(57)【要約】本発明は、抗ウイルス剤として有効な6-メチルピリジン誘導体に関するもので、より詳細には、本発明はC型肝炎ウイルス(HCV)の増殖抑制効果がすぐれた下記の化学式Iに表示される新規の6-メチルピリジン誘導体 (式I）【化１】2006506358.tif 000010及びその薬学的に許容される塩及びその製造方法と、前記化合物を有効成分になる抗ウイルス用薬学的な組成物に関し、本発明による化学式Iに表示になる新規の6-メチルピリジン誘導体は、C型肝炎ウイルス(HCV)の増殖を抑制する効果が優れ、毒性も少ないので、C型肝炎の予防と治療制として有用に使われることができるものである。
2006506358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の化学式Iで表示される6-メチルピリジン誘導体及び薬学的に許容されるその塩:
…(I)
【化１】
2006506358.tif 000007
【請求項２】
化学式IIの2-クロル6-メチルニコチン酸と、化学式IIIの4-(4-モルポリノー)アニリンとを下記の反応式に示すように反応する、化学式Iの6-メチルピリジン誘導体の製造方法。
[反応式I]
【化２】
2006506358.tif 000008
【請求項３】
下記の化学式Iに示される6-メチルピリジン誘導体及び薬学的に許容されるその塩を有効成分として含むC型肝炎の治療または予防用薬学組成物。
…(I)
【化３】
2006506358.tif 000009
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ウイルス剤に使用する6-メチルピリジン誘導体に関し、より詳細には、C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus、 HCV:以下 ″HCV″という)の増殖抑制効果がすぐれた下記化学式Iで示される新規の6-メチルピリジン誘導体及びその製造方法、並びにこれを含する抗ウイルス用薬学的組成物に関する。
…(I)
【化１】
2006506358.tif 000003
【背景技術】
【０００２】
C型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非A型、非B型肝炎(non-A、non-B viral hepatitis)の主因子として、主に輸血後及び地域特異的な (community-acquired)ものである。 一度HCVに感染すると、罹病者の約80%は、慢性肝炎に進行し、残りの約20%が肝硬化を起す急性肝炎に進行して肝癌になる。最近の公式報告によると、全世界的には、約2億人以上がHCVに感染している。例えば、アメリカ国内では450万人以上と推定され(最大1,500万人になることに推定される)、ヨーロッパでも5百万人以上がHCV患者であることが報告されている。
【０００３】
HCVは、フラビウイルス(Flaviviridae)科の仲間である。 更に詳しくは、膜内に約9.5kb大きさの一本鎖(+)-RNA(single stranded positive-sense RNA)をゲノムとして持っており、RNAゲノムは、5'末端と3'末端の非翻訳部分と、一つの長いオープン  リーデング  フレーム (ORF)で構成されている。 このORFは宿主細胞の酵素によって3,100ないし3,040個のアミノ酸からなるポリプロテインであって、宿主細胞とウイルス自身のプロテアーゼによって3種の構造蛋白質と、6種の非構造蛋白質とに分解される。ゲノムの5'末端と3' 末端部位にはそれぞれ等しい保存領域 が存在し、この部分がウイルスの蛋白質形成とRNA複製に重要な役割をすると考えられる。
【０００４】
長鎖ORFは、転写段階(cotrabslational)あるいは転写後の過程 (post―translational processing) 中にポリプロテインとして明示され、処理された構造蛋白質、即ちコアー抗原蛋白質(core)と、表面抗原蛋白質(E1、E2)、及び非構造蛋白質、即ちNS2(蛋白質分解プロテアーゼ、NS3 (セリン  プロテアーゼ、  ヘリカーゼ)、NS4A (セリンプロテアーゼ  コファクター)、NS4B (レジスタンスに含まれるプロテアーゼ  コファクター)、 NS5A、及びNS5B (RNA従属RNAポリメラーゼ、RdRp)であり、それぞれウイルス増殖に作用する。構造蛋白質は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼによって、coreと、E1およびE2との部分に分けられる。一方、非構造蛋白質は、ウイルスのセリンプロテアーゼ (NS3)と、コファクター(NS2、 NS4A、および NS4B)によって処理される。コアー抗原蛋白質は、構造蛋白質の表面抗原蛋白質と一緒に、ウイルスのキャプシド(capsid)を構成し、NS3およびNS5Bの様な非構造蛋白質は、ウイルスRNAの複製(replication)に重要な役割をすることになる(参照: 非特許文献１)。
【０００５】
他のフラビウイルス(Flavivirus)と同様に、ウイルスRNAの5'末端部位と3'末端部位は、一定の保存された非翻訳部分(UTR)が存在する。一般に、この部分はウイルスの複製に非常に重要な役割をすることが知られている。 5'末端には341個のヌクレオチドから成る5'-UTRが存在し、この部分は4個のステム アンド  ループ構造(I,II,IIIおよびIV)を有する。実際、これはこのような蛋白質発現のための転写過程に必要な内部リボゾーム侵入部位(IRES)として作用する。 特に、一番大きく、安定した保存された塩基配列構造を有するステムIIIは、リボゾーム結合に一番必要な部分として作用することが報告されている。そして、最近の研究で、ステムIVの単一RNA部分に存在するAUGから転写過程が開始されてウイルスの蛋白質が構築される報告されている(参照: 非特許文献２)。 
【０００６】
また、3'末端には、318個のヌクレオチドで構成された3'-UTRが存在する。この部分は、RNA複製に非常に必要な酵素であるNS5Bの結合が始まることに重要な役割をすることが知られている。塩基配列と3次構造による3'-UTRは,3種の異なる部分、すなわち、5'末端から98番目のヌクレオチド(98nt)への-X-tail-5'スタート部分、連続的にUTPが存在する-poly(U)-部分と、そして3'-UTR-の三つの部分からなる。更に詳しくは、X-tail-5'部分は、非常に保存された配列を持つ98個のヌクレオチドから成り、3個のステム  アンド  ループ構造を有し、それにより非常に安定した3次構造を造っている。恐らくこれが持つので、X-tail-5'部分がNS5Bの結合に極めて重要となっていると考えられられる。同様に、-poly(U)-部分は、RNAポリメラーゼ効果を促進するピリミジン  トラックの作用を有している。最後に、3'-UTRの残りの部分はループの3次構造を持ってNS5Bの結合に重要な役割をするが、その構造が何らか安定的でないことが知られている。全体から見て、HCV RNA の3'末端部分は、NS5Bの結合の重要な構造を持つことが知られている。 (参照: 非特許文献３)
【０００７】
HCVのその他の酵素の中でNS5Bは、RNA複製に直接含まれるものの一つであり、ことが非常に重要である。NS5Bは、約65kDaの分子量を持つ591個のアミノ酸から成る。 アミノ酸配列によって、1aと1bとを含めた6個の遺伝型に分けることができ、RNA重合とターミナル  トランスフェラーゼが活性化される。NS5B酵素には、二つのRNA結合の範囲、即ちRBD1 とRBD2がある。RBD1はアミノ酸83番から194番の間に存在し、RBD2はアミノ酸196番から298番の間に存在する。RNA結合と活性に必須的に存在する重要なモチーフであるアミノ酸は、'Asp'(アミノ酸220番)、'Gly'(アミノ酸283番)、'Gly'(アミノ酸317番)、'Asp'(アミノ酸318番)、'Asp'(アミノ酸３19番)、'Lys'(アミノ酸346番)である。また、もし、ウイルス自身のRNA鋳型が存在するならば、この酵素は、その他のプライマーなしで、重合反応をリードすることができる(参照: 非特許文献４)
【０００８】
HCVのRNAゲノムは、1989年分子クローニングによってが分離された(参照:Choo、 Q-L, et al., 1989, Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A、non-B viral hepatitis genome. Science 244:359-362) その後、HCVに対する多くの分子生物学的研究があったが、より効果的な細胞培養システムと動物モデルの不足による制約が常にあった。幸いにも、安定的にHCVの複製ができるヘパトマ  セル  ライン（hepatoma cell line）の導入によって、このような問題が多少でも解決できるようになった(参照: 非特許文献５) 
【０００９】
現在まで、HCVに対する極めて有効なワクチンや治療剤は実際には見つかっていない。したがって、世界の多くの製薬会社と研究所でＣ型肝炎の治療と予防の開発が試みられている。 HCVの患者は、世界中に流行し、肝硬化および/または肝癌に進む割合がHBVより非常に高い。同様に、慢性肝炎に進行の割合が多いにもかかわらず、ウイルスの影響メカニズムについての研究はまだ進行中である。 また、C型肝炎は輸血あるいは静脈注射による薬物使用や、入れ墨によっても感染がおこるが、HCV感染の殆どのケースは、直接的な血液接触によるものである。 しかし、HAV患者の40〜50%は、いまだに、どうしてなったかを正確に判っていない。不幸にも、上記以外のその他の経路にＨＣＶに感染すると、大部分の患者が慢性に進行し、また肝硬変症に進行して肝臓癌に発展する。このような状況を考えると、病気を治療するための効果的なワクチンと治療剤の開発が非常に緊急の問題である。一般に、 HCVは菌株（strain）と突然変異との間の遺伝型（diverse genotypes）により発見される。 一度HCVによる慢性肝炎になった人は、多様な遺伝的変異型(genetic variants)による再感染や共感染を見ることは難しくない。 このために、HCVの効果的なワクチンの開発は成功しにくかった。 その他のHCV治療例にアルファ  インターフェロンが使われている。しかし、この方法は、HCVの遺伝子型の違いに対するアルファ  インターフェロンの効果も多様であり、投与を中断すれば大部分の場合に再発するので、良い結果が証明されていない。  その為、HCV再感染をコントロールするため、特定の蛋白質のみを結合する阻害剤の開発が重要になっている。このような研究で一番良い標的は、HCVのNS3プロテアーゼ/ヘリカーゼとHAVのNS5BRNAポリメラーゼである。これら酵素のタイプがは、自分の複製には必要であるが、 宿主細胞には不必要なので、抗HCV剤の開発に非常に有用である。言い換えれば、HCVのNS5B(RNA 依存RNA ポリメラゼ(レプリカーゼ)は増殖に必要なHCVの酵素なので、HCVの複製を抑制するための治療に良い標的になることができるはずである。
【００１０】
現在、HCVは、ワクチンでは処理が難しく、α-インターフェロンとリバビリンを用いた新しい治療法が施行されているが、 これもまた、副作用があり、C型肝炎の治療効果がない。例えば、HCV患者の約25%がインターフェロン治療の効果がみれず、約25%が一時的に反応してからｃを再発している。残りの約50%の患者では、治療終了後、ALT値が正常に維持されてHCV RNAが陰性になるが、その中50%位は治療終了後3〜6ケ月内にC型肝炎を再発している。結局、HCV患者の25%だけが、6ケ月以上治療効果が維持されいる。 また、世界中患者に見られるHCVサブタイプの殆どがサブタイプ２および３と比較してインターフェロン治療に良い反応性を見せない１( 1a, 1b)である。インターフェロンとリバビリンとの併用療法を使うと、治療効果が2倍程度高くなることが確認されたが、リバビリンだけを単独で使う場合にはHCVには効果があまりなく、むしろエリスロクラスチック貧血症の様な副作用が現われることが知られている。このため、リバビリンは、主にインターフェロン治療に反応がない場合とか、HCV Cが再発した場合にのみ処方することとされている。 したがって今まではHCVの複製を抑えることによるC型肝炎を治療する抗ウイルス剤は開発できなかった。
【非特許文献１】Bartenschager、R. 、Molecular targets in inhibition of hepatitis C virus replication、 Antivir. Chem. Chemother. 8: 281-301
【非特許文献２】Stanley、M. Lemon and Masao Honda、1997, Internal ribosome entry sites within the RNA genomes of hepatitis C virus and other Flaviviruses、seminars in Virology 8:274-288
【非特許文献３】Yamada et al.、1996、 Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus genome、 Virology 223:255-281
【非特許文献４】Lohmann、 V. et al., 1997, Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNA dependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs  essential for enzymatic activity、 J. virol. 71:8416-8428
【非特許文献５】Lohmann, V., F. Korner, J-O Koch, U. Herian, L. Theilmann, R. Bartenschlager, 1999, Replication of subgenomic hepatitis c virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 285:110-113
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本願発明は、組換えHCV RNAポリメラーゼの活性を阻害する物質を研究することによって、毒性と副作用が殆どなく優れた抗ウイルス活性を示す非ヌクレオチド化合物を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
副作用及び毒性が少なくて耐性ウイルス出現が低い、新しいC型肝炎治療剤の開発を目的にして、HCVに対して優秀な抗ウイルス活性を現わす化合物を開発するために努力した結果、本願発明者は、前記化学式Iに示す新規の6-メチルピリジン誘導体を合成し、この物質がHCVの増殖抑制効果が優秀さを明らかにすることによって本発明を完成することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の目的は、抗C型肝炎ウイルス（HCV）に有効な6-メチルピリジン誘導体と薬学的に許容されるその塩、ならびにその製造方法を提供することである。 
本発明のその他の目的は、前記化合物を有効成分にして副作用が少なくて経済的な、C型肝炎の治療及び予防のための薬学的組成物を提供することである。 
【００１４】
前記目的を果たすために、下記の化学式Iに表示される新しい6-メチルピリジン誘導体及び薬学的に許容されるその塩を提供する。
…(I)
【化２】
2006506358.tif 000004
【００１５】
上に述べたとおり、上記の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態で使うことができる。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸によって形成された酸附加塩が有用に使用されうる。化学式Iの化合物は、当該技術分野で通常的な方法によって薬剤学的に許容される酸附加塩を形成することができる。 遊離酸につぃては、有機酸と無機酸を使うことができるし、 無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸などを使うことができる。、有機酸は、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、蟻酸、プロピオン酸、クエン酸酸、４−トリフルオロ酢酸、臭酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、琥珀酸、４−トルエンスルホン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸などを使うことができる。
【００１６】
本発明では下記のスキムIに表示される化学式Iの6-メチルピリジン誘導体の製造方法を提供する。
(反応式Ｉ）
【化３】
2006506358.tif 000005
【００１７】
前記反応式Iで表示したように、化学式Iで示される6-メチルピリジン誘導体は、前記化学式IIの2-クロロー6-メチルニコチン酸と化学式IIIの4-(4-モルフォリノ)アニリンとを反応させて製造する。出発物質、即ち化学式IIの2-クロル6-メチルニコチン酸及び反応物質、即ち化学式IIIの4-(4-モルフォリノ)アニリンは、商業的に市販される薬品であり、誰でも購入可能である。
【００１８】
前記反応式Iの製造方法をさらに具体的に説明すれば、メタノール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、ジクロロメタン、クロロフォルム、アセトニトリル、N、N-ジメチルフォルムアミド、アセトンなどの有機溶媒中で、ピリジン、2、6-ルチヂン、4-N、N-ジ-メチルアミノピリジン、N、N-ジ-メチルアニリンなど弱塩基を40℃-80℃の温度範囲内で1日ないし6日の比較的長い反応時間の間に徐々に反応させる。
【００１９】
また本発明では、化学式Iの6-メチルピリジン誘導体及び/またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、C型肝炎の治療または予防用の薬学組成物を提供する。本発明の化学式Iの化合物は、C型肝炎の治療剤として臨床投与の時に、経口または非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使われることができる。本発明の化学式Iの化合物は実際の臨床投与の時に経口及び非経口(望ましくは注射剤で)のさまざまな形態で投与されることができる。製剤化する必要があれば、通常使う充填剤、増量剤、結合剤、芳香剤、崩解剤、または洗剤（または界面活性剤）などの希釈剤、または附形剤を使って調剤される。
【００２０】
経口投与のための固型製剤には、 錠剤、ピル、粉末、顆粒、カプセル剤などが含まれており、このような固型製剤は一つ以上の化学式Iの化合物に少なくとも一つ以上の附形剤、例えば澱粉、炭酸カルシウム、シュークロスまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。 経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、溶液剤、油剤、シロップ剤などが使用できるし、よく使われる単純希薄剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな附形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが使用することができる。 非経口の投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤などが含まれる。 非水性溶剤、懸濁剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステルなどが使うことができる。
【００２１】
本発明の化学式Iの化合物の有効用量は、性別、年齢、患者の状態などを考慮して適切に選択されることができるが、一般的に大人に10 - 1000 mg/日、望ましくは20 - 500 mg/日であり、一日に1 - 3回の分割投与することができる。
【実施例】
【００２２】
以下本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。 しかしながら、 下記実施例は本発明を例示することであって、本発明の内容が実施例によって限定されるのではない。
【００２３】
実施例１：  6-メチル-2-[4-(4-モルフォリノ)アニリノ]ニコチン酸の製造
クロロフォルム100mLに、2-クロロ6-メチルニコチン酸5g、4-(4-モルフォリノ)アニリン5.45g、およびピリジン7.2mLとを加えた後、加熱して60℃で5日間反応させた。反応完結後、室温に冷却して反応途中に析出した少量の固体を濾過して、クロロフォルム10mLで洗滌して不純物をとり除いた。溶媒であるクロロフォルムを減圧濃縮してメタノール60mLで濃縮させ、1時間撹拌した後、濾過し、メタノール10mLで2回洗滌し、得られた結晶を35℃-45℃で真空乾燥して7.31g(収率89%)の目的化合物を得た。
m.p. : 220 - 221 ℃
1H-NMR (DMSO-d6)、 ppm : d 2.39(s, 3H), 3.04(t, 4H), 3.73(t, 4H), 6.61(dd, 1H), 6.89(d, 2H), 7.57(dd, 2H), 8.05(dd, 1H), 10.21(s, 1H)
【００２４】
実験例１：  HCV RNAポリメラーゼ (RNA依存型RNAポリメラゼ、 NS5B)に対する阻害活性の生体外(in vitro)試験
本発明の化合物のHCV RNAポリメラゼ（RNA 依存型RNAポリメラゼ NS5B）に対する本願本願発明化合物の活性阻害効果を調べるため、以下の生体外実験を実施した。
【００２５】
組換えHCV RNA重合酵素の構築
HCV RNAポリメラーゼは次のような方法で調製した。先に、HCV-1b型C型肝炎ウイルス患者の血液からcDNAを得た後、PCRを利用してNS5B(1773bps)部位を増幅してバキュロウイルス(baculovirus)トランスファーベクターpVLHISに挿入した組換えトランスファーベクターを製造した。製造されたトランスファーベクターをwild-type AcNPVベクターと一緒に昆虫細胞(Sf 9 cell line)に共感染させてヒスティジンタグ担持する組換えベクター pVLHIS-NS5Bを持った組換えバキュロウイルスを作った。 製造された組換えバキュロウイルスを充分に培養された昆虫細胞に感染して、10% FBSが添加されたグレース  メヂウム（Grace'medium）で3-4日間培養した後、感染された細胞のみを遠心分離して得た。得られた細胞をPBSで3回洗滌した後、超音波分解処理し、Ni-NTA His bind resin(Novagen社)を利用した親和性カラムクロマトグラフィー過程をへて純粋なNS5B蛋白質を製造した。(His)6-タグ化 NS5Bは、Ni-NTA resinに結合し、そしてイミダゾールを含む結合緩衝液で洗浄した。結合したNS5Bは100 - 300mMのステップ勾配法でイミダゾールを含む結合緩衝液で溶出された。NS5Bタンパク質画分は、緩衝液[50mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 1mM DTT, 5mg MgCl2, 10% glycerol]に対して透析し、少量に分けて-70℃で保存した。
【００２６】
HCV 3' 末端(3'-UTR)を含むRNA鋳型(RNA template) の製造
HCV 3'-UTRを含むRNA鋳型は次のような方法で製造した。先にC型肝炎患者の血液から得られたHCV RNAからPCR方法をへてcDNAを得た後、制限酵素EcoR1を利用して3'-UTRの部位を含むDNA切片を得た。このDNAから生体外転写過程を経って3'-UTRを含むRNAを製造した。
【００２７】
組換えHCV RNAポリメラーゼに対する本発明の化合物の生体外阻害活性測定
本発明に使われたHCV RNA重合酵素に対する本発明の化合物の生体外阻害活性測定方法は次のようにおこなった。
測定しようとする試料に接触するようにストレプトアビジン(streptavidin)でコーティングされたウェル(well)プレートを準備して、先に、各ウェルに2X反応緩衝液[50mM Tris-Cl (pH 7.5)、100mM NaCl、10mM MgCl2 、20mM KCl、1mM EDTA、1mM DTT]を25μlずつ加えて、分離精製されたHCV RNAポリメラーゼ200ngを10μlずつ加えた後、試験物質を最終濃度がそれぞれ10、1、0.1、0.01 μg/mLになるように5μlずつ添加した後、最後にRNA鋳型のHCV 3'-UTR RNAと反応のためのヌクレオチドとしてDIG-(digoxigenin)-UTP、 biotin-UTP、 ATP、 CTP、 GTP、 UTPが混合した反応混合額を10μlずつ加えた後、22℃から60分の間反応させた。HCVポリメラーゼの活性によってRNAが作られてここにはビオチン結合UTPが含まれているので、新しいRNAはウェルにコーティングされているストレプトアビジンと結合した。反応が終了後、未反応の不純物をとり除くために各ウェル当たり200μlの洗滌緩衝液(pH 7.0、Roche社)を加えた後、3回繰り返して洗った。次いで、2次抗体である抗DIG-POD (ペルオキシターゼ、 Roche社)を100μlずつ加えて37℃で1時間反応させた後、再度洗滌緩衝液で各ウェルを洗った。最後にPODの基質であるABTS登録商標(Roche社)をそれぞれ100μlずつ加えて15-30分間に反応させた後、ELISAリーダー(Bio-Tek Instrument社)を利用して405nmで吸光度(OD値)を測定した。この時、試料を入れない対照群(positive control)との相対的な吸光度差によってHCV重合酵素に対する活性抑制効果を計算した。その結果を次の表1に現わした。
【表１】
2006506358.tif 000006
【００２８】
表から判るように、本発明の化合物はHCVの複製に重要な役割をするHCV RNAポリメラーゼの活性を阻害する効果が優れており、この性質からHCVの増殖を抑制することができることが立証される。同様に、本願発明の化合物は、C型肝炎の予防剤及び治療制として有利に使用することが出来る。。
【００２９】
実験例２：  細胞毒性の実験
化学式Iの6-メチルピリジン誘導体が細胞毒性(Cytotoxicity)を現わすかを調べるために、HepG2細胞を利用して一般的に広く知られたMTT分析方法で試験管内(in vitro)実験を実施した。その結果、実験に使われた化合物は全てCC50値が100μg/mL以上であるので、 細胞に対する毒性が非常に少ない物質であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
前記で説明したように、本発明による前記化学式Iで表示される新規の6-メチルピリジン誘導体は、C型肝炎ウイルス(HCV)の増殖を抑制する効果が優れており、毒性も少ないので、C型肝炎の予防剤及び治療剤として有用である。
【国際調査報告】
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