(57)【要約】【課題】【解決手段】流体中での成分の望ましくない活性化を抑制、除去又は軽減する目的で、前記流体から物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させるか、又は前記流体中の１若しくは複数の物質を結合するためのポリマーアフィニティーマトリックス、並びに、流体から前記物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させる方法、前記マトリックスを製造する方法、前記マトリックスの使用、及び前記マトリックスを備えたキットが記載されている。前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、固相支持体と、スペーサーと、結合ユニットとしてアルギニンを含有するリガンドとを備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で、前記流体から物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させて前記流体中の１又は複数の物質を結合するためのポリマーアフィニティーマトリックスであって、
ａ）固相支持体と、
ｂ）該固相支持体に結合され且つ各スペーサーに連結された少なくとも１つのスペーサーと、
ｃ）少なくとも１つの官能基を有する少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドと、を備え、前記ポリマーアフィニティーマトリクスが前記物質を選択的に結合することができる、ポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項２】
前記リガンドが電荷及び／又は疎水性／親水性について前記物質の結合モチーフの三次元構造と相補的である所定の三次元構造を有する、請求項１に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項３】
前記リガンドが、以下の式で表され、
−Ｘ１ｎ−Ｙｍ［Ｘ２ｉ−Ｚ１；Ｘ３ｊ−Ｚ２］１／２（ｍ＋１）、（一般式Ｉ）
式中、
ｎ＝０又は１；
ｍ＝２ｋ−１；
ｋ＝０ないし１０、ｋ＝０の場合、Ｘ２＝Ｘ３かつＺ１＝Ｚ２；
ｉ＝０又は１；
Ｊ＝０又は１、
又は、
−（Ｘ１ｎ−Ｙ１［Ｙ２ｍ［Ｘ２ｉ−Ｚ１；Ｘ３ｊ−Ｚ２］１／２（ｍ＋１））ｒ−Ｘ４ｐ−Ｚ３、（一般式ＩＩ）
式中、
ｎ＝０又は１；
ｍ＝２ｋ−１；
ｋ＝０ないし１０、ｋ＝０の場合、Ｘ２＝Ｘ３かつＺ１＝Ｚ２；
ｒ＝１−１００；
ｉ＝０又は１；
Ｊ＝０又は１；及び
ｐ＝０又は１、
ここで、Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、各々が結合ユニットを表しており、それぞれ、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、炭水化物、レクチン、ヌクレオチド、及びそれらの誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される有機分子であって、Ｙ、Ｙ１、Ｙ２は、それぞれ、アミノ、ヒロドキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ、及びそれらの誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含有する三官能性分岐分子であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ、必要に応じて使用される二官能性間隔付与分子であって、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ、及びそれらの誘導体又はそれらの組み合わせからなる群から選択される２つの官能基を含有する；
及び／又は前記リガンドが環状である、請求項１及び２の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項４】
前記リガンドが１−１００個の官能基、好ましくは１−３２個の官能基を含む、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項５】
各結合ユニットがアミノ酸であり、少なくともその一部が血液の生理的ｐＨ付近で正に帯電している、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項６】
前記アミノ酸が６．０以上のｐＫＡを有する、請求項５に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項７】
前記アミノ酸がアルギニン、リジン、ヒスチジン、又はシステイン、好ましくはアルギニンである、請求項6に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項８】
前記アミノ酸の量又は濃度が０．０１−５ｍｍｏｌ／ｇマトリックスである、請求項7に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項９】
前記アミノ酸の量又は濃度が約０．０１、０．１、１、２、３、４又は５ｍｍｏｌ／ｇマトリックスである、請求項8に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１０】
リガンド当たりのアミノ酸分子の数が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６、好ましくは４−８である、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１１】
前記アミノ酸がアルギニンであり、アルギニンの量又は濃度が３ｍｍｏｌ／ｇマトリックス以下である、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの官能基がアミノ基若しくは置換されたアミノ基、カルボキシ基、水酸基、チオール基、グアニジノ基、又はそれらの組み合わせ、好ましくはアミノ基若しくはグアニジノ基である、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１３】
前記リガンドが、以下の式で示される樹状又は櫛状構造を有し、
一般式Ｉ、即ち、−Ｘ１ｎ−Ｙｍ［Ｘ２ｉ−Ｚ１；Ｘ３ｊ−Ｚ２］１／２（ｍ＋１）を有するリガンドの例、ここで、
−Ｌｙｓｍ［Ａｒｇ］（ｍ＋１）、すなわち
ｎ＝ｉ＝ｊ＝０；
ｍ＝２ｋ−１；
Ｚ１＝Ｚ２＝Ａｒｇ；
すべてのＹ＝Ｌｙｓ；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は存在しない：
【化１】
2006505385.tif 000009
一般式ＩＩ、即ち、−（Ｘ１ｎ−Ｙ１［Ｙ２ｍ［Ｘ２ｉ−Ｚ１；Ｘ３ｊ−Ｚ２］１／２（ｍ＋１））ｒ−Ｘ４ｐ−Ｚ３を有するリガンドの例、ここで、
−（Ｌｙｓ［Ｌｙｓｍ［Ａｒｇ］（ｍ＋１）ｒ−Ｈ、すなわち、
ｎ＝ｉ＝ｊ＝ｐ＝０；
ｍ＝２ｋ−１；
Ｚ１＝Ｚ２＝Ａｒｇ；
Ｚ３＝Ｈ；
すべてのＹ＝Ｌｙｓ；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、存在しない：
【化２】
2006505385.tif 000010
及び／又は環状構造、好ましくは、下式に示されている環状構造を含む
【化３−１】
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【化３−２】
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先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１４】
前記官能基のうち少なくとも２つの正電荷が、結合すべき物質の結合モチーフ中に存在する各々負に帯電した基、好ましくはエンドトキシン中のリン酸基との各々の距離によって規定される距離だけ、互いに離れている、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１５】
前記スペーサーが実質的に疎水性又は親水性であり、前記リガンドに対する固着部分の機能を有している、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１６】
前記スペーサーが、式Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎは２−２５０である）のポリ若しくはオリゴエチレングリコール、又はポリビニルアルコール、ポリビニルアミン、ポリグリシドール、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンオキシド、又はそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１５に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１７】
前記スペーサーが、直鎖及び／又は分岐状の立体配置であり、４００−１００００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はそれらの誘導体である、請求項１６に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１８】
前記固相支持体が、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレン若しくはポリアクリレートから製造されるポリマー、水酸基により官能性をもたせたポリメタクリレート、ヒドロキシアルキル−ポリスチレン、ヒドロキシアリールポリスチレン、ヒドロキシアルキル−アリール−ポリスチレン、ポリヒドロキシアルキル化されたポリスチレン、ポリヒドロキシアリール化されたポリスチレン、イソシアナートアルキル−ポリスチレン、イソシアナートアリールポリスチレン、カルボキシアルキル−ポリスチレン、カルボキシアリールポリスチレン、アミノアルキル−ポリスチレン、アミノアリールポリスチレン、ポリメタクリレート、架橋されたポリエチレングリコール、セルロース、シリカ、炭水化物、ラテックス、シクロ−オレフィン共重合体、ガラス又はそれらの組み合わせからなる群から選択される材料から構成され、好ましくは架橋されたポリスチレンから構成される、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項１９】
前記固相支持体が、ビーズ、膜、粒子、網、織布若しくは不織布、繊維、マット、チューブ、フィルム、ホイル又はそれらの組み合わせ、又は架橋された互いに貫通し合うネットワークの形態、好ましくはポリスチレン−ＰＥＧビーズの形態を有する、請求項１８に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項２０】
前記マトリックスが生体適合性であり、全血の灌流を可能とするのに十分な膨潤能を有する、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーマトリックス。
【請求項２１】
乾燥状態から水和された形態への膨潤能が約１．５−２０倍、好ましくは２−６倍である、請求項２０に記載のポリマーマトリックス。
【請求項２２】
前記マトリックスが、細菌若しくはウイルス由来の構成成分、エンドトキシン、エキソトキシン、細菌のＤＮＡ又はその断片、オリゴヌクレオチド、細胞、特に、内皮細胞、幹細胞、腫瘍細胞、血液細胞、特に、リンパ球、血小板、顆粒球、樹状細胞、単球、プリオン、寄生生物、真菌、過剰投与後の薬物、発熱性食品添加物、糖尿病、肝疾患、尿毒症、腎疾患若しくは炎症によって生じる急性若しくは慢性の代謝的かく乱から得られる産物、ヘパリン、細菌及びウイルス、病原体を有する血液細胞、又はそれらの少なくとも一部若しくは分解産物、DNA、ホスフェート、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ケモカイン、尿毒性トキシン、血液凝固タンパク質、凝固促進タンパク質、炎症若しくは炎症促進タンパク質、マクロファージ遊走阻害因子、可溶性タンパク質若しくは細胞表面に結合したタンパク質、可溶性接着分子、及びグルコース若しくはグルコースの分解産物、発熱物質、細菌性エキソトキシン、グラム陽性細菌から得られる産物、好ましくはリポタイコ酸、特に細菌性発熱物質、好ましくはエンドトキシン、特にリポ多糖（ＬＰＳ）のリピドＡ成分からなる群から選択される少なくとも１つの物質を結合するための三次元の相補的構造を与える、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項２３】
前記マトリックスが約１×１０２ないし１×１０６ダルトンのカットオフ値を有し、疎水性物質及び／又は親水性物質をともに結合する、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項２４】
前記物質を除去し又は減少させるべき前記流体が、水性又は有機溶液、体液、好ましくは血液、治療用流体、生命科学に用いるための流体、好ましくは生物学、診断又はバイオテクノロジーに用いるための緩衝溶液、注入液又は透析液、輸液に使用される健康なドナーから得られる血漿、血小板濃縮物、赤血球濃縮物などの血液製品、血液代替物、好ましくは酸素キャリア、改変されたヘモグロビン溶液及び人工ヘモグロビン溶液、栄養を補給するための流体及び産業で使用するための流体である、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項２５】
前記固相支持体が架橋されたポリスチレンであり、前記スペーサーがポリエチレングリコールであり、各結合ユニットがアルギニンである、先行する全請求項の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックス。
【請求項２６】
流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去又は軽減する目的で前記流体から１又は複数の物質を除去し及び／又は前記物質の量又は濃度を減少させる方法であって、前記物質の量又は濃度を減少させ及び／又は前記物質を除去するのに十分な時間、好ましくは最大２４時間、請求項１−２４の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスに前記流体を接触させることを備えた方法。
【請求項２７】
前記時間が１秒ないし２時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記物質がエンドトキシンであり、前記流体が血液であり、除去又は減少された後のエンドトキシンの量又は濃度が血中成分を活性化させることができず、又は血中成分若しくはプロセスの活性化を抑制する量又は濃度である、請求項２６及び２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１ないし２５の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスを製造する方法であって、
ａ）固相支持体にスペーサーを付着させて第一の複合体を得る工程と、
ｂ）少なくとも１つの官能基を有する少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か
又は、
ｃ）少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドにスペーサーを付着させて第二の複合体を得る工程と、
ｄ）前記固相支持体を前記第二の複合体に付着させる工程か
又は、
ｅ）前記スペーサーを前記固相支持体に付着させて第一の複合体を得る工程と、
ｆ）前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程か、
又は、
ｇ）グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
ｈ）少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
ｉ）グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
ｋ）前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程と、を備え、
結合する物質上の三次元構造、電荷の存在、結合モチーフの疎水性／親水性領域についての情報がＸ線結晶学、タンパク質配列決定、タンパク質のモデリング又は疎水性及び親水性の計算から収集され、前記結合ユニットを含有するリガンドが電荷及び／又は親水性／疎水性について前記物質の結合モチーフと相補的となるように作られている方法。
【請求項３０】
ａ）とｂ）の場合、固相支持体を活性化し、固相支持体上にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、該リガンドを前記スペーサー分子に部位特異的に連結させるか、又は
ｃ）とｄ）の場合、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、スペーサー分子をリガンドに連結させ、固相支持体を活性化し、スペーサー−リガンド複合体を固相支持体に部位特異的に連結させるか、又は
ｅ）とｆ）の場合、固相支持体を活性化し、活性化された固相支持体にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを支持体に結合されたスペーサー上で固相合成する、工程を備えた、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ａ）とｂ）の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結と、活性化されたスペーサーへのリガンドの連結、又は
ｃ）とｄ）の場合、リガンドの合成と、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサー分子へのリガンドの部位特異的連結と、固相支持体へのスペーサー−リガンド複合体の連結、又は
ｅ）とｆ）の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結、固相支持体に結合されたスペーサー上でのリガンドの固相合成、という工程を備えた、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
１又は複数の物質、好ましくはエンドトキシンを、流体、好ましくは体液若しくは治療用の流体、最も好ましくは血液若しくは血清から除去するための又は前記流体中の前記物質の量若しくは濃度を減少させるための、請求項１ないし２５の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスの使用。
【請求項３３】
活性化が減少した血液又は血中成分若しくはプロセスの望ましくない活性化を抑制するための請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
体外での血液精製プロセスの一部としての又は血液若しくは任意の体液と身体中、好ましくは血管系、血管若しくは腹腔中で接触させるためのインプラントとしての、請求項３３に記載の使用。    
【請求項３５】
活性化が減少した血液を製造するための又は血中成分若しくはプロセスの望ましくない活性化を抑制するための請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で、前記流体から１又は複数の物質を除去し及び／又は前記流体中の前記物質の量又は濃度を減少させるためのキットであって、請求項１ないし２５の何れか１項に記載のポリマーアフィニティーマトリックスを備えた、キット。
【請求項３７】
試料管と、前記流体、好ましくは血液又は血清を体外及び／又は体内処理するための器具と、をさらに備えた請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
流体から１又は複数の物質を除去し又は前記流体中に存在する前記物質の量若しくは濃度を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスを製造するためのポリマーマトリックスの使用であって、
特異的なアフィニティーが前記ポリマーマトリックス上に付与される任意のリガンドに依存し、
前記ポリマーマトリックスが固相支持体とスペーサーとを含み、
該固相支持体が、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレン若しくはポリアクリレートから製造されるポリマー、水酸基により官能性をもたせたポリメタクリレート、ヒドロキシアルキル−ポリスチレン、ヒドロキシアリールポリスチレン、ヒドロキシアルキル−アリール−ポリスチレン、ポリヒドロキシアルキル化されたポリスチレン、ポリヒドロキシアリール化されたポリスチレン、イソシアナートアルキル−ポリスチレン、イソシアナートアリールポリスチレン、カルボキシアルキル−ポリスチレン、カルボキシアリールポリスチレン、アミノアルキル−ポリスチレン、アミノアリールポリスチレン、ポリメタクリレート、架橋されたポリエチレングリコール、セルロース、シリカ、炭水化物、ラテックス、シクロ−オレフィン共重合体、ガラス又はそれらの組み合わせからなる群から選択される材料、好ましくは架橋されたポリスチレンから構成され、
前記スペーサーが式Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎは２−２５０である）のポリ又はオリゴエチレングリコールからなる群から選択される、ポリマーマトリックスの使用。
【請求項３９】
前記固相支持体が、ビーズ、ゲル、膜、粒子、網、織布若しくは不織布、繊維、マット、チューブ、フィルム、ホイル又はそれらの組み合わせ、又は架橋された互いに貫通し合うネットワークの形態を有する、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記スペーサーが、直鎖及び／又は分岐状の立体配置のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、４００−１００００ダルトンの平均分子量を有し、又はそれらの誘導体である、請求項３８又は３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記ポリマーマトリックスが血漿又は全血の灌流を可能とするのに十分な膨潤能を有する、請求項３８ないし４０の何れか１項に記載の使用。
【請求項４２】
乾燥状態から水和された形態への膨潤能が約１．５−２０倍、好ましくは２−６倍である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記ポリマーマトリックスがゲル型ビーズの形態を有する、請求項３８ないし４２の何れか１項に記載の使用。
【請求項４４】
前記流体が水性又は有機溶液、体液、好ましくは血液、治療用流体、生命科学に用いるための流体、好ましくは生物学、診断又はバイオテクノロジーに用いるための緩衝溶液、注入液又は透析液、健康なドナーから得られる血漿、血小板濃縮物、赤血球濃縮物などの血液製品、好ましくは酸素キャリア、改変されたヘモグロビン溶液及び人工ヘモグロビン溶液、栄養を補給するための流体及び産業で使用するための流体である、請求項３８ないし４３の何れか１項に記載の使用。
【請求項４５】
前記ポリマーマトリックスが約１×１０２ないし約１０６ダルトンのカットオフ値を有し、疎水性及び／又は親水性物質を結合する、請求項３８ないし４４の何れか１項に記載の使用。
【請求項４６】
前記固相支持体が架橋されたポリスチレンであり、前記スペーサーがポリエチレングリコールである、請求項３８ないし４５の何れか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去又は軽減する目的で、前記流体から物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させるために、流体中の１又は複数の物質を結合するためのポリマーアフィニティーマトリックスと、前記流体から前記物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させる方法と、前記マトリックスを製造する方法と、前記マトリックスの使用と、前記マトリックスを備えたキットと、に関する。
【０００２】
本発明は、流体から１又は複数の物質を除去し又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスを製造するためにポリマーマトリックスを使用することにも関する。
【発明の背景】
【０００３】
体外処理
血液その他あらゆる体液などの流体を体外処理するには、例えば、チューブ、ライン、ビーズまたは膜などの形態の材料に流体を接触させることが必要である。このような材料を導入することは、外来性であるために生体に適合しないことがある（例えば、免疫学的に活性であり、または凝固を促進する）材料を使用することを意味する。かかる外来性材料を使用すると、例えば、リンパ球、血小板または補体もしくは凝固カスケード中のタンパク質のような様々なタイプの血漿タンパク質カスケードなどの血中成分の宿主免疫系の活性化が付随する。また、機械的な損傷またはストレスによって生じた損傷（例えば赤血球への損傷）など、細胞への損傷は、溶血や溶血後に患者に発生する致死的な合併症を引き起こすことがある。したがって、血液やあらゆる体液など流体を処理するには、前記流体（例えば、血液）中の成分に望ましくない活性化が生じないようにするため、生体適合性が極めて高い材料を使用することが必要である。
【０００４】
細菌のトキシン
血液細胞と宿主中の可溶性タンパク質とエンドトキシンとの間に生じる複合的な相互作用によって引き起こされる活性化のために、細菌のエンドトキシンやエキソトキシンは、過剰な炎症性免疫反応を宿主に起こさせる。この免疫反応は、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）、敗血症または敗血症ショックの臨床症状における本質的な特徴として記載されている。病態は重篤であり、本症状は、敗血症によって生じる組織障害、多臓器不全、死亡にいたる。最近の治療行為に関する研究(Dinarello et al. in European Cytokine Network 1997,8:294)では、重篤な敗血症または敗血症ショックを有する患者を保護できないことが明らかとなっているため、敗血症患者を治療するための新しい治療薬と方法を探索することは重要である。また、治療用物質または流体を製造する場合には、製品が非発熱性であるように、すなわち、エンドトキシン濃度がゼロであるか、その効果を発揮するものとして受容されている限度を下回るように、注意を払わなければならない。
【０００５】
エンドトキシン
グラム陰性菌（例えば、Esherichia coli、Salmonella typhi、Pseudomonas aeruginosa又はProteus vulgaris）の細胞膜の外膜に由来するエンドトキシン又は「パイロジェン」は、敗血症、敗血症ショックおよび全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の発症に重大な役割を果たしている。例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉから得られるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のようなエンドトキシンは、リピドＡとポリ多糖鎖から構成されている（Zahringer et al. Adv. Carb. Chem. Biochem., 1994）。図１には、ＬＰＳの分子構造が示されている。リピドＡ部分は、生物学的に最も活性な部分であり、細胞に対するエンドトキシンの毒性効果を媒介する。リピドＡは、グラム陰性細菌の様々な系統中で極めて保存されているのに対して、ポリ多糖部分はずっと多様性に富んでいる。
【０００６】
Ｅ．  ＣｏｌｉのリピドＡは、２つのグルコサミン部分からなり、このグルコサミン部分には、２つのグルコサミンの反対側末端に位置する負に帯電した２つのリン酸基と、２つのグルコサミン環に連結された疎水性の高い６つの長鎖脂肪酸残基とが含有されている。多様性を有するエンドトキシンのポリ多糖鎖も、前記グルコサミンの１つに連結されている。
【０００７】
エンドトキシンの除去
エンドトキシンを除去することは困難であり、大切なタンパク質（すなわち、除去すべきでないタンパク質）の回復に関する問題や大切なタンパク質に対する損傷に関する問題、または血液もしくは体液やエンドトキシンを除去するために用いた手段の生体適合性の問題が発生することが多い。このような生体適合性の問題は、単に宿主の防御機構が活性化されることによって引き起こされるものであって、複数の細胞の活性化や、補体カスケード中のサイトカインおよびタンパク質などの可溶性タンパク質の放出が関わっている。細胞の活性化とタンパク質の放出は、重度の炎症（すなわち、全身的な敗血症または敗血症ショック）を引き起こすことがあり、その結果、組織の損傷や臓器不全が起こる。血液凝固によって生じる凝血は、生体不適合性によって引き起こされる別の問題である。さらに、パイロジェンが完全には除去されないことがある。
【０００８】
エンドトキシンを除去するための公知の方法には、熱、酸またはアルカリを使用した不活化がある（米国特許第３，６４４，１７５号、第３，６５９，０２７号、および第４，０７０，２８９号）。この種の処理を使用することにより、流体やその大切なタンパク質も変性または不活化されてしまうことがあるので、このような方法は、最終製品の品質を損なってしまうこと、すなわち、不活化された解毒流体が得られることが多い。その他の使用される方法としては、活性炭への吸着、または酸化剤（例えば、過マンガン酸カリウム、過酸化水素水、次亜塩素酸塩）を用いた酸化的分解がある。
【０００９】
エンドトキシンを除去するための従来の手段
敗血症患者の血漿または全血からエンドトキシンを体外除去することは、敗血症、敗血症ショックおよびＳＩＲＳの治療において採り得る療法として議論されている。ヒトの血漿中には、例えば、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、殺菌性透過亢進タンパク質（ＢＰＩ）、ｓＣＤ１４、ＣＡＰ１８、ラクトフェリンなど、エンドトキシンが細胞に及ぼす効果の媒介および阻害において役割を果たしている結合タンパク質が幾つか存在する。ペプチド抗生物質であるポリミキシンＢ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａによって産生される）は、細胞に対するエンドトキシンの作用を阻害する。カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）も、エンドトキシン結合タンパク質を含んでおり、本種から得られる細胞可溶化物はエンドトキシンの検出に用いられている（カブトガニ血球抽出物、ＬＡＬ、またはＬｉｍｕｌｕｓテスト）。このようなエンドトキシン結合タンパク質の結合モチーフは、敗血症患者の血漿または全血の体外治療に使用できる可能性がある。
【００１０】
多くのエンドトキシン結合配列に共通する特徴は、その結合部分中に正に帯電したアミノ酸と疎水性アミノ酸が交互に存在することである。カブトガニから得られたあるエンドトキシン結合タンパク質は、エンドトキシン結合配列が両親媒性の二次構造を形成しており、この二次構造中では、正に帯電した残基と疎水性残基がループ構造の反対表面に位置していることが示されている（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９３）。他のエンドトキシン結合部位についても、同様のパターンが提唱されている。
【００１１】
ポリエチレンイミン(Mizner et al. Artif. Organs, 1993; Weber et al. ASAIO J, 1995; Petsch et al. J Chromatogr. Biomed. Sci. Appl., 1998)またはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）で修飾されたセルロース(Weber et al. A.S.A.I.O.J.,1995)などの正に帯電したポリマーは、エンドトキシンを吸着する能力をある程度有しているが、これは、正電荷がリピドＡの負に帯電したリン酸残基と相互作用することによるものであろう。ポリエチレンイミンの欠点は、ヘパリンを強く吸収すること、および数多く報告されている血小板との相互作用であり、インビボまたはエキソビボで使用した際に凝固などの生体不適合性の問題が生じる。
【００１２】
同様に、正に帯電した膜フィルターが注入液の精製に使用されている。吸収は、このように、誘引電荷に依存するため、特異性が低く、従って、望ましい大切なタンパク質も除去してしまう可能性がある。
【００１３】
セファロース上に固定されたアルギニンを用いて、血漿、血液、薬学的溶液からエンドトキシンを除去することが提案されている（ＥＰ  ０，４９４，８４８号およびＥＰ  ０，３３３，４７４号）。
【００１４】
ＷＯ  ９２／１１８４７号は、エンドトキシンによって生じた効果を治療するために、経口、静脈内、筋肉内、皮内または腹腔内で使用する医薬を調製するための化合物の使用およびエンドトキシンによって生じた効果を治療するための方法を記載している。ＷＯ  ９２／１１８４７号に記載されている化合物は、固相支持体上に固定されていない。
【００１５】
同じく、疎水性ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン）も、水溶液中でエンドトキシンを吸着することができる。この特性は、水および透析／注入液（すなわち、タンパク質含量が少ないか、またはゼロの溶液）を精製するための限外ろ過膜に使用されている(Weber et al., Int. J. Artific. Org.,1997)。しかし、単なる疎水性吸収であり特異性が低いために、血液または血漿からエンドトキシンを除去すると、循環血漿タンパク質（ＬＢＰ、ＢＰＩ、ｓＣＤ１４）や細胞受容体（例えば、ＣＤ１４）のタンパク質が吸着マトリックスへの吸着を競合するという問題が発生する。
【００１６】
エンドトキシンを除去するために正に帯電したポリマーまたは疎水性ポリマーを使用することにより、結合の特異性が低く、従って、血漿中のエンドトキシンを除去するための選択性も低いことが明らかとされている。実際、高い生体適合性を保ちながら、高い特異性と高い選択性を有する効率的なエンドトキシン吸着剤の開発が試みられてきた。
【００１７】
例えば、殺菌性透過亢進（ＢＰＩ）タンパク質産物を使用することによって、エンドトキシン結合タンパク質から得られるペプチド配列を治療に用いることが提案されている（米国特許第５，６３９，７２７号および第５，６４３，８７５号）。固定化されたペプチドの欠点は、合成のコストと、結合構造を妨害せずにペプチドを固定化しなければならないことである。
【００１８】
ヒスタミン、ヒスチジン、ポリミキシンＢなどのアフィニティーリガンドは、エンドトキシンを除去するのに有効であるが、それらの有効性は流体中の他のタンパク質に依存しており、血清アルブミンや負に帯電した他のタンパク質のような血清タンパク質が存在すると激減する(Anspach and Hilbeck, J. Chromatogr. , 1995, Petsch et al. J. Chromatogr., 1997, EP 0 129 786)。しかし、ポリミキシンＢは、中枢神経系に対する毒性があるとともに、腎障害を引き起こすことがある。これは、患者の血液中に漏出するリスクのために、市場化の承認を得る上での欠点となる。米国特許第４，７７１，１０４号には、ポリミキシンＢに固定された繊維状担体から構成されるエンドトキシン解毒物質が記載されている。
【００１９】
水に不溶性のポリ（ε−リジン）（ＰＬ）粒子を使用してエンドトキシン（特に、ＬＰＳ）を薬物や流体から除去することが、「Hirayama et al, in Journal of Chromatography B, 271 (1999), 187-195」に記載されている。
【００２０】
限界と将来の展望
タンパク液からのエンドトキシンの効率的な除去は、エンドトキシンを除去すべき所望の大切なタンパク質の総電荷に依存している。エンドトキシンとそのリガンド間の相互作用には、疎水性のものとイオン性の両方があるが、それぞれの寄与は流体のイオン強度とｐＨに依存する。効率的なエンドトキシンの除去は、例えば、細胞の活性化や血液凝固を抑えるために前記エンドトキシンを除去する手段の灌流および生体適合性の高さにも依存する。
【００２１】
しかし、例えば、血液、他の体液または治療用の流体などの流体からエンドトキシンのような物質を除去するために多くの手段が開発または提案されてきたが、報告されている手段は何れも生体適合性が高いものではなく、除去すべき物質（例えば、エンドトキシン）に対する特異性と選択性の程度も高くなく、同時に、例えば全血または血漿によって、例えば、エンドトキシンを容易に灌流できない。このため、流体から、物質（例えば、エンドトキシン）を除去するための極めて効率的で、生体適合的かつ効果的な方法と手段を開発し、従来の装置に伴う問題を回避できるようにすることが望まれている。この点について、本発明は、かかる要求と関心に応えるものである。
【００２２】
流体中の成分またはプロセスが不必要に活性化されるのを抑制し、解消し、または軽減させる目的で、特に生物医学の分野で、流体から１又は複数の物質（例えば、血液、その他のあらゆる体液または治療用流体からエンドトキシン）の濃度を減少させまたは除去するための新規かつ効率的な方法と手段が必要とされていることは、上述した理由から明らかである。このような方法と手段は、敗血症患者の血漿からパイロジェンまたは他の活性化物質を体外除去することによって、敗血症、敗血症ショックおよびＳＩＲＳを治療する上でも、特に有用であろう。
【００２３】
さらに、マトリックスまたは基材に生物特異的リガンド（例えば、抗体またはペプチド）を結合し、これによって、身体または血液循環から、例えば、病態生理的に重要な物質を除去することが周知である。
【００２４】
使用されている公知の物質には、ビーズまたは粒子の形態をした、例えば、セファロース（セファデックス、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ポリアクリレートまたはエポキシド樹脂がある。
【００２５】
公知のビーズは、例えば、ポリメチル−メタクリレート（例えば、ＬＤＬを吸着するためのDALI-System(Fresenius)）；セファロース（例えば、フィブリノーゲンを吸着するために固定化ペプチドを用いるPlasmaselectのRheosorb-System；ヒト免疫グロブリンを結合する固定化ヒツジ抗体を用いて自己抗体を除去するためのTherasorb-Immunoadsorption-System；免疫グロブリンを結合するために固定化された細菌タンパク質を用いたExcorim-Protein  Ａカラム（および他のメーカーの類似システム））からできている。
【００２６】
公知の膜には、例えば、ポリアミド（ＭＡＴ／Ｍｅｒｃｋ）や一般にアフィニティーメンブレンと称されるその他の膜がある。
【００２７】
公知のファブリックには、例えば、ＬＰＳを結合するためにポリミキシンＢリガンドを備えたＴｏｒａｙのポリスチレン／ポリエチレンメッシュがある。
【００２８】
これらの基材はすべて、生物リガンド（ペプチドまたは抗体など）を使用する場合には、湿式化学の慣用法によって修飾される。すなわち、まず、（例えば、ペプチド合成によって、バイオテクノロジー法によって）対応する特異的リガンドを形成または単離した後に精製し、固相マトリックスに固定化する。
【００２９】
これらのマトリックスの場合、固相合成で使用される化学物質（保護基などを切断するために用いられる溶媒、酸、塩基）に対して化学的に不適合であるために、マトリックス上でリガンド（例えば、ペプチド）を直接固相合成することができない。
【００３０】
固相合成に適したマトリックス（例えば、ポリスチレン）は、生体適合性がないために、治療用途には適さない。
【００３１】
したがって、固相合成が可能で、且つ血液成分（例えば、血漿または全血）と接触させることができる固相マトリックスは、以下の理由で有利である。
【００３２】
（１）適切なリガンドを見つけるための開発工程（例えば、ペプチド構造の最適化）を同じ固相マトリックス上で行うことができ、この固相マトリックスを後に治療のために使用することができる。これは、その後の治療用途の条件と極めて似通った条件下で、必要な生物的検定操作（例えば、アフィニティー、特異性、結合能の測定）を行えることを意味している。これにより、生物検定操作によって得られる情報は極めて信頼性が高くなり、その後に行われる治療または臨床用途についての予測が可能となる。このため、時間とコストが節約され、失敗や副作用のリスクが少なくなる。
【００３３】
（２）（配列やジオメトリに関して）正確に確定された方法で、固相合成によって（ペプチド）リガンドを構築することができる。これは、固相マトリックスへの（ペプチド）リガンドの結合（すなわち、共有結合の位置）が正確に定まっていることも意味している。
【００３４】
膨潤または湿潤特性について、このようなマトリックスが満たすべき要件は若干矛盾している。固相合成の場合、通常、非水系有機溶媒（ジメチルホルムアミドなどの極性溶媒またはジクロロメタンなどの無極性溶媒）または溶媒の混合物が用いられる。これに対して、治療への使用は、水系環境（例えば、血漿、血液、治療溶液など）で行わなければならない。両環境（すなわち、水系溶媒と有機溶媒）中で、ポリマーマトリックスは容易に湿潤可能で且つ膨潤可能でなければならない。すなわち、
（１）未結合の（過剰な）リガンドまたは構造単位（例えば、保護されたアミノ酸）または化学物質（例えば、カルボジイミドなどのカップリング剤、有機酸または塩基などの脱保護剤）を効果的に除去または洗浄できるようにするため、また、
（２）水系環境から各トキシンが除去できるようにするために、マトリックスは、この環境中でも湿潤可能で且つ膨潤可能でなければならない。
【００３５】
従って、公知のポリマーマトリックスが有する問題は、流体から除去すべき物質を捕捉した材料のみを溶出し、結合した活性リガンド自体は溶出させないようにするために使用する再生流体の種類が限定されてしまうことと、所定のペプチド／分子またはランダムに重合したポリペプチド／オリゴマーとしてリガンドを構築した後、支持材料そのものに結合させなければならないため、結局、どのような形で終了したのか分からないことである。
【００３６】
本発明の使用によって得られる利点は、ポリエチレングリコールがグラフトされた固相支持体上に直接リガンドを構築することができ、リガンドが構築された固相支持体を直接使用できるということである。これにより、従来のマトリックスでは得られなかった確実性が得られる。さらに、生物学的に活性／特異的なリガンドが医療器具の一部となっており、開発時間が短縮されるので（これにより、一種の個別的治療が可能または容易になる）、技術的な利点も有している。
【００３７】
開発中には、本発明の材料が現在明らかとなっているような卓抜した働きを見せることは知られておらず、予想もされていなかった。予想されていた欠点は、例えば、ポリマーマトリックスが膨潤し、器具内の流れを塞ぐということであった。さらに、全血のような流体を与えた際の圧力低下も大きすぎると予想された。最後に、上述した理由により、固相材料中に流体を灌流するのは不適当であると考えられていた。
【００３８】
好ましい実施形態の１つに係るポリマーマトリックスは、蒸気滅菌し、その後乾燥するのに極めて適していることが示された。乾燥が終わったら、ポリマーマトリックスに対して生理食塩水溶液を添加して再度膨潤させ、即座に使用できるようにすることにより、残存する空気は容易に除去される。これにより、病院での準備時間が短縮されることになるが、これは、例えば、緊急状態や作業量が多い場合には重要である。
【００３９】
さらに、様々なタイプのリガンドについて使用される多くの既存の固相支持体とは異なり、前記材料は即時に湿潤させることができる。これは、活性なリガンド用の固相材料としては極めて重要な特徴である。さらに、前記材料は、一定の範囲で圧縮および除圧することができ、前記材料は、補体活性化、接触相活性化、細胞毒性、顆粒球活性化に関して生体適合性がある。
【発明の概要】
【００４０】
従って、本発明の主たる目的は、流体中に存在する上記の望ましくない物質（例えば、エンドトキシン）を除去し及び／又はその量または濃度を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスであって、生体適合性が高く、特異的で、選択的、且つ容易に灌流されるポリマーアフィニティーマトリックス、すなわち、従来技術の利点を全て備えるとともに、欠点が全くなくなったポリマーアフィニティーマトリックスを提供することによって、従来技術に伴う問題をなくすことである。
【００４１】
この目的は、本発明の第一の側面、すなわち、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、軽減する目的で、前記流体から物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させて前記流体中の１又は複数の物質を結合するためのポリマーアフィニティーマトリックスであって、
ａ）固相支持体と、
ｂ）該固相支持体に結合され且つ各スペーサーに連結された少なくとも１つのスペーサーと、
ｃ）少なくとも１つの官能基を有する少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドであって、前記物質の結合モチーフの三次元構造に対して相補的な電荷及び／又は親水性／疎水性である所定の三次元構造を有するリガンドと、を備え、前記ポリマーアフィニティーマトリクスが前記物質を選択的に結合することができる、ポリマーアフィニティーマトリックスによって達成される。
【００４２】
好ましい実施形態において、本発明は、エンドトキシンを除去して流体中における成分またはプロセスの望ましくない活性化を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスであって、前記マトリックスが、前記エンドトキシンの結合モチーフの三次元構造に対して相補的な三次元構造を有するリガンドを与えることにより、前記エンドトキシンを結合することができる、ポリマーアフィニティーマトリックスに関する。
【００４３】
本発明の前記ポリマーアフィニティーマトリックスの好ましい実施形態において、前記固相支持体は架橋されたポリスチレンであり、前記スペーサーはポリエチレングリコールであり、前記リガンドの少なくとも１つの結合ユニットはアミノ酸であり、各官能基はアミノ基又はグアニジノ基である。
【００４４】
前記流体の活性化を減少させるためにエンドトキシンを除去するための好ましい実施形態において、前記ポリマーアフィニティーマトリックス中の各結合ユニットは、血液の生理的ｐＨにおいて又は血液の生理的ｐＨ付近で正に帯電したアミノ酸、最も好ましくはアルギニン、リジン、システイン、若しくはヒスチジン、又は血液の生理的ｐＨにおいて又は血液の生理的ｐＨ付近で正に帯電した少なくとも１つの官能基を有する別の二若しくは三官能分子を備える。このようなポリマーアフィニティーマトリックスは、約１×１０２−１×１０６ダルトンという所定のカットオフを与え、疎水性物質及び／又は親水性物質をともに結合するために使用することができる。
【００４５】
別の側面において、本発明は、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で前記流体から１又は複数の物質を除去し及び／又は前記液体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させる方法であって、前記目的の物質の量又は濃度を減少させ及び／又は前記目的の物質を除去するのに十分な時間、好ましくは最大２４時間、最も好ましくは１秒ないし２時間、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスに前記流体を接触させることを備えた方法に関する。但し、前記時間は、流速、カラムサイズ、適用様式（すなわち、処置がインビボ、エキソビボ、又はインビトロで行われるかどうか）に応じて異なる。除去又は減少が行われた後の前記物質の量又は濃度は、血中の成分又はプロセスを活性化できなくなるか、あるいは、血中の成分又はプロセスの活性化を抑制することが好ましい。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを製造する方法であって、
ａ）固相支持体にスペーサーを付着させて第一の複合体を得る工程と、
ｂ）少なくとも１つの官能基を有する少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
ｃ）少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドにスペーサーを付着させて第二の複合体を得る工程と、
ｄ）前記固相支持体を前記第二の複合体に付着させる工程か、
又は
ｅ）前記スペーサーを前記固相支持体に付着させて第一の複合体を得る工程と
ｆ）前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程か、
又は
ｇ）グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
ｈ）少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
ｉ）グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
ｋ）前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程、を備え、
三次元構造、電荷の存在、結合する物質上の結合モチーフの疎水性／親水性領域についての情報がＸ線結晶学、タンパク質の配列決定、タンパク質のモデリング、疎水性及び親水性の計算から収集され、前記結合ユニットが電荷及び／又は親水性／疎水性について前記物質の結合モチーフと相補的となるように作られている、方法に関する。
【００４７】
さらなる側面において、本発明は、１又は複数の物質、好ましくはエンドトキシンを、流体、好ましくは体液（ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄ）若しくは治療用の流体、最も好ましくは血液から除去するための又は前記流体中の前記物質の量若しくは濃度を減少させるための前記ポリマーアフィニティーマトリックスの使用に関する。
【００４８】
さらなる側面において、本発明は、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で、前記流体から１又は複数の物質を除去し及び／又は前記流体中の前記物質の量又は濃度を減少させるためのキットであって、前記ポリマーアフィニティーマトリックスと、試料管と、前記流体、好ましくは血液又は血清を体外及び／又は体内処理するための器具と、を備えたキットに関する。
【００４９】
本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを使用することにより、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制、除去又は軽減する目的で、前記流体からエンドトキシンなどの１又は複数の物質を除去し及び／又は前記物質の量又は濃度を減少させるために、血液、他の任意の体液又は治療用の流体などの流体の処理を最適に行えるであろう。
【００５０】
具体的には、本発明の極めて生体適合性が高く且つ灌流可能な材料を使用することは、前記ポリマーアフィニティーマトリックスを使用している間に前記流体中で活性化が起こらないようにするために重要である。
【００５１】
このことは、敗血症患者の血漿または血液からエンドトキシンを体外除去するのに特に重要であり、敗血症、敗血症ショックおよびＳＩＲＳの治療において採り得る療法として開示されている。さらなる利点として、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを使用することにより、患者の治療時間が短くなるものと思われる。
【００５２】
本発明のさらなる利点と特徴は、図面及び添付の特許請求の範囲を併用することにより、以下の詳細な説明からさらに明確となるであろう。
【発明の詳細な説明】
【００５３】
上述のように、本発明は、血液、他の任意の体液又は治療用の流体などの流体から物質を除去して前記流体中に存在する成分又はプロセスの活性化を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスであって、同時に、前記流体中に存在する他の有益な物質、例えば、血液の生理的成分の吸着を回避するのに十分な特異性を有する、ポリマーアフィニティーマトリックスに関する。該マトリックスには、例えば、エンドトキシンの量又は濃度を喪失又は減少させるために、前記物質の結合モチーフの構造に相補的な構造を有するリガンドが与えられる。
【００５４】
定義
本明細書において、「物質を除去する」という用語は、ある物質を抑制し、低減し、減少し、中和し、不活化し、分解し、修飾し、取り除き、結合し、または隠すことを意味するものとし、物質の量又は濃度がゼロであることを必ずしも意味するものではない。さらに、「物質の量又は濃度を減少させる」という用語は、その後に流体中で生じる成分の活性化及び／又は流体中での細胞及び／又は非細胞性の生物的機序を抑制又は阻害するのに十分な程度まで、前記流体中の物質の量又は濃度を低減又は減少させることを意味する。
【００５５】
「成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制し、排除し、又は軽減する」という用語は、流体中、例えば血液又は組織細胞中における何らかの化学的、生物的又は生化学的プロセス（例えば、シグナル伝達経路等の血漿タンパク質カスケード、補体又は凝固プロセス及び／又はこのようなプロセスに関与する成分の活性化）を、直接的又は間接的に不活性化し、阻害し、低下し、減少し、軽減し、速度を低下させ又は抑制することを意味する。物質の「直接的な除去」では、中間工程を一切行わずに、操作を実行するのに対して、「間接的な除去」では、物質の除去が一連の長い反応又は反応のカスケードの一部を成すことを意味し、この場合、上流の物質を除去することによって、目的とする下流の現象が抑制され、速度が低下し又は阻害される。このことは、例えば血液から物質を除去することにより、不活性化された血液又は活性化の程度が低下した血液が得られる可能性があることを意味している。また、血液などの流体の活性化を抑制することも意味している。
【００５６】
「流体」という用語には、慣用の溶液（例えば、水溶液又は有機溶液）、又は血液、任意の体液又は治療用の流体、生物学、診断又はバイオテクノロジーで使用するための流体など生命科学で使用するための流体（例えば、緩衝液、注入液、又は透析液、栄養を補給するための液体）及び産業で使用するための流体を含む懸濁液又は溶液など、あらゆる気体又は液体などのあらゆる流体が含まれるものとする。
【００５７】
「体液（ｂｏｄｙ  ｆｌｕｉｄ）」という用語には、血液、血漿、脳脊髄液、腹水及び（例えば、血液濃縮後の）補液、輸血に使用する血漿、血小板濃縮物、赤血球濃縮物など健康なドナーから得られた血液製品が含まれるものとする。
【００５８】
「治療用の流体」という用語には、腹膜透析液、血液透析濃縮物及び透析水、補充液／オンライン調製された液体、注入液、非経口栄養液、手術で使用される洗浄液、血液成分を調製するための液体、血液代替物（例えば、酸素キャリア、改変されたヘモグロビン溶液、人工ヘモグロビン溶液）が含まれるものとする。
【００５９】
「生命科学で使用するための流体」という用語には、細胞培養組織工学、分子生物学（例えば、ＰＣＲ技術に使用されるタンパク質や酵素の溶液）、微生物学、分析学及び医薬の調製を行うための流体及び／又は媒体が含まれるものとする。
【００６０】
「栄養を補給するための流体」という用語には、飲用水、戸外で使用する流体、飲食物の濃縮物又は粉末を戻すための流体が含まれるものとする。
【００６１】
「固相支持体」という用語は、リンカー又はスペーサーを介在させ又は介在させずに、例えばポリペプチドの形態をしたリガンドなどの分子をその上に合成又は結合させることができる固相又は支持体又は不溶性マトリックスを意味するものとする。
【００６２】
「官能基」という用語は、例えば、アミノ酸、脂肪酸、炭水化物、レクチン、ヌクレオチド、及びそれらの誘導体、又はそれらの組み合わせ、特定の化学的特性又は構造（例えば、正又は負の電荷、疎水性又は親水性、及び／又は他の任意の物理化学力、例えば、ファンデルワールス力や芳香族基間のπ−π相互作用、又は水素結合若しくは共有結合などのさらなる結合を形成する力）など、分子を与える特定の原子又は原子群、すなわち、本発明のマトリックス中に存在する結合ユニットを意味するものとする。アミノ酸上の官能基の例は、ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、グアニジノ、及びＮＨ２であるが、置換されたアミノ基又は正に帯電した任意の基又はそれらの混合物であってもよい。
【００６３】
「結合ユニット」という用語は、「官能基」という用語の定義中で先述した分子を意味するものとし、該分子は、除去及び／又は軽減すべき物質への結合に必要であり、少なくとも１つの官能基を含み、本発明のポリマーアフィニティーマトリックス中のスペーサーに結合したリガンド中に含まれる。
【００６４】
「結合モチーフ」という用語は、除去すべき物質上に存在する単一の又は反復した三次元の構造的及び化学的なモチーフを意味するものとする。
【００６５】
「リガンド」という用語は、スペーサーを介してマトリックスに結合した三次元分子の全体、すなわち、少なくとも１つの官能基とともに少なくとも１つの結合ユニットを備えたものをいう。前記リガンドは、除去すべき前記物質上に存在する結合モチーフに結合し、該モチーフとともに三次元の相補的構造を形成する。ここで、「相補的」とは、除去すべき物質の結合モチーフの相補的三次元構造と正確に対合できることを特徴とする三次元的及び幾何学的に規定された構造を意味するものとする。
【００６６】
ある化合物に関して用いられた「その誘導体」という用語は、その化合物自体と同一又は実質的に同一の機能を有するように誘導体化された１又は複数の化合物を意味するものとする。
【００６７】
さらに、リガンドを構成する前記化合物の異性体がその化合物自体と同一又は実質的に同一の機能を示す限り、異性体も本発明の範囲に含まれるものとする。構造式中、α及びεは、アミノ酸について一般に使用される命名法に従って、分子をさらに共有結合するために使用されるアミノ基を表している。
【００６８】
「物質」という用語は、前記結合ユニットに結合することが意図されている、可溶性又は不溶性の少なくとも１つの目的の成分又は分子を意味するものとする。物質の例としては、ウイルスや細菌に由来する物質などの血液細胞を活性化できる毒性物質（例えば、エンドトキシン）、リンパ球、血小板、顆粒球、樹状細胞、単球、内皮細胞、幹細胞、腫瘍細胞などの血液細胞集団、グルコースから得られた分子又はその分解産物、血液凝固タンパク質、凝血原タンパク質、炎症又は炎症促進タンパク質、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、ケモカイン、尿毒症毒素、マクロファージ遊走阻止因子などの血液成分又は代謝活性から得られる産物が挙げられる。血液成分の例としては、例えばウイルス粒子、プリオン、又は寄生生物、真菌、病原体が存在する血液細胞などの接触感染症を引き起こす感染性物質の他、過剰投与後の薬物、病原性食品添加物又は身体に由来しないその他の成分が挙げられる。さらに、発熱物質、特に細菌の発熱物質、細菌のエンドトキシン、リポタイコ酸などグラム陽性細菌から得られる産物、例えば糖尿病、肝疾患、尿毒症又は腎疾患又は炎症によって起こる慢性又は急性の代謝的なかく乱から生じる産物、並びに接着カスケード（例えば、可溶性接着分子）も、前記物質に含まれる。除去するのに好ましい物質は、例えば、ＬＰＳなどのグラム陰性細菌由来のエンドトキシン、並びに細菌のＤＮＡ又はその断片又はそれらの分解産物、及びオリゴヌクレオチド、ヘパリン、ホスフェート、血液細胞、可溶性タンパク質又は細胞表面に結合したタンパク質である。
【００６９】
「スペーサー」という用語は、固相支持体の一部を成すように固相支持体を修飾し、少なくとも１つの官能基を含有する少なくとも１つの結合ユニットを有するリガンドを前記固相支持体から離れて配置させ、固相支持体からの立体障害によって前記リガンドが受ける制約を少なくするとともに、結合すべき物質（例えばエンドトキシン、細胞集団又は血液成分）にとってリガンドを利用し易くする鎖状に形成された分子（例えば、ポリマー）を意味するものとする。スペーサー分子は、直鎖及び／又は分岐及び／又は環状の様式とすることができる。スペーサーの長さは、除去すべき物質の構造的な要件によって予め規定される。
【００７０】
「間隔付与分子（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」という用語は、所望であれば、前記結合ユニットと一般式Ｉ及びＩＩで表される三官能性分岐分子との間及び／又は前記スペーサーと前記三官能性分岐分子との間に構造的な距離を与える機能を有する前記リガンド内の二官能性分子を意味するものとする。間隔付与分子は、環状の様式とすることもできる。
【００７１】
「発熱物質」、特に「細菌性発熱物質」という用語は、より一般的には細菌由来の発熱性物質、例えばエンドトキシンを表す。
【００７２】
本明細書において、「生体適合性」という用語は、マトリックスの使用により、患者の免疫系の活性化を引き起こさず、あるいは、仮に活性化が起こっても、少なくとも活性化の程度が僅かであるという意味において、例えば細胞、凝固、補体カスケード又は類似のプロセスの活性化などの活性化能が欠如し又は存在しないことを意味するものとする。このことは、生体適合性のある化合物又は物質を使用すれば、例えば、血液又は他の体液中で成分又はプロセスの望まない又は望ましくない活性化や機械的な又はストレスによる細胞死又は細胞溶解が一切生じないと思われることを意味する。
【００７３】
ポリマーアフィニティーマトリックス
様々な物質を結合し、吸着するのに十分な多様性を本発明のポリマーアフィニティーに与えるために、前記リガンドは、１−１００個の官能基、好ましくは１−３２個の官能基を含むことができる。
【００７４】
本発明のポリマーアフィニティーマトリックスは、ビーズ、ゲル様構造、膜若しくは膜の一部、フィルム、又はネット、又はこれらの組み合わせの形態とすることができる。
【００７５】
具体的には、前記マトリックスが本発明に従って構成される場合、約１×１０２ないし１×１０６ダルトンの所定のカットオフを与え、一切の制約なしに、疎水性物質と親水性物質をともに結合することができるであろう。
【００７６】
好ましい実施形態では、前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、ＰＥＧをスペーサーとして使用したＰＳ−ＰＥＧビーズ（例えば、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎから入手可能なＴｅｎｔａＧｅｌ（Ｒ））の形態である。スペーサーとして使用されるＰＥＧには、有機溶媒と水性溶媒の両溶媒中でビーズの膨潤が優れているという利点があり、準流体的特性を有しているため、流体中におけると同様の拡散過程、好ましくは、水の拡散計数（すなわち、４０％）に近い拡散が可能となる。
【００７７】
生体適合性
本発明によれば、前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、好ましい形態において、全血の体外処理などの特定の用途に用いた場合に高い生体適合性を示すはずである。生体適合性が高いということは、ある一定の特性が別の特性より重要であるように意図されていることを意味する。例えば、Ｄｅｐｐｉｓｃｈら(Kidney Int. 37:696-706)に従って、初期複合体の形成と終末補体複合体（ＴＣＣタンパク質）の定量によって測定した場合に、補体の活性化が存在しないことが重要である。また、血栓形成が少ないことが患者にとって望ましい。血栓形成の程度は、Ｄｅｐｐｉｓｃｈら(Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23,1994)に従い、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）を定量することによって測定され、血液又は血漿処理中に増加すべきでない。さらに、処理前と処理後に白血球と赤血球の血液細胞数が一定であること、接触相活性化による細胞の活性化が存在しないことも含まれる。血液細胞数が一定であるとは、単なる圧力、活性化又は機械的な損傷によって血液細胞に生じる損傷の程度が低く、又は実質的に損傷が生じないことを意味するものとする。
【００７８】
活性化が起こると、細菌性の敗血症や敗血症ショックを有する患者では、例えば顆粒球又は好中球によって産生されるエラスターゼなどのプロテアーゼが増加する(Heiden et al. Sem. Thromb. Hemost. 1996)。好中球のエラスターゼは、感染の有効な初期マーカーであることも示唆されている(Jensen et al., Scand. J Clin. Lab. Invest, 1996; Groenenveld et al, Cytokine, 1995)。エラスターゼを測定することは、生体適合性に関する情報をさらに与えることがあり、従って、血液処理の間に、レベルが変化すべきでない。
【００７９】
リガンド
エンドトキシンなどの除去すべき物質の結合モチーフと相補的なリガンドを作製できるようにするためには、三次元構造が形成されなければならない。これは、例えば、必要とされる三次元構造にとって最適な方法で容易に合成できる柔軟な又は剛直なポリペプチド構造を使用することによって行うことができる。このようなポリマーは、直鎖又は分枝状（例えば、樹状構造や櫛状構造）又は環状とすることができる。本来的に柔軟性を有するため、アミノ酸を使用することが、このような三次元構造を形成させるのに有用である。このようなポリマー（例えばポリペプチド）を結合するための化学は、本分野において周知である。本発明の好ましい実施形態では、このようなポリマーは、ペプチド結合によって互いに連結された複数のアミノ酸、一般には最大約１００のアミノ酸を含有するポリマー、すなわちオリゴマーを指す。直鎖ポリマーの例は、α−カルボキシル基と隣接する残基のα−アミノ基とのアミド結合によって形成されたポリペプチド又はオリゴペプチドであり、分枝ポリマーの例は、非α−アミノ基を１つ以上含んだアミド結合によって形成されたポリペプチド又はオリゴペプチドである。
【００８０】
上述したように、前記リガンド分子は環状の様式とすることもできる。環状構造は、リガンド構造内にある２つの適切な官能基間の共有結合、例えば、酸化によるシステインの２つのＳＨ基間のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）（天然のタンパク質構造中でも共通の環状化反応が起こる）によって形成することができる。
【００８１】
図２Ａと２Ｂには、固相支持体に結合されたスペーサーに連結されているリガンドの様々な樹状及び櫛状分枝構造の例が、それぞれ示されている。これらの構造において、リガンドは、リジン残基を基礎として構築されており、各リガンド中の結合ユニットはアルギニン残基である。本発明のポリマーアフィニティーマトリックス中に含まれるリガンドは、以下の２つの式によって表すことができる。
【００８２】
一般式Ｉ：
−Ｘ１ｎ−Ｙｍ［Ｘ２ｉ−Ｚ１；Ｘ３ｊ−Ｚ２］１／２（ｍ＋１）
樹状構造を表している一般式Ｉにおいて、様々な記号は以下の意味を有している。
【００８３】
ｎ＝０又は１；
ｍ＝２ｋ−１；
ｋ＝０ないし１０、ｋ＝０の場合、Ｘ２＝Ｘ３かつＺ１＝Ｚ２；
ｉ＝０又は１；
Ｊ＝０又は１、
一般式ＩＩ：
−（Ｘ１ｎ−Ｙ１［Ｙ２ｍ［Ｘ２ｉ−Ｚ１；Ｘ３ｊ−Ｚ２］１／２（ｍ＋１））ｒ−Ｘ４ｐ−Ｚ３
櫛状構造を表している一般式ＩＩにおいて、様々な記号は以下の意味を有している。
【００８４】
ｎ＝０又は１；
ｍ＝２ｋ−１；
ｋ＝０ないし１０、ｋ＝０の場合、Ｘ２＝Ｘ３かつＺ１＝Ｚ２；
ｒ＝１−１００；
ｉ＝０又は１；
Ｊ＝０又は１；及び
ｐ＝０又は１。
【００８５】
Ｚ１、Ｚ２及びＺ３は、各々が結合ユニットを表しており、それぞれ、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、炭水化物、レクチン、ヌクレオチド、それらの誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される有機分子であって、Ｙ、Ｙ１、Ｙ２は、それぞれ、アミノ、ヒロドキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ及びそれらの誘導体又はそれらの組み合わせからなる群から選択される官能基を含有する三官能性分岐分子であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、それぞれ、必要に応じて使用される二官能性間隔付与分子であって、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオール、マレイミド、エポキシ及びそれらの誘導体又はそれらの組み合わせからなる群から選択される２つの官能基を含有する。
【００８６】
図２Ｃには、環状リガンド構造を有するポリマーアフィニティーマトリックスの例が示されている。構造式中、Ｒは−Ｌｙｓｍ［Ａｒｇ］（ｍ＋１）を意味し、ｍ＝２ｋ−１であり、ｋ＝０、１、２の例が示されている。
【００８７】
このように、本発明のポリマーアフィニティーマトリックス中に存在するリガンドの少なくとも１つの結合ユニットは、少なくとも１つの官能基、好ましくはアミノ基又はグアニジン基又は置換されたアミノ基又は前記官能基のうち少なくとも１つを含有している。
【００８８】
好ましくは、前記アミノ酸は、生理的なｐＨ、具体的には血液のｐＨ≧７．２において又はその付近で、正に帯電している（すなわち、ｐＫが約６．０以上）という特性によって選択される。このような好ましいアミノ酸の例は、アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）である。さらなる多様性を与えるために、前記アミノ酸の混合物をマトリックスのリガンド中で使用することもできる。
【００８９】
最も好ましくは、前記リガンドはアルギニンを結合ユニットとして備え、３ｍｍｏｌ／ｇマトリックス以下を占める。一般に、アミノ酸の量は、少なくとも約０．０１−５ｍｍｏｌ／ｇマトリックスであり得る。
【００９０】
分岐したリガンドの結合ユニットがアミノ酸アルギニンを含んでいる実施形態では、リガンド当りのアルギニン分子の数は２−１００個のアルギニン分子、好ましくは４−８分子（Ａｒｇ４−８として知られる）である。さらに、三官能性アミノ酸、すなわち、３つの官能基（ここでは、２つのアミノ基と１つのカルボキシ基）を含有するアミノ酸（リジンなど）を使用することによって、分岐構造を作製することができる。いわゆる多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）を使用したこのアプローチは、Ｔａｍらによって導入され、米国特許第５．２２９．４９０号に記載されている。図２に関して上述されているように、分岐の数を変化させることにより、末端基（例えば、正に帯電した官能基を終末に有する正電荷を帯びたアルギニン）のクラスタリングと距離を変化させることができる。
【００９１】
ポリマーアフィニティーマトリックスによって除去すべき物質がエンドトキシンである本発明の実施形態では、アミノ酸の官能基の正電荷は、図３に示されているように、エンドトキシン中の負に帯電した各リン酸基間の距離によって規定される距離に保持される。
【００９２】
上述したように、アミノ酸の量と立体配置がポリマーアフィニティーマトリックス中の相補的リガンドの多様性を作出し、このため、多様な物質を吸収するのに十分な多様性を作出することができる。本発明の別の実施形態では、アミノ酸の量は、少なくとも約０．０１、０．１、１、２、３、４、又は５ｍｍｏｌ／ｇマトリックスである。
【００９３】
結合ユニットを含有するリガンドの設計
物質に対して相補的な構造を得るために、構造、一定の距離に保持された正電荷の存在、帯電した基の近くに位置する疎水性領域の存在に関する関係を調べるための本分野において公知の手技（例えば、Ｘ線結晶学、タンパク質の配列決定、タンパク質モデリング、又は実施例１に記載され、図３と図１１に図示されているような疎水性及び親水性の計算）から情報を収集する。
【００９４】
好ましい実施形態において、除去すべき物質は、リピドＡを含有するＬＰＳなどのエンドトキシンであり、例えば分子内の帯電したリン酸基の構造と距離に関する、分子についての当業者に公知の情報を用いて、ポリマーアフィニティーマトリックス中に少なくとも１つの結合ユニットを有するリガンドを形成する。リガンドを形成するポリマーは、本実施形態において、アミノ酸（例えば、アルギニン及び／又はリジン）によって合成される。しかし、ヒスチジン又はシステイン等の他のアミノ酸を使用してもよいであろう。
【００９５】
除去すべき物質（例えば、エンドトキシン）の結合モチーフに対する相補的部分がＡｒｇ４−８である本発明の実施形態では、結合ユニットとしての前記アルギニンは、図３に示されているように、エンドトキシンを除去するために以下の特性を有する。
【００９６】
ａ）リピドＡ中の負に帯電したリン酸基の距離と最適に適合する距離に正電荷が存在すること、
ｂ）電荷を帯びた基の近くに疎水性領域が存在し、この領域がリピドＡの脂肪酸部分との疎水的相互作用を可能にする
ｃ）ａ）とｂ）の前記特性の組み合わせにより、リピドＡに相補的な構造を与え、最適な結合を可能にする。
【００９７】
スペーサー
本発明のポリマーアフィニティーマトリックスは、固相支持体の一部となるという意味で固相支持体を修飾する実質的に疎水的又は親水的なスペーサーを備えており、少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを備えたリガンドに対するアンカー部分という機能を有している。
【００９８】
好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、４００−１００００ダルトンの好ましい平均分子量で直鎖又は分岐状に配置されたスペーサー分子として用いられ、式Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎは約２−２５０である）で表される。ＰＥＧ鎖の柔軟性により、リガンドポリマーの三次元構造内にトキシン分子が十分に近接することができる。
【００９９】
さらに、本発明の別の実施形態では、前記固相支持体に同一又は異なる種類のスペーサー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアミン、ポリグリシドール、又はポリエチレンイミン、及びそれらの誘導体を２つ以上与えることができる。
【０１００】
あるいは、例えば、結合すべき物質の相補的結合モチーフの三次元構造によって、結合が生じるためにスペーサーが存在しなくてもよい場合には、ポリマーアフィニティーマトリックス中にスペーサーが存在することは必要でない。このため、本発明の該実施形態によれば、前記結合ユニットは前記固相支持体に直接結合される。
【０１０１】
固相支持体
固相支持体は、様々な多孔性とサイズ排除特性を与えるべきである。また、好ましい実施形態において、ポリペプチドを合成するための固相合成の支持体となるべきである。本発明において使用し得る様々な固相支持体、すなわちポリマーが、ＥＰ  ０，１８７，３９１号、ＷＯ  ９９／１７１２０号、米国特許第４，９０８，４０５号に記載されている。ここで、前記固相支持体は、０．０５−１０％の架橋度を有する直鎖及び／又は分岐状の生体適合性グラフトコポリマーであり、ポリニビルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレンとエチレングリコールとから製造されるポリマー、式Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎは約２−２５０である）のポリ又はオリゴエチレングリコール、水酸基により官能性をもたせたポリアクリレート又はポリメタクリレート、及びそれらの誘導体から選択される。本発明において、上述した架橋度は最大５０％とすることができる。
【０１０２】
前記固相支持体の素材は、上述したもの以外に、ポリスチレン、ヒドロキシアルキル−ポリスチレン、ヒドロキシアリール−ポリスチレン、ヒドロキシアルキル−アリール−ポリスチレン、ポリヒドロキシアルキル化されたポリスチレン、ポリヒドロキシアリール化されたポリスチレン、イソシアナートアルキル−ポリスチレン、イソシアナートアリール−ポリスチレン、カルボキシアルキル−ポリスチレン、カルボキシアリール−ポリスチレン、アミノアルキル−ポリスチレン、アミノアリール−ポリスチレン、架橋されたポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、セルロース、シリカ、炭水化物、ラテックス、シクロ−オレフィンコポリマー、ガラス、他の適切なポリマー又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記固相支持体の形態は、ビーズ、膜、粒子（例えば、ナノ粒子）、網、織布及び不織布、繊維、マット、チューブ、フィルム、ホイル又はそれらの組み合わせ、又は架橋された互いに貫通し合う(interpenetrating)ネットワークとすることができる。好ましい実施形態では、上述したアフィニティーマトリックスは、ＰＥＧがスペーサーとしてその上にグラフトされている架橋されたポリスチレンからなる。
【０１０３】
本発明において好ましい固相支持体の素材は、灌流可能性と生体適合性に優れた支持体を与えるのに十分なサイズを有するビーズ、例えば、ポリスチレン、好ましくはリジン及び／又はアルギニンが付着したＰＥＧをスペーサーとして組み合わせたポリスチレンであり、親水性又は疎水性物質について全く制約が存在しないはずのビーズである。適切な市販のビーズのリストが、表１に示されている。
【０１０４】
市販されている活性化されたビーズａ
【表１】
2006505385.tif 000003
【０１０５】
ａ上記市販の活性化されたビーズはリガンドを固定化できる状態にすることができる。
【０１０６】
ポリマーアフィニティーマトリックスの灌流性
ポリマーアフィニティーマトリックスが水和されると、ヒドロゲル様の構造が形成され、水和のために、膨潤する。膨潤能は、ポリマーが乾燥状態から水和して膨潤し、水和されたゲル様のマトリックスを形成することと定義される。このような膨潤は、水和された際の単位容積当たりの重量の増加として定義することができ、乾燥型のポリマーアフィニティーマトリックスと水和された型のポリマーアフィニティーマトリックスとを比較した場合、本発明においては、約１．５−１０倍、好ましくは３−５倍の増加倍数であり得る。この膨潤能によって、血液細胞と数を損なわずに、マトリックス全体にわたって全血を完全に灌流することが可能となる。
【０１０７】
上述したように、好ましい実施形態では、ポリマーアフィニティーマトリックス自体が、血液細胞の灌流を可能とする約１×１０２−１×１０６ダルトンの所定のカットオフを有するマトリックスを与え、親水性及び／又は疎水性物質について拡散の制限がほぼ皆無である。
【０１０８】
物質を除去する方法
本発明は、流体中での成分又はプロセスの望ましくない活性化を抑制し、除去し又は軽減する目的で、流体から１又は複数の物質を除去し及び／又は前記流体中におけるそれらの量又は濃度を減少させる方法であって、前記物質の量又は濃度を減少させ及び／又は前記物質を除去するのに十分な時間、前記流体を本発明のポリマーアフィニティーマトリックスに接触させることを備えた、方法にも関する。本方法を用いた好ましい実施形態では、血液又は他の任意の体液から物質（例えば、エンドトキシン）を除去することによって、上記「物質」の定義に列記されている望ましくない物質に結合されることによって、例えば血液細胞の活性化が直接又は間接に抑制されるであろう。好ましくは、これは、前記流体を上述したポリマーアフィニティーマトリックスに最大２４時間、最も好ましくは１秒ないし２時間接触させて、血液やその成分の活性化を低下させ又は活性化を抑制することによって行うことができる。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明に開示されている前記方法によって除去すべき物質は、エンドトキシンである。本発明は、白血球（例えば、Ｔ細胞とＢ細胞）、単球、血小板、顆粒球及び／又は好中球から選択される所定の血液細胞種又は集団を除去することにも関する。グルコースとその分解産物、カルボニル化合物、炎症性及び炎症誘発性タンパク質及び／又は血栓形成若しくは補体カスケードに関与するタンパク質、細菌由来の構成成分、エンドトキシン、細胞、血液細胞、細菌及びウイルス、又は病原体を保有する血液細胞、又はそれらの少なくとも一部分若しくは分解産物、ＤＮＡ若しくはその断片、又はホスフェートからなる群から選択される細胞外及び／又は細胞内シグナル伝達経路の成分も、少なくとも１つの結合ユニットを備え、前記物質の結合モチーフの構造に相補的な構造を有するリガンドを与えることによって、上記ポリマーマトリックスによる除去が想定されている。
【０１１０】
この好ましい実施形態では、例えば固相カラムの静的なインキュベーション又は灌流を２時間行う間に、５０％未満のエンドトキシン（例えば、ＬＰＳ）が除去される。
【０１１１】
この好ましい実施形態において、約１秒ないし約２時間（２時間を含む）の所定の時間に、以下に記されているＬＡＬアッセイによって測定したときに、血液を不活化させ又は血液の活性化を抑制する量または濃度まで、エンドトキシンは除去される。ＬＡＬアッセイの使用は本分野において公知であり、エンドトキシンレベルについての情報が得られるであろう。
【０１１２】
迅速且つ効率的である本発明の方法によって、上述した１秒ないし２時間以内に、ＬＡＬアッセイによって測定したエンドトキシンレベルは、血液を活性化することができなくなるか、又は血液細胞と成分を僅かに活性化できるに留まる。
【０１１３】
ポリマーアフィニティーマトリックスを作製する方法
本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを作製する方法には、以下の工程が含まれる。
【０１１４】
ａ）固相支持体にスペーサーを付着させて第一の複合体を得る工程と、
ｂ）少なくとも１つの官能基を有する少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か
又は、
ｃ）少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドにスペーサーを付着させて第二の複合体を得る工程と、
ｄ）前記固相支持体を前記第二の複合体に付着させる工程か
又は、
ｅ）前記スペーサーを前記固相支持体に付着させて第一の複合体を得る工程と、
ｆ）前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程か、
又は、
ｇ）グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
ｈ）少なくとも１つの官能基を有する前記少なくとも１つの結合ユニットを含有するリガンドを前記第一の複合体に付着させる工程か、
又は
ｉ）グラフトによって固相支持体上に直接モノマーからスペーサーを構築若しくは合成する工程と、
ｋ）前記固相支持体に結合された前記スペーサー上でリガンドを固相合成する工程、を備え、
結合する物質上の三次元構造、電荷の存在、結合モチーフの疎水性／親水性領域についての情報がＸ線結晶学、タンパク質のモデリング、疎水性及び親水性の計算から収集され、前記結合ユニットを含有するリガンドが電荷及び／又は親水性／疎水性について前記物質の結合モチーフと相補的となるように作られている。
【０１１５】
ある実施形態では、上記方法は、図４にさらに詳細に示されている以下の方法のうち何れかにより、固相支持体上に固定化されたリガンドを備えたスペーサー分子を有するマトリックスを製造することも含む。
【０１１６】
上記ａ）とｂ）の場合、固相支持体を活性化し、固相支持体にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、リガンドを前記スペーサー分子に部位特異的に連結させるか、又は
上記ｃ）とｄ）の場合、結合ユニットを含有するリガンドを合成し、スペーサー分子をリガンドに連結させ、固相支持体を活性化し、スペーサー−リガンド複合体を活性化された前記固相支持体に部位特異的に連結させるか、又は
上記ｅ）とｆ）の場合、固相支持体を活性化し、活性化された固相支持体にスペーサー分子を連結し、結合ユニットを含有するリガンドを該支持体上で固相合成する。
【０１１７】
上記工程ａ）−ｆ）を有する前記方法は、別の実施形態では、ａ）とｂ）の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結と、活性化されたスペーサーへのリガンドの連結、又は、
ｃ）とｄ）の場合、リガンドの合成と、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサー分子へのリガンドの部位特異的連結と、固相支持体へのスペーサー−リガンド複合体の連結、又は、
ｅ）とｆ）の場合、スペーサーの活性化と、活性化されたスペーサーの固相支持体への連結、固相支持体に結合されたスペーサー上でのリガンドの固相合成という具体的な工程も備える。
【０１１８】
上述したように、本発明において好ましいのは、固相支持体の活性化と、スペーサー分子の連結と、結合ユニットを含有するリガンドを固相支持体上で直接固相合成することとによって、固相支持体とスペーサーとリガンドが固定化される上記方法である。
【０１１９】
ポリマーアフィニティーマトリックスの使用
本発明は、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスの使用、好ましくは、とりわけ、活性化の程度が低い血液を製造するため又は血中成分若しくはプロセスの望ましくない活性化を抑制するために、１又は複数の物質、好ましくはエンドトキシンを、流体、好ましくは体液若しくは治療用の流体、最も好ましくは血液から除去するための又は前記流体中の前記物質の量若しくは濃度を減少させるための前記ポリマーアフィニティーマトリックスの使用にも関する。前記ポリマーアフィニティーマトリックスは、体外での血液精製プロセスの一部として使用するか、又は血液若しくは血流と接触させて、例えば、血液若しくは任意の体液に接触させるために、身体（例えば、血管系、血管又は腹腔中）に埋め込むインプラントとして、使用するのが好ましい。
【０１２０】
ポリマーアフィニティーマトリックスを備えたキット
１つの実施形態において、本発明は、流体中での成分の望ましくない活性化を抑制、除去、又は軽減する目的で前記流体から１又は複数の物質を除去し及び／又は前記流体中に存在する前記物質の量又は濃度を減少させるためのキットであって、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスと、試料管と、前記流体、好ましくは血液又は血清を体外及び／又は体内処理するための器具と、を備えたキットに関する。
【０１２１】
結論
本発明は、極めて効率的且つ時間のかからない方法で、流体から物質を除去するための手段を提供する。これは、生体適合性が高く、膨潤能に優れているために全血を貫流させることが可能な本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを使用することによって実現される。効率的な手段は、除去すべき物質の結合モチーフに相補的な結合ユニットを備えたリガンドの生成によるものでもある。従って、本発明は、例えば、治療的用途のための透析及び輸液医療などの体外的な血液処理、幹細胞治療及び／又は治療的な細胞療法、診断用途に使用することができ、バイオテクノロジー、生物工学、遺伝子技術、食品化学、水の調製及び／又は精製にも使用できる。
【０１２２】
本発明は、流体から１又は複数の物質を除去し又は前記流体中におけるその量若しくは濃度を減少させるためのポリマーアフィニティーマトリックスを製造するためのポリマーマトリックスの使用であって、特異的なアフィニティーが前記ポリマーマトリックス上に付与される任意のリガンドに依存し、前記ポリマーマトリックスが固相支持体とスペーサーとを含み、該固相支持体が、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシスチレン、クロロメチル化されたポリスチレン若しくはポリアクリレートから製造されるポリマー、水酸基により官能性をもたせたポリメタクリレート、ヒドロキシアルキル−ポリスチレン、ヒドロキシアリールポリスチレン、ヒドロキシアルキル−アリール−ポリスチレン、ポリヒドロキシアルキル化されたポリスチレン、ポリヒドロキシアリール化されたポリスチレン、イソシアナートアルキル−ポリスチレン、イソシアナートアリールポリスチレン、カルボキシアルキル−ポリスチレン、カルボキシアリールポリスチレン、アミノアルキル−ポリスチレン、アミノアリールポリスチレン、ポリメタクリレート、架橋されたポリエチレングリコール、セルロース、シリカ、炭水化物、ラテックス、シクロ−オレフィン共重合体、ガラス又はそれらの組み合わせからなる群から選択される材料、好ましくは架橋されたポリスチレンから構成され、前記スペーサーが式Ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−ＯＨ（式中、ｎは２−２５０である）のポリ又はオリゴエチレングリコールからなる群から選択される、ポリマーアフィニティーマトリックスの使用にも関する。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態において、前記固相支持体は、ビーズ、膜、粒子、網、織布及び不織布、繊維、マット、チューブ、フィルム、ホイル又はそれらの組み合わせ、又は架橋された互いに貫通し合うネットワークを有する。
【０１２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記スペーサーは、直鎖及び／又は分岐状の立体配置のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、４００−１００００ダルトンの平均分子量を有し、又はそれらの誘導体である。
【０１２５】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記ポリマーマトリックスは、血漿又は全血の灌流を可能とするのに十分な膨潤能を有する。
【０１２６】
本発明の別の好ましい実施形態において、乾燥状態から水和された形態への前記ポリマーマトリックスの膨潤能や約１．５−２０倍、好ましくは２−６倍である。
【０１２７】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記ポリマーマトリックスはゲル型ビーズの形態を有する。
【０１２８】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記流体は、水性又は有機溶液、体液、好ましくは血液、治療用流体、生命科学に用いるための流体、好ましくは生物学、診断又はバイオテクノロジーに用いるための緩衝溶液、注入液又は透析液、健康なドナーから得られる血漿、血小板濃縮物、赤血球濃縮物などの血液製品、好ましくは酸素キャリア、改変されたヘモグロビン溶液及び人工ヘモグロビン溶液、栄養を補給するための流体及び産業で使用するための流体である。
【０１２９】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記ポリマーマトリックスは約１×１０２ないし約１０６ダルトンのカットオフ値を有し、疎水性及び／又は親水性物質を結合する。
【０１３０】
本発明の別の好ましい実施形態において、前記固相支持体は架橋されたポリスチレンであり、前記スペーサーはポリエチレングリコールである。
【０１３１】
体外的な血液処理に使用できる特異的な結合構造の合理的な開発には、（ｉ）リガンドを構築するための柔軟な技術、（ｉｉ）生体適合性、毒性、加工性に関する基本的な必要条件、が要求される。生体適合性のあるポリマー物質（好ましい実施形態の１つでは、ポリスチレン−ポリエチレングリコールをグラフトした生体物質に特異的な共重合体）上に組み立てられる明確なリガンド構造を得るために、固相ペプチド合成が用いられる。
【０１３２】
リガンドモチーフの幾何学的構造を系統的に変化させることによって、本発明者らは、構造ブロックのモル濃度に関して、リガンドアフィニティーが１０ないし１００倍増加することを実証することができた。これらの研究は、ヒトの血清、すなわち、競合するタンパク質の存在下で行われた。
【０１３３】
血液の適合性の評価は、ヒト血漿及び／又は全血中でのインビトロアッセイによって行った。リガンドを与えた又はリガンドを与えないＰＳ−ＰＥＧ基材は、補体の活性化、接触相活性化、細胞毒性及び顆粒球活性化に関して生体適合性がある。
【０１３４】
前記基本ポリマー構造は、特に体外で用いるために有利な生体適合性プロファイルを示す。リガンド合成に用いられる技術によって、毒性のある残余物質を生成させずに、特定のポリマー材料のプロセッシングが可能となる。
【実施例１】
【０１３５】
ＬＰＳに対する結合ユニットを含有するリガンドの設計
本実施例では、ＬＰＳを除去するための結合ユニットを含有するリガンドの設計について説明するが、本発明を限定するものではない。
【０１３６】
原理
トキシン、例えばＬＰＳを効率的に除去するには、除去すべき物質の結合モチーフに相補的な結合ユニットを備えたリガンドが必要とされる。これには、相補的な電荷、疎水性及び親水性のような特徴による生物特異的な認識を最適化するために、除去すべき物質の三次元的な形状と分子の正確な配置とが含まれる。これにより、上述した特徴の適切な距離と相俟って、結合ユニットを有するリガンドが完成されるであろう。また、ポリマーマトリックス内にこのようなリガンドの全体を三次元的に提示することは、高い灌流、リガンドの提示、リガンドの柔軟性にとって、空間的に最適なはずである。また、生体適合性が高いことは、患者でインビボ又はエキソビボ血液精製を行うために必須である。前記のマトリックスでは、到達性が非固相の水性溶液と同等又は同一である。ＬＰＳの構造は図１に示されている。推定されるＬＰＳへの相補的な結合が図３Ａ−Ｄに示されており、ＬＰＳのリン酸基と疎水性尾部が相補的な結合モチーフを形成すると考えられている。図２には、Ａｒｇ４とＡｒｇ８についてこの推定構造が示されており、図１１には三次元的な形式でそれらが記されている。Ａｒｇ８は、左側の図においてアルギニン位置の半分を示し、右側の図１１Ｂにおいてアルギニン位置の半分を示している。スペーサー（ここでは、ＰＥＧ）への連結も示されている。
【０１３７】
分子シミュレーション
さらに分子シミュレーションを用いて、前記結合部位の三次元の幾何学的な構造と化学的な構造を同定、確認した。シミュレーションは、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ−Ｐａｃｋａｇｅ(Molecular Simulations Inc.(MSI),San Diego,CA)と同梱の最適化アリゴリズム（例えば、ＡＭＢＥＲ−ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄｓ）を使用して、Silicon Graphics Octane2 Workstationで行った。Ａｒｇ４とＡｒｇ８の三次元配置の結果は、それぞれ、図１１ＡとＢに示されている。ここで、この模式図では、ＰＥＧスペーサー又は固相支持体を省略して、マトリックスの三次元末端部分の原理を示している。
【０１３８】
リガンドの合成
結合ユニットを有するリガンドは、図４に従って合成され、図には、３つの異なる方法が記されている。前記３つの方法のうち好ましい方法は、固相支持体に付着されたＰＥＧスペーサー上に直接固相合成する方法である。以下の実施例では、結合ユニットが使用されている。
【実施例２】
【０１３９】
分岐リガンドと直鎖リガンドの比較
本実施例では、ヒト血漿からエンドトキシンＬＰＳを吸着することについて説明する。本実施例には、エンドトキシンを吸着するための直鎖リガンドと分岐リガンドの比較についても示されている。
【０１４０】
原理
ヘパリン処理を施したヒト血漿とともにビーズを２時間インキュベートする。２時間のインキュベーション後に、ＬＡＬアッセイを用いて、エンドトキシンレベルを測定する。
【０１４１】
材料
以下のビーズを使用する。
【表Ａ】
2006505385.tif 000004
操作
ヘパリン処理を施した血漿中で、ビーズのインキュベーションを３７℃で行う。試料をゆっくり撹拌し、２時間インキュベートした後、遠心によってビーズを除去する。
【０１４２】
分析
ビーズとのインキュベーション後のエンドトキシンのレベルを定量するために、ＬＡＬアッセイを行う。本アッセイは、ＬＡＬによって生じる色素産生性物質の反応により行われる(Chromogenics, Molndal, Sweden)。ヘパリン処理したヒト血漿中に存在する所定の濃度のエンドトキシンを用いて得た標準曲線により、レベルを計算する。
【０１４３】
結果
ＬＡＬアッセイを用いて、２時間のインキュベーション後に、以下のエンドトキシン濃度が測定された。
【０１４４】
エンドトキシン（ＩＵ）／ｍｌ
ＰＳ−ＰＥＧ−ＬＢＰ  ９４−１０８                          １０
ＰＳ−ＰＥＧ−ＢＰＩ  ８５−９９                              ９
ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８                                        ２
ＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃ                                    １０
ビーズなし                                                    ８
初期値                                                      １０
考察
本実験は、ＰＳ−ＰＥＧビーズ上に分岐した三次元マトリックスを使用することにより、エンドトキシンのレベルが５分の１に減少することを示している。直鎖リガンドを有するビーズは効率性が劣り、それらの試料中のエンドトキシンレベルは、エンドトキシンの初発レベルと同じか又は初発レベルに近かった。
【実施例３】
【０１４５】
エンドトキシン結合の速度論
本実施例では、ＬＰＳ結合について最適化された三次元マトリックスを有するビーズを血漿とともにインキュベートし、様々な時点で分析したときのエンドトキシン結合の速度論を示している。
【０１４６】
原理
吸収の速度論は、ポリマーマトリックスの構造と架橋度に依存する。ヘパリン処理したヒト血漿とともにビーズをインキュベートする。１、１０、１２０分後に、試料を採取する。ＬＡＬアッセイを用いて、エンドトキシンレベルを測定する。
【０１４７】
材料
以下のビーズを使用する。
【表Ｂ】
2006505385.tif 000005
操作
ヘパリン処理した血漿中のビーズのインキュベーションを３７℃で行う。試料をゆっくり撹拌し、１、１０、１２０分のインキュベーション期間後に、被検試料を採取する。ビーズは、遠心によって除去する。
【０１４８】
分析
実施例２と同様に、エンドトキシンレベルを定量するためにＬＡＬアッセイを行う。
【０１４９】
結果
図５は、様々な時点で測定されたエンドトキシンレベルの結果を示している。図は、効率的な除去を行うためには、すなわち、試料中の初発レベルの２０−３０％のエンドトキシンが残存するようにするためには、２時間の期間が必要とされることを示している。アルギニンを含有する直鎖リガンド（ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ）は、エンドトキシンの量を半分除去するにすぎない、すなわち１２０分後に６０％のレベルが残存している。同様に、対照ビーズ（ＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃ）を添加した場合、ビーズとともにインキュベーションを行った後のエンドトキシンの量はなお不変である、すなわち、１２０分後にも初期値のままであった。
【実施例４】
【０１５０】
ポリマーの末端アミノ酸と分岐の影響
本実施例では、末端アミノ酸（アルギニンｖｓリジン）の影響とリガンドの分岐の影響（非分岐ｖｓ４倍分岐ｖｓ８倍分岐）とを示している。
【０１５１】
原理
エンドトキシンを加え又は加えずに、ヘパリン処理したヒト血漿とともにビーズをインキュベートする。２時間後に、ＬＡＬアッセイを用いて、エンドトキシンレベルを測定する。
【０１５２】
材料
以下のビーズを使用する。
【表Ｃ】
2006505385.tif 000006
分析
実施例２と同様に、ＬＡＬアッセイを行う。
【０１５３】
結果
エンドトキシン（ＩＵ）／ｍｌ
ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８                                      ０．４
ＰＳ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ８                                      １．８
ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ４                                      ０．０１
ＰＳ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ４                                      ２．７
ＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃ                                    ７．８
ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ                                        ３．５
ビーズなし                                                  １１
インキュベーション前、すなわち初期値                        １３
考察
結果は、エンドトキシンの除去には、分岐リガンドが直鎖型より効率的であること、アルギニンがリジンより数倍（それぞれ、Ａｒｇ８とＡｒｇ４で４倍及び２００倍）効率的であることを示している。また、２時間後にエンドトキシンを除去するのにＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ４が最も効率的である。
【実施例５】
【０１５４】
ＣＤ１４＋単球中でのエンドトキシン依存性ＩＬ６誘導の減少
本実施例では、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８を用いることによって、ヒト単球中でのエンドトキシン依存性ＩＬ６誘導が減少することを記載する。
【０１５５】
ＬＰＳに反応して、単球は、ＩＬ６の転写と発現を開始する。アップレギュレートされたＩＬ６のレベルは、細胞内フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によって、４時間後には測定することができる。
【０１５６】
材料
全血から得たヒト単核球を使用する。エンドトキシンを除去するために、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８を使用し、ＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃを対照として加える。インビトロでＭＮＣを刺激するために、リポ多糖（Ｂｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ  Ｃｏ．から入手したＥ．ｃｏｌｉ  菌株  ０５５：Ｂ５）を使用する。ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＣＳＣＡＮ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｒ））を用いて行う。
【０１５７】
操作  ３７℃（５％ＣＯ２）で３０分間、１０又は３０ＩＵ／ｍｌのＬＰＳとともに、全血をインキュベートする。ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズを加え、及びＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８を加えずに、また対照ビーズＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃとともに、試料を平行してインキュベートする。ＰｅｒｍＦｉｘ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｒ））中に細胞を固定し、抗−ＣＤ１４−ＦＩＴＣと抗−ＩＬ６−ＰＥを用いて二重染色を行った。ＦＡＣＳ分析の細胞試料当たり２０，０００細胞が計数される。ＣＤ１４＋細胞として定義される単球は、通常、全細胞集団の約５％を占める。
【０１５８】
分析
単球は、細胞懸濁液中のＣＤ１４＋細胞として定義される。細胞内ＩＬ６（ｉｃＩＬ６）を内部標準に対して較正し、１０又は３０ＩＵ／ｍｌのＬＰＳとともに３０分間インキュベートした後に、ＦＡＣＳ分析を使用して、ＣＤ１４＋細胞集団中で定量する。計算は、CellQuest Software Package(Beckton Dickinson(R))を用いて行う。
【０１５９】
結果
ＦＡＣＳデータ及び該データから行った計算を用いて、当業者がＣＤ１４＋単球集団の分析を行うことによって、図６に示されている以下のデータが得られる。対照ビーズ（（ＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃ）及びビーズを加えていない試料と比べて、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズを用いたときに、エンドトキシンレベルが７０％減少することが、グラフに示されている。ＩＬ６の細胞内レベルが、ヒストグラムで示されている。右側には、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズとともにインキュベーションを行った後に、ＩＬ６レベルが減少する様子が示されている。左下の列は、新鮮な細胞中に細胞内ＩＬ６が存在しないことを示している。
【０１６０】
考察
本実験は、単球内におけるＬＰＳ依存性のＩＬ６アップレギュレーションの阻害によって測定される、ヒトＣＤ１４＋単球集団中でのＬＰＳ刺激の阻害が迅速且つ完全に行われることを示している。
【実施例６】
【０１６１】
全血灌流後の細胞数
本実施例では、ビーズ上のポリマーアフィニティーマトリックスを通して貫流した後の血液細胞の透過処理について説明するが、本発明を限定するものではない。
【０１６２】
原理
血液精製では、細胞への損傷も細胞の活性化も生じてはいけない。特に赤血球に対する物理的な損傷により、溶血が生じ、その後、生命に脅かす合併症を引き起こす可能性がある。本発明のポリマーマトリックスのようなハイドロゲルは、驚くべきことに、全血細胞によって灌流することができる。
【０１６３】
材料
膨潤性の高いポリマーマトリックスＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズを使用する。内径２０ｍｍのカラムに、マトリックスの１ｇを充填し、４−５ｍｌの水を吸収させた後、使用前に生理的食塩水溶液で予め洗浄する。次いで、全血の灌流を行うためにカラムを使用する。
【０１６４】
操作
層流の滅菌装置を用いて、クエン酸とＬＰＳ（３０ＩＵ／ｍｌ）を加えた新鮮な全血をカラムに灌流する。ＬＰＳを加えた全血を、５ｍｌ／分の流速にて、３７℃で灌流する。灌流の前後に血液試料を採取し、分析した。分析した細胞は、赤血球（ＲＢＣ）、ヘマトクリット（ＨＴＣ）、遊離のヘモグロビン、白血球（ＷＢＣ）、血小板、血小板数（ＴＲＣ）である。
【０１６５】
カラム灌流前と灌流後に、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって、細胞数を数える。
【０１６６】
赤血球を完全に溶解させた後、４０５ｎｍで光度測定による定量を行って、総ヘモグロビンレベルとして遊離のヘモグロビンを測定する。全血灌流後の赤血球の完全性は、血漿中の遊離ヘモグロビンを４０５ｎｍで測光定量することによって示される。
【０１６７】
結果と考察
細胞数とＨＣＴを測定し、結果を図７Ａ（血小板）、７Ｂ（ＨＣＴ）、７Ｃ（ＲＢＣ）、７Ｄ（ＷＢＣ）に示してある。さらに、遊離ヘモグロビンの増加は全く見られない。すなわち、溶血は誘導されない（データは示さず）。本実験で得られたデータは、初期の希釈効果に起因する初期の一過性保持時間を過ぎると、細胞数は、カラムを通す前の値に安定することを示している。前カラム細胞数が後カラム細胞数と同じなので、データは、約１００％のマトリックス材料が透過処理されたことを示している。また、生きた細胞数と赤血球細胞の溶血を測定したところによれば、細胞は無傷のままである。
【実施例７】
【０１６８】
生体適合性の特徴
本実施例では、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８マトリックスの生体適合性プロファイルの一部について説明する。
【０１６９】
原理
本実施例において、生体適合性又は非生体適合性は、補体活性化、エラスターゼ放出、トロンビン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体形成による血栓形成として測定される。
【０１７０】
材料
実施例６と同様に、セルロース系材料を対照材料として使用する。
【０１７１】
方法
特異的な酵素結合免疫吸着検定法(ELISA；Diagnostic Product Co.)を用いて、全血灌流から得られた血漿中でエラスターゼを測定する。
【０１７２】
補体活性化は、Ｄｅｐｐｉｓｃｈら(Kidney Int. 37:696-706)に従って、終末補体複合体（ＴＣＣタンパク質）の定量により測定する。
【０１７３】
ＴＡＴ、血栓形成の程度は、Ｄｅｐｐｉｓｃｈら(Neuphrol. Dial. Transplant Suppl. 3:17-23,1994)に従って測定する。
【０１７４】
結果
図８には、ＴＣＣの形成が経時的に示されている。対照ビーズＰＳ−ＰＥＧ−ＮＨ−Ａｃ（ＴＧ−基本又は対照材料）では、ＴＴＣ形成が４−５倍の増加を示す。ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８の場合、最初１０−１５分にわたって上昇した後、ＴＣＣの形成は灌流前のレベルに落ち着く。
【０１７５】
図９では、エラスターゼのレベルが経時的に測定されている。前カラム値に比べて、レベルは変化していない。３５分にわたる測定値が示されている。対照材料の場合、３５分にわたって、エラスターゼレベルは８−９倍増加する。
【０１７６】
図１０には、ＴＡＴの形成が示されている。ＴＡＴ形成の増加は検出されない。
【０１７７】
考察
生体適合特性は、エキソビボ及びインビボ血液処理（例えば透析）において重要である。前述のマトリックスは、補体系の活性化、凝固系の活性化を全く示さず、使用した対照材料に比べて、エラスターゼを全く放出しない、すなわち、生体適合性が高い。実施例６に示されている全血の高い灌流能と総合すれば、このことは、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスが、全血を含む血液の体外処理に極めて適していることを示している。
【実施例８】
【０１７８】
さらなるエンドトキシン吸着実験
エンドトキシンを結合するためのリガンドを構築する官能基（すなわち、アルギニン残基）の幾何学的に確定された特定の配置を見出すことの重要性を示すために、エンドトキシン吸着実験を行った。エンドトキシン結合は、アルギニン（すなわち、正電荷）の量のみに依存するのではなく、所定の幾何学的配置がさらに重要であることが示されている。
【０１７９】
操作
ヒト血清（血液、血漿等のヒトの体液の代表として）に、所定量のエンドトキシン（すなわち、３ＩＵ／ｍｌと１０ＩＵ／ｍｌ）を添加し、リガンドとして、Ａｒｇ８配置又はＡｒｇ４配置の何れかを含有する４０ｍｇのＰＳ−ＰＥＧ−Ｂｅａｄｓとともにインキュベートした。前記二種類のビーズ／リガンド配置には、異なる量のアルギニンが含有されている。Ａｒｇ４は０．７２ｍｍｏｌ／ｇを含有しており、Ａｒｇ８は１．８９ｍｍｏｌ／ｇを含有している。Ａｒｇ８ビーズのアルギニン含量が高いのは、リジンの分岐によって分岐が追加されることによるものである。３０分のインキュベーションを行った後、上清血清中のエンドトキシンの遊離（すなわち、表面又はマトリックスに結合していない）濃度を（ＬＡＬ試験によって）測定する。
【０１８０】
分析
表２  ヒト血清を用いたインキュベーション実験の結果
【表２】
2006505385.tif 000007
【０１８１】
これらのデータは、固相表面でのリガンド−受容体相互作用と平衡（例えば、タンパク質の吸着）を記述するＬａｎｇｍｕｉｒアプローチを使用することによって分析した(Ref:JD Andrade: Principles of protein adsorption. in: JD Andrade (Ed.) Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers. Volume 2, Protein Adsorption, Plenum Press New York 1985, pp 1-80.)。この分析は、リガンド−マトリックスに結合したトキシン（すなわち、エンドトキシン）の量（添加した量とインキュベーション後に上清中に残存する量との差から算出される）をマトリックスに存在するリガンドの総数で除した値を、上清中のトキシンの平衡濃度（すなわち、インキュベーション後のエンドトキシン濃度）に対してプロットすることによって行われる。次いで、このプロットをＬａｎｇｍｕｉｒの等温式の数式にフィッティングし、様々なマトリックスに結合したリガンドのトキシンに対する親和定数又は結合定数を得る。図１２Ａと１２Ｂには、Ｌａｎｇｍｕｉｒのアプローチの例が示されている。
【０１８２】
マトリックスに存在するリガンドの総数の規定の仕方が異なる二種類のＬａｎｇｍｕｉｒプロットを行った。
【０１８３】
（１）リガンドの総数の指標としてグラムで表したビーズの重量のみを考慮することによって、ビーズのアルギニン含量の差を無視する（図１２Ａ）。リガンド−ポリマー−マトリックスが実際に使用される場合、例えば、体外回路中で血液又は血漿等のヒトの体液を灌流すべき吸着装置中では、患者内のトキシンの濃度を治療で有効に減少させるために、装置の中に充填しなければならないビーズの総重量又は総容積によって、ある程度制限されるため、このアプローチは正当化される。この制限は、例えば、装置を通過する際の圧力低下、血液成分（タンパク質や細胞）に対する非特異的な効果又はある場合には装置に対する保存スペースに関する。
【０１８４】
（２）リガンドの総数の指標として、グラムで表したビーズの重量をｍｍｏｌ／ｇで表したアルギニンの添加量で除することにより、ビーズのアルギニン含量の差を考慮に入れる（図１２Ｂ）。アルギニン含量がリガンド−ポリマーマトリックスの製造における主なコスト要因であるという事実によって、このアプローチは正当化される。結果は、経済的観点からのリガンドの効率性を表す。
【０１８５】
異なるＬａｎｇｍｕｉｒプロットに対する平衡パラメータが表３に示されている。
【０１８６】
表３：フィッティングを行った曲線から得られた平衡パラメータ
【表３】
2006505385.tif 000008
【０１８７】
結果と考察
親和定数は、あるリガンドが、存在するリガンドの量とは無関係に、トキシンをどの程度強く結合できるかを記載し、特徴付ける。驚くべきことに、Ａｒｇ８リガンドの親和定数は、Ａｒｇ４リガンドの親和定数より１０倍超（すなわち、１２．３倍）高かった。
【０１８８】
飽和濃度は、無限量のトキシンが利用できると仮定して、各リガンド−マトリックスが結合できるトキシンの最大量を表している。驚くべきことに、Ａｒｇ８リガンド−マトリックスの飽和濃度は、Ａｒｇ４リガンド−マトリックスの飽和濃度より２倍超（すなわち、２．８倍）高かった。Ｌａｎｇｍｕｉｒの吸着モデルによれば、飽和濃度は親和定数から完全に独立しているので、これは、例えば、リガンド−マトリックスのＰＥＧ部分の形態（例えば、結晶様ｖｓ流体）に影響を与えることにより、Ａｒｇ８リガンドの特異的な幾何学的配置がリガンド−マトリックスのトキシンへの到達性に影響を与えるというように解釈することができる。
【０１８９】
以下の例は、治療的に適切なトキシン濃度の減少を達成するために必要とされるマトリックスの量に関して、Ａｒｇ８リガンドーマトリックスエンドトキシンのアフィニティーの向上が重要且つ適切であることを実証している。すなわち、敗血症患者では、０．１ないし１ＥＵ／ｍｌの範囲のエンドトキシン濃度が観察される（例えば、Nakamura et al.Renal Failure 2000; 22: 225-234）。治療開始時の血漿濃度が０．３ＥＵ／ｍｌ、治療後の血漿濃度が０．０３ＥＵ／ｍｌ、血漿容量が４０００ｍｌと仮定すると、これは、治療中に１０８０ＥＵのエンドトキシンがリガンド−マトリックスに結合しなければならないことを意味している。この量のエンドトキシンを結合するのに必要なマトリックスの量は、各リガンドに対する親和定数と飽和濃度を用いて、Ｌａｎｇｍｕｉｒの式から計算することができる。次いで、治療終了時の濃度が平衡濃度となる。表３の平衡データを用いてこの計算を行うと、Ａｒｇ８の場合、８３ｇのリガンド−マトリックスが必要であるのにすぎないのに対して、Ａｒｇ４の場合、治療目標を達するには１２０１ｇのリガンド−マトリックスが必要であることが示される。両リガンドマトリックスの密度（容積当たりの重量）は似ているので、このことは、Ａｒｇ８リガンドの場合に吸着装置の容量とサイズがずっと小さくなり、血漿又は血液による灌流が促進されることを意味している。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１は、ＬＰＳ分子のリビドＡ部分とその構造要素を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａと２Ｂは、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスの樹状構造（２Ａ）と櫛状構造（２Ｂ）に属するリガンドの例を示す模式図である。
【図２Ｂ】図２Ａと２Ｂは、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスの樹状構造（２Ａ）と櫛状構造（２Ｂ）に属するリガンドの例を示す模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、環状リガンド構造を有するポリマーアフィニティーマトリックスの例を示している。
【図３】図３Ａ−３Ｂは、結合モチーフ中で構造的な条件と正電荷、疎水性領域及び最適な距離を使用することによって、エンドトキシンの相補的構造を作製する方法を示している。
【図４−１】図４には、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを作製する様々な方法が記載されている。
【図４−２】図４には、本発明のポリマーアフィニティーマトリックスを作製する様々な方法が記載されている。
【図５】図５は、ＰＳ−ＰＥＧ−ビーズとともに、様々な時間（１、１０、１２０分）インキュベートした後のヒト血漿中のエンドトキシンのレベルを示している。
【図６】図６Ａ−６Ｇは、ＬＰＳ刺激を行った血液をＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズで処理した後の単球内におけるエンドトキシン誘導性の細胞内ＩＬ６の産生阻害を、マトリックスのないビーズ（すなわち、対照材料（ＰＳ−ＰＥＧ−対照材料））と比較した図である。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｄは、白血球（ＷＢＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の数、血小板（ＴＨＲ）の数およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を測定したＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズの生体適合性プロフィールを示している。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｄは、白血球（ＷＢＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の数、血小板（ＴＨＲ）の数およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を測定したＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズの生体適合性プロフィールを示している。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｄは、白血球（ＷＢＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の数、血小板（ＴＨＲ）の数およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を測定したＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズの生体適合性プロフィールを示している。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｄは、白血球（ＷＢＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の数、血小板（ＴＨＲ）の数およびヘマトクリット（ＨＣＴ）を測定したＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズの生体適合性プロフィールを示している。
【図８】図８は、全血中でＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズを使用した後にＴＣＣ（terminal complement complex）が形成されないことを示している。
【図９】図９は、全血中でＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズを使用した後にエラスターゼが放出されないことを示している。
【図１０】図１０は、全血中でＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８ビーズを使用した後にＴＡＴ（thrombin-antithrombin III complex）が形成されないことを示している。
【図１１Ａ】図１１Ａ−１１Ｂは、ＬＰＳ結合について最適化されたＡｒｇ８およびＡｒｇ４の結合ユニットを含有するリガンドの三次元構造を示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、ＬＰＳ結合について最適化されたＡｒｇ８およびＡｒｇ４の結合ユニットを含有するリガンドの三次元構造を示している。
【図１２】図１２Ａは、ビーズのグラム重量に関して、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８及びＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ４のカーブフィッティングを行ったラングミューアの等温式を示している。図１２Ｂは、アルギニンのモルに関して、ＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ８及びＰＳ−ＰＥＧ−Ａｒｇ４のカーブフィッティングを行ったラングミューアの等温式を示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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