(57)【要約】本発明は、遺伝的に改変された生物を培養することによるエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは二次産物の製造方法に関する。また、本発明は、その遺伝的に改変された生物自体、特に酵母に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型と比較して、
低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および、
増加したHMG-CoA還元酵素活性および、
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも1種の活性の増加した活性、
を有する生物を培養することによる、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の製造方法。
【請求項２】
Δ22-デサチュラーゼ活性を低下させるために、Δ22-デサチュラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を、野生型と比較して低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
機能的なΔ22-デサチュラーゼ遺伝子を含まない生物を用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
HMG-CoA還元酵素活性を増加させるために、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現を、野生型と比較して増加させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子発現を増加させるために、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸を含む核酸構築物を前記生物中に導入し、該生物中でのその発現が野生型と比較して低下した調節を受ける、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸構築物が、前記生物中で、野生型プロモーターと比較して低下した調節を受けるプロモーターを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
HMG-CoA還元酵素をコードする核酸が、前記生物中での発現が相同的、オーソロガスな核酸と比較して低下した調節を受ける核酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
HMG-CoA還元酵素をコードする核酸が、HMG-CoA還元酵素の触媒領域をコードする核酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
導入される核酸が、配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号4の配列と少なくとも30％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導される配列を含み、HMG-CoA還元酵素の酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号3の配列を含む核酸を導入する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性を増加させるために、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比較して増加させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子発現を増加させるために、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする1種以上の核酸を前記生物中に導入する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
導入される核酸が、配列番号6のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号6の配列と少なくとも30％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導される配列を含み、ラノステロールC14-デメチラーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号5の配列を含む核酸を導入する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
スクアレンエポキシダーゼ活性を増加させるために、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比較して増加させる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現を増加させるために、スクアレンエポキシダーゼをコードする1種以上の核酸を前記生物中に導入する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
導入される核酸が、配列番号8のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号8の配列と少なくとも30％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導される配列を含み、スクアレンエポキシダーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号7の配列を含む核酸を導入する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
スクアレン合成酵素活性を増加させるために、スクアレン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現を野生型と比較して増加させる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子発現を増加させるために、スクアレン合成酵素をコードする1種以上の核酸を前記生物中に導入する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
導入される核酸が、配列番号10のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号10の配列と少なくとも30％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導される配列を含み、スクアレン合成酵素の酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号9の配列を含む核酸を導入する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
用いる生物が酵母である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
培養後、生物を回収し、続いて、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を該生物から単離する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
遺伝的改変が、野生型と比較して、
Δ22-デサチュラーゼ活性を低下させ、および、
HMG-CoA還元酵素活性を増加させ、および、
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも1つの活性を増加させる、
遺伝的に改変された生物。
【請求項２６】
遺伝的改変が、野生型と比較して、
Δ22-デサチュラーゼ活性を低下させ、および
HMG-CoA還元酵素活性を増加させ、および
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性を増加させる、
請求項２５に記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項２７】
遺伝的に改変された生物が、野生型と比較して増加した含量のエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を有する、請求項２５または２６に記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項２８】
用いる生物が酵母である、請求項２５または２６に記載の遺伝的に改変された生物。
【請求項２９】
エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の製造のための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の遺伝的に改変された生物の使用。
【請求項３０】
出発生物から出発して、
Δ22-デサチュラーゼ活性を低下させ、および
HMG-CoA還元酵素活性を増加させ、および
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも1つの活性を増加させる、
遺伝的に改変された生物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に改変された生物を培養することによる、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の製造方法、ならびに該遺伝的に改変された生物、特に、酵母そのものに関する。
【背景技術】
【０００２】
エルゴスタ-5,7-ジエノールおよびステロール代謝のその生合成中間体、例えば、ファルネソール、ゲラニオール、スクアレンならびにラノステロールおよびチモステロール、ならびにステロール代謝のその生合成代謝物、例えば、哺乳動物における、カンペステロール、プレグネノロン、17-OH-プレグネノロン、プロゲステロン、17-OH-プロゲステロン、11-デオキシコルチゾール、ヒドロコルチゾン、デオキシコルチコステロンまたはコルチコステロンは高い経済的価値を有する化合物である。
【０００３】
エルゴスタ-5,7-ジエノールは、生物形質転換、化学合成または生物工学的製造を介するステロイドホルモンの製造のための出発化合物として働くことができる。
【０００４】
ヒドロコルチゾンは、弱い糖質コルチコイド作用を有し、高い抗炎症作用、非進行性作用または増殖防止作用を有する活性成分の合成のための人気のある出発化合物である。
【０００５】
スクアレンは、テルペンの合成のためのビルディングブロックとして用いられる。その水素化された形態においては、それは皮膚科学および化粧品においてはスクアランとして、ならびにその種々の誘導体においてはスキンケアおよびヘアケア製品の構成要素として用いられる。
【０００６】
他の経済的に有用な物質は、チモステロールおよびラノステロールなどのステロールであり、ラノステロールはサポニンおよびステロイドホルモンの化学合成のための中心となる生材料および合成材料である。その良好な皮膚浸透性および拡散特性のため、ラノステロールは乳液補助剤およびスキンクリームの活性成分として用いられる。
【０００７】
従って、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の製造のための経済的な方法は非常に重要である。
【０００８】
特に経済的である方法は、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を産生する、天然の生物または遺伝子改変により最適化された生物を利用する生物工学的方法である。
【０００９】
酵母におけるエルゴステロール代謝の遺伝子は広く知られており、クローニングされており、例えば、
HMG-CoA還元酵素(HMG)をコードする核酸(Bason M.E.ら(1988) Structural and functional conservation between yeast and human 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases, the rate-limiting enzyme of sterol biosynthesis. Mol Cell Biol 8:3797-3808)、
トランケートされたHMG-CoA還元酵素(t-HMG)をコードする核酸(Polakowski T, Stahl U, Lang C.(1998) Overexpression of a cytosolic hydroxymethylglutaryl-CoA reductase leads to squalene accumulation in yeast. Appl Microbiol Biotechnol. Jan; 49(1):66-71)、
ラノステロールC14-デメチラーゼ(ERG11)をコードする核酸(Kalb VF, Loper JC, Dey CR, Woods CW, Sutter TR (1986) Isolation of a cytochrome P-450 structural gene from Saccharomyces cerevisiae. Gene 45(3):237-45)、
スクアレンエポキシダーゼ(ERG1)をコードする核酸(Jandrositz, A.,ら(1991) The gene encoding squalene epoxidase from Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107:155-160)および、
スクアレン合成酵素(ERG9)をコードする核酸(Jennings, S.M., (1991): Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase. Proc Natl Acad Sci USA. Jul15;88(14):6038-42)、
などが挙げられる。
【００１０】
さらに、酵母および真菌におけるステロール代謝の特定の中間体および異化代謝産物における含量を増加させる公知の方法が存在する。
【００１１】
HMG-CoA還元酵素の発現速度の増加はスクアレンなどの初期ステロールの含量のわずかな増加をもたらすが、エルゴステロールなどの後期ステロールの含量は有意に変化しないか、または減少する傾向さえあるということが、T. Polakowski, Molekularbiologische Beeinflussung des Ergosterolstoffwechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae [Molecular-biological effects on the ergosterol metabolism of the yeast Saccharomyces cerevisiae], Shaker Verlag Aachen, 1999, 59〜66頁から知られている。
【００１２】
Tainakaら、J, Ferment. Bioeng. 1995, 79, 64-66はさらに、ERG11(ラノステロールC14-デメチラーゼ)の過剰発現が4,4-ジメチルチモステロールの蓄積をもたらすが、エルゴステロールの蓄積はもたらさないことを記載している。野生型と比較して、形質転換体のチモステロール含量は、発酵条件に依存して、1.1から1.47の因子により増加する。
【００１３】
WO 99/16886は、遺伝子tHMG、ERG9、SAT1およびERG1の組合せを過剰発現する酵母におけるエルゴステロールの製造方法を記載している。
【００１４】
EP 486 290は、HMG-CoA還元酵素の発現速度を増加させ、エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノール-22-デヒドロゲナーゼ(以下Δ22-デサチュラーゼ(ERG5)とも呼ぶ)の代謝経路を同時に妨害することにより、酵母におけるスクアレン、チモステロール、エルゴスタ-5,7,24(28)-トリエノールおよびエルゴスタ-5,7-ジエノール含量を増加させる方法を開示している。
【００１５】
しかしながら、この方法の欠点は、エルゴスタ-5,7-ジエノールの収率が依然として満足のいくものではないことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、より高い生産収率などの有利な特性を有する、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の製造のためのさらなる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、この課題が、野生型と比較して、
低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および、
増加したHMG-CoA還元酵素活性および、
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも1種の活性の増加した活性、
を有する生物を培養する、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を製造する方法により達成されることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
低下した活性とは、活性の低下だけではなく、活性の完全な消失をも意味するものと理解される。従って、活性の低下は、例えば、関連する酵素活性の検出可能性の欠如または関連するタンパク質の免疫学的な検出可能性の欠如によりアッセイすることができる、生物における関連するタンパク質の量的な低下から関連するタンパク質の完全な不在までをも包含する。
【００１９】
Δ22-デサチュラーゼ活性は、Δ22-デサチュラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【００２０】
Δ22-デサチュラーゼは、エルゴスタ-5,7-ジエノールをエルゴスタ-5,7,22,24-テトラエン-3β-オールに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００２１】
従って、Δ22-デサチュラーゼ活性は、特定の時間内にタンパク質Δ22-デサチュラーゼにより変換されたエルゴスタ-5,7-ジエノールの量、または形成されたエルゴスタ-5,7,22,24-テトラエン-3β-オールの量を意味するものと理解される。
【００２２】
かくして、野生型と比較して低下したΔ22-デサチュラーゼ活性の場合、特定の時間内にタンパク質Δ22-デサチュラーゼにより変換されたエルゴスタ-5,7-ジエノールの量、または形成されたエルゴスタ-5,7,22,24-テトラエン-3β-オールの量は野生型と比較して低下している。
【００２３】
Δ22-デサチュラーゼ活性は、野生型と比較して、少なくとも90％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも30％、さらにより好ましくは少なくとも10％、さらにより好ましくは少なくとも5％まで低下し、特に野生型のΔ22-デサチュラーゼ活性の0％まで低下するのが好ましい。従って、特に好ましいのは、生物におけるΔ22-デサチュラーゼ活性の消失である。
【００２４】
Δ22-デサチュラーゼ(ERG5)活性を、以下に記載のように決定することができる。
【００２５】
S. cerevisiae Erg5突然変異体(Parksら、1985. Yeast sterols.yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 111:333-346)から単離された、種々の濃度のエルゴスタ-5,7-ジエノールおよび50μgのジラウロイルホスファチジルコリンを混合し、白色の懸濁形態になるまで超音波処理する。処理されたミクロソームを加える(1 ml)(3 mg/mlタンパク質)。NADPH(最終濃度1 mM)を試験混合物に加えて、酵素反応を開始させる。混合物を37℃にて20分間インキュベートする。3 mlのメタノールを加えることにより反応を停止させ、水中の2 mlの60％(wt/vol)KOHの添加によりステロールを加水分解する。混合物を90℃にて2時間インキュベートする。冷却後、混合物を5 mlのヘキサンで3回抽出し、回転式エバポレーター上での蒸発により濃縮する。続いて、ステロールを、ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(50μlのトルエン中の50μl)を用いて60℃にて1時間、シリル化する。ステロールをガスクロマトグラフィー／質量スペクトル分析(GC-MS)(例えば、Model VG 12-250ガスクロマトグラフィー-質量分析装置；VG Biotech, Manchester, United Kingdom)により分析する。得られたΔ22-脱飽和中間体を、用いた基質の量の関数として同定することができる。基質と共にインキュベートされないミクロソームは参照として働く。
【００２６】
この方法は、Lambら：Purification, reconstitution, and inhibition of cytochrome P-450 sterol delta22-desaturase from the pathogenic fungus Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 1999 Jul;43(7):1725-8に記載の方法を改変したものである。
【００２７】
Δ22-デサチュラーゼ活性を、例えば、目的の酵素の阻害剤の添加によって、タンパク質レベルで対応する活性を阻害することにより、または野生型と比較してΔ22-デサチュラーゼをコードする対応する核酸の遺伝子発現を低下させることにより、異なる細胞機構により独立に低下させることができる。
【００２８】
本発明による方法の好ましい実施形態においては、Δ22-デサチュラーゼ活性を、Δ22-デサチュラーゼをコードする対応する核酸の遺伝子発現を低下させることにより、野生型と比較して低下させる。
【００２９】
野生型と比較してΔ22-デサチュラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を低下させることは、例えば、
a) 例えば、内因性Δ22-デサチュラーゼ活性の発現を阻害することにより、Δ22-デサチュラーゼ活性を阻害することができるアンチセンス核酸配列に転写され得る核酸配列を導入すること、
b) 同時抑制をもたらす、相同的Δ22-デサチュラーゼ核酸配列を過剰発現させること、
c) 生物にRNA/DNAオリゴヌクレオチドを導入することにより、ナンセンス突然変異をエンドゲンに導入すること、
d) 遺伝子発現の低下をもたらす、特異的DNA結合因子、例えば、ジンクフィンガー転写因子型の因子を導入すること、または
e) 例えば、T-DNA突然変異誘発もしくは相同組換えを援用したノックアウト突然変異体の作製、
などの種々の方法で行うことができる。
【００３０】
本発明による方法の好ましい実施形態においては、Δ22-デサチュラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を、ノックアウト突然変異体を作製することにより、特に好ましくは相同組換えにより低下させる。
【００３１】
従って、機能的なΔ22-デサチュラーゼ遺伝子を有さない生物を用いるのが好ましい。
【００３２】
好ましい実施形態においては、ノックアウト突然変異体の作製、すなわち、標的のΔ22-デサチュラーゼ遺伝子座の欠失を、相同組換えにより、活性が野生型と比較して増加したタンパク質をコードする、以下に記載の少なくとも1種の核酸を含む発現カセットの組込みと同時に行う。
【００３３】
この目的のために、プロモーター、コード配列、および必要に応じて、ターミネーターを含む以下に記載の発現カセットに加えて、ならびに以下に記載の選択マーカーに加えて、3’および5’末端に、欠失させようとする遺伝子の始めおよび終わりの核酸配列と同一である核酸配列を含む核酸構築物を用いることができる。
【００３４】
一度選択すれば、リコンビナーゼ系により、例えば、Creリコンビナーゼを用いて、選択マーカーの3’および5’末端のloxPシグナル(Cre-LoxP系)により、再度選択マーカーを除去するのが好ましい。
【００３５】
好ましい生物Saccharomyces cerevisiaeにおいては、Δ22-デサチュラーゼ遺伝子は遺伝子ERG5(配列番号1)を意味する。配列番号2は対応するSaccharomyces cerevisiaeのΔ22-デサチュラーゼを構成する(Skaggs, B.A.ら: Cloning and characterization of the Saccharomyces cerevisiae C-22 sterol desaturase gene,encoding a second cytochrome P-450 involved in ergosterol biosynthesis, Gene.1996 Feb22;169(1):105-9.)。
【００３６】
HMG-CoA還元酵素活性は、HMG-CoA還元酵素(3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムA還元酵素)の酵素活性を意味するものと理解される。
【００３７】
HMG-CoA還元酵素は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAをメバロン酸に変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００３８】
従って、HMG-CoA還元酵素活性は、特定の時間内にタンパク質HMG-CoA還元酵素により変換される3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAの量、または形成されるメバロン酸の量を意味するものと理解される。
【００３９】
かくして、野生型と比較して増加したHMG-CoA還元酵素活性の場合、特定の時間内にタンパク質HMG-CoA還元酵素により変換される3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAの量、または形成されるメバロン酸の量は、野生型と比較して増加する。
【００４０】
好ましくは、HMG-CoA還元酵素活性におけるこの増加は、野生型のHMG-CoA還元酵素活性の少なくとも5％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも100％、さらにより好ましくは少なくとも300％、特に好ましくは少なくとも500％、特に、少なくとも600％に達する。
【００４１】
HMG-CoA還元酵素活性を、Th. Polakowski, Molekularbiologische Beeinflussung des Ergosterolstoffwechsels der Hefe Saccharomyces cerevisiae, Shaker-Verlag, Aachen 1999, ISBN 3-8265-6211-9に記載のように決定する。
【００４２】
この参考文献に従えば、48時間齢培養物の109個の酵母細胞を遠心分離(3500xg、5分間)により回収し、2 mlのバッファーI(100 mMリン酸カリウムバッファー、pH 7.0)中で洗浄する。細胞ペレットを500μlのバッファー1(細胞質ゾルタンパク質)または2(100 mMリン酸カリウムバッファー pH 7.0；1％ Triton X-100)(総タンパク質)中に取り、1μlのイソプロパノール中の500 mM PMSFを加える。500μlのガラスビーズ(d = 0.5 mm)を細胞に加え、細胞を1分間、5 xでボルテックスすることにより破壊する。ガラスビーズ間の液体を新鮮なEppendorfチューブに移す。細胞破片および膜成分を、15分間遠心分離(14000 xg)することにより除去する。上清を新鮮なEppendorfチューブに移し、タンパク質画分を構成させる。
【００４３】
HMG-CoA活性を、基質として加えた3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoAの還元におけるNADPH+H+の消費を測定することにより決定する。
【００４４】
1000μlの反応容量中、910μlのバッファーI；50μlの0.1 M DTTおよび10μlの16 mM NADPH+H+と共に20μlの酵母タンパク質単離物を加える。この反応混合物を30℃に加温し、340 nmにて7.5分間、光測定器中で測定する。この時間中に測定されるNADPHの減少は、基質を添加しない場合の崩壊速度であり、バックグラウンドとして考慮に入れる。
【００４５】
その後、基質を添加し(10μlの30 mM HMG-CoA)、測定を7.5分間継続する。HMG-CoA還元酵素活性を、特異的なNADPH崩壊速度を決定することにより算出する。
【００４６】
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性は、ラノステロールC14-デメチラーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【００４７】
ラノステロールC14-デメチラーゼは、ラノステロールを4,4-ジメチルコレスタ-8,14,24-トリエノールに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００４８】
従って、ラノステロールC14-デメチラーゼ活性は、特定の時間内にタンパク質ラノステロールC14-デメチラーゼにより変換されるラノステロールの量、または形成される4,4-ジメチルコレスタ-8,14,24-トリエノールの量を意味するものと理解される。
【００４９】
かくして、野生型と比較して増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性の場合、特定の時間内にタンパク質ラノステロールC14-デメチラーゼにより変換されるラノステロールの量、または形成される4,4-ジメチルコレスタ-8,14,24-トリエノールの量は、野生型と比較して増加する。
【００５０】
好ましくは、ラノステロールC14-デメチラーゼ活性におけるこの増加は、野生型のラノステロールC14-デメチラーゼ活性の少なくとも5％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも100％、さらにより好ましくは少なくとも300％、特に好ましくは少なくとも500％、特に、少なくとも600％に達する。
【００５１】
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性を、Omura, TおよびSato, R. (1964) The carbon monoxide binding pigment in liver microsomes. J.Biol.Chem. 239, 2370-2378に記載のように測定する。この試験において、P450酵素の量は、結合したヘムとのホロ酵素として半定量可能である。(ヘムを含む)(活性な)ホロ酵素を、COにより還元することができ、CO-還元された酵素のみが450 nmでの最大吸光度を有する。かくして、450 nmでの最大吸光度はラノステロールC14-デメチラーゼ活性の尺度である。
【００５２】
活性の決定を実行するために、ミクロソーム画分(100 mMリン酸カリウムバッファー中の4〜10 mg/mlタンパク質)を、アッセイに用いるタンパク質濃度が2 mg/mlとなるように1:4に希釈する。アッセイを細胞中で直接実行する。
【００５３】
スパーテル1杯のジチオナイト(S2O4Na2)をミクロソームに加える。基線を380〜500 nmの範囲で分光分析装置を用いて記録する。
【００５４】
続いて、約20〜30個のCO気泡を、サンプルを通じて気泡化する。ここで、吸光度を同じ範囲で測定する。450 nmでの吸光レベルは反応混合物中のP450酵素の量に対応する。
【００５５】
スクアレンエポキシダーゼ活性は、スクアレンエポキシダーゼの酵素活性を意味するものと理解される。
【００５６】
スクアレンエポキシダーゼは、スクアレンをスクアレンエポキシドに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００５７】
従って、スクアレンエポキシダーゼ活性は、特定の時間内にタンパク質スクアレンエポキシダーゼにより変換されるスクアレンの量、または形成されるスクアレンエポキシドの量を意味するものと理解される。
【００５８】
かくして、野生型と比較して増加したスクアレンエポキシダーゼ活性の場合、特定の時間内にタンパク質スクアレンエポキシダーゼにより変換されるスクアレンの量、または形成されるスクアレンエポキシドの量は、野生型と比較して増加する。
【００５９】
好ましくは、スクアレンエポキシダーゼ活性におけるこの増加は、野生型のスクアレンエポキシダーゼ活性の少なくとも5％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも100％、さらにより好ましくは少なくとも300％、特に好ましくは少なくとも500％、特に、少なくとも600％に達する。
【００６０】
スクアレンエポキシダーゼ活性を、Leber R, Landl K, Zinser E, Ahorn H, Spok A, Kohlwein SD, Turnowsky F, Daum G. (1998) Dual localization of squalene epoxidase, Erg1p, in yeast reflects a relationship between the endoplasmic reticulum and lipid particles, Mol. Biol. Cell. 1998, Feb;9(2):375-86に記載のように決定する。
【００６１】
この方法は、総量500μl中に、100 mM Tris-HCl, pH 7.5、1 mM EDTA、0.1 mM FAD、3 mM NADPH、0.1 mMスクアレン2,3-エポキシダーゼシクラーゼ阻害剤U18666A、0.005% Tween 80中に分散させた32μM[3H]スクアレン中の0.35〜0.7 mgのミクロソームタンパク質または3.5〜75μgの脂質粒子タンパク質を含む。
【００６２】
アッセイを30℃で行う。10分間予備処理した後、スクアレンを添加することにより反応を開始させ、3 mlのクロロホルム／メタノール(2:1 vol/vol)および750μlの0.035% MgCl2を用いた液体抽出により、15、30または45分後に停止させる。
【００６３】
液体を窒素下で乾燥させ、0.5 mlのクロロホルム／メタノール(2:1 vol/vol)中に再溶解する。薄層クロマトグラフィーのために、一部をシリカゲル60プレート(0.2 mm)上に置き、溶離剤としてクロロホルムを用いて分離する。[3H]2,3-オキシドスクアレンおよび[3H]スクアレンを含む位置を引っかいて取り、シンチレーションカウンターを用いて定量する。
【００６４】
スクアレン合成酵素活性は、スクアレン合成酵素の酵素活性を意味するものと理解される。
【００６５】
スクアレン合成酵素は、ファルネシルピロリン酸をスクアレンに変換する酵素活性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００６６】
従って、スクアレン合成酵素活性は、特定の時間内にタンパク質スクアレン合成酵素により変換されるファルネシルピロリン酸の量、または形成されるスクアレンの量を意味するものと理解される。
【００６７】
かくして、野生型と比較して増加したスクアレン合成酵素活性の場合、特定の時間内にタンパク質スクアレン合成酵素により変換されるファルネシルピロリン酸の量、または形成されるスクアレンの量は、野生型と比較して増加する。
【００６８】
好ましくは、スクアレン合成酵素活性におけるこの増加は、野生型のスクアレン合成酵素活性の少なくとも5％、より好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも100％、さらにより好ましくは少なくとも300％、特に好ましくは少なくとも500％、特に、少なくとも600％に達する。
【００６９】
スクアレン合成酵素活性を、以下に記載のように決定することができる。
【００７０】
反応混合物は、ガラス管中、総量200μl中に50 mM Mops, pH 7.2、10 mM MgCl2、1％(v/v) Tween-80、10％(v/v) 2-プロパノール、1 mM DTT、1 mg/ml BSA、NADPH、FPP(またはPSPP)およびミクロソーム(タンパク質含量3 mg)を含む。放射活性基質[1-3H]FPP(15〜30 mCi/μmol)と共に、反応物を30℃で30分間インキュベートし、懸濁混合物に1倍量の1:1(v/v)40％水性KOH:メタノールを充填する。液体NaClを、溶液が飽和するまで加え、0.5%(v/v)スクアレンを含む2 mlのリグロインを同様に加える。
【００７１】
懸濁液を30秒間ボルテックスする。パスツールピペットを用いて、リグロイン層の1 ml部分を、パックされた0.5 x 6 cmアルミニウムカラム(80〜200メッシュ、Fisher)に印加する。このカラムは0.5%(v/v)スクアレンを含む2 mlのリグロインで予め平衡化させておく。続いて、カラムを5 xの0.5%(v/v)スクアレンを含む1 mlトルエンで溶出する。スクアレンの放射活性を、シンチレーションカウンター(Beckman)を用いて、Cytoscint(ICN)シンチレーションカクテル中で測定する。
【００７２】
この方法は、Radiskyら、Biochemistry. 2000 Feb 22;39(7):1748-60、Zhangら(1993) Arch. Biochem. Biophys. 304, 133-143およびPoulter, C. D.ら(1989) J. Am. Chem. Soc. 111, 3734-3739に記載の方法を改変したものである。
【００７３】
野生型は、対応する遺伝子改変されていない出発生物を意味するものと理解される。好ましくは、および特に、該生物または野生型が不明瞭に同定可能でない場合、Δ22-デサチュラーゼ活性の低下、HMG-CoA還元酵素活性の増加、ラノステロールC14-デメチラーゼ活性の増加、スクアレンエポキシダーゼ活性の増加およびスクアレン合成酵素活性の増加のため、ならびにエルゴスタ-5,7-ジエノールおよび／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量の増加のための野生型は、参照の生物を意味するものと理解される。この参照生物は、酵母株Saccharomyces cerevisiae AH22であるのが好ましい。
【００７４】
HMG-CoA還元酵素活性、ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性またはスクアレン合成酵素活性を、例えば、発現およびタンパク質レベルで調節機構を阻害して排除することにより、または野生型と比較して、対応する核酸、すなわち、HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより、種々の方法で独立に増加させることができる。
【００７５】
野生型と比較して対応する核酸の遺伝子発現を増加させることを、例えば、活性化因子により対応する遺伝子を誘導する、すなわち、活性化因子によりHMG-CoA還元酵素遺伝子、ラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子、スクアレンエポキシダーゼ遺伝子またはスクアレン合成酵素遺伝子を誘導することにより、または1コピー以上の対応する核酸、すなわち、HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼもしくはスクアレン合成酵素をコードする1種以上の核酸を、生物中に導入することにより、種々の方法で同様に行うことができる。
【００７６】
本発明に従って、HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加はまた、生物自身の、特に酵母自身の、内因性HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素の発現の操作を意味するものと理解される。
【００７７】
これを、例えば、HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素をコードする遺伝子のためのプロモーターDNA配列を改変することにより達成することができる。目的の遺伝子の発現速度の増加をもたらす、そのような改変を、例えば、DNA配列の欠失または挿入によりもたらすことができる。
【００７８】
上記のように、外因性の刺激因子を印加することにより、内因性HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素の発現を改変することができる。これを、特定の生理条件、すなわち、外来物質の印加によりもたらすことができる。
【００７９】
さらに、内因性HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼもしくはスクアレン合成酵素遺伝子の発現の改変または増加を、これらの遺伝子のプロモーターと相互作用する形質転換されていない生物中では生じない調節タンパク質により達成することができる。
【００８０】
そのような調節因子は、例えば、WO 96/06166に記載のような、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインからなるキメラタンパク質であってもよい。
【００８１】
好ましい実施形態においては、野生型と比較したラノステロールC14-デメチラーゼ活性の増加を、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより行う。
【００８２】
さらに好ましい実施形態においては、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加を、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする1種以上の核酸を、前記生物中に導入することにより行う。
【００８３】
原理的には、任意のラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子(ERG11)、すなわち、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする任意の核酸を、この目的のために用いることができる。イントロンを含む、真核生物起源のゲノムラノステロールC14-デメチラーゼ核酸配列の場合、および宿主生物が対応するラノステロールC14-デメチラーゼを発現することができないか、もしくは発現を可能にできない事象においては、対応するcDNAなどの予め処理された核酸配列を用いるのが好ましい。
【００８４】
ラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子の例は、Saccharomyces cerevisiae (Kalb VF, Loper JC, Dey CR, Woods CW, Sutter TR (1986) Isolation of a cytochrome P-450 structural gene from Saccharomyces cerevisiae. Gene 45(3):237-45)、Candida albicans (Lamb DC , Kelly DE, Baldwin BC, Gozzo F, Boscott P, Richards WG, Kelly SL (1997) Differential inhibition of Candida albicans CYP51 with azole antifungal stereoisomers. FEMS Microbiol Lett 149(1):25-30)、Homo sapiens (Stromstedt M, Rozman D, Waterman MR. (1996) The ubiquitously expressed human CYP51 encodes lanosterol 14 alpha-demethylase, a cytochrome P450 whose expression is regulated by oxysterols. Arch Biochem Biophys 1996 May 1;329(1):73-81c)またはRattus norvegicus(Aoyama Y, Funae Y, Noshiro M, Horiuchi T, Yoshida Y. (1994) Occurrence of a P450 showing high homology to yeast lanosterol 14-demethylase (P450(14DM)) in the rat liver. Biochem Biophys Res Commun. Jun 30;201(3):1320-6)に由来するラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸である。
【００８５】
本発明によるトランスジェニック生物中に、好ましい実施形態においては、野生型と比較して少なくとも1個のさらなるラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子が存在する。
【００８６】
本発明によるトランスジェニック生物中のラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子の数は、少なくとも2個、好ましくは3個以上、特に好ましくは4個以上、さらに特に好ましくは6個以上である。
【００８７】
本明細書に記載の核酸は全て、例えば、RNA、DNAまたはcDNA配列であってよい。
【００８８】
上記の方法は、配列番号6のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号6の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導された配列を含むタンパク質であって、ラノステロールC14-デメチラーゼの酵素特性を有する前記タンパク質をコードする核酸を用いるのが好ましい。
【００８９】
配列番号6の配列は、Saccharomyces cerevisiaeのラノステロールC14-デメチラーゼのアミノ酸配列を構成する。
【００９０】
ラノステロールC14-デメチラーゼおよびラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子のさらなる例を、例えば、ゲノム配列が公知である種々の生物から、アミノ酸配列または配列番号2を含むデータベースからの対応する戻し翻訳される核酸配列の相同性比較により、容易に見出すことができる。
【００９１】
ラノステロールC14-デメチラーゼおよびラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子のさらなる例を、例えば、配列番号5の配列から出発して、ゲノム配列が公知ではない種々の生物から、ハイブリダイゼーションおよびPCR技法による公知の様式で容易に見出すことができる。
【００９２】
本明細書における、用語「置換」は1個以上のアミノ酸による1個以上のアミノ酸の置換を意味するものと理解される。置き換えられるアミノ酸が元のアミノ酸と類似した性質を有する、保存的置換として知られるもの、例えば、AspによるGlu、AsnによるGln、IleによるVal、IleによるLeu、ThrによるSerの置換を行うのが好ましい。
【００９３】
欠失は、直接結合によるアミノ酸の置き換えである。欠失にとって好ましい位置は、ポリペプチドの末端および個々のタンパク質ドメイン間の連結部である。
【００９４】
挿入は、ポリペプチド鎖へのアミノ酸の導入であり、直接結合が1個以上のアミノ酸により形式的に置換される。
【００９５】
2個のタンパク質間の同一性は、それぞれタンパク質の長さ全体に渡るアミノ酸の同一性、特に、以下のパラメーターを設定する：
マルチアラインメントパラメーター：
Gapペナルティ10
Gap長ペナルティ10
ペアワイズアラインメントパラメーター：
K-tuple 1
Gapペナルティ3
ウィンドウ5
保存対角線5、
Clustal法(Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1)を用いる、DNASTAR, inc. Madison, Wisconsin (USA)社製のLasergeneソフトウェアを援用したアラインメントにより算出される同一性を意味するものと理解される。
【００９６】
従って、アミノ酸レベルで配列番号6の配列と少なくとも30％の同一性を有するタンパク質は、その配列が配列番号6の配列と共に、特に、上記のパラメーター設定を用いて上記のプログラムアルゴリズムに従って整列させた場合、少なくとも30％の同一性を有するタンパク質を意味するものと理解される。
【００９７】
さらに好ましい実施形態においては、Saccharomyces cerevisiaeのラノステロールC14-デメチラーゼ(配列番号6)のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸を生物中に導入する。
【００９８】
好適な核酸配列を、例えば、遺伝子コードに従ってポリペプチド配列を戻し翻訳することにより取得することができる。
【００９９】
この目的のために好ましく用いられるコドンは、生物特異的コドン使用に従って頻繁に用いられるものである。コドン使用を、目的の生物の他の公知の遺伝子のコンピューターによる評価を援用して容易に決定することができる。
【０１００】
例えば、タンパク質を酵母中で発現させる場合、戻し翻訳の際に酵母のコドン使用を用いるのが有利であることが多い。
【０１０１】
特に好ましい実施形態においては、配列番号5の配列を含む核酸を生物中に導入する。
【０１０２】
配列番号5の配列は、配列番号6の配列と共にラノステロールC14-デメチラーゼをコードする、Saccharomyces cerevisiae(ORF S0001049)に由来するゲノムDNAを構成する。
【０１０３】
上記のラノステロールC14-デメチラーゼ遺伝子は全て、例えば、二本鎖の個々の重複相補核酸単位の断片縮合などにより、それ自体公知の様式で化学合成によりヌクレオチド単位からさらに作製することができる。オリゴヌクレオチドを、例えば、ホスホアミダイト法(Voet, Voet,第2版, Wiley Press New York, 896-897頁)を用いる公知の様式で化学的に合成することができる。合成オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびDNAポリメラーゼKlenow断片を援用したギャップの補充および連結反応は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されており、一般的なクローニング方法である。
【０１０４】
好ましい実施形態においては、野生型と比較したHMG-CoA還元酵素活性の増加を、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより行う。
【０１０５】
本発明による方法の特に好ましい実施形態においては、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加を、生物中に、該生物中での発現が野生型と比較して低下した調節にかけられるHMG-CoA還元酵素をコードする核酸を含む核酸構築物を導入することにより行う。
【０１０６】
野生型と比較して低下した調節とは、上記で定義された野生型と比較して低下している調節、好ましくは発現またはタンパク質レベルで調節されていないことを意味するものと理解される。
【０１０７】
低下した調節を、前記核酸構築物中のコード配列に機能し得る形で連結され、前記生物中で野生型プロモーターと比較して低下した調節を受けやすいプロモーターを用いて達成するのが好ましい。
【０１０８】
例えば、酵母中のミドル(middle)ADHプロモーターは低下した調節を受けやすく、従って、上記の核酸構築物中のプロモーターとして特に好ましい。
【０１０９】
ADH12sプロモーターのこのプロモーター断片(以後ADH1とも呼ぶ)は、ほとんど構成的な発現を示す(Ruohonen L, Penttila M, Keranen S. (1991) Optimization of Bacillus alpha-amylase production by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. May-Jun;7(4):337-462; Lang C, Looman AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. Dec;44(1-2):147-56.)ので、エルゴステロール生合成中間体を介する転写調節はもはや進行しない。
【０１１０】
低下した調節を示すさらに好ましいプロモーターは、例えば、酵母TEF1プロモーター、酵母GPDプロモーターまたは酵母PGKプロモーター(Mumberg D, Muller R, Funk M.(1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156(1):119-22;  Chen CY, Oppermann H, Hitzeman RA.(1984) Homologous versus heterologous gene expression in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. Dec 11;12(23):8951-70.)などの構成的プロモーターである。
【０１１１】
さらに好ましい実施形態においては、低下した調節を、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸として、生物中での発現が、相同的、オーソロガスな核酸と比較して低下した調節を受けやすい核酸を用いて達成することができる。
【０１１２】
HMG-CoA還元酵素をコードする核酸として、HMG-CoA還元酵素の触媒領域のみ(トランケートされた(t-)HMG-CoA還元酵素)をコードする核酸を用いるのが特に好ましい。EP 486 290およびWO 99/16886に記載された、この核酸(t-HMG)はHMG-CoA還元酵素の触媒活性部分のみをコードするが、タンパク質レベルで調節を担う膜ドメインは欠いている。かくして、この核酸は、特に酵母中で低下した調節を受けやすく、HMG-CoA還元酵素の遺伝子発現の増加をもたらす。
【０１１３】
上記の核酸構築物を、それぞれ上記の核酸構築物を含む組込みベクターを用いて染色体的に、またはエピゾームプラスミドを用いてエピゾーム的に宿主生物に組み込むことができる。
【０１１４】
特に好ましい実施形態においては、配列番号4のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号4の配列と少なくとも30％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導された配列を含むタンパク質をコードし、そのタンパク質がHMG-CoA還元酵素の酵素特性を有する、核酸を、好ましくは上記の核酸構築物を介して導入する。
【０１１５】
配列番号4の配列は、トランケートされたHMG-CoA還元酵素(t-HMG)のアミノ酸配列を構成する。
【０１１６】
HMG-CoA還元酵素、およびかくして触媒部分、もしくはコード遺伝子まで減少されたt-HMG-CoA還元酵素のさらなる例を、例えば、ゲノム配列が公知である種々の生物から、配列番号4と、データベースに由来するアミノ酸配列または対応する戻し翻訳された核酸配列との相同性比較により容易に見出すことができる。
【０１１７】
HMG-CoA還元酵素、およびかくして触媒部分、もしくはコード遺伝子まで減少されたt-HMG-CoA還元酵素のさらなる例を、ゲノム配列が公知ではない種々の生物から、例えば、配列番号3の配列から始めて、それ自体公知の様式でハイブリダイゼーションおよびPCR技術により容易に見出すことができる。
【０１１８】
トランケートされたHMG-CoA還元酵素をコードする核酸として配列番号3の配列を含む核酸を用いるのが特に好ましい。
【０１１９】
特に好ましい実施形態においては、低下した調節を、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸として、生物中での発現がその生物自身のオーソロガスな核酸と比較して低下した調節を受けやすい核酸を用いることにより、および野生型プロモーターと比較して該生物中で低下した調節を受けやすいプロモーターを用いることにより達成する。
【０１２０】
好ましい実施形態においては、野生型と比較したスクアレンエポキシダーゼ活性の増加を、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより行う。
【０１２１】
さらに好ましい実施形態においては、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の遺伝子発現の増加を、生物中に、スクアレンエポキシダーゼをコードする1個以上の核酸を導入することにより行う。
【０１２２】
原理的には、任意のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子(ERG1)、すなわち、スクアレンエポキシダーゼをコードする任意の核酸を、この目的のために用いることができる。イントロンを含む、真核生物起源のゲノムスクアレンエポキシダーゼ核酸配列の場合、および宿主生物が対応するスクアレンエポキシダーゼを発現することができないか、または発現させることができない事象においては、対応するcDNAなどの予め処理された核酸配列を用いるのが好ましい。
【０１２３】
スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の例は、Saccharomyces cerevisiae (Jandrositz, A.,ら(1991) The gene encoding squalene epoxidase from Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107:155-160)、Mus musculus (Kosuga K, Hata S, Osumi T, Sakakibara J, Ono T. (1995) Nucleotide sequence of a cDNA for mouse squalene epoxidase, Biochim Biophys Acta, Feb 21;1260(3):345-8b)、Rattus norvegicus (Sakakibara J, Watanabe R, Kanai Y, Ono T. (1995) Molecular cloning and expression of rat squalene epoxidase. J Biol Chem  Jan 6;270(1):17-20c)またはヒト(Nakamura Y, Sakakibara J, Izumi T, Shibata A, Ono T. (1996) Transcriptional regulation of squalene epoxidase by sterols and inhibitors in HeLa cells., J. Biol. Chem. 1996, Apr 5;271(14):8053-6)に由来するスクアレンエポキシダーゼをコードする核酸である。
【０１２４】
本発明によるトランスジェニック生物中に、この好ましい実施形態においては、野生型と比較して少なくとも1個のさらなるスクアレンエポキシダーゼ遺伝子が存在する。
【０１２５】
本発明によるトランスジェニック生物中のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子の数は、少なくとも2個、好ましくは3個以上、特に好ましくは4個以上、さらに特に好ましくは6個以上である。
【０１２６】
上記の方法は、配列番号8のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号8の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導される配列を含み、スクアレンエポキシダーゼの酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸を用いるのが好ましい。
【０１２７】
配列番号8の配列は、Saccharomyces cerevisiaeのスクアレンエポキシダーゼのアミノ酸配列を構成する。
【０１２８】
スクアレンエポキシダーゼおよびスクアレンエポキシダーゼ遺伝子のさらなる例を、例えば、ゲノム配列が公知である種々の生物から、配列番号8とデータベース由来のアミノ酸配列または対応する戻し翻訳された核酸配列との相同性比較により容易に見出すことができる。
【０１２９】
スクアレンエポキシダーゼおよびスクアレンエポキシダーゼ遺伝子のさらなる例を、例えば、配列番号7の配列から始めて、ゲノム配列が公知ではない種々の生物からハイブリダイゼーションおよびPCR技術によりそれ自体公知の様式で容易に見出すことができる。
【０１３０】
さらに好ましい実施形態においては、Saccharomyces cerevisiaeのスクアレンエポキシダーゼのアミノ酸配列(配列番号8)を含むタンパク質をコードする核酸を生物中に導入する。
【０１３１】
好適な核酸配列を、例えば、遺伝子コードに従ってポリペプチド配列を戻し翻訳することにより取得することができる。
【０１３２】
この目的に好ましく用いられるコドンは、生物特異的なコドン使用に従って頻繁に用いられるものである。コドン使用を、目的の生物の他の公知の遺伝子のコンピューターによる評価を援用して容易に決定することができる。
【０１３３】
例えば、タンパク質を酵母中で発現させる場合、戻し翻訳の際に酵母のコドン使用を用いるのが有利であることが多い。
【０１３４】
特に好ましい実施形態においては、配列番号7の配列を含む核酸を生物中に導入する。
【０１３５】
配列番号7の配列は、配列番号8の配列を含むスクアレンエポキシダーゼをコードする、Saccharomyces cerevisiae(ORF S0003407)に由来するゲノムDNAを構成する。
【０１３６】
さらに、上記のスクアレンエポキシダーゼ遺伝子は全て、例えば、個々の重複する相補的な二本鎖の核酸単位の断片縮合などによる、それ自体公知の様式の化学合成によって、ヌクレオチド単位から作製することができる。オリゴヌクレオチドを、例えば、ホスホアミダイト法(Voet, Voet,第2版, Wiley Press New York, 896-897頁)を用いる公知の様式で化学的に合成することができる。合成オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびDNAポリメラーゼKlenow断片を援用したギャップの補充および連結反応は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されており、一般的なクローニング方法である。
【０１３７】
好ましい実施形態においては、野生型と比較したスクアレン合成酵素活性の増加を、スクアレン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現を増加させることにより行う。
【０１３８】
さらに好ましい実施形態においては、スクアレン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現の増加を、生物中に、スクアレン合成酵素をコードする1個以上の核酸を導入することにより行う。
【０１３９】
原理的には、任意のスクアレン合成酵素遺伝子(ERG9)、すなわち、スクアレン合成酵素をコードする任意の核酸を、この目的のために用いることができる。イントロンを含む、真核生物起源のゲノムスクアレン合成酵素核酸配列の場合、および宿主生物が対応するスクアレン合成酵素を発現することができないか、または発現させることができない事象においては、対応するcDNAなどの予め処理された核酸配列を用いるのが好ましい。
【０１４０】
スクアレン合成酵素をコードする核酸の例は、Saccharomyces cerevisiae (ERG9)由来のスクアレン合成酵素をコードする核酸(Jennings, S.M., (1991): Molecular cloning and characterization of the yeast gene for squalene synthetase. Proc Natl Acad Sci USA. Jul15;88(14):6038-42)、Botryococcus braunii Okada由来のスクアレン合成酵素をコードする核酸(Devarenne, T.P.ら: Molecular characterization of squalene synthase from the green microalga Botryococcus braunii, raceB, Arch. Biochem. Biophys. 2000, Jan15, 373(2):307-17)、potato tuber由来のスクアレン合成酵素をコードする核酸(Yoshioka H.ら: cDNA cloning of sesquiter penecyclase and squalene synthase, and expression of the genes in potato tuber infected with Phytophthora infestans, Plant. Cell. Physiol.1999, Sep;40(9):993-8)またはGlycyrrhiza glabra由来のスクアレン合成酵素をコードする核酸(Hayashi, H.ら: Molecular cloning and characterization of two cDNAs for Glycyrrhiza glabra squalene synthase, Biol. Pharm. Bull. 1999, Sep;22(9):947-50)である。
【０１４１】
本発明によるトランスジェニック生物中に、この好ましい実施形態においては、野生型と比較して少なくとも1個のさらなるスクアレン合成酵素遺伝子が存在する。
【０１４２】
本発明によるトランスジェニック生物中のスクアレン合成酵素遺伝子の数は、少なくとも2個、好ましくは3個以上、特に好ましくは4個以上、さらに特に好ましくは6個以上である。
【０１４３】
上記の方法は、配列番号10のアミノ酸配列、またはアミノ酸レベルで配列番号10の配列と少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、特に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の同一性を有する、アミノ酸の置換、挿入もしくは欠失によりこの配列から誘導される配列を含み、スクアレン合成酵素の酵素特性を有するタンパク質をコードする核酸を用いるのが好ましい。
【０１４４】
配列番号10の配列は、Saccharomyces cerevisiaeのスクアレン合成酵素(ERG9)のアミノ酸配列を構成する。
【０１４５】
スクアレン合成酵素およびスクアレン合成酵素遺伝子のさらなる例を、例えば、ゲノム配列が公知である種々の生物から、配列番号10とデータベース由来のアミノ酸配列または対応する戻し翻訳された核酸配列との相同性比較により容易に見出すことができる。
【０１４６】
スクアレン合成酵素およびスクアレン合成酵素遺伝子のさらなる例を、例えば、配列番号9の配列から始めて、ゲノム配列が公知ではない種々の生物からハイブリダイゼーションおよびPCR技術によりそれ自体公知の様式で容易に見出すことができる。
【０１４７】
さらに好ましい実施形態においては、Saccharomyces cerevisiaeのスクアレン合成酵素のアミノ酸配列(配列番号10)を含むタンパク質をコードする核酸を生物中に導入する。
【０１４８】
好適な核酸配列を、例えば、遺伝子コードに従ってポリペプチド配列を戻し翻訳することにより取得することができる。
【０１４９】
この目的に好ましく用いられるコドンは、生物特異的なコドン使用に従って頻繁に用いられるものである。コドン使用を、目的の生物の他の公知の遺伝子のコンピューターによる評価を援用して容易に決定することができる。
【０１５０】
例えば、タンパク質を酵母中で発現させる場合、戻し翻訳の際に酵母のコドン使用を用いるのが有利であることが多い。
【０１５１】
特に好ましい実施形態においては、配列番号9の配列を含む核酸を生物中に導入する。
【０１５２】
配列番号9の配列は、配列番号10の配列のスクアレン合成酵素をコードする、Saccharomyces cerevisiae(ORF YHR190W)に由来するゲノムDNAを構成する。
【０１５３】
さらに、上記のスクアレン合成酵素遺伝子は全て、例えば、個々の重複する相補的な二本鎖の核酸単位の断片縮合などによる、それ自体公知の様式の化学合成によって、ヌクレオチド単位から作製することができる。オリゴヌクレオチドを、例えば、ホスホアミダイト法(Voet, Voet,第2版, Wiley Press New York, 896-897頁)を用いる公知の様式で化学的に合成することができる。合成オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびDNAポリメラーゼKlenow断片を援用したギャップの補充および連結反応は、Sambrookら(1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されており、一般的なクローニング方法である。
【０１５４】
本発明による方法において培養される生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性およびラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される活性の少なくとも1個以上の増加した活性を有する生物である。
【０１５５】
好ましい実施形態においては、培養される生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性またはスクアレン合成酵素活性を有する生物である。
【０１５６】
本発明による方法の特に好ましい実施形態においては、前記生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性、およびラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも2個の活性の増加した活性を有する。
【０１５７】
特に好ましい組合せは、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性およびスクアレンエポキシダーゼ活性もしくはラノステロールC14-デメチラーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性または増加したスクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性である。
【０１５８】
本発明による方法のさらに特に好ましい実施形態においては、前記生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性および増加したスクアレンエポキシダーゼ活性および増加したスクアレン合成酵素活性を有する。
【０１５９】
生物または遺伝的に改変された生物は、野生型と同様、または以前の遺伝的改変のために、本発明に従う、例えば、細菌、特に、以下の属、Bacillus、Echerichia coli、Lactobacillus種またはStreptomyces種の細菌、
例えば、酵母、特に、以下の属、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastorisまたはKlyveromyces種の酵母、
例えば、真菌、特に、以下の属、Aspergillus種、Penicillium種またはDictyostelium種の真菌、
ならびに、例えば、エルゴスタ-5,7-ジエノールおよび／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を生成し得る昆虫細胞系、
を意味するものと理解される。
【０１６０】
特に好ましい生物または遺伝的に改変された生物は、酵母、特にSaccharomyces cerevisiae種、特に、酵母株Saccharomyces cerevisiae AH22、Saccharomyces cerevisiae GRF、Saccharomyces cerevisiae DBY747およびSaccharomyces cerevisiae BY4741である。
【０１６１】
エルゴスタ-5,7-ジエノールの生合成中間体は、用いる生物中でのエルゴスタ-5,7-ジエノール生合成における中間体として生じる全ての化合物、好ましくは、化合物メバロン酸、ファルネシルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸、スクアレンエポキシド、4-ジメチルコレスタ-8,14,24-トリエノール、4,4-ジメチルチモステロール、スクアレン、ファルネソール、ゲラニオール、ラノステロール、チモステロン(zymosterone)およびチモステロールを意味するものと理解される。
【０１６２】
エルゴスタ-5,7-ジエノールの生合成代謝物は、用いる生物中のエルゴスタ-5,7-ジエノールの生合成誘導体、すなわち、エルゴスタ-5,7-ジエノールが中間体として生じる全ての化合物を意味するものと理解される。これらは、用いる生物がエルゴスタ-5,7-ジエノールから天然に産生する化合物であってもよい。
【０１６３】
しかしながら、これらは、出発生物がオーソロガスな遺伝子を有さない他の生物から遺伝子および酵素活性を導入することにより、該生物中でエルゴスタ-5,7-ジエノールから産生され得るに過ぎない化合物を意味するものとしても理解される。
【０１６４】
酵母へのさらなる植物遺伝子および／または哺乳動物遺伝子の導入により、例えば、この酵母中で、植物および／または哺乳動物においてのみ天然に生じる生合成エルゴスタ-5,7-ジエノール代謝物を産生させることができる。
【０１６５】
例えば、植物のΔ7-還元酵素(DWF5)またはその機能的な等価物もしくは変異体をコードする核酸ならびに成熟形態のCYP11A1、ADX(FDX1)、ADR(FDXR)および3β-HSDまたはその機能的な等価物もしくは変異体をコードする核酸の、酵母への導入は、この酵母中でのプロゲステロンの生合成をもたらす。酵母の対応する遺伝子改変のための手順ならびに方法および材料の詳細な説明はC. Duportら、Nat. Biotechnol. 1998, 16, 186-189およびそこに引用された参考文献中に公開されており、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１６６】
例えば、植物のΔ7-還元酵素(DWF5)またはその機能的な等価物もしくは変異体をコードする核酸ならびに成熟形態のCYP11A1、ADX(FDX1)およびADR(FDXR)またはその機能的な等価物もしくは変異体をコードする核酸ならびにミドコンドリア形態のADXおよびCYP11B1、3β-HSD、CYP17A1およびCYP21A1またはその機能的な等価物もしくは変異体をコードする核酸の、酵母への導入は、ヒドロコルチゾン、11-デオキシコルチゾール、コルチコステロンおよびアセタルプレグネノロンの生合成をもたらす。
【０１６７】
例えば、ヒドロコルチゾンなどの生合成エルゴスタ-5,7-ジエノール代謝物の含量をさらに増加させるためには、無駄な代謝経路、すなわち、所望の生成物をもたらさない生合成経路を抑制することがさらに有利である。例えば、酵母における、ATF2、GCY1およびYPR1の遺伝子産物の活性の低下、特に好ましくは、これらの活性の欠失は、ヒドロコルチゾン含量のさらなる増加をもたらす。
【０１６８】
酵母の対応する遺伝子改変のためのこの手順ならびに方法および材料の詳細な説明は、F.M. Szczebaraら、Nat. Biotechnol. 2003, 21, 143-149およびそこに引用された参考文献中に公開されており、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０１６９】
従って、生合成エルゴスタ-5,7-ジエノール代謝物は、具体的には、カンペステロール、プレグネノロン、17-OHプレグネノロン、プロゲステロン、17-OH-プロゲステロン、11-デオキシコルチゾール、ヒドロコルチゾン、デオキシコルチコステロン、および／またはコルチコステロンを意味するものと理解される。
【０１７０】
好ましい生合成代謝物は、プロゲステロン、コルチコステロンおよびヒドロコルチゾン、特に好ましくはヒドロコルチゾンである。
【０１７１】
本発明による方法で製造される化合物のいくつかは、それ自身ステロイドホルモンであり、治療目的で用いることができる。
【０１７２】
例えば、エルゴスタ-5,7-ジエノールまたはヒドロコルチゾンなどの、製造される化合物を、生物形質転換、化学合成またはバイオテクノロジーによる製造を介して、ステロイドホルモンの調製または強力な抗炎症活性、流産活性もしくは増殖防止活性を有する活性成分の合成にさらに用いることができる。
【０１７３】
エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の製造のための本発明による方法においては、遺伝的に改変された生物(以下トランスジェニック生物とも呼ぶ)を培養する工程の後、該生物を回収し、該生物からエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を単離するのが好ましい。
【０１７４】
この生物を、目的の生物に適合するそれ自体公知の様式で回収する。発酵により液体の栄養培地中で増殖させた細菌、コケ類、酵母および真菌などの微生物または植物細胞を、例えば、遠心分離、デカンテーションまたは濾過により分離することができる。
【０１７５】
回収されたバイオマスに由来するエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を、例えば、抽出および、必要に応じて、例えば、沈降法、結晶法、精留法などの温度分離法もしくは例えば、クロマトグラフィーなどの物理的分離法などのさらなる化学的または物理的精製処理により、それ自体公知の様式で各化合物について一緒に、または別々に単離する。
【０１７６】
本発明はさらに、出発生物から出発して、Δ22-デサチュラーゼ活性が低下し、HMG-CoA還元酵素活性が増加し、ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも1つの活性が増加している遺伝的に改変された生物を作製する方法に関する。
【０１７７】
標的のΔ22-デサチュラーゼ遺伝子座を欠失させるための方法は既に上記に詳述されている。
【０１７８】
好ましくは、出発生物、特に、酵母を、HMG-CoA還元酵素をコードする少なくとも1個の核酸を含む核酸構築物ならびにラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸およびスクアレン合成酵素をコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1個の核酸を含む核酸構築物であって、その核酸が該生物中での転写および翻訳を確実にする1個以上の調節シグナルに機能し得る形で連結された前記核酸構築物を用いて形質転換することにより、トランスジェニック生物、特に、酵母を作製することができる。この実施形態においては、前記トランスジェニック生物を、核酸構築物を用いて作製する。
【０１７９】
この目的に用いることができる核酸構築物は、以下に記載する発現カセットに加えて、プロモーター、コード配列および、必要に応じて、ターミネーター、およびさらに以下に記載の選択マーカーを含み、その3’および5’末端に、欠失させる遺伝子の開始点および終末点の核酸配列と同一である核酸配列を含むものである。
【０１８０】
しかしながら、好ましくは、前記トランスジェニック生物を、HMG-CoA還元酵素をコードする少なくとも1個の核酸を含む核酸構築物ならびにラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸およびスクアレン合成酵素をコードする核酸からなる群より選択される少なくとも1個の核酸を含む核酸構築物または核酸構築物の組合せを含む核酸構築物の組合せであって、それぞれ生物中での転写および翻訳を確実にする1個以上の調節シグナルに機能し得る形で連結された前記組合せを用いて、出発生物、特に、酵母を形質転換することにより作製することもできる。この実施形態においては、前記トランスジェニック生物を、個々の核酸構築物または核酸構築物の組合せを用いて作製する。
【０１８１】
コード核酸配列が生物、特に、酵母中での転写および翻訳を確実にする1個以上の調節シグナルに連結された核酸構築物を、以下発現カセットとも呼ぶ。
【０１８２】
この発現カセットを含む核酸構築物は、例えば、ベクターまたはプラスミドである。
【０１８３】
この調節シグナルは、生物、特に、酵母中で転写および翻訳を確実にする1個以上のプロモーターを含むのが好ましい。
【０１８４】
発現カセットは、調節シグナル、すなわち、宿主細胞中でのコード配列の発現を制御する調節核酸配列を含む。好ましい実施形態に従えば、発現カセットは、コード配列の上流、すなわち、5’末端にプロモーター、および下流、すなわち、3’末端にターミネーター、ならびに、必要に応じて、少なくとも1個の上記遺伝子の挿入されたコード配列に機能し得る形で連結されたさらなる調節エレメントを包含する。
【０１８５】
機能し得る形での連結とは、各々の調節エレメントがコード配列の発現に際してその意図される機能を満たすことができるような、プロモーター、コード配列、必要に応じて、ターミネーターおよび必要に応じて、さらなる調節エレメントの連続的な配置を意味するものと理解される。
【０１８６】
例えば、酵母および真菌のための好ましい核酸構築物、発現カセットおよびプラスミド、ならびにトランスジェニック酵母を作製する方法ならびにトランスジェニック酵母自体は、以下の本文に記載されている。
【０１８７】
原理的には、発現カセットのための好適なプロモーターは、生物、特に、酵母中で外来遺伝子の発現を制御することができる任意のプロモーターである。
【０１８８】
好ましく用いられるプロモーターは、特に、例えば、ミドルADHプロモーターなどの、酵母中で低下した調節を受けるプロモーターである。
【０１８９】
ADH12sプロモーターのこのプロモーター断片(以下、ADH1とも呼ぶ)は、ほぼ構成的発現を示す(Ruohonen L, Penttila M, Keranen S. (1991) Optimization of Bacillus alpha-amylase production by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. May-Jun;7(4):337-462; Lang C, Looman AC. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. Dec;44(1-2):147-56.)ので、エルゴステロール生合成中間体による転写調節はもはや有効ではない。
【０１９０】
低下した調節を有するさらに好ましいプロモーターは、例えば、酵母TEF1プロモーター、酵母GPDプロモーターまたは酵母PGKプロモーター(Mumberg D, Muller R, Funk M.(1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 1995 Apr 14;156(1):119-22;  Chen CY, Oppermann H, Hitzeman RA.(1984) Homologous versus heterologous gene expression in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. Dec 11;12(23):8951-70.)などの構成的プロモーターである。
【０１９１】
前記発現カセットは、生物中で、HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素をコードする核酸の発現を、特定の時点で制御することができる、誘導性プロモーター、特に、化学誘導性プロモーターを含んでもよい。
【０１９２】
例えば、酵母CupIプロモーター(Etcheverry T. (1990) Induced expression using yeast copper metallothionein promoter. Methods Enzymol. 1990;185:319-29.)、酵母Gal1-10プロモーター(Ronicke V, Graulich W, Mumberg D, Muller R, Funk M. (1997) Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae, Methods Enzymol.283:313-22)または酵母Pho5プロモーター(Bajwa W, Rudolph H, Hinnen A.(1987) PHO5 upstream sequences confer phosphate control on the constitutive PHO3 gene. Yeast. 1987 Mar;3(1):33-42)などのそのようなプロモーターを例として用いることができる。
【０１９３】
発現カセットにとって好適なターミネーターは、原理的には、生物、特に、酵母中で外来遺伝子の発現を制御することができる任意のターミネーターである。
【０１９４】
酵母トリプトファンターミネーター(TRP1ターミネーター)が好ましい。
【０１９５】
例えば、T. Maniatis, E.F.FritschおよびJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、T.J. Silhavy, M.L. BermanおよびL.W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)およびAusubel, F.M.ら、 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.および Wiley-Interscience (1987)に記載のような慣用的な組換えおよびクローニング技術を用いて、好適なプロモーターを、HMG-CoA還元酵素、ラノステロールC14-デメチラーゼ、スクアレンエポキシダーゼまたはスクアレン合成酵素をコードする上記の核酸および、必要に応じて、ターミネーターに融合させることにより、発現カセットを作製するのが好ましい。
【０１９６】
本発明による核酸は、合成されたものであるか、もしくは天然に得られたものであってよく、または合成および天然の核酸成分の混合物を含むか、または種々の生物に由来する種々の異種遺伝子断片からなるものであってよい。
【０１９７】
好ましいものは、上記のように、酵母により好まれるコドンを有する合成ヌクレオチド配列である。酵母により好まれるこれらのコドンを、目的の酵母種の多くにおいて発現される最も高いタンパク質頻度を有するコドンから決定することができる。
【０１９８】
発現カセットを調製する場合、種々のDNA断片を操作して、正確な向きで適切に読み取り、正確なリーディングフレームを備えたヌクレオチド配列を得ることができる。アダプターまたはリンカーを該断片に加えて、DNA断片を互いに連結することができる。
【０１９９】
プロモーターおよびターミネーター領域を、転写の向きに、この配列の挿入のための1個以上の制限切断部位を含むリンカーまたはポリリンカーと共に適切に提供することができる。原則として、このリンカーは1〜10個、多くの場合、1〜8個、好ましくは2〜6個の制限切断部位を有する。一般的には、調節領域内のリンカーは100 bp未満、しばしば60 bp未満のサイズであるが、少なくとも5 bpのサイズを有する。プロモーターは、天然、または宿主生物に関して、同種、もしくは外来、または異種のものであってよい。前記発現カセットは、転写の5’-3’の方向に、プロモーター、コード核酸配列または核酸構築物および転写終結のための領域を含むのが好ましい。種々の終結領域を所望のように互いに交換することができる。
【０２００】
好適な制限切断部位を提供するか、または不必要なDNAもしくは制限切断部位を除去する操作をさらに用いることができる。例えば、転位および転換などの挿入、欠失または置換が好適である場合、in vitro突然変異誘発、プライマー修復、制限または連結を用いることができる。
【０２０１】
例えば、制限、チューイングバックまたは平滑末端の突端の充填などの好適な操作は、連結のための断片の相補的末端を提供することができる。
【０２０２】
本発明はさらに、トランスジェニック生物、特に、酵母の作製のための、上記の核酸、上記の核酸構築物または上記のタンパク質の使用に関する。
【０２０３】
これらのトランスジェニック生物、特に、酵母は、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに/またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量が野生型と比較して増加しているのが好ましい。
【０２０４】
本発明はさらに、生物中のエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量を増加させるための、上記の核酸または本発明による核酸構築物の使用に関する。
【０２０５】
上記のタンパク質および核酸を、トランスジェニック生物中でエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を産生させるのに用いることができる。
【０２０６】
生物、特に酵母のゲノムへの外来遺伝子の導入を形質転換と呼ぶ。
【０２０７】
それ自体公知である形質転換方法を、この目的のために、特に酵母において用いることができる。
【０２０８】
酵母を形質転換するための好適な方法は、例えば、Schiestl RH, Gietz RD. (1989) High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier, Curr Genet. Dec;16(5-6):339-46に記載のLiAC法、Manivasakam P, Schiestl RH. (1993) High efficiency transformation of Saccharomyces cerevisiae by electroporation. Nucleic Acids Res. Sep 11;21(18):4414-5に記載のエレクトロポレーション、またはMorgan AJ. (1983) Yeast strain improvement by protoplast fusion and transformation, Experientia Suppl. 46:155-66に記載のプロトプラストの調製である。
【０２０９】
好ましくは、発現させる構築物を、ベクター、特に、酵母の形質転換に好適であるプラスミド、例えば、ベクター系Yep24(Naumovski L, Friedberg EC (1982) Molecular cloning of eucaryotic genes required for excision repair of UV-irradiated DNA: isolation and partial characterization of the RAD3 gene of Saccharomyces cerevisiae.J Bacteriol Oct;152(1):323-31)、Yep13 (Broach JR, Strathern JN, Hicks JB. (1979) Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene. Gene. 1979 Dec;8(1):121-33)、pRSベクター系列(セントロメアおよびエピゾーム) (Sikorski RS, Hieter P. (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. May;122(1):19-27)およびベクター系YCp19またはpYEXBXなどにクローニングする。
【０２１０】
従って、本発明はさらに、ベクター、特に、上記の核酸、核酸構築物または発現カセットを含むプラスミドに関する。
【０２１１】
本発明はさらに、出発生物中に、上記の核酸または上記の核酸構築物を機能的に挿入することによる、遺伝的に改変された生物の作製方法に関する。
【０２１２】
本発明はさらに、遺伝子改変が、野生型と比較して、
Δ22-デサチュラーゼ活性を低下させ、および、
HMG-CoA還元酵素活性を増加させ、および、
ラノステロールC14-デメチラーゼ活性、スクアレンエポキシダーゼ活性およびスクアレン合成酵素活性からなる群より選択される少なくとも1種の活性を増加させる、
遺伝的に改変された生物に関する。
【０２１３】
好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性を有する。
【０２１４】
さらに好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したスクアレンエポキシダーゼ活性を有する。
【０２１５】
さらに好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したスクアレン合成酵素活性を有する。
【０２１６】
特に好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性および増加したスクアレンエポキシダーゼ活性を有する。
【０２１７】
さらに特に好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性および増加したスクアレン合成酵素活性を有する。
【０２１８】
さらに特に好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したスクアレンエポキシダーゼ活性および増加したスクアレン合成酵素活性を有する。
【０２１９】
さらに特に好ましい実施形態においては、遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、低下したΔ22-デサチュラーゼ活性および増加したHMG-CoA還元酵素活性および増加したラノステロールC14-デメチラーゼ活性および増加したスクアレンエポキシダーゼ活性および増加したスクアレン合成酵素活性を有する。
【０２２０】
上記のように、これらの活性を、野生型と比較して、HMG-CoA還元酵素をコードする核酸、ラノステロールC14-デメチラーゼをコードする核酸、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸またはスクアレン合成酵素をコードする核酸の遺伝子発現を独立に増加させることにより増加させるのが好ましい。
【０２２１】
本発明による好ましい遺伝的に改変された生物のさらに好ましい実施形態は、上記に方法中で説明される。
【０２２２】
上記の遺伝的に改変された生物は、野生型と比較して、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量が増加している。
【０２２３】
従って、本発明は、野生型と比較して、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量が増加している上記の遺伝的に改変された生物に関する。
【０２２４】
生物または遺伝的に改変された生物は、本発明に従えば、例えば、細菌、特に、以下の属、Bacillus、Escherichia coli、Lactobacillus種またはStreptomyces種の細菌、
例えば、酵母、特に、以下の属、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastorisまたはKlyveromyces種の酵母、
例えば、真菌、特に、以下の属、Aspergillus種、Penicillium種またはDictyostelium種の真菌、
ならびに、例えば、野生型として、もしくは先述の遺伝的改変により、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物を生成することができる昆虫細胞系、
を意味するものと理解される。
【０２２５】
特に好ましい生物または遺伝的に改変された生物は、酵母、特に、Saccharomyces cerevisiae種、特に、酵母株Saccharomyces cerevisiae AH22、Saccharomyces cerevisiae GRF、Saccharomyces cerevisiae DBY747およびSaccharomyces cerevisiae BY4741である。
【０２２６】
本発明の目的のために、エルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量を増加させることは、好ましくは、遺伝的に改変されていない生物と比較して、遺伝的に改変された生物中で、最初に言及したこれらの化合物の少なくとも1種の生合成速度が増加した人工的に獲得した能力を意味する。
【０２２７】
野生型と比較して増加したエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量とは、特に、野生型と比較して、前記生物中の上記化合物の少なくとも1種の含量が少なくとも50％、好ましくは100％、より好ましくは200％、特に好ましくは400％増加することを意味するものとして理解される。
【０２２８】
上記化合物の少なくとも1種における含量の決定を、それ自体公知の分析方法により行うのが好ましく、またこれは好ましくはステロールが産生される生物のこれらのコンパートメントに関する。
【０２２９】
従来技術と比較した本発明の利点は以下のようなものである：
本発明による方法は、産生生物中のエルゴスタ-5,7-ジエノールならびに／またはその生合成中間体および／もしくは代謝物の含量を増加させることを可能にする。
【実施例】
【０２３０】
本発明を以下の実施例により説明するが、これは限定的なものではない。
【０２３１】
I. 一般的な実験条件
1. 制限処理
プラスミド(1〜10μg)を30μlの反応物中で制限処理した。この目的のために、DNAを24μlのH2O中に取り、3μlの目的のバッファー、1 mlのBSA(ウシ血清アルブミン)および2μlの酵素で処理した。酵素濃度は、DNA量に応じて、1ユニット/μlまたは5ユニット/μlであった。いくつかの場合においては、1μlのRNaseも反応物に加えて、tRNAを破壊させた。制限反応物を37℃にて2時間インキュベートした。制限を、ミニゲルを用いて調べた。
【０２３２】
2. ゲル電気泳動
ゲル電気泳動を、ミニゲルまたはワイドミニゲル装置中で行った。ミニゲル(約20 ml、8ウェル)およびワイドミニゲル(50 ml、15または30ウェル)は、TAE中の1％アガロースからなった。用いたランニングバッファーは1 x TAEであった。サンプル(10μl)を、3μlの停止溶液で処理し、印加した。HindIII切断I-DNAは標準物(バンド：23.1 kb；9.4 kb; 6.6 kb; 4.4 kb; 2.3 kb; 2.0 kb; 0.6 kb)として働いた。分離のために、80ボルトを45〜60分間印加した。その後、ゲルを、臭化エチジウム溶液中で染色し、UV光の下で、ビデオ記録システムINTASを用いて記録するか、または橙色フィルターを用いて写真撮影した。
【０２３３】
3. ゲル溶出
所望の断片を、ゲル溶出により単離した。制限反応物を、ミニゲルのいくつかのウェルに載せ、走らせた。λ-HindIIIおよび「犠牲レーン(sacrificial lane)」のみを臭化エチジウム溶液で染色し、UV光下で可視化し、所望の断片をマーキングした。このように、臭化エチジウムおよびUV光による、残りのウェル中のDNAに対する損傷を防止した。染色された、および染色されていないゲルスラブを互いに隣り合うように配置することにより、マーカーを参照して染色されていないゲルスラブから所望の断片を切り出すことが可能であった。単離しようとする断片を含むアガロース切片を透析チューブに入れ、気泡を含まない少量のTAEバッファーを用いて密封し、BioRadミニゲル装置に入れた。ランニングバッファーは1 x TAEからなり、印加した電圧は100 Vで40分間であった。その後、電流の極性を2分間逆転して、透析チューブに固着したDNAを再溶解させた。DNA断片を含む、透析チューブのバッファーを、反応容器中に移し、エタノール沈降の実行に用いた。この目的のために、1/10倍量の3M酢酸ナトリウム、tRNA(50μl溶液あたり1μl)および2.5倍量の氷冷96％エタノールをDNA溶液に加えた。反応物を-20℃で30分間インキュベートした後、12000 rpmで4℃にて30分間遠心分離した。DNAペレットを乾燥し、10〜50μlのH2O中に取った(DNA量に応じる)。
【０２３４】
4. Klenow処理
Klenow処理は、平滑末端が得られるようにDNA断片の突端を充填するものである。以下の混合物を各μgのDNAについて一緒にピペッティングした。
【０２３５】
DNAペレット＋11μl H2O
＋1.5μl 10 x Klenowバッファー
＋1μl 0.1 M DTT
＋1μlヌクレオチド(dNTP 2 mM)
25＋1μl Klenowポリメラーゼ(1ユニット/μl)
【０２３６】
この目的のためのDNAは、Klenowポリメラーゼを阻害する夾雑物を防止するためのエタノール沈降から得るべきである。混合物を37℃で30分間インキュベートし、さらに70℃で5分間インキュベートすることにより反応を停止させた。エタノールの沈降により混合物からDNAを取得し、10μlのH2O中に取った。
【０２３７】
5. 連結
連結しようとするDNA断片を混合した。13.1μlの最終容量は、ベクター：インサート比1:5を有する約0.5μlのDNAを含んでいた。サンプルを70℃で45秒間インキュベートし、室温まで冷却し(約3分間)、次いで氷上で10分間インキュベートした。その後、連結バッファー(2.6μlの500 mM TrisHCl pH 7.5および1.3μlの100 mM MgCl2)を加え、混合物を氷上でさらに10分間インキュベートした。1μlの500 mM DTTおよび1μlの10 mM ATPを加えた後、さらに氷上で10分間インキュベートし、1μlのリガーゼ(1ユニット/pl)を加えた。処理は全てできるだけ振動しないように行い、結合したDNA末端が再び分離しないようにすべきである。連結を14℃で一晩行った。
【０２３８】
6. 大腸菌の形質転換
コンピテントな大腸菌(E. coli)NM522細胞を、連結反応のDNAを用いて形質転換した。これを、陽性対照として50μgのpScL3プラスミドを含む反応物およびゼロ対照としてDNAを含まない反応物と共に行った。各形質転換反応について、100μlの8％PEG溶液、10μlのDNAおよび200μlのコンピテント細胞(大腸菌NM522)を、卓上遠心分離チューブにピペットで入れた。反応物を氷上に30分間置き、時々振とうした。
【０２３９】
次いで、これらに熱ショック処理を与えた：42℃で1分間。再生のため、1 mlのLB培地を細胞に加え、混合物を振とう器上、37℃にて90分間インキュベートした。未希釈反応物、1:10希釈物および1:100希釈物の100μl部分を、LB＋アンピシリンプレート上に入れ、37℃で一晩インキュベートした。
【０２４０】
7. 大腸菌からのプラスミドの単離(miniprep)
大腸菌コロニーを、卓上遠心分離チューブ中、1.5 mlのLB＋アンピシリン培地中で37℃、120 rpmで一晩増殖させた。次の日、細胞を5000 rpmおよび4℃で5分間遠心分離し、ペレットを50μlのTEバッファー中に取った。各反応物を100μlの0.2 N NaOH、1％ SDS溶液で処理し、混合し、氷上に5分間置いた(細胞溶解)。その後、400μlの酢酸ナトリウム／NaCl溶液(230μlのH2O、130μlの3M酢酸ナトリウム、40μlの5M NaCl)を加え、反応物を混合し、氷上にさらに15分間置いた(タンパク質沈降)。11000 rpmで15分間遠心分離した後、プラスミドDNAを含む上清をエッペンドルフチューブに移した。上清が完全に透明ではない場合、再度遠心分離した。上清を360μlの氷冷イソプロパノールで処理し、-20℃で30分間インキュベートした(DNA沈降)。DNAを遠心分離し(15分間、12000 rpm、4℃)、上清を廃棄し、ペレットを100μlの氷冷96％エタノールで洗浄し、-20℃で15分間インキュベートし、再度遠心分離した(15分間、12000 rpm、4℃)。ペレットをSpeed Vac装置中で乾燥した後、100μlのH2O中に取った。プラスミドDNAを制限酵素分析により特性評価した。この目的のために、10μlの各反応物を制限処理し、ワイドミニゲル(上記を参照)中でのゲル電気泳動により分離した。
【０２４１】
8. 大腸菌からのプラスミド調製(maxiprep)
大量のプラスミドDNAを単離するために、maxiprep法を行った。100 mlのLB＋アンピシリン培地を含む2本のフラスコに、コロニーまたは単離しようとするプラスミドを含む100μlの凍結培養物を接種し、37℃および120 rpmで一晩インキュベートした。次の日、培養物(200 ml)をGSAビーカーに移し、4000 rpm(2600 x g)で10分間遠心分離した。細胞ペレットを6 mlのTEバッファー中に取った。細胞壁を消化するために、1.2 mlのリゾチーム溶液(20 mg/ml TEバッファー)を加え、混合物を室温で10分間インキュベートした。続いて、細胞を12 mlの0.2 N NaOH、1％ SDS溶液で溶解し、さらに5分間室温にてインキュベートした。9 mlの冷3 M酢酸ナトリウム溶液(pH 4.8)を加え、氷上で15分間インキュベートすることにより、タンパク質を沈降させた。遠心分離(GSA: 13000 rpm(27500 x g)、20分間、4℃)の後、DNAを含む上清を新鮮なGSAビーカーに移し、15 mlの氷冷イソプロパノールを用いて-20℃で30分間インキュベートしてDNAを沈降させた。DNAペレットを、5 mlの氷冷エタノール中で洗浄し、空気中で乾燥させた(約30〜60分間)。次いで、これを1 mlのH2O中に取った。プラスミドを、制限分析により検証した。希釈物をミニゲルに印加することにより濃度を決定した。微小透析(孔径0.025μm)を30〜60分間行って、塩含量を低下させた。
【０２４２】
9. 酵母の形質転換
Saccharomyces cerevisiae AH22株の前培養物を、酵母の形質転換のために確立した。20 mlのYE培地を含むフラスコに、100μlの凍結培養物を接種し、28℃および120 rpmで一晩インキュベートした。主培養を、10μl、20μlまたは50μlの前培養物を接種した100 mlのYE培地を含むフラスコ中、同一の条件下で行った。
【０２４３】
9.1 コンピテント細胞の作製
次の日、血球計測計を用いてフラスコを計数し、3〜5 x 107細胞/mlの細胞濃度を有するフラスコを、以下の手順で選択した。細胞を遠心分離(GSA: 5000 rpm(4000 x g) 10分間)により回収した。細胞ペレットを10 mlのTEバッファー中に取り、2個の卓上遠心分離チューブ(それぞれ5 ml)に分割した。細胞を6000 rpmで3分間遠心分離し、それぞれ5 mlのTEバッファー中で2回洗浄した。続いて、細胞ペレットを109細胞あたり330μlの酢酸リチウムバッファー中に取り、滅菌した50 ml Erlenmeyerフラスコ中に移し、28℃で1時間振とうした。かくして、細胞は形質転換用のコンピテントになった。
【０２４４】
9.2 形質転換
各形質転換反応について、15μlのニシン精子DNA(10 mg/ml)、10μlの形質転換しようとするDNA(約0.5μg)および330μlのコンピテント細胞を、卓上遠心分離チューブにピペットで移し、28℃で30分間インキュベートした(振とうなし)。その後、700μlの50％PEG 6000を加え、反応物を振とうさせずにさらに1時間、28℃にてインキュベートした。この後、42℃で5分間、熱ショック処理を行った。100μlの懸濁液を選択培地(YNB、Difco)上に塗布して、ロイシン原培養について選択した。G418耐性の選択の場合、熱ショック処理(9.3 再生期を参照)に従って細胞を再生する。
【０２４５】
9.3 再生期
選択マーカーはG418に対する耐性であるので、細胞は耐性遺伝子を発現するための時間を必要とした。形質転換反応物を4 mlのYE培地で処理し、振とう器(120 rpm)上で28℃にて一晩インキュベートした。次の日、細胞を遠心分離(6000 rpm、3分間)し、1 mlのYE培地中に取り、100μlまたは200μlのこれをYE＋G418プレート上に塗布した。プレートを28℃で数日インキュベートした。
【０２４６】
10. PCRのための反応条件
ポリメラーゼ連鎖反応のための反応条件を、それぞれの場合について最適化する必要があるが、各手順については一般的には妥当ではない。かくして、特に、用いるDNAの量、塩濃度および融点を変化させることが可能である。本発明者らの手法については、サーモサイクラー中での使用に好適なエッペンドルフチューブ中で以下の物質を混合することが好適であると証明された：5μlのSuper Buffer、8μlのdNTP(各々0.625μm)、5’-プライマー、3’-プライマーおよび0.2μgの鋳型DNAを、PCR反応について50μlの総量となる量の水に溶解し、2μl(=0.1 U)のSuper Taqポリメラーゼを加えた。反応物を軽く遠心分離し、油滴で被覆した。増幅のために37〜40サイクルを選択した。
【０２４７】
II. 実施例
実施例1
S. cerevisiae GRFにおけるトランケートされたHMG-CoA還元酵素の発現
ADH-プロモーター-tHMG-トリプトファン-ターミネーターからなる発現カセットのコード核酸配列を、一般的な反応条件下、上記で詳述したような標準的な方法を用いるPCRにより、ベクターYepH2(Polakowskiら(1998) Overexpression of a cytosolic hydroxymethylglutaryl-CoA reductase leads to squalene accumulation in yeast. Appl Microbiol Biotechnol. Jan;49(1):66-71)から増幅した。
【０２４８】
この目的のために用いたプライマーは、DNAオリゴマーAtHT-5’(フォワード：tHMGNotF: 5’- CTGCGGCCGCATCATGGACCAATTGGTGAAAACTG-3’;配列番号11)およびAtHT-3’ (リバース: tHMGXhoR: 5’- AACTCGAGAGACACATGGTGCTGTTGTGCTTC-3’;配列番号12)である。
【０２４９】
得られたDNA断片を、まずKlenowで処理した後、ベクターpUG6中で平滑末端化し、EcoRV切断部位中にクローニングし、ベクターpUG6-tHMG(図1)を得た。
【０２５０】
プラスミドを単離した後、伸長された断片を、得られた断片が以下の構成要素：loxP-kanMX-ADH-プロモーター-tHMG-トリプトファン-ターミネーター-loxPからなるように、PCRを用いてベクターpUG-tHMGから増幅した。選択したプライマーは、5’および3’突端に、ぞれぞれURA3遺伝子の5’または3’配列を含み、アニーリング領域中に、ベクターpUG-tHMGの5’および3’のloxP領域の配列を含むオリゴヌクレオチド配列であった。これにより、第1に、KanRおよびtHMGを含む断片全体が増幅され、第2に、続いてこの断片を酵母中に形質転換し、断片全体が相同組換えにより酵母URA3遺伝子座に組み込まれることが確実になる。
【０２５１】
用いた選択マーカーはG418に対する耐性である。得られたS. cerevisiae GRF-tH1ura3株は、ウラシル栄養要求株であり、ADHプロモーターおよびトリプトファンターミネーターの制御下で遺伝子tHMGのコピーを含む。
【０２５２】
続いて、G418に対する耐性を再び除去するために、得られた酵母株を、creリコンビナーゼベクターpSH47(Guldener U, Heck S, Fielder T, Beinhauer J, Hegemann JH. (1996) A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. Jul 1;24(13):2519-24.)を用いて形質転換する。このベクターに基づいて、creリコンビナーゼを酵母中で発現させ、結果として、2個のloxP配列内の配列領域が遺伝子の外側で組み換えられる。この結果は、2個のloxP配列のうちの一方のみおよびADH-tHMG-TRPカセットがURA3遺伝子座中に保持されることである。結果として、酵母株は再びG418耐性を失い、かくして、このcre-lox系を用いて酵母株中へのさらなる遺伝子の組込みまたはそれらの除去に好適である。ベクターpSH47を、ウラシル(20 mg/l)およびFOA(5-フルオロオロト酸)(1 g/l)を補充したYNB寒天プレート上での対抗選択により再び除去することができる。この目的のために、このプラスミドを担持する細胞を、まず非選択的な条件下で培養し、続いてFOAを含有する選択プレート上で増殖させる必要がある。ウラシル自体を合成することができない細胞のみが、これらの条件下で増殖することができる。本発明の場合、これらはもはやプラスミド(pSH47)を含まない細胞である。
【０２５３】
酵母株GRFtH1ura3および元の株GRFを、20 mlの培養容量中、28℃および160 rpmにてWMXIII培地中で48時間培養した。続いて、500μlのこの前培養物を同じ培地の50 mlの主培養に移し、バッフルフラスコ中、28℃および160 rpmにて4日間培養した。
【０２５４】
Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 1985;111:333-46に記載の方法に従って、4日後にステロールを抽出し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。これにより表1に示されるデータが得られる。割合は酵母の乾燥重量に基づく。
【表１】
2006520204.tif 000002
【０２５５】
実施例2
ERG5の同時的欠失を含むS. cerevisiae GRFtH1ura3におけるERG1の発現；GRFtH1ura3ERG1erg5の作製
実施例2.1
組込みベクターpUG6-ERG1の作製
ADH-プロモーター-ERG1-トリプトファン-ターミネーターからなるカセットのDNA配列を、標準的な方法を用いて、酵素NheIおよびBsp68I(NruI)による制限処理によりベクターpFlat3-ERG1から単離した。得られたDNA断片をKlenowで処理した後、ベクターpUG6のEcoRV切断部位中に平滑末端クローニングしたところ、ベクターpUG6-ERG1が得られた(図2)。
【０２５６】
実施例2.2
組込み形質転換
プラスミドを単離した後、得られた断片が以下の構成要素：loxP-kanMX-loxP-ADH1-Pr.-ERG1-Trp-Termからなるように、PCRを用いてベクターpUG6-ERG1から伸長された断片を増幅した。用いたプライマーは、アニーリング領域中に、ベクターpUG6-ERG1の、増幅しようとするカセットの後ろの配列を含み、5’および3’突端部に、それぞれ組込み遺伝子座ERG5の5’または3’配列を含むオリゴヌクレオチド配列であった。これにより、第1に、KanRおよび標的遺伝子ERG1を含む断片全体が増幅され、第2に、続いてこの断片を酵母中に形質転換し、相同組換えにより酵母の標的遺伝子座ERG5中に組込むことができることが確実になる。この目的のために以下のプライマーを用いた：
ERG5-Crelox-5’ (配列番号13): 5’-ATGAGTTCTG TCGCAGAAAA TATAATACAA CATGCCACTC CCAGCTGAAGCTTCGTACGC-3’および
ERG5-Crelox-3’ (配列番号14): 5’-TTATTCGAAG ACTTCTCCAG TAATTGGGTC TCTCTTTTTG GCATAGGCCA CTAGTGGATC TG-3’
【０２５７】
用いる選択マーカーは、ゲネチシン(G418)に対する耐性である。得られた株は、ADH1プロモーターおよびトリプトファンターミネーターの制御下に1コピーの標的遺伝子ERG1を含む。この遺伝子の組込みにより、標的遺伝子座の対応する遺伝子ERG5を同時に欠失させることができる。続いてG418に対する耐性を再び除去するために、得られた酵母株を、creリコンビナーゼベクターpSH47を用いて形質転換する。このベクターに基づいて、creリコンビナーゼを酵母中で発現させ、結果として、2個のloxP配列内の配列領域が遺伝子を組換え、その結果、2個のloxP配列のうちの一方のみおよびADH1-prom.-ERG1-TRP1-termからなるカセットが標的遺伝子座ERG5中で保持される。結果として、この酵母株は、G418耐性を再び失う。ここで、ベクターpSH47をFOA培地上での培養により選択的に除去することができる。
【０２５８】
得られた酵母株GRFtH1ura3ERG1erg5を、20 mlの培養容量で、28℃および160 rpmにてWMVII培地中で48時間培養した。続いて、500μlのこの前培養物を同じ培地の50 mlの主培養に移し、バッフルフラスコ中、28℃および160 rpmにて3日間培養した。
【０２５９】
Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 1985;111:333-46に記載の方法に従って、ステロールを4日後に抽出し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。これにより表2に記載のデータが得られる。割合は酵母の乾燥重量に基づく。
【表２】
2006520204.tif 000003
【０２６０】
比較例1
S. cerevisiae GRFtH1ura3におけるERG5の欠失；GRFtH1ura3erg5の作製
S. cerevisiae GRFtH1ura3におけるERG5の欠失を、実施例2と同様に行った。ERG5遺伝子のみを欠失させるため、同じ方法を用いたが、ベクターpUG6-ERG1の代わりにベクターpUG6を用いた。このベクターpUG6は、ADH-prom-ERG1-Trp-termからなるカセットを含まない。このベクターを用いることにより、1個の遺伝子、この場合、遺伝子ERG5を欠失させることができる。
【０２６１】
得られた酵母株GRFtH1ura3erg5を、20 mlの培養容量で、28℃および160 rpmにてWMVII培地中で48時間培養した。続いて、500μlのこの前培養物を同じ培地の50 mlの主培養に移し、バッフルフラスコ中、28℃および160 rpmにて3日間培養した。
【０２６２】
Parks LW, Bottema CD, Rodriguez RJ, Lewis TA. (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Methods Enzymol. 1985;111:333-46に記載の方法に従って、ステロールを4日後に抽出し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。これにより表3に記載のデータが得られる。割合は酵母の乾燥重量に基づく。
【表３】
2006520204.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０２６３】
【図１】図１は、ベクターpUG6-tHMGを示す。
【図２】図２は、ベクターpUG6-ERG1を示す。
【配列表】
2006520204.tif 000005
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【図１】
2006520204.tif 000038
【図２】
2006520204.tif 000039
【国際調査報告】
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2006520204.tif 000041
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