(57)【要約】本発明は、遺伝子改変されたBlakeslea属の生物を産生するための方法であって、以下の工程：（ｉ）少なくとも１つの細胞を形質転換すること、（ｉｉ）場合によっては、工程（ｉ）で得られた細胞をホモカリオン性にすることで、核が全て、少なくとも１つの遺伝的特徴において均一に改変されており、かつ上記遺伝子改変を発現に転換する細胞を生成すること、および（ｉｉｉ）遺伝子改変された細胞を選択および培養することを含む上記方法に関する。
2006513729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変されたBlakeslea属の生物を産生するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）少なくとも１つの細胞の形質転換、
（ｉｉ）核の１つ以上の遺伝的特徴がすべて同一の様式で改変されており、かつ前記遺伝子改変が細胞中でそれ自体を明示する細胞を産生するための工程（ｉ）で得られた細胞の場合によるホモカリオン転換、および
（ｉｉｉ）遺伝子改変された細胞の選択および培養、
を包含する方法。
【請求項２】
細胞がBlakeslea trispora種の真菌由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベクターまたは遊離の核酸が形質転換（ｉ）において使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターがプロモーターおよび/またはターミネーターを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ｇｐｄプロモーター、ｐｃａｒＢプロモーター、ｐｃａｒＲＡプロモーター、および／もしくはｐｔｅｆ１プロモーター、ならびに／またはｔｒｐＣターミネーターを含むベクターが形質転換（ｉ）において利用される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
耐性遺伝子を含むベクターが形質転換（ｉ）において利用される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターがハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、特に大腸菌由来のものを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ｇｐｄプロモーターが配列番号１の配列を有する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ｔｒｐＣターミネーターが配列番号２の配列を有する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｔｅｆ１プロモーターが配列番号３５の配列を有する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ｇｐｄプロモーターおよびｔｒｐＣターミネーターがAspergillus nidulans由来である、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ベクターが配列番号３を含む、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
形質転換（ｉ）が、アグロバクテリア、接合、化学物質、エレクトロポレーション、ＤＮＡ負荷粒子を用いる衝撃、プロトプラスト、またはマイクロインジェクションを使用して実行される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
突然変異誘発物質がホモカリオン転換（ｉｉ）において利用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
利用される突然変異誘発物質がＮ−メチル−Ｎ’−ニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、ＵＶ照射、またはＸ線である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択が単核細胞の標識化および／または選択によって実行される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
５−炭素−５−デアザリボフラビン（ｄａｒｆ）およびハイグロマイシン（ｈｙｇ）または５−フルオロロテート（ＦＯＡ）およびウラシルおよびハイグロマイシンが選択において利用される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが、カロチノイドまたはそれらの前駆体を産生するための遺伝子情報を含む、請求項３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが、カロチンまたはキサントフィルを産生するための遺伝子情報を含む、請求項３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、アンドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、リコピン、β−カロチン、α−カロチン、ルテイン、ビキシン、フィトフルエンまたはフィトエンを産生するための遺伝子情報を含む、請求項３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが、その中に含まれる遺伝子情報をBlakeslea trisporaゲノムに導入するように設計される、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが発現後にケトラーゼ活性および/またはヒドロキシラーゼ活性を示す遺伝子情報を含む、請求項３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが配列番号７０もしくは７１もしくは７６および/または配列番号７２を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが配列番号３７〜５１からなる群からの配列を有する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが、その中に含まれる遺伝子情報が細胞においてスイッチが切られるように設計される、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
フィトエンデサチュラーゼ遺伝子が、形質転換（ｉ）に起因してスイッチが切られる、請求項３〜２１および２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが配列番号６９を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターが配列番号６２の配列を有する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
リコピンシクラーゼ遺伝子が、形質転換に起因してスイッチが切られる、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法によって取得可能な、Blakeslea属の真菌、特にBlakeslea trisporaの遺伝子改変された多核細胞。
【請求項３２】
カロチノイドまたはそれらの前駆体を生産するための、請求項３０に記載の細胞またはそこから形成される菌糸体の使用。
【請求項３３】
カロチンまたはキサントフィルを生産するための、請求項３０または３１に記載の使用。
【請求項３４】
アスタキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、アンドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、リコピン、β−カロチン、α−カロチン、ルテイン、ビキシン、フィトフルエンまたはフィトエンを生産するための、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法において使用するための配列番号１または３５の配列を有するプロモーター。
【請求項３６】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法において使用するための配列番号２の配列を有するターミネーター。
【請求項３７】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法において使用するための配列番号３を含むベクター。
【請求項３８】
配列番号６９および/または配列番号７０もしくは７１および/または配列番号７２もしくは７６を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法において使用するための請求項３６に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Blakeslea属の生物の遺伝子改変方法、それに関連して生じる生物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Blakeslea属の真菌は、生産生物として知られている。従って、例えばBlakeslea trisporaは、β−カロチン（Ciegler, 1965, Adv Appl Microbiol. 7:1）およびリコピン（EP 1201762, EP 1184464, WO 03/038064）についての生産生物として使用される。さらに、Blakesleaは、例えば、他のカロチノイドおよびそれらの前駆体、リン脂質、トリアシルグリセリド、ステロイド、ワックス、脂溶性ビタミン、プロビタミンならびにコファクターなどの他の親油性物質を産生するために好適であり、あるいは、例えば、タンパク質、アミノ酸、ヌクレオチド、および水溶性ビタミン、プロビタミンおよびコファクターなどの親水性物質を産生するために好適である。
【０００３】
β−カロチンおよびリコピンの高生産性によって、Blakeslea(特に、Blakeslea trispora)は、カロチノイドおよびそれらの前駆体の経済的な発酵的生産にとって魅力的なものとなる。
【０００４】
しかしながら、以前に天然に産生されたカロチンおよびそれらの前駆体のこの生産性をさらに増大させること、ならびに例えば、以前には、もしあったとしても、非常に低い程度までのみBlakesleaによって産生され、かつBlakesleaから単離されたキサントフィルなどのカロチノイドを産生することをさらに可能にすることもまた、関心対象のことである。
【０００５】
カロチノイドは、飼料、食材、栄養補助食品、化粧品、および医薬品に添加される。カロチノイドは、とりわけ着色のための色素として使用される。このことを別として、カロチノイドの抗酸化作用およびこれらの物質の他の特性が利用される。カロチノイドは、純粋な炭化水素、カロチン、および酸素含有炭化水素、キサントフィルに分けられる。カンタキサンチンおよびアスタキサンチンなどのキサントフィルは、例えば、鶏卵および魚の着色において利用される（Brittonら、1998, Carotinoids, 第3巻, Biosynthesis and Metabolism）。カロチンであるβ−カロチンおよびリコピンはとりわけヒト栄養において利用される。例えば、β−カロチンは、飲料用の着色料として使用される。リコピンは疾患予防作用を有する（ArgwalおよびRao, 2000, CMAJ 163:739-744; RaoおよびArgwal 1999, Nutrition Research 19:305-323）。無色のカロチノイド前駆体フィトエンは、抗酸化剤としての適用のためにとりわけ適している。
【０００６】
上述の適用における添加物として利用される、大部分のカロチノイドおよびそれらの前駆体は化学合成によって調製される。上記化学合成は、多段階であり、非常に複雑であり、高い製造コストを生じる。対照的に、発酵プロセスは比較的単純で、かつ高価でない開始材料に基づく。以前の発酵プロセスの生産性が増大し、または新規なカロチノイドが既知の生産生物に基づいて調製されることが可能であるならば、カロチノイドを産生するための発酵プロセスは、経済的に魅力的でありかつ化学合成と競合することが可能であり得る。
【０００７】
特に、発明がキサントフィルを産生するためにBlakesleaを利用する場合には、これらの化合物はBlakesleaによって天然に合成されないので、Blakeslea trisporaの遺伝子改変方法が必要となる。
【０００８】
Blakeslea trisporaの種々のＤＮＡ配列、特にゲラニルゲラニルピロリン酸からβ−カロチンへのカロチノイド生合成の遺伝子をコードするＤＮＡ配列がすでに公知である（WO 03/027293）。
【０００９】
しかし、これまでに、Blakeslea、特にBlakeslea trisporaの遺伝子操作による改変のための方法は知られていない。
【００１０】
いくつかの場合において首尾よく利用されてきた遺伝子改変された真菌の産生のための方法は、アグロバクテリウム媒介形質転換である。従って、例えば、以下の生物がアグロバクテリウムによって形質転換されてきた：Saccharomyces cerevisiae（Bundockら、1995, EMBO Journal, 14:3206-3214）、Aspergillus awamori、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Colletotrichum gloeosporioides、Fusarium solani pisi、Neurospora crassa、Trichoderma reesei、Pleurotus ostreatus、Fusarium graminearum（van der Toorrenら、1997, EP 870835）、Agraricus bisporus、Fusarium venenatum（de Grootら、1998, Nature Biotechnol. 16:839-842）、Mycosphaerella graminicola（Zwiersら 2001, Curr. Genet. 39:388-393）、Glarea lozoyensis（Zhangら, 2003, Mol. Gen. Genomics 268:645-655）、Mucor miehei（Monfortら、2003, FEMS Microbiology Lett. 244:101-106）。
【００１１】
特に関心対象のものは相同組換えであり、これは、導入されるDNAと細胞DNAとの間に可能な限り多くの配列相同性を含み、その結果、レシピエント生物のゲノム中で部位特異的な遺伝情報を導入または除去することが可能である。さもなくば、ドナーＤＮＡは、部位特異的でない非正統的組換えまたは非相同的組換えによってレシピエント生物のゲノムに組み込まれる。
【００１２】
アグロバクテリウム媒介形質転換および引き続く導入DNAの相同組換えは、以下の生物について以前に検出されてきた：Aspergillus awamori（Goukaら、1999, Nature Biotech 17:598-601）、Glarea lozoyensis（Zhangら、2003, Mol. Gen. Genomics 268:645-655）、Mycosphaerella graminicola（（Zwiersら、2001, Curr. Genet. 39:388-393）。
【００１３】
真菌を形質転換するための別の公知の方法は、エレクトロポレーションである。Hill, Nucl. Acids. Res. 17:8011は、エレクトロポレーションによる酵母の組み込み形質転換を示した。糸状菌の形質転換はChakabortyおよびKapoor（1990, Nucl. Acids. Res. 18:6737）によって記載されている。
【００１４】
「微粒子銃」法、すなわち、ＤＮＡ負荷した粒子を用いる細胞の衝撃によるＤＮＡの導入は、例えば、Trichoderma harzianumおよびGliocladium virens（Loritoら 1993, Curr. Genet. 24:349-356）において記載されている。
【００１５】
しかし、Blakesleaおよび特にBlakeslea trisporaの特異的遺伝子改変のためにこれらの方法を首尾よく利用することは以前には可能ではなかった。
【００１６】
特異的に遺伝子改変したBlakesleaおよびBlakeslea trisporaを産生する際の特定の困難さは、それらの細胞が、有性細胞および栄養細胞のサイクルのすべての段階において多核性であるという事実である。例えば、Blakeslea trispora株NRRL2456およびNRRL2457の胞子は、胞子あたり平均4.5核を有することが見い出された（MethaおよびCerda-Olmedo, 1995, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42:836-838）。このことの結果として、遺伝子改変は、通常、1個またはいくつかの核のみにおいて存在し、すなわち、細胞はヘテロカリオン性である。
【００１７】
遺伝子改変されたBlakeslea種、特にBlakeslea trisporaが製造のために使用されることが意図される場合、特に遺伝子欠失の場合に、安定かつ高度な合成性能を副生成物を伴わずに可能にするために、遺伝子改変が生産株のすべての核に存在することが重要である。この株は、上記遺伝子改変に関して、結果的にホモカリオン性でなくてはならない。
【００１８】
ホモカリオン性細胞を生成する方法は、Phycomyces blakesleeanusについてのみ記載されてきた（Ronceroら、1984, Mutat. Res. 125:195）。そこに記載される方法に従って、１つの機能的な核のみを有する統計学的に確実な数の細胞を得るために、突然変異誘発物質ＭＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を加えることによって、核が細胞中で除去される。次いで、細胞を、劣性の選択マーカーを有する単核細胞のみが菌糸体中で増殖する選択に供する。これらの選択細胞の子孫は多核性でありかつホモカリオン性である。Phycomyces blakesleanusについての劣性選択マーカーの一例はｄａｒである、ｄａｒ＋株は、ｄａｒ−株とは異なり毒性リボフラビンアナログ５−炭素−５−デアザリボフラビンを吸収する（Delbruckら、1979, Genetics 92:27）。劣性突然変異体は５−炭素−５−デアザリボフラビン（ＤＡＲＦ）を加えることによって選択される。
【００１９】
しかし、この方法は、Blakeslea、特にBlakeslea trisporaについては未知であり、そして特に、形質転換に関して記載されていない。
【発明の開示】
【００２０】
本発明の目的は、Blakeslea株、特にBlakeslea trisporaを遺伝子改変することができる方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、遺伝子改変されたホモカリオン性株を産生することを可能にする方法を提供することである。従って、本発明の更なる目的は、遺伝子改変した細胞を提供することである。
【００２１】
この目的は、Blakeslea属の遺伝子改変された生物を産生する方法によって達成され、この方法は以下の工程を含む：
（ｉ）少なくとも１つの細胞の形質転換、
（ｉｉ）核の１つ以上の遺伝的特徴がすべて同一の様式で改変されており、かつ上記遺伝子改変が細胞中でそれ自体を明示する細胞を産生するための工程（ｉ）で得られた細胞の場合によるホモカリオン転換、
（ｉｉｉ）遺伝子改変された細胞の選択。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の方法は、均一の核を有する細胞の菌糸体をこのやり方で入手するために、Blakeslea菌の多核細胞が特異的かつ安定な様式で遺伝子改変されることを可能にする。この細胞は、好ましくはBlakeslea trispora種の真菌の細胞である。  形質転換は、生物、特に真菌中への遺伝子情報の導入を意味する。これは、上記情報、特にＤＮＡを導入する、当業者に公知の任意の可能な方法、例えば、ＤＮＡ負荷粒子を用いる衝撃、プロトプラストを使用する形質転換、ＤＮＡのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、コンピテント細胞の接合または形質転換、化学物質またはアグロバクテリウムを媒介する形質転換を含むべきである。遺伝子情報は、遺伝子の部分、１つの遺伝子または複数の遺伝子を意味する。遺伝子情報は、例えば、ベクターの補助を伴って、または遊離の核酸(例えば、DNA、RNA)として、および他の任意の様式で細胞に導入され得、そして組換えによって宿主ゲノムに組み込まれるか、または細胞中で遊離の形態で存在するかのいずれかである。本発明において特に好ましいのは相同組換えである。
【００２３】
好ましい形質転換方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）によって媒介される形質転換である。この目的のために、導入されるドナーＤＮＡは、最初に、（ｉ）導入されるＤＮＡに隣接するＴ−ＤＮＡ末端を有し、（ｉｉ）選択マーカーを含み、そして（ｉｉｉ）適切な場合、ドナーＤＮＡの遺伝子発現のためのプロモーターおよびターミネーターを有する、ベクターに挿入される。上記ベクターは、ｖｉｒ遺伝子を含むＴｉプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス株に導入される。ｖｉｒ遺伝子は、BlakesleaにおけるＤＮＡ導入の原因である。この２ベクター系は、アグロバクテリウムからBlakesleaにＤＮＡを導入するために使用される。この目的のために、アグロバクテリウムはアセトシリンゴンの存在下で最初にインキュベートされる。アセトシリンゴンはｖｉｒ遺伝子を誘導する。次いで、Blakeslea trisporaの胞子が、アセトシリンゴン含有培地上でアグロバクテリウム・ツメファシエンスの誘導された細胞と一緒にインキュベートされ、その後、形質転換体、すなわち、遺伝子改変されたBlakeslea株の選択を可能にする培地に移される。
【００２４】
ベクターという用語は、本願において、外来性ＤＮＡをそこに導入し、かつ、適切な場合、細胞中で上記外来性ＤＮＡを増殖させるために使用されるＤＮＡ分子をいうために使用される（Rompp Lexikon Chemie-ＣＤＲＯＭバージョン２．０, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1999の「vector」もまた参照されたい）。本願において、「ベクター」という用語は、この目的に役立つプラスミド、コスミドなどを含むことを意図する。
【００２５】
発現は、本願において、ＤＮＡまたはＲＮＡから開始して遺伝子産物（本発明において好ましくは、カロチノイド）に至る、遺伝子情報の導入を意味し、そして過剰発現という用語を含むこともまた意図する。過剰発現という用語は、形質転換されない細胞（野生型）中ですでに産生されている産物が増加して産生されるような、または全体の細胞含量の大多数の部分を形成するような発現の増加を意味する。
【００２６】
遺伝子改変は、レシピエント生物への遺伝子情報の導入であって、その結果、上記情報が安定な様式で発現され、かつ細胞分裂の間に伝播するものを意味する。次いで、適当な場合には、ホモカリオン転換(すなわち、均一の核のみを含む細胞の産生）が行われ、すなわち、核は同じ遺伝情報の内容を有する。
【００２７】
このホモカリオン転換は、形質転換によって導入される遺伝子情報が劣性である場合、すなわち、それ自体を明示しない場合に、特に必要とされる。しかし、形質転換が優性の遺伝子情報の存在を生じる場合、すなわち、上記情報がそれ自体を明示する場合、ホモカリオン転換が絶対的に必要なわけではない。
【００２８】
ホモカリオン転換は、好ましくは、単核胞子を選択する工程を含む。少ない割合のBlakeslea trispora胞子が本来単核であり、その結果、これらの胞子は、適切な場合、特異的標識後、例えば、細胞核の染色後に選別され得る。これは、好ましくは、単核細胞の低い蛍光に基づいて、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ））を使用して実行される。
【００２９】
代替的には、ホモカリオン転換は、最初に核の数を減少させることによって実行され得る。この目的のために、突然変異誘発物質、特にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）が利用され得る。ＵＶ照射またはＸ線などの高エネルギー照射もまた、核の数を減少させるために使用できる。引き続く選択が、ＦＡＣＳ法または劣性選択マーカーを使用して実行され得る。
【００３０】
選択は、その核が同じ遺伝子情報を含む細胞、すなわち、耐性または生成物の産生もしくは産生の増加などの同じ特性を有する細胞の選択を意味する。選択のために、ＦＡＣＳ法の他に、５−炭素−５−デアザリボフラビン（ｄａｒｆ）およびハイグロマイシン（ｈｙｇ）または５’−フルオロロテート(5'-fluororotate)（ＦＯＡ）およびウラシルを使用することが好ましい。
【００３１】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターは上記ベクターに含まれる遺伝子情報が少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込まれるように設計され得る。この点に関して、細胞中の遺伝子情報は、スイッチが切られ得る。
【００３２】
しかしながら、形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、上記ベクター中に含まれる遺伝子情報が細胞中で発現されるような方法で設計されることもできる。すなわち、対応する野生型において存在しないか、あるいは上記形質転換によって増加または過剰発現される遺伝子情報が導入される。
【００３３】
このベクターは、Blakeslea属の生物の遺伝子改変のためのいかなる遺伝子情報をも含み得る。
【００３４】
「遺伝子情報」とは、好ましくは、Blakeslea属の生物へのその導入がBlakeslea属の生物における遺伝子改変を生じる、すなわち、例えば、開始生物との比較において、酵素活性の増加または減少を引き起こす核酸を意味する。
【００３５】
このベクターは、例えば、カロチノイドおよびそれらの前駆体、リン脂質、トリアシルグリセリド、ステロイド、ワックス、脂溶性ビタミン、プロビタミンならびにコファクターなどの親油性物質を産生するための遺伝子情報、または例えば、タンパク質、アミノ酸、ヌクレオチド、および水溶性ビタミン、プロビタミン、およびコファクターなどの親水性物質を産生するための遺伝子情報を含み得る。
【００３６】
利用されるベクターは、好ましくは、カロチノイドもしくはキサントフィルまたはそれらの前駆体を産生するための遺伝子情報を含む。
【００３７】
このベクターは、好ましくは、カロチノイド生合成酵素が、カロチノイド生合成が起こる細胞内区画中に局在されることを引き起こす遺伝子情報を含む。
【００３８】
アスタキサンチン、ゼアキサンチン、エキネノン、β−クリプトキサンチン、アンドニキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、３−ヒドロキシエキネノンおよび３’−ヒドロキシエキネノン、リコピン、ルテイン、β−カロチン、フィトエン、またはフィトフルエンを産生するための遺伝子情報が特に好ましい。フィトエン、ビキシン、リコピン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、およびアスタキサンチンを産生するための遺伝子情報が非常に特に好ましい。
【００３９】
従って、本発明の好ましい変形は、カロチノイド生合成中間体の合成の速度の増加、およびカロチノイド生合成の最終生成物について結果的に増加した生産性を有する生物を産生および培養することを含む。カロチノイド生合成中間体の合成の速度は、特に、酵素：３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素、イソペンテニルピロホスフェートイソメラーゼ、およびゲラニルピロホスフェートシンターゼの活性を増加させることによって増加する。
【００４０】
従って、本発明の特に好ましい変形は、野生型と比較して、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の増加を有する生物を産生および培養することを含む。
【００４１】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性とは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素）の酵素活性を意味する。
【００４２】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素とは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡをメバロン酸に転換する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００４３】
従って、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性とは、特定の時間内にタンパク質ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素によって、転換された３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡの量または産生されたメバロン酸の量を意味する。
【００４４】
野生型と比較したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の増加の場合には、このようにタンパク質ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素は、野生型と比較して、特定の時間内に、転換された３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡの量または産生されたメバロン酸の量を増加する。
【００４５】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性のこの増加は、好ましくは、野生型のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも３００％、さらにより好ましくは少なくとも５００％、特に少なくとも６００％である。
【００４６】
好ましい実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって、野生型と比較して増加される。
【００４７】
本発明の方法の特に好ましい実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸を含む核酸構築物を生物に導入することによって増加され、上記生物中のその発現は、野生型と比較して、調節が減少されやすい。
【００４８】
野生型と比較した調節の減少とは、上記に規定された野生型との比較において、発現レベルまたはタンパク質レベルで、調節が減少していること、好ましくは調節が存在しないことを意味する。
【００４９】
また、調節の減少は、好ましくは、核酸構築物中のコード配列に機能的に連結され、かつ、野生型プロモーターと比較して、生物における調節の減少の影響を受けやすいプロモーターによって達成され得る。
【００５０】
例えば、Blakeslea trisporaのｐｔｅｆ１プロモーターおよびAspergillus nidulansのｐｇｐｄＡプロモーターは、調節の減少のみの影響を受けやすく、それゆえに特に好ましいプロモーターである。
【００５１】
これらのプロモーターは、Blakeslea trisporaにおいてほぼ構成的発現を示し、その結果、転写調節はもはやカロチノイド生合成の中間体を介しては起こらない。
【００５２】
さらに好ましい実施形態において、上記調節の減少は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸を使用することによって達成され得、上記生物におけるその発現は、上記生物に固有のオーソロガス核酸と比較して、調節の減少を受けやすい。
【００５３】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の触媒領域のみ（末端切断型（ｔ−）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）をコードする核酸を使用することは特に好ましい。調節の原因である膜ドメインは存在しない。従って、使用される核酸は調節の減少を受けやすく、従って、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子発現の増加を生じる。
【００５４】
特に好ましい実施形態において、配列番号７５の配列を含む核酸がBlakeslea trisporaに導入される。
【００５５】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、および従ってまた、触媒領域またはコード遺伝子まで減少したｔ−ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のさらなる例は、例えば、そのゲノム配列が、配列番号７５を用いたデータベースからの配列の相同性比較によって知られている種々の生物から、容易に見い出され得る。
【００５６】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、および従ってまた、触媒領域またはコード遺伝子まで減少したｔ−ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素のさらなる例は、それ自体公知の様式で、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ技術によって、そのゲノム配列が知られていない種々の生物から、例えば配列番号７５の配列から開始してさらに容易に見い出され得る。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、上記調節の減少は、上記生物におけるその発現が上記生物に固有であるオーソロガス核酸と比較して調節の減少を受けやすいＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードする核酸を使用すること、および野生型プロモーターと比較して、上記生物中で調節の減少を受けやすいプロモーターを使用することによって達成される。
【００５８】
従って、本発明の好ましい変形は、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子発現のスイッチを切る、従って、生物によって生成されるフィトエンが単離されることを可能にする形質転換を含む。それゆえに、形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、本発明の１つの実施形態において、フィトエンデサチュラーゼ、特に、配列番号６９を有するBlakeslea trispora ｃａｒＢの遺伝子のフラグメントをコードする配列を好ましくは含む。
【００５９】
従って、本発明の好ましい変形は、形質転換によってスイッチが切られるリコピンシクラーゼ遺伝子発現を含み、従って、生物によって産生されるリコピンが単離されることを可能にする。それゆえに、上記形質転換において利用されるベクターは、本発明の１つの実施形態において、好ましくは、リコピンシクラーゼ遺伝子、特にBlakeslea trisporas ｃａｒＲ(WO 03/027293)のフラグメントをコードする配列を含む。
【００６０】
更に好ましい実施形態において、Blakeslea属の生物は、野生型との比較において遺伝子改変されたヒドロキシラーゼ活性および／またはケトラーゼ活性を有するBlakeslea属の生物によって、例えば、ゼアキサンチンまたはアスタキサンチンなどのキサントフィルを産生することが可能である。
【００６１】
従って、本発明のさらに好ましい変形において、形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、発現後にケトラーゼ活性および／またはヒドロキシラーゼ活性を示し、その結果、生物がゼアキサンチンまたはアスタキサンチンを産生する遺伝子情報を含む。
【００６２】
ケトラーゼ活性とは、ケトラーゼの酵素活性を意味する。
【００６３】
ケトラーゼとは、カロチノイドの場合によって置換されたβ−イオノン環におけるケト基を導入する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００６４】
ケトラーゼとは、特に、β−カロチンをカンタキサンチンに転換する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【００６５】
従って、ケトラーゼ活性とは、特定の時間内にタンパク質ケトラーゼによって転換されるβ−カロチンの量または産生されるカンタキサンチンの量を意味する。
【００６６】
本発明に従って、「野生型」という用語は、Blakeslea属の対応する遺伝子改変されていない開始生物を意味する。
【００６７】
「生物」という用語は、文脈に依存して、Blakeslea属の開始生物（野生型）、またはBlakeslea属の本発明に従う遺伝子改変された生物、または両方を意味し得る。
【００６８】
好ましくは、ケトラーゼ活性を引き起こす「野生型」およびヒドロキシラーゼ活性を引き起こす「野生型」は、各々の場合において参照生物を意味する。
【００６９】
Blakeslea属のこの参照生物は、接合型に関してのみ異なるBlakeslea trispora ATCC 14271またはATCC 14272である。
【００７０】
Blakeslea属の本発明に従う遺伝子改変された生物、および野生型または参照生物におけるケトラーゼ活性は、好ましくは以下の条件下で決定される。
【００７１】
Blakeslea属の生物におけるケトラーゼ活性は、Fraserら（J. Biol. Chem. 272(10): 6128-6135, 1997）の方法に従って決定される。抽出物中のケトラーゼ活性は、脂質（ダイズレシチン）および界面活性剤（コール酸ナトリウム）の存在下で基質β−カロチンおよびカンタキサンチンを使用して決定される。ケトラーゼアッセイの基質対生成物の比はＨＰＬＣによって決定される。
【００７２】
この好ましい実施形態において、Blakeslea属の本発明に従う遺伝子改変された生物は、遺伝子改変されていない野生型と比較して、ケトラーゼ活性を有し、従って、トランスジェニック的にケトラーゼを発現することが可能であることが好ましい。
【００７３】
さらに好ましい実施形態において、Blakeslea属の生物におけるケトラーゼ活性は、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現によって引き起こされる。
【００７４】
この好ましい実施形態において、ケトラーゼをコードする核酸の遺伝子発現は、ケトラーゼをコードする核酸をBlakeslea属の開始生物に導入することによって引き起こされることが好ましい。
【００７５】
この目的のために、原理的に、任意のケトラーゼ遺伝子、すなわち、ケトラーゼをコードする任意の核酸を使用することが可能である。
【００７６】
本明細書中で言及される任意の核酸とは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡの配列であり得る。
【００７７】
イントロンを含む、真核生物供給源からのゲノムケトラーゼ配列の場合において、Blakeslea属の宿主生物が対応するケトラーゼを発現できないか、または発現するように作製されることができない場合、対応するｃＤＮＡなどのすでにプロセシングされた核酸配列を使用することが好ましい。
【００７８】
本発明の方法において使用できる、ケトラーゼをコードする核酸および対応するケトラーゼの例は、例えば、以下からの配列である：
Haematoccus pluvialis、特にHaematoccus pluvialis Flotow em. Wille由来（アクセッション番号:X86782;核酸：配列番号１１、タンパク質：配列番号１２）、
Haematoccus pluvialis、NIES-144(アクセッション番号：D45881；核酸：配列番号１３、タンパク質：配列番号１４）、
Agrobacterium aurantiacum（アクセッション番号：D58420；核酸：配列番号１５、タンパク質：配列番号１６）、
Alicaligenes種（アクセッション番号：D58422；核酸：配列番号１７、タンパク質：配列番号１８）、
Paracoccus marcusii（アクセッション番号：Y15112；核酸：配列番号１９、タンパク質：配列番号２０）、
Synechocystis種PC6803株（アクセッション番号：NP442491；核酸：配列番号２１、タンパク質：配列番号２２）、
Bradyrhizobium種（アクセッション番号：AF218415；核酸：配列番号２３、タンパク質：配列番号２４）、
Nostoc種PCC7120株（アクセッション番号：AP003592, BAB74888；核酸：配列番号２５、タンパク質：配列番号２６）、
Nostoc punctiforme ATTC 29133、核酸：アクセッション番号NZ_AABC01000195、塩基対55,604〜55,392（配列番号２７）；タンパク質；アクセッション番号ZP_00111258（配列番号２８）（推定タンパク質と注記される）、または
Nostoc punctiforme ATTC 29133、核酸：アクセッション番号NZ_AABC01000196、塩基対140,571〜139,810（配列番号２９）、タンパク質：（配列番号３０）（注記なし）。
【００７９】
本発明のプロセスにおいて使用できる、ケトラーゼおよびケトラーゼ遺伝子のさらなる天然の例は、例えば、そのゲノム配列が、以前に記載された配列の同一性を有し、ならびに特に配列番号１２および／または２６および／または３０の配列の同一性を有する、データベースからのアミノ酸配列または対応する逆翻訳された核酸配列の同一性を比較することによって公知である種々の生物から容易に見い出され得る。
【００８０】
ケトラーゼおよびケトラーゼ遺伝子のさらなる天然の例は、以前に記載された核酸配列、特に、配列番号１２および／または２６および／または３０の配列から開始して、それ自体公知である様式でハイブリダイゼーション技術を使用して、そのゲノム配列が未知である種々の生物からさらに容易に見い出され得る。
【００８１】
ハイブリダイゼーションは、穏やかな（低ストリンジェンシー）条件下で、または好ましくは、ストリンジェントな（高ストリンジェンシー）条件下で実行され得る。
【００８２】
これらの型のハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57頁またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００８３】
例えば、洗浄工程の間の条件は、低ストリンジェンシー条件（５０℃で２×ＳＳＣを用いる）および高ストリンジェンシー条件（５０℃、好ましくは６５℃で０．２×ＳＳＣを用いる）（２０×ＳＳＣ：０．３Ｍクエン酸ナトリウム、３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）によって限定される条件範囲から選択され得る。
【００８４】
さらなる可能性は、洗浄工程の間に、室温、２２℃での穏やかな条件を、６５℃でのストリンジェントな条件まで、温度を上昇させることである。
【００８５】
塩濃度と温度の両方のパラメーターが同時変化され得、そして２つのパラメーターのうちの１つを一定に保ち、他の一方のみを変化させることもまた可能である。ハイブリダイゼーションの間に、例えばホルムアミドまたはＳＤＳなどの変性剤を利用することもまた可能である。５０％ホルムアミドの存在下でのハイブリダイゼーションは、４２℃で好ましく実行される。
【００８６】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程のための条件のいくつかの例が以下に示される：
（１）例えば、以下を用いるハイブリダイゼーション条件
（ｉ）６５℃で４×ＳＳＣ、または
（ｉｉ）４５℃で６×ＳＳＣ、または
（ｉｉｉ）６８℃で６×ＳＳＣ、１００ｍｇ／ｍｌ変性魚精子ＤＮＡ、または
（ｉｖ）６８℃で６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、または
（ｖ）４２℃で６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ変性フラグメント化サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、または
（ｖｉ）４２℃で５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、または
（ｖｉｉ）４２℃で５０％（容量／容量）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルポリピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、または
（ｖｉｉｉ）５０℃で２×または４×ＳＳＣ（穏やかな条件）、または
（ｉｘ）４２℃で３０〜４０％ホルムアミド、２×または４×ＳＳＣ（穏やかな条件）。
【００８７】
（２）例えば、各々以下を用いる１０分間の洗浄工程：
（ｉ）５０℃で０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ、または
（ｉｉ）６５℃で０．１×ＳＳＣ、または
（ｉｉｉ）６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、または
（ｉｖ）４２℃で０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、または
（ｖ）４２℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、または
（ｖｉ）６５℃で２×ＳＳＣ（穏やかな条件）。
【００８８】
Blakeslea属の本発明に従う遺伝子改変された生物の好ましい実施形態において、配列番号１２のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によりこの配列に由来し、かつ、配列番号１２の配列とアミノ酸レベルで少なくとも２０％の同一性、優先的には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９０％の同一性、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつケトラーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸が導入される。
【００８９】
このことに関連して、ケトラーゼ配列が、他の生物からの配列の同一性比較によって上記に記載されるように見い出され得る天然のものであること、またはケトラーゼ配列が、人工的な変異、例えば、アミノ酸の置換、挿入、または欠失によって配列番号１２の配列から開始して改変された人工的なものであることが可能である。
【００９０】
さらに、本発明の方法の好ましい実施形態は、配列番号２６のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこの配列に由来し、かつ、配列番号２６の配列とアミノ酸レベルで少なくとも２０％の同一性、優先的には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９０％の同一性、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつケトラーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸を導入する工程を包含する。
【００９１】
このことに関連して、ケトラーゼ配列が、他の生物からの配列の同一性比較によって上記に記載されるように見い出され得る天然のものであること、またはケトラーゼ配列が、人工的な変異、例えば、アミノ酸の置換、挿入、または欠失によって配列番号２６の配列から開始して改変された人工的なものであることが可能である。
【００９２】
さらに、本発明の方法の好ましい実施形態は、配列番号３０のアミノ酸配列、またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこの配列に由来し、かつ、配列番号３０の配列とアミノ酸レベルで少なくとも２０％の同一性、優先的には少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％の同一性、特に９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつケトラーゼの酵素特性を有する配列を含むタンパク質をコードする核酸を導入する工程を包含する。
【００９３】
このことに関連して、ケトラーゼ配列が、他の生物からの配列の同一性比較によって上記に記載されるように見い出され得る天然のものであること、またはケトラーゼ配列が、人工的な変異、例えば、アミノ酸の置換、挿入、または欠失によって配列番号３０の配列から開始して改変された人工的なものであることが可能である。
【００９４】
「置換」という用語は、本明細書中では、１つ以上のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換を意味する。置き換えられたアミノ酸がもとのアミノ酸と同様の特性を有する「保存性置換」（例えば、ＡｓｐによるＧｌｕの置換、ＡｓｎによるＧｌｎの置換、ＩｌｅによるＶａｌの置換、ＩｌｅによるＬｅｕの置換、ＴｈｒによるＳｅｒの置換）を実行することが好ましい。
【００９５】
欠失は直接的結合によるアミノ酸の置き換えである。欠失のための好ましい位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の結合部である。
【００９６】
挿入は、１つ以上のアミノ酸による直接的結合の形式的な置き換えを伴う、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の挿入である。
【００９７】
２つのタンパク質間の同一性とは、各タンパク質の全体の長さにわたるアミノ酸の同一性を意味し、特に、以下のパラメーターを設定して、Clustal法（Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1）を使用して、DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin（USA）からのLasergeneソフトウエアを用いる比較によって計算される同一性を意味する：
複数アラインメントパラメーター：
ギャップペナルティー    １０
ギャップ長ペナルティー  １０
ペアワイズアラインメントパラメーター：
Ｋ−タプル              １
ギャップペナルティー    ３
ウィンドウ              ５
保存対角                ５。
【００９８】
従って、配列番号１２または２６または３０の配列とアミノ酸レベルで少なくとも２０％の同一性を有するタンパク質は、配列番号１２または２６または３０の配列とのその配列の比較において、特に上記のパラメーターのセットを用いるプログラムのロガリズム（ｌｏｇａｒｉｔｈｍ）を使用して、少なくとも２０％の同一性、好ましくは８０％、８５％、特に９０％の同一性、特に９５％の同一性を有するタンパク質を意味する。
【００９９】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝コードに従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって得られうる。
【０１００】
この目的のために好適に使用されるコドンは、Blakeslea特異的なコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンである。コドン使用頻度は、Blakeslea属の生物の他の公知の遺伝子のコンピュータ分析によって容易に見い出され得る。
【０１０１】
特に好ましい実施形態において、配列番号１１の配列を含む核酸が上記属の生物に導入される。
【０１０２】
特に好ましい実施形態において、配列番号２５の配列を含む核酸が上記属の生物に導入される。
【０１０３】
特に好ましい実施形態において、配列番号２９の配列を含む核酸が上記属の生物に導入される。
【０１０４】
上述のすべてのケトラーゼ遺伝子は、それ自体公知の様式で、ヌクレオチドビルディングブロックからの化学合成によって、例えば、二重ヘリックスの個々の重複する相補性核酸ビルディングブロックのフラグメント縮合によって、さらに調製され得る。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Voet, Voet, 第２版, Wiley Press NewYork, 896-897頁）によって公知の様式において可能である。合成オリゴヌクレオチドの付加ならびにＤＮＡポリメラーゼのクレナウフラグメントおよびライゲーション反応の補助を伴ってギャップを埋めること、ならびに一般的なクローニング方法もまた、Sambrookら（1989）, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【０１０５】
それゆえに、形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、本発明の１つの実施形態において、ケトラーゼ、特に配列番号７２を有するNostoc punctiformeケトラーゼをコードする配列を好ましく含む。
【０１０６】
ヒドロキシラーゼ活性とは、ヒドロキシラーゼの酵素活性を意味する。
【０１０７】
ヒドロキシラーゼとは、場合によって置換された、カロチノイドのβ−イオノン環上のヒドロキシル基を導入する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【０１０８】
特に、ヒドロキシラーゼとは、β−カロチンをゼアキサンチンにまたはカンタキサンチンをアスタキサンチンに転換する酵素活性を有するタンパク質を意味する。
【０１０９】
従って、ヒドロキシラーゼ活性は、特定の時間内にヒドロキシラーゼタンパク質によって、転換されるβ−カロチンまたはカンタキサンチンの量、または産生されるゼアキサンチンまたはアスタキサンチンの量を意味する。
【０１１０】
従って、ヒドロキシラーゼ活性が野生型と比較して増加される場合、特定の時間内にヒドロキシラーゼタンパク質によって転換されるβ−カロチンまたはカンタキサンチンの量、または産生されるゼアキサンチンまたはアスタキサンチンの量は、野生型と比較して増加される。
【０１１１】
ヒドロキシラーゼ活性のこの増加は、好ましくは、野生型のヒドロキシラーゼ活性の少なくとも５％、さらに好ましくは少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも３００％、なおより好ましくは少なくとも５００％、特に少なくとも６００％である。
【０１１２】
本発明の遺伝子改変した生物ならびに野生型および参照生物におけるヒドロキシラーゼ活性は、以下の条件下で好ましく決定される。
【０１１３】
ヒドロキシラーゼ活性は、Bouvierら（Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328）の方法によってインビトロで決定される。フェレドキシン、フェレドキシン−ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ケタラーゼ、ＮＡＤＰＨおよびβ−カロチンが、モノガラクトシルグリセリドおよびジガラクトシルグリセリドとともに、所定の量の生物抽出物に加えられる。
【０１１４】
ヒドロキシラーゼ活性は、Bouvier, Keller, d'HarlingueおよびCamara（Xanthophyll biosynthesis: molecular and functional characterization of carotenoid hydroxylases from pepper fruits (Capsicum annuum L.; Biochim. Biophys. Acta 1391 (1998), 320-328）の以下の条件下で特に好ましく決定される。
【０１１５】
インビトロアッセイは、０．２５０ｍｌの容量で実行される。混合物は以下を含む：５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、０．０２５ｍｇのホウレンソウフェレドキシン、０．５単位のホウレンソウフェレドキシン−ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ、０．２５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、０．０１０ｍｇのβ−カロチン（０．１ｍｇのＴｗｅｅｎ８０中で乳化）、０．０５ｍＭのモノガラクトシルグリセリドおよびジガラクトシルグリセリドの混合物（１：１）、１単位の触媒、２００のモノガラクトシルグリセリドおよびジガラクトシルグリセリド（１：１）、０．２ｍｇのウシ血清アルブミンおよび種々の量の生物抽出物。反応混合物は３０℃で２時間インキュベートする。反応生成物は、THF、アセトンまたはクロロホルム／メタノール（２：１）などの有機溶媒で抽出し、ＨＰＬＣによって測定する。
【０１１６】
ヒドロキシラーゼ活性は、Bouvier, d'HarlingueおよびCamara（Molecular Analysis of carotenoid cyclae inhibition; Arch. Biochem. Biophys. 346(1) (1997) 53-64）の以下の条件下で特に好ましく決定される。
【０１１７】
インビトロアッセイは、２５０μｌの容量で実行される。混合物は以下を含む：５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、種々の量の生物抽出物、２０ｎＭリコピン、２５０μｇのパプリカ有色体ストロマタンパク質、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨおよび１ｍＭ  ＡＴＰ。ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨおよびＡＴＰはインキュベーション媒体への添加の直前に１ｍｇのＴｗｅｅｎ８０とともに１０ｍｌのエタノール中に溶解する。６０分、３０℃での反応時間後、反応はクロロホルム／メタノール（２：１）の添加により停止される。クロロホルム中に抽出された反応生成物は、ＨＰＬＣによって分析される。
【０１１８】
放射活性基質を用いる代替的なアッセイは、FraserおよびSandmann（Biochem. Biophys. Res. Comm. 185(1) (1992) 9-15）において記載されている。
【０１１９】
ヒドロキシラーゼ活性は種々の方法において、例えば、発現およびタンパク質レベルにおける阻害性調節メカニズムのスイッチを切ること、または野生型と比較して、ヒドロキシラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させることによって、増加され得る。
【０１２０】
ヒドロキシラーゼをコードする核酸の遺伝子発現は、種々の方法において、例えば、アクチベーターによってヒドロキシラーゼ遺伝子を誘導すること、または１つ以上のヒドロキシラーゼ遺伝子コピーを導入することによって、すなわち、Blakeslea属の生物にヒドロキシラーゼをコードする少なくとも１つの核酸を導入することによって、野生型と比較して、同様に増加され得る。
【０１２１】
好ましい実施形態において、ヒドロキシラーゼをコードする核酸の遺伝子発現は、Blakeslea属の生物にヒドロキシラーゼをコードする少なくとも１つの核酸を導入することによって増加される。
【０１２２】
この目的のために、原理的には任意のヒドロキシラーゼ遺伝子、すなわち、ヒドロキシラーゼをコードする任意の核酸を使用することが可能である。
【０１２３】
イントロンを含む真核生物供給源からのゲノムヒドロキシラーゼ配列の場合、宿主生物が対応するヒドロキシラーゼを発現できないか、または発現するように作製されることができないならば、対応するｃＤＮＡなどのすでにプロセシングされた核酸配列を使用することが好ましい。
【０１２４】
ヒドロキシラーゼ遺伝子の１つの例は、アクセッション番号AX038729を有するHaematococcus pluvialisヒドロキシラーゼをコードする核酸(WO 0061764；核酸：配列番号３１、タンパク質：配列番号３２）、Erwinia uredovora 20D3ヒドロキシラーゼ（ATCC 19321、アクセッション番号D90087；核酸：配列番号３３、タンパク質：配列番号３４）または配列番号７６の配列によってコードされるThermus thermophilusヒドロキシラーゼ（DE 102 34 126.5）由来である。
【０１２５】
更なるヒドロキシラーゼは、以下のアクセッション番号を有する核酸によってコードされる：
｜ｅｍｂ｜ＣＡＢ５５６２６．１、ＣＡＡ７０４２７．１、ＣＡＡ７０８８８．１、ＣＡＢ５５６２５．１、ＡＦ４９９１０８＿１、ＡＦ３１５２８９＿１、ＡＦ２９６１５８＿１、ＡＡＣ４９４４３．１、ＮＰ＿１９４３００．１、ＮＰ＿２０００７０．１、ＡＡＧ１０４３０．１、ＣＡＣ０６７１２．１、ＡＡＭ８８６１９．１、ＣＡＣ９５１３０．１、ＡＡＬ８０００６．１、ＡＦ１６２２７６＿１、ＡＡＯ５３２９５．１、ＡＡＮ８５６０１．１、ＣＲＴＺ＿ＥＲＷＨＥ、ＣＲＴＺ＿ＰＡＮＡＮ、ＢＡＢ７９６０５．１、ＣＲＴＺ＿ＡＬＣＳＰ、ＣＲＴＺ＿ＡＧＲＡＵ、ＣＡＢ５６０６０．１、ＺＰ＿０００９４８３６．１、ＡＡＣ４４８５２．１、ＢＡＣ７７６７０．１、ＮＰ＿７４５３８９．１、ＮＰ＿３４４２２５．１、ＮＰ＿８４９４９０．１、ＺＰ＿０００８７０１９．１、ＮＰ＿５０３０７２．１、ＮＰ＿８５２０１２．１、ＮＰ＿１１５９２９．１、ＺＰ＿０００１３２５５．１。
【０１２６】
従って、この好ましい実施形態において、少なくとも１つのヒドロキシラーゼ遺伝子が、野生型と比較して、Blakeslea属の本発明に従う好ましいトランスジェニック生物中に存在する。
【０１２７】
この好ましい実施形態において、遺伝子改変された生物は、例えば、ヒドロキシラーゼをコードする少なくとも１つの外因性核酸を有する。
【０１２８】
上記の好ましい実施形態において、ヒドロキシラーゼ遺伝子として、配列番号３２、２４のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、もしくは配列番号７６の配列によってコードされるタンパク質をコードする核酸、またはアミノ酸の置換、挿入、もしくは欠失によってこの配列に派生し、かつ配列番号３２、３４の配列、もしくは配列番号７６を有する配列によってコードされる配列に対して、アミノ酸レベルで、少なくとも３０％の同一性、好ましくは少なくとも５０％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％の同一性、なおより好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性、特に、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有し、かつヒドロキシラーゼの酵素的特性を有する配列を使用することが好ましい。
【０１２９】
ヒドロキシラーゼおよびヒドロキシラーゼ遺伝子のさらなる例は、例えば、上記のように、そのゲノム配列が知られている種々の生物から、配列番号３１、３３、または７６との、データベースからのアミノ酸配列または対応する逆翻訳された核酸配列の相同性比較によって、容易に見い出され得る。
【０１３０】
ヒドロキシラーゼおよびヒドロキシラーゼ遺伝子のさらなる例は、それ自体公知の様式で、例えば、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ技術によって、上記のように、そのゲノム配列が知られていない種々の生物から、配列番号３１、３３、または７６の配列から開始してさらに容易に見い出され得る。
【０１３１】
さらに特に好ましい実施形態において、配列番号３２、３４の配列のヒドロキシラーゼのアミノ酸配列、または配列番号７６の配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸は、ヒドロキシラーゼ活性を増加するために生物に導入される。
【０１３２】
適切な核酸配列は、例えば、遺伝コードに従ってポリペプチド配列の逆翻訳によって得られうる。
【０１３３】
この目的のために、生物特異的なコドン使用頻度に従って頻繁に使用されるコドンを使用することが好ましい。この使用頻度は、問題の生物の他の公知の遺伝子のコンピュータ分析に基づいて容易に決定されうる。
【０１３４】
特に好ましい実施形態において、配列番号３１、３３、または７６の配列を含む核酸が生物に導入される。
【０１３５】
上述のすべてのヒドロキシラーゼ遺伝子は、それ自体公知の様式で、ヌクレオチドビルディングブロックからの化学合成によって、例えば、二重ヘリックスの個々の重複する相補性核酸ビルディングブロックのフラグメント縮合によって、さらに調製され得る。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Voet, 第２版, Wiley Press NewYork, 896-897頁）によって公知の様式において可能である。合成オリゴヌクレオチドの付加ならびにＤＮＡポリメラーゼのクレナウフラグメントおよびライゲーション反応の補助を伴ってギャップを埋めること、ならびに一般的なクローニング方法もまた、Sambrookら（1989）, Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載される。
【０１３６】
それゆえに、形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、本発明の更なる実施形態において、ヒドロキシラーゼ、特に配列番号７０を有するHaematococcus pluvialisヒドロキシラーゼをコードする配列、または配列番号７１を有するErwinia uredovaヒドロキシラーゼ、または配列番号７６の配列によってコードされるThermus thermophilusヒドロキシラーゼをコードする配列を好ましく含む。
【０１３７】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、好ましくはまた、発現を制御および支持する領域、特にプロモーターおよびターミネーターを含む。
【０１３８】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、好ましくはｇｐｄプロモーターおよび／またはｐｔｅｆ１プロモーターおよび／またはｔｒｐＣターミネーターを含み、これらのすべてがBlakesleaの形質転換において特に、成功することが判明した。発現および転写を制御するための当業者によく知られている「逆方向反復」（IR, Rompp Lexikon der Biotechnologie 1992, Thieme Verlag Stuttgart, 407頁「Inverse repetitive sequences」）の使用もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１３９】
ベクター中で利用されるｇｐｄプロモーターは、有利には、配列番号１の配列を有する。ベクター中で利用されるｔｒｐＣターミネーターは、有利には、配列番号２の配列を有する。ベクター中で利用されるｐｔｅｆ１プロモーターは、有利には、配列番号３５の配列を有する。
【０１４０】
本発明において、特にAspergillus nidulans由来のｇｐｄプロモーターおよびｔｒｐＣターミネーターおよびBlakeslea trispora由来のｐｔｅｆ１プロモーターを使用することが好ましい。
【０１４１】
形質転換（ｉ）において利用されるベクターは、特に耐性遺伝子を含む。後者は、好ましくはハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、特に大腸菌由来のものである。この耐性遺伝子は、形質転換の検出および細胞の選択に特に適切であることが判明している。
【０１４２】
このようなｈｐｈのために利用される好ましいプロモーターはｐ−ｇｐｄＡであり、これはAspergillus nidulansのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのコード領域のプロモーターである。ｈｐｈのために好ましく利用されるターミネーターはｔ−ｔｒｐＣであり、これは、Aspergillus nidulansアントラニル酸シンターゼ成分をコードするｔｒｐＣ遺伝子のターミネーターである。
【０１４３】
ｐＢｉｎＡＨｙｇベクターの誘導体は、特に適切なベクターであることが判明した。従って、形質転換のために利用されるこのベクターは、好ましくは配列番号３を含む。所望されるカロチノイドまたはその前駆体に依存して、上記のように、ヒドロキシラーゼ、ケトラーゼ、フィトエンデサチュラーゼなどをコードする配列がこのベクターに加えられるだろう。従って、本発明の１つの実施形態において、このベクターは、上記フィトエンデサチュラーゼをコードする配列番号６９の配列を含む。本発明のさらなる実施形態において、このベクターはまた、ケトラーゼをコードする配列番号７２の配列を含む。本発明のさらなる実施形態において、このベクターはさらに、ヒドロキシラーゼをコードする配列番号７０または７１または７６の配列を含む。上述の配列の対応する組み合わせもまた、本発明の範囲内にある。従って、１つの実施形態において、このベクターは、ケトラーゼをコードする配列番号７２の配列と、ヒドロキシラーゼをコードする配列番号７０または７１または７６の配列の両方を含み、従って、アスタキサンチンが産生されることを可能にする。
【０１４４】
特に、本発明の範囲内で、配列番号３７〜５１および６２からなる群から選択されるベクターを使用することが可能である。
【０１４５】
本発明の方法によれば、遺伝子改変されたBlakeslea生物、特に遺伝子改変されたBlakeslea trispora種またはそれらによって形成される菌糸体を得ることができる。
【０１４６】
遺伝子改変された生物は、カロチノイド、キサントフィル、またはそれらの前駆体、特にフィトエン、ビキシン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、およびカンタキサンチンを産生するために使用できる。適当な遺伝子情報を導入することにより、野生型中には天然には存在しない新規なカロチノイドが、特異的に遺伝子改変された細胞によって、またはそれらによって形成した菌糸体によって生成され、引き続いて単離されることもまた可能である。
【０１４７】
特異的に遺伝子改変された細胞またはそれによって形成した菌糸体を使用して、カロチノイドまたはそれらの前駆体を入手することが好ましい。
【０１４８】
遺伝子改変が、見い出された接合型（Blakeslea trisporaについては、（＋）または（−））の一方の細胞においてのみ実行される場合、対応する他方、改変されていない接合型が培養に加えられる。なぜなら、この方法において、第２の、改変されていない接合型によって放出される物質（例えば、トリスポリック酸）のおかげで、カロチノイドまたはそれらの前駆体の良好な産生を達成することが可能であるからである。しかし、有利には、遺伝子改変は、両方の接合型の細胞において実行され、次いでこれらは一緒に培養され、それによって特に良好な増殖およびカロチノイドまたはそれらの前駆体の最適な産生を達成する。トリスポリック酸の（人工的な）添加は可能でありかつ有用である。
【０１４９】
トリスポリック酸は、BlakesleaなどのMucorales真菌中の性ホルモンであり、これは接合胞子の形成およびβ−カロチンの産生を刺激する（van den Ende 1968, J. Bacteriol. 96:1298-1303, Austinら、1969, Nature 223:1178-1179, Reschke Tetrahedron Lett. 29:3435-3439, van den Ende 1970, J. Bacteriol. 101:423-428）。
【実施例】
【０１５０】
材料および方法
分子遺伝学研究を、他に記載しない限り、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons）における方法によって実行した。
【０１５１】
株および増殖条件
Blakeslea trispora株ATCC 14271（接合型（＋））およびATCC 14272（接合型（−））をアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手した。B. trisporaをＭＥＰ培地（麦芽エキス−ペプトン培地：３０ｇ／ｌ  麦芽抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、３ｇ／ｌペプトン（Ｓｏｙｔｏｎｅ，Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／ｌ寒天、ｐＨ５．５に設定、Ｈ２Ｏで１０００ｍｌに調整（２８℃））中で増殖させた。
【０１５２】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス LBA4404をHoekemaら（1983, Nature 303:179-180）に従って、２８℃で２４時間、アグロバクテリア最少培地（ＡＭＭ）：１０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  グルコース、ＭＭ塩（２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、７００μＭ  ＣａＣｌ２、９μＭ  ＦｅＳＯ４、４ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４）中で増殖させた。
【０１５３】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換
プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇをアグロバクテリア株LBA 4404にエレクトロポレーションした（Hoekemaら, 1983, Nature 303:179-180）（MozoおよびHooykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16:917-918）。以下の抗生物質を、アグロバクテリア増殖の間に選択のために使用した：リファンピシン５０ｍｇ／ｌ（A.ツメファシエンス染色体についての選択）、ストレプトマイシン３０ｍｇ／ｌ（ヘルパープラスミドについての選択）、およびカナマイシン１００ｍｇ／ｌ（バイナリーベクターについての選択）。
【０１５４】
Blakeslea trisporaの形質転換
ＡＭＭにおける増殖の２４時間後、アグロバクテリアを、誘導培地（ＩＭ：ＭＭ塩、４０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ５．６）、５ｍＭ  グルコース、２ｍＭ  ホスフェート、０．５％  グリセロール、２００μＭアセトシリンゴン）中で０．１５のＯＤ６００まで形質転換のために希釈して、再度約０．６のＯＤ６００まで、ＩＭで一晩増殖させた。
【０１５５】
Blakeslea ATCC 14271またはATCC14272およびアグロバクテリウムの同時インキュベーションのために、１００μｌのアグロバクテリア懸濁物を、１００μｌのBlakeslea胞子懸濁物（１０７胞子／ｍｌ、０．９％ＮａＣｌ中）と混合し、滅菌様式でＩＭ−アガロースプレート（ＩＭ＋１８ｇ／ｌ寒天）上のナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に分注した。２６℃で３日間のインキュベーション後、メンブレンをＭＥＰ−寒天プレート（３０ｇ／ｌ麦芽抽出物、３ｇ／ｌペプトン、ｐＨ  ５．５、１８ｇ／ｌ寒天）に移した。形質転換したBlakeslea細胞を選択するために、培地は１００ｍｇ／ｌの濃度でハイグロマイシンを含み、そしてアグロバクテリアに対して選択するために、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムを含んだ。インキュベーションを２６℃で約７日間実行した。これに続いて、菌糸体を新鮮な選択プレートに移すことを行った。得られた胞子を０．９％ＮａＣｌですすぎ、そしてＣＭ１７−１寒天（３ｇ／ｌ  グルコース、２００ｍｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン、５０ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２５μｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌ  酵母抽出物、１００ｍｇ／ｌ  デオキシコール酸ナトリウム、１００ｍｇ／Ｌ  ハイグロマイシン、１００ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム、ｐＨ  ５．５、１８ｇ／ｌ寒天）上にプレーティングした。個々の遺伝子改変された胞子を、それらを選択培地上に個々に配置することによって、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＦＡＣＳ装置（モデルＶａｎｔａｇｅ＋Ｄｉｖａオプション）を使用して単離した。
【０１５６】
アグロバクテリウム媒介形質転換による遺伝子改変されたBlakeslea trisporaの調製
組換えプラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇの調製
ｇｐｄＡ−ｈｐｈ−ｔｒｐＣ−カセットを、プラスミドｐＡＮｓＣｏｓ１（図１、Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26:87-90, 配列番号４）からのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したバイナリープラスミドｐＢｉｎ１９（Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721）にライゲーションした。この方法で得られたベクターはｐＢｉｎＡＨｙｇと呼ばれ（図２、配列番号３）、ｇｐｄプロモーター（配列番号１）の制御下に大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）、ならびにAspergillus nidulans由来のｔｒｐＣターミネーター（配列番号２）およびアグロバクテリウムＤＮＡ導入のために必要である対応するボーダー配列を含んだ。本明細書中以下に記載される例示的な実施形態において言及されるベクターは、ｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体である。
【０１５７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスへのｐＢｉｎＡＨｙｇおよびｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体の導入
ｐＢｉｎＡＨｙｇプラスミドのアグロバクテリアへの導入は以下の実施例によって記載されている。この誘導体は類似の様式で導入された。
【０１５８】
プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇを、アグロバクテリア株ＬＢＡ  ４４０４にエレクトロポレーションした（Hoekemaら、1983, Nature 303:179-180）（MozoおよびHooykaas, 1991, Plant Mol. Biol. 16:917-918）。以下の抗生物質を、アグロバクテリア増殖の間に選択のために使用した：リファンピシン５０ｍｇ／ｌ（A.ツメファシエンス染色体についての選択）、ストレプトマイシン３０ｍｇ／ｌ（ヘルパープラスミドについての選択）、およびカナマイシン１００ｍｇ／ｌ（バイナリーベクターについての選択）。
【０１５９】
Blakeslea trisporaへのｐＢｉｎＡＨｙｇおよびｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体の導入
ＡＭＭにおける増殖の２４時間後、アグロバクテリアを、誘導培地（ＩＭ：ＭＭ塩、４０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ  ５．６）、５ｍＭ  グルコース、２ｍＭ  ホスフェート、０．５％  グリセロール、２００μＭアセトシリンゴン）中で０．１５のＯＤ６６０まで形質転換のために希釈し、再度約０．６のＯＤ６６０まで、ＩＭで一晩増殖させた。
【０１６０】
Blakeslea trispora（Ｂ．ｔ．）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔ．）の同時インキュベーションのために、１００μｌのアグロバクテリア懸濁物を、１００μｌのBlakeslea胞子懸濁物（１０７胞子／ｍｌ、０．９％ＮａＣｌ中）と混合し、滅菌様式でＩＭ−アガロースプレート（ＩＭ＋１８ｇ／ｌ寒天）上のナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に分注した。２６℃で３日間のインキュベーション後、メンブレンをＭＥＰ−寒天プレート（３０ｇ／ｌ麦芽抽出物、３ｇ／ｌペプトン、ｐＨ  ５．５、１８ｇ／ｌ寒天）に移した。
【０１６１】
形質転換したBlakeslea細胞を選択するために、培地は１００ｍｇ／ｌの濃度でハイグロマイシンを含み、そしてアグロバクテリアに対して選択するために、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムを含んだ。インキュベーションを２６℃で約７日間実行した。これに続いて、菌糸体を新鮮な選択プレートに移すことを行った。得られた胞子を０．９％ＮａＣｌですすぎ、そしてＣＭ１７−１寒天（３ｇ／ｌ  グルコース、２００ｍｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン、５０ｍｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、１５０ｍｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２５μｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、１００ｍｇ／ｌ  酵母抽出物、１００ｍｇ／ｌ  デオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ  ５．５、１００ｍｇ／ｌ  セフォタキシム、１００ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシン、１８ｇ／ｌ寒天）上にプレーティングした。新鮮な選択プレートへの胞子の移動を３回反復した。このようにして、形質転換体Blakeslea trispora  ＧＭＯ  ３００５を単離した。代替的には、胞子を個々に１００ｍｇ／Ｌ  セフォタキシム、１００ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンを含むＣＭ−１７寒天に適用することによって、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅ＋Ｄｉｖａ  Ｏｐｔｉｏｎによって、ＧＭＯ（遺伝子改変生物）を選択した。この場合において、真菌の菌糸体は、胞子が遺伝子改変された場合のみに形成した。
【０１６２】
Blakeslea trisporaにおけるｐＢｉｎＡＨｙｇおよびｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体の導入に起因する遺伝子改変の検出
導入の検出が、Blakeslea trisporaにおけるｐＢｉｎＡＨｙｇについて、以下の実施例によって記載されている。
【０１６３】
誘導体の導入の検出は、同様の様式で実行された。
【０１６４】
２００ｍｌのＭＥＰ培地（３０ｇ／ｌ  麦芽抽出物、３ｇ／ｌ  ペプトン、ｐＨ  ５．５）に、１０５〜１０７個の胞子のBlakeslea trispora  ＧＭＯ  ３００５形質転換体を接種し、ロータリーシェーカー上で２００ｒｐｍおよび２６℃で、７日間インキュベートした。成功した形質転換を検出するために、ＤＮＡを菌糸体から単離し（Ｐｅｑｌａｂ  Ｆｕｎｇａｌ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット）、ＰＣＲ（プログラム：９４℃で１分間、次いで、１分間９４℃、１分間５８℃、１分間７２℃の３０サイクル）において使用した。
【０１６５】
プライマーｈｐｈ−フォワード（５’−ＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡ、配列番号５）およびプライマーｈｐｈ−リバース（５’−ＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴ、配列番号６）を、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）を検出するために使用した。予測されるｈｐｈフラグメントは８００ｂｐ長であった。
【０１６６】
プライマーｎｐｔＩＩＩ−フォワード（５’−ＴＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧ、配列番号７）およびプライマーｎｐｔＩＩＩ−リバース（５’−ＡＧＣＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣ、配列番号８）を、カナマイシン耐性遺伝子ｎｐｔＩＩＩの増幅のために、従ってアグロバクテリアについてのコントロールとして使用した。予測されるｎｐｔＩＩＩフラグメントは７００ｂｐ長であった。
【０１６７】
プライマーＭＡＴ２９２（５’−ＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣＣＡＴＣＧＣＴＧＴＣ、配列番号９）およびプライマーＭＡＴ２９３（５’−ＡＧＴＧＧＧＴＡＣＴＣＴＡＡＡＧＧＣＣＡＴＡＣＣ、配列番号１０）を、グリセリンアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｇｐｄ１のフラグメントの増殖のため、従って、Blakeslea trisporaについてのコントロールとして使用した。予測されるｇｐｄｌフラグメントは５００ｂｐ長であった。
【０１６８】
図３は、標準ゲルに基づくBlakeslea trisporaＤＮＡのＰＣＲの結果を示す。ゲルのレーンには以下のようにロードした：
１）１００ｂｐサイズマーカー（１００ｂｐ〜１ｋｂ）
２）Ｂ．ｔ．ＧＭＯ  ３００５  プライマーｎｐｔＩＩＩ−フォワード／ｎｐｔＩＩＩ−リバース
３）Ｂ．ｔ．ＧＭＯ  ３００５  プライマーｈｐｈ−フォワード／ｈｐｈ−リバース
４）Ｂ．ｔ．ＧＭＯ  ３００５  プライマーＭＡＴ２９２／ＭＡＴ２９３（ｇｐｄ）
５）ｐＢｉｎＡＨｙｇプラスミドを有するＡ．ｔ．  プライマーｎｐｔＩＩＩ−フォワード／ｎｐｔＩＩＩ−リバース
６）ｐＢｉｎＡＨｙｇプラスミドを有するＡ．ｔ．  プライマー  ｈｐｈ−フォワード／ｈｐｈ−リバース
７）Ｂ．ｔ．１４２７２ＷＴ  プライマーｎｐｔＩＩＩ−フォワード／ｎｐｔＩＩＩ−リバース
８）Ｂ．ｔ．１４２７２ＷＴ  プライマーｈｐｈ−フォワード／ｈｐｈ−リバース
９）Ｂ．ｔ．１４２７２ＷＴ  プライマーＭＡＴ２９２／ＭＡＴ２９３（ｇｐｄ）。
【０１６９】
ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）および、陽性対照として、グリセリンアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄ１）がBlakeslea trispora ＤＮＡにおいて検出された。対照的に、ｎｐｔＩＩＩは検出されなかった。
【０１７０】
従って、アグロバクテリウム媒介形質転換によるBlakeslea trisporaの遺伝子改変が検出された。
【０１７１】
ホモカリオン性Blakeslea trisporaＧＭＯの単離：
ｐＢｉｎＡＨｙｇベクターおよびｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体のBlakeslea trisporaへの首尾よい導入は、Blakeslea trisporaの遺伝子改変された生物(ＧＭＯ)を産生する。しかし、Blakesleaは栄養細胞および生殖細胞のサイクルのすべての段階において多核細胞を有する。それゆえに、外来性ＤＮＡは、通常１つの核においてのみ挿入される。外来性ＤＮＡがすべての核に挿入されるBlakeslea株を得ることが目的であり、すなわち、その目的は同核組換え真菌菌糸体である。
【０１７２】
１）ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）の手段による同核組換え株の調製
Blakeslea trisporaの胞子または遺伝子改変されたBlakeslea trispora株の少ない割合が本来単核である。ｐＢｉｎＡＨｙｇまたはｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体の外来ＤＮＡを含む同核組換え株を産生するために、単核胞子をＦＡＣＳを用いて分取し、１００ｍｇ／ｌセフォタキシムおよび１００ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含むＭＥＰ（３０ｇ／ｌ麦芽抽出物、３ｇ／ｌペプトン、ｐＨ  ５．５、１８ｇ／ｌ寒天）上にプレーティングした。ここで産生された菌糸体は同核であった。ＦＡＣＳ分取のために、３日目の古いスメアの胞子を、寒天プレートあたり、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ＋０．１％  Ｓｐａｎ２０で洗浄した。胞子濃度は０．５〜０．８×１０７胞子／ｍｌであった。１ｍｌのＤＭＳＯおよび１０μlのＳｙｔｏ  １１（ＤＭＳＯ中の色素ストック溶液、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｎｏ．Ｓ−７５７３）を９ｍｌの胞子懸濁物に加えた。これに続いて、３０℃で２時間の染色を行った。選択および適用を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦａｃｓＶａｎｔａｇｅ＋Ｄｉｖａ  Ｏｐｔｉｏｎ型装置を用いて実行した。最初に、個々の胞子を凝集物および夾雑物から分離するために、サイズ選択を実行した。次いで、これらの胞子を、それらの蛍光に従って（励起＝４８８ｎｍ；発光＝５３０ｎｍ）、適用し分取した。蛍光頻度の分布のガウス曲線の左の肩は、単核胞子を含んだ。
【０１７３】
２）核の数を減少させることおよびＦＡＣＳを用いる選択による同核株の調製
胞子あたりの核の数を減少させるために、選択の前に、胞子懸濁物をＭＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で処理し、従って、化学的突然変異誘発によって核の数の減少を達成した。
【０１７４】
このために、最初に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ  ７．０中に１×１０７胞子／ｍｌを含む胞子懸濁物を調製した。この胞子懸濁物を、１００μｇ／ｍｌの最終濃度のＭＮＮＧと混合した。ＭＮＮＧ中のインキュベーションの時間は、胞子の生存率が約５％であるような方法で選択した。ＭＮＮＧとのインキュベーション後、胞子を、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０中の１ｇ／ｌ  Ｓｐａｎ２０で３回洗浄し、分取し、そして１）に記載される方法によって選択した。
【０１７５】
代替として、Cerda-OlmedoおよびPatricia Reau in Mutation Res., 9（1970）369-384によって記載されるようなＸ線およびＵＶ光線を使用することによって胞子中の核の数を減少させることもまた可能であった。
【０１７６】
３）劣性選択マーカーのための選択による同核株の調製
同核菌糸体の選択のための適切な劣性選択マーカーは、例えば、劣性選択マーカーｐｙｒＧである。Blakeslea trisporaの野生型株はｐｙｒＧ＋である。これらの株は、ピリミジンアナログ５−フルオロロテート（ＦＯＡ）の存在下で増殖することができない。なぜなら、これらは、オロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼを介してＦＯＡを致死的な代謝産物に転換するからである。遺伝子改変されたｐｙｒＧ−−同核Blakesleaは、オロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼの酵素活性を欠く。結果として、これらのｐｙｒＧ−株は、５−フルオロオロテートを利用することができない。それゆえに、これらの株は、ＦＯＡおよびウラシルの存在下で増殖する。ｐｙｒＧ−突然変異および外来ＤＮＡインサートが単核胞子の核と合わさった場合、この胞子は同核組換え真菌菌糸体を形成しうる。
【０１７７】
最初に、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｙｒＧ−ＳＣＯ（配列番号３６、図４）を、Blakeslea trisporaからのｐｙｒＧのフラグメント（配列番号６５）をｐＢｉｎＡＨｙｇに挿入することによって生成した。上記プラスミドは、Blakeslea trisporaに形質転換され、そして相同組換えに起因して、そこでｐｙｒＧ破壊を引き起こした。
【０１７８】
ｐｙｒＧ−表現型を有する同核Blakeslea trispora  ＧＭＯを以下のように選択した。ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｙｒＧ−ＳＣＯのアグロバクテリウム媒介形質転換のために、１００ｍｇ／Ｌ  セフォタキシムおよび１００ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンを含むＭＥＰ（３０ｇ／ｌ麦芽抽出物、３ｇ／ｌペプトン、ｐＨ  ５．５、１８ｇ／ｌ寒天）上でのプレーティングを上記のように実行した。形質転換体の胞子を、寒天プレートあたり、１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ＋０．１％  Ｓｐａｎ２０で洗浄した。胞子濃度は０．５〜０．８×１０７胞子／ｍｌであった。次いで、胞子を、１００ｍｇ／ｌ  セフォタキシムおよび１００ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシンを含むＦＯＡ培地上にプレーティングした。ＦＯＡ培地は、１リットルあたり、２０ｇのグルコース、１ｇのＦＯＡ、５０ｍｇのウラシル、２００ｍｌのクエン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ  ４．５）およびSutter, 1975, PNAS, 72:127に従う４０ｍｌの痕跡塩(trace salt)溶液を含んでいた。同核ｐｙｒＧ−突然変異体は、ウラシル含有ＦＯＡ培地上での増殖を示したが、ウラシルを含まないＦＯＡ培地上にプレーティングされた場合、増殖を示さなかった。同様にして、同核ＧＭＯを、以下にキサントフィルの産生について記載されるBlakeslea trispora  ＧＭＯから調製した。
【０１７９】
代替的には、５−炭素−５−デアザリボフラビンおよびさらにハイグロマイシンを含む培地上に、Ronceroらによるプロトコールに従って、胞子をプレーティングすることが可能である（Ronceroら、1984, Mutation Research, 125: 195-204）。これは、遺伝子型ｈｙｇＲおよびｄａｒ−のホモカリオン細胞が選択されることを可能にする。
【０１８０】
この原理に従って、表現型ｈｙｇＲおよびｄａｒ−を有するホモカリオン性Blakeslea trispora株が生成される。
【０１８１】
カロチノイドおよびカロチノイド前駆体を産生するためのBlakeslea trisporaの遺伝子改変生物を調製するための例示的な実施形態
以下に言及するプラスミドを、「重複伸長ＰＣＲ」法、および引き続くｐＢｉｎＡＨｙｇプラスミドへの増幅産物の挿入によって生成した。重複伸長ＰＣＲ法は、Innisら（編）PCR protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, San Diegoにおいて記載されるように実行した。ｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体の形質転換および同核遺伝子改変Blakeslea trispora株の調製を、上記のように実行した。
【０１８２】
ゼアキサンチンを産生するための遺伝子改変されたBlakeslea trispora株
以下のプラスミド（ｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体）は、ゼアキサンチンの産生のためにBlakeslea trisporaの遺伝子改変のために使用され、従って、とりわけ、ヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）をコードする。
【０１８３】
−  ｐｔｅｆ１−ＨＰｃｒｔＺ、Blakeslea trispora ｐｔｅｆ１プロモーターの制御下に、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144（アクセッション番号ＡＦ１６２２７６）からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼ（配列番号７０）の遺伝子を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐＴＥＦ１−ＨＰｃｒｔＺ、配列番号３７、図５）。
【０１８４】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ、Blakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下に、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ、配列番号３８、図６）。
【０１８５】
−  ｐ−ｃａｒＢ−ＨＰｃｒｔＺ、Blakeslea trispora ｐｃａｒＢプロモーターの制御下に、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＢ−ＨＰｃｒｔＺ、配列番号３９、図７）。
【０１８６】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＴＡＧ−３’ｃａｒＡ−ＩＲ、Blakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下に、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子を含む。逆方向反復構造がヒドロキシラーゼ遺伝子の下流に位置しており、この構造は、ｃａｒＡの３’末端およびｃａｒＡの下流の領域に由来する（ＩＲ、配列番号７４、「逆方向反復１」ｃａｒＡの約３５０ｂｐ、次いで約２００ｂｐ「ループ」そして次いで約３５０ｂｐ「逆方向反復２」）（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＴＡＧ−３’ｃａｒＡ−ＩＲ、配列番号４０、図８）。
【０１８７】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＧＣＧ−３’ｃａｒＡ−ＩＲ、Blakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下に、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子を含む。ヒドロキシラーゼ遺伝子は、ｃａｒＡの３’末端およびｃａｒＡの下流の領域に由来する逆方向反復構造に融合されている（ＩＲ、配列番号７４、「逆方向反復１」ｃａｒＡの約３５０ｂｐ、次いで約２００ｂｐ「ループ」そして次いで約３５０ｂｐ「逆方向反復２」）。結果として、誘導された融合タンパク質は、Haematococcus pluvialisヒドロキシラーゼおよびBlakeslea trispora ＣａｒＡのカルボキシ末端からなる（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＧＣＧ−３’ｃａｒＡ−ＩＲ、配列番号４１、図９）。
【０１８８】
−  ｐ−ｔｅｆ１−ＥＵｃｒｔＺ、ｐｔｅｆ１プロモーターの制御下に、Erwinia uredova 20D3（アクセッション番号Ｄ９００８７）からのＥＵｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子（配列番号７１）を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐＴＥＦ１−ＥＵｃｒｔＺ、配列番号４２、図１０）。
【０１８９】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＥＵｃｒｔＺ、Blakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下に、Erwinia uredova 20D3からのＥＵｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＥＵｃｒｔＺ、配列番号４３、図１１）。
【０１９０】
−  ｐ−ｃａｒＢ−ＥＵｃｒｔＺ、Blakeslea trispora ｐｃａｒＢプロモーターの制御下に、Erwinia uredova 20D3からのＥＵｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＢ−ＥＵｃｒｔＺ、配列番号４４、図１２）。
【０１９１】
−  ｐ−ｇｐｄＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ｔ−ｃｒｔＺ、ｇｐｄＡプロモーターの制御下にHaematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子およびｔ−ｃｒｔＺターミネーター(すなわち、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのｃｒｔＺの下流の配列部分（配列番号７３）)を含む（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇ−ｇｐｄＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ｔｃｒｔＺ、配列番号４３、図１３）。
【０１９２】
−  ｐ−ｇｐｄＡ−ＢＴｃａｒＲ−ＨＰｃｒｔＺ−ＢＴｃａｒＡ、Blakeslea trisporaからのリコピンシクラーゼｃａｒＲの遺伝子、Haematococcus pluvialis Flotow NIES-144からのＨｐｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子、およびBlakeslea trisporaからのフィトエンシンターゼｃａｒＡの遺伝子の遺伝子融合を含み、かつAspergillus nidulans ｇｐｄＡプロモーターの制御下にある（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇ−ｃａｒＲ＿ｃｒｔＺ＿ｃａｒＡ、配列番号４６、図１４）。
【０１９３】
カンタキサンチンを産生するための遺伝子改変されたBlakeslea trispora株の調製
以下のプラスミド（ｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体）は、カンタキサンチンの産生のためにBlakeslea trisporaの遺伝子改変のために使用され、従って、とりわけ、ケトラーゼ（ｃｒｔＷ）をコードする。
【０１９４】
−  ｐ−ｔｅｆ１−ＮＰｃｒｔＷ、Nostoc punctiforme PCC73102（ＯＲＦ１４８、アクセッション番号ＮＺ＿ＡＡＢＣ０１０００１９６）からのＮＰｃｒｔＷケトラーゼ（配列番号７２）の遺伝子を含み、かつBlakeslea trispora ｐｔｅｆ１プロモーターの制御下にある（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐＴＥＦ１−ＮｐｕｃｒｔＷ、配列番号４７、図１５）。
【０１９５】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＮＰｃｒｔＷ、Nostoc punctiforme PCC73102からのＮＰｃｒｔＷケトラーゼの遺伝子を含み、かつBlakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下にある（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＮｐｕｃｒｔＷ、配列番号４８、図１６）。
【０１９６】
−  ｐ−ｃａｒＢ−ＮＰｃｒｔＷ、Nostoc punctiforme PCC73102からのＮＰｃｒｔＷケトラーゼの遺伝子を含み、かつBlakeslea trispora ｐｃａｒＢプロモーターの制御下にある（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＢ−ＮｐｕｃｒｔＷ、配列番号４９、図１７）。
【０１９７】
アスタキサンチンを産生するための遺伝子改変されたBlakeslea trispora株の調製
以下のプラスミド（ｐＢｉｎＡＨｙｇ誘導体）は、アスタキサンチンの産生のためにBlakeslea trisporaの遺伝子改変のために使用され、すなわち、とりわけ、ヒドロキシラーゼ（ｃｒｔＺ）およびケトラーゼ（ｃｒｔＷ）をコードする。
【０１９８】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ｐｃａｒＲＡ−ＮＰｃｒｔＷ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  Ｆｌｏｔｏｗ  ＮＩＥＳ−１４４からのＨＰｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子およびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ７３１０２からのＮＰｃｒｔＷケトラーゼの遺伝子（ＯＲＦ１４８、アクセッション番号ＮＺ＿ＡＡＢＣ０１０００１９６）を含み、両方とも各々の場合においてBlakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下にある（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＮｐｕｃｒｔＷ、配列番号５０、図１８）。
【０１９９】
−  ｐ−ｃａｒＲＡ−ＥＵｃｒｔＺ−ｐｃａｒＲＡ−ＮＰｃｒｔＷ、Erwinia uredova 20D3からのＥＵｃｒｔＺヒドロキシラーゼの遺伝子（アクセッション番号Ｄ９００８７）、およびNostoc punctiforme PCC73102からのＮＰｃｒＴＷケトラーゼの遺伝子を含み、両方とも各々の場合においてBlakeslea trispora ｐｃａｒＲＡプロモーターの制御下にある（Ｓｅｑ．ｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＥＵｃｒｔＺ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＮｐｕｃｒｔＷ、配列番号５１、図１９）。
【０２００】
Blakeslea trisporaの遺伝子改変の例として利用され得る遺伝子およびプロモーターのクローニングおよび配列分析
種々のBlakeslea trisporaの遺伝子およびプロモーターのクローニングおよび配列決定が以下に例として記載される。
【０２０１】
ｐｔｅｆ１のクローニングおよび配列決定分析
Blakeslea trispora ｐ−ｔｅｆを、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて以前に公開された、Blakeslea trispora翻訳伸長因子１−αの構造遺伝子（ＡＦ１５７２３５）の配列に基づいてクローニングした。その配列から開始して、エントリーＡＦ１５７２３５プライマーを、上記構造遺伝子の上流のプロモーター領域を増幅および配列決定するために、逆方向ＰＣＲのために選択した。
【０２０２】
Blakeslea trispora ATCC14272のＸｈｏ１切断されかつ環状化された２００ｎｇのゲノムＤＮＡの逆方向ネスト化ＰＣＲにおいて、３０００ｂｐフラグメントを、以下の反応混合物中に得た：テンプレートＤＮＡ（Blakeslea trispora ATCC14272の１μｇのゲノムＤＮＡ）、プライマーＭＡＴ３４４  ５’−ＧＧＣＧＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＣＣＣＴＴＡＣＣＧ−３’（配列番号６３）およびプライマーＭＡＴ  ３４５  ５’−ＡＴＴＧＡＴＧＣＴＣＣＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＡＴＴ−３’（配列番号６４）、各０．２５μＭ、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ緩衝液１０×、５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（８５℃で加える）、Ｈ２Ｏで１００μｌにする。ＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９５℃、１０分間（１サイクル）；８５℃、５分間（１サイクル）；６０℃、３０秒間、７２℃、６０秒間、９５℃、３０秒間（３０サイクル）；７２℃、１０分間（１サイクル）。３０００ｂｐフラグメント中のｔｅｆ１遺伝子の推定の開始コドンの上流の配列部分は、ｐｔｅｆ１プロモーターと見なされた。
【０２０３】
Blakeslea trispora由来のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の遺伝子のクローニング、配列決定分析
最初に、Blakeslea trispora ATCC 14272、接合型（−）の遺伝子ライブラリーを調製するために、コスミドベクターｐＡＮｓＣｏｓ１を使用した。ベクターをＸｂａＩを用いる切断によって線状化し、次いで脱リン酸化した。ＢａｍＨＩを用いるさらなる切断は挿入部位を生成し、そこにBlakeslea trisporaゲノムＤＮＡ（部分的にＳａｕ３ＡＩで切断され、脱リン酸化されている）がライゲーションされた。続いて、この方法で生成されたコスミドはインビトロでパッケージングされ、大腸菌に移された。
【０２０４】
ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をコードするBlakeslea trispora遺伝子のフラグメントの既知の配列に基づいて（Eur. J. Biochem 220, 403-408 (1994)）、３１５ｂｐ  ＤＮＡプローブを以下のＰＣＲによって調製した。反応混合物：１μｇのBlakeslea trispora ATCC 14272ゲノムＤＮＡ、プライマーＭＡＴ３１４  ５’−ＣＣＧＡＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＧＡＡＧＧＴＴＧＴＴ−３’（配列番号７９）およびプライマーＭＡＴ３１５  ５’−ＣＡＴＧＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴ−３’（配列番号８０）、各０．２５μＭ、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ緩衝液  １０×、５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（８５℃で加える）、Ｈ２Ｏで１００μｌにする。ＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９５℃、１０分間（１サイクル）；８５℃、５分間（１サイクル）；５８℃、３０秒間、７２℃、３０秒間、９５℃、３０秒間（３０サイクル）；７２℃、１０分間（１サイクル）。
【０２０５】
このＤＮＡプローブは、コスミド遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために使用した。そのコスミドが上記ＤＮＡプローブとハイブリダイズするクローンを同定した。このコスミドのインサートを配列決定した。ＤＮＡ配列は、MHG-CoA還元酵素の遺伝子に割り当てられた部分を含んだ（配列番号７５）。
【０２０６】
ｃａｒＢのクローニングおよび配列決定分析
（ｃａｒＢ＝Blakeslea trisporaフィトエンデサチュラーゼ遺伝子）
縮重プライマーＭＡＴ１８２  ５’−ＧＣＮＧＡＲＧＧＮＡＴＨＴＧＧＴＡ−３’（配列番号５２）およびＭＡＴ１９２  ５’−ＴＣＮＧＣＮＡＧＲＡＡＤＡＴＲＴＴＲＴＧ−３’（配列番号５３）を、フィトエンデサチュラーゼのペプチド配列の比較、およびPhycomyces blakesleeanus、Cercospora nicotianae、Phaffia rhodozymaおよびNeurospora crassaの対応するＤＮＡ配列の比較から導いた。ＰＣＲを１００μｌ反応混合物中で実行した。これらは、Blakeslea trispora ATCC 14272の２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１μＭ  ＭＡＴ１８２、１μＭ  ＭＡＴ１９２、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＰｆｕポリメラーゼ緩衝液  １０×、２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（８５℃で加える）、Ｈ２Ｏ（１００μｌに調整）を含んだ。
【０２０７】
ＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９５℃、１０分間（１サイクル）；８５℃、５分間（１サイクル）；４０℃、３０秒間、７２℃、３０秒間、９５℃、３０秒間（３５サイクル）；７２℃、１０分間（１サイクル）。
【０２０８】
これは、３５８ｂｐフラグメントを生じ、この導き出されたペプチド配列はフィトエンデサチュラーゼ配列と類似している。逆方向ＰＣＲ（Innisら、PCR protocols: a guide to methods and applications. 1990.219〜227頁）の方法を、染色体ウォーキングの原理に従って、以下のように３５０ｂｐフラグメントの上流および下流の遺伝子領域を増幅、クローニング、および配列決定のために使用した。
【０２０９】
（ｉ）１．１ｋｂｐフラグメント、プライマーＭＡＴ２１９  ５’−ＡＡＧＴＧＡＣＡＣＣＧＧＴＴＡＣＡＣＧＣＴＴＧＴＣＴＴ−３’（配列番号５４）およびＭＡＴ  ２２０  ５’−ＧＣＴＴＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号５５）を用いるＰＣＲによって、ＥｃｏＲＩ切断されかつ環状化されたBlakeslea trispora ATCC 14272の２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．２５μＭ  ＭＡＴ２１９、０．２５μＭ  ＭＡＴ２２０、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ緩衝液  １０×、５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（８５℃で加える）、Ｈ２Ｏ（１００μｌに調整）から得られた。ＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９５℃、１０分間（１サイクル）；８５℃、５分間（１サイクル）；６０℃、３０秒間、７２℃、６０秒間、９５℃、３０秒間（３０サイクル）；７２℃、１０分間（１サイクル）。
【０２１０】
（ｉｉ）２．９ｋｂｐフラグメント、プライマーＭＡＴ２１９およびＭＡＴ２２０を用いるＰＣＲによって、ＸｂａＩ切断されかつ環状化されたBlakeslea trispora ATCC 14272の２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．２５μＭ  ＭＡＴ２１９、０．２５μＭ  ＭＡＴ２２０、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ緩衝液  １０×、５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ（８５℃で加える）、Ｈ２Ｏ（１００μｌに調整）から得られた。ＰＣＲプロフィールは以下の通りであった：９５℃、１０分間（１サイクル）；８５℃、５分間（１サイクル）；６０℃、３０秒間、７２℃、３分間、９５℃、３０秒間（３０サイクル）；７２℃、１０分間（１サイクル）。
【０２１１】
図２０(配列番号７７)は、クローニングされた配列部分を図解的に示す。配列決定を、クローニングされたフラグメントおよびＰＣＲ産物を使用して順方向および逆方向で実行した。図２１(配列番号７８)は、クローニングされた配列部分の配列を示す。
【０２１２】
配列比較
ｃａｒＢのヌクレオチド配列および誘導タンパク質ＣａｒＢのペプチド配列を、関連するタンパク質の既知の配列と比較した。配列を、ＧＡＰプログラムおよびＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用して比較した。
【０２１３】
ＣａｒＢ−ＧＡＰに従う同一のアミノアシル残基
プログラム設定：
ギャップ重み：    ８
長さ重み：        ２
平均マッチ：      ２．９１２
平均ミスマッチ：  −２．００３
Blakeslea trispora ATCC14272のＣａｒＢに一致するアミノ酸の％で示される以下の値が見い出された：
Phycomyces blakesleeanus：    ７２．４９１
Phaffia rhodozyma：           ５０．４６０
Neurospora crassa：           ４７．９４３
Cercospora nicotianae：       ４７．７４０
【０２１４】
ＣａｒＢ−ＢＥＳＴＦＩＴに従う同一のアミノアシル残基
プログラム設定：
ギャップ重み：    ８
長さ重み：        ２
平均マッチ：      ２．９１２
平均ミスマッチ：  −２．００３
Blakeslea trispora ATCC14272のＣａｒＢに一致するアミノ酸の％で示される以下の値が見い出された：
Phycomyces blakesleeanus：    ７３．３８０
Phaffia rhodozyma：           ５３．１７５
Neurospora crassa：           ５１．８９６
Cercospora nicotianae：       ５０．７９１
【０２１５】
ｃａｒＢ−ＧＡＰに従う同一の塩基
プログラム設定：
ギャップ重み：    ５０
長さ重み：        ３
平均マッチ：      １０．０００
平均ミスマッチ：  ０．０００
Blakeslea trispora ATCC14272のＣａｒＢに一致する塩基の％で示される以下の値が見い出された：
Phycomyces blakesleeanus：    ６４．８５３
Cercospora nicotianae：       ５０．１４３
Phaffia rhodozyma：           ４３．１７９
Neurospora crassa：           ４２．１３０
【０２１６】
ｃａｒＢ−ＢＥＳＴＦＩＴに従う同一の塩基
プログラム設定：
ギャップ重み：    ５０
長さ重み：        ３
平均マッチ：      １０．０００
平均ミスマッチ：  −９．０００
Blakeslea trispora ATCC14272のＣａｒＢに一致する塩基の％で示される以下の値が見い出された：
Phycomyces blakesleeanus：    ６８．９２６
Phaffia rhodozyma：           ６２．４０３
Neurospora crassa：           ６０．２３０
Cercospora nicotianae：       ５６．８８４
【０２１７】
ｃａｒＢ発現のためのクローニング
Blakeslea trispora ｃａｒＢをクローニングおよび発現するために、可能なタンパク質配列が、上記のBlakeslea trisporaからクローニングされた配列部分から６つのリーディングフレームにおいて導き出された。これらのタンパク質配列は、Phycomyces blakesleeanus、Phaffia rhodozyma、Neurospora crassa、Cercospora nicotianaeからのフィトエンデサチュラーゼの配列と比較された。配列比較に基づいて、３つのエキソンが、Blakeslea trisporaゲノムＤＮＡのクローニングされた配列部分において同定され、これは、まとめると、その由来する遺伝子産物が、その全体の長さにわたって、Phycomyces blakesleeanusのＣａｒＢフィトエンデサチュラーゼと７２．７％同一であるアミノアシル残基を有するコード領域を生じる。３つの可能性のあるエキソンおよび２つの可能性のあるイントロンを含むこの配列部分は、それゆえに、遺伝子ｃａｒＢと呼ばれた。予測される遺伝子構造を確認するために、Blakeslea trispora ｃａｒＢのコード配列は、Blakeslea trispora ｃＤＮＡをテンプレートとして、ならびにプライマーＢｏｌ１４２５  ５’−ＡＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣ−３’（配列番号５６）およびＢｏｌ１４２６  ５’−ＡＧＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号５７）を使用して、ＰＣＲによって生成された。得られたＤＮＡフラグメントを配列決定した。エキソンおよびイントロンの位置は、ゲノムｃａｒＢ  ＤＮＡとｃＤＮＡを比較することによって確認された。図２１は、ｃａｒＢのコード配列を図解的に示す。大腸菌中でのｃａｒＢの発現のために、最初に、ｃａｒＢにおけるＮｄｅＩ切断部位を重複伸長ＰＣＲ法によって除去し、ＮｄｅＩ切断部位を遺伝子の５’末端に導入し、ＢａｍＨＩ切断部位を３’末端に導入した。得られたＤＮＡフラグメントをベクターｐＪＯＥ２７０２とライゲーションした。得られたプラスミドをｐＢＴ４と呼び、大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅにｐＣＡＲ−ＡＥとともにクローニングした。発現を、ラムノースを用いて誘導した。酵素活性を、ＨＰＬ
Ｃを通してリコピン合成を検出することによって検出した。クローニング工程を以下に記載する。
【０２１８】
ＰＣＲ１．１：
約０．５μｇのBlakeslea trispora ｃＤＮＡ、０．２５μＭ  ＭＡＴ３５０  ５’−ＡＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号５８）、０．２５  μＭ  ＭＡＴ２４４  ５’−ＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＧＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＡＧＴＡＡＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ−３’（配列番号５９）、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＰｆｕポリメラーゼ緩衝液（１０×）、２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（８５℃で添加、「ホットスタート」）、およびＨ２Ｏ（１００μＬに調整）。
【０２１９】
温度プロフィール：
１．９５℃  １０分間、２．８５℃  ５分間、３．４０℃  ３０秒間、４．７２℃  １分３０秒間、５．９５℃  ３０秒間、６．５０℃  ３０秒間、７．７２℃  １分３０秒間、８．９５℃  ３０秒間、９．７２℃  １０分間。
【０２２０】
サイクル：（１〜２．）１回、（３〜５．）５回、（６〜８．）２５回、（９．）１回。
【０２２１】
ＰＣＲ１．２：
約０．５μｇのBlakeslea trispora ｃＤＮＡ、０．２５  μＭ  ＭＡＴ２４３  ５’−ＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＣＡＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＡＣ−３’（配列番号６０）、０．２５  μＭ  ＭＡＴ３５３  ５’−ＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧ−３’（配列番号６１）、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＰｆｕポリメラーゼ緩衝液（１０×）、２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（８５℃で添加、「ホットスタート」）、およびＨ２Ｏ（１００μＬに調整）。
【０２２２】
温度プロフィール：
１．９５℃  １０分間、２．８５℃  ５分間、３．４０℃  ３０秒間、４．７２℃  １分３０秒間、５．９５℃  ３０秒間、６．５０℃  ３０秒間、７．７２℃  １分３０秒間、８．９５℃  ３０秒間、９．７２℃  １０分間。
【０２２３】
サイクル：（１〜２．）１回、（３〜５．）５回、（６〜８．）２５回、（９．）１回。
【０２２４】
ＰＣＲ１．１、１．２からのＰＣＲフラグメントの精製
この目的のために、ｐＪＯＥ２７０２にクローニングするためのBlakeslea trispora ｃａｒＢのコード配列を調製するためにＰＣＲ２を実行した。
【０２２５】
約５０ｎｇのＰＣＲ１．１産物および約５０ｎｇのＰＣＲ１．２産物、ならびに、０．２５μＭ  ＭＡＴ３５０（５’−ＡＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣ−３’配列番号５８）、０．２５  μＭ  ＭＡＴ３５３（５’−ＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧ−３’配列番号６１）、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＰｆｕポリメラーゼ緩衝液（１０×）、２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（８５℃で添加、「ホットスタート」）、およびＨ２Ｏ（１００μＬに調整）。
【０２２６】
温度プロフィール：
１．９５℃  １０分間、２．８５℃  ５分間、３．５９℃  ３０秒間、４．７２℃  ２分間、５．９５℃  ３０秒間、６．７２℃  １０分間。
【０２２７】
サイクル：（１〜２．）１回、（３〜５．）２２回、（６．）１回。
【０２２８】
続いて、得られたフラグメント（約１．７ｋｂｐ）を精製し、次にベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ−Ａｍｐへのライゲーション、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅへのクローニング、インサートの配列決定、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いる切断、ならびにｐＪＯＥ２７０２へのライゲーションを行った。得られたプラスミドはｐＢＴ４と呼ばれた。
【０２２９】
ＣａｒＢ（フィトエンデサチュラーゼ）の酵素活性の特徴付けおよび検出
ｃａｒＢから導かれた遺伝子産物をＣａｒＢと呼ぶ。ＣａｒＢはペプチド配列分析に基づき、以下の特性を有する：
長さ：５８２アミノアシル残基
分子量：６６４７０
等電点：６．７
触媒活性：フィトエンデサチュラーゼ
反応物：フィトエン
生成物：リコピン
ＥＣ番号：ＥＣ  １．１４．９９−
【０２３０】
酵素活性をインビボで検出した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅへのプラスミド（ｐＣＡＲ−ＡＥ）の導入は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＣＡＲ−ＡＥ）株を生じる。この株はフィトエンを合成する。大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅへのｐＢＴ４プラスミドのさらなる導入は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＣＡＲ−ＡＥ）（ｐＢＴ４）株を生じる。酵素的に活性なフィトエンデサチュラーゼが、ｃａｒＢから開始して形成されるので、この株はリコピンを産生する。
【０２３１】
それゆえに、プラスミドｐＣＡＲ−ＡＥおよびｐＢＴ４は大腸菌に導入された。カロチノイドが、液体培地中で増殖した細胞から抽出され、特徴付けされた（上記を参照されたい）。
【０２３２】
ＨＰＬＣ分析は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＣＡＲ−ＡＥ）株がフィトエンを産生し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ｐＣＡＲ−ＡＥ）（ｐＢＴ４）株がリコピンを産生することを明らかにした。結果として、ＣａｒＢはフィトエンデサチュラーゼの酵素活性を有する。
【０２３３】
フィトエンを産生するための遺伝子改変されたBlakeslea trispora株の調製
フィトエンを産生するための遺伝子改変された生物の調製は、以下に例示として記載される。
【０２３４】
Blakeslea trisporaのｃａｒＢ−突然変異体を生成するためのベクターｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢ
ベクターｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢ（配列番号６２、図２２）を、Blakeslea trisporaにおいてｃａｒＢを欠失させるために構築した。ｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢの前駆体はｐＢｉｎＡＨｙｇ（配列番号３、図２）であり、これは以下のように構築された。
【０２３５】
ｇｐｄＡ−ｈｐｈカセットを、プラスミドｐＡＮｓＣｏｓ１（配列番号４、図１、Osiewacz, 1994, Curr. Genet. 26:87-90）からのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離し、そしてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したバイナリープラスミドｐＢｉｎ１９（Bevan, 1984, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721）にライゲーションした。この方法で得られたベクターはｐＢｉｎＡＨｙｇと呼ばれ、ｇｐｄプロモーターの制御下に大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｈ）ならびにAspergillus nidulans由来のｔｒｐＣターミネーターおよびアグロバクテリウムＤＮＡ導入のために必要である適切なボーダー配列を含む。
【０２３６】
ｃａｒＢコード配列は、プライマーＭＡＴ３５０およびＭＡＴ３５３、ならびに以下のパラメーターを使用するＰＣＲによって増幅された：
５０ｎｇのｐＢＴ４ならびに０．２５μＭ  ＭＡＴ３５０（５’−ＡＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＡＴＧＣＧＡＡＴＡＴＣＧＴＴＧＣＴＧＣ−３’；配列番号５８）、０．２５  μＭ  ＭＡＴ３５３（５’−ＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＴＡＴＴＧ−３’；配列番号６１）、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌのＰｆｕポリメラーゼ緩衝液、２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼ（８５℃で添加、「ホットスタート」）、およびＨ２Ｏ（１００μＬまで）。
【０２３７】
温度プロフィール：
１．９５℃  １０分間、２．８５℃  ５分間、３．５８℃  ３０秒間、４．７２℃  ２分間、５．９５℃  ３０秒間、６．７２℃  １０分間。
【０２３８】
サイクル：（１〜２．）１回、（３〜５．）３０回、（６．）１回。
【０２３９】
得られるフラグメント（約１．７ｋｂｐ）を引き続いて精製し、次にＨｉｎｄＩＩＩで切断を行い、３６４ｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントｃａｒＢの精製をさらに行い、次にＨｉｎｄＩＩＩでｐＢｉｎＡＨｙｇの切断を行い、３６４ｂｐＨｉｎｄＩＩＩフラグメントｃａｒＢの、ｐＢｉｎＡＨｙｇへのライゲーションを行い、このベクターの大腸菌への形質転換および構築物の単離を行い、上記のように、このベクターをｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢと呼んだ。代替的には、ＨｉｎｄＩＩＩを用いる部分切断を実行し、より大きなｃａｒＢＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＢｉｎＡＨｙｇにクローニングして、ｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢを産生した。
【０２４０】
Blakeslea trisporaのｃａｒＢ−突然変異体の生成
最初に、ｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢプラスミドを、例えば、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム株ＬＢＡ  ４４０４に導入した（上記を参照されたい）。次に、プラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス  ＬＢＡ  ４４０４から、Blakeslea trispora ATCC 14272およびBlakeslea trispora ATCC 14271に移した（上記を参照されたい）。Blakeslea trisporaへの首尾よい遺伝子導入の検出は、以下のプロトコールに従うポリメラーゼ連鎖反応を通して実行された：
Blakeslea trispora ATCC 14272 ｃａｒＢ−またはATCC 14271 ｃａｒＢ−からの約０．５μｇのＤＮＡを０．２５μＭプライマーｈｐｈフォワード(５’−ＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡ−３’；配列番号５）、０．２５μＭプライマーｈｐｈリバース(５’−ＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴ−３’；配列番号６）、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ緩衝液、２．５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（８５℃で添加、「ホットスタート」）、およびＨ２Ｏ（１００μＬまで）と反応させた。
【０２４１】
温度プロフィール：
１．９５℃  １０分間、２．８５℃  ５分間、３．５８℃  １分間、４．７２℃  １分間、５．９４℃  １分間、６．７２℃  １０分間。
【０２４２】
サイクル：（１．〜２．）１回、（３〜５．）３０回、（６．）１回。
【０２４３】
陰性対照として、アグロバクテリウムカナマイシン耐性遺伝子を増幅することが試みられた。この目的のために、以下のＰＣＲ条件が使用された：
Blakeslea trispora ATCC 14272 ｃａｒＢ−およびATCC 14271 ｃａｒＢ−からの約０．５μｇのＤＮＡを０．２５μＭプライマーｎｐｔＩＩＩフォワード(５’−ＴＧＡＧＡＡＴＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧ−３’；配列番号７）、０．２５μＭプライマーｎｐｔＩＩＩリバース（５’−ＡＧＣＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣ−３’；配列番号８）、１００μＭ  ｄＮＴＰ、１０μＬのＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ緩衝液、２．５ＵのＨｅｒｃｕｌａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（８５℃で添加、「ホットスタート」）、およびＨ２Ｏ（１００μｌまで）と反応させた。
【０２４４】
温度プロフィール：
１．９５℃  １０分間、２．８５℃  ５分間、３．５８℃  １分間、４．７２℃  １分間、５．９４℃  １分間、６．７２℃  １０分間。
【０２４５】
サイクル：（１〜２．）１回、（３〜５．）３０回、（６．）１回。
【０２４６】
Blakeslea trisporaによるカロチノイドおよびカロチノイド前駆体の産生
カロチノイドゼアキサンチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、およびフィトエンは、対応する遺伝子改変されたBlakeslea trispora（＋）株および（−）株を発酵させ、産生したカロチノイドをＨＰＬＣ分析によって検出し、およびそれを単離することによって産生された。
【０２４７】
カロチノイドを産生するための液体培地は、１リットルあたり：１９ｇのトウモロコシ粉、４４ｇのダイズ粉、０．５５ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．００２ｇのチアミン塩酸塩、１０％のヒマワリ油を含んだ。ｐＨはＫＯＨで７．５に調整した。
【０２４８】
カロチノイドを産生するために、シェーカーフラスコに、Blakeslea trispora ＧＭＯの（＋）株および（−）株の胞子懸濁物を接種した。シェーカーフラスコを２６℃で２５０ｒｐｍで７日間インキュベートした。代替的には、トリスポリック酸を４日後に株の混合物に添加し、続いてさらに３日間インキュベートした。トリスポリック酸の最終濃度は３００〜４００μｇ／ｍｌであった。
【０２４９】
抽出および分析
抽出：
１．１０ｍｌの培養懸濁物の取り出し
２．遠心分離、１０分間、５０００×ｇ
３．上清の廃棄
４．１ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中でボルテックスによってペレットを再懸濁
５．遠心分離、５分間、５０００×ｇ
６．ＴＨＦ相の取り出し
７．工程４．から６．の反復（２回）
８．ＴＨＦ相のプール
９．残渣の水相を除去するための、プールしたＴＨＦ相の遠心分離、２０  ０００×ｇ、５分間。
【０２５０】
分析
ＨＰＬＣによるフィトエン測定
カラム：ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ８、５μｍ、１５０＊４．６ｍｍ
温度：４０℃
流速：０．５ｍｌ／分
注入量：１０μｌ
検出：ＵＶ  ２２０ｎｍ
停止時間：１２分
ポストラン時間：０分
最高圧力：３５０ｂａｒ
溶離液Ａ：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ２．５、過クロム酸を含む
溶離液Ｂ：アセトニトリル
グラジエント：    時間（分）    Ａ（％）    Ｂ（％）    供給（ｍｌ／分）
０          ５０          ５０      ０．５    
１２          ５０          ５０      ０．５    
【０２５１】
発酵ブロスの抽出物はマトリックスとして使用された。ＨＰＬＣの前に、各サンプルは０．２２μｍフィルターを通して濾過された。サンプルは、冷所に保たれ、光から保護された。各々の場合、較正のために５０〜１０００ｍｇ／ｌがＴＨＦ中で秤量および溶解された。使用された標準はフィトエンであり、所定の条件下で７．７分の保持時間を有する。
【０２５２】
ＨＰＬＣによるリコピン、β−カロチン、エキネノン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、およびアスタキサンチンの測定
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−７  Ｃ１８、２５０＊４．０ｍｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ）
温度：２５℃
流速：１．３ｍｌ／分
注入量：１０μｌ
検出：４５０ｎｍ
停止時間：１５分
ポストラン時間：２分
最高圧力：２５０ｂａｒ
溶離液Ａ：１０％アセトン、９０％Ｈ２Ｏ
溶離液Ｂ：アセトン
グラジエント：    時間（分）    Ａ（％）    Ｂ（％）    供給（ｍｌ／分）
０          ３０          ７０      １．３    
１０            ５          ９５      １．３    
１２            ５          ９５      １．３    
１３          ３０          ７０      １．３    
【０２５３】
発酵ブロスの抽出物はマトリックスとして使用された。ＨＰＬＣの前に、各サンプルは０．２２μｍフィルターを通して濾過された。サンプルは、冷所に保たれ、光から保護された。各々の場合、較正のために１０ｍｇが１００ｍｌのＴＨＦ中で秤量および溶解された。以下の保持時間を有する以下のカロチノイドが標準として使用された：β−カロチン（１２．５分）、リコピン（１１．７分）、エキネノン（１０．９分）、クリプトキサンチン（１０．５分）、カンタキサンチン（８．７分）、ゼアキサンチン（７．６分）、およびアスタキサンチン（６．４分）（図２３を参照されたい）。
【０２５４】
遺伝子改変されたBlakeslea trispora株によるゼアキサンチンの産生
Blakeslea trisporaの遺伝子改変された生物（ＧＭＯ）によるゼアキサンチンの産生が以下に例として記載される。
【０２５５】
ベクターｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐＴＥＦ１−ＨＰｃｒｔＺが、アグロバクテリウム媒介形質転換（上記を参照されたい）によってBlakeslea trisporaに導入された。ハイグロマイシン耐性クローンを単離し、ポテト−グルコース寒天プレート（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）に移した。
【０２５６】
このプレートから開始して、胞子懸濁物を、２６℃での３日間のインキュベーション後に調製した。バッフルを備えず、そして５０ｍｌの増殖培地（４７ｇ／ｌトウモロコシ粉、２３ｇ／ｌのダイズ粉、０．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、２．０ｍｇ／ｌのチアミン塩酸塩、滅菌前にＮａＯＨでｐＨを６．２〜６．７に調整）を含む２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコに、１×１０５個の胞子を接種した。この前培養を、２６℃、２５０ｒｐｍで４８時間インキュベートした。主培養のために、バッフルを備えず、４０ｍｌの製造培地を含む２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコに、４ｍｌの前培養物を接種し、２６℃にて、１５０ｒｐｍ、８日間インキュベートした。製造培地は、５０ｇ／ｌグルコース、２ｇ／ｌカゼイン酸加水分解物、１ｇ／ｌ酵母抽出物、２ｇ／ｌ  Ｌ−アスパラギン、１．５ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、５ｍｇ／ｌ  チアミン−ＨＣｌ、１０ｇ／ｌ  Ｓｐａｎ２０、１ｇ／ｌ  Ｔｗｅｅｎ  ８０、２０ｇ／ｌ  リノール酸、８０ｇ／ｌ  コーンスチープリカーを含んだ。７２時間後、ケロシンを最終濃度４０ｇ／ｌで加えた。培養物を収集後、残渣の培養容量約３５ｍｌを水で４０ｍｌに増加した。続いて、高圧ホモジナイザー（ｔｙｐｅ  Ｍｉｃｒｏｎ  Ｌａｂ  ４０、ＡＰＶ  Ｇａｕｌｉｎ）中で、３回、１５００バールで細胞を破壊した。
【０２５７】
破壊された細胞を含む懸濁物を、３５ｍｌのＴＨＦと混合し、２５０ｒｐｍで振盪しながら室温で、暗所で６０分間インキュベートした。次いで、２ｇのＮａＣｌを加え、混合物をさらに１回振盪しながらインキュベートした。次いで、抽出混合物を５０００×ｇで１０分間遠心分離した。着色したＴＨＦ相を取り出すと、細胞塊は完全に無色であった。
【０２５８】
ＴＨＦ相を、ロータリーエバポレーター中で３０ミリバール、３０℃で１ｍｌまで濃縮し、次いで再度１ｍｌのＴＨＦに溶解した。２００００×ｇで５分間の遠心分離後、上相のアリコートを取り出し、ＨＰＬＣによって分析した（図２４、図２３）。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１】図１は、ベクターｐＡＮｓＣｏｓ１を示す。
【図２】図２は、ベクターｐＢｉｎＡＨｙｇを示す。
【図３】図３は、標準ゲルに基づくBlakeslea trisporaＤＮＡのＰＣＲの結果を示す。
【図４】図４は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｙｒＧ−ＳＣＯを示す。
【図５】図５は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐＴＥＦ１−ＨＰｃｒｔＺを示す。
【図６】図６は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ         を示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＢ−ＨＰｃｒｔＺを示す。
【図８】図８は、プラスミドｐ−ｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＴＡＧ−３’ｃａｒＡ−ＩＲを示す。
【図９】図９は、プラスミドｐ−ｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＧＣＧ−３’ｃａｒＡ−ＩＲを示す。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐＴＥＦ１−ＥＵｃｒｔＺを示す。
【図１１】図１１は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＥＵｃｒｔＺを示す。
【図１２】図１２は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＢ−ＥＵｃｒｔＺを示す。
【図１３】図１３は、プラスミドｐ−ＢｉｎＡＨｙｇ−ｇｐｄＡ−ＨＰｃｒｔＺを示す。
【図１４】図１４は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇ−ｃａｒＲｃｒｔＺｃａｒＡを示す。
【図１５】図１５は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇ−ＢＴｐＴＥＦ１−ＮｐｃｒｔＷを示す。
【図１６】図１６は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇ＿ＢＴｐｃａｒＲＡ＿ＮＰｃｒｔＷを示す。
【図１７】図１７は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇ−ＢＴｐｃａｒＢ−ＮＰｃｒｔＷを示す。
【図１８】図１８は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＨＰｃｒｔＺ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＮｐｕｃｒｔＷを示す。
【図１９】図１９は、プラスミドｐＢｉｎＡＨｙｇＢＴｐｃａｒＲＡ−ＥＵｃｒｔＺ−ＢＴｐｃａｒＲＡ−ＮｐｕｃｒｔＷを示す。
【図２０】図２０は、ｃａｒＢに関してクローニングされた配列部分を図解的に示す。
【図２１】図２１は、ｃａｒＢのコード配列を図解的に示す。
【図２２】図２２は、ベクターｐＢｉｎＡＨｙｇΔｃａｒＢを示す。
【図２３】図２３は、ＨＰＬＣによるリコピン、β−カロチン、エキネノン、カンタキサンチン、クリプトキサンチン、ゼアキサンチン、およびアスタキサンチンの測定結果を示す。
【図２４】図２４は、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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