(57)【要約】本発明は、内皮細胞および／または腫瘍細胞上で発現されたトロポミオシン（Ｔｍｐ）を標的にすることによって、血管形成を阻害し、そして腫瘍および癌を処置するための新規な方法、血管形成のインヒビターを結合する、Ｔｐｍポリペプチドおよびペプチド、ならびにそれらの改変体および誘導体、そして血管形成をブロックまたは刺激する抗Ｔｐｍ抗体に関する。ＨＫａのＤ５サブユニットに結合し、血管形成を阻害する環状ペプチドもまた含まれる。Ｔｐｍに結合する候補抗血管形成分子として試験化合物をスクリーニングする方法が開示される。本発明のタンパク質、ペプチド、改変体および誘導体を含むアフィニティーリガンドもまた開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたトロポミオシン（Ｔｐｍ）関連抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドであって、
（ａ）内皮細胞の表面上で発現される全長のネイティブＴｐｍタンパク質のフラグメント、または該フラグメントの改変体である、
（ｂ）約１７ｋＤａの分子量を有し、かつその配列に対応するか、または抗血管形成ポリペプチド因子についての結合部位であるネイティブＴｐｍアイソフォームの内部フラグメントの改変体である、ならびに
（ｃ）該ネイティブＴｐｍ内部フラグメント結合部位に結合する該抗血管形成ポリペプチド因子に結合する、
ポリペプチドまたはペプチドであり、
ここで
該ペプチドは、約４アミノ酸と約４０アミノ酸との間のアミノ酸を有し；そして
該ポリペプチドまたはペプチドの改変体は、ネイティブＴｐｍ配列の保存的置換改変体であり；そして
該単離された抗血管形成レセプターポリペプチド、ペプチドまたは改変体は、該ネイティブＴｐｍ内部フラグメントと実質的に同じ該抗血管形成ポリペプチド因子に結合する生化学的活性を有する、
ポリペプチドまたはペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、前記ネイティブＴｐｍアイソフォームは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列絵番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項３】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドまたは改変体であって、前記ネイティブＴｐｍの内部フラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドまたはペプチドまたは改変体。
【請求項４】
請求項１に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、前記Ｔｐｍアイソフォームは、ヒトＴｐｍアイソフォームである、ポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、前記単離されたポリペプチドまたはペプチドに結合する前記抗血管形成ポリペプチド因子は、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）  ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａのＤ５ドメインの、Ｔｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント
からなる群より選択される、単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項６】
請求項５に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、該ポリペプチド、ペプチドまたは改変体は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６のうちの１つ以上に結合する、ポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドまたは改変体であって、該ペプチドまたは改変体は、そのＮ末端、そのＣ末端、またはそのＮ末端およびＣ末端の両方でキャップされる、ペプチドまたは改変体。
【請求項８】
活性化内皮細胞の表面に発現されるＴｐｍアイソフォームのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢＦ）であって、該抗体またはＡＢＦは、
（ａ）該活性化内皮細胞に結合し、該細胞における抗血管形成シグナルの生成を引き起し、結果として、（ｉ）移動、浸潤、増殖もしくは血管形成の阻害、または（ｉｉ）アポトーシスを生じるという点での抗血管形成活性；あるいは
（ｂ）該内皮細胞上のＴｐｍに競合的に結合し、Ｔｐｍ結合抗血管形成因子の該細胞への結合を阻害し、それにより、他の方法で該抗血管形成因子によって阻害される移動、浸潤、増殖または血管形成を可能にするかまたは促進するという点での血管形成促進活性
を有する、抗体またはフラグメント。
【請求項９】
請求項８に記載の、抗血管形成抗体またはＡＢＦ。
【請求項１０】
請求項８に記載の血管形成促進抗体またはＡＢＦ。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦが特異的な前記エピトープは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０のポリペプチドもしくはペプチドに存在するか、またはこれらのポリペプチドによって形成される、抗体またはＡＢＦ。
【請求項１２】
請求項８、１０、または１１のいずれかに記載の抗体またはＡＢＦであって、前記Ｔｐｍ結合抗血管形成因子は、  
（ａ）ヒトＨＰＲＧ；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトもしくはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）  ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａの該Ｄ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント
からなる群より選択される、抗体またはＡＢＦ。
【請求項１３】
モノクローナル抗体である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、該抗体は、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１６】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、該抗体は、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１１に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１７】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用なすべての抗体であって、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１２に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１８】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１３に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１９】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１４に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項２０】
請求項１５に記載の抗体であって、前記検出可能な標識は、放射性核種、ＰＥＴ画像化可能因子、ＭＲＩ画像化可能因子、蛍光分子、蛍光原、発色団、色素原、リン光分子、化学発光分子または生体発光分子である、抗体。
【請求項２１】
診断に有用なＴｐｍ結合抗体組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）検出可能に標識された、請求項１５または１６に記載の抗体またはＡＢＦ；および
（ｂ）診断的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項１７に記載の組成物であって、前記検出可能な標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂおよび２０１Ｔｌからなる群より選択される、放射性核種である、組成物。
【請求項２３】
請求項１７に記載の組成物であって、前記検出可能な標識は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、フルオレセイン誘導体、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄｏｌ  ＧｒｅｅｎおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群より選択される蛍光分子または蛍光原である、組成物。
【請求項２４】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項８または９のいずれかに記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２５】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１１に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２６】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１２に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２７】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１３に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２８】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１４に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２９】
インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的抗血管形成薬学的組成物であって、該組成物は、
（ａ）有効量の、請求項２４に記載の抗体またはＡＢＦ；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組成物であって、前記治療的に活性な部分は、前記抗体により結合されている、組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の治療的薬学的組成物であって、前記治療的に活性な部分は、放射性核種、薬物または毒素である、組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の治療的薬学的組成物であって、前記部分は、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂおよび２１７Ｂｉからなる群より選択される、放射性核種である、組成物。
【請求項３３】
注射に適切な形態である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の治療的抗体または薬学的組成物。
【請求項３４】
ＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を刺激する治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項８または１０に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３５】
ＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を刺激する治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１１に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３６】
インビトロまたはインビボで血管形成を刺激するＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とする治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１２に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３７】
インビトロまたはインビボで血管形成を刺激するＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とする治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１３に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３８】
インビトロまたはインビボで血管形成を刺激するＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とする治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１４に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３９】
薬学的血管形成促進組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）有効量の、請求項３５に記載の抗体または抗体フラグメント；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項４０】
注射に適切な形態である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の治療的抗体または薬学的組成物。
【請求項４１】
ＨＫａのＤ５ドメインに結合し、血管形成のインビトロまたはインビボのアッセイにおいて血管形成を阻害する、約４と約２０との間のアミノ酸の環状ペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載の環状ペプチドであって、以下：
【化１】
2006501139.tif 000023
からなる群より選択される、環状ペプチド。
【請求項４３】
内皮細胞の移動、浸潤、増殖もしくは血管形成を阻害するため、または内皮細胞アポトーシスを誘導するための方法であって、内皮細胞と、有効量の、活性化内皮細胞の表面上で発現されたＴｐｍに結合する抗血管形成ポリペプチドもしくはペプチドとを接触させ、それによって該阻害もしくは該アポトーシスを引き起こす工程を包含する、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記Ｔｐｍ結合ポリペプチドは、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトもしくはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｇ）トロポニンＴ；
（ｈ）トロポモジュリン；
（ｉ）カルデスモン；
（ｊ）アクチン；
（ｋ）カルポニン；
（１）ｐＥＬ９８；
（ｍ）グルタミンデヒドロゲナーゼ；および
（ｎ）（ｇ）〜（ｍ）のいずれかのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
【請求項４５】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項２９に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項３０に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項３１に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項３２に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４５に記載の方法であって、前記被験体は腫瘍を有し、前記血管形成阻害は、該腫瘍のサイズもしくは増殖速度の低下または該腫瘍の破壊を生じる、方法。
【請求項５０】
前記被験体はヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
増加した血管形成を必要とする被験体において血管形成を刺激するための方法であって、該方法は、以下の工程：
有効量の、請求項３９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
活性化内皮細胞の表面上で発現されるＴｐｍのアイソフォームの存在を生物学的サンプル中で検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、請求項１５に記載の抗体またはＡＢＦとを接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルと関連した標識の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
生物学的サンプル中のＴｐｍの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、活性化内皮細胞の表面上で発現されるＴｐｍに結合する、前記検出可能に標識された抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドとを接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルと関連した標識の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドは、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）  ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
【請求項５５】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記サンプルは、血漿、血清、細胞、組織、器官、または該細胞、組織、もしくは器官の抽出物である、方法。
【請求項５６】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程および検出する工程は、インビトロで行われる、方法。
【請求項５７】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程はインビボで行われ、前記検出する工程はインビトロで行われる、方法。
【請求項５８】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程はインビボで行われ、前記検出する工程はインビトロで行われる、方法。
【請求項５９】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程および検出する工程はインビボで行われる、方法。
【請求項６０】
Ｔｐｍに結合する候補抗血管形成分子として試験化合物を同定するスクリーニング試験であって、該試験は、以下の工程：
（ａ）該試験化合物を、Ｔｐｍの供給源とＴｐｍ結合抗血管形成ポリペプチドもしくはペプチド因子または抗Ｔｐｍ抗体との混合物に添加する工程であって、ここで（ｉ）該Ｔｐｍまたは（ｉｉ）該因子または抗体のうちの少なくとも１つは検出可能に標識される、工程；
（ｂ）並行して、同様の量の該Ｔｐｍと該因子または抗体とを、該試験化合物の非存在下で混合する工程；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）における該Ｔｐｍを用いて、該因子の結合を測定する工程、
を包含し、ここで（ａ）における結合が（ｂ）における結合より小さい場合、その試験は、該結合のインヒビターである該試験化合物について陽性であるとみなされ、それによって、該試験化合物を候補抗血管形成分子として同定する、スクリーニング試験。
【請求項６１】
請求項６０に記載のスクリーニング試験であって、該試験は、候補抗血管形成分子として同定された試験化合物を、インビトロまたはインビボの血管形成アッセイにおける血管形成インヒビターとしてのその活性について試験する工程をさらに包含する、スクリーニング試験。
【請求項６２】
請求項６０または６１に記載のスクリーニング試験であって、前記因子は、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン、および
（ｆ）該ＨＫａもしくは該ＨＫａのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、
からなる群より選択される、
スクリーニング試験。
【請求項６３】
Ｔｐｍ結合抗血管形成分子または結合分子を発現する細胞に結合するかまたは該分子または細胞を単離するために有用なアフィニティーリガンドであって、固体支持体またはキャリアに固定化された、請求項１〜４のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドを含む、アフィニティーリガンド。
【請求項６４】
Ｔｐｍ結合抗血管形成分子または結合分子を発現する細胞に結合するかまたは該分子または細胞を単離するために有用なアフィニティーリガンドであって、固体支持体またはキャリアに固定化された、請求項５に記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドを含む、アフィニティーリガンド。
【請求項６５】
Ｔｐｍ結合抗血管形成分子または結合分子を発現する細胞に結合するかまたは該分子または細胞を単離するために有用なアフィニティーリガンドであって、固体支持体またはキャリアに固定化された、請求項６に記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドを含む、アフィニティーリガンド。
【請求項６６】
複合体混合物からＴｐｍ結合抗血管形成分子を単離するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該混合物と、請求項６２に記載のアフィニティーリガンドとを接触させる工程；
（ｂ）該混合物中に任意の材料を該リガンドに結合させる工程；
（ｃ）該リガンドから結合していない材料を除去する工程；および
（ｄ）該結合したＴｐｍ結合分子を溶出する工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法であって、前記抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０の配列を有するか；（ｉｉ）該配列のうちの１つのＴｐｍ結合ペプチドフラグメントであるか；または（ｉｉｉ）該ペプチドフラグメントの該配列のうちの１つのＴｐｍ結合保存的置換改変体である、ポリペプチドまたはペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
生化学および医学の分野における本発明は、内皮細胞および／または腫瘍細胞の表面上に発現されたトロポミオシンを標的にすることによって、血管形成を阻害し、腫瘍および癌を処置するための新規の方法と、血管形成のインヒビターを結合するトロポミオシンポリペプチドおよびペプチドと、血管形成をブロックまたは刺激する抗トロポミオシン抗体と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術の説明）
血管形成、すなわち既存の毛細血管からの新しいものの形成（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９７１，２８５：１１８２−１１８６；Ｈａｎａｈａｎ  Ｄら，Ｃｅｌｌ，１９９６，８６：３５３−３６４）は、胚発育、創傷治癒、および女性の生殖機能の正常な部分である。しかし、血管形成はまた、特定の疾患の確立および進行において病原性の役割も果たす。癌、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症は、このような疾患の例である（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐら，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７：２４９−２５７）。抗血管形成治療は、こうした疾患の進行を阻害することが期待できる。
【０００３】
血管形成は、いくつかの血管形成促進サイトカインによって誘導され得る。癌の状況において、低酸素状態下の腫瘍細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を分泌する。これらのタンパク質は、拡散し、局部的な脈管構造において内皮細胞（ＥＣ）上の特定のレセプターに結合し、血管形成を優先して、血管形成促進力と抗血管形成力とのバランスを乱す。これらのタンパク質を結合する結果、ＥＣは活性化されて、（ａ）関連する組織マトリックスの再構築を誘導する酵素を分泌し、（ｂ）インテグリンなどの接着分子の発現のパターンおよびレベルを変更する。マトリックスの分解に続き、ＥＣは増殖して低酸素腫瘍へと転移し、新しい血管の産生および成熟という結果につながる。
【０００４】
興味深いことに、多くの抗血管形成因子は、マトリックスタンパク質の分解から生じる−すなわち血管形成促進酵素の作用の結果である。例として、エンドスタチン、ＸＩＩＩ型コラーゲンのフラグメント（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ  １９９７，８８：２７７−２８５）、プラスミノゲンのｋｒｉｎｇｌｅ５（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ，９９４，７９：３１５−３２８）およびＰＥＸ、ＭＭＰ−２のＣ末端非触媒サブユニット（Ｂｒｏｏｋｓ  Ｐ．Ｃ．ら，Ｃｅｌｌ，１９９８，９２：３９１−４００）が含まれる。
【０００５】
多量の血管形成促進因子が原因で、これらの抗血管形成分子が、原発性腫瘍において血管形成促進のバランスに打ち勝つことができないという概念が生じていた。しかし、それらが循環内に分泌されるので、これらの抗血管形成分子は、腫瘍細胞が浸潤し始め得た他の場所における血管形成を阻害することができる。このため、これらの新しい場所においてこれらの腫瘍細胞を包含する微小転移は休止状態が維持される。この仮説は、何年も前に外科医によってなされた不可解な観察を説明する：顕著な転移性の疾患がない患者の原発性腫瘍を外科的に除去した後の多様な経過時間において、その患者が進行した転移性の疾患を有して戻ってくるのである。
【０００６】
したがって、１つ以上の抗血管形成因子での処置による臨床的な介入は、血管形成のプロセスを阻害し、腫瘍の成長および転移を停止させ得る。文献（上記に引用）における有意な証拠がこの観念を支持する。
【０００７】
無秩序な血管形成は、多くの腫瘍性疾患だけではなく、関節炎、多様な眼の障害、および乾癬を含む異常な新血管形成に関連する多数の非腫瘍性疾患の病理の一因となる。たとえば、Ｍｏｓｅｓら．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０−６３４；Ｆｏｌｋｍａｎら．，１９９５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３３：１７５７−１７６３；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｒら．，１９８５，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１−４１１；Ｆｏｌｋｍａｎ，１９８５，Ａｄｖ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  ４３：１７５−２０３；Ｐａｔｚ，Ａ，１９８２，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５−７４３；Ｐａｔｚ，Ａ，１９８２，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：５５２−５５４を参照されたい。角膜、レンズ、および小柱網の無血管状態の維持は、視覚および通常の眼の生理学にとって重大である。多数の眼の疾患は眼における新血管形成から生じ、それらの疾患のうちのいくつかは失明につながり、それらの疾患としては糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、眼の炎症性疾患、および眼の腫瘍（たとえば網膜芽細胞腫）が挙げられる。新血管形成に関連するその他の眼の疾患には、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜症、および黄斑変性が含まれる。約２０の眼の疾患が脈絡膜新血管形成に関連し、約４０の眼の疾患が虹彩新血管形成に関連する（Ｗａｌｔｍａｎ  ＤＤら．，１９７８，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４−７１０およびＧａｒｔｎｅｒ，Ｓ．ら．，１９７８，Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１−３１２）。これらの疾患の現在の処置、特に一旦新血管形成が起こってからの処置は、失明を回避するためには不適切であることがしばしばである。通常の眼の組織（角膜および硝子体）内に存在する血管抑制性因子が病変した状態において失われることを、研究が示唆してきた。
【０００８】
（トロポミオシン（Ｔｐｍ））
トロポミオシン（Ｔｐｍ）は、１９４８年に骨格筋において最初に発見された（Ｂａｉｌｅｙ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９４８）  ４３：２７１−２７９）。Ｔｐｍはトロポニン複合体を結合し、それによってＣａ＋２調節された筋収縮を調節する役割を果たす（Ｐｅｒｒｙ  ＳＶ，Ｊ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．（２００１）  ２２：５−４９；Ｓｑｕｉｒｅ  ＪＭら，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９８）１２：７６１−７１）。Ｔｐｍは後に、遍在性タンパク質であることが発見された（Ｌｉｎ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．（１９９７）  １７０：１−３８）が、これは、選択的スプライシングおよび差示的プロモーター制御の結果として４つの異なる遺伝子から生じる多くのアイソフォームで脊椎動物の非筋肉細胞内において見つけられる（Ｌｉｎら，前出）。これはアクチン、細胞の統合性の維持、ならびに運動、細胞質分裂、および開口分泌のプロセスに関わるアクチン細胞骨格の成分を結合する。他の多くのコイルドコイルタンパク質のように、Ｔｐｍの配列は、αヘリックス構造におけるヘプタペプチドモチーフの繰り返しを包含する（Ｓｑｕｉｒｅら，前出、Ｌｉｎら，前出）。ダイマーの各ユニットは棒状の分子で、他のユニットと絡み合う。
【０００９】
Ｔｐｍと血管形成との最初の結びつきは、エンドスタチンが、その抗血管形成の効果を、細胞内のＴｐｍアイソフォーム３（ｈＴｍ３）との相互作用によって仲介する、という仮定の試験の研究からであった（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＮＪら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）．２７６：２５１９０−１９６）。この研究では、蛍光顕微鏡によって、透過されたヒトの臍静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）にエンドスタチンが結合することを示され、さらに、インビトロにおいてエンドスタチンがｈＴｍ３に結合することが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって特徴づけられた。約１００μＭのＫｄが開示された。このことは、ナノモルの範囲におけるエンドスタチンの生物活性を示した文献の主部と明らかに矛盾する（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ＭＳら．，Ｃｅｌｌ（１９９７）．８８：２７７−２８５；Ｂｏｅｈｍ  Ｔら．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：４０４−４０７）。ＭｃＤｏｎａｌｄらは、エンドスタチンがインターナリゼーションされて細胞内のＴｐｍに結合し、結果としてアクチン細胞骨格が破壊され、アポトーシスにつながると結論づけた。しかし、この説明は、本発明には当てはまらないように思われる。この文献は、エンドスタチンのための細胞表面レセプターの同一性に関して何ら示していない。固定化したｈＴｍ３への結合のＫｄは、細胞内の結合を反映すると言われるが、関連するレセプターへの結合を正確に反映するはずである測定された生物活性に対応しない。さらに、Ｔｐｍが細胞表面上に発現されるという示唆も、エンドスタチン、または他のタイプの細胞に対するその他のリガンドのための細胞表面レセプターとして働き得る、という示唆もなかった。
【００１０】
Ｔｐｍは一般的に細胞内タンパク質として知られているが、染色体転座によって作り出される、少なくとも２つのキメラ腫瘍性タンパク質：Ｔｒｋ腫瘍性タンパク質（Ｎａｋａｇａｗａｒａ  Ａ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．（２００１）．１６９：１０７−１４）、およびＴＰＭ３−ＡＬＫ融合タンパク質（Ｌａｍａｎｔ  Ｌら．，Ｂｌｏｏｄ（１９９９）．９３：３０８８−９５１０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であるとして報告されている。細胞外二量体Ｔｐｍは、融合タンパク質のチロシンキナーゼドメインを永久的に活性化するように見えた。
【００１１】
Ｋｅｓａｒｉ  ＫＶら（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）．１１８：２１９−２７）は、潰瘍性大腸炎における推定標的自己抗原として、細胞内タンパク質であるＴｐｍアイソフォーム５（ｈＴＭ５）の研究を行った。ｈＴＭ５は、膜結合大腸上皮細胞タンパク質（ＣＥＰ）とゆるやかに会合する形態において，大腸上皮細胞表面およびＬＳ−１８０大腸癌細胞株の細胞表面において発見されたが、小腸上皮細胞表面には発見されなかった（ＬＳ−１８０細胞は、培養培地の中に、ＣＥＰと共にｈＴＭ５を同時に放出した）。著者らは、ｈＴＭ５は大腸において外面化されるが、小腸上皮細胞においては外面化されないと結論づけ、ＣＥＰとの物理的関係性に基づいて、ｈＴＭ５の移送におけるＣＥＰのシャペロン機能の可能性を示唆した。
【００１２】
しかし、限られた数の前記の場合における細胞表面上のＴｐｍのための生理学的役割は、曖昧なままである。さらに、文献には、ＥＣ表面にあるＴｐｍに関する報告はない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、単離されたトロポミオシン（Ｔｐｍ）関連抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドであり、
（ａ）内皮細胞表面上に発現される全長ネイティブのＴｐｍタンパク質のフラグメント、またはこのフラグメントの改変体であり、
（ｂ）分子量が約１７ｋＤａであり、抗血管形成ポリペプチド剤の結合部位である、ネイティブなＴｐｍアイソフォーム、好ましくはヒトアイソフォームの内部フラグメントに、配列において対応するか、またはその改変体であり、
（ｃ）ネイティブＴｐｍ内部フラグメント結合部位に結合する抗血管形成ポリペプチド剤に結合する、
単離されたトロポミオシン（Ｔｐｍ）関連抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドに関し、
その中において、ペプチドは約４〜４０のアミノ酸を有し、ポリペプチドまたはペプチドの改変体は、ネイティブＴｐｍ配列の保存的置換改変体であり、単離された抗血管形成レセプターポリペプチド、ペプチド、または改変体は、ネイティブＴｐｍ内部フラグメントと実質的に同様の、抗血管形成ポリペプチド剤に結合する生化学的活性を有する。
【００１４】
上記単離されたポリペプチド、ペプチド、または改変体の好ましい実施形態において、ネイティブＴｐｍアイソフォームは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
別の好ましい単離されたポリペプチド、ペプチド、または改変体においては、ネイティブＴｐｍの内部フラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
請求する前記単離されたポリペプチド、ペプチド、または改変体は、好ましくは以下に結合するものである：（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；（ｄ）２鎖ヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；または（ｆ）ＨＫａまたはそのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント。上記ポリペプチド、ペプチド、または改変体は、好ましくは、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、および２６のいずれか１つ以上に結合する。
【００１７】
前述のものがペプチドまたはペプチド改変体である場合は、そのＮ末端、Ｃ末端、またはＮおよびＣ末端の両方においてキャップされ得る。
【００１８】
また、ＨＫａのＤ５ドメインに結合し、血管形成のインビトロまたはインビボのアッセイにおいて血管形成を阻害する、約４〜２０のアミノ酸である環状ペプチドも提供される。
抗血管形成直鎖ペプチドに依存する、本明細書に要約されたすべての方法は、本発明の抗血管形成環状ペプチドと共に実施し得る。
【００１９】
本発明はまた、抗体、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、より好ましくはヒトもしくはヒト化ｍＡｂ、またはそれらの抗原結合性フラグメント（ＡＢＦ）に関し、その抗体は、活性化された内皮細胞表面上に発現されるＴｐｍアイソフォームのエピトープに特異的であり、その抗体またはＡＢＦは以下を有する：
（ａ）活性化された内皮細胞に結合し、細胞内で抗血管形成シグナルを生成し、その結果（ｉ）移動、浸潤、増殖、もしくは血管形成を阻害するか、または（ｉｉ）アポトーシスを引き起こす、抗血管形成活性；あるいは、
（ｂ）好ましくは競合的結合によって上皮細胞上のＴｐｍに結合して、Ｔｐｍ結合抗血管形成剤の細胞への結合を阻害し、それにより、そうでなければ抗血管形成剤によって阻害される移動、浸潤、増殖、もしくは血管形成を許容する、または促進する、血管形成促進活性。
【００２０】
前述の抗体またはＡＢＦは、好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０のポリペプチドまたはペプチド中に存在する、あるいはそれによって形成される、エピトープに特異的である。
【００２１】
この抗体またはＡＢＦは、好ましくは、その中においてＴｐｍ結合抗血管形成剤が以下のとおりのものである：（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；（ｄ）２鎖ヒトキニノゲン（ＨＫａ）；（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；または（ｆ）ＨＫａまたはそのＤ５ドメインのＴｐｍ結合、抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント。
【００２２】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとしての役割を果たすＴｐｍポリペプチドまたはペプチドの検出に使用され得るこの抗体またはＡＢＦは、好ましくは検出可能に標識される。好ましい検出可能な標識には、放射性核種、ＰＥＴ画像化可能因子、ＭＲＩ画像化可能因子、蛍光分子、蛍光原、発色団、色素原、リン光分子（ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光分子（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、または生体発光分子（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）が含まれる。好ましい放射性核種には、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、および２０１Ｔｌが含まれる。好ましい蛍光分子または蛍光原には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミン、フルオレセイン誘導体、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）、ロードルグリーン（Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ）、およびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）が含まれる。
【００２３】
また、前述の検出可能に標識される抗体またはＡＢＦ、および、診断上許容性のあるキャリヤーを含有する診断上有用なＴｐｍ結合抗体組成物も提供される。
【００２４】
別の実施形態は、Ｔｐｍまたはそれのエピトープを標的にし、インビトロまたはインビボにおいて血管形成を阻害する治療上有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦである。こうした組成物は、前述の抗体またはＡＢＦを含有し、その抗体またはＡＢＦに、必要に応じて、直接または非直接的に、放射性核種、薬物、または毒などの治療上活性な成分が結合される。放射性核種は、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、および２１７Ｂｉからなる群より選択される。
【００２５】
治療上の抗血管形成薬剤組成物は、前述の抗体（必要に応じて治療上の標識で標識される）および薬学的に受容可能なキャリヤーを、好ましくは注射に好適な形態で含有する。この組成物は、インビトロ、またはインビボ、若しくは双方において血管形成を阻害するものであり得る。
【００２６】
また、前述のとおり治療上有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦ（および薬学的に受容可能なキャリヤーを含有する組成物）も本明細書において提供され、その抗体は、ＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的にし、インビトロまたはインビボにおいて血管形成を刺激する。この治療上の抗体または薬剤組成物は、好ましくは注射に好適な形態である。
【００２７】
本発明はまた、内皮細胞の移動、浸潤、増殖、もしくは血管形成を阻害する方法、または、内皮細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供し、この方法は、活性化された内皮細胞表面上に発現されるＴｐｍに結合する効果的な量の抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドと内皮細胞とを接触させ、それによって阻害またはアポトーシスを引き起こす工程を包含する。
【００２８】
この方法において、Ｔｐｍ結合ポリペプチドは、（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；（ｄ）２つの鎖ヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；または（ｆ）ＨＫａまたはそのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；（ｇ）トロポニンＴ；（ｈ）トロポモジュリン；（ｉ）カルデスモン；（ｊ）アクチン；（ｋ）カルポニン；（ｌ）ｐＥＬ９８；（ｍ）グルタミンデヒドロゲナーゼ；および（ｎ）（ｇ）〜（ｍ）のうちいずれかのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；であり得る。
【００２９】
また、疾患または望まれない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成に関連する状態を有する被験体、好ましくはヒトを処置するための方法も提供され、この方法は、血管形成を阻害するのに効果的な量の前述の薬剤組成物を被験体に投与する工程を包含する。被験者が腫瘍を有するという疾患であった場合、血管形成を阻害すると、結果として腫瘍のサイズや成長速度が減少するか、または腫瘍が破壊（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）される。
【００３０】
別の実施形態は、血管形成を強化する必要のある被験体において血管形成を刺激するための方法であり、これは、血管形成促進抗体またはＡＢＦを含有する効果的な量の本薬剤組成物を被験体に投与する工程を包含する。
【００３１】
別の実施形態は、生物学的サンプルにおいて、活性化された内皮細胞表面上に発現されるアイソフォームのＴｐｍの存在を検出する方法であり、これは、（ａ）検出可能に標識された形態の本抗体またはＡＢＦとサンプルとを接触させる工程、および（ｂ）このサンプルに結合した標識の存在を検出する工程が含まれる。
【００３２】
生体サンプルにおいてＴｐｍの存在を検出するための代わりの方法としては、（ａ）活性化された内皮細胞表面上に発現されたＴｐｍに結合する本発明の検出可能に標識された抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドとサンプルとを接触させる工程、および（ｂ）このサンプルと結合した標識の存在を検出する工程を包含する。こうした抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドの例には、（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；（ｄ）２つの鎖ヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；または（ｆ）ＨＫａまたはそのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、が含まれる。
【００３３】
前述の方法で試験され得るサンプルには、血漿、血清、細胞、組織、器官、および細胞、組織、もしくは器官の抽出物が含まれる。
【００３４】
前述の方法において、接触および検出する工程はインビトロにおいて行われ得る；あるいは、接触がインビボにおいて、検出がインビトロにおいて行われる。また、この方法は、接触がインビトロにおいて、検出がインビボにおいて実施され得る。最後に、接触および検出の両方がインビボ内であり得る。
【００３５】
本発明は、Ｔｐｍに結合する候補抗血管形成分子としての試験化合物を同定するためのスクリーニング試験を包含する。こうした試験は以下を含む：
（ａ）（ｉ）Ｔｐｍまたは（ｉｉ）薬剤または抗体の少なくとも１つが検出可能に標識されている、Ｔｐｍと、Ｔｐｍ結合抗血管形成ポリペプチドあるいはペプチド剤または抗Ｔｐｍ抗体との原料混合物に、試験化合物を添加する工程；
（ｂ）平行して、試験化合物無しで、同じような量のＴｐｍと、薬剤または抗体とを混合する工程；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）における薬剤のＴｐｍとの結合を測定する工程。
この中において、（ａ）における結合が（ｂ）における結合よりも少ない場合は、試験化合物が結合のインヒビターとしてポジティブであるとみなされ、それによって試験化合物は候補抗血管形成分子として同定される。
【００３６】
前述のスクリーニング試験は、インビトロまたはインビボの血管形成アッセイにおける血管形成のインヒビターとしての活性を見るために、候補抗血管形成分子として同定されている試験化合物を試験する工程をさらに包含する。
【００３７】
また、Ｔｐｍ結合抗血管形成分子またはその結合分子を発現する細胞に結合する、またはそれらを単離するために有用なアフィニティーリガンドも本明細書において提供され、これには、固体の支持体またはキャリヤーに固定化された、上述の単離されたポリペプチドまたはペプチドが含まれる。
【００３８】
上述のアフィニティーリガンドは、以下を含有する複雑な混合物からＴｐｍ結合抗血管形成分子を単離するための方法の土台を提供する：
（ａ）アフィニティーリガンドと混合物とを接触させること；
（ｂ）混合物内のいかなる物質もリガンドに結合するのを可能にすること；
（ｃ）非結合の物質をリガンドから除去すること；および
（ｄ）結合されたＴｐｍ結合分子を溶出すること。
抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドは以下であり得る：
（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、また配列番号２０の配列を有する；
（ｉｉ）前述の配列のうち１つのＴｐｍ結合ペプチドフラグメントである；または
（ｉｉｉ）これら配列またはそれらのペプチドフラグメントのうちの１つのＴｐｍ結合保存的置換改変体である。
【００３９】
（好ましい実施形態の説明）
本出願の発明者は、Ｔｐｍが活性化されたＥＣ（ＥＣ）表面上に存在すること、および、それが抗血管形成シグナルの重要な媒介物であることを発見していた。
【００４０】
ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）におけるＨＫａによるＥＣアポトーシスの誘導、およびＨＫａの抗血管形成活性は、モノクローナル抗Ｔｐｍ抗体（ｍＡｂ  ＴＭ−３１１）によって完全に阻害された。ＴＭ−３１１はまた、精製されたＴｐｍおよび増殖するＥＣの双方に対し、ＨＫａが高親和性（Ｋｄ〜２．６ｎＭ）でＺｎ２＋に依存して結合をすることをブロックした。ｍＡｂ  ＴＭ−３１１で染色されたＥＣの共焦点顕微鏡による分析、および、インタクトなＥＣ上の細胞表面タンパク質のビオチン標識は、増殖するＥＣの表面上の強化されたＴｐｍ露出を明らかにした。よって、本出願の発明者は、ＨＫａの抗血管形成の効果が、ＥＣ細胞表面Ｔｐｍに対する高親和性結合に依存することを発見した。
【００４１】
本発明がなされる前には、媒介物または抗血管形成シグナルとしてのＴｐｍの役割は、何ら示唆されていなかった。
【００４２】
ニワトリの砂嚢由来の平滑筋Ｔｐｍ（ｃＴＰＭ１）の配列（ＥｘＰＡＳｙ登録番号＃Ｐ０４２６７）が配列番号１と以下に示される：
【００４３】
【数１】
2006501139.tif 000003
キモトリプシンが切断したＴｙｒ（Ｙ）残基にアンダーラインが引かれている。配列番号１の残基６１−２１４に対応するフラグメント（上記下線部）が、ＨＫａＤ５などの、抗血管形成ポリペプチドリガンドを結合する、より短いポリペプチドとして同定された（以下を参照）。このポリペプチドは以下の配列を有しており、配列番号２とされる。
【００４４】
【数２】
2006501139.tif 000004
このポリペプチドは、「抗血管形成リガンド結合ポリペプチド」あるいは「ＡＡＬＢＰ」と呼ばれる。
【００４５】
本出願の発明者は、抗血管形成ポリペプチド、特にヒトキニノゲン、すなわちＨＫａのＤ５ドメインを包含するアフィニティーカラムに対し、ｃＴＰＭ１のキモトリプシン消化物を通過させることによってＡＡＬＢＰを発見した。カラムに結合する物質は、Ｎ末端の配列決定に供された。配列はＳＥＳＶＫＥＡＱＥであり、ｃＴＰＭ１の残基６１−６９（配列番号１）、および配列番号２の残基１−９に対応することが測定された。微量な混入物が、異なるＮ末端配列を有していた。Ｄ５結合ポリペプチドおよびそのＣ末端のサイズは、質量分析法（ＭＳ）、特に、マトリックス補助レーザー脱離飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳによって測定された。
【００４６】
Ｔｐｍのヒトアイソフォームは、８つが知られている−類似の２つの群は、どのアイソフォームであるか不明である−。それらは以下に記載され、その配列が示されている（整列されたフォーマットで）。ニワトリとヒト（およびニワトリとニワトリ）のＴｐｍの間における特定のアラインメントの比較に関する更なる情報が与えられる。また、ｃＴＰＭ１のＡＡＬＢＰに対応するポリペプチドフラグメントも示される。
【００４７】
【表１】
2006501139.tif 000005
全長Ｔｐｍ配列同士のある部分の同一性（％）を含むアラインメントの情報が、表２に示される。
【００４８】
【表２】
2006501139.tif 000006
以下の表３は、２つのニワトリＴｐｍアイソフォームおよび８つのヒトＴｐｍアイソフォームの全長配列を示している。また、アンダーラインで示されているのは、前述のｃＴＰＭ１の場合のように、ＡＡＬＢＰに対応する、より短いポリペプチドである。これらのより短いポリペプチドのアミノ酸配列が、別途表４に示される。
【００４９】
【表３】
2006501139.tif 000007
2006501139.tif 000008
【００５０】
【表４】
2006501139.tif 000009
本発明は、上記ポリペプチドのうちいずれかの保存的アミノ酸置換改変体を含む。また本発明には、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０に由来する、少なくとも４つのアミノ酸、好ましくは約１０〜約４０のアミノ酸、またはそれらの保存的置換改変体を有する、オーバーラップするペプチドのセットも含まれる。本発明のポリペプチドおよびペプチドは、（ａ）ＨＫａＤ５、またはＨＰＲＧ、またはＨＰＲＧの血管形成ペプチドフラグメントなどの血管形成ポリペプチドまたはペプチドに直接的に結合するか、あるいは（ｂ）細胞表面上に発現されるか、固体の支持体に固定されるか、または本明細書に記載された競合結合アッセイにおける溶液中にあるか、いずれかのＴｐｍタンパク質への、そうした血管形成ペプチドの結合を阻害するか、いずれかであると特徴づけられる。
【００５１】
別の形態において、本発明は、ヒトＴｐｍ、好ましくは配列番号５、７、あるいは９、またはそのフラグメント、好ましくは配列番号６、８、または１０に相同なペプチドを含有する。１つの実施形態において、このペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＴｐｍの野生型フラグメントの配列に少なくとも７０％同一である。同一性は、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％である。
【００５２】
ｃＴＰＭ１ポリペプチド配列番号２の場合、ＴＭ−３１１Ａｂはこのフラグメントを認識しない。注目すべきは、ＴＭ−３１１ｍＡｂがＴｐｍのＨＫａ結合をブロックするにもかかわらず、このｍＡｂは、ＨＵＶＥＣまたはＣＡＭアッセイのような、試験されてきたヒトのシステムにおいて抗血管形成ではない。このｍＡｂは、マウスのシステムにおいて抗血管形成であり、抗腫瘍活性を有する。
【００５３】
本発明は、抗体、好ましくは、前述のようにＴｐｍ、またはＡＡＬＢＰなどのＴｐｍポリペプチドもしくはペプチドを直接結合し、細胞表面Ｔｐｍを経由して細胞に結合するか、または血管形成ＥＣ表面上に発現されたＴｐｍに結合して、その細胞内の抗血管形成シグナルを呼び出すことによって、血管形成のインヒビターまたはアンタゴニストとして作用するｍＡｂに関する。
【００５４】
発明者らは、本明細書において開示された結果に関する特定の機構の説明に縛られることを望まないが、本発明の組成物および方法が、（１）アポトーシスにつながる、ＥＣにおけるシグナルの発生によって仲介される抗血管形成の効果か、（２）表面上にＴｐｍポリペプチドを発現する腫瘍細胞への直接的なアポトーシスシグナルか、（３）両方のメカニズムか、のいずれかによって抗腫瘍の効果を発揮することに想到している。
【００５５】
本発明によれば、細胞表面Ｔｐｍに結合し得、アポトーシス経路を開始するか、さもなければ血管形成を阻害するいずれのタンパク質も、望まれない血管形成、例えば、腫瘍の成長および転移に関連する状態を処置するために使用し得る。以下はＴｐｍ結合タンパク質の、限定されないリストである（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ＳＶ，Ｊ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｒｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌ．（２００１），２２：５−４９；Ｓｑｕｉｒｅ  ＪＭら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９８）１２：７６１−７７１；Ｌｉｎ  ＪＪら，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．（１９９７）．１７０：１−３８参照）。このＴｐｍ結合タンパク質は、血管形成を阻害するために、本発明に従って使用し得る：トロポニンＴ（Ｓｍｉｌｌｉｅ，ＬＢ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（１９７９）．４：１５１−１５５；Ｚｏｔ  ＡＳら,Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ（１９８７）１６：５３５−５５９）；トロポモジュリン（Ｆｏｗｌｅｒ  ＶＭ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８７）２６２：１２７９２−８００）；カルデスモン（Ｍａｒｓｔｏｎ  ＳＢら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ（１９９１）：２７９：１−１６）；カルポニン（Ｇｉｍｏｎａ  Ｍら，Ｉｎ：Ｂａｒａｎｙ（編），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ，ｐｐ９１−１０３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．（１９９６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ（１９８６）１４１：２０−２６）；ｐＥＬ９８（Ｔａｋｅｎａｇａ  Ｋら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９４）１２４：７５７−７６８）；グルタミン酸脱水素酵素（Ａｋｕｔｓｕ  Ｓら，Ｚｏｏｌ  Ｓｃｉ（２０００）．１７：８７１−８７９）およびアクチン。
【００５６】
２つの他の分子（トロポニンＩおよびトロポニンＣ）とともに、トロポニンＴは、Ｔｐｍに結合する三量体を形成する。トロポニンＴは、Ｔｐｍ結合を引き起こすサブユニットである。米国特許番号６，０２５，３３１（Ｍｏｓｅｓら，２０００年２月１５日）は、これら３つのタンパク質すべてが、ｂＦＧＦによって誘導されるウシの毛細血管のＥＣの増殖を阻害し得ることを開示した。この文献は、これらのタンパク質が血管形成を阻害するために使用し得ることを示した。Ｍｏｓｅｓ，ＭＡら，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２６４５−２６５０は、明らかな均質性に精製されたヒトの軟骨のトロポニンＩが、Ｂ１６−ＢＬ６マウス黒色腫モデルを使用した、インビボおよびインビトロにおける血管形成の、およびインビボにおける腫瘍の転移の、強力な、および特定のインヒビターであることを開示した。これらの著者は、トロポニンＩがインビトロにおける毛細血管のＥＣの増殖、およびインビボにおける血管形成を阻害したメカニズムについて、公知ではないと述べているが、ＥＣ細胞成長および毛細血管の形態形成における、アクチンに関連するタンパク質を含む細胞骨格およびその調節要素の操作を通じたＥＣ細胞形態の調節の公知の効果と関連することを示唆している。ＥＣトロポニンＩレセプターの存在は、このタンパク質がＥＣ形態における変化を誘導し得、それが次に、これら細胞の成長を抑制する手段として示唆された。さらに、生理学的条件において、リジン含有量が比較的多いトロポニンＩ（ｐＩ８．８８）が、ヘパリンへの親和性を通じて、ｂＦＧＦ、およびおそらくはＶＥＧＦへ結合し、そしてＥＣ表面上の硫酸ヘパリンプロテオグリカンについて競合し得ることが示唆された。
【００５７】
前述のように、トロポニンＩはＴｐｍに結合しない。むしろ、前述の研究においては、トロポニンＴはトロポミオシンを結合するサブユニットであるのに対し、トロポニンＩは抗血管形成活性を有していた。
【００５８】
（トロポミオシン結合血管形成インヒビター）
本発明によれば、Ｔｐｍはいくつかの抗血管形成タンパク質によって標的とされる。これらは以下に記載される。
【００５９】
（１  ヒスチジンプロリンリッチ糖タンパク質およびそれらのフラグメント）
これらのポリペプチドおよびそれらの抗血管形成特性は、２００１年２月１４日に出願された、同時係属の、同一出願人による、米国特許出願番号１０／０７４，２２５にその詳細が記載されており、この文献はその全体が参考として本明細書中に援用される。
全長ヒトＨＰＲＧは、アミノ酸配列の配列番号２１を有する：
【００６０】
【数３】
2006501139.tif 000010
ウサギＨＰＲＧは、以下の通りアミノ酸配列の配列番号２２を有する：
【００６１】
【数４】
2006501139.tif 000011
イタリック：シグナル配列
二重線：Ｐｒｏ−リッチドメイン
一重線：Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（Ｈ／Ｐ）リッチドメイン
ヒトＨＰＲＧのＨ／Ｐドメインは配列番号２３の配列を有する：
【００６２】
【数５】
2006501139.tif 000012
ウサギＨＰＲＧのＨ／Ｐドメインは配列番号２４の配列を有する：
【００６３】
【数６】
2006501139.tif 000013
（２  ヒトキニノゲン（ＨＫ）およびフラグメント）
ＨＫの成熟した形態の全長配列（配列番号２５）が以下に示される：
【００６４】
【数７】
2006501139.tif 000014
ＨＫのＤ５ドメイン（成熟したＨＫ配列のアミノ酸残基３８４−５０８；上記表の下線の部分）は、血管形成の、および、細胞の増殖を含む多様なＥＣ機能のインヒビターとして有用である。このことは、２００１年７月２４日に出願された、本出願の発明者の何人かとの同一人に譲渡されたＰＣＴ／ＵＳ０１／２３１８５、「ヒトキニノゲンＤ５ドメインポリペプチド」に開示されており（Ａ．Ｍａｚａｒ  ＆  Ｊｏｓｅ  Ｊｕａｒｅｚ）、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００６５】
１２５残基Ｄ５ドメインは、配列番号２６の配列を有する：
【００６６】
【数８】
2006501139.tif 000015
本発明はまた、ヒトまたはニワトリのＴｐｍまたはそれらのＡＡＬＢＰフラグメントの機能的ホモログに関する。機能的ホモログは、生化学的活性および生物学的活性、好ましくは、抗血管形成活性および抗腫瘍活性を有していなければならず、これらの活性は本明細書に記載されるインビトロまたはインビボの方法を使用して試験し得る。この機能的特性を考慮すると、もしタンパク質が配列の類似性、ならびに記載された生化学的活性および生物学的活性を有するのであれば、他種の由来する相同性Ｔｐｍタンパク質の使用は、まだ発見されていないタンパク質を含め、本発明の範囲内である。
【００６７】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性％を測定するために、この配列は最適な比較目的のために整列される。（例えば、最適な整列のために、第１および第２アミノ酸配列あるいは核酸配列のひとつまたは両方に、ギャップが導入され得、相同性のない配列は、比較の目的のために無視され得る。）好ましい整列方法において、Ｃｙｓ残基が配列される。
【００６８】
好ましい実施形態において、比較される配列の長さは、参照する配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。例えば、好ましい整列は、ヒトＴｐｍ  ｈＴＰＭ２（配列番号７）、またはそのフラグメント配列番号８と、アミノ酸残基の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％が配列される。次に、対応するアミノ酸（またはヌクレオチド）の位置において、アミノ酸残基（またはコードする配列のヌクレオチド）が比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基（またはヌクレオチド）によって占められている場合、その位置における分子は同一ということになる。（本明細書に使用されるとおり、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同意義である。）２つの配列間の同一性％は、これらの配列が共有する同一の位置の数の関数であり、この２つの配列の最適な整列のために導入が必要な、ギャップの数、および各ギャップの長さが考慮される。
【００６９】
２つの配列間における配列の比較および同一性％の測定は、数学的アルゴリズムを使用することにより達成し得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間における同一性％は、  ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して測定される。この際、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みが用いられる。別の好ましい実施形態においては、２つのヌクレオチド配列間における同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）におけるＧＡＰプログラムを使用して測定されるが、この際、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、および、１、２、３、４、５、または６の長さ重みが用いられる。別の実施形態においては、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を使用して測定されるが、この際、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長さペナルティー、および４のギャップペナルティーが用いられる。
【００７０】
存在するポリペプチド配列および本発明のポリペプチド配列をコードする核酸は、さらに、公のデータベースを検索して、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するための「クエリー配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として使用し得る。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行し得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を使用して実行し得、ヒトまたはマウスのＨＰＲＧ核酸分子に相同性を有するヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して実行し得、本発明のＨＰＲＧタンパク質分子に相同性を有するアミノ酸配列を得る。比較する目的でギャップが設けられた整列を得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用し得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際は、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用し得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｋ参照。
【００７１】
したがって、前述のヒトＴｐｍの特定のアイソフォームのホモログは、（ａ）ネイティブＴｐｍまたはそれらのリガンド結合フラグメントの機能的活性、および（ｂ）前述のように測定された場合、少なくとも約３０％（アミノ酸レベルにおいて）、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％の、ネイティブＴｐｍへの配列の類似性を有するとして特徴づけられる。
【００７２】
開示されたＴｐｍの配列に基づいて、ＤＮＡプローブを使用してこのようなタンパク質を得ること、および発現させることは、当技術分野の範囲内のことである。したがって、このタンパク質の生化学的活性および生物学的活性は、本明細書に記載されたような当技術分野において認識された方法を容易に使用して試験し得る。
（ペプチド組成物）
好ましい組成物は、Ｔｐｍの結合活性および／または生物学的活性を有することに特徴づけられる、Ｔｐｍの生物学的に活性のペプチドであるか、もしくはそれを含む。このような結合は、ＥＣと相互作用し、それらのアポトーシスを促進するか、もしくはさもなければ血管形成に関連するいかなるＥＣ機能をも減少させるシグナルを生成する、好ましくは抗血管形成タンパク質、またはペプチドであるリガンドに対するものである。
【００７３】
さらに、生物学的に活性のペプチドは、インビトロまたはインビボにおける、本明細書中で特徴づけられるような結合活性または生物学的活性のアッセイにおいて、Ｔｐｍのような活性を有する。好ましくは、このペプチドは、ＨＰＲＧ、またはＨＫａＤ５、または抗−Ｔｐｍ  ｍＡｂｓの、（ａ）細胞表面Ｔｐｍを経由してＥＣへ、あるいは（ｂ）直接結合アッセイにおいて単離Ｔｐｍへの結合をブロックする。好ましいペプチドには、抗血管形成の抗−Ｔｐｍ  ｍＡｂへの結合に必要な最小の配列が含まれる。
【００７４】
このペプチドは、そのＮ末端およびＣ末端において、それぞれアシル（略称「Ａｃ」）基、アミノ（略称「Ａｍ」）基でキャップされ得る。例えば、Ｎ末端はアセチル（ＣＨ３ＣＯ−）およびＣ末端はアミノ（−ＮＨ２）でキャップされ得る。
【００７５】
広範囲のＮ末端キャップ機能、好ましくは末端アミノ基への連結における機能が、例えば以下のように考えられる：
ホルミル；
アセチル、プロピオニル、ブチリルなどの、１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル；
ヘクス−３−エノイルなどの、１〜１０個の炭素原子を有するアルケノイル；
ヘクス−５−イノイル（ｙｎｏｙｌ）などの、１〜１０個の炭素原子を有するアルキノイル；
ベンゾイルまたは１−ナフトイルなどの、アロイル；
３−ピロイルまたは４−キノロイルなどの、ヘテロアロイル；
メタンスルホニルなどの、アルキルスルホニル；
ベンゼンスルホニルまたはスルファニリルなどの、アリールスルホニル；
ピリジン−４−スルホニルなどの、ヘテロアリールスルホニル；
４−アミノブチリルなどの、１〜１０個の炭素原子を有する置換されたアルカノイル；
６−ヒドロキシ−ヘクス−３−エノイルなどの、１〜１０個の炭素原子を有する置換されたアルケノイル；
３−ヒドロキシ−ヘクス−５−イノイル（ｙｎｏｙｌ）などの、１〜１０個の炭素原子を有する置換されたアルキノイル；
４−クロロベンゾイルまたは８−ヒドロキシ−ナフト−２−オイルなどの、置換されたアロイル；
２，４−ジオキソ−１，２，３，４−テトラヒドロ−３−メチル−キナゾリン−６−オイルなどの、置換されたヘテロアロイル；
２−アミノエタンスルホニルなどの、置換されたアルキルスルホニル；
５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニルなどの、置換されたアリールスルホニル；
１−メトキシ−６−イソキノリンスルホニルなどの、置換されたヘテロアリールスルホニル；
カルバモイルまたはチオカルバモイル；
置換されたカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）および置換されたチオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）であり、Ｒ’はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、置換されたアルキル、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、置換されたアリール、または置換されたヘテロアリールである；
置換されたカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ）または置換されたチオカルバモイル（Ｒ’−ＮＨ−ＣＳ）であり、Ｒ’は、前述により定義されたようにアルカノイル、アルケノイル、アルキノイル、アロイル、ヘテロアロイル、置換されたアルカノイル、置換されたアルケノイル、置換されたアルキノイル、置換されたアロイル、または置換されたヘテロアロイルである。
【００７６】
Ｃ末端のキャップ機能は末端のカルボキシルとのアミド結合またはエステル結合のどちらかであり得る。アミド結合を提供するキャップ機能は、ＮＲ１Ｒ２として表され、Ｒ１およびＲ２は独立的に、以下の群から引き出され得る：
水素；
メチル、エチル、イソプロピルなどの、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル；
プロプ−２−エニルなどの、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルケニル；
プロプ−２−イニルなどの、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキニル；
ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、メルカプトアルキル、アルキルチオアルキル、ハロゲノアルキル、シアノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルカノイルアルキル、カルボキシアルキル、カルバモイルアルキルなどの、１〜１０個の炭素原子を有する置換されたアルキル；
ヒドロキシアルケニル、アルコキシアルケニル、メルカプトアルケニル、アルキルチオアルケニル、ハロゲノアルケニル、シアノアルケニル、アミノアルケニル、アルキルアミノアルケニル、ジアルキルアミノアルケニル、アルカノイルアルケニル、カルボキシアルケニル、カルバモイルアルケニルなどの、１〜１０個の炭素原子を有する置換されたアルケニル；
ヒドロキシアルキニル、アルコキシアルキニル、メルカプトアルキニル、アルキルチオアルキニル、ハロゲノアルキニル、シアノアルキニル、アミノアルキニル、アルキルアミノアルキニル、ジアルキルアミノアルキニル、アルカノイルアルキニル、カルボキシアルキニル、カルバモイルアルキニルなどの、１〜１０個の炭素原子を有する置換されたアルキニル；
フェナシル（ｐｈｅｎａｃｙｌ）または２−ベンゾイルエチルなどの、１０個以下の炭素原子を有するアロイルアルキル；
フェニルまたは１−ナフチルなどのアリール；
４−キノリルなどの、ヘテロアリール；
アセチルまたはブチリルなどの、１〜１０個の炭素原子を有するアルカノイル；
ベンゾイルなどの、アロイル；
３−キノロイルなどの、ヘテロアロイル；
ＯＲ’またはＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’およびＲ’’は独立的に、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アシル、アロイル、スルホニル、スルフィニルである）または、ＳＯ２−Ｒ’’’またはＳＯ−Ｒ’’’（Ｒ’’’は、置換されたあるいは置換されていない、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、またはアルキニルである）。
【００７７】
エステル結合を提供するキャップ機能は、ＯＲとして表され、Ｒは以下のものであり得る：アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、置換されたアルコキシ、置換されたアリールオキシ、置換されたヘテロアリールオキシ、置換されたアラルキルオキシ、または置換されたヘテロアラルキルオキシ。
【００７８】
Ｎ末端のキャップ機能またはＣ末端のキャップ機能のいずれか、あるいは両方は、キャップされた分子が、活性の薬物を放出するために、体内において自発性のまたは酵素による転換を経験し、親薬物の分子を超えてデリバリー特性を改善されているプロドラッグ（親薬物の分子の薬理学的に不活性の誘導体）として機能するような構造であり得る（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  Ｈ，Ｅｄ：Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）。
【００７９】
キャップする基を賢明に選択することにより、ペプチド上における他の活性を追加することが可能となる。例えば、Ｎ末端またはＣ末端のキャップに連結されるスルフヒドリル基が存在すれば、誘導体化されたペプチドの他の分子への結合体化が可能となる。
【００８０】
（環状ペプチド）
本発明に従った血管形成インヒビターとして有用な別のクラスのペプチドは、環状ペプチドである（これが追加的な化学的リンカーを包含するのであれば、ペプチド誘導体と考えられ得る）。本発明の環状ペプチドには、４〜約２０個のアミノ酸を有し、固定化されたＨＫａのＤ５ドメイン（前述）またはＤ５を含むＨＫａのより大きな形態に結合する特性を有するペプチドが包含される。環状ペプチドはまた、本明細書に記載されるいかなる公知の直接または代理のアッセイにおいても血管形成を阻害するはずである。
【００８１】
環状ペプチドの製造方法、直鎖状ペプチドの環化などは、当技術分野において周知であるので、本明細書では詳細を述べない。例えば、Ｊｏｎｅｓらの米国特許番号５，９４２，４９２、Ｍａｚａｒらの米国特許番号６，２７７，８１８、２０００年１１月３日出願された米国特許出願番号第０９／７０４，７３１号（これは、前述の２つの特許を生み出した出願、またはそれらの継続出願の優先権を主張している）を参照。これらの特許／出願の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００８２】
１１マー環状ペプチドの一般的な式が以下に示される：
【００８３】
【化１】
2006501139.tif 000016
この一般的な式において、Ｘ１をＸ２に連結するアミド結合（ＣＯ−ＮＨ）は、カルボニル部分がアミノ酸Ｘ１に由来し、アミノ部分がアミノ酸Ｘ２に由来するようになっている。Ｘ２とＸ３との間の連結についても同様であり、この１１マーペプチド内において以下同様である。このペプチドは、そのＮ末端としてＸ１を有し、そのＣ末端としてＸ１１を有する。好ましい実施形態において、Ｘ１およびＸｎ（このペプチドの直鎖状の式におけるＣ末端の残基）は、ジスルフィド結合によって連結されるＣｙｓ残基であり、このジスルフィド結合がこのペプチドを環化する。このような場合、追加的なリンカー（Ｌ）は必要ない。他の実施形態においては、以下に述べるとおりのリンカーが採用される。
【００８４】
前述の式の化合物を調製するためには、Ｌが選択されて、一方の末端において、アミノ酸Ｘ１１のカルボキシルＣ原子に化学的に結合され得る官能基が提供され、他方の末端において、アミノ酸Ｘ１のα−アミノＮ原子に化学的に結合され得る官能基が提供される。
【００８５】
好ましくは、リンカーＬはこのペプチドに水溶性を与え、結果として、Ｎ末端残基Ｘ１のＣαと、Ｃ末端残基Ｘ１１のＣαとの間の分子内距離が４〜１２Åとなる。
【００８６】
あるいは（単に例として再度１１ｍｅｒを使用）、直鎖状ペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１は、究極の最終リンカー基Ｌの部分を含む、Ｘ１１における拡張部分を用いて合成され得る：この拡張部分はＬｂと呼ばれる。ペプチド鎖を合成後、Ｘ１末端は、やはり究極のリンカーの一部分となる拡張部分を用いて拡張される；この基はＬａで表される。これらの工程は、以下の式の化合物を生み出す：
Ｌａ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｌｂ。
次にＬａおよびＬｂの遊離末端は、お互いに化学的に結合する。このようにして、環化工程中に、あらかじめ付着されたフラグメントＬａおよびＬｂから、リンカーＬが形成される。以下に挙げたＬの例では、Ｌの方向は、左から右にみて、Ｘ１からＸ１１へとなり、すなわち、ＬのＣ末端はＸ１に結合され、ＬのＮ末端はＸ１１に結合される。
【００８７】
Ｌが、Ｃｙｓ、ＨｏｍｏＣｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、γ−カルボキシル改変Ｇｌｕ、またはβ−カルボキシル改変Ａｓｐ残基を含む場合は、このような残基のエナンチオマー中心の構成は、Ｌ−か、またはＤ−か、のいずれかであり得る。
【００８８】
有用なリンカーの例を以下に挙げる。
【００８９】
【化２】
2006501139.tif 000017
Ｌ６〜Ｌ１０におけるＲ１基は、弱塩基性ジアミノ基、−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ２であってよく、親ジアミンＨ２Ｎ−Ｒ２−ＮＨ２における各一級アミノ基のｐＫａは約８．０未満であり、Ｒ１の部分が−ＮＨ−Ｒ２−ＮＨ２の場合のその一級アミノ基のｐＫａも、約８．０未満である。Ｒ２の好ましい例は、ｐ−フェニレン、ｏ−フェニレン、またはｍ−フェニレンである。
【００９０】
本発明の環状ペプチドの部分であるリンカーＬ１５にＲ１基を導入するためには、好ましくは、弱塩基性アミンＲ１ＮＨ２がグリシン「スパー（ｓｐｕｒ）」に結合される（これが、上記に示されたＬ１５の強調される部分である）。このリンカーを対象としたアミンは、構造によって特に限定されないアミンである。むしろ、唯一の必要条件は、そのアミノ基のｐＫａが約８．０未満であることである。一般的に常に弱塩基性である芳香性アミンのクラスのうちで、実際、アリニンは、弱塩基性アミンの単純でプロトタイプな例である。芳香性Ｒ１基を導入するためには、芳香性アミンが使用される。Ｒ１は、ホモアリールまたはヘテロアリール残基であり得、広範囲から引き出される１つ以上の置換基で置換され得る。芳香性基は多環式であり得、その際、多様な環が縮合されても、縮合されなくても、または縮合と非縮合の両方でもよい。多環式芳香性基において、環は、単素環式または複素環式、あるいはその両方の混合であり得る。この環は、広範囲から引き出される１つ以上の置換基で置換され得る。好ましい実施形態において、Ｌ１５のＲ１はフェニルまたは置換されたフェニルである。
【００９１】
Ｌ１５のＲ１基は、弱塩基性に必須の特性を有するために芳香性残基である必要はない。例えば、アミンのクラスは、ω−（アミノオキシ）ｎ−１〜１０個の炭素のアルキル基、で置換されるいかなる芳香性残基をも含む。これは以下の式によって表される：Ｈ２Ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ（ここでｘ＝１〜１０）。好適なアミンの別のクラスは、以下の式を有するものである：Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ホモアリール、または、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ヘテロアリール（ここでｘ＝２〜１０）。ホモアリール残基またはヘテロアリール残基は、広範囲から引き出される１つ以上の置換基で置換され得る。前述のように、ホモアリール残基は多環式であり得、縮合されても、縮合されていなくても、またはその両方でもよい。ヘテロアリール残基は、１つを超える単素環を追加的に包含し得、それは、縮合されても、縮合されていなくても、または縮合もしくは非縮合の両方であってもよい。前述のこれらの化合物は限定されず、本発明の範囲内に含まれる弱塩基性アミンの特性であり得る広範な構造的性質を例示したものである。
【００９２】
３つの好ましい環状ペプチドおよびそれらを使用した研究の結果が、実施例ＶＩＩに記載されている。
【００９３】
（ペプチドおよび誘導体の製造）
（一般的な化学合成の手順）
本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して調製し得る。しかし、長さを考えると、好ましくは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）によって一般的に記載されているものなどの，固相合成を使用して調製される。ただし、当技術分野において公知の、他の同等の化学合成もまた有用である。固相ペプチド合成は、保護されたα−アミノ酸を好適な樹脂にカップリングすることによって、このペプチドのＣ末端から開始され得る。このような出発物質は、クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチル樹脂へのエステル結合、あるいは、ＢＨＡ樹脂またはＭＢＨＡ樹脂へのアミド結合により、α−アミノが保護されたアミノ酸を付着させることによって調製され得る。
【００９４】
このような方法は当技術分野において周知であり、例えば米国特許番号５，９９４，３０９（１９９９年１１月３０日発行）において開示されており、この文献はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【００９５】
（アミノ酸の置換および付加改変体）
やはり本発明に含まれているのが、少なくとも１つのアミノ酸残基、および好ましくは、１つだけのアミノ酸残基が除去されて、ネイティブ配列と比較すると異なる残基が、その除去された位置に挿入されるペプチドである。タンパク質の化学的性質および構造の詳細な説明については、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９、およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８４参照。これらは参考として本明細書中に援用される。本発明のペプチドの分子内で行なわれ得る置換のタイプは保存的置換であり、以下の基のうちの１つ内の交換として本明細書に定義される：
１．小さな脂肪族の、無極性の、またはわずかに極性の残基：例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ；
２．極性の、負に荷電された残基およびそれらのアミド：例えば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の、正に荷電された残基：例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
プロ（Ｐｒｏ）は、その異常な相対位置により、鎖をきつく束縛する。機能的特性における実質的な変更は、前述の基（前述には挙げていない他の２つのアミノ酸基）内よりはむしろその間などで、より保存的でない置換を選択することによってなされ、それは、（ａ）置換領域内のペプチドのバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さを維持する効果においてより顕著に異なる。本発明によるほとんどの置換は、ペプチド分子の特性における根本的な変更を生み出さないものである。置換を行なう前にその置換の正確な効果を予測するのが困難である場合でも、当業者であれば、慣用的スクリーニングアッセイ、好ましくは後で述べる生物学的アッセイによって、効果が評価され得ることを理解する。酸化還元または熱の安定性、疎水性、タンパク質分解への感受性、あるいはキャリヤーとの凝集または多量体への凝集の傾向を含むペプチド特性の変更は、当業者に周知の方法によってアッセイされる。
【００９６】
本発明は、血管形成、腫瘍の成長、ＥＣの増殖、ＥＣの移動、またはＥＣの管形成を阻害するまたは減少させる、あるいは、ＥＣのアポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００９７】
本発明はまた、ＴｐｍもしくはＡＡＬＢＰのフラグメント、ペプチド、配座異性体、ＡＡＬＢＰに対する抗体、ＴｐｍもしくはＡＡＬＢＰの生物学的等価物、または薬剤組成物を提供する。
【００９８】
ＡＡＬＢＰは、組織の抽出物、または「ネイティブ」Ｔｐｍを生成する培養液において増殖する細胞株の生成物、好ましくは細胞表面Ｔｐｍ、またはＴｐｍのＡＡＬＢＰフラグメント、または遺伝的に改変されている「非ネイティブ」ＴｐｍもしくはＡＡＬＢＰ、またはそれらの機能的な誘導体などの、任意の適切な組織原料から単離されたＴｐｍから得られ得、それにより、このような細胞が、このポリペプチド、あるいは、ドメインまたはより短いフラグメントなどの、それらの機能的誘導体を発現する。
【００９９】
Ｔｐｍフラグメントまたは誘導体は、化学的に合成され、または組換え法によって生成される。当技術分野において公知の組換え法は、例えば細胞抽出物におけるｍＲＮＡの逆転写の後でＰＣＲを用いることによる、ｃＤＮＡライブラリのＰＣＲを用いたＤＮＡ増幅を含むが、これに限定されない。
【０１００】
基本的なテキストは、分子生物学の一般的な方法を開示し、それらのすべては参考として本明細書中に援用される。それには以下が含まれる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（現行版）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ｅｄ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ＆ＩＩ巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５；Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）；Ｗａｔｏｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、第２版，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；およびＯｌｄ，ＲＷら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）。
【０１０１】
Ｔｐｍのフラグメントは、制御されたプロテアーゼ反応によって得られる（Ｂｏｒｚａ  Ｄ−Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５；１９２５−１９３４）。キモトリプシン消化が本明細書に例示される。あるいは、Ｔｐｍは、限定されたプラスミン消化、その後にジオスレイトールでの部分的還元に供されて、Ｔｐｍ結合のフラグメントを作成し、Ｔｐｍ結合抗血管形成薬剤の作用をブロックする。これらは、ブロックをしないと血管形成を制限し得る、内在的なホメオスタシスのメカニズムをブロックすることにより、血管形成を促進するのが望ましい場合に有効であり得る。
【０１０２】
（ＴｐｍおよびＡＡＬＢＰの化学的誘導体）
ＴｐｍまたはＡＡＬＢＰの「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の一部ではない追加的な化学的部分を包含する。ポリペプチドの共有結合性の改変は、本発明の範囲に含まれる。このような誘導体化された部分は、溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善し得る。このような効果を仲介できる部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）に開示されている。
【０１０３】
このような改変は、ポリペプチドの標的とされたアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応可能な有機誘導体化薬剤で反応させることによって、分子内に導入し得る。別の改変は、タンパク質の環化である。
【０１０４】
システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチルの誘導体を与える。また、システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジル−ジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応することによって誘導体化される。
【０１０５】
ヒスチジル残基は、薬剤が、ヒスチジルの側鎖に比較的特異的である、ジエチルプロカーボネート（ｐＨ５．５−７．０）と反応させることによって誘導体化される。ｐ−ブロモフェナシルブロミドも有用である；反応は、好ましくはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムにおいて行なわれる。
【０１０６】
リジニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）およびアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸で誘導体化される。環状カルボン酸無水物での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。アミノを包含する残基を誘導体化するための他の好適な試薬には、メチルピコリニミデートなどのイミドエステル、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４ペンタンジオン、およびグリオキシレートのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１０７】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む１つまたは複数の従来型の試薬との反応によって改変される。このような誘導体化では、グアニジン官能基のｐＫａ値が高いために、反応がアルカリ性条件下で行なわれる必要がある。さらに、これらの試薬は、リジン基およびアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０１０８】
チロシル残基の改変は、ペプチドへのスペクトル標識の導入を可能にする。これは、芳香性ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって達成される。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌ）およびテトラニトロメタンが使用されて、それぞれＯ−アセチルチロシル種、３−ニトロの誘導体が作成される。
【０１０９】
カルボキシル側鎖、アスパルチルまたはグルタミルは、１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア（ａｚｏｎｉａ）−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に改変され得る。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニアとの反応によって、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基へと転換され得る。
【０１１０】
アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラジニル残基およびグルタミニル残基へと転換される。逆に、グルタミニル残基およびアスパラジニル残基は、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミドされ得る。脱アミド化は、温和な酸性条件下で行なわれ得る。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内である。
【０１１１】
二官能性の試薬での誘導体化は、非水溶性の支持マトリックスまたはその他の巨大分子のキャリヤーにペプチドを架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋薬剤には、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−アジドサリチル酸を有するエステル、３，３−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、および、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性のマレイミドが含まれる。
【０１１２】
メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化薬剤は、光の存在下で架橋を形成できる光活性化可能な中間体を産出する。あるいは、臭化シアン活性化された炭水化物、および、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、ならびに同第４，３３０，４４０号に記載された反応性基質などの非水溶性の反応性マトリックスが、タンパク質の固定化のために採用される。
【０１１３】
他の改変には、プロリンおよびリジンの水酸化と、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化と、リジン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７９−８６（１９８３））と、Ｎ末端アミンのアセチル化と、場合によっては、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１１４】
さらに含まれるのは、１つ以上のＤ−アミノ酸が１つ以上のＬ−アミノ酸に置換されるペプチドである。
【０１１５】
（診断的組成物および予後組成物）
本発明のペプチドは、例えば、細胞表面上あるいは細胞内部に拘わらず、タンパク質リガンドを結合するペプチド、または細胞の結合部位／レセプター（例えば活性化されたＥＣ、腫瘍細胞上などの結合部位など）を検出するために、検出可能に標識されて使用され得る。結合中および結合後のペプチドの運命は、標識を検出するための適切な方法を使用することによって、インビトロまたはインビボにおいて追跡し得る。標識されたペプチドは、診断および予後のため、例えば、潜在性の転移巣を画像化するために、または、その他のタイプのインサイチュでの評価のために、インビボにおいて利用し得る。
【０１１６】
用語「診断的に標識された」は、ポリペプチドまたはペプチドが、自身に診断的に検出可能な標識を付着させていることを意味する。多くの異なる標識および標識の方法が当業者に公知であり、それらは以下に記載される。本発明において使用され得る標識の一般的なクラスには、放射性同位元素と、常磁性同位元素と、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって画像化され得る化合物、あるいは、蛍光化合物または着色された化合物などが含まれる。好適な検出可能な標識には、放射性の、蛍光の、蛍光発生的な、色素生産性の、またはその他の化学的な標識が含まれる。有用な放射標識（放射性核種）は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーによって単純に検出されるが、それらには、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および１４Ｃが含まれる。１３１Ｉはまた、有用な治療上の同位元素である（以下を参照）。
【０１１７】
参考として本明細書中に援用される多数の米国特許が、より大きな分子に金属を錯体化させるための方法および組成物を開示しており、それには有用なキレート化薬剤の記載が含まれる。この金属は、好ましくは、放射性核種を含む検出可能な金属原子であり、タンパク質およびその他の分子に錯体化される。これらの文献には、米国特許第５，６２７，２８６号（ヘテロ原子を有するリガンドおよびそれらの金属錯体）、米国特許第５，６１８，５１３号（放射能標識されたペプチドを調製する方法）、米国特許第５，５６７，４０８号、米国特許第５，４４３，８１６号（ペプチド−金属イオンの薬学的調製および方法）、米国特許番号５，５６１，２２０（炎症を画像化するためのＴｃ−９９ｍに標識されたペプチド）が含まれる。
【０１１８】
一般的な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレスカミンが含まれる。ダンシル基などのフルオロフォアは、蛍光を発するために、特定の波長の光によって励起されなければならない。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，第６版，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ．，１９９６参照。フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、およびオレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）およびその誘導体などのフルオレセイン様分子、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）およびその誘導体、およびロードルグリーン（Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）は、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、またはジクロロトリアジニル−反応基を用いてアミン基にカップリングされる。同様に、フルオロフォアもまた、マレイミド、ヨードアセトアミド、およびアジリジン−反応基を用いてチオールに連結され得る。波長の長いローダミンは、基本的には窒素における置換基を有するローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）の誘導体であり、公知のもののうち最も光安定性の蛍光標識薬剤である。そのスペクトルは、ｐＨ４からｐＨ１０の間の変更によって影響されず、多数の生物学的適用を行なうための、フルオレセインへの重要な利点である。このグループには、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、およびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（登録商標）の誘導体が含まれる。本発明によるペプチドの誘導体化のための、その他の好ましいフルオロフォアは、紫外線によって励起されるものである。例としてはカスケードブルー、クマリンの誘導体、ナフタレン（塩化ダンシルがメンバーである）、ピレン、およびピリジルオキサゾールの誘導体が含まれる。やはり標識として含まれるのが、最近記載された２つの関連する無機物質である：例えば硫酸カドミウム（Ｂｒｕｃｈｅｚ，Ｍ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１３−２０１６（１９９８））を含む半導体ナノ結晶、および、例えば亜鉛−スルフィドでキャップされたＣｄセレン化物（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２０１６−２０１８（１９９８））などの量子ドット。
【０１１９】
さらに別のアプローチにおいて、ペプチドのアミノ基は、例えばフルオレスカミン、ｏ−フタルジアルデヒドなどのジアルデヒド、ナフタレン−２，３−ジカルボキシレート、およびアントラセン−２，３−ジカルボキシレートなどの蛍光生成物を生み出す試薬と反応することが認められる。７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）の誘導体は、塩化物およびフッ化物の両方が、アミンを改変して蛍光製品を生み出すのに有用である。
【０１２０】
本発明のペプチドはまた、１５２Ｅｕ、またはランタニド系列の他のものなどの蛍光放射金属を使用して、検出のために標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ、後述の実施例Ｘ参照）、または、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用してペプチドに付着させ得る。ＤＴＰＡは、例えば無水物として入手可能であるが、これは本発明のＮＨ２を含むペプチドを容易に改変し得る。
【０１２１】
インビボでの診断または治療のためには、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡなどのキレート化薬剤を使用して、放射性核種が直接的または間接的にペプチドに結合され得る。このような放射性核種の例としては、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、および２０１Ｔｌが含まれる。一般的に、診断での使用における検出可能性に必要な標識されたペプチドの量は、患者の年齢、状態、性別、ならびに疾病の範囲、もしあれば禁忌症、およびその他の変数などの考慮によって異なり、個々の内科医または診断医によって調整されなければならない。投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで変動し得る。
【０１２２】
ペプチドはまた、リン光性化合物または化学発光性化合物に結合することによって検出可能にし得る。次いで、化学発光性のタグがつけられたペプチドの存在は、化学反応の過程中に起こる発光の存在を検出することによって測定される。特に有用な化学発光剤の例は、ルミノール、イソルミノール、ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。同様に、ペプチドを標識するために、生物発光化合物が使用され得る。生物発光は、生物系において見られる化学発光の１つのタイプであり、その中において、触媒タンパク質が、化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって測定される。標識の目的において重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンである。
【０１２３】
さらに別の実施形態において、高吸光係数を有する発色団を有する、または結果としてそれになる色素生産性化合物に基づいて、比色検出が使用される。
【０１２４】
標識されたペプチドのインサイチュでの検出は、被験体から組織標本を取り出し、適切な条件下、顕微鏡によって検査して標識を検出することによって達成され得る。当業者であれば、多様な組織学的方法（染色手順など）のいずれかが、このようなインサイチュでの検出を達成するために変更され得ることを、容易に認識する。
【０１２５】
診断上のインビボでの放射性画像化のためには、入手可能な検出器具のタイプは、放射性核種の選択における主要な要因である。選択される放射性核種は、特定の器具によって検出可能な減衰（ｄｅｃａｙ）のタイプを有していなければならない。一般的に、診断画像を視覚化するための任意の従来型の方法が、本発明に従って利用され得る。インビボでの診断のための放射性核種を選択する上での別の要因は、標的組織による最大取り込みの時期においてもまだ標識が検出可能であるように、その半減期が十分な長さであるが、宿主の有害な照射が最小化されるような短さでもあることである。１つの好ましい実施形態において、インビボの画像化のために使用される放射性核種は、粒子を放射しないが、１４０〜２００ｋｅＶの範囲において多数の光量子を産生し、この光量子が従来型のγカメラによって容易に検出され得る。
【０１２６】
転移が細胞表面Ｔｐｍを発現する場合に、他の方法では観察できない潜在的なそのような転移を検出するために、インビボの画像化が使用され得る。腫瘍を非浸潤的に病期決定するために、あるいは、抗Ｔｐｍ抗体、またはＨＰＲＧもしくはＨＫａＤ５などのＴｐｍについてのリガンドと結合することにより、表面Ｔｐｍの増加したレベルの存在に関連する他の疾患を検出するために、画像化が使用され得る。
【０１２７】
（ペプチド模倣物）
本明細書に記載されるペプチドの化学誘導体の好ましいタイプは、Ｔｐｍ、ＡＡＬＢＰ、またはそれらの生物学的に活性のペプチドの生物学的効果を模倣する、ペプチド模倣性化合物である。ペプチド模倣性薬剤は、Ｔｐｍの結合活性または生物学的活性を有するように、Ｔｐｍの結合要素の立体空間的特性を再生する、非天然のペプチドまたは非ペプチドの薬剤であり得る。生物学的に活性のペプチドと同様、ペプチド模倣物は、結合面（Ｔｐｍが結合する任意のリガンドと相互作用する）および非結合面を有する。この場合も、Ｔｐｍまたはそのペプチドと同様、ペプチド模倣物の非結合面は、ペプチド模倣物の結合面を改変することなしに、多様な治療上および診断上の部分によって改変され得る官能基を包含する。ペプチド模倣物の好ましい実施形態には、分子の非結合面上のアニリンが含まれる。アニリンのＮＨ２基は、約４．５のｐＫａを有し、従って、ペプチド模倣物の結合面上のいずれのＮＨ２官能基を改変することなしに、任意のＮＨ２選択性の試薬によって改変され得る。その他のペプチド模倣物は、その結合面上に任意のＮＨ２官能基を有さなくてもよく、従って、任意のＮＨ２は、ｐＫａ値にかかわらず、結合体化のための部位として非結合面上にディスプレイされ得る。加えて、−ＳＨ、−ＣＯＯＨなどの他の改変可能な官能基は、結合部位として、ペプチド模倣物の非結合面に組み込まれ得る。治療上または診断上の部分はまた、ペプチド模倣物の合成中に直接的に組み込まれ得、好ましくは、分子の非結合面上にディスプレイされる。
【０１２８】
本発明はまた、部分的なペプチド特性を保持する化合物も含む。例えば、本発明のペプチド内の任意のタンパク分解性に非安定性の結合は、分子の残りがそのペプチドの性質を保持する一方で、等配電子（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）などの非ペプチド要素（Ｎ−メチル化、Ｄ−アミノ酸）、または還元型のペプチド結合によって、選択的に置換され得る。
【０１２９】
アゴニスト、基質、あるいはインヒビターのいずれかのペプチド模倣化合物は、オピオイドペプチド、ＶＩＰ、トロンビン、ＨＩＶプロテアーゼなどの多数の生物活性のペプチドについて記載されている。ペプチド模倣化合物を設計および調製する方法は、当技術分野において公知である（Ｈｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）、Ｗｉｌｅｙ，Ｒ．Ａ．ら，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１３：３２７−３８４（１９９３）、Ｍｏｏｒｅら．，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３３：９１−１４１（１９９５）、Ｇｉａｎｎｉｓら，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．２９：１−７８（１９９７）（これらの文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。これらの方法は、少なくともＨＰＲＧペプチドの結合能力および特異性を有し、好ましくは、生物学的活性をも有するペプチド模倣物を作成するために使用される。当業者が入手可能なペプチド化学および一般的な有機化学の知識は、現在の開示を考慮すると、このような化合物を設計および合成するのに十分である。
【０１３０】
例えば、このようなペプチド模倣物は、遊離であるか、あるいは（ａ）ヘパリン、プラスミノゲン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、およびトロンボスポンジン、または（ｂ）ヘムおよび遷移金属イオン（亜鉛、胴、およびニッケル）などの小さなリガンド、などのリガンドと複合体において結合している、本発明のペプチドの、結晶構造解析の３次元構造の検査によって同定し得る。あるいは、リガンドに結合する本発明のペプチドの構造は、核磁気共鳴分光学の技術によって得られ得る。ペプチドとそのリガンドまたはレセプターとの相互作用の立体化学に関するより良い知識が、このようなペプチド模倣薬剤の合理的な設計を可能とする。リガンドが無い状態の本発明のペプチドまたはタンパク質の構造もまた、模倣分子の設計のための骨格を提供し得る。
【０１３１】
（トロポミオシンのエピトープに特異的な抗体）
本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル両方の、Ｔｐｍのエピトープ、好ましくはＡＡＬＢＰフラグメントのエピトープとの反応性を有する抗体を提供する。これらの抗Ｔｐｍ抗体は、ヒト化またはキメラの抗体などの、それらの外因性の、同種異系の、同系の、または改変された形態であり得る。抗Ｔｐｍ抗体のイディオタイプに特異的な抗イディオタイプ抗体もまた含まれる。
【０１３２】
以下の説明において、免疫学の当業者に公知の多様な方法論が言及される。言及されているこのような公知の方法論を記載する刊行物およびその他の資料は、全体が記載されるが如く、その全体が参考として本明細書中に援用される。免疫学の一般原則を記載する標準的な参考資料には、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００、Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，第４版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９、Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（現行版），Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（１９９９）、Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，（１９９０）が含まれる。
【０１３３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびその製造方法ならびに使用は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）、米国特許番号４，３７６，１１０、Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．ら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８０）、Ｈ．Ｚｏｌａら，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に記載される。
【０１３４】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Ｉｄｉｏｔｙｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  第７９巻，１９８４、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  第９０巻，１９８６、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１１９巻，１９８５、Ｂｏｎａ，Ｃ．ら，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｐｐ３３−８１（１９８１）、Ｊｅｒｎｅ，ＮＫ，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５Ｃ：３７３−３８９（１９７４）、Ｊｅｒｎｅ，ＮＫ，Ｉｎ：Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｉｄｅ，Ｗｅｓｔｅｎ−Ｓｃｈｎｕｒｒ，Ｉ．，ｅｄ．，Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，１９８２，Ｕｒｂａｉｎ，Ｊら．，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３Ｄ：１７９−（１９８２）、Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：５６９−６０７（１９８３）に記載される。
【０１３５】
用語「抗体」は、インタクトな分子のみならず、抗原結合部位を含み、Ｔｐｍエピトープへの結合が可能なそれらのフラグメントをも含むことも意味する。これらにはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれ、これらは、インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠き、循環からより迅速に消失し、非特異的な組織結合をインタクトな抗体よりも少なく有し得る（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。Ｆｖフラグメントもまた含まれる（Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０−１１３５、Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．ら，（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１−１５９４）。これらの多様なフラグメントは、プロテアーゼ切断または化学的切断などの従来型の技術を使用して産生される（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：６６３−６９（１９８６）参照）。
【０１３６】
ポリクローナル抗体は、ウサギ、ヤギ、齧歯動物などの免疫された動物から血清として得られ、さらなる処置を施さずに直接的に使用され得るか、あるいは、硫安沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどの、従来型の濃縮または精製方法に供され得る（前述のＺｏｌａら参照）。
【０１３７】
本発明の抗Ｔｐｍ抗体の産生に使用される免疫原は、完全Ｔｐｍタンパク質、あるいはそれらのフラグメントまたは誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ＴｐｍのＡＡＬＢＰ中心的ドメインの全部または一部を含む。このドメインを含む免疫原は、当技術分野において公知の多様な方法により産生される。例えば、従来型の組換え方法を用いたクローン化遺伝子の発現、起源の細胞からの、Ｔｐｍを高水準に発現する細胞集団の単離などである。
【０１３８】
ｍＡｂは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（前出）によって導入される手順、およびその改変などの、従来型のハイブリドーマ技術を使用して産生し得る（前述の文献参照）。動物、好ましくはマウスが、前述の免疫原での免疫化によって感作され、この感作された動物において所望の抗体反応が引き出される。
【０１３９】
準備された動物のリンパ節、脾臓、または末梢血から得られたＢリンパ球は、通常、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合促進薬剤の存在下、骨髄腫細胞に融合される。このような使用には、多数のマウスの骨髄腫細胞株のうち任意のものが利用可能である：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、またはＨＬ１−６５３の各骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤより入手可能）。続く工程には、融合されていない親骨髄腫細胞およびドナーのリンパ球が最終的に死ぬ一方で、ハイブリドーマ細胞だけが生き残るように、選択培地において成長させることが含まれる。これらはクローン化され、成長させられ、例えば、Ｔｐｍタンパク質を使用した免疫測定法の技術によって、上清がスクリーンされて所望の特異性を有する抗体の存在が測定される。陽性のクローンは、例えば限界希釈法によってサブクローン化され、ｍＡｂは単離される。
【０１４０】
これらの方法に従って産生されたハイブリドーマは、当技術分野において公知の技術を使用して、インビトロまたはインビボにおいて（腹水の中で）増殖され得る（一般的には、Ｆｉｎｋら，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，９：１２１−３３（１９８４）参照）。一般的に、個々の細胞株は培養で増殖され、高濃度の単一ｍＡｂを含有する培養培地、デカンテーション、濾過、または遠心単離法によって収集し得る。
【０１４１】
この抗体は、通常の多量体の構造のかわりに、単鎖の抗体またはｓｃＦｖとして産生し得る。単鎖の抗体は、目的のＩｇからの超可変領域を含み、ネイティブＩｇの抗原結合部位を再生する一方で、インタクトなＩｇのサイズの一部分である（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４１、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ら，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７−５１５、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９、Ｂｉｒｄら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎら，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９、Ｊｏｓｔ  ＣＲら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  ２６９：２６２６７−２６２７３、米国特許番号４，７０４，６９２、米国特許番号４，８５３，８７１、米国特許番号４９４，６７７８、米国特許番号５，２６０，２０３、米国特許番号５，４５５，０３０）。Ｈ鎖およびＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、少なくとも約４つのアミノ酸（代表的には低分子の中性アミノ酸）をコードするリンカーに結合される。この融合によりコードされるタンパク質は、最初の抗体の特異性および親和性を保持する機能的可変領域の構築を可能にする。
【０１４２】
インビボでの使用のために、特にヒトへの注射のためには、当技術分野において公知の方法を用いて抗体をヒト化することによって、ｍＡｂの免疫原性を減少させることが望ましい。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する動物の生成物であり得る（例えばＷＯ９０／１００７７およびＷＯ９０／０４０３６参照）。あるいは、目的の抗体が、遺伝子的に操作されて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換し得る（ＷＯ９２／０２１９０参照）。
【０１４３】
抗体は、特定の所望の特性のために選択し得る。治療に使用される抗体の場合、抗体のスクリーニングの手順には、血管形成、細胞浸潤などを測定する任意のインビトロまたはインビボのバイオアッセイが含まれる。更に抗体は、血管形成（または結果として生じる腫瘍の成長または転移）を促進するか、または阻害するかをみるために、本明細書に記載される多様な腫瘍モデルにおいてスクリーンし得る。このようにして、Ｔｐｍ模倣物またはアンタゴニストである抗体が選択され得る。従って、本発明には、ＴｐｍまたはそのＡＡＬＢＰ「ドメイン」において、抗血管形成リガンドに結合すること、さもなければ抗血管形成リガンドの作用を阻害することによって血管形成を促進する治療上の抗体（詳細は以下に記載）が含まれる。
【０１４４】
（細胞表面または遊離型のＴｐｍまたはＡＡＬＢＰフラグメントを検出するための抗体の使用）
Ｔｐｍのエピトープに特有的な抗体は、細胞表面上、または体液内、あるいはサンプル内、好ましくは血清または血漿における、これらのエピトープを含有する分子を検出するための免疫測定法において有用である。このような抗体は、Ｔｐｍ、またはＴｐｍのエピトープ保有フラグメントを検出する。従って、腫瘍環境におけるタンパク分解が、血漿または組織内におけるＴｐｍまたはＡＡＬＢＰの放出をもたらす。
【０１４５】
腫瘍細胞、または活性化されたＥＣからのＴｐｍの放出水準を測定することにより、本発明の抗体および免疫測定法が診断的に使用されて、疾患の進行をモニターし、その場合においてＴｐｍ水準は、存在する腫瘍組織の量を反映し得る。
【０１４６】
当技術分野において公知の、任意の従来型の免疫測定法がこの目的のために採用され得るが、ＥＬＩＳＡなどの酵素免疫測定法が好ましい。免疫測定の方法は、以下にも記載されている：Ｃｏｌｉｇａｎ，ＪＥら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１（または現行版）、Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．（編）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４、Ｂｉｚｏｌｌｏｎ，Ｃｈ．Ａ．，ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ＥＬＩＳＡ（第２９章），Ｉｎ：ｖａｎ  Ｏｓｓ，ＣＪら，（ｅｄｓ），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６、Ｗｏｒｋ，ＴＳら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，（１９７８）（Ｃｈａｒｄ，Ｔ．による章「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｎｏ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」）。
【０１４７】
（組成物のインビトロにおける試験）
（Ａ．９６ウェルプレートにおける固定化されたＴｐｍへの結合）
固定化されたＴｐｍへの結合は、公知のリガンド、ビオチン−ＨＫａを用いた競合アッセイによって、または、相当するビオチン化タンパク質の直接結合によって実行される。プレートは、室温で、トリス緩衝液生理食塩水（ＴＢＳ）（２００ｎｇ／ウェル）において、ニワトリの砂嚢のＴｐｍ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いてコーティングされる。２時間のインキュベーション後、ウェルはＴＢＳで洗浄され、次に各ウェルに対して１％ＢＳＡ／ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０が加えられ、３７℃で２時間インキュベートされる。製造業者の指示に従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ（Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて予めビオチン化されているＨＫａ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）が、ＺｎＣｌ２（１０μＭ）および適切な濃度のタンパク質、ドメイン、またはペプチドの競合物と共に、１０ｎＭの濃度でプレートに加えられる。プレートは室温でインキュベートされ、次にＴＢＳ／ツィーン２０を用いて洗浄される。アビジン−ＨＲＰが加えられ、室温で２０分間インキュベートされ、ＴＢＳ／ツィーン２０で洗浄され、色素生産性の基質が加えられる。反応が硫酸を用いて停止され、プレートが４９０ｎｍにおいて読みとられる。
【０１４８】
（Ｂ．ＥＣの移動のアッセイ）
ＥＣの移動のために、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）が、トランスウェル当たり２００μＬのコラーゲン溶液を加えることにより、タイプＩコラーゲン（５０μｇ／ｍＬ）を用いてコーティングされ、次に３７℃で一晩インキュベートされる。トランスウェルは、２４−ウェルプレート内で構築され、化学誘引物質（例えばＦＧＦ−２）が、全容積が０．８ｍＬの培地中で底部チャンバに加えられる。トリプシンを用いて単層培養物から剥離されている、ＨＵＶＥＣなどのＥＣが、血清を含まない培地を用いて、約１０６細胞／ｍＬの最終濃度に希釈され、０．２ｍＬのこの細胞懸濁液が、各トランスウェルの上部チャンバに加えられる。試験にかけるべきインヒビターが、上部チャンバおよび下部チャンバの両方に加えられ、３７℃で加湿された環境下で５時間、移動が進行するようにされる。トランスウェルは、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標）を用いて染色されたプレートから除去される。移動しなかった細胞が、綿棒でこすり取ることによって上部チャンバから除去され、膜が剥離され、スライドに乗せられ、移動した細胞の数を測定するために、倍率の高い視野（４００倍）において数が数えられる。
【０１４９】
（Ｃ．抗浸潤性活性の生物学的アッセイ）
本発明の組成物は、抗浸潤性能力が試験される。ＥＣまたは腫瘍細胞（例えばＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞）などの細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイ系として公知のアッセイにおいて、再構成された基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））を通過して浸潤する能力については、その詳細が、Ｋｌｅｉｎｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：３１２−３１８，１９８６およびＰａｒｉｓｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５２：３７８−３８３，１９９２に記載されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、ｂＦＧＦに結合して局在化させる、ペルルカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）などのへパラン硫酸プロテオグリカン、ビトロネクチンと同様に、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、およびプラスミノゲン活性化因子インヒビタータイプＩ（ＰＡＩ−１）として公知のセルピンを含有する、再構成された基底膜である（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５５：１５７８−１５８５，１９９５）。細胞外のレセプターまたは酵素を標的とする化合物のためのこのアッセイで得られた結果は、インビボでのこれら化合物の有効性を予測するものであることが、当技術分野において認められている（Ｒａｂｂａｎｉら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６３：８４０−８４５，１９９５）。
【０１５０】
このようなアッセイは、トランスウェル組織培養の挿入断片を採用する。浸潤性の細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびポリカーボネート膜の上部面（ａｓｐｅｃｔ）を越えて、膜の底部に付着できる細胞として定義される。ポリカーボネート膜（孔径８．０μｍ）を含有するトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ製）は、滅菌したＰＢＳにおいて７５μｇ／ｍＬの最終濃度（挿入断片につき６０μＬの希釈されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））に希釈されているＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）でコーティングされ、２４−ウェルプレートのウェル内に配置される。膜は、生物学的に安全なキャビネットにおいて一晩乾燥され、次に、抗生物質を含有する１００μＬのＤＭＥＭを加えることによって、シェーカーテーブル上で１時間、再水和される。ＤＭＥＭは、吸引によって各挿入断片から除去され、０．８ｍＬのＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／抗生物質が、トランスウェルの外側（「下部チャンバ」）を囲むように、２４−ウェルプレートの各ウェルに加えられる。新鮮なＤＭＥＭ／抗生物質（１００μＬ）、ヒトＧｌｕプラスミノゲン（５μｇ／ｍＬ）、および試験されるべき任意のインヒビターが、トランスウェルの上端の内側（「上部チャンバ」）に加えられる。試験されるべき細胞がトリプシン処理され、ＤＭＥＭ／抗生物質内で再懸濁され、次に８００，０００細胞／ｍＬの最終濃度で、トランスウェルの上端チャンバに加えられる。上部チャンバの最終容積は、２００μＬになるように調節される。次に構築されたプレートは、湿性の５％ＣＯ２環境下で７２時間、インキュベートされる。インキュベート後、細胞は固定され、ＤｉｆｆＱｕｉｋ（登録商標）（ギムザ染色）を使用して染色され、次に上部チャンバが綿棒でこすり取られてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および膜を通って浸潤しなかった細胞すべてが除去される。膜は、Ｘ−アクト（ａｃｔｏ）（登録商標）ブレードを使用してトランスウェルから剥離され、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（登録商標）を使用してスライド上に乗せられ、カバーガラスが乗せられ、次に、倍率の高い視野（４００倍）において数が数えられる。浸潤された細胞数の平均が、５〜１０視野で測定され、数が数えられ、インヒビター濃度の関数としてプロットされる。
【０１５１】
（Ｄ．抗血管形成活性のチューブ形成アッセイ）
本発明の化合物は、その抗血管形成活性が、インビトロにおける２つの異なるアッセイ系の１つにおいて試験される。
【０１５２】
調製し得る、または市販のものが得られるＥＣ、例えば、ＨＵＶＥＣまたはヒトの微小血管のＥＣ（ＨＭＶＥＣ）が、フィブリノーゲン（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において５ｍｇ／ｍＬ）と、１：１（ｖ／ｖ）の割合で濃度２×１０５細胞／ｍＬで混合される。トロンビンが加えられ（５ユニット／ｍＬの最終濃度）、混合物はすぐに２４−ウェルプレートに移される（ウェル当たり０．５ｍＬ）。フィブリンゲルが形成されるようにされ、次にＶＥＧＦおよびｂＦＧＦが（各々５ｎｇ／ｍＬの最終濃度で）、試験化合物と共にウェルに加えられる。細胞は３７℃で５％ＣＯ２において４日間インキュベートされ、その間、各ウェル内の細胞の数が数えられ、丸い、分岐がなく長い、１つの分岐を有して長い、または２つ以上の分岐を有して長い、のいずれかに分類される。結果は、各濃度の化合物について５つの異なるウェルの平均として表される。代表的には、血管形成インヒビターの存在下、細胞は丸いままであるか、または未分化型のチューブを形成する（例えば０または１つの分岐）。
【０１５３】
このアッセイは、インビボにおける血管形成（または抗血管形成）の効力を予測するものであることが、当技術分野において認められている（Ｍｉｎ，ＨＹら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２４２８−２４３３，１９９６）。
【０１５４】
別のアッセイにおいては、ＥＣがＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養される場合に、ＥＣチューブ形成が観察される（Ｓｃｈｎａｐｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６５：１０７−１１８  １９９５）。ＥＣ（１×１０４細胞／ウェル）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）がコーティングされた２４−ウェルプレートに移され、４８時間後にチューブ形成が定量化される。インヒビターが、それを加えることにより、ＥＣと同じ時間、またはその後の多様な時点において試験される。チューブ形成もまた、（ａ）ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦなどの血管形成増殖因子、（ｂ）分化刺激剤（例えばＰＭＡ）、または（ｃ）それらの組み合わせを加えることによって刺激され得る。
【０１５５】
このアッセイは、ＥＣに特定のタイプの基底膜を与えることにより血管形成をモデリングする。すなわち、ＥＣを移動させ、分化させるマトリックスの層が、最初に遭遇することが予期され得る。結合した増殖因子に加え、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（およびインサイチュで基底膜）内で見られたマトリックス構成成分またはそれらのタンパク質分解生成物もまた、ＥＣチューブ形成に対して刺激性を有し、そのことがこのモデルを、前述のフィブリンゲル血管形成モデルを補完するものにする（Ｂｌｏｏｄら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０３２：８９−１１８，１９９０、Ｏｄｅｄｒａら，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．４９：１１１−１２４，１９９１）。本発明の化合物は、両方のアッセイにおいてＥＣチューブ形成を阻害し、このことは、この化合物が抗血管形成活性も有することを示唆している。
【０１５６】
（Ｅ．増殖の阻害のアッセイ）
本発明の化合物がＥＣの増殖を阻害する能力は、９６ウェルフォーマットで測定され得る。タイプＩコラーゲン（ゼラチン）が、プレートのウェルをコーティングするのに使用される（ＰＢＳにおいて０．１−１ｍｇ／ｍＬ、ウェル当たり０．１ｍＬを３０分間室温で）。プレートを洗浄後（３ｘ  ｗ／ＰＢＳ）、ウェル当たり３〜６，０００個の細胞がプレートされ、０．１〜２％のＦＢＳを含有する内皮細胞成長培地（ＥＧＭ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ製）またはＭ１９９培地において、４時間付着させておく（３７０Ｃ／５％ＣＯ２）。培地および付着していない細胞は４時間後に除去され、ｂＦＧＦ（１〜１０ｎｇ／ｍＬ）またはＶＥＧＦ（１〜１０ｎｇ／ｍＬ）を含有する新鮮な培地が各ウェルに加えられる。試験されるべき化合物が最後に加えられ、プレートは２４〜４８時間インキュベートさせておく（３７０Ｃ／５％ＣＯ２）。ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）が各ウェルに加えられ、１〜４時間インキュベートさせておく。細胞数に比例する、４９０ｎｍでの吸光度が測定されて、コントロールウェルと試験化合物を含有するウェルとの間の増殖における相違が決定される。
【０１５７】
類似のアッセイ系が、培養された接着性の腫瘍細胞を用いてセットアップされ得る。しかし、このフォーマットにおいてコラーゲンは除外され得る。腫瘍細胞（例えば３，０００〜１０，０００／ウェル）がプレートされ、一晩付着させておく。次に血清を含まない培地がウェルに加えられ、細胞が２４時間同期化される。次に１０％ＦＢＳを含有する培地が各ウェルに加えられ、増殖が刺激される。試験されるべき化合物がウェルのいくつかにおいて含まれる。２４時間後、ＭＴＳがプレートに加えられ、前述のようにアッセイが展開され、読みとられる。
【０１５８】
（Ｆ．細胞毒性のアッセイ）
組成物の抗増殖性および細胞毒性の効果が、腫瘍細胞、ＥＣ、線維芽細胞およびマクロファージを含む多様な細胞タイプにおいて測定され得る。これは、放射線治療剤または毒素などの治療上の部分に結合体化されている本発明の化合物を試験する際に特に有用である。例えば、組成物の１つと、１３１Ｉでヨウ素化されているボルトン−ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬との結合体は、表面ＴｐｍまたはＡＡＬＢＰを発現する細胞の増殖を阻害すると予測される（大概はアポトーシスを誘導することによって）。腫瘍細胞および刺激されたＥＣに対する抗増殖性の効果が予測されるが、環境によっては、静止状態のＥＣまたは正常なヒトの真皮性線維芽細胞については予測されない。その正常な細胞で観察された抗増殖性または細胞毒性の効果はいかなるものも、非特異的な結合体の毒性を示す。
【０１５９】
代表的なアッセイは、９６−ウェルプレート内でウェル当たり５〜１０，０００個の細胞密度で細胞をプレートすることを含む。試験されるべき化合物が、結合アッセイにおいて測定されたＩＣ５０の１０倍の濃度で加えられ（これは結合体により異なる）、細胞と共に３０分間インキュベートさせておく。細胞は培地を用いて３回洗浄され、次に、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ｍＬ）を含有する新鮮な培地が細胞に加えられ、３７℃で５％ＣＯ２内において２４時間および４８時間インキュベートさせておく。細胞は、１Ｍ  ＮａＯＨを使用して多様な時点で溶解され、ウェル当たりの数がβ−カウンターを使用して測定される。増殖は、ＭＴＳ試薬またはＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）を使用して放射性を使わずに測定され得、細胞の総数が測定される。細胞毒性のアッセイには（細胞の溶解を測定）、Ｐｒｏｍｅｇａ９６−ウェル細胞毒性キットが使用される。抗増殖性活性の証拠がある場合、アポトーシスの誘導が、ＴｕｍｏｒＴＡＣＳ（Ｇｅｎｚｙｍｅ製）を使用して測定され得る。
【０１６０】
（Ｇ．カスパーゼ−３活性）
本発明の化合物がＥＣのアポトーシスを促進する能力は、カスパーゼ−３の活性化を測定することにより決定され得る。タイプＩコラーゲン（ゼラチン）が、Ｐ１００プレートをコーティングするのに使用され、５×１０５のＥＣが、１０％ＦＢＳを含有するＥＧＭ内に播種される。２４時間後（３７℃で５％ＣＯ２において）、培地は２％ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および所望の試験化合物を含有するＥＧＭに交換される。細胞が６時間後に収集され、細胞の溶解物が１％Ｔｒｉｔｏｎ内で調製され、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）カスパーゼ−３アッセイキット＃１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製）を使用して、製造業者の指示に従ってアッセイされる。
【０１６１】
（Ｔｐｍ結合抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドのインビボでの研究）
（Ａ．角膜の血管形成モデル）
使用されるプロトコルは、Ｖｏｌｐｅｒｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：６７１−６７９（１９９６））によって記載されているものと本質的に同一である。手短に言えば、メスのフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ラット（１２０〜１４０ｇｍ）が麻酔され、Ｈｙｄｒｏｎ（登録商標）、ｂＦＧＦ（１５０ｎＭ）、および試験されるべき化合物を含むペレット（５μｌ）が、角膜内の、角膜輪部から１．０〜１．５ｍｍ地点に小さく切開された部分に移植される。移植後５日目および７日目において、新血管形成が評価される。７日目において、動物が麻酔され、コロイド状の炭素などの染料が注入されて、血管が染色される。次に動物を安楽死させ、角膜がホルマリンで固定され、この角膜が平らにして撮影され、新血管形成の程度が評価される。新血管は、血管の総面積または長さを画像化すること、または単純に血管の数を数えることによって定量化され得る。
【０１６２】
（Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイ）
このアッセイは、本質的に、Ｐａｓｓａｎｉｔｉら（Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−５２８（１９９２））によって記載されたように実行される。氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（例えば５００μＬ）（マサチューセッツ州ベッドフォードのＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．製）が、ヘパリン（例えば５０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（例えば４００ｎｇ／ｍｌ）、および試験されるべき化合物と混合される。いくつかのアッセイにおいては、ｂＦＧＦは、血管形成刺激物として腫瘍細胞と置換され得る。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の混合物が、４〜８週齢の無胸腺ヌードマウスの、腹腔の正中線付近の皮下に、好ましくはマウス当たり３回、注射される。注射されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、触知できる固体ゲルを形成する。注射する部位は、各動物が、陽性のコントロールプラグ（ＦＧＦ−２＋ヘパリンなど）、陰性のコントロールプラグ（例えば緩衝液＋ヘパリン）、および血管形成に対する効果が試験されている化合物を含むプラグ（例えばＦＧＦ−２＋ヘパリン＋化合物）を受け取るように選択される。すべての処置は、好ましくは三連で行われる。動物は、注射後約７日目、または血管形成を観察するのに最適であり得る別の時点で、頚部を脱臼させて屠殺する。マウスの皮膚が、腹腔の正中線に沿って剥離され、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のプラグが回収されて、直ちに高解像度でスキャンされる。次にプラグが水に分散され、３７℃で一晩インキュベートされる。ヘモグロビン（Ｈｂ）の水準が、製造業者の指示に従って、Ｄｒａｂｋｉｎの水溶液（例えばＳｉｇｍａより得られる）を使用して測定される。プラグにおけるＨｂの量は、サンプル中の血液の量を反映するので、血管形成の間接的な尺度である。加えて、または代わりに、動物は屠殺される前に、フルオロフォアが結合体化されている高分子量のデキストランを含有する０．１ｍｌの緩衝液（好ましくはＰＢＳ）を注射され得る。蛍光定量的に測定される分散されたプラグ内の蛍光量もまた、プラグにおける血管形成の尺度として役立つ。ｍＡｂ抗ＣＤ３１での染色（ＣＤ３１は「血小板−ＥＣ付着分子またはＰＥＣＡＭ」である）もまた、プラグにおける新血管形成および微小血管の密度を確認するために使用され得る。      
【０１６３】
（Ｃ．ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）における血管形成のアッセイ）
このアッセイは本質的に、Ｎｇｕｙｅｎら（Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓ．４７：３１−４０（１９９４））によって記載されたように実行される。血管形成因子（ｂＦＧＦ）または腫瘍細胞プラスインヒビターのいずれかを含有するメッシュが、８日齢のニワトリの胚のＣＡＭ上に配置され、サンプルの移植から３〜９日後にＣＡＭが観察される。血管形成が、血管を含有するメッシュにおける平方のパーセンテージを測定することにより、定量化される。
【０１６４】
（Ｄ．腫瘍細胞を用いたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイを使用した、血管形成阻害および抗腫瘍効果のインビボにおける評価）
このアッセイにおいては、腫瘍細胞、例えば、１〜５×１０６個の３ＬＬ  Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞、またはラットの前立腺細胞株ＭａｔＬｙＬｕが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と混合され、次に前述のセクションＢ．に記載されているプロトコルに従ってマウスの脇腹に注射される。腫瘍細胞の塊および強力な血管形成反応が、約５〜７日後のプラグにおいて観察され得る。実際の腫瘍環境における化合物の抗腫瘍および抗血管形成作用が、それをプラグに入れることによって評価され得る。次に腫瘍の重量、Ｈｂ水準または蛍光水準（屠殺前に注射されるデキストラン−フルオロフォア結合体の）の測定が行なわれる。Ｈｂまたは蛍光を測定するために、プラグは最初に組織のホモジナイザーを用いて均質化される。
【０１６５】
（Ｅ．皮下の（ｓ．ｃ．）腫瘍成長の異種移植モデル）
ヌードマウスが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒトの乳癌）およびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（０．２ｍＬにおいて１×１０６個の細胞）を、右の脇腹の皮下に接種される。腫瘍が２００ｍｍ３までステージされ（ｓｔａｇｅｄ）、次に試験組成物を用いた処置が開始される（１００μｇ／動物／日が毎日ＩＰで与えられる）。腫瘍の容積が１日おきに得られ、動物は処置の２週間後に屠殺される。腫瘍が切除され、重さが計られ、パラフィン包埋される。腫瘍の組織学的切片が、ＨおよびＥ、抗ＣＤ３１、Ｋｉ−６７、ＴＵＮＥＬ、およびＣＤ６８の染色によって分析される。
【０１６６】
（Ｆ．転移の異種移植モデル）
本発明の化合物もまた、実験的な転移モデルを使用して、遅発型の転移の阻害が試験される（Ｃｒｏｗｌｅｙ，ＣＷら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ５０２１−５０２５（１９９３））。遅発型の転移は、腫瘍細胞の付着および血管外遊走、局在的な浸潤、植種、増殖、および血管形成の工程を含む。レポーター遺伝子（好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が、しかし代わりとして酵素クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺをコードする遺伝子）でトランスフェクトされたヒトの前立腺癌細胞（ＰＣ−３）は、ヌードマウスに接種される。このアプローチは、これらの細胞の運命を追うために、これらのマーカー（ＧＦＰの蛍光検出、または酵素的活性の組織化学的比色検出）のいずれかの利用を可能とする。細胞が、好ましくはｉｖ注射され、転移が特に肺において、しかし局在性の異なるリンパ節、大腿および脳においても、約１４日後に同定される。これが、ヒトの前立腺癌において自然に起こる転移の器官の向性を模倣する。例えば、ＧＦＰ発現ＰＣ−３細胞（マウス当たり１×１０６細胞）が、ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの尾静脈にｉｖ注射される。動物は、毎日ＩＰで与えられる１００μｇ／動物／日において、試験組成物で処置される。単一の転移細胞および病巣が可視化されて、蛍光顕微鏡検査法あるいは光学顕微鏡使用組織化学によって、または組織をすりつぶして検出可能な標識を定量的な比色アッセイにかけることにより、定量化される。
【０１６７】
（Ｇ．細胞表面トロポミオシンに作用する抗血管形成薬剤による、インビボでの自発的転移の阻害）
ラット同系乳癌系（Ｘｉｎｇら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：４２３−４２９（１９９６））は、Ｍａｔ  ＢＩＩＩラット乳癌細胞を採用する。腫瘍細胞、例えば０．１ｍＬのＰＢＳに懸濁された約１０６個の細胞が、メスのフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ラットの乳房の脂肪部分（ｆａｔ  ｐａｄ）に接種される。接種時、Ａｌｚａの浸透圧性のミニポンプが１４日、腹腔内に埋め込まれて試験化合物を分配する。この化合物がＰＢＳ内に溶解され（例えば２００ｍＭストック）、無菌で濾過され、ミニポンプ内に配置されて、約４ｍｇ／ｋｇ／日の放出率を得る。コントロール動物はミニポンプ内で、ビヒクル（ＰＢＳ）のみを、またはビヒクルコントロールペプチドを受け取る。動物は、約１４日目に屠殺される。
【０１６８】
（治療上の結果）
本発明の活性化合物で処置されたラットにおいて、原発性腫瘍のサイズにおいて、ならびいに脾臓、肺、肝臓、腎臓、およびリンパ節（個々の病巣として列挙）における転移の数において、大幅な減少が観察される。組織学的および免疫組織化学的分析は、処置された動物の腫瘍における壊死の増加およびアポトーシスの徴候を明らかにする。大きな壊死の領域が、新血管形成に欠く腫瘍部分において見られる。１３１Ｉが結合体化される（ペプチドの分子当たり１個または２個のＩ原子）、ヒトまたはウサギＨＰＲＧ、ＨＫａ、Ｄ５ドメインのいずれか、およびそれらの誘導体（１３１Ｉが結合体化されている（ペプチド一分子あたり１または２個のＩ原子））は、効果的な放射線治療剤であり、結合体化されないポリペプチドの少なくとも２倍の効能を有することが見出されている。対照的に、コントロールペプチドを用いた処置は、腫瘍のサイズまたは転移について大幅な変化を起こすことができない。
【０１６９】
（Ｈ．３ＬＬ  Ｌｅｗｉｓ肺癌：原発性腫瘍の成長）
この腫瘍株は、１９５１年にＣ５７ＢＬ／６マウスにおける肺癌として自発的に発生した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：３９，１９５５。Ｍａｌａｖｅ，Ｉら，Ｊ．Ｎａｔ‘ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６２：８３−８８（１９７９）も参照）。それは、皮下（ｓｃ）への接種により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける継代によって伝播され、半同種異系Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２Ｆ１マウスにおいて、または同種異系Ｃ３Ｈマウスにおいて試験される。代表的には、皮下（ｓｃ）への移植に１群当たり６匹の動物が、または筋肉内（ｉｍ）への移植に１群当たり１０匹の動物が使用される。腫瘍は、２〜４ｍｍのフラグメントとしてｓｃに、または、約０．５〜２×１０６個の細胞の懸濁された接種物質としてｉｍまたはｓｃに、移植され得る。処置は、移植の２４時間後に開始するか、または、特定のサイズの腫瘍（通常約４００ｍｇ）が触診され得るまで遅らせる。試験化合物が、１１日間毎日ｉｐに投与される。
【０１７０】
動物は、重さの測定、触診、および腫瘍のサイズの測定によって追跡される。ｉｍ接種後１２日目の処置されないコントロールレシピエントにおける、代表的な腫瘍の重さは、５００〜２５００ｍｇである。代表的なメディアン生存時間は１８〜２８日である。陽性のコントロール化合物、例えばシクロホスファミドが、１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ／注射で、１〜１１日目に使用される。算出された結果は、平均的な動物の重量、腫瘍のサイズ、腫瘍の重さ、生存時間を含む。確認された治療上の活性のために、試験化合物は、２回の複数用量のアッセイにおいて試験されるべきである。
【０１７１】
（Ｉ．３ＬＬ  Ｌｅｗｉｓ肺癌：原発性成長および転移のモデル）
このモデルは、多数の研究者によって利用されてきた。例えば、Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｅら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６５：１２５７−１２６４（１９８０）、Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｅ．ら，Ｒｅｃ．Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．７５：２０−２８（１９８０）、Ｉｓａｋｏｖ，Ｎら，Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｍｅｔａｓ．２：１２−３２（１９８２）、Ｔａｌｍａｄｇｅ  ＪＥら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．６９：９７５−９８０（１９８２）、Ｈｉｌｇａｒｄ，Ｐ．ら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５：７８−８６（１９７７）参照。試験マウスは、オスのＣ５７ＢＬ／６マウスであり、２〜３か月齢である。ｓｃ、ｉｍ、または足蹠内への移植後、この腫瘍は、好ましくは肺に転移を生成する。いくつかの腫瘍株を用いると、原発性腫瘍が抗転移効果を発揮し、転移相の研究の前に最初に切除されなければならない（米国特許第５，６３９，７２５号も参照）。
【０１７２】
単一細胞の懸濁液が、みじん切りにされた腫瘍の組織を０．３％トリプシンの溶液で処置することにより、固形腫瘍から調製される。細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄され、ＰＢＳに懸濁される。このようにして調製された３ＬＬ細胞の生存可能性は、一般的に約９５〜９９％である（トリパンブルーの生死判定法により）。０．０５ｍｌのＰＢＳ懸濁された、生存可能な腫瘍細胞（３×１０４−５×１０６）が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部領域内、または１つの後脚の足蹠内のいずれかに、皮下注射される。目に見える腫瘍が、１０６個の細胞を背部の皮下に注射した３〜４日後に現れる。腫瘍が現れた日、および定着した腫瘍の直径が、２日ごとにキャリパーによって測定される。
【０１７３】
処置は、１週間当たり１回または２回の用量のペプチドまたは誘導体として与えられる。別の実施形態においては、ペプチドは浸透圧性のミニポンプによって送られる。
【０１７４】
背部の腫瘍の切除を含む実験において、腫瘍のサイズが約１５００ｍｍ３に到達すると、マウスは無作為に２つの群に分けられる：（１）原発性腫瘍が完全に切除されている；または（２）偽手術が実行され、腫瘍はインタクトのままである。５００〜３０００ｍｍ３の腫瘍が転移の成長を阻害するとはいえ、１５００ｍｍ３が、高い生存率で、局在性の的な再成長がなく安全に切除される、最大の原発性腫瘍のサイズである。２１日後、すべてのマウスが屠殺され、剖検にかけられる。
【０１７５】
肺が除去され、重さが測られる。肺は、ブワン溶液中で固定され、目に見える転移の数が記録される。転移の直径も、８倍の倍率で、マイクロメーター含有接眼レンズを備えた両眼の立体顕微鏡によって測定される。記録された直径に基づき、各転移の容積の算出が可能である。肺当たりの転移の総容積を測定するために、目に見える転移の平均数に、転移の平均容積を掛ける。更に転移の成長を測定するために、１２５ＩｄＵｒｄの肺細胞への取り込みが測定可能である（Ｔｈａｋｕｒ，Ｍ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８９：２１７−２２８（１９７７））。腫瘍の切断から１０日後、２５μｇのフルオロデオキシウリジンが、癌を持った腹膜内に接種される（および、もし使用されれば、腫瘍が切除されたマウス）。３０分後、マウスは１μＣｉの１２５ＩｄＵｒｄ（ヨードデオキシウリジン）が与えられる。１日後、肺および脾臓が除去され、重さが計られ、１２５ＩｄＵｒｄの取り込み水準が、ガンマカウンターを使用して測定される。
【０１７６】
足蹠の腫瘍を持つマウスにおいて、腫瘍の直径が約８〜１０ｍｍに達すると、マウスは無作為に２つの群に分けられる：（１）腫瘍を持つ脚が、膝関節の上の結紮の後、切断される；または（２）マウスは、切断されない腫瘍を持ったコントロールとして、インタクトのままとする（腫瘍を持ったマウスにおける腫瘍のない脚の切除は、それに続く転移への効果については知られておらず、麻酔、ストレス、手術において可能性を有する効果を除外する）。マウスは接種後１０〜１４日後に屠殺される。転移が前述のように評価される。
統計：腫瘍を持ったマウスの肺における転移の発生率およびその成長を示す値は、正常には分布されない。従って、マンホイットニーＵ検定などの非パラメータの統計が、分析に使用され得る。
【０１７７】
Ｇｏｒｅｌｉｋら（１９８０、前出）によるこのモデルの研究は、腫瘍細胞接種物質のサイズが、転移の成長の範囲を決定することを示した。手術されたマウスの肺における転移率は、原発性腫瘍を有するマウスのものと異なっていた。従って、原発性腫瘍がより大きな用量の３ＬＬ細胞（１〜５×１０６個）の接種により誘導され、その後外科的に除去されていたマウスの肺において、転移の数は、手術されなかった腫瘍を有するマウスよりも少なかったが、転移の容積は、手術されなかったコントロールよりも大きかった。肺の転移の尺度として１２５ＩｄＵｒｄの取り込みを使用して、腫瘍が切除されたマウスの肺と、はじめに１０６個の３ＬＬ細胞が注射された腫瘍を有するマウスの肺との間では、顕著な違いは見られなかった。１０５個の腫瘍細胞の接種後に生成された腫瘍の切除は、転移の成長を劇的に加速させた。これらの結果は、局在性の腫瘍を切除した後のマウスの生存と一致する。局在性の腫瘍の切除後に転移の成長が加速される現象は、繰り返し観察されてきた（例えば、米国特許番号５，６３９，７２５参照）。これらの観察は、癌の外科手術を受ける患者の予後について意味を持つ。
【０１７８】
本発明に従うと有用な化合物としては、前述（インビトロまたはインビボ）のアッセイシステムのうち少なくとも１つにおいて活性を示すはずである。
【０１７９】
（薬学上および治療上の組成物およびそれらの投与）
本発明の薬学的組成物において採用され得る化合物には、前述のポリペプチド化合物およびペプチド化合物のすべてが含まれると同時に、これらの化合物の薬学的に受容可能な塩も含まれる。塩基を含有する、本発明の化合物の薬学的に受容可能な酸添加塩は、当技術分野において公知の方法により、適切であれば、強酸あるいは中程度の強酸、非毒性酸、有機酸、または非有機酸もしくは無機酸と共に形成される。本発明に含まれる酸添加塩の例は、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルフォン酸塩、ベンゼンスルフォン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、および硝酸塩である。
【０１８０】
酸性基を含有する、本発明の化合物の薬学的に受容可能な塩基添加塩は、公知の方法によって、有機塩基および非有機塩基から調製され、例えば、カルシウム、ナトリウム、カリウムならびに水酸化アンモニウムなどの非毒性アルカリ金属およびアルカリ土類塩基と、トリエチルアミン、ブチルアミン、ピペラジン、ならびにトリ（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどの非毒性有機塩基と、を含む。
【０１８１】
前述のように、本発明の化合物は、ＥＣの増殖、運動性、または浸潤性および血管形成を阻害する能力と、癌、特に転移性の癌の処置において活用される特性と、を有する。本発明の組成物は、それ自体が活性であり得、またはインビボで活性形態に転換される「プロドラッグ」として作用し得る。
【０１８２】
（治療的に標識された組成物）
好ましい実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドおよびペプチドは、「治療的に結合体化され」または「治療的に標識され」ており（これらの用語は交換できることが意図されている）、腫瘍の転移あるいは感染／炎症の病巣、再狭窄または線維症の部位などの、化合物がホーミングし、結合する部位へ、治療薬剤を送達するために使用される。用語「治療的に結合体化され」とは、改変されたペプチドが、根本にある原因か、腫瘍浸潤、血管形成、炎症、または他の病理学の「構成要素」か、のいずれかに関連する、別の治療薬剤に結合体化されることを意味する。治療的に標識されたタンパク質またはペプチドは、好適な治療的「標識」を運ぶが、これは本明細書において、「治療的部分（ｍｏｉｅｔｙ）」と呼ばれる。治療的部分は、ペプチドに加えられて、標的の疾患または状態、主に所望でない血管形成に関連するものの処置において活性化する、原子、分子、化合物、または任意の化学成分である。前述のように、本発明のペプチドは、従来型の手段、すなわち、化学合成、Ｔｐｍまたはそれの抗血管形成リガンドのタンパク分解、あるいは組換え手段のいずれかによって調製される。治療的部分は、ペプチドに直接的または非直接的に結合され得る。治療的に標識されたタンパク質またはペプチドが、薬学的に受容可能なキャリヤーまたは賦形剤を含む薬学的組成物として投与され、好ましくは注射に好適な形態である。
【０１８３】
有用な治療的放射性同位元素（原子番号により順序付けられる）の例には、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、および２１７Ｂｉが含まれる。これらの原子は、キレートの一部として直接的および非直接的にペプチドに結合体させ得るか、またはヨウ素の場合には、ヨウ素化されたＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ基の一部として非直接的に結合体させ得る。放射性ヨウ素は、この基がペプチド化合物に結合される前、または後のいずれにおいても導入され得る。
【０１８４】
放射性核種結合体の好ましい用量は、標的部位に送達されるべき特定の放射能の関数である。これは、腫瘍のタイプ、腫瘍の場所および血管新生、ペプチドキャリヤーのキネティクスならびに体内分布、核種による放射性排出のエネルギーなどにより異なる。放射線治療分野の当業者であれば、所望の治療的利点をもたらすために、過度の実験を必要とせずに、特定の核種の用量と関連するペプチドの用量を容易に調節し得る。
【０１８５】
本明細書に含まれる別の治療的アプローチは、ホウ素中性子捕獲治療法の使用であり、ホウ素化されたペプチドが、腫瘍、最も好ましくは頭蓋内腫瘍などの所望の標的部位に送達される（Ｂａｒｔｈ，ＲＦ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．１４：５３４−５５０（１９９６）、Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．（編），Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，１９９６、Ｓｏｌｏｗａｙ，Ａ．Ｈ．ら，（編），Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌ．３３：１−１８８（１９９７））。安定の同位元素１０Ｂが、低エネルギー（＜０．０２５ｅＶ）の熱中性子で照射され、その結果生じる核の捕獲が、α粒子および７Ｌｉ原子核を生み出す。これらは高線エネルギー転移を有し、経路の長さはそれぞれ、約９μｍおよび５μｍである。この方法は、血液、ＥＣ、および正常な組織（例えば脳）におけるより低い水準での腫瘍における１０Ｂ蓄積について断定される。このような送達は、上皮増殖因子を使用して達成されていた（Ｙａｎｇ．Ｗ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：４３３３−４３３９（１９９７））。
【０１８６】
本発明の方法に従ってペプチド化合物にカップリングさせ得るその他の治療的薬剤は、薬物、プロドラッグ、プロドラッグを活性化させるための酵素、光感作性の薬剤、核酸治療剤、アンチセンスベクター、ウイルスベクター、レクチンおよびその他の毒素である。
【０１８７】
レクチンはタンパク質であり、一般的に植物に由来し、炭水化物に結合する。その他の活性の中で、いくつかのレクチンは毒性を有する。最も細胞毒性の強い物質のうち公知のもののいくつかは、細菌性のおよび植物性の起源であるタンパク質毒素である（Ｆｒａｎｋｅｌ，ＡＥら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．３７：１２５−１４２（１９８６））。これらの分子は細胞表面に結合し、細胞蛋白質の合成を阻害する。最も一般的に使用される植物の毒素は、リシンおよびアブリンである；最も一般的に使用される細菌性の毒素は、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素Ａである。リシンおよびアブリンにおいては、結合機能および毒性機能が、２つの別のタンパク質サブユニット、すなわちＡ鎖およびＢ鎖内に含有される。リシンのＢ鎖は、細胞表面の炭水化物に結合し、細胞内へのＡ鎖の取り込みを促進する。一旦細胞内に入ると、リシンのＡ鎖は、真核生物のリボソームの６０Ｓサブユニットを不活性化することによって、タンパク質の合成を阻害する（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５９０８−５９１２（１９８７））。その他の植物に由来する毒素は、単鎖リボソームの阻害性タンパク質であるが、それらは、ヤマゴボウの抗ウイルスタンパク、小麦の胚タンパク質、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ジアンチン、ｍｏｍｏｒｃｈａｒｉｎ、トリコサンチン、および他に多くを含む（Ｓｔｒｉｐ，Ｆ．ら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９５：１−８（１９８６））。ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素Ａもまた、単鎖のタンパク質であり、それらの結合機能および毒性機能は、同じタンパク質内の別のドメインに存在する。シュードモナス外毒素Ａは、ジフテリア毒素と同じ触媒作用活性を有する。リシンは、その毒性α鎖を、抗体などの標的とする分子に結合することによって治療的に使用され、毒性の効果が部位に特異的に送達されることを可能にしている。細菌性の毒素もまた、抗腫瘍結合体として使用されている。本明細書で意図されているように、毒性のペプチド鎖またはドメインは、本発明の化合物に結合体化され、部位に特異的な方法で、転移巣などの毒性の活性が所望される標的部位に送達される。抗体またはその他のリガンドなどのタンパク質への毒素の結合体は、当技術分野において公知である（Ｏｌｓｎｅｓ，Ｓ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １０：２９１−２９５（１９８９）、Ｖｉｔｅｔｔａ，Ｅ．Ｓ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：１９７−２１２（１９８５））。
【０１８８】
ＤＮＡ，ＲＮＡ、およびタンパク質の合成を含む重大な細胞の過程を妨害する細胞毒性の薬物は、抗体に結合体化され、引き続いてインビボの治療に使用されている。このような薬物には、ダウノルビシン、ドキソルビシン、メトトレキサートが含まれるが、これらに限定されない。また、マイトマイシンＣもまた、本発明の化合物にカップリングされ、この形態において治療的に使用される。
【０１８９】
本発明の好ましい実施形態において、細胞毒性の薬物は、Ｔｐｍリガンドへの結合体によって、ＥＣまたは腫瘍細胞の表面上のＴｐｍを標的とする。やはり、細胞表面Ｔｐｍのための好ましいリガンドには、ＨＰＲＧまたはそれらのＨ／Ｐドメインペプチド、ＨＫａあるいはＤ５ドメインまたはそれらのより短いフラグメント、より好ましくは、これらの細胞表面に発現されたＴｐｍのエピトープに特異的な抗体が含まれる。
【０１９０】
本発明の化合物は、薬学的に受容可能なそれらの塩と同様に、カプセル、含浸ウェーハ、錠剤または注射可能な調製物などの、便利な投薬形態に組み込まれ得る。個体または液体の薬学的に受容可能なキャリヤーが採用され得る。
【０１９１】
固体のキャリヤーには、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム二水和物、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸が含まれる。液体のキャリヤーには、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、生理食塩水、水、ブドウ糖、グリセロールなどが含まれる。同様に、キャリヤーまたは希釈剤は、モノステアリン酸グリセリン、またはジステアリン酸グリセリンなどの任意の長期の放出物質を、単独で、またはワックスと共に含み得る。液体のキャリヤーが使用される場合、調製物は、シロップ、エリキシル剤、乳濁液、ソフトゼラチンカプセル、アンプルなどの滅菌した注射可能な液体（例えば溶液）、あるいは、水溶性または非水溶性の液体懸濁液の形態であり得る。このような薬学的組成物の要約は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ  第１８版  １９９０）において見られ得る。
【０１９２】
薬学的調製物は、錠剤の形態が必要な場合には混合、造粒および圧縮の工程、また、経口の、非経口の、局所的、経皮的、腟内、陰茎内、鼻腔内、気管支内、頭蓋内、眼内、耳内、および直腸の投与用の、所望の生成物を提供するために、必要に応じて混合、充填および構成要素の溶解の工程、などのような工程を含む、従来型の製薬化学技術に従って調製される。薬学的組成物もまた、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの、少量の非毒性の補助的物質を含有し得る。
【０１９３】
本発明は、多数の動物の属および種に属する任意の動物の診断または処置において使用され得、ヒトの医学または獣医学での実践において等しく適用可能である。従って、薬学的組成物は、ヒトと同様に、鳥、より好ましくは哺乳類を含む、家庭のおよび商用の動物の処置に使用され得る。
【０１９４】
用語「全身投与」は、本明細書に記載されたポリペプチド、ぺプチド、または核酸などの組成物または薬剤が、結果として被験体の循環系にこの組成物が導入されるような、または体全体に広がることを可能にするような方法、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）への注射（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）などによる投与をいう。「領域性の」投与とは、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜下、または特定の臓器などの、特定の、および幾分より限定された解剖学的スペース内への投与をいう。例としては、腟内、陰茎内、鼻腔内、気管支内（または肺への滴下）、頭蓋内、耳内、または眼内が含まれる。用語「局所投与」とは、組成物または薬物の、腫瘍の塊への腫瘍内注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射などの、限定された、または限局性の解剖学的スペース内への投与をいう。当業者であれば、局所投与または領域性の投与も、しばしば組成物を循環系に入れる結果となり、すなわち、ｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．もまた、全身投与の経路であることを理解するはずである。注射可能または注入可能な調製物は、溶液あるいは懸濁液か、溶液あるいは懸濁液に好適な、注射あるいは注入前に液体内に入れた固体形態か、または、乳濁液のいずれかとして、従来型の形態で調製し得る。好ましい投与の経路は、ｉ．ｖ．などの全身性であるものの、この薬学的組成物は、局所的または経皮的に、例えば軟膏、クリームまたはゲルとして；経口的に；直腸に、例えば坐剤として；投与し得る。
【０１９５】
局所的な適用のために、化合物は、軟膏（ｓａｌｖｅ）または軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）などの局所的に適用されるビヒクルに組み込まれ得る。活性成分のためのキャリヤーは、噴霧可能な形態または噴霧不可能な形態のいずれでもあり得る。噴霧不可能な形態は、局所的な適用に固有のキャリヤーを含み、好ましくは水より高い動的粘度を有する、半固体または固体の形態であり得る。好適な剤形には、溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、パウダー、リニメント剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）などが含まれるが、これらに限定されない。もし所望であれば、これらは滅菌され、または、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、または浸透圧に影響を与えるための塩などの、補助的薬剤と混合され得る。噴霧不可能な局所的調製物用に好ましいビヒクルには、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）基剤、例えばポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）；ＨＥＢクリームなどの従来型のクリーム；ゲル；ワセリンなどが含まれる。
【０１９６】
肺への滴下用と同様に局所的な適用にも好適なものは、噴霧可能なエアゾール調製物であり、その中においては化合物が、好ましくは固体または液体の不活性キャリヤー物質と組み合わされて、加圧された、揮発性の、通常はガス状の噴霧剤と共に、スクイーズボトルの中または混合物の中にパッケージされる。エアゾール調製物は、本発明の化合物に加え、溶媒、緩衝剤、界面活性剤、芳香剤、および／または酸化防止剤を含有し得る。
【０１９７】
特にヒトにとって好ましい局所的な適用のためには、罹患した領域、例えば皮膚表面、粘膜、目などへ、効果的な量の化合物を投与することが好ましい。この量は、一般的に１回の適用当たり約０．００１ｍｇ〜約１ｇの範囲であるが、これは処置されるべき領域、症状の重症度、および採用される局所的ビヒクルの性質に依存する。
【０１９８】
抗血管形成組成物は、管理された期間に選択された部位に対してトロポニン活性薬剤を放出する、生物分解性の、生体適合性の重合体移植物と組み合わせて投与され得る。好ましい重合体物質の例には、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレンビニルアセテート、ならびにこれらの共重合体および混合物が含まれる。例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），１９８４，Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ、Ｒａｎｇｅｒら，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１、Ｌｅｖｙら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇら，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄら，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照。別の実施形態においては、管理された放出システムが、例えば脳などの治療上の標的に近接して配置され得、従って全身の用量の一部（ｆｒａｃｔｉｏｎ）だけを要する（Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｉｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，第２巻，ｐｐ．１１５−１３８）。その他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３による総説に論じられている。
【０１９９】
本発明のポリペプチドまたは核酸の組成物のための、その他の薬学的に受容可能なキャリヤーは、リポソーム、すなわち、活性のタンパク質が、分散されるか、あるいは脂質性層に付着する水溶性の同心性層からなる小体の中に多様に存在するか、のいずれかで含有される、薬学的組成物である。活性のポリペプチドあるいはペプチド、または核酸は、好ましくは、水溶性層内および脂質性層内、内側あるいは外側、または、いずれにしても、リポソーム懸濁液として一般的に公知の均質でないシステム内に存在する。疎水性層または脂質性層は、一般的に、レシチンおよびスフィンゴミエリンなどのリン脂質、コレステロールなどのステロイド、ジセチルフォスフェイト、ステアリルアミン、またはホスファチジン酸などの多少イオン性の表面活性物質、および／または疎水性の性質を有するその他の物質を含むが、排他的なわけではない。当業者であれば、本発明のリポソーム剤形のその他の好適な実施形態を理解する。
【０２００】
腫瘍および癌を処置するための治療的組成物は、抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドに加え、例えばビンブラスチンなどの有糸分裂のインヒビター；シクロホスファミドなどのアルキル化薬剤；メトトレキサート、ピリトレキシム（ｐｉｒｉｔｒｅｘｉｍ）、またはトリメトレキサートなどの葉酸塩インヒビター；５−フルオロウラシルおよびシトシンアラビノシドなどの代謝拮抗剤；アドリアマイシンおよびブレオマイシンなどのインターカレートする抗生物質；アスパラギナーゼなどの酵素または酵素インヒビター；エトポシドなどのトポイソメラーゼインヒビター；または、インターフェロンあるいはインターロイキンなどの生物学的反応重合調整剤などの、１つ以上の追加的抗腫瘍薬剤を含み得る。実際、本明細書に開示されたペプチドと組み合わせた任意の公知の癌治療を含む薬学的組成物は、本発明の範囲内である。薬学的組成物はまた、例えば抗菌性、抗真菌、抗寄生性、抗ウイルス性、および抗コクシジアを含む抗感染性の薬剤などの、標的の患者が危険に晒されている追加的な症状を処置するための１つ以上のその他の医薬をも含み得る。
【０２０１】
投与される治療上の投与量は、当業者に公知である、または当業者が容易に確かめられる、治療上効果的な量である。投与量はまた、レシピエントの年齢、健康状態、および重さ、同時に行なう処置の種類（もしあれば）、処置の頻度、および、例えば抗炎症効果または抗細菌効果などの所望の効果の性質に依存する。
【０２０２】
いくつかの抗体は、細胞表面Ｔｐｍに直接的に結合し、抗血管形成活性（「アゴニスト」）を誘導する一方、Ｔｐｍのエピトープに特異的なその他の抗体は、Ｈ／Ｐドメイン、Ｄ５などを経由してＨＰＲＧの結合および抗血管形成の効果を阻害すると予期される。このような抗体は、「アンタゴニスト」と呼ばれ、新血管形成の誘導において有用であり、血管形成の増加が所望である疾患または状態を処置するために使用され得る。このような状態には、冠動脈疾患および末梢動脈疾患が含まれ、この場合において治療上の血管形成が有益であることが知られている（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＳＢら，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，２００２，１３６：５４−７１およびＪ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２００１  ３３：３７９−３９３、Ｄｕｒａｉｒａｊ，Ａ．ら，Ｃａｒｄｉｏｌ  Ｒｅｖ，２０００，８：２７９−２８７、Ｅｍａｎｕｅｌｉ，Ｃら，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１，１３３：９５１−９５８、Ｉｓｎｅｒ，ＪＭら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１９９６，７：９５９−８８）。一般的に、血管閉塞、血管疾患、または外科手術から生じた組織の虚血の任意の形態は、この方法で処置され得る（Ｉｓｎｅｒら，前出、Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＫＡ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ，２０００，１０：１１３−１２５）。例えば、抹消肢の虚血または肝臓移植における肝臓動脈閉塞において（Ｙｅｄｌｉｃｋａ，ＪＷら，Ｊ  Ｖａｓｃ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｒａｄｉｏｌ，１９９１，２：２３５−２４０）、本発明の抗体は虚血性の組織の血管再生を促進する。
【０２０３】
これらのアンタゴニスト抗体は、創傷治癒（外科手術の創傷からの回復を含む）の促進において有用であり、これは血管形成過程に依存することが公知であり（Ｌｉｅｋｅｎｓ  Ｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１，６１：２５３−２７０、Ｌｉｎｇｅｎ，ＭＷ，Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ，２００１，１２５：６７−７１、Ｒａｚａ  ＳＬら，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ，２０００，５：４７−５４、Ｔｏｎｎｅｓｅｎ  ＭＧら，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ，２０００，５：４０−４６、Ｈｕｎｔ  ＴＫ，Ａｄｖ  Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃａｒｅ，２０００，１３（２  Ｓｕｐｐｌ）：６−１１、Ｇｒａｎｔ  ＤＳら，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ，２０００，４７６：１３９−１５４、Ｄｒｉｘｌｅｒ  ＴＡら，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ，２０００，１６６：４３５−４４６、Ｓｉｎｇｅｒ  ＡＪら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，１９９９，３４１：７３８−７４６、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７６：７５−８１）、また、骨折の回復の加速または強化においても有用である（Ｇｌｏｗａｃｋｉ，Ｊ，Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ，１９９８，３５５  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８２−８９）。
【０２０４】
アンタゴニスト抗Ｔｐｍ抗体は、血管内皮が作用して膵臓の器官形成および膵臓のβ細胞によるインシュリンの生成を刺激または誘導するので、糖尿病の処置において、細胞治療および膵臓の島細胞の移植と併せて使用され得る（Ｌａｍｍｅｒｔ  Ｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４：５６４−５６７、また、５３０−５３１ページも参照）。肝臓の器官形成もまた、血管形成ＥＣおよび発生期血管によって促進される（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９４：５５９−５６３）。ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ，Ｌ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １５：１７（２００１）も参照されたい。
【０２０５】
所望の抗血管形成または血管形成促進活性を有する抗Ｔｐｍ抗体を検出するための、ハイブリドーマ培養物の抗体または上清のスクリーニングは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグアッセイなどの、前述のインビトロおよびインビボでのバイオアッセイを使用して実行される。
【０２０６】
（治療上の方法）
本発明の方法は、腫瘍の成長および被験体への浸潤を阻害するため、または、ＥＣの成長および移動を阻害することによる腫瘍によって誘導される血管形成を抑制するために使用され得る。腫瘍または血管形成の成長または浸潤を阻害することにより、この方法は結果として腫瘍の転移を阻害する。脊椎動物である被験体、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトが、腫瘍の成長、浸潤、または血管形成を阻害するのに効果的な量の化合物を投与される。この化合物または薬学的に受容可能なそれらの塩は、好ましくは前述の薬学的組成物の形態で投与される。
【０２０７】
タンパク質（抗体を含む）、ペプチド、ペプチド多量体などの投与量は、好ましくは、効果的な量のペプチドを含む薬学的投与量ユニットを含む。投与量ユニット形態とは、哺乳類の被験体に対する単一の投与量として適応させた、物理的に別個のユニットをいう。各ユニットは、必要とされる薬学的キャリヤーと関連する、所望の治療上の効果を生み出すように計算された、所定の量の活性物質（例えばＨＰＲＧ由来のドメインまたはペプチド、あるいはポリペプチドをコードする核酸）を包含する。本発明の投与量ユニット形態のための仕様は、以下によって決定づけられるか、それらに対して直接的に依存する：（ａ）活性物質の独特の特性、および得られるべき特定の治療上の効果、ならびに（ｂ）個別の被験体の処置、および敏感性などのためにこのような活性化合物を配合することに関する技術分野に内在する限定。
【０２０８】
効果的な量とは、結果として疾患の任意の関連するパラメータにおける測定可能な減少となる、インビボでの安定した状態の濃度を達成するのに十分な量を意味し、原発性腫瘍または転移腫瘍の成長、炎症反応性の任意の認められた指数、または、疾患のない間隔または生存の測定可能な延長を含み得る。例えば、患者の２０％において腫瘍の成長が減少すれば、効果的であると考えられる（Ｆｒｅｉ  ＩＩＩ，Ｅ．，Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：１２７−１３６（１９９７））。しかし、この規模の効果は、本発明に従って効果的であるべき投与量についての最低限の必要条件であるとは考えられない。
【０２０９】
１つの実施形態において、効果的な投与量は、本明細書に記載されるインビボのアッセイにおける化合物の５０％の有効用量（ＥＤ５０）よりも、好ましくは１０倍、より好ましくは１００倍多い。
【０２１０】
投与されるべき活性化合物の量は、正確なペプチドまたは選択された誘導体、疾患または状態、投与の経路、レシピエントの健康状態および重さ、その他の同時に行なう処置の存在（もしあれば）、処置の頻度、例えば腫瘍の転移の阻害などの所望の効果の性質、ならびに熟練者の判断に依存する。
【０２１１】
毛細血管の内皮細胞の増殖、移動、および血管の内殖の阻害のうち任意のいずれかの１つを含む、インビボでの血管形成の阻害のための治療上有効な投与量は、本明細書に記載されたインビトロの阻害アッセイから推定され得る。効果的な投与量はまた、送達の方法および手段にも依存する。例えば、いくつかの適用においては、乾癬または糖尿病性網膜症の処置におけるように、インヒビターは局所的−眼のキャリヤーで送達される。その他の適用においては、固形腫瘍の処置におけるように、インヒビターは、生分解性のポリマーインプラントによって送達される。タンパク質もまた、例えば、効果的な投与量に影響するポリエチレングリコール処理によって改変され得る。
【０２１２】
腫瘍を有する被験体、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを処置するためのアゴニスト抗Ｔｐｍの好ましい投与量は、体重のキログラム当たり約１００ｍｇ以下の活性タンパク質、またはペプチドベースの化合物である。ペプチドまたはペプチド模倣物の代表的な単一投与量は、体重１ｋｇ当たり約１ｎｇ〜約１００ｍｇである。局所的投与のためには、化合物の約０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜５重量％の濃度の範囲の投与量が示唆される。１日当たりの総投与量は、約０．１ｍｇ〜約７ｇの範囲が、静脈内投与にとって好ましい。しかし、個別の処置レジメンにおける変数の数が大きく、これらの好ましい値からの可動域が相当であると予期されるので、前述の範囲は示唆的なものである。
【０２１３】
インビトロでのＥＣの増殖または移動を阻害するためのペプチドの効果的な量または投与量は、細胞当たり約１ピコグラム〜約５ナノグラムの範囲である。効果的な投与量および最適な投与量の範囲は、本明細書に記載される方法を使用してインビトロで決定され得る。
【０２１４】
本発明の化合物は、腫瘍細胞またはＥＣの増殖、移動、浸潤、または血管形成、あるいは腫瘍の転移または炎症性反応に対する阻害的な効果を生み出すとして特徴づけられ得る。この化合物は、腫瘍を有する哺乳類の宿主、好ましくはヒトにおいて抗腫瘍の効果を生み出すときに特に有用である。
【０２１５】
血管形成インヒビターは、炎症性血管形成および外傷性脊髄損傷に続く神経膠症を予防する役割を果たし得、それによってニューロンの接続性の回復を促進する（Ｗａｍｉｌ，ＡＷら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３１８８−１３１９３（１９９８））。従って、本発明の組成物は、外傷性脊髄損傷を受けた後なるべく早く、その後数日間から約２週間の間で投与され、ニューロンの接続性の回復を立体的に阻止する、血管形成および神経膠症を阻害する。この処置は、脊椎損傷の部位における損傷の領域を減少させ、ニューロン機能の再生を促進し、それによって運動麻痺を予防する。本発明の化合物はまた、ウォラー変性からの軸索を保護し、アミノブチラートに媒介される脱分極（外傷を負ったニューロンにおいて起こる）を逆転させ、および、培養中の単離された中枢神経系細胞および組織におけるニューロンの伝導性の再確立を改善することも予期される。
【０２１６】
（一般的なＤＮＡ組換え方法）
分子生物学の一般的な方法を開示する基本的なテキストは、その全てが参考として本明細書中に援用されるが、それらには以下が含まれる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（またはそれ以降），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（現行版）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｆｔ．ｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｆｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＭ，ｅｄｉｔｏｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ＆ＩＩ巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５、Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版（またはそれ以降），Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ，ＪＤら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，第２版（またはそれ以降），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、およびＯｌｄ，ＲＷら，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版（またはそれ以降），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ（１９８１）。
【０２１７】
特に示されない限り、特定の核酸配列が、それらの保存的置換改変体（例えば縮重コドン置換）および相補配列を含むことが意図される。用語「核酸」は「ポリヌクレオチド」と同義であり、遺伝子、ｃＤＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子と同様に、オリゴヌクレオチドなどのこれらの任意のフラグメント、更にそれらの同等物    を含むことが意図される（以下により十分に説明する）。核酸のサイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで表される。これらは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）から、ユーザによって測定される、または公開されている核酸配列から、推定される。タンパク質のサイズは、キロダルトン（ｋＤａ）の分子量として、または長さ（アミノ酸残基の数）として表される。タンパク質のサイズは、ＰＡＧＥ、配列、コードする核酸配列に基づく推定上のアミノ酸配列、または公開されているアミノ酸配列から推定される。
【０２１８】
特に、本発明のＴｐｍポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメント、あるいはそれらの活性改変体に対応するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ分子は、本明細書に開示されたタンパク質の配列に由来するプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成され得る（例えば米国特許番号４，６８３，２０２参照）。これらのｃＤＮＡ配列は、真核生物のまたは原核生物の発現ベクターの中に構築され得、結果として生じるベクターは、適切な宿主細胞、例えばＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞による、融合ポリペプチドまたはそのフラグメントあるいは誘導体の合成を方向付けるために使用され得る。
【０２１９】
本発明は、新規のＴｐｍポリペプチド、ドメイン、ペプチドフラグメント、またはそれらの同等物をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸、および、それらのポリペプチド生成物を発現するために、インビトロまたはインビボで細胞をトランスフェクトする際のそれらの使用を含む。本明細書に使用される核酸という用語は、このようなフラグメントまたは同等物を含むことが意図される。本発明の核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【０２２０】
ＴｐｍポリペプチドをコードするｃＤＮＡヌクレオチド配列は、総ｍＲＮＡを適切な細胞株から単離することによって得られ得る。二本鎖ｃＤＮＡは、総ｍＲＮＡから調製される。ｃＤＮＡは、多数ある公知の技術のうちいずれか１つを使用して、好適なプラスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターの中に挿入され得る。
【０２２１】
ヌクレオチド配列に関連して、用語「同等な」とは、自然的に生じるアイソフォーム、または、関連する免疫学的に交差反応するこれらのタンパク質のファミリーメンバーなどの、構造的に相同な、および／または機能的に同等なタンパク質をコードする配列を含むことを意図する。このようなアイソフォームまたはファミリーメンバーは、例えば、配列番号１または３、あるいは、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、１７、または１９に類似する機能およびアミノ酸配列を共有するタンパク質として定義される。
【０２２２】
（核酸のフラグメント）
核酸配列のフラグメントは、全長Ｔｐｍタンパク質、ＡＡＬＢＰフラグメント、あるいはより小さなフラグメントまたはドメインをコードするヌクレオチド配列よりも有するヌクレオチドが少ないヌクレオチド配列として定義される。本発明は、（１）血管形成、内皮チューブ形成、細胞浸潤、あるいは腫瘍の成長または転移のインヒビターを結合するＴｐｍポリペプチドの能力を保持するポリペプチドをコードするような核酸フラグメントを含む。
【０２２３】
一般的に、Ｔｐｍのフラグメントをコードする核酸配列は、成熟したタンパク質（またはそれらの活性フラグメント）をコードする配列に由来するヌクレオチドを含む。
【０２２４】
核酸配列、特に本発明のペプチド多量体をコードするものは、リンカーまたはスペーサー配列も含み得る（好ましくはＧｌｙ１−６をコードする）。核酸は更に、コードされたポリペプチドまたはペプチドのクローニング、発現、または精製に関連する操作に有用な、ネイティブまたは改変された制限酵素の部位およびその他の配列を含み得る。これらおよびその他の核酸配列の改変は、本明細書に記載されているか、または当技術分野において周知である。
【０２２５】
ＤＮＡコード配列を構築するおよび発現する技術は、オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ベクターの構成、発現システムなどを含む。これらは、当業者が標準的な資源物質、特定の条件および手順に精通するように、当技術分野において良く確立されている。
【０２２６】
（発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結されたＴｐｍポリペプチド、ドメイン、またはペプチドをコードする核酸配列を含む、発現ベクターを含む。
【０２２７】
本明細書において使用される用語「発現ベクター」または「発現カセット」は、このｙとうな配列と適合性を有する宿主内でタンパク質コード配列の発現に影響を与え得るヌクレオチド配列をいう。発現カセットは、少なくとも、ポリペプチドコード配列と、および、必要に応じてその他の配列、例えば転写終結シグナルと作動可能に連結されたプロモーターを含む。発現をもたらすために必要または有用な追加的な因子、例えばエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）も含まれ得る。
【０２２８】
「作動可能に連結された」とは、コード配列の発現を可能にするような方法で、コード配列が制御配列に連結されることを意味する。公知の制御配列は、適切な宿主細胞における所望のタンパク質の発現を方向付けるために選択される。従って、用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御エレメントを含む。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８５巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。
【０２２９】
従って、発現カセットは、プラスミド、組換えウイルス、組換え「裸のＤＮＡ」ベクターの任意の形態などを含む。「ベクター」は、細胞を感染させ、トランスフェクトさせ、一過性にまたは永久的に形質導入し得る核酸を含む。ベクターは裸の核酸、あるいは、タンパク質または脂質と複合させた核酸であり得ると認識される。ベクターは必要に応じて、ウイルスまたは細菌の核酸および／またはタンパク質、および／または膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ベクターは、ＤＮＡのフラグメントが付着され、複製され得るレプリコン（例えばＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含むが、これらに限定されない。従ってベクターは、ＲＮＡ、自律性の自己複製する環状または直線状のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばプラスミド、ウイルスなどを含むがこれらに限定されず（米国特許番号５，２１７，８７９）、発現プラスミドおよび非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養が「発現ベクター」の宿主である場合、これは、染色体外の環状または直線状のＤＮＡと、宿主染色体に組み込まれるＤＮＡと、の両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合には、ベクターは、自律性の構造として、有糸分裂の間、細胞によって安定して複製されるか、宿主のゲノム内に組み込まれるかの、いずれもあり得る。
【０２３０】
当業者であれば、本発明の発現ベクターの特定の設計が、トランスフェクトされるべき宿主細胞、および、発現されるべきポリペプチドの性質（例えばサイズ）などの考慮に依存することを理解する。
【０２３１】
本発明の発現ベクターは、Ｔｐｍポリペプチド、フラグメント、またはオペプチドの多様な実施形態をコードする全範囲の核酸分子を含む。
【０２３２】
このような発現ベクターは、ＤＮＡの発現、および、融合タンパク質またはペプチドを含む、コードされるタンパク質の生成のために、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される（インビトロ、エキソビボ、またはインビボで）。Ｔｐｍポリペプチド、ドメイン、ペプチドフラグメントまたは多量体を発現する遺伝的に改変された細胞は、細胞がその定まった目的に有用であるのに十分な時間、外因性のＤＮＡを一過性に発現し得ると理解される。
【０２３３】
宿主細胞はまた、少なくともＴｐｍポリペプチドまたはＡＡＬＢＰフラグメントの部分、あるいはより短いペプチドをコードするＤＮＡ、および、少なくとも第２のＴｐｍに由来する配列（または改変体）の部分をコードするＤＮＡを、単独で、または組み合わせで含む１つ以上の発現ベクターで、宿主細胞が、両方の部分を含むＴｐｍポリペプチド、ドメイン、またはペプチドフラグメントを更に生成するように、トランスフェクトされ得る。
【０２３４】
Ｔｐｍポリペプチド、ドメイン、またはペプチドフラグメントを生成する方法は、すべて当技術分野において従来型のものである。培養物は代表的に、宿主細胞、適切な増殖培地、およびその他の副産物を含む。好適な培養培地は、当技術分野において周知である。Ｔｐｍポリペプチド、ドメイン、またはペプチドフラグメントは、硫安塩析、分画カラムクロマトグラフィ（例えばイオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなど）、および／または電気泳動を含む、タンパク質およびペプチドを精製するための従来型の技術を使用して、培地または細胞溶解物から単離され得る（一般的には、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２２：２３３−５７７（１９７１）参照）。一旦、部分的または均一になるまで精製されると、本明細書に更に詳しく記載されているように、本発明の組換えポリペプチドが薬学的組成物内で利用され得る。
【０２３５】
本明細書において使用される用語「単離された」は、分子または組成物のことをいう場合、この分子または組成物が、少なくとも１つの他の化合物（タンパク質、その他の核酸など）から、または、生来関連する、またはプロセシング中に関連するようになるその他の混入物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）から分離されること、を意味する。単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質な状態であり得、乾燥しているか、水溶液内に存在し得る。純度および均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの分析化学技術を使用して測定され得る。タンパク質が、ゲルパターン内で均質な、または優性なバンドとして現れるように単離されている場合でも、一般的にそれと同時精製する微量の混入物があると理解される。
【０２３６】
形質転換、またはトランスフェクトされてＴｐｍポリペプチド、ドメイン、またはペプチドフラグメントを発現する原核生物の、または真核生物の宿主細胞は、本発明の範囲内である。例えば、Ｔｐｍポリペプチド、ドメイン、またはペプチドフラグメントは、大腸菌などの細菌の細胞、昆虫の細胞（バキュロウイルス）、酵母、あるいは、チャイニーズハムスターの卵巣の細胞（ＣＨＯ）またはヒトの細胞（トランスフェクトされる細胞のヒトへの治療上の使用にとって好ましい）などの哺乳類の細胞内で発現され得る。その他の好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，（１９９０），前出、において見出され得るか、さもなければ当業者に公知である。
【０２３７】
真核生物の細胞における発現は、部分的または完全なグリコシル化、および／または、組換えポリペプチドの、関連する鎖間または鎖内のジスルフィド結合の形成につながる。
【０２３８】
酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。培養された昆虫の細胞（ＳＦ  ９細胞）におけるタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）を含む。一般的に、ＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．，（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５−１８２）は、ｐＣＤＭ８（Ａｒｕｆｆｏ  Ａ．およびＳｅｅｄ，Ｂ．，前述）などのベクターと組み合わせて、哺乳類の細胞における一過性の増幅／発現のために使用されるが、一方で、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−陰性のＣＨＯ）細胞は、ｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）などのベクターと共に、哺乳動物の細胞における安定した増幅／発現のために使用される。ＮＳ０骨髄腫細胞株（グルタミン合成酵素発現システム）は、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．から入手可能である。
【０２３９】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解性の切断部位が、レポーター基および標的タンパク質の接合部において導入されて、融合タンパク質の精製に続いて、レポーター基からの標的タンパク質の分離を可能にする。このような切断のためのタンパク分解性の酵素およびそれらの認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。
【０２４０】
代表的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれ、これらは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａをそれぞれ、標的組換えポリペプチドへ融合する。
【０２４１】
誘導性の非融合発現ベクターには、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １ｌｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が含まれる。標的遺伝子発現が、ｐＴｒｃにおけるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターに由来する宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する一方で、ｐＥＴ  １ｌｄに挿入される標的遺伝子の発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃＯ融合プロモーターに由来する転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写コントロール下にＴ７ｇｎ１を保有する内在性λプロファージから宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０２４２】
（ベクターの構成）
所望のコーディングおよび制御配列を含む好適なベクターの構成は、当技術分野においてよく理解されている標準的な連結および制限の技術を採用する。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断され、仕立てられ（ｔａｉｌｏｒ）、および再連結される。ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多数のソースから入手可能である。バックボーンベクターおよび制御システムは、一般的には、構築物中の配列のバルク用に使用される入手可能な「宿主」ベクター上に見られる。妥当なコード配列のためには、最初の構築は、ｃＤＮＡまたはゲノムのＤＮＡライブラリから適切な配列を検索する問題であり得、通常はそうである。しかし、一旦配列が開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から始めて、インビトロで全体の遺伝子配列を合成することが可能である。例えば５００〜１０００ｂｐの、相当な長さの遺伝子のための全体の遺伝子配列は、個々のオーバーラップする相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、デオキシリボヌクレオチド３リン酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、１本鎖のオーバーラップしない部分を埋めることによって調製され得る。このアプローチは、公知の配列のいくつかの遺伝子を構成するのに使用され、成功してきた。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６、Ｎａｍｂａｉｒ，Ｋ．Ｐ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９、およびＪａｙ，Ｅ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９８４）２５９：６３１１参照。
【０２４３】
合成のオリゴヌクレオチドは、前述の引用文献に記載されたリン酸トリエステル法か、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄ  Ｌｅｔｔ（１９８１）２２：１８５９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３１８５に記載されたホスホラミダイト法のいずれかによって調製され、また、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して調製され得る。アニールする前の、または標識するための１本鎖のキナーゼ処置が、周知の方法を使用して達成される。
【０２４４】
一旦所望のベクターの構成成分がこのようにして入手可能になると、それらは、標準的な制限および結合の手順を使用して切除および結合され得る。部位に特異的なＤＮＡ切断は、当技術分野において一般的に理解されている条件下、好適な制限酵素（または複数の酵素）を用いて処置することによって実施され、それらの詳細は、これらの市販の制限酵素の製造業者によって特定される。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃａｔａｌｏｇ参照。もし所望であれば、切断されたフラグメントのサイズ分離は、標準的な技術を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルの電気泳動によって実施され得る。サイズ分離に関する一般的な記述は、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９−５６０に見られる。
【０２４５】
本発明の改変体が、組換えで生成されなければならない場合、これらを生成するためにコード配列の中に突然変異を導入するために、多数の方法のうち任意の方法が使用される。これらの突然変異は、単純な欠失または挿入、塩基のクラスターの系統的な欠失、挿入または置換、あるいは、一塩基の置換を含む。ＤＮＡ配列の改変は、部位指向性変異原誘発によって生み出されるが、これは周知の技術であり、そのためのプロトコルおよび試薬が市販されている（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ，ＪＰら，ＤＮＡ（１９８３）２：１８３−１９３）。単離されたＤＮＡは、制限によって分析され、および／または、Ｍｅｓｓｉｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９に更に記載されているように、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシヌクレオチド方法によって（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７７）７４：５４６３）、またはＭａｘａｍら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，前出、の方法によって配列決定される。
【０２４６】
ベクターＤＮＡは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、リポフェクション、あるいはエレクトロポレーションなどの従来型の技術によって哺乳類の細胞の中に導入され得る。宿主細胞を形質転換するための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびその他の標準的なテキストに見られる。融合発現ベクターにおいて、タンパク分解性の切断部位が、レポーター基および標的タンパク質の接合部において導入されて、融合タンパク質の精製に続いて、レポーター基からの標的タンパク質の分離を可能にする。このような切断のためのタンパク分解性の酵素およびそれらの認識配列には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。
【０２４７】
（プロモーターおよびエンハンサー）
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書に使用されているように、「プロモーター配列」とは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるＤＮＡまたはＲＮＡの鎖上に見られる、プロモーターのヌクレオチド配列である。本発明の好ましいプロモーター配列は、哺乳類の細胞において作動可能でなければならず、真核生物のプロモーターまたはウイルスのプロモーターのいずれかであり得る。好ましいプロモーターは実施例に記載されているが、その他の有用なプロモーターおよび制御エレメントは以下に記載される。好適なプロモーターは、誘導性の、抑制性の、または構成性のものであり得る。「構成性の」プロモーターは、細胞の環境内で、および発生の全体にわたって直面するほとんどの条件下で活性であるものである。「誘導性の」プロモーターは、環境上または発生上の制御下にあるものである。「組織特異性の」プロモーターは、生物体の特定の組織タイプにおいて活性である。構成性のプロモーターの例はウイルスプロモーターＭＳＶ−ＬＴＲであり、多様な細胞タイプにおいて効率的および活性であり、他のほとんどのプロモーターとは対照的に、停止細胞および成長細胞において、同様の増強活性を有する。その他の好ましいウイルスプロモーターは、ＣＭＶ−ＬＴＲ（サイトメガロウイルスから）（Ｂａｓｈａｒｔ，Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１（１９８５））、または、ＲＳＶ−ＬＴＲ（Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスから）（Ｇｏｒｍａｎ，ＣＭ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２）に存在するものを含む。やはり有用であるのが、マウスのメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｓ．，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５（１９８２））、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））、および酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７９：６９７１−６９７５（１９８２）、Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９５５（１９８４））である。プロモーター領域と関連する転写因子ならびに転写因子の別の活性化、ＤＮＡ結合に関するその他の実例的な記載は、以下を含む：Ｋｅｅｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）２３１：６９９、Ｆｉｅｌｄｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４０：２４５、Ｊｏｎｅｓ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：９、Ｌｅｗｉｎ，Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：１１６１、Ｐｔａｓｈｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：３２９、Ａｄａｍｓら，Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：３０６。これらリストアップされたすべての文献に関連する開示は、参考として本明細書中に援用される。
【０２４８】
プロモーター領域は、特定の組織において見つけられた特定のタンパク質と相互作用することによって、やはり組織特異的なエンハンサーとして機能し得る、八量体領域を更に含み得る。本発明のＤＮＡ構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされるべき標的細胞に特異的であるか、または、そのような標的細胞の細胞因子によって高度に活性化されるものである。ベクター（プラスミドまたはレトロウイルス）の例は、Ｒｏｙ−Ｂｕｒｍａｎら，米国特許番号５，１１２，７６７に開示されている。エンハンサーおよびそれらの転写における作用についての一般的な考察は、Ｌｅｗｉｎ，ＢＭ，Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９９０）ｐｐ．５５２−５７６を参照。特に有用であるのが、レトロウイルスのエンハンサーである（例えばウイルスＬＴＲ）。エンハンサーは、好ましくはプロモーターの上流に配置され、それと共に相互作用して遺伝子発現を刺激する。レトロウイルスベクターとの使用のためには、内在性のウイルスＬＴＲは、エンハンサーを無くさせ、組織の特異性、または、転写効率などのその他の所望の特性を与える、その他の所望のエンハンサー配列と置換され得る。
【０２４９】
本発明の核酸配列もまた、標準的な技術を使用して化学的に合成され得る。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する多様な方法が、固相合成を含め公知である。固相合成は、ペプチド合成のように、市販のＤＮＡ合成機で完全に自動化されている（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら．米国特許番号４，５９８，０４９、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら．米国特許番号４，４５８，０６６、およびＩｔａｋｕｒａ米国特許番号４，４０１，７９６ならびに４，３７３，０７１参照。これらは参考として本明細書中に援用される）。
【０２５０】
（細胞および動物への核酸の送達）
ＤＮＡの送達は、（１）エキソビボで細胞内に、および最終的に、細胞を投与することにより生きた動物内に、または（２）直接動物内に、のいずれかに、「外来の」ＤＮＡを導入することに関与する。「遺伝子治療」を含む目的のための、「遺伝子の送達」（すなわち、任意の核酸ベクターの送達）のためのいくつかの一般的な戦略が、広範囲に研究され、検討されている（Ｙａｎｇ，Ｎ−Ｓ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−３５６（１９９２）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）、Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＳ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）、Ｃｒｙｓｔａｌ，ＲＧ，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（ｓｕｐｐｌ  ６Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）、Ｚｗｉｅｂｅｌ，ＪＡ  ら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６１８：３９４−４０４（１９９１）、ＭｃＬａｃｈｌｉｎ，ＪＲら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．３８：９１−１３５（１９９０）、Ｋｏｈｎ，ＤＢら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．７：１７９−１９２（１９８９）。これらはその全体が参考として本明細書中に援用される）。
【０２５１】
１つのアプローチは、全身的に、または特定の器官または組織内にのいずれかで、培養における初代細胞内への核酸の移動の後に、エキソビボで形質転換された細胞の宿主内への自己移植を含む。
【０２５２】
以下に記載されている送達用の好ましいＤＮＡ分子は、Ｔｐｍ、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、または配列番号１９、あるいはそれらのＡＡＬＢＰフラグメント（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０）、もしくはこれらの配列に基づくより短いペプチドをコードする。
【０２５３】
本発明の目的を達成するために、核酸治療が、インビボでの、機能的に活性のＤＮＡの哺乳類の身体の組織または器官内への直接移入によって達成される。ＤＮＡ移入は、以下に記載の多数のアプローチを使用して達成され得る。これらのシステムは、ＤＮＡを発現するトランスフェクトされたクローンを選択するための選択マーカー（例えばＧ４１８耐性）を使用して、インビトロでの発現の成功について試験され得、その後に、適切な免疫測定法における生成物に対する抗体を使用して、抗原含有発現生成物の存在が検出される（誘導性のシステムの場合はインデューサーでの処理の後で）。ＤＮＡの取り込み、プラスミドの組込み、および組み込まれたプラスミドの安定性を含む手順の効率は、公知の方法を使用してプラスミドＤＮＡを直線化すること、および、高分子量の哺乳類のＤＮＡを「キャリヤー」として使用して、同時トランスフェクトすることによって改善される。
【０２５４】
当技術分野において報告されている成功した「遺伝子移入」の例は、以下を含む：（ａ）プラスミドＤＮＡのマウスの筋肉組織への直接注射は、不定の期間、マーカー遺伝子の発現を導いた（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５（１９９０）、Ａｃｓａｄｉ，Ｇ．ら，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ３：７１（１９９１））；（ｂ）レトロウイルスベクターは、血管組織のインビボおよびインサイチュ感染に効果的である；（ｃ）レトロウイルス調製物の肝臓への門脈注射および直接注射は、インビボにおける遺伝子移入および発現に影響を与えた（Ｈｏｒｚａｇｌｏｕ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７２８５（１９９０）、Ｋｏｌｅｋｏ，Ｍ．ら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：２７（１９９１）、Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３８７（１９９１））；（ｄ）組換えアデノウイルスの、肺組織内への気管内注入は、インビボでの移入および肺の気道上皮における外来遺伝子の長期の発現に効果的であった（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１（１９９１）；（ｅ）単純ヘルペスウイルスベクターは、インビボでの脳組織内への遺伝子移入を達成した（Ａｈｍａｄ，Ｆ．ら，ｅｄｓ，Ｍｉａｍｉ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ−Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｈｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ  １，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｅｈｅｉｍｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ，１９９１）。多数の方法うち任意のものを用い、レトロウイルスベクターを用いたプラスミドによるトランスフェクトを使用した嚢胞性線維症の遺伝子治療は、Ｃｏｌｌｉｎｓら，米国特許番号５，２４０，８４６に記載されている。
【０２５５】
レトロウイルス媒介性のヒトの治療は、広宿主性の、複製欠損レトロウイルスシステムを利用する（Ｔｅｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１１１（１９９０）、Ｔｅｍｉｎら，米国特許番号４，９８０，２８９、Ｔｅｍｉｎら，米国特許番号４，６５０，７６４、Ｔｅｍｉｎら，米国特許番号５，１２４，２６３、Ｗｉｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．米国特許番号５，１７５，０９９、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，米国特許番号４，８６１，７１９）。このようなベクターは、機能的ＤＮＡをヒトの細胞または組織内に導入するため、たとえば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ球内へ、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子および腫瘍壊死因子のための遺伝子を腫瘍潤滑性リンパ球内へ導入するために使用されてきた。レトロウイルス媒介性遺伝子の送達は、一般的に、遺伝子の移入のために標的細胞の増殖を要する（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９（１９９０））。この条件は、本発明のＤＮＡ分子が導入されるべき特定の好ましい標的細胞、すなわち活性に成長する腫瘍細胞によって満たされる。本発明のＴｐｍポリペプチド、ドメインまたはペプチドフラグメントをコードするＤＮＡ分子は、複製−欠損のレトロウイルスを生成するパッケージング細胞株を使用して、レトロウイルスベクター内にパッケージし得る。これは当技術分野において周知である（例えば、Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９−６３５３（１９８４）、Ｍａｎｎ，ＲＦら，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３−１５９（１９８３）、Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＤら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７（１９８５）、Ｓｏｒｇｅ，Ｊら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１７３０−１７３７（１９８４）、Ｈｏｃｋ，ＲＡら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：２５７（１９８６）、Ｍｉｌｌｅｒ，ＡＤら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２（１９８６）参照）。遺伝子移入において効率的および安全な、より新しいパッケージング細胞株も記載されている（Ｂａｎｋら米国特許番号５，２７８，０５６）。
【０２５６】
このアプローチは、選択する組織または器官に対してレトロウイルスベクターを送達するために、部位に特異的な方法で利用され得る。従って、例えば、カテーテル送達システムが使用され得る（Ｎａｂｅｌ，ＥＧら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１３４２（１９８９））。このような方法は、レトロウイルスベクターか、リポソームベクターか、のいずれかを使用して、発現されるべき核酸を、血管壁へ、または腫瘍の血液循環内へ送達するために特に有用である。
【０２５７】
その他のウィルベクターもまた、組換えアデノウイルス（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｓ．，Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮら，ｅｄｓ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐ．１６７９、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＫＬ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６  ９１９（１９８８），Ｓｔｒａｕｓｓ，ＳＥ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ＨＳ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４，第１１章）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含め、ニューロンに特異的な送達および持続のために使用され得る。ヒトの遺伝子への送達にアデノウイルスベクターを使用する利点には、組換えがまれであること、このようなウイルスと関連するヒトの悪性腫瘍は知られていないこと、アデノウイルスのゲノムが、最大で７．５ｋｂまでの大きさの外来遺伝子を受け入れるために操作され得る２本鎖のＤＮＡであること、そして、生きたアデノウイルスが、安全なヒトのワクチンの有機体であること、という事実が含まれる。アデノ随伴ウイルスはまた、本発明において、ヒトの治療にも有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＲＪら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３９４１（１９９１））。
【０２５８】
特にヒトにおいて有用な別のベクターは、ワクシニアウイルスであり、これは、複製しないようにならしめ得る（米国特許番号第５，２２５，３３６号、第５，２０４，２４３号、第５，１５５，０２０号、第４，７６９，３３０号、Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１０８４７−１０８５１、Ｆｕｅｒｓｔ，ＴＲら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：２５４９−２５５３、Ｆａｌｋｎｅｒ  ＦＧら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８７）１５：７１９２、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３４０３−３４０９）。異種性ＤＮＡを含有する組換えワクシニアウイルスならびにその他のウィルス、それらの免疫化における使用およびＤＮＡ治療は、以下に記載されている：Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．（１９９３）３：８６−９０、Ｍｏｓｓ，  Ｂ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）２０：３４５−３６２、Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１５８：２５−３８、Ｍｏｓｓ，Ｂ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５２：１６６２−１６６７、Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａら，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）３４：４３−６４、Ｍｏｓｓ，Ｂら，Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ（１９８３）３：２０１−２１３。
【０２５９】
裸のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはウィルスベクターに加え、操作された細菌がベクターとして使用され得る。多数の細菌の菌株には、サルモネラ菌、ＢＣＧおよびリステリア菌（ＬＭ）が含まれる（Ｈｏｉｓｅｔｈ＆Ｓｔｏｃｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９１，２３８−２３９（１９８１）、Ｐｏｉｒｉｅｒ，ＴＰら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８，２５−３２（１９８８）、Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，３３６−３３８（１９８８）、Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４５６−４６０（１９９１）、Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，４７９−４８２（１９９１）、Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，５３−５９（１９９２）、Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，２２０９−２２１８（１９９４））。これらの有機体は、感染が腸管の経路を経ることを可能にし、核酸の経口の送達の可能性を提供する。
【０２６０】
インビボでのウィルスに媒介される遺伝子移入に加え、当技術分野において周知の物理的手段が、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆら，１９９０，前出）、および、微粒子銃に媒介された遺伝子移入（Ｙａｎｇ，Ｎ．−Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８（１９９０）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＲＳら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２７２６（１９９１）、Ｚｅｌｅｎｉｎ，ＡＶら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２８０：９４（１９９１）、Ｚｅｌｅｎｉｎ，ＡＶら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４：６５（１９８９）、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＳＡら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：１１（１９９１））を含めた、ＤＮＡの直接移入のために使用され得る。更に、インビトロで遺伝子を細胞内に移入するための周知の手段である電気穿孔法が、インビボで本発明のＤＮＡ分子を組織へ移入するために使用され得る（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，ＡＶら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：１３１（１９９１））。
【０２６１】
「キャリヤーに媒介される遺伝子移入」もまた記載されている（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５（１９８９）、Ｗｕ，ＧＹら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）、Ｓｏｒｉａｎｏ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７１２８（１９８３）、Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１（１９８２）、Ｗｉｌｓｏｎ，ＪＭら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３（１９９２））。好ましいキャリヤーは、イムノリポソームなどの、標的とされたリポソームであり（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１０６８（１９８３）、Ｓｏｒｉａｎｏら，前出）、これは、アシル化されたｍＡｂを脂質二重層内に組み入れ得る（Ｗａｎｇら，前出）。結合体が、標的組織（例えば肝臓のためのアシアロオロソムコイド）を認識する分子と、トランスフェクトされるべきＤＮＡに結合するためのＤＮＡ結合化合物と、を含む場合に、アシアロ糖タンパク質／ポリリジンなどのポリカチオン（Ｗｕら，１９８９，前出）が使用され得る。ポリリジンは、損傷を与えずにＤＮＡを結合するＤＮＡ結合分子の例である。次にこの結合体は、移入のために、本発明のプラスミドＤＮＡとの複合体にされる。
【０２６２】
トランスフェクトまたはマイクロインジェクションに使用されるプラスミドＤＮＡは、当技術分野において周知の方法を使用して、例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ手順（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して、その後に、本明細書に例示された方法などの公知の方法を用いてＤＮＡを精製して、調製され得る。
【０２６３】
（処置されるべき疾患および障害）
本発明に従って処置され得る、悪性のおよび転移性の疾患および状態（腫瘍および癌）には、固形腫瘍、例えば、悪性腫瘍、肉腫、リンパ腫、および、以下の表にリストアップされたものなどのその他の悪性の、または悪性ではない腫瘍が含まれるが、これらに限定されない（このような疾患についての総説には、臨床腫瘍学の任意のテキストの最新版、例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，第５版（ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．ら，編），Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９７、を参照されたい）。
【０２６４】
【表５】
2006501139.tif 000018
本発明は、増殖性の糖尿病性網膜症、新生血管の加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、未熟児網膜症、鎌状赤血球網膜症、網膜静脈閉塞、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、角膜移植片の新血管形成と同様に、その他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、および脈絡膜または虹彩の新血管形成に関連する疾患に関連する、またはその原因となるものなどの、病原性の眼の新血管形成に関わる眼の障害の処置に関する。
【０２６５】
本発明に従って処置され得るその他の障害には、子宮内膜症などの子宮の疾患、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム斑、創傷治癒の遅延、肉芽形成、血友病関節症、肥厚性瘢痕、偽関節の骨折、オースラー−ウェーバー症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、および血管の癒着が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６６】
本発明の治療的または予防的な有用性、および、治療的に効果的な投与量の決定は、ヒトで試験する前に、好適な動物モデルシステムにおいて、インビボで決定、または実証され得る。このようなモデルシステムは、ラット、マウス、ニワトリ、牛、サル、ウサギなどの使用に基づき得る。インビボの試験のためには、ヒトへの投与の前に、当技術分野において公知の任意の動物モデルシステムが使用され得る。いくつかの好ましいモデルシステムは前に述べている。
【０２６７】
本発明の概要を記載してきたので、以下の実施例を参照することにより、本発明がより容易に理解される。実施例は実例として提供されており、特に明記しない限り、本発明を限定することは意図されない。
（実施例）
（実施例のための材料および方法）
２つの鎖の高分子量キニノゲン（ＨＫａ）が、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＩＮ）から購入された。組換えｂＦＧＦおよびＶＥＧＦは、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から購入された。ＮＨＳ（スルホ）−ＬＣ−ビオチンおよびビス（ｓｕｌｆｏｃｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）スベリン酸塩（ＢＳ３）は、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）より購入された。
【０２６８】
ニワトリの砂嚢Ｔｐｍに対して生じさせた抗Ｔｐｍ  ｍＡｂＴＭ−３１１が、腹水として、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得られ、プロテインＡ―セファロース（登録商標）で精製された。ＨＫａの、ウロキナーゼレセプター（ｕＰＡＲ）のドメイン２＋３への結合をブロックするアフィニティー−精製されたウサギの抗体は、Ｃｏｌｍａｎ，ＲＷら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，１４８１−１４８７に記載されている。ＨＫの、サイトケラチン１への結合をブロックするウサギの抗体は、Ｄｒ．Ａｌｖｉｎ  Ｓｃｈｍａｉｅｒから得た（Ｈａｓａｎ，ＡＡら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：３６１５−３６２０）。ＨＫの、ＥＣ  ｇＣ１ｑＲへの結合をブロックするｍＡｂは、Ｄｒ．Ｂｅｒｈａｎｅ  Ｇｅｅｂｒｅｈｅｗｅｉｔから得られた（Ｊｏｓｅｐｈ，Ｋら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８５５２−８５５７）。
【０２６９】
（キニノゲンドメイン５のクローニング、発現、リフォールディング、および精製）
組換えＨＫａドメイン５（ＨＫａＤ５）が、大腸菌におけるカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）結合体として生成された。簡単に言うと、ドメイン５ｃＤＮＡは、プライマー５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＧＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＣＴＴＣ−３’（配列番号２７）および５’−ＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＴＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２８）を使用して、全長ＨＫｃＤＮＡからＰＣＲ増幅された。精製されたＰＣＲ生成物は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、  発現ベクターｐＣＡＬ−ｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内に結合された。このベクターは、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内に形質転換され、サブクローンが増殖され、１  ｍＭのＩＰＴＧで誘導された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、大多数の発現されたＣＢＰ−ＨＫａ  Ｄ５が封入体内にあることを明らかにした。これらを精製するために、５００ｍｌのバクテリア培養からのペレットが溶解され、４％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ内にホモジェナイズされ、１０，０００  ｘ  ｇで４５分間、遠心分離された。精製された封入体は、７ＭのグアニジンＨＣｌ内で超音波処理され、変性されたタンパク質が遠心分離によって浄化され、次に、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ  ８．８）の１０００ｍｌに加えられた。リフォールドされたＣＢＰ−ＨＫａ  Ｄ５は、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、次にα−トロンビン（２．５μｇ／ｍｇのＣＢＰ−Ｄ５）で消化された。遊離するＨＫａ  Ｄ５が、Ｍｏｎｏ  Ｓを使用して精製された。
【０２７０】
（細胞の培養）
ＨＵＶＥＣが、前述のとおりに単離され、培養された（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．−Ｃ．ら（２０００）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １４：２５８９−２６００）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞が、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得られた。
【０２７１】
（ＥＣ増殖アッセイ）
ｍＡｂ  ＴＭ−３１１の存在下、または非存在下におけるＥＣに対するＨＫａの効果が、前出のＺｈａｎｇらに記載された通りに、増殖アッセイを使用して最初に評価された。ＨＫａの存在下、または非存在下における４８時間のインキュベーション後に各９６ウェルマイクロプレートに残存する細胞の相対数が、Ａｑｕｅｏｕｓ（登録商標）細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して測定された。結果は、ｂＦＧＦに誘導されるＥＣ増殖の阻害パーセントとして示され、これは、本質的にＨＫａに誘導されたＥＣアポトーシスの程度を反映する。本明細書に記載された研究のうちほとんどにおいて、ＥＣマイトジェンとしてｂＦＧＦが使用されているが、ＶＥＧＦを使用しても同じ結果が得られた。
【０２７２】
（ＥＣアポトーシスの評価）
ＨＫａまたはＨＫａ  Ｄ５に誘導されたＥＣアポトーシスに対するＴＭ−３１１の効果が、いくつかの方法を使用して測定された。最初に、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）を使用したコントロールまたはＨＫａが露出したＥＣの染色が、アポトーシスに関連する核の形態における変化を強調表示するために採用された。第２に、アポトーシスが、Ａｐｏ−Ｄｉｒｅｃｔキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、ＴＵＮＥＬ染色によって評価された。全ての核を明確にするために、細胞が、ヨウ化プロピジウムを用いて対比染色され、アポトーシス（ＴＵＮＥＬ陽性）の核のパーセンテージが、手集計によって測定された。最後に、ＤＮＡのヌクレオチド鎖切断によって内皮のアポトーシスを評価するために、０．８％のアガロースゲル電気泳動を使用して、ＥＣのＤＮＡが単離され、分離された。ゲルは臭化エチジウムで染色され、ＤＮＡはＵＶ光を使用して視覚化された。
【０２７３】
（細胞表面上のＴｐｍの露出）
ＥＣ上におけるＴｐｍの露出を検出するために、２つのアプローチが使用された。最初に、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）チャンバ（Ｎｕｎｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ  ＩＬ）内で培養されたコンフルエントな、または増殖性のＥＣが、３．７％のパラホルムアルデヒドへの露出によって固定され、１０％のロバの血清を使用してブロックされ、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１か、非免疫性のマウスのＩｇＧ１か、のいずれかを用いてインキュベートされた。結合された抗体が、ローダミンに結合体化されたロバの抗マウスＩｇＧを使用して検出され、染色された細胞が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ  ６００レーザースキャニング共焦点顕微鏡を使用して試験された。共焦点画像のために、コントロールの染色が黒い背景を背にセットされ、陽性のサンプルが、同じレーザー強度、絞り、ゲイン、および黒いレベルセッティングにおいて見られた。カバーガラス表面から頂点の表面まで、１ミクロンの光学切片が各サンプルについて撮られた。Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン４．０２を使用して投影がなされた。いくつかの実験において、細胞が、染色前にＰＢＳ内の０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００へ１５分間露出された。
【０２７４】
コンフルエントな、または増殖性のＥＣの表面上のＴｐｍの使用可能性を更に評価するために、Ｍａ，Ｋら，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１５５４１−１５５４８に記載されるように、インタクトの、固定されない細胞が、ＮＨＳ（スルホ）−ＬＣ−ビオチンを使用して標識された。標識後、細胞の抽出物が、０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、およびプロテアーゼインヒビターを含有する緩衝液内で調製され、コンフルエントな、およびコンフルエント未満の培養に由来する同じ量のタンパク質が、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１を使用して免疫沈降された。沈殿されたタンパク質は、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜へ移された。ビオチン化されたタンパク質は、Ｋｏｄａｋ  ＸＬ−青いオートラジオグラフィーのフィルムへ露出する前に、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび化学発光試薬とともに膜をインキュベートすることによって検出された（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）。
【０２７５】
（ＨＫａのＥＣへの架橋）
ＨＫａが、増殖するＥＣ上の特異的なタンパク質と相互作用するかどうかを測定するために、本発明者らは、ＨＫａがこのようなタンパク質へ架橋され得るかどうかを測定した。ビオチンで標識されたＨＫａ（Ｍａら，前出）が、増殖する、またはコンフルエントなＥＣと共に３０分間、３７℃でインキュベートされた。次に細胞は洗浄され、二官能価の膜不透過性の架橋剤、ＢＳ３へ、１５分間、室温で露出された。界面活性剤抽出物が調製され、増殖する、またはコンフルエントな培養に由来する４０μｇの細胞タンパク質が、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。タンパク質はＰＶＤＦへ移され、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび化学発光を使用して、ビオチン化されたタンパク質が検出された。架橋手順の特異性を評価するために、やはり、５０倍モル過剰の標識されていないＨＫａの存在下、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を用いて研究がなされた。
【０２７６】
ＥＣおよび精製されたＴｐｍへのＨＫａの結合。ＨＫａのＥＣへの結合は、Ｈａｓａｎ，ＡＡら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９２５６−１９２６１に記載されているように測定された。簡単に言うと、３ｘ１０４のＨＵＶＥＣ／ｍｌが、９６ウェルプレート内で培養され、次に洗浄されて、増加する濃度のビオチン−ＨＫａで、２時間、４℃でインキュベートされた。短時間の洗浄後、細胞は、Ａ４９０を測定する前に、希釈度が１：７５０のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ基質、ターボＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）で連続してインキュベートされた。結合されたＨＫａの絶対量が、Ａ４９０値と、既知の量のビオチン−ＨＫａを使用して調製された標準的な曲線とを比較することによって測定された。結合は、１０μＭ  Ｚｎ２＋の存在下（総結合量を測定するため）、および、非存在下（非特異的な結合を測定するため）、で測定され、特異的な結合が、総結合と非特異的結合との間の差異として定義された（ｖａｎ  Ｉｗａａｒｄｅｎ，Ｆら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：４６９８−４７０３）。解離定数（Ｋｄ）が、Ｐｒｉｓｍソフトウェアプログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、非線形回帰により飽和等温線にフィットすることによって測定された。
【０２７７】
選択された実験において、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１がＨＫａの細胞への結合を阻害する能力が、増加する濃度の抗体の存在下、ビオチン−ＨＫａをＥＣと共にインキュベートすることによって評価された。ＨＫａの結合を５０％阻害したＴＭ−３１１の濃度（ＩＣ５０）が、結合されたＨＫａのプロット対ＴＭ−３１１のログの濃度から測定された。
【０２７８】
精製されたＴｐｍへのＨＫａの結合を測定するために、９６ウェルマイクロプレートが、２０μｇ／ｍｌのニワトリの砂嚢Ｔｐｍ（Ｓｉｇｍａ）、または、コントロールとしてウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）でコーティングされた。次にウェルは、５％の脱脂乳を含有するリン酸塩で緩衝された生理食塩水    を用いたインキュベーションによってブロックされ、増加する濃度のＨＫａ（０．０１−２０ｎＭ）を用いて２時間インキュベートされた。特異的に結合されたＨＫａが、細胞結合アッセイ（ｖａｎ  Ｉｗａａｒｄｅｎら，前出）について記載された通りに、また、１００倍モル過剰の標識されていないＨＫａが、結合のためにビオチン−ＨＫａと競争する能力を評価することによって、定量化された。
選択された実験において、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１および組換えＨＫａ  Ｄ５が、ビオチン−ＨＫａのＴｐｍへの結合を阻害する能力が評価された。これらの研究は、方程式を使用した、ＨＫａ  Ｄ５をＴｐｍへ結合するためのＫｄの決定を可能にした。
【０２７９】
Ｋｄ（Ｄ５）＝ＩＣ５０／（１＋［ＨＫａ］／Ｋｄ（ＨＫａ））
この式において、ＩＣ５０は、ＨＫａ結合を５０％阻害したＨＫａ  Ｄ５の濃度であり、Ｋｄ（ＨＫａ）は、ＨＫａをＴｐｍへ結合するためのＫｄである。
【０２８０】
（ニワトリの漿尿膜の膜のアッセイ）
ニワトリの漿尿膜の（膜（ＣＡＭ）のアッセイが、インビボでのＨＫａの抗血管形成活性におけるＴｐｍの役割を評価するために使用された（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍら（１９９３）Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ４７：４０）。３日齢の受精されたホワイトレグホンの卵が、滅菌したペトリ皿内で割られた。胚が、４％のＣＯ２下、３７℃で、７日目まで培養され、３０ｎｇのｂＦＧＦ（陽性コントロール）か、３０ｎｇのｂＦＧＦならびに１０μｇのＨＫａか、３０ｎｇのｂＦＧＦのいずれかと、１０μｇのＨＫａおよび２０μｇのｍＡｂ  ＴＭ−３１１を含有する３．０ｍｍのフィルターディスクが、ＣＡＭ上に置かれた。各実験の条件が、少なくとも６つの卵において試験された。１０日目に、ＳＰＯＴデジタルカメラを使用して、胚の写真が取られた。血管形成が、フィルターディスクに直接接触する新血管の数を数えることによって定量化された。
【実施例１】
【０２８１】
（Ｔｐｍに特異的な抗体が、ＥＣ上のＨＫａの作用をブロックする）
Ｚｎ２＋が結合されたＨＫａ  Ｄ５の構造を定義することを目的とする予備的な研究（Ｋｕｍａｒ，ＧＡら，２００１，Ａｂｓｔ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２２２：１３４）が、ＨＫａ  Ｄ５と、コラーゲンＸＶＩＩＩのＮＣドメインを含むエンドスタチン（Ｚｎ２＋が結合された抗血管形成ポリペプチド）との間の構造的相同性を示唆した（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，ＭＳら（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５、Ｄｉｎｇ，Ｙ−Ｈら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１０４４３−１０４４６）。
【０２８２】
本発明者らのうちの１人および同僚による先の研究は、先に報告された、このポリペプチドの抗血管形成効果におけるＨＫまたはＨＫａのためのＥＣ結合部位の関わりを示すことができなかった（Ｚｈａｎｇら，前出）。最近の報告は、エンドスタチンの抗血管形成活性が、Ｔｐｍへの結合を通じて媒介されることを示唆した（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，ＮＪら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５１９０−２５１９６）。従って本発明者らは、ＴｐｍがＨＫａと同様に機能するかどうかを測定しようとした。
【０２８３】
最初の研究は、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１が、ＨＫａが増殖因子に誘導されるＥＣ増殖をブロックする能力に影響を与えるかどうかを測定するように設計された。実際ＴＭ−３１１は、濃度に依存する方法において、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦに誘導されるＥＣ増殖の、ＨＫａおよびＤ５に媒介される阻害をブロックした（図１Ａ）。異なるレセプター、すなわち、ウロキナーゼレセプター（Ｃｏｌｍａｎ，ＲＷら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１４８１−１４８７）、ｇＣｌｑＲ（Ｊｏｓｅｐｈら，前出、Ｈｅｒｗａｌｄ，Ｈら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１３０４０−１３０４７）、およびサイトケラチン１（Ｈａｓａｎら，前出）への、ＨＫａの結合をブロックする抗体は、このような効果を有していなかった（図１Ｂ）。
【０２８４】
これらの効果は、ＨＫａに誘導されたＥＣアポトーシスのＴＭ−３１１による阻害を反映した。ＴＭ−３１１は、ＤＮＡのヌクレオチド鎖切断の断片化（図２）と同様に、核形態学におけるアポトーシスの特徴的変化、および、増殖するＥＣのＨＫａまたはＨＫａ  Ｄ５への露出に続くＴＵＮＥＬ陽性の細胞の増加を防止した（Ｚｈａｎｇら，前出）。非免疫性のマウスのＩｇＧ（ＭＯＰＣ−２１骨髄腫タンパク質）も、任意のこのような活性に欠けた。
【０２８５】
これらの効果の特異性は、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１の、このような活性を有する別の抗血管形成薬剤である２−メトキシエストラジオールによって誘導されるＥＣを阻害する能力を評価することによって処理された（Ｙｕｅ，ＴＬら（１９９７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  ５１：９５１−９６２）。しかし、６μＭの非常に高い濃度においても、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１は、２μＭの２−メトキシエストラジオールによって誘導されるＥＣアポトーシスを阻害しなかった（図２、第６レーンと第７レーンの対比）。
【実施例２】
【０２８６】
（Ｔｐｍは活性化されたＥＣ表面上に存在する）
実施例１の結果は、ＨＫａに誘導されたＥＣアポトーシスの媒介におけるＴｐｍの本質的な役割を示唆した。しかし、Ｔｐｍは骨格タンパク質であり、それが内皮表面上に露出されるとの報告はなかった。実際、唯一先の研究で示されたのが、任意の細胞タイプ−大腸の上皮細胞および大腸の癌腫株の細胞の表面上で観察された、Ｔｐｍの単一アイソフォーム、すなわちｈＴＭ５であった（Ｋｅｓａｒｉ  ＫＶら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）．１１８：２１９−２７）。最近の報告は、エンドスタチンの抗血管形成活性がＴｐｍとの相互作用を要することを示唆したが、これが起こるためには、エンドスタチンのインターナリゼーションが必要であると仮定された（ＭｃＤｏｎａｌｄら，前出）。
【０２８７】
ＴｐｍがＥＣ表面上で発現されるかどうかを評価するため、および、ＥＣを増殖するためのＨＫａの選択性を取り扱うために、本発明者らは、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１で染色されたＥＣの増殖する培養およびコンフルエントな培養を評価した。増殖する細胞がＴＭ−３１１で特異的に染色され（図３Ａ対図３Ｂ）、これらの細胞の表面の染色が、コンフルエントな細胞の場合よりも顕著であった（図３Ｂ対図３Ｃ）。増殖する細胞における表面の染色のパターンは、特にコンフルエントな細胞において明白である（図３Ｃ）、Ｔｐｍの細胞内プールが、より顕著ではあったが、細胞が染色前に０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００への露出によって透過された場合に変化しなかった。
【０２８８】
ＥＣ表面上においてＴｐｍが存在する結果を確認するために、増殖するＥＣまたはコンフルエントなＥＣ上の表面タンパク質がビオチンで標識され、この標識された界面活性剤抽出物は、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１を用いて免疫沈降された。ＴＭ−３１１は、予期されるＴｐｍの分子量（Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒ，ＪＰら（１９９１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １３：４２９−４３７、Ｌｉｎ，ＪＪＣら，（１９９７）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  １７０：１−３８）と一致して、両方のＥＣ培養から、約３６ｋＤａおよび約４０ｋＤａのタンパク質を沈降した（図４）。しかし、これらのタンパク質は、増殖する細胞からの方が、著しく多い量が沈降された（図４）。
【０２８９】
（ＨＫａのＥＣおよびＴｐｍへの結合の特徴づけ）
ＨＫａがＥＣ上のＴｐｍへ結合する可能性を更に評価するために、いくつかのアプローチが使用された。
【０２９０】
第１に、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１がＨＫａのコンフルエント未満のＥＣへの結合をブロックする能力が試験された。ビオチン−ＨＫａは、Ｚｎ２＋に依存する方法において、約２．５ｎＭのＫｄで、これらの細胞に特異的に結合した（図５Ａ）。コントロールＩｇＧ（ＭＯＰＣ−２１）ではなく、ＴＭ−３１１が、ＨＫａの細胞への特異的な結合を、約９０％阻害した（図５Ｂ）。
【０２９１】
次に、９６ウェルマイクロプレートにおいて固定化された精製されたＴｐｍへのＨＫａの結合が研究された。結果は図６Ａ〜６Ｃ／ＰＮＡＳに示されている。ＨＫａは、同様の親和性で（約２．６ｎＭのＫｄ）、および、Ｚｎ２＋に依存する方法で、精製されたＴｐｍに結合した（図６Ａ）。ｍＡｂ  ＴＭ−３１１（図６Ｂ）と同様にＨＫａ  Ｄ５（図６Ｃ）も結合を阻害し、ＨＫａ  Ｄ５が高い親和性によりＴｐｍに結合することが確認された（推定されるＫｄは約２．１ｎＭ）。
【０２９２】
新しい図７は、ＥＬＩＳＡによる、固定化されたＴｐｍへのｍＡｂ  ＴＭ−３１１の直接結合を示している。図８は、この抗体が、このような固定化されたＴｐｍへ結合するために、ＨＫａと競合するという追加的な証拠を提供する。
【０２９３】
最後に、ビオチン化されたＨＫａが、ＴｐｍのサイズのＥＣ表面タンパク質へ架橋され得るかどうかを測定するための研究がなされた。膜不透過性の架橋剤、ＢＳ３へ露出する前にコンフルエントなＥＣとともにインキュベートされた場合、ビオチン−ＨＫａは細胞の抽出物内においてほとんど検出可能ではなかった（図５、レーン１）。しかし、ＨＫａは、増殖する細胞の抽出物内における、非複合型の形態（１１０ｋＤａ以下のＭｒ）、および、広範囲の高分子量の複合物（図５、レーン３）の両方において検出された。ＨＫａとＴｐｍとの間の複合体は、約１４０〜１５０ｋＤａのＭｒを示すことが予期される。実際、このサイズの別のバンドが、広範囲のバンド内で観察された（図５、矢印）。
【０２９４】
この相互作用の特異性は、複合体の形成が、過剰な標識されないＨＫａによって防止された点（図５、レーン４）、および、細胞がＥＣであるよりもむしろＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞であった場合に、高分子量の複合体が観察されなかった点（図５、レーン５）の観察によって支持される。
【０２９５】
１５０ｋＤａより大きい分子のサイズを有する複合体内にＨＫａが存在することは、アクチンまたはその他のＴｐｍ結合タンパク質とＨＫａ−Ｔｐｍ複合体の会合、または、ＨＫａとその他のＥＣ結合タンパク質との間の複合体から生じ得る。
【実施例３】
【０２９６】
（ＭＡｂ  Ｔｍ  ３１１は、インビボにおけるＨＫａの抗血管形成の効果をブロックする）
インビボの血管形成モデルにおけるＴｐｍの機能的役割を評価するために、ＣＡＭアッセイが採用された。結果は図８Ａ〜８Ｄに示されている。ＨＫａは、血管の数を数えることによって測定された通り、ｂＦＧＦを含有するフィルターディスクによって誘導される血管形成を約８５％阻害した（図８Ａ対図８Ｃ）。ＨＫａ  Ｄ５を使用しても同様の結果が得られた（Ｃｏｌｍａｎ，ＲＷら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５：５４３−５５０）。しかし、ＨＫａの抗血管形成の効果は、ＴＭ−３１１によってブロックされたが（図８Ｃ対図８Ｄ）、一方で、非免疫性のマウスのＩｇＧは効果なしだった。これらの結果は、Ｔｐｍが、インビボ並びにインビトロにおけるＨＫａの抗血管形成活性を媒介し、よって、ＨＫａのための「抗血管形成」結合部位として機能し得ることを示している。
【０２９７】
（実施例１〜３の考察）
本明細書に示された結果は、ＨＫａが、ＨＫａ  Ｄ５ドメインに関する相互作用を通じ、高い親和性をもってＴｐｍへ結合すること、および、抗Ｔｐｍ抗体によるこの相互作用の阻害が、（ａ）ＥＣアポトーシスの誘導と、（ｂ）ＨＫａによる血管形成の阻害と、をブロックすることを証明している。これらの観察は、増殖するＥＣ上におけるＨＫａの効果が、Ｔｐｍへの直接結合を通じて媒介されるという説得力のある証拠を提供する。
【０２９８】
ＨＫａのための新しいＥＣ結合部位を同定することに加え、Ｔｐｍ、すなわち細胞骨格タンパク質が、増殖する細胞の表面上に優先的に露出されるということを示すことによって、本発明は、血管形成中のＥＣの生物学に対する洞察を提供する。内皮表面上におけるＴｐｍの露出は、（ａ）直接の視覚化、および、（２）Ｔｐｍがビオチン化されたＮＨＳ（スルホ）ＬＣ−ビオチンであり得る事実、によって立証された。
【０２９９】
より早い段階の研究におけるＨＫまたはＨＫａのＥＣへの結合の試験では、コンフルエントな、静的なＥＣの単層が使用された。しかし、現在の研究結果は、これらの条件下において、Ｔｐｍが細胞表面において最小限に利用可能であり、単鎖の（Ｈａｓａｎら，前出、Ｈｅｒｗａｌｄら，前出、Ｈａｓａｎ，ＡＡら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１８２２−３１８３０、Ｈｅｒｗａｌｄ，Ｈら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４６３４−１４６４２、Ｄｅｄｉｏ，Ｊら（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９９：２５５−２５８、Ｄｅｄｉｏ，Ｊら，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３５３４−３５４２）、または２本鎖の（Ｃｏｌｍａｎら，１９９７，前出）、高分子量のキニノゲンを結合する際におけるより顕著な役割に対して、その他の結合部位を残していることを示している。
【０３００】
これらの研究結果は、ＥＣの細胞骨格が、静止状態と増殖状態との間を移行する間に劇的な構造上の再配置を経験する（Ｉｎｇｂｅｒ，ＤＥ（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５９：５７５−５９９、Ｉｎｇｂｅｒ，ＤＥら（１９９５）Ｊ．：Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ２８：１４７１−１４８４、Ｈｕａｎｇ，Ｓら（２０００）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６１：９１−１０３）ことを示す研究と一致する。
【０３０１】
しかし、アクチンが培養されたＥＣ表面上に示されたという１つの報告（Ｄｕｄａｎｉ，ＡＫら（１９９６）Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ９５：１６８−１７８）以外には、ＥＣ表面上における細胞骨格構成成分の露出に関する証拠がほとんどない。従って、現在の結果は、細胞骨格がすべての条件下でＥＣ形質膜の境界内に単独で存在する、というパラダイムに疑問を投げかけるものである。更に、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１がＨＫａの抗血管形成活性を阻害するという観察が、Ｔｐｍがインビボにおいて血管形成ＥＣの表面上で利用可能であることを示唆している。
【０３０２】
脊椎動物の細胞は、細胞特異的方法において多数のＴｐｍアイソフォームを発現する。非筋肉の細胞におけるＴｐｍの発現は、少なくとも８つのアイソフォームを発現する（Ｌｉｎら，前出）、ヒトの線維芽細胞において最も集中して研究されてきた。本発明者らは、ＥＣも複数のＴｐｍアイソフォームを発現することを示唆する結果を得てきた。
Ｔｐｍの主な役割は、アクチンフィラメントを結合し安定化させること、それらが、ゲルゾリンまたはアクチン脱重合因子などの因子によって分離または脱重合することから保護すること、である（Ｌｉｎら，前出、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：７４９０−７４９７）。Ｔｐｍアイソフォーム発現における変化は、細胞の形質転換において役割を果たすことが報告されており（Ｌｉｎら，前出、Ｔａｋｅｎａｇａ，Ｋら，（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：３９３４−３９３７、Ｐｒａｄａｄ，ＧＬら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９０：７０３９−７０４３）、Ｔｐｍが細胞骨格の組織化の状態に影響を与え得ることを示唆している。本発明に従えば、Ｔｐｍの発現および細胞の局在化における変化は、静止状態から「血管形成」表現型へのＥＣの移行に寄与する。
ＨＫａの抗血管形成活性に要する内皮結合部位としてのＴｐｍの同定は、ＨＫａがＥＣアポトーシスを誘導するメカニズムに関するいくつかの問題を引き起こす。ＨＫおよびＨＫａは抗付着性の特性を有するが（Ｃｏｌｍａｎ，ＲＷら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ９０：３８１９−３８４３、Ｃｈａｖａｋｉｓ，Ｔら，（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６：５１４−５２２）、一般的に抗付着性活性と関連する濃度未満の濃度において、ＨＫａが増殖するＥＣのアポトーシスを誘導する能力は、ＨＫａの抗血管形成活性の原因となる追加的なメカニズムを支持して実証される（Ｚｈａｎｇら，前出）。前述の開示された結果は、ＨＫａがＥＣの細胞骨格に直接影響を与え得、おそらく、細胞骨格とインテグリン接着レセプターとの間の相反性の相互作用に依存して、下流のシグナル伝達経路において第２の変化を引き起こすことを示唆する。実際、細胞骨格を通して媒介される生体力学の影響は、細胞周期へのエントリー、細胞成長、およびアポトーシスなどの生命の過程において重大な役割を果たす（Ｉｎｇｂｅｒら，前出、Ｈｕａｎｇら，前出）。
【０３０３】
ＭａｃＤｏｎａｌｄら，前出、による最近の報告は、エンドスタチン結合環状ペプチドと反応性を有する抗体が、ヒトのＴｐｍ  ３（ｈＴＭ３）と交差反応したこと、および、ｈＴＭ３が、インビボにおけるエンドスタチンの抗血管形成の効果に関わり得ること、を開示した。前述の研究において採用された、この抗体およびｍＡｂ  ＴＭ−３１１の両方が、約３８ｋＤａの分子量を有するＥＣタンパク質を認識し、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１（Ｔｐｍアイソフォーム特異性がよく特徴づけされていなかった）は、ｈＴＭ３を認識することを示唆する。
【０３０４】
ＴＭ−３１１がＨＫａに誘導されたＥＣアポトーシスをブロックしたので、ｈＴＭ３がＨＫａの抗血管形成活性を同様に媒介し得る可能性がある。しかし、現在の研究において、ＴＭ−３１１は、約３６ｋＤａおよび約４０ｋＤａの２つのＥＣタンパク質を認識した（図３）ので、ＨＫａの活性の媒介におけるｈＴＭ３の任意の特定の役割は、決定的なものではない。実際ＨＫａがｈＴＭ３を結合するのであれば、ＨＫａのＴｐｍに対する親和性（Ｋｄが約２．６ｎＭ）がエンドスタチンの親和性より桁数が多い（Ｋｄが約１００μＭ）ので、この相互作用はエンドスタチンの相互作用と異なり得る。更に、ＭａｃＤｏｎａｌｄら，前出、は、高分子量のキニノゲンがＥＣによってインターナリゼーションされない（Ｈａｓａｎ，ＡＡら，（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：３１３４−３１４３）一方で、エンドスタチンがｈＴＭ３と相互作用する前にインターナリゼーションを要し得ることを示唆した。
【０３０５】
現在の結果が、ＨＫａが細胞表面に露出されたＴｐｍへ直接結合するという概念を支持するので、エンドスタチンがＴｐｍとの相互作用の前にインターナリゼーションされるという必要条件を再考することは、有用であり得る。それでもなお、少なくとも２つの抗血管形成ポリペプチドが、Ｔｐｍとの相互作用を通じてＥＣに結合するという観察は、Ｔｐｍ、および、おそらくはその他の骨格タンパク質の、自然に発生する血管形成インヒビターの活性を媒介する際のより広い役割において有利に働く。
【０３０６】
要約すると、本発明は、ＨＫａの抗血管形成活性の根底にある、ＨＫａとＥＣのＴｐｍとの間の新規の相互作用の発見に基づく。これはまた、病理学的血管形成過程の抑止に向けて標的とされる新規の薬剤の開発のための基盤として役立つ。
【実施例４】
【０３０７】
（ＨＫａおよびその他の抗血管形成薬剤のＴｐｍへの結合）
ＨＫａおよびそのドメインＤ５（これは、全部ではないにしろ、抗血管形成活性のほとんどを有する）のＴｐｍへの結合親和性が、ニワトリの砂嚢のＴｐｍがプレートに固定化されたと先に記載したのと同じように、プレート結合アッセイ内で測定された。図１５に示されているように、両方のタンパク質に関して得られたＫｄ値は、約１ｎＭであった。この値は、ＨＵＶＥＣを用いてインビボで得られた値と同一である。
【０３０８】
その他のヒトＴｐｍヒトアイソフォームが、この同じアッセイで試験され、同様の結果が得られた。いくつかのその他の抗血管形成タンパク質も、Ｔｐｍに結合する。エンドスタチンは、約２μＭのＫｄで、固定化されたＴｐｍに結合し、これは先に報告されたものよりも５０倍高い（ＳＰＲで測定）が、ＨＫａまたはＨＫａ−Ｄ５結合の親和性よりも約１０００倍低い（図１４および図１５）。
【０３０９】
トロポニンＩは、筋肉細胞において結合してアクチンの収縮性を制御するトロポニン複合体の構成成分であり、やはり抗血管形成分子であることが発見されている。トロポニンＩは、ナノモルの範囲のＫｄ値で、固定化されたＴｐｍへ結合するようである。
【実施例５】
【０３１０】
（ＨＰＲＧに由来する短いペプチドによるＴｐｍ結合および血管形成の阻害）
豊富な複数のドメインの血漿タンパク質であるヒスチジン−プロリン−リッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）が、本発明者の何人かおよび彼らの同僚によって示され、強い抗血管形成特性を有するにことが示された（２００２年２月１４日出願の、米国特許出願番号第６０／２６８３７０号および第１０／０７４，２２５号。これらはその全体が参考として本明細書中に援用される）。
【０３１１】
興味深いことに、ウサギのＨＰＲＧ、および、抗血管形成活性の原因である、ＨＰＲＧのヒスチジン−プロリンリッチ（「Ｈ／Ｐ」）ドメインは、高い親和性および特異性で、Ｔｐｍへ結合する（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。算出されたＫｄは、約２ｎＭであり、Ｔｐｍへ結合するＨＫａまたはＨＫａ−Ｄ５のＫｄと同様である。コントロールとして、すべてのＨＰＲＧマイナスＨ／Ｐドメインに対応する、ウサギのＮ／Ｃフラグメントは、試験された濃度において結合を示さない（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。
【０３１２】
ウサギのＨＰＲＧのＨ／Ｐドメインは、ＨＨＰＨＧ（配列番号２９）の２回の繰り返し、ＰＰＰＨＧ（配列番号３０）の７回の繰り返し、ＨＰＰＨＧ（配列番号３１）の６回の繰り返しで構成される。ヒトのＨ／Ｐドメインは、配列ＨＨＰＨＧの１０個のタンデム反復を含有する。結合されたヒトとウサギのコンセンサス配列は、（Ｈ／Ｐ）（Ｈ／Ｐ）ＰＨＧ（配列番号３２）と呼ばれる。
【０３１３】
重要な抗血管形成活性を有するＨ／Ｐドメイン内の最小配列を同定するための努力において、本発明者らは、前述のコンセンサス配列から３つのペプチド  を合成し、評価した（ＨＨＰＨＧ、ＨＰＰＨＧおよびＰＰＰＨＧ）。これら３つのペプチドの固定化されたＴｐｍへの結合親和性と共に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｐｌｕｇアッセイにおける活性が測定された。表５に概要が示されている。
【０３１４】
表５に示されたペプチドのための、ビオチン化されたＨＫａの置換のためのＩＣ５０値が、以下の通りに測定された：１０ｎＭのビオチン−ＨＫａが、１０μＭのＺｎＣｌ２の存在下、事前に２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍでコーティングされた９６ウェルプレートへ加えられる。増加する量のペプチドがウェルに加えられる。残存するＴｐｍへのビオチン−ＨＫａ結合が、アビジン−ＨＲＰおよび色素生産性基質を使用して検出された。Ｋｄ値が、実験によって得られるデータの非線形回帰分析によって測定された。Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｐｌｕｇアッセイに対する効果が、以下の通りに測定された：４００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５０μｇ／ｍｌのヘパリンを含有し、ペプチド（３００μＭ）ありまたはなし、または生理食塩水緩衝液を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（０．５ｍＬ）が、マウスの横腹に注射される。５日後、プラグが除去され、このプラグがスキャンされる。
【０３１５】
ペプチドＨＨＰＨＧは、約１００μＭの親和性でＴｐｍを結合し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｐｌｕｇアッセイにおいて実質的な活性を有する。ＨＰＰＨＧにおける第１のＨｉｓのアラニン置換（ＡＰＰＨＧを生成するための）は、Ｔｐｍ結合および抗血管形成活性の完全な欠失を引き起こす（図１６および図１７）。従って、Ｔｐｍ結合活性の欠失は、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグにおいて、抗血管形成の欠失と同調して起こった。
【０３１６】
【表５】
2006501139.tif 000019
ＨＨＰＨＧはまた、ＭａｔＬｙＬｕ前立腺癌細胞に対して抗腫瘍活性を示したが、一方で、Ａｌａで置換された突然変異体、ＡＨＰＨＧ（配列番号３６）は、その中において、インビトロでのＴｐｍへの結合が無効にされたが、やはり著しく少ない抗腫瘍活性を有する（図１８）。
【０３１７】
ペンタペプチドＨＨＰＨＧのＮ端末は、生産的な分子の接触（または相互作用）を増やすことによって、Ｔｐｍに対するペンタペプチドの親和性を増加させる試みにおいて、誘導体化された（キャップされた）。表６は、親化合物よりも高いＴｐｍに対する親和性を既に有するキャッピング基を含む、これらの誘導体のうちいくつかを示す。表に示された、キャップされたペプチドのためのビオチン化されたＨＫａの置換に対するＩＣ５０値は、以下により測定された：１０ｎＭのビオチン−ＨＫａが、１０μＭのＺｎＣｌ２の存在下、事前に２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍでコーティングされた、９６ウェルプレートに加えられた。増加する量のペプチドが、ウェルに加えられた。残存する、Ｔｐｍに結合されたビオチン−ＨＫａが、アビジン−ＨＲＰおよび色素生産性基質を使用して検出された。Ｋｄは、実験によって得られるデータの非線形回帰分析によって測定された。
【０３１８】
【表６】
2006501139.tif 000020
【実施例６】
【０３１９】
（ＨＰＲＧおよびＨ／ＰドメインがインビボでのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）プラグモデルにおいてＦＧＦ−２によって刺激された血管形成を阻害する）
本発明者らは、ＨＫａ−Ｄ５に結合するＴｐｍの領域を同定した。ニワトリの砂嚢のＴｐｍが、異なるヒトのＴｐｍアイソフォームへの相同性の程度が高いことから、モデルとして使用されてきた。
【０３２０】
このＴｐｍは、キモトリプシンで部分的にタンパク分解された。約２０〜２５ｋＤａのフラグメントが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク分解中に富化されるとして同定された（図１９）。このフラグメントが、セファロース樹脂に固定化されたＨＫａ−Ｄ５ドメインに結合するということは、ＨＫａ−Ｄ５に結合する領域を含有することを示唆する。
【０３２１】
このフラグメントは、セファロース−ＨＫａ−Ｄ５のアフィニティーカラムに、キモトリプシン消化物を通すことにより、部分的に精製された。カラムは広範に洗浄され、高い塩の緩衝液で溶出された。その結果得られた材料がＳＤＳゲル上で泳動された。図２０に示される。前述のように単離されたＴｐｍのキモトリプシンフラグメントが、水に対して透析され、Ｎ末端配列決定（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、および、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙの施設における質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にかけられた。このフラグメントのＮ末端配列は、配列番号１の残基６１〜６９（または配列番号２の残基１〜９）として上に示される。
【０３２２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析から推定されるこのフラグメントの分子量は、約１７ｋＤａであった。配列に基づくこのポリペプチドの実際の分子量は、１７，６８４．６Ｄａである。
【実施例７】
【０３２３】
（ＨＫａ  Ｄ５に結合する環状ペプチドによる血管形成の阻害）
以下の３つの環状ペプチドが、ＨＫａ−Ｄ５を結合することが発見され、試験された。
【０３２４】
【数９】
2006501139.tif 000021
これらの環状ペプチドは、２つの末端Ｃｙｓ残基の間のジスルフィド連結によって安定化され、末端Ｃ（システイン）残基の間の「ライン」または「結合」として上に示される。
【０３２５】
これらのペプチドが固定化されたＴｐｍに結合したＨＫａを置換するかどうかを調べるために、研究が行なわれた。その結果が図２１に示される。
【０３２６】
図２１に示された結合の結果は、環状ペプチドであるＡＴＮ−３１０、ＡＴＮ−３１１およびＡＴＮ−３１２（図の挿入部分において、それぞれ３１０．０００．０１、３１１．０００．０１および３１２．０００．０１とされる）が、Ｔｐｍに結合されるＨＫａを置換したが、一方で、コントロールＡＴＮ−２４６は置換しなかった（示されていない）ことを示している。この実験において、１０ｎＭのビオチン−ＨＫａが、１０μＭのＺｎＣｌ２の存在下、事前に２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍでコーティングされた９６ウェルプレートに加えられた。増加する量のこの３つの環状ペプチドが、示されたようにウェルに加えられた。結合されたビオチン−ＨＫａが検出され、図１０に関する記載と同様に、Ｋｄが算出された。
【０３２７】
これらの環状ペプチドは、ＭａｔｒｉｇｅｌプラグアッセイにおけるインビボでのｂＦＧＦに誘導される血管形成を阻害する能力についても試験された。４００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１０μＭのペプチド（ＡＴＮ−３１０、ＡＴＮ−３１１、またはＡＴＮ−３１２）を含むまたは含まない５０μｇ／ｍｌのヘパリン、またはコントロール用の生理食塩水緩衝液を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（０．５ｍＬ）が、前述の通りにマウスの後部脇腹に皮下注射された。すべての処置が３連で行なわれた。５日後、フルオレセインイソチオシアネートと結合体化された１００μｌのデキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン；ＭＷ  ２５０，０００，Ｓｉｇｍａ）のｉ．ｖ．注射の後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグの血管新生が蛍光定量的に測定された。注射の５日後、プラグが除去され、組織がすりつぶされて、上清内に血管性のＦＩＴＣ−デキストランを放出させた。上清のサンプルが、プラグの血管分布を測定するために、蛍光定量法にかけられた。脈管構造（新血管）の量は、プラグの総血管血液量を反映する蛍光シグナルに直接的に比例する。結果は下の表７に、陰性コントロールに対する任意の蛍光単位または阻害のパーセンテージとして表される。
【０３２８】
【表７】
2006501139.tif 000022
この濃度においては、３つのペプチドが全て非常に効果的な血管形成のインヒビターであることが結論づけられた。これらの環状ペプチドの濃度がより低い場合にも、血管形成の阻害が観察された。
【０３２９】
前述の文献は、具体的に援用されているかどうかにかかわらず（その中に記載された文献と同様に）、すべて参考として本明細書中に援用される。
【０３３０】
本発明について完全に詳しく記載したものの、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、過度の実験を要さずに、広範囲の等価のパラメータ、濃度、および条件内において、本発明が実行され得ることが、当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３３１】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＥＣ増殖のＨＫａによる阻害および抗Ｔｐｍ抗体による防止を示している。図１Ａは、２０ｎＭ  ＨＫａ（白い棒グラフ）および６０ｎＭ  ＨＫａドメイン５（黒い棒グラフ）による、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）に誘導されたＥＣ増殖の阻害が、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１濃度を高めることによって予防されることを示している。図１Ｂは、ＨＫａによるＥＣ増殖の阻害における、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１および他のＥＣ  ＨＫまたはＨＫａ結合タンパク質に対する、抗体の効果を示している。（１）１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（刺激物）、（２）ｂＦＧＦ＋20ｎＭのＨＫａ、または（３）ｂＦＧＦ＋ＨＫａ＋抗体（３００ｎＭ）を添加した後に、増殖が測定された。試験された抗体は、ウロキナーゼレセプター（抗−ｕＰＡＲ）またはサイトケラチン１（抗−ＣＫ１）に対するポリクローナル抗体、あるいは、Ｃ１ｑ（抗−ｇＣ１ｑＲ）の球状ヘッドのためのレセプターに対する、またはＴｐｍ（ＴＭ−３１１）に対するｍＡｂｓであった。コントロール抗体には、ｍＡｂについてのＭＯＰＣ−２１（マウスのＩｇＧ１）、およびポリクローナルについては非免疫ウサギＩｇＧ（ＮＲＩｇＧ）が含まれた．
【図２】図２は、ＤＮＡのヌクレオチド鎖切断によって評価される、ＨＫａに誘導されたＥＣアポトーシスにおけるｍＡｂ  ＴＭ−３１１の効果を示している。ＥＣのＤＮＡは、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１のみ（レーン１）、２０ｎＭのＨＫａ（レーン２）、２０ｎＭのＨＫａ＋６０ｎＭのＴＭ−３１１（レーン３）、５０ｎＭのＨＫａドメイン５（レーン４）、５０ｎＭのＨＫａドメイン５＋１５０ｎＭのｍＡｂ  ＴＭ−３１１（レーン５）、２μＭの２−メトキシエストラジオール（レーン６）、または２μＭの２−メトキシエストラジオール＋６μＭのｍＡｂ  ＴＭ−３１１（レーン７）の存在下で、１２時間培養された細胞から単離された。
【図３】図３は、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１によって内皮Ｔｐｍを免疫沈降した結果を示している。増殖性およびコンフルエントなＨＵＶＥＣにおける細胞表面タンパク質が、ＮＨＳ−ＬＣビオチンで標識された。界面活性剤抽出物が調製され、各培養液からの同量のタンパク質が、ＴＭ−３１１またはＭＯＰＣ−２１を使用して免疫沈降された。免疫沈降されたタンパク質は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して単離され、ＰＶＤＦに移され、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよび化学発光を使用して検出された。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、共焦点レーザー走査顕微鏡による、増殖性およびコンフルエントなＥＣの分析を示す顕微鏡写真のセットである。図１Ａは、コントロールＭＯＰＣ−２１で染色された増殖性ＥＣを示している。図１Ｂは、ＴＭ−３１１で染色された増殖性ＥＣを示している。図４Ｃは、ＴＭ−３１１で染色されたコンフルエントなＥＣを示している。（Ｃ）の画像は、８つの個体の共焦点の「カット」の編集（細胞の可視化に必要）を表している。一方で、（Ｂ）の画像は、シングルカットのみを表している。すべての細胞は、染色の前に、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００への露出によって透過化処理された。
【図５】図５は、ＥＣ表面タンパク質へのＨＫａの架橋を示している。ビオチン−ＨＫａは、ＢＳ３を使用して架橋する前に、２０倍モル過剰の非標識ＨＫａの非存在下（レーン１および３）、または２０倍モル過剰の存在下（レーン２および４）で、コンフルエントな（レーン１および２）または増殖的な（レーン３および４）ＥＣとともにインキュベートされた。ビオチン−ＨＫａはまた、同一の条件（レーン５）下、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞とともにインキュベートされた。界面活性剤抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離され、次にＰＶＤＦに移され、化学発光によって検出された。矢印は、約１４０〜１５０ｋＤａのバンドが顕著であることを表しているが、これはＨＫａ−Ｔｐｍ複合物において予想されるサイズである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、増殖性ＥＣへのＨＫａの特異的結合およびそのｍＡｂ  ＴＭ−３１１による阻害を示している。図６Ａは、増殖を誘導する条件下で培養されたＥＣへのＨＫａの特異的結合を示している。固定されていない細胞は、１０μＭのＺｎ２＋の非存在下または存在下、濃度が増加するビオチンＨＫａとともにインキュベートされた。細胞が結合されたビオチン−ＨＫａは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ基質ターボＴＭＢを使用して検出された。曲線は非線形回帰に一致し、約２．５ｎＭのＫｄを産出した。図６Ｂは、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１による、増殖性ＥＣへのビオチン−ＨＫａの結合の阻害を示している。ビオチン−ＨＫａ（２０ｎＭ）は、１０μＭのＺｎ２＋および濃度が増加するｍＡｂ  ＴＭ−３１１の存在下、ＥＣとともにインキュベートされた。
【図７−１】図７Ａ−７Ｃは、精製され、固定化されたＴｐｍへのＨＫａの特異的結合およびその阻害を示している。図７Ａは、精製されたニワトリの砂嚢のポリスチレンに固定化されたＴｐｍへのＨＫａの特異的結合を示している（９６ウェルマイクロプレートにおいて）。プレートは、１０μＭのＺｎ２＋の非存在下または存在下、濃度が増加するビオチン−ＨＫａとともにインキュベートされた。結合されたリガンドは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびターボＴＭＢを使用して測定され、曲線は非線形回帰に一致し、約２．５ｎＭのＫｄを生じた。図７Ｂは、１０μＭのＺｎ２＋の存在下における、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１による、固定化Ｔｐｍ（前述のとおり）への２０ｎＭのビオチン−ＨＫａの結合の阻害が示されている。図７Ｃは、ＨＫａドメイン５（Ｄ５）が、精製されたＴｐｍへの２０ｎＭのビオチンＨＫａの結合を阻害することを示している。この阻害に関するＩＣ５０は、約８．１ｎＭであった。
【図７−２】図７Ａ−７Ｃは、精製され、固定化されたＴｐｍへのＨＫａの特異的結合およびその阻害を示している。図７Ａは、精製されたニワトリの砂嚢のポリスチレンに固定化されたＴｐｍへのＨＫａの特異的結合を示している（９６ウェルマイクロプレートにおいて）。プレートは、１０μＭのＺｎ２＋の非存在下または存在下、濃度が増加するビオチン−ＨＫａとともにインキュベートされた。結合されたリガンドは、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼおよびターボＴＭＢを使用して測定され、曲線は非線形回帰に一致し、約２．５ｎＭのＫｄを生じた。図７Ｂは、１０μＭのＺｎ２＋の存在下における、ｍＡｂ  ＴＭ−３１１による、固定化Ｔｐｍ（前述のとおり）への２０ｎＭのビオチン−ＨＫａの結合の阻害が示されている。図７Ｃは、ＨＫａドメイン５（Ｄ５）が、精製されたＴｐｍへの２０ｎＭのビオチンＨＫａの結合を阻害することを示している。この阻害に関するＩＣ５０は、約８．１ｎＭであった。
【図８】図８Ａ−８Ｄは、ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）におけるインビボでの血管形成に対するＨＫａおよび／またはＴＭ−３１１の効果を示している。ｂＦＧＦ（図８Ａ）、ｂＦＧＦ＋ＴＭ−３１１（図８Ｂ）、ｂＦＧＦ＋ＨＫａ（図８Ｃ）、およびｂＦＧＦ＋ＨＫａ＋ＴＭ−３１１（図８Ｄ）の効果である。ＨＫａは、塩基性ＦＧＦに誘導された血管形成を阻害した。次にＨＫａの抗血管形成の効果は、ＴＭ−３１１によって阻害された。
【図９】図９は、固定化Ｔｐｍへの抗Ｔｐｍ抗体の直接結合を示している。増加する量のビオチン化抗Ｔｐｍ抗体が、事前に２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍでコートされた９６ウェルプレートに加えられた。結合された抗Ｔｐｍ抗体が、アビジンＨＲＰおよび色素生産性基質を使用して検出された。Ｋｄは、実験によって得られるデータの非線形回帰分析により測定された。
【図１０】図１０は、抗Ｔｐｍ抗体による、ビオチンＨＫａのＴｐｍへの結合についての競合を示している。１０ｎＭのビオチンＨＫａが、１０μＭのＺｎＣｌ２の存在下、２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍで事前にコートされた９６ウェルプレートに加えられた。増加する量の抗Ｔｐｍ  ｍＡｂ  ＴＭ３１１抗体が加えられた。結合されたビオチンＨＫａが、アビジンＨＲＰおよび色素生産性基質を使用して検出された。図９と同様にＫｄが測定された。
【図１１】図１１は、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグモデルにおける、抗Ｔｐｍ  ｍＡｂによる血管形成の阻害を示している。４００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２０μｇの抗Ｔｐｍ  ｍＡｂを含むまたは含まない５０μｇ／ｍｌのヘパリン、または食塩水緩衝液を含有するＭａｔｒｉｇｅｌのアリコート（０．５ｍＬ）が、マウスの脇腹に注射された。５日後、プラグが除去され、ヘモグロビン水準が測定された。ポジティブコントロール（処置なし）からネガティブコントロール（ｂＦＧＦなし）を引いた場合のヘモグロビン水準が、１００％として設定された。
【図１２】図１２および１３は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＭａｔＬｙＬｕモデルにおける、血管形成および腫瘍の成長の抗Ｔｐｍ抗体による阻害を示している。３０μｇの抗Ｔｐｍ  ｍＡｂを含むまたは含まない２×１０６ＭａｔＬｙＬｕ細胞、または食塩水緩衝液を含有するＭａｔｒｉｇｅｌのアリコート（０．５ｍＬ）が、マウスの脇腹に注射された。７日後、プラグが除去され、スキャンされ、秤量され、ヘモグロビン水準が測定された。ポジティブコントロール（処置なし）からネガティブコントロール（細胞なし）を引いた場合のヘモグロビン水準が、１００％として設定された。
【図１３】図１２および１３は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＭａｔＬｙＬｕモデルにおける、血管形成および腫瘍の成長の抗Ｔｐｍ抗体による阻害を示している。３０μｇの抗Ｔｐｍ  ｍＡｂを含むまたは含まない２×１０６ＭａｔＬｙＬｕ細胞、または食塩水緩衝液を含有するＭａｔｒｉｇｅｌのアリコート（０．５ｍＬ）が、マウスの脇腹に注射された。７日後、プラグが除去され、スキャンされ、秤量され、ヘモグロビン水準が測定された。ポジティブコントロール（処置なし）からネガティブコントロール（細胞なし）を引いた場合のヘモグロビン水準が、１００％として設定された。
【図１４】図１４は、ＨＫ−Ｄ５およびＨＰＲＧ−Ｈ／Ｐは、固定化Ｔｐｍに対する親和性が、エンドスタチンよりも約１０００倍高い値であることが示されている。１０ｎＭのビオチンＨＫａが、１０μＭのＺｎＣｌ２の存在下、２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍで事前にコートされた９６ウェルプレートに加えられた。増加する量のＨＫ−Ｄ５、ＨＰＲＧ−Ｈ／Ｐドメインまたはエンドスタチンがウェルに加えられた。結合されたビオチンＨＫａが検出され、図１０の場合と同様にＫｄが算出された。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＨＰＲＧがそのＨ／Ｐドメインを通じてニワトリの砂嚢の固定化Ｔｐｍに結合することを示している。図１５Ａ：増加する量のビオチン化ＨＰＲＧ、ＨＫａ、またはＨＫａ−Ｄ５が、９６ウェルのＴｐｍコートされたプレートに加えられた。図１５Ｂ：１０ｎＭのビオチンＨＫａが、９６ウェルのＴｐｍコートされたプレートに加えられた。増加する量のＨＰＲＧ−Ｈ／ＰドメインまたはＨＰＲＧ−Ｎ／Ｃフラグメントが、ウェルに加えられた。図１５Ａおよび１５Ｂの双方において、結合されたビオチンＨＫａが検出され、図１０の場合と同様にＫｄが算出された。
【図１６】図１６は、ＡＴＮ−２２８は固定化Ｔｐｍに結合したが、ＡＴＮ−２４６は結合しなかったことを示している。１０ｎＭのビオチンＨＫａが、９６ウェルプレートのＴｐｍにコートされたプレートに加えられた。増加する量のＡＴＮ−２２８またはＡＮＴ−２４６がウェルに加えられた。結合されたビオチンＨＫａが検出され、図１０の場合と同様にＫｄが算出された。
【図１７】図１７は、Ｍａｔｒｉｇｅｌプラグモデルにおいて、ＡＴＮ２４６ではなくＡＴＮ２２８が血管形成を阻害したことを示している。４００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２０μｇのＡＴＮ−２２８またはＡＴＮ−２４６を含むまたは含まない５０μｇ／ｍｌのヘパリン、または食塩水緩衝液を含有するＭａｔｒｉｇｅｌのアリコート（０．５ｍＬ）が、マウスの脇腹に注射された。５日後、プラグが除去されてスキャンされた。
【図１８】図１８は、Ｍａｔｒｉｇｅｌモデル／ＭＬＬにおいて、ＡＴＮ２４９ではなくＡＴＮ２３０がＭａｔＬｙＬｕの成長を阻害したことを示している。７００μＭのＡＴＮ２３０または９００μＭのＡＴＮ２９４を含むまたは含まない２×１０６ＭａｔＬｙＬｕ細胞、または食塩水緩衝液を含有するＭａｔｒｉｇｅｌのアリコート（０．５ｍＬ）が、マウスの脇腹に注射された。７日後、プラグが除去されて秤量された。
【図１９】図１９は、時間の経過における、キモトリプシンによるＴｐｍ消化の効果を示している。ニワトリの砂嚢のＴｐｍ（０．４ｍｇ／ｍｌ）が、ＴＢＳ  ｐＨ７．５、３７℃で、５μｇ／ｍｌのキモトリプシンとともにインキュベートされ、示された時間においてアリコートが得られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液が加えられ、このサンプルは８０℃で４分間加熱され、１０％ＮｕＰａｇｅゲル（インビトロゲン）上にロードされ、泳動された。
【図２０】図２０は、ＨＫａ−Ｄ５に結合するＴｐｍのフラグメントを同定する研究結果が示されている。ニワトリの砂嚢のＴｐｍが、１００分間、図１９で説明されたようにキモトリプシンで部分的に消化され、２０ｋＤａのフラグメントが濃縮されるようにした。ＨＫ−Ｄ５は、活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（ＣＮＢｒで活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において前もって固定化されていた。キモトリプシンのフラグメントが、１０μＭのＺｎＣｌ２を含有するＴＢＳ中でＨＫ−Ｄ５−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂とともにインキュベートされ、同じ緩衝液において広範に洗浄され、２Ｍ  ＮａＣｌにおいて抽出された。サンプルは、１０％ＮｕＰａｇｅゲル（インビトロゲン）において泳動された。
【図２１】図２１は、ＡＴＮ−３１０、ＡＴＮ−３１１、およびＡＴＮ−３１２が、Ｔｐｍに結合するＨＫａを置き換えることを示している。１０ｎＭのビオチンＨＫａが、１０μＭのＺｎＣｌ２の存在下、２００ｎｇのニワトリの砂嚢のＴｐｍで事前にコートされた９６ウェルプレートに加えられた。増加する量のＡＴＮ−３１０、ＡＴＮ−３１１、またはＡＴＮ−３１２が、ウェルに加えられた。結合されたビオチンＨＫａが検出され、図１０で説明されたようにＫｄが算出された。
【図１】
2006501139.tif 000024
【図２】
2006501139.tif 000025
【図３Ａ】
2006501139.tif 000026
【図３Ｂ】
2006501139.tif 000027
【図３Ｃ】
2006501139.tif 000028
【図４】
2006501139.tif 000029
【図５】
2006501139.tif 000030
【図６】
2006501139.tif 000031
【図７−１】
2006501139.tif 000032
【図７−２】
2006501139.tif 000033
【図８Ａ】
2006501139.tif 000034
【図８Ｂ】
2006501139.tif 000035
【図８Ｃ】
2006501139.tif 000036
【図８Ｄ】
2006501139.tif 000037
【図９】
2006501139.tif 000038
【図１０】
2006501139.tif 000039
【図１１】
2006501139.tif 000040
【図１２】
2006501139.tif 000041
【図１３】
2006501139.tif 000042
【図１４】
2006501139.tif 000043
【図１５】
2006501139.tif 000044
【図１６】
2006501139.tif 000045
【図１７】
2006501139.tif 000046
【図１８】
2006501139.tif 000047
【図１９】
2006501139.tif 000048
【図２０】
2006501139.tif 000049
【図２１】
2006501139.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月10日(2005.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたトロポミオシン（Ｔｐｍ）関連抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドであって、
（ａ）内皮細胞の表面上で発現される全長のネイティブＴｐｍタンパク質のフラグメント、または該フラグメントの改変体である、
（ｂ）約１７ｋＤａの分子量を有し、かつその配列に対応するか、または抗血管形成ポリペプチド因子についての結合部位であるネイティブＴｐｍアイソフォームの内部フラグメントの改変体である、ならびに
（ｃ）該ネイティブＴｐｍ内部フラグメント結合部位に結合する該抗血管形成ポリペプチド因子に結合する、
ポリペプチドまたはペプチドであり、
ここで
該ペプチドは、約４アミノ酸と約４０アミノ酸との間のアミノ酸を有し；そして
該ポリペプチドまたはペプチドの改変体は、ネイティブＴｐｍ配列の保存的置換改変体であり；そして
該単離された抗血管形成レセプターポリペプチド、ペプチドまたは改変体は、該ネイティブＴｐｍ内部フラグメントと実質的に同じ該抗血管形成ポリペプチド因子に結合する生化学的活性を有する、
ポリペプチドまたはペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、前記ネイティブＴｐｍアイソフォームは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列絵番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、および配列番号１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項３】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドまたは改変体であって、前記ネイティブＴｐｍの内部フラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドまたはペプチドまたは改変体。
【請求項４】
請求項１に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、前記Ｔｐｍアイソフォームは、ヒトＴｐｍアイソフォームである、ポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、前記単離されたポリペプチドまたはペプチドに結合する前記抗血管形成ポリペプチド因子は、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）  ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａのＤ５ドメインの、Ｔｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント
からなる群より選択される、単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項６】
請求項５に記載の単離されたポリペプチド、ペプチドまたは改変体であって、該ポリペプチド、ペプチドまたは改変体は、配列番号２１、２２、２３、２４、２５および２６のうちの１つ以上に結合する、ポリペプチド、ペプチドまたは改変体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドまたは改変体であって、該ペプチドまたは改変体は、そのＮ末端、そのＣ末端、またはそのＮ末端およびＣ末端の両方でキャップされる、ペプチドまたは改変体。
【請求項８】
活性化内皮細胞の表面に発現されるＴｐｍアイソフォームのエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合フラグメント（ＡＢＦ）であって、該抗体またはＡＢＦは、
（ａ）該活性化内皮細胞に結合し、該細胞における抗血管形成シグナルの生成を引き起し、結果として、（ｉ）移動、浸潤、増殖もしくは血管形成の阻害、または（ｉｉ）アポトーシスを生じるという点での抗血管形成活性；あるいは
（ｂ）該内皮細胞上のＴｐｍに競合的に結合し、Ｔｐｍ結合抗血管形成因子の該細胞への結合を阻害し、それにより、他の方法で該抗血管形成因子によって阻害される移動、浸潤、増殖または血管形成を可能にするかまたは促進するという点での血管形成促進活性
を有する、抗体またはフラグメント。
【請求項９】
請求項８に記載の、抗血管形成抗体またはＡＢＦ。
【請求項１０】
請求項８に記載の血管形成促進抗体またはＡＢＦ。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦが特異的な前記エピトープは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０のポリペプチドもしくはペプチドに存在するか、またはこれらのポリペプチドによって形成される、抗体またはＡＢＦ。
【請求項１２】
請求項８、１０、または１１のいずれかに記載の抗体またはＡＢＦであって、前記Ｔｐｍ結合抗血管形成因子は、  
（ａ）ヒトＨＰＲＧ；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトもしくはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）  ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａの該Ｄ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント
からなる群より選択される、抗体またはＡＢＦ。
【請求項１３】
モノクローナル抗体である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、該抗体は、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１６】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、該抗体は、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１１に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１７】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用なすべての抗体であって、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１２に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１８】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１３に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項１９】
内皮細胞上で抗血管形成レセプターとして働くＴｐｍポリペプチドまたはペプチドを検出するために有用な抗体であって、検出可能な標識で検出可能に標識された、請求項１４に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体。
【請求項２０】
請求項１５に記載の抗体であって、前記検出可能な標識は、放射性核種、ＰＥＴ画像化可能因子、ＭＲＩ画像化可能因子、蛍光分子、蛍光原、発色団、色素原、リン光分子、化学発光分子または生体発光分子である、抗体。
【請求項２１】
診断に有用なＴｐｍ結合抗体組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）検出可能に標識された、請求項１５または１６に記載の抗体またはＡＢＦ；および
（ｂ）診断的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項１７に記載の組成物であって、前記検出可能な標識は、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂおよび２０１Ｔｌからなる群より選択される、放射性核種である、組成物。
【請求項２３】
請求項１７に記載の組成物であって、前記検出可能な標識は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、フルオレセイン誘導体、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈ
ｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄｏｌ  ＧｒｅｅｎおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄからなる群より選択される蛍光分子または蛍光原である、組成物。
【請求項２４】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項８または９のいずれかに記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２５】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１１に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２６】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１２に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２７】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１３に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２８】
Ｔｐｍまたはそのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的に有用な抗血管形成抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、必要に応じて、治療的に活性な部分と直接的または間接的に結合した、請求項１４に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項２９】
インビトロまたはインビボで血管形成を阻害する治療的抗血管形成薬学的組成物であって、該組成物は、
（ａ）有効量の、請求項２４に記載の抗体またはＡＢＦ；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の組成物であって、前記治療的に活性な部分は、前記抗体により結合されている、組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の治療的薬学的組成物であって、前記治療的に活性な部分は、放射性核種、薬物または毒素である、組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の治療的薬学的組成物であって、前記部分は、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１０９Ｐｄ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂおよび２１７Ｂｉからなる群より選択される、放射性核種である、組成物。
【請求項３３】
注射に適切な形態である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の治療的抗体または薬学的組成物。
【請求項３４】
ＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を刺激する治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、
請求項８または１０に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３５】
ＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とし、インビトロまたはインビボで血管形成を刺激する治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１１に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３６】
インビトロまたはインビボで血管形成を刺激するＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とする治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１２に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３７】
インビトロまたはインビボで血管形成を刺激するＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とする治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１３に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３８】
インビトロまたはインビボで血管形成を刺激するＴｐｍまたはＴｐｍのエピトープを標的とする治療的に有用な血管形成促進抗体またはＡＢＦであって、該抗体またはＡＢＦは、請求項１４に記載の抗体またはＡＢＦを含む、抗体またはＡＢＦ。
【請求項３９】
薬学的血管形成促進組成物であって、該組成物は、以下：
（ａ）有効量の、請求項３５に記載の抗体または抗体フラグメント；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含む、組成物。
【請求項４０】
注射に適切な形態である、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の治療的抗体または薬学的組成物。
【請求項４１】
ＨＫａのＤ５ドメインに結合し、血管形成のインビトロまたはインビボのアッセイにおいて血管形成を阻害する、約４と約２０との間のアミノ酸の環状ペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載の環状ペプチドであって、以下：
【化１】
2006501139.tif 000051
からなる群より選択される、環状ペプチド。
【請求項４３】
内皮細胞の移動、浸潤、増殖もしくは血管形成を阻害するため、または内皮細胞アポトーシスを誘導するための方法であって、内皮細胞と、有効量の、活性化内皮細胞の表面上で発現されたＴｐｍに結合する抗血管形成ポリペプチドもしくはペプチドとを接触させ、それによって該阻害もしくは該アポトーシスを引き起こす工程を包含する、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、前記Ｔｐｍ結合ポリペプチドは、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトもしくはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｇ）トロポニンＴ；
（ｈ）トロポモジュリン；
（ｉ）カルデスモン；
（ｊ）アクチン；
（ｋ）カルポニン；
（１）ｐＥＬ９８；
（ｍ）グルタミンデヒドロゲナーゼ；および
（ｎ）（ｇ）〜（ｍ）のいずれかのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
【請求項４５】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項２９に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項３０に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項３１に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
所望でない細胞の移動、浸潤、増殖、または血管形成と関連する疾患または状態を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、以下の工程：
血管形成阻害有効量の請求項３２に記載の薬学的組成物を被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
請求項４５に記載の方法であって、前記被験体は腫瘍を有し、前記血管形成阻害は、該腫瘍のサイズもしくは増殖速度の低下または該腫瘍の破壊を生じる、方法。
【請求項５０】
前記被験体はヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
増加した血管形成を必要とする被験体において血管形成を刺激するための方法であって、該方法は、以下の工程：
有効量の、請求項３９に記載の薬学的組成物を該被験体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
活性化内皮細胞の表面上で発現されるＴｐｍのアイソフォームの存在を生物学的サンプル中で検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、請求項１５に記載の抗体またはＡＢＦとを接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルと関連した標識の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
生物学的サンプル中のＴｐｍの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルと、活性化内皮細胞の表面上で発現されるＴｐｍに結合する、前記検出可能に標識された抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドとを接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルと関連した標識の存在を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法であって、前記抗血管形成ポリペプチドまたはペプチドは、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）  ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン；および
（ｆ）該ＨＫａまたは該ＨＫａのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、
からなる群より選択される、方法。
【請求項５５】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記サンプルは、血漿、血清、細胞、組織、器官、または該細胞、組織、もしくは器官の抽出物である、方法。
【請求項５６】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程および検出する工程は、インビトロで行われる、方法。
【請求項５７】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程はインビボで行われ、前記検出する工程はインビトロで行われる、方法。
【請求項５８】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程はインビボで行われ、前記検出する工程はインビトロで行われる、方法。
【請求項５９】
請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法であって、前記接触させる工程および検出する工程はインビボで行われる、方法。
【請求項６０】
Ｔｐｍに結合する候補抗血管形成分子として試験化合物を同定するスクリーニング試験であって、該試験は、以下の工程：
（ａ）該試験化合物を、Ｔｐｍの供給源とＴｐｍ結合抗血管形成ポリペプチドもしくはペプチド因子または抗Ｔｐｍ抗体との混合物に添加する工程であって、ここで（ｉ）該Ｔｐｍまたは（ｉｉ）該因子または抗体のうちの少なくとも１つは検出可能に標識される、工程；
（ｂ）並行して、同様の量の該Ｔｐｍと該因子または抗体とを、該試験化合物の非存在下で混合する工程；ならびに
（ｃ）（ａ）および（ｂ）における該Ｔｐｍを用いて、該因子の結合を測定する工程、を包含し、ここで（ａ）における結合が（ｂ）における結合より小さい場合、その試験は、該結合のインヒビターである該試験化合物について陽性であるとみなされ、それによって、該試験化合物を候補抗血管形成分子として同定する、スクリーニング試験。
【請求項６１】
請求項６０に記載のスクリーニング試験であって、該試験は、候補抗血管形成分子として
同定された試験化合物を、インビトロまたはインビボの血管形成アッセイにおける血管形成インヒビターとしてのその活性について試験する工程をさらに包含する、スクリーニング試験。
【請求項６２】
請求項６０または６１に記載のスクリーニング試験であって、前記因子は、以下：
（ａ）ヒトヒスチジン−プロリンリッチ糖タンパク質（ＨＰＲＧ）；
（ｂ）ウサギＨＰＲＧ；
（ｃ）ヒトまたはウサギＨＰＲＧのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント；
（ｄ）２つの鎖のヒトキニノゲンヒトキニノゲン（ＨＫａ）；
（ｅ）ＨＫａのＤ５ドメイン、および
（ｆ）該ＨＫａもしくは該ＨＫａのＤ５ドメインのＴｐｍ結合抗血管形成ホモログ、改変体、ドメインまたはフラグメント、
からなる群より選択される、
スクリーニング試験。
【請求項６３】
Ｔｐｍ結合抗血管形成分子または結合分子を発現する細胞に結合するかまたは該分子または細胞を単離するために有用なアフィニティーリガンドであって、固体支持体またはキャリアに固定化された、請求項１〜４のいずれかに記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドを含む、アフィニティーリガンド。
【請求項６４】
Ｔｐｍ結合抗血管形成分子または結合分子を発現する細胞に結合するかまたは該分子または細胞を単離するために有用なアフィニティーリガンドであって、固体支持体またはキャリアに固定化された、請求項５に記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドを含む、アフィニティーリガンド。
【請求項６５】
Ｔｐｍ結合抗血管形成分子または結合分子を発現する細胞に結合するかまたは該分子または細胞を単離するために有用なアフィニティーリガンドであって、固体支持体またはキャリアに固定化された、請求項６に記載の単離されたポリペプチドまたはペプチドを含む、アフィニティーリガンド。
【請求項６６】
複合体混合物からＴｐｍ結合抗血管形成分子を単離するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該混合物と、請求項６２に記載のアフィニティーリガンドとを接触させる工程；
（ｂ）該混合物中に任意の材料を該リガンドに結合させる工程；
（ｃ）該リガンドから結合していない材料を除去する工程；および
（ｄ）該結合したＴｐｍ結合分子を溶出する工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法であって、前記抗血管形成レセプターポリペプチドまたはペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、または配列番号２０の配列を有するか；（ｉｉ）該配列のうちの１つのＴｐｍ結合ペプチドフラグメントであるか；または（ｉｉｉ）該ペプチドフラグメントの該配列のうちの１つのＴｐｍ結合保存的置換改変体である、ポリペプチドまたはペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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