(57)【要約】プライマー伸長、次いでリアルタイムＰＣＲ定量を用いてテロメラーゼ活性を測定する方法が開示される。本発明の方法は、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性に関して、迅速な、感度よい、且つ正確な測定を提供する。一つの態様において、当該方法は、第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物；第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物；及び第１反応混合物と第２混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること；生物学上のサンプルを第１反応混合物とインキュベートすること；伸長産物を第２反応混合物と混合すること；リアルタイムＰＣＲを用いて伸長産物を増幅及び定量すること、の工程を含む。別の態様において、上記検出方法は、完全細胞内で伸長産物の生成を許容するインサイチュプライマー伸長工程を含む。この態様においては、定量工程の完了の前に延長された時間のための適切な条件下で伸長産物が保存される。
2006506068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量するための方法であって、
第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物；
第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物；及び
第１反応混合物と第２混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること；
第１プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下で生物学上のサンプルを第１反応混合物とインキュベートすることであって、但し伸長産物は３’末端を有し；
伸長産物を第２反応混合物と混合すること；
単一の２９３Ｔ細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせる条件下でリアルタイムＰＣＲを用いて伸長産物を増幅すること；及び
対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、
の工程を含む方法。
【請求項２】
生物学上のサンプルを細胞抽出物又は組織抽出物の形態で添加する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１プライマーと第２プライマーの間の配列に結合する蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることによりリアルタイムポリメラーゼ鎖反応を定量する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
二重鎖ＤＮＡに選択的に結合する蛍光染料の存在下でリアルタイムポリメラーゼ鎖反応を実施する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第２プライマーが、蛍光原性プライマーが二重鎖ポリメラーゼ鎖反応産物に取り込まれた時に増量の蛍光放射を生じる単一標識蛍光原性プライマーである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ポリアデニル化及び連結の一方により３’末端の伸長産物を伸長させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
対照鋳型が配列番号：２に記載されたヌクレオチド配列を有する、請求項１記載された方法。
【請求項８】
サンプル細胞中のテロメラーゼ活性を検出及び定量するための方法であって、
サンプル細胞へ第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を導入すること；
細胞内で第１プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下でサンプル細胞をインキュベートすること；
リアルタイムＰＣＲを用いて伸長産物を増幅すること；及び
対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、
の工程を含む方法。
【請求項９】
サンプル細胞を溶解バッファーにより溶解することをさらに含む、請求項８岸の方法。
【請求項１０】
第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸をリン酸カルシウム沈殿法によりサンプル細胞に導入する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
細胞を少なくとも１回針に通過さること；及び
第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を含む培養培地中で細胞を培養することを含む方法により、第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸をサンプル細胞に導入する、請求項８岸の方法。
【請求項１２】
二重鎖ＤＮＡに選択的に結合する蛍光染料の存在下でリアルタイムポリメラーゼ鎖反応を実施する、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
リアルタイムポリメラーゼ鎖反応を第２プライマーの存在下で実施し、そして第２プライマーが、蛍光原性プライマーが二重鎖ポリメラーゼ鎖反応産物に取り込まれた時に増量の蛍光放射を生じる蛍光原性プライマーである、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
対照鋳型が配列番号：２に記載されたヌクレオチド配列を有する、請求項８記載された方法。
【請求項１５】
生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量するための方法であって、
第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物；
第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物；及び
第１反応混合物と第２混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること；
第１プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下で生物学上のサンプルを第１反応混合物とインキュベートすること；
ポリアデニル化及び連結のうちの一つにより伸長産物を３’において伸長すること；
ワックス層を溶解することにより伸長産物を第２反応混合物と混合すること；
単一の２９３Ｔ細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせる条件下でリアルタイムＰＣＲを用いて伸長産物を増幅すること；及び
対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、
の工程を含み、但し、第２プライマーは伸長された伸長産物の３’末端のヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項１６】
テロメラーゼ活性を検出するためのキットであって、
第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物；
第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物；及び
第１反応混合物を第２混合物反応から分離するワックス層
を含む反応チューブ、及び
第１反応混合物；
第２プライマー、対照鋳型、及びＤＮＡポリメラーゼを含む第２反応混合物；及び
対照チューブ内で第１反応混合物を第２混合物反応から分離するワックス層を含む、対照チューブ
を含むキット。
【請求項１７】
対照鋳型が配列番号：２に記載されたヌクレオチド配列を有する、請求項１６記載されたキット。
【請求項１８】
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ又は（ｂ）リガーゼ及びオリゴヌクレオチドを含む伸長混合物をさらに含む、請求項１６記載のキット。
【請求項１９】
テロメラーゼ活性を検出するためのキットであって、
サンプル細胞を溶解するための溶解バッファー；
第１プライマー；
ヌクレオシド３リン酸；
第２プライマー；及び
ＤＮＡポリメラーゼ
を含む反応バッファー；及び
配列番号：２に記載されたヌクレオチド配列又は配列番号：２に記載されたヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列を含む対照鋳型
を含むキット。
【請求項２０】
テロメラーゼ活性を阻害する薬剤による被験者の治療の効果を監視するための方法であって、
薬剤を投与する前に被験者から、前投与サンプル（pre-administration sample）を得て；
前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを検出し；
一つ又はそれより多い後投与サンプルを被験者から得て；
後投与サンプル中のテロメラーゼ活性を検出し；そして
前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを後投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルと比較する、
工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願に対するクロスレファレンス
この出願は、２００２年１１月１２日に出願された合衆国仮特許出願連続番号６０／４２５，６２０の利益を主張し、その開示は引用により本明細書に編入する。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般的には、医学上の診断及び予後の技術に関する。特定すれば、本発明は、テロメラーゼ活性の検出のための方法及び組成物に関する。
【０００３】
背景
テロメラーゼは、染色体の末端上でテロメアを合成する酵素である。テロメアは真核染色体の末端に見いだされるＤＮＡ配列であり、複製の間の遺伝情報の忠実度を保持する。正常な状況下では、テロメアは細胞分割の各サイクルと共に短くなる。十分に短いテロメアは、細胞が分割を停止させるシグナルを送ると信じられる。
【０００４】
テロメラーゼは、ＤＮＡを創製するための鋳型としてＲＮＡを使用する逆転写酵素として知られる種類の酵素である。テロメラーゼは、ＲＮＡ成分及び蛋白質成分の両方を含む。当該酵素のＲＮＡ部分はテロメア中のＤＮＡに結合し、一方蛋白質部分はＤＮＡサブユニットを当該領域へ誘い出し、それらを染色体の末端に付着させる。テロメラーゼは、次に、テロメアリピートを付加することにより染色体の末端のＧリッチ鎖を伸長する。この伸長は、テロメラーゼのＲＮＡ成分の一部の逆転写により生じ、その部分はテロメアリピートに相補な配列を含む。Ｇリッチ鎖のテロメラーゼにより触媒された伸長に続き、テロメアの相補なＤＮＡ鎖は、より慣用な手段により、おそらく複製される。真核生物の場合、テロメラーゼは、例えばヒトにおいては配列ＴＴＡＧＧＧを含む、繰り返された限定ヌクレオチド配列（リピート）の蓄積から構成される。
【０００５】
テロメラーゼ活性は、生殖細胞を除いた正常組織では検出不可能である。生殖細胞は、その染色体末端が繰り返しラウンドのＤＮＡ複製を通して保持されなければならず、おそらくはテロメラーゼ活性のために、時間と共にそれらのテロメラーゼの長さを減少させることがない。再生する組織の幹細胞は極めて低いレベルのテロメラーゼを発現し、そしてそれらのテロメアは複数の細胞分割により短くなる。テロメラーゼ活性は、時折、腫瘍に隣接した組織において検出可能であり、肉眼では見えない微小癌組織の転移の存在を反映する可能性がある。
【０００６】
テロメラーゼは細胞の老化のプロセスにおいて役割を有すると信じられている。体細胞中のテロメラーゼ活性の抑圧は、それらが分割する回数を制御するのに重要らしい。事実、初期繊維芽細胞中のテロメアの長さは、老化する前にそれらの細胞が経験できた分割の回数と、よく相関する。テロメアＤＮＡの損失は、多細胞生物がそれらの細胞の増殖を制限することによる全体の機構の一部として、その複製能力の終わりを細胞に合図するのかもしれない。
【０００７】
複製を制御するその役割のために、テロメラーゼは、最近、腫瘍形成にも関係付けられてきた。テロメラーゼ活性はほとんどの腫瘍細胞において検出された。テロメラーゼがヒト癌細胞の制御されていない成長に必須であることが示唆されている。正常細胞と異なり、癌細胞においては、分割を停止するためのシグナルを細胞が決して受け入れないようにテロメアの長さを保持することにより、テロメラーゼが細胞の不死性を授与するらしい。テロメラーゼ酵素は、この酵素がヒトの腫瘍において約９０％活性であるがほとんどの正常細胞においては不活性であるため、化学治療のための理想的な標的である。製薬会社は、テロメラーゼをブロックすることができる薬剤を発見するために幾千もの化合物をスクリーニングした。
【０００８】
テロメラーゼリピート増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）と呼ばれる方法が、テロメラーゼ活性を測定するために開発された。ＴＲＡＰは、酵素活性のインビトロ検出を基礎とする。簡単に言えば、テロメア配列由来の合成オリゴヌクレオチドを基質として使用する。この基質を試験サンプル中のテロメラーゼにより伸長させ、そして次に伸長産物を増幅及び定量する。ＴＲＡＰ法の詳細な記載は、例えば、Ｈａｒｌｅｙらに対する合衆国特許番号５，８９１，６３９（以後、Ｈａｒｌｅｙ）及びＥｍｒｉｃｈらに対する合衆国特許番号６，２２１，５８４（以後、Ｅｍｒｉｃｈ）に見いだすことができる。最近、多数の研究グループが、リアルタイムポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）技術を用いた修飾ＴＲＡＰ法を報告した（例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：５１９−５２４，２００１；Ｅｌｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１，１７７−１８５，２００２；及びＷｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：Ｅ３−３，２００３を参照）。特定すれば、テロメラーゼの伸長産物の迅速かつより感度の高い定量を提供するために、リアルタイムＰＣＲ技術を用いた。
【０００９】
現在のＴＲＡＰｓは、複数のインキュベーション工程及び各インキュベーション工程の後のサンプルの一つのチューブから別のチューブへの移し替えを含むのが典型的である。移し替えのプロセスは、時間を浪費し、そして汚染及び誤操作をこうむる（例えば、サンプルを間違ったチューブ又はウエルに加えること）。現在のＴＲＡＰｓは、細胞抽出物又は組織抽出物から始めるのが典型的である。ＲＮＡ成分と蛋白質成分の両方を含むテロメラーゼは、抽出物中のプロテアーゼ及びＲＮａｓｅの消化に供されるから、テロメラーゼの分解を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤及び／又はＲＮａｓｅ阻害剤がしばしば必要とされる。プロテアーゼ阻害剤及び／又はＲＮａｓｅ阻害剤の抽出物への添加は、分析のコストを増加させる。即ち、より柔軟性があり、且つ低コストにて容易に素早く実施可能なテロメラーゼアッセイに関する要求が存在する。
【００１０】
概要
プライマー伸長、続いてリアルタイムのＰＣＲを用いてテロメラーゼ活性を測定するための方法が開示される。当該方法は、生物学上のサンプル中での迅速で、感度がよく、そして正確なテロメラーゼ活性測定を提供する。
【００１１】
一つの態様において、上記方法は、（１）第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物、及び第１反応混合物と第２混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること；（２）第１プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下で生物学上のサンプルを第１反応混合物とインキュベートすること；（３）伸長産物を第２反応混合物と混合すること；（４）単一の２９３Ｔ細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせる条件下でリアルタイムＰＣＲを用いて伸長産物を増幅すること；及び（５）工程（４）の条件下で増幅される対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、の工程を含む。上記態様の単一のチューブのデザインは、実験手法を単純化させ、そして実験誤差を減らす。
【００１２】
別の態様において、上記検出方法は、（１）サンプル細胞へ第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を導入すること；（２）細胞内で第１プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下でサンプル細胞をインキュベートすること；（３）リアルタイムＰＣＲを用いて伸長産物を増幅すること；及び（４）工程（３）の条件下で増幅される対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、の工程を含む。この態様において、伸長産物は完全なサンプル細胞の中で生成され、そして定量工程の完了の前の延長された時間、適切な条件下で保存できる。
【００１３】
また、上記方法を実施するため及びテロメラーゼ関連疾患を診断するための試薬キットも開示される。一つの態様において、当該試薬キットは、（１）第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物、第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物、及び第１反応混合物を第２混合物反応から分離するワックス層を含む反応チューブ、及び（２）第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第１反応混合物、第２プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び対照鋳型を有する第２反応混合物、及び第１反応混合物を第２混合物反応から分離するワックス層を含む、対照チューブ又はウエルを含む。
【００１４】
詳細な説明
図１は、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量する方法を示す。最初に、生物学上のサンプルを、第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を有する第２反応混合物及び第２プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを有する第２反応混合物を含む反応チューブに加える（工程１０２）。第１反応混合物は、高温で溶けるワックスの層により、第２反応混合物から分離される。生物学上のサンプルを第１反応混合物と混合し、反応チューブの上部を占め、第１プライマーから伸長産物を生成するためにテロメラーゼのために適した条件下でインキュベートされる（工程１０４）。伸長産物は、次に、ワックス層を溶かすことにより第２反応混合物と混合され（工程１０８）、そしてリアルタイムＰＣＲにより増幅される（工程１１０）。第１反応混合物中の伸長されなかった第１プライマー及び第２反応混合物中の第２プライマーが、ＰＣＲ増幅のためのプライマー対を形成する。次に、反応チューブ中のＰＣＲ産物の量を公知の量の対照鋳型を有する対照チューブの中のＰＣＲ産物の量に比較することにより、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を定量する（工程１１２）。この態様において、第１プライマー伸長及びＰＣＲ反応のための実験条件は、単一の２９３Ｔ細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせるように、最適化される。
【００１５】
生物学上のサンプルは、被験者から単離された組織、細胞、及び生物学上の流体、並びに被験者中に存在する組織、細胞及び生物学上の流体を含む。生物学上のサンプルは、始原（primary）細胞、形質転換された細胞、及びあらゆるその他の培養細胞をも含む。本発明の方法はＲＮａｓｅ感受性のリボヌクレオプロテインであるテロメラーゼの活性を検出するのであって、単にテロメラーゼのＲＮＡ成分及び蛋白質成分の存在を検出するのではないから、上記方法は酵素上活性な細胞又はサンプルを必要とする。一つの態様において、生物学上のサンプルは、被験者から慣用手段により単離された組織サンプル、例えば生検である。好ましくは、生物学上のサンプルは、細胞抽出物又は組織抽出物、特にヒト細胞又は組織からの抽出物である。抽出物は、細胞の凍結／解凍の繰り返しによるか、細胞又は組織をホモジェナイズするか、又は非イオン性又は／及び両性イオン性の洗浄剤を含む溶解バッファーの中で細胞又は組織を溶解することにより、生成してよい。非イオン性洗浄剤の例は、限定ではないが、トゥイーン２０、トライトンＸ−１００、トライトンＸ−１１４，ポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、ＮＰ−４０，ｎ−オクチルグルコシド、Ｎ−ドデシルグルコシド、Ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−マルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０）、及びイソトリデシル−ポリ（エチレングリコエーテル）ｎを含む。両性イオン性洗浄剤の例は、限定ではないが、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルフォネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルフォネート）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルフォネート、及びジギトニンを含む。溶解バッファー中の洗浄剤の量は、約０．１重量％から約２重量％まで変更してよい。一つの態様において、溶解バッファーは約０．５重量％の洗浄剤を含む。
【００１６】
テロメラーゼはＲＮＡ成分及び蛋白質成分の両方を含むから、プロテアーゼ及び／又はＲＮａｓｅ阻害剤を抽出物に添加することにより、他の細胞プロテアーゼによる抽出物中のテロメラーゼの分解を防いでよい。プロテアーゼ阻害剤の例は、限定ではないが、アマスタチン、４−アミジノフェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＡＭＰＳＦ）、アンチパイン、アプロチニン、ベスタチン、キモスタチン、シスタチン、３，４−ジクロロイソクマリン、エベラクトンＡ及びＢ、エラスタチナル、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、ふぇにるメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ホスホロアミドン、トシルリジルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、及びトリプシン阻害剤を含む。ＲＮａｓｅ阻害剤の例は、限定ではないが、膵臓タイプのＲＮａｓｅ阻害剤、ヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤、及びジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を含む。
【００１７】
反応チューブは、上記方法の特定の適用の要求に適合したあらゆる形態及びサイズのコンテナであり得る。第１のプライマーは２つの機能を担う：伸長産物を生成するためのテロメラーゼの基質となり、そして次のＰＣＲ反応においてプライマーとしても機能する。一つの態様において、第１プライマーの長さは１０−６０ヌクレオチドである。別の態様において、第１プライマーの長さは１２ー３０ヌクレオチドである。好ましくは、第１プライマーはテロメラーゼの基質として機能するが、第１プライマーを基質として用いる特定のテロメラーゼの全テロメアリピート配列を含まない。例えば、ヒトのテロメラーゼは配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：１）のテロメアリピートを付加する。従って、本発明の方法を用いてヒトのテロメラーゼ活性をアッセイするのなら、テロメラーゼ基質は完全なリピート配列５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’を欠くヒトテロメラーゼ基質であるべきである。理由は、テロメアリピートの添加によってのみテロメラーゼはテロメラーゼ基質を伸長できるからである。よって、第２プライマーはＰＣＲ反応において第１プライマーとプライマー対を形成するためのものであるが、必然的に、テロメアリピートに相補な配列を含むことになる。テロメラーゼ伸長反応において用いられる第１プライマー（即ち、テロメラーゼ基質）がテロメアリピートを含むのなら、その場合、ＰＣＲ反応において用いられる第２プライマーは、伸長していない第１プライマーに容易にハイブリダイズして、プライマーダイマーを形成して、負のＰＣＲ結果を導く可能性がある。
【００１８】
反応混合物中のヌクレオシド３リン酸は、限定ではないが、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン３リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン３リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシチミジン３リン酸（ｄＴＴＰ）及びデオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）を含む。一つの態様において、反応混合物は、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＵＴＰかｄＴＴＰのうちの一方を等モル比にて含む。ヌクレオシド３リン酸は集合的にｄＮＴＰｓと記される。
【００１９】
第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸に加えて、第１反応混合物は、テロメラーゼのためのプライマー伸長反応のために最適なｐＨを保持するためのバッファー系を含んでもよい。バッファー系の例は、限定ではないが、リン酸バッファー系、クエン酸バッファー系、硼酸バッファー系、（トリス−ヒドロキシメチル）アミノメタン、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−２−［エタンスルフォン酸］（ＨＥＰＥＳ）、及び３−［Ｎ−モルフォリノ］プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）を含む。
【００２０】
テロメラーゼが第１プライマーから伸長産物を生成するのに適した条件は、当業界公知である。典型的には、テロメア伸長反応が約２０−３０℃において約１０−６０分間、好ましくは約２５℃においてか又は約３０℃において約１５−３０分間、そしてもっとも好ましくは約２５℃において約２０分間実施される。
【００２１】
工程１０４の伸長産物は、追加の鋳型非依存性伸長（工程１０６）に供してよい。この伸長は、好ましくは、酵素反応により、例えばターミナルトランスフェラーゼを用いてヌクレオチドを付加することによるか、又はＤＮＡリガーゼを用いて短いＤＮＡ断片を連結することにより達成される。一つの態様において、ポリＡテイルをターミナルトランスフェラーゼにより伸長産物の３’末端に添加する。別の態様においては、１０−２０ヌクレオチドの短いオリゴマーを伸長産物の３’末端に連結する。これらの修飾は第２プライマーのための唯一の配列を生じ、即ち、全テロメアリピート配列の第１プライマーへの包含を可能にさせる。図２に示すとおり、ヒトテロメアリピートＴＴＡＧＧＧを含む第１プライマーをヒトテロメラーゼ基質として用いる。テロメラーゼ媒介性の伸長の後に、伸長産物は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’の３’配列を有することになり、式中、ｎは０に等しいか又は０より大きい整数である。少なくとも１０ヌクレオチドのポリＡテイルを伸長産物の３’末端に添加する追加の鋳型非依存性伸長の後で、伸長された伸長産物は、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡｍ−３’の３’配列を有することになり、式中、ｎは０に等しいか又は０より大きい整数である。第２プライマーは、次に、伸長された伸長産物の３’末端におけるテロメアリピート配列とポリＡ配列の接合点に対して相補な配列を有するようにデザインされ得る。図２に示すとおり、テロメアリピートと追加のヌクレオチドの接合点に相補な第２プライマーは、第１プライマーがその３’末端において完全なテロメアリピート配列を有さない限り、伸長されなかった第１プライマーを伸長された産物から識別することができるべきである。
【００２２】
追加の伸長工程１０６の不在下では、第２反応混合物中の第２プライマーは、典型的には、複数の不完全なテロメアリピート配列及び少なくとも一つの完全なテロメアリピート配列を含むことにより、非特異的ＰＣＲ産物、例えばプライマーダイマーの形成を最少にする。
【００２３】
第２反応混合物中のＤＮＡポリメラーゼは、標準ＰＣＲ条件に適したあらゆるＤＮＡポリメラーゼであり得る。そのような酵素は当業者に知られている。一つの態様において、第２反応混合物は、伸長産物のＰＣＲ増幅のための最適なマグネシウムを提供するマグネシウム塩も含む。別の態様において、第２反応混合物は、第１プライマー、又はｄＮＴＰ又は両方も含む。
【００２４】
第１反応混合物を第２反応混合物から分離するワックス層は、約５０−９０℃の範囲、そして好ましくは約６０−８０℃の範囲の熔融（melting）温度を有するべきである。一つの態様において、トレース量の染料を第１反応混合物か第１反応混合物の一方に加えることにより、ＰＣＲ増幅の前にワックス層を通して可能な漏れを監視してよい。別の態様においては、第２反応混合物をワックスと予め混合し、そしてワックスが固形化するときにワックス層内に閉じ込められる。第２反応混合物の含有物は、ワックス層が高温において熔融するときに、放出される。
【００２５】
伸長産物（追加の伸長を伴おうと伴わずとも）は、リアルタイムＰＣＲ増幅により定量される。当業者には知られるとおり、ＰＣＲ増幅は、典型的には、熱安定性酵素及びプライマーの対を、鋳型を含み且つ複数のサーマルサイクルを通る反応混合物に加えることにより達成される。方法１００においては、第１反応混合物中の伸長されない第１プライマーが５’ＰＣＲプライマーとして機能し、そして第２反応混合物中の第２プライマーが３’ＰＣＲプライマーとして機能する。
【００２６】
リアルタイムＰＣＲ反応におけるＰＣＲ産物は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術を用いて検出できる。特異的ＰＣＲ産物の蓄積は、各増幅の直線部分を公知の鋳型を用いて生じさせた標準曲線と比較することにより、測定することができる。
【００２７】
一つの態様において、ｐＨ反応は通常どおりに実施されるが、２つのフランキングＰＣＲプライマーの間の配列に結合する蛍光標識プローブオリゴヌクレオチドの添加により実施される。上記方法は、プローブの５’末端から蛍光標識ヌクレオチドを分割するＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。上記プローブオリゴヌクレオチドは全蛍光を抑圧する３’末端における蛍光クエンチャーも有するので、５’標識ヌクレオチドを除去するときには効果が失われ、なぜなら２つのフルオロフォアの距離は互いに干渉しあうのにはあまりに離れすぎているからである。各サイクルは蛍光の増大をさらに生じさせ、全ＰＣＲ反応がリアルタイムにおいて追随することを可能にさせる。反応中に存在する鋳型ＤＮＡの量は対数増幅の直線部分を標準曲線と比較することにより計算することができる。各検出系の例は、限定ではないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア）。
【００２８】
別の態様において、ＰＣＲ産物は、単一標識の蛍光原性（fluorogenic）プライマー、例えばＬＵＸ（登録商標）（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア）及びＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ  ＲＰ（登録商標）プライマー（ケミコン、テメクラ、カリフォルニア）を用いて検出される。プライマーは、蛍光原性プライマーが二重鎖ＰＣＲ産物に取り込まれた場合に、増量した蛍光放射を生じる。次に、密閉された反応チューブ内の各ＰＣＲサイクルの増幅工程の間に生成する蛍光に基づいて、ＰＣＲ産物の量を測定する。
【００２９】
また別の態様においては、二重鎖ＤＮＡに選択的に結合する蛍光染料を用いて、ＰＣＲ産物を検出する。染料、例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎは、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で作成された二重鎖産物の量を定量することができる。
【００３０】
テロメラーゼ活性は、反応チューブ中の蛍光の増加を、公知量の対照鋳型を含む対照チューブ内の蛍光の増加に対して比較することにより、定量される（工程１１０）。典型的には、リアルタイムＰＣＲを実施することにより、異なる希釈の対照鋳型を含むセットの対照チューブ又はウエルを用いて、標準曲線を生じさせる。テロメラーゼ活性は、通常、一定の時間内に合成されたテロメアリピートの量に基づいて表現される。ヒトテロメラーゼのための好ましい対照鋳型はＴＳＲ９であり、
５’−
ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧ−３’（配列番号：２）の配列を有する。
【００３１】
別の態様において、細胞抽出物又は組織抽出物を、第１プライマー、第２プライマー、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ及び二重鎖ＤＮＡに選択的に結合する蛍光染料を含むマスター反応混合物に加える。テロメラーゼ媒介性の伸長及びＰＣＲ増幅は、同じ反応チューブ内で連続して実施される。
【００３２】
図３は、テロメラーゼ活性の検出のための別の方法３００を示す。この態様においては、プライマー伸長工程を完全細胞中で実施する。特定すれば、第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を完全なサンプル細胞に導入する（工程３０２）；サンプル細胞を次に細胞構造の完全性を保持しながら第１プライマーから伸長産物を生成させるのに細胞内のテロメラーゼに適した条件下でインキュベートする（工程３０４）。工程３０４は「インサイチュプライマー伸長工程」とも呼ばれるが、伸長産物がサンプル細胞の内部で生じるからである。伸長産物を、次に、リアルタイムＰＣＲ及び対照鋳型を用いて増幅及び定量する（工程３０８）。一つの態様においては、サンプル細胞を第２反応混合物と混合して、ＰＣＲ増幅に供する。別の態様においては、サンプル細胞を溶解バッファー中で溶解して、そして溶解物をリアルタイムＰＣＲ反応に用いる。
【００３３】
或いは、サンプル細胞をテロメラーゼ媒介性プライマー伸長の完了後に保存してよい（工程３０６）。この態様において、伸長産物はまだ完全なサンプル細胞の中に存在するから、伸長産物は、細胞／組織抽出物により生成される伸長産物よりも良好に保存できる。方法３００は、即ち、操作者が、サンプルを受け取った直後にテロメラーゼ媒介プライマー伸長工程を実施し、そしてのちの定量のためにプライマー伸長工程３０４の後に中間生成物、即ちサンプル細胞を保存することを可能にさせる。
【００３４】
サンプル細胞は、懸濁又は単層にて培養してよい。第１プライマー及びｄＮＴＰｓは、当業者に知られた方法を用いて細胞内に導入してよい。例は、限定ではないが、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リポフェクチン／リポフェクタミントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、音波処理、機械的専断（例えば、シリンジ針に細胞を押し通す）、及び細胞膜を破壊するか又は細胞膜の透過性を改善するための他の化学的又は物理的手段を含む。一つの態様においては、細胞を懸濁して、２５ゲージの針に少なくとも１回、好ましくは２−５回押し通す。次に、細胞を反応チューブ又はウエルの中の。第１プライマー及びｄＮＴＰｓを含む培養培地に植える。針を通過することの専断効果は、細胞膜を破壊し、そして第１プライマーが細胞内に侵入するのを可能にさせる。シリンジ処理された細胞を、次に、第１プライマー及びｄＮＴＰｓとインキュベートすることにより、細胞内のテロメラーゼにより伸長産物の生成を可能にする。
【００３５】
別の態様においては、第１プライマー及びｄＮＴＰｓをリン酸カルシウム沈殿法を用いて細胞内に導入する。リン酸カルシウム沈殿法は第１プライマー及びｄＮＴＰｓの存在下で形成され、そして細胞の添加される。細胞は、次に、３７℃において１０−１２０分間インキュベートされて、細胞内のテロメラーゼによる伸長産物の生成を可能にさせる。
【００３６】
本発明の方法は、ホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患の推移又は重度を決定するための診断アッセイにおいて使用してよい。テロメラーゼ活性の定量は、例えば、治療後のテロメラーゼ関連疾患の重度の決定にも有用である。
【００３７】
本明細書にて記載された検出方法は、例えば、第１プライマー及びヌクレオシド３リン酸を含む伸長組成物、及び第２プライマー、ヌクレオシド３リン酸、二重鎖ＤＮＡ結合染料、及びＤＮＡポリメラーゼを含む検出組成物を含む予めパッケージされた診断キットを利用することにより、実施してよい。伸長組成物はテロメラーゼと混合されたときに第１プライマーから伸長産物を生成することができ；そして検出組成物はＰＣＲ反応において伸長産物を増幅して、標識された増幅産物を定量のために生成できる。診断キットは、被験者が呈する兆候又はホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患の家族の病歴を診断するために、例えば臨床セッティングにおいて便利に使用してよい。テロメラーゼが発現される全ての細胞種又は組織を、本明細書にて記載された予後（prognostic）又は診断のアッセイにおいて利用してよい。
【００３８】
一つの態様においては、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を決定し、そして予め決定された正常レベルを超えるテロメラーゼ活性の増加がホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患を示唆する。
【００３９】
本明細書にて記載された検出方法は、異常なテロメラーゼ活性に付随した、ホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患を発症する危険を有する被験者を同定するための予想アッセイとして利用することもできる。
【００４０】
さらに、本明細書にて記載された予想アッセイは、異常なテロメラーゼ活性に付随した疾患を治療又は予防するための薬剤の候補を被験者が投与される得るか否かを決定するために使用することができる。即ち、本発明は、異常なテロメラーゼ活性に付随した疾患のための薬剤により被験者が有効に治療され得るか否かを決定する方法を提供する。予想アッセイは、テロメラーゼ関連疾患の治療を受ける被験者が長期間の生存又は疾患の進行に関する見通しが乏しいか否かを決定するために工夫され得る。上記疾患の異なるステージのテロメラーゼ活性プロフィールを、始まりから後のステージまで確立するために、貧困な予後の増加した尤度（likelihood）に対して特定の活性プロフィールを相関させるために、活性パターンが出現するかもしれない。この予後は、次に、より攻撃的な治療プログラムを工夫して、長期間の生存及び幸福（well-being）の尤度を増加させるために使用してよい。同様に、本発明の検出方法は、テロメラーゼの活性に対する薬剤（例えば、ドラッグ類、小分子類、蛋白質類、ヌクレオチド類）の影響を監視するために基礎的なドラッグのスクリーニング又は臨床試験において使用することができる。例えば、テロメラーゼ活性を低下させるためのスクリーニングアッセイにより決定される薬剤の効果は、増加したテロメラーゼ活性を呈する被験者の臨床試験において監視することができる。そのような臨床試験においては、テロメラーゼの活性を特定の組織の表現型の「読み出し（read-out）」として使用することができる。
【００４１】
一つの態様において、本発明は、被験者の薬剤による治療の効果を監視するための方法を提供し、（ｉ）薬剤を投与する前に被験者から、前投与サンプル（pre-administration sample）を得て；（ｉｉ）前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを検出し；（ｉｉｉ）一つ又はそれより多い後投与サンプルを被験者から得て；（ｉｖ）後投与サンプル中のテロメラーゼ活性を検出し；（ｖ）前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを後投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルと比較し；そして（ｖｉ）薬剤の被験者への投与を結果的に変更する、工程を含む。例えば、テロメラーゼ活性を検出されたレベルよりも高いレベルに増加させる、即ち薬剤の効果を低下させるために、薬剤の投与の低下が望まれてよい。そのような態様によれば、観察可能な表現型の応答の不在下でさえ、テロメラーゼ活性を薬剤の効果の指示薬として使用してよい。
【００４２】
本明細書にて記載されるとおり、テロメラーゼ活性検出方法は様々な適用のために使用してよく、限定ではないが、テロメラーゼ阻害剤の効果を評価すること、テロメラーゼ活性と細胞培養条件の間の関係を測定すること、テロメラーゼ活性と薬剤の間、或いはテロメラーゼ活性と腫瘍形成能の間の関係を決定すること、テロメラーゼ関連疾患を診断すること、及びそのような疾患の治療を監視することを含む。
【００４３】
実施例
実施例１、プライマー比の決定
２９３Ｔ細胞系（専断されたヒトアデノウイルス５型（Ａｄ  ５）ＤＮＡ及びＳＶ−４０のＴ抗原により形質転換された初代ヒト胚腎臓、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で３７℃において加湿インキュベーターにて５％のＣＯ２と共に培養した。細胞を７０−８５％コンフルエンスにて回収し、計数し、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１ｍＭベンズアミジン、５ｍＭ  ｂ−メルカプトエタノール、０．５％  ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ，及び１０％  ｗ／ｖグリセロールを含む溶解バッファー（ＣＨＡＰＳ溶解バッファー）を用いて氷の上で３０分間かけて溶解した。蛋白質濃度はＢＣＡ蛋白質アッセイキット（ピアス、ロックフォード、イリノイ）を用いて測定した。細胞抽出物を−７０℃にて保存した。
【００４４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社から得た。第１プライマー（ＦＰ）は、５’−ＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：３）を有し、そしてＴＳと呼び、そして第２プライマー（ＳＰ）は５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＡＣＣ−３’（配列番号：４）を有し、そしてＡＣＸと呼ぶ。第１プライマー対第２プライマーのプライマー比の効果を試験するために、異なる比率（ＦＰ：ＳＰ＝１：１，１：０．８，１：０．５，及び１：０．２）を用いた。簡単に言うと、異なる希釈の１μｌの細胞抽出物を１μｌのプライマー混合物（０．５μｇのＴＳ／ＡＣＸを異なる比率で）、１１．５μｌの水、及び０．２５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ、２．５ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ及びＳＹＢＲグリーン（モリキュラープローブズ社、ユージーン、オレゴンから購入した、ＳＹＢＲグリーン１ストック溶液（Ｓ−７５６３）の１：２０００希釈）を含む１２．５μｌのＰＣＲプレミックスバッファーと混合し、２５℃において２０分間インキュベートし、そして次に９５℃において１０分間インキュベートし、そして定量性リアルタイムＰＣＲにより増幅した（９５℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間を４０サイクル）。結果は、比率１／１（ｗ／ｗ）が最良の結果を提供したことを示した（表１）。
【００４５】
【表１】
2006506068.tif 000003
【００４６】
実施例２、アッセイ感度の測定
テロメラーゼ活性アッセイ方法の感度を試験するため、実施例１に記載された条件及び１／１のＦＰ／ＳＰ比において、異なる量（細胞数）の２９３Ｔ細胞抽出物を用いてアッセイを実施した。表２及び図４に示すとおり、上記方法は、単一の２９３Ｔ細胞からテロメラーゼ活性を検出できる。
【００４７】
【表２】
2006506068.tif 000004
【００４８】
実施例３、標準曲線の生成
リアルタイムＰＣＲ反応からの結果を定量するため、対照鋳型分子を用いて、実施例２に記載された条件下で標準曲線を生成して、閾値サイクルを通した反応あたりの鋳型分子数にテロメラーゼ活性を相関させた。表３及び図５に示すとおり、標準反応条件及び対照鋳型ＴＳＲ９下でリアルタイムＰＣＲの閾値（ＣＴ）の読み取りを用いて、標準曲線を生成した。図６は、２９３Ｔ細胞数と閾値サイクルの間の直線回帰及び対照鋳型ＴＳＲ９分子数と閾値サイクルの間の直線回帰を示す。
【００４９】
【表３】
2006506068.tif 000005
【００５０】
実施例４、テロメラーゼアッセイ方法の特異性
テロメラーゼアッセイ方法の特異性を試験するため、ＭＣＦ７（胸膜の流出性アデノカルシノーマ），ＺＲ−７５−１（胸部腹水の動脈管カルシノーマ）及びヒーラ（子宮頸部アデノカルシノーマ）細胞を含む幾つかの腫瘍細胞系、脳、腎臓、肝臓、心臓、精巣、及び血液を含む様々なマウス組織（成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスから回収された）並びに熱不活性化（９５℃において１０分間）された２９３Ｔ細胞からの抽出物を用いて、アッセイを実施した。表４及び図７に示すとおり、テロメラーゼ活性を、増殖細胞、癌細胞系、（２９３Ｔ、ヒーラ、ＭＣＦ７及びＺＲ−７５−１）において検出するが、熱不活性化２９３Ｔ細胞抽出物及びブランク対照においては検出しない。結果は、正常な成体マウス組織において低いテロメラーゼ活性が存在したことも示したため、正常組織中の増殖細胞（例えば、幹細胞）は検出可能であることを示唆する。
【００５１】
【表４】
2006506068.tif 000006
【００５２】
実施例５、反応混合物の安定性
テロメラーゼアッセイにおいて使用された試薬の安定性を試験するため、第１プライマーＴＳ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及びＳＹＢＲグリーンを含む反応混合物を調製した。反応混合物のアリコートを室温において、０、２４、４８又は７２時間放置し、そしてテロメラーゼアリコートにおいて試験した。表５に示すとおり、反応混合物は室温において少なくとも７２時間は安定であったようである。
【００５３】
【表５】
2006506068.tif 000007
【００５４】
実施例６、完全細胞内でのプライマー伸長
２９３Ｔ細胞を成長培地（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコイーグル修飾培地（ＤＭＥＭ））中で３７℃にて加湿インキュベーター中で５％のＣＯ２と共に培養した。細胞をトリプシン処理し、成長培地で洗浄し、１ｘ１０６細胞／ｍｌにて成長培地に懸濁し、そして以下の処理の一つに供した：
処理Ａ：細胞懸濁液を滅菌遠心分離管に移し、８００ｒｐｍにて５分間ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心分離機の中で遠心分離し、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に再懸濁した。再懸濁細胞を滅菌１ｍｌシリンジの中へ２５ゲージの針を通して吸い上げ、そしてプランジャー上で一定の圧力によりはじいた。当該シリンジ法を５回繰り返した。細胞を滅菌遠心分離チューブに１ｘ１０４細胞／チューブに移し、移動培地（２．５ｍＭのｄＮＴＰ及び０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を加え、そしてＴＳプライマーを加えるか又は加えなかった。細胞を３７℃において６０分間培養した。チューブを４℃において２０分間遠心分離し、そして懸濁液を回収した。沈殿は、Ｃｈａｐｓバッファーを用いて４℃において３０分間溶解した。溶解物を１４，０００ｒｐｍにて２０分間４℃において遠心分離した。上清を回収し、９５℃において１０分間過熱し、そして使用前に−７０℃において保存した。
【００５５】
或いは、シリンジ法の後に、細胞を１ｘ１０４細胞／ウエルの密度にて９６ウエルプレート内に収容し、そして３７℃において一晩、加湿インキュベーター内で５％のＣＯ２と共に培養してよい。次の日に、細胞をＰＢＳで洗浄し、所望の量の移動バッファー（ＴＳプライマー、０．５μｇ／ウエル、ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ；又はｄＮＴＰ，２．５ｍＭ及び０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ、又はＰＢＳのみ）を各ウエルに加える。３７℃において３０分間、６０分間及び一晩インキュベートした後、細胞を回収し、そしてＣＨＡＰＳバッファーにより４℃にて３０分間で溶解した。溶解物を１４，０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清を回収し、９５℃において１０分間過熱し、そして使用前に−７０℃において保存した。
【００５６】
処理Ｂ：細胞懸濁液を直接９６ウエルプレートに収容し、一晩培養し、そして所望の量のＴＳプライマー及びｄＮＴＰによりリン酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクトした。簡単に言えば、２９３Ｔ細胞を成長培地（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）の中で一晩生育させた。リン酸簡単に沈殿法（ＧＩＢＣＯからのリン酸カルシウムキットを用いた）は、ＴＳプライマー及びｄＮＴＰ（ＨＢＳ  １００ｕｌ，リン酸２ｕｌ，Ｈ２Ｏ  ２６ｕｌ，キャリアＤＮＡ  １０ｕｌ，第１プライマー  ２０ｕｌ，０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ，１２ｕｌ  カルシウム）の下で形成し、そして細胞に加えた。細胞を３７℃において１０、３０、６０分間インキュベートし、そしてＣＨＡＰＳ溶解バッファーを用いて４℃において３０分間で溶解した。溶解物を１００℃において１０分間過熱し、そして１４，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。上清を回収して−７０℃に保存した。
【００５７】
処理Ａ又はＢからの１マイクロリットルの溶解物を、１１．５μｌの水及びｄＮＴＰｓ（各ヌクレオシド３リン酸に関して２．５ｍＭ）、０．２５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ、０．２５μｇのＡＣＸプライマーを含む１２．５μｌのプレミックスと混合し、そして定量リアルタイムＰＣＲに供した（９５℃において１０分間、９５℃において３０秒間、６０℃において３０秒間、７２℃において３０秒間を３５−４０サイクル）。図８に示す結果は、処理Ａにおいて記載されたとおりＴＳプライマー及びｄＮＴＰによる１時間のインキュベーション後にテロメラーゼ活性が２９３Ｔ細胞中で検出可能であることを示す。図９に示す結果は、処理Ｂにおいて記載されたとおりＴＳプライマー及びｄＮＴＰを含むリン酸カルシウム沈殿法による３０分間のインキュベーション後にテロメラーゼ活性が２９３Ｔ細胞中で検出可能であることを示す。ＴＳプライマー不在下ではテロメラーゼ活性が検出不可能であったことから、検出された生成物はテロメラーゼ特異的であることを示唆する。
【００５８】
好ましい態様及びそれらの利点を詳細に記載してきたが、請求の範囲及びそれらの均等物により定義されるとおりの組成物及び方法の範囲から逸脱することなしに本明細書において、様々な変化、置換及び変更がなされてよく、そして全てのそのようなものは請求された範囲内であることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、テロメラーゼ活性を検出するための方法の一態様を描写する模式図である。
【図２】図２は、テロメラーゼ活性を検出するための方法における追加の伸長工程を描写する模式図である。
【図３】図３は、テロメラーゼ活性を検出するための方法の別の態様を描写する模式図である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、それぞれ、蛍光／ＰＣＲサイクルプロット及び閾値サイクル／細胞数プロットであり、上記検出方法の感度を示す。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、対照鋳型を用いてリアルタイムＰＣＲにより生じさせた、それぞれ、蛍光／ＰＣＲサイクルプロット及び閾値サイクル／鋳型分子数プロットである。
【図６】図６は、サンプル細胞数と閾値サイクルの間か又は鋳型分子数と閾値サイクルの間の直線回帰を示すプロットである。
【図７】図７は、様々な細胞系及び組織におけるテロメラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図８】図８は、シリンジ処理後のインサイチュプライマー伸長に供された細胞におけるテロメラーゼ活性の検出を示す蛍光／ＰＣＲサイクルプロットである。
【図９】図９は、リン酸カルシウム沈殿後のインサイチュプライマー伸長に供された細胞におけるテロメラーゼ活性の検出を示す蛍光／ＰＣＲサイクルプロットである。
【配列表】
2006506068.tif 000008
【図１】
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【図２】
2006506068.tif 000010
【図３】
2006506068.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2006506068.tif 000017
【国際調査報告】
2006506068.tif 000018
2006506068.tif 000019
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