(57)【要約】【課題】小分子、タンパク質、及び核酸の細胞内輸送【解決手段】アミノ酸配列Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）として機能し、小分子、タンパク質、及び核酸を細胞の細胞内区画に輸送することができる。アミノ末端リシンリンカーは、ＰＴＤの効率を改良する。核局在シグナルは、ＰＴＤを細胞の核に向けるために用いることができる。ＰＴＤは、細胞を可逆的に不死化することができ、また、培養中の細胞の生存度を上昇することができる、ＰＴＤ-カーゴ部分複合体中で用いることができる。
2006521819.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有する単離及び精製されたポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドであって、そのアミノ末端にLys-Xaa-Xaaをさらに含み、該Xaaが小さい中性極性即ち非極性のアミノ酸であるポリペプチド。
【請求項３】
請求項２のポリペプチドであって、前記アミノ酸配列がLys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：２)であるポリペプチド。
【請求項４】
Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)をコードする、単離及び精製されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む複合体であって、前記ＰＴＤがArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む複合体。
【請求項８】
前記カーゴ部分が、小分子、核酸、及びポリペプチドから成る群から選択される、請求項７の複合体。
【請求項９】
請求項８の複合体であって、前記カーゴ部分が小分子であり、該小分子が、放射性核種、蛍光マーカー、染料、及び医薬品から成る群から選択される複合体。
【請求項１０】
請求項８の複合体であって、前記カーゴ分子がポリペプチドであり、該ポリペプチドが、不死化タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、及び抗体から成る群から選択される複合体。
【請求項１１】
請求項１０の複合体であって、前記ポリペプチドが不死化タンパク質であり、該不死化タンパク質が、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼから成る群から選択される複合体。
【請求項１２】
請求項１０の複合体であって、前記ポリペプチドが抗アポトーシスタンパク質であり、該抗アポトーシスタンパク質が、突然変異体p53及びBclxLから成る群から選択される複合体。
【請求項１３】
前記複合体が融合タンパクである、請求項７の複合体。
【請求項１４】
ポリペプチドカーゴ分子に結合されたArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む融合タンパクをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
以下の工程を具備する、カーゴ部分を培養細胞の細胞内区画に輸送する方法：
細胞をインビトロで、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む複合体と接触させること、ここにおいて、該ＰＴＤはArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含み、それによって、前記カーゴ部分が前記細胞の細胞内区画に輸送される。
【請求項１８】
以下の工程を具備する、培養中の細胞を可逆的に不死化する方法：
細胞をインビトロで、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む複合体と接触させること、ここにおいて、前記ＰＴＤはArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含み、前記カーゴ部分が不死化タンパク質であり、それによって前記細胞が可逆的に不死化される。
【請求項１９】
前記複合体を、前記細胞培養培地から除去して不死化を逆転させる工程をさらに具備する、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記細胞は一次細胞である、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記一次細胞が、脂肪細胞、星状細胞、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺性細胞、グリア細胞、造血性細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、卵巣細胞、膵臓ベータ細胞、腎臓細胞、平滑筋細胞、及び横紋筋細胞から成る群から選択される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記不死化タンパク質がＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼから成る群から選択される、請求項１８の方法。
【請求項２３】
請求項１８の方法によって可逆的に不死化された細胞。
【請求項２４】
以下の工程を具備する、培養中の細胞の生存度を上昇させる方法：
細胞をインビトロで、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む複合体と接触させること、ここで、前記カーゴ分子は抗アポトーシスタンパク質である。
【請求項２５】
前記抗アポトーシスタンパク質は、突然変異体p53及びBclxLから成る群から選択される、請求項２４の方法。 
【請求項２６】
前記細胞が一次細胞（primary cell）である、請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記ＰＴＤが、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む、請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記一次細胞が、脂肪細胞、星状細胞、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺性細胞、グリア細胞、造血性細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、卵巣細胞、膵臓ベータ細胞、腎臓細胞、平滑筋細胞、及び横紋筋細胞から成る群から選択される、請求項２６の方法。
【請求項２９】
化学的クロスリンカーをさらに含む、請求項１のポリペプチド。
【請求項３０】
前記化学的クロスリンカーは、マレイミドまたは3-ニトロ-2-ピリジルジチオ基である、請求項２９のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜を横切ってカーゴ部分を運搬する「細胞内輸送」を促進するペプチドの分野に関する。特に、小分子、タンパク質、及び核酸の細胞内輸送のためのタンパク質導入ドメインとして機能するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜は、細胞質とその外側の環境の間の非常にすぐれたバリヤーを提供する。細胞は一般に、小分子、タンパク質、及び核酸に不透過性である。小分子のなかには細胞膜を横切って拡散できるものもあるが、その拡散速度は有用であるには緩慢すぎる。
【０００３】
小分子、タンパク質、及び核酸を細胞の細胞内区画に輸送するための、試薬及び方法が存在する。そのような試薬及び方法の例には、脂質、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、遺伝子銃粒子照射、組換えウイルス感染、及び直接微量注入法が含まれる。現在の試薬及び方法の殆どは、細胞に有毒であるか、またはわずかな細胞のみが小分子、タンパク質、または核酸を受け取ることになる。加えて、現在の試薬及び方法は、小分子、タンパク質、または核酸の、インビボでの細胞への輸送には実用的でない。
【０００４】
幾つかのペプチドは、細胞膜を通過して細胞内に入る能力を有する。それらのペプチドは、「タンパク質導入ドメイン」（ＰＴＤｓ）と名付けられ、カーゴ部分に結合可能であり、細胞膜を横切ってカーゴ部分を細胞内へ輸送することができる。そのような輸送は、そのペプチドが細胞膜を横切ってカーゴ部分を細胞内へ輸送するために「ペプチド輸送」と名付けられる。カーゴ部分は小分子、タンパク質、または核酸であってよい。
【０００５】
ペプチド輸送は、細胞膜を横切って、小分子、タンパク質、または核酸を細胞の細胞内区画へ輸送する新しい方法を提供する。良く特徴付けられたタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）の一つは、tat-由来ペプチドである。フランクルら（Frankel et al.）(米国特許第5,804,604, 米国特許第5,747,641, 米国特許第5,674,980, 米国特許第5,670,617, 及び米国特許第5,652,122)は、アミノ酸49-57のtatを含むペプチドをカーゴタンパク質に接合することによって、カーゴタンパク質（β-ガラクトシダーゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼ）の細胞内への輸送を実証した。
【０００６】
ペネトラチン（penetratin）は、細胞膜を横切って親水性巨大分子を輸送することができる(Derossi et al., Trends Cell Biol., 8:84-87 (1998))。ペネトラチンは、アンテナペディア、ショウジョウバエ転写因子のホメオドメインのアミノ酸43-58に対応し、培養中の細胞によって内部に取り入れられる、１６のアミノ酸ペプチドである。しかしながら、５５塩基より長い核酸及び１００アミノ酸より長いタンパク質のペネトラチン媒介ペプチド輸送は、非効率的である。
【０００７】
単純ヘルペスウイルス・タイプ１（ＨＳＶ−１）の外皮タンパク質、ＶＰ２２は、タンパク質及び細胞膜を横切って核酸を輸送する能力を有している(Elliot et al., Cell 88:223-233, 1997)。ＶＰ２２の残基267-300は、必要であるが、しかし輸送には十分ではない。輸送機能の原因である領域が同定されていないために、全ＶＰ２２タンパク質が通常、カーゴタンパク質及び核酸を、細胞膜を横切って輸送するために用いられる(Schwarze et al., Trends Pharmacol Sci, 21:45-48, 2000)。
【０００８】
細胞膜を横切って、細胞の細胞内区画へカーゴ部分を効率的に輸送できるペプチドが、当該分野では引き続き必要である。
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一つの態様において、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を有する単離及び精製されたポリペプチドが提供される。該ＰＴＤは、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。
【００１０】
本発明の他の態様において、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)をコードする単離及び精製されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１１】
本発明のさらに他の態様において、ベクターが提供される。該ベクターは、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１２】
本発明のさらに他の態様において、宿主細胞が提供される。該宿主細胞は、ベクターを含む。該ベクターは、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１３】
本発明の他の態様において、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む副導体が提供される。該ＰＴＤは、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。
【００１４】
本発明のさらに他の態様において、融合タンパクをコードするポリヌクレオチドが提供される。該融合タンパクは、ポリペプチドカーゴ部分に結合されたArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。
【００１５】
本発明のさらに他の態様において、ベクターが提供される。該ベクターは、融合タンパクをコードするポリヌクレオチドを含む。該融合タンパクは、ポリペプチドカーゴ部分に結合されたArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。
【００１６】
本発明のさらに他の態様において、宿主細胞が提供される。該宿主細胞はベクターを含む。該ベクターは、融合タンパクをコードするポリヌクレオチドを含む。該融合タンパクは、ポリペプチドカーゴ部分に結合されたArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。
【００１７】
本発明の他の態様において、カーゴ部分を培養細胞の細胞内区画に輸送するための方法が提供される。細胞は、複合体とインビトロで接触される。該複合体はカーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む。該ＰＴＤはArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。該カーゴ部分はそれによって、前記細胞の細胞内区画に輸送される。
【００１８】
本発明のさらに他の態様において、培養中の細胞を可逆的に不死化する方法が提供される。細胞は、複合体にインビトロで接触される。該複合体は、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む。該ＰＴＤはArg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。該カーゴ部分は不死化タンパク質である。該細胞はそれによって可逆的に不死化される。
【００１９】
本発明のさらに他の態様において、可逆的に不死化された細胞が提供される。該細胞は、該細胞をインビトロで複合体に接触させる方法によって可逆的に不死化される。該複合体は、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む。該ＰＴＤは、Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を含む。該カーゴ部分は不死化されたタンパク質である。該細胞はそれによって可逆的に不死化される。
【００２０】
本発明のさらに他の態様において、培養中の細胞の生存度を上昇させる方法が提供される。細胞は複合体にインビトロで接触される。該複合体は、カーゴ部分に結合されたＰＴＤを有するポリペプチドを含む。該カーゴ部分は抗アポトーシスタンパク質である。
【００２１】
本発明は、このように、カーゴ部分を細胞の細胞内区画に輸送するための試薬及び方法に関する技術を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００２２】
本願は、２００３年３月４日出願の米国仮出願番号60/451,243の優先権を主張し、その全ての内容を参考として本明細書に援用する。
【００２３】
タンパク質導入ドメイン
アミノ酸配列Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)を有するタンパク質導入ドメインを有するポリペプチドは、細胞膜を通過し、カーゴ部分を細胞の細胞内区画に輸送可能であるという、予想外の性質を有する。配列番号：１は、WO 01/15511の「内部移行化ペプチド（internalizing peptide）」として確認されている、Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Thr-Ser-Lys-Met-Lys-Arg (配列番号：２５)の逆異性体である。
【００２４】
ウェンダーらは、tat-由来ペプチド（配列番号：２３）の逆異性体（逆tat）が、tat-由来ペプチド（配列番号：２４）（tat）の約３倍効率的に原形質膜を通過できることを報告している（Wender et al. (Proc. Natl. Acad. Sci USA, 97:13003-13008, 2000)）。ウェンダーらは、輸送がキラリティーの機能ではないと結論付けた。逆tat（配列番号：２３）による輸送の効率の上昇の理由は、しかしながら、逆tatペプチド（配列番号：２３）のアミノ末端におけるアルギニン含有量に起因した。逆tat（配列番号：２３）の最初の３アミノ酸はアルギニンであるのに、tat（配列番号：２４）は最初の３アミノ酸内にアルギニンを一つだけ含有する。tat（配列番号：２４）において、アルギニン含有量はカルボキシ末端で最も高い。配列番号：１におけるアルギニン含有量はカルボキシ末端内で最も高い。よって、tat（配列番号：２４）またはWO 01/15511ペプチド（配列番号：２５）よりも、より効率的なＰＴＤとして機能する配列番号：１のペプチドの能力は、予想外のものである。
【００２５】
ＰＴＤｓの生成
本発明のＰＴＤｓは、ペプチド合成の技術において知られている任意の方法によって産生されることができる。例えば、ＰＴＤｓは、化学的に合成されることができ、また、組替え的に生産されることができる。
【００２６】
化学合成
ＰＴＤｓは、例えば、Ｆｍｏｃ又はｔＢＯＣ化学（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995）を用いて、固相又は液相で合成されることができる。ペプチド合成は、手動技術を用いて、又は自動操作によって行われることができる。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ431Ａペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。
【００２７】
組換え発現
ペプチドは、該ペプチドのコーディング配列をクローニングし、それをインビトロで発現させることによって組換え的に生産されることができる。ＰＴＤをコードする任意のポリヌクレオチド配列が使用可能である。ポリヌクレオチド配列は、例えば、ホスホロアミジト化学を用いてインビトロで合成されることができる。核酸合成は、手動技術を用いて、又は、自動操作によって行われることができる。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ3900ＤＮＡ合成機（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。
【００２８】
ＰＴＤ-コーディングポリヌクレオチドは、挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含む、発現ベクター中に挿入されることができる。転写及び翻訳制御因子は、例えば、プロモーター（例えば、Ｔ７又はＴ３）、リボソーム結合サイト、開始コドン、停止コドン、及びポリアデニル化サイトを含む。ＰＴＤ-含有ポリペプチドをコードする配列並びに適切な転写及び翻訳制御因子を含有する発現ベクターを構築するために、当該分野の技術者に周知の方法を用いることができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及び、インビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、例えば、サンブルックら（Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor, N.Y.)）及び、アウスベルら（Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989）に開示されている。
【００２９】
宿主細胞における発現
ＰＴＤをコードする配列を発現するために、種々の発現システムが利用可能である。そのようなシステムの例は、これに限られないが、細菌、酵母、昆虫、植物及び動物の細胞系を含む。細菌は、組換えバクテリオファージ、発現プラスミド、又はコスミド発現ベクターで形質転換されることができる。酵母は、酵母発現ベクターで形質転換されることができる。昆虫細胞は、発現ベクターで形質移入されることができ、或いは、組換え昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で形質導入されることができる。植物細胞は、組換え植物ウイルス（例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス）で形質導入されることができる。動物細胞は、発現ベクター（例えば、pcDNA3又はpCMV-Sport）で形質移入されることができ、或いは、組換えウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、又はセムリキフォレストウイルス）で形質導入されることができる。宿主細胞を形質転換する方法、形質移入する方法、又は形質導入する方法は、当該分野で周知であり、任意の適切な方法を用いることができる。
【００３０】
ＰＴＤは、ポリペプチドを精製する当該分野で既知の任意の方法によって、宿主細胞又は宿主細胞培養培地から精製されることができる。そのような方法の例は、塩分別、高圧液体クロマトグラフィー、抗体カラムクロマトグラフィー、親和性タグカラムクロマトグラフィー、及びアシルアミドゲル電気泳動を含む。そのような方法は当該分野の技術者に周知である。
【００３１】
無細胞（Cell-free）発現
ＰＴＤは、無細胞発現系において、ＰＴＤコーディング配列を転写及び翻訳することによって製造されることもできる。ＰＴＤのコーディング配列は、当該分野で周知の方法によって、適切な転写及び翻訳制御因子に結合されることができる。そのような方法の例には、ＰＣＲ、制限酵素消化及びライゲーション、及び化学合成が含まれる。そのような技術は、例えば、サンブルックら（Sambrook et al.(1989) ）及びアウスベルら（ Ausubel et al. (1989)）に開示されている。無細胞転写及び翻訳は、例えば、プロメガコーポレーションのような商業的な供給者によるキットで入手可能である、ウサギ網状赤血球又はコムギ胚芽抽出物の成分を用いて、達成することができる。
【００３２】
ＰＴＤｓに対する抗体
ＰＴＤに対する抗体は、例えば、ハーロウら（Harlow et al., USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998.）の方法に従って得ることができる。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってよい。「抗体」という語は、無傷の免疫グロブリン又はそれらの断片を意味する。断片の例は、Fab、F(ab')2、及びFvを含む。抗体カラムクロマトグラフィーによるＰＴＤの精製のための抗体カラムは、当該分野で周知の技術と試薬を用いて製造され使用されることができる。例えば、ピアス者のＩｇＧオリエンテーションキットを使用することができる。
【００３３】
アミノ酸及びアミノ酸置換
本発明のＰＴＤｓは、保存された置換、即ち、一つのアミノ酸を他の類似の性質を有するものに交換する置換を含むことができる。保存された置換の例には、これに限定されないが、１）グリシン及びアラニン；２）バリン、イソロイシン、及びロイシン；３）アスパラギン酸及びグルタミン酸；４）リシン及びアルギニン；５）アスパラギン及びグルタミン；及び６）セリン及びスレオニンが含まれる。
【００３４】
ＰＴＤは、Ｄ-又はＬ-アミノ酸から合成され得る。さらに、アミノ酸アナログの使用も期待される。アミノ酸アナログの例は、これに限定されないが、エチルエステル、メチルエステル、ナフチルアミド、及び７-アミド-4-メチルクマリンを含む。
【００３５】
ＰＴＤｓのためのリンカー
本発明のＰＴＤｓは、Ｎ-末端又はＣ-末端に付着するリンカーを有することもできる。該リンカーは、通常０，１，２，３，４，又は５のアミノ酸の長さであり、通常、グリシン、システイン、セリン又はスレオニンのような、小さい中性極性即ち無極性のアミノ酸である。好ましいリンカーは、アミノ酸配列Lys-Xaa-Xaaを有し、ここでXaaは、小さい中性極性即ち無極性アミノ酸である。好ましいXaaは、グリシンである。リシンリンカーを有する好ましいＰＴＤは、アミノ酸配列Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：２)を有する。
【００３６】
核局在化シグナル
本発明のＰＴＤｓは、一以上の核局在シグナルを含むこともできる。好ましい核局在シグナルは、アミノ酸配列Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val(配列番号：３)を有する。核局在シグナルは、ＰＴＤのアミノ末端又はカルボキシ末端に位置することができる。核局在シグナルを含むＰＴＤは、さらに、リシンリンカーを含むこともできる。核局在シグナルは、リシンリンカーの上流又は下流に位置することができる。好ましくは、リシンリンカーを含むＰＴＤ、並びに核局在シグナルは、ペプチドのカルボキシ末端に位置する。リシンリンカー及び核局在シグナルを有する好ましいＰＴＤは、アミノ酸配列Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (配列番号：４)を有する。リシンリンカーを有する他の好ましいＰＴＤは、二つの核局在シグナルを含む。一つの核局在シグナルは、好ましくはリシンリンカーの下流のアミノ末端に位置し、第二の核局在シグナルは、好ましくはカルボキシ末端に位置する。リシンリンカー及び二つの核局在シグナルを有する好ましいＰＴＤは、アミノ酸配列Lys-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (配列番号：５)を有する。
【００３７】
カーゴ部分
カーゴ部分は小分子、ポリペプチド、核酸、又はウイルスである。これらのカーゴ部分の何れも、医薬品であり得る。小分子は、例えば、放射性核種、蛍光マーカー、又は染料であってよい。本発明に従ったポリペプチドは、二以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸のポリマーであり、ペプチド及びタンパク質を含む。該ポリペプチドは、例えば、不死化タンパク質（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びテロメラーゼ）、抗アポトーシスタンパク質（例えば、突然変異体ｐ５３及びＢｃｌｘＬ）、抗体、発癌遺伝子（例えば、ras, myc, HPV E6/E7, 及び アデノウイルス Ela）、細胞サイクル調節タンパク質（例えば、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ）、又は酵素（例えば、緑色蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）であってよい。核酸は、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はｃＤＮＡであってよい。核酸配列は、コーディング配列又は非コーディング配列（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）であってよい。ウイルスは、ウイルス全体又はウイルス核酸を含むウイルスのコア（即ち、ウイルスエンベロープのない、パッケージされたウイルス核酸）であってよい。輸送されることができるウイルス及びウイルスコアの例は、これに限定されないが、パピローマウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスコア、及びセムリキウイルスコアを含む。
【００３８】
核酸カーゴ部分のヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（例えば、アデノシン、シトシン、グアニン、チミン、イノシン及びウラシル）であってよく、或いは、それらはヌクレオチド誘導体（例えば、ビオチン化ヌクレオチド）又はアナログ（例えばホスホロチオエートヌクレオチド）であってよい。例えば、核酸カーゴ部分は、ホスホロチオエートヌクレオチドを含むアンチセンス配列であってよい。
【００３９】
ＰＴＤ-カーゴ部分複合体化
カーゴ部分は、特定のカーゴ部分に適切な、当該分野で周知の任意の方法によってＰＴＤに複合化されることができる。熟練した技術者は、カーゴ部分のＰＴＤとの複合体化に適した方法を選択できるであろう。そのような方法の例は、これに限定されないが、化学的架橋結合、遺伝子融合、及び橋かけ（bridging）を含む。
【００４０】
化学的架橋結合
ホモ二官能性クロスリンカー又はヘテロ二官能性クロスリンカーの何れかを、ＰＴＤとカーゴ部分との架橋結合のために用いることができる。ホモ二官能性又はヘテロ二官能性のクロスリンカーは、ＰＴＤが細胞膜を横切ってカーゴ部分を輸送した後に、ＰＴＤのカーゴ部分からの分離を促進するために切断可能である。ホモ二官能性クロスリンカーは、少なくとも二つの同じ反応基を有する。ホモ二官能性クロスリンカー剤の使用は、結果として自己接合、分子内架橋結合及び／又は重合になり得る。ホモ二官能性クロスリンカーは、第一に、一級アミン-反応性（例えば、イミドエステル、Ｎ-スクシンイミジルエステル、イソチオシネート、カルボキシル酸、及び塩化スルフォニル）又はスルフヒドリル反応性（例えば、2-ピリジルジチオ、3-ニトロ-2-ピリジルジチオ、マレイミド、ビニルスルホン、ハロゲン化アリール、ジニトロフルオロベンゼン、有機水銀化合物、ｐ-クロロ水銀ベンゾエート、ビスマレイミドへキサン、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、及び1,4-ジ-（3’−（2’-ピリオイルジチオ）-プロピオンアミド）ブタン）である。ホモ二官能性イミドエステルの例は、これに限定されないが、ジメチルアジピイミデート（dimethyladipimidate）、ジメチルスベリミデート(dimethylsuberimidate)、及びジチオビスプロピオンイミデートを含む。ホモ二官能性NHSエステルの例は、これに限定されないが、ジスクシンイミジルグルタラート、ジスクシンイミジルスベレート、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)、及びジスクシンイミジルタルタレート（tartarate）を含む。
【００４１】
ヘテロ二官能性クロスリンカーは、特定の基との連続的な接合を可能にする、二以上の異なる反応基を有し、それ故、望ましくない重合又は自己接合を最小化する。そのようなヘテロ二官能性クロスリンカーは、一端でアミン反応性であり、他端でスルフヒドリル反応性である。そのようなクロスリンカー剤の例は、これに限定されないが、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート、ビスマレイミドへキサン、及びN-(g-マレイミドブチリロキシ)スクシンイミドエステルを含む。
【００４２】
ホモ二官能性又はヘテロ二官能性架橋結合反応は、ＰＴＤにホモ二官能性又はヘテロ二官能性クロスリンカーを加えて結合した後に停止されてよい。ホモ二官能性架橋剤またはヘテロ二官能性架橋剤を有するＰＴＤは、当該分野で周知の方法によって精製されてよく、カーゴ部分を追加するためのストックとして用いられる。そのような、付加されたホモ二官能性又はヘテロ二官能性架橋剤を有する精製されたＰＴＤは、例えば、-２０℃で、一定分量で貯蔵され、続いて解凍されることができる。一旦解凍されれば、カーゴ部分は、架橋結合反応を完了させることによって付加されることができる。
【００４３】
遺伝子融合
遺伝子融合は、インフレームのＰＴＤのコーディング配列を、ポリペプチドカーゴ部分のコーディング配列と結合することによって生成されることができる。当該分野には、コーディング配列を互いに結合させるための多くの方法が存在する。代表的な方法は、これに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ステッチＰＣＲ、並びに、制限エンドヌクレアーゼ消化及びライゲーションを含む。例えば、ＰＴＤコーディング配列は、カーゴ部分の選択のためのＰＣＲプライマーの５’-末端に付加されて良い；ＰＣＲ後、ＰＴＤのコーディング配列とポリペプチドカーゴ部分は、互いに結合されている。熟練した技術者には、ＰＴＤのリーディングフレーム及びカーゴ部分を確実にフレーム内にする方法、並びに、転写制御配列（例えば、開始コドン及び終止コドン）をどこに置くべきであるかということは周知であろう。プロテアーゼ切断サイトは、ＰＴＤ及びカーゴ部分の間に含まれることができる。そのようなプロテアーゼ切断サイトの例は、これに限定されないが、因子Xaタバコエッチ（etch）ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを含む。
【００４４】
橋かけ（bridging）分子
ＰＴＤｓ及びカーゴ部分は、橋かけ分子の対を用いて複合体化されることができる。そのような対の例は、これに限定されないが、(a)ストレプトアビジン及びビオチン、(b)グルタチオン及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、及び(c)ポリヒスチジン及び親和性クロマトグラフィー試薬（例えば、四座ニトリロ三酢酸(NTA)又はイミノ二酢酸(IDA))（これはＮｉ+2のようなイオンを介して相互作用する）を含む。ＰＴＤは、その対のどちらに結合されてもよく、カーゴはもう一方の橋かけ分子に結合される。例えば、ＰＴＤがグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼに結合された場合、カーゴはグルタチオンに結合される。ＰＴＤがストレプトアビジンに結合され、カーゴがビオチンに結合されることが好ましい。ＰＴＤ及びストレプトアビジンは、ペプチドと橋かけ分子を結合するための、当該分野で周知の任意の方法によって結合されることができる。そのような方法の例は、これに限定されないが、化学的架橋結合又は遺伝子融合を含む。ＰＴＤ及びストレプトアビジンは、遺伝子融合によって結合されることが好ましい。カーゴは、小分子、タンパク質、又は核酸のビオチン化のために、当該分野で周知の任意の方法、例えば化学的架橋結合によって、ビオチンに結合される。ＰＴＤカーゴ部分複合体は、ＰＴＤ-ストレプトアビジンをビオチン化カーゴ部分と接触させることによって形成されることができる。
【００４５】
他の態様において、グルタチオン及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼが橋かけ分子の対として用いられる。その場合、ＰＴＤは、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼに結合され、カーゴがグルタチオンに結合されることが好ましい。ＰＴＤ及びグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼは、上記の任意の方法で結合されることができるが、遺伝子融合が好ましい。カーゴは、グルタチオンを小分子、タンパク質、又は核酸に結合するための当該分野で周知の任意の方法によって、グルタチオンに結合される。そのような方法の例は、化学的架橋結合である。ＰＴＤ-カーゴ部分複合体は、ＰＴＤ-グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼをグルタチオン-結合カーゴ部分と接触させることによって形成されることができる。
【００４６】
さらに他の態様において、親和性クロマトグラフィー試薬及びポリヒスチジンが、橋かけ分子の対として用いられる。この場合、ＰＴＤは、親和性クロマトグラフィー試薬に結合されることが好ましい。親和性クロマトグラフィー試薬は、異なる親和力をもってＮｉ+2のようなイオンに結合する。強力な親和力でＮｉ+2に結合するＮＴＡはＩＤＡである。熟練した技術者は、特定の適用に望ましい結合親和力を選択することができるであろう。ＰＴＤ及び親和性クロマトグラフィー試薬は、例えば、化学的架橋結合によって結合されることができる。カーゴは、ポリヒスチジンを小分子、タンパク質、又は核酸に結合させるために、当該分野で周知の任意の方法によって、ポリヒスチジンに結合される。ＰＴＤ-カーゴ部分複合体は、ＰＴＤ-親和性クロマトグラフィー試薬複合体を、Ｎｉ+2のようなイオンの存在下において、ポリヒスチジン結合カーゴ部分と接触させることによって形成されることが出来る。
【００４７】
ＰＴＤ及びカーゴ部分の配向
ＰＴＤ及びカーゴ部分は、ＰＴＤ又はカーゴ部分の機能性を破壊しない限り、ＰＴＤ又はカーゴ部分の何れかの任意の位置で、化学的に或いは橋かけ分子の対を用いることによって、複合体化されることができる。例えば、架橋剤は、アミノ末端又はカルボキシ末端（例えばタンパク質の）に位置する適切な官能基と、５’末端又は３’末端（例えば核酸の）に位置する適切な官能基と、或いは、分子を介して反応する。熟練した技術者は、ＰＴＤ-カーゴ部分複合体のそれぞれの部分が生物活性を保持するかどうかを決定できる。ＰＴＤは、それがカーゴを細胞内に輸送できる場合、生物活性を保持する。輸送活性は、例えばＰＴＤカーゴ部分複合体を細胞に加えることによって、また、カーゴ部分が細胞膜を横切って輸送されたかどうかを判定するために細胞をアッセイすることによって、確認されることができる。当該分野の技術者は、カーゴが細胞内に位置するかどうかを、当該分野で周知の方法を用いて測定することができる（例えば、免疫組織化学的染色）。カーゴ部分は、カーゴ部分のタイプに適格の方法を用いて活性をアッセイされることができる（例えば、酵素のための酵素アッセイ、腫瘍性タンパク質のための形質転換アッセイ、抗アポトーシスタンパク質のための抗アポトーシスアッセイ、及び、不死化タンパク質のための不死化アッセイ）。これらのアッセイは、当該分野で周知であり、サンブルックら（Sambrook et al., 1989 and Ausubel et al., 1989.）に開示されている。
【００４８】
ＰＴＤ及びポリペプチドカーゴ部分が遺伝子的に結合された場合、ポリペプチドカーゴ部分は、ＰＴＤのアミノ末端又はＰＴＤのカルボキシ末端のいずれかに複合体化されることができる。ポリペプチドカーゴ部分は、ＰＴＤのカルボキシ末端に複合体化されることが好ましい。
【００４９】
細胞
本発明のＰＴＤｓは、カーゴ部分を、種々の哺乳類、両生類、爬虫類、鳥類、又は昆虫の細胞に輸送できる。細胞は、一次細胞又は細胞株であってよい。哺乳類細胞は、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ハムスター、及びウサギであってよい。両生類の細胞の例には、これに限定されないが、カエル及びサンショウウオが含まれる。爬虫類の細胞には、これに限定されないが、ヘビ及びトカゲが含まれる。鳥類の細胞の例には、これに限定されないが、ニワトリ、ウズラ、およびカモが含まれる。昆虫細胞は、例えば、ショウジョウバエおよび鱗翅目（例えば、フォールヨトウムシ（fall army worm）であってよい。哺乳類からの一次細胞は、これに限定されないが、脂肪細胞、星状細胞、心筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経節細胞、腺性細胞、グリア細胞、造血性細胞、肝細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、卵巣細胞、膵臓ベータ細胞、腎臓細胞、平滑筋細胞、および横紋筋細胞を含む。細胞株には、182-PF-SK、184A1、2H-11、2F-2B、293、27FR、28SC、3B-11、4T1、7F2、A172、A375.S2、A-253、A-431、ARH-77、AHH-1、AML-193、A-10、BS-C-1、BHK-21、BE(2)-117、BCE、BJ、B16-F0、BT-20、BT-474、BLP-1、BRL-3A、BLO-11、CTX-TNA2、C8-D30、C8-S、CPAE、CPA47、CHO-K1、CV-1、C6、CHP-212、C8-B4、C166、C-211、CCD-25Sk、C32、CTPS、C1-S1、C127、CF41-Mg、CMMT、CAMA-1、C5/MJ、C3A、C2C12、COS-1、COS-7、Dempsey、Detroit 532、Daudi、EBTr(NBL4)、EOMA、EJG、E Derm、EB、EM-9、FBHE、FL、F98、G-361、GK-5、GDM-1、G-7、G-8、HIG-82、H9c2(2-1)、HUV-EC-C、HeLa、HaK、HEp-2、HT-1080、HG-261、HEL-299、H2.35、HEp-G2、H4、HAAE-1、HAAE-2、HUVE-12、Hs27、Hs68、HL-60、H4TG、Hepal-6、IMR-32、IP-1B、J1-31、J2 3T3、JC、JHK3、KB、K-562、KG-1、L-132、LLC-MK2、LA7、LMH、L8、MDBK、M059K、Mar Vin、MM5MTC、MCF7、MoB、MOLT-3、MH1C1、NIH 3T3、Neuro-2a、NB41A3、NIE-115、NMVMG、NMU、OV-90、P19、PFSK-1、PC-12、PaCa-2、PANC-1、QM-7、RF/6A、RK13、ratl、rat2、RG2、RT101、RBA、Rn2T、RBL-1、Swiss SFMF、SK-N-AS、SH-SYSY、SfiEp、SW-13、SW-527、SK-BR-3、SNU449、SK-Hepl、Snyder、Sf9、Sf21、T98G、TH-1、Toledo、UV41、Vero、WS6、WR-21、XP17BE、Y-1、ZR-75-1、およびZR-75-30が含まれる。
【００５０】
可逆的不死化
通常の健康な細胞は、それらが老化する前にのみ固定された数の分裂を経験し、そしてそれ以上は複製しない。不死化タンパク質は、細胞の老化を防ぐタンパク質である。例には、これに限定されないが、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびテロメラーゼが含まれる。不死化された細胞は、しかしながら、それらの相対物の通常の老化の後にも多くの回数分裂できる。
【００５１】
ＰＴＤおよび不死化タンパク質の複合体は、培養細胞を可逆的に不死化するために用いられることができる。ＰＴＤは、アミノ酸配列Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)、Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：２)、Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Val (配列番号：４)、又はLys-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Val (配列番号：５)を有することが好ましく、不死化カーゴ部分は、SV40ラージT抗原又はテロメラーゼであることが好ましい。細胞は、インビトロで複合体に接触されることができる。ＰＴＤカーゴ部分複合体は、細胞培養培地に加えられることもでき、或いは、細胞に供給される培地中に含まれることもできる。該複合体は、約１ nMのＰＴＤより多い量で存在することが好ましい。例えば、該複合体は、約10 nM〜約1000 nM（即ち、10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,又は1000 nM),）のＰＴＤの量で存在することができ、好ましくは、約10 nM〜約500 nM、より好ましくは、約10 nM〜約100 nM、さらに好ましくは、約10 nM〜約50 nMのＰＴＤの量で存在できる。ＰＴＤは、細胞膜を横切って不死化ペプチドを輸送し、不死化タンパク質は細胞を不死化する。複合体の存在下において培養され続ける限り、その細胞は不死化する、即ち、分裂し続ける。複合体が培地から除去されると、細胞はもはや不死化されない。
【００５２】
細胞生存度を上昇させる方法
ＰＴＤおよび抗-アポトーシスタンパク質の複合体は、細胞生存度を上昇させるために用いられることができる。好ましくは、ＰＴＤはアミノ酸配列Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)、Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：２)、Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Val (配列番号：４)、又はLys-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Val (配列番号：５)を有する。細胞は、インビトロで複合体と接触されることができる。ＰＴＤカーゴ部分複合体は、細胞培養培地に加えられることもでき、又は、細胞に供給される培地に含まれることもできる。該複合体は、約１ nMのＰＴＤより多い量で存在することが好ましい。例えば、該複合体は、約10 nM〜約1000 nM (即ち、10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 又は1000 nM)のＰＴＤ、好ましくは約10 nM〜約500 nM, より好ましくは約10 nM〜約100 nM,およびさらに好ましくは約10 nM〜約50 nM のＰＴＤの量で存在できる。ＰＴＤは、細胞膜を横切って抗-アポトーシスカーゴ部分を輸送し、アポトーシスを阻害することによって細胞生存度を上昇させる。該複合体の存在下で培養され続ける限り、細胞は上昇された生存度を有する。抗-アポトーシス剤は、これに限定されないが、p53及びBclxLを含む。
【００５３】
キット
ＰＴＤ及びカーゴ部分は、キット中で供給されることができる。ＰＴＤは、好ましくはＰＴＤ-ストレプトアビジン融合タンパク質であり、該ストレプトアビジンは、ＰＴＤのカルボキシ末端に位置することが好ましい。ＰＴＤは、好ましくは、アミノ酸配列Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：１)、Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg (配列番号：２)、Lys-Gly-Gly-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Val (配列番号：４)、又はLys-Gly-Gly-Lys-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Lys-Met-Leu-Lys-Ser-Thr-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Val (配列番号：５)を有する。カーゴ部分は小分子（例えば、放射性核種、蛍光マーカー、染料、又は医薬品）、タンパク質（例えば、不死化剤、抗-アポトーシス剤、酵素、腫瘍性タンパク質、細胞サイクル調製タンパク、又は抗体）、核酸（例えば、RNA、DNA、及びcDNA）、又はウイルス（例えば、パピローマウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルスコア、又はセムリキウイルスコア）であってよい。カーゴ部分は好ましくはビオチン化される。ＰＴＤ及びカーゴ部分は、一回の又は分割された一定分量で、一つの又は分割された容器で供給されることができる。ＰＴＤ-カーゴ部分複合体を構築するため、及び／又は複合体を使用するための、説明書を含めることができる。その説明書は、ラベル又は容器に書かれて良い。この説明書は、単に読み手に、ウェブサイト又は他の情報源のような他のありかを紹介させるものであってもよい。
【００５４】
本明細書において記載された全ての特許、特許出願、及び参考文献は、その全ての内容が参考として本明細書中に援用される。
【００５５】
以下の例は、説明のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５６】
［例１］
ＰＴＤ形質導入効率に及ぼすビオチン位置の影響
形質導入効率に及ぼすビオチン位置の影響を測定するために、ビオチンを３つのＰＴＤのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかに加えた。（Gly）3リンカーをＮ-末端ビオチン化ペプチドのアミノ末端に加えた。Ｃ-末端のビオチン化のために、Ｃ-末端リンカーの最後のＧｌｙをリシンで置換した。リシンの側鎖を、ビオチン基の付加のために使用した。無視できる形質導入活性を有するペプチド（Mi et al., Mol. Ther., 2:339-347, 2000）（配列番号：６）をネガティブコントロールとして用いた。ＰＴＤのアミノ酸配列及び試験されたビオチン位置を表１に示した。ＰＴＤ及びβ-ガラクトシダーゼを、ストレプトアビジン-ビオチン架橋と共に複合体化した。
【表１】
2006521819.tif 000003
【００５７】
形質導入効率の試験のために、293ＨＥＫ細胞を96-ウェルプレートに、約4500細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートした。ペプチド複合体を調製するため、等モル濃度のビオチン化ＰＴＤ及びストレプトアビジン-架橋結合β-ガラクトシダーゼを、細胞培養培地中で混合し希釈した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、複合体を形成させた。それぞれの複合体を、最終濃度50ｎＭで加え、３７℃で３０分間インキュベートした。β-ガラクトシダーゼ活性のアッセイのために、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、100μＬのアッセイ試薬（Pierce）に溶解した。細胞可溶化液を３７℃で３０分間インキュベートし、150μＬの停止溶液（Pierce）を加えて該反応を停止させた。ウォラック（Wallac）・ビクター・スペクトロルミノメーターで405ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１に示す。
【００５８】
図１は、異なる複合体のそれぞれで形質導入された細胞の、405 nmでの吸光度を示す。結果から、ビオチンの位置影響が示された。ビオチンがＰＴＤのカルボキシ末端に加えられた場合、細胞可溶化液中のより多いβ-ガラクトシダーゼの存在によって示されるように、形質導入効率が高い。配列番号：８及び９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、細胞可溶化液中に存在するβ-ガラクトシダーゼの量が、ネガティブコントロール（配列番号：６）より少ないか又は等しいことから、ＰＴＤとして機能していなかった。
【００５９】
［例２］
一次細胞へのペプチド形質導入
β-ガラクトシダーゼをヒト一次（ＨＵＶＥＣ）細胞中に転位置する、ＰＴＤの能力を調査した。ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼに曝露される時間の関数として、形質導入効率を分析した。
【００６０】
形質導入効率の試験のために、ＨＵＶＥＣ細胞を、例１で記載したように、９６ウェルプレートに播種した。ＰＴＤ-ガラクトシダーゼ複合体を例１に記載したように調製した。それぞれの複合体を、９６ウェルプレートのウェルに50 nMの最終濃度で加えた。細胞は、３７℃で7, 14, 24, 35, 又は45分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。最後のＰＢＳ洗浄に続いて、細胞を100μＬのアッセイ試薬（Pierce）に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。この溶解反応は、150μＬの停止溶液（Pierce）を加えることで停止させ、405 nmにおける吸光度をウォラック（Wallac）・ビクター・スペクトロルミノメーターで測定した。その結果を図２に示す。
【００６１】
図２は、一次ＨＵＶＥＣ細胞が、ＰＴＤで形質導入され得ることを示している。さらに、形質導入は、ＰＴＤに曝露した後７分程の早さで検出可能である。これらは、細胞内β-ガラクトシダーゼの蓄積とＰＴＤ複合体への曝露時間との間に線形相関が存在する。４５分のインキュベーションの間、飽和は検出されなかった。
【００６２】
４５分のインキュベーションで飽和が検出されなかったために、延長されたインキュベーション（２００分まで）の影響が分析された。二つのタイプの一次細胞：一次真皮性線維芽細胞及び一次ＨＵＶＥＣ細胞を用いた。細胞は、上記のように播種し、12.5 nM最終濃度のＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体がそれぞれのウェルに添加された。細胞は、３７℃で、120、160、又は200分インキュベートした。細胞は、上記のように洗浄及び溶解した。溶解反応を停止させ、そして、405 nmでの吸光度を測定した。一次真皮性線維芽細胞（図３）及び一次ＨＵＶＥＣ細胞の結果は、ＰＴＤ複合体の細胞内蓄積の検出可能な飽和が、200分のインキュベーションまで生じないことを示している。
【００６３】
［例３］
形質導入効率における温度の影響
ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体の活性を、４℃、室温（ＲＴ）、及び３７℃で比較し、形質導入効率における温度の影響を分析した。ＨＵＶＥＣ細胞は例２に記載したように培養し、ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体（例１に記載した）は50 nM最終濃度で培養物に加えた。ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体の添加に続いて、細胞を特定の温度で３０分間インキュベートした。細胞を、上記のように洗浄して溶解した。溶解反応を停止させ、405 nmでの吸光度を測定した。その結果を図４に示す。図４は、ＰＴＤの形質導入活性が温度に依存することを示している。
【００６４】
［例４］
ＰＴＤの逆転異性体の形質導入効率
Ｎ-末端ビオチン化定方向（direct）及び逆転（inverted）異性体を、ＰＴＤの逆転異性体の形質導入効率を測定するために比較した。表２には、用いたＰＴＤの配列を一覧にした。ＰＴＤ及びβ-ガラクトシダーゼをストレプトアビジン-ビオチン架橋と共に複合体化した。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を９６ウェルプレートに播種し上記のようにインキュベートした。ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体を形成し（例１で記載したように）、最終濃度12.5 nMで添加した。この細胞を上記のように３７℃で１時間インキュベートして溶解させた。この溶解反応を停止させ、405 nmでの吸光度を測定した。結果を図５に示す。逆転異性体の形質導入活性は、定方向ＰＴＤの形質導入活性よりも強い。
【表２】
2006521819.tif 000004
【００６５】
［例５］
形質導入効率に及ぼすアミノ末端リシンの影響
２ＰＴＤの活性を比較して、ビオチン部分に並列されたリシン残基の導入が形質導入活性に影響するかどうかを測定した。ペプチドのアミノ酸配列は表２に示してある。ペプチドの対は、ビオチンペプチドリンカー内のグリシンからリシンへの置換によって異なる。ＰＴＤ及びβ-ガラクトシダーゼは、ストレプトアビジン−ビオチン架橋と共に複合体化された。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、上記のように播種した。ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体を20 nMの最終濃度で添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、上記のように溶解した。溶解反応を停止させ、405 nmでの吸光度を測定した。結果を図６に示す。ビオチンに並列されたリシン残基の存在は、形質導入活性を約２倍増強させた。
【００６６】
ビオチンリンカーに位置するリシン残基の役割をさらに調査するために、リンカー内のリシン残基を有する間接型ＰＴＤ及び直接型ＰＴＤを比較した。用いた細胞はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞であり、ＰＴＤ複合体の最終濃度は12.5 nMであった。このアッセイは、上記のように行った。結果を図７に示す。リシン残基の導入は、形質導入効率を７２％も改善した。
【００６７】
［例６］
ＰＴＤを形質導入された細胞の割合
レポータータンパク質を受け取った細胞の割合に基づいて、形質導入の効率を測定するために、レポータータンパク質の組織化学的な染色を行って、細胞をアッセイした。この実験の目的は、全細胞可溶化液におけるβ-ガラクトシダーゼ活性が、細胞培養プレートのプラスチック表面に沈降したＰＴＤ複合体から生じるものではないということを保証することである。
【００６８】
ＨＵＶＥＣ及びヒト真皮性線維芽細胞を、それぞれ２４ウェルプレートの各ウェルに40,000で播種し、一晩インキュベートした。ＰＴＤ複合体（配列番号：７-ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ又は配列番号：６-ストレプトアビジン-β-ガラクトシダーゼ）を、ウェルに最終濃度50 nMで加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、固定化し、そして、β-ガラクトシダーゼ染色セット（Roche）を用いて製造者の説明書に従って、β-ガラクトシダーゼを染色した。β-ガラクトシダーゼ活性の発生に続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、光学顕微鏡で可視化した。図８Ａは、配列番号：８で示されるポリペプチド配列及びストレプトアビジン-結合β-ガラクトシダーゼを含む、ＰＴＤ-カーゴ部分複合体で形質導入されたヒト真皮性線維芽細胞を示す。図８Ｂは、配列番号：７で示されるポリペプチド配列及びストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼを含むＰＴＤカーゴ部分複合体で形質導入されたヒト真皮性線維芽細胞を示す。その結果は、細胞はβ−ガラクトシダーゼレポータータンパク質に陽性であり、溶解アッセイにおけるβ-ガラクトシダーゼ活性は、プラスチックに付着した複合体に帰するものではないことを示している。またその結果は、Ｃ-末端ビオチン化ＰＴＤによる形質導入が、Ｎ-末端ビオチン化ペプチドよりも強力であることを実証している。
【００６９】
［例７］
ＰＴＤ複合体の細胞内局在
複合体の細胞内局在を測定するために、細胞をストレプトアビジンで免疫染色した。２４ウェル組織培養プレートにＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を播種し、一晩インキュベートした。細胞を、配列番号：１４に示すポリペプチド配列及びストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼを含む、20 nMのＰＴＤ-カーゴ部分複合体で、３７℃で１時間処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、室温で正常なヤギの血清で３０分間インキュベートして、非特異的結合をブロックした。マウスの抗ストレプトアビジンモノクローナル抗体（Monosan, Catalog No. 5043）を、20％の正常なヤギ血清を含むＰＢＳで１μｇ/ｍｌに希釈した。希釈されたモノクローナル抗体を細胞に加え、細胞を室温で１時間インキュベートした。
【００７０】
細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ヤギ抗-マウスＩｇＧ（Molecular Probes, Catalog No. A-11019）に接合した二次的な（secondary）アレクサフルオロ（Alexa Fluor）568を、20％の正常なヤギ血清を含むＰＢＳで１：２００に希釈した。室温で３０分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化した。結果を図９Ａに示す。図９Ｂは、図９Ａと同じ細胞フィールドであるが、位相差顕微鏡法によって可視化したものである。この複合体は細胞質に局在していた。
【００７１】
［例８］
ＰＴＤ形質導入によるアルカリホスファターゼの輸送
上記の結果がβ-ガラクトシダーゼレポータータンパク質に限定されるという可能性を除外するために、代替のレポータータンパク質の形質導入を分析した。アルカリホスファターゼをＰＴＤ（表２）のＣ末端に、ストレプトアビジン-ビオチン架橋によって複合体化し、上記の方法を用いてＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に形質導入した。洗浄及び溶解の後、アルカリホスファターゼ活性を測定した。図１０に、アルカリホスファターゼも効率的に細胞中へ輸送されることが示されている。
【００７２】
［例９］
細胞増殖におけるＰＴＤの細胞毒性
ＰＴＤｓが細胞毒性であるかどうかを測定するために、ＰＴＤｓ（配列番号：７及び１０）を、カーゴ部分の非存在下において、最終濃度範囲０〜１０００ nMでＮＩＨ  ３Ｔ３培養物に加えた。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、播種して一晩インキュベートし、ペプチドを培養物に加えた。細胞を４８時間インキュベートし、細胞生存度をアラマルブルー（Alamar blue）アッセイを用いて測定した。
【００７３】
配列番号：１１に示されるＰＴＤの結果を図１１Ａに示す。配列番号：８に示されるＰＴＤの結果を図１１Ｂに示す。ナノモーラー範囲におけるＰＴＤの濃度は何れも、細胞増殖を阻害しなかった。
【００７４】
［例１０］
ＰＴＤ-カーゴ部分複合体の核局在
核局在シグナルの導入がＰＴＤ-カーゴ部分複合体の転座に影響するかどうかを測定するために、ＰＴＤｓの輸送活性を比較した。ＰＴＤｓのアミノ酸配列を表３に示す。カーゴ部分は、ストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼであった。カーゴ部分は、ストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼであった。ペプチドは、核局在シグナルの位置によって異なった。核局在化シグナルは、アミノ末端（リシンリンカーの下流）又はカルボキシ末端に位置した。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は上記のように播種した。それぞれのＰＴＤ複合体を、20 nMの最終濃度で加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、β-ガラクトシダーゼの核局在をアッセイした。β-ガラクトシダーゼ活性は比色アッセイにおいて405 nmで測定した。
【００７５】
結果を図１２に示す。局在化シグナルの存在は、複合体の転座に不利に影響しなかった。ＰＴＤ（配列番号：１９）のカルボキシ末端に位置する核局在化シグナルは、ＰＴＤのアミノ末端に位置した核局在化シグナルよりも、複合体を転座させるのによりよく機能した。
【００７６】
二つの核局在シグナルを含むペプチドを、ペプチド輸送における多重核局在化シグナルの役割を調査するために試験した。該ペプチドのアミノ酸配列は表３に示した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、上記のように播種した。ＰＴＤ-β-ガラクトシダーゼ複合体を、最終濃度20 nMで加え、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートに続き、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、β-ガラクトシダーゼの核局在化をアッセイした。結果を図１３に示す。多重核局在化シグナルは、細胞への輸送を増強しなかった。
【表３】
2006521819.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、ＰＴＤが媒介するβ-ガラクトシダーゼの輸送における、ＰＴＤ及びビオチンの異なる位置の影響を示す。
【図２】図２は、細胞膜を横切るβ-ガラクトシダーゼの輸送における、ＰＴＤ複合体の細胞への曝露の影響を示す。
【図３】図３は、細胞膜を横切るβ-ガラクトシダーゼの輸送における、ＰＴＤ複合体の細胞への曝露の延長の影響を示す。
【図４】図４は、ＰＴＤが媒介するβ-ガラクトシダーゼの輸送における、温度の影響を示す。
【図５】図５は、ＰＴＤが媒介するβ-ガラクトシダーゼの輸送における、キラリティーの影響を示す。
【図６】図６は、ＰＴＤ輸送におけるアミノ末端リジン残基の影響を示す。
【図７】図７は、ＰＴＤｓの定方向及び逆転の異性体の、導入活性の比較を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、配列番号：８に示されるポリペプチド配列及びストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼを含む、ＰＴＤ-カーゴ部分複合体を導入された、ヒト真皮線維芽細胞を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、配列番号：７に示されるポリペプチド配列及びストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼを含む、ＰＴＤ-カーゴ部分複合体を導入された、ヒト真皮線維芽細胞を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、配列番号：１４に示されるポリペプチド配列及びストレプトアビジン結合β-ガラクトシダーゼを含むＰＴＤカーゴ部分複合体を導入され、抗ストレプトアビジン抗体を用いてストレプトアビジンを染色された、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を示す。該細胞は蛍光顕微鏡観察によって可視化された。
【図９Ｂ】図９Ｂは、位相差顕微鏡観察で可視化された図９ＡのＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を示す。
【図１０】図１０は、アルカリホスファターゼの輸送におけるＰＴＤ複合体の細胞への曝露の延長の影響を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、細胞培養中の細胞生存度におけるＰＴＤ濃度の影響を示す。生細胞の相対数は、アラマル（Alamar）ブルー染色を用いて測定した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、細胞培養中の細胞生存度におけるＰＴＤ濃度の影響を示す。生細胞の相対数は、アラマル（Alamar）ブルー染色を用いて測定した。
【図１２】図１２は、ＰＴＤ輸送における核局在化シグナルの影響を示す。
【図１３】図１３は、ＰＴＤ輸送における多重核局在化シグナルの影響、及び、Ｎ末端-リジンリンカー近くの核局在化シグナルの位置の影響を示す。
【図１】
2006521819.tif 000006
【図２】
2006521819.tif 000007
【図３】
2006521819.tif 000008
【図４】
2006521819.tif 000009
【図５】
2006521819.tif 000010
【図６】
2006521819.tif 000011
【図７】
2006521819.tif 000012
【図８Ａ】
2006521819.tif 000013
【図８Ｂ】
2006521819.tif 000014
【図９Ａ】
2006521819.tif 000015
【図９Ｂ】
2006521819.tif 000016
【図１０】
2006521819.tif 000017
【図１１Ａ】
2006521819.tif 000018
【図１１Ｂ】
2006521819.tif 000019
【図１２】
2006521819.tif 000020
【図１３】
2006521819.tif 000021
【配列表】
2006521819000001.app
【国際調査報告】
2006521819.tif 000022
2006521819.tif 000023