(57)【要約】ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを選択的に結合する蛋白質、又は核酸分子の変性を減少させ、そして混合されたＲＮＡ：ＤＮＡ核酸ハイブリッドの特異的検出を増強するように修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを利用した、ＲＮＡの捕捉、検出及び定量のための方法を提示する。ＲＮＡの標識及び／又は増幅はこれらの方法を実施するのに必要ない。そのような方法において有用な修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のＲＮＡ配列の検出のための方法であって、
ａ．目的の特定のＲＮＡ配列及び当該ＲＮＡ配列に相補なＤＮＡプローブを含むＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を含むかもしれない混合物を用意し；
ｂ．ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子に選択的にハイブリダイズする抗体以外の蛋白質に上記混合物を接触させることにより結合した蛋白質を形成させ：そして
ｃ．上記結合した蛋白質を検出するが、その際蛋白質の結合がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子、即ち特定のＲＮＡ配列の存在を示す
工程を含む方法。
【請求項２】
さらに、
ｄ．工程ｃにおいて検出された結合蛋白質の量の測定から特定のＲＮＡを定量すること
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記蛋白質がヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせであり、そして上記蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を保持するがヌクレアーゼ活性又はポリメラーゼ活性を呈さない条件下で使用される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記蛋白質が、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を保持するがヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性の一方又は両方を呈さないように修飾された、ヌクレアーゼの誘導体、ポリメラーゼの誘導体、逆転写酵素の誘導体又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせの誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記蛋白質が、ヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性の一方又は両方を呈さないように修飾された、ヌクレアーゼの誘導体、ポリメラーゼの誘導体、逆転写酵素の誘導体又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせの誘導体であって、そして、上記蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関するその選択性、親和性、又は選択性と親和性の両方に関して修飾されてもいる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないような条件下で使用されるＲＮａｓｅ  Ｈファミリーの蛋白質のメンバーである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないような条件下で使用されるＲＮａｓｅ  Ｈファミリーの蛋白質のメンバーの誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈファミリーの蛋白質のメンバーの誘導体であり、そして上記蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関するその選択性、親和性、又は選択性と親和性の両方に関してさらに修飾されている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないような条件下で使用されるエシェリヒアコリ由来のＲＮａｓｅ  Ｈである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾されたエシェリヒアコリ由来のＲＮａｓｅ  Ｈの誘導体である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
上記蛋白質がヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾され、そしてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関するその選択性、親和性、又は選択性と親和性の両方に関してさらに修飾されている、エシェリヒアコリ由来のＲＮａｓｅ  Ｈの誘導体である、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡプローブが固定されている、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
検出工程ｃ又は定量工程ｄが、表面プラズモン共鳴又は表面プラズモン共鳴イメージング及び関連する技術により実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
検出工程ｃ又は定量工程ｄが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を選択的にハイブリダイズする蛋白質に融合された、たやすくアッセイされる分子により実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
検出工程ｃ又は定量工程ｄが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を選択的にハイブリダイズする蛋白質に対する抗体により実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合できるがＲＮＡを分解せず、そして蛋白質／核酸複合体に取り込まれる蛍光分子そ減衰させて、蛋白質を複合体から解離させて、ＲＮＡ集団を含む混合物からのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと再結合させるような様式にて蛋白質が核酸との複合体として予め結合されて加えられる工程ｂのための条件を提供することにより検出工程ｃが実施され；そして新たに結合した蛋白質の工程ｃの検出が蛍光測定により実施されるが、その際結合した蛋白質が特定のＲＮＡ配列の存在を示唆する、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を呈する蛋白質の使用により検出工程ｃが実施され；工程ａからのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を含むかもしれない混合物中の未ハイブリダイズ核酸を一本鎖特異的エキソヌクレアーゼにより消化し、そして消化された物質及びエキソヌクレアーゼを洗浄により除去し；そしてＲＮａｓｅ  Ｈが工程ｂにおいて添加された蛋白質であり、そしてＲＮａｓｅ  ＨがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを分解することを許容され、但し当該分解はモノ−及びオリゴ−リボヌクレオチドを遊離させ；そして次に一本鎖特異的ＲＮＡエキソヌクレアーゼを添加することによりあらゆるＲＮＡオリゴ−ヌクレオチドをモノ−リボヌクレオチドに分解し；次に、あらゆる遊離のＡＭＰからＡＴＰを生成させるために系を加えることにより検出工程ｃを実施し；そしてたやすくアッセイ可能な反応を推進させるための系を用いることによりＡＴＰを定量するが、その際ＡＴＰが特定のＲＮＡ配列の存在を示す、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに選択的にハイブリダイズする上記蛋白質を用いることにより、不均質集団から特定のＲＮＡ配列又はＲＮＡ分子のファミリーを単離し、結合したＲＮＡ分子を回収するさらなる工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
上記蛋白質が固定され、そして結合したＲＮＡ／ＤＮＡが洗浄後に溶出されることにより未結合の核酸を除去する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
蛋白質／ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体の回収を、
ｉ．未結合のＲＮＡ及びＤＮＡのエキソヌクレアーゼによる消化；
ｉｉ．上記混合物を固定されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド上に通過させることによる未結合蛋白質の除去；及び
ｉｉｉ．親和精製による蛋白質／ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体の回収
を含むプロセスにおいて実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＲＮＡ中の単一の塩基ミスマッチの検出に適用されるが、
但し、目的のＲＮＡ配列に相補な工程ａの上記ＤＮＡプローブが一本鎖であり、そして少なくとも８ヌクレオチドの長さであり；
但し、方法の工程が、少なくとも８塩基の長さであり、そして特定の単一塩基ミスマッチ以外は目的のＲＮＡ配列に相補である第２の一本鎖ＤＮＡプローブを用いても実施され；そして
但し、蛋白質の結合が、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子が上記２つのＤＮＡプローブ配列に関して存在するか否かを示し、それによりＲＮＡ中の単一塩基ミスマッチの検出を許容する、
請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ＲＮａｓｅ保護アッセイを実施するための方法であって、
ａ．目的の特定のＲＮＡ配列を含むＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を含むかもしれない混合物及び当該ＲＮＡ配列に相補な標識ＤＮＡプローブを用意し；
ｂ．ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子に選択的にハイブリダイズする抗体以外の蛋白質に上記混合物を化合して、結合した蛋白質のを形成させ；そして
ｃ．結合した蛋白質を検出するが、その際、蛋白質の結合が、ＲＮａｓｅ保護に供されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子の存在を示し、
その際、結合した蛋白質を検出する工程がＲＮａｓｅを用いた一本鎖ＲＮＡの消化を含む
工程を含む方法。
【請求項２３】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を選択的に結合する蛋白質であって、但し、当該蛋白質は以下の配列置換：
（ｉ）１３４位に対応するアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ又はＡｌａ）であり、
（ｉｉ）９４位に対応する残基がグリシン残基（Ｇ又はＧｌｙ）であるか、アスパラギン酸（Ｅ又はＧｌｕ）又はグルタミン酸（Ｄ又はＡｓｐ）であり、そして
（ｉｉｉ）少なくとも２つの残基が以下に列挙されたとおりであり、
【表１】
2006510371.tif 000011
を有する配列番号：１から本質的になるアミノ酸配列を有し、但し、上記蛋白質が単離されて、精製されている、蛋白質。
【請求項２４】
アミノ酸配列が、配列番号：２、は配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５からなる群から選択される、請求項２３記載の蛋白質。
【請求項２５】
以下の配列置換：
（ｉ）１３４位に対応するアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ又はＡｌａ）であり、
（ｉｉ）９４位に対応する残基がグリシン残基（Ｇ又はＧｌｙ）であるか、アスパラギン酸（Ｅ又はＧｌｕ）又はグルタミン酸（Ｄ又はＡｓｐ）であり、そして
（ｉｉｉ）少なくとも２つの残基が以下に列挙されたとおりであり、
【表２】
2006510371.tif 000012
を有する配列番号：１から本質的になる蛋白質を核酸のコード部分がコードする、単離されて精製された核酸であって、当該核酸はＤＮＡ又はその相補体及び構築物を含む、核酸。
【請求項２６】
そのコード部分が、配列番号：６、は配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、又は配列番号：１０を有する核酸から本質的になる、請求項２５記載の蛋白質。
【請求項２７】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの存在又は不在を検出する方法であって、
（ａ）可能なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを用意し；
（ｂ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が存在したならＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するような時間及び条件下で、上記可能なＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に暴露し；そして
（ｃ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定し、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の結合がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが存在することを示す
工程を含む方法。
【請求項２８】
さらに以下の工程
（ｉ）標的ＲＮＡにハイブリダイズするようにデザインされたＤＮＡプローブを用意し；
（ｉｉ）標的ＲＮＡを含むかもしれない試験溶液を用意し；
（ｉｉｉ）標的ＲＮＡがＤＮＡプローブにハイブリダイズすることにより標的ＲＮＡが存在する場合にＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成させるのに十分な条件及び時間、標的ＲＮＡを含むかもしれない試験溶液にＤＮＡプローブを接触させて、それにより可能なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成させること
を含むことにより工程（ａ）において可能なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを用意することを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定するために以下の工程：
（Ａ）工程（ｉ）のＤＮＡプローブが結合する固相支持体を用意し、それにより、工程（ｉｉｉ）において形成されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを結合し；
（Ｂ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の上にマーカーを用意し；
（Ｃ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合しなかったＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質から、固相支持体に結合させたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質を分離させ；
（Ｄ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が固相支持体に結合したらしいか否かを分析し、固相支持体に結合したマーカーが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が工程（ｃ）においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合したことを示すこと
をさらに含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
工程（ｃ）においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定するために以下の工程：
（Ａ）工程（ｉ）のＤＮＡプローブが結合する固相支持体を用意し、それにより、工程（ｉｉｉ）において形成されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを結合すること
をさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
複数の規定されたＤＮＡプローブが固相支持体に結合している、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定するために以下の工程：
（Ｂ）表面プラズモン共鳴イメージングを用いてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の結合をイメージ化すること
をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程：
（ｄ）結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の量を定量すること
をさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質へ可能なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを暴露するための工程（ｂ）下の条件が、ヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼ活性が低下する条件でもある、請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が蛍光マーカーである、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の上のマーカーが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に付随した、たやすくアッセイ可能な第２蛋白質である、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に付随した、たやすくアッセイ可能な第２蛋白質が、第２蛋白質に特異的な抗体を用いて検出され、それによりＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が工程（ｃ）において結合したか否かの決定を許容する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
さらに以下の工程：
（Ａ）反応物ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に結合した場合に、ドナーの蛍光が減衰するように、蛍光ドナー／クエンチャー対の他のドナー／クエンチャーに共有結合させた反応物ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合した蛍光ドナー／クエンチャー対のドナー又はクエンチャーに共有結合させたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質を用意し；その際、工程（ｃ）においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを決定することを、蛍光の減衰を監視することにより実施すること
を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３９】
特定のＲＮＡ分子の存在又は不在を検出する方法であって、工程：
（ａ）固相支持体の領域に結合したＤＮＡプローブを用意し；
（ｂ）ＤＮＡプローブにハイブリダイズすることができるＲＮＡを含むかもしれない試験サンプルを用意し；
（ｃ）ＤＮＡプローブにハイブリダイズできるＲＮＡへのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションを許容することにより、適当なＲＮＡが存在した場合にＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するのに十分な時間、ハイブリダイズする条件下で、試験サンプルにＤＮＡプローブを接触させ；
（ｄ）ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を用意し；
（ｅ）ＤＮＡプローブが結合する固相支持体の領域をＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に接触させ；
（ｆ）ハイブリッドが存在する場合にＲＮａｓｅ  Ｈ酵素のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへの結合を許容するのに十分な時間、固相支持体とＲＮａｓｅ  Ｈ酵素の間の接触を保持し；
（ｇ）結合したＲＮａｓｅ  Ｈの存在又は不在に関してＤＮＡプローブが結合した固相支持体の領域を分析し、それにより、ＤＮＡプローブへハイブリダイズできる特定のＲＮＡ分子の存在又は不在を検出すること
を含む方法。
【請求項４０】
工程（ｃ）の後に、ＤＮＡプローブが結合した固相支持体の領域から未結合のＲＮＡを洗い流す工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｆ）の後に、ＤＮＡプローブが結合した固相支持体の領域から未結合のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を洗い流す工程をさらに含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
固相支持体がＤＮＡチップである、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が、アルカリホスファターゼ系、ルシフェラーゼ系、又は工程（ｇ）に記載された固相支持体の領域を分析することにおける使用のための蛍光標識により標識されている、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
蛍光ドナー／クエンチャー対のドナー／クエンチャーに共有結合させたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質、及び蛍光ドナー／クエンチャー対のドナー／クエンチャーに共有結合させた核酸を含むＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質反応物組成物であって、当該核酸がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に結合したときに、ドナーの蛍光が減衰するようにした、組成物。
【請求項４５】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質がＲＮａｓｅ  Ｈである、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質反応物組成物。
【請求項４６】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が配列番号：５に相当するアミノ酸配列を有する、請求項４５記載のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質反応物組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の背景
本発明は、核酸検出方法、特定すればＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの検出の分野；及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド−結合活性を有する蛋白質の分野にも関する。
【０００２】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを検出するための現在の方法は、モノクローナル抗体を用いた免疫検出方法を含む。そのような免疫検出法の一つにおいて、ＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼにより製造されたＲＮＡ：ＤＮＡヘテロポリマー二重鎖に対してモノクローナル抗体を出現させる。高い親和性及び特異性を有するモノクローナル抗体が選択される。モノクローナル抗体及びアルカリホスファターゼ標識された二次抗体を用いて、長さを変えた固定化ＤＮＡプローブと２３ＳリボソーマルＤＮＡの間に形成されたハイブリッドを測定する（比色応答により）。Ｂｏｇｕｓｌａｗｓｋｉら、”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＤＮＡ：ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８６  Ｍａｙ  １；８９（１）：１２３−３０を参照。
【０００３】
いくつかの蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するが、特にＲＮＡポリメラーゼを含み、これは典型的にはＤＮＡ鋳型からＲＮＡを重合するが、逆転写酵素を含み、これはＲＮＡ鋳型に基づいてＤＮＡを重合する。リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）の生化学活性は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの結合も含む。いくつかの逆転写酵素及びポリメラーゼはＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有し、当該活性のエキソヌクレアーゼの側面を含む。
【０００４】
ＲＮａｓｅ  Ｈは、２つの異なる系統発生的サブタイプ、タイプ１及びタイプ２に分類される、偏在する酵素ファミリーである。ＲＮａｓｅ  Ｈは、相補なＤＮＡ一本鎖にハイブリダイズする一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡを結合し、次にＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を分解する共通の能力により統一される。ＲＮａｓｅ  ＨはＤＮＡの複製及び組換え、及び修復において関係するが、それらの生理学上の役割は完全に理解されていない。インビトロにおいては、当該酵素類が、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するよりも低い親和性ではあるが、二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及びｄｓＲＮＡにも結合する。
【０００５】
本発明者らは、ＲＮＡ分子の混合された集団か又は純粋な集団において特定のＲＮＡ配列を定量するための新規な方法の基礎を提供するために、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識して結合する蛋白質の能力を探索するための方法を見いだした。本発明者らは、他の新規な応用、例えば同一のヌクレオチド配列又は密接に関連するヌクレオチド配列を全てが含むＲＮＡの全ファミリーの捕捉、においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識して結合する蛋白質の用途をも意図する。
【０００６】
さらに、本発明者らは、当分野のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素の以下の問題を克服するか又は最小化することにより前の段落において示唆された方法に有用な、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質、ＲＮａｓｅ  Ｈを作成する方法を見いだした。
【０００７】
野生型ＲＮａｓｅ  ＨはＲＮＡ−依存性活性を有し、本発明者らにより意図されたようなＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの認識に対する応用の問題を提起し得る。例えば、ＲＮＡ−分解はＲＮＡを分解して、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド内で特異的に検出されるようにするかもしれない。このため、当分野のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド認識抗体方法は、酵素、例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性のこのエキソヌクレアーゼの側面を欠く逆転写酵素を用いる。さらに、野生型のＲＮａｓｅ  ＨはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに加えて、他の種類の核酸を結合する。本発明の方法においては、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの結合が他の種類の核酸結合、例えば一本鎖核酸よりも増強されることが好ましい。従って、他の種類の二重鎖核酸を超えた、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの間の識別の改善の余地がある。
【０００８】
酵素ＲＮａｓｅ  Ｈの偏在性ゆえに、文献公知のＲＮａｓｅ  Ｈにはいくつかの配列が存在する。当分野ではいくつかのＲＮａｓｅ  Ｈ酵素が知られており、それらのアミノ酸配列は広く異なる。合衆国特許第５，２６８，２８９号は、熱安定性ＲＮａｓｅ  Ｈを開示しており、合衆国特許第５，５００，３７０号のようにである。合衆国特許第６，３７６，６６１号はヒトＲＮａｓｅ  Ｈ及びその組成物及び用途を開示する。合衆国特許第６，００１，６５２号は、ヒトタイプ２ＲＮａｓｅ  Ｈを開示する。合衆国特許第６，０７１，７３４号は、ＨＢＶポリメラーゼからのＲＮａｓｅ  Ｈを開示する。
【０００９】
蛋白質の配列データベース、ＮＣＢＩ（ナショナルセンターフォーバイオロジカルインフォメーション）は、配列番号：１のエシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  Ｈに同一の提出されたアミノ酸配列に関するいくつかの文献を列挙しており、例えば、ｇｉ２４１１１６４５及びｇｉ２４０５０４１８（列挙された１９２残基のうちの全部で１５５が適合）；ｇｉ１５７９９８９０，ｇｉ１５８２９４６４，ｇｉ１６１２８２０１，ｇｉ１３３１６３，ｇｉ１７３１１，ｇｉ４４３４３３，ｇｉ４４３２２７，ｇｉ１９４２３２２，ｇｉ４２０６２，ｇｉ４２７７７，ｇｉ１４７６８０，及びまだ他にある（列挙された１５５残基のうちの１５５が適合）；ｇｉ１９４２２１３は残基１３４のアスパラギン酸（Ｄ）から何かへの変更を開示する；ｇｉ１９４２２１１はＤ（アスパラギン酸）からＡ（アラニン）への変異を開示する。ＲＮａｓｅ  Ｈ１の好適データベース内の初期のヌクレオチド配列は蛋白質中のひとつのあまりに少ないシステイン残基をもたらす点エラーを有する。
【００１０】
本発明に対する対位において、当分野はＲＮａｓｅ  Ｈ生化学活性を欠く逆転写酵素を利用するいくつかのＲＮＡ検出方法を教示する。例は、合衆国特許第６，２７７，５７９号及び第５，９９４，０７９号に開示された方法”Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”を含む。合衆国特許第５，６６８，００５号及び第５，４０５，７７６号は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を欠く逆転写酵素の遺伝子を開示する。
【００１１】
当分野の別のエリア、アンチセンス核酸方法においては、ＲＮａｓｅ  Ｈを利用してＲＮＡを分割する。２００１年１１月２２日に公開された公開合衆国特許出願番号２００１００４４１４５、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ”を参照されたく、選択された蛋白質をコードするＲＮＡを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドによる選択された蛋白質の発現の阻害を促進させる方法を教示しており、その際、ＲＮａｓｅ  Ｈがオリゴヌクレオチド−ＲＮＡに結合して、ＲＮＡ鎖を分割することにより、蛋白質の発現の阻害を促進させる。
【００１２】
要約すると、低いＲＮＡ−分割（核酸分解性）活性しか有さないＲＮａｓｅ  Ｈに関する要求が存在する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと他の形態の核酸、例えばｓｓＤＮＡ，ｓｓＲＮＡ，ｄｓＤＮＡ及びｄｓＲＮＡの間の改善された識別に関して多大な要求が存在する。
【００１３】
発明の簡単な概要
本発明は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを認識して結合する能力を利用した新規なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド検出方法を提供する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合能力は、混合された集団内のメッセージにおいて特定のＲＮＡ（ほとんどおそらくはｍＲＮＡ）を定量する方法の基礎、並びに他の応用、例えば同じヌクレオチド配列か又は密接に関連するヌクレオチド配列を全てが含むＲＮＡの全ファミリーの捕捉の基礎を形成する。
【００１４】
特定のＲＮＡの検出の方法を含む本発明の方法のほとんどが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの存在又は不在の検出を含む。可能性のあるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が、存在したならば、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するような条件下で、ＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質に暴露する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合するなら、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは存在する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの識別は定性的であるか又は定量的であり得る。
【００１５】
本発明のいくつかの態様において、可能性のあるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを、標的ＲＮＡへハイブリダイズするようにデザインされたＤＮＡプローブと、標的ＲＮＡを含むかもしれない分析物の間で形成させる。そのような態様は、試験溶液中の特定のＲＮＡ配列又はＲＮＡファミリーの検出を含み、ＲＮＡ及びＤＮＡの不均質な混合物を含んでもよい。いくつかの態様においては、ＤＮＡプローブ又はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の何れかが固相支持体上で固定化される。いくつかの態様においては、支持体がその上に固定された少量の物質を伴うチップであり得るのに十分上記方法は感度が良い。他の態様においては、反応ウエルを企図する。また別の態様においては、均質な「ワンポット」検出方法が企図され、固相支持体を用いない。
【００１６】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質は、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、逆転写酵素、又はヌクレアーゼとポリメラーゼの組み合わせである。意図されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質は抗体以外である。好ましい態様においては、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性は、他の形態の核酸の結合又は核酸分解活性又は重合活性を含む、他の生化学活性を超えるのが好ましい。生化学活性は、蛋白質の生物学上の配列の変更を通してか、又は反応条件の操作を通して、修飾される。
【００１７】
即ち、発明は、特定のＲＮＡ配列の検出のための方法を意図する。特定のＲＮＡ配列の検出方法においては、ＲＮＡ−含有溶液を目的のＲＮＡ配列に相補なＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。抗体以外のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質を、ＤＮＡプローブとのＲＮＡ混合物に加える。結合蛋白質を検出する。
【００１８】
発明は、特定のＲＮＡ配列の定量分析のための方法も意図する。定量性ＲＮＡ検出方法においては、ＲＮＡ−含有溶液を、特定の標的ＲＮＡに相補なＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子に選択的に結合するＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質を試験溶液に加える。存在する特定のＲＮＡ標的の量を、結合した蛋白質の量の測定を通して測定する。
【００１９】
特定のＲＮＡの検出方法においては、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質は、ヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼである。いくつかの好ましい態様においては、ヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼを、上記蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を呈するが実質上は低下した核酸分解活性及び／又はポリメラーゼ活性を呈する条件下で使用する。いくつかの好ましい態様において、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質は、ヌクレアーゼ活性又はポリメラーゼ活性又は両方の活性を呈さないが、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性は保持したままであるように修飾された、ヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼの誘導体である。
【００２０】
いくつかの好ましい態様において、蛋白質は、ヌクレアーゼ又はポリメラーゼの活性の何れか（又は両方）を低下させるように修飾され、そしてさらにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの結合の選択性及び／又は親和性を改善するように修飾されたヌクレアーゼ及び／又はポリメラーゼの誘導体である。
【００２１】
いくつかの好ましい態様において、蛋白質は、実質上低下したヌクレアーゼ活性を呈する条件下で使用される蛋白質のＲＮａｓｅ  Ｈファミリーのメンバーである。いくつかの好ましい態様において、蛋白質は、ヌクレアーゼ活性を呈さないように修飾され、且つＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関するその選択性及び／又は親和性を改善するようにさらに修飾された、酵素のＲＮａｓｅ  Ｈファミリーのメンバーの誘導体である。いくつかの好ましい態様において、ＲＮａｓｅ  ＨはエシェリヒアコリのＲＮａｓｅ  Ｈ１のそれに相同な生物学上の特性を有する。
【００２２】
ＤＮＡプローブを用いるいくつかの好ましい態様においては、ＤＮＡプローブを、好ましくは固相表面上に、固定化する。固定化されたＤＮＡプローブ又は固定化されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質を用いるいくつかの好ましい態様においては、表面プラズモン共鳴又は表面プラズモン共鳴イメージング及び関連する技術により、上記検出又は定量を実施する。
【００２３】
いくつかの好ましい態様において、検出又は定量は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子に選択的に結合する蛋白質に融合された容易にアッセイ可能な分子により実施される。いくつかの好ましい態様において、検出又は定量は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド複合体を選択的に認識する蛋白質に対する特異的抗体により実施される。
【００２４】
いくつかの好ましい態様において、ＲＮＡの検出及び／又は定量の方法は、均質なアッセイにおいて実施される。均質なアッセイにおいては、ＲＮＡ集団を、目的のＲＮＡ配列に相補なＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二重鎖に選択的に結合する蛋白質を、それがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドには結合するがＲＮＡを分解しない条件下で、当該混合物に加える。この態様においては、蛋白質：核酸複合体に取り込まれる蛍光分子を減衰させる様式において、上記蛋白質を核酸に予め結合させて加える。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質は、上記複合体から解離してＲＮＡ集団からのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと再度結合することが許容される。新たに結合した蛋白質は、蛍光測定により検出されるか、及び／又は定量される。
【００２５】
いくつかの好ましい態様において、特定のＲＮＡ配列の検出及び／又は定量は、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を呈する蛋白質を用いて実施される。そのような方法においては、ＲＮＡ集団を目的のＲＮＡ配列に相補な固定化ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。未ハイブリダイズの核酸は、一本鎖特異的エキソヌクレアーゼを用いて消化する。消化された物質及びエキソヌクレアーゼは、洗浄により除去する。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を呈する少なくとも一つの蛋白質を添加して、ＲＮａｓｅ集団とＤＮＡプローブの間のハイブリッドを分解させ、モノ−又はオリゴリボヌクレオチドを遊離させる。一本鎖特異的ＲＮＡエキソヌクレアーゼを加えることにより、あらゆる遊離のＲＮａｓｅオリゴリボヌクレオチドをモノマーまで分解する。あらゆる遊離したＡＭＰからＡＴＰを生じさせるシステムを加える。そうして生成されたＡＴＰを次に用いることにより、容易にアッセイ可能なＡＴＰ検出反応を推進させる。
【００２６】
ＲＮＡ検出のいくつかの好ましい態様においては、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド二重鎖に選択的にハイブリダイズする蛋白質を用いて、不均質な集団から特定のＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子のファミリーを単離する。そのような方法においては、ＲＮＡ集団を目的のＲＮＡ配列に相補なＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。当該蛋白質は、それがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合できる条件下で加えられる。上記のＲＮＡ検出方法の好ましい態様においては、蛋白質を固定化して、未結合の核酸を除去するために洗浄した後に、結合したＲＮＡ：ＤＮＡを溶出する。好ましくは、蛋白質／ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体の回収は、
未結合のＲＮＡ及びＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化し、未結合の蛋白質を除去し（例えば、混合物を固定化されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド上に通過させることにより）、そして親和性精製を用いることにより蛋白質−ＲＮＡ：ＤＮＡ複合体を回収することにより達成される。
【００２７】
いくつかの態様においては、発明の方法をＲＮＡ中の単一塩基ミスマッチの検出に適用する。一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（少なくとも約８のヌクレオチドの長さ、好ましくは５０ヌクレオチドの長さを超えず、より好ましくは１０ヌクレオチドの長さを超えない）であって、目的のＲＮＡの完全に相補なものが提供される。また、目的のＲＮＡが有するかもしれない特定の単一塩基変化を除いて、目的のＲＮＡの完全に相補な一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドも提供される。それらのＤＮＡオリゴヌクレオチドの何れかを、その配列が決定される目的のＲＮＡを含む溶液にハイブリダイズさせる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質を上記混合物に加え、そして上記オリゴヌクレオチドの各々に関して結合を検出するか、及び／又は定量する。単一塩基変化を含むオリゴデオキシヌクレオチドを用いた反応におけるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへの強い結合は、変更された配列の存在を示す。
【００２８】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質、好ましくはＲＮａｓｅ  Ｈを、ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせたＲＮＡに結合させる保護アッセイも意図される。フットプリンティング消化（例えば、ヒドロキシラジカルボンバードメント）を用いることにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の上記ハイブリッドへの結合をアッセイする。
【００２９】
本明細書において記載された修飾ＲＮａｓｅ  Ｈ誘導体に関しては、それらのアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列も意図され、好ましくは、種にとって好ましいコドン使用量を用い、エシェリヒアコリを含む多くの種に関して当業界においては知られている。
【００３０】
本発明は、さらに、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関しての増強された親和性及び選択性及び／又は低下したヌクレオチド分解活性を有する、修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を提供する。
【００３１】
本発明は多くの利益及び利点を有し、幾つかが以下に列挙される。
特異的ＲＮＡ検出方法の一つの利益は、ＲＮＡ分子の混合物中における一つ又は複数の特定のＲＮＡの検出のためにそれが有用であることである。
【００３２】
上記ＲＮＡ検出方法の一つの利点は、ＲＮＡ又はＤＮＡプローブの何れかにより標識することにより相対的に低いレベルにおいてのみ発現されるｍＲＮＡを検出するのにそれが有用なことである。
【００３３】
開示された方法において修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを用いる利益は、アッセイの感度及び選択性が典型的な天然のＲＮａｓｅ  Ｈの使用に比較して増強されていることである。
発明のいくつかの態様の利点は、修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを用いる方法が、測定値に偏りを導入し得るサンプルＲＮＡの中間体形態への化学的又は酵素的変換の何れかに関する要求なしに特定のサンプルＲＮＡの正確且つ直接の定量を可能にする。
【００３４】
これらの利益及びそれ以上が、この開示から当業者には明らかである。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖結合蛋白質の技術的応用を提供する。ＲＮａｓｅ  Ｈ１、及びいくつかのＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、本発明の方法における使用のために好ましい。発明の方法は、ＲＮＡ分子の混合されたか又は純粋な集団中の特定のＲＮＡを定量するための新規な方法の基礎を提供するために、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを選択的に認識して結合する蛋白質の能力を探索する。発明は、他の新規な応用、例えば、同じか又は密接に関連したヌクレオチド配列を全て含むＲＮＡの全ファミリーの捕捉におけるＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質の使用も意図する。
【００３６】
特定のＲＮＡの検出方法を含む本発明の方法のほとんどは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの存在又は不在の検出に関する以下の工程を共通とする。可能なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを用意する。可能なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを一定時間、もし存在するならＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合するような条件下で、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に暴露する。次に、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したか否かを測定する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が結合したなら、そのときは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが存在する。
【００３７】
以下のセクションにおいては、意図された方法と共に有用ないくつかのＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質に加えて、意図されたＲＮＡ検出方法の様々な態様が論じられる。
ＲＮＡ検出の態様の一つのセットにおいて、本発明は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を自然界で呈する蛋白質、好ましくはヌクレオチド分解活性を排除し、そしてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへの結合を増強するか、及び／又はＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関する選択性を改善するように修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを用いて、ＲＮＡ分子の均質集団又は不均質集団中の検出の方法を提供する。当該ＲＮＡ検出方法は、以下の工程を含む。ＲＮＡ集団を、目的のＲＮＡ配列に相補なＤＮＡプローブにハイブリダイズさせる。ＲＮａｓｅ  Ｈ誘導体を、それがあらゆるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを結合し得るような条件下で上記混合物に加える。結合したＲＮａｓｅ  Ｈを検出及び／又は定量する。あるいは、ヌクレオチド分解活性が実質上抑圧される条件下で、例えば二価のカチオン（例えば、マグネシウムイオン）への最少のアクセスで、ＲＮａｓｅ  Ｈを利用する。
【００３８】
特定のＲＮＡの検出
本発明は、固相支持体、好ましくはＤＮＡチップへ結合したＤＮＡを用いての、特定のＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子の検出及び／又は定量に関する態様を意図する。
【００３９】
特定のＲＮＡの検出の方法は、当業界において莫大な応用を有する。以下の実施例において、本発明の方法を用いて、様々な条件下で熱ショック蛋白質の発現を分析した。応用は、当業者に明らかな大多数のその他の間での、疾患の状態の決定、発生の進行を含む。
【００４０】
この態様に関して、一本鎖ＤＮＡプローブを用意し、好ましくは、公知のヌクレオチド配列を有する。ＤＮＡプローブはハイブリダイゼーションのために十分な長さであるべきであり、よって少なくとも８ヌクレオチドの長さである。好ましくは、ＤＮＡプローブは８から１００ヌクレオチドの長さであり、もっとも好ましくは１０から約５０ヌクレオチドの長さであり、１０から３０ヌクレオチドがＤＮＡプローブの長さに関してはもっとも特別に好ましい。
【００４１】
ＲＮＡを標識することなしに本発明において最大の感度を実現するためには、ＤＮＡプローブを、例えば放射線により、蛍光により又は化学的に標識してよい。ＤＮＡプローブは非標準の、還元すれば典型的なＡ，Ｇ，Ｃ又はＴヌクレオチドではないものを含んでよい。ＤＮＡプローブは、非標準の結合、例えば典型的なリン酸結合に代えて分解耐性のホスホロチオエート結合を含んでよい。
【００４２】
好ましい態様においては、ＤＮＡプローブを固相支持体に付着させる。そのようなＤＮＡ用の固相支持体は当業界でよく知られており、ガラスプレート（例えば、ＤＮＡチップ上のＤＮＡプローブアレイ中で使用されるもの）及びナイロン膜を含む。ＤＮＡチップの文献は、合衆国特許第６，３６８，８０８号「ＤＮＡチップとその製造」及び合衆国特許第６，３４２，３５９号「核酸検出法、核酸検出器、及びその製造方法」を含む。複数のＤＮＡプローブをＲＮＡ含有サンプルでチャレンジする一つの態様において、公知のＤＮＡ配列は固相支持体上の規定された領域上に存在することが好ましく、それにより如何なる位置のＤＮＡプローブの配列も、それらがそうして選択されるならば、アッセイ結果を分析する人により決定され得る。
【００４３】
この態様に関して、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、好ましくは低下したＲＮＡ分解活性を有する修飾ＲＮａｓｅ  Ｈ及び／又は増強されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合選択性を有する修飾ＲＮａｓｅ  Ｈが提供される。
【００４４】
好ましい態様において、ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は適当なリポーターシステムに結合させる。リポーターシステムは当業界公知であり、多くが本発明に使用可能である。そのようなリポーターシステムの例は、ＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質のルシフェラーゼ／ルシフェリン、アルカリホスファターゼ、及び直接蛍光標識を含む。ルシフェラーゼ／ルシフェリンリポーターシステムは、ＡＴＰが基質として存在する場合に蛍光を生じる。アルカリホスファターゼリポーターシステムは、適当な基質が存在したときに光を生じ、例えばＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）ＡＰ蛍光基質システム（プロメガコーポレーション）と共に使用した場合に蛍光を生じる。
【００４５】
存在又は不在が決定されつつあるＲＮＡを含むかもしれないサンプルは、あらゆる源であってよい。例えば、細胞からの全ＲＮＡ単離物からのＲＮＡの混合サンプルは、分析される源を提供するかもしれず、例えば、ＲＮＡｇｅｎｔｓ（登録商標）（プロメガコーポレーションの全ＲＮＡ単離システム）又はＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）（プロメガコーポレーションのｍＲＮＡ単離システム）を用いて得られるＲＮＡである。好ましい態様において、上記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の混合物を含むｍＲＮＡサンプルである。ＲＮａｓｅ  Ｈを使用するか又は他の核酸種にわたりＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを選択的に結合する他の蛋白質を使用する場合、他の種類の核酸からｍＲＮＡを単離するためにサンプルを前処理する必要性が減るが、もっとも感度の良いアッセイにはなお好ましい。
【００４６】
ＤＮＡプローブをＲＮＡサンプルと共にハイブリダイゼーションを許容する条件下で接触させることは、ＤＮＡプローブと十分に相補なＲＮＡの間の二重鎖ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを可能にする。ＤＮＡが固相支持体に結合するとき、ＲＮＡサンプルの非ハイブリダイズ部分は、好ましくは洗い流し、支持体に結合してＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成させる。好ましい態様においては、ＤＮＡチップをｍＲＮＡサンプルに暴露し、相補配列がどこで可能であってもＤＮＡチップにｍＲＮＡを結合させることを許容す。次に、チップを洗浄して、本発明によるＲＮａｓｅ  Ｈ法を用いて結合をアッセイする。
【００４７】
固相支持体を分析することにより、ＲＮａｓｅ  Ｈの使用により、好ましくは「本明細書に記載の修飾ＲＮａｓｅ  Ｈにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの存在を決定する。好ましい態様において、上記ＲＮａｓｅ  Ｈは上記のとおりに標識される。ＲＮａｓｅ  Ｈが導入されて、固相支持体上でＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子へ結合することが許容される。未結合の物質は、次に、洗い流されて、アッセイされる物質が残される。
【００４８】
いくつかの態様において、このｍＲＮＡ検出方法は、特定のｍＲＮＡ種がどの程度オリジナルの不均質集団中に存在したかの定量的な読みを提供する。
別の意図された検出方法は、表面プラズモン共鳴イメージング（ＳＰＩＲ）を用いる。Ｎｅｌｓｏｎ，ＢＰらの、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｏｎｔｏ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３（１）：１−７（２００１年１月１日）を参照。ＳＰＩＲは、ＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質のためのリポーター分子又は標識についての要求を排除する。
【００４９】
ＳＰＩＲ検出方法の感度を改善するためには、ＲＮａｓｅ  Ｈに特異的な抗体を、ＲＮａｓｅ  Ｈと結合したＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの複合体を含む表面に結合させることができる。感度に関するさらなる改善は、固体ナノ粒子、例えば金に結合させたＲＮａｓｅ  Ｈの特異的抗体を用いて達成することができる。
【００５０】
均質特異的ＲＮＡアッセイ
本発明は、任意の定量データと共に、均質アッセイにおいて特定のＲＮＡ（ほとんどおそらくはｍＲＮＡ）の検出を意図する。発明のこの側面の態様は、図２に示される。好ましい態様において、二重−成分（dual-component）シグナル、例えば蛍光減衰を用いることにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中においてプローブＤＮＡと複合した所望のＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｈへの結合を監視する。
【００５１】
核酸に結合させたクエンチャー分子がＲＮａｓｅ  Ｈ上の蛍光タグをマスクする様式にて、ＲＮａｓｅ  Ｈが二重鎖核酸分子に結合した。クエンチャー分子がＲＮａｓｅ  Ｈに結合し、そして核酸が蛍光分子に結合することも意図される。蛍光／クエンチャー分子対は当業界においてよく知られており、蛍光を発するか及び／又は減衰する分子を用いた蛋白質及び核酸の修飾方法のようにである。
【００５２】
この態様においては、修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを用いるのが好ましい。クエンチャー分子を伴う核酸以外のＲＮａｓｅ  Ｈの標的不在下では、結合した蛋白質が未結合の物質との平衡下で、結合した分子に都合の良い平衡を保ち、そして蛍光が大きく減衰する。これは、特定のＲＮＡを検出するためのアッセイの開始地点である。好ましくは、アッセイされるサンプルＲＮＡとのチャレンジングの前に、ＲＮａｓｅ  Ｈに結合した核酸分子が選択されるが、ＲＮａｓｅ  Ｈが個々の核酸分子成分の何れか（ＲＮＡサンプル又はｓｓＤＮＡプローブ）に対するよりもそれを貪欲に結合するように、且つＲＮａｓｅ  Ｈが標的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド複合体（ｓｓＤＮＡプローブを用いてアッセイされるＲＮＡから形成される）よりもそれを低い貪欲さで結合するようにである。
【００５３】
所望の特定のＲＮＡを含んでよい過剰のＲＮＡ抽出物を、特定の標的ＲＮＡにハイブリダイズできる適当なＤＮＡプローブと共に、（好ましくは修飾された）ＲＮａｓｅ  Ｈに加える。特定の標的ＲＮＡがプローブＤＮＡと二重鎖を形成したら、ＲＮａｓｅ  Ｈは、結合する追加の非減衰標的を有し、そしてＲＮａｓｅ  Ｈ結合平衡は減衰物質からシフトして離れ、それによりより多数の蛍光が検出される。この方法は、単一チューブ（均質）アッセイにおいて特定のＲＮＡ種が（定量的又は定性的に）測定されることを可能にする。
【００５４】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の使用は、本発明のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド検出方法において意図される。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合するいくつかのクラスの酵素が存在する。これらは、ポリメラーゼ、逆転写酵素及びヌクレアーゼを含む。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを特異的に結合するかもしれない抗体は、本発明に関して意図されない。
【００５５】
ポリメラーゼである、意図されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の例は、ＲＮＡポリメラーゼを含む。さらに、いくつかの逆転写酵素、典型的にはＲＮＡウイルス、例えばＨＩＶに随伴しており、ＲＮＡからＤＮＡを生成するが、ポリメラーゼドメインとＲＮａｓｅ  Ｈドメインを有する。上記ＲＮＡに相補なＤＮＡ第１鎖が作成された後に、ＲＮａｓｅ  Ｈドメインが当該ＲＮＡを除去することにより、第２ＤＮＡ鎖がその場所に作成できる。本質的にＲＮＡ：ＤＮＡ結合のみを有して、ＲＮＡ合成活性又は分解活性を有さないポリペプチドは、本発明のいくつかの態様において好ましい。
【００５６】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合する酵素のポリメラーゼ活性及びヌクレアーゼ活性は、有効なポリメラーゼ／ヌクレアーゼ生化学活性に必要な金属イオン共因子、例えばマグネシウムイオンの省略により最小化できる。即ち、蛋白質の配列の修飾なしに、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の制御のみを通して、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の生化学活性を、本発明のいくつかの態様において好ましい様式にて、変更できる。例えば、逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、マグネシウムイオンの存在を正確に避けることにより、本発明のプロセスにて、より有用なものを作成することが意図される。マグネシウムイオンなしに、逆転写酵素のヌクレオチド分解活性が顕著に減じられる。
【００５７】
ポリメラーゼ又はヌクレアーゼの生化学活性は、アミノ酸配列の修飾を通して修飾することができる。例えば、ポリメラーゼ活性に必要であるがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合には必要でないことが当業界において公知の特定の残基を変更できる。
【００５８】
発明のいくつかの態様に有益な意図された修飾の種類は、精製を促進させるためにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質をタグに連結することを含む。そのような修飾は、蛋白質精製の分野においてよく知られており、本発明における使用のためのＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質に関して意図されるが、本発明者らによれば、発明に対する中心となるとは考えられていない。よく知られた例として、いくつかの蛋白質精製カラムはビオチンとストレプトアビジンの強固な結合を利用する。適切な修飾が蛋白質中になされることにより、迅速な精製のためにそれを特異的にカラムに接着させる。別のよく知られた例は、カラムへの特異的結合のためのヒスチジンストレッチの融合である。
【００５９】
本発明のいくつかの態様に有益な、別の種類の意図された修飾は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質の検出を促進するための、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質のリポーター分子（例えば、蛍光タグ）への結合を含む。
【００６０】
ＲＮａｓｅ  Ｈ及び修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ
ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素は、発明のいくつかの態様においてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質としての使用のために意図される。本発明のいくつかの好ましい態様においては、ＲＮａｓｅ  Ｈの生化学活性を修飾する。
【００６１】
いくつかの態様においては、意図された修飾ＲＮａｓｅ  Ｈが低下したヌクレアーゼ活性を有する。ＲＮＡの検出のための本発明のいくつかの態様においては、ヌクレアーゼ活性が核酸を分解することにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中で検出され得る。上でＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を呈するポリメラーゼ及びヌクレアーゼを用いた一般ケースにおいて論じられたとおり、例えばマグネシウムイオンの省略のような、条件の修飾は、ＲＮａｓｅ  Ｈのヌクレアーゼ活性を低下させる。以下に論じられるおとり、アミノ酸配列の修飾は、ヌクレオチド分解活性を低下させることもできる。ヌクレオチド分解活性を核酸結合活性の修飾と組み合わせたいくつかの態様が意図される。
【００６２】
天然のＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに加えて、他の種類の核酸に結合するが、親和性は異なる（ＲＮＡ：ＤＮＡ＞ｓｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡ＞ｄｓＤＮＡ＞ｄｓＲＮＡ）。多数の応用のために、他の種類の核酸を超えたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの結合が増強されるならば好ましい。従って、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと他の種類の核酸の間を識別するＲＮａｓｅ  Ｈの能力の改善に関して余地がある。
【００６３】
本発明の方法は、公知のＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する蛋白質を用いて実施してよい。ＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、相補なＤＮＡ一本鎖にハイブリダイズした一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡへの結合、及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分の分解を含む。インビボにおいては、ＲＮａｓｅ  ＨがＤＮＡの複製及び組換えにおいて役割を担い、そして他の機能も有するかもしれない。インビトロにおいては、ＲＮａｓｅ  Ｈは、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡに結合することが知られているが、それが混合されたＲＮＡ：ＤＮＡ核酸ハイブリッドに結合するよりもはるかに低い親和性である。
【００６４】
ＲＮａｓｅ  Ｈを用いた本発明の方法は、単に厳密に配列番号：１から配列番号：５までを有するポリペプチドのみならず、あらゆるＲＮａｓｅ  Ｈを用いて有用である。最小限の要求は、ＲＮａｓｅ  ＨがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を有することである。即ち、例えば、配列番号：１から配列番号：５までの異なる生物配列を有する、熱安定性（例えば、合衆国特許第５，２６８，２８９号、及び第５，５００，３７０号を参照）及びヒトＲＮａｓｅ  Ｈ酵素（例えば合衆国特許第６，３７６，６６１号を参照）が、本発明の方法における使用、及び本発明の方法を実施するための試薬又はキット又は製品のためにも意図される。
【００６５】
いくつかの好ましい態様においては、本明細書において記載された修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素、又はそのバリアントを用いる。アミノ酸配列の「バリアント」は、内部付加、内部欠失、保存的及び非保存的アミノ酸交換を含み、そしてＲＮａｓｅ  ＨのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合活性を有するポリペプチドをコードする。天然に生じるアミノ酸残基の非天然に生じる類似体、特にマーカーによる置換も、特に意図される。他のポリペプチド、残基、マーカー、精製タグ又は酵素ドメインの何れかの末端における融合も意図される。
【００６６】
本発明の方法及び組成物における使用のために、２種類の生物活性修飾をもっとも好ましいＲＮａｓｅ  Ｈ（配列番号：５）と組み合わせた。（ｉ）ＤＮＡ分解（ヌクレオチド分解）活性の排除及び（ｉｉ）ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドへの結合の増強が存在する。結合における改善は、他の形態の核酸（ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）への結合に比較して、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関しての親和性の増加及び識別の両方を組み合わせる。
【００６７】
修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に関して特に意図されたのは、配列番号：１から配列番号：５までを最適にアラインさせた時に、添付の生物配列表及び図４にも示されるとおり、（ｉ）１３４位に対応するアミノ酸残基がアラニン残基（Ａ又はＡｌａ）であり、（ｉｉ）９４位に対応する残基が好ましくはグリシン残基（Ｇ又はＧｌｙ）であるか、アスパラギン酸（Ｅ又はＧｌｕ）又はグルタミン酸（Ｄ又はＡｓｐ）は好ましさが劣り、そして（ｉｉｉ）少なくとも２つ、好ましくは５つ、もっとも好ましくは全ての残基が以下に列挙されたとおりであり、
【００６８】
【表１】
2006510371.tif 000002
【００６９】
但し、いくつかの好ましい態様において、上記配列は残基１０９から１１７の６つの変化のうちの少なくとも４つを有し；いくつかの好ましい態様において、当該配列は残基１３９から１５５の９つの変化のうちの少なくとも５つを含む。
【００７０】
「保存的アミノ酸交換」なる表現は、変化が極性又は電荷に変化を導かず、そして好ましくは極性又は電荷に変化が無くてサイズにほとんど又は全く変化をもたらさない、別のアミノ酸残基へのアミノ酸残基の交換に関する。保存的アミノ酸交換の例は、非極性アミノ酸残基の非極性アミノ酸残基への交換である。
【００７１】
互いに関連するポリペプチド分子の相同性は、公知の方法の助けにより決定することができる。規則として、特定の要求を参酌する、アルゴリズムを伴う特定のコンピュータープログラムを用いる。相同性の決定のための好ましい方法は、分析された配列間のもっとも大きな一致を最初に生じる。２つの配列間の相同性の決定のためのコンピュータープログラムは、限定ではないが、ＧＣＧプログラムパッケージを含み、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１２）：３８７１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，（ＷＩ））；ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３／４１０）１９９０））を含む。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも相同性を決定するために使用することができる。開示されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を製造するために有用な核酸も意図される。そのような核酸配列（ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、構築物及びＲＮＡ）は、発現及び翻訳に際して、本明細書にて列挙された機能特性を有するポリペプチド配列を提供する。当業者は、ルーチンの手法及び公知の方法及びコドン使用頻度を通して、本明細書にて開示されたアミノ酸配列として有用な核酸配列を用意することができる。適切な宿主細胞中でのクローン化及び組換え発現は、当業界公知の方法と材料を用いて達成される。
【００７２】
開示されたＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質をコードする核酸配列を含む構築物が意図される。構築物は、好ましくは、発現に適しており、そして意図された核酸の発現を制御するプロモーターを含む。プロモーターの選択は、ルーチンな事柄の選択であり、典型的には、発現のために使用される発現系に依存する。構成的なプロモーター又は誘導可能なプロモーター（例えば、メタロチオネイン）が典型的である。制御領域を含むベクターも適しており、例えば、バクテリオファージ、ラムダ誘導体、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０ウイルス、及びレトロウイルスを含む。多数の原核及び真核発現系が当業界公知である。典型的な宿主細胞は、原核細胞、例えば、酵母、植物、昆虫細胞、及び哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ，ＣＯＳ，ヒーラ細胞）を含む。また、意図されるのは、所望の蛋白質を発現するトランスジェニック植物又は植物細胞培養である。そのような発現のための方法及び材料は当業界公知であり、所望のＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質の発現のための系を選択して採用することはルーチンな事柄の手法である。
【００７３】
また意図されるのは、そのエクソン配列が意図されたポリペプチドを提供する核酸配列である。用語「エクソン配列」は、イントロン配列により中断される真核遺伝子配列又はＲＮＡ転写物中の相当する配列の何れかを意味する。エクソン配列及び非コードイントロン配列は一緒に転写され；イントロン転写物はのちに欠失されることにより、機能性ＲＮＡを得る。
【００７４】
ＤＮＡ配列の例は、付随の生物配列表に提供され、その開示は引用により本明細書に編入される。配列番号：４及び配列番号：５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするエシェリヒアコリ内の発現及び翻訳のために修飾されたＤＮＡ配列は、配列番号：６及び配列番号：７として提供される。また意図されるのは、反対の鎖の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、及び、遺伝子コードを基にした、配列番号：６及び７の配列に対して縮重した核酸配列である。
【００７５】
さらに意図されるのは、開示された機能性ＲＮａｓｅ  Ｈ酵素又は誘導体酵素を含むＲＮａｓｅ  Ｈ融合蛋白質である。典型例は、蛋白質を提供するため、又はＲＮａｓｅ  ＨのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合アッセイを探索するアッセイのために助けとなる、マーカー、精製用ポリペプチド又はリンカーポリペプチドとの融合である。
【００７６】
開示されたＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質の製造のための手法を開発するために、蛋白質の製造のための当業界公知の手法を適合させることは、ルーチンな手法の事柄である。好ましくは、開示されたＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質をコードする核酸分子又は構築物が適切な宿主細胞中で発現されて、蛋白質が慣用のプロセスの使用を通して宿主細胞又は培地から単離される。
【００７７】
実施例１．特定のＲＮＡの検出
発明のこの実施例は、ＤＮＡチップ上の特定のＲＮＡの検出及び定量のための態様において、図１に例示される。
【００７８】
ＤＮＡチップは公知の位置に規定された配列のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをその上に固定して有するものが用意される。チップ上でＲＮＡと相補なＤＮＡ分子の間で二重鎖形成（ハイブリダイゼーション）を生じさせるようにするため、ＤＮＡチップを、不均質ｍＲＮＡ集団を有するｍＲＮＡの試験サンプル調製物に接触させる。未結合のｍＲＮＡは洗い流す。
【００７９】
ルシフェラーゼに結合させた修飾ＲＮａｓｅ  Ｈを用意する。修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを導入して、ＤＮＡチップ上でＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子に結合させるようにする。未結合の物質を次に洗い流し、そして残りの物質をルシフェリン／ＡＴＰ系を用いてアッセイした。光の出力をルミノメーターで読むことにより、ＤＮＡチップの規定された領域各々に結合したＲＮａｓｅ  Ｈ量を測定する。光の出力の強度の増加は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合した、大量の標識された修飾ＲＮａｓｅ  Ｈが存在するところに生じる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが存在しないなら、ＲＮａｓｅ  Ｈはこの位置に結合しないのが当然であり；よって、ルシフェラーゼ／ルシフェリン反応からの光の出力が最小である。
【００８０】
光の出力を公知量の標識された修飾ＲＮａｓｅ  Ｈの標準曲線と比較することにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの量に関して、即ち、どれほどのハイブリダイズするｍＲＮＡ種がＲＮＡサンプル中に存在するかについての定量データを提供する。
【００８１】
実施例２．均質ｍＲＮＡアッセイ
この実施例は、均質アッセイ中のｍＲＮＡの検出及び／又は定量を示す。天然ＲＮａｓｅ  Ｈに比較して増強されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合特性を有して、低下した核酸分解特性を有する修飾ＲＮａｓｅ  Ｈを用意する。結合した核酸に結合したクエンチャー分子がＲＮａｓｅ  Ｈ上の蛍光タグをマスクするように、修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを二重鎖核酸分子に結合させる。クエンチャー分子を伴う核酸以外のＲＮａｓｅ  Ｈの標的の不在下では、結合した蛋白質が未結合の物質と平衡であり、そして平衡は結合した分子を好み、そうして蛍光が大きく減衰する。これは、特定のｍＲＮＡを検出するためのアッセイの出発点である。
【００８２】
所望の特定のｍＲＮＡを含むかもしれない過剰のｍＲＮＡ抽出物を、特定のｍＲＮＡメッセージを標的とするためにハイブリダイズすることができる適切なＤＮＡプローブと共に、減衰した修飾ＲＮａｓｅ  Ｈに加える。特定の標的ｍＲＮＡがプローブＤＮＡと二重鎖形成したなら、ＲＮａｓｅ  Ｈは、今、結合すべき追加の非減衰標的を有し、そしてＲＮａｓｅ  Ｈ結合の平衡が減衰物質からシフトして離れ、そしてより多くのＲＮａｓｅ  Ｈが蛍光を発することを許容する。この様式においては、特定のＲＮＡ種の量を単一のチューブ（均質）アッセイにて測定する。
【００８３】
実施例３．ＲＮＡメッセージのファミリーの検出
ＲＮＡのファミリーへの応用のため、ＤＮＡプローブは、ＲＮＡファミリー内のバリエーションが相同の領域の外にあるようにＲＮＡファミリーへのプローブ結合の長さを通して相補な塩基対相同性を有するのが好ましい。
【００８４】
この実施例は、図３に記載された特定のｍＲＮＡ捕捉を利用したＲＮＡ検出方法を示す。そのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合能力を増強するように修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ分子を固相支持体上に固定する。ｍＲＮＡサンプルを一つ又は複数のＤＮＡプローブと混合して、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成させるようにする。ＤＮＡプローブを標識する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含む溶液を、次に、固相支持体に結合したＲＮａｓｅ  Ｈに接触させる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅ  Ｈに結合して、それにより、固相支持体上に残り、一方分析物の未結合部分は洗い流される。
【００８５】
固定されたＲＮａｓｅ  Ｈは不均質ｍＲＮＡプールから特定のメッセージ又はメッセージファミリーを分離するための、特定ＲＮＡ捕捉系を提供する。特定のＲＮＡメッセージ又はメッセージファミリーはＤＮＡプローブに結合し、そして修飾されたＲＮａｓｅ  ＨがＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合する。
【００８６】
実施例４．修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ
この実施例は、異なるアミノ酸配列を有する様々なＲＮａｓｅ  Ｈ酵素の生化学活性を比較することにより、記載されたアミノ酸配列の活性に影響する配列変化及び意図されたバリエーションのための重要な領域に焦点を合わせる。
【００８７】
野生型のＲＮａｓｅ  Ｈに加えて、野生型に比較してＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド親和性を約２倍に増加させながらＲＮＡ分解活性を約１０００倍に低下させるＲＮａｓｅ  Ｈ配列の変異が、数年の間に当業界にて公知となった（公表されたデータ）。図４は、野生型のＲＮａｓｅ  Ｈ酵素配列（配列番号：１）とこのヌクレアーゼ欠損単離物（配列番号：２）のアラインメントを示す。配列番号：２の蛋白質は、増強されたＲＮＡ：ＤＮＡ結合親和性及び選択性に関しての変異及び反復の選択のための基質として機能した。２つの独立の変異導入プロトコルを用いることにより、変異ＲＮａｓｅ  Ｈの２つのプールを生じさせた。一つのセットでは、配列番号：２をコードする遺伝子をランダム点変異導入法に供した。第２のプロトコルでは、配列番号：２をコードする遺伝子［エシェリヒアコリｒｎｈ１（Ｄ１３４Ａ）］を、２つの他の相同なＲＮａｓｅ  Ｈ１遺伝子、エルシニアペスティスｒｎｈ１（Ｄ１３４Ａ）、クレブシエラニューモニエｒｎｈ１（Ｄ１３４Ａ）とのランダムインビトロ組換えに供して、キメラＲＮａｓｅ  Ｈ１遺伝子を創製した。
【００８８】
２つのプールを別個に、競合性反復選択プロセスに供することにより、改善されたハイブリッド結合特性を伴う単離物に関して豊富にした。選択的に選択された蛋白質の生化学特性が各プールから「最良」の蛋白質を同定した（以下で論じられる特性）。各々からの「最良」の候補の配列、配列番号：３及び４を示す。配列番号：３と配列番号：４は、共に、配列番号：２のオリジナルのＤ１３４Ａ点変異を保持しており、ｓｓＤＮＡ，ｓｓＲＮＡ，ＤＮＡ：ＤＮＡ及びＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド結合活性に対して増強されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド親和性及び選択性を有することがわかった。
【００８９】
本発明者らは、両方の「良好な」ＲＮａｓｅ  Ｈ単離物の、一つの「最良中の最良の」蛋白質への特性を合同化することができた（配列番号：５）。配列番号：３の９４位からの単一のグリシンのポイント変化の配列番号：４の蛋白質内の同じ位置への導入により、本発明者らは本発明の修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を創製した。
【００９０】
当業界でよく知られた標準の手法を用いて個々に選択されて変異を合同させて、エシェリヒアコリに移されるために、蛋白質発現構築物が作成された。選択における親分子として作用した野生型ＲＮａｓｅ  Ｈのヌクレアーゼ−欠損Ｄ１３４Ａ変異体に平行して、上記蛋白質を精製して、次に特性決定した。
【００９１】
図５は、蛋白質：核酸親和性の定量性測定のための当業界でよく知られた手法である、ニトロセルロースフィルター結合実験においてアッセイされる様々なＲＮａｓｅ  Ｈ酵素アッセイのためのＲＮＡ：ＤＮＡ結合親和性の観察された増加を示す。当該実験において、示されたＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質の連続希釈を、以下の配列の放射線標識されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドと共に、１Ｘ  ＦＢバッファー［１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ；５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０］中で個別にインキュベートした。
【００９２】
ＲＮＡ：ＤＮＡ＃１
配列番号：６  5’-GGACCGGAAAGGUACGAGCAUGUGA-3’（ＲＮＡ）
配列番号：７  3’-CCTGGCCTTTCCATGCTCGTACACT-5’（ＤＮＡ）
（ハイブリッドＲＮＡ：ＤＮＡ＃１のＤＮＡ鎖は実験のためにラジオヌクリド３２Ｐにより一方の末端のみ標識された。）
【００９３】
２５℃において３０分間インキュベート後に、５０μｌの反応物を素早くバッファー平衡化ニトロセルロースに通して濾過し、そして２回、５００μｌの洗浄バッファー［１０％グリセロール。５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０］で洗浄した。蛋白質はニトロセルロースに結合するが、二重鎖の核酸はしない；よって、フィルター上の放射活性は直接に蛋白質結合核酸を反映する。各フィルターにより保持されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの量を、チェレンコフカウンティングにより湿ったフィルターから直接定量した。各蛋白質を３重に試験して、結果を平均した。全投入量放射活性を測定するための対照フィルターを用いることにより、結合した全投入量ハイブリッドのパーセントを計算した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びデンシトメトリーは、蛋白質の濃度を再確認した。
【００９４】
反応物中のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドはｐＭ濃度にて存在し、相互作用のＫＤをはるかに下回った。従って、半数が飽和するのに必要な蛋白質濃度は結合定数に等しい。この事実を用いて、図５に示した（及び以下のセクションにおいて表にされた）データは、このＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関する各々の蛋白質の絶対的親和性及び相対的親和性の両方を証明する。当該データは、それぞれ黒三角及び白四角により表された配列番号：３及び４の、選択された変異体が、白丸の親の配列番号：２に比較して、このＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関して、より高い親和性を表すことを示す。類似のデータは、選択された候補のプールから、本明細書で配列番号：３及び４と呼ばれる最良の候補蛋白質を独自に同定した。さらに、「合同化された（combined）」変異体、配列番号：５（黒星印）は、「成分」蛋白質の何れかよりわずかに高い親和性をもって、ＲＮＡ；ＤＮＡハイブリッドに結合する。
【００９５】
図６は、前段落において記載されたニトロセルロースフィルター結合実験の標準バリエーションである、平衡競合実験において試験されたところによると、大過剰のコンペティター核酸の存在下で、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを選択的に場所を見つけて結合する、別のＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質の能力を証明する。当該実験においては、標識されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを、一本鎖ＤＮＡである新たに熱変性して専断されたサケ精子ＤＮＡの連続希釈と混合した。前の実験は、最大の感度のための条件を同定した。ｓｓＤＮＡ，ｄｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡの何れかによる競合は、ｓｓＤＮＡが、ＲＮａｓｅ  ＨへのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの結合に関しての、もっとも有効な核酸コンペティターであることを証明した。ＲＮａｓｅ  ＨをそのＲＮＡ：ＤＮＡ親和性に平衡な最終濃度に加えたところ、投入量のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの約４０％の結合をもたらした（上に示すとおり１／２最大飽和）。各ｓｓＤＮＡ濃度は二重に試験した。２５℃において３０分間インキュベート後に、反応物を加工し、放射活性を定量し、そしてサンプルを平均化し、上に示すとおりであった。
【００９６】
半数飽和の条件下で、反応物は、コンペティター分子による阻害に対して最大の感度である。添加したコンペティター核酸を含まない対照反応物を用いることにより、半数飽和の条件が各蛋白質／ハイブリッド化合物に合致したことを判定し、且つ最終データを最終分析において１００％に標準化した。
【００９７】
この実施例の結果は、図６においてグラフ化して、以下において表にした（ｓｓＤＮＡに関してのＩＣ５０）。当該ＩＣ５０は、ｓｓＤＮＡに関するＲＮａｓｅ  ＨのＫＤに等しく、逆に、ｓｓＤＮＡに関するＲＮａｓｅ  Ｈ変異体の親和性を反映する。データは、個々の選択された変異体、配列番号：３及び４（それぞれ、黒三角及び白四角により表される）がｓｓＤＮＡに関して低下した親和性を有したことを示す。配列番号：５におけるように、変異体を合わせると、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド選択性におけるさらなる増加をもたらす（黒星印により表されるデータ）。
【００９８】
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド配列選択性において観察された増加は一般的な現象であり、分析された特定の核酸配列の人工物ではなかったことを確認するために、ＲＮＡ：ＤＮＡ＃１以外の異なる配列の２つの追加のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを、平行フィルター結合及び平衡競合デモンストレーションにおいて上で詳細に説明したとおりに比較した。オリジナル及び別のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの配列を示す。
【００９９】
ＲＮＡ：ＤＮＡ＃１
配列番号：６    5’-GGACCGGAAAGGUACGAGCAUGUGA-3’（ＲＮＡ）
配列番号：７    3’-CCTGGCCTTTCCATGCTCGTACACT-5’（ＤＮＡ）
ＲＮＡ：ＤＮＡ＃２
配列番号：８    5’-GGCGAACAGGACUGCGUAUGAUAGG-3’（ＲＮＡ）
配列番号：９    3’-CCGCTTGTCCTGACGCATACTATCC-5’（ＤＮＡ）
ＲＮＡ：ＤＮＡ＃３
配列番号：１０  5’-AGUUCGACGAGCAUGGAGAGGUCAG-3’（ＲＮＡ）
配列番号：１１  3’-TCAAGCTGCTCGTACCTCTCCAGTC-5’（ＤＮＡ）
これらの追加の実験の結果は、図５及び図６に描写したものに対して類似の結果を生じた。
【０１００】
全２４の個別の滴定曲線からの臨界値を以下において表にした。前の段落で詳細に説明したとおり、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関するＫＤ値は、ニトロセルロースフィルター結合データに由来し、示されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの半分を超える結合を達成する、反応中のＲＮａｓｅ  Ｈの最終濃度をｎＭ  ＲＮａｓｅ  Ｈとして記録した。平衡競合アッセイにより生じた、ｓｓＤＮＡに関するＩＣ５０は、競合反応に存在するμＭ  ｓｓＤＮＡとして記録する。
【０１０１】
【表２】
2006510371.tif 000003
【０１０２】
試験された全部で３つのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド配列に関して、ＲＮＡ：ＤＮＡ
とｓｓＤＮＡの親和性の相対的傾向は、投入したハイブリッドの配列に拘わらず、保持される。配列番号：３と４のＲＮａｓｅ  Ｈは、配列番号：２のＲＮａｓｅ  Ｈよりも、ｓｓＤＮＡに関して主として高いＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合選択性を有した。配列番号：５を有するＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに関して高い親和性と、配列番号：２、３又は４よりも低い程度のｓｓＤＮＡによる競合を呈する。ＲＮａｓｅ  ＨのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合特性における観察された改善は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列とは無関係に、ＲＮＡ：ＤＮＡ配列結合の増強された選択性が通常の現象であって、本明細書に記載された変異に関して配列依存性ではないことを証明する。
【０１０３】
ＲＮａｓｅ  Ｈ改善の程度を定量するために、我々は、ＲＮＡ：ＤＮＡ解離定数（ＫＤ）によりｓｓＤＮＡに関する親和性（ＩＣ５０）を割ることにより、各個々のＲＮａｓｅ  Ｈに関する「ハイブリッド選択性」を定義するように選択した。各ハイブリッド配列に関する値を、次に、配列番号：２の蛋白質に関して計算された「ハイブリッド選択性」に対して標準化した。配列番号：２、３、４、及び５のＲＮａｓｅ  Ｈに関する標準化された値を以下に表にする。
【０１０４】
【表３】
2006510371.tif 000004
【０１０５】
配列番号：３及び配列番号：４のＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド選択性において、それぞれ６倍及び１２倍の増強を呈する。配列番号：５を有するＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質のＲＮＡ：ＤＮＡ結合特性は、ほぼ２桁の規模で、本明細書に開示されたグループのはるか最上に増強される。
【０１０６】
このデータは、配列番号３及び配列番号：４が増強された選択性の自律機構を具体化することも証明する。当該機構が異なるのなら、６倍の増加及び１２倍の増加を組み合わせて、選択性における約７２倍の改善を創製するべきである。配列番号：５に関しての選択性において約９０倍の増加の独立した実験測定は、配列番号：３及び４の独立したアミノ酸の変化の組み合わせが増強された選択性の別々の機構を達成することを確証する。追加の特性が試験された全てのハイブリッドに関して別個に観察されたという事実は、上記の機構がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの螺旋構造に一般的であるらしいということを再確認させる。
【０１０７】
この実施例は、本発明の好ましいＲＮａｓｅ  Ｈ配列が、配列番号：１から配列番号：５の９４位のＧ又は配列番号：１から配列番号：５の１３４位に相当する位置におけるＡに相当する変異を有することを示す。特に好ましいＲＮａｓｅ  Ｈ配列は、Ｇ９４又はＡ１３４及び以下の変異（配列番号：１に関して）：Ａ→Ｌ１０９，Ｌ→Ｉ１１１，Ｇ→Ｑ１１２，Ｑ→Ｓ１１３，Ｑ→Ｔ１１５，Ｋ→Ｑ１１７，Ａ→Ｑ１３９，Ａ→Ｇ１４０，Ｍ→Ｎ１４２，Ｎ→Ｓ１４３，Ｅ→Ｄ１４７，Ｔ→Ｖ１４９，Ｑ→Ｌ１５２，Ｖ→Ｐ１５３，及びＶ→Ｓ１５５の少なくとも一つを有する。好ましい配列を有するＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質は、ｓｓＤＮＡに関してのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを結合することにおいて増加した識別力を呈し、且つ改善されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合親和性を呈する。
【０１０８】
実施例５．固相支持体上でのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの
ＲＮａｓｅ  Ｈを媒介した検出
図１に描写された、固相支持体上でのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮａｓｅ  Ｈを媒介した検出の実行可能性を、図７Ａ及びＢに例示する。データの解釈は、用いられた方法の説明を必要とする。
【０１０９】
当該実施例は、検出系、放射線標識されたＲＮａｓｅ  Ｈ、及び基質、荷電したナイロン膜に繋がれたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの個別の製造を必要とした。各々の製造及び使用を以下の段落に詳細に説明する。
【０１１０】
検出のためにＲＮａｓｅ  Ｈを適合させるため、以下のＤＮＡ配列をＲＮａｓｅ  Ｈ（配列番号：５）遺伝子の５’末端において挿入した：
【０１１１】
【化１】
2006510371.tif 000005
【０１１２】
エシェリヒアコリ内のこの修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈ遺伝子の発現は、ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）ビオチン化及びｃＡｍｐ−依存性蛋白質キナーゼ（ＰＫＡ）リン酸化による翻訳後修飾のためのペプチドモチーフを、ＲＮａｓｅ  Ｈの配列番号：５のＮ末端へ融合させる。ビオチン付加（５０μＭ）培地中でのエピトープ内のＢｉｒＡ同時発現は、示されたリジンにおいて一カ所ビオチン化された（＞９５％）ＲＮａｓｅ  Ｈを生成する。さらに、精製された蛋白質は［γ３３Ｐ］ＡＴＰ存在下において蛋白質キナーゼＡによりインビトロにおいてリン酸化され得る。これらの翻訳後修飾は、ＰＫＡにより導入された放射線標識を通して直接か又は標識されたアビジン／ストレプトアビジン配合体により間接に、ＲＮａｓｅ  Ｈの検出を促進させる。
【０１１３】
この実施例に関しては、ビオチン化されたＲＮａｓｅ  Ｈを［γ３３Ｐ］ＡＴＰ存在下においてＰＫＡで標識した。標準の２０μｌ標識反応は、５０μＭのＲＮａｓｅ  Ｈ１，１００μＭのＡＴＰ，１００μＣｉの［γ３３Ｐ］ＡＴＰ，及び１Ｘ  ＰＫＡバッファー［１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５］中の１００Ｕの蛋白質キナーゼＡ［１Ｕ＝３０℃においてＫＥＭＰＴＩＤＥ（登録商標）（配列ＬＲＲＡＳＬＧを有するＳ６キナーゼ基質）に１分あたりに１ｎｍｏｌ  ＰＯ４が転移される］を用いた。３０℃において４時間後に、反応は本質的に完了し、３０μｌのストップミックス［０．８４ｍＭ  ＥＤＴＡ；１．７ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ］の添加によりさらなる標識を減衰させる。未反応の［γ３３Ｐ］ＡＴＰ及びバッファー塩は、１Ｘ  ＨＢＳ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０（ＤＥＰＣ処理された）］により平衡化された２つの連続するゲル濾過カラム（１０ｋＤａ排除）を通過させることにより除去した。カラムにより精製された３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  Ｈを、安定化及び保存のために、等しい量の１００％グリセロールと混合した。以下の実験の各々に関しては、残りの３３Ｐ−ＡＴＰの厳密な除去が、非特異的バックグラウンドを低下させ、そして検出された放射活性が結合したＲＮａｓｅ  Ｈの量を直接反映することを保証する。
【０１１４】
最終分析におけるハイブリダイゼーション効率の曖昧さを排除するために、予め形成されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにより基底膜を調製した。ホモポリマー核酸ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）を紫外線吸収により定量した。等モル量を混合し、熱変性し、そして１Ｘ  ＨＢＳバックグラウンド中でアニールした。連続希釈のポリ（ｒＡ：ｄＴ）ハイブリッドをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ電荷ナイロン膜上に直接スポットした。当該膜は、２Ｘ  ＳＳＣ［０．３Ｍ  ＮａＣｌ；０．０３Ｍ  Ｎａ３クエン酸；ｐＨ７．０］中で湿潤させた。１２μＪの紫外線照射により、核酸を湿った膜へ架橋結合させた。ＲＮａｓｅ  Ｈの膜への非特異的吸着を低下させるため、膜を１Ｘ  ＴＢＳ［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２０］中の１％カゼインにより１時間かけてブロックした。電荷した膜及びカゼインのブロッカーとしての選択は、ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介性検出のための最良のペアリングになるように決定した。
【０１１５】
当該実験においては、５０ｎＭの３３Ｐ−標識されたＲＮａｓｅ  Ｈ（配列番号：５）；１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ；６５ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ；２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０を含む溶液を加えて、室温において１時間インキュベートした。未結合のＲＮａｓｅ  Ｈは１Ｘ  ＴＢＳＴ［１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０；２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．２］のそれぞれ５分、１５分及び１５分間の３回の洗浄により洗い流した。洗浄された膜を保存用リンに暴露し、そして各スポットからの平均放射線シグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ８４０ホスホルイメジャーを用いて定量した。暴露時間は、ホスホルイメジャーの直線範囲内のシグナルの全範囲を保つように調製した。
【０１１６】
３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  Ｈ検出の後のナイロン膜の結果のリンイメージを図７のセクションＢに示し、そしてシグナルの定量のグラフによる表現を図７のセクションＡに示す。データは、３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  Ｈが存在するＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの量の直接の読みを可能にし；結合した３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  ＨがスポットされたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの量に比例して増加することを示す。検出の低いエンドからのデータは、１から２ｆｍｏｌの１００ｂｐのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの範囲内での検出限界を示唆する。高いＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドレベルでのシグナルのプラトーは、ＲＮａｓｅ  Ｈを含む核酸スポットの飽和による。アッセイの配置は、アッセイの直線範囲の利用性を最大にするための市販のナイロン基材のアレイにより、最大値を超える値におけるプラトーを、実行可能にさせる。
【０１１７】
実施例６．熱ショックストレス下のゲノミック発現のｍＲＮＡ分析
本発明の方法の有益な適用の例として、公表されたデータに対して比較を行った。熱ショックの結果としてのエシェリヒアコリのゲノミック発現における変化の平行分析が、Ｃ．Ｓ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｊ．Ｄ．Ｇｌａｓｎｅｒ，Ｒ．Ｍａｕ，Ｊ．Ｈｏｎｇｆａｎ  ａｎｄ  Ｆ．Ｒ．Ｂｌａｔｔｎｅｒ，”Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：３８２１−３８３５（１９９９）に開示される。
【０１１８】
その研究において、エシェリヒアコリのＭＧ１６５５の全部で４２９０の注釈を付けられたオープンリーディングフレームを、各オープンリーディングフレームに関して特異的な遺伝子長のＰＣＲ断片を、（ｉ）荷電したナイロン膜上にスポットして、次に放射活性ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションし、そして（ｉｉ）ガラスマイクロアレイ上にスポットして、次に蛍光ｃＤＮＡとハイブリダイゼーションすることにより分析した。Ｒｉｃｈｍｏｎｄらの公表データから、熱ストレスにより強くアップ制御された３つの遺伝子（ｈｓｌＵ，ｈｓｌＶ及びｉｂｐＢ）及び熱制御される遺伝子としては確認されなかった７つの遺伝子（ｐｔｓＮ，ｈｏｌＡ，ｅｎｄＡ，ｔｕｆＡ，ｄｎａＮ，ｓｐｅＢ，ｔｒｍＤ）を、この実施例の対照として選択した。熱ショック応答は、主に、転写物の合成のレベルにおいて媒介されて、発明の評価のための理想的なシステムを提供する。
【０１１９】
この実施例においては、発明の方法を用いて、３つの熱ショック遺伝子及び７つのハウスキーピング遺伝子の１０遺伝子の発現を平行に分析した。エシェリヒアコリＭＧ１６５５の培養物を生育させ、２つのサブカルチャーに分けて、そして一つのサブカルチャーをＲｉｃｈａｒｄｓｏｎらに従い熱ショック（５０℃）に供して、第２のサブカルチャーは非ストレス条件下に残した（３７℃）。全ＲＮＡを、熱した酸−フェノール抽出、続く標準のエタノール及びＬｉＣｌの沈殿により単離した。発明のＲＮａｓｅ  Ｈ試薬の高い選択性の性質のため、サンプルＲＮＡのさらなる処理は必要なかった。大規模なヌクレアーゼ処理及び再精製を含むこの追加の工程を除外することは、このよりストリンジェントなプロトコルによりルーチンにもたらされるサンプルの４０−５０％の損失を回避する。
【０１２０】
荷電したナイロン膜上の１０の遺伝子のミニアレイを用意した。各遺伝子に関して、オリゴヌクレオチド対を選択することにより、目的遺伝子に相当する約５００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅した。当該ＰＣＲ産物をエシェリヒアコリのＭＧ１６５５のゲノミックＤＮＡから増幅し、標準のプラスミドベクターにクローン化し、そして配列決定することにより、それらの正体（identity）を確認した。各遺伝子断片のためのＤＮＡプラスミドクローンが、アレイ構築のための遺伝子断片の大規模ＰＣＲ増幅のための基質として機能した。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらに詳説される手法に従い、約０．０６μｇ／ｍｌのＤＮＡを［１Ｍ  ＮａＯＨ；３０ｍＭ  ＥＤＴＡ］とそれぞれ２：１の比で混合することにより、精製されたｄｓＤＮＡのＰＣＲ産物を、アルカリ変性した。１μｌのアルカリ変性されたＰＣＲ  ＤＮＡのスポットを、次に、マニュアルによりＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓ荷電ナイロン膜の上にスポットした。全部で１０のＰＣＲ産物をスポットしたら、膜を５分間２Ｘ  ＳＳＣ  ＋  ０．２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中でインキュベートした。中和の工程の後に、１２μＪの紫外線光に暴露することにより、ＤＮＡを膜に架橋結合させた。ハイブリダイゼーションの前に、膜を１Ｘ  ＦＰＨ［５Ｘ  ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ；７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳ，０．１％  Ｆｉｃｏｌｌ；０．１％ポリビニル−ピロリドン；０．１％  ＢＳＡ（グレードＶ），５０％  ホルムアルデヒド］と４２℃において３０分間インキュベートし、そしてバッファーを捨てた。目的のＲＮＡサンプルを、１Ｘ  ＦＰＨ中で約０．４μｇ／ｍｌにて、７０℃において１５分間変性し、膜に添加し、そして４０時間４２℃においてハイブリダイズさせた。添加したＲＮＡを含まない対照を平行して実施した。膜を室温におけるストリンジェントな洗浄に供し、２回５分間２Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳにより、同じ条件したで２回０．２Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳにより行った。２Ｘ  ＳＳＣ中での早いリンスを３０分間のｓｓＲＮＡ−特異的ＲＮａｓｅ洗浄［２Ｘ  ＳＳＣ  ＋  １０Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１；１μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ］の前に行って、ハイブリダイズしなかったＲＮＡを除去した。膜をリンスし［２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ］、残りのＲＮａｓｅを除去し、そして紫外線架橋結合を前のとおりに行った。３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性の検出及びシグナル定量を前の実施例に記載されたとおりに実施した。
【０１２１】
３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  Ｈのアレイへの結合の結果を図８に示す。前のとおり、放射線シグナルは結合したＲＮａｓｅ  Ｈの存在を直接に反映する。左のパネルは投入ＲＮＡのない対照反応を示す。中のパネルは３７℃のＲＮＡサンプル由来であり、そして右のパネルは５０℃の熱ショックを受けた集団を反映する。各パネルは、同一の遺伝子がアレイ内の同一の位置にあるような向きになる。ＲＮＡを含まない対照膜への３３Ｐ−ＲＮａｓｅ  Ｈ結合に関するバックグラウンドシグナルは、ＲＮＡを含むバッファーに暴露された２つの膜に比較して、わずかに上昇した。各スポットのシグナル強度は、研究対象の遺伝子の発現の変更されたレベルを反映する。生のデータの直接の可視による比較でさえ、少なくとも３つの遺伝子の相対スポット強度が熱ショックに際して顕著に増加することを示す。
【０１２２】
定量による評価を図９において模式的に示す。提示されたデータは、以下の様式に由来する：測定されたアレイないの各スポットからの平均シグナル、差引されたＲＮＡ不含の対照からのバックグラウンドシグナル、及び、報告された３７℃のデータに比較した５０℃のデータからのシグナルの比率。各スポットからのシグナルの強度は、研究対象の遺伝子の発現の変更されたレベルを反映する。遺伝子発現における観察された変化は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらの公表された観察と相関するが、いくつかの顕著な相違を伴った。７つのハウスキーピング遺伝子に関しては、発現にほとんど変化がなかった。データセットは、ｈｓｌＵ及びｈｓｌＶのいずれかよりも高い程度にｉｂｐＢがアップ制御されるということにも一致する。この実施例で評価されたｉｂｐＢ内の変化の絶対的規模（absolute magnitude）は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらからの４００倍の値に比較して４６倍である。同様に、ｈｓｌＵとｈｓｌＶに関する実施例の値は、それぞれ１６倍及び３２倍の値に比較して、５倍及び７倍である。制御の絶対的等級を決定することに関する方法論の能力の間の矛盾は、当該方法における真の差異又は成長期における僅かな差異の蓄積された効果及び誘導された熱ショックのタイミングを反映するかもしれない。一つの側面は、方法とは無関係であるべきで；ｈｓｌＵとｈｓｌＶは同時に転写されて、集団中で等しく表現される（represented）べきである。ｈｓｌＵとｈｓｌＶの転写物の豊富さが等モルであるとの予測から、ＲＮａｓｅ  Ｈ方法は、標識されたｃＤＮＡ法より、ほぼ等モルの値を与える。
【０１２３】
実施例７．逆転写酵素を用いた特異的ｍＲＮＡ転写
発明のこの実施例は、固相支持体、例えばナイロン膜上に固定されたいくつかのＤＮＡプローブが存在するという点において、実施例１と類似である。
【０１２４】
ＤＮＡプローブを、不均質なｍＲＮＡ集団を有するｍＲＮＡの試験サンプル調製物に接触させることにより、固相表面上でＲＮＡと相補なＤＮＡプローブの間で二重鎖形成が生じることを許容させる。未結合のｍＲＮＡは洗い流す。
【０１２５】
ホースラディッシュパーオキシダーゼドメインに結合させた逆転写酵素をマグネシウム不含条件下で用意する。逆転写酵素を導入して、マグネシウム不含条件下で固相表面上でＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子を結合することを可能にする。未結合の物質は、次に、洗い流されて、残りの物質をホースラディッシュパーオキシダーゼ可視光基質アッセイを用いてアッセイする。光の投入量はスペクトロメーターで測定することにより、固相表面の規定された領域の各々に結合した逆転写酵素の量を測定する。大量のホースラディッシュパーオキシダーゼ−標識された逆転写酵素がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合して存在する場合には、増加した強度の吸収が生じる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが存在しないなら、逆転写酵素はその部位で結合すべきでなく、よって、ホースラディッシュパーオキシダーゼ反応からの光吸収は最小である。
【０１２６】
上記吸収を、ホースラディッシュパーオキシダーゼ逆転写酵素の公知量の標準曲線と比較することにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの量に関して、即ち、如何に多くのハイブリダイズするｍＲＮＡ種がＲＮＡサンプル中に存在するのかに関する定量データを提供する。
【０１２７】
前記から、多数の修飾及び変化が本発明の真の精神及び範囲を逸脱する事なくなされ得ることが観察される。提示された特定の実施例に関して限定を意図せず、あるいは推論されるべきであることが理解される。開示は請求の範囲の修飾によりカバーすることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、ＤＮＡチップ上での特定のＲＮＡ（ほとんどｍＲＮＡ）の検出及定量のための態様を例示し、以下に論じられて、実施例１においても例示される。ＤＮＡチップは、規定された位置において固定された規定された配列のｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをその上に有する。チップをｍＲＮＡ調製物に接触させると、二重鎖の形成（ハイブリダイゼーション）が、チップ上でＲＮＡと相補ＤＮＡ分子の間に起こる。未結合のＲＮＡは洗い流される。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合する蛋白質、例えば修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを、適当なリポーター又は標識に連結する。標識されたＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質を導入して、チップ上のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド分子へ結合させる。未結合の物質は、次に、洗い流されて、残った物質をアッセイする。このＲＮＡ検出方法は、様々な予め選択された特定ＲＮＡ種の各々が、どの程度オリジナルの不均質集団中に存在したのかについての定量的読みを提供する。
【図２】図２は、均質アッセイでのＲＮＡ（ほとんどｍＲＮＡ）の検出及定量のための態様を例示し、以下に論じられて、実施例２においても例示される。ＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質、例えば修飾されたＲＮａｓｅ  Ｈを、ＲＮＡ：ＤＮＡ結合蛋白質上の蛍光タグが核酸に付着させたクエンチャー分子によりマスクされるか又はその逆である様式にて、二重鎖核酸分子（ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＤＮＡ）に結合させる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質に関する他の標的の不在下では、蛍光が大きく減衰する。適当なプローブＤＮＡにハイブリダイズさせた特定の標的ＲＮＡの存在下では、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質は、今、結合する追加の非クエンチング標的を有し、蛍光を容認する（permitting）。この様式においては、特定のＲＮＡ種を単一のチューブ（均質）アッセイにおいて測定する（定量的又は定性的）。
【図３】図３は、実施例３に記載された、特異的ＲＮＡ捕捉を利用するＲＮＡ検出方法を例示する。固定されたＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質が、不均質なｍＲＮＡプールから特定のメッセージ又はメッセージファミリーを分離するための特異的ＲＮＡ捕捉を提供する。特定のＲＮＡメッセージ又はメッセージファミリーがＤＮＡプローブに結合し、そしてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合蛋白質がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに結合する。
【図４】図４は、様々なＲＮａｓｅ  Ｈ配列間の比較を示す。配列番号：１は、野生型のエキソヌクレアーゼのＲＮａｓｅ  Ｈ１酵素であり、本明細書に記載する通常のＲＮａｓｅ  Ｈ生化学活性の全てを有する。配列番号：２は１３４位において単一のＤからＡへの変異を有し、野生型に比較してＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド親和性を約２倍に増加させつつ、ヌクレオチド分解活性を＞１０００倍低下させる。配列番号：３は上記Ｄ１３４Ａ及び９４位にＤ→Ｇも有する。配列番号：４及び５は１３４及び９４に変異を有し、そしてＡ→Ｌ１０９，Ｌ→Ｉ１１１，Ｇ→Ｑ１１２，Ｑ→Ｓ１１３，Ｑ→Ｔ１１５，Ｋ→Ｑ１１７，Ａ→Ｑ１３９，Ａ→Ｇ１４０，Ｍ→Ｎ１４２，Ｎ→Ｓ１４３，Ｅ→Ｄ１４７，Ｔ→Ｖ１４９，Ｑ→Ｌ１５２，Ｖ→Ｐ１５３，及びＶ→Ｓ１５５も共通である。さらに、配列番号：５は、配列番号；３のように９４位にＧを有し、一方配列番号：４は９４位にＥを有する。新規な配列（配列番号：３、４及び５）は全て、他の核酸に比較してＲＮＡ：ＤＮＡ結合親和性及びＲＮＡ：ＤＮＡに関する結合選択性において増加を示す。
【図５】図５は、図４に記載されたＲＮａｓｅ  Ｈ酵素に関するＲＮＡ：ＤＮＡ結合親和性曲線を示す。もっとも高いＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド親和性を有するＲＮａｓｅ  Ｈは配列番号：５であり、黒の星印の結合曲線により示される。白い四角は配列番号：４のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合曲線を示す。黒の三角は配列番号：３のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合曲線を示す。白の丸は配列番号：２のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド結合曲線を示す。野生型の配列番号：１は示さないが、配列番号：２よりも低い結合親和性を有し（図５のキャプションにおいて示されるとおり）、そして配列番号３、４及び５よりも相応じて低い親和性を有する。
【図６】図６は、平衡競合アッセイを示す。ピコモラー量のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを、変異ＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質の添加前に示されたマイクロモラーの量のｓｓＤＮＡと混合したことに注目することが重要である。従って、当該実験は、大過剰のｓｓＤＮＡコンペティターの存在下でＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを選択的に認識して結合するような、クレームされたＲＮａｓｅ  Ｈ蛋白質（配列番号：３、４及び５）の改善された能力を示す。もっとも低いｓｓＤＮＡ親和性又はｓｓＤＮＡによる競合に抵抗することにもっとも高い能力を有するＲＮａｓｅ  Ｈが配列番号：５であり、黒の星印の結合曲線により示される。白い四角は配列番号：４のｓｓＤＮＡ競合曲線を示す。黒の三角は配列番号：３のｓｓＤＮＡ結合曲線を示す。白の丸は配列番号：２のｓｓＤＮＡ結合曲線を示す。野生型の配列番号：１は示さないが、配列番号：２と均等のｓｓＤＮＡ結合親和性を示す。
【図７】図７は、固相支持体上のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの直接ＲＮａｓｅ  Ｈ−媒介性検出の柔軟性を例示する。ハイブリダイゼーション効率のあいまいさを排除するために、公知の量のポリｒＡ：ｄＴ、ＲＮＡ：ＤＮＡホモポリマー、を直接に荷電したナイロン膜にスポットした。単一のリボヌクレオチドで標識されたＲＮａｓｅ  Ｈを加え、結合を許容し、そして余剰物を洗い流した。上記ナイロン膜の結果のオートラジオグラフを図７のセクションＡに示す。結合したＲＮａｓｅ  Ｈに相当する平均の放射活性シグナルがスポット中のＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの量に比例して増加する。これらのデータは、ピコモラーの核酸範囲を容易に下回ったＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの検出の感度も示す。
【図８】図８は、熱ショックに応答したエシェリヒアコリのゲノミック発現の変化の分析においてのｍＲＮＡの特異的測定を例示し、実施例６において以下に記載されるとおりである。図８は、摂氏３７度及び摂氏５０度における実際の膜及びｍＲＮＡ発現及びｍＲＮＡの存在しない対照を示す。
【図９】図９は、図８に示した生のデータに由来し、実施例６に論じられた１０個の遺伝子に関する熱ショックに対する応答において観察された遺伝子発現の模式的及び定量的変化を示す。
【配列表】
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2006510371.tif 000009
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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