(57)【要約】本発明は全体として、平滑筋細胞機能を変調する方法、およびそのために有用な薬剤に関する。より詳細には、本発明は、細胞内スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を変調することによって平滑筋の緊張を変調する方法に関する。本発明の方法はとりわけ、異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な平滑筋の緊張、特に異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な血管、気管支、または腸の平滑筋の緊張によって特徴付けられる状態の処置および/または予防において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の平滑筋細胞活性を変調する方法であって、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが該平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが該平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする、方法。
【請求項２】
哺乳動物における平滑筋細胞活性を調節する方法であって、該哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達活性を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが該平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが該平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする、方法。
【請求項３】
哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法であって、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが該平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが該平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする、方法。
【請求項４】
平滑筋細胞が血管、気管支、または腸の平滑筋細胞である、請求項1または2または3記載の方法。
【請求項５】
血管平滑筋細胞が動脈平滑筋細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
平滑筋細胞が胃、膀胱、または子宮の平滑筋細胞である、請求項1または2または3記載の方法。
【請求項７】
平滑筋細胞活性が平滑筋細胞の緊張である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
平滑筋細胞が気管支平滑筋細胞であり、かつ気管支平滑筋細胞の緊張の変調が緊張のダウンレギュレーションである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
平滑筋細胞が血管平滑筋細胞であり、かつ血管平滑筋細胞の緊張の変調が緊張のダウンレギュレーションである、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
平滑筋細胞が血管平滑筋細胞であり、かつ血管平滑筋細胞の緊張の変調が緊張のアップレギュレーションである、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
状態が過度の動脈抵抗であり、平滑筋細胞活性が動脈平滑筋細胞の緊張であり、かつスフィンゴシンキナーゼ活性の変調が活性のダウンレギュレーションである、請求項3記載の方法。
【請求項１２】
状態が高い血圧である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
高い血圧が高血圧症と相関する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
状態が不十分な動脈抵抗であり、平滑筋細胞活性が動脈平滑筋細胞の緊張であり、かつスフィンゴシンキナーゼ活性の変調が活性のアップレギュレーションである、請求項3記載の方法。
【請求項１５】
状態が低血圧症または敗血症性ショックである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
低血圧症がウォーターハウス-フリーデリックセン症候群と関連する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
敗血症性ショックが細菌性髄膜炎と関連する、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
状態が過度の気管支収縮であり、平滑筋細胞活性が気管支平滑筋細胞の緊張であり、かつスフィンゴシンキナーゼ活性の変調がダウンレギュレーションである、請求項3記載の方法。
【請求項１９】
過度の気管支収縮が喘息、アレルギー、またはアナフィラキシーショックと関連する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
変調がスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のアップレギュレーションであり、かつ該アップレギュレーションは、スフィンゴシンキナーゼ、またはその機能的等価物、誘導体、もしくはホモログをコードする核酸分子、あるいはスフィンゴシンキナーゼ発現産物、またはその機能的誘導体、ホモログ、アナログ、等価物、もしくは模倣物を平滑筋細胞に導入することによって達成される、請求項1〜7、10、または14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
変調が、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の転写的および/または翻訳的調節を変調するタンパク質性分子または非タンパク質性分子と平滑筋細胞を接触させることによって達成される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
変調がスフィンゴシンキナーゼレベルのアップレギュレーションであり、かつ該アップレギュレーションは、スフィンゴシンキナーゼ発現産物のアゴニストとして機能するタンパク質性分子または非タンパク質性分子と平滑筋細胞を接触させることによって達成される、請求項1〜7、10、または14〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
変調がスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のダウンレギュレーションであり、かつ該ダウンレギュレーションは、スフィンゴシンキナーゼ発現産物に対してアンタゴニストとして機能するタンパク質性分子または非タンパク質性分子と平滑筋細胞を接触させることによって達成される、請求項1〜9、11〜13、または18〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
分子が変異体スフィンゴシンキナーゼであり、この変異体が82位のグリシン残基のアスパラギン酸への置換によって特徴付けられる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
平滑筋細胞活性がインビボで変調される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
平滑筋細胞活性がインビトロで変調される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物における血管平滑筋細胞活性の調節のための医用薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的に有効なレベルを変調することが可能である薬剤の使用であって、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする、使用。
【請求項２８】
哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置のための医用薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的に有効なレベルを変調することが可能である薬剤の使用であって、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする、使用。
【請求項２９】
平滑筋細胞が血管、気管支、または腸の平滑筋細胞である、請求項27または28に記載の使用。
【請求項３０】
血管平滑筋細胞が動脈平滑筋細胞である、請求項29記載の使用。
【請求項３１】
平滑筋細胞が胃、膀胱、または子宮の平滑筋細胞である、請求項27または28記載の使用。
【請求項３２】
平滑筋細胞活性が平滑筋細胞の緊張である、請求項27〜31のいずれか一項記載の使用。
【請求項３３】
平滑筋細胞が気管支平滑筋細胞であり、かつ気管支平滑筋細胞の緊張の変調が緊張のダウンレギュレーションである、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
平滑筋細胞が血管平滑筋細胞であり、かつ血管平滑筋細胞の緊張の変調が緊張のダウンレギュレーションである、請求項32記載の使用。
【請求項３５】
平滑筋細胞が血管平滑筋細胞であり、かつ血管平滑筋細胞の緊張の変調が緊張のアップレギュレーションである、請求項32記載の使用。
【請求項３６】
状態が過度の動脈抵抗であり、平滑筋細胞活性が動脈平滑筋細胞の緊張であり、かつスフィンゴシンキナーゼ活性の変調が活性のダウンレギュレーションである、請求項28記載の使用。
【請求項３７】
状態が高い血圧である、請求項36記載の使用。
【請求項３８】
高い血圧が高血圧症と相関する、請求項37記載の使用。
【請求項３９】
状態が不十分な動脈抵抗であり、平滑筋細胞活性が動脈平滑筋細胞の緊張であり、かつスフィンゴシンキナーゼ活性の変調が活性のアップレギュレーションである、請求項28記載の使用。
【請求項４０】
状態が低血圧症または敗血症性ショックである、請求項39記載の使用。
【請求項４１】
低血圧症がウォーターハウス-フリーデリックセン症候群と関連する、請求項40記載の使用。
【請求項４２】
敗血症性ショックが細菌性髄膜炎と関連する、請求項40記載の使用。
【請求項４３】
状態が過度の気管支収縮であり、平滑筋細胞活性が気管支平滑筋細胞の緊張であり、かつスフィンゴシンキナーゼ活性の変調がダウンレギュレーションである、請求項28記載の使用。
【請求項４４】
過度の気管支収縮が、喘息、アレルギー、またはアナフィラキシーショックに関連する、請求項43記載の使用。
【請求項４５】
変調がスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のアップレギュレーションであり、かつアップレギュレーションが、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的等価物、誘導体、もしくはホモログをコードする核酸分子、あるいはスフィンゴシンキナーゼ発現産物、またはその機能的誘導体、ホモログ、アナログ、等価物、もしくは模倣物を平滑筋細胞に導入することによって達成される、請求項27〜32、35、または39〜42のいずれか一項記載の使用。
【請求項４６】
変調が、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子の転写的および/または翻訳的調節を変調するタンパク質性分子または非タンパク質性分子と平滑筋細胞を接触させることによって達成される、請求項27〜44のいずれか一項記載の使用。
【請求項４７】
変調がスフィンゴシンキナーゼレベルのアップレギュレーションであり、かつアップレギュレーションが、スフィンゴシンキナーゼ発現産物のアゴニストとして機能するタンパク質性分子または非タンパク質性分子と平滑筋細胞を接触させることによって達成される、請求項27〜32、35、または39〜42のいずれか一項記載の使用。
【請求項４８】
変調がスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のダウンレギュレーションであり、かつダウンレギュレーションが、スフィンゴシンキナーゼ発現産物に対してアンタゴニストとして機能するタンパク質性分子または非タンパク質性分子と平滑筋細胞を接触させることによって達成される、請求項27〜34、36〜38、または43〜44のいずれか一項記載の使用。
【請求項４９】
分子が変異体スフィンゴシンキナーゼであり、この変異体は82位のグリシン残基のアスパラギン酸への置換によって特徴付けられる、請求項48記載の使用。
【請求項５０】
平滑筋細胞活性がインビボで変調される、請求項27記載の使用。
【請求項５１】
平滑筋細胞活性がインビトロで変調される、請求項27記載の使用。
【請求項５２】
上記に定義したような変調剤と1種またはそれ以上の薬学的に許容されるキャリアおよび/または希釈剤とを含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は全体として、平滑筋細胞機能を変調する方法、およびそのために有用な薬剤に関する。より詳細には、本発明は、細胞内スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を変調することによって平滑筋の緊張を変調する方法に関する。本発明の方法は、異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な平滑筋の緊張、特に異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な血管、気管支、または腸の平滑筋の緊張によって特徴付けられる状態の処置および/または予防にとりわけ有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において著者によって引用された刊行物の参考文献一覧の詳細は、本明細書の末尾にアルファベット順にまとめられている。
【０００３】
本明細書におけるいかなる先行技術に対する言及も、その先行技術がオーストラリアにおける共通の一般的な知見の一部を形成することの承認またはいかなる形態の示唆でもなく、かつそのように取られるべきでもない。
【０００４】
前世紀の初期(1919)、Baylissは、緊張の増加を伴って伸長するように反応する平滑筋細胞の固有の特性を記述した。この効果は、経壁圧の増加に対して血管収縮を伴って応答する抵抗血管の自己調節特性（圧誘導性の筋原性血管収縮）のための基礎であり、「全体的な血圧の高さがどのようなものであろうと、それら血管によって供給される組織を通して一定の血流を可能な限り維持する」ことが提供された(Bayliss, W.M. (1919) J Physiol Lond 28:220〜231)。さらに、筋原性応答は全身の血圧に直接的に影響し、全体的な末梢抵抗の増加の３分の２までに寄与する(Metting, P.J., Stein, P.M., Stoos, B.A. et al. (1989) Am J Physiol 256:R98-R105)。
【０００５】
血圧は、血液が循環系を通して運ばれるときに動脈壁に対して作用する力である。この力は心臓のポンプ機能に関連して測定され、水銀柱ミリメートル(mmHg)で測定される。収縮期血圧は心臓が収縮または拍動するときに起こる圧力の測定値であり、拡張期血圧は拍動間、つまり心臓が弛緩するときに記録される測定値である。
【０００６】
高血圧症は、血流のために必要とされる力が正常よりも高いことを示す。Sixth Report of the Joint National Committee on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure (JNC VI)によると、130/85未満の血圧測定値は正常と見なされ、130〜140/85〜90は高めの正常と定義される。高血圧症は、一般的には一次性および二次性に分類される。一次性高血圧症は原因不明である。しかし、遺伝的および生活習慣的な要因（例えば、体重および塩消費量など）が高い血圧に寄与すると考えらる。高血圧症と診断された人の80〜90%がこのカテゴリーに適合する。他の原因を見い出すことができない場合にこのように診断されることも多い。二次性高血圧症は、通常、例えば腎臓疾患、クッシング症候群、妊娠、または慢性アルコール依存症などの別の医学的状態の存在によって引き起こされる。経口避妊薬、プレドニゾン、シクロスポリン、およびいくつかの他の治療もまた、薬物関連副作用としての高血圧症を引き起こす可能性がある。
【０００７】
人に高血圧症のリスクを負わせる要因はいくつか存在する。加齢、性別、遺伝、および人種は、制御不可能な要因である。高齢者はとりわけ、高血圧症の存在についての定期的なスクリーニングを受けることが奨励される。なぜなら、この状態はこの集団によく見られ、同定されれば処置可能であるからである。男性は一般的に女性よりもリスクが高い。しかし、女性が年齢を重ねるにつれて、女性のリスクは閉経の発生に伴って増大し、人生の後期において女性のリスクは男性のリスクを上回るほどである。遺伝は、一方または両方の親が高血圧症であると診断されている場合にリスク要因となり得る。
【０００８】
制御可能なリスク要因は生活習慣関連、つまり肥満、食事、運動不足、ストレス、特定の医用薬剤の使用、喫煙、および過度のアルコール消費である。
【０００９】
多くの人にとって、高血圧症が無症候性である場合、診断されないままであることが多い。しかし一部の人々は、頭痛、眩暈、不規則なもしくは急速な心拍、鼻血、疲労、および視力障害などの症候を経験することがある。成人の４人に１人が血圧の上昇を示し、彼らの30%より多くがこの事実に気付いていないと見積もられている。高血圧症を有する人はいかなる徴候も示さないことがあるため、彼らの高い血圧は合併症が発生するまで診断されないことも多い。
【００１０】
抵抗動脈で筋原性応答が開始し発展する手段はほとんど未知のままであるが、この点において、特に圧力に対する動脈平滑筋細胞の高度に再生可能な反応を誘導する筋フィラメントのカルシウム感受性の圧力依存的な増加に対する、細胞外カルシウムCa2+の膜を横切る流入を制御するメカニズムの協調的な調節に関して、限られた情報がある。従って、高血圧症の発症によって課せられる顕著な健康問題の観点から、不適切な血管平滑筋の緊張を治療的および/または予防的に処置する手段が開発され得るように、血管収縮を調節するメカニズムを解明することが緊急に必要である。
【００１１】
本発明につながる研究において、驚くべきことに、抵抗動脈における静止緊張および筋原性応答は、スフィンゴシンキナーゼの発現および活性を変化させることによって変調されることが決定された。特に、スフィンゴシンキナーゼは、微小血管の緊張の主要な決定要因であり、かつ筋原性応答の2つの主要な成分を組織化(orchestrate)するための有力な候補であることが同定された。本発明をいかなる1つの理論または作用様式に限定するものではないが、スフィンゴシンキナーゼは、機械的な力を細胞内シグナルに翻訳する経路の不可欠な構成成分であり、それゆえに、機械的な刺激を特定の細胞内シグナルに翻訳するすべての細胞型に対して非常に重要である。この細胞シグナル伝達のメカニズムの解明により、スフィンゴシンキナーゼの機能を調節することによって平滑筋収縮（特に、血管、気管支、および腸の平滑筋の収縮）を変調することに関する方法論の合理的設計が容易となる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈が他を必要としない限り、語「含む(comprise)」およびそのバリエーション(例えば、「含む(comprises)」または「含んでいる(comprising)」など)は、言及された整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を含むことを意味するが、任意の他の整数もしくは段階、または整数もしくは段階の群を含まないことを意味しないと理解される。
【００１３】
本発明の1つの局面は、平滑筋細胞活性を変調する方法に関し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００１４】
別の局面において、血管平滑筋細胞活性を変調する方法が特に提供され、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの血管平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの血管平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００１５】
なお別の局面において、気管支平滑筋細胞活性を変調する方法が提供され、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの気管支平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの気管支平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００１６】
さらに別の局面において、本発明は平滑筋細胞の緊張を変調する方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋の緊張をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋の緊張をダウンレギュレートする。
【００１７】
さらになお別の局面において、本発明は血管平滑筋細胞の緊張を変調する方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの血管平滑筋の緊張をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの血管平滑筋の緊張をダウンレギュレートする。
【００１８】
なおさらに別の局面において、本発明は気管支平滑筋細胞の緊張を変調する方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの気管支平滑筋の緊張をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの気管支平滑筋の緊張をダウンレギュレートする。
【００１９】
本発明のなお別の局面は、哺乳動物における平滑筋細胞活性を調節する方法に関し、この方法は、この哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達活性を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００２０】
本発明のさらになお別の局面は、哺乳動物における血管平滑筋細胞活性を調節する方法に関し、この方法は、この哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００２１】
別の局面において、本発明は、哺乳動物における気管支平滑筋細胞活性を調節する方法に関し、この方法は、この哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達活性を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの気管支平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの気管支平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００２２】
なおさらに別の局面において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をアップレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効なレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、有効量の薬剤をこの哺乳動物に投与する段階を含む。
【００２３】
さらに別の局面において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をアップレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効なレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分の有効量をこの哺乳動物に投与する段階を含む。
【００２４】
なお別のさらなる局面において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をアップレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効なレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分をコードするヌクレオチド配列の有効量をこの哺乳動物に投与する段階を含む。
【００２５】
さらに別のさらなる局面において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効でないレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、有効量の薬剤をこの哺乳動物に投与する段階を含む。
【００２６】
本発明のなお別のさらなる局面は、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００２７】
本発明の別の局面は、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な血管平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００２８】
別の局面において、本発明は、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な気管支平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法を意図し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００２９】
本発明のなお別の局面は、哺乳動物における血管平滑筋細胞活性の調節のための医用薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的に有効なレベルを変調することが可能である薬剤の使用に関し、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００３０】
さらに別の局面において、本発明は、平滑筋細胞活性の調節のための医用薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分、またはこの構成成分をコードする核酸分子の使用に関し、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートする。
【００３１】
さらになお別の局面において、本発明は、上記に定義したような変調剤ならびに1種またはそれ以上の薬学的に許容されるキャリアおよび/または希釈剤を含有する薬学的組成物を意図する。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、平滑筋細胞の緊張、特に血管平滑筋細胞の緊張を調節するシグナル伝達経路がスフィンゴシンキナーゼによって媒介されるという判断に、部分的に基礎を置いている。この発展により、異常なまたは望ましくない平滑筋細胞の緊張によって特徴付けられる状態の処置のための治療的および/または予防的方法の合理的設計が可能となる。
【００３３】
従って、本発明の1つの局面は、平滑筋細胞活性を変調する方法に関し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００３４】
「平滑筋細胞」との言及は、平滑筋組織の細胞に対する言及と理解されるべきである。本発明を任意の1つの理論または作用様式に限定するものではないが、平滑筋は、一般的に不随意性様式で機能する筋組織であり、はるかに高いアクチン:ミオシン比を示すこと、およびはるかに小さな部分のその休止の長さまで収縮する能力によって、横紋筋とは異なる。平滑筋細胞は、血管壁において、腸の周りに、および子宮において見い出される。収縮系およびその制御は、線維芽細胞および白血球などの運動性組織細胞のそれと類似している。語句「平滑筋細胞」はまた、平滑筋細胞の形態、表現型、および/または機能的活性の1つまたはそれ以上を示す細胞に対する言及としても理解されるべきであり、またその変異体または改変体に対する言及でもある。「改変体」には、発生の任意の分化段階において平滑筋細胞の形態学的もしくは表現型的特性または機能的活性のいくつかを示すがすべてを示すわけではない細胞が含まれるが、これらに限定されない。「変異体」には、天然にまたは非天然に改変された平滑筋細胞(例えば遺伝的に改変された細胞)が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
本発明の平滑筋細胞は発生の任意の分化段階にあり得ることが理解されるべきである。従って、細胞は未成熟であってもよく、それゆえに、さらなる分化の非存在下で機能的にコンピテントでなくてもよい。この点に関して、平滑筋細胞に分化する能力を保持している高度に未成熟な細胞(例えば幹細胞)は、それにも関わらず、適切な条件下で平滑筋細胞に分化するそれらの能力から、本明細書中で使用される「平滑筋細胞」の定義を満たすものと理解されるべきである。好ましくは、対象の平滑筋細胞は血管、胃、膀胱、腸、気管支、または子宮の平滑筋細胞である。
【００３６】
最も好ましくは、この平滑筋細胞は、血管、気管支、または腸の平滑筋細胞である。
【００３７】
従って、1つの好ましい態様において、血管平滑筋細胞活性を変調する方法がより特に提供され、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの血管平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの血管平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００３８】
別の好ましい態様において、気管支平滑筋細胞活性を変調する方法が提供され、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの気管支平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの気管支平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００３９】
平滑筋細胞「活性」との言及は、平滑筋細胞が、例えば血管平滑筋細胞の緊張を保持することが可能である、任意の1つまたはそれ以上の機能的活性に対する言及として理解されるべきである。「緊張(tone)」とは、平滑筋細胞の収縮(contractile)状態を意味する。この点に関して、本発明をいかなる1つの理論または作用様式に限定するものでないが、喘息などの状態と関連する時折の重篤な呼吸困難は、気管支平滑筋細胞の望ましくない収縮から生じる。この収縮は、多数の原因のいずれか1つによって引き起こされ得るが、アレルゲン(しばしば見かけは無害なもの)に対する望ましくない免疫応答が最も一般的な原因の1つである。このようなアレルゲンには、ハウスダストのダニ、食物(例えば、ナッツ)、ラテックス、薬物(例えば、ペニシリン)、ペットの毛、化学物質、または毒素(例えば、ハチ刺され)が含まれるが、これらに限定されない。望ましくない免疫学的応答は異なる様式で、例えば涙もしくは鼻水の流出またはくしゃみで明らかになることがあるが、これは、生命を脅かす可能性のある状況となり得る種々の程度の呼吸困難(例えば、咳、喘鳴、および呼吸の短縮)をもたらす応答である。このような状態においては、これらが、喘息、「アレルギー」(例えば、ペットもしくは食物のアレルギー)、またはアナフィラキシーとして分類され得るか否かに関わらず、観察される呼吸困難は、望ましくない免疫応答に起因する気管支平滑筋細胞の収縮に起因する。しかし、気管支平滑筋収縮を同様に生じるが、その状態は免疫学的原因と関連しない多数の状態が存在することもまた理解されるべきである。例えば、アナフィラキシー様反応はアナフィラキシーショックに似ているが免疫学的障害ではない。これらの状態の任意の1つまたはそれ以上の気管支収縮の徴候の処置には、気管支平滑筋細胞の収縮を開放する手段が有効であろう。
【００４０】
なお、いかなる場合においても本発明を限定することなく、かつ本発明の好ましい態様の別の文脈において、大動脈および他の全身動脈は、収縮および弛緩を介して動脈の半径を変化させ得る平滑筋によって取り囲まれている。これは、組織を通る血流を維持するための圧力のリザーバーとして動脈が機能することを可能にする。さらに、これは、血流に対する抵抗を変化させる手段を提供し、それによって、血圧を変化させる手段を効果的に提供する。詳細には、動脈の半径が減少するにつれて(平滑筋細胞の収縮により)、血流に対する動脈内の抵抗が顕著に増大する。動脈の周りの平滑筋の弛緩に関して、逆もまた真である。例えば、平滑筋の弛緩を介して動脈の半径が2倍になると、それが提供する抵抗は約16倍減少し、それゆえにそれを通る血流は16倍増大する。任意の所与の時点において、血管平滑筋は、収縮のある一定の基底レベル(しばしば「休止緊張」と呼ばれる)を示す。
【００４１】
小動脈は、異なる器官への相対的な血流分布を決定するための主要な原因である。各小動脈のための駆動圧は同一であるので、流れの違いは各小動脈によって提供される流れに対する抵抗の違いによって一般的に決定される。小動脈の長さはほぼ同じであり、かつ血液の粘度は比較的一定のままであるので、小動脈によって提供される抵抗の違いはそれらの半径の違いに大部分起因する。小動脈は、弛緩または収縮し得る平滑筋を含み(すなわち、平滑筋細胞「緊張」の変調)、それによって小動脈の内腔の半径を変化させる。従って、血流分布のパターンは、各器官および組織中の小動脈平滑筋収縮の程度に大部分依存する。小動脈の周りの平滑筋は、大部分が単一単位の平滑筋であり、かつ高い程度の固有の筋原性活性(すなわち、「自発的」収縮)を有する。この緊張が、小動脈によって提供される基底の抵抗の多くの割合の原因である。しかし、種々の生理学的要因が、収縮の程度を増加させるか、または減少させるかのいずれかのために細胞内カルシウム濃度を変化させることによって平滑筋に作用し、それによって血管の抵抗を変化させる。正常な生理学的状況における制御メカニズムは、局所的制御または外因性制御である2つの一般的カテゴリーの1つに分類される。局所的制御には、例えば、能動性充血および圧力自動調節(圧力誘導性筋原性血管収縮としても知られる)が含まれる。外因性制御には、交感神経およびホルモンによって提供されるものが含まれる。細胞内カルシウムレベルを変調することに加えて、平滑筋緊張が筋フィラメントカルシウム感受性の変調によって調節されることもまた決定されている。
【００４２】
従って、本発明は、なおより特定には、平滑筋細胞の緊張を変調する方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの平滑筋の緊張をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの平滑筋の緊張をダウンレギュレートする。
【００４３】
好ましくは、この平滑筋は、血管、気管支、胃、膀胱、腸、または子宮の平滑筋である。
【００４４】
従って、1つの好ましい態様において、本発明は、血管平滑筋細胞の緊張を変調する方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの血管平滑筋の緊張をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの血管平滑筋の緊張をダウンレギュレートする。
【００４５】
別の好ましい態様において、本発明は、気管支平滑筋細胞の緊張を変調する方法を提供し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることがこの気管支平滑筋の緊張をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることがこの気管支平滑筋の緊張をダウンレギュレートする。
【００４６】
「スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達」との言及は、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-リン酸の一方または両方、またはそれらの機能的誘導体もしくはホモログを利用する細胞内シグナル伝達経路に対する言及として理解されるべきである。スフィンゴシンキナーゼは、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性において鍵となる調節酵素であり、内因性スフィンゴ脂質メディエータースフィンゴシン-1-リン酸を生成するように作用する。なおさらに、いかなる場合においても本発明を限定することはないが、スフィンゴシンキナーゼおよびスフィンゴシン-1-リン酸は、平滑筋細胞の緊張、特に動脈血管平滑筋細胞の緊張の変調をもたらすRhoA/Rhoキナーゼ経路を活性化するシグナル伝達カスケードの一部であると考えられている。
【００４７】
「変調する」との言及は、対象の平滑筋細胞活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることに対する言及として理解されるべきである。平滑筋細胞活性を「ダウンレギュレートする」との言及は、それゆえに、平滑筋細胞の機能の1つまたはそれ以上の局面を妨害する、減少する(例えば、遅延する)、またはさもなくば阻害すること(例えば、動脈収縮を遅延させるか、または妨害すること)に対する言及として理解されるべきであり、「アップレギュレートする」との言及は、逆の意味を有すると理解されるべきである。
【００４８】
スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達「活性」との言及は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路が実行し得る活性のいずれか1つまたはそれ以上に対する言及として理解されるべきである。例えば、本発明をいかなる場合においても限定するものではないが、好ましい態様の1つに従って、筋原性の血管収縮は、スフィンゴシンキナーゼ依存性でそれゆえにスフィンゴシン-1-リン酸媒介性のRhoA/Rhoキナーゼ経路の活性化の、包括的なシグナル伝達制御の下で、RhoAおよびRhoキナーゼの活性によって制御される。これは、筋原性応答の不可欠な構成成分であることが決定された。スフィンゴシンキナーゼ/スフィンゴシン-1-リン酸媒介シグナル伝達以外のメカニズムによるRhoA/Rhoキナーゼ経路の活性化が、有意に小さな筋原性応答の誘導を生じる。この点に関して、対象のスフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-リン酸は、平滑筋細胞活性を変調するように直接的または間接的に機能し得ることが理解されるべきである。「間接的」変調とは、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-リン酸が平滑筋細胞の緊張を変調するように直接的には作用しないが、RhoA/Rhoキナーゼシグナル伝達メカニズムなどの介在メカニズムを介して機能することを意味する。しかし、対象のスフィンゴシンキナーゼ/スフィンゴシン-1-リン酸がまた、平滑筋細胞の緊張を変調するために、例えば、収縮装置に直接的にシグナルを送達することによって、平滑筋細胞の緊張を変調するように直接的に、すなわち、非スフィンゴシンキナーゼ経路分子が関与することなしに、作用し得ることが理解されるべきである。別の例においては、活性化に際して、スフィンゴシンキナーゼは、それがオートクライン様式および/またはパラクリン様式でS1Pレセプターに結合する場合に、細胞外空間にS1Pを放出する。これらのレセプターのいくつか(例えば、S1PR2、これは抵抗動脈において存在する)はRhoA/Rhoキナーゼ経路に関連する。さらなる経路はS1Pによる細胞内貯蔵部位からのCa2+の細胞内放出である。このメカニズムは、IP3とは別であることが示されている。これは、ミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)の活性化を介する収縮の変調を生じるRhoA非依存性経路である。従って、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の「活性」の変調は、シグナル伝達メカニズムをアップレギュレートするかまたはダウンレギュレートするかのいずれかに対する言及として理解されるべきである。このような変調は任意の適切な手段によって達成され得、以下を含む。
(i)スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-リン酸などのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分の絶対的レベルを変調して、これらの分子を多かれ少なかれ活性化のためおよび/または下流の標的と相互作用するために利用可能とする。
(ii)スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-リン酸などのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分を作用させるかまたは拮抗させて、これら分子のいずれか1つまたはそれ以上の分子の機能的有効性が増加されるかまたは減少されるかのいずれかであるようにする。例えば、スフィンゴシンキナーゼの半減期を増加させることにより、スフィンゴシンキナーゼの絶対的な細胞内濃度の増加を実際に必要とすることなく、スフィンゴシンキナーゼ活性の全体的レベルの増加を達成し得る。同様に、スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-リン酸の部分的な拮抗作用は、例えばこれらの分子をその下流の標的へのこれらの結合に関連する何らかの立体障害を導入する構成要素をカップリングすることによって、これらが提供するシグナル伝達の有効性を減少するように作用し得るが、必ずしも除去するものではない。従って、これは、この経路の構成成分の絶対的な濃度を必ずしもダウンレギュレートすることなく、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達をダウンレギュレートする手段を提供し得る。
【００４９】
スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを達成することに関して、この目的を達成するための手段は当業者に周知であり、以下を含むが、これらに限定されない。
(i)細胞のスフィンゴシンキナーゼ媒介経路の構成成分を発現する能力をアップレギュレートするために、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の構成成分、またはその機能的等価物、誘導体、もしくはアナログをコードする核酸分子を細胞に導入すること。
(ii)遺伝子の転写的および/または翻訳的調節を変調するタンパク質性分子または非タンパク質性分子を細胞に導入することであって、ここでこの遺伝子は、任意のスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成成分、特にスフィンゴシンキナーゼもしくはスフィンゴシン-1-リン酸、もしくはその機能的部分、またはスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分の発現を直接的もしくは間接的に変調する何らかの他の遺伝子であり得る。
(iii)スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分の発現産物(活性型または不活性型のいずれか)の1つまたはそれ以上、またはその機能的誘導体、ホモログ、アナログ、等価物、もしくは模倣物を細胞に導入すること。
(iv)スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の発現産物の1つまたはそれ以上の構成成分に対してアンタゴニストとして機能するタンパク質性分子または非タンパク質性分子を導入すること。
(v)スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の発現産物のアゴニストとして機能するタンパク質性分子または非タンパク質性分子を導入すること。
【００５０】
上記のタンパク質性分子は、任意の適切な供給源(例えば、天然の供給源、組換えの供給源、または合成の供給源)に由来し得、例えば、天然物のスクリーニングの後で同定された融合タンパク質または分子を含む。非タンパク質性分子との言及は、例えば、核酸分子に対する言及であり得るか、または天然の供給源(例えば、天然物のスクリーニングなど)に由来する分子であり得るか、または化学合成された分子であり得る。本発明は、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成要素のアナログ、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することができる低分子を意図する。
【００５１】
化学的アゴニストはスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成要素に必ずしも由来しなくてもよいが、特定のコンホメーションの類似性を共有してもよい。あるいは、化学的アゴニストは特定の生理化学的特性を満たすように詳細に設計され得る。アンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成要素がその通常の生物学的機能を実行することをブロック、阻害、またはさもなくば妨害することができる任意の化合物であり得る(例えばその活性化を妨害するか、またはさもなくば活性化された分子の下流の機能を妨害する分子など)。アンタゴニストには、哺乳動物細胞中でスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成要素の遺伝子またはmRNAの転写または翻訳を妨害するモノクローナル抗体およびアンチセンス核酸が含まれる。発現の変調はまた、抗原、RNA、リボソーム、DNAzyme、RNAアプタマー、抗体、または共抑制における使用に適切な分子を利用して達成され得る。上記の点(i)-(v)において言及されるタンパク質性分子および非タンパク質性分子は、本明細書中では集合的に「変調剤」といわれる。
【００５２】
本明細書中上記に規定した変調剤のスクリーニングは、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子（またはスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成要素をコードする任意の他の遺伝子）またはその機能的等価物もしくは誘導体を含む細胞を薬剤と接触させること、およびスフィンゴシンキナーゼタンパク質産生または機能的活性の変調、スフィンゴシンキナーゼをコードする核酸分子の発現の変調、または下流のスフィンゴシンキナーゼ細胞標的の活性もしくは発現の変調をスクリーニングすることを含むがこれに全く限定されない、いくつかの適切な方法の任意の1つによって達成され得る。このような変調の検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動度シフトアッセイおよび/またはスフィンゴシンキナーゼ活性のレポーターの読み取り(例えばルシフェラーゼ、CATなど)のような技術を利用して達成され得る。
【００５３】
スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその機能的等価物もしくは誘導体は、試験の対象物である細胞中に天然に存在し得るか、または試験目的のために宿主細胞にトランスフェクトされたものであってもよいことが理解されるべきである。さらに、天然に存在するかまたはトランスフェクトされた遺伝子は構成的に発現されてもよく、それによって、とりわけ核酸レベルまたは発現産物レベルのいずれかにおいてスフィンゴシンキナーゼ活性をダウンレギュレートする薬剤のスクリーニングのために有用であるモデルを提供し、あるいは遺伝子は活性化を必要としてもよく、それによって、とりわけスフィンゴシンキナーゼ発現をアップレギュレートする薬剤のスクリーニングのために有用であるモデルを提供する。さらに、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子が細胞にトランスフェクトされる程度に、その分子は完全なスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を含んでよく、またはそれは単に遺伝子の一部(例えばスフィンゴシンキナーゼ産物の発現を調節する部分など)を含んでよい。例えば、スフィンゴシンキナーゼプロモーター領域は試験の対象である細胞にトランスフェクトされ得る。この点に関して、プロモーターのみが利用される場合、プロモーター活性の変調を検出することは、例えば、プロモーターをレポーター遺伝子にライゲーションすることによって達成できる。例えば、プロモーターはルシフェラーゼまたはCATプロモーターにライゲーションされ得、その遺伝子の発現の変調はそれぞれ蛍光強度またはCATレポーター活性の変調を介して検出できる。
【００５４】
別の例において、検出の対象は、スフィンゴシンキナーゼ自体ではなく、下流のスフィンゴシンキナーゼ調節標的であり得る（例えばスフィンゴシン-1-リン酸）。なお別の例には、最小のレポーターにライゲーションされたスフィンゴシンキナーゼ結合部位が含まれる。例えば、スフィンゴシンキナーゼ活性の変調は平滑筋細胞の機能的活性の変調をスクリーニングすることによって検出できる。これは、スフィンゴシンキナーゼ発現の変調自体が検出の対象ではない場合の間接的システムの例である。むしろ、スフィンゴシンキナーゼがその発現を調節する分子の変調がモニターされる。
【００５５】
これらの方法は、例えば合成のライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学ライブラリー、および天然のライブラリーを含むタンパク質性または非タンパク質性の薬剤などのような推定変調因子のハイスループットスクリーニングを実行するためのメカニズムを提供する。これらの方法はまた、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子もしくはその発現産物のいずれかを結合するか、または上流の分子(この上流の分子は続いてスフィンゴシンキナーゼ発現または発現産物の活性を変調する)の発現を変調する薬剤の検出を容易にする。従って、これらの方法は、スフィンゴシンキナーゼの発現および/または活性を直接的または間接的のいずれかで変調する薬剤を検出するためのメカニズムを提供する。
【００５６】
本発明の方法に従って利用される薬剤は任意の適切な形態を取り得る。例えば、タンパク質性薬剤は、種々の程度まで、グルコシル化されてもよくもしくはグルコシル化されなくてもよく、リン酸化されてもよくもしくは脱リン酸化されていてもよく、および/または、タンパク質と共に使用され、連結され、結合され、またはさもなくば関連する様々な他の分子(例えばアミノ酸、脂質、炭水化物、または他のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質)を含んでもよい。同様に、対象の非タンパク質性分子もまた、任意の適切な形態を取り得る。本明細書中に記載されるタンパク質性薬剤および非タンパク質性薬剤は両方とも、任意の他のタンパク質性分子または非タンパク質性分子と連結、結合、さもなくは関連され得る。例えば、本発明の1つの態様において、薬剤は局在領域への標的化を可能にする分子に関連する。
【００５７】
対象のタンパク質性分子または非タンパク質性分子は、スフィンゴシンキナーゼの発現またはスフィンゴシンキナーゼ発現産物の活性を変調するために直接的または間接的のいずれかで作用し得る。該分子は、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子または発現産物に関連する場合、直接的に作用し、それぞれ発現または活性を変調する。該分子は、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子または発現産物以外の分子に関連する場合であって、他の分子がそれぞれスフィンゴシンキナーゼ核酸分子または発現産物の発現または活性を直接的または間接的のいずれかで変調する場合、間接的に作用する。従って、本発明の方法は、調節段階のカスケードの誘導を介するスフィンゴシンキナーゼ核酸分子発現または発現産物活性の調節を含む。
【００５８】
用語「発現」とは、核酸分子の転写および翻訳をいう。「発現産物」との言及は、核酸分子の転写および翻訳から生じる産物に対する言及である。「変調」との言及は、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションに対する言及であると理解されるべきである。
【００５９】
本明細書中に記載される分子の「誘導体」(例えばスフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシン-1-リン酸、または他のタンパク質性薬剤もしくは非タンパク質性薬剤)には、天然の供給源または天然でない供給源のいずれかからのフラグメント、部分(parts)、部分(portion)、または改変体が含まれる。天然でない供給源には、例えば、組換え供給源または合成供給源が含まれる。「組換え供給源」は、対象の分子がそこから収集される細胞供給源が遺伝的に変化されていることを意味する。このことは、例えばその特定の細胞供給源による産生の速度および量を増加またはさもなくば向上させるために起こり得る。部分またはフラグメントには、例えば分子の活性領域が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換に由来し得る。アミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端融合物および/またはカルボキシ末端融合物、ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入が含まれる。挿入アミノ酸配列改変体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基がタンパク質中の所定の部位に導入されるが、得られる産物の適切なスクリーニングを用いるランダムな挿入もまた可能である。欠失改変体は、配列からの1つまたはそれ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。置換アミノ酸改変体は、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸配列への付加には、上記に詳述したように、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合が含まれる。
【００６０】
誘導体にはまた、ペプチド、ポリペプチド、または他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の分子に融合された特定のエピトープまたは全体のタンパク質の部分を有するフラグメントが含まれる。例えば、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体は、細胞への侵入を容易にするための分子に融合され得る。本明細書中で意図される分子のアナログには、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の取り込み、ならびに架橋剤の使用およびコンホメーションの制約をタンパク質性分子またはそれらのアナログに課す他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明の方法に従って利用され得る核酸配列の誘導体も同様に、他の核酸分子との融合を含む、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失、および/または付加に由来し得る。本発明において利用される核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、PCRプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制および融合における使用に適した分子が含まれる。核酸配列の誘導体にはまた、縮重改変体が含まれる。
【００６２】
スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-リン酸の「改変体」は、それが改変体であるスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-リン酸の型の少なくとも何らかの機能的活性を示す分子を意味すると理解されるべきである。バリエーションは任意の型を取り得、天然の供給源または天然に存在しない供給源であり得る。変異体分子は修飾された機能的活性を示すものである。
【００６３】
「ホモログ」は、その分子が本発明の方法に従って扱われているもの以外の種に由来することを意味する。これは、例えば、扱われているもの以外の種が、扱われる対象によって天然に産生されるスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-リン酸に対して同様で適切な機能的特徴を示すスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-リン酸の型を産生することが決定される場合に起こり得る。
【００６４】
化学的等価物および機能的等価物は、対象の分子の機能的活性の任意の1つまたはそれ以上を示す分子として理解されるべきであり、その機能的等価物は、任意の供給源に由来するものであってよい(例えば天然物スクリーニングなどのようなスクリーニングプロセスを介して化学合成または同定される)。例えば化学的または機能的等価物は、周知の方法(例えばコンビナトリアルケミストリーまたは組換えライブラリーのハイスループットスクリーニングまたは天然物スクリーニングに従うことなど)を利用して設計および/または同定することができる。
【００６５】
例えば、有機低分子を含むライブラリーがスクリーニングされ得、ここで多数の特定の親となる基の置換を有する有機分子が使用される。全体的な合成スキームは公開された方法に従えばよい(例えば、Bunin BA, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4708-4712; DeWitt SH, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6969-6913)。手短に述べると、各連続的な合成段階において、複数の異なる選択された置換基の1つがアレイにおけるチューブの選択されたサブセットの各々に加えられ、チューブのサブセットの選択は、ライブラリーを産生する際に利用される異なる置換基のすべての可能な順列を生成することなどである。1つの適切な順列ストラテジーは米国特許第5,763,263号に概説されている。
【００６６】
生物学的に活性な化合物を探索するためにランダムな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを使用することに、現在広い関心が寄せられている(例えば、米国特許第5,763,263号を参照されたい)。この型のライブラリーをスクリーニングすることによって発見されたリガンドは、天然のリガンドを模倣するかもしくはブロックする際に、または生物学的標的の天然に存在するリガンドを妨害する際に有用であり得る。本発明の文脈において、例えば、これらは、より強力な薬理学的効果などの特性を示すスフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸アナログを開発することのための出発点として使用され得る。スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸またはその機能的部分は、本発明に従って、種々の固相または液相の合成方法によって形成される組み合わせライブラリーにおいて使用され得る(例えば米国特許第5,763,263号およびその引用文献を参照されたい)。米国特許第5,753,187号において開示されるような技術の使用によって、数百万の新規な化学的および/または生物学的な化合物が数週間未満で日常的にスクリーニングされ得る。同定された多数の化合物の中で、適切な生物学的活性を示すもののみがさらに分析される。
【００６７】
ハイスループットライブラリースクリーニング方法に関して、選択された生物学的薬剤(例えば生体分子、高分子複合体、または細胞など)と特異的に相互作用可能であるオリゴマー性または低分子ライブラリー化合物は、様々な周知の方法(例えば上記のものなど)から当業者によって容易に選択されるコンビナトリアルライブラリーデバイスを利用してスクリーニングされる。このような方法において、ライブラリーの各メンバーは、選択された薬剤と特異的に相互作用する能力についてスクリーニングされる。この方法を実施する場合、化合物を含むチューブに生物学的薬剤を引き入れ、各チューブ中で個々のライブラリー化合物と相互作用させる。この相互作用は、望ましい相互作用の存在をモニターするために使用され得る検出可能なシグナルを産生するように設計される。好ましくは、この生物学的薬剤は水溶液中に存在し、さらなる条件は所望の相互作用に依存して適合される。検出は、例えば物質の検出のための任意の周知の機能ベースまたは非機能ベースの方法によって実行され得る。
【００６８】
スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸の活性を模倣する分子をスクリーニングすることに加えて、平滑筋細胞活性を変調することに関するスフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸の機能的活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために、スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸に対してアゴニスト的またはアンタゴニスト的に機能する分子を同定および利用することが望ましい場合もある。このような分子の使用を以下にさらに詳細に記載する。対象の分子がタンパク質性である場合、例えば、融合タンパク質を含む天然のまたは組換えの供給源に由来し得るか、または例えば、上記のスクリーニング方法に従う。非タンパク質性分子は、例えば、上記に同定した方法論に従ってまた同定または生成された化学的分子または合成分子であり得る。従って、本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができるスフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸の化学的アナログの使用を意図する。化学的アゴニストはスフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸に必ずしも由来しなくてもよいが、特定のコンホメーションの類似性を共有してよい。あるいは、化学的アゴニストはスフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸の特定の物理化学的特性を模倣するように特異的に設計され得る。アンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸がその通常の生物学的機能を実行することをブロック、阻害、またはさもなくば妨害することができる任意の化合物であり得る。アンタゴニストには、スフィンゴシンキナーゼおよび／もしくはスフィンゴシン-1-リン酸またはスフィンゴシンキナーゼおよび／もしくはスフィンゴシン-1-リン酸の一部に特異的なモノクローナル抗体が含まれる。
【００６９】
スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸のアナログまたは本明細書中で意図されるスフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸のアゴニスト性またはアンタゴニスト性薬剤のアナログには、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および/または誘導体の取り込み、ならびに架橋剤の使用およびコンホメーションの制約をそれらのアナログに課す他の方法が含まれるが、これらに限定されない。これらの修飾を取り得る特定の型は、対象の分子がタンパク質性であるかまたは非タンパク質性であるかに依存する。特定の修飾の性質および/または適合性は当業者によって日常的に決定され得る。
【００７０】
例えば、本発明によって意図される側鎖の修飾の例には、例えばアルデヒドを用いる反応による還元的アルキル化、続いてNaBH4を用いる還元によるアミノ基の修飾；メチルアセトイミデートを用いるアミジン化；無水酢酸を用いるアシル化；シアン酸を用いるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いるアミノ基のトリニトロベンゼン化；無水コハク酸およびテトラヒドロフタル酸無水物を用いるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール-5-リン酸を用いるリジンのピリドキシル化、続いてNaBH4を用いる還元が含まれる。
【００７１】
アルギニン残基のグアニジン基は、例えば2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬を用いるヘテロ環縮合生成物の形成によって修飾され得る。
【００７２】
カルボキシル基はO-アシルイソウレア形成、その後の引き続く誘導体化(例えば対応するアミドまで)を介するカルボジイミド活性化によって修飾され得る。
【００７３】
スルフヒドリル基は、例えばヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いるカルボキシルメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物を用いる混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドを用いる反応；4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル水銀クロライド、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、および他の水銀剤を使用する水銀誘導体の形成；アルカリpHにおけるシアン酸を用いるカルバモイル化のような方法によって修飾され得る。
【００７４】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシニミドを用いる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはスルフェニルハライドを用いるインドール環のアルキル化によって修飾され得る。他方、チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いるニトロ化によって変化させ、3-ニトロチロシン誘導体を形成させ得る。
【００７５】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化またはジエチルピロカーボネートを用いるN-カルボエトキシル化によって達成され得る。
【００７６】
タンパク質合成の間に非天然アミノ酸および誘導体を取り込むことの例には、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で意図される非天然アミノ酸のリストを表1に示す。
【００７７】
（表１）
2006521293.tif 000002
2006521293.tif 000003
2006521293.tif 000004
【００７８】
架橋剤は、例えば、ホモ二官能性架橋剤(例えばn=1からn=6の(CH2)nスペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシニミドエステルなど)、ならびにN-ヒドロキシスクシニミドのようなアミノ反応性部分および別の基特異的反応性部分を通常含むヘテロ二官能性試薬を使用して、3Dコンホメーションを安定化するために使用され得る。
【００７９】
スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の「機能的に有効なレベル」または「機能的に有効でないレベル」のいずれかを達成することに対する本明細書中における言及は、平滑筋細胞活性、特に血管または気管支の平滑筋細胞の緊張の変調が、それがアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであるかに関わらず達成され得るシグナル伝達のレベルを達成することに対する言及として理解されるべきである。この点に関して、日常的な手順を利用して、シグナル伝達の閾値レベル（それよりも上であれば平滑筋細胞活性がアップレギュレートされ得、それよりも下であれば平滑筋細胞活性がダウンレギュレートされる）を決定することは、当該技術分野における当業者の技能の範囲内にある。例えば、スフィンゴシンキナーゼのリン酸化状態または細胞局在を調節する任意の方法がこの点に関する使用のために適切であり、スフィンゴシンキナーゼのRNA合成の変化に基づく任意の方法も同様である(例えば、アンチセンス構築物、DNAザイム、またはRNAiは、タンパク質のレベルを変化させ得る)。「有効なレベル」との言及は、望ましい応答を少なくとも部分的に達成するために必要であるレベルを意味すると理解されるべきである。この量は、処置される細胞集団および/または個体の健康および肉体的な状態、処置される細胞集団および/または個体の分類学的グループ、所望されるアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの程度、利用される組成物の処方、医学的状況の評価、ならびに他の関連する因子に依存して異なる。従って、このレベルは個体の状況間で変化し得、そのため日常的な治験を通して決定され得る広い範囲を含むと考えられる。
【００８０】
本発明をいかなる1つの理論または作用様式にも限定するものではないが、1つの好ましい態様という意味での例示として、スフィンゴシンキナーゼ-1がスフィンゴシンをリン酸化して、スフィンゴシン-1-リン酸のレベルの上昇を生じ、それによって血管平滑筋のカルシウム感受性を増大させることが挙げられる。しかし、カルシウムに対して収縮装置の感作をもたらすことに加えて、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路はまた、筋原性応答のための開始シグナルである細胞内カルシウム濃度の増大をもたらす。この効果は、スフィンゴシンキナーゼが速い応答系であり、かつ血管収縮を誘導し得る両方の主要な経路、すなわちCa2+依存性およびRhoA媒介Ca2+非依存性経路の調節に関与することを示す。これは、スフィンゴシンキナーゼをこのような強力な血管収縮因子にする独特な状況である。これらの経路は別々には活性化されず、正確な空間的時間的相互作用においてスフィンゴシン-1-リン酸によって同時に開始されることがさらに決定された。特に、スフィンゴシン-1-リン酸は、RhoA/Rhoキナーゼ経路を介して動脈において圧力で誘導される筋原性収縮を増強した。しかし、スフィンゴシン-1-リン酸は、Rho非依存性様式で平滑筋のカルシウム感作を増強する。従って、休止緊張の確立および維持と、刺激（圧力誘導性刺激か、他の手段、例えばホルモンによる刺激かに関わらず）に続いて起こる筋原性応答の程度の両方は、スフィンゴシンキナーゼの発現および活性を変化させることによって変調され得る。従って、この分子は、直接的およびRhoA/Rhoファミリー分子を介しての両方で、血管緊張の主要な決定因子である。
【００８１】
本発明の方法は、インビトロおよびインビボの両方で機能する平滑筋細胞の変調を意図する。好ましい方法はインビボで個体を処置することであるが、それにも関わらず、本発明の方法は、例えば血管平滑筋細胞の緊張の分析のインビトロモデルを提供するために、インビトロ環境において適用され得ることが望ましいこともあると理解されるべきである。別の例において、インビトロ環境における本発明の方法の応用は、本明細書中上記されたものなどのスクリーニング技術のための読み取りメカニズムを提供することに拡張され得る。すなわち、これらのスクリーニング技術を利用して同定された分子は、本発明の方法に従って機能的に変調された平滑筋細胞に対してそれらの機能的効果の程度および/または性質を観察するためにアッセイされ得る。
【００８２】
好ましい方法は、平滑筋細胞の緊張をダウンレギュレートすること、例えば動脈抵抗(例えば高血圧症の進行をダウンレギュレートするため、または組織へのより多くの血流を促進するため)、または気管支収縮をダウンレギュレートすることであるが、平滑筋細胞の緊張をアップレギュレートすることが所望される状況もまた存在し得ることが理解されるべきである。例えば、低血圧症は、血管の緊張を増大させることが所望される1つの例である。従って、敗血症性ショックにおいても所望される。本発明をいかなる場合においても限定することはないが、敗血症性ショックを有する患者は、大量の平滑筋iNOS(誘導性NOシンターゼ)誘導のために正常な割合を少なくとも1000倍超えるNO出力を伴い、最大の末梢血管拡張に苦しむ。血圧を維持するために、心臓出力が劇的に増大される。これらのことは、大部分が患者(とりわけ細菌性髄膜炎、ウォーターハウス-フリーデリックセン症候群の末期段階にある小児)にとって致命的である。大量のNO産生を妨害するためのストラテジーはNOSインヒビターを適用することである。不運なことに、これらのインヒビターは、iNOSのみを阻害するのに十分に特異的ではなく、重要な内皮アイソフォーム(eNOS)も阻害する。それゆえに、これらのストラテジーは、初期の病態生理学的な状態、すなわち高血圧性クリーゼを生じる末梢抵抗の増大という正反対のものを生じる。この型のショックのために、抵抗動脈のNO依存性拡張を妨害する血管収縮剤、例えば本発明によって提供されるようなものを使用することが望ましい。
【００８３】
従って、本発明の別の局面は、哺乳動物における平滑筋細胞活性を調節する方法に関し、この方法は、哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達活性を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００８４】
好ましくは、平滑筋は、血管、気管支、胃、腸、または子宮の平滑筋である。
【００８５】
より詳細には、本発明は、哺乳動物における血管平滑筋細胞活性を調節する方法に関し、この方法は、哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００８６】
別の好ましい態様において、本発明は、哺乳動物における気管支平滑筋細胞活性を調節する方法に関し、この方法は、哺乳動物におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達活性を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが気管支平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが気管支平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００８７】
好ましくは、平滑筋細胞活性は平滑筋細胞の緊張である。
【００８８】
スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達活性の変調は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分をコードする核酸分子、またはこの構成成分の機能的活性のいずれか1つもしくはそれ以上、または構成成分をコードする遺伝子の発現の変調をもたらす薬剤(本明細書中では集合的に「変調剤」と呼ばれる)の投与によって達成される。
【００８９】
従って、1つの好ましい態様において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をアップレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効なレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、有効量の薬剤を哺乳動物に投与する段階を含む。
【００９０】
別の好ましい態様において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をアップレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効なレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む。
【００９１】
なお別の好ましい態様において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をアップレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効なレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の構成成分をコードするヌクレオチド配列の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む。
【００９２】
さらに別の好ましい態様において、哺乳動物における平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする方法が提供され、この方法は、機能的に有効でないレベルのスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を誘導するために十分な時間の間および条件下で、有効量の薬剤を哺乳動物に投与する段階を含む。
【００９３】
これらの好ましい態様によると、平滑筋細胞活性は、好ましくは血管平滑筋細胞の緊張である。
【００９４】
さらに別の好ましい態様において、平滑筋は、血管、気管支、胃、膀胱、腸、または子宮の平滑筋である。
【００９５】
最も好ましくは、平滑筋は血管または気管支である。
【００９６】
「誘導する」との言及は、機能的に有効なレベルであるか機能的に有効でないレベルであるかに関わらず、所望のスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達レベルを達成することに対する言及として理解されるべきである。この誘導は、本明細書中に上記したようなスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達経路の1つまたはそれ以上の構成成分の機能的活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって達成される可能性が最も高いが、誘導を達成するための任意の他の適切な手段が、それにも関わらず、これとともに本発明の方法に含まれる。
【００９７】
本発明のさらなる局面は、疾患状態または他の望ましくない状態の処置および/または予防に関連する本発明の使用に関する。本発明をいかなる１つの理論または作用様式にも限定することはないが、平滑筋細胞活性、特に血管または気管支の平滑筋細胞の緊張の調節は、それぞれ血圧および呼吸を制御することに関して必須の要件である。
【００９８】
それゆえに、本発明は、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法を意図し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【００９９】
好ましくは、平滑筋は、血管、気管支、胃、膀胱、腸、または子宮の平滑筋である。
【０１００】
最も好ましくは、平滑筋は血管または気管支である。
【０１０１】
最も好ましくは、平滑筋細胞活性は平滑筋細胞の緊張である。
【０１０２】
「異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な」平滑筋細胞活性との言及は、不活性化された機能、それが望ましくないという点で不適切である生理学的には正常な機能、または過剰に活性である平滑筋細胞機能に対する言及として理解されるべきである。本明細書中上記に詳述したように、平滑筋細胞機能、特に平滑筋細胞の緊張の正しいレベルの誘導に依存する多数の状態が存在する。例えば、本明細書中に開示される好ましい態様に関して、高血圧症を発症している個体において、血管平滑筋細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のダウンレギュレーションは動脈抵抗を減少する手段を提供し、それによって個体の血圧を減少する。望ましくない気管支収縮(例えば喘息またはアナフィラキシーショックによって誘導されるような)という意味において、気管支平滑筋細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のダウンレギュレーションは気道を拡張する手段を提供し、それによって呼吸困難を緩和する。
【０１０３】
それゆえに、本発明は好ましくは、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な血管平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法を意図し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【０１０４】
好ましくは、血管平滑筋活性は血管平滑筋細胞の緊張である。最も好ましくは、該状態は高血圧症であり、かつ平滑筋細胞の収縮は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のダウンレギュレーションを介して弛緩される。
【０１０５】
別の好ましい態様において、本発明は、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはさもなくば不適切な気管支平滑筋細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法を意図し、この方法は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的活性を変調する段階を含み、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【０１０６】
好ましくは、気管支平滑筋細胞活性は気管支平滑筋細胞の緊張である。最も好ましくは、該状態は喘息であり、平滑筋細胞の収縮は、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達のダウンレギュレーションを介して弛緩される。
【０１０７】
「有効量」は、少なくとも部分的に、望ましい応答を達成するか、または発症を遅らせるかもしくは進行を阻害するか、または処置される特定の状態の発症もしくは進行を全体的に中断するために必要である量を意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体的な状態、処置される個体の分類学的なグループ、所望される保護の程度、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連する因子に依存して異なる。この量は、日常的な治験を通して決定され得る比較的広い範囲に収まることが予想される。
【０１０８】
本明細書中における「処置」および「予防」に対する言及は、その最も広い意味でとらえるべきである。用語「処置」は、被験体が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防」は、被験体が最終的に疾患状態に罹患しないことを必ずしも意味しない。従って、処置および予防には、特定の状態の徴候の寛解、または特定の状態を発症するリスクを妨害もしくは減少させることが含まれる。用語「予防」は、特定の状態の重篤度または発症を減少させることと見なされ得る。「処置」はまた、すでに存在している状態の重篤度を減少させ得る。
【０１０９】
本発明はさらに、例えば、望ましい治療的なまたは予防的な結果を容易にし得る他のタンパク質性または非タンパク質性の分子と共に変調剤を投与するなどの、治療の組み合わせを意図する。
【０１１０】
本明細書中上記に記載した本発明の分子[本明細書中では集合的に「変調剤」と呼ばれる]の薬学的組成物の形態での投与は、任意の便利な手段によって実行され得る。薬学的組成物の変調剤は、特定の場合に依存する量で投与された場合に治療活性を示すことが意図される。バリエーションは、例えば、ヒトまたは動物、および選択された変調剤に依存する。広い範囲の用量が適用可能であり得る。患者を想定すると、例えば、約0.1mgから約1mgまでの変調剤が1日当たり体重1キログラム当たりに投与され得る。投薬レジメは最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、いくつかの分割された用量が毎日、毎週、毎月、もしくは他の適切な時間間隔で投与され得、あるいは用量は状況の緊急性に示されるのに応じて比例的に減少され得る。
【０１１１】
変調剤は、便利な様式、例えば経口、静脈内(水溶性である場合)、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、もしくは坐剤経路、または移植(例えば、徐放性分子を使用して)などにより投与され得る。変調剤は、酸付加塩または金属複合体、例えば、亜鉛、鉄などとの塩(これらは本願の目的のための塩と見なされる)のような薬学的に許容される非毒性塩の形態で投与され得る。このような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性成分が錠剤型で投与される場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含み得る。
【０１１２】
投与経路には、呼吸器、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、くも膜下腔内、脳内、鼻腔内、注入、経口、直腸、IVドリップパッチを介して、および移植が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、投与経路は経口である。
【０１１３】
これらの方法に従って、本発明に従って規定される薬剤は1つまたはそれ以上の他の化合物または分子と同時投与され得る。「同時投与される」は、同じまたは異なる経路を介する同じ製剤または2つの異なる製剤中での同時投与、あるいは同じまたは異なる経路による連続的投与を意味する。例えば、対象のスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-リン酸は、その効果を向上させるためにアゴニスト性薬剤と共に投与され得る。あるいは高血圧症の場合、例えば、スフィンゴシンキナーゼおよび／またはスフィンゴシン-1-リン酸アンタゴニストは他の高血圧症薬物と共に投与され得る。「連続的」投与は、2種類の分子の投与間の時間的な差（秒、分、時間、または日数）を意味する。これらの分子は任意の順序で投与され得る。
【０１１４】
本発明の別の局面は、哺乳動物における平滑筋細胞活性の調節のための医用薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能的に有効なレベルを変調することが可能な薬剤の使用に関し、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが血管平滑筋細胞活性をアップレギュレートし、かつスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効でないレベルまでダウンレギュレートすることが平滑筋細胞活性をダウンレギュレートする。
【０１１５】
本発明の別の局面は、平滑筋細胞活性の調節のための医用薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の構成成分またはこの成分をコードする核酸分子の使用に関し、ここで、スフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達を機能的に有効なレベルまでアップレギュレートすることが平滑筋細胞活性をアップレギュレートする。
【０１１６】
好ましくは、平滑筋は、血管、気管支、胃、膀胱、腸、または子宮の平滑筋である。
【０１１７】
より好ましくは、対象平滑筋は血管平滑筋であり、活性は緊張である。最も好ましくは、活性はダウンレギュレートされる収縮である。
【０１１８】
別の好ましい態様において、平滑筋は気管支平滑筋であり、活性は緊張である。最も好ましくは、活性はダウンレギュレートされる収縮である。
【０１１９】
本明細書中で使用される用語「哺乳動物」および「被験体」は、ヒト、霊長類、家畜動物(例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ)、実験動物(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコ)、および捕獲された野生動物(例えば、キツネ、カンガルー、シカ)を含む。好ましくは哺乳動物はヒトまたは実験動物である。さらにより好ましくは哺乳動物はヒトである。
【０１２０】
なお別のさらなる局面において、本発明は、本明細書中上記に規定したような変調剤と、1つもしくはそれ以上の薬学的に許容される担体および/または希釈剤とを含む薬学的組成物を意図する。該薬剤を活性成分と呼ぶ。
【０１２１】
注射としての使用のために適切な薬学的形態は、滅菌水溶液(水溶性の場合)もしくは分散物、および滅菌注射用溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末を含み、またはクリーム形態もしくは局所的適用のために適切な他の形態であり得る。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤（superfactant）の使用によって維持され得る。微生物の作用の妨害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤(例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど)によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤(例えば、糖または塩化ナトリウム)を含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤(例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を使用することによってもたらされ得る。
【０１２２】
滅菌注射用溶液は、上記に列挙された種々の他の成分と共に適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物を組みこみ、必要であればその後にフィルターで滅菌することによって調製される。一般的に、分散物は、種々の滅菌された活性成分を、基本分散媒体および上記に列挙されたものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組みこむことによって調製される。滅菌注射用溶液調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、事前にフィルター滅菌された溶液から活性成分および任意の付加的な所望される成分の粉末を生じる。
【０１２３】
活性成分が適切に保護される場合、それらは例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用の担体と共に経口投与され得、またはハードシェルまたはソフトシェルのゼラチンカプセル中に封入され得、または錠剤中に圧縮され得、または食物と共に直接的に組みこまれ得る。経口治療的投与のために、活性化合物は賦形剤と共に組みこんでもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウェハースなどの形態で使用される。このような組成物および調製物は重量で少なくとも1%の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物のパーセンテージは当然異なり得、好都合には、単位の重量の約5%から約80%までの間であり得る。このような治療的に有用な組成物における活性化合物の量は、適切な投薬量が得られるようなものである。本発明に従う好ましい組成物または調製物は、経口用量単位形態が約0.1μgから2000mgの間の活性化合物を含むように調製される。
【０１２４】
また、錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、以下に列挙されるような成分を含み得る：ガム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトース、もしくはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香料などの香料が加えられ得る。用量単位形態がカプセルである場合、上記のような材料に加えて、液体担体を含み得る。種々の他の材料が、コーティングとして、または用量単位の物理的形態を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルが、セラック、糖、または両方でコートされ得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料としてスクロース、保存料としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、ならびにチェリー香料またはオレンジ香料などの香料を含み得る。当然、どのような用量単位形態を調製する際に使用されるいずれの材料も、薬学的に純粋であり、かつ使用量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性の調製物および製剤に組みこみ得る。
【０１２５】
薬学的組成物はまた、例えば標的細胞にトランスフェクト可能であるベクターなどの遺伝的分子を含み得、ここでベクターはスフィンゴシンキナーゼまたは本明細書中上記に規定された変調剤をコードする核酸分子を有する。ベクターは、例えばウイルスベクターであり得る。
【０１２６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに定義される。
【０１２７】
実施例1
スフィンゴシンキナーゼはRhoA/Rhoキナーゼの活性化を介して微小血管の緊張および筋原性応答を変調する
方法および材料
抵抗動脈の単離および動脈培養における平滑筋トランスフェクション
血管の調製、カルシウムおよび直径測定の技術(Bolz, S.S., de Wit, C., Pohl,U. (1999) Br J Pharmacol 128:124-134)、ならびに動脈培養およびトランスフェクションの方法(Bolz, S.S., Pieperhoff, S., de Wit, C. et al. (2000) Am J Physiol Heart Circ Physiol 279:H1434-H1439)はすでに詳細に記載されている。手短に述べると、小抵抗動脈のセグメント(最大直径213±3μm、n+116)を雌性シリアンハムスターの薄筋から切除し、ガラスマイクロピペットでカニューレ挿入し、そして45mmHgの経壁圧で培養培地で灌流した。平滑筋細胞の選択的トランスフェクションについては、60μl/mLトランスフェクション試薬(Effectene, Qiagen, Germany)および5μgの各DNAプラスミドを、20〜22時間、臓器溶液（organ bath）に加えた。
【０１２８】
トランスフェクション効率は、GFPまたはSphk-GFP融合タンパク質をコードするプラスミドを使用して評価した(図1)。
【０１２９】
プラスミド
ヒトSphk1およびそのドミナントネガティブ変異体hSK-G82Dをコードするプラスミドは以前に記載されている(Pitson, S.M., Moretti, P.A., Zebol, J.R. et al. (2000) J Biol Chem 275:33945〜33950)。RhoA変異体N19RhoAおよびL63RhoAは、Alan Hall博士(Medical Research Council Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, UK)から恵与され、ドミナントネガティブRhoキナーゼをコードするプラスミドは、Shuh Narumiya博士(Dept. of Pharmacology, Kyoto University Faculty of Medicine, Sakyo, Kyoto, Japan)から供与された。
【０１３０】
遺伝的に修飾された抵抗動脈におけるCa2+および直径の測定
培養期間の終了後、抵抗動脈をMOPS緩衝化塩溶液で洗浄し、倒立顕微鏡に移した。反管腔側からのfura2とのインキュベーション(37℃で2時間)により、血管壁中での平滑筋Ca2+の選択的測定を行った。平滑筋細胞内Ca2+および直径の同時測定は以前に記載されたように実行した(Bolz, S.S., de Wit, C., Pohl,U. (1999)、前出)。本研究に含まれる116個の動脈すべてにおいて、平滑筋および内皮の機能を、すべての抵抗動脈をノルエピネフリン(NE 0.3μmol/L)に対する収縮応答、およびアセチルコリン(ACh、1μmol/L)に対する拡張応答について試験することによって評価した。AChに対して最大拡張を示さなかった動脈は研究から除外した(121個の血管のうちの5個)。測定は37℃で実行した。
【０１３１】
統計
緊張を、1μmol/LのAChでの刺激下でのCa2+を含まない溶液における各実験の最後に、最大直径の%[緊張(直径最大の%)=((直径最大-直径休止)/直径最大)×100)]として計算して決定した。
【０１３２】
筋原性応答を、経壁圧の増加後の所与の時点における動脈の実際の直径である直径時間を用い、初期のひずみの逆転（reversal of initial distension, RID）%として、RID=((直径拡張-直径時間)/(直径拡張-直径休止))×100として計算して表した。
【０１３３】
平滑筋Ca2+または圧力下の直径の変化として示されるグラフのデータは、それぞれ休止Ca2+または直径からの変化%として記載した[Ca2+については、ΔCa2+(Ca2+休止の%)=((Ca2+圧力-Ca2+休止)/Ca2+休止)×100-100]。
【０１３４】
スチューデントt-検定を使用して定常状態値を比較し、違いを0.05未満(p<0.05)の誤差確率で有意であると見なした。
【０１３５】
圧力の適用後の経時的なCa2+iおよび直径の変化を比較するために、非線形回帰分析を利用した。手短に述べると、Gompertz関数への適合度を、最初にすべての個々の曲線について計算し、次いでプールしたデータセットについて計算した。F検定が、プールしたデータに対する適合における偏差と比較して各個々の適合における偏差について有意に小さい平方和を示した場合に、曲線を有意に異なると見なした(Motulsky, H.J., Ransnas, L.A. (1987) FASEB J. 1:365-374)。
【０１３６】
結果
Sphk1の過剰発現は抵抗動脈の休止緊張を増大する
緑色蛍光タンパク質(GFP、図1c)または融合タンパク質Sphk-GFP(図1d)でトランスフェクトした動脈は、血管壁の実質的にすべての平滑筋細胞においてタンパク質発現を示した(図1)。それぞれ51±3および49±4%の最大直径(OMD)によるNE(03.μmol/L)誘導性収縮、ならびに1μmol/L AChの後の完全な拡張は、これらの動脈におけるインタクトな収縮および内皮機能を明らかにした。
【０１３７】
しかし、Sphk1でトランスフェクトした抵抗動脈は、GFPでトランスフェクトした動脈(10±1% OMD, MD: 228±7μm, n=18, 図1)よりも有意に高い休止緊張(23±3% OMD, MD: 230±6μm, n=12, 図1)を生じたが、両群における細胞内Ca2+のレベルには違いがなかった。
【０１３８】
S1Pの内因性生成をブロックするために、アゴニスト刺激性S1P生成を阻害することが以前に示されているドミナントネガティブSphk1変異体hSK-G82Dを用いて動脈をトランスフェクトした(Pitson, S.M., Moretti, P.A., Zebol, J.R. et al. (2000) 前出)。この遺伝子操作により休止緊張(2% OMD、MD:247±5μm、n=16、図1)のほぼ完全な消失が生じ、Sphk1が微小血管休止緊張の決定因子として中心的な生理学的役割を果たすという概念がさらに支持された。
【０１３９】
休止微小血管緊張に対する効果はRhoA/Rhoキナーゼによって媒介される
RhoA/Rhoキナーゼ経路の関与の可能性を研究するために、Sphkを、RhoA(N19RhoA)またはRhoキナーゼ(KD1A)それぞれのドミナントネガティブ変異体と同時発現させて、Rho経路の高度に特異的な阻害を達成した。休止緊張は、Sphk1がN19RhoA(Sphk1+N19RhoA:1.0±0.3% OMD、MD:242±9μm、n=8、図1)またはKD1A(Sphk1+KD1A:2.8±1.0% OMD、MD:239±iμm、n=8、図1)とともに同時発現された抵抗動脈においてほぼ消滅した。
【０１４０】
さらに、ドミナントアクティブRhoA変異体L63RhoA(緊張を22±2% OMD増大する、MD:223±8μm、n=8、図1)は、Sphk1の緊張増大効果に実質的に類似していた。
【０１４１】
いずれの遺伝子操作も休止細胞内Ca2+レベルに影響を与えなかった。
【０１４２】
抵抗動脈における筋原性応答のためのRhoA/Rhoキナーゼの役割
本発明者らは、本発明者らが抵抗動脈におけるRhoA/Rhoキナーゼについて以前に実証した顕著なCa2+感作効果(Bolz, S.S., Galle, J., Derwand, R. et al. (2000) Circulation 102:2402-2410)から、RhoA経路の活性化は、筋原性応答の開始および発展にも寄与するかもしれないという仮説を立てた。実際に、新たに単離したかまたは培養した動脈(Bolz, S.S., Pieperhoff, S., de Wit, C. et al. (2000) 前出)におけるものに匹敵する、GFPがトランスフェクトされた動脈(59±9%初期のひずみの逆転((RID)、n=8、図2aおよび3)における筋原性応答は、RhoAのドミナントネガティブ変異体(N19RhoA、2±11%のさらなるひずみ、n=7)もしくはRhoキナーゼのドミナントネガティブ変異体(KD1A、4±5% RID、n=6)を過剰発現する、または薬理学的なRhoキナーゼインヒビターY27632(1±2% RID、n=10)で処置された抵抗動脈において実質的に消滅した。これらの薬剤によるRhoA/Rhoキナーゼ経路の阻害は、Ca2+における圧力誘導性増大に影響を与えなかった(N19RhoA:16±3%、KD1A:17±2%、Y27632:19±3%)。しかし、これらの圧力誘導性のCa2+の増大ならびに対照動脈における引き続く収縮は、L型カルシウムチャネルブロッカーフェロジピン(1nmol/L、n-7)によって完全に阻害された。
【０１４３】
筋原性応答に関するSphk1およびS1Pの役割
10nmol/L SP1は有意な収縮を誘導しなかったが、抵抗動脈における筋原性応答を有意に増強した(144±11% RID、n=5)。この効果は、RhoキナーゼインヒビターY27632によってブロックされ(3±1% RID、n=4)、ドミナントネガティブRhoA変異体N19RhoAでトランスフェクトされた動脈では存在しなかった(2±5%のさらなるひずみ、n=3)ことから、RhoA/Rhoキナーゼ活性化は外因性S1Pによって筋原性応答の変調を媒介したことが示唆された。この変調効果は、外因性S1Pに限定されなかった。なぜなら、内因性S1P生成Sphk1の強制的発現も筋原性応答を有意に増大したからである(154±14% RID、n=12、対 59±9% GFPについて、図2bおよび3)。対照的に、ドミナントネガティブSphk1変異体hSK-G82Dを過剰発現する動脈における筋原性応答はほんの痕跡程度であった(15±5% RID、n=16、p<0.005%)。Sphk1でトランスフェクトした動脈における増強された筋原性応答は、GFPでトランスフェクトした対照(40秒後に20±3%、n=8、p<0.005%、図4)と比較して、有意に高い初期のCa2+の圧力誘導性増強と関連した(40秒後の34±3%で最大、n=12、図4)。hSK-G82Dを用いるSphk1の遺伝的阻害は、Ca2+の初期の増加を有意に減少し(40秒後9±1%、n=16、p<0.005、図4)、4分後にプラトーとなった細胞内Ca2+のゆっくりとした増加はそのままであった。4分後、すべての群の平滑筋Ca2+レベルは同じプラトーレベルに達した(Sphk1において19±2%、GFPにおいて17±2%、およびhSK-G82Dにおいて17±3%、すべて休止Ca2+レベルに対して標準化、図4)。
【０１４４】
途中で20分間中断された5分間にわたる45〜110mmHg経壁圧の反復的増大によってSphk1を過剰発現する動脈を刺激することにより、休止緊張は進行的に増大し(n=6、図5)、筋原性応答は加速および強化された。
【０１４５】
筋原性応答に対するSphk1の効果はRhoA/Rhoキナーゼによって媒介される
筋原性応答に対するSphk1の効果に対するRhoAまたはRhoキナーゼの寄与の可能性を確認するために、Sphk1をN19RhoAまたはKD1Aとともに同時発現させた。両方とも有意に筋原性血管収縮を阻害した(Sphk1+N19RhoA: 1±14% RID; Sphk1+KD1A: 9±4% RID、各n=8、図3)。
【０１４６】
RhoA経路単独の活性化は、ドミナントアクティブRhoA変異体L63Rhoaのトランスフェクションによって達成され、92±12% RID(n=8、図3)の筋原性反応を生じ、これはGFPでトランスフェクトした動脈(59±9% RID、p<0.005)よりも高かったが、Sphk1でトランスフェクトした動脈(154±14% RID、p,0.005)よりも有意に低かった。
【０１４７】
微小血管収縮に対する遺伝子操作の効果
トランスフェクトした動脈における収縮が一般的に影響されるかどうかを決定するために、0.3μmol/L NEの単回用量に対する収縮応答を、すべての遺伝子改変した抵抗動脈において評価した。得られたNE誘導性緊張は、Sphk1が遺伝的に阻害された動脈(hSK-G82D)を例外として、群中で同様であった(GFP:51±3%、Sphk1:51±2%、L63RhoA:53±1%、Sphk1+KD1A:51±2%、Sphk1+N19RhoA:38±10% OMD)。それらはNE誘導性緊張の顕著な減少を示した(27±6% OMD、n=16、p<0.05)。
【０１４８】
実施例2
抵抗動脈のカルシウム感受性のNO誘導性減少は、ミオシン軽鎖ホスファターゼの活性化に起因し、かつRhoA/Rhoキナーゼ経路によって拮抗される
材料および方法
薬物
MOPS緩衝化塩溶液は以下を含んだ(mmol/L):145 NaCl、4.7 KCl、1.5 CaCl2、1.17 MgSO4、1.2 NaH2PO4、2.0 ピルビン酸、0.02 EDTA、3.0 MOPS、および5.0 グルコース。120mmol/L KClを有する「脱分極溶液」において、NaClは代償的に29.7mmol/Lまで減少させた。fura 2-AMはMolecular Probes(Oregon, USA)から購入し、ノルエピネフリン(NE)、アセチルコリン(ACh)、NS1619およびニトロプルシドナトリウム(SNP)はSigma Chemicals(Deisenhofen, Germany)から購入した。Y27632はWelfide Corporation, Osaka, Japanから購入した。C3トランスフェラーゼおよびN19RhoAプラスミドは、Alan Hall博士(University College London, UK)から恵与された。
【０１４９】
エフェクテン(Effectene)(登録商標)は、Qiagen, Germanyから、Trans LTはMobitec, Germanyから入手した。本文中に示される濃度は最終溶液濃度をいう。
【０１５０】
小RAの調製ならびにCa2+iおよび直径の測定
動物の取り扱いおよび実験手順はドイツ国動物保護法に従った。血管の調製およびカルシウム(fura 2)および直径の測定技術は以前に記載されている(Bolz et al., 1999, 前出;Bolz SS, Fisslthaler B, Pieperhoff S et al., FASEB J. 2000;14:255-260)。手短に述べると、雌性ハムスターの薄筋からのRA(最大外径180〜250μm)をマイクロピペットを用いてカニューレ挿入し、45mmHg経壁圧で研究した。fura 2を340nmまたは380nmで交互に励起した。510nmにおけるF340nm/F380nm比を、バックグラウンド蛍光(8mmol/L MnCl2を用いるfura 2クエンチングの後で得た)を差し引いて計算した。直径を、fura 2測定の干渉を回避するために、>610nmの波長においてビデオ顕微鏡によって同時に記録した。
【０１５１】
インタクトRAのトランスフェクション
C3トランスフェラーゼまたは各変異RhoA配列(N19RhoA、RhoAAla-188)を含むプラスミドをVSMCにトランスフェクトするために、動脈を、抗生物質、トランスフェクタントエフェクテン(登録商標)(16μl/ml)および5μgの各プラスミドを含む培養培地を用いる動脈培養系(Bolz et al., 2000、前出)中で18〜21時間インキュベートした。トランスフェクション手順の非特異的効果を、トランスフェクトしていないRAの血管応答および緑色蛍光タンパク質(GFP)でトランスフェクトした動脈の血管応答を比較することによって評価した。RhoA-GFP融合タンパク質でトランスフェクトした動脈においては、顕微鏡視野あたりのすべてのVSMCがGFP関連蛍光を示した(共焦点顕微鏡、励起488nm、発光525〜565nm;図5b)。
【０１５２】
Trans LTを使用してインタクトなC3トランスフェラーゼタンパク質をトランスフェクトするための技術は以前に記載されている(Bolz et al., 2000, 前出)。
【０１５３】
免疫蛍光およびデジタル画像処理
動脈を3.7%ホルムアルデヒドで固定し、0.3% Triton X-100で透過化処理し、1%BSAでブロックし、そして一次抗体(MLCP:ウサギ抗マウス、1:200、Covance;RhoA:マウスモノクローナル、1:200、Santa Cruz Biotechnology)とともにインキュベートした。FITC標識ヤギ抗ウサギまたはロバ抗マウス(各1:200)を二次抗体として使用した。画像を、Kr/Arレーザーおよび40×/1.2W水浸漬対物レンズを備えたZeiss LSM410共焦点顕微鏡を使用して得た。
【０１５４】
イムノブロッティング
ハムスター大動脈の組織試料を液体窒素中で急速冷凍し、ホモジナイズした。細胞質および粒子の画分を、100,000gでホモジネートを遠心分離(Beckman Coulter, Optima Max-E)して分離した。ペレットを、溶解緩衝液+1% Triton-X 100中で再懸濁した。タンパク質が一致する試料をSDS-PAGE(7%)によって電気泳動し、ニトロセルロースメンブレン(Amersham)に転写し、そしてポリクローナル一次抗体(ウサギ抗マウス、1:500)を使用して免疫染色に供した。HRP標識二次抗体(ヤギ抗ウサギ、1:10000、Santa Cruz)をECLplus(Amersham)とともに使用して、シグナルを可視化した。
【０１５５】
実験プロトコール
直径および[Ca2+]iの変化を、41匹の動物からの70個の血管において連続的に記録した。研究したすべての血管が自発的な緊張を発生した(最大直径の9.6±1%)。各血管の生存度を、NE(0.3μmol/L)に対する収縮および1μmol/L AChに応答した>80%の拡張によって評価した。
【０１５６】
動脈の見かけのCa2+感受性を、脱分極溶液(120mmol/L K+)中に保持された動脈の周囲の細胞外Ca2+濃度を段階的に増加させることによって(Ca2+ex、0〜3mmol/L)評価した。電位依存性カルシウムチャネルの脱分極依存性の開口は、Ca2+exを増加させ、続いてVSMC[Ca2+]iを再現性よく増加させた(Bolz et al., 2000, 前出)。Ca2+感受性を、対照条件下、SNPの存在下、ならびにSNPおよび各変調物質またはタンパク質(ODQ、カリキュリン(calyculin)A、S1P、RhoAAla-188)の組み合わせ存在下で評価した。
【０１５７】
さらに、SNPについての用量応答曲線を、対照条件下で0.3μmol/L NEによってあらかじめ収縮された動脈において、RhoキナーゼインヒビターY27632(1μmol/L)の存在下で、またはN19RhoAをトランスフェクトした動脈中で得た。
【０１５８】
統計学的分析
拡張は、「最大拡張の%」=[(拡張VD-拡張NE)/(拡張最大-拡張NE)]×100として表し、拡張VDおよび拡張NEは、NEまたは各血管拡張剤の投与2分後の定常状態直径を表し、拡張最大はCa2+を含まない1mmol/L EGTA含有MOPS緩衝液で得られる最大直径である。
【０１５９】
インタクトな血管中で[Ca2+]iについての正確な値を計算することにおいては方法論的な不確かさがあるため(Meininger GA, Zawieja DC, Falcone JC et al., Am J Physiol. 1991;261:H950-H959)、蛍光比(F340nm/F380nm)を代わりに示す。無細胞系において得られた検量線は、ここで得られた比率範囲(0.4〜6.3)が、生理学的細胞内Ca2+濃度(42.2〜1520nmol/L)を含む曲線の直線範囲に適合することを示した。
【０１６０】
異なる群からの定常状態値を、ANOVA、続いて事後（post hoc）解析手段を用いて比較した。データは平均±SEMとして提示される。違いは、p<0.05の誤差確率で有意であると見なした。
【０１６１】
非線形回帰分析を使用して最初にすべての個々の曲線に適用し、次いでプールしたデータに適用して、曲線を比較した。F-検定が、プールしたデータに対する適合における偏差と比較して各個々の適合における偏差について有意に小さな平方和を示した場合に、曲線は異なると見なした(Motulsky et al., 1987、前出)。
【０１６２】
結果
収縮装置のNO誘導性脱感作はcGMPに依存する
Ca2+exの増大と並行して起こるK+-脱分極した動脈の段階的な収縮は、10μmol/L SNP(p<0.05、n=7、図6)の存在下で有意に減弱した。[Ca2+]iの増大は、任意の所与の濃度のCa2+exについて、対照およびSNP処理動脈において実質的に同一であり(図7)、NOが筋フィラメントCa2+感受性を減少させたことが示唆された。このNO効果は完全にcGMPによって媒介された。なぜなら、これは、ODQ(1μmol/L、p<0.05、n=7、図6)による可溶性グアニル酸シクラーゼの阻害後にブロックされたからである。[Ca2+]iは、対照、SNP処理RA、またはSNP/ODQ処理RAにおいて有意な違いはなかった。
【０１６３】
MLCPはNOのCa2+脱感作効果を媒介する
NO誘導性Ca2+脱感作におけるMLCPの関与可能性を、MLCPに特異的であるとされている濃度(120nmol/L)のMLCPインヒビターカリキュリンAで前処理されたRAにおいて評価した(Ishihara H, Martin BL, Brautigan DL et al., Biochem Biophys Res Commun. 1989;159:871-877)。カリキュリンAはNOの脱感作効果をほぼ消滅させ(p<0.05、n=7、図7)、この効果は十分に機能的なMLCPを必要とすることが示唆された。筋フィラメントCa2+感受性変調処理のいずれもが、VSMC[Ca2+]iに影響を与えなかった(図2)。
【０１６４】
RhoA/Rhoキナーゼの活性化はNO誘導性の脱感作および拡張と拮抗する
濃度<1μmol/Lにおいて、スフィンゴ脂質メディエーターS1PはRAの収縮を誘導し、これはRhoAインヒビターC3トランスフェラーゼ(n=7)またはRhoキナーゼインヒビターY27632(n=7、表2)を用いる処理後に消滅した。RhoA/RhoキナーゼのS1P誘導性活性化は、MLCPサブユニットMYPT1のVSMC原形質膜へのトランスロケーションを誘導した(図8)。これは最近MLCPの阻害と関連付けられた効果である(Shin HM, Je HD, Gallant C et al., Circ Res. 2002; 90:546-553)。S1P誘導性トランスロケーションは、ドミナントネガティブRhoA変異体N19RhoAでトランスフェクトした動脈、およびY27632(1μmol/L、図8)で前処理した動脈においては存在しなかった。
【０１６５】
Ca2+exの中程度の濃度範囲(0.25〜0.75mmol/L)においてのみ、それ自体がCa2+感受性を増大させたS1P(10nmol/L、n=11)は、Ca2+exの全体の範囲にわたって、NO誘導性Ca2+脱感作を消滅させた(図9a)。
【０１６６】
休止条件下で細胞質局在を示すRhoAは、10nmol/L S1Pを用いる刺激後、膜にトランスロケーションした(図9b、c)。このトランスロケーションは、SNP(10μmol/L、3分間、図9d)の引き続く付加によって影響されなかった。
【０１６７】
1μmol/L S1Pを用いる事前収縮後のSNP(1μmol/L)誘導性拡張は、実質的に同一の事前収縮レベル(130±10対128±2μm、n=4)にも関わらず、0.3μmol/L NEを用いる事前収縮後の拡張よりも有意に小さかった(64±8%、n=4)。
【０１６８】
RhoAAla-188のトランスフェクションは、NO誘導性Ca2+脱感作効果に影響を与えない
最近、Sauzeau et al.により、透過処理した大動脈輪において、活性化されたRhoAを細胞質ゾルに戻すcGK I媒介性トランスロケーションを通して、SNPが直接RhoAを不活性化することが示された(Sauzeau V, Le JH, Cario-Toumaniantz C et al. Cyclic GMP-dependent Protein Kinase Signalling Pathway Inhibits RhoA-induced Ca2+ Sensitization of Contraction in Vascular Smooth Muscle. J Biol. Chem. 2000;275:21722-21729)。RAにおけるNOの脱感作効果におけるこのメカニズムの関与を試験するために、インタクトなRAを、cGK Iによってリン酸化することができないRhoAAla-188を用いてトランスフェクトした(n=6)。NOの脱感作効果は、RhoAAla-188トランスフェクトRAにおいて完全に維持された(図9e)。VSMC[Ca2+]iはSNPによって影響されなかった。
【０１６９】
RhoA/Rhoキナーゼの不活性化は、NOによって誘導される拡張を増強する
C3トランスフェラーゼをトランスフェクトしたRAにおけるCa2+/直径曲線は有意に右側にシフトした(図10a)。これは、RhoA/Rhoキナーゼの高い基底活性を示唆する(Gong MC, Fujihara H, Somlyo AV et al., J Biol Chem. 1997; 272:10704-10709)。この高い基底活性が休止条件下でのCa2+脱感作およびNOの拡張効果と拮抗するかどうかを試験するために、NO誘導性拡張を、Y27632で処理した動脈(n=5)、またはN19RhoAでトランスフェクトした動脈(n=6)において研究した。これらのRhoA/Rhoキナーゼの阻害は、NO誘導性拡張を有意に増強した（図10c）。
【０１７０】
N19RhoAを用いるトランスフェクションによるRhoAの遺伝的阻害は、ACh(0.01〜1μmol/L、L-NA/インドメタシンの存在下、30μmol/L、各、n=4、図10d)またはKCaチャネルオープナーNS1619(1〜100μmol/L、n=4、図10d)によって誘導されるCa2+依存性拡張に影響を与えなかった。ACh(+L-NA/インドメタシン)およびNS1619による拡張は、KCaチャネルインヒビターカリブドトキシンの存在下で消滅した(各n=4、p<0.001)。
【０１７１】
当業者は、本明細書中に記載された発明が、具体的に記載されたもの以外のバリエーションおよび改変を受け入れ可能であることを認識する。本発明はすべてのこのようなバリエーションおよび改変を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、個別にまたは集合的に、本明細書中で言及されるかまたは示されるすべての段階、特色、組成物、および化合物を、ならびに段階または特色の任意の2つまたはそれ以上の任意の組み合わせおよびすべての組み合わせを含む。
【０１７２】
参照文献
2006521293.tif 000005
2006521293.tif 000006
【０１７３】
（表２）<1μmol/Lのスフィンゴシン-1-リン酸誘導性血管収縮はRhoA(C3トランスフェラーゼ、n=7)またはRhoキナーゼ(Y27632、n=7)の阻害後に減少した。
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(平均±SEM、C3およびY27632 対 対照についての群間の有意差(p<0.05)を*で示す)
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】a)スフィンゴシンキナーゼの変異体（活性:Sphk1、n=12、不活性:hSK-G82D、n-16）を単独で、またはRhoA(N19RhoA、n=8)もしくはRhoキナーゼ(KD1A、n=8)のドミナントネガティブ変異体と組み合わせた血管平滑筋細胞の選択的トランスフェクション後の、単離された抵抗動脈における休止緊張の画像である。L83RhoAは、構成的に活性なRhoA変異体である。緑色蛍光タンパク質(GFP、n=18)でトランスフェクトされた動脈を対照とした。トランスフェクション効率は、本研究において使用された他のすべての構築物と同じベクター(pcDNA3)にクローニングされたSphk-GFP融合タンパク質を使用する別々の実験において制御された。画像c)(GFPトランスフェクション、共焦点平面)およびd)(Sphk-GFP、非共焦点)において示されるように、トランスフェクトされた抵抗動脈の血管壁中の実質的にすべての細胞が、GFPおよびSphk-GFPをそれぞれ発現した。対照的に、非トランスフェクト動脈においては蛍光は検出可能ではなかった(b)。
【図２】緑色蛍光タンパク質(GFP、n=8、a)またはSphk1(n=12、b)でトランスフェクトされた、単離された抵抗動脈の圧力誘導性筋原性応答のキネティクスのグラフ表示である。45mmHgから110mmHgまでの圧力の増加によって誘発される初期のひずみは、Sphk1を過剰発現する動脈において有意に加速および増強された、引き続く血管収縮によって部分的に逆転される。強化されたSphk1の発現もまた、平滑筋Ca2+の圧力誘導性の増加を増強した。データは、休止Ca2+および直径のレベルに対してそれぞれ標準化され、10秒毎にまとめられた(記号は平均±SEMを示す)。
【図３】Sphk1の変異体(活性:Sphk1、n=12、ドミナントネガティブ:hSK-G82D、n=16)を単独で、またはRhoA/Rhoキナーゼ経路を遺伝的に活性化したRhoA(N19RhoA、n=8)もしくはRhoキナーゼ(KD1A、n=8)のドミナントネガティブ変異体と組み合わせた血管平滑筋細胞の選択的トランスフェクション後の、単離された抵抗動脈における圧力誘導性筋原性応答のグラフ表示である。バーは4分後の初期のひずみの逆転(RID)の定常状態のレベルを示す(平均±SEM)。
【図４】緑色蛍光タンパク質(GFP、n=8)、スフィンゴシンキナーゼ(Sphk1、n=12)、ドミナントネガティブスフィンゴシンキナーゼ(hSK-G82D、n=16)、またはドミナントアクティブRhoA(L63RhoA、n=8)でトランスフェクトされた動脈における平滑筋Ca2+の圧力誘導性の増加のキネティクスのグラフ表示である。Sphk1でトランスフェクトされた動脈はCa2+の増加が強化されていた。RhoA経路の活性化(L63RhoA)はCa2+の圧力誘導性増加のキネティクスに影響を与えなかった。ドミナントネガティブ変異体hSK-G82Dによるスフィンゴシンキナーゼの遺伝的阻害は、有意に減弱および遅延したCa2+の増加を生じた。データは、休止Ca2+レベルに対して標準化され、10秒毎にまとめられた(記号は平均±SEMを示す)。
【図５】勾配増加的に（progrediently）休止緊張を増加した20分間の中断によって阻止された、5分間にわたる45から110mmHgまでの経壁圧の増加によるSphk1でトランスフェクトされた動脈の反復刺激のグラフ表示である。示される値(平均±SEM、n=6)は最大直径(max)、開始時の休止緊張(#1)、ならびに第1(#2)および第2(#3)の筋原性応答後の休止緊張を表す。
【図６】細胞外Ca2+(Ca2+ex0〜3mmol/L)の増加に応答した脱分極した抵抗動脈(120mmol/L K+)の収縮が、10μmol/Lニトロプルシドナトリウムの存在下で有意に減弱したことを示すグラフ表示である(n=7)。この効果は、ODQ(1μmol/L、n=7)を用いる可溶性グアニル酸シクラーゼの阻害後に完全に逆転された(平均±SEM、SNP対 対照については*によって;およびODQ対SNPについては#によって、群間の有意な違い(p<0.05)が示される)。
【図７】増加するCa2+exによって誘発された脱分極した抵抗動脈の収縮のSNP誘導性減少が、カリキュリン(calyculin)A(120nmol/L、n=7)によるミオシン軽鎖ホスファターゼの阻害後に逆転されたことを示すグラフ表示である。得られる細胞内Ca2+のレベルは、任意の所与のCa2+ex(上のパネル)についてすべての群において同様であり、収縮の減少がNOによって誘導されるCa2+脱感作メカニズムに起因することを示唆した(平均±SEM、SNP対 対照については*によって;およびカリキュリンA+SNP対SNPは#によって、およびカリキュリンA対 対照については§によって、群間の有意な違い(p<0.05)が示される)。
【図８】100nmol/L S1Pによる2分間のインタクト抵抗動脈の刺激が、休止状態下で細胞質性であった（「対照」）MLCPミオシン結合サブユニット(MYPT1)の、平滑筋細胞の原形質膜(「S1P」)へのトランスロケーションを誘導したことを示す画像である。トランスロケーションは、ハムスター大動脈から得られたウェスタンブロッティング組織試料によって確認した。S1Pを用いる刺激の際のMYPT1のトランスロケーションは、N19RhoAでトランスフェクトされた抵抗動脈(左下)およびY27632で前処理した抵抗動脈(右下)においては存在しなかった(各画像は、3〜5回の独立した実験の代表的なものであり、「C」=細胞質、「P」=粒子画分であり、示されるウェスタンブロットは3回の実験について代表的なものである)。
【図９】a)脱分極された抵抗動脈におけるCa2+に対するNO誘導性脱感作(120mmol/L K+)が、リン脂質メディエータースフィンゴシン-1-リン酸(S1P、10nmol/L、n=6)を用いるRhoA/Rhoキナーゼ経路の刺激後にブロックされた画像である。RhoAの免疫染色は、未刺激における細胞質分布(b))、ならびにS1Pを用いて刺激された動脈(10nmol/L、2分間、c))および10μmol/L SNPへの3分間露出前に10nmol/L S1Pを用いて刺激されたものにおける膜へのトランスロケーションを示した(平均±SEM、SNP対SNP+S1Pについては*によって;およびS1P対 対照は#によって、群間の有意な違い(p<0.05)が示される)。
【図１０】a)C3トランスフェラーゼをコードするプラスミドのトランスフェクションによるRhoAの特異的阻害がCa2+に対して収縮装置を有意に脱感作したことを示す画像である。b)NO誘導性の拡張が、RhoA/Rhoキナーゼ活性がY27632(1μmol/L、n=5)、またはN19RhoAの過剰発現(n=6)のいずれかによって阻害されたときに、NE(0.3μmol/L)であらかじめ収縮された抵抗動脈において有意に増強された。N19RhoAまたはY27632のいずれもが、休止(Y27632:198±17対(対照)対195±18μm(Y27632))またはNE誘導性緊張(109±5対115±5μm)に有意に影響を与えなかった(平均±SEM、Y27632対 対照については*によって;およびN19RhoAトランスフェクト動脈対 対照は#によって、群間の有意な違い(p<0.05)が示される)。c)RhoA-GFP融合タンパク質でトランスフェクトされた抵抗動脈は、実質的にすべてのVSMCにおいてRhoA-GFPの発現を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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