(57)【要約】メソテトラキスＮ−アルキルピリジルポルフィリン（アルキルはメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル）の一連のオルト異性体とそのＭｎ（III）錯体を合成し、元素分析、ｕｖ／ｖｉｓ分光法、エレクトロスプレーイオン化質量分析、及び電気化学により確認した。１〜８までのアルキル鎖の炭素原子の数の増加は、（ａ）クロマトグラフィーの保持因子、Ｒｆにより測定される親油性、（ｂ）＋２２０〜＋３６７ｍＶｖｓＮＨＥまでの金属中心の酸化還元電位、Ｅ１／２、及び（ｃ）１０．９〜１３．３までのプロトン解離定数、の増加を伴う。Ｍｎ（III）ポルフィリンのＥ１／２とＲｆの間、及びメタルフリー化合物のｐＫａ２とＲｆの間に直線関係が見出された。ポルフィリンが次第により親油性になるに従って、水和作用の減少は、電荷の分離を嫌い、一方で、正の荷電をもつピリジン窒素原子の電子吸引性効果は強められる。従って、Ｅ１／２はｐＫａ２の増加と伴に直線的に増加し、本発明者らが他の水溶性Ｍｎ（III）ポルフィリンについて以前に報告したものと反対のポルフィリンの塩基性の傾向である。これらＭｎ（III）ポルフィリンの全ては、超酸化物の不均化（不均一化）のための強力な触媒である。鎖の長さの増加を伴うＥ１／２の好ましい増加にも関わらず、触媒速度定数は、メチル（ｌｏｇＫｃａｔ＝７．７９）からｎ−ブチルまで減少し、その後増加し、ｎ−オクチルは、メチル及びエチル化合物がそうであるように、強力なＳＯＤミミックである。観察された挙動は、電子効果を変える、水和及び立体効果の相互作用から生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2006501163.tif 000009
（式中、
各Ｒは、独立して、８個を超える炭素のアルキル基であり、
各Ａは、独立して、水素または電子吸引性基であり、
Ｍは、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選択される金属であり、並びに
Ｚ−は、対イオンである）で示される化合物。
【請求項２】
少なくとも１つのＡが、ハロゲンである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、式Ｉまたは式ＩＩで示されるものであり、Ｍがマンガンである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が、式ＩまたはＩＩＩで示されるものである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が式Ｉで示されるものであり、Ｍがマンガンである請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
酸化剤により誘発される毒性から細胞を保護する方法であって、保護がもたらされるような条件下で、前記細胞と、保護量の請求項１に記載の化合物を接触させることを包含する方法。
【請求項７】
前記細胞が、哺乳類の細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸化剤により誘発される毒性に起因する患者の病理学的状態を治療する方法であって、治療がなされるような条件下で、前記患者に、有効量の請求項１に記載の化合物を投与することを包含する方法。
【請求項９】
ＮＯ・の分解に起因する患者の病理学的状態を治療する方法であって、治療がなされるような条件下で、前記患者に、有効量の請求項１に記載の化合物を投与することを包含する方法。
【請求項１０】
患者の炎症性肺疾患を治療するための方法であって、治療がなされるような条件下で、前記患者に、有効量の請求項１に記載の化合物を投与することを包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願は、２００２年６月７日に出願された仮出願第６０／３８６，４５４号の優先権を主張するものであって、その内容は、本明細書の一部として本願に援用される。
【０００２】
緒言
酸化ストレス損傷の治療を目的とした、反応性酸素種及び反応性窒素種の低分子量触媒的捕捉剤が盛んに求められている。マンガン錯体の３つの主なグループが開発され、インビトロ及びインビボで試験されている；Ｍｎポルフィリン１〜９、Ｍｎ環状ポリアミン１０、及びＭｎサレン誘導体１１である。本発明者らが水溶性Ｍｎ（III）及びＦｅ（III）ポルフィリン２−４について明らかにした構造−活性相関に基づいて、Ｍｎ（III）メソテトラキス（Ｎ−メチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン（ＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋，ＡＥＯＬ−１０１１２）、及びＭｎ（III）メソテトラキス（Ｎ−エチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン（ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋，ＡＥＯＬ−１０１１３）が提案され、スーパーオキシドの不均化のための強力な触媒であることを示した４，１２。オルト位におけるアルキル置換は、ポルフィリン面に対するピリジル環の回転を制限する。従って、両化合物は、４つのアトロプ異性体の混合物として存在し、これら全てがＯ２・−の不均化のための、等しく強力な触媒であることが示された１３。これらＭｎポルフィリンは、ＳＯＤ欠乏大腸菌が好気性条件下で生長することも可能にし４，１２、げっ歯類モデルの脳卒中１４、糖尿病１５、鎌状赤血球症１６、及び癌／放射線１７等の酸化ストレスの保護を提供する。これら金属ポルフィリンの高形式＋５電荷は、金属ポルフィリンの組織分布、生体膜を挟んだ輸送、及び他の生体分子への結合に影響し得、これらの低親油性は金属ポルフィリンの保護的な効果を制限し得る。メタロポルフィリンの亜細胞分布を調節するという目的で、親油性を増大させた高級Ｎ−アルキルピリジルポルフィリン類似体（スキーム１）を合成した。これらの比較動力学的及び熱力学的特性決定が、ポルフィリンベースの触媒的酸化防止剤の作用様式及び酸化ストレス障害のメカニズムへの洞察を深めるであろうと本発明者らは予測する。
【０００３】
発明の詳細な説明
本発明は、式
【化２】
2006501163.tif 000002
【０００４】
（式中、
各Ｒは、独立して、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル（好ましくは、Ｃ８〜Ｃ１２アルキル）であり、
各Ａは、独立して、水素または電子吸引性基であり、
Ｍは、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル及び亜鉛からなる群から選択される金属であり、及び
Ｚ−は、対イオンである）で示される化合物に関する。１つの態様において、少なくとも１つのＡは、ハロゲンである。
【０００５】
本発明はさらに、細胞と上述の化合物の保護量を接触させることを包含する、酸化剤が誘発する毒性からの細胞（例えば哺乳類の細胞）の保護方法に関する。本発明はさらに、かかる化合物の有効量を患者に投与することを包含する、酸化剤が誘発する毒性に起因する患者の状態の治療方法に関する。本発明は、また、上述の化合物の有効量を患者に投与することを包含する、ＮＯ・の分解に起因する患者の病理学的状態の治療方法に関する。加えて、本発明は、上述の化合物の有効量を患者に投与することを包含する、患者の炎症性肺疾病の治療方法に関する。炎症性肺疾病は、過反応性気道疾病（hyper-reactive airway disease）であり得る。本疾病は、喘息であり得る。
【０００６】
本明細書中に引用された全ての文献の全内容は、本明細書の一部として本願に援用する。同様に、本明細書の一部として、Batinic-Haberle等の、J.Chem.Soc., Dalton Trans. 2002, 2689-2696 を本願に援用する。
【０００７】
同様に、本明細書の一部として、２００１年６月１４日に出願された、米国出願０９／８８０，１２５を本願に援用する。
【０００８】
実験
原料と方法
一般。  ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏと、Ｂａｋｅｒ−ｆｌｅｘシリカゲルＩＢ  ＴＬＣプレートを、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから購入した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ｐ−トルエンスルホン酸エチル、２−プロパノール（９９．５＋％）、ＮＨ４ＰＦ６（９９．９９％）、ＮａＣｌ、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（９９＋％）、及びテトラブチルアンモニウムクロライドは、Ａｌｄｒｉｃｈ製のものであり、一方、キサンチン及びフェリシトクロムｃはＳｉｇｍａ製のものであった。ｐ−トルエンスルホン酸のｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチルエステルは、ＴＣＩアメリカ製のものであった。メタノール（無水、純粋）、エタノール（純粋）、アセトン、エチルエーテル（無水）、クロロホルム、ＥＤＴＡ、及びＫＮＯ３は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ製のものであり、アセトニトリルは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のものであった。キサンチンオキシダーゼは、Ｒ．Ｗｉｌｅｙにより調製され、Ｋ．Ｖ．Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎにより供給された１８。カタラーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製のものであり、超純粋アルゴンは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｅｌｄｅｒｓ  Ｓｕｐｐｌｙ社製、及びトリス緩衝液（超純粋）は、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ製のものであった。
【０００９】
Ｈ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋。  テトラキス（２−ピリジル）ポルフィリン、Ｈ２Ｔ−２−ＰｙＰは、Ｍｉｄ−Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬから購入した。増大した親油性を有するｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、及びｎ−オクチル類似体は、メチル及びエチル化合物について用いられた合成法４，１２のわずかな改変を必要とした。典型的に、１００ｍｇのＨ２Ｔ−２−ＰｙＰを、２０ｍＬのＤＭＦ中に１００℃で溶解させ、次いで４ｍｌの対応するｐ−トルエンスルホン酸エステルを加えた。Ｎ−アルキル化の経過を、移動相として、１：１：８のＫＮＯ３飽和Ｈ２Ｏ：Ｈ２Ｏ：アセトニトリルを用いたシリカゲルＴＬＣプレート上での薄層クロマトグラフィーにより追跡した。メチル類似体については、Ｎ−アルキル化が数時間以内で達成される一方で、必要とされる時間が徐々に長くなり、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル化合物を調製するためには、それぞれ３日及び５日かかった。完結後、メチル、エチル、及びｎ−プロピル化合物については、反応混合物を、水及びクロロホルムをそれぞれ２００ｍＬ含む分液漏斗中に注ぎ、十分に振り混ぜた。クロロホルム相を捨て、ＣＨＣｌ３を用いた抽出を数回繰り返した。ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル類似体は、より親油性であり、クロロホルム相に残存する傾向があった。よって、ポルフィリンを水／メタノール相中に抽出するために、増加する量のメタノールを水／ＣＨＣｌ３混合物に加えた。この相をろ過し、ＮＨ４ＰＦ６の濃水溶液を添加することにより、ポルフィリンをＰＦ６−塩として沈殿させた。沈殿物を、メチル及びエチル化合物の場合は、１：１の２−プロパノール：ジエチルエーテルを用いて、他については、純粋なジエチルエーテルを用いて、徹底的に洗浄した。その後、沈殿物をアセトン中に溶解させ、ろ過し、アセトン中に溶解させたテトラブチルアンモニウムクロライドを添加することによりクロライド塩として沈殿させた。沈殿物を、アセトンを用いて徹底的に洗浄し、減圧下、室温で乾燥させた。元素分析：Ｈ２ＴｎＰｒ−２−ＰｙＰＣｌ４×１２．５Ｈ２Ｏ（Ｃ５２Ｈ７１Ｎ８Ｏ１２．５Ｃｌ４）：実測値：Ｃ，５４．２；Ｈ，６．４２；Ｎ，９．９１；Ｃｌ，１２．０４。計算値：Ｃ，５４．２０；Ｈ，６．１８；Ｎ，９．６８；Ｃｌ，１２．２５。Ｈ２ＴｎＢｕｔ−２−ＰｙＰＣｌ４×１０．５Ｈ２Ｏ（Ｃ５６Ｈ７５Ｎ８Ｏ１０．５Ｃｌ４）：実測値：Ｃ，５７．１６；Ｈ，６．９４；Ｎ，９．５１３；Ｃｌ，１．７７。計算値：Ｃ，５７．１０；Ｈ，６．４１；Ｎ，９．５１；Ｃｌ，１２．０３。Ｈ２ＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰＣｌ４×１１Ｈ２Ｏ（Ｃ６４Ｈ１００Ｎ８Ｏ１１Ｃｌ４）：実測値：Ｃ，５９．１９；Ｈ，７．３１；Ｎ，８．６１；Ｃｌ，１１．０９。計算値：Ｃ，５９．１６；Ｈ，７．７５１；Ｎ，８．６０；Ｃｌ，１０．９１。Ｈ２ＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰＣｌ４×１３．５Ｈ２Ｏ（Ｃ６４Ｈ１２１Ｎ８Ｏ１３．５Ｃｌ４）：実測値：Ｃ，５９．３７；Ｈ，７．４１；Ｎ，７．７３。計算値：Ｃ，５９．３７；Ｈ，８．３７；Ｎ，７．６９。
【００１０】
ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋。Ｎ−アルキル化ポルフィリンのメタレーションを、メチル及びエチル化合物について以前に記述された通りに行った４，１２。金属取り込みは、アルキル鎖が長くなるに従ってより遅くなった。同じ条件下（２０倍過剰の金属、２５℃、ｐＨ  １２．３）で、メタレーションは、メチル及びエチルについてはほぼ即座に、ｎ−プロピルについては数分以内で、ｎ−ブチルについてはほぼ３０分で、ｎ−ヘキシルについてはほぼ１時間で起こり、及びｎ−オクチルポルフィリンについては１００℃で数時間かかった。Ｍｎ（II）ポルフィリンの生成と、そのＭｎ（III）への酸化は、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル類似体をメタル化した際には、明確に識別可能な工程であった。金属フリーの配位子の場合と同様に、Ｍｎ（III）ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、及びｎ−オクチル化合物のＰＦ６−塩は、ジエチルエーテルのみを用いて洗浄した。元素分析：ＭｎIIIＴｎＰｒ−２−ＰｙＰＣｌ５×１１．５Ｈ２Ｏ（ＭｎＣ５２Ｈ７５Ｎ８Ｏ１１．５Ｃｌ５）：実測値：Ｃ，５０．９０；Ｈ，６．０７；Ｎ，９．２７；Ｃｌ，１３．４８。計算値：Ｃ，５０．８５；Ｈ，６．１６；Ｎ，９．１２；Ｃｌ，１４．４３。ＭｎIIIＴｎＢｕｔ−２−ＰｙＰＣｌ５×１２．５Ｈ２Ｏ（ＭｎＣ５６Ｈ８５Ｎ８Ｏ１２．５Ｃｌ５）：実測値：Ｃ，５１．５８；Ｈ，６．３３；Ｎ，９．５５；Ｃｌ，１５．５３。計算値：Ｃ，５１．６４；Ｈ，６．５８；Ｎ，８．６０；Ｃｌ，１３．６１。ＭｎIIIＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰＣｌ５×１０．５Ｈ２Ｏ（ＭｎＣ５６Ｈ９７Ｎ８Ｏ１２．５Ｃｌ５）：実測値：Ｃ，５５．６４；Ｈ，７．１４；Ｎ，８．２３；Ｃｌ，１２．６０。計算値：Ｃ，５５．７６；Ｈ，７．０９；Ｎ，８．１３；Ｃｌ，１２．８６。ＭｎIIIＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰＣｌ５×１０Ｈ２Ｏ×２．５ＮＨ４Ｃｌ（ＭnＣ６４Ｈ１２２Ｎ１０．５Ｏ１０Ｃｌ７．５）：実測値：Ｃ，５３．５６；Ｈ，７．１３；Ｎ，９．１２；Ｃｌ，１６．８４。計算値：Ｃ，５３．５３；Ｈ，７．６０；Ｎ，９．１０；Ｃｌ，１６．４６。
【００１１】
薄層クロマトグラフィー。    全ての配位子とそのＭｎ（III）錯体を、１：１：８のＫＮＯ３飽和Ｈ２Ｏ：Ｈ２Ｏ：アセトニトリルを用いた、シリカゲルＴＬＣプレート上でのクロマトグラフィーで分離した。アトロプ異性体は、メチル１９及びエチル類似体２〜４については分離されることがなかったが、ｎ−プロピル及びｎ−ブチル種については分離し始め、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル化合物については明確に分離された。
【００１２】
Ｕｖ／ｖｉｓ分光分析。    ｕｖ／ｖｉｓスペクトルを、２５℃で、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２５０１ＰＣ分光光度計で測定した。プロトン解離定数（ｐＫａ２）を、２５℃、０．１Ｍ（ＮａＯＨ／ＮａＮＯ３）のイオン強度で、以前に記述した４通り、分光測定で決定した。
【００１３】
電気化学。    測定を、ＣＨインストルメンツモデル６００ボルタンメトリアナライザ３，４によって行った。直径３ｍｍガラス状炭素ボタン作用電極（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、並びにＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極、及びＰｔ補助電極を有する、小容積セル（０．５ｍＬ〜３ｍＬ）中の３電極システムを用いた。溶液は、ｐＨ７．８の０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１ＭＮａＣｌ、及び０．５ｍＭ金属ポルフィリンを含んでいた。走査速度は、０．０１〜０．５Ｖ／ｓ、典型的には０．１Ｖ／ｓであった。電位差を、フェロシアン化カリウム／フェリシアン化カリウム２０に対して、及び（または）ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋に対して標準化した。全てのボルタモグラムは可逆的であった。
【００１４】
エレクトロスプレー質量分析。    ＥＳＭＳ測定を、大気圧で動作する空気補助型（pneumatically assisted）静電イオン源を備えた、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  ＬＣ  三連四重極質量分析計によって行った。典型的に、金属フリーのポルフィリンのクロライド塩またはそのＭｎ（III）錯体の０．５ｍＭ５０％アセトニトリル水溶液を、８μＬ／ｍｉｎで流れる５０％アセトニトリル水溶液流へ、ループインジェクションにより導入した。５ｓで１００〜５００ｍ／ｚから走査し、２０Ｖ及び２４Ｖのコーン電圧を用いて、質量スペクトルを連続様式で得た。質量スケールを、ポリエチレングリコールを用いて較正した。
【００１５】
Ｏ２−不均化の触媒作用。    本発明者らは、Ｏ２・−／シトクロムｃ還元アッセイは、ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋、｛ＭｎIIIＢＶＤＭＥ｝２、｛ＭｎIIIＢＶ｝２、及びＭｎＣｌ２についてのパルス放射線分解を行う場合と同じ触媒速度定数を与えることを以前に示している２１。従って、簡便なシトクロムｃアッセイを、一連のＭｎ（III）Ｎ−アルキルピリジルポルフィリンの特性を決定するために用いた。キサンチン／キサンチンオキシダーゼ反応は、Ｏ２・−源であり、フェリシトクロムｃを、Ｏ２・−の指示捕捉剤として用いた２２。シトクロムｃの還元を、５５０ｎｍで追跡した。アッセイを、（２５±１）℃、ｐＨ７．８の０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、１５μｇ／ｍＬのカタラーゼの存在下及び不存在下で行った。金属ポルフィリンとＯ２・−の反応についての速度定数は、他に記述した通り２１、１０μＭシトクロムｃとの競合に基づくものであり、Ｋｃｙｔ  ｃ＝２．６×１０５Ｍ−１ｓ−１であった。Ｏ２・−は、１分間につき１．２μＭの速さで生成した。試験化合物によるキサンチン／キサンチンオキシダーゼ反応の阻害による、いずれもの起こり得る干渉を、シトクロムｃ不存在下で２９５ｎｍでの尿酸塩蓄積速度を追跡することにより調べた。金属ポルフィリンによるシトクロムｃの再酸化は、観察されなかった。
【００１６】
結果
薄層クロマトグラフィー。    アルキル鎖の長さの増加は、保持ファクタＲｆ（ポルフィリンパス／溶媒パス）（表１、図１Ａ、図１Ｂ）の増加により示されるように、化合物の親油性の増大を伴う。Ｍｎ（III）錯体についてより短い鎖の場合に観察された明らかなずれ（図１Ｂ）は、おそらく、それらのより高い総形式電荷（Ｍｎ（III）錯体については＋５、配位子については＋４）によるものである。鎖が長くなるに従って、全体的な親油性に対するそれらの寄与は増大し、最終的に、メチル類似体と比較して、ｎ−オクチルポルフィリン及びそのＭｎ（III）錯体は、より等しいＲｆにある。
【００１７】
Ｕｖ／ｖｉｓ分光法。  モル吸光係数。    ポルフィリンは、１０−７Ｍから１０−５Ｍで、ベール・ランバートの法則に従い、ｕｖ／ｖｉｓデータを表２に与える。アルキル鎖の長さが、メチルからｎ−ブチルに増加するに従って、モル吸光係数の増加ばかりでなく、ソーレ吸収最大値のレッドシフトも一般的に観測され、これらの効果は、ブチル化合物を超えると一定状態になる。このような傾向は、ポルフィリン環のひずみ（レッドシフト）及びＮ−アルキルピリジル基の電子吸引性（ブルーシフト）の相互作用の点から理解され得る１２、２３。
【００１８】
メタレーション挙動及びプロトン解離定数。    ｐＨ〜１２．３でのＭｎ２＋の取り込み速度は、鎖の長さの増加に従って低下した。同様のことが、ｐＨ７未満でのこれらの化合物へのＺｎ２＋及びＣｕ２＋挿入の速度式についても見受けられ、速度式は、金属及びポルフィリン濃度において１次であった２４。遊離塩基であるポルフィリンＨ２Ｐ４＋反応物は、４つのアトロプ異性体の混合物であるため、それぞれの異性体は、同様のメタレーション速度定数を有する。水溶性及び不溶性ポルフィリンの両者について以前に認められたように、オルト位に置換基を有する化合物は、メタ位またはパラ位に同様の置換基を有する誘導体と比べて、より緩徐にメタル化する傾向がある２５〜３４。
【００１９】
プロトン解離定数Ｋａ２及びＫａ３は、以下のように定義される：
【化３】
2006501163.tif 000003
【００２０】
Ｎ−アルキルピリジル系列についてのｐＫａ２値を表１に与える。アルキル鎖が長くなるに従って、ポルフィリンはより水和されにくくなり、電荷の分離（式［１］）はより有利ではなく、すなわち、ｐＫａ２が増加する（図２挿入）。図２Ａは、ｐＫａ２とＲｆ間の直線関係を示す。
【００２１】
反応［２］についての平衡定数ｐＫａ３は、メタＨ２ＴＭ−３−ＰｙＰ４＋については１．８であり、パラＨ２ＴＭ−４−ＰｙＰ４＋については１．４、オルトＨ２ＴＭ−２−ＰｙＰ４＋については−０．９である４，２５。メタ及びパラＮ−メチルピリジルポルフィリンは、１．０Ｍ  ＨＣｌ中で、プロトン化されたＨ３Ｐ５＋及びＨ４Ｐ６＋の混合物である一方で、オルト置換されたＨ２ＴＭ−２−ＰｙＰ４＋ないしＨ２ＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰ４＋化合物は、１．０Ｍ  ＨＣｌ中及び１．０Ｍ  ＨＮＯ３中で、プロトン化されていない遊離塩基Ｈ２Ｐ４＋として残る。オルト、メタ、及びパラＮ−メチルピリジルポルフィリンについては、ｐＫａ２は、ｐＫａ３が増加するに従って増加する。
【００２２】
１．０Ｍ  ＨＮＯ３中でのＺｎＮ−メチル化誘導体３５からの、酸及びアニオンにより触媒された亜鉛除去の半減期は、メタＺｎＴＭ−２−ＰｙＰ４＋については８９秒、パラＺｎＴＭ−２−ＰｙＰ４＋については１６５秒、及びオルトＺｎＴＭ−２−ＰｙＰ４＋については１９時間であった。亜鉛喪失の徴候は、ＺｎＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰ４＋化合物については、一週間以内では全く観測されなかった３６。同様の挙動が、１．０Ｍ  ＨＣｌ中で、メタメチルについての２１秒から、ＺｎＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰ４＋についての７６時間に渡るｔ１／２で観測された。固体ＭｎＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰ５＋を１２Ｍ  ＨＣｌ中に溶解した時、スペクトルは３ヶ月以内では変化せず、一方でＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋種から５０％を超えるＭｎが、１ヶ月以内で失われたという観察と一致する。ポルフィリン環のひずみ２９〜３２に加えて、漸次より長くなるアルキル鎖によりもたらされる立体障害及び溶媒和効果もまた、メタレーション／デメタレーション挙動における相違に寄与し得る。
【００２３】
その高い金属中心の酸化還元電位のために、インビボでのＭｎ（III）メソテトラキスオルトＮ−アルキルピリジルポルフィリンは、アスコルビン酸のような細胞還元剤により、容易に還元され得る２，３，１２。還元されたＭｎ（II）ポルフィリンも、Ｏ２・−不均化の触媒反応において、一時的に生成され得る。従って、還元され、より生物学的に関連のあるＭｎIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋化合物の挙動も検討した。メチル、ｎ−ヘキシル、及びｎ−オクチル誘導体（６μＭ）を、好気的及び嫌気的に、７０倍過剰のアスコルビン酸（ｐＨ７．８，０．１Ｍトリス緩衝液）の存在下、並びに１５０倍過剰のＥＤＴＡの存在及び不存在下で比較した。嫌気的な条件下では、両Ｍｎ（II）ポルフィリンは、Ｍｎ喪失及びポルフィリン分解に対して２４時間以内は安定であった。好気的には、ほぼ４０％のＭｎ  メチル化合物が１２５分以内で分解を起こしたが、Ｍｎ  ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル化合物は、１２５分以内では分解を起こさなかった。吸収スペクトルの変化は、Ｈ２Ｏ２の生成をもたらすアスコルビン酸によるＭｎポルフィリンを触媒とした酸素の還元により分解が起こったことを示している。該過酸化物が、次に、ポルフィリンの分解を引き起こす。これらの観察は、より電子リッチな化合物（ＭｎIIＴＭ−２−ＰｙＰ４＋）が、より電子欠乏種（ＭｎIIＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰ４＋）よりも早くＯ２を還元することを示す先の結果と一致する。ＥＤＴＡは、ポルフィリンの分解またはＭｎ損失に著しい影響を与えない。
【００２４】
電気化学。    Ｍｎ（III）のサイクリックボルタンメトリーは、Ｍｎ（III）／Ｍｎ（II）酸化還元対に起因するものとした可逆的なボルタモグラムを示す。金属中心の酸化還元電位Ｅ１／２は、表１に示されており、ＭｎIII／IIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋／４＋、及びＭｎIII／IIＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰ５＋／４＋化合物の代表的なボルタモグラムが、裏付け資料である図Ｓ１に示されている。親油性（図１Ｂ）とＥ２／１（図２Ｂ，挿入）の双方が、アルキル鎖におけるＣＨ２基の数と伴に、指数関数的に増加する。従って、Ｅ１／２の増加は、Ｒｆの一次関数である（図２Ｂ）。
【００２５】
エレクトロスプレー質量分析。    ＥＳＭＳは、遊離のベースポルフィリンとそのＭｎ錯体の性質を入手するための貴重な手段であり、それによって、溶媒和、イオン対、酸化還元特性、プロトン化／脱プロトン化、脱アルキル、及び触媒特性による構造の影響が明確に示される。
【００２６】
Ｈ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋。    ２０Ｖの低いコーン電圧において得られる金属フリーのポルフィリンのＥＳＭＳは、Ｈ２Ｐ４＋／４、及び（または）そのモノ脱プロトン化類似体であるＨ２Ｐ４＋−Ｈ＋／３（表３及び裏付け資料である図Ｓ２Ａ−Ｅ）に帰属する主要分子イオンを示した。無視し得る二重脱プロトン（Ｈ２Ｐ４＋−２Ｈ＋／２）が認められた。Ｈ２ＴＭ−２−ＰｙＰ４＋のみが、高い強度のＨ２Ｐ４＋＋Ｈ＋／５ピークを生じた。
【００２７】
ＥＳＭＳは、アルキル鎖が長くなるに従って、アセトニトリルによる溶媒和の著しい減少を示す。ベースピークと比較して、モノ溶媒和された分子イオンの相対強度は、メチルについての４０％から、エチルについての１５％、及びより高級の類似体についての＜１０％に渡る。ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチルポルフィリンについてのみ、クロライドと結合したイオンに由来する小さなピーク（＜５％）が観測される。
【００２８】
メチルからｎ−ブチルに渡って、分子イオンピークのモノ脱プロトン化イオンピークに対する比が減少し、これはｐＫａ２における傾向と一致する。従って、メチルについてのベースピークは、分子イオンのものであり、一方、ｎ−プロピル及びｎ−ブチルポルフィリンのベースピークは、モノ脱プロトン化イオンである。このｐＫａ２の傾向は、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル化合物のより高い親油性により弱まり、およそ同じ強度の分子イオン（１００％）とモノ脱プロトン化イオン（９８％）のピークが観測される。１つのアルキル基の喪失（Ｈ２Ｐ４＋−ａ＋／３）が全ての誘導体（メチルを除く）について認められ、及び２番目のアルキル基の喪失（Ｈ２Ｐ４＋−２ａ＋／２）は全く観測されないか、わずかに観測されるかのいずれかである。
【００２９】
ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋。    Ｍｎ（III）錯体のＥＳＭＳを、本発明者らの先の研究（３０〜５８Ｖ）３７におけるよりも低いコーン電圧（２０Ｖ）で行った。従って、より少ないフラグメンテーションが生じ、より溶媒会合し、よりイオン対を形成した種を観測することができた（表４及び裏付け資料である図Ｓ３Ａ−Ｅ）。溶媒和及びイオン対形成は、金属フリーの配位子と比較して、より明白である。より親油性であるＭｎ（III）ポルフィリンは、エレクトロスプレーイオン化源において、より容易に脱溶媒和される。本発明者らの先の観察と一致して、ＥＳＭＳもまた、これらの化合物の酸化還元特性を反映する３７，３８。Ｅ１／２が高ければ高いほど、より還元されたポルフィリンが認められた。アセトニトリルと溶媒和した、またはクロライドと結合した種が、Ｍｎ（III）及びＭｎ（II）化合物の双方について観測された。２つのクロライドは、Ｍｎ（III）ポルフィリンとのみ結合した。
【００３０】
ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチルポルフィリンのＥＳＭＳにおいて、金属（ＭｎIＰ３＋／３）か、または金属とポルフィリン環の双方（ＭｎIIＰ３＋／３）かのいずれかにおいて二重に還元された化合物に帰属するｍ／ｚ３３７及び３７５における強いシグナルを観測した。このような二重に還元されたマンガンポルフィリンは、金属を失うより高い傾向を有し、実際に、金属フリーの種についてのピークが、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチル誘導体について観察され、一方で、二重に還元され、脱金属化された種のごく少量のみが、ｎ−ブチルについて観察された。
【００３１】
ＭｎポルフィリンのＥＳＭＳ挙動は、一度アルキル鎖がブチルを超えて長くなると、対応する金属フリーの類似体について観察されるように、急激に変化する。メチル基の喪失は全く検出されなかった３７。ブチルまで鎖が長くなるに従って、Ｍｎ（III）及びＭｎ（II）ポルフィリンからのアルキル基の喪失は、より著しくなり、その後、ｎ−ヘキシル及びｎ−オクチルについてはその傾向は減少する。同様の傾向が、しかしより低い強度で、２つのアルキル基の喪失について認められた。モノ塩素化Ｍｎ（III）種のモノ塩素化Ｍｎ（II）種に対する比は、メチルからｎ−ブチルまでは減少し、その後、ｎ−オクチルまでは増加する。従って、メチル及びエチルポルフィリンのベースピークは、ＭｎIIIＰ５＋＋Ｃｌ−／４に関連し、一方、ｎ−プロピル及びｎ−ブチル誘導体については、ＭｎIIＰ４＋＋Ｃｌ−／３に関連する。さらに、ｎ−ヘキシルについては、ＭｎIIIＰ５＋＋Ｃｌ−／４及びＭｎIIＰ４＋＋Ｃｌ−／３ピークは、両方とも１００％強度であり、ジ塩素化種（ＭｎIIIＰ５＋＋２Ｃｌ−／３）は、８６％強度である。ｎ−オクチル類似体については、モノ塩素化種及びジ塩素化種は、１００％のＭｎIIIＰ５＋＋Ｃｌ−／４及び８９％のＭｎIIIＰ５＋＋２Ｃｌ−／３ピークを生じ、第３の最も強い（５９％）シグナルは、ＭｎIIＰ４＋＋Ｃｌ−／３に関する。本明細書中及び他の場合３７にも観測される金属フリーのポルフィリンとクロライドとのかなりの結合の欠如は、クロライドが金属と結合しているという見解を強く裏付ける。さらに、同様のコーン電圧において、オルトＭｎＴＭ−２−ＰｙＰ５＋のベースピークは、モノ塩素化種であり、これは、パラ異性体についてはわずか３５％であった。このことは、鎖が長ければ長いほど、２個までのクロライドイオンを保持し得る空洞がより明確に規定され、Ｍｎ（III）状態がより安定となることを示唆する。２つのクロライドを有する種が、ＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋においては殆ど認められない一方で、これはＭｎIIIＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰ５＋のＥＳＭＳの第２の主なピークである。
【００３２】
Ｏ２・−不均化の触媒作用。    親の金属フリーのポルフィリンは、Ｏ２・−不均化活性を全く示さない。マグネシウム化合物の全ては、７．７９〜７．２５のｌｏｇＫｃａｔで、Ｏ２・−不均化の強力な触媒である。表１に示されるように、ｌｏｇＫｃａｔは、メチルからｎ−ブチルまでは減少し、その後増加し、ｎ−オクチルとメチルを同等の抗酸化効力のものとしている。
【００３３】
考察
金属ポルフィリンＳＯＤミミック（mimic）を設計する際に、本発明者等は、酵素の活性部位の酸化還元特性に近づけることを目指している。スーパーオキシドジスムターゼは、＋３００Ｖ対ＮＨＥ（ｐＨ  ７．０）で、Ｈ２Ｏ２とＯ２へのＯ２・−の不均化（dismutation）（不均一化（disproportionation））を触媒する３９，４０。この電位は、Ｏ２・−の還元についての電位（＋８９０Ｖ対ＮＨＥ）４１と酸化についての電位（−１６０Ｖ対ＮＨＥ）４１との間のおおよそ中間（＋３６０ｍＶ対ＮＨＥ）であり、従って、触媒サイクルにおいて、両方の半反応について同等の推進力を与える。Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤによるＯ２・−不均化が、触媒速度定数ｋｃａｔ＝ｋｒｅｄ＝ｋｏｘ≒２×１０９Ｍ−１ｓ−１（ｌｏｇＫｃａｔ≒９．３）で起こる４２〜４４。
【００３４】
本発明者らは、種々の水溶性メソ置換ポルフィリンについて、ｌｏｇｋｃａｔと、Ｍｎ（III）／Ｍｎ（II）対の金属中心のＥ１／２との間の構造活性関係を以前に立証した（図３Ａ）２〜４。ポルフィリン環上の電子吸引性置換基は、Ｅ１／２をより正の値へシフトさせ、その結果、ｋｃａｔについてより高い値になる２〜４。Ｅ１／２の各１２０ｍＶの増加は、１０倍のｋｃａｔ増加を与え４、これは外圏型電子移動反応についてのマーカスの式（Ｍａｒｃｕｓ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）４５と一致する（図３Ａ）。マーカスの式は、触媒的不均化サイクルにおける２つの段階
【化４】
2006501163.tif 000004
の一方が律速である限り成立する。
【００３５】
構造活性関係等に基づいて、Ｍｎ（III）メソテトラキスＮ−メチル及びＮ−エチルピリジルポルフィリンのオルト異性体を試験し、Ｏ２・−不均化の強力な触媒であることが証明された。それらのｌｏｇｋｃａｔ値は、７．７９と７．７６であり、それらは、酵素自体の電位と類似する電位（＋２２０及び＋２２８Ｖ）で働く。これら２つの金属ポルフィリンは、インビボモデルの酸化ストレス障害における保護作用も示す１４〜１７。本発明者らは次に、自らの研究を、一連のＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋化合物にまで拡張した。ここでアルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、及びｎ−オクチルである（スキームI）。触媒効力を保ったままでの（表１）、これら一連の化合物に沿った親油性の著しい相違（図１Ａ）は、これら新規ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋化合物の好ましく選択的な亜細胞分布をもたらし得、従ってより広いその有用性をもたらし得る。
【００３６】
Ｅ１／２対ｐＫａ２。    本発明者らは、メチルからｎ−ヘキシルへのアルキル鎖の増加は、アルキルアミンの塩基度に対し影響を及ぼさないという事実４６に基づいて、該一連の化合物に沿ったＥ１／２の大きな変化を予想しなかった。しかしながら、本発明者らは、金属中心の酸化還元電位が、メチル化合物についての＋２２０ｍｖ（対ＮＨＥ）からｎ−オクチル化合物についての＋３６７ｍｖ（対ＮＨＥ）に変化することを発見した。このようなＥ１／２の増加は、ピリジン窒素において正電荷が次第に遮蔽されないことにより生じ得、これは、化合物の親油性が増大するので、配位したＭｎへの強い電子吸引性効果を及ぼし得る。この推論は、ＥＳＭＳデータ（表４、及び裏付け資料である図Ｓ３Ａ−Ｅ）により裏付けられ、このデータは、Ｍｎ錯体のアルキル鎖が長くなるに従って、脱溶媒和に対する感受性が、より大多数の還元されたＭｎ（II）ポルフィリンイオンを伴うことを示している。本発明者らは、主として、ｐＫａ３の減少がＥ１／２の直線的な増加を伴うように（図４、挿入）、電子効果が、金属フリーのポルフィリンのｐＫａと、対応する金属錯体のＥ１／２の間の関係を決定することを、以前に報告している４。しかしながら、化合物がますますより親油性になるに従って、溶媒和が十分でないことは、電荷の分離を嫌忌し（より高いｐＫａ２値）、一方で、正に電荷したピリジン窒素の電子吸引効果は高められる。従って、電子のｐＫａ２効果は、溶媒和／立体効果により圧倒され、結果、反転した傾向を生じる。すなわち、Ｅ１／２はｐＫａ２が増加するに従って、直線的に増加する（図４）。
【００３７】
Ｌｏｇ  Ｋｃａｔ対Ｅ１／２。    以前に確率された水溶性のＭｎ（III）ポルフィリンについての構造活性関係４に基づいて、Ｅ１／２の１４７ｍＶの増加は、Ｋｃａｔのほぼ１２倍の増加を伴うことが予想された（図３Ａ）４。Ｋｃａｔは、メチルからｎ−ブチルまでは減少し、その後、ｎ−オクチルまで同様のほぼ３の倍率で増加することを本発明者らは実際に見いだした（表１、図３Ｂ）。１つの説明は、ＥＳＭＳデータからも示されるように、マンガンポルフィリンは異なる程度で溶媒和され、これはＫｃａｔの大きさに影響するということである。Ｋｃａｔにおけるこの傾向は、Ｍｎ（III）中心上の１つの正電荷の遮蔽から生じる静電／立体効果により影響され得る。従って、金属フリーの配位子（形式上＋４）とＭｎ（III）錯体（形式上＋５）の間の親油性の大きさの差異は、アルキル鎖が長くなるに従って、より顕著ではなくなる（表１）。これら形式＋４荷電のＨ２Ｐ４＋化合物は、溶液状態で＋１．６〜＋１．８電解液として動力学的に挙動する２４。メチルからｎ−ブチルまで、ｌｏｇＫｃａｔは、ほぼ直線的に減少する（図３Ｂ，挿入）。一連のＭｎポルフィリンに沿ったＥ１／２の指数関数的な増加のために（図２Ｂ，挿入）、好ましくない静電／立体効果は、一部分は妨げられ、最終的に、増大した脱溶媒和（親油性）から生じる次第により好ましい酸化還元電位が打ち勝つ。従って、非常に親油性であるｎ−オクチル化合物は、より親油性でないメチル及びエチル誘導体と同じくらい、本質的に、強力なＳＯＤミミックである。
【００３８】
Ｒｅｇａｎ等４７は、クロライドイオンとメチル−及びｔｅｒｔ−ブチル−置換クロロアセトニトリルの反応において、立体及び溶媒和効果を切り離すことを可能にし、これらの両効果は同等の大きさであることを示した。同様に、Ｎ−アルキルピリジルポルフィリンの反応性は、電子、立体及び溶媒和効果の相互作用の結果であり、一連化合物のうちより親油性のものについては、後者が支配的である。
【００３９】
最近の発見は、Ｏ２・−不均化以外の、生物学上関連のある反応が、Ｍｎポルフィリンの金属中心において起こり得ることを示している２，３，５，７，８，４８〜５２。同様のことが、酵素活性部位についても報告されており２０，５３〜５７、従って、酵素及びそのミミックの遊離ラジカル化学及び生物学における複雑さを生じている。活性酸素種及び活性窒素種は、核酸、タンパク質、及び脂肪酸のような重要な生物学的ターゲットの直接的な損傷に関与し、このような化学種は情報伝達プロセスの変調にも関与するという証拠の量がますます増加している１４，５８，５９。従って、Ｍｎポルフィリン及び関連する化合物の作用のメカニズムを理解することは重要なことである。本研究中で観察された、静電、立体、溶媒和、及び親油性効果に基づいて、Ｎ−アルキルピリジル系列の構成要素は、その薬物動態に関してばかりでなく、活性酸素種及び活性窒素種に対するその特異性に関して、酸化ストレス障害のインビボモデルにおいて、それぞれ異なるものであると予測される。このような研究は、進行中である。
【００４０】
略語
ＳＯＤ，スーパーオキシドディスムターゼ；ＡＮ，アセトニトリル；ＤＭＦ，Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド；ＮＨＥ，標準水素電極；ＴＬＣ，薄層クロマトグラフィー；Ｈ２Ｐ４＋，全てのメソテトラキスＮ−アルキルピリジルポルフィリン配位子；ＭｎIII／IIＰ４＋／５＋，全てのＭｎ（III／II）メソテトラキスＮ−アルキルピリジルポルフィリン；メソとは、ポルフィリン中心の５、１０、１５、及び２０（メソ炭素）位における置換基を指す；ＭｎIIIＴ（アルキル）−２（３，４）−ＰｙＰ５＋，マンガン（III）メソテトラキス（Ｎ−メチル、Ｎ−エチル、Ｎ−ｎ−プロピル、Ｎ−ｎ−ブチル、Ｎ−ｎ−ヘキシル、Ｎ−ｎ−オクチル）ピリジニウム−２（３，４）−イル）ポルフィリン；アルキルは、ピリジン環上で、Ｍ，メチル；Ｅ，エチル；ｎＰｒ，ｎ−プロピル；ｎＢｕ，ｎ−ブチル；ｎＨｅｘ，ｎ−ヘキシル；ｎＯｃｔ，ｎ−オクチル；２はオルト、３はメタ、及び４はパラ異性体；ＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋は、ＡＥＯＬ−１０１１２、ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋は、ＡＥＯＬ−１０１１３；ＭｎIIIＰＴｒＭ−２−ＰｙＰ４＋，マンガン（III）５−フェニル−１０，１５，２０−トリス（Ｎ−メチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン；ＭｎIIIＢＭ−２−ＰｙＰ３＋，マンガン（III）メソビス（２−ピリジル）−ビス（Ｎ−メチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴｒＭ−２−ＰｙＰ４＋，５−（２−ピリジル）−１０，１５，２０−トリス（Ｎ−メチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴ（ＴＭＡ）５＋，マンガン（III）メソテトラキス（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウム−４−イル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴ（ＴＦＴＭＡ）Ｐ５＋，マンガン（III）メソテトラキス（２，３，５，６−テトラフルオロ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアニリニウム−４−イル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴＳＰＰ３−，マンガンメソテトラキス（４−カルボキシラトフェニル）ポルフィリン；ＭｎＴＳＰＰ３−，マンガン（III）メソテトラキス（４−スルホナトフェニル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴ（２，６−Ｃｌ２−３−ＳＯ３−Ｐ）Ｐ３−，マンガン（III）メソテトラキス（２，６−ジクロロ−３−スルホナトフェニル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴ（２，６−Ｆ２−３−ＳＯ３−Ｐ）Ｐ３−，マンガン（III）メソテトラキス（２，６−ジフロロ−３−スルホナトフェニル）ポルフィリン；ＭｎIIIＴ（２，４，６−Ｍｅ３−３，５−（ＳＯ３）２−Ｐ）Ｐ７−，マンガン（III）５，１０，１５，２０−テトラキス（２，４，６−トリメチル−３，５−ジスルホナトフェニル）ポルフィリン；ＭｎIIIｈｅｍａｔｏＰ−，マンガン（III）ヘマトポルフィリンＩＸ。
【００４１】
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56. S. I. Liochev and I. Fridovich J. Biol. Chem., 2000, 275, 38482.
57. E. D. Coulter, J. P. Emerson, D. M. Jr., Kurtz and D. E. Cabelli, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 11555.
58. B. M. Matata and M. Galinanes, J. Biol. Chem., 2002, 277, 2330.
59. (a) Z. Vujaskovic, I. Batinic-Haberle, M. S. Anscher, Z. N. Rabbani, T. V. Samulski, K. Amin, M. W. Dewhirst and Z. Haroon, Proc. of the 43rd Annual Meeting of American Society for Therapeutics in Radiation Onciology, San Francisco 2001, 88-89. (b) Z. Vujaskovic, I. Batinic-Haberle, Z. N. Rabbani, Q. -F. Feng, S. K Kang, I. Spasojevic, T. V. Samulski, I. Fridovich, M. W. Dewhirst, M. S. Anscher, Free Rad. Biol. Med. In press. 
【表１】
2006501163.tif 000005
【表２】
2006501163.tif 000006
【表３】
2006501163.tif 000007
【表４】
2006501163.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】研究した系列の最も親水性の（ＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋）、及び最も親油性の（ＭｎIIIＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰ５＋）構成要素の構造。αβαβアトロプ異性体を示す（スキーム１）
【図１Ａ】Ｈ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋化合物の親油性を示すＲｆ対ＣＨ２基の数
【図１Ｂ】ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋化合物の親油性を示すＲｆ対ＣＨ２基の数
【図２Ａ】Ｒｆの関数としての、金属フリーのポルフィリンであるＨ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋のプロトン解離定数ＰＫａ２  挿入：ＰＫａ２（図２Ａ）対ＣＨ２基の数
【図２Ｂ】Ｒｆの関数としての、ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンのＭｎ（III）／Ｍｎ（II）対についての金属中心の酸化還元電位Ｅ１／２  挿入：Ｅ１／２（図２Ｂ）対ＣＨ２基の数
【図３Ａ】ｌｏｇＫｃａｔ対Ｅ２／１で表される、Ｏ２・−のための触媒としての水溶性Ｍｎ（III）ポルフィリン（文献４）の反応性
【図３Ｂ】ｌｏｇＫｃａｔ対Ｅ２／１で表される、Ｏ２・−のための触媒としてのＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンの反応性
【図４】ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンのＭｎ（III）／Ｍｎ（II）対についてのＥ２／１に対する、対応する金属フリー配位子のＰＫａ２。挿入：水溶性Ｍｎ（III）ポルフィリンのＥ２／１対ＰＫａ３（文献４に基づくデータ）；ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋（１）、ＭｎＴＭ−２−ＰｙＰ５＋（２）、ＭｎＰＴｒＭ−２−ＰｙＰ４＋（３）、ＭｎIIIＴＭ−４−ＰｙＰ５＋（４）、ＭｎIIIＴＭ−３−ＰｙＰ５＋（５）、ＭｎIIIＴ（２，６−Ｃｌ２−３−ＳＯ３−Ｐ）Ｐ３−（６）、ＭｎIIIＴ（ＴＦＴＭＡ）Ｐ５＋（７）、ＭｎIIIＴ（αααα−２−ＭＩＮＰ）Ｐ５＋（８）、ＭｎIIIＴ（２，６−Ｃｌ２−３−ＳＯ３−Ｐ）Ｐ３−（９）、ＭｎIIIＴ（２，４，６−Ｍｅ３−３，５−（ＳＯ３）２−Ｐ）Ｐ７−（１０）、ＭｎIII（ＴＭＡ）Ｐ５＋（１１）、ＭｎＴＳＰＰ３−（１２）、ＭｎＴＣＰＰ３−（１３）、ＭｎIIIｈｅｍａｔｏＰ−（１４）
【図Ｓ１】０．１Ｖ／ｓの走査速度における、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）中の０．５ｍＭのＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋及びＭｎIIIＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンのサイクリックボルタンメトリー
【図Ｓ２】２０Ｖのコーン電圧における、１：１の水：アセトニトリル中のＨ２Ｔ（アルキル）２−ＰｙＰ４＋化合物の０．５ｍＭ溶液のエレクトロスプレー質量分析
【図Ｓ３】２０Ｖのコーン電圧における、１：１の水：アセトニトリル中のＭｎIIIＴ（アルキル）２−ＰｙＰ５＋化合物の０．５ｍＭ溶液のエレクトロスプレー質量分析
【図Ｓ４】Ｍｎポルフィリンのアルキル鎖が長くなるに従って、Ｅ１／２の好ましい増加が、好ましくない立体／静電効果に打ち勝ち、従って、メチル及びエチル化合物と同様に、ｎ−オクチルは、Ｏ２・−不均化の強力な触媒である
【図１】
2006501163.tif 000010
【図１Ａ】
2006501163.tif 000011
【図１Ｂ】
2006501163.tif 000012
【図２Ａ】
2006501163.tif 000013
【図２Ｂ】
2006501163.tif 000014
【図３Ａ】
2006501163.tif 000015
【図３Ｂ】
2006501163.tif 000016
【図４】
2006501163.tif 000017
【図Ｓ１】
2006501163.tif 000018
【図Ｓ２】
2006501163.tif 000019
【図Ｓ３】
2006501163.tif 000020
【図Ｓ４】
2006501163.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月7日(2004.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
緒言
酸化ストレス損傷の治療を目的とした、反応性酸素種及び反応性窒素種の低分子量触媒的捕捉剤が盛んに求められている。マンガン錯体の３つの主なグループが開発され、インビトロ及びインビボで試験されている；Ｍｎポルフィリン１〜９、Ｍｎ環状ポリアミン１０、及びＭｎサレン誘導体１１である。本発明者らが水溶性Ｍｎ（III）及びＦｅ（III）ポルフィリン２−４について明らかにした構造−活性相関に基づいて、Ｍｎ（III）メソテトラキス（Ｎ−メチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン（ＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋，ＡＥＯＬ−１０１１２）、及びＭｎ（III）メソテトラキス（Ｎ−エチルピリジニウム−２−イル）ポルフィリン（ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋，ＡＥＯＬ−１０１１３）が提案され、スーパーオキシドの不均化のための強力な触媒であることを示した４，１２。オルト位におけるアルキル置換は、ポルフィリン面に対するピリジル環の回転を制限する。従って、両化合物は、４つのアトロプ異性体の混合物として存在し、これら全てがＯ２・−の不均化のための、等しく強力な触媒であることが示された１３。これらＭｎポルフィリンは、ＳＯＤ欠乏大腸菌が好気性条件下で生長することも可能にし４，１２、げっ歯類モデルの脳卒中１４、糖尿病１５、鎌状赤血球症１６、及び癌／放射線１７等の酸化ストレスの保護を提供する。これら金属ポルフィリンの高形式＋５電荷は、金属ポルフィリンの組織分布、生体膜を挟んだ輸送、及び他の生体分子への結合に影響し得、これらの低親油性は金属ポルフィリンの保護的な効果を制限し得る。メタロポルフィリンの亜細胞分布を調節するという目的で、親油性を増大させた高級Ｎ−アルキルピリジルポルフィリン類似体（図１）を合成した。これらの比較動力学的及び熱力学的特性決定が、ポルフィリンベースの触媒的酸化防止剤の作用様式及び酸化ストレス障害のメカニズムへの洞察を深めるであろうと本発明者らは予測する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
結果
薄層クロマトグラフィー。    アルキル鎖の長さの増加は、保持ファクタＲｆ（ポルフィリンパス／溶媒パス）（表１、図２）の増加により示されるように、化合物の親油性の増大を伴う。Ｍｎ（III）錯体についてより短い鎖の場合に観察された明らかなずれ（図２Ｂ）は、おそらく、それらのより高い総形式電荷（Ｍｎ（III）錯体については＋５、配位子については＋４）によるものである。鎖が長くなるに従って、全体的な親油性に対するそれらの寄与は増大し、最終的に、メチル類似体と比較して、ｎ−オクチルポルフィリン及びそのＭｎ（III）錯体は、より等しいＲｆにある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
Ｎ−アルキルピリジル系列についてのｐＫａ２値を表１に与える。アルキル鎖が長くなるに従って、ポルフィリンはより水和されにくくなり、電荷の分離（式［１］）はより有利ではなく、すなわち、ｐＫａ２が増加する（図３挿入）。図２Ａは、ｐＫａ２とＲｆ間の直線関係を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
電気化学。    Ｍｎ（III）のサイクリックボルタンメトリーは、Ｍｎ（III）／Ｍｎ（II）酸化還元対に起因するものとした可逆的なボルタモグラムを示す。金属中心の酸化還元電位Ｅ１／２は、表１に示されており、ＭｎIII／IIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋／４＋、及びＭｎIII／IIＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰ５＋／４＋化合物の代表的なボルタモグラムが、裏付け資料である図６に示されている。親油性（図２Ｂ）とＥ２／１（図３Ｂ，挿入）の双方が、アルキル鎖におけるＣＨ２基の数と伴に、指数関数的に増加する。従って、Ｅ１／２の増加は、Ｒｆの一次関数である（図３Ｂ）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
Ｈ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋。    ２０Ｖの低いコーン電圧において得られる金属フリーのポルフィリンのＥＳＭＳは、Ｈ２Ｐ４＋／４、及び（または）そのモノ脱プロトン化類似体であるＨ２Ｐ４＋−Ｈ＋／３（表３及び図７）に帰属する主要分子イオンを示した。無視し得る二重脱プロトン（Ｈ２Ｐ４＋−２Ｈ＋／２）が認められた。Ｈ２ＴＭ−２−ＰｙＰ４＋のみが、高い強度のＨ２Ｐ４＋＋Ｈ＋／５ピークを生じた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋。    Ｍｎ（III）錯体のＥＳＭＳを、本発明者らの先の研究（３０〜５８Ｖ）３７におけるよりも低いコーン電圧（２０Ｖ）で行った。従って、より少ないフラグメンテーションが生じ、より溶媒会合し、よりイオン対を形成した種を観測することができた（表４及び図８）。溶媒和及びイオン対形成は、金属フリーの配位子と比較して、より明白である。より親油性であるＭｎ（III）ポルフィリンは、エレクトロスプレーイオン化源において、より容易に脱溶媒和される。本発明者らの先の観察と一致して、ＥＳＭＳもまた、これらの化合物の酸化還元特性を反映する３７，３８。Ｅ１／２が高ければ高いほど、より還元されたポルフィリンが認められた。アセトニトリルと溶媒和した、またはクロライドと結合した種が、Ｍｎ（III）及びＭｎ（II）化合物の双方について観測された。２つのクロライドは、Ｍｎ（III）ポルフィリンとのみ結合した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明者らは、種々の水溶性メソ置換ポルフィリンについて、ｌｏｇｋｃａｔと、Ｍｎ（III）／Ｍｎ（II）対の金属中心のＥ１／２との間の構造活性関係を以前に立証した（図４Ａ）２〜４。ポルフィリン環上の電子吸引性置換基は、Ｅ１／２をより正の値へシフトさせ、その結果、ｋｃａｔについてより高い値になる２〜４。Ｅ１／２の各１２０ｍＶの増加は、１０倍のｋｃａｔ増加を与え４、これは外圏型電子移動反応についてのマーカスの式（Ｍａｒｃｕｓ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）４５と一致する（図４Ａ）。マーカスの式は、触媒的不均化サイクルにおける２つの段階
【化４】
2006501163.tif 000022
の一方が律速である限り成立する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
構造活性関係等に基づいて、Ｍｎ（III）メソテトラキスＮ−メチル及びＮ−エチルピリジルポルフィリンのオルト異性体を試験し、Ｏ２・−不均化の強力な触媒であることが証明された。それらのｌｏｇｋｃａｔ値は、７．７９と７．７６であり、それらは、酵素自体の電位と類似する電位（＋２２０及び＋２２８Ｖ）で働く。これら２つの金属ポルフィリンは、インビボモデルの酸化ストレス障害における保護作用も示す１４〜１７。本発明者らは次に、自らの研究を、一連のＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋化合物にまで拡張した。ここでアルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ヘキシル、及びｎ−オクチルである（図１）。触媒効力を保ったままでの（表１）、これら一連の化合物に沿った親油性の著しい相違（図２Ａ）は、これら新規ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋化合物の好ましく選択的な亜細胞分布をもたらし得、従ってより広いその有用性をもたらし得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
Ｅ１／２対ｐＫａ２。    本発明者らは、メチルからｎ−ヘキシルへのアルキル鎖の増加は、アルキルアミンの塩基度に対し影響を及ぼさないという事実４６に基づいて、該一連の化合物に沿ったＥ１／２の大きな変化を予想しなかった。しかしながら、本発明者らは、金属中心の酸化還元電位が、メチル化合物についての＋２２０ｍｖ（対ＮＨＥ）からｎ−オクチル化合物についての＋３６７ｍｖ（対ＮＨＥ）に変化することを発見した。このようなＥ１／２の増加は、ピリジン窒素において正電荷が次第に遮蔽されないことにより生じ得、これは、化合物の親油性が増大するので、配位したＭｎへの強い電子吸引性効果を及ぼし得る。この推論は、ＥＳＭＳデータ（表４、及び図８）により裏付けられ、このデータは、Ｍｎ錯体のアルキル鎖が長くなるに従って、脱溶媒和に対する感受性が、より大多数の還元されたＭｎ（II）ポルフィリンイオンを伴うことを示している。本発明者らは、主として、ｐＫａ３の減少がＥ１／２の直線的な増加を伴うように（図５、挿入）、電子効果が、金属フリーのポルフィリンのｐＫａと、対応する金属錯体のＥ１／２の間の関係を決定することを、以前に報告している４。しかしながら、化合物がますますより親油性になるに従って、溶媒和が十分でないことは、電荷の分離を嫌忌し（より高いｐＫａ２値）、一方で、正に電荷したピリジン窒素の電子吸引効果は高められる。従って、電子のｐＫａ２効果は、溶媒和／立体効果により圧倒され、結果、反転した傾向を生じる。すなわち、Ｅ１／２はｐＫａ２が増加するに従って、直線的に増加する（図５）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
Ｌｏｇ  Ｋｃａｔ対Ｅ１／２。    以前に確率された水溶性のＭｎ（III）ポルフィリンについての構造活性関係４に基づいて、Ｅ１／２の１４７ｍＶの増加は、Ｋｃａｔのほぼ１２倍の増加を伴うことが予想された（図４Ａ）４。Ｋｃａｔは、メチルからｎ−ブチルまでは減少し、その後、ｎ−オクチルまで同様のほぼ３の倍率で増加することを本発明者らは実際に見いだした（表１、図４Ｂ）。１つの説明は、ＥＳＭＳデータからも示されるように、マンガンポルフィリンは異なる程度で溶媒和され、これはＫｃａｔの大きさに影響するということである。Ｋｃａｔにおけるこの傾向は、Ｍｎ（III）中心上の１つの正電荷の遮蔽から生じる静電／立体効果により影響され得る。従って、金属フリーの配位子（形式上＋４）とＭｎ（III）錯体（形式上＋５）の間の親油性の大きさの差異は、アルキル鎖が長くなるに従って、より顕著ではなくなる（表１）。これら形式＋４荷電のＨ２Ｐ４＋化合物は、溶液状態で＋１．６〜＋１．８電解液として動力学的に挙動する２４。メチルからｎ−ブチルまで、ｌｏｇＫｃａｔは、ほぼ直線的に減少する（図４Ｂ，挿入）。一連のＭｎポルフィリンに沿ったＥ１／２の指数関数的な増加のために（図３Ｂ，挿入）、好ましくない静電／立体効果は、一部分は妨げられ、最終的に、増大した脱溶媒和（親油性）から生じる次第により好ましい酸化還元電位が打ち勝つ。従って、非常に親油性であるｎ−オクチル化合物は、より親油性でないメチル及びエチル誘導体と同じくらい、本質的に、強力なＳＯＤミミックである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】  研究した系列の最も親水性の（ＭｎIIIＴＭ−２−ＰｙＰ５＋）、及び最も親油性の（ＭｎIIIＴｎＯｃｔ−２−ＰｙＰ５＋）構成要素の構造。αβαβアトロプ異性体を示す（スキーム１）
【図２Ａ】Ｈ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋化合物の親油性を示すＲｆ対ＣＨ２基の数
【図２Ｂ】ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋化合物の親油性を示すＲｆ対ＣＨ２基の数
【図３Ａ】Ｒｆの関数としての、金属フリーのポルフィリンであるＨ２Ｔ（アルキル）−２−ＰｙＰ４＋のプロトン解離定数ＰＫａ２  挿入：ＰＫａ２対ＣＨ２基の数
【図３Ｂ】Ｒｆの関数としての、ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンのＭｎ（III）／Ｍｎ（II）対についての金属中心の酸化還元電位Ｅ１／２  挿入：Ｅ１／２対ＣＨ２基の数
【図４Ａ】ｌｏｇＫｃａｔ対Ｅ２／１で表される、Ｏ２・−のための触媒としての水溶性Ｍｎ（III）ポルフィリン（文献４）の反応性
【図４Ｂ】ｌｏｇＫｃａｔ対Ｅ２／１で表される、Ｏ２・−のための触媒としてのＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンの反応性
【図５】ＭｎIIIＴ（アルキル）−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンのＭｎ（III）／Ｍｎ（II）対についてのＥ２／１に対する、対応する金属フリー配位子のＰＫａ２。挿入：水溶性Ｍｎ（III）ポルフィリンのＥ２／１対ＰＫａ３（文献４に基づくデータ）；ＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋（１）、ＭｎＴＭ−２−ＰｙＰ５＋（２）、ＭｎＰＴｒＭ−２−ＰｙＰ４＋（３）、ＭｎIIIＴＭ−４−ＰｙＰ５＋（４）、ＭｎIIIＴＭ−３−ＰｙＰ５＋（５）、ＭｎIIIＴ（２，６−Ｃｌ２−３−ＳＯ３−Ｐ）Ｐ３−（６）、ＭｎIIIＴ（ＴＦＴＭＡ）Ｐ５＋（７）、ＭｎIIIＴ（αααα−２−ＭＩＮＰ）Ｐ５＋（８）、ＭｎIIIＴ（２，６−Ｃｌ２−３−ＳＯ３−Ｐ）Ｐ３−（９）、ＭｎIIIＴ（２，４，６−Ｍｅ３−３，５−（ＳＯ３）２−Ｐ）Ｐ７−（１０）、ＭｎIII（ＴＭＡ）Ｐ５＋（１１）、ＭｎＴＳＰＰ３−（１２）、ＭｎＴＣＰＰ３−（１３）、ＭｎIIIｈｅｍａｔｏＰ−（１４）
【図６】０．１Ｖ／ｓの走査速度における、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）中の０．５ｍＭのＭｎIIIＴＥ−２−ＰｙＰ５＋及びＭｎIIIＴｎＨｅｘ−２−ＰｙＰ５＋ポルフィリンのサイクリックボルタンメトリー
【図７】２０Ｖのコーン電圧における、１：１の水：アセトニトリル中のＨ２Ｔ（アルキル）２−ＰｙＰ４＋化合物の０．５ｍＭ溶液のエレクトロスプレー質量分析
【図８】２０Ｖのコーン電圧における、１：１の水：アセトニトリル中のＭｎIIIＴ（アルキル）２−ＰｙＰ５＋化合物の０．５ｍＭ溶液のエレクトロスプレー質量分析
【図９】Ｍｎポルフィリンのアルキル鎖が長くなるに従って、Ｅ１／２の好ましい増加が、好ましくない立体／静電効果に打ち勝ち、従って、メチル及びエチル化合物と同様に、ｎ−オクチルは、Ｏ２・−不均化の強力な触媒である
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2006501163.tif 000023
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ａ】
2006501163.tif 000024
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｂ】
2006501163.tif 000025
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ａ】
2006501163.tif 000026
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｂ】
2006501163.tif 000027
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ａ】
2006501163.tif 000028
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４Ｂ】
2006501163.tif 000029
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2006501163.tif 000030
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2006501163.tif 000031
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2006501163.tif 000032
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2006501163.tif 000033
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2006501163.tif 000034
【国際調査報告】
2006501163.tif 000035