若しくは疾患と関係することを簡単な手法によって知るあるいは測定することで十分である。
【０１９６】
上記に開示された通り、ＸＩＩａ因子は生体中の血液凝固の接触システムにかかわっていると長い間知られてきた。より近年の研究は、ＸＩＩａ因子はまた、ヘモ凝固物ならびに補体活性化に関する他のシステムにかかわっていることを示唆し、ならびに更なる臨床ならびに実験結果は接触システムが多くの他の症状にかかわっていることを示している。そのような症状は上記「臨床的有用性」項に記載されている。ＸＩＩａ因子形態が病気若しくは疾患あるいは病気若しくは疾患の治療と臨床的な関係があるかどうかは、たとえば下記に記載の通り、簡単な手法で確立可能である。
【０１９７】
したがって、本発明は、ＸＩＩａ因子と関係があると現時点で知られている病気若しくは疾患に限定されない。臨床的関連性がＸＩＩａ因子と病気若しくは疾患との間にあるかどうかは、簡単な手法によって測定可能である。
【０１９８】
本発明は、病気若しくは疾患を持っているあるいは病気若しくは疾患の治療を受けている被験者から得られた試料における、ＸＩＩａ因子に対する一連の分析の実施、ならびに、病気若しくは疾患あるいは治療に関するＸＩＩａ因子レベル値の情報を提供する分析法の選択からなる方法を提供する。
【０１９９】
本発明はまた、病気若しくは疾患を持っているかあるいは持っていると疑われる被験者の、病気若しくは疾患の罹病性、進行、転帰、又は病気若しくは疾患についての診断、モニタリング、又は治療の予測に関する情報提供に適したＸＩＩａ因子の分析法を提供する方法を提供し、該方法は病気若しくは疾患を持っているあるいは治療を受けている被験者から得られた試料に対するＸＩＩａ因子に対する一連の分析を実施すること、ならびに、どの分析（群）が病気若しくは疾患の罹病性、進行、転帰、又は病気若しくは疾患についての診断、モニタリング、又は治療の予測に関するＸＩＩａ因子レベル値の情報を提供するかを決定することからなる。
【０２００】
本方法は、好ましくは、病気若しくは疾患を持っているあるいは治療を受けている被験者から得られた試料におけるＸＩＩａ因子についての得られた結果と、少なくとも一種以上の以下から得られた同一の方法を用いて得られた結果とを比較することからなる：
（ｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者；
（ｉｉ）病気若しくは疾患を持っている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関してモニターされている被験者；
（ｉｉｉ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者；
（ｉｖ）病気若しくは疾患を持ち、ならびに治療を受けている被験者であって、病気若しくは疾患の進行ならびに／あるいは転帰に関して治療に関しモニターされている被験者；（ｖ）病気若しくは疾患をもっていない被験者；
（ｖｉ）病気若しくは疾患の発症前、あるいは、病気若しくは疾患治療の開始前の、上記の被験者；ならびに
（ｖｉｉ）病気若しくは疾患、又は病気若しくは疾患の治療のより前期あるいはより後期のステージにある、あるいは病気若しくは疾患の発症前の、上記の被験者。
【０２０１】
分析される試料は、病気若しくは疾患の進行中あるいは治療中であるといった、さまざまな被験者から得られた一連の試料であることが望ましい。
【０２０２】
使用される分析法は、免疫検定法ならびに他の分析法などの、発明の実施に関し上記に記載されたもののいずれでもあり得る。特定の分析法を用いてＸＩＩａ因子の特定形態と病気若しくは疾患あるいは病気若しくは疾患の治療との間に臨床的関連性が発見された場合、その分析法はその後、本発明ならびに上記に記載された、病気若しくは疾患の罹病性、進行、転帰、又は病気若しくは疾患についての診断、モニタリング、又は治療の予測のために使用され得る。
【０２０３】
さまざまな分析法とさまざまな症状における関係性に関する得られた結果をデータベースに集約することは有用であり得、該データベースは続いて研究中の特定被験者から得られた結果の解釈を助けるのに使用され得る。そのような方法は、上記に記載されたような集約された結果からなるデータベースと同様に本発明の一部分である。
【０２０４】
以上のように、ＸＩＩａ因子が異なる形態で存在し、ならびに異なる形態と病気若しくは疾患ならびに病気若しくは疾患の治療の間に臨床的関連性があるという発見は、ＸＩＩａ因子が従来から関係していた凝固システム、ならびにＸＩＩａ因子と関係があるとして現在までに確認されてきた病気若しくは疾患を超えた実用性を持つ。
【０２０５】
下記の限定されない実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【０２０６】
実施例１
この実施例において、血漿におけるＸＩＩａ因子の多数種の存在が、蛍光標識化抗体との結合、ならびに得られた複合体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分子量に基づく分離によって立証された。
【０２０７】
抗体２／２１５を、生産者の取扱書にしたがってフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）にて標識化した。
【０２０８】
ＨＰＬＣシステムはウォーターズ  １５２５  バイナリー  ＨＰＬＣ  ポンプ、ウォーターズ  ２４８７  二重γ（波長）吸光度検出器、ならびにジャスコ  ＦＰ１５２０  インテグラル  蛍光検出器からなった。
【０２０９】
ＨＰＬＣに使用された移動相は０．１Ｍ  塩化ナトリウム  ０．０５Ｍトリス塩酸、０．４％（ｗ／ｖ）トリス−ナトリウム  クエン酸塩  ｐＨ７．５であった。固定相は一連の２×３０ｃｍ  バイオセップ−セック−Ｓ  ３０００  カラム（フェノメネクス，英国，チェシャー  エスケー１０  ２ビーエヌ，マックルズフィールド，ハーズフィールド  インダストリアル  エステート，クィーンズ  アベニュー）からなった。流速は１．０ｍｌ
ｍｉｎ-1、ならびに注入量は１００μｌであった。ジャスコ蛍光検出器の調整は：励起波長４９４ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ、増幅率１０００、減衰１とした。
【０２１０】
ＨＰＬＣシステムを通過させた試料はＦＩＴＣ標識化２／２１５のみ、血漿試料のみ、ならびにＦＩＴＣ標識化２／２１５と４時間培養させた血漿（２５０μｌの血漿に１μｌのＦＩＴＣ標識化抗体を加えた）であった。
【０２１１】
蛍光対時間曲線の例を図２ａないし図２ｄに示す。
【０２１２】
図２ａにおいて、血漿試料のみに対するトレースから、血漿試料は内因性の蛍光を示すことがみてとれる。図２ｂにおいて、ＦＩＴＣ標識化抗体に関する蛍光が観測される。図２ｃにおいて、ＦＩＴＣ標識化抗体との事前培養がなされている血漿に関して、図２ａならびに２ｂのものに追加されたいくつものピークが観測される。これはＦＩＴＣ標識化抗体が血漿試料中の数種の成分に結合していることを示す。このことは、さらに、図２ｄ中に示されたトレースによって示され、該図においては、内因性の蛍光ならびにＦＩＴＣ標識化抗体のみに関するシグナルが差し引かれ、結果として得られたトレースは血漿中での種に対する抗体の結合のみを反映している。
【０２１３】
実施例２
この実施例において、血漿における活性化ＸＩＩ因子の多数種の存在が、ラジオトレーサー（ヨウ素１２５）で標識化された抗体断片との結合、ならびに得られた複合体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分子量に基づく分離によって立証された。
【０２１４】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体断片を、生産者の取扱書にしたがって「イミュノピュア  Ｆａｂ  調製キット」（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）を用いて調製した。これらＦａｂ断片は次にヨウ素１２５を用いてアマシャム  ファルマシア  バイオテク（英国  エッチピー８  ４エスピー，チャルフォント  ストリート  ジャイルズ  ナイチンゲールズ  レーン  ポラーズ  ウッド）によって放射能標識化した。
【０２１５】
１μｌの放射能標識化抗体が多数の健康なボランティアの各々からの１ｍｌの血漿に添加された。４時間培養後、血漿成分は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離された。ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００システムであった。
【０２１６】
ＨＰＬＣに使用された移動相は０．１Ｍ  塩化ナトリウム  ０．０５Ｍトリス塩酸、０．４％（ｗ／ｖ）トリス−ナトリウム  クエン酸塩  ｐＨ７．５であった。固定相は一連の２×３０ｃｍ  バイオセップ−セック−Ｓ  ３０００  カラム（フェノメネクス，英国，チェシャー  エスケー１０  ２ビーエヌ，マックルズフィールド，ハーズフィールド  インダストリアル  エステート，クィーンズ  アベニュー）からなった。流速は０．７ｍｌ
ｍｉｎ-1、ならびに注入量は１００μｌであった。
【０２１７】
ＨＰＬＣ溶出画分は、２０秒ごとに１画分を集めるようにセットした、自動フラクションコレクターを用いて集められた。放射能活性は次にマルチウェル  シンチレーション  カウンターを用いて各画分において測定された。
【０２１８】
放射能活性対時間曲線の例を図３に示す、そこにはいくつかのピークの存在がみてとれ、放射能標識化抗体断片は血漿中でいくつもの異なる種に結合していることが立証された。
【０２１９】
実施例３
細胞性ＸＩＩａ因子に対するマイクロタイタープレート分析
試料の１００μｌアリコートはｍＡｂ２／２１５にて事前コートされたマイクロプレートのウェルに添加された。６０分間培養後、プレートはボレートバッファー  生理食塩水  洗浄溶液（ｐＨ７．４）にて洗浄された。１００μｌの関連接合体（アルカリ  ホスフォターゼ標識化抗体）が各ウェルに添加され、プレートはさらに６０分間培養された。プレートの再洗浄後、１００μｌのフェノールフタレイン  ホスフェート基質が添加された。適切な培養期間後、アルカリ性停止溶液が更なる基質転換を抑制するために添加され、ならびに吸光度が５５０ｎｍにて記録された。
【０２２０】
方法
血液はボランティアから２本のクエン酸塩チューブの中へ集められ、赤血球が１０００ｇで１０分間の遠心分離によって分離された。これらチューブからの血漿はあらゆる収集チューブのばらつきを除去するために溜められた。血漿比率はエッペンドルフチューブ内に１ｍｌアリコートとして分取され、「濃細胞血漿」と名づけられた。
【０２２１】
該血漿の残部は分取され、ならびに次に微量遠心機で高速（１６０００ｇで１０分間）にて遠心分離された。上清は分離され、ならびに「希細胞血漿」と名づけられた。沈殿物は次に、１００ｍＭ  ホスフェートバッファー  生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁され、ならびに１６０００ｇで１０分間遠心分離され、その後上清が処分されることによって洗浄された。ペレット状物質は同様の方法でさらに２回洗浄され、その後ＰＢＳに再懸濁され、「洗浄細胞」と名づけられた。
【０２２２】
３試料（濃細胞血漿、希細胞血漿ならびに洗浄細胞）は次に上記に記載されたマイクロタイタープレート分析を用いて分析され、該分析において、ｍＡｂ２／２１５が細胞性ＸＩＩａ因子を捕獲するために使用され、標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）あるいは標識化ポリクローナル抗体（ポリクローナル接合体）のどちらか一方が捕獲された細胞性ＸＩＩａ因子の検出に使用された。
【０２２３】
得られた結果は表１に示される。２／２１５二重（捕獲抗体ならびに接合体抗体）分析に標準物質が利用できなかったので、２／２１５接合体を用いた結果は吸光度として表現された。標準化されたこのデータ曲線は図４ａならびに図４ｂに示される。
【表１】
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【０２２４】
表１ならびに図４ａ及び図４ｂからみてとれるように、ポリクローナル接合体では著しい応答が濃細胞ならびに希細胞血漿の双方について得られるが、しかしながら洗浄細胞ではわずかな応答しか得られなかった。対照的に、２／２１５接合体を用いた場合には、最大応答は洗浄細胞で得られ、一方で最低応答は希細胞血漿について得られた。
【０２２５】
実施例４
細胞性ＸＩＩａ因子のＩＭｘ分析
アボットＩＭｘシステムは、酵素免疫学的検定法ならびに蛍光偏光免疫学的検定技術を用いて分析を実施するために設計された自動化免疫学的分析器である。
【０２２６】
これら実施例において使用された技術は微粒子酵素免疫学的検定法（ＭＥＩＡ）である。ＭＥＩＡ技術は測定される分子に対して特異的な捕獲分子（この場合は抗体）にてコートされた微粒子を用いた。
微粒子の有効表面積ならびに検体と固相間の拡散距離は分析動態を改善させ、ＭＥＩＡ分析が他の多くの免疫学的検定法よりもより迅速に完了されることを可能にした。結合検体とともに微粒子は、ＭＥＩＡ反応セル内で使用されたグラスファイバーマトリックスに不可逆的に結合することによって反応混合物から分離された。
【０２２７】
ＭＥＩＡ分析に必要とされる反応物質は
●捕獲分子（この場合はモノクローナル抗体２／２１５）でコートされた微粒子
●アルカリホスファターゼ標識化接合体（この場合は活性化ＸＩＩ因子に対する抗体
、ポリクローナル抗体又はｍＡｂ２／２１５のどちらでも）
●発色基質、４−メチルアンベリフェリル  ホスフェート（ＭＵＰ）
●免疫複合体が結合するグラスファイバーマトリックスを含む反応セル。
希釈剤ならびに／あるいは洗浄溶液のような他の試薬もまた必要とされた。
【０２２８】
以下はＭＥＩＡ反応プロセスの説明である。
１．ＩＭｘシステムは、試料ならびに微粒子（捕獲分子でコートされた）を反応セルの培養ウェルに移動させた。培養期間の間、検体は微粒子に結合し、免疫複合体を創出した。２．ＩＭｘシステムは免疫複合体の１アリコートを反応セルの不活性なグラスファイバーマトリックスに移動させた。免疫複合体は不可逆的にグラスファイバーマトリックスに結合する。ＩＭｘは非結合物質を除去するためにマトリックスを洗浄し、ならびに、過剰の反応混合物がマトリックス中の大きな孔を通って迅速に流れ出た一方で、免疫複合体はグラスファイバーに保持された。
３．ＩＭｘシステムはマトリックスにアルカリフォスファターゼ標識化接合体を添加した。接合体は抗体−検体−接合体「サンドイッチ」を完成させるために免疫複合体に結合した。ＩＭｘシステムはマトリックスをさらに洗浄した。
４．ＩＭｘシステムはマトリックスに蛍光基質４−メチルアンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）を添加した。接合体は４−メチルアンベリフェリルホスフェート（ＭＵＰ）を４−メチルアンベリフェロン（ＭＵ）にする加水分解に触媒作用を及ぼした。
５．ＩＭｘ機器内部の光学ＭＥＩＡは蛍光生成物（ＭＵ）がグラスファイバーマトリックス上に生成される速度を測定した。ＭＵがマトリックス上に生成される速度はテスト試料中の検体濃度に比例した。
【０２２９】
下記に記載されたＩＭｘ実験装置を用いたプロトコルは添付図面の図５に記載されている。
【０２３０】
方法ならびに結果
ボランティアからの血液は６本のクエン酸塩チューブの中へ集められ、赤血球が１０００ｇで１０分間の遠心分離によって分離された。すべてのチューブからの血漿はあらゆる収集チューブのばらつきを除去するために溜められた。血漿比率はエッペンドルフチューブ内に１ｍｌアリコートとして分取され、「濃細胞血漿」と名づけられた。
【０２３１】
血漿残存物は分取され、ならびに次に微量遠心機で高速（１６０００ｇで１０分間）にて
遠心分離された。上清は分離され、ならびに「希細胞血漿」と名づけられた。沈殿物は次に１００ｍＭ  ホスフェートバッファー  生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁され、ならびに１６０００ｇで１０分間遠心分離され、その後上清が処分されることによって洗浄された。ペレット状物質は同様の方法でさらに２回洗浄され、その後ＰＢＳに再懸濁され、「細胞懸濁液」と名づけられた。
【０２３２】
３試料（濃細胞血漿、希細胞血漿ならびに懸濁液）は次に、２／２１５接合体ならびにポリクローナル接合体の双方を用いて、実施例３に記載されたマイクロタイタープレート分析を用いて分析された。試料はまたアボットＩＭｘ自動免疫測定機器を用いた活性化ＸＩＩ因子に対する分析を用いて分析された。この場合に細胞性ＸＩＩａ因子の検出に使用された接合体は、アルカリホスファターゼ標識化ｍＡｂ２０１／９及び２／２１５であり、実施例３を参照のこと。マイクロタイタープレート分析で得られたデータ曲線は図６ａ及び図６ｂに示され、ならびにＩＭｘ分析で得られたデータ曲線は図７ａ及び図７ｂに示される。
【０２３３】
図６ａ及び図６ｂに示された通り、ポリクローナル接合体を用いたマイクロタイタープレート分析においては、わずかな応答が細胞懸濁液で得られた一方、著しい応答が濃細胞ならびに希細胞血漿について得られたが、２／２１５接合体の使用した場合に最大応答が細胞懸濁液について得られた。２／２１５接合体を用いた場合、より低い応答が濃細胞及び希細胞血漿について得られ、希細胞血漿は最低応答を与えた。
【０２３４】
図７ａ及び図７ｂに示された通り、２０１／９接合体を用いたＩＭｘ分析においては、わずかな応答が細胞懸濁液から得られた一方、著しい応答が濃細胞血漿ならびに希細胞血漿の双方について得られた。２／２１５接合体をＩＭｘ分析にて用いた場合、著しい応答が細胞懸濁液ならびに濃細胞血漿にみられ、希細胞血漿はより少ない応答がみてとれる。
【０２３５】
実施例５
細胞性ＸＩＩａ因子のフローサイトメトリー分析
血漿中の細胞上にｍＡｂ２／２１５がＸＩＩａ因子に結合していたかどうか評価する代替手法として、フロサイトメトリーが使用された。
【０２３６】
ｍＡｂ２／２１５はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にて標識化された。このＦＩＴＣ標識化２／２１５抗体は濃細胞血漿と培養され、ならびに、コントロール物質（標識化抗体を添加しない）とともにフローサイトメトリーを用いて試験された。得られたアウトプットは図８ａ及び図８ｂに示される。図８ａは標識化抗体の不存在下で血漿について得られたデータを示し、図８ｂは血漿が標識化抗体と培養された場合に得られたデータを示す。
【０２３７】
図８ａ及び８ｂにおいて、ＦＩＴＣ標識化抗体の添加による右方向へのピーク移動は抗体が血漿試料中の細胞に結合していることを指す。
【０２３８】
実施例６
放射能標識化抗体との培養による細胞性ＸＩＩａ因子の測定
ＸＩＩａ因子の更なる立証及び定量化（測定）方法は、全血あるいは血漿への放射能標識化２／２１５抗体の添加、遠心分離によって細胞を分離し、ならびにこの画分に結合した放射能活性量を測定することによるものである。
【０２３９】
モノクローナル抗体２／２１５はヨウ素１２５にて標識化させた。血液試料は８人のボランティアから得られ、ならびに放射能標識化抗体と培養させた。赤血球は低遠心力（１０００ｇ）にての遠心分離によって除去され、ならびに他の細胞（血小板及び白血球を含む
）は高遠心力（１６０００ｇ）にての遠心分離によって分離された。ペレット状細胞は１００ｍＭホスフェート  バッファー  生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁され、ならびに１６０００ｇで１０分間遠心分離され、その後上清が処分されることによって洗浄された。ペレット状物質は同様の方法でさらに２回洗浄され、その後ＰＢＳに再懸濁され、「細胞懸濁液」と名づけられた。
【０２４０】
この細胞性物質に関連する放射能活性、ならびにＸＩＩａ因子に結合した抗体の総量が測定され、ならびに細胞性画分中のＸＩＩａ因子の比率がそれに応じて計算された。
【０２４１】
表２において、細胞性ＸＩＩａ因子に結合した添加抗体のパーセンテージ及び細胞性画分に関するＸＩＩａ因子と結合した抗体の比率が示される。著しいしかしながらさまざまな細胞性ＸＩＩａ因子の量が存在することがみてとれる。図９は８個体の細胞性ＸＩＩａ因子濃度に関するグラフ表示である。
【表２】
2006510896.tif 000004
【０２４２】
実施例７
「ＸＩＩ因子欠乏」固体の細胞性ＸＩＩａ因子
クエン酸塩添加した血液は「正常な」ボランティアならびにＸＩＩ因子が完全に欠乏しているとみなされる個体（ＥＲＬ，英国，スウォンジー，スケルティ  ロード  １５  から入手可能な抗体を用いたＸＩＩ抗原ＥＬＩＳＡによって立証された）から集められ、ならびに凝固分析を用いたＸＩＩ因子の測定によった（グリフィン，Ｊ．Ｈ．ならびにコックレーン，Ｃ．Ｇ．，酵素学の方法，アカデミックプレス（ニューヨーク）４５，５６−６５，１９７６）。細胞は１０００ｇにて１０分間遠心分離することによって分離された。すべてのチューブからの血漿は各個体についてあらゆる収集チューブのばらつきを除去するために溜められた。血漿の一部はエッペンドルフチューブ内に１ｍｌアリコートとして分取され、「濃細胞血漿」と名づけられた。
【０２４３】
血漿残存物は分取され、ならびに次に微量遠心機で高速（１６０００ｇで１０分間）にて遠心分離された。上清は分離され、ならびに「希細胞血漿」と名づけられた。沈殿物は次に１００ｍＭ  ホスフェートバッファー  生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に再懸濁され、ならびに１６０００ｇで１０分間遠心分離され、その後上清が処分されることによって洗浄された。ペレット状物質は同様の方法でさらに２回洗浄され、その後ＰＢＳに再懸濁され、「細胞懸濁液」と名づけられた。
【０２４４】
３試料（濃細胞血漿、希細胞血漿ならびに懸濁液）は次に、実施例１に記載された２／２１５接合体ならびにポリクローナル接合体を使用したマイクロタイタープレート分析を用いて分析された。試料はまた、実施例４に記載されたアボットＩＭｘ自動免疫測定機器を用いた活性化ＸＩＩ因子に対する分析を用いて分析された。この場合、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に使用された接合体は過酸化酵素標識化ｍＡｂ２０１／及び２／２１５であり、実施例３を参照のこと。
【０２４５】
「完全にＸＩＩ因子が欠乏している」個体からの細胞性ＸＩＩａ因子の応答が存在するという驚くべき観察がなされた、図１０ａ、１０ｂ、１１ａ、１１ｂ、１２ａ、１２ｂ、１３ａ及び１３ｂに示されたデータを参照のこと。
【０２４６】
ＸＩＩ因子循環は肝臓から生ずる。「ＸＩＩ因子欠乏」個体は水相内でＸＩＩ因子循環がないために、脂質結合ＸＩＩａ因子は水相ＸＩＩ因子又はＸＩＩａ因子の吸着によって形成され得ず、それゆえに細胞性ＸＩＩ因子及びＸＩＩａ因子は他の源によって生成されたはずであった。リンパ球あるいは巨核球などの他の細胞株内でＸＩＩ因子の生産が起こっているらしいとみなされる。
【０２４７】
実施例８
この実施例において、血漿における脂質結合ＸＩＩａ因子の存在は、ラジオトレーサー（ヨウ素１２５）で標識化されたモノクローナル抗体２／２１５断片の血漿への添加、リポタンパク質の沈殿、ならびに沈殿させたリポタンパク質画分に関する放射能活性量の評価によって、立証された。
【０２４８】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体断片を、生産者の取扱書にしたがって「イミュノピュア  Ｆａｂ  調製キット」（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）を用いて調製した。これらＦａｂ断片は次にヨウ素１２５を用いてアマシャム  ファルマシア  バイオテク（英国  エッチピー８  ４エスピー，チャルフォント  ストリート  ジャイルズ  ナイチンゲールズ  レーン  ポラーズ  ウッド）によって放射能標識化した。
【０２４９】
クエン酸塩添加した血漿は１２人の健康なボランティアから得られた（男性６人及び女性６人）。
【０２５０】
１μｌの放射能標識化抗体が各ボランティアの１ｍｌの血漿に添加された。４時間培養後、血漿は細胞性成分を除去するために１２，０００ｇで１０分間遠心分離された。リポタンパク質は、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、２１５ｍＭ  塩化マンガンならびに５００Ｕ／ｍｌ  ヘパリンを含む３００μｌの沈殿剤の、４００μｌの血漿上清への添加によって沈殿させた。混合、ならびに１０分間の培養後、試料は１２，０００ｇで１０分間遠心分離された。上清は除去され、ならびにリポタンパク質ペレットはあらゆる残留水相ＸＩＩａ因子を除去するために、該ペレットを１ｍｌの沈殿剤に再懸濁させ、１２，０００ｇで１０分間遠心分離させ、ならびに上清を除去させることによって、洗浄された。この洗浄手順を３回実施した後、ペレット状物質に関する放射能活性がマルチウェルシンチレーションカウンターを用いて測定された。
【０２５１】
図１４は１２人のボランティアから得られた脂質結合ＸＩＩａ因子レベル値を示す。図１４から、脂質結合ＸＩＩａ因子はすべてのテスト試料に見出される一方で、個体間の濃度にかなりのバリエーションがあることがみてとれる。
【０２５２】
実施例９
この実施例において、血漿における脂質結合ＸＩＩａ因子の存在は、ラジオトレーサー（ヨウ素１２５）で標識化されたモノクローナル抗体２／２１５断片の血漿への添加、リポタンパク質の沈殿、ならびに沈殿させたリポタンパク質画分に関する放射能活性量の評価によって、立証された。
【０２５３】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体断片を、生産者の取扱書にしたがって「イミュノピュア  Ｆａｂ  調製キット」（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）を用いて調製した。これらＦａｂ断片は次にヨウ素１２５を用いてアマシャム  ファルマシア  バイオテク（英国  エッチピー８  ４エスピー，チャルフォント  ストリート  ジャイルズ  ナイチンゲールズ  レーン  ポラーズ  ウッド）によって放射能標識化した。
【０２５４】
クエン酸添加した血漿は胸痛で病因に入院した６４人の患者から得られた。
【０２５５】
５μｌの放射能標識化抗体が各患者の１ｍｌのクエン酸添加した全血に添加された。３時間培養後、血漿は細胞性成分を除去するために１６，０００ｇで１０分間遠心分離された。リポタンパク質は、５１．５４ｍＭ  ホスフォタングステン酸、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．１５に調節された０．０７Ｍ  塩化マンガンを含む５００μｌの沈殿剤の、２００μｌの血漿上清への添加によって沈殿させた。混合、ならびに１０分間の培養後、試料は１６，０００ｇで１０分間遠心分離された。上清は除去され、ならびにリポタンパク質ペレットはあらゆる残留水相ＸＩＩａ因子を除去するために、ペレットを１ｍｌの沈殿剤に再懸濁させ、１６，０００ｇで１０分間遠心分離させ、ならびに上清を除去させることによって、洗浄された。この洗浄手順を３回実施した後、ペレット状物質に関する放射能活性がシングルウェルシンチレーションカウンターを用いて測定された（ラブ  ロジック社，英国  エス１１  ８ユーエックス，シェフィールド，プサルター  レーン  １３１，セントジョーンズハウス）。
【０２５６】
図１５は前記６４人の患者から得られた脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度を示す。図１５から、脂質結合ＸＩＩａ因子はすべてのテスト試料に見出される一方で、個体間の濃度にかなりのバリエーションがあることがみてとれる。
【０２５７】
実施例１０
この実施例において、マイクロタイターＥＬＩＳＡ免疫学的検定法が脂質結合ＸＩＩａ因子の存在を立証するために使用された。血漿試料におけるリポタンパク質は、リポタンパク質粒子上に存在するタンパク質に対する抗体によって捕獲される。これらリポタンパク質上のＸＩＩａ因子の存在は次にアルカリホスファターゼ標識化ｍＡｂ２／２１５の添加によって立証される。
【０２５８】
クエン酸塩添加した血漿は８人の健康なボランティアから得られた。
【０２５９】
１００μｌのクエン酸添加した血漿のアリコートがβ−リポタンパク質に対するヤギのポリクローナル抗体（シグマ社，英国，ドーセット，ギリンガム，ニュー  ロード，ザ  オールド  ブリックヤード）で事前コートされたマイクロプレートのウェルに添加された。６０分間培養後、プレートはボレートバッファー  生理食塩水  洗浄溶液（ｐＨ７．４）
にて洗浄された。アルカリホスファターゼ標識化２／２１５抗体を含む１００μｌの接合体が各ウェルに添加され、プレートはさらに６０分間培養された。プレートの再洗浄後、１００μｌのフェノールフタレインホスフェート基質が添加された。３０分間培養期間後、アルカリ性停止溶液が更なる基質転換を抑制するために添加され、ならびに吸光度が５５０ｎｍにて記録された。
【０２６０】
図１６は、上記に示されたＥＬＩＳＡ方法によって評価された、８人のボランティアから得られた脂質結合ＸＩＩａ因子濃度を示す。図１６から、脂質結合ＸＩＩａ因子はすべてのテスト試料に見出される一方で、個体間の濃度にかなりのバリエーションがあることがみてとれる。
【０２６１】
実施例１１
尿のＸＩＩａ因子のマイクロタイタープレート分析
５人の正常なランダム尿試料は健康な男性ボランティアから得られた。これら試料は下記に記載されたようなマイクロタイタープレート分析を用いてＸＩＩａ因子の存在について試験された。
【０２６２】
試料の１００μｌアリコートがｍＡｂ２／２１５にて事前コートされたマイクロタイタープレートのウェルに添加された。６０分間培養後、プレートはボレートバッファー  生理食塩水  洗浄溶液（ｐＨ７．４）にて洗浄された。１００μｌの接合体（ヒトβＸＩＩａに対するアルカリ  ホスフォターゼ標識化羊ポリクローナル抗体）が各ウェルに添加され、プレートはさらに６０分間培養された。プレートの再洗浄後、１００μｌのフェノールフタレイン  ホスフェート基質が添加された。適切な培養期間後、アルカリ性停止溶液が更なる基質転換を抑制するために添加され、ならびに吸光度が５５０ｎｍにて記録された。試料中のＸＩＩａ因子濃度は次に、試料の吸光度と既知濃度のβＸＩＩａ因子を含む水性試料から得られたものとを比較することによって計算された。得られた尿のＸＩＩａ因子濃度は表３に示される。
【表３】
2006510896.tif 000005
【０２６３】
実施例１２
尿のＸＩＩａ因子のＩＭｘ分析
５人の正常なランダム尿試料が健康な男性ボランティアから得られた。これら試料は上記実施例４に記載されたようなＩＭｘ分析を用いて、ポリクローナル抗体ベースの接合体を用いて、ＸＩＩａ因子の存在について試験された。尿のＸＩＩａ因子濃度の結果は表４に示される。
【表４】
2006510896.tif 000006
【０２６４】
実施例１３
この実施例において、尿のＸＩＩａ因子の存在は、蛍光標識化抗体との結合、ならびに非結合分子からＸＩＩａ因子に結合する抗体の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分子量に基づく分離によって立証された。
【０２６５】
ｍＡｂ２／２１５を、生産者の取扱書によりフルオロセインイソチオシアネート（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）にて標識化した。
【０２６６】
ＨＰＬＣシステムはウォーターズ  １５２５  バイナリー  ＨＰＬＣ  ポンプ、ウォーターズ  ２４８７  二重γ吸光度検出器、ならびにジャスコ  ＦＰ１５２０  インテグラル
蛍光検出器からなった。ＨＰＬＣに使用された移動相は０．１Ｍ  塩化ナトリウム  ０．０５Ｍトリス塩酸、０．４％（ｗ／ｖ）トリス−ナトリウム  クエン酸塩  ｐＨ７．５であった。固定相は一連の２×３０ｃｍ  バイオセップ−セック−Ｓ  ３０００  カラム（フェノメネクス，英国，チェシャー  エスケー１０  ２ビーエヌ，マックルズフィールド，ハーズフィールド  インダストリアル  エステート，クィーンズ  アベニュー）からなった。流速は１．０ｍｌ  ｍｉｎ-1、ならびに注入量は１００μｌであった。ジャスコ蛍光検出器の調整は：励起波長４９４ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ、増幅率１０００、減衰１とした。
【０２６７】
ＨＰＬＣシステムを通過させる試料はＦＩＴＣ標識化２／２１５のみ、尿試料のみ、ならびにＦＩＴＣ標識化２／２１５と４時間培養させた尿（２５０μｌの尿に１μｌのＦＩＴＣ標識化抗体を加えた）であった。
【０２６８】
蛍光対時間曲線の例を図１７ａないし図１７ｄに示す。
【０２６９】
図１７ａにおいて、尿試料のみに対するトレースは、尿試料が内因性の蛍光を示すことを示す。図１７ｂにおいて、ＦＩＴＣ標識化抗体に関する蛍光が観測される。図１７ｃにおいて、ＦＩＴＣ標識化抗体と事前培養がなされている尿は、図１７ａならびに図１７ｂのものに追加ピークを示す。これはＦＩＴＣ標識化抗体が尿試料中の成分に結合していることを示す。このことは、さらに、図１７ｄにおいても示され、該図においては、内因性の蛍光ならびにＦＩＴＣ標識化抗体のみに関するシグナルが差し引かれ、結果として得られ
たトレースは尿のＸＩＩａ因子への抗体の結合のみを反映している。
【０２７０】
実施例１４
この実施例において、血漿における尿のＸＩＩａ因子の存在は、ラジオトレーサー（ヨウ素１２５）で標識化された抗体断片との結合、ならびに得られた複合体の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分子量に基づく分離によって立証された。
【０２７１】
ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００システムからなった。
【０２７２】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体断片を、生産者の取扱書にしたがって「イミュノピュア  Ｆａｂ  調製キット」（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）を用いて調製した。これらＦａｂ断片は次にヨウ素１２５を用いてアマシャム  ファルマシア  バイオテク（英国  エッチピー８  ４エスピー，チャルフォント  ストリート  ジャイルズ  ナイチンゲールズ  レーン  ポラーズ  ウッド）によって放射能標識化した。
【０２７３】
１μｌの放射能標識化抗体が健康なボランティアから得られた１ｍｌの尿に添加された。４時間培養後、血漿成分は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離された。
【０２７４】
ＨＰＬＣに使用された移動相は０．１Ｍ  塩化ナトリウム  ０．０５Ｍトリス塩酸、０．４％（ｗ／ｖ）トリス−ナトリウム  クエン酸塩  ｐＨ７．５であった。固定相は一連の２×３０ｃｍ  バイオセップ−セック−Ｓ  ３０００  カラム（フェノメネクス，英国，チェシャー  エスケー１０  ２ビーエヌ，マックルズフィールド，ハーズフィールド  インダストリアル  エステート，クィーンズ  アベニュー）からなった。流速は０．７ｍｌ
ｍｉｎ-1、ならびに注入量は１００μｌであった。
【０２７５】
ＨＰＬＣ溶出画分は、２０秒ごとに１画分を集めるようにセットした、自動フラクションコレクターを用いて集められた。放射能活性は次にマルチウェル  シンチレーション  カウンターを用いて各画分において測定された。
【０２７６】
放射能活性対時間曲線の例を図１８に示す、該図においては非結合抗体断片のピークに追加したピークが存在することがみてとれ、放射能標識化抗体断片は尿中で存在するＸＩＩａ因子に結合していることが立証された。
【０２７７】
実施例１５
この実施例において、経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）を受けた患者におけるＸＩＩａ因子形態の識別的応答が立証された。
【０２７８】
試料は冠状動脈血管形成術の直前、直後、５日後の患者から得られた。試料は次にＸＩＩａ因子の特定形態の測定に有利にはたらくように設計された２つの分析を用いてＸＩＩａ因子に対して分析された。
【０２７９】
分析１において、ｍＡｂ２／２１５はヌンク（ヌンク  Ａ／Ｓ，デンマーク，４０００ロスキレ，私書箱  ２８０，カルストルプエジュ  ９０）マックスソーブ  マイクロプレート（１００μｌの抗体が各ウェルにコートされている）上に１５μｇ  ｍｌ-1濃度でカーボネート  コーティング  バッファー（ｐＨ．９．６）内でコートされた。０．５％（ｖ／ｖ）の最終トリトン濃度で添加したトリトンＸ−１００（シグマ社，英国，ドーセット，ギリンガム，ニュー  ロード，ザ  オールド  ブリックヤード）と共に７５μｌの血漿はマイクロタイタープレートのウェルに添加され、ならびに室温にて６０分間培養された
。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄後、１００μｌの接合体が添加された。この接合体はアルカリホスファターゼに接合したモノクローナル抗体２０１／９からなった。６０分間培養後、マイクロタイタープレートのウェルは再洗浄され、ならびにフェノールフタレインホスフェートを含む１００μｌの基質溶液が添加された。室温にて６０分間培養後、反応は強塩基溶液（５０ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加にて停止させられ、５５０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【０２８０】
分析２において、抗体２／２１５はヌンク  マックスソーブ  マイクロプレート（１００μｌの抗体が各ウェルにコートされている）上に２μｇ  ｍｌ-1濃度でホスフェート  コーティング  バッファー（ｐＨ．７．４）内でコートされた。トリトンＸ−１００無添加の７５μｌの血漿はマイクロタイタープレートのウェルに添加され、ならびに室温にて６０分間培養された。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄後、１００μｌの接合体が添加された。この接合体はアルカリホスファターゼに接合したＸＩＩ抗因子（エンザイム
リサーチ  ラボラトリーズ社，英国，スウァンジ，スケルティ  ロード）に対するポリクローナル抗体からなった。６０分間培養後、マイクロタイタープレートのウェルは再洗浄され、ならびにフェノールフタレインホスフェートを含む１００μｌの基質溶液が添加された。室温にて６０分間培養後、反応は強塩基溶液（５０ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加にて停止させられ、５５０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【０２８１】
図１９は個体から得られた典型的な数値傾向を示す。そこには血管形成術の直前、直後、ならびに５日後の試料間に分析１によって優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態の濃度においてごく小さい変化があることがみてとれる。これは、分析２によって優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態の濃度変化とは大いに異なり、分析２では数値の大きな増加は明らかに血管形成術直後であり、５日間で血管形成術直前の数値に戻る。
【０２８２】
図２０において、分析２によって測定したＸＩＩａ因子の特定形態の応答は血管形成術を受けた個体間で変化することが示される。患者Ｓ０２１６は血管形成直後にＸＩＩａの増加を示し、更なる数値上昇が５日後の試料において明白となった。患者Ｓ０８１１ならびにＳ０９０９が血管形成直後にＸＩＩａ因子の大きな増加を示し、５日後の試料は血管形成術直前の試料と類似あるいはより低い数値を与える一方で、患者Ｓ０７９４はＸＩＩａ因子の最小変化しか示さなかった。これらの応答の差異はＸＩＩａ因子を含む生理学的システムの活性化の程度を反映し、ならびにそれゆえに血管形成術処置の有効性を示し得る。
【０２８３】
実施例１６
この実施例において、血栓溶解を受けた患者におけるＸＩＩａ因子の識別的応答が立証された。
【０２８４】
試料は血栓溶解治療の直前、直後、５日後の患者から得られた。試料は次にＸＩＩａ因子の特定形態の測定に有利にはたらくように設計された２つの分析を用いてＸＩＩａ因子に対して分析された。使用された分析（すなわち分析１及び分析２）は実施例１５に記載された通りである。
【０２８５】
図２１は個体から得られた典型的な数値傾向を示す。そこには血栓溶解の直前、直後、ならびに５日後の試料間に分析１によって優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態の濃度においてほとんど変化がないことがみてとれる。これは分析２によって優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態の濃度変化とは大いに異なり、分析２では数値の大きな増加は明らかに血栓溶解直後であり、５日間で血栓溶解直前の数値に戻る。
【０２８６】
図２２において、分析２によって測定したＸＩＩａ因子の特定形態の応答は血栓溶解を受
けた個体間で変化することが示される。患者Ｓ０６８４は血栓溶解によってＸＩＩａ因子の変化を示さないが、患者Ｓ０６９３は血栓溶解直後に大きな増加が起こり、５日間で血栓溶解直前の数値に戻る一方で、患者Ｓ０６８５は血栓溶解の直後ならびに５日後の数値において連続的な減少が起こる。これらの応答の差異はＸＩＩａ因子を含む生理学的システムの活性化の程度を反映し、ならびにそれゆえに血栓溶解術の有効性を示し得る。この結論は、血栓溶解後に著しい増加を示した患者は少なくとも３０日間再発せずにいる一方で、血栓溶解の直前ならびに直後に得られた数値においてほとんど変化を見せなかった２人の患者は数日で死亡したという事実によって確認された。
【０２８７】
実施例１７
この実施例はＸＩＩａ因子の特定形態の測定は、心筋梗塞ならびに急性冠不全症候群の疑いで病院に入院した患者の、心筋梗塞の再発あるいは心臓死のリスク予測を提供することを立証する。
【０２８８】
データは病院に入院した８２０人の患者から得た。各患者はいくつかの分析を用いてＸＩＩａ因子を測定され、その結果異なるＸＩＩａ因子形態が測定された。各分析は、最初の入院期間あるいは入院３０日後の間に、その後のトロポニン陽性イベント（心筋梗塞）又は心臓死における第一次臨床的エンドポイントの予測を提供するかどうかを解明するために研究された。
【０２８９】
分析の予測の有用性は、それぞれ異なるＸＩＩａ因子形態を優先的に測定する、各分析に対してのＸＩＩａ因子数値のランキング（最低から最高）、ならびに次に集団の四分位への分割、すなわち最もＸＩＩ因子濃度の低い２０５個体は１番目の四分位に、最もＸＩＩ因子濃度の高い２０５個体は４番目の四分位に分割することによって決定された。
【０２９０】
異なるＸＩＩａ因子形態はさまざまな臨床転帰のリスクファクターであり、それゆえに異なるＸＩＩａ因子形態を測定する異なる分析はさまざまな定義された転帰に対する最もよい臨床的有用性を提供することが見出された。
【０２９１】
初入院後の入院期間中におけるその後のトロポニン陽性イベントの第一次臨床的エンドポイントについて評価した場合、とりわけ、試料がＸＩＩａ因子複合体あるいは試料中に存在する粒子とのＸＩＩａ因子の会合を分裂させるような界面活性剤と接触していないので、最もよい予測指標は複合体ならびに／あるいは多数ＸＩＩａ因子分子を含む粒子の測定をすると考えられる分析であることが発見された。
【０２９２】
使用される分析はマイクロタイタープレート形式の免疫学的検定法であり、該分析においてｍＡｂ２／２１５はヌンク  マックスソーブ  マイクロプレート（１００μｌの抗体が各ウェルにコートされている）上に２μｇ  ｍｌ-1濃度でホスフェート  コーテイング  バッファー（ｐＨ．７．４．）内でコートされた。トリトンＸ−１００無添加の７５μｌの血漿はマイクロタイタープレートのウェルに添加され、室温で６０分間培養された。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄後、１００μｌの接合体が添加された。この接合体はアルカリホスファターゼに接合した同一抗体、ｍＡｂ２／２１５が使用された。６０分間培養後、マイクロタイタープレートのウェルは再洗浄され、ならびにフェノールフタレインホスフェートを含む１００μｌの基質溶液が添加された。室温にて６０分間培養後、反応は強塩基溶液（５０ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加にて停止させられ、５５０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【０２９３】
図２３から、分析によって測定された、ＸＩＩａ因子の多分子からなるＸＩＩａ因子形態であると考えられ、ＸＩＩａ因子分子の分子複合体として会合している、ならびに／あるいは細胞あるいは細胞残片あるいはリポタンパク質粒子あるいはその残片などの粒子表面
上に存在していても良いＸＩＩａ因子形態の低い濃度値を持つ個体は、初入院期間中に二次トロポニン陽性イベントが起こるさらに増加したリスクに瀕している、ということがみてとれる。図２４から、ＸＩＩａ因子の他の形態を優先的に測定する分析はこの臨床的有用性を提供しないことがみてとれる。
【０２９４】
しかしながら、使用される第一次臨床的エンドポイントが、入院期間後の、しかしながら入院日３０日以内の、その後のトロポニン陽性イベントであるとき、異なるＸＩＩａ因子形態の高い濃度値は、すなわち上記に記載された分析によって測定された形態との差異は、大きな前兆となることが発見された。
【０２９５】
このことは、４番目の四分位のイベントは最初の２つの四分位群のいずれに比べても８倍以上であるところの図２５において示される。図２５のマイクロタイタープレート分析の条件はヌンク  マックスソーブ  マイクロプレート（１００μｌの抗体が各ウェルにコートされている）上に１５μｇ  ｍｌ-1濃度でカーボネート  コーティング  バッファー（ｐＨ．９．６）内でコートされたｍＡｂ２／２１５である。０．５％（ｖ／ｖ）の最終トリトン濃度で添加したトリトンＸ−１００（シグマ社，英国，ドーセット，ギリンガム，ニュー  ロード，ザ  オールド  ブリックヤード）と共に７５μｌの血漿はマイクロタイタープレートのウェルに添加され、ならびに室温にて６０分間培養された。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄後、１００μｌの接合体が添加された。この接合体はアルカリホスファターゼに接合したｍＡｂ２０１／９からなった。６０分間培養後、マイクロタイタープレートのウェルは再洗浄され、ならびにフェノールフタレインホスフェートを含む１００μｌの基質溶液が添加された。室温にて６０分間培養後、反応は強塩基溶液（５０ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加にて停止させられ、５５０ｎｍにおける吸光度が測定された。図２６から、優先的に他のＸＩＩａ因子形態を測定する分析はこの臨床有用性を提供しないということがみてとれる。
【０２９６】
死亡が臨床的エンドポイントとして使用された場合、３番目の分析が最もよい臨床的有用性を提供することが見出された。この分析は患者にその後のトロポニン陽性イベントを起こるかどうかにかかわらず、患者の死亡リスクに関するＸＩＩａ因子形態を測定するようにみえる。
【０２９７】
図２７において、Ｕ型のカーブが見られ、ＸＩＩａ因子の特定形態濃度のより低い・より高い患者のどちらも、平均値に近い特定形態濃度を持つ者と比べて、著しく増加した死のリスクに瀕していることがわかる。
【０２９８】
図２７におけるイベントの特徴を提供するマイクロタイタープレート分析の分析条件は、ヌンク  マックスソーブ  マイクロプレート（１００μｌの抗体が各ウェルにコートされている）上に２μｇ  ｍｌ-1濃度でホスフェート  コーティング  バッファー（ｐＨ．９．６）内でコートされたｍＡｂ２／２１５である。トリトンＸ−１００無添加の７５μｌの血漿はマイクロタイタープレートのウェルに添加され、ならびに室温にて６０分間培養された。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄後、１００μｌの接合体が添加された。この接合体はアルカリホスファターゼに接合したＸＩＩ因子（エンザイム  リサーチ  ラボラトリーズ社，英国，スウァンジ，スケルティ  ロード）に対するポリクローナル抗体からなった。６０分間培養後、マイクロタイタープレートのウェルは再洗浄され、ならびにフェノールフタレインホスフェートを含む１００μｌの基質溶液が添加された。室温にて６０分間培養後、反応は強塩基溶液（５０ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加にて停止させられ、５５０ｎｍにおける吸光度が測定された。図２８から、優先的に他のＸＩＩａ因子形態を測定する分析はこの臨床有用性を提供しないということがみてとれる。
【０２９９】
実施例１８
深刻な敗血症にて病院に入院した患者はＸＩＩａ因子数値を測定された。
【０３００】
細胞性ＸＩＩａ因子レベルは、ヨウ素１２５で放射能標識化させた２／２１５Ｆａｂ断片５μｇとともに、１ｍｌのクエン酸添加した全血を培養し、室温で３時間培養することにより測定されたが、この間に試料中のトータル放射能活性が測定された。
細胞は次に１６，０００ｇで遠心分離することによって血漿から分離され、ならびに血漿は除去された。残った細胞は１ｍｌのホスフェートバッファー生理食塩水（ｐＨ７．４）を添加し、混合し、１６，０００ｇで遠心分離し、そして上清を除去することにより６回洗浄した。６回洗浄後、残存細胞ペレットの放射能活性が分析され、ならびに最初のトータル試料の放射能活性のパーセンテージとして示された。これは、血液試料に添加された放射能活性化抗体量における、あらゆる小さな変化を是正するために行われた。敗血症患者からの試料にこの手順を用いたのと同様に、敗血症ではない患者１００人からの対応試料についてもまた実施された。
【０３０１】
敗血症ではない患者１００人の細胞性ＸＩＩａ因子量が０．５１ないし４．１０％に及ぶ（平均１．５０、標準偏差０．７５）のに対して、敗血症患者の細胞性ＸＩＩａ因子の数値は８．２０％であった。したがって、敗血症患者はコントロール群と比べてより高い細胞性ＸＩＩａ因子数値を持っていた。
【０３０２】
実施例１９
この実施例は、脂質結合ＸＩＩａ因子が心筋梗塞あるいは急性冠不全症候群の疑いで入院した患者の、心筋梗塞の反復あるいは心臓死のリスク予測を提供するものであることを立証する。
【０３０３】
データは心筋梗塞の疑いで入院した１６０人の患者によって得た。各患者は脂質結合ＸＩＩａ因子を測定された。結果は、入院後６ヶ月間の、その後のトロポニン陽性イベントの第一次臨床的エンドポイントあるいは心臓死の予測を提供するかどうかを解明するために研究された。
【０３０４】
分析の予測有用性はＸＩＩａ因子数値のランキング（最低ないし最高）、ならびに次に母集団の四分位への分割、すなわち最も濃度の低い４０個体を１番目の四分位に、最も濃度の高い４０個体を４番目の四分位へと分割することによって、測定された。次に各四分位における二次イベントを起こした患者数が計算された。
【０３０５】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体断片を、生産者の取扱書にしたがって「イミュノピュア  Ｆａｂ  調製キット」（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）を用いて調製した。これらＦａｂ断片は次にヨウ素１２５を用いてアマシャム  ファルマシア  バイオテク（英国  エッチピー８  ４エスピー，チャルフォント  ストリート  ジャイルズ  ナイチンゲールズ  レーン  ポラーズ  ウッド）によって放射能標識化した。
【０３０６】
クエン酸添加した血漿は胸痛で入院した１６０人の患者から得られた。
【０３０７】
５μｌの放射能標識化抗体が各患者の１ｍｌのクエン酸添加した全血に添加された。３時間培養後、血漿は細胞性成分を除去するために１６，０００ｇで１０分間遠心分離された。リポタンパク質は、５１．５４ｍＭ  ホスフォタングステン酸、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．１５に調節された０．０７Ｍ  塩化マンガンを含む５００μｌの沈殿剤の、２００μｌの血漿上清への添加によって沈殿させた。混合、ならびに１０分間の培養後、試料は１６，０００ｇで１０分間遠心分離された。上清は除去され、ならびにリポタンパ
ク質ペレットはあらゆる残留水相ＸＩＩａ因子を除去するために、ペレットを１ｍｌの沈殿剤に再懸濁させ、１６，０００ｇで１０分間遠心分離させ、ならびに上清を除去させることによって、洗浄された。この洗浄手順を３回実施した後、ペレット状物質に関する放射能活性がシングルウェルシンチレーションカウンターを用いて（ラブ  ロジック，英国
Ｓ１１  ８ユーエックス，シェフィールド，プサルター  レーン  １３１，セントジョーンズハウス）測定された。
【０３０８】
データは次に上記に示されたように四分位に仕分けられ、ならび２次イベントを被った個体数が各四分位において数えられた。
【０３０９】
図２９から、脂質結合ＸＩＩａ因子濃度の増加は、入院から６ヶ月以内の、致命的でないトロポニン陽性イベントであるか心臓死である、二次イベントのリスク増加と関係していることがみてとれる。
【０３１０】
実施例２０
この実施例は、放射能活性化抗体との培養とその後のＨＰＬＣによって分析された尿におけるＸＩＩａ因子の特定形態の濃度は、腎疾患の患者で増加することを立証した。
【０３１１】
２４時間の尿試料を腎疾患の患者５人ならびに健康なボランティア５人から得た。各被験者から集められた全尿試料は十分混合され、ならびに３０ｍｌのアリコートが除去されならびに分析に使用された。
【０３１２】
抗体２／２１５のＦａｂ抗体断片を、生産者の取扱書にしたがって「イミュノピュア  Ｆａｂ  調製キット」（ピアス，イリノイ州  ６１１０５，ロックフォード，私書箱  １１７，３７３７  エヌ  メリディアン  ロード）を用いて調製した。これらＦａｂ断片は次にヨウ素１２５を用いてアマシャム  ファルマシア  バイオテク（英国  エッチピー８  ４エスピー，チャルフォント  ストリート  ジャイルズ  ナイチンゲールズ  レーン  ポラーズ  ウッド）によって放射能標識化した。
【０３１３】
１μｌの放射能標識化抗体は各ボランティアならびに各患者からの１ｍｌ尿試料に添加された。４時間培養後、尿成分は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離された。ＨＰＬＣシステムはアジレント１１００システムであった。
【０３１４】
ＨＰＬＣに使用された移動相は０．１Ｍ  塩化ナトリウム  ０．０５Ｍトリス塩酸、０．４％（ｗ／ｖ）トリス−ナトリウム  クエン酸塩  ｐＨ７．５であった。固定相は一連の１×３０ｃｍ  バイオセップ−セック−Ｓ  ３０００  カラムならびに１×３０ｃｍ  バイオセップ−セック−Ｓ  ２０００  カラム（フェノメネクス，英国，チェシャー  エスケー１０  ２ビーエヌ，マックルズフィールド，ハーズフィールド  インダストリアル  エステート，クィーンズ  アベニュー）からなった。流速は０．５ｍｌ  ｍｉｎ-1、ならびに注入量は１００μｌであった。
【０３１５】
溶出液の放射能活性はハイ  センシティビティ  ヨウ素１２５  デテクション  システムが組み込まれたインライン  シングル−ウェル  シンチレーション  カウンター（ラブ  ロジック，英国  エス１１  ８ユーエックス，シェフィールド，プサルター  レーン  １３１，セントジョーンズハウス）を用いてモニターされた。
【０３１６】
βＸＩＩａ因子に対応するピーク範囲（放射能標識化抗体と培養させた純βＸＩＩａ因子と同一の保持時間に基づいたもの）は各尿試料について積分によって得られた。
得られた数値は表５ならびに図として図３０に示される。腎障害の患者について得た数値は健康なボランティアのものよりも著しく高いことがみてとれる。
【表５】
2006510896.tif 000007
【０３１７】
実施例２１
この実施例は、マイクロタイタープレート分析によって分析された尿におけるＸＩＩａ因子の特定形態の濃度は、腎疾患の患者で増加することを立証した。
【０３１８】
２４時間の尿試料は腎疾患患者５人ならびに健康なボランティア５人から得た。各被験者からの全尿試料は完全に混合され、ならびに３０ｍｌアリコートが除去されならびに分析に使用された。
【０３１９】
抗体２／２１５はヌンク（ヌンク  Ａ／Ｓ，デンマーク，４０００ロスキレ，私書箱  ２８０，カルストルプエジュ  ９０）マックスソーブ  マイクロプレート（１００μｌの抗体が各ウェルにコートされている）上に１５μｇ  ｍｌ-1濃度でカーボネート  コーティング  バッファー（ｐＨ．９．６）内でコートされた。０．５％（ｖ／ｖ）の最終トリトン濃度で添加したトリトンＸ−１００と共に７５μｌの血漿はマイクロタイタープレートのウェルに添加され、ならびに室温にて６０分間培養された。マイクロタイタープレートのウェルを洗浄後、１００μｌの接合体が添加された。この接合体はアルカリホスファターゼに接合したモノクローナル抗体２０１／９からなった。６０分間培養後、マイクロタイタープレートのウェルは再洗浄され、ならびにフェノールフタレインホスフェートを含む１００μｌの基質溶液が添加された。室温にて６０分間培養後、反応は強塩基溶液（５０ｇ／ｌの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５）の添加にて停止させられ、５５０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【０３２０】
吸光度値は表６に示され、図３１にはグラフ表示される。腎疾患の個体は健康なボランテ
ィアよりも著しく高い結果を与えた。
【表６】
2006510896.tif 000008
【０３２１】
実施例２２
この実施例は本発明による使用に適したモノクローナル抗体の製造に関する一般的なプロトコルを与える。
【０３２２】
抗体の産生に用いられた抗原はＸＩＩ因子あるいはその断片であった。ＸＩＩ因子の抗原性断片は、それ自身免疫原であってもよいし、あるいは免疫原になるには小さすぎてもよく、その場合、該断片は下記に記載されたような他のタンパク質に接合することなどによって免疫原に変換された。ここで使用されるような「ＸＩＩ因子抗原断片」とは、ペプチドなどの断片、及びそれ自身が免疫原でない場合、そのような断片の免疫原形態、の双方を含む。
【０３２３】
ＸＩＩ因子の抗原性断片は、ＸＩＩａ因子の、たとえばαＸＩＩ因子あるいはβＸＩＩａ因子あるいはその断片、たとえば、βＸＩＩａ抗因子を認識できる少なくとも一種の抗原性決定基であるかあるいは該基を含むβＸＩＩａ因子の断片であるペプチド、であり得る。
【０３２４】
免疫原の調製方法は当業者に知られている。それらの方法のいずれも、免疫原性を与えるためにあるいはＸＩＩ因子又はその抗原断片の免疫原性の改善に利用される、国際特許第９０／０８８３５号を参照。
【０３２５】
たとえば、βＸＩＩａ因子はＸＩＩａ抗因子モノクローナル又はポリクローナル抗体産生のための免疫原として使用され得る。βＸＩＩａ因子は、Ｋ．フジカワならびにＥ．Ｗ．ダヴィ（酵素学の方法，１９８１，８０，１９８−２１１）によって記載された方法などによる、アンモニウムサルフェート沈殿と陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせ
などによって、新鮮な又は新鮮に凍結された血漿からのＸＩＩ因子を最初に単離することからなる方法で製造され得る。ＸＩＩ因子をβＸＩＩａ因子に変換する方法ならびに得られた混合物からβＸＩＩａ因子を単離する方法は、Ｋ．フジカワ及びＢ．Ａ．マクマラン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８３，２５８，１０９２４−１０９３３）ならびにＢ．Ａ．マクマラン及びＫ．フジカワ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８５，２６０，５３２８）によって記載されている。βＸＩＩａ因子を得るために、たとえばトリプシン又はトリプシン類似の酵素を用いて（一般にはトリプシンとＸＩＩ因子のモル比が１：５００やトリプシンとＸＩＩ因子の質量比が１：７５というような高度に希薄された形態において）、化学的又は酵素学的な消化により、ＸＩＩ因子を一般に限定された分裂に付され、分裂生成物は一般にクロマトグラフィーによって分離された。
【０３２６】
βＸＩＩａ因子の抗原性断片は免疫学的又は化学的手法によってβＸＩＩａ因子の分化によって生成され得る。たとえば、βＸＩＩａ因子のジスルフィド結合軽鎖ペプチドは、βＸＩＩａ因子の還元ならびにカルボキシメチル化ならびにクロマトグラフィーによる断片の分離によって得られ得る（Ｋ．フジワラならびにＢ．Ａ．マクマラン  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８３，２５８，１０２９４）。
あるいは、βＸＩＩａ因子の抗原性断片は、それ自身のアミノ酸配列が知られている場合、βＸＩＩａ因子自身のように合成的に製造される。ペプチド合成に関する多くの公知の化学的手法のどれでも使用することができ、特に自動装置を利用したものが使用される。
【０３２７】
βＸＩＩａ因子の抗原性断片は、βＸＩＩａ因子自身のように組換えＤＮＡ技術のテクニックを用いて製造された。クールら，１９８５ならびに１９８７，前掲個所、はヒト血液凝固ＸＩＩ因子ｃＤＮＡ及び遺伝子を特徴づけた。組換え生成物は既知の方法により達成される、国際特許第９０／０８８３５号を参照のこと。
【０３２８】
他に特定されなければ、ここで使用される「βＸＩＩａ因子」ならびに「βＸＩＩａ」という用語はβＸＩＩａ因子分子の抗原性断片を含む。
【０３２９】
本発明による使用に対するモノクローナル抗体はＸＩＩ因子チモーゲンに顕著な結合を見せないということが、不可欠ではないが好ましい。後者の場合、ＸＩＩ因子の修正交差反応性は、たとえば０．１％以下である。本発明の抗体のＸＩＩ因子との交差反応性の分析において考慮する要素は、たとえ「純」ＸＩＩ因子調製液であってもほぼ必然的に少量のＸＩＩａ因子にて汚染されることである（シルバーバーグならびにカプラン，Ｂｌｏｏｄ
６０，１９８２，６４−７０）。国際特許第９０／０８８３５号はＸＩＩ因子との修正交差反応性の分析方法の詳細を与える。他に特定されなければ、「交差反応性」という用語はここで修正した交差反応性を意味するために使用される。
【０３３０】
モノクローナル抗体生成に使用される方法は、周知であり、たとえば以下を参照のこと：酵素学の方法，Ｈ．ヴァン  ヴナキス  ならびに  Ｊ．Ｊ．ロンゴン（編者）１９８１，７２（Ｂ）ならびに同書，１９８３  ９２（Ｅ）。
【０３３１】
モノクローナル抗体はたとえばコーラーならびにミルスタインの方法の変更によって生成され得る（Ｇ．コーラー  ならびにＣ．ミルスタイン，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５）。
【０３３２】
たとえば、メスのＢａｌｂ／Ｃ又はＣ／５７マウスはＸＩＩ因子又はその免疫性断片、たとえば１０ないし３０μｇ、一般には２０μｇのβＸＩＩａ因子又は他の抗原の対応する量の腹腔内の注入によって免疫性を与えられる。βＸＩＩａ因子又は他の抗原は、好ましくは、他のタンパク質分子、たとえば、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体、あるいは
好ましくはウシチログロブリンに接合する。接合はカルボキシイミド手法あるいはヘテロ−二官能性試薬の使用などによって実施され得る。免疫原は一般に補助剤に存在し、好ましくは完全フロイント補助剤に存在する。この手順は一般に間隔を置いて、一般に同一容量で同一免疫原を用いて繰り返され、たとえば、３週間の間隔を置いてマウスは、適切な応答レベルが観測されるまで、完全フロイント補助剤中の２０μｇの接合βＸＩＩａ因子を用いて追加免疫された。
事前溶解追加免疫は、好ましくは（マウス）の屠殺前に与えられ、たとえば、屠殺前に静脈注入された。
【０３３３】
抗体応答は、たとえば、１２５Ｉ放射能標識などで適切に標識化された望ましい形態のＸＩＩａ因子、たとえば、一種以上の細胞性ＸＩＩａ因子、脂質結合ＸＩＩａ因子、ならびに複合体形態あるいはＸＩＩａ因子の他の分子又は低もしくは高親和性結合パートナーとの会合形態のＸＩＩａ因子を用いて、ＲＩＡ  抗血清カーブ分析などによってモニターされた。ある場合においては、この段階で、１２５Ｉ放射能標識化されたＸＩＩ因子あるいはその断片、たとえば放射能標識化βＸＩＩａ因子、あるいはクロラミン−Ｔ法を用いて調製された他のβＸＩＩａ因子抗原などを使用することが適し得る（Ｐ．Ｊ．マコナヒー
ならびにＦ．Ｊ．ディクソン，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９６６，２９，１８５）。純度は、還元状態下で稼動させたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルなどの自動Ｘ線撮影を用いることなどによって確かめられた。
【０３３４】
免疫化マウスの脾臓細胞は次に骨髄腫細胞、たとえばＮＳＯマウス骨髄腫細胞と、４０−５０％のＰＥＧ４，０００又は５０％のＰＥＧ１５００の存在下で、溶解させた。細胞は次に培養プレートのウェル中に蒔かれ、ならびに選択された培地上で培養された。上清は、細胞性ＸＩＩａ因子、脂質結合ＸＩＩａ因子、ならびに複合体形態あるいはＸＩＩａ因子の他の分子又は低もしくは高親和性結合パートナーとの会合形態のＸＩＩａ因子といった、ＸＩＩａ因子の望ましい形態に対する反応性について、ペルオキシダーゼ標識化抗マウスＩｇＧなどを用いた固相酵素分析などにより、テストされた。試験に使用された抗原に対する特異性を示したすべてのウェルは一般に更なる二次スクリーニングが行われた。二次スクリーニングは、溶液中で適切な抗原、たとえば細胞性ＸＩＩａ因子、脂質結合ＸＩＩａ因子、ならびに複合体形態あるいはＸＩＩａ因子の他の分子又は低もしくは高親和性結合パートナーとの会合形態のＸＩＩａ因子などに結合したすべての特定抗体のスクリーニングなどからなった。これらは、好ましくは、５０％のＢ  ｍａｘに必要な抗体希釈を測定するために滴定された。非放射性に対する用量−応答カーブ、すなわち非標識化抗原が生成され、好ましくはＸＩＩ因子に対して生成された（ＸＩＩ因子の交差反応性が要求されない場合）。プラスミン及びフィブロネクチンもまた使用され得る。交差反応性の範囲は以下の式によって測定され得る。
【化１】
2006510896.tif 000009
【０３３５】
これらの、少なくとも１０10Ｍ-1の親和定数を持つような、望ましい抗原に結合する適切なレベルを見せる抗体は、一般にクローニングのために事前に得られる。
【０３３６】
成功したクローンは一般にアイソタイプである。細胞は次に、望ましいＸＩＩａ因子形態、たとえば細胞性ＸＩＩａ因子、脂質結合ＸＩＩａ因子、ならびに複合体形態あるいはＸＩＩａ因子の他の分子又は低もしくは高親和性結合パートナーとの会合形態のＸＩＩａ因
子などに結合する望ましい抗体の製造のために、好ましくは、限界希釈法によってサブクローンされ、ならびに酵素免疫測定あるいは放射免疫測定を用いることなどによって、再度スクリーニングされた。各クローニングからの選択されたサブクローンは、放射免疫測定又はＥＲＩＳＡを用いて、特異性ならびに用量応答について評価され得る。
【０３３７】
必要であれば、抗体は、好ましくは１．５％以下、たとえば１％以下、たとえば０．５％以下、たとえば０．１％もしくはそれ以下の所定のＸＩＩ因子に対する明白な交差反応性を示すものに対して、スクリーニングされ得る。
【０３３８】
上記に記載されたように、ＸＩＩａ因子の望ましい形態に対するスクリーニングは、一般に最初に実施され、しかしながら２回あるいは所望により３回のスクリーンが任意の順序で実施され得る。スクリーニングステップにおいて、適切な場合、ｍＡｂ２／２１５又はｍＡｂ２０１／９は参照抗体として使用され得る。これは、ｍＡｂ２／２１５又は２０１／９と同一あるいは類似の、ＸＩＩａ因子の特定形態に対する結合特性をもつ、モノクローナル抗体の入手が要求される場合に、特に有用である。
【０３３９】
スキャッチャード分析は各抗体の親和定数値を生成するために用量応答データに使用される。
【０３４０】
サブクローン又はクローンハイブリドーマ細胞は、腹水製造のためにＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に注射される。免疫グロブリンは、４℃で飽和アンモニウムスルフェート溶液（同量の）を用いるなどして腹水から沈殿させ得る。沈殿物は好ましくは精製され、たとえば遠心分離され、５０ｍＭのトリス塩酸バッファーｐＨ７．５（元の腹水量と同量）などを用いて溶解され、ならびに次に同バッファーから透析させる。免疫グロブリン画分は次に、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製され得、たとえば、タンパク質溶液がモノ−Ｑ  陰イオン交換カラム（ファルマシア）に適用され、生産者の取扱書にしたがって同バッファー中で塩勾配によって溶出され得る。免疫グロブリンを含む画分は一般に溜められ、ならびに貯蔵のため−２０℃で凍結される。あるいは、ハイブリドーマ細胞は抗体を生産するために培養液の中で成長させられ、ならびに、抗体は基本的に腹水溶液のために、上記に示されたように単離される。あるいは、ハイブリドーマは試験管内で培養される。
【０３４１】
ここで上記に示されているハイブリドーマはマウス脾臓細胞に由来するものであるが、本発明はネズミあるいはネズミの一部分由来のハイブリドーマに限定されない。両融合パートナー（脾臓細胞ならびに骨髄腫）はあらゆる適切な動物から得ることができる。組み換え抗体が生成されることができる。抗体は、必要な場合には、キメラあるいはヒト化形態に転換され得る。ハイブリドーマは好ましくは試験管中で培養される。
【０３４２】
ハイブリドーマの寄託
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２／２１５はハイブリドーマ２／２１５（ＢＦｘ１１ａ）によって生産され、英国，ソールズベリー  ＳＰ４  ０ＪＧ，ポートンダウンの応用微生物学及び研究のためのＰＨＬＳ  センターの生物学部門である欧州動物細胞カルチャーコレクション（ＥＣＡＣＣとして知られる）へ１９９０年１月１６日に寄託ナンバー９００１１６０６で寄託されており、ならびに、モノクローナル抗体２０１／９を生産するハイブリドーマ２０１／９（ＥＳＢＴ４  １．１）はＥＣＡＣＣへ１９９０年１月１８日に寄託ナンバー９００１１８９３で寄託されている。
【図１】
2006510896.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006510896.tif 000017
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2006510896.tif 000020
【図１２】
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【図１３】
2006510896.tif 000022
【図１４】
2006510896.tif 000023
【図１５】
2006510896.tif 000024
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2006510896.tif 000034
【図２６】
2006510896.tif 000035
【図２７】
2006510896.tif 000036
【図２８】
2006510896.tif 000037
【図２９】
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【図３０】
2006510896.tif 000039
【図３１】
2006510896.tif 000040
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月26日(2005.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】図１は、生体中に存在するＸＩＩａ因子の異なる形態に関する仮説の図式的表示を示す。
【図２】図２ａから２ｄは、蛍光検出法を用いたＨＰＬＣトレースを示す：図２ａ、血漿試料のみ；図２ｂ、ＦＩＴＣ標識２／２１５抗体；図２ｃ、ＦＩＴＣ標識２／２１５抗体と培養させた血漿；図２ｄ、図２ａならびに図２ｂで示されたトレースを差し引いた後の図２ｃのトレース。
【図３】図３は、ＨＰＬＣを用いて成分を分離した後の、放射能標識化２／２１５Ｆａｂ断片と培養させた血漿における放射活性を示す。ピーク１ないし５は血漿成分に結合したｍＡｂ２／２１５Ｆａｂの結果であり、ピーク６はｍＡｂ２／２１５Ｆａｂと結合せずに残ったものである。
【図４】図４ａと４ｂは、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に対して、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５ならびに標識化ポリクローナル抗体（ポリクローナル接合体）（図４ａではひし形、図４ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）（図４ａでは四角、図４ｂでは黒色棒）を使用した、マイクロタイタープレートによるＸＩＩａ因子の免疫検定法における、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、洗浄細胞の標準化された応答を示す。
【図５】図５は、アボットラボラトリーズ社のＩＭｘシステムを用いた、細胞性ＸＩＩａ因子の免疫検定法の実施に使用されるプロトコルを示す。
【図６】図６ａと図６ｂは、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に対して、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに標識化ポリクローナル抗体（ポリクローナル接合体）（図６ａではひし形、図６ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）（図６ａでは四角、図６ｂでは黒色棒）を使用した、マイクロタイタープレートによるＸＩＩａ因子の免疫検定法における、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の応答を示す。
【図７】図７ａと図７ｂは、細胞性ＸＩＩａ因子の検出に対して、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに標識化ｍＡｂ２０１／９（２０１／９接合体）（図７aではひし形、図７ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（２／２１５接合体）（図７ａでは四角、図７ｂでは黒色棒）を使用した、ＩＭｘ装置によるＸＩＩａ因子の免疫検定法における、異なる三試料、濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の応答を示す。
【図８】図８ａと図８ｂは、血漿と培養させたＦＩＴＣ標識化ｍＡｂ２／２１５について得られた、フローサイトメトリーデータを示す。図８ａは標識化抗体の不存在下で血漿について得られたデータを示し、図８ｂは血漿が標識化された抗体とともに培養された時に得られたデータを示す。分布のシフトは標識化２／２１５抗体が血漿の細胞成分に結合したことを示唆している。
【図９】図９は、放射能標識化ｍＡｂ２／２１５の添加によって測定された、８個体の血漿における細胞性ＸＩＩａ因子の含有量を示している。
【図１０】図１０ａと図１０ｂは、ＸＩＩ因子が「完全に欠乏」個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９（図１０aではひし形、図１０ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（図１０ａでは四角、図１０ｂでは黒色棒）を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。
【図１１】図１１ａと図１１ｂはＸＩＩ因子が「完全に欠乏」個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の標準化された応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９（図１１aではひし形、図１１ｂでは網掛け棒）、ならびに標識化ｍＡｂ２／２１５（図１１ａでは四角、図１１ｂでは黒色棒）を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。
【図１２】図１２ａと図１２ｂは、正常なボランティアならびにＸＩＩ因子が「完全に欠乏」個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の標準化された応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２／２１５を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。（図１２aではひし形ならびに図１２ｂでは網掛け棒が正常なボランティアからの試料を示し；図１２ａでは四角ならびに図１２ｂでは黒色棒が「ＸＩＩ因子欠乏」個体から得られた試料を示す。）
【図１３】図１３ａおよび図１３ｂは、正常なボランティアならびにＸＩＩ因子が完全に欠乏した個体から得られた、異なる三試料、すなわち濃細胞血漿、希細胞血漿、細胞懸濁液の標準化された応答を示す。ＸＩＩａ因子の免疫検定法は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を使用して、ＩＭｘ分析装置で行われた。（図１３aではひし形ならびに図１３ｂでは網掛け棒が正常なボランティアからの試料を示し；図１３ａでは四角ならびに図１３ｂでは黒色棒が「ＸＩＩ因子欠乏」個体から得られた試料を示す。）
【図１４】図１４は、放射能標識化２／２１５抗体断片のクエン酸血漿への添加、細胞物質の除去、マンガン／ヘパリン沈殿法を用いたリポタンパク質の沈殿、及び沈殿画分の放射活性の測定によって評価された、１２人の健康なボランティアから得られた、脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度を示す。
【図１５】図１５は、放射能標識化２／２１５抗体断片の全血への添加、それに続く細胞物質の除去、ホスホタングステート沈殿法を用いたリポタンパク質の沈殿、及び沈殿画分の放射活性の測定によって評価された、胸痛によって入院した６４人の患者から得られた、脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度を示す。
【図１６】図１６は、８人のボランティアから得られた、ＥＬＩＳＡ法によって評価された、脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度（５５０ｎｍにおける吸光度として表現）を示す。
【図１７】図１７ａから１７ｄは蛍光検出法を用いたＨＰＬＣトレースを示す：図１７ａ、尿試料のみ；図１７ｂ、ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ２／２１５；図１７ｃ、ＦＩＴＣ標識ｍＡｂ２／２１５と培養させた尿；図１７ｄ、図１７ａならびに図１７ｂで示されたトレースを差し引いた図１７ｃのトレース。
【図１８】図１８は、ＨＰＬＣを用いて成分を分離した後の、放射能標識化ｍＡｂ２／２１５Ｆａｂ断片と培養させた尿における放射活性を示す。ピーク１は尿中のＸＩＩａ因子と結合したｍＡｂ２／２１５Ｆａｂの結果であり、ピーク２はｍＡｂ２／２１５Ｆａｂと結合せずに残ったものである。
【図１９】図１９は、経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）の直前、直後、５日後における、患者の血漿試料のＸＩＩａ因子濃度を測定するために、二種の異なる免疫検定法を用いて得られた典型的な数値パターンを示す。分析１は試料の培養ステップを含む免疫検定法である。前記分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料の培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。分析２は、接合体としてＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体とともに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５を用いるものであり、試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わない。ひし形で表されたデータポイントは分析１から得られた結果を示し；四角で表されたデータポイントは分析２から得られた結果を示す。
【図２０】図２０は、冠動脈形成（ＰＴＣＡ）の直前、直後、５日後に得られた血漿試料の分析によって得られた、４人の患者（患者Ｓ０２１６、Ｓ０７９４、Ｓ０８１１、ならびにＳ０９０９）から得られた血漿試料中のＸＩＩａ因子の濃度を示す。ＸＩＩａ因子は試料培養ステップを含む免疫検定法により測定された。分析は、試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。網掛け棒はＰＴＣＡ前に得られた数値を示し、斜線棒はＰＴＣＡ後に得られた数値を示し、ならびに黒色棒はＰＴＣＡ５日後に得られた数値を示す。
【図２１】図２１は、血栓溶解治療の直前、直後、５日後に患者から得られた試料のＸＩＩａ因子の濃度を示す。分析１は試料培養ステップを含む免疫検定法である。分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５を、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。分析２は、接合体としてＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いるとともに捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５を用いるものであり、試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わない。ひし形で表されたデータポイントは分析１から得られた結果を示し；四角で表されたデータポイントは分析２から得られた結果を示す。結果は個体から得られる典型的数値パターンである。
【図２２】図２２は、血栓溶解治療の直前、直後、５日後から得られた試料における、３人の患者（Ｓ０６８４、Ｓ０６８５、ならびにＳ０６９３）のＸＩＩａ因子の濃度を示す。ＸＩＩａ因子は試料培養ステップを含む免疫検定法により測定された。分析は試料の培養ステップ間にはトリトン添加を行わずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。網掛け棒は血栓溶解治療前に得られた数値を示し、斜線棒は血栓溶解治療後に得られた数値を示し、ならびに黒色棒は血栓溶解治療５日後に得られた数値を示す。
【図２３】図２３は、心筋梗塞の疑いや急性冠症候群で入院した患者の初入院後の、入院期間中のトロポニン陽性イベントの反復頻度を示す。トロポニン陽性イベントの反復頻度は、ＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。ＸＩＩａ因子は、試料培養ステップを含む免疫検定法で測定される。分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化された同一の抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。
【図２４】図２４は、図２３の入院期間中の、それぞれ優先的にＸＩＩａ因子の異なる形態を測定する、数種の異なる分析を用いた、トロポニン陽性イベントの反復頻度を示す。これは、ＸＩＩａ因子の特定の形態が臨床的有用性を提供するが他の形態はしないということを実証する。前記分析は試料培養ステップを含む免疫検定法であった。分析ａにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は、点を含んだ明るい棒にて示される。分析ａは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（重炭酸塩バッファー中で１５μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化された同一の抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである（図２３に示されたデータと同様に）。分析ｂにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は暗い棒にて示される。分析ｂは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｃにて優先的に測定されるＸＩＩａ因子形態は斜線の入った明るい棒にて示される。分析ｃは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたβＸＩＩａ因子に対するポリクローナル抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。
【図２５】図２５は、図２３で示された同一患者の、入院日３０日以内の、その後のトロポニン陽性イベントの頻度を示す。トロポニン陽性イベントの反復頻度は、ＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。ＸＩＩａ因子は、試料培養ステップを含む免疫検定法で測定される。分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである。暗い棒は致命的でないトロポニン陽性イベントを示し、斜線の明るい棒は致命的なトロポニン陽性イベントを示す。
【図２６】図２６は、図２５と同様に入院日３０日以内の、それぞれ優先的にＸＩＩａ因子の異なる形態を測定する、数種の異なる分析を用いた、その後のトロポニン陽性イベントの頻度を示す。これは、ＸＩＩａ因子の特定の形態が臨床的有用性を提供するが、他の形態はしないということを実証する。分析ｘにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は、点を含む明るい棒にて示される。分析ｘは、ｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたβＸＩＩａ因子に対するポリクローナル抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｙにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は暗い棒にて示される。分析ｙは、ｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてアルカリホスファターゼで標識化されたＸＩＩａ因子に対するポリクローナル抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｚにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は斜線の入った明るい棒にて示される。分析ｚは、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（重炭酸塩バッファー中で１５μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れたものである（図２５に示されたデータと同様に）。
【図２７】図２７は、図２３ならびに図２５の患者の同一試料を用いた、臨床的エンドポイントとしての死亡頻度を示す。死亡頻度はＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。ＸＩＩａ因子は、試料培養ステップを含む免疫検定法で測定される。分析は、試料培養ステップにおいてトリトン添加をせずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体としてＸＩＩ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。暗い棒は二次トロポニン陽性放出を伴わない心臓死を示し、斜線の明るい棒は二次トロポニン陽性放出ならびに死亡を示す。
【図２８】図２８は図２７と同様に、それぞれ優先的にＸＩＩａ因子の異なる形態を測定する、二種の異なる分析を用いた、臨床的エンドポイントとしての死亡頻度を表す。これは、ＸＩＩａ因子の特定の形態が臨床的優位性を提供するが、他の形態はしないということを実証する。分析ｉにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は、点を含む明るい棒にて示される。分析ｉは、ｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに、接合体としてアルカリホスファターゼで標識化された同一の抗体を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。分析ｉｉにて優先的に測定されたＸＩＩａ因子形態は暗い棒にて示される。分析ｉｉは、試料培養ステップにおいてトリトン添加をせずに、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５（ホスフェートバッファー中で２μｇ  ｍｌ-1にコートされる）、ならびに接合体としてＸＩＩａ抗因子ポリクローナル抗体を用いた。
【図２９】図２９は、致命的でない心筋梗塞の反復頻度（トロポニン陽性イベント）、ならびに心筋梗塞の疑いで入院した患者の初入院後の、６ヶ月間の心臓死を示す。イベントの反復頻度は脂質結合ＸＩＩａ因子の濃度によって分類される。明るい棒は致命的でない心筋梗塞を示し、暗い棒は心臓死を示す。
【図３０】図３０は、放射能標識化抗体との培養ならびにＨＰＬＣにより確かめられた、５人の健康なボランティアならびに腎疾患を持っている５個体に対する、尿のβＸＩＩａ因子の濃度を示す。
【図３１】図３１は、マイクロタイタープレート免疫検定法にて得られた吸光度として表現された、５人の健康なボランティアならびに腎疾患を持っている５個体に対する、尿のβＸＩＩａ因子の数値を示す。前記分析は、捕獲抗体としてｍＡｂ２／２１５、ならびに接合体として標識化ｍＡｂ２０１／９を用い、ならびに試料培養ステップにトリトン添加を組み入れないものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）２０１／９、あるいは抗体２０１／９と呼ばれる、とは、ハイブリドーマ２０１／９から生成された抗体であり、ＥＣＡＣＣへ１９９０年１月１８日に寄託ナンバー９００１１８９３で寄託されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
実施例１２
尿のＸＩＩａ因子のＩＭｘ分析
５人の正常なランダム尿試料が健康な男性ボランティアから得られた。これら試料は上記実施例４に記載されたようなＩＭｘ分析を用いて、ポリクローナル抗体ベースの接合体を用いて、ＸＩＩａ因子の存在について試験された。尿のＸＩＩａ因子濃度の結果は表４に示される。
【表４】
2006510896.tif 000041
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１６】
βＸＩＩａ因子に対応するピーク範囲（放射能標識化抗体と培養させた純βＸＩＩａ因子と同一の保持時間に基づいたもの）は各尿試料について積分によって得られた。
得られた数値は表５ならびに図として図３０に示される。腎障害の患者について得た数値は健康なボランティアのものよりも著しく高いことがみてとれる。
【表５】
2006510896.tif 000042
【国際調査報告】
2006510896.tif 000043
2006510896.tif 000044
2006510896.tif 000045