(57)【要約】本発明は、脂質またはリポタンパク質代謝に関与し、かつ薬物標的として役立つであろう遺伝子を同定するためのモデルとしての線虫の使用に関する。また、本発明は、心血管障害および異脂肪血症などの、脂質（たとえば、コレステロール）もしくはリポタンパク質（たとえば、LDL）（例えば）の望ましくないか、または異常なレベルと関係する疾患の治療または予防に有用な薬物をスクリーニングするための系を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整する化合物を同定するための方法であって：
（a）試験線虫と化合物を接触させることと；
（b）前記試験線虫の表現型を、前記化合物と接触されていない線虫の前記表現型と比較することと、
を含み、前記表現型の修飾は、脂質またはリポタンパク質の調整されたレベルと相関し、前記表現型は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および（iv）後胚発生の速度からなる群より選択され、
これにより、前記表現型の相違によって前記化合物を同定する方法。
【請求項２】
線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整する遺伝子を単離するための方法であって：
（a）clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む線虫を突然変異生成に供して、試験線虫を製作することと；
（b）突然変異生成に供していない線虫の表現型と比較して、修飾された表現型を示す試験線虫を同定することであって、前記修飾された表現型は、脂質またはリポタンパク質の調整されたレベルを示し、前記表現型は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および（iv）後胚発生の速度からなる群より選択されることと；並びに、
（c）工程（a）で変異された遺伝子を工程（b）の試験線虫からクローニングすることを含む方法。
【請求項３】
線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整する遺伝子を同定するための方法であって、
（a）clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む試験線虫を、線虫遺伝子の発現レベルを特異的に減少させる核酸と接触させることと；および、
（b）前記核酸と接触していない線虫の表現型と比較して、修飾された表現型を示す試験線虫を同定することと、
を含み、前記試験線虫における前記表現型の修飾は、前記試験線虫の遺伝子線虫が脂質またはリポタンパク質のレベルを調整することを示し、前記表現型は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および（iv）後胚発生の速度からなる群より選択される方法。
【請求項４】
前記核酸がアンチセンス核酸および二重鎖RNA分子からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記接触が、前記核酸を含む細菌と共に線虫を与えることを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
脂質またはリポタンパク質のレベルが調整された線虫を選択するための方法であって：
（a）試験線虫を処理して脂質またはリポタンパク質のレベルを調整することと；および、
（b）処理されていない線虫の表現型と比較して、修飾された表現型を示す試験線虫を同定することと、
を含み、前記試験線虫において脂質またはリポタンパク質が調整されたレベルは、修飾された表現型によって示され、前記表現型は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および（iv）後胚発生の速度からなる群より選択される方法。
【請求項７】
請求項1または6に記載の方法であって、前記試験線虫は、（a）clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異；（b）clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異およびdsc-3遺伝子に少なくとも１つの突然変異；または（c）clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異およびdsc-4遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む方法。
【請求項８】
請求項1、2、3、4、5、または6に記載の方法であって、工程（b）における前記試験線虫の表現型は、（i）排便サイクルの長さの減少；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度の増大；（iii）胚発生の速度の増大；または（iv）後胚発生の速度の増大によって修飾される方法。
【請求項９】
単離された核酸であって：
（a）SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：7のヌクレオチド配列；
（b）SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：8のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（c）SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：7のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列；
（d）  （a）、（b）、または（c）に相補的なヌクレオチド配列、
を含み、前記核酸は、SEQ ID NO：1または7に隣接するか、またはSEQ ID NO：1または7の後に隣接するゲノム配列を含まないことを条件とする核酸。
【請求項１０】
（a）SEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：7のヌクレオチド配列からなる核酸プローブ；または、
（b）  （a）の相補物；
に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離された核酸であって、
前記単離された核酸は、yk357a6、K02D7、H06H21、またはY17G9と称されるクローンのうちの1つの核酸ではないことを条件とする核酸。
【請求項１１】
前記核酸が二重鎖RNA分子である、請求項10に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸が、ヌクレオチド354のヌクレオチド残基がチミン残基であり、かつ位置605のヌクレオチドがアデニン残基であること以外は、SEQ ID NO：1のヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項10に記載の核酸であって、前記核酸は、SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：8のアミノ酸配列の断片からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ポリペプチドは、DSC-3またはDSC-4ポリペプチドの1つまたは複数の機能的な活性を示す核酸。
【請求項１４】
SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：8を含む単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：8のアミノ酸配列の少なくとも8つの連続したアミノ酸を含むポリペプチドの断片。
【請求項１６】
SEQ ID NO：2またはSEQ ID NO：8のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の一致性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項14に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、位置62のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であり、位置146のアミノ酸残基がスレオニン残基であること以外は、SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１８】
SEQ ID NO2もしくはSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはこれらの断片と免疫特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
請求項9に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項9に記載の核酸を含む組換え核酸を含む細胞。
【請求項２１】
請求項9または10に記載の核酸を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２２】
線虫（C. elegans）である、請求項21に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２３】
以下の工程を含むポリペプチドを作製するための方法：
（a）組換えMOLL核酸を含む細胞を、前記細胞によってMOLLポリペプチドを発現させることができる条件下で培養することと；および、
（b）MOLLポリペプチドを単離すること。
【請求項２４】
以下の工程を含むMOLLポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法：
（a）MOLLポリペプチドを、前記MOLLポリペプチドを試験化合物に結合させることができる条件下で、前記試験化合物と接触させることと；および、
（b）前記試験化合物に対する前記MOLLポリペプチドの結合を検出すること
【請求項２５】
ヒトのアテローム性動脈硬化症または異脂肪血症障害を予防または治療するための方法であって、前記方法は、これらの必要なヒトに対して、MOLLポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを含む薬学的組成物の量を投与することを含む方法。
【請求項２６】
ヒトのアテローム性動脈硬化症を予防または治療するための方法であって、前記方法は、これらの必要なヒトに対してclk-1アンタゴニストを含む薬学的組成物の量を投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記MOLL核酸がdsc-3またはdsc-4である、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
前記MOLLポリペプチドがDSC-3またはDSC-4である、請求項24または25の方法。
【請求項２９】
前記脂質がコレステロールである、請求項1、2、3、または6に記載の方法。
【請求項３０】
前記リポタンパク質がLDL様リポタンパク質である、請求項1、2、3、または6に記載の方法。
【請求項３１】
請求項1、2、3、または6に記載の方法であって、前記修飾された表現型は、（i）前記表現型の目視検査；（ii）1つまたは複数の指標遺伝子の発現プロフィール；（iii）1つまたは複数のリポーター遺伝子の発現；（iv）前記試験線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルおよび／または分布の変化によって検出される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2003年3月14日に出願された米国仮出願番号第60/454,925号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
1.発明の分野
本発明は、潜在的な薬物ターゲットの発見のためのモデルとしての線虫の使用に関する。本発明は、心臓血管疾患および異脂肪血症などの一定の脂質代謝障害の治療および予防に有用な薬物をスクリーニングするための系を提供する。
【背景技術】
【０００３】
2.発明の背景  
2.1  線虫（C. elegans）のclk-1遺伝子およびclk-1変異体の多面的な表現型  
線虫（Caenorhabditis elegans）のclk1遺伝子の変異体は、非常に多面的であり、広範囲にわたる時間尺度を通じて生じる生理的特徴の速度に影響を及ぼす（Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259）。これらは、初期胚発生、胚発生、および後胚発生の細胞周期、並びに成体の排便、遊泳、および咽頭音ポンピングサイクルの平均の延長を生じる。また、clk-1突然変異は、卵産生速度および自己血のサイズ等の生殖の特徴に影響を及ぼし、これにより、寿命を減少し、および増大を引き起こす。
【０００４】
多くの観察では、clk-1変異体の表現型が適切に生理的プロセスの速度をセットすることができないことによる結果であることを示唆する（Branicky et al., 2000、Bioessays 22：48-56て、およびWong et al.（1995）Genetics 139：1247-1259）。一例には、clk-1突然変異によって影響を受ける特徴の多くが、平均してより緩徐であることに加えて、変化しやすい。例えば、clk-1変異体の胚形成の平均の長さは、野生型のものよりも緩徐であるが、いくつかのclk-1胚は、野生型よりも急速に胚発生することができ、一方でその他では、2回以上長くかかることから、変異体ではタイミングが調節解除されていることを示唆する（Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259）。また、clk-1変異体の胚は、温度変化に対する応答の発生速度を適切に調整することができない。野生型胚を特定の温度で2細胞期に培養し、次いで新たな温度に移すと、これらは、新たな温度に対応する速度で直ちに発生する。対照的に、clk-1変異体胚を新たな温度へ移すと、新たな温度での発生速度は、移動前に経験した温度によって強い影響を受ける（Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259）。これは、clk-1が、温度変化に応答して生理的速度をリセットすることをも必要とするであろうことを示唆する。最後に、clk-1変異体で影響を受ける表現型の全てが、母系性にレスキューするとができ、すなわち、ヘテロ接合性の雌雄同体に由来するホモ接合性の変異体の子孫は、表現型的に野生型である。この母系性のレスキューは、成体期まで延長され、その結果全て成体の挙動、およびclk-1変異体の長寿命さえレスキューされる（Hekimi et al., 1995、Genetics 141：1351-1364、およびWong et al.（1995）Genetics 139：1247-1259）。従って、clk-1は、虫の生理的速度のセットに関与する調節プロセスに影響を及ぼすと考えられている（Branicky et al., 2000、Bioessays 22：48-56；Felkai et al., 1999、EMBO J 18：1783-17
92；Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259）。母系性に供給されたclk-1産物の存在下では、ホモ接合性のclk-1変異体がその後に発生して、野生型の様な挙動をすることができるように、タイミングを発生の早期に適切にセットすることができる。
【０００５】
clk-1は、真核生物の中で構造的および機能的に非常に保存されているミトコンドリアのタンパク質をコードし（Ewbank et al., 1997, Science 275： 980-983； Jonassen et al., 1996, Arch Biochem Biophys 330： 285-289； Proft et al.,1995, EMBO J 14： 6116-6126； Vajo et al., 1999, Mamm Genome 10： 1000-1004）、およびユビキノン（UQ、補酵素Q、CoQとも呼ばれる）（呼吸鎖複合体IIおよびIIIの電子の輸送体として機能するプレニル化ベンゾキノン脂質）の生合成に必要とされる推定上のヒドロキシラーゼをコードする（Stenmark et al., 2001, J Biol Chem 276：33297-300）。clk-1（coq-7）の酵母相同体の変異体は、UQを産生しない、したがって、非発酵性の炭素供与源では成長することができない（Marbois  and Clarke, 1996, J Biol Chem 271： 2995-3004）。また、clk-1変異体から単離されたミトコンドリアは、検出可能なレベルのユビキノンを含まないが、その代わりにUQ生合成の中間体デメトキシユビキノン（DMQ）を蓄積する（Miyadera et al., 2001, J Biol Chem 276： 7713-7716）。clk-1変異体において、この化合物は、電子伝達体として機能し、その結果ミトコンドリアは、UQが完全に存在しないにもかかわらず呼吸を維持することができる（Felkai et al., 1999, EMBO J 18： 1783-1792 and Miyadera et al., 2001, J Biol Chem 276： 7713-7716）。しかし、clk-1変異体は、これらにUQを産生しない大腸菌株を与えると、完全に発生することができないので、DMQは、UQを完全に置換することができるというわけではない（Jonassen et al., 2001、PNAS 98：421-426）。
【０００６】
しかし、この生化学的な表現型と全体の表現型の重篤さとの間には相関がないために、UQの非存在が、どのようにその他の変異体の表現型に関連するかは明らかではない。実際に、キノンの表現型は、全部で3つの既知のclk-1対立遺伝子（e2519、qm30、およびqm51）と同一であり：UQは、全3つのケースにおいてミトコンドリアには全く無く、3つ全てが同一量のDMQを蓄積する。それでも、clk-1変異体において影響を受ける大部分の特徴は、推定上のヌル対立遺伝子qm30およびqm51において、これらが部分的な機能喪失対立遺伝子e2519で起こるよりも激しく減速される。（Felkai et al., 1999、EMBO J 18：1783〜1792、およびWong et al.（1995）Genetics 139：1247-1259）。また、無処理の虫におけるエネルギー代謝の種々の測定により、clk-1変異体は、野生型と同等の代謝能およびATP濃度を有することが示された（Braeckman et al., 1999, Curr Biol 9： 493-496.）。あわせると、これらの観察は、clk-1変異体の表現型の多くがミトコンドリアのUQの非存在またはエネルギー産生レベルの減少の直接的な結果ではないことを示唆する。
【０００７】
clk-1変異体において影響を受ける特徴のうちの1つは、排便サイクルである。線虫において、排便は、常同的な排便運動プログラム（Defecation Motor Program：DMP）によって遂行される。DMPは、3つの異なった工程からなる：後方の体筋収縮（pBoc）、前方の体筋収縮（aBoc）、および腸内の筋収縮（EMC）からなる放出（Exp）（Thomas et al., 1990, Genetics 124： 855-872.）。十分な食物の存在下において、56秒の排便サイクル周期は、一匹の動物において、全時間に渡り、かつ動物間で規則的であり、数秒だけの標準偏差を有する。その厳密な周期現象に加えて、排便サイクルは、内因性の「時計」によって制御されているかもしれないことを示唆するその他の性質を有する。たとえば、サイクルの段階は、軽く動物を触診することによってリセットすることができ、リズムは、DMPの発現の非存在下でさえも維持される（Liu and Thomas, 1994, J Neurosci 14： 1953-1962）。
【０００８】
排便サイクルの周期現象は、少なくとも13遺伝子の突然変異によって変更することができる（Dec表現型）。これらの突然変異は、2つの主要な分類に入る：サイクル長を減少させる突然変異に関して短Dec（short Dec: Dec-s）、およびサイクル長を増大する突然変異に関して長Dec（long Dec:Dec-L）（Iwasaki et al., 1995, PNAS 92： 10317-10321）。細胞内カルシウム濃度の調節に関与するタンパク質である、Dec-L遺伝子（dec-4（lef-1/itr-1））のイノシトール三リン酸受容体（IP3受容体）としての分子同定により、カルシウムの周期的変動がリズムの調節に寄与していることが示唆される。実際に、Dal Santo et al. （1999, Cell 98： 757-767）は、DMPの最初の筋収縮の直前に、腸においてカルシウムレベルがピークまで上がり、腸のIP3受容体の発現は、正常なリズムが生じるために十分であったことを示した。異なるDec遺伝子が、どのように相互作用して排便サイクルを調節するのかいまだに明らかではないが、2つのその他の遺伝子、flr-1およびunc-43/dec-8の分子の特徴付けが、リズム調節におけるカルシウムおよび腸の役割を補助するかもしれない。flr-1変異体は、元来はフッ化物に対するこれらの抵抗性に基づいて同定され（Katsura et al., 1994, Genetics 136： 145-154）、その他の排便表現型の中でも非常に短い排便サイクル長を有する（Iwasaki et al., 1995, PNAS 92： 10317-10321）。flr-1は、degenerin／上皮ナトリウムチャネル・スーパーファミリーのイオンチャネルをコードし、胚から成体の腸においてのみ発現する（Take-Uchi et al., 1998、PNAS 95：11775-11780）。unc-43の突然変異は、排便表現型を含む複数の行動に欠陥を生じる（Liu and Thomas, 1994, J Neurosci 14： 1953-1962 and Reiner et al., 1999, Nature 402： 199-203）。機能喪失突然変異は、排便頻度の増大を生じ、通常、一次運動プログラムの開始後〜13秒でDMP反復を生じるが、機能獲得突然変異では、排便頻度の減少を生じる。unc-43は、ニューロン、筋肉、および腸において広く発現される線虫のカルモジュリンキナーゼIIをコードする（Reiner et al., 1999, Nature 402： 199-203）。
【０００９】
2.2脂質代謝  
食餌中に存在する脂質は、吸収されて、血液に輸送されることになっている。脂質の代謝は、脂質、アポタンパク質、リポタンパク質、胆汁酸、および酵素の相互作用を含む。総説については、Brown & Goldstein, In, The Pharmacological Basis Of Therapeutics, 8th Ed., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Ch. 36, pp. 874-896； and Fuchs, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 284：G551-557を参照されたい。
【００１０】
リポタンパク質は、種々のタイプの脂質およびアポタンパク質の様々な比率を含む血漿において見いだされるミセル様の構築物である。血清リポタンパク質には、密度を増大する順に、カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（VLDL）、中間型リポタンパク質（IDL）、低密度リポタンパク質（LDL）、および高密度リポタンパク質（HDL）の5つの主なクラスがある。多くのタイプの脂質は、それぞれのリポタンパク質クラスと関係することが見いだされているが、それぞれのクラスは、主に1タイプの脂質を輸送する：上記したトリアシルグリセロールは、カイロミクロン、VLDL、およびIDL中に輸送され；一方、リン脂質およびコレステロールエステルは、それぞれHDLおよびLDL中に輸送される。アポタンパク質は、非共有結合的にリポタンパク質の表面に結合し、種々の粒子の代謝における結合部位および酵素補因子として作用する。主要アポリポタンパク質は、apoA-I、A-II、A-IV、B-100、B-48、CI、C-II、C-III、D、およびでEある。ApoB-100は、VLDL、IDL、およびLDLに存在するが、apoEは、カイロミクロン残遺物、VLDLおよびIDLに存在する。高レベルの循環LDLおよび血中のβ-VLDLは、特に心血管心疾患の危険度の増大と関連していた。
【００１１】
カイロミクロンは、腸において、腸管上皮によって作製される吸収された脂質およびアポタンパク質から形成される。これらは、水よりも高密度ではない大径粒子（80〜500nm）である。カイロミクロンは、腸の上皮細胞で形成され、次いで細胞を通過して組織液中にでる。そこから、これらは、腸絨毛の中心乳糜管に集められる。リンパ系は、これらの大きなリポタンパク質を全身循環へ運ぶ。カイロミクロンは、腸から脂肪組織および肝臓へ食餌脂肪を輸送する。
【００１２】
大部分のVLDLは、肝臓に由来し、肝臓からその他の組織までトリアシルグリセロールを輸送する機構の代表例である。生成および放出の機構は、腸におけるカイロミクロンの粒子の分泌と著しく似ている。乳腺を除き、肝臓および腸は、粒子性の脂質を分泌する唯一の組織である。粒子性の脂質は、予め加水分解することなく毛管壁を通過することはできず、従って、リンパ系へ退けられる。VLDLは、内因的に合成された脂肪を脂肪組織に送達する。
【００１３】
カイロミクロンおよびVLDL（30〜100nm）粒子は代謝されて、迅速に血液から消去される。脂肪組織、心臓、および筋肉は、大部分の代謝を行う。これは、血管および組織に存在する酵素リポタンパク質リパーゼの作用を経て達成される。リポタンパク質複合体は、血管壁に結合されることとなり、ここで酵素がトリアシルグリセロールを遊離脂肪酸およびグリセロールに加水分解する。いくらかの遊離脂肪酸が血液に放出されるが、ほとんどは組織に輸送される。生じるカイロミクロン残遺物は、非常に小さく、コレステロールおよびコレステロールエステル中に濃縮される。これらの残遺物は、受容体を媒介したた機構によって肝臓によって摂取される。
【００１４】
LDL（25〜30nm）は、VLDLから、およびおそらくカイロミクロンから形成される。正常細胞において、LDLは内在化され、コレステロールエステルは加水分解され、タンパク質はリソソーム（lysozomes）で破壊され、細胞コレステロール合成が抑制される。細胞膜上のLDL結合部位の数は、細胞のコレステロールに対する要求によって調節される。LDLの半分は、肝臓において代謝される。肝臓によるトリアシルグリセロールの合成およびVLDLの分泌を増大する因子は、高炭水化物の食餌、エタノールの摂取、インスリンの高濃度、およびグルカゴンの低濃度を含む。VLDLおよびLDLは、アテローム生成的リポタンパク質である。ApoB-100およびapoEは、LDL受容体のリガンドである。
【００１５】
肝臓および腸は、最も小さな（7.5〜10nm）、大部分の可溶性、かつタンパク質リッチなリポタンパク質のHDLを合成し、分泌するが、腸の供与源は、肝臓供与源から後で付加されるタンパク質を欠いている。HDLは、その核にコレステロールエステルを含み、リン脂質およびタンパク質によって囲まれている。血漿HDL濃度は、冠状動脈疾患の発病率と反対に関連する。HDLは、組織から肝臓へ余剰コレステロールを運ぶコレステロール・スカベンジャーとして作用すると考えられる。HDLは、末梢組織からコレステロールを除去し、動脈壁における脂質の蓄積を防げる。
【００１６】
コレステロールは、ステロイドホルモンおよび胆汁酸の代謝前駆体であり、並びに細胞膜の必須な構成要素でもある。ヒトおよびその他の動物において、コレステロールは、食餌の際に摂取されて、更に肝臓およびその他の組織によって合成される。食餌によるコレステロール吸収、内因性のコレステロール合成、および胆汁のコレステロール分泌が、全身のコレステロール・バランスを調節する。高血漿コレステロール・レベルは、アテローム性動脈硬化症の危険因子であり、また体内の大部分のコレステロールは、胆のう組織を経て配置されるので、腸肝循環および胆汁酸の合成および輸送の調節は、脂質代謝の非常に重要な部分である。肝臓では、コレステロールが7-ヒドロキシコレステロールに変換され、次いでコール酸およびケノデオキシコール酸に変換される。これらの胆汁酸は、腸を経て再吸収され、肝臓へ送達される。
【００１７】
肝臓リパーゼおよびリポタンパク質リパーゼは、リポタンパク質およびリン脂質の結合、取り込み、異化反応、および再造形を媒介する多機能タンパクである。リポタンパク質リパーゼおよび肝臓リパーゼは、それぞれ末梢組織および肝臓内の内皮細胞の管腔の表面に結合した間に機能する。両酵素は、体からの排出のために、またはリサイクルのために、末梢組織から肝臓へコレステロールを移動する逆コレステロール輸送に関与する。肝臓リパーゼおよびリポタンパク質リパーゼにおける遺伝子欠損は、リポタンパク質代謝の家族性障害の原因であることが既知である。リポタンパク質の代謝の欠陥は、高コレステロール血症、高脂血症、およびアテローム性動脈硬化症を含む深刻な代謝障害を生じる。
【００１８】
アテローム性動脈硬化症は、組織学的な用語で、血管壁、特に大動脈（大動脈、冠動脈、頸動脈）における脂質およびその他の血液誘導体の沈着（脂質または線維脂質プラーク）によって定義される複雑な多遺伝子性疾患である。アテローム硬化型のプロセスの進行の程度に応じて多少石灰化されたこれらのプラークは、病変と連関している可能性があり、本質的にコレステロールエステルからなる脂肪質沈着の血管における蓄積と関係する。これらのプラークは、血管壁の肥厚、平滑筋の肥大、泡沫細胞（動員されたマクロファージによる抑制されていないコレステロールの取り込みによって生じる脂質でいっぱいの細胞）の出現、および線維組織の蓄積を伴う。粥状斑は、壁から著しく突出し、アテローム、血栓症、または塞栓症による血管閉塞を生じさせ、これらは、最も影響を受けている患者に生じる。これらの病変は、梗塞、突然死、心不全、および脳卒中などの深刻な心血管病態に至る可能性がある。
【００１９】
脂質恒常性における種々の酵素およびアポタンパク質の役割に関する発展した理解にもかかわらず、脂質代謝に関与し、および／または調節するタンパク質をコードするさらなる遺伝子を同定する必要がある。
【００２０】
2.3脂質代謝に関連した障害のための現在の治療
標準的な治療様式は、食餌療法、身体運動、および薬物療法を含む。現在、血清コレステロールおよびトリグリセリドを下げるために推奨される薬物は、いくつかのクラスに分類することができる。しかし、ぞれそれ、有効性、副作用、および認定する患者集団に関して、それ自体が欠点および制限を有する。
【００２１】
胆汁酸結合樹脂は、腸から肝臓への胆汁酸の再利用を中断する薬物クラスである；たとえば、コレスチラミン（Questran Light（商標）., Bristol-Myers Squibb）および塩酸コレスチポール（Colestid（商標）., The Upjohn company）。しかし、このような樹脂の使用は、せいぜい約20%まで血清コレステロール・レベルを低下させるだけであり、便秘および特定のビタミン欠乏症を含む胃腸の副作用と関係している。
【００２２】
スタチン類（statins）は、AMGCoAレダクターゼを阻害することによってコレステロール合成をブロックするコレステロール低下薬であり−鍵となる酵素がコレステロール生合成経路に関与する。スタチン類、たとえばロバスタチン（Mevacor（商標）, Merck & Co., Inc.）およびプラバスタチン（Pravachol（商標）, Bristol-Myers Squibb Co.）は、時に胆汁酸結合樹脂と結合して使用される。スタチン類は、有意に血清コレステロールおよびLDL血清レベルを減少させ、冠状動脈硬化症の進行を遅くする。しかし、血清HDLコレステロール・レベルは、わずかに増大されるだけである。LDL低下効果の機構は、VLDLレベルの減少およびLDL受容体の細胞発現の誘導を含無可能性があり、LDL産生の減少および／またはLDLの増大された異化反応を引き起こす。肝臓および腎臓の機能障害を含む副作用は、これらの薬物の使用と関係する（Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Montvale, N.J. 1997）。
【００２３】
ナイアシンまたはニコチン酸は、栄養補助食品および抗高脂血症薬剤として使用される水溶性カルニチン複合体である。ナイアシンは、VLDLの生産を減弱させ、LDLを下げることに有効である。これは、胆汁酸結合樹脂と結合して使用される。十分な用量で使用するときに、ナイアシンはHDLを増大することができるが、このような用量で使用するときには、その有用性が重大な副作用によって制限される。
【００２４】
フィブラート類（Fibrates）は、高コレステロール血症とも関係しているであろう種々の形態の高脂血症（すなわち、高血清トリグリセリド）を治療するために使用される脂質を低くする薬物のクラスである。たとえば、クロフィブラート（Atromid-S（商標）、Wyeth-Ayerest Laboratories）は、VLDL画分を減少させることによってより低い血清トリグリセリドに対して（未知の機構を経て）作用する抗脂質血症薬である。血清コレステロールは、一定の患者の亜集団において減少されるであろうが、薬物に対する生化学的反応は、変化しやすく、どの患者が良好な結果を得るかについて必ずしも予測できるわけではない。悪性腫瘍（特に胃腸癌）、胆嚢疾患、および非冠状動脈死の発病率の増大などの毒性を含む深刻な副作用が、フィブラートの使用と関係している。
【００２５】
従って、血清コレステロールを低下させること、LDL血清レベルを低下させること、虚血性心疾患を防止すること、および／または既存の障害を治療することに有効で、より安全な薬物を開発する必要がある。
【発明の開示】
【００２６】
3.発明の概要  
本発明は、脂質代謝、特に脂質および／またはリポタンパク質濃度の調整に関与する遺伝子の発見のためのモデルとしての線虫の使用に関する。このような遺伝子は、（脂質およびリポタンパク質の修飾因子（Modulators Of Lipids and LipoproteinsまたはMOLLs）とも呼ばれる）は、創薬のための標的として役立つことができ、またはさらなるMOLLsを同定するためにスクリーニングアッセイをする際に使用することができる。
【００２７】
一つの態様において、本発明は、脂質またはリポタンパク質の調整されたレベルを有する線虫を選択するための方法であって：試験線虫を処理して脂質またはリポタンパク質のレベルを調整することと；処理されていない工程（a）の試験線虫の表現型と比較して、修飾された表現型を表し／示す試験線虫を同定することと、および試験線虫の脂質またはリポタンパク質の調整されたレベルと修飾された表現型を相関させることとを含む方法を包含する。使用することができる表現型の例は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；または（iv）後胚発生の速度を含む。
【００２８】
もう一つの態様において、本発明は、線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整する遺伝子を単離するための方法であって：clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む線虫を突然変異生成に供して、試験線虫を製作することと；突然変異生成に供していない工程（a）の線虫の表現型と比較して、修飾された表現型を示す試験線虫を同定することと、および試験線虫の脂質またはリポタンパク質の調整されたレベルと修飾された表現型を相関させることと、ここで修飾された表現型は、脂質またはリポタンパク質が調整されたレベルを示し、前記表現型は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および／または（iv）後胚発生の速度であることができ、並びに当該技術分野において周知技術によって、試験線虫において変異した遺伝子をクローニングすることとを含む方法を包含する。
【００２９】
もう一つの態様において、本発明は、線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整する遺伝子を単離するための方法であって、clk-1遺伝子に少なくとも１つの突然変異を含む試験線虫を、線虫遺伝子の発現レベルを特異的に減少させる核酸と接触させることと；および修飾された表現型を試験線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルの変化と相関させることとを含み、前記核酸と接触していない試験線虫の表現型と比較した表現型の修飾は、線虫遺伝子が線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整することを示し、前記表現型は、以下の（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および／または（iv）後胚発生の速度のいずれかである方法を包含する。
【００３０】
もう一つの態様において、本発明は、線虫の脂質またはリポタンパク質のレベルを調整する化合物をスクリーニングする方法であって：試験線虫と化合物を接触させることと；試験線虫の表現型を、化合物と接触していない線虫の表現型と比較することとを含み、これにより、表現型の相違によって化合物を同定する方法を包含する。表現型の修飾は、脂質またはリポタンパク質の調整されたレベルと相関しており、該表現型は、（i）排便サイクルの長さ；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度；（iii）胚発生の速度；および（iv）後胚発生の速度からなる群より選択される。
【００３１】
本方法の種々の態様において、修飾される表現型は、（i）排便サイクルの長さの減少；（ii）細胞体発達の速度と比較した生殖系列発達の速度の増大；（iii）胚発生の速度の増大；または（iv）後胚発生の速度の増大である。
【００３２】
また、哺乳類にも存在するであろう線虫のこのような脂質の例は、コレステロール、脂肪酸、ステロール、およびユビキノンを含むが、これらに限定されない。線虫のこのようなリポタンパク質の例は、ApoBs、ビテロゲニン、およびApoB様の配列の断片を含むリポタンパク質を含むヒト・アポリポタンパク質の相同体を含むLDL様リポタンパク質、並びにこのようなタンパク質を含むその他の脂質含有粒子を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明はMOLL遺伝子、特にdsc-3およびdsc-4のヌクレオチド配列、およびこれらでコードされるタンパク質、並びに機能的に活性である断片、誘導体、および類似体（すなわち、これらは全長野生型MOLLタンパク質に関係する1つまたは複数の既知の機能的活性を示すことができる）のアミノ酸配列にも関する。このような機能的活性は、抗原性、免疫原性、および生物活性（たとえば、脂質およびアポリポタンパク質の結合、コレステロール、LDL、および／またはROSレベルの調整）を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、本発明は、単離されたMOLL核酸分子であって：SEQ ID NO：1または7のヌクレオチド配列と少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含むか；SEQ ID NO1または7のヌクレオチド配列からなる核酸プローブまたはこれらの相補物とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、またはSEQ ID NO：2または8のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む、MOLL核酸分子を包含する。また、単離されたMOLL核酸分子の相補物、断片、および変種も包含される。
【００３４】
もう一つの態様において、本発明は、単離されたMOLLポリペプチド、特にDSC-3およびDSC-4を含む。特定の実施態様において、本発明は、SEQ ID NO：2または8の一部のアミノ酸配列を含むポリペプチド；SEQ ID NO：2または8の天然に存在する対立遺伝子変異体、およびSEQ ID NO：2または8と少なくとも90%同一の変種を包含する。
【００３５】
また、MOLLタンパク質、誘導体、および類似体の生産方法は、たとえば組換え手段によって提供される。また、組換えMOLL核酸および／または組換えMOLLポリペプチドを含む細胞および線虫も包含される。
【００３６】
また、本発明は、脂質、リポタンパク質、および／またはROSの望ましくない、または異常なレベルによって特徴づけられる障害の予防および治療的な治療を提供する。このような方法は、これらの必要な被検者に対して、病理学的表現型が改善されるように、脂質（コレステロールなどのステロールを含む）、リポタンパク質（LDLなど）、および／またはROSのレベルを変化させる本発明の薬剤の有効な量を投与することを含む。本発明の薬剤は、clk-1および／またはMOLLタンパク質および核酸、並びにMOLLタンパク質並びにこれらの類似体および誘導体（断片を含む）；これに対する抗体；MOLLタンパク質をコードする核酸、類似体、または誘導体；並びにMOLLアンチセンス核酸；の発現レベルまたは活性を調整することができる組成物を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
5.発明の詳細な説明  
本発明は、脂質代謝に関与し、および薬物標的として役立ち得る遺伝子を同定するためのモデルとしての線虫の使用に関する。本発明は、線虫のclk-1遺伝子の変異体における生殖系列の発達が、身体の発達とは連関していないこと（すなわち、期外発生表現型）、および脊椎動物の低密度リポタンパク質（LDL）の線虫類似体の生産を減少させるか、または酸化を増大することにより、この表現型を抑制することの発見に基づく。これらの観察は、脂質代謝の研究のために遺伝子のモデル系を提供し、細胞成分の酸化がclk-1変異体において減少されること、および天然のリポタンパク質が阻害するが、酸化型のリポタンパク質は生殖系列発達を促進することを示す。従って、生殖系列発達の速度およびclk-1変異体のその他の表現型は、一般にリポタンパク質代謝および脂質代謝の側面を研究するために使用することができる。また、線虫および遺伝子により、このような遺伝子の相互作用、活性酸素種（ROS）などの環境要因、および／またはリポタンパク質酸化の状況にける薬物および多細胞動物モデルにおけるその生物学的効果を研究することができる。
【００３８】
本発明の創薬プラットフォームの利点のうちの1つは、本アッセイ法のエレメントを組み合わせて種々のアッセイ法を作製することができるということである。また、標的を同定するために使用される線虫およびこれらの表現型の多くは、化合物をスクリーニングするためにも使用することができる。本発明の線虫変異体の遺伝子型および対応する表現型に基づいて、変異体線虫の1つまたは複数の特徴的な表現型と関係する望ましい生物学的結果を生じさせる薬物の標的遺伝子／遺伝子産物の1つまたは複数に対して作用する化合物をスクリーニングするための、種々のアッセイ法が提供された。従って、本発明は、一部において、感受性が高く、高スループットの遺伝子発現アッセイ法と組み合わせた、代謝期または障害のインビボモデルを含む系統的なアプローチに基づいている。本発明は、心臓血管疾患の病態および進行において役割を果たす新規の経路に関与する新規の遺伝子および遺伝子産物（新規であるか既知であるかにかかわらず）の発見を可能にする確証されたプラットフォームを提供する。従って、本発明により、診断、モニタリング、薬物のスクリーニングおよび設計、および／またはその他の治療的な介入に有用なヒトの標的を限定することができる。
【００３９】
哺乳類では、腸での脂質吸収、または肝臓での脂質貯蔵の後のいずれにおいても、リポタンパク質は、組織に対して脂質を再分布する際の必須成分である。種々の生理的設定において、リポタンパク質は、ROSによって酸化型になり、これらの性質が変化する。例えば、天然のLDLは、LDL受容体によって認識され、その一方で酸化型のLDL（OxLDL）は、LDL受容体に結合しないが、マクロファージ上のスカベンジャー受容体を含む種々のタイプの受容体によって認識される。LDLおよびOxLDLは、血管の内皮細胞を含む種々の細胞型に対して異なった生物学的効果を有する。特に、OxLDLは、これが血管壁に蓄積され、ここでマクロファージによって特異的に摂取され、こうして泡沫細胞になるであろうから、病理生物学的な重要性を有する。このプロセスは、アテローム性動脈硬化症に至るイベントのカスケードにおいて重要であり、従って、人の健康に関して中心的な重要性がある。
【００４０】
clk-1は、ユビキノン（UQ、補酵素Q、CoQとも呼ばれる）（呼吸鎖の複合体IIおよびIIIの電子輸送体として機能するプレニル化ベンゾキノン脂質）の生合成に必要とされるミトコンドリアのヒドロキシラーゼをコードする。UQおよびその還元型ユビキノールは、活性酸素種（ROS）の産生の主要部分である。電子伝達の間に、不安定であり、スーパーオキシドを産生するユビセミキノン種が形成される。さらにまた、ユビキノン／ユビキノールは、ROSを産生するその他の酵素系、たとえば原形質膜NAD（P）Hオキシドレダクターゼ、並びにリソソームおよびペルオキシソームの電子伝達鎖のレドックス活性な補因子である。これらの部位の全てにおいて、ROSは、ユビキノン／ユビキノールを含むレドックス反応の間に産生され得る。
【００４１】
clk-1（coq-7）の酵母相同体の変異体は、UQを産生せず、したがって、非発酵性の炭素源で成長することができない。また、clk-1変異体から単離されたミトコンドリアは、検出可能なUQレベルを含まず、その代わりにUQ生合成の中間体デメトキシユビキノン（DMQ）を蓄積する（Miyadera et al., 2001, J Biol Chem 276: 7713-7716）。clk-1変異体において、この化合物は、電子伝達体として機能し、その結果ミトコンドリアは、UQが完全に存在しないにもかかわらず呼吸を維持することができる。しかし、clk-1変異体は、これらがUQを産生しない大腸菌株を与えられたときに完全に発達することができないので、DMQは、UQを完全に置換することができない（Jonassen et al., 2001、PNAS 98：421-426）。
【００４２】
線虫において、本発明者らは、UQがDMQによって置換されているclk-1変異体の緩徐な生殖系列発達が、ミクロソーム・トリグリセリド転移タンパク質（MTP）の大サブユニットの線虫相同体のdsc-4（これは、apoB依存的なLDL様リポタンパク質の分泌に必要とされる）の突然変異によって抑制されることを見いだした。同一の効果が、ビテロゲニンVIT-3、VIT-4、およびVIT-5の合成（apoBの虫相同体）を阻害することによって、およびSOD-1の発現の破壊によって（細胞質のスーパーオキシドジスムターゼであって、その解毒機能は、LDLの酸化に対して多大な影響を有すると考えられている（Guo et al., 2001, Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:1131-1138）も得られる。これらの知見に基づいて、天然のLDL様リポタンパク質と酸化型のLDL様リポタンパク質が生殖系列に対して反対の効果を有し、これらのリポタンパク質の酸化レベルがDMQの存在下で減少されるというモデルが提供される。UQは、ROSを産生する多くの系のための補因子、並びに抗酸化物として機能する。従って、DMQがUQの代わりの補因子としてに使用されるか、またはDMQが良好な抗酸化物であるときは、DMQの効果は、ROS生産の減少による可能性がある。いずれの特定の理論によっても拘束されないが、clk-1突然変異の様に、過剰のビタミンEにより生殖系列発達を遅くすることが観察されており（Harrington and Harley, 1988）、したがって、ビタミンEの再生を促進する際におけるUQ以上のDMQの増大された能力は、生殖系列発達に対するその効果を説明することができる。
【００４３】
いずれの作用機序によっても拘束されることは企図しないが、本質的には、clk-1変異体線虫によって示されるいくつかの表現型（たとえば、緩徐な生殖系列発達および排便サイクル長の増大）は、一部には、天然の（未酸化状態の）LDL様リポタンパク質のプールの蓄積のためである。従って、このようなclk-1変異体の表現型は、天然のLDL様リポタンパク質の濃度を減少させる一定のプロセスによって、線虫においてレスキューことができる。これは、天然のLDL様リポタンパク質の合成／分泌を減少すること、または天然のものから酸化型LDL様リポタンパク質への転換を増大することを含む種々のプロセスで達成することができる。本明細書において以下に提供される実施例では、天然のLDL様リポタンパク質レベルの操作を介して、clk-1変異体線虫の野生型表現型を回復することによる原理の証明を提供した。1つのアプローチでは、主に食餌の脂質（すなわちコレステロール）またはLDLのタンパク質成分（すなわちapoB相同体vit-3、vit-4、およびvit-5）の利用能を低下させることによって、線虫におけるLDL様リポタンパク質の合成／分泌を減少させた。コレステロールの枯渇（8.3節を参照されたい）およびvit-3、vit-4、vit-5 RNAiの投与（8.2節を参照されたい）は、本質的に野生型であった生殖系列発達の速度に変化を生じさせた。または、LDLレベルは、天然のLDLから酸化型LDLへの転換を増大することによって低下された。酸化型のLDLの産生は、天然のLDLとの相互作用に利用できる活性酸素種（ROS）を増大することによって増大された。ROSレベルは、SOD RNAiの投与によって抗酸化物酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の機能を減少させることによって増大された（8.4節）。また、酸化型LDLが増大されたことによる天然のLDLレベルの減少は、本質的に野生型および生殖系列発達の割合に変化を生じさせた。
【００４４】
clk-1の抑制因子変異体としてのdsc-3変異体の同定、およびclk-1変異体に対するコレステロール枯渇の効果から、clk-1表現型がコレステロールおよび関連した代謝産物などの一定の脂質のレベルの変化に感受性であることをさらに示す。このような脂質レベルの変化は、天然のLDL様リポタンパク質濃度の変化に関与しており、これにより線虫の表現型に影響を及ぼすことができる。
【００４５】
一つの態様において、本発明は、脂質代謝、特にコレステロール・レベル、LDL分泌、およびLDL酸化の変化に関与する新規遺伝子を同定するための、線虫のclk-1変異体の使用を提供する。clk-1変異体の表現型は多面的であり、胚細胞周期、全胚発生、後胚発生、排便、咽頭のポンピング、および遊泳などの種々の周期性の挙動、並びに産卵速度および老化を含む発達、挙動、および再生の大部分の側面が平均して遅くなっている。（Wong et al., 1995、Genetics、139：1247〜1259）。本発明の方法に従って、異なる環境条件下で種々のclk-1変異体の表現型を抑制する変異体を作製し、単離することにより、clk-1機能の特定の側面に影響を及ぼす新規の遺伝子クラスを同定することができる。抑制因子変異体を同定し、特徴づける際に使用することができる表現型は、たとえば排便サイクルの長さ、生殖系列発達の速度、並びに胚発生および後胚発生を含む。本発明の方法は、試験線虫の脂質および／またはリポタンパク質のレベルの変化と、このような表現型との相互関係に依拠する。機能解析に基づくこれらのアッセイ法の詳細な説明は、第5.4節に提供してある。
【００４６】
関連した側面において、本方法は、また、脂質代謝に関与する脊椎動物の遺伝子と構造エレメントを共有し、および／または配列相同性をする線虫遺伝子の機能を調査し、確証するために使用することができる。新規の遺伝子標的を同定し、特徴づけるための本発明の方法は、5.3.1節および6節に詳細に記載してある。
【００４７】
もう一つの関連した側面において、本方法は、また、ROSによって酸化され得る線虫のタンパク質、特に酸化型が異なる生物学的性質を有し、その結果線虫の表現型に変化を生じる分子を同定するために使用することができる。
【００４８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、clk-1変異体の表現型を抑制する新規の遺伝子および遺伝子産物を提供する。これらの遺伝子は、本発明の方法によって同定され、修飾されたclk-1変異体の表現型の側面に応じて、いくつかの分類に分けることができる。また、これらの遺伝子のいずれか一つに突然変異を含む線虫、および生物学的アッセイ法および薬物スクリーニングアッセイ法におけるこれらの使用も提供される。関連した態様において、本発明は、また、本発明の方法によって同定される線虫遺伝子のヒト相同体が線虫にクローン化され、かつ発現されている「ヒト化」線虫を提供する。生物学的アッセイ法および薬物スクリーニングアッセイ法におけるこのような線虫の使用が想定される。
【００４９】
特定の態様において、本発明は、脊椎動物のMTPの線虫相同体であることが見いだされている、線虫のdsc-4遺伝子およびdsc-4遺伝子産物を提供する。第7節に記載されている実験結果は、LDL様リポタンパク質の産生および酸化に関与する構造エレメントが、線虫に存在し、脊椎動物において観察されるものと同様の方法で機能的に関連していることを示す。脊椎動物と同様に、コレステロール摂取の減少はLDL様リポタンパク質の分泌を減少させること、およびROSはこれらの酸化を減少させることが観察された。この知見は、線虫生殖系列発達における酸化型のLDL様リポタンパク質の効果が、アテローム性動脈硬化症に至る脊椎動物での酸化型のLDLの生物学的な効果に類似していることを示す。
【００５０】
もう一つの特定の態様において、本明細書に記載されている遺伝子同定方法を使用して、本発明者らは、線虫遺伝子を同定し、本明細書においてdsc-3と命名した。dsc-3の突然変異は、clk-1変異体の緩徐な排便表現型を抑制する。dsc-3突然変異の効果は、dsc-4突然変異のものに対して相加的ではないことから、2つの突然変異が同じ経路で作用するか、または同じプロセスに影響を及ぼすことを示唆する。配列相同性に基づいて、dsc-3の遺伝子産物DSC-3は、IV型P型ATPaseのファミリー、特にATP感受性のアミノリン脂質輸送体のメンバーである。ヒトのdsc-3相同体のうちの1つは、肝内胆汁うっ滞（すなわち解剖学的な閉塞のない正常な胆汁流の障害）によって特徴づけられる常染色体劣性の家族性肝臓障害を被っている患者において欠損した、ヒト遺伝子ATP8B1である。ヒトのATP8B1の非存在または機能障害によって胆汁鬱帯に至る機構は、現在決定されていない。哺乳類のコレステロール・レベルは、腸管吸収、内因性合成、および胆汁の分泌の同調調節によって調節されているので、本発明の方法によるdsc-3の同定では、胆汁酸調節に対するその作用を介して、それが線虫並びに哺乳類のコレステロール恒常性に役割を果たしていることを示す。
【００５１】
種々の態様において、本発明は、脂質および／またはリポタンパク質、並びに対応する遺伝子活性のレベルと線虫の表現型との相互関係を提供する。そして、このような遺伝子の相同体の機能は、哺乳類において既知であるので、本発明は、本発明の方法によって同定される線虫遺伝子（例えばdsc-3、dsc-4およびその他）およびこれらの相同体を、優れた薬物スクリーニングのターゲット、並びに変異されるか、または脂質代謝に関連したヒト障害において調節解除される遺伝子の候補として認識することができる。このクラスの遺伝子のその他のメンバー、dsc-1、dsc-2、dsc-5、dsc-7、およびdec-7、並びに本明細書に記載されている種々の方法におけるこれらの使用も、本発明に包含される。
【００５２】
従って、本発明は、遺伝分析、突然変異生成、組換え発現、診断アッセイ法などのアッセイ法、遺伝子治療、およびトランスジェニック実験における、例示的なメンバーであるsc-3およびdsc-4を含む遺伝子のdscクラスなどの核酸の使用を含む。本発明の核酸のヌクレオチド配列およびこれらの使用の詳細は、第5.1.1節に記載されている。
【００５３】
また、本発明は、抗体生成、タンパク質工学（その他のタンパク質との融合を含む）、療法、およびび生物学的アッセイ法および薬物スクリーニングアッセイ法を含む種々のアッセイ法における、DSC-3およびDSC-4ポリペプチドなどのdsc遺伝子産物の使用を含む。本発明のポリペプチドのアミノ酸配列およびこれらの使用の詳細は、第5.1.2節に記載されている。
【００５４】
また、本発明の1つまたは複数の遺伝子の突然変異およびclk-1を含む既知の線虫遺伝子の突然変異を含む変異体線虫も包含される。特定の態様において、本発明は、dsc-4および／またはdsc-3の少なくとも１つの突然変異を含む線虫変異体、または正常レベルのdsc-4および／またはdsc-3発現が減少された線虫、またはclk-1/dsc-3およびclk-1/dsc-4二重突然変異体などの少なくとも2つの遺伝子の突然変異を含む変異体を提供する。変異体線虫を製作し使用する組成物および方法の詳細は、第5.3.1節に提供してある。
【００５５】
また、本発明は、遺伝的および生物学的な解析、並びにスクリーニングの種々の方法における、dsc-3核酸、DSC-3ポリペプチド、dsc-4核酸、DSC-4ポリペプチド、および／または上述した変異体線虫の使用を含む。薬物標的としてのdsc-3遺伝子、DSC-3ポリペプチド、dsc-4遺伝子、およびDSC-4ポリペプチドの使用は、特に提供される。関連した側面において、リポタンパク質代謝に関与するさらなる遺伝子を同定するための本発明のアッセイ法における、dsc-3変異体および／またはdsc-4変異体の使用も想定される。
【００５６】
本発明の主な目的のうちの1つは、心臓血管疾患および異脂肪血症障害を含む（しかしこれらに限定されない）代謝障害の分野に使用される化合物を選択するために方法を提供すことである。本発明は、ヒトにおけるこのような代謝障害の治療および予防に有用な薬物をスクリーニングするためのプラットフォームを特徴とする。試験線虫の1つまたは複数の特徴的な表現型と関係する望ましい生物学的結果を生じる化合物をスクリーニングするために、種々のアッセイ法が提供される。胚細胞周期、全胚発生、後胚発生、および種々の周期的挙動、たとえば、排便、咽頭ポンピング、および遊泳、並びに産卵速度および老化などの表現型を使用することができる。本質的に、試験線虫の表現型は、1つまたは複数の標的遺伝子／遺伝子産物の活性または一定の脂質および／またはリポタンパク質のレベルについての本発明のアッセイ法における生物学的読み出しとして使用される。試験化合物は、試験線虫において最初に未知の薬物標的遺伝子／遺伝子産物に対して作用してもよい。たとえば、本発明は、脊椎動物、好ましくはヒトにおいてLDL分泌のレベルおよび／またはLDL酸化を減少させる化合物をスクリーニングするための、試験線虫の生殖系列発達に基づいたアッセイ法を提供する。また、線虫の表現型は、標的遺伝子産物の活性を反映する線虫の一定の脂質代謝産物のレベルを示すことができる。また、本発明の方法は、複製解除（dereplication）並びに薬理学的研究および毒性研究など（しかし、限定されない）のその他の薬剤開発の要求のために使用してもよい。本発明の化合物をスクリーニングするアッセイ法の詳細は、第5.3.2節に提供してある。
【００５７】
関連した側面において、本発明は、脂肪酸、ステロール（たとえば、コレステロール）、および一次および二次胆汁酸塩および酸の輸送を含む、脂質輸送および／またはリポタンパク質輸送を調整することができる化合物をスクリーニングするためのアッセイ法を提供する。線虫ゲノムは、VLDLおよびLDLリポタンパク質において見いだされるapoBタンパク質に似ているいくつかのvit遺伝子を含む。ビテロゲニンは、線虫を含む種々の生物体の卵黄の主要成分である。哺乳類では、LDL様リポタンパク質の形成および脂質化は、DSC-4に相同的なミクロソーム・トリグリセリド転移タンパク質（MTP）の活性に必要である。線虫DSC-4の合成および活性の減少は、特異的な生物学的効果を生じるが、卵黄の合成には影響を及ぼさないか、またはわずかだけである。これらの結果は、小胞体（ER）においてアセンブルされるLDL様リポタンパク質が、線虫においてapoB含有リポタンパク質の小サブセットを表すことを示す。いずれの理論によっても拘束されないが、apoB含有卵黄粒子は、一部のその他生物体の大多数のリポタンパク質と同様に、細胞外で構築することができることが分かる。MTP依存的に、ERで構築されたリポタンパク質は、その他のapoB含有リポタンパク質とは異なる構造を有する可能性が高い。線虫において、さらに卵母細胞生産のための卵黄様リポタンパク質が優性に存在することから考えても、哺乳類と同様に、高密度リポタンパク質（HDL）様の粒子、超低密度リポタンパク質（VLDL）様の粒子など（しかし、限定されない）の、脂質輸送に関与する1つまたは複数のリポタンパク質を含む多様なその他の粒子が存在することが想定される。本発明のアッセイ法の標的として、これらの複合体線虫リポタンパク質粒子の使用が包含される。また、本発明のdsc遺伝子は、線虫におけるこのようなリポタンパク質粒子の合成、構築、および輸送に関与するこのような粒子または酵素の成分をコードすることができることが想定される。
【００５８】
もう一つの特定の態様において、本発明は、細胞、細胞小器官、細胞構成要素、細胞表面成分、細胞外材料、脂質、タンパク質、炭水化物、および核酸を含む（しかし、これらに限定されない）、インビボで生物学的実態の酸化状態を調整することができる化合物をスクリーニングするためのアッセイ法を提供する。このような実体の例は、LDLである。
【００５９】
関連した側面において、本発明は、線虫の形態学的、行動、および、発達の表現型が目視によって評価されないアッセイ法を提供する。これらのアッセイ法は、表現型と関係する遺伝子発現プロフィールおよび／または活性が表現型と関係する線虫プロモーターを含むリポーター遺伝子構築物の使用に基づく。もう一つの関連した側面において、本発明は、また、線虫の脂質および／またはリポタンパク質のレベルが定方向に（directed）観察され、および／または測定されるアッセイ法を提供する。上記の視覚的および非視覚的なアッセイ法は、本発明の線虫をスクリーニングし、解析するためのプラットフォームの不可欠な部分を形成する。本発明のアッセイ法のいくつか、特に非視覚的アッセイ法は、多くまたは全ての工程が自動化することができるように開発した。
【００６０】
本発明のアッセイ法によって同定される活性化合物は、薬学的、獣医学的、または農芸化学的／農薬の（たとえば殺虫性のおよび／または線虫撲滅性の）使用のためのものである。活性化合物は、脊椎動物、好ましくは伴侶動物、家畜、および被保護野生動物などの哺乳類、および最も好ましくはヒトに使用することができる。本システムのその他の態様、使用、利益は、本明細書において以下に提供されるさらなる明細書から明らかになるであろう。
【００６１】
5.1  脂質およびリポタンパク質のレベルのモジュレーター  
本発明は、脂質代謝に関与し、薬物標的として役立つことができる線虫遺伝子の同定に関する。このような遺伝子は、一般的に脂質およびリポタンパク質のモジュレーター（またはMOLL）と呼ばれ、線虫における脂質およびリポタンパク質のレベルを調整することができる遺伝子を含む。MOLL核酸および／またはポリペプチドは、i）リポタンパク質の合成／分泌、ii）胆汁酸／塩の合成、吸収、および排出；（iii）より多くの、および少ない脂質をリポタンパク質に組み入れるために、または胆汁酸／塩類に転換するために利用できるように、一般に脂質レベルを調整すること；（iv）ステロールの合成、輸送、および利用、v）LDL酸化、vi）ROS産生、および／またはvii）ROSクリアランスを含む（しかし、これらに限定されない）脂質代謝において役割を有する。脂質代謝におけるMOLLsの関与は、直接的（たとえば、リポタンパク質またはリポタンパク質複合体の成分であるポリペプチド、LDLを酸化する酵素、体内または細胞内の1つの位置から別の位置に脂質を輸送するポリペプチド、その他）、または間接的（たとえば、脂質代謝、その他に直接関与するポリペプチドの活性レベルに変化を生じさせるポリペプチド）であることができる。従って、多くの異なる脂質、リポタンパク質、およびこれらの代謝産物のレベルが、本発明の試験線虫および遺伝子のモデルにおいて調整されると思われる。Watts and Browse, 2002, PNAS 99:5854-5859, Watts et al., 2003, Genetics 163:581-589, Lesa et al., 2003, J. Cell Sci. 116:4965-4975, Kniazeva et al., 2003, Genetics 163:159-169を参照されたい。このような脂質の例は、C-12脂肪酸（たとえば、ラウリン酸）、C-14脂肪酸（たとえば、ミリスチン酸）、C-16脂肪酸（たとえば、パルミチン酸）、C-18脂肪酸（たとえば、ステアリン酸）、C-20脂肪酸（たとえば、アラキドン酸）およびC-22脂肪酸（たとえば、セルボン酸）；電子伝達に関与するユビキノンおよび関連した脂質；ステロール（たとえば、コレステロール）、オキシステロール（たとえば、22（R）-ヒドロキシル・コレステロール）、フィトステロール（たとえば、カンペステロール、シトステロール、スチガステロール（stigasterol））；並びにラノステロールから始まるコレステロールコレステロール生合成の中間体および一次および二次胆汁酸／塩類を介したコレステロール、7-ヒドロキシコレステロールの利用の中間体を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
MOLLsの例は、dsc-1、dsc-2、dsc-3、dsc-4、dsc-5、dsc-7、またはdec-7を含む。好ましい態様において、本発明は、例示的なMOLL核酸としてのdsc-3およびdsc-4を提供する。
【００６３】
変異体MOLLsは、本発明の標的スクリーニングにおいて、天然のLDLまたはROSの望ましくないレベルによって生じる線虫のclk-1変異体表現型（たとえば、排便サイクル長、期外発生の生殖系列発達、速度の未発達の、または後胚発生）の抑制因子として同定することができる。一つの態様において、変異体MOLLsは、線虫並びにその他の種（たとえば、ヒト）の野生型MOLL相同体を単離するために使用することができる。もう一つの態様において、変異体MOLLsは、線虫に導入することができ、さらなるMOLLsを同定するためのさらなる標的スクリーニングに使用することができる（変異体clk-1の代わりに）、または薬物において、スクリーニングすることは本発明の薬剤を同定するためにアッセイする。一部の態様において、1つの変異体MOLLを有する線虫は、本発明のさらなる標的または薬剤をスクリーニングするために使用される。その他の態様において、複数の変異体MOLLを有する線虫は、本発明のさらなる標的または薬剤をスクリーニングするために使用される。
【００６４】
5.1.1  MOLL核酸  
本発明は、MOLL核酸（それぞれSEQ ID NO：1および7に記載されたdsc-4,dsc-3核酸など）を含む。本発明者らは、原理の証明として、MOLLsを同定するために本発明のスクリーニング行い、MOLLの第1の例としてdsc-4を同定した。本発明のスクリーニング法において同定した全ての変異体MOLL核酸、並びにこれらの野生型対応物は、本発明の核酸である。加えて、本発明の核酸は、また、本発明のMOLLヌクレオチド配列の変種（任意の断片、相同体、天然に存在する対立遺伝子、またはこれらの変異体を含むが、これらに限定されない）を含むことはいうまでもない。また、本発明の核酸は、ストリンジェントな条件下でMOLL核酸にハイブリダイゼーションすることができる核酸を含む。また、本発明の核酸は、MOLL核酸と同じポリペプチドをコードすることができる核酸、並びにストリンジェントな条件下でMOLL核酸と同じポリペプチドをコードすることができる核酸にハイブリダイズすることができる核酸を含む。本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの1つまたは複数の活性は、本発明の方法によって同定されるMOLL核酸によってコードされるポリペプチドの活性と比較して変化させることができる。
【００６５】
一つの態様において、本発明は、MOLLポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を提供する。また、本発明は、SEQ ID NO：2または8のアミノ酸配列またはこれらの断片などのMOLLポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。特定の態様において、核酸は、イントロン配列、または線虫ゲノムのSEQ ID NO：1または7に記載したヌクレオチド配列に隣接するゲノム配列、または線虫ゲノムの個々のエキソンに対応するSEQ ID NO：1または7の後に隣接するゲノム配列を含まない。もう一つの特定の態様において、yk357a6、K02D7、H06H21、またはY17G9と命名された核酸クローンの核酸は、本発明に包含されない。
【００６６】
もう一つの態様において、MOLLヌクレオチド配列（たとえば、SEQ ID NO：1、または7）またはこれらの変種と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%同一である核酸は、本発明に包含される。2つの核酸配列のパーセント一致性を決定するために、配列を最適な比較効果となるように整列させる（たとえば、第二のまたは核酸配列との最適な配列のために、第1の核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第1の配列の位置が第2の配列の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められるときには、分子は、その位置で同一である。2つの配列間のパーセント一致性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、%一致性=同一の重複する位置の数／位置の総数×100%）。一つの態様において、2つの配列は、同じ長さである。
【００６７】
また、2つの配列間のパーセント一致性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。2つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定の例は、Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul, 1993, PNAS 90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み入れられる。BLASTヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得るために、たとえばスコア=100、wordlength=12にセットしたNBLASTヌクレオチド・プログラム・パラメータで行うことができる。比較のためにギャップを作った配列を得るためには、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるように、Gapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI BLASTを使用して、分子の距離関係を検出する繰り返された検索を行うことができる（同上）。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI Blastプログラムを利用するときに、それぞれのプログラムの（たとえば、NBLASTの）デフォルト・パラメータを使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムのもう一つの好ましい非限定の例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列配列ソフトウェア・パッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのALIGNプログラムを利用するときに、PAM120重量残基表（weight residue table）、12のギャップ・レングス・ペナルティ（gap length penalty）、および4のギャップ・ペナルティ（gap penalty）を使用することができる。
【００６８】
2つの配列間のパーセント一致性は、ギャップを可能にし、またはせずに、上記したものと同様の技術を使用して決定することができる。パーセント一致性を算出する際に、典型的に、完全一致だけが計数される。好ましくは、配列比較は、核酸配列、通常核酸プローブ配列の少なくとも1つの全長に沿って行われる。
【００６９】
もう一つの態様において、MOLL核酸の断片またはこれらの変種は、本発明によって包含される。本発明は、本発明の方法によって同定されたMOLLヌクレオチド配列（たとえば、SEQ ID NO：1または7）またはこれらの変種もしくは相補物の少なくとも100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、または4100隣接するヌクレオチドの断片を含む核酸分子を特徴とする。好ましい態様において、断片は、少なくとも一部のオープンリーディングフレームまたはコード配列を含む。もう一つの態様において、断片は、本発明のMOLLポリペプチドの1つまたは複数のエキソンおよび／またはドメイン（たとえば、機能的ドメイン）をコードする。
【００７０】
あまり好ましくない態様において、本発明のMOLL核酸は、MOLL核酸またはその断片を含み、かつ総ゲノムDNAまたは染色体特異的ゲノムDNAのクローニングによって作製されるゲノムDNAライブラリーに由来する、ゲノムDNAの単離されたクローンまたは断片を含まない。
【００７１】
特定の態様において、MOLLは、dsc-4、dsc-4のapoB結合ドメイン、PDI結合ドメイン、または脂質結合ドメインの1つまたは複数をコードする核酸断片である（たとえば、図3Cおよび4を参照）。
【００７２】
もう一つの特定実施例において、MOLLは、dsc-3、Harris et al. （2003, Biochem Biophys Acta 1633:127-131それは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）の図1で定義される8つの保存されたドメインと共に整列される1つまたは複数のドメイン、または膜貫通領域のうちの1つをコードする核酸断片である。（図11）。また、核酸断片は、大きな細胞質ループのリン酸化ドメイン、ATP結合ドメイン、ATP加水分解ドメイン、および／またはATP結合部位を基質転位置のための膜貫通領域の保存された残基に接続するヒンジ・ドメインなどの、DSC-3の機能的ドメインの1つまたは複数を含むペプチドをコードすることができる。本発明の核酸断片の例は、7節よび9節にさらに記載してある。
【００７３】
当業者であれば、コードされるアミノ酸配列に変化を生じさせるであろう、または生じさせないであろう核酸配列多型が、集団（たとえば、ヒト集団）内に存在するであろうことを認識する。このような遺伝子多型は、天然の対立形質のバリエーションにより、集団内の個体間に存在するであろう。対立遺伝子は、所与の遺伝子座にオルターナティブに生じる一群の遺伝子のうちの1つである。本明細書に使用されるものとして、「対立遺伝子変異体」の句は、所与の場所に存在するヌクレオチド配列を、またはヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをいう。本明細書に使用されるものとして、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（たとえば、天然のタンパク質をコードする）RNAまたはDNA分子をいう。天然に存在する対立形質のバリエーションは、典型的には、所与の遺伝子のヌクレオチド配列にの1〜5%の相違を生じ得る。通常、天然に存在するバリエーションは、コードされるポリペプチドの機能的活性を変更しないか、または実質的に変更しない。オルターナティブな対立遺伝子は、多くの異なる個体で関心対象の遺伝子をシーケンスすることによって同定することができる。これは、種々の個体の同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーション・プローブを使用することによって容易に行うことができる。このようなヌクレオチド・バリエーションおよび生じるアミノ酸の多型、または天然の対立形質のバリエーションの結果生じるバリエーションのいずれかおよび全てが、本発明の範囲内であることが企図される。一つの態様において、特定の障害と関係する多型は、前記障害を診断するためのマーカーとして使用される。
【００７４】
さらに、線虫および線虫タンパク質のものとは異なる（たとえば、ヒト）ヌクレオチド配列を有するその他の種（相同体）に由来する本発明のタンパク質をコードする核酸分子は、本発明の範囲内であることが企図される。本発明の核酸の天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技法に従って、ハイブリダイゼーションプローブとして、線虫もしくはヒト核酸、またはこれらの一部を使用して、線虫またはヒト核酸分子に対するこれらの一致性に基づいて単離することができる。
【００７５】
従って、もう1つの態様において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、または4100の長さの隣接するヌクレオチドであり、ストリンジェントな条件下で、MOLL核酸またはこれらの相補物のヌクレオチド配列を含む核酸分子（好ましくはコード配列）に対してハイブリダイズする。
【００７６】
本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者であれば、タンパク質の生物活性を変更し、または変更することなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じさせるであろう、または生じさせないであろう、本発明の核酸のヌクレオチド配列への突然変異によって変化を導入することができることをさらに認識する。また、このような変異体核酸も本発明に包含される。
【００７７】
従って、もう1つの態様において、本発明は、少なくとも１つの活性にる必須なアミノ酸残基に変化を含む本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に属する。このようなポリペプチドは、MOLL核酸によってコードされるポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。
【００７８】
本発明のもう一つの態様は、MOLLポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、75%、85%、95%、または98%同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子に属する。本明細書に使用されるものとして、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」の用語は、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%が互いに同一のヌクレオチド配列が、典型的にはハイブリダイズしたままの状態にあるハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載することが企図される。このようなストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、たとえば、Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3において見出される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定の例は、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中で約45℃でのハイブリダイゼーション、続く0.2×SSC、0.1%のSDS中で50〜65℃での1回または複数回の洗浄である。6×SSC中で約45℃でのフィルター結合DNAに対するハイブリダイゼーション、続く0.1×SSC／0.2%のSDS中で約60℃での1回または複数回の洗浄などという、高度にストリンジェントな条件を本発明に使用することもできる。
【００７９】
一つの態様において、MOLL核酸は、MOLL遺伝子の発現レベルをモニターするためのプローブとして使用することができる。特定の実施態様において、MOLL核酸発現は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDLを含むが、これに限定されず）、および／またはROSが関与する障害を診断するために使用される。もう一つの特定の態様において、MOLL核酸発現は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDL含むが、これに限定されず）、および／またはROSに関与する障害の治療（MOLLに基づいた、または非MOLLに基づいた治療）の有効性をモニターするために使用される。もう一つの特定の態様において、MOLL核酸の発現は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDL含むが、これに限定されず）、および／またはROSに関与する障害にかかりやすい、または罹患する可能性が高い個体を予測するために使用される。
【００８０】
もう一つの態様において、MOLL核酸は、MOLLポリペプチドを組換えで発現するために使用することができる。これらの全長MOLLまたはいずれかの部分またはドメインを発現させて、必要に応じて、従来の技術によって精製することができる。加えて、融合タンパク質は、MOLL核酸が異種ポリペプチドまたはこれらの部分をコードする核酸に連結された融合構築物を発現することによって作製することができる。
【００８１】
もう一つの態様において、MOLL核酸は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDL含むが、これに限定されず）、および／またはROSに関与する障害の治療方法に使用する本発明の薬剤である。たとえば、MOLL核酸は、MOLL発現を増大するために（すなわち、遺伝子治療）、またはインビボでMOLL発現を減少させるために（すなわち、MOLLアンチセンス）使用することができる。
【００８２】
5.1.2  MOLL・ポリペプチド  
本発明は、DSC-4およびDSC-3（そのアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：8に記載されている）などのMOLLポリペプチドを含む。変異体MOLLポリペプチドを本発明のスクリーニング法で同定し、並びにこれらの野生型対応物は、本発明のポリペプチドである。加えて、加えて、本発明のポリペプチドは、また、本発明のMOLLポリペプチドの変種（任意の断片、相同体、天然に存在する対立遺伝子、またはこれらの変異体を含むが、これらに限定されない）を含むことはいうまでもない。また、本発明のポリペプチドは、第5.1.1節に記載されているいずれの核酸によってコードされるポリペプチドも含む。
【００８３】
本明細書に使用されるものとして、「誘導体」の用語は、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加の導入によって変化された本発明のMOLLポリペプチド（たとえば、dsc-4）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをいう。誘導体ポリペプチドは、すなわちポリペプチドに対する分子の任意のタイプの共有結合によって修飾された残基を有してもよく、または有していなくてもよい。たとえば（しかし、限定するためにではなく）、本発明の誘導体ポリペプチドは、たとえばグリコシル化、アセチル化、ペグ化（pegylation）、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性の切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質に対する結合などによって修飾されてもよい。本発明のポリペプチドの誘導体は、特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む（しかし、これらに限定されない）当業者に既知の技術を使用して化学修飾によって修飾してもよい。さらにまた、本発明のポリペプチドの誘導体は、1つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含んでいてもよい。
【００８４】
一つの態様において、ポリペプチド誘導体は、機能的に活性な誘導体であり、少なくとも１つの、好ましくはより多くの、以下などの本発明のMOLLポリペプチドと同様の、または同一の機能を有する：野生型MOLLポリペプチドに対して生じる抗体に対して結合すること、LDLレベルを変更すること、酸化型のLDLレベルを変更すること、ROSレベルを変更すること、コレステロール・レベルを変更すること、線虫の排便サイクル長を変更すること、線虫生物体（たとえば、胚発生または後胚発生）またはこれらの組織の発達（たとえば、生殖系列組織の発達）の速度を変更すること。もう一つの態様において、本発明のポリペプチドの誘導体は、変更のないポリペプチドと比較したときに、前述の機能の1つまたは複数が増大され、または減少された活性を有する。その他の変更される活性は、タンパク質分解に対する抵抗性または細胞膜を横切る能力の増大を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
一つの態様において、本発明のスクリーニング法によって同定されたMOLLポリペプチドと少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%同一であるポリペプチドまたはこれらの変種も本発明に包含される。類似性（またはパーセント一致性）の程度は、第5.1.1節に開示した方法によって算出することができる（NBLASTは、BLASTアミノ酸検索に使用されないという警告によって、むしろXBLASTを、たとえばプログラム・パラメーターをスコア-50、wordlength=3にセットして使用する）。特定の態様において、DSC-4の変種は、図11に示したとおりの共通配列（SEQ ID NO：13）を含み、コンセンサス残基が存在しないアミノ酸残基の位置については、前記位置は、図11に示した整列させたヒトまたは線虫の配列のいずれの残基位置にも整列されたことが見いだされるアミノ酸残基のうちの1つからなる。ある種の実施形態において、DSC-4の変種は、図11に示したとおりの共通配列（SEQ ID NO：13）を含み、コンセンサス残基が存在しないアミノ酸残基位置については、その位置は、変種DSC-4配列が図11に示した整列されたヒト配列を含まないことを条件として、図11に示した整列させたヒトまたは線虫配列のいずれの残基位置にも整列されたことが見いだされるアミノ酸残基のうちの1つからなる。
【００８６】
もう一つの態様において、本発明のMOLLポリペプチドまたはこれらの変種の断片は、本発明に含まれる。本発明は、MOLLポリペプチドまたはこれらの変種のアミノ酸配列の少なくとも5、10、15、20、25、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、または1400の連続したアミノ酸残基の断片を含むポリペプチドを特徴とする。本発明のポリペプチドの断片は、免疫原性および／または抗原性であっても、またはなくてもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドの断片は、全長ポリペプチドの少なくとも１つの活性のうちのいくらかのレベルの機能を保持する。一つの態様において、断片は、本発明のMOLLポリペプチドの1つまたは複数のエキソンおよび／またはドメイン（たとえば、機能的なドメイン）を含む。特定の態様において、MOLLがdsc-4である場合、断片は、apoB結合ドメイン、PDI結合ドメイン、または脂質結合ドメインの1つまたは複数を含む（たとえば、図3Cおよび4を参照）。もう一つの態様において、MOLLがdsc-3である場合、断片は、大きな細胞質ループのリン酸化ドメイン、ATP結合ドメイン、ATP加水分解ドメイン、および／またはATP結合部位を基質転位置のための膜貫通領域の保存された残基に接続するヒンジ・ドメインなどの1つまたは複数の機能的ドメインを含む。
【００８７】
従って、もう1つの態様において、本発明の単離されたポリペプチドは、少なくとも25の、50、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、または1400の長さの隣接するアミノ酸であり、本発明のこのようなポリペプチドをコードする核酸は、本発明の方法によって単離されたMOLLポリペプチドまたはこれらの変種をコードする核酸に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００８８】
本発明のポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者であれば、タンパク質の生物活性を変更し、または変更することなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じさせるであろう、または生じさせないであろう、本発明の核酸のヌクレオチド配列への突然変異によって変化を導入することができることをさらに認識する。また、このような変異体核酸も本発明に包含される
従って、もう1つの態様において、本発明は、少なくとも１つの活性に必須であってもよく、またはなくてもよいアミノ酸残基に変化を含むポリペプチドに属する。このようなポリペプチドは、MOLLポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるが、そのMOLLポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持する。
【００８９】
本発明のもう一つの側面は、本発明のスクリーニング法によって同定されたMOLLポリペプチドのいずれか1つと免疫特異的に結合する抗体によって、免疫特異的に結合するポリペプチドに属する。
【００９０】
一つの態様において、MOLLポリペプチドは、MOLL抗体、好ましくはモノクローナル抗体を作製するために使用することができる。MOLL抗体は、MOLL遺伝子産物（またはポリペプチド）の発現レベルをモニターするためのプローブとして使用することができる。特定の態様において、MOLLポリペプチド発現は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDLを含むが、これに限定されない）、および／またはROSに関与する障害を診断するために使用される。もう一つの特定実施例において、MOLLポリペプチド発現は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDLを含むが、これに限定されない）、および／またはROSに関与する障害の治療（MOLLに基づいた、またはMOLLに基づいていない治療）の有効性をモニターするために使用される。もう一つの特定実施例において、MOLLポリペプチド発現は、望ましくないレベルの脂質、胆汁酸塩／酸、リポタンパク質（LDL含むが、これに限定されず）、および／またはROSに関与する障害に係りやすい、または罹患する可能性が高い個体を予測するために使用される。
【００９１】
もう一つの態様において、MOLLポリペプチドは、望ましくないレベルのLDLおよび／またはROSまたは異常な脂質または胆汁代謝に関与する障害の治療方法に使用される本発明の薬剤である。たとえば、MOLLポリペプチドは、インビボでMOLLレベルを増大するために個体に投与することができる。
【００９２】
もう一つの態様において、MOLLポリペプチドは、MOLLポリペプチドと結合する本発明の薬剤を同定するための、薬物スクリーニングアッセイ法に使用することができる。
【００９３】
5.1.2.1  抗体  
本発明は、本発明のMOLLポリペプチド（たとえば、DSC-3、またはDSC-4）と免疫特異的に結合する抗体、またはこれらの断片を含む。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であることができる。「免疫特異的に」の用語は、本明細書において使用されるものとして、本発明の抗体が、その他の非MOLLポリペプチドとの交差反応性を伴わずにMOLLポリペプチドに結合する能力をいう。
【００９４】
一つの態様において、本発明は、ヒト、非ヒト、もしくはヒト化抗体、またはこれらの断片を含む、実質的に精製された抗体またはこれらの断片の使用であって、該抗体または断片は、免疫特異的にSEQ ID NO：2または8のアミノ酸配列およびSEQ ID NO：1または7からなるポリヌクレオチドによってコードされるおよびアミノ酸配列を含む本発明のポリペプチド；またはSEQ ID NO：2または8のアミノ酸配列の少なくとも8つの隣接するアミノ酸残基の断片に結合する使用を提供する。非ヒト抗体は、ヤギ、マウス、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウサギ、またはラット抗体であることができる。
【００９５】
その他の態様において、本発明は、ヒト、非ヒト、もしくはヒト化抗体、またはこれらの断片を含む、実質的に精製した抗体またはこれらの断片であって、該抗体または断片は、以下を含む本発明のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体またはこれらの断片を提供する：i）SEQ ID NO：2または8のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体であって、該ポリペプチドは、SEQ ID NO：1または7のヌクレオチド配列からなるMOLL核酸またはこれらの相補物とストリンジェント条件下でハイブリダイズするMOLL核酸によってコードされる変異体；ii）SEQ ID NO：1または7からなる核酸と少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含むMOLL核酸またはこれらの相補物によってコードされるポリペプチド；およびiii）SEQ ID NO：2または8のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるポリペプチド。非ヒト抗体は、ヤギ、マウス、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ウサギ、またはラット抗体であることができる。本発明の抗体は、本発明の方法に使用することができる。
【００９６】
特定の態様において、本発明の抗体は、本発明のMOLLポリペプチドのエキソンまたはドメイン（たとえば、機能的ドメイン）に結合し、内因性の結合パートナーに対するポリペプチドの結合を防げ、またはポリペプチドの分解を生じさせる。より特異的な態様において、MOLLがDSC-4である場合、ドメインは、apoB結合ドメイン、PDI結合ドメイン、または脂質結合ドメインである（たとえば、図3Cを参照）。もう一つの特定実施例において、MOLLがDSC-3である場合、ドメインは、その膜貫通領域の1つまたは複数を含むことができる（図11を参照）。
【００９７】
種々の態様において、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドと免疫特異的に結合するいずれかの抗体と同じエピトープに結合するか、またはたとえばELISAまたは何らかのその他の適切な免疫アッセイによってアッセイすると、本発明のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体と競合する。本明細書に使用されるものとして、「エピトープ」の用語は、動物において、好ましくは哺乳類において、および最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性の活性を有する本発明の一部のポリペプチドをいう。免疫原性の活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を誘発する本発明の一部のポリペプチドである。抗原性の活性を有するエピトープは、当該技術分野において周知の何らかの方法によって、たとえば免疫アッセイ法によって決定すると、ポリペプチドに対する抗体が免疫特異的に結合する本発明の一部のポリペプチドである。抗原エピトープは、免疫原性であることに必ずしも必要であるというわけではない。エピトープは、ポリペプチドに対して翻訳後修飾された、たとえばグリコシル化およびリン酸化された残基を含むことができる。
【００９８】
本明細書に使用されるものとして、「本発明のポリペプチドと免疫特異的に結合する抗体またはこれらの断片」の用語は、本発明のMOLLポリペプチド（たとえば、DSC-3またはDSC-4）に対して特異的に結合し、かつその他のポリペプチドと特異的に結合しない抗体またはこれらの断片をいう。好ましくは、本発明のポリペプチドまたはこれらの断片と免疫特異的に結合する抗体または断片は、その他の抗原と交差反応しない。免疫特異的に本発明のポリペプチドと結合する抗体または断片は、たとえば、当業者に既知の免疫アッセイまたはその他の技術によって同定することができる。本発明の抗体は、合成の抗体、モノクローナル抗体、組換えで産生された抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Fvs（sFv）、単鎖抗体、内体、Fab断片、F（ab'）断片、ジスルフィド結合されたFvs（sdFv）、および抗イディオタイプ（抗Id）抗体）、並びに上記のいずれかのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない。特に、本発明の抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち本発明のポリペプチドの抗原（たとえば、抗体の1つまたは複数の相補性決定領域（CDR））と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含む。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（たとえば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（たとえば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）またはサブクラスのものであることもできる。
【００９９】
種々の態様において、本発明の抗体またはこれらの断片は、キメラおよび／またはヒト化抗体であることができる。本発明の方法に使用される抗体は、トリおよび哺乳類（たとえば、ヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含むいずれの動物起源であってもよい。好ましくは、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。本明細書に使用されるものとして、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリン・ライブラリーから、またはヒト遺伝子からの抗体を発現するマウスから単離された抗体を含む。
【０１００】
本発明の方法に使用される抗体は、一特異的、二特異的（bispecific）、三特異的（trispecific）、またはより多特異的であってもよい。多特異的抗体は、本発明のMOLLポリペプチドの異なるエピトープと免疫特異的に結合してもよく、または本発明のMOLLポリペプチドと同様に、SegalによってU.S. Patent NOs. 4,676,980号に記載されているように異種ポリペプチドなどの異種のエピトープに免疫特異的に結合してもよい。たとえば、国際公開番号WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、およびWO 92/05793；Tutt、et al., 1991、J.Immunol.147：60-69；U.S. Patent NOs. 4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、および5,601,819；並びにKostelny et al., 1992、J. Immunol.148：1547-1553を参照されたい。
【０１０１】
本発明の方法に使用される抗体は、すなわち抗体に対する分子の任意のタイプの共有結合によって共有結合するように修飾された誘導体を含む。たとえば（しかし、限定するためにではなく）、本発明の抗体誘導体は、たとえばグリコシル化、アセチル化、ペグ化（pegylation）、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解性の切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質に対する結合などによって修飾されてもよい。本発明のポリペプチドの誘導体は、特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む（しかし、これらに限定されない）当業者に既知の技術を使用して化学修飾によって修飾してもよい。さらにまた、本発明のポリペプチドの誘導体は、1つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含んでいてもよい。特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成、その他を含む（しかし、これらに限定されない）既知の技術によって、何らかの多くの化学修飾を行ってもよい。加えて、誘導体は、1つまたは複数の非古典的なアミノ酸を含んでいてもよい。
【０１０２】
また、本発明は、当業者に既知のフレームワーク領域を含む、本発明の抗体またはこれらの断片を提供する。好ましくは、本発明の抗体またはこれらの断片は、ヒトでまたはヒト化されたものである。特定の態様において、本発明の抗体またはこれらの断片は、本発明のMOLLポリペプチドに免疫特異的に結合するいずれかの抗体に由来する1つまたは複数のCDRを含む。より特異的な態様において、本発明の抗体またはこれらの断片は、本発明のMOLLポリペプチドを免疫特異的に認識するいずれかの抗体に由来する1つまたは複数のCDRを含む。
【０１０３】
本発明は、カメライズされた（camelized）単一ドメインの抗体を含む、単一ドメインの抗体を含む（たとえば、Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth.  231:25; International Publication Nos. WO 94/04678 and WO 94/25591; U.S. Patent No. 6,005,079を参照されたい）。一つの態様において、本発明は、単一ドメインの抗体が形成されて、本発明のMOLLポリペプチドに免疫特異的に結合するいずれかの抗体に由来するVHドメインのいずれかのアミノ酸配列を有するように、修飾を有する2つのVHドメインを含む単一ドメインの抗体を提供する。もう一つの態様において、本発明は、また、本発明のMOLLポリペプチドに免疫特異的に結合するいずれかの抗体に由来するVH CDRの1つまたは複数を含む2つのVHドメインを含む単一ドメインの抗体を提供する。
【０１０４】
また、本発明の方法は、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、15日を超える、好ましくは20日を超える、25日を超える、30日を超える、35日を超える、40日を超える、45日を超える、2月を超える、3月を超える、4月を超える、または5月を超える半減期（例えば血清半減期）を有する抗体またはこれらの断片の使用を包含する。哺乳類、好ましくはヒトにおいて、本発明の抗体またはこれらの断片の半減期が増大されると、哺乳類においてより高い血清力価の前記抗体または抗体断片を生じ、したがって前記抗体または抗体断片の投与の頻度を減少させ、および／または投与される前記抗体または抗体断片の濃度を減少させる。インビボ半減期が増大された抗体またはこれらの断片は、当業者に既知の技術によって作製されることができる。たとえば、インビボ半減期が増大された抗体またはこれらの断片は、FcドメインとFcRn受容体の間の相互作用に関与することが同定されるアミノ酸残基を修飾する（たとえば、置換する、欠失させる、または付加する）ことによって作製することができる（たとえば、国際公開番号WO 97/34631を参照されたい）。インビボ半減期が増大された抗体またはこれらの断片は、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）などの重合体分子を前記抗体または抗体断片に付着することによって作製することができる。PEGは、前記抗体または抗体断片のNまたはC末端に対するPEGの部位特異的な結合を介して、またはリジン残基に存在するε-アミノ基を経て、いずれかによって多機能性のリンカーと共に、または伴わずに、前記抗体または抗体断片に付着させることができる。生物活性の減少を最小減にする、直鎖状または分枝の重合体の誘導体化が使用される。抱合の程度は、抗体に対するPEG分子の適当な抱合を確実にするために、SDS-PAGEおよび質量分析によって詳細にモニターされる。反応していないPEGは、たとえば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって抗体-PEG抱合体から分離することができる。
【０１０５】
また、本発明は、フレームワークまたは可変領域に突然変異（たとえば、1つまたは複数のアミノ酸置換）を有する本発明のMOLLポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体のアミノ酸配列を含む抗体または抗体断片の使用を含む。好ましくは、これらの抗体の突然変異は、これらが免疫特異的に結合する特定の抗原に対する抗体の結合活性および／または親和性を維持し、または増強する。当業者に既知の標準的な技術（たとえば、免疫アッセイ法）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１０６】
たとえば、部位特異的変異誘発およびPCRを媒介した突然変異生成を含む当業者に既知の標準的な技術を使用して、抗体またはこれらの断片をコードするヌクレオチド配列にアミノ酸置換を生じる突然変異を導入することができる。好ましくは、誘導体は、本来の抗体またはこれらの断片と比較して、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、または2つ未満のアミノ酸置換を含む。好ましい態様において、誘導体は、予測される非必須アミノ酸残基の1つまたは複数に作製された保存的アミノ酸置換を有する。
【０１０７】
本発明の抗体またはこれらの断片は、抗体の合成のための当該技術分野において既知の何らかの方法によって、特に化学合成によって、または好ましくは組換え発現技術によって作製することができる。
【０１０８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え技術、およびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組み合わせを含む、当該技術分野において既知の多種多様な技術を使用して調製することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知のものを含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができ、たとえばHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988）; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 （Elsevier, N.Y., 1981）に教示される。「モノクローナル抗体」の用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体をいい、これが産生される方法（たとえば、ハイブリドーマ技術）ではない。また、本発明の方法は、発明の抗体をコードするポリヌクレオチドをコードするか、またはこれに高いストリンジェンシー、中間またはより低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【０１０９】
一旦抗体のヌクレオチド配列が決定されれば、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当該技術分野において周知の方法、たとえば組換えDNA技術、部位定方向突然変異生成、PCR、その他（たとえば、Sambrook et al., supra and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術を参照されたい）を使用して操作して、たとえばアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を作製して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作成する。ポリヌクレオチドに対するその他の変化は、本発明によって包含され、当該技術分野における技術の範囲内である。
【０１１０】
5.1.2.1.1  内体  
ある種の形態において、本発明のMOLLポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。従って、抗体が細胞内に抗原（すなわち、内体（intrabody））を結合するために有利であろう。内体は、少なくとも、抗原に免疫特異的に結合することができる一部の抗体を含み、その分泌のためにコードする配列を好ましくは含まない。このような内体は、これが結合する本発明のポリペプチドの活性を調整するために使用することができる。一つの態様において、拮抗する内体は、本発明のポリペプチドの活性を減少させるために投与される。もう一つの態様において、作用薬の内体は、本発明のポリペプチドの活性を増大するために投与される。もう一つの態様において、本発明の内体は、これが特定の細胞小器官コンパートメントに局在化されて、したがってその位置においてのみ本発明のポリペプチドを調整するように、投与される。
【０１１１】
一つの態様において、内体は、単鎖Fv（「sFv」）を含む。sFvsは、抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体断片であって、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、sFvポリペプチドは、VHとVLドメインの間にポリペプチド・リンカーをさらに含み、これによりsFvが抗原結合のための所望の構造を形成することができる。sFvsの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.  113, Rosenburg and Moore eds.  Springer-Verlag, New York, pp.  269-315 （1994）.を参照されたい。
【０１１２】
さらなる態様において、内体は、好ましくは動作可能な分泌性の配列をコードせず、したがって細胞内に残る（一般的にはMarasco, WA, 1998, “Intrabodies: Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications” Springer:New Yorkを参照されたい）。
【０１１３】
内体の生成は、当業者に周知であり、たとえばU.S. Patent NOs. 6,004,940；6,072,036；5,965,371に記載されている。さらに、内体の構築は、Ohage and Steipe, 1999, J. Mol. Biol. 291:1119-1128; Ohage et al., 1999, J. Mol. Biol. 291:1129-1134; およびWirtz and Steipe, 1999, Protein Science 8:2245-2250において論議されている。また、組換え抗体の作製（たとえば、5.1.2.1節および5.2節）のために記載されているものなどの組換え分子生物学的の技術は、内体の作製に使用してもよい。
【０１１４】
一つの態様において、組換えで発現された内体タンパク質は、患者に投与される。このような内体ポリペプチドは、予防的または治療的効果を媒介するように細胞内になければならない。本発明のこの態様において、内体ポリペプチドは、「膜透過性配列」と結合される。膜透過性配列は、細胞の外側から細胞の内部に細胞膜を通って透過することができるポリペプチドである。また、もう一つのポリペプチドに連結されたときに、膜透過性配列は、同様に細胞膜を横切ってそのポリペプチドの転位置を誘導することができる。膜透過性配列の例は、シグナルペプチドの疎水性部分である（たとえば、Hawiger, 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:89-94; Hawiger, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:189-94; U.S. Patent Nos. 5,807,746 and 6,043,339, von Heijne, 1987, Prot. Seq. Data Anal. 1:41-2; von Heijne and Abrahmsen, 1989, FEBS Lett. 224:439-46を参照されたい。
【０１１５】
もう一つの態様において、内体をコードするポリヌクレオチドは、（たとえば、遺伝子治療として）患者に投与される。本態様において、第5.6.2節に記載したとおりの本方法を、内体ポリヌクレオチドを投与するために使用することができる。
【０１１６】
5.2  組み換え発現  
本発明のもう一つの側面は、本発明の核酸またはこれらの変種を含むベクター、好ましくは発現ベクターに属する。本明細書に使用されるものとして、「ベクター」の用語は、これが連結されたもう一つの核酸を輸送することができるポリヌクレオチドをいう。ベクターの1つのタイプは、「プラスミド」であり、これはさらなるDNAセグメントを導入することができる環状の二本鎖DNAループをいう。ベクターのもう一つのタイプは、ウィルス・ベクターであって、さらなるDNAセグメントをウィルスゲノムに導入することができる。
【０１１７】
一定のベクターは、これらが導入された宿主細胞中で自律的に増殖できる（たとえば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。その他のベクター（たとえば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞内に導入することによって宿主細胞のゲノムに組み込まれて、これにより宿主ゲノムとともに複製される。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態であることが多い。しかし、本発明は、ウィルス・ベクター（たとえば、複製欠損があるレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのようなその他の形態を含むことが企図される。
【０１１８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内に核酸の発現のために適した形態で本発明の核酸を含む。これは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現されるポリヌクレオチドと動作可能に結合されている1つまたは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターの中で、「動作可能に結合される」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列を発現できる方法で制御配列に連結されている（たとえば、インビトロでの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入される宿主細胞において）ことを意味することが企図される。「制御配列」の用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現調節エレメント（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが企図される。このような制御配列は、たとえばGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, （1990） Academic Press, San Diego, CA, p. 185に記載されている。制御配列は、宿主細胞の多くのタイプでヌクレオチド配列の発現を構成的に誘導するもの、および一定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（たとえば、組織特異的な制御配列）を含む。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、要求されるタンパク質の発現レベル、その他などの因子に依存するであろうことが当業者には認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載したとおりの核酸によって、融合タンパク質またはペプチドを含むコードされるタンパク質またはペプチドを産生させることができる。
【０１１９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物（たとえば、大腸菌）、または真核生物の細胞（たとえば、昆虫細胞を使用するバキュロウイルス発現ベクター、酵母細胞、線虫細胞、または哺乳動物細胞）で本発明のMOLLポリペプチドを発現するようにデザインすることができる。適切な宿主細胞は、上記Goeddelにおいてさらに論議されている。あるいは、組換え発現ベクターは、たとえばT7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写し、翻訳することができる。
【０１２０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合、融合または非融合タンパク質の発現を誘導する構成的または誘導性のプロモーターを含むベクターを有する大腸菌において行われる。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質に対して、通常組換えタンパク質のアミノ末端に対して、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、典型的には少なくとも3つの目的を果たす：1）組換えタンパク質の発現を増大すること；2）組換えタンパク質の溶解度を増大すること；および／または3）アフィニティー精製において、リガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。たいてい、融合発現ベクターには、タンパク分解性の切断部位が融合部分と組換えタンパク質の結合部に導入されており、融合部分から組換えタンパク質を分離してその後の融合タンパク質の精製することができる。このような酵素、およびこれらの同族の認識配列は、第Xａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、pGEXを含む（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）、およびpRIT5（Pharmacia、Piscataway、NJ）を含み、これらは、標的組換えタンパク質対してそれぞれグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを融合する。
【０１２１】
適切な誘導性の非融合大腸菌の発現ベクターの例は、pTrc（Amann et al., 1988, Gene 69:301-315）およびpET 11d（Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California （1990） p. 60-89）を含む。pTrcベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの宿主RNAポリメラーゼの転写に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたウイルスRNAポリメラーゼ（T7 gn1）によって媒介されるT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウィルス・ポリメラーゼは、lacUV 5プロモーターの転写調節下で、T7 gn1遺伝子を収容する常在性のλプロファージからの、宿主株BL21（DE3）またはHMS174（DE3）によって供給される。
【０１２２】
大腸菌における組換えタンパク質発現を最大にする1つのストラテジーは、タンパク分解性に組換えタンパク質を切断するように、障害された能力を有する宿主菌のタンパク質を発現することになっている（Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California （1990） p. 119-128）。もう一つのストラテジーは、それぞれのアミノ酸のための個体コドンが大腸菌において優先して利用したものであるために、発現ベクターに挿入される核酸の配列を変更することになっている（Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。本発明のポリヌクレオチドのこのような改変は、標準的なDNA合成技術によって行うことができる。
【０１２３】
もう一つの態様において、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S.セレビジア S.cerevisiae）の発現のためのベクターの例は、pYepSec1（Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234）、pMFa（Kurjan and Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123）、pYES2（Invitrogen Corp., San Diego, CA）およびpPicZ（Invitrogen Corp., San Diego, CA）を含む。
【０１２４】
もう一つの態様において、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（たとえば、Sf9細胞）におけるタンパク質の発現のために利用できるバキュロウイルスベクターは、pAcシリーズ（Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）、およびpVL一連（Lucklow and Summers, 1989, Virology 170:31-39）を含む。
【０１２５】
もう一つの態様において、発現ベクターは、線虫発現ベクターである。線虫における発現のためのベクターの例は、pPD49.78およびpPD49.83などの熱ショック・プロモーターを有するベクター、およびプロモーターのないベクター（その上流の制御領域を含む関心対象の遺伝子の配列は、エピフロレッセンスによって発現をモニターするための遺伝子蛍光タンパク質遺伝子と共にインフレームでクローン化されている（一般に、Mello and Fire, 1995, DNA transformation in “Methods in Cell Biology Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an organism” vol. 48, Shakes and Epstein eds., Academic Press:San Diegoを参照されたい））を含む、ファイヤー・ベクター・コレクション（Fire vector collection （http://ftp.ciwemb.edu/PNF:byName:/FireLabWeb/FireLabInfo/FireLabVectors/））から公的に利用できるベクターの全セットを含む。加えて、遺伝子発現は、そのプロモーター領域がいずれのベクターにもクローン化されてないcDNA（たとえば、PCR産物または制限酵素断片）の注射によって線虫において誘導することができる。
【０１２６】
さらにもう一つの態様において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、pCDM8（Seed, 1987, Nature 329:840-842）およびpMT2PC（Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6:187-193）を含む。哺乳動物細胞で使用したときに、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。たとえば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40に由来する。
【０１２７】
原核生物および真核生物の細胞のためのその他の適切な発現系については、chapters 16 and 17 of Sambrook et al.  1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。
【０１２８】
もう一つの態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、優先して特定の細胞型の核酸の発現を誘導することができる（たとえば、核酸を発現するために組織特異的調節エレメントが使用される）。組織特異的な調節エレメントは、当該技術分野において既知である。適切な組織特異的なプロモーターの非限定の例は、アルブミン・プロモーター（肝臓特異的；Pinkert et al., 1987, Genes Dev. 1:268-277）、リンパ系特異的なプロモーター（Calame and Eaton, 1988, Adv. Immunol. 43:235-75）、特にT細胞受容体（Winoto and Baltimore, 1989, EMBO J. 8:729-733）および免疫グロブリン（Banerji et al., 1983, Cell 33:729-740; Queen and Baltimore, 1983, Cell 33:741-748）のプロモーター、ニューロン特異的なプロモーター（たとえば、神経フィラメント・プロモーター；Byrne and Ruddle, 1989, PNAS 86:5473-5477）、膵臓特異的なプロモーター（Edlund et al., 1985, Science 230:912-916）、並びに乳腺特異的なプロモーター（たとえば、ミルク乳漿プロモーター；U.S. Patent No. 4,873,316およびEuropean Application Publication No. 264,166）を含む。また、発生的に調節されたプロモーター、例えばマウスのhoxプロモーター（Kessel and Gruss, 1990, Science 249:374-379）をおよびαフェトプロテイン・プロモーター（Campes and Tilghman, 1989, Genes Dev.  3:537-546）も包含される。
【０１２９】
本発明は、アンチセンス配向で発現ベクターにクローン化された本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターをさらに提供する。すなわち、DNA分子が、本発明のポリペプチドをコードするmRNAに対してアンチセンスであるRNA分子を発現（DNA分子の転写によって）することができる様式で、制御配列と操作可能に結合されている。操作可能にアンチセンス配向でクローン化された核酸と結合された制御配列を選択して、種々の細胞型のアンチセンスRNA分子の連続的な発現を誘導することができ、たとえばウィルス・プロモーターおよび／またはエンハンサーまたは制御配列を選択して、アンチセンスRNAの組織特異的または細胞型特異的な発現を構成的に誘導することができる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の制御領域の制御下で産生される組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒ウイルスの形態であることができ、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定することができる。
【０１３０】
もう一つの態様において、細胞、株化細胞、または微生物内における本発明の核酸に対応する内因性遺伝子の発現の特徴は、関心対象の内因性遺伝子に対して異種のDNA調節エレメントを、挿入された調節エレメントが内因性遺伝子によって有効に連結され、内因性遺伝子を制御し、調整し、または活性化するように、細胞、安定な株化細胞、またはクローン化された微生物のゲノムに挿入することによって修飾してもよい。たとえば、通常「転写的にサイレントである」本発明の内因性遺伝子、すなわち通常は発現されないか、または株化細胞または微生物において非常に低レベルでのみ発現されている遺伝子は、その株化細胞または微生物において通常発現される遺伝子産物の発現を促進することができる調節エレメントを挿入することによって活性化してもよい。あるいは、本発明の転写的にサイレントな内在性の遺伝子は、細胞型全体に作用する無差別の調節エレメントの挿入によって活性化してもよい。
【０１３１】
当業者に周知のターゲットされた相同的組換えなどの技術を用いて、異種の調節エレメントを、本発明の核酸に対応する内因性遺伝子に機能的に連結して、発現を活性化するように、安定な株化細胞またはクローン化した微生物に挿入してもよい（たとえば、U.S. Patent NOs. 5,272,071号および5,968,502国際公開番号WO 91/06667およびWO 94/12650を参照されたい）。あるいは、当該技術分野において周知の非ターゲットされた技術（たとえば、非相同的組換え）を使用することもできる（たとえば、国際公開番号WO 99/15650を参照されたい）。
【０１３２】
本発明のもう一つの側面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に属する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」の用語は、本明細書において交換可能に使用される。このような用語は、特定の被検者の細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫をもいうことが理解される。突然変異または外界の影響によって、一定の修飾が次の世代に生じてもよいので、このような子孫は、実際には親細胞と同一ではないが、本明細書に使用されるものとして、なおも本用語の範囲内に含まれる。
【０１３３】
従って、本発明は、本発明の核酸またはこれらの変種を含む発現ベクターを有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、いずれの原核生物（たとえば、大腸菌）または真核生物の細胞（たとえば、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞）であることもできる。また、本発明は、本発明の核酸を発現し、したがってコードされたポリペプチド（たとえば、DSC-3およびDSC-4などのMOLLポリペプチド）を作製するための方法であって、（a）本発明の組換え核酸を含む細胞を、前記細胞によって前記ポリペプチドを発現することができる条件下で培養することと；および発現されたポリペプチドを単離することとの工程を含む方法を提供する。
【０１３４】
ベクターDNAは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を経て原核生物または真核生物の細胞に導入することができる。本明細書に使用されるものとして、「形質転換」および「トランスフェクション」の用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストランを媒介したトランスフェクション法、リポフェクション法、または電気穿孔法を含む、外来核酸を宿主細胞に導入するための種々の当該技術分野において認識された技術をいうことが企図される。宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトするための適切な方法は、Sambrook、et al.（上記）およびその他の研究室マニュアルにおいて見いだすことができる。
【０１３５】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小数だけがそれらのゲノムに外来性DNAを組み込むであろうことが既知である。これらのインテグラント（integrant）を同定し、選択するために、通常、選択可能なマーカーをコードする（たとえば、抗生物質耐性のための）遺伝子が関心対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーは、G418、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬物に対する抵抗を与えるものを含む。導入された核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（たとえば、選択可能なマーカー遺伝子を組み入れた細胞は生存するが、その他の細胞は死滅する）。
【０１３６】
培養の原核生物または真核生物の宿主細胞などの、本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生するために使用することができる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使用して本発明のポリペプチドを産生するための方法をさらに提供する。一つの態様において、本方法は、発明の宿主細胞（その中に、本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されたもの）を、ポリペプチドが産生されるように適切な培地中で培養することを含む。もう一つの態様において、本方法は、培地または宿主細胞から本発明のポリペプチドを単離することをさらに含む。
【０１３７】
5.3  本発明のアッセイ法のための線虫の調製  
一つの態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法に使用される線虫は、少なくとも１つの突然変異を有する。突然変異は、コレステロール、LDL、および／またはROSのレベルに影響を及ぼし、その結果線虫は、望ましくないレベルのLDLおよび／またはROSと関係する1つまたは複数の表現型（たとえば、排便サイクルの長さの増減、期外発生の生殖系列発達、胚発生または後胚発生の速度の増減）を示す。突然変異は、天然に存在するものであっても、ランダムに誘導されていても、または部位定方向突然変異生成またはRNAiなどによって導入されていてもよい。
【０１３８】
一つの態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法に使用される線虫は、clk-1に突然変異を含む。野生型clk-1の配列は、たとえばGenbankアクセッション番号NM_065727、NM_009940、およびNM_06138として見いだすことができる。当該技術分野において既知の突然変異生成のいずれの方法（たとえば、下記の記載されているもの）を使用して本発明のアッセイ法に使用される変異体clk-1を作製することもできる。特定の態様において、スクリーニングに使用される線虫は、clk-1（qm30）突然変異を有する。もう一つの特定の態様において、スクリーニングに使用される線虫は、clk-1（e2519）突然変異を有する。もう一つの特定の態様において、スクリーニングに使用される線虫は、clk-1（qm51）突然変異を有する。（一般に、clk-1突然変異のためには、国際特許公開番号WO 98/17823, Felkai et al., 1999, EMBO J 18: 1783-1792, Wong et al., 1995, Genetics 139: 1247-1259, Ewbank et al., 1997, Science 275:980-983, Branicky et al., 2001, Genetics 159:997-1006を参照されえたい。もう一つの態様において、その他の種のclk-1相同体で単離された突然変異を本発明のアッセイ法に使用することもできる。対応する突然変異は、定方向突然変異生成によって線虫clk-1に作製することができる。たとえば、Marbois and Clark （1996, J. Biol. Chem. 271:2995-3004）は、coq-7（酵母clk-1の相同体）における突然変異を解説する。
【０１３９】
もう一つの態様において、本発明のスクリーニングアッセイ法に使用される線虫は、MOLLに突然変異を含む。特定の態様において、MOLLは、dsc-1、dsc-2、dsc-3、dsc-4、dsc-5、およびdsc-7からなる群より選択される。当該技術分野において既知の突然変異生成のいずれの方法（たとえば、下記の記載されているもの）を使用して本発明のアッセイ法に使用される変異体MOLLを作製することもできる。より特異的な態様において、MOLLは、dsc-4である。もう一つの特定の態様において、MOLLは、dsc-3である。dsc-4およびdsc-3の野生型配列は、それぞれSEQ ID NO：1およびSEQ ID NO：7である。さらにより特異的な態様において、スクリーニングに使用される線虫は、dsc-4（qm182）突然変異を有する。
【０１４０】
5.3.1  ターゲットの同定について  
一つの態様において、本発明は、コレステロールおよびLDLなどの脂質またはリポタンパク質、並びにROSのレベルの変化に関与する標的遺伝子を同定するための線虫の使用を含む。このような態様において、変異体clk-1または変異体MOLLを有する線虫（たとえば、dsc-3、またはdsc-4）は、望ましくないレベルのLDLおよび／またはROSと関係する1つまたは複数の表現型（たとえば、排便サイクルの長さの増減、期外発生の生殖系列発達、胚発生または後胚発生の速度の増減；第5.4.2節を参照されたい）を示すように、さらに変異誘発される。次いで、虫が、変異体表現型が少なくなること（すなわち、最初の変異体表現型よりも野生型に類似する表現型）、または変異体表現型が悪化すること（すなわち、最初の変異体表現型よりもあまり野生型に類似しない表現型）を記録する。
【０１４１】
当該技術分野において既知のいずれの方法も、本発明の標的スクリーニングアッセイ法に使用する変異体を作製するために使用することができるEMS化学的欠失突然変異生成およびTc1トランスポゾン挿入突然変異生成を含む（しかし、これらに限定されない）。突然変異生成の方法を使用して、線虫のゲノムに突然変異をランダムに作製することができる。あるいは、RNAiおよび部位定方向突然変異生成などの分子進化技術（しかし、これらに限定されない）を含む突然変異生成の方法を使用して、特定の遺伝子（たとえば、MOLLであると予想され、または予測される遺伝子）を誘導することができる。定方向突然変異生成におけるその使用に加えて、RNAi突然変異生成は、これまで未知のMOLLsを同定するために使用してもよい。線虫におけるそれぞれの遺伝子の発現は、RNAi高スループット技術（たとえば、Kamath et al., 2003, Nature 421:231-7, Ashrafi et al., 2003, Nature 421:268-72, Taschl, 2003, Nature 421:220-221、および第5.3.1.4節を参照されたい）を使用して、系統的に減少／阻害することができる。この技術は、事前に候補MOLLsを同定することなく使用することができるので、ランダム突然変異生成法、RNAiも同様に使用することができる。
【０１４２】
天然のLDLレベルを減少することによってclk-1変異体線虫をレスキューする突然変異は、2つの主なクラス−すなわち、天然のLDL合成／分泌を減少させる突然変異および天然のLDLの酸化型のLDLへの転換を促進する突然変異に分類することができる。スクリーニングにおいてclk-1抑制因子のそれぞれのカテゴリーに同定された遺伝子は、これらの正常な機能が不均一であろうが、変異させたときに、全てが天然のLDLレベルを減少する特徴を共有する。突然変異生成が、異なる方法で（たとえば、完全もしくは部分的な機能喪失、機能獲得、過剰発現、その他）遺伝子の機能に影響を及ぼすことができるという事実により、さらなる不均一性の程度が導入される。従って、遺伝子の機能は、存在する突然変異のタイプによって減少または増強のいずれを行うこともできる。
【０１４３】
変異されたときに天然のLDL合成／分泌を減少させるclk-1抑制因子として同定された遺伝子のクラスのメンバーは、変異体でないときには種々の異なる機能を有していてもよい。たとえば、これらの通常の機能が減少されるように変異されたこれらの遺伝子は、以下に関与する通常の機能を有することができる：i）LDL合成／分泌を増大すること、ii）LDL合成／分泌の増大に関与する分子の発現または活性を促進すること、iii）LDL合成／分泌の阻害に関与する分子の発現または活性を減少させること、iv）一般により多くがLDLに組み入れるために利用できるように脂質レベルを増大すること、またはv）一般に脂質レベルの増大に関与する分子の発現または活性を促進すること、またはvi）一般に脂質レベルの低下に関与する分子の発現または活性を減少させること。あるいは、これらの通常の機能が増強されるように変異されたこれらの遺伝子は、以下に含まれる通常の機能を有することができる：i）LDL合成／分泌を減少すること、ii）LDL合成／分泌の減少に関与する分子の発現または活性を促進すること、iii）LDL合成／分泌の阻害に関与する分子の発現または活性を増大すること、iv）一般により少量がLDLに組み入れるために利用できるように脂質レベルを減少すること、v）一般に脂質レベルの減少に関与する分子の発現または活性を促進すること、またはvi）一般に脂質レベルの増大に関与する分子の発現または活性を減少させること。
【０１４４】
同様に、変異されたときに、天然のLDLの酸化型のLDLへの転換を促進するclk-1抑制因子として同定される遺伝子のクラスのメンバーは、変異されていないときに種々の異なる機能を有していてもよい。たとえば、これらの通常の機能が減少するように変異されたこれらの遺伝子は、以下に含まれる通常の機能を有することができる：i）LDL酸化を減少すること、ii）LDL酸化の減少に関与する分子の発現または活性を促進すること、iii）LDL酸化の増大に関与する分子の発現または活性を減少させること、iv）ROS生産を減少すること、v）ROS生産の減少に関与する分子の発現または活性を促進すること、vi）ROS生産の増大に関与する分子の発現または活性を減少させること、vii）ROSクリアランスを増大すること、viii）ROSクリアランスの減少に関与する分子の発現または活性を減少させること、またはix）ROSクリアランスの増大に関与する分子の発現または活性を促進すること。  あるいは、これらの通常の機能が増強されるように変異されたこれらの遺伝子は、以下に関与する通常の機能を有することができる：i）LDL酸化を増大すること、ii）LDL酸化の増大に関与する分子の発現または活性を促進すること、iii）LDL酸化の減少に関与するる分子の発現または活性を減少させること、iv）ROS生産を増大すること、v）ROS生産の増大に関与する分子の発現または活性を促進すること、vi）ROS生産の減少に関与する分子の発現または活性を減少させること、vii）ROSクリアランスを減少させること、viii）ROSクリアランスの増大に関与する分子の発現または活性を減少させること、またはix）ROSクリアランスの減少に関与する分子の発現または活性を促進すること。
【０１４５】
clk-1抑制因子として同定される各々のこれらの遺伝子は、互いに非常に異なった機能を有することができるが、これらは、それぞれ天然のLDLレベルに機能的に影響を及ぼすことができる。この共通の特徴のために、それぞれを創薬のための標的として使用することができ、その結果天然のLDLレベルに影響を及ぼす化合物が同定される（第5.3.2節を参照されたい）。
【０１４６】
好ましくは、変異体MOLLポリペプチドは、野生型MOLLポリペプチドによって示される少なくとも１つの機能において、改変された活性を示す。変異体ポリペプチドの改変された活性は、減少（たとえば、機能喪失突然変異）であることができる、または活性において増大することができる（たとえば、機能獲得突然変異）。本明細書に使用されるものとして、「機能喪失突然変異」の句は、変異体ポリペプチドが減少した活性を有するような突然変異をいう。減少した活性は、ポリペプチドの各々の機能／活性に存在してもよく、またはポリペプチドの機能／活性の全てよりも少数で存在してもよい。機能喪失突然変異は、完全な（ヌル）または部分的な機能喪失であることもできる。本明細書に使用されるものとして、「機能獲得突然変異」の句は、ポリペプチドが有する変異体が活性を増大するような突然変異をいう。増大された活性は、ポリペプチドの各々の機能／活性に存在してもよく、またはポリペプチドの機能／活性の全てよりも少数で存在してもよい。
【０１４７】
5.3.1.1  EMS化学的欠失突然変異生成  
エチルメタンスルホネート（EMS）は、線虫において関心対象の遺伝子の機能喪失突然変異を作製するために一般的に使用される化学的突然変異原である。EMSによって誘導される約13%の突然変異は、小さな欠失である。本明細書において記載されている方法では、4×106のEMS変異誘発されたゲノムをスクリーニングすることによって関心対象の欠失を同定する確率がほぼ95%である。突然変異生成の後、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子内のこれらの突然変異を同定するために、変異体線虫をさらにスクリーニングする。簡潔には、この手順は、96穴プレートに小さなプールに分配された数100万の変異が誘発された線虫のライブラリーであって、それぞれのプールが約400の単相体ゲノムで構成されるライブラリーを作製することを含む。それぞれのプールの一部を使用して、変異誘発された線虫に由来するゲノムDNAの対応するライブラリーを作製する。関心対象の欠失を有するゲノムを有するプールを同定するために、DNAライブラリーをPCRアッセイ法によってスクリーニングして、所望の欠失を有する変異体虫を変異誘発された動物の対応するプールから回収する。EMSは、欠失を作製するための好ましい変異誘発物質であるが、X線、γ線、ジエポキシブタン、ホルムアルデヒド、および紫外線と共にトリメチルプソラレンなどのその他の変異誘発物質を使用して、有意な欠失を得ることができる。SulstonおよびHodgkin （1988, pp. 587-606, in The Nematode Caenorhabditis elegans, Wood, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）によって記載されている方法などの、当業者に既知の任意の手順を使用して、EMSによって線虫に変異誘発してもよい。変異誘発物質に対する曝露に続いて、線虫をシャーレ（1〜2日インキュベートされる）に分け、次亜塩素酸塩処理によって胚を単離する（同上）。胚を孵化させて、L1幼虫を一晩インキュベーション後に収集する。幼虫をプレートにつき200匹の動物の平均密度でペトリ皿に分けて、ちょうど飢えるまで5〜7日間インキュベートした。線虫の試料を、蒸留水の溶液で洗浄することによってそれぞれのプレートから収集し、それぞれのプレートから洗浄した線虫を96穴プレートの1つのウェルに配置する。虫を溶解して、さらなる解析まで-80℃でDNAを貯蔵する。それぞれのプレートからの生きている線虫を、生きている動物のチューブの物理的配置は、96穴プレートの対応するDNA可溶化液の配置と同様であるように、-80℃でストレージするためのラック内のチューブに等分する。
【０１４８】
貯蔵ストラテジーを使用して、DNA可溶化液の効率的なPCRスクリーニングを行うことができる。プールは、プレート内のウェルのそれぞれのカラムを含む8ウェルから10μlの可溶化液を混合することによって、それぞれの96穴プレートから作製される。それぞれのカラムについてプールした可溶化液をPCRでのスクリーニングのために使用する。PCRプライマーは、座位のサイズに応じて、関心対象のそれぞれの座位が約1.5〜12kb間隔であるようにデザインし、その結果、本発明のMOLL核酸の全てのコード領域を含む欠失を、先に述べた手順に従って検出することができるPlasterk, 1995, Methods in Cell Biology 48:59-80を参照されたい）。それぞれの領域について、ネスティッドPCRストラテジーを行うために、外側のセットを第1ラウンドのPCRのために使用し、内部のセットを第2ラウンドのPCRのために使用するように2セットのプライマー対を選択する。第2ラウンドのPCRを行って、反応におけるより優れた特異性を達成する。
【０１４９】
第2ラウンドのPCR産物をアガロースまたはアクリルアミドゲルでの電気泳動法によって解析してもよい。欠失の可能性のある産物が2つの反応のうちの少なくとも1つにおいて観察される場合、2ラウンドのPCRを、ポジティブなプールに対応するカラムに由来する個々のウェルからの可溶化液に対して上記の通りに行う。これにより、欠失変異体を含むポジティブな「アドレス」（すなわち個々のプレート内の特定のウェルの同定がなされる。ポジティブなアドレスを上記の通りに2ラウンドのPCRを使用して、四回再テストし、産物をゲルで精製して、直接シーケンスし、所望の欠失の存在を確認した。
【０１５０】
一旦ポジティブなアドレスが同定され、配列分析によって確認されれば、関連したプレートからの約300匹の個々の虫を別々の新しいプレートにクローン化する。F1動物がプレートに存在するときには、上記の通りに親線虫を緩衝液に入れて、溶解する。欠失を同定するために使用したものと同じプライマー対および循環条件を使用して、これらの動物に対してPCRを行う。一旦欠失を有する単一の動物が同定されれば、欠失動物のホモ接合性の集団が得られるまでその子孫をクローン化して、上記したものと同じ条件を使用して検査する。
【０１５１】
5.3.1.2  Tc1トランスポゾン挿入突然変異生成  
関心対象の遺伝子内への転移因子の挿入により、遺伝子機能の不活性化を生じさせることができるので、転移因子Tc1は、線虫にける変異誘発物質として使用してもよい。突然変異生成の後、変異体線虫をさらにスクリーニングして、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子内の突然変異を同定する。突然変異生成遺伝子のバックグランドに高コピー数のTc1転移因子を含む株（すなわち、転移因子が高度に可動性である株）で開始して、約3,000個体の培養を含むTc1ライブラリーを前述したように作製する（たとえば、Zwaal et al., 1993, PNAS 90:7431-7435; Plasterk, 1995, “Reverse Genetics: From Gene Sequence to Mutant Worm”, in Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism （Epstein and Shakes, Eds.） pp. 59-80.を参照されたい）。Tc1配列対して特異的な1セットのプライマーおよび1セットの遺伝子特異的なプライマー（たとえば、clk-2のためのプライマー）によるポリメラーゼ連鎖反応法を使用して、ライブラリーを関心領域のTc1挿入についてスクリーニングした。Tc1は、イントロン内の挿入に対する選択を示すので、時に、関心対象の遺伝子の一部または全体の欠失を生じ得る（通常、1〜2kbのゲノム配列が欠失する）転移因子の不正確な切除について、挿入動物の集団の二次スクリーニングを行うことが必要である。Tc1欠失についてのスクリーンを行って、上記したEMSスクリーンと同様の方法で欠失動物を回収する。
【０１５２】
5.3.1.3  分子進化技術  
変異体ポリペプチドは、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を本発明の核酸（たとえば、dsc-4）のヌクレオチド配列に導入することによって作製することができ、その結果、1つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失がコードされるタンパク質に導入される。突然変異は、部位特異的分子進化技術（一般に、Arnold, 1993, Curr. Opinion Biotechnol. 4:450-455を参照されたい）；たとえば、部位特異的突然変異生成（たとえば、Kunkel, 1985, PNAS, 82:488-492; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177-183を参照されたい）；オリゴヌクレオチド定方向突然変異生成（たとえば、Reidhaar-Olson et al., 1988, Science 241:53-57を参照されたい）；化学的突然変異生成（たとえば、Eckert et al., 1987, Mutat. Res. 178:1-10を参照されたい）；誤りがちなPCR（error prone PCR）（たとえば、Caldwell & Joyce, 1992, PCR Methods Applic. 2:28-33を参照されたい）；カセット突然変異生成（たとえば、Arkin et al., PNAS, 1992, 89:7871-7815を参照されたい）；DNAシャッフリング法（DNA shuffling methods）（たとえば、Stemmer et al., 1994, PNAS, 91:10747-10751; United States Patents 5,605,793; 6,117,679; 6,132,970; 5,939,250; 5,965,408; 6,171,820を参照されたい）などの標準的な技術によって導入することができる。
【０１５３】
一つの態様において、特定のヌクレオチド配列または核酸の位置が突然変異のためにターゲットされる。このようなターゲットされた突然変異は、核酸のいずれかの位置に導入することができる。たとえば、ヌクレオチド置換を行って、「非必須」または「必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換を生じさせることができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなく野生型配列から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基は、少なくとも１つのポリペプチドの生物活性に必要とされる。たとえば、種々の種の相同体の間で保存されないか、または半保存のアミノ酸残基は、活性に非必須であろう。あるいは、種々の種（たとえば、マウスおよびヒト）の相同体間で保存されるアミノ酸残基は、活性に必須であろう。
【０１５４】
また、このようなターゲットされた突然変異は、1つまたは複数の非保存アミノ酸残基でも行うことができる。「非保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が異なる側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン）、無電荷の極性側鎖（たとえば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β枝分れ側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【０１５５】
非保存アミノ酸残基の置換の代わりに、または加えて、このようなターゲットされた突然変異は、1つまたは複数の保存されたアミノ酸残基でもなされる。「保存されたアミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたものである。突然変異生成に続いて、コードされるタンパク質は、組換えで発現させることができ、タンパク質の活性を決定することができる。
【０１５６】
もう一つの態様において、突然変異は、コード配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができる（たとえば、飽和突然変異生成によって）。ある形態では、同様のドメイン、構造モチーフ、活性部位を有するか、またはミスマッチまたは不完全なマッチを有する本発明の酵素遺伝子の一部と共に整列するその他の関連したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を配列の多様性を作製するための突然変異生成プロセスに使用することができる。前述のいくつかの技術のそれぞれの突然変異生成工程に対して、工程のいずれかまたは全ての数回の反復サイクルを、配列の多様性を最適化するために行ってもよいことが理解されるはずである。上記の方法は、いずれの所望の順位に組み合わせて使用することもできる。多くの例において、方法は、変異体ヌクレオチド配列のプールまたは変異体ヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞のプールを生じる。所望の特徴を有する修飾された酵素を発現するヌクレオチド配列または宿主細胞は、当該技術分野において周知の1つまたは複数のアッセイ法でスクリーニングすることによって同定することができる。本アッセイ法は、所望の物理的または化学的特徴を有するポリペプチドを選択する条件下で行ってもよい。ヌクレオチド配列の突然変異は、クローン内の変異体ポリペプチドをコードする核酸をシーケンスすることによって決定することができる。
【０１５７】
5.3.1.4  RNA干渉
ある態様において、RNA干渉（RNAi）分子を、RNAiが向けられている核酸の発現を減少すること、または阻害することによって線虫を変異誘発するために使用する。RNAiは、関連したヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現を抑制するための、二重鎖RNA（dsRNA）または小さな干渉RNA（siRNA）の使用をいう。また、RNAiは、転写後遺伝子サイレンシング（またはPTGS）と呼ばれている。通常細胞の細胞質に見いだされる唯一のRNA分子は、一本鎖mRNA分子であるので、細胞は、二本鎖RNAを認識し、21〜25の塩基対（約2つの二重らせんのターンであって、小さな干渉RNAまたはsiRNAと称される）を含む断片に切断する酵素を有する。断片のアンチセンス鎖は、これが内因性細胞mRNAの分子の相補的なセンス配列とハイブリダイズするように、センス鎖から十分に分れている。このハイブリダイゼーションにより、二本鎖領域のmRNAの切断をトリガーし、したがってこれがポリペプチドに翻訳される能力を破壊する。したがって、特定の遺伝子に対応する二本鎖RNAを導入することにより、特定の組織において、および／または選択された時間に、その遺伝子の細胞自体の発現がノックアウトされる。
【０１５８】
二本鎖（ds）RNAは、線虫、哺乳類、その他を含む（しかし、これらに限定されない）多くの生物体の遺伝子発現を妨害するために使用することができる。dsRNAは、本発明の核酸分子のヌル変異体のものと同様の表現型を生じるように、本発明の核酸分子の機能の抑制性RNAまたはRNAiとして使用される（Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Nature Cell Biology 2: 70-75）。
【０１５９】
あるいは、siRNAを直接細胞に導入してRNA干渉を媒介することができる（Elbashir et al., 2001、Nature 411：494-498）。siRNAを作製するために多くの方法、たとえば化学合成またはインビトロでの転写が開発された。一旦作製されれば、siRNAsは、一過性のトランスフェクションを経て細胞に導入される。また、RNA 干渉のRNA配列特異的なメディエータに向けられたUS Patent Applications 60/265232、09/821832、およびPCT/US01/10188を参照されたい。また、一過性に、かつ安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞においてsiRNAsを絶えず発現させるために、多くの発現ベクターが開発された（Brummelkamp et al., 2002 Science 296:550-553; Sui et al., 2002, PNAS 99（6）:5515-5520; Paul et al., 2002, Nature Biotechnol. 20:505-508）。これらのベクターのいくつかは、小さなヘアピンRNA（shRNAs）を発現するように設計されており、これがインビボで遺伝子特異的なサイレンシングを行うことができるsiRNA様の分子にプロセスされる。siRNA発現ベクターのもう一つのタイプは、別々のpol IIIプロモーターの抑制下でセンスおよびアンチセンスsiRNA鎖をコードする（Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnol. 20:497-500）。このベクターからのsiRNA鎖は、その他のベクターのshRNAsの様に、5'チミジン終結シグナルを有する。両タイプの発現ベクターによるサイレンシングの有効性は、一過性にsiRNAをトランスフェクトすることによって誘導されるものと同等であった。
【０１６０】
RNAi技術は、線虫における高スループット使用のためにも適応されてきた（たとえば、Kamath et al., 2003, Nature 421:231-7, Ashrafi et al., 2003, Nature 421:268-72, Taschl, 2003, Nature 421:220-221を参照されたい）。簡潔には、選択の二重鎖RNA（dsRNA）をコードするDNAプラスミドを大腸菌に挿入する。dsRNAをコードする核酸は、大腸菌での発現が誘導分子（たとえば、IPTG）の存在下でのみ生じるように、誘導性プロモーターの制御下に配置することができる。最後の幼虫段階の線虫を、dsRNAを発現する大腸菌のローン上に配置して大腸菌に摂取させる。摂取された細菌は、線虫内部でdsRNAを放出する。その結果、dsRNAに対応する配列の遺伝子は、あたかも遺伝子が機能喪失突然変異を有するかのようにふるまう。
【０１６１】
5.3.2  薬剤の同定のため  
一つの態様において、本発明は、生物体の脂質またはリポタンパク質のレベルを変更する本発明の薬剤をアッセイし、スクリーニングし、または同定するための、線虫の使用を包含する。このような態様において、望ましくないレベルの脂質またはリポタンパク質と関連した表現型（たとえば、排便サイクル長の増減、期外発生の生殖系列発達、胚発生もしくは後胚発生の速度の増減；第5.4節を参照されたい）を示す、変異体clk-1および／または変異体MOLL遺伝子（たとえば、dsc-3、またはdsc-4）を含む線虫を候補化合物とインキュベートするか、または摂取させる。次いで、変異体表現型の減少（すなわち、最初の変異体表現型よりも野生型に似た表現型）または変異体表現型の悪化（すなわち、最初の変異体表現型よりもさらに野生型に似ていない表現型）について、虫を記録する。
【０１６２】
特定の作用機序によって拘束されることは企図しないが、本発明の薬剤または化合物は、たとえばclk-1またはMOLL核酸／ポリペプチド発現を増強し/妨害すること、内因性結合パートナー（たとえば、野生型生物体内のポリペプチドと相互作用するポリペプチド、脂質、または核酸）とclk-1またはMOLLポリペプチドの相互作用を増強し、または妨害すること、clk-1もしくはMOLL活性を増強し／妨害すること、その他によってclk-1またはMOLLポリペプチドの活性を変更することができる。本方法は、一般にclk-1またはMOLL核酸／ポリペプチド分子（変異体または野生型）を発現する動物と共に薬剤をインキュベートすることと、次いで望ましくないレベルの脂質またはリポタンパク質と関係する表現型の変化（たとえば、排便サイクル長、期外発生の生殖系列発達、胚発生もしくは後胚発生の速度）についてアッセイすることとを含み、これにより本発明の薬剤を同定する。また、本発明は、clk-1またはMOLLポリペプチド分子と結合する試験化合物を同定するための、生化学アッセイ法の使用を含む。次いで、clk-1またはMOLLポリペプチドと結合することが見いだされた化合物は、何らかの表現型を変更する性質を決定するために、線虫に基づいたアッセイ法でアッセイすることができる。
【０１６３】
1つの特異的な態様において、本発明は、野生型表現型を部分的もしくは完全に回復することができるか、またはclk-1変異体線虫においてdsc変異体（たとえば、dsc-3、またはdsc-4）もしくはdsc遺伝子のRNAiの存在を表現型模写することができる化合物をアッセイするための、線虫clk-1試験変異体線虫の使用を提供する。また、本発明は、上記の通りに、clk-1変異体アッセイ法において、野生型表現型を部分的もしくは完全に回復するポジティブな化合物を特徴づけるために、複数の遺伝子（二重変異体のclk-1/dsc-3およびclk-1/dsc-4など）の突然変異または1つもしくは複数の遺伝子のRNAiを含む試験線虫の使用を提供する。表現型の多くが定量的な特徴であるので、本方法により、表現型に対する効果が化合物との接触および変異体遺伝子型の存在に関して相加的であるかどうかを決定することができる。このような方法は、ポジティブな化合物が変異体遺伝子型の1つと同じプロセスに影響を及ぼするかどうかを決定するために使用することができる。
【０１６４】
特に、天然のLDLレベルを減少することによって部分的に、または完全にclk-1変異体線虫をレスキューする薬剤または化合物は3つの主なカテゴリーに、すなわちコレステロール吸収を減少させる化合物、天然のLDL合成／分泌を減少させる化合物、および天然のLDLの酸化型LDLへの転換を促進する化合物に分類することができる。それぞれのカテゴリーの化合物は、事実上不均一であることができるが、全てが天然のLDLレベルを低下させる能力の特徴を共有する。たとえば、コレステロール吸収を減少させる化合物は、以下に関与する分子のレベルまたは活性を減少させることによって作用することができる：（i）コレステロールの結合、（ii）原形質膜および／または細胞小器官膜を越えたコレステロールの輸送、または（iii）吸収および輸送することができる関連したステロールへのコレステロールの転換。天然のLDL合成／分泌を減少させる化合物は、以下によって作用することができる：i）LDL合成／分泌に関与する分子の発現または活性を減少させること、ii）LDL合成／分泌を阻害することに関与する分子の発現または活性を促進すること、iii）一般に脂質レベルを低下させることに関与する分子の発現または活性を、これらをLDLに組み入れるために利用できないように、促進すること、またはiv）脂質レベルを上昇することに関与する分子の発現または活性を減少させること。天然のLDLの酸化型LDLへの転換を促進する化合物は、以下によって作用することができる：i）LDL酸化に関与する分子の発現または活性を促進すること、ii）LDL酸化を阻害することに関与する分子の発現または活性を減少させること、iii）ROS生産に関与する分子の発現または活性を促進すること、iv）ROS産生を阻害することに関与する分子の発現または活性を減少させること、v）ROSクリアランスを増大することに関与する分子の発現または活性を減少させること、またはvi）ROSクリアランスの減少に関与する分子の発現または活性を促進すること。
【０１６５】
5.3.2.1  候補薬剤  
本明細書に使用されるものとして、「薬剤」の用語は、所望の生物学的効果を有する分子をいう。薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、抗体、その他を含む（しかし、これらに限定されない）タンパク質性分子；または無機または有機化合物を含む（しかし、これらに限定されない）大分子；または無機または有機化合物を含む（しかし、これらに限定されない）500ダルトン未満の小分子；または2本鎖DNA、1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、もしくは三重らせん核酸分子を含む（しかし、これらに限定されない）核酸分子を含む（しかし、これらに限定されない）。薬剤は、いずれの既知の生物体（動物、植物、細菌、真菌、原生生物、またはウイルスを含むが、これらに限定されない）に由来する天然物、または合成分子のライブラリーからのものであることができる。本明細書に使用されるものとして、「薬剤」および「化合物」の用語は、交換可能に使用される。
【０１６６】
好ましい態様では、候補薬剤は、野生型clk-1変異体線虫の表現型のうちの1つを部分的に、または完全に回復することができる。関連した態様において、候補薬剤は、clk-1変異体線虫のdsc遺伝子の突然変異の1つまたは複数の効果を表現型模写することができる。特定の態様において、候補薬剤は、DSC-3およびDSC-4などの（しかし、これらに限定されない）dsc遺伝子産物のアンタゴニストである。
【０１６７】
候補薬剤の例は、U.S. Patent NOs. 5,474,991、5,929,091；6,147,214、6,197,798、6,417,367、6,444,664に開示されている。候補薬剤の例は、DSC-3の酵素機能を調整するバナジン酸塩などの特異的および非特異的なATPase阻害剤、並びに一般的な代謝プロセスに影響を及ぼすエジチミベ（Ezetimibe）（Zetia Schering Plough）などの薬物を含む。本発明の方法の一定の態様において、CYP7A1酵素の活性を増大するタウリン（しかし、これらに限定されない）などの胆汁合成を増大することが既知のその他の薬剤を薬剤として使用することができる。
【０１６８】
5.4  本発明のアッセイ法  
本発明において、脂質代謝における種々の遺伝子の役割を調査するためのモデルとして線虫が使用される。本発明者らは、本発明の遺伝子に突然変異を有する線虫が、種々の形態的、行動的、発達的な表現型を示すことを観察した。RNA干渉または本発明の薬剤とのインキュベーション、並びに温度などの環境要因により、このような表現型をさらに修飾することができる。本モデルは、線虫の特異的な形態的、行動的、発達上の表現型が一定の代謝イベントまたは状態と関係しており、これがヒトにおいても生じ、ヒト障害とも関係するという発見に基づく。
【０１６９】
一つの態様において、線虫モデルは、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化症、および心臓血管疾患の発生に至る脂質代謝に関与する機構に関与する遺伝子を同定するために使用することができる。これは、特異的な表現型を生じる線虫を使用すること、このような線虫のゲノムに突然変異を生じさせること、修飾された表現型を示す変異体線虫をスクリーニングすること、および修飾された表現型を生じる変異した遺伝子を単離することによって達成することができる。たとえば、本発明は、コレステロール・レベルの減少、LDLの産生もしくは分泌、またはLDLの酸化が、生殖系列発達の速度を増大することを提供する。生殖系列発達に同様の変化を生じさせる変異体を同定することによって、生殖系列発達のプロセスにおいて役割を果たす遺伝子を見いだすことができる。従って、本発明は、特定の遺伝子型および表現型の線虫を突然変異生成に供し、表現型に変化を示す変異された線虫を単離するアッセイ法を提供する。選択的に、さらに表現型の変化を区別し、特徴づけるために、変異された線虫は、温度の変化などの一定の環境に供することができる。
【０１７０】
もう一つの態様において、線虫ゲノムにランダムまたは非ランダムな突然変異を生じさせる代わりに、線虫の多くの既知のまたは予測される遺伝子のmRNAレベルを特異的に減少させて表現型の変化を試験することができる。これは、RNAを媒介した干渉を含む当該技術分野において既知の多くの方法によって達成することができる。
【０１７１】
もう一つの態様において、線虫モデルは、障害に関連した代謝イベントまたは状態の変化を反映するか、または既知の薬物標的の活性の変化と相関する候補化合物の効果を線虫の表現型の変化を観察することによって評価することができることによる薬物スクリーニングのために使用することができる。特異的な表現型を生じる線虫を使用することにより、候補化合物との接触後に修飾された表現型を示すことから、化合物が動物において関連した代謝イベントまたは状態に影響を及し（たとえば、一定の脂質および／またはリポタンパク質のレベルの増加または減少）、並びにそれぞれの薬物ターゲットが既知であるならば（たとえば、MOLLポリペプチド）相互作用することができることを示す。従って、本発明は、特異的な表現型の線虫を試験化合物と接触し、接触後に表現型に変化を示す線虫を同定し、単離するアッセイ法を提供する。表現型の変化は、動物内の一定の位置での一定の脂質（たとえば、コレステロール）および／またはリポタンパク質（たとえば、LDL様リポタンパク質）のレベルの増減などの、動物における関連した代謝イベントまたは状態の変化に相関させることができる。次いで、変化を生じた試験化合物を、試験線虫においてこれが相互作用した標的などの、その作用様式についてさらに解析し；さらに、候補薬として開発される。選択的に、接触工程の前に、間に、または後に、線虫を温度の変化などの一定の環境に供して、一定レベルの脂質またはリポタンパク質、または一定の活性と相関について、さらに表現型の変化を区別し、特徴づけることができる。
【０１７２】
さらにもう一つの態様において、線虫の特定の表現型を変更することができるその他の生物体に由来する遺伝子を本発明のスクリーニングするアッセイ法に使用することができる。たとえば、ヒト遺伝子ATP8B1、ATP8B2、ATP8B4、またはMTPを含む（しかし、これらに限定されない）その他の生物体（またはこれらの変異体）に由来するMOLL相同体を、第5.3節に開示したものなどの当該技術分野において一般的な技術によって線虫に導入して発現させること、および本発明のスクリーニングアッセイ法に使用することができる（Harris et al., 2003, Biochem. Biophy. Acta 1633:127-131）。たとえば、MOLL相同体（たとえば、ATP8B1、ATP8B2、ATP8B4、またはMTP）をコードするヒト遺伝子の発現可能な形態を変異体dsc-3またはdsc-4遺伝子型を含み、および／または変異体dsc-3またはdsc-4表現型を示す虫に発現させて、野生型表現型を回復する際のヒト遺伝子の効果を決定することができる。次いで、試験化合物をMOLL遺伝子（たとえば、dsc-3またはdsc-4）のヒト相同体を含む虫に添加することができ、その結果ヒト遺伝子の機能を崩壊させる化合物を同定することができる。
【０１７３】
関連した態様において、薬物スクリーニングアッセイ法は、1つまたは複数の特異的な遺伝子（試験線虫において最初の表現型を生じるものに加えて）の発現が減少させる試験線虫で行うことができる。これは、RNAを媒介した干渉などの当該技術分野において既知の方法によって達成することができる。
【０１７４】
さらにもう一つの態様において、本発明は、また、表現型と関連した代謝状態またはイベントの結果を直接測定する技術を使用するアッセイ法を提供する。典型的には、これらのアッセイ法では、線虫の一部または全部にける、脂質およびリポタンパク質などの一定の代謝産物の存在、濃度および分布を測定する。
【０１７５】
上記概説した本発明の標的スクリーニングアッセイ法および薬物スクリーニングアッセイ法は、共通の基本要素を共有する。第1に、本アッセイ法は、1つまたは複数の特徴的な表現型を示す既知の線虫の遺伝子型の試験であって、表現型は、一定の代謝状態またはイベントの存在を示す試験を使用する。第2に、本アッセイ法は、表現型の存在もしくは表現型の変化を検出するための手段、または表現型の変化を測定するための手段（これらの多くは、性質上定量的である）が必要である。これらの共通の要素は、本発明の種々のアッセイ法を行うために組み合わせることができることが想定される。柔軟で、生産的で、かつ制限がないことは、本発明の創薬プラットフォームの利点のうちの1つである。たとえば、特定の表現型の線虫を標的スクリーニングアッセイ法、並びに薬物スクリーニングアッセイ法に使用することができ、線虫の処理、すなわち突然変異生成、特異的なmRNA減少、または試験化合物との接触のいずれかを受けることにより、相違が生じる。処理された線虫の表現型の変化は、同一セットの技術によって評価することができる。従って、試験線虫の特異的な表現型を評価するために開発された特定の手段または方法を多くの異なるアッセイ法に使用することができる。
【０１７６】
本発明の種々の線虫アッセイ法において、特異的な表現型を検出し、観察し、および／または測定して、その他の実験線虫および対照線虫と比較する。多くの表現型の定量的性質により、線虫の脂質／リポタンパク質レベルと相関させることができる。以下の節では、関心対象の表現型によって構成される本発明の線虫アッセイ法を記載する。
【０１７７】
5.4.1  アッセイ技術  
本発明のアッセイ法は、顕微鏡的線虫の種、線形動物（Nematoda）、杆線虫科（Rhabditidae）、好ましくは線虫（C. elegans）および線虫（C. briggsae）などの線虫（Caenorhabditis）種で使用することができる。最も好ましくは、線虫（C. elegans）が使用される。モデル生物体として線虫（C. elegans）を使用することには、多くの利点がある。第1に、線虫（C. elegans）は、約3日の短い生活環を有し、これらの線虫（これらの変異体、トランスジェニクス、および／または安定株を含む）を迅速かつ多数で、増殖させ、発生させることができる。この短い寿命のため、線虫に基づいたアッセイ法では、化合物の安定性に関連したいずれの問題も伴わずに、化合物が1つまたは複数回以上、および本質的に全ての発生段階まで試験されるであろう。第2に、線虫は、透明であり、したがって内部臓器および内部プロセスの視覚的または非視覚的に検査すること、およびが更には線虫がまだ生きている間でさえも、蛍光リポータータンパク質などのマーカーを使用することができる。従って、このような検査は、プレートリーダーなどの適切な設備を使用する自動化された様式で行ってもよい。最後に、線虫（C. elegans）の遺伝学は、周知であり、またゲノムはシーケンスされており、したがってDNAおよびタンパク質マイクロアレイなどの多くの技術および遺伝的解析のためのツールに線虫は向いている。
【０１７８】
線虫（C. elegans）形質転換する、扱う、育るて、維持する、貯蔵する（たとえば、冷凍試料として）ための技術は、当該技術分野において十分に確立されており、たとえばW.B. Wood et al., "The nematode Caenorhabditis elegans", Cold Spring Harbor Laboratory Press （1988）およびRiddle et al.," C. elegans II", Cold Spring Harbor Laboratory Press （1997）; C. elegans: A Practical Approach by I.A.  Hope, Oxford University Press, England 1999にを記載されており、これらのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１７９】
モデル生物体として線虫（C. elegans）を使用するインビボ・アッセイ法を行うことのための一般的な技術および方法論は、Rand and Johnson, Chapter 8, Vol. 84 “Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of An Organism”, Ed.  Epstein and Shakes, Academic Press, 1995、WO 98/51351、W099/37770、WO 00/34438、WO/00/01846、WO 00/63427、WO 00/63425、WO 00/63426、WO 01/88532、およびWO 01/94627などの当該技術分野において記載されているが（これらのそれぞれが、参照によりその全体が本明細書に援用される）、これらに限定されない。これらの出願に記載されているように、線虫の使用を含むアッセイ法の主な利点のうちの1つは、このようなアッセイ法が複数ウエルプレートの形式（それぞれのウェルで、通常1〜100の間の線虫試料を含む）で行うことができることである。
【０１８０】
通常、下記に記載されているアッセイ法では、線虫を複数ウェルのプレートなどの適切な容器または区画で、適切な培地（これは、固体、半固体、粘着性、または液体培地であってもよい）で、通常複数ウエルプレートの形式でのアッセイ法に好ましい液体および粘着性培地と共にインキュベートする。また、培地は、線虫の食物として役立つ細菌と共にまかれる。アッセイでは、線虫が1つまたは複数の試験化合物と接触させる場合に、化合物を線虫が増殖している培地上、または内に添加することができ、または線虫を種々の時間間隔の間、化合物を含む溶液中に浸漬することができる。適切な（すなわち、あるとしても、化合物が線虫に対してその効果を有するのに十分な）インキュベーション時間の後、次いで、線虫は、目視検査によるか、または関心対象の表現型に適した1つまたは複数の技術による検出または測定に供される。線虫は、培地中で動き回ることができるので、線虫は、選択的に解析の前に殺してもよく、または麻痺していてもよく；このさらなる工程は、シグナル検出のために均一に区画またはウェル内の線虫の分布を保つために使用してもよい。試験化合物と接触させていない対照と比較した表現型の変化は、線虫に対する化合物の影響の指標である。操作の多くは、当該技術分野において既知の適切なロボット工学および高スループット・アッセイ法技術を使用するなどにより、自動化することができる。好ましくは、自動化されたアッセイ法において、蛍光または核酸ハイブリダイゼーションの測定などの非視覚的検査法を含む技術を使用することができる。
【０１８１】
本発明の多くのスクリーニングアッセイ法において、表現型に対する遺伝子変異、RNA干渉分子、または試験化合物の効果を決定するために、検出および測定の非視覚的方法が使用される。種々の態様において、これらの方法は、1つまたは複数の指標遺伝子（たとえば、特定の組織タイプ、発生の時期または挙動、その他と関係する遺伝子）の発現または変化と、関心対象の表現型の発現の関連生に基づく。
【０１８２】
一つの態様において、本発明の方法は、指標遺伝子の発現レベルをモニターし、表現型の出現、並びに表現型の定量的側面を決定するための1つまたは複数の指標遺伝子の遺伝子発現プロフィールを使用する。例示的な指標遺伝子のリストは、本発明のアッセイ法に使用される各々の表現型について、下記の本明細書に提供してある。
【０１８３】
もう一つの態様において、本発明の方法は、表現型の出現と平行したシグナル生成の指標遺伝子の、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列の活性を利用する。検出可能なシグナルは、単独で、またはアクセサリー分子の使用によって、リポーター分子によって産生される。本明細書に使用されるものとして、リポーターは、指標遺伝子の制御配列と動作可能に結合されているリポーター遺伝子の遺伝子産物である。リポーターは、非線虫タンパク質またはたとえば、部分的または完全な指標遺伝子産物と非線虫タンパク質の融合タンパク質であることができる。「動作可能に結合される」または「動作可能に連結される」とは、プロモーターおよびリポーター遺伝子配列が、線虫内での転写を可能にするような方法で接続され、配置されている関連をいう。リポーター分子の例は、第5.4.1.2節の一覧表に記載してある。
【０１８４】
1つまたは複数の指標遺伝子の発現は、それぞれの指標遺伝子のメッセンジャーRNAのレベルまたは指標遺伝子産物のレベルを検出および／または測定することによって直接評価することができる。リポーター遺伝子が、試験線虫内の指標遺伝子制御領域と動作可能に結合されている場合、該領域の転写および／または翻訳の活性は、リポーター遺伝子mRNAのレベル、リポーターのレベル、またはリポーターによって生じるシグナルを測定することによって決定することができる。
【０１８５】
あるいは、指標遺伝子の発現は、その他の代謝産物の産生または処理が、指標遺伝子産物の発現および機能的な活性を反映する場合には、産生または処理を検出し、測定することによって間接的に決定することができる。このアプローチは、特に、指標遺伝子産物が酵素である場合に適用できる。このような代謝産物は、指標遺伝子産物が関与する経路の下流にある生化学的反応の産物であることができる。指標遺伝子または機能的なヌクレオチド配列の発現を検出するこのような代替法は、本発明の範囲内に入ることが企図される。
【０１８６】
試験線虫における指標遺伝子の発現またはリポーター遺伝子は、核酸に基づいた検出技術によって検出または測定することができる。試験線虫に由来するリボ核酸（RNA）をこのようなアッセイ技術のための開始点として使用することができ、当業者にとって周知である標準的な核酸調製手順に従って単離することができる。RNAは、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイ法に使用することができる。十分な量の試験線虫を得ることができる場合、指標遺伝子またはリポーター遺伝子のメッセンジャーRNA発現のレベルを決定するために標準的なノーザン分析を行うことができる。
【０１８７】
ノーザンブロット解析、ドット・ブロット、またはスロット・ブロットハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイは、たとえば試験線虫に由来するRNAを1つまたは複数のラベルされた核酸プローブと共に、これらのプローブが指標遺伝子ないのこれらの相補配列に対して特異的にアニーリングするのに好ましい条件下で接触させ、インキュベートすることを含むことができる。好ましくは、核酸プローブの長さは、少なくとも15ヌクレオチドである。インキュベーション後、全ての非アニール核酸をプローブ：指標転写物ハイブリッドから除去する。次いで、このような任意の分子が存在する場合には、ハイブリダイズされた核酸の存在が検出される。種々の指標遺伝子に適した核酸プローブは、公共のおよび商業的な供与源から、または周知の化学法によって合成すること、または増幅およびプラスミドベクターへのサブクローニングによって得ることができる。指標遺伝子のヌクレオチド配列は、Harris et al., 2004, Nucleic Acids Research, 32, Database issue D411-D417に記載されているように、Wormbaseなどのデータベースから得ることができる。
【０１８８】
このような検出スキームを使用して、指標遺伝子またはリポーター遺伝子の核酸は、たとえばマイクロタイタープレート、ガラススライド、シリコンウエハ、またはポリスチレンビーズに対してなど、膜、ガラス面、シリコン基板、またはプラスチック表面などの固体担体に固定することができる。この場合、インキュベーション後に、非アニールされていない、ラベルされた核酸プローブは、固体担体を洗浄することによって除去することができる。残留する、アニールされた、ラベルされた指標核酸試薬の検出または測定は、使用するラベルに応じて、オートラジオグラフィー、リンイメージング、蛍光測定、光散乱、その他などの当該技術分野において周知の標準的な技術を使用して達成される。いずれのの適切な同位体および非同位体ラベルを使用することができる。核酸プローブがアニールされる指標遺伝子転写物の量を、変異されず、またはRNAi分子または試験化合物に曝露されなかった対照線虫から得られた量と比較することができる。
【０１８９】
ノーザンブロット解析の変形例は、転写物の複合混合物を含む試験線虫から得られるRNAまたはこのようなRNAから調製されるcDNAを本発明のハイブリダイゼーションアッセイ法のプローブとして使用することができる。標準的な技術によって同位体的に、または非同位体的にラベルされたRNAまたはcDNAプローブを表現型と関連する指標遺伝子の選択されたパネルと接触し、インキュベートすることができる。これらの遺伝子の配列またはこれらのサブシーケンスを含む核酸は、アレイの形態で固体担体上へ固定して、標識プローブに対して提示することができる。パネルの遺伝子内のこれらのそれぞれの相補配列に対するラベルされたプローブの特異的なアニーリングに好ましいインキュベーション条件が使用される。パネルに含まれる指標遺伝子の転写物が試験線虫に存在する場合、ラベルされた転写物部分が指標遺伝子の固定された核酸にハイブリダイズされる。インキュベーション後、全てのアニールされていないプローブを除去し、次いで、パネルの遺伝子にハイブリダイズされたラベルされたプローブの存在および量を検出する。各々の遺伝子に対する、残留する、アニールされた、ラベルされた核酸プローブの検出または測定は、オートラジオグラフィー、リンイメージング（phosphorimaging）、蛍光測定、光散乱、その他などの当該技術分野において周知の標準的な技術を使用して達成される。たとえば、Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnol 14:1675-1680;およびFerguson et al., 1996, Nature Biotechnol, 14:1681-1684を参照されたい。
【０１９０】
ハイブリダイゼーション結果の平行した高スループット解析を容易にするために、指標遺伝子の核酸を空間的に識別可能な形式で固体担体上に高密度で固定して、アレイを形成することができる。たとえば、Reinke, 2002, Nat Genet 32 Suppl:541-6およびHill et al., 2000, Science 290:809-12（それぞれが、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているアプローチを参照されたい。核酸のアレイまたはマイクロアレイを作製するためのいずれの方法を使用することもできる。たとえば、DNAを多孔性膜またはガラスなどの固体担体上へ直接スポットしてもよく（Zhao et al., 1995, Gene 156:207-213; Shalon et al., 1996, Genome Research 6:639-645）、またはインクジェット式技術によって表面へ移してもよい（Blanchard et al., 1996, Biosens. Bioelectron. 11:687-690）。あるいは、フォトリソグラフィーおよびオリゴヌクレオチド化学の組み合わせを使用して、指標遺伝子のサブシーケンスを含むオリゴヌクレオチドを誘導体化されたガラスまたはシリコン上に直接合成することができる（Fodor et al., 1991, Science 251:767-773; Fodor et al., 1993, Science 364:555-556）。この平行した、高スループット・アプローチに有用なDNAアレイは、商業的に利用できる（たとえば、Affymetrix, Inc. Santa Clara, CAから）。
【０１９１】
このアプローチの利点のうちの1つは、試験線虫の試料の多くの指標遺伝子の発現が1つの単純なハイブリダイゼーションアッセイ法で評価することができることである。従って、本発明の方法は、同時に多数の指標遺伝子の発現に基づいて表現型の徴候を評価するために使用することができる。
【０１９２】
指標またはリポーター遺伝子特異的な転写物の検出のための他の検査法、たとえばポリメラーゼ連鎖反応法によってこれらを増幅すること（PCR；U.S. Patent NOs. 4,683,202号）、続いて当業者にとって周知の技術を使用して増幅された分子を検出することを含むことができる。生じる増幅された配列を、試験化合物に、もしくはRNAi分子に曝露されていないか、または変異されていない試験線虫から得られるものと比較することができる。また、定量的PCR技術を使用して指標／リポーター遺伝子転写物の絶対量または標準と関連した転写物の濃度を決定することができる（Wang et al., 1989, PNAS 86:9717-9721; Gilliland et al., 1990, PNAS 87:2725-2729）。同時に1つの試料から、1つ以上の指標遺伝子転写物、またはを指標遺伝子転写物の1つ以上部分を増幅することができる多重PCRを行うことができる。
【０１９３】
このような検出スキームの一つの態様において、cDNAは、指標／リポーター遺伝子のRNAから（たとえば、RNA分子のcDNAへの逆転写によって）合成される。次いで、cDNA内の配列をPCR増幅反応、等の核酸増幅反応のためのテンプレートとして使用する。PCRプライマーの好ましい長さは、少なくとも9〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、放射性または非放射性のラベルされたヌクレオチドを使用して核酸増幅を行うことができる。あるいは、十分に増幅された産物を、標準的な臭化エチジウム染色によって、または他の何らかの適切な核酸染色法によって視覚化することができるように、利用することができる。
【０１９４】
増幅およびハイブリダイゼーションを含む技術は、全ての指標遺伝子転写物が完全には特徴づけられるというわけではないときに、特に有用である。たとえば、PCRによるディファレンシャルディスプレイ（Liang et al., 1992, Science 257:967-971; Pardee et al., U.S. Patent NOs. 5,262,311号）、および遺伝子転写物の連続解析（SAGE; Velculescu et al., 1995, Science 270:484-487）などの技術を使用してもよいが、これらに限定されない。
【０１９５】
当業者であれば、ルーチン試験を使用することによって上記の技術の効果のある、最適な条件を決定することができるであろう。
【０１９６】
また、本発明は、指標遺伝子産物、リポーター分子、融合タンパク質、または代謝産物の物理的な、免疫学的な、または機能的な性質に基づくタンパク質に基づいたスクリーニングアッセイ法を提供する。指標遺伝子産物、リポーター分子、または代謝産物は、たとえば、イオン交換、親和性結合、サイズ除外、および疎水的相互作用に基づいたクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを含む標準的な方法によって単離し、精製することができる。また、遠心分離、差次的な溶解度、および一次元および二次元のゲル電気泳動などのその他の標準的な技術を使用することもできる。本明細書において使用されるタンパク質単離法は、たとえばHarlow and Lane （Harlow and Lane, 1988, “Antibodies:  A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）に記載されているものなどであってもよい（これは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１９７】
抗体または抗体断片を使用して、リポタンパク質および酸化型のリポタンパク質を含む、指標遺伝子産物、リポーター分子、融合タンパク質、または代謝産物の存在を免疫特異的な結合によって定量的に、または定性的に検出することができる。
【０１９８】
これは、たとえば蛍光ラベルされた抗体を、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量的な検出と組み合わせて使用する免疫蛍光法によって達成することができる。
【０１９９】
種々の態様において、親油性の染料および染色を使用して、試験線虫によって産生される脂質、リポタンパク質、および代謝産物を定量的にまたは定性的に検出することができる。染料および染色により、培地中の、線虫の組織、卵、幼虫、および検出され、および／または測定されるその他の生命段階の、脂質およびリポタンパク質の濃度および分布を変化させることができる。このような染料および染色によって生じるシグナルは、比色および好ましくは蛍光であり、顕微鏡観察によって観察することができる、または蛍光マイクロプレートリーダーなどの種々の手段によって測定することができる。種々の態様において、アッセイ反応および／または線虫をラベルするために1つまたは複数の親油性の化合物が使用され、特定のパターンまたはプロフィールのラベリングが検出される。好ましくは、蛍光親油性の染料を使用するときは、特定の励起条件下での波長発光の特定の比率などの特異的な蛍光プロフィールまたはサインを使用することができる。たとえば、デヒドロエルゴステロールおよびコレステロール結合ポリエン抗生物質フィリピンなどの蛍光コレステロール類似体を生細胞におけるコレステロール分布および輸送を研究するために使用されてきた（Mukherjee et al., 1998, Biophysical J., 75:1915-1925）。また、ヨウ化3,3'-ジオクタデシルインドカルボシアニン（dil[3]）を低密度リポタンパク質（LDL）と混合して高度に蛍光性のLDL誘導体dil[3]-LDLを形成させるなど、染料をリポタンパク質に組み入れて、トレーサーとして使用することができる（Barak and Webb, 1981, J Cell Biol 903:595-604）。コレステリルエステルは、コレステロールの3-ヒドロキシル群に対してエステル化された脂肪酸からなる。これらの無極性の種は、アテローム硬化型のプラークおよび低密度および高密度リポタンパク質（LDLおよびHDL）コアの主な脂質成分である。蛍光色素の商業的な供給元は、Molecular Probes社などの蛍光ラベルされた脂肪酸の−BODIPY FL C12（C-3927）、BODIPY 542/563 C11（C-12680）、BODIPY 576/589 C11（C-12681）、およびジフェニルヘキサトリエニルプロピオン酸のコレステリルエステルを提供し、アッセイ反応において、および／または線虫において、脂質およびリポタンパク質のレベルの測定、並びに追跡に使用するために採用することができる。
【０２００】
フローサイトメトリーおよび蛍光標示式細胞分取（FACS）は、これらの蛍光性質および寸法に基づいて粒子をアッセイし、分離するための周知の方法である（Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165）。これらの技術に基づいた高スループットな系は、生きている／死んだ線虫、線虫卵、永続幼虫（dauer larvae）、および線虫の異なる生命段階を解析し、ソートするために利用できる利用できる（たとえばUnion Biometrica, Somerville, Massachusetts, USによるCOPAS BIOSORT）。本技術では、ソートするパラメーターとして、長さの指標である飛行時間および／またはサイズおよび内部構造体の指標である吸光を使用してもよい。さらに、線虫試験の混合種個体群を、異なる波長で放射する複数の蛍光ラベルでラベルすることによってソートすることができる。この技術により、細菌、糞便、およびその他の未使用の代謝産物を含むであろう増殖培地から試験線虫を分離することができる。ソートされた線虫は、さらなる解析のために複数ウエルプレートの個々のウェルに直接沈殿させることができる。フローサイトメトリーおよびFACSは、特に排便速度、産卵速度などを決定することが必要であるアッセイ法に有用であろう。
【０２０１】
5.4.1.1  指標遺伝子  
本発明は、間接的に線虫の発生段階または挙動をモニターするための指標遺伝子を提供する。指標遺伝子の使用によって、発生段階または挙動の実行を決定するために線虫の直接の目視検査は、高スループット技術に受け入れられる方を選択して迂回することができる。本発明のアッセイ法でモニターされる線虫表現型の側面は、指標遺伝子の発現に変換することができる。
【０２０２】
本明細書に使用されるものとして、「指標遺伝子」の用語は、異なる状況下での発生の間の、または特定の挙動の間の、異なる時期に、線虫の発現のレベル、位置、またはタイミングを変化する線虫遺伝子をいう。タイミングおよび位置、並びに遺伝子産物の発現の相対的な発現レベルは、線虫に関する種々の情報（たとえば、特定の組織タイプが発達するかどうか、特定の発生段階が達成されたかどうか、特定の挙動が行われているかどうかなど）を示すものと解釈することができる。指標遺伝子は、標的遺伝子およびアッセイ法の一部として試験線虫において操作または変異された遺伝子を除外する。好ましくはないが、指標遺伝子は、もっぱら1つの組織タイプ、発生の時期、または挙動の側面のみと関連している必要はない。たとえば、指標遺伝子の発現は、時間とともに蓄積してもよいが、発生の特定の時期に非常に濃縮される。本発明は、一定の態様において、それぞれの個々の指標遺伝子の発現が特異的でない場合であっても、多くの指標遺伝子の発現のパターンまたはプロフィールを線虫に関する情報の特異的な断片を決定するために使用することができる。
【０２０３】
一つの態様において、本発明のアッセイ法は、生殖系列発達の速度に基づく。特定の態様において、生殖系列発達は、配偶子に特異的に発現される1つまたは複数の指標遺伝子の発現をモニターすることによってモニターされる。
【０２０４】
もう一つの態様において、本発明のアッセイ法は、後胚発生の速度に基づく。特定の態様において、後胚発生の特定の段階と関係する指標遺伝子が発現されるときにモニタリングすることによって、後胚発生がモニターされる。もう一つの特定の態様において、後胚発生は、互いに比較して種々の組織の相対的な寸法をモニターすることによってモニターされる。たとえば、後胚発生の間に、生殖系列および体細胞の生殖腺の相対的な寸法が増大するが、残りの体に関する咽頭のサイズは減少する。相対的な寸法が発生の間に変化する2つ以上の組織タイプを（たとえば、それぞれの組織タイプに排他的または主に発現される指標遺伝子をモニターすることによって）モニターすることによって、発生の速度を追跡することができる。
【０２０５】
もう一つの態様において、本発明のアッセイ法は、胚発生の速度に基づく。特定の態様において、胚発生の特定の段階と関係する指標遺伝子が発現されるときの胚発生をモニタリングすることによってモニターされる。体細胞の指標遺伝子の例は、myo3（体壁筋）、elt-2（腸）、myo2（咽頭）、dpy-7（皮下組織）を含むが、これらに限定されない。組織および細胞特異的な指標遺伝子の例は、公的にアクセスできるデータベースに記載されている（たとえばWormbase, http://www.wormbase.org/; NEXTDB, http://nematode.lab.nig.ac.jp/;ホープ研究室発現パターン・データベース（The Hope Laboratory Expression Pattern Database）, http://129.11.204.86:591/default.htm）。
【０２０６】
5.4.1.2  レポーター遺伝子  
本発明は、関心対象の分子（たとえば、核酸またはポリペプチド）の発現をモニターするためのリポーター遺伝子を提供する。一つの態様において、関心対象の分子は、指標遺伝子（上記の通り）である。もう一つの態様において、関心対象の分子は、MOLLsである。特定の態様において、本発明の薬剤の同定を補助するために、試験化合物の効果を確認するためにMOLL核酸およびポリペプチドの発現をモニターすることができる。
【０２０７】
一般に、関心対象の分子が示すリポーター遺伝子産物の量または局在の変化は、たとえば発生を通じた進行または候補化合物とのインキュベーションによる変化を表す。一つの態様において、関心対象の分子のプロモーターまたはエンハンサーの制御下に1つまたは複数のリポーター遺伝子を発現するトランスジェニック動物が作製される。このような動物は、本発明のスクリーニングアッセイ法に使用されてもよい。
【０２０８】
リポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、β‐ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼを含むが、これらに限定されない。このような方法は、当業者に周知である。好ましい態様において、リポーター遺伝子は、容易にアッセイされ、宿主細胞において通常見いだされない活性を有する。
【０２０９】
一つの態様において、ルシフェラーゼは、リポーター遺伝子である。ルシフェラーゼは、酸素および基質（ルシフェリン）の存在下において光を放射し、リアルタイムの、細胞培養、個々の細胞、生物体全部、およびトランスジェニック生物における遺伝子発現の低照度イメージングのために使用される酵素である（Greer & Szalay, 2002, Luminescence 17:43-74によって概説）。
【０２１０】
本明細書に使用されるものとして、「ルシフェラーゼ」の用語は、全てのルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼに由来する組換え酵素を包含することが企図される。ホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子は、たとえば、PhotinusおよびLuciola種からよく特徴づけられている（Photinus pyraliについては、sInternational Patent Publication No. WO 95/25798、Luciola cruciata and Luciola lateralisについては、European Patent Application No. EP 0 524 448、およびLuciola mingrelicaについては、Devine et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1173:121-132を参照されたい）。その他の真核生物のルシフェラーゼ遺伝子は、シー・パンジー（sea panzy）（Renilla reniformis、たとえば、Lorenz et al., 1991, PNAS 88:4438-4442を参照されたい）およびツチボタル（glow worm）（Lampyris noctiluca、たとえば、Sula-Newby et al., 1996, Biochem J. 313:761-767を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。細菌ルシフェリン・ルシフェラーゼ系は、陸生のフォロラブダス・ルミネセンスの細菌lux遺伝子（Photorhabdus luminescens）（たとえばManukhov et al., 2000, Genetika 36:322-30を参照されたい）並びに海洋細菌ビブリオ・フィシェリ（Vibrio  fischeri）の遺伝子およびビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（それぞれ、Miyamoto et al., 1988, J. Biol. Chem.  263:13393-9,およびCohn et al., 1983, PNAS 80:120-3を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。本発明によって本願されるルシフェラーゼは、U.S. Patent NOs. 6,265,177に記載されている変異体ルシフェラーゼも含む。
【０２１１】
もう一つの態様において、緑色蛍光タンパク質（「GFP」）は、リポーター遺伝子である。GFPは、発色団の形成に関与する65〜67アミノ酸を有する238アミノ酸のタンパク質であり、蛍光を発するためにさらなる基質または補因子を必要としない（たとえば、Prasher et al., 1992, Gene 111:229-233; Yang et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:1252-1256; and Cody et al., 1993, Biochemistry 32:1212-1218を参照されたい）。
【０２１２】
本明細書に使用されるものとして、「緑色蛍光タンパク質」または「GFP」の用語は
全てのGFP（緑以外の色を示すGFPの種々の形態を含む）またはGFP活性を有するGFPに由来する組換え酵素を包含することが企図される。GFPの天然の遺伝子は、生物発光クラゲのエクオリア・ビクトリア（Aequorea victoria）からクローン化された（たとえばMorin et al., 1972, J. Cell Physiol. 77:313-318を参照されたい）。野生型GFPは、395nmに主な励起ピークを、および470nmに微量の励起ピークで有する。470nmで吸収ピークにより、標準的なフルオレッセインイソチオシアネート（FITC）フィルターセットを使用して、GFPレベルをモニタリングすることができる。GFP遺伝子の変異体は、発現を増強し、励起および蛍光を修飾するために有用であることが見いだされた。たとえば、位置65のセリンをアラニン、グリシン、イソロイシンまたはスレオニンで置換された変異体GFPは、488nmで励起したときに、励起極大がシフトし、野生型タンパク質よりも強い蛍光を有する変異体GFPを生じる（たとえば、Heim et al., 1995, Nature 373:663-664; U.S. Patent No.  5,625,048; Delagrave et al., 1995, Biotechnology 13:151-154; Cormack et al., 1996, Gene 173:33-38; and Cramer et al., 1996, Nature Biotechnol. 14:315-319を参照されたい）。488nmでGFPを励起する能力により、標準的な蛍光標示式細胞分取（「FACS」）設備でのGFPの使用が可能になる。もう一つの態様において、GFPは、シー・パンジー（sea panzy）（Renilla reniformis）などのクラゲ以外の生物体から単離されるが、これに限定されない。
【０２１３】
一般にGFPで細胞をラベリングするための技術は、U.S. Patent Nos. 5,491,084 および5,804,387; Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805; Heim et al., 1994, PNAS 91:12501-12504; Morise et al., 1974, Biochemistry 13:2656-2662; Ward et al., 1980, Photochem. Photobiol. 31:611-615; Rizzuto et al., 1995, Curr. Biology 5:635-642;並びにKaether & Gerdes, 1995, FEBS Lett. 369:267-271に記載されている。大腸菌および線虫におけるGFPの発現は、U.S. Patent NOs. 6,251,384に記載されている。植物細胞におけるGFPの発現は、Hu & Cheng, 1995, FEBS Lett. 369:331-33に論議されており、ショウジョウバエにおけるGFP発現は、Davis et al., 1995, Dev.  Biology 170:726-729に記載されている。
【０２１４】
もう一つの態様において、リポーター遺伝子、βガラクトシダーゼ（「β-gal」）が使用される。β-galは、β-ガラクトシダーゼ（たとえば、ラクトース）並びにガラクトシド類似体（たとえば、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（「ONPG」）およびクロロフェノールレッド-β-D-ガラクトピラノシド（「CPRG」））の加水分解を触媒する酵素である（たとえばNielsen et al., 1983 PNAS 80:5198-5202; Eustice et al., 1991, Biotechniques 11:739-742;よびHenderson et al., 1986, Clin. Chem. 32:1637-1641を参照されたい）。
【０２１５】
本明細書に使用されるものとして、「β-ガラクトシダーゼ」または「β-gal」の用語は、lacZ遺伝子産物またはβ-galな活性を有するβ-galsに由来する組換え酵素を含む、全てのβ-galを包含することが企図される。β-gal遺伝子は、タンパク質産物が極めて安定で、細胞可溶化液中でのタンパク分解性の分解に抵抗性であり、容易にアッセイされるために、リポーター遺伝子として満足に機能する。ONPGが基質である態様において、β-gal活性を分光光度計またはマイクロプレートリーダーで定量化して、420nmでの変換ONPGの量を決定することができる。CPRGが基質である態様において、β-gal活性を活性を分光光度計またはマイクロプレートリーダーで定量化して、570〜595nmで変換されるCPRGの量を決定することができる。さらにもう一つの態様において、β-gal活性は、XgalおよびIPTGを含むプレート上へβ-gal構築物で形質転換された細菌細胞をまくことによって視覚的に確認することができる。濃青色である細菌コロニーは、高いβ-galな活性の存在を示し、ばらついた青い陰のコロニーは、様々なレベルのβ-galな活性を示す。
【０２１６】
一つの態様において、リポーター遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）が使用される。哺乳動物細胞は、検出可能なレベルのCAT活性を有さないので、CATは、哺乳類細胞システムのリポーター遺伝子として共通して使用される。CATのアッセイ法は、放射性ラベルしたクロラムフェニコールおよび適切な補因子と共に細胞抽出物をインキュベートすること、たとえば薄層クロマトグラフィー（「TLC」）によって開始材料を生成物から分離すること、続いてシンチレーション計数することを含む（たとえば、U.S. Patent NOs. 5,726,041を参照されたい）。
【０２１７】
本明細書に使用されるものとして、「クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ」または「CAT」の用語は、全てのCATまたはCAT活性を有するCATに由来する組換え酵素を包含することが企図される。細胞プロセシング、放射性同位元素、およびクロマトグラフ分離を必要としないリポーター系は、高スループット・スクリーニングにより受け入れられるであろうことが好ましいが、リポーター遺伝子としてのCATは、リポーター遺伝子の安定性が重要な状況において好ましいであろう。たとえば、CATリポータータンパク質は、約50時間のインビボでの半減期を有し、結果の累積的な変化、対、動的な変化タイプが要求されるときに有利である。
【０２１８】
もう一つの態様において、リポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ（「SEAP」）が使用される。SEAP酵素は、アルカリホスファターゼの切断型であり、タンパク質の膜貫通領域の切断により、周囲の培地に細胞から分泌することができる。好ましい態様において、アルカリホスファターゼは、ヒト胎盤から単離される。
【０２１９】
本明細書に使用されるものとして、「分泌型アルカリホスファターゼ」または「SEAP」の用語は、全てのSEAPまたはアルカリホスファターゼ活性を有するSEAPに由来する組換え酵素を包含することが企図される。SEAP活性は、蛍光基質の触媒作用の測定、免疫沈降、HPLC、および放射測定の検出を含む（しかし、これらに限定されない）種々の方法によって検出することができる。発光の方法は、熱量測定検査法以上にその増大された感受性のために好ましい。SEAPを使用することの利点は、SEAPタンパク質が細胞から分泌さるので、細胞溶解工程が必要とされず、標本抽出およびアッセイ法の自動化が容易になることである。C型肝炎ウイルス・プロテアーゼの阻害剤の、細胞に基づいた評価に使用するためのSEAPを使用する、細胞に基づいたアッセイ法は、U.S. Patent NOs. 6,280,940号に記載されている。
【０２２０】
5.4.2  線虫に基づいたアッセイ法  
5.4.2.1  排便速度に基づいたアッセイ法  
本発明は、試験表現型として排便サイクルの長さを使用するアッセイ法を特徴とする。線虫において、排便は、常同的な排便運動プログラム（Defecation Motor Program：DMP）によって遂行される。DMPは、3つの異なった工程からなる：後方の体筋収縮（pBoc）、前体筋収縮（aBoc）、および腸内の筋収縮（EMC）からなる放出（Exp）（Thomas et al., 1990, Genetics 124: 855-872.）。排便サイクル長は、2つの連続した排便のpBoc工程の間の期間として定義される。野生型動物では（十分な食品の存在において）、排便サイクル長は、〜56秒であり、±3.4秒（20℃で）の標準偏差である。排便サイクル（たとえば、clk-1突然変異）の長さおよび／または周期現象に影響を及ぼす突然変異は、このアッセイ法に使用することができる。
【０２２１】
一つの態様において、変異体clk-1は、アッセイ法に使用される。前述したように（Felkai et al., 1999、EMBO J 18：1783〜1792、およびWong et al.（1995）Genetics 139：1247-1259）、clk-1変異体では、排便サイクルは、長さが増大され、より不規則であり：clk-1（qm30）動物では、サイクルの長さが88秒であり、±14秒の標準偏差を有し、およびより弱い対立遺伝子clk-1（e2519）では、77秒であり、±7秒の標準偏差を有する（20℃で）。
【０２２２】
20℃での排便サイクル長に加えて、新たな温度へ移された後に変異体線虫がこれらの排便サイクルの長さを再調整する能力も影響を受ける。野生型虫とは対照的に、clk-1変異体は、新たな温度へ移された後にこれらの排便サイクルの長さを再調整することができない。clk-1変異体が20℃から25℃に、または20℃から15℃に移されたときに、平均サイクル長は、いずれも不変である。変異体表現型のこの側面のレスキューは、より低い温度（たとえば、15℃）サイクル長の増大およびより高い温度（たとえば、25℃）でのサイクル長の減少を回復する。たとえば、clk-1変異体虫に添加された試験化合物アッセイ法により、これらがclk-1/dsc-3二重突然変異体虫またはclk-1/dsc-4二重突然変異体を表現型模写する能力に基づいて同定することができる。ある種の態様では、変異体虫および試験化合物を有する虫の表現型がより高いおよびより低い温度下で測定される。
【０２２３】
さらにその他の関連した態様において、線虫の排便サイクルの変化によって特徴づけられる1つもしくは複数の遺伝子またはこれらの変異体は、本発明のスクリーニングアッセイ法に使用することができる。
【０２２４】
もう一つの態様において、本方法は、発現レベルが排便と関係する指標遺伝子の制御配列に動作可能に連結されたリポーター遺伝子によってコードされるリポーターの発現を検出することを含む。加えて、指標遺伝子の発現プロフィールを使用してもよい。プロモーターを使用することができる例示的な指標遺伝子は、公的にアクセスできるデータベースに記載されているものを含む（たとえばWormbase, http://www.wormbase.org/; NEXTDB, http://nematode.lab.nig.ac.jp/;ホープ研究室発現パターン・データベース（The Hope Laboratory Expression Pattern Database）, http://129.11.204.86:591/default.htm）。
【０２２５】
5.4.2.2  生殖系列発達の速度に基づくアッセイ法  
本発明は、試験表現型として生殖系列発達の速度を使用するアッセイ法を特徴とする。野生型線虫において、細胞体および生殖系列は、同じ速度で発達する。細胞体／生殖系列の発達の同時発生に影響を及ぼす突然変異（たとえば、clk-1突然変異）は、このアッセイ法に使用することができる。一つの態様において、変異体clk-1は、アッセイ法に使用される。clk-1変異体は、一般に生殖系列の発達が細胞体よりもゆっくりとなるように、生殖系列と細胞体との間の発達の速度の同期の破壊によって特徴づけられる期外発生の表現型を示す。第7.2節に記載されている実験によって証明されるように、この表現型の抑制は、低レベルのコレステロール摂取、LDL様タンパク質の産生および／または分泌のレベルの減少、または低レベルのLDL様タンパク質の酸化と関係していた。対照線虫と比較した生殖系列発達の速度の促進または正常な速度への復活は、このアッセイ法においてポジティブとスコアされる。生殖系列発達の速度は、ピークの産卵速度が達成される時期、後方生殖系列の近端部の卵母細胞がある時期、および配偶子形成の開始がある時期を含む（しかし、これらに限定されない）多くの方法で測定することができる。
【０２２６】
一つの態様において、ピークの産卵速度は、clk-1突然変異の抑制因子をスクリーニングするために使用される。clk-1変異体線虫（C. elegans）は、野生型線虫（C. elegans）よりも3倍ゆっくりとこれらの産卵速度のピークに達する（成体への脱皮の後72時間に対し24時間）。変異誘発された線虫clk-1つの変異体を、成体に脱皮した約24時間後にピークの産卵速度に達するものを検査することができる。
【０２２７】
もう一つの態様において、後方生殖系列の近端部の卵母細胞は、clk-1突然変異の抑制因子をスクリーニングするために使用される。線虫成体の雌雄同体生殖腺は、2本のU型のアーム（前方および後方）からなり、それぞれは貯精嚢において終わる。2つの貯精嚢（遠位端）は、生殖腺アームを、受精卵を貯臓する子宮に連結し、外陰部（近端部）で融合する。生殖系列の発達段階では、遠位の基部軸に沿って分極化する。大部分の精子形成は、近位の生殖腺で起こる。卵形成のためには、それぞれの生殖腺の遠位のアームが、有糸分裂を受けている胚細胞核を含む合胞体を形成する。近位に移動して、胚細胞は、分裂周期を出て、減数分裂の第一期通って進む。成体脱皮の6時間後に、野生型線虫（C. elegans）は、前方および後方の生殖系列の近端部に卵母細胞を有する。比較すると、卵形成の発達は、clk-1変異体において劇的に遅延性である。約3%のclk-1線虫だけが、成体脱皮の6時間後までに卵形成を開始した。変異誘発されたclk-1線虫は、成体脱皮の6時間後までに卵形成を開始したものについて検査することができる。
【０２２８】
さらにもう一つの態様において、配偶子形成の開始は、clk-1の抑制因子をスクリーニングするために使用される。野生型線虫（C. elegans）は、成体脱皮の1.5時間後に第一精母細胞形成を完了する。対照的に、clk-1変異体線虫は、成体脱皮の1.5時間後に第一精母細胞形成を開始しなかったか、またはちょうど開始した。変異誘発されたclk-1線虫は、成体脱皮の1.5時間後に第一精母細胞形成を完了するものについて検査することができる。
【０２２９】
さらにもう一つの態様において、本方法は、発現レベルが生殖系列発達と関係する指標遺伝子の制御配列に動作可能に連結されたリポーター遺伝子によってコードされるリポーターの発現を検出することを含む。加えて、指標遺伝子の発現プロフィールを使用してもよい。本プロモーターを使用することができる例示的な指標遺伝子は、ark-1、itr-1、およびletを60含むが、これらに限定されない。第5.4.2節に記載されている実験は、発現レベルが生殖系列発達と関係するこのような指標遺伝子の使用を証明する。本プロモーターを使用することができる例示的な指標遺伝子のその他の例は、Reinke et al., 2000, Mol. Cell 6:605-16; Colaiacovo et al., Genetics 2002 Sep;162:113-28または公的にアクセスできるデータベース（たとえばWormbase, http://www.wormbase.org/; NEXTDB, http://nematode.lab.nig.ac.jp/;ホープ研究室発現パターン・データベース（The Hope Laboratory Expression Pattern Database）, http://129.11.204.86:591/default.htm）に開示したものを含む。
【０２３０】
5.4.2.3  胚発生の速度に基づくアッセイ法  
本発明は、試験表現型として胚発生の速度を使用するアッセイ法を特徴とする。線虫の同調的な集団は、母から2〜4細胞段階の胚を解剖すること、および新たなプレート上にこれらを配置することによって得ることができる（たとえば、Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259を参照されたい）。野生型線虫において、胚発生は、13時間要する。胚発生の速度に影響を及ぼす突然変異（たとえば、clk-1）を本アッセイ法に使用することができる。
【０２３１】
一つの態様において、変異体clk-1は、アッセイ法に使用される。clk-1変異体線虫の胚発生は、17〜22時間の間を要する。
【０２３２】
もう一つの態様において、本方法は、発現レベルが胚発生と関係する指標遺伝子の制御配列に動作可能に連結されたリポーター遺伝子によってコードされるリポーターの発現を検出することを含む。加えて、指標遺伝子の発現プロフィールを使用してもよい。本プロモーターを使用することができる例示的な指標遺伝子は、公的にアクセスできるデータベースにおいて記載されているものを含む（たとえばWormbase, http://www.wormbase.org/; NEXTDB, http://nematode.lab.nig.ac.jp/;ホープ研究室発現パターン・データベース（The Hope Laboratory Expression Pattern Database）, http://129.11.204.86:591/default.htm）。
【０２３３】
5.4.2.4  後胚発生の速度に基づくアッセイ法  
本発明は、試験表現型として後胚発生の速度を使用するアッセイ法を特徴とする。線虫の同調的な集団は、新たなプレートに卵を拾い、1時間後に検査することによって得ることができる（たとえば、Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259を参照されたい）。この期間中に孵化する動物がアッセイ法にに使用される。野生型線虫は、孵化の45〜51時間後の間に成体期に達する。後胚発生の速度に影響を及ぼす突然変異（たとえば、clk-1）をアッセイ法に使用することができる。
【０２３４】
一つの態様において、線虫clk-1つの変異体は、アッセイ法に使用される。これらの変異体は、孵化の63〜81時間後の間に成体期に達する。
【０２３５】
もう一つの態様において、本方法は、発現レベルが後胚発生と関係する指標遺伝子の制御配列に動作可能に連結されたリポーター遺伝子によってコードされるリポーターの発現を検出することを含む。加えて、指標遺伝子の発現プロフィールを使用してもよい。本プロモーターを使用することができる例示的な指標遺伝子は、公的にアクセスできるデータベースにおいて記載されているものを含む（たとえばWormbase, http://www.wormbase.org/; NEXTDB, http://nematode.lab.nig.ac.jp/;ホープ研究室発現パターン・データベース（The Hope Laboratory Expression Pattern Database）, http://129.11.204.86:591/default.htm）。
【０２３６】
5.4.2.5  本発明の遺伝子変異およびアッセイ法  
本発明の方法の一定の態様において、本方法は、1つまたは複数の遺伝子に突然変異を含む線虫で行われる。このような変異体は、スクリーニングおよび／またはバリデーション実験のための、および複数の突然変異を有する虫を作製するための、望ましい遺伝的バックグランドを提供する。他の好ましい態様では、変異体線虫（C. elegans）は、clk-1、dsc-3、またはdsc-4遺伝子の1つまたは複数に、ノックアウト（機能喪失）または機能調整の突然変異を含む。本発明の一定の態様に従って、突然変異は、clk-1、dsc-3、またはdsc-4のドメインの1つまたは複数の置換、欠失、または挿入変異である。
【０２３７】
関連した態様において、本発明の方法は、clk-1突然変異およびその他の遺伝子の1つまたは複数の突然変異を含む変異体線虫で行われる。関連した態様において、本発明の方法は、clk-1突然変異およびdsc-3の1つまたは複数の突然変異を含む変異体線虫で行われる。関連した態様において、本発明の方法は、clk-1突然変異およびdsc-4の1つまたは複数の突然変異を含む変異体線虫で行われる。本発明の方法に有用な突然変異の例は、clk-1（e2519）、dsc-3（qm180）、およびdsc-3（qm184）を含むが、これらに限定されない。このような組み合わせの変異体バックグランドの非限定の例は、clk-1（qm30）／dsc-3（qm184）を含む。
【０２３８】
本発明の1つの側面よれば、clk-1、dsc-3、またはdsc-4突然変異を含む線虫は、以下の1つまたは複数の発現をブロックするための1つまたは複数のRNAi抑制構築物をさらに含むことができる：fat-2、fat-3、elo-1、elo-2、vit-2、vit-3、vit-4、vit-5、vit-6、sod-1、sod-2、sod-3、sod-4、またはlet-60。コレステロールおよび／またはLDL代謝、排便サイクル、生殖系列発達の速度、またはROSレベルに関与するその他の遺伝子の発現は、また、本発明の方法に使用される望ましい生物学的バックグランドをもつ線虫を作製するためにRNAiを使用してブロックすることができる。関連した態様において、遺伝子の1つまたは複数を、周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイム、および／または三重らせん体法などの共通に使用される当該技術分野のその他の技術を使用して抑制することができる。
【０２３９】
関連した態様において、変異体線虫（C. elegans）は、排便サイクルの調整を生じる遺伝子にノックアウト（機能喪失）または機能調整の突然変異を含む。このような突然変異の例は、itr-1（sa73）およびisp-1（qm150）を含むが、これらに限定されない。
【０２４０】
関連した態様において、変異体線虫（C. elegans）は、vit-2、vit-3、vit-4、vit-5、またはvit-6遺伝子の1つまたは複数に、ノックアウト（機能喪失）または機能調整の突然変異を含む。これらの遺伝子は、線虫（C. elegans）の腸細胞によって分泌されるapoB相同体であるビテロゲニンをコードする。また、ビテロゲニンは、卵黄リポタンパク質のにおいて機能することが既知である。第8.2節において本明細書で提示した結果は、apoB依存的なLDL粒子に似ており、かつ卵黄リポタンパク質粒子とは異なるであろうリポタンパク質粒子におけるビテロゲニンの機能が、脊椎動物において見いだされたことを示す。apoBは、哺乳類の腸におけるLDL粒子の合成および分泌に関与しているので、vit遺伝子の変異体も、LDL取り込みまたはコレステロール・レベルを調整する化合物を同定するための本発明の方法に使用することができる。
【０２４１】
その他の関連した態様において、変異体線虫は、活性酸素種（ROS）レベルの変化を生じる1つまたは複数の遺伝子にノックアウト（機能喪失）または機能調整の突然変異を含む。たとえば、本発明の一定の態様において、変異体バックグランドは、clk-1、sod-1、sod-2、sod-3、またはsod-4に突然変異を含むことができる。一定の本発明の態様に従って、本発明の方法は、動物モデルで実施してもよい。たとえば、1つまたは複数の遺伝子、遺伝子の変異形、または本明細書において記載された遺伝子を抑制するようにデザインされた構築物により、線虫、マウス、またはラットなどの生物体に形質転換することができる。次いで、このような形質転換された動物を本発明の方法において化合物を同定するために使用することができる。
【０２４２】
5.4.2.6  ATPaseアッセイ法  
ATPase酵素は、必須膜タンパク質である酵素の大きなファミリーである。該酵素は、金属、イオン、およびリン脂質などの薬剤を、ATPを使用して膜を越えて輸送する（Harris et al, 2003, Biochim. Biophys. 1633:127-131）。ヒトATP8B1／FIC1遺伝子の突然変異などのATPaseの突然変異は、バイラー病に特徴的な胆汁うっ滞性の表現型を生じる（Trauner et al, 2002, Physiol. Rev. 83:633-671）。胆汁うっ滞性の疾患は、肝臓内の胆汁の流れが障害される症状であり、ATP8B1／FIC1などの（しかし、これに限定されない）ATPase酵素が胆汁酸輸送および分泌において役割を果たすことを示唆する。また、ATPase酵素は、膜を越えた脂質輸送を容易にする血漿膜リン脂質の非対称を維持することに関与する（Daleke、2003、J. Lip. Res. 44：233-242）。ATP8B1／FIC1は、CHOK1細胞に発現され、次いで膜において脂質の分布の変化が観察された場合には、これらの細胞の膜において同定される（Ujhazy et al., 2001、Hepatology 34：768-775）。
【０２４３】
dsc-3は、下記の実施例切片にて説明したように、ATPaseに類似点を有して、ATPase酵素活性を調整することによってその生物学的機能を調整する化合物のスクリーニングアッセイ法に使用することができる。DSC-3は、当該技術分野において既知の技術によって得ること、または作製することができる。たとえば、DSC-3は、dsc-3を発現する組換えまたは正常細胞の膜から、またはDSC-3を組換えで産生するようにデザインされた細胞において単離することができる。次いで、DSC-3酵素は、試験化合物の存在下および非存在下でATPおよび脂質の量と接触させることができ、試験化合物の存在下および非存在下で生じるATPの量は、試験化合物が酵素の活性を調整するかどうかを示す。関連した態様において、ATPは、ラベルされている。
【０２４４】
また、dsc-3は、膜を越えた脂質輸送を調整する化合物のスクリーニングアッセイ法に使用することができる。このようなアッセイ法では、単離された膜または膜を含むDSC-3を有する全細胞を、試験化合物の存在下および非存在下で脂質と接触させることができる。たとえば、ラベルされた脂質を、試験化合物の存在下および非存在下で膜を含むDSC-3を有する細胞に接触して、ラベルされた脂質の細胞内および細胞外分布の変化を試験化合物の存在下および非存在下で観察する場合には、DSC-3脂質輸送を調整する化合物が同定される。
【０２４５】
また、dsc-3は、胆汁うっ滞性疾患の治療および予防に有用であろう、胆汁酸の輸送および／または分泌を調製する、すなわち増強するか、または阻害する化合物のスクリーニングアッセイ法に使用することができる。たとえば、マウスなどの胆汁酸の輸送および／または分泌を示す生物体を形質転換してdsc-3を発現させることができる。胆汁酸分泌のレベルに対する効果は、形質転換されたマウスと形質転換されていないマウスの胆汁液をサンプリングすることによって測定することができる。また、このようなトランスジェニック・マウスは、胆汁酸の輸送および／または分泌を調整する化合物をスクリーニングするために使用することができる。たとえば、肝臓の胆汁酸のレベルを、試験化合物の存在下および非存在下でdsc-3を発現するマウスで測定することができ、その結果、胆汁のレベルが試験化合物の存在下および非存在下で異なる場合、胆汁酸を調整する化合物が同定される。
【０２４６】
本発明の一定の態様において、dsc-3またはdsc-4に対応するヒト遺伝子を形質転換されたマウスに発現させて、胆汁うっ滞性疾患の治療および予防に有用であろう、胆汁酸の輸送および／または分泌を調整する化合物をスクリーニングすることができる。関連した態様において、dsc-3またはdsc-4に対応するヒト遺伝子は、dsc-3またはdsc-4に対して約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはよりも大きな類似性を有する。
【０２４７】
5.4.3  線虫に基づかないアッセイ法  
また、本発明は、線虫（C. elegans）を含まないインビボ・アッセイ法を含む。一つの態様において、clk-1または本発明のMOLLに結合するポリペプチドまたは薬剤は、酵母ツー・ハイブリッド・スクリーンを使用して同定される。当該技術分野において既知のいずれの方法も、このようなツー・ハイブリッド・スクリーンを行うために使用することができる。ツーハイブリッド系の一つのバージョンが記載されており（Chien et al., 1991, PNAS 88:9578-9582）し、Clontech（Palo Alto, CA）から商業的に入手可能である。一つの態様において、clk-1またはMOLLを結合するポリペプチドが同定される。このような態様では、同定されたポリペプチドは、それ自体がMOLLであるかどうかを調べるために試験することができ、したがって、上記論議したように（第5.3.1.1〜5.3.1.4節を参照されたい）、定方向突然変異生成技術を使用する標的として有用である。あるいは、同定されたポリペプチドは、それと結合する薬剤を同定するために使用することができる。もう一つの態様において、clk-1またはMOLLに結合する薬剤が同定される。このような態様では、同定された薬剤は、以前に記載されているスクリーニングでの活性によって証明されるように（第5.3.2節を参照されたい）、それが本発明の薬剤であるかどうかを調べるため試験することができるする。
【０２４８】
5.4.4  インビトロでの生化学的アッセイ法  
本発明のMOLLポリペプチド（たとえば、dsc-4）と結合する化合物は、当該技術分野において既知のいずれの方法によっても同定することができる。たとえば、電気泳動法、サイズ排除クロマトグラフィー、および質量分析を含む（しかし、これらに限定されない）、本発明の結合していないポリペプチドから、試験化合物と複合体を形成した本発明のMOLLポリペプチドの物性（たとえば、サイズ、移動度、その他）の変化を検出するいずれの方法も、本発明の方法に使用することができる。また、アフィニティークロマトグラフィー、シンチレーション近接アッセイ法、核磁気共鳴分光法、および蛍光共鳴エネルギー転移を含む（しかし、これらに限定されない）、本発明および試験化合物のMOLLポリペプチド間の結合を検出するその他の方法を直接使用することができる。
【０２４９】
第一の態様において、電気泳動法は、本発明のMOLLポリペプチドに結合することができる試験化合物を同定するために使用される。一般に、試験化合物に結合した本発明のMOLLポリペプチドは、本発明の結合していないMOLLポリペプチドよりも大きい。サイズに基づく電気泳動分離により、このようなサイズの変化を決定することができる。変性および非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、尿素ゲル電気泳動、ゲル濾過、パルスフィールドゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動、連続流電気泳動、ゾーン電気泳動、アガロースゲル電気泳動、並びにキャピラリー電気泳動法を含む（しかし、これらに限定されない）、いずれの電気泳動分離法を使用することもできる。
【０２５０】
好ましい態様において、キャピラリー・カートリッジ（たとえばU.S. Patent Nos. 5,885,430; 5,916,428; 6,027,627；5,916,428；6,027,627；および6,063,251を参照されたい）またはチップ（たとえば、U.S. Patent Nos. 5,699,157；5,842,787；5,869,004；5,876,675；5,942,443；5,948,227；6,042,709；6,042,710；6,046,056；6,048,498；6,086,740；6,132,685；6,150,119；6,150,180；6,153,073；6,167,910；6,171,850；および6,186,660を参照されたい）を含む（しかし、これらに限定されない）、自動化された電気泳動系を使用することができる。
【０２５１】
他の好ましい態様において、分離のゲル電気泳動法は、試験化合物に結合していない、または結合した本発明のMOLLポリペプチドの移動度を区別するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、好ましくは非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む。もう一つの態様において、電気泳動法によって分離される本発明のMOLLポリペプチドは、免疫ブロットのために膜へ転写される。このような技術は、当業者に周知であろう。
【０２５２】
第二の態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、本発明のMOLLポリペプチドを結合できる試験化合物を同定するために使用される。サイズ排除クロマトグラフィーは、これらのサイズに基づいて分子を分離し、特定の粒度分布を有するビーズから構成されるゲルに基づいた媒体を使用する。カラムに適用したときは、この媒体は、きつく圧縮されたマトリックスに定着し、孔の複雑なアレイを形成する。分離は、分子の大きさに基づいてこれらの孔によって分子が含まれ、または排除されることによって達成される。小分子は孔に含まれ、従ってマトリックスを通ってこれらが移動することにより、これらが溶出前に進行しなければならない距離が加算されるために遅れる。大分子は、マトリックスに適用されると、孔から締め出され、空隙容量とともに移動する。本発明において、試験化合物に結合した本発明のMOLLポリペプチドは、より大きく、したがって結合していないMOLLポリペプチドよりもサイズ除外カラムからより迅速に溶出される。
【０２５３】
第三の態様において、質量分析は、本発明のポリペプチドに結合することができる試験化合物を同定するために使用される。何千もの成分を含む複合混合物を解析することができ、かつバックグラウンド・ノイズを補正し、荷電したピークおよび原子同位体ピークを増加させることができる質量分析計データを解析するための自動化された方法は、U.S. Patent No.  6,147,344に記載されている。U.S. Patent No.  6,147,344に開示される系は、対照試料測定を行ってバックグラウンド・ノイズ検査を提供する質量分析計データを解析するための方法である。時間の関数としてのそれぞれのm／z比でピークの高さおよび幅の値がメモリーに記憶される。解析される材料に対する質量分析計の操作を行い、時間に対するそれぞれのm／z比でのピークの高さおよび幅の値を2次のメモリーロケーションに記憶させる。解析される材料に対する質量分析計の操作を繰り返して固定された回数行い、それぞれの時間増分のそれぞれのm／z比レベルで記憶された対照試料の値を、それぞれの対応する最適な実行のものから減算し、したがってそれぞれの時間増分で複数の実行のそれぞれについて、それぞれの質量比で異なる値を生じる。MS値引くバックグラウンド・ノイズが、設定値を上回らない場合、m／z比のデータポイントは記録されず、したがって、質量分析計データからバックグラウンド・ノイズ、化学的ノイズ、および偽陽性ピークが除去される。次いで、複数の実行のそれぞれについての記憶データを、それぞれのm／z比での予め定められた値と比較して、ピークが有意であるm／z位置で生じる一連のピーク（これは、ここでバックグランド以上であることが決定される）を記憶する。
【０２５４】
第四の態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、本発明のMOLLポリペプチドに結合することができる試験化合物を同定するために使用される。これを達成するために、本発明のMOLLポリペプチドは、本発明のMOLLポリペプチドが親和性タグおよび固体支持体との相互作用を介して固体担体に付着することができるように、親和性タグ（たとえば、GST、HA、真菌、ストレプトアビジン、ビオチン）でラベルされる。本発明のタグの付いたMOLLポリペプチドを、溶液中で遊離しているか間、または固体担体に結合した間に試験化合物と接触させる。固体担体は、典型的には含まれる、親和性タグのためのリガンドと結合する架橋されたアガロースビーズで構成されるが、これに限定されない。あるいは、固体担体は、ガラス、シリコン、金属、または炭素、プラスチック（ポリスチレン、ポリプロピレン）であって、共有結合で付着された親和性タグのためのリガンドか、または本発明のMOLLポリペプチド上のタグに対して固有の親和性を有する自己構築された単層を伴っても、伴わなくてもよい。一旦本発明のMOLLポリペプチドと試験化合物との間の複合体が平衡に達して、捕獲されたならば、当業者であれば、結合した化合物の保持および結合していない化合物の除去を大過剰の結合反応緩衝液で固体担体を洗浄することによって容易に行うことができることを認識するであろう。さらにまた、高親和性化合物の保持および低親和性化合物の除去は、洗浄のストリンジェンシーを増大する多くの手段によって達成することができ；これらの手段には、洗浄の回数および期間を増大すること、洗浄緩衝液の塩濃度を増大すること、洗浄緩衝液に洗浄剤または界面活性物質を添加すること、および洗浄緩衝液に非特異的な競合者を添加することを含むが、これらに限定されない。結合していない化合物の除去に続いて、本発明の固定されたMOLLポリペプチドに対して高親和性を有する結合した化合物を溶出して解析することができる。試験化合物の溶出は、本発明のポリペプチドと試験化合物との間の非共有結合性の相互作用を破壊するいずれの手段によっても達成することができる。溶出のための手段は、pHを変えること、塩濃度を変えること、有機溶媒を適用すること、および結合したリガンドと競合する分子を適用することを含むが、これらに限定されない。好ましくは、溶出のために使用される手段は、本発明のMOLLポリペプチドから化合物を放出するが、親和性タグと固体担体との間の相互作用はなされないことにより、試験化合物の選択的な溶出を達成する。
【０２５５】
第5の態様において、シンチレーション近接アッセイ法（「SPA」）は、本発明のポリペプチドに結合することができる試験化合物を同定するために使用される。本態様において、本発明のポリペプチドまたは試験化合物が、ラベルされなければならない（たとえば、放射性同位元素、その他によって）。ラベルされていない実体は、シンチラント（scintillant）を含浸させた表面に付着される。次いで、ラベルされた実体を、結合が可能な条件下で、付着されたラベルされていない実体と共にインキュベートする。本発明のポリペプチドと試験化合物との間の結合の量は、シンチレーションカウンターによって定量化される（Cook, 1996, Drug Discov. Today 1:287-294; Mei et al., 1997, Bioorg. Med. Chem. 5:1173-1184; Mei et al., 1998, Biochemistry 37:14204-14212）。高スループットスクリーニングSPAでは、シンチラントをプラスチックに直接組み入れるか（Nakayama et al., 1998, J. Biomol. Screening 3:43-48）、またはプラスチックに被覆することのいずれかのマイクロプレートを使用する。好ましい態様において、このようなマイクロタイタープレートが、本発明の方法であって、（a）放射性ラベルを有する本発明のMOLLポリペプチドをラベルすることと；（b）シンチラントで被覆されたマイクロタイターウェルに付着された試験化合物とラベルされたMOLLポリペプチドを接触させることと；および（c）SPAで試験化合物に結合した本発明のポリペプチドの量を同定し、定量化することを含む方法に使用される。
【０２５６】
第6の態様において、核磁気共鳴分光学（「NMR」）は、本発明のポリペプチドに結合することができる試験化合物を同定するために使用される。NMRは、緩和効果を使用して特異的に測定される距離から、化学シフトの中の変化を定性的に決定することによって試験化合物と結合する本発明のMOLLポリペプチドを同定するために使用される。NMRに基づいたアプローチは、タンパク質薬物標的の小分子結合剤の同定に使用されてきた（Xavier et al., 2000, Trends Biotechnol. 18:349-356）。小分子のライブラリーを用いたNMRによるリード生成のためのストラテジーは、記載されている（Fejzo et al., 1999, Chem. Biol. 6:755-769）。
【０２５７】
第7の態様において、蛍光共鳴エネルギー転移（「FRET」）は、本発明のポリペプチドに結合することができる試験化合物を同定するために使用される。本態様において、本発明のMOLLポリペプチドおよび試験化合物は、異なる蛍光分子（すなわち、フルオロフォア）でラベルされる。重複する発光および励起波長のバンドを有する2つのフルオロフォアが、結合イベントなどにより近くに近接して共に保持されると、蛍光の特性に変化が生じる。ラベルとして使用されるフルオロフォアのうちの一方は、ラベルとして使用される他方のフルオロフォアと重複する励起および発光スペクトルを有し、その結果、一方のフルオロフォア（ドナー）が他方のフルオロフォア（アクセプター）にその発光エネルギーを転移して励起する。アクセプターは、好ましくは基底状態にリラックスすると、即座に異なる波長の光を放射するか、または非放射性にリラックスして蛍光をクエンチする。FRETは、2つのフルオロフォアの間の距離に非常に感受性であり、10nm未満の分子距離を測定することができる（たとえば、U.S. Patent 6,337,183 and Matsumoto et al., 2000, Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1857-1861）。
【０２５８】
5.5  予防／治療の方法  
本発明は、脂質またはリポタンパク質の望ましくない／異常なレベル、またはROSと関係する障害を、本発明の1つまたは複数の薬剤の治療的または予防的に有効な量をこれらが必要な被検者に投与することによって治療し、予防し、管理するための方法を提供する。本発明の薬剤は、単独で、またはMOLLに基づいていない障害の治療、予防、もしくは管理に有用な1つまたは複数のその他の予防的／治療的薬剤と組み合わせて投与することができる。被検者は、好ましくは、非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、その他）および霊長類（たとえば、カニクイザルなどのサルおよびヒト）を含む哺乳類であるが、これらに限定されない。好ましい態様において、被検者は、ヒトである。
【０２５９】
また、本明細書に記載されている方法および組成物は、望ましくない脂質プロフィールなどの、このような障害と関係する症状の改良のために適用してもよい。本発明の方法によって治療または予防することができる障害または症状の例は、心血管障害、心疾患、アテローム性動脈硬化症、血管疾患、脳血管障害、および肥満を含むが、これらに限定されない。説明のみの目的であって、本発明の方法および組成物によって治療される障害の範囲を限定しないが、心血管障害を一例として本明細書において以下で論議してある。
【０２６０】
心血管障害の一定の側面は、少なくとも一つには、遺伝子産物の過剰なレベルによって、または異常な、もしくは過剰な活性を示す遺伝子産物の存在によってもたらされる。従って、このような遺伝子産物のレベルおよび／または活性の減少は、障害症状の改良をもたらす。上記のように、高レベルの循環LDLおよびLDLの酸化は、心血管障害の発生において主要な役割を果たしている。一つの態様において、本発明は、LDLの形成および蓄積に関与する標的遺伝子産物、たとえば、LDLの成分であるアポタンパク質の合成に関与する標的遺伝子、並びにコレステロールなどの脂質のプロセスし、および輸送する酵素およびキャリアのレベルおよび／または活性を減少させる化合物の使用を提供する。もう一つの態様において、本発明は、酸化型のLDLの形成および蓄積に関与する標的遺伝子産物のレベルおよび／または活性を減少させる化合物の使用を提供する。
【０２６１】
その他の側面において、心血管障害は、少なくとも一つには、遺伝子発現レベルの非存在または減少によって、または遺伝子産物の活性レベルの減少によってもたらされる、従って、このような遺伝子産物の遺伝子発現レベルおよび／または活性の増加は、心血管障害症状の改良がもたらされるであろう。
【０２６２】
場合によっては、障害における遺伝子のアップレギュレーションは、障害の症状に反応する遺伝子産物の保護の役割を反映する。このような標的遺伝子の発現、または標的遺伝子産物の活性の増強は、これが及ぼす保護作用を補強すると考えられる。いくつかの心血管障害は、このような保護遺伝子の異常に低い活性レベルによって生じるであろう。これらの場合も、遺伝子発現のレベルおよび／またはこのような遺伝子産物の活性の増大により、心血管障害症状の改良がもたらされるであろう。
【０２６３】
一つの態様において、本発明の方法によって治療され、または予防される障害は、アテローム性動脈硬化症である。ヒトにおいて、これは、少なくとも一部には、過剰な酸化型LDLによってき起こされる。酸化型LDLは、マクロファージ上のスカベンジャー受容器を含む天然のLDLとは異なる受容体型によって認識される。次いで、これらのマクロファージは、アテローム性動脈硬化症の発症に関与する泡沫細胞を発生することができる。
【０２６４】
たとえば、上記した（たとえば、第5.4節）アッセイ法で同定されるものなどの、阻害力を示す化合物は、心血管障害を治療または予防するために、または症状を改善するために、本発明に従って使用してもよい。このような分子は、小有機分子、ペプチド、抗体、などを含んでもよいが、これらに限定されない。
【０２６５】
本発明の方法によって同定される薬剤または化合物は、疾患の治療または予防のために使用することができる。ある種の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、胆汁鬱帯を治療するために使用することができる。関連した態様において、胆汁うっ滞性疾患は、遺伝性の遺伝子欠損の結果として生じる。その他の態様において、胆汁うっ滞性疾患は、後天性である。胆汁うっ滞性疾患は、胆汁の流れの障害によって特徴づけられる（van Mil et al., 2001, Seminars in Liver Disease 21:4）。
【０２６６】
ある種の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、また、これらの必要な生物体に、または予防薬として、このような化合物を投与することによって活性酸素種（ROS）レベルを増大するために使用することができる。
【０２６７】
ある種の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、循環していてコレステロールのレベルの調整することを必要とする患者のコレステロール・レベルを調整するために使用することができる。その他の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、患者のコレステロール・レベルの増加を予防するために使用することができる。ある種の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、コレステロール代謝を調整することができる。
【０２６８】
ある種の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、動脈硬化またはアテローム性動脈硬化症などの、血管における脂質または脂肪の沈着の増大に関与する疾患を治療または予防するために使用することができる。その他の態様において、本発明の方法によって同定される化合物は、動脈硬化またはアテローム性動脈硬化症を予防するために使用することができる。
【０２６９】
5.5.1  治療的／予防的な有用性の測定  
本発明の方法および組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前に、所望の治療的または予防的な活性について、インビトロで、次いでインビボで試験されされる。たとえば、特定の治療方法での投与が示され定ルかどうかを下っていするために使用することができるインビトロでのアッセイ法は、患者の組織試料を培養液中で増殖して、治療薬に曝露するか、さもなければ投与して、組織試料に対するこのような薬剤の効果を観察するという、インビトロでの細胞培養アッセイ法を含む。あるいは、患者から細胞を培養する代わりに、関連した株化細胞（たとえば、内皮株化細胞）の細胞を使用して、薬剤および方法をスクリーニングしてもよい。
【０２７０】
治療に使用するための薬剤は、ヒトでの試験の前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスター、その他を含む（しかし、これらに限定されない）適切な動物モデル系において試験することができる。次いで、薬剤はを適切な臨床試験で使用することができる。
【０２７１】
本発明の予防および／または治療方法の毒性および有効性は、たとえば、LD50（集団の50%にとって致命的な用量）およびED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的手法によって決定することができる。
【０２７２】
中毒性の効果と治療的な効果との間の用量比は、治療係数であり、LD50／ED50比として表すことができる。大きな治療指標を示す、予防的および／または治療的な薬剤が好ましい。中毒性の副作用を示す予防的および／または治療的な薬剤を使用してもよいが、非感染細胞へのダメージの可能性を最小限にすることにより副作用を減少させるために、このような薬剤を患部組織の部位にターゲットするデリバリーシステムをデザインすることに注意すべきである。
【０２７３】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための予防的および／または治療的な薬剤の用量の範囲に処方する際に使用することができる。このような薬剤の用量は、毒性をほとんど、または全く有さないED50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変更してもよい。本発明の方法に使用されるいずれの薬剤についても、治療的に有効な用量は、まず最初に細胞培養アッセイ法から推定することができる。用量は、細胞培養において決定して、IC50（すなわち、症状の最大半減の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルで処方されてもよい。このような情報は、ヒトでの有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０２７４】
5.5.2  その他の予防的／治療的な薬剤との併用療法  
一部の態様において、本発明は、もう一つの予防的／治療的な薬剤と組み合わせて、本発明の1つまたは複数の薬剤を投与することによって障害を治療するための方法を提供する。いくつかの特定の態様において、本発明の薬剤との併用療法によって、予防的／治療的な投与量を減少することができ、その結果、予防的／治療的な薬剤をあまり頻繁に投与しなくてもよいであろうし、または不必要な／有害な効果が減少される。また、本発明は、併用予防薬／治療薬の有効性が、層化鉄器以上である相乗的な組み合わせを含む。ある種の態様において、本発明に含まれる併用予防薬／治療薬は、いずれの単独成分の投与と比較しても全体に改善された治療を提供する。
【０２７５】
また、本発明は、予防的／治療的な方法に対する被検者の感受性を増大する方法であって、本発明の薬剤（たとえば、MOLL核酸、MOLLポリペプチド、MOLLアゴニスト、MOLLアンタゴニスト、MOLLアゴニスト阻害剤、MOLLアンタゴニスト阻害剤）を、予防的／治療的な方法を受けているか、受けたか、または受けるであろう患者に対して投与することを含む。特定の態様において、患者は、1つまたは複数のその他の非MOLLに基づいた予防薬／治療薬に耐性であった。
【０２７６】
併用して使用することができる、予防的／治療的な薬剤の例は、胆汁酸-結合樹脂（たとえば、コレスチラミンおよび塩酸コレスチポール）、スタチン類（たとえば、ロバスタチンおよびプラバスタチン）、フィブラート類（たとえば、クロフィブラート）およびナイアシンである。予防的／治療的な薬剤、およびこれらの用量、投与の経路、並びに推奨される使用は、当該技術分野において既知であり、Physician’s Desk Reference （56th ed., 2002）, and Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition, Chapter 36. Drug Therapy for Hypercholesterolemia and Dyslipidemia等（これらは、参照によりその全体が本明細書に援用される）の文献に記載されている。
【０２７７】
本明細書に使用されるものとして、「併用」の用語は、複数の予防的および／または治療的な薬剤の使用をいう。「併用」の用語の使用は、予防的および／または治療的な薬剤が障害を有する被検者に投与される順位を制限しない。第1の予防的および／または治療的な薬剤は、第2の予防的および／または治療的な薬剤を、疾患を有したか、有するか、または疾患に対して感受性がある患者に投与する前に（たとえば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間前）、同時に、または後に（たとえば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、または12週間後）投与することができる。いずれのさらなる予防的または治療的な薬剤も、その他のさらなる予防的または治療的な薬剤とともに、いずれの順序でも投与することができる。ある種の態様において、本発明の薬剤は、投与される予防的および／または治療的な薬剤のうちの1つである。ある種の態様において、本発明の薬剤は、本発明のMOLLポリペプチドに基づかない予防薬および／または治療薬と併用して投与される。
【０２７８】
5.6  薬学的組成物  
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に有用なバルク製剤組成物（たとえば、不潔な、または非滅菌の組成物）および単位用量形態の調製に使用することができる非経口的薬学的組成物（すなわち、被検者または患者に投与するために適した組成物）を含む。このような組成物は、本明細書に開示された予防的および／または治療的な薬剤の予防的に、または治療的に有効な量、またはこれらの薬剤と薬学的に許容されるキャリアの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、本発明の1つまたは複数の薬剤の予防的に、または治療的に有効な量、および薬学的に許容されるキャリアを含む。さらなる態様において、本発明の組成物は、本発明の薬剤と同じ障害を治療し、管理し、または予防するために有用さらなる予防薬または治療薬をさらに含む。
【０２７９】
特定の実施態様において、「薬学的に許容される」の用語は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されたか、または動物、特にヒトに使用するための米国薬局方またはその他の一般に認識された薬局方の一覧表に記載された意味である。「キャリア」の用語は、希釈液、アジュバント（たとえば、完全および不完全フロイントアジュバント）、賦形剤、または治療薬が共に投与される媒体をいう。このような薬学的キャリアは、水、および石油、動物油、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油等の植物油、または合成起源のものを含む油等の滅菌液であることができる。水は、薬学的組成物が静脈内に投与されるときに、好ましいキャリアである。特に注射用溶液のためには、食塩水および水性デキストロースおよびグリセリン溶液を液体キャリアとして使用することもできる。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、必要に応じて、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、タブレット、ピル、カプセル、粉、徐放性の製剤などの形態をとることができる。
【０２８０】
一般に、本発明の組成物の成分は、別々に、または混合されて共に単位用量形態で、たとえば活性な薬剤の量を示すアンプルまたはサッシェなどの密封して封着された容器に、乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物を注入によって投与する場合は、薬品グレードの滅菌水または塩類溶液を含有する注入ボトルと共に分配される。組成物が注射によって投与される場合、注射用滅菌水のアンプルまたは塩類溶液が、投与の前に成分が混合されるであろうように提供することができる。
【０２８１】
本発明の組成物は、中性または塩の形態として処方することができる。薬学的に許容される塩は、塩化水素、リン、酢、蓚酸の、酒石酸酸、その他に由来するものなどの陰イオンで形成されるものおよび、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノ・エタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンで形成されるものを含む
5.6.1  投与方法  
本発明のに従って使用するための薬学的組成物は、1つまたは複数の生理的に許容されるキャリアまたは賦形剤を使用する慣用法で処方してもよい。製剤は、投与様式に適しているべきである。種々のデリバリーシステムが既知であり、本発明の薬剤、または本発明の薬剤と本発明の薬剤と同じ障害を治療し、管理し、または予防するために有用であるおよび予防薬または治療薬の組み合わせを投与するために使用することができる。本発明の薬学的組成物の投与は、経口、吸入、非経口的、静脈内、筋肉内、腹腔内、眼窩内、眼内、嚢内、髄腔内、胸骨内、動脈内、皮内、皮下、局所的、デポー（depo）注射、移植、徐放性の様式、腔内、鼻腔内、腫瘍内、および徐放、経粘膜、並びに直腸の投与を含むが、これらに限定されない。当業者であれば、投与様式を選択する際に考えられる特異的な利点および不利な点を認識することができる。
【０２８２】
複数の投与様式が本発明によって包含される。たとえば、本発明の薬剤は、皮下注射によって投与される、一方で併用治療薬は、静脈内注入によって投与される。
【０２８３】
また、全身投与は、経粘膜または経皮の手段によることができる。経粘膜または経皮の投与には、浸透するバリアに適した透過剤を製剤中に使用する。経粘膜の投与のための浸透剤は、通常、当該技術分野において既知であり、たとえば洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜の投与は、点鼻薬または坐薬の使用によって達成することができる。経皮投与のためには、活性化合物が当該技術分野で一般に知られているような軟膏、膏薬、またはクリームに処方される。経皮投与のために適応される薬学的組成物は、長期間表皮と均質に接触したままになることを企図した分離したパッチとして提供することができる。
【０２８４】
眼に対する局所的な投与に適応した薬学的組成物は、たとえば点眼または注射用の組成物を含む。これらの組成物において、活性成分は、適切なキャリアに溶解または懸濁することができ、これには、たとえばカルボキシメチルセルロースを含むまたは含まない水性溶媒を含む。
【０２８５】
口への局所的な投与に適応される薬学的組成物は、たとえばロゼンジ、パステル、および含嗽薬を含む。経口投与に適応される薬学的組成物は、たとえば、カプセル、タブレット、粉末、顆粒、溶液、シロップ、懸濁液（水性または非水性の液体中）、食用の形態、ホイップ、またはエマルジョンとして提供してもよい。タブレットまたは固いゼラチンカプセルは、たとえばラクトース、澱粉またはこれらの誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム・サッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸、またはこれらの塩を含んでもよい。軟ゼラチンカプセルは、たとえば植物油、ワックス、脂肪、半固体、または液体ポリオールを含んでもよい。溶液およびシロップは、たとえば、水、ポリオール、および糖を含んでもよい。
【０２８６】
薬学的に互換性の結着剤および／または補助材を組成物の一部として含むことができる。タブレット、ピル、カプセル、およびトローチは、以下の成分または同様の性質の化合物いずれを含むこともできる：微結晶性セルロース、トラガント、またはゼラチンなどの結合剤；澱粉またはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド性二酸化ケイ素などの滑沢剤（glidant）；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ調味料などの香料。
【０２８７】
経口投与のために企図される活性な薬剤は、消化管における活性な薬剤の崩壊を遅延させるか、または吸収に影響を及ぼす材料（たとえば、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレート）で被覆され、または混合されていてもよい。従って、たとえば、徐放性の活性薬剤が、長時間にわたって達成されるであろうし、必要に応じて、活性薬剤を消化管内での分解から保護することができる。消化管に沿った種々のpHおよび酵素の条件を利用することにより、経口投与のための薬学的組成物を特定の胃腸の位置で活性な薬剤を放出することが容易になるように処方してもよい。経口製剤は、好ましくは重量の10%〜95%の活性成分を含む。
【０２８８】
鼻噴投与に適応される薬学的組成物は、粉末（好ましくは、20〜500ミクロンの範囲の粒径を有する）などの固体担体を含むことができる。粉末は、嗅ぎタバコでなされる方法で、すなわち鼻部の近くに保持された粉末の容器から鼻部を介して迅速に吸入することによって投与することができる。あるいは、鼻噴投与のために採用される組成物は、たとえば点鼻薬または点鼻薬などの液体キャリアを含んでいてもよい。これらの組成物は、活性成分の水性溶液または油溶液を含んでいてもよい。吸入による投与のための組成物は、加圧されたエアロゾル、噴霧器、または通気器を含む（しかし、これらに限定されない）特別に適応された装置で出力してもよく、これを活性成分の予め定められた用量を提供するように構築することができる。
【０２８９】
直腸の投与に適応される薬学的組成物は、直腸のデリバリーのための坐薬（たとえば、カカオ脂およびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤によって）または保持浣腸の形態で調製することができる。膣内投与に適応される薬学的組成物は、たとえば、膣座薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提供してもよい。
【０２９０】
一つの態様において、本発明の薬学的組成物は、徐放性の系によって送達される。徐放性の系は、Langer （1990, Science 249:1527-1533）による総説において論議されている。当業者に既知のいずれの技術も、本発明の1つまたは複数の治療薬を含む徐放性製剤を製造するために使用することができる。たとえば、U.S. Patent No. 4,526,938; International Publication Nos. WO 91/05548 and WO 96/20698; Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al., 1997, Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照されたい。たとえば、薬学的組成物は、静脈内注入、移植可能な浸透ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、またはその他の投与様式を使用して投与してもよい。一つの態様において、ポンプを使用してもよい（たとえば、Langer, 1990, Science 249:1527-33; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Eng. J. Med. 321:574を参照されたい）。もう一つの態様において、化合物は、小胞、特にリポソーム内で送達することができる（たとえば、Langer, 1990, Science 249:1527−1533; Treat et al., 1989, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler （eds.） Liss, New York, pp. 353−65; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-27; International Patent Publication No.  WO 91/04014; U.S. Patent No. 4,704,355を参照されたい）。もう一つの態様において、重合物質を使用することができる（たとえば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise （eds.） CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball （eds.） Wiley: New York （1984）; Ranger and Peppas, 1953, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann Neurol.  25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105を参照されたい）。
【０２９１】
一つの態様において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、またはその他の薬剤を含む活性化合物は、体からの化合物の迅速な除去を防護するキャリアと共に調製される。このようなキャリアは、徐放製剤であることができ、これは、移植組織およびマイクロカプセル科されたデリバリーシステムを含むが、これらに限定されない。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生物分解性の生物学的適合性を有するポリマーを使用することができる。このような製剤の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。また、材料は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Incから商業的に得ることもできる。薬学的に許容されるキャリア、リポソームの懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞にターゲットされるリポソームを含む）を使用することもできる。これらは、たとえば、U.S. Patent No. 4,522,811に記載されているように周知の方法に従って調製することができる。
【０２９２】
特定の態様において、本発明のポリペプチドは、逆熱的ゼラチンの性質を有する生分解性高分子を使用して投与することができる（U.S. Patent No. 5,702,717を参照されたい）。
【０２９３】
さらにもう一つの態様において、徐放性の系は、標的の付近に配置することができる。たとえば、癌を治療するために、マイクロポンプにより、直接腫瘍領域に制御された用量により、必要な全身性の用量の一部分のみをデリバリーしてもよい（たとえば、Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, vol.  2, pp. 115−138を参照されたい）。
【０２９４】
一つの態様において、治療を必要とする領域に局所的に本発明の薬学的組成物を投与することが望ましいであろう；これは、たとえば、血管形成術、手術、局所適用（たとえば、手術後の創傷被覆材と組み合わせて）、注射の間の局部的な注入によって、カテーテルによって、坐薬によって、または移植によって達成してもよい。移植組織は、シアラスティック（sialastic）膜などの膜または繊維を含む多孔性、非多孔性、またはゼリー状の材料であることができる。
【０２９５】
注射用の使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（または分散液）または滅菌の粉末（滅菌の注射用の溶液または分散液を即座に調製するためのもの）を含む。静脈内投与のためには、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌性の水、Cremophor EL（商標）（BASF；Parsippany、NJ）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）を含む。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適当な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散媒の場合には必要とされる粒径を維持することによって、または界面活性物質の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどの、種々の抗菌薬および抗真菌薬によって達成することができる。たとえば、糖、多価アルコール（たとえば、マンニトール）、ソルビトール、および塩化ナトリウムなどの等張性の薬剤を組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用の組成物の遅延性吸収は、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含むことによってもたらすことができる。
【０２９６】
吸入による投与のためには、化合物は、適切な噴霧剤、たとえば二酸化炭素などのガス、または噴霧器を含む加圧された容器またはディスペンサーからエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０２９７】
経口または非経口的組成物は、投与の容易さおよび用量の均一性のために単位剤形に処方することができる。単位剤形は、本明細書に使用されるものとして、それぞれの単位が、所望の治療的な効果を生じるように算出された活性化合物の予め定められた量と薬学的キャリアを含むように、治療される被検者に一体的用量として適した物理的に分離した単位をいう。当業者であれば、単位剤形が活性化合物の独特な特徴、達成される特定の治療効果、およびヒト投与のためにこのような活性化合物を合成する技術に固有の制限に依存的であることを認識するであろう。
【０２９８】
当業者であれば、以前の治療処方計画、障害の重篤さ、一般的な健康、および／または被検者の年齢、並びに同時発生の障害を含む（しかし、これらに限定されない）一定の因子が、認識する効率的に、被検者を有効に治療するために必要な用量に影響を及ぼす可能性があることを認識するであろう。さらに、本発明の薬剤の治療上有効な量での被検者の治療は、単一の治療を含むことができ、または好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【０２９９】
5.6.2  本発明の薬剤としての核酸の投与  
特定の態様において、本発明の核酸（たとえば、MOLLアンチセンス核酸、MOLL二本鎖RNA、またはMOLLポリペプチドもしくはMOLL内体をコードする核酸）は、遺伝子治療として障害を治療し、予防し、または管理するために投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または表現可能な核酸を被検者に対して投与することによって行われる治療をいう。本発明のこの態様において、核酸は、予防的または治療的効果を媒介する。
【０３００】
当該技術分野において利用できるいずれの遺伝子治療のための方法も、本発明に従って使用することができる。例示的な方法を以下に記載してある。遺伝子治療の方法の一般的な総説については、Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191; May, 1993, TIBTECH 11:155を参照されたい。使用することができる組換えDNA技術の当該技術分野において一般に既知の方法は、Ausubel et al. （eds.）, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY （1993）; and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY （1990）に記載されている。
【０３０１】
好ましい側面において、本発明の組成物は、本発明の核酸（たとえば、アンチセンスまたは内体分子をコードする）であって、適切な宿主中に核酸を発現する発現ベクターの部分である核酸を含む。特に、このような核酸は、プロモーター（好ましくは、異種プロモーター）であって、該プロモーターは、誘導性または構成的であり、および選択的に組織特異的であるプロモーターを有する。もう一つの特定の態様において、使用される核酸分子は、ゲノムの所望の部位での相同的組換えを促進する領域と隣接し、したがって、本発明の核酸の染色体内発現を提供する本発明の核酸分子を含む（Koller and Smithies, 1989, PNAS 86:8932; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435）。
【０３０２】
被検者への核酸のデリバリーは、直接であってもよく、この場合は、被検者が核酸または核酸を有するベクターに直接さらされるか、または間接的であってもよく、この場合は、最初に細胞をインビトロで核酸によって形質転換し、次いで被検者に移植される。これらの2つのアプローチは、それぞれインビボまたはエキソビボの遺伝子治療として既知である。特定の態様において、核酸配列は、インビボで直接投与される。これは、当該技術分野において既知の多くのいずれの方法によっても、たとえば、適切な核酸発現ベクターの一部としてこれらを構築し、これを、たとえば欠損があるか、もしくは弱毒化したレトロウイルス、またはその他のウィルス・ベクター（たとえば、U.S. Patent No. 4,980,286を参照されたい）を使用して感染させることにより、細胞内に入るように投与することによって、または裸のDNAの直接注射によって、または微小粒子照射（たとえば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）を使用することによって、または脂質もしくは細胞表面受容体またはトランスフェクト薬を被覆するか、リポソーム、微小粒子、もしくはマイクロカプセルにカプセル化するか、またはこれらを、細胞（たとえば、膜浸透性配列）および／または核に入るために既知であるペプチドに対して、たとえばチオエステル結合を介して連結して投与することによって、これを、受容体依存性のエンドサイトーシスを受けるリガンドに連結して投与することによって（たとえば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429を参照されたい）（これは、受容体を特異的に発現する標的細胞タイプに使用することができる）、その他によって達成することができる。もう一つの態様において、核酸-リガンドの複合体であって、リガンドがfusogenicウィルス・ペプチド含み、エンドソームを崩壊させることができ、核酸をリソソームによる分解から回避することができる複合体を形成させることができる。さらにもう一つの態様において、核酸は、特異的な受容体をターゲットすることによって、細胞特異的な取り込みおよび発現をインビボでターゲットすることができる、（たとえば、International Publication Nos. WO 92/06180; WO 92/22635; W092/203 16; W093/14188, WO 93/20221を参照されたい）。あるいは、核酸は、相同的組換えによって細胞内に導入すること、および発現のために宿主細胞DNA内に組み込むことができる（Koller and Smithies, 1989, PNAS 86:8932; and Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435）。
【０３０３】
特定の態様において、本発明の核酸配列を含むウィルス・ベクターが使用される。たとえば、レトロウイルスのベクターを使用することができる（Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウィルスゲノムを適切にパッケージングし、宿主細胞DNA内に組込むために必要な成分を含む。遺伝子治療に使用される核酸配列は、1つまたは複数のベクターにクローン化されており、これにより、被検者への核酸のデリバリーが容易になる。レトロウイルスベクターについてのより多くの詳細は、Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302, Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Klein et al., 1994, Blood 83:1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; and Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics Devel. 3:110-114において見出される。
【０３０４】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用することができるその他のウィルス・ベクターである。アデノウイルスは、特に呼吸器の上皮に遺伝子を送達するための魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然では呼吸器の上皮に感染し、ここでこれらが軽度の疾患を生じさせる。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics Development 3:499は、アデノウイルスに基づいた遺伝子治療の総説を示す。Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5:3-10 では、アカゲザルの呼吸器の上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用のその他の例は、Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225; International Patent Publication No. W094/12649; and Wang et al., 1995, Gene Therapy 2:775において見出すことができる。好ましい態様において、アデノウイルスベクターが使用される。また、アデノ随伴ウィルス（AAV）も、遺伝子治療に使用するために提案された（Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300; and U.S. Patent No. 5,436,146）。
【０３０５】
細胞に外来遺伝子を導入のために、多くの技術が当該技術分野において既知であり（たとえばLoeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618を参照されたい）、レシピエント細胞の必要な発達上および生理的な機能が崩壊しないことを条件として、本発明に従って使用してもよい。本技術は、細胞に対する核酸の安定な導入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、その細胞子孫によって発現可能である。
【０３０６】
6.実施例：  Dsc変異体の同定  
6.1  材料および方法  
6.1.1  一般的な方法および株  
ほとんどの株は、野生型線虫N2ブリストル株に由来しており、記載されているように培養した（Brenner, 1974, Genetics 77:71-94）。一部の連鎖解析のために、配列にタグを付けた部位（STS）を使用して、野生型RW7000株を使用した。全ての動物は、特に明記しない限り20℃で培養した。使用した遺伝子、対立遺伝子、およびSTSsは、以下の通りである：
LGI: bli-4（e937）、stP124; LGII: rol-6（e187）、rol-1（e91）、unc-52（su250ts）、maP1; LGIII: daf-2（e1368）、dpy-17（e164）、clk-1（qm30）、unc-32（e189）、dec-7（sa296）、vab-7（e1562）; LGIV: flr-3（ut9）、dpy-9（e12）、unc-33（e204）、unc-5（e53）、unc-31（e928）、dpy-4（e1166sd）、sP4; LGV: unc-34（e315）、dpy-11（e224）、stP192; LGX: lin-15（n765）、flr-4（ut7）、unc-3（e151）、lon-2（e678）、unc-2（e55）、stP103。
【０３０７】
6.1.2  サプレッサー突然変異の単離  
clk-1（qm30）動物は、記載されているとおりに25mMのエチルメタンスルホナート（EMS）によって変異誘発した（Sulston and Hodgkin, 1988, Methods, pp. 587-606 in The Nematode Caenorhabditis elegans, edited by W. B. Wood. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.）。5匹の変異誘発された雌雄同体（P0）の群を60mmのペトリ皿にまいて、自己受精させた。25匹のF1動物の群を若年成体として90mmのプレートに移して、〜24時間の卵を産ませた。F2動物は、それぞれ20℃で1回の排便サイクルを記録した。特定のサプレッサー突然変異が、形態学的またはその他の行動の欠陥を生じさせないという仮定に基づいて、野生型に見えている動物だけを記録した。最高50匹のF2動物をそれぞれのプレートから記録し、同じ突然変異を有する複数の虫を記録する確率を最小にした。65秒未満の排便サイクル長を有した動物を60mmのプレートに拾って、選び出し、自己受精させた。選び出された候補虫の子孫（F3）を排便について記録した；F3世代の中で有意な比率の速い排便の虫を有した株だけを、さらなる遺伝的および表現型の解析のために維持した。合計5421匹のF2動物をスクリーニングした（2134の単相体のゲノムに相当する数）（Ellis and Horvitz, 1991, Development 112:591-603）。
【０３０８】
6.1.3  サプレッサー突然変異のマッピング  
突然変異は、3つの方法のうちの1つの染色体に連鎖した。野生型（clk-1（+））バックグランドにマップすることができる突然変異について、DA438株（qm133のために、qm141）を使用することによって（Avery, 1993, Genetics 133: 897-917）、または記載されているように（Williams, 1995, Genetic Mapping with Polymorphic Sequence-Tagged Sites, pp. 81-95 in Caenorhabditis elegans:  Modern Biological analysis of an Organism, edited by H. F. Epstein and D. C. Shakes. Academic Press, San Diego）野生型RW7000株を使用してPCR解析（qm142のために、qm183）によりSTSに対する連鎖を試験することによって、いずれかによって連鎖解析を行った。野生型バックグランドよりも明らかでない表現型を有するか、またはSTSに連鎖することができない突然変異については、それぞれの染色体に対する連鎖を、clk-1（qm30）バックグランド（qm178、qm179、qm180、qm182、およびqm184のための）の可視マーカーを含む突然変異株を使用して別々に試験した。qm166については、これがclk-1（qm30）に密接に連鎖することが見いだされたので、正式な連鎖解析は必要ではなかった。一旦染色体に対する連鎖が確立されるたなら、突然変異を2および3点のマッピング・ストラテジーを使用してより正確にマップした。
【０３０９】
マーカー効果を回避するために、大部分の3点マッピング実験については、ホモ接合性の組換え子孫をF2組換え動物から単離し、ホモ接合性の変異体の雄と交雑させた。排便は、F1交雑子孫で記録した。qm133は、排便サイクル長に加えて、乏しい、飢餓した見かけを含む記録することができるその他の表現型を有するので、qm133の全てのマッピングでは、従来法を（組換えF2動物を選び出し、F3世代の1/4のqm133動物の存在をスコアすることによって）使用した。qm133、qm141、およびqm183の全てのマッピングは、clk-1（+）バックグランドの株で行い、20℃で記録し；qm179、qm180、qm182、およびqm184の全てのマッピングは、clk-1（qm30）バックグランドの株で行い、25℃で記録した。また、qm142のマッピングは、clk-1（qm30）バックグランドで行い、20℃で記録した。qm142が優性効果を有するので、clk-1（qm30）の雄とのホモ接合性の組換え子孫を交雑させて、ここれらが成体期に達したあとに48時間後に、qm142の優性効果が最も強いときに、F1動物を記録するとによってマップした。マッピング・データは、表2に要約してある。
【０３１０】
6.1.4  補完試験  
補完試験は、異なる突然変異が、同じ遺伝子領域にマップされるように見えるときに、または突然変異が、以前にdec遺伝子がマップされた領域に位置するときに行った。通常、1つの突然変異についてホモ接合性の雄をその他の突然変異についてホモ接合性の雌雄同体に交配し、トランスヘテロ接合性のF1動物において排便を記録した。この方法では：qm166およびqm178は、互いに、および以前に同定された変異体dec-7（sa296）を補完することができ、従ってこれらは全て対立形質である可能性が高い。同様に、qm179、qm184、およびqm180は、全て互いに補完することができず、従って全て対立形質である可能性が高い。qm133は、flr-4領域に位置するが、flr-4（ut7）を補完し、これらが異なった遺伝子を定義することを示唆する。同様に、qm182は、flr-3領域に位置するが、flr-3（ut9）を補完し、これらが異なった遺伝子を定義することを示唆する。
【０３１１】
6.1.5  行動解析  
排便は、特に明記しない限り、これらの成体期の１日目の雌雄同体において20℃で記録した。排便サイクル長は、2回の連続する排便のpBoc工程間の期間として定義した。それぞれの動物では、5回の連続したサイクル（6回の連続したpBocs）について記録し、平均および標準偏差を算出した。記録期間の間に動物が顕微鏡灯によって加熱されることを防止するために、プレートは、「吸熱器」（水で満たされるシャーレ）上に配置し、動物は最大で15分間までこれらから記録しただけであった。
【０３１２】
6.1.6  温度シフト実験  
動物は、20℃で培養し、若年成体と同様に15℃または25℃へ移した。次いで、動物をその温度へ移してから2〜6時間後に15℃または25℃で記録した。プレートの温度を15度に維持することが困難であったので、この温度で3回の連続したサイクルについて動物を記録しただけであり、1匹の動物を記録するために必要とされる時間だけプレートを顕微鏡に維持した。
【０３１３】
6.1.7  qm142の時間経過研究  
ヘテロ接合性のdsc-2（qm142）／+動物を作製するために、dsc-2（qm142）dpy-11（e224）動物をN2雄と交配した。qm30；qm142／+動物、clk-1（qm30）を作製するために；unc-5（e53）雌雄同体をclk-1（qm30）；dsc-2（qm142）雄と交配させた。後期L4段階で、F1世代動物をプレートに拾い、3時間後に検査した。この期間中に成体に脱皮した動物を実験に使用し、間隔の終わりに1.5時間齢の成体であるとみなした。それぞれの時点についてのそれぞれの遺伝子型の試料規模は、〜10である。同一セットの動物を異なる時点で記録した。
【０３１４】
6.1.8  統計解析  
N2およびclk-1（qm30）変異体が、15℃および25℃で記録したときに、20℃でこれらを培養して記録されたときとは異なっているかどうかを決定するために、試料の不均等な分散を考慮して2試料スチューデントt検定を行った。20℃対15℃で、N2およびclk-1（qm30）の両方に関して非常に有意差（p<0.05）が見いだされた。有意差は、20℃対25℃でのN2について（p=0.40）、または20℃対25℃でのclk-1（qm30）について（p=0.27）は、検出されなかった。また、N2およびclk-1（qm30）変異体では、20℃で培養して、15℃および25℃で記録したときに、20度でこれらを培養して記録されたときとは異なっているかどうかを決定するために、2試料スチューデントt検定を行った。20℃対15℃（p=0.29）で、および20℃対25℃（p=0.99）で、clk-1（qm30）を除く全ての比較において非常に有意差（p<0.001）が見いだされた。また、それぞれのサプレッサー突然変異が、あらゆる温度で、clk-1（qm30）を有するそれぞれのclk-1（qm30）二重突然変異体株とclk-1（+）を有するあらゆるclk-1（+）突然変異株とを比較することによって排便サイクルに対して有意な効果を有するかどうかを決定するために、2試料スチューデントt検定を行った。以下を除く全ての比較において非常に有意差（p<0.001）が見いだされた：15℃（p=0.34）および25℃（p=0.97）でのclk-1（qm30）dec-7（qm166）対clk-1（qm30）；15℃（p=0.83）および25℃（p=0.15）でのclk-1（qm30）dec-7（qm178）対clk-1（qm30）；clk-1（qm30）；15℃（p=0.80）でのdsc-3（qm184）対clk-1（qm30）；clk-1（qm30）；20℃（p=0.12）および25℃（p=0.31）での10（qm183）対clk-1（qm30）。
【０３１５】
6.2  clk-1変異体の排便サイクル表現型  
線虫（Caenorhabditis elegans）の排便は、常同的な運動プログラムの周期的な活性化によって達成される。野生型動物において、排便サイクル長は56秒であり、3.4秒だけの標準偏差である（20℃で）。前述したように（Felkai et al., 1999、EMBO J 18：1783〜1792、およびWong et al.（1995）Genetics 139：1247-1259）、clk-1変異体では、排便サイクルの長さが増大され、より不規則になり：clk-1（qm30）動物では、サイクル長は、88秒であり、14秒の標準偏差で、より弱い対立遺伝子clk-1（e2519）では、77秒であり7秒の標準偏差である（20℃で）（表1）。
【０３１６】
野生型およびclk-1変異体虫の排便サイクル長に対する温度の効果を検査するために、15℃または25℃で2世代の間虫を発生させて、これらが発生された温度で記録した。clk-1変異体は、全ての温度で野生型よりも緩徐であり、両遺伝子型では、15℃で培養して記録したときには、20℃培養して記録したときより有意に長いサイクルを有した（データ示さず）。対照的に、野生型または変異体虫を25℃で培養して、記録したときは、排便速度は、20℃のものと有意な相違はなかった（データ示さず）。
【０３１７】
排便サイクル長に対する温度変化の影響変化を野生型およびclk-1虫において検査した。20℃から25℃に移した野生型虫は、13秒まで平均サイクル長が減少されたが、20℃から15℃に移した野生型虫は、平均サイクル長を26秒まで増大させた。この調整は、非常に迅速に起こり、たとえば、野生型虫は5分を記録し、またはこれらが25℃に移された2〜6時間後には、実質的に同様のサイクル長の減少があった（データ示さず）。25℃で発生して、記録した野生型虫の排便サイクルは、虫を20℃で発生し、次いで記録のために25℃に移したときよりも実際に緩徐である点に留意されたい。これは、虫が発症の間により高い温度に適応されたか、または気候順化し、したがって、その温度で記録したときにあまり影響を受けなかったことを示唆した。しかし、虫を15℃または20℃で発生したがどうかによっては、15℃で記録したときに排便サイクルの長さに影響を及ぼさなかった。
【０３１８】
野生型虫での観察とは対照的に、clk-1変異体は、新たな温度に移された後にこれらの排便サイクルの長さを再調整することができなかった。clk-1変異体が20℃から25℃に、または20℃から15℃に、いずれかに移されたときに、平均サイクル長の変化はなかった（表1）。これは、20℃に適応された変異体が、温度シフトにより排便サイクル長を再調整することができず、したがって、野生型clk-1の活性が調整を生じさせるために必要とされることを示唆した。
【０３１９】
6.3  緩徐な排便表現型を抑制スクリーン  
clk-1と相互作用して排便サイクル長を調節する遺伝子を同定するために、clk-1の抑制因子のためのスクリーンを行った。単離される突然変異は、clk-1を抑制することができ、排便サイクルの長さを野生型虫のものまで回復することができるものであった。clk-1（qm30）の虫をEMSで変異誘発し、第二世代の（F2）動物では、それぞれの20℃で1回の排便サイクルについて直接記録した。65秒未満のサイクル長を有した動物をさらなる解析のために維持した。このように、5421匹のF2動物（〜2134単相体ゲノムの同等物）をスクリーニングして、8つのサプレッサー突然変異を同定した。これらの突然変異のうちの7つは、劣性であり、1つの突然変異dsc（qm142）は、優性の効果を有した（以下に詳細に記載してある）。行ったマッピングおよび補完試験に基づいて（表2）、これらの突然変異は、4つの新たな補完群を定義し、これらはclk-1の排便抑制因子に関するdscと呼んだ。2つの突然変異、qm166およびqm178は、以前に同定されたDec-s遺伝子dec-7の対立遺伝子であった。2つのその他の劣性突然変異は、スクリーニングによって単離され、dsc（qm141）およびdsc（qm183）は、排便に影響を及ぼしたが、clk-1（qm30）を抑制しなかった。
【０３２０】
6.4  Dsc抑制因子の解析  
抑制因子変異体の表現型を多くの異なる方法で解析した。スクリーニングで同定された突然変異の全てが、野生型clk-1バックグランドおよびclk-1（e2519）（部分的なclk-1活性を有する対立遺伝子）バックグランドでも単離された。排便サイクルの長さをdscの単一変異体およびdsc/clk-1二重突然変異体で記録した。このようなスコアリングは、20℃で、並びに15℃および25℃に移した後に行った。結果は、表1に示してある。
【０３２１】
6.4.1  clk-1（qm130）または野生型バックグランドでの効果  
抑制因子を、温度シフト（特に25℃に）後にこれらがclk-1（qm30）を抑制する能力差に基づいて2つの異なるクラスに分類した。クラスI変異体は、20℃で、並びに25℃への変化の後に強力にclk-1（qm30）を抑制する。このクラスに分類された単離された変異体は、dsc-3（qm179、qm180、qm184）およびdsc-4（qm182）であった。25℃で、dsc-3（qm179）（この点で最も強い変異体）は、変異体の排便サイクル長を野生型長よりも短いclk-1（qm30）短くした。従って、異なる温度でのクラスI dsc/clk-1（qm30）二重突然変異体の排便プロフィールは、実質的に野生型のものと同様である（すなわち、15℃で最も緩徐で、25℃で最も急速）。従って、これらの変異体は、20℃で培養して記録したときのclk-1（qm30）変異体の長い排便サイクルを抑制し、並びに20℃で培養し、次いで別の温度に移したときの温度非感受性を抑制した。
【０３２２】
クラスI変異体とは対照的に、クラスII変異体は、温度シフト後に弱く（dsc-1（qm133）およびdsc-2（qm142））抑制されるだけか、または全く（dec-7（qm166、qm178））抑制されなかった。これは、これらの変異体が20℃でclk-1（qm30）変異体の長い排便サイクルを抑制したが、これらが温度シフト後にclk-1（qm30）変異体がこれらの排便サイクル長を再調整する能力がなくなるのを抑制することができないことを示唆した。
【０３２３】
クラスIおよびクラスII変異体は、clk-1（qm30）バックグランドよりも表現型野生型バックグランドでよく似ているが、クラスI変異体は、一般に、特に15℃および20℃で、クラスII変異体よりも野生型で弱い効果を有した。全ての突然変異は、全ての温度で有意に排便サイクルの長さを減少させ、クラスIおよびクラスII変異体は両方とも、野生型と同じ温度の変化に反応して変化した（すなわち、排便は、25℃で最も急速であり、15℃で最も緩徐であった。）。これは、clk-1（qm30）バックグランドでの25℃のクラスII変異体の効果の欠如は、dsc突然変異が、いずれも本質的に温度感受性であることに起因しないであろうことを示す。全体として、clk-1（qm30）バックグランドでの観察では、2つの異なった相互作用のクラスがあり、異なるクラスの遺伝子が異なる様式でclk-1と相互作用することを示唆する。
【０３２４】
6.4.2  clk-1（e2519）バックグランドでの効果  
dsc突然変異をclk-1（e2519）バックグランドで再び単離し、これは、clk-1（qm30）よりも弱い表現型を有した。clk-1（e2519）／dsc二重突然変異体の排便サイクル長は、clk-1（qm30）／dsc二重突然変異体のものよりも短かったが、相違は、通常非常に小さかった（表1；dsc-5（qm141）の特別な場合の記述について下記を参照されたい）。
【０３２５】
抑制因子をスクリーニングする一方で、強力にclk-1（qm30）を抑制する突然変異を単離することができなかったへんいたいから、多くの候補株が単離された。しかし、2つのケースにおいて、候補株から、排便の速度に有意に影響を及ぼした突然変異を分離した。これらの突然変異のうちの1つdsc-5（qm141）は、全ての温度で、野生型虫の排便サイクルに対して、並びにclk-1（e2519）変異体に対して強力な効果を有したが、全ての温度でclk-1（qm30）変異体に対しては非常に弱いが、有意な効果を有した。これは、dsc-5（qm141）がヌル変異体（qm30）に対してわずかな影響を及ぼすが、部分的な機能喪失突然変異clk-1（e2519）を完全に抑制したので、これは、clk-1を介して主に作用しているかもしれないことを示唆する。また、単離されたその他の突然変異qm183は、全ての温度で野生型虫の排便サイクルに対して有意な効果を有したが、clk-1（e2519）またはclk-1（qm30）変異体を抑制することができなかった。従って、clk-1（qm30）変異体の緩徐な排便は、単に野生型の排便サイクル長を減少させるすべての突然変異によって抑制することができるというわけでないことが明らかである。実際に、いくつかの突然変異は、排便サイクルに影響を及ぼすためには、完全な（すなわちqm183）または最も少なく部分的な（すなわちqm141）野生型clk-1の活性を必要とするであろう。
【０３２６】
6.4.3  dsc-2およびdec-7のさらなる特徴付け  
qm142変異体表現型の強度は、非常に異なる割合であるとはいえ、ヘテロ接合体およびホモ接合体のいずれの動物においても年齢と共に変化する。時間経過研究を行い、同じ動物において、これらが成体に脱皮した後の異なる時点で排便を記録した。clk-1（qm30）バックグランドでは、ホモ接合性のdsc-2（qm142）動物は、成体に脱皮した2時間後のclk-1（qm30）動物とほとんど同じ程度に緩徐であるが、8時間まで、排便サイクル長は、野生型の長さに回復し、18時間まで、排便サイクル長は、野生型のものより有意に短い。1つのdsc-2（qm142）対立遺伝子および1つの野生型dsc-2対立遺伝子をもつclk-1（qm30）虫の排便サイクル長は、約40時間までclk-1（qm30）動物のものに非常に似ていた。成体に脱皮した約48時間後まで、dsc-2（qm142）／+ヘテロ接合性の動物は、年齢が一致する野生型動物都道程度の速さの排便サイクル長を有した。dsc-2（qm142）／+ヘテロ接合体は、どの時点でもホモ接合体と同程度に速くなることはなく、有意に速くなるホモ接合体よりも長時間かかり、qm142突然変異の効果は、野生型対立遺伝子以上に不完全に優性である。また、これは、qm142ヘテロ接合体および野生型バックグランドでのホモ接合体の観察によっても確認されたが、効果は、それほど劇的でなかった。dsc-2（qm142）対立遺伝子がこの半優性の時間依存効果を有することができる一つの方法は、突然変異により、野生型dsc-2タンパク質の機能に干渉することができるタンパク質を生じるということである。時間とともに変異体産物が蓄積して、変異体表現型の発生度を増大することができる。
【０３２７】
全ての抑制因子変異体は、それぞれ5回の排便サイクルを記録した多くの動物の平均排便サイクル長を解析することによって特徴づけた（表1）。clk-1（qm30）バックグランドにおいてdec-7突然変異を有する動物は、15℃および20℃で非常に高い標準偏差を有したが、25℃では有さない。この変動を4つの異なる温度でclk-1／dec-7動物の一回の排便サイクル長の頻度をプロットすることによってさらに解析した。clk-1（qm30）変異体については、全ての温度で1回の頻度ピークだけがあったが、25℃以下（たとえば、22.5℃、20℃、および15℃）の3つの温度でのclk-1/dec-7二重突然変異株の両方については、2つのピークがあった。ピークのうちの1つは、他方のピークが生じる場合の2倍のサイクル長で生じる。しかし、25℃では、clk-1（qm30）ピークと同時の1つのピークだけがある。
【０３２８】
このパターンの1つの解釈は、clk-1および／またはdec-7が、排便運動プログラム（DMP）の活性化をサイクルに連関させる役割を有し、その結果、clk-1/dec-7二重突然変異体では、温度の増加と共にますます連関ができなくなる。これが二重のサイクル長を生じると考えられ、25℃で観察されるあらゆるサイクルは、実は二重のサイクルであることを意味するのであろう。複数の分離したサイクル長は、野生型clk-1バックグランドでのdec-7変異体において、またはその他のクラスII変異体において観察されず、したがって、この現象は、clk-1/dec-7変異体に特異的なようである。
【０３２９】
もう一つの解釈は、温度の増加と共に、dec-7によるclk-1の抑制の表現率に減少があるということである。これは、20℃、22.5℃、および25℃では、メインピークが非抑制clk-1ピークと同時であるという観察によって示唆される。しかし、これは、15℃で起こらなず、この解釈によって説明するのは困難である。
【表１】
2006520189.tif 000002
【表２】
2006520189.tif 000003
a四角括弧で与えられる遺伝子型は、子孫が2および3因子マッピング・データを得ることが記録されたF1動物である。
【０３３０】
b非Dpy F2子孫は、qm182突然変異の存在について記録した；分母は、単離されたqm182動物の数を表し、分子は、また、dpy-9突然変異についてヘテロ接合性でもあったqm182動物の数を表す。
【０３３１】
7.実施例：Dsc-4の特徴付け  
7.1  材料および方法  
7.1.1  株および培養方法  
動物は、20℃で記載されているとおりに培養し（Brenner, 1974, Genetics 77:71-94）、を特に明記しない限り大腸菌株OP50を与えた。コレステロール欠枯渇実験は、いずれのコレステロール（NGM-C）も添加しなかったこと以外、OP50と共に播種した標準的なNGMプレート上で行われた。生殖系列発達の速度を検査する前に、虫を二世代以上の間NGM-Cプレートの上で培養した。
【０３３２】
RNAi実験のためには、虫を1mMのIPTGおよび50μg/mL のアンピシリンを補ったNGMプレート上で培養し、pPD129.36由来のプラスミドで形質転換した大腸菌株HT115を与えた。P0sをL4幼虫と同様にRNAiプレートに移し、F1世代を検査した。
【０３３３】
野生型株は、N2（ブリストル株）であった。以下の突然変異を使用した：clk-1（qm30）III；dsc-4（qm182）、dpy-9（e12）、lin-1（e1026）、unc-33（e204）、lfe-1/itr-1/dec-4（sy328）、unc-24（e138）、let-60（n1046）IV、sid-1（qt）V。
【０３３４】
7.1.2  dsc-4のクローニングおよびシーケンシング  
dsc-4は、LG IV（-27.6）の左腕にマップされた。unc-33 dpy-9での三点マッピング実験では、dsc-4が左にあったか、またはdpy-9まで非常に近接することが示唆され：clk-1；dsc-4およびclk-1；unc-33 dpy-9の間の交雑では、14/14 Unc非Dpy dsc-4のを拾い、一方で0/20 Dpy非Unc dsc-4を拾った。2点マッピング実験では組換えによってdpy-9からdsc-4を分離することができなかったことから、dsc-4がdpy-9に非常に近いことを示唆するが、同様にdpy-9の左にマップされるその他の遺伝子についても既報告であり（Katsura et al., 1994, Genetics 136:145-154）、組換えは、この領域において抑制される可能性が高い。この遺伝子領域にざっと対応する14のコスミドを活性のレスキューについてアッセイした。これらは、3つのプールに分けて（プール1；C15E6、T05C7、B0545、B0312、およびF52F6、プール2；R02D3、T21D12、K02D7、F18F11、AH12、F40D2、およびT07A9、プール3；M04G7およびM02G12）それぞれのプールをclk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体に注射した。それぞれのプールについて、コスミドの総濃度は、15μg/mLであり、同時注入マーカーPttx-3：：gfp（Hobert et al., 1997、Neuron 19：345-357）の濃度は、185μg/mlであった。プール2は、clk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体（セミコロンは、別々の染色体状の突然変異を示す）の迅速な排便をレスキューした。プール2のそれぞれのコスミドを個々に試験して、コスミドK02D7は、clk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体をレスキューすることが見いだされた。K02D7上の予測される遺伝子に対応するPCR産物を個々に試験して、Genefinderソフトウェアによってコスミド上に存在すると予測される遺伝子に対応するPCR産物で、かつK02D7.4（K02D7のうちの26654から34896まで）と称されるものが、clk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体をレスキューすることができることが判明した（図8Aおよび8B）。このPCR産物をネスティッドPCRによってN2ゲノムDNAから増幅し、dsc-4の上流に領域の1.6kbを含む。PCR産物を190μg/mlの濃度の同時注入マーカーPttx-3：：gfpと共に2μg/mlの濃度で注射した。
【０３３５】
qm182突然変異の性質を決定するために、K02D7.4の予測される配列をclk-1（qm30）、clk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体のゲノムDNA試料からPCRによって増幅した。K02D7.4の予測される配列に対応する増幅されたゲノムDNAのセンスおよびアンチセンス鎖をシーケンスした。K02D7.4の予測されるヌクレオチド配列との比較により、2つのミスセンス突然変異がclk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体に見いだされた（C355TおよびG605A）。cDNAの位置354でのC→T移行により、タンパク質の位置62でセリンのフェニルアラニンへの置換を生じ；cDNAの位置605でのG〜A移行により、タンパク質の位置146でアラニンのスレオニンへの置換を生じた（図4および3A）。これらの突然変異は、clk-1（qm30）変異体から得られるPCR製産物にはなかった。
【０３３６】
図4（SEQ ID NO：1）に示したdsc-4 DNA配列は、11のエキソンを含み、5'非翻訳の領域に続いてヌクレオチド塩基1〜169で見いだすることができる。ヌクレオチド塩基対の位置は、以下の通りである：SEQ ID NO：1のうちのエキソン1：170〜215、エキソン2：216〜472、エキソン3：473〜819、エキソン4：820〜924、エキソン5：925〜1084、エキソン6：1085〜1251、エキソン7：1252〜1543、エキソン8：1544〜1738、エキソン9：1739〜2182。エキソン10：2183〜252、9およびエキソン11：2530-2848。dsc-4配列において、エキソン・コード領域は、ヌクレオチド塩基対2849〜2922が見いだされる3'非翻訳領域に続いた。
【０３３７】
clk-1、dsc-4突然変異および野生型のバックグランドをもつ虫の表現型に対するdsc-4の配列に基づくRNAiの効果を調査した。RNAiは、clk-1バックグランドのqm182突然変異をほとんど正確に表現型模写するdsc-4配列に対して向けた。clk-1（qm30）；dsc-4（RNAi）動物の排便速度、並びに産卵速度は、clk-1（qm30）；dsc-4（qm182）変異体のものと同様である。dsc-4（RNAi）の効果は、clk-1バックグランドでの排便または産卵に関して、dsc-4突然変異のものに相加的ではないことが観察された。また、dsc-4（RNAi）はdsc-4変異体において、いずれの表現型の明らかな増強も生じさせなかった。共に、これらの結果は、それを証明する。およびK02D7.4の予測される遺伝子配列はdsc-4のものに対応すること、およびqm182対立遺伝子は、強力なまたは完全な機能喪失対立遺伝子であることを証明する。
【０３３８】
7.1.3  dsc-4アミノ酸配列分析  
dsc-4遺伝子は、892残基のタンパク質をコードし、ミクロソーム・トリグリセリド転移タンパク質（MTP）の大サブユニットに類似する。DSC-4は、ゲノムがシーケンスされたあらゆる動物種において単一の明白な相同体を有するが、植物および単細胞生物には無いようである。相同体間の一致性は、全ての配列全体に及び、特定の領域またはドメインに限定されず、脊椎動物のMTPのDSC-4の整列では、多数のギャップは必要でない（図3A）。PSI-blastを使用してDSC-4をNCBI非重複性タンパク質データベースと比較すると、最高のスコアを有する7つのタンパク質は、真の脊椎動物のMTPである。出願人は、アミノ酸残基19-295をapoB結合ドメインとして、アミノ酸残基296-609をapoBおよびPDI結合ドメインとして、およびアミノ酸残基610-890を脂質結合ドメインとして定義した。しかし、これらのドメインは、厳密ではなく機能的ドメインを定義し、特徴的なモチーフを有するタンパク質ドメインではない。
【０３３９】
7.1.4  dsc-4 cDNAのシーケンシング  
予測されるK02D7.4遺伝子に対応するcDNAクローンyk357a6が同定された。cDNAクローンをシーケンスした。クローン配列とK02D7.4配列の配列比較では、cDNAクローン配列が、dsc-4の完全な5'末端を含まないことを示した。SL1特異的なプライマーおよびdsc-4遺伝子特異的なプライマーを用いて、dsc-4の5'末端を、選択されたRNAがポリdTプライマーを使用して混合段階の野生型動物から単離されたポリ（A）+の逆転写によって作製した第1鎖cDNAライブラリーから増幅した。dsc-4の5'末端に対応する混合段階の野生型動物からのcDNAのセンスおよびアンチセンスDNA鎖をシーケンスした（図4）。混合段階の野生型動物からのdsc-4 cDNAの配列（SEQ ID NO：1）は、GenefinderによってK02D7.4で予測されたものとは異なり：予測される第一エキソンはなく、第2のエキソンは、予測されるより、5'末端でわずかに長かった。
【０３４０】
7.1.5  RNA干渉  
RNAi実験は、記載されているように行った（Kamath et al., 2001, Genome Biol 2:research0002.1-research0002.10）。対照には、pPD129.36ベクターを形質転換したHT115細菌を与えた。生殖系列および外陰部発達の表現型は、正常なNGMプレートと比較して、RNAiプレート上で異なることが見いだされたので、遺伝子作用に対するRNA干渉の効果を試験した全ての実験について、比較のために使用した対照も、RNAiプレート上で培養した。dsc-4 RNAiクローンは、pPD129.36のHindIII XhoI部位にクローン化されたyk357a6のHindIII-XhoI断片であった。
【０３４１】
7.1.6  転写および翻訳でのdsc-4：gfp融合体の構築  
翻訳融合Pdsc-4：：dsc-4：：gfpは、2つの工程で構築した。工程1：dsc-4の1.6kbの上流の領域（K02D7のうちの30259から34896まで）と5'-末端を含むPCR産物をN2ゲノムDNAから増幅し；PCR産物から作製したHindIII-XbaI断片をpPD95.75にクローン化した。工程2：dsc-4（終止コドンを除く）の3'末端をyk357a6（498から2845まで）から増幅し；PCR産物から作製したSalI-StuI断片を第1のクローンのSalIおよびSmaI部位にクローン化した。Pdsc-4：：dsc-4：：gfpクローンは、100μg/mlの同時注入マーカーPttx-3：：gfpと共に100μg/mLで注射した。
【０３４２】
転写融合Pdsc-4（1.6kb）：：GFPは、以下の通りに構築した：K02D7.4の1.6kb上流と最初の22アミノ酸残基を含む領域（K02D7のうちの32017から34922まで）を増幅した。PCR産物をpPD95.75のHindIIIおよびSmaI部位にクローン化した。Pdsc-4：：GFPは、100μg/mLの同時注入マーカーpRF4と共に100μg/mLで注射した（これは、優性突然変異rol-6（su1006）を含む）。
【０３４３】
7.1.7  表現型解析  
産卵速度の時間経過解析：L4段階の動物をプレートに拾い、3時間後に検査した。この期間中に成体脱皮した動物を実験に使用し、間隔の終わりに1.5時間齢の成体であるとみなした。24時間の間隔で、動物を選び出し、4時間の間産卵させた。虫あたりに時間につき産まれた平均産卵数を算出した。
【０３４４】
一腹仔数：L4動物を選び出し、産卵期間の間に毎日新たなプレートに移した。虫あたりの生まれた子孫の総数を決定した。
【０３４５】
後胚発生の速度：卵をプレートに採集し、1時間後に検査した。この期間中に孵化した動物を実験に使用した。それぞれの時点までに成体に達した動物の割合を記録した。
【０３４６】
生殖系列の発生段階：虫は、産卵速度の時間経過解析に関して最終的な脱皮に同調させた。生殖系列の近位部分をその直後（1.5h齢の成体を検査するために）、または4.5時間後（6時間齢の成体を検査するために）のずれかをDIC顕微鏡観察を使用して検査した。
【０３４７】
卵生産の時間経過解析：虫は、産卵速度の時間経過解析に関して最終的な脱皮に同調させた。虫を3時間の間隔で検査し、子宮内に受精卵を含む虫の割合を決定した。
【０３４８】
外陰部形成：動物を解剖顕微鏡下で検査し、これらが複数の外陰部を有する場合にMuvであるとみなした。
【０３４９】
7.2  期外発生の表現型の抑制  
clk-1変異体は、胚発生および後胚発生、周期的な挙動、再生、および老化の平均的な緩徐化を含む多面的な表現型を有する（Wong et al., 1995, Genetics 139: 1247-1259）。緩徐な再生表現型は、虫が成体（図1A）に脱皮したあとの異なる時点で時間あたりの産卵数を計数することによって詳細に解析した。野生型動物は、成体に脱皮の約24時間後にこれらのピークの産卵速度に達し、72時間でほぼ受精卵の産卵を終えた。これらは、72時間程度でこれらのピーク速度に達するので、産卵のピークは、clk-1（qm30）変異体において遅延性である。遅延の1つの原因は、卵の保持である可能性があるが（産卵欠損（Egl-d）表現型）；clk-1変異体は、Egl-dでない。遅延のもう一つの可能性は、過剰な精子形成である可能性がある（Hodgkin and Barnes, 1991, Proc R Soc Lond B Biol Sci 246:19-24）。線虫の雌雄同体は、最初に精子を産生し、次いで永久に卵母細胞の産生にスイッチする。従って、精子形成が終わる前には卵母細胞も卵も産生することができなず、産生される精液の数が一腹仔数を決定する。野生型と比較したclk-1変異体の減少した一腹仔数は、その過剰な精子形成が遅延性の産卵の原因ではないことを示唆する（図1B）（Wong et al., 1995、Genetics 139：1247-1259）。第3の可能性（これを詳細に検査した）は、細胞体と比較して生殖系列の発生がclk-1変異体において遅延性であるということである。
【０３５０】
線虫の成体雌雄同体の生殖腺は、2本のU型のアーム（前方および後方）からなり、それぞれは貯精嚢において終わる。2つの貯精嚢は、生殖腺アームを、受精卵を貯臓する子宮に連結し、外陰部で融合する。遠位の基部軸に言及するときは、それは外陰部と比較しており、外部に対する生殖腺の基端側開口部である。生殖系列の発達段階では、遠位の基部軸に沿って分極化する。大部分の精子形成は、近位の生殖腺で起こる。卵形成のためには、それぞれの生殖腺の遠位のアームが、有糸分裂を受けている胚細胞核を含む合胞体を形成する。近位に移動して、胚細胞は、分裂周期を出て、減数分裂の第一期通って進む。野生型雌雄同体において、第一精母細胞（分化する最初の配偶子）は、後期のL4段階で観察され、雌雄同体が成体に脱皮した直後に卵形成た始まる。生殖系列の発生は、clk-1変異体において緩徐であるという可能性を探索するために、本発明者らは、DIC顕微鏡観察を使用して、虫が成体に脱皮した直後に、前方および後方の生殖腺の近端部での生殖系列の発生段階を検査した。成体脱皮の6時間後に、検査した全ての野生型の虫は、前方および後方の生殖系列の近端部に卵母細胞を有し、また半分の動物が受精卵を有した（図1C、2B）。比較として、卵形成の発生は、clk-1変異体において劇的に遅延性であり、6時間齢の成体において検査した前方生殖腺の97%は、精子形成をまだ受けていおり、3%だけが卵形成を開始した（図1C、2D）。面白いことに、clk-1変異体の後方生殖腺の生殖系列の発生は、また、野生型のものと比較して遅延性であるが、それは意外なことに、前方生殖腺よりも影響を受けず：28%が卵形成を開始し、19%はすでに卵が受精していた（図1C）。
【０３５１】
また、配偶子分化の開始（すなわち、精子形成）がclk-1変異体において遅延性であったかどうかを決定するために、生殖系列の近位の前腕を成体脱皮の直後に検査した。野生型虫を、これらが成体に脱皮した1.5時間後に検査したときに、大多数（87%）は、第一精母細胞形成を完了していた（図1D）。対照的に、大多数のclk-1変異体は、第一精母細胞形成の前か（42%）、またはプロセス中（48%）のいずれかであった。共に、これらの結果は、clk-1変異体が期外発生の表現型を示すことを示しており：身体発達の所与の段階での変異体の生殖系列の全体的な発達は、野生型動物と関連して遅延性であり、成体脱皮でのclk-1変異体の生殖系列の段階は、中期から後期のL4段階での野生型動物に対応している。
【０３５２】
dsc-4（qm182）は、clk-1変異体の緩徐な排便表現型の抑制因子として単離された（Branicky et al., 2001、Genetics 159：997-1006）。dsc-4突然変異は、clk-1表現型の全ての側面を抑制するというわけではないが、クローザー調査（closer examination）では、いくつかのその他の表現型を実際に抑制することを明らかにした。上記の通りで、野生型虫は、成体脱皮の24〜48時間後の間にこれらの産卵のピークに達するが、clk-1変異体は、72時間でこれらの産卵のピークに達するだけである。clk-1/dsc-4二重突然変異体のピーク産卵速度は、約48時間までに到達するので（図1A）、dsc-4突然変異は、この遅延を抑制した。clk-1変異体の遅延性の産卵は、これらの卵母細胞の遅延性の生産によることを考えると（上記のものを参照）、これらの結果は、dsc-4突然変異がclk-1変異体の遅延性の卵形成を抑制したことを示唆した。
【０３５３】
生殖系列の発生に対するdsc-4突然変異の効果を、DIC顕微鏡観察を使用してclk-1/dsc-4二重突然変異体の生殖系列の観察を介して直接検査した。成体脱皮の6時間後に、clk-1の単一変異体の3%だけと比較して、clk-1／dsc-4二重突然変異体の50%は、前方生殖系列の近端部に卵母細胞を有した（41%は子宮に卵がなく、9%は、卵を有する；図1C、2E）。二重突然変異体の100%が卵形成（97%が子宮に卵を有する）を受けていたので、後方生殖系列の近端部は、dsc-4（qm182）によってさらに前方よりもより進行された。これは、dsc-4がclk-1変異体の全体の緩徐な生殖系列発達を劇的に抑制することができるが、clk-1変異体の前方生殖腺にさらなる欠陥があり、克服することができないことを示唆した。近位の生殖系列は、より初期の時点で検査し、dsc-4突然変異も配偶子形成の開始の遅延を抑制することを明らかにした。成体脱皮の1.5時間後に、clk-1の単一変異体の10%だけと比較して、clk-1/dsc-4二重突然変異体で検査した100%の生殖系列が、第一精母細胞生産を終えていた（図1D）。clk-1/dsc-4二重突然変異体は、細胞体の発達と比較して適切な段階で精子形成および卵形成を開始したので、これは、clk-1変異体において観察される期外発生の欠陥の完全な抑制に対応した。
【０３５４】
dsc-4による抑制が、身体発達の遅滞によるのではなく、むしろ生殖系列発達の加速によって生じたどうかを決定するために、後胚発生の速度に対するdsc-4（qm182）突然変異の効果を解析した。野生型虫は、孵化の45〜51時間後の間に成体期に達した（図1E）。dsc-4変異体は、これらが孵化の57〜69時間後の間に成体期に達するだけであったので、野生型よりも緩徐な後胚発生を有する。しかし、clk-1/dsc-4二重突然変異体の後胚発生の期間は、clk-1変異体のものとほぼ同一である。clk-1とclk-1／dsc-4変異体は両者とも、孵化の63〜81時間後の間に成体期に達した。これは、dsc-4突然変異が身体発達を減速することのなく、細胞体のものと共に生殖系列の発達を再度同調させることによってclk-1変異体の期外発生の欠陥を抑制することを示した。
【０３５５】
変異体は、コスミドK02D7によって、および予測される配列K02D7.4を含むPCR産物によってレスキューされた。PCR産物は、clk-1/dsc-4二重突然変異体の速い排便、並びに急速な産卵速度をレスキューした。K02D7.4の発現は、clk-1/dsc-4および野生型バックグランドのRNAiによって阻害された。K02D7.4 RNAiは、clk-1バックグランドにおいてdsc-4（qm182）突然変異を表現型模写することが見いだされた。clk-1（qm30）／K02D7.4 RNAi動物の排便速度、並びに産卵速度は、clk-1（qm30）／dsc-4（qm182）二重突然変異体のものと同様であった。（データ示さず）。しかし、K02D7.4 RNAiの効果は、clk-1バックグランドにおける排便または産卵に関して、dsc-4突然変異のものに相加的ではなかった。また、K02D7.4 RNAiはdsc-4変異体において、いずれの表現型にも明らかな増強を生じさせなかった。共に、これらの結果は、ゲノムのコスミドクローンK02D7.4の遺伝子がdsc-4であり、dsc-4（qm182）対立遺伝子が、おそらくヌルであることを証明した。
【０３５６】
dsc-4は、dsc-4遺伝子は、892残基のタンパク質をコードし、ミクロソーム・トリグリセリド転移タンパク質（MTP；図3A、C、および4）の大サブユニットに類似する。MTPは、小胞体（ER）タンパク質であり、アポリポタンパク質B（apoB）含有リポタンパク質特にLDLの分泌に必要である（Berriot-Varoqueaux et al., 2000, Ann, Rev. Nutr. 20:663）。リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステリルエステル、コレステロール、およびリン脂質を含む種々の脂質と複合体を形成する高分子量のタンパク質からなる。
【０３５７】
ヒトにおいて、MTPの大サブユニットの突然変異は、無βリポタンパク質血症（ABL）、LDL分泌の切断欠損を生じさせる（Nakamuta et al., 1996, Genomics 33:313-316 and Sharp et al., 1993, Nature 365:65-69）。DSC-4ポリペプチドは、分泌のための推定上のN末端のシグナル配列を有し、予測される切断部位は、残基18と19の間である（図4）。DSC-4は、ゲノムがシーケンスされたあらゆる動物種において単一の明白な相同体を有するが、植物および単細胞生物には無いようである。相同体間の一致性は、全ての配列全体に及び、特定の領域またはドメインに限定されず、脊椎動物のMTPのDSC-4の整列では、多数のギャップは必要でない（図3A）。PSI-blastを使用してDSC-4をNCBI非重複性タンパク質データベースと比較すると、最高のスコアを有する7つのタンパク質は、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ、およびゼブラフィッシュMTP、並びにアノフェレスおよびショウジョウバエのMTPを含む新の脊椎動物のMTPであった。dsc-4（qm182）対立遺伝子は、アミノ酸置換を生じる2つの点突然変異を有することが見いだされ、その一つは、種の間で高度に保存されている（図3A）。MTPは、apoB結合ドメイン、apoBおよびPDI結合ドメイン、並びに脂質結合および転移ドメインを有する（図3Cおよび4）（Mann et al.,1999, J Mol Biol 285:391-408）。dsc-4（qm182）の突然変異点は、apoB-結合ドメインにあり、無βリポタンパク質血症患者において見いだされるものとは異なっていた。
【０３５８】
dsc-4：：GFP融合タンパク質（転写または翻訳のリポーター）を使用してdsc-4発現を解析した。2つのタイプのリポーターは、ほぼ同一の発現パターンを示した。翻訳リポーターに由来する融合タンパク質は、全長dsc-4配列をコードし、変異体の表現型をレスキューすることができたことから、観察される発現のパターンは、内因性dsc-4のものを反映したことを示唆する。しかし、GFP蛍光は、小胞体（ER）に限られずにむしろ細胞質を満たした。おそらく、ERにおけるこのタンパク質の過剰発現は、困難であり、異常な局在化は、過剰発現によるものであった。GFP蛍光は、幼虫の段階（図2G）から成体期の全体にわたって伸長（図2F）を介しした直後の、初期発生から腸において観察され、また、雄の腸においても観察された。虫において、非常に大きな腸は、消化器であり、主要な分泌器官である。特に、腸は、apoB相同体であるビテロゲニンを分泌する。従って、dsc-4の発現は、脊椎動物におけるMTPの発現のパターンと整合しており、主に腸および肝臓において見いだされる。
【０３５９】
8.実施例：dsc-4のバリデーション  
dsc-4は、分泌されたLDL様リポタンパク質を減少させることによってclk-1変異体線虫をレスキューする（MTPに対するその相同性によって証明されるとおり）。LDL様リポタンパク質のレベルは、clk-1の単一変異体の線虫において、、その他の検査方法で（たとえば、コレステロール欠損、vit RNAiまたはSOD RNAiによって）これらがclk-1／dsc-4二重突然変異体を表現型模写することができた場合に操作された。
【０３６０】
8.1  材料および方法  
8.1.1  株および培養方法  
動物は、20℃で記載されているとおりに培養し（Brenner, 1974, Genetics 77:71-94）、を特に明記しない限り大腸菌株OP50を与えた。コレステロール欠枯渇実験は、いずれのコレステロール（NGM-C）も添加しなかったこと以外、OP50と共に播種した標準的なNGMプレート上で行われた。生殖系列発達の速度を検査する前に、虫を二世代以上の間NGM-Cプレートの上で培養した。
【０３６１】
RNAi実験のためには、虫を1mMのIPTGおよび50μg/mL のアンピシリンを補ったNGMプレート上で培養し、pPD129.36由来のプラスミドで形質転換した大腸菌株HT115を与えた。P0sをL4幼虫と同様にRNAiプレートに移し、F1世代を検査した。
【０３６２】
野生型株は、N2（ブリストル株）であった。以下の突然変異を使用した：clk-1（qm30）III；unc-33（e204）、dpy-9（e12）、dsc-4（qm182）IV。
【０３６３】
8.1.2  RNA干渉  
SOD RNAiクローンのために、PCR産物を第1鎖cDNAライブラリー（ランダム・プライマーを使用して混合段階N2虫から単離した総RNAの逆転写によって作製される）から増幅した。PCR産物をpPD129.36のSmaI部位にクローン化した。以下の領域を使用した：SOD-1のために、C15F1の17287-18262；SOD-2のために、F10D11のうちの1216-2354；SOD-3のために、C08A9の14358-15759；SOD-4のために、F55H2のうちの1253-2977。
【０３６４】
vit RNAiクローンのために、PCR産物をN2ゲノムDNAから増幅し、消化して、pPD129.36にクローン化した。vit-2のためには、内部EcoRI-SalI断片をクローン化した（C42D8の24381-25252）。vit-5のためには、C04F6の9271-10130に対応するPCR産物をPstIおよびXbaI部位にクローン化した。vit-6のためには、K07H8の5787-6851に対応するPCR産物をXhoIおよびHindIII部位にクローン化した。全ての挿入断片をシーケンスして、クローン化されたvit遺伝子の一致性を確認した。
【０３６５】
RNAi実験は、記載されているように行った（Kamath et al., 2001, Genome Biol. 2:research0002.1-research0002.10）。対照には、pPD129.36ベクターを形質転換したHT115細菌を与えた。
【０３６６】
8.1.3  表現型解析  
産卵速度の時間経過解析：L4段階の動物をプレートに拾い、3時間後に検査した。この期間中に成体脱皮した動物を実験に使用し、間隔の終わりに1.5時間齢の成体であるとみなした。24時間の間隔で、動物を選び出し、4時間の間産卵させた。虫あたりに時間につき産まれた平均産卵数を算出した。
【０３６７】
一腹仔数：L4動物を選び出し、産卵期間の間に毎日新たなプレートに移した。虫あたりの生まれた子孫の総数を決定した。
【０３６８】
後胚発生の速度：卵をプレートに採集し、1時間後に検査した。この期間中に孵化した動物を実験に使用した。それぞれの時点までに成体に達した動物の割合を記録した。
【０３６９】
生殖系列の発生段階：虫は、産卵速度の時間経過解析に関して最終的な脱皮に同調させた。生殖系列の近位部分をその直後（1.5h齢の成体を検査するために）、または4.5時間後（6時間齢の成体を検査するために）のずれかをDIC顕微鏡観察を使用して検査した。
【０３７０】
卵生産の時間経過解析：虫は、産卵速度の時間経過解析に関して最終的な脱皮に同調させた。虫を3時間の間隔で検査し、子宮内に受精卵を含む虫の割合を決定した。
【０３７１】
8.2  VITのノックダウン／突然変異  
哺乳類において、MTPは、apoB含有リポタンパク質の分泌のために必要とされる。線虫のゲノムは、5つのapoB様遺伝子（vit-2、-3、-4、-5、および-6）および1つのapoB様偽遺伝子（vit-1）を含む（（Blumenthal et al., 1984, J Mol Biol 174:1-18; Spieth and Blumenthal, 1985, Mol Cell Biol 5:2495-2501; Spieth et al., 1985, Nucleic Acids Res 13:7129-7138）。線虫（C.elegans）のapoB様の遺伝子の分泌の変更により、生殖系列発達に対するdsc-4の効果を表現型模写することができるかどうかを決定するために、vit遺伝子（vit-2、-5および-6）をRNAiによって壊した。vit-5のRNAiクローンのコード領域は、vit-3および-4の両者と98%同一であるので、vit-5 RNAi処理は、vit-3および-4の機能も破壊するものと思われる（図5A）。
【０３７２】
clk-1変異体の産卵速度に対するvit RNAiの効果を解析した。動物が成体脱皮の24時間後に、最も有意な効果が観察された（図5C）。その時に、clk-1／vit-5 RNAi動物は、卵を産み始めたが、clk-1対照では産まなかった（図5B、C）。clk-1／vit-5 RNAi動物の産卵速度のピークは、clk-1対照の約12時間前に到達した（図5C）。vit-5 RNAiの効果は、dsc-4突然変異の効果がVITタンパク質分泌の減少による場合に予想されるとおり、dsc-4の効果に対して相加的ではなかった。その他のvit遺伝子に対するRNAiの効果は、その計測では極めて弱かった（図5B）。排便時の効果は、いずれの遺伝子についても見られなかった。
【０３７３】
産まれる産卵速度の増大は、生殖系列発達の速度の増大によって生じたかどうかを決定するために、時間経過実験を行って、vit-5 RNAi動物の生殖系列発達の速度を検査した。これらの子宮の中に受精卵を含む動物の割合をclk-1の単一変異体およびclk-1/vit-5 RNAi二重突然変異体について決定した。clk-1変異体動物は、これらが成体脱皮した15〜18時間後の間に受精卵を有し始め、全ての虫が受精卵を含むためには、36時間かかる。対照的に、clk-1／vit-5 RNAi二重突然変異体は、6〜9時間の間に受精卵を有し始め、21時間までに全てが受精卵を含む（図5D）。vit-5 RNAiは、24時間において産卵のに対して最も有意な効果を有するように見えたので（図5C）、子宮内の平均産卵数をその時に記録した。その時に、clk-1/vit-5 RNAi二重突然変異体は、これらの子宮の中にclk-1動物よりも10媒以上多くの卵を含んだ（図5EおよびF）。従って、vit-5発現のノックダウンは、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制した。
【０３７４】
時間経過解析は、子宮内の卵の存在を記録すると、vit-5 RNAiの効果の非常に感受性のある基準となることを示した。また、vit-2 RNAiおよびvit-6 RNAiを成体脱皮の18時間後にこのような方法で記録し、これらの遺伝子のわずかな効果を明らかにすることに成功した（子宮内に卵をもつ動物のパーセント：clk-1=5.2%、clk-1／vit-2 RNAi=30.4%、clk-1/vit-6 RNAi=25.0%、clk-1/vit-5 RNAi=87%；n>44）。
【０３７５】
要約すると、apoB相同体vit-3、-4、および-5の産生の減少、並びによりわずかな程度にvit-2および-6は、生殖系列発達に対するdsc-4の効果を媒介するように見えた。vitsで観察される効果が、dsc-4で観察されるものよりも激しくなかった理由の1つの可能性は（排便に対しての効果がないことを含む）、vit遺伝子に対するRNAiが、これらが高レベルで発現したために効率的ではなかったことである（Kimble and Sharrock, 1983 Dev Biol 96:189-196; Sharrock, 1983, Dev Biol 96:182-188）。もう一つの可能性は、全てのvit遺伝子が最大効果のためには直ちにターゲットされなければならないであろうということである。また、この可能性は、vitsが必須な卵黄タンパク質として機能するが、RNAiは卵を産生する能力に対して有意な効果を有しないという観察によって支持される（図5）。
【０３７６】
vit遺伝子は、元来は、卵黄タンパク質をコードする遺伝子として単離された。vit-2および-6は、主に雌雄同体の腸で合成され、腸から生殖系列まで運搬される（Kimble and Sharrock, 1983, Dev Biol 96:189-196）。vit-5は、ノーザンブロット法（Blumenthal et al., 1984, J Mol Biol 174:1-18）によって強力な雌雄同体特異的なシグナルを示すことが報告されており、vit-5および／またはvit-3、-4（これは、vit-5と97%同一である）も卵黄タンパク質をコードすることを示唆する。しかし、本発明者らの結果は、vitsもリポタンパク質粒子中で機能し、脊椎動物に見いだされるapoB依存的なLDL様粒子に似ていること、および卵黄リポタンパク質とは異なっているかもしれないことを示した。2つの証拠が、これを示唆する。第1に、dsc-4の破壊は、一腹仔数に影響を及ぼさない。dsc-4が卵黄生産必要にされるならば、dsc-4の突然変異は、卵黄タンパク質の受容体をコードするrme-2の一腹仔数様の突然変異を大幅に減少させるはずである（Grant and Hirsh, 1999, Mol Biol Cell 10:4311-4326）。第2に、卵黄タンパク質生産は、雌雄同体においてのみ必要とされるはずであるが、dsc-4はまた、雄の腸においても発現されている。
【０３７７】
8.3  コレステロール枯渇  
dsc-4は、分泌型LDL様リポタンパク質の減少を生じたので、dsc-4がコレステロールの枯渇によって表現型模写される突然変異であるかどうかを決定するための実験を行われった。哺乳類において、コレステロールは、リポタンパク質の主要構成分であり、その摂取または合成を減少させると、LDLレベルの現象を引き起こす。線虫は、コレステロールを合成することができないので、食餌コレステロールの量を減少させることにより、内部コレステロールレベルの減少を生じる（Crowder et al., 2001, J Biol Chem 276:44369-44372）。生殖系列の発達に対するコレステロール欠損の効果を野生型、clk-1、dsc-4、およびclk-1/dsc-4バックグランドで検査した（図1D）。コレステロール欠損は、完全にclk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を消滅させたが、その他の遺伝子型に対しては、穏やかな効果だけを有した。clk-1生殖系列に対する低コレステロールの効果は、コレステロールの存在下におけるdsc-4のものと見分けがつかなかったことから、哺乳類と同様に、食餌コレステロールの減少がLDL様の粒子の分泌を減少させることを示唆した。
【０３７８】
一般に、コレステロール欠損は、生殖系列発達に対するdsc-4突然変異の効果を模倣したが、コレステロール欠損の効果は、より激しく、dsc-4変異体では見られない多くの欠陥を含んだ（Crowder et al., 2001, J Biol Chem 276:44369-44372; Gerisch et al., 2001, Dev Cell 1:841-851; Merris et al., 2003, J Lipid Res 44:172-181; Shim et al., 2002, Mol Reprod Dev 61:358-366; Yokoyama, 2000, Ann N Y Acad Sci 902:241-247）。この相違は、種々の方法で説明することができる。1つの可能性は、dsc-4ポリペプチドは、虫でのLDL様リポタンパク質の分泌のために哺乳類のMTPほど厳密に必要とされないということである。もう一つの可能性は、虫の腸から末梢組織へのコレステロール再分布のその他の経路があり、これにより1本の経路の破壊がコレステロール摂取の全体の欠損ほど重症ではなくなる。哺乳類では、たとえば、HDLなどのリポタンパク質の形態があり、分泌のためにMTPを必要としない。最後に、コレステロール枯渇した虫で観察されるいくつかの欠陥は、腸自体においてコレステロールを必要とする種々のプロセスの結果であるかもしれず、腸からの再分布だけが影響を受けるときは、それ自体が現れないと考えられる。
【０３７９】
8.4SOD-1ノックダウン／突然変異  
clk-1は、UQの生合成に必要とされる推定上のヒドロキシラーゼをコードする。（Stenmark et al., 2001, J Biol Chem 276:33297-33300）。clk-1変異体には、UQがなく、その代わりに生合成の中間体であるデメトキシユビキノン（DMQ）が蓄積する（Miyadera et al., 2001, J Biol Chem 276: 7713-7716）。UQの重要な役割のうちの1つは、ミトコンドリアの呼吸鎖における電子伝達体としてのものである。この役割において、UQは、活性酸素種（ROS）生産の主要部位のうちの1つである（Raha and Robinson, 2000, Trends Biochem Sci 25:502-508）。しかし、UQは、いくつかのその他の細胞役割も有し、やや逆説的であるが、抗酸化物としての役割を含む。DMQのレドックス特性は、UQのものとは定量的に異なっており、特にDMQは、ROS生産をあまり起しやすくないかもしれない（Miyadera et al., 2002, FEBS Lett 512:33-37）。抗酸化物、ビタミンEでの処理が、線虫の生殖系列発達を遅くするという観察と合わせると（Harrington and Harley, 1988, Mechanisms of Aging and Development 43:71-78.）、これは、生殖系列の発達に対するclk-1の効果が、ROSの代謝の変化介して媒介されるであろう可能性が高くなる。生殖系列の発達のタイミングがレドックス制御されており、DMQのレドックス特性が、UQよりも酸化的ストレスを生じさせない場合、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）などの抗酸化物酵素の機能を減少させることにより、ROSの量を増大することによる生殖系列発達の異常なタイミングを抑制することができる。
【０３８０】
ROSレベルが生殖系列の発達の速度に影響を及ぼすかどうかを試験するために、RNAiによるSOD活性の減少の効果を検査した。SOD-1、-2、-3、および-4のレベルがRNAiによって減少されたときは、効果は、野生型動物の産卵速度に対して何の効果も見られなかった（図6A）。しかし、clk-1変異体では、SOD-1 RNAiにより、遅延性の卵産生を抑制した。（図6B）この効果は、その他の遺伝子のいずれに対するRNAiが投与されたときにも、見られなかった。clk-1変異体は、72時間でこれらの産卵ピークに達したが、clk-1/SOD-1 RNAi二重突然変異体は、48時間までにこれらの産卵ピークに達した。これらの結果は、clk-1変異体の生殖系列の緩徐な発達が、細胞質で産生されるスーパーオキシドの量を増大することによって軽減することができることを示唆する（SOD-1は、細胞質のCu／Znスーパーオキシドジスムターゼであるので）。clk-1変異体の中心的な欠陥は、UQの代わりにDMQが蓄積することであるので、これは、DMQが、UQの存在する時よりも低レベルのスーパーオキシドを生じさせることを示唆する。
【０３８１】
SOD-1 RNAiは、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制したが、これはclk-1/dsc-4二重突然変異体に対しては何の効果も有さなかった（図6C）。これは、od-1およびdsc-4が、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制するために同じプロセスまたはシグナリング経路で機能することを示唆する。上記のように、clk-1変異体の生殖系列発達に対するdsc-4突然変異の効果は、LDL様リポタンパク質の分泌に影響を及ぼす際にその役割を介する可能性が非常に高い。sod-1 RNAiは、dsc-4突然変異と同一の効力を有したという観察は、脂質酸化がclk-1変異体で減少され（Braeckman et al., 2002, Mech Aging Devel 123:1447-56）および細胞質のCu／Zn-SODが強くその他の系のLDL酸化のレベルを調節する（Guo et al., 2001, Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:1131-1138）という以前の知見と共に、LDL様リポタンパク質の酸化が線虫の生殖系列の発達を制御する際の重要な因子であることを示唆する。
【０３８２】
結論として、LDL様リポタンパク質の酸化を減少させることにより、細胞体と比較して生殖系列発達の速度を減速するが（clk-1変異体と同様に）、細胞体と生殖系列の適当な調整は、SOD-1の機能に干渉することによって、または天然のLDL様リポタンパク質の産生および分泌を減少させることによって（clk-1／dsc-4二重突然変異体と同様に）、いずれかにより回復することができる。従って、酸化型リポタンパク質は、生殖系列発達を刺激し、天然のリポタンパク質は、阻害する（図7A）。
【０３８３】
9.  実施例：Dsc-3  
9.1  同定および特性付け  
dsc-3遺伝子は、線虫の第4染色体の0.5cMの遺伝子領域にマップされた。しかしdsc-3遺伝子は、、この遺伝子間隔に対応するコスミドに由来するDNAの注射によりdsc-3変異体をレスキューすることができなかったので、標準的な形質転換レスキュー技術によってクローン化されることができなかった。
【０３８４】
dsc-3を同定するために候補アプローチをとった。dsc-3突然変異がマップされたゲノム領域の遺伝子が調査して、1つの潜在的候補の予測されるヌクレオチド配列H06H21.10がインターネット・ウェブサイトwormbase.orgから入手可能な配列データベースから同定された。予測されるヌクレオチド配列H06H21.10には、ヒト遺伝子をコードするDNAと類似性を有する胸の注釈がついていた。予測されるH06H21.10遺伝子があまり大きく（＞13kb）、利用できるいずれのコスミドにも完全には含まれていなかったので、レスキュー実験を容易に行うことができなかった。
【０３８５】
予測されるH06H21.10遺伝子をさらに検査するために、ゲノム配列をヒト遺伝子のヌクレオチド配列と比較した。配列のアラインメントのさらなる解析および洗練により、さらに2つのエキソンが本領域に存在するが、虫配列データベースでは、予測されるH06H21.10遺伝子の配列をコードするものと同定されなかったことが明らかになった。本発明によれば、この遺伝子の適切なコード配列（本明細書において、dsc-3と称される）は、3945bpを含み、1314アミノ酸を有するタンパク質をコードし、図9およびSEQ ID NO：7を参照されたい。dsc-3のコード配列は、予測されるH06H21.10遺伝子のエキソン4とエキソン5の間の1つのエキソンの付加（ヌクレオチド459-613）に対応するさらなる276bps（ヌクレオチド459-734）、および予測されるエキソン5（ヌクレオチド614-734）に対する第2の付加の121ヌクレオチド5'を含む。データベースにおいて報告されるH06H21.10遺伝子の予測される配列は、誤っている。本発明によれば。dsc-3の22エキソンは、以下のヌクレオチド塩基対で同定された：エキソン1：1〜110、エキソン2：111〜224、エキソン3：225〜323、エキソン4：324〜458、エキソン5：459〜613、エキソン6：614〜991、エキソン7：992〜1272、エキソン8：1273〜1341、エキソン9：1342〜1764、エキソン10：1765〜1890、エキソン11：1891〜2088、エキソン12：2089〜2232、エキソン13：2233〜2320、エキソン14：2321〜2469、エキソン15：2470〜2620、エキソン16：2621〜3014、エキソン17：3015〜3147、エキソン18：3148〜3476、エキソン19：3477〜3693、エキソン20：3694〜3791、エキソン21：3792〜3909およびエキソン22：SEQ ID NO：7の3910-3945。
【０３８６】
dsc-3によってコードされる予想アミノ酸配列は、図10に示してあり（SEQ ID NO：8）、以後DSC-3と称する。DSC-3とヒト由来の4相同的なIV型P型 ATPaseのアミノ酸配列のアラインメント（SEQ ID NO：9、10、11、および12）を図11に示してある。ATP8B1は、ATP8B2およびATP8B4と最高のアミノ酸一致性を共有する。DSC-3とATP8B4配列の間のアミノ酸一致性の程度は、アミノ酸をDSC-3：137〜1115とATP8B4：2〜946を整列させたときに54%である。
【０３８７】
9.2  RNA干渉
Rdsc-3の発現を減少させるためにNA干渉（RNAi）を使用した。エキソン18および19を第1の鎖cDNAライブラリー（ランダム・プライマーを使用して混合段階N2虫から単離された総RNAの逆転写によって作製される）から、PCRによって増幅した。PCR産物（dsc-3転写物のヌクレオチド3182-3666に対応する）をpPD129.36のT7プロモーターに隣接するPstIおよびNheI部位にクローン化した。T7プロモーターに対して相補的なプライマーを使用して、クローンからdsc-3断片を増幅した。このPCR産物をインビトロでの転写反応のテンプレートとして使用し、二重鎖RNA（dsRNA）を産生した。このdsRNAは、Fire et al., 1998 （Nature. 391（6669）:806-11.）に記載したように、〜1μg/mLの濃度でclk-1（qm30）変異体に注射した。
【０３８８】
dsc-3の発現の減少を示する虫は、完全にdsc-3変異体を表現型模写する（同じ表現型を生じる）ことができる。このRNAi実験の結果から、予測されるdsc-3は、上記第9.1節に記載の通り、その機能を減少させるとDsc表現型を生じるので、dsc遺伝子であることが明らかである。
【０３８９】
9.3  DSC-3および脂質代謝
3つのdsc-3つの変異体、dsc-3（qm179）、dsc-3（qm180）、およびdsc-3（qm184）が、clk-1変異体の緩徐な排便表現型の抑制因子として単離された。dsc-3変異体は、dsc-4変異体と同じ表現型を有し、すなわち、これらは20℃で、並びに25℃に変化した後でclk-1変異体の緩徐な排便を抑制する。また、dsc-3変異体も、dsc-4変異体において観察される生殖系列発達の促進を示す。そのほかに、dsc-3（qm179）突然変異の効果は、dsc-4（qm182）突然変異のものに対して相加的ではないことから、これらの2つの突然変異が同じ経路において作用するか、または同じプロセスに影響を及ぼすことを示唆する。
【０３９０】
dsc-3は、IV型P型ATPase、より詳細には、ATP依存性アミノリン脂質輸送体をコードする。dsc-3は、ヒト遺伝子ATP8B1によってコードされるアミノ酸配列と50%同一であり、これは、FIC1／BRIC／PFIC1のヒト疾患座位に対応する。ATPase酵素は、金属、、イオン、およびリン脂質などの因子を、ATPを使用して膜を越えて輸送する必須膜タンパク質である酵素の大ファミリーである（Harris et al, 2003, Biochim. Biophys. 1633:127-131）。このような酵素は、膜の2枚の小葉間に非対称の脂質組成を生じて、このような膜に特定の性質を与える（Daleke, 2003, Journal of Lipid Research 44:233-42）。このようなATPaseの突然変異のヒトATP8B1／FIC1では、バイラー病の胆汁うっ滞性の表現型の特徴を生じる（Bull et al., 1998, Nature Genetics 18:219-24; Trauner et al, 2002, Physiol. Rev. 83:633-671）。ATP8B1／FIC1（しかし、限定されない）などのATPase酵素は、胆汁酸の輸送および分泌において役割を果たす。ATP8B1／FIC1は、CHOK1細胞で発現され、次いでこれらの細胞の膜で同定され、ここで膜における脂質の分布の変更が観察された（Ujhazy et al., 2001, Hepatology 34:768-775）。
【０３９１】
胆汁うっ滞性疾患は、肝臓内の胆汁の流れが障害される症状である。哺乳類において、コレステロール恒常性は、その腸管吸収、内因性合成、および胆汁排泄の同調調節で達成される。胆汁代謝を変更することは、コレステロールおよびLDLレベルを制御するための方法のうちの1つである（Lu et al., 2001, Trends in Endocrinology and Metabolism 12:314-20; Fuchs, 2003, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284:G551-7）。アミノリン脂質輸送の欠損と胆汁鬱帯との間の関係は、正確に理解されていないが、ATP8B1は、胆汁塩排出において、例えば肝臓小管の膜における脂質非対称を維持することによって胆汁酸輸送体の活性の調節に重要な役割を果たしている（Bull et al., 1998, Nature Genetics 18:219-24）。加えて、この遺伝子は、肝臓に発現されるが、腸においてより優勢であるので、膜を越えた脂質非対称は、腸のステロール吸収および分泌に関与する膜輸送体の活性に影響を及ぼすことができる（Ujhazy et al., 2001、Hepatology 34：768-75）。
【０３９２】
dsc-4がLDL様リポタンパク質の分泌に必要な活性をコードすること、およびLDL様リポタンパク質分泌の低下またはコレステロールの低下がdsc-3と同じ生殖系列発達の速度に対する効果を有することを考えると、本発明者らは、dsc-3が、ヒトにおいてその相同体が行うように、虫においても実際にコレステロールホメオスタシスに影響を及ぼすと結論する。dsc-3の配列解析では、ヒトのアテローム性動脈硬化症、コレステロール代謝に関連した肝臓および腸の問題の治療および／または予防のための化合物をスクリーニングするための標的としてdsc-3（およびヒト相同体を含むその相同体）を使用する本発明をサポートする。
【０３９３】
当業者であれば、ルーチン試験だけを使用して、本明細書に記載された本発明の特異的な態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。このような均等物は、請求の範囲に含まれることが企図される。
【０３９４】
この明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に援用され得ことを具体的かつ個々に示されたのと同じ範囲で、本明細書において参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３９５】
【図１Ａ】図1A-1E：dsc-4（qm182）突然変異およびコレステロール摂取の減少は、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制する。（A）産卵速度の時間経過解析。虫を成体脱皮（時間0）状態に同調させて、産卵速度（時間あたりに産まれる産卵数）は、24h間隔で測定した（n≧30）。遺伝子型は、以下の通りであった：野生型（N2）；dsc-4（qm182）；clk-1（qm30）；およびclk-1（qm30）／dsc-4（qm182）。野生型動物では、24〜48時間の間に産卵ピークに達したが、clk-1変異体では、72時間で産卵ピークに達した。dsc-4（qm182）突然変異では、clk-1/dsc-4二重突然変異体によって証明されるように抑制され、48時間までに産卵ピークに達した。dsc-4の単一変異体では、24時間までに産卵ピーク達し、野生型におけるよりもわずかに早かった。
【図１Ｂ】（B）一腹仔数。それぞれの遺伝子型の10匹以上の動物によって産まれる子孫の平均数を示してある。エラー・バーは、標準偏差（SD）を表す。平均一腹仔数±野生型のSD=315.0±30.4、dsc-4（qm182）=210.9±31.8、clk-1（qm30）=206.8±52.4、およびclk-1（qm30）／dsc-4（qm182）= 233.8±33.7。
【図１Ｃ】（C）成体脱皮の6時間後の生殖系列の発達。4つの異なる発育段階の各々における生殖系列の割合をそれぞれの遺伝子型について示してある（n≧30）。前方（A）および後方（P）生殖腺アームの発達段階を別々に示してある。全ての野生型動物は、卵形成が進行中であり、これらの約半分が受精卵を有した。対照的に、clk-1（qm30）変異体の半分未満では、卵形成が進行中であった。後方の生殖系列の発達は、前方のものよりも進行した。dsc-4（qm182）突然変異は、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制したが、それは前方および後方の生殖腺の違いを克服することができない。
【図１Ｄ】（D）成体脱皮の1.5時間後の生殖系列発達。コレステロールの補充を伴ったおよび伴っていないプレートでのそれぞれの遺伝子型について、4つの異なる発育段階の各々における生殖系列の割合を示してある（それぞれ、n≧30およびn≧19）。大部分の野生型動物は、後期のL4段階で一次精母細胞形成を開始し、一次精母細胞形成を終えた。対照的に、clk-1（qm30）変異体の半分は、第一精母細胞形成を未だに開始していなかった。大部分のclk-1（qm30）／dsc-4（qm182）二重突然変異体は、第一精母細胞形成を終えたので、dsc-4（qm182）突然変異は、clk-1（qm30）変異体よりも緩徐な生殖系列発達を抑制した。
【図１Ｅ】（E）後胚発生の期間。それぞれの時間間隔の間に成体期に達した虫の割合を示してある（n≧50）。野生型動物は、孵化の51時間後にまでに全てが成体期に達っした。clk-1（qm30）変異体は、clk-1（qm30）／dsc-4（qm182）二重突然変異体と同様に、孵化の81時間後までに全てが成体期に達したことから、dsc-4は、clk-1変異体の緩徐な後胚発生を抑制しないことを示している。
【図２】図2A-2G：dsc-4の発現の生殖系列の発達およびパターンに対するclk-1およびdsc-4の効果。（A）後期および若年成体雌雄同体のL4の生殖系列の近位部分の概略図。生殖腺は、通常、中央に位置する子宮に連結し、外陰部に対して融合された2本のU型のアーム（前および後方）からなる。遠位-近位の軸は、外陰部（外部に対する生殖腺の基端側開口部）に対して相関する。（B）-（D）成体脱皮の6時間後の後方生殖系列の近端部。左が前であり、上部は背面である。星印は、最も近位の卵母細胞の核を示す。矢印は、生殖系列の近端部を示す。文字「e」は、受精卵を示す。（B）野生型は、生殖系列の近端部に卵母細胞を有した。（D）clk-1（qm30）変異体は、なおも精子形成を受けていた（点線）。また、第一精母細胞は、生殖系列の近端部の近くで観察された（実線）。（C）dsc-4（qm182）シングルの変異体および（E）clk-1（qm30）／dsc-4（qm182）二重突然変異体は、子宮の生殖系列、並びに受精卵の近端部に卵母細胞を有した。（F）-（G）dsc-4：：GFP転写融合リポーター遺伝子に由来するGFP蛍光。動物の輪郭および胚は、点線によって示してある。バーは、10マイクロメートルを示す。（F）コンマ段階（comma stage）胚の腸で観察されるGFP蛍光。（G）後期の幼虫の後側末端。GFP蛍光は、成体期まで、およびその間に腸で観察された。
【図３Ａ−１】図3A-3C：dsc-4遺伝子およびタンパク質産物の構造および相同性。（A）DSC-4ポリペプチドの一次構造を（SEQ ID NO：2）ゼブラフィッシュ、マウス、およびヒトMTPと共に整列した。同一の残基は、掛けしてあり、＞75%および＞50%の類似性を有する残基をそれぞれ黒および光灰色にしてある。星印は、dsc-4（qm182）で突然変異が見いだされた突然変異点を示す。遺伝子の位置354にC→T移行があり、タンパク質の位置62でセリンからフェニルアラニンへの置換を生じ、遺伝子の位置605のG→A移行により、タンパク質の位置146でアラニンからスレオニンへの置換を生じた。シグナル配列は、示されていない。DSC-4のドメインは：apoB結合ドメイン（アミノ酸残基19〜295）、apoBおよびPDI結合ドメイン（アミノ酸残基296〜609）、並びに脂質結合ドメイン（アミノ酸残基610〜890）を含む。
【図３Ａ−２】図３A-1の続き。
【図３Ａ−３】図３A-2の続き。
【図３Ｂ】（B）dsc-4遺伝子のゲノムの構造。黒四角および白四角は、それぞれ非コードおよびコード領域に対応する。cDNA並びに第1鎖cDNAライブラリーから増幅されたPCR産物のシーケンシングにより、dsc-4メッセージはSL1トランススプライスされており、11のエキソンを含むことが明らかになった。
【図３Ｃ】（C）dsc-4タンパク質の概略図。掛けされた四角は、シグナル配列、apoB結合ドメイン、apoBおよびPDI結合ドメイン、並びに脂質結合および輸送ドメインを表す。
【図４Ａ】dsc-4 cDNA（SEQ ID NO：1）およびタンパク質（SEQ ID NO：2）の配列。^は、予測されるシグナル配列による切断部位を示す。#は、抑制因子スクリーニングで同定されたdsc-4（qm182）変異体で変異された部位を示す。ヌクレオチド位置354のCからTへの突然変異により、アミノ酸の位置62でセリンからフェニルアラニンへの置換を生じ、ヌクレオチド位置605のGからAへの移行により、アミノ酸の位置146でアラニンからスレオニンへの置換を生じた。下線を引いた残基は、apoB結合ドメインに対応しており、点線の下線を引いた残基は、apoBおよびPDI結合ドメインに対応しており、二重下線を引いた残基は、脂質結合ドメインに対応する。また、5'-および3'-UTRの配列も含めた。示したdsc-4 DNA配列は11のエキソンを含み、ヌクレオチド塩基1〜169に5'非翻訳の領域に続いて見いだすことができる。dsc-4コード配列内のエキソンのヌクレオチド位置は、以下の通りである：エキソン1：170〜215、エキソン2：216〜472、エキソン3：473〜819、エキソン4：820〜924、エキソン5：925〜1084、エキソン6：1085〜1251、エキソン7：1252〜1543、エキソン8：1544〜1738、エキソン9：1739〜2182。エキソン10：2183〜2529、およびエキソン11：2530〜2848。
【図４Ｂ】図4Aの続き。
【図４Ｃ】図4Bの続き。
【図４Ｄ】図4Cの続き。
【図５Ａ】図5A-5F：vit-3、-4、および-5に対するRNA干渉は、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制した。（A）vit遺伝子間の一致性の比較。vit遺伝子配列間の同一のヌクレオチドの割合を示してある。vit-3、-4、および-5は、互いに実質的に同一であり、それぞれvit-2および-6と約66%および40%の相同性を示す。vit-2は、vit-6と42%の一致性を有する。
【図５Ｂ】（B）〜（E）については、成体脱皮（時間0）状態にある虫を同調させて、産卵速度（時間あたりの産卵数）を24時間間隔で測定した（n≧20）。（B）産卵速度に対するvit RNAiの効果。脱皮から成体期への24時間後のclk-1変異体の産卵速度を示してある（n≧20）。エラー・バーは、SDを示す。vit-5 RNAiは、dsc-4 RNAiよりも弱い抑制を生じ、一方vit-2 RNAiおよびvit-6 RNAiは、この計測によっては実質的に効果がなかった。
【図５Ｃ】（C）産卵速度に対するvit-5 RNAiの効果。野生型、clk-1（qm30）およびclk-1（qm30）／dsc-4（qm182）変異体をvit-5 RNAiで処理して時間経過実験を行った（n≧27）。vit-5 RNAiは、clk-1（qm30）バックグランドにおいてのみ産卵速度に影響を及ぼした。vit-5 RNAiの効果は、dsc-4突然変異のものに対して付加的なものではなかった。
【図５Ｄ】（D）生殖系列発達に対するvit-5 RNAiの効果。それぞれの時点でその子宮内に卵をもつ動物の割合を示してある（n≧30）。clk-1（qm30）の生殖系列発達は、vit-5 RNAiによって促進され、対照の9時間前に、受精した卵をもつ最初の動物が出現した。さらにまた、全てのvit-5 RNAi処理した動物は、全ての対照の15時間前に卵を有した。
【図５Ｅ】成体脱皮の24時間後のclk-1単一変異体（E）およびclk-1/vit-5 RNAi二重突然変異体（F）動物。バーは、10μmを示す。対照プレート上のclk-1（qm30）変異体は、これらの子宮に平均0.9±1.6の受精卵を有し（n=28）、その一方でclk-1/vit-5 RNAi動物は、10.3±1.9の卵を有した（n=20）。子宮の3×拡大像を右下に示してある。鏃は、受精卵を示す。
【図５Ｆ】成体脱皮の24時間後のclk-1単一変異体（E）およびclk-1/vit-5 RNAi二重突然変異体（F）動物。バーは、10μmを示す。対照プレート上のclk-1（qm30）変異体は、これらの子宮に平均0.9±1.6の受精卵を有し（n=28）、その一方でclk-1/vit-5 RNAi動物は、10.3±1.9の卵を有した（n=20）。子宮の3×拡大像を右下に示してある。鏃は、受精卵を示す。
【図６】図6A-6C：SOD-1 RNAiは、clk-1変異体の緩徐な生殖系列発達を抑制した。虫を成体脱皮（時間0）に同調させて、産卵速度（時間あたりの産卵数）を24時間間隔で測定した。13〜23匹の動物の平均産卵速度は、それぞれの遺伝子型について示してある。（A）野生型の産卵速度に対する、SOD-1、-2、-3、-4に対するRNAiの効果。22匹以上の動物をそれぞれのRNAi処理について検査した。SOD-1、-2、-3、および-4に対するRNAiは、野生型動物の産卵速度に対して効果を有さなかった。（B）clk-1変異体の産卵速度に対する、SOD-1、-2、-3、-4に対するRNAiの効果。19匹以上の動物をそれぞれのRNAi処理について検査した。SOD-1 RNAiは、clk-1変異体の遅延性の産卵を抑制した。clk-1（qm30）変異体は、対照プレート上で成体脱皮の72時間後に産卵のピークに達したが、clk-1（qm30）／SOD-1 RNAi二重突然変異体では、48時間で産卵のピークに達した。SOD-2および-3に対するRNAiは、数時間あたりの産卵数を減少したが、産卵の時間経過に有意な影響を及ぼさず、一方で、SOD-4に対するRNAiは、clk-1変異体に対して効果を有さなかった。（C）clk-1（qm30）の産卵速度に対する、SOD-1／dsc-4（qm182）二重突然変異体に対するRNAiの効果。23匹以上の動物をそれぞれの条件について検査した。SOD-1に対するRNAiは、dsc-4（qm182）またはclk-1（qm30）／dsc-4（qm182）変異体バックグランドのいずれにおいても効果を有さなかった。
【図７】図7A-7B：虫および脊椎動物のリポタンパク質酸化に関与する遺伝子産物よプロセスの間の機能的な関係のモデル。（A）リポタンパク質による線虫生殖系列発達の調節のためのモデル。7節および8節に記載されている結果は、生殖系列発達が酸化型のLDL様リポタンパク質によって促進され、天然のLDL様リポタンパク質によって阻害されることを示す。天然のリポタンパク質の産生に有利な活性およびプロセスは、明るい灰色であり、酸化に有利なものは、濃い灰色である。DSC-4ポリペプチド（MTPの虫相同体）は、LDL様リポタンパク質の分泌に必要とされる。clk-1ポリペプチドは、ユビキノン（UQ）（ROSの主要供与源であるが、抗酸化物でもあるレドックス活性脂質）の生合成に必要であった。clk-1変異体には、UQは作製されないが、生合成の前駆体（デメトキシユビキノン（DMQ））が蓄積する。DMQは、ROS産生を生じにくいが、より良好な抗酸化物でもあろう。従って、LDL様リポタンパク質は、clk-1変異体においてより酸化型ではない。一方で、サイトゾルのスーパーオキシドジスムターゼをコードするSOD-1に対するRNAiは、細胞質のROSの増加に至る。LDL様リポタンパク質は、ROSによって酸化されるので、これがDMQの存在下によって生じる酸化の還元に反対に作用して、酸化型のLDL様リポタンパク質に対する天然の野生型の比率を回復することにより、生殖系列の発達を促進する。LDL様リポタンパク質の分泌は、dsc-4の突然変異によって、コレステロール摂取の減少性によって、およびVITタンパク質（apoBの虫相同体）の生産を減少させることによって減少される。これらの条件では、天然および酸化型のLDL様リポタンパク質に重大な影響を及ぼし、したがって、抑制性および刺激性の入力の両方を除去することによって細胞体および生殖系列の同調を回復すると思われる。（B）脊椎動物および虫におけるリポタンパク質の分泌および酸化に関与するエレメントの比較。LDL様リポタンパク質の産生および酸化に関与する構造的エレメントが虫に存在し、脊椎動物で観察されるものと同様の方法で機能的に関連する。DSC-4は、MTPの虫相同体であり、一方vit-3、vit-4、およびvit-5は、apoBの虫相同体である。虫では、脊椎動物と同様に、コレステロール摂取の減少により、LDL様リポタンパク質分泌が減少し、そのROSがこれらの酸化を引き起こす。酸化型のリポタンパク質は、特異的な生物学的効果を有する。脊椎動物において、最も特徴づけられた効果のうちの1つは、アテローム性動脈硬化症に至るプロセスの開始である。虫では、生殖系列の発達に対する効果が同定された。MTP=ミクロソームのトリグリセリド転移タンパク質；apoB=アポリポタンパク質 B；LDL=低密度リポタンパク質；VIT=ビテロゲニン；ROS=活性酸素種。
【図８】図8A-8B：K02D7.4は、dsc-4（qm182）によって与えられるclk-1（qm30）変異体の緩徐な排便の抑制および緩徐な生殖系列発達の両方をレスキューした。qmEx254およびqmEx251は、K02D7.4遺伝子を含む2つの異なる染色体外アレイである。（A）排便。dsc-4（qm182）突然変異は、20および25℃でclk-1（qm30）変異体の緩徐な排便を抑制する。両方の染色体外アレイが、この抑制効果をレスキューした。それぞれのバーは、20または25℃のいずれかでの5連続の排便サイクルを記録した＞15匹の動物の平均排便サイクル長を表す；エラー・バーは、平均標準偏差を表す。（B）生殖系列発達。dsc-4（qm182）突然変異は、clk-1変異体の遅延性の生殖系列発達を抑制し、成体脱皮の直後の産卵速度の増大を生じた。両方の染色体外アレイがこの効果をレスキューした。それぞれのバーは、12の成体脱皮の24時間後における＞30匹の動物の産卵速度（時間あたりの産卵数）の平均を表す；エラー・バーは、標準偏差を表す。K02D7.4の野生型コピーは、dsc-4（qm182）突然変異によって生じる表現型をレスキューしたことから、dsc-4がK02D7.4に対応することを示す。
【図９Ａ】dsc-3転写物のヌクレオチド配列（SEQ ID NO：7）。dsc-3の22エキソンは、以下のヌクレオチド塩基対で同定された：エキソン1：1〜110、エキソン2：111〜224、エキソン3：225〜323、エキソン4：324〜458、エキソン5：459〜613、エキソン6：614〜991、エキソン7：992〜1272、エキソン8：1273〜1341、エキソン9：1342〜1764、エキソン10：1765〜1890、エキソン11：1891〜2088、エキソン12：2089〜2232、エキソン13：2233〜2320、エキソン14：2321〜2469、エキソン15：2470〜2620、エキソン16：2621〜3014、エキソン17：3015〜3147、エキソン18：3148〜3476、エキソン19：3477〜3693、エキソン20：3694〜3791、エキソン21：3792〜3909、およびエキソン22：3910〜3945。太字体のヌクレオチド（ヌクレオチド3182〜3666）は、予測された転写物のエキソン18および19に対応していない。DNAのこの部分をcDNAライブラリーから増幅して、二重鎖RNAdsRNAを作製するためのテンプレートとして使用し、H06H21.10遺伝子に対するRNA干渉（RNAi）を行うために使用した。dsc-3遺伝子に対するRNAiは、変異体dsc-3を表現型模写した。
【図９Ｂ】図９Aの続き。
【図１０】DSC-3のアミノ酸配列。アミノ酸配列は、wormbase（www.wormbase.org）由来のH06H21.10の予想アミノ酸配列および92のさらなるアミノ酸（アミノ酸154〜245）を含む。これらの92のアミノ酸は、クエリーとしてヒトATP8B4タンパク質の配列を使用するワームゲノム配列のtBlastn検索によって同定した。
【図１１Ａ】遺伝子dsc-3、ヒト由来の4つの相同的なタイプIV P-タイプATPaseのアミノ酸配列の整列、および共通配列。FIC1／PFIC1／BRICは、ATP8B1に対応しており、ATP8B2およびATP8B4と最高のアミノ酸一致性を共有する。dsc-3（アミノ酸位35〜1127）とAT8B1（アミノ酸位91〜1163）のパーセント一致性は、50%である。dsc-3（アミノ酸位20〜1172）とATP8B2（アミノ酸位46〜1161）のパーセント一致性は、56%である。dsc-3（アミノ酸位25〜812）とATP8B3（アミノ酸位194〜1034）のパーセント一致性は、38%である。dsc-3（アミノ酸位137〜1115）とATP8B4（2〜946）のパーセント一致性は、54%である。
【図１１Ｂ】図11Aの続き。
【図１１Ｃ】図11Bの続き。
【図１１Ｄ】図11Cの続き。
【図１１Ｅ】図11Dの続き。
【図１１Ｆ】図11Eの続き。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006520189.tif 000039
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