(57)【要約】本発明は、HIV関連認知症(HAD)、微少認知/運動障害(MCMD)、HADに関連する神経因性疼痛または他の要因による神経因性疼痛を処置および予防するための新規な方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIVウイルスまたはそのタンパク質に曝露された神経細胞の細胞死を抑制する方法であって、HIV-1に曝露された神経細胞をエリスロポエチンポリペプチドのアポトーシス抑制量と接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記エリスロポエチン存在下においてその非存在下と比較して神経組織における神経細胞死の量が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エリスロポエチン存在下においてその非存在下と比較して神経細胞死が10％減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記エリスロポエチン存在下においてその非存在下と比較して神経細胞死が50％減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記エリスロポエチン存在下においてその非存在下と比較して神経細胞死が100％減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記エリスロポエチン存在下においてその非存在下と比較して神経細胞死が200％減少する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞をエリスロポエチンレセプターポリペプチドと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
神経細胞死を抑制する方法であって、神経組織をエリスロポエチンポリペプチドのアポトーシス抑制量と選択的に接触させることを含む方法。
【請求項９】
前記エリスロポエチンを鼻腔内に投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記エリスロポエチンをくも膜下腔内に投与する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経組織をエリスロポエチンレセプターポリペプチドと接触させることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
神経疾患症状を軽減する方法であって、感染症関連神経疾患に罹患している個体を同定し、該個体にエリスロポエチンの治療有効量を投与することを含む方法であって、該感染症がHIV-1感染症である方法。
【請求項１３】
前記神経疾患が、HIV関連認知症(HAD)、微少認知/運動障害(MCMD)、HADに関連する神経因性疼痛または他の要因による神経因性疼痛からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記個体がヒトのオスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記個体が授乳中でないヒトのメスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記エリスロポエチンの治療有効量が約1U/kg/日から2000U/kg/日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
可溶性エリスロポエチンの治療有効量が約100U/kg/日から1500U/kg/日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記エリスロポエチンの治療有効量が約1000U/kg/日から1250U/kg/日である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記エリスロポエチンを鼻腔内に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記エリスロポエチンをくも膜下腔内に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量を前記個体に投与することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量が約1U/kg/日から2000U/kg/日である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量が約100U/kg/日から1500U/kg/日である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量が約1000U/kg/日から1250U/kg/日である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターを鼻腔内に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターをくも膜下腔内に投与する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターおよびエリスロポエチンの両方を患者に投与した場合、可溶性エリスロポエチンレセプターによりエリスロポエチンの安定性が増加する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
神経疾患症状を軽減する方法であって、慢性神経障害に罹患している個体を同定し、該個体にエリスロポエチンの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記神経障害が、肥満関連神経障害または神経因性疼痛である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記個体がヒトのオスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記個体が授乳中でないヒトのメスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記エリスロポエチンの治療有効量が約1U/kg/日から2000U/kg/日である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
可溶性エリスロポエチンの治療有効量が約100U/kg/日から1500U/kg/日である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記エリスロポエチンの治療有効量が約1000U/kg/日から1250U/kg/日である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記エリスロポエチンを鼻腔内に投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記エリスロポエチンをくも膜下腔内に投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量を前記個体に投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量が約1U/kg/日から2000U/kg/日である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量が約100U/kg/日から1500U/kg/日である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量が約1000U/kg/日から1250U/kg/日である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターを鼻腔内に投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターをくも膜下腔内に投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記可溶性エリスロポエチンレセプターおよびエリスロポエチンの両方を患者に投与することにより、可溶性エリスロポエチンレセプターがエリスロポエチンの安定性を増加させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
エリスロポエチン、可溶性エリスロポエチンレセプターおよび製薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項４５】
1またはそれ以上の容器に請求項４４の医薬組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経因性疼痛を処置するためのエリスロポエチン(EPO)を含む組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の症状のひとつに、HIV関連認知症(HAD)に指定されている認知および運動障害症候群(syndrome of cognitive and motor dysfunction)がある。高活性抗レトロウイルス治療(HAART)の時代ではあるが、微少認知/運動障害(minor cognitive/motor disorder)(MCMD)と名付けられた軽度の神経性機能障害が明らかな認知症よりも蔓延しつつある可能性がある。HADおよびMCMDは、依然として後天性免疫不全症候群(AIDS)による死亡の重要な独立危険因子である(Kaul, M., et al., Nature 410:988-994(2001), and Power, C., et al. Can. J. Neurol. Sci. 29:19-32, (2002))。末梢神経におけるウイルス複製の制御法および日和見感染の処置法が改善されているにもかかわらず、HAARTではHADの進行を完全に防ぐことができない。
【発明の開示】
【０００３】
［発明の概要］
本発明は、例えばHIV-1感染などの感染症に関連するような神経細胞死を抑制するための組成物および方法を特徴とする。該方法は、HIV-1に曝された神経細胞をEPOポリペプチドのアポトーシス抑制量と接触させることによって行う。EPOは、神経細胞がHIV-1またはgp120に曝される前または後のいずれかに投与する。EPOはまた、神経症状を検出する前または後のいずれかに投与する。好ましくは、神経細胞は、gp120誘導性アポトーシスが開始する前にEPOポリペプチドと接触させる。EPO非存在下と比較してEPO存在下の方が神経細胞死は減少する。例えば、EPO非存在下よりもEPO存在下またはEPOと細胞を接触させた後の方が、神経細胞死は10％、50％、100％、200％またはそれより多い割合で減少する。該方法は状況に応じて、神経細胞または神経組織とEPOレセプターポリペプチドを接触させる段階を含む。
【０００４】
また本発明は、神経組織とEPOポリペプチドのアポトーシス抑制量を選択的に接触させることにより神経細胞死を抑制する方法も含む。例えばEPOは、非神経組織への曝露が最小限になるように、鼻腔内またはくも膜下腔内に投与する。状況に応じて、EPOレセプターポリペプチドを投与する。
【０００５】
感染症関連神経障害または慢性疾患関連神経障害(例えば糖尿病関連神経障害)の神経疾患症状を軽減する方法は、神経症状を伴う感染症(例えばHIV-1)または慢性疾患に罹患している個体を同定し、該個体にエリスロポエチンの治療有効量を投与することによって行う。疼痛および微少または重篤な認知症などの認知機能障害のような症状は、EPO組成物を投与すると軽減する。例えば、被験者はオスまたは授乳中でないメスである。
【０００６】
EPOの治療有効量とは神経疾患症状を軽減する量である。好ましくは、gp120誘導性神経細胞アポトーシス死、CXCR4の活性化、アストロサイト増加、マクロファージの浸潤、ミクログリア数の増加、多核巨細胞、髄鞘の淡明化、樹状突起およびシナプスの損傷、明らかな神経細胞の損失を引き起こすアポトーシス、マクロファージ/ミクログリアの蓄積、gp41、gp160、Tat、Nef、RevまたはVpr誘導性神経細胞アポトーシス死、Ca2+の過剰、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)、ミトコンドリアのチトクロームc放出、カスパーゼの活性化、フリーラジカル形成、脂質の過酸化およびクロマチン凝縮を軽減する量のEPOを投与する。例えば、エリスロポエチンの治療有効量は約1U/kg/日から2000U/kg/日であり、可溶性エリスロポエチンレセプターの治療有効量は約1U/kg/日から2000U/kg/日である。状況に応じて、IGF-1をEPOと併せて同時投与または投与する(例えば、EPO投与前または投与後、数分、1から12時間または1から7日以内)。インスリン様成長因子Iの治療有効量は約1U/kg/日から2000U/kg/日である。該組成物は鼻腔内、くも膜下腔内または静脈内に投与する。可溶性エリスロポエチンレセプターおよびエリスロポエチンの両方を患者に投与する場合は、エリスロポエチンの安定性が増加する量の可溶性エリスロポエチンレセプターを投与する。
【０００７】
また本発明は、エリスロポエチン、可溶性エリスロポエチンレセプターおよび製薬的に許容される担体を含有する医薬組成物、および1またはそれ以上の容器に前記医薬組成物を含むキットも含む。本明細書に記載する組成物は精製物である。例えば、組換えタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、または他の組換え方法を用いて発現し、当分野で既知の方法で培養細胞から単離する。精製または単離したということは、目的タンパク質またはポリペプチドが組成物に対して85重量％であることを意味する。好ましくは、目的EPOポリペプチドは組成物に対して少なくとも90、95、98、99または100重量％である。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
HIV関連認知症(HAD)、微少認知/運動障害(MCMD)、HADに関連する神経因性疼痛または他の要因による神経因性疼痛を処置するために、エリスロポエチン(EPO)を単独で、または可溶性EPOレセプター(短いEPO半減期をより長くする)と同時に投与する。EPOは、外皮糖タンパク質gp120などのHIV-1関係毒素への曝露による損傷やアポトーシスから神経細胞を保護する。
【０００９】
HIV-1外皮糖タンパク質gp120は神経細胞の損傷やアポトーシスを誘導し、これがHIV関連認知症の一因となる(Kaul, et al., Nature 410:988-994(2001))。EPOは脳で生産され神経を保護するサイトカインであるが(Digicaylioglu & Lipton, Nature 412:641-647(2001))、gp120誘導性の神経細胞損傷に対するEPOの効果はこれまで評価されていない。
【００１０】
エリスロポエチン(EPO)は赤血球前駆細胞の増殖および分化を誘導する主要な成長因子であり、インターロイキン2から7、G-CSF、GM-CSF、TPO、成長ホルモンおよびレプチンを含むサイトカインファミリーのメンバーである(Koury and Bondurant, Transfusion 30: 673-674(1992))。
【００１１】
EPOがEPOレセプターに結合すると、細胞表面上でのリガンド媒介性レセプター二量体形成によって、シグナル伝達が誘発される。EPOレセプターの細胞外領域の膜基部へシステイン残基を導入する点変異は、その結果、ジスルフィド結合したレセプターダイマーを細胞表面に生じるものであり、恒常的に活性である。そのようなレセプターにより、ホルモン非存在下において、EPO依存性細胞株の細胞増殖およびEPOの他の生物学的作用が引き起こされる(Yoshimura et al., Nature 348: 647-649 (1990); Watowich et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:2140-2144 (1992); and Watowich et al., Mol. Cell. Biol. 14:3539-3549 (1994))。マウスにおいてこれらの構成的なEPOレセプターが発現すると、シグナル経路の無秩序な活性化によって赤白血病が起こる(Longmore and Lodish, Cell 67:1089-1102(1991); Longmore et al., Mol. Cell. Biol. 14: 2266-2277 (1994))。EPOレセプターが活性化するとEPO上の高親和性部位1と結合し、次いで第二のレセプターが低親和性部位2と結合するという、連続した二量体形成機構が進行することが示されている(Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:9471-9476 (1996))。
【００１２】
本明細書で使用する「エリスロポエチン」なる用語は「EPO」と同義であり、天然に存在するヒトEPO(配列番号：１)またはその相同体のアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドを意味する。本発明において有用であるEPOには、ヒトおよび他の霊長類のEPO、ウシ、ブタ、マウスおよびラットの相同体などの哺乳類のEPO、およびゼブラフィッシュ(Danio rerio)の相同体のような他の脊椎動物の相同体が含まれる。従って、EPOなる用語は、以下の表１に示した成熟ヒトEPO配列(配列番号：１)の種相同体もしくはスプライス型、イソ型およびグリコシル化変異体、および前駆体を包含する。
【表１】
2006521404.tif 000002
【００１３】
EPOは一般的に、天然に存在する成熟ヒトEPO(配列番号：１)に対して少なくとも約80％のアミノ酸一致度のアミノ酸配列を有し、また例えば、配列番号：１に対して90％または95％またはそれより大きいアミノ酸一致度を持つ可能性もある。配列一致度は、NCBIウェブサイトのBLASTPを利用して標準的なパラメーターを用いて決定する。
【００１４】
天然のエリスロポエチンは高度にグリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞から調製したEPOは、Nが3つおよびOが1つ結合した、平均炭水化物量が約40％のグリコシル化部位を持つ。天然のEPOにおいて、炭水化物は、安定性、生合成、頂端分泌および生物学的活性において重要な役割を担っている。グリコシル化はEPOの高次構造には影響しないが、特に、高次構造の安定性および溶解性の両方が向上するようである。従ってEPO類似体は、天然のヒトEPOと比較して過剰グリコシル化型でもあり得る。そのような類似体は当分野で既知であり、ダルベポエチン(Darbepoietin)を含むがこれに限定されない。
【００１５】
様々なグリコシル化パターンを持つ多様な形態のエリスロポエチンが市販されており、EPOGEN(Amgen、サウザンドオークス、カリフォルニア州)、EPOGIN(中外製薬、東京、日本)、EPOMAX(Elanex、ボセル、ワシントン州)、EPREX(Janssen-Cilag、Beerse、ベルギー)、NEORECORMONおよびRECORMON(Roche、バーゼル、スイス)およびPROCRIT(Ortho Biotech、ラリタン、ニュージャージー州)等があるが、これらに限定されない。様々な形態のEPOはまた総称的にEPOETIN ALFA、EPOETIN BETAおよびEPOETIN OMEGAとして入手できる。従って、本発明に有用なEPOは、市販品から得るか、または、これらに限定するものではないが、自然源からの精製、組換え体の発現またはペプチド合成または化学合成などの周知の様々な方法で調製することができる。本発明の方法は、要するならば「EPO類似体」を用いて実施できる。本明細書で使用する「EPO類似体」なる用語は、エリスロポエチンレセプターの発現、活性または細胞内シグナリングを誘導または促進し、またインスリン様成長因子と協力して、神経細胞において即座に相乗的な神経保護作用を創出する分子を意味する。そのような類似体は、以下に限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態物、小分子、リボザイム、核酸分子、オリゴヌクレオチド、オリゴサッカライド、細胞、ファージまたはウイルス、またはそれらの組み合わせであり得る。さらに以下に記述するように、本発明に有用なEPO類似体には、これらに限定するものではないが、エリスロポエチン擬態性ペプチド(EMPs)、環状ペプチドまたはペプチド擬態物などの環状分子、ダイマーおよびオリゴマーのEPO類似体、血漿半減期がより長い類似体、抗EPOレセプター抗体、EPOレセプターの二量体化を誘導する小分子薬、EPOの過剰グリコシル化型、EPOをコードする核酸分子および構成型のEPOレセプターも包含する。EPO類似体なる用語は、以上に記載したEPOの活性断片も包含すると理解されたい。
【００１６】
可溶性EPOレセプターはEPOと共に投与して、患者のEPO半減期を延ばすことができる。EPOレセプターのアミノ酸配列の例を以下の表２に示す。
【表２】
2006521404.tif 000003
【００１７】
組換え型ヒトEPOは、強い加熱により、システイン7および161が関与する分子間ジスルフィド結合に基づいて二量体を形成する。従って、エリスロポエチンのオリゴマー型並びにオリゴマーのEPO断片およびその類似体は本発明に有用であり得る。概して、DePaolis et al., J. Pharm. Sci. 84: 1280-1284 (1995)およびDerby et al., Int.J. Peptide Protein Res. 47: 201-208 (1996)を参照のこと。
【００１８】
本発明に有用なEPOのオリゴマー型またはそれらの活性断片または類似体には、ダイマーおよびトリマー、およびより多量体型が含まれる。EPOのオリゴマー型には、EPOまたはそれらの活性断片または類似体の、2またはそれ以上、3またはそれ以上、4またはそれ以上、5またはそれ以上、6またはそれ以上、7またはそれ以上、8またはそれ以上、9またはそれ以上、10またはそれ以上、15またはそれ以上、20またはそれ以上、50またはそれ以上、100またはそれ以上、200またはそれ以上、500またはそれ以上、1000またはそれ以上のコピーも含まれ得る。例として、化学的架橋結合、合成ペプチド化学、ファージディスプレイおよびビオチンで標識したEPOとストレプトアビジンのコンジュゲートは、オリゴマーEPO類似体の作製に有用であり得る。
【００１９】
ダイマーおよびトリマーEPO類似体は、2つの機能を持つ架橋結合試薬を用いて、例えば、エリスロポエチンモノマーの第一のプールを化学的に修飾して遊離のスルフヒドリル残基を含ませ、このプールとマレイミド基を含む第二のプールを混合することによって作製でき、オリゴマーEPOは例えばサイズ排除HPLCで実質的に精製できる。
【００２０】
天然のヒトエリスロポエチンは約4から13時間という比較的短い血漿半減期を持つが、より分子サイズの大きいEPO類似体は減少したクリアランス速度を持つ可能性があり、それゆえ血漿生存時間およびインビボ生物活性は増大する可能性がある。従って、EPOのオリゴマー型またはその活性断片または類似体などのより分子量の大きいEPO類似体は、天然のモノマーのヒトEPOの血漿半減期と比較して増加した半減期を示す可能性がある(Sytkowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1184-1188 (1998))。オリゴマー型のEPOは、例えば、少なくとも15、18、21、24、48、72または96時間の半減期を持ち得る。当業者は、要すれば、天然のエリスロポエチンまたはその活性断片または類似体の半減期を延ばすために可溶性EPOレセプターを用いることができ、それにより治療的効果が得られることを認識している。
【００２１】
多数の形態のエリスロポエチン、並びにその活性断片および類似体が本発明の方法に有用であり得る。神経細胞をEPOまたはその活性断片、例えばヒトEPOまたはその活性断片と接触させる。別の態様において、神経細胞と、これらに限定するものではないが、ペプチド、ペプチド擬態物、小分子または核酸EPO類似体であり得るEPO類似体を接触させる。好ましいEPO類似体は以下のアミノ酸配列を含む：
2006521404.tif 000004
【００２２】
EPOまたはその活性断片または類似体は、好ましくは、天然ヒトEPOよりも少なくとも10倍高い、EPOレセプターに対する親和性を持つ。EPOタンパク質または活性断片はオリゴマー、例えばダイマーである。例として、そのようなEPOのダイマー型は各モノマーが以下のアミノ酸配列を含む：
2006521404.tif 000005
【００２３】
HIV感染の神経病理学
HADは、アストロサイト増加、マクロファージの浸潤、ミクログリア数の増加、多核巨細胞、髄鞘の淡明化、樹状突起およびシナプスの損傷、および明らかな神経細胞の損失を引き起こすアポトーシスなどの特定の神経病理学的症状をしばしば伴う。マクロファージ/ミクログリアの蓄積はHADの重傷度と相関しており、HIV-1に感染したかまたは免疫によって刺激されたマクロファージ/ミクログリアは神経毒を生産する。重要なことには、神経細胞にはHIV-1の増殖的感染はないが、主に小児の場合アストロサイトにだけまれにそれが起こる。
【００２４】
興味深いことに、少なくともインビトロでは、無傷のウイルスが存在しない場合でさえ、HIVタンパク質gp120、gp41、gp160、Tat、Nef、RevおよびVprが神経を損傷することが報告されており、インビボでも動物モデルにおいて数件報告されている。インビボで齧歯類にgp120を脳室内注射すると脳が損傷し、またgp120を発現するトランスジェニックマウスモデルでは、HAD患者の死後脳標本で観察される多くの神経病理学的特性が現れる。
【００２５】
HADにおけるケモカインレセプター
マクロファージおよびリンパ球へのHIV-1感染は、ウイルス外被タンパク質gp120が、CD4およびいくつかの潜在的なケモカインレセプターの1つと結合した後に起こる。マクロファージおよびミクログリアへの感染は主としてβケモカインレセプターCCR5またはCCR3を通して起こるが、βケモカインレセプターCXCR4も関与している可能性がある。ケモカインレセプターの内でもHIVコレセプターCCR5およびCXCR4は神経細胞およびアストロサイト上にも存在する。CXCR4はHIV関連の神経細胞の損傷に直接的に関与しているが、CCR5はさらに保護的な役割を担っている可能性がある。
【００２６】
大脳皮質の神経細胞および神経細胞株においては、ピコモーラー濃度のHIV-1のgp120は未処理のウイルスと同様、CXCR4レセプターを介して神経細胞死を引き起こすことができる。未処理の脳細胞組成物を模倣した、神経細胞/グリア細胞を混合した大脳皮質培養においては、直接的な神経の損傷よりむしろ、主にミクログリアの毒の放出によって、アポトーシス死が媒介されるようである。しかし、CXCR4と相互作用する(間質細胞由来因子)SDF-1αがナノモーラー濃度存在すれば、ミクログリア非存在下で神経細胞のアポトーシス死を引き起こすことができ、このことは、アストロサイトとの相互作用の一方、神経細胞との直接的な相互作用が起こり得ることを示唆している。これらの発見とは対照的に、SDF-1αがある程度高濃度で存在すると、海馬の単離神経細胞をX4指向性株のgp120誘導性の損傷から保護することが報告されている。しかし、非神経細胞が関係細胞死経路を修飾することが分かっているので、単離神経細胞から得られた結果は、神経細胞/グリア細胞混合培養に見られる結果とは異なる可能性がある。
【００２７】
ラットおよびマウスの大脳皮質の神経細胞/グリア細胞混合培養を用いて、gp120の神経毒性下でのケモカインレセプターの役割を調査した。CXCR4(X4)およびCCR5(R5)指向性および二重細胞指向性(dual-tropic)HIV-1株由来のgp120の全てが神経細胞死を誘発した。βケモカインであるマクロファージ抑制性タンパク質(macrophage inhibitory protein)(MIP)-1βおよびRANTESは、gp120の神経毒性を抑制する。興味深いことに、あるX4指向性HIV-1株のgp120はCXCR4欠損大脳皮質培養において神経毒性を欠いていたが、X4に分類された別の株のgp120は、二重細胞指向性株のgp120SF2と同様に神経細胞死を誘導する能力をいくらか残していた。驚いたことにgp120SF2は、CCR5ノックアウト培養において、野生型またはCXCR4欠損型の培養と比較して、さらに高い神経毒性を示した。これらの発見は、主としてgp120によるCXCR4活性化の細胞毒性効果と一致する。対照的に、CCR5の活性は少なくともある程度は神経保護的である。にもかかわらず、R5指向性HIV-1のgp120も神経細胞死を誘導する。しかし、HIV-1のR5またはX4指向性による分類は、主として、細胞死シグナリング経路の活性化または誘導よりむしろ、標的細胞への感染に特定のレセプターを利用するウイルスの能力に基づいていることを念頭に置いておくことが重要である。それゆえこの分類は、感染を引き起こすHIV外被の相互作用に限り有効である。従って、HAD機構を理解するためには、感染における特定のケモカインレセプターへの指向性によって分類したHIV-1のgp120を、活性化および下流の細胞内シグナリングを誘発する他のレセプターとのさらなる相互作用能に関して再評価しなければならないかもしれない。特に、R5指向性マクロファージ向性株のgp120の、CXCR4を介する細胞内シグナリング開始能について検査する必要があるかもしれない。
【００２８】
ミクログリア活性化を抑制すると、少なくともインビトロでは、gp120曝露後の神経細胞死を十分防ぐことができることから、gp120の神経毒性にはマクロファージ/ミクログリアにおけるCXCR4の刺激が必須であるようである。対照的に、SDF-1はアストロサイトおよび神経細胞においてCXCR4を直接活性化し、例えばアストロサイトのグルタミン酸取得の回復によって、神経細胞死を誘発する可能性がある。
【００２９】
脳におけるHIV-1とNMDAレセプター活性化
AIDS患者の検体の分析ならびにインビボおよびインビトロ実験では、HIV-1感染はCNSにおいて興奮毒性状態を創出することが示されている。マクロファージおよびミクログリアは脳内でHIV-1に増殖的に感染する支配的細胞であり、重大な役割を担っている。さらに、HIV-1に感染した、またはgp120によって刺激された単核食細胞は、NMDAレセプターを直接刺激するキノリン酸、システイン、血小板活性化因子(PAP)およびNToxに指定されている低分子量化合物などの神経毒を放出することが示された。
【００３０】
さらに、HIVに感染した、またはHIVにより活性化したマクロファージ/ミクログリアおよびおそらくアストロサイトも、興奮毒性の神経細胞損傷に間接的に寄与する可能性がある、腫瘍壊死因子(TNF)α、アラキドン酸代謝物、フリーラジカル(活性酸素種(ROS)および一酸化窒素(NO))およびマトリックスメタロプロテアーゼ(MMPs)のような細胞外基質分解酵素などの炎症性メディエータを生産する。これらの事実から、gp120により活性化したマクロファージ/ミクログリアから放出されるアラキドン酸を介してアストロサイトのグルタミン酸取得が回復することにより、興奮毒性状態を悪化させることが分かった。SDF-1、TNF-αおよびプロスタグランジンはまた、アストロサイトのCa2+依存性グルタミン酸放出を促進することができる。
【００３１】
HIV-1感染および関連する神経障害には、ケモカインレセプターおよびNMDAレセプターの両方が媒介する興奮毒性が関与する。ケモカインレセプターは、まずHIV感染において、さらにウイルス感染の結果生産され得るケモカインへの反応において種々の度合いで関与する。例えば、単球走化性タンパク質(monocyte chemoattractant protein)(MCP)-1、MIP-1α、MIP-β、RANTESおよびSDF-1は全て、直接的および/または間接的に、神経細胞、アストロサイトおよびミクログリアの生理的機能を妨害するようである。NMDAレセプターは神経伝達物質および神経毒などの興奮物質に反応するが、ケモカインレセプターと結合したGタンパク質もそれらの活性に影響する可能性があり、逆もまた同様である。βケモカインであるRANTESは、NMDAレセプターの過剰な刺激によって誘導される神経細胞損傷を減少させることができる。すなわち、興奮毒性刺激によってCCR5の発現を促進できる。
【００３２】
NMDAレセプターの下流経路
NMDAレセプターの過剰な刺激が起こり、初めの興奮毒性侵襲が劇症性である場合、細胞はイオン恒常性を失い急性の膨張および溶解(壊死)を引き起こして初期に死ぬ。膨張がより穏やかであれば、HADを伴う場合に見られるように、神経細胞はアポトーシスとして知られるプログラム死経路に入る。興奮毒性膨張後の神経細胞アポトーシスには、Ca2+の過剰、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の活性化、ミトコンドリアのチトクロムcの放出、カスパーゼの活性化、フリーラジカル形成、脂質の過酸化およびクロマチン凝縮が関与している。p38MAPKは、ミオサイトエンハンサー因子(myocyte enhancer factor)2(MEF2)などの転写因子をリン酸化および活性化する。興味深いことに、MEF2をカスパーゼで切断することによっても、神経細胞アポトーシスに寄与できる。カスパーゼ3および7により、転写活性を欠くがDNAとの結合は保っている切断MEF2分子が生成する。従って、MEF2断片は明らかに非切断MEF2と競合し、結果として神経細胞の生存促進遺伝子の転写を妨げる。
【００３３】
抗体媒介性のTNF-αの中和またはその下流エフェクターカスパーゼ8の抑制によっても、培養大脳皮質神経細胞においてHIVgp120の神経毒性を防ぐことができる。カスパーゼ8の活性化はカスパーゼ3活性を誘発し、アポトーシスを引き起こす。少なくともインビトロでは、Bcl-2ファミリータンパク質は、HIV-1感染後の神経細胞の損傷を抑止する潜在力を持っている。神経細胞は明らかに、HIV感染によって生じる興奮毒性に応答してBcl-2またはBcl-xLを上方制御する能力を持っておらず、このことが神経細胞の脆弱性を助長している可能性がある。
【００３４】
足場タンパク質PSD-95(後シナプス肥厚(postsynaptic density)-95)は、NMDAレセプター作動性イオンチャンネルと、Ca2+により活性化する酵素である神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)を繋いでおり、nNOSをCa2+の近接近へ運ぶ。細胞内Ca2+が過剰であるとnNOSおよびプロテインキナーゼカスケードを過剰刺激し、ROS、NOおよび過酸化亜硝酸(ONOO-)などの細胞毒性フリーラジカルの生成を引き起こす。ROSおよびNOは細胞毒性の高いONOO-を作り出すことができる。HIV患者の死後脳標本の研究データは、免疫性NOS(iNOS)およびgp41の発現がHADの発症および重症度と相関していることを示している。さらに、gp120の神経毒性作用も、少なくともインビトロでは、NOS(おそらくnNOSとiNOSの両方)に依存している。
【００３５】
NOの細胞内作用に加え、MMP-9のニトロシル化およびそれに次ぐ活性化によって媒介される、神経細胞傷害への潜在的な細胞外タンパク質分解経路が、近年確認されている。タンパク質分解活性を持つMMP-9は、おそらく細胞接着因子と細胞外マトリックスの相互作用を破壊することによって神経細胞死を引き起こす。MMP-2およびMMP-9を含むMMPの発現および活性化は、非感染対照と比較すると、HIV感染マクロファージ、またAIDS患者の死後脳標本において増加している。
【００３６】
MMPの活性化は興奮毒性脳傷害およびNOS活性に伴って起こる可能性がある。例えば、MMP-9をニトロシル化により活性化する。次いで、インビトロで大脳皮質培養の神経細胞に対するNO活性化MMP-9の作用を調査した。これらの実験のために、組換え体(R)-proMMP-9を、培養へ投入する前に、内在性のNO供与体であるS-ニトロソシステイン(SNOC)で前活性化した。18時間後に神経細胞アポトーシスを評価した。培養が活性化MMPでインキュベートされる頃にはNOはすでにSNOCから放出されきっているので、SNOCから直接放出されたNO、またはSNOCから放出されたNOからの過酸化亜硝酸の生成および結果生じるスーパーオキシドアニオン(O2-)との反応が誘発する神経細胞死は起こり得なかった。しかし、非活性のproMMP-9またはMMPインヒビターGM6001で処置すると神経細胞死はブロックされたが、NO活性化MMP-9では神経細胞アポトーシスが有意に増加した。さらに、多くの神経細胞がNO活性化MMP-9への曝露後にシャーレから離れた。これらの結果は、非活性のproMMP-9タンパク質は神経細胞に有害な作用を及ぼさないことを示している。しかし、NO誘発性の活性化によりMMP-9は神経毒へと変化した。
【００３７】
HADの処置における治療的アプローチ
HADに対する真に効果的な薬物療法は未だ開発されていない。HADの原因に関して蓄積されてきた証拠から、抗レトロウイルス(ARVs)に加えいくつかの潜在的な治療戦略が適用できることが示されている。臨床的耐容性を持つNMDAレセプターアンタゴニストであるメマンチンは検討中の薬剤のひとつである。他の薬剤には、βケモカイン、例えばCXCR4およびCCR5を活性化するケモカインおよびサイトカインレセプターアンタゴニスト、MMP、p38MAPKまたはカスパーゼのインヒビター、および抗酸化物質が含まれる。
【００３８】
ケモカインレセプターはHIV-1感染を媒介し、特定のケモカインはインビボで感染をブロックする。さらに、HIV患者のCSFにおけるβケモカイン濃度の上昇と比較的良い神経病理学的効果とは相関している。
【００３９】
NMDAレセプターアンタゴニストに関して、メマンチンはNMDAレセプターに関連するイオンチャンネルの非競合性のオープンチャンネルブロッカーであることが分かった。メマンチンは、異常な長さでNMDAレセプター作動性チャンネルが開いている時のみ該チャンネルをブロックする。反対に、正常な神経伝達が行われており、NMDAレセプター依存性チャンネルの活性がより小さい時には、メマンチンは僅かにしか作用しない。実際に、メマンチンは、中程度から重度の認知症を伴うアルツハイマー病二期の患者の最近の臨床試験において、HADへの適用が期待できる結果を示し、三期の試験においては明らかに好ましい効果を表した。
【００４０】
NO関係ニトロソニウムイオン(NO+)を生成するニトログリセリンは、少なくともある程度において、NMDAレセプター/チャンネル複合体の酸化還元調節部位に作用し、レセプター活性および後の過剰なCa2+流入による神経細胞損傷を減少させる。
【００４１】
投与計画
本発明の組成物をあらゆる適切な形態で投与し、HIV関連認知症(HAD)、微少認知/運動障害(MCMD)、HADに関連する神経因性疼痛または他の要因による神経因性疼痛に目的の処置を施す。
【００４２】
本発明は、より効果的なHADの処置方法、および該方法に使用可能なHADを処置するための医薬組成物を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、HADに罹患している患者を処置するための、処置に必要な、または病気の症状を少なくとも部分的に軽減するEPOの治療有効量、およびその使用説明書を含むキットに関する。
【００４４】
本発明はHADの症状の軽減に適している。これらのHADの症状とは、HADに関連する、またはHADに起因する症状を含み、また神経因性疼痛を含む。
【００４５】
患者に(処置の)効果あるかどうかを評価するためには、例えば、神経因性疼痛の軽減などの量的な方法で患者の症状を検査する。処置が成功した場合、患者の状態は改善されるはずである(つまり、神経因性疼痛の症状が軽減する)。
【００４６】
認知症の症状には、記憶、問題解決能力、意志決定能力、判断、外界に対する自身の位置を確認する能力、および簡単な文章をつなぎ合わせ言葉で意思疎通する能力の喪失が含まれる。これはしばしば人格の変化とも関連する。神経障害の症状には、知覚麻痺、疼痛、脱力感および位置覚の喪失が含まれる。
【００４７】
神経障害は神経伝導速度(NCV)の測定または筋電図検査(EMG)によって診断する。神経伝導速度の研究では活動電位が神経を伝わる速度を記録し、電気的反応を測定する。EMGは筋組織における電気的活性を記録し、神経障害と筋肉疾患(筋傷害)を区別するのに用いられる。
【００４８】
認知症は、(1)近時記憶と遠隔記憶の低下、および(2)1またはそれ以上の以下の機能傷害の証拠を観察することによって診断する：単語の誤用または単語を正しく記憶および使用する能力の欠如(つまり失語症)、身体能力は完全なままであるが運動活動を行う能力の障害(つまり失行症)、知覚機能は完全なままであるが物体を認識する能力の障害(つまり失認)、または計画、組織化、要約して考える能力の障害。
【００４９】
あらゆる薬物において、投与量は処置の成功および患者の健康にとって重要な要素である。あらゆる場合において、特定の範囲内で、医師は担当患者の性別、年齢、体重、病態および他の条件から最適な投与量を決定しなければならない。
【００５０】
本発明の医薬組成物は活性物質の治療有効量を含む。化合物の量は処置する患者に依拠するであろう。適切な量を決定する際には、患者の体重、病気の重症度、投与方法および処方医の判断を考慮に入れるべきである。EPOの治療有効量の決定は当業者の技能の範囲内で行えば良い。
【００５１】
いくつかの場合、薬剤の患者の処置に関する添付文書に書かれた範囲外の用量を投与する必要がある可能性がある。これらの場合は処方医には明らかであろう。そのような用量が必要な場合に、患者の反応と併せて処置を中断、調整または中止する方法や時期も医師は知っているであろう。
【００５２】
製剤および投与
本発明の化合物は安定に製剤した投与形態で投与する。化合物は製薬的に許容される塩の形態で、または医薬組成物に含めて患者に投与する。医薬組成物に含めて投与する化合物は、適切な担体または賦形剤とともに、該組成物中に治療有効量が存在するように混合する。「治療有効量」なる用語は、目的のエンドポイント(例えばHADに関連する症状の軽減)に到達するのに必要な化合物の量を意味する。
【００５３】
個体、半個体、液体およびガス状などの様々な調製物が、EPO含有医薬組成物の製剤に利用できる。製剤および投与技術は「レミングトン：薬学の科学と実践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)、第20版」(Lippincott Williams & Wilkins, フィラデルフィア、ペンシルベニア州)に記載されているであろう。錠剤、カプセル、丸薬、粉末、顆粒剤、糖衣錠、ゲル、スラリー、軟膏、溶液、坐薬、注射、吸入薬およびエアロゾルなどがそのような製剤の例である。該製剤は、局在的または全身的方法で、またはデポーまたは徐放形式で投与することができる。組成物の投与は様々な方法で行うことができる。好ましい態様において、投与ルートは鼻腔内またはくも膜下腔内である。他の態様においては、投与ルートに、経口、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮および気管内ルートを用いることができる。本発明の組成物は、本明細書に記載の安定化剤、担体および/またはカプセル封入製剤などの様々な製薬的賦形剤と組み合わせて投与できる。
【００５４】
医薬または薬理学的組成物の調製は、本発明と同分野の技術を有する者であれば知るところであろう。一般に、そのような組成物は、錠剤のような固形または徐放性カプセルのような経口投与のための他の個体として調製することができる。
【００５５】
ヒトへの投与においては、FDAに要求される無菌CMC製造基準に則って調製しなければならない。
【００５６】
化合物単独の投与または併用療法は、静脈内または鼻腔内輸送(固体または液体)でなされると予測される。本発明の化合物の特に重宝な投与頻度は1日1回または1日2回である。
【００５７】
治療において、製剤はその薬理学的に有効な量を、剤形に適合した方法で投与すればよい。製剤は、既述の静脈内または鼻腔内のような様々な投与形態で簡単に投与できる。これに関連して、活性物質の量および投与する組成物の体積は、処置する宿主動物に依拠する。投与に必要な活性化合物の正確な量は、熟練者の判断に委ねるものであり、個体により異なる。
【００５８】
活性化合物を分散させるのに必要な組成物の最小体積は一般に用いられているものである。適切な投与計画も可変であるが、初めに化合物を投与し、結果をモニタリングし、その後さらに間隔をおいて投与量を再度調節するといった形に類型化できるであろう。本発明の化合物および併用療法は、水性または非水性溶媒に溶解、懸濁または乳化することによって製剤できる。野菜(例えばごま油)または同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルおよびプロピレングリコールなどが非水性溶媒の例である。ハンクス液、リンゲル液または生理食塩水緩衝液などの水溶液も用いることができる。
【００５９】
遊離塩基としての活性化合物または製薬的に許容される塩の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物、および油でも調製できる。通常の保管および使用環境において、微生物の成長を防ぐために、これらの調製物には防腐剤を含有させる。
【００６０】
経口薬は、当分野で周知の製薬的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。担体によって、例えば患者が経口接種するための錠剤、丸薬、カプセル、溶液、懸濁液、徐放剤、粉末、液体またはゲルとして化合物を製剤することができる。経口製剤は、固体賦形剤と化合物を混合し、状態に応じて生じた混合物を粉砕し、適切な補助剤を加え、得られた顆粒混合物を加工するなどの様々な方法で調整することができる。以下は経口製剤に用いることができる賦形剤の例である：ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖、トウモロコシのデンプン、グルテン非含有小麦デンプン、ジャガイモのデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤およびポリビニルピロリドン(PVP)。経口製剤は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような一般に用いられる賦形剤を含む。
【００６１】
特定の態様において、経口医薬組成物は、不活性な希釈剤または消化吸収できる食用担体を含むか、または硬または軟ゼラチンカプセルのシェルに封入するか、または錠剤に圧縮するか、または治療食に直接含ませることができる。経口治療投与において、活性化合物は賦形剤に組み込んでもよく、摂取可能な錠剤、頬側の錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの形態で使用できる。そのような組成物および製剤は少なくとも0.1％の活性化合物を含まなければならない。組成物および調製物の割合は、もちろん、多様でよく、簡便には単位重量の約2から約75％、または好ましくは25から60％でよい。そのような治療的に有用な組成物に含まれる活性化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。
【００６２】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、以下を含んでもよい：トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、ジャガイモのデンプン、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、ウィンターグリーン油またはサクランボ風味などの香料。投与単位形態がカプセルである場合、上述の種類の材料に加え、液体担体を含んでもよい。コーティング剤としての、または投与単位の物理的形態を改変するための他の様々な物質を含んでもよい。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルを、セラック、糖またはその両方で皮膜してもよい。エリキシル剤のシロップに、活性化合物、甘味料としてスクロース、防腐剤としてメチルおよびプロピルパラベン、ダイおよびサクランボまたはオレンジ風味の香料を含ませてもよい。
【００６３】
本発明の化合物は、エアロゾルスプレー製剤に含ませ、加圧パック、噴霧器または乾燥粉末吸入器から送り込むこともできる。噴霧器に用いることができる適切な噴霧剤には、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよび二酸化炭素などがある。加圧エアロゾルの場合は、バルブを用いて投与量を設定し、調節した化合物量を送り込むことができる。
【００６４】
吸入またはガス注入用組成物には、製薬的に許容される水性または有機溶媒、またはそれらの混合物に調製した溶液および懸濁液、および粉末などがある。液体または固体組成物は、前に列記した製薬的に許容される適切な賦形剤を含んでもよい。好ましくは、該組成物は、局所的または全身的効果を得るために、経口、経鼻呼吸ルートで投与する。望ましくは滅菌した製薬的に許容される溶媒中の組成物を、不活性ガスを用いて噴霧してもよい。噴霧装置から噴霧した溶液を直接吸気してもよく、または噴霧装置をフェイスマスク、テントまたは間欠適用圧呼吸装置に装着してもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、製剤を適切な方法で送り込む装置から、好ましくは経口または経鼻的に、投与してもよい。
【００６５】
他の投与方法に適したさらなる製剤には、直腸カプセルまたは坐薬などがある。坐薬における、伝統的な結合剤および担体には、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセライドなどがあり、そのような坐薬は0.5％から10％、好ましくは1％から2％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成できる。
【００６６】
本発明の方法で処置される対象は、哺乳類、より好ましくはヒトである。これらの方法の以下の特性または利用は、非ヒト哺乳類、例えば類人猿、サル、イヌ、マウスなどにも適用できるが、本質的にヒトへの適用のために記述する。このように、本発明はまた獣医師も利用できる。
【００６７】
本発明の医薬組成物はHADの処置に用いられる。また、HADに起因する症状も本発明の医薬組成物で処置する。HADに関連する、または起因する症状には、神経因性疼痛を含む。
【００６８】
EPOの、gp120誘発性神経毒性を減少させる神経保護作用は、以下に記載の通り増加した。
【実施例】
【００６９】
［実施例１］
計画/方法：  神経細胞/グリア細胞皮質培養を、30から40％の神経細胞を含むように混合した。培養は受精16から17日のラットから調製し、プレーティング後17日間使用した。EPO(10U/ml)の存在または非存在下で、培養を200pMのgp120に24時間曝した。アポトーシス神経細胞をMAP-2、神経特異的マーカーおよびプラスの形態を染色するTUNELで標識して同定した。細胞内シグナリング経路はAktおよびGSK3のイムノブロットおよび免疫細胞化学で同定した。優位な妨害型Aktによる形質移入はアデノウイルスコンストラクトで行った。
【００７０】
結果：  HIV/gp120によって対照と比較して神経細胞アポトーシスは増加した(506％対114％)。EPOで3時間プレインキュベートすると、アポトーシスが387％に減少した。次に、EPOがgp120から神経を保護することに関与する細胞シグナリングを調査した。gp120に曝すとGSK3が脱リン酸化した。EPOの神経保護作用は、GSK3のリン酸化を妨げる優位な妨害型Akt変異体による変換でAktが抑制されることによってかなりブロックされた。
【００７１】
［均等物］
当業者であれば、本明細書に記載した特定の処置と均等なものが膨大に存在することを認識し、日常的な程度の実験でそれを確かめることができるであろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、添付の特許請求の範囲に含まれる。特許請求の範囲で定義した本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な置換、変更および改変を本発明に行うことができる。他の側面、有利性および改変も本発明の範囲内である。本発明を通して引用されたあらゆる文献、交付済み特許および特許公開公報の内容は、参考としてここに完全に含める。それらの特許、特許出願および他の文献の適切な成分、過程および方法は本発明および本発明の態様に選択され得る。
【配列表】
2006521404.tif 000006
2006521404.tif 000007
2006521404.tif 000008
2006521404.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月21日(2005.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006521404000001.app
【国際調査報告】
2006521404.tif 000010
2006521404.tif 000011