(57)【要約】本発明は、前立腺上皮細胞分化を促進することによって前立腺ガンを治療する方法および組成物を提供する。治療方法は、活性形態の前立腺由来因子（ＰＤＦ）、または不活性ＰＤＦ前駆体、またはプロタンパク質転換酵素（ＰＣ）とＰＤＦ前駆体との組合せを投与して、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させ、前立腺上皮細胞分化を促進することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要のある対象における前立腺ガンを治療する方法であって、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することによって、対象中で前立腺上皮細胞分化を促進することを含む方法。
【請求項２】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することが、治療上有効量のＰＤＦをその対象に投与することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＰＤＦを投与することを含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することが、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素をその対象に投与することを含み、ここに、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量のＰＤＦを与えるのに十分である請求項１記載の方法。
【請求項５】
ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、単一剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒に投与することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、第１の剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体を投与し、次いで、第１の剤形とは別個の第２の剤形で医薬上許容される担体中のある量のプロタンパク質転換酵素を投与することを含む請求項４記載の方法。
【請求項７】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することが、治療上有効量のプロタンパク質転換酵素をその対象に投与することを含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を投与することを含む請求項７記載の方法。
【請求項９】
その必要のある対象における前立腺ガンを治療する方法であって、
その対象から前立腺組織の試料を採取し；
その組織試料中のガン性細胞の特性を調べて細胞がＰＤＦの受容体を有するかどうか決定し；
細胞の特性を調べて細胞がＰＤＦの前駆体を合成し分泌するかどうかを調べ；次いで、
細胞の特性を調べて細胞がＰＤＦの前駆体をプロセシングして活性ＰＤＦを産生するかどうか決定することを含む方法。
【請求項１０】
細胞がＰＤＦの前駆体を合成も分泌もせず、治療上有効量のＰＤＦをその対象に投与するステップをさらに含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
治療上有効量の活性ＰＤＦを投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＰＤＦを投与することを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞がＰＤＦの前駆体を合成も分泌もせず、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒にその対象に投与するステップをさらに含み、ここに、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量のＰＤＦを与えるのに十分である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、単一剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒に投与することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、第１の剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体を投与し、次いで、第１の剤形とは別個の第２の剤形で医薬上許容される担体中のある量のプロタンパク質転換酵素を投与することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
細胞がＰＤＦの前駆体を合成し分泌するがＰＤＦの前駆体をプロセシングせず、治療上有効量のＰＤＦをその対象に投与するステップをさらに含む請求項９記載の方法。
【請求項１６】
治療上有効量のＰＤＦを投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＰＤＦを投与することを含む請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
細胞がＰＤＦの前駆体を合成し分泌するがＰＤＦの前駆体をプロセシングせず、ＰＤＦの前駆体をプロセシングする治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を対象に投与するステップをさらに含む請求項９記載の方法。
【請求項１８】
治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を投与することを含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
その必要がある対象における前立腺ガンを治療する方法であって、前立腺ガンの早期に、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することによって、対象中で前立腺細胞分化を促進することを含む方法。
【請求項２０】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大する剤をその対象に投与することが、治療上有効量のＰＤＦをその対象に投与することを含む請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
治療上有効量のＰＤＦを投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＰＤＦを投与することを含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することが、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒にその対象に投与することを含み、ここに、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量のＰＤＦを与えるのに十分である請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、単一剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒に投与することを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、第１の剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体を投与し、次いで、第１の剤形とは別個の第２の剤形で医薬上許容される担体中のある量のプロタンパク質転換酵素を投与することを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することが、治療上有効量のプロタンパク質転換酵素をその対象に投与することを含む請求項１９記載の方法。
【請求項２６】
治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を投与することが、医薬上許容される担体中の治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を投与することを含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
対象における前立腺ガンを治療または予防する組成物であって、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＰＤＦの前駆体を含む組成物。
【請求項２８】
対象における前立腺ガンを治療または予防する組成物であって、医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの不活性前駆体およびプロタンパク質転換酵素を含み、ここに、ある量のＰＤＦの不活性前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量のＰＤＦを与えるのに十分な組成物。
【請求項２９】
単一剤形で、ある量のＰＤＦの不活性前駆体、ある量のプロタンパク質転換酵素および医薬上許容される担体を含む請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
第１の剤形である量の医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体および、第１の剤形とは別個の第２の剤形である量の医薬上許容される担体中のある量のプロタンパク質転換酵素を含む請求項２８記載の組成物。
【請求項３１】
対象における前立腺ガンを治療または予防する組成物であって、医薬上許容される担体中の治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２００２年１１月８日に出願され、出典明示してその明細書が全て本明細書に含まれるとみなされる米国仮出願番号第６０／４２４,９４８号を基礎とする優先権を主張する。
連邦政府により資金提供を受けた研究開発
適用せず。
配列表の参照
この開示の一部である配列表は、フロッピーディスク上に、本発明のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を含むテキストファイルを含む。配列表の構成要素は出典明示して全て本明細書に含まれるとみなされる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、概略、ガン治療に関し、特に、前立腺ガン治療としての前立腺上皮細胞分化の調節に関する。
【０００３】
前立腺ガンは男性の前立腺内に発生する悪性腫瘍である。前立腺は陰茎基部の後方、直腸の前方で膀胱の下方に位置するクルミ大の腺である。それは、陰茎を通り尿および精液を運ぶ管状チャネルである尿道を取り囲む。前立腺の主たる機能は、精子を保護し、支持し、輸送を助ける精液中の液体成分を産生することにある。９５％を超える前立腺ガンは、腺組織内で発生するガン、腺ガンである。もうひとつの重要な型の前立腺ガンは、神経内分泌腺、すなわち、小細胞悪性ガンとして知られている。この型は早期に転移するが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を産生しない。
【０００４】
前立腺ガンは男性では最もありふれたガンである。２００２年、約１８９,０００人が新たな前立腺ガン患者であると米国で診断されることが予測される。前立腺ガンは男性ではガンによる死亡原因の第２位であり［S.L. Parker et al., Cancer statistics, CA. Cancer J. Clin. 47:5-27 (1997)］、２００２年中に推定３０,２００例の死亡が発生すると予測される。前立腺ガンによる死亡数は全男性中減少しているが、死亡率は、白人において、黒人の２倍以上である。
【０００５】
全ての前立腺ガン患者の８３パーセントが、その病気が前立腺内部およびその周辺臓器にとどまっているうちに発見される。これらの場合、１００％の患者が診断後少なくとも５年間は生存することが予測される。前立腺ガンの全ての段階での全相対的５年生存率は９６％である。１０年および１５年生存率は、それぞれ、７５％および５４％である。
【０００６】
現在の前立腺ガン治療オプションは、外科手術、放射線治療、医学的療法、医学的療法と外科手術または放射線治療の組合せ、化学療法、および経過観察を含む。患者の治療オプションは、一般的に、患者の年齢および病気の段階による。しかしながら、これらの治療オプションは多くの副作用を有し、多くの場合、その増殖の早期における新生物の治療には用いられない。
【０００７】
形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの特定のメンバーであるタンパク質は前立腺ガン細胞の分化および増殖に影響することが示された。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は正常なラットおよびヒトの前立腺および前立腺ガン中で発現された［S.E. Harris et al., Prostate 24:204-211 (1994)］。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３は、正常および腫瘍化ヒト前立腺中で発現された［K.T. Perry et al., Prostate 33:133-140 (1997)］。ＴＧＦ−β１は前立腺の腫瘍化と関連付けられた［P. Wikstorm et al., Role of transforming growth factor-β1 in prostate cancer, Microscopy Res. Tech. 52:4111-419 (2001)］。
【０００８】
一旦分泌されたＴＧＦ−β１スーパーファミリーのタンパク質は生物学的効果を有するように活性化されなければならない。まず、ＴＧＦ−Ｂタンパク質が比較的大きな生物学的に不活性な前駆体（プロタンパク質ともいう）として合成され、それらが二塩基部位（Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｒ）にてタンパク質分解的にプロセシングされて成熟した活性ＴＧＦ−β類を放出する。プロセシング部位はフリンのごときプロタンパク質転換酵素に対する共通切断モチーフである。しかしながら、現在では、前立腺細胞におけるＴＧＦ−β類の分泌およびプロセシングについて非常に小さな別のものが知られている。
【０００９】
前立腺由来因子（ＰＤＦ）はＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質の分派メンバーであり、それは胎盤および前立腺内で高度に発現され、前立腺上皮の分化にも関与する。ＰＤＦはＰＬＡＢ［R. Hromas et al., Biochem. Biophys. Acta. 1354:40-44 (1997)］、胎盤形質転換成長因子−β（ＰＴＧＦ−β）［M. Yokoyama-Kobayashiet al., J. Biochem. 122:622-626 (1997)］、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）［M.R. Bootcov et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11514-11519 (1997)］、および増殖分化因子−１５（ＧＤＦ−１５）［M. Bottner et al., Gene 237:105-111 (1999)］としても知られている。
【００１０】
ＰＤＦは正常および腫瘍化前立腺細胞内で発現される［V.M. Paralkar et al, J. Biol Chem. 273:13760-13767 (1998); R. Thomas et al., Int. J. Cancer 93:47-52 (2001)］。ＰＤＦ遺伝子は、非新生物前立腺組織と比較して、初期前立腺ガン組織においてダウンレギュレートされるが、骨およびリンパ節における二次転移損傷において再発する［R. Thomas et al., (2001)］。様々な前立腺ガン細胞によるＰＤＦの分化合成および分泌は以前調査されていなかった。かくして、ＰＤＦの分泌およびプロセシングの正確な特徴および前立腺における腫瘍形成との関係は不明である。
【００１１】
【非特許文献１】S.L. Parker et al., Cancer statistics, CA. Cancer J. Clin. 47:5-27 (1997)
【非特許文献２】S.E. Harris et al., Prostate 24:204-211 (1994)
【非特許文献３】K.T. Perry et al., Prostate 33:133-140 (1997)
【非特許文献４】P. Wikstorm et al., Role of transforming growth factor-β1 in prostate cancer, Microscopy Res. Tech. 52:4111-419 (2001)
【非特許文献５】R. Hromas et al., Biochem. Biophys. Acta. 1354:40-44 (1997)
【非特許文献６】M. Yokoyama-Kobayashiet al., J. Biochem. 122:622-626 (1997)
【非特許文献７】M.R. Bootcov et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11514-11519 (1997)
【非特許文献８】M. Bottner et al., Gene 237:105-111 (1999)
【非特許文献９】V.M. Paralkar et al, J. Biol Chem. 273:13760-13767 (1998)
【非特許文献１０】R. Thomas et al., Int. J. Cancer 93:47-52 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前立腺ガン治療および前立腺上皮細胞分化の調節のための方法および組成物を提供する。特に、本発明は活性ＰＤＦ、ＰＤＦ前駆体およびプロタンパク質転換酵素を単独でまたは組み合わせて用いて、前立腺ガン細胞におけるＰＤＦの発現および活性を促進する細胞分化療法を提供する。本発明の具体例は、活性形態のＰＤＦをＰＤＦの受容体を有するガン性細胞に投与し、プロタンパク質転換酵素（ＰＣ）を投与して、プロタンパク質ＰＤＦを分泌する能力を有するがそれをプロセシングしないかまたは不十分にしかプロセシングしない細胞において活性ＰＤＦの産生を促進することを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
代表的な具体例において、その必要のある対象の前立腺ガンを治療する方法は、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することによって、前立腺上皮細胞分化を促進することを含む。例えば、その剤は、治療上有効量の活性ＰＤＦである。あるいは、その剤は、ある量のＰＤＦ前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素であって、ある量のＰＤＦ前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量の活性ＰＤＦを与えるのに十分である。あるいは、その剤は治療上有効量のプロタンパク質転換酵素である。
【００１４】
もうひとつの具体例において、その必要のある対象の前立腺ガンを治療する方法は、その対象から前立腺組織の試料を採取し、組織試料中のガン性細胞の特性を調べて細胞がＰＤＦの受容体を有するかどうか決定し、細胞の特性を調べて細胞がＰＤＦの前駆体をプロセシングして活性ＰＤＦを産生するかどうかを決定することを含む。この方法の一つの代替的な具体例において、細胞はＰＤＦの前駆体を合成も分泌もせず、本発明の方法はその対象に治療上有効量のＰＤＦを投与することをさらに含む。この方法のもうひとつの代替的な具体例において、細胞はＰＤＦの前駆体を合成も分泌もせず、本発明の方法はその対象にある量のＰＤＦ前駆体をある量のプロタンパク質転換酵素と一緒に投与するステップをさらに含み、ある量のＰＤＦ前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量の活性ＰＤＦを与えるのに十分である。この方法のさらにもうひとつの代替的な具体例において、細胞はＰＤＦの前駆体を合成し分泌するが、ＰＤＦの前駆体を有さず、本発明の方法は、その対象に治療上有効量のＰＤＦを投与するステップをさらに含む。この方法のなおもうひとつの代替的な具体例において、細胞はＰＤＦの前駆体を合成し分泌するが、ＰＤＦの前駆体を有さず、本発明の方法は、その対象にＰＤＦの前駆体をプロセシングするための治療上有効量を投与するステップを含む。
【００１５】
もうひとつの具体例において、その必要のある対象の前立腺ガンを治療する方法は、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤を、前立腺ガンの早期に、その対象に投与することによって前立腺細胞分化を促進させることを含む。
【００１６】
もうひとつの具体例において、対象の前立腺ガンを治療または予防するための組成物は、医薬上許容される担体中の治療上有効量の活性ＰＤＦを含む。
【００１７】
もうひとつの具体例において、対象の前立腺ガンを治療または予防するための組成物は、医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの不活性前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を含み、ある量のＰＤＦの不活性前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量の活性ＰＤＦを与えるのに十分である。
【００１８】
もうひとつの具体例において、対象の前立腺ガンを治療または予防するための組成物は、医薬上許容される担体中の治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を含む。
【００１９】
本発明の他の特徴は、ある部分当業者にとって明白であり、ある部分下記の詳細な説明に指摘される。
本発明のこれらのおよび他の特徴、局面および利点は明細書、特許請求の範囲および不随する図面を参照してより理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
全般的に、以下用いる命名法および実験手順は、当業者によく知られ、かつ、普通に採用されているものである。とくに断りなければ、ここで用いる技術的および科学的用語は、本発明が関する分野の当業者に普通に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の範囲および目的から逸脱することなく、ここに記載されるものと同様または同等のいかなる方法および物質を本発明の実施または試験に用い得るが、好ましい方法および物質を記載する。
【００２１】
本発明の細胞分化療法は、ある部分、限定されないが、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３およびＤＵ１４５を含む様々な前立腺ガン細胞系統のＰＤＦの分化的産生、分泌およびプロセシングの発見に基礎をおく。本発明の細胞分化療法は、ある部分、サイトケラチン発現パターンおよびアンドロゲン依存前立腺特異抗体（ＰＳＡ）産生によって評価された前立腺上皮分化のプロタンパク質転換酵素依存変化の発見にも基礎をおく。
【００２２】
ここで用いるとき、「前立腺由来因子(prostate-derived factor)」または「ＰＤＦ」［V.M. Pralkar et al., J. Biol. Chem. 273:13760-13767 (1998)］はＰＤＦの全ての種および同族体をいい、ＰＬＡＢ［R. Hromas et al., Biochem. Biophys. Acta. 1254:40-44 (1997)］、ＰＴＧＦ−β［M. Yokoyama-Kobayashi et al., J. Biochem. 122:622-626 (1997)］、ＭＩＣ−１［M.R. Bootcov et al., Proc. Nat'l Acad. Sci, USA 94:11541-11519 (1997)］、およびＧＤＦ−１５（ＧＤＦ−１５）［M. Bottner et al., Gene237:105-111 (1999)］、ならびに組換えＰＤＦタンパク質およびＰＤＦ、ＰＬＡＢ、ＰＴＧＦ−β、ＭＩＣ−１およびＧＤＦ−１５の機能的誘導体を含む。
【００２３】
ここで交換可能に用いられるとき、「前立腺由来因子前駆体 (prostate-derived factor precursor)」、「ＰＤＦ前駆体(PDF precursor)」、「ＰＤＦの前駆体(precursor of PDF)」および「プロＰＤＦ(pro-PDF)」は、不活性ＰＤＦプロタンパク質をいい、それは分泌された比較的大きな未成熟形態のＰＤＦであって、それは、まず、プロタンパク質転換酵素によってタンパク質分解的にプロセシングして成熟した生物学的に活性なＰＤＦにしなければならない
【００２４】
ここで交換可能に用いられるとき、「プロタンパク質転換酵素(proprotein convertases)」および「ＰＣ(PCs)」は、限定されないが、フリン、ＰＣ１／３、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＢＭＰ１およびＰＣ７／８、ならびにそれらの機能的誘導体および同族体、およびほ乳類においてＰＤＦを調節するように働く組換えＰＣを含む。
【００２５】
ここで用いるとき、「組換えＰＤＦタンパク質(recombinant PDF protein)」は、組換え核酸技術の使用により得られるタンパク質である。そのような組換えタンパク質の主な構造は、その天然に産出する対応ＰＤＦのものと同一であるか、または単一または複数の突然変異を含むさらなるまたは異なるアミノ酸残基を含有することができる。
【００２６】
ここで用いるとき、「組換えＰＣ(recombinant PC)」は組換え核酸技術の使用により得られるプロタンパク質転換酵素である。そのような組換えプロタンパク質転換酵素の主たる構造は、その天然に産出するプロタンパク質転換酵素対応物のものと同一であるか、または単一または複数の突然変異を含むさらなるまたは異なるアミノ酸残基を含有することができる。
【００２７】
ここで用いるとき、ＰＤＦ、ＰＬＡＢ、ＰＴＧＦ−β、ＭＩＣ−１、ＧＤＦ−１５の「機能的誘導体(functional derivative)」であるタンパク質は、ＰＤＦに対する構造的および機能的類似性を有するタンパク質である。構造的に類似するタンパク質は、例えば、細胞分化を促進する機能を実質的に減じないアミノ酸欠損、挿入または保存的置換によってＰＤＦとは異なるタンパク質を含む。
【００２８】
ここで用いるとき、ＰＣの「機能的誘導体(functional derivative)」であるプロタンパク質転換酵素は、ＰＣに対して構造的および機能的類似性を有するプロタンパク質転換酵素である。構造的に類似するプロタンパク質転換酵素は、例えば、ＰＤＦ発現および／または細胞分化を促進する機能を実質的に減じないアミノ酸欠損、挿入または保存的置換によってＰＣとは異なるプロタンパク質転換酵素である。
【００２９】
ここで用いるとき、「医薬上許容される担体(pharmaceutically-acceptable carriers)」は、リン酸バッファーまたは生理食塩水のように当業者によく知られている。そのような医薬上許容される担体は水性または非水性溶液、懸濁液および乳化液である。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのごとき注射用有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、乳化液または懸濁液を含み、生理食塩水およびバッファー化媒体を含む。非経口賦形剤は塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース等を含む。例えば、抗生剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス等のごとき保存剤その他の添加物を存在させてもよい。
【００３０】
ここで用いるとき、「対象(subject)」は、前立腺ガンを発生するか被ることが可能ないかなる動物または人工修飾動物を意味する。人工修飾動物は、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、モルモット、フェレット、ウサギ、および霊長類を含む。好ましい具体例において、対象はヒトである。
【００３１】
ここで用いるとき、「投与する(administering)」ことは、当業者に知られている様々な方法のいずれかによって行いまたは実行することができる。投与することは静脈内、筋肉内および皮下投与を含む。
【００３２】
ここで用いるとき、「治療上有効量(therapeutically-effective dose)」は、罹患した対象の前立腺ガン細胞の増殖を選択的に阻害する用量である。投与レベルは疾患または状況の本質、患者の状態、担当医の判断、および投与の頻度および態様に高度に依存する。
【００３３】
ここで用いるとき、「細胞分化(cell differentiation)」は、細胞が成熟して、成熟した成体形態および機能を獲得するプロセスの全体を意味し、例えば、基底上皮細胞の管内分泌細胞への分化である。
【００３４】
ここで用いるとき、「治療する(treating)」または「治療すること(to treat)」なる用語は、一時的にもしくは恒久的にかのいずれかで症状を軽減し、原因を除去すること、または症状の発現を予防することもしくは遅延させることを意味する。「治療(treatment)」なる用語は、前立腺ガンの軽減、原因の排除または予防を含む。
【００３５】
ＰＤＦに関してここで用いるとき、「生物学的活性(biological activity)」なる用語は、プロＰＤＦおよびＰＤＦのイン・ビボでの生化学的挙動をいい、それによってＰＤＦが最終的にその効果を体組織に対して有効にする。「生物学的活性(biological activity)」は、プロＰＤＦの合成、プロＰＤＦの分泌およびプロタンパク質転換酵素による成熟活性ＰＤＦ形態へのプロＰＤＦのプロセシングを包含する意図である。
【００３６】
ＰＤＦの生物学的活性に関してここで用いるとき、「増大させる(increase)」および「増大させる(increasing)」なる用語は、実施例に記載するように、ガン性前立腺組織に観察されるＰＤＦの生物学的活性のダウンレギュレーションを促進し、または、少なくとも部分的に復活させることをいう。
【００３７】
前立腺ガンに関してここで用いるとき、「早期(early stage)」なる用語は、前立腺内の腫瘍負荷の観点で限定された発現を示す前立腺ガンであり、腫瘍体積は触診直腸検査（ＤＲＥ）では検出されないが、ガン性前立腺組織は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のごときバイオマーカーの測定のような微視的証拠によって検出可能である。ＰＳＡ倍加時間（ＰＳＡＤＴ）およびＰＳＡ速度の増加（ＰＳＡ速度、またはＰＳＡＶ）などの方法が当該分野で知られており、ＤＲＥで体積が検出可能になる前に前立腺ガンを検出するために用いられる。
【００３８】
代表的な具体例において、その必要のある対象の前立腺ガンを治療する方法は、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤をその対象に投与することによって、前立腺上皮細胞分化を促進することを含む。例えば、その剤は、治療上有効量の活性ＰＤＦである。あるいは、その剤は、ある量のＰＤＦ前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素であって、ある量のＰＤＦ前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量の活性ＰＤＦを与えるのに十分である。あるいは、その剤は治療上有効量のプロタンパク質転換酵素である。これらの剤のいずれも、医薬上許容される担体とともにその剤を含有する医薬組成物の形態で投与することができる。
【００３９】
投与する剤の選択は、ある部分、対象の前立腺組織におけるＰＤＦ活性のダウンレギュレーションに寄与する因子の評価に依存する。ダウンレギュレーションは、細胞中のＰＤＦ受容体発現のダウンレギュレーションに起因するか、プロＰＤＦの合成および分泌のダウンレギュレーションに起因するか、成熟した活性ＰＤＦ形態へのプロＰＤＦのプロセシングのダウンレギュレーションに起因するか、またはこれらの因子の全てのいくつかの組合せに起因するであろう。これらの可能性を区別するため、前立腺組織の試料を採取し、組織試料中のガン性細胞の特性を調べて、まず、細胞がＰＤＦの受容体を有するかどうか決定して、細胞が外因性ＰＤＦ療法に反応することを示す。それらの細胞の特性をさらに調べて細胞がＰＤＦの前駆体を合成し分泌するかどうかを決定し、特性を調べて活性ＰＤＦを産生するためのＰＤＦの前駆体を有するかどうかを決定する。細胞がＰＤＦの前駆体を合成も分泌もしなければ、ひとつの具体例において、治療上有効量の成熟した活性ＰＤＦを対象に投与する。あるいは、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒に対象に投与する。細胞がプロＰＤＦを合成し分泌するが、成熟した活性ＰＤＦへプロＰＤＦをプロセシングしなければ、ひとつの具体例において、治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を対象に投与して、対象のプロＰＤＦをプロセシングし得るようにする。
【００４０】
本発明は、単一剤形で、ある量のＰＤＦの前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を一緒に投与することを含むことを意図し、また、第１の剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦの前駆体を投与し、次いで、第１の剤形とは別の第２の剤形で医薬上許容される担体中のある量のプロタンパク質転換酵素を投与すること含むことも意図する。
【００４１】
もうひとつの具体例において、その必要のある対象の前立腺ガンの発現を予防する方法は、対象中でＰＤＦの生物学的活性を増大させる剤を、前立腺ガンの早期に、その対象に投与することによって前立腺細胞分化を促進させることを含む。その剤は、治療上有効量の活性ＰＤＦ、治療上有効量のプロタンパク質転換酵素、または、ある量のプロＰＤＦおよびある量のプロタンパク質転換酵素であって、ある量のプロＰＤＦおよびある量のプロタンパク質転換酵素は一緒になって治療上有効量の活性ＰＤＦを与えるのに十分である。このプロＰＤＦおよびプロタンパク質転換酵素は、医薬上許容される担体中の単一剤形で一緒に投与し得、または、第１の剤形で医薬上許容される担体中のある量のＰＤＦを投与し、第２の剤形で医薬上許容されるある量のプロタンパク質転換酵素を投与し得る。
【００４２】
ＰＤＦ、プロＰＤＦまたはプロタンパク質転換酵素を単独でまたは組み合わせて、医薬上許容される担体と共に提供するとき、前立腺ガンの治療用の新規組成物となる。動物対象の治療の使用のため、本発明の組成物を医薬組成物または獣医学的組成物として調剤し得る。治療する対象、投与の態様および所望する治療のタイプ、例えば、予防、防止、治療に依存して；これらのパラメータにふさわしいように調剤する。そのような技術の要約は、例えば、［Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton PA］に見られる。例えば、所望の治療効果を達成するようなＰＤＦの量、またはプロＰＤＦとプロタンパク質転換酵素の総量は、特定の個別化合物または選ばれた化合物を含む因子数、特定の使用、投与経路、対象の臨床学的状態、対象の年齢、体重、性別および規定食に依存することを理解すべきである。
【００４３】
前立腺ガン治療用の新規化合物は、例えば、ある量の活性ＰＤＦを医薬上許容される担体中に含む組成物を含む。代替的な具体例において、前立腺ガン治療用の組成物は、ある量のＰＤＦの不活性な前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を医薬上許容される担体中に含み、ある量のＰＤＦの不活性な前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素は治療上有効量の活性ＰＤＦを与えるのに十分である。ある量のＰＤＦの不活性な前駆体およびある量のプロタンパク質転換酵素を医薬上許容される担体中で一緒に組み合わせることができ、または、２つの個別注射液または２つの個別の錠剤もしくはカプセル剤のごとき２つの個別剤形に調剤することができる。あるいは、前立腺ガン治療用の組成物はある量のプロタンパク質転換酵素および医薬上許容される担体を含む。
【００４４】
本発明の組成物の投与は、投与の頻度、用量、持続態様および経路を含む投与の様々なパラメータを修正することによって、薬理動態学的または薬力学的に制御することができる。必要な活性が生じるように投与の用量、持続時間および態様を変更する。
【００４５】
プロタンパク質転換酵素と組み合わせたプロＰＤＦの使用を規定すると、本発明の方法は、組合せの有益な効果を奏する投薬計画において連続的に各剤を投与すること、および、これらの有効成分を固定比率で含む単一のカプセルもしくは投与装置で、または、同時期に一緒に摂取し得るか、当該組合せを構成する剤の双方からの有利な効果を受容するのに十分な時間内に摂取し得るような各剤用の複数の個別カプセルもしくは個別投与装置でのごとく、実質的に同時にこれらの剤を共投与することを含むことを意図する。
【００４６】
医薬上許容される担体は、限定されないが、生理食塩水、リンガー液、リン酸の溶液またはバッファー、バッファー化食塩水その他当該分野で知られている担体を含む。医薬組成物は安定化剤、抗酸化剤、着色剤、および希釈剤を含むこともできる。医薬上許容される担体および添加物は、その医薬組成物からの副作用が最小限になるように、かつ、治療を無効にする程度にまでその組成物の性能を相殺し阻害しないように選択される。
【００４７】
医薬組成物は経小腸および非経口投与することができる。非経口投与は、注入その他の当該分野で知られている投与方法による、皮下、筋肉内、胸骨内、皮内、乳房内、血管内投与を含む。経小腸投与は、水剤、錠剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、およびシロップ剤を含む。投与の際、医薬組成物を体温近くにすることができる。
【００４８】
当該組合せは滅菌注射液または油性懸濁液の形態で投与し得る。そのような懸濁液は、上記の湿潤剤および懸濁化剤または他の許容される剤の分散に適したものを用いる公知技術に準じて調剤することができる。滅菌注射用調剤は、例えば、１,３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒で非経口的に許容される希釈剤または溶剤中の滅菌注射液または懸濁液であってよい。許容される賦形剤および溶剤のなかでも、水、リンガー液、および等張化塩化ナトリウム溶液を採用することができる。さらに、滅菌キャリアオイルが、溶剤または懸濁媒体として従来から採用されている。この目的のため、合成モノまたはジグリセリド類を含むいずれのブランドキャリアオイルを用いることもできる。さらに、ｎ−３ポリ不飽和脂肪酸が注射製剤での使用が見出される。
【００４９】
当該組合せは、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠、トローチ、薬用ドロップ、水性もしくは油性懸濁剤、分散可能な粉剤もしくは粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤として経口投与し得る。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造技術分野で知られているいずれかの方法に準じて調剤することができ、そのような組成物は、医薬上洗練されたおいしい調剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および防腐剤よりなる群から選択される１以上の剤を含有することができる。
【００５０】
錠剤は、錠剤の製造に適した非毒で医薬上許容された補形剤と混合して有効成分を含有する。これらの補形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；粒状化または崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア、および滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってよい。錠剤は、被覆しなくてもよいし、胃腸内での崩壊および吸着を遅らせ、それによって、長期にわたる持続作用を与えるために、公知技術によって被覆することもできる。例えば、モノステアリン酸グリセルまたはジステアリン酸グリセリルのごとき時間遅延物質を用いることができる。
【００５１】
硬ゼラチンカプセル剤は、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合して有効成分を含有し、軟ゼラチンカプセル剤としては、有効成分はそのように、または水、または油性媒体、例えば、ピーナツ油、液状パラフィンまたはオリーブ油と混合して存在させる。
【００５２】
水性懸濁剤の製造に適した補形剤と混合して活性物質を含有する水性懸濁剤を製造し得る。そのような補形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり；分散化剤または湿潤剤は天然に産出するリン脂質、例えば、レシチン、または脂肪酸とのアルキレンオキシドの縮合生成物、例えばポリエチレンステアリン酸エステル、または、長鎖ポリオキシエチレンステアリン酸エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、または、脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分的エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸エステル、または、脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導された部分的エステルとのエチレンオキシドの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルであってよい。水性懸濁剤は、１以上の保存剤、例えば、エチルもしくはｎ−プロピルのｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、１以上の着色剤、１以上の香味剤、またはスクロースもしくはサッカリンのごとき１以上の甘味剤も含有することができる。
【００５３】
油性懸濁剤は、有効成分をオメガ−３脂肪酸、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油中に、または、液状パラフィンのごとき鉱物油中に有効成分を懸濁させることによって調剤することができる。これらの油性懸濁剤は粘稠化剤例えば、蜂ロウ、硬パラフィンまたはセチルアルコールを含有することができる。
【００５４】
上記のごとき甘味剤および香味剤を添加して口あたりのよい経口製剤にすることができる。これらの組成物をアスコルビン酸のごとき硬酸化剤の添加により保存することができる。
【００５５】
水性懸濁剤を調剤するのに適した分散可能な粉剤および粒剤は、水の添加によって分散化剤または湿潤剤、懸濁化剤および１以上の保存剤と混合された有効成分を与える。適当な分散化剤または湿潤剤はすでに上記したもので代表される。さらなる補形剤、例えば、甘味剤、香味時遭および着色剤も入れることができる。
【００５６】
新規の組合せを含有するシロップ剤およびエリキシル剤は甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトールまたはスクロースとともに調剤することができる。そのような製剤は粘滑剤、保存剤ならびに香味および甘味剤も含有することができる。
【００５７】
本発明の第１の具体例において、未分化前立腺ガン細胞を対象から採取し、特性を調査して、それらの細胞がＰＤＦの受容体を有しているかどうか決定する。そうであれば、対象に活性形態のＰＤＦを投与してガン細胞中の分化を促進し得る。
【００５８】
あるいは、ＰＤＦ前駆体を対象に投与した後、プロＰＤＦをＰＤＦにプロセシングし、それによって、細胞分化を促進するＰＣを投与することができる。しかしながら、ＰＤＦの受容体を持たない細胞は、そのような治療に応答しないであろう。現在、この具体例は、２つのタンパク質の対象への投与としてはあまり好まれず、免疫応答のリスクを増大し、対象にとって不便である。
【００５９】
もうひとつの代替的な具体例において、ＰＤＦ前駆体は、組換えＰＣとの独自の相互作用を与えて、活性ＰＤＦまたはその機能的同族体を産生するように加工された組換えポリペプチドであってよい。そのような組換えＰＤＦ前駆体およびＰＣは、天然または突然変異１級アミノ酸配列を含むことができ、その中では遺伝子および／またはタンパク質が天然では見出されない細胞以外の細胞中での組換えＤＮＡ分子によってもたらされた遺伝子の発現によってそれらは得られる。言い換えれば、その遺伝子は、その中でそれが発現される宿主および／またはそこにそれが投与される対象とは異種のものである。当該遺伝子に対するアフィニティー精製部位をコードするポリヌクレオチドの付加を含む、遺伝子のいずれの改変もその遺伝子をこの目的のためには非天然にすること、かくして、いかなる細胞にも天然にその遺伝子は見いだせないことを特記する。
【００６０】
そのような組換えタンパク質をコードするための組換えＤＮＡ分子は、その製造方法またはその構造のいずれかによって規定される。その製造方法への言及、例えば、ある製造方法によって作製された物において、プロセスは組換え核酸技術の使用であり、例えば、ヌクレオチド配列への人の介入、典型的には選別または製造に関与する。あるいは、天然では互いに隣接しない２つの断片の融合を含む配列を創製することによって作られた核酸であり得るが、天然の産物、例えば、天然に産出する突然変異体を排除する意味ではない。かくして、例えば、天然に産出しないベクターで細胞を形質転換することによって作られた産物が含まれ、いずれかの合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導された配列を含む核酸である。そのようなことをしばしば行って、同一または保存的アミノ酸をコードするコドンとアルコドンとを置換する一方、配列認識部位を導入したり除去したりする。あるいは、所望する機能の核酸セグメントを一緒にして、普通に入手可能な天然形態には見出されない所望する機能の組合せを含む単一の遺伝子全体を創製する。制限酵素認識部位は、しばしば、そのような人為操作の標的であるが、他の部位特異的標的、例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、調節配列、制御配列または他の有用な特徴を設計により取り込むことができる。
【００６１】
そのような組換えＰＤＦ前駆体は、組換えＰＣとのみ相互作用するように加工することができる。かくして、さもなければ、非組み換えＰＣの投与に起因するかもしれない他のＴＧＦ−βメンバーのプロセシングを増大することを回避しつつ、ＰＤＦ産生の増大を達成することができる。さらに、そのような組換えタンパク質は、副作用を引き起こすかもしれないＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーのプロセシングを回避する助けとなり得る。
【００６２】
組換えＰＣの使用によって、特定の標的天然プロＰＤＦに付与することができる同様の利点を達成することができる。例えば、有効な組換えＰＣは天然ＰＣのプロＰＤＦ結合部位またはＰＣのフランキング配列の操作から生じ、かくして非ＰＤＦプロタンパク質に結合し、それをプロセシングするＰＣの能力に悪影響を及ぼす。そのような組換えＰＣは単独で、組換えプロＰＤＦおよび組換えＰＣの組合せについて上記したものと同様の利点を生じる。
【００６３】
第２の具体例として、対象のガン細胞の特性を調べて、細胞がＰＤＦを分泌できるがそれをプロセシングするかまたはそれを十分にプロセシングする能力を有しないかどうかを決定する。そうであれば、対象に、活性形態のＰＤＦを投与するか、または、ＰＤＦ前駆体に引き続き治療上有効量のプロタンパク質転換酵素を与えて、細胞分化を促進することができる。
【００６４】
第３の具体例において、ＰＤＦを分泌する能力およびプロセシングする能力の双方を持つガン細胞を有する対象に、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＰＣを投与する。プロタンパク質転換酵素はＰＤＦのプロセシングを支援し、それにより、細分化を促進する。
【００６５】
本発明の細胞分化療法は、ＰＤＦがＬＮＣａＰおよびＰＣ３前立腺ガン細胞系統の双方でプロＰＤＦ形態として合成されるという発見に支持される。ＰＤＦはＬＮＣａＰ中でプロタンパク質転換酵素（ＰＣ）によって活性化されるが、ＰＣ３細胞中では活性化されない。ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞の細胞表現型の差異は、ある部分、ＰＣ３細胞内のＴＦＧ−βスーパーファミリーのメンバーの不完全成熟によるのであろう。ＬＮＣａＰおよびＰＣ３を含む前立腺ガン細胞は、骨芽細胞性骨形成を刺激し、骨芽細胞転移を引き起こす様々なＢＭＰを産生することが示されている［T. Yoneda, Cellular and molecular mechanisms of breast and prostate cancer metastasis to bone, Eur. J. Cancer 34:240-245 (1998)］。同様に、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞中での様々なＢＭＰのｍＲＮＡ発現が報告されている。イン・ビボで、ＬＮＣａＰ腫瘍は骨芽細胞応答を刺激し、一方、ＰＣ３細胞は広範囲にわたる骨崩壊および骨分解応答を生じる［D.H. Shevrin et al., Development of skeletal metastasis by human prostate cancer in athymic nude mice, Clin. Exp. Metastasis 6:401-409 (1988); G. Soos et al., Comparative intraosseal growth of human prostate cancer cell lines LNCap and PC3 in nude mice, Anticancer Res. 17:4253-4258 (1997)］。ＰＣによるＰＤＦ含有ＴＧＦ−βの活性における差異がこれらの応答に寄与しているのであろう。
【００６６】
本発明は、さらに、フリンのごときＰＣがヒト前立腺ガン細胞系統間で異なる活性を発揮するという発見よって支持される。特に、ＰＣの活性レベルは、ＤＵ１４５細胞やＰＣ３細胞と比較してＬＮＣａＰ細胞中で著しく高い。合成プロテアーゼ阻害剤であるデカノイル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＣＭＫ）での細胞処理は、全ての細胞系統中でＰＣ活性を阻害する。かくして、本発明の療法によれば、ＬＮＣａＰ細胞中のＰＣ活性はＰＤＦプロセシングを生じる。ＰＣ３細胞は低活性のＰＣを有するが、ＰＤＦプロセシング活性は検出できず、それにより、ＰＤＦへの特異的ＰＣ活性がＰＣ３細胞では欠如していることが示唆される。
【００６７】
ＣＭＫによるＰＤＦプロセシングの阻害は、前立腺ガンにおける管内および基底前立腺上皮細胞分化マーカーの調節に変化を生じる。ＬＮＣａＰ細胞へのＣＭＫの添加は、サイトケラチン８、１８および１９のダウンレギュレーションおよびサイトケラチン１４のアップレギュレーションをもたらし、それによって、分化細胞の特徴の喪失を示す。近年、ＴＧＦ−βは、ラットの正常前立腺細胞系統において、管内サイトケラチン遺伝子発現のアップレギュレーションおよび基底サイトケラチン遺伝子発現のダウンレギュレーションを誘発することが実証された［D. Danielpour, Transdifferentiation of NRP-152 rat prostatic basal epithelial cells toward a luminal phenotype: regulation by glucocorticoid, insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta, J. Cell. Sci. 112:69-179 (1999)］。同様に、本発明において、ＰＣ活性の阻害は、ＰＤＦを含むＴＧＦ−βのプロセシングを低下させ、分化細胞表現型の喪失をもたらす。しかしながら、ＣＭＫ処理はＤＵ１４５およびＰＣ３細胞においてサイトケラチンの発現に影響を及ぼさない。これはＰＣの活性が低いことか特定のＰＣがないことによるのであろう。
【００６８】
さらに、ＣＭＫはジヒドロテストステロン誘発ＰＳＡ発現を阻害する。ＰＤＡは十分に分化した前立腺上皮細胞中で発現し、アンドロゲンによって調節される［S.W. Hayward et al., The prostate: development and physiology, Radiol. Clin. North America 38:1-14 (2000)］。アンドロゲン受容体とｓｍａｄ３とが共同して、ＰＳＡ遺伝子発現を誘発することが示された［H.Y. Kang et al., From transforming growth factor-β signaling to androgen action: identification of smad3 as an androgen receptor coregulator in prostate cancer cells, Proc Nat'l Acad. Sci. USA (2001)］。本発明はこれらの観察と一致する。かくして、ＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のプロセシング阻害はアンドロゲン誘発ＰＳＡ発現の低減を生じるのであろう。
【００６９】
さらなる労力なく、当業者は前記説明を用いて本発明をその完全なる程度まで利用し得ることが確信される。しかしながら、下記の実施例を参照することによって、本発明はより理解されるであろう。詳細な実験は、本発明の単なる例示であって本発明の開示または範囲の残りを制限するものでは全くないと理解されるべきである。
【実施例】
【００７０】
原料および方法
ＣＭＫはCalbiochem (San Diego, CA)から入手し、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）はSigma (St. Louis, MO)から入手した。抗プロＰＤＦ抗体、抗サイトケラチン８、１８、１９抗体、および前立腺特異抗原抗体はSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から購入した。サイトケラチン１４および１５はChemicon (Temecula, CA)から購入した。Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−７−アミノ−４−メチルクマリン（Ｂｏｃ−ＲＶＲＲ−ＡＭＣ）はBachem Bioscience (King of Prussia, PA)から入手した。成熟ＰＤＦに対する抗血清は、Ｔａｎ［M. Tan et al., PTGF-β, a type transforming growth factor (TGF-β) superfamily member, is a p53 target gene that inhibit tumor cell growth via TGF-β signaling pathway, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:109-114 (2000)］に記載されたように、ＰＤＦのＣ末端に位置する２０−ａａペプチド配列（ＣＱＫＴＤＴＧＶＳＬＱＴＹＤＤＬＬＡＫＤ）をウサギに注射することによって作製した。ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞系統はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Rockville, MD)から入手した。ＲＰＭＩ１６４０はCellgro Mediatech (Herndon, VA)から、胎性ウシ血清はAtlas Biologicals (Fort Collins, CO)から購入した。
【００７１】
細胞培養
ヒト前立腺ガン細胞は、１０％胎性ウシ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖し、３７℃にて９５％空気および５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下に維持して培養した。
【００７２】
逆方向転写ＰＣＲ分析
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて、業者の指示に準じて、様々な細胞系統から調製した。ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて調製した。各ｃＤＮＡ反応の効率は、β−アクチン用プライマー(Promega, Madison, WI)でのβ−アクチン転写物の増幅によって評価した。ＰＤＦ遺伝子を増幅するのに用いたプライマーは、センス：５’−ＣＡＴＴＣＡＡＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣ、アンチセンス：ＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡ−３’であった。ＰＤＦのＰＣＲ条件は次のようである：９４℃にて３分間を１サイクル；９５℃にて１５秒間、５４℃にて３０秒間、７２℃にて１分間を３０サイクル。このＰＣＲ反応は２．０ｍＭのＭＧＣｌ２および２．５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含む５０μＬの体積を用いた。ＤＮＡ不純物を調べるために、ＰＣＲ前に逆方向転写酵素を添加しない対象実験を行った。増幅生成物（１０μＬ）を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。
【００７３】
ウェスターンブロット分析
細胞（約１×１０６細胞）を１００ｍｍの細胞培養皿に播種し、１０％胎性ウシ血清で補充したＲＰＭＩ１６４０中、５％ＣＯ２にて培養した。低融合細胞をリン酸バッファー化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、溶解バッファー(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)中で溶解して、細胞ライゼートに用いた。調整培地中のＰＤＦの検出のため、低融合細胞を２４時間血清欠乏状態にした。その無血清培地を収集し、１０％トリクロロ酢酸で沈殿させた。遠心後、８Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）および０．１％ＮＰ−４０からなるバッファーにペレットを溶解させた。試料を２％ベータ−メルカプトメタノール入りの５×Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーと混合し、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に付し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳで室温にて１時間ブロックし、適当な一次抗体および抗血清（１：５００〜２０００）とともに４℃にて一晩インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで、これらの膜を３回洗浄した後、これらの膜を適当なワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：２０００）とともに４℃にて１時間インキュベートした。タンパク質バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ＥＣＬキット(PIERCE, Rockford, IL)を用いるケミルミネッセンスによって可視化した。この手順をＰＤＦ、サイトケラチンおよびＰＳＡの検出に用いた。
【００７４】
プロタンパク質転換酵素の活性アッセイ
細胞ＰＣ活性の決定のため、３０,０００個の細胞を４８ウェルプレートに２４時間播種した。翌日、最終濃度が１０００μＭに達するまで、増殖培地およびＣＭＫを添加した。２４時間のインキュベーション後、培地を交換し、細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞数を決定するために、さらなる４８ウェルプレートを同様に調製し、それを正規化に用いた。浸透化のため０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りのＲＰＭＩ１６４０および蛍光基質としてＲＶＲＲ−ａｍｃ（１００μＭ）からなる１５０μＬのアッセイ培地を各ウェルに添加した。基質添加の４時間後、３６０ｎｍ励起波長および４６０ｎｍ発光波長で蛍光測定した。データを細胞数に対して正規化した。陽性対象として、ヒト組換えフリン(Sigma, St. Louis, MO)を用いた。
【００７５】
統計的解析
データは、２ないし６回の独立した試験の各々において３つの培養ウェルの平均±ＳＤで示している。統計的解析はスチューデントのｔテストを用いて行った。Ｐ値＜０．０５が有意であるとした。
【００７６】
結果
細胞内および分泌されたＰＤＦは、アンドロゲン依存性（ＬＮＣａＰ）およびアンドロゲン非依存性（ＰＣ３およびＤＵ１４５）の異なる細胞系統中で調べられた。異なる前立腺ガン細胞培養物から単離された全細胞内ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに付す。図１Ａに示すように、ＰＤＦ特異的プライマーは、１００ｂｐフラグメントを産生した。さらに、ＰＤＦｍＲＮＡ発現は、ＬＮＣａＰ細胞およびＰＣ３細胞中で検出されたが、ＤＵ１４５細胞中では検出されなかった。ＰＤＦタンパク質の存在をさらに図１Ｂに示すように免疫ブロット分析によって確認した。プロＰＤＦは、プロＰＤＦは認識するが成熟ＰＤＦは認識しない抗プロＰＤＦ抗体（〜４０ｋｄプロＰＤＦ形態）によってＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞系統中で検出された。しかしながら、抗成熟ＰＤＦ抗血清（〜１７ｋｄ成熟ＰＤＦ形態）は全細胞系統由来の細胞ライゼート中で成熟ＰＤＦを検出できなかった。プロＰＤＦではなく成熟ＰＤＦがＬＮＣａＰ調整培地中で検出されたが、プロＰＤＦだけはＰＣ調整培地中で検出されなかった。これらの結果は、成熟ＰＤＦは、ＤＵ１４５やＰＣ３の細胞にはよらず、ＬＮＣａＰ細胞によってのみ分泌されプロセシングされることを示す。プロＰＤＦはプロセシングなしにＰＣ３によって分泌されるということは、これらの細胞がＰＣを欠如しているのであろうと示唆する。ＤＵ１４５細胞はＰＤＦを全く発現しなかった。
【００７７】
次に、前立腺ガン細胞におけるＰＣ活性およびＣＭＫによるＰＣ活性の阻害を調べた。ＬＮＣａＰ、ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞を１００μＭのＣＭＫの存在下または不存在下で２４時間インキュベートした。その後、１００μＭの蛍光基質ｂｏｃ−ＲＶＲＲ−ａｍｃを添加し、細胞をさらに４時間インキュベートした。ＰＣ活性は、蛍光基質の切断を測定することによってアッセイした。図２に示した結果は、ＰＣ３およびＤＵ１４５の細胞中よりもＬＮＣａＰ中で有意に高いＰＣ活性および２４時間のＣＭＫによるＰＣ阻害を示す。
【００７８】
ＬＮＣａＰ細胞中のＰＣ依存性ＰＤＦプロセシングも、ＣＭＫの存在下ＰＤＦについて免疫ブロットすることによって調べた。細胞を培養し、ＣＭＫ無しおよび様々な濃度のＣＭＫ有りで２４時間血清欠乏状態にした。細胞および上清を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動に付した。免疫ブロットを抗プロＰＤＦ抗体（〜４０ｋｄプロＰＤＦ形態）および抗ＰＤＦ抗血清（〜１７ｋｄ成熟ＰＤＦ形態）で行った。図３に示すように、ＣＭＫでの処理は、ＬＮＣａＰ調整培地中でのＰＤＦプロセシングの用量依存性様式の低減と同時にプロＰＤＦの増加を生じた。ＣＭＫは細胞内ＰＤＦに影響を及ぼさなかった。
【００７９】
前立腺において、管内上皮細胞は基底上皮細胞から分化する。細胞型は管内上皮細胞においてサイトケラチン８および１８、基底上皮細胞においてサイトケラチン５、１５および１４の発現によって識別される［Y. Xue et al., Identification of intermediate cell types by keratin expression in the developing human prostate, Prostate 34:292-301 (1998)］。サイトケラチン１９は、前立腺細胞の分化プロセスの中間段階のマーカーであることが示唆されている［D.L. Hudson et al., Epithelial cell differentiation pathway in the human prostate: identification of intermediate phenotype by keratin expression. J. Histochem. Cytochem. 49:271-278 (2001)］。最近のデータは、ＮＲＰ−１５２ラット前立腺基底上皮細胞において、ＴＧＦ−βが管内サイトケラチン遺伝子発現のアップレギュレーションおよび基底サイトケラチン遺伝子発現のダウンレギュレーションを誘発することを示した［D. Danielpour, Transdifferentiation of NRP-152 rat prostatic basal epithelial cells toward a luminal phenotype: regulation by glucocorticoid, insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta. J. Cell. Sci. 112:169-179 (1999)］。
【００８０】
ＣＭＫが、ＰＤＦを含むＴＧＦ−βスーパーファミリープロセシングの不活性化の結果として、ＬＮＣａＰ細胞の分化表現型を調節するかどうかを調べるため、無血清ＲＰＭＩ１６４０の存在下、前立腺ガン細胞系統を様々な濃度のＣＭＫで処理した。培養培地およびＣＭＫを２４時間ごとに交換した。細胞を７２時間処理し、溶解し、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動に付した。免疫ブロットを抗サイトケラチン８（〜５２ｋｄ）、１４（〜５２ｋｄ）、１８（〜４５ｋｄ）および１９（〜４４ｋｄ）抗体を用いて行った。サイトケラチン８および１８は管内上皮細胞表現型を代表し、サイトケラチン１９および１４は、それぞれ、中間分化および基底上皮細胞表現型を代表する。図４に示されるように、ＣＭＫは、ＬＮＣａＰ細胞中ではサイトケラチン８、１８および１９の発現をダウンレギュレーションするが、ＤＵ１４５およびＰＣ３の細胞中ではダウンレギュレーションしない。サイトケラチン１４は、ＬＮＣａＰ中、用量依存性様式でアップレギュレーションされるが、ＤＵ１４５およびＰＣ３の細胞中では検出されなかった。
【００８１】
ＰＳＡは患者の前立腺ガンに対して広く用いられ、かつ、重要な血清学的マーカーである。通常、ＰＳＡ発現は十分に分化した前立腺上皮細胞においてアンドロゲンによって調節される［S.W. Hayward et al., The prostate: development and physiology, Radiol. Clin. N. America 38:1-14 (2000)］。前立腺ガン患者における血漿ＴＧＦ−βレベルの増大は上昇したＰＳＡレベルと相関する［H.L. Adler et al., Elevated levels of circulating interleukin-6 and transforming growth factor-β1 in patients with matastatic prostatic carcinoma, J. Urol. 161:182-187 (1999)］。アンドロゲン受容体の強力によるＰＳＡ遺伝子発現の調節における、ＴＧＦ−βの細胞内シグナリングメディエーターであるｓｍａｄ３の役割が、ＬＮＣａＰ細胞中で報告されている［H.Y. Kang et al., From transforming growth factor- signaling to androgen action; identification of smad3 as an androgen receptor coregulator in prostate cancer cells, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 98:3018-3023 (2001)］。したがって、アンドロゲン誘発ＰＳＡ発現へのＣＭＫの効果を調査することが、前立腺腫瘍発生におけるＰＤＦを含むＴＧＦ−βスーパーファミリーの作用メカニズムを理解するために重要であった。ＤＨＴの存在下および不存在下、ＬＮＣａＰ細胞を２４時間様々な濃度のＣＭＫで処理した。細胞ライゼートを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動に付し、次いで、抗ＰＳＡ抗体（〜３７ｋｄ）で免疫ブロットを行った。図４に示すように、アンドロゲン誘発ＰＳＡ発現はＣＭＫの添加によって阻害され、一方、ＤＨＴ不存在下での内在ＰＳＡのレベルは影響を受けなかった。ＰＳＡはＰＣ３およびＤＵ１４５の細胞中で発現されないので、これらの実験はこれらの細胞型では実行しなかった。
【００８２】
上記の詳細な説明は、当業者が本発明を実施する助けとするためにある。そうであっても、本明細書で議論された具体例における修正や変更は、本発明の発見の精神または範囲を逸脱することなく当業者によってなし得るのであり、この詳細な説明が本発明を過度に制限するものと理解されるべきではない。
【００８３】
本明細書に引用された全ての刊行物、特許、特許出願その他の参考文献は、出典明示して、あたかも、個々の刊行物、特許、特許出願そのたの参考文献の各々がその完全なるまで具体的かつ個別的に本明細書に示されているとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】前立腺由来因子ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析（Ａ）；様々なヒト前立腺ガン細胞による分化ＰＤＦ合成および分泌を実証する、抗プロＰＤＦ抗体および抗ＰＤＦ抗血清での免疫ブロット（Ｂ）。
【図２】ヒト前立腺ガン細胞系統における蛍光基質ｂｏｃ−ＲＶＲＲ−ａｍｃの分解および１００μＭ ＣＭＫの効果を測定して決定されたＰＣ活性のアッセイ。
【図３】ＬＮＣａＰ細胞においてＣＭＫによるＰＤＲプロセシング阻害を実証する、抗プロＰＤＦ抗体および抗ＰＤＦ抗血清での免疫ブロット。
【図４】前立腺上皮細胞分化マーカーへのＣＭＫの効果を実証する、抗サイトケラチン８、１４、１８および１９抗体での免疫ブロット。
【図５】ＬＮＣａＰ細胞においてＤＨＴ−刺激ＰＳＡ発現へのＣＭＫの効果を実証する、抗ＰＤＡ抗体での免疫ブロット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月6日(2005.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006505617000001.app
【国際調査報告】
2006505617.tif 000007
2006505617.tif 000008