(57)【要約】本発明は単一または複数の染色体上の関心対象の遺伝子座の多数の配列を決定するために有用な方法を提供する。本方法は制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように制限酵素に対する認識部位を含むオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。5'オーバーハングは検出可能なヌクレオチドを取り込むために鋳型として使用する。本方法は核酸の1試料からの一塩基遺伝子多型のような多数の配列の分析に特に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いることにより鋳型ポリヌクレオチドから関心対象の遺伝子座を含むDNAの領域を複製する段階であって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を生じさせる配列を含む段階；
（b）第2のプライマーにより生じた認識部位を認識する制限酵素でDNAを消化することによりDNAフラグメントを生成する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項２】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上で関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅DNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項３】
鋳型DNAが細菌、真菌、ウィルス、原生動物、植物、動物およびヒトからなる群より選択される起源から得られる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
鋳型DNAがヒト起源から得られる、請求項2記載の方法。
【請求項５】
鋳型DNAが細胞、組織、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物、腹腔液、糞便物質または身体滲出物からなる群より選択される試料から得られる、請求項2記載の方法。
【請求項６】
（a）における増幅がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む、請求項2記載の方法。
【請求項７】
制限酵素が認識部位においてDNAを切断する、請求項2記載の方法。
【請求項８】
第2のプライマーの5'領域が鋳型DNAにアニーリングしない、請求項7記載の方法。
【請求項９】
第1のプライマーの5'領域が鋳型DNAにアニーリングしない、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
制限酵素がBsaJI、BsskI、DdeI、EcoNI、Fnu4HIおよびHinfIからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
制限酵素が認識部位から少し離れてDNAを切断する、請求項2記載の方法。
【請求項１２】
第2のプライマーの5'領域が鋳型DNAにアニーリングしない、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
第1のプライマーの5'領域が鋳型DNAにアニーリングしない、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
第2のプライマーの3'領域のアニーリング長が25〜20、20〜15、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4および4塩基未満からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
PCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3'領域の一部の融解温度近傍である、請求項2記載の方法。
【請求項１６】
PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3'領域の一部の融解温度近傍である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
PCRの残りのサイクルのアニーリング温度が第2のプライマー全体の融解温度近傍である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
第2のプライマーの3'末端が関心対象の遺伝子座に隣接している、請求項2記載の方法。
【請求項１９】
認識部位がIIS型制限酵素に対するものである、請求項11記載の方法。
【請求項２０】
IIS型制限酵素がAlw I、Alw26 I、Bbs I、Bbv I、BceA I、Bmr I、Bsa I、Bst71 I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspM I、Ear I、Fau I、Fok I、Hga I、Ple I、Sap I、SSfaN IおよびSthi32 Iからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
IIS型制限酵素がBceAIまたはBsmFIである、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
第1のプライマーが第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含む、請求項2記載の方法。
【請求項２３】
第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階を更に含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第1または第2のプライマーが5'末端にタグを含む、請求項2記載の方法。
【請求項２５】
第1のプライマーが5'末端にタグを含む、請求項2記載の方法。
【請求項２６】
鋳型DNAから増幅されたDNAを分離するためにタグを使用する、請求項27記載の方法。
【請求項２７】
取り込まれたヌクレオチドを含まない増幅されたDNAから取り込まれたヌクレオチドを含む増幅されたDNAを分離するためにタグを使用する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
タグが、放射性同位体、蛍光レポーター分子、化学発光レポーター分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、ビオチン、ビオチンの誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、同種重合体オリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反磁性部分、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分、検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
タグがビオチンである、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
ストレプトアビジンマトリックスを用いて鋳型DNAから増幅されたDNAを分離するためにビオチンタグが用いられる、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ストレプトアビジンマトリックスがマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされている、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
（c）におけるヌクレオチドの取り込みが、大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T7DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼ、VentDNAポリメラーゼおよびシーケナーゼからなる群より選択されるDNAポリメラーゼにより行われる、請求項2記載の方法。
【請求項３３】
（c）におけるヌクレオチドの取り込みが標識されたヌクレオチドの取り込みを含む、請求項2記載の方法。
【請求項３４】
（c）におけるヌクレオチドの取り込みが未標識ヌクレオチドの取り込みを更に含む、請求項2記載の方法。
【請求項３５】
標識されたヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドからなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
標識されたヌクレオチドが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチンの誘導体、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分および検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率からなる群より選択される分子で標識される、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
標識されたヌクレオチドが蛍光分子により標識される、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
未標識ヌクレオチドの取り込みを更に含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
（d）における関心対象の遺伝子座の配列の決定がヌクレオチドの検出を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４０】
（d）における関心対象の遺伝子座の配列の決定が標識されたヌクレオチドの検出を含む、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
検出が、ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、蛍光検出、配列決定、ELISA、質量分析、蛍光分析、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイおよびサザンブロットからなる群より選択される方法による、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
検出方法がDNA配列決定である、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
検出方法が蛍光検出である、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
関心対象の遺伝子座が一塩基遺伝子多型または突然変異を含むことが疑われる、請求項2記載の方法。
【請求項４５】
関心対象の複数の遺伝子座の配列を同時に決定するために方法が使用される、請求項2記載の方法。
【請求項４６】
鋳型DNAが単一の染色体に由来する複数の遺伝子座を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
鋳型DNAが種々の染色体に由来する複数の遺伝子座を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座が1回の反応において増幅される、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座の各々が異なる反応において増幅される、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
増幅されたDNAが増幅されたDNAの消化の前に共にプールされる、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
関心対象の遺伝子座を含む（c）における標識されたDNAの各々が（d）の前に分離される、請求項45記載の方法。
【請求項５２】
関心対象の遺伝子座の少なくとも1つが一塩基遺伝子多型または突然変異を含むことが疑われる、請求項45記載の方法。
【請求項５３】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含み、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、制限酵素に対する完全な認識部位が鋳型DNAの増幅の際に生じる段階；
（b）第2のプライマーおよび鋳型DNAにより生じた完全な認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、
（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項５４】
第2のプライマーの3'領域が鋳型DNAとのミスマッチを含む、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
ミスマッチが3'領域の最後の1、2または3塩基において起こる、請求項53記載の方法。
【請求項５６】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じ、第1のプライマーは、第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5'末端にタグを含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内に標識されたヌクレオチドを取り込む段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項５７】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じ、第1のプライマーが第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5'末端にタグを含み、PCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3'領域の一部の融解温度近傍であり、PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3'領域の一部の融解温度近傍であり、残りのサイクルのアニーリング温度が第2のプライマー全体の融解温度近傍である段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内に標識されたヌクレオチドを取り込む段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項５８】
タグを用いて鋳型DNAから増幅されたDNAを分離する、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
請求項1〜58のいずれか一項記載の方法において使用されるキットであって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を生じさせる配列を含む、前記方法において使用されるプライマーのセット、および取扱説明書のセットを含むキット。
【請求項６０】
配列決定すべき関心対象の遺伝子座および制限酵素に対する認識部位を含むDNAフラグメントであって、制限酵素による消化によりDNAフラグメント上の5'オーバーハングが生成され、関心対象の遺伝子座および制限酵素認識部位は制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるような相互関係にあるフラグメント。
【請求項６１】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上で関心対象の遺伝子座の対立遺伝子を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるようにその制限酵素に対する認識部位を含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）異なる対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングにおけるヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項６２】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含み、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、制限酵素に対する完全な認識部位が鋳型DNAの増幅の際に生じる段階；
（b）第2のプライマーおよび鋳型DNAにより生じた完全な認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）異なる対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングにおけるヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれる段階；
（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項６３】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じ、第1のプライマーは、第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5'末端にタグを含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的な標識されたヌクレオチドが該対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）異なる対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、かつ該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングにおけるヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項６４】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じ、第1のプライマーが第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5'末端にタグを含み、PCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3'領域の一部の融解温度近傍であり、PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3'領域の一部の融解温度近傍であり、PCRの残りのサイクルのアニーリング温度が第2のプライマー全体の融解温度近傍である段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的な標識されたヌクレオチドが該対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）異なる対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれ、該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングにおけるヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該異なる対立遺伝子の5'オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項６５】
正常対立遺伝子の存在下で突然変異対立遺伝子の配列を決定するために用いられる、請求項61記載の方法。
【請求項６６】
突然変異対立遺伝子および正常対立遺伝子が、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6〜1：10、1：11〜1：20、1：21〜1：30、1：31〜1：40、1：41〜1：50、1：51〜1：60、1：61〜1：70、1：71〜1：80、1：81〜1：90、1：91〜1：100、1：101〜1：200、1：250、1：251〜1：300、1：301〜1：400、1：401〜1：500、1：501〜1：600、1：601〜1：700、1：701〜1：800、1：801〜1：900、1：901〜1：1000、1：1001〜1：2000、1：2001〜1：3000、1：3001〜1：4000、1：4001〜1：5000、1：5001〜1：6000、1：6001〜1：7000、1：7001〜1：8000、1：8001〜1：9000、1：9001〜1：10,000；1：10,001〜1：20,000、1：20,001：1：30,000、1：30,001〜1：40,000、1：40,001〜1：50,000および1；50,000を上回る比率からなる群より選択される比率で存在する、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
突然変異対立遺伝子がBRCA1、BRCA2、MSH6、MSH2、MLH1、RET、PTEN、ATM、H-RAS、p53、ELAC2、CDH1、APC、AR、PMS2、MLH3、CYP1A1、GSTP1、GSTM1、AXIN2、CYP19、MET、NAT1、CDKN2A、NQ01、trc8、RAD51、PMS1、TGFBR2、VHL、MC4R、POMC、NROB2、UCP2、PCSK1、PPARG、ADRB2、UCP3、glurl、cart、SORBS1、LEP、LEPR、SIM1、TNF、IL-6、IL-1、IL-2、IL-3、IL1A、TAP2、THPO、THRB、NBS1、RBM15、LIF、MPL、RUNX1、Her-2、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、p21、p27、K-RAS、N-RAS、網膜芽細胞腫タンパク質、Wiskott-Aldrich（WAS）遺伝子、第V因子Lieden、第II因子（プロトロンビン）、メチレンテトラヒドロフォレート還元酵素、嚢胞性線維症、LDL受容体、HDL受容体、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子およびSHOX遺伝子からなる群より選択される遺伝子のものである、請求項65記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2002年3月11日出願の米国特許第10/093,618号、および2002年3月1日および2002年5月8日にそれぞれ出願の米国仮特許第60/360,232号および第60/378,354号の優先権を主張する。これらの出願の内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は核酸の配列を決定するための迅速な方法に関する。本方法は遺伝子タイピングのため、および、複数の染色体上の一塩基遺伝子多型（SNP）または突然変異の1個〜10個〜数百個〜数千個の検出のため、および、トランケーション、トランスバァージョン、トリソミーおよびモノソミーのような染色体異常の検出のために特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
背景
個体内の配列の変異は欠失性疾患の突然変異からニュートラル多形に至る連続的事象である。現在300種を超える遺伝子疾患が知られており、例えばデュシエーヌ筋ジストロフィー、アルツハイマー病、嚢胞性線維症およびハンチントン病が挙げられる（D.N.Cooper および M.Krawczak, "Human Genome Mutations," BIOS Scientific Publishers,Oxford（1993））。更にまた、特定のDNA配列は個体に対し、種々の疾患、例えば肥満、アテローム性動脈硬化症および種々の癌、例えば乳癌、前立腺癌および結腸癌の素因をもたらす。更にまた、ダウン症をもたらすトリソミー21、エドワード症候群をもたらすトリソミー18、パトー症候群をもたらすトリソミー13、ターナー症候群をもたらすモノソミーX、および他の性異数性のような染色体異常は出生ヒトにおける遺伝的欠陥の大部分に相当する。遺伝子突然変異、染色体異常および遺伝子配列における変異、例えば一塩基遺伝子多型（SNP）に関する知識は疾患の理解、診断、予防および治療に役立つと考えられる。
【０００４】
最も頻繁には、配列の変異はミニサテライトおよびマイクロサテライト、小規模の挿入または欠失、および、個々の塩基の置換のような反復配列エレメントの長さにおける相違において観察される。一塩基遺伝子多型（SNP）は配列変異の最も一般的な形態を示し；5％を超える人口上の頻度を有する3百万の一般的SNPがヒトゲノム内に存在すると推定されている。フレームシフト突然変異を通常起こす小規模な欠失および挿入は、平均で、ゲノムDNAの各12キロベース中1回起こる（Wang,D.G.ら、Science 280：1077-1082（1998））。これらの多形を指針として用いた遺伝子地図が開発されている（http：//research.marshfieldclinic.org/genetics/；2002年1月10日付けのインターネットアドレス）。
【０００５】
ヒトゲノムの核酸配列は2001年2月に公開され、前例のない解明となった遺伝子地図を与えており、それには数十万のSNPマーカーおよびヒトの疾患に関する情報の潜在的価値が含まれている（Venterら、Science 291：1304-1351（2001）；International Human Genome Sequencing Consortium,Nature 409：860-921（2001））。しかしながら、ヒト染色体内に含まれるDNAの長さは合計で30億塩基対を超えており、各個体のゲノムの配列決定は非現実的である。即ち、疾患の表現型の素因を与える、または誘発するSNPおよび点突然変異の対立遺伝子変異体の存在を迅速に決定するための高スループットの方法を開発することは必須である。個体の生理、精神、聴覚、視覚、神経、薬剤応答、薬剤代謝および薬剤相互作用に影響する機能的多形を特定するための効率的な方法も必要とされている。
【０００６】
幾つかの技術が遺伝子の変異を分析して検出するために広範に使用されており、例えばDNA配列決定、制限断片長多形（RFLP）、DNAハイブリダイゼーション試験、例えばDNAマイクロアレイおよびペプチド核酸分析およびタンパク質切断試験（PTT）が挙げられ、これらは全て限界がある。DNA配列決定は最も決定的な方法であるが、最も時間と経費を要する。コード配列の僅かな一部分が関心事項である場合でも、遺伝子の全コード配列が分析されることが多い。殆どの場合において、何れかの特定の遺伝子の限定された数量の突然変異が疾患の表現型の大部分を説明するものである。
【０００７】
例えば、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子は250,000塩基対に渡る24エクソンからなる（Rommensら、Science 245：1059-1065（1989）；Riordanら、Science 245：1066-73（1989））。現在、嚢胞性線維症の疾患状態に関わる約200突然変異がCFTR遺伝子内に存在している。従って、CFTR遺伝子の読み枠の極めて僅かの部分のみが分析を必要としている。更に、合計10突然変異が全ての既知疾患例の75.1％を閉めている。単一のフェニルアラニン残基F508の欠失が白人の全嚢胞性線維症の66％に相当する。
【０００８】
ハイブリダイゼーション法、例えばサザンブロット、スロットブロット、ドットブロットおよびDNAマイクロアレイは遺伝子変異を検出するために一般的に使用されている（Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Third Edition（2001））。典型的なハイブリダイゼーション試験においては、未知のヌクレオチド配列（「標的」）は、既知ヌクレオチド配列を有する別のフラグメント（「プローブ」）に対するその親和性に基づいて分析される。「ストリンジェントな条件」下で2フラグメントがハイブリダイズする場合、配列は相補的であると考えられ、そして標的フラグメントの配列は「プローブ」配列から推量してよい。
【０００９】
しかしながら、典型的なハイブリダイゼーション試験の結果は解釈が困難である場合が多い。ハイブリダイゼーションシグナルの有無は「ストリンジェントな条件」の定義に依存している。塩の濃度、競合ヌクレオチドフラグメントの有無、非特異的結合を除去するために行われる洗浄の回数、および、ハイブリダイゼーションを行う時間および温度のような幾つかの変数を用いてストリンジェンシーを高めたり低めたりしてよい。一般的に、ハイブリダイゼーション条件は各「標的」ヌクレオチドフラグメントに対して至適化されなければならず、これは時間を要し、高スループットの方法には合致しない。ハイブリダイゼーション試験では高い水準の変動性並びに高い比率の擬陽性が観察される。典型的には、ハイブリダイゼーション試験は可能性のある候補を得るためのスクリーンとして機能するが、陽性の確認はDNA配列分析を必要とする。
【００１０】
突然変異の検出のための幾つかの方法がハイブリダイゼーション分析の原理に基づいて開発されている。例えばプライマー伸長試験においては、目的のヌクレオチドに渡るDNA領域をPCRまたは他の適当な増幅技術により増幅する。増幅後、プライマーを標的核酸配列にハイブリダイズし、そこでプライマーの3'末端の最後のヌクレオチドが分析すべき標的配列上のヌクレオチドの位置に直ちに5'側でアニーリングする。アニーリングしたプライマーは単一の標識されたヌクレオチドトリホスフェートにより伸長される。次に取り込まれたヌクレオチドを検出する。
【００１１】
プライマー伸長試験には幾つかの限界がある。第1に、プライマー伸長の前に目的の領域を増幅しなければならず、これは試験の時間と経費を増大させる。第2に、プライマー伸長の前にPCRプライマーおよびdNTPを完全に除去しなければならず、残存する混在物は結果の適切な分析を妨害する場合がある。第3の試験の最も制約的な局面はプライマーをDNA鋳型にハイブリダイズすることであり、これは各プライマーに対する、そして分析する各配列に対する条件の至適化を要する。ハイブリダイゼーション試験は再現性の程度が低く、非特異性の程度が高い。
【００１２】
ペプチド核酸（PNA）親和性試験は伝統的なハイブリダイゼーション試験の派生型である（Nielsenら、Science 254：1497-1500（1991）；Egholmら、J.Am.Chem.Soc.114：1895-1897（1992）；Jamesら、Protein Science 3：1347-1350（1994））。PNAはワトソンクリック塩基対形成規則に従う構造的DNA模倣体（mimic）であり、標準的なDNAハイブリダイゼーション試験に使用されている。PNAは、PNA/DNAミスマッチがDNA/DNAミスマッチよりも高度に脱安定化し、そして、相補PNA/DNA鎖は相補DNA/DNA鎖よりも強力な結合を形成するため、ハイブリダイゼーション試験においてより高度な特異性を示す。しかしながらPNAを用いた遺伝子分析はなお厄介なハイブリダイゼーション工程を必要とし、そのため、高い水準の非特異性および再現性困難に供する。
【００１３】
最近、遺伝子の変異および多形を検出するためにDNAマイクロアレイが開発された（Tatonら、Science 289：1757-60,2000；Lockhartら、Nature 405：827-836（2000）；Gerholdら、Trends in Biochemical Sciences 24：168-73（1999）；Wallace,R.W.,Molecular Medicine Today 3：384-89（1997）；Blanchard および Hood,Nature Biotechnology 149：1649（1996））。DNAマイクロアレイはガラスまたはナイロンの基盤上に高速ロボットにより加工され、知られた特徴を有するDNAフラグメント（「プローブ」）を含んでいる。マイクロアレイは伝統的な塩基対形成規則に基づいて既知および未知のDNAフラグメント（「標的」）をマッチングさせるために使用される。DNAマイクロアレイの利点は1つのDNAチップが同時に数千の遺伝子に関する情報を提供し得る点である。しかしながら、DNAマイクロアレイはなおハイブリダイゼーションの原理に基づいており、そのため、上記したような不都合な点に供する。
【００１４】
タンパク質切断試験（PTT）もまた遺伝子多形を検出するために一般的に使用されている（Roestら、Human Molecular Genetics 2：1719-1721,（1993）；Van Der Luitら、Genomics 20：1-4（1994）；Hogervorstら、Nature Genetics 10：208-212（1995））。典型的には、PTTにおいては、目的の遺伝子をPCR増幅し、インビトロの転写/翻訳に供し、精製し、そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。PTTはコード配列の大部分をスクリーニングし、終始コドンを与える突然変異を検出するために有用であり、これにより予測されるタンパク質の大きさは大きく低減する。しかしながら、PTTはタンパク質の大きさを大きく変化させない突然変異を検出するためには考案されていない。
【００１５】
即ち、DNA、特に一塩基遺伝子多型または突然変異の一つまたは複数を有することが疑われるゲノムDNAを分析する迅速な方法がなお望まれている。
【発明の開示】
【００１６】
発明の簡単な概要
本発明は関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、前記方法が、（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上で関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を含む段階；（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階を含む方法に関する。
【００１７】
本発明はまた関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、前記方法が、（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含み、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、制限酵素に対する完全な認識部位が鋳型DNAの増幅の際に生じる段階；（b）第2のプライマーおよび鋳型DNAにより発生された完全な認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階を含む方法に関する。
【００１８】
本発明はまた関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、前記方法が、（a）第1および第2のプライマーを用いることによりポリヌクレオチドの鋳型から関心対象の遺伝子座を含むDNAの領域を複製する段階であって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが発生するように、第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を発生させる配列を含む段階；（b）第2のプライマーにより発生した認識部位を認識する制限酵素でDNAを消化することによりDNAフラグメントを生成する段階；（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階を含む方法に関する。
【００１９】
本発明はまた配列決定すべき関心対象の遺伝子座および制限酵素に対する認識部位を含むDNAフラグメントであって、制限酵素による消化によりDNAフラグメント上の5'オーバーハングが生成され、そして、関心対象の遺伝子座および制限酵素認識部位は制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが発生するような相互関係にある上記フラグメントに関する。
【００２０】
鋳型DNAは合成核酸、好ましくは細菌、真菌、ウィルス、植物、原生動物、動物またはヒト起源を含む何れかの起源から得ることができる。1つの態様においては鋳型DNAはヒト起源から得られる。別の態様においては、鋳型DNAは細胞、組織、血液試料、血清試料、血漿資料、尿試料、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物、腹腔液、糞便試料または身体滲出物から得られる。
【００２１】
第1および/または第2のプライマーの3'領域は鋳型DNAとのミスマッチを含むことができる。ミスマッチはこれに限定されないが最後の1、2または3塩基において3'末端で起こることができる。
【００２２】
本発明で使用する制限酵素は認識部位においてDNAを切断できる。制限酵素はPflF I、Sau96 I、ScrF I、BsaJ I、Bssk I、Dde I、EcoN I、Fnu4H I、Hinf IまたはTth111 Iであり得るが、これに限定されない。または、本発明において使用される制限酵素はその認識部位から少し離れてDNAを切断することができる。
【００２３】
別の態様においては、第1のプライマーは制限酵素に対する認識部位を含む。好ましい態様においては、制限酵素認識部位は第2のプライマー上の制限酵素認識部位とは異なる。本発明は第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化することを包含する。
【００２４】
好ましくは、第2のプライマー上の認識部位は、自らの認識部位と少し離れてDNAを切断し、そして、関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを発生させる制限酵素に対するものである。好ましい態様においては、第2のプライマー上の認識部位はIIS型制限酵素に対するものである。IIS型制限酵素は例えば、Alw I、Alw26 I、Bbs I、Bbv I、BceA I、Bmr I、Bsa I、Bst71 I、BsmA I、BsmB I、BsmF I、BspM I、Ear I、Fau I、Fok I、Hga I、Ple I、Sap I、SSfaN IおよびSthi32 Iからなる群より選択され、より好ましくはBceA IおよびBsmF Iである。
【００２５】
1つの態様においては、第2のプライマーの5'領域は鋳型DNAにアニーリングしないか、および/または、第1のプライマーの5'領域は鋳型DNAにアニーリングしない。第1または第2のプライマーの3'領域のアニーリング長は25〜20、20〜15、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4または4塩基未満であることができる。
【００２６】
1つの態様においては、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含むことができる。別の態様においてはPCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3'領域の融解温度近傍である。別の態様においては、PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3'領域の融解温度近傍である。別の態様においては、残余のサイクルのアニーリング温度が第2のプライマーの全配列の融解温度近傍である。
【００２７】
1つの態様においては、第2のプライマーの3'末端は関心対象の遺伝子座に隣接している。
【００２８】
第1および/または第2のプライマーは5'末端においてタグを含むことができる。好ましくは、第1のプライマーは5'末端においてタグを含む。タグは鋳型DNAから増幅されたDNAを分離するために使用できる。タグは標識されたヌクレオチドを含まない増幅されたDNAから標識されたヌクレオチドを含む増幅されたDNAを分離するために用いることができる。タグはこれに限定されないが、放射性同位体、蛍光レポーター分子、化学発光レポーター分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、ビオチン、ビオチンの誘導体、の誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、単独重合体オリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反磁性部分、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分、検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率またはこれらの組み合わせであることができる。好ましくは、タグはビオチンである。ストレプトアビジンマトリックスを用いて鋳型DNAから増幅されたDNAを分離するためにビオチンタグを用いる。ストレプトアビジンマトリックスはマイクロプレートのウェル上にコーティングされる。
【００２９】
本発明の方法におけるヌクレオチドの取り込みはこれに限定されないが、大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T5DNAポリメラ−ゼ、T7DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼ、VentDNAポリメラーゼ、バクテリオファージ29、REDTaq（商標）ゲノムDNAポリメラーゼおよびシーケナーゼ（sequenase）を含むDNAポリメラーゼにより行う。
【００３０】
ヌクレオチドの取り込みは更に標識または未標識のヌクレオチドの混合物を用いることを含むことができる。ヌクレオチド1個、ヌクレオチド2個、ヌクレオチド3個、ヌクレオチド4個、ヌクレオチド5個または5個より多いヌクレオチドを取り込んでよい。標識および未標識のヌクレオチドの組み合わせを取り込むことができる。標識されたヌクレオチドはこれに限定されないがジデオキシヌクレオチドトリホスフェートおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートであることができる。未標識のヌクレオチドはこれに限定されないがジデオキシヌクレオチドトリホスフェートおよびデオキシヌクレオチドトリホスフェートであることができる。標識されたヌクレオチドは、これに限定されないが放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチンの誘導体、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分または検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率のような分子で標識される。好ましくは、標識されたヌクレオチドは蛍光分子により標識される。蛍光標識ヌクレオチドの取り込みは更に、蛍光および未標識のヌクレオチドの混合物を用いることを包含する。
【００３１】
1つの態様において、関心対象の遺伝子座の配列の決定は取り込まれたヌクレオチドを検出することを含む。1つの態様においては、検出はこれに限定されないが、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、蛍光検出、配列決定、ELISA、質量スペクトル分析、飛行時間質量スペクトル分析、四極子質量分析、扇型磁場質量分析、扇型電場質量分析、蛍光分析、赤外スペクトル分析、紫外スペクトル分析、パレンシオスタティック（palentiostatic）電流測定、ハイブリダイゼーション、例えばサザンブロットまたはマイクロアレイにより行う。
【００３２】
好ましい態様においては、関心対象の遺伝子座が一塩基遺伝子多型または突然変異を含むことが疑われる。方法は、目的の複数の遺伝子座の配列を同時に決定するために使用できる。鋳型DNAは単一の染色体に由来する複数の遺伝子座を含むことができる。鋳型DNAは種々の染色体に由来する複数の遺伝子座を含むことができる。鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座は1反応において増幅されることができる。または、鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座の各々が別々の反応において増幅されることができる。増幅されたDNAは増幅されたDNAの消化の前に合わせることができる。関心対象の遺伝子座を含む標識されたDNAの各々は関心対象の遺伝子座の配列の決定の前に分離することができる。1つの態様においては、関心対象の遺伝子座の少なくとも1つは一塩基遺伝子多型または突然変異を含むことが疑われる。
【００３３】
別の態様においては、本発明の方法は単一の個体または複数の個体に由来する目的の複数の遺伝子座の配列を決定するために使用することができる。更にまた、本発明の方法は複数の個体に由来する目的の単一の遺伝子座の配列を決定するために使用することができる。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は特に関心対象の遺伝子座または目的の複数の遺伝子座におけるDNAの配列を迅速に決定するための新しい方法を提供する。何れかの鋳型DNAまたは核酸試料中の関心対象の遺伝子座1〜数百または数千以上のDNA標的の任意の数の配列も、効率的に、正確に、そして、経済的に決定することができる。方法は特に、1個〜数万個以上の遺伝子、遺伝子の領域、遺伝子のフラグメント、一塩基遺伝子多型および単一の染色体または複数の染色体上の突然変異の迅速な配列決定のために有用である。
【００３５】
本発明は関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、前記方法が、（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上で関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが発生するようにその制限酵素に対する認識部位を含む段階；（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階を含む方法に関する。
【００３６】
本発明はまた、関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、前記方法が、（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第1および/または第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含み、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが発生するように、制限酵素に対する完全な認識部位が鋳型DNAの増幅の際に生じる段階；（b）第2のプライマーおよび鋳型DNAにより発生された完全な認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階を含む方法に関する。
【００３７】
DNA鋳型
「関心対象の遺伝子座」とは核酸のより大きい領域内にある核酸の選択された領域を意図する。関心対象の遺伝子座はこれらに限定されないが1〜100、1〜50、1〜20または1〜10ヌクレオチド、好ましくは1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2または1ヌクレオチドを含むことができる。
【００３８】
本明細書においては、「対立遺伝子」とは、遺伝子の幾つかの代替形態の1つまたは染色体上の同じ位置を占めるDNAの非コード領域である。対立遺伝子という用語は何れかの生物、これらに限定されないが細菌、ウィルス、真菌、原生動物、糸状菌、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物および古細菌に由来するDNAを説明する場合に用いることができる。
【００３９】
本明細書においては、個体に関しては、「突然変異体対立遺伝子」とは疾患の状態に関わる変異体対立遺伝子を指すものとする。例えば、細菌は典型的にはDNAの大型鎖1個を有する。細菌のDNAに関する対立遺伝子という用語は、同じ種の異なる細菌の細胞中の同じ遺伝子の形態と比較した場合の1つの細胞中で認められるある遺伝子の形態を指す。
【００４０】
対立遺伝子は同一の配列を持つことができ、或いは、1ヌクレオチドまたは1より多いヌクレオチド異なることができる。各染色体の2コピーを有する生物に関しては、両方の染色体が同じ対立遺伝子を有する場合、その状態はホモ接合であると称される。2染色体における対立遺伝子が異なる場合、その状態はヘテロ接合であると称される。例えば、関心対象の遺伝子座が染色体1上のSNPXであり、そして母方染色体がSNPXにおいてアデニンを含み（A対立遺伝子）、そして父方の染色体がSNPXにおいてグアニンを含む（G対立遺伝子）場合、個体はSNPXにおいてヘテロ接合である。
【００４１】
本明細書においては、「配列（配列決定）（sequence）」とは、ポリヌクレオチド中の1ヌクレオチドまたは1個より多い隣接するヌクレオチドの名称、または名称を決定すること（それぞれ、名詞または動詞として用いられているかどうかによる）を指す。1ヌクレオチド、例えばSNPの場合、「配列」は本明細書においては「名称」と互換である名詞として使用され、そして、「配列決定」は本明細書においては「同定する」と互換に動詞として使用される。
【００４２】
「鋳型」という用語は本発明の増幅のために使用できる何れかの核酸分子を指す。天然には2本鎖ではないRNAまたはDNAは鋳型DNAとして使用されるように2本鎖DNAとすることができる。任意の2本鎖DNAまたは複数の異なる2本鎖DNA分子を含む調製物も、鋳型DNA内に含まれる遺伝子座または関心対象の遺伝子座を増幅するための鋳型DNAとして使用できる。
【００４３】
鋳型DNAを得るための核酸の起源は何れかの生物、これらに限定されないが、ヒトまたは非ヒト、例えば、細菌、ウィルス、酵母、真菌、植物、原生動物、動物、組織、体液（例えば血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、精液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）、糞便物質、個々の細胞の核酸含有の試料、または、これらの核酸を含有するこのような起源の抽出物、および細胞下の構造、例えばミトコンドリアまたはクロロプラストに由来する核酸を含む何れかの適切な起源に由来するものであることができ、その際当技術分野において十分確立されたプロトコルが使用される。核酸はまた、核酸が付着しているか抽出されている法医学的物質、食品、考古学的物質または無機の試料から得ることもできる。好ましい態様においては、核酸は、医学上の症状または疾患を診断できる、または対象をそれらに罹患しやすくするような遺伝子一つまたは複数の存在についてスクリーニングされるヒトまたは動物から得られている。
【００４４】
分析すべき核酸は、何れかの核酸、例えば、ゲノム、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、人工または合成したDNA、例えば独特のDNA配列、および、cDNAのようなRNA試料から逆転写されているDNAであることができる。RNAの配列は、鋳型DNAとして使用されるべき2本鎖DNA型にすることができれば、本発明に従って決定することができる。
【００４５】
「プライマー」および「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、鋳型にアニーリングし、そしてその鋳型のコピーの合成をプライミングするために使用できるオリゴヌクレオチドを論じるために使用される場合は、互換である。
【００４６】
「増幅された」DNAとは、例えばポリメラーゼ連鎖反応により1回または複数回「コピー」されているDNAである。関心対象の遺伝子座の十分な数量のコピーが試験すべき試料中に既に存在しているような大量のDNAが試験できる場合、関心対象の遺伝子座のDNAを更に多数の複製コピーにまで「増幅」する必要はない。むしろ、単に、制限酵素認識部位を2本鎖とすることができるヘアピン構造を含むもののような適切なプライマーのセットを用いて1回鋳型DNAを「コピーする」だけで十分である。
【００４７】
「コピーされたDNA」における「コピー」とは、1回コピーされているDNA、または、1コピーより多く増幅されているDNAを指す。
【００４８】
1つの態様においては、核酸は核酸の起源を含む元の試料中で直接増幅される。核酸を抽出、精製または生成することは必須ではなく；増幅できる形態で提供されればよい。増幅の前のプライマーを用いた核酸のハイブリダイゼーション工程は必要ではない。例えば、増幅は当技術分野においてよく知られた標準的なプロトコルを用いて細胞または試料の溶解物中で行うことができる。固体支持体上、固定された生物学的プレパレーション、または、なんらか別の非DNA物質を含む組成物中にあり、そして、固体支持体または固定されたプレパレーションまたは組成物中の非DNA物質からまず抽出されることなく増幅できるDNAは、そのDNAが適切なプライマーとアニーリングでき、コピーでき、特に増幅でき、そして、コピーまたは増幅された産物が回収でき、本明細書に記載するとおり利用できる限り、更に精製することなく直接使用できる。
【００４９】
好ましい態様においては、核酸は、増幅の前に、当技術分野において知られた方法を用いて、元の試料中に存在する非核酸物質から、抽出、精製または単離される。
【００５０】
別の態様においては、核酸の起源を含む元の試料から抽出、精製または単離され、そして、増幅の前に、酵素的消化、手作業による切断および超音波処理を含む当技術分野においてよく知られた幾つかの方法を用いて核酸をフラグメント化する。例えばDNAは、関心対象の遺伝子座内に存在しない認識部位、特に8塩基または6塩基対の認識部位を有する一つまたは複数の制限酵素で消化することができる。典型的には、DNAは例えば50、100、250、500、1,000、5,000、10,000、50,000および100,000塩基対長を含む任意の所望の長さにもフラグメント化することができる。別の態様においては、DNAは約1000〜2000塩基対の平均長にまでフラグメント化される。しかしながら、DNAをフラグメント化することは必須ではない。
【００５１】
関心対象の遺伝子座を含むDNAのフラグメントは増幅の前に関心対象の遺伝子座を含まないDNAのフラグメントから精製することができる。精製は、関心対象の遺伝子座を含むフラグメントを取り出すためのフックとして増幅で用いられるプライマー（後の「プライマー設計」のセクションを参照されたい）を用いることにより、関心対象の遺伝子座にアニーリングするそのプライマーの能力に基づいて行うことができる。好ましい態様においては、タグ修飾プライマー、例えばビオチニル化プライマーを用いる。追加のタグについては、「増幅されたDNAの精製」のセクションも参照されたい。
【００５２】
関心対象の遺伝子座を含むDNAフラグメントを精製することにより、増幅反応の特異性を向上することができる。これにより、鋳型DNAの非特異的領域の増幅を最小限にできる。DNAフラグメントの精製はまた、マルチプレックスPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）または複数の目的遺伝子座の増幅を、向上した特異性をもって行えるようにする。
【００５３】
1つの態様においては、核酸試料は、例えば所定の遺伝子座または関心対象の遺伝子座の配列を本発明の方法を用いて決定するなど、所望の目的を念頭において得られる。例えば、核酸は、対象が罹患しやすい、または治療を要する症状または疾患一つまたは複数、または、特定の一塩基遺伝子多型の存在を同定する目的のために得られる。別の態様においては、DNAが特定の細菌または真菌の微生物、または個体に由来するものであることが、DNA配列マーカーの存在により明らかになる前記DNA配列マーカー一つまたは複数の有無についてスクリーニングするために試料を得る。
【００５４】
配列決定すべき関心対象の遺伝子座は配列のみに基づいて選択することができる。ヒトにおいては、142万個を超える一塩基遺伝子多型（SNP）が報告されている（Nature 409：928-933(2001)；The SNP Consortium LTD）。平均して、ヒトゲノムの各1.9kb当たり1個のSNPが存在する。しかしながら、関心対象の遺伝子座の間の距離は本発明により配列決定するべき関心対象の遺伝子座の選択の際には考慮する必要はない。ゲノムDNA上1個より多い関心対象の遺伝子座を分析しようとする場合、選択された関心対象の遺伝子座は同じ染色体上、または、異なる染色体上にあることができる。
【００５５】
好ましい態様においては、増幅すべき配列の長さは好ましくは関心対象の遺伝子座が大きさにより分離できるように、目的の各遺伝子座につき異なっている。
【００５６】
実際、遺伝子配列全体をコピーするプライマーを利用する必要がないという点が本発明の利点である。むしろコピーされた関心対象の遺伝子座は好ましくは全遺伝子の僅かな部分のみである。遺伝子全体の配列を決定することは、費用を増大させ、結果を遅延させるため都合が悪い。遺伝子内の所望の塩基または関心対象の遺伝子座のみを配列決定すれば、最も高速に最小限の費用内で最大数の関心対象の遺伝子座を測定できるようなるため、方法の全体的効率を最大限にする。
【００５７】
多数の配列をともに分析できることから、本発明の方法は多数の個々の試料の大規模スクリーニングに特に適している。
【００５８】
任意の数量の目的遺伝子座も、本発明の方法を用いて特に同時に、分析および処理することができる。1つの関心対象の遺伝子座または複数の関心対象の遺伝子座において同時に配列を決定するために試料を分析することができる。例えば、疾患関連遺伝子内の10または20箇所の最も頻繁に生じる突然変異部位を配列決定することにより疾患保有者の大多数を検出することができる。
【００５９】
あるいは、2、3、4、5、6、7、8、9、10〜20、20〜25、25〜30、30〜35、35〜40、40〜45、45〜50、50〜100、100〜250、250〜500、500〜1,000、1,000〜2,000、2,000〜3,000、3,000〜5,000、5,000〜10,000、10,000〜50,000または50,000を上回る多くの関心対象の遺伝子座を、全面的なゲノムスクリーニングが望まれる場合には同時に分析することができる。このような全面的なゲノムスクリーニングは、特定の微生物または個体を同定するため、または、SNP遺伝子タイピングのための遺伝子指紋を得るために本発明の方法を用いる場合に望ましいものである。
【００６０】
関心対象の遺伝子座の複数を種々の生物由来の標的とすることができる。例えば、治療を要する植物、動物またはヒトの対象は病原体一つまたは複数による感染の症状を有する場合がある。このような植物、動物またはヒトの対象から得た核酸試料は、その病原体を診断可能とする関心対象の遺伝子座があれば、その配列を決定することにより同時に複数の疑われる、または可能性のある病原体の存在を分析することができる。このような診断可能な配列の対象内の存在は症状の原因を迅速に特定するのみならず、検出されない他の病原体を除外することもできる。このようなスクリーニングを用いることにより生物または環境全体にわたり病原体が蔓延している程度を評価することができる。同様の方法において、遺伝子的異常に起因する疾患を有することが疑われる個体に由来する核酸を、疾患をもたらす既知突然変異の一部または全部、またはより一般的な突然変異一つまたは複数について分析することができる。
【００６１】
本発明の方法は生物の遺伝子的性質の一体性をモニタリングするために使用することができる。例えば、酵母の試料を発酵過程の種々の時点において種々のバッチから採取し、その存在または同一性を本明細書に提供したそのゲノム配列の迅速分析により、所望の菌株と比較することができる。
【００６２】
コピーされるべき関心対象の遺伝子座はコード配列内またはコード配列外にあることができる。好ましくは、コピーされるべき関心対象の遺伝子座一つまたは複数が遺伝子内にある。好ましい態様においては、コピーされる鋳型DNAはイントロンまたはエクソンの何れかであるゲノムコード配列内にある関心対象の遺伝子座である。高度に好ましい態様においては、エクソンDNA配列をコピーする。関心対象の遺伝子座は、突然変異が疾患を起こすか、疾患状態となる傾向を高めることがわかっているような部位であることができる。関心対象の遺伝子座は一塩基遺伝子多型の部位であることができる。または、コピーされるべき関心対象の遺伝子座はコード配列の外部、例えば、転写調節領域、特にプロモーター、エンハンサーまたはリプレッサーの配列内にあることができる。
【００６３】
プライマー設計
コンセンサス配列を含む公開された配列を用いて鋳型DNAの増幅に用いるプライマーを設計または選択することができる。関心対象の遺伝子座にフランキングするプライマーの構築のために用いるべき配列の選択は、関心対象の遺伝子座またはそれに接する配列の検討により行うことができる。ヒトゲノムの細菌公開された配列は、有用なコンセンサス配列の情報源となり、これより所望のヒト遺伝子の関心対象の遺伝子座にフランキングするプライマーを設計できる。
【００６４】
関心対象の遺伝子座に「フランキングする」とは、1つのプライマーの3'領域の少なくとも一部が鋳型DNAのアンチセンス鎖および関心対象の遺伝子座の上流に相補的であり（フォワードプライマー）そして他方のプライマーの3'領域の少なくとも一部が鋳型DNAのセンス鎖および関心対象の遺伝子座の下流に相補的である（リバースプライマー）ようなプライマーの配列であることを意味する。「プライマー対」とはフォワードプライマーとリバースプライマーの対を特定するものである。プライマー対の両方のプライマーは、伸長により関心対象の遺伝子座の領域において鋳型DNAが増幅できるように、プライマーの伸長を可能とする様式でアニーリングする。
【００６５】
プライマーは広範な種類の方法、これらに限定されないが適切な配列のクローニングおよび当技術分野においてよく知られた方法を用いた直接の化学合成により調製することができる（Narangら、Methods Enzymol.68：90（1979）；Brownら、Methods Enzymol.68：109（1979））。プライマーはまたオペロンテクノロジー、アマーシャムファルマシアバイオテク、シグマおよびライフテクノロジーのような販売元から得ることもできる。プライマー対のプライマーは同じ長さを有することができる。または、プライマー対の一方のプライマーがプライマー対の他方のプライマーより長いこともできる。プライマーは同じ融解温度を有することができる。プライマーの長さを5'末端または3'末端において伸ばすか短くすることにより、所望の融解温度を有するプライマーを作成できる。好ましい態様においては、プライマー対内のプライマーの3'アニーリング長は異なっている。更に、プライマー対の配列および長さが所望の融解温度を与えるように各プライマー対のアニーリング位置を設計することもできる。25塩基対より小さいプライマーの融解温度を決定するための最も単純な等式はWallaceの法則（Td＝2（A＋T）＋4（G＋C））である。プライマーの設計にはコンピュータープログラムを使用することもでき、これらに限定されないがアレイデザイナーソフトウエア（Arrayit Inc.）、遺伝子分析用オリゴヌクレオチドプローブ配列デザインソフトウエア（Olympus Optical Co.）、NetPrimerおよびHitachi Software EngineeringのDNAsisが挙げられる。各プライマーのTM（融解温度またはアニーリング温度）はNetPrimerのようなソフトウエアを用いて計算する（インターネットを基盤とした無料プログラム、http：//premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html（2002年2月13日のインターネットアドレス）。
【００６６】
別の態様においては、プライマーのアニーリング温度は増幅の何サイクルか、これらに限定されないがサイクル1、2、3、4、5、サイクル6〜10、サイクル10〜15、サイクル15〜20、サイクル20〜25、サイクル25〜30、サイクル30〜35またはサイクル35〜40の後に再計算して高めることができる。増幅の初回サイクルの後、プライマーの5'半分を各関心対象の遺伝子座の産物内に取り込み、これにより、各プライマーの5'半分および3'反部の配列の両方に基づいてTMを再計算することができる。
【００６７】
例えば、図1Bにおいて、増幅の第1サイクルは13塩基である鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3'領域（領域「c」）の融解温度近傍で行う。第1サイクルの後、アニーリング温度は、鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3'領域（領域「b」）の融解温度近傍であるTM2にまで上昇させることができる。第2のプライマーは、それが元のDNA鋳型中の13塩基にアニーリングできるのみであり、そして、TM2は第1のプライマーの3'アニーリング領域である約20塩基の融解温度近傍であるため、元の鋳型DNAには結合できない（図1C）。しかしながら、第1のプライマーは反応の第1のサイクルにおいてコピーされたDNAに結合できる。第3のサイクルにおいては第2のプライマーの全配列（「c」および「d」）の融解温度の近傍であるTM3までアニーリング温度を上昇させる。PCRの第2のサイクルで生成した鋳型DNAは領域c'およびd'の両方を含み、従って、第2のプライマーはTM3においてアニーリングし、伸長することができる（図1D）。残余のサイクルはTM3で実施する。第1のプライマーの全配列（a＋b'）はPCRの第3のサイクルで得られる鋳型にアニーリングでき、そして伸長する（図1E）。アニーリング温度を上昇させることは、非特異的結合を低減し、反応の特異性を高めることであり、これは3×109塩基対を含むヒトゲノムDNAから関心対象の遺伝子座を増幅する場合に特に有用である。
【００６８】
本明細書においては、アニーリング温度に関する「近傍」という用語は、記載した温度の10℃以内の温度を包含するために使用する。
【００６９】
1つの態様においては、関心対象の遺伝子座の各々につき1プライマー対を用いる。しかしながら、関心対象の遺伝子座の各々につき複数のプライマー対を用いることもできる。
【００７０】
1つの態様においては、プライマー対の一方または両方のプライマーが制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）一つまたは複数に対する5'領域における配列を含むようにプライマーを設計する。
【００７１】
本明細書においては、制限酵素がDNAを消化する位置に関しては、「センス」鎖は制限酵素が切断する方向に5'から3'を読みとる鎖である。例えばBsmF Iは以下の配列を認識する。
5'GGGAC（N）10↓3'（配列番号：1）または
3'CCCTG（N）14↑5'
5'↓（N）14GTCCC3'（配列番号：2）
3'↑（N）10CAGGG5'
【００７２】
即ち、センス鎖は制限酵素が切断する方向に5'から3'を読み取るため「GGGAC」配列を含む鎖である。
【００７３】
本明細書においては、制限酵素がDNAを消化する位置に関しては、「アンチセンス」鎖は制限酵素が切断する方向に3'から5'を読みとる鎖である。即ち、アンチセンス鎖はそれが3'から5'を読み取るため、「ccctg」を含む鎖である。
【００７４】
本発明においては、プライマー対のプライマーの一方は、制限酵素による消化により陥凹3'末端および関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが形成されるように制限酵素に対する制限酵素認識部位を含むように設計することができる（本明細書においては「第2のプライマー」と証する）。例えば、プライマー対の第2のプライマーは認識部位ではDNAを切断できないが、認識部位から「n」ヌクレオチド離れて切断できる制限酵素に対する認識部位を含むことができる。「N」は認識部位から制限酵素による切断の部位までの距離である。認識配列が制限酵素BceAIに対するものである場合、酵素はセンス鎖上の認識部位から10ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖上の認識部位から12ヌクレオチド離れて切断する。
【００７５】
プライマーの3'領域、そして好ましくは3'半分は関心対象の遺伝子座にフランキングする配列にアニーリングするように設計される（図1A）。第2のプライマーは、このプライマー上の制限酵素認識部位を認識する制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じる限り、関心対象の遺伝子座からどのような距離でアニーリングしてもよい。5'オーバーハングはどのような大きさであることもでき、これらに限定されないが、1、2、3、4、5、6、7、8塩基および8塩基を超えてもよい。
【００７６】
好ましい態様においては、第2のプライマーの3'末端は関心対象の遺伝子座から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14塩基または14塩基を超えて、または、関心対象の遺伝子座においてアニーリングすることができる。
【００７７】
好ましい態様において、第2のプライマーはプライマー対のもう一方のプライマーよりも関心対象の遺伝子座に対してより近接してアニーリングするように設計される（もう一方のプライマーとは本明細書においては「第1のプライマー」と称する）。第2のプライマーはフォワードまたはリバースプライマーであることができ、かつ、第1のプライマーはそれぞれリバースまたはフォワードプライマーであることができる。第1または第2のプライマーがフォワードまたはリバースプライマーであるかどうかは、どちらの設計が良好な配列決定結果を与えるかにより決定できる。
【００７８】
例えば、関心対象の遺伝子座により近接してアニーリングするプライマーはセンス鎖上の認識部位から10ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖上の認識部位から14ヌクレオチドで切断する制限酵素BsmF Iに対する認識部位を含むことができる。この場合、プライマーは、制限酵素認識部位が関心対象の遺伝子座から13塩基、12塩基、10塩基または11塩基であるように設計することができる。認識部位が関心対象の遺伝子座から13塩基である場合、BsmF Iによる消化では5'オーバーハング（RXXX）が生じ、ここでで関心対象の遺伝子座（R）はオーバーハング（3'から5'に読む）の最初のヌクレオチドであり、Xは任意のヌクレオチドである。認識部位が関心対象の遺伝子座から12塩基である場合は、BsmF Iによる消化で5'オーバーハング（XRXX）が生じ、ここで関心対象の遺伝子座（R）はオーバーハング（3'から5'に読む）の2番目のヌクレオチドである。認識部位が関心対象の遺伝子座から11塩基である場合は、BsmF Iによる消化で5'オーバーハング（XXRX）が生じ、ここで関心対象の遺伝子座（R）はオーバーハング（3'から5'に読む）の3番目のヌクレオチドである。制限酵素認識部位と関心対象の遺伝子座との間の距離は、制限酵素による消化が目的の遺伝子を含む5'オーバーハングを生じるように設計することができる。認識部位と関心対象の遺伝子座との間の効果的な距離は制限酵素の選択に応じて変化する。
【００７９】
別の態様においては、第1のプライマーと比較して関心対象の遺伝子座により近接してアニーリングできる第2のプライマーは、関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを生じさせる制限酵素が関心対象の遺伝子座におけるヌクレオチドとは無関係に切断部位において同じ配列に会合するように設計することができる。例えば、制限酵素BsmF Iに対する認識部位（5'GGGAC3'）が関心対象の遺伝子座から13塩基にあるように関心対象の遺伝子座により近接してアニーリングするプライマーを設計する場合は、制限酵素は関心対象の遺伝子座の上流1塩基のアンチセンス鎖を切断する。関心対象の遺伝子座におけるヌクレオチドは切断部位に隣接し、そしてDNA分子ごとに異なっていてよい。切断部位に隣接するヌクレオチドが同一であることが望まれる場合、BsmF Iに対する制限酵素認識部位が関心対象の遺伝子座から12塩基離れるようにプライマーを設計することができる。BsmF Iを用いた消化により5'オーバーハングが生じ、これにおいては関心対象の遺伝子座はオーバーハング（3'から5'に読む）の第2の位置にあり、もはや切断部位に隣接していない。制限酵素認識部位が関心対象の遺伝子座から12塩基にあるようにプライマーを設計することにより、関心対象の遺伝子座におけるヌクレオチドとは無関係に切断部位に隣接するヌクレオチドを同一のものとすることができる。更にまた、制限酵素認識部位が関心対象の遺伝子座から11または10塩基にあるように設計されているプライマーは、関心対象の遺伝子座におけるヌクレオチドとは無関係に、切断部位に隣接するヌクレオチドを同一のものとすることができる。
【００８０】
第1のプライマー（フォワードまたはリバースの何れか）の3'末端は関心対象の遺伝子座から選択された距離でアニーリングするように設計することができる。好ましくは、この距離は関心対象の遺伝子座から10〜25、25〜50、50〜75、75〜100、100〜150、150〜200、200〜250、250〜300、300〜350、350〜400、400〜450、450〜500、500〜550、550〜600、600〜650、650〜700、700〜750、750〜800、800〜850、850〜900、900〜950、950〜1000および1000塩基よりも多く離れている。第1のプライマーのアニーリング部位は、各々逐次的に上流のプライマーが更に対応する下流のプライマーから離れるように選択される。
【００８１】
例えば、関心対象の遺伝子座1において第1および第2のプライマーの3'末端がZ塩基離れている場合、関心対象の遺伝子座2において、上流および下流のプライマーの3'末端はZ＋K塩基離れており、ここで、K＝1、2、3、4、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜200、200〜300、300〜400、400〜500、500〜600、600〜700、700〜800、800〜900、900〜1000または1000塩基よりも大きい（図2）。上流のプライマーをますます対応する下流のプライマーから離れさせる目的は、関心対象の遺伝子座の全てのPCR産物の大きさを異なるものとし、例えば配列決定ゲル上で分離可能とすることである。これにより、後の工程においてPCR産物を合わせることによりマルチプレックス化が可能となる。
【００８２】
1つの態様においては、第1のプライマーの5'領域は制限酵素の何れかの種類に対する認識部位を有することができる。好ましい態様においては、第1のプライマーは第2のプライマーにおける制限酵素認識部位とは異なる制限酵素認識部位を少なくとも1個を有する。別の好ましい態様においては、第1のプライマーは第2のプライマーよりも関心対象の遺伝子座から更に離れてアニーリングする。
【００８３】
好ましい態様においては、第2のプライマーは、2塩基の5'オーバーハングおよび4塩基の5'オーバーハングをそれぞれ精製するBceA IおよびBsmF IのようなIIS型の制限酵素に対する制限酵素認識配列を含むが、それに限定されない。IIS型である制限酵素が好ましい理由は、それらが非対称の塩基配列を認識するためである（オーソドックスなII型の酵素のようにパリンドロームではない）。IIS型制限酵素は、認識部位の外側、典型的には認識部位の外側20塩基までである特定の位置においてDNAを切断する。これらの特性によりIIS型制限酵素およびその認識部位は、本発明の方法において特に有用である。好ましくは、本方法において使用されるIIS型制限酵素は5'オーバーハングおよび陥凹3'末端を与える。
【００８４】
広範な種類のIIS型制限酵素が知られており、このような酵素は真核生物藻類の細菌、ファージ、古細菌およびウィルスから単離されており、そして、市販されている（Promega,Madison WI；New England Biolabs,Beverly,MA；Szybalski W.ら、Gene 100：13-16,（1991））。本発明の方法において有用であるIIS型制限酵素の例は表Iに示すものを包含するがこれらに限定されない。
【００８５】
（表I）5'オーバーハングおよび陥凹3'末端を生じるIIS方制限酵素
2006523082.tif 000002
【００８６】
1つの態様においては、プライマー対は、1つの制限酵素に対して唯一である制限酵素認識部位を与えるプライマーの各々の5'領域に配列を有する。
【００８７】
別の態様においては、プライマー対は1種より多い制限酵素、そして特に1種より多いIIS型制限酵素により認識される認識部位を与えるプライマーの各々の5'領域に配列を有する。例えば、特定のコンセンサス配列は1種より多い酵素により認識されることができる。例えば、BsgI、Eco57IおよびBpmIは全て、コンセンサス5'（G/C）TgnAG3'を認識し、アンチセンス鎖上で16bp、およびセンス鎖上で14bp離れて切断する。このようなコンセンサス配列を与えるプライマーは制限酵素BsgI、Eco57IおよびBpmIの任意のものよって認識され得る部位を有する産物を与える。
【００８８】
認識部位からある距離でDNAを切断し陥凹3'末端および5'オーバーハングを生成する他の制限酵素にはIII型制限酵素が包含される。例えば、制限酵素EcoP15Iは配列5'CAGCAG3'を認識し、センス鎖上の下流25塩基およびアンチセンス鎖上の27塩基で切断する。更にまた当業者の知るとおり、新しい制限酵素がなお発見され続けており、本発明における使用に容易に適用できる。
【００８９】
別の態様においては、第2のプライマーは制限酵素の認識配列の一部を含むことができ、その場合、制限酵素の認識部位全体は、制限酵素を用いた消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるような鋳型DNAの増幅により生じさせる。例えば、BsmF Iに対する認識部位は5'GGGACN10↓3'である。第2のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域はヌクレオチド「GGG」で終わることができ、これは鋳型DNAと相補的である必要はない。3'アニーリング領域が約10〜20塩基である場合、最後の3塩基がアニーリングしない場合であっても、プライマーは伸長し、かつBsmF I部位が生じる。
2006523082.tif 000003
【００９０】
第2のプライマーは鋳型DNAにアニーリングするように設計することができ、この場合、鋳型DNAの次の2塩基はチミジンおよびグアニンであり、これによりアデノシンおよびシトシンがプライマーに取り込まれ、BsmF Iに対する認識部位、5'GGGACN10↓3'が形成できる。第2のプライマーは、BsmF Iを用いた消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるような様式でアニーリングするように設計できる。
【００９１】
別の態様においては、第2のプライマーは制限酵素の認識部位の全体または全長、または、認識部位で切断する制限酵素を用いた消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを生じさせるような鋳型DNAの増幅により全認識部位を生じる認識部位の一部を含むことができる。例えば、制限酵素BsaJ Iは以下の認識部位、5'C↓CN1N2GG3'に結合する。第2のプライマーはプライマーの3'領域が「CC」で終わるように設計することができる。目的のSNPは「N1'」により表され、SNPの下流の鋳型配列は「N2'CC」である。
2006523082.tif 000004
【００９２】
BsaJ Iで消化した後、以下の配列の5'オーバーハングが生じる。
2006523082.tif 000005
【００９３】
ヌクレオチドグアニンが関心対象の遺伝子座において報告されない場合、3'陥凹末端はオーバーハングの最初のヌクレオチドに相補的な未標識のシトシンでフィルインすることができる。過剰なシトシンを除去した後、標識されたddNTPを用いることにより、関心対象の遺伝子座を示す次のヌクレオチドN1'をフィルインできる。または、グアニンが関心対象の遺伝子座における潜在的ヌクレオチドとして報告される場合は、標識されたヌクレオチドを用いて関心対象の遺伝子座の3'のヌクレオチドを検出することができる。未標識のdCTPを「フィルイン」に使用し、その後標識されたヌクレオチドである別のそのシトシンでフィルインすることができる。シトシンは相補ではない塩基にそれが到達するまで取り込まれる。関心対象の遺伝子座がグアニンを含んでいた場合、それはdCTPでフィルインされ、これにより標識されたヌクレオチドの取り込みが可能となる。しかしながら、関心対象の遺伝子座がグアニンを含有していなかった場合は、標識されたヌクレオチドは取り込まれない。他の制限酵素、これらに限定されないが
2006523082.tif 000006
を使用することができる。
【００９４】
第2のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域は鋳型DNAに100％相補的である必要はない。例えば第2のプライマーの3'末端の最後の1、2または3ヌクレオチドは鋳型DNAとミスマッチであることができる。鋳型DNAにアニーリングするプライマーの領域はそのプライマーをターゲティングし、プライマーを伸長させる。例えば最後の2つのヌクレオチドが鋳型DNAに相補でない場合であっても、プライマーは伸長し、制限酵素認識部位を生じさせる。
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【００９５】
BsaJ Iで消化した後、以下の配列の5'オーバーハングが生じる。
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【００９６】
ヌクレオチドシトシンが関心対象の遺伝子座において報告されない場合、5'オーバーハングは未標識のシトシンによりフィルインすることができる。過剰なシトシンを漱ぎ出し、標識されたddNTPでフィルインできる。取り込まれる最初のヌクレオチド（N1）は関心対象の遺伝子座に相当する。
【００９７】
あるいは、第1および第2のプライマーを使用して完全な制限酵素認識配列を生成することも可能である。認識部位が少なくとも1個の可変ヌクレオチドを含む限り任意の制限酵素に対する認識部位を生じさせることができる。少なくとも1個の可変ヌクレオチドを含む部位を認識する制限酵素は、これらに限定されないが
2006523082.tif 000009
である。本態様においては、第1またはび第2のプライマーは関心対象の遺伝子座により近接してアニーリングするか、または第1もしくは第2のプライマーは関心対象の遺伝子座から等しい距離においてアニーリングしてよい。第1および第2のプライマーは3'末端において鋳型DNAに対するミスマッチを含むように設計することができ、このようなミスマッチは制限酵素認識部位を生成する。3'末端において認容されるミスマッチの数はプライマーの長さにより異なり、かつ1、2または2個より多いミスマッチを含むがこれらに限定されない。例えば、関心対象の遺伝子座がN1'により表される場合は、第1のプライマーは領域「a」として以下に示す鋳型DNAに相補的となるように設計することができる。第1のプライマーの3'領域は「CC」で終わり、これは鋳型DNAに相補的ではない。第2のプライマーは領域「b」として以下に示す鋳型DNAに相補的となるように設計することができる。第2のプライマーの3'領域は「CC」で終わり、これは鋳型DNAに相補的ではない。
2006523082.tif 000010
【００９８】
1ラウンドの増幅の後、以下の産物、即ち、
2006523082.tif 000011
および、
2006523082.tif 000012
が生じる。
【００９９】
サイクル2において、プライマーはPCRの第1のサイクルから生じた鋳型、即ち、
2006523082.tif 000013
にアニーリングすることができる。
【０１００】
PCRのサイクル2の後、以下の産物が生じる。
2006523082.tif 000014
【０１０１】
BsaJ Iに対する制限酵素認識部位が生じ、BsaJ Iを用いた消化の後、関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じる。関心対象の遺伝子座は以下に詳述するとおり検出することができる。または、第1および第2のプライマーの3'領域は、1、2、3または3個より多いミスマッチ、そしてその後に鋳型DNAに相補的なヌクレオチドを含むことができる。例えば、第1および第2のプライマーは、以下のDNA配列：5'CCTNN↓NNNAGG3'に結合する制限酵素EcoN Iに対する認識部位を生成するために使用することができる。各プライマーの最後のヌクレオチドは「CCTN1またはCCTN1N2」となる。ヌクレオチド「CCT」は鋳型DNAに相補的であっても無くてもよいが、N1およびN2は鋳型DNAに相補的なヌクレオチドである。これによりプライマーは潜在的ミスマッチ後に鋳型DNAへのアニーリングが可能となり、これを用いて制限酵素認識部位を生成する。
【０１０２】
別の態様においては、プライマー対は制限酵素2種以上により認識される認識部位2個以上を与えるプライマーの各々の5'領域における配列を有する。
【０１０３】
最も好ましい態様においては、プライマー対は、望ましくない配列が存在する場合はこれを切断除去するために異なる制限酵素が必要となるように、5'領域、特に5'末端において異なる制限酵素認識部位を有している。例えば、関心対象の遺伝子座「A」に対する第1のプライマーは、任意の種類の制限酵素であることもできる制限酵素「X」により認識される配列を含むことができ、かつ、関心対象の遺伝子座により近接してアニーリングする関心対象の遺伝子座「A」に対する第2のプライマーは、「n」ヌクレオチド離れて切断し5'オーバーハングおよび陥凹3'末端を与えるIIS型制限酵素である制限酵素「Y」に対する配列を含むことができる。5'オーバーハングは関心対象の遺伝子座を含む。増幅されたDNAをストレプトアビジンコーティングウェルに結合した後、酵素「Y」を用いて消化し、漱ぎ、次に標識されたヌクレオチドでフィルインし、そして漱ぎ、そして次に固体マトリックスから関心対象の遺伝子座を含むDNAフラグメントを放出させる制限酵素「X」を用いて消化する。関心対象の遺伝子座は、関心対象の遺伝子座、例えばSNP部位において「フィルイン」された標識ヌクレオチドを検出することにより分析できる。
【０１０４】
別の態様においては、本発明により増幅される異なる関心対象の遺伝子座に対する第2のプライマーは、同じ制限酵素に対する5'領域中の認識配列を含み、そして同様に、第1のプライマーは全て、第2のプライマーを認識する酵素とは異なる酵素である同様の制限酵素認識部位を含む。関心対象の遺伝子座により近接してアニーリングするプライマー（フォワードまたはリバースプライマー）は、例えばIIS型制限酵素に対する認識部位を含む。
【０１０５】
別の態様において、本発明により増幅される複数の関心対象の遺伝子座に対する第2のプライマーは、異なる制限酵素に対する5'領域における制限酵素認識配列を含む。
【０１０６】
別の態様において、本発明により増幅される複数の関心対象の遺伝子座に対する第1のプライマーは、異なる制限酵素に対する5'領域における制限酵素認識配列を含む。
【０１０７】
複数制限酵素配列は合わせられた関心対象の遺伝子座が固体支持体から放出される順序に影響する機会を与える。例えば、関心対象の遺伝子座50個を増幅する場合、第1のプライマーは精製を目的とした最も5'末端におけるタグおよび制限酵素認識部位を有し、かつ、第2のプライマーはIIS型制限酵素に対する認識部位を含むことができる。例えば、第1のプライマーの幾つかは、EcoR Iに対する制限酵素認識部位を有することができ、別の第1のプライマーはPst Iに対する認識部位を有することができ、そして更に別の第1のプライマーはBamH Iに対する認識部位を有することができる。増幅の後、第1のプライマー上のタグを用いて関心対象の遺伝子座を固体支持体に結合させることができる。1回に1種の制限酵素で制限消化を行うことにより、増幅された関心対象の遺伝子座を順次放出させることができる。初回の消化をEcoRIで行う場合、EcoR Iに対する認識部位を含む第1のプライマーで増幅された関心対象の遺伝子座が放出され回収されるが、一方、他の関心対象の遺伝子座は固体支持体に結合したままとなる。増幅された関心対象の遺伝子座は、1回に1種の制限酵素で消化することにより、選択的に固体支持体から放出することができる。第1のプライマー中種々の制限酵素認識部位を使用することにより、より多数の関心対象の遺伝子座を単一の反応チューブにおいて増幅できるようになる。
【０１０８】
好ましい態様においては、各プライマーの制限酵素認識部位の任意の領域5'を、フラグメントの操作、処理、同定および/または精製を可能にする官能基で修飾することができる。このような官能基、またはタグの例はビオチン、ビオチンの誘導体、誘導体、炭水化物、ハプテン、染料、放射性分子、抗体および抗体フラグメント、ペプチドおよび免疫原性分子を含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
別の態様において、鋳型DNAは、1ラウンドの複製を超えて増幅されること無く、1回複製することができる。これは試料中に既に関心対象の遺伝子座のコピー多数が存在し、それ以上のコピーが必要ないような分析に使用できるDNAが大量に存在する場合に有用である。本態様においては、プライマーは好ましくは、配列が逆行重複してその内部の配列に相補的様式にアニーリングするような5'領域内の「ヘアピン」構造を含むように設計される。鋳型DNAが1回のみ複製される場合、認識部位を含むDNA配列は、「ヘアピン」構造の場合を除き1本鎖となる。しかしながら、ヘアピン構造の存在下では、その領域は効果的に2本鎖となり、これにより制限酵素による活性に対する2本鎖基質を与える。
【０１１０】
反応条件が適合する範囲において、DNAの関心対象の遺伝子座を分析するための全てのプライマー対を混合して本発明の方法において使用することができる。好ましい態様においては、全プライマー対を単一の反応容器中で鋳型DNAと混合する。このような反応容器は例えば反応チューブまたはマイクロプレートのウェルであることができる。
【０１１１】
あるいは、ヌクレオチドの競合を回避し、プライマーの2量体およびプライマーに対するアニーリング温度の困難を最小限とするために、各々の関心対象の遺伝子座または関心対象の遺伝子座の小集団を別の反応チューブまたはウェルにおいて増幅し、そして産物は所望により後に合わせることもできる。例えば、別々の反応を単一の反応容器に合わせた後に関心対象の遺伝子座またはSNP部位を含む5'オーバーハングおよび3'陥凹末端を生じさせる制限酵素で消化することができる。好ましくは、各プライマー対のプライマーは等モル量で与えられる。更にまた、特に好ましくは、異なるプライマー対の各々を、使用される他の対に対して等モル量で与える。
【０１１２】
別の態様においては、対応する関心対象の遺伝子座の効率的な増幅を可能にするプライマー対の組み合わせを使用することができる（例えば図2参照）。このような組み合わせは本発明の方法において使用する前に決定することができる。マルチウェルプレートおよびPCR装置を用いることにより相互に良好に作用するプライマー対を選択することができる。例えばEppendorf Mastercycler（登録商標）グラジエントPCR装置のようなグラジエントPCR装置を使用して各プライマー対に対する至適アニーリング温度を選択することができる。同様の特性を有するプライマー対を単一の反応チューブ内でともに使用することができる。
【０１１３】
別の態様においては、多試料容器、例えば96穴以上のプレートを用いることにより、複数の鋳型DNA試料から同じプライマー対を用いて単一の関心対象の遺伝子座をその関心対象の遺伝子座に対する至適PCR条件を用いて増幅することができる。または、別々の多試料容器を関心対象の遺伝子座の各々の増幅のために使用し、各鋳型DNA試料の産物を後に合わせることもできる。例えば、96種類のDNA試料に由来する遺伝子Aをマイクロプレート1中で増幅し、96種のDNA試料に由来する遺伝子Bをマイクロプレート2中で増幅するなどし、そしてその後、増幅産物を合わせることができる。
【０１１４】
複数の関心対象の遺伝子座の増幅の結果は関心対象の遺伝子座の各々の配列を有する代表的なPCR産物を含む調製物である。例えば、1個体のみに由来するDNAを鋳型DNAとして用い、そして、鋳型DNAから疾患関連の関心対象の遺伝子座数百を増幅する場合、増幅されたDNAは関心対象の遺伝子座の各々からの小型のPCR産物の混合物となる。このような調製物をその時点で更に分析して関心対象の遺伝子座の各々における、または、関心対象の遺伝子座の僅か一部における配列を決定する。更にまた、調製物はDNAを保存する様式で保存し、後に分析することもできる。増幅されたDNAに含まれる情報は、蛍光検出、配列決定、ゲル電気泳動および質量スペクトル分析を含むがこれらに限定されない何れかの適当な方法で明らかにすることができる（後述する「取り込まれたヌクレオチドの検出」のセクションを参照されたい）。
【０１１５】
関心対象の遺伝子座の増幅
鋳型DNAは当技術分野において知られた何れかの適当な方法を用いて増幅することができ、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、3SR（セルフサステインド配列反応）、LCR（リガーゼ連鎖反応）、RACE-PCR（cDNA末端の迅速増幅）、PLCR（ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応の組み合わせ）、Q-βファージ増幅（Shahら、J.Medical Micro.33：1435-41（1995））、SDA（鎖置換増幅）、SOE-PCR（スプライスオーバーラップ伸長PCR）等が挙げられるがこれらに限定されない。これらの方法を用いて本出願で詳述した放出可能なプライマー媒介サイクル型増幅反応の変法を設計できる。最も好ましい態様においては、鋳型DNAはPCRを用いて増幅する（PCR：A Practical Approach,M.J.McPherson,ら、IRL Press （1991）；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis,ら、Academic Press（1990）；およびPCR Technology：Principals and Applications of DNA Amplification,H,A,Erlich,Stockton Press（1989））。PCRはまた米国特許第4,683,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第4,965,188号；第4,889,818号；第5,075,216号；第5,079,352号；第5,104,792号、第5,023,171号；第5,091,310号；および第5,066,584号を含む多くの米国特許に記載されている。
【０１１６】
典型的なPCR反応の成分は例えば、鋳型DNA、プライマー、反応緩衝液（ポリメラーゼの選択による）、dNTP（dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP）およびDNAポリメラーゼを含むがこれらに限定されない。適当なPCRプライマーは上記した通り設計して調製できる（上記「プライマー設計」のセクションを参照されたい）。簡単に言えば、反応は2分間95℃で加熱することにより鋳型DNAの鎖を分離し、反応を適温（設計されたプライマーのアニーリング温度の計算により決定）まで冷却することによりプライマーを鋳型DNAにアニーリングさせ、そして、2分間72℃に加熱して伸長させる。
【０１１７】
好ましい態様においては、アニーリング温度は増幅の最初の3サイクルの各々で上昇させることにより非特異的増幅を低減する。後述する実施例1も参照されたい。PCRの第1サイクルのTM1は鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3'領域の融解温度近傍である。アニーリング温度はサイクル2〜10において、好ましくはサイクル2において、第1のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域の融解温度近傍であるTM2まで上昇させることができる。アニーリング温度をサイクル2において上昇させる場合は、アニーリング温度はアニーリング温度の次回の上昇までほぼ同じに維持される。最終的に、アニーリング温度をTM2まで上昇させたサイクルの後の任意のサイクルにおいて、好ましくはサイクル3において、第2のプライマー全体の融解温度近傍であるTM3までアニーリング温度を上昇させる。第3サイクルの後、残余のサイクルのアニーリング温度はTM3近傍とするか、またはより高温としてよい。本例においては、アニーリング温度はサイクル2およびサイクル3において上昇させる。しかしながら、アニーリング温度はサイクル1における低いアニーリング温度からサイクル2における高いアニーリング温度まで、それ以上の温度上昇を行うことなく上昇させることができ、または、アニーリング温度は任意の数の漸増工程において低いアニーリング温度から高いアニーリング温度まで漸進的に変化することができる。例えば、アニーリング温度はサイクル2、3、4、5、6等において変化することができる。
【０１１８】
アニーリングの後、各サイクルの温度を「伸長」温度まで上昇させることによりプライマーを「伸長」させ、次に、伸長後、各サイクルの温度を変性温度まで上昇させる。大きさが500塩基対未満のPCR産物の場合は、各サイクルの伸長工程を省略でき、そして変性およびアニーリングの工程のみを行う。典型的なPCR反応は上記した通り25〜45サイクルの変性、アニーリングおよび伸長からなる。しかしながら、前述したとおり、増幅の僅か1サイクルのみ（1コピー）のみであっても本発明の実施には十分であることができる。
【０１１９】
プライマー伸長を触媒する任意のDNAポリメラーゼも使用でき、大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T7DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼ、VentDNAポリメラーゼ、バクテリオファージ29、およびREDTaq（商標）ゲノムDNAポリメラーゼまたはシーケナーゼを挙げることができるがこれらに限定されない。好ましくは、熱安定性DNAポリメラーゼを用いる。「ホットスタート」PCRもまた行うことができ、その場合、反応は2分間95℃で加熱した後にポリメラーゼを添加するか、または、サイクル1の初回加熱工程までポリメラーゼを不活性化しておくことができる。「ホットスタート」PCRは非特異的増幅を最小限にするために使用することができる。任意の回数のPCRサイクルもDNA増幅のために使用でき、2、5、10、15、20、25、30、35、40または45サイクルが含まれるがこれらに限定されない。最も好ましい態様においては、実施するPCRサイクル数は各々の関心対象の遺伝子座が等モル量形成されるようなものとする。
【０１２０】
増幅されたDNAの精製
増幅されたDNAの精製は本発明の実施のためには必須ではない。しかしながら、1つの態様においては、精製が好ましい場合は、プライマー（第1または第2のプライマー）の5'末端をPCR産物の精製を容易にするタグで修飾することができる。好ましい態様においては、第1のプライマーをPCR産物の精製を容易にするタグで修飾する。修飾は好ましくは全プライマーについて同様とするが、PCR産物を異なる群に分離することが望まれる場合は異なる修飾を用いることもできる。
【０１２１】
タグは放射性同位体、蛍光レポーター分子、化学発光レポーター分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、ビオチン、ビオチンの誘導体、の誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、単独重合体オリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反磁性部分、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分、検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率およびこれらの組み合わせであることができる。
【０１２２】
好ましい態様においては、プライマーの5'末端はビオチニル化することができる（Kandpalら、Nucleic Acids Res.18：1789-1795（1990）；Kaneokaら、Biotechniques 10：30-34（1991）；Greenら、Nucleic Acids Res.18：6163-6164（1990））。ビオチンは目的とならないゲノムDNAまたは何らか別のDNA分子からコピーされたDNAを精製するために用いることができるアフィニティータグを与える。ビオチニル化分子はRoche Molecular Biochemicalsより入手できるStreptawell透明ハイバインドプレート（カタログ番号1 645 692、Roche Molecular Biochemicalsの2001バイオケミカルズカタログ中に掲載）のような図1Fに示すよストレプトアビジンコーティングマトリックスを用いて精製することができる。
【０１２３】
関心対象の遺伝子座の各々のPCR産物をストレプトアビジンコーティングプレートの別々のウェルに入れる。または、関心対象の遺伝子座のPCR産物を合わせ、Roche Molecular Biochemicalsより入手できるStreptawell透明ハイバインドプレート（カタログ番号1645692、Roche Molecular Biochemicalsの2001バイオケミカルズカタログ中に掲載）のようなストレプトアビジンコーティングマトリックスに入れる。
【０１２４】
増幅したDNAは例えば標準的なプロトコルを用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動により当技術分野において知られた非アフィニティー法を用いて鋳型DNAから分離することもできる。
【０１２５】
増幅されたDNAの消化
増幅されたDNAは当技術分野において知られた標準的なプロトコルを用いて第1または第2のプライマー上に与えられている配列を認識する制限酵素により消化することができる（図6A〜6D）。使用される酵素は第1または第2のプライマーにより生じる制限認識部位により異なる。プライマー上に生じた制限認識部位に関する詳細は上記した「プライマー設計」のセクションを参照されたい。
【０１２６】
IIS型制限酵素は認識部位の外部の約10〜20塩基対を切断する点において極めて有用である。好ましくは、使用されるIIS型制限酵素は5'オーバーハングおよび陥凹3'末端を生じさせるものであり、BceA IおよびBsmF Iを含むがそれに限定されない（例えば表I参照）。最も好ましい態様においては、関心対象の遺伝子座に近接してアニーリングする第2のプライマー（フォワードまたはリバースの何れか）はBsmF IまたはBceA Iに対する制限酵素認識配列を含む。IIS型制限酵素BsmF Iは核酸配列GGGACを認識し、アンチセンス鎖上の認識部位から14ヌクレオチドおよびセンス鎖上の認識部位から10ヌクレオチドを切断する。BsmF Iによる消化により、4塩基の5'オーバーハングが生じる。
【０１２７】
例えば、増幅後、制限酵素認識部位が関心対象の遺伝子座から13塩基にあるように第2のプライマーを設計する場合、消化後は、関心対象の遺伝子座は5'オーバーハング（3'から5'に読む）の最初の塩基であり、そして、陥凹3'末端は関心対象の遺伝子座の1塩基上流である。3'陥凹末端は関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドでフィルインできる。オーバーハングの1塩基はジデオキシヌクレオチドを用いてフィルインできる。しかしながら、オーバーハングの1、2、3または全4塩基はジデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドとでオキシヌクレオチドの混合物を用いてフィルインすることができる。
【０１２８】
制限酵素BsmF Iはセンス鎖上の認識部位から10ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖上の認識部位から14ヌクレオチドでDNAを切断する。しかしながら、配列依存性の様式で、制限酵素BsmF Iはまたセンス鎖上の認識部位から11ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖上の認識部位から15ヌクレオチドでも切断する。即ち、2つの集団のDNA分子、即ち、10/14で切断されたDNA分子および11/15で切断されたDNA分子が消化後に存在することになる。BsmF Iに対する認識部位が増幅産物中の関心対象の遺伝子座から13塩基にある場合、11/15で切断されたDNA分子はオーバーハング（3'から5'に読む）の第2の位置に関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを生じさせる。DNA分子の3'陥凹末端は標識されたヌクレオチドでフィルインできる。例えば、標識されたジデオキシヌクレオチドを用いる場合は、11/15で切断された分子の3'陥凹末端は関心対象の遺伝子座の上流の塩基に相当する1塩基でフィルインされ、そして、10/14で切断された分子の3'陥凹末端は関心対象の遺伝子座に相当する1塩基でフィルインされる。10/14で切断されているDNA分子および11/15で切断されているDNA分子は大きさにより分離することができ、そして、組み込まれたヌクレオチドを検出できる。これにより、関心対象の遺伝子座の前のヌクレオチドの検出とともに関心対象の遺伝子座そして潜在的には関心対象の遺伝子座の後の3塩基対の検出が可能となる。
【０１２９】
あるいは、関心対象の遺伝子座の上流の塩基と関心対象の遺伝子座が異なるヌクレオチドである場合は、11/15で切断された分子の3'陥凹末端は上流の塩基に相補的なジデオキシヌクレオチドでフィルインすることができる。残余のデオキシヌクレオチドは洗浄して除去し、関心対象の遺伝子座の部位を標識されたデオキシヌクレオチド、未標識デオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチドまたは未標識ジデオキシヌクレオチドの何れかでフィルインすることができる。フィルイン反応の後、ヌクレオチドを何れかの適当な方法で検出することができる。即ち、dNTPを用いた最初のフィルイン反応の後には、10/14および11/15で切断された分子の3'陥凹末端は関心対象の遺伝子座の上流にある。3'陥凹末端はこの時点で関心対象の遺伝子座に相当する1塩基、2塩基、3塩基または4塩基によりフィルインできる。
【０１３０】
あるいは、関心対象の遺伝子座の上流の塩基と関心対象の遺伝子座の下流の塩基が同じであると報告された場合は、11/15で切断された分子の3'陥凹末端は未標識のデオキシヌクレオチドで「フィルイン」でき、その後、標識されたジデオキシヌクレオチドで「フィルイン」できる。例えば、関心対象の遺伝子座の上流のヌクレオチドがシトシンであり、そしてシトシンが関心対象の遺伝子座における潜在的ヌクレオチドであり、そしてアデノシンが関心対象の遺伝子座の3'にある最初のヌクレオチドである場合、「フィルイン」反応は未標識のデオキシグアニントリホスフェート（dGTP）を用いて行うことができ、その後、標識されたジデオキシチミジントリホスフェートを用いてフィルインする。関心対象の遺伝子座がシトシンを含む場合、ddTTPは取り込まれ、検出される。しかしながら、関心対象の遺伝子座がシトシンを含まない場合は、dGTPは取り込まれず、これによりddTTPの取り込みが防止される。
【０１３１】
制限酵素BceA Iは核酸配列ACGGCを認識し、そしてセンス鎖上の認識部位から12ヌクレオチドおよびアンチセンス鎖上の認識部位から14ヌクレオチドを切断する。第2のプライマー上のBceA Iに対する認識部位からの距離が関心対象の遺伝子座から13塩基であるように設計される場合（図4A〜4D参照）、BceA Iでの消化により、関心対象の遺伝子座を含む2塩基の5'オーバーハングおよび関心対象の遺伝子座の上流にある陥凹3'末端が生じる。関心対象の遺伝子座は5'オーバーハング（3'から5'に読む）内の最初のヌクレオチドである。
【０１３２】
代替的な切断は制限酵素BceA Iによっても観察されるが、BsmF Iで観察されるより遥かに低い頻度である。制限酵素BceA Iはセンス鎖上の認識部位から13ヌクレオチド、アンチセンス鎖上の認識部位から15ヌクレオチドで切断できる。即ち、2つの集団のDNA分子、即ち、12/14で切断されたDNA分子および13/15で切断されたDNA分子が存在する。制限酵素認識部位が増幅産物中の関心対象の遺伝子座から13塩基にある場合、13/15で切断されたDNA分子はオーバーハング（3'から5'に読む）の第2の位置に関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを生じさせる。標識されたジデオキシヌクレオチドを用いてDNA分子の3'陥凹末端をフィルインできる。13/15で切断されたDNA分子はフィルインされた関心対象の遺伝子座の上流の塩基を有し、そして12/14で切断されたDNA分子はフィルインされた関心対象の遺伝子座の部位を有する。13/15で切断されたDNA分子および12/14で切断されたものは大きさにより分離でき、取り込まれたヌクレオチドを検出できる。即ち、オルタナティブ切断を用いて別の配列定法を得ることができる。
【０１３３】
あるいは5'オーバーハング内の2塩基が異なる場合、13/15で切断されているDNA分子の3'陥凹末端をオーバーハングの最初の塩基に相補的なデオキシヌクレオチドでフィルインし、過剰なデオキシヌクレオチドを洗浄除去することができる。フィルインの後、12/14で切断されたDNA分子および13/15で切断されたDNA分子の3'陥凹末端は関心対象の遺伝子座の上流にある。3'陥凹末端は標識されたジデオキシヌクレオチド、未標識のジデオキシヌクレオチド、標識されたデオキシヌクレオチドまたは未標識のデオキシヌクレオチドの何れかでフィルインできる。
【０１３４】
プライマーがコピーされた関心対象の遺伝子座の特定のものに対して種々の制限部位を与える場合、全ての必要な制限酵素をともに添加することによりコピーされたDNAを同時に消化することができる。または、例えば1回に1種の制限酵素を用いてその制限酵素に特異的な産物のみが消化されるように、種々の制限消化を順次行うこともできる。
【０１３５】
標識されたヌクレオチドの取り込み
第2のプライマー上の配列を認識する制限酵素を用いた消化により陥凹3'末端および関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じる（図1G）。陥凹3'末端は、未標識または標識されたヌクレオチドまたは未標識および標識ヌクレオチドの混合物の存在下に鋳型として5'オーバーハングを用いてフィルインすることができる。ヌクレオチドは、これらに限定されないが放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチンの誘導体、の誘導体、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分および検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率のような検出を可能にする化学基または部分の何れかの種類で標識することができる。ヌクレオチドは一つまたは複数の化学基または部分で標識できる。各ヌクレオチド々は同じ化学基または部分で標識できる。または、各々の異なるヌクレオチドを異なる化学基または部分で標識できる。標識されたヌクレオチドはdNTP、ddNTPまたはdNTPおよびddNTPの両方の混合物であることができる。未標識のヌクレオチドはdNTP、ddNTPまたはdNTPおよびddNTPの両方の混合物であることができる。
【０１３６】
ヌクレオチドを取り込むためには、これらに限定されないが、未標識デオキシヌクレオチド、標識デオキシヌクレオチド、未標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、標識および未標識のデオキシヌクレオチドの混合物、標識および未標識のジデオキシヌクレオチドの混合物、標識デオキシヌクレオチドおよび標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、標識デオキシヌクレオチドおよび未標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、未標識デオキシヌクレオチドおよび未標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、未標識デオキシヌクレオチドおよび標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、ジデオキシヌクレオチド類縁体、デオキシヌクレオチド類縁体、ジデオキシヌクレオチド類縁体およびデオキシヌクレオチド類縁体の混合物、ホスホリル化ヌクレオチド類縁体、2-デオキシヌクレオシド-5'トリホスフェートおよび修飾2'-デオキシヌクレオシド-5'トリホスフェートのような任意のヌクレオチドの組み合わせを使用できる。
【０１３７】
例えば、図1Hに示すとおり、ポリメラーゼの存在下、3'陥凹末端を鋳型として5'オーバーハングを用いた蛍光ddNTPで充填することができる。取り込まれたddNTPは、これに限定されないが、蛍光検出を含む何れかの適当な方法を用いて検出できる。
【０１３８】
4種全てのヌクレオチドを異なる蛍光基で標識し、これにより、1種の反応を4種全ての標識ヌクレオチドの存在下に実施することができる。または、5種の別々の「フィルイン」反応を各関心対象の遺伝子座について行うことができ；4種の反応の各々が、異なる標識ヌクレオチド（例えばddATP＊、ddTTP＊、ddUTP＊、ddGTP＊またはddCTP＊、但しここで＊は標識ヌクレオチドを示す）を含むようにする。各ヌクレオチドを異なる化学基または同じ化学基で標識できる。標識されたヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであることができる。
【０１３９】
別の態様においては、ヌクレオチドを蛍光染料、これらに限定されないが、フルオレセイン、ピレン、7-メトキシクマリン、カスケードブルーTM、アレキサフロル（Alexa Flur）350、アレキサ
フロル430、アレキサフロル488、アレキサフロル532、アレキサフロル546、アレキサフロル568、アレキサフロル594、アレキサフロル633、アレキサフロル647、アレキサフロル660、アレキサフロル680、AMCA-X、ジアルキルアミノクマリン、パシフィックブルー、マリーナブルー、BODIPY493/503、BODIPY Fl-X、DTAF、オレゴングリーン500、ダンシルーX、6-FAM,オレゴングリーン488、オレゴングリーン514、ローダミングリーン-X、ロードルグリーン（Rhodol Green）、カルセイン、エオシン、臭化エチジウム、NBD、TET、2',4',5',7'テトラブロモスルホンフルオレセイン、BODIPY-R6G、BODIPY-F1 BR2、BODIPY530/550、HEX、BODIPY558/568、BODIPY-TMR-X、PyMPO、BODIPY564/570、TAMRA、BODIPY576/589、Cy3、ローダミンレッド-x、BODIPY581/591、カルボキシXローダミン、テキサスレッド-X、BODIPY-TR-X、Cy5、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン＃1、スペクトラムグリーン＃2、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッドまたはナフトフルオレセインで標識することができる。
【０１４０】
別の態様においては、「フィルイン」反応は蛍光標識されたdNTPを用いて行うことができ、その場合、ヌクレオチドは種々の蛍光基により標識される。取り込まれたヌクレオチドは、これに限定されないが、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を含む何れかの適当な方法により検出できる。
【０１４１】
別の態様においては、標識されたddNTPと未標識のdNTPの混合物をSNPまたは関心対象の遺伝子座を含むDNA配列の陥凹3'末端のフィルインに用いることができる。好ましくは、5'オーバーハングは1個より多い塩基、例えば2、3、4、5、6または6個より多い塩基からなる。例えば、5'オーバーハングが配列「XGAA」、ただしXは関心対象の遺伝子座、例えばSNPであるものである場合は、標識ddNTPと未標識dNTPの混合物によるフィルインにより数種類のDNAフラグメントか形成される。標識されたddNTPが位置「X」において取り込まれる場合、反応は終了し、単一の標識された塩基が取り込まれる。しかしながら、未標識dNTPが取り込まれる場合、標識されたddNTPが取り込まれるまで、ポリメラーゼは他の塩基を取り込み続ける。取り込まれた最初の2個のヌクレオチドがdNTPである場合、第3のヌクレオチドはddNTPであり、3'陥凹末端は3塩基分だけ伸長される。このDNAフラグメントは1、2または4塩基の大きさだけ伸長された他のDNAフラグメントから分離することができる。標識dNTPおよび未標識dNTPの混合物はオーバーハングの塩基の全てをフィルインさせ、そして関心対象の遺伝子座、例えばSNPに関する更に別の配列情報を与える（図7Eおよび9D参照）。
【０１４２】
標識ヌクレオチドの取り込みの後、第1のプライマーにより与えられる配列を認識する制限酵素を用いて、増幅されたDNAを消化することができる。例えば、図1Iにおいては、ストレプトアビジンマトリックスから取り込まれたヌクレオチドを含むDNAフラグメントを放出させる領域「a」に結合する制限酵素を用いて、増幅されたDNAを消化する。
【０１４３】
あるいは、各関心対象の遺伝子座の各プライマー対の一方のプライマーをこれに限定されないがマイクロタイタープレートのウェルを含む固体支持体マトリックスに結合させることができる。例えば、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートを一方のプライマーがビオチニル化されたプライマー対とともに増幅反応に用いることができる。第1に、ビオチニル化されたプライマーをストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートに結合させる。次に、プレートを関心対象の遺伝子座のPCR増幅のための反応容器として使用する。増幅反応が終了した後、過剰のプライマー、塩類、および鋳型DNAを洗浄により除去できる。増幅されたDNAはマイクロタイタープレートに結合したまま残存する。増幅されたDNAは第2のプライマー上の配列を認識し関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングを生じさせる制限酵素により消化することができる。消化されたフラグメントは洗浄により除去できる。消化の後、SNP部位または関心対象の遺伝子座は5'オーバーハング内に露出する。陥凹3'末端をポリメラーゼの存在下で、これに限定されないが、蛍光ddNTPのような標識ヌクレオチドでフィルインする。標識されたDNAは、第1のプライマーの5'領域内の配列を認識する制限酵素を用いた消化によりマイクロタイタープレート内の上澄み中に放出することができる。
【０１４４】
関心対象の遺伝子座の分析
標識された関心対象の遺伝子座は、これらに限定されないが、蛍光検出、DNA配列決定ゲル、自動化DNA配列決定装置上のキャピラリー電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動または他の配列決定方法、質量スペクトル分析、飛行時間質量スペクトル分析、四極子質量分析、扇型磁場質量分析、扇型電場質量分析、赤外スペクトル分析、紫外スペクトル分析、パレンシオスタティック（palentiostatic）電流測定またはDNAハイブリダイゼーション技術、例えばサザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、および、DNAフラグメントが「プローブ」および「標的」の両方として有用であるDNAマイクロアレイ、ELISA、蛍光分析、および、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を含む種々の方法により分析することができる。
【０１４５】
関心対象の遺伝子座はゲル電気泳動とその後の取り込まれたヌクレオチドの蛍光検出を用いて分析できる。関心対象の遺伝子座を分析または読み取るための別の方法は蛍光プレートリーダーまたは蛍光計を96穴ストレプトアビジンコーティングプレート上で直接使用する方法である。プレートは蛍光プレートリーダーまたはスキャナー、例えばPharmacia 9200 Typhoon上に置き、各関心対象の遺伝子座を読み取ることができる。
【０１４６】
あるいは、関心対象の遺伝子座のPCR産物を合わせ、そして「フィルイン」の後（図10）、産物を何れかの適切な方法で大きさにより分離することができ、そしてその後、これらに限定されないが、蛍光検出、DNA配列決定ゲル、自動化DNA配列決定装置上のキャピラリー電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動、他の配列決定方法、DNAハイブリダイゼーション技術、例えばサザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびDNAマイクロアレイ、質量スペクトル分析、飛行時間質量スペクトル分析、四極子質量分析、扇型磁場質量分析、扇型電場質量分析、赤外スペクトル分析、紫外スペクトル分析、パレンシオスタティック電流測定を含む種々の方法を用いて分析する。例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動は大きさでDNAを分離するために使用でき、ゲルをスキャンして各バンドにおける蛍光の色を検出する（例えばABI 377 DNA配列決定装置またはPharmacia Typhoon 9200を使用）。
【０１４７】
別の態様においては、1ヌクレオチドを用いて遺伝子の複数の対立遺伝子の配列を決定する。伸長反応を停止させるヌクレオチドを用いて遺伝子の複数の対立遺伝子の配列を決定することができる。1対立遺伝子において、停止ヌクレオチドは該対立遺伝子の5'オーバーハング中の関心対象の遺伝子座に相補的である。ヌクレオチドは取り込まれ、反応を停止させる。異なる対立遺伝子において、停止ヌクレオチドは関心対象の遺伝子座に相補的ではなく、これにより非停止ヌクレオチドがその異なる対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に取り込まれることが可能になる。しかしながら、停止ヌクレオチドは該異なる対立遺伝子の5'オーバーハング中の関心対象の遺伝子座から下流にあるヌクレオチドに相補的である。対立遺伝子の配列は停止ヌクレオチドの取り込みのパターンを分析することにより決定することができる。停止ヌクレオチドは標識されているか、または未標識であることができる。
【０１４８】
別の態様においては、停止ヌクレオチドは伸長反応を停止させるか遮蔽するヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド誘導体、ジデオキシヌクレオチド類縁体、ジデオキシヌクレオチド相同体、イオウ化学基を有するジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド誘導体、デオキシヌクレオチド相同体、デオキシヌクレオチド類縁体、および、イオウ化学基を有するデオキシヌクレオチド、アラビノシドトリホスフェート、アラビノシドトリホスフェート類縁体、アラビノシドトリホスフェート相同体またはアラビノシド誘導体を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
別の態様においては、これに限定されないが、蛍光染料のようなシグナル発生部分タグ1個で標識された停止ヌクレオチドを用いて関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定できる。1シグナル発生部分タグで標識された1ヌクレオチドを用いることにより、種々の蛍光部分を用いる場合に起こる難点を排除できる。更にまた、1シグナル発生部分タグで標識された1ヌクレオチドを用いて関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定することにより、反応数が減少し、ピペッティングの誤操作が排除される。
【０１５０】
例えば、第2のプライマーがBsmFIに対する制限酵素認識部位を含む場合、消化により4塩基の5'オーバーハングが生じる。第2のプライマーは、オーバーハングの最初の位置に関心対象の遺伝子座が位置するように設計することができる。代表的なオーバーハングは以下に示すとおりであり、ここでRは関心対象の遺伝子座を示す。
2006523082.tif 000015
【０１５１】
1シグナル発生部分タグを有する1ヌクレオチドを用いて可変部位がホモ接合であるかヘテロ接合であるかを決定することができる。例えば可変部位がアデニン（A）またはグアニン（G）である場合、2、3または4位のオーバーハング内にアデニンまたはグアニンが有る限り、アデニンまたはグアニンの何れかを用いて関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定できる。
【０１５２】
例えばオーバーハングの2位のヌクレオチドがアデニンに相補のチミジンである場合、標識されたddATP、未標識のdCTP、dGTPおよびdTTPを用いて関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定できる。ddATPは、これに限定されないが、蛍光染料を含む何れかのシグナル発生部分で標識できる。鋳型DNAがアデニンにホモ接合である場合は、標識されたddATP＊は対立遺伝子においてオーバーハングに相補の1位に取り込まれ、そして、オーバーハングに相補の2、3または4位ではヌクレオチドの取り込みは観察されない。
2006523082.tif 000016
【０１５３】
1シグナルはオーバーハングに相補の1位における標識ddATPの取り込みに相当し、これは個体がこの位置におけるアデニンに関してホモ接合であることを示す。この標識方法により、異なる量子係数を有する異なる染料を用いた場合に生じる難点が排除される。
【０１５４】
ホモ接合グアニン：
鋳型DNAグアニンに関してホモ接合である場合、ddATPはオーバーハングに相補の1位には取り込まれないが、ddATPは最初の可能な位置において取り込まれ、それは、この場合、オーバーハングに相補の2位となる。例えば、オーバーハングの2位がチミジンに相当する場合、下記の通りとなる。
2006523082.tif 000017
【０１５５】
1シグナルはオーバーハングに相補の2位におけるddATPの取り込みに相当して観察され、これは個体がグアニンに関してホモ接合であることを示す。オーバーハングに相補の2位においてフィルインされている分子は、オーバーハングに相補の1位においてフィルインされている分子とは異なる分子量を有する。
【０１５６】
ヘテロ接合条件：
2006523082.tif 000018
【０１５７】
2シグナルが観察される。即ち第1のシグナルはオーバーハングに相補の1位においてフィルインされたddATPに相当し、第2のシグナルはオーバーハングに相補の2位においてフィルインされたddATPに相当する。この2つのシグナルは分子量に基づいて分離することができる。即ち、対立遺伝子1および対立遺伝子2は1塩基対により分離され、これにより、シグナルの容易な検出および定量が可能となる。1位においてフィルインされた分子と2位においてフィルインされた分子とは、これらに限定されないが、ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、DNA配列決定および質量スペクトル分析を含む分子量に基づいて判別する任意の方法を用いて識別することができる。ヌクレオチドを化学部分で標識する必要は無く、種々の対立遺伝子に相当するDNA分子を分子量に基づいて分離できる。
【０１５８】
オーバーハングの2位がアデニンに相補でない場合、3位または4位がアデニンに相補である可能性がある。例えば、オーバーハングの3位はヌクレオチドアデニンに相補であってよく、この場合、標識されたddATPを用いて両方の対立遺伝子の配列を決定してよい。
【０１５９】
アデニンに関するホモ接合：
2006523082.tif 000019
【０１６０】
グアニンに関するホモ接合：
2006523082.tif 000020
【０１６１】
ヘテロ接合：
2006523082.tif 000021
【０１６２】
2つのシグナルが観察される。即ち第1のシグナルはオーバーハングに相補の1位においてフィルインされたddATPに相当し、第2のシグナルはオーバーハングに相補の3位においてフィルインされたddATPに相当する。この2つのシグナルは分子量に基づいて分離することができる。即ち、対立遺伝子1および対立遺伝子2は2塩基により分離され、これは分子量に基づいて判別する任意の方法を用いて検出できる。
【０１６３】
あるいは、2位および3位がアデニンに相補ではない（即ちオーバーハングの2位および3位がグアニン、シトシンまたはアデニンに相当する）が4位がアデニンに相補である場合、標識されたddATPを用いて両方の対立遺伝子の配列を決定できる。
【０１６４】
アデニンに関するホモ接合：
2006523082.tif 000022
【０１６５】
オーバーハングに相補の1位においてddATPでフィルインされた分子の分子量に相当する1つのシグナルが観察され、これは個体が可変部位においてアデニンに関してホモ接合であることを示す。
【０１６６】
グアニンに関するホモ接合：
2006523082.tif 000023
【０１６７】
オーバーハングに相補の4位においてフィルインされた分子の分子量に相当する1つのシグナルが観察され、これは個体がグアニンに関してホモ接合であることを示す。
【０１６８】
ヘテロ接合：
2006523082.tif 000024
【０１６９】
2つのシグナルが観察される。即ち第1のシグナルはオーバーハングに相補の1位においてフィルインされたddATPに相当し、第2のシグナルはオーバーハングに相補の4位においてフィルインされたddATPに相当する。この２つのシグナルは分子量に基づいて分離することができる。即ち、対立遺伝子1および対立遺伝子2は3塩基により分離され、これによりシグナルの検出および定量化が可能になる。1位においてフィルインされた分子および4位においてフィルインされた分子は分子量に基づいて識別できる。
【０１７０】
上記した通り、可変部位がアデニンまたはグアニンを含む場合、標識されたアデニンまたは標識されたグアニンを用いて両方の対立遺伝子の配列を決定することができる。オーバーハングの2位、3位または4位がアデニンに相補ではないが、位置の1つがグアニンに相補の場合、標識されたddGTPを用いて鋳型DNAがアデニンまたはグアニンに関してホモ接合であるかヘテロ接合であるかを決定することができる。例えば、オーバーハングの3位がシトシンに相当する場合、鋳型DNAがグアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合またはヘテロ接合である場合には、以下に示すシグナルが予測される。
【０１７１】
グアニンに関するホモ接合：
2006523082.tif 000025
【０１７２】
オーバーハングに相補の1位においてddGTPでフィルインされた分子の分子量に相当する1つのシグナルが観察され、これは個体がグアニンに関してホモ接合であることを示す。
【０１７３】
アデニンに関するホモ接合：
2006523082.tif 000026
【０１７４】
オーバーハングに相補の3位においてフィルインされた分子の分子量に相当する1つのシグナルが観察され、これは個体が可変部位においてアデニンに関してホモ接合であることを示す。
【０１７５】
ヘテロ接合：
2006523082.tif 000027
【０１７６】
2つのシグナルが観察される。即ち第1のシグナルはオーバーハングに相補の1位においてフィルインされたddGTPに相当し、第2のシグナルはオーバーハングに相補の3位においてフィルインされたddGTPに相当する。この2つのシグナルは分子量に基づいて分離することができる。即ち、対立遺伝子1および対立遺伝子2は2塩基により分離され、これによりシグナルの容易な検出および定量化が可能になる。
【０１７７】
ある種のIIS型制限酵素もまた前述した代替的切断を示す。例えば、BsmFIは認識部位から10/14および11/15において切断する。しかしながら、切断パターンは相互に排他的ではなく、11/15切断パターンが特定の配列で観察される場合、10/14切断も観察される。制限酵素BsmF Iが認識部位から10/14で切断する場合、5'オーバーハングはX1X2X3X4となる。制限酵素BsmF Iが認識部位から11/15で切断する場合、5'オーバーハングはX0X1X2X3となる。オーバーハングのX0位が標識されたヌクレオチドに相補である場合、標識されたヌクレオチドはX0位において取り込まれ、品質保証水準が更に向上する。これは更に別の配列情報を与える。
【０１７８】
例えば可変部位がアデニンまたはグアニンであり、そしてオーバーハングの3位がアデニンに相補である場合、標識されたddATPを用いて可変部位における遺伝子型を決定できる。11/15オーバーハングの0位がアデニンに相補のヌクレオチドを含む場合、ddATPがフィルインされ、更に別のシグナルが観察される。
【０１７９】
ヘテロ接合：
2006523082.tif 000028
【０１８０】
3つのシグナルが観察される。即ち1つはオーバーハングに相補の0位において取り込まれたddATPに相当し、1つはオーバーハングに相補の1位において取り込まれたddATPに相当し、そして1つはオーバーハングに相補の3位において取り込まれたddATPに相当する。オーバーハングに相補の0位、1位および3位においてフィルインされた分子は分子量が異なり、これらに限定されないが、ゲル電気泳動および質量スペクトル分析を含む分子量に基づいて判別する何れかの手法を用いて分離することができる。
【０１８１】
1つの対立遺伝子の別の対立遺伝子に対する比を定量化するため、または、野生型DNA配列の存在下に突然変異DNA配列の相対量を測定する際には、正確で高い感度の検出方法を使用しなければならない。IIS型制限酵素により示される代替的切断は、制限酵素が2種の対立遺伝子に対して等しく代替的切断（11/15）を示さないため、1つの対立遺伝子の別の対立遺伝子に対する比の測定がさらに困難になる。例えば、対立遺伝子1は80％の場合10/14、および20％の場合11/15で切断される。しかしながら、この2つの対立遺伝子は配列が異なるため、対立遺伝子2は90％の場合10/14、および20％の場合11/15で切断される。
【０１８２】
定量化の目的のためには、代替的切断の問題は、オーバーハングの0位のヌクレオチドが標識されたヌクレオチドに相補ではない場合には、排除することができる。例えば、可変部位がアデニンまたはグアニンに相当し、オーバーハングの3位がアデニンに相補である場合（即ちオーバーハングの3位にチミジンが位置する場合）、標識されたddATPを用いて可変部位の遺伝子型を決定できる。11/15切断特性により生じたオーバーハングの0位がアデニンに相補でない場合（即ちオーバーハングの0位がグアニン、シトシンまたはアデニンに相当する場合）、認識部位から11/15で切断されたフラグメントからはそれ以上のシグナルは観察されない。オーバーハングに相補の0位は未標識のヌクレオチドでフィルインでき、制限酵素の代替的切断パターンから生じる任意の複雑性も排除できる。この方法は例えば突然変異または一塩基遺伝子多型のような可変部位の比を定量化するための高精度の方法を提供する。
【０１８３】
例えば、SNP Xがアデニンまたはグアニンである場合、この標識方法により、制限酵素が代替的切断パターンに関して対立遺伝子間で何らかの相違を示すかどうかを調べることなく、アデニンに相当する対立遺伝子およびグアニンに相当する対立遺伝子の定量化が可能となる。
【０１８４】
ヘテロ接合：
2006523082.tif 000029
【０１８５】
BsmF Iの代替的切断特性により生じるオーバーハングを以下に示す。
2006523082.tif 000030
【０１８６】
標識されたddATPおよび未標識のdGTP、dCTP、dTTPでフィルインした後、以下の分子が生じる。
2006523082.tif 000031
【０１８７】
2つのシグナルが観察される。即ち1つはオーバーハングに相補の1位においてddATPでフィルインされた分子に相当し、1つはオーバーハングに相補の3位においてddATPでフィルインされた分子に相当する。11/15オーバーハングの0位は未標識ヌクレオチドでフィルインされ、これにより対立遺伝子1上の可変部位のヌクレオチドと対立遺伝子2の可変部位のヌクレオチドの比を定量化する際の任意の困難が排除される。
【０１８８】
アデニン、アデニン誘導体、アデニン相同体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン相同体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン相同体、チミジン、チミジン誘導体もしくはチミジン相同体、または、アデニン、アデニン誘導体、アデニン相同体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン相同体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン相同体、チミジン、チミジン誘導体もしくはチミジン相同体の任意の組み合わせを含む任意のヌクレオチドが使用できる。
【０１８９】
ヌクレオチドは、これらに限定されないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチンの誘導体、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分および検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率を含む任意の化学基または部分で標識することができる。ヌクレオチドは一つまたは複数の化学基または部分で標識することができる。
【０１９０】
別の態様においては、標識および未標識のヌクレオチドを使用することができる。デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドの何れかの組み合わせ、これらに限定されないが、標識ジデオキシヌクレオチドおよび標識デオキシヌクレオチド；標識ジデオキシヌクレオチドおよび未標識デオキシヌクレオチド；未標識ジデオキシヌクレオチドおよび未標識デオキシヌクレオチド；および未標識ジデオキシヌクレオチドおよび標識デオキシヌクレオチドを使用できる。
【０１９１】
別の態様においては、化学部分で標識されたヌクレオチドをPCR反応に使用することができる。その後、未標識ヌクレオチドを用いて、制限酵素による消化後に生じた5'オーバーハングをフィルインする。未標識の停止ヌクレオチドを未標識ヌクレオチドの存在下に用いて関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定することができる。
【０１９２】
例えば、標識されたdTTPをPCR反応に用いた場合、以下の5'オーバーハングがBsmF I消化後に生じる。
2006523082.tif 000032
【０１９３】
未標識のddATP、未標識のdCTP、未標識のdGTPおよび未標識のdTTPを用いて5'オーバーハングをフィルインできる。2つのシグナルが観察される。即ち1つのシグナルはオーバーハングに相補の1位において未標識ddATPでフィルインされたDNA分子に相当し、第2のシグナルはオーバーハングに相補の3位において未標識ddATPでフィルインされたDNA分子に相当する。DNA分子は分子量に基づいて分離でき、そして、PCR反応中に取り込まれたdTTPの蛍光により検出できる。
【０１９４】
目的の標識されたDNA遺伝子座は、これらに限定されないが、蛍光検出、DNA配列決定ゲル、自動化DNA配列決定装置上のキャピラリー電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動または他の配列決定方法、質量スペクトル分析、飛行時間質量スペクトル分析、四極子質量分析、扇型磁場質量分析、扇型電場質量分析、赤外スペクトル分析、紫外スペクトル分析、パレンシオスタティック電流測定またはDNAハイブリダイゼーション技術、例えばサザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、および、DNAフラグメントが「プローブ」および「標的」の両方として有用であるDNAマイクロアレイ、ELISA、蛍光分析、および、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）を含む種々の方法により分析することができる。
【０１９５】
本標識方法は極めて高感度であり、これらに限定されないが、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6〜1：10、1：11〜1：20、1：21〜1：30、1：31〜1：40、1：41〜1：50、1：51〜1：60、1：61〜1：70、1：71〜1：80、1：81〜1：90、1：91〜1：100、1：101〜1：200、1:250、1：251〜1：300、1：301〜1：400、1：401〜1：500、1：501〜1：600、1：601〜1：700、1：701〜1：800、1：801〜1：900、1：901〜1：1000、1：1001〜1：2000、1：2001〜1：3000、1：3001〜1：4000、1：4001〜1：5000、1：5001〜1：6000、1：6001〜1：7000、1：7001〜1：8000、1：8001〜1：9000、1：9001〜1：10,000、1：10,001〜1：20,000、1：20,001〜1：30,000、1：30,001〜1：40,000、1：40,001〜1：50,000および1：50,000を上回る比率を含む種々の比率で存在する関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の検出を可能にする。
【０１９６】
例えば、この標識方法により、1シグナル発生部分で標識された1ヌクレオチドを用いてSNP遺伝子座における対立遺伝子の配列の決定、または、正常な対立遺伝子の集団内における突然変異対立遺伝子の検出、または、抗生物質感受性の細菌に由来する対立遺伝子内における菌体由来の抗生物質耐性をコードする対立遺伝子の検出、または、薬剤感受性ウィルス由来の対立遺伝子内における薬剤耐性ウィルス由来の対立遺伝子の検出、または、病原性細菌株由来の対立遺伝子内における非病原性細菌株由来の対立遺伝子の検出が可能となる。
【０１９７】
上記した通り、1ヌクレオチドを用いて特定の関心対象の遺伝子座における対立遺伝子の配列を決定できる。この方法は、特定の突然変異に関して個体がホモ接合であるかヘテロ接合であるかを判定するため、または、特定のSNP部位における対立遺伝子の配列を決定するために特に有用である。本標識方法は種々の染料の量子係数に起因する誤差を排除する。更にまた、例えばマイクロタイタープレートのウェルまたは単一のエッペンドルフ試験管のような単一の反応容器中で反応を進行させることができる。
【０１９８】
本標識方法は同じ試料中の複数の遺伝子シグナルの検出のために特に有用である。例えば、この方法は母方DNAおよび胎児DNAの両方を含有する妊娠女性の血液、血清または血漿中の胎児DNAの検出に有用である。母方DNAおよび胎児DNAは97：3などの比率で血液、血清または血漿中に存在する。しかしながら、上記した方法は胎児DNAの検出に使用することができる。本標識方法は試料集団中の2種、3種または4種の異なる遺伝子シグナルを検出するために使用できる。
【０１９９】
本標識方法は野生型対立遺伝子の大集団内に含まれる突然変異対立遺伝子の検出のために特に適している。更にまた、本標識方法は野生型細胞の大集団中の単一の突然変異細胞の検出を可能にする。例えば、本標識方法は正常細胞の大集団内の単一の癌細胞を検出するために使用できる。典型的には、癌細胞はDNA配列中に突然変異を有する。突然変異DNA配列は野生型DNA配列の大量のバックグラウンドが存在する場合でも、同定することができる。本標識方法はこれらに限定されないが、結腸、直腸、乳房、膀胱、肝臓、腎臓、脳、肺、前立腺の癌、および白血病を含む血液の癌を含む何れかの種類のスクリーニング、検出または診断のために使用できる。
【０２００】
本標識方法はまた、これらに限定されないが、細菌、真菌、ウィルス、原生動物およびマイコバクテリウムを含む病原体の検出のために使用できす。本発明はさらに、これらに限定されないが、細菌、真菌、ウィルス、原生動物およびマイコバクテリウムを含む微生物の病原性菌株と非病原性菌株との判別に使用できる。
【０２０１】
例えば、Escherichia coli（大腸菌）には数菌株あるが、大部分は非病原性である。しかしながら、一部の菌株、例えば大腸菌O157は病原性である。非病原性大腸菌と病原性大腸菌には遺伝子的相違がある。上記した標識方法を用いることにより、場合により個体の正常な細菌叢に伴っている非病原性の生物の大集団中の病原性の微生物を検出することができる。
【０２０２】
別の態様において、関心対象の遺伝子座の配列は関心対象の遺伝子座に対して3'であるヌクレオチドの取り込みを検出することにより決定することができ、その場合、該ヌクレオチドは関心対象の遺伝子座における可能なヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである。本態様はSNPの配列決定および検出に特に有用である。DNAポリメラーゼがヌクレオチドを取り込む効率および速度は各ヌクレオチドごとに変化する。
【０２０３】
ヒトゲノムプロジェクトのデータによれば、全SNPの99％がバイナリである。ヒトゲノムの配列は目的のSNPに対して3'であるヌクレオチドを決定するために用いることができる。SNP部位に対して3'であるヌクレオチドがSNP部位における可能なヌクレオチドとは異なる場合、SNPに対して3'である一つまたは複数の塩基であるヌクレオチドを用いてSNPの同一性を決定することができる。
【０２０４】
例えば、染色体13上のSNP Xの同一性を決定しようとすると仮定する。ヒトゲノムの配列はSNP Xがアデノシンまたはグアニンの何れかであることができ、そして、関心対象の遺伝子座に3'のヌクレオチドはチミジンであることを示している。増幅後に関心対象の遺伝子座から13塩基となるように設計されるBsmF Iに対する制限酵素認識部位を含むプライマーを用いてSNP Xを含むDNAフラグメントを増幅する。制限酵素BsmF Iによる消化の結果、アデノシンまたはグアニンの何れかであることができる関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じる。消化産物は2つの「フィルイン」反応に分割でき、一方はdTTPを含み、他方の反応はdCTPを含む。関心対象の遺伝子座がグアニンに関してホモ接合である場合は、dCTPと混合されたDNA分子のみがフィルインされる。関心対象の遺伝子座がアデノシンに関してヘテロ接合である場合、dTTPと混合されたDNA分子のみがフィルインされる。関心対象の遺伝子座がヘテロ接合である場合、dCTPと混合されたDNA分子並びにdTTPと混合されたDNA分子がフィルインされる。過剰なdNTPを除去するために洗浄した後、関心対象の遺伝子座に対して3'であるヌクレオチド（チミジン）に相補である標識されたddATPで試料をフィルインする。前の反応でフィルインされたDNA分子は標識されたddATPでフィルインされる。個体がアデノシンに関してホモ接合である場合、dTTPと混合されたDNA分子がその後、標識されたddATPでフィルインされる。しかしながら、dCTPと混合されたDNA分子はそのヌクレオチドを取り込んでおらず、従って、ddATPを取り込むことができないはずである。dTTPと混合された分子内にのみ標識されたddATPが検出されることは、染色体13上のSNP Xにおけるヌクレオチドの名称がアデノシンであることを示す。
【０２０５】
別の態様においては、1ヌクレオチド突然変異の有無の大規模スクリーニングを行うことができる。単一の染色体上または複数の染色体上の関心対象の遺伝子座1〜数十〜数百〜数千を、「プライマー設計」のセクションで記載したとおりプライマーを用いて増幅できる。プライマーは、各々の増幅された関心対象の遺伝子座が異なる大きさのものであるように設計できる（図2）。関心対象の遺伝子座において同じヌクレオチドを有することが公開された野生型配列にもとづいて予測される増幅された関心対象の遺伝子座を合わせ、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートのような固体支持体に結合させ、第2のプライマー上の認識部位に結合する制限酵素で消化することができる。消化の後、3'陥凹末端を、各ヌクレオチドが異なる基で標識されている標識ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTPの混合物を用いてフィルインできる。過剰のヌクレオチドを除去するために洗浄した後、プレートリーダーまたは蛍光計を用いて直接ストレプトアビジンコーティングプレート上で蛍光スペクトルを検出できる。関心対象の遺伝子座50個全てが野生型ヌクレオチドを含む場合、僅か1蛍光スペクトルが観察される。しかしながら、関心対象の遺伝子座50個のうち一つまたは複数が突然変異を含む場合、異なるヌクレオチドが取り込まれ、他の蛍光パターンが観察される。ヌクレオチドは固体マトリックスから放出され、配列決定ゲル上で分析されることにより、突然変異を含む関心対象の遺伝子座が決定される。関心対象の遺伝子座50個の各々は大きさが異なるため、配列決定ゲル上では分離される。
【０２０６】
複数の関心対象の遺伝子座は、単一の染色体、複数の染色体、複数の遺伝子、単一の遺伝子または何れかのこれらの組み合わせ上に複数の関心対象の遺伝子座を示す1個体に由来するDNA試料のものであることができる。複数の関心対象の遺伝子座はまた同じ関心対象の遺伝子座であるが複数の個体に由来するものを示すこともできる。例えば、50の異なる個体に由来する50のDNA試料を合わせ、分析することにより、遺伝子「X」における目的の特定のヌクレオチドを決定することができる。
【０２０７】
ヒトデータを分析する場合、既知配列は1個体（例えばDNAが現在分析中である個体を含む）から決定されている特定の配列であることができ、または、ヒトゲノムの部分として公開されているもののようなコンセンサス配列であることができる。
【０２０８】
キット
本発明の方法はキットの形態で本方法において使用される試薬を与えることにより最も好都合に実施される。キットは好ましくは一つまたは複数の要素、即ち、キットの使用のための取扱説明書、適切な緩衝液、塩、DNA抽出洗剤、プライマー、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、5'末端修飾物質、および、所望により、適切な純度の水を別々の容器またはパッケージ中に格納して包含しており、このような要素はキットの使用者が適切な核酸試料を抽出し、これを本発明の方法に従って分析することを可能とする。キットとともに提供されるプライマーはキットの目的およびキットを使用して試験することが望まれるDNAにより異なる。好ましい態様においては、酵素を用いた消化により配列決定法の間に生じたDNAフラグメント中に関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じるように、制限酵素に対する認識部位の発生を可能とするプライマーをキットは含んでいる。
【０２０９】
キットはまた、所望の、または種々の一塩基遺伝子多型、特に望ましくない症状または疾患に関わるものを検出するように設計できる。例えば、あるキットは他の要素と合わせて、乳癌に関わる一つまたは複数の関心対象の遺伝子座を増幅するためのプライマーの一つまたは複数のセットを含むことができる。別のキットは、他の要素と合わせて、I型またはII型糖尿病の発症傾向に関わる遺伝子に対するプライマーの一つまたは複数のセットを含むことができる。更に別のキットは、他の要素と合わせて、心臓病の発症傾向に関わる遺伝子に対するプライマーの一つまたは複数のセットを含むことができる。このようなキットの用途に関する詳細は後に記載する「用途」のセクションに記載する。
【０２１０】
用途
本発明の方法は、特定の核酸、その内部の一つまたは複数の関心対象の遺伝子座の配列を知ることが望ましい場合に使用できる。本発明の方法はゲノムDNAに適用する場合に特に有用である。臓器特異的または腫特異的な関心対象の遺伝子座からDNAを増幅する場合、本発明の方法はDNAの起源の同定のための遺伝子タイピングにおいて使用でき、即ち、DNA試料の由来元である生物または種の同一性を確認または明示する。生物は任意の核酸含有生物、例えばウィルス、細菌、酵母、植物、動物またはヒトであることもできる。
【０２１１】
何れかの生物集団内部において、本発明の方法は試料核酸の配列と既知核酸の配列との間の相違を発見するために有用である。このような相違は例えば対立遺伝子変異、突然変異、多形および特に一塩基遺伝子多型である。
【０２１２】
好ましい態様においては、本発明の方法は一塩基遺伝子多型の同定のための方法を提供する。
【０２１３】
好ましい態様においては、本発明の方法は、疾患、特に、ゲノム配列の存在または他の生物学的状態の結果として生じる遺伝子疾患の存在をを知ることが望ましい個体において同定することが望まれる該疾患の存在を同定するための方法を提供する。このようなゲノム配列の存在に基づいた対象中のこのような配列の同定は、例えば、対象がキャリアであることを決定するため、または、対象が特定の遺伝的な形質、状態または疾患を発症する傾向にあるかどうかを知らば得るために、使用することができる。本発明の方法は親および子の出生前遺伝子試験において特に有用である。本発明により診断できる疾患の一部の例を表IIに列挙する。
【０２１４】
（表II）
2006523082.tif 000033
2006523082.tif 000034
2006523082.tif 000035
【０２１５】
本発明の方法は遺伝子形質または遺伝子疾患に関わる目的の遺伝子座の数十、数百、または数千等のような複数の目的の遺伝子座における個体のスクリーニングを、その形質または疾患に関わる目的の遺伝子座、特に該形質または状態に最も頻繁に関わっているものを配列決定することにより行う際に有用である。本発明は、心疾患、癌、内分泌障害、免疫障害、神経学的障害、骨格筋障害、眼科障害、遺伝子異常、トリソミー、モノソミー、トランスバージョン、転座、皮膚障害および家族性疾患等を含む疾患の特定のセットを分析するために有用である。
【０２１６】
本発明の方法は物質、例えば食品物質中の特定の微生物の存在を迅速に同定するような、微生物の遺伝子タイピングのために使用できる。この点に関し、本発明の方法は食品、液体または気体の試料中の望ましくない生物学的混在物、例えば微生物、カビまたは動物の廃棄物の存在について分析する迅速な方法を提供する。本発明は種々の生物、例えばウィルス、カビ、原生動物、糸状菌、酵母、植物、動物および古細菌の検出に有用である。本発明は種々の原料、例えば水、空気、ホテル、会議室、プール、トイレ、航空機、宇宙船、電車、バス、自動車、事務室、家屋、商業地、協会、公園、海岸、運動施設、遊園地、劇場、および公の会合場所である他の何れかの施設から収集した生物の検出に有用である。
【０２１７】
本発明の方法はヒトまたは動物の血液試料から得た血液培養物中の細菌またはウィルスの多くの型の存在を試験するために使用できる。
【０２１８】
本発明の方法はまた、発酵製品、例えばワイン、ビールおよび他のアルコール類中の望ましい、または望ましくない酵母の菌株の存在、その特定の形質の確認または同定のため、または、その非存在の同定のために使用できる。
【０２１９】
本発明の方法はまた、入手源既知のDNAに対する未知配列のDNAの関連性を確認または同定するため、例えば、犯罪学、法医学、母親性または父親性の試験、考古学的分析等のために使用できる。
【０２２０】
本発明の方法はまた、植物、樹木および草木、および交配された植物、樹木および草木、例えば果実や野菜や他の作物を生産する植物、樹木および草木、例えばコムギ、オオムギ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、リンゴ、アンズ、バナナ、オレンジ、ナシ、ネクタリン、イチジク、デーツ、レーズン、プラム、モモ、アプリコット、ブルーベリー、イチゴ、クランベリー、ベリー類、サクランボ、キウイ、ライム、レモン、メロン、パイナップル、プランチーノ、グアバ、プルーン、パッションフルーツ、タンジェリン、グレープフルーツ、ブドウ、スイカ、カンタロープ、ハネデューメロン、ザクロ、カキ、ナッツ、アーティチョーク、モヤシ、ビート、カルドン、チャヨーテ、エンダイブ、ネギ、オクラ、グリーンオニオン、ワケギ、エシャロット、パースニップ、サツマイモ、ヤムイモ、アスパラガス、アボカド、コールラビ、カブカンラン、ナス、スクワシュ、カブ、カボチャ、トマト、ジャガイモ、キュウリ、ニンジン、キャベツ、セロリ、ブロッコリ、カリフラワー、ラディッシュ、コショウ、ホウレンソウ、マッシュルーム、ズッキーニ、タマネギ、エンドウマメ、インゲンマメおよび他のマメ類の遺伝子型を決定するために使用できる。
【０２２１】
特に、本発明の方法は、多くの異なる目的の遺伝子座を含む核酸試料の混合物および/または目的の遺伝子座に関して分析すべき種々の原料に由来する核酸試料の混合物をスクリーニングするために有用である。大規模スクリーニングの例は畜産用動物の群れ、または、食用植物の作物、例えばトウモロコシまたはコムギに由来する核酸の試料を採取すること、これらを合わせること、そして次に合わせた試料を望ましくない遺伝子マーカーの存在について後に分析することを包含し、その際、個々の試料は、合わせた試料がそのような望ましくない遺伝子配列を示す場合には後日個々の試料を分析するのみである。望ましくない遺伝子配列の例は畜産用動物から採取した核酸試料中のウィルスまたは細菌の核酸、マイコバクテリウムまたは脚部や口腔の病気のウィルスの配列、または、植物のカビ性または細菌性の病原体の検出である。
【０２２２】
核酸を合わせたものの他の例は、生存または死亡した動物またはヒトの対象、特に病原体または突然変異が検出されれば治療が必要となる対象から得た一つまたは複数の組織に由来する試料中の病原体または遺伝子突然変異の存在について試験するために使用できる。例えば多くの試料を、病原体または他の望ましくない遺伝子突然変異の存在についてスクリーニングすべき動物またはヒトの対象から採取でき、各生物学的試料に由来する目的の遺伝子座を個々に増幅し、そして次に、増幅されたDNAの試料を組み合わせ、制限消化、「フィルイン」および検出に付す。これは病原体または突然変異の存在の診断を可能とする核酸配列の有無の試験のための初期のスクリーニングとして有用である。次に病原体または突然変異の望ましくない核酸配列が検出されれば、個々の試料を別々に分析して望ましくない配列の分布を調べる。このような分析は試験すべき試料数が大量である場合には特に経費効率的である。病原体の試料は、マイコバクテリウム、特に結核またはパラ結核を誘発するもの、細菌、特に細菌戦に用いられる細菌性病原体、例えばバチルス・アンスラックス、および食中毒を誘発することができる猛毒細菌、ウィルス、特にインフルエンザおよびAIDSウィルス、および、悪性細胞に関わることがわかっている突然変異を包含する。このような分析はまた病原性細菌について食品を大規模スクリーニングするために有利である。
【０２２３】
逆に、本発明の方法は例えば組み合わせた試料をスクリーニングし、その後必要に応じて個々の試料をスクリーニングすることにより、植物、動物またはヒトの対象において、または、対象の集団において、種々の位置における所望の遺伝子配列の存在および分布を検出するために使用できる。
【０２２４】
本発明の方法は薬剤代謝、薬剤相互作用および単剤または多剤への応答性に対して作用を有する個体の遺伝子変異を分析するために有用である。本発明の方法は特に薬理ゲノム学において有用である。
【０２２５】
このように本発明を一般的に記述したが、これは、説明のみを目的とし、特段の記載が無い限り制限する意図のない、明細書に記載した特定の実施例を参照することにより更に理解される。
【０２２６】
実施例
以下の実施例は説明のみを目的としており、請求項により定義される本発明の範囲を限定する意図はない。
【０２２７】
実施例1
DNA配列はPCRで増幅し、その際、非特異的増幅を低減する目的で、サイクル1のアニーリング工程は特定の温度で実施し、次にサイクル2において上昇させ、サイクル3において更に上昇させた。PCRのサイクル1のTM1は第2のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域の融解温度を計算することにより決定した。例えば、図1Bにおいて、TM1は領域「c」の融解温度近傍とすることができる。アニーリング温度はサイクル2において第1のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域の融解温度近傍であるTM2まで上昇させた。例えば、図1Cにおいて、アニーリング温度（TM2）は領域「b」の融解温度に相当する。サイクル3においては、第2のプライマーの全配列の融解温度の近傍であるTM3までアニーリング温度を上昇させた。例えば、図1Dにおいて、アニーリング温度（TM3）は領域「c」＋領域「d」の融解温度に相当する。残余の増幅サイクルはTM3で実施した。
【０２２８】
鋳型DNAの調製
鋳型DNAはインフォームドコンセントのもとにヒトボランティアから静脈穿刺により採取した血液の5ml試料から調製した。血液は36人のボランティアから収集した。鋳型DNAはQIAGENから入手したQIAamp DNA Blood Midiキット（カタログ番号51183）を用いて各血液試料から単離した。単離の後、36人のボランティアの各々から得た鋳型DNAを合わせてその後の分析に付した。
【０２２９】
プライマー設計
以下の4種の一塩基遺伝子多型、即ちSNP HC21S00340、ヒト染色体21 SNPデータベースに帰属する識別番号、（図3、レーン1）染色体21上に位置する；SNP TSC0095512（図3、レーン2）、染色体1上に位置する、SNP TSC0214366（図3、レーン3）、染色体1上に位置する；および、SNP TSC0087315（図3、レーン4）、染色体1に位置するものを分析した。SNPコンソーシアムLtdデータベースは2002年2月14日付けで有効なウェブサイトアドレスhttp：//snp.cshl.org/においてアクセスできる。
【０２３０】
SNP HC21S00340は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000036
【０２３１】
SNP TSC0095512は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000037
【０２３２】
SNP TSC0214366は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000038
【０２３３】
SNP TSC0087315は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000039
【０２３４】
全プライマーは3'領域が関心対象の各遺伝子座の側方の上流または下流の配列の何れかに対して相補であり、そして、5'領域が制限酵素認識部位を含むように設計した。第1のプライマーは5'末端にビオチンタグ、そして制限酵素EcoRIに対する認識部位を含んでいた。第2のプライマーは制限酵素BceAIに対する認識部位を含んでいた。
【０２３５】
PCR反応
関心対象の遺伝子座4つの全てをPCRを用いて鋳型ゲノムDNAから増幅した（米国特許4,683,195号および4,683,202号）。PCR反応の要素は以下の通り、即ち、鋳型DNA40ng、5μM第1プライマー、5μM第2プライマー、QIAGENより入手した1×ホットスターTaqマスターミックス（カタログ番号203443）とした。1×ホットスターTaqマスターミックスはDNAポリメラーゼ、PCR緩衝液、200μMの各々のdNTPおよび1.5mM MgCl2を含んでいた。
【０２３６】
関心対象のSNPを含む各鋳型DNAの増幅は、本明細書では低ストリンジェンシーアニーリング温度、中ストリンジェンシーアニーリング温度、および、高ストリンジェンシーアニーリング温度と称する一連の3種の異なるアニーリング温度を用いて実施した。アニーリング温度プロトコルとは無関係に、各PCR反応は増幅40サイクルからなるものとした。PCR反応はQIAGENより入手したホットスタートTaqマスターミックスキットを用いて実施した。製造元の取扱説明書記載の通り、PCRの最初のサイクルの前に反応物を15分間95℃でインキュベートした。各伸長工程の後の変性工程は30秒間95℃で実施した。アニーリング反応は温度を上昇させることなく効率的伸長を可能にする温度で実施した。
【０２３７】
低ストリンジェンシーアニーリング温度は最初の3サイクルの各々において3種の異なるアニーリング温度とした。第1サイクルのアニーリング温度は37℃30秒；第2サイクルのアニーリング温度は57℃30秒；第3サイクルのアニーリング温度は64℃30秒とした。アニーリングはその後のサイクルは終了まで64℃で実施した。
【０２３８】
ゲルの写真（図3A）からわかるとおり、SNP TSC0087315を含むDNA鋳型の増幅後には複数のバンドが観察された（レーン4）。SNP HC21S00340（レーン1）、SNP TSC0095512（レーン2）およびSNP TSC0214366（レーン3）を含むDNA鋳型の増幅では高強度の単一のバンドおよび低強度の1本のバンドが生じ、これはより高分子量のものであった。低アニーリング温度条件を用いた場合、正しい大きさの生成物が生じ、これは各反応において優勢な生成物であった。
【０２３９】
中ストリンジェンシーアニーリング温度は最初の3サイクルの各々において3種の異なるアニーリング温度とした。第1サイクルのアニーリング温度は40℃30秒；第2サイクルのアニーリング温度は60℃30秒；第3サイクルのアニーリング温度は67℃30秒とした。アニーリングはその後のサイクルは終了まで67℃で実施した。低ストリンジェンシーアニーリング条件下に観察されたものと同様、SNP TSC0087315を含むDNA鋳型の増幅（図3B、レーン4）では中ストリンジェンシー条件下に複数のバンドが生じた。SNPを含む他の3種のDNAフラグメント（レーン1〜3）の増幅では単一のバンドが生じた。これらの結果によれば、変動するアニーリング温度を用いることにより13塩基のアニーリング長を有するプライマーを用いてゲノムDNAから関心対象の遺伝子座を明確に増幅することができることを示している。
【０２４０】
高ストリンジェンシーアニーリング反応は最初の3サイクルの各々において3種の異なるアニーリング温度とした。第1サイクルのアニーリング温度は46℃30秒；第2サイクルのアニーリング温度は65℃30秒；第3サイクルのアニーリング温度は72℃30秒とした。アニーリングはその後のサイクルは終了まで72℃で実施した。ゲルの写真（図3C）からわかるとおり、高ストリンジェンシーアニーリング温度を用いたSNP TSC0087315を含むDNA鋳型の増幅（レーン4）では正確な分子量の単一のバンドが生じた。アニーリング温度を最初の3サイクルの各々につき上昇させることにより、非特異的増幅が排除された。SNP TSC0095512を含むDNAフラグメントの増幅（レーン2）では単一のバンドが生じた。SNP HC21S00340（レーン1）およびSNP TSC0214366（レーン3）を含むDNAフラグメントは高ストリンジェンシーアニーリング温度では増幅できなかったが、中ストリンジェンシーアニーリング温度ではこれらのSNP含有DNAフラグメントは単一のバンドとして増幅された。これらの結果によれば、変動するアニーリング温度を用いることによりSNP TSC0087315を含有するDNAフラグメント（図3、レーン4）で観察されたものと同様、非特異的PCR産物が低減できることがわかる。
【０２４１】
実施例２
染色体1（TSC0095512）、13（TSC0264580）および21（HC21S00027）上のSNPを分析した。SNP TSC0095512はプライマーの2種の異なるセットを用いて分析し、SNP HC21S00027はヌクレオチドの取り込みに関して2つの型の反応を用いて分析した。
【０２４２】
鋳型DNAの調製
鋳型DNAはインフォームドコンセントのもとにヒトボランティアから静脈穿刺により採取した血液の5ml試料から調製した。鋳型DNAはQIAGENから入手したQIAamp DNA Blood Midiキット（カタログ番号51183）を用いて単離した。鋳型DNAはキットに含まれる取扱説明書に従って単離した。単離の後、36人のヒトボランティアの各々から得た鋳型DNAを合わせ、制限酵素EcoRIで切断した。制限酵素消化は製造元の取扱説明書に従って行った。
【０２４３】
プライマー設計
SNP HC21S00027は以下のプライマーセットを用いてPCRにより増幅した。
2006523082.tif 000040
【０２４４】
第1のプライマーは5'最末端にビオチンタグ、そして制限酵素EcoRIに対するヌクレオチド配列を含んでいた。第2のプライマーは制限酵素BsmFIに対するヌクレオチド配列を含んでいた（図4A）。
【０２４５】
またSNP HC21S00027は、同じ第1のプライマーを用いるが、以下の配列を有する異なる第2のプライマーを用いてPCRにより増幅した。
2006523082.tif 000041
【０２４６】
この第2のプライマーは制限酵素BceAIに対する認識部位を含んでいた（図4B）。
SNP TSC0095512は以下のプライマーを用いてPCR増幅した。
2006523082.tif 000042
【０２４７】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグ、そしてEcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた（図4C）。
【０２４８】
更にまたSNP TSC0095512は同様の第1のプライマーおよび以下の配列を有する異なる第2のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000043
【０２４９】
この第2のプライマーは制限酵素BceAIに対する認識部位を含んでいた（図4D）。
【０２５０】
染色体13上に位置するSNP TSC0264580は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000044
【０２５１】
第1のプライマーは5'最末端にビオチンタグ、そしてEcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０２５２】
PCR反応
関心対象の遺伝子座全てをポリメラーゼ連鎖反応（PCR、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号、参照として本明細書に組み入れられる）を用いた鋳型ゲノムDNAから増幅した。本実施例においては、関心対象の遺伝子座は別々の反応において増幅したが、単一のPCR反応においてともに増幅することもできる。特異性を高めるために、「ホットスタート」PCRを使用した。PCR反応はQIAGENより入手したホットスターTaqマスターミックスキットを用いて行った（カタログ番号203443）。反応ごとの鋳型DNAおよびプライマーの量は各々の関心対象の遺伝子座に対して旨適化できるが、本実施例においては40ngの鋳型ヒトゲノムDNAおよび5μMの各プライマーを使用した。40サイクルのPCRを実施した。以下のPCR条件を用いた。
（1）95℃15分15秒；
（2）37℃30秒；
（3）95℃30秒；
（4）57℃30秒；
（5）95℃30秒；
（6）64℃30秒；
（7）95℃30秒；
（8）工程6および7を39回反復；
（9）72℃で5分。
【０２５３】
PCRの第1サイクルにおいて、アニーリング温度は第2のプライマーの3'アニーリング領域の融解温度近傍とし、これは37℃であった。PCRの第2サイクルにおけるアニーリング温度は第1のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域の融解温度近傍とし、これは57℃であった。PCRの第3サイクルにおけるアニーリング温度は第2のプライマーの全配列の融解温度近傍とし、これは64℃であった。残余のサイクルのアニーリング温度は64℃とした。PCRの最初の3サイクルにおいてTM1〜TM2〜TM3へとアニーリング温度を上昇させることにより特異性が大きく高められる。これらのアニーリング温度は代表例であり、各サイクルのアニーリング温度は使用する特定のプライマーに応じて変化することは当業者の知るとおりである。
【０２５４】
変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間は種々の設定を検討し最良の結果を与えるパラメーターを用いることにより最適化できる。SNP HC21S00027およびSNP TSC0095512に関するPCR産物を図5A〜5Dに示す。
【０２５５】
関心対象の遺伝子座を含むフラグメントの精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。各PCR産物をRoche Diagnostics GmbHから入手したStreptawell透明ハイバインドプレート（カタログ番号1645692、Roche Molecular Biochemicalsの2001バイオケミカルズカタログ中に掲載）の4種の別々の反応ウェルに分割した。第1のプライマーは、PCR産物がストレプトアビジンコーティングウェルに結合し、ゲノム鋳型DNAは結合しないように5'ビオチンタグを含んでいた。ストレプトアビジン結合反応はサーモミキサ（Eppendorf）を用いて1000rpmで20分間37℃で行った。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、1×PBSを用いて3回、穏やかに混合しながら洗浄した（Kandpalら、Nucl.Acids Res.18：1789-1795（1990）；Kaneokaら、Biotechniques 10：30-34（1991）；Greenら、Nucl.Acids Res.18：6163-6164（1990））。
【０２５６】
関心対象の遺伝子座を含む単離されたフラグメントの制限酵素消化
精製されたPCR産物を、第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素を用いて消化した。SNP HC21S00027（図6Aおよび6B）およびSNP TSC0095512（図6Cおよび6D）を含むDNA鋳型を2種の異なる第２のプライマーを用いた別々の反応において増幅した。図6A（SNP HC21S00027）および図6C（SNP TSC0095512）は制限酵素BsmFI（New England Biolabs、カタログ番号R0572S）で消化した後のPCR産物を示す。図6B（SNP HC21S00027）および図6D（SNP TSC0095512）は制限酵素BceAI（New England Biolabs、カタログ番号R0623S）で消化した後のPCR産物を示す。消化は制限酵素とともに入手した取扱説明書に従って、Streptawell内で行った。SNP TSC0264580を含むDNAフラグメントはBsmFIで消化した。適切な制限酵素で消化した後、ウェルを3回PBSで洗浄し、切断されたフラグメントを除去した。
【０２５７】
標識されたヌクレオチドの取り込み
上記した制限酵素消化によりSNP部位または関心対象の遺伝子座および3'陥凹末端を含む5'オーバーハングを有するDNAフラグメントが得られた。5'オーバーハングは、DNAポリメラーゼの存在下に一つまたは複数のヌクレオチドの取り込みを可能にする鋳型として機能した。
【０２５８】
各SNPにつき、4種の別々のフィルイン（埋める；fill in）反応を行った；4種の反応の各々は、異なる蛍光標識のddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTPまたはddCTP）を含んでいた。以下の成分：蛍光標識ddNTP1μl、未標識ddNTP0.5μl（40μM）、ただしこれらは蛍光標識されたヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドを含むもの、10×シーケナーゼ緩衝液2μl、シーケナーゼ0.25μlおよび水を反応物が20μlになるように各フィルイン反応に添加した。フィルイン反応は全て40℃で10分間行った。非蛍光標識ddNTPはFermentas Inc.（Hanover,MD）より購入した。全ての他の標識試薬はAmershamより入手した（サーモシケーナーゼダイターミネーターサイクルシーケンシングコアキット、US79565）。蛍光標識ddNTPの存在下、3'陥凹末端は1塩基伸長し、これはSNPまたは関心対象の遺伝子座に相当する（図7A〜7D）。
【０２５９】
標識ddNTPおよび未標識dNTPの混合物はまたSNP HC21S00027の「フィルイン」反応のためにも使用した。「フィルイン」条件は40μM未標識dNTP、1μl蛍光標識ddATP,1μ蛍光標識ddTTP、1μl蛍光標識ddCTP、および、1μlddGTPを含有する混合物を用いる以外は上記と同様とした。蛍光ddNTPはAmershamより入手した（サーモシケーナーゼダイターミネーターサイクルシーケンシングコアキット、US79565；Amershamは蛍光ヌクレオチドの濃度を公開していない）。SNP HC21S00027を含有するDNAフラグメントは、4塩基の5'オーバーハングを生じさせる制限酵素BsmFIを用いて消化した。図7Eに示すとおり、取り込まれた第1のヌクレオチドが標識されたddNTPである場合、3'陥凹末端は1塩基によりフィルインされ、SNPまたは関心対象の遺伝子座の検出を可能とする。しかしながら、取り込まれた第1のヌクレオチドがdNTPである場合、ポリメラーゼはddNTPがフィルインされるまでヌクレオチドの取り込みを継続する。例えば、最初の2個のヌクレオチドがdNTPで、そして第3のヌクレオチドがddNTPでフィルインされる場合があり、これによりオーバーハング上の第3のヌクレオチドの検出が可能となる。即ち、5'オーバーハングの配列が決定され、各SNPまたは関心対象の遺伝子座から得られる情報が増量する。
【０２６０】
標識後、Streptawellを1×PBS（100μl）で3回洗浄した。次に「フィルイン」されたDNAフラグメントを、酵素とともに入手した製造元の取扱説明書に従って制限酵素EcoRIを用いた消化によりStreptawellから遊離させた（図8A〜8D）。消化は120rpmで振とうしながら37℃で1時間行った。
【０２６１】
関心対象の遺伝子座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後、10μl試料の2〜3μlを48穴のメンブレントレーに投入した（The Gel Company,カタログ番号TAM48-01）。トレー中の試料を48フローメンブレンコーム（The Gel Company,カタログ番号TAM48）に吸収させ、36cmの5％アクリルアミド（尿素）ゲル（Bio Whittaker Molecular Applications,ロングレンジャーランゲルパック、カタログ番号50691）内に挿入した。
【０２６２】
試料を3分間3000ボルトでゲル内に電気泳動させた。メンブレンコームを除去し、ゲルをABI377自動シーケンシング装置上3で時間泳動した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０２６３】
図9Aに示すとおり、36人の個体の試料から、2ヌクレオチドの一方、即ちアデノシンまたはグアニンの何れかが、SNP HC21S00027において検出された。SNP HC21S00027には2ヌクレオチドが存在することが報告されている（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。2ヌクレオチドの一方、即ちグアニンまたはシトシンはSNP TSC0095512において検出された（図9B）。関心対象の遺伝子座がBceAIに対する認識部位を含む第2のプライマーで増幅されても、または第2のプライマーがBsmFIの認識部位を含んでいても、同様の結果が得られた。
【０２６４】
図9Cに示すとおり、2ヌクレオチドの一方がSNP TSC0264580において検出され、これはアデノシンまたはシトシンの何れかであった。このSNP部位については2ヌクレオチドが報告されている（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。更にまた、関心対象の遺伝子座の1塩基上流でチミジンが検出された。配列依存的に、BsmFIは一部のDNA分子は10/14位で、そして同じ配列を有する他のDNA分子は11/15位で切断する。制限酵素BsmFIがセンス鎖上で11ヌクレオチド離れ、アンチセンス鎖上で15ヌクレオチド離れて切断する場合、3'陥凹末端はSNP部位の1塩基上流にある。SNP TSC0264580の配列はSNP部位の直前の塩基がチミジンであったことを示していた。標識されたddNTPのこの位置への取り込みにより、10/14位において切断されたフラグメントより1塩基小さいフラグメントが生じた。即ち、11/15位で切断されたDNA分子はSNP部位の直前の塩基に関する同一性情報を与え、そして、10/14位で切断されたDNA分子はSNP部位に関する同一性情報を与える。
【０２６５】
SNP HC21S00027はBsmFIに対する認識部位を含む第2のプライマーを用いて増幅した。標識されたddNTPおよび未標識のdNTPの混合物を用いてBsmFIによる消化で生じた5'オーバーハングをフィルインした。dNTPが取り込まれた場合、ポリメラーゼはddNTPが取り込まれるまでヌクレオチドの取り込みを継続した。各々1塩基異なるDNAフラグメントの集団を生じさせ、これにより、オーバーハングの全配列が決定できた。
【０２６６】
図9Dに示すとおり、アデノシンが検出され、これはSNPまたは関心対象の遺伝子座の直前のヌクレオチド（チミジン）に相補であった。このヌクレオチドは既に詳述したBsmFIの11/15切断特性により検出された。グアニンおよびアデノシンはSNP部位で検出され、これはこのSNP部位に関して報告されている2ヌクレオチドであった（図9A）。2ヌクレオチドは、染料の分子量が異なるため2ヌクレオチドの分離が可能となることから、SNP部位において検出された。検出された次のヌクレオチドはチミジンであり、これは、SNP部位のすぐ下流のヌクレオチドに相補であった。検出された次のヌクレオチドはグアニンであり、これはSNP部位の2塩基下流のヌクレオチドに相補であった。最後に、アデノシンが検出され、これはSNP部位の下流の3番目のヌクレオチドに相補であった。配列の情報はSNP部位に関してのみならず、SNP部位の直前のヌクレオチドおよび次の3ヌクレオチドについでも得られた。
【０２６７】
関心対象の遺伝子座のいずれも突然変異を含んでいなかった。しかしながら、関心対象の遺伝子座の1つが例えば点突然変異、挿入、欠失、転座またはこのような突然変異の何れかの組み合わせのような突然変異を含む場合、コンセンサスまたは公開された配列との比較によりそれを同定できる。遺伝子のネイティブの非疾患関連配列に対して関心対象の遺伝子座の各々に帰属される配列を比較することにより、その配列内の突然変異の有無を決定する。次に、配列内の突然変異の発見を、その個体における所定の疾患の存在、または、これを発症しやすい傾向として、適宜解釈する。突然変異または正常または非突然変異の配列の相対量を評価することにより、対象が突然変異配列の1または2対立遺伝子を有するかどうか、即ち、対象がキャリアであるか、または、示された突然変異が優性または劣性の状態をもたらすかどうかを決定できる。
【０２６８】
実施例3
染色体1の関心対象の遺伝子座4つおよび染色体21の関心対象の遺伝子座2つを別々のPCR反応において増幅し、合わせ、分析した。プライマーは、増幅された関心対象の遺伝子座の各々が関心対象の遺伝子座の検出を可能にする異なる大きさとなるように設計した。
【０２６９】
鋳型DNAの調製
鋳型DNAはインフォームドコンセントのもとにヒトボランティアから静脈穿刺により採取した血液の5ml試料から調製した。鋳型DNAはQIAGENから入手したQIAamp DNA Blood Midiキット（カタログ番号51183）を用いて単離した。鋳型DNAはキットに含まれる取扱説明書に従って単離した。鋳型DNAは36人のヒトボランティアから単離し、次に合わせて1試料とし、その後の分析に付した。
【０２７０】
プライマー設計
SNP TSC0087315は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000045
【０２７１】
SNP TSC0214366は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000046
【０２７２】
SNP TSC0413944は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000047
【０２７３】
SNP TSC0095512は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000048
【０２７４】
SNP HC21S00131は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000049
【０２７５】
SNP HC21S00027は以下のプライマーを用いて増幅した。
2006523082.tif 000050
【０２７６】
各SNPについて、第1のプライマーは制限酵素EcoRIに対する認識部位を含み、5'最末端においてビオチンタグを有していた。各SNPの増幅に用いた第2のプライマーは制限酵素BceAIに対する認識部位を含んでいた。
【０２７７】
PCR反応
PCR反応は以下のアニーリング温度、即ち、PCR第1サイクルのアニーリング温度37℃30秒、PCR第2サイクルのアニーリング温度57℃30秒、そしてPCR第3サイクルのアニーリング温度64℃30秒を用いた以外は実施例2と同様に実施した。その後の全てのサイクルはアニーリング温度64℃30秒とした。37サイクルのPCRを行った。PCRの後、1/4の容量を各反応物から除去し、単一のチューブに合わせた。
【０２７８】
関心対象の遺伝子座を含むフラグメントの精製
PCR産物（この時点では1試料に合わさっており、「試料」と称する）を、Streptawellマイクロタイタープレートの単一のウェルに試料を結合させた以外は実施例2に記載の通り、ゲノム鋳型DNAから分離した。
【０２７９】
関心対象の遺伝子座を含む単離されたフラグメントの制限酵素消化
第2のプライマーの認識部位に結合する制限酵素BceAIを用いて試料を消化した。制限酵素消化は酵素とともに入手した取扱説明書に従って実施した。制限酵素で消化した後、ウェルを1×PBSで3回洗浄した。
【０２８０】
ヌクレオチドの取り込み
上記した制限酵素消化によりSNP部位または関心対象の遺伝子座および3'陥凹末端を含む5'オーバーハングを有するDNA分子が得られた。5'オーバーハングは、DNAポリメラーゼの存在下にヌクレオチドの取り込みを可能にする鋳型として機能した。
【０２８１】
フィルイン反応には以下の成分：蛍光標識ddATP1μl；蛍光標識ddTTP1μl；蛍光標識ddGTP1μl；蛍光標識ddCTP1μl；10×シーケナーゼ緩衝液2μl、シーケナーゼ0.25μlおよび水を反応物が20μlになるように用いた。フィルイン反応は40℃で10分間行った。全ての他の標識試薬はAmershamより入手した（サーモシケーナーゼダイターミネーターサイクルシーケンシングコアキット（US79565）；キットにおいて提供されたddNTPの濃度は企業秘密であり、Amershamは公開していない）。蛍光標識ddNTPの存在下、3'陥凹末端は1塩基伸長し、これはSNPまたは関心対象の遺伝子座に相当する。
【０２８２】
ヌクレオチドの取り込みの後、Streptawellを1×PBS（100μl）で3回すすいだ。次に「フィルイン」されたDNAフラグメントを、製造元の取扱説明書に従って、制限酵素EcoRIで消化することによりStreptawellから遊離させた。消化は120rpmで浸透しながら37℃で1時間行った。
【０２８３】
関心対象の遺伝子座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後、10μl試料の2〜3μlを48穴のメンブレントレーに投入した（The Gel Company,カタログ番号TAM48-01）。トレー中の試料を48フローメンブレンコーム（The Gel Company,カタログ番号TAM48）に吸収させ、36cmの5％アクリルアミド（尿素）ゲル（Bio Whittaker Molecular Applications,ロングレンジャーランゲルパック、カタログ番号50691）内に挿入した。
【０２８４】
試料を3分間3000ボルトでゲル内に電気泳動させた。メンブレンコームを除去し、ゲルをABI377自動シーケンシング装置上で3時間泳動した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０２８５】
プライマーは増幅された関心対象の遺伝子座の各々が異なる大きさとなるように設計した。図10に示すとおり、増幅された関心対象の遺伝子座の各々は約5〜10ヌクレオチド異なっており、これにより関心対象の遺伝子座はゲル電気泳動により相互に分離できた。2ヌクレオチドがSNP TSC0087315において検出されこれらはグアニンとシトシンであった。2ヌクレオチドがSNP TSC0087315について存在することが報告されている（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。試料は36人の個体に由来する鋳型DNAよりなり、そして、グアニンを取り込んだDNA分子はシトシンを取り込んだものと分子量が異なるため、各ヌクレオチドについて異なるバンドが観察された。
【０２８６】
2ヌクレオチドがSNP HC21S00027において検出され、これらはグアニンとアデノシンであった（図10）。このSNP部位において報告されている2ヌクレオチドはグアニンおよびアデノシンである（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。上記した通り、試料は36人の個体に由来する鋳型DNAを含有し、試料中に両方のヌクレオチドが現れることが予測できる。グアニンを取り込んだDNAフラグメントの分子量はアデノシンを取り込んだDNAフラグメントの分子量と異なり、これにより両方のヌクレオチドの検出が可能となる。
【０２８７】
ヌクレオチドシトシンはSNP TSC0214366において検出された（図10）。このSNP位置において存在が報告されている2ヌクレオチドはチミジンおよびシトシンである。
【０２８８】
ヌクレオチドグアニンはSNP TSC0413944において検出された（図10）。このSNPについて報告されている2ヌクレオチドはグアニンおよびシトシンである（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。
【０２８９】
ヌクレオチドシトシンはSNP TSC0095512において検出された（図10）。このSNP部位について報告されている2ヌクレオチドはグアニンおよびシトシンである（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。
【０２９０】
SNP HC21S00131において検出されたヌクレオチドはグアニンであった。このSNP部位について報告されている2ヌクレオチドはグアニンおよびアデノシンである（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）。
【０２９１】
上記した通り、試料は36人の個体に由来するDNA鋳型を含んでおり、SNP部位において両方のヌクレオチドが現れることが予測される。SNP TSC0413944、TSC0095512、TSC0214366およびHC21S00131については、2ヌクレオチドの一方が検出された。これらのSNP部位について報告された両方のヌクレオチドが試料中に存在するが、一方の蛍光染料が他方を凌駕すると考えられる。1ヌクレオチドを取り込んだDNA分子の分子量によって、他のヌクレオチドを取り込んだDNA分子の効率的な分離は起こらなかった。しかしながら、SNPは容易に相互に分離され、各SNPにつき、適切なヌクレオチドが取り込まれた。PCR後に1試料として取り扱った複数の染色体由来の複数の関心対象の遺伝子座の配列を決定した。
【０２９２】
蛍光標識ddNTPを含む単一の反応を、複数の関心対象の遺伝子座を含む試料を用いて実施した。または、4種の別々のフィルイン反応を行うことができ、その際各反応には1種の蛍光標識ヌクレオチド（ddATP、ddTTP,ddGTPまたはddCTP）および未標識のddNTP（実施例2、図7A〜Dおよび図9A〜C参照）が含まれる。4種の別々の「フィルイン」反応は関心対象の遺伝子座に存在する何れかのヌクレオチドの検出を可能にする。例えば、単一の個体に由来する複数の関心対象の遺伝子座を含む試料を分析し、そして、該外個体が一つまたは複数の関心対象の遺伝子座においてヘテロ接合である場合、4種の別々の「フィルイン」反応を用いることにより、ヘテロ接合の関心対象の遺伝子座におけるヌクレオチドを決定することができる。
【０２９３】
更にまた、複数の個体に由来する鋳型を含む試料を分析する場合、4種の別々の「フィルイン」反応により、関心対象の遺伝子座においてどの程度の頻度でヌクレオチドが発見されるかに関わらず、試料中に存在するヌクレオチドの検出が可能となる。例えば、試料が50個体に由来するDNA鋳型を含み、そして、49個体が関心対象の遺伝子座においてチミジンを有し、そして、1個体がグアニンを有する場合、図9A〜9Cに示すようなゲルの別々のレーン中で各々の「フィルイン」反応を行うような4種の別々の「フィルイン」反応を行うことにより、グアニンの検出が可能となる。複数のDNA鋳型からなる試料を分析する場合、複数の「フィルイン」反応は、質量の相違により関心対象の単一の部位における複数のヌクレオチドを識別する必要性を軽減する。
【０２９４】
本実施例においては、複数の一塩基遺伝子多型を分析する。複数の関心対象の遺伝子座から点突然変異、遷移、トランスバージョン、転座、挿入および欠失のような突然変異の有無を調べることも可能である。複数の関心対象の遺伝子座は単一の染色体または複数の染色体に由来するものであることができる。複数の関心対象の遺伝子座は単一の遺伝子または複数の遺伝子に由来するものであることができる。
【０２９５】
疾患の表現型を誘発するか、その傾向を高める複数の関心対象の遺伝子座の配列を決定することができる。例えば、癌または他の疾患に関与する1〜数十〜数百〜数千の遺伝子を増幅することができる。プライマーは各々の増幅された関心対象の遺伝子座の大きさが異なるように設計することができる。PCRの後、増幅された関心対象の遺伝子座を合わせて、単一の試料として処理する。また、関心対象の複数の遺伝子座を一回のPCR反応で増幅することができる、もしくは関心対象の遺伝子座の総数（例えば100個）を、複数の試料（例えば1回のPCR反応あたり10個の関心対象の遺伝子座）に分割して、その後あわせる(pool)ことができる。本明細書に示すとおり、複数の関心対象の遺伝子座の配列を決定できる。即ち、1つの反応において、疾患の表現型の傾向を高めるか誘発する遺伝子1〜10〜数百〜数千の配列を決定できる。
【０２９６】
実施例4
ゲノムDNAをインフォームドコンセントを得た後に4人の個体から得た。染色体13上の6種のSNP（TSC0837969、TSC0034767、TSC1130902、TSC0597888、TSC0195492、TSC0607185）を鋳型DNAを用いて分析した。これらのSNPに関する情報は2003年2月11日付けで有効なウェブサイト（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml）において入手できる。
【０２９７】
1つの蛍光染料で標識された1ヌクレオチドを用いて6種の選択されたSNP部位における個体を遺伝子タイピングした。プライマーは単一の反応において6種のSNPが分析できるように設計した。
【０２９８】
鋳型DNAの調製
鋳型DNAはインフォームドコンセントのもとにヒトボランティアから静脈穿刺により採取した血液の9ml試料から調製した。鋳型DNAはQIAGENから入手したQIAamp DNA Blood Midiキット（カタログ番号51183）を用いて単離した。鋳型DNAはキットに含まれる取扱説明書に従って単離した。
【０２９９】
プライマー設計
SNP TSC0837969は以下のプライマーセットを用いて増幅した。
2006523082.tif 000051
【０３００】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から44塩基でアニーリングするように設計した。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０３０１】
SNP TSC0034767は以下のプライマーセットを用いて増幅した。
2006523082.tif 000052
【０３０２】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から50塩基でアニーリングするように設計した。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０３０３】
SNP TSC1130902は以下のプライマーセットを用いて増幅した。
2006523082.tif 000053
【０３０４】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から60塩基でアニーリングするように設計した。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０３０５】
SNP TSC0597888は以下のプライマーセットを用いて増幅した。
2006523082.tif 000054
【０３０６】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から70塩基でアニーリングするように設計した。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０３０７】
SNP TSC0195492は以下のプライマーセットを用いて増幅した。
2006523082.tif 000055
【０３０８】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から80塩基でアニーリングするように設計した。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０３０９】
SNP TSC0607185は以下のプライマーセットを用いて増幅した。
2006523082.tif 000056
【０３１０】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から90塩基でアニーリングするように設計した。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含んでいた。
【０３１１】
関心対象の遺伝子座全てをポリメラーゼ連鎖反応（PCR、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号、参照として本明細書に組み入れられる）を用いた鋳型ゲノムDNAから増幅した。本実施例においては、関心対象の遺伝子座は別々の反応において増幅したが、単一のPCR反応においてともに増幅することもできる。特異性を高めるために、「ホットスタート」PCRを使用した。PCR反応はQIAGENより入手したホットスターTaqマスターミックスキットを用いて行った（カタログ番号203443）。反応ごとの鋳型DNAおよびプライマーの量は各々の関心対象の遺伝子座に対して旨適化できるが、本実施例においては40ngの鋳型ヒトゲノムDNAおよび5μMの各プライマーを使用した。40サイクルのPCRを実施した。以下のPCR条件を用いた。
（1）95℃15分15秒；
（2）37℃30秒；
（3）95℃30秒；
（4）57℃30秒；
（5）95℃30秒；
（6）64℃30秒；
（7）95℃30秒；
（8）工程6および7を39回反復；
（9）72℃5分。
【０３１２】
PCRの第1サイクルにおいて、アニーリング温度は第2のプライマーの3'アニーリング領域の融解温度近傍とし、これは37℃であった。PCRの第2サイクルにおけるアニーリング温度は第1のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域の融解温度近傍とし、これは57℃であった。PCRの第3サイクルにおけるアニーリング温度は第2のプライマーの全配列の融解温度近傍とし、これは64℃であった。残余のサイクルのアニーリング温度は64℃とした。PCRの最初の3サイクルにおいてTM1〜TM2〜TM3へとアニーリング温度を上昇させることにより特異性が大きく高められる。これらのアニーリング温度は代表例であり、各サイクルのアニーリング温度は使用する特定のプライマーに応じて変化することは当業者の知るとおりである。
【０３１３】
変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間は種々の設定を検討し最良の結果を与えるパラメーターを用いることにより最適化できる。本実施例においては、第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から種々の距離でアニーリングするように設計した。当業者の知るとおり、第1のプライマーのアニーリング位置は関心対象の遺伝子座から5〜10、11〜15、16〜20、21〜25、26〜30、31〜35、36〜40、41〜45、46〜50、51〜55、56〜60、61〜65、66〜70、71〜75、76〜80、81〜85、86〜90、91〜95、96〜100、101〜105、106〜110、111〜115、116〜120、121〜125、126〜130、131〜140、141〜160、161〜180、181〜200、201〜220、221〜240、241〜260、261〜280、281〜300、301〜350、351〜400、401〜450、451〜500、または、500塩基超であることができる。
【０３１４】
関心対象の遺伝子座を含むフラグメントの精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離した。PCR反応の後、1固体由来の各PCR産物の1/4容量をRoche Diagnostics GmbHから入手したStreptawell透明ハイバインドプレート（カタログ番号1645692、Roche Molecular Biochemicalsの2001バイオケミカルズカタログ中に掲載）の1ウェル中で混合した。第1のプライマーは、PCR産物がストレプトアビジンコーティングウェルに結合し、ゲノム鋳型DNAは結合しないように5'ビオチンタグを含んでいた。ストレプトアビジン結合反応はサーモミキサ（Eppendorf）を用いて1000rpmで20分間37℃で行った。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、1×PBSを用いて3回、穏やかに混合しながら洗浄した（Kandpalら、Nucl.Acids Res.18：1789-1795（1990）；Kaneokaら、Biotechniques 10：30-34（1991）；Greenら、Nucl.Acids Res.18：6163-6164（1990））。
【０３１５】
関心対象の遺伝子座を含む単離されたフラグメントの制限酵素消化
精製されたPCR産物を、第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFIを用いて消化した。消化は制限酵素とともに入手した取扱説明書に従ってStreptawell内で行った。消化後、ウェルを3回PBSで洗浄し、切断されたフラグメントを除去した。
【０３１６】
標識されたヌクレオチドの取り込み
上記した制限酵素消化によりSNP部位または関心対象の遺伝子座および3'陥凹末端を含む5'オーバーハングを有するDNAフラグメントが得られた。5'オーバーハングは、DNAポリメラーゼの存在下に一つまたは複数のヌクレオチドの取り込みを可能にする鋳型として機能した。
【０３１７】
以下にSNP TSC0837969の5'オーバーハングの模式図を示す。全DNA配列は再現せず、一部のみを用いてオーバーハングを示した（Rは可変部位を示す）。
2006523082.tif 000057
【０３１８】
5'センス鎖（ここでは上側の鎖として示す）の上のTSC0837969について観察されたヌクレオチドはアデニンおよびグアニンであった。アンチセンス鎖上のオーバーハング中の3位はグアニンに相補であるシトシンに相当した。この可変部位はアデニンまたはグアニンであることができるため、未標識のdCTP、dTTPおよびdATPの存在下の蛍光標識ddGTPを用いて両方の対立遺伝子の配列を決定した。グアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合、またはヘテロ接合の個体のフィルイン反応を以下の略図に示す。
【０３１９】
TSC0837969においてグアニンに関してホモ接合
2006523082.tif 000058
【０３２０】
標識されたddGTPはオーバーハングの最初の位置に取り込まれる。1シグナルのみが観察され、これはオーバーハングの最初の位置の標識されたddGTPでフィルインされた分子に相当する。
【０３２１】
TSC0837969においてアデニンに関してホモ接合
2006523082.tif 000059
【０３２２】
未標識のdATPはオーバーハングの1位に取り込まれ、そして未標識のdTTPがオーバーハングの2位に取り込まれる。標識されたddGTPはオーバーハングの3位に取り込まれる。1シグナルのみが観察された；3位においてddGTPでフィルインされた分子は1位においてフィルインされた分子とは異なる分子量を有し、これによりアデニンまたはグアニンに関してホモ接合の個体が容易に同定できる。
【０３２３】
TSC0837969においてヘテロ接合
2006523082.tif 000060
【０３２４】
2つのシグナルが観察された；1つのシグナルは1位でddGTPによりフィルインされたDNA分子に相当し、第2のシグナルはオーバーハングの3位でフィルインされた分子に相当する。2つのシグナルは例えばゲル電気泳動のような分子量に基づいて分離する何れかの手法を用いて分離できる。
【０３２５】
以下にSNP TSC0034767の5'オーバーハングの模式図を示す。全DNA配列は再現せず、一部のみを用いてオーバーハングを示した（Rは可変部位を示す）。
2006523082.tif 000061
【０３２６】
5'センス鎖（ここでは上側の鎖として示す）の上のTSC0034767について観察されたヌクレオチドはシトシンおよびグアニンである。オーバーハング中の2位はチミジンに相補のアデニンであり、オーバーハングの3位はグアニンに相補であるシトシンに相当する。蛍光標識ddGTPを未標識のdCTP,dTTPおよびdATPの存在下に用いて両方の対立遺伝子の配列を決定する。
【０３２７】
この場合、第2のプライマーは関心対象の遺伝子座の上流でアニーリングし、即ちフィルイン反応はアンチセンス鎖（ここでは下側の鎖として示す）上で起こる。IIS型制限酵素認識部位を含む第2のプライマーが関心対象の遺伝子座の上流か下流のどちらでアニーリングするかに応じて、センス鎖またはアンチセンス鎖の何れかがフィルインされる。
【０３２８】
以下にSNP TSC1130902の5'オーバーハングの模式図を示す。全DNA配列は再現せず、一部のみを用いてオーバーハングを示した（Rは可変部位を示す）。
2006523082.tif 000062
【０３２９】
5'センス鎖の上のTSC1130902について観察されたヌクレオチドはアデニンおよびグアニンである。オーバーハング中の2位はチミジン相当し、オーバーハング中の3位はグアニンに相補のシトシンに相当する。
【０３３０】
蛍光標識ddGTPを未標識のdCTP,dTTPおよびdATPの存在下に用いて両方の対立遺伝子の配列を決定する。
【０３３１】
以下にSNP TSC0597888の5'オーバーハングの模式図を示す。全DNA配列は再現せず、一部のみを用いてオーバーハングを示した（Rは可変部位を示す）。
2006523082.tif 000063
【０３３２】
5'センス鎖（ここでは上側の鎖として示す）の上のTSC0597888について観察されたヌクレオチドはシトシンおよびグアニンである。オーバーハング中の3位はグアニンに相補のシトシンである。蛍光標識ddGTPを未標識のdCTP,dTTPおよびdATPの存在下に用いて両方の対立遺伝子の配列を決定する。
【０３３３】
以下にSNP TSC0607185の5'オーバーハングの模式図を示す。全DNA配列は再現せず、一部のみを用いてオーバーハングを示した（Rは可変部位を示す）。
2006523082.tif 000064
【０３３４】
5'センス鎖（ここでは上側の鎖として示す）の上のTSC0607185について観察されたヌクレオチドはシトシンおよびチミジンである。この場合、第2のプライマーは関心対象の遺伝子座の上流でアニーリングし、これによりアンチセンス鎖がフィルインされる。アンチセンス鎖（ここでは下側の鎖として示す）はグアニンまたはアデニンでフィルインされる。
【０３３５】
5'オーバーハング中の2位はアデニンに相補のチミジンであり、そしてオーバーハングの3位はグアニンに相補のシトシンに相当する。蛍光標識されたddGTPを未標識のdCTP、dTTPおよびdATPの存在下に用いて両方の対立遺伝子の配列を決定する。
【０３３６】
以下にSNP TSC0195492の5'オーバーハングの模式図を示す。全DNA配列は再現せず、一部のみを用いてオーバーハングを示す。
2006523082.tif 000065
【０３３７】
この部位に観察されたヌクレオチドはセンス鎖（ここでは上側の鎖として示す）上のシトシンおよびグアニンである。5'オーバーハング中の2位はチミジンに相補のアデニンであり、オーバーハング上の3位はグアニンに相補のシトシンに相当する。蛍光標識されたddGTPを未標識のdCTP,dTTPおよびdATPの存在下に用いて両方の対立遺伝子の配列を決定する。
【０３３８】
上記に示したとおり、6種のSNPの両方の対立遺伝子の配列は、未標識のdATP,dTTPおよびdCTPの存在下にddGTPで標識することにより決定できる。以下の成分：蛍光標識ddNTP1μl、未標識ddNTP0.5μl（40μM）、ただしこれらはグアニン以外の全てのヌクレオチドを含むもの、10×シーケナーゼ緩衝液2μl、シーケナーゼ0.25μlおよび水を反応物が20μlになるように各フィルイン反応に添加した。フィルイン反応は40℃10分間行った。非蛍光標識ddNTPはFermentas Inc.（Hanover,MD）より購入した。全ての他の標識試薬はAmershamより入手した（サーモシケーナーゼダイターミネーターサイクルシーケンシングコアキット、US79565）。
【０３３９】
標識後、Streptawellを1×PBS（100μl）で3回洗浄した。次に「フィルイン」されたDNAフラグメントを、酵素とともに入手した製造元の取扱説明書に従って制限酵素EcoRIを用いた消化によりStreptawellから遊離させた。消化は120rpmで振とうしながら37℃で1時間行った。
【０３４０】
関心対象の遺伝子座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後、試料を36cmの5％アクリルアミド（尿素）ゲル（Bio Whittaker Molecular Applications,ロングレンジャーランゲルパック、カタログ番号50691）の1つのレーン内に投入した。試料を3分間3000ボルトでゲル内に電気泳動させた。ゲルを配列決定装置上で3時間処理した（HoeferSQ3シーケンサー）。ゲルを装置から除き、タイフーン9400バリアブルモードイメージャー上でスキャニングした。取り込まれたヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０３４１】
図11に示すとおり、SNP TSC0837969のレーン1および2の鋳型DNAはアデニンに関してホモ接合であった。個体がアデニンに関してホモ接合である場合、以下のフィルイン反応が起こることが予測された。
【０３４２】
TSC0837969におけるアデニンに関するホモ接合
2006523082.tif 000066
【０３４３】
未標識のdATPはオーバーハングに相補の第1の位置に取り込まれた。未標識のdTTPはオーバーハングに相補の第2の位置に取り込まれた。標識されたddGTPはオーバーハングに相補の第3の位置に取り込まれた。1本のバンドのみが観察され、これはアクリルアミドゲルの約46位において移行していた。これは、アデニンが1位においてフィルインされているヌクレオチドであることを示している。ヌクレオチドグアニンがフィルインされている場合は、44位にバンドが予測される。
【０３４４】
しかしながら、SNP TSC0837969に対するレーン3および4の鋳型DNAはヘテロ接合であった。個体がヘテロ接合の場合は以下のフィルイン反応が予測された。
【０３４５】
TSC0837969におけるヘテロ接合
2006523082.tif 000067
【０３４６】
2つの異なるバンドが観察された；一方のバンドはオーバーハングに相補の1位においてddGTPによりフィルインされた分子に相当し（G対立遺伝子）、第2のバンドはオーバーハングに相補の3位においてddGTPによりフィルインされた分子に相当する（A対立遺伝子）。2本のバンドをゲル電気泳動を用いて分子量の差に基づき分離した。1つの蛍光標識ヌクレオチドddGTPを用いて個体がSNP部位においてヘテロ接合であることを判定した。これは、2つの異なる対立遺伝子の存在を効率的に検出するための1ヌクレオチドの最初の使用である。
【０３４７】
SNP TSC0034767につき、レーン1および3の鋳型DNAは、2種の異なるバンドにより明らかな通り、シトシンおよびグアニンについてヘテロ接合である。より低いバンドはオーバーハングに相補の1位においてフィルインされたddGTPに相当する。僅かにより高分子量の第2のバンドは3位においてフィルインされたddGTPに相当し、オーバーハングの最初の位置が未標識のdCTPでフィルインされたことを示しており、これによりポリメラーゼはオーバーハングに相補の3位においてそれがddGTPを取り込むまでヌクレオチドの取り込みが継続可能となる。レーン2および4の鋳型DNAは、オーバーハングに相補の最初の位置においてddGTPがフィルインされていれば高分子量の単一のバンドにより明らかになるとおり、グアニンに関してホモ接合であった。
【０３４８】
SNP TSC1130902については、ゲル上の約62位において移行している単一のより高分子量のバンドから明らかな通り、可変部位においてアデニンに関してホモ接合である。レーン3における鋳型DNAは、2種の異なるバンドの存在により示されるとおり、可変ぶいにおいてヘテロ接合であった。より低いバンドはオーバーハングに相補の1位においてddGTPでフィルインされた分子に相当した（グアニン対立遺伝子）。より高分子量のバンドはオーバーハングに相補の3位においてddGTPでフィルインされた分子に相当した（アデニン対立遺伝子）。
【０３４９】
SNP TSC0597888については、レーン1および4の鋳型DNAは可変部位においてシトシンに関してホモ接合であり；レーン2の鋳型DNAは可変部位においてヘテロ接合であり、そしてレーン3の鋳型DNAはグアニンに関してホモ接合であった。予測されるフィルイン反応を以下の略図に示す。
【０３５０】
シトシンに関してホモ接合
2006523082.tif 000068
【０３５１】
グアニンに関してホモ接合
2006523082.tif 000069
【０３５２】
グアニン/シトシンに関してヘテロ接合
2006523082.tif 000070
【０３５３】
可変部位においてグアニンに関してホモ接合である鋳型DNAは単一のバンドを示し、これはオーバーハングに相補の1位においてddGTPでフィルインされたDNA分子に相当した。これらのDNA分子はオーバーハングの3位においてddGTPでフィルインされているDNA分子と比較してより小さい分子量のものであった（SNP TSC0597888の3レーン参照）。DNA分子は分子量において2塩基分異なっていた。
【０３５４】
可変部位においてシトシンに関してホモ接合である鋳型DNAは単一のバンドを示し、これはオーバーハングに相補の3位においてddGTPでフィルインされたDNA分子に相当した。これらのDNA分子は1位においてddGTPでフィルインされたDNA分子よりも高い分子量において移行していた（SNP TSC0597888のレーン1および4参照）。
【０３５５】
可変部位においてヘテロ接合である鋳型DNAは2つのバンドを示し；1つのバンドはオーバーハングに相補の1位においてddGTPでフィルインされているDNA分子に相当し、第2のバンドはオーバーハングに相補の3位においてddGTPでフィルインされているDNA分子に相当し、そしてより高分子量のものであった（SNP TSC0597888のレーン3参照）。
【０３５６】
SNP TSC0195492については、レーン1および3の鋳型DNAは可変部位においてヘテロ接合であり、これは2つの異なるバンドの存在により明らかにされた。レーン2の鋳型DNAは可変部位においてグアニンに関してホモ接合であった。レーン4の鋳型DNAはシトシンに関してホモ接合であった。このSNPについてはレーン4において唯一のバンドが観察されており、これはオーバーハングに相補の1位においてddGTPでフィルインされたDNA分子よりも高分子量を有していた（レーン2、3および4を比較）。
【０３５７】
SNP TSC0607185について観察された対立遺伝子はシトシンおよびチミジンとして報告されている。一貫性のために、SNPコンソーシアムはセンス鎖中に現れた状態で観察された対立遺伝子を示している（www.snp.schl.org/snpsearch.shtml；ウェブサイトは2003年2月11日付で有効）。このSNPについて、第2のプライマーは関心対象の遺伝子座の上流でアニーリングしており、これによりBsmFIによる消化後にアンチセンス鎖上でフィルイン反応が起こった。
【０３５８】
レーン1およびレーン3の鋳型DNAはヘテロ接合であり；レーン2の鋳型DNAはチミジンにホモ接合であり、レーン4の鋳型DNAはシトシンにホモ接合であった。アンチセンス鎖はddGTPによりフィルインされており、センス鎖上のヌクレオチドはシトシンに相当した。
【０３５９】
分子量マーカーを用いて予測されるバンドの位置を同定することができる。または、分析する各SNPにつき、既知のヘテロ接合試料を用いることができ、これにより2つの予測されるバンドの位置が厳密に同定される。
【０３６０】
図11に示されるとおり、1つの蛍光染料で標識された1ヌクレオチドを用いて可変部位、例えばSNPおよび1ヌクレオチド突然変異の同一性を決定することができる。典型的には、ある個体があるSNP部位においてホモ接合またはヘテロ接合であるかを判定するためには、1染料で標識された1ヌクレオチドおよび第2の染料で標識された第2のヌクレオチドを用いて複数の反応を実施する。しかしながら、これは、2種の染料が異なる量子係数を有することから結果の比較に問題が生じさせる。異なるヌクレオチドを同じ染料で標識した場合でも、量子係数は異なる。1染料で標識した1ヌクレオチドの使用は異なる染料の量子係数から生じる任意の誤差も排除する。
【０３６１】
本実施例においては、蛍光標識したddGTPを使用した。しかしながら、方法は放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭化水素、ビオチン、ビオチンの誘導体、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分、および検出可能な電子スピン共鳴、静電容量、誘電率または伝導率を有する部分を含む任意のシグナル発生部分でタグ付けされたヌクレオチドに対しても適用可能である。更にまた標識されたddATP、ddTTPまたはddCTPも使用できる。
【０３６２】
上記した実施例は第2の対立遺伝子のインジケーターとしてオーバーハングに相補の第3の位置を使用していた。しかしながら、オーバーハングの第2または第4の位置は同様に使用できる（ヌクレオチドの取り込みのセクション参照）。更にまた、IIS型酵素BsmFIによってオーバーハングが生じたが、その結合部位から少し離れてDNAを切断する任意の酵素、例えば表Iに示す酵素も使用できる。
【０３６３】
更にまた、上記実施例において、SNP部位の直前のヌクレオチドはフィルインされた鎖上のグアニンではなかった。これにより除去すべきIIS型制限酵素の代替的切断特性の作用が排除できた。例えば、SNP TSC0837969において、センス鎖上のSNP部位の上流のヌクレオチドはアデニンであった。BsmFIが代替的切断特性を示す場合、アデニン対立遺伝子およびグアニン対立遺伝子について以下に示すオーバーハングが生じる。
2006523082.tif 000071
【０３６４】
グアニン対立遺伝子については、オーバーハングの第1の位置はdATPでフィルインされ、これによりオーバーハングに相補の2位においてポリメラーゼがddGTPを取り込めるようになる。10/14位で切断された分子と11/15位で切断された分子の間には検出可能な相違はない。
【０３６５】
アデニン対立遺伝子については、オーバーハングに相補の第1の位置はdATPでフィルインされ、第2の位置はdATPでフィルインされ、第3の位置はdTTPでフィルインされ、そして第4の位置はddGTPでフィルインされる。10/14で切断された分子と11/15で切断された分子の間に分子量の差はない。唯一の相違はDNA分子が可変部位におけるアデニンまたはカ変部位におけるグアニンを含んでいたかどうかに相当する。
【０３６６】
図11に示されるとおり、第1のプライマーのアニーリング領域を位置決めすることにより、ゲルの単一のレーンにおいて複数のSNPを分析できるようになる。更にまた、同じ染料を有する同じヌクレオチドを用いる場合、単一のフィルイン反応を行うことができる。本実施例においては、6種のSNPを1レーンで分析した。しかしながら、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18.17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30〜40、41〜50、51〜60、61〜70、71〜80、81〜100、101〜120、121〜140、141〜160、161〜180、181〜200および200超等の任意の数量のSNPも単一の反応において分析できる。
【０３６７】
更にまた、両方の対立遺伝子を検出するための1標識ヌクレオチドを異なるセットのSNPを検出するために使用する第2の標識ヌクレオチドと混合することができるが、標識されたヌクレオチドのいずれも可変部位（11/15切断の0位のヌクレオチドに相補）の直前にあってはならない。例えば、SNP Xが可変部位においてグアニンまたはチミジンであり、そしてBsmFI消化の後に以下の5'オーバーハングが生じると仮定する。
2006523082.tif 000072
【０３６８】
標識されたddGTP、未標識のdATP、dCTPおよびdTTPを用いたフィルイン反応の後、以下の分子が生じる。
2006523082.tif 000073
【０３６９】
ここでSNP Yがアデニンまたはチミジンであってもよく、BsmFI消化の後に以下の5'オーバーハングが生じると仮定する。
2006523082.tif 000074
【０３７０】
標識されたddATP、未標識のdCTP、dGTPおよびdTTPを用いたフィルインの後、以下の分子が生じる。
2006523082.tif 000075
【０３７１】
本実施例においては、標識されたddGTPおよび標識されたddATPを用いてSNP XおよびSNP Yの両方の対立遺伝子の同一性をそれぞれ決定する。フィルインされる鎖においてSNP Xの直前のヌクレオチド（11/15切断のオーバーハングの0位のヌクレオチドに相補）はグアニンまたはアデニンではない。同様に、フィルインされる鎖においてSNP Yの直前のヌクレオチドもグアニンまたはアデニンではない。これにより両方のSNPに関するフィルイン反応が標識されたddGTP、標識されたddATPおよび未標識のdCTPおよびdTTPを用いて単一の反応において起こることができる。これにより実施すべき必要のある反応の数が低減し、そして、1回の反応で分析できるSNPの数が増大する。
【０３７２】
各SNPに対する第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から異なる距離でアニーリングするように設計でき、これによりSNPはゲル上の異なる位置で移行することができる。例えば、SNP Xを増幅するために使用される第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から30塩基でアニーリングでき、そしてSNP Yを増幅するために使用される第1のプライマーは関心対象の遺伝子座から35塩基でアニーリングできる。更にまた、重ならないスペクトルで発光する蛍光染料でヌクレオチドを標識することができる。ゲルの泳動の後、ゲルを1つの染料に特異的な1波長によっておスキャンできる。その染料で標識された分子のみがシグナルを発光する。その染料で標識された分子のみがシグナルを発光する。この方法により単一の反応において分析できるSNPの数の最大の圧縮が可能となる。
【０３７３】
本実施例においては、フィルインされた鎖の可変部位の前のヌクレオチドはアデニンまたはグアニンではない。本方法は標識ヌクレオチドの何れかの組み合わせを用いて行うことができ、そして、どの標識反応が複合でき、どれができないかは、当業者の知るとおりである。例えば、第1のSNPがチミジンで標識され、第2のSNPがシトシンで標識される場合、センス鎖上において各可変部位の直前のヌクレオチドがチミジンまたはシトシンでなく、かつセンス鎖上において可変部位の直後のヌクレオチドがチミジンまたはシトシンでなければ、SNPは単一の反応において標識できる。
【０３７４】
本方法により、代替的切断の程度を測定したり、染料の量子係数について補正するという複雑さが加わることなく、1対立遺伝子からのシグナルを第2の対立遺伝子からのシグナルに比較することができる。本方法はある対立遺伝子の他のものに対する比を定量使用とする際に特に有用である。例えば、本方法は染色体異常の検出のために有用である。ヘテロ接合部位における対立遺伝子の比は約1：1であることが予測される（1つのA対立遺伝子および1つのG対立遺伝子）。しかしながら、特別な染色体が存在する場合、比は約1：2となると予測される（1つのA対立遺伝子および2つのG対立遺伝子または2つのA対立遺伝子および1つのG対立遺伝子）。本方法は母方DNAの存在下に胎児DNAを検出しようとする際に特に有用である。
【０３７５】
更に、本方法は1つの試料中の2つの遺伝子シグナルの検出のために有用である。例えば、本方法は野生型細胞の存在下に突然変異細胞を検出できる（実施例5参照）。突然変異細胞が特定の遺伝子のDNA配列中に突然変異を含む場合、本方法を用いて突然変異シグナルと野生型シグナルの両方を検出できる。本方法を用いては野生型DNA配列の存在下に突然変異DNA配列を検出できる。突然変異DNAの野生型DNAに対する比は、1つのシグナル発生部分で標識された1つのシグナルヌクレオチドを使用しているために、定量できるのである。
【０３７６】
実施例5
種々の型の癌の検出のための非侵襲的方法は疾患の罹患率および死亡率を低減する可能性がある。結腸鏡、バリウム浣腸およびS字鏡を含む結腸直腸腫瘍の早期検出のための幾つかの方法が開発されているが、手法が侵襲性であり、患者のコンプライアンスが低い比率となるため、使用に限界がある。非侵襲性の遺伝子試験は、早期の結腸直腸腫瘍の発見において有用であると考えられる。
【０３７７】
1991年、研究者等により大腸腺腫性ポリポーシス（adenomatous polyposis coli)(APC）遺伝子が発見され、これは結腸直腸腫瘍の形成において重要な役割を果たしている（Kinzlerら、Science 253：661-665,1991）。APC遺伝子は染色体5q21-22上にあり、合計15エクソンが8529ヌクレオチドのRNA分子をコードしており、これにより300KdのAPCタンパク質が生産される。このタンパク質は多くの細胞型において発現され、細胞接着に必須である。
【０３７８】
APC遺伝子における突然変異は一般的には結腸直腸の新生物形成を開始させる（Tsao,J.ら、Am.J.Pathol.145：531-534,1994）。APC遺伝子における突然変異の約95％がナンセンス/フレームシフト突然変異をもたらす。最も一般的な突然変異はコドン1061および1309において起こり；これらのコドンにおける突然変異が全生殖細胞系突然変異の1/3に相当する。体細胞の突然変異に関しては、60％がコドン1268-1513で起こり、これはコード配列の約10％である。この領域は突然変異クラスター領域（MCR）と呼ばれている。多くの突然変異型がAPC遺伝子内に発見されており、例えばヌクレオチド置換（表III参照）、スプライシングエラー（表IV参照）、小欠失（表V参照）、小挿入（表VI参照）、小挿入／小欠損（表VII参照）、大欠損（表VIII参照）、大挿入（表IX参照）および複合再配列（表X参照）が挙げられる。
【０３７９】
研究者等は糞便試料中のAPC遺伝子における突然変異を保有している細胞の発見を試みた（Traverso,G.ら、New England Journal of Medicine,Vol.346：311-320,2002）。APC突然変異はほぼ全ての腫瘍に存在するが、糞便試料中の250細胞中約1個がAPC遺伝子の突然変異を有しており；大部分の細胞は糞便中に放出された正常細胞である。更にまた、ヒトDNAは糞便試料中に検出される総DNAの約百万分の一に相当し；大部分のDNAは細菌性である。Traverso等により使用された手法はトランケーションされたタンパク質をもたらす突然変異を検出するのみである。
【０３８０】
上記した通り、APC遺伝子における多くの突然変異は結腸直腸腫瘍の形成に関与しているとされている。即ち、高度な感度を有し、非侵襲性の結腸直腸腫瘍検出のための方法がなお必要とされている。以下にAPC遺伝子中の2突然変異の検出のための方法を記載する。しかしながら、明細書に記載した方法を用いて多くの突然変異を分析できる。
【０３８１】
鋳型DNAの調製
鋳型DNAは例えば糞便試料のような結腸細胞を含有する試料から精製する。鋳型DNAはAhlquist等の記載した操作法を用いて精製する（Gastroenterology,119：1219-1227,2000）。糞便試料が凍結されている場合は、試料を室温で解凍し、エキストラクター糞便振とう器でホモゲナイズする（Exact Laboratories,Maynard,Mass.）。ホモゲナイズ後、各試料の4グラム糞便相当分を5分間2536gで遠心分離する。試料を再度10分間16,500gで遠心分離する。上澄みをRNase（ミリリットル当たり0.5mg）20μlとともに37℃で1時間インキュベートする。DNAをリットル当たり酢酸ナトリウム3モルの1/10容量および等容量のイソプロパノールで沈殿させる。DNAをTRIS-EDTA（1リットル当たりTris0.01モル（pH7.4）および1リットル当たりEDTA0.001モル）5mlに溶解する。
【０３８２】
プライマー設計
コドン1370に突然変異があるかどうかを調べるために、以下のプライマーセットを用いた。
2006523082.tif 000076
【０３８３】
第1のプライマーは5'最末端にビオチンタグおよび制限酵素EcoRIに対するヌクレオチド配列を含む。第2のプライマーは制限酵素BsmFIに対するヌクレオチド配列を含む。
【０３８４】
コドン1302に小欠失が存在するかどうかを調べるために、以下のプライマーセットを用いた。
2006523082.tif 000077
【０３８５】
第1のプライマーは5'末端にビオチンタグを有し、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含む。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含む。
【０３８６】
PCR反応
関心対象の遺伝子座をポリメラーゼ連鎖反応（PCR、米国特許4,683,195号および4,683,202号、参照として本明細書に組み入れられる）を用いた鋳型ゲノムDNAから増幅する。関心対象の遺伝子座は別々の反応チューブにおいて増幅したが、単一のPCR反応においてともに増幅することもできる。特異性を高めるために、「ホットスタート」PCRを使用し、例えばQIAGENより入手したホットスターTaqマスターミックスキットを用いる（カタログ番号203443）。反応ごとの鋳型DNAおよびプライマーの量は各々の関心対象の遺伝子座に対して旨適化できるが、本実施例においては鋳型ヒトゲノムDNA40ngおよび5μMの各プライマーを使用した。40サイクルのPCRを実施した。以下のPCR条件を用いた。
（1）95℃15分15秒；
（2）37℃30秒；
（3）95℃30秒；
（4）57℃30秒；
（5）95℃30秒；
（6）64℃30秒；
（7）95℃30秒；
（8）工程6および7を39回反復；
（9）72℃5分。
【０３８７】
PCRの第1サイクルにおいて、アニーリング温度は第2のプライマーの3'アニーリング領域の融解温度近傍とし、これは37℃である。PCRの第2サイクルにおけるアニーリング温度は第1のプライマーの鋳型DNAにアニーリングする3'領域の融解温度近傍とし、これは57℃である。PCRの第3サイクルにおけるアニーリング温度は第2のプライマーの全配列の融解温度近傍とし、これは64℃である。残余のサイクルのアニーリング温度は64℃とする。PCRの最初の3サイクルにおいてTM1〜TM2〜TM3へとアニーリング温度を上昇させることにより特異性が大きく高められる。これらのアニーリング温度は代表例であり、各サイクルのアニーリング温度は使用する特定のプライマーに応じて変化することは当業者の知るとおりである。
【０３８８】
変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間は種々のセッティングを検討し最良の結果を与えるパラメーターを用いることにより旨適化できる。
【０３８９】
関心対象の遺伝子座を含むフラグメントの精製
PCR産物をゲノム鋳型DNAから分離する。各PCR産物をStreptawell透明ハイバインドプレート（カタログ番号1645692、Roche Molecular Biochemicalsの2001バイオケミカルズカタログ中に掲載）の4種の別々の反応ウェルに分割する。第1のプライマーは、PCR産物がストレプトアビジンコーティングウェルに結合し、ゲノム鋳型DNAは結合しないように5'ビオチンタグを含んでいる。ストレプトアビジン結合反応はサーモミキサー（Eppendorf）を用いて1000rpmで20分間37℃で行った。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、1×PBSを用いて3回、穏やかに混合しながら洗浄する（Kandpalら、Nucl.Acids Res.18：1789-1795（1990）；Kaneokaら、Biotechniques 10：30-34（1991）；Greenら、Nucl.Acids Res.18：6163-6164（1990））。
【０３９０】
あるいは、PCR産物をストレプトアビジンプレートの単一のウェルにいれ、単一のウェル内でヌクレオチド取り込み反応を行う。
【０３９１】
関心対象の遺伝子座を含む単離されたフラグメントの制限酵素消化
精製されたPCR産物を、第2のプライマーからPCR産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素BsmFI（New England Biolabsカタログ番号R0572S）を用いて消化する。消化は制限酵素とともに入手した取扱説明書に従ってStreptawell内で行った。適切な制限酵素で消化後、ウェルを3回PBSで洗浄し、切断されたフラグメントを除去した。
【０３９２】
標識されたヌクレオチドの取り込み
上記した制限酵素消化により関心対象の遺伝子座および3'陥凹末端を含む5'オーバーハングを有するDNAフラグメントが得られる。5'オーバーハングは、DNAポリメラーゼの存在下にヌクレオチドの取り込みを可能にする鋳型として機能する。
【０３９３】
関心対象の各遺伝子座につき、4種の別々のフィルイン反応を行った；4種の反応の各々は、異なる蛍光標識のddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTPまたはddCTP）を含んでいる。以下の成分：蛍光標識ddNTP1μl、未標識ddNTP0.5μl（40μM）、ただしこれらは蛍光標識されたヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドを含むもの、10×シーケナーゼ緩衝液2μl、シーケナーゼ0.25μlおよび水を反応物が20μlになるように各フィルイン反応に添加する。フィルイン反応は全て40℃10分間行う。非蛍光標識ddNTPはファーメンタス(Fermentas Inc.)（Hanover,MD）より購入する。全ての他の標識試薬はAmershamより入手する（サーモシケーナーゼダイターミネーターサイクルシーケンシングコアキット、US79565）。蛍光標識ddNTPの存在下、3'陥凹末端は1塩基伸長し、これはSNPまたは関心対象の遺伝子座に相当する。
【０３９４】
標識ddNTPおよび未標識ddNTPの混合物も「フィルイン」反応のためにも使用できる。「フィルイン」条件は40μM未標識dNTP、1μl蛍光標識ddATP,1μ蛍光標識ddTTP、1μl蛍光標識ddCTP、および1μlddGTPを含有する混合物を用いた以外は上記と同様とする。蛍光ddNTPはAmershamより入手する（サーモシケーナーゼダイターミネーターサイクルシーケンシングコアキット、US79565；Amershamは蛍光ヌクレオチドの濃度を公開していない）。関心対象の遺伝子座は4塩基の5'オーバーハングを生じさせる制限酵素BsmFIを用いて消化する。取り込まれた第1のヌクレオチドが標識されたddNTPである場合、3'陥凹末端は1塩基によりフィルインされ、関心対象の遺伝子座の検出を可能とする。しかしながら、取り込まれた第1のヌクレオチドがdNTPである場合、ポリメラーゼはddNTPがフィルインされるまでヌクレオチドの取り込みを継続する。例えば、最初の2個のヌクレオチドがdNTPで、そして第3のヌクレオチドがddNTPでフィルインされる場合があり、これによりオーバーハング上の第3のヌクレオチドの検出が可能となる。即ち、5'オーバーハングの配列が決定され、各SNPまたは関心対象の遺伝子座から得られる情報が増量する。この型のフィルイン反応は挿入、欠失、挿入と欠失、再配列および転座の存在を検出する際に特に有用である。
【０３９５】
あるいは、単一の染料で標識された1ヌクレオチドを用いて関心対象の遺伝子座の配列を決定する。実施例4が参照できる。本方法は異なる量子係数を有する異なる色素を使用する場合にいかなる潜在的な誤差も排除する。
【０３９６】
標識後、各Streptawellを1×PBS（100μl）で3回洗浄した。次に「フィルイン」されたDNAフラグメントを、酵素とともに入手した製造元の取扱説明書に従って制限酵素EcoRIを用いた消化によりStreptawellから遊離させる。消化は120rpmで振とうしながら37℃で1時間行う。
【０３９７】
関心対象の遺伝子座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後、試料を36cmの5％アクリルアミド（尿素）ゲル（Bio Whittaker Molecular Applications,ロングレンジャーランゲルパック、カタログ番号50691）内に添加する。試料を3分間3000ボルトでゲル内に電気泳動させる。ゲルを配列決定装置（HoeferSQ3シーケンサー）ヲ用いて3時間泳動する。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出する。
【０３９８】
別々のフィルイン反応を実施する場合にAPC遺伝子のコドン1370に何れかの細胞が突然変異を含んでいるかどうか調べるために、ddATPおよびddTTPに対するフィルイン反応に相当するゲルのレーンを分析する。正常細胞のみが存在する場合は、ddATPによるフィルイン反応に相当するレーンが輝度のあるシグナルとなる。ddTTPによる「フィルイン」反応に対してはシグナルは検出されない。しかしながら、APC遺伝子のコドン1370において突然変異を有する細胞を患者の試料が含む場合、ddATPによるフィルイン反応に相当するレーンが輝度のあるシグナルとなり、そして、ddTTPによるフィルイン反応に相当するレーンからシグナルが検出される。ddTTPによるフィルイン反応に相当するレーンからのシグナルの強度は試料中の突然変異細胞の数を示す。
【０３９９】
あるいは、APC遺伝子のコドン1370における対立遺伝子の配列を決定するために、1標識ヌクレオチドを用いる。コドン1370において、正常配列はAAAであり、これはアミノ酸リジンをコードしている。しかしながら、ヌクレオチド置換がコドン1370において発見されており、これは結腸直腸腫瘍に関連する。特に、AからTへの変化（AAA-TAA）は典型的にはコドン1370に存在し、これが停止コドンを与える。標識されたddATP、および未標識のdTTP、dCTPおよびdGTPを用いて単一のフィルイン反応を行う。1つの蛍光染料で標識された1ヌクレオチドを用いてコドン1370をコードする正常および突然変異のDNA配列の両方の存在を調べる。該当するDNA配列は以下に示すとおりであり、コドン1370に相当する配列は太字とした。
2006523082.tif 000078
【０４００】
BsmFIで消化した後、以下のオーバーハングを形成する。
2006523082.tif 000079
【０４０１】
患者試料がコドン1370における突然変異を保有する細胞を有さない場合、標識されたddATPの取り込みに相当する1シグナルが観察される。
2006523082.tif 000080
【０４０２】
しかしながら、APC遺伝子のコドン1370における突然変異を有する細胞を患者試料が有する場合、コドン1370における正常配列に相当する1シグナルが観察され、そしてコドン1370における突然変異配列に相当する第2のシグナルが観察される。シグナルは分子量が異なるため明確に同定される。
2006523082.tif 000081
【０４０３】
突然変異対立遺伝子が存在する場合は2つのシグナルが観察される。突然変異DNA分子を野生型DNA分子の1塩基後でフィルインされる。2つのシグナルは分子量に基づいて判別するいずれかの方法を用いて分離する。1つの標識ヌクレオチド（ddATP）を用いて野生型DNA配列および突然変異DNA配列の両方の存在を検出する。本方法は実施するのに必要な反応数を減らし、患者試料中の突然変異細胞の数の正確な定量を可能とする。試料中の突然変異細胞の数を用いて患者の予後、疾患の程度および重症度を調べる。本標識方法により、異なる量子係数を有する異なる染料を使用することに伴う煩雑製を排除できる。本標識方法はまたピペッティング反応に伴う誤差も排除する。
【０４０４】
別々のフィルイン反応を行う場合にAPC遺伝子のコドン1302において何れかの細胞が突然変異を含むかどうかを調べるためには、ddTTPおよびddCTPに関するフィルイン反応に相当するゲルのレーンを分析する。正常DNA配列は以下に示す通りであり、コドン1302をコードする配列は太字で示す。
2006523082.tif 000082
【０４０５】
消化後、以下の5'オーバーハングを形成する。
2006523082.tif 000083
【０４０６】
フィルイン反応後、標識されたddTTPが取り込まれる。
2006523082.tif 000084
【０４０７】
典型的にはコドン1302をコードするAPC配列の1塩基の欠失は結腸直腸腫瘍に関連している。突然変異DNA配列は以下に示すとおりであり、関連の配列を太字で示す。
2006523082.tif 000085
【０４０８】
APC遺伝子に突然変異がない場合、ddCTP＊を用いたフィルイン反応についてはシグナルは検出されないが、ddTTP＊を用いたフィルイン反応については輝度のあるシグナルが検出される。しかしながら、APC遺伝子内に突然変異を有する患者試料中の細胞が存在すれば、シグナルはddCTP＊およびddTTP＊によるフィルイン反応について検出される。
【０４０９】
あるいは未標識dNTP。蛍光標識ddATP、蛍光標識ddTTP、蛍光標識ddCTPおよび蛍光標識ddGTPを含む混合物を用いて単一のフィルイン反応を実施する。欠失がない場合は、標識されたddTTPが取り込まれる。
2006523082.tif 000086
【０４１０】
しかしながら、Tが欠失していれば、標識されたddCTP＊が取り込まれる。
2006523082.tif 000087
【０４１１】
2つのシグナルはチミジンヌクレオチドの欠失のため分子量により分離される。突然変異細胞が存在する場合、同じレーンに2つのシグナルが生じるが、1塩基対により分離される（この原理は図9Dにおいて説明する）。欠失によりDNAフラグメントの分子量が変化し、これにより正常および突然変異の細胞の両方の存在を検出するための単一のフィルイン反応の使用が可能となる。
【０４１２】
上記した実施例において、ヌクレオチドの置換および小欠失の検出のための方法を記載した。しかしながら、方法はヌクレオチド置換（表III参照）、スプライシングエラー（表IV参照）、小欠失（表V参照）、小挿入（表VI参照）、小挿入/欠失（表VII参照）、大欠損（表VIII参照）、大挿入（表IX参照）および複合再配列（表X参照）のような任意の型の突然変異の検出のためにも用いられる。
【０４１３】
更に、上記した方法は表IIに列挙したもののような任意の型の疾患の検出のためにも使用される。更にまた、任意の型の突然変異遺伝子、例えば表IIに示す疾患に関わる遺伝子、BRCA1、BRCA2、MSH6、MSH2、MLH1、RET、PTEN、ATM、H-RAS、p53、ELAC2、CDH1、APC、AR、PMS2、MLH3、CYP1A1、GSTP1、GSTM1、AXIN2、CYP19、MET、NAT1、CDKN2A、NQ01、trc8、RAD51、PMS1、TGFBR2、VHL、MC4R、POMC、NROB2、UCP2、PCSK1、PPARG、ADRB2、UCP3、glurl、cart、SORBS1、LEP、LEPR,SIM1、TNF、IL-6、IL-1、IL-2、IL-3、IL1A、TAP2、THPO、THRB、NBS1、RBM15、LIF、MPL、RUNX1、Her-2、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、p21、p27、K-RAS,N-RAS、網膜芽細胞腫タンパク質、ウィスコットアルドリッチ（WAS）遺伝子、第V因子ライデン(Lieden)、第II因子（プロトロンビン）、メチレンテトラヒドロフォレート還元酵素、嚢胞性線維症、LDL受容体、HDL受容体、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子およびSHOX遺伝子、酸化窒素調節に関与する遺伝子、細胞周期調節に関与する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、癌遺伝子、神経変性に関わる遺伝子、肥満に関わる遺伝子も、本明細書に記載した方法を用いて検出される。略記法はヒト遺伝子突然変異データベースに掲載されるタンパク質に相当し、これは参照として本明細書に組み入れられる（www.archive.uwcm.ac.uk/uwcm、2003年2月12日付けで有効）。
【０４１４】
上記した実施例は糞便試料からの突然変異細胞および突然変異対立遺伝子の検出を説明している。しかしながら、本明細書に記載した方法は、これらに限定するわけではないが、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物、腹腔液、糞便試料、身体滲出物、乳汁、肺吸引物、細胞、組織、個々の細胞もしくはこれらの細胞からのそれらの核酸を含む抽出液、およびミトコンドリアまたはクロロプラストなどの細胞構造成分(subcellular structure)を含む任意の生物学的試料からの突然変異細胞の検出にも使用される。更にまた、本明細書に記載した方法は例えば法医学、食品、考古学、農業または無機の試料のような核酸含有起源の多くのものからの突然変異細胞および突然変異DNAの検出のために使用される。
【０４１５】
上記した実施例はAPC遺伝子の突然変異の検出に関するものである。しかしながら、本明細書に記載した本発明は疾患に関わる、または、疾患に罹患しやすくするいずれかの遺伝子における突然変異の検出のためにも使用される（表XI参照）。
【０４１６】
例えば、グルタチオンSトランスフェラーゼP1（GSTP1）の過剰メチル化は前立腺癌における最も一般的なDNA改変である。プロモーターのメチル化の状態は重亜硫酸ナトリウムおよび本明細書に記載した方法を用いて測定される。
【０４１７】
重亜硫酸ナトリウムの投与により非メチル化シトシン残基はウラシルに変換され、メチル化シトシンは未変化のまま残存する。本明細書に記載した方法を用いて、第1および第2のプライマーを設計し、メチル化される場合が多いGSTP1プロモーターの領域を増幅する。重亜硫酸ナトリウム投与前のGSTP1プロモーターの領域を以下に示す。
【０４１８】
重亜硫酸ナトリウム投与前
2006523082.tif 000088
【０４１９】
重亜硫酸ナトリウム投与、PCR増幅およびIIS型制限酵素BsmFIによる消化の後のGSTP1プロモーターの領域を以下に示す。
2006523082.tif 000089
【０４２０】
標識されたddATP、未標識dCTP、dGTPおよびdTTPを用いて5'オーバーハングをフィルインする。以下の分子が生じる。
2006523082.tif 000090
【０４２１】
2つのシグナルが観察され、1つはオーバーハングに相補の1位においてddATPでフィルインされたDNA分子に相当し（非メチル化）、そして、もう1つはオーバーハングに相補の4位においてddATPでフィルインされたDNA分子に相当する（メチル化）。2つのシグナルは分子量に基づいて分離される。または、1つの反応で標識ddGTP,別の反応で標識ddATPを用いる別々の反応においてフィルイン反応を行う。
【０４２２】
本明細書に記載した方法を用いて前立腺癌をスクリーニングし、疾患の進行および重症度をモニタリングする。メチル化および非メチル化の配列の両方を検出するために1ヌクレオチドを使用することによって、正確な定量が可能となり、疾患の早期検出のための有用なツールであるメチル化配列に対する感度が高まる。
【０４２３】
表III〜Xに含まれる情報はヒト遺伝子突然変異データベースより入手した。本明細書において提示する情報を用いれば、何れかの遺伝子に対する対立遺伝子の配列の決定のためにどのように本方法を適用するかは当業者の理解されるだろう。多数の遺伝子およびその関連突然変異が以下のウェブサイトに掲載されている。
www.archive.uwcm.ac.uk/uwcm
【０４２４】
（表III）ヌクレオチド置換
2006523082.tif 000091
2006523082.tif 000092
2006523082.tif 000093
【０４２５】
（表IV）ヌクレオチド置換
2006523082.tif 000094
【０４２６】
（表V）APC小欠失
太字はコドンを示す。下線文字は欠失を示す。欠失がコード領域を超えて伸びる場合、他の位置の情報を与える。例えば略記法5'UTRは5'未翻訳領域を示し、略記法E6I6はエクソン6/イントロン6境界を示す。
2006523082.tif 000095
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2006523082.tif 000103
2006523082.tif 000104
【０４２７】
（表VI）小挿入
2006523082.tif 000105
2006523082.tif 000106
【０４２８】
（表VII）小挿入/欠失
2006523082.tif 000107
【０４２９】
（表VIII）大欠失
2006523082.tif 000108
【０４３０】
（表IX）大挿入および重複
2006523082.tif 000109
【０４３１】
（表X）複合再配列（逆位を含む）
2006523082.tif 000110
【０４３２】
（表XI）診断用途
2006523082.tif 000111
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2006523082.tif 000113
【０４３３】
本発明を以上のように記載したが、本発明は広範で等しい範囲の条件、パラメーターなどを用いながら、本発明の精神または範囲またはその態様に影響することなく実施できることは当業者に理解されるだろう。
【０４３４】
本明細書に引用した全文書、例えば化学論文、特許および特許公開は、各々の文書が特定して、そして個別にその全体が参照として組み入れられる程度と同等の範囲まで、その全体が、参照として本明細書に組み入れられる。引用文書が文書の第1ページを与えるのみである場合は、文書の残余のページも含む全文書を意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【０４３５】
【図１】図1Aは、2本鎖DNA分子を示す模式図である。曲がった矢印で示したプライマー対は塩基N14において三角印で示した関心対象の遺伝子座をフランキングしている。関心対象の遺伝子座は一塩基遺伝子多型、点突然変異、挿入、欠失、転座等であることができる。各プライマーは第1のプライマーにおける領域「a」として、そして、第2のプライマーにおける領域「d」として示した5'末端から約10bpの制限酵素認識部位を含む。制限酵素認識部位「a」は任意の種類の制限酵素に対するものであることもできるが、認識部位「d」はその認識部位から「n」ヌクレオチドを切断して5'オーバーハングおよび陥凹した3'末端を与える制限酵素に対するものである。このような酵素の例はこれに限定されないが、BceAIおよびBsmFIである。5'オーバーハングは3'陥凹末端へのヌクレオチドの取り込みのための鋳型として機能する。  第1のプライマーは精製を容易にするために5'末端においてビオチンで修飾された状態で示す。プライマーの3'末端の配列はプライマーが関心対象の遺伝子座の上流または下流の所望の距離においてアニーリングするようにしてある。第2のプライマーは関心対象の遺伝子座に近接してアニーリングし；領域「c」として示されるアニーリング部位は、第2のプライマーの3'末端が関心対象の遺伝子座から1塩基はなれてアニーリングするように設計されている。第2のプライマーは関心対象の遺伝子座からどのような距離でもアニーリングできるが、但し、本プライマー上の領域「d」を認識する制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5'オーバーハングが生じなければならない。  領域「b」で示される第1のプライマーのアニーリング部位は約20塩基である。  図1Bは、PCRによる増幅の第1サイクルのアニーリングおよび伸長の工程を示す模式図である。増幅の第1のサイクルは領域「c」で示した第2のプライマーの、鋳型DNAにアニーリングし、本例では13塩基対である3'領域の融解温度近傍で行われる。本温度において、第1および第2のプライマーは両方とも、それぞれの相補鎖にアニーリングし、点線で示すとおり伸長を開始する。この第1のサイクルにおいては、第2のプライマーが伸長し、第1のプライマーが次のサイクルにおいてアニーリングできる領域bをコピーする。  図1Cは、PCR増幅の第2のサイクルにおける変性後のアニーリングおよび伸長を示す模式図である。増幅の第2のサイクルはより高いアニーリング温度（TM2）において行われ、これは、領域「b」として示される鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3'領域の20bpの融解温度近傍である。従って、TM2においては、領域bに相補的な第1のプライマーが反応の第1サイクルにおいてコピーされたDNAに結合することができる。しかしながら、TM2においては、第2のプライマーは、アニーリング温度が高すぎるため、元の鋳型DNAや反応の第1サイクルにおいてコピーされたDNAにはアニーリングできない。第2のプライマーは元の鋳型DNAにおける13塩基にはアニーリングできるが、TM2は20塩基の融解温度近傍に計算されている。  図1Dは、増幅の第3サイクルの間の変性後のアニーリングおよび伸長反応を示す模式図である。本サイクルにおいては、アニーリング温度TM3は領域「c」および「d」を含む第2のプライマー全体の融解温度近傍である。領域「c」＋「d」の長さは��27〜33bp長であり、即ちTM3はTM1およびTM2より有意に高温である。このより高いTMにおいて、領域cおよびdを含む第2のプライマーはサイクル2において生じたコピーされたDNAにアニーリングする。  図1Eは、増幅の残余のサイクルに関するアニーリングおよび伸長反応を示す模式図である。残余のサイクルに関するアニーリング温度は第2のプライマー全体の融解温度近傍である。TM3において、第2のプライマーは領域c'およびd'を含む鋳型に結合し、そして、第1のプライマーは領域a'およびbを含む鋳型に結合する。TM1からTM2を経てTM3へと、最初の3サイクルにつき、各サイクルで順次アニーリング温度を上昇させることにより、非特異的増幅は顕著に低減する。  図1Fは、固体マトリックスに結合した目的の増幅された遺伝子座を示す模式図である。  図1Gは、「d」を認識する制限酵素を用いた消化の後の、結合された増幅されたDNAを示す模式図である。「下流」の末端が上澄みに放出され、何れかの適当な緩衝液を用いた洗浄により除去されうる。関心対象の遺伝子座を含む上流の末端は固体マトリックスに結合したまま残存する。  図1Hは、標識されたddNTPで「フィルイン」された後の結合された増幅されたDNAを示す模式図である。DNAポリメラーゼを用いて関心対象の遺伝子座（N14）に相補的な塩基（N'14）を「フィルイン」する。本例においては、関心対象の遺伝子座または目的のSNPのみがフィルインされるように、ddNTPのみが本反応中に存在する。  図1Iは、制限酵素「a」で消化した後の標識された結合されたDNAを示す模式図である。標識されたDNAは上澄み中に放出され、これを収集することにより取り込まれた塩基を同定することができる。
【図２】プライマーが目的の各遺伝子座をフランキングするように特異的にアニーリングされた、関心対象の遺伝子座の数「N」およびプライマー対x1、y1〜xn,ynの数「n」を有する2本鎖DNA鋳型を示す模式図である。第1のプライマーは●で示される5'末端においてビオチニル化され、制限酵素の何れかの型により認識される制限酵素認識部位「a」を含む。第2のプライマーは制限酵素認識部位「d」を含み、ここで「d」はその認識部位から少し離れてDNAを切断し、そして関心対象の遺伝子座と陥凹3'末端を含む5'オーバーハングを生じさせる制限酵素に対する認識部位である。第2のプライマーは目的のそれぞれの遺伝子座に隣接してアニーリングする。第2のプライマーの制限酵素部位「d」の厳密な位置は、制限酵素「d」により目的の各遺伝子座のPCR産物を消化することにより関心対象の遺伝子座と3'陥凹末端を含む5'オーバーハングが生じるように設計される。第1のプライマーのアニーリング部位は約20塩基長であり、そして、各々の逐次的な第1のプライマーが更にそのそれぞれ第2のプライマーから離れるように選択される。例えば遺伝子座1において第1および第2のプライマーの3'末端がZ塩基対はなれている場合は、遺伝子座2において、第1および第2のプライマーの3'末端はZ＋K塩基対離れており、ここでK＝1、2、3または3より多い塩基である。遺伝子座Nに対するプライマーはZN-1＋K塩基対はなれている。それぞれ第2のプライマーから更に離れている各々の逐次的な第1のプライマーを作成する目的は、「フィルイン」された制限フラグメント（図1B-1Iに記載した増幅、精製、消化および標識の後に生じる）の大きさが異なり、そして、例えば電気泳動により分割することができ、これにより目的の各々の個々の遺伝子座の検出を可能とすることである。
【図３】複数のアニーリング温度を用いたSNPを含むDNAフラグメントのPCR増幅である。36人のボランティアに由来するゲノムDNA鋳型を含む試料を以下の4種のSNP、即ち、SNP HC21S00340（レーン1）、ヒト染色体21 cSNPデータベースに帰属する認識番号、染色体21上に位置；SNP TSC0095512（レーン2）、染色体1上に位置；SNP TSC0214366（レーン3）、染色体1上に位置；および、SNP TSC0087315（レーン4）、染色体1に位置するもの、に関して分析した。SNPを含む各DNAフラグメントを、3種の異なるアニーリング温度プロトコル、即ち本明細書において低ストリンジェンシーアニーリング温度；中ストリンジェンシーアニーリング温度；および高ストリンジェンシーアニーリング温度と称するものを用いてPCRにより増幅した。アニーリング温度プロトコルとは無関係に、SNPを含む各DNAフラグメントを40サイクルのPCRで増幅した。各PCR反応の変性工程は95℃で30秒間行った。  図3Aは、低ストリンジェンシーアニーリング温度プロトコルを用いた異なるSNPを含む4DNAフラグメントのPCR増幅を示すゲルの写真である。  図3Bは、中ストリンジェンシーアニーリング温度プロトコルを用いた異なるSNPを含む4DNAフラグメントのPCR増幅を示すゲルの写真である。  図3Cは、高ストリンジェンシーアニーリング温度プロトコルを用いた異なるSNPを含む4DNAフラグメントのPCR増幅を示すゲルの写真である。
【図４】図4Aは、染色体21に位置するヒト染色体21cSNPデータベースに帰属するSNP HC21S00027（配列番号：27および28）のDNA配列を示す。第1のプライマー（配列番号：17）および第2のプライマー（配列番号：18）はそれぞれHC21S00027の配列の上および下に示す。第1のプライマーはビオチニル化され、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含む。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含み、そしてDNA配列にアニーリングする13塩基対を含む。SNPはR（A/G）およびr（T/C；Rに相補）により示される。  図4Bは、染色体21に位置するヒト染色体21cSNPデータベースに帰属するSNP HC21S00027（配列番号：27および28）のDNA配列を示す。第1のプライマー（配列番号：17）および第2のプライマー（配列番号：19）はそれぞれHC21S00027の配列の上および下に示す。第1のプライマーはビオチニル化され、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含む。第2のプライマーはBceAIに対する制限酵素認識部位を含み、そしてDNA配列にアニーリングする13塩基対を含む。SNPはR（A/G）およびr（T/C；Rに相補）により示される。  図4Cは、染色体1に由来するSNP TSC0095512（配列番号：29および30）のDNA配列を示す。第1のプライマー（配列番号：11）および第2のプライマー（配列番号：20）はそれぞれTSC0095512の配列の上および下に示す。第1のプライマーはビオチニル化され、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含む。第2のプライマーはBsmFIに対する制限酵素認識部位を含み、そしてDNA配列にアニーリングする13塩基対を含む。SNPはS（G/C）およびs（C/G；Sに相補）により示される。  図4Dは、染色体1に由来するSNP TSC0095512（配列番号：29および30）のDNA配列を示す。第1のプライマー（配列番号：11）および第2のプライマー配列番号：12）はそれぞれTSC0095512の配列番号の上および下に示す。第1のプライマーはビオチニル化され、EcoRIに対する制限酵素認識部位を含む。第2のプライマーはBceAIに対する制限酵素認識部位を含み、そしてDNA配列にアニーリングする13塩基対を含む。SNPはS（G/C）およびs（C/G；Sに相補）により示される。
【図５】図5A〜5Dは、図4A〜4Dに記載したプライマーを用いた増幅の後のSNP HC21S00027（図5A（配列番号：31および32）および図5B（配列番号：31および配列番号：33））およびSNP TSC0095512（図5C（配列番号：34および35）および図5D（配列番号：34および36））のヌクレオチド配列を示す模式図である。プライマー配列中の制限部位は太字で示す。
【図６】図6A〜6Dは、適切なIIS型制限酵素による消化の後のSNPを含む各々の増幅されたDNAフラグメントのヌクレオチド配列を示す模式図である。図6A（配列番号：31および32）および図6B（配列番号：31および33）はそれぞれIIS型制限酵素BsmFIおよびBceAIで消化したSNP HC21S00027を含むDNA配列のフラグメントを示す。図6C（配列番号：34および35）および図6D（配列番号：34および36）はそれぞれIIS型制限酵素BsmFIおよびBceAIで消化したSNP TSC0095512を含むDNA配列のフラグメントを示す。
【図７】図7A〜7Dは、'陥凹末端を「フィルイン」するための鋳型としての消化されたSNPの5'オーバーハングを用いた蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを示す模式図である。図7A（配列番号：31、37および41）および図7B（配列番号：31、37および39）は取り込まれた標識ddNTPを有する消化されたSNP HC21S00027遺伝子座を示す（＊R-dd＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。図7C（配列番号：34および38）および図7D（配列番号：34）は取り込まれた標識ddNTPを有する消化されたSNP TSC0095512遺伝子座を示す（＊S-dd＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。ddNTPの使用により、5'オーバーハング中に存在する目的のヌクレオチドまたはSNPに相補的な1ヌクレオチドで3'陥凹末端が確実に伸長されるようにできる。  図7Eは、SNP部位を含む5'オーバーハング内へのdNTPおよびddNTPの取り込みを示す模式図である。SNP HC21S00007を含むDNAフラグメントを4塩基の5'オーバーハングを生じさせるBsmFIで消化した。dNTPとddNTPの混合物の使用により3'陥凹末端が1ヌクレオチド（ddNTPが第1に取り込まれる）（配列番号：31、37および41）；2ヌクレオチド（dNTPが取り込まれ、その後、ddNTPが取り込まれる）（配列番号：31、39および41）；3ヌクレオチド（2個のdNTPが取り込まれ、その後、ddNTPが取り込まれる）（配列番号：31、40および41）；または4ヌクレオチド（3個のdNTPが取り込まれ、その後、ddNTPが取り込まれる）（配列番号：31および41）に伸長されるようにできる。4種の生成物全ては大きさおよび検出される取り込まれたヌクレオチドにより分離できる（＊R-dd＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。SNPまたは遺伝子座の部位に相当する第1のヌクレオチドおよび次の3個のヌクレオチドの検出により更なる水準の品質保証が可能となる。SNPはR（A/G）およびr（T/C）（Rに相補）により示される。
【図８】図8A〜8Dは、固体支持体マトリックス、即ちストレプトアビジンコーティングウェルからの「フィルイン」されたSNPの放出を示す。SNP HC21S00027は図8A（配列番号：31、37および41）および図8B（配列番号：31、37および39）に示し、SNP TSC0095512は図8C（配列番号：34および38）および図8D（配列番号：34）に示す。「フィルイン」されたSNPは溶液中で遊離しており、検出可能である。
【図９】図9Aは、BceAIで消化したSNP HC21S00027を含むDNAフラグメントの配列分析。4種の「フィルイン」反応を示し；各々の反応は1種の蛍光標識ヌクレオチド、ddGTP、ddATP、ddTTPまたはddCTPおよび未標識のddNTPを含む。BceAIによる消化により生じた5'オーバーハングおよびこのSNP部位における予測されるヌクレオチドを示す。  図9Bは、SNP TSC0095512の配列分析を示す。SNP TSC0095512をBceAIに対する認識部位を含む第2のプライマーを用いて、そして、別の反応においてはBsmFIに対する認識部位を含む第2のプライマーを用いて増幅した。各PCR産物について4種のフィルイン反応を示し；各反応は1種の蛍光標識ヌクレオチド、ddGTP、ddATP、ddTTPまたはddCTPおよび未標識のddNTPを含む。BceAIおよびBsmFIによる消化により生じた5'オーバーハングおよび予測されるヌクレオチドを示す。  図9Cは、BsmFIに対する認識部位を含む第2のプライマーを用いた増幅後のSNPTSC0264580の配列分析を示す。4種の「フィルイン」反応を示し；各反応は1種の蛍光標識ヌクレオチド、即ちddGTP、ddATP、ddTTPまたはddCTP、および未標識のddNTPを含む。2種の異なる5'オーバーハングが示されており：1つはセンス鎖で11ヌクレオチド離れアンチセンス鎖上で15ヌクレオチド離れて切断されたDNA分子を示し、もう1つはセンス鎖上で10ヌクレオチド離れアンチセンス鎖上で14ヌクレオチド離れて切断されたDNA分子を示す。予測されるヌクレオチドも示す。  図9Dは、BsmFIに対する認識部位を含む第2のプライマーで増幅されたSNP HC21S00027の配列分析を示す。標識ddNTPおよび未標識dNTPの混合物を用いてBsmFIによる消化により生じた5'オーバーハングをフィルインした。2種の異なる5'オーバーハングが示されており：1つはセンス鎖で11ヌクレオチド離れアンチセンス鎖上で15ヌクレオチド離れて切断されたDNA分子を示し、もう1つはセンス鎖上で10ヌクレオチド離れアンチセンス鎖上で14ヌクレオチド離れて切断されたDNA分子を示す。SNPの上流のヌクレオチド、SNP部位のヌクレオチド（試料は36個体由来のDNA鋳型を含んでおり；両方のヌクレオチドが試料中に示されると予測される）およびSNPの下流の3ヌクレオチドを示す。
【図１０】複数のSNPの配列分析を示す。染色体21上に位置するSNP HC21S00131およびHC21S00027、および、染色体1上に存在するSNP TSC0087315、SNP TSC0214366、SNP TSC0413944およびSNP TSC0095512をBsmFIに対する認識部位を含む第2のプライマーを用いて個別のPCR反応により増幅した。プライマーは各々の増幅された関心対象の遺伝子座が異なる大きさとなるように設計した。増幅後、反応物をあわせて1試料とし、その後の全工程をその試料につき実施した（図1F〜1Iに示すとおり）。各SNPおよび各SNPにおいて観察されたヌクレオチドを示す。
【図１１】1種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたSNP TSC0837969、TSC0034767、TSC1130902、TSC0597888、TSC0195492、TSC0607185の両方の対立遺伝子の配列決定を示す。標識されたddGTPを未標識dATP、dCTP、dTTPの存在下に使用してBsmFIによる消化の後に生じたオーバーハングをフィルインした。フィルインされた鎖上の可能な部位に先行するヌクレオチドはグアニンではなく、そして、フィルインされた鎖上の可変部位の後方のヌクレオチドはグアニンではなかった。フィルインされた鎖上の可変部位の2塩基後方のヌクレオチドはグアニンであった。可変部位にグアニンを含む対立遺伝子を標識ddGTPでフィルインする。グアニンを含まない対立遺伝子は未標識のdATP、dCTPまたはdTTPでフィルインし、そして標識されたddGTPがオーバーハングに相補的な位置3においてフィルインされるまで、ポリメラーゼはヌクレオチドを取り込み続ける。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2006523082.tif 000145
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月30日(2005.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いることにより鋳型DNAから関心対象の遺伝子座を含むDNAの領域を複製する段階であって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるように、第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を生じさせる配列を含む段階；
（b）第2のプライマーにより生じた認識部位を認識する制限酵素でDNAを消化することによりDNAフラグメントを生成する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項２】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上で関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるように、第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅DNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項３】
鋳型DNAが細菌、真菌、ウィルス、原生動物、植物、動物およびヒトからなる群より選択される起源から得られる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
鋳型DNAが細胞、組織、血液、血清、血漿、尿、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌物、腹水、唾液、粘膜分泌物、腹腔液、糞便物質または身体滲出物からなる群より選択される試料から得られる、請求項1、2、または3記載の方法。
【請求項５】
（a）における増幅がポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む、請求項2または3記載の方法。
【請求項６】
制限酵素が認識部位においてDNAを切断する、請求項2または3記載の方法。
【請求項７】
第1および/または第2のプライマーの5’領域が鋳型DNAにアニーリングしない、請求項6記載の方法。
【請求項８】
制限酵素がBsaJI、BsskI、DdeI、EcoNI、Fnu4HIおよびHinfIからなる群より選択される、請求項6または7記載の方法。
【請求項９】
制限酵素が認識部位から少し離れてDNAを切断する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第1および/または第2のプライマーの5’領域が鋳型DNAにアニーリングしない、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第2のプライマーの3’領域のアニーリング長が25〜20、20〜15、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4および4塩基未満からなる群より選択される、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
PCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3’領域の一部の融解温度近傍である、請求項2〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3’領域の一部の融解温度近傍である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
PCRの残りのサイクルのアニーリング温度が第2のプライマー全体の融解温度近傍である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
第2のプライマーの3’末端が関心対象の遺伝子座に隣接している、請求項2〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
認識部位がIIS型制限酵素に対するものである、請求項9記載の方法。
【請求項１７】
IIS型制限酵素がAlwI、Alw26I、BbsI、BbvI、BceAI、BmrI、BsaI、Bst71I、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、EarI、FauI、FokI、HgaI、PleI、SapI、SSfaNIおよびSthi32Iからなる群より選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
第1のプライマーが第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含む、請求項2〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階を更に含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第1および/または第2のプライマーが5’末端にタグを含む、請求項2〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
第1のプライマーが5’末端にタグを含む、請求項2〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
鋳型DNAから増幅されたDNAを分離するためにタグを使用する、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
取り込まれたヌクレオチドを含まない増幅されたDNAから取り込まれたヌクレオチドを含む増幅されたDNAを分離するためにタグを使用する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
タグが、放射性同位体、蛍光レポーター分子、化学発光レポーター分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、ビオチン、ビオチンの誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、同種重合体オリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反磁性部分、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分、検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率または伝導率およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項20、21、22、または23記載の方法。
【請求項２５】
ストレプトアビジンマトリックスを用いて鋳型DNAから増幅されたDNAを分離するためにビオチンタグが用いられ、任意でストレプトアビジンマトリックスがマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされる、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
（c）におけるヌクレオチドの取り込みが、大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、T7DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、PfuDNAポリメラーゼ、VentDNAポリメラーゼおよびシーケナーゼからなる群より選択されるDNAポリメラーゼにより行われる、請求項2〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
（c）におけるヌクレオチドの取り込みが標識されたヌクレオチドの取り込みを含む、請求項2〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
（c）におけるヌクレオチドの取り込みが未標識ヌクレオチドの取り込みを更に含む、請求項2〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
標識されたヌクレオチドがジデオキシヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
標識されたヌクレオチドが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチンの誘導体、リン光部分、発光部分、電子化学発光部分、染色性部分および検出可能な電子スピン共鳴を有する部分、静電容量、誘電率、伝導率およびこれらの組み合わせからなる群より選択される分子で標識される、請求項28または29記載の方法。
【請求項３１】
（d）における関心対象の遺伝子座の配列の決定がヌクレオチドの検出を含む、請求項2〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
（d）における関心対象の遺伝子座の配列の決定が標識されたヌクレオチドの検出を含む、請求項27〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
検出が、ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、蛍光検出、配列決定、ELISA、質量分析、蛍光分析、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイおよびサザンブロットからなる群より選択される方法による、請求項31または32記載の方法。
【請求項３４】
関心対象の遺伝子座が一塩基遺伝子多型または突然変異を含むことが疑われる、請求項2〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
関心対象の複数の遺伝子座の配列を同時に決定するために方法が使用される、請求項2〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
鋳型DNAが単一の染色体または複数の染色体に由来する複数の遺伝子座を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座が1回の反応において増幅される、請求項35または36記載の方法。
【請求項３８】
鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座の各々が異なる反応において増幅される、請求項35または36記載の方法。
【請求項３９】
増幅されたDNAが増幅されたDNAの消化の前に共にプールされる、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
関心対象の遺伝子座を含む（c）における標識されたDNAの各々が（d）の前に分離される、請求項27〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
関心対象の遺伝子座の少なくとも1つが一塩基遺伝子多型または突然変異を含むことが疑われる、請求項35〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含み、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるように、制限酵素に対する完全な認識部位が鋳型DNAの増幅の際に生じる段階；
（b）第2のプライマーおよび鋳型DNAにより生じた完全な認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階；および、
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項４３】
第2のプライマーの3’領域が鋳型DNAとのミスマッチを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ミスマッチが3’領域の最後の1、2または3塩基において起こる、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じ、第1のプライマーは、第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5’末端にタグを含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内に標識されたヌクレオチドを取り込む段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項４６】
関心対象の遺伝子座の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じ、第1のプライマーが第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5’末端にタグを含み、PCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3’領域の一部の融解温度近傍であり、PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3’領域の一部の融解温度近傍であり、残りのサイクルのアニーリング温度が第2のプライマー全体の融解温度近傍であるものである段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）鋳型として関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングを用いることにより（b）の消化されたDNA内に標識されたヌクレオチドを取り込む段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項４７】
タグを用いて鋳型DNAから増幅されたDNAを分離する、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
請求項1〜47のいずれか一項記載の方法において使用されるキットであって、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるように第2のプライマーがその制限酵素に対する認識部位を生じさせる配列を含む、前記方法において使用されるプライマーのセット、および取扱説明書のセットを含むキット。
【請求項４９】
配列決定すべき関心対象の遺伝子座および制限酵素に対する認識部位を含むDNAフラグメントであって、制限酵素による消化によりDNAフラグメント上の5’オーバーハングが生成され、関心対象の遺伝子座および制限酵素認識部位は制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるような相互関係にあるフラグメント。
【請求項５０】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上で関心対象の遺伝子座の対立遺伝子を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるようにその制限酵素に対する認識部位を含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）他の対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、該他の対立遺伝子の5’オーバーハングにおける結果として生じたヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項５１】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含み、制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じるように、制限酵素に対する完全な認識部位が鋳型DNAの増幅の際に生じる段階；
（b）第2のプライマーおよび鋳型DNAにより生じた完全な認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）他の対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、該他の対立遺伝子の5’オーバーハングにおける結果として生じたヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）（c）のDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項５２】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じ、第1のプライマーは、第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5’末端にタグを含む段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的な標識されたヌクレオチドが該対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）他の対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、かつ該他の対立遺伝子の5’オーバーハングにおける結果として生じたヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する段階
を含む方法。
【請求項５３】
関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定するための方法であって、
（a）第1および第2のプライマーを用いて鋳型DNA上の関心対象の遺伝子座を増幅する段階であって、第2のプライマーが認識部位から少し離れてDNAを切断する制限酵素に対する認識部位を含み、かつ制限酵素による消化により関心対象の遺伝子座を含む5’オーバーハングが生じ、第1のプライマーが第2のプライマー上の制限酵素に対する認識部位とは異なる制限酵素に対する認識部位を含み、かつ5’末端にタグを含み、PCRのサイクル1のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第2のプライマーの3’領域の一部の融解温度近傍であり、PCRのサイクル2のアニーリング温度が鋳型DNAにアニーリングする第1のプライマーの3’領域の一部の融解温度近傍であり、PCRの残りのサイクルのアニーリング温度が第2のプライマー全体の融解温度近傍である段階；
（b）第2のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で増幅されたDNAを消化する段階；
（c）（b）の消化されたDNA内にヌクレオチドを取り込む段階であって、
（i）伸長を停止させ、かつ対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的な標識されたヌクレオチドが該対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、かつ
（ii）他の対立遺伝子の関心対象の遺伝子座に相補的なヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれ、該他の対立遺伝子の5’オーバーハングにおける結果として生じたヌクレオチドに相補的である該停止ヌクレオチドが該他の対立遺伝子の5’オーバーハングに取り込まれる段階；
（d）第1のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素で（c）のDNAを消化する段階；および、
（e）標識されたヌクレオチドを含む（d）の消化されたDNAの配列を決定することにより関心対象の遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する段階；
を含む方法。
【請求項５４】
正常対立遺伝子の存在下で突然変異対立遺伝子の配列を決定するために用いられる、請求項50〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
突然変異対立遺伝子および正常対立遺伝子が、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6〜1：10、1：11〜1：20、1：21〜1：30、1：31〜1：40、1：41〜1：50、1：51〜1：60、1：61〜1：70、1：71〜1：80、1：81〜1：90、1：91〜1：100、1：101〜1：200、1：250、1：251〜1：300、1：301〜1：400、1：401〜1：500、1：501〜1：600、1：601〜1：700、1：701〜1：800、1：801〜1：900、1：901〜1：1000、1：1001〜1：2000、1：2001〜1：3000、1：3001〜1：4000、1：4001〜1：5000、1：5001〜1：6000、1：6001〜1：7000、1：7001〜1：8000、1：8001〜1：9000、1：9001〜1：10,000；1：10,001〜1：20,000、1：20,001：1：30,000、1：30,001〜1：40,000、1：40,001〜1：50,000および1；50,000を上回る比率からなる群より選択される比率で存在する、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
突然変異対立遺伝子がBRCA1、BRCA2、MSH6、MSH2、MLH1、RET、PTEN、ATM、H-RAS、p53、ELAC2、CDH1、APC、AR、PMS2、MLH3、CYP1A1、GSTP1、GSTM1、AXIN2、CYP19、MET、NAT1、CDKN2A、NQ01、trc8、RAD51、PMS1、TGFBR2、VHL、MC4R、POMC、NROB2、UCP2、PCSK1、PPARG、ADRB2、UCP3、glurl、cart、SORBS1、LEP、LEPR、SIM1、TNF、IL-6、IL-1、IL-2、IL-3、IL1A、TAP2、THPO、THRB、NBS1、RBM15、LIF、MPL、RUNX1、Her-2、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、甲状腺受容体、p21、p27、K-RAS、N-RAS、網膜芽細胞腫タンパク質、Wiskott-Aldrich（WAS）遺伝子、第V因子Lieden、第II因子（プロトロンビン）、メチレンテトラヒドロフォレート還元酵素、嚢胞性線維症、LDL受容体、HDL受容体、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子およびSHOX遺伝子からなる群より選択される遺伝子のものである、請求項54または55記載の方法。
【国際調査報告】
2006523082.tif 000149
2006523082.tif 000150
2006523082.tif 000151