(57)【要約】本発明は、癌組織中のチミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失に基づいて、化学療法計画への応答を予測する方法を対象とする。この方法は、チミジレートシンターゼについての患者の正常組織の遺伝子型を決定し；チミジレートシンターゼについての前記患者の腫瘍組織の遺伝子型を決定し；上記正常組織の遺伝子型と上記腫瘍組織の遺伝子型を比較し；上記比較に基づいて、チミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失がおこったか否かを決定し；そして、上記腫瘍サンプル中のヘテロ接合性の喪失に基づいて、上記化学療法計画への応答を予測すること；を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌組織中のチミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失に基づいて、化学療法計画への応答を予測する方法であって、以下のステップ：
（ａ）チミジレートシンターゼについての患者の正常組織の遺伝子型を決定し；
（ｂ）チミジレートシンターゼについての前記患者の腫瘍組織の遺伝子型を決定し；
（ｃ）上記正常組織の遺伝子型と上記腫瘍組織の遺伝子型を比較し；
（ｄ）上記ステップ（ｃ）の比較に基づいて、チミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失が発生したか否かを決定し；そして、
（ｅ）上記腫瘍サンプル中のヘテロ接合性の喪失に基づいて、上記化学療法計画への応答を予測すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
上記腫瘍組織がホルマリン固定され、パラフィン包埋されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ホルマリン固定され、パラフィン包埋された（ＦＰＥ）腫瘍組織をレーザーキャプチャーマイクロダイセクションに供するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記腫瘍組織中のＴＳ遺伝子発現レベルを測定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに以下のステップ：
（ｉ）上記化学療法計画に応答した腫瘍を有する、応答者である患者の腫瘍細胞におけるＴＳ遺伝子発現のレベルを決定し；
（ｉｉ）上記化学療法計画に応答を示さなかった腫瘍を有する、非応答者である患者の腫瘍細胞におけるＴＳ遺伝子発現のレベルを決定し；
（ｉｉｉ）前記患者の腫瘍組織中におけるＴＳ遺伝子発現のレベルを、応答者のＴＳ遺伝子発現レベル及び非応答者のＴＳ遺伝子発現レベルと比較し；そして
（ｉｖ）上記ステップ（ｉｉｉ）の比較に基づいて、上記化学療法計画への応答を予測すること；
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、上記正常組織の遺伝子型が２Ｒ／３Ｒであり、上記腫瘍組織の遺伝子型が２Ｒ／欠失であり、そしてここで、上記化学療法計画への応答が、２Ｒ／２Ｒの癌又は正常組織遺伝子型を有する患者における同じ化学療法計画への応答に類似すると予測される、前記方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、上記正常組織の遺伝子型が２Ｒ／３Ｒであり、上記腫瘍組織の遺伝子型が３Ｒ／欠失であり、そしてここで、上記化学療法計画への応答が、３Ｒ／３Ｒの癌又は正常組織遺伝子型を有する患者における同じ化学療法計画への応答に類似すると予測される、前記方法。
【請求項８】
上記化学療法計画がＴＳ阻害剤の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記化学療法計画が、５’−ＦＵ、FUdR、UFT、S-1、カペシタビン、ラチトレキセド、ペメトレキセド、又はノラトレキセド、或いはそれらの組み合わせの投与を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記化学療法計画が、５’−ＦＵ、FUdR、UFT、S-1、カペシタビン、ラチトレキセド、ペメトレキセド、又はノラトレキセドの投与とシスプラチン、オキサリプラチン、タキサン又は放射線照射との併用を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記患者の正常組織の遺伝子型を該患者と同じ正常組織の遺伝子型を有する他の個人と比較することを含み；ここで、
（ｉ）化学療法計画で治療された前記他の個人における薬物毒性レベルを計算し；そして、
（ｉｉ）前記患者の同じ化学療法計画への応答を予測するために、前記薬物毒性レベルと前記患者を相関させること；
を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
チミジレートシンターゼ（TS）は、２’−デオキシウリジレート５,１０−メチレンテトラヒドロ葉酸を還元メチル化して２’−チミジレート及びジヒドロ葉酸を形成することを触媒する。TSはチミン塩基の唯一のde novo供給源であり、そしてその反応がDNA合成における律速段階の一つであるため、TSの阻害は癌化学療法における実りの多いアプローチであった（Danenberg,P.V., Biochim. Biophys. Acta, 473: 73-92, 1977）。TSは、約５０年にわたって多くの癌を治療するための大黒柱である薬の一つであった５−フルオロウラシル（５−FU）の標的酵素である。５−FUは、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸、TS及び５−FUの活性代謝物である５−フルオロ−２’デオキシウリジレートの間で安定な三元複合体を形成することによるTS阻害を通して細胞毒性をあらわす。５−FUの出現以来、FUdR、UFT、S-1及びカペシタビンのような他のフルオロピリミジンに基づく治療剤並びにラチトレキセド（ratitrexed）、ペメトレキセド（pemetrexed）及びノラトレキセド（nolatrexed）などの葉酸ベースのTS阻害剤が開発された。In vitroの研究は、TS発現をアップレギュレーションし、そして細胞内TSレベルを上げることによって、細胞がTS阻害剤に対して耐性となることを示し（Wang, W. et al., Cancer Res., 61:55055510, 2001）、腫瘍中のTS量からTSを標的とする治療法への応答を予測可能であるかもしれないという期待に導いた。実際、最近の研究は、TS発現が腫瘍の間でもかなり異なり、多様な腫瘍の５−FUに基づく化学療法への感受性がTSの腫瘍内レベルと相関することを示した（Huang, C.L., et al., Int. J. Oncol., 17: 47-54, 2000; Nishimura, R., et al., Anticancer Res., 19: 5621-5626, 1999; Salonga, D., et al., Clin. Cancer Res., 6: 1322-1327, 2000; Shirota, Y., et al., J. Clin. Oncol., 19: 4298-4304, 2001; Yeh, K.H., et al., Cancer, 82: 1626-1631, 1998）。さらに、腫瘍内での高いTSレベルも予後の悪化と関連することも示された（Kralovanszky, J et al., Oncology 62: 167174, 2002; Nakagawa, T., et al., Lung Cancer, 35: 165-70, 2002）。
【０００２】
TS発現がin vivoで制御されるメカニズムは未だ明らかに定義されていない。しかしながら、TSプロモーター中に発生する多形が１つの制御因子を構成するかも知れないと示唆された。TS遺伝子は、５’−非翻訳領域（５’−UTR）中のタンデムに反復する独特の２８塩基対の配列を有し、この反復数が多形性であることが知られている（Horie, N., et al., Cell Struct. Funct., 20: 191-197, 1995）。いくつかの場合にはより高次な反復が見出されるが、ほとんどの個人は、２つのタンデム反復（２R/2R）、３つの反復（３R/3R）又はへテロ接合性（２R/3R）の遺伝子型のいずれかを有する（Marsh, S., et al., Genomics, 58: 310-312, 1999）。TSエンハンサー領域（TSER）の多形は、ヒトの胃腸の癌におけるTSタンパク質の発現の部分的な決定因子であり（Kawakami, K., et al., Anticancer Res., 19: 3249-3252, 1999）、この出典は参考文献としてそっくりそのまま本明細書中に援用されている。
【０００３】
３R/3R遺伝子型を有する癌組織は、２R/3R遺伝子型を有するものよりも顕著に高いTSタンパク質の発現を示し、これはin vitroの実験において確認されており（Kawakami, K., et al., Clin. Cancer Res., 7: 4096-4101, 2001）、この出典は参考文献としてそっくりそのまま本明細書中に援用されている。TS遺伝子型とTS発現のこの関係は、５−FUに基づく化学療法におけるTS発現の役割とともに、タンデム反復数に関するTS遺伝子型から５−FUに基づく化学療法が少なくとも部分的に予測できるものであると示唆する。実際に、いくつかの最近の臨床における相関研究は、このTSERのTS遺伝子型が５−FUに基づく治療法で治療された結腸直腸癌患者の応答及び生存と関連しているという予備的な証拠を得た（Iacopetta, B., et al., Br. J. Cancer, 85: 827-830, 2001; Marsh, S., et al., Int. J. Oncol., 19: 383-386, 2001; Pullarkat, S. et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001; Villafranca, E., et al., J. Clin. Oncol., 19: 1779-1786, 2001）。
【０００４】
TSER中の可変数の２８塩基対のタンデム反復配列の存在は、最近かなりの関心を引いた。なぜなら、これは、５−FUに基づく治療法で治療された患者の臨床成績をある程度予測することのできる、ｐ５３突然変異以外の唯一の遺伝子の傷害だからである。これまで行われたすべての研究は、５−FUで治療された患者において、２R/２R遺伝子型を有することが３R/３R遺伝子型よりも大きな臨床的利益と一貫して関連していた、ということで一致している（Iacopetta, B., et al., Br. J. Cancer, 85: 827-830, 2001; Pullarkat, S. T. et al., Pharmacogenomics J. 1, 65-70, 2001; Villafranca, E., et al., J.Clin. Oncol., 19: 1779-1786, 2001; Etienne MC, et al., J. Clin. Oncol. 20: 2832-43, 2002）。腫瘍応答の決定因子であるかもしれないTS多形の発見は、重要な関心事であり、それは、容易に利用可能な（末梢血液細胞などの）正常組織の分析によって腫瘍応答の予測が実施可能である可能性があるためである。この期待は、正常組織における遺伝型が癌組織中のものと同一であるという仮定に基づく。しかしながら、最近得られた証拠は、TS遺伝子型の場合にはこの仮定が必ずしも常に真実でないことを示している。癌組織中のTS遺伝子座において、LOHが高い出現率で観察され、これは正常組織においてヘテロ接合性である場合に、腫瘍中でのTS遺伝子型の変更に導くものである（Kawakami K., et al., Jpn J Cancer Res. 93: 1221-1228, 2002; Zinzindohoue F, et al., J. Clin. Oncol. 19: 3442, 2001）。すなわち、その正常組織中にヘテロ接合性の２R/3R遺伝子型を有する個人におけるLOHの出現は、２R/損失又は３R/損失TSER遺伝子型のいずれかを有する腫瘍を生じさせるであろう。したがって、ヘテロ接合性である患者及びその腫瘍組織中のTS遺伝子座においてLOHを有する患者は、LOH事象の間にどちらの対立遺伝子が除去されるかによって、かなり異なる化学療法からの結果を経験するかもしれない。
【０００５】
したがって、治療の前に、多様な化学療法への応答を予測する方法が依然として必要とされている。正確な予測は、所望の化学療法計画を進めるか又は他の化学療法計画を試みるかの医師の決定を可能とするであろう。ほとんどの化学療法は有害な副作用をごく普通に有するため、不要又は不成功な治療を排除するために、化学療法剤への腫瘍の応答を予測できることが望ましい。さらに、医師が治療への応答を予測可能である場合には、失敗しそうな治療に時間が浪費されることはなく、そしてその代わりに医師がより有望な治療に注目することが可能であろう。治療への応答を予測する方法は、単純な試行錯誤のアプローチよりも治療法を選択するためのガイドラインを医師に提供するであろう。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約
本発明は、癌組織中のチミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ相同性の喪失に基づいて化学療法への応答を予測する方法を対象とする。この方法は、チミジレートシンターゼに関する患者の正常組織の遺伝子型を決定し；チミジレートシンターゼに関する上記患者の腫瘍組織の遺伝子型を決定し；正常組織の遺伝子型と腫瘍組織の遺伝子型を比較し；遺伝子型の比較に基づいて、チミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失が腫瘍組織において発生しているか否かを決定し；そして腫瘍サンプルにおけるヘテロ接合性の喪失に基づいて化学療法計画への応答を予測することを含む。
【０００７】
本発明はまた、患者の化学療法計画への応答を（薬物毒性応答と同様）予測することを助けるために、正常組織の遺伝子型を利用することも考慮する。
【０００８】
応答の予測を支援するために、本発明は、正常組織及び癌組織両方の遺伝子型、治療される癌、与えられる化学療法計画、患者の応答、すなわち、腫瘍サイズの減少、それがある場合には腫瘍の成長、転移の増加、患者の生存、化学療法剤の用量、毒性データ、患者の寿命など、を含むがこれらに限られない患者のデータに関するデータベースなどの患者のデータを蓄積することを考慮する。データベースは、患者の因子を（正常組織及び癌組織の遺伝子型、化学療法計画、及び治療成績などの）以前の患者の類似の因子と比較することを可能とすることによって、患者の応答を予測することを支援するであろう。
【０００９】
応答の予測並びにデータベースの作成の両方において、組織の遺伝子型を決定するために新鮮な又は保存された組織が使用されることができる。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、癌組織中のチミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失に基づく化学療法計画への応答を予測する方法を提供する。TS遺伝子は、１８番染色体の短いアームのテロメア領域、染色体バンド18p11.32に局在化されており（Hori, T., et al., Human Genetics, 85(6):576-80,1990）、これは、高いパーセンテージの結腸直腸癌において欠失することが知られているゲノムの領域である（Vogelstein B. et al., Science, 244:207-211, 1989）。これらの欠失事象のおもな標的の一つは、周知の腫瘍抑制遺伝子DCC（deleted-in-colorectal cancer）であることができる（Klingelhutz AJ et al., Oncogene 10: 1581-1586, 1995）。１８番染色体欠失の標的遺伝子の近傍にあることによって、TS遺伝子はいくつかの場合において欠失されたDNA部分内に含まれることができる。実際、発明者らは、先の研究において、２R/３Rの個人からのTS遺伝子型のゲル電気泳動による分析が、ヘテロ接合性の喪失（LOH）によってヘテロ接合性の２R/３R遺伝子型が、２R/欠失又は３R/欠失の遺伝子型のいずれかに変換することにより、腫瘍組織サンプルと正常組織との２R及び３Rのバンドの比率が異なること（すなわち、対立遺伝子のアンバランス）を示した場合、ヘテロ接合性の喪失（LOH）が腫瘍DNA中のTS遺伝子座においてしばしば発生することを確認している（Kawakami K, et al., Jpn J Cancer Res., 93:1221-1228, 2002）。（参考文献としてそっくりそのまま本明細書中に援用されている）この先の研究（同上）において、観察されたLOHの頻度はTSプロモーターについてヘテロ接合性である患者の６２％（５０中の３１）であり、これは結腸直腸癌（CRC）患者群においてZinzindohueらにより報告されたもの（19/30；６３％）（Zinzincohoud F, et al., J. Clin. Oncol., 19:3442,2001）とほとんど同じであった。本研究の患者の組において観察されたLOH頻度はさらに高く（７７％）、これは、可能な限り間質組織を含まない腫瘍細胞の区域を単離するために、すべての検体にレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）法を使用したことによる。腫瘍組織を精製するためのこの技術によって、図２に示すように、いずれかのTS対立遺伝子の欠失がかなり明瞭に観察可能であり、したがって、TS遺伝子座におけるLOHの存在又は不存在を明確に示すことが可能である。
【００１１】
本発明は、TS遺伝子座が癌組織において比較的頻繁なLOHヘテロ接合性の喪失を有し、正常組織においてヘテロ接合性である場合にはこれが腫瘍中でTS遺伝子型の変更に導くという所見に部分的に基づく。すなわち、その正常組織においてヘテロ接合性の２R/3R遺伝子型を有する個人におけるLOHは、LOH事象の間にどちらの対立遺伝子が除去されるかによって、２R/欠失又は３R/欠失遺伝子型のいずれかを有する腫瘍を生じさせる。したがって、３R対立遺伝子が失われる場合、腫瘍は２R/欠失遺伝子型を有する。もし、２R対立遺伝子が失われると、腫瘍は３R/欠失遺伝子型を有する。
【００１２】
本発明は、ヘテロ接合性の２R/3Rの腫瘍中のTS遺伝子座におけるLOHがあり、２R/欠失又は３R/欠失遺伝子型のいずれかを生じる場合には、腫瘍は２R/２R及び３R/３R腫瘍の化学受容性の特徴をそれぞれ獲得するという発見に部分的に基づく。この研究の顕著な発見は、腫瘍遺伝子型が治療の成績を決定し：腫瘍中に２R/欠失遺伝子型を有する２R/３Rの患者が、２R遺伝子型のみを有する患者と同様に生存するが、２R/欠失遺伝子型を有する患者が３R/欠失遺伝子型の患者よりも衝撃的に良い治療結果を応答率（８０％対１４％）と生存（３３３日対２０３日）の両方において得たということである。これらの結果は、腫瘍組織中のTSER多形状態と（限定的ではないが、５−FU、FUdR、UFT、S-1及びカペシタビンなどの）TS阻害剤に基づく治療法への応答の間の直接的な関連を示唆する。データはさらに、２Rが正の効果を有するのに対して、３回のTSER反復（３R）が腫瘍の応答に直接的な負の効果を有することを表している。図２に示すように、腫瘍２R/３R遺伝子型を有する患者の生存期間は３Rのみの患者と同様に短いが、LOHの間に３R対立遺伝子が失われる場合には、得られた２R/欠失腫瘍は高い応答率及び長い生存期間を有する。
【００１３】
TSERの多形性の反復が腫瘍応答に影響するメカニズムは、未だ明らかでない。2回の反復を有するTS遺伝子に連結したレポーター遺伝子の発現活性は、３回の反復を有する遺伝子の場合よりも低いというHorieらの観察（Cell Struct. Funct., 20:191-197,1995）は、TSER多形は、TS遺伝子の発現を制御することによって腫瘍の５−FUへの感受性に影響することを示唆している。この仮説は、結腸直腸癌患者におけるTSER−依存性のTS遺伝子発現の顕著な相違（約３．６倍）を報告し、この相違は２R/２R遺伝子型に比べた３R/３R癌患者の低い応答率によるものであると示唆したPullarkatら（Pullarkat, S.T.et al., Pharmacogenomics J., 1、65-70、2001）によって確認されたとみられる。しかしながら、他のデータを考慮すると、TSER多形の数とTS遺伝子発現の間の関連は、簡単なものではないように見える。例えば、１３０の結腸直腸癌検体を分析したが、２R/２R及び３R/３R遺伝子型の間にTS遺伝子発現の顕著な相違は見出されなかった。代わりに、３R/３R腫瘍は顕著に高いTSタンパクレベルを有し（Pullarkat, S.T., et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001）、これは３R/3R患者におけるより低い応答率の原因でもあるだろう。この発見は、３Rプロモーターが翻訳活性の増大を引き起こすことを示すin vitroの実験（上述）によって実際に支持されたとおり、TSタンパク質をｍRNAから作り出す翻訳活性がTSER多形により影響されることを示唆した。Etienneらは、５−FU／フォルニック酸で治療された１０３のCRC腫瘍を分析し、２R/３R腫瘍が２R/2R又は３R/3R腫瘍よりも高いTS酵素活性、並びに最も短い患者の生存を有するという興味深い発見をした。
【００１４】
本発明にいたる研究において、３R遺伝子型のみを有する腫瘍（３R/3R＋３R/欠失）は、２R遺伝子型のみを有するものよりも高い平均TS遺伝子発現を示した（１．５倍以下）。３R/欠失遺伝子型が同様の量だけ２R/欠失遺伝子型よりも高い発現を有するという発見（表６）は、３RがTS遺伝子発現のたとえわずかであっても直接的なアップレギュレーションをおこなうことを示唆している。しかしながら、２Rのみ又は３R遺伝子型のみを有する腫瘍間の平均TS遺伝子発現量の相違は、S-1治療へのむしろ衝撃的な応答の違いを説明するには不十分であると思われ、TS制御以外の（又はさらなる）メカニズムが関与するかもしれないことを示唆している。
【００１５】
例えば、いくつかの最近の研究は、TSER反復が葉酸代謝のレベルを制御しており、これが患者への薬物毒性及び葉酸を利用する酵素と相互作用する薬物の抗腫瘍活性に影響することを示唆する。葉酸及びホモシステインの顕著に低い血漿レベルが、３R/3R遺伝子型の個人において見出された（Trinh, B.N., et al., Hum. Genet., 111:299-302, 2002）。この知見は、３R/3R患者によって経験された５−FU治療の低毒性を説明することができる（Pullarkat, S.T. et al., Pharmacogenomics J., 1, 65-70, 2001）。なぜなら、血漿ホモシステインレベルの上昇は、薬物毒性の高いリスクと関連することが見出されているからである（Niyikiza, C., et al., Molecular Cancer Therapeutics, 1:545-52, 2002）。TSER反復の状態は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であり、また、葉酸レベルの影響を受けることもできるメトトレキセートへの成人急性リンパ芽球性白血病（ALL）の応答と結びついていた（Krajinovic, M., et al., Lancet, 359:1033-1034, 2002）。TSER多形、葉酸の取り込み及び結腸直腸癌のリスクの間の関連（Ulrich, C.M. et al., Cancer Res., 62:3361-3364, 2002）、並びに成人ALLのリスクの増大のリスク全体が注目された（Skibola, C.F. et al., Blood, 99:3786-91, 2002）。
【００１６】
したがって、本発明は、高いパーセンテージの癌患者が腫瘍中TS遺伝子座におけるLOHを経験し、２R/3R正常組織遺伝子型を有する人は、異なる腫瘍TS遺伝子型を有する2つの群に別れ、その一つ（２R/欠失の患者）に属する人は他方（３R/欠失の患者）よりもかなり良好な臨床成績をフルオロピリミジン治療から期待することができる、という発見に部分的に基づく。特別な個人が２R/欠失又は３R/欠失腫瘍を獲得するか否かは、最後にどちらになるかという等しい確率の問題である。したがって、腫瘍組織におけるTS遺伝子型の分析は、TS遺伝子発現の測定とともに、TSを目標とする治療計画による化学療法のよい候補と考えられるべきである患者及びその応答の可能性の低さにより他のタイプの治療法の候補と考えられるべき患者を同定する助けとなることができる。
【００１７】
したがって、本発明は、応答の予測及び治療法の選択のための手段としてのこれらのTS遺伝子多形の使用に関する。したがって、腫瘍中におけるTS多形の状態を確認するためには、正常組織のみの分析では不十分であり、腫瘍組織も分析されなければならないことは明らかである。さらに、本発明は、正常組織の遺伝子型が化学療法計画への応答の予想、特に薬物毒性のレベルの予想への洞察も提供するものであるため、正常組織の遺伝子型を分析することをも考慮する。
【００１８】
したがって、化学療法への応答を予測することにおいて、腫瘍組織の遺伝子型は、腫瘍が化学療法計画に応答しそうか否かを予測することに関係する。さらに、非腫瘍組織の遺伝子型は、薬物毒性をあらわすリスクを予測することに関係する。したがって、両方の組織の遺伝子型に関する知識は、腫瘍との戦いにおけるより大きな成功のチャンスを有する一方、薬物毒性のリスクも減らすであろう好適な化学療法計画を医師が開発することを支援する。
【００１９】
したがって、本発明の１つの側面は、癌組織中のチミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失に基づく化学療法計画への応答を予測する方法を提供する。この方法は、正常組織及び癌性組織中の患者のチミジレートシンターゼ遺伝子型を決定することを含む。チミジレートシンターゼ遺伝子座におけるヘテロ接合性の喪失が腫瘍組織において起こったか否かを決定するために、該２つの遺伝子型が比較される。腫瘍サンプル中でのヘテロ接合性の喪失に基づいて、化学療法計画への応答が予測可能である。上記のように、腫瘍サンプル中に２R/欠失遺伝子型を有する患者は、２R/2R腫瘍サンプル遺伝子型を有する患者と類似した応答を化学療法計画に対して有するらしい。例えば、２R/2R腫瘍サンプルを有する患者が化学療法計画に正の応答をした場合、２R/欠失腫瘍遺伝子型を有する患者も同じ化学療法計画に正の応答をすることが予測可能である。同様に、３R/3R腫瘍サンプルを有する患者が化学療法計画に負の応答をするか又は応答しない場合、３R/欠失腫瘍遺伝子型を有する患者もまた、同じ化学療法計画に負の応答をするか又は応答しないということが予測可能である。
【００２０】
さらに、正常組織の遺伝子型は、患者の薬物毒性をあらわすリスクを予測することに使用されることができる。例えば、上記のように、研究は、３R/３R患者が２R/2R患者よりも薬物毒性のより低いリスクを経験することが見出されたことを示した。したがって、２R/3R正常組織の患者は、３R/３R患者よりもいくらか低い用量で薬物毒性を示す可能性があるが、２R/２R患者よりも高用量に耐えることが可能であろう。
【００２１】
「応答」という用語が意味するものは、腫瘍組織又は細胞に対する化学療法計画の効果に関係する。そのような応答の測定方法は、適宜、可変の基準によって定義され、通常は化学療法計画及び治療される癌の種類に依存する。一般に、基準は、腫瘍サイズの縮小、（結腸直腸癌の場合におけるリンパ節及び肺への転移のような）離れた部位への転移、そして癌組織の種類、癌及び転移のステージ並びに化学療法計画に依存する他の基準を含む。当業者は、腫瘍の種類及び化学療法を取り巻く状況に関する適当な基準を理解するであろう。例えば、本発明に導く研究のひとつにおいては、化学療法計画への「応答者」と分類されるには、他の病気の進行又は新たな病変の出現なしに、腫瘍は、指標となるその病変の垂直の直径の合計が５０％減少しなくてはならない。したがって、この場合の正の応答とは、腫瘍の縮小及び新たな病変の形成されないことを意味する。反対に、負の応答とは、腫瘍の縮小のないこと又はむしろ持続的な腫瘍の成長及び／又は新たな病変の出現を意味する。
【００２２】
本発明の１つの実施態様においては、患者の正常組織の遺伝子型も潜在的な薬物毒性を予測するために使用される。例えば、上記のように、研究により３R/３R患者が２R/２R患者よりも５−FUの薬物毒性のリスクの低いことが見出されたことが示された。したがって、２R/3R正常組織患者は、３R/3R患者よりもいくらか低い用量で薬物毒性を示す可能性がある。したがって、化学療法計画への応答を予測するための本発明の１つの方法を用いることにより、２R/3R正常組織遺伝子型及び２R/欠失腫瘍組織遺伝子型を有する患者が５−FU治療に対して正の反応をする（すなわち、腫瘍サイズの縮小）が、３R/3R正常組織遺伝子型を有する患者よりも薬物毒性に対して敏感であることが予測される。したがって、他の類似する個人について蓄積されたデータとともにこの予測を用い、腫瘍応答及び薬物毒性に関する患者の以前のデータに基づいて、医師は化学療法計画及び投薬を適合させることができる。
【００２３】
腫瘍サンプルの遺伝子型の決定において、新鮮な又は保存された腫瘍組織／細胞が使用されることができる。保存されている場合、それらはホルマリン固定パラフィン包埋（FPE）サンプルであることが好ましい。そして、FPE腫瘍サンプルはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）に供されることが好ましい。LCMは、非腫瘍細胞から腫瘍細胞を単離するのに有用であり、したがって、腫瘍組織遺伝子型のより正確な評価を提供する。
【００２４】
腫瘍組織中のTS遺伝子発現レベルも測定されることができる。そのような測定は、in vitroの研究がTS発現のアップレギュレーション及び細胞内TSレベルの上昇によって細胞がTS阻害剤に耐性となることを示したため、化学療法計画に対する応答の予測を支援することができる。研究により、TS発現が腫瘍間でかなり異なり、多様な腫瘍の５−FUに基づく化学療法への感受性がTSの腫瘍内レベルと相関することが示された。したがって、腫瘍の遺伝子型の決定に加えて、腫瘍中のTS遺伝子発現の測定は化学療法の結果に対する応答を予測するための情報を提供することができる。
【００２５】
応答の予測を支援するために、本発明はまた、患者の腫瘍及び正常組織遺伝子型並びに化学療法計画へのかれらの応答そして／又は腫瘍細胞中のTS遺伝子発現レベルに関するデータを蓄積することも考慮する。例えば、その腫瘍が化学療法計画に対して応答する患者は、「応答者」として分類されることができる。かれらの腫瘍の遺伝子型、並びにかれらの腫瘍中のTS遺伝子発現レベルが決定され、そして記録される。同様に、その腫瘍が化学療法計画に順調に応答しなかった患者は、「非応答者」として分類されることができる。かれらの腫瘍の遺伝子型、並びにかれらの腫瘍中でのTS遺伝子発現レベルが決定され、そして記録される。そして、患者が癌と診断された場合、腫瘍中のTS遺伝子発現レベル同様に腫瘍の遺伝子型が試験され、そして蓄積データと比較される。患者の腫瘍遺伝子型及びTS遺伝子発現レベルが応答者群と相関する場合、その患者には正の応答が予測される。逆に、患者の腫瘍遺伝子型及びTS発現レベルが非応答者群と相関する場合、その患者に関しては化学療法計画に対する負の応答が予測されることができる。
【００２６】
例えば、患者「A」が２R/3Rの正常組織遺伝子型を有し、腫瘍組織遺伝子型が２R/欠失である場合、本発明の方法を用いて、患者「A」における化学療法計画への応答が、２R/2R腫瘍又は２R/2R正常組織遺伝子型を有する患者における同じ化学療法計画への応答に類似することが予測される。他の例としては、患者「B」が２R/3Rの正常組織遺伝子型及び３R/欠失の腫瘍組織遺伝子型を有する場合、本発明の方法を用いて、患者「B」における化学療法計画への応答が、３R/3R癌又は正常組織遺伝子型を有する患者における同じ化学療法計画への応答に類似することが予測される。
【００２７】
同様に、薬物毒性の予測において、本発明は、患者の正常組織及び腫瘍組織の遺伝子型とともに患者における薬物毒性レベルに関するデータを蓄積することを考慮する。したがって、投与される薬物の（致死的な薬物毒性を引き起こす前の）「安全な」レベルは、患者の正常組織遺伝子型と同じ正常組織遺伝子型を有する他の患者との比較及びかれらの安全な薬物用量レベルに基づいて予測されることができる。
【００２８】
化学療法計画は、目的の癌／腫瘍の治療に有用ないかなる治療計画であってもよい。当業者は選択するべき好適な化学療法計画についての知識を有するであろう。多様な因子は、癌の種類、患者の状態／健康、癌の程度、腫瘍サイズ、などを含むがこれらに限られない。さらに、放射線療法又は化学療法剤の併用のような他の治療法も同時に使用されることができる。化学療法計画は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する遺伝子治療、癌抗原に対する抗体、補助因子、放射線療法などの使用を含む他の治療法と併用されることができる。
【００２９】
結腸直腸癌のようなヒト胃腸癌の場合、フルオロピリミジン及び葉酸に基づく阻害剤を含むTS阻害剤は、最近人気の高い化学療法であると思われる。したがって、本発明は、限定的ではないが、TS阻害剤に対する応答を予測することを考慮する。TS阻害剤は、５’−FU、FUdR、UFT、S-1、カペシタビン、ラチトレキセド、ペメトレキセド、及びノラトレキセド又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。CRCの治療にはしばしば、複数の治療法が含まれる。これらは、シスプラチン、オキサリプラチン、タキサンのような追加の化学療法剤の投与並びに放射線療法を含む。
【実施例】
【００３０】
実施例１：
患者母集団
好適な患者は、（ａ）手術後の播種性又は再発した結腸直腸癌の診断；（ｂ）適切な血液学的、肝臓及び腎臓の機能を伴う、０〜２の程度のEastern Cooperative Oncology Groupの一般全身状態；（ｃ）先の４週間の間に治療を受けていないこと；及び（ｄ）放射線医学的試験によって測定可能な病変を有した。
【００３１】
治療
1日２回のS-1で２８日間、患者を治療し、続いて２週間、休薬した。朝食及び夕食後にＳ−１を経口投与した。先の臨床第２相試験（Villafranca, E., et al., J. Clin. Oncol., 19: 1779-1786, 2001; Zinzindohoue, F., et al., J. Clin. Oncol., 19:3442, 2001）におけるように、体表面積（BSA）をS-1投与量を決定するために以下のように使用した：BSA＜１．２５m2, 40mg；１．２５〜１．５m2、５０mg；＞＝１．５m2、６０mg。これらの治療を、治療している医師により病状悪化が判定されるまで、又は医師の自由裁量で繰り返す。
【００３２】
プロトコールは、試験開始前に、施設内審査委員会及び倫理委員会によって審査され、そして許可され、施設内規定にしたがって各患者からインフォームドコンセントを得た。
【００３３】
評価
２サイクルの治療の後、測定可能な病気を再評価した。応答基準は、国内共同試験のために使用した標準的定義（Green, S. et al., Investig. New Drugs, 10: 239-253, 1992）である。応答は肝臓、リンパ節、及び肺転移中、並びに原発病変中のCTによって評価した。「応答者」と分類されるには、他の病気の進行又は新たな病変の出現なしに、腫瘍は、指標となるその病変の垂直の直径の合計が５０％減少しなくてはならない（上記）。
【００３４】
マイクロダイセクション
病理学者が、代表的なホルマリン固定パラフィン包埋S1前処置腫瘍検体を、ヘマトキシリン及びエオシン染色スライドの検査後に選択した。厚さ１０ミクロンの切片をニュートラルファストレッドで染色して、腫瘍細胞のみが試験されたことを確実にするために実施したレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Munich Germany)のための組織像の可視化を可能とした。組織病理学により癌の浸潤のないとした検体から集めた組織を正常組織とみなした。
【００３５】
RNA単離及びｃDNA合成
パラフィン包埋された検体からのRNAの単離を、本明細書中に参考文献としてそっくりそのまま援用されている米国特許第６，２４８，５３５号に記載の方法にしたがって行った。RNAの単離に続いて、cDNAを各サンプルから先の記載のとおりに調製した（Lord RV, et al., J. Gastrointest Surg., 4: 135-142, 2000）。
【００３６】
RT-PCR
TS及び内部参照遺伝子（β−アクチン）についてのcDNAの相対的定量化を、蛍光に基づくリアルタイムの検出方法（ABI PRISM 7900 Sequence Detection System [TaqMan（登録商標）],Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて先に記載のとおりに行った（Lord RV, et al., J. Gastrointest Surg., 4: 135-142, 2000; Heid CA, et al., Genome Res., 6: 986-994, 1996; Gibson UE, et al., Genome Res., 6:995-1001, 1996）。使用したプライマー及びプローブ配列を表１に示す。PCR反応混合物は、６００nMの各プライマー、２００nMのプローブ、２．５UのAmpliTaq Gold Polymerase、２００μMの各dATP、dCTP、dGTP、４００μMのdUTP、５．５mMのMgCl2、及び参照用色素を含む１×Taqman Buffer Aからなり、最終体積２５μlであった（すべての試薬は、Applied Biosystems, Foster City, CA）。繰り返し条件は、５０℃で１０秒、９５℃で１０分、続いて９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４６サイクルであった。結腸、肝臓、及び肺のRNA（すべてStratagene, La Jolla, CA）を各プレートにおいて対照標準物質として用いた。
【００３７】
DNA抽出、PCR及び電気泳動
集めたDNAをQIAamp Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)を使用して抽出した。TS遺伝子のプロモーター領域を、以下のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した：順方向プライマー５’−GCGGAAGGGGTCCTGCCA−３’（配列番号：１）及び逆方向プライマー５’−TCCGAGCCGGCCACAGGCAT−３’（配列番号：２）。先に記載の条件を用いてPCRを実施した（Kawakami, K., et al., Anticancer Res., 19: 3249-3252, 1999）。PCR産物を１０％TBE-尿素ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）上の電気泳動によって分析した。
【００３８】
統計解析
遺伝子発現値を２つの絶対測定値の間の比率（目的の遺伝子／内部参照遺伝子）によって表す。各TS遺伝子型群中の遺伝子発現値を、Mann-Whitney U検定を用いて解析した。カイ二乗独立性検定を、TS遺伝子型及び化学療法への応答の間の関連を評価するために用いた。TS遺伝子型と生存の間の関連を測定するために、ログランク検定を使用した。
【００３９】
結果
全員がステージIVの病気である３０人の患者からの全部で３０の原発性S1前処置結腸直腸癌検体について研究した。患者の１３人（４３．３％）をS-1への応答者として分類し、１７人の患者（５６．７％）を非応答者と分類した。TS遺伝子型及びTS発現値を３０人の患者すべてから得た。試験に含まれた３０人の患者の１４人（４６．６％）は男性であり年齢の中央値は６５．０歳（３９〜７９歳の範囲）であった。３０人の患者すべてについての生存期間全体の中央値は２１５．５日（９８〜６２７日の範囲）であった。S-1に応答する腫瘍を有する患者についての生存期間全体の中央値は、３０３日（１３９〜６２７日の範囲）であり、非応答者に関しては１９０日（９８〜４３５日の範囲）であった。
【００４０】
結腸直腸正常組織及び癌組織中のTS反復配列の数におけるTS多形及びLOH
推定の長さが１０７及び１３５塩基対のPCR断片を得た（図１）。１０７及び１３５塩基対の断片は、２及び３の反復（２R及び３R）配列を表す。TS遺伝子型は、２R−ホモ接合体（２R/2R）、３R−ホモ接合体（３R/3R）、及び２R/3R−ヘテロ接合体に分類した。３０の結腸直腸正常組織中の各遺伝子型の頻度を表２に示す。２R/3R遺伝子型を有する２２の正常組織において、１０の癌組織は２R-配列バンド（２R/欠失）のみを示し、７の癌組織は３R−配列バンド（３R/欠失）のみを示した。表３及び図１を参照のこと。TS遺伝子座中のヘテロ接合性の喪失事象それぞれの比率は、２R/欠失遺伝子型の４５％（10/22）及び欠失/３R遺伝子型の３１．８％（7/22）であった（表３）。
【００４１】
LOHによって変更された臨床病理学的特徴及びTS多形
30人の患者をLOHによって変更されたTS遺伝子型によって５群に分けた。臨床病理学的特徴に関しては、これらの５つの群の間に顕著な相違はなかった（表４）。再発カテゴリーに関しては、３０人の患者全体の１３人（４３％）が肝臓転移を有した。腫瘍の大部分（２９／３０）は、病理学的に高分化型又は中分化型の腺癌であった。
【００４２】
LOHによって変更されたTS多形及びS-1化学療法への応答
癌の中に２R／欠失遺伝子型を有する１０人の患者の応答率は８０％（８／１０）であって各遺伝子型の中で最高であり、３R／欠失遺伝子型を有する７人の患者の応答率は１４％（７／２２）であって各遺伝子型の中で最低である。各応答率の間には顕著な差がある（ｐ＝０．０２９）（表５）。
【００４３】
LOHによって変更されたTS多形及び全生存期間
その正常組織中に２R/３R遺伝子型そして癌組織中に２R/欠失遺伝子型を有する結腸直腸癌患者についての全生存期間の中央値は３３３日（９５％C.I；２４１−４６８日）であった。この生存期間は、他の遺伝子型を有する患者については顕著に長かった（ｐ＝０．００４）（表４及び図２）。２R/２R又は２R/欠失遺伝子型を癌組織中に有する結腸直腸癌患者についての全生存期間の中央値は３０８日（９５％C.I.；２３３４１８日）であった。これは、癌組織中に他の遺伝子型を有する患者のそれよりも顕著に長い（ｐ＝0.002）（表５及び図３）。
【００４４】
LOHによって変更されたTS多形及び腫瘍内TSｍRNA発現
腫瘍内TSｍRNA発現の中央値は、癌組織中に２R/２R又は２R/欠失遺伝子型を有する患者については２．４５（０．６〜４．１４の範囲）、癌組織中に２R/3R遺伝子型を有する患者については２．９７（１．６３〜１９．２３の範囲）、癌組織中に欠失/３R又は３R/３R遺伝子型を有する患者については３．６８（１．６４〜１１．９７の範囲）であった。LOHによって変更された癌組織中のTS遺伝子型は、腫瘍内TSｍRNA発現と統計学的に関連していた（ｐ＝０．０２６）（表６）。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Aは、３回の反復配列を有するTS５’フランキング領域の構造を示す。翻訳領域を中実のバーで示す。矢印を含む白いバーはTSERを示す。矢印は、タンデム反復配列及び相補的逆配列を表す。開始コドンの最初のヌクレオチドを+１と定義すると、数字はヌクレオチドの位置を示す。３回の反復が２回の反復のTSERよりも長いPCR産物を与えるように、PCRプライマーは、タンデム反復の領域に隣接するように設計されている。
【図１Ｂ】図１Bは、結腸直腸癌患者からの対応する正常（N）及び腫瘍（T）DNAにおけるTS遺伝子型の分析の例を示す。上側及び下側のバンドは、３R及び２Rをそれぞれ有するTSER部分の増幅からのPCR産物を表す。数字は、異なる患者のケースを意味する。各患者は、両方のバンドに存在によって示すように、正常組織中でヘテロ接合性の２R/3R遺伝子型を有する。ケース１：LOHは２R/欠失遺伝子型を有する腫瘍を生じさせた。ケース２：LOHは起こらなかった。ケース３：LOH は欠失/３R遺伝子型を有する腫瘍を生じさせた。
【図２】図２は、可能性のある様々な腫瘍TSER遺伝子型のそれぞれを個別に有する患者についての生存確率を示す生存（Kaplan-Meier）プロットを表す。
【図３】図３は、２Ｒ遺伝子型のみ（２Ｒ／欠失+２Ｒ／２Ｒ）、３Ｒ遺伝子型のみ（３Ｒ／３Ｒ＋３Ｒ／欠失）及びヘテロ接合性（２Ｒ／３Ｒ）によって分類された患者についての生存確率を示す生存（Kaplan-Meier）プロットを表す。
【図４】図４は、TSmRNA定量のための増幅プライマー及びプローブの配列を示す（表１）。
【図５】図５は、ＣＲＣ患者の試験における正常組織中のＴＳ遺伝子型を示す表（表２）である。
【図６】図６は、ＣＲＣ患者の試験の腫瘍組織中のヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）の頻度を示す表（表３）である。
【図７】図７は、臨床病理学的変量とＬＯＨによって変更されたＴＳ遺伝子型の間の関連を示す表（表４）である。
【図８】図８は、ＴＳ遺伝子型によって分けられた患者の臨床結果を表す表（表５）である。
【図９】図９は、ＴＳ遺伝子型によって分けられたＴＳ発現を示す表（表６）である。
2006520197.tif 000002
【図２】
2006520197.tif 000003
【図３】
2006520197.tif 000004
【図４】
2006520197.tif 000005
【図５】
2006520197.tif 000006
【図６】
2006520197.tif 000007
【図７】
2006520197.tif 000008
【図８】
2006520197.tif 000009
【図９】
2006520197.tif 000010
【配列表】
2006520197000001.app
【国際調査報告】
2006520197.tif 000011
2006520197.tif 000012
2006520197.tif 000013
2006520197.tif 000014
2006520197.tif 000015