(57)【要約】本発明は、新規な、一般式（I）：R(OAlk)nOCH2COOH［式中、R は、アルコール由来の C1〜50 アルキル、アルケニル及び／又はアルキルフェニル基であり、OAlk は、開環エチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシド単位を表し、n は 0〜100 の数である。］に相当するエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（I）：
R(OAlk)nOCH2COOH        （I）
［式中、R は、アルコール由来の C1〜50 アルキル、アルケニル及び／又はアルキルフェニル基であり、OAlk は、開環エチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシド単位を表し、n は 0〜100 の数である。］
に相当するエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステル。
【請求項２】
R が、任意に他の官能基を含むアルコール由来の直鎖 C1〜36 アルキル基であることを特徴とする、請求項１に記載のステロールエステル及び／又はスタノールエステル。
【請求項３】
R が、単官能性アルコール由来の直鎖 C1〜18 アルキル基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のステロールエステル及び／又はスタノールエステル。
【請求項４】
R が、二官能性アルコール由来の直鎖ヒドロキシル末端 C2〜36 アルキル基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のステロールエステル及び／又はスタノールエステル。
【請求項５】
OAlk が、開環エチレンオキシド単位 OCH2CH2 を表すことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のステロールエステル及び／又はスタノールエステル。
【請求項６】
n が 1〜20、好ましくは 3〜15 の数であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のステロールエステル及び／又はスタノールエステル。
【請求項７】
ステロール及び／又はスタノールを、式（II）：
R(OAlk)nOCH2COOX        （II）
［式中、R は、アルコール由来の C1〜50 アルキル、アルケニル及び／又はアルキルフェニル基であり、OAlk は、開環エチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシド単位を表し、n は 0〜100 の数であり、X は水素又はアルカリ金属である。］
に相当するエーテルカルボン酸又はその塩で、エステル化触媒の存在下、エステル化することを特徴とする、エーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの製造方法。
【請求項８】
請求項１に記載のエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの、ステロール源及び／又はスタノール源としての、好ましくはステロイド前駆体製造用原料としての、より好ましくは 4-アンドロステン-3,17-ジオン（AD）及び／又は 4-アンドロスタジエン-3,17-ジオン（ADD）の発酵生産用原料としての使用。
【請求項９】
請求項１に記載のエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの、乳化剤としての、より好ましくは化粧品組成物中及び食品中の乳化剤としての使用。
【請求項１０】
請求項１に記載のエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの、化粧品活性成分としての使用。
【請求項１１】
請求項１に記載のエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの、コレステロール低下活性成分としての、より好ましくは食品中及び／又は栄養補助食品中のコレステロール低下活性成分としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ステロール及び／又はスタノールのエステル、とりわけ新規なエーテルカルボン酸エステル、それらの製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ステロール、とりわけ植物ステロールへの関心が高まっている。例えば、植物ステロールは、アンドロステンジオンのようなステロイド中間体への発酵において広範に使用されており、アンドロステンジオンは、多くの場合化学修飾によって、テストステロン、エストラジオール、テストラクトン又はコルチゾンのような医薬活性ステロイドに転化される。更に、植物ステロールはヒト血液中のコレステロール値を低下させる有利な性質を有し、そのため、植物ステロール及び植物ステロール脂肪酸エステルは食品添加物として使用されている。
【０００３】
ステロール及び水素化によって得られるスタノールを使用することの主要な問題の 1 つは、水への溶解度が極めて乏しく、脂肪への溶解度が極小なことである。水性分散体を製造する 1 つの方法は、ステロールの粒度を、種々の高圧ホモジナイザーを用いて小さくすることである。即ち、コロイドミルのような高剪断装置を用いることによる、とりわけ水性媒体中での植物ステロール微粒子の製造は、WO 00/45648 から知られている。
ステロール水性分散体を製造するもう 1 つの方法は、乳化剤を用い、一般には続いて、例えば EP-B-897 671 により均一化する方法である。
【０００４】
EP-A-195311 は、脂肪への向上した溶解性を有するステロール誘導体を記載しており、この誘導体は、植物ステロール及び分枝脂肪族アルコールを、脂肪酸又は脂肪酸エステルで、リパーゼの存在下、エステル化することによって製造され得る。
DE-A-2035069 は、触媒として過塩素酸を用いてアシル化することにより製造された植物ステロールのカルボン酸エステルを含む、透明な調理用油及びサラダドレッシングを開示している。
更に、β-シトスタノールの脂肪酸エステルによるエステル交換触媒存在下でのエステル交換によって製造されるβ-シトスタノール脂肪酸エステルは、WO 92/19640 から知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、広範な用途に使用するために、高価な高圧ホモジナイザーを必要とせず、水中に多量に分散可能な、ステロール誘導体及び／又はスタノール誘導体を提供することである。同時に、該誘導体は自己分散性であり得る。即ち、水性分散体製造用の乳化剤の存在は、必須ではなく任意であるにすぎない。更に、該誘導体は、ステロール及び／又はスタノール自体より低い融点を有し、例えば、発酵の結果生じる反応を簡素化する。最後に、本発明は、ステロール及び／又はスタノールを、水性媒体中に制御条件下で所望により再放出できる誘導体を提供することを追求した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、一般式（I）：
R(OAlk)nOCH2COOH        （I）
［式中、R は、アルコール由来の C1〜50 アルキル、アルケニル及び／又はアルキルフェニル基であり、OAlk は、開環エチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシド単位を表し、n は 0〜100 の数である。］
に相当するエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルに関する。
【０００７】
本発明はまた、ステロール及び／又はスタノールを、一般式（II）：
R(OAlk)nOCH2COOX        （II）
［式中、R は、アルコール由来の C1〜50 アルキル、アルケニル及び／又はアルキルフェニル基であり、OAlk は、開環エチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシド単位を表し、n は 0〜100 の数であり、X は水素又はアルカリ金属である。］
に相当するエーテルカルボン酸又はその塩で、エステル化触媒の存在下、エステル化することを特徴とする、エーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの製造方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、式（I）に相当するエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの、ステロール源及び／又はスタノール源、好ましくはステロイド前駆体製造用原料、より好ましくは 4-アンドロステン-3,17-ジオン（AD）及び／又は 4-アンドロスタジエン-3,17-ジオン（ADD）の発酵生産用原料としての、乳化剤、より好ましくは化粧品組成物中及び食品中の乳化剤としての、化粧品活性成分としての、最後に、コレステロール低下活性成分、より好ましくは食品中及び／又は栄養補助食品中のコレステロール低下活性成分としての使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ステロール及びスタノール
しばしばステリンとも称されるステロールは、第三炭素原子にヒドロキシル基を有する C27〜30 ステロイドである。一般に、ステロールは二重結合も有する。スタノールは、二重結合を有さない対応する飽和ステロール化合物である。ステロールは、エステル又はグリコシドとして広く自然界に存在する。動物性ステロール、いわゆる動物ステロール、植物性ステロール、いわゆる植物ステロール、菌類由来のステロール、いわゆる菌類ステロールがある。基本的に、ステロール又はスタノールのいずれも、しかし好ましくは植物ステロール又はそれらの水素化スタノール化合物が、本発明の目的に適している。以下の化合物の 1 種以上を主に含む植物ステロールが好ましい：β-シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、スチグマスタノール及びカンペスタノール。
【００１０】
以下の化合物の少なくとも 2 種を含むステロール及び／又はスタノールの混合物が、特に本発明の目的に適している：下記の構造式を有する、β-シトステロール、カンペステロール、カンペスタノール及び／又はβ-シトスタノール。
【化１】
2006520349.tif 000002
【００１１】
植物油、より好ましくは菜種油から誘導された植物ステロールが、本発明の目的に最も好ましい。Cognis Corporation から Generol（登録商標）100 及び Generol（登録商標）122 の商品名で市販されているステロール混合物が、特に適している。Generol（登録商標）100 は、β-シトステロール、カンペステロール及びスチグマステロールを多く含み（約 80 重量％）、加えて、ブラシカステロール（約 5 重量％）、スチグマスタノール（約 12 重量％）及びカンペスタノール（100 重量％になるまで）を含む混合物である。また、Generol（登録商標）122 は、40〜55 重量％のβ-シトステロール、20〜28 重量％のカンペステロール、14〜23 重量％のスチグマステロール、及び任意に 0〜8 重量％のブラシカステロール、0〜5 重量％のスチグマスタノール及び 0〜2 重量％のカンペスタノールを含む混合物である。更に、Cognis Deutschland GmbH & Co. KG から市販されている、40〜60 重量％のβ-シトステロール、30〜45 重量％のカンペステロール及び 8〜18 重量％のブラシカステロール、0〜5 重量％のスチグマステロール、0〜5 重量％のスチグマスタノール、0〜5 重量％のエルゴスタノールの混合物（総含有量 90〜100 重量％）である Generol R（登録商標）もまた、特に適している。
【００１２】
エーテルカルボン酸
本発明において、ステロール及び／又はスタノールは、式（I）に相当するエーテルカルボン酸によりエステル化される。即ち、ステロール及び／又はスタノールのヒドロキシル基は、エーテルカルボン酸によりエステル基を形成する。
それ自体既知のエーテルカルボン酸は、第一工程段階で任意にアルコールをアルコキシル化し、次いで、ハロカルボン酸又はその塩でカルボキシメチル化することによって製造される。この製法は、例えば、DE-C-197 40 954 に記載されている。
【００１３】
エーテルカルボン酸の基になるアルコールは、脂肪族、脂環式又は芳香族であり得、飽和及び不飽和の両方であり得る。任意に他の官能基を含む直鎖脂肪族 C1〜36 アルコール（即ち、式（I）中の R は、アルコール由来の直鎖 C1〜36 アルキル基であり、任意に他の官能基を含む。）が適していることが分かっている。他の官能基は、好ましくはヒドロキシル基、より好ましくは末端ヒドロキシル基である。言い換えれば、エーテルカルボン酸の基になるアルコールは、ジオール、即ち、二官能性アルコールであり得、好ましくは 2〜36 個の炭素原子を含む。この場合、一般式（I）中の R は、二官能性アルコール由来の直鎖ヒドロキシル末端 C2〜36 アルキル基である。このような二官能性アルコールの例は、エチレングリコール、プロピレングリコール、ペンタン-1,5-ジオール、オクタン-1,8-ジオール、ヘキサン-1,6-ジオール、デカン-1,10-ジオール、ドデカン-1,12-ジオール又は専門家に知られている二量体及び／又は三量体アルコールである。二量体ジオール／三量体トリオールは、不飽和 C12〜22 脂肪酸好ましくは不飽和 C16〜18 脂肪酸又はそのメチルエステルをオリゴマー化し、続いて高圧水素化することによって得られる工業用混合物である。
【００１４】
本発明において、一般式（I）に相当するエーテルカルボン酸は、好ましくは、単官能性脂肪族アルコールから誘導される。適当な第一級単官能性直鎖アルコールの例は、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール、ノナデカノール、エイコサノール、ドコサノール、テトラコサノール、10-ウンデセン-1-オール、オレイルアルコール、エライジルアルコール、リシノリルアルコール、リノレイルアルコール、リノレニルアルコール、ガドレイルアルコール、アラキドニルアルコール、エルシルアルコール、ブラシジルアルコールである。適当な第一級単官能性分枝アルコールの例は、イソノニルアルコール、イソトリデシルアルコール、又は脂肪アルコールの二量化によって得られ、構造上、末端 CH2OH 基に対するα-位に、好ましくは 2〜12 個の炭素原子を含む比較的長いアルキル基を有することを特徴とするゲルベアルコールである。適当なゲルベアルコールは、2-ヘキシルデカノール、2-オクチルデカノール及び 2-ヘキシルデシルパルミテート／ステアレート、2-エチルヘキサノール及びプロピルヘプタノールである。
【００１５】
単官能性飽和直鎖 C1〜18 アルコール由来のエーテルカルボン酸（即ち、一般式（I）中の R が単官能性アルコール由来の直鎖 C1〜18 アルキル基である。）が、本発明の目的に好ましい。特に適当なエーテルカルボン酸は、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、カプロンアルコール、カプリルアルコール、カプリンアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール及び／又はステアリルアルコール、並びにこれらの工業用混合物（例えば、脂肪及び油ベースの工業用メチルエステルの高圧水素化によって形成される。）から誘導される。直鎖 C1〜6 アルコールのエーテルカルボン酸が特に好ましい。
【００１６】
一般式（I）に相当するエーテルカルボン酸は、任意に開環エチレンオキシド、プロピレンオキシド及び／又はブチレンオキシド単位（OAlk）を含む。OAlk は、好ましくはエチレンオキシド単位 OCH2CH2 を表す。一般式（I）に相当するエーテルカルボン酸のアルコキシル化度は「n」によって表されており、もちろん、純粋な統計的数値である。n は、好ましくは 1〜20、より好ましくは 3〜15 の数である。
【００１７】
特に適当なエーテルカルボン酸は、例えば、花王（Kao）から、Akypo LF 1（登録商標）（5 mol のエチレンオキシドでエトキシル化されたオクタノールベースエーテルカルボン酸）、Akypo LF 2（登録商標）（8 mol のエチレンオキシドでエトキシル化されたオクタノールベースエーテルカルボン酸）、Akypo RLM 100（登録商標）（10 mol のエチレンオキシドでエトキシル化された C12/14 アルコールベースエーテルカルボン酸）のように、Akypo（登録商標）の商品名で市販されている。
【００１８】
エーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルの製造方法
本発明のステロールエステル及び／又はスタノールエステルは、エステル化触媒の存在下、ステロール及び／又はスタノールを一般式（II）に相当するエーテルカルボン酸又はその塩でエステル化することによって製造される。
【００１９】
一般に、ステロール及び／又はスタノールとエーテルカルボン酸とを、2：1〜1：2、好ましくは 1.5：1〜1：1.5、より好ましくは 1.3：1〜1：1.3 のモル比で使用する。完全なエステル化を達成するために、エーテルカルボン酸をやや過剰に使用することが推奨される。エステル化は、例えばシュウ酸亜鉛、酸化亜鉛又は酸化カルシウムのような既知のエステル化触媒の存在下で行う。反応温度は、ステロール及び／又はスタノールの融点より高くて分解点より低く、好ましくは 190〜230 ℃である。アルコール成分の過剰量を用いた場合、エステル化度を、DIN 53402 に従って酸価から算出できる。エステル化は、10 未満、好ましくは 5 未満の残留酸価（AV）で、事実上完全であると見なすことができる。酸成分の過剰量を用いても、同様手法を採用することができる。
【００２０】
一般に、反応時間は約 4〜6 時間であり、使用する触媒量、反応温度及び残留ヒドロキシル価が、相互決定因子である。所望の場合は、エステル化を減圧下で行うことができる。更に、実際のエステル化前に、出発物質を乾燥することが有利であり得る。
【００２１】
産業上の応用例
本発明のステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸エステルは、液状生成物又は容易に融解するワックス状生成物である。本発明のステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸エステルは、乳化剤が存在しなくても水中で容易に乳化する。即ち、水中で自己乳化性である。ステロール及び／又はスタノールに関するこれらの有利な特性によって、本発明のステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸エステルは、ステロール源及び／又はスタノール源になる。即ち、ステロール及び／又はスタノールと同様の用途に使用できる。本発明によれば、ステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸エステルは、一方では、4-アンドロステン-3,17-ジオン（AD）及び／又は 4-アンドロスタジエン-3,17-ジオン（ADD）の発酵生産用原料として好ましく使用され、AD 及び ADD は、テストステロン、エストラジオール、エチニルエストラジオール、テストラクトン、プロゲステロン、コルチゾン、コルチゾール、プレドニゾン又はプレドニゾロンのような様々なステロイド誘導体の生産に使用され得る。AD 及び ADD の発酵生産では、ステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸を、エトキシル化ステロールの存在下でのコレステロールの発酵を記載している DE 3147834-A に開示されているのと同様の条件で反応させ、後処理する。より詳しい情報は、P. Fernandez らによる論説 "Microbial conversion of steroid compounds : recent developments", Enzyme and Microbial Techn., 第 32 巻、2003 年、第 688〜705 頁から入手できる。上記物質をステロール源として使用する場合、エステル分解のためのリパーゼの存在が重要である。
【００２２】
自己乳化特性によって、ステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸エステルを、乳化剤として、とりわけ化粧品組成物中及び食品中の乳化剤として使用できる。ステロール及び／又はスタノールのエーテルカルボン酸エステルは、o/w 及び w/o エマルション用の乳化剤として適している。使用量は用途によって決まり、一般に、個々の組成物に基づいて 0.1〜10 重量％、好ましくは 0.5〜5 重量％である。他の既知の乳化剤と組み合わせて使用することが、特に好ましい。適当な他の乳化剤は、例えば、以下の群の少なくとも 1 種から選ばれる非イオン性界面活性剤である：
・直鎖 C8〜22 脂肪アルコール、C12〜22 脂肪酸、アルキル基中に 8〜15 個の炭素原子を有するアルキルフェノール、及びアルキル基中に 8〜22 個の炭素原子を有するアルキルアミンの、エチレンオキシド 2〜30 mol 及び／又はプロピレンオキシド 0〜5 mol 付加物；
・アルキル基中に 8〜22 個の炭素原子を有するアルキル及び／又はアルケニルオリゴグリコシド、及びそのエトキシル化類似体；
・ヒマシ油及び／又は水素化ヒマシ油のエチレンオキシド 1〜15 mol 付加物；
・ヒマシ油及び／又は水素化ヒマシ油のエチレンオキシド 15〜60 mol 付加物；
・不飽和直鎖又は飽和分枝の 12〜22 個の炭素原子を有する脂肪酸及び／又は 3〜18 個の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸の、グリセロール部分エステル及び／又はソルビタン部分エステル、並びにそれらのエチレンオキシド 1〜30 mol 付加物；
【００２３】
・ポリグリセロール（平均自己縮合度 2〜8）、ポリエチレングリコール（分子量 400〜5,000）、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、糖アルコール（例えばソルビトール）、アルキルグルコシド（例えばメチルグルコシド、ブチルグルコシド、ラウリルグルコシド）及びポリグルコシド（例えばセルロース）と、飽和及び／又は不飽和の直鎖又は分枝の 12〜22 個の炭素原子を有する脂肪酸、及び／又は 3〜18 個の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸の部分エステル、並びにそれらのエチレンオキシド 1〜30 mol 付加物；
・ペンタエリスリトール、脂肪酸、クエン酸及び脂肪アルコールの混合エステル、及び／又は 6〜22 個の炭素原子を有する脂肪酸、メチルグルコース及びポリオール（好ましくはグリセロール又はポリグリセロール）の混合エステル；
・モノ-、ジ-及びトリ-アルキルホスフェート、及びモノ-、ジ-及び／又はトリ-PEG-アルキルホスフェート、並びにそれらの塩；
・羊毛ワックスアルコール；
・ポリシロキサン／ポリアルキル／ポリエーテルコポリマー及び対応する誘導体；
・ブロックコポリマー、例えばポリエチレングリコール-30 ジポリヒドロキシステアレート；
・ポリマー乳化剤、例えば Goodrich の Pemulen タイプ（TR-1, TR-2）；
・ポリアルキレングリコール；及び
・グリセロールカーボネート。
【００２４】
エーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルを、化粧品活性成分としても使用できる。
更に、請求項１に記載のエーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルを、コレステロール低下活性成分として、とりわけ食品及び／又は栄養補助食品中のコレステロール低下活性成分としても使用できる。例えば、エーテルカルボン酸のステロールエステル及び／又はスタノールエステルを、上記の引用文献に従って、マーガリン、サラダドレッシング及び調理用油のような食品中に、好ましくは製品に基づいて 0.1〜10 重量％の量で使用できる。ヒト及び動物の血中コレステロール値は、上記エステルの摂取、体内リパーゼによるエステルの分解、及びその結果起こるステロールの放出によって低下する。
【００２５】
実施例
Cognis Deutschland GmbH & Co. KG によって市販されている Generol R（登録商標）は、β-シトステロール 40〜60 重量％、カンペステロール 30〜45 重量％、ブラシカステロール 8〜18 重量％、スチグマステロール 0〜5 重量％、スチグマスタノール 0〜5 重量％、エルゴスタノール 0〜5 重量％の植物ステロール混合物（総含有量 90〜100 重量％）である。融点範囲は、130〜145 ℃である。
【実施例１】
【００２６】
反応フラスコ内で、Cognis Deutschland GmbH & Co. KG 製 Generol R（登録商標）（特性：OHV = 132；OHV から計算した平均分子量 = 425.1 g/mol）0.5 mol（212.3 g）及び花王（Kao）社製エーテルカルボン酸 Akypo LF 1（登録商標）（5 mol のエチレンオキシドでエトキシル化された n-オクタノールベースエーテルカルボン酸；酸価 118；平均分子量 474.4 g/mol）0.65 mol（308.1 g）を、140 ℃で 1 時間乾燥した。次いで、酸化カルシウム 0.8 g（0.15 重量％）をエステル化触媒として添加し、水流減圧下、200 ℃で 5 時間反応させた。約 60 ℃に冷却後、生成物をヌッチェフィルターで濾過した。表 1 に示した特性値を有する、室温で液状のエーテルカルボン酸を得た。鹸化価と酸価との差が、エステル化が起こったことを明らかに示している。
残留酸価は、不完全反応によって説明される。
【実施例２】
【００２７】
Cognis Deutschland GmbH & Co. KG 製 Generol R（登録商標）0.5 mol 及び Akypo LF 2（登録商標）（8 mol のエチレンオキシドでエトキシル化されたオクタノールベースエーテルカルボン酸；酸価 96.4）0.65 mol を実施例 1 と同様に反応させた。融点範囲が 30〜40 ℃で、表 1 に示した特性値を有するワックス様エーテルカルボン酸エステルを得た。
【実施例３】
【００２８】
Cognis Deutschland GmbH & Co. KG 製 Generol R（登録商標）0.5 mol 及び Akypo RLF 100（登録商標）（10 mol のエチレンオキシドでエトキシル化された C12/14-アルコールベースエーテルカルボン酸；活性成分含有量 85 重量％；酸価 74）0.65 mol を実施例 1 と同様に反応させた。融点範囲が 30〜40 ℃で、表 1 に示した特性値を有するワックス様エーテルカルボン酸エスエルを得た。
【実施例４】
【００２９】
水 90 g を、実施例 1〜3 で製造したエーテルカルボン酸エステル 10 g に添加し、撹拌した。各々の場合で、沈澱物がほとんどないベージュ色水性エマルションを得た。他の乳化剤を加える必要がなかったので、エステルは水に自己乳化性である。
得られたステロール混合物のエーテルカルボン酸エステルの特性値を、以下の表 1 に示す。
鹸化価（SV）は、DGF C-V 3 に従って測定した。
ヒドロキシル価（OHV）は、DGF C-V 17a に従って測定した。
酸価（AV）は、DIN 53402 に従って測定した。
【００３０】
【表１】
2006520349.tif 000003
【実施例５】
【００３１】
o/w エマルションの製造
o/w エマルションを、乳化剤、脂肪アルコール及びエモリエントを含む油相を 80 ℃に加熱し、撹拌しながら均一化することによる、標準的な加熱製法によって製造した。次いで、80 ℃に同様に加熱したグリセロール／水相を、80 ℃で撹拌しながら添加した。撹拌しながら混合物を冷却し、ホルマリンを防腐剤として添加した。
エマルションを、粘度（ブルックフィールド RVF、スピンドル 5、10 r.p.m.）及び安定性（1〜5 の光学スケール、1 が最高点、-5 ℃及び 40 ℃で 1 週間貯蔵後）について試験した。
o/w エマルションの配合（g で示した量）及び評価結果を、以下の表 2 に示す。
【００３２】
【表２】
2006520349.tif 000004
【００３３】
表 2 から、本発明のステロールのエーテルカルボン酸エステルは、それ自体で（実施例 5a）、及び共乳化剤と組み合わせて（実施例 5b）、乳化剤特性を有する。
【実施例６】
【００３４】
実施例 1 のステロール-EO エステルのステロイド前駆体への生体内変換
酵母エキス及びポテトデキストロース寒天（米国在 Difco 社製）、p.a. 純度のグリセロール（ドイツ国在 Riedel de Haeen 社製）、Tween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート）、4-アンドロステン-3,17-ジオン（AD）及び 1,4-アンドロスタジエン-3,17-ジオン（ADD）（米国在 Sigma 社製）を使用した。
細胞培養：マイコバクテリウム sp. NRRL B-3805 細胞を、斜面培養管内のポテトデキストロース寒天で培養した（42 g/l）。
接種材料：マイコバクテリウム sp. NRRL B-3805 細胞を、pH 7 のリン酸カリウム緩衝液（20 mM）中、酵母エキス（10 g/l）、グリセロール（10 g/l）、ステロールエステル（別途記載がない限り 1.0 g/l）、Tween 20（0.8 g/l）の複合培地 A で、30 ℃で 3 日間培養した。
次いで、細胞を、20 ml 又は 160 ml の同培地 A に導入した。24 時間培養後、1.4 l 接種するために培地 A を使用した（2 l 発酵槽（Braun Bio stat MD））。発酵過程は曝気を伴い（曝気速度 0.5 vvm）、発酵培地の pH を、NaOH（2 N）又は H2SO4（2 N）の添加によって pH 7 に調整した。形成された AD 濃度を測定するために、試料を採取した。
【００３５】
分析方法
発酵培地の試料を、一定間隔で定期的に採取し、内部標準としての二倍量のプロゲステロンの n-ヘプタン溶液（0.2 g/l）で抽出した。有機相を、HPLC によりステロール／ステロイド含有量について分析した。
実施例 1 のエステルの試料を、以下のようにして鹸化した：約 1 g の各エステルを、KOH の 0.5 M エタノール溶液 25 ml に添加し、28 ℃で一晩保温した。次いで、25 ml の NaCl 溶液（5 重量％）を添加し、全体を、25 ml のジエチルエーテルで抽出した。有機相を蒸発によって濃縮し、乾燥残渣を得た。約 6 mg の鹸化試料を 2 ml の内部標準溶液に溶解し、HPLC によってステロールを定量分析した。
【００３６】
発酵試験の間に、試料を採取し、以下のようにして鹸化した：KOH の 0.5 M エタノール溶液 2.5 ml を 500 ml の発酵試料に添加し、28 ℃で一晩保温した。次いで、25 ml の 5 重量％ NaCl 溶液を添加し、全体を、25 ml のジエチルエーテルで抽出した。有機相を蒸発によって濃縮し、得られた乾燥残渣を 1 ml の内部標準溶液に溶解し、HPLC によってステロールを定量分析した。
HPLC 分析（Lichrospher Si-60 カラム、粒度 10 μm）を、基質濃度及び生成物濃度を測定するため、1 ml/分の流速で行った（215〜254 nm での UV 検出）。移動相は、体積比 96：4 の n-ヘプタン及びエタノールからなっていた。
130 時間の発酵時間後、約 0.6 mM の 4-アンドロステン-3,17-ジオンが得られた。この結果は、本発明に従って、マイコバクテリウム sp. NRRL B-3805 細胞が、エステルを AD に転化できることを示している。
【国際調査報告】
2006520349.tif 000005
2006520349.tif 000006
2006520349.tif 000007
2006520349.tif 000008
2006520349.tif 000009
2006520349.tif 000010