(57)【要約】本発明は、UVB誘導性皮膚損傷、例えばしわを、防止および／または軽減する化合物をスクリーニングする方法を特徴とする。本方法は、p21シグナル伝達経路の構成要素の発現、活性またはレベルを増大または誘導する作用物を同定することを含む。UVB誘導性皮膚損傷を治療するための方法および組成物もまた含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
しわの出現または形成を軽減する作用物をスクリーニングする方法であって、該方法が
被験作用物を提供する段階；
被験作用物がp21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導するかどうかを判断する段階；および
p21シグナル伝達経路の構成要素の発現、活性またはレベルを増大する被験作用物の能力を、しわの出現または形成を軽減するその作用物の能力と関連づける段階
を含み、それによってしわの出現または形成を軽減する作用物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
対象の皮膚上のしわに対する作用物の効果を評価する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
p21シグナル伝達の構成要素の発現、活性またはレベルを増大する被験作用物を選択する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
判断する段階が、被験作用物がp21を増大または誘導するかどうかを判断する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験作用物が、動物性抽出物、植物性抽出物、真菌性抽出物、小分子、タンパク質、脂質、および核酸からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
判断する段階が、
(a) レポーターポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に動作可能に連結したp21シグナル伝達経路の構成要素の制御領域を含む外来核酸を含む細胞、組織、または非ヒト対象を提供する段階；および
(b) 細胞、組織、または非ヒト対象におけるレポーターポリペプチドの活性を増大させる被験作用物の能力を評価する段階
を含み、そこにおいて被験作用物がレポーターポリペプチドの活性を増大させる場合、それがp21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導すると判断される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
判断する段階が、
(a) レポーターポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に動作可能に連結したp21制御領域を含む外来核酸を含む細胞、組織、または非ヒト対象を提供する段階；および
(b) 細胞、組織、または非ヒト対象におけるレポーターポリペプチドの活性を増大させる被験作用物の能力を評価する段階
を含み、そこにおいて被験作用物がレポーターポリペプチドの活性を増大させる場合、それがp21を増大または誘導すると判断される、請求項4記載の方法。
【請求項８】
評価する段階が、対象の皮膚に作用物を局所的に投与する段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項９】
対象が実験動物である、請求項2記載の方法。
【請求項１０】
対象がヒトである、請求項2記載の方法。
【請求項１１】
UVB誘導性のしわへの作用物の効果が評価される、請求項2記載の方法。
【請求項１２】
しわを予防するかまたは治療する方法であって、該方法が、
(a)しわの予防または治療を必要としている対象を同定する段階；および
(b)該対象にp21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導する作用物を投与する段階
を含む方法。
【請求項１３】
作用物が局所的に投与される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
p21シグナル伝達経路の構成要素がp21である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
対象がUVB照射に曝露されたか、またはされようとしている、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
p21を増大または誘導する作用物を含む化粧品組成物。
【請求項１７】
化粧品成分をさらに含む、請求項16記載の化粧品組成物。
【請求項１８】
化粧品成分が芳香剤である、請求項17記載の化粧品組成物。
【請求項１９】
化粧品成分が日焼け止め剤である、請求項17記載の化粧品組成物。
【請求項２０】
記録を提供する方法であって、該方法が、
被験作用物を提供する段階；
被験作用物がp21を増大または誘導するかどうかを判断する段階；および
p21の発現、活性またはレベルを増大する被験作用物の能力を、しわの出現または形成を軽減するその作用物の能力と関連づける記録を生成する段階
を含み、それによって記録を提供する方法。
【請求項２１】
対象にしわ防御を提供する方法であって、該方法が、
対象にp21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導する組成物を提供する段階；および
対象にしわを予防または軽減するために該組成物を使用するための説明書を提供する段階
を含む方法。
【請求項２２】
p21シグナル伝達経路の構成要素がp21である、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
説明書が、日光曝露に先立って皮膚に組成物を適用する指示を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
組成物が化粧品成分をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
対象においてしわを予防するためのキットであって、該キットが、
p21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導する作用物を含む組成物；および
しわを予防するために組成物を使用するための説明書
を含むキット。
【請求項２６】
p21シグナル伝達経路の構成要素がp21である、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
組成物が化粧品成分をさらに含む、請求項25記載のキット。
【請求項２８】
説明書が、日光曝露に先立って皮膚に組成物を適用する指示を含む、請求項25記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連する出願
この出願は2002年9月20日に提出されたU. S. Provisional Application 60/412,503の利益を主張するものであり、その内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
p21（p53の下流エフェクター）は、癌制御遺伝子として機能すると考えられている。p53、p21、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Sp1、Sp3、Notch 1、およびPCNAを含むp21シグナル伝達経路は、細胞周期制御およびアポトーシスに関係しているとされてきた。従って、この経路は癌治療のための確立された標的である（Dotto (2000) Biochim. Biophys. Acta 1471: M43-M56によって概説されている）。p21は、ケラチノサイトの分化にもまた関係しているとされてきた（Topley ら (1999) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 9089; Missero ら(1995) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92: 5451 ; Missero ら(1996) Genes & Devel. 10: 3065; Prowse ら(1997) J. Biol. Cheｍ. 272: 1308; Di Cunto ら(1998) Science 280: 1069; Rangarajan ら(2001) EMBO J. 20: 3427; Santini ら(2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98: 9575）。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は、p21シグナル伝達経路が皮膚のメンテナンスおよび／または外見にとって重要であるという発明者の発見に一部基づく。特に、発明者は、p21シグナル伝達経路が皮膚損傷、例えばUVB（短波長紫外線）誘導性皮膚損傷の予防、例えばしわの防止、軽減および／または治療、において重要であることを見出した。従って、発明者は、p21シグナル伝達経路を、UVB誘導性皮膚損傷の予防および／または軽減、例えばUVB誘導性のしわの防止および／または軽減、のためのスクリーニングおよび治療方法のための標的として特定した。本発明は、従って、UVB誘導性のしわの防止および／または軽減のためのスクリーニングおよび治療方法、ならびに関連した組成物、例えば化粧品組成物を特徴とする。
【０００４】
従って、1の局面において、本発明は、UVB誘導性皮膚損傷、例えばしわ、を予防および／または軽減する作用物の、スクリーニングの方法を特徴とする。本方法はp21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、p53、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Notch 1、Sp1、またはSp3、しかし好ましくはp21、の発現、活性またはレベルを増大または誘導する作用物を同定することを含む。
【０００５】
本方法は、p21シグナル伝達経路の構成要素の発現、活性またはレベルの増大を、しわを予防または軽減する作用物の能力と関連づけること、例えば同定した作用物をしわを予防または軽減する作用物として特定すること（例えば、同定した作用物およびその使用法と関係した印刷物またはコンピュータ可読媒体、例えば情報、販売または教材用の印刷物またはコンピュータ可読媒体、を提供すること）をもまた含み得る。関連づけるとは、p21シグナル伝達経路の構成要素の発現、活性またはレベルを増大させる（そして好ましくはp21の発現、活性またはレベルを増大させる）被験作用物を、しわを予防、軽減または治療する作用物として特定することを意味する。関連づけるステップには、例えば、記録、例えば実験室の記録もしくはデータセットまたはEメールのような印刷物またはコンピュータ可読媒体を、生成または提供すること、p21シグナル伝達経路の構成要素の発現、活性またはレベルを増大させる（そして好ましくはp21の発現、活性またはレベルを増大させる）被験作用物を、しわを予防、軽減または治療できる作用物として特定すること、が含まれ得る。その記録には、例えば特異的被験作用物識別子、日付、方法の操作者、または被験作用物の源、構造、精製の方法、もしくは生物活性などのその他の情報が含まれ得る。記録または記録に由来する情報は、例えば、被験作用物を薬学的または治療学的使用のための化合物または候補作用物（リード化合物）として同定するために用いることができる。同定した作用物は、しわの治療または軽減のための作用物または可能性のある作用物として特定することができる。この方法によって同定された作用物、例えば化合物は、例えばしわのための治療（または療法、例えば化粧法など、の開発）において用いることができる。
【０００６】
1の態様において、本方法には、例えばしわと関連したパラメータ、例えばしわの存在、範囲、またはタイプなどを評価すること；および、スクリーニングから作用物、例えば皮膚への損傷を予防または軽減する、例えば皮膚のしわを予防または軽減する作用物を選択することなど、作用物の皮膚への効果を評価、例えば測定、することが含まれる。好ましくは、作用物の皮膚への効果を評価することには、作用物を組織または対象に、例えば局所的に、投与し、しわと関連したパラメータ、例えば組織または対象におけるしわの存在、範囲、またはタイプを、選択的に参照値、例えば対照または基礎値、例えば異なるように処理された、例えば作用物が投与されていない、組織または対象における同様なパラメータの値と、比較することが含まれる。作用物の皮膚への効果は、皮膚損傷の源、例えばしわ形成を誘発する作用物または処理、例えばUVB照射、の非存在または存在において評価できる。一部の態様においては、評価には、評価のための値、例えばしわの存在、範囲、またはタイプなどを、データベースまたはその他の記録に入力することが含まれる。
【０００７】
好ましい態様において、作用物は、UVB誘導性のしわを予防または軽減する能力について評価される。
【０００８】
好ましい態様において、対象は、実験動物、例えば野生型またはトランスジェニック実験動物、例えばげっ歯類動物、例えばラット、マウスまたはモルモットである。対象はヒトであってもよい。好ましい態様において、評価するステップは、作用物を対象の皮膚に、例えば局所的に、投与することを含む。
【０００９】
好ましい態様において、p21の発現、活性またはレベルを増大または誘導する作用物が同定される。
【００１０】
好ましい態様において、同定ステップには、(a) レポーターポリペプチド（例えば光に基づく、例えば比色または蛍光検出性ラベル、例えば蛍光レポーターポリペプチド、例えばGFP、EGFP、BFP、RFP）をコード化するヌクレオチド配列に動作可能に連結したp21シグナル伝達経路の構成要素の制御領域（例えばプロモータ）を含む外来核酸を持つ細胞、組織、または非ヒト動物を提供すること；(b) 細胞、組織、または非ヒト動物におけるレポーターポリペプチドの活性を増大させる被験作用物の能力を評価すること；および(c)レポーターポリペプチドの活性を増大させる被験作用物を、p21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導させる作用物として選び出すこと；が含まれる。1の態様において、細胞または組織は、皮膚の細胞または組織、例えばケラチノサイト細胞または組織、例えば皮膚の外植片である。別の態様において、非ヒト動物は、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニックげっ歯動物、例えば、核酸を持ったマウス、ラット、またはモルモットである。1の態様においては、p21シグナル伝達経路の構成要素はp21である。
【００１１】
1の態様において、本方法には2つの評価ステップが含まれ、例えば本方法には、第1の系、例えば細胞または組織系において、被験作用物を評価する第1のステップ、および第2の系、例えば第2の細胞もしくは組織系または非ヒト動物において、被験作用物を評価する第2のステップなどが含まれる。その他の態様において、本方法には、同じタイプの系における2つの評価ステップ、例えば作用物が非ヒト動物における第1の評価の後で同じかまたは異なる非ヒト動物において再評価されるステップ、が含まれる。2つの評価は、任意の期間、例えば日単位、週単位、月単位、年単位によって隔て得る。
【００１２】
好ましい態様において、UVB誘導性のしわへの作用物の効果が評価される。例えば、作用物はUVB曝露の前、間、および／または後において評価される。
【００１３】
p21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、の発現、活性またはレベルを増大または誘導する作用物は、未精製もしくは半精製の抽出物、例えば有機性、例えば動物性または植物性の抽出物、または単離化合物、例えば小分子、タンパク質、脂質もしくは核酸、であり得る。特に好ましいものは、天然に生ずる物質または抽出物、例えば植物または真菌性抽出物である。例えば作用物は、(a) p21シグナル伝達経路のポリペプチド性構成要素、例えばp21ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは模倣物；(b) p21シグナル伝達経路の活性を増大する、例えばp21、p53、サイクリン／CDK複合体の形成もしくは核局在、p300、CBP、NFkB、Sp1、またはSp3を増大する、p21シグナル伝達経路の構成要素のペプチド性またはタンパク質性アゴニスト；(c) p21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、p53、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Sp1、およびSp3の発現を、例えばその遺伝子のプロモータ領域に結合することによって、増大する小分子；(d) 抗体、例えばp21経路の構成要素に結合し、結合パートナーとの結合、例えばp21のサイクリン／CDKへの結合を、安定化または補助する抗体； (e) 化合物、例えば有機化合物、例えば p21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、p53、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Sp1、およびSp3、の発現を増大する天然に生ずるまたは合成の有機化合物、または； (f) p21経路のポリペプチドまたはその機能的断片もしくはアナログをコード化するヌクレオチド配列、のうち任意のものであり得る。ヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはDNA配列であり得る。ヌクレオチド配列には、p21経路構成要素のコード化領域；プロモータ配列、例えばp21経路構成要素遺伝子またはその他の遺伝子からのプロモータ配列；エンハンサー配列；非翻訳制御配列、例えば5'非翻訳領域（UTR）、例えば、p21遺伝子またはその他の遺伝子からの5'UTR、3'UTR 、例えばp21遺伝子またはその他の遺伝子からの3' UTR；ポリアデニル化部位；インスレーター配列；が含まれ得る。別の好ましい態様において、p21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、p53、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Sp1、またはSp3のレベルは、p21シグナル伝達経路の内在の構成要素、例えばp21、p53、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Sp1、またはSp3の発現のレベルを増大させることによって、例えばp21遺伝子の転写を増大させることまたはp21 mRNAの安定性を増大させることによって、増大する。好ましい態様において、p21遺伝子の転写は、内性因子p21遺伝子の制御配列を、例えば体細胞において、例えば正の制御要素（例えばエンハンサーまたは転写活性化因子のDNA結合部位など）の付加によって、改変すること；負の制御要素（例えば転写抑制因子のDNA結合部位など）を除去すること；および／または内在の制御配列もしくはその要素を別の遺伝子のそれと置換することによって、p21遺伝子のコード化領域がより効率的に転写されるようにすること；により増大する。好ましい態様において、作用物は未精製または半精製の植物性抽出物中にある。
【００１４】
別の局面において、本発明は、皮膚を治療する、例えばしわを予防または軽減する方法を、特徴とする。本方法には、(a)しわの予防または治療を必要としている対象を特定すること；および(b) 対象においてp21シグナル伝達経路の構成要素を増大または誘導すること、例えば対象にp21シグナル伝達経路の構成要素の活性、レベル、または発現を増大または誘導する効果的な量の作用物、例えば本明細書に記載されている作用物、を投与することが含まれる。好ましくは、作用物は対象の皮膚に、例えば局所的に、投与される。作用物は、顔、胸、首、手、および身体のその他の部位に投与され得る。治療は、作用物の1回より多くの投与、例えば少なくとも2回、3回、または4回の投与を含み得る。治療は作用物の毎日の投与をも含みうる。
【００１５】
好ましい態様において、作用物はp21の発現、レベル、または活性を増大または誘導する。
【００１６】
好ましい態様において、対象はUVB照射に曝露されたか、またはされようとしている。
【００１７】
好ましい態様において、本方法はしわに対する投与の効果を評価することを含む。
【００１８】
しわを予防するかまたは治療することを必要としている対象の特定は、例えば対象によって、医療サービス提供者によって、または化粧品の提供者によって実行し得る。作用物は、例えば対象によって、医療サービス提供者によって、または化粧品の提供者によって投与される可能性がある。同様に、しわ形成の効果の評価は、例えば対象によって、医療サービス提供者によって、または化粧品の提供者によって実行される可能性がある。
【００１９】
別の局面において、本発明は、しわ、例えばUVB誘導性のしわ、を予防または軽減するために、p21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、の発現活性またはレベルを増大または誘導する作用物、例えば本明細書に記載されている作用物、例えば本明細書に記載されているスクリーニング方法で同定した作用物、を含む組成物をもまた特徴とする。好ましい態様において、作用物は薬学的に許容される組成物中に提供される。好ましい態様において、組成物は無菌である。組成物は、皮膚に使用したとき、（例えば一時的に）しわの出現を、例えば少なくとも1から100日、より好ましくは7から90日、さらにより好ましくは14から60日の間、予防または軽減するために効果的であるか、またはそれはしわの出現をより長い期間、例えば少なくとも3から9ヶ月、より好ましくは4から8ヶ月、もしくはおよそ6ヶ月、予防または軽減するために効果的であり得る。好ましい態様において、組成物は、芳香、保存料、またはその他の化粧品成分、例えば保湿剤、または日焼け止め剤、例えばメトキシケイヒ酸オクチル、アミノ安息香酸、オキシベンゾン、パディメート０、ホモサラート、もしくは二酸化チタン、をもまた含む。組成物は、オイル、クリーム、ローション、フォーム、ゲル、またはその他の化粧品製剤において提供され得る。
【００２０】
別の局面において、本発明は、対象にp21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、の発現活性またはレベルを増大または誘導する作用物、例えば本明細書に記載されている作用物、例えば本明細書に記載されているスクリーニング方法で同定した作用物、を含む組成物を、好ましくは紫外線曝露、例えばUVB、例えば日光暴露の、前または後に適用する説明書とともに供給することによって、対象にしわ防御を提供する方法を特徴とする。
【００２１】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載されている組成物、例えばp21シグナル伝達経路の構成要素、例えばp21、の発現活性またはレベルを増大または誘導する作用物；および、使用のための説明書、例えば組成物を、紫外線、例えばUVB、例えば日光暴露の、前または後に適用する説明書を含む、対象にしわ防御を提供するためのキットを特徴とする。
【００２２】
本発明の作用物の効果的な量は、対象への投与に際して、対象におけるしわの形成を予防するか、または対象におけるしわの出現を軽減する組成物の量と定義される。対象に投与すべき効果的な量は、一般的に、年齢、性別、表面積、体重、および皮膚の状態を含む様々な要因に基づく。身体の表面積は、患者の身長および体重から概算的に求めることが可能である。例えば、Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537を参照のこと。効果的な用量は、当業者によって認められるように、投与経路、賦形剤の使用、および、その他のしわを軽減する化合物の使用などのその他の治療との共使用の可能性に依存して、様々となる。
【００２３】
本明細書に使用される「しわを予防または軽減する」とは、しわを有するか、もしくはしわができやすい、またはしわの原因となるおそれのある作用物、例えば紫外線照射、例えばUVB照射、に曝露された対象への、しわの出現またはしわの形成についての予防、軽減、改善、緩和、変化、救済、改良、または影響を目的とした、治療剤の使用または投与を意味する。本発明の化合物は、対象自身によって、または別の人間、例えば医療サービス提供者もしくは化粧品提供者によって、対象に投与され得る。本方法の好ましい態様において、しわ、例えば縮緬皺は、対象において、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、25%またはそれより多く、予防または軽減される。
【００２４】
本方法および組成物は、予防的に（例えばしわが出現する前に）使用でき、またはそれらは、対象においてさらなるしわ形成を予防するか、またはしわの出現を軽減するために使用できる。しわを予防または治療するための薬品または化粧品の製造のための本組成物の使用は、本発明の範囲内にある。
【００２５】
詳細な説明
発明者は、p21シグナル伝達経路を、UVB誘導性皮膚損傷の予防および／または軽減、例えばしわの予防および／または軽減のための、スクリーニングおよび治療方法、ならびに関連する化粧品組成物の標的として特定した。
【００２６】
しわ
しわは一般に皮膚の自然な老化過程、および日光の紫外線への曝露の結果である。しわは、組織学的なレベルでの特異的構造変化を伴わない、皮膚の表面における形状変化である。一般に、しわは、参照として本明細書に組み入れられるKligmanら（1985）Br J Derm 113:37-42に記載されているとおりに分類される。Kligmanは、しわを3つのクラス、線状皺、縦溝状皺、および縮状皺に分類する。線状皺は、直線状であり、一般に顔面の皮膚において見出され、自然の老化または紫外線への曝露に起因する。縦溝状皺は、外見的にしわの三角形または四角形の形をなし、太陽光に曝される顔面、手、および首に見出され、紫外線への曝露または日光性皮膚症（dermatoheliosis）によって悪化する。縮状皺は、たるんだ皮膚上の細い縮れたしわで、皮膚のどこにでも見出されるが、主として手の甲および眼瞼に見出される。
【００２７】
しわの形成または出現に対する化合物の効果は、例えば目視試験によって質的に、または例えば顕微鏡もしくはコンピューターを介したしわの形態の測定によって量的に評価できる。好ましくは、しわの形態は量的に解析され、例えば皮膚の単位面積あたりの数、深さ、長さ、面積、体積、および／または広さが測定される。しわを測定するための定量的方法の例には、限定するものではないが、参照として本明細書に組み入れられるHoshinoら（1992）Pixel 45:121提案の、レーザー光線を用いた光学的切断手法；または、例えばShiseido Wrinkle Analyzer 3D Pro system（Takasuら（1996）J Soc Cosmet Chem Japan 29:394-405）などの、3次元皮膚レプリカを解析する方法が含まれる。
【００２８】
スクリーニングの方法
p53、p21、サイクリン／CDK複合体、p300、CBP、NFkB、Sp1、およびSp3を含むp21シグナル伝達経路は、よく特徴づけられている。経路の構成要素はクローン化されていて、それらのタンパク質および遺伝子配列は、当業者に容易に利用可能である。例えば、p21 cDNAおよび遺伝子のクローニングは、Xiongら(1993) Nature 366 (6456): 701-4; GenBank Accession Nos. S67388, AAB29246, およびNM_078467)に記載されている。P21レポーター・コンストラクトは、例えばDatto ら (1995) J. Biol. Chem. 270, 28623-28628に記載されている。
【００２９】
作用物が特定のタンパク質の発現または活性またはレベルを変ずるかどうかを評価するための、多数の方法が存在する。1の態様において、p21プロモータからの発現を（例えば永続的にまたは一時的に）調節する（例えば増大または減少させる）被験作用物の能力が、例えば通常のレポーター（例えばLacZまたはGFP）転写アッセイによって評価される。例えば、細胞またはトランスジェニック動物であって、それらのゲノムがp21プロモータと動作可能に連結されたレポーター遺伝子を含むものを、被験作用物と接触させることができ、レポーター活性を増大または減少させる被験作用物の能力は、色素沈着を調節する作用物の能力を示す。別の態様において、p21の発現、またはp21の活性もしくはレベルを調節する被験作用物の能力は、トランスジェニック動物、例えば本明細書に記載されているトランスジェニック動物において、評価される。p21の発現、またはp21の活性もしくはレベルへの被験作用物の効果は、細胞もしくは細胞可溶化液、または対象、好ましくは非ヒト実験動物、より好ましくはげっ歯動物（例えばラット、マウス、ウサギ）、またはそれらの外植片（例えば皮膚）を使用して、評価される可能性がある。p21発現を評価する多数の方法、例えばノザーン解析、リボヌクレアーゼ・プロテクション検定、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）またはRNAインサイチュ・ハイブリダイゼーションなどが、当分野において知られている（例えばSambrookら、 Molecular Cloning : A Laboratory Manual （第3版、2001）を参照のこと）。p21のレベルは、例えばウエスタン解析、免疫学的検定、またはインサイチュ・ハイブリダイゼーションによって、モニターされる可能性がある。p21の活性（例えば、変化したプロモータ結合活性および／または転写活性）は、例えば電気泳動モビリティー・シフトアッセイ、DNAフットプリント、またはレポーター遺伝子検定によって、求められる可能性がある。好ましくは、p21の発現またはp21の活性もしくはレベルへの被験作用物の効果は、トランスジェニック細胞または非ヒト動物、またはそれから由来する外植片もしくは細胞を使用して、評価される。
【００３０】
被験作用物
本明細書に記載されているスクリーニング方法において試験されるべき作用物には、未精製のもしくは精製された有機源の抽出物、例えば動物性または植物性抽出物、および半分もしくは完全に精製されたまたは合成の作用物、例えば小分子、ポリペプチド、脂質および／または核酸、およびそれらのライブラリーが含まれる。癌治療学において有用なp21またはp53癌制御活性の誘導因子として以前に同定されている作用物は、本明細書に記載されているしわに関連した方法または組成物において試験および／または使用することができる。
【００３１】
投与
しわの予防または軽減のための組成物は、経口、局所、皮下、腹腔内、筋肉内、鼻腔内、および静脈内を含む、非経口経路を介して投与される可能性がある。局所投与が好ましい。組成物の連続投与、例えば連続局所投与を利用することができる。一つより多くの投与の経路を同時に、例えば局所投与を経口投与と共同して、利用することができる。非経口投薬形態の例としては、等張食塩水、5%グルコースまたはその他のよく知られた医薬的に許容できる賦形剤における活性作用物の水溶液が挙げられる。サイクロデキストリンのような可溶化剤、または本分野に親しい者によく知られたその他の可溶化剤を、しわ軽減組成物の送達のための薬学的賦形剤として用いる事ができる。
【００３２】
本発明の組成物は、慣用的な方法を利用するその他の投与経路のための投薬形態に配合することもできる。薬学的組成物は、例えば経口投与のための投薬形態、カプセル、錠剤（それぞれ持効性および除放性の配合を含む）、またはゲルシール、に配合できる。カプセルは、例えばゼラチンまたはセルロース誘導体のような、任意の標準的な薬学的に許容できる素材を含む可能性がある。錠剤は、p21誘導性化合物および固形担体、および潤滑剤の混合物を圧縮することにより慣用的な手段に基づいて配合される可能性がある。固形担体の例には、でんぷんおよび糖ベントナイトが含まれる。しわを軽減する組成物は、例えば結合剤としての乳糖またはマンニトール、慣用的な充填剤、および錠剤加工剤を含む、殻の固い錠剤またはカプセルの形状においても投与され得る。
【００３３】
本明細書に記載されている、しわを軽減する化合物の局所的投与は、上述の多くの異なる経路のうち、好ましい投与の経路を提示する。局所的投与のために、本発明の組成物は、皮膚と相性のよい媒体を含み得る。そのような局所的な薬学的組成物は、様々な形状、例えば、溶液、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、シャンプー、またはエアロゾルの形状の、皮膚への適用に適した製剤形態で存在し得る。本発明のしわ軽減組成物には、例えばアルコール、アロエゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンAおよびEオイル、ミネラルオイル、ならびにポリエチレングリコールのような、多種多様な担体素材を用いることができる。その他の添加物、例えば保存料、芳香剤、日焼け止め剤、またはその他の化粧品成分が組成物中に存在し得る。局所的組成物は、速やかに適用および除去でき、あるいはそれを適用してから、長時間、例えば一昼夜または終日に渡って、皮膚表面上、例えば顔面に、残したままにできる。
【００３４】
キット
作用物、例えば本明細書に記載されている方法を介して同定された作用物は、キットの状態で提供できる。キットには、(a)作用物、例えば作用物を含む組成物；および(b)情報資料が含まれる。情報資料は、本明細書に記載されている方法および／または本明細書に記載されている方法のための作用物の使用に関係した、説明用の、教育上の、マーケティング用の、またはその他の資料であり得る。例えば、情報資料は、しわまたはそれらの予防または軽減に関係する。
【００３５】
1の態様において、情報資料は、本明細書に記載されている方法を実行するために適した様式において、例えば適した用量、投薬形態、または投与の方式（例えば、本明細書に記載されている用量、投薬形態、または投与の方式）において、作用物を投与するための説明書を含み得る。好ましい用量、投薬形態、または投与の方式は、局所的、例えば皮膚の表面上である。別の態様において、情報資料は、適した対象、例えばヒト、例えばしわを有するかまたはその危険性があるヒト、に作用物を投与する説明書を含み得る。例えば、資料は、作用物を顔、首または手に投与するための説明書を含み得る。
【００３６】
キットの情報資料は、その形状において制限はない。多くの場合、情報資料、例えば説明書は、印刷物、例えば印刷された文章、図、および／または写真、例えばラベルまたは印刷されたシートの状態で、提供される。しかしながら、情報資料は、その他の形状、例えば点字、コンピュータ可読データ、ビデオ撮り、または録音においてもまた提供することができる。別の態様において、キットの情報資料は、そこでキットの利用者が作用物および／または本明細書に記載の方法におけるその使用について重要な情報を得ることができる窓口案内、例えば実際の住所、電子メールアドレス、ウェブサイト、または電話番号である。もちろん、情報資料は任意の形状の組み合わせにおいても提供することができる。
【００３７】
作用物に加えて、キットの組成物は、例えば溶媒もしくは緩衝液、安定剤、保存料、芳香剤、またはその他の化粧品成分、および／または本明細書に記載されている状態もしくは疾患を治療するための第2の作用物などの、その他の成分、例えば日焼け止めを含み得る。または、その他の成分を、但し作用物とは異なる組成物または容器の中において、キットに含ませることができる。そのような態様において、キットは、作用物およびその他の成分を混合するための、または作用物をその他の成分と共に使用するための説明書を、含み得る。
【００３８】
作用物は任意の形状、例えば液体、乾燥、または凍結乾燥形状、において提供できる。作用物は、実質的に純粋および／または無菌であることが好ましい。作用物が溶液の状態で提供される場合、溶液は水溶液であることが好ましく、無菌水溶液であることが好ましい。作用物が乾燥形状として提供される場合、再構成は通常適当な溶媒の添加による。溶媒、例えば無菌の水または緩衝液は、選択的にキットの中に提供され得る。
【００３９】
キットは、作用物を含む組成物のための1つまたは複数の容器を収納し得る。一部の態様において、キットは組成物および情報資料のための別々の容器、仕切り、または区画を収納する。例えば、組成物は瓶、バイアル、または注射器に収納することができ、情報資料はプラスチック製スリーブまたは小さい包に収納することができる。その他の態様において、キットの別々の要素は、単一の分割されていない容器の中に収納される。例えば、組成物は、瓶、バイアル、または注射器であって、そこにラベルの形状の情報資料が添付されているものに収納される。一部の態様において、キットには、各々が作用物の1つまたは複数単位の投薬形態（例えば本明細書に記載されている投薬形態）を含む複数の（例えば一パックの）独立した容器が含まれる。例えば、キットには、各々が単一単位用量の作用物を収納する複数の注射器、アンプル、ホイルの小さい包、またはブリスターパックが含まれる。キットの容器は、気密および／または防水であり得る。
【００４０】
キットには、選択的に、組成物の投与に適した装置、例えば、注射器、吸入剤、ピペット、ピンセット、計測スプーン、ドロッパー（例えば点眼瓶）、スワブ（綿棒または木製スワブ）または任意のそのような送達装置、が含まれる。
【００４１】
本発明のしわを軽減する組成物およびそのような組成物の生物試験を説明する、以下の具体的な実施例は、一例に過ぎず、何であれ決して本開示の残りの部分を制限するものでないと解釈されるべきである。
【００４２】
実施例
実施例1： p21ノックアウトマウスは、しわの形成の増大を示す
野生型およびp21ノックアウト雌マウス（8週齢）は、毛を刈り込んでから、UVB（累積UVB用量：6.4J/cm2）を照射した。UVB照射を受けない野生型マウスは対照として使用した。マウスはしわ形成の程度につき評価し、次のような5つのカテゴリーの各々のうちの1つに割り振った：  0、しわなし；  1、わずかなしわ；  2、はっきりしたしわ；  3、強いしわ；  4、重度のしわ（表1、n=2）。長期間のUVB照射は、p21欠損雌マウスにおいて、野生型マウスと比較して、顕著なしわ形成をもたらした。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
p21ノックアウトマウスにおいて、野生型および非照射のマウスと比較して、より多くのしわが観察された。組織学的解析により、p21ノックアウトマウスにおいて、野生および非照射の野生マウスと比較して、真皮上部および真皮の弾性組織において炎症細胞の蓄積が示された。
【００４５】
実施例2：p21ノックアウトマウスはUVB照射によってより多くの炎症を示す
UVB照射（112mJ/cm2）の後に耳が腫脹する反応を雄マウス（8週齢、n=3）において評価した。耳の厚さは標準的な隙間ゲージ（Mitsutoyo Corp）によって測定した。結果を表2に示す。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
p21ノックアウトマウスにおいては、野生型のマウスと比較して、UVB照射後、より多くの腫脹が観察された。
【００４８】
実施例3：p21ノックアウトマウスはしわ形成の増大を示す
雌マウスは、UVB照射期間（8〜18週齢）中に第3毛周期に入る。雄マウスは、照射期間中に第3毛周期に入らないため、長期UVB照射の代替モデルである。
【００４９】
雄マウス（8週齢）は、毛を刈り込んでから、UVBを照射した。長期UVB照射（累積UVB用量：1.4J/cm2）は、p21欠損雄マウスにおいて、野生型マウスと比較して、顕著なしわ形成をもたらした（表3、n=4）。マウスはしわ形成の程度につき評価し、次のような5つのカテゴリーの各々のうちの1つに割り振った：  0、しわなし；  1、わずかなしわ；  2、はっきりしたしわ；  3、強いしわ；  4、重度のしわ。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
組織学的解析により、p21ノックアウトマウスにおいて、野生型および非照射の野生マウスと比較して、真皮上部ならびに真皮の弾性組織および線維において炎症細胞の蓄積の増大が示された。
【００５２】
同等物
当業者は、本明細書に記載されている発明の具体的態様の多くの同等物を認め、または通常のものに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。そのような同等物は、特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【国際調査報告】
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