(57)【要約】本発明は、複合抗原剤組成物およびウイルス感染を防止するかまたは処置するためのこの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合抗原剤であって：
【化１】
2006513273.tif 000015
（配列番号１）を含み、ここで、Ｒ１は、ＣｙｓもしくはＧｌｙを含む０〜２個のアミノ酸残基または核酸配列であり；ｍは、少なくとも１であり；ｎは、少なくとも１であり；Ｘａａ１は、Ｌｙｓ−Ｒ４を含む０〜１個のアミノ酸残基であり；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｂ細胞決定因子、Ｔ細胞決定因子または標的分子であり；Ｒ５は、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは核酸配列である、複合抗原剤。
【請求項２】
Ｂ細胞決定因子が、マトリックスタンパク質２またはこの相同体の外部ドメインを含む、請求項１に記載の複合抗原剤。
【請求項３】
第１の、および第２の複合抗原剤のＲ１が、Ｃｙｓ−Ｇｌｙであり、前記第１の、および第２の複合抗原剤の前記Ｃｙｓ残基が、共有結合して二量体を生成する、請求項１に記載の複合抗原剤。
【請求項４】
請求項１に記載の複合抗原剤および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項５】
組成物がさらに補助剤を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
組成物がワクチンを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
組成物がワクチンを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ウイルス感染を防止または処置するための方法であって、被検者に、ウイルス感染の徴候または症候を防止または処置するのに有効な量の請求項４に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
ウイルス感染を防止または処置するための方法であって、被検者に、ウイルス感染の徴候または症候を防止または処置するのに有効な量の請求項５に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
ウイルス感染を防止または処置するための方法であって、被検者に、ウイルス感染の徴候または症候を防止または処置するのに有効な量の請求項６に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
ウイルス感染を防止または処置するための方法であって、被検者に、ウイルス感染の徴候または症候を防止または処置するのに有効な量の請求項７に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
ウイルス感染がインフルエンザＡ型ウイルスを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス感染がインフルエンザＡ型ウイルスを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルス感染がインフルエンザＡ型ウイルスを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ウイルス感染がインフルエンザＡ型ウイルスを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序文
本発明は、アレルギーおよび感染性疾患の国立機関（ＮＩＡＩＤ許諾番号ＡＩ−４６４５７およびＡＩ−１３９８９）により出資された研究の経過においてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の背景
３種のタイプの膜貫通タンパク質が、インフルエンザＡ型ビリオンおよびウイルスに感染した細胞の膜において発現される。赤血球凝集素およびノイラミニダーゼは、それぞれ〜５１０および〜４２０個のアミノ酸の大きい外部ドメインを有する糖タンパク質である。赤血球凝集素は、ホモ三量体として組み立てられ、ノイラミニダーゼは、ホモ四量体として組み立てられ、ウイルス膜上で、およびウイルス成熟の細胞部位において、長さが１３〜１４ｎｍのロッド型の表面突起の密な層を形成する。現在のインフルエンザウイルスワクチンは、これらの糖タンパク質、特に赤血球凝集素に対する強力な抗体応答を誘発することを目的とし、このようなものとして抗体は、感染に対して高度に保護的であるとよく知られている。問題は、インフルエンザＡ型ウイルスが、これらの保護的な抗体により認識された決定因子を変化させる高度な性向を有し、これにより、これらの抗原的な変化を反映する更新されたワクチン株での反復されたワクチン接種が必要であることである。
【０００３】
対照的に、第３のウイルス膜貫通タンパク質であるマトリックスタンパク質２（Ｍ２）は、ヒトインフルエンザウイルス株の中で高度に保存された外部ドメイン（Ｍ２ｅ）を含む。Ｍ２を用いたインフルエンザＡ型ウイルス感染に対する広範囲の保護的な免疫性は、検査されている(Slepushkin, et al. (1995) Vaccine 13:1399-1402; Frace, et al. (1999) Vaccine 17:2237-44; Neirynck, et al. (1999) Nature Med. 5:1157-63; Okuda, et al. (2001) Vaccine 19:3681-91)。
【０００４】
Ｍ２は、９７個のアミノ酸の非グリコシル化膜貫通タンパク質である(Lamb, et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4170-4; Lamb, et al. (1985) Cell 40:627-33)。これは、ホモ四量体を形成し(Holsinger and Lamb (1991) Virology 183:32-43; Sugrue and Hay (1991) Virology 180:617-24)、これは、ウイルス粒子の膜において低密度で（平均のビリオンあたり〜１０のＭ２四量体、これと比較して〜４００の赤血球凝集素三量体および〜１００のノイラミニダーゼ四量体）、しかし感染した細胞の原形質膜において高密度（赤血球凝集素と同様の密度）で発現される(Zebedee and Lamb (1988) J. Virol. 62:2762-72)。
【０００５】
Ｍ２四量体は、ｐＨにより誘発可能なプロトン輸送活性を示し(Steinhauer, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11525-9; Pinto, et al. (1992) Cell 69:517-28)、これは、融合後のウイルス膜からのＲＮＰ複合体の放出を促進し(Zhirnov (1990) Virology 176:274-9)、ウイルス膜貫通タンパク質の小胞体から原形質膜への排出の間に、輸送小胞内でのｐＨの過度の降下を防止し、これにより赤血球凝集素における早発性の酸により誘発された立体構造変化を防止するとみられる(Steinhauer, et al. (1991) 上記)。２３個のアミノ酸の長さのＭ２ｅは、この９個のＮ末端アミノ酸中で全体的に保存され、この膜近位の１５個のアミノ酸の長さの部分において、比較的小さい程度の構造的な多様性のみを示す(Zebedee and Lamb (1988) 上記; Ito, et al. (1991) J. Virol. 65:5491-8)。Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１サブタイプのヒト単離物の中で、２種の代替のアミノ酸が、７カ所の位置において見出されたが、ヒト単離物の大部分は、実際には同一の配列を共有する。
【０００６】
Ｍ２ｅ特異性モノクローナル抗体１４Ｃ２は、培養培地または寒天上敷き中に導入した際には、インビトロでのウイルス感染を防止せず、ウイルス収率およびプラークの大きさを減少させる(Zebedee and Lamb (1988) 上記; Hughey, et al. (1995) Virology 212:411-21)。すべてのＭ２ｅ特異性抗体が、この活性を示すわけではなく(Hughey, et al. (1995) 上記)、すべてのウイルス株が、これに影響されやすいわけではない(Zebedee and Lamb (1988) 上記)。インビボで、受動的なモノクローナル抗体１４Ｃ２は、同様に、ウイルス成長を減少させ(Treanor, et al. (1990) J. Virol. 64:1375-7)、またＰＲ８に対しても有効であり(Mozdzanowska, et al. (1999) Virology 254:138-46)、これは、抗体により媒介された成長制限にインビトロで影響されにくく(Zebedee and Lamb (1988) 上記; Mozdzanowska, et al. (1999) 上記)、このことは、抗体により媒介されたウイルス成長阻害が、インビトロおよびインビボでの異なった機構により生じることを示す。
【０００７】
能動的に誘発されたＭ２特異性免疫性の保護的な効能は、種々のタイプのワクチン構成物およびワクチン接種様式を用いて試験された。マウスおよびケナガイタチにＭ２発現組換えワクシニアウイルスをワクチン接種した最初の研究により、保護の証拠は示されなかった(Epstein, et al. (1993) J. Immunol. 150:5484-93; Jakeman, et al. (1989) J. Gen. Virol. 70:1523-31)が、Ｍ２特異性免疫応答の誘発は、立証されなかった。その後の研究では、無傷のＭ遺伝子セグメントを含むプラスミドＤＮＡ（Ｍ１およびＭ２タンパク質をコードする）(Okuda, et al. (2001) 上記)、無傷の組換えＭ２タンパク質膜調製物(Slepushkin, et al. (1995) 上記)、欠失した膜貫通部分を有するＭ２タンパク質（毒性を低下させ、溶解性を増大させるために）(Frace, et al. (1999) 上記)、並びにＭ２ｅをＢ型肝炎ウイルス核タンパク質に融合させた構成物(Neirynck, et al. (1999) 上記)が試験された。これらの後者のワクチン接種プロトコルにより、ウイルス成長および死亡率の低下の観点の両方において、保護が誘発された。
【０００８】
ここで、ヘルパーＴ細胞決定因子に結合したＭ２ｅを含む複合抗原剤は、ウイルス保護を誘発するのに有効なワクチンであることが見出された。Ｍ２ｅ−ＭＡＡは、コレラ毒素（ＣＴ）および刺激性ＣｐＧモチーフを有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と共に、マウスの血清において強力なＭ２ｅ特異性抗体力価を誘発し、インフルエンザウイルス攻撃に対して顕著な保護をもたらす。
【０００９】
発明の概要
本発明の１つの観点は、構造：
【化１】
2006513273.tif 000002
（配列番号１）を有し、ここで、Ｒ１は、ＣｙｓもしくはＧｌｙを含む０〜２個のアミノ酸残基または核酸配列であり；ｍは、少なくとも１であり；ｎは、少なくとも１であり；Ｘａａ１は、Ｌｙｓ−Ｒ４を含む０〜１個のアミノ酸残基であり；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｂ細胞決定因子、Ｔ細胞決定因子または標的分子であってもよく；Ｒ５は、すべてのアミノ酸、ペプチドまたは核酸配列である、複合抗原剤（ＭＡＡ）である。好ましい態様において、Ｂ細胞決定因子は、マトリックスタンパク質２またはこの相同体の外部ドメインである。他の好ましい態様において、第１のＭＡＡのＮ末端に位置するＣｙｓ残基は、ジスルフィド結合を介して、式Ｉの第２のＭＡＡのＮ末端において、第２のＣｙｓ残基に共有結合して、式Ｉで表されるＭＡＡ二量体を生成する。
【００１０】
本発明の他の観点は、ＭＡＡおよび薬学的に許容し得る担体を含む組成物である。好ましい態様において、ＭＡＡおよび薬学的に許容し得る担体を含む組成物は、さらに補助剤を含むことができる。このような組成物は、ウイルス感染を防止または処置するために有用である。従って、ウイルス感染を防止または処置するための方法であって、感染しやすい被検者またはウイルス感染の徴候もしくは症候を示す被検者に、ウイルス感染の徴候または症候を防止または処置するのに有効な量の本発明の組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。好ましくは、前述のウイルス感染は、インフルエンザＡ型ウイルスである。
【００１１】
本発明のこれらのおよび他の観点を、本発明の以下の記載中に一層詳細に述べる。
【００１２】
発明の詳説
ここで、複合Ｂ細胞決定因子およびＴヘルパー細胞（Ｔｈ）決定因子を含む複合抗原剤（ＭＡＡ）を接種した動物は、感染性ウイルスでのその後の攻撃に対して、顕著な耐性を示すことが見出された。本明細書中に定義したように、複合抗原剤は、動物において特異的な免疫応答を誘発することができる、１種より多いペプチドまたは核酸部分を含む剤である。Ｂ細胞決定因子は、抗体応答を誘発し、またＴ細胞応答を誘発することができる。ここで提供されるＭＡＡの利点は、多数の抗原側鎖を、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ繰り返しを含む核ペプチドに付着させ、これにより数種の構造的に結合した決定因子の提示を可能にすることができることである。さらに、Ｃｙｓ残基が、核ペプチドのＮ末端に結合する際には、２種の核ペプチドを、ジスルフィド結合を介して共有結合させて、抗原側鎖の数を有効に二倍化し、従って動物における免疫応答を改善することができる。さらに、ここで提供するＭＡＡを、容易に化学的に合成することができるため、ＭＡＡの製造は、高度に制御され、汚染物は最小化される。
【００１３】
従って、本発明の１つの観点は、構造：
【化２】
2006513273.tif 000003
（配列番号１）を有し、ここで、ｍが、少なくとも１であり、ｎが、少なくとも１である、ＭＡＡを提供する。好ましい態様において、ｍおよびｎの合計は、約１０〜３０、好ましくは約１０である。
【００１４】
式Ｉで表されるＭＡＡにおいて、アミノ酸部分Ｘａａ１は、０〜１個のアミノ酸残基であり、ここで、前述のアミノ酸残基は、Ｌｙｓ−Ｒ４である。
【００１５】
式Ｉで表されるＭＡＡにおいて、Ｒ１部分は、０〜２個のアミノ酸残基であり、ここで、前述のアミノ酸残基は、ＧｌｙもしくはＣｙｓであるか、または核酸配列、例えば刺激性ＣｐＧモチーフを有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）であってもよい。好ましい態様において、Ｒ１は、ジペプチドＣｙｓ−Ｇｌｙである。第１のＭＡＡのＮ末端アミノ酸が、Ｃｙｓ残基である際には、これは、好ましくは、第２のＣｙｓ残基に、式Ｉで表される第２のＭＡＡのＮ末端において共有結合している。第１のシステイン残基と第２のシステイン残基との間のジスルフィド結合により、式Ｉで表される共有結合したＭＡＡ二量体が生じる。二量体のペプチドは、Ｌｙｓ−Ｇｌｙ繰り返しの数（即ちｍおよびｎの数）、Ｘａａ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５において、同一であっても異なっていてもよいことを意図する。
【００１６】
式Ｉで表されるＭＡＡにおいて、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｂ細胞決定因子、Ｔ細胞決定因子または標的分子であってもよい。好ましい態様において、少なくとも１つのＢ細胞決定因子および１つのＴ細胞決定因子は、式Ｉで表されるＭＡＡ中に存在する。例えば、本発明のモノマーＭＡＡは、５つのＢ細胞決定因子、２つのＴ細胞決定因子および２つの標的分子側鎖を含むことができる。あるいはまた、本発明のモノマーＭＡＡは、例えば、８つのＢ細胞決定因子、１つのＴ細胞決定因子および１つの標的分子側鎖を含むことができる。組み合わせは、特定的に限定されず、選択されたＢ細胞決定因子、Ｔ細胞決定因子または標的分子に伴って、変化し得る。さらに、ｍおよびｎにより表す、１つのＬｙｓ−Ｇｌｙ繰り返し単位内のＲ基は、変化し得る。例えば、ｍ＝３である場合には、第１のＬｙｓ−Ｇｌｙ繰り返しのＲ２は、Ｂ細胞決定因子であってもよく、第２のＬｙｓ−Ｇｌｙ繰り返しのＲ２は、Ｔ細胞決定因子であってもよく、第３のＬｙｓ−Ｇｌｙ繰り返しのＲ２は、標的分子であってもよい。
【００１７】
本明細書中で用いるＢ細胞決定因子は、好ましくは、例えば抗体の野生型のウイルスタンパク質への産生により決定して、測定可能なＢ細胞応答を発現させる。式Ｉで表されるＭＡＡにおいて用いることができるＢ細胞決定因子には、業界においてすでに知られているものおよび、Ｂ細胞応答を発現するすべての他の抗原、例えばグリカン、ポリペプチドまたは核酸が含まれる。１つの態様において、抗原は、エンベロープを有するかまたはエンベロープを有しないウイルスから誘導される。
【００１８】
他の態様において、抗原は、アデノウイルス科、アレナウイルス科（例えばリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）、アルテリウイルス（例えばウマ動脈炎ウイルス）、アストロウイルス科（ヒトアストロウイルス１）、ビルナウイルス科（例えば伝染性膵臓壊死ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、ブニアウイルス科（例えばカリフォルニア脳炎ウイルス群）、カリシウイルス科（例えばカリシウイルス）、コロナウイルス科（例えばヒトコロナウイルス２９９ＥおよびＯＣ４３）、デルタウイルス（例えば肝炎デルタウイルス）、フィロウイルス科（例えばマールブルウイルス、エボラウイルスザイール型(Ebola virus Zaire)）、フラビウイルス科（例えば黄熱病ウイルス群、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドウイルス科（例えばＢ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えばエプスタインバーウイルス、シンプレックスウイルス、ワリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロセオロウイルス(Roseolovirus)、リンホクリプトウイルス、ラジノウイルス(Rhadinovirus)）、オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ）、パポバウイルス科（例えばパピローマウイルス）、パラミクソウイルス科（例えばパラミクソウイルス属、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１、はしかウイルス、例えば麻疹ウイルス、ルブラウイルス、例えばおたふく風邪ウイルス、ニューモウイルス、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス）、ピコルナウイルス科（例えばライノウイルス、例えばヒトライノウイルス１Ａ、ヘパトウイルス、例えばヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトポリオウイルス、カルディオウイルス、例えば脳心筋炎ウイルス、アフトウイルス、例えば口蹄疫ウイルスＯ、コクサッキーウイルス）、ポックスウイルス科（例えばオルソポックスウイルス、例えば痘瘡ウイルス）、レオウイルス科（例えばロタウイルス、例えばＡ〜Ｆ群ロタウイルス）、レトロウイルス（霊長類レンチウイルス群、例えばヒト免疫不全ウイルス１および２）、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）並びにトガウイルス科（例えばルビウイルス、例えば風疹ウイルス）の科からのものが含まれるか、これらには限定されないウイルスから由来する。
【００１９】
式Ｉで表されるＭＡＡにおいて用いることができる例示的なＢ細胞決定因子には、Ｍ２ｅまたはこの相同体が含まれるが、これらには限定されない。１つの好適な態様において、式Ｉで表されるＭＡＡのＢ細胞決定因子は、Ａ型インフルエンザから由来するＭ２ｅである。他の態様において、Ｂ細胞決定因子は、ウイルス膜貫通タンパク質の外部ドメイン、例えばインフルエンザＢ型ウイルスのＮＢまたはインフルエンザＣ型ウイルスのＣＭ２から由来する。
【００２０】
Ｔ細胞決定因子は、Ｔｈおよび細胞毒性Ｔ細胞決定因子を共に含むことを意図する。Ｔ細胞応答の発現を、例えば、本明細書中に例示したように、またはサイトカイン、例えばＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５もしくはＩＬ−１０の産生を測定することにより、検出することができる。式Ｉで表されるＭＡＡにおいて用いることができる例示的なＴ細胞決定因子には、赤血球凝集素Ｔ細胞決定因子およびヒトＭＨＣ  ＩＩ群タンパク質に、好ましくは広範囲のハプロタイプに限定されるＴ細胞決定因子が含まれるが、これらには限定されない。
【００２１】
Ｒ２、Ｒ３またはＲ４部分として抗原に共有結合している標的分子は、一般的に、抗原を所望の部位に送達する炭水化物、脂質、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドである。本発明のＭＡＡ中に導入され得る標的分子には、コレラ毒素、刺激性ＣｐＧモチーフを有するＯＤＮ、並びに内因性ヒト免疫調節物質、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦが含まれるが、これらには限定されない。
【００２２】
式Ｉで表されるＭＡＡのＲ５部分は、特定的に限定されず、すべてのアミノ酸（例えばβ結合アラニン）、ペプチドまたは核酸配列、例えば刺激性ＣｐＧモチーフを有するＯＤＮであってもよい。
核酸配列が式Ｉ中に導入される場合には、前述の核酸配列を、スペーサーまたはリンカー分子、例えばヒドロキシ−カルボン酸を介して付着させることができる。
【００２３】
式Ｉで表されるＭＡＡを、本明細書中に例示した方法、またはペプチドおよびペプチド接合体を化学的に合成するすべての他の好適な方法に従って、製造することができる。
本明細書中に提供する例は、マウスにおける免疫応答を誘発するための式Ｉで表されるＭＡＡの種々の誘導体を開示し、例示するものであり、本発明の範囲を限定しないことを意図する。本発明の範囲内の他の観点、利点および修正は、本発明が関連する当業者に明らかである。
【００２４】
Ｍ２ｅ−ＭＡＡを投与して、マウスを、５０μｌの用量で鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路により麻酔した。一次および追加免疫接種材料は、３μｇのＭＡＡ、３μｇのホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６および０．５μｇのコレラ毒素（ＣＴ）をリン酸緩衝生理食塩水中に含んでおり、４〜５週間の間隔において施与した。ＯＤＮおよびＣＴを単独で、または感染性ウイルスをｉ．ｎ．で接種されたマウスを、それぞれ負の、および正の対照として用いた。後者の場合において、第１の感染は、ＰＲ８により、第２の感染は、ＰＲ８−ＳＥＱ１４、即ちＰＲ８と、保護的モノクローナル抗体により認識された赤血球凝集素決定因子において１４個のアミノ酸置換により異なり、ＰＲ８免疫マウスにおいて容易に感染を誘発することができる変種によるものであった。
【００２５】
追加免疫の１０〜３０日後、縦隔リンパ節からの細胞（ＭｅｄＬＮ）を、遊離のＳ１ペプチド、赤血球凝集素およびＭ２ｅに応答して増殖するこれらの能力について試験した。上気道から排出される脾臓およびリンパ節からの細胞は、比較的小さい応答を示し、比較的小規模で研究された。Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したマウスの応答は、一貫して、補助剤で刺激した対照のマウスの応答を超えた。データ群の２つのみが、対照のマウスの応答を、統計学的基準で超えた（対応のあるｔ検定、ｐ≧０．０５）。しかし、１つの群として、Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したマウスは、対照のマウスよりも、顕著に大きいＳ１および赤血球凝集素特異性応答を示した（対応のないｔ検定、ｐ≦０．０５）。
【００２６】
Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したマウスの赤血球凝集素特異性応答は、感染により免疫されたマウスの赤血球凝集素特異性応答と、大きさが同様であったが、Ｓ１特異性Ｔｈを、Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したが、感染により免疫されていないマウスにおいて検出したという点で、上質な特異性で異なっていた。マンノシル化されたＭＡＡは、インビトロでのこの一層大きい刺激能力とは大いに異なって、インビボでＳ１特異性Ｔｈ応答を誘発するにあたり、マンノシル化されていないＭＡＡよりも優れてはいなかった。さらに、Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したが、感染により免疫されていないマウスは、Ｍ２ｅ特異性増殖性Ｔ細胞を含んでおり、このことは、Ｍ２ｅ自体が、少なくとも１つのＨ２ｄ限定Ｔｈ決定因子を含むことを示す。
【００２７】
Ｍ２ｅ−ＭＡＡによるＭＨＣ  Ｉ群制限細胞毒性記憶Ｔ（Ｔｃ）応答の誘発には、証拠がなく、これは、特徴的なＫｄ制限、Ｄｄ制限またはＬｄ制限モチーフがＭ２ｅに存在しないことと整合する(Engelhard (1994) Curr. Opin. Immunol. 6:13-23; Corr, et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1877-92)。記憶Ｔｃは、感染により免疫されたマウスにおいて容易に検出可能であった。
【００２８】
Ｍ２ｅ特異性血清抗体力価を、（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよびＪＡＰ−ＭＤＣＫ細胞単層の固相免疫吸着剤上でのＥＬＩＳＡにより、測定した。各々のアッセイを標準化し、精製したＭ２ｅ特異性モノクローナル抗体１４Ｃ２の同時の滴定により定量し、試験試料中の抗体力価を、血清１ミリリットルあたりのＭ２ｅ特異性抗体の相当するμｇとして定義した。
【００２９】
マウスを刺激後２および４週間、第２の免疫後２および４〜５週間並びに第３の免疫後２および５週間出血させた、４つの独立した免疫実験からの組み合わせたデータにより、異なる免疫実験からの群力価の平均およびＳＥＭが得られた。このデータは、（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡが、（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡよりも迅速かつ強力な応答を誘発し、マンノースの存在の結果、抗体応答のさらなる低下がもたらされたことを示した。このことは、（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよびＪＡＰ−ＭＤＣＫ細胞に対して測定した抗体力価に、共に有効であった。（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡでの免疫は、第２の免疫の２週間後に、顕著な抗体力価を一貫して誘発し、時々一次的な免疫の４週間後直ちに顕著な応答を誘発した（４つの独立した実験において、第１の免疫の４週間後に、１．０、２．０、４．６および１０３５μｇ／ｍｌの平均力価）。
【００３０】
（２）Ｍ２ｅ−ＭＡＡを、２つの実験にのみ導入し、（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡと（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡとの中間である応答を誘発した。この発見は、Ｍ２ｅの多量体提示により、Ｂ細胞応答が、Ｍ２ｅ特異性Ｂ細胞上での膜Ｉｇの架橋を促進することにより増大したことを示す(Bachmann and Zinkernagel (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:235-70)。
【００３１】
このデータは、さらに、Ｍ２ｅ−ＭＡＡ免疫マウスからの血清が、ＪＡＰ−ＭＤＣＫ細胞に対するよりも、Ｍ２ｅ−ＭＡＡに対して高い力価を一貫して示すことを示した。血清におけるＭ２ｅ−ＭＡＡ対ＪＡＰ−ＭＤＣＫ反応性抗体の比率は、１０の平均を示し、２〜３１の個別の血清の範囲内であった。これは、Ｍ２ｅ−ＭＡＡ免疫の後の抗体応答の特異性が、個別のマウスの中で異なっており、平均して〜１０％のＭ２ｅ−ＭＡＡ特異性抗体が、感染した細胞上でウイルスにより誘発されたＭ２ｅと交差反応したことを示す。残留する抗体を、Ｔｈ決定因子、骨格ペプチド、ウイルスにより誘発されたＭ２四量体またはこれらの構造物の組み合わせにより共有されていない合成Ｍ２ｅペプチドに対する決定因子に向けることができる。
【００３２】
Ｍ２ｅ−ＭＡＡに対するＥＬＩＳＡにより、さらに、ウイルスで感染したマウスからの血清が、極めて低いＭ２ｅ特異性抗体力価を含むことが示された。ＪＡＰ−ＭＤＣＫに対するＥＬＩＳＡは、多くのウイルスタンパク質に対する抗体を検出し、従って感染により免疫されたマウスにおけるＭ２特異性応答を定量するためには用いられなかった。唯一の例外は、第１にＰＲ８による、第２にＪＡＰによる、および第３にＸ３１による、３種の連続的な感染により免疫され、〜３０μｇ／ｍｌのＭ２ｅ−ＭＡＡ特異性力価を示し、これが（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡ免疫マウスにおいて見られるウイルス性Ｍ２ｅ特異性抗体力価（ＪＡＰ−ＭＤＣＫに対して）と同一の範囲内にある、１つの群のマウスであった。このデータは、（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡが、Ｍ２ｅ特異性抗体応答を誘発するにあたりウイルス感染よりも有効であることを示した。
【００３３】
Ｍ２ｅ特異性免疫エフェクターは、２種の連続的な感染により免疫されたマウスには、事実上存在しなかった。Ｍ２が、感染した細胞の原形質膜中で高い密度で発現されること(Lamb, et al. (1985) 上記; Zebedee and Lamb (1988) 上記)および、膨大な数の上皮細胞が、全体的な気道感染の経過において感染すること(Yilma, et al. (1979) J. Inf. Disease 139:458-64)を考慮すると、これは驚異的である。この発見は、ヘテロサブタイプ的(heterosubtypic)保護の強度が、感染により誘発されたエフェクターおよびＭ２ｅ特異性ワクチン接種の同時の誘発により増強され得ることを示す。
【００３４】
第２の免疫の４〜５週間後に、マウスを、Ｘ３１で攻撃し、鼻、気管および肺組織におけるウイルス力価を、３日後に決定した。マンノースを有するかまたは有しない、単一のＭ２ｅを含むＭＡＡで免疫したマウスは、鼻および肺組織におけるウイルス複製に対して、有意な耐性を示さなかったが（ｎｓ、ｐ＞０．０１、スチューデントｔ検定による）、補助剤のみで刺激したマウスと比較して、気管における減少したウイルス複製を示した。対照的に、（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したマウスは、気道のすべての部分において、減少したウイルス成長を示した。感染により免疫されたマウスと比較して、（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡ免疫マウスにおける耐性は、鼻および気管組織において同様の強度であったが、肺組織において比較的低い強度であった。
【００３５】
Ｍ２ｅ特異性血清抗体力価を、個別のマウスにおいて、ウイルス力価との相関関係について試験した。抗体力価並びに、鼻および肺であるが気管ではないウイルス力価は、（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡで免疫したマウスにおいて逆の相関を有していた（相関係数Ｒ２は、それぞれ鼻および肺について０．５３および０．５１、ｐ＜０．００１）。しかし、相関の実質的な部分は、１ｍｌの血清あたり〜９０μｇの抗Ｍ２ｅ抗体を含む単一の、範囲外のマウスのためであった。この排除により、抗体とウイルス力価との間の相関関係が、鼻において有意ではない値に減少したが、肺においては減少せず、ここでこれは、有意なままであった（Ｒ２  ０．４１、ｐ＝０．００２）。気管および感染により免疫されたマウスにおいては、Ｍ２ｅ特異性抗体とウイルス力価との間に、相関関係は見られなかった。
【００３６】
これらの結果を考慮して、本発明の他の観点は、ＭＡＡを、治療剤および予防剤の両方として、ウイルス感染を処置または防止するために用いることを提供する。一般的に、これは、有効量の本発明の１種または２種以上のＭＡＡを、好適な形態で、感染しやすい被検者またはウイルス感染の徴候もしくは症候を示す被検者に投与することを含む。
【００３７】
当業者により理解されるように、式Ｉで表されるＭＡＡのためのＢ細胞決定因子の選択は、防止されるかまたは処置されるべきウイルス感染に依存する。例えば、インフルエンザウイルス感染を防止するかまたは処置するために、式Ｉで表されるＭＡＡのＢ細胞決定因子は、インフルエンザウイルス（例えばＭ２ｅ）から由来しなければならない。
【００３８】
同族のＢ細胞決定因子を用いるにあたり、式Ｉで表されるＭＡＡは、エンベロープを有するかまたはエンベロープを有しないウイルスに対する免疫応答を発生するのに有効であることが意図され、これには、アデノウイルス科、アレナウイルス科（例えばリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）、アルテリウイルス（例えばウマ動脈炎ウイルス）、アストロウイルス科（ヒトアストロウイルス１）、ビルナウイルス科（例えば伝染性膵臓壊死ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）、ブニアウイルス科（例えばカリフォルニア脳炎ウイルス群）、カリシウイルス科（例えばカリシウイルス）、コロナウイルス科（例えばヒトコロナウイルス２９９ＥおよびＯＣ４３）、デルタウイルス（例えば肝炎デルタウイルス）、フィロウイルス科（例えばマーバーグウイルス、エボラウイルスザイール型）、フラビウイルス科（例えば黄熱病ウイルス群、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えばＢ型肝炎ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えばエプスタインバーウイルス、シンプレックスウイルス、ワリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロセオロウイルス、リンホクリプトウイルス、ラジノウイルス）、オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ）、パポバウイルス科（例えばパピローマウイルス）、パラミクソウイルス科（例えばパラミクソウイルス属、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１、はしかウイルス、例えば麻疹ウイルス、ルブラウイルス、例えばおたふく風邪ウイルス、ニューモウイルス、例えばヒト呼吸器合胞体ウイルス）、ピコルナウイルス科（例えばライノウイルス、例えばヒトライノウイルス１Ａ、ヘパトウイルス、例えばヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトポリオウイルス、カルディオウイルス、例えば脳心筋炎ウイルス、アフトウイルス、例えば口蹄疫ウイルスＯ、コクサッキーウイルス）、ポックスウイルス科（例えばオルソポックスウイルス、例えば痘瘡ウイルス）、レオウイルス科（例えばロタウイルス、例えばＡ〜Ｆ群ロタウイルス）、レトロウイルス（霊長類レンチウイルス群、例えばヒト免疫不全ウイルス１および２）、ラブドウイルス（例えば狂犬病ウイルス）並びにトガウイルス科（例えばルビウイルス、例えば風疹ウイルス）の科からのものが含まれるか、これらには限定されない。
【００３９】
ウイルス感染を有する個体の処置は、ウイルス感染の徴候または症候を示す被検者を同定し、前述の被検者に、有効量の本発明の式Ｉで表されるＭＡＡを投与することを含む。ウイルス感染の徴候または症候は、一般的に、特定のウイルスに依存し、技術のある臨床医に十分知られている。例えば、ウイルス感染の典型的な症候には、高熱、重篤な痛みおよび疼痛、頭痛、並びに咽頭炎が含まれるが、これらには限定されない。ウイルス感染を処置するためのＭＡＡを、混合物として、例えば等しい量で、または個別に連続的に提供して用いるか、もしくは投与するか、またはすべてを１回で投与することができ、経口的に、局所的に、もしくは非経口的に、ウイルス感染の徴候または症候の低減をもたらすのに十分な量で投与することができる。さらに、本発明のＭＡＡを、他の十分知られている抗原、ワクチンまたは補助剤と同時に投与することができる。
【００４０】
同様に、ウイルス感染に対する防止または保護のための活性な免疫は、１種または２種以上のＭＡＡをワクチンの成分として投与することを含む。ワクチン接種を、経口的に、局所的に、または非経口的に、受容体被検者が関連するウイルスに対する保護的な免疫性を発生してウイルス感染の徴候または症候を防止することができるのに十分な量で、行うことができる。ＭＡＡの投与量、投与の経路などが、このような応答に影響するのに十分である場合に、量は、ウイルス感染の徴候または症候を防止するのに十分であると言える。ＭＡＡ投与に対する応答を、被検者の生命徴候の分析により測定することができる。
【００４１】
投与に適するＭＡＡ組成物は、受容体被検者により耐容されるものである。このようなＭＡＡ組成物は、製剤を製造する既知の方法により製造することができ、これにより、ＭＡＡは、薬学的に許容し得る担体との混合物で組み合わせられる。薬学的に許容し得る担体は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro編、第２０版、Lippingcott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000中に提供されている。投与に適するＭＡＡ組成物を形成するために、このような組成物は、有効量のＭＡＡを、用いる投与量および濃度において曝露される細胞または哺乳類に無毒である好適な量の担体、補形剤または安定剤と共に含む。
【００４２】
一般的に、製剤は、０．２μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの範囲内、最も好ましくは約１００μｇ／ｍｌのＭＡＡの最終濃度を含む。しばしば、担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。薬学的に許容し得る担体の例には、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０個の残基よりも少ない）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびPLURONICS（登録商標）が含まれる。
【００４３】
ＭＡＡまたは本発明のＭＡＡを含む組成物もしくは製剤は、さらに、抗原に対する被検者のＴ細胞応答を増強するための補助剤を含むことができる。このような補助剤の例には、アルミニウム塩；不完全フロイントアジュバント；スレオニルおよびムラミルジペプチドのｎ−ブチル誘導体；ムラミルトリペプチドの親油性誘導体；モノホスホリルリピドＡ；３’−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホリルリピドＡ；コレラ毒素；ＣｐＧモチーフを有するホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド；並びに補助剤、例えば米国特許第6,558,670号に開示されているものが含まれるが、これらには限定されない。
【００４４】
ＭＡＡまたは本明細書中に開示したＭＡＡを含む組成物もしくは製剤の投与を、非経口注射（例えば腹腔内、皮下もしくは筋肉内注射）を含むすべての好適な手段により、経口的に、またはＭＡＡ（典型的に医薬製剤中に担持された）の気道表面への局所的な用途により、行うことができる。ＭＡＡの気道表面への局所的な適用を、鼻腔内投与（例えば点滴器、綿棒または医薬製剤を鼻腔内に蓄積させる吸入器を用いることにより）により行うことができる。ＭＡＡの気道表面への局所的な投与をまた、吸入投与により、例えばＭＡＡをエアゾール懸濁液として含む医薬製剤（固体粒子および液体粒子を共に含む）の呼吸用粒子を作成し、次に被検者に呼吸用粒子を吸入させることにより、行うことができる。医薬製剤の呼吸用粒子を投与するための方法および装置は、十分知られており、すべての慣用の手法を用いることができる。
【００４５】
経口投与は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続された放出製剤または散剤の形態とすることができ、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。被検者への経口投与のためのカプセル、錠剤およびピルに、例えばメタクリル酸およびメタクリル酸メチルのコポリマー、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コーティングを設けることができる。
【００４６】
本発明の組成物を、投与量製剤と適合性の方法で、並びに予防的に、および／または治療的に有効な量で、投与することができる。一般的に用量あたり５μｇ〜２５０μｇのＭＡＡの範囲内の、投与されるべき量は、処置されるべき被検者、被検者の免疫系が抗体を合成する能力および所望の保護の程度に依存する。好ましい範囲は、用量あたり約１５μｇ〜約５０μｇである。
【００４７】
好適な用量の大きさは、約０．５ｍｌである。従って、例えば筋肉内注射のための用量は、０．５％の補助剤との混合物において２０μｇのＭＡＡを含む０．５ｍｌを構成する。
【００４８】
正確な投与量は、処置を必要とする被検者に関連する要因の観点から、技術のある開業医により決定される。投与量および投与を調整して、十分なレベルの活性ＭＡＡを提供するか、またはウイルス徴候もしくは症候を防止するかもしくは低下させる所望の効果を維持するか、またはウイルス感染の重篤度を減少させる。考慮することができる要因には、疾患状態の重篤度、被検者の一般的な健康、年齢、体重および被検者の性別、食物、投与の時間および頻度、１または２以上の薬剤組み合わせ、反応感受性および療法への耐容性／応答が含まれる。
【００４９】
組成物を、単一の投与スケジュールで、または好ましくは複数の投与スケジュールで施与することができる。複数の投与スケジュールは、投与の一次的な経過が、１〜１０の個別の用量を有していてもよく、続いて他の用量を、免疫応答を維持し、およびまたは補強するのに必要なその後の時間間隔で、例えば第２の投与について１〜４カ月において、および必要である場合には、数ヶ月後のその後の１または２以上の投与を施与するものである。投薬の投与計画はまた、少なくとも部分的に、個体の必要性により決定され、開業医の判定に依存する。
【００５０】
本発明を、以下の非限定的な例により、一層詳細に記載する。
【００５１】
例１：複合抗原剤構成物（ＭＡＡ）の合成
３種の準直角に(quasi-orthogonally)除去可能なアミノ保護基の組み合わせを用いた、以下のもの：
【化３】
2006513273.tif 000004
（配列番号：２）からなる多価マンノシル化（１）Ｍ２ｅ−Ｍａｎ−ＭＡＡおよび以下のもの：
【化４】
2006513273.tif 000005
（配列番号：３）からなる非マンノシル化ペプチド構成物（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよび以下のもの：
【化５】
2006513273.tif 000006
（配列番号：４）からなる（２）Ｍ２ｅ−ＭＡＡの固相合成を、十分知られている方法(Kragol and Otvos (2001) Tetrahedron 57:957-66)を用いて行った。
【００５２】
以下のもの：
【化６】
2006513273.tif 000007
（配列番号：５）からなり、Ｍ２ｅの４つのコピー並びにヘルパーＴ細胞決定因子Ｓ１およびＳ２の各々の２つのコピーを有する、ジスルフィド結合した八量体ペプチド構成物（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡを、溶液中の遊離のスルフヒドリル含有システイン誘導体から、分子間ジスルフィド形成により作成した(Kragol, et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:1417-20)。
【００５３】
以下のもの：
Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ
（配列番号：６）からなるペプチド構成物Ｃｙｓ−主鎖および以下のもの：
【化７】
2006513273.tif 000008
（配列番号：７）からなるＣｙｓ−Ｍ２ｅを、連続フロー自動化ペプチド合成装置Ｍｉｌｉｇｅｎ９０５０上で、慣用のＦｍｏｃ化学(Fields and Noble (1990) Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214)を用いて組み立てた。これらの構成物中で、Ｓ１は、Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（配列番号：８）であり、Ｓ２は、Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ（配列番号：９）であり、Ｍ２ｅは、Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ（配列番号：１０）であった。
【００５４】
０．３ｍｍｏｌ／ｇの初期負荷を有するFmoc TentaGel S RAM樹脂(Advanced Chem Tech, Louisville, KY)を用いた。鎖の伸長のために、４モル過剰のアミノ酸を、インサイチュ(in situ)で、ＨＡＴＵで活性化した。カップリング時間は、Peptide Companionアルゴリズム(Windowchem, Fairfield, CA)により予測されたカップリング困難により、１〜２．５時間の範囲内であった。ペプチド構成物Ｃｙｓ−主鎖の合成の間、ＣｙｓのＮ末端アミノ基を、Ｂｏｃ基で保護し、一方Ｌｙｓ側鎖アミノ基は、Ａｌｏｃ保護を有していた。接触水素化によるＡｌｏｃ基の選択的除去、続いて２つの２４量体Ｍ２ｅペプチドの同時のペプチド鎖組み立てにより、完全に保護されたペプチド構成物Ｃｙｓ−Ｍ２ｅが得られた。ペプチドを、樹脂から、トリフルオロ酢酸により、５％チオアニソールおよび５％水の存在下で切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。ペプチドの純度を、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ質量分析法により確認した。
【００５５】
ペプチド−ＤＮＡキメラを、２つの方法の１つにより製造する。１つの方法は、ペプチドまたは核酸断片を、慣用のＦｍｏｃ化学および好適なヒドロキシ−カルボン酸リンカーを用いて同時合成することを含む(Soukchareun, et al. (1995) Bioconjugate Chemistry 6:43-53)。第２の方法は、チオール含有二官能価カップリング試薬を用いて化学的に連結することを含む(Soukchareun, et al. (1998) Bioconjugate Chemistry 9:466-475; Stetsenko and Gait (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4908)。
【００５６】
例２：培地および溶液
ＩＳＣ−ＣＭは、２−メルカプトエタノールを０．０５ｍＭで、トランスフェリン(Sigma, St. Louis, MO)を０．００５ｍｇ／ｍｌで、グルタミン(JRH Biosciences, Lenexa, KS)を２ｍＭで、およびゲンタマイシン(Mediatech, Herndon, VA)を０．０５ｍｇ／ｍｌで加えた、イスコーブダルベッコ(Iscove's Dulbecco's)培地(Life Technologies, Gaithersburg, MD)からなっていた。ＩＳＣ−ＣＭに、さらに、示したように、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）(HyClone Laboratories, Logan, UT)またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma, St. Louis, MO)を加えた。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２に、３ｍＭのＮａＮ３を加えた（ＰＢＳＮ）。
【００５７】
例３：ウイルス
ＰＲ８ (A/PR/8/34(H1N1))は、マウスに適合した株であった。ＰＲ８−ＳＥＱ１４は、１４個の異なるＰＲ８（ＨＡ）特異性モノクローナル抗体の連続的な存在下でＰＲ８から選択された逸脱突然変異体であった。Ｘ３１は、Ｈ３およびＮ２をコードするものを除いて、すべてのＰＲ８由来遺伝子を含む再構築ウイルスであり、これは、(A/Aichi/68(H3N2))からであった(Kilbourne (1969) Bull. WHO 41:643-5)。ＪＡＰは、(A/Japan/305/57(H2N2))であり、Ｂ／ＬＥＥは、Ｂ型インフルエンザウイルス株Ｂ／Ｌｅｅ／４０であった。
【００５８】
例４：Ｍ２ｅ特異性ハイブリドーマの製造
３種のＭ２ｅ特異性ハイブリドーマ（Ｍ２−５６、Ｍ２−８０、Ｍ２−８６）は、２種の連続的な感染で、第１にＰＲ８で、および第２にＸ３１で攻撃したＢＡＬＢ／ｃマウスから由来していた。融合の３日前に、マウスに、静脈内に（ｉ．ｖ．）、ＰＢＳ中の５μｇの（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡを注射し、脾臓細胞をＳｐ２／Ｏ骨髄腫細胞と融合させた。２種のハイブリドーマ（Ｍ２−１、Ｍ２−１５）は、３種の連続的なヘテロサブタイプ的感染（第１にＰＲ８で、第２にＸ３１で、第３にＪＡＰで）から回復したマウスから由来しており、鼻腔内で（ｉ．ｎ．）、５μｇの（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡ並びに３μｇのホスホロチオエート化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）ｃ１８２６および０．５μｇのコレラ毒素（ＣＴ）で追加免疫した。排出するリンパ節（表層、頸部および縦隔）からの細胞を、３日後に融合させた。ハイブリッド培養物を、ＥＬＩＳＡにおいて（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよび／またはＪＡＰで感染したMadin Darbyイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞と反応する抗体の分泌について、スクリーニングした。これらのプロトコルにより発生したすべてのＭ２ｅ特異性ハイブリドーマは、Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよびＪＡＰで感染したＭＤＣＫ細胞と交差反応した。ハイブリドーマ１４Ｃ２は、業界において十分知られている(Zebedee and Lamb (1988) 上記)。
【００５９】
例５：ＥＬＩＳＡによる抗体測定
コスター(Costar)血清クラスター(serocluster)の、丸底のポリビニルプレートのウェルを、（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡで、０．５μｇ／ｍｌでＰＢＳＮ中で２５μｌの（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡと共に室温で一晩インキュベートする（蒸発を防止するために覆った）ことにより、被覆した。プレートを、アッセイの前に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＮで１〜２時間遮断した。ＪＡＰ−ＭＤＣＫ  ＥＬＩＳＡプレートを、以下のようにして作成した：ＭＤＣＫ細胞を、ファルコン(Falcon)、マイクロテスト(microtest)、平坦底、９６ウェル、ポリスチレン、ｔｃプレートにおいて、典型的には、ウェルに、５％ＦＣＳを含むＩＳＣ−ＣＭ１００μｌ中で、４×１０４個のＭＤＣＫ細胞を播種することにより、密集度において成長させた。１日のインキュベーション（３７℃、６％ＣＯ２）の後に、単層を、ＰＢＳで洗浄して、血清成分を除去し、インキュベーション（３７℃）により、ＪＡＰウイルスの〜１０６のＴＣＩＤ５０を含む５０μｌのＩＳＣ−ＣＭで感染させた。１時間後、５％ＦＣＳを含む１００μｌのＩＳＣ−ＣＭを、各々のウェルに加え、インキュベーションを、前述のように、６〜７時間継続した。
【００６０】
次に、単層を、ＰＢＳで洗浄し、室温で５分間、５％の緩衝フォーマルド−フレッシュ(Formalde-Fresh)(FisherChemical, Pittsburgh, PA)と共にインキュベートすることにより固定し、ＰＢＳＮで洗浄し、遮断し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＮと共に４℃で貯蔵した。ＥＬＩＳＡにおいて、すべての試験試料および試薬を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＮ中で希釈し、２５μｌ／丸底ウェルまたは５０μｌ／平坦底ウェルにおいて用い、室温で９０分間インキュベートした。結合したマウス抗体を、一般的に、ビオチニル化されたラット抗マウス−Ｃκモノクローナル抗体１８７．１、続いてストレプトアビジン−ＡＰ(Sigma, St. Louis, MO)およびｐＮＰＰ(Sigma, St. Louis, MO)で検出した。ｐＮＰＰ溶液を、それぞれ丸底および平坦底ウェルあたり５０μｌおよび１００μｌにおいて用いた。吸収を、EMAX（登録商標）プレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で測定し、ＯＤ４０５とＯＤ７５０との差異（ＯＤ４０５−７５０）を、通常インキュベーションの３０〜４５分後に記録した。すべてのアッセイは、試験試料の定量について、適切な特異性を有する精製されたモノクローナル抗体の滴定を含んでいた。ＥＬＩＳＡデータを、SOFTMAX PRO（登録商標）ソフトウエア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で分析した。
【００６１】
例６：ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の分析
抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、実験未使用のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から調製した。パーコール(PERCOLL)（登録商標）(PHARMACIA（登録商標）、Uppsala, Sweden)を、細胞懸濁液に加えて、３３％の最終濃度を得た。懸濁液を、小さい容積の７０％パーコール（登録商標）と共に下に配置し、遠心分離（１０分、６００ｇ、室温）して、細胞残骸および赤血球を除去した。３３％／７０％界面における細胞を収穫し、洗浄し、照射し（２２００ｒａｄ）、ＩＳＣ−ＣＭ中に５×１０６個の細胞／ｍｌにおいて懸濁させた。１００μｌを、平坦底組織培養プレートのウェルあたり分配した。ＩＳＣ−ＣＭ中の抗原を、ウェルあたり５０μｌの容積で加えた。５０μｌの応答細胞懸濁液、典型的には１０７／ｍｌにおけるＭｅｄＬＮ細胞またはＩＳＣ−ＣＭ中で４×１０５／ｍｌにおけるＴｈクローンを、ウェルあたり加えた。１μＣｉのＨ３−チミジンを、インキュベーションの３日目（Ｔｈクローン）または４日目（ＬＮ応答細胞）の間に加えた。次に、プレートを凍結させ、１回融解させ、細胞を、スカトロン(Skatron)細胞収穫装置(Skatron Instruments Inc., Sterling, VA)で、フィルターマット(Skatron Instruments Inc., Sterling, VA)上に収穫した。フィルターマットの打ち抜いた片を、シンチレーション流動体中に移送し、放射活性について計数した。
【００６２】
例７：ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞応答の分析
ワクチン接種したマウスからの脾臓細胞を、３３％／７０％パーコール（登録商標）勾配において提供したように精製し、応答細胞として用いた。Ａ２０細胞（Ｈ２ｄ、ＭＨＣ  ＩＩ群について陽性）を、ＰＲ８（１０６ＴＣＩＤ５０／１０６Ａ２０、３７℃で１時間）で感染させ、４４００ｒａｄで照射し、洗浄し、刺激剤として用いた。培養液（６ｍｌ）を、Ｔ２５ファルコン(Falcon)フラスコ中に配置し、２５×１０６個の応答細胞および１０６個の刺激細胞を、５％ＦＣＳを含むＩＳＣ−ＣＭ中に含んでいた。インキュベーション（静止、直立）の５日後に、生存細胞を、３３％／７０％パーコール（登録商標）勾配において精製し、計数し、標準的な方法(Mozdzanowska, et al. (1997) Virology 239:217-25)を用いて、４時間のインキュベーション期間の間の、ＰＲ８およびＢ／ＬＥＥで感染したＰ１．ＨＴＲ標的細胞からの５１Ｃｒの放出を誘発する能力について試験した。
【００６３】
例８：免疫プロトコル
５０μｌの合計容積での、Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよび補助剤を、麻酔したマウスの鼻腔上に配置し（ケタミンおよびキシラジンを腹腔内に、それぞれ７０ｍｇ／体重１ｋｇおよび７ｍｇ／体重１ｋｇで注射した）、この結果、気道中へのこの吸引がもたらされた。５０μｌの１回の用量は、３μｇのＭ２ｅ−ＭＡＡ、３μｇのＯＤＮ１８２６(Krieg, et al. (1995) Nature 374:546-9; Yi, et al. (1998) J. Immunol. 160:4755-61)および０．５μｇのＣＴ(Sigma, St. Louis, MO)を含んでいた。補助剤の組み合わせおよび投与は、標準的な方法(Mozdzanowska, et al. (1999) 上記)に基づいていた。追加免疫接種を、４〜５週間隔で投与した。Ｍ２ｅ−ＭＡＡを有しない補助剤溶液を施与されたマウスを、負の対照として用い、第１にＰＲ８で、第２にＰＲ８−ＳＥＱ１４での、２種の連続的な気道感染を施されたマウスを、正の対照として用いた。
【００６４】
例９：ウイルス攻撃実験
ワクチンにより誘発された保護の強度を、〜１０３ＭＩＤ５０（５０％マウス感染用量）のＸ３１でのマウスのｉ．ｎ．攻撃により試験した。３日後、マウスを麻酔し、心臓穿刺により放血させ、鼻、気管および肺組織を採集するために解剖した。感染性ウイルスの力価を、標準的な方法(McCluskie and Davis (2000) 上記)を用いた、ＭＤＣＫ細胞培養物または孵化鶏卵中の組織ホモジネートの滴定により、決定した。
【００６５】
例１０：ＭＡＡへの免疫応答のインビトロ分析
野生型のウイルスＭ２ｅに対するＴｈ依存性抗体応答を誘発するために、Ｍ２ｅ−ＭＡＡは、Ｂ細胞エピトープを、野生型のウイルスにより誘発されたＭ２ｅと共有し、Ｔｈ細胞に対して提示され得る決定因子を含んでいた。ＪＡＰ−ＭＤＣＫ細胞およびＭ２ｅ−ＭＡＡを、ＥＬＩＳＡにおけるいくつかのＭ２ｅ特異性モノクローナル抗体とのこれらの反応について比較した。１４Ｃ２モノクローナル抗体は、精製されたウイルスＭ２(Zebedee and Lamb (1988) 上記)で免疫されたマウスから発生しており；すべての他の抗体は、連続的なインフルエンザＡ型ウイルス感染から回復し、融合の３日前に（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡで追加免疫されたマウスから単離された。（４）Ｍ２ｅ−ＭＡＡでの最終的な追加免疫を行って、Ｍ２ｅ特異性ハイブリドーマの単離の頻度を増大させた。６種のＭ２ｅ特異性モノクローナル抗体はすべて、Ｍ２ｅ−ＭＡＡおよびＪＡＰ−ＭＤＣＫの両方と良好に反応したが、４種は、ＪＡＰ−ＭＤＣＫに結合するにあたり、（１）Ｍ２ｅ−ＭＡＡで１．５ｎｇ／ウェルで被覆されたウェルよりも、わずかに有効であり、２種は、わずかに有効ではなかった。データは、Ｍ２ｅ−ＭＡＡが、野生型のウイルスにより誘発された四量体Ｍ２ｅのいくつかのＢ細胞決定因子を有効に模倣することを示した。
【００６６】
構造的に異なるＭ２ｅ−ＭＡＡは、等モルのＭ２ｅ濃度で用いた際には、Ｍ２ｅ特異性モノクローナル抗体との反応において、顕著な差異を示さなかった。
【００６７】
Ｔｈにより媒介された補助を最適化するために、２種の別個のＴｈ決定因子を、ＭＡＡ中に導入し、一方（Ｓ１）は、Ｅｄにより提示され、他方（Ｓ２）は、Ａｄにより提示された。これらの決定因子は、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスのＨＡ（ＰＲ８）特異性Ｔｈ応答の２種の免疫優性の標的として同定された(Gerhard, et al. (1991) J. Virol. 65:364-72)。Ｓ１は、ＨＡ領域１１０〜１２０に対応し、Ｓ２は、１２６〜１３８に対応する。しかし、この構造物中のＳ２ペプチドは、野生型のＳ２と比較して、位置１３５におけるシステインをセリンで置換して、Ｓ２と、Ｍ２ｅペプチド中に含まれるシステインとの間のジスルフィド結合の形成を回避することにより、変化していた。
【００６８】
ＭＡＡが、Ｓ１およびＳ２特異性Ｔｈクローンを刺激する効能を、ＡＰＣとして照射したＢＡＬＢ／ｃ脾臓細胞、レスポンダーとしてＳ１またはＳ２特異性Ｔｈクローンおよび種々の濃度の遊離のＳ１またはＳ２ペプチド、Ｍ２ｅ−ＭＡＡまたは精製したＨＡを含む培養物中で、決定した。Ｔｈクローンの増殖を、培養の３日目の間に、３Ｈ−チミジン導入により評価した。すべてのＭ２ｅ−ＭＡＡは、Ｓ１特異性ＴｈクローンＶ２．１を、遊離のＳ１ペプチドと等しいか、またはこれより高い効能で刺激した。マンノシル化されたＭＡＡの１００倍大きい刺激効能は、ＡＰＣ上で発現されたマンノース−レセプターによるこのＭＡＡの改善された捕集のために、最も可能性が高く観察された(Engering, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:2417-2; Tan, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:2426-35)。このＭＡＡの刺激活性は、モル基準で、またマンノシル化された炭水化物側鎖を含むＨＡ分子の活性と同様である(Keil, et al. (1985) EMBO J. 4:2711-20)。
【００６９】
対照的に、ＭＡＡのいずれも、Ｓ２特異性Ｔｈクローン５．１−５Ｒ６を刺激しなかった。このＴｈクローンは、単離された野生型のＳ２ペプチドおよび無傷のＨＡでの刺激に良好に応答し、従ってＣｙｓ（１３５）のＳｅｒへの変化は、このＴｈクローンについてのこの刺激効能を低下した場合がある。２種の追加の、クローン的に関連していないＳ２特異性Ｔｈクローンを試験し、またＭＡＡに応答していなかった。Ｃｙｓ（１３５）→Ｓｅｒが、Ａｄに結合するペプチドの能力に影響しないため(Sette, et al. (1989) J. Immunol. 142:35-40)、これは、野生型のＳ２決定因子に特異的なＴｈにより認識されない抗原的に新規なＴｈ決定因子を形成し得る。Ｓ２／Ａｄ錯体の結晶構造分析により、位置１３５におけるアミノ酸は、アンカー残基ではないことが示された(Scott, et al. (1998) Immunity 8:319-29)。
【００７０】
従って、インビトロ分析により、Ｍ２ｅ−ＭＡＡが、野生型のウイルスにより誘発されたＭ２ｅのＢ細胞決定因子を模倣し、少なくとも１つの機能的なＴｈ決定因子を含むことが示された。
【配列表】
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【国際調査報告】
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