(57)【要約】本発明は、ホモセリン−スクシニル転移酵素の野生型酵素と比較して少なくとも１つの突然変異を有し、そして野生型の酵素と比較して低減されたＬ−メチオニン又はＳＡＭに対する感受性を示し、その際、野生型酵素は、位置９０〜１１５に部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏを、かつ位置２８５〜３１０に部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏを有し、アミノ酸配列の位置１は開始メチオニンであるアミノ酸配列を有するホモセリン−スクシニル転移酵素であって、突然変異が、部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏ中のアスパラギン酸のアミノ酸交換又は部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏ中のチロシンのアミノ酸交換であることを特徴とするホモセリン−スクシニル転移酵素に関する。
2006516092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモセリン−スクシニル転移酵素の野生型酵素と比較して少なくとも１つの突然変異を有し、そして野生型の酵素と比較して低減されたＬ−メチオニン又はＳＡＭに対する感受性を示し、その際、野生型酵素は、位置９０〜１１５に部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏを、かつ位置２８５〜３１０に部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏを有し、アミノ酸配列の位置１は開始メチオニンであるアミノ酸配列を有するホモセリン−スクシニル転移酵素であって、突然変異が、部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏ中のアスパラギン酸のアミノ酸交換又は部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏ中のチロシンのアミノ酸交換であることを特徴とするホモセリン−スクシニル転移酵素。
【請求項２】
野生型と比較して２倍高められたＳＡＭ又はＬ−メチオニンに対する耐性（高められたＫｉ）を有する、請求項１記載のホモセリン−スクシニル転移酵素。
【請求項３】
第１表に列記された突然変異の１つを有する、請求項１又は２記載のホモセリン−スクシニル転移酵素。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項記載のホモセリン−スクシニル転移酵素をコードするｍｅｔＡアレル。
【請求項５】
プラスミドであって、請求項４記載のｍｅｔＡアレルと一緒にプロモーターを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項６】
微生物株であって、請求項４に記載のフィードバック耐性ｍｅｔＡアレルを有することを特徴とする微生物株。
【請求項７】
微生物株がグラム陰性細菌株、有利には大腸菌である、請求項６記載の微生物株。
【請求項８】
請求項６又は７記載の微生物株の培養によるＬ−メチオニン又はＳＡＭの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素、この酵素を有する微生物株並びにＬ−メチオニン又はＳ−アデノシルメチオニンの製造のためのその使用に関する。
【０００２】
メチオニンはヒト及び多くの動物のための必須アミノ酸である。該アミノ酸は、とりわけ飼料市場のために生産され、そしてラセミ体として動物の餌に添加される。その合成は化学的にアクロレイン及びメタンチオールから３−（メチルチオ）プロパンアルデヒドを介し実施され、該アルデヒドを青酸、アンモニア及び二酸化炭素によりヒダントインを介してＤ，Ｌ−メチオニンに変換する。ラセミ分割は酵素により行うことができる。
【０００３】
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）は代謝において最も重要なメチル基供与体であり、そして医薬品分野で、うつ病、肝臓疾患及び関節炎の治療において使用される。ＳＡＭの製造について記載される方法は、例えばとりわけ前駆体のＬ−メチオニンの存在下での酵母の培養（Schlank F.及びDePalma R.E.、J.Biol.Chem.1037-1050 (1957), Shiozaki S.ら、Agric.Biol.Chem.53, 3269-3274 (1989)）及び自己分解後のクロマトグラフィーによる精製である。
【０００４】
メチオニンの微生物による合成は、特に細菌の大腸菌において集中的に調査されている（Greene, R.C.、Biosynthesis of Methionine in: Neidhardt F.C., Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and molecular biology、第二版、ASM出版、ワシントンＤＣ（１９９６年）、第５４２〜５６０頁及びそこに含まれる参考文献）。該合成は一連の酵素触媒反応からなり、そして厳密に制御されている。アスパラギン酸から出発してホモセリンまでの合成の第一工程は、アミノ酸のトレオニン、ロイシン、イソロイシン及びバリンの形成に関して並行して進行する。メチオニン合成に特異的な第一工程は、スクシニル−ＣｏＡ及びホモセリンからの補酵素Ａの分解を伴うＯ−スクシニルホモセリンの形成である。これらの反応は酵素ホモセリンスクシニル転移酵素（ホモセリン−Ｏ−スクシニル転移酵素、ＭｅｔＡ、ＥＣ２．３．１．４６）により触媒される。ＳＡＭの合成は、Ｌ−メチオニン及びＡＴＰから一工程で行われる。
【０００５】
ホモセリン−スクシニル転移酵素の活性は、Ｌ−メチオニン及び／又はＳＡＭの存在下に阻害される（Lee L. -W.ら、J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)）。この最終生成物による阻害は、一方で細菌においてメチオニン及びＳＡＭの過剰なエネルギーを消費する合成を抑制するが、他方で工業的規模での前記の両者の物質の微生物による製造を妨げる。ホモセリン−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子は、９３０塩基対（停止コドンを含む）からなり、それによりコードされるタンパク質は３０９アミノ酸からなる。今までに、ホモセリン−スクシニル転移酵素の構造は解明されておらず、従ってまた最終生成物による阻害に関与するアミノ酸の同定も不可能である。
【０００６】
代謝産物の合成を増強する公知の方法は、活性が代謝経路の最終生成物によってもはや阻害され得ない改変酵素を使用することである（フィードバック耐性突然変異体）。このように、例えばＬ−トリプトファン及びＬ−フェニルアラニンの合成を高めるための３−デスオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸合成酵素のフィードバック耐性突然変異体が製造され（ＥＰ０７４５６７１号Ａ２）、そしてフェニルアラニン産生の強化のためにコリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸デヒドラターゼのフィードバック耐性突然変異体が製造された（ＵＳ５１２０８３７号）。
【０００７】
つい先頃、大腸菌由来の酵素ホモセリン−スクシニル転移酵素は、該酵素をコードするＤＮＡ配列の突然変異によって、生ずるタンパク質が１ｍＭのＬ−メチオニン又は１ｍＭのＳＡＭの存在下に明らかに低減された活性阻害を有するように改変された（ＪＰ２０００１３９４７１号Ａ）。これは以下のアミノ酸交換に関連する：位置２７のアルギニンをシステインに交換し、位置２９６のイソロイシンをセリンに交換し、そして位置２９８のプロリンをロイシンに交換した。改変されたホモセリン−スクシニル転移酵素は、１ｍＭのＬ−メチオニンの存在下に４４〜８９％の残留活性を示し、１ｍＭのＳＡＭの存在下に１０〜７３％の残留活性を示した。前記の改変タンパク質を有する細菌株は、高められたＬ−メチオニン産生を示す。しかしながら前記の改変されたホモセリン−スクシニル転移酵素はＬ−メチオニン及びＳＡＭの不在下に野生型と比較して明らかに低減された活性を示す。活性の程度及びＬ−メチオニン及び／又はＳＡＭによる阻害の程度において異なるできる限り多くのホモセリン−スクシニル転移酵素を提供することが望ましい。それというのもＬ−メチオニン及びＳＡＭの微生物による生合成は、その進行及び調節において極めて複雑であり、更に複雑に細胞内の多様な別の代謝経路と結びついているからである。従って、その変異体により、微生物株の増殖、生存に重要な代謝経路の釣り合い及びＬ−メチオニン及びＳＡＭの産生に対してどのような効果を達成できるかを事前に予想できない。
【０００８】
本発明の課題は、野生型（ＷＴ）酵素と比較して高められたＬ−メチオニン及びＳＡＭに関するフィードバック耐性を示すホモセリン−スクシニル転移酵素（ＭｅｔＡ−タンパク質）の広範な新規の変異体を提供することである。
【０００９】
前記課題は、ホモセリン−スクシニル転移酵素の野生型酵素と比較して少なくとも１つの突然変異を有し、そして野生型の酵素と比較して低減されたＬ−メチオニン又はＳＡＭに対する感受性を示し、その際、野生型酵素は、位置９０〜１１５に部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏを、かつ位置２８５〜３１０に部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏを有し、アミノ酸配列の位置１は開始メチオニンであるアミノ酸配列を有するホモセリン−スクシニル転移酵素であって、突然変異が、部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏ中のアスパラギン酸のアミノ酸交換又は部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏ中のチロシンのアミノ酸交換であることを特徴とするホモセリン−スクシニル転移酵素によって解決される。部分配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏ中のＡｓｐと部分配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏ中のＴｙｒは種々の微生物のホモセリン−スクシニル転移酵素の比較により保存されている。保存されたアスパラギン酸Ａｓｐを有する配列領域ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏ中は、大腸菌のＭｅｔＡ−タンパク質において配列番号２の位置１０１〜１０９に存在する。該配列領域は別のＭｅｔＡ−タンパク質において位置９０〜１１５の範囲に存在する。保存されたチロシンＴｙｒを含有する配列領域ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏは大腸菌のＭｅｔＡ−タンパク質において配列番号２の位置２９４〜２９８に存在する。該配列領域は、別のＭｅｔＡ−タンパク質において位置２８５〜３１０の範囲に存在する。Ｘａａは任意の天然アミノ酸を意味する。
【００１０】
今までにホモセリン−スクシニル転移酵素の立体構造は解明されていない。従って種々の機能、例えば酵素活性及びＬ−メチオニン及び／又はＳＡＭによる阻害を規定のアミノ酸に割り当てることは不可能である。タンパク質の折り畳みは更に複雑な事象なのでタンパク質の一次配列から立体構造を推論できず、そして一次配列において互いにかけ離れたアミノ酸が折り畳まれたタンパク質においてすぐ近くに存在すること及びその逆は稀にしか起こらない。意想外にも、本発明による、タンパク質の位置１０１又は位置２９４でのアミノ酸交換は、Ｌ−メチオニンに対するフィードバック阻害もＳＡＭに対するフィードバック阻害も減少に導くことが判明した。
【００１１】
本発明によるホモセリン−スクシニル転移酵素は、野生型酵素と比較して、阻害剤ＳＡＭ及び／又はＬ−メチオニンに対する改善された耐性（従って高められたＫｉ）を有する。有利には該酵素は、野生型に対して少なくとも２倍高められたメチオニン及び／又はＳＡＭに対する耐性を有する。特に有利には、本発明によるホモセリン−スクシニル転移酵素は、野生型と比較して１０倍高められた、特に有利には５０倍高められたメチオニン及び／又はＳＡＭに対する耐性、殊に有利にはＪＰ２０００１３９４７１号Ａに挙げられるＭｅｔＡ突然変異体と比較して高められた耐性を有する。
【００１２】
特に有利には、本発明によるホモセリン−スクシニル転移酵素のタンパク質配列は、第１表に列記される突然変異又は挙げられる突然変異の組合せを有する。
【００１３】
本発明によるホモセリン−スクシニル転移酵素は、例えば本発明によるホモセリン−スクシニル転移酵素をコードするＤＮＡ配列の発現によって得ることができる。
【００１４】
従って本発明は、本発明によるホモセリン−スクシニル転移酵素をコードするＤＮＡ配列にも関する。
【００１５】
かかるＤＮＡ配列は、ｍｅｔＡ遺伝子の１つ以上のコドンにおける１つの塩基の突然変異であって、大腸菌の野生型酵素において位置１０１に存在する保存されたアスパラギン酸に関するコドン又は大腸菌の野生型酵素において位置２９４に存在する保存されたチロシンに関するコドンにおいて少なくとも１つの突然変異が存在し、その際、コドン１は配列番号１の配列からの最初の塩基から始まることを特徴とする突然変異によって得られる。
【００１６】
本発明によるＤＮＡ配列は、ｍｅｔＡ遺伝子であって、ＭｅｔＡタンパク質中の位置９０〜位置１１５に存在する配列ＡｓｐＧｌｙＸａａＸａａＸａａＴｈｒＧｌｙＡｌａＰｒｏ中のアスパラギン酸Ａｓｐに関するコドン及び／又は位置２８５〜位置３１０に存在する配列ＴｙｒＧｌｎＸａａＴｈｒＰｒｏ中の保存されたチロシンＴｙｒに関するコドンが改変されている遺伝子である。
【００１７】
以下に本発明によるＤＮＡ配列をフィードバック耐性ｍｅｔＡアレルと呼称する。
【００１８】
本発明の範囲において、アルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（ＧＣＧウィスコンシンパッケージ、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、マジソン、ウィスコンシン）による分析において、大腸菌の野生型ｍｅｔＡ遺伝子に対して５０％より高い配列同一性を有する遺伝子もｍｅｔＡアレルと解釈される。同様に、大腸菌の野生型のホモセリン−スクシニル転移酵素に対して５０％より高い配列同一性（アルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＣＧウィスコンシンパッケージ、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、マジソン、ウィスコンシン）を有し、ホモセリン−スクシニル転移酵素活性を有するタンパク質をホモセリン−スクシニル転移酵素と解釈する。
【００１９】
有利には、本発明によるｍｅｔＡアレルは、第１表の第２行もしくは第４行に列記される突然変異又は挙げられる突然変異の組合せを含む。
【００２０】
本発明によるｍｅｔＡアレルは、例えば非特異的な又は意図的な突然変異誘発によって、以下に記載される出発材料から製造できる。挙げられるＤＮＡ領域内の非特異的な突然変異は、例えば化学薬品（例えば１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸など）によって及び／又は物理的方法及び／又は規定の条件下で実施されるＰＣＲ反応によって及び／又は変異誘発株（例えばＸＬ１−Ｒｅｄ）におけるＤＮＡの増幅によって作製することができる。ＤＮＡ断片内の特異的な位置に突然変異を導入する方法は公知である。フィードバック耐性ｍｅｔＡアレルの作製のための他の可能性は、フィードバック耐性をもたらす種々の突然変異を組み合わせて、新規の特性を有する複数の突然変異体にすることにある。
【００２１】
突然変異誘発のための出発材料としては、有利には野生型のｍｅｔＡ遺伝子のＤＮＡが用いられる。突然変異されるべきｍｅｔＡ遺伝子は、染色体として又は染色体外としてコードされていてよい。前記の突然変異誘発法の使用によって、ＤＮＡ配列の１つ以上のヌクレオチドを、ここで該遺伝子によってコードされるタンパク質が、大腸菌の野生型酵素において位置１０１に存在する保存されたアスパラギン酸の突然変異又は大腸菌の野生型酵素において位置２９４に存在する保存されたチロシンの突然変異を有し、その際、位置１は配列番号２からの開始メチオニンであるように改変される。
【００２２】
前記の手法により、任意のｍｅｔＡ遺伝子において前記のＤＮＡ領域で１つ以上の突然変異を導入することができる。これらの突然変異は、コードされたホモセリン−スクシニル転移酵素がＳＡＭ及び／又はＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性に導くアミノ酸配列を有するようにする。
【００２３】
例えば前記のように実施された突然変異誘発に引き続いて、所望の表現型を有する突然変異体の選択を、例えば突然変異されたホモセリン−スクシニル転移酵素のＬ−メチオニン選択性及び／又はＳＡＭ選択性の程度を測定することによって行う。
【００２４】
ホモセリン−スクシニル転移酵素のＬ−メチオニン選択性及び／又はＳＡＭ選択性の測定のために、酵素活性をＬ−メチオニン又はＳＡＭの存在下に測定できる、どの方法も利用できる。例えば、ホモセリン−スクシニル転移酵素の測定を、Ｋｒｅｄｉｃｈ及びＴｏｍｋｉｎｓによって記載されたセリン−アセチル転移酵素の活性測定法（Kredich N.M.及びTomkins G.M.、J. Biol. Chem. 241, 4955-4965 (1966)）に従って行ってよい。酵素活性は、ホモセリン及びスクシニルＣｏＡを含有する混合物中で測定される。該反応は酵素の添加により開始し、そしてチオエステル結合がスクシニル補酵素Ａに分解されることによって引き起こされる２３２ｎｍでの吸光度の低下を介して分光光度計において行われる。前記の試験は、ホモセリン−スクシニル転移酵素のＬ−メチオニン選択性の測定のために好適である。ホモセリン−スクシニル転移酵素活性の阻害は、種々の濃度のＬ−メチオニンの存在下に反応混合物中で試験される。種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の酵素活性は、Ｌ−メチオニンの存在及び不存在で測定され、そしてそこから、阻害剤の不在下に測定できる活性の５０％だけの活性となる阻害濃度を説明する阻害定数Ｋｉが算出される。
【００２５】
種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の活性のＳＡＭ選択性の測定のために、例えばLee L. W.ら、J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)に記載されるような活性試験を行ってよい。この場合に、酵素抽出物と一緒にホモセリン及びスクシニルＣｏＡをインキュベートする。種々の時点で、一部の試験バッチを、エタノール、水及び５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）からなる混合物に添加することによって停止させる。吸光度は、４１２ｎｍで測光測定する。前記の試験は、例えばホモセリン−スクシニル転移酵素のＳＡＭ選択性の測定のために好適である。ホモセリン−スクシニル転移酵素活性の阻害は、種々の濃度のＳＡＭの存在下に反応混合物中で試験される。種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の触媒活性は、ＳＡＭの存在下及び不在下に測定され、そしてそこから阻害定数Ｋｉが算出される。
【００２６】
一般に、Ｌ−メチオニン選択性及び／又はＳＡＭ選択性が低下されたのと同時に触媒活性が改変されていないホモセリン−スクシニル転移酵素が有利である。別の計画のために、Ｌ−メチオニン選択性及び／又はＳＡＭ選択性及び触媒活性の同時の低下が追求されることもある。
【００２７】
本発明の他の対象は、本発明によるフィードバック耐性ｍｅｔＡアレルを有する微生物株である。かかる微生物株は、少なくともフィードバック耐性ｍｅｔＡアレルによって下方調節されたＬ−メチオニン代謝もしくはＳＡＭ代謝を有することを特徴とする。全ての微生物では前記の代謝は同一の自体公知の経路を介して進行し、そして本発明による株の製造のために使用すべき手法は、例えば標準的な教科書から一般に公知であり、かつ全ての微生物で使用可能なので、本発明による菌株は任意の微生物から製造できる。有利には細菌が本発明による菌株の製造のために好適である。特に有利には、グラム陰性細菌、特に大腸菌が好適である。
【００２８】
本発明の更なる対象は、本発明による微生物を培養することによるＬ−メチオニン又はＳＡＭの製造であり、更にメチオニンを有する（例えばメチオニン含有ペプチド）か、又は微生物の代謝においてＬ−メチオニン又はＳＡＭから誘導される（例えばポリアミン、リポン酸、ビオチン及びキノン）生成物の製造のための本発明による微生物の使用である。更に、野生型と比較して増強された量でＳＡＭを産生する本発明による微生物を、ＳＡＭのメチル基の転移によって生ずる生成物を製造するために使用してよい。
【００２９】
フィードバック耐性ｍｅｔＡアレルは、改変されたホモセリン−スクシニル転移酵素の発現のために慣用の方法により宿主株中に形質転換される。
【００３０】
フィードバック耐性ｍｅｔＡアレルの発現は、ｍｅｔＡ遺伝子の前方に位置するプロモーターの調節下に、又は当業者に公知の別の適当なプロモーター系を使用することによって行うことができる。この場合に、相応の遺伝子は、かかるプロモーターの調節下に１以上のコピーで宿主生物の染色体上にあるか、又はベクター、有利にはプラスミド上にあってよい。従って本発明は、本発明によるフィードバック耐性ｍｅｔＡアレルと一緒にプロモーターを有することを特徴とするプラスミドに関する。
【００３１】
クローニングのために、既に遺伝子エレメント（例えば構成的又は調節可能なプロモーター、ターミネーター）を有し、ホモセリン−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子の継続誘導可能な又は調節誘導可能な発現を可能にするベクターを使用してよい。更に、発現ベクター上に、有利には別の調節エレメント、例えばリボソーム結合部位及び終結配列並びに選択マーカー及び／又はリポーター遺伝子をコードする配列が存在する。かかる発現マーカーの発現は、形質転換体の同定を容易にする。選択マーカーとしては、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は別の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が好適である。本発明によるｍｅｔＡアレルが染色体外で複製されることが望ましい場合には、プラスミドベクターが有利には複製起点を有することが望ましい。特にプラスミドベクター、例えば大腸菌ベクターｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＣ１０１及びその誘導体が有利である。誘導可能なプロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、λＰＬ、ａｒａプロモーター又はｔｅｔプロモーター又はそれらから誘導される配列が好適である。ＧＡＰＤＨプロモーターによる構成的発現が有利である。本発明の特に有利な実施態様では、ホモセリン−スクシニル転移酵素をコードする遺伝子はＧＡＰＤＨプロモーターの調節下にｐＡＣＹＣ１８４から誘導されたプラスミド中に存在する。染色体中に遺伝子組み換えするための戦略は先行技術である。
【００３２】
適当な宿主株を、Ｌ−メチオニン不感性及び／又はＳＡＭ不感性のホモセリン−スクシニル転移酵素をコードする転写単位を有する発現ベクターで形質転換する。宿主株としては、Ｌ−メチオニン感受性タンパク質及び／又はＳＡＭ感受性タンパク質を有する株、例えば細菌が使用される。
【００３３】
宿主株としては、有利には大腸菌野生株又は、内因性ｍｅｔＡ遺伝子が不活性化されている株、例えば大腸菌株ＤＬ４１、ＣＧＳＣ菌寄託番号７１７７が使用される。かかる菌株は、本発明によるｍｅｔＡ遺伝子によって補完される。本発明による菌株がＬ−メチオニン又はＳＡＭを微生物的に産生する能力は付加的な措置によって増強することができる。例えば前記の目的のために、メチオニン代謝の遺伝子のリプレッサーをコードする遺伝子ｍｅｔＪがもはや発現されない菌株を使用してよい（ＪＰ２０００１３９４７１号Ａ）。
【００３４】
Ｌ−メチオニン又はＳＡＭの産生は、有利には本発明による微生物株の培養によって行われる。このために、微生物株は、例えば発酵槽において、適当な炭素源及び適当なエネルギー源、並びに別の添加物を含有する栄養培地中で培養される。
【００３５】
発酵の間に形成される物質、例えばＬ−メチオニン又はＳＡＭを引き続き精製してよい。
【００３６】
以下の実施例は本発明を更に説明するのに役立つ。全体で使用される分子生物学的手法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素、クレノウ断片及びリガーゼによるＤＮＡの改変、形質転換などは当業者に公知の手法及び様式で、文献に記載される手法及び様式で又はそれぞれの製造元に推奨される手法及び様式で実施した。
【００３７】
実施例１：
ｍｅｔＡ構造遺伝子の非部位特異的な突然変異誘発によるフィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素の製造
大腸菌由来の遺伝子ｍｅｔＡを、配列５′−ＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＴＴＣＴＴＡＴ−３′（配列番号３）を有する５′末端のリン酸化されたオリゴヌクレオチドｍｅｔＡｆｗ及び配列５′−ＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＡＴＣＣＡＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＣ−３′（配列番号４）を有するｍｅｔＡｒｅｖをプライマーとして使用し、かつ大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）由来の染色体ＤＮＡを基体として使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。１．１キロ塩基長の産物が電気泳動により単離され、これをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社）によって精製した。次いで前記産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びクレノウ断片（ロシェ社）により処理されているプラスミドｐＢＲ３２２（ＭＢＩファーメンタス社）中にＴ４−ＤＮＡリガーゼにより導入した。生じたプラスミドｐＫＰ４３８を突然変異誘発のために使用した。
【００３８】
プラスミドｐＫＰ４３８を大腸菌株ＸＬ１−Ｒｅｄ（ストラタジェン社）に形質転換することによって導入し、そして製造元の指示に従い培養することによってプラスミドｐＫＰ４３８に突然変異を導入した。突然変異誘発は、臨界濃度のメチオニン類縁物質の存在下に、Lawrence D. A.及びSmith D. A.、Genetics 58: 473-492 (1968)に記載のように行った。前記の手順によって、メチオニン過剰生産を示す突然変異体を選択する。前記突然変異体の殆どが、プラスミドｐＫＰ４３８にコードされる改変されたホモセリン−スクシニル転移酵素に起因する。
【００３９】
２種の突然変異体からのプラスミドを単離し、そしてｍｅｔＡ遺伝子のＤＮＡ配列を調べた。両方の遺伝子は、それぞれ野生型と比較して、それぞれのコードされるホモセリン−スクシニル転移酵素にアミノ酸改変をもたらす塩基交換を有することが示された。ｐＢＲ１中のｍｅｔＡは、塩基３０１として野生型遺伝子に存在するＧの代わりにＡを有し、それによりコードされるタンパク質において位置１０１ではアスパラギン酸の代わりにアスパラギンが組み込まれる。ｐＢＲ３は、塩基８８１として野生型遺伝子に存在するＡの代わりにＧを有し、それによりコードされるタンパク質において位置２９４ではチロシンの代わりにシステインが組み込まれる。
【００４０】
実施例２：
ｍｅｔＡ構造遺伝子中の意図的な塩基交換によるフィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素の製造
実施例１においては、塩基交換とそれに伴う位置１０１もしくは位置２９４でのアミノ酸改変に基づいてＬ−メチオニン及び／又はＳＡＭに対してフィードバック耐性のホモセリン−スクシニル転移酵素をコードするｍｅｔＡアレルを製造した（実施例３及び実施例４を参照）。従って位置特異的突然変異誘発によって、ホモセリン−スクシニル転移酵素をコードし、位置１０１のアミノ酸アスパラギン酸又は位置２９４のアミノ酸チロシンのいずれかが種々の別のアミノ酸によって交換されており、そしてそれによりＬ−メチオニン及びＳＡＭによるその活性の阻害に関する改変された特性を有する遺伝子を構築した。
【００４１】
本発明によるプラスミドの構築のための基本プラスミドとして、ｐＡＣＹＣ１８４から誘導され、ブラウンシュバイクのドイツ微生物系統保存施設で番号ＤＳＭ１０１７２として寄託されているプラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨを使用した。このプラスミドに、ＧＡＰＤＨプロモーターの配列と、更にその前方にＮｄｅＩ切断部位を以下の方法により導入した：ＧＡＰＤＨプロモーターをポリメラーゼ連鎖反応によって当業者に公知の慣習に従って増幅させ、その際、配列５′−ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴＧＣ−３′（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドＧＡＰＤＨｆｗ及び配列５′−ＧＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＡ−３′（配列番号６）を有するＧＡＰＤＨｒｅｖＩＩをプライマーとして、そして大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣ２７３２５）由来の染色体ＤＮＡを基体として用いた。生成物を電気泳動により単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社）により精製し、そして制限酵素ＭｌｕＩ及びＰａｃＩにより製造元の指示に従い処理した。引き続き該生成物を前記と同じ酵素で処理されたベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ中にＴ４−リガーゼを用いて挿入し、それによりプラスミドｐＫＰ２９０が生じた。
【００４２】
大腸菌由来の遺伝子ｍｅｔＡを、配列５′−ＣＡＴＧＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＴＣＴＡＡＣＧＴＡＧ−３′（配列番号７）を有するオリゴヌクレオチドｍｅｔＡｆｗ２及び配列５′−ＡＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＴＡＣＴＡＴＴＡＡＴＣＣＡＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＣ−３′（配列番号８）を有するｍｅｔＡｒｅｖ２をプライマーとして使用し、かつ大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）由来の染色体ＤＮＡを基体として使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。１．１キロ塩基長の産物が電気泳動により分離され、これをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社）によって精製した。次いで該生成物を以下のように準備されたベクターｐＫＰ２９０中にライゲーションした：制限酵素ＮｄｅＩ、クレノウ酵素、制限酵素ＢｇｌＩＩ及び大豆ヌクレアーゼ（ロシェ社）による処理。生じたプラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰを図１に示す、そしてこれはブラウンシュバイクのドイツ微生物系統保存施設において番号ＤＳＭ１５２２１として寄託されている。該プラスミドは大腸菌由来のｍｅｔＡ遺伝子をＧＡＰＤＨプロモーターの制御下に有し、そしてフィードバック耐性ｍｅｔＡアレルの製造のための出発プラスミドとして用いられる。
【００４３】
プラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰを、ｍｅｔＡ構造遺伝子のコドン２９３に関する位置特異的突然変異誘発に付した。そのために、Ｐｆｕポリメラーゼ（プロメガ社）を用いて当業者に公知の慣習に従い逆ポリメラーゼ連鎖反応を行った。プライマーとして、５′末端でリン酸化された配列５′−ＮＮＮＣＡＧＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＡＣＧＡＴＣＴＡＣ−３′（配列番号９）（合成においてＮについてはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇの１：１：１：１混合物を使用した）を有するオリゴヌクレオチドｍｅｔＡｍｕｔｆｗ１及び配列５′−ＧＡＣＧＴＡＡＴＡＧＴＴＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＧ−３′（配列番号１０）を有するｍｅｔＡｍｕｔｒｅｖ１を用いた。４．３キロ塩基大の産物が電気泳動により単離され、これをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて製造元の指示に従って精製した。次いで分子間ライゲーションをＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて製造元の指示に従い行った。菌株ＤＨ５αの大腸菌細胞の形質転換を、ＣａＣｌ２法に従って当業者に公知の様式及び方法で実施した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天平板（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、１５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートした。所望の形質転換体をＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン社）を用いるプラスミド単離の後に制限分析によって同定した。切断部位Ｅｓｐ３Ｉ及びＳｃａＩの間のｍｅｔＡ構造遺伝子のコドン２９４を有する領域の配列決定を行い、該領域を単離し、そしてそれと同じ酵素で処理されたプラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰ中に当業者に公知の方法により導入した。
【００４４】
コドン１０１に関する部位特異的突然変異のために同様に行うが、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして配列５′−ＮＮＮＧＧＴＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＣＧ−３′（配列番号１１）（合成においてＮについてはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇの１：１：１：１混合物を使用した）を有するオリゴヌクレオチドｍｅｔＡｍｕｔｆｗ２及び配列５′−ＡＡＡＧＴＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＡＴＣ−３′（配列番号１２）を有するｍｅｔＡｍｕｔｒｅｖ２を使用した。野生型のｍｅｔＡと比較して改変されたコドン１０１の位置を有するプラスミドを切断部位Ｅｓｐ３Ｉ及びＰｖｕＩＩの間の領域において配列決定し、それを単離し、そしてそれと同じ酵素で処理されたプラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰ中に導入した。
【００４５】
こうして構築されたプラスミドは完全なｍｅｔＡ遺伝子を有すると共に、野生型配列と比較してそれぞれ改変された配列をコドン２９４もしくはコドン１０１に有し、それにより該プラスミドはホモセリン−スクシニル転移酵素の種々の変異体の製造のために使用できる（第１表）。
【００４６】
第１表：出発プラスミド並びに改変されたコドン１０１もしくはコドン２９４を有するｍｅｔＡ変異体を有するプラスミド
【００４７】
【表１】
2006516092.tif 000003
*）：コドン２９４はｍｅｔＡ配列に欠失を有する
**）：アミノ酸２９４は欠失している
【００４８】
実施例３：
ホモセリン−スクシニル転移酵素の突然変異体の活性及びＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性
種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の活性及びＬ−メチオニンによる活性に対する影響を、各タンパク質が産生されている細胞抽出物での酵素試験によって調査した。このために、改変されたホモセリン−スクシニル転移酵素をコードする相応のプラスミドを形質転換により当業者に公知の方法に従って大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）中に導入した。形質転換バッチを、ＬＢ−テトラサイクリン−寒天平板（１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母エキス、５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１５ｇ／ｌの寒天、１５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン）上に塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートした。得られた形質転換体をＳＭ１培地（１ｌの培地に関して：ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ  ０．０１４７ｇ、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．３ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ  ０．１５ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  ２．５ｍｇ、ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ  ０．７ｍｇ、ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ、ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ  １．６ｍｇ、ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ３．０ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  １２．０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ、ＮａＣｌ  ０．６ｇ、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ  ０．００２ｇ、Ｎａ３クエン酸×２Ｈ２Ｏ  １ｇ、グルコース  ５ｇ、トリプトン  １ｇ、酵母エキス  ０．５ｇ）中で培養し、６００ｎｍで約０．８の吸光度になるまで遠心分離し、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５中で洗浄し、そして再び遠心分離した。これらの細胞を５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、２ｍＭのジチオトレイトール、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホン酸フッ化物中に再懸濁し、そしてフレンチプレス中で該細胞を破砕した。更なる遠心分離の上清を酵素抽出物として試験において使用した。酵素活性を、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭのホモセリン及び０．１ｍＭのスクシニルＣｏＡを有する混合物中で測定するが、その際、該反応で生ずる補酵素Ａは２３２ｎｍでの吸光度の低減を介して、Ｋｒｅｄｉｃｈ及びＴｏｍｋｉｎｓによって記載された、セリン−アセチル転移酵素の活性測定法（Kredich N. M.及びTomkins G. M.、J. Biol. Chem. 241, 4955-4965 (1966)）に従って測光的に定量した。添加されるべきＬ−メチオニンによる活性に対する影響を調査し、そして阻害性をＫｉとして定量した。Ｋｉとして、ホモセリン−スクシニル転移酵素の活性がＬ−メチオニンの不在下の活性の５０％だけであるＬ−メチオニンの濃度を規定している。
全てのホモセリン−スクシニル転移酵素の突然変異体は、野生型と比較して高められたＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性を示す。第２表は結果のまとめを示している。
【００４９】
第２表：野生型酵素の活性及びホモセリン−スクシニル転移酵素の突然変異体の活性並びにＬ−メチオニンに対するフィードバック耐性
【００５０】
【表２】
2006516092.tif 000004
＊  Ｌ−メチオニンの不在下での活性が１００％に相当する。
【００５１】
実施例４：
ホモセリン−スクシニル転移酵素のＳＡＭに対するフィードバック耐性
種々のホモセリン−スクシニル転移酵素の活性に対するＳＡＭの影響を種々のＳＡＭ濃度（Ｃｌ塩、シグマ社）の存在下での活性を定量することによって調査した。培養及び細胞抽出物の調製は、実施例３に記載されるのと同様に実施した。活性試験は、Lee L. W.ら、J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)に記載されるように実施し、その際、酵素抽出物と一緒に５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、３ｍＭのホモセリン及び０．３ｍＭのスクシニルＣｏＡをインキュベートした。種々の時点で、１００μｌの試験混合物を４００μｌのエタノール、４００μｌの水及び１００μｌの５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）からなる混合物に添加することによって停止させた。該バッチを室温で５分間インキュベートした後に、４１２ｎｍでの吸光度を測光測定した。タンパク質濃度を測定した後に、吸光係数を用いて酵素活性を計算した。ＳＡＭによる活性の阻害についての尺度としてＫｉを調べた。
【００５２】
第３表：ホモセリン−スクシニル転移酵素の突然変異体の活性及びＳＡＭに対するフィードバック耐性
【００５３】
【表３】
2006516092.tif 000005
＊  ＳＡＭの不在下での活性が１００％に相当する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１はプラスミドｐＫＰ４１３ＧＡＰを示す
【図１】
2006516092.tif 000006
【配列表】
2006516092000001.app
【国際調査報告】
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