(57)【要約】アテローム性動脈硬化症プラークの存在を示す抗原を提供する。この抗原は、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法であって、哺乳類にこの哺乳類の上記抗原に特異的な結合部位を有する結合剤を投与することを含んでなる方法に用いられる。また、アテローム性動脈硬化症を発症する危険性を有する哺乳類を診断する方法であって、上記抗原の量を決定することを含んでなる方法も包含される。更に、アテローム性動脈硬化症の検出および診断のための上記抗原の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のアテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法であって、
a)  上記哺乳類の細胞表面または細胞内のインテグリンα10鎖または上記鎖をコードする核酸に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量を哺乳類に投与し、
b)  アテローム性動脈硬化症プラークの進行および/または退縮を評価し、
c)  上記b)の評価を上記アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止しおよび/または退縮させることと相関させる
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
細胞表面が平滑筋細胞の細胞表面である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
結合剤が平滑筋細胞の細胞内に結合部位を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
アテローム性動脈硬化症の治療を必要とする哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法であって、上記哺乳類の細胞表面または細胞内にインテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量を哺乳類に投与する段階を含んでなる、方法。
【請求項５】
アテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有する哺乳類の診断方法であって、
a)  哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量を測定し、
b)  上記哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロールと比較して評価し、
c)  上記段階b)で得た量をコントロールから得た量と相関させ、哺乳類がアテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有するかどうかを決定する
段階を含んでなる、方法。
【請求項６】
測定をイン・ビボで行う、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
測定をイン・ビトロで行う、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
インテグリンα10鎖の量の測定が、インテグリンα10鎖を、このインテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤と接触させることを更に含んでなる、請求項5-7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークを検出する方法であって、
a)  哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量を測定し、
b)  上記哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロールと比較して評価し、
c)  上記段階b)で得た量をコントロールから得た量と相関させ、哺乳類における上記アテローム性動脈硬化症プラークを検出する
段階を含んでなる、方法。
【請求項１０】
測定をイン・ビボで行う、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
測定をイン・ビトロで行う、請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
インテグリンα10鎖の量の測定が、インテグリンα10鎖を、上記インテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤と接触させることを更に含んでなる、請求項9-11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類がヒトである、請求項1-12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類がマウスである、請求項1-12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させるためのインテグリンα10鎖の使用。
【請求項１６】
アテローム性動脈硬化症の治療用組成物を調製するためのインテグリンα10鎖の使用。
【請求項１７】
アテローム性動脈硬化症を診断するためのインテグリンα10鎖の使用。
【請求項１８】
アテローム性動脈硬化症プラークを検出するためのインテグリンα10鎖の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラーク形成の進行を防止するためのインテグリンα10鎖の方法および使用に関する。また、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークを検出するためのインテグリンα10鎖の方法および使用も包含される。
【発明の背景】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症
アテローム性動脈硬化症およびその血栓性合併症は、先進国における罹病率と死亡率の主要な原因である。2000年の主要なアテローム性動脈硬化症の症例数は主要な製薬市場で174百万近くに上り、この数字は高齢者人口の増加と共に増加し続けると思われる。また、これらのほんの僅かしか、疾患の明白な徴候を示さない。残りのものは、疾患それ自身が徴候を示し、最悪の場合には心臓発作または卒中として現れるまで診断されないままである。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、内皮下空間から始まる血管壁内での脂質(主として、コレステロールエステル)、炭水化物、血液産物、繊維状組織、およびカルシウムの蓄積による動脈の肥厚化と硬化を特徴とする病巣病理学的現象である。脂肪性沈着物が次第に蓄積されることによってプラークが形成され、これが結局は動脈を狭めて、塞いでしまう。このようなプラーク形成の原因と検出については、真剣に検討が行われてきている。
【０００４】
アテローム性動脈硬化症は、いずれの動脈で起きる可能性もある。冠動脈では、これは心臓発作を生じることがあり、大脳動脈では、これは卒中を生じることがあり、末梢動脈では、これは四肢の壊疽を生じることがある。
【０００５】
The American Heart Association Committee on Vascular Lesions (Stary et al, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol., 1995; 15(9): 1512-31)は、Fuster (Fuster et al, Circulation, 1994 Oct; 90(4): 2126-46)によって単純化された明確なプラークの標準化分類を発展させており、Corti et al (Ann N Y Acad Sci. 2001; 947: 181-95; および195-8頁の記載)によって概説されている。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症の過程
アテローム性動脈硬化症の過程は、単球が血管壁に付着して血管内膜に蓄積する特殊な型の慢性炎症と考えることができる。低密度リポタンパク質(LDL)の存在下では、単球は活性化したマクロファージに転換され、これがリポタンパク質粒子を吸収して泡沫細胞となる。これに続いて、動脈内膜内でvSMC(血管平滑筋細胞)が移動して増殖し、アテローム性動脈硬化症プラークに見られる内膜の大きな拡大を生じる。
【０００７】
vSMCの増殖は、伸縮性から合成表現型へのvSMCの表現型調節と両立する。増殖の他に、この表現型調節により、細胞外マトリックス(ECM)分子の産生が増加する(Thyberg et al, Arteriosclerosis. 1990; 10(6): 966-90)。ECMは血管を健全に保つのに重要であり、その構成成分の明確な特性により引張強さ、粘弾性、弾性反発および圧縮性を付与する。ECMとvSMCの相互作用は、インテグリンのような細胞表面受容体によって伝達される。インテグリンは、非共有結合したαおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体分子である。これらの分子は細胞と細胞外マトリックス成分の相互作用の広汎な分布を伝達し、接着、移動、増殖、分化およびアポトーシスなど多数の細胞応答に影響を与える。
【０００８】
α10
新たに見出されたコラーゲン結合インテグリンであるα10β1は、インテグリンサブユニットα10を含んでいる(Camper et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 20383-20389)。このインテグリンは軟骨細胞で発現し、コラーゲンII型アフィニティー精製によってウシ軟骨細胞から単離すると、還元後に160kDaのMrを示す。
【０００９】
クローニングおよびcDNAシークエンシングでは、他のインテグリンαサブユニットの一般的構造を共有することを示した。予想アミノ酸配列は、シグナルペプチド(22アミノ酸)、長い細胞外ドメイン(1098アミノ酸)、膜貫通ドメイン(22アミノ酸)、および短い細胞質ドメイン(22アミノ酸)を含む1167アミノ酸の成熟タンパク質からなっている。ほとんどのα-インテグリンサブユニットとは対照的に、α10の細胞質ドメインは保存配列KXGFF(R/K)Rを含まない。代わりに、α10の予想アミノ酸配列はKLGFFAHである。α鎖のGFFKRモティーフはインテグリンサブユニットの会合およびインテグリンの血漿膜への輸送に重要であることが示唆されている(De Melker et al. (1997) Biochem. J. 328: 529-537)。
【００１０】
細胞外部分は7個からなる反復配列、1個のI-ドメイン(199アミノ酸)および3個の二価カチオン結合部位と思われるものを含む。配列分析により、α10サブユニットはIドメイン含有αサブユニットに極めて密接して関係しており、α1(37%)、α2 (35%)およびα11 (42%)に対する同一性は最高であることが明らかになった。
【００１１】
アテローム性動脈硬化症におけるインテグリンの役割
幾つかのインテグリンが正常なvSMCに存在することは知られているが(Raines E.W., Int J Exp Pathol. 2000; 81(3): 173-82)アテローム性動脈硬化症の際のインテグリン発現における変化についてはほとんど知られていない。アテローム性動脈硬化症における傷ついた(合成)vSMCは, in atherosclerosis, are able to modulate theirインテグリン発現 by switching fromα1β1からα2β1へ変えることによってそのインテグリン発現を調節し、細繊維コラーゲン、特にコラーゲンIの産生を増加することができる(Skinner et al, Am J Pathol. 1994; 145(5): 1070-81; Thyberg et al, Arteriosclerosis, 1990; 10(6): 966-90)。
【００１２】
細胞相互作用は、アテローム性動脈硬化症の病変のその展開の総ての段階における進展に決定的なものである。コラーゲンのようなECM分子の受容体であるインテグリンは、細胞外マトリックスとのvSMCの連絡に重要な役割を果たしており、vSMCの表現型を調節する(Hynes R.O., Cell. 1992; 69(1): 11-25)。将来の治療法はインテグリンによって介在されるこれらの接着相互作用の調節に関するものとなるであろうし、これが次にアテローム性動脈硬化症プラークの成長を抑止し、プラーク活性化を制限し、活性化に伴う血栓応答を少なくすることができる。
【００１３】
今日まで、アテローム性動脈硬化症の治療は、主として食事調整およびコレステロール低下薬の投与によりアテローム性動脈硬化症の進展を遅らせまたは停止させることによって行われている。しかしながら、アテローム性動脈硬化症の退縮については、ごく限られた成果、すなわちアテローム性動脈硬化症の脂肪性プラーク沈着物の減少しか報告されていない。
【００１４】
従って、上記の問題点を考慮すれば、アテローム性動脈硬化症の適当な治療用ターゲット分子および有望な診断用マーカーの手段および方法、特にアテローム性動脈硬化症プラークを抑制し、退縮する手段および方法を開発することが極めて望ましい。これに関して本発明は、これの必要性と利益を説明する。
【００１５】
発明の概要
哺乳類をアテローム性動脈硬化症について治療しまたはアテローム性動脈硬化症プラークを検出するときに当該技術分野で知られている上記不利益を考慮すれば、本発明は、アテローム性動脈硬化症を予防し、治療しまたは検出するのに適したアテローム性動脈硬化症プラークの存在を示す抗原、すなわちインテグリンα10鎖を提供する。
【００１６】
本発明の一つの目的は、哺乳類のアテローム性動脈硬化症プラークの発達を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法を提供することである。
【００１７】
もう一つの目的は、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークを検出する方法を提供することである。
【００１８】
従って、本発明は、哺乳類のアテローム性動脈硬化症プラークの発達を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法を提供する。この方法は、  a)  インテグリンα10鎖または上記哺乳類の細胞表面または細胞内で上記鎖をコードする核酸に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量を哺乳類に投与し、
b)  アテローム性動脈硬化症プラークの進行および/または退縮を評価し、
c)  上記b)の評価を上記アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止しおよび/または退縮させることと相関させる
段階を含んでなる。
【００１９】
また、本発明は、アテローム性動脈硬化症の治療を必要とする哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症の治療方法であって、上記哺乳類の細胞表面または細胞内にインテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量を哺乳類に投与する段階を含んでなる、方法を提供する。
【００２０】
更に、本発明は、アテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有する哺乳類の診断方法であって、
a)  哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量を測定し、
b)  上記哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロールと比較して評価し、
c)  上記段階b)で得た量をコントロールから得た量と相関させ、哺乳類がアテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有するかどうかを決定する
段階を含んでなる、方法を提供する。
【００２１】
他の態様は、測定をイン・ビボで行うことを特徴とするものを包含する。
【００２２】
他の態様は、測定をイン・ビトロで行うことを特徴とするものを包含する。
【００２３】
本発明による方法は、他の態様では、インテグリンα10鎖の量の測定が、試料をこのインテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤と接触させることを特徴とするものを包含する。
【００２４】
更にまた、本発明は、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークを検出する方法であって、
a)  哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量を測定し、
b)  上記哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロールと比較して評価し、
c)  上記段階b)で得た量をコントロールから得た量と相関させ、哺乳類における上記アテローム性動脈硬化症プラークを検出する
段階を含んでなる、方法を提供する。
【００２５】
本発明による方法は、他の態様では、哺乳類がヒト、またはウサギ、マウスまたはラットのような齧歯類、チンパンジー、リスザル、ホエザル、アカゲザル、カニクイザルのような霊長類、またはブタ、例えば、白ベルギーブタ(White Belgian pig)であることを特徴とするものを包含する。
【００２６】
他の態様は、哺乳類が高コレステロールおよび/または高脂肪食を投与されていることを特徴とするものを包含する。
【００２７】
アテローム性動脈硬化症プラークの発達を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させ、アテローム性動脈硬化症の治療のための組成物を調製し、アテローム性動脈硬化症を診断し、アテローム性動脈硬化症プラークを検出するためのインテグリンα10鎖の使用も提供される。
【００２８】
発明の具体的説明
定義
本明細書で用いられる「アテローム性動脈硬化症プラーク」という用語は、血管壁内部の脂肪性プラーク沈着物の体積を表す。
【００２９】
「齧歯類」および「複数の齧歯類」という用語は、系統発生上のRodentia目の総ての動物を表す。
【００３０】
「ネズミ」という用語は、ラットおよびマウスなどMuridae科の任意および総ての動物を表す。
【００３１】
本明細書で用いられる「治療上有効量」または「有効量」または「治療上有効な」とは、所定の条件および投与法について治療効果を提供する量を表す。これは、必要な添加剤及び希釈剤、すなわちキャリヤーまたは投与ビヒクルに関連して所望な治療効果を生じるように計算した活性材料の所定量である。更に、これは、宿主の活性、機能および応答の臨床的に重要な欠損を減少させ、最も好ましくは予防するのに十分な量を意味する。あるいは、治療上有効量は、宿主の臨床上重要な状態を改良するのに十分である。当業者であれば理解しているように、化合物の量はその特定の活性によって変化することができる。適当な用量は、必要な希釈剤、すなわちキャリヤー、または添加剤に関して所望の治療効果を生じるように計算した活性組成物の所定量を含むことができる。
【００３２】
本明細書で用いられる「治療」とは、アテローム性動脈硬化症に関連した状態または様々な状態の完全な治癒または部分的治癒でよい治癒のための治療を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる「緩解」とは、アテローム性動脈硬化症に関連した状態または様々な状態の減少、すなわち少なくなるまたは緩和されることを意味する。
【００３４】
本明細書で用いられる「予防」とは、アテローム性動脈硬化症に関連した状態または様々な状態の展開または突発の完全または部分的ブロックを意味する。
【００３５】
本発明の方法および使用では、活性成分または結合剤の治療上有効量が提供される。治療上有効量は、当該技術分野で周知のように、年齢、体重、性別、状態、合併症、他の疾患などのような患者の特徴に基づいて通常の熟練した医師または獣医師が決定することができる。
【００３６】
抗原
上記で明らかにしたように、本発明は、アテローム性動脈硬化症プラークの存在を示す抗原、すなわちインテグリンα10鎖配列を提供する。インテグリンα10鎖は知られており、GenBank(商品名)/EBI Data Bank受託番号AF074015で公然と入手可能である。例えば、上記インテグリンα10鎖の新規な使用および方法を、本発明で開示する。
【００３７】
従って、本発明は、アテローム性動脈硬化症の予防、早期検出および治療において用いることができる方法について今日のところまだ満たされていない要望を満たす目的で、アテローム性動脈硬化症における治療用ターゲット分子および有望な診断用マーカーとしてのインテグリンα10鎖の使用を提供する。
【００３８】
アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法
本発明によれば、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法が開示される。このような方法は、
a)  哺乳類の細胞表面上のインテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量を上記哺乳類に投与し、
b)  アテローム性動脈硬化症プラークの進行および/または退縮を評価し、
c)  上記b)の評価を上記アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止しおよび/または退縮させることと相関させる
段階を含んでなる。
【００３９】
インテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量の投与は、それぞれの症例で評価しなければならない。結合剤は、ヒトインテグリンα10のようなインテグリンα10をターゲッティングする任意の薬剤である。結合剤は、投与の必要な哺乳類に一定範囲の用量にわたって投与した後、アテローム性動脈硬化症プラークに対する薬剤の(様々な)効果について様々な時点で分析しなければならない。結合剤の有効用量は哺乳類毎および患者毎に異なる可能性があるが、一般的にはアテローム性動脈硬化症プラークに対して臨床または病理学的効果または他の所望な治療効果が起こるところから出発するが、有意な望ましくない副作用が見られる量を下回る量を包含する。投与した投薬量は、患者の年齢、健康および体重、同時治療があればその種類、治療の頻度、および所望な効果の種類によって変化する。有効用量は、日常的実験のみを用いて薬剤の相対的なイン・ビボでの有効性とバイオアベイラビリティーを比較することによって変更することができる。
【００４０】
結合剤は、一般に薬学上許容可能なキャリヤー、希釈剤および/または他の添加剤と共に局所および/または全身投与される。薬学上許容可能なキャリヤーおよび/または希釈剤としては、任意の総ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張性の吸収遅延剤などが挙げられる。このような薬学活性物質の媒質および薬剤は、当該技術分野で周知である。任意の通常の媒質または薬剤が活性成分と不混和性である場合を除き、治療組成物でのその使用が考えられる。補足的活性成分を、組成物に配合することもできる。
【００４１】
有効量の結合剤は、経口的、または静脈内、腹腔内、皮下、直腸、移植、経皮、徐放、口内、大脳内または鼻内投与のような非経口的のいずれでも任意の通常の方法で投与することができる。大脳内投与には、結合剤は血液脳関門を通過する必要があり、これを促進するために化学的に修飾し、例えば、疎水性にしたり、または脳に直接または他の適当な経路を介して投与しなければならないことがある。
【００４２】
注射用には、水溶性の場合には、滅菌水溶液が一般に用いられ、あるいは滅菌注射用溶液を即座に調製するための滅菌粉末を用いることができる。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、また細菌や真菌のような微生物の汚染作用から保護しなければならない。
【００４３】
キャリヤーは、例えば、水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど、適当なそれらの混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であることができる。微生物の作用は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、シルメロサール(thirmerosal)などによって予防することができる。多くの場合に、等張薬、例えば砂糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射用結合剤は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを結合剤に使用することによって長時間吸収を行うことができる。
【００４４】
滅菌注射用溶液は、必要ならば様々な量の上記の他成分と共に必要量の結合剤を適当な溶媒に配合した後、滅菌、例えば濾過または放射線照射を行うことによって調製する。滅菌した注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、本発明の好ましい方法は真空乾燥および凍結乾燥法であり、これは活性成分に予め滅菌して濾過した溶液からの任意の追加の所望な成分を加えた粉末を生じる。
【００４５】
結合剤が適当に保護されているときには、それらは不活性希釈剤または同化性の食用キャリヤーと共に蛍光灯することができ、またはこれを硬質または軟質殻のゼラチンカプセルに封入することができ、またはこれを圧縮して錠剤とすることができ、またはこれを治療食の食物と混合することができる。経口による治療用投与には、活性化合物を賦形剤と混合して、接種可能な錠剤、口内錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハーなどの形態で用いることができる。活性結合剤の量は、適当な有効用量が得られるようにする量である。
【００４６】
様々な形態の錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどを用いることもでき、上記の他成分を含むこともできる。
【００４７】
結合剤は、他の態様では、アテローム性動脈硬化症、特にあてろろプラークに有効であることが知られている薬剤、タンパク質、すなわち抗体および酵素、またはペプチド、すなわちポリペプチドまたはオリゴペプチドと共に投与することができる。このような追加の他の薬剤は、結合剤に結合したまたは結合していない状態で直接または間接的に投与することができる。
【００４８】
本発明による結合剤は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体のような任意のタンパク質、またはその部分、インテグリンα10鎖に結合するポリペプチドまたはオリゴペプチド、またはその部分、例えばI-ドメインまたはスプライスドメインであることができる。インテグリンα10鎖は、インテグリンβ1鎖で形成したヘテロ二量体になることもできる。例えば、結合剤は、インテグリン鎖の両方、すなわちα10β1ヘテロ二量体に結合することもできる。
【００４９】
他の態様では、結合剤はインテグリンα10鎖の任意の細胞内または細胞外部分と結合することができる。
【００５０】
結合剤は、他の態様では、インテグリンα10鎖のI-ドメインおよび/またはスプライスドメインに結合することができる。
【００５１】
結合剤は、インテグリンα10鎖または上記ヘテロ二量体に結合する任意の他分子、例えば化学ライブラリーのスクリーニングから得た分子であることもできる。
【００５２】
他の態様では、結合剤は、インテグリンα10鎖をコードするリボ核酸RNAまたはデオキシリボ核酸DNAのような任意の核酸に結合するかまたはハイブリダイズすることができる。
【００５３】
他の態様では、結合剤は、インテグリンα10鎖の発現を調節するタンパク質をコードするリボ核酸RNAまたはデオキシリボ核酸DNAのような任意の核酸に結合するかまたはハイブリダイズすることができる。
【００５４】
従って、結合剤は、任意の単離核酸、例えばリボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、ペプチド核酸(PNA)のようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであって、インテグリンサブユニットα10をコードする上記DNAまたはRNAにハイブリダイズするものであることができ、上記ポリオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはインテグリンサブユニットαl1、αl、α2などの他のインテグリンをコードするDNAまたはRNAにハイブリダイズすることはできない。これが、α10発現の直接調節である。
【００５５】
他の態様では、結合剤は、インテグリンα10鎖の発現を直接または間接的に調節する化学ライブラリーからスクリーニングした任意のタンパク質、ポリペプチドまたは化学的化合物のような他分子のみであることができる。
【００５６】
他の態様は、結合剤が任意の単離核酸、例えばリボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、ペプチド核酸(PNA)のような任意の単離核酸であって、インテグリンα10鎖の発現を調節するタンパク質をコードするリボ核酸RNA、またはデオキシリボ核酸DNAのような任意の核酸にハイブリダイズするものを包含する。これは、α10発現の間接的調節である。
【００５７】
アテローム性動脈硬化症プラークは、管腔面の内皮単層を少数の平滑筋細胞を含む非細胞の弾性細胞外マトリックスと共に含んでなる動脈壁の内膜における堆積物である。アテローム性動脈硬化症プラークの最初の徴候は、内膜におけるリポタンパク質の蓄積である。リポタンパク質は単球を引きつけ、これがマクロファージとなってリポタンパク質を包み込む(マクロファージ泡沫細胞)。次いで、平滑筋細胞が内膜中に移入して増殖し、内膜が著しく肥厚する。これは、平滑筋細胞の表現型調節も伴う。更に、リンパ球がプラークに見られる可能性がある。平滑筋細胞は、血管の完全性の維持に重要な脂質および炎症性細胞を取り巻く細胞外マトリックスキャップを蓄積する。プラークは慢性的炎症の箇所となり、これにより繊維症を生じ、内膜が更に肥厚する(Stary HC et al. Circulation 1995; 92: 1355-1374, Fayad ZA et al. Circ Res 2001; 98: 305-316)。活性化したマクロファージは数種類のマトリックス分解メタロプロテアーゼを放出し、プラークの細胞外キャップを分解したり不安定にする。細胞外マトリックスの産生と分解のバランスがとれておらず且つ分解が優性になると、プラーク破裂の危険性が高まる。インテグリンα10鎖は、平滑筋細胞、マクロファージまたは内皮細胞のようなアテローム性動脈硬化症プラークの細胞上に細胞内および細胞外ドメインを有する。
【００５８】
従って、本発明による方法の他の態様は、細胞が平滑筋細胞であり、インテグリンα10鎖の結合部位がこのような細胞の表面の細胞内および/または細胞外にあるものを包含する。内膜平滑筋細胞での機能調節および数値上の増加は、進行したヒト病変における細胞変化から突出している。平滑筋細胞は、部分的には病変に先行する常在性内膜細胞であり、部分的には様々な刺激に対する応答として生じるそれらの後継細胞である。刺激としては、脂質蓄積、内膜構造の破壊、内膜細胞およびマトリックスの損傷、血小板およびフィブリノーゲンの沈着物が挙げられ、それらの総ては常在性細胞を活性化して分裂促進因子を生成することがある。更に、アテローム性動脈硬化症の病変におけるコラーゲンの増加は、内膜平滑筋細胞によって産生される(Stary HC et al. Circulation 1995; 92: 1355-1374)。
【００５９】
特定の態様では、インテグリンα10鎖に特異的な結合部位は、平滑筋細胞の細胞表面にある。
【００６０】
哺乳類での主要なイン・ビボ効果は、結合剤がアテローム性動脈硬化症プラークにおける上記細胞の細胞表面上のターゲット、すなわちインテグリンα10鎖を見出して局在化させることである。また、下記のように、アテローム性動脈硬化症プラークをイン・ビトロまたはイン・ビボで検出するには、インテグリンα10鎖の細胞内発現を同様に用いることもできる。
【００６１】
アテローム性動脈硬化症の治療を必要とする哺乳類での治療方法
本発明によれば、アテローム性動脈硬化症の治療を必要とする哺乳類での治療方法が開示される。この方法は、
a)  上記哺乳類の細胞表面上または細胞内のインテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤の有効量を哺乳類に投与する
段階を含んでなる。
【００６２】
哺乳類への投与、結合剤並びに目的とする細胞を包含する他の態様は、「アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法」の節に更に記載されている。
【００６３】
アテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有する哺乳類の診断方法
本発明によれば、アテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有する哺乳類の診断方法が包含される。この方法は、
a)  哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量を決定し、
b)  上記哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロールと比較して評価し、
c)  上記段階b)で得た量をコントロールから得た量と相関させ、哺乳類がアテローム性動脈硬化症に罹っているかまたはこれを発症する危険を有するかどうかを決定する
段階を含んでなる。
【００６４】
他の態様では、この方法は定量法であって、インテグリンα10鎖をコントロールと比較して定量的に決定する方法である。
【００６５】
抗体またはその断片、またはポリペプチドのようなタンパク質であって、インテグリンα10鎖に特異的に結合し、ビオチン、蛍光プローブまたは同位体のような薬剤で標識されていないまたはされているタンパク質を用いることができる。インテグリンα10鎖に特異的に結合するポリペプチドは、例えばインテグリンα10鎖に結合する抗体の抗原結合部位の部分、またはインテグリンα10鎖に結合親和性を有する任意の他のポリペプチドであることができる。上記タンパク質は直接検出され、またはガドリニウムのようなコントラスト剤をアテローム性動脈硬化症プラークに向けるのに用いられる。結合した抗体またはコントラスト剤は、高分解能磁気共鳴画像形成(MRI)、超音波、蛍光放出分光分析法、または核画像形成のような手法を用いて可視化することができる。当業者に知られている任意の他の適当な方法を用いることもできる。従って、上記の手法を用いて定量することができる結合したコントラスト剤の量は、組織におけるインテグリンα10鎖の量を反映している(Naghavi M et al.. Current Atherosclerosis Reports 2001; 3: 125-135. Yu X et al. Magnetic Resonance in Medicine 2000; 44: 867-872. Flacke S et al. Circulation 2001; 104: 1280-1285. Tsimikas S et al. Arterosler. Thromb. Vasc. Biol. 2000; 20: 289-697)。
【００６６】
更に他の態様では、インテグリンα10鎖の量は、マウス、ラットまたはヒトのような哺乳類由来の生験で決定される。
【００６７】
他の態様は、生験が動脈のような任意の血管に由来するものを包含する。
【００６８】
更に他の態様は、インテグリンα10鎖の量の決定が、アテローム性動脈硬化症プラーク、またはアテローム性動脈硬化症プラークがあると考えられる哺乳類の部分を上記インテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤と接触させることをも含んでなるものを包含する。上記の結合剤は、「アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法」の節に更に記載されている。
【００６９】
更に他の態様は、上記b)の評価および上記c)の相関がアテローム性動脈硬化症の特定の疾患段階に対する評価および相関であるものを包含する。アテローム性動脈硬化症プラークの様々な評価方法が知られており、以下に簡単に説明する。
【００７０】
The Committee on Vascular Lesionsは、臨床的が造形性の検討で突き止めた病変の出現を組織学的病変の種類および相当する臨床的徴候と相関させようとした。組織学的分類では、病変はローマン体の数字で表され、図1に示したように病変の進行の通常の順序を示している。初期(I型)病変は、マクロファージの増加および分散したマクロファージ泡沫細胞の形成を誘発するのに十分なアテローム発生性リポタンパク質を含む。II型の病変は、主としてマクロファージ泡沫細胞と脂質が蓄積した平滑筋細胞の層からなり、大ざっぱに脂肪線条と呼ばれる病変を含む。III型は、II型とIV型との中間段階である(アテローム、徴候を示す可能性のある病変)。II型の脂質が蓄積した細胞の他に、III型の病変は幾つかの内膜平滑筋細胞の結合力を崩壊させる細胞外液滴および粒子の集合が分散したものを含む。この細胞外脂質は、IV型の病変を特徴づける細胞外脂質の一層大きな集密し且つ一層破壊的なコアの中間前駆体である。人生の40再頃から始まり、通常は脂質コアを有する病変は、厚い層状の繊維状結合組織(V型病変)および/または亀裂、血腫および血栓(VI型病変)を含むこともある。幾つかのV型病変は大部分が石灰化し(Vb型)、幾つかは主として繊維状結合組織からなり、脂質またはカルシウムをほとんどまたは全く蓄積しなかった(Vc型)(Stary HC et al., Circulation 1995; 92: 1355-1374)。
【００７１】
American Heart Association Committee on Vascular Lesionsの基準によれば、病変の進行は図1に示されるように5期に分割することができる。進行は、病理学的および臨床的知見に基づいている。1期では、初期の病変が見られる(病変I-III型)。これらの病変は、次に繊維脂質プラークを有する2期に進む可能性がある(病変IV-Va型)。2期は急性期(3または4期)に進行する可能性があり、3および4期の病変はVI型である。血栓症または血腫の形成は狭心症(3期)または閉塞性血栓症による急性冠状動脈症候群(4期)を引き起こすことがある。3および4期の病変は、狭窄が一層強くなったプラーク(病変Vb-c)を特徴とする繊維症期(5期)に発達する可能性があり、これは閉塞性病変に進行することがある(Fayad ZA et al. Circ Res 2001; 98: 305-316)。
【００７２】
哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークの検出方法
本発明によれば、哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症プラークの検出方法が開示される。このような方法は、
a)  哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量を決定し、
b)  上記哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロールと比較して評価し、
c)  上記段階b)で得た量をコントロールから得た量と相関させ、アテローム性動脈硬化症プラークの量を検出する
段階を含んでなる。
【００７３】
他の態様では、この方法は定量的方法であって、哺乳類におけるインテグリンα10鎖の量をコントロール試料と比較して定量的に決定する方法である。
【００７４】
更に他の態様では、インテグリンα10鎖の量が、マウス、ラットまたはヒトのような哺乳類由来の生験で決定される。
【００７５】
他の態様は、生験が動脈のような任意の血管に由来するものを包含する。
【００７６】
他の態様は、インテグリンα10鎖の量がイン・ビボで決定されるものを包含する。
【００７７】
他の態様は、インテグリンα10鎖の量がマウス、ラットまたはヒトのような哺乳類由来の生験でイン・ビトロで決定されるものを包含する。
【００７８】
他の態様は、インテグリンα10鎖の量が免疫組織学的分析によってイン・ビトロで決定されるものを包含する。このような方法は当業者に知られており、下記の例で更に説明する。
【００７９】
簡単に説明すれば、組織を固定剤によって固定し、または当業者に知られている方法を用いて冷凍する。組織を固定した後、それらをパラフィンに埋設し、またはTissue Tek(登録商標)O.C.T.化合物(Sakura Finetek Europe B.V., オランダ)に固定して冷凍し、更に薄片状に切断する。パラフィン埋設した組織をミクロトームなどを用いて室温で切断し、冷凍した組織はクリオスタットを用いて0℃を下回る温度で切断する。次に、切片を、幾つかの方法が利用可能であり且つ当業者に知られている抗原を最もよく回収する方法で処理する。更に、組織切片を、バックグラウンドとして検出系によって検出できる任意の内在性抗原または染色ついてブロックすることができる。次に、切片を、インテグリンα10鎖に特異的な抗体と共にインキュベーションする。抗体を蛍光、酵素またはビオチンのような薬剤で標識して、次に適当な検出系を用いて検出することができる。あるいは、蛍光、酵素またはビオチンのような薬剤で標識した二次抗体を用いて、抗インテグリンα10鎖抗体を検出することができる。染色の量は、コンピューター処理を行う画像形成装置を用いて測定することができる。染色の量を、組織のα10鎖の量と相関させる(Camper L et al Cell Tissue Res. 2001; 306: 107-116)。
【００８０】
他の態様は、インテグリンα10鎖の量は、任意の画像形成法のような任意の侵襲または非侵襲性の方法によって決定する。このような方法の例は、磁気共鳴画像形成(MRI)、血管内超音波(IVUS)のような超音波、電子ビームコンピューター断層撮影法(EBCT)およびマルチスライス断層撮影走査法のようなコンピューター断層撮影法、並びに血管造影法である。当業者に知られている任意の他の適当な方法を用いることもできる。
【００８１】
更に他の態様は、インテグリンα10鎖の量の決定が、更に試料を上記インテグリンα10鎖に特異的な結合部位を有する結合剤と接触させることを含んでなるものを包含する。上記結合剤は、「アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させる方法」の節に更に記載されている。
【００８２】
インテグリンα10鎖の発現を調節する方法
インテグリンα10の発現は、哺乳類細胞でα10タンパク質発現をコードする(複数の)遺伝子の遺伝子ターゲッティングによって調節することもできる。ターゲッティングを行う細胞は、ヒトまたはマウスのような哺乳類でイン・ビトロまたはイン・ビボでターゲッティングすることができる。特異的遺伝子または遺伝子のグループの発現を調節するためのイン・ビトロ法は、当業者に知られている。例は、Talts JF., Brakebusch C., Fassler, R (1999)「インテグリン遺伝子ターゲッティング(インテグリン遺伝子 targeting)」. Methods Mol. Biol 129, 153-187; Kozarsky KF (2001) Current Opinion in Pharmacology 1: 1997- 202)に示されている。
【００８３】
簡単に説明すれば、遺伝子は、通常はターゲッティングを行う目的とする遺伝子に相補性核酸配列をコードする構築体によってターゲッティングされる。全遺伝子並びにその一部分をターゲッティングすることができる。本明細書において「その一部分」とは、プロモーターまたは遺伝子の他の制御配列、並びに遺伝子のイントロンまたはエキソン配列のような発現を直接または間接的に制御する遺伝子の一部分を表す。従って、α10タンパク質の発現は、遺伝子レベルでのターゲッティングによって調節することができ、例えば、α10インテグリンタンパク質の発現をダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションすることができる。
【００８４】
本発明によれば、アテローム性動脈硬化症プラークの細胞中のインテグリンα10鎖の発現を調節する方法が開示される。このような方法は、
a)  インテグリンα10鎖遺伝子、その部分、または制御配列を遺伝子にターゲッティングする構築物を提供し、
b)  イン・ビボまたはイン・ビトロでアテローム性動脈硬化症プラークでインテグリンを発現する細胞を上記構築物と接触させ、
c)  細胞をイン・ビボまたはイン・ビトロで形質転換し、
d)  場合によっては、形質転換細胞をイン・ビボまたはイン・ビトロで選択し、
e)  α10鎖タンパク質のタンパク質発現を検出し、
f)  α10鎖タンパク質のタンパク質発現を上記a)の構築物を提供する前の発現と相関させることによって、インテグリンα10鎖タンパク質の発現の調節を評価する
段階を含んでなる。
【００８５】
インテグリンα10鎖の発現の調節は、インテグリンα10タンパク質発現を制御する他の因子を介して直接または間接的に行うことができる。因子の例は、増殖因子、例えば繊維芽増殖因子、インスリン様増殖因子、形質転換増殖因子-β、副甲状腺ホルモン関連ペプチド、骨形態発生タンパク質、インディアン・ヘッジホッグおよびソニック・ヘッジホッグ、SOX5-6およびSOX9のような転写因子、またはインテグリンα10タンパク質の発現を調節する他の因子である。
【００８６】
構築物は、インテグリンα10鎖遺伝子、その部分、または制御配列を遺伝子にターゲッティングする任意の薬剤を含んでなる。これは、遺伝子、その部分、または制御配列をインテグリンα10タンパク質の発現を調節する因子の遺伝子にターゲッティングすることもできる。
【００８７】
更に、構築物は、遺伝子、その部分、または制御配列のいずれかを上記遺伝子にイン・ビボ送達するためのウイルスまたは非ウイルス系を含んでなることもできる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、単純疱疹ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。非ウイルス系の例としては、裸のDNA、カチオン性リポソーム、カチオン性脂質およびポリマー、並びにDNA/カチオン性リポソーム/ポリカチオン複合体が挙げられる。
【００８８】
外来遺伝子材料のイン・ビボでの発現は、「遺伝子療法」と呼ばれることが多い。本発明によるこのような治療法および方法を応用する疾患状態および手順としては、遺伝子異常およびアテローム性動脈硬化症のような血管系の疾患が挙げられる。形質転換細胞の細胞伝達は様々な方法を用いて行うことができ、輸液が挙げられる。輸液法の一例は、Tangirala RK et al. (1999) Circulation 100: 1816-1822に記載されている。
【００８９】
構築物は、更にインテグリンα10鎖遺伝子、その部分、または制御配列を遺伝子にターゲッティングする化合物を含むことがある。これは、遺伝子、その部分、または制御配列を上記のようにインテグリンα10タンパク質の発現を調節する因子の遺伝子にターゲッティングすることもできる。
【００９０】
アンチセンス法を用いて、最終的にインテグリンα10鎖の発現に影響を及ぼす上記遺伝子の転写を調節することができる。この構築物は、アンチセンスDNAまたはRNA、すなわち目的とする所定のmRNA配列に相補性のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドを包含することができる。DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドのmRNAへの結合により、その特定のmRNAの翻訳がブロックされる。
【００９１】
アンチセンスについての伝達系の例としては、裸のDNAまたはRNA、カチオン性リポソーム、カチオン性脂質およびポリマー、並びにDNA/カチオン性リポソーム/ポリカチオン複合体の使用が挙げられる。
【００９２】
更に、この構築物としては、遺伝子、その部分、または制御配列のいずれかを上記遺伝子にイン・ビボ伝達するためのウイルスベクターを挙げることができる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、単純疱疹ウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。
【００９３】
他の態様としては、遺伝子のターゲッティングが、α10鎖タンパク質の発現をアップレギュレーションするように発現を調節するものが挙げられる。例えば、アップレギュレーションは、通常レベルの遺伝子に対するものであることができる。「通常レベル」とは、本明細書では、特定の哺乳類の細胞がその特定の細胞型およびその細胞型の活性化段階で発現するレベルを意味するものと解釈される。これは、時には野生型発現とも呼ばれる。
【００９４】
更に他の態様は、インテグリンα10鎖タンパク質発現のイン・ビボ調節を包含する。このようなイン・ビボ調節も同様に、イン・ビボでの遺伝子のターゲッティングによる遺伝子レベルでの調節によることがある。例えば、α10タンパク質の発現を遺伝子レベルでのターゲッティングにより調節し、例えばタンパク質の発現をイン・ビボで下向き調節することができる。
【００９５】
他の態様は、遺伝子のターゲッティングが、α10鎖タンパク質の発現をイン・ビボでアップレギュレーションするように発現を調節するものを包含する。
【００９６】
上記の方法を、インテグリンα10鎖タンパク質の発現を調節するための遺伝子治療法として用いることができる。このような使用は、これを必要とするヒト、マウスまたはラットのような哺乳類におけるイン・ビボ発現を抑制し、防止し、増加し、または減少させることができる。デオキシ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、ペプチド核酸(PNA)、またはそれらの混合物のような核酸を再導入することによって、活性を調節することができ、例えばインテグリンα10鎖タンパク質の非存在または過剰発現を部分的または完全に補償することができる。
【００９７】
本発明による方法の更にもう一つの使用は、アテローム性動脈硬化症における活性を予防し、阻害し、緩解しまたは逆転することである。
【００９８】
哺乳類
開示した方法および使用には、哺乳類が考えられる。他の態様では、哺乳類はヒトでよい。
【００９９】
更に他の態様は、哺乳類が、ラットまたはマウスのような齧歯動物、またはMuridae科の任意の他の動物であるものを包含する。
【０１００】
他の態様は、哺乳類がウサギであるか、またはチンパンジー、リスザル、ホエザル、アカゲザル、カニクイザルのような霊長類、またはブタ、例えば、白ベルギーブタ(White Belgian pig)であることを特徴とするものを包含する。
【０１０１】
他の態様は、哺乳類が高コレステロールおよび/または高脂肪食を投与されていることを特徴とするものを包含する。
【０１０２】
方法および使用のあるものでは、これを必要とする哺乳類が開示される。このような哺乳類、例えば、ヒトまたはマウスは、アテローム性動脈硬化症プラークの初期の徴候を示す任意の哺乳類、完全に発現したアテローム性動脈硬化症プラーク、またはアテローム性動脈硬化症プラークを形成しやすいまたはその危険性があるものであることができる。
【０１０３】
様々な条件により、哺乳類にアテローム性動脈硬化症にすることができる。例えば、他の態様としては、哺乳類のアテローム性動脈硬化症が、1型糖尿病、ApoA1欠損症、循環器疾患、例えば冠状動脈疾患(CAD)、全身性エリテマトーデス(SLE)、急性虚血、慢性虚血、またはSjoegren症候群のような疾患によって引き起こされる。
【０１０４】
アテローム性動脈硬化症の他の危険因子としては、高血圧、高レベルの低密度リポタンパク質、低レベルの高密度リポタンパク質、喫煙、糖尿病、肥満、メイル・セックス(male sex)、高ホモシステインレベル、Chlamydia pneumoniae感染症、早発性アテローム性動脈硬化症の家系が挙げられる。従って、更に他の態様としては、治療を必要とする哺乳類が、上記の危険因子のようなアテローム性動脈硬化症に伴う様々な危険因子に暴露されている哺乳類であるものが挙げられる。
【０１０５】
本発明による使用
本発明によれば、インテグリンα10鎖の幾つかの使用が開示される。
【０１０６】
アテローム性動脈硬化症プラークの進行を遅らせまたは抑止し、および/または退縮させるためのインテグリンα10鎖の使用が、包含される。
【０１０７】
更に、アテローム性動脈硬化症の治療のための組成物の調製を目的とするインテグリンα10鎖の使用が包含される。このようなアテローム性動脈硬化症の治療は、これを必要とする哺乳類に対するものである。哺乳類、例えばヒトまたはマウスは、アテローム性動脈硬化症プラークの初期の徴候を示す任意の哺乳類、完全に発現したアテローム性動脈硬化症プラーク、またはアテローム性動脈硬化症プラークを形成しやすいまたはその危険性があるものであることができる。
【０１０８】
更に、アテローム性動脈硬化症を診断するためのインテグリンα10鎖の使用が開示される。
【０１０９】
更にまた、アテローム性動脈硬化症プラークを検出するためのインテグリンα10鎖の使用も包含される。
【実施例】
【０１１０】
例１  大動脈アテローム性動脈硬化症プラークでのインテグリンα10鎖の検出
目的
この例の目的は、大動脈アテローム性動脈硬化症プラークでのインテグリンα10鎖の検出を記載することである。
【０１１１】
材料
ネズミ大動脈プラーク切片を用いた。切片をクリオスタットでSuperfrost Plusスライド(Menzel-Glaser, Histolab)上での5μmの厚さに切断した。次に、切断切片を、-20℃で保管した。
【０１１２】
大動脈プラークの検出
染色前に、冷凍切片を室温まで約30分間融解した。
【０１１３】
切片をアセトン中で-20℃で10分間固定した後、ヒアルロニダーゼ(2mg/ml, Sigma)で37℃で30分間処理した。
【０１１４】
切片を、PBSで希釈した4%ロバ血清(Harlan)で室温にて30分間ブロックした。
【０１１５】
ブロッキング段階中に、抗-α10抗体を、様々な濃度、例えば0.01、0.1および0.5mg/mのα10ペプチド、すなわちブロッキングペプチドと4℃で30分間インキュベーションした。
【０１１６】
次に、切片を、ウサギ抗-ヒトα10を1:100に希釈したもの、および予備インキュベーションしたウサギ抗-ヒトα10およびブロッキングペプチドを1:100に希釈したものとインキュベーションした。切片を、室温で７５分間インキュベーションした。
【０１１７】
PBS中で15分間洗浄した後、切片をロバ抗-ウサギCy3(IgG, 1:100, Jackson製)と室温にて 60分間インキュベーションした。
【０１１８】
最後にPBS中で15分間洗浄した後、切片をVectashield (Vector Labs)で固定して、蛍光顕微鏡下で写真を撮った。
【０１１９】
結果および吟味
図2に、大動脈プラークでのインテグリンα10発現を検出するための染色の結果を示す。上段の写真Aは、大動脈プラークの細胞の細胞表面のストロングステイニング(strong staining)としてのインテグリンα10鎖の染色を示す。中段の写真Bは、インテグリンα10鎖のペプチドによるインテグリンα10鎖の染色の特異的ブロックであって、ほとんど総ての染色がペプチドによってブロックされていることを示す。下段の写真Cは、二次抗体のみを用いるコントロール染色を示す。二次抗体ロバ-抗-ウサギCy3による非特異的結合が検出される。
【０１２０】
例２  インテグリンα10鎖欠損マウスでの血管損傷後の新内膜形成におけるインテグリンα10鎖の影響の評価
目的
この例の目的は、新内膜(またはアテローム性動脈硬化症プラーク)の形成におけるインテグリンα10鎖の役割および機能、および血管損傷後のコレステロールレベルを評価することである。
【０１２１】
動物
インテグリン鎖α10-/-マウス、および野生型の週齢を合わせたコントロールマウス。
【０１２２】
マウス動脈損傷
マウスに動脈損傷を機械的に誘発する幾つかの方法が利用可能であり、当業者に知られている。一つの例の頸動脈カフ損傷(cuff-injury)をここでは提供する(Dimayuga P et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999; 264: 465-468)。
【０１２３】
動物を、イソフルランに続いてAvertin (2.5%溶液の0.016ml/g体重を腹腔内注射)で麻酔した。
【０１２４】
右頸動脈を、切開顕微鏡下で慎重に単離する。
2.5mm長の管を頸動脈の周りに適用し、皮膚の切れ目を閉じる。
【０１２５】
分析
新内膜の大きさを測定し、炎症性細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞および内皮細胞のような細胞、およびコラーゲン、プロテオグリカンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分、およびインテグリンのような様々な細胞表面マーカーに関するその含量を、様々な染色法および当業者に知られている特異的抗体を用いて分析した。
マウスを、損傷誘発の3週間後に屠殺する。
【０１２６】
頸動脈を慎重に切開し、0.9%食塩水で灌流し、Tissue Tek(登録商標)O.C.T.化合物(Sakura Finetek Europe B.V., オランダ)に埋設して-70℃で冷凍するか、またはリン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋設する。
【０１２７】
次に、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン染料、および/またはVerhoeff Van-Giesion染料で染色して、形態学的検討を行う。形態測定分析は、Verhoeff Van-Giesonで染色した切片で行う。
【０１２８】
内部の弾性薄膜の内側の面積(IELA)である管腔面積および外部の弾性薄膜によって取り巻かれた面積の測定を、それぞれの切片について行う。内側の面積はIELAを外部弾性薄膜から差し引くことによって計算し、内膜面積(IA)は管腔面積をIELAから差し引くことによって計算する。これらの測定値から、IAと内側の面積の比(I/M比)を計算する。コンピューター処理を行う画像分析を用いて、染色の定量的評価および新内膜の形態測定分析(Optimas Systemのような系, BioscanまたはScion Image分析ソフトウェア, Scion)を行う (Dimayuga P et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999; 264: 465-468, Zhu et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 450-455)。
【０１２９】
血漿試料を集め、酵素分析法を用いて総コレステロールレベルを測定する(Sigma, St Louis, MO, U.S.A.)。HDLレベルは、アポ-B含有リポタンパク質をホスホタングステン酸で沈澱した後に測定する(Sigma, St Louis, MO, U.S.A.)。
【０１３０】
また、組織コレステロールのレベルは、Dimayuga P et alによって報告されている方法で測定する(Biochemical and Biophysical Research Communications,1999; 264: 465-468)。
【０１３１】
例３  インテグリン鎖α10-/-アポE-/-マウスでのアテローム性動脈硬化症発現におけるインテグリンα10鎖の関与および機能の評価
目的
この例の目的は、インテグリンα10鎖とアポEを両方とも欠損した(α10-/- アポE-/-)ダブルノックアウトマウスを作製することである。
【０１３２】
もう一つの目的は、α10-/-アポE-/-を、週齢および性別を合わせたシングルノックアウトマウス(α10-/-およびアポE-/-)および野生型のコントロールマウスを、アテローム性動脈硬化症の発現およびコレステロールレベルに関して比較することである。
【０１３３】
動物
インテグリン鎖α10-/-,アポE-/-マウス、および週齢および性別を合わせた野生型コントロール。マウスには、標準的食餌(例えば、PicoLab Rodent chow 20、4.5重量%脂肪、0.02%コレステロール)またはWestern型食餌(例えば、Tekland Adjusted Calories Western型食餌、21重量%脂肪、0.15%コレステロール、コール酸ナトリウムなしの19.5%カゼイン)を与える。
【０１３４】
α10-/-アポE-/- ダブルノックアウトマウスの生成
ホモ接合インテグリン鎖α10-/-マウスを、ホモ接合アポE-/-マウスとつがわせる。生成したヘテロ接合F1マウスを更に用いて、マウスホモ接合α10とアポEをいずれも欠損したホモ接合マウスを生成する。
【０１３５】
インテグリン鎖α10-/--およびアポE-/--ダブルノックアウトマウスにおけるアテローム性動脈硬化症発現の分析
新内膜の大きさを測定し、炎症性細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞および内皮細胞のような細胞、およびコラーゲン、プロテオグリカンおよびフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分、およびインテグリンのような様々な細胞表面マーカーに関するその含量を、様々な染色法および当業者に知られている特異的抗体を用いて分析する。
マウスを様々な週齢で屠殺して、アテローム性動脈硬化症の進行を検討する。
【０１３６】
動脈を慎重に切開し、0.9%食塩水で灌流し、Tissue Tek(登録商標)O.C.T.化合物(Sakura Finetek Europe B.V., オランダ)に埋設して-70℃で冷凍するか、またはリン酸緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋設する。
【０１３７】
次に、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン染料、および/またはVerhoeff Van-Giesion染料で染色して、形態学的検討を行う。
形態測定分析は、Verhoeff Van-Giesonで染色した切片で行う。
【０１３８】
内部の弾性薄膜の内側の面積(IELA)である管腔面積および外部の弾性薄膜によって取り巻かれた面積の測定を、それぞれの切片について行う。内側の面積はIELAを外部弾性薄膜から差し引くことによって計算し、内膜面積(IA)は管腔面積をIELAから差し引くことによって計算する。これらの測定値から、IAと内側の面積の比(I/M比)を計算する。コンピューター処理を行う画像分析を用いて、染色の定量的評価および新内膜の形態測定分析(Optimas Systemのような系, BioscanまたはScion Image分析ソフトウェア, Scion)を行う (Dimayuga P et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1999; 264: 465-468, Zhu et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 450-455)。
【０１３９】
血漿試料を集め、酵素分析法を用いて総コレステロールレベルを測定する(Sigma, St Louis, MO, U.S.A.)。HDLレベルは、アポ-B含有リポタンパク質をホスホタングステン酸で沈澱した後に測定する(Sigma, St Louis, MO, U.S.A.)。
【０１４０】
また、組織コレステロールのレベルは、Dimayuga P et alによって報告されている方法で測定する(Biochemical and Biophysical Research Communications,1999; 264: 465-468)。
【０１４１】
インテグリン鎖α10-/-,アポE-/-ダブルノックアウトマウスからの結果を、週齢および性別を合わせたシングルノックアウトマウス(インテグリン鎖α10-/-およびアポE-/-ノックアウトマウス)および野生型コントロールマウスと比較する。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】アテローム性動脈硬化症の進行における相および病巣の形態(Corti et al 2001 Ann. N. Y Acad. Sci 947: 181-198)を示す説明図。
【図２】ネズミ大動脈のアテローム性動脈硬化症プラークにおけるインテグリンα10鎖の検出を示す説明図。上段の写真Aは、大動脈プラークの細胞の細胞表面のストロングステイニング(strong staining)としてのインテグリンα10鎖の染色。中段の写真Bは、インテグリンα10鎖のペプチドによるインテグリンα10鎖の染色の特異的ブロックであって、ほとんど総ての染色がペプチドによってブロックされていることを示す。下段の写真Cは、二次抗体のみを用いるコントロール染色を示す。二次抗体ロバ-抗-ウサギCy3による非特異的結合が検出される。
【図１】
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【図２】
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