(57)【要約】本発明は概して、最近同定された痛みの感覚に関与するＧタンパク質共役受容体（図６Ｂ）のファミリーの１つであるヒトＭｒｇＤポリペプチドに関する。痛みの感覚を変化させる際にアゴニストおよびアンタゴニストを利用する方法とともに、ヒトＭｒｇＤのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する特定の方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５のヒトＭｒｇＤポリペプチドと少なくとも８０％配列同一性を有する単離ＭｒｇＤポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３５の単離ヒトＭｒｇＤポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞は、原核細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記宿主細胞は、エシェリヒア・コリである、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞は、真核細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞は、ハムスター胚腎（ＨＥＫ）細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
異種アミノ酸配列に融合された請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項９】
前記異種アミノ酸配列は、エピトープタグ配列である、請求項８に記載のキメラ分子。
【請求項１０】
前記異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常ドメイン配列である、請求項８に記載のキメラ分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の単離ＭｒｇＤポリペプチド［のｃ末端内のエピトープ］に特異的に結合する単離抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、モノクローナル抗体、抗体断片およびヒト化抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１１に記載の単離抗体。
【請求項１３】
前記抗体は、アゴニスト抗体および中和抗体からなる群から選択される抗体である、請求項１１に記載の単離抗体。
【請求項１４】
薬学的に許容可能なキャリアと混合した、請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容可能なキャリアと混合した、請求項１１に記載の抗ＭｒｇＤ抗体を含む組成物。
【請求項１６】
容器、
薬学的に許容可能なキャリアと混合した請求項１の単離ＭｒｇＤポリペプチド、および
哺乳類において痛みを治療する組成物の使用説明書
を含む製品。
【請求項１７】
哺乳類から得られる組織試料において、請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドの発現を確認する方法であって、前記試料を抗ＭｒｇＤ抗体と接触させること、および前記試料への前記抗体の結合を決定することを含む方法。
【請求項１８】
前記組織試料は、後根神経節から得られる試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳類において痛みの感知を変化させるために使用することができる化合物を同定する方法であって、
ａ）試験化合物を請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドと接触させる工程と、
ｂ）前記ＭｒｇＤポリペプチドと複合体を形成する試験化合物を同定する工程と、
ｃ）痛みを患う動物モデルにおいて、ｂ）で同定された試験化合物の効果を測定する工程と、
ｄ）哺乳類において痛みの感知を変化させるために有用であるとして、動物モデルにおいて痛みの感知を変化させる化合物を同定する工程と
を含む方法。
【請求項２０】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、天然型ヒトＭｒｇＤポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物は、痛みの感知を増大させる化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物は、痛みの感知を減少させる化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
工程ａ）において前記試験化合物の少なくとも１つ、または前記ＭｒｇＤポリペプチドが、固体支持体に結合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体は、マイクロタイタープレートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程ａ）において前記ＭｒｇＤポリペプチドは、細胞膜に存在するポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、イムノアドヘシンに存在するポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
工程ａ）において、前記ＭｒｇＤポリペプチドは、ＭｒｇＤポリペプチドを発現する細胞から調製される細胞膜の画分に存在するポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験化合物は、ペプチド、ペプチド擬似体、抗体、有機低分子および無機低分子からなる群から選択される化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記試験化合物は、ペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程ａ）において前記試験化合物は、固定化された抗体に特異的に結合することにより固体支持体に固着される化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、標識されたポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記試験化合物は、標識された化合物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記試験化合物は、細胞抽出物中に含有された化合物である、請求項１９に記載の方法
。
【請求項３５】
前記細胞抽出物は、ＭｒｇＤポリペプチドを発現することが知られている細胞から調製された抽出物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞抽出物は、後根神経節細胞から調製された抽出物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＭｒｇＤポリペプチドを結合する化合物を同定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドまたはそれらの断片を、試験化合物およびＲＦアミドペプチドリガンドと、結合が起こり得る条件下で接触させる工程と、
ｂ）前記試験化合物の、前記ＭｒｇＤポリペプチドへの前記ＲＦアミドペプチドの結合を妨害する能力を決定する工程と
を含む方法。
【請求項３８】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、天然型ヒトＭｒｇＤポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＭｒｇＤポリペプチドを、前記試験化合物と接触させる前に、前記ＲＦアミドペプチドと接触させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
ＭｒｇＤアゴニストを同定する方法であって、
ａ）セカンドメッセンジャー応答を生じることが可能な宿主細胞において、請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドを発現させる工程と、
ｂ）前記宿主細胞を、１つまたはそれ以上の試験化合物と接触させる工程と、
ｃ）前記宿主細胞においてセカンドメッセンジャー応答を測定する工程と、
ｄ）哺乳類において感覚認識を変化させる際に有用であるアゴニストとして、前記測定したセカンドメッセンジャー応答を増大させる化合物を同定する工程と
を含む方法。
【請求項４２】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、配列番号３５のヒトＭｒｇＤポリペプチドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞は、真核細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記宿主細胞は、ハムスター胚腎（ＨＥＫ）細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＨＥＫ細胞は、Ｇα１５を発現する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
セカンドメッセンジャー応答を測定することは、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞内カルシウム濃度の変化は、ＦＵＲＡ−２カルシウム指示色素を用いて測定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
セカンドメッセンジャー応答を測定することは、前記細胞の膜を通る電流の流れを測定することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記感覚認識は、痛みの感知である、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
ＭｒｇＤポリペプチドアンタゴニストを同定する方法であって、
ａ）セカンドメッセンジャー応答を生じることが可能な宿主細胞において、請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドを発現させる工程と、
ｂ）前記宿主細胞を、ＲＦアミドペプチドと接触させる工程と、
ｃ）前記宿主細胞を、１つまたはそれ以上の試験化合物と接触させる工程と、
ｄ）前記宿主細胞においてセカンドメッセンジャー応答を測定する工程と、
ｅ）ＭｒｇＤアンタゴニストとして、前記ＲＦアミドペプチドに対する前記測定したセカンドメッセンジャー応答を変化させる化合物を同定する工程と
を含む方法。
【請求項５１】
前記ＭｒｇＤポリペプチドは、配列番号３５のヒトＭｒｇＤポリペプチドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
抗ＭｒｇＤアゴニスト抗体を同定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のＭｒｇＤポリペプチドに特異的に結合する候補抗体を調製する工程と、
ｂ）セカンドメッセンジャー応答を生じることが可能であることが知られている宿主細胞において、ヒトＭｒｇＤ（配列番号３５）を発現させる工程と、
ｃ）前記宿主細胞を、候補抗体と接触させる工程と、
ｄ）前記宿主細胞においてセカンドメッセンジャー応答を測定する工程と、
ｅ）アゴニスト抗体として、前記測定したセカンドメッセンジャー応答を増大させる抗体を同定する工程と
を含む方法。
【請求項５３】
工程ａ）において、前記候補抗体は、配列番号３５のヒトＭｒｇＤに特異的に結合する抗体である、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は包括的には、正常な動物では発現されるが、ニューロゲニン−１欠損動物では発現されない新規の遺伝子に関する。本発明は特に、後根神経節（dorsal root ganglion）中で発現される、Ｇタンパク質共役受容体の新規のファミリーおよび２つの膜貫通セグメントタンパク質の新規のファミリー、ならびに侵害受容感覚ニューロン中で特異的に発現される遺伝子に関するスクリーニング方法に関する。
【０００２】
［関連技術の説明］
急性および慢性の難治性の痛みの治療は、製薬産業における薬剤開発の主要な目的である。痛みの感知は、末梢的には皮膚に、かつ中枢的には脊髄に向けて突出する後根神経節（ＤＲＧ）中の一次感覚ニューロンにより媒介される。これらのニューロンは、痛みの感知に関与するシグナル伝達分子、例えば受容体、イオンチャネルおよび神経ペプチドを発現している。
その例の一つとして、いわゆるバニロイド受容体（Vanilloid Receptor）−１（ＶＲ−１）が挙げられ、これはカプサイシン（チリペッパー）ならびに熱および酸により活性化される。このような痛みのシグナル伝達分子は、感知経路の陽性または陰性モジュレーターとして作用することにより、間接的に痛みの感知に影響を及ぼし得る。このようなシグナル伝達分子と相互作用する薬剤、例えば受容体アゴニストまたはアンタゴニストなどの探索は、痛みの治療のための新規の療法の発見への重要なアプローチである。したがって痛みの感知性（「侵害受容」）感覚ニューロンによって伝達される新規の候補シグナル伝達分子は、新規の薬剤スクリーニングおよび薬剤発見の試みのための非常に望ましい標的である。本発明者等は、以前に、ニューロゲニン（Ｎｇｎ）と呼ばれる塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子の新規のファミリーを同定したが、これはＤＲＧにおける感覚ニューロンの発達に不可欠である。種々のＮｇｎは、感覚ニューロンの種々のサブセットの発達に必要とされる。特にＮｇｎ１は、すべてでないとしてもほとんどの侵害受容感覚ニューロンの発達に必要である。Ｎｇｎ１-/-突然変異マウスでは、ＤＲＧは存在し続けるものの、サイズが縮小し、侵害受容ニューロンの大多数がなくなっていることが、ｔｒｋＡおよびＶＲ−１のようなマーカーにより確認される（Ma et al. Genes & Develop, 13:1717−1728, （1999））。これらの結果により、野生型（正常）のＤＲＧ中で発現されるがＮｇｎ１-/-ＤＲＧ中では発現されない遺伝子を単離することができれば、分化中のまたは成熟侵害受容感覚ニューロン中で発現される、新規の薬剤標的分子の同定につながり得ることが示唆された。
【０００３】
痛みは、通常は組織損傷の天然型の影響であるが、治癒過程が開始すると、損傷に関連した痛みおよび圧痛が消散する。しかしながら、明白な損傷を伴わずに痛みが生じたり、初期傷害後に痛みが長引くために苦しんだりする患者もいる。さらに慢性または難治性の痛みは、ある種の疾病、例えば骨変性疾患、末期癌、ＡＩＤＳおよび反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）などに関連して起こり得る。このような患者は、依存性および耐容性のような問題があるために、オピオイド化合物、例えばモルヒネ等の現在利用可能な痛み軽減（抗侵害受容）薬による軽減処置を受けることができない可能性がある。したがって、痛み、特に慢性の痛みを治療するための新規治療薬の需要が高くなっている。
【０００４】
［発明の概要］
本発明者等は、ディファレンシャルハイブリダイゼーションを用いてポジティブ選択を行い、野生型ＤＲＧで発現されるが、Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧでは発現されない遺伝子のスクリーニングを実行した。このスクリーニングによって、ＶＲ−１などの侵害受容ニューロ
ンの機能に関与する既知のシグナル伝達分子及び侵害受容感覚ニューロン中で高い特異性で発現される新規のシグナル伝達分子の両方を同定した。したがって本発明は、正常マウス中で発現されるが、Ｎｇｎ１ヌル突然変異マウスにおいては発現されない新規の遺伝子の発見を含む。スクリーニングにより単離された新規遺伝子のファミリーは、Ｇタンパク質共役受容体の特徴である７つの膜貫通セグメントを有する受容体タンパク質ｍｒｇをコードしている。その後の染色実験（図２、図２Ａ〜図２Ｄ参照）によって、ｍｒｇ遺伝子がＤＲＧ中の侵害受容ニューロンのサブセット中で特異的に発現することを確証した。このスクリーニングで単離される別の新規の遺伝子ファミリーｄｒｇ−１２は、２つの膜貫通セグメントを有するタンパク質をコードする。
【０００５】
特に、本発明は、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｒｇＤポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む単離核酸分子、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＭｒｇＤポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離核酸分子、配列番号４９のＭｒｇＤポリペプチドをコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離核酸分子、および配列番号４９のＭｒｇＤポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズする単離核酸分子からなる群から選択される単離核酸分子を包含する。
【０００６】
本発明はまた、１つまたはそれ以上の発現調節エレメントに、制御要素の発現を調節することができるように連結された上述の核酸分子を含み、、さらに単離された上記核酸分子を含むベクターを含む。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含有するように形質転換した宿主細胞、およびタンパク質が発現される条件下で本発明の核酸分子で形質転換した宿主細胞を培養する工程を含むタンパク質の産生方法を含む。宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、ハムスター胚腎臓（ＨＥＫ）細胞または酵母細胞）を用いることができる。
【０００７】
本発明はさらに、上述の単離核酸分子によりコードされる単離ポリペプチド、および配列番号３５のヒトＭｒｇＤポリペプチドからなる群から選択される単離ＭｒｇＤポリペプチドを提供する。
【０００８】
ＭｒｇＤポリペプチドは、エピトープタグ配列または免疫グロブリン定常領域配列のような異種アミノ酸配列に融合させることができる。
【０００９】
本発明はさらに、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、抗体断片ならびにヒト化抗体を含む、本発明のポリペプチドに特異的に結合する単離抗体を提供する。
【００１０】
別の態様では、本発明は、薬学的に許容可能なキャリアと混合したＭｒｇＤポリペプチドまたは抗ＭｒｇＤ抗体を含む組成物を提供する。また、組成物、容器、および哺乳類において感知を変化させるための組成物の使用に関する指示書を含む製品も提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、哺乳類において痛みの感知の変化に使用することができる化合物を同定する方法を提供する。試験化合物を本発明のＭｒｇＤポリペプチドの少なくとも一部において接触させる。ＭｒｇＤポリペプチドまたは試験化合物は、マイクロタイタープレートのような固体支持体に結合させてもよい。さらに、好ましくは、試験化合物またはＭｒｇＤポリペプチドのいずれかを標識する。
【００１２】
ＭｒｇＤポリペプチドとの複合体の形成が可能な試験化合物が同定される。これらの化合物の影響を、痛みを患う動物モデルで測定し、動物モデルにおいて痛みの感知を変化させる化合物は、哺乳類において痛みの感知を変化させる際に有用なものとして同定される
。化合物は、痛みの感知を増大、または減少させ得る。
【００１３】
一実施形態では、ＭｒｇＤポリペプチドは、天然型ヒトＭｒｇＤポリペプチド、好ましくは配列番号３５のＭｒｇＤポリペプチドである。
【００１４】
別の実施形態では、ＭｒｇＤポリペプチドは、ＭｒｇＤポリペプチドを発現する細胞から調製される細胞膜または細胞膜の分画中に存在し得る。さらなる実施形態では、ＭｒｇＤポリペプチドは、イムノアドヘシン(immunoadhesin)中に存在する。
【００１５】
試験化合物は、好ましくは、ペプチド、ペプチド擬似体、抗体、有機低分子および無機低分子からなる群から選択される。好ましい実施形態では、試験化合物はペプチドである。ペプチドは、固定化抗体への特異的結合により固体支持体に固着させることができる。さらに、試験化合物は、細胞抽出物、特に、後根神経節細胞のようなＭｒｇＤポリペプチドを発現することが知られている細胞から調製される細胞抽出物中に含有させることができる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ＭｒｇＤポリペプチドまたは断片を、試験化合物、およびＲＦアミドペプチドのようなリガンドと結合が起こり得る条件下で接触させることにより、ＭｒｇＤポリペプチドを結合する化合物を同定する方法を提供する。好ましくは、ＭｒｇＤポリペプチドは、試験化合物と接触させる前に、ＲＦアミドペプチドと接触させる。試験化合物の、ＭｒｇＤポリペプチドへのＲＦアミドペプチドの結合を妨げる能力が決定される。
【００１７】
一実施形態では、ＭｒｇＤポリペプチドは、天然型ヒトＭｒｇＤポリペプチド、好ましくは配列番号３５のＭｒｇＤポリペプチドである。
【００１８】
本発明はまた、哺乳類において感知を変化させるために使用することができるＭｒｇＤアゴニストを同定する方法を提供する。例えば、アゴニストは、痛みの感知を増大または減少させるために使用され得る。ＭｒｇＤポリペプチドを、セカンドメッセンジャー応答が可能な宿主細胞中で発現させる。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくはハムスター胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、より好ましくはＧα１５を発現するＨＥＫ細胞である。
【００１９】
宿主細胞を、１つまたはそれ以上の試験化合物と接触させ、セカンドメッセンジャー応答を測定する。測定したセカンドメッセンジャー応答を増大させる化合物は、哺乳類において感知を変化させるために使用することができるアゴニストとして同定される。一実施形態として、細胞内カルシウム濃度の変化を測定することにより、セカンドメッセンジャー応答を測定する。これには、例えば、ＦＵＲＡ−２指示薬色素を使用することができる。別の実施形態では、セカンドメッセンジャー応答は、細胞膜を通る電流の流れを測定することにより測定される。
【００２０】
別の態様では、本発明は、哺乳類において感覚認識障害を治療する際に有用であるＭｒｇＤポリペプチドアンタゴニストを同定する方法を提供する。特に、上記方法は、痛みの感知を変化させるアンタゴニストを同定するために有用である。
【００２１】
一実施形態では、ＭｒｇＤポリペプチド、好ましくは配列番号３５のＭｒｇＤポリペプチドを、セカンドメッセンジャー応答を示すことができる宿主細胞中で発現させる。次に、宿主細胞を、ＲＦアミドペプチド、および１つまたはそれ以上の試験化合物と接触させる。例えば上述の方法によりセカンドメッセンジャー応答を測定し、ＲＦアミドペプチドに対するセカンドメッセンジャー応答を変化させる化合物が、痛みのような感覚認識障害
を治療する際に有用であるアゴニストとして同定される。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、哺乳類において痛みの感知を変化させるために使用することができる抗ＭｒｇＤアゴニスト抗体を同定する方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、痛みを患う哺乳類において痛みを治療するために使用することができる抗ＭｒｇＤアゴニスト抗体を同定するために使用される。
【００２３】
好ましい実施形態では、ＭｒｇＤポリペプチド、より好ましくは配列番号３５のＭｒｇＤポリペプチドに特異的に結合する候補抗体が調製される。ＭｒｇＤポリペプチド、好ましくは配列番号３５のＭｒｇＤポリペプチドを、セカンドメッセンジャー応答を示すことが知られている宿主細胞中で発現させる。次に、宿主細胞を、候補抗体と接触させて、セカンドメッセンジャー応答を測定する。セカンドメッセンジャー応答を増大させる抗体は、哺乳類において痛みを治療するために使用することができるアゴニスト抗体として同定される。
【００２４】
本発明はまた、ＭｒｇＤアゴニストの哺乳類への投与により、哺乳類において痛みを治療する方法を提供する。一実施形態では、アゴニストは、配列番号３５のヒトＭｒｇＤポリペプチドのアゴニストである。
【００２５】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
Ｉ．概要
上記のように、本発明は、正常マウスのＤＲＧ中で発現されるが、Ｎｇｎ１ヌル突然変異マウスにおいては発現されない新規の遺伝子の発見に基づいている。スクリーニングにより単離される新規の遺伝子ファミリーの１つは、Ｇタンパク質共役受容体の特徴である７つの膜貫通セグメントを有する受容体タンパク質をコードする。この新規の７つの膜貫通受容体は癌遺伝子ｍａｓに最も密接に関連しており、したがって暫定的にｍａｓ関連遺伝子−３（ｍｒｇ３）と呼ばれた。ｍｒｇ３は、現在はＭｒｇＡ１として既知であり、この用語は本明細書中では互換的に用いられる。Ｍａｓ関連遺伝子（Ｍｒｇ）ファミリーのほぼ５０の遺伝子が同定されており、その多くは非ペプチド作動性侵害受容器中で特異的に発現する。Ｇタンパク質共役受容体の大ファミリーは、他の種類の感覚ニューロン、例えば嗅覚および味覚ニューロン中でも発現される。
【００２６】
ＧＰＣＲのマウスＭｒｇファミリーは、３つの主要サブファミリー（ＭｒｇＡ、ＢおよびＣ）を含有し、その各々が１０より多い高重複遺伝子、ならびにＭａｓ１、Ｒｔａ、ＭｒｇＤおよびＭｒｇＥなどの単一コピー遺伝子から成る（図６Ｂ）。ＭｒｇＡサブファミリーは、マウスにおいては少なくとも２０の遺伝子：ＭｒｇＡ１（配列番号２）；ＭｒｇＡ２（配列番号４）；ＭｒｇＡ３（配列番号６）；ＭｒｇＡ４（配列番号１１）；ＭｒｇＡ５（配列番号２１）；ＭｒｇＡ６（配列番号２３）；ＭｒｇＡ７（配列番号２５）；ＭｒｇＡ８（配列番号２７）；ＭｒｇＡ９（配列番号５３）；ＭｒｇＡ１０（配列番号５５）；ＭｒｇＡ１１（配列番号５７）；ＭｒｇＡ１２（配列番号５９）；ＭｒｇＡ１３（配列番号６１）；ＭｒｇＡ１４（配列番号６３）；ＭｒｇＡ１５（配列番号６５）；ＭｒｇＡ１６（配列番号６７）；ＭｒｇＡ１７（配列番号６９）；ＭｒｇＡ１８（配列番号７１）；ＭｒｇＡ１９（配列番号７３）；およびＭｒｇＡ２０（配列番号７５）から成る。ＭｒｇＡサブファミリーに最も密接に関連する４つのヒト配列：ＭｒｇＸ１（配列番号１６）；ＭｒｇＸ２（配列番号１８）；ＭｒｇＸ３（配列番号３１）；およびＭｒｇＸ４（配列番号３３）も同定されている。
【００２７】
ＭｒｇＢサブファミリーは、マウスにおいては少なくとも１２の遺伝子：ＭｒｇＢ１（配列番号３９）；ＭｒｇＢ２（配列番号４１）；ＭｒｇＢ３（配列番号４３）；ＭｒｇＢ４（配列番号４５）；ＭｒｇＢ５（配列番号４７）；ＭｒｇＢ６（配列番号７７）；Ｍｒ
ｇＢ７（配列番号７９）；ＭｒｇＢ８（配列番号８１）；ＭｒｇＢ９（配列番号８３）；ＭｒｇＢ１０（配列番号８５）；ＭｒｇＢ１１（配列番号８７）；およびＭｒｇＢ１２（配列番号８９）から成る。
【００２８】
ＭｒｇＣサブファミリーの１０の遺伝子：ＭｒｇＣ１（配列番号９１）；ＭｒｇＣ２（配列番号９３）；ＭｒｇＣ３（配列番号９５）；ＭｒｇＣ４（配列番号９７）；ＭｒｇＣ５（配列番号９９）；ＭｒｇＣ６（配列番号１０１）；ＭｒｇＣ７（配列番号１０３）；ＭｒｇＣ８（配列番号１０５）；ＭｒｇＣ９（配列番号１０７）；およびＭｒｇＣ１０（配列番号１０９）がマウスにおいて同定されている。
【００２９】
ＭｒｇＤサブファミリーの一つの遺伝子、ｍＭｒｇＤ（配列番号４９）がマウスにおいて同定されており、そのオーソログ遺伝子、ｈＭｒｇＤ（配列番号３５）がヒトにおいて同定されている。同様に、ＭｒｇＥサブファミリーの一つの遺伝子、マウスにおいてｍＭｒｇＥ（配列番号５１）、ならびにヒトにおいてｈＭｒｇＥ（配列番号３７）が同定されている。
【００３０】
他のＧＰＣＲサブファミリーの場合と同様に、ＭｒｇＣサブファミリーのすべての遺伝子を含む多数のＭｒｇが偽遺伝子であると思われる。いくつかのＭｒｇ遺伝子近くのＬ１レトロトランスポゾンエレメントの存在は、偽遺伝子拡張がＬ１媒介性形質導入により促進された可能性を高める（Goodier et al. Hum Mol Genet 9:653−7（2000））。
【００３１】
全体としてほぼ４０の無傷コード配列を含むマウスＭｒｇＡおよびＢサブファミリーとは対照的に、４つのみの無傷ヒトＭｒｇＸ配列が同定された。残りの１０のヒトＭｒｇ配列は、偽遺伝子であると思われる。他の関連受容体、例えばｈＭｒｇＤおよびｈＭａｓ１を含めると、このファミリーにおける無傷ヒトコード配列の総数は９になる（図６Ｂ）。
【００３２】
本発明がされる前までは、第一侵害受容感覚ニューロンは異なる化学的刺激を特異的に識別せず、むしろＶＲ１のような広範に反応する受容体によって種々の有害な刺激を検出すると考えられていた（Tominaga et al. Neuron 21:531−43（1998））。Ｍｒｇの発現は、侵害受容感覚ニューロン間の分子多様化が予期しない程度に起こることを明示する。感覚ニューロンの約１３〜１４％がＭｒｇＡ１を発現し、一方１７〜１８％がＭｒｇＤを発現し、そしてこれら２つの集団間の重複は１５％だけである。ＭｒｇＡ１+集団は、ＭｒｇＡ２〜８を発現するニューロンのほとんどまたはすべてを含むと思われる。しかしながら、これらの後者のＭｒｇＡ遺伝子は、同一ニューロン中ですべて発現されるというわけではない。したがって、８つのＭｒｇＡ遺伝子およびＭｒｇＤは、少なくとも６つの異なるニューロンサブ集団を規定し、残りの１６ＭｒｇＡ遺伝子はさらに多くの多様性を付加する。
【００３３】
ＭｒｇＡおよびＤがともにＩＢ４+、ＶＲ１-感覚ニューロン中で発現されるということは顕著である。ＩＢ４+ニューロンは、ラミナＩＩｉに向けて突出することが知られており（Snider and McMahon Neuron 20:629−32（1998））、これは、神経損傷を伴うような慢性の痛みに関与する（Malmberg et al. Science 278:279−83（1997））。ＶＲ１は、熱刺激、およびカプサイシンのような化学的刺激の両方により活性化される（Caterina et al. Nature 389:816−824（1997）; Tominaga et al. Neuron 21:531−43（1998））が、ＶＲ１+ニューロンは有害機械的刺激の感知には必要でない（Caterina et al. Science
288:306−13（2000））。これは、ＭｒｇＡ+ニューロンの機能のうちの１つによって、神経障害性または炎症性の痛みを伴う有害な機械的刺激が感知されていることを示す。
【００３４】
侵害受容感覚ニューロン中で特異的に発現される推定Ｇタンパク質共役受容体のファミリーの存在は、これらの分子が痛みの感知の主要媒介物質またはモジュレーターであるこ
とを示唆する。したがって、慢性難治性の痛みの管理のために、これらの受容体の活性を調節する内因性および合成の両方のリガンドを同定することは非常に興味深い。実際、異種細胞発現系におけるリガンドスクリーニングは、これらの受容体が、その原型リガンドが軟体動物心臓興奮性ペプチドＦＭＲＦ−アミドであるＲＦ−アミド神経ペプチドと相互作用し得ることを示す（Price and Greenberg Science 197:670−671（1977））。哺乳動物ＲＦ−アミドペプチドとしては、ＮＰＦＦおよびＮＰＡＦが挙げられるが、これらは、後脊髄のＩおよびＩＩ層のニューロン中で発現される共通のプロペプチド前駆物質に由来する（Vilim et al. Mol Pharmacol 55:804−11（1999））。Ｍｒｇ発現感覚ニューロンのシナプス末端部におけるこの神経ペプチドＦＦ前駆物質の発現、機能性アッセイにおいてこれらの受容体を活性化し得るＮＰＡＦおよびＮＰＦＦの能力、ならびに背側角における第一感覚求心神経上にこのようなペプチドのための結合部位が存在すること（Gouarderes et al. Synapse 35:45−52（2000））は、これらの神経ペプチドがｉｎ ｖｉｖｏでのＭｒｇ受容体に関するリガンドであることを示す。ＮＰＦＦ／ＮＰＡＦペプチドの鞘内注射は、例えば神経障害性の痛み（Xu et al. Peptides 20:1071−7（1999））を含めたいくつかの慢性の痛みを患うモデルにおいて長期残存性抗侵害受容作用を生じる（Panula et al Brain Res. 848:191−6（1999））で論評されている）ので、これらのデータはさらに、Ｍｒｇが痛みの調節に直接関与することを示す。
【００３５】
マウス侵害受容器により発現されるＭｒｇ間の多様性の範囲は、異なる末梢標的、例えば腸、皮膚、毛包、血管、骨および筋肉を神経支配する感覚ニューロンにより、異なるＭｒｇが発現されるという可能性を示唆する。これらの標的は、異なるＭｒｇごとに異なるリガンドを分泌し得る。別の可能性として、異なるＭｒｇを発現するニューロンは末梢侵害受容器感受性の共通のモジュレーターに応答するが異なる親和性を有することも考えられる。このようなメカニズムにより、例えば、このようなモジュレーターの濃度が徐々にベースラインに戻るにつれて、創傷治癒中の侵害受容器の集団における正常刺激感応性は徐々に回復する。このような段階的応答は、異なるサブセットの侵害受容器の活性化閾値と結びつけられ得るか、あるいは活性化閾値を決定さえし得る。このスクリーニングで単離される別の新規の遺伝子ファミリーｄｒｇ−１２は、２つの推定膜貫通セグメントを有するタンパク質をコードする。ｄｒｇ−１２は、マウス（配列番号１４）、およびヒト（配列番号２９）において同定された。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ｍｒｇ遺伝子と同様に、この遺伝子がＤＲＧ感覚ニューロンのサブセット中でも特異的に発現されることが示される。これは膜タンパク質であるので、これらのニューロンによるシグナル伝達にも関与し得る。このタンパク質と他の既知のタンパク質との間に明白な相同性は認められないが、侵害受容感覚ニューロン中で特異的に発現される２つのプリン受容体（Ｐ2Ｘ2およびＰ2Ｘ3）は同様の二回膜貫通トポロジーを有するということは注目に値する。したがって、ファミリーｄｒｇ−１２は侵害受容感覚形質導入またはその調節に関与する受容体またはイオンチャネルもコードする可能性がある。
【００３６】
本発明のタンパク質は、例えば慢性難治性の痛みおよび神経障害性の痛みの治療において、それらの発現または活性を調整する治療薬として、および作用物質の標的として役立つ可能性がある。例えば、痛みのシグナルの受容、伝達および伝送のような侵害受容性に関連した生物学的プロセスを調節する作用物質を同定することができる。
【００３７】
ＩＩ．特定の実施形態
Ａ．定義
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同一の意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons （New York, NY 1994）；Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press（Cold Springs Harbor NY 1989）を参照されたい。本発明の目
的のために、以下の用語は下記のように定義される。
【００３８】
本明細書中で用いる場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、ひとつには、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。本用語は、天然のアレル変異体、ならびに上記で特定的に列挙したアミノ酸配列とわずかに異なるアミノ酸配列を有するタンパク質も指す。アレル変異体は、上記で引用したものとわずかに異なるアミノ酸配列を保有するが、依然としてそのタンパク質に対して同一または類似の生物学的機能を有する。
【００３９】
本願明細書において、アミノ酸配列に関する同一性または相同性は、最大パーセンテージの相同性を達成するために、必要な場合は配列をアラインし、ギャップを導入した後に、既知のペプチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージによって定義される。この際、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない（関連パラメーターに関してはセクションＢを参照）。融合タンパク質、あるいはペプチド配列におけるＮ末端、Ｃ末端または内部配列の伸長、欠失または挿入は、相同性に影響を及ぼさないと解釈するものとする。
【００４０】
タンパク質は、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Thompson et al. Nucleic Acids Res 22:4673−80（1994））を用いてアラインすることができ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性検索用に作成されたプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ（Karlin, et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87:2264−2268（1990）およびAltschul, S.F. J. Mol. Evol. 36:290−300（1993）、これらの記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）により用いられるアルゴリズムを用いてＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール；Basic Local Alignment Search Tool）分析することにより決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムにより用いられるアプローチは、まずクエリー配列およびデータベース配列間の類似セグメントを考察し、次に同定されたすべての対の統計学的有意性を評価し、最後に有意性のある予め選択した閾値を満たす対のみを集約する。配列データベースの類似性検索における基本的問題を考察するためには、Altschul et al.（Nature Genetics 6:119−129（1994））（この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。ヒストグラム、記述、アラインメント、予測（すなわち、データベース配列に対する対となる塩基を報告するための統計学的有意閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルターの検索パラメーターは、デフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより用いられるデフォルト評価マトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Henikoff, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915−10919（1992）、この記載内容全体が、参照により本明細書中に援用される）。ｂｌａｓｔｎに関しては、評価マトリックスは、Ｍ（すなわちマッチング残基対に関する報酬スコア）対Ｎ（すなわちミスマッチング残基に関するペナルティースコア）の比率により設定され、この場合、ＭおよびＮに関するデフォルト値はそれぞれ５および−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは以下のように調整された：Ｑ＝１０（gap creation penalty）；Ｒ＝１０（gap extension penalty）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ったすべてのｗｉｎｋ番目の位置でワードヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップ化アラインメントが生成される幅内でウインドウ幅を設定）。等価Ｂｌａｓｔｐパラメーター環境は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間の最適適合比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（gap creation penalty）およびＬＥＮ＝３（gap extension pena
lty）を使用し、タンパク質比較における等価設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００４１】
「変異体」は、天然型配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾および／または置換によって、例えばｍｒｇ３（配列番号２）に関して図１に示したような、本発明の天然型配列ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有しつつも、生物学的に活性なポリペプチドである。変異体としては、少なくとも５個のアミノ酸の、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸の、さらに好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸の、さらにより好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸を有し、対応する天然型配列ポリペプチドの生物学的活性を保有するペプチド断片が挙げられる。変異体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が天然型配列のＮまたはＣ末端に、または天然型配列内に付加されたポリペプチドも含む。さらに変異体としては、多数のアミノ酸残基が欠失し、１つまたはそれ以上の異なるアミノ酸残基により任意に置換されたポリペプチドも含む。
【００４２】
本明細書中で用いる場合、「保存的変異体」とは、タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化が生じたものを指す。置換、挿入または欠失は、変化した配列が、タンパク質に関連する生物学的機能を妨げるかまたは崩壊させる場合、タンパク質に悪影響を及ぼすという。例えばタンパク質の全体的電荷、構造または疎水性／親水性特性は、生物学的活性に悪影響を及ぼさずに変化し得る。したがって、アミノ酸配列は、例えばペプチドをより疎水性または親水性にするなどして、タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼさないように変化し得る。
【００４３】
本明細書中で用いる場合、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９のアミノ酸配列に関連した「タンパク質ファミリー」としては、マウスおよびヒトに加えて、ほかの生物体の後根神経節から単離されたタンパク質が挙げられる。開示されたマウスおよびヒトタンパク質のようなこれらのタンパク質に関連したタンパク質のファミリーの他のタンパク質を同定および単離するために用いられる方法は以下で説明する。
【００４４】
別記しない限り、「Ｍｒｇ」という用語は、本明細書中で用いる場合、任意の１つまたはそれ以上の哺乳動物ｍａｓ関連遺伝子（Ｍｒｇ）受容体（すなわち、ＭｒｇＡ１〜８、ＭｒｇＢ、ＭｒｇＣ、ＭｒｇＤ、ＭｒｇＥ、ＭｒｇＸ１〜４、およびすでに既知であるか、または将来同定されるｍａｓ関連遺伝子（Ｍｒｇ）ファミリーの任意のその他の受容体）、例えばマウスまたはヒトなどの哺乳動物の天然型配列Ｍｒｇ受容体、Ｍｒｇ受容体変異体；Ｍｒｇ受容体細胞外ドメイン；ならびにキメラＭｒｇ受容体（これらの各々は本明細書中で定義されている）を指す。本用語は特に、ＭｒｇＡファミリーの天然型配列マウスＭｒｇ受容体、例えば配列番号２、４、６、１２、２１、２３、２５、２７、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３および７５；ＭｒｇＢファミリーの天然型配列マウスＭｒｇ受容体、例えば配列番号３９、４１、４３、４５、４７、７７、７９、８１、８３、８５、８７および８９；ＭｒｇＣファミリーの天然型配列マウスＭｒｇ受容体、例えば配列番号９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９；ＭｒｇＤファミリーの天然型配列マウスＭｒｇ受容体、例えば配列番号４９；ＭｒｇＥファミリーの天然型配列マウスＭｒｇ受容体、例えば配列番号５１；それらのヒト相同体、並びに配列番号１６、１８、３１および３３の「ＭｒｇＸ」と呼ばれる天然型配列ヒトＭｒｇ受容体を含む。
【００４５】
「ｍａｓ関連遺伝子」、「ｍｒｇ」および「Ｍｒｇ」という用語は、本明細書中では互
換的に用いられる。さらに用語ｍｒｇ３、ＭｒｇＡ１およびｍＭｒｇＡ１、用語ｍｒｇ４、ＭｒｇＡ２およびｍＭｒｇＡ２、用語ｍｒｇ５、ＭｒｇＡ３およびｍＭｒｇＡ３、用語ｍｒｇ８、ＭｒｇＡ４およびｍＭｒｇＡ４、用語ｍｒｇ９、ＭｒｇＡ５およびｍＭｒｇＡ５、用語ｍｒｇ１０、ＭｒｇＡ６およびｍＭｒｇＡ６、用語ｍｒｇ１１、ＭｒｇＡ７およびｍＭｒｇＡ７、用語ｍｒｇ１２、ＭｒｇＡ８およびｍＭｒｇＡ８、用語ヒト１、ＭｒｇＸ１およびｈＭｒｇＸ１、用語ヒト２、ＭｒｇＸ２およびｈＭｒｇＸ２、用語ヒト４、ＭｒｇＸ３およびｈＭｒｇＸ３ならびに用語ヒト５、ＭｒｇＸ４およびｈＭｒｇＸ４は、それぞれ互換的に用いられる。これらの用語はすべて、本明細書中に記載された天然型配列Ｍｒｇタンパク質、ならびに機能的誘導体、例えばそのアミノ酸配列変異体を指す。
【００４６】
「天然型」または「天然型配列」のＭｒｇ受容体またはｄｒｇ−１２受容体は、その調製方式に関係なく、任意の哺乳動物種（ヒトを含む）における天然Ｍｒｇ受容体または天然ｄｒｇ−１２受容体のアミノ酸配列を有する。したがって、天然型Ｍｒｇ受容体または天然型配列Ｍｒｇ受容体、もしくは天然型ｄｒｇ−１２受容体または天然型配列ｄｒｇ−１２受容体は、天然から単離されるか、組換えＤＮＡ技術の技術により生成されるか、化学的に合成されるか、もしくはこれらの方法、または同様の方法の任意の組合せにより生成することができる。天然型Ｍｒｇ受容体および天然型ｄｒｇ−１２受容体には、特に、天然に生じたアレル変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチド、当該技術分野で既知である、もしくは以下に発見されたこれらの受容体のアイソフォームまたはスプライシングされた変異体のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００４７】
「細胞外ドメイン」（ＥＣＤ）は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを本質的に含有しない、すなわちそれらのドメインが１％未満、好ましくはそれらのドメインが０．５〜０％、さらに好ましくはそれらのドメインが０．１〜０％であるＭｒｇ受容体またはｄｒｇ−１２受容体の形態をいう。通常は、ＥＣＤは、例えばｍｒｇ３に関して図１Ａに示されているような（Ｅ１、Ｅ２等）、天然型Ｍｒｇタンパク質またはｄｒｇ−１２タンパク質の１つまたはそれ以上のＥＣＤのアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、よりいっそう好ましくは９５％から少なくとも９９％までのアミノ酸配列同一性を、そして最終的には１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、したがって下記のようなポリペプチド変異体を含む。
【００４８】
第一予測細胞外ドメイン（ＥＣＤ１）は、およそＭｒｇＡ１に関しては１〜２１、ＭｒｇＡ２に関しては１〜２１、ＭｒｇＡ３に関しては１〜２１、ＭｒｇＡ４に関しては１〜２１、ＭｒｇＡ５に関しては１〜３、ＭｒｇＡ６に関しては１〜１７、ＭｒｇＡ７に関しては１〜２１、およびＭｒｇＡ８に関しては１〜２１のアミノ酸からなる。第二予測細胞外ドメイン（ＥＣＤ２）は、およそＭｒｇＡ１に関しては７０〜８７、ＭｒｇＡ２に関しては７０〜８８、ＭｒｇＡ３に関しては７０〜８８、ＭｒｇＡ４に関しては７０〜８８、ＭｒｇＡ５に関しては５２〜７０、ＭｒｇＡ６に関しては６６〜８４、ＭｒｇＡ７に関しては７０〜８８、ＭｒｇＡ８に関しては７０〜８８のアミノ酸からなる。第三予測細胞外ドメイン（ＥＣＤ３）は、およそＭｒｇＡ１に関しては１４９〜１６０、ＭｒｇＡ２に関しては１５０〜１６１、ＭｒｇＡ３に関しては１５０〜１６１、ＭｒｇＡ４に関しては１５０〜１６１、ＭｒｇＡ５に関しては１３２〜１４４、ＭｒｇＡ６に関しては１４６〜１５７、ＭｒｇＡ７に関しては１５０〜１６１、およびＭｒｇＡ８に関しては１５０〜１６１のアミノ酸からなる。第四予測細胞外ドメイン（ＥＣＤ４）は、およそＭｒｇＡ１に関しては２２２〜２２４４、ＭｒｇＡ２に関しては２２３〜２４５、ＭｒｇＡ３に関しては２２３〜２４２、ＭｒｇＡ４に関しては２２３〜２４５、ＭｒｇＡ５に関しては２０５〜２２５、ＭｒｇＡ６に関しては２１９〜２４１、ＭｒｇＡ７に関しては２２３〜２４５、およびＭｒｇＡ８に関しては２２３〜２４５のアミノ酸からなる。
【００４９】
「ｄｒｇ−１２」という用語は、本明細書中で用いる場合、目下既知のまたは将来同定される任意の１つまたはそれ以上の哺乳動物（マウスやヒト等の天然型配列哺乳動物を含む）のｄｒｇ−１２受容体、ｄｒｇ−１２受容体変異体；ｄｒｇ−１２受容体細胞外ドメイン；ならびにキメラｄｒｇ−１２受容体を指す（これらは各々、本明細書中で定義されている）。本用語は特に、天然型配列マウスｄｒｇ−１２受容体、例えば配列番号１４、ならびに任意のヒト相同体、例えばヒトｄｒｇ−１２受容体（配列番号２９）を含む。
【００５０】
本明細書中で用いる場合、「核酸」は、上記のようなタンパク質またはペプチドをコードするか、このようなペプチドをコードする核酸配列と相補的であるか、このような核酸とハイブリダイズし、かつ適当にストリンジェントな条件下でそれと安定的に結合を維持できるか、オープンリーディングフレーム全体で少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８５％、９０％または９５％のヌクレオチド配列同一性を示すか、あるいはペプチド配列との少なくとも約５０％、６０％、７０％、または７５％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％または９５％またはそれより高い同一性を有するポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡとして定義される。特に意図されるのは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子、ならびに代替的な主鎖を基礎とする核酸であり、天然由来のものか、合成されたものかにかかわらず、代替的塩基を含むものを含む。しかしながら、さらに、このようなハイブリダイズ用または相補的核酸は、新規なものであり、かつ、従来の核酸と比較して非自明であるものとして定義され、これをコードするか、適当にストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズするか、または本発明のタンパク質をコードする核酸と相補的である配列を含む。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、核酸、ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドという用語は互換可能であり、ホスホジエステル結合で構成される場合、または修飾結合、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルトン結合で構成される場合、およびこのような結合の組合せで構成される場合に関係なく、任意の核酸を指す。
【００５２】
核酸、ポリヌクレオチドおよびヌクレオチドという用語は特に、５つの生物学的生成塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基を含む核酸も含む。例えば本発明のポリヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５´−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含み得る。
【００５３】
さらに本発明に用いられるポリヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含み得る。
【００５４】
「ストリンジェントな条件」とは、（１）洗浄のために低イオン強度および高温の条件、例えば０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳ、５０℃を用いるか、あるいは（２）ハイブリダイゼーション中に変性剤、例えばホルムアミドを、例えば５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド（０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液を含む）を、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと共に４２℃で用いる条件である。別の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランの４２℃での使用、さらに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃での洗浄という条件である。明白かつ検出可能なハイブリダイゼーションのシグナルを適切に得るために、当業者はストリンジェントな条件を容易に決定し、かつ変更し得る。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、核酸分子は、他のポリペプチドをコードする夾雑核酸分子から当該核酸分子が実質的に分離される場合に、「単離される」といわれる。
【００５６】
本明細書中で用いる場合、コード核酸分子の断片とは、完全長タンパク質をコードする配列の一部分を指す。断片のサイズは、意図された用途により決定される。例えば断片がタンパク質の活性部分をコードするために選択される場合、断片はタンパク質の機能性領域（単数または複数）をコードするために十分な大きさである必要がある。例えば、予測抗原領域に対応するペプチドをコードする断片が調製され得る（図３および図４参照）。断片が核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる場合には、断片長は、プロービング／プライミング中に相対的に少数の擬陽性を得るように選択される（セクションＨの考察参照）。
【００５７】
高度関連遺伝子相同体とは、ＭｒｇＡ１（配列番号２）のような本発明の天然型配列ポリヌクレオチドのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、よりいっそう好ましくは、１％の増分で少なくとも約８５％から少なくとも約９９％までのアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
「哺乳動物」という用語は、哺乳動物種に属する個体として定義され、その例としては、ヒト、家畜および農場動物、ならびに動物園、スポーツまたはペット用の動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコまたはウシが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは本明細書中の哺乳動物はヒトである。
【００５９】
「機能的誘導体」としては、アミノ酸配列変異体、ならびに対応する天然型ポリペプチドの定性的生物学的活性を保有する限り天然型ポリペプチドの共有結合誘導体を含む。
【００６０】
「Ｍｒｇリガンド」とは、Ｍｒｇ受容体と特異的に結合し、好ましくはＭｒｇ受容体を活性化する分子を意味する。Ｍｒｇリガンドの例としては、ＭｒｇＡ受容体、例えばＭｒｇＡ１に対するＲＦ−アミド神経ペプチド、例えばＦＭＲＦ、ＦＬＲＦ、ＮＰＡＦ、ＮＰＦＦおよびＲＦＲＰ−１が挙げられるが、これらに限定されない。分子のＭｒｇとの結合能は、例えばＭｒｇを発現する細胞から調製される膜分画とに対する推定リガンドの結合
能により決定され得る。
【００６１】
同様に、ｄｒｇ−１２リガンドは、ｄｒｇ−１２受容体と特異的に結合し、好ましくはｄｒｇ−１２受容体を活性化する分子である。
【００６２】
「キメラ」分子は、異種ポリペプチドに融合または結合された本発明の完全長ポリペプチド、変異体、あるいは本発明のポリペプチドの１つまたはそれ以上のドメインを含むポリペプチドである。キメラ分子は一般に、天然型配列ポリペプチドと共通の少なくとも１つの生物学的特性を有する。キメラ分子の例として、精製目的のためにエピトープタグ付けされた分子が挙げられる。他に、キメラ分子として、イムノアドヘシンが挙げられる。
【００６３】
「エピトープタグ付け」という用語は、本明細書中で用いる場合、「タグポリペプチド」に融合されたＭｒｇまたはｄｒｇ−１２を含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、抗体を生成することができるエピトープを提供するために十分な残基を有するが、それはＭｒｇまたはｄｒｇ−１２の生物学的活性と相互作用しないよう十分に短い。タグポリペプチドは、好ましくは、それに対する抗体が実質的に他のエピトープと交差反応しないよう、かなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に少なくとも６つのアミノ酸残基を、通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約９〜３０残基）を有する。好ましいのはポリヒスチジン配列であり、これはニッケルを結合して、記載されたようなＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによるタグ付けタンパク質の単離を可能にする（例えばLindsay et al. Neuron 17:571−574（1996）参照）。
【００６４】
「アゴニスト」は、本発明のポリペプチドの１つまたはそれ以上の生物学的特性を刺激する分子または化合物である。これらの例としては、有機低分子および無機低分子、ペプチド、ペプチド擬似体およびアゴニスト抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
「アンタゴニスト」という用語は最も広範な意味で用いられ、そしてアゴニストの結合を阻止することにより、本発明の受容体により媒介される生物学的活性を、部分的にまたは全体的に、遮断、抑制または中和する任意の分子または化合物を指す。アンタゴニストとしては、有機低分子および無機低分子、ペプチド、ペプチド擬似体および中和抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本発明のタンパク質は、好ましくは単離形態である。本明細書中で用いる場合、タンパク質は、物理的、機械的または化学的方法により、普通はタンパク質と会合している細胞構成分を当該タンパク質から除去した場合に、単離されたという。単離タンパク質を得るための標準精製方法を、当業者は容易に用いることができる。場合によっては、本発明の単離タンパク質は多数の細胞構成分から単離または精製されているものの、依然として細胞膜断片または膜構成成分と会合している。
【００６７】
したがって「単離Ｍｒｇ」および「単離ｄｒｇ−１２」は、それぞれ、タンパク質供給源から精製されるか、または組換え方法または合成方法により調製され、精製されたＭｒｇまたはｄｒｇ−１２ポリペプチドを意味する。精製Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２は、他のポリペプチドまたはペプチドを実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、ここでは、約５％未満、好ましくは約２％未満、さらに好ましくは約１％未満、さらにより好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満の他の供給源のタンパク質の混入を意味する。
【００６８】
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量を基礎にして少なくとも約９０重量％のタンパク質を、好ましくは少なくとも約９５重量％、さらに好ましくは少なくとも約９０重量％、さらにより好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物
を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の総重量を基礎にして少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
【００６９】
「生物学的特性」とは、生物学的活性または免疫学的活性であって、この場合、生物学的活性は、ポリペプチド中のエピトープに対する抗体の産生を誘導する機能以外の、天然型配列または本明細書中の変異体ポリペプチド分子により引き起こされる生物学的機能（抑制性または刺激性のいずれか）を指し、抗体の産生を誘導する機能の特性は免疫学的活性と呼ばれる。生物学的特性としては特に、本明細書中の受容体分子の天然リガンドを結合する能力、好ましくは特異的結合、さらに好ましくは高親和性を伴う特異的結合をする機能が挙げられる。
【００７０】
「抗体」（Ａｂ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すが、一方、免疫グロブリンは抗体、および抗原特異性を欠くその他の抗体様分子の両方を含む。抗原特異性を欠くその他の抗体様分子のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで産生され、そして骨髄腫により高レベルで産生される。
【００７１】
「天然型抗体」および「天然型免疫グロブリン」は、通常は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から成るヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に連結される。ジスルフィド結合の連結の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。各重鎖および軽鎖は、規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶH）を、それに続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶL）を、その他方の端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと直線状に並び、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと直線状に並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン間に界面を形成すると考えられる。
【００７２】
「抗体」という用語は、本明細書中では最も広範な意味で用いられ、特にヒト、非ヒト（例えばマウス）およびヒト化モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二特異性抗体）およびそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を含む。
【００７３】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部分、一般的にはそれらの抗原結合性ドメインまたは可変ドメインを含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）2およびＦｖ断片、最小組み換え二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から生成される多特異性抗体が挙げられる。
【００７４】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、一集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得ると考え得る天然突然変異体をのぞいて同一である抗体の集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一の抗原部位に特異的である。さらにモノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の任意の方法により調製され得る。例えば本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495（1975）に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、あるいは組換えＤＮＡ法により作製され得る（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えばClackson et al., Nature 352:624−628（1991）およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581−597（1991）に記載された技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。
【００７５】
モノクローナル抗体は、本明細書中では特に、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種に由来する抗体中の、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対
応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含むが、一方、鎖（単数または複数）の残り部分は、別の種に由来する抗体中の、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である。キメラ抗体の断片も含まれるが、但しそれらは所望の生物学的活性を示す（米国特許第４，８１６，５６７号およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851−6855（1984））。
【００７６】
「ヒト化」型非ヒト（例えばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む抗体である。ヒト化抗体とは一般に、その超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および容量を有する非ヒト種、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類からの超可変領域残基により置き換えられたヒト免疫グロブリンである。ヒト免疫グロブリンの枠組み構造領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられ得る。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体中にまたはドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインを実質的にすべて含むが、この場合、すべてのまたは実質的にすべての超可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応するか、あるいはすべてのまたは実質的にすべてのＦＲはヒト免疫グロブリン配列を有するものである。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も任意に含む。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature 321:522−525（1986）；Reichmann et al., Nature 332:323−329（1988）およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593−596（1992）を参照されたい。
【００７７】
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上にあり、（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体のための結合部位を指すために用いる。
【００７８】
「アゴニスト抗体」とは、本発明の受容体のためのリガンドであり、したがって天然型配列Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２の１つまたはそれ以上のエフェクター機能を活性化かつ／または刺激し得る抗体を意味する。
【００７９】
「中和抗体」とは、本発明のポリペプチドのエフェクター機能を遮断するかまたは有意に低減し得る、本明細書中で定義されるような抗体分子を意味する。例えば中和抗体は、既知のリガンドによりＭｒｇまたはｄｒｇ−１２活性化を抑制または低減し得る。
【００８０】
「Ｍｒｇイムノアドヘシン」という用語は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２分子（天然または変異体）および免疫グロブリン配列の少なくとも一部分を含むキメラ分子を指す。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうである必要はない。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の特性の多くを保有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジおよび定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るため、当該結合特異性は、全ヒト構成成分を用いて達成され得る。このようなイムノアドヘシンは患者に対する免疫原性が最小限であり、長期または反復使用に対しても安全である。イムノアドヘシン構造の２つの機能部位が異なる特異性を有する場合、イムノアドヘシンは、二重特異性抗体との類似性により、「二特異性イムノアドヘシン」と呼ばれる。
【００８１】
本明細書中で用いる場合、「治療」とは、患者が表す疾患、障害または生理学的状態に対応して行う臨床的診療行為である。治療の目的としては、症状の軽減または予防、疾患、障害または状態の進行または悪化の遅延または停止、ならびに疾患、障害または状態の寛解が挙げられる。「治療」とは、治療上の処置および予防的または防止的手段の両方を指す。治療を必要とするものとしては、疾患または障害または望ましくない生理学的状態の影響を受けたもの、及び疾患または障害または望ましくない生理学的状態が防止される
べきものが含まれる。特に治療には、既存の状態または障害に起因する痛みを含めた痛みの軽減、あるいは痛みが発生するであろうと考えられる状況において痛みの防止を含み得る。
【００８２】
本発明の方法において、「制御」という用語およびその文法的に変形した用語は、例えば痛みの存在、または発生のような望ましくない事象の防止、部分または完全抑制、軽減、遅延または減速を指すために用いられる。
【００８３】
「有効量」という用語は、有益なまたは望ましい臨床結果をもたらすために十分な量を指す。アゴニストまたはアンタゴニストの有効量は、疾患、障害または望ましくない生理学的状態を治療するために有効である量である。
【００８４】
「痛み」とは、接触、圧力、熱および寒冷の感知とは区別される、神経組織により認識される感覚の経験である。痛みの感覚の範囲、ならびに個体による痛みの感知は変動するため、痛みの明確な定義はほぼ不可能である。本発明の状況では、「痛み」は、考え得る最も広範な意味で用いられ、その例としては組織損傷および組織炎症に関連した痛みのような侵害受容の痛み、有害刺激に関連した痛み、急性の痛み、慢性の痛みおよび神経障害性の痛みが含まれる。
【００８５】
「急性の痛み」はしばしば、特定の原因および目的に伴って一時的であり、一般に持続性心理学的反応を生じない。急性の痛みは、柔組織損傷中に、感染および炎症を伴って起こり得る。それは、その原因を処置することにより、かつ痛みを治療するための鎮痛薬および感染を治療するための抗生物質を用いた併用方法により、調節および除去され得る。
【００８６】
「慢性の痛み」とは、急性の痛みとは明瞭に異なり、より複雑である。慢性の痛みは時間制限を有さず、しばしば明らかな原因を有さず、明白な生物学的効果を示さないことがある。慢性の痛みは、患者および医療提供者の両者を困惑させる多数の心理学的問題を誘発して、無力感、絶望感といった感情をもたらし得る。慢性の痛みの最も一般的な原因としては、下背部痛、頭痛、再発性顔面痛、癌に関連した痛みおよび関節炎痛が挙げられる。
【００８７】
痛みは、それが神経学的機能不全を伴う場合、「神経障害性」と呼ばれる。「神経障害性の痛み」には、複雑で変動性の病因がある。それは典型的には、痛覚過敏（痛みの閾値低下および痛みの感知増強）により、ならびに異痛（無害な機械的または熱刺激からの痛み）により特徴付けられる。神経障害性の痛みは、通常は慢性であり、「通常の痛み」（障害受容性の痛み）のための同一の治療薬剤は効果を示さない傾向があり、したがって治療は非常に困難である。神経障害性の痛みは、外傷、糖尿病、帯状ヘルペスまたは後期癌のような疾患、あるいは化学的損傷（例えば擬似ヌクレオチド抗ＨＩＶ薬を含めた作用物質の副作用のような）により神経が損害を受けた場合、いつでも発症し得る。それは、切断術（例えば乳房切除）後にも発症し得る。神経障害性の痛みの例としては、単一神経根障害、三叉神経痛、ヘルペス後神経痛、複合局所性の痛み症候群および種々の末梢神経障害が挙げられる。これは、正常術後痛、外傷関連の痛みおよび関節炎の慢性の痛みを含む「通常の痛み」または「侵害受容の痛み」と対照を成す。
【００８８】
「末梢神経障害」は、末梢神経に影響を及ぼす神経変性障害であって、しばしば運動機能障害、感覚機能障害、感覚運動機能障害または自律神経性機能不全のうちの１つまたはそれらの組合せとして表徴される。末梢神経障害は、例えば糖尿病（糖尿病性神経障害）、アルコール症および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のような疾患または障害、癌における細胞増殖抑制薬療法のような治療法、あるいは遺伝的疾病素質に起因し得る末梢感覚ニューロンの変性により特徴付けられる。遺伝的後天性末梢神経障害としては、例えば
クラッベ病、異染性白質ジストロフィーおよびシャルコー−マリー−トゥース（ＣＭＴ）病が挙げられる。末梢神経障害はしばしば痛みを伴う。
【００８９】
「薬学的に許容可能な」キャリア、例えば賦形剤または安定剤は、用いられる投与量および用いられる濃度でそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である。しばしば生理学的に許容可能なキャリアは、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液のような水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容可能なキャリアは、１つまたはそれ以上の以下の物質を含み得る：酸化防止剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、アミノ酸、炭水化物（例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン）、キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えばマンニトールまたはソルビトール）、塩生成対イオン（例えばナトリウム）、ならびに非イオン性界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニックス（商標））。
【００９０】
「ペプチド擬似体」は、本発明の受容体との相互作用において、ペプチドの代わりとして作用する分子である（Morgan et al., Ann. Reports Med. Chem. 24:243−252（1989））。ペプチド擬似体は本明細書中で用いる場合、ペプチドの構造的および機能的特徴を有する合成体を含む。ペプチド擬似体は、アミノ酸および／またはペプチド結合を含むことも含まないこともある。「ペプチド擬似体」という用語は、ペプトイドおよびオリゴペプトイドも含み得るが、これらは、Ｎ置換アミノ酸のペプチドまたはオリゴマーである（Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367−9371（1972））。さらにペプチド擬似体として含まれるのはペプチドライブラリーであり、これは規定アミノ酸長を有するよう設計されたペプチドの集合であり、それに対応するアミノ酸のすべての考え得る配列を意味する。
【００９１】
Ａ．後根神経節の一次感覚ニューロン中で発現されるタンパク質
本発明は、単離ｍｒｇタンパク質および単離ｄｒｇ−１２タンパク質、それらのタンパク質のアレル変異体およびそれらのタンパク質の保存的アミノ酸置換体を提供する。本発明のいくつかのＭｒｇタンパク質のポリペプチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２１、２３、２５、２７、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９で提供される。本発明のいくつかのｄｒｇ−１２タンパク質のポリペプチド配列は、配列番号１４、１９および２９で提供される。
【００９２】
本発明のタンパク質はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９で記述される配列の挿入変異体、欠失変異体または保存的アミノ酸置換変異体を含む。
【００９３】
通常、変異体、アレル変異体、保存的置換変異体および他の種における対応する相同体を含むタンパク質ファミリーに属するタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９で記述され
る配列と少なくとも約５０％または約６０〜７５％のアミノ酸配列同一性を、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の上記の配列との配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９４】
本発明のタンパク質としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７および１０９で開示されたアミノ酸配列を有する分子、タンパク質の少なくとも約３、４、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上のアミノ酸残基の連続配列を有するそれらの断片、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、開示したコード配列のＮまたはＣ末端またはその内部に挿入されているアミノ酸配列変異体、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が別の残基により置換されている開示した配列のアミノ酸配列変異体、あるいは上記のようなそれらの断片が挙げられる。このような断片は、ペプチドまたはポリペプチドとも呼ばれ、抗原領域、既知のタンパク質ドメインに対応するアミノ酸配列の領域として同定されたタンパク質の機能性領域、ならびに顕著な親水性の領域を含み得る。それらの領域は、市販のタンパク質配列分析ソフトウェア、例えばＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）（Oxford Molecular）を用いることにより、すべて容易に同定することが可能である。
【００９５】
意図される変異体としてはさらに、例えば相同組換え、部位特異的またはＰＣＲ突然変異誘発により、予定の突然変異を起こした変異体、他の動物種、例えばウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヒトおよび非ヒト霊長類種（これらに限定されない）の対応するタンパク質やタンパク質ファミリーのアレル変異体またはその他の天然の変異体、ならびに天然に存在するアミノ酸以外の部分（例えば酵素または放射性同位元素のような検出可能部分）においてタンパク質が置換、化学的、酵素的またはその他の適切な手段により共有的に修飾された誘導体が挙げられる。
【００９６】
タンパク質ドメイン（例えばリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば７つの膜貫通セグメントおよびサイトゾルループ、または２つの膜貫通ドメインおよびサイトゾルループを含む）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン）、ならびに活性部位はすべて、本発明のタンパク質またはポリペプチド中に見出され得る。このようなドメインは、キメラタンパク質作製のために、および本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのために有用である。
【００９７】
本発明の天然型配列タンパク質の、あるいは本発明で同定された種々のドメインの変異は、例えば当該技術分野で既知の任意の技術を用いてなされ得る。変異は、例えばタンパク質の１つまたはそれ以上のドメイン中において、他の任意のアミノ酸により少なくとも１つのアミノ酸を置換することにより達成することができる。天然型配列タンパク質と比較した場合の本発明のタンパク質のアミノ酸配列の変化は、タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のコドンの置換、欠失または挿入により産生することができる。相同の既知のタンパク質分子の配列と、変化したＭｒｇまたはｄｒｇ−１２ポリペプチドの配列との比較により、どのアミノ酸残基が所望の生物学的活性に影響を及ぼすことなく、挿入、置換または欠失され得るかについての指針を提供することができる。特に、相同性が高い領域で起こるアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることは、有益であるだろう。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造的特性および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばセリンによるロイシンの置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果であり得る。挿入または欠失は、任意に約１〜５アミノ酸の範囲であり得る。許容可能な変異は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に起こし、その結果生じた変異体の活性を、完全長配列または成熟天然型配列により示される活性に対して
試験することにより決定することができる。
【００９８】
ポリペプチド断片は、本発明の方法においても有用である。このような断片は、例えば完全長天然型タンパク質と比較した場合に、Ｎ末端またはＣ末端が切断されているか、あるいは内部残基を欠くこともある。ある種の断片は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２ポリペプチドの所望の生物学的活性に不可欠でないアミノ酸残基を欠く。
【００９９】
Ｍｒｇ断片またはｄｒｇ−１２断片は、多数ある従来技術のいずれかにより調製することができる。所望のペプチド断片は、化学的に合成されるか、または、特定のアミノ酸残基により規定される部位でタンパク質を切断する既知の酵素を用いてタンパク質を処理するなどの酵素消化により生成することができる。あるいは、タンパク質をコードするＤＮＡは、適切な制限酵素を用いて消化され、所望の断片が単離され得る。さらに別の適切な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し、増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５´および３´プライマーとして用いられる。好ましくはＭｒｇまたはｄｒｇ−１２ポリペプチド断片は、天然型Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２ポリペプチドとそれぞれ少なくとも１つの生物学的活性および／または免疫学的活性を共有する。
【０１００】
それぞれ天然型配列に対応した必要な生物学的特性を有するアミノ酸配列変異体を作製する場合、アミノ酸の疎水親水指数が検討され得る。例えば、ある種のアミノ酸は、生物学的活性が有意に変化することなく、同様の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換し得ることが既知である。したがって、＋４．５の疎水親水指数を有するイソロイシンは一般に、バリン（＋４．２）またはロイシン（＋３．８）に置換することができ、ポリペプチドの生物学的活性に有意の影響を及ぼすことはないと予測される。同様に、通常は、リシン（−３．９）はアルギニン（−４．５）に置換することができ、基礎的なポリペプチドの生物学的特性における任意の有意の変化はないと予測される。アミノ酸置換の選択に関するその他の考察としては、側鎖置換基の類似性、例えば種々のアミノ酸のサイズ、求電子性、電荷が挙げられる。概して、アラニン、グリシンおよびセリン；アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンは互換可能性であり、生物学的特性における任意の有意の変化はないと予測される。このような置換は、一般に保存的アミノ酸置換と呼ばれ、本発明のポリペプチド内での好ましい種類の置換である。
【０１０１】
非保存的置換は、あるクラスのアミノ酸が、別のクラスのアミノ酸によって必然的に交換されることである。このような置換残基は、保存的置換部位にも、さらに好ましくは残りの（非保存）部位にも導入され得る。
【０１０２】
変異は、部位特異的突然変異誘発、アラニン走査突然変異誘発、およびＰＣＲ突然変異誘発などの当該技術分野で既知の方法を用いて起こすことができる。Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２変異体ＤＮＡを産生するために、部位特異的突然変異誘発（Carter et al., Nucl.
Acids Res., 13:4331（1986）; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487（1987））、カセット突然変異誘発（Wells et al., Gene, 34:315（1985））、制限選択突然変異誘発（Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415（1986））またはその他の既知の技術をクローン化ＤＮＡに対して用いることができる。
【０１０３】
走査アミノ酸分析は、生物学的活性に有意の影響を及ぼすことなく置換できる１つまたはそれ以上のアミノ酸を同定するために用いられ得る。好ましい走査アミノ酸のうちの１つは、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリンおよびシステインが挙げられる。アラニンは、最も一般的なアミノ酸である
ことのほかに、それがβ炭素の向こうに側鎖を排除し、変異体の主鎖立体配座を変更することはないと考えられるため好ましい（Cunningham and Wells, Science, 244:1081−1085（1989））。さらにアラニンはしばしば、内側または外側の位置の両方に見出される（Creighton, The Proteins, （W.H. Freeman & Co., N.Y.）; Chothia, J. Mol. Biol., 150:1（1976））。アラニン置換が十分な量の変異を生じない場合、等比体積アミノ酸を用いることができる。
【０１０４】
下記のように、タンパク質ファミリーに属するタンパク質が：１）タンパク質の少なくとも１つの活性を調節する作用物質を同定するために、２）タンパク質に関する結合パートナーを同定するために、３）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するための抗原として、４）治療上の標的として、５）痛みの感覚ニューロンの特定集団に対する診断マーカーとして、ならびに６）構造に基づくリガンド同定のための標的として用いられ得る。
【０１０５】
Ｂ．核酸分子
本発明はさらに、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７または１０９を有するｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質、および本明細書中に記載された関連ポリペプチドをコードする核酸分子を、好ましくは単離形態で提供する。Ｍｒｇ受容体の８つの完全長変異体（ｍＭｒｇＡ１〜８）をコードするｃＤＮＡは、図６Ａ（配列番号１、３、５、１１、２０、２２、２４、２６）に提示される。
【０１０６】
好ましい分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６または２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６または１０８の相補体と上記で定義したストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして機能的ペプチドをコードするものである。好ましいハイブリダイズ分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、または２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６または１０８のオープンリーディングフレームまたはコード配列の相補鎖と上記条件下でハイブリダイズするものである。
【０１０７】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドの供給源によって限定されない。ポリヌクレオチドは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物由来のもの、任意の組換え体が供給源のもの、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは化学合成により合成されるものであってよい。ヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得るし、二本鎖、一本鎖または部分的二本鎖形態で存在し得る。
【０１０８】
本発明で有用な核酸としては、例えば、アンチセンスＤＮＡおよび／またはＲＮＡのようなオリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝子療法のためのＤＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡキメラ、種々の構造的形態のＤＮＡ（例えば一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、超らせんＤＮＡおよび／または三重らせんＤＮＡ）、Ｚ−ＤＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は、大量に核酸を調製するために典型的に用いられる任意の従来手段により、調製することができる。例えばＤＮＡおよびＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法により、市販の試薬および合成機を用いて化学的に合成することができる（例えばGait
, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England参照）。
【０１０９】
Ｍｒｇ核酸配列またはｄｒｇ−１２核酸配列によりコードされる任意のｍＲＮＡ転写体、特にｍＲＮＡ前駆物質の選択的スプライシングまたはプロセシングの産物であるｍＲＮＡ転写体を、本発明の方法に用いることができる。
【０１１０】
修飾ヌクレオシド結合を有する核酸も、本発明の方法に用いることができる。核酸を修飾することにより、例えば分解に対してより強い耐性を有し得る。このような核酸は、当該技術分野で既知の試薬および方法を用いて合成することができる。例えばホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、メトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレンスルフィド（−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2）、ジメチレン−スルホキシド（−ＣＨ2−ＳＯ−ＣＨ2）、ジメチレン−スルホン（−ＣＨ2−ＳＯ2−ＣＨ2）、２´−Ｏ−アルキルおよび２´−デオキシ−２´−フルオロホスホロチオエートヌクレオシド結合を含む核酸の合成方法が、当該技術分野でよく知られている。
【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態では、用いられるヌクレオチドはα−アノマーヌクレオチドである。α−アノマーヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的二重鎖ハイブリッドを形成するが、この場合、通常のβ単位とは逆に、その鎖は互いに平行に結合する（Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625−6641）。ヌクレオチドは、２´−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131−6148）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327−330）であり得る。
【０１１２】
本発明の核酸を精製するための手段は当該技術分野で既知であり、当業者は、特定の状況下で最適な精製方法を選択することができる。このような選択は、ひとつにはＤＮＡのサイズ、精製される量および所望の純度に基づいてすることができる。例えば核酸は、逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動により精製することができる。
【０１１３】
Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２コード配列の少なくとも１０ヌクレオチド（すなわちハイブリダイズ可能部分）を有する単離ポリヌクレオチドまたは精製ポリヌクレオチド、またはその相補体も、本発明の方法に用いることができる。他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＭｒｇコード配列のうちの、少なくとも２５個の（連続）ヌクレオチド、５０個のヌクレオチド、１００個のヌクレオチド、１５０個のヌクレオチドまたは２００個のヌクレオチド、または完全長Ｍｒｇコード配列を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに本発明は、上記のコード配列の相補体と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｍｒｇコード配列の少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０または２００個のヌクレオチド、あるいは完全長Ｍｒｇコード配列を含む。
【０１１４】
Ｍｒｇタンパク質の突然変異体、Ｍｒｇのペプチド断片、Ｍｒｇの切断形態およびＭｒｇ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列も、本発明の方法に有用であり得る。融合タンパク質をコードするヌクレオチドとしては、完全長Ｍｒｇ配列、切断形態のＭｒｇ、または非関連タンパク質またはペプチドに融合されたＭｒｇのペプチド断片をコードするヌクレオチド（例えばマーカーとして用いられ得る蛍光タンパク質または発光タンパク質のような例えばＩｇＦｃドメインに融合されたまたは酵素に融合されたドメイン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１５】
さらに、少なくとも一部において、誘導された進化の形態、例えば遺伝子シャッフリングまたは反復配列組み換えが起こった結果、生成されたポリヌクレオチド変異体を、本発明の方法に用いることができる。例えばこのような技術を用いることにより、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２と類似のタンパク質をコードするが、機能的または構造的特徴が変化した新規の配列を生成することができる。
【０１１６】
上記のポリヌクレオチド配列をコードするＭｒｇの高度関連遺伝子相同体も、本発明に有用であろう。高度関連相同体は、Ｍｒｇタンパク質と機能的活性を共有するタンパク質をコードし得る。
【０１１７】
本発明はさらに、コード核酸分子の断片を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプローブまたは特異的プライマーとして、あるいは本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために用いられる本発明のコード核酸分子の断片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、化学的技術により、例えばMatteucci等（J. Am. Chem. Soc.
103:3185−3191, 1981）のホスホトリエステル法により、または自動合成法を用いて容易に合成され得る。さらに、既知の方法により、例えば遺伝子の種々の調節セグメントを規定する一群のオリゴヌクレオチドの合成と、その後のオリゴヌクレオチドの連結反応とにより、完全修飾遺伝子を構築し、より大きいＤＮＡセグメントを容易に調製することができる。
【０１１８】
本発明のコード核酸分子はさらに、診断目的および試験目的のための検出可能標識を含むように修飾することができる。種々のこのような標識は当該技術分野で既知であり、本明細書中に記載された配列分子とともに容易に用いることができる。適切な標識としては、ビオチン、放射能標識ヌクレオチド等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸分子の標識された変異体を生成するために、当業者は任意のこのような標識を容易に用いることができる。
【０１１９】
本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列を用いて、以下でさらに詳細に説明するように、タンパク質を発現する組換え分子を生成することができる。さらに本発明の方法は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２コード配列および異種タンパク質の第二コード配列を含む融合ポリヌクレオチドも利用することができる。
【０１２０】
Ｃ．その他の関連核酸分子の単離
上記のように、ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質をコードする核酸分子の同定および特徴付けをすることにより、本明細書中に記載された配列のほかに、同一タンパク質ファミリーのその他のタンパク質をコードする核酸分子を、当業者は単離することができる。
【０１２１】
本質的に、適切な細胞から調製された発現ライブラリーをスクリーニングするための抗体プローブを生成するために、当業者は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７あるいは１０９のアミノ酸配列を容易に用いることができる。典型的には、精製タンパク質（下記のような）で免疫化したウサギのような哺乳動物からのポリクローナル抗血清、あるいはモノクローナル抗体を用いて、哺乳動物ｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリー（例えばラムダｇｔＩＩライブラリー）をプローブして、タンパク質ファミリーの他のタンパク質に関する適切なコード配列を得ることができる。クローン化ｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として発現され、それ自体の制御配列を用いて直接発現され、あるいはタンパク質の発現に用いられる特定の宿
主に適した制御配列を用いた構築により発現され得る。
【０１２２】
あるいは、本明細書中に記載されたコード配列の一部は、合成され、任意の哺乳動物生物体由来の細胞からの、特にＭｒｇタンパク質を発現すると考えられる細胞からのＭｒｇタンパク質ファミリーに属するタンパク質をコードするＤＮＡを検索するためのプローブとして用いられ得る。約１８〜２０ヌクレオチドを含有する（約６〜７アミノ酸長をコードする）オリゴマーが調製され、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ、ストリンジェントな条件下で、または過度のレベルの擬陽性を排除するために十分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。コード配列の５´または３´末端に対応するオリゴヌクレオチドを用いて、より長いヌクレオチド配列を生成し得る。
【０１２３】
完全長ｃＤＮＡを生成するためには、複数のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが必要とされ得る。さらに、完全５´末端コード領域を生成するためにＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）技術のような技術を用いることが必要であり得る。ＲＡＣＥは、不完全ｃＤＮＡの５´末端を増幅するためのＰＣＲを基にした戦略の一つである。ｃＤＮＡの５´末端を生成するために、アンカープライマーおよび３´プライマーを用いて５´−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ上でＰＣＲは実行される。次に、アンカープライマーおよびネステッド３´プライマーを用いて、二次ＰＣＲが実施される。いったん完全長ｃＤＮＡ配列が生成されれば、それはアミノ酸配列に翻訳されて、同定可能領域、例えば翻訳開始および終結部位が側面に位置する連続オープンリーディングフレーム、潜在的シグナル配列、そして最後は本明細書中に開示されたタンパク質配列との全体的構造的類似性に関して検査することができる。
【０１２４】
関連核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いることにより検索されて、コード核酸分子を選択的にクローニングすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示されたタンパク質コード配列を基礎にして設計された変性オリゴヌクレオチドプライマープールであり得る。反応のための鋳型はｃＤＮＡでもよく、該ｃＤＮＡは、例えばＭｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子のアレルを発現することが既知であるかまたは考えられる、ヒトまたは非ヒト細胞株または組織、例えばＤＲＧ組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）により得られる。このようなＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ変性／アニーリング／伸長サイクルは当該技術分野に既知であり、他のコード核酸分子を単離する用途に容易に適応させることができる。
【０１２５】
増幅配列がＭｒｇまたはｄｒｇ−１２コード配列の配列を表していることを確認するために、ＰＣＲ産物はサブクローニングされ、シーケンシングされ得る。次にＰＣＲ断片は、種々の方法により完全長ｃＤＮＡクローンを単離するために用いられ得る。例えば増幅断片は標識され、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。あるいは標識断片を用いて、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによりゲノムクローンを単離することができる。
【０１２６】
ＰＣＲ技術は、完全長ｃＤＮＡ配列を単離するために利用することができる。ＲＮＡは、適切な細胞または組織供給源、例えば後根神経節（ＤＲＧ）から単離され、ＲＴ反応は、一次鎖合成を誘導するために、増幅断片のほとんどの５´末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実行することができる。次に、その結果生じたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、末端トランスフェラーゼ反応によってグアニンを用いて「末端伸長」し、ハイブリッドをＲＮＡアーゼＨで消化し、次に、ポリＣプライマーを用いて、二次鎖合成を誘導することができる。これにより、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列の単離が可能になる。
【０１２７】
ｍｒｇおよびｄｒｇ−１２ファミリーの他のタンパク質をコードする核酸分子は、既存のゲノム情報またはその他の配列情報において、任意の利用可能なコンピュータを用いた方法、例えばＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Altschul, et al.（1997） Nucleic Acids Res. 25:3389−3402）、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ（Zhang, et al.（1998）, Nucleic Acids Res. 26:3986−3990）、３Ｄ−ＰＳＳＭ（Kelly et al. J. Mol. Biol. 299（2）:499−520（2000））、ならびにその他のコンピューターを用いた分析法（Shi et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 262（1）: 132−8（1999）およびMatsunami et al. Nature 404 （6778）:601−4（2000））（これらに限定されない）を用いて同定することができる。
【０１２８】
Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子の突然変異体またはアレル変異体のｃＤＮＡクローンも単離することができる。突然変異体または変異体タンパク質の考えられる供給源は、ＤＲＧ組織のようなＭｒｇまたはｄｒｇ−１２を発現することが既知の組織であって、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２の突然変異体または変異体の形態を保有すると推定される個体から得られる組織である。このような個体は、例えば痛みの刺激に対する応答性の増大または低減を実証することにより同定され得る。一実施形態では、突然変異体あるいは変異Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子はＰＣＲによって同定することができる。第一のｃＤＮＡ鎖は、変異体を保有すると推定される組織から単離されたｍＲＮＡとオリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、逆転写酵素により新規の鎖を伸長することにより合成することができる。次に、第二のｃＤＮＡ鎖は、正常遺伝子の５´末端と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成される。次に、これら２つのプライマーを用いて、生成物をＰＣＲにより増幅し、適切なベクター中でクローニングし、当業者に既知の方法によりＤＮＡ配列の分析を行う。突然変異ＭｒｇアレルのＤＮＡ配列を、正常ＭｒｇアレルのＤＮＡ配列と比較することにより、突然変異Ｍｒｇ遺伝子産物の機能のあらゆる損失または変化の原因となる突然変異（単数または複数）を突き止めることができる。
【０１２９】
あるいはゲノムライブラリーは、突然変異Ｍｒｇアレルを保有すると考えられるかまたはそれが既知である個体から得られるＤＮＡを用いて構築されるか、あるいは、突然変異Ｍｒｇアレルを発現することが既知のまたはそれが考えられる組織からのＲＮＡを用いて構築され得る。次に、非損傷Ｍｒｇ遺伝子またはその任意の適切な断片を標識し、このようなライブラリー中の対応する突然変異Ｍｒｇアレルを同定するためのプローブとして用いることができる。次に、突然変異Ｍｒｇ遺伝子配列を含有するクローンを精製し、当業者に既知の方法により配列の分析を行う。
【０１３０】
さらに、例えばこのような突然変異Ｍｒｇアレルを保有すると考えられる個体中で突然変異Ｍｒｇアレルを発現することが既知の組織、またはそれが考えられる組織から単離されたＲＮＡから合成されるｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築することができる。このようにして、推定突然変異組織により作製される遺伝子産物を、以下に記載するように、正常Ｍｒｇ遺伝子産物に対して産生される抗体を用いて、標準抗体スクリーニング法によって発現させ、スクリーニングすることができる。
【０１３１】
Ｄ．核酸分子を含む組換えＤＮＡ分子
本発明はさらに、コード配列を含有する組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書で使用する場合、ｒＤＮＡ分子は、ｉｎ ｓｉｔｕにて分子操作を施したＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列を発現制御配列および／またはベクター配列に、これが機能するように連結することができる。
【０１３２】
したがって、本発明はまた、任意にコード配列の発現を誘導する調節エレメントと結合している、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２コード配列および／またはそれらの相補体のいずれか１つを含むＤＮＡベクターを企図する。本発明の配列をコードするタンパク質ファミリーの一つが、これが機能するように結合したベクターおよび／または発現制御配列の選択は、当該技術分野で既知のように、タンパク質発現、形質転換されるべき宿主細胞などの所望の機能特性に直接依存する。本発明により意図されるベクターは、少なくともｒＤＮＡ分子に含まれる構造遺伝子の複製、または該遺伝子の宿主染色体への挿入、好ましくは該遺伝子の発現をも誘導することが可能である。
【０１３３】
クローニングベクターおよび発現ベクターの両方は、ベクターが１つまたはそれ以上の選択宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にして、かつ複製起点または自己複製配列を含むものである。かかる配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスに関して既知である。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は、酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【０１３４】
生物体の少なくとも１つの種類にて複製可能であることに加えて、ほとんどの発現ベクターは、発現用の別の生物体にトランスフェクトすることができる。例えば、ベクターは、大腸菌にて複製された後、同一ベクターが発現用の酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。
【０１３５】
ＤＮＡはまた、宿主ゲノムへの挿入により増幅され得る。例えば、バシラス属ゲノム配列に相補的なＤＮＡ配列を含むベクターを用いたバシラス属のトランスフェクションは、ゲノムによる相同組換えおよびベクター由来のＤＮＡの挿入をもたらす。このタイプの系の１つの欠点は、ＤＮＡを切除するために制限酵素消化が必要であるため、所定のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡの回収が、外因的に複製されたベクターのＤＮＡの回収よりも複雑であることである。
【０１３６】
発現の調節が可能なように連結される、タンパク質コード配列の発現を調節するために使用される発現制御エレメントは、当該技術分野で既知であり、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、および他の調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、誘導性プロモーターは、例えば、宿主細胞培地における栄養分に応答するように容易に制御される。
【０１３７】
一実施形態では、コード核酸分子を含有するベクターは、原核生物レプリコン、すなわち、組換えＤＮＡ分子で形質転換した原核宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）の染色体外で、組換えＤＮＡ分子の自己複製および維持を誘導する能力を有するＤＮＡ配列を含み得る。かかるレプリコンは、当該技術分野で既知である。さらに、原核生物レプリコンを含むベクターはまた、その発現が薬剤耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【０１３８】
原核生物レプリコンを含むベクターは、大腸菌のような細菌宿主細胞においてコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を誘導することが可能な原核生物またはバクテリオファージのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写の開始を可能にするＤＮＡ配列により形成される発現制御エレメントである。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的に、本発明のＤＮＡセグメントを挿入するために便利な制限部位を含むプラスミドベクターにて提供される。典型的なかかるベクタ
ープラスミドは、BioRad Laboratories （Richmond、CA）から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、ならびにPharmacia （Piscataway、NJ）から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。
【０１３９】
真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合する発現ベクターもまた、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を形成するために使用することができる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野で既知であり、幾つかの商業的供給元から入手可能である。典型的に、所望のＤＮＡセグメントを挿入するために便利な制限部位を含むかかるベクターが提供される。典型的に、かかるベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Pharmacia）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（International Biotechnologies, Inc.）、ｐＴＤＴ１（ATCC,＃31255）、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターのような真核生物ウイルスベクター、および同様の真核発現ベクターである。
【０１４０】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために使用される真核細胞発現ベクターは、真核細胞にて有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーをさらに含んでもよい。この遺伝子は、選択培地にて培養する形質転換宿主細胞の生存または成長に必要な因子をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するか、栄養要求株の欠損を補完するか、あるいは培地から与えられていない重要な栄養分を供給するタンパク質をコードする。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子をもたらす遺伝子である（Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327−341, 1982）。選択可能なマーカーは任意に、個々のプラスミド上に配置することができ、また同時トランスフェクションにより導入することができる。
【０１４１】
選択系の一例にて、哺乳動物細胞形質転換体は、ベクター（複数可）を取り込んだおかげで、形質転換体のみが生存することが可能であるような選択強制条件下に置かれる。選択強制条件は、培地における選択作用物質の濃度を徐々に増加することにより強くされ、それにより選択遺伝子および所望のタンパク質をコードするＤＮＡの両方の増幅を刺激する。増幅は、成長に不可欠なタンパク質の産生のために要求される遺伝子が、組換え細胞の続く世代の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。Ｍｒｇのようなさらに高いレベルの所望のタンパク質は、増幅ＤＮＡから合成される。増幅可能な遺伝子の例としては、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−ＩおよびＩＩ、アデノシンデアミナーゼ、およびオルニチンデカルボキシラーゼが挙げられる。
【０１４２】
したがって、一実施形態では、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216（1980）に記載されるように、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を調製および増殖する。次に、ＣＨＯ細胞をＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換し、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培地にて培養することにより、形質転換体を同定する。次に、形質転換細胞を、増大したレベルのメトトレキセートに曝露する。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の多重コピーの合成、同時に所定のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、ＭｒｇをコードするＤＮＡ）のような、発現ベクターを含む他のＤＮＡの多重コピーの合成が引き起こされる。
【０１４３】
あるいは、宿主細胞は、Ｍｒｇのような所定のタンパク質、野生型ＤＨＦＲタンパク質、およびアミノグリコシド３´−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換され得る。次に、形質転換体は、アミノグリコシド系抗生物質（例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８）のような、選択マーカーとしての選択作用物質を含む培地での増殖により選択
することができる。
【０１４４】
上述のように、発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体により認識され、かつ所定のタンパク質をコードする核酸の発現を調節することができるように連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５´）に位置する非翻訳配列（一般に約１００〜１０００ｂｐ内）であり、そのプロモーターが発現を調節することができるように連結している、Ｍｒｇ核酸配列のような特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する。そのプロモーターは、誘導性であっても、または構造性であってもよい。誘導性プロモーターは、温度変化のような、培養条件の一定の変化に応答して、それらの制御下にてＤＮＡから増大したレベルの転写を開始する。所定のタンパク質をコードするＤＮＡの発現を調節することができるようにプロモーターを連結する方法が、多種のプロモーターについて当該技術分野で既知である。天然型Ｍｒｇプロモーター配列またはｄｒｇ−１２プロモーター配列、および多くの異種プロモーターの両方が、ＭｒｇＤＮＡまたはｄｒｇ−１２ＤＮＡの増幅および／または発現を誘導するために使用され得る。しかしながら、異種プロモーターは、天然型プロモーターと比較して、一般に所望のタンパク質のより高い転写および高収率を達成するため、好ましく用いられる。
【０１４５】
原核生物宿主について使用するために適したプロモーターとしては、例えば、β−ラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系が挙げられる（Chang et al., Nature, 275:615 （1978）; Goeddel et al., Nature, 281:544 （1979））。しかしながら、他の細菌プロモーターが当該技術分野で既知であり、適切である。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、所定のタンパク質をコードするＤＮＡの発現を調節することができるように連結され得るシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むであろう。
【０１４６】
真核細胞において使用することが可能なプロモーター配列もまた既知である。実質的にすべての真核生物遺伝子が、転写開始部位の約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位の７０〜８０塩基の上流に見出される別の配列は、ＣＸＣＡＡＴ領域（ここで、Ｘは任意のヌクレオチドでよい）である。たいていの真核生物遺伝子の３´末端に、コード配列の３´末端へのポリＡ尾鎖の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列が存在する。これらの配列すべてが、真核生物発現ベクターに挿入され得る。
【０１４７】
酵母宿主について使用するために適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ用のプロモーター（Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 （1980））、または他の解糖系酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 （1968）; Holland, Biochemistry, 17:4900 （1978））が含まれる。
【０１４８】
酵母において使用するための誘導性プロモーターもまた既知であり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のためのプロモーター領域が含まれる。酵母発現に使用するための適切なベクターおよびプロモーターは、欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターとともに使用するのも好ましい。
【０１４９】
哺乳動物宿主細胞のベクターからのＭｒｇまたはｄｒｇ−１２転写はまた、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）など）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）か
ら得られるプロモーター、熱ショックプロモーターから得られるプロモーター、および天然型配列に一般に関連したプロモーターから得られるプロモーターにより制御され、かかるプロモーターは宿主細胞系に適合する性質を有する。
【０１５０】
転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより活性化され得る。エンハンサーは、その転写を増加するようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）が現在既知である。好ましくは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の末端に位置するＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の末端に位置するポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、タンパク質コード配列に対して５´位または３´位にあるベクターに結合され得るが、プロモーターからの部位５´に位置されることが好ましい。
【０１５１】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体由来の有核細胞）にて使用される発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含むであろう。これらの配列は多くの場合、真核生物のＤＮＡまたはｃＤＮＡ、もしくはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５´、および時折３´非翻訳領域に見出され、当該技術分野で既知である。
【０１５２】
上述の成分の１つまたはそれ以上を含むプラスミドベクターは、当該技術分野で既知の標準技術を用いて容易に構築される。
【０１５３】
構築したプラスミドにおいて正確な配列を確認するための分析に関して、プラスミドを、大腸菌にて複製し、精製して、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析して、および／または従来法により配列決定する。
【０１５４】
本発明のタンパク質の調製において特に有用なのは、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞での一過性の発現を提供する発現ベクターである。一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次に発現ベクターによりコードされる高レベルのポリペプチドを合成するように、宿主細胞にて効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を含む（上述のSambrook et al., pp. 16.17−16.22）。一過性の発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされるポリペプチドのポジティブ識別に便利であり、所望の生物学的特性または生理学的特性によるかかるポリペプチドのスクリーニングを可能にする。したがって、一過性の発現系は、本発明のポリペプチドの生物学的に活性な類似体および変異体の同定のために、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストの同定のために、本発明において特に有用である。
【０１５５】
組換え脊椎動物細胞培養におけるＭｒｇまたはｄｒｇ−１２の合成への応用に適切な他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、当該技術分野で既知であり、特定の状況に応じて容易に応用される。
【０１５６】
Ｅ．外因的に供給されるコード核酸分子を含む宿主細胞
本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子で形質転換した宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、原核生物系または真核生物系であり得るが、好ましくは真核生物系である。
【０１５７】
本発明のタンパク質の発現に有用な真核細胞は、細胞系が細胞培養法に適合性であり、発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現と適合性である限りは限定されない。かかる
宿主細胞は、複合体プロセシングおよびグルコシル化活性能力がある。原則として、脊椎動物培養由来であろうと無脊椎動物培養由来であろうと、任意のより高度な真核細胞培養が実行可能である。好ましい真核生物宿主細胞としては、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト細胞系に由来するもののような脊椎動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真核生物宿主細胞としては、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ １６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞（ＮＩＨ／３Ｔ３）、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ＨＥＫ２９３細胞、および同様の真核組織培養細胞系が挙げられる。
【０１５８】
培養における脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手法である。例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors （1973）を参照されたい。容易に培養され得る有用な哺乳動物宿主細胞系のさらなる例は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、 ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243−251 （1980））、サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカグリーンモンキー腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、およびマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）である。
【０１５９】
アフリカツメガエル卵母細胞には、標準的手法によりｍｒｇタンパク質またはｄｒｇ−１２タンパク質のいずれかを発現することが可能なＲＮＡを直接注入してもよい（Tominaga et al. Jpn J. Pharmacol. 83（1）:20−4 （2000）; Tominaga et al. Neuron 21（3）:531−43 （1998）、およびBisogno et al. Biochem, Biophys. Res. Commun. 262（1）275−84 （1999）を参照）。
【０１６０】
宿主細胞として使用することができる無脊椎細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株および変異体、ならびに相当する許容昆虫宿主細胞が当該技術分野で既知であり、本発明の方法において使用することができる。さらに、植物細胞培養物が既知であり、例えばＭｒｇまたはｄｒｇ−１２コードＤＮＡを含むように操作されたアグロバクテリウム・チュメファシエンスとのインキュベーションによりトランスフェクトされてもよい。
【０１６１】
本発明のタンパク質またはタンパク質断片をコードするｒＤＮＡ分子を発現させるために、任意の原核生物宿主を使用することができる。適切な原核生物としては、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌のような真正細菌、例えば腸内細菌科（Enterobacteriaceae）（例えば、エシェリヒア属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、ネズミチフス菌）、セラチア属（例えば、霊菌）、および赤痢菌属）、ならびに桿菌属（例えば枯草菌およびバシラス・リシェニフォルミス（B.licheniformis）（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ第２６６，７１０号に開示されるバシラス・リシェニフォルミス４１Ｐのような桿菌））、緑膿菌のようなシュードモナス属、およびストレプトマイセス属が挙げられる。好ましい原核細胞宿主は、大腸菌である。さらに、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌することが好ましい。
【０１６２】
原核生物のほかに、糸状菌または酵母のような真核微生物は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２コードベクター用の適切なクローニング宿主または発現宿主である。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を使用することができる。さらに、分
裂酵母属（Schizosaccharomyces pombe）（Beach et al. Nature, 290:140 （1981）、欧州特許第１３９，３８３号）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）宿主（米国特許第４，９４３，５２９号、上述のFleer et al.）（例えばＫ．ラクティス（lactis）（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４、Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 （1983））、Ｋ．フラギリス（fragilis）（ATCC １２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（bulgaricus）（ATCC １６，０４５）、Ｋ．ウィッケラミイ（wickeramii）（ATCC ２４，１７８）、Ｋ．ワルチイ（waltii）（ATCC ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（drosophilarum）（ATCC ３６，９０６、上述のVan den Berg et al.）、Ｋ．サーモトレランス（thermotolerans）、およびＫ．マルキシアヌス（marxianus））、ヤロウィア（yarrowia）（欧州特許第４０２，２２６号）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）（欧州特許第１８３，０７０号、Sreekrishna et al. J. Basic Microbiol., 28:265−278 （1988））、カンジダ属、トリコデルマ・レエシア（Trichoderma reesia）（欧州特許第２４４，２３４号）、アカパンカビ属Neurospora crassa（Case et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 76:5259−5263 （1979））、シュワンニオマイセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）（欧州特許第３９４，５３８号）のようなシュワンニオマイセス属、ならびに糸状菌（例えばアカパンカビ属、ペニシリン属、トリポクラジウム属（Tolypocladium）（国際公開第９１／００３５７号）、およびＡ．ニドゥランス（nidulans）（Ballance et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284−289 （1983）; Tilburn et al., Gene, 26:205−221 （1983）; Yelton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470−1474 （1989））およびＡ．ニガー（niger）（Kelly et al. EMBO J., 4:475−479 （1985））のようなアスペルギルス宿主）のような多数の他の属、種および株が一般に利用可能であり、本明発明にて有用である。
【０１６３】
本発明のｒＤＮＡ分子による適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用するベクター型および用いる宿主系によって決まる既知の方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーションおよび塩処理法が典型的に使用され、例えばCohen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, （1972）、およびManiatis et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY （1982）を参照されたい。ｒＤＮＡを含有するベクターでの脊椎動物細胞の形質転換に関して、エレクトロポレーション、陽イオン性脂質または塩処理法が典型的に用いられ、例えば、Graham et al. Virol. 52:456, （1973）、Wigler et al. Proc. Natl. Avad. Sci. USA 76: 1373−76, （1979）を参照されたい。リン酸カルシウム沈殿法は好ましく用いられる。しかしながら、核マイクロインジェクションおよび細菌原形質融合を含む細胞にＤＮＡを導入する他の方法もまた使用することができる。
【０１６４】
組換えチャネルの一過性の発現に関して、Ｎａ+電流または細胞内Ｎａ+レベルの測定用の形質転換宿主細胞は典型的に、リン酸カルシウム沈殿技術（Ukomadu et al. Neuron 8,
663−676 （1992））を用いて、ＨＥＫ２９３細胞のような細胞に、蛍光レポータープラスミド（例えばｐＧｒｅｅｎ Ｌａｎｔｅｒｎ−１、Life Technologies）と構築物を同時にトランストランスフェクトすることにより調製される。４８時間後、緑色の蛍光を伴う細胞が、記録用に選択される（Dib−Hajj et al. FEBS Lett. 416, 11−14 （1997））。同様に、実施例４に記載するように、Ｍｒｇ受容体の一過性発現の測定および受容体活性化に応答した細胞内Ｃａ2+の変化の測定においても、ＨＥＫ細胞は、Ｍｒｇ発現構築物および蛍光レポータープラスミドを同時にトランスフェクトし得る。ＨＥＫ２９３細胞は典型的に、１０％ウシ胎児血清（Life Technologies）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地（Life Technologies）において増殖される。
【０１６５】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核細胞は、上述のSambrook等に一般に記載されるように、適切な培地にて培養される。
【０１６６】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は、Ｈａｍ'ｓＦ１０（Sigma）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma）のような市販の培地を含むが、これらに限定されない、様々な培地にて培養することができる。さらに、Ham et al.
Meth. Enz., 58:44 （1979）、Barnes et al. Anal. Biochem. 102:255 （1980）、米国特許第４，７６７，７０４号、米国特許第４，６５７，８６６号、米国特許第４，９２７，７６２号、米国特許第４，５６０，６５５号、または米国特許第５，１２２，４６９号、国際公開第９０／０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号、または米国特許再審査第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞用培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、必要な場合にホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インシュリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質、微量元素、およびグルコースまたは等価エネルギー源を補充してもよい。任意の他の必要なサプリメントはまた、当業者により決定されるように、適切な濃度で含入され得る。培養条件は、発現に関して選択した宿主細胞ですでに使用したものであり、当業者には明らかであろう。
【０１６７】
本開示にて言及される宿主細胞は、培養細胞、ならびに宿主動物内にある細胞を含む。
【０１６８】
形質転換に成功した細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、選択マーカーを用いた選択を含む既知の技術により同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入により生じる細胞をクローニングして、単一コロニーを生産することができる。これらのコロニーからの細胞を収集し、溶解して、Southern, J. Mol. Biol. 98:503, （1975）またはBerent et al., Biotech. 3:208, （1985）により記載されるような方法を用いて、ｒＤＮＡの存在についてそれらのＤＮＡ内容物を検査するか、または以下に記載のような免疫学的方法により細胞から生産されるタンパク質をアッセイすることができる。
【０１６９】
遺伝子増幅および／または遺伝子発現は、本明細書中に提供する配列に基づいて、適切な標識プローブを用いた、サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量化するためのノーザンブロッティング（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201−5205 （1980））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む当該技術分野で既知の任意の技術により測定することができる。様々な標識、最も一般的には放射性同位体、特に32Ｐを用いることができる。遺伝子発現を測定する免疫学的方法としては、組織切片または培養液中の細胞の免疫組織化学的染色、ならびに培地または体液におけるタンパク質レベルをアッセイすることが挙げられる。免疫組織化学的染色技術を用いる場合、脱水および固定化により細胞試料を調製した後、遺伝子産物に特異的な標識抗体を結合させるが、酵素標識、蛍光標識、発光標識などは通常視覚的に検出可能である。
【０１７０】
試料液の免疫組織化学的染色および／またはアッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり、本明細書中に記載するように調製することができる。
【０１７１】
Ｆ．ｒＤＮＡ分子を用いた組換えタンパク質の生産
本発明はさらに、本明細書中に記載の核酸分子を用いて本発明のタンパク質を生産する方法を提供する。包括的には、組換え型のタンパク質の生産は典型的に、以下の工程を含む。
【０１７２】
第一に、本発明のｍｒｇタンパク質またはｄｒｇ−１２タンパク質をコードする核酸分
子（例えば、配列番号１のヌクレオチド１１５〜１０２６、配列番号１のヌクレオチド１１５〜１０２９、配列番号３のヌクレオチド１３７〜１０５１、配列番号３のヌクレオチド１３７〜１０５４、配列番号５のヌクレオチド１６５〜１０７０、配列番号５のヌクレオチド１６５〜１０７３、配列番号７のヌクレオチド１〜４５０、配列番号９のヌクレオチド１〜４５９、配列番号１１のヌクレオチド１８２０〜２７３４、配列番号１３のヌクレオチド１７０〜５７４、配列番号１３のヌクレオチド１７０〜５７７、配列番号１５のヌクレオチド３２８〜１２９３、配列番号１５のヌクレオチド３２８〜１２９６、配列番号１７のヌクレオチド１７１〜１１６０、配列番号１７のヌクレオチド１７１〜１１６３、配列番号２０のヌクレオチド８３〜９４３、配列番号２０のヌクレオチド８３〜９４６、配列番号２２のヌクレオチド１６〜９１８、配列番号２２のヌクレオチド１６〜９２１、配列番号２４のヌクレオチド１０６〜１０２０、配列番号２４のヌクレオチド１０６〜１０２３、配列番号２６のヌクレオチド４５〜９５９、配列番号２６のヌクレオチド４５〜９６２、配列番号２８のヌクレオチド１〜４０５、および配列番号２８のヌクレオチド１〜４０８）を得る。これらの配列のように、コード配列がイントロンにより中断されない場合、それは任意の宿主における発現にまさに適している。
【０１７３】
次に、核酸分子を、好ましくは上述のように適切な制御配列によって発現が調節できるように連結して、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現ユニットを形成する。発現ユニットを用いて、適切な宿主を形質転換し、形質転換した宿主を、組換えタンパク質の生産が可能な条件下にて培養する。任意に、組換えタンパク質を、培地または細胞から単離する。タンパク質の回収および精製は、不純物が許容される場合、または組換え細胞が例えばハイスループットアッセイにて使用される場合、必ずしも必要でない。
【０１７４】
先述の工程のそれぞれは、様々な態様で実行することができる。例えば、所望のコード配列を、ゲノム断片から得て、適切な宿主に直接使用してもよい。様々な宿主にて発現を調整することができる発現ベクターの構築は、上述のように、適切なレプリコンおよび制御配列を用いて達成される。制御配列、発現ベクターおよび形質転換の方法は、遺伝子を発現するために使用される宿主細胞型により決定されることは、上述した。適切な制限部位が、一般に利用可能でない場合、コード配列の末端に付加され、これらのベクターに挿入するための切除可能な遺伝子を提供し得る。当業者は、組換えタンパク質を生産するために、本発明の核酸分子とともに使用するための当該技術分野で既知の任意の宿主／発現系を容易に適合させることができる。
【０１７５】
一実施形態では、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２は、相同組換えにより生じ得る。簡潔に述べると、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２コード遺伝子を含む初代ヒト細胞をベクターで形質転換し、該ベクターは増幅を可能にする遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ））およびＭｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子のコード領域の遺伝子座にてＤＮＡ配列と相同的な少なくとも約１５０ｂｐ長の少なくとも１つのフランキング領域を含む。増幅を可能にする遺伝子は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子の発現を妨害しないように位置しなければならない。形質転換時に、構築物は、初代細胞のゲノムに相同的に組み込まれるようになり、増幅を可能にする領域を規定する。
【０１７６】
次に、構築物中に存在する増幅を可能にする遺伝子マーカーまたは他のマーカーに基づいて、形質転換細胞を選択する。マーカー遺伝子の存在は、宿主ゲノムに構築物が存在することおよび組込まれていることを証明する。ＰＣＲ、これに続くシーケンシングまたは制限断片分析を用いて、相同組換えが生じたことを確認することができる。
【０１７７】
次に、増幅可能領域の全体を、同定した初代細胞から単離して、宿主細胞を形質転換する。次に、増幅可能領域を含むクローンを選択した後、増幅作用物質との処理により増幅する。最終的に、遺伝子を発現させ、所望のタンパク質を生産するために、宿主細胞を増
殖させる。
【０１７８】
本発明のタンパク質は、直接的に生産するだけでなく、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして、組換え的に生産してもよい。一実施形態では、異種ポリペプチドは、シグナル配列であってもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、または、ベクターに挿入されるＭｒｇもしくはｄｒｇ−１２ＤＮＡの一部であり得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチドにより切断される）配列である。原核宿主細胞における発現に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、および熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列であってもよい。酵母分泌に関して、天然型シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス属およびクルイベロマイセス属α因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダー、およびＣ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダーを含む）により置換されてもよい。任意の天然型シグナル配列は、哺乳動物細胞発現に適している。あるいは、それは、関連タンパク質からのシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）により置換されてもよい。かかる前駆物質領域のためのＤＮＡは、リーディングフレーム内で、成熟タンパク質またはその可溶性変異体をコードするＤＮＡに連結される。
【０１７９】
異種ポリペプチドはまた、例えば融合タンパク質の発現位置を同定するために使用され得るマーカーポリペプチドであり得る。蛍光タンパク質のようなマーカーポリペプチドが当該技術分野にて既知であるだろう。好ましいマーカータンパク質は、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【０１８０】
Ｇ．Ｍｒｇポリペプチドの修飾
Ｍｒｇおよびｄｒｇ−１２ならびにそれらの各変異体の共有結合的修飾は本発明の範囲に含まれる。一つの実施形態では、本発明のポリペプチドの特定アミノ酸残基を、誘導体化する有機試薬と反応させる。二官能性作用物質による誘導体化は、例えば非水溶性支持マトリックスまたはその表面に、ＭｒｇまたはＭｒｇ断片もしくは誘導体を架橋するために有用であり、抗Ｍｒｇ抗体の精製、ならびに結合パートナーおよびリガンドを同定する方法として使用することができる。さらに、ＭｒｇまたはＭｒｇ断片は、結合特異性およびエフェクター機能を調節するために、互いに架橋されてもよい。多くの架橋剤が当該技術分野で既知であり、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８１】
他の意図される修飾としては、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ相当するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基の水酸基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79−86 （1983））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１８２】
本発明のポリペプチドのグリコシル化型の修飾も意図される。ポリペプチドのグリコシル化型の改変方法が当該技術分野で既知である。例えば、天然型配列Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２に見られる１つまたはそれ以上の炭水化物部分は、化学的に、酵素的に、またはグリコシル化部位の修飾により除去されてもよい。あるいは、例えば直接的に炭水化物部分の組成を操作することより、あるいはアミノ酸配列を改変することで天然型配列Ｍｒｇま
たはｄｒｇ−１２に存在しないグルコシル化部位を付加することにより、さらにグリコシル化することもできる。
【０１８３】
本発明のポリペプチドの別のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、米国特許第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号、または米国特許第４，１７９，３３７号に記載された方法で、ポリペプチドまたはその断片もしくは誘導体を、様々な非タンパク質ポリマー（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）の１つに連結することを含む。
【０１８４】
本発明のポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＭｒｇまたはｄｒｇ−１２を含むキメラ分子を形成する方法にて修飾することができる。
【０１８５】
一実施形態では、かかるキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合され得るエピトープを有するタグポリペプチドと、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２との融合を含む。エピトープタグは、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に置かれるのが一般である。エピトープタグは、キメラタンパク質の同定を可能にし、ならびにエピトープタグに結合する抗タグ抗体または別のタイプのアフィニティマトリックスを用いたアフィニティ精製によるキメラタンパク質の精製を可能にする。多数のタグポリペプチドおよびそれらに対するそれぞれの抗体は、当該技術分野で既知である。既知のタグとしては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ、ｆｌｕｅ ＨＡタグポリペプチド（Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159−2165 （1988））、ｃ−ｍｙｃタグ（Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610−3616 （1985））、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ（Paborsky et al., Protein Engineering, 3（6）:547−553 （1990））、およびＦｌａｇペプチド（Hopp et al., Bio Technology, 6:1204−1210 （1988））が挙げられる。
【０１８６】
別の実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域と、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２との融合を含む。イムノアドヘシンを生産するために、本発明のポリペプチドまたはそれらの断片もしくは特定ドメイン（複数可）は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域と融合され得る。典型的に、免疫グロブリン重鎖定常領域配列と融合される。本発明における使用のためのＭｒｇまたはｄｒｇ−１２免疫グロブリンキメラは一般的に、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端で融合したＭｒｇまたはｄｒｇ−１２受容体の、１つまたはそれ以上の細胞外ドメインをコードする核酸、またはそれらの断片から調製される。Ｎ末端融合もまた可能である。
【０１８７】
本発明のイムノアドへシンにおいては必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合されているか、あるいはＭｒｇまたはｄｒｇ−１２に直接融合されて、存在してもよい。共有結合させるために、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時に発現されてもよい。ハイブリッド重鎖およびハイブリッド軽鎖は、２つのジスルフィド連結免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を与えるために、分泌時に共有結合される。
【０１８８】
二重特異性イムノアドヘシンもまた作製することができる。二重特異性イムノアドヘシンは、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２ドメイン、および別の受容体由来の細胞外ドメインのようなドメインと組み合わせることができる。あるいは、本明細書中のイムノアドヘシンは、それぞれが免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列に融合した２つの異なるＭｒｇ受容体部分を含んでもよい。
【０１８９】
さらに別の実施形態では、本発明のキメラ分子は、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２あるいはその断片もしくはドメイン（複数可）と、異種受容体またはその断片もしくはドメイン（複数可）との融合を含む。異種受容体は、関連Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２ファミリーのタンパク質であってもよく、あるいは完全に関連のないものであってもよい。特定リガンドに関する所望のリガンド特異性または所望の親和性を有する融合タンパク質を得るために、あるいは所望のエフェクター機能を有する融合タンパク質を得るために、Ｍｒｇタンパク質またはｄｒｇ−１２タンパク質に融合される異種タンパク質が選択され得る。
【０１９０】
Ｈ．分子プローブもしくは診断プローブとしてｍｒｇまたはｄｒｇを使用する方法
本発明の配列および抗体、タンパク質およびペプチドは、感覚の認識、特に痛みの感知に関連もしくは関与した細胞または組織の検出のための分子プローブとして使用することができる。多くの方法が、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて本発明の核酸またはタンパク質を検出するために使用され得るが、好ましいプローブとしては、アンチセンス分子および抗ｍｒｇまたは抗ｄｒｇ−１２抗体が挙げられる。
【０１９１】
本発明の核酸またはタンパク質の検出用プローブは、緑内障または慢性の痛みのような特定の病状のために、あるいは感覚の認識を増大または抑制するために、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質の関与を同定するために使用することができる。特に、例えば異痛症、痛覚過敏または慢性の痛みを有する患者、または緑内障のような疾患もしくは障害を有する患者のような、感覚認識の変化を示す患者において、本発明のプローブは、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２発現が増加または減少しているかどうかを決定する際に有用であり得る。本発明のポリペプチドの発現の減少または過剰発現を決定することは、例えば、Ｍｒｇもしくはｄｒｇ−１２アゴニストまたはアンタゴニストを投与するような、障害を治療する治療上のアプローチを特定する際に有用であり得る。
【０１９２】
また、病状、特に痛みを患う動物モデルでのＭｒｇまたはｄｒｇ−１２発現レベルの変化の決定は、その発現または活性を調整する化合物によって、効果的に治療することができる障害の種類を特定する際に有用であり得る。
【０１９３】
さらに、本発明のプローブ、例えばアンチセンス分子および抗体は、Ｍｒｇ変異体またはｄｒｇ−１２変異体の突然変異体または変異体形態の発現を検出するために使用することができる。かかる変異体を検出する能力は、特定の病状、および特定の患者が感じている症状における変異体の関与を特定する際に有用であり得る。疾患もしくは障害におけるＭｒｇ変異体またはｄｒｇ−１２の変異体の関与を特定することにより、遺伝子治療、または受容体変異体に結合することが知られているアゴニストもしくはアンタゴニストを投与するような、疾患または障害の治療のための治療上のアプローチを提案することができる。
【０１９４】
さらに、本発明のプローブは、互いの関係を含めた様々なＭｒｇおよびｄｒｇ−１２ファミリーのタンパク質の正確な発現パターンを決定するために使用することができる。例えば、図２のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの検鏡画像によると、新生野生型（ＷＴ）マウスおよびニューロゲニン１ヌル突然変異（Ｎｇｎ１-/-）マウス由来の後根神経節（ＤＲＧ）の横断切片における配列番号２（「ｍｒｇ３」）および配列番号４（「ｍｒｇ４」）のヌクレオチドに対するアンチセンス染色が局在化していることを示す。白点線は、ＤＲＧの輪郭を描いており、黒点線は、脊髄の輪郭を描いている。Ｎｇｎ１-/-突然変異体にて、ＤＲＧの大きさが、３つの他の別個のマーカー（ｔｒｋＡ、ＶＲ−１およびＳＮＳ−ＴＴＸｉ（Ma et al., （1999））を用いて同定した場合、侵害受容感覚ニューロンの損失に起因して、激しく減少していることに留意されたい。ｍｒｇ３は、ＷＴマウスにてＤＲＧサブセットで発現される（Ａ）が、Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧには存在しない（Ｂ）。ｍｒｇ４は、ｍｒｇ３よりも小さいＤＲＧサブセットで発現される（Ｃ）。ｍｒｇ
４もまた、Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧには存在しない（Ｄ）。Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧにおけるｍｒｇ発現ニューロンの損失は、これらのニューロンが侵害受容性である可能性が高いことを示す。
【０１９５】
後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンのサブセットでのｍｒｇの発現を図２Ａに示す。野生型マウス（ａ〜ｉ）およびｎｇｎ１-/-（ｊ）突然変異新生マウス由来のＤＲＧの凍結した横断切片をアンチセンスジゴキシゲニンＲＮＡプローブを用いてアニーリングして、アルカリホスファターゼ結合抗体を用いてハイブリダイゼーションを可視化した。陽性シグナルを濃紫染色として示す。ＴｒｋＡは、野生型ＤＲＧニューロンの大部分で発現される（ａ）が、ｎｇｎ１-/-のニューロンでは存在しない（データを示さず）。８個のｍｒｇ遺伝子のそれぞれが、野生型ＤＲＧにおけるニューロンの小さなサブセットで発現され（ｂ〜ｉ）、ｎｇｎ１-/-ＤＲＧでは完全に存在しない（ｊ以外にデータを示さず）。黒点線は、ｎｇｎ１-/-突然変異ＤＲＧの輪郭を描いている。
【０１９６】
図２Ｂでは、ｍｒｇは、ＴｒｋＡ+侵害受容ニューロンにより発現される。二重標識技術を用いて、ＤＲＧニューロンにおけるＴｒｋＡ（緑、［ｂ、ｅ］）およびｍｒｇ（赤、［ａ、ｄ］）を同時局在化した。二重標識実験中、ｍｒｇ３（ａ〜ｃ）またはｍｒｇ５（ｄ〜ｆ）フルオレセイン標識アンチセンスＲＮＡプローブのいずれかを用いて、野生型ＤＲＧの凍結切片をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズした後、抗ＴｒｋＡ抗体免疫染色した。同一の２つの枠（ａおよびｂ、ｄおよびｅ）は、同時局在化の程度を明らかにするためにデジタル方式で重ね合わせた（ｃ、ｆ）。ｍｒｇ３またはｍｒｇ５のいずれかとのＴｒｋＡの同時局在化は、合併画像にて黄色のように見える（それぞれ、ｃ、ｆ）。白矢頭は、二重陽性細胞の例を示す。
【０１９７】
図２Ｃでは、ｍｒｇおよびＶＲ１が、ＤＲＧにおける２つの異なる侵害受容ニューロンの集団を規定する。ｍｒｇ３またはｍｒｇ５フルオレセイン標識アンチセンスＲＮＡプローブのいずれかを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤）と抗ＶＲ−１抗体免疫染色（緑）との組合せにより、ｍｒｇ３（ａ〜ｃ）もｍｒｇ５（ｄ〜ｆ）も、ＶＲ−１陽性ニューロンにより発現されないことを実証した。併合画像（ｃ、ｆ）では、ｍｒｇ３またはｍｒｇ５のいずれかとのＶＲ１の同時局在化は存在しなかった。白矢頭は、ｍｒｇ発現侵害受容ニューロンであるが、ＶＲ１陰性の侵害受容ニューロンを指し示す。
【０１９８】
図２Ｄでは、ｍｒｇが、ＩＢ４+侵害受容ニューロンにより発現されることがわかる。二重標識技術を用いて、ＤＲＧニューロンにおけるＩＢ４（緑、［ｂ、ｅ］）およびｍｒｇ（赤、［ａ、ｄ］）を同時局在化した。ｍｒｇ３およびｍｒｇ５の発現は、上述のように、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズすることにより可視化した。続いて同一ＤＲＧ切片をＦＩＴＣ結合レクチンによりＩＢ４結合を施した。併合画像（ｃ、ｆ）では、ｍｒｇおよびＩＢ４染色との間に広範囲の重なりが存在した（矢頭で示した黄色いニューロン）。
【０１９９】
正常組織における、および疾患の動物モデルから、あるいは疾患または障害を患う患者から摂取した組織における本発明の受容体の発現パターンに関する情報は、受容体の生物学的機能をさらに規定する際に、および特定の疾患または障害に関与する特定受容体または受容体の組合せに対して、治療方法を適合させる際に有用であろう。
【０２００】
Ｉ．結合パートナーの同定方法
以下により詳述するように、数個のペプチドが、Ｍｒｇ受容体の内因性リガンドとして推定的に同定された。特に、ＮＰＡＦおよびＮＰＦＦを含むＲＦ−アミドペプチドは、幾つかのＭｒｇ受容体を効果的に刺激することがわかった。Ｍｒｇ受容体のさらなる新規リガンドおよびｄｒｇ−１２のリガンドを同定するために、これらの受容体に結合する化合物を同定することがまず必要である。したがって、本発明の別の実施形態は、本発明のタ
ンパク質の結合パートナーまたはリガンドを単離および同定する方法を提供する。Ｍｒｇと相互作用する巨大分子は、この議論のために「結合パートナー」と名付ける。以下の議論は具体的には、Ｍｒｇ受容体に関する結合パートナーを同定することに関するが、本発明のアッセイは同様にｄｒｇ−１２に関する結合パートナーを同定するために使用することができると意図される。
【０２０１】
受容体結合は、天然の供給源から単離されるか、または直接合成されるＭｒｇ受容体を用いて試験することができる。しかしながら、上述の組換え法により得られるＭｒｇ受容体が好ましい。
【０２０２】
本発明によりスクリーニングし得る化合物としては、ポリペプチド、ペプチド（ランダムペプチドライブラリーのペプチド（例えば、Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354:82−84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354:84−86を参照）、およびＤおよび／またはＬ配置アミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーを含むが、これに限定されない）、ホスホペプチド（ランダムまたは部分的縮重指向性ホスホペプチドライブラリーを含むが、これに限定されない、例えばSongyang, Z. et al.,
1993, Cell 72:767−778を参照）、ペプチド擬似体、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または単鎖抗体、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ´）2およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ならびにそれらのエピトープ結合断片を含むが、これらに限定されない）、および有機低分子または無機低分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
候補または試験化合物のＭｒｇ受容体との結合能力は、例えば競合的結合アッセイにて、直接的または間接的に測定することができる。競合結合実験では、受容体に結合した別の化合物の５０％が置換するために必要な試験化合物濃度（ＩＣ50）が、結合親和性の尺度として用いられる。これらの実験では、受容体に結合した別の化合物とは、ＲＦ−アミドペプチドのような、高親和性でＭｒｇ受容体に結合することが知られているリガンドである。
【０２０４】
生化学的スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースのアッセイおよびタンパク質−タンパク質結合アッセイを含む様々なアッセイ形式を用いることができ、それらのすべてが当該技術分野で十分に特徴づけされている。一実施形態では、アッセイは、試験化合物を固相上に固着すること、Ｍｒｇ受容体を含む非固定化成分を添加すること、反応終了時に固相上に固着したＭｒｇ／試験化合物複合体を検出することを含む。代替的実施形態では、試験化合物を固着するのではなく、Ｍｒｇを固体表面上へ固着させることもできる。両方の状況にて、複合体の同定を可能にするために、試験化合物またはＭｒｇ受容体のいずれかが、直接的あるいは間接的に標識される。例えば、Ｍｒｇ−Ｉｇイムノアドヘシンを固体支持体に固着し、１つまたはそれ以上の試験化合物と接触させることもできる。
【０２０５】
マイクロタイタープレートは、好ましくは、固相として利用され、固着成分は、非共有結合または共有結合により固定化され得る。非共有結合は、タンパク質溶液で固体表面を単にコーティングして、乾燥することにより達成することができる。あるいは、固定化されるべきタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いて、タンパク質を固体表面に固着することもできる。
【０２０６】
また、反応は、液相で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離し、複合体を検出することができる。例えば、溶液中で形成される任意の複合体を固着するためのＭｒｇポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質、あるいは試験化合物に特異的な固定化抗体、および固着した複合体を検出するための考え得る複合体以外の成分に特異的な標識抗
体を用いることにより複合体を検出することができる。
【０２０７】
これらの方法の一実施形態では、潜在的結合パートナーが本発明のタンパク質と会合できる条件下にて、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質断片（例えば、細胞外ドメイン断片）を、１つまたはそれ以上の潜在的結合パートナー、または細胞の抽出物もしくは分画と混合する。混合後、本発明のタンパク質と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の分子を混合物から分離する。次に、本発明のタンパク質に結合した結合パートナーを取り出し、同定し、さらに分析する。結合パートナーを同定および単離するために、全Ｍｒｇタンパク質、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２１、２３、２５、２７、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７または１０９の全アミノ酸配列を含むタンパク質が使用され得る。あるいは、Ｍｒｇポリペプチド断片が使用され得る。
【０２０８】
本明細書で使用する場合、細胞抽出物は、溶解細胞または破壊細胞から作製される調製物あるいは分画である。細胞抽出物の好ましい供給源は、ＤＲＧに由来する細胞であろう。あるいは、細胞抽出物は、正常ヒト腎組織を含む任意の組織、または利用可能な細胞系、特に腎臓由来細胞系に由来する細胞から調製することができる。
【０２０９】
様々な方法を用いて、細胞抽出物を得ることができる。細胞は、物理的または化学的な破壊方法を用いて破壊することができる。物理的破壊方法としては、超音波処理および機械的剪断が挙げられるが、これらに限定されない。化学的溶解方法としては、洗浄剤溶解および酵素溶解が挙げられるが、これらに限定されない。本方法で使用するための抽出物を得るために、当業者は、細胞抽出物を調製する方法を容易に選択することができる。
【０２１０】
細胞抽出物がいったん調製されると、その抽出物は、タンパク質が結合パートナーと会合し得る条件下にて、本発明のタンパク質と混合される。あるいは、１つまたはそれ以上の既知の化合物または分子を本発明のタンパク質と混合することができる。様々な条件を使用することができ、最も好ましいのは、ヒト細胞の細胞質において見られる条件に非常に近い条件である。モル浸透圧濃度、ｐＨ、温度および使用する細胞抽出物濃度のような条件は、結合パートナーとタンパク質との会合を最適化するために変化させることができる。
【０２１１】
適切な条件下で混合した後、結合した複合体を混合物から分離する。混合物を分離するために、様々な技術を利用することができる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体は、結合パートナー複合体を免疫沈降するために使用することができる。あるいは、クロマトグラフィーおよび密度／沈降物遠心分離のような標準的な化学的分離技術を使用することができる。
【０２１２】
抽出物中に見られる非会合細胞構成成分および／または未結合化合物または分子を除去した後、従来法を用いて、複合体から結合パートナーを解離することができる。例えば、解離は、混合物の塩濃度またはｐＨを変えることにより達成され得る。
【０２１３】
混合抽出物から、会合した結合パートナー対を分離するのを補助するために、本発明のタンパク質を固体支持体上に固定化することができる。例えば、タンパク質を、ニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに結合することができる。固体支持体へのタンパク質の結合は、抽出物中に見られる他の構成成分から、ペプチド／結合パートナー対を分離するために役立つ。同定した結合パートナーは、単一タンパク質、または２つもしくはそれ以上のタンパク質または任意の他の高分子から構成される複合体のいずれかであ
り得る。
【０２１４】
あるいは、結合パートナーは、Takayama et al. Methods Mol. Biol. 69:171−84 （1997）またはSauder et al. J. Gen. Virol. 77（5）: 991−6の手順にしたがってファーウェスタンアッセイを用いて同定することもでき、あるいはエピトープでタグ付けしたタンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質を使用して同定することもできる。
【０２１５】
結合パートナーはまた、当該技術分野で既知の全細胞結合アッセイによって同定することができる。一実施形態では、Ｍｒｇ受容体は、ＣＯＳ細胞のような、Ｍｒｇ受容体が通常は発現されない細胞において発現される。次に、Ｍｒｇを発現する細胞を、好ましくは放射性マーカーまたは蛍光マーカーであらかじめ標識した潜在的結合パートナーと接触させる。続いて、細胞を洗浄して、未結合物質を除去し、潜在的結合パートナーの細胞との結合を評価する。例えば、フィルター上で細胞を収集し、放射活性を計数することにより評価する。トランスフェクトしていない細胞または見せかけのトランスフェクトした細胞に潜在的結合パートナーが結合する量をバックグラウンドとして減算する。
【０２１６】
このタイプのアッセイは、幾つかの代替的様式で実行することができる。例えば、一実施形態では、全細胞ではなく、Ｍｒｇでトランスフェクトした細胞からの、またはＭｒｇを発現することが既知の細胞からの細胞膜分画を用いて、アッセイが行われる。別の実施形態では、精製Ｍｒｇは、アッセイにおいて使用される膜を生産するために脂質にてリフォールディングされる。
【０２１７】
あるいは、本発明の核酸分子は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、細胞ベースの系にて使用することができる（国際公開第９９／５５３５６号を参照）。これらの系を用いて、他のタンパク質パートナー対を同定し、本明細書中に記載の核酸分子を使用するために容易に適応させることができる。
【０２１８】
Ｍｒｇ受容体と相互作用する溶解性タンパク質、膜貫通タンパク質、または細胞内タンパク質を含むが、これらに限定されないタンパク質を同定するために、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために適切な任意の方法を用いてもよい。Ｍｒｇと相互作用するタンパク質を同定するために使用され得る伝統的な方法には、免疫共沈降、架橋、およびグラジエントまたはクロマトグラフィーカラムによる共精製がある。かかるアッセイに関して、Ｍｒｇ成分は、完全長タンパク質、それらの溶解性誘導体、所定ドメインに相当するペプチド、あるいはＭｒｇの幾つかの領域を含有する融合タンパク質であり得る。
【０２１９】
Ｍｒｇと相互作用することが可能なタンパク質をコードする遺伝子を同時同定する方法を使用することもできる。これらの方法としては、例えば標識Ｍｒｇまたはそれらの変異体を用いて、発現ライブライリーを精査することが挙げられる。
【０２２０】
Ｍｒｇ結合パートナーを同定するために使用することができるｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質相互作用を検出する一方法は、酵母ツーハイブリッドシステムである。このシステムは、当該技術分野で既知であり、Clontech（Palo Alto, CA）から市販されている。
【０２２１】
簡潔に言うと、一方がＭｒｇ受容体、あるいはそれらに由来するポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質に融合された転写活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含み、他方は未知の標的タンパク質に融合された転写活性化因子タンパク質の活性化ドメインを含むツーハイブリッドタンパク質が用いられる。これらのタンパク質は、調節領域が転写活性化因子の結合部位を含有するレポーター遺伝子（例えば、ＨＢＳまたはｌａｃＺ）を含有する酵母サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の株にて発現される。どちらかのハイブリッドタンパク質のみでは、レポーター遺伝子の転写を活
性化することはできないが、二つのハイブリッドタンパク質の相互作用により、機能的活性化因子タンパク質が再構成され、レポーター遺伝子の発現をもたらし、それはレポーター遺伝子産物をアッセイすることにより検出される。
【０２２２】
標的タンパク質は、好ましくは、ＤＲＧ細胞のような、Ｍｒｇ受容体を発現することが知られている組織または細胞から得られる。例えば、ＤＲＧ細胞から調製されるｃＤＮＡライブラリーを使用することができる。
【０２２３】
結合パートナーはまた、既知のリガンドの相互作用を妨害または崩壊するそれらの能力により同定することができる。Ｍｒｇ受容体を活性化しない結合パートナーであっても、既知のリガンドとの相互作用を妨害する結合パートナーは、身体中のＭｒｇ活性を調節または増大する際、および／またはＭｒｇ活性（またはそれらの欠損）に関連した障害を制御する際に有用であり得る。
【０２２４】
Ｍｒｇおよび既知のリガンドとの間の相互作用を妨害する化合物は、Ｍｒｇ、あるいはそれらのある種の変異体または断片、およびＲＦ−アミドペプチドのような既知の結合パートナーを含む反応混合物を、この２つを相互作用および結合させるために十分な条件かつ十分な時間で調製し、複合体を形成することにより同定され得る。抑制活性に関して化合物を試験するために、試験化合物の存在下および非存在下にて、反応混合物を調製する。試験化合物は、反応混合物中に初めから含入することもでき、あるいはＭｒｇおよびその結合パートナーの添加の後に、続いて添加することもできる。対照反応混合物を試験混合物なしでインキュベートする。次に、Ｍｒｇおよび結合パートナー間の任意の複合体の形成を検出する。対照反応中で複合体を形成する一方、試験化合物を含有する反応混合物中ではその複合体を形成しないことは、化合物がＭｒｇおよび既知の結合パートナーの相互作用を妨害していることを示す。さらに、試験化合物および正常なＭｒｇタンパク質を含む反応混合物内の複合体形成と、試験化合物および突然変異Ｍｒｇを含む反応混合物内の複合体形成とを比較することができる。この比較は、突然変異体、すなわち突然変異したＭｒｇの相互作用を特異的に崩壊するが、正常なＭｒｇタンパク質の相互作用は崩壊しない化合物を同定しようとする場合に重要であるだろう。
【０２２５】
反応物の添加の順序は、試験される化合物に関する種々の情報を得るために変化させることができる。例えば、競合により相互作用を妨害する試験化合物は、試験物質の存在下にて結合反応を実施することにより同定することができる。この場合、試験化合物は、Ｍｒｇおよび既知の結合パートナーが添加されるよりも前に、あるいはそれと同時に反応混合物に添加される。あるいは、予め形成した複合体を崩壊する能力を有する試験化合物は、複合体が形成された後に、反応混合物に試験化合物を添加することにより同定することができる。
【０２２６】
本発明の代替的実施形態では、Ｍｒｇと相互作用性結合パートナーの予備形成複合体を調製し、この場合、Ｍｒｇまたはその結合パートナーのいずれかが標識されているが、その標識が発生するシグナルは、複合体の形成により抑えられる（例えば、米国特許第４，１０９，４９６号（Rubenstein）を参照、これはイムノアッセイのためにこのアプローチを利用する）。予備形成複合体を形成するグループの１つと競合して置換する試験化合物を添加すると、バックグラウンドを超えるシグナルが発生する結果となる。このようにして、相互作用を崩壊する試験物質を同定することができる。
【０２２７】
Ｍｒｇを発現する全細胞、Ｍｒｇを発現する細胞から調製される膜分画、またはリフォールディングされたＭｒｇを含む膜は、上述のアッセイにおいて使用することができる。しかしながら、これらと同じアッセイが、完全長タンパク質の一方または両方の代わりに、Ｍｒｇの結合ドメインおよび／または相互作用性パートナーもしくは結合パートナー（
結合パートナーがタンパク質である場合）に相当するペプチド断片を用いて行うことができる。当該技術分野で通常用いられる任意の多数の方法を用いて、結合部位を同定および単離することができる。これらの方法としては、Ｍｒｇタンパク質をコードする遺伝子の突然変異誘発、および既知のリガンドの結合崩壊に関するスクリーニングが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
同定した化合物は、例えば、野生型Ｍｒｇおよび／または突然変異Ｍｒｇの活性を調節する際に有用であったり、Ｍｒｇ受容体の生物学的機能を詳しく調べる際に有用であったり、正常なＭｒｇ受容体相互作用を崩壊、またはそれ自体かかる相互作用を崩壊もしくは活性化し得る化合物を同定するためのスクリーニングにて利用することができる可能性があり、かつ治療上有用であり得る。
【０２２９】
Ｊ．核酸の発現を調節する作用物質の同定方法
本発明の別の実施形態は、本発明のｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質、あるいはｍｒｇまたはｄｒｇ−１２媒介経路に関与する別のタンパク質をコードする核酸の発現を調節する作用物質の同定方法を提供する。これらの作用物質は、適切な細胞へ（例えば、ＤＲＧの細胞へ）侵入して、遺伝子の発現に影響を及ぼすことが可能なペプチド、ペプチド擬似体、および有機低分子であり得るが、これらに限定されない。Ｍｒｇもしくはｄｒｇ−１２、またはｍｒｇ媒介経路におけるタンパク質の発現を調節する作用物質は、例えば、痛みの感知のような感覚を増大または減少させるために、緑内障を治療するために、あるいは創傷治癒を増大または減少させるために、治療上有用であり得る。
【０２３０】
かかるアッセイは、本発明の核酸の発現レベルの変化をモニターすることができる任意の利用可能な手段を利用することができる。本明細書中で使用する場合、作用物質は、細胞中の遺伝子もしくはｍＲＮＡレベルの核酸の発現を増大または減少する調節が可能である場合に、本発明の核酸、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７または１０９の配列を有するタンパク質をコードする核酸の発現を調節するという。
【０２３１】
一アッセイ形式では、本発明の遺伝子のオープンリーディングフレームおよび／または５´または３´調節配列と、任意のアッセイ可能な融合パートナーとの間でのレポーター遺伝子融合を含む細胞系を調製してもよい。ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む数多くのアッセイ可能な融合パートナーが既知であり、容易に利用可能である（Alam et al. Anal. Biochem.
188:245−254 （1990））。次にレポーター遺伝子融合を含む細胞系を、適切な条件下および時間で、試験されるべき作用物質に曝露する。作用物質に曝露した試料と対照試料との間のレポーター遺伝子の発現の差異は、ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質をコードする核酸の発現を調節する作用物質を同定する。
【０２３２】
さらなるアッセイ形式は、本発明のｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質をコードする核酸の発現を調節する作用物質の能力をモニターするために使用することができる。例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸へのハイブリダイゼーションにより直接的にモニターすることができる。適切な条件下および時間で、細胞系を試験されるべき作用物質に曝露して、Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に開示されるような標準的手順により、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡが単離される。
【０２３３】
作用物質に曝露した細胞および対照細胞間のＲＮＡ発現レベルの差異を検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製することができる。高ストリンジェンシー条件下で、標的核酸とのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましいが、必ずしも必要ではない。高ストリンジェンシー条件下では、非常に相補性の高い核酸のみハイブリッド形成が起こる。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーによって、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在すべき相補性の量が決定される。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッド、および潜在的プローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の差異が最大になるように選択されるべきである。
【０２３４】
プローブは、当該技術分野で既知の方法により、本発明の核酸から設計することができる。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含有量、およびプローブ長は、その標的配列へのプローブ結合に影響を及ぼし得る。プローブの特異性を最適化する方法は一般に、Sambrook et al. （Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989）、またはAusubel et al. （Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., NY, 1995）にて利用可能である。
【０２３５】
ハイブリダイゼーションの条件は、各プローブに応じて、Sambrook et al.およびAusubel et al.に記載されるような既知の方法を用いて変更される。全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡに関して濃縮したＲＮＡのハイブリダイゼーションは、任意の利用可能な形式で達成することができる。例えば、全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡに関して濃縮したＲＮＡは、固体支持体に固定され、その固体支持体は、プローブが特異的にハイブリダイズすると考えられる条件下で、本発明の配列の少なくとも１つ、または少なくともその１つの一部を含む、少なくとも１つのプローブに曝露され得る。あるいは、本発明の配列の少なくとも１つ、あるいはその１つの一部を含む核酸断片は、シリコンチップまたは多孔質ガラスウェハーのような固体支持体に固定され得る。次に、そのウェハーは、固定した配列が特異的にハイブリダイズすると考えられる条件下にて、試料由来の全細胞ＲＮＡまたはポリＡ ＲＮＡに曝露され得る。かかるウェハーおよびハイブリダイゼーションを用いる方法は、広範に利用可能であり、それらは例えばBeattieにより開示される（国際公開第９５／１１７５５）。所定のプローブが、未処理細胞集団、および作用物質に曝露した細胞集団のＲＮＡ試料に特異的にハイブリダイズする能力を有するかを検査することにより、ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２をコードする核酸の発現を増大または減少の方向に調節する作用物質が同定される。
【０２３６】
ｍＲＮＡの定性的および定量的分析のためのハイブリダイゼーションもまた、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（すなわち、ＲＰＡ、Ma et al. Methods 10: 273−238 （1996）を参照）を用いて実施することができる。簡潔に言うと、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡおよびファージ特異的ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を含む発現媒体を、ファージプロモーターの下流にあるｃＤＮＡ分子の３´末端にて線状化し、続いてかかる線状化分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によるｃＤＮＡの標識アンチセンス転写物の合成のための鋳型として使用される。次に、８０％ホルムアミド、４０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．４、０．４Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で一晩、４５℃にてインキュベートすることにより、標識転写物を単離ＲＮＡ（すなわち、全または分画ｍＲＮＡ）の混合物にハイブリダイズさせる。次に、得られたハイブリッドを、４０μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡおよび２μｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼを含む緩衝液中で消化させる。外来性タンパク質を不活性化し、さらに抽出後、分析用に試料を尿素／ポリアクリルアミドゲル上に載せる。
【０２３７】
別のアッセイ形式では、ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子産物を生理学的に発現する産物、細胞または細胞系がまず同定される。そのように同定された細胞および／または細胞系は、適切な表面伝達メカニズムおよび／またはサイトゾルカスケードと、作用物質との
外因性の接触に関して、転写装置の調節の忠実度が維持されるために必要な細胞機構を含むことが予想される。次に、かかる細胞または細胞系は、本遺伝子産物に特有な１つまたはそれ以上の抗原断片に融合された本遺伝子産物をコードする構造遺伝子の末端を含む制御能力がある非翻訳５´または３´プロモーターを含む発現媒体（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）構築物を用いて形質導入またはトランスフェクトされるが、ここで上記断片は、上記プロモーターの転写制御下にあり、分子量が天然に存在するポリペプチドと区別することができるポリペプチド、あるいは免疫学的に明瞭なタグをさらに含み得るポリペプチドとして発現する。かかるプロセスは、当該技術分野で既知である。
【０２３８】
次に、上記に概説した形質導入もしくはトランスフェクトした細胞または細胞系を適切な条件下にて作用物質と接触させて、例えば作用物質は、薬学的に許容可能な賦形剤を含み、生理学的ｐＨにあるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理学的ｐＨにあるイーグル平衡塩溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳもしくはＢＳＳ、あるいは３７℃でインキュベートしたＰＢＳもしくはＢＢＳおよび／または血清を含む条件培地のような、生理学的緩衝水溶液中に含まれる細胞と接触させる。上記条件は、当業者により必要と思われる場合に調節され得る。作用物質との細胞の接触に続いて、ポリペプチド分画をプールし、免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降またはウェスタンブロット）によりさらに処理されるべき抗体と接触できるように、上記細胞を破壊して、可溶化液のポリペプチドを分画する。「作用物質に接触させた」試料から単離されるタンパク質プールは、賦形剤のみを細胞と接触させた対照試料と比較され、対照試料と比較した「作用物質に接触させた」試料から免疫学的に発生されるシグナルの増加または減少が、作用物質の有効性の識別に用いられるであろう。
【０２３９】
適用した作用物質に応答したＭｒｇ ｍＲＮＡの発現の差異を同定するための上述のプローブはまた、哺乳動物集団、例えば感覚認識レベルの異なる集団におけるＭｒｇ ｍＲＮＡの発現の差異を同定するために使用することができる。遺伝子の発現の差異を同定する方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、ｍＲＮＡは、神経障害性の痛みを感じている患者、あるいはＭｒｇ受容体が役割を果たし得る疾患または障害を患う患者、例えば緑内障を患う患者のように、変化した感覚認識を示す患者から採取した組織または細胞から調製され、Ｍｒｇ発現レベルは、上述のプローブを用いて定量化される。次に、Ｍｒｇ発現レベルを他の集団の発現レベルと比較して、Ｍｒｇ発現が感覚認識の変化において果たす役割を決定することができ、かつＭｒｇ発現レベルの増加および減少を目的とした治療が適切であるかどうかを決定することができる。
【０２４０】
Ｋ．ＤＲＧ一次感覚ニューロンのタンパク質レベルまたはタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する作用物質の同定方法。
本発明の別の実施形態は、アゴニストおよびアンタゴニストを含む、本発明のｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質のタンパク質レベルおよび／または少なくとも１つの活性を調節する作用物質あるいは条件を同定する方法を提供する。かかる方法またはアッセイは、所望の活性をモニターまたは検出する任意の手段を利用し得る。
【０２４１】
一形式では、試験されるべき作用物質に曝露されていない対照細胞集団と比較した、試験されるべき作用物質に曝露された細胞集団の本発明のタンパク質の相対量がアッセイされ得る。この形式で、特定抗体のようなプローブは、異なる細胞集団におけるタンパク質の発現の差異をモニターするために用いられる。細胞系または集団を適切な条件下および時間で試験されるべき作用物質に曝露する。曝露細胞系または集団、および対照の非暴露細胞系または集団から、細胞可溶化液を調製することができる。次に細胞可溶化液をプローブを用いて分析する。
【０２４２】
別の実施形態では、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２受容体を発現することが知られている動
物を、特定の環境的刺激にさらし、刺激にさらすことにより、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２タンパク質の発現において生じる変化を測定する。特定位置にて特定のＭｒｇを発現するように生産されたトランスジェニックマウスのようなトランスジェニック動物を使用してもよい。環境的刺激は、例えば、ストレスを引き起こす条件への曝露、あるいは有害な刺激または痛みを伴う刺激への曝露であり得るが、これらに限定されない。環境的刺激に応答したＭｒｇ受容体発現レベルの差異は、Ｍｒｇの生物学的役割、および使用した刺激に関連する疾患または障害の治療可能性に対する洞察を提供する。
【０２４３】
抗体プローブは、本発明のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、免疫原性を高めるために十分な長さである場合、あるいはそれが望ましい場合またはそれが必要である場合に、適切なキャリアと結合させて、それらの結合体を用いて、適切な免疫化プロトコルにて適切な哺乳動物宿主を免疫化することにより調製される。ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質のようなキャリアとの免疫原性結合体を調製する方法は、当該技術分野で既知である。場合によっては、例えばカルボジイミド試薬を用いた直接的な結合が効果的である。他の場合では、ハプテンへの接近を提供するためにPierce Chemical Co. （Rockford, IL）により供給されるような連結試薬が望ましい。ハプテンペプチドは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにてシステイン残基によって伸長させることができ、あるいは例えばキャリアへの連結を容易にするためにシステイン残基を点在させることもできる。免疫原の投与は、当該技術分野で一般に理解されているように、一般に適切な期間にわたる注入により、かつ適切なアジュバントを用いて実施される。免疫化スケジュール中、抗体形成の妥当性を決定するために抗体力価が調べられる。
【０２４４】
このようにして生産したポリクローナル抗血清は、幾つかの用途に満足なものであり得るが、薬学的組成物においては、モノクローナル調製物を使用するのが好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞系は、一般に知られているように、Kohler and
Milstein Nature 256:495−497 （1975）の標準的方法、あるいはリンパ球または脾細胞の不死化をもたらす変法を用いて調製され得る。所望の抗体を分泌する不死化細胞系は、抗原がペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタンパク質であるイムノアッセイによりスクリーニングされる。所望の抗体を分泌する適切な不死化細胞培養が同定されると、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで、あるいは腹水液中生産のいずれかにより、細胞を培養することができる。
【０２４５】
次に、所望のモノクローナル抗体を培養上清から、または腹水上清から回収する。免疫学的に有意な部分を含有するモノクローナル抗血清またはポリクローナル抗血清の断片をアンタゴニスト、ならびに無傷抗体として使用することができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ´またはＦ（ａｂ´）2断片のような免疫学的に反応性の断片の使用は、これらの断片が免疫グロブリン全体よりも免疫原性が一般に低いため、特に治療上の状況で多くの場合好ましい。
【０２４６】
抗体または断片はまた、現在の技術を用いて、組換え手段により生産することができる。タンパク質の所望の領域に特異的に結合する抗体領域はまた、以下に詳述するように、ヒト化抗体のような複数種起源を有するキメラの状況で生産することもできる。
【０２４７】
１．アゴニストおよびアンタゴニストの同定
本発明は、Ｍｒｇおよび／またはｄｒｇ−１２の１つまたはそれ以上の生物学的特性を有するアゴニストあるいはアンタゴニストとして作用する化合物を同定するためのアッセイを提供する。Ｍｒｇアゴニストおよびアンタゴニストは、感覚認識、特に侵害受容に関連した問題を防止または治療するために有用であり得る。Ｍｒｇアゴニストおよびアンタゴニストは、感覚認識、特に痛みの感知を変更させ得る。例えば、Ｍｒｇ受容体アゴニストとして同定された化合物は、Ｍｒｇ受容体の活性化を刺激するために使用することがで
き、したがって、痛みの感知を低減することにより、痛みを患う哺乳動物を治療するために有効であり得る。Ｍｒｇ受容体アンタゴニストとして同定された化合物は、例えば、Ｍｒｇ受容体のエフェクター機能を減少するために使用され得る。これは、Ｍｒｇ受容体の応答性が増大している突然変異を含む場合に、またはＭｒｇ受容体が過剰発現している場合に有用であり得る。例えば、Ｍｒｇ受容体アンタゴニストは、糖尿病の幾つかの形態のような、感覚応答性が低減する疾患のように、適切な場合に哺乳動物の痛みに対する感受性を増大するために有用であり得る。
【０２４８】
アゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのアッセイは、受容体にリガンドが結合した後の細胞応答をモニタリングすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。アゴニストは細胞性応答をもたらす一方で、アンタゴニストは、細胞性応答に対して影響しないが、既知のアゴニストに対する細胞性応答を防止することが可能であろう。
【０２４９】
ａ．小分子
小分子は、Ｍｒｇアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する能力を有することができ、したがって、Ｍｒｇの生物学的活性上の影響によってスクリーニングすることができる。小分子は、好ましくは、１０ｋＤ未満、より好ましくは５ｋＤ未満、さらに好ましくは２ｋＤ未満の分子量を有する。かかる小分子は、天然の小分子、合成有機化合物または合成無機化合物、ペプチドおよびペプチド擬似体を含み得る。しかしながら、本発明における小分子は、これらの形態に限定されない。小分子の広範なライブラリーが市販され、所望の活性によってこれらの分子をスクリーニングするための各種アッセイは、当該技術分野で既知である。
【０２５０】
Ｍｒｇアゴニストおよびアンタゴニストの小分子の候補は、好ましくは、潜在的アゴニストおよびアンタゴニストの迅速な同定を可能にするアッセイにてまず同定される。かかるアッセイの例は、結合アッセイであり、ここで上述のように、Ｍｒｇ受容体への候補分子の結合能力が測定される。別の例では、ＭｒｇＡ１に対するＦＭＲＦアミドのような、既知のリガンドの結合を妨害する候補分子の能力を測定する。続いて、Ｍｒｇタンパク質に結合する能力、または既知のリガンドの結合を妨害する能力により同定される候補分子は、１つまたはそれ以上の生物学的活性を刺激する能力に関して試験される。
【０２５１】
本発明のタンパク質の活性は、試験されるべき作用物質（単数または複数）へ曝露した際の細胞における生理学的変化をアッセイすることにより、本発明のｍｒｇおよび／またはｄｒｇ−１２タンパク質を発現する細胞においてモニターされ得る。かかる生理学的変化としては、細胞膜を通過する電流の流れが挙げられるが、これに限定されない。
【０２５２】
一実施形態では、タンパク質は、セカンドメッセンジャー応答を生じることができる細胞であって、かつＭｒｇまたはｄｒｇ−１２を正常に発現しない細胞において発現させる。次に、細胞を所定の化合物と接触させて、セカンドメッセンジャー応答の変化を測定する。これらの変化をモニターまたはアッセイする方法は、容易に利用可能である。例えば、本発明のｍｒｇ遺伝子は、Ｇタンパク質αサブユニットであるＧα１５を発現する細胞にて発現され得るが、該Ｇタンパク質αサブユニットは、Chandrashekar et al. Cell 100: 703−711, （2000）に開示されるように、ＦＵＲＡ−２カルシウム指示色素を用いて、単一細胞レベルにてモニターされ得る細胞内カルシウム［Ｃａ2+］を増加させる受容体の活性化に関連する。このアッセイは、実施例５にてより詳述する。
【０２５３】
同様のアッセイもまた、Ｍｒｇもしくはｄｒｇ−１２活性化の阻害剤またはアンタゴニストを同定するために用いることができる。例えば、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２を発現する細胞であって、かつ受容体活性化に対する定量可能な応答をもたらし得る細胞を、既知
のＭｒｇまたはｄｒｇ−１２活性化因子、および試験されるべき化合物と接触させる。一実施形態では、Ｇα１５およびＭｒｇＡ１を発現するＨＥＫ細胞を、ＦＭＲＦアミドおよび試験されるべき化合物と接触させる。細胞性応答、この場合には［Ｃａ2+］の増加が測定される。既知の活性化因子だけで処理した場合と比較した、減少した応答は、その化合物が活性化の阻害剤として作用していること示す。
【０２５４】
かかるアッセイは、任意の方法で構成されてもよいが、特に好ましい形式は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＰ）が可能なものである。本発明のＨＴＰアッセイでは、一日に、数千もの異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることが可能である。例えば、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、別個のアッセイ、例えば上述のように分子内カルシウムの増加によって、受容体活性を調節する試験化合物の能力に基づいたアッセイを実行することができる。
【０２５５】
上述の方法にてアッセイされる作用物質は、ランダムに選択され得るか、あるいは合理的に選択または設計され得る。本明細書で使用する場合、作用物質が、本発明のタンパク質の単独での会合に関与した特定配列、またはその会合基質（結合パートナー等）の会合に関与した特定配列を考慮せずにランダムに選択される場合に、作用物質は、ランダムに選択されると言われる。ランダムに選択した作用物質の例は、化学的ライブラリー、またはペプチドコンビナトリアルライブラリー、あるいは生物体の成長ブロスの使用である。
【０２５６】
本明細書で使用する場合、作用物質が、作用物質の作用と関連した標的部位の配列および／またはその立体配座を考慮する非ランダムな基礎に基づいて選択される場合に、作用物質は、合理的に選択または設計されると言われる。所定の部位は、膜貫通領域内のペプチド、これらの膜貫通領域間の細胞質および細胞外ペプチドループ、あるいはＮ末端細胞外ドメインまたはＣ末端細胞内ドメイン内の選択配列であってもよい。作用物質は、これらの部位を構成するペプチド配列を利用することにより合理的に選択、または合理的に設計され得る。
【０２５７】
本発明の作用物質は、例えば、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体、ならびに炭水化物であり得る。優勢阻害タンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質のペプチド断片、またはこれらのタンパク質の擬似体を細胞に導入して、機能に影響を及ぼし得る。本明細書で使用する「擬似体」は、親ペプチドと化学的には異なる構造であるが、親ペプチドと組織分布的および機能的に類似した構造を提供するための、ペプチド分子の一つのまたは幾つかの領域の修飾体を指す（Grant GA. in: Meyers （ed.） Molecular Biology and Biotechnology （New York,
VCH Publishers, 1995）, pp. 659−664を参照）。当業者は、本発明の作用物質の構造的性質に関して限定されないことを容易に理解することができる。
【０２５８】
本発明のペプチド作用物質は、従来技術で既知であるように、標準的な固相（または溶液相）ペプチド合成法を用いて調製することができる。さらに、これらのペプチドをコードするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成してもよく、また標準的な組換え生産系を用いて組換え的に生産してもよい。遺伝子によりコードされないアミノ酸が含まれる場合には、固相ペプチド合成を用いた生産が必要である。
【０２５９】
ｂ．抗体
本発明の別の種類の作用物質は、本発明のタンパク質の非常に重要な位置での免疫反応性を有する抗体である。これらの抗体は、ヒトもしくは非ヒトのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得て、アゴニスト抗体または中和抗体として作用し得る。それらには、抗体のアミノ酸配列変異体、抗体のグリコシル化変異体および抗体の断片が含まれる。抗体作用物質は、抗原領域として、抗体により標的とされることを目的とするタ
ンパク質部分を含むペプチドで、適切な哺乳動物被験体を免疫化することにより得られる。かかる抗体産生の一般的技術、およびアゴニスト抗体または中和抗体の選択は、当該技術分野で既知である。
【０２６０】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、異種複合抗体、または抗体断片であり得る。さらに、抗体は、組換え方法を含む当該技術分野で既知の任意の方法により作製することができる。
【０２６１】
Ｍｒｇアゴニスト抗体および中和抗体は、Ｍｒｇ受容体に結合する能力に基づいて予備的に同定することができる。例えば、当該技術分野で既知のウェスタンブロット技術を用いて、様々な抗体をＭｒｇに結合する能力によってスクリーニングを行うことができる。次に、Ｍｒｇアゴニスト抗体および中和抗体は、それらの生物活性に基づいて、候補とした抗体の群から同定される。一実施形態では、Ｍｒｇアゴニスト抗体は、Ｍｒｇタンパク質を発現し、かつセカンドメッセンジャー系を有する細胞において、セカンドメッセンジャー系の活性化を誘発するそれらの能力により同定される。例えば、Ｇα１５を過剰発現し、かつｍｒｇでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を、潜在的Ｍｒｇアゴニスト抗体と接触させてもよい。実施例５に記載するように測定される細胞内カルシウムの増加は、その候補とした抗体がアゴニスト抗体であることを示すであろう。
【０２６２】
中和抗体の同定は、Ｍｒｇを発現する細胞を、ＲＦ−アミドペプチドのような既知のＭｒｇリガンド、ならびに候補とした抗体と接触させること、およびＭｒｇ活性化に対する抗体の効果を観察することを含む。一実施形態では、Ｇα１５を過剰発現するＨＥＫ細胞にて発現されるＭｒｇ受容体を、ＦＭＲＦアミドのようなＭｒｇリガンド、および候補とした中和抗体と接触させる。実施例５に記載するように測定されるリガンドに対する応答性の減少は、その候補とした抗体が中和抗体であることを示すであろう。
【０２６３】
ｃ．他のアンタゴニスト
Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２アンタゴニストは、Ｍｒｇまたはｄｒｇ−１２リガンドに限定されない。他のアンタゴニストには、内因性リガンドを結合する能力を保持するが、生物学的応答を媒介することができない天然型Ｍｒｇ受容体または天然型ｄｒｇ−１２受容体の変異体が含まれる。Ｍｒｇリガンドまたはｄｒｇ−１２リガンドを結合する可溶性受容体およびイムノアドヘシンは、結合部位付近のリガンドを特異的に結合し、天然型受容体との相互作用を阻害する抗体であり得るため、アンタゴニストとして用いることができる。これらのアンタゴニストは、上述のアッセイにて同定することができる。
【０２６４】
ｄ．コンピュータモデリング
コンピュータモデリングおよび検索技術は、Ｍｒｇ受容体の発現または活性を調節することができる化合物の同定またはすでに同定した化合物の改良を可能にする。いったんアゴニストまたはアンタゴニストが同定されれば、リガンド結合部位のような活性部位または領域が決定される。活性部位は、当該技術分野で既知の方法を用いて（例えばリガンド結合に対する様々なアミノ酸置換または欠失の影響を決定することにより、あるいはＸ線結晶学のような、その天然リガンドとの関連化合物または組成物の複合体の研究から）同定することができる。
【０２６５】
次に、活性部位の三次元幾何学構造は、例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、化学的架橋または当該技術分野で既知の他の方法により決定される。コンピュータモデリングを利用して、実験結果が明確でない構造に関する予測を立てることができる。分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation, Waltham, MA）である。いったん予測構造が決定されると、活性部位と相互作用することが可能な構造を有する化合物を見つけ出すために、それらの分子構造に関する情報とともに化合物
を含むデータベースを検索することにより、候補とする調節化合物が同定され得る。この検索から見つけ出される化合物は、本発明のタンパク質の活性の潜在的モジュレーターであり、上述のアッセイにて試験することができる。
【０２６６】
上述するように細胞ベースのアッセイにて同定される試験化合物のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性は、動物、例えば以下に詳述するようなＭｒｇ受容体を過剰発現するトランスジェニック動物を用いたアッセイにてさらに解明され得る。一実施形態では、潜在的Ｍｒｇアンタゴニストまたはアゴニストの投与が、有害な刺激または痛みを伴う刺激のような感覚刺激に対するトランスジェニック動物の応答性に及ぼす効果を測定する。かかる化合物の治療上の有用性は、上記のタイプの実験により、あるいは特定障害の動物モデル（例えば、神経障害性の痛みを患う動物モデル）にて試験することにより確認することもできる。
【０２６７】
Ｌ．タンパク質の少なくとも１つの活性を調節する作用物質の使用。
実施例にて提供されるように、本発明のｍｒｇまたはｄｒｇ−１２のタンパク質および核酸は、ＤＲＧの一次侵害受容感覚ニューロンにて発現される。さらに、Ｍｒｇ受容体は、創傷修復の役割を果たす特殊皮膚細胞にて発現される。さらに、Ｍｒｇ受容体に相同的なタンパク質は、眼の小柱網にて発現され、眼圧の調節において役割を果たすと提唱されてきた（Gonzalez et al. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41: 3678−3693 （2000））。したがって、本発明はさらに、本発明のタンパク質の発現または少なくとも１つの活性を調節する、１つまたはそれ以上の作用物質を含む組成物を提供する。例えば、本発明は、Ｍｒｇ受容体を直接活性化するリガンドを提供する。
【０２６８】
アゴニストやアンタゴニストのようなタンパク質や作用物質の発現を増加または減少の方向に調節する作用物質を用いて、タンパク質の機能および活性に関連した生物学的プロセスおよび病理学的プロセスを調節することができる。ＲＦ−アミドペプチドを含むＭｒｇ受容体を活性化する幾つかの作用物質が、実施例にて同定される。したがって、本発明は、神経障害性の痛みを含む痛みのような感覚認識障害を治療する方法、ならびに創傷治癒を促進する方法、損傷後に正常感受性を回復する方法、および眼の症状、特に緑内障のような圧力に関連した症状を治療する方法を提供する。
【０２６９】
図および実施例に記載するように、本発明のタンパク質の発現は、侵害受容の生物学的プロセスに関連し、それらはまた、病理学的プロセスとみなすこともできる。本明細書中で使用する場合、作用物質が、プロセスの度合い、厳格性または種類を変化させる場合、作用物質は、生物学的または病理学的プロセスを調節すると言われる。例えば、痛みのシグナルの神経伝達は、本発明のタンパク質の発現もしくは少なくとも１つの活性を、何らかの方法で、増加、減少、または調節する作用物質の投与により阻止あるいは調節することができる。
【０２７０】
本発明のタンパク質ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストにより治療することができる痛みは、いかなる場合においても限定されず、該痛みとしては、疾患または障害に関連した痛み、組織損傷に関連した痛み、炎症に関連した痛み、任意の種類の有害な刺激に関連した痛み、および末梢神経障害に関連した痛みを含む神経障害性の痛み、ならびに原因が同定できない痛みが含まれる。痛みは、主観的であってもよく、客観的に同定可能な作用または応答と関連する必要はない。
【０２７１】
痛みの治療のほかに、本発明の化合物および方法は、感覚応答を増加または減少させるために有用であり得る。刺激に対する応答性の減少を特徴とする幾つかの病状にて、例えば糖尿病にて、有害な刺激および痛みを伴う刺激を含む刺激に対する応答性を増加させるために有用であり得る。
【０２７２】
痛みおよび末梢神経障害に関連した慢性病状のようなある種の症状、特に欠損Ｍｒｇ遺伝子に起因する症状は、Ｍｒｇ受容体リガンドに対する応答性を増加させることにより利益を得ることができる。したがって、これらの症状は、かかる症状を患う患者の細胞において機能的Ｍｒｇ受容体の数を増加させることによって治療することができる。これは、Ｍｒｇコード核酸を用いた遺伝子治療により細胞中のＭｒｇ受容体の発現を増加することができる。これには、単一治療により持続性効果が達成される遺伝子治療、および発現の増加が一過性である遺伝子治療の両方が含まれる。適切な細胞中のＭｒｇの選択的発現は、組織特異的に、もしくは誘導性プロモーターにより制御されるＭｒｇ遺伝子を使用することにより、または組換えＭｒｇ遺伝子を保有する複製欠陥ウイルスを用いて限局性感染を生じることにより、あるいは当該技術分野において既知の任意の他の方法により達成され得る。
【０２７３】
さらなる実施形態では、過剰なＭｒｇ、Ｍｒｇリガンドに対する過敏症、またはＭｒｇの過剰な活性化を患う患者は、Ｍｒｇ遺伝子コード領域に相当するアンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを有効量投与することにより、したがってＭｒｇの発現を減少させることにより治療され得る。
【０２７４】
本明細書中で使用する場合、哺乳動物が本発明のタンパク質により媒介される病理学的または生物学的プロセスの調節を必要とする限り、治療されるべき被験体は、任意の哺乳動物であり得る。例えば、被験体は、痛みを感じていてもよく、あるいは手術のような痛みを伴う事象を控えている状態であってもよい。本発明は、ヒト被験体の治療にて特に有用である。
【０２７５】
本発明の治療方法にて、本発明のＭｒｇタンパク質、ペプチド断片、Ｍｒｇ変異体、Ｍｒｇアゴニスト、Ｍｒｇアンタゴニストまたは抗Ｍｒｇ抗体のような本発明の組成物を有効量、患者に投与する。
【０２７６】
本発明の作用物質は、単独で、あるいは特定の生物学的または病理学的プロセスを調節する他の作用物質と併用して提供され得る。例えば、本発明の作用物質を、他の既知の薬剤と併用して投与することができ、あるいは１つもしくはそれ以上の他の病理学的プロセスの存在または非存在下にて生じる痛みの治療中に使用される鎮痛薬あるいは非鎮痛薬と併用してもよい。本明細書中で使用する場合、２つまたはそれ以上の作用物質は、２つの作用物質が同時投与されるか、あるいは作用物質が同時に作用するような方法で別個に投与される場合に、併用して投与されると言われる。
【０２７７】
本発明の作用物質は、既知の方法にしたがって、哺乳動物、好ましくはヒト患者に投与される。したがって、本発明の作用物質は、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、脳脊髄内、関節内、滑液包内、鞘内、経皮、局所、吸入または頬経路により投与され得る。それらは、輸液またはボーラス注射により連続的に投与してもよい。一般に、作用物質は、障害が認められる部位へ部位特異的な方法で供給されるべきである。あるいは、経口経路投与を併用してもよい。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もし存在するのであれば同時に施されている治療の種類、治療頻度、および所望の効果の性質に依存するであろう。
【０２７８】
本発明の作用物質の毒性および治療上の有効性は、細胞培養または実験動物にて標準的薬学的手法により決定することができる。有毒な副作用を示す作用物質が使用され得る限りは、副作用を低減するために、所望の作用部位へかかる化合物を特異的に供給できる供給系を設計することに注意を払うべきである。
【０２７９】
個々の必要性が様々であると同時に、各成分の有効量の最適範囲の決定は、当該既知技術の範囲内である。疾患の予防または治療に関して、作用物質の適切な投薬量は、治療されるべき疾患の型、疾患の重篤性および経過、作用物質が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、これまでの治療、患者の臨床的病歴および作用物質に対する応答、ならびに主治医の判断に依存するであろう。治療上の薬剤は、一度に、または一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。典型的な投薬量は、０．１〜１００μｇ／ｋｇ体重よりなる。好ましい投薬量は、０．１〜１０μｇ／ｋｇ体重よりなる。最も好ましい投薬量は、０．１〜１μｇ／ｋｇよりなる。症状によっては、数日またはそれ以上にわたる反復投与によって、病状の望ましい抑制が起きるまで治療が続けられる。この療法の経過は、従来の技術および従来のアッセイにより簡単にモニターされる。
【０２８０】
薬理学的に活性な作用物質のほかに、本発明の組成物は、作用部位へ供給するために薬学的に使用され得る調製物へと活性化合物を加工しやすくする賦形剤および助剤を含む、薬学的に許容可能な適切なキャリアを含み得る。非経口投与のための適切な配合物としては、水溶性形態、例えば水溶性塩のような活性化合物の水性溶液が挙げられる。さらに、適切な油状注射懸濁液としての活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適切な親油性溶媒または媒質としては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよく、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが挙げられる。任意に、懸濁液はまた、安定剤を含有してもよい。細胞へ供給するために、作用物質を被包するためのリポソームを使用することもできる。作用物質はまた、タンパク質を含む固形疎水性ポリマーの半透性支持体を含む、持続的放出性配合物として調製することもできる。持続的放出性調製物は、ゲル、フィルムまたはカプセルの形態をとり得る。
【０２８１】
本発明による全身投与のための薬学的配合物は、経腸、非経口または局所投与用に配合され得る。実際には、３つのタイプすべての配合物は、有効成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。
【０２８２】
経口投与に適切な配合物としては、硬質または軟質ゼラチンカプセル、丸剤、被覆錠剤を含む錠剤、エリキシル、懸濁液、シロップまたは吸入薬、およびそれらの制御放出性形態が挙げられる。
【０２８３】
本発明の方法を実施する際、本発明の化合物は、単独で、あるいは他の治療薬または診断薬と併用して使用することができる。ある好ましい実施形態では、本発明の化合物は、一般に受け入れられている医学上の実践にしたがって、これらの症状のために典型的に処方される他の化合物と一緒に同時投与されてもよい。本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏにて、通常、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスのような哺乳動物にて、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏにて利用され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで使用される場合、化合物は、滅菌性でなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０２８４】
ａ．製品
本発明の別の実施形態では、上述の障害の治療に有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器および、容器上のまたは容器に付随したラベルもしくは添付文書（複数可）を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成され得る。容器は、症状を治療するために効果的な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針により突き刺すことが可能なストッパーを有する静脈溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性な作用物質は、Ｍｒｇア
ゴニストである。ラベルまたは添付文書は、組成物が、感覚認識障害を治療する、例えば神経障害性の痛みを低減するような選ばれた症状を治療するために使用されることを示す。一実施形態では、ラベルまたは添付文書は、Ｍｒｇアゴニストを含む組成物が、痛み、緑内障を治療するために、あるいは創傷治癒を促進するために使用できることを示す。
【０２８５】
Ｍ．トランスジェニック動物
ｍｒｇおよび／またはｄｒｇ−１２配列に相当する突然変異遺伝子、ノックアウト遺伝子または改変遺伝子を含有するトランスジェニック動物もまた本発明に含まれる。トランスジェニック動物は、組換え遺伝的物質、外因性遺伝的物質またはクローン化遺伝的物質を実験的に移入した遺伝子改変動物である。かかる遺伝的物質は、多くの場合「導入遺伝子」と命名される。導入遺伝子の核酸配列、この場合、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６または２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６または１０８の形態が、特定の核酸配列が他の位置では通常は見出されないゲノムの位置にて、あるいは導入遺伝子用の正常な位置にて組み込まれ得る。さらに導入遺伝子は、非機能性変異体をコードし得る。導入遺伝子は、標的動物種と同一種または異種のゲノムに由来する核酸配列から構成され得る。
【０２８６】
「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、遺伝的改変または遺伝情報が生殖細胞系に導入され、それによりトランスジェニック動物が遺伝情報を子孫に伝えるための能力が付与されたトランスジェニック動物を指す。実際にかかる子孫がその改変または遺伝情報のいくらかまたは全てを保有する場合、それらもまたトランスジェニック動物である。
【０２８７】
改変または遺伝情報は、レシピエントが属する動物種にとって外来性であってもよく、特定の個々のレシピエントにとってのみ外来性であってもよく、あるいはレシピエントがすでに保有している遺伝情報であってもよい。最後の場合では、改変遺伝子または導入遺伝子は、天然型遺伝子と異なって発現され得る。
【０２８８】
トランスジェニック動物は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、胚幹細胞における遺伝子ターゲティング、ならびに組換えウイルス感染および組換えレトロウイルス感染を含む種々様々な方法により生産され得る（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、米国特許第５，６０２，３０７号、Mullins et al.
Hypertension 22（4）:630−633 （1993）、Brenin et al. Surg. Oncol. 6（2）99−110 （1997）、Tuan （ed.）, Recombinant Gene Expression Protocols, Methods in Molecular Biology No. 62, Humana Press （1997）を参照）。
【０２８９】
活性発癌遺伝子配列を発現するマウス（米国特許第４，７３６，８６６号）、サルＳＶ４０ Ｔ抗原を発現するマウス（米国特許第５，７２８，９１５号）、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現を欠如したマウス（米国特許第５，７３１，４９０号）、ドーパミン作動性機能不全を示すマウス（米国特許第５，７２３，７１９号）、血圧制御に関与した少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するマウス（米国特許第５，７３１，４８９号）、天然のアルツハイマー病に現れる症状に対して非常に類似性を示すマウス（米国特許第５，７２０，９３６号）、細胞接着を媒介する能力が低減したマウス（米国特許第５，６０２，３０７号）、ウシ成長ホルモン遺伝子を保有するマウス（Clutter et al.
Genetics 143（4）: 1753−1760 （1996））、または完全ヒト抗体反応を生じることができるマウス（McCarthy The Lancet 349 （9049）: 405 （1997））を含む多くの組換えマウスまたはトランスジェニックマウスが生産されている。
【０２９０】
マウスおよびラットは、ほとんどのトランスジェニック実験にとって一般的に好まれる動物であるものの、場合によっては、代替的動物種を使用することが好ましいか、あるいは代替的動物種の使用が必要でさえある。トランスジェニック手法は、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよびモルモットを含めた種々の非マウス動物において首尾よく利用されてきた（例えば、Kim et al.
Mol. Reprod. Dev. 46（4）: 515−526 （1997）、Houdebine Reprod. Nutr. Dev. 35 （6） 609−617 （1995）、Petters Reprod. Fertil. Dev. 6（5）: 643−645 （1994）、Schnieke et al. Science 278 （5346）: 2130−2133 （1997） およびAmoah J. Animal Science 75（2）: 578−585 （1997）を参照）。
【０２９１】
組換えコンピテント哺乳動物細胞に核酸断片を導入する方法は、複数の核酸分子を同時に形質転換するために好都合な任意の方法を用いることができる。米国特許第５，４８９，７４３号および米国特許第５，６０２，３０７号での開示を含むトランスジェニック動物を生産する詳細な手法は、当業者に容易に利用可能である。
【０２９２】
特定のＭｒｇまたはｄｒｇ−１２遺伝子を欠如したマウス、あるいは特定のＭｒｇまたはｄｒｇ−１２の発現が増加または減少したマウスは、Ｍｒｇが感覚応答、特に痛みを伴う刺激に対する応答を含む行動にどのように影響を及ぼすかを決定するためのアッセイにて使用することを企図する。特に、トランスジェニックマウスは、Ｍｒｇが機械的、熱的または化学的といった特定型の有害な刺激に対する応答を媒介するかどうかを決定するために使用されるであろう。したがって、一実施形態では、天然型Ｍｒｇ受容体を欠如したトランスジェニックマウス、またはＭｒｇ受容体発現レベルが改変されたトランスジェニックマウスは、圧力、温度、および他の有害な刺激に対するそれらの感受性を決定するために試験されるであろう。刺激に対する感受性を決定するためのアッセイは、当該技術分野で既知である。これらとしては、機械的な痛み（フォン・フライ毛またはテイルピンチ）、熱による痛み（ホットプレートアッセイにて全速力で動くか、または飛び回るための潜伏期間）、化学的な痛み（カプサイシンまたはホルマリンのような有害な物質が脚に注射される場合の、全速力で動くための潜伏期間）、内臓の痛み（酢酸の腹腔内注射に応答した腹部ストレッチング）、および神経障害性の痛みに対する応答性を測定するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、１つまたはそれ以上のＭｒｇが欠失されたマウスは、様々な強度の様々な痛みを伴う刺激に対するそれらの応答性に関して試験されるであろう。Ｍｒｇ受容体により媒介される感覚応答を決定することにより、Ｍｒｇ受容体を刺激または抑制することが知られている治療薬が、これらのタイプの応答を含むことが知られている病状の治療のために選択され得る。さらに、これらの応答を含む疾患の治療を特異的にねらった治療薬は、Ｍｒｇ受容体を標的とすることにより開発され得る。
【０２９３】
一実施形態では、１つまたはそれ以上のヒトＭｒｇタンパク質を発現するトランスジェニックマウスが生産される。次に、ヒトＭｒｇタンパク質の発現パターンを決定することができ、様々な感覚様式に対するヒトＭｒｇタンパク質の発現の効果を研究することが可能である。さらに、これらのマウスにおいて、潜在的治療薬の有効性を研究することができる。
【０２９４】
さらに、特定のＭｒｇタンパク質の発現レベルの変化の影響は、病状の動物モデルにて研究することができる。Ｍｒｇ受容体レベルおよび活性化を増加または減少させることによる影響を同定することにより、疾患を治療するために有用な治療方法を開発することができる。一実施形態では、Ｍｒｇ受容体発現レベルが増加または減少したマウスは、神経障害性の痛みのモデルにて試験される。
【０２９５】
さらに、Ｍｒｇ発現レベルを操作したマウスは、鎮痛薬のような、痛みに対する応答性を調節することが知られている化合物に対する応答能力に関して試験することができる。このようにして、さらに、痛みの感知におけるＭｒｇの役割が解明され得る。例えば、Ｍｒｇを欠如したトランスジェニックマウスにおける既知の鎮痛薬に対して応答がなければ、Ｍｒｇ受容体が鎮痛薬の作用を媒介する役割を果たすことを示すであろう。
【０２９６】
別の好ましいトランスジェニックマウスは、Ｍｒｇ遺伝子がグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなマーカーまたはトレーサーを発現するように改変されるものである。マーカーまたはトレーサーの発現パターンを検査することにより、Ｍｒｇを含有するニューロンおよび他の細胞の正確な位置および投影がマッピングされ得る。この情報を、特定の病状における関与がすでに同定されているニューロンおよび他の細胞の位置および投影と比較する。このようにして、本発明の化合物が治療において使用される可能性がさらに高まり得る。
【０２９７】
Ｎ．診断方法
実施例にて記載するように、本発明の遺伝子およびタンパク質は、感覚ニューロン、および感覚ニューロンにおける生物学的もしくは病理学的活性の存在または非存在を診断あるいはモニターするために使用することができる。例えば、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現を観察して、急性の痛み、慢性難治性の痛み、または異痛症に関連した感覚神経活性が正常か異常かを区別することができる。発現レベルは、神経異常の様々な段階または重篤性を区別するために使用することができる。本発明の核酸分子またはタンパク質を用いて、痛みの伝達に関与した感覚ニューロンの病理学的状態を診断する一手段は、生存被験体から組織を得ることを含む。これらの被験体は、痛みを患う非ヒト動物モデルであり得る。
【０２９８】
分子生物学的ツールの使用は、法医学的技術において日常的になってきた。例えば、核酸プローブは、法医学的／病理学的検体において、本発明の配列のすべてまたは少なくとも一部を含む核酸分子の発現を決定するために使用してもよい。さらに、核酸アッセイは、転写プロファイリング分析を実施する任意の手段により実行され得る。核酸分析のほかに、本発明の法医学的方法は、遺伝子発現の増大または減少の調節を決定するために、本発明のタンパク質を標的とし得る（Shiverick et al., Biochim Biophys Acta 393 （1）: 124−33 （1975））。
【０２９９】
本発明の方法は、組織をコラゲナーゼまたは他のプロテアーゼで処理し、細胞溶解しやすい組織を作製することを含み得る（Semenov et al., Biull Eksp Biol Med 104（7）: 113−6 （1987））。さらに、分析用の腎組織または他の組織の種々の領域から生検試料を得ることが可能である。
【０３００】
本発明の核酸またはタンパク質分子を検出するためのアッセイは、任意の利用可能な形式であり得る。核酸分子用の典型的なアッセイとしては、ハイブリダイゼーションベース、またはＰＣＲベースのアッセイが含まれる。本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの検出のための典型的なアッセイには、ｉｎ ｓｉｔｕ結合アッセイ等のような任意の利用可能な形式での抗体プローブの使用が含まれる。Harlow et al., Antibodies:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 ans Section Gを参照されたい。好ましい実施形態では、アッセイは、適切な対照とともに実行される。
【０３０１】
上記方法はまた、他の組織または器官における病状を検出するためのプロトコルおよび方法を含む他の診断プロトコルにおいて使用することもできる。
【０３０２】
Ｏ．一次侵害受容感覚ニューロンにおいて発現される他の遺伝子を同定する方法。
実施例に記載するように、本発明のｍｒｇ遺伝子およびｄｒｇ−１２遺伝子は、野生型のＤＲＧにて発現されるが、Ｎｇｎ１突然変異マウスのＤＲＧでは発現されない遺伝子を濃縮させ、抑制ＰＣＲベースの方法（Clontech）を用いて、ＲＮＡ同定した。この一般的な方法を用いて、ＤＲＧニューロンの侵害受容サブセットの発達または存在に必要な他の遺伝子を発現しないトランスジェニックマウスを生産することにより他のＤＲＧ特異的遺伝子を同定および単離することができる。例えば、ＴｒｋＡ-/-マウスは、侵害受容ＤＲＧニューロンに関連した他の遺伝子を単離するために、本発明の方法において使用することができる（Lindsay Philos. Trans R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 351 （1338）: 365−73 （1996）、およびWalsh et al. J. Neurosci. 19（10）: 4155−68を参照）。
【０３０３】
さらなる説明がなくても、先述の説明および以下の例示的な実施例を用いて、当業者は、本発明の化合物を作製および利用することができ、また特許請求した方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実用的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘し、いかなる場合においても本開示の残部を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０３０４】
侵害受容に関与する候補遺伝子を同定するための、野生型ＤＲＧおよびＮｇｎ１-/-ＤＲＧ間のポジティブ選択によるディファレンシャルハイブリダイゼーション。
これまでの研究は、ｂＨＬＨ転写因子であるニューロゲニン１（Ｎｇｎ１）（Ma et al. Cell 87: 43−52 （1996））が、後根神経節（ＤＲＧ）における侵害受容感覚ニューロンの細胞の予定運命の決定に必要であることを示した（Ma et al. Genes & Dev. 13: 1717−1728 （1999））。Ｎｇｎ１-/-突然変異マウス胚において、全部ではないがほとんどのｔｒｋＡ+ニューロン（これは、侵害受容サブクラスを含む）は生成されていない。この突然変異体の表現型を利用して、新生期野生型ＤＲＧおよびＮｇｎ１-/-ＤＲＧからｃＤＮＡをとることにより、かかるニューロンにて特異的に発現される遺伝子を単離した。野生型ＤＲＧのｃＤＮＡ集団では発現されるが、Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧのｃＤＮＡ集団では発現されない遺伝子は、ｔｒｋＡ+侵害受容ニューロンに特異的である。
【０３０５】
新生児野生型マウスまたはＮｇｎ１-/-マウスの後根神経節（ＤＲＧ）から全ＲＮＡを単離した（Ma et al. Genes Develop. 13: 1717−1728（1999）, Fode et al. Neuron 20: 483−494 （1988）、およびMa et al. Neuron 20:469−482 （1988）を参照）。次に、抑制ＰＣＲベースの方法（Clontech）を用いて、野生型ＤＲＧでは発現されるが、Ｎｇｎ１突然変異ＤＲＧでは発現されない遺伝子を濃縮した。簡潔に述べると、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Gibco）を使用して、オリゴｄＴプライマーを用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＳｍａｒｔＰＣＲ増幅キット（Clontech）を用いて増幅した。増幅した野生型ＤＲＧ ｃＤＮＡおよびＮｇｎ１-/-ＤＲＧ ｃＤＮＡを、ＰＣＲセレクトサブトラクティブハイブリダイゼーションプロトコル（Clontech）にて、それぞれテスターおよびドライバーとして使用した。ドットブロット分析によるディファレンシャルスクリーニングにより、Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧ由来のｃＤＮＡと比べて、野生型ＤＲＧ由来のｃＤＮＡが濃縮された幾つかのクローンを同定した。これらのクローンを、ヌクレオチドシーケンシングおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりさらに分析した。
【０３０６】
約１，６００個の陽性の遺伝子が、最初のスクリーニングによって同定され、これらのうち１４２個をシーケンシングした。これらのうち５０個が既知の遺伝子を表し、９２個が新規遺伝子を表した（表２を参照）。既知の遺伝子の中に、侵害受容感覚ニューロンにて特異的に発現される幾つかのシグナル伝達分子が存在した。これらには、ＶＲ−１、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、テトロドトキシン非感受性ナトリウムチャネル（ＳＮＳ−ＴＴＸｉ）およびジアシルグリセロールキナーゼが含まれていた。新規遺伝子の中には、イオンチャネルまたは受容体に特徴的な構造的特徴を有する幾つかのコー
ドタンパク質が存在し、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりＤＲＧ感覚ニューロンのサブセットにて特異的に発現されることが明らかとなった。これらの分子について実施例２および３にてさらに詳述する。
【０３０７】
【表１】
2006504641.tif 000002
【実施例２】
【０３０８】
侵害受容感覚ニューロンにおいて特異的に発現される推定Ｇタンパク質共役受容体の新規ファミリー。
スクリーニングにより単離された新規遺伝子の中に、Ｇタンパク質共役受容体の特徴である７つの膜貫通セグメント（配列番号１）を有する受容体タンパク質をコードする２つの別個のクローンが存在した。単離した新規の７つの膜貫通受容体は、発癌遺伝子（ｍａｓ）に最も密接に関連しており、したがって、ｍａｓ関連遺伝子−３（ｍｒｇ３）と命名した。ｍｒｇ３はまた、ｍａｓ関連遺伝子Ａ１、すなわちＭｒｇＡ１としても知られている。ｍｒｇ３に関する完全コード配列を、ゲノムＤＮＡ配列から推定した（図１Ａおよび配列番号２）。ＭｒｇＡ１は、ＭＡＳ１に対して有意な相同性（３５％同一性）を示す（Young et al. Cell 45: 711−9 （1986）。それはまた、Ｍａｓ関連遺伝子１（ＭＲＧ１）（Monnot et al. Mol Endocrinol 5: 1477−87 （1991））およびラット胸大動脈（ＲＴＡ）（Ross et al. Proc Natl Acad Sci USA 87:3052−6 （1990））と呼ばれる２つの他の哺乳動物ＧＰＣＲと有意な相同性（３０〜３５％同一性）を共有する。
【０３０９】
かかるＧタンパク質共役受容体は、嗅覚ニューロンおよび味覚ニューロンのような他の種類の感覚ニューロンにて発現されるが、この種類の分子は、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）を除いて、ＤＲＧ感覚ニューロンに関して、これまでに報告されてない。
【０３１０】
プローブとしてｍｒｇ３ＤＮＡを用いて、マウスＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリーおよびマウスゲノムライブラリーをさらにスクリーニングすることにより、ｍｒｇ４（ＭｒｇＡ２）、ｍｒｇ５（ＭｒｇＡ３）、ｍｒｇ６、ｍｒｇ７、ｍｒｇ８（ＭｒｇＡ４）、ｍｒｇ９（ＭｒｇＡ５）、ｍｒｇ１０（ＭｒｇＡ６）、ｍｒｇ１１（ＭｒｇＡ７）、およびｍｒｇ１２（ＭｒｇＡ８）と命名される、密接に関連した９個の遺伝子をさらに同定した。それらのうち、ｍｒｇ４、ｍｒｇ５およびｍｒｇ８〜１２は、完全長オープンリーディング
フレームを含む（図１を参照）。ブラストプログラムを用いてデータベースを検索することにより、２つのヒト相同体が見出された。８個のｍｒｇ遺伝子、すなわちｍｒｇ３〜８およびヒト１〜２のタンパク質アラインメントは、それらが新規Ｇタンパク質共役受容体遺伝子ファミリーを規定することを示唆した（図１Ａ）。
【０３１１】
特に、Ｐ０マウスＤＲＧ ｃＤＮＡライブラリーからＭｒｇＡ１〜４を単離し、フィルター上に配列したマウスゲノムＢＡＣライブラリー（Incyte Genomics）からＭＲＧ Ａ５〜８の全ＯＲＦを含有するクローンを単離した。図６Ａは、ＭｒｇＡ１〜８のポリペプチド配列のアラインメントを示し、膜貫通ドメインならびに細胞質および細胞外ループを示す。さらに、クエリーとしてＭｒｇＡ１を用いて、ＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用してCeleraマウスおよびヒト（Venter et al. Science 291: 1304−51 （2001））ゲノムデータベースを検索することにより、他のマウスＭｒｇＡ配列、ならびに他のヒトＭｒｇ配列を同定した。表３は、ＭｒｇＡ遺伝子が互いに高度に相同性であることを示す。ある特徴的な保存残基の存在と組み合わせて、高度の相同性は、それらがＧＰＣＲのＭＡＳファミリーの新規サブファミリーを規定することを示す。
【０３１２】
マウスＭｒｇファミリーの遺伝子をさらに同定するために、クエリーとしてＭＲＧＡ１およびＭＲＧＡ４タンパク質配列を用いて、Celeraマウス断片データベース（２００１年１月７日掲載、１８，２５１，３７５個の断片）に対してＴＢＬＡＳＴＮ検索を実行した。これらの検索により、２９９個の特有のマウスゲノムＤＮＡ断片を同定した。これらの断片の配列をダウンロードし、ストリンジェントな条件下でＧＥＬＭＥＲＧＥ（GCG Wisconsin Package）を用いてコンティグを構築した（９０％同一性、２０ｎｔ最小重複）。ＧＥＬＭＥＲＧＥを再び実行して（８０％同一性、２０ｎｔ最小重複）、さらにデータセットを絞りこんだ。次に、各コンティグからのコンセンサスヌクレオチド配列を、ＢＬＡＳＴＮを用いてCeleraマウス断片データベースに対して照会し、構築のためのさらなる配列を同定した（最終ｎ＝５３６の断片）。最終構築からのコンセンサス配列をＦＡＳＴＡフォーマット済データベースに入れた。次に、クエリーとしてＭＲＧＡ１を用いてＴＦＡＳＴＹによりこのデータベースを検索して、変異性のゲノム配列がタンパク質へ終止コドンまたはフレームシフトを導入したかどうかに関わらず、各コンセンサス配列からの潜在的コード領域を同定した（Pearson, W.R. （1999）. Flexible similarity searching with the FASTA3 program package. In Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener and S.A. Krawetz, eds. （Totowa, NJ: Humana Press）, pp. 185−219）。次に、これらの検索からのタンパク質配列を、系統学的分析のために単一ＦＡＳＴＡフォーマット済ファイルに結集させた。
【０３１３】
この分析を用いて、マウスＭｒｇＡサブファミリーの１６個のさらなる遺伝子を同定した（図６Ｂ）。このサブファミリーのほかに、ＭｒｇＢおよびＭｒｇＣと呼ばれる２つの密接に関連したＭｒｇサブファミリーもまた発見された（図６Ｂ）。マウスＭｒｇＢ遺伝子におけるＯＲＦの存在を確認するために、高性能のＰＣＲを用いて、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスゲノムＤＮＡからｍＭｒｇＢ１〜５、ｍＭｒｇＤ、およびｍＭｒｇＥを増幅した。幾つかの別個のクローンをシーケンシングし、ＯＲＦ予測を確認した。構築したCelera配列における数多くの終止コドンおよびフレームシフトの存在は、ｍＭｒｇＣ遺伝子が偽遺伝子であることを示した。
【０３１４】
ＭｒｇＢサブファミリーが１４個の遺伝子を含むのに対し、ＭｒｇＣは１２個の遺伝子を有する。これらのサブファミリーそれぞれの間の配列同一性パーセントは、５０％よりも大きい（表３）。際立って、１２個のＭｒｇＣの遺伝子すべてが、複数の早発性終止コドン、早発性フレームシフト突然変異、またはその両方を含有するため、すべて偽遺伝子のようである（図１Ｂ、“Ψ”）。したがって、総合して、ＭｒｇＡおよびＭｒｇＢサブファミリーは、３６個の完全長ＯＲＦを含む。
【０３１５】
【表２】
2006504641.tif 000003
【０３１６】
タンパク質配列間の同一性パーセント（右上、太字）および類似性パーセント（左下）を示す。「ｈＭＲＧ」は、ヒトＭＲＧアミノ酸配列を示し、「ｍＭＲＧ」は、マウスＭＲＧ配列を示す。「ｈＭＲＧＸ」は、ｍＭＲＧＡおよびｍＭＲＧＢ配列のヒト相同体を示すために使用される（図１Ｂ）。値は、ＧＣＧパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いた包括的なアラインメントから得た値である。
【０３１７】
ＢＬＡＳＴ（Altschul et al. Journal of Molecular Biology 215: 403−410 （1990））およびHidden Markovモデル（ＨＭＭ（Eddy. Bioinformatics 14, 755−63 （1998））の両方を用いたCelera（Venter et al. Science 291: 1304−51 （2001））およびパブリック（Consortium. Nature 409: 860−921 （2001））ゲノム配列データベースの検索により、４個の密接に関連した（「〜５０％同一性」）完全長ヒト遺伝子、および少なくとも１０個のヒト偽遺伝子が明らかとなった。簡潔に述べると、クエリーとしてｍＭｒｇＡ１タンパク質配列を用いて、Celeraヒトゲノムデータベース（Venter et al. Science 291: 1304−51 （2001））に対してＴＢＬＡＳＴＮ検索を実行した。この検索にて同定されるゲノム配列をダウンロードし、ＦＡＳＴＡフォーマット済データベースに入れて、ＴＦＡＳＴＹを用いて検索して、タンパク質の非重複性セットを同定した。ｈＭｒｇＸ３、ｈＭｒｇＥ、およびｈＭｒｇΨ８を除いて、パブリックヒトゲノム配列（Consortium. Nature 409: 860−921 （2001））の同様の分析から、すべてのヒトＭｒｇが別個に同定された。ヒトＭｒｇＸ１〜４配列は、遺伝子を含有するヒトＢＡＣクローンに由来するＰＣＲ増幅産物から別個に立証された。
【０３１８】
明確なオルソロガス対がない状態にて、ヒト遺伝子は、系統樹によるとＭｒｇＢサブファミリーよりもマウスＭｒｇＡサブファミリーに類似しているように見える（図６Ｂ、ｈＭｒｇＸ１〜４）が、本発明者等は、現段階でヒト遺伝子をｈＭｒｇＸ遺伝子と称する。ＭｒｇＡ、ＢおよびＣサブファミリーのほかに、本発明者等がＭｒｇＤ〜Ｆと命名したものを含む多数のさらなるＭａｓ−１関連オーファンＧＰＣＲがこの検索により同定された（図６Ｂ）。ＭｒｇＤのようなこれらの配列の幾つかは、明確なヒトオルソログを有する（図６Ｂ、ｈＭｒｇＤ）。ｈＭｒｇＤおよびｍＭｒｇＤは、タンパク質レベルでは５８％の同一性を有し、７３％の類似性を有していて、一方、ヌクレオチドレベルでは７３％の同一性を有する。まとめて、本発明者等は、このファミリーに属するほぼ４５個のマウスの、および９個のヒトの完全コード配列を同定した。
【０３１９】
【表３】
2006504641.tif 000004
【０３２０】
タンパク質配列間の同一性パーセント（右上、太字）および類似性パーセント（左下）を示す。「ｈＭＲＧ」は、ヒトＭＲＧアミノ酸配列を示し、「ｍＭＲＧ」は、マウスＭＲＧ配列を示す。「ｈＭＲＧＸ」は、ｍＭＲＧＡおよびｍＭＲＧＢ配列のヒト相同体を示すために使用される（図１Ｂ）。値は、ＧＣＧパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いた包括的なアラインメントから得られた。
【０３２１】
ＭＲＧ受容体は、外見上シグナルペプチドのない、短い（３〜２１アミノ酸）Ｎ末端を有し、細胞外に位置すると予測される。膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、高度に保存され、受容体が共有機能を有することを示唆する。ＭＲＧＡファミリー受容体のほとんどの多岐にわたる領域は、細胞外ループに局在化しているようであり（図６Ａ）、これらの受容体が、異なるリガンド、あるいは同一リガンドであっても異なる親和性を有する
リガンドを認識することを示唆する。興味深いことに、本発明者等は、マウス株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊおよび１２９ＳｖＪ間のＭｒｇＡ１コード配列において１２個の一塩基多型を同定した。これらの１２個の変化は、６個のアミノ酸置換を生じる結果となり、それらすべては、保存的であるか、または他のファミリー遺伝子により同じ位置にて発現される置換残基であった。
【０３２２】
巨大マウスゲノムコンティグを、ＭｒｇＡ配列を含有する重複ＢＡＣクローンを分析することにより構築した（図６Ｃ）。このコンティグには、３個の偽遺伝子を含む７個のＭｒｇＡ遺伝子が存在していた。かかるクラスター形成は、ＧＰＣＲコード遺伝子ファミリーの共通の特徴である（Xie et al. Mamm Genome 11: 1070−8 （2000））。際立って、ヒトＭｒｇ遺伝子すべて（Ｍａｓ１およびＭｒｇ１を除く）は、第１１番目染色体に位置し、それらはまた、ヒト嗅覚受容体遺伝子すべての５０％を含有する。マウスＢＡＣコンティグ（図６Ｃ）におけるＭｒｇＡ遺伝子の全ては、多くの他のＧＰＣＲコード遺伝子と同様に、Ｎ末端メチオニンを有する完全長ＯＲＦをコードする。Celeraマウスゲノムデータベースを用いて、各ＭｒｇＡコード領域に隣接する配列を獲得および分析した。この分析により、少なくとも６個のＭｒｇＡ遺伝子がそれらのコード配列の〜６５０ｂｐ下流に位置するＬ１レトロトランスポゾン配列を有することが明らかとなった（図６Ｂ、「Ｌ１」で示す）。
【０３２３】
８個の完全長ｍａｓ関連遺伝子ｍｒｇ３〜５、およびｍｒｇ８〜１２のすべては、ｎｇｎ１-/-突然変異ＤＲＧにて排除されるＤＲＧ感覚ニューロンのサブセットにおいてそれらが発現されることから示されるように、侵害受容感覚ニューロンにて濃縮される（図２および図２Ａ）。
【実施例３】
【０３２４】
侵害受容感覚ニューロンにて特異的に発現される新規の２つの膜貫通セグメントタンパク質。
このスクリーニングにて単離される別の新規遺伝子ｄｒｇ１２（配列番号１３）は、２つの推定膜貫通セグメントを有するタンパク質をコードする（配列番号１４）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ｍｒｇ遺伝子と同様に、この遺伝子ｄｒｇ１２もまたＤＲＧ感覚ニューロンのサブセットにおいて特異的に発現されることを示す。このタンパク質とデータベース中の他の配列との間に明白な相同性は存在しないが、侵害受容感覚ニューロンにて特異的に発現される２つのプリン受容体（Ｐ2Ｘ2およびＰ2Ｘ3）が、類似した二連膜貫通トポロジーを有することは注目に値する。したがって、ｄｒｇ１２はまた、侵害受容感覚伝達またはその調節に関与した受容体あるいはイオンチャネルをコードすると思われる。ｄｒｇ１２ヒト配列（配列番号１９）の相同領域の疎水性を、図４のｄｒｇ１２マウス配列の相同領域の疎水性と比較する。
【実施例４】
【０３２５】
ｍｒｇおよびｄｒｇ−１２遺伝子は、侵害受容感覚ニューロンにて特異的に発現される。
ｍｒｇファミリー遺伝子およびｄｒｇ−１２遺伝子に関する機能は、以下に記載するようなリガンドの同定を考慮しつつ、それらの構造および発現パターンに基づいて、予測される。Ｍｒｇタンパク質がＤＲＧニューロンにて発現されるかどうかを決定するために、ジオキシゲニン（dioxygenin）標識リボプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。簡潔に述べると、Ｐ０マウスの子から組織を得て、４％パラホルムアルデヒド中にて４℃で一晩固定し、３０％ショ糖中で一晩凍結保護し、ＯＣＴ中に包埋した。組織切片を１８μｍにて低温維持装置上で横方向に切断した。ｃＲＮＡプローブを用いて、これまでに記載されたように、凍結切片に関して非同位体性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した（Ma et al. Cell 87: 43−52 （1996）; Perez et al. D
evelopment 126: 1715−1728 （1999））。８個のＭｒｇＡ、５個のＭｒｇＢおよびＭｒｇＤをプローブとして使用した。少なくとも１０個のＤＲＧを分析して、各プローブに関して陽性であるニューロン数を計数した。
【０３２６】
８個のＭｒｇＡ（ＭｒｇＡ１〜８）すべてを含むＭｒｇおよびｄｒｇ１２遺伝子は、マウスの後根神経節（ＤＲＧ）における小径感覚ニューロンのサブセットにて発現される（図７Ｂ〜図７Ｉ）。重要なことに、８個すべてのＭｒｇＡの発現は、差し引きハイブリダイゼーションスクリーニングのパターンと合致して、Ｎｇｎ１-/-動物のＤＲＧにて事実上存在しなかった（図７Ｊ）。検査した８個のＭｒｇＡクローンの中で、ＭｒｇＡ１は、ＤＲＧ中の感覚ニューロン内で最も広範に発現する（１３．５％）。他のＭｒｇＡは、ＤＲＧ切片中の数個の細胞にて発現されるだけである（０．２〜１．５％の範囲のＤＲＧニューロン）。この存在量の差によって、ＭｒｇＡ１のみがオリジナルのスクリーニングによって単離された理由が説明できる。ＭｒｇＡ１〜８の発現パターンの明らかな差異は、異なる軸レベルからのＤＲＧにて認められなかった。身体のいかなる他の組織においても、またはこれまで検査した神経系のいかなる他の領域においても、これらの遺伝子の発現がこれまでは検出されなかったという点で、この発現は非常に特異的である。
【０３２７】
ＭｒｇＡ遺伝子と同様に、ＭｒｇＤもまた、ＤＲＧ感覚ニューロンのサブセットにて特異的に発現する（以下を参照、図１５）。対照的に、ＭｒｇＢ１〜５は、ＤＲＧにて発現が検出できなかった。しかしながら、ｍＭｒｇＢ１発現は、新生児マウスの皮膚の表皮層中の、ならびに脾臓および顎下腺中の散乱細胞にて観察された（図１３および図１４）。これらの細胞は、創傷修復において役割を果たす免疫細胞のようである。ｍＭｒｇＢ２もまた、この発現パターンを示す。対照的に、ｍＭｒｇＢ３、ｍＭｒｇＢ４およびｍＭｒｇ５は、これらの組織のいずれにおいても発現されないようである。
【０３２８】
ノーザンブロット分析を用いて、ヒトＭｒｇＤは、ヒト後根神経節ニューロンにおいて発現されることが見出された。ヒトＤＲＧニューロン由来の総ＲＮＡ２０μｇを含有するノーザンブロットを、ヒトＭｒｇＤプローブとハイブリダイズさせて、４．４ｋｂの転写物が検出された。さらなる分析により、ヒトＭｒｇＤは、ヒト脳、心臓、骨格筋、胸腺、結腸、膵臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺または末梢血白血球では発現されないことが示された。したがって、ｍＭｒｇＤと同様に、ヒトＭｒｇＤは、痛みの感覚ニューロンに非常に制限された発現を示す。さらに、データは、マウスＭｒｇＤおよびヒトＭｒｇＤが機能的オルソログであることを示す。
【０３２９】
これらの結果は、Ｍｒｇおよびｄｒｇ１２遺伝子が一次感覚ニューロンにて発現されることを示す。しかしながら、ＤＲＧは、種々のタイプの感覚（例えば、熱、痛み、触覚および体位）を助長する種々の種類のニューロンを含む。Ｎｇｎ１突然変異は、個々のマーカーｔｒｋＡ、ＶＲ−１およびＳＮＳ−ＴＴＸｉの発現により同定されるＤＲＧニューロンの侵害受容（有害な刺激感覚）サブセットのそれぞれを独立して、大部分または完全に排除することが知られている（Ma et al. Genes & Dev. 13:1717−1728 （1999））ため、ｍｒｇファミリーおよびｄｒｇ１２遺伝子を発現するニューロンがＮｇｎ１-/-ＤＲＧにおいて大部分または完全に排除されるという事実により個々の同定がされる（図２）。したがって、Ｎｇｎ１-/-突然変異ＤＲＧにおけるｍｒｇおよびｄｒｇ−１２発現ニューロンの損失は、これらの遺伝子が侵害受容感覚ニューロンにて発現される可能性が非常に高いことを示す。他の種類の少数の感覚ニューロン（ｔｒｋＢ+およびｔｒｋＣ+）は、同様にＮｇｎ１-/-突然変異体にて排除されるものの、ｍｒｇおよびｄｒｇ１２遺伝子は、これらの種類の感覚ニューロンにて発現されないと思われる。なぜならば、それらがｍｒｇおよびｄｒｇ１２発現感覚ニューロンの大部分である場合にＮｇｎ１-/-突然変異体にて残されると予測されるが、その予測が事実とは異なるからである。
【０３３０】
Ｎｇｎ１-/-マウスからのＤＲＧにおけるＭｒｇＡの発現の欠如は、それらが皮膚感覚ニューロンにおいて発現されるという概念と合致する。さらに、ＭｒｇＡ１+細胞の分布は、侵害受容感覚ニューロンのマーカーであるｔｒｋＡを発現するニューロンの分布と類似していた（McMahon et al. Neuron 12: 1161−71 （1994）; Snider and Silos−Santiago Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 351:395−403（1996））（図７Ａ、図７Ｂ）。ＭｒｇＡ遺伝子がｔｒｋＡ+細胞にて発現されるかどうかを直接決定するために、新生期ＤＲＧにおいて、抗ｔｒｋＡ抗体を用いた免疫標識と合わせて、ＭｒｇＡ１、Ａ３およびＡ４に関してｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。フルオレセイン−ＵＴＰ標識ｃＲＮＡプローブを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合抗フルオレセイン抗体（１：２０００、Roche）を用いて検出し、ファストレッド（Roche）を用いて発色させて、赤色蛍光シグナルを発生させた。蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した後、切片をＴｒｋＡに対する一次抗体（１：５０００、Louis Reichardt博士から寄贈）、ＶＲ１（１：５０００、D. Julius博士から寄贈）、ＣＧＲＰ（１：５００、Chemicon）、またはサブスタンスＰ（１：１０００、Diasorin）にてインキュベートした。すべての抗体は、１％正常ヤギ血清および０．１％トリトンＸ−１００を含有する１×ＰＢＳにて希釈した。一次抗体インキュベーションを４℃にて一晩実施した。使用した二次抗体は、Ａｌｅｘａ４８８に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２５０、Molecular Probes）であった。Griffonia simplicifolia ＩＢ４レクチンでの二重標識のために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション後に、１２．５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ＩＢ４レクチン（Sigma）とともに切片をインキュベートした。
【０３３１】
抗ｔｒｋＡ抗体とｍｒｇアンチセンスＲＮＡプローブを用いた二重標識実験により、ｍｒｇ、具体的にはＭｒｇＡが、ＤＲＧにてｔｒｋＡ+侵害受容ニューロンにより同時発現されることが確認された（図７Ｂおよび図８Ａ〜Ｃを参照）。同様の結果がＭｒｇＤに関して得られた（図８Ｄ）。合わせて、これらのデータは、ＭｒｇＡおよびＭｒｇＤがＤＲＧにおいて侵害受容感覚ニューロンにより特異的に発現されることを示す。
【０３３２】
侵害受容器の特定のサブセットにてＭｒｇが発現されるかどうかを決定するために、さらなる実験を行った。上述するように、抗ＶＲ１標識、およびイソレクチンＢ４（ＩＢ４）標識した、ｍｒｇアンチセンスＲＮＡプローブを用いたさらなる二重標識実験により、ｍｒｇはＩＢ４+侵害受容ニューロンにより選択的に発現されるが、一方、ＶＲ−１発現侵害受容ニューロンにおいては発現されないことを示した（図２Ｃおよび図２Ｄ）。特に、ＭｒｇＡ１、Ａ３、Ａ４およびＭｒｇＤプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと共に用いたＩＢ４による併用蛍光標識により、これらの受容体がＩＢ４+ニューロンにより発現され（図８Ｅ〜図８Ｈ）、このサブセットに対する発現が制限され得ることを明確に示した。この結果は、これらのＭｒｇがＩＩｉ層に突き出た非ペプチド作動性侵害受容ニューロンにより発現されることを示す（Snider and McMahon Neuron 20: 629−32 （1998））。この結果に合致して、ＭｒｇＡ１+の大部分（９０％）、およびＭｒｇＡ３+、Ａ４+およびＭｒｇＤ+全ての細胞が、物質Ｐの発現を欠如する（図８Ｉ〜図８Ｌ）。同様に、ＭｒｇＡ１+の大部分の細胞（７０％）、およびＭｒｇＡ３+、Ａ４+およびＭｒｇＤ+の全ての細胞が、Ｃ線維侵害受容器により発現される別の神経ペプチドであるＣＧＲＰを発現しない（図８Ｍ〜図８Ｐ）。これまでの研究は、ＩＢ４+侵害受容ニューロンが、神経損傷に起因する神経障害性痛みに関与することを示した（Malmberg, A.
B. et al. Science 278: 279−83 （1997））。疱疹後神経痛、反射性交感神経性ジストロフィー、および幻肢痛を含む神経障害性の痛みは、最も管理しにくい痛みである。Ｍｒｇは、神経障害性の痛みを媒介する本質的な役割を果たし、神経障害性の痛みを管理するための代替的解決法を提供し得る。
【０３３３】
最近の研究によると、ＩＢ４+侵害受容器の神経化学的および機能的に異なった２つのサブ集団：バニロイド受容体ＶＲ１を発現するもの（Caterina et al. Science 288: 306
−13 （1997））、および発現しないもの（Michael and Priestley J Neurosci 19: 1844−54 （1999）; Stucky and Lewin J Neurosci 19: 6497−505 （1999））の存在に関する証拠が提供されている。抗ＶＲ１抗体免疫染色と合わせたＭｒｇＡプローブおよびＭｒｇＤプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ＭｒｇＡ１、Ａ３、Ａ４およびＭｒｇＤを発現する細胞集団が、ＶＲ１+（ＶＲ１を発現する）細胞と相容れないことが顕著に示された（図８Ｑ〜図８Ｔ）。まとめると、これらの発現データにより、ＭｒｇＡ遺伝子およびＭｒｇＤ遺伝子が、ＩＢ４+およびＶＲ１-である非ペプチド作動性皮膚感覚ニューロンのサブクラスにおいて発現されることが示される（図９）。
【０３３４】
ＭｒｇＡ１は、他のＭｒｇＡ遺伝子とともに同時発現される
ＭｒｇＡ１は、他のＭｒｇＡ遺伝子よりも広く発現され（図２）、ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＡ２〜８は、侵害受容器の異なるサブセットまたは重複サブセットにより発現されることを示唆する。ジゴキシゲニンおよびフルオレセインで標識したプローブを用いた二重標識ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる研究は、ＭｒｇＡ３またはＭｒｇＡ４を発現するほとんどのニューロンもしくは全部のニューロンがＭｒｇＡ１を同時発現することを示した（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。興味深いことに、チラミド増幅を用いたＭｒｇＡ３およびＭｒｇＡ４に関するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルにおける蛍光は多くの場合、ファストレッドにより検出されるＭｒｇＡ１ ｍＲＮＡの細胞質発現により区切られる核内ドットとして出現した（図１０Ｆ）。かかるドットは、低感度ファストレッド検出方法を用いると観測されず、ＭｒｇＡ１+細胞の核にてのみ観察された。同様の核内ドットが、フェロモン受容体遺伝子発現の研究にてこれまでに観察されており、転写部位を表すことが示唆されてきた（Pantages and Dulac Neuron 28: 835−845 （2000））。ＭｒｇＡ１、３および４に関する結果は、より稀なＭｒｇＡ遺伝子（ＭｒｇＡ２〜８）を発現するニューロンは、ＭｒｇＡ１をも発現するニューロンのサブセットであることを示す。
【０３３５】
ＭｒｇＡ２〜Ａ８が同一のニューロンにて発現されるのか、または異なるニューロンにて発現されるのかどうかの問題に取り組むために、単一プローブにより標識されるニューロン数を、７つ全てのプローブの混合物により標識されるニューロン数と比較した（Buck
and Axel Cell 65: 175−187 （1991））。ＭｒｇＡ４に対する別個のプローブによる標識よりも、約３倍以上のニューロン（４．５％対１％）が混合プローブにより標識され（図１０Ｊ、図１０Ｋ）、これらの遺伝子が、同一のニューロン集団にてすべて同時発現されるわけではないことを示す。しかしながら、混合プローブにより標識されるニューロンのパーセント（４．５％）は、７つの別個のプローブのそれぞれにより標識されるニューロンのパーセントの総計（６．６％）よりは小さかったので、ＭｒｇＡ２〜Ａ８の発現は、一定の重複が存在することを示す。さらに、単一プローブを用いる場合よりも混合プローブを用いた場合に、より高いシグナル強度が個々のニューロンにて観察された。
【０３３６】
ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＤプローブを用いた二重標識実験もまた実施した。これらのタンパク質は、図６Ｂおよび表３に示すように、６０％だけの配列類似性を共有する。これらの実験の結果によって、これら２つの受容体を発現するニューロン間の重複は、ほんの部分的であることを示した（図１０Ｇ〜図１０Ｉ）。ＭｒｇＡ１またはＭｒｇＤを発現するニューロンの約１５％（１１８／７８６）は両遺伝子を同時発現した。ＭｒｇＡ１+細胞の３４％（１１８／３４４）がＭｒｇＤを同時発現したのに対して、ＭｒｇＤ+細胞の２６．７％（１１８／４４２）がＭｒｇＡ１を同時発現した。
【０３３７】
合わせて、これらのデータは、ＩＢ４+、ＶＲ１-感覚ニューロンの少なくとも３つの別個のサブ集団：ＭｒｇＡ１+ＭｒｇＤ+、ＭｒｇＡ１+ＭｒｇＤ-、およびＭｒｇＡ１-ＭｒｇＤ+の存在を示す。ＭｒｇＡ１+サブセットはさらに、１つまたはそれ以上のＭｒｇＡ２〜Ａ８を発現する異なるサブセットに分割される。
【０３３８】
Ｍｒｇファミリー遺伝子は、推定Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）をコードする
ｍｒｇファミリー遺伝子のコードアミノ酸配列の疎水性プロットは、７つの膜貫通セグメントを有する膜タンパク質を予測する。かかる構造は、「Ｇタンパク質」を通じてシグナル伝達する受容体に特徴的である。Ｇタンパク質は、環状ヌクレオチド（ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ）、ＩＰ3および細胞内遊離カルシウム（Ｃａ++）のような「セカンドメッセンジャー」分子の生成または減少に関与する酵素を活性化あるいは抑制する細胞質分子のファミリーである。続いて、かかるセカンドメッセンジャー分子は、イオンチャネルおよび他の受容体のような細胞内シグナル伝達に関与する他の分子を活性化あるいは抑制する。
【０３３９】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、膜受容体の最大のスーパーファミリーの１つを構成し、異なるリガンドに特異的な受容体の多くのサブファミリーを含む。これらのリガンドには、身体により製造される神経伝達物質および神経ペプチド（例えば、それぞれノルアドレナリン、アドレナリン、ドーパミン、およびサブスタンスＰ、スマトスタチン）、ならびに外界に存在する感覚分子（臭気物質、風味物質）が含まれる。
【０３４０】
ｍｒｇファミリー遺伝子は高度に相同性であるが、最も多岐にわたる領域は、細胞外ドメインであった（図６Ａ参照）。ｍｒｇファミリーの細胞外ドメインの可変性は、それらが異なるリガンドを認識し得ることを示唆する。
【０３４１】
ｍｒｇファミリー遺伝子がＧＰＣＲをコードし、侵害受容感覚ニューロンにて特異的に発現されるという事実は、これらの受容体が、痛み、熱もしくは他の有害な刺激の感知または調節に、直接的あるいは間接的に関与することを示唆する。したがって、ｍｒｇコード受容体は、痛み、熱もしくは他の有害な刺激の感知または調節をするために効果のある薬剤を同定するための標的として有用である。最も有用な型の薬剤（アゴニスト性またはアンタゴニスト性）の性質は、かかる有害な刺激の感覚に対してこれらの受容体が受ける一般的な影響の性質に依存するであろう。例えば、ｍｒｇコード受容体が一般に負に作用する場合、痛みを抑制または抑圧するために、アゴニスト性薬剤が有用な治療薬となり、反対に、受容体が一般に正に作用する場合、痛みを促進または増大するために、アンタゴニスト性薬剤が有用な治療薬となるであろう。ある種の臨床場面において、例えば糖尿病に関連した抹消神経感覚神経障害において、有害な刺激に対する感受性を高めるために有用であり得る。
【０３４２】
痛みの感知に対するｍｒｇコードＧＰＣＲの影響の性質は、マウスにおけるこれらの遺伝子の標的突然変異の表現型の結果により明らかとなり得る。例えば、かかるマウスが有害な刺激に対する感受性が増大した場合、受容体は一般に痛みに対する応答を抑制または抑圧するために機能し、またその逆においても機能することを結論付けることができた。あるいは、ハイスループットスクリーニングを用いて、ｍｒｇコード受容体に強固に結合する小分子を同定してもよい。かかる分子は、２つのカテゴリー：アゴニストおよびアンタゴニストに分類されると予測される。アゴニストが、受容体依存性様式で細胞内セカンドメッセンジャー経路を活性化する能力により同定される一方で、アンタゴニストは、それらを抑制する能力により同定されるであろう。次に、痛みの感受性の動物モデルでのかかる薬剤の試験は、ＧＰＣＲの機能に関するさらなる情報を明らかにするであろう。例えば分子がｉｎ ｖｉｔｒｏにて受容体アンタゴニストとして作用し、かつ、それらがｉｎ ｖｉｖｏで有害な刺激に対する感受性または応答性を抑圧する場合に、受容体は一般に、痛みの感覚を促進または増大するために機能することが結論付けられ得る。逆に、受容体アゴニストがｉｎ ｖｉｖｏにて痛みの感覚を抑圧し、一方アンタゴニストがそれを増大する場合、受容体は一般に、痛みの感覚を抑圧または抑制するために機能すると結論付けることができる。
【０３４３】
ｄｒｇ１２は、推定膜貫通シグナル伝達分子をコードする
ｄｒｇ１２遺伝子のコードアミノ酸配列の疎水性プロットは、膜タンパク質が２つの膜貫通セグメントを有していることを予測させる。このタンパク質は、ポリペプチドのエピトープタグ付け様式でトランスフェクトした培養細胞の免疫染色により膜局在化していることが立証された。ＤＲＧ１２アミノ酸配列はタンパク質の既知のファミリーに対して相同性はなかったものの、その二連膜貫通構造は、それが細胞内シグナル伝達のいくつかの局面において、例えば受容体、イオンチャネルまたは別の受容体のモジュレーターもしくはイオンチャネルのモジュレーターに関与することを強く示唆する。この予測は、類似した二連膜貫通トポロジーであるプリン作動性Ｐ2Ｘ2およびＰ2Ｘ3受容体を有する２つの既知の受容体が、ＤＲＧ１２と同様に侵害受容感覚ニューロンにて特異的に発現されるという公知の知見により支持される。
【０３４４】
この構造データ、および侵害受容感覚ニューロンにおいて特異的に発現することを考慮すれば、ＭＲＧ１２が、有害な刺激の感知または調節に、直接的あるいは間接的に関与する可能性がある。したがって、ｄｒｇ１２コードタンパク質は、痛みの治療のための新規治療薬の開発用の有用な標的である。
【実施例５】
【０３４５】
Ｍｒｇタンパク質は、神経ペプチドのための受容体である。
上述のように、Ｍｒｇ遺伝子によりコードされるタンパク質の構造は、それらが受容体として機能することを示す。Ｍｒｇ受容体に関するリガンドを同定するために、選択したＭｒｇＡ遺伝子を、カルシウム放出アッセイにて試験した。ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＡ４を含むＭｒｇＡ遺伝子を真核生物発現ベクターにクローニングし、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＴＣＣから得られ、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。Aurora Biosciences CorporationからＧα15を安定に発現するＨＥＫ２９３−Ｇα15細胞系が提供され、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（成長因子を減じたＭａｔｒｉｇｅｌ、Becton Dickinson、血清を含まないＤＭＥＭで１：２００希釈）で被覆したフラスコ上で成長させ、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、および３μｇ／ｍｌのブラストシジンＳを補充したＤＭＥＭ（GibcoBRL）中で３７℃にて維持した。トランスフェクションのために、Ｍａｔｒｉｇｅｌで被覆した３５ｍｍのガラス底皿（Bioptech Inc., Butler, PA）上に細胞を播種した。１６〜２４時間後、ＦｕＧＥＮＥ６（Roche）を用いて細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション効率は、ＭｒｇＡ１およびＡ４のＣ末端に融合したＧＦＰの可視化により概算され、典型的に６０％を超えた。さらに、ＭｒｇＡコード配列のＣ末端に対してＧＦＰを融合することにより、受容体の細胞内分布およびトランスフェクトした細胞におけるそれらの膜組込みを可視的に確認することが可能になった（図１１Ｄ）。
【０３４６】
カルシウム放出アッセイの感受性を増加するために、幾つかの実験にて、ＭＲＧＡ−ＧＦＰ融合タンパク質が、Ｇα15を発現するように改質されたＨＥＫ２９３細胞にて発現され、細胞内遊離Ｃａ2+の放出を誘発するシグナル伝達経路にＧＰＣＲを連結する（Offermann and Simon J Biol Chem 270: 15175−80 （1995））。このカルシウム放出は、蛍光指示色素としてＦｕｒａ−２を用いて比較測定的に（ratiometrically）にモニターされ得る（Tsien et al. Cell Calcium 6: 145−57 （1985））（図１１Ａ〜図１１Ｃ）。この異種発現系は、味覚受容体用のリガンドを同定するためにこれまで使用されてきた（Chandrashekar et al. Cell 100: 703−11 （2000））。
【０３４７】
ＭＲＧＡは、ペプチドホルモン受容体に対して最高の配列類似性を示すので、細胞内Ｃａ2+放出アッセイを用いて、ＭＲＧＡ１を活性化する能力に関して約４５個の候補ペプチドをスクリーニングした。簡潔に述べると、トランスフェクトした細胞を、１１ｍＭのＤ
−グルコースおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、を有するハンクスの平衡塩溶液（ｐＨ７．４）（アッセイ緩衝液）で一度洗浄し、２μＭのＦｕｒａ−２ＡＭ（Molecular Probes）を室温にて９０分間、回転させながら負荷した。負荷した細胞をアッセイ緩衝液で２回洗浄し、微小灌流チャンバ（Bioptech）に入れた。チャンバをOlympus ＩＭＴ２倒立顕微鏡の最上部に置き、Olympus ＤＰｌａｎＡｐｏ４０Ｘ油浸対物レンズにより結像した。７５Ｗのキセノン球で試料を照射し、コンピュータ制御フィルター交換器（Lambda−10; Shutter Instruments）を用いて、励起波長を切替えた。蛍光を検出する際に、冷却ＣＣＤカメラ（Photometric）を使用した。励起波長４００ｎｍ、２色５０５ｎｍロングパスフィルター、および５３５ｎｍのエミッターバンドパス（Chroma Technology）を用いて、フィールド内のＧＦＰ陽性細胞を同定した。同じフィールド内で、励起波長３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ、ならびに発光波長５１０ｎｍにてカルシウム測定を実施した。アッセイ緩衝液でアゴニストを希釈し、微小灌流ポンプ（Bioptech）により溶液変化が達成された。ＧＦＰ陽性細胞から生じるＦｕｒａ−２蛍光シグナル（３４０ｎｍ、３８０ｎｍおよび３４０／３８０比）を、Ａｘｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ４．０ソフトウェア（Axon）を用いて、０．４または１秒間隔で連続的にモニターおよび収集した。計装の較正は、ガラス底皿（MatTek Corp.）にて標準カルシウム溶液（Molecular probes）を用いて実施した。
【０３４８】
濃度１μＭにて、数多くの神経ペプチドにより、ＭｒｇＡ１発現細胞が、幾分か活性化された（図１２Ａ）。これらの神経ペプチドの中には、ＡＣＴＨ、ＣＧＲＰ−ＩおよびＣＧＲＰ−ＩＩ、ＮＰＹならびにソマトスタチン（ＳＳＴ）が含まれていた。それにもかかわらず、多くの他のペプチドホルモン（アンギオテンシンＩ〜ＩＩＩならびにニューロキニンＡおよびＢ、α−ＭＳＨおよびγ２−ＭＳＨを含む）は、ＭＲＧＡ１を活性化しなかった（図１２Ａ以外にデータを示さず）。ＭｒｇＡ１は、プロスタグランジンＥ１およびアラキドン酸のようなエコサノイドリガンドによっては、わずかに活性化されただけであった（データを示さず）。
【０３４９】
ＭｒｇＡ１発現ＨＥＫ細胞における最も効果的な応答は、ＦＬＲＦおよび軟体動物心臓作用性神経ペプチドＦＭＲＦアミドを含むＲＦアミドペプチドにより誘発された（Price and Greenberg Science 197:670−671 （1977））（Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−アミド）（図１１Ｃ、図１２Ａ）。次に、共通のプロペプチド前駆物質から切断される（Vilim et al. Mol Pharmacol 55: 804−11 （1999））２つの哺乳動物ＲＦアミドペプチド、ＮＰＡＦおよびＮＰＦＦを試験した。１μＭでのＮＰＦＦに対するＭｒｇＡ１発現細胞の応答は、ＦＭＲＦアミドを用いた場合に見られる応答と類似している一方で、ＮＰＡＦに対する応答は、有意に低かった（図１２Ａ）。ＭｒｇＡ１はまた、２つの他のＲＦアミドリガンド、γ1−ＭＳＨおよびｓｃｈｉｓｔｏＦＬＲＦによってもわずかに活性化された（データは示さず）。
【０３５０】
ＭｒｇＡ１およびＡ４の活性化の特異性をさらに検査するために、初期スクリーニングによって見いだした最良の候補リガンドを、ＲＦアミドペプチドに対する応答を保持するこの系にて発現されるＧα15−ＭｒｇＡ１およびＡ４が欠如したＨＥＫ細胞にて発現されるこれらの同一受容体に関して試験し（図１２Ｂ、図１２Ｃ）、初期スクリーニングにおいて見られる細胞内Ｃａ2+放出応答が、外因性Ｇα15の存在に依存していないことを実証する。このことは、ＭｒｇＡがＧｑまたはＧｉを介してＨＥＫ細胞にて作用することを示す。ＮＰＦＦに対するＭｒｇＡ１発現ＨＥＫ細胞の応答は、ＦＬＲＦに対する応答より低く、ＮＰＡＦに対しては応答しなかった（図１２Ｂ）。反対に、ＭｒｇＡ４発現細胞は、ＮＰＡＦに対して応答したが、ＮＰＦＦまたはＦＬＲＦには応答しなかった（図１２Ｃ）。両方の場合において、Ｇα15発現細胞において見られるＮＰＹに対する応答（図１１Ａ）は完全に失われる一方で、ＣＧＲＰ−ＩＩおよびＡＣＴＨに対する応答は相当減少した。
【０３５１】
ＭｒｇＡ１およびＡ４を活性化することが可能なＲＦアミドリガンドの最低濃度を決定するために、より大きな感受性をもたらすＧα15を発現するＨＥＫ細胞にて、用量応答実験を実施した（図１２Ｄ、図１２Ｅ）。これらの実験は、ＭｒｇＡ１がナノモル濃度のＦＬＲＦにより（図１２Ｄ、ＥＣ50約２０ｎＭ）、および概してそれよりもより高濃度のＮＰＦＦにより（図１２Ｄ、ＥＣ50約２００ｎＭ）活性化され得る一方で、ＮＰＡＦはかなり効果が少ないことを示す。対照的に、ＭｒｇＡ４は、ＮＰＡＦにより十分に活性化され（図１２Ｅ、ＥＣ50約６０ｎＭ）、ＦＬＲＦおよびＮＰＦＦによりかなり弱く活性化された。どちらの受容体も、異なる前駆物質から生産される一連のＲＦアミドリガンドであるＲＦＲＰ−１、２または３に応答した強力な活性化を示さなかった（Hinuma et al. Nat Cell Biol 2: 703−8 （2000））。これらのデータにより、ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＡ４が、この系における種々のＲＦアミドリガンドに対する種々の選択性を示すことが確認される。対照的に、これらの受容体は、ＡＣＴＨに対しては同様に応答した（それぞれ、ＭｒｇＡ１およびＡ４に関してＥＣ50〜６０および２００ｎＭ、データは示さず）。
【０３５２】
最終的に、ＭＲＧＡ受容体およびＭＡＳ１との間の配列類似性を考えて、ＮＰＦＦ、ＮＰＡＦおよびＦＬＲＦに対する外因性Ｍａｓ１を発現する細胞の応答性を試験した。ＭＡＳ１は、ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＡ４のいずれとも異なるプロフィールを示した（図１２Ｆ）。ＭｒｇＡ１と同様に、それは、ペプチドの同程度の濃度（ＥＣ50約４００ｎＭ）にてＮＰＦＦにより活性化されたが、ＭｒｇＡ１と異なり、それは、ＦＬＲＦによりあまり活性化されなかった。ＭｒｇＡ４とは対照的に、ＭＡＳ１は、ＮＰＡＦに対して十分に応答しなかった。この受容体を活性化するとこれまでに報告されていたリガンドであるアンギオテンシンＩおよびＩＩに対して曝露しても、ＭＡＳ−１発現細胞にて応答は検出されなかった（Jackson, T. R., et al. Nature 335: 437−40 （1988））。ＭＡＳ１はまたＡＣＴＨに対しても応答しなかった。したがって、この異種系で発現されるＭＡＳ１、ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＡ４は、ＲＦアミドファミリーリガンドによりすべて活性化されるが、異なるリガンド感受性および選択性を有する（表４）。
【０３５３】
【表４】
2006504641.tif 000005
【０３５４】
示したリガンドによる示した受容体の活性化の相対的有効性を示す。定量化に関しては、図６を参照されたい。「＋＋＋」は、１０ｎｍ＜ＥＣ50＜１００ｎＭを示し、「＋＋」は、１００ｎＭ＜ＥＣ50＜５００ｎＭを示し、「＋／−」は、１μＭにて見られる弱い応答を示す。詳細に関しては、図６を参照されたい。
【０３５５】
約５０個のＭＡＳ１関連Ｇタンパク質共役受容体から構成される新規ファミリーが同定された。侵害受容感覚ニューロンのサブセットにおいて、これらの受容体の幾つかの種類が特異的に発現することは、これらの受容体が痛みの感知または調節にて役割を果たすことを示す。一貫して、これらの受容体は、無痛覚を媒介することが知られているＲＦアミド神経ペプチドにより活性化されることがわかった。結果として、これらの受容体は、抗侵害受容薬剤のための新規標的を提供する。
【０３５６】
本発明は、上述の例を参照して詳細に記載してきたが、各種変更は、本発明の思想を逸脱することなくなされ得ることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。本出願にて参照したすべての引用特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３５７】
【図１】配列番号２、４、６、８、１０および１２、ならびにｍｒｇファミリーの２つのヒトタンパク質（配列番号１６および１８）のアミノ酸配列の相同領域のアラインメントを示す。
【図１Ａ−１】ｍｒｇが新規のＧタンパク質共役受容体遺伝子ファミリーを規定することを示す。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて８つのマウス完全長ｍｒｇ遺伝子のアミノ酸配列をアラインした。予測タンパク質の５０％より大きい同一残基を暗色陰影で示す。保存的置換は明灰色で目立たせている。予測膜貫通ドメイン１〜７のおよその位置をＴＭ１〜ＴＭ７として配列の上部に示す。予測細胞外ドメインおよび細胞質ドメインは、それぞれＥ１〜Ｅ７およびＣ１〜Ｃ７として示す。
【図１Ａ−２】ｍｒｇが新規のＧタンパク質共役受容体遺伝子ファミリーを規定することを示す。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて８つのマウス完全長ｍｒｇ遺伝子のアミノ酸配列をアラインした。予測タンパク質の５０％より大きい同一残基を暗色陰影で示す。保存的置換は明灰色で目立たせている。予測膜貫通ドメイン１〜７のおよその位置をＴＭ１〜ＴＭ７として配列の上部に示す。予測細胞外ドメインおよび細胞質ドメインは、それぞれＥ１〜Ｅ７およびＣ１〜Ｃ７として示す。
【図１Ａ−３】ｍｒｇが新規のＧタンパク質共役受容体遺伝子ファミリーを規定することを示す。ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて８つのマウス完全長ｍｒｇ遺伝子のアミノ酸配列をアラインした。予測タンパク質の５０％より大きい同一残基を暗色陰影で示す。保存的置換は明灰色で目立たせている。予測膜貫通ドメイン１〜７のおよその位置をＴＭ１〜ＴＭ７として配列の上部に示す。予測細胞外ドメインおよび細胞質ドメインは、それぞれＥ１〜Ｅ７およびＣ１〜Ｃ７として示す。
【図２】図２におけるｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの顕微鏡像は、新生野生型（ＷＴ）マウスおよびニューロゲニン１ヌル突然変異（Ｎｇｎ１-/-）マウスからの後根神経節（ＤＲＧ）の横断切片中の配列番号２（「ｍｒｇ３」）および配列番号４（「ｍｒｇ４」）のヌクレオチドに対するアンチセンス染色の局在化を示す。白点線はＤＲＧの輪郭を描き、黒点線は脊髄の輪郭を描く。３つの他の別々のマーカー（ｔｒｋＡ、ＶＲ−１およびＳＮＳ−ＴＴＸｉ（Ma et al.,（1999）））を用いて同定した場合、Ｎｇｎ１-/-突然変異体おいて、ＤＲＧの大きさが侵害受容感覚ニューロンの損失に起因して、激しく減少することに留意されたい。ｍｒｇ３はＷＴマウスにおけるＤＲＧのサブセット中では発現される（Ａ）が、Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧ中には存在しない（Ｂ）。ｍｒｇ４は、ｍｒｇ３が発現されるＤＲＧのサブセットよりさらに小さいＤＲＧのサブセット中で発現される（Ｃ）。これはまたＮｇｎ１-/-ＤＲＧの中には存在しない（Ｄ）。Ｎｇｎ１-/-ＤＲＧ中にｍｒｇ発現ニューロンが存在しないことは、これらのニューロンが侵害受容性である可能性が高いことを示す。
【図２Ａ】後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンのサブセット中のｍｒｇの発現を示す。野生型（ａ〜ｉ）およびｎｇｎ１-/-（ｊ）突然変異新生マウスからのＤＲＧの凍結横断切片をアンチセンスジゴキシゲニンＲＮＡプローブを用いてアニーリングして、アルカリホスファターゼ−結合抗体を用いてハイブリダイゼーションを可視化した。陽性シグナルを濃紫染色として示す。ＴｒｋＡは、野生型ＤＲＧニューロンの大部分において発現される（ａ）が、しかしｎｇｎ１-/-中には存在しない（データは示さず）。８つのｍｒｇ遺伝子（ｂ〜ｉ）の各々は、野生型ＤＲＧ中のニューロンの小サブセット中で発現され、ｎｇｎ１-/-ＤＲＧ中では完全に存在しない（ｊ以外のデータは示さず）。黒点線は、ｎｇｎ１-/-突然変異ＤＲＧの輪郭を描く。
【図２Ｂ】ｍｒｇがＴｒｋＡ+侵害受容ニューロンにより発現されることを示す。二重標識技術を用いて、ＤＲＧニューロン中のＴｒｋＡ（ｂ、ｅ）およびｍｒｇ（ａ、ｄ）を同時局在化した。二重標識実験中、ｍｒｇ３（ａ〜ｃ）またはｍｒｇ５（ｄ〜ｆ）フルオロセイン標識アンチセンスＲＮＡプローブのどちらかを用いて、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った後、抗ＴｒｋＡ抗体免疫染色を野生型ＤＲＧの凍結切片にて施した。同一の２つのフレーム（ａおよびｂ、ｄおよびｅ）をデジタル方式で重ね合わせて、同時局在化の程度を明示した（ｃ、ｆ）。白矢頭は、二重陽性細胞の例を示す。
【図２Ｃ】ｍｒｇおよびＶＲ１が、ＤＲＧ中の侵害受容ニューロンの２つの異なる集団を規定することを示す。ｍｒｇ３またはｍｒｇ５フルオレセイン標識アンチセンスＲＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび抗ＶＲ１抗体免疫染色の組合せは、ｍｒｇ３（ａ〜ｃ）およびｍｒｇ５（ｄ〜ｆ）共にＶＲ１−陽性ニューロンにより発現されないことを実証した。併合画像（ｃ、ｆ）では、ｍｒｇ３またはｍｒｇ５とのＶＲ１の同時局在化は認められない。白矢頭は、ｍｒｇを発現するが、ＶＲ１陰性である侵害受容ニューロンを指す。
【図２Ｄ】ｍｒｇがＩＢ４+侵害受容ニューロンにより発現されることを示す。二重標識技術を用いて、ＤＲＧニューロン中のＩＢ４（ｂ、ｅ）およびｍｒｇ（ａ、ｄ）を同時局在化した。上記と同様にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、ｍｒｇ３およびｍｒｇ５の発現を可視化した。その後、同一ＤＲＧ切片にＦＩＴＣ結合レクチンによりＩＢ４結合を施した。併合画像（ｃ、ｆ）では、ｍｒｇ染色およびＩＢ４染色間の広範な重複が認められた（黄色ニューロンを矢頭で示す）。
【図３】（Ａ）ｍｒｇ３（配列番号２）、（Ｂ）ヒト１遺伝子（配列番号１５）、および（Ｃ）ヒト２遺伝子（配列番号１７）のアミノ酸配列の膜貫通領域を予測する疎水性プロットを比較する。陽性値が高いほどより疎水性であることを示す。
【図４】（Ａ）マウスｄｒｇ１２（配列番号１４）；（Ｂ）ヒトｄｒｇ１２（配列番号１９）のアミノ酸配列の膜貫通領域を予測する疎水性プロットを比較する。
【図５】ｍｒｇ９（配列番号２１）、ｍｒｇ１０（配列番号２３）、ｍｒｇ１１（配列番号２５）、およびｍｒｇ１２（配列番号２７）のアミノ酸配列の膜貫通領域を予測する疎水性プロットを比較する。
【図６Ａ−１】株Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからのｃＤＮＡおよびＢＡＣクローンのヌクレオチド配列から推定されるＭＲＧＡ１〜Ａ８のアミノ酸配列のアラインメントである。膜貫通（ＴＭ１〜ＴＭ７）、細胞外（Ｅ１〜Ｅ４）および細胞質（Ｃ１〜Ｃ４）ドメインの予測位置を、アラインした配列上に示す。
【図６Ａ−２】株Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからのｃＤＮＡおよびＢＡＣクローンのヌクレオチド配列から推定されるＭＲＧＡ１〜Ａ８のアミノ酸配列のアラインメントである。膜貫通（ＴＭ１〜ＴＭ７）、細胞外（Ｅ１〜Ｅ４）および細胞質（Ｃ１〜Ｃ４）ドメインの予測位置を、アラインした配列上に示す。
【図６Ａ−３】株Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからのｃＤＮＡおよびＢＡＣクローンのヌクレオチド配列から推定されるＭＲＧＡ１〜Ａ８のアミノ酸配列のアラインメントである。膜貫通（ＴＭ１〜ＴＭ７）、細胞外（Ｅ１〜Ｅ４）および細胞質（Ｃ１〜Ｃ４）ドメインの予測位置を、アラインした配列上に示す。
【図６Ｂ】データベース検索から同定されたＭＲＧファミリー成員の系統発生的分析を示す。ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて、ＭＲＧすべてのタンパク質配列をアラインした（Thompson et al. Nucleic Acids Res 22:4673−80（1994））。Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ法および１，０００ブートストラップ試験を用いたＰＨＹＬＵＰソフトウェアパッケージにより、樹状図を作成した。枝の水平長は、アミノ酸の数の変化に比例する。垂直距離は任意である。それらの停止コドンのレトロトランスポゾン配列〜６５０ｎｔ３´を有するマウス（ｍ）Ｍｒｇ遺伝子を強調表示する（Ｌ１）。偽遺伝子をコードすると予測される遺伝子はすべて、プサイ（Ψ）の記号で示す。
【図６Ｃ】重複ＢＡＣクローンの分析から推定された一マウスＭｒｇクラスターの染色体構成を示す。クラスターは、４つの完全長ＯＲＦおよび３つの偽遺伝子を含む。
【図７】図７Ａは、ＮＧＦ受容体ｔｒｋＡの発現により明示されるような生後０日目（Ｐ０）ＤＲＧ中の侵害受容感覚ニューロンの分布を示す。この集団は、Ｎｇｎ１-/-突然変異体において選択的に排除される（Ma et al. Genes & Dev. 13:1717−1728（1999））。    図７Ｂは、ＭｒｇＡ１を検出するｃＲＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＭｒｇＡ１は、図７Ａに示した隣接切片上のｔｒｋＡ+ニューロンと同様のパターンで発現される。    図７Ｃは、ＭｒｇＡ２〜ＭｒｇＡ８を検出するｃＲＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。    図７Ｊは、ＭｒｇＡ１発現が、他のＭｒｇＡ遺伝子の発現（示されていない）と同様に、Ｎｇｎ１-/-マウス中で排除されることを示す。残りのＤＲＧニューロンは点線で境界を画する領域中に存在し、一般的ニューロンマーカーの発現により可視化され得る。
【図８】ＭｒｇＡの発現が、内部ＩＩ層に向かって突出する非ペプチド作動性侵害受容器に制限されることを示す。ｔｒｋＡ（Ａ〜Ｄ）、サブスタンスＰ（Ｉ〜Ｌ）、ＣＧＲＰ（Ｍ〜Ｐ）、ＶＲ１（Ｑ〜Ｔ）の蛍光抗体検出または蛍光イソレクチンＩＢ４（ＩＢ４；Ｅ〜Ｈ）による染色と組合せた、指示Ｍｒｇプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの共焦点顕微鏡像を示す。ＭｒｇＡ+またはＭｒｇＤ+細胞はｔｒｋＡおよびＩＢ４を同時発現する（Ａ〜Ｈ、矢頭）が、ほとんどがｓｕｂＰ、ＣＧＲＰまたはＶＲ１を発現しない（Ｉ〜Ｔ、矢頭；Ｉ、Ｍの矢印は、ＳｕｂＰおよびＣＧＲＰを同時発現するＭｒｇＡ１+ニューロンのマイナーのサブセットを示す）。
【図９】ＩＩｉ層に向けて突出する非ペプチド作動性ＩＢ４+、ＶＲ１-感覚ニューロンへのＭｒｇＡ（およびＭｒｇＤ）発現の制限の模式図である（Snider and McMahon Neuron 20: 629−32（1998））。ＩＩｉ層中のシナプス後ニューロンはＰＫＣγを発現する。
【図１０】個々の感覚ニューロンが複数のＭｒｇＡを同時発現することを示す。（Ａ〜Ｃ）ＭｒｇＡ１（Ａ）およびＡ３（Ｂ）を用いた二重標識ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。（Ｄ〜Ｆ）ＭｒｇＡ１（Ｄ）およびＡ４（Ｅ）を用いた二重標識。両方の場合に、ＭｒｇＡ３またはＡ４を発現する細胞は、ＭｒｇＡ１を発現するもののサブセットである（Ｃ、Ｆ、矢頭）。（Ｆ）の矢印は、転写の部位を表し得るＭｒｇＡ４発現の核内ドットを示す。（Ｇ〜Ｉ）ＭｒｇＡ１およびＭｒｇＤを用いたｉｎ ｓｉｔｕでの二重標識。２つの集団間の多少の重複が観察される（Ｉ、矢頭）が、一方、ほとんどの細胞はある受容体は発現するが、他のものは発現しない（Ｉ、矢印）。ＭｒｇＡ１またはＭｒｇＤを発現する細胞のうち、約１５％が、両遺伝子を同時発現する。パネル（Ｃ、Ｆ、Ｉ）の右に付した垂直バーは、Ｙ軸に沿って見られるｚシリーズを表し、パネルの下の水平バーはｘ軸に沿って見られるｚシリーズを表す。（Ｊ、Ｋ）それぞれの単一ＭｒｇＡプローブ（Ｊ）および７つのＭｒｇＡプローブの混合物（Ｋ）を用いて得られたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションシグナルの比較。約１％のニューロンがＭｒｇＡ４プローブにより標識され、一方、〜４．５％が混合プローブにより標識された。個々のＭｒｇＡ２〜８プローブにより標識されたニューロンのパーセンテージの和は〜６．６％であり、これは、この集団内に部分重複が存在することを示唆する。（Ｌ）ｉｎ ｓｉｔｕ分析により明示された遺伝子発現の組合せを示すベン図。例えばＭｒｇＡ２〜８がＭｒｇＤと部分的に重複するかどうか、われわれには分からないため、図は、サブセットの数の控えめの概算である。円の大きさは比例していない。
【図１１】ＭＲＧＡ１を発現するＨＥＫ細胞のＦＬＲＦにより引き出される細胞内遊離Ｃａ++の増大を示す。（Ａ、Ｂ）および（Ｅ、Ｆ）は、ＭＲＧＡ１−ＧＦＰ融合タンパク質（Ａ〜Ｄ）またはＧＦＰ単独（Ｅ〜Ｈ）を発現するＨＥＫ−Ｇα15細胞中での３４０ｎｍ（Ａ、Ｅ）および３８０ｎｍ（Ｂ、Ｆ）でのＦｕｒａ−２蛍光を示す。画像は、１μＭのＦＬＲＦアミドの添加の２分後に撮った。内在性ＧＦＰ蛍光により明示されたＭＲＧＡ１−ＧＦＰの核周囲斑点状分布（Ｄ、矢頭）はＥＲ−ゴルジ網状構造に特徴的であり、これは受容体の膜取込みおよび細胞内輸送を示す。これに対比して、対照ＧＦＰタンパク質は細胞質である（Ｈ）。細胞内Ｃａ2+（［Ｃａ2+］i）放出は、ＦＵＲＡ−２ ３４０ｎＭ／３８０ｎＭ発光比から決定された（Ｃ、Ｇ）。ＭＲＧＡ１発現細胞（しかし周囲の非トランスフェクト細胞ではない）は３４０／３８０ｎｍでのＦｕｒａ−２蛍光の比率の増大を示す（Ｃ、矢頭）が、これは［Ｃａ2+］iの増大を示すことに留意されたい。これに対比して、対照ＧＦＰ発現細胞においてはこのような増大は観察されない（Ｇ）。ＭＲＧＡ１発現細胞において観察された３４０／３８０ｎｍでの蛍光の増大は、リガンドの付加に依存した（図示せず）。
【図１２Ａ】神経ペプチドリガンドにより異種細胞中で発現されるＭＲＧＡ受容体の活性化を示す。１μＭの濃度で指示リガンドを用いて、ＭＲＧＡ１を発現するＨＥＫ−Ｇα15細胞（Offermanns and Simon. J Biol Chem 270:15175−80（1995））を試験した。データは、カルシウム応答を示すＧＦＰ陽性（すなわちトランスフェクトされた）細胞の平均パーセンテージを示す。指示されたアゴニストで、トランスフェクトされていない細胞中の内因性受容体による任意の応答を示したものはなかった。ＲＦアミド神経ペプチドであるＦＭＲＦ、ＦＬＲＦおよびＮＰＦＦ、ならびにＮＰＹ、ＡＣＴＨ、ＣＧＲＰ−ＩおよびＩＩそしてソマトスタチン（ＳＳＴ）が最強応答を生じたことに留意されたい。
【図１２Ｂ】Ｇα15を欠くＨＥＫ細胞中で発現されたＭＲＧＡ１のリガンド選択性を示す。（Ａ）の場合と同様に、１μＭの濃度で細胞をリガンドに曝露した。
【図１２Ｃ】ＭＲＧＡ４のリガンド選択性を示す。図１２Ｂおよび１２Ｃに提示したデータは、ほとんどの有効リガンドに対する応答がＧα15の存在に依存しないことを示す。ＭＲＧＡ１発現細胞はＦＬＲＦおよびＮＰＦＦに応答するが、ＮＰＡＦには応答せず、一方逆にＭＲＧＡ４発現細胞はＮＰＡＦに応答するが、ＮＰＦＦまたはＦＬＲＦに応答しないことに留意されたい。
【図１２Ｄ】選択ＲＦアミド神経ペプチドに対してＨＥＫ−Ｇα15細胞中で発現されるＭＲＧＡ１に関する用量−応答曲線を示す。各データ点は、少なくとも３つの個々の決定の平均（±）Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。各決定に関して、少なくとも２０のＧＦＰ+細胞を分析した。その後、５μＭ濃度のＦＬＲＦに対して同一細胞により示される最大応答に、各リガンド濃度での応答を標準化した。ＭＲＧＡ１（Ｄ）はＦＬＲＦ（四角、ＥＣ50約２０ｎＭ）に対して最高感受性を、そしてＮＰＦＦ（丸、ＥＣ50約２００ｎＭ）に対してはより低い感受性を示す。
【図１２Ｅ】選択ＲＦアミド神経ペプチドに対してＨＥＫ−Ｇα15細胞中で発現されるＭＲＧＡ４に関する用量−応答曲線を示す。各データ点は、少なくとも３つの個々の決定の平均（±）Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。各決定に関して、少なくとも２０のＧＦＰ+細胞を分析した。その後、５μＭ濃度のＮＰＡＦに対して同一細胞により示される最大応答に、各リガンド濃度での応答を標準化した。ＭＲＧＡ４は、ＮＰＡＦ（三角、ＥＣ50約６０ｎＭ）により優先的に活性化される。
【図１２Ｆ】選択ＲＦアミド神経ペプチドに対してＨＥＫ−Ｇα15細胞中で発現されるＭＡＳ１に関する用量−応答曲線を示す。各データ点は、少なくとも３つの個々の決定の平均（±）Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。各決定に関して、少なくとも２０のＧＦＰ+細胞を分析した。その後、５μＭ濃度のＮＰＦＦに対して同一細胞により示される最大応答に、各リガンド濃度での応答を標準化した。ＭＡＳ１は、ＭＲＧＡ１と同様に、同様の効果を有するＮＰＦＦ（ＥＣ50約４００ｎＭ）により活性化されるが、ＦＬＲＦ（四角）により同様に活性化されるわけではない。
【図１３】新生マウスの矢状断面における、ｍＭｒｇＢ１の発現パターンを示す。染色パターンは、ｍＭｒｇＢ１遺伝子が、皮膚の上皮層中、脾臓中および顎下腺中の分散細胞中で発現されることを示す。
【図１４】図１３に示した脾臓および皮膚中でのｍＭｒｇＢ１発現の高倍率図である。
【図１５】成体後根神経節中でのｍＭｒｇＤの発現を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ａ−３】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ａ−３】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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