(57)【要約】ＨＦＥ２Ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチド、および若年性ヘモクロマトーシスに関連する突然変異、および有機小分子を含む鉄代謝の疾患の処置のための物質のスクリーニングおよび同定についてこれらを利用する方法は、鉄代謝の疾患の処置およびまたは改善の方法と共に開示される。特にヒト患者におけるものが開示される。ＨＦＥ２Ａを用いた診断用化合物、キットおよび方法もまた開示される。
2006523440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａプロモーターと動作可能に連結するレポーター遺伝子の発現を支持する条件下で、前記レポーター遺伝子を含む遺伝子構成体と接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定することを含み、
ここで発現の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記調節が前記レポーター遺伝子の発現の増加であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記調節が前記レポーター遺伝子の発現の減少であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａプロモーターが哺乳類ＨＦＥ２Ａプロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記哺乳類がマウス、ラットおよびヒトより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記プロモーターが配列番号１９のヌクレオチド配列を持つことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子構成体が細胞中にあることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記細胞が前記遺伝子を発現するように処理された組換え細胞であり、またここで前記細胞が、前記処理がなければ前記遺伝子を発現しないことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、前記哺乳類細胞が、マクロファージ、炎症細胞、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系細胞のいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記試験化合物が鉄代謝の制御に有用であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、前記試験化合物が、前記方法を用いてＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として最初に同定されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、前記変化が酵素活性の変化を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子を発現する細胞と接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ＨＦＥ２Ａ遺伝子の発現の変化を測定することを含み、
ここで発現の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項１５】
ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化動物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を支持する条件下で、ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの前記活性の変化を測定することを含み、
ここで活性の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが哺乳類ＨＦＥ２Ａポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記哺乳類がマウス、ラットおよびヒトより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法において、前記変化が前記活性の減少であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法において、前記変化が前記活性の増加であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法において、前記ポリペプチドが細胞の一部であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、前記細胞が前記ポリペプチドを包含するように処理されていることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記細胞が遺伝子操作により処理されたことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記細胞が、前記処理がなければ前記ポリペプチドを包含しないことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法において、前記細胞が、マクロファージ、炎症細胞、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系の細胞のいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが高度に精製されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが半精製ポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが固体表面に付着されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法において、前記固体表面が樹脂であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが抽出物の一部であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１５に記載の方法において、前記ポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドによりエンコードされることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１５に記載の方法において、前記ポリペプチドが、配列番号１０、１１および１２から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
疾患を処置するための方法であって、前記方法が、前記疾患に苦しむ動物に、治療上効果的な量のＨＦＥ２Ａ調節因子を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、請求項１、１４あるいは１５のいずれか一項に記載の方法において調節活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記調節因子が前記方法を用いてＨＦＥ２Ａ調節因子として最初に同定されたことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、選択的ＨＦＥ２Ａアゴニスト、選択的ＨＦＥ２Ａアンタゴニスト、それらの薬剤として許容される塩、およびこれらの組み合わせより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、前記選択されたものが薬剤として許容される担体中にあることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、抗体、アンチセンス分子、リボザイムおよび薬剤様有機小分子から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法において、前記疾患が鉄代謝の疾患であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、鉄過剰疾患および鉄欠乏症より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシス、輸血関連鉄過剰状態、サラセミア、ポルフィリン症、および若年性ヘモクロマトーシスより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、貧血および慢性疾患に伴う貧血より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ
型糖尿病、およびインスリン抵抗性から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４４】
疾患を予防するための方法であって、前記方法は、前記疾患を発症する恐れのある動物に、治療上効果的な量のＨＦＥ２Ａ調節因子を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が請求項１、１４あるいは１５のいずれか一項に記載の方法において調節活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、前記調節因子が、前記方法を用いてＨＦＥ２Ａ調節因子として最初に同定されたことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４４に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、選択的ＨＦＥ２Ａアゴニスト、選択的ＨＦＥ２Ａアンタゴニスト、それらの薬剤として許容される塩、およびこれらの組み合わせより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記選択されたものが薬剤として許容される担体中にあることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４４に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、抗体、アンチセンス分子、リボザイムおよび薬剤様有機小分子から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４４に記載の方法において、前記疾患が鉄代謝の疾患であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、鉄過剰疾患および鉄欠乏症より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシス、輸血関連鉄過剰状態、サラセミア、ポルフィリン症、および若年性ヘモクロマトーシスより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、貧血および慢性疾患に伴う貧血より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５５】
鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れのある個人を診断するための方法であって、前記方法が、前記個人のＨＦＥ２Ａ遺伝子の核酸配列における突然変異あるいは多型を測定することを含み、ここで前記遺伝子における前記突然変異あるいは多型が、前記個人を鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法において、前記突然変異あるいは多型が、表１に示す突然変異あるいは多型であることを特徴とする方法。
【請求項５７】
鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れのある個人を診断するための方法であって、前記方法が、前記個人のＨＦＥ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列における突然変異あるいは多型を測定することを含み、ここで前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドの突然変異あるいは多型が、前記個人を鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項５８】
鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れのある個人を診断するための方法であって、前記方法が、前記個人のＨＦＥ２Ａポリペプチドのレベルあるいは量の減少を測定することを含み、ここで減少が、前記個人を鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５５ないし５８のいずれか一項に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が成人発症ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５５ないし５８のいずれか一項に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が若年性ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項５５ないし５８のいずれか一項に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患がＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６２】
ＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定するための方法であって、前記方法が、（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａを発現する細胞と接触させ、（ｂ）前記試験化合物の、ＨＦＥ２Ａ核酸の転写あるいはＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する能力を測定することを含み、それによりＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定することを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物が抗ＨＦＥ２Ａポリペプチド抗体であることを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物がアンチセンスＨＦＥ２Ａ核酸分子であることを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物がＨＦＥ２Ａリボザイムであることを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物が有機小分子であることを特徴とする方法。
【請求項６７】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１および２２より成るグループから選択された配列と最低６０％のパーセント同一性を持つヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低７０％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６９】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低７８％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９０％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９５％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９８％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１および２２より成るグループから選択されたものであることを特徴とする。
【請求項７４】
配列番号１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７および２８より成るグループから選択されたアミノ酸配列と最低９０％のパーセント同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９５％であることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７６】
請求項７４に記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９８％であることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７７】
請求項７４に記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記アミノ酸配列が、配列番号１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７および２８より成るグループから選択されることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７８】
請求項６７に記載のポリヌクレオチドの組換え型を含む細胞系。
【請求項７９】
請求項７４に記載のポリペプチドの組換え型を含む細胞系。
【請求項８０】
ヘモジュヴェリンの発現あるいは活性を調節する組成物を同定するための方法における、請求項７８あるいは７９に記載の細胞系の使用法。
【請求項８１】
鉄代謝の疾患を処置するための組成物であって、前記組成物が、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の請求項７４に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８２】
鉄代謝の疾患を処置するための方法であって、前記方法が、必要とする患者に、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の請求項８１に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８３】
請求項８２に記載の方法であって、前記疾患が若年性ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項８４】
化合物によるＨＦＥ２Ａ遺伝子発現の調節に関する試験情報を生成するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａプロモーターに動作可能に結合するレポーター遺伝子の発現を支持する条件下で、前記レポーター遺伝子を含む遺伝子構成体と接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定し、ここで前記変化は調節を示し、
（ｃ）遺伝子調節活性を示す、測定された遺伝子の発現の変化に基づく前記試験化合物の遺伝子調節活性に関する試験情報を生成することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８５】
化合物によるＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の調節に関する試験情報を生成するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定し、ここで前記変化は調節を示し、
（ｃ）調節活性を示す、ＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の変化に基づく前記試験化合物のＨＦＥ２Ａポリペプチド調節活性に関する試験情報を生成することを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．本出願は２００３年４月１５日に出願された合衆国仮出願６０／４６２８６７号、２００３年７月１８日に出願された合衆国仮出願６０／４８８６０７号および２００３年８月２８日に出願された合衆国仮出願６０／４９８４５８号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。
【０００２】
本発明は、概して鉄代謝疾患、特に若年性ヘモクロマトーシス（血色素症）の分野、それらに関連する遺伝子に関し、また鉄代謝疾患の治療法を含む、治療に有用な物質のスクリーニングおよび同定に対してのこの遺伝子およびその発現産物の使用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
少なくとも４つのヘモクロマトーシスと呼ばれる鉄過剰疾患が、臨床的特徴、生化学的特徴および遺伝的特徴に基づいて分類されている。ヘモクロマトーシス１型は標準的なヘモクロマトーシスであり（ときに“ＨＦＥ”と示される）（ＯＭＩＭ  Ｎｕｍｂｅｒ：２３５２００；Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ Ｍａｎ，ＯＭＩＭＴＭ．  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ａｔ  ｗｗｗ.ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／参照）、常染色体劣性疾患であって、染色体６ｐ２１．３上のＨＦＥを指定する遺伝子における突然変異により引き起こされる。若年性ヘモクロマトーシスと呼ばれる内科的疾患（ときに“ＪＨ”あるいは“若年性ヘモクロマトーシス”と呼ばれる）もまた、ヘモクロマトーシス２型（“ＨＦＥ２”）として知られている。ヘモクロマトーシス３型（ＨＦＥ３；ＯＭＩＭ６０４２５０）は、常染色体劣性疾患であり、７ｑ２２に位置するトランスフェリン受容体（レセプター）２（ＴＦＲ２；ＯＭＩＭ６０４７２０）をエンコードする遺伝子における突然変異により引き起こされる。ヘモクロマトーシス４型（ＨＦＥ４；ＯＭＩＭ６０６０６９）は、常染色体優性疾患であり、Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎをエンコードし、２ｑ３２に位置するＳＬＣ１１Ａ３遺伝子（ＯＭＩＭ６０４６５３）における突然変異により引き起こされる。
【０００４】
いくつかのファミリーにおいては、若年性ヘモクロマトーシスは染色体１ｑ２１との関連を示すが、一方他のファミリーにおいては、染色体１９ｑ１３に位置するヘプシジン抗微生物ペプチドをエンコードする遺伝子における突然変異により引き起こされる。若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）の２つのフォームが仮にそれぞれＨＦＥ２ＡおよびＨＦＥ２Ｂと示される。本発明は、染色体１ｑ２１と関連するＪＨのフォームであるＨＦＥ２Ａの遺伝的性質に関する。
【０００５】
若年性ヘモクロマトーシス（ＪＨ）は、標準的な遺伝的ヘモクロマトーシスとは異なる。ＨＦＥは男性（雄）に発現する傾向があるが、一方ＪＨは両方の性に等しく影響を与える。ＪＨは鉄蓄積を含み、若年期に発現し、通常３０歳前に臨床症状を引き起こす。ＪＨは標準的な遺伝的ヘモクロマトーシスよりもより深刻な疾患であり、ＪＨは頻繁に低ゴナドトロピン性性機能低下症、心不全、不整脈およびまたは心筋ミオパチーの徴候を示す。未治療の場合には、疾患は、心合併症および他の合併症のために致命的である。
【０００６】
ＨＦＥ２Ａの染色体位置としての１ｑ２１の同定は、Ｒｏｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４：１３８８−１３９３（１９９９）にて最初に報告されたが、この遺伝子座は、鉄代謝に関連する任意の既知の遺伝子の染色体位置とは一致しなかった。
【０００７】
本発明は、ＨＦＥ２Ａについての遺伝的性質の同定を提供し、それにより鉄代謝の疾患を処置するためのより強力な物質の開発を容易にする。ＨＦＥ２Ａ遺伝子あるいはそのタンパク質の投与は、治療的なものとなり得る。また、内在する遺伝的突然変異は、鉄代謝の疾患を処置するための新規治療標的を同定する。この治療標的は、より効果的な治療物質の同定および発見に用いることができる。ＨＦＥ２Ａを用いた診断用化合物、キットおよび方法もまた、ＪＨの診断のために、また成人ヘモクロマトーシスの発現および重症度の診断および予測のために、また鉄代謝疾患のタイプの区別のために用いることができるであろう。
【発明の開示】
【０００８】
（発明の簡単な要約）
本発明は、若年性ヘモクロマトーシス（ヘモクロマトーシス２Ａ型あるいはＨＦＥ２Ａ）が、配列番号１から９に提示されるヌクレオチド配列およびまたは配列番号１０から１２に提示される対応するアミノ酸配列を持つ１ｑ２２に見られるヒト遺伝子における突然変異により引き起こされることの発見に関する。遺伝子とタンパク質は、ここでＨＦＥ２Ａおよびまたヘモジュヴェリン（ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ）と称され、これらの用語は文脈上他の意味に解すべき場合を除き、遺伝子、遺伝子産物およびそれらから発現したタンパク質を示す。遺伝子はまたＨＦＥ２と名づけられ、これは１ｑ２１の位置の遺伝子により引き起こされるＪＨフォームを意味する。この命名法はここでの発明に不可欠なものではない。
【０００９】
一態様において、本発明はヘモジュヴェリンを調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、試験化合物をヘモジュヴェリンと接触させ、化合物によるヘモジュヴェリン活性における変化を測定し、それにより所望の型の調節因子を同定することを含む。調節因子は、遺伝子あるいはタンパク質の活性を変換する薬剤様小分子、抗体、アンチセンス核酸、リボザイムあるいは他の化合物であり得る。
【００１０】
一態様において、本発明はＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子の発現を促進する条件下（すなわち、ポリヌクレオチドが発現する条件）で試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子を含むポリヌクレオチドと接触させ、試験化合物の存在による発現の変化を測定することを含む。これは、試験化合物を調節因子として同定する。好ましい実施例において、この発現の変化は遺伝子の転写の変化として検出され、好ましくはここで遺伝子は哺乳類遺伝子であり、最も好ましくはここで遺伝子は細胞によって発現される。
【００１１】
他の態様において、本発明はＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は試験化合物を、プロモーター配列と動作可能に連結するレポーター遺伝子と接触させ、試験化合物によるレポーター遺伝子の発現の変化を測定し、構成体の調節因子を同定することを含む。これは、好ましくはＨＦＥ２Ａプロモーター、最も好ましくはマウス、ラットあるいはヒトＨＦＥ２Ａプロモーター等の哺乳類ＨＦＥ２Ａに動作可能に連結する前記レポーター遺伝子の転写の調節である。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は動物の疾患を処置およびまたは予防するための方法に関し、前記方法は、疾患に苦しむ動物あるいは前記疾患の発症の恐れのある動物に、治療上効果的な量のＨＦＥ２Ａ調節因子を投与することを含む。好ましい実施例において、ＨＦＥ２Ａ調節因子は本発明の方法において調節活性を示し、最も好ましくはここで前記物質は、前記方法を用いて最初にＨＦＥ２Ａ調節因子として同定され、そうでなければ前記活性を持つことが知られなかったものである。
【００１３】
またさらなる態様において、本発明は、ＨＦＥ２Ａあるいは関連疾患に苦しむ個体あるいは発現する恐れのある個体を診断する方法に関し、前記方法は前記個体のＨＦＥ２Ａ遺伝子の核酸配列を測定することを含み、ここで前記遺伝子の突然変異あるいは多型は、前記個体をＨＦＥ２Ａあるいは関連疾患に苦しむ個体あるいは発現する恐れのある個体として識別する。
【００１４】
本発明はまた、ＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定するための方法を意図し、前記方法は（ａ）ＨＦＥ２Ａを発現する細胞を試験化合物と接触させ、（ｂ）試験化合物の、ＨＦＥ２Ａ核酸の転写あるいはＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する能力を測定することを含み、それによりＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定する。前記方法の好ましい実施例において、化合物は抗ＨＦＥ２Ａポリペプチド抗体、リボザイムあるいはアンチセンスＨＦＥ２Ａ核酸分子である。その一つの好ましい実施例において、化合物はＨＦＥ２Ａリボザイムである。
【００１５】
本発明はまた、ここに開示された遺伝子の単離されたポリヌクレオチドあるいは単離されたポリペプチドを包含する。
【００１６】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＬＯＣ１４８７３８遺伝子構造の図である。ＬＯＣ１４８７３８遺伝子は４つのエキソンと５つの転写産物を持つ。５つの転写産物は２００ＡＡ、３１３ＡＡおよび４２６ＡＡの３つのタンパク質をコードする。エキソン２は、アンサンブル（Ｅｎｓｅｍｂｌ）により、ｃＤＮＡ配列ＡＫ０９８１６５．１から予測された。エキソン２へのアクセプター部位は、ゲノム配列から推測される。エキソン３ａおよび３ｂは、同一のアクセプター部位を持つが、異なるドナー部位を持つ。非翻訳配列は白色で翻訳配列は黒色である。転写産物は長いものから短いものの順で記載されている。
【００１７】
図２は、ヒト、マウスおよびラットのＨＦＥ２Ａのプロモーター配列のアラインメント（配列構造）である。ヒト配列の転写開始位置は、このアラインメントの１５１４の位置から始まり、エキソン１は１６７６の位置で終了する。３つの反復配列がヒト配列内に存在する。（ＴＡＧＡ）ｎが５８から１２９の位置であり、ａｌｕ反復配列が３２４から６０３の位置であり、（ＧＧＡＡ）ｎが６０４から７０２の位置である。これらの配列はげっ歯動物配列には存在せず、遺伝子のプロモーター境界線を規定していると思われる。種間の配列相同性は、このアラインメントの８４４の位置の５′、転写開始の約６７０ｂｐだけ５′側の位置で失われる。推定転写開始位置（ＴＡＴＡ）は、ヒトの転写開始位置の２７から２４ｂｐだけ５′側の位置で、３つの種全てにおいて保存されている。
【００１８】
図３は、ヒトＬＯＣ１４８７３８４２６ａａ遺伝子産物（タンパク質３）およびヒトパラログ（重複）のタンパク質配列アラインメントを示す；染色体１５上のヒト反発誘導分子（Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ヒトＲＧＭ）（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿０６４５９６．１）および染色体５上で同定されたＥＮＳＥＳＴＰ００００００２３３９３（アンサンブル）−ヒトパラログの比較。
【００１９】
図４は、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いたＬＯＣ１４８７３８配列の配列アラインメントを示す。ヒト（タンパク質３）、マウス（アンサンブル：ＥＮＳＭＵＳＥＳＴＰ００００００１６６３４）、ラット（ＮＣＢＩ：ＡＫ０９８１６５．１から翻訳された、しかしながら、ヒト配列として注釈が付けられ、ラットゲノム配列と９９．９％同一であり、ヒトゲノム配列と８６．６％だけ同一である）、およびフグ（アンサンブル：ＳＩＮＦＲＵＰ０００００１３８３０８）。
【００２０】
図５は、ヒトＬＯＣ１４８７３８遺伝子産物とニワトリ反発誘導分子（ＲＧＭ）のタンパク質配列アラインメントを示す。ヒト（タンパク質３）、ニワトリ＿ＲＧＭ（ＮＣＢＩ：ＡＹ１２８５０７．１の翻訳）、Ａ＝シグナルペプチド、Ｂ＝ＲＧＤ、Ｃ＝Ｎ−グリコシル化位置、Ｄ＝不完全フォン  ヴィレブランド  タイプＤドメイン、Ｅ＝ＧＰＩ修飾、矢印＝可能性のある切断部位。
【００２１】
図６Ａは、複数種のホモログ間の高度の類似性の概要を示す。
【００２２】
図６Ｂは、異なる種におけるＨＦＥ２Ａに類似する遺伝子間の高度の類似性を示す。
【００２３】
図７（ａ）−ＬＯＣ１４８７３８の４２６ａａ翻訳オープンリーディングフレーム（読み取り枠）の構造的特徴。ＲＧＤ−細胞結合トリアミノ酸モチーフ、ｖＷＦ−不完全フォン  ヴィレブランド因子タイプＤドメイン、ＴＭ−膜貫通ドメイン。矢印は、１７２と１７３の位置の間の可能性のあるタンパク質分解部位、３３５と３３６の位置の間のフューリン切断部位、および４００の位置の予測されたＧＰＩ修飾部位を示す。図７（ｂ）は、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｈｅｎｒｉｋ  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０，１−６（１９９７））を用いたＨＦＥ２Ａの４２６ａａ翻訳におけるシグナルペプチド切断部位の予測を示す。ペプチド切断部位は、Ｓ３５とＱ３６の間にあると予測される。図７（ｃ）は、ＴＭＨＭＭを用いたＨＦＥ２Ａの４２６ａａ翻訳における膜貫通領域の予測を示す。膜貫通領域は４０３から４２５残基である。図７（ｄ）は、ＮＣＢＩ保存ドメインサーチを用いた不完全フォン  ヴィレブランド  タイプＤドメインの同定（５７％）を示す（ＬＯＣ１４８７３８＝ＨＦＥ２Ａ）。図７（ｅ）は、ニワトリ反発誘導分子（ＲＧＭ）との配列比較により同定された１７２Ｄおよび１７３Ｐ残基間の可能性のあるタンパク質分解切断部位（矢印）を示す。
【００２４】
図８は、ＬＯＣ１４８７３８の転写産物４（タンパク質３）から翻訳された４２６ａａオープンリーディングフレームの核酸およびアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、予測されたアンサンブル転写産物ＥＮＳＴ０００００３０６５６１からのアンサンブルタンパク質ＥＮＳＰ０００００３０４６１４と同一である。ボックス、開始コドン；三角形、潜在的なシグナルペプチド切断部位；ドット、ＲＧＤ部位；十字形、予測されたＯ−グリコシル化部位（ＮｅｔＯＧｌｙｃ２．０  予測）；ひし形、予測されたＮ−グリコシル化部位（ＮｅｔＮＧｌｙｃ１．０  予測）；矢印、ニワトリＲＧＭとの比較からの推定切断部位；２つの矢印、フューリン切断部位；四角形、予測されたＧＰＩアンカー修飾部位；アスタリスク、終止コドン。
【００２５】
図９（ａ）から（ｅ）は、若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図を示す。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヘモジュヴェリンあるいはＨＦＥ２Ａと称される鉄代謝の疾患に関連する遺伝子およびその対応するタンパク質を提供する。ヘモジュヴェリンおよびＨＦＥ２Ａは、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、遺伝子、遺伝子産物およびそれらから発現したタンパク質の両方を示す。
【００２７】
本発明にしたがって、ヒトＨＦＥ２Ａ遺伝子が開示される。この遺伝子は、突然変異を起こした場合、若年性ヘモクロマトーシス（ヘモクロマトーシス２Ａ型）をもたらす。この遺伝子はまたＨＦＥ２Ａと名づけられ、これは１ｑ２１の位置の遺伝子により引き起こされるＪＨフォームを意味する。遺伝子産物／タンパク質もまた、ときに“ヘモジュヴェリン”と呼ばれる。この命名法はここでの発明に不可欠なものではない。
【００２８】
一態様において本発明は、ＨＦＥ２Ａを包含する、あるいはＨＦＥ２Ａに対応するゲノム配列、ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡ、多型、対立遺伝子、アイソフォーム（成熟、新生児、その他）およびそれらの突然変異型、またベクター、プラスミドを含む遺伝子の核酸構成体、組換え細胞、トランスジェニック生物（あるいはそれらのノックアウト）を含む、ＨＦＥ２Ａの核酸配列に関する。前記核酸配列は、配列番号１から９および１３から２２に規定される。
【００２９】
他の態様において本発明は、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸配列、多型、対立型、アイソフォーム（成熟、新生児、その他）、それらの突然変異型、ＨＦＥ２ＡのｍＲＮＡあるいは他の転写産物、組換え細胞およびトランスジェニック生物を含む、ここでときにヘモジュヴェリンあるいはＨＦＥ２Ａポリペプチドと呼ばれるＨＦＥ２Ａの遺伝子産物に関する。ここで、このポリペプチドあるいはこれらに対応するポリペプチドは発現する。前記アミノ酸配列は、配列番号１０から１２および２３から２８に規定される。
【００３０】
本発明の一態様において、ＨＦＥ２Ａはスクリーニング分析に組み込まれ、そこで化合物（潜在的な治療物質）がＨＦＥ２Ａ遺伝子発現活性を調節するかどうか測定するために試験され、それにより潜在的な治療物質を同定する。
【００３１】
前記にしたがって、本発明はＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子を発現する細胞と接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ＨＦＥ２Ａ遺伝子の発現の変化を測定することを含み、
ここで、発現の変化が前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として同定する。
【００３２】
好ましい実施例において、この発現の変化は、前記遺伝子の転写における変化を検出することにより検出され、例えばここで転写における変化は、転写の減少あるいは増加である。他の好ましい実施例において、ＨＦＥ２Ａ遺伝子は哺乳類ＨＦＥ２Ａ遺伝子であり、最も好ましくはここで哺乳類はマウス、ラットあるいはヒトである。
【００３３】
他の好ましい実施例において、その調節が測定される遺伝子は、哺乳類細胞、好ましくは組換え細胞中に存在し、ここで細胞は、マクロファージ、炎症細胞、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系の細胞であることを含む。
【００３４】
他の態様において、本発明はＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化動物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を支持する条件下で、ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの前記活性の変化を測定することを含み、
ここで活性の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質として同定する。
【００３５】
前記方法の好ましい実施例において、ＨＦＥ２Ａエンコードポリペプチドは哺乳類ＨＦＥ２Ａポリペプチドであり、最も好ましくはマウス、ラットあるいはヒト由来のものである。
【００３６】
他の好ましい実施例において、前記調節は前記生物学的活性の減少あるいは増加である。非常に有用な実施例において、ポリペプチドは、細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくは組換え細胞中にあるか、あるいはその一部であり、ここで細胞はマクロファージ、炎症細胞、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系の細胞であることを含む。他の好ましい実施例において、細胞は例えば遺伝子操作により、前記ポリペプチドを包含するように処理されたものであり、特にここで前記細胞は、前記操作がなければ前記ポリペプチドを発現しないものである。
【００３７】
さらなる好ましい実施例において、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドによりエンコードされ、最も好ましくはここで、前記ポリペプチドは配列番号１０、１１および１２の配列から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本発明はまた、ポリヌクレオチドの組換え型を含む、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９の前記ポリヌクレオチドの一つあるいはそれ以上を含む細胞系（セルライン）に関し、また配列番号１０、１１および１２のポリペプチド、好ましくはポリペプチドの組換え型の一つあるいはそれ以上を含む細胞系に関する。他の実施例において、本発明はヘモジュヴェリンの発現あるいは活性を調節する組成物を同定するための方法における前記細胞系の使用に関する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は動物の疾患を処置およびまたは予防するための方法に関し、前記方法は、疾患に苦しむ動物あるいは前記疾患の発症の恐れのある動物に、治療上効果的な量のＨＦＥ２Ａ調節因子を投与することを含む。好ましい実施例において、ＨＦＥ２Ａ調節因子は本発明の方法において調節活性を示し、最も好ましくはここで前記物質は、前記方法を用いて最初にＨＦＥ２Ａ調節因子として同定され、そうでなければ前記活性を持つことが知られなかったものである。前記方法の好ましい実施例において、ＨＦＥ２Ａ調節因子は、選択的ＨＦＥ２Ａアゴニストあるいは選択的ＨＦＥ２Ａアンタゴニスト、その薬剤として許容される塩、およびまたはこれらの任意の組み合わせであり、ここでこれらは薬剤として許容される担体（薬剤許容担体）中のものであることを含む。一実施例において、前記疾患は、鉄過剰疾患およびまたは鉄欠乏症を含む鉄代謝の疾患である。このような鉄代謝の疾患はまた、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病およびインスリン抵抗性の一つあるいはそれ以上を含み得る。
【００４０】
またさらなる態様において、本発明は、ＨＦＥ２Ａあるいは関連疾患に苦しむ個体あるいは発現する恐れのある個体を診断する方法に関し、前記方法は前記個体におけるＨＦＥ２Ａ遺伝子の核酸配列の全部あるいは一部を測定することを含み、ここで前記遺伝子の突然変異あるいは多型は、前記個体をＨＦＥ２Ａあるいは関連疾患に苦しむ個体あるいは発現する恐れのある個体として識別する。他の実施例において、本発明はＨＦＥ２Ａあるいは関連疾患に罹患した個体あるいは発現する恐れのある個体を診断する方法に関し、前記方法は前記個体におけるＨＦＥ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列の全部あるいは一部を測定することを含み、ここで前記遺伝子の突然変異あるいは多型は、前記個体をＨＦＥ２Ａあるいは関連疾患に罹患した個体あるいは発現する恐れのある個体として識別する。
【００４１】
本発明はまた、ＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定するための方法を意図し、前記方法は（ａ）ＨＦＥ２Ａを発現する細胞を試験化合物と接触させ、（ｂ）試験化合物の、ＨＦＥ２Ａ核酸の転写あるいはＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する能力を測定することを含み、それによりＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定する。前記方法の好ましい実施例において、化合物は抗ＨＦＥ２Ａポリペプチド抗体、リボザイムあるいはアンチセンスＨＦＥ２Ａ核酸分子である。その一つの好ましい実施例において、化合物はＨＦＥ２Ａリボザイムである。他の実施例において、化合物は有機小分子である。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１および２２より成るグループから選択された配列と最低６０％のパーセント同一性を持つヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドを包含する。他の実施例において、前記パーセント同一性は、最低７０％であり、より好ましくは最低７８％であり、さらにより好ましくは最低９０％であり、またより好ましくは最低９５％であり、さらにより好ましくは最低９８％であり、最も好ましくはここでヌクレオチド配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１および２２より成るグループから選択されたものである。
【００４３】
他のそのような実施例において、本発明は特に、配列番号１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７および２８より成るグループから選択されたアミノ酸配列と最低９０％、好ましくは最低９５％、より好ましくは最低９８％のパーセント同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを包含し、最も好ましくはここで、前記アミノ酸配列は配列番号１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７および２８より成るグループから選択されたものである。
【００４４】
本発明はまた、本発明の方法により同定された物質、あるいは本発明の方法において有用な物質が、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の本発明のポリペプチド、あるいはその薬剤として活性を持つ断片を含む、鉄代謝の疾患を処置するための組成物の形状で存在し得ることを包含する。それらにしたがって、本発明は特に鉄代謝の疾患を処置するための方法を意図し、前記方法は必要とする患者に、治療上効果的な量の前記組成物を投与することを含む。その一実施例において、疾患は若年性ヘモクロマトーシスである。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は鉄代謝疾患の治療のための物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）動物に、ここに開示された方法を用いて活性を持つことが認められた物質を投与し、
ｂ）前記動物における、前記投与に起因した鉄代謝の変化の指標である変化を検出し、
それにより鉄代謝の疾患を治療するための物質を同定することを含む。
【００４６】
好ましくは、動物はヒト等の哺乳類である。特定の実施例において、鉄代謝の変化は、鉄の貯蔵組織分布の変化であり得る。
【００４７】
本発明の好ましい実施例において、ＨＦＥ２Ａを調節することが確認された化合物は、関連遺伝子あるいはタンパク質の前方のＨＦＥ２Ａに選択性を持ち、したがって直接結合によって他の関連遺伝子あるいはタンパク質の活性を調節することはあまりない。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は鉄代謝の疾患に苦しむ動物の状態を処置するための方法に関し、前記方法は前記動物に、本発明の分析法により最初に同定された物質の効果的な量を投与することを含む。好ましくは、前記動物はヒト患者、例えば鉄代謝の慢性疾患に苦しむ患者である。
【００４９】
さらなる態様において、ここに開示された分析法により同定された化合物、および前記化合物を用いて患者を処置する方法は、ＨＦＥ２Ａ活性を調節することにより処置可能なことが認められた鉄代謝の疾患を超えた、代わりのあるいはさらなる兆候に対して適用される。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、この分野における通常の技術を有する者によりこれから同定され得るＨＦＥ２Ａを調節する化合物に関する。これらの化合物は、抗体、アンチセンス化合物、遺伝子治療ベクターおよびタンパク質、また小分子有機化合物を含む。本発明はまた、異常なＨＦＥ２Ａ活性と関連する疾患の治療へのこれらの化合物の使用法を含む。一実施例において、これは鉄代謝の疾患の処置への化合物の使用法である。
【００５１】
他の態様において、本発明はある産物を生み出すための方法に関し、前記方法は本発明のプロセスにしたがって物質を同定することを含み、ここで前記産物は、前記プロセスの結果としての前記物質に関して集められた情報であり、またここで前記情報は、前記物質の化学的構造およびまたは性質を伝えるのに十分なものである。
【００５２】
他の態様において、患者における、配列番号１４、１６および１８に同定された特異的突然変異、および後に関連することが明らかとなるだろう他の突然変異を含む、配列番号１から１２に対応するポリヌクレオチドあるいはポリペプチドにおける一つあるいはそれ以上の突然変異の存在あるいは不在を同定する診断用および薬理ゲノム学用組成物、キットおよび方法に関する。この実施例は、若年性ヘモクロマトーシスの存在あるいは不在の診断に有用である。また、成人発症ヘモクロマトーシスの診断および、その発現と重症度の予測に有用である。
【００５３】
図１は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子の転写中に生じる選択的スプライス変異体を示す。便宜上、コーディングエキソンのヌクレオチド配列は以下のように設定される。
【００５４】
2006523440.tif 000003
【００５５】
選択的スプライス変異体は、遺伝子産物から最低５つの転写産物として生じる。ｃＤＮＡ配列（あるいはＴがＵに置換されている場合にはプロセッシングを受けたｍＲＮＡ配列）に対応する転写産物１から４のそれぞれのヌクレオチド配列は、以下のように設定される。
【００５６】
2006523440.tif 000004
【００５７】
これらの４つのＨＦＥ２Ａ遺伝子の転写産物のそれぞれは、ＨＦＥ２Ａポリペプチドに翻訳され得る。転写産物１および２は、同一の全長タンパク質を生じさせ、したがって、それぞれ２００、３１３および４２６のアミノ酸（ａ.ａ.）の３つの全長タンパク質である。各転写産物から生じるアミノ酸配列は、以下のように設定される。
【００５８】
2006523440.tif 000005
【００５９】
最長のｃＤＮＡ配列（転写産物４、配列番号９）と最長のタンパク質配列（タンパク質３、配列番号１２）は、本明細書において用いられたシークエンシング  ナンバリング慣例法の基礎として用いられてきた。
【００６０】
ＨＦＥ２Ａの配列の特徴は、以下のものを含む種々の情報源に既に開示されている：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ  ａｎｄ  Ｎａｍｅ：ＬＯＣ１４８７３８；ＮＣＢＩ  ＬｏｃｕｓＩＤ：１４８７３８；他の名称：ＥＮＳＧ０００００１６８５０９（アンサンブルｖ．１２．３１．１）、ＮＭ＿１４５２７７（ＲｅｆＳｅｑ）；遺伝子位置：染色体１上の１４２０００３９３から１４２００４６５７ｂｐ（アセンブリ：ヒトゲノムのＮＣＢＩ  ３１アセンブリ、凍結日：２００２年１１月）（参照配列のアンサンブル  バージョン：アンサンブルｖ．１２．３１．１）。ＨＦＥ２Ａの不完全断片は、ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５１４３８に包含され、ここでＲＧＭ３として記載され、神経発達における反発誘導分子（５′コーディング末端からの３アミノ酸、９ｎｔの欠失）として関連している。
【００６１】
以下の実施例１に提示されるポジショナルクローニング法が、染色体領域１ｑ２１が若年性ヘモクロマトーシスと非常に関連することを確認するために用いられた。候補遺伝子が、突然変異が存在するかを確認するために調査された。ここに開示されたＨＦＥ２Ａ遺伝子は、以下に示す種々の有害な突然変異を含むことについて確認された。
【００６２】
【表１】
2006523440.tif 000006
【００６３】
表１は、ＨＦＥ２Ａ（ＥＮＳＥ００００１２７７３５１）において確認された遺伝的変異を示す。突然変異のｃＤＮＡ位置は、一列目に数字で示されている（すなわち、ｃ．６６５）。突然変異は、ＥＮＳＴ０００００３０６５６１（転写産物４）（配列番号９）における開始ＡＴＧコドンから数えた。各変異について、両側の配列の１０塩基が、大文字で記された野生型（ＷＴ）および突然変異型（ＭＴ）塩基と共に示されている。
【００６４】
【表２】
2006523440.tif 000007
【００６５】
表２は、若年性ヘモクロマトーシスファミリーにおいて同定された遺伝的変異を示す。一列目は変異を開示し、他の列は各ファミリーにおける発端者の、突然変異の部位での各染色体の遺伝子型を提示する。ＪＨ３、４、５、６、７、８、９、１０および１２は、変異がホモ接合である。ＪＨ１１は、２つの変異の合わさったヘテロ接合である。
【００６６】
ＨＦＥ２Ａ罹患患者のＨＦＥ２Ａにおける指定された突然変異の分離は、表２で同定されたファミリーにおける全ての罹患者で確認された。変異は、１２８人のヨーロッパ人と３７人のギリシャ人のコントロール（未罹患）個人には見られなかった。したがって、Ｇ３２０Ｖをもたらす１つのコーディング変換を持つ７つのファミリー、１２８１Ｔをもたらす独特のコーディング変換を持つ１つのファミリーおよび、このタンパク質の早期切断（Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｔｒａｎｃａｔｉｏｎ）を持つ２つの他のファミリーの存在は、ＨＦＥ２Ａ（遺伝子３（ＬＯＣ１４８３７８）ＥＮＳＧ０００００１６８５０９  ｖ．１２．３１．１）における突然変異が若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす確信的な証拠となる。
【００６７】
コントロールサンプル（すなわち、ＪＨに罹患していない無関係のヒト）において他の変異が生じた。１２８人のオランダ人のコントロールの２人が、ｃ．１２０７Ｇ＞Ａ，ｐ．Ｖ４０３Ｉについてヘテロ接合である。これらの２つのサンプルにおいてヘテロ接合であったため、ＪＨ表現型が現れるとは思われず、これらの個人においても見られない。この変異は、有害でないオランダ人母集団における一塩基変異多型（ＳＮＰ）であり得る。または、ホモ接合型において現れる場合には、潜在的なＪＨの原因となる突然変異であり得る。この時点ではそれはＳＮＰであるが、診断目的あるいは治療目的について有用であり得る。
【００６８】
ＨＦＥ２Ａの高度に保存されたゲノムＤＮＡプロモーター核酸配列は、ヒト、マウスおよびラットについて、以下のように特定されている。
【００６９】
2006523440.tif 000008
【００７０】
図２のプロモーター配列のアラインメントは、調節領域における種間の高度の保存性を示す。配列保存性は、ヒト配列の転写開始部位の約６７０ｎｔ５′で実質的に失われる。
【００７１】
ゲノム配列：ＨＦＥ２Ａの周辺の核酸配列を説明する全ヒトゲノム配列は、配列番号２２に規定される。エキソンは大文字で示されている。
【００７２】
これらにしたがって、本発明の方法に有用な遺伝子は、配列番号１９、２０、２１および２２より成るグループから選択されたヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチに対応するポリヌクレオチドを含む。
【００７３】
他の態様において、本発明はＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａプロモーターと動作可能に連結するレポーター遺伝子の発現を支持する条件下で、前記レポーター遺伝子を含む遺伝子構成体と接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定することを含み、
ここで発現の変化が前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として同定あるいは確認する。
【００７４】
その好ましい実施例において、前記調節は前記レポーター遺伝子の発現、特に転写の減少あるいは増加であり、また、ＨＦＥ２Ａプロモーターが哺乳類ＨＦＥ２Ａプロモーター、好ましくはマウス、ラットあるいはヒトＨＦＥ２Ａプロモーターである実施例を含む。より好ましい実施例において、プロモーターは配列番号１９のヌクレオチド配列を持つ。
【００７５】
好ましい実施例において、前記レポーター遺伝子の発現は、酵素の活性を測定することにより判断され、例えばここでレポーター遺伝子は容易に測定可能な酵素活性を持つタンパク質をエンコードする。
【００７６】
ここで用いられるように“同定”という用語は、前記試験化合物を、遺伝子発現あるいはポリペプチド活性を調節する物質として最初に同定すること（すなわち、前記物質はこの活性を持つことを今までに知られていなかったか、あるいは予想されていなかったものである）を含むことができ、あるいはそのような活性を、本発明の一つあるいはそれ以上の分析法を実施することにより確認すること（ここで前記物質はこの活性を持つことが既に予想されていたものであるが、そのような活性を持つことが明確に示されなかったものである）を含むことができる。例えばここで、ある物質はＨＦＥ２Ａ遺伝子あるいはポリペプチド活性の調節に以前から関係していたものであり、あるいはここで前記物質は鉄代謝を変更、調節あるいは作用することができる物質であることが予想されたか、あるいはそうでなければ信じられていたものであり、例えばここで前記物質は鉄代謝の調節に関係しており、前記物質の活性は本発明の方法に利用される活性を持つことが確認され、前記物質は示唆された活性を持つことが確認されていたと思われる。
【００７７】
他の態様において、本発明はＨＦＥ２Ａポリペプチド活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）化学物質を、タンパク質間相互作用を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、またあるいは、
ｂ）化学物質を、ＨＦＥ２Ａリガンド−ＨＦＥ２Ａレセプター相互作用を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、またあるいは、
ｃ）化学物質を、脂質組成の修飾を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、またあるいは、
ｄ）化学物質を、関連するセカンドメッセンジャーシグナリング（シグナル伝達）の変換を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
ここで前記相互作用、変換あるいは修飾が調節を示し、それにより前記化学物質を、ＨＦＥ２Ａポリペプチド活性を調節する物質として同定することを含む。
【００７８】
ＨＦＥ２Ａ活性は、関連するセカンドメッセンジャーの変換を介して媒介され得る。
【００７９】
非常に有用な実施例の一つにおいて、遺伝子構成体は、細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくは組換え細胞中に存在し、例えばここで、哺乳類細胞はマクロファージ、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、炎症細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系細胞である。
【００８０】
以下の表３は、コントロール個人のＨＦＥ２Ａ遺伝子中に確認された他の多型（すなわち、若年性ヘモクロマトーシスあるいは他の鉄代謝疾患の臨床発現のないもの）を示す。これらの多型あるいはこの分野における通常の知識を有する者により発見され得る他のものは、診断用あるいは治療用、もしくは他の用途について有用であり得る。
【００８１】
【表３】
2006523440.tif 000009
【００８２】
大文字は多型の位置および性質を示す。ＷＴ＝野生型、ＭＴ＝突然変異
他のヒト遺伝子との類似性
図３は、ＨＦＥ２Ａと、ヒトゲノム中に見られる２つの関連タンパク質との間のアラインメントを示す。類似性は、いくつかの機能がこれらのタンパク質間で共有あるいは類似し得ることを示す。
【００８３】
表４は、ＢＬＡＳＴ＊＊を用いたヒトＬＯＣ１４８７３８  ４２６ａａタンパク質配列（タンパク質３）のヒトパラログ＊との比較を示す。
【００８４】
【表４】
2006523440.tif 000010
【００８５】
＊  染色体５上のＥＮＳＥＳＴＰ００００００２３３９３（アンサンブル）および染色体１５上のヒト反発誘導分子（ヒトＲＧＭ）（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿０６４５９６．１）
＊＊  “ＢＬＡＳＴ  ２配列”を用いた配列比較（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）。パラメーター：ｂｌａｓｔｐ、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、オープンギャップペナルティー  １１、伸張ギャップペナルティー  １、ギャップ×＿ドロップオフ  ５０、ワードサイズ  ３、期待値  １０。
【００８６】
他の生物におけるＨＦＥ２Ａの保存性
２．ヒトＨＦＥ２Ａ遺伝子のホモログが、マウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ラット（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））およびサカナ（トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）（“Ｆｕｇｕ”））において発見された。図４は、これらの配列のヌクレオチドレベルでの配列比較を示す。これらの配列の高度の保存性は表５に示される。表５は、ＢＬＡＳＴ＊＊を用いたヒトＬＯＣ１４８７３８  ４２６ａａタンパク質配列（タンパク質３）のオルソログ（Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）＊との比較を示す。
【００８７】
【表５】
2006523440.tif 000011
【００８８】
＊  生物配列：マウス（アンサンブル：ＥＮＳＭＵＳＥＳＴＰ００００００１６６３４）、ラット（ＮＣＢＩ：ＡＫ０９８１６５．１から翻訳）およびフグ（アンサンブル：ＳＩＮＦＲＵＰ０００００１３８３０８）
＊＊  “ＢＬＡＳＴ  ２配列”を用いた配列比較（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）。パラメーター：ｂｌａｓｔｐ、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、オープンギャップペナルティー  １１、伸張ギャップペナルティー  １、ギャップ×＿ドロップオフ  ５０、ワードサイズ  ３、期待値  １０。
【００８９】
ヒトＨＦＥ２ＡのニワトリＲＧＭとの比較が図５に示される。ヒトＬＯＣ１４８７３８の４２６ａａ配列翻訳物（ＥＮＳＰ０００００３０４６１４と同一のタンパク質３）は、ニワトリ＿反発誘導分子（ＲＧＭ）（ＮＣＢＩ：ＡＹ１２８５０７．１の翻訳）と、かなりの配列相同性（ホモロジー）を共有する。ニワトリＲＧＭアミノ酸配列は、配列番号２８に記載されている。“ＢＬＡＳＴ  ２配列”（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用い、３９５の残基が４６％の同一性、６１％の正数および９％のギャップで揃う。２つのタンパク質はまた、Ｎ−末端シグナルペプチド、細胞接着に関連し得るＲＧＤトリアミノ酸モチーフ、ニワトリＲＧＭ中の可能性のある切断部位として同定された部位、不完全（〜５７％）フォン  ヴィレブランド  タイプＤドメイン、および予測されたＮ−グリコシル化部位を共有する。両タンパク質はまた、Ｃ末端でのＧＰＩ修飾を持つことが予測される。
【００９０】
ヒトＨＦＥ２Ａと、マウス、ラットおよびフグにおけるホモログ、またＭａｃａｃ  ＲＧＭ、ニワトリＲＧＭ、ゼノパスＲＧＭおよびＣ．エレガンスＮＰ由来の配列の間で共通する類似性の概観が図６に示される。この類似性の程度は、他の種由来の類似遺伝子あるいはタンパク質が本発明の種々の実施例に有用であり得ることを示している。タンパク質はまた、３３５と３３６の間の位置での切断をもたらす前駆タンパク質転換酵素フューリン（Ｍｏｌｌｏｙ，Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１６３９６−１６４０２（１９９２））の一致した切断部位（Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ）に相当する配列Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ３３５を持つ。
【００９１】
ヒト、マウス、ラット、ニワトリおよびゼブラフィッシュ由来の関連遺伝子間の配列の比較が図６Ｂに示される。ヒトＨＦＥ２Ａタンパク質のオルソログは、マウス、ラットおよびゼブラフィッシュに見られる（図６Ｂ）。配列比較は、ヒトＨＦＥ２Ａが哺乳類のオルソログと８５％より高く（＞８５％）同一であり、またサカナのオルソログと４５％まで同一であることを示している。ＨＦＥ２Ａの４２６アミノ酸翻訳物もまた、ヒトの反発誘導分子（ＲＧＭあるいはＲＧＭＡ）（４８％の同一性）およびニワトリのＲＧＭ（４６％の同一性）とかなりの配列類似性を共有する（図６Ｂ）。ヒトにおいてはまた、その生物学的機能が現在知られていない第３のＲＧＭ様遺伝子がある。
【００９２】
ＨＦＥ２Ａポリペプチド機能
本発明は、ＨＦＥ２Ａが鉄代謝の重大な調節因子（レギュレーター）であるという重要な発見を教示する。正確にそれがどのようにこのプロセスに関連するかは、依然として十分に明らかにされていない。このタンパク質の活性についての重要な情報は、タンパク質ドメインの分析に基づいて測定することができる。
【００９３】
４２６ａａＬＯＣ１４８７３８遺伝子産物（タンパク質３）は、小胞体へ進入するためのＮ末端疎水性シグナルペプチドを含むＧＰＩ（グリコシル  ホスファチジル  イノシトール）結合タンパク質（図７ａ）と一致した構造上の特徴を持ち、ここでＧＰＩアンカー付加が起こり（残基１から３５、図７ｂ）、またＣ末端疎水性ドメイン／ＧＰＩ付加シグナル配列が起こる（残基４０３−４２５、図７ｃ）（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ  Ｓ  ａｎｄ  Ｋｏｄｕｋｕｌａ  Ｋ  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９５）。ＧＰＩ予測プログラムであるｂｉｇ−Ｐｉ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒは、この遺伝子産物が修飾されたＧＰＩであること、およびアミノ酸３９９あるいは４００のどちらかがオメガ部位として働くことができることを予測する（Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭＢ，２９２（３），７４１−７５８，１９９９）。確認された他の特徴は、ＲＧＭ−細胞接着トリアミノ酸モチーフ（残基９８−１００）（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２，６９７−７１５（１９９６））および不完全フォン  ヴィレブランド因子タイプＤドメインである。フォン  ヴィレブランド因子タイプＤドメインは、フォン  ヴィレブランド因子（残基１６７−２５３）の多量体化のために必要である（Ｊｏｒｉｅｕｘ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９８  Ｄｅｃ  １５；９２（１２）：４６６３−７０）。さらにタンパク質は、残基１７２と１７３の間に、ニワトリ反発誘導分子（ＲＧＭ）との配列比較により同定された可能性のあるタンパク質分解切断部位を持つ（図７ｅ）（Ｍｏｎｎｉｅｒ，Ｐ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１９，３９２−３９４，２００２）。また存在するが示されないものは、コンセンサス配列と一致することが明らかなＮ−グリコシル化部位およびＯ−グリコシル化部位である。
【００９４】
図８は、ヌクレオチド／アミノ酸展望からのＨＦＥ２Ａのタンパク質ドメイン分析を示す。配列の特徴はそこに示されている。
【００９５】
生化学レベルでのＨＦＥ２Ａポリペプチド機能のさらなる特徴は、標準技術を用いてこの分野における通常の知識を有する者により確定されるであろう。ヒトにおけるこの遺伝子の欠如が若年性ヘモクロマトーシス（２Ａ型）あるいはＨＦＥ２Ａの状態を引き起こすことから、ＨＦＥ２Ａポリペプチドが鉄輸送に直接的に関連していることは、本発明から明らかである。
【００９６】
１６個のヒト組織が、エキソン４からのプローブを用いたノーザンブロッティング法により、ＨＦＥ２Ａ発現について検査された。著しいＨＦＥ２Ａ発現が、肝臓、心臓（特に心房）および骨格筋において検出された（不図示）。
【００９７】
公に入手可能なＥＳＴｓ（発現配列タグ）に基づいて、この遺伝子の断片もまた以下の組織中に発現することが認められた。
【００９８】
ヒトＨＦＥ２Ａ：骨格筋、肝臓、坐骨神経、肝臓および脾臓、前立腺、心臓
マウスＨＦＥ２Ａ：乳腺、心臓、舌、肝臓、剣状軟骨、延髄
ラットＨＦＥ２Ａ：脳、卵巣、胎盤、腎臓、肺、肝臓、心臓、筋肉、脾臓
したがって、ＨＦＥ２Ａ遺伝子は、多くの組織に広く発現するが、かなり低いレベルで発現すると思われる。
【００９９】
ＨＦＥ２Ａ突然変異の若年性ヘモクロマトーシスの引き起こし方、あるいは成人発症ヘモクロマトーシスのもたらし方の働きの任意の特定の機構に結びつけられることは望まないが、本発明の遺伝子／タンパク質が鉄代謝において働き得る異なる役割を推測することはできる。例えば、ＨＦＥ２Ａタンパク質は、鉄代謝経路におけるヘプシジンの上流あるいは下流に位置し得る。一つの可能性としては、タンパク質はヘプシジンレセプターあるいはヘプシジンレセプターの共同因子（コファクター）である。他の可能性としては、ヘプシジンの転写、翻訳およびまたはプロセッシングにおけるＨＦＥ２Ａの機能が、ヘプシジンの適切な機能に必要である。ＨＦＥ２Ａはヘプシジン相互作用タンパク質であり得る。別の機能としては、ＨＦＥ２Ａタンパク質は、ヘプシジンレベルのホルモンあるいはホルモン様化合物レギュレーターとしてパラクライン様式で働く、骨髄あるいは肝臓からの分泌因子であり得る。
【０１００】
これらの可能性のある働きの機構は、タンパク質のさらなる探査について示唆するものであるが、しかしながら、ここに含まれる請求の範囲に限定されることを意図するものではない。これらのシナリオの全てにおいて、機能的因果関係は同様であり、すなわち、ＨＦＥ２Ａの機能の喪失は正常ヘプシジン機能を介して鉄代謝を制御する身体の能力の喪失をもたらし、その結果若年性ヘモクロマトーシスあるいは成人発症ヘモクロマトーシスの発現を促進する（おそらくここで、ヘプシジン／ＨＦＥ２Ａ代謝経路における他の因子は、十分に機能しない）。したがって、ＨＦＥ２Ａの活性の調節は、体内の鉄の血清レベル、生体内分布およびまたは代謝を調節するための方法である。
【０１０１】
ＨＦＥ２Ａの調節はまた、鉄あるいは鉄代謝に直接的に関連しない疾患を処置するための方法である。鉄代謝における提示された役割と無関係なＨＦＥ２Ａの機能は、血液量を調節する機能である。ＨＦＥ２Ａは心臓、特に右心房中に多く発現し、そのためＨＦＥ２Ａは、循環血液量検出（センシング）および血液量調節等において、血液学的役割を果たすことができる。または、ＨＦＥ２Ａは心臓において、鉄関連疾患から局所的筋細胞を保護するパラクライン機能を果たし得る。したがって、ＨＦＥ２Ａの活性を調節する化合物は、血液疾患、心疾患（心不全、心筋ミオパチー、体液恒常性障害および不整脈を含むがこれらに限定されない）およびホルモン障害の処置あるいは予防に有用である。また重要なことは、ヘプシジンレベルが細菌感染、炎症、ＬＰＳ注入に対する応答等において活性化されるため、ＨＦＥ２Ａがこれらの疾患の媒介側面に対する適当な治療標的であることであり、また細菌種等の処置において重要であり得る。
【０１０２】
本発明は、ＨＦＥ２Ａの機能が、その正確な働きの機構に係わらず、人体における必須の鉄調節因子であることを証明する。したがって、動物における鉄代謝の疾患を処置するための望ましい薬剤標的である。例えば、ＨＦＥ２Ａが本発明にしたがってＪＨおよび成人発症ヘモクロマトーシスに直接関連するため、発明者は、ＪＨおよび鉄代謝の不良な他の疾患がＨＦＥ２Ａの化学的調節因子を投与することにより処置可能であろうことを認識している。この疾患は、必ずしも異常なＨＦＥ２Ａ遺伝子あるいはタンパク質活性と関連していないであろう。例えば、ＨＦＥ２Ａ活性を調節する化合物は、鉄代謝経路の他の側面における機能不全を補い得る。あるいは、ＨＦＥ２Ａの調節因子は、血液中の鉄レベルに間接的に応答する疾患の処置に用いられ得る。
【０１０３】
本開示において用いられるように、“鉄代謝の疾患”という語句は、その最も広い背景で解釈されるべきである。これは疾患を含み、ここで異常鉄代謝が直接的に疾患を引き起こし、あるいはここで鉄の血中レベルが異常調節されて疾患を引き起こし、またはここで鉄異常調節は他の疾患の結果であり、またはここで疾患は鉄レベル等を調節することにより処置することができる。より特には、本開示にしたがった鉄代謝の疾患は、鉄過剰疾患、鉄欠乏症、鉄の生体内分布の疾患、鉄代謝の他の疾患および鉄代謝に潜在的に関連する他の疾患、その他を含む。さらにより特には、鉄代謝の疾患は、ヘモクロマトーシス、ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ突然変異ヘモクロマトーシス、トランスフェリンレセプター２突然変異ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、新生児ヘモクロマトーシス、ヘプシジン欠乏症、輸血関連鉄過剰状態、サラセミア（地中海貧血）、サラセミア  インテルメディア、αサラセミア、鉄芽球性貧血、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、アフリカ型鉄過剰症、ｈｙｐｅｒｆｅｒｒｉｔｉｎｅｍｉａ、セルロプラスミン欠損症、無トランスフェリン血症、先天性赤血球異形成貧血、慢性疾患に伴う貧血、貧血症、低色素性小球性貧血、鉄欠乏性貧血、ヘプシジン過剰状態、フリードリッヒ運動失調、大腿薄筋症候群、ハレルフォルデン  スパッツ病、ウィルソン病、肺ヘモジデリン沈着症、肝細胞癌、癌、肝炎、肝硬変、異食症、慢性腎不全、インスリン抵抗性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病を含む。
【０１０４】
特に、ＨＦＥ２Ａの調節因子は、慢性疾患に伴う貧血を効果的に処置できる。世界的に、慢性疾患に伴う貧血（ＡＣＤ、また炎症性貧血としても知られている）は２番目に一般的な種類の貧血である。ＡＣＤは入院患者において、最も一般的な貧血に相当する。ＡＣＤは、感染、悪性腫瘍および慢性炎症を含む様々な状態の患者に見られる後天性疾患である。マクロファージによる鉄の保持と、腸の鉄吸収の減少が特徴であり、これは赤血球生成への鉄の利用可能性の減少をもたらす。これらの疾患の経過の初期には、ＡＣＤを患う患者は、異常な鉄再生利用による軽度の正球性貧血を有する。後期には減少した腸吸収により、低色素性小球性状況の鉄欠乏となる。ＡＣＤにおけるヘプシジンの役割を探査した初期の研究は、過剰なヘプシジン生成がＡＣＤの根拠となることを示している。
【０１０５】
マウスヘプシジンの機能の喪失は、重度の鉄過剰をもたらし、ＪＨの生化学的、臨床的表現型と似た表現型を呈する。その一方、動物モデルおよびヒト疾患の両方において、ヘプシジンの過剰発現がマクロファージ鉄保持と、ＡＣＤに見られる鉄障害に特有の鉄欠乏性表現型をもたらす。既存のＡＣＤの治療は、特異的に鉄表現型の改善に向けられた有効な処置を伴わず、主に基礎疾患を処置することを狙っている。したがって、例えばＨＦＥ２Ａの抑制により、ヘプシジン生成を減少させる治療方針は、ＡＣＤに見られる鉄障害を処置するための重要で新規な方法に相当する。
【０１０６】
場合によって、“鉄代謝の疾患”の定義に含まれる疾患および障害は、通常は鉄関連であると識別されない。ＨＦＥ２Ａ（ヘモジュヴェリン）およびその関連タンパク質であるヘプシジンの組織分布に基づく本発明によって、鉄代謝がこれらの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことが認識されている。例えば、ヘプシジンがマウス膵臓中に非常に多く発現することが最近示され、これは糖尿病（Ｉ型あるいはＩＩ型）、インスリン抵抗性、耐糖能異常および他の疾患が根本的な鉄代謝疾患の治療により改善され得ることを示唆するものである（ＩＩｙｉｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｆｅｂｓ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５４２  ２２−２６）。そのようなものとして、これらの疾患は広い定義に包含される。
【０１０７】
治療標的としてＨＦＥ２Ａを用いた処置方法
ＨＦＥ２Ａにおける突然変異が、ヒトにおいて明らかに定義できる生理学的結果（すなわち若年性ヘモクロマトーシス）に関連することの発見は、発明者が、ヘモジュヴェリン、ＨＦＥ２Ａ遺伝子およびＨＦＥ２Ａポリペプチドがヒトにおける鉄代謝の疾患の処置への治療標的として有用であることを初めて証明することを可能にする。“治療標的”という用語は、治療的介入が遺伝子あるいはタンパク質の活性を調節する治療物質によって得られることを意味することが意図される。“調節”は、活性を増加させ、減少させ、あるいはそれ以外に変化させることを意味する。標準的な産業プロセスが、遺伝子あるいはタンパク質の活性を調節し、そのいくつかが以下に規定される治療物質の独自性を確認するために、この分野における通常の知識を有する者によって利用可能である。
【０１０８】
前記にしたがって、本発明は疾患を処置するための方法に関し、前記方法は、前記処置を必要とするヒトに、効果的な量の選択的ＨＦＥ２Ａアゴニストあるいはアンタゴニスト、またはその薬剤として許容される塩、もしくはどちらかの構成要素を包含する薬剤組成物を投与することを含む。
【０１０９】
好ましい実施例において、前記疾患は鉄代謝の疾患である。さらに好ましい実施例において、前記投与は経口あるいは静脈投与法により行われる。
【０１１０】
治療物質を同定するためのスクリーニング分析におけるＨＦＥ２Ａの使用法および潜在的な治療物質の分類
本発明は、ＨＦＥ２Ａの活性を調節する能力にしたがって鉄代謝の疾患を処置する物質の同定のための異なる方法を容易に提供する。前記化合物の同定に有用な分析法の例がここに詳細に示されるが、この分野における通常の知識を有する者は他の方法を知っている。
【０１１１】
以下にある程度詳細に開示される一連の実施例において、分析法は、ＨＦＥ２Ａに関連する生物学的活性を測定するために設計された分析フォーマットにおける、一つずつあるいは組み合わせでの化合物の試験用ライブラリーを伴う。望ましい様式で生物学的活性を調節するこれらのライブラリー化合物は、これにより本発明の治療物質として同定される。実質的に、幅広い種類の化合物が、この分析の測定可能な生物学的活性に影響を与えるか測定するために、順次この分析について試験される。分析は、ＨＦＥ２Ａに対応する遺伝子あるいはポリペプチドの様々な測定可能な生物学的活性の一つあるいはそれ以上に基づき得る。
【０１１２】
ここで用いられるように、“ＨＦＥ２Ａ活性”あるいは“ＨＦＥ２Ａ生物学的活性”は、特にスクリーニング分析に関して、広く解釈されるべきであり、また全ての直接あるいは間接的に測定可能であり同定可能なＨＦＥ２Ａ遺伝子、遺伝子産物およびＨＦＥ２Ａポリペプチドの生物学的活性を意図する。精製ＨＦＥ２Ａポリペプチドタンパク質に関して、ＨＦＥ２Ａポリペプチド活性は、タンパク質の全ての生物学的プロセス、相互作用、結合性質、結合活性関係、ｐＫａ、ｐＤ、酵素反応速度、安定性および機能評価を含むが、これらに限定されない。細胞画分、再構成細胞画分あるいは全細胞におけるＨＦＥ２Ａポリペプチド活性に関して、これらの活性は、ＨＦＥ２Ａポリペプチドが任意の測定可能な生物学的生物学的特徴を実施する速度、および細胞増殖、発生あるいは行動、ＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の他の直接的あるいは間接的作用を含む、これらの作用の全ての測定可能な結果を含むが、これらに限定されない。ＨＦＥ２Ａ遺伝子および転写に関して、ＨＦＥ２Ａ活性は、ＲＮＡを生成するためのゲノムＤＮＡの転写速度、規模あるいは範囲、前記転写における調節タンパク質の作用、前記転写における前記調節タンパク質の調節因子の作用、加えてｍＲＮＡ転写産物の安定性および行動、転写後プロセッシング、ｍＲＮＡ量およびターンオーバー、ｍＲＮＡの発現およびポリペプチド配列への翻訳の全測定値、およびタンパク質発現レベルあるいは動態の全測定値を含む。生物におけるＨＦＥ２Ａ活性に関して、これは、これらの生物における異常なＨＦＥ２Ａ生物学的活性により引き起こされる疾患プロセスあるいは障害において、その不在あるいは不足により同定された生物学的活性を含むが、これに限定されない。いくつかの既知のあるいは示唆された生物学的活性が、本明細書において提供されたＨＦＥ２Ａの開示中に示されるが、この分野における通常の知識を有する者は、通常の知識を用いてさらなる測定可能なＨＦＥ２Ａの活性を同定することができるであろう。大まかに言って、ＨＦＥ２Ａ生物学的活性は、この分野において知られているタンパク質および遺伝子の生物学的特性を分析するためのこれら全ての方法およびその他の方法により測定することができる。
【０１１３】
この分野における通常の知識を有する者がここに開示された配列に対応するＨＦＥ２Ａの型を使用することを好むかもしれないが、同一である必要はないこともまた認識されている。例えば、スクリーニング分析ではヒト、マウス、ラットあるいはフグ由来のＨＦＥ２Ａを採用することが望ましいが、他の分析では異なる生物、好ましくは脊椎動物、最も好ましくは哺乳類種由来のＨＦＥ２Ａを利用することができる。したがって本発明は、より特にここでヒトＨＦＥ２Ａと示されたものと同一の目的に対して、ヒツジ、イヌ、ウシあるいはウマＨＦＥ２Ａを含むがこれらに限定されないものの使用を包含する。ＨＦＥ２Ａのこれらの型の共通する技術的特徴は、発現した場合にそれらが類似の生物学的活性を持つことであり、またＨＦＥ２Ａと機能的類似性を共有することであり、場合によっては、例えばそれはこの分野における通常の知識を有する者により測定され得る。本発明にしたがったＨＦＥ２Ａ遺伝子およびまたはＨＦＥ２Ａポリペプチドはまた、ここでの開示に基づいて、他の哺乳類種、他の脊椎動物、無脊椎動物および微生物から獲得され得る。
【０１１４】
したがって、（自然発生スプライス変異体および対立遺伝子を含む、プロセッシングを受けた、あるいはプロセッシングを受けていない）ＨＦＥ２Ａをエンコードするポリヌクレオチドに“対応する”、本発明のスクリーニング分析において用いるためのポリヌクレオチドは、ＨＦＥ２Ａポリヌクレオチド（配列番号１から９、あるいは１３から２２）によりエンコードされたＲＮＡ、あるいは適度に厳密な条件下でのハイブリダイゼーション等により前記ポリヌクレオチドと相補的なＲＮＡと最低４０％、好ましくは最低５０％、より好ましくは最低６０％、特に最低７０％、さらにより好ましくは最低８０％、あるいはさらに最低８５％、最も好ましくは最低９０％、あるいはさらに最低９５％、または最も特には最低９８％同一であり、特に好ましい実施例においては同一であり、また特にその配列を持つ。さらに、ＨＦＥ２Ａに対応する任意の核酸配列と同じポリペプチドをエンコードするＨＦＥ２Ａタンパク質配列はまた、その配列のパーセント同一性に係わらず、任意のあるいは全ての前記配列に依存する本発明の任意の方法により特に意図され、それは他にどの様に開示あるいは限定されているかに係わらない。したがって、任意の前記配列が、本発明にしたがって開示された任意の方法の実施において用いるために利用可能である。前記配列はまた、ＨＦＥ２Ａポリヌクレオチド内に存在する、ここに定義されたオープンリーディングフレームを含む。
【０１１５】
最初のＲＮＡ転写産物の最終ｍＲＮＡへの変形において起こり得るプロセッシングのために、ここに開示された配列は、全ゲノム配列よりも短いものに相当し得る。これらはまた、エキソンの選択的スプライシングから得られた配列に相当し得る。したがって、細胞内に存在する（そしてゲノム配列に相当する）遺伝子およびここに開示された配列、主にｃＤＮＡ配列は、同一であるか、あるいはｃＤＮＡｓがゲノム配列中の全エキソン未満のエキソンを包含しているものであり得る。前記遺伝子およびｃＤＮＡ配列は、それらが共に類似のＲＮＡ配列をエンコードしているため、対応する配列であると見なされる。したがって、非限定的な例示のみを目的として、転写後により短いｍＲＮＡに加工されるＲＮＡ転写産物をエンコードする遺伝子は、前記ＲＮＡの両方をエンコードしていると見なされ、したがってここに開示されたＨＦＥ２Ａ配列に対応するＲＮＡをエンコードする（この分野における通常の知識を有する者は、“エンコード”という用語およびその派生語が、この分野において、“転写可能である”あるいは“翻訳可能である”という意味であることを理解している）。したがって、ここに開示された配列は、細胞に包含される遺伝子に対応し、またそれらの配列が、これらの遺伝子によりエンコードされたＲＮＡｓと同じ配列であるかあるいは相補的であるため、転写の相対的レベルを測定するために用いられる。前記遺伝子はまた、本発明のプロセスにおいて用いられる細胞中で生じ得る異なる対立遺伝子およびスプライス変異体を含む。
【０１１６】
ここで用いられるように、“パーセント同一性”あるいは“パーセント同一性の”という用語は、配列を示す場合には、配列が、比較される配列（“比較配列”）の、開示あるいは請求された配列（“参照配列”）とのアライメントの後に、請求あるいは開示された配列と比較されることを意味する。その後パーセント同一性は以下の公式にしたがって測定される：
パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
ここでＣは、参照配列と比較配列との間のアライメントの全長にわたる参照配列と比較配列との間の差異の数であり、ここで（ｉ）比較配列中に対応するアライメントされた塩基あるいはアミノ酸のない参照配列中の各塩基あるいはアミノ酸、および（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および（ｉｉｉ）比較配列中のアライメントされた塩基あるいはアミノ酸と異なる参照配列中のアライメントされた各塩基あるいはアミノ酸が差異を構成し、Ｒは、参照配列中に構成されたギャップも塩基あるいはアミノ酸として数に入れた、比較配列とのアライメントの全長の参照配列中の塩基あるいはアミノ酸の数である。
【０１１７】
アライメントが比較配列と参照配列との間に存在し、それに対する上記のように計算されたパーセント同一性が規定の最小パーセント同一性と同等あるいはそれ以上である場合には、たとえアライメントが、上記の算出されたパーセント同一性が規定のパーセント同一性以下である場合に存在したとしても、比較配列は参照配列に対して規定の最小パーセント同一性を持つ。
【０１１８】
ここで文脈は、配列がＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ｔｏｏｌｓを用いて分析されたこと、配列スコア、アラインメント、同一性％、正数％およびギャップ％がこれらの計算に基づいて算出されたことを示唆する。分節対については、アラインメントスコアは、スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）値の合計である。アミノ酸置換行列の理論は［１］に開示され、［２］においてＤＮＡ配列比較に適用される。正数の数が、アラインメントスコアが正数値となる残基の数である。ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックス［３］が、最も弱いタンパク質類似性の検出に最適であることが実験により示された。［１］Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）“Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．”  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５。［２］Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９１）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｃｅｓ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０。［３］Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（１９９２）“Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９。
【０１１９】
ここで用いられるように、“部位”、“分節”および“断片”という用語は、ポリヌクレオチドに関して用いられた場合、ヌクレオチド残基の連続した配列を示し、この配列はより大きな配列の一部を形成する。前記用語は、前記ポリヌクレオチドの任意の共通エンドヌクレアーゼでの処理により産生された生成物、あるいは合成的に合成することが可能なポリヌクレオチドの伸長を含む。これらは、対応遺伝子のエキソンおよびイントロン配列を含み得る。
【０１２０】
本発明は、ＨＦＥ２Ａの活性を測定し、また前記活性に作用するものを同定するために行う化合物の試験に有用な多くの分析法を提供する。分析法のフォーマットに関して、分析法は、細胞全体、細胞抽出物あるいは再構成細胞抽出物、または、精製あるいは半精製タンパク質を用いることができ、あるいはより大きな規模の組織もしくは動物全体の分析であり得る。一般的な分析法は、蛍光、発光、放射活性、あるいはタンパク質／遺伝子転写産物レベル、量あるいは安定性の他の指標に基づく測定を用いる。ポリペプチド分析はまた、ＨＦＥ２Ａポリペプチドが樹脂や他のポリマー等の固体担体に付着されることを含み、特にここでこれは活性を測定するためのカラム処置の一部である。または、バッチ処置もまた使用され得る。
【０１２１】
一態様において、本発明はＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を支持する条件下で、ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドの前記活性の変化を測定することを含み、
ここで、活性の変化が、前記試験化合物をＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質として同定する。
【０１２２】
好ましい実施例において、前記遺伝子は配列番号１から９の配列を持つ。
【０１２３】
好ましい実施例において、ステップ（ｂ）において観察された活性の変化は活性の減少あるいは増加であり、最も好ましくはここで前記活性の変化は、ステップ（ｂ）の前記化学物質による前記ポリペプチドへの結合の結果である。好ましい実施例において、前記物質は、鉄代謝の疾患の処置に有用である。
【０１２４】
他の好ましい実施例において、ポリペプチドは無傷細胞、好ましくは哺乳類細胞の一部であり、また細胞は組換え細胞であり得る。ＨＦＥ２Ａについて、最も関連のある細胞は、マクロファージ、肝細胞、腸細胞、心臓細胞（特に心房細胞）、膵臓細胞、骨格筋細胞および骨髄の細胞を含むが、他の組織由来の細胞も採用し得る。一実施例において、前記細胞は前記ポリペプチドを包含するように処理され、前記処理は遺伝子操作を含み、特にここで前記細胞は前記操作が無ければ前記ポリペプチドを所有しない。したがって本発明は特に、細胞が遺伝子操作以外の方法により処理される実施例を意図し、例えばここでポリペプチドの活性は増強されるものであり、また細胞は前記ポリペプチドを包含するように、あるいはその表面に持つように処理されるが、しかしながらここで前記ポリペプチドは、細胞中に含まれる遺伝子の発現によってではなく、前記細胞の膜あるいは細胞質へのポリペプチドの物理的挿入により存在する。例えばポリエチレングリコール、ウイルス、その他のものの使用といったこの分野においてよく知られた方法は、前記挿入をもたらすために利用され、その方法の詳細はここにさらに開示される必要はない。
【０１２５】
前記方法の好ましい一実施例において、ポリペプチドは、配列番号１０から１２の配列と最低９５％同一、より好ましくは最低９８％同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドと反応する、あるいは特異的な抗体と反応するポリペプチドであり、またここでアミノ酸配列中の任意の差異は、保存されたアミノ酸置換のみに因る。特に好ましい実施例において、ポリペプチドは配列番号１０から１２のアミノ酸配列を持つ。
【０１２６】
本発明のＨＦＥ２Ａポリペプチド分析は、ポリペプチドの活性に起因する分析状態における変化に対する応答における、色を変える種々の染料、あるいは蛍光シグナリング（シグナル伝達）／クエンチングの能力等（しかし、これらに限定されない）の化合物スクリーニング技術を適用し得る。化合物スクリーニング分析はまた、標的ペプチド（ＨＦＥ２Ａポリペプチド）および既知のあるいは発見された相互作用タンパク質もしくはタンパク質レセプターの相互作用を調節するための試験化合物の能力に基づくことができる。前記相互作用タンパク質は、例えば放射性免疫沈降法、共免疫沈降、破壊試験におけるエピトープ標識した構成体の使用、抽出およびクロマトグラフィー技術による同時精製、および酵母２ハイブリッドスクリーニングを含む、この分野における種々の既知の技術により同定することができる。前記相互作用はさらに、表面プラスモン共鳴、蛍光物あるいは蛍光色素を用いた蛍光および発生団を用いたクエンチング等の直接検出法、放射標識タンパク質、蛍光偏光、共焦点蛍光像あるいはシンチレーション近接技術を含むがこれらに限定されない方法により分析することができる。間接的相互作用はまた、細胞静止判別試験、Ｇタンパク質共役型レセプター分析等のセカンドメッセンジャーレポーティング、ｃＡＭＰ検出、酸化窒素シンターゼ、ホスホジエステラーゼ活性、あるいはスフィンゴミエリナーゼ等の脂質修飾、イノシトール三リン酸分析を介して監視され得る。
【０１２７】
ＨＦＥ２Ａポリペプチドの半減期を調節する作用を持つ物質もまた、鉄代謝の疾患を処置するために有用である。非限定的な例示を目的として、この種の物質についての分析は、野生型ＨＦＥ２Ａポリペプチドを発現する細胞を含み、ここで前記ポリペプチドは、翻訳の間一時的、代謝的に標識され、候補化合物と接触させられ、またポリペプチドの半減期は標準技術を用いて測定される。ポリペプチドの半減期を調節する化合物は、本発明において有用な化合物である。
【０１２８】
ここに開示された遺伝子によりエンコードされたポリペプチドが有用である前記分析の一つにおいて、精製あるいは半精製ＨＦＥ２Ａポリペプチド（あるいはその断片、もしくはエピトープ標識した形態またはその断片）は、適当な担体（例えば、前記ポリペプチドのｈｉｓ標識（ヒスタグ）形態の場合のニトロセルロース、抗体あるいは金属アガロース）に結合する。担体への結合は好ましくは、前記ポリペプチドと関連するタンパク質が関連を維持できる条件下で行われる。前記条件は、タンパク質間相互作用の障害を最小限にするバッファの使用を含み得る。必要に応じて、他のタンパク質（例えば、細胞溶解物）は添加され、ポリペプチドと関連する機会が与えられる。その後固定されたポリペプチドは、ポリペプチドあるいは担体に非特異的に関連付けられ得るタンパク質あるいは他の細胞構成体を除去するために洗浄される。固定されたポリペプチドはその後、多目的に使用することができる。Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）により提供されるような、化合物スクリーニング実施例において、結合ＨＦＥ２Ａポリペプチドは、ロー、ミディアムあるいはハイスループット能力での自動化リガンド同定システム（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）に用いられる。この場合、試験化合物のプールは、試験化合物のタンパク質への特異的結合を促進する条件（すなわち、バッファ、温度、その他）下で、ＨＦＥ２Ａへさらされる。非特異的結合を伴う化合物は、混合物から分離される。ＨＦＥ２Ａ／リガンド複合体は続いて回収され、結合リガンドは解除されて質量分析計により測定される。情報分析システムは、質量情報と、元の試験化合物混同物中に含まれる化合物質量のリストと相互に関連付ける。別の実施例において、化合物は、ＨＦＥ２Ａポリペプチドと他の結合分子（推定上ＨＦＥ２Ａポリペプチド相互作用タンパク質である）との間の相互作用に干渉する能力について試験され得る。相互作用タンパク質をうまく置き換えることができる化合物は、それにより本発明のＨＦＥ２Ａポリペプチド調節物質として同定される。精製あるいは半精製標的タンパク質を使用する他のよく知られたタンパク質結合分析はまた、タンパク質への特異的な結合親和性を持つ試験化合物を同定するために用いることができる。
【０１２９】
ＨＦＥ２Ａポリペプチド相互作用タンパク質を同定するように設計された別の実施例において、固定されたポリペプチドはその担体から解離され、またそれに結合したタンパク質は（例えば加熱により）解除され、あるいは結びついたタンパク質は、担体からポリペプチドを解除することなくポリペプチドから解除される。解除されたタンパク質および他の細胞構成体は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、ウェスタンブロッティングおよび特異的抗体を用いた検出、ホスホアミノ酸分析、プロテアーゼ消化、タンパク質シークエンシング、あるいは等電点電気泳動法により、分析することができる。前記ポリペプチドの正常および突然変異形態は、特定の因子がポリペプチドのどの位置に結合するかについてのさらなる情報を得るために、これらの分析に用いることができる。さらに、不完全に精製されたポリペプチドが用いられた場合、タンパク質の正常および突然変異形態の比較は、正確な結合タンパク質の識別を促進するために用いることができる。前記分析は、ＨＦＥ２Ａポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドと相互作用することが知られている精製あるいは半精製タンパク質または他の分子を用いて実施することができる。
【０１３０】
この分析法は以下のステップを含み得る。
【０１３１】
１．エンコードされたポリペプチドを回収し、適当な蛍光標識を結合させ、
２．相互作用タンパク質（あるいは他の分子）を第２の、異なる蛍光標識で標識する。互いに近接近している場合と物理的に離れている場合とで異なるクエンチングパターンを引き起こす染料（すなわち、互いに近接している場合に互いを消光し、近接近していない場合に蛍光する染料）を用い、
３．相互作用分子を、相互作用分子と固定されたポリペプチドの間の相互作用に干渉する能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下で、固定されたポリペプチドにさらし、
４．蛍光読み出し情報を回収する。
【０１３２】
前記タンパク質相互作用についての別の分析法は、蛍光エネルギー共鳴移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ））分析法である。この分析法は以下のようにして実施することができる。
【０１３３】
１．エンコードされたタンパク質あるいはその適当なポリペプチド断片を用意し、適当なＦＲＥＴドナー（例えば、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ））を結合させ、
２．相互作用タンパク質（あるいは他の分子）をＦＲＥＴアクセプター（例えばローダミン）で標識し、
３．アクセプター標識相互作用分子を、アクセプター標識相互作用分子とドナー標識ポリペプチドの間の相互作用に干渉する能力について試験される化合物の存在下あるいは不在下で、ドナー標識ポリペプチドにさらし、
４．蛍光エネルギー共鳴移動を測定する。
【０１３４】
クエンチング分析法とＦＲＥＴ分析法は適応される。分析法において、どちらの蛍光物の組み合わせが用いられるかに依存して、どちらかの分析法を任意のケースに採用することができる。
【０１３５】
ここに示されたＨＦＥ２Ａの解説は、ロー、ミディアムあるいはハイスループットスクリーニング分析の開発に有用であり得るＨＦＥ２Ａの多種多様な生物学的活性を教示する。
【０１３６】
種々の分析法に役立つ有用な生物学的活性の一つは、リガンド結合（すなわち、ＨＦＥ２Ａのリガンドとの結合を抑制あるいは増強する分析法）である。ヘプシジンタンパク質（ＯＭＩＭ：６０６４６４、Ｒｏｅｔｔｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２００３．ＮＡｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３３：２１−２２参照）は、ＨＦＥ２Ａのリガンドであり得る。この分野における通常の知識を有する者は、他のリガンドを見出し得る。ＨＦＥ２Ａの特異的なリガンドとの結合を抑制あるいは増強する試験化合物の能力を測定する、全細胞、細胞抽出物あるいは精製タンパク質に基づく分析法は、開発され得る。
【０１３７】
細胞機能分析法を設計することができる。これらの分析法において、ＨＦＥ２Ａ活性に依存する測定可能な細胞機能は、試験化合物による抑制あるいは増強を判断するために測定することができる。前記機能は細胞増殖分析法を含み、例えばここで、全体で引用例としてここに組み込まれているＰＣＴ国際公開第０２／０５１４３８号パンフレットに開示されている分析法等において、化合物は、軸作成長に影響を与える能力について評価される。ＲＧＤおよびフォン  ヴィレブランド因子様ドメインの存在に基づいて、ＨＦＥ２Ａは細胞間接着に関連し得る。分析法は、ＨＦＥ２Ａ誘導接着の生物学的活性に依存し、また試験化合物の接着を調節する能力を測定するように設計することができる。
【０１３８】
他の細胞に基づく分析法において、ＨＦＥ２Ａタンパク質応答が最初に測定される。例えばＨＦＥ２Ａは、マクロファージによるトランスフェリンへの鉄の放出を調節し得る。あるいはＨＦＥ２Ａは、ＣａＣｏ２膜を超えた鉄の輸送を調節し得る。または、ＨＦＥ２Ａは、分析においてＮＲＡＭＰ２鉄輸送動作の変化を引き起こし得る。ＨＦＥ２Ａに対するこれらの引き起こされた反応を調節する化合物について分析し、それによりＨＦＥ２Ａの生物学的活性の調節因子を見出すことができる。シグナル伝達分析は、ＨＦＥ２Ａのシグナル伝達分子としての可能性のある機能に基づいて開発することができる。適応され得る鉄輸送分析法は、十二指腸腺窩細胞のＨＦＥ−ＣＨＯ細胞モデルにおける鉄取り込みを含む。これは９６ウェルプレート中での分析に適用することができ、ここで試験化合物は鉄取り込みを減少させる。同様に、試験化合物はヒトヘパトーマ細胞（ＨＬＦ）における５９Ｆｅ結合トランスフェリン取り込みを抑制し得る。適応に適した分析法は、Ｓｕ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９２  Ｎｏ．６（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５），１９９８：ｐｐ．２１５７−２１６３；Ｎｕｎｅｚ  ＭＴ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｎｕｔｒ  １９９６  Ｓｅｐ；１２６（９）：２１５１−８；Ｔａｎｄｙ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００  Ｊａｎ  １４；２７５（２）：１０２３−９；あるいはＦｅｅｎｅｙ  ＧＰ  ａｎｄ  Ｗｏｒｗｏｏｄ  Ｍ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００１  Ａｐｒ  ２３；１５３８（２−３）：２４２−５１に開示されたものを含む。ＨＦＥ２Ａは、ヒト反発誘導分子（ＲＧＭ）（図３）およびニワトリＲＧＭ様分子（図５）と配列類似性を共有し、また類似の構造のドメインを共有する。ＲＧＭは神経発生および免疫応答に関連するタンパク質のファミリーである（国際公開第０２／０５１４３８号パンフレット参照）が、タンパク質およびｍＲＮＡ発現が神経細胞中に見られないため、最低いくつかのこれらの機能のＨＦＥ２Ａタンパク質への割り当ては、疑わしいと考えなければならない。ともかく関連タンパク質は細胞膜上で、局所的には細胞内シグナルを開始するレセプターとして、また全身的には分割可溶性タンパク質として働くことが知られている。ニワトリＲＧＭのように、ＨＦＥ２Ａは、それが可溶性ペプチドとして働くことを示唆する推定上の細胞外切断部位を持つ。一つの提示された作用機構は、この分泌分子がヘプシジンのような腸上皮細胞の基底側面表面上のタンパク質と相互作用し、飲食物からの鉄の先端面取り込みを調節するものであり得る。この相互作用は、腸細胞の基底面で直接的であり、あるいは鉄取り込みの調節をもたらす上流相互作用を介し得る。この直接あるいは間接的作用は、細胞培養システムにおいて分析することができる。
【０１３９】
ＨＦＥ２Ａ誘導応答（すなわちＨＦＥ２Ａ生物学的活性）に依存する化合物スクリーニング分析の一例は、Ｃａｃｏ２  ＨＦＥ２Ａ誘導鉄輸送分析である。Ｃａｃｏ２細胞はヒト結腸直腸細胞系であり、腸内吸収を測定するための標準規格であると認められている。コンフルエント（集合する）まで増殖したこれらの細胞は、明確な先端および側底面と、密着結合を形成する。トランスウェル  プレート  インサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｉｎｓｅｒｔｓ）において透過膜上で増殖され、Ｃａｃｏ２細胞は膜上で細胞の側底面を伴って分裂し、Ｂチャンバー溶質にさらされる。一方、細胞の先端部はＡチャンバー中の溶質にさらされる。このシステムは、ＡからＢへの腸上皮を介した鉄の積極的輸送と、細胞を介した腸管腔から血液への偽輸送を測定するために有用である。ＨＦＥ２Ａに対する応答は、ＣａＣｏ２分析のＢ（側底）チャンバーにＨＦＥ２Ａを添加することにより引き起こすことができる。組換えＨＦＥ２Ａは哺乳類細胞中で生成することができ、精製タンパク質はＢチャンバーに直接添加される。または、培養細胞はＨＦＥ２Ａ構成体を移入（トランスフェクト）することができ、続いてＨＦＥ２Ａタンパク質を発現する。トランスフェクションに適した細胞は、それぞれヒト肝臓癌細胞あるいはマウスマクロファージ細胞である、ＨｅｐＧ２あるいはＲＡＷ細胞であろう。これらの２つの細胞型は、鉄代謝に関連し、またおそらくＨＦＥ２Ａを発現することが知られている。ＨＦＥ２Ａを包含するこれらのトランスフェクト“ドナー”細胞からの培地は、Ｃａｃｏ２細胞のＢチャンバーに適用することができ、調整された培地の“アクセプター”およびＡチャンバーからの鉄吸収を監視することができる。トランスフェクトドナー細胞はまた、Ｂチャンバー表面の底部でも増殖させることができ、したがってアクセプター細胞の基底面からミリメートルの範囲内で、Ｂチャンバー中に直接ＨＦＥ２Ａを放出することができる。
【０１４０】
ＨＦＥ２Ａが、レセプターとして働こうと、細胞内シグナル分子として働こうと、あるいは分泌タンパク質として働こうと、この多細胞コミュニケーションシステムはＨＦＥ２Ａ誘導反応を測定するために用いることができる。この分析法は鉄輸送、Ａチャンバーからの鉄取り込み、鉄吸収、およびまたはＢチャンバーへの鉄の細胞分泌を測定し得る。この細胞コミュニケーションシステムはその後、腸吸収における鉄調節のための初期薬剤化合物スクリーニングに用いることができる。
【０１４１】
全細胞あるいは細胞抽出物を用いて、ＧＰＩ切断あるいはＨＦＥ２Ａの分泌を増加あるいは減少させる化合物のために、あるいはＨＦＥ２ＡのＮ−グリコシル化を増加あるいは減少させる化合物のために、分析法を開発することができる。ＨＦＥ２Ａの翻訳後修飾因子を調節する化合物を測定する分析法は、潜在的な治療物質を同定するために用いることができる。
【０１４２】
いくつかの分析法は、好ましくは精製あるいは半精製ＨＦＥ２Ａタンパク質分析法を採用する。このタンパク質は、ＧＰＩ結合型、あるいは切断、可溶性型であり得る。Ｉ１２５標識ＨＦＥ２Ａは、これらの分析法に対して有用であり得る。前記分析法は、ＲＧＤあるいはフォン  ヴィレブランド因子様ドメインによって凝集あるいはホモ二量体化するＨＦＥ２Ａの傾向に基づいて設計された分析法である凝集法を含む。この分析法において化合物は、その同種親和性二量体化ドメインの凝集を増強あるいは抑制する能力について試験される。この場合、上記タンパク質間相互作用分析は、異なる蛍光体で標識されたＨＦＥ２Ａの２つのプールを用いることができる。いくつかの実施例において、ＨＦＥ２ＡのＧＰＩ切断型が、ＧＰＩ結合型と共に用いられ得る。代わりの半精製フォーマットは、酵母２ハイブリッドおよびまたはファージディスプレイフォーマットを含み、ここでＨＦＥ２Ａ結合領域はベイトベクターおよびプレイベクターの両方に組み込まれる。このフォーマットは、ラジオイムノアッセイあるいはプレートフォーマットに適した、適度なハイスループットスクリーニング分析を提供するであろう。
【０１４３】
さらに、ＨＦＥ２Ａは鉄代謝経路の他の既知のタンパク質：トランスフェリン、Ｔｆレセプター、Ｈｆｅ、ヘプシジン、ｐ９７あるいは他の鉄輸送体、およびそのレセプターと相互作用し得ることは注意されるべきである。この相互作用は、スクリーニング分析の基礎として用いられ得る有用な活性である。
【０１４４】
さらに、薬剤スクリーニング分析もまた、遺伝子機能とのアンチセンス相互作用により推定されたポリペプチド機能に基づき得る。ＨＦＥ２Ａの細胞内局在、あるいは前記タンパク質の細胞内局在における変化に起こる影響もまた、薬剤スクリーニングのための分析法として用いられ得る。
【０１４５】
前記にしたがって本発明は、ヒトの身体の組織中に見られ（例えばヒト由来の配列番号１０から１２）、また若年性ヘモクロマトーシスの遺伝的感染と関連する、ヘモジュヴェリンあるいはＨＦＥ２Ａに指定されたタンパク質のアミノ酸配列を提供する。さらに、複数の突然変異が、若年性ヘモクロマトーシスを持つことが確認された個体から得られたこの配列中に認められた。したがって、ヘモジュヴェリンあるいはＨＦＥ２Ａと関係を持つ物質は、本発明の治療物質として評価するための候補化合物に相当する。
【０１４６】
別の広い分野のスクリーニング分析法は、転写分析である。これらの分析法は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子の転写を調節する（すなわち、増加あるいは減少）化合物を同定しようとするものである。転写分析に関連して、一態様において本発明は、その転写が鉄代謝の疾患の改善に役立つポリヌクレオチドの活性を調節する物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）化学物質を、生理的条件下で、ＨＦＥ２Ａのプロモーター領域に対応するポリヌクレオチド（好ましい実施例において、プロモーターは配列番号１９の配列を持つ）と接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリヌクレオチドの転写の変化を検出し、
それにより、前記ポリヌクレオチドの転写あるいは遺伝子活性を調節する物質を同定することを含む。
【０１４７】
前記調節は、好ましくは転写の減少あるいは増加である。好ましい実施例において、前記転写は転写産物の量を測定することにより測定される。有用な実施例において、ＨＦＥ２Ａのプロモーター領域はレポーター遺伝子、すなわちその転写が適宜測定される遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等のレポーター遺伝子）に動作可能に結合する。
【０１４８】
好ましい実施例において、その転写が測定あるいは監視されるべきポリヌクレオチドは、無傷細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはマクロファージ、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞および他の骨髄、神経、ＣＮＳの細胞、あるいは脊髄細胞から選択された細胞中に存在するが、他の組織由来の細胞もまた用いられ得る。さらなる好ましい実施例において、前記無傷細胞は、例えば遺伝子操作により、前記ポリヌクレオチドを包含するように処理された細胞であり、好ましくはここで前記細胞は、そのような操作がなければ目的とする遺伝子あるいはポリヌクレオチドを発現しないものである。または、非組換え細胞は、例として組織の細胞あるいは細胞系に採用することができ、ここでＨＦＥ２Ａの転写は構成的であり、あるいは誘導することができる。
【０１４９】
ここでの開示にしたがって、ＨＦＥ２Ａ遺伝子の上流非翻訳領域およびプロモーター領域は、配列番号１９あるいは２２および公開された検索可能な配列データベースから容易に得られる。前記ゲノムあるいは非翻訳領域は、その転写を調節する物質を同定するための分析等において、同定された遺伝子を包含するプラスミドに含まれ得る。そのような一つの分析法において、上流ゲノム領域はレポーター遺伝子に連結（ライゲーション）し、転写プラスミド中に組み込まれる。プラスミドは細胞中にトランスフェクトされ、組換え細胞は試験化合物にさらされる。レポーターの発現を増加あるいは減少させるこれらの化合物は、その結果遺伝子／タンパク質の調節因子であり、本発明の治療物質と見なされる。
【０１５０】
本発明はまた、ここに開示されたポリヌクレオチドあるいはポリペプチドを発現するように処理された組換え細胞を請求する。ここで動物においてＨＦＥ２Ａに関連すると開示された遺伝子あるいはその断片は、タンパク質を発現させるための手段として使用可能であり、ここで前記遺伝子はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、適切な細胞中でタンパク質をエンコードし、あるいは薬剤スクリーニングのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析において用いるための十分に大量なタンパク質を生成するために用いることができる発現ベクター中に複製することができる。または、発現構成体は、ＨＦＥ２Ａのゲノムプロモーター領域を使用し、それをその発現レベルが容易に測定されるレポーター遺伝子等の遺伝子に連結する。採用され得る発現システムは、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、細菌システム、およびＣＨＯ細胞等の真核生物システムを含む。裸ＤＮＡおよびＤＮＡ−リポソーム複合体もまた用いることができる。したがって本発明は、異種ＨＦＥ２Ａ遺伝子を包含する組換え細胞系を請求する。
【０１５１】
前記組換え細胞は、前記細胞を治療特性を持ち得る物質と接触させた後の、ＨＦＥ２Ａ遺伝子あるいは適当なレポーター遺伝子の転写レベルを分析するための転写分析において用いられ得る。遺伝子転写レベルは、ノーザンブロット分析あるいはＲＴ−ＰＣＲにより、あるいはまた生成されたタンパク質の量の測定により、この分野において知られた多数の方法の一つにより、またはそれらの遺伝子あるいは他の遺伝子によりエンコードされたポリペプチドの生物学的活性のレベルを測定することにより、定量することができる。このように遺伝子転写は、物質に対する細胞の生理学的反応の指標となる標識として働くことができる。したがって、この反応状態は、前記物質での個体の処置の前に、またその間の様々な時点で測定され得る。
【０１５２】
精製タンパク質分析が望まれる場合には、組換え細胞系はまた、精製タンパク質の調製に好適である。この分野における通常の知識を有する者は、組換え細胞系を産生し、高度に精製されたタンパク質を包含するタンパク質画分を抽出することができる。これらのサンプルは、タンパク質と相互作用する化合物を同定するための種々の結合分析に用いることができる。相互作用する化合物は、本発明の治療物質あるいはその類似体である。
【０１５３】
標的選択性は、治療物質の開発の重要な側面である。本発明は特に、ここに定義された、ＨＦＥ２Ａ遺伝子の転写あるいは、それによりエンコードされたＨＦＥ２Ａポリペプチド（ヒト由来の配列番号１０から１２等）の活性に高い特異性を持って作用あるいは拮抗し、また他の遺伝子およびまたはポリペプチドにほとんどあるいは全く影響を与えない化学物質、特に有機小分子の同定を意図する。
【０１５４】
したがって、そのような好ましい実施例の一つにおいて、ＨＦＥ２Ａに対応する遺伝子、好ましくはヒト由来の配列番号１から９の配列を持つ遺伝子の発現を調節、好ましくは抑制し、あるいはそれらによりエンコードされるポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための、ここに開示された方法は、最初に前記物質を同定し、続いて最低一つの他の遺伝子あるいはポリペプチド、好ましくは治療的介入により阻害されず、また、ほとんどあるいは全く影響のない重要な生理学的結果を伴う遺伝子あるいはポリペプチドの発現あるいは活性への影響について、前記物質を試験することを含む。
【０１５５】
他の態様において本発明は、本発明の化合物をコンピュータにより同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）（すなわち、Ｘ線結晶学的技法あるいは他の技法を介して）ＨＦＥ２Ａポリペプチドタンパク質の活性部位の結晶構造を測定し、（ｂ）コンピュータモデリングを介して、活性部位と相互作用する化合物を同定し、それにより化合物ありはその類似体を前記ポリペプチドの活性の調節に有用な化合物として同定することを含む。このプロセスは時にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニングのように示される。コンピュータで作成した数千万の化合物を試験することができる、標的タンパク質と相互作用できる試験化合物の可能性を試験するための高性能ソフトウェアが、この分野における通常の知識を有する者に利用可能である。
【０１５６】
本発明の方法を用いて同定された潜在的な治療化合物は通常、推測された効果を確認するために、動物モデルシステムで試験される。したがって、さらなる態様において、本発明は治療物質を同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）動物に、ここに開示された分析法あるいはスクリーニング法を用いて活性を持つと認められた物質を投与し、
ｂ）前記動物における、前記投与に起因した鉄代謝の変化を検出し、
それにより、鉄代謝の疾患を処置するための物質を同定することを含む。
【０１５７】
この分野における通常の知識を有する者は、動物モデルにおいて（すなわち潜在的な治療物質での処置の結果として）調節され得る鉄代謝の通常の測定結果が、トランスフェリン飽和率、ヘプシジンレベル、腸での放射性鉄取り込み、肝臓鉄含量、全身鉄含量、貧血指数を含むことを承知している。研究に特化したマウスモデルは、貧血性マウス、鉄過剰マウス、ヘモクロマトーシスマウス（ｈｆｅ／ｈｆｅ）、Ｈｐｘマウス（低トランスフェリン血症マウス）、およびその他のマウスを含む。
【０１５８】
さらなる態様において本発明は、鉄代謝の疾患に苦しむ動物の状態を処置するための方法に関し、前記方法は、前記動物に本発明の分析法により最初に同定された物質の効果的な量を投与することを含む。好ましくは、前記動物は、鉄代謝の疾患に苦しむ患者等のヒト患者である。
【０１５９】
したがって、本発明のスクリーニング分析は、鉄代謝の疾患を処置するための治療物質の評価、同定および開発を簡素化する。
【０１６０】
本発明はまた、ヘモジュヴェリン、ＨＦＥ２Ａポリペプチドあるいはそのエピトープを標的とする、あるいは相互作用する、もしくは結合する抗体および免疫反応性物質を含む。ここに開示されたポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドは、モノクローナル抗体を含む抗体をもたらす抗原として用いることができる。前記抗体は、治療物質、機能性試験、薬剤スクリーニング分析、およびまたは診断用物質を含むがこれらに限定されない多種多様な目的に有用であろう。本発明にしたがって同定されたＨＦＥ２Ａポリペプチドの発現あるいは生物学的活性に対する物質（例えば有機小化合物）の影響を監視することは、基礎的な薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験においても適用することができる。例えば、遺伝子転写、タンパク質レベル、あるいは生物学的活性を増加あるいは減少させる、ここに開示されたスクリーニング分析により測定された物質の効果は、不適当な遺伝子転写、タンパク質レベル、あるいは生物学的活性に起因する鉄代謝の疾患の症状を示す被験者（例えば、ここで研究された個体）の臨床試験において監視することができる。または、ＨＦＥ２Ａ遺伝子、および構造的、機能的に関連する遺伝子、それらと高い配列相同性を持つ遺伝子の転写、タンパク質レベル、あるいは生物学的活性を調節することが、スクリーニング分析により測定された物質の効果は、減少した、変換された遺伝子転写、タンパク質レベル、あるいは生物学的活性を示す被験者の臨床試験において監視することができる。このような臨床試験において、ここに開示された遺伝子あるいはポリペプチド、および好ましくは、例えば鉄代謝に関わる他の遺伝子の転写あるいは活性は、特定の薬剤の効果を解明するために用いることができる。
【０１６１】
好ましい実施例において、本発明はある物質（例えば、ここに開示されたスクリーニング分析により同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、小分子あるいは他の薬剤候補）での被験者の処置の効果を監視するための方法を提供し、前記方法は、（ｉ）患者が鉄代謝疾患あるいは障害の処置を必要としていることを判断し、（ｉｉ）ここに開示されたスクリーニング分析の一つを用いて同定された物質の効果的な量を投与し、（ｉｉｉ）前記投与後の鉄代謝の改善を解明し、（ｖｉ）それに応じて被験者への物質の投与を変えるステップを含む。例えば、前記物質の投与の増加は、遺伝子あるいはエンコードされたポリペプチドの発現あるいは活性を減少させるために、すなわち前記物質の効果を高めるために望ましいものであり得る。
【０１６２】
ここで、患者はヒト以外であり、バイオプシーサンプルが、タンパク質、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡ投与後サンプルのレベルを測定し、投与前サンプルの前記タンパク質、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡの発現あるいは活性のレベルと、対応する投与後サンプルのそれとを比較し、それにより、ここに開示された一つあるいはそれ以上の遺伝子、および同時に起こる鉄代謝の疾患の減少への薬剤投与の効果を示すこと等により、遺伝子転写の減少を示すために用いることができる。
【０１６３】
精製あるいは半精製ＨＦＥ２Ａタンパク質、あるいはその断片、もしくはＨＦＥ２Ａに対応するタンパク質、および任意のそれらの生化学的に修飾された型は、それら自体が本発明の治療物質である。これらのタンパク質あるいは断片の組換えあるいは非組換え型は、鉄代謝の疾患等の疾患の治療のために、それを必要とするヒトに投与することができる。この分野における通常の知識を有する者は、前記物質を産み出すための技術および、投与の状態を測定するための技術をよく知っている。
【０１６４】
ＨＦＥ２Ａの細胞における遺伝子発現あるいは遺伝子転写レベルを調節し得る特定の化合物は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子（前記遺伝子のエキソンあるいはイントロン、プロモーター、３′末端部等を含む）と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、リボザイムおよび他の核酸構成体を含む。これらの特定の化合物は本発明の化合物であり、また前述の疾患の処置に有用である。前記化合物の設計および製造は、この分野における通常の知識を有する者によく知られている。
【０１６５】
ＨＦＥ２Ａの活性を調節する特定の化合物は、前記ポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体（ポリクローナルあるいはモノクローナル）および、修飾された抗体あるいは抗体の断片を含む。これらの特定の化合物は本発明の化合物であり、また前述の疾患の処置に有用である。前記化合物の設計および製造は、この分野における通常の知識を有する者によく知られている。特に、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、その他により提供される技術を用いて生成されたヒト化抗体がどちらかといえば好ましい。
【０１６６】
体内のＨＦＥ２Ａの活性を調節する特定の化合物は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子配列あるいは突然変異ＨＦＥ２Ａ配列の全部または一部を包含する遺伝子治療ベクターを含む。この分野における通常の知識を有する者によく知られているように、遺伝子治療は生物中でＨＦＥ２Ａの細胞への送達を可能にし、ここでＨＦＥ２Ａは活動して発現し、それにより前記細胞におけるＨＦＥ２Ａポリペプチドタンパク質のレベルあるいは量を変える。それによりこれらのベクターは、体内でのＨＦＥ２Ａの活性を調節し、ここに開示された治療指標に有用である。
【０１６７】
体内のＨＦＥ２Ａの活性を調節する特定の化合物は、有機小分子を含む。前記化合物は自然発生し得る。あるいは合成したものであり得る。前記化合物の収集物および組み合わせライブラリーは、商業的供給源から広く入手可能である。この分野における通常の知識を有する者に知られているように、本明細書中に開示された分析法等のスクリーニング分析は、望ましいＨＦＥ２Ａ調節能力を持つ治療物質を同定するために、容易に適用することができる。鉄代謝の疾患の減少に効果的であることが認められたアゴニスト、アンタゴニスト、あるいは模倣薬は、動物モデル（例えば、マウス、チンパンジー、その他）において有用であることが確認され得る。他の実施例において、本発明の化合物を用いた処置は、複合的な効果、場合によってはさらに相乗効果を獲得するために、他の治療物質と組み合わされ得る。
【０１６８】
候補調節因子は、精製（あるいは実質的に精製された）分子であり得るか、あるいは化合物の混合（例えば、細胞から得られた抽出物あるいは上清）の一成分であり得る。混合化合物分析において、遺伝子発現は、単一化合物あるいは最小限の化合物混合体が治療効果を持つ態様で遺伝子あるいはタンパク質活性あるいは発現を調節することが示されるまで、候補化合物プール（例えば、ＨＰＬＣあるいはＦＰＬＣ等の標準精製技術により生成される）の漸次小さくなるサブセットに対して試験される。
【０１６９】
最適化誘導および、類似体開発および選択
通常、治療特性を持つ新規薬剤は、自然産物あるいは合成（あるいは半合成）抽出物両方のライブラリー、場合によっては大きなライブラリーから、もしくはこの分野において知られる方法にしたがった化学ライブラリーから同定される。この分野、あるいは薬剤発見および開発における通常の技術を有する者は、試験抽出物あるいは化合物の正確な情報源が本発明のスクリーニング法に絶対不可欠なものではないことを理解するであろう。したがって、事実上いくらでも化学抽出物あるいは化合物を、ここに開示された例となる方法を用いて選別することができる。前記抽出物あるいは化合物の例は、植物、菌類、原核生物あるいは動物抽出物、発酵もろみ液、合成化合物、および既存の化合物の修飾体を含むがこれらに限定されない。多数の方法がまた、サッカライド、脂質、ペプチド、および核酸の化合物を含むがこれらに限定されない任意の数の化学物質のランダムあるいはダイレクト合成体（例えば、半合成あるいは完全合成体）を生成するために利用可能である。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）およびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている。または、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形状の自然化合物のライブラリーは、Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ，ＦＬ）、およびＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃｈａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む、多数の情報源から市販されている。さらに、自然的および合成的に産生されたライブラリーは、必要な場合には、この分野において知られた方法にしたがって、例えば標準抽出および分画法によって作成される。さらに、必要な場合には、任意のライブラリーあるいは化合物が、標準化学的、物理的あるいは生化学的方法を用いて容易に修正される。
【０１７０】
治療活性について既知の物質の複製あるいは繰返しの脱複製（Ｄｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製および化学的脱複製、あるいはそれらの任意の組み合わせ）あるいは除去が、可能であればいつでも用いることができる。
【０１７１】
未精製抽出物が治療活性を持つことが分かった場合、さらに陽性主要抽出物の分画が、観察された効果に関与する化学成分を単離するために可能である。したがって、抽出、分画および精製プロセスの目的は、前記治療活性を持つ未精製抽出物中の化学物質の慎重な特性決定および同定である。化合物の混同体における活性の検出のための、ここに開示された同じ分析法を、活性成分を精製するために、またその誘導体を試験するために用いることができる。前記異種抽出物の分画法および精製法は、この分野において知られている。必要な場合には、病原性の処置に有用な物質であることが示された化合物は、この分野において知られた方法にしたがって、化学的に修飾される。治療価値があることが同定された化合物はその後、この分野において知られた鉄代謝疾患の任意の標準動物モデルを用いて分析される。
【０１７２】
通常、これらのスクリーニング法は、さらに評価されて少数の活性中心構造体に凝縮される大集団（すなわち、組み合わせ法により作成されたもの等の化学ライブラリー）から、関連する自然産物抽出物あるいは合成化合物を選択するための迅速な方法を提供する。前記中心構造体の多数の類似体は、治療物質として改良された特性を持つ好ましい類似体を同定するために開発され、試験され得る。
【０１７３】
改良された類似体はまた、改良された安定性、生体内分布、薬物動態あるいは治療標的の調節に直接的に関連しない治療物質に関して望ましい他の特徴を持つ化合物を含み得る。好ましい実施例において、本発明の改良された類似体は、生理学的方法あるいは補助的な方法により、ＨＦＥ２Ａポリペプチドタンパク質を発現する体内の細胞に効果的にもたらされる。類似体化合物は、それらが同定された生物学的活性を調節するか評価するために体系的に選別され、効果的に調節するものは、その結果、本発明にしたがった治療物質あるいはさらなるそれらの類似体である。
【０１７４】
治療物質およびそれらの使用法
この分野における通常の知識を有する者は、ここに開示された疾患の処置に用いるための、本発明によって最初に同定された新規化学物質および化合物の効果および安全性を証明するために用いられる臨床前試験およびヒト臨床試験に必要なステップに精通している。
【０１７５】
本発明の一つあるいはそれ以上の分析法を用いて、有用な治療物質であると最初に同定された化合物は、単位剤形において、薬剤として許容される希釈剤、担体あるいは賦形剤と共に投与され得る。従来の製薬実務が、前記組成物を患者に投与するのに適した剤形あるいは組成を提供するために用いられ得る。経口投与が好ましいが、任意の適切な投与経路、例えば静脈内、非経口、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、心室内、嚢内、髄腔内、くも膜下腔、硬膜外、槽内、腹腔内、鼻腔内、あるいはエアロゾル投与が用いられ得る。治療剤形は、溶液あるいは懸濁液の形態であり得る。経口投与に対しては、剤形は錠剤あるいはカプセルの形態であり得る。また鼻腔内に対しては、剤形は粉末、点鼻薬あるいはエアロゾルの形態であり得る。
【０１７６】
剤形形成についてのこの分野においてよく知られた方法は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ．，１９９５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｓｔｏｎ，ＰＡに見られる。非経口投与の剤形は、例えば、賦形剤、滅菌水あるいは生理食塩水、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、植物性油、もしくは水素化ナフタレンを含み得る。生体適合性、生体分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド  コポリマー、あるいはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン  コポリマーは、化合物の放出を調節するために用いられ得る。本発明のアゴニストの他の潜在的に有用な非経口送達システムは、エチレンビニルアセテート  コポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み式注入システム、およびリポソームを含む。吸入用の剤形は、賦形剤、例えばラクトースを含み得るか、あるいは例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩を包含する水溶液であり得るか、もしくは点鼻薬の形態で、あるいはゲルとして投与するための油性溶液であり得る。
【０１７７】
組み合わせ治療もまた発明者により意図されている。ここに開示されたスクリーニング法の一つにより同定された治療物質は、同時に起こる状態を処置することを目的とする他の物質と共に投与され得る。例えばここで、治療物質および抗癌剤が、続けてあるいは同時に与えられる。
【０１７８】
本発明はまた、例えば前記産物の同定を容易にするために試験情報を生成することによる、ある産物を産生するための方法を含むプロセスに関し、前記プロセスは、前記物質（すなわちここに開示された分析法にしたがって同定された治療物質）を同定するための開示されたプロセスの一つにしたがって物質を同定することを含み、ここで前記産物は前記同定プロセスあるいは分析法の結果としての前記物質に関して集められた情報であり、またここで前記情報は、前記物質の化学的特徴および／または構造および／または性質を伝達するのに十分なものである。例えば、本発明は特に、本発明の分析法の使用者が希望の酵素調節活性を持つ化合物を選別するために前記分析法を用い、そして化合物を同定し、続いてその情報（すなわち構造、投薬量その他についての情報）を、本発明にしたがって治療あるいは研究目的で前記物質を再生産し、それを投与するために前記情報を利用する他の使用者に伝達するといった状況を意図する。例えば、前記分析の使用者（使用者１）は、多数の試験化合物を前記化合物の構造あるいは同一性を知らずに選別し（例えばここで多数のコード番号が用いられ、最初の使用者は前記コード番号が付されたサンプルが与えられるだけである）、本発明の一つあるいはそれ以上の分析プロセスを用いてスクリーニングプロセスを実施した後、続いて口頭あるいは文書で、もしくは同等の方法で、特定の調節活性を持つ化合物を同定するのに十分な情報（例えば対応する結果を伴ったコード番号）を次の使用者（使用者２）に伝える。この使用者１から使用者２への情報の伝達は、本発明により特に意図される。
【０１７９】
前記にしたがって、本発明は化合物によるＨＦＥ２Ａ遺伝子発現の調節に関する試験情報を生成するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａプロモーターに動作可能に結合するレポーター遺伝子の発現を支持する条件下で、前記レポーター遺伝子を含む遺伝子構成体と接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定し、ここで前記変化は調節を示し、
（ｃ）遺伝子調節活性を示す、測定された遺伝子の発現の変化に基づく前記試験化合物の遺伝子調節活性に関する試験情報を生成することを含む。
【０１８０】
別のそのような実施例において、本発明は化合物によるＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の調節に関する試験情報を生成するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定し、ここで前記変化は調節を示し、
（ｃ）調節活性を示す、ＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の変化に基づく前記試験化合物のＨＦＥ２Ａポリペプチド調節活性に関する試験情報を生成することを含む。
【０１８１】
診断および薬理ゲノム学
さらなる実施例において、本発明は診断用および薬理ゲノム学用化合物、キットおよび方法に関する。この態様は、若年性ヘモクロマトーシス、成人発症ヘモクロマトーシス、鉄代謝の疾患の発症あるいは発症の重傷度の予後診断を含む診断についての、あるいは患者への治療物質の選択（すなわち薬理ゲノム学）におけるＨＦＥ２Ａ遺伝子（ＨＦＥ２Ａ、ヘモジュヴェリン遺伝子）の分析に関する。また、鉄代謝の疾患を患うか、あるいは患う恐れのある患者を分類するためのＨＦＥ２Ａ診断の使用法に関する。
【０１８２】
例えば、核酸分析は、ここに開示されたＨＦＥ２Ａ突然変異を同定するために用いることができ、したがって、若年性ヘモクロマトーシスの診断を確認する。
【０１８３】
本発明において開示された核酸配列、野生型（非疾患関連）配列（配列番号１から９）および疾患関連（突然変異）配列（配列番号１４、１６および１８）の両方を用いて、この分野における通常の知識を有する者は、多数の異なるタイプの核酸診断法、化合物およびキットを開発することができる。技術は、ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーションプロービング、単鎖配座解析、ミスマッチ増幅等のＰＣＲを基礎にした技術、および無数の他のよく知られた方法を含む。それらの分析法の全てが、患者により提供された血液、唾液、尿あるいは他の組織の小サンプルについて実施することができる。
【０１８４】
または、本発明において開示されたタンパク質配列（配列番号１０から１２）を用いて、抗体を基礎にした分析法等のタンパク質を基礎にした分析法（ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ等）は、正常あるいは突然変異ＨＦＥ２Ａタンパク質（ＨＦＥ２Ａポリペプチド）、例えばここに開示された突然変異に起因する突然変異ポリペプチドの発現、量または存在あるいは不在を同定するために用いることができる。
【０１８５】
相対的および絶対的な遺伝子転写および、生物学的活性、突然変異分析は、それぞれ鉄代謝の疾患に対する診断手段として働くことができ、したがって、ＨＦＥ２ＡｍＲＮＡの量の測定は、前記疾患に関係する突然変異の存在あるいは不在を診断するために用いることができる。
【０１８６】
本発明に基づいて、この分野における通常の知識を有する者はまた、動物組織サンプルと共に用いるのに適した、他のＨＦＥ２Ａ突然変異の生化学的、化学的および診断用分析法を開発することができるであろう。
【０１８７】
本発明の有用な実施例は、鉄代謝の疾患を患うか、あるいは患う恐れのある患者を分類するための診断分析を用いるものである。増強した血清フェリチンレベル、トランスフェリンレセプター飽和率、あるいはヘモクロマトーシスの遺伝子（すなわちＨｆｅ遺伝子）における突然変異の同定等の、鉄代謝の疾患についての多くの危険因子がある。これらの危険因子の全てが、鉄代謝の疾患の進行の原因となるわけではない。本発明の教示を用いて、既知の危険因子に基づいて鉄代謝の疾患を患う恐れのある患者を受け入れ、またさらにＨＦＥ２Ａにおける突然変異について判断することが可能であり、ここで（遺伝子の一複製あるいは両複製における）ＨＦＥ２Ａの突然変異は、統計的に、鉄代謝の疾患の発現の高い可能性を示す。この発見は特に、Ｈｆｅ遺伝子の既知の突然変異と軽くのみ関連する、成人発症ヘモクロマトーシスの恐れの診断および予後診断の助けとなる。
【０１８８】
以下のものは、成人発症ヘモクロマトーシスに関連するＨＦＥ２Ａの診断利益の例である。ここに開示されたＨＦＥ２Ａ突然変異を同定するために用いられる核酸あるいはタンパク質分析は、成人ヘモクロマトーシスの発症あるいは重傷度を予測するために用いることができる。成人ヘモクロマトーシスは、臨床浸透度の広い可変性を示す。ＨＦＥ突然変異についてホモ接合である、あるヒト被験者では、重症表現型が早期に発症し、一方ＨＦＥ突然変異についてホモ接合である他の被験者では、臨床的に正常のままである。ＨＦＥ２Ａ遺伝子の評価は、患者に成人疾患が現れること、および比較的症状がないままであることについて情報を与えるものであり得る。
【０１８９】
患者は、Ｈ６３ＤでのＨｆｅ１遺伝子の突然変異について、ヘテロ接合であることが分かった。この突然変異は、常にヘモクロマトーシスの発症を引き起こすわけではない軽度の突然変異であると考えられる。その後、第２の診断試験がＨＦＥ２Ａ遺伝子について実施された。それにより以下のホモ接合突然変異が明らかとなった。
【０１９０】
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【０１９１】
患者は、成人発症ヘモクロマトーシスを発症した。したがって、ＨＦＥ２Ａの突然変異の検出は、既知の危険因子（例えばＨｆｅ１突然変異）により、ヘモクロマトーシスを発症する恐れのある患者を同定し、分類し、またどの患者が疾患を発症するのか判断するのに有用である。
【０１９２】
したがって、本発明は鉄代謝の疾患を発症する恐れのある患者を分類する方法を開示し、前記方法は、
ａ）鉄代謝の疾患についての最初の評価を実施し、
ｂ）ＨＦＥ２Ａについて診断分析を実施することを含み、
ここでＨＦＥ２Ａにおける突然変異の発見は、前記患者を、前記疾患を発症する恐れが統計的に高い患者であると分類する。
【０１９３】
薬理ゲノム学は、病気に冒された個人における変化した薬物動態および異常作用に起因する、薬剤に対する応答の臨床的に重要な遺伝的変異を取り扱う（Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２３：９８３−９８５，１９９６；Ｌｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４３：２５４−２６６，１９９７）。通常、２つのタイプの薬理ゲノム学的状態が区別することができる。遺伝的状態は、薬剤の身体への働き方を変える単一因子（変化した薬剤作用）として伝えられる。あるいは遺伝的状態は、身体の薬剤への働き方を変える単一因子（変化した薬剤代謝）として伝えられる。変化した薬剤作用は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子のプロモーター、イントロンあるいはエキソン配列における多型（例えば、一塩基変異多型あるいはＳＮＰ）を持つ患者に起こり得る。したがって、多型の存在および普及率を測定することにより、特定の治療物質に対する患者の反応の予測が可能である。
【０１９４】
この薬理ゲノム学分析は、治療物質、特に本明細書に開示された疾患を処置するための治療物質の投与による副作用の予測を含む、患者の遺伝子型にしたがった薬剤処置の仕立て方をもたらすことができる。薬理ゲノム学は、個人の遺伝子型（例えば、個人の遺伝子型は、個人の特定の薬剤に反応する能力を測定するために検査される）に基づく、個人の治療あるいは予防処置のための物質（例えば、薬剤）の選択を可能にする。
【０１９５】
ＨＦＥ２Ａ遺伝子（ＨＦＥ２Ａ）に対応する遺伝子あるいはタンパク質を用いる診断はまた、潜在的な治療物質の臨床試験のための患者の選択に有用である。患者は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子のＤＮＡあるいはタンパク質配列にしたがって階層を成すことができ、薬剤処置に対する反応を評価することができる。前記階層化は、潜在的な治療物質についての効果を証明することが求められる患者の数を大きく減らすことができる。
【０１９６】
したがって本発明は、ＨＦＥ２Ａ遺伝子の突然変異の存在あるいは不在を同定するように設計された化合物、試薬およびキットを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９７】
（実施例１）
若年性ヘモクロマトーシス２Ａ（ＨＦＥ２Ａ）に関与する遺伝子突然変異の同定
３．我々は、ＪＨＨを伴う１３人の個人を含むギリシャ人の１０家族を集めた。これらの家族の家系図は、図９ａから９ｄに示される。これらの家族（ＪＨ３から１２）の５家族が既に報告されていた（ＪＨ３から７）（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １ｑ  ｉｎ  Ｇｒｅｅｋ  ｆａｍｉｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．２７，７４４−７４９（２００１））。１家族、ＪＨ７のみが、血族であることが知られている。我々は、疾患が、ゲノム配列から同定された６つの新規マイクロサテライト標識を含む２５個の遺伝子型標識を用いることにより、新しい家族の１ｑ２１（ＨＦＥ２Ａ；ＯＭＩＭ６０２３９０）との関連と一致することを確認した。Ｂｕｉｌｄ  ３１ヒトゲノム配列集合はギャップと複製を含んでいるが、我々は連結間隔の大きさを推定することができ、また既存の配列コンティグに基づいて連結境界と遺伝子含有量を明確にすることができた。ＪＨ７のホモ接合性マッピングは、標識ＣＡ３ＡＬ５９０４５２（１４１５９５６０４から１４１５９５８４７ｂｐ）とＣＡ１ＡＬ５９６１７７（１４３２９３５４３から１４３２９３８２６ｂｐ）の間の〜１．７Ｍｂ間隔中の候補領域の境界を明確にした（各標識のプライマー配列は表６にある）。
【０１９８】
この領域のホモ接合性はまた、既知の血族でない７家族の病気に冒された個人にも観察された。我々は、さらに１２個の標識を用いてハプロタイプを構成することにより、６つの異なるギリシャ人ハプロタイプを得た。家族ＪＨ３、５、６、７、１０、１１および１２の病気に冒された個人は、連結間隔中に最低６から７の標識に対する対立遺伝子を共有していた。ＪＨ４および８の病気に冒された個人は、異なるホモ接合ハプロタイプを示した。
【０１９９】
【表６】
2006523440.tif 000013
【０２００】
ＨＦＥ２Ａの突然変異の同定
ＨＦＥ２Ａの突然変異、（ＬＯＣ１４８７３８）ＥＮＳＧ０００００１６８５０９、転写産物ＥＮＳＴ０００００３０６５６１、アンサンブル  ｖ．１２．３１．１、２００２年１１月。
【０２０１】
我々は最初、この遺伝子の３つのコーディングエキソンの一つ（ＥＮＳＥ００００１２７７３５１、ｖ．１２．３１．１）の配列を決定した。シークエンシングは最初、家族ＪＨ３および４の、固有のハプロタイプを保持していたであろう発端者に限定した。最初に同定された突然変異は、ＪＨ４−２０３における、３′エキソンのＴからＣへの転移（ｃ．８４２Ｔ＞Ｃ、ｐ．１２８１Ｔ）であった。ＪＨ４−２０３は、このＳＮＰについてホモ接合である。病気に冒されていない２人の兄弟と１人の子供は、このＳＮＰについてヘテロ接合である。このＳＮＰは、いずれの他のＪＨ発端者あるいは家族の構成員にも存在せず、また７４人のヨーロッパ人および７４人のギリシャ人のコントロールの染色体にも存在しなかった。
【０２０２】
このエキソン内で同定された第２の遺伝的変異は、ＧからＴへの塩基転換（ｃ．９５９Ｇ＞Ｔ、ｐ．Ｇ３２０Ｖ）である。このＳＮＰは、ＪＨ３発端者ではホモ接合であった。病気に冒されたＪＨ３は、ｃ．９５９Ｔ対立遺伝子についてホモ接合であり、病気に冒されていない１人の兄弟は、このＳＮＰについてヘテロ接合である。このＳＮＰは、１２８人のヨーロッパ人と３７人のギリシャ人のコントロールの染色体には存在しなかった。１０のＪＨ家族の全ての家族構成員のシークエンシングの後、このＳＮＰが家族ＪＨ５、ＪＨ６、ＪＨ７、ＪＨ１０の病気に冒された個人ではホモ接合であり、ＪＨ１１発端者および、ＪＨ１２発端者の両親ではヘテロ接合であることが分かった。
【０２０３】
第３の変異、ヌクレオチド１０７９の欠失（ｃ．１０７９ｄｅｌＣ、ｐ．Ｃ３６１ｆｓＸ３６６）は、ＪＨ８においてホモ接合状態で同定された。これは、５つの固有のアミノ酸および未成熟終止をもたらす。このＳＮＰはまた、ＪＨ１１発端者にも存在し、この個人が複合へテロ接合であることを示す。
【０２０４】
本明細書における配列番号リストに開示された配列についてのさらなる情報
ＬＯＣ１４８７３８エキソン
エキソン１、３ａ、３ｂおよび４はまた、遺伝子ＥＮＳＧ０００００１６８５０９（アンサンブル）およびＲＥＦＳＥＱ  ＮＭ＿１４５２７７．１（ＮＣＢＩ）に見られた。エキソン２は、配列ＡＫ０９８１６５．１に基づくアンサンブル予測から推測され得る。
【０２０５】
配列検索を簡略化するために、エキソン配列配位が、ヒトゲノムのＮＣＢＩ３１アセンブリに基づいて以下に提供される。これらについての配列番号は以下のとおりである。
【０２０６】
配列番号１−エキソン１  ＥＮＳＥ００００１１５５１８８
開始：１４２０００３９３、終止：１４２０００５４１  Ｃｈｒ：１
配列番号２−エキソン２
開始：１４２００１７９０、終止：１４２００１９９３  Ｃｈｒ：１
配列番号３−エキソン３ａ  ＥＮＳＥ００００１１５５１８２
開始：１４２００２３９４、終止：１４２００２４３０  Ｃｈｒ：１
配列番号４−エキソン３ｂ  ＥＮＳＥ００００１２７７３２０
開始：１４２００２３９４、終止：１４２００２９５３  Ｃｈｒ：１
配列番号７−転写産物２  ＥＮＳＴ０００００３１７９２０
エキソン１、３ａ、４、翻訳＿開始：２０８
配列番号８−転写産物３  エキソン１、３ｂ、４  翻訳＿開始：３９２
配列番号９−転写産物４  エキソン１、２、３ｂ、４  翻訳＿開始：２５７
【０２０７】
ＬＯＣ１４８７３８翻訳タンパク質
タンパク質１は、転写産物１および転写産物２のタンパク質翻訳であり、アンサンブルタンパク質ＥＮＳＰ０００００３２００７２およびＮＣＢＩタンパク質ＮＰ＿６６０３２０．１と類似する。タンパク質２は、転写産物２のタンパク質翻訳であり、ＡＫ０９８１６５．１のタンパク質翻訳に見られ得る。タンパク質３は、予測アンサンブルタンパク質ＥＮＳＰ０００００３０４６１４と類似する。配列番号は以下のとおりである。
【０２０８】
配列番号１０−タンパク質１  ＥＮＳＰ０００００３２００７２
転写産物１および転写産物２より翻訳された
配列番号１１−タンパク質２
転写産物３より翻訳された
配列番号１２−タンパク質３  ＥＮＳＰ０００００３０４６１４
転写産物４より翻訳された
【０２０９】
ヒト、マウスおよびラット由来のＨＦＥ２Ａプロモーター配列
配列番号１９から２１については、プロモーター配列は、転写開始部位の１５００ｂｐ５′で始まると思われる。
【０２１０】
ＨＦＥ２Ａプロモーター領域およびエキソンを含むヒトゲノムＤＮＡ断片は以下の配列番号を持つ。
【０２１１】
配列番号２２−ＨＦＥ２Ａプロモーター領域およびエキソンを含むヒトゲノムＤＮＡ断片
配列番号２３−ｇｉ｜２４３０８１８９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０６４５９６．１｜ヒトＲＧＭと類似する
配列番号２４−染色体５上のＥＮＳＥＳＴＰ００００００２３３９３  ヒトＨＦＥ２Ａパラログ、最初のメチオニンから開始する配列と類似する
配列番号２５−ＥＮＳＭＵＳＥＳＴＰ００００００１６６３４  マウスＨＦＥ２Ａと類似する
配列番号２６−ヒト由来であると注釈されるがヌクレオチド配列はラット由来であると同定される、ｇｉ｜２１７５８１２０｜ｄｂｊ｜ＢＡＣ０５２４８．１｜ラットＨＦＥ２Ａと類似する
配列番号２７−Ｎ末端が不明である、ＳＩＮＦＲＵＰ０００００１３８３０８  フグＨＦＥ２Ａと類似する
配列番号２８−ｇｉ｜２２６５１８３４｜ｇｂ｜ＡＡＭ９５４４９．１｜ニワトリＲＧＭと類似する
【０２１２】
この分野における通常の知識を有する者は、上述の化合物および方法の多数の変形に精通しており、その全てがさらに以上に示される請求の範囲によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】ＬＯＣ１４８７３８遺伝子構造を示す図
【図２】ヒト、マウスおよびラットのＨＦＥ２Ａのプロモーター配列のアラインメントを示す図
【図３】ヒトＬＯＣ１４８７３８４２６ａａ遺伝子産物およびヒトパラログのタンパク質配列アラインメントを示す図
【図４】ＣｌｕｓｔａｌＸを用いたＬＯＣ１４８７３８配列の配列アラインメントを示す図
【図５】ヒトＬＯＣ１４８７３８遺伝子産物とニワトリＲＧＭのタンパク質配列アラインメントを示す図
【図６Ａ】複数種のホモログ間の高度の類似性の概要を示す図
【図６Ｂ】異なる種におけるＨＦＥ２Ａに類似する遺伝子間の高度の類似性を示す図
【図７Ａ】ＬＯＣ１４８７３８の４２６ａａ翻訳読み取り枠の構造的特徴を示す図
【図７Ｂ】ＨＦＥ２Ａの４２６ａａ翻訳におけるシグナルペプチド切断部位の予測を示す図
【図７Ｃ】ＨＦＥ２Ａの４２６ａａ翻訳における膜貫通領域の予測を示す図
【図７Ｄ】不完全フォン  ヴィレブランド  タイプＤドメインの同定を示す図
【図７Ｅ】タンパク質分解切断部位（矢印）を示す図
【図８Ａ】ＬＯＣ１４８７３８の転写産物４から翻訳された４２６ａａオープンリーディングフレームの核酸およびアミノ酸配列を示す図
【図８Ｂ】ＬＯＣ１４８７３８の転写産物４から翻訳された４２６ａａオープンリーディングフレームの核酸およびアミノ酸配列を示す図
【図９】若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図
【図９Ａ】若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図
【図９Ｂ】若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図
【図９Ｃ】若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図
【図９Ｄ】若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図
【図９Ｅ】若年性ヘモクロマトーシスを引き起こす遺伝的突然変異を同定するために用いた家系図
【図１】
2006523440.tif 000014
【図２】
2006523440.tif 000015
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
2006523440.tif 000027
【図３】
2006523440.tif 000028
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2006523440.tif 000031
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【配列表】
2006523440000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月6日(2005.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａプロモーターと動作可能に連結するレポーター遺伝子の発現を支持する条件下で、前記レポーター遺伝子を含む遺伝子構成体と接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定することを含み、
ここで発現の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記調節が前記レポーター遺伝子の発現の増加であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記調節が前記レポーター遺伝子の発現の減少であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａプロモーターが哺乳類ＨＦＥ２Ａプロモーターであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記哺乳類がマウス、ラットおよびヒトより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記プロモーターが配列番号１９のヌクレオチド配列を持つことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記遺伝子構成体が細胞中にあることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記細胞が前記遺伝子を発現するように処理された組換え細胞であり、またここで前記細胞が、前記処理がなければ前記遺伝子を発現しないことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法において、前記哺乳類細胞が、マクロファージ、炎症細胞、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系細胞のいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、前記試験化合物が鉄代謝の制御に有用であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、前記試験化合物が、前記方法を用いてＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として最初に同定されることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法において、前記変化が酵素活性の変化を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子を発現する細胞と接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ＨＦＥ２Ａ遺伝子の発現の変化を測定することを含み、
ここで発現の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａ遺伝子発現を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項１５】
ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ）試験化動物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を支持する条件下で、ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの前記活性の変化を測定することを含み、
ここで活性の変化が、前記試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する物質として同定することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが哺乳類ＨＦＥ２Ａポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記哺乳類がマウス、ラットおよびヒトより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法において、前記変化が前記活性の減少であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法において、前記変化が前記活性の増加であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法において、前記ポリペプチドが細胞の一部であることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記細胞が哺乳類細胞であることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法において、前記細胞が前記ポリペプチドを包含するように処理されていることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記細胞が遺伝子操作により処理されたことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記細胞が、前記処理がなければ前記ポリペプチドを包含しないことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法において、前記細胞が、マクロファージ、炎症細胞、肝臓細胞、肝細胞、腸細胞、造血性細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞あるいは神経系の細胞のいずれかであることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが高度に精製されることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが半精製ポリペプチドであることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが固体表面に付着されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法において、前記固体表面が樹脂であることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項１５に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドが抽出物の一部であることを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項１５に記載の方法において、前記ポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８および９より成るグループから選択された配列を持つポリヌクレオチドによりエンコードされることを特徴とする方法。
【請求項３２】
請求項１５に記載の方法において、前記ポリペプチドが、配列番号１０、１１および１２から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
疾患を処置するための方法であって、前記方法が、前記疾患に苦しむ動物に、治療上効果的な量のＨＦＥ２Ａ調節因子を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、請求項１、１４あるいは１５のいずれか一項に記載の方法において調節活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記調節因子が前記方法を用いてＨＦＥ２Ａ調節因子として最初に同定されたことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、選択的ＨＦＥ２Ａアゴニスト、選択的ＨＦＥ２Ａアンタゴニスト、それらの薬剤として許容される塩、およびこれらの組み合わせより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、前記選択されたものが薬剤として許容される担体中にあることを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、抗体、アンチセンス分子、リボザイムおよび薬剤様有機小分子から選択されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法において、前記疾患が鉄代謝の疾患であることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、鉄過剰疾患および鉄欠乏症より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシス、輸血関連鉄過剰状態、サラセミア、ポルフィリン症、および若年性ヘモクロマトーシスより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、貧血および慢性疾患に伴う貧血より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項３９に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４４】
疾患を予防するための方法であって、前記方法は、前記疾患を発症する恐れのある動物に、治療上効果的な量のＨＦＥ２Ａ調節因子を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が請求項１、１４あるいは１５のいずれか一項に記載の方法において調節活性を示すことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法において、前記調節因子が、前記方法を用いてＨＦＥ２Ａ調節因子として最初に同定されたことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４４に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、選択的ＨＦＥ２Ａアゴニスト、選択的ＨＦＥ２Ａアンタゴニスト、それらの薬剤として許容される塩、およびこれらの組み合わせより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記選択されたものが薬剤として許容される担体中にあることを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４４に記載の方法において、前記ＨＦＥ２Ａ調節因子が、抗体、アンチセンス分子、リボザイムおよび薬剤様有機小分子から選択されることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４４に記載の方法において、前記疾患が鉄代謝の疾患であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、鉄過剰疾患および鉄欠乏症より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシス、輸血関連鉄過剰状態、サラセミア、ポルフィリン症、および若年性ヘモクロマトーシスより成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、貧血および慢性疾患に伴う貧血より成るグループから選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５４】
請求項５０に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性から選択されたものであることを特徴とする方法。
【請求項５５】
鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れのある個人を診断するための方法であって、前記方法が、前記個人のＨＦＥ２Ａ遺伝子の核酸配列における突然変異あるいは多型を測定することを含み、ここで前記遺伝子における前記突然変異あるいは多型が、前記個人を鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項５６】
請求項５５に記載の方法において、前記突然変異あるいは多型が、表１に示す突然変異あるいは多型であることを特徴とする方法。
【請求項５７】
鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れのある個人を診断するための方法であって、前記方法が、前記個人のＨＦＥ２Ａポリペプチドのアミノ酸配列における突然変異あるいは多型を測定することを含み、ここで前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドの突然変異あるいは多型が、前記個人を鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項５８】
鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れのある個人を診断するための方法であって、前記方法が、前記個人のＨＦＥ２Ａポリペプチドのレベルあるいは量の変化を測定することを含み、ここで前記変化が、前記個人を鉄代謝の疾患に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項５９】
請求項５５ないし５８のいずれか一項に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が成人発症ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項６０】
請求項５５ないし５８のいずれか一項に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患が若年性ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項６１】
請求項５５ないし５８のいずれか一項に記載の方法において、前記鉄代謝の疾患がＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性から選択されることを特徴とする方法。
【請求項６２】
ＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定するための方法であって、前記方法が、（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａを発現する細胞と接触させ、（ｂ）前記試験化合物の、ＨＦＥ２Ａ核酸の転写あるいはＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を調節する能力を測定することを含み、それによりＨＦＥ２Ａ活性を調節することができる化合物を同定することを特徴とする方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物が抗ＨＦＥ２Ａポリペプチド抗体であることを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物がアンチセンスＨＦＥ２Ａ核酸分子であることを特徴とする方法。
【請求項６５】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物がＨＦＥ２Ａリボザイムであることを特徴とする方法。
【請求項６６】
請求項６２に記載の方法において、前記化合物が有機小分子であることを特徴とする方法。
【請求項６７】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１および２２より成るグループから選択された配列と最低６０％のパーセント同一性を持つヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低７０％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６９】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低７８％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９０％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９５％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９８％であることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１９、２０、２１および２２より成るグループから選択されたものであることを特徴とする。
【請求項７４】
配列番号１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７および２８より成るグループから選択されたアミノ酸配列と最低９０％のパーセント同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドを含む単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９５％であることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７６】
請求項７４に記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記パーセント同一性が最低９８％であることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７７】
請求項７４に記載の単離されたポリペプチドにおいて、前記アミノ酸配列が、配列番号１０、１１、１２、２３、２４、２５、２６、２７および２８より成るグループから選択されることを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７８】
請求項６７に記載のポリヌクレオチドの組換え型を含む細胞系。
【請求項７９】
請求項７４に記載のポリペプチドの組換え型を含む細胞系。
【請求項８０】
ヘモジュヴェリンの発現あるいは活性を調節する組成物を同定するための方法における、請求項７８あるいは７９に記載の細胞系の使用法。
【請求項８１】
鉄代謝の疾患を処置するための組成物であって、前記組成物が、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の請求項７４に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項８２】
鉄代謝の疾患を処置するための方法であって、前記方法が、必要とする患者に、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の請求項８１に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８３】
請求項８２に記載の方法であって、前記疾患が若年性ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項８４】
化合物によるＨＦＥ２Ａ遺伝子発現の調節に関する試験情報を生成するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａプロモーターに動作可能に結合するレポーター遺伝子の発現を支持する条件下で、前記レポーター遺伝子を含む遺伝子構成体と接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定し、ここで前記変化は調節を示し、
（ｃ）遺伝子調節活性を示す、測定された遺伝子の発現の変化に基づく前記試験化合物の遺伝子調節活性に関する試験情報を生成することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８５】
化合物によるＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の調節に関する試験情報を生成するための方法であって、前記方法が、
（ａ）試験化合物を、ＨＦＥ２Ａポリペプチドの活性を促進する条件下で、前記ＨＦＥ２Ａポリペプチドと接触させ、
（ｂ）前記接触の結果としての前記ポリペプチドの活性の変化を測定し、ここで前記変化は調節を示し、
（ｃ）調節活性を示す、ＨＦＥ２Ａポリペプチド活性の変化に基づく前記試験化合物のＨＦＥ２Ａポリペプチド調節活性に関する試験情報を生成することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８６】
単離されたポリペプチドあるいはその断片であって、前記ポリペプチドが、配列番号１０、１１および１２より成るグループから選択されたアミノ酸配列と最低９０％のパーセント同一性を持つアミノ酸配列を含み、前記断片が最低１０個のアミノ酸残基を含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項８７】
請求項８６に記載の単離されたポリペプチドあるいはその断片において、前記パーセント同一性が最低９５％であることを特徴とする単離されたポリペプチドあるいはその断片。
【請求項８８】
請求項８６に記載の単離されたポリペプチドあるいはその断片において、前記パーセント同一性が最低９８％であることを特徴とする単離されたポリペプチドあるいはその断片。
【請求項８９】
請求項８６に記載の単離されたポリペプチドあるいはその断片において、前記ポリペプチドが配列番号１０、１１および１２より成るグループから選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする単離されたポリペプチドあるいはその断片。
【請求項９０】
請求項８６、８７、８８あるいは８９のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するように処理されたことを特徴とする組換え細胞系。
【請求項９１】
ヘモジュヴェリンの発現あるいは活性を調節する組成物を同定することへの、請求項９０に記載の細胞系の使用。
【請求項９２】
鉄代謝の疾患を処置するための組成物であって、前記組成物が、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の請求項８６、８７、８８あるいは８９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項９３】
鉄代謝の疾患を処置するための方法であって、前記方法が、必要とする患者に、薬剤として許容される担体中の治療上効果的な量の請求項８６、８７、８８あるいは８９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項９４】
請求項９３に記載の方法において、前記疾患が若年性ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項９５】
請求項９３に記載の方法において、前記疾患が成人発症ヘモクロマトーシスであることを特徴とする方法。
【請求項９６】
請求項９３に記載の方法において、前記疾患が慢性疾患に伴う貧血であることを特徴とする方法。
【請求項９７】
請求項９３に記載の方法において、前記疾患が鉄欠乏性貧血であることを特徴とする方法。
【請求項９８】
請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドが、ポリペプチドの１３ｋＤａから４０ｋＤａの分解産物をエンコードすることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９９】
請求項６８に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドがＨＦＥ２Ａポリペプチドの分解産物をエンコードし、前記分解産物がおおよそ１３ｋＤａから４０ｋＤａであることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１００】
請求項６９に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドがＨＦＥ２Ａポリペプチドの分解産物をエンコードし、前記分解産物がおおよそ１３ｋＤａから４０ｋＤａであることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
請求項７０に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドがＨＦＥ２Ａポリペプチドの分解産物をエンコードし、前記分解産物がおおよそ１３ｋＤａから４０ｋＤａであることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
請求項７１に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドがＨＦＥ２Ａポリペプチドの分解産物をエンコードし、前記分解産物がおおよそ１３ｋＤａから４０ｋＤａであることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
請求項７２に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドがＨＦＥ２Ａポリペプチドの分解産物をエンコードし、前記分解産物がおおよそ１３ｋＤａから４０ｋＤａであることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
請求項７３に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記ヌクレオチド配列が配列番号７、８および９より成るグループから選択され、前記単離されたポリヌクレオチドがＨＦＥ２Ａポリペプチドの分解産物をエンコードし、前記分解産物がおおよそ１３ｋＤａから４０ｋＤａであることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
請求項９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３あるいは１０４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドにおいて、前記分解産物が約２６ｋＤａのポリペプチドを含むことを特徴とする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
請求項５８に記載の方法において、前記変化が減少であることを特徴とする方法。
【請求項１０７】
請求項５８に記載の方法において、前記変化が増加であることを特徴とする方法。
【請求項１０８】
慢性疾患に伴う貧血を診断するための方法であって、前記方法が、個人におけるＨＦＥ２Ａポリペプチドのレベルあるいは量の変化を測定することを含み、前記変化が前記個人を慢性疾患に伴う貧血に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項１０９】
鉄欠乏性貧血を診断するための方法であって、前記方法が、個人におけるＨＦＥ２Ａポリペプチドのレベルあるいは量の変化を測定することを含み、前記変化が前記個人を鉄欠乏性貧血に冒されているか、あるいは発症する恐れがあるとして同定することを特徴とする方法。
【請求項１１０】
請求項１０８または１０９に記載の方法において、前記変化が減少であることを特徴とする方法。
【請求項１１１】
請求項１０８または１０９に記載の方法において、前記変化が増加であることを特徴とする方法。
【請求項１１２】
請求項５７に記載の方法において、前記突然変異あるいは多型が前記ポリペプチドの断片の存在を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項１１３】
請求項１１２に記載の方法において、前記診断が、前記断片の大きさを測定することに基づくことを特徴とする方法。
【請求項１１４】
請求項５８に記載の方法において、前記変化が前記ポリペプチドの断片の存在を検出することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項１１５】
請求項１１４に記載の方法において、前記診断が、前記断片の大きさを測定することに基づくことを特徴とする方法。
【請求項１１６】
請求項１０８または１０９に記載の方法において、前記変化が前記ポリペプチドの断片のレベルあるいは量を測定することにより測定されることを特徴とする方法。
【請求項１１７】
請求項１１６に記載の方法において、前記診断が、前記断片の大きさを測定することに基づくことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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