(57)【要約】本発明は、平形支持体（２）と、この平形支持体（２）上に配置されている捕捉分子を含むスポット（４）のアレイ（３）とを備え、各スポット（４）には捕捉分子と検体溶液によりもたらされる標的分子との間の結合事象を検出するためのマイクロ電極装置（５）が付設されているバイオチップに関する。バイオチップの感度および結合固有の測定効果を高めるために、電極装置が、標的分子にとって透過性である親水性反応層（１４）内に少なくとも部分的に埋め込まれている。
2006510882.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平形支持体（２）と、この平形支持体（２）上に配置されている捕捉分子を含むスポット（４）のアレイ（３）とを備え、各スポット（４）には捕捉分子と検体溶液によりもたらされる標的分子との間の結合事象を検出するためのマイクロ電極装置（５）が付設されているＤＮＡチップにおいて、電極装置（５）が、標的分子にとって透過性である親水性反応層（１４）内に少なくとも部分的に埋め込まれ、反応層（１４）内には固定された捕捉分子が３次元に分布させられていることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項２】
反応層（１４）の厚みが２〜１００μｍであることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡチップ。
【請求項３】
電極幅と電極間隔との合計をＬとするとき、反応層はほぼ１〜５Ｌの範囲にある厚みを有することを特徴とする請求項２記載のＤＮＡチップ。
【請求項４】
電極幅および電極間隔が１μｍ（＝１０００ｎｍ）の範囲にあり、反応層が２〜１０μｍの厚みを有することを特徴とする請求項２又は３記載のＤＮＡチップ。
【請求項５】
マイクロ電極装置が２極システムであり、反応層が約３μｍの厚みを有することを特徴とする請求項３記載のＤＮＡチップ。
【請求項６】
マイクロ電極装置が４極システムであり、反応層が約７μｍの厚みを有することを特徴とする請求項１乃至５の１つに記載のＤＮＡチップ。
【請求項７】
反応層（１４）が約９５℃まで熱的に安定していることを特徴とする請求項１乃至６の１つに記載のＤＮＡチップ。
【請求項８】
反応層（１４）が捕捉分子の共有結合のための結合グループを含んでいることを特徴とする請求項１乃至７の１つに記載のＤＮＡチップ。
【請求項９】
反応層（１４）はヒドロゲルであることを特徴とする請求項１乃至８の１つに記載のＤＮＡチップ。
【請求項１０】
結合グループとして、無水マレイン酸および／またはアクリル酸（メタクリル酸）グリシジルを有するアクリルアミドをベースとするラジカルに架橋結合可能なヒドロゲルが用いられることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡチップ。
【請求項１１】
インターディジタル構造の電極装置（５）が設けられていることを特徴とする請求項１乃至１０の１つに記載のＤＮＡチップ。
【請求項１２】
インターディジタル構造の電極装置（５）は２極のマイクロ電極システムであることを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡチップ。
【請求項１３】
インターディジタル構造の電極装置（５）は４極のマイクロ電極システムであることを特徴とする請求項１１記載のＤＮＡチップ。
【請求項１４】
平形支持体（２）は半導体層およびこの半導体層に結合された絶縁層（１３）を含み、絶縁層（１３）は半導体層とは反対側の面に電極装置（５）および反応層（１４）を担持することを特徴とする請求項１乃至１３の１つに記載のＤＮＡチップ。
【請求項１５】
半導体層はシリコン層（１２）であることを特徴とする請求項１４記載のＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の前文に記載のバイオチップ、特にＤＮＡチップに関する。
【０００２】
バイオチップもしくはＤＮＡチップは、一方の面に少なくとも１つのスポットアレイ、すなわち分析位置の格子状配置が存在する平形支持体を含む。スポットは、支持体表面上に固定されたプローブ分子、すなわち捕捉分子、例えばオリゴヌクレオチドを含んでいる。１つのスポットに付着させられた検体溶液の中に含まれている標的分子、例えばＤＮＡ断片が捕捉分子に連結される。このような連結事象もしくは結合事象を検出可能な信号へ変換することは、光学的方法、圧電法、熱量測定法、電気化学法、あるいはインピーダンス分光法により行なわれる。
【０００３】
独国特許第１９６１０１１５号明細書から公知のインピーダンス分光法により読み出し可能なＤＮＡチップでは、センサ面にインターディジタル構造の電極装置が存在し、捕捉分子が電極上および電極間に配置された面上に固定されている。捕捉分子への標的分子の連結は、例えば電荷変化により、電極によって発生される交番電界の変化もしくは一般には電極周囲における電気特性、例えばインピーダンスの変化をもたらす。インピーダンス変化の測定は例えば２極のインターディジタル構造の電極装置により行なわれ、この電極装置では電極が多数の部分電極から構成されている。
【０００４】
後者の様式の結合事象検出における問題点は、電極構造の寸法が分子の大きさと複数桁で異なることにある。なおも是認できる技術的費用にて、幅および間隔を合わせて約２〜２０μｍの値Ｌ（幅＋間隔）と約０．１〜０．５μｍの高さとを有する電極を作り上げることができる。
【０００５】
このような電極装置の電界のインピーダンス分光法により検出可能な範囲は支持体表面もしくは電極装置が占める平面において約１〜５Ｌ（＝２〜１００μｍ）に及んでいる。これに対して、例えば１００個の塩基対を有する補足分子は約３０ｎｍの長さしか持たない。センサ面もしくは電極に固定されている捕捉分子の単分子層内での結合事象の電界への影響は、とりわけ僅かの結合プロセスしか行なわれない場合には捕捉分子の長さに相応して僅かである。刊行物「“Ｎａｎｏｓｃａｌｅｄ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ（生化学センサ用のナノ規模のインターディジタル構造の電極アレイ）”，Ｖａｎ  Ｇｅｒｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ，Ｂ４９，１９９８，７３−８０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓ．Ａ．」においては、電極構造の寸法をＤＮＡ標的分子の寸法に近づけることが提案され、約２５０〜５００ｎｍの範囲にある幅および相互間隔を有する部分電極を備えた電極構造が追求されている。しかしながら、このような寸法は製造費用の増大につながる。
【０００６】
更に、国際公開第９８／１９１５３号パンフレットから、導電性ポリマー内に埋め込まれた電極が存在する生化学用のセンサが知られている。導電性ポリマーは検体と接触し、検体においては交流電流の影響によって生化学プロセスが行なわれる。プロセス変化が導電性ポリマーを介してインピーダンス変化として電極システムへ伝達されて検出される。
【０００７】
そのようにして構成されたセンサチップは感度に問題がある。更に、導電性ポリマー内への電極の埋め込みもしくは被覆は高価であるので、上述のバイオセンサは実践には適していない。
【０００８】
本発明の課題は、従来技術から出発して、改善された感度を有し低コストで製造可能でありかつインピーダンス分光法による読み出しが可能であるＤＮＡチップを提供することにある。
【０００９】
この課題は本発明によれば請求項１の特徴事項によって解決される。発展形態は従属請求項に示されている。
【００１０】
本発明においては、電極装置が、標的分子にとって透過性の親水性反応層内に少なくとも部分的に埋め込まれ、反応層内には固定された捕捉分子が３次元に分布させられている。反応層は、電極装置によって発生された電界の大部分が、もしくは電極装置のインピーダンス分光法による検出範囲が反応層を貫通するように設計されている。
【００１１】
本発明によるバイオチップの主たる利点は、反応層内部に、支持体表面上および電極表面上の単分子層内におけるよりも遥かに多数の捕捉分子を配置できることにある。しかしながら、さらになお、反応層の寸法が電界もしくはその電気力線によって貫通される空間に合わせられているので、上記の検出範囲内にはほぼ均一の分布で非常に多数もしくは高濃度の捕捉分子が存在する。その結果、電極装置の電界もしくはインピーダンス分光法による検出範囲に遥かに大きな影響がもたらされる。このように構成されたＤＮＡチップはそれ相応に大きな測定感度を有する。
【００１２】
反応層の厚みは好ましくは最大で１００μｍであるべきである。しかしながら、反応層の厚みは大きすぎてはならない。さもなければ、捕捉分子への標的分子の移動のための拡散経路が長くなりすぎ、従って反応時間が長くなりすぎるからである。
【００１３】
電極幅が約１μｍの範囲にありかつ電極間隔が同じ範囲にある場合、反応層の厚みは２〜１０μｍ、例えば２極のマイクロ電極システムの場合には約３μｍ、４極のマイクロ電極システムの場合には約７μｍである。
【００１４】
有利な実施態様では、電極幅と電極間隔との合計をＬとするとき、反応層はほぼ１〜５Ｌの範囲にある厚みを有する。それによって、一方では比較的高い電気力線密度を有する電界範囲を結合事象の検出に利用することが保証され、他方では反応層の厚みは標的分子の拡散および反応を妨げるほど大きくないことが保証される。
【００１５】
約９５℃まで熱的に安定している反応層により、問題の様式のＤＮＡチップがＰＣＲ反応に適用可能である。なお、“熱的に安定している”とは、反応層が上記温度においても、反応層が溶解せず、反応層が捕捉分子を係留し、反応層内で標的分子と捕捉分子との間の反応が妨げられずに行なわれ、そして反応層がその他の特性も基本的には維持する、という性質を有することを意味する。他の有利な実施態様において、反応層は、捕捉分子が共有結合する結合グループを有するポリマーを含んでいる。それによって、標的分子と捕捉分子とからなる結合対が分析経過中における洗浄プロセスにおいて反応層内に引きとめられることが確実に保証されている。特に適した反応層はヒドロゲルからなる。ヒドロゲルは機械的に安定な形の水性の媒体を形成する。この水性の媒体は主に水性の検体との物質交換を可能にする。結合グループとして、無水マレイン酸および／またはアクリル酸（メタクリル酸）グリシジルを有するアクリルアミドをベースとするラジカルに架橋結合可能なヒドロゲルが特に適していることが分かった。
【００１６】
他の有利な実施態様では、ＤＮＡチップの平形支持体がシリコン層およびこのシリコン層に結合された絶縁層を含み、絶縁層はシリコン層とは反対側の面に電極装置および反応層を担持する。このような装置では、電極構造と、シリコン半導体技術から知られているアナログおよびディジタル回路との電気配線接続が実現される。
【００１７】
特許請求の範囲に関連した以下の図面に基づく実施例の説明から本発明の更なる詳細および利点を明らかにする。
図１は平形支持体とスポットアレイとを含むバイオチップの簡略化した斜視図を示す。
図２は図１における線ＩＩ−ＩＩに沿った１つのスポットの横断面を拡大部分図で示す。
図３は１つのスポットに付設された電極装置の一部分を示す。
図４は４極の電極装置を有するバイオチップの実施形態を図２に対応して示す。
図５は図４のバイオチップの電極装置を図３に対応して示す。
【００１８】
図１が示すように、バイオチップ１は平形支持体２を含み、これの一方の面にスポットアレイ３が設けられている。スポット４は固定された捕捉分子、例えばオリゴヌクレオチドを含んでいる。１つのスポット上に未知の標的分子を有する検体溶液がもたらされた際に、塩基配列が相応に一致すれば捕捉分子への標的分子の結合が起きる。このような結合事象によってひき起こされた特性変化、例えば抵抗率または誘電率の変化が電極装置５により検出される。
【００１９】
図２の実施例では２極の電極装置が存在する。これは、例えばホトリソグラフィック法により平形支持体２上に設けられる。電極装置５は、インターディジタル構造の形に形成されている２つの電極６，７を有する。すなわち、各電極は互いに平行に延びる多数の条片状の部分電極６ａ，７ａを含み、これらの部分電極６ａ，７ａはそれぞれ相手方の電極に属する２つの部分電極の間隙内に延びている。部分電極６ａ，７ａは、部分電極６ａ，７ａに対して直角方向に延びている同様に条片状の接続導体６ｂ，７ｂによって互いに接続されている。電極６，７は例えばメガヘルツ範囲の交流電圧を印加されている。部分電極６ａ，７ａの幅８は約１μｍであり、それらの高さ９は約１００〜５００ｎｍである。部分電極６ａ，７ａ間には同様に約１μｍの間隔１０が存在する。
【００２０】
平形支持体２は、シリコン層１２およびこのシリコン層１２と電極６，７との間に配置され例えば酸化シリコンまたは窒化シリコンからなる絶縁層１３を含む。結合事象のインピーダンス分光測定に必要な電気的配線および構成部品は、従来のように、（図示されていない）シリコン層の相応の構造化によって実現されている。絶縁層１３上には、以下に更に詳しく説明するヒドロゲルからなる反応層１４が設けられている。
【００２１】
反応層１４つまりヒドロゲルの中には、図２に誇張されて象徴的に示されている捕捉分子１５が埋め込まれて均一に分布させられている。３００個の塩基を備えた捕捉分子は約１００ｎｍの長さを有する。従って、捕捉分子の単分子層は、従来のバイオチップの場合、おそらく、ほぼ図２における線１６に対応する厚みを持つ。このような層は比較的僅かの捕捉分子１５を収容し、従って結合事象の場合に電界に僅かしか影響を与えることができないことを簡単に窺い知ることができる。これに対して、本発明によるバイオチップの場合、捕捉分子を含み且つ電気力線によって貫通される反応範囲が著しく広がり、１０の数乗多い標的分子１５のための場所を提供する。このように形成されたスポットアレイ３もしくはスポット４上に検体溶液が付着されると、その中に含まれる標的分子１９（図２において同様に誇大に象徴的に示されている。）は、捕捉分子１５の形の著しく多数の結合相手を見つけ出す。反応層１４は、インピーダンス分光法の検出範囲が実際上完全に利用されるように設計され、もしくは厚みを有すると好ましい。これはいずれの場合にも反応層１４の厚みが約２〜１００μｍの際に、実質的には２〜１０μｍの際に達成される。従って、この範囲における捕捉分子１５の相応の濃度において、バイオチップの結合特有の測定効果が著しく高められる。
【００２２】
反応層１４は水性の反応媒体を用立てる。更に、反応層は、反応層の活性に影響を及ぼすことなく、標的分子１９または反応に必要な他の物質、例えばポリメラーゼを反応層内に拡散させることができる。
【００２３】
既に述べたように、本発明によれば、ヒドロゲルが反応層１４として使用される。ヒドロゲルは、機械的に安定な形の水性の媒体を形成し、同時に主に水性の周囲内との物質交換を保証する。成分およびそれらの割合に関係する化学的組成の選択によって、水含有量、膨潤挙動、機械的安定性などのヒドロゲルの特性を、広い範囲にわたって変化させることができる。
【００２４】
簡単に製造可能であり且つ電極装置５に対しても絶縁層１３に対しても良好な付着性を有するヒドロゲルは、アクリルアミドをベースとするラジカルに架橋結合可能なヒドロゲルである。このヒドロゲルは、変更された捕捉分子に応じてリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）グループを介して共有結合を可能にするコモノマーを含んでいる。ヒドロゲルは、ポリアクリルアミドのモノマー予備段階のほかに、架橋剤、少なくとも１つのラジカル開始剤、反応性リンカーグループを有する少なくとも１つのコモノマー、および場合によっては少なくとも１つの軟化剤を含んでいる。層形成およびそれに続く熱もしくは光による架橋結合の後に、水で膨潤可能なヒドロゲルが得られ、このヒドロゲルは捕捉分子の固定のための反応性リンカーグループを含んでいる。架橋剤としては、メチレンビスアクリルアミドおよび／またはジメチルアクリル酸エステル、例えばジメタクリル酸テトラエチレングリコールが使用される。
【００２５】
架橋剤の濃度の変化によってヒドロゲルの網目幅が調整される。使用されたコモノマーは無水マレイン酸および／またはアクリル酸（メタクリル酸）グリシジルを含んでいる。軟化剤としては、モノジエチレングリコールおよび／またはトリエチレングリコールが適している。上述の出発物質は、水と混合可能な有極性溶剤、とりわけジメチルホルムアミドと混合されている。
【００２６】
溶剤成分の変化によって加工粘性を調整することができる。平形支持体表面並びに電極装置５への付着は、例えばシランをベースとする通常の付着仲介剤を混ぜ合わせることによって強めることができる。
【００２７】
図４および図５には４極の電極装置２０が示されている。電極装置２０は、２つの電流電極２２，２３と２つの電圧もしくはプローブ電極２４，２５とから構成されている。電流電極２２，２３は図２による実施例の電極装置５に対応して配置されて構成されている。プローブ電極２４，２５は同様に条片状であり、蛇行状の二重線として部分電極２２ａ，２３ａ間に存在する間隙を通って延びている。電流電極２２，２３は高周波の交流電流を印加される。プローブ電極２４，２５には電圧測定器２６が接続され、この電圧測定器２６により一連の結合事象における交番電界の変化が検出可能である。
【００２８】
従って、電流電極に依存せずに測定を行なうことができるので、例えば電極インピーダンスを高める電流電極の分極が測定に影響することはない。これに対して、２極電極装置の場合、検体溶液もしくは反応層の、測定にとって重要なインピーダンスを決定できるようにするために、測定技術上好ましくない相応に高い測定周波数によって電極インピーダンスを小さく保たなければならない。
【００２９】
反応層内に結合事象によってひき起こされた静電容量変化を検出するために、非常に高い測定周波数（＞１ＭＨｚ）と組み合わせた２極の電極装置が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】平形支持体とスポットアレイとを含むバイオチップの簡略斜視図
【図２】図１における線ＩＩ−ＩＩに沿った断面図
【図３】１つのスポットに付設された電極装置の一部分を示す平面図
【図４】４極の電極装置を有するバイオチップの実施形態を示す断面図
【図５】図４のバイオチップの電極装置を示す平面図
【符号の説明】
【００３１】
１        バイオチップ
２        平形支持体
３        スポットアレイ
４        スポット
５        電極装置
６        電極
６ａ      部分電極
６ｂ      接続導体
７        電極
７ａ      部分電極
７ｂ      接続導体
８        部分電極の幅
９        部分電極の高さ
１０        部分電極の間隔
１２        シリコン層
１３        絶縁層
１４        反応層
１５        捕捉分子
１６        線
１７        電気力線
１８        検体溶液
１９        標的分子
２０        電極装置
２２        電流電極
２２ａ      部分電極
２３        電流電極
２３ａ      部分電極
２４        プローブ電極
２５        プローブ電極
２６        電圧測定器
【図１】
2006510882.tif 000003
【図２】
2006510882.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2006510882.tif 000009
2006510882.tif 000010
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