(57)【要約】本発明は、αMインテグリンのＩドメインに結合することによりαMインテグリンとｐｒｏＭＭＰ−９との間の複合体形成を阻害し、好中球遊走を阻止することが見出されたペプチド化合物に関する。上記ペプチド化合物は、ヘキサペプチド配列ＨＦＤＤＤＥを含む。上記ペプチド化合物は、炎症性病態の予防及び治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキサペプチド配列 ＨＦＤＤＤＥを有する化合物。
【請求項２】
請求項１の化合物を有効成分として含有する医薬。
【請求項３】
請求項１の化合物を有効成分として含有する、好中球遊走の阻害剤。
【請求項４】
請求項１の化合物を有効成分として含有する、炎症性病態の予防及び治療のための医薬。
【請求項５】
請求項１の化合物と薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項６】
請求項１の化合物を有効成分として含有する、好中球遊走に起因する病態の予防用及び治療用医薬組成物。
【請求項７】
請求項１の化合物を有効成分として含有する、炎症性病態の予防用及び治療用医薬組成物。
【請求項８】
好中球遊走に起因する病態の治療処置または予防処置のための方法であって、ヘキサペプチド配列 ＨＦＤＤＤＥを有する化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項９】
炎症性病態の治療処置または予防処置のための方法であって、ヘキサペプチド配列 ＨＦＤＤＤＥを有する化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、αMインテグリンのＩドメインに結合することによりαMインテグリンとｐｒｏＭＭＰ−９との複合体形成を阻害し、こうして好中球遊走を阻止するペプチド化合物に関する。上記ペプチド化合物は、炎症性病態の治療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
多形核好中球（ＰＭＮ）は血液白血球の大部分を占め、侵入微生物に対する食作用と殺菌作用により急性炎症に中心的に関与する。好中球は、アズール親和性顆粒、特殊顆粒、ゼラチナーゼ顆粒、分泌小胞という４つの顆粒コンパートメントを含み、アズール親和性顆粒はミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を、特殊顆粒はラクトフェリン（ＬＦ）を、ゼラチナーゼ顆粒はゼラチナーゼを、分泌小胞は潜在性アルカリホスファターゼを、それぞれ、高濃度に含有することが特徴である。エラスターゼ（参考文献１）、コラゲナーゼ（参考文献２）、ＭＭＰ−９などのタンパク質分解酵素はこれらの顆粒中に局在しており、タンパク質分解酵素は、白血球が骨髄を抜け出して体循環に進入し、炎症部位に集合するために重要な役割を果たす（参考文献３）。
【０００３】
ＭＭＰ−９は組織再構成（tissue remodeling）、組織修復及び創傷治癒に関与し、慢性関節リウマチ（参考文献４）や多発性硬化症（参考文献５）などの炎症性疾患のマーカーである。ＰＭＮ（多形核好中球）は骨髄での成熟の最終段階にＭＭＰ−９を産生し、ＭＭＰ−９は潜在的形態（ｐｒｏＭＭＰ−９）としてゼラチナーゼ顆粒に貯蔵される。細胞が刺激を受けると、細胞内顆粒が急速に移動し、原形質膜と融合する。プロテインキナーゼＣ経路のような特定のシグナル伝達カスケードを開始させる細胞外刺激に応答して、酵素前駆体ｐｒｏＭＭＰ−９が誘導・分泌される（参考文献６、７）。ＭＭＰ−９はまた、ヒト白血球を補体Ｃ５ａアナフィラトキシン（参考文献８）や腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（参考文献９）などの可溶性アゴニストで処理したときにも放出される。細胞外基質への細胞接着もまたｐｒｏＭＭＰ−９やその他のＭＭＰ類を分泌させることが知られる刺激である（参考文献１０、１１）。ＭＭＰ−９の選択的な発現は、ＰＭＮにおけるαMβ2インテグリンのリガンドとの結合（参考文献１０）やＴリンパ腫細胞におけるαLβ2インテグリンのリガンドとの結合の結果として誘導される（参考文献１２）。
【０００４】
その結果、下記の３つの異なる形態のｐｒｏＭＭＰ−９が細胞外空間に放出されることがザイモグラフィーで検出される：  ９２ｋＤａのモノマー、２００ｋＤａのホモダイマー、及び好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）（輸送タンパク質のリポカリンファミリー中の２５ｋＤａのもの）にＭＭＰ−９が結合した１２０ｋＤａの複合体。ｐｒｏＭＭＰ−９の活性化は、プロティナーゼにより細胞外から行なうことができ、また、水銀化合物または反応性酸素種を用いて化学的に行なうこともできる（参考文献１３、１４）。活性化されると、分泌されたＭＭＰ−９は、細胞外空間に存在する組織性メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）とα2−マクログロブリンにより阻害され得る。しかし、ＴＩＭＰは好中球表面のＭＭＰ−９は弱く阻害するだけである（参考文献１５）。従って、細胞表面への局在化は、ＭＭＰ活性調節の次の段階を構成する。
【０００５】
最近、本発明者らは、白血病細胞をホルボールエステルで活性化すると、ｐｒｏＭＭＰ−２ゼラチナーゼとｐｒｏＭＭＰ−９ゼラチナーゼが白血病細胞表面にαLβ2インテグリンやαMβ2インテグリンとの複合体として現れることを示した（参考文献１６、ＦＩ２００３０９２３）。β2インテグリン類（ＣＤ１１／ＣＤ１８）は大半の白血球機能に重要な役割をもつ（参考文献１７、１８）。以下の４種類のインテグリンが知られている：  白血球に多いαLβ2型、顆粒球に多いαMβ2型、そして単核白血球とマクロファージに多いαXβ2型とαDβ2型。これらインテグリンの細胞性リガンドは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞間接着分子（ＩＣＡＭｓ）−１〜５である。白血球インテグリンが完全な機能を発揮するためには活性化されることが必要である（参考文献１７）。Ｔリンパ球は最も詳細に研究されており、活性化はＴ細胞受容体を介して起こる（参考文献１７、１９）のであり、プロテインキナーゼＣが関与する可能性がある（参考文献２０）。顆粒球では、αMβ2インテグリンは細胞内の特殊顆粒に存在することが知られており、活性化により細胞表面に移動する（参考文献２１）。移動のメカニズムや、関与する細胞成分はよく分かっていない。
【０００６】
本発明者らは、ＭＭＰ触媒ドメインに存在すると考えられるｐｒｏＭＭＰ−９の主要なインテグリン認識配列のマッピングを行なった（参考文献１６）。この配列はインテグリンαMのＩドメインにバイオパニングで見出されたファージディスプレイペプチドにより模倣されたものであり、最も活性の高いペプチドはＡＤＧＡＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣＧＡＡＧ（ＤＤＧＷ）であった。本願では、本発明者らは、ＰＭＮでのｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体の発生とＰＭＮ遊走における役割について研究した。本発明者らは、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2との複合体が細胞のゼラチナーゼ顆粒中ですでに形成されており、また、細胞活性化にともなうゼラチナーゼ顆粒の放出とともに上記複合体が細胞表面に移動することを見出した。さらに、ＭＭＰ−９の触媒ドメインに由来するわずか６アミノ酸の長さのペプチドでも、ｐｒｏＭＭＰ−９のβ2インテグリンへの結合と競合することができた。ヘキサペプチドとＤＤＧＷのいずれもが、in vitroとin vivoの両方でＰＭＮの遊走を弱めたが、これは、ＭＭＰ−インテグリン複合体がＰＭＮの運動性に関与することを示唆する。
【０００７】
発明の概要 
組換えＭＭＰ−９ドメインでの実験により、インテグリンと相互作用する部位がＭＭＰ−９の触媒ドメイン上に存在するという本発明者らの知見がさらに裏付けられた。本発明者らは、わずか６残基の長さの、活性なＩドメイン結合性ペプチドを開発した。このペプチドＨＦＤＤＤＥはＭＭＰ−９触媒ドメインの直鎖状配列に対応し、ｐｒｏＭＭＰ−９のαMβ2インテグリンへの結合またはｐｒｏＭＭＰ−９の精製したαMβ2インテグリンＩドメインへの結合と効率的に競合する。このペプチドのアミノ酸配列を乱すと活性を示さないので、負に帯電したアミノ酸の順序が活性に不可欠であることを示す。ファージディスプレイに由来するペプチドＤＤＧＷと同様に、ＨＦＤＤＤＥは細胞結合型ｐｒｏＭＭＰ−９を脱離させ、in vitroとin vivoの両方で好中球の遊走を阻害した。これらの結果は、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2インテグリンとの複合体が好中球の運動性に重要であることを示唆するが、このペプチドがｐｒｏＭＭＰ−９以外のβ2インテグリンリガンドにも影響する可能性は排除できない。しかし、ＤＤＧＷとＨＦＤＤＤＥが、（休止した好中球ではなく）活性化好中球のトランスウェルでの遊走と内皮貫通遊走（transwell and transendothelial migration）を阻害したことは、これらのペプチドの作用の特異性を示すものである。ＣＴＴ、抗ＭＭＰ−９抗体及び抗インテグリン抗体を用いて、本発明者らは、上記ペプチドがｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2インテグリンの両方を必要とする好中球遊走を阻害することを示した。同様に、ＴＨＰ−１細胞系列を用いて、本発明者らは、ｐｒｏＭＭＰ−９が、β2インテグリンが指揮する好中球遊走に少なくともin vitro条件下で関与することを知見した。
【０００８】
発明の詳細な説明 
本発明者らは最近、ｐｒｏマトリックスメタロプロティナーゼ、特にｐｒｏＭＭＰ−９が、白血球β2インテグリンに対する強力なリガンドであることを示した。本願では、好中球の主要なＭＭＰとインテグリンであるｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2インテグリンを研究した。休止した好中球では、ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2インテグリン複合体は細胞内顆粒中に検出されるが、細胞が活性化された後は、細胞表面に移動することが免疫沈降法と二重免疫蛍光法で示される。複合体形成のさらなる証拠としては、好中球及びαMβ2をトランスフェクトしたＬ細胞は、固定化したｐｒｏＭＭＰ−９またはその組換え触媒ドメインに対する結合（即ち、β2インテグリン依存性の結合）を示したが、一方、野生型のＬ細胞と白血球接着不全症（ＬＡＤ）細胞は、そのような結合を示さなかった、ということが挙げられる。αMインテグリンのＩドメンインに結合してｐｒｏＭＭＰ−９との複合体形成を阻害するペプチドは、in vitroの内皮貫通アッセイ（transendothelial assay）とin vivoのチオグリコレート誘発腹膜炎で好中球遊走を阻害した。これらの結果は、ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体の移動が、好中球遊走を導く細胞表面機構の一部であることを示唆する。
【０００９】
この研究において本発明者らは、ＰＭＮ（多形核好中球）は細胞内顆粒中にｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体を形成し、この複合体は、細胞がホルボールエステルまたは炎症性メディエイターにより活性化されたときに細胞表面に移動する、ということを示す証拠を提示する。ｐｒｏＭＭＰ−９はαMβ2インテグリンと同じ細胞内顆粒中に局在することは知られているが、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2インテグリンとが細胞内で会合することは従来知られていない。ｐｒｏＭＭＰ−９がαMインテグリンＩドメインに直接結合できるということは、アクセサリー分子が介在する可能性は排除できないが、内在性ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2インテグリンとの相互作用が直接的に行なわれることを示唆するものである。これまで、内在性好中球エラスターゼ、プロティナーゼ３とカテプシンＧは全てαMβ2インテグリンに結合することが報告されている。従って、αMβ2インテグリンは一部のプロティナーゼに特異的なキャリア機能を有する可能性がある。本発明者らは、ＩＣＡＭ−１またはフィブリノーゲンはｐｒｏＭＭＰ−９の結合と競合しないこと、及び、ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体に対するＤＤＧＷペプチド阻害剤はＩＣＡＭ−１、フィブリノーゲンまたはＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの白血球の一次接着を阻害できないが、それでも細胞遊走を阻害する、ということを見出した。これらの結果は、αMβ2に結合したｐｒｏＭＭＰ−９は白血球の一次接着には必須ではないが、細胞浸潤の他の段階に必須であり、おそらくインテグリンによる基質タンパク質への結合を解除する際に必須であるものと考えられる。
【００１０】
ＴＨＰ−１白血病細胞の代謝ラベルにより、本発明者らは［35Ｓ］−メチオニンパルス後２時間以内に、インテグリン鎖が最初に明確に視認できる状態になった時に、インテグリン抗体がｐｒｏＭＭＰ−９と共沈することを示した。これらの結果は、ｐｒｏＭＭＰ−９とインテグリンの会合はインテグリンの形成後の早期に起こる現象であり、また、免疫沈降物はエンドサイトーシスまたはリサイクル中のインテグリンではないということを示す。このことは、活性化されていないＰＭＮにおいてｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2の大幅な細胞内共局在化を示す二重免疫蛍光法による研究結果と一致するものである。ＰＭＡにより誘発された脱顆粒に続き、染色の拡散が観察され、共局在化が細胞表面に移動した。また、細胞表面画分からの共沈が最も強く生じた。これらの結果は、あらかじめ形成されたｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体の細胞内プールから細胞表面への移動が活性化後にすばやく起きることを示している。この考え方のほうが、「分泌されたＭＭＰが細胞表面のインテグリンに結合する」という考え方よりも、ＭＭＰ／インテグリン複合体形成のメカニズムの説明として確度が高い。まず第一に、インテグリンは細胞内で結合したｐｒｏＭＭＰ−９を、細胞外のＭＭＰ阻害剤やインテグリンリガンドから競合されることなく適切な場所に移動することができる。第二に、αMβ2のＩドメインは活性化ＭＭＰ−９には結合しないので、インテグリンは、ｐｒｏＭＭＰ−９活性化のタイミングと活性化触媒の放出を調節できる。
【００１１】
白血球β2インテグリンは白血球の移動性に関与する。αMまたはαLのノックアウトマウスによる研究も、炎症性刺激に応答してβ2インテグリンが白血球接着活性、遊走活性及び貪食活性を仲介することの重要性を示す。Ｉ型白血球接着不全症（ＬＡＤ−１）の患者から採取した白血球は、ｐｒｏＭＭＰ−９を発現するのに、β2インテグリンサブユニットに欠陥があるので適切な遊走ができず、これは、ｐｒｏＭＭＰ−９のみでは細胞遊走能は付与されないことを示す。本発明者らは、ＬＡＤ−１細胞は先導端（leading edge）にＭＭＰ−９の免疫反応性を発現するが、固定化したｐｒｏＭＭＰ−９には接着しないことを見出した。野生型Ｌ細胞について非常に似た結果が得られており、野生型Ｌ細胞は固定化したｐｒｏＭＭＰ−９には接着できないが、αMβ2をトランスフェクトすると、ｐｒｏＭＭＰ−９に接着できるようになる。ＰＭＮによる実験では、ｐｒｏＭＭＰ−９は、細胞内の「不活性」インテグリン及びＰＭＡ、Ｃ５ａまたはＴＮＦαなどの刺激で活性化された細胞外のインテグリンの両方と会合することが示される。ＬＡＤ−１細胞においてβ2インテグリンの不存在下に（ｐｒｏ）ＭＭＰ−９がどのようにして細胞表面に配置されるのかは不明である。ＭＭＰ−９については他に数多くの結合タンパク質が公知文献に報告されている。
【００１２】
細胞遊走アッセイにより、細胞運動性の２つの方式が明らかになった。即ち、β2インテグリン依存性で、ＤＤＧＷやその他のペプチドで阻害されるものと、β2インテグリン非依存性で、ペプチドで阻害されないものである。従って、好中球遊走におけるｐｒｏＭＭＰ−９の役割について文献の議論が分かれているのは驚くにあたらない。実験モデルと動物種により、好中球遊走におけるプロテアーゼの機能を支持する研究もあるし、支持しない研究もある。刺激の違いにより異なる遊走方式を示す細胞の能力により、このような矛盾の多くに説明がつく。β2インテグリンとＭＭＰに非依存性の白血球遊走は、in vitro条件下に３次元のコラーゲン中で観察される白血球のアメーバ様の動き（これはＭＭＰ阻害剤に非感受性である）に対応する可能性がある。
【００１３】
ＭＭＰ−９完全欠損マウスにおいても、チオグリコレートで誘導された腹膜炎で好中球遊走が見られ、また、ＴＮＦ−αで処理した内皮細胞の間を好中球がin vitroでトランスマイグレーションする。しかし、ＭＭＰ類の機能はオーバーラップすることが知られており、ＭＭＰ−９以外のＭＭＰ類がＭＭＰ−９欠損を補うことができる。本発明者らはこれまでに、ｐｒｏＭＭＰ−２とαMβ2インテグリンとの複合体を見出したが、本研究では、好中球ＭＭＰ−８もまた精製したインテグリンＩドメインに結合できることを示す。ＨＦＤＤＤＥ配列は分泌型ＭＭＰ類に高度に保存されており、多くのＭＭＰ類に由来するそのようなペプチドはpepspot膜アッセイでαMＩドメインに結合できる（参考文献１６、ＦＩ２００３０９２３）。ＭＭＰ−９ノックアウトマウスではどのＭＭＰ−インテグリン複合体が機能するのかはまだ不明である。さらに、他のプロティナーゼ（例えばエラスターゼやウロキナーゼ）へのαMβ2インテグリンの結合能が好中球の浸潤に影響するであろうと考えられる。
【００１４】
ＤＤＧＷとＨＦＤＤＤＥはマウス腹膜炎モデルのin vivoで高い活性を示したが、いずれのペプチドも別な種類のβ2インテグリンリガンドを阻害する潜在能力も有するため、上記の活性がどの程度までｐｒｏＭＭＰ−９の阻害に起因するのかは不明である。β2インテグリンリガンドの中にはＤＤＧＷ様配列を有するものがあり、そのようなリガンドにはＭＭＰの他に少なくとも補体ｉＣ３ｂとトロンボスポンジン−１が含まれる。本発明者らの得た結果から、特定のβ2インテグリンが指揮する好中球の運動機構の一部を、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2との複合体が構成している可能性が示唆される。
【００１５】
従って本発明は、新規なペプチド化合物に関し、さらに詳しくは、ヘキサペプチド配列 ＨＦＤＤＤＥを有するペプチド化合物に関する。上記ペプチド化合物は、好中球遊走を阻害するための医薬として用いることができる。そのような阻害活性はin vitro とin vivo の実験の両方で示された。従って、上記ペプチド化合物は炎症性病態の予防と治療において有用である。
【００１６】
従って、本発明はヘキサペプチド配列 ＨＦＤＤＤＥを有する化合物に関し、特に、好中球遊走の阻害に用いることを特徴とする化合物と炎症性病態の予防及び治療に用いることを特徴とする化合物に関する。
【００１７】
本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含有する、好中球遊走に起因する病態の治療用医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明の他の１つの態様においては、有効成分としての本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物が開示される。
【００１９】
本発明のさらなる１つの態様においては、好中球遊走に起因する病態の治療処置または予防処置のための方法であって、本発明の化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法が開示される。本発明の具体的な態様としては、炎症性病態の予防または治療のための方法が挙げられる。
【００２０】
本願で使用する略語 
ＨＭＥＣ            ヒト微小血管内皮細胞
ＰＭＮ              多形核好中球
ＣＴＴ              ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド
ＣＴＴ Ｗ→Ａ       ＣＴＴＨＡＧＦＴＬＣペプチド
ＬＬＧ−Ｃ４        ＣＰＣＦＬＬＧＣＣペプチド
ＤＤＧＷ            ＡＤＧＡＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣＧＡＡＧペプチド
ＨＳＡ              ヒト血清アルブミン
ＫＫＧＷ            ＡＤＧＡＣＩＬＷＭＫＫＧＷＣＧＡＡＧペプチド
ＬＦ                ラクトフェリン
ＭＰＯ              ミエロペルオキシダーゼ
ＮＧＡＬ            好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
ＧＰＡ              グリコールホリンＡ
ＴＡＴ−２          腫瘍関連トリプシノーゲン−２
【００２１】
なお本明細書中、発明の背景技術を説明するため、また、特に本発明の実施態様に関する詳細を補うために言及又は使用する各種刊行物及びその他の文献は、言及したことにより本明細書中に組み込まれたものとする。以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
好中球調製物及び細胞系 
多形核好中球（ＰＭＮ）を、クエン酸デキストロース中で抗凝固処理された末梢血から単離した。赤血球を２％デキストランＴ−５００を用いて遠心分離で沈殿させ、得られた白血球を多く含有する上清をペレット化し、生理食塩水に再懸濁し、リンホプレップ（Lymphoprep）（ノルウェー国、オスロ、Nyegaard製）を用いて、４００ｇで３０分間遠心分離し、多形核細胞を血小板及び単核球から分離した（参考文献２２）。ＰＭＮの純度は９５％より高く、典型的に好酸球の比率は２％より低い。細胞生存率を、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル テトラゾリウムブロマイド）アッセイを製造者（Roche）の説明書に従って用いて測定した。
【００２３】
S. Mustjoki（ヘルシンキ大学、ハートマン  インスティテュート）より寄贈されたヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）（参考文献２３）を、ＲＰＭＩ １６４０中で、２ｍＭ グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含有する１０％ ＦＢＳの存在下で生育した。ヒト単球性ＴＨＰ−１細胞を公知の方法（参考文献２４、２５）で維持した。Ｉ型白血球接着不全症（ＬＡＤ−１）細胞、野生型及びαMβ2−トランスフェクト型Ｌ９２９マウス線維芽細胞はDr. Jean-Pierre Cartron（フランス国、パリ、INSERM）からの寄贈である。これらの細胞を、公知の方法（参考文献２６）で維持し、αMβ2の発現を蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ、カルフォルニア州、サンホセ、Becton Dickinson）によって試験した。
【００２４】
抗体とその他の試薬 
モノクローナル抗体ＭＥＭ１７０とモノクローナル抗体ＯＫＭ１０は、αMインテグリンサブユニットに対する抗体である（参考文献２５）。抗ＭＭＰ−９モノクローナル抗体（ＧＥ−２１３）はLab Vision（カルフォルニア州、フリーモン）から入手し、抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology（カリフォルニア州、サンタクルーズ）から入手した。公知のアフィニティ精製した抗ＭＭＰ−９抗体（参考文献３）も用いた。対照モノクローナル抗体として、マウスＩｇＧ（オーストラリア国、ホーソン、Silenius製）及び抗グリコホリンＡ（ＧＰＡ）（ＡＴＣＣ）を用いた。抗トリプシノーゲン−２（ＴＡＴ−２）抗体をウサギポリクローナル抗体の対照とした（参考文献２７）。ペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnologyから入手した。マウスαMインテグリンに対するラット抗体（ＭＣＡ７４）及びＦＩＴＣ結合抗ラット抗体（Ｆａｂ’）2はSerotec（英国、オックスフォード）より購入した。ペプチドであるＣＴＴ、Ｗ→Ａ ＣＴＴ、ＬＬＧ−Ｃ４、ＤＤＧＷ及びＫＫＧＷは公知である（参考文献１６、２８）。ＨＦＤＤＤＥペプチド及びＤＦＥＤＨＤペプチドはNeosystem（フランス国、ストラスブール）に特別注文した。ｐｒｏＭＭＰ−８はCalbiochemから、ｐｒｏＭＭＰ−９はRocheから購入した。フルオロリン酸ジイソプロピルはAldrich Chemical Company Inc.（ドイツ国、シュタインハイム）から入手した。ヒトＣａ５はCalbiochem（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ、Biosciences, Inc.）から、組換えＴＮＦ−αはSigma-Aldrich（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。
【００２５】
細胞画分（subcellular fraction） 
ＰＭＮを、３×１０7個／ｍｌでクレブズ−リンガーリン酸塩（Krebs-Ringer phosphate）（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２７ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．９５ ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．４））に懸濁した。ＰＭＮを酢酸ミリスチン酸ホルボール（phorbol myristate acetate）（ＰＭＡ；２μｇ／ｍｌ）と一緒に、またはなしで＋３７°Ｃで１５分間インキュベートし、その後２５ｍｍｏｌ／Ｌ フルオロリン酸ジイソプロピルと共に氷上で５分間インキュベートし、上清（Ｓ０）を採取した。顆粒画分（granule fractions）を公知の方法（参考文献２９）で精製した。端的に言うと、ＰＭＮを、ナイトロジェン  キャビテーション法（nitrogen cavitation）で破砕し、細胞残渣を遠心分離で除去した。得られた上清（postnuclear supernatant）（Ｓ１）に、パーコール（Ｐercoll）を用いて３層の密度勾配（１．０５０／１．０９０／１．１２０ｇ／ｍｌ）を形成し、＋４°Ｃで３０分間遠心した。画分１〜６、７〜１２、１３〜１８、及び１９〜２４（各１ｍｌ）を採取し、４つの異なるグループとしてプールした。最後の画分（２５〜３０）に、透明な細胞質ゾル（Ｓ２）が存在した。分取したものについて、個々の区分（括弧内に示す）に対応するマーカータンパク質の存在を試験した：ＭＰＯ（αバンド／アズール親和性）、ＬＦ（β１バンド／特殊）、ゼラチナーゼ（β２バンド／ゼラチナーゼ）、アルブミン（γバンド／分泌小胞及び原形質膜）（参考文献２１）。タンパク質レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで測定した。
【００２６】
ゼラチンザイモグラフィー、免疫沈降及び免疫ブロット法 
顆粒画分を１％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で、氷冷しながら溶解し、溶解産物を＋４°Ｃで１０分間遠心分離することにより不純物を除去した。溶解産物を、０．２％ゼラチンを含有する８％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いたゼラチンザイモグラフィーで分析した（参考文献２７）。免疫沈降を行う前に、溶解産物をプロテインＧ−セファロースと共に、＋４°Ｃで３０分間インキュベートすることにより予備清掃（preclear）した。遠心分離後、得られた上清を、抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体または抗αMモノクローナル抗体（ＯＫＭ−１０）を用いて免疫沈降に付した。プロテインＧ−セファロースと共に＋４°Ｃで１時間インキュベートした後、免疫複合体をペレット化し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解緩衝液で３回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。２−メルカプトエタノールを含有するLaemmliサンプル緩衝液で可溶化し、試料を４〜１５％ 勾配 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Bio-Rad laboratories）で電気泳動させ、半乾燥電気泳動（semidry electrophoresis）を１５Ｖで３０分行うことによってニトロセルロース膜に移した（ドイツ国、ダッセル、Schleicher & Schuell）。上記の膜を５％ 粉ミルクと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液に＋４°Ｃで一晩浸漬することによって、非特異的結合をブロッキングした。上記の膜をαMモノクローナル抗体（ＭＥＭ１７０）（１０μｇ／ｍｌ）と共に室温で２時間インキュベートした後、西洋ワサビ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００ 希釈液；デンマーク国、コペンハーゲン、DAKO A/S）と共に２５°Ｃで３０分間インキュベートした。数回洗浄した後、高感度化学発光システム（Enhanced ChemiLuminescence system）（Amersham Pharmacia Biotech製）を、製造者の説明書に従って用いて、ブロットを展開した。結合した抗体を膜から除去し、抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体でリプローブした。適切な二次抗体を用いた。免疫検出の後は毎回、膜をＴＢＳ中に＋４°Ｃで保存した。
【００２７】
インテグリンＩドメインとＭＭＰ−９組換えタンパク質の発現と精製 
ＧＳＴ−αMＩドメイン融合タンパク質及びＧＳＴ−αLＩドメイン融合タンパク質を、公知の方法で発現させ、精製した（参考文献３０）。トロンビン（Sigma製）を用いてＧＳＴをαMＩドメインから切り離し、ＦＰＬＣシステム（Pharmacia製）を用いたモノ Ｓ ＨＲ５／５カラムによるイオン交換クロマトグラフィでＩドメインを精製した。ΔＭＭＰ−９及びＦｎＩＩドメインの精製については別の場で発表する（参考文献３３）。組換えタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００２８】
ＭＭＰ−９ドメインとαMＩドメインの相互作用 
ＩＣＡＭ−１、フィブリノゲン、ｐｒｏＭＭＰ−８、ｐｒｏＭＭＰ−９または組換えドメイン（０．５μｇのＰＢＳ溶液／ウェル）をプラスチック製９６ウェルプレートに＋４°Ｃで１６時間被覆し、ウェルを、３％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液を用いて室温で２時間ブロッキングに付した。ＧＳＴ−αMＩドメインの結合を、実質的に第一優先権出願に記載の通り測定した。逆方向のアッセイ（reverse assay）においては、ＧＳＴ−αMＩドメインで被覆し、ｐｒｏＭＭＰ−９の結合をＧＥ−２１３抗体を用いて測定した。実験を行う前に、競合ペプチドをαMＩドメインと共に２０分間プレインキュベートした。
【００２９】
代謝放射性同位元素標識法(metabolic radiolabelling)及び免疫沈降 
非活性化、または５０ｎＭのＰＭＡにより活性化させたＴＨＰ−１細胞（１×１０7個）を［35Ｓ］−メチオニンを用いて生合成的に標識した（biosynthetic labeling）（参考文献３１）。細胞を、メチオニンを含有せず、透析した、加熱不活性化１０％ウシ胎仔血清を含有する培地に懸濁し、＋３７°Ｃで１０分間、５０μＣｉ／ｍｌの［35Ｓ］−メチオニンでパルス標識（pulsed-labelling）した。細胞を素早く洗浄し、１０％ ＦＣＳを含有する完全培地で＋３７°Ｃで、後述の所定時間インキュベートした。細胞をペレット化し、冷却したＰＢＳを２ｍｌずつ３回（３０分後、２時間後及び４時間後）添加することにより標識付けを停止させた。洗浄の後、細胞を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン及び１ｍＭ フッ化フェニルメチルスルフォニルのＰＢＳ溶液で溶解し、超遠心分離法で不純物を除去し、プロテインＧ−セファロースで予備清掃した。溶解産物を、アフィニティ精製したウサギ抗ＭＭＰ−９抗体とαMモノクローナル抗体（ＯＫＭ−１０）（３μｇ／ｍｌ）で免疫沈降した。ヒトＩｇＧ1を対照抗体とした。プロテインＧ−セファロースと共に＋４°Ｃで１時間インキュベートした後、免疫複合体をペレット化して洗浄し、７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ゲルをエンハンサー（Amplify、Amersham Biosciences製）で処理し、ろ紙上で乾燥させ、Kodak X-Omat ARフィルムに−７０°Ｃで１週間曝露した。
【００３０】
免疫蛍光染色 
ＰＭＮ及びＬＡＤ−１細胞を、２０ｎＭ ＰＭＡで＋３７°Ｃで１５分間処理するか、或いは未処理のままで、ポリ−Ｌ−リシンで被覆したカバーガラスに付着させ、２．５％ パラフォルムアルデヒド中で、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の存在下または非存在下で、＋２５°Ｃで１０分間固定化し、数回洗浄した。上記細胞を２０％（ｖ／ｖ）ウサギ血清及び３％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液を用いて、室温で３０分間ブロッキングした。細胞をウサギ抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体及びマウス抗αM抗体（ＭＥＭ１７０）（１：２５０で希釈）と共にインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体であるローダミン（ＴＲＩＴＣ）結合抗ウサギ抗体またはＦＩＴＣ結合抗マウス抗体（Ｆａｂ’）2（DAKO製）を１：５００に希釈したものと３０分間インキュベートした。得られた試料をカバーガラスに載せ、＋４°Ｃの暗所で保存した。αMβ2及びＭＭＰ−９の細胞内分布を、蛍光顕微鏡法により、６３倍の油浸対物レンズ及びライカＴＣＳ ＳＰ２スキャンユニットを備えた共焦点顕微鏡（ライカ マルチバンド共焦点イメージングスペクトロフォトメーター（Leica multi band confocal imagine spectrophotometer）を用いて調べた。
【００３１】
細胞接着 
ＭＭＰ−９タンパク質（２００ｎＭ ＰＢＳ溶液）を＋４℃で１６時間かけて被覆したマイクロタイターウェルを、３％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液で、室温で１時間ブロッキングした。αMβ2インテグリン Ｌ−細胞トランスフェクタント及びＰＭＮ（１×１０5個／ウェル）を２ｍＭ ＭｇＣｌ2と０．１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ培地に懸濁し、ＰＭＡ（２０ｎＭ）で２０分間活性化、或いはＣ５ａ（５０ｎＭ）またはＴＮＦ−α（１０ｎＭ）で＋３７℃で４時間活性化した。野生型Ｌ９２６細胞及びＬＡＤ−１細胞を対照として用いた。細胞を、所定の抗体（２０μｇ／ｍｌ）またはペプチド（５０μＭ）で、＋３７℃で３０分間処理し、無血清倍地で２回洗浄し、マイクロタイターウェル中で、＋３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、接着細胞の数をフォスファターゼアッセイで定量した（参考文献２５）。
【００３２】
細胞遊走 
ＰＭＮには孔サイズが３μｍの、ＴＨＰ−１細胞には８μｍのCostar製２４−トランスウェル遊走チェンバー（24-transwell migration chambers）を用いて細胞遊走を行った。β2インテグリンに指揮される遊走を研究するため、チェンバーの膜の両面をＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴインテグリンリガンド（４０μｇ／ｍｌ）または対照としてＧＳＴで被覆し、１０％血清含有培地でブロッキングした（参考文献１６）。内皮貫通遊走を研究するために、コンフルエントなＨＭＥＣ（４×１０5 個／ウェル）をゼラチンで被覆した膜の上側で５日間生育した。３日後に培地を交換した。ＰＢＳでＨＭＥＣ層を２回洗浄した後、Ｃ５ａ（５０ｎＭ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみを下室に添加して化学走性活性化を＋３７℃で４時間行った。その後、培養物を再度２回洗浄して全ての試薬を除去した。ＰＭＮまたはＴＨＰ−１細胞を、研究したペプチド阻害剤または抗体と１時間プレインキュベートしてから、上室へ移動した（１００μｌ ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳ含有完全培地中に１×１０5個）。ＰＭＮをＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ被覆膜を通して２時間、ＨＭＥＣ単分子層を通して３０分間遊走させた。ＴＨＰ−１細胞を１６時間遊走させた。遊走しなかった細胞を上部表面から綿棒で除去し、フィルターを通過した細胞をクリスタルバイオレットで染色して数えた。
【００３３】
マウス炎症モデル 
３１〜３２週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、３％（ｗ／ｖ）チオグリコレートの無菌生理食塩水を注射した（参考文献３２）。ペプチド（１００μｌ中に５〜５００μｇ）を尾静脈に注射した。３時間後に動物を安楽死させ、腹膜細胞を、１０ｍｌの無菌ＰＢＳを腹膜壁より注射することによって採取した。洗浄液中に存在する赤血球細胞を低張溶解法（hypotonic lysis）により除去した。細胞を遠心分離機にかけ、１ｍｌの無菌０．２５％ ＢＳＡ／クレブズ−リンガー溶液に再懸濁した。上清も採取しゼラチンザイモグラフィーで分析した。０．１％クリスタルバイオレットで染色し、１００倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて好中球の数を決定した。免疫蛍光染色をするために、細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆カバーガラスに結合させ、２．５％ パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を用いて＋４℃で３０分間固定化し、数回洗浄した。Ｆｃレセプターを２０％のウサギ血清及び３％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液の存在下でブロッキングした。その後細胞を抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体及びαMモノクローナル抗体（ＭＣＡ７４）と３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体であるローダミン（ＴＲＩＴＣ）結合抗ウサギ抗体またはＦＩＴＣ結合抗ラット抗体（Ｆａｂ’）2とさらに３０分間インキュベートした。試料を共焦点顕微鏡で調べた。動物実験はヘルシンキ大学倫理委員会の承認を得た。
【００３４】
統計分析 
得られた結果をＦ−検定（F-test）（分散分析（ANOVA））で分析し、グループ間で有意差が出た場合には、続いて、ダンカンの多重範囲検定（Duncan's Multiple Range test）に付した。用いたプログラムはウィンドウズ用ＳＰＳＳの８．０版である。
【００３５】
ゼラチナーゼの細胞からの脱離に対するペプチドの効果 
ＴＨＰ−１細胞（５０,０００個／１００μｌ）を無血清ＲＰＭＩ培地で、２００μＭの本発明のペプチドの存在下または非存在下で１６時間、所定の方法でインキュベートした。ＴＨＰ−１細胞からの上清とマウス腹腔内液をゼラチンザイモグラフィーで分析した。ゼラチン分解活性を濃度計でスキャニングして定量した。
【００３６】
結果 
ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体の細胞内での形成 
休止状態のＰＭＮをαM抗体とＭＭＰ−９抗体で染色することにより、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００による透過処理後に強い細胞内共局在化が示された（図１のＡ）。透過処理をしていない細胞では、そのような共局在化は見られず、もしＭＭＰ−９が細胞表面に存在したとしてもごくわずかであった（図１のＢ）。細胞内顆粒のエクソサイトーシスを引き起こすＰＭＡ処理を行った後、細胞内の染色が減少し、αMβ2インテグリンとＭＭＰ−９が細胞表面に共局在した（図１のＣ−Ｄ）。エクソサイトーシスをＣ５ａで引き起こした場合も同様の結果が得られた（データは示さない）。二重免疫蛍光染色の対照として、αMβ2を欠くＢ細胞由来のＬＡＤ−１細胞系（図１のＥ）を用いた。ＰＭＡ刺激の後、ＬＡＤ−１細胞がｐｒｏＭＭＰ−９を分泌したことがザイモグラフィー分析で検出され、分泌されたｐｒｏＭＭＰ−９は細胞表面に発現したが分布は好中球の場合とは異なり、ＭＭＰ−９は細胞の先導端に局在した。
【００３７】
ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2の細胞内共局在化は、ＰＭＮ顆粒において、細胞表面への移動の前にｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2インテグリン複合体が形成されることを示唆した。ＰＭＡで処理した細胞及び未処理の細胞由来のアズール親和性画分（αバンド）、特殊画分（β１バンド）、ゼラチナーゼ画分（β２バンド）、及び原形質膜を含む分泌小胞画分（γバンド）を、３段階の非連続的Percoll勾配で精製した。各画分の純度は、顆粒特異的マーカーで測定した。ＭＰＯをアズール親和性顆粒のマーカー；ＬＦ及びＮＧＡＬを特殊顆粒のマーカー；ＭＭＰ−９をゼラチナーゼ顆粒のマーカー；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を分泌小胞のマーカー；そしてヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を原形質膜のマーカーとして用いた（図２）。ＰＭＡが顆粒マーカーの大部分を細胞外環境に放出させたが、ＭＰＯはアズール親和性顆粒から部分的に放出されただけであった。ＮＧＡＬは特殊顆粒から上清（Ｓ０）に７５％放出され、ＬＦは９０％放出された。同様に、ゼラチナーゼ顆粒中ではＭＭＰ−９の含有量は９０％減少し、Ｓ０上清中では増加した。ＨＳＡは８５％が分泌小胞から放出され、Ｓ０上清中で多量に検出された。原形質膜のマーカーであるＨＬＡは、比較的一定であった。細胞を活性化すると、ＨＳＡ、ＮＧＡＬ、ＬＦ及びＭＭＰ−９のレベルは上清（postnuclear supernatant）（Ｓ１）中で大幅に減少した。細胞質ゾル画分（Ｓ２）はこれらのマーカーを有さなかったが、これは細胞分画（subcellular fractionation）によって完全な顆粒（intact granule）を単離したことを示している。
【００３８】
顆粒画分の免疫ブロット分析により、ｐｒｏＭＭＰ−９が、細胞画分において、αMβ2インテグリンと類似の分布を示すことが示された（図３のＡ）。休止状態のＰＭＮにおいて、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2の大部分がβ２バンドに見られ、β１バンド及びγバンドにおいてはより少なかった。免疫蛍光分析の結果と一致して、ＰＭＡはβ２バンド含有量の減少を引き起こした。ゼラチンザイモグラフィーによる画分の分析により、同様に、ＰＭＡが細胞内ｐｒｏＭＭＰ−９単量体及び二量体、ならびにそのＮＧＡＬとの複合体の量を減少させたことが示された（図３のＢ）。酵素前駆体ｐｒｏＭＭＰ−９は、分泌小胞及び原形質膜を示すγバンド、及び細胞外環境（extracellular milieu）（Ｓ０）において見られた。
【００３９】
非活性化ＰＭＮにおいて、αMインテグリン抗体であるＯＫＭ−１０は、β１バンド、β２バンド及びγバンドから１６５ｋＤａのαM鎖を免疫沈降させた。９２ｋＤａのｐｒｏＭＭＰ−９はβ２バンドから共沈した（図３のＣ）。細胞をＰＭＡで刺激すると、αM鎖はβ１バンド及びγバンドから免疫沈降したが、β２バンドからはそれ以上免疫沈降しなかった。上記インテグリン抗体は、ｐｒｏＭＭＰ−９のみをγバンドから共沈させた。可溶性αMＩドメインを加えることにより、共沈が阻止された。
【００４０】
ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2インテグリンとの内因性の複合体の生合成を、このような研究に適したＴＨＰ−１白血病細胞系を用いて調べた。上記の複合体を［35Ｓ］−メチオニンでパルス標識した細胞から免疫沈降によって２時間及び４時間の時点で上記複合体を検出した（図３のＤ、レーン５及び８）。ＯＫＭ１０抗体はαM鎖とｐｒｏＭＭＰ−９を共沈した。αM鎖は、抗ＭＭＰ−９抗体との免疫沈降物中に弱く検出されただけであり（レーン４及び７）、これはリガンドと結合していないｐｒｏＭＭＰ−９が過剰量存在するためであると考えられる。対照抗体は、αMもｐｒｏＭＭＰ−９も共沈しなかった（レーン３、６及び９）。
【００４１】
ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2インテグリン複合体のペプチド阻害剤は好中球遊走を阻害する 
本発明者らの以前の研究において、pepspot分析により、ｐｒｏＭＭＰ−９がインテグリンと相互作用する部位はｐｒｏＭＭＰ−９の触媒ドメインに存在する２０個のアミノ酸配列（ＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬＷＳＬＧＫＧＶＶＶ）であることが示された（第一優先権書類を参照されたい）。pepspotシステムによる更なるスクリーニングにより、この配列をヘキサペプチドＨＦＤＤＤＥにまで短縮しても充分なインテグリン結合活性が達成されることが分かった（データは示さない）。そのような短い配列がｐｒｏＭＭＰ−９の生物活性部位であることを確認するために、まず、細菌で発現させたＭＭＰ−９の組換えドメインを作成した（図４のＡ）。ΔＭＭＰ−９はｐｒｏドメイン（Ｐｒｏ）と触媒ドメインからなるが、ヘモペキシンドメインを欠いている。ＩＩ型フィブロネクチン繰返し配列（ＦｎＩＩ）は重要な基質結合領域なので、これも別の組換えタンパク質として作成した。ｐｒｏ触媒ドメイン構築体ΔＭＭＰ−９は、野生型ｐｒｏＭＭＰ−９とほぼ同じ効率でαMのＩドメインと結合した（図４のＢ）。ＦｎＩＩタンパク質は活性をほとんど欠いていた。固相pepspot分析で同定されたＨＦＤＤＤＥペプチドをペプチド合成で製造すると高い活性を示し、ｐｒｏＭＭＰ−９のαMＩドメインへの結合を阻害し、その際、２０μＭでＩＣ50を達成した（図４のＣ）。結合されたｐｒｏＭＭＰ−９の決定は、ＦｎＩＩドメインにあるエピトープを認識するＧＥ−２１３抗体を用いて行なった（データは示さない）。配列を乱したスクランブルペプチドＤＦＥＤＨＤ（同じ負に帯電したアミノ酸を有する）は活性を示さなかった。ＨＦＤＤＤＥは、ファージディスプレイで発見した上述のαMＩドメイン結合性ペプチドであるＤＤＧＷと同様に活性であった。ＤＤＧＷの対照用ペプチドであるＫＫＧＷは効果を示さなかった。ＭＭＰファミリーのペプチドにはＨＦＤＤＤＥ配列が高度に保存されているので、本発明者らは、αMＩドメインの、ヒト好中球コラゲナーゼであるＭＭＰ−８への結合についても調べた。Ｉドメインは、ｐｒｏＭＭＰ−９に対するのと同様に、ｐｒｏＭＭＰ−８に対して、ＤＤＧＷで阻害可能な結合を示した（図４のＤ）。ＩＣＡＭ−１とフィブリノゲンはいずれのｐｒｏＭＭＰとも競合せず、このことは、Ｉドメインにおいては、基質タンパク質とｐｒｏＭＭＰに対する結合部位が異なることを示唆する。
【００４２】
インテグリンが活性化された後、ＰＭＮはｐｒｏＭＭＰ−９への接着能力を示した。ＰＭＡで刺激したＰＭＮは、ｐｒｏＭＭＰ−９に対するのとほとんど同じ強度で、マイクロタイターウェルに塗布したΔＭＭＰ−９に結合した（図５のＡ）。ＰＭＮをＣ５ａまたはＴＮＦ−αで刺激すると同様の結果が得られ、ＰＭＮの接着が３倍となった（図５のＢ）。ＦｎＩＩドメインはＰＭＮの接着を支持しなかった。ＰＭＮの接着はＨＦＤＤＤＥ（５０μＭ）、ＤＤＧＷ（５０μＭ）、可溶性αMＩドメイン、ＭＥＭ１７０抗体により阻害され（図５のＣ）、β2インテグリンが指揮する結合であることを示した。対照ペプチド（ＤＦＥＤＨＤ、ＫＫＧＷ）及び無関係なモノクロナール抗体（抗ＧＰＡ抗体）は効果を示さなかった。ＣＴＴペプチドはＭＭＰ−９の触媒ドメインに結合したが、ＭＭＰ阻害活性を欠くＷ→Ａ ＣＴＴ対照ペプチドは結合せず（未公開の結果）、また、ＣＴＴペプチドはＰＭＮの接着を阻害した。ＭＭＰ−９抗体は部分的に阻害した。
【００４３】
本発明者らはまた、トランスフェクトによりαMβ2を発現したＬ細胞（αMβ2-transfected L cells）についても調べてみた。αMβ2発現Ｌ細胞トランスフェクタントは、ＰＭＮと同様に、ｐｒｏＭＭＰ−９とΔＭＭＰ−９に結合し、そして、ＩドメインリガンドとＭＭＰ−９阻害剤は結合を弱めた（図５のＤ）。トランスフェクトした細胞はまた、ＦｎＩＩドメインに弱い接着を示したが、調べたペプチドと抗体はこの結合を阻害しなかった。野生型のＬ細胞とＬＡＤ−１のいずれもｐｒｏＭＭＰ−９やそのドメインには結合しなかった。
【００４４】
ＰＭＮのin vitroでの遊走をトランスウェルフィルターアッセイで研究した。人工的なβ2インテグリンリガンドＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴで被覆することにより、細胞遊走がβ2インテグリンに依存するようになる（参考文献１６，２５）。ＰＭＡで活性化したＰＭＮのＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ層中での遊走は、ＧＳＴ層中における遊走の５倍であった（図６のＡ）。ＨＦＤＤＤＥ（２００μＭ）は、ＰＭＡで刺激された細胞の遊走を阻害したが、不活性化細胞の基礎的遊走は阻害しなかった。ＤＤＧＷ、ＣＴＴ、ＭＥＭ１７０（２０μｇ／ｍｌ）及び抗ＭＭＰ−９ポリクロナール抗体（２０μｇ／ｍｌ）は類似の活性を示し、ＰＭＡで活性化した細胞の遊走のみに影響を与えた。対照ペプチドと対照抗体（抗ＴＡＴ−２）は効果を示さなかった。内皮貫通遊走アッセイ（transendothelial migration assay）からも同様の結果が得られた（図６のＢ）。Ｃ５ａまたはＴＮＦ−αによる化学走性によりＰＭＮのトランスマイグレーション（transmigration）が５〜１０倍に増加し、また、それをＤＤＧＷ、ＨＦＤＤＤＥ及びＣＴＴが阻害したが、対照ペプチドは阻害しなかった。同様に、αM抗体とＭＭＰ−９抗体は阻害したが、対照抗体（抗ＧＰＡ抗体）は阻害しなかった。本発明者らはまた、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴで被覆したトランスウェルフィルターを通過するＴＨＰ−１白血病細胞の遊走に対して各種ペプチドが与える影響を調べた。結果はＰＭＮの場合におけるのと同じであった。ＨＦＤＤＤＥ、ＤＤＧＷ及びＣＴＴはＴＨＰ−１の遊走を阻害したが、対照ペプチドは阻害しなかった（図６のＣ）。
【００４５】
ＤＤＧＷペプチドに関する以前の研究により、ＤＤＧＷペプチドがＴＨＰ−１細胞からｐｒｏＭＭＰ−９を脱離させることができることが示されている（ＦＩ２００３／０９２３）。本発明者らはまた、ＨＦＤＤＤＥペプチドもｐｒｏＭＭＰ−９を脱離させることができるが、ＤＤＧＷペプチドを用いた場合ほど有効性が高くないことを見出した（図６のＤ）。配列を乱したスクランブルペプチドはｐｒｏＭＭＰ−９の脱離を誘導しなかった。１６時間のインキュベーションの間、各種ペプチドはｐｒｏＭＭＰ−２の分泌に影響しなかった。
【００４６】
好中球のin vivoでの遊走を調べるために、本発明者らはチオグリコレートで誘発したマウス腹膜炎モデルを用いた。チオグリコレートで刺激してから３時間以内に腹腔に浸潤した細胞の大部分は、クリスタルバイオレット染色によりＰＭＮであると判定された。この炎症モデルにおいては、ＤＤＧＷペプチドとＨＦＤＤＤＥペプチドは強いin vivo活性を示した（図７のＡ）。ＤＤＧＷペプチドまたはＨＦＤＤＤＥペプチドを尻尾へ静脈注射することでＰＭＮの腹腔内蓄積を阻害した。対照として用いたＫＫＧＷペプチドとＤＦＥＤＨＤペプチドは効果を示さなかった。ＤＤＧＷペプチドとＨＦＤＤＤＥペプチドの効果は濃度依存性であり、ＤＤＧＷペプチドの投与量５０μｇ／マウスとＨＦＤＤＤＥペプチドの投与量５００μｇ／マウスで、９０％までの阻害を達成できた。ＤＤＧＷペプチドは、５μｇ／マウスの投与量（０．１ｍｇ／マウス組織１ｋｇの有効量に相当する）でさえも活性を示した。チオグリコレートで刺激した後、ＰＢＳを用いた対照と比較して約２０倍のＰＭＮが腹腔内に存在していた。採取した炎症性ＰＭＮは、ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体の存在について二重免疫蛍光法で染色した（図７のＢ）。ＰＢＳ注射の後に採取した細胞は上記複合体を欠いており、インテグリンを発現していたが、細胞表面ＭＭＰ−９を有さなかった（図７のＣ）。採取した腹腔液の上清をザイモグラフィーで分析したところ、ＰＢＳの場合と比較して、チオグリコレートがゼラチナーゼレベルの上昇を誘導したことが示された（図７のＤ）。ＤＤＧＷペプチドとＨＦＤＤＤＥペプチドは、細胞遊走の阻害にともない、ゼラチナーゼレベルの上昇を防止したが、スクランブルペプチドはそのような活性を示さなかった。
【００４７】
参考文献 
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3.      Kjeldsen, L., O. W. Bjerrum, J. Askaa, and N. Borregaard. 1992. Subcellular-localization and release of human neutrophil gelatinase, confirming the existence of separate gelatinase-containing granules. Biochem. J. 287:603.
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33.      Submitted manuscript: Mikael Bjorklund, Pia Heikkila and Erkki Koivunen. Title: Peptide inhibition of catalytic and noncatalytic activities of matrix metalloproteinase-9 blocks tumor cell migration and invasion.
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ヒト好中球とＬＡＤ−１細胞におけるαMβ2及びｐｒｏＭＭＰ−９の二重免疫蛍光染色。健康な提供者から得た新鮮単離ＰＭＮ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）とＬＡＤ−１細胞（Ｅ）をＭＭＰ−９及びαMβ2インテグリンについて二重染色した（実施例を参照されたい）。簡単に説明すると、刺激していないＰＭＮ（Ａ及びＢ）またはＰＭＡで刺激したＰＭＮ（Ｃ及びＤ）をポリ−Ｌ−リシンで被覆したカバーガラスに載せ、固定し、そして透過処理したもの（Ａ及びＣ）と透過処理しないもの（Ｂ及びＤ）を用意した。抗αMβ2抗体及び抗ＭＭＰ−９抗体で細胞を処理し、次いでＦＩＴＣ標識二次抗体またはＴＲＩＴＣ標識二次抗体で染色した。ＬＡＤ−１細胞は透過処理せず、固定と染色は同様に行った（Ｅ）。蛍光性は共焦点顕微鏡を使って検出した（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。バーはＡが４．５μｍ、Ｂが３．４μｍ、Ｃが７．０μｍ、Ｄが４．８μｍそしてＥが５．８μｍである。実験を少なくとも３回繰返し、同様の結果が得られた。
【図２】ナイトロジェン キャビテーション法（nitrogen cavitation）によって破砕した好中球の細胞画分を、パーコール密度勾配遠心にかけた結果を示す。細胞破砕前、単離した好中球を、休止状態に保つか刺激した。パーコールで密度勾配を形成して遠心分離を行い、得られた各画分をα、β１、β２及びγという群に分けた。Ｓ０はＰＭＡ刺激前またはＰＭＡ刺激後の上清であり、Ｓ１は得られた上清（postnuclear supernatant）であり、Ｓ２は細胞質ゾル物質である。プールした画分をＭＰＯ（Ａ）、ＮＧＡＬ（Ｂ）、ＬＦ（Ｃ）、ＭＭＰ−９（Ｄ）、ＨＳＡ（Ｅ）及びＨＬＡ（Ｆ）についてＥＬＩＳＡでアッセイを行なった。実験を少なくとも３回繰返し、同様の結果が得られた。
【図３】好中性顆粒におけるαMβ2及びＭＭＰ−９の細胞内局在性。（Ａ）各顆粒のプール（αバンド、β１バンド、β２バンド及びγバンド）から等量の総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体及び抗αM抗体ＭＥＭ１７０を用い、免疫ブロット法により分析した。（Ｂ）各プールのゼラチナーゼ活性をゼラチンザイモグラフィーにより検出した。ゼラチン分解活性を有するバンドの位置と分子量（ｋＤａ）を矢印で示す。（Ｃ）各プールから単離した可溶化した膜タンパク質を抗αM抗体ＯＫＭ１０で免疫沈降し、抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体または抗αM抗体ＭＥＭ１７０を用いたウェスタンブロット法で検出した。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞を［35Ｓ］−メチオニンで１０分間パルスラベルし、４時間チェイスした。細胞溶解物は抗ＭＭＰ−９抗体、抗αM抗体または対照抗体（ヒトＩｇＧ抗体）と共に３時間インキュベートした。免疫沈降物は２４時間後にフルオログラフィーにより視覚化した。ｐｒｏＭＭＰ−９とαMサブユニットの位置を示す。
【図４】組換えＭＭＰ−９ドメインへのαMＩドメインの結合。（Ａ）ＭＭＰ−９、及びE. coliを用いて製造したＭＭＰ−９の組換え体を模式的に示す。（Ｂ）ｐｒｏＭＭＰ−９、その組換え体またはＢＳＡをマイクロタイターウェルに８０μｇ／ウェルとなるように被覆し、可溶性ＧＳＴ−αMＩドメインを図に記載の濃度で結合させた。結合は抗ＧＳＴモノクローナル抗体で測定した。測定結果を、３つのウェルからの測定値の平均値±標準偏差で示す（（Ｃ）、（Ｄ）についても同様）。（Ｃ）図に記載の濃度の各種ペプチドの存在下における、固定化したＧＳＴ−αMＩドメインへのｐｒｏＭＭＰ−９の結合。結合は、抗ＭＭＰ−９抗体ＧＥ−２１３を用いて測定した。（Ｄ）固定化したｐｒｏＭＭＰ−８、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１及びフィブリノーゲンへのＧＳＴ−αMＩドメインの結合を、５０μＭのＩＣＡＭ−１、ＤＤＧＷまたはＫＫＧＷを競合ペプチドとして用いて調べた。対照ウェルには、ＧＳＴ−αMＩドメインの代わりにＧＳＴを加えた。実験を３回繰返し、同様の結果が得られた。
【図５】αMβ2インテグリン発現細胞による、組換えＭＭＰ−９ドメインの認識。ここで用いた細胞は以下の通りである：ＰＭＮ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、αMβ2発現Ｌ細胞トランスフェクタント（Ｄ）、非トランスフェクタント（Ｄ）及びＬＡＤ−１細胞（Ｄ）。ｐｒｏＭＭＰ−９またはそのドメインに対する結合実験の前に、ＰＭＮは休止状態、或いはＰＭＡ（Ａ、Ｃ）かＣ５ａかＴＮＦα（Ｂ）で刺激された状態にした。細胞は、図に記載の各種ペプチド（５０μＭ）、抗体（２０μｇ／ｍｌ）またはαMＩドメインで前処理した。結合しなかった細胞は洗浄除去し、接着した細胞の数をフォスファターゼアッセイによって定量した。実験を３回繰返し、同様の結果が得られた。
【図６】ゼラチナーゼとβ2インテグリンに対する阻害剤による、in vitroにおけるＰＭＮとＴＨＰ−１の細胞遊走の阻害。図に記載のペプチド（２００μＭ）または抗体（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴまたはＧＳＴで被覆した表面（Ａ）またはＨＭＥＣ単分子層（Ｂ）上に、ＰＭＮ（１００ μｌ中に１×１０5個）を塗布した。ＰＭＮを２０ｎＭのＰＭＡで刺激するか（Ａ）、ＨＭＥＣで処理して５０μＭのＣ５ａまたは１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで刺激するか、或いは未処理のままで用いた（Ｂ）。ＴＨＰ−１細胞（１００ μｌ中に５×１０4個）に５０ｎＭのＰＭＡで刺激を与え、各種ペプチド（２００μＭ）と共に被覆表面上に塗布した（Ｃ）。トランスウェルフィルターを貫通して遊走した細胞を染色し、顕微鏡を使って染色された細胞数を数えた。実験は全て、最低２回繰り返し行った。（Ｄ）ホルボールエステルで活性化したＴＨＰ−１細胞（１００ μｌ中に５×１０4個）を、図に記載のペプチドの存在下または非存在下、＋３７℃で１６時間インキュベートした。ならし培地をゼラチンザイモグラフィーで分析した。
【図７】炎症を起こした組織への好中球遊走の阻害。（Ａ）マウスにチオグリコレートまたはＰＢＳを腹膜注射によって投与し、図に記載の分量の各ペプチドを静脈注射した。３時間経過後、腹膜内白血球を採取し、細胞数を数えた。得られた結果を、１群２〜４匹からなる群の平均値±標準偏差で示す。アスタリスク（＊）は統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示す。実験は最低３回繰返し行った。チオグリコレート（Ｂ）またはＰＢＳ（Ｃ）を投与したマウスの組織に浸潤した好中球を、「図面の簡単な説明」の図３の説明に記載の方法で抗ＭＭＰ−９抗体及び抗αM抗体で染色した。蛍光性は共焦点顕微鏡を使って調べた。バーは（Ｂ）が９．１μｍ、（Ｃ）が４．８μｍである。（Ｄ）マウス腹腔から（Ａ）に記載の方法で採取した上清液のゼラチン分解活性。レーン１〜４：チオグリコレートを投与したマウスから採取した試料。レーン５：ＰＢＳを投与したマウスから採取した試料。ＤＤＧＷ、ＨＦＤＤＤＥ及びＤＦＥＤＨＤをマウス１匹当たり各々０．１ｍｇ、０．２ｍｇ及び０．２ｍｇの投与量で静脈注射した。矢印はｐｒｏＭＭＰ−９二量体、ｐｒｏＭＭＰ−９とｐｒｏＭＭＰ−２を示す。実験を３回繰返し、同様の結果が得られた。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
配列番号１      インテグリンＩドメイン結合テトラペプチド
配列番号２      インテグリンＩドメイン結合ヘキサペプチド
配列番号３      環状ＣＴＴペプチド
配列番号４      ＣＴＴペプチドのＡｌａ置換体
配列番号５      ＬＬＧ−Ｃ４ペプチド
配列番号６      ＤＤＧＷ全長配列
配列番号７      ＤＤＧＷの対照ペプチド
配列番号８      ＫＫＧＷ全長ペプチド
配列番号９      ＨＦＤＤＤＥペプチドに対する、スクランブル（配列並べ替え）による対照ペプチド
配列番号１０    インテグリンと相互作用する部位
【図１】
2006527741.tif 000002
【図２】
2006527741.tif 000003
【図３】
2006527741.tif 000004
【図４】
2006527741.tif 000005
【図５】
2006527741.tif 000006
【図６】
2006527741.tif 000007
【図７】
2006527741.tif 000008
【配列表】
2006527741000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月19日(2005.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥを有効成分として含有する医薬。
【請求項２】
ヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥを有効成分として含有する、炎症性病態の予防または治療のための医薬。
【請求項３】
有効成分としてのヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥと少なくとも１種の薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項４】
ヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥを有効成分として含有する、炎症性病態の予防用または治療用医薬組成物。
【請求項５】
好中球遊走に起因する病態の治療処置または予防処置のための方法であって、ヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥを、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項６】
炎症性病態の治療処置または予防処置のための方法であって、ヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥを、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項７】
炎症性病態の治療処置または予防処置のための方法であって、ヘキサペプチド ＨＦＤＤＤＥを有効成分として含有する医薬組成物を、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【国際調査報告】
2006527741.tif 000009
2006527741.tif 000010
2006527741.tif 000011
2006527741.tif 000012
2006527741.tif 000013