(57)【要約】本発明は新規のアポトーシス関連核酸およびポリペプチドに関しならびに異常な細胞の増殖、分化、または変性と関係する疾患の処置方法を含めて、その使用方法に関する。細胞移植および細胞に基づく遺伝子治療手順の成功率を高める方法が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Acheron活性のレベルが変化している、単離された遺伝子操作細胞。
【請求項２】
Acheron活性が低下している、請求項1記載の単離された細胞。
【請求項３】
Acheron活性が増加している、請求項1記載の単離された細胞。
【請求項４】
細胞が、筋芽細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項５】
細胞が、神経幹細胞である、請求項1記載の細胞。
【請求項６】
細胞が、外来性遺伝子を含む、請求項1記載の細胞。
【請求項７】
受容者内への移植用の細胞を調製する方法であって、細胞内のAcheronの発現または活性を低下させるのに有効な量のAcheron阻害剤と細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項８】
Acheron阻害剤が、Acheron特異的抗体、Acheron核酸に相補的なアンチセンス核酸、Acheron mRNAを切断する小さな阻害性RNA、Acheron核酸を切断するリボザイム、ドミナントネガティブなAcheronポリペプチドをコードする核酸分子、およびドミナントネガティブなAcheronポリペプチドからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Acheron特異的抗体、Acheron核酸に相補的なアンチセンス核酸、Acheron mRNAを切断する小さな阻害性RNA、Acheron核酸を切断するリボザイム、およびドミナントネガティブなAcheronポリペプチドからなる群より選択されるAcheron阻害剤ならびに、移植用の細胞を調製する方法で用いる使用説明書を含むキット。
【請求項１０】
以下の段階を含む、異常なアポトーシスまたは細胞分化と関係する疾患の処置のための候補化合物を同定する方法であって、Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性を調節する試験化合物がアポトーシスまたは細胞分化と関係する疾患の処置のための候補化合物である方法：
Acheron核酸分子またはポリペプチドを提供する段階; 
Acheron核酸分子またはポリペプチドを試験化合物と、その核酸の発現またはポリペプチドの活性を測定できる条件の下で接触させる段階; および
Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性に対する試験化合物の何らかの効果を評価する段階。
【請求項１１】
Acheronの核酸分子またはポリペプチドが、細胞中に存在する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階をさらに含む、請求項10記載の方法：
Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性を増加させる候補化合物を選択する段階; および
異常な細胞増殖と関係する疾患を抱える哺乳類においてその候補化合物を評価する段階。
【請求項１３】
哺乳類が、臨床試験におけるヒト被験体である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
以下の段階をさらに含む、請求項10記載の方法：
Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性を減少させる化合物を選択する段階; および
異常な細胞変性と関係する疾患を抱える哺乳類においてその化合物を評価する段階。
【請求項１５】
哺乳類が、臨床試験におけるヒト被験体である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
疾患が、筋ジストロフィーである、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
以下からなる群より選択される単離された核酸分子:
a) 配列番号:4内において5〜490残基の連続したアミノ酸の配列を含むAcheronポリペプチドであって、アポトーシスまたは細胞分化に対し、完全長Acheronポリペプチドの測定済みの作用(affect)のうちの少なくとも25%となる測定可能な作用(affect)を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子、および
b) 配列番号:4のアミノ酸位置34-491内において5〜457残基の連続したアミノ酸の配列を含むドミナントネガティブなAcheronポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１８】
請求項17記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１９】
異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項18記載のベクター。
【請求項２０】
請求項17記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項２１】
以下からなる群より選択される単離されたポリペプチド:
a) 配列番号:4内において5〜490残基の連続したアミノ酸の配列を含むAcheronポリペプチドであって、アポトーシスまたは細胞分化に対し、完全長Acheronポリペプチドの測定済みの作用(affect)のうちの少なくとも25%となる測定可能な作用(affect)を有するポリペプチド、および
b) 配列番号:4のアミノ酸位置34-491内において5〜457残基の連続したアミノ酸の配列を含むドミナントネガティブなAcheronポリペプチド。
【請求項２２】
異種のアミノ酸配列をさらに含む、請求項21記載のポリペプチド。
【請求項２３】
Acheronポリペプチドに結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２４】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または単一特異性抗体である、請求項23記載の単離された抗体。
【請求項２５】
抗原結合部分が、Fv、Fab、またはF(ab)2である、請求項23記載の単離された抗原結合部分。
【請求項２６】
細胞移植の必要がある被験体を治療する方法であって、有効量のAcheron活性が低下している細胞を被験体に投与する段階を含む方法。
【請求項２７】
異常な細胞変性と関係する疾患を患う被験体を治療する方法であって、被験体に、野生型細胞と比べて細胞中のAcheron活性を低下させるのに有効な量のAcheron阻害剤を含んだ細胞を投与する段階を含む方法。
【請求項２８】
Acheron阻害剤が、Acheron特異的抗体、Acheron核酸に相補的なアンチセンス核酸、Acheron mRNAを切断する小さな阻害性RNA、Acheron核酸を切断するリボザイム、ドミナントネガティブなAcheronポリペプチドをコードする核酸分子、およびドミナントネガティブなAcheronポリペプチドからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明はAcheron発現の制御に関する。
【０００２】
連邦政府が後援した研究または開発
本研究は部分的に、米国立衛生研究所から与えられた助成金番号GM40458の下で政府の支援によってなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
脊椎動物の器官形成における一般的な傾向は、最終的に必要とされるものよりもはるかに多くの細胞が産生されるということである。細胞間の相互作用により、細胞は自己が発生的集団のうちの価値あるメンバーなのかまたは組織形成には必要とされない余分な個体なのかを決めることが可能になる。この後者の集団は適切な生存プログラムを活性化することができず、その代わりにアポトーシスを起こす。この細胞のいす取りゲームは、悪性転換の危険性をもたらす潜在的に有害な有糸分裂能を有する細胞、例えば、がん細胞または前がん細胞を除去するのに役立つ。アポトーシスの実行段階を調節する分子機構が研究されてきたが、このプログラムを系統特異的に活性化するシグナル伝達経路についてはさらに知られていない。
【発明の開示】
【０００４】
概要
本発明は、一つには、タバコスズメ蛾マンデュカ・セクスタ(Manduca sexta)から最初にクローニングされた新規の死関連遺伝子であって、古代ギリシャ神話で冥界に通じる川の名前にちなんでAcheronと名付けた遺伝子の発見に基づくものである。
【０００５】
一つの局面では、本発明は、Acheron活性のレベルが変化している、例えば、Acheron活性が低下しているかまたは増加している単離された遺伝子操作細胞を提供する。この細胞は筋芽細胞、神経幹細胞、および造血幹細胞を含めて、任意のタイプの細胞とすることができる。いくつかの態様では、この細胞は外来性遺伝子を含む。この細胞は永続的にまたは一過的に変化した、例えば、低下したまたは増加したAcheron活性を有することができる、例えば、Acheron阻害剤を発現している細胞またはそれで処理された細胞とすることができる。本発明はさらに、そのような細胞を調製する方法を提供する。
【０００６】
本明細書では、Acheron阻害剤はAcheronの発現または活性を低下させる。典型的なAcheron阻害剤としては、Acheron特異的抗体、Acheron核酸に相補的なアンチセンス核酸、Acheron mRNAを切断する小さな阻害性RNA、Acheron核酸を切断するリボザイム、およびドミナントネガティブなAcheronポリペプチドが挙げられる。いくつかの態様では、Acheron阻害剤はCASK-Cのドミナントネガティブである。いくつかの態様では、本発明は一つまたは複数のAcheron活性の阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含んだ組成物を含む。
【０００７】
他の局面では、本発明は受容者内への移植用の細胞を調製する方法を提供する。この方法は細胞内のAcheronの発現または活性を低下させるのに有効な量のAcheron阻害剤と細胞を接触させる段階を含む。
【０００８】
本発明はAcheron阻害剤と、移植用の細胞を調製する方法で用いる使用説明書とを含むキットをさらに提供する。
【０００９】
本発明は同様に、例えば、本明細書に記載の、異常なアポトーシスまたは細胞分化と関係する疾患の処置のための候補化合物を同定する方法を提供する。この方法はAcheron核酸分子またはポリペプチドを提供する段階; Acheron核酸分子またはポリペプチドを試験化合物と、その核酸の発現またはポリペプチドの活性を測定できる条件の下で接触させる段階; およびAcheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性に対する試験化合物の何らかの効果を評価する段階を含む。Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性を調節する試験化合物がアポトーシスまたは細胞分化と関係する疾患の処置のための候補化合物である。いくつかの態様では、Acheronの核酸分子またはポリペプチドは細胞中に存在する。
【００１０】
いくつかの態様では、この方法は同様に、Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性を増加させる候補化合物を選択する段階; および異常な細胞増殖と関係する疾患を抱える哺乳類においてその候補化合物を評価する段階を含む。
【００１１】
いくつかの態様では、この方法は同様に、Acheron核酸の発現またはAcheronポリペプチドの活性を減少させる化合物を選択する段階; および異常な細胞変性、例えば、筋ジストロフィーと関係する疾患を抱える哺乳類においてその化合物を評価する段階を含む。
【００１２】
いくつかの態様では、この哺乳類は臨床試験におけるヒト被験体である。
【００１３】
他の局面では、本発明は以下を含む単離された核酸分子を提供する:
(a) 配列番号:4内において5〜490残基の連続したアミノ酸からなるAcheronポリペプチドであって、アポトーシスまたは細胞分化に対し、完全長Acheronポリペプチドの測定済みの作用(affect)のうちの少なくとも25%となる測定可能な作用(affect)を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子、および
(b) 配列番号:4のアミノ酸位置34-491内において5〜457残基の連続したアミノ酸からなるドミナントネガティブなAcheronポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【００１４】
本発明は同様に、本明細書に記載される核酸分子を含むベクター、および、場合によっては、異種ポリペプチドをコードする核酸配列も含むベクター、ならびに本明細書に記載される核酸分子を含む宿主細胞、例えば、哺乳類の宿主細胞、例えば、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の宿主細胞を含む。
【００１５】
本発明は同様に、以下を含む単離されたポリペプチドを含む:
(a) 配列番号:4内において5〜490残基の連続したアミノ酸の配列を含むAcheronポリペプチドであって、アポトーシスまたは細胞分化に対し、完全長Acheronポリペプチドの測定済みの作用(affect)のうちの少なくとも25%となる測定可能な作用(affect)を有するポリペプチド、および
(b) 配列番号:4のアミノ酸位置34-491内において5〜457残基の連続したアミノ酸の配列を含むドミナントネガティブなAcheronポリペプチド。
【００１６】
いくつかの態様では、このポリペプチドは同様に、異種のアミノ酸配列、例えば、ジストロフィンを含む。いくつかの態様では、このポリペプチドは完全長のタンパク質の少なくとも一つの生物活性、例えば、アポトーシスまたは分化の制御、あるいはParkin(パーキン)、カルシウム/カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼC(CASK-C)および/またはAriadneの結合を保持する配列番号:4のアミノ酸配列の活性な断片である。いくつかの態様では、このポリペプチドはドミナントネガティブとして作用する配列番号:4のアミノ酸配列の断片、例えば、配列番号:4の最初の33アミノ酸を欠いているがそのアミノ酸34-491を含む断片である。例えば、このポリペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然由来の対立遺伝子変異体であって、配列番号:3もしくは配列番号:5を含む核酸分子、またはその相補体に、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする核酸によりコードされるポリペプチドとすることができる。本発明は同様に、本明細書に記載される新たなポリペプチドを、例えば、そのポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件の下で本明細書に記載される宿主細胞を培養することにより、産生する方法を含む。
【００１７】
さらに、本発明は、本明細書に記載される核酸またはポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの態様では、この組成物は同様に、生理学的に許容される担体を含む。
【００１８】
他の局面では、本発明はAcheronポリペプチドに結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分(例えば、Fv、Fab、またはF(ab')2)を含む。この単離された抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または単一特異性抗体とすることができる。
【００１９】
他の局面では、本発明は細胞移植の必要がある被験体を治療する方法を含む。この方法はAcheron活性が低下している細胞の有効量を被験体に投与する段階を含む。
【００２０】
本発明はさらに、異常な細胞変性と関係する疾患を患う被験体を治療する方法を提供する。この方法は被験体に、野生型細胞と比べて細胞中のAcheron活性を低下させるのに有効な量のAcheron阻害剤を含んだ細胞を投与する段階を含む。このAcheron阻害剤は、例えば、Acheron特異的抗体、Acheron核酸に相補的なアンチセンス核酸、Acheron mRNAを切断する小さな阻害性RNA、Acheron核酸を切断するリボザイム、ドミナントネガティブなAcheronポリペプチドをコードする核酸分子、およびドミナントネガティブなAcheronポリペプチドとすることができる。
【００２１】
他の局面では、本発明は、本明細書に記載の、異常な細胞変性により特徴付けられる疾病を患う被験体を治療する方法を特徴とする。この方法はAcheron活性の阻害剤を被験体に投与する段階を含む。いくつかの態様では、Acheron活性の阻害剤は、アンチセンス核酸、small interfering核酸、リボザイム、ドミナントネガティブなポリペプチド、キナーゼ阻害剤、またはドミナントネガティブ、例えば、AcheronのドミナントネガティブまたはCASK-Cのドミナントネガティブをコードする核酸の一つまたは複数を含むことができる。
【００２２】
本発明はさらに、例えば、本明細書に記載の、異常な細胞の増殖または分化により特徴付けられる疾病を患う被験体を治療する方法を特徴とする。この方法はAcheron活性の一つまたは複数の促進剤を投与する段階を含む。いくつかの態様では、Acheron活性の促進剤は、本明細書に記載される核酸分子またはポリペプチドを含む。
【００２３】
他の局面では、本発明は試料中に本明細書に記載のAcheronポリペプチドが存在することを検出する方法を提供する。この方法はポリペプチドに選択的に結合する化合物と試料を接触させる段階; およびその化合物が試料中のそのポリペプチドに結合しているかどうかを測定する段階を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドに結合する化合物は抗体である。いくつかの態様では、ポリペプチドはAcheron、CASK-C、またはAriadneである。
【００２４】
本発明は同様に、本明細書に記載のAcheronポリペプチドまたは核酸分子に選択的に結合する一つまたは複数の化合物、および使用説明書を含むキットを提供する。
【００２５】
試料中にAcheron核酸分子が存在することを検出する方法。この方法は核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマーと試料を接触させる段階、およびその核酸プローブまたはプライマーが試料中の核酸分子に結合しているかどうかを測定する段階を含む。いくつかの態様では、試料はmRNA分子を含んでおり、その試料を核酸プローブと接触させる。本発明は同様に、請求項1記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする化合物および使用説明書を含むキットを含む。
【００２６】
本発明はさらに、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば、Acheronに結合する化合物を同定する方法を提供する。この方法はポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞を試験化合物と接触させる段階; およびそのポリペプチドがその試験化合物に結合しているかどうかを測定する段階を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドとの試験化合物の結合は、試験化合物/ポリペプチド結合を直接的に検出することによる結合の検出; 競合結合アッセイを利用した結合の検出; Acheronの細胞内局在性を検出することによる結合の検出; およびAcheron媒介性アポトーシスに対するアッセイ利用した結合の検出からなる群より選択される方法により検出される。
【００２７】
他の局面では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチド、例えば、Acheronの活性を調節する方法を提供する。この方法は、ポリペプチドまたはポリペプチドを発現する細胞を、そのポリペプチドの活性を調節するのに十分な濃度でそのポリペプチドに結合する化合物と接触させる段階を含む。
【００２８】
本発明は同様に、本明細書に記載されるポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ポリペプチドまたは核酸を試験化合物と接触させる段階; およびそのポリペプチドまたは核酸の発現または活性に対する試験化合物の効果を測定し、それによってそのポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節する化合物を同定する段階を含む。
【００２９】
他の局面では、本発明は遺伝子導入動物、例えば、その体細胞および胚細胞の少なくとも一部が本明細書に記載の少なくとも一つのAcheronトランス遺伝子を含んでいる動物を含む。
【００３０】
異常な細胞変性と関係する疾患の処置または予防用の薬剤の製造における、Acheronおよび/または本明細書に記載されるAcheron活性の阻害剤のいずれか、例えば、アンチセンス核酸、small interfering核酸、リボザイム、抗体、ドミナントネガティブなポリペプチド、キナーゼ阻害剤、またはドミナントネガティブをコードする核酸の使用もまた本発明の範囲内である。この薬剤は、異常な細胞変性と関係する疾患に苦しんでいる患者またはその疾患の危険性がある患者において、異常な細胞変性と関係する疾患を治療するまたは予防する方法で使用することができる。
【００３１】
さらに、異常な細胞の分化および/または増殖と関係する疾患の処置または予防用の薬剤の製造における、Acheronおよび/または本明細書に記載されるAcheron活性の促進剤のいずれか、例えば、Acheron核酸もしくはポリペプチドまたはその活性な断片の使用は本発明の範囲内である。この薬剤は、異常な細胞の分化および/または増殖と関係する疾患に苦しんでいる患者またはその疾患の危険性がある患者において、異常な細胞の分化および/または増殖と関係する疾患を治療するまたは予防する方法で使用することができる。
【００３２】
異常な細胞の変性、分化および/または増殖と関係する疾患の治療に用いるAcheron核酸、ポリペプチド、抗体、アンチセンス核酸、small interfering核酸、リボザイム、ドミナントネガティブなポリペプチド、またはドミナントネガティブをコードする核酸もまた本発明の範囲内である。
【００３３】
特別の定めのない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験に際して、本明細書に記載される方法および材料に類似または等価であるものを使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記述する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾が生じた場合には、定義を含めて、本明細書により統制される。さらに、材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず限定することを意図するものではない。
【００３４】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００３５】
詳細な説明
本発明は、一つには、タバコスズメ蛾マンデュカ・セクスタの体節間の筋肉の死滅に基づくモデル系の研究、およびAcheron(Ach)と名付けた新規の死関連遺伝子の発見に基づくものである。蛾Acheron(mAch)およびヒトAcheron(hAch)は、31%の同一性および40%の類似性を共有している。筋芽細胞系においてAch活性の阻害は分化およびアポトーシスを低下させるのに対し、Achの過剰発現はアポトーシスレベルの増大を引き起こす。Acheronは有糸分裂促進剤、例えば、EGFによる処理に反応して、EGF感受性の乳がん細胞の核に移行する。さらに、横紋筋肉腫(RMS)由来細胞の核にAcheronが移行することは、発がん能および転移能の増大と関係している。すなわち、hAch活性の調節、例えば、Acheronの転写、翻訳、翻訳後修飾、または移行の調節は、アポトーシス(例えば、新生細胞において)を増加させる方法で有用であり、およびアポトーシス(例えば、細胞変性と関連する病気において、または細胞に基づいた遺伝療法のためにAch以外の他の遺伝子を同様に発現している細胞を含めた細胞の移植を含む、細胞移植手順において)を低下させる方法で有用である。Acheronは細胞の分化にも影響を及ぼし、したがってそれを腫瘍細胞の分化に役立てることができる。腫瘍細胞を含めて、細胞がひとたび細胞周期から抜け出て分化すれば、不適切な有糸分裂または遊走を起こすその可能性が低下する。
【００３６】
ある局面では、本発明は、例えば、Acheronとの結合またはAcheron活性への効果を評価することにより、アポトーシスに影響を及ぼす治療薬のスクリーニング法としてAcheronを使用する方法を提供する。本明細書では「Acheron活性」、「Acheronの生物活性」または「Acheronの機能活性」とは、インビボまたはインビトロで測定されるような、Acheronのタンパク質、ポリペプチド、または核酸分子が、例えば、Acheron応答性細胞、例えば、Acheronおよび/または上皮成長因子受容体(EGF-R)を発現している細胞、例えば、筋管細胞、筋芽細胞、乏突起膠細胞またはその他の神経もしくは筋肉由来細胞、あるいは腫瘍細胞に及ぼす活性、またはAcheronの基質、例えば、タンパク質の基質、例えば、CASK-Cに及ぼす活性を指す。一例として、Acheron活性はアポトーシスまたは分化の調節とすることができる。一つの態様では、Acheron活性はAcheron標的分子との会合などの、直接的な活性である。「標的分子」または「結合パートナー」とは、Acheronタンパク質が結合するかまたは相互作用する分子、例えば、Ariadne、Parkin、またはCASK-Cである。Acheron活性は間接的な活性、例えば、Acheron結合パートナーとのAcheronタンパク質の相互作用が媒介する細胞のシグナル伝達活性とすることもできる。このように、Acheron活性の調節因子は、Acheronの転写、翻訳、翻訳後修飾、または移行に影響を及ぼすことができる。
【００３７】
アポトーシスの実行段階の各構成成分は明らかにされているが、このプログラムを系統特異的に活性化するシグナル伝達経路についてはあまり知られていない。これらの潜在的な制御分子を同定するために、分子技術を利用して、タバコスズメ蛾マンデュカ・セクスタの体節間の筋肉(ISM)から死関連遺伝子をスクリーニングした。ISMは内分泌信号に反応して、変態終期の30時間の間に死滅し消滅する巨大な線維(約5 mm長)からなっている。
【００３８】
マンデュカのISMは、蛹から成虫への発育の第17日目で死滅するように傾倒された状態となり、その上を覆う蛹クチクラからの蛾成虫の羽化と同期して、その翌日遅くに能動的に死滅し始める。第18日目のISM cDNAライブラリーをスクリーニングし、死滅細胞で上方制御される転写産物を探索した。differential cloning法を利用し、このスクリーニングでISMが死滅に傾倒することと同期して劇的に上方制御されているcDNAの単離に基づいて、蛾Acheron(Genbank Acc＃AF443827; SEQ NO:1)遺伝子が同定された。そのアミノ酸配列がSEQ N0:2に示されている。
【００３９】
ノーザンブロット解析により、Acheron mRNAは第17日目までISMにおいて検出不可能であり、その後、羽化に続いて死滅が始まる間(羽化後3時間および5時間; 図1A)中は上昇したままであることが実証された。ISMの死滅の時期を遅らせる昆虫脱皮ホルモン20-ヒドロキシエクダイソン(20-HE)を第17日目の動物に注射することで、Acheron mRNAの蓄積が低下した(20-HE; 図1A)。Acheron発現の上昇が、循環ホルモンの単なる変化ではなくISMが死滅に傾倒することと関係していたことを確実にするために、飛翔筋、男性器付属腺、卵巣、マルピーギ管、および脂肪体を含めて、第18日目の各種の蛾組織でAcheron mRNAを調べた。Acheron mRNAはISMで最も豊富に発現されていた(図1C; ISMで存在量の低い、高分子量の転写産物があるのは、プロセッシングされていない伝達暗号、選択的スプライシングまたはRNA変性が不完全であったことを反映している可能性がある)。Acheron転写産物は脂肪体や程度は低いが飛翔筋でも検出されたが、しかしその他の試験組織では検出されなかった。卵巣は未受精の卵母細胞で主に構成されているので、Acheronが母系性転写産物である可能性は低い。
【００４０】
データベース解析により、マンデュカのAcheronと86残基のアミノ酸にわたって59%の同一性および68%の類似性を共有するヒトESTが明らかとなった。このESTをプローブとして利用して、ヒト海馬cDNAライブラリーをスクリーニングし、Acheronのヒト相同体を単離し、翻訳開始コドンを含む5'末端領域を反転(inverse) RT-PCRによりクローニングした。この完全長のcDNA配列(Acc＃ AF443829; 配列番号:3)は2056 bpの全長を有し、推定分子量が55 KDaの491アミノ酸長のタンパク質をコードする。データベース解析により、ショウジョウバエ(Drosophila)のAcheron相同体(Acc＃ CG17386)、および6日齢の新生仔マウスの頭部から単離されたmRNAより作製されたcDNAライブラリーから単離されたマウスのAcheron相同体cDNAクローン(Acc＃: AK017372; 配列番号:6)が明らかとなった。ヒトおよびマウスのAcheronタンパク質(それぞれ配列番号:4および7)は全体で90%の同一性および94%の類似性を共有し、それぞれがマンデュカのAcheronに対し約31%の同一性および40%の類似性を示す。ショウジョウバエの相同体はそのヒトタンパク質と415残基のアミノ酸にわたって31%の同一性および46%の類似性を示す。ヒト、マウス、ハエおよび蛾由来のAcheronタンパク質の配列アライメントが図10に示されている; このアライメントを利用して、当業者はさらなる共通配列を判定することができるであろう。
【００４１】
ヒトAcheronのアミノ酸配列をクエリー配列としてデータベースを検索することで、ヒト胎盤cDNAライブラリーから単離されたcDNAによりコードされる、機能未知(hypothetical)のヒトタンパク質FLJ11196(AK002058)との同一性が明らかとなった。この配列はヒトAcheronの103番目のアミノ酸にそれほど重要ではない翻訳上の相違(Y103C)を1箇所含んでいる。ヒトAcheronは同様に、機能未知の部分的なヒトタンパク質XM_007678と同一であり、ならびに横紋筋肉腫細胞から単離された完全なヒトタンパク質AAH06082.1 (BC006082)およびAAH09446.1 (BC009446)と同一である。SEQ IN NO:3および5 (hAch, Acc＃;AF443829)に示されるようにFLJ11196(「FLJ」)とhAcheronとの間にはヌクレオチドの相違が5箇所存在している: 1. FLJ 299t 対 hAch 298c; 2. FLJ 379g 対 hAch 378a; 3. FLJ 734t 対 hAch 733c; 4. FLJ 845c 対 hAch 844t; 5. FLJ 1429g 対 hAch 1428c。その2番目の相違(FLJ 379g 対 hAch 378a)がアミノ酸配列の変化、つまりFLJではCysであり、hAchではTyrである残基103を生じさせている。
【００４２】
ヒトAcheronのアミノ酸配列のさらなる解析により、本明細書で「Acheron機能ドメイン」といわれるいくつかの機能ドメインの存在が明らかとなった。例えば、このタンパク質は高度に保存されたN末端La(Lupus抗原)ドメイン(ProDom004143)を含んでおり、このドメインは99-171番目の71アミノ酸の領域に及んでおり且つLa-1(99-116番目のアミノ酸、正真正銘のヒトLaタンパク質に対し61%の同一性)、La-2(125-140番目のアミノ酸、19%の同一性)およびLa-3(156-171番目のアミノ酸、50%の同一性)モチーフで構成されている。このように、AcheronはLa(Lupus抗原)タンパク質と大いに結び付きがある。Laタンパク質は細胞の機能および遺伝子発現で数多くの役割を果たしている; これらの特性に関する記述は次の総論で見出すことができる: Wolin and Cedervall, Annu. Rev. Biochem. 71: 375-403 (2002); Maraia and Intine, Gene Expr. 10(1-2):41-57 (2001)。
【００４３】
昆虫から哺乳類まで、全てのAcheronタンパク質はLaドメイン領域内で極めて高い保存性を示し、「AcheronモチーフI」(KDAFLLKHVRRNK; 配列番号:11)と名付けた、La-1とLa-2モチーフ間の111-123位の13アミノ酸に対し100%の同一性を有する(図6および10)。230-236位に「AcheronモチーフII」([V/I]-R-[V/I]-L-[K/R]-P-G; 配列番号:12) と名付けたおよび258-263位に「AcheronモチーフIII」(C-A-[I/L]-V-E-[F/Y]; 配列番号:13)と名付けた、さらに2箇所の高度に保存されたRNA結合ドメイン内のモチーフが見出された。
【００４４】
Laの特性、およびAcheronとLaタンパク質との間の構造類似性に基づけば、Acheronが同様にLaタンパク質と同じ活性の一部または全部に関与できるはずであると推測することは理に適っている。したがって、Acheronは以下の過程に関与している可能性がある:
1) RNAプロセッシング
2) RNAシャペロン
3) ウイルス遺伝子発現の制御
4) mRNA翻訳の制御
5) tRNA、rRNAおよびmRNAを含めて、RNA安定性の制御
6) RNAiまたはsiRNA機能
7) RNAスプライシング
【００４５】
さらに、ヒトAcheronは、推定されるいくつかのN-結合糖鎖付加部位(317-320、337-340、および405-408); 96-110の推定されるチロシン硫酸化部位; 168-171および244-247の推定されるcAMP-およびcGMP-依存的プロテインキナーゼリン酸化部位; 128-130、134-136、194-196、229-231、247-249、358-360、393-395、および455-457の推定されるいくつかのプロテインキナーゼCリン酸化部位; 4-7、56-59、58-61、72-75、338-341、340-343、および408-411の推定されるカゼインキナーゼIIリン酸化部位; 41-49および322-329の推定されるチロシンキナーゼリン酸化部位; 68-73、225-230、254-259、および463-468の推定されるN-ミリストイル化部位; アミノ酸184-296の間にある、RNA認識モチーフ(RRM)としても知られている、不完全なRNA結合ドメイン(RBD; 配列番号:14); アミノ酸位置351-354の推定されるアミド化部位(AGRR; 配列番号:15); 推定されるいくつかのチロシンおよびセリン/スレオニンリン酸化部位; アミノ酸位置297-103の考えられる核移行シグナル(PKKKPAK; 配列番号:16); アミノ酸位置186-193の考えられる核輸送シグナル(LLVYDLYL; 配列番号:17); ならびにNF-ATファミリーの転写因子に見られる位置376-385の3×SP反復配列を含めて、その他のAcheron機能ドメインを含む(図6を参照されたい)。
【００４６】
ヒトAcheron遺伝子のゲノム構造が決定された。ヒトAcheron遺伝子はヒトゲノムのうちの22,590 bpの領域に及んでおり、そのコード領域は3個のエクソンにわたって分布している。その5'UTR配列は70 bpを含んでいるが、この領域に関するさらなる配列は公開データベースのなかに現在のところ存在していない。ヌクレオチド配列のわずかな相違が、本発明者らの配列とデータベースの配列との間で観測されており、第1エクソンで最も顕著であった。第1エクソンは隣接の第1イントロン配列の一部とともに高いGC含量(80%)を有していることは、CpG制御因子アイランド(CpG regulator island)としての役割が考えられることを示唆するものである。
【００４７】
ヒトAcheronのゲノム配列をクエリー配列として用いたヒトESTデータベースの解析によって、第1エクソンと第2エクソンとの間にさらに3個の推定エクソンが明らかとなったことで、選択的スプライスによるアイソフォームの存在が示唆された。
【００４８】
ヒトAcheron遺伝子の染色体局在は、全ヒトゲノムの放射線照射による齧歯類雑種細胞クローン93種からなるGenebridge 4パネルを用いた放射線ハイブリッドマッピングおよびその結果をRHMAPPER (バージョン1.22)プログラム(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research)で解析することにより確定した。この解析によれば、ヒトAcheron遺伝子は第15染色体上、マイクロサテライトD15S216-D15S160の間隔内に3.0を超えるlod(対数尤度比)でWhitehead framework marker WI-6247より1.71 cR遠位に位置している。この間隔は第15染色体のq22.3-q23領域にマッピングされており、9 cMの広間隔cen-D15S125-D15S114-qter内に位置している。さらなる解析によってまた、ヒトAcheron遺伝子の位置が間隔D15S197-D15S160、つまり2cMのBBS4遺伝子座内の長さ1 cM未満の領域内に狭められており、GB4放射線雑種細胞マップにおいて第15染色体の先端から253.46 cRのframework marker WI-19667(STS-T15623)と同じ位置にこれが位置付けられた。ヒトAcheron cDNAとのWI-19667配列の比較によって、ヒトAcheron転写産物の3'-UTRの領域に対しおよび放射線ハイブリッドマッピングで使用したヒトAcheron PCR産物に対し100%の同一性が示された。
【００４９】
三つの共通の同義的多型が第3エクソンに見出された: TTCをTTT (Phe221Phe)に変える残基661のTからCへの変化(T>C); TGTをTGC (Cys258Cys)に変える残基772のTからCへの変化(T>C); およびCTCをCTT (Leu454Leu)に変える残基1362のCからTへの変化(C>T)。ミスセンス変化をもたらすヘテロ接合性のヌクレオチド置換が1個体で第3エクソン中に見出されており、His484Asp置換を引き起こした。これは、その他の対立遺伝子には変化が見出されなかったことから、稀有な変異体であるものと推測された。SSCP解析を対照として健常人でも行って、SSCPゲル中で移動の変化を示す試料を配列決定した。
【００５０】
ヒトAcheronは、受精後8〜9週の全胎児、受精後19週の胎児の心臓および肺、受精後20週の胎児の肝臓および脾臓ならびに受精後20、24、26週の胎児脳を含めて、ヒトの成体組織および胎生組織で広く発現している。発現は幼児および出生後15週の脳でも認められている。成体では、ヒトAcheron転写産物の発現は、骨、骨髄間質細胞、腎臓、前立腺、精巣、閉経後の卵巣、子宮、妊娠子宮、胎盤、結腸、膵島、およびリンパ節で観察されている。これは同様に、脳の海馬および視床下部で発現されており、末梢神経系の後根神経節で発現されている。
【００５１】
ヒトAcheron mRNAはミュラー管混合腫瘍、乳頭状漿液性腺がん、明細胞がんおよび紡錘細胞がんなどの異なるタイプの転移陽性の卵巣腫瘍を含めて、新生物組織でも発現される。発現は骨格筋横紋筋肉腫、腎臓の明細胞腺がん、膵臓、乳腺および結腸の転移性腺がん、原発性および転移性ウィルムス(Wilm's)腫瘍、胚細胞腫瘍、肺カルチノイド、子宮の高分化型子宮内膜腺がん、子宮平滑筋肉腫、黒色腫、鼻咽頭がんならびに副腎皮質がんでも観察されている。ヒトAcheron転写産物を発現する新生物の中には、退形成乏突起膠腫、膠芽細胞腫、および神経芽細胞腫などの脳腫瘍も含まれる。
【００５２】
SAGE解析(Velculescu et al., Science 270(5235):484-7 (1995))による遺伝子発現の定量的評価によって、小脳、脳白質、卵巣の正常な表面上皮、多形性膠芽腫細胞系H566(テロメラーゼ陽性)、卵巣がんのプール細胞系および正常乳腺上皮性器官(normal mammary gland epithelial organoid)で高発現していることが分かった。
【００５３】
ラットAcheron相同体の発現様式をE16ラット胚の矢状切片およびP1新生ラット産仔の脳の冠状切片で評価した。明瞭な染色は胚神経系で、ならびに新生児脳の皮質、海馬、扁桃体、および視床で認められた。胚形成のこの段階で皮質中に発現していることから、神経細胞移動および分化における役割が示唆される。このことから、神経形成および神経発達障害におけるAcheronの役割が示唆される。
【００５４】
マウスC2C12筋芽細胞におけるhAchの異所性発現は、Myf5およびBcl-2の発現を遮断し、分化用培地中での単核補充細胞（reserve cell）の生存度を大幅に低下させる。対照的に、ドミナントネガティブまたはアンチセンスhAchは、MyoDの発現、筋管形成およびアポトーシスを遮断し、静止状態、自己再生、および多核筋管の産生能を含めて、多くの特徴を骨格筋衛星細胞と共有する単核細胞である「補充細胞」のほぼ純粋な集団をもたらす(以下の実施例を参照されたい)。総合すれば、これらのデータから、系統発生的に保存されたAcheronタンパク質は分化および死を制御することによって、筋形成の重要な分岐点を調節する可能性が示唆される。
【００５５】
Acheronが分化決定を制御する機構を詳細に調べるため、ベイト(餌)としてAcheronおよびプレイ(獲物)としてマウス17日胚由来cDNAライブラリーを用い、酵母ツーハイブリッドスクリーンを行った。約4.8×106個の形質転換体をスクリーニングし、その中から二つのAcheron結合パートナーが同定された。一つはAriadne、つまり常染色体劣性若年性パーキンソニズムに関与すると考えられている遺伝子によりコードされるParkinタンパク質に対し構造的および機能的相同性を有するRINGフィンガータンパク質である。RINGフィンガータンパク質は、ユビキチンE3リガーゼとして機能してユビキチン-プロテアソーム-依存的分解に対する特異的基質を標的化しており、したがって、AriadneはAcheronを分解の標的にすることによって、Acheronのレベルの制御に重要な役割を果たす可能性がある。
【００５６】
もう一つのクローンは、N末端CaMキナーゼIIドメインおよびC末端膜結合グアニル酸キナーゼ(MAGUK)ドメインを含んだカルシウム/カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ(CASK)遺伝子ファミリーの新規アイソフォームをコードしていた。CASKは、寄生虫類および哺乳類で主要な系統特異的決定を制御する線虫(C. elegans) lin-2遺伝子の相同体である。新規CASK遺伝子は過去に報告されている他の二つの哺乳類CASKと高い配列同一性を共有するタンパク質をコードするが、その遺伝子は独立した遺伝子に相当しており、今後、CASK-C (配列番号:9および10)と呼ばれる。CASKは転写因子として機能するが、しかし核局在ドメインを持っていない。Acheronタンパク質は実にこの標的モチーフを含んでおり、細胞をEGFなどの増殖因子で処理すると核内に推進されることができる。一つの仮説として、Acheronはシャトルとしての機能を果たし、CASK-Cを核にトランスローケーションさせる可能性がある(実施例10〜13を参照されたい)。
【００５７】
AcheronとCASK-Cとの間の相互作用は特異的であり、酵母ツーハイブリッドアッセイでベイトとプレイ配列を入れ替えることにより、ならびにGSTプルダウンアッセイにより確認されている(実施例10〜13を参照されたい)。これらのおよびその他のアッセイによって、AcheronのN末端はCASK-CのCaMキナーゼIIドメインと特異的に相互作用することが示唆される。限定することを意図するわけではなく、一つの仮説として、Acheronが筋芽細胞で分化決定を制御する能力はCASK-Cによって調節される可能性がある。
【００５８】
Acheronポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、一つには、本明細書でAcheronといわれる(「Ach」ともいわれる)遺伝子の発見および特徴付けに基づくものである。AcheronのヒトアイソフォームをコードするcDNAのヌクレオチド配列は配列番号:3であり、ヒトAcheronポリペプチドの推定アミノ酸配列は配列番号:4である。さらに、そのコード領域のヌクレオチド配列は配列番号:5である。
【００５９】
非翻訳領域を含めて約2056ヌクレオチド長であるヒトAcheron配列(配列番号:3)は、終止コドンを含めて、予想の(開始)メチオニンから始まる約1476ヌクレオチドのコード配列(配列番号:3のコード配列として示されているヌクレオチド; このコード配列が配列番号:5である)を含む。このコード配列は491アミノ酸のタンパク質(配列番号:4)をコードする。Acheronの構造解析では、いずれかの明白な触媒ドメインを同定することができなかった。hAchは高度に保存されたN末端La(Lupus抗原)モチーフ(ProDom 004143、ヒトおよびマウスでは配列番号:4のアミノ酸99-171)、3箇所のLa-様モチーフ、不完全なRNA結合ドメイン、および推定される核移行シグナルを含んでいる。データベース解析および系統樹作成により、Acheronタンパク質は高度に保存されており、Laタンパク質と構造的に関連しているが、しかし新たなサブファミリーを規定することが明らかになった。
【００６０】
Acheronタンパク質、その断片、ならびに配列番号:4の配列のその誘導体および他の変異体は、「本発明のポリペプチドもしくはタンパク質」または「Acheronポリペプチドもしくはタンパク質」と総称される。そのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸分子は、「本発明の核酸」または「Acheron核酸」と総称される。「Acheron分子」とは、Acheronの核酸およびポリペプチドを指す。
【００６１】
本明細書では「核酸分子」という用語は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えば、mRNAまたはsiRNA、例えば、dsRNA)ならびに、例えば、ヌクレオチド類似体の使用により作製されたDNAまたはRNAの類似体を含む。核酸分子は一本鎖または二本鎖とすることができる。一つの態様では、核酸は二本鎖DNAである。核酸は配列番号:3または5の配列に相補的、例えば、アンチセンス核酸とすることができる。このように本発明は変異体、断片、アンチセンス核酸分子、リボザイム、small interfering RNA(siRNA)、および修飾型のAcheron核酸分子を含めたAcheron核酸を含むものである。
【００６２】
「単離されたまたは精製された核酸分子」という用語は、核酸の入った天然源に存在しているその他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。例えば、ゲノムDNAに関して、「単離された」という用語は、ゲノムDNAが本来結合している染色体から分離された核酸分子を含む。「単離された」核酸には、通常、その核酸が由来する生物のゲノムDNAにおいてはその核酸に本来隣接している配列(すなわち、その核酸の5'および/または3'末端に位置する配列)がない。例えば、各種の態様では、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムDNAにおいてはその核酸分子に本来隣接している5'および/または3'ヌクレオチド配列の約5 kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb、または0.1 kb未満を含むことができる。さらに、cDNA分子のような「単離された」核酸分子は、その他の細胞物質が実質的にない、または組換え技術により産生された場合には培地が実質的にないものとすることができ、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体またはその他の化学物質が実質的にないものとすることができる。
【００６３】
本明細書では「ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を述べている。ストリンジェントな条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6で見出すことができる。水性および非水性の方法がその文献に記述されており、そのどちらでも使用することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃の6×SSC中でハイブリダイゼーション、続けて65℃の0.2×SSC、0.1% SDS中で1回または複数回の洗浄である。典型的には、配列番号:3または配列番号:5の配列にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然由来の核酸分子(またはその相補体)に相当する。
【００６４】
本明細書では「天然由来の」核酸分子とは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する(例えば、天然型または野生型タンパク質をコードする)RNAまたはDNA分子を指す。
【００６５】
本明細書では「Acheron遺伝子」および「組換えAcheron遺伝子」という用語は、Acheronタンパク質、例えば、哺乳類のAcheronタンパク質をコードする読み取り枠を含んだ核酸分子を指し、それらの用語は非コード調節配列、およびイントロンをさらに含むことができる。
【００６６】
「単離された」または「精製された」ポリペプチドまたはタンパク質には、そのタンパク質が由来する細胞または組織起源からの細胞物質またはその他の夾雑タンパク質が実質的にない、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体またはその他の化学物質が実質的にない。一つの態様では、「実質的にない」という用語は、Acheron以外のタンパク質(本明細書では「夾雑タンパク質」ともいわれる)を、または化学的前駆体もしくはAcheron以外の化学物質を約10%(乾燥重量で)未満有するAcheronタンパク質の調製物を意味する。Acheronタンパク質またはその断片が組換えにより産生される場合、通常、これには同様に培地が実質的にない、すなわち、培地はタンパク質調製物の容量の約10%未満に相当する。本発明は乾燥重量で少なくとも0.01ミリグラムの単離されたまたは精製された調製物を含む。
【００６７】
「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を消失させるかまたは実質的に変化させることなくAcheronの野生型配列(例えば、配列番号:4の配列)から変化させることができる残基であり、その一方で、「必須」アミノ酸残基はそのような変化を引き起こす。
【００６８】
「同類アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β-分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。このように、Acheronタンパク質において予測される非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基と置換することができる。または、他の態様では、変異をAcheronコード配列の全部または一部に沿って無作為に、例えば、飽和突然変異誘発により導入することができ、得られた変異体をAcheronの生物活性を目的にスクリーニングして、活性を保持している変異体を同定することができる。配列番号:3または配列番号:5の突然変異誘発後、コードされるタンパク質を組換えにより発現させることができ、そのタンパク質の活性を測定することができる。
【００６９】
本明細書では、Acheronタンパク質の「生物学的に活性な部分」とは、その完全長のタンパク質の少なくとも一つの生物活性を有する、例えば、その完全長のタンパク質の少なくとも一つの生物活性の少なくとも25%、例えば、約35%、50%、65%、80%、90%、または100%を有するAcheronタンパク質の断片を含む。Acheronタンパク質の生物学的に活性な部分は、Acheronタンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号:4に示されるアミノ酸配列に十分に相同的であるかまたはその配列に由来するアミノ酸配列を含んだペプチドであって、完全長のAcheronタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、Acheronタンパク質の少なくとも一つの活性を示すペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、Acheronタンパク質の少なくとも一つの活性、例えば、アポトーシスおよび/または分化の制御活性を有するドメインまたはモチーフを含む。Acheronタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが10、25、50、100、200またはそれ以上のアミノ酸であるポリペプチドとすることができる。Acheronタンパク質の生物学的に活性な部分は、Acheron媒介性の活性、例えば、アポトーシスまたは分化の制御活性を調節する薬剤を開発するための標的として使用することができる。
【００７０】
配列間の相同性または配列同一性(これらの用語は本明細書では同義的に使用される)の計算は、当技術分野において知られる方法を利用して、例えば、以下のように行うことができる:
【００７１】
二つのアミノ酸配列の、または二つの核酸配列の同一性の割合を決定するため、最適に比較する目的でそれらの配列を整列させる(例えば、最適に整列するためにギャップを第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができ、比較する目的で非相同配列を無視することができる)。比較する目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも60%である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が第二の配列中のその対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているなら、それらの分子はその位置で同一である。二つの配列間の同一性の割合は、二つの配列を最適に整列するために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れて、それらの配列が共有する同一位置の数の関数になる。
【００７２】
二つの配列間の配列の比較および同一性の割合の決定は数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。二つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、12のギャップ長ペナルティー、4のギャップペナルティー、および5のフレームシフトギャップペナルティーを用いてBlossum 62スコアリング行列で決定することができる。
【００７３】
本明細書に記載の核酸およびタンパク質の配列を「クエリー配列」として使用して公開データベースに対する検索を行い、例えば、その他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定することができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索をNBLASTプログラム、スコア = 100、文字長 = 12で行って、本発明のAcheron核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索をXBLASTプログラム、スコア = 50、文字長 = 3で行って、本発明のAcheronタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップのある整列を得るために、Gapped BLASTをAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記述されているように利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。ncbi.nlm.nih.govのワールドワイドウェブを参照されたい。
【００７４】
本発明のAcheronポリペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列に実質的に同一のアミノ酸配列を有する。「実質的に同一の」という用語は、第一および第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ドメインまたは共通の機能活性を有するように第二のアミノ酸またはヌクレオチド配列に同一または等価(例えば、類似の側鎖を有する)なアミノ酸残基またはヌクレオチドを十分数または最小数含んだ第一のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指すように本明細書で使用される。例えば、少なくとも約95%の同一性を有する共通の構造ドメインを含んだアミノ酸またはヌクレオチド配列は、本明細書で十分にまたは実質的に同一と定義される。
【００７５】
本明細書では「異所性発現または異常な発現」とは、RNAまたはタンパク質のレベルでの、非野生型の遺伝子発現パターンを指す。これは、非野生型レベルでの発現、すなわち、過剰または過小な発現; 遺伝子が発現する時期または段階という観点から野生型とは異なる発現パターン、例えば、所定の発生の期間または段階での発現の増加または減少(野生型と比べて); 所定の細胞型または組織型における発現の減少(野生型と比べて)という観点から野生型とは異なる発現パターン; 細胞内局在性という観点から野生型とは異なる発現パターン; 発現するポリペプチドのスプライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または生物活性という観点から野生型とは異なる発現パターン; 遺伝子の発現に対する環境刺激または細胞外刺激の作用という観点から野生型とは異なる発現パターン、例えば、刺激の強さの増加または減少がある場合の発現の増加または減少(野生型と比べて)のパターンを含む。
【００７６】
本明細書では「被験体」とは、哺乳類、例えば、ヒトを指すことができ、または実験モデルもしくは動物モデルもしくは疾患モデルを指すことができる。被験体はヒト以外の動物、例えば、獣医学的被験体、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス、ラットまたはその他の家畜とすることもできる。被験体は昆虫、例えば、タバコスズメ蛾とすることもできる。
【００７７】
本明細書では「精製された細胞調製物」とは、動物細胞の場合には、全くの無傷な動物(細胞)ではなくビトロでの細胞調製物を指す。培養細胞または微生物細胞の場合には、それは対象細胞の少なくとも10%およびより典型的には50%の調製物からなる。
【００７８】
単離された核酸分子
一つの局面では、本発明は、本明細書に記載のAcheronポリペプチド、例えば、完全長のAcheronタンパク質またはその断片、例えば、Acheronタンパク質の生物学的に活性な部分またはその他の機能的な断片、例えば、ドミナントネガティブな断片をコードする単離されたまたは精製された核酸分子を提供する。同様に含まれるのは、例えば、Acheronポリペプチドをコードする核酸分子を同定するために使用できる、ハイブリダイゼーション用プローブとして用いるのに適した核酸断片、例えば、Acheron mRNA、およびプライマー、例えば、核酸分子の増幅および変異用のPCRプライマーとして用いるのに適した断片である。
【００７９】
一つの態様では、単離されたAcheron核酸分子は、配列番号:3もしくは配列番号:5に示されるヌクレオチド配列、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分を含む。一つの態様では、その核酸分子は、ヒトAcheronタンパク質をコードする配列(すなわち、配列番号:5に示されるような、配列番号:3の「コード領域」)、ならびに5'非翻訳配列を含む。または、その核酸分子には、配列番号:3のコード領域(例えば、配列番号:5)だけが含まれてもよく、例えば、対象配列に通常は付随しているフランキング配列がない。他の態様では、その核酸分子は、配列番号:4のおよそアミノ酸34からアミノ酸492までを含むN末端が切断されたタンパク質の断片(本明細書では切断型Acheron、または「tAch」ともいわれる)に相当する配列をコードする。他の態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:3もしくは配列番号:5に示されるヌクレオチド配列またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分、の相補体である核酸分子を含む。他の態様では、本発明の核酸分子は、これが配列番号:3または5に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それによって安定な二重鎖を形成できるように、配列番号:3または配列番号:5に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【００８０】
一つの態様では、単離されたAcheron核酸分子は、配列番号:3または配列番号:5に示されるヌクレオチド配列の全長、またはその一部分に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上相同的であるヌクレオチド配列を含む。
【００８１】
Acheron核酸断片
本発明の核酸分子は配列番号:3または5の核酸配列の一部分または断片を含む。例えば、このような断片をプローブもしくはプライマーとしてまたはAcheronタンパク質の一部分、例えば、Acheronタンパク質の免疫原性部分または生物学的に活性な部分をコードするように使用することができる。Acheron遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列により、その他のAcheronファミリーメンバー、またはその断片、ならびにAcheron相同体、またはその断片をその他の種から同定する際におよび/またはクローニングする際に用いるために設計されるプローブおよびプライマーの作製が可能になる。
【００８２】
他の態様では、核酸はコード領域の一部または全部を含むヌクレオチド配列を含んでおり、5'または3'非コード領域の一方(または両方)に及んでいる。他の態様は、本明細書に記載のアミノ酸断片をコードするヌクレオチド配列を含んだ断片を含む。核酸断片は本明細書に記載される特定のドメインもしくは部位またはその断片、特に長さが少なくとも100、200、300、または400アミノ酸であるその断片をコードすることができる。断片は同様に本明細書に記載される特定のアミノ酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含む。例えば、断片はヒトAcheron(配列番号:4)のアミノ酸34-491、例えば、ドミナントネガティブとして作用して、Acheron活性を低下させるAcheronのN末端切断型をコードする配列番号:3または5のそのヌクレオチドを、例えば、含むことができる。核酸断片は本発明の前に開示されている可能性のあるその断片を包含するものと解釈されるべきではない。
【００８３】
核酸断片はAcheronの機能的なドメイン、領域、または本明細書に記載される機能部位に対応する配列を含むことができる。核酸断片はAcheronの機能的なドメイン、領域、または本明細書に記載される機能部位を一つまたは複数含むこともできる。すなわち、例えば、Acheron核酸断片はLaドメインに対応する配列を含むことができる。
【００８４】
Acheronのプローブおよびプライマーを提供する。典型的には、プローブ/プライマーは単離されたまたは精製されたオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは典型的には、配列番号:3もしくは配列番号:5のセンスもしくはアンチセンス配列の、または配列番号:3もしくは配列番号:5の天然由来の対立遺伝子変異体もしくは突然変異体の少なくとも約7、12もしくは15、20もしくは25、30、35、40、45、50、55、60、65、または75個の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００８５】
一つの態様では、その核酸は長さが少なくとも10、12、または15塩基対であって、長さが200、100、または50塩基対未満であるプローブである。それは本明細書に開示される配列と、同一とするべきであり、あるいは1塩基だけ、または5もしくは10塩基未満だけ異なっているべきである。この比較のためにアライメント(整列)が必要とされるなら、相同性が最大となるようにそれらの配列を整列するべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチにより「環状になって」突き出た配列は、相違と考えられる。
【００８６】
プローブまたはプライマーはhAchの一つまたは複数の部分、例えば、最初(N末端)の34アミノ酸、Laドメインの一つまたは複数、あるいは潜在的な局在ドメインまたはRNA結合ドメインをコードする核酸のセンスまたはアンチセンス鎖に由来することができる。
【００８７】
他の態様では、一連のプライマー、例えば、Acheron配列の選択の領域、例えば、本明細書に記載されるドメイン、領域、部位またはその他の配列を増幅させるために使用できる、PCRで用いるのに適したプライマーを提供する。このプライマーは長さを少なくとも10、12、15、20、25または50塩基対とするべきであり、長さを100塩基対未満、または200塩基対未満とするべきである。このプライマーは本明細書に開示される配列とまたは天然由来の変異体と同一とするべきであり、または1塩基だけ異なっているべきである。
【００８８】
核酸断片は本明細書に記載されるポリペプチドの抗原決定基を持つ領域をコードすることができる。
【００８９】
「Acheronポリペプチドの生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、Acheronの生物活性(例えば、本明細書に記載のAcheronタンパク質の生物活性)を有するポリペプチドをコードする、SEQ ID N0:3または5のヌクレオチド配列の一部分を単離し、Acheronタンパク質のそのコード部分を発現し(例えば、インビトロでの組換え発現により)、Acheronタンパク質のそのコード部分の活性を評価することにより調製することができる。Acheronポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする核酸断片は、長さが200、300、400またはそれ以上のヌクレオチドを超えるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９０】
いくつかの態様では、核酸は長さが約300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300またはそれ以上のヌクレオチドであるヌクレオチド配列を含んでおり、それは配列番号:3または配列番号:5の核酸分子(またはその相補体)にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする。
【００９１】
Acheron核酸変異体
本発明は配列番号:3または配列番号:5に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子をさらに包含する。そのような相違は遺伝コードの縮重によるものとすることができ、それは本明細書に開示されるヌクレオチド配列によりコードされるものと同じAcheronタンパク質をコードする核酸をもたらす。一つの態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号:4に示されるものとは少なくとも1アミノ酸残基だけ異なるが、しかし5、10、20または25アミノ酸残基未満だけ異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。この比較のためにアライメント(整列)が必要とされるなら、相同性が最大となるようにそれらの配列を整列するべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチにより「環状になって」突き出た配列は、相違と考えられる。
【００９２】
本発明の核酸は特定の発現系に好ましいコドンを有するように選択することができる。例えば、この核酸は、少なくとも一つまたは複数のコドン、典型的には少なくとも10%または20%のコドンをその配列が大腸菌(E. coli)細胞、酵母細胞、ヒト細胞、昆虫細胞、またはCHO細胞での発現に最適となるように改変してあるものとすることができる。
【００９３】
核酸変異体は対立遺伝子変異体(同じ遺伝子座)、相同体(異なる遺伝子座)、および相同分子種(異なる生物)のような、天然由来のものとすることができ、またはそれは非天然由来のものとすることができる。ポリヌクレオチド、細胞、または生物に当てはまるものを含めて、非天然由来の変異体は、突然変異誘発技術により作製することができる。この変異体はヌクレオチドの置換、欠失、逆位、および挿入を含むことができる。変異はコード領域および非コード領域の一方または両方で起こることができる。この変異は同類アミノ酸置換と非同類アミノ酸置換(そのコード産物で比較して)の両方をもたらすことができる。
【００９４】
一つの態様では、その核酸は配列番号:1もしくは3のもの、またはATCCアクセッション番号AF443829の配列とは、例えば、少なくとも1ヌクレオチドだけしかし10、20、30、または40ヌクレオチド未満だけ; 少なくとも1ヌクレオチドだけしかし対象核酸のヌクレオチドの1%、5%、または10%未満だけ異なる。この解析に必要ならば、相同性が最大となるようにそれらの配列を整列するべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチにより「環状になって」突き出た配列は、相違と考えられる。
【００９５】
相同分子種、相同体、および対立遺伝子変異体は当技術分野において知られている方法を利用して同定することができる。これらの変異体は、配列番号:3もしくは5に示されるヌクレオチド配列またはこれらの配列の断片に少なくとも約65%、約70〜75%、約80〜85%、あるいは少なくとも約90〜95%またはそれ以上同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。そのような核酸分子は、配列番号:3もしくは5に示されるヌクレオチド配列またはその配列の断片あるいはその相補体に、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズできるものとして容易に同定することができる。本発明のAcheron cDNAの相同分子種、相同体、および対立遺伝子変異体に相当する核酸分子は、Acheron遺伝子と同じ染色体または遺伝子座にマップすることによりさらに同定することができる。変異体はアポトーシスまたは分化と関係するものを含むことができる。
【００９６】
Acheron、例えば、ヒトAcheronの対立遺伝子変異体は、機能的なタンパク質および非機能的なタンパク質の両方を含む。機能的な対立遺伝子変異体は、ある個体群のうちアポトーシスまたは分化に影響を及ぼす能力を有する、Acheronタンパク質の天然由来のアミノ酸配列変異体である。機能的な対立遺伝子変異体は、通常、配列番号:4の一つもしくは複数のアミノ酸の同類置換のみを含むか、またはそのタンパク質の非必須領域にある非必須残基の置換、欠失もしくは挿入を含むはずである。非機能的な対立遺伝子変異体は、ある個体群のうちアポトーシスまたは分化に影響を及ぼす能力がない、Acheron(例えば、ヒトAcheron)タンパク質の天然由来のアミノ酸配列変異体である。非機能的な対立遺伝子変異体は、通常、配列番号:4のアミノ酸配列の非同類置換、欠失、もしくは挿入、または中途の切断を含むか、あるいはそのタンパク質の必須残基または必須領域での置換、挿入、または欠失を含むはずである。このような非機能的な対立遺伝子変異体は、例えば、ドミナントネガティブまたは拮抗阻害剤として有用となる可能性がある。
【００９７】
さらに、その他のAcheronファミリーメンバーをコードし、したがって、配列番号:3または配列番号:5のAcheron配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００９８】
アンチセンス核酸分子、リボザイム、small interfering RNA(siRNA)、および修飾型のAcheron核酸分子
本発明は同様に、Acheronの発現または活性を変化させる、例えば、高めるかまたは阻害するために使用できる核酸分子を含む。これらはアンチセンス、siRNA、リボザイム、およびPNAのようなその他の修飾核酸分子を含む。これらの核酸は発現を目的に細胞中に導入することができる(例えば、Acheronの発現を阻害するアンチセンスまたはsiRNAを発現するベクターを使用する)。あるいはこれらの核酸は、例えば、単離されたアンチセンスまたはRNAi分子で細胞を処理することによりもっと一過性に使用することができる。こちらにはAcheronを阻害する効果が一過性となるという利点がある。Acheronは死滅および分化の両方を阻害するので、こちらが望ましい、つまりAcheronの活性または発現を一過性に阻害することで、初めに細胞が生存することを可能とし、その後、時間とともに、分化するかまたは他の細胞と融合する能力を獲得することを可能とするからである。これらの段階のどちらかがいったん起これば、それらは生存プログラムを活性化し、Acheronの恩恵を必要にしないはずである。さらに、その細胞は必要に応じて細胞死を起こすことができるはずであり、本質的には不死化された細胞であるものを宿主内に移植することに関する長期的な懸念が軽減される。
【００９９】
他の局面では、本発明は、Acheron mRNAにハイブリダイズするヌクレオチドのアンチセンス鎖である単離された核酸分子を特徴とする。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的であるかまたはmRNA配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。このアンチセンス核酸は、Acheronのコード鎖全体に、またはその一部分(例えば、配列番号:5に対応するヒトAcheronのコード領域の全部または一部)のみに相補的とすることができる。他の態様では、このアンチセンス核酸分子は、Acheronをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」(例えば、5'および3'非翻訳領域)の全部または一部に対しアンチセンスである。当業者は、本明細書に開示される配列に基づいて、本発明によって用いるのに適した多くのアンチセンス分子のいずれかを容易に選択して合成することができる。例えば、FIATの核酸の全長に及ぶ15〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「ジーンウォーク(gene walk)」を調製することができ、続けてこれがFIATの発現を阻害するか試験することができる。任意で、5〜10ヌクレオチドのギャップをそれらのオリゴヌクレオチドの間に残して、合成し試験済みのオリゴヌクレオチドの数を減らすことができる。
【０１００】
アンチセンス核酸はこれがAcheron mRNAのコード領域全体に相補的であるように設計することができるが、しかしより典型的には、それはAcheron mRNAのコード領域または非コード領域の一部分のみに対しアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。例えば、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Acheron mRNAの翻訳開始部位周辺の領域、例えば、対象とする標的遺伝子のヌクレオチド配列の-10から+10領域の間に相補的とすることができる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号:5のヌクレオチド97-1398の全部または一部に対応することができる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、残基1-33; 残基34-491; またはAcheron機能ドメインの一つもしくは複数の全部もしくは一部をコードする配列番号:3または5の領域を標的化することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、またはそれ以上のヌクレオチド長とすることができる。
【０１０１】
本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野において知られる手順を用いた化学合成および酵素連結反応により構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然由来のヌクレオチドあるいは分子の生物学的安定性を増大させるためにまたはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成された二重鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々な修飾ヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。このアンチセンス核酸は同様に、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、対象とする標的核酸に対しアンチセンス方向のものとなるはずである、以下の小区分にさらに記述されている)。いくつかの態様では、このアンチセンス核酸はモルホリノオリゴヌクレオチドである(例えば、Heasman, Dev. Biol. 243:209-14 (2002); Iversen, Curr. Opin. Mol. Ther. 3:235-8 (2001); Summerton, Biochim. Biophys. Acta. 1489:141-58 (1999)を参照されたい)。
【０１０２】
本発明のアンチセンス核酸分子は、通常、被験体に投与される(例えば、組織部位に直接注射することにより)、あるいはそれらがAcheronタンパク質をコードする細胞性mRNAおよび/またはゲノムDNAとハイブリダイズしまたはそれに結合し、それによって、例えば、転写および/または翻訳を阻害することでそのタンパク質の発現を阻害するようにインサイチューで産生される。あるいは、アンチセンス核酸分子を修飾して選択の細胞を標的化し、それから、全身に投与することができる。全身投与の場合、アンチセンス分子をそれらが選択細胞の表面に発現されている受容体または抗原に、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、特異的に結合するように修飾することができる。このアンチセンス核酸分子は、本明細書に記載されるベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下に配置されているベクター構築体を使用することができる。
【０１０３】
他の態様では、本発明のアンチセンス核酸分子はα-アノマー核酸分子である。α-アノマー核酸分子は相補的RNAと、通常のβ-ユニットとは異なり、鎖が相互に並走する特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する(Gaultier et al. Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641 (1987))。このアンチセンス核酸分子は同様に、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al. Nucleic Acids Res. 15:6131-6148 (1987))またはRNA-DNAキメラ類似体(Inoue et al. FEBS Lett. 215:327-330 (1987))を含むことができる。
【０１０４】
他の態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。Acheronをコードする核酸に特異性があるリボザイムは、本明細書に開示されるAcheron cDNAのヌクレオチド配列(すなわち、配列番号:3または配列番号:5)に相補的な一つまたは複数の配列と、mRNA切断に関与する周知の触媒配列を有する配列とを含むことができる(米国特許第5,093,246号またはHaselhoff and Gerlach, Nature 334:585-591 (1988)を参照されたい)。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がAcheronをコードするmRNA中の切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナ(Tetrahymena) L-l9 IVS RNAの誘導体を構築することができる。例えば、Cech et al.,米国特許第4,987,071号; およびCech et al.,米国特許第5,116,742号を参照されたい。または、Acheron mRNAを使用して、RNA分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択することができる。例えば、Bartel and Szostak, Science 261:1411-1418 (1993)を参照されたい。例えば、リボザイムは、残基1-33; 残基34-491; またはAcheron機能ドメインの一つまたは複数をコードする配列番号:3または5の領域を標的化することができる。
【０１０５】
Acheronの遺伝子発現は、Acheronの制御領域(例えば、Acheronのプロモーターおよび/またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞でのAcheron遺伝子の転写を抑制する三重らせん構造を形成させることにより阻害することができる。一般的には、Helene, Anticancer Drug Des. 6:569-84 (1991); Helene Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992); およびMaher Bioassays 14:807-15 (1992)を参照されたい。三重らせん形成のために標的化できる潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより増加させることができる。スイッチバック分子は、それらが最初に二重鎖の一方の鎖と塩基対合しそれからもう一方の鎖と塩基対合するように、5'から3'、3'から5'の交互形式で合成し、プリンまたはピリミジンのかなり大きなストレッチが二重鎖の片鎖に存在している必要性をなくす。
【０１０６】
本発明は同様に、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ分子を提供する。典型的には、そのような標識は化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、または比色標識である。
【０１０７】
Acheron核酸分子を塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で修飾して、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を向上させることができる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成することができる(Hyrup B. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 4:5-23 (1996)を参照されたい)。本明細書では「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、核酸模擬体、例えば、デオキシリボースリン酸骨格が擬ペプチド骨格により置換されており、4種類の核酸塩基のみが保持されているDNA模擬体を指す。PNAの中性骨格は低イオン強度の条件下でDNAおよびRNAとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることができる。PNAオリゴマーの合成は、Hyrup B. et al. (1996) 上記; Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行うことができる。
【０１０８】
Acheron核酸分子のPNAを治療用途および診断用途で使用することができる。例えば、PNAは遺伝子発現を、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導することによりまたは複製を阻害することにより配列特異的に調節するアンチセンスまたはアンチジーン剤として使用することができる。Acheron核酸分子のPNAを同様に、遺伝子における単一塩基対変異の解析で(例えば、PNAを用いたPCRクランピングにより); その他の酵素と組み合わせて使用する場合には「人工制限酵素」として(例えば、S1ヌクレアーゼ(Hyrup B. et al. (1996) 前記)); あるいはDNA配列決定またはハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーとして(Hyrup B. et al. (1996) 前記; Perry-O'Keefe 前記)使用することができる。
【０１０９】
他の態様では、そのオリゴヌクレオチドは、ペプチドのようなその他の付加基(例えば、宿主細胞の受容体をインビボで標的化するため)、あるいは細胞膜を隔てた輸送を容易にする作用物質(例えば、Letsinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652 (1987); PCT国際公開公報第88/09810号を参照されたい)または血液脳関門を隔てた輸送を容易にする作用物質(例えば、PCT国際公開公報第89/10134号を参照されたい)を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション誘発性の切断剤(例えば、Krol et al. Bio-Techniques 6:958-976 (1988)を参照されたい)または挿入剤(例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)を参照されたい)で修飾することができる。このために、このオリゴヌクレオチドを他の分子(例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性の架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発性の切断剤)に結合させることができる。
【０１１０】
本発明は分子ビーコンオリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブ分子も含むものであり、その分子ビーコンはこれが試料中での本発明のAcheron核酸の存在を定量化するのに有用となるように、本発明のAcheron核酸に相補的である少なくとも一つの領域と、二つの補完的領域であって一方がフルオロフォアを有しもう一方が消光剤を有する領域とを有する。分子ビーコン核酸は、例えば、Lizardi et al., 米国特許第5,854,033号; Nazarenko et al., 米国特許第5,866,336号、およびLivak et al., 米国特許第5,876,930号に記述されている。
【０１１１】
RNA干渉
RNAiは、二本鎖RNA(dsRNA、本明細書ではsmall interfering RNAの場合にはsiRNAともいわれ、または二本鎖のsmall interfering RNAの場合にはds-siRNAともいわれる)が動物および植物細胞において相同mRNAの配列特異的な分解を引き起こす非常に効率的な過程である(Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev.:12, 225-232 (2002); Sharp, Genes Dev., 15:485-490 (2001))。哺乳類細胞では、RNAiは、21ヌクレオチド(nt)の二重鎖のsmall interfering RNA(siRNA)により(Chiu et al., Mol. Cell. 10:549-561 (2002); Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001))、あるいはミクロRNA(miRNA)、機能的な短いヘアピンRNA(shRNA)、またはRNAポリメラーゼIIIプロモーターを有する鋳型DNAを用いてインビボで発現されるその他のdsRNAにより誘発することができる
2006525031.tif 000002
。
【０１１２】
したがって、本発明はAcheron mRNAを標的とするそのような分子を含む。
【０１１３】
siRNA分子
本発明の核酸分子または構築体は、各鎖に16〜30ヌクレオチド、例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドを含むdsRNA分子であって、その鎖の一方がmRNA中の標的領域と実質的に同一であり、例えば、少なくとも80%(またはそれ以上、例えば、85%、90%、95%、もしくは100%)同一であり、例えば、ミスマッチヌクレオチドを3、2、1、または0個有しており、もう一方の鎖がその第一鎖に相補的であるdsRNA分子を含む。本発明のdsRNA分子は化学的に合成することができる、あるいはそのdsRNA分子は鋳型DNAからインビトロで、または、例えば、shRNAからインビボで転写することができる。このdsRNA分子は当技術分野において知られる任意の方法により、例えば、以下のプロトコルにより設計することができる:
1. AUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を探す; 各AAおよびその3'の16またはそれ以上の隣接ヌクレオチドが潜在的なsiRNA標的となる。5'非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍の領域(約75塩基またはその程度内)から作られたsiRNAは、これが調節タンパク質結合部位に富んでいる場合があり、UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体がsiRNAまたはRISCエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害する場合があるので、あまり有用とはならない可能性がある。したがって、一つの態様では、その核酸分子は開始コドンの50〜100 nt下流より始まるcDNA配列の領域から選択される。さらに、低いG/C含量(35〜55%)のsiRNAは55%を超えるG/C含量のものよりも活性が高い可能性がある。したがって、一つの態様では、本発明は35〜55%のG/C含量を有する核酸分子を含む。さらに、siRNAの各鎖は1〜4ヌクレオチド、例えば、2ヌクレオチドの3'突出部を有するようにして対合させることができる。したがって、他の態様では、その核酸分子はTTのような、2ヌクレオチドの3'突出部を有することができる。この突出しているヌクレオチドはRNAまたはDNAとすることができる。
2. 当技術分野において知られる任意の方法を利用して、潜在的な標的を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)と比較し、その他のコード配列と有意な相同性がある標的配列を考慮の対象から除外する。このような配列相同性検索のためのその方法の一つはBLASTとして知られており、それはncbi.nlm.nih.gov/BLASTのワールドワイドウェブで利用可能である。
3. 評価基準を満たす一つまたは複数の配列を選択する。
【０１１４】
siRNAの設計および使用に関するさらなる一般情報は、mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/sirna.htmlのワールドワイドウェブで利用可能な「The siRNA User Guide」で見出すことができる。
【０１１５】
陰性コントロールのsiRNAは選択のsiRNAと同じヌクレオチド組成を有するべきであるが、しかし適切なゲノムとの有意な配列相補性をなくすべきである。そのような陰性コントロールは選択のsiRNAのヌクレオチド配列を無作為に混ぜ合わせることにより設計することができる; 相同性検索を行って、その陰性コントロールが適切なゲノムにおいてその他の任意の遺伝子と相同性がないことを確実にすることができる。さらに、陰性コントロールのsiRNAは、一つまたは複数の塩基ミスマッチを配列の中に導入することにより設計することができる。
【０１１６】
長期発現のためのsiRNA送達
合成siRNAを陽イオンリポソームによるトランスフェクション(形質移入)およびエレクトロポレーションにより細胞中に送達することができる。これらの外来性siRNAは抑制効果の持続が短期的で、一過性(4〜5日)である。哺乳類Pol IIIプロモーター系(例えば、機能的な二本鎖siRNAを発現できるH1またはU6/snRNAプロモーター系(Tuschl (2002)、前記))を含めて、siRNA二重鎖を細胞内で組換えDNA構築体から発現させるいくつかの戦略により、細胞中での長期的な標的遺伝子の抑制が可能になる(Bagella et al., J. Cell. Physiol. 177:206-213 (1998); Lee et al. (2002)、前記; Miyagishi et al. Nature Biotechnol. 20(5):497-500 (2002); Paul et al. (2002)、前記; Yu et al. (2002)、前記; Sui et al. (2002)、前記)。RNA Pol IIIによる転写終結は鋳型DNA中で連続的に4つのT残基が続く部位で起こることから、siRNAの転写を特定配列で終わらせる機構が可能になる。このsiRNAは標的遺伝子の配列に5'から3'方向および3'から5'方向で相補的であり、このsiRNAの2本の鎖は同じ構築体でまたは別の構築体で発現させることができる。H1またはU6 snRNAプロモーターにより駆動されて細胞中で発現されるヘアピンsiRNAは、標的遺伝子の発現を阻害することができる(Bagella et al. (1998)、前記; Lee et al. (2002)、前記; Miyagishi et al. (2002)、前記; Paul et al. (2002)、前記; Yu et al. (2002)、前記; Sui et al. (2002) 前記)。siRNA配列をT7プロモーターの制御下に含んだ構築体は同様に、T7 RNAポリメラーゼを発現するベクターとともに細胞中に同時形質移入する場合、機能的なsiRNAを作り出す(Jacque (2002), Nature 418(6896):435-8)。
【０１１７】
動物細胞は、ミクロRNA(miRNA)と名付けられた約22ヌクレオチドの一連の非コードRNAを自然に発現し、動物の発生の間に遺伝子発現を転写後または翻訳の段階で調節することができる。miRNAの共通点の一つは、これらが全て約70ヌクレオチドのRNA前駆体のステムループから、おそらくDicer、つまりRNase III型酵素、またはその相同体により切り出されるということである。miRNA前駆体のステム配列を標的mRNAに相補的なmiRNA配列で置換することにより、新規のmiRNAを発現するベクター構築体を使用してsiRNAを産生し、哺乳類細胞中の特異的mRNA標的に対するRNAiを開始させることができる(Zeng (2002)、前記)。ポリメラーゼIIIプロモーターを含んだDNAベクターにより発現される場合、ミクロRNAにより設計されたヘアピンは遺伝子発現を抑制することができる(McManus (2002)、前記)。ウイルス媒介性の送達機構を使用してsiRNAを発現させることにより、例えば、RNA Pol IIプロモーター転写制御下にあるsiRNAを持つ組換えアデノウイルスを作製することにより、標的化遺伝子の特異的抑制を引き起こすこともできる(Xia et al. Nature Biotechnol. 20(10):1006-1010 (2002))。HeLa細胞にこれらの組換えアデノウイルスを感染させることで、内在性標的遺伝子の発現の低下が可能になる。siRNAの標的遺伝子を発現している遺伝子導入マウスにこの組換えアデノウイルスベクターを注入することで、標的遺伝子の発現をインビボで低下させられる(同文献)。動物モデルの場合、全胚エレクトロポレーションは合成siRNAを着床後のマウス胚内へ効率的に送達することができる(Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(22):14236-40 (2002))。成体マウスの場合、siRNAの効率的な送達は「高圧」送達技術、つまり尾静脈を介して動物内へ大量のsiRNA含有溶液を急速注入(5秒以内)することにより達成することができる(Liu (1999)、前記; McCaffrey, Nature 48(6893):38-9 (2002); Lewis, Nature Genetics 32:107-108 (2002))。ナノ粒子およびリポソームを使用して、siRNAを動物内へ送達することもできる。
【０１１８】
RNAiを誘発するための遺伝子操作RNA前駆体の使用
細胞または生物そのものに導入される遺伝子操作RNA前駆体は、所望のsiRNA分子の産生をもたらすことができる。そのsiRNA分子は次いで、RNAi経路の内在性タンパク質成分と会合して、特異的mRNA配列に結合しその配列を切断および分解に向けるはずである。このようにして、遺伝子操作RNA前駆体から生成されるsiRNAが標的とするmRNAは細胞または生物から消耗されることになり、細胞または生物においてそのmRNAがコードするタンパク質の濃度が減少するはずである。
【０１１９】
修飾Acheron核酸分子
本発明の核酸組成物は、未結合とすることができまたはナノ粒子のような他の成分に結合させて、組成物の特性、例えば、吸収、効力、生体利用効率、および/または半減期などの薬物動態パラメータを向上させることができる。この結合は当技術分野において知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.:47(1), 99-112 (2001)の方法(ポリアルキルシアノアクリレート(PACA)ナノ粒子に取り込まれた核酸について記述している); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)の方法(ナノ粒子に結合された核酸について記述している); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)の方法(挿入剤、疎水基、ポリカチオンまたはPACAナノ粒子に連結された核酸について記述している); およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)の方法(ナノ粒子に連結された核酸について記述している)を利用して達成することができる。
【０１２０】
本発明の核酸分子は当技術分野において知られる任意の方法を利用して標識することもできる; 例えば、その核酸組成物を検出可能な物質で標識することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる; 適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる; 適当な蛍光物質の例としては、量子ドット、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる; 発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる; 生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる、ならびに適当な放射性物質の例としては、とりわけ32Pまたは3Hが挙げられる。この標識化は、市販されているキット、例えば、SILENCER(商標) siRNA標識化キット(Ambion)を含めて、当技術分野において知られている方法を利用して行うことができる。
【０１２１】
単離されたAcheronポリペプチド
他の局面では、本発明は抗Acheron抗体を産生するかまたは試験する(またはより一般的には結合させる)ための免疫原または抗原として用いる単離されたAcheronポリペプチドまたはその断片を特徴とする。Acheronタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を利用して細胞源または組織源から単離することができる。Acheronタンパク質またはその断片は、組換えDNA技術により産生することができまたは化学的に合成することができる。
【０１２２】
本発明のポリペプチドは同義遺伝子、選択的転写事象、選択的RNAスプライシング事象、ならびに選択的翻訳および翻訳後事象の存在の結果として生じるものを含む。このポリペプチドは、ポリペプチドが野生型細胞で発現される場合に存在するのと実質的に同じ翻訳後修飾をもたらす系、例えば、培養細胞で、あるいは野生型細胞で発現される場合に存在する翻訳後修飾、例えば、糖鎖付加または切断の変化または欠落をもたらす系で発現させることができる。
【０１２３】
一つの態様では、Acheronポリペプチドは、以下の特徴の一つまたは複数を有する:
(i) そのポリペプチドはアポトーシスまたは分化を調節する能力を有する;
(ii) そのポリペプチドは典型的には翻訳後修飾による何らかの寄与を無視して、配列番号:4の、分子量、例えば、推定分子量、アミノ酸組成またはその他の物理的特性を有する;
(iii) そのポリペプチドは配列番号:4のポリペプチドと、少なくとも60、70、80、90、または95%の全長配列での類似性を有する; および/または
(iv) そのポリペプチドは以下の一つまたは複数を含む: 以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域: 残基1-33; 残基34-491;
(v) そのポリペプチドはAcheronの機能ドメインの一つまたは複数を含む。
【０１２４】
一つの態様では、Acheronタンパク質、またはその断片は、配列番号:4の対応配列とは異なる。一つの態様では、それは少なくとも1アミノ酸残基異なるが、しかし15、10、または5アミノ酸残基未満異なる。(この比較にアライメント(整列)が必要とされるなら、相同性が最大となるようにそれらの配列を整列するべきである。欠失もしくは挿入、またはミスマッチにより「環状になって」突き出た配列は、相違と考えられる。) この相違は典型的には、非必須残基での相違もしくは変化または同類置換である。一つの態様では、この相違が以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域: 残基1-33; 残基34-491; Acheron機能ドメインの一つまたは複数の全部または一部: のいずれかのなかにない。他の態様では、一つまたは複数の相違が、以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域: 残基1-33; 残基34-491; Acheron機能ドメインの一つまたは複数の全部または一部: の一つまたは複数のなかにある。一つの態様では、このAcheronタンパク質は少なくとも最初(N末端)の33アミノ酸を欠くことにより、配列番号:4の配列とは異なる(例えば、AcheronのN末端切断型)。
【０１２５】
他の態様としては、一つまたは複数のアミノ酸配列の変化、例えば、活性にとって必須ではないアミノ酸残基の変化を含むタンパク質が挙げられる。このようなAcheronタンパク質はアミノ酸配列が配列番号:4とは異なるが、生物活性を保持している。
【０１２６】
一つの態様では、このAcheronタンパク質は、配列番号:4に少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
Acheronのキメラタンパク質または融合タンパク質
他の局面では、本発明はAcheronのキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書では、Acheronの「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、Acheron以外のポリペプチドに連結されたAcheronポリペプチドを含む。「Acheron以外のポリペプチド」とは、Acheronタンパク質に実質的に相同的ではないタンパク質、例えば、Acheronタンパク質とは異なっており且つ同じまたは異なる生物に由来するタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。この融合タンパク質のAcheronポリペプチドは、Acheronのアミノ酸配列の全部または一部、例えば、本明細書に記載されるその断片に相当することができる。一つの態様では、Acheronの融合タンパク質は、少なくとも一つ(または二つの)Acheronタンパク質の生物学的に活性な部分を含む。そのAcheron以外のポリペプチドは、AcheronポリペプチドのN末端またはC末端に融合することができるが、典型的にはそのC末端に融合される。
【０１２８】
この融合タンパク質は、あるリガンドに高い親和性を有する成分を含むことができる。例えば、この融合タンパク質は、Acheronの配列がGST配列のC末端に融合されているGST-Acheron融合タンパク質とすることができる。他の例として、この融合タンパク質は、一つまたは複数のFLAG(登録商標)配列(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; 配列番号:8)がAcheronのN末端に融合されているFLAG(登録商標)-Acheron融合タンパク質とすることができる。このような融合タンパク質は組換えAcheronの精製および/または検出を容易にすることができる。または、この融合タンパク質はそのN末端に異種のシグナル配列を含んだAcheronタンパク質とすることができる。ある種の宿主細胞(例えば、哺乳類の宿主細胞)では、Acheronの発現および/または分泌を異種のシグナル配列の使用により増大させることができる。
【０１２９】
融合タンパク質は血清タンパク質の全部または一部、例えば、IgGの定常領域、またはヒト血清アルブミンを含むことができる。
【０１３０】
本発明のAcheron融合タンパク質を薬学的組成物の中に組み込んで、これを被験体にインビボ投与することができる。このAcheron融合タンパク質を使用して、Acheron基質の生体利用効率に影響を及ぼすことができる。Acheron融合タンパク質は、例えば、(i) Acheronタンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾または突然変異; (ii) Acheron遺伝子の調節不全; および(iii) Acheronタンパク質の異常な翻訳後修飾により引き起こされる疾患の処置に対し治療的に有用とすることができる。
【０１３１】
さらに、本発明のAcheron融合タンパク質を免疫原として使用して抗Acheron抗体を被験体内で産生させることや、それを使用して、Acheronリガンドを精製することやスクリーニングアッセイで、Acheron基質とのAcheronの相互作用を阻害する分子を同定することができる。
【０１３２】
融合成分(例えば、GSTポリペプチドまたはFLAGペプチド)をコードする核酸配列を含んだ発現ベクターが知られており市販されている。Acheronをコードする核酸をそのような発現ベクターの中に、その融合成分がAcheronタンパク質に同じ読み枠で連結されるようにクローニングすることができる。
【０１３３】
Acheronタンパク質の変異体
他の局面では、本発明は同様に、Acheronポリペプチドの変異体、例えば、アゴニスト(模倣体)としてまたはアンタゴニストとして機能するポリペプチドを特徴とする。Acheronタンパク質の変異体は突然変異誘発、例えば、不連続の点突然変異、配列の挿入もしくは欠失またはAcheronタンパク質の切断により生成させることができる。Acheronタンパク質のアゴニスト変異体は、天然型Acheronタンパク質の生物活性と実質的に同じか、またはその一部を保持することができる。Acheronタンパク質のアンタゴニスト変異体は、例えば、Acheronタンパク質によるAcheron媒介性の活性を競合的に調節することにより、例えば、ドミナントネガティブとして作用することにより、天然型Acheronタンパク質の活性の一つまたは複数を阻害することができる。このように、機能が限定された変異体で処理することにより、特定の生物学的作用を引き出すことができる。
【０１３４】
Acheronタンパク質の変異体は、Acheronタンパク質の変異体、例えば、切断型変異体のコンビナトリアルライブラリーをアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。
【０１３５】
Acheronタンパク質をコードする配列の断片、例えば、N末端断片、C末端断片、または内部断片のライブラリーを使用して、Acheronタンパク質の変異体をスクリーニングし引き続いて選択するための変化に富んだ断片群をもたらすことができる。
【０１３６】
一つまたは複数のシステイン残基を付加してあるかまたは欠失させてある変異体、あるいはグリコシル化されている残基を付加してあるかまたは欠失させてある変異体を使用することもできる。
【０１３７】
点突然変異または切断により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および選択の特性を有する遺伝子産物についてcDNAライブラリーをスクリーニングする方法は、当技術分野において知られている。再帰的集団突然変異誘発(Recursive ensemble mutagenesis)(REM)、つまりライブラリー中の機能的変異体の頻度を向上させる新しい技術を、Acheron変異体を同定するスクリーニングアッセイと組み合わせて使うことができる(Arkin and Yourvan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815 (1992); Delgrave et al., Protein Engineering 6:327-331 (1993)。
【０１３８】
細胞に基づくアッセイを利用して、変化に富んだAcheronライブラリーを分析することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを細胞系、例えば、通常はAcheronに基質依存的に応答する細胞系の中に形質移入することができる。次いで、この形質移入された細胞をAcheronと接触し、Acheron基質によるシグナル伝達に対する変異体の発現の効果を、例えば、アポトーシスの判定により検出することができる。次いで、プラスミドDNAを阻害、またはあるいは、Acheron基質によるシグナル伝達の増強を得た細胞から回収することができ、その個々のクローンをさらに特徴付けることができる。
【０１３９】
他の局面では、本発明はAcheronポリペプチド、例えば、非野生型の活性を有するペプチド、例えば、天然由来のAcheronポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニスト、またはスーパーアゴニストを作製する方法を特徴とする。この方法はAcheronポリペプチドの配列を、例えば、非保存領域の一つまたは複数の残基、本明細書に開示されるドメインまたは残基の置換または欠失により変化させる段階、および変化させたポリペプチドを所望の活性について試験する段階を含む。いくつかの態様では、そのドメインは、以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域である: 残基1-33; 残基34-491; またはAcheron機能ドメインの一つもしくは複数の全部もしくは一部。
【０１４０】
いくつかの態様では、そのアンタゴニスト変異体はAcheronのドミナントネガティブ形、例えば、AcheronのN末端切断型、例えば、配列番号:4の最初の33アミノ酸がない変異体である。いくつかの態様では、この変異体は、以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域を含む: 残基1-33; 残基34-491; または本明細書に記載のAcheron機能ドメインの全部もしくは一部。
【０１４１】
他の局面では、本発明は天然由来のAcheronポリペプチドの少なくとも一つの生物活性を有するAcheronポリペプチドの断片または類似体を作製する方法を特徴とする。この方法はAcheronポリペプチドの配列を、例えば、Acheronポリペプチドの一つまたは複数の残基の置換または欠失により変化させる段階、例えば、非保存領域の配列、または本明細書に記載されるドメインもしくは残基を変化させる段階、および変化させたポリペプチドを所望の活性について試験する段階を含む。いくつかの態様では、この変化されるドメインは、以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域である: 残基1-33; 残基34-491; または本明細書に記載の一つまたは複数のAcheron機能ドメインの全部もしくは一部。
【０１４２】
抗Acheron抗体
他の局面では、本発明は抗Acheron抗体を含む。本明細書では「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子またはその免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原結合部分を指す。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗体をペプシンなどの酵素で処理することによって生成させることができるFv、F(ab)、およびF(ab')2断片が挙げられる。
【０１４３】
その抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、例えば、キメラ抗体もしくはヒト化抗体、完全なヒト抗体、ヒト以外の抗体、例えば、マウス抗体、または一本鎖抗体とすることができる。一つの態様では、それはエフェクター機能を有し、補体を備えることができる。この抗体を毒素または造影剤に結合させることができる。
【０１４４】
モノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野において知られている。基本的に、その工程はインビボでまたはインビトロで対象とする抗原(例えば、Acheron)を用いて予め免疫されている哺乳類(例えば、マウス)の脾臓から抗体を分泌する免疫細胞(リンパ球)を得る段階を含む。次いで、抗体を分泌するリンパ球を細胞培養で無限に複製できる骨髄腫細胞または形質転換細胞と融合し、それによって免疫グロブリンを分泌する不死の細胞系を産生させる。この得られた融合細胞、またはハイブリドーマを培養し、得られたコロニーについて所望のモノクローナル抗体を産生しているかスクリーニングする。そのような抗体を産生しているコロニーをクローニングし、インビボまたはインビトロで増殖させて、大量の抗体を産生させる。そのような細胞を融合させる理論的基礎および実践的方法に関する説明は、参照により本明細書に組み入れられるKohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)に記述されている。
【０１４５】
本発明のタンパク質またはポリペプチド、例えば、Acheronを用いて動物(例えば、マウス)をインビボで免疫することにより、哺乳類のリンパ球が免疫性を与えられる。そのような免疫を必要に応じて数週間までの間隔で繰り返して、十分な力価の抗体を得る。最後の抗原追加免疫の後、その動物を屠殺し、脾臓細胞を取り出す。
【０１４６】
細胞培養で無限に複製できる哺乳類の骨髄腫細胞またはその他の融合パートナーとの融合は、周知の技術により、例えば、ポリエチレングリコール(「PEG」)またはその他の融合剤を用いて達成される(参照により本明細書に組み入れられるMilstein and Kohler, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)を参照されたい)。マウスのものとするのが好ましいがしかし、ラットおよびヒトを含むがこれらに限定されることはない、その他の哺乳類種の細胞から派生させることもできるこの不死の細胞系は、ある種の栄養素を利用するのに必要な酵素が欠損しているように、素早く増殖できるように、および十分な融合能を有するように選択される。そのような多くの細胞系が当業者に知られており、その他のものが恒常的に報告されている。
【０１４７】
ポリクローナル抗体を産生させるための手順も知られている。典型的には、そのような抗体は、予め免疫前血清が採血されているNew Zealand白ウサギに本発明のタンパク質またはポリペプチドを皮下投与することにより産生させることができる。その抗原は異なる6部位に1部位につき総量100 μlで注射することができる。注射される各物質は、合成界面活性剤アジュバントのプルロニックポリオール、またはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後のタンパク質もしくはポリペプチドを含有する粉状のアクリルアミドゲルを含むことができる。次に、そのウサギを最初の注射から2週間後に採血し、6週間ごとに3回、同じ抗原で定期的に追加免疫する。次いで、血清試料を各追加免疫から10日後に回収する。次に、抗体を捕捉する対応抗原を使ったアフィニティークロマトグラフィーにより、ポリクローナル抗体を血清から回収する。最後に、そのウサギを、例えば、ペントバルビタール150 mg/Kg IVで安楽死させる。ポリクローナル抗体を産生させるためのこの手順およびその他の手順は、E. Harlow, et. al., editors, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)に開示されている。
【０１４８】
完全な抗体を利用することに加えて、本発明はそのような抗体の結合部分を使用することを包含する。そのような結合部分としては、Fab断片、F(ab')2断片、およびFv断片が挙げられる。これらの抗体断片は、J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 98-118 (N.Y. Academic Press 1983)に記述されているように、タンパク質分解による断片化法のような、従来の手法により作製することができる。
【０１４９】
完全長のAcheronタンパク質またはAcheronの抗原性ペプチド断片を免疫原として使用することができ、またはそれらを使用して、その他の免疫原、例えば、細胞、膜調製物、および同様のもので作製した抗Acheron抗体を識別することができる。Acheronの抗原性ペプチドは配列番号:4に示されるアミノ酸配列の少なくとも8アミノ酸残基を含んでいなければならず、そのペプチドはAcheronの抗原決定基を包含していなければならない。典型的には、その抗原性ペプチドは少なくとも10、15、20、または30アミノ酸残基を含んでいる。いくつかの態様では、その抗原性ペプチドは以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域である: 残基1-33; 残基34-491; または本明細書に記載のAcheron機能ドメインの全部もしくは一部。
【０１５０】
Acheronの断片を使用してAcheronタンパク質の各領域に対する抗体を作製することができる、例えば、その断片を免疫原として使用することができる、またはその断片を使用して抗体の特異性を特徴付けることができる。これらの領域のいずれか、または本明細書に記載されるその他の領域もしくはドメインと反応する抗体、またはそれらに特異的な抗体を提供する。疎水性領域、親水性領域、または高い抗原性を有することが予想される領域などの特定の領域は、当技術分野において知られる方法を利用して同定することができる。
【０１５１】
抗原性ペプチドに含まれる抗原決定基は、タンパク質の表面に位置するAcheronの各領域、例えば、親水性領域、ならびに高い抗原性を有する領域を含むことができる。例えば、ヒトAcheronタンパク質の配列でEminiによる表面の確率解析を使用して、Acheronタンパク質の表面に局在しているという確率が特に高く、したがって抗体産生の標的とするのに有用な表面残基となる可能性が高い領域を示すことができる。
【０１５２】
一つの態様では、その抗体は本明細書に記載されるAcheronタンパク質のいずれかのドメインまたは領域の抗原決定基に結合する。
【０１５３】
反復投与を含む用途、例えば、ヒト患者の治療上の処置(およびある種の診断用途)には、当技術分野において知られているようなキメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫化抗体および完全なヒト抗体が望ましい。
【０１５４】
抗Acheron抗体は一本鎖抗体とすることができる。一本鎖抗体(scFV)は遺伝子工学で作り変えることができる(例えば、Colcher, D. et al. (1999) Ann NY Acad Sci 880:263-80; およびReiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52を参照されたい)。この一本鎖抗体を二量体化または多量体化して、同じ標的Acheronタンパク質の異なる抗原決定基に特異性を有する多価抗体を産生させることができる。
【０１５５】
一つの態様では、その抗体はFc受容体を結合する能力が低下しているかまたはその能力がない。例えば、それはFc受容体との結合に関する機能がないアイソタイプもしくはサブタイプ、断片またはその他の変異体であり、例えば、それはFc受容体結合領域が変異しているかまたは欠失している。
【０１５６】
本明細書に記載の抗Acheron抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によりAcheronを単離することができる。さらに、抗Acheron抗体を使用して、そのタンパク質の存在量、発現様式、および細胞内局在性を評価するためにAcheronタンパク質(例えば、細胞溶解物、細胞上清、または組織試料、例えば、生検試料中の)を検出することができる。抗Acheron抗体を、例えば、所定の処置計画の効果を判定する臨床試験手順の一部として診断的に使用して、組織中でのタンパク質量、または細胞内局在性をモニターすることができる。その抗体を検出可能な物質に結合させること(すなわち、物理的に連結させること)(すなわち、抗体の標識化)により、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる; 適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる; 適当な蛍光物質の例としては、量子ドット、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる; 発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる; 生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる、ならびに適当な放射性物質の例としては、とりわけ125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
【０１５７】
組換え発現ベクター、宿主細胞および遺伝子操作細胞
他の局面では、本発明は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含んだ、発現ベクターなどのベクターを含む。本明細書では「ベクター」という用語は、これに連結されている他の核酸を輸送することができる核酸分子を指し、その用語はプラスミド、コスミドまたはウイルスベクターを含むことができる。このベクターは自己複製能を有することができ、またはそれは宿主DNA内に入り込むことができる。ウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。
【０１５８】
ベクターは、Acheron核酸を宿主細胞内でのその核酸の発現に適した形態で含むことができる。典型的には、その組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結された一つまたは複数の調節配列を含む。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含む。調節配列は組織特異的調節配列および/または誘導性配列だけでなく、ヌクレオチド配列の構成的発現を命令するものを含む。この発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベル、および同様のものなどの要因に依存する可能性がある。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に記載の核酸によりコードされる、融合タンパク質または融合ポリペプチドを含めた、タンパク質またはポリペプチド(例えば、Acheronタンパク質、Acheronタンパク質の変異型、融合タンパク質、および同様のもの)を産生させることができる。
【０１５９】
本発明の組換え発現ベクターは、Acheronタンパク質を原核細胞または真核細胞で発現するように設計することができる。例えば、本発明のポリペプチドを大腸菌、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現ベクターを利用して)、酵母細胞または哺乳類細胞で発現させることができる。適当な宿主細胞はGoeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)の中でさらに論じられている。または、その組換え発現ベクターを、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写させて発現させることができる。
【０１６０】
原核生物でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質の発現を命令する構成的または誘導性プロモーターを含んだベクターを用いて大腸菌で行われることが最も多い。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸をそのベクター中にコードされるタンパク質に、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは主として3つの目的、つまり1) 組換えタンパク質の発現を増加させること; 2) 組換えタンパク質の溶解性を増加させること; および3) アフィニティー精製でリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助することを果たす。多くの場合、タンパク質分解切断部位を融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入して、融合タンパク質の精製後に組換えタンパク質を融合部分から分離することを可能にする。そのような酵素、およびその同起源の認識配列としては、第Xa因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしてはpGEX (Pharmacia Biotech社; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)およびpRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ)が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAを標的の組換えタンパク質に融合する。
【０１６１】
精製した融合タンパク質をAcheron活性アッセイ(例えば、以下に詳述される直接アッセイまたは競合アッセイ)で、またはAcheronタンパク質に特異的な抗体を産生させるために使用することができる。一つの態様では、本発明のレトロウイルス発現ベクターで発現させた融合タンパク質を使用して、放射線照射を受けた受容者の体内へ後に移植する骨髄細胞に感染させることができる。十分な時間(例えば、6週間)が経過した後、対象受容者の病状を次に検査する。
【０１６２】
組換えタンパク質の発現を大腸菌で最大にするため、一つには、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれている細菌宿主でそのタンパク質を発現させることができる(Gottesman, S., (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128)。他の戦略は、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌で選択的に利用されるものとなるように変化させることである(Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本発明の核酸配列をそのように変化させることは、標準的なDNA合成法により行うことができる。
【０１６３】
Acheron発現ベクターは、例えば、酵母用発現ベクター、昆虫細胞での発現用のベクター、例えば、バキュロウイルス発現ベクター、または哺乳類細胞での発現に適したベクターとすることができる。
【０１６４】
哺乳類細胞で使用する場合、その発現ベクターの制御機能はウイルス調節要素により供与されることができる。例えば、よく使われるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス40に由来する。
【０１６５】
他の態様では、その組換え哺乳類用発現ベクターは、その核酸の発現を特定の細胞型で選択的に命令することができる(例えば、組織特異的な調節要素を使用して、その核酸を発現させる)。適当な組織特異的プロモーターの限定するものではない例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277)、リンパ球特異的プロモーター(Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275)、具体的にはT細胞受容体プロモーター(Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733)および免疫グロブリンプロモーター(Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿(milk whey)プロモーター; 米国特許第4,873,316号および欧州公開公報第264,166号)が挙げられる。発生調節プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター(Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379)およびα-フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)も包含される。
【０１６６】
本発明は、アンチセンス方向で発現ベクター中にクローニングされた本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターをさらに提供する。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列(例えば、ウイルスのプロモーターおよび/またはエンハンサー)は、各種の細胞型でアンチセンスRNAの構成的、組織特異的または細胞型特異的な発現を命令するものを選択することができる。このアンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態をとることができる。アンチセンス遺伝子を利用した遺伝子発現の制御に関する論考については、Weintraub, H. et al., Reviews - Trends in Genetics 1:1 (1986)を参照されたい。
【０１６７】
本発明の他の局面は、本明細書に記載される核酸分子、例えば、組換え発現ベクター内のAcheron核酸分子またはAcheron核酸分子を宿主細胞のゲノムの特定部位に相同的に組換えることを可能にする配列を含んだAcheron核酸分子を含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義的に使用される。その用語は特定の被験体細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。ある種の改変が後の世代で変異または環境の影響によって生じる可能性があるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお本明細書で使用されるその用語の範囲内に含まれる。
【０１６８】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞とすることができる。例えば、Acheronタンパク質を大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳類細胞(チャイニーズハムスター卵母細胞(CHO)またはCOS細胞のような)で発現させることができる。その他の適当な宿主細胞は当業者に知られている。
【０１６９】
ベクターDNAは、従来の形質転換法または形質移入法により宿主細胞中に導入することができる。本明細書では「形質転換」および「形質移入」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、DEAE-デキストランを介した形質移入法、リポフェクション法、またはエレクトロポレーション法を含めて、外来核酸(例えば、DNA)を宿主細胞中に導入するための、当技術分野において認識されている種々の方法を指すように意図される。
【０１７０】
本発明の宿主細胞を使用して、Acheronタンパク質を産生させる(すなわち、発現させる)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を使用してAcheronタンパク質を産生させる方法をさらに提供する。一つの態様では、この方法は本発明の宿主細胞(Acheronタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている)をAcheronタンパク質が産生されるように適当な培地中で培養する段階を含む。他の態様では、この方法はその培地または宿主細胞からAcheronタンパク質を単離する段階をさらに含む。
【０１７１】
他の局面では、本発明はAcheronトランス遺伝子を含む細胞もしくは細胞の精製調製物、または別の方法でAcheronを異所発現する細胞もしくは細胞の精製調製物を特徴とする。この細胞の調製物はヒトまたはヒト以外の細胞、例えば、齧歯類の細胞、例えば、マウスまたはラットの細胞、ウサギの細胞、チャイニーズハムスター卵母(CHO)細胞、またはブタの細胞からなることができる。いくつかの態様では、この細胞または細胞群はAcheronトランス遺伝子、例えば、Acheronの異種型、例えば、ヒト以外の細胞の場合にはヒトに由来する遺伝子を含む。このAcheronトランス遺伝子を異所発現させることができる、例えば、その遺伝子を過剰発現させることができ、過小発現させることができ、または異所局在化させることができる。他の態様では、この細胞または細胞群は内在性Acheronを異所発現する遺伝子、例えば、遺伝子の発現が妨害されている遺伝子、例えば、ノックアウト遺伝子を含む。このような細胞は、変異しているかもしくは異所発現しているAcheron対立遺伝子に関係する疾患を研究するためのモデルまたは薬剤スクリーニングで用いるモデルとして役立てることができる。
【０１７２】
他の局面では、本発明はAcheronポリペプチドをコードする核酸で形質転換した細胞、例えば、哺乳類細胞、例えば、筋芽細胞、神経幹細胞、または造血幹細胞を特徴とする。
【０１７３】
同様に提供されるのは、内在性Acheron(遺伝子)が通常は内在性Acheron遺伝子の発現を制御していない調節配列の制御下にある細胞、例えば、ヒトの細胞、例えば、ヒトの神経細胞、造血性細胞、または筋芽細胞である。細胞、例えば、細胞系または微生物の内部での内在性遺伝子の発現特性は、挿入する調節要素が内在性Acheron遺伝子に作動可能に連結されるように異種DNA調節要素を細胞のゲノム中に挿入することによって変化させることができる。例えば、「転写的に不活性」である、例えば、通常は発現されていないか、またはごく僅かな量でしか発現されていない内在性Acheron遺伝子は、その細胞で通常発現されている遺伝子産物の発現を促進できる調節要素を挿入することによって活性化させることができる。例えば、Chappel、米国特許第5,272,071号; 1991年5月16日付で公開されている国際公開公報第91/06667号に記述されているように、標的相同組換えなどの技術を使用して、異種DNAを挿入することができる。
【０１７４】
他の局面では、本発明は被験体内への移植に適している単離された遺伝子操作Acheron宿主細胞、例えば、移植細胞の生着の増加が望まれるような細胞移植に基づく遺伝子治療またはその他の移植療法に用いる細胞を提供する。遺伝子操作細胞とは、永続的変化(例えば、Acheronトランス遺伝子を安定的に発現している細胞、またはAcheronノックアウト細胞)、および一時的変化(例えば、Acheron阻害剤、例えば、Acheronのアンチセンス、抗体、siRNA、またはドミナントネガティブポリペプチドで処理した細胞)の両方を含むヒトの介入によって、ある変化が生じている細胞である。例えば、そのような細胞は自己幹細胞もしくは異種幹細胞または神経前駆細胞および筋肉前駆細胞(例えば、筋芽細胞)を含むが、これらに限定されることはない部分的に分化した細胞とすることができる。いくつかの態様では、この宿主細胞は一つまたは複数のさらなる異所性遺伝子、例えば、移植細胞の生着を増加させることを目的としたAcheron以外の遺伝子、または疾患を治療することを目的とした遺伝子、例えば、ジストロフィンまたはSOD-1を発現することもできる。そのような遺伝子は、遺伝的欠陥、例えば、突然変異を補正することを目的とした遺伝子を含むことができる。いくつかの態様では、この宿主細胞は自家性である、例えば、その細胞は対象とする移植者から採取される。いくつかの態様では、この宿主細胞はAcheronを異所発現する、例えば、その細胞はAcheron活性が増加しているかまたは低下している。例えば、Acheron活性が低下している細胞、例えば、Acheron遺伝子の全部または一部を欠いている遺伝子操作細胞あるいはAcheronのアンチセンスもしくはds-siRNAまたはAcheronのドミナントネガティブを発現している遺伝子操作細胞は、アポトーシスを受ける可能性が低くなっており、したがってその細胞は受容者に移植された場合に生着している見込みが高くなっている。いくつかの態様では、この細胞はAcheronの発現または活性の一過性阻害剤、例えば、Acheronのアンチセンス、抗体、siRNA、またはドミナントネガティブなAcheronポリペプチドで処理されている。
【０１７５】
遺伝子導入動物
本発明はヒト以外の遺伝子導入動物を提供する。そのような動物はAcheronタンパク質の機能および/または活性を研究するためにならびにAcheron活性の調節因子を同定するおよび/または評価するために有用である。本明細書では「遺伝子導入動物」とは、ヒト以外の動物、例えば、哺乳類、典型的にはラットまたはマウスなどの齧歯類であって、その動物の細胞の一つまたは複数がAcheronトランス遺伝子を含んでいる動物である。遺伝子導入動物のその他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類、および同様のものが挙げられる。トランス遺伝子は外来性DNAまたは再配列、例えば、内在性の染色体DNAの欠失であり、これは遺伝子導入動物の細胞のゲノム中に組み込まれる可能性がありまたは遺伝子導入動物の細胞のゲノムで生じる。トランス遺伝子はコードする遺伝子産物の発現を遺伝子導入動物の一つまたは複数の細胞型または組織で命令することができ、その他のトランス遺伝子、例えば、ノックアウト遺伝子は発現を低下させることができる。したがって、遺伝子導入動物は、例えば、その内在性遺伝子とその動物の発生前に動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に導入された外来性DNA分子との間の相同組換えによって内在性Acheron遺伝子が改変されているものとすることができる。
【０１７６】
イントロン配列およびポリアデニル化シグナルを同様にトランス遺伝子の中に含ませて、トランス遺伝子の発現の効率を高めることができる。組織特異的な調節配列を本発明のトランス遺伝子に作動可能に連結させて、特定の細胞にAcheronタンパク質の発現を命令することができる。遺伝子導入創始動物は、Acheronトランス遺伝子がそのゲノム中に存在することおよび/またはその動物の組織もしくは細胞中のAcheron mRNAの発現に基づいて同定することができる。次に、遺伝子導入創始動物を使用して、トランス遺伝子を持つさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、Acheronタンパク質をコードするトランス遺伝子を持つ遺伝子導入動物をその他のトランス遺伝子を持つその他の遺伝子導入動物にさらに繁殖させることができる。
【０１７７】
Acheronのタンパク質またはポリペプチドを遺伝子導入動物または植物で発現させることができる、例えば、そのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を動物のゲノム中に導入することができる。いくつかの態様では、その核酸を組織特異的プロモーター、例えば、ミルクまたは卵子特異的プロモーターの制御下に配置し、その動物が作り出すミルクまたは卵子からその核酸を回収する。適当な動物はマウス、ブタ、ウシ、ヤギ、およびヒツジである。
【０１７８】
本発明は同様に、遺伝子導入動物由来の細胞の集団を含む。
【０１７９】
用途
本明細書に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗体を以下の方法の一つまたは複数で使用することができる: a) スクリーニングアッセイ; b) 予知医学(例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験の監視、および薬理遺伝学); およびc) 細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患、ならびに、例えば、本明細書に記載の、細胞の変性と関係する疾患の処置(例えば、治療および予防)の方法。
【０１８０】
本発明の単離された核酸分子を使用して、以下でさらに記述されるように、例えば、Acheronタンパク質を発現させること(例えば、遺伝子治療用途において宿主細胞中の組換え発現ベクターにより)、Acheron mRNA(例えば、生体試料中の)を検出することまたはAcheron遺伝子の遺伝子変化を検出すること、およびAcheron活性を調節することができる。そのAcheronタンパク質を使用して、不十分なまたは過剰なAcheron基質の産生またはAcheron阻害剤の産生により特徴付けられる疾患を治療することができる。さらに、そのAcheronタンパク質を使用して、不十分なまたは過剰な、Acheronタンパク質の産生またはAcheron野生型タンパク質と比べて低い、異常な、もしくは望ましくない活性を有するAcheronタンパク質型の産生により特徴付けられる疾患(例えば、異常な細胞の分化、増殖、または変性と関係する疾患)を治療することができるだけでなく、天然由来のAcheron基質をスクリーニングすること、Acheron活性を調節する薬物または化合物をスクリーニングすることができる。そのような疾患としては細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患、ならびに、例えば、本明細書に記載の、細胞の変性と関係する疾患の処置が挙げられる。さらに、本発明の抗Acheron抗体を使用して、Acheronタンパク質を検出し単離し、Acheronタンパク質の生体利用効率を制御し、およびAcheron活性を調節することができる。
【０１８１】
被験体のAcheronポリペプチドと相互作用する、例えば、そのポリペプチドを結合する能力について化合物を評価する方法を提供する。この方法は化合物を被験体のAcheronポリペプチドと接触させる段階; および被験体のAcheronポリペプチドと相互作用する、例えば、そのポリペプチドを結合するまたはそのポリペプチドと複合体を形成する化合物の能力を評価する段階を含む。この方法はインビトロで、例えば、無細胞系で、またはインビボで、例えば、ツーハイブリッドの相互作用トラップアッセイで行うことができる。この方法を使用して、被験体のAcheronポリペプチドと相互作用する天然由来の分子を同定することができる。この方法を使用して、被験体のAcheronポリペプチドの天然または合成阻害剤を見出すこともできる。スクリーニング方法は以下でさらに詳細に論ずる。
【０１８２】
Acheronの調節因子を同定する方法
本発明は、Acheronタンパク質に結合し、例えば、Acheronの発現またはAcheronの活性に刺激作用または阻害作用を及ぼす、あるいは、例えば、Acheron基質の発現または活性に刺激作用または阻害作用を及ぼす調節因子、すなわち、候補化合物もしくは試験化合物または候補薬剤もしくは試験薬剤(例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、小分子またはその他の薬物)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」ともいわれる)を提供する。このように同定された化合物を使用して、治療プロトコルで標的遺伝子(例えば、Acheron遺伝子)産物の活性を調節することができ、標的遺伝子産物の生物学的機能を詳しく調べることができ、または通常の標的遺伝子の相互作用を壊す化合物を同定することができる。
【０１８３】
一つの態様では、本発明はAcheronタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分の基質となる候補化合物または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。他の態様では、本発明はAcheronタンパク質もしくはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたはそれらの活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。
【０１８４】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー; ペプトイドライブラリー(ペプチドの機能性を有する、但し酵素的分解に耐性を示すがそれでもなお生物活性を残す今までにない非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー; 例えば、Zuckermann, R.N. et al., J. Med. Chem. 37:2678-85 (1994)を参照されたい); 空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー; デコンボリューションを必要とする合成ラリブラリー法; 「1-ビーズ1-化合物」ライブラリー法; およびアフィニティークロマトグラフィー選択を利用する合成ライブラリー法を含めて、当技術分野において知られるコンビナトリアルライブラリー法における多数の手法のいずれかを利用して得ることができる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーの手法はペプチドライブラリーに限定されるのに対し、その他の4手法はペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用できる(Lam, K.S., Anticancer Drug Des. 12:145 (1997))。
【０１８５】
分子ライブラリーの合成方法の例は当技術分野において、例えば、DeWitt et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993); Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422 (1994); Zuckermann et al. J. Med. Chem. 37:2678 (1994); Cho et al. Science 261:1303 (1993); Carrell et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059 (1994); Carell et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 (1994); およびGallop et al. J. Med. Chem. 37:1233 (1994)で見出すことができる。
【０１８６】
化合物のライブラリーは溶液(例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421(1992))中で、あるいはビーズ(Lam, Nature 354:82-84 (1991))、チップ((Fodor, Nature 364:555-556 (1993))、細菌(Ladner, 米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner 米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al. Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869 (1992))上でまたはファージ(Scott and Smith, Science 249:386-390 (1990); Devlin, Science 249:404-406 (1990); Cwirla et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 (1990); Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310 (1991); Ladner 前記)上で供与することができる。
【０１８７】
一つの態様では、アッセイは、Acheronタンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させて、試験化合物がAcheron活性を調節する能力を測定するという細胞に基づくアッセイである。試験化合物がAcheron活性を調節する能力を測定することは、例えば、アポトーシスまたは細胞分化をモニターすることにより達成することができる。その細胞は、例えば、哺乳類由来のもの、例えば、マウス、ラット、またはヒトのものとすることができる。
【０１８８】
試験化合物が化合物、例えば、Acheron基質またはCASK-CもしくはAriadneなどの結合パートナーとのAcheronの結合を調節する能力、あるいはAcheronに結合する能力を評価することもできる。これは、例えば、Acheronとの化合物(例えば、基質)の結合を複合体中の標識化合物(例えば、基質)の検出により測定できるように、化合物(例えば、基質)を放射性標識または酵素標識と結び付けることにより達成することができる。あるいは、Acheronを放射性標識または酵素標識と結合させて、試験化合物が複合体中のAcheron基質とのAcheronの結合を調節する能力をモニターすることができる。例えば、化合物(例えば、Acheron基質)を125I、35S、14C、または3Hで直接的にまたは間接的に標識することができ、その放射性標識を放射線放出の直接的計測によりまたはシンチレーション計測により検出することができる。あるいは、化合物を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、その酵素標識を適切な基質の生成物への変換の測定により検出することができる。
【０１８９】
Acheronと相互作用する化合物(例えば、Acheron基質)の能力は、その相互作用物のいずれかを標識してまたは標識せずとも評価することができる。例えば、マイクロフィジオメータを使用してAcheronとの化合物の相互作用を、化合物またはAcheronを標識せずとも検出することができる。McConnell, H. M. et al. Science 257:1906-1912 (1992)。本明細書では「マイクロフィジオメータ」(例えば、Cytosensor)とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレス可能電位計測センサ(LAPS)を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化を化合物とAcheronとの間の相互作用の指標として使うことができる。
【０１９０】
他の態様では、Acheronタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させて、試験化合物がAcheronタンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力を評価するという無細胞アッセイを提供する。本発明のアッセイで使用されるAcheronタンパク質の生物学的に活性な部分は、Acheron以外の分子との相互作用に関与する断片、例えば、表面にある確率のスコアが高い断片を含む。
【０１９１】
単離されたタンパク質(例えば、Acheronタンパク質またはその生物学的に活性な部分)の可溶型および/または膜結合型を本発明の無細胞アッセイで使用することができる。そのタンパク質の膜結合型を使用する場合、可溶化剤を利用することが望ましいかもしれない。そのような可溶化剤の例としては、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton(登録商標) X-100、Triton(登録商標) X-114、Thesit(登録商標)、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホン酸(CHAPS)、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸(CHAPSO)、またはN-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホン酸などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１９２】
無細胞アッセイは標的遺伝子のタンパク質と試験化合物の反応混合液を、この二つの成分を相互作用させて結合させるのに十分な時間および条件の下で調製する段階、それによって除去できるおよび/または検出できる複合体を形成させる段階を含む。
【０１９３】
二つの分子間の相互作用は、例えば、蛍光エネルギー移動(FET) (例えば、Lakowicz et al., 米国特許第5,631,169号; Stavrianopoulos, et al., 米国特許第4,868,103号を参照されたい)を利用して検出することもできる。第一の「供与体」分子上のフルオロフォア標識は、その放出蛍光エネルギーが第二の「受容体」分子上の蛍光標識により吸収され、蛍光標識がその吸収エネルギーによって蛍光を発することができるように選択する。または、その「供与体」タンパク質分子は単にトリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを利用することができる。異なる波長の光を放出する標識を選択し、その結果、「受容体」分子の標識を「供与体」のものと区別することができる。標識間のエネルギー移動の効率はこれらの分子を引き離している距離に関係するので、これらの分子間の空間的関係を評価することができる。これらの分子間に結合が生じる状況で、このアッセイにおける「受容体」分子の標識の蛍光放出が最大となるはずである。FET結合事象は当技術分野において周知の標準的な蛍光検出手段により(例えば、蛍光分光計(fluorimeter)を用いて)好都合に測定することができる。
【０１９４】
他の態様では、Acheronタンパク質が標的分子に結合する能力を測定することは、リアルタイム相互作用分析(BIA)を利用して行うことができる(例えば、Sjolander, S. and Urbaniczky, C. Anal. Chem. 63:2338-2345 (1991)およびSzabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 (1995)を参照されたい)。「表面プラズモン共鳴」または「BIA」はどの相互作用物質も標識せずに、生体特異的相互作用をリアルタイムで検出するものである(例えば、BIAcore)。結合表面での質量の変化(結合事象を示す)が表面近傍で光の屈折率の変化(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象)を引き起こし、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用できる検出可能なシグナルをもたらす。
【０１９５】
一つの態様では、標的遺伝子産物または試験物質を固相上に固着する。固相上に固着された標的遺伝子産物/試験化合物の複合体を反応の終わりに検出することができる。例えば、標的遺伝子産物を固相表面に固着することができ、試験化合物(これは固着されていない)を本明細書で論じられる検出可能な標識で直接的にまたは間接的に標識することができる。
【０１９６】
Acheron、抗Acheron抗体、またはその標的分子を固定化して、アッセイの自動化のために便宜を図るだけでなく、それらのタンパク質の一方または両方の非複合型からの複合型の分離を容易とすることが望ましいかもしれない。Acheronタンパク質との試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および非存在下での標的分子とのAcheronタンパク質の相互作用は、それらの反応物質を含有するのに適したいずれかの容器中で行うことができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が挙げられる。一つの態様では、各タンパク質の一方または両方を基材に結合可能とするドメインを付加している融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/Acheron融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質をグルタチオンセファロース(登録商標)ビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化されたマイクロタイタープレート上に吸着させることができ、これらを次に試験化合物または試験化合物および吸着されていない標的タンパク質もしくはAcheronタンパク質と混合し、この混合物を複合体形成に寄与する条件の下で(例えば、塩およびpHに対する生理学的条件で)インキュベートする。インキュベーション後、このビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合の成分を除去し、ビーズの場合には基材を固定化し、複合体を、例えば、上述のように直接的にまたは間接的に測定する。あるいは、この複合体を基材から解離させることができ、Acheronの結合または活性のレベルを標準的な技術を利用して測定することができる。
【０１９７】
Acheronタンパク質または標的分子を基材上に固定化するその他の技術としては、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合の利用が挙げられる。ビオチン化したAcheronタンパク質または標的分子を当技術分野において知られる技術(例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を利用してビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製することができ、これをストレプトアビジンでコーティングされた96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル中に固定化することができる。
【０１９８】
アッセイを行うため、固着成分を含むコーティング表面に未固定の成分を添加する。反応の完了後、形成されたいずれかの複合体が固相表面上に固定化されたままとなるような条件の下で、未反応成分を除去する(例えば、洗浄により)。固相表面上に固着された複合体の検出は、様々な方法で行うことができる。前もって固定化されていない成分が予め標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出によって複合体が形成されたことが示される。前もって固定化されていない成分が予め標識されていない場合、間接的な標識を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる; 例えば、固定化された成分に特異的な標識抗体(この抗体は直接的に標識することができまたは、例えば、標識抗Ig抗体で間接的に標識することができる)を使用する。
【０１９９】
一つの態様では、Acheronタンパク質または標的分子と反応するが、但しAcheronタンパク質のその標的分子との結合を妨害しない抗体を利用して、このアッセイを行う。そのような抗体をプレートのウェルに対して誘導体化することができ、未結合の標的またはAcheronタンパク質を抗体との結合によりウェル中に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法は、GST-固定化複合体について上述したものに加えて、Acheronタンパク質または標的分子と反応する抗体による複合体の免疫検出、ならびにAcheronタンパク質または標的分子と関係する酵素活性の検出による酵素結合(免疫)アッセイを含む。
【０２００】
または、無細胞アッセイを液相で行うことができる。そのようなアッセイでは、分画遠心法(例えば、Rivas, G., and Minton, A. P., Trends Biochem Sci 18:284-7 (1993)を参照されたい); クロマトグラフィー法(ゲルろ過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法); 電気泳動法(例えば、Ausubel et al. eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York.を参照されたい); および免疫沈降法(例えば、Ausubel et al., eds. (1999) 前記を参照されたい)を含むがこれらに限定されない、多くの標準的な方法のいずれかにより、その反応生成物を未反応の成分から分離する。その樹脂およびクロマトグラフ法は当業者に知られている(例えば、Heegaard, J Mol Recognit 11:141-8 (1998); Hage, D.S., and Tweed, S.A. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525 (1997)を参照されたい)。さらに、蛍光エネルギー移動を好都合に利用して、本明細書に記述されているように、溶液から複合体をさらに精製することなく結合を検出することもできる。
【０２０１】
一つの態様では、このアッセイはAcheronタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、Acheronを結合する周知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成させる段階と、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる段階と、試験混合物がAcheronタンパク質と相互作用する能力を測定する段階とを含み、試験混合物がAcheronタンパク質と相互作用する能力を測定する段階は、公知化合物と比べて、試験混合物がAcheronまたはその生物学的に活性な部分に選択的に結合する能力、あるいは標的分子の活性を調節する能力を測定する段階を含む。
【０２０２】
本発明の標的遺伝子産物はタンパク質などの、一つまたは複数の細胞のまたは細胞外の高分子とインビボで相互作用することができる。この論述を目的に、そのような細胞のおよび細胞外の高分子を本明細書で「結合パートナー」という。そのような相互作用を壊す化合物は、標的遺伝子産物の活性を制御するのに有用とすることができる。そのような化合物としては、抗体、ペプチド、および小分子などの分子を挙げることができるが、これらに限定されることはない。典型的には、この態様で用いる標的遺伝子/産物は、本明細書に記載されるAcheron遺伝子である。別の態様では、本発明はAcheron標的分子の下流のエフェクターの活性を調節することによりAcheronタンパク質の活性を調節する試験化合物の能力を測定する方法を提供する。例えば、前述のように、適当な標的に対するエフェクター分子の活性を測定することができ、または適当な標的とのエフェクターの結合を測定することができる。
【０２０３】
標的遺伝子産物とその細胞のまたは細胞外の結合パートナーとの間の相互作用を壊す化合物を同定するため、標的遺伝子産物と結合パートナーを含む反応混合物をその二つの産物が複合体を形成することを可能とするのに十分な時間および条件の下で調製する。阻害剤を試験するため、この反応混合物は試験化合物を入れておよび入れないで供与する。この試験化合物は最初から反応混合物中に含有させることができ、またはこれは標的遺伝子およびその細胞のまたは細胞外の結合パートナーの添加後に添加することができる。対照の反応混合物は試験化合物なしでまたは偽薬とともにインキュベートする。標的遺伝子産物と細胞のまたは細胞外の結合パートナーとの間のいずれかの複合体の形成を次に検出する。対照反応物中では複合体が形成されるが、試験化合物を含有する反応混合物中では複合体が形成されないことで、その化合物が標的遺伝子産物および相互作用性の結合パートナーの相互作用を妨害することが示唆される。さらに、試験化合物および正常型の標的遺伝子産物を含有する反応混合物内での複合体形成を試験化合物および変異型の標的遺伝子産物を含有する反応混合物内での複合体形成と比較することもできる。この比較は正常型ではなく変異型の標的遺伝子産物の相互作用を壊す化合物を同定することが望まれる場合に重要となる可能性がある。
【０２０４】
これらのアッセイ法は不均一なまたは均一な形式で行うことができる。不均一法は標的遺伝子産物または結合パートナーを固相上に固着する段階、および反応の終わりに固相上に固着された複合体を検出する段階を含む。均一法の場合、反応全体を液相中で行う。どちらの手法でも、反応物質の添加の順序を変えて、試験している化合物に関する異なる情報を得ることができる。例えば、標的遺伝子産物と結合パートナーとの間の相互作用を、例えば、競合によって妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことにより同定することができる。または、事前に形成された複合体を壊す試験化合物、例えば、複合体由来の構成成分の一つと置き換わる、結合定数がさらに高い化合物は、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に添加することにより試験することができる。この各種の形式を以下に簡単に記述する。
【０２０５】
不均一なアッセイ系では、標的遺伝子産物または相互作用性の細胞のもしくは細胞外の結合パートナーを固相表面(例えば、マイクロタイタープレート)上に固着し、その一方で固着させない種を直接的にまたは間接的に標識する。この固着させる種は非共有結合または共有結合により固定化することができる。または、固着させる種に特異的な固定化抗体を使用して、その種を固相表面に固着させることができる。
【０２０６】
アッセイを行うため、固定化した種のパートナーを、試験化合物とともにまたはなしでコーティング表面にさらす。反応の完了後、未反応成分を除去して(例えば、洗浄により)、形成されたいずれかの複合体が固相表面上に固定化されたままとすることができる。固定化させていない種が予め標識されている場合、表面上に固定化された標識の検出によって複合体が形成されたことが示される。固定化させていない種が予め標識されていない場合、間接的な標識を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる; 例えば、前もって固定化させていない種に特異的な標識抗体(この抗体は直接的に標識することができまたは、例えば、標識抗Ig抗体で間接的に標識することができる)を使用する。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害する試験化合物または事前に形成された複合体を壊す試験化合物を検出することができる。
【０２０７】
あるいは、この反応は液相中で試験化合物を入れてまたは入れないで行うことができ、その反応生成物を未反応成分から分離することができ、複合体を検出することができる; 例えば、結合成分の一つに特異的な固定化抗体を使用して、溶液中に形成されたいずれかの複合体を固着し、その他のパートナーに特異的な標識抗体を使用して、固着した複合体を検出する。この場合も同様に、液相に反応物質を添加する順序に応じて、複合体を阻害する試験化合物または事前に形成された複合体を壊す試験化合物を同定することができる。
【０２０８】
本発明の他の態様では、均一法を使用することができる。例えば、標的遺伝子産物またはその結合パートナーを標識するが、但しその標識により発せられるシグナルが複合体の形成によって消光されるという点で、標的遺伝子産物および相互作用性の細胞のまたは細胞外の結合パートナー産物の事前形成複合体を調製する(例えば、この手法を免疫測定法に利用している米国特許第4,109,496号を参照されたい)。事前に形成された複合体由来の種の一つと競合して置き換わる試験物質の添加により、バックグラウンドを超えるシグナルが発生するはずである。このようにして、標的遺伝子産物と結合パートナーとの間の相互作用を壊す試験物質を同定することができる。
【０２０９】
他の局面では、Acheronタンパク質をツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ(例えば、米国特許第5,283,317号; Zervos et al. Cell 72:223-232 (1993); Madura et al. J. Biol. Chem. 268:12046-12054 (1993); Bartel et al. Biotechniques 14:920-924 (1993); Iwabuchi et al. Oncogene 8:1693-1696 (1993); およびBrent 国際公開公報第94/10300号を参照されたい)で「ベイトタンパク質」として使用して、Acheronに結合するかまたはAcheronと相互作用しAcheron活性に関与するタンパク質を同定することができる。そのようなAcheron結合タンパク質は、例えば、Acheron媒介性のシグナル伝達経路の下流要素として、Acheronタンパク質またはAcheron標的によるシグナルの活性化因子または阻害因子とすることができる。このような方法で同定されるタンパク質としては、CASK-CおよびAriadneが挙げられる。
【０２１０】
ツーハイブリッド系は、分離可能なDNA結合ドメインおよび活性化ドメインからなる大部分の転写因子のモジュール的性質に基づいている。つまり、このアッセイでは二つの異なるDNA構築体を利用する。一方の構築体では、Acheronタンパク質をコードする遺伝子を、公知の転写因子(例えば、GAL-4)のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。もう一方の構築体では、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードする、DNA配列のライブラリー由来のDNA配列を、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。または、Acheronタンパク質を活性化ドメインに融合させることができる。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで、相互作用可能であり、Acheron依存的な複合体を形成している場合、転写因子のDNA結合ドメインおよび活性化ドメインが近づけられる。この接近によって、転写因子に応答する転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子(例えば、LacZ)の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現を検出することが可能であり、機能的な転写因子を含む細胞コロニーを単離し使用して、Acheronタンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【０２１１】
他の態様では、Acheron発現の調節因子を同定する。例えば、細胞または無細胞混合物を候補化合物と接触させて、Acheron mRNAまたはタンパク質の発現を候補化合物なしの場合のAcheron mRNAまたはタンパク質の発現レベルと比べて評価する。候補化合物がある場合にこれがない場合よりもAcheron mRNAまたはタンパク質の発現が高くなっている場合、その候補化合物はAcheron mRNAまたはタンパク質の発現の刺激因子と同定される。あるいは、候補化合物がある場合にこれがない場合よりもAcheron mRNAまたはタンパク質の発現が低い(統計学的に有意に低い)場合、その候補化合物はAcheron mRNAまたはタンパク質の発現の阻害因子と同定される。Acheron mRNAまたはタンパク質の発現レベルは、Acheron mRNAまたはタンパク質を検出するための本明細書に記載の方法により決定することができる。
【０２１２】
他の局面では、本発明は、本明細書に記載されるアッセイの二つまたはそれ以上の組み合わせに関する。例えば、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを利用して調節剤を同定することができ、この調節剤がAcheronタンパク質の活性を調節する能力をインビボで、例えば、異常な細胞の増殖、分化、または変性と関係する疾患動物モデルなどの動物で確認することができる。
【０２１３】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイにより同定された新規の薬剤に関する。したがって、本明細書に記載されるように同定された薬剤(例えば、Acheron調節剤、アンチセンスAcheron核酸分子、Acheron特異的抗体、またはAcheron結合パートナー、例えば、CASK-CまたはAriadne)を適切な動物モデルでさらに使用して、そのような薬剤による処置の効力、毒性、副作用、または作用機序を決定することは本発明の範囲内である。さらに、前述のスクリーニングアッセイにより同定された薬剤、例えば、CASK-CおよびAriadneを本明細書に記載の処置に使用することができる。
【０２１４】
検出アッセイ
本明細書で同定された核酸配列の一部分または断片をポリヌクレオチド試薬として使用することができる。例えば、これらの配列を使用して、(i) その各遺伝子を染色体上にマップする、例えば、遺伝的疾患と関係する遺伝子領域を位置付けるかまたはAcheronを疾患と関連付けることができる; (ii) 僅かな生体試料から個体を識別すること(組織適合試験)ができる; および(iii) 生体試料の法鑑定に役立てることができる。これらの用途を達成する方法は当技術分野において知られている。
【０２１５】
診断アッセイおよび予後アッセイ
生体試料中のAcheronのタンパク質または核酸の存在、レベル(量)、細胞内局在性または欠如は、被験体から生体試料を得て、Acheronタンパク質またはAcheronタンパク質をコードする核酸(例えば、mRNA、ゲノムDNA)を検出できる化合物または薬剤とこの生体試料を接触させることによって評価することができる。「生体試料」という用語は、被験体から単離した組織、細胞、および生体液を含む。典型的な生体試料としては、血清および生検腫瘍組織が挙げられる。Acheron遺伝子の発現レベルは、Acheron遺伝子がコードするmRNAの測定; Acheron遺伝子がコードするタンパク質の量の測定; またはAcheron遺伝子がコードするタンパク質の活性の測定を含むがこれらに限定されない、様々な方法で測定することができる。Acheronタンパク質の細胞内局在性は、免疫組織化学を含めて、当技術分野において知られる方法により、例えば、公知の病理学的方法および本明細書に記載される抗Acheron抗体を利用して測定することができる。
【０２１６】
細胞中のAcheron遺伝子に対応するmRNAのレベルは、インサイチュー形式によってもインビトロ形式によっても決定することができる。
【０２１７】
単離されたmRNAは、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用することができる。mRNAレベルを検出する診断法の一つは、単離されたmRNAを、検出される遺伝子がコードするmRNAにハイブリダイズできる核酸分子(プローブ)と接触させる段階を含む。この核酸プローブは、例えば、配列番号:4の核酸のような完全長のAcheron核酸、または長さが少なくとも7、15、30、50、100、250もしくは500ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであって、AcheronのmRNAまたはゲノムDNAにストリンジェントな条件の下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドのようなその一部分とすることができる。診断アッセイで用いるのに適したその他のプローブが本明細書に記述されている。
【０２１８】
一つの形式では、例えば、単離されたmRNAをアガロースゲル上で泳動して、このmRNAをゲルからニトロセルロースなどの膜に転写することにより、mRNA(またはcDNA)を表面上に固定化し、これをプローブと接触させる。別の形式では、例えば、二次元の遺伝子チップアレイで、プローブを表面上に固定化して、mRNA(またはcDNA)をこのプローブと接触させる。当業者は、Acheron遺伝子がコードするmRNAのレベルの検出で用いるために公知のmRNA検出法を適合することができる。
【０２１９】
Acheron遺伝子がコードするmRNAの試料中のレベルは核酸増幅を使い、例えば、rtPCR法 (Mullis (1987) 米国特許第4,683,202号)、リガーゼ連鎖反応法(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自立複製法(Guatelli et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅システム法(Kwoh et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-ベータレプリカーゼ法(Lizardi et al., (1988) Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製法(Lizardi et al., 米国特許第5,854,033号)、またはその他の任意の核酸増幅法により、増幅された分子を当技術分野において知られる技術を利用して引き続き検出することにより評価することができる。本明細書では、増幅プライマーは遺伝子の5'または3'領域(それぞれプラスおよびマイナス鎖、またはその逆)にアニールできる核酸分子の対であると定義するものであり、増幅プライマーは(その二つの)間に短い領域を含んでいる。一般に、増幅プライマーは長さが約10〜30ヌクレオチドであり、そのプライマーは長さが約50〜200ヌクレオチドの領域を挟んで隣接する。適切な条件の下でおよび適切な試薬を用いることで、そのプライマーは、プライマーによって挟まれたヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０２２０】
インサイチュー法の場合、細胞または組織試料を調製し/処理し、これを支持体、典型的にはガラススライド上に固定化し、次いでこれを、解析されるAcheron遺伝子をコードするmRNAにハイブリダイズできるプローブと接触させることができる。
【０２２１】
他の態様では、この方法は対照試料を、AcheronのmRNAまたはゲノムDNAを検出できる化合物または薬剤と接触させる段階、および対照試料中のAcheronのmRNAまたはゲノムDNAの存在を試験試料中のAcheronのmRNAまたはゲノムDNAの存在と比較する段階をさらに含む。
【０２２２】
様々な方法を使用して、Acheron遺伝子がコードするタンパク質のレベルを決定することができる。一般に、これらの方法はこのタンパク質に選択的に結合する薬剤、例えば、抗体を試料と接触させて、試料中のタンパク質のレベルを評価する段階を含む。一つの態様では、この抗体は検出可能な標識を持つ。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルとすることができる。完全な抗体、またはその断片(例えば、Fv、Fab、またはF(ab')2)を使用することができる。
【０２２３】
この検出方法を使用して、生体試料中のAcheronタンパク質をインビトロでならびにインビボで検出することができる。Acheronタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、およびウエスタンブロット解析法が挙げられる。Acheronタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、被験体内に標識抗Acheron抗体を導入することが挙げられる。例えば、この抗体をマーカー、例えば、放射性マーカーで標識することができ、被験体内でのその存在および位置を標準的な画像化技術により検出することができる。
【０２２４】
他の態様では、この方法は対照試料を、Acheronタンパク質を検出できる化合物または薬剤と接触させる段階、および対照試料中のAcheronタンパク質の存在を試験試料中のAcheronタンパク質の存在と比較する段階をさらに含む。
【０２２５】
本発明は同様に、生体試料中のAcheronの存在を検出するためのキットを含む。例えば、このキットは生体試料中のAcheronのタンパク質またはmRNAを検出できる化合物または薬剤および標準物質を含むことができる。この化合物または薬剤は適当な容器中に包装することができる。このキットは、キットを使用してAcheronのタンパク質または核酸を検出するための使用説明書をさらに含むことができる。
【０２２６】
抗体に基づくキットの場合、このキットは、(1) 本発明のマーカーに相当するポリペプチドに結合している一次抗体(例えば、固相支持体に付着されている)、および任意で、(2) そのポリペプチドまたは一次抗体に結合する異なる二次抗体であって、検出可能な薬剤に結合させてある抗体を含むことができる。
【０２２７】
オリゴヌクレオチドに基づくキットの場合、このキットは、(1) 本発明のマーカーに相当するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドまたは(2) 本発明のマーカーに相当する核酸分子を増幅するのに有用なプライマーの対を含むことができる。このキットは緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤を含むこともできる。このキットは検出可能な薬剤を検出するのに必要な成分(例えば、酵素または基質)を含むこともできる。このキットは対照試料または一連の対照試料を含むこともでき、この試料を検定して、(試験に)含まれる試験試料と比較することができる。このキットの各成分は個別の容器の中に封入することができ、その各種の容器は全て、キットを利用して行ったアッセイの結果を解釈するための使用説明書とともに、単一の包装の中に入れることができる。
【０２２８】
本明細書に記載される診断法は、異所発現性のまたは異常なまたは望ましくないAcheronの発現または活性と関係する疾病または疾患を患う被験体、あるいはその疾病または疾患を発症する危険性がある被験体を同定することができる。本明細書では「望ましくない」という用語は、痛みまたは無秩序な細胞増殖のような、生物学的反応に関わる望ましくない現象を含む。
【０２２９】
一つの態様では、異常なまたは望ましくないAcheronの発現または活性と関係する疾病または疾患、例えば、細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患、ならびに、例えば、本明細書に記載の、細胞の変性と関係する疾患を同定する。試験試料を被験体から採取し、Acheronのタンパク質または核酸(例えば、mRNAまたはゲノムDNA)を評価し、その際にAcheronのタンパク質または核酸のレベル、例えば、存在または欠如、あるいはAcheronタンパク質の細胞内局在性が異常なまたは望ましくないAcheronの発現または活性と関係する疾病または疾患を患う被験体、あるいはその疾病または疾患を発症する危険性がある被験体に対する診断となる。
【０２３０】
例えば、Acheronが核に局在している横紋筋肉腫由来細胞系は、核内にAcheronがない細胞系よりも攻撃的であり、高い転移能を有する。したがって、Acheronが核に局在している腫瘍細胞を検出することで、転移する確率が高い腫瘍が示唆されるはずである。したがって、一つの態様では、Acheronタンパク質の存在、レベル、欠如、または細胞内局在性により、腫瘍の程度、例えば、腫瘍が転移性であるかどうか、または転移性になる可能性が高いかどうかが示唆される。
【０２３１】
本明細書に記載される予後アッセイを使用して、異常なまたは望ましくないAcheronの発現または活性と関係する疾病または疾患を治療するために薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、またはその他の薬剤候補)を被験体に投与できるかどうかを判定することができる。例えば、このような方法を使用して、異常なAcheronの活性または発現と関係する疾患、例えば、異常な細胞の増殖、分化、または変性と関係する疾患に対し、被験体を薬剤で効果的に治療できるかどうかを判定することができる。
【０２３２】
本発明の方法を使用してAcheron遺伝子の遺伝子変化を検出し、それによって遺伝子変化のある被験体が異常な細胞の増殖、分化、または変性と関係する疾患のような、Acheronのタンパク質活性または核酸発現の調節不全により特徴付けられる疾患に対する危険性があるかどうかを判定することもできる。いくつかの態様では、この方法は、被験体由来の試料において、Acheronタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化の少なくとも一つにより特徴付けられる変化、例えば、Acheron遺伝子の異所性発現が存在することまたは存在しないことを検出する段階を含む。例えば、そのような変化または異所性発現は、1) Acheron遺伝子由来の一つまたは複数のヌクレオチドの欠失; 2) Acheron遺伝子への一つまたは複数のヌクレオチドの付加; 3) Acheron遺伝子の一つまたは複数のヌクレオチドの置換、4) Acheron遺伝子の染色体再構成; 5) Acheron遺伝子の伝令RNA転写産物のレベルの変化、6) Acheron遺伝子の、例えば、そのゲノムDNAのメチル化様式の異常な修飾、7) Acheron遺伝子の伝令RNA転写産物に関する非野生型のスプライシング様式の存在、8) 非野生型のレベルのAcheronタンパク質、9) Acheron遺伝子の対立遺伝子の欠損、10) Acheronタンパク質の細胞内局在性またはレベルの変化、および11) Acheronタンパク質の不適当な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在を確認することにより検出することができる。
【０２３３】
変化は、プローブ/プライマーなしで、アンカーPCRまたはRACE PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応で、あるいは、連結連鎖反応(LCR)で検出することができ、その後者のものはAcheron遺伝子の点突然変異を検出するのに特に有用とすることができる。この方法は、被験体から細胞の試料を回収する段階、その試料から核酸(例えば、ゲノム、mRNAまたはその両方)を単離する段階、その核酸試料をAcheron遺伝子の(存在する場合には)ハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件の下で、Acheron遺伝子に特異的にハイブリダイズする一つまたは複数のプライマーと接触させる段階、ならびに増幅産物が存在することもしくは存在しないことを検出する段階、または増幅産物のサイズを検出する段階およびその長さを対照試料のものと比較する段階を含むことができる。PCRおよび/またはLCRは本明細書に記載の変異検出に使用される技術のいずれかと組み合わせて予備的な増幅段階として使用することが望ましいものと思われる。あるいは、本明細書に記載されるまたは当技術分野において知られるその他の増幅方法を使用することができる。
【０２３４】
他の態様では、細胞試料由来のAcheron遺伝子の突然変異は、制限酵素による切断様式の変化を検出することにより同定することができる。例えば、試料および対照DNAを単離し、これを増幅し(任意で)、一種類または複数種類の制限酵素で消化し、断片長のサイズを、例えば、ゲル電気泳動により決定し、比較する。試料と対照DNAとの間の断片長のサイズの相違により、試料DNA中の突然変異が示唆される。さらに、配列特異的なリボザイム(例えば、米国特許第5,498,531号を参照されたい)の効用を利用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な突然変異の存在を得ることができる。
【０２３５】
他の態様では、Acheronの遺伝子突然変異は、試料および対照用の核酸、例えば、DNAまたはRNAを二次元アレイ、例えば、チップに基づくアレイにハイブリダイズさせることにより同定することができる。そのようなアレイは複数のアドレスを含んでおり、その各々が他のものとは位置的に識別可能である。この複数のアドレスのそれぞれに異なるプローブが位置付けられている。このアレイは高密度のアドレスを有することができる、例えば、アレイは数百のまたは数千のオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる(Cronin, M. T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M.J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759)。例えば、Acheronの遺伝子突然変異は、Cronin, M.T. et al(前記)に記載の光発生DNAプローブを含む二次元アレイで同定することができる。簡単に言えば、第一のハイブリダイゼーション用プローブアレイは、配列の重複するプローブの直線アレイを作製することによって、試料および対照中のDNAの長いストレッチを端から端まで走査して塩基変化をその配列間で同定するように使用することができる。この段階により点突然変異の同定が可能となるので、この段階に続いて、検出された全ての変異体または突然変異に相補的なもっと小さな、特異性プローブの使用によって個別の突然変異の特徴付けを可能とする第二のハイブリダイゼーション用アレイに進む。各変異アレイは類似のプローブセットからなっており、つまり一方は野生型遺伝子に相補的であり、もう一方は変異型遺伝子に相補的である。
【０２３６】
他の態様では、当技術分野において知られる種々の配列決定反応のいずれかを使用して、Acheron遺伝子の配列を直接決定し、試料のAcheronの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより突然変異を検出することができる。診断アッセイ((1995) Biotechniques 19:448)を行う場合、質量分析による配列決定法を含めて、自動配列決定法を利用することができる。
【０２３７】
Acheron遺伝子の突然変異を検出する他の方法としては、切断試薬からの保護を使用して、RNA/RNAまたはRNA/DNAヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる(Myers et al. (1985) Science 230:1242; Cotton et al. (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295)。
【０２３８】
他の態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料から得られたAcheron cDNA中の点突然変異を検出しマッピングするための規定の系で二本鎖DNA中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたは複数のタンパク質(いわゆる「DNAミスマッチ修復」酵素)を利用するものである。例えば、大腸菌のmutY酵素はG/AミスマッチでAを切断し、HeLa細胞由来のチミジンDNAグリコシラーゼはG/TミスマッチでTを切断する(Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662; 米国特許第5,459,039号)。
【０２３９】
他の態様では、電気泳動移動度の変化を使用して、Acheron遺伝子の突然変異を同定することができる。例えば、一本鎖構造多型(SSCP)を使用して、変異型核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の相違を検出することができる(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766、同様にCotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; およびHayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79を参照されたい)。試料および対照用のAcheron核酸の一本鎖DNA断片を変性して復元させることができる。一本鎖核酸の二次構造は配列に応じてさまざまであり、その結果生じる電気泳動移動度の変化により、たった一塩基の変化でさえも検出することが可能になる。このDNA断片は標識することができ、または標識プローブで検出することができる。このアッセイの感度は、二次構造が配列の変化に対してさらに感受性であるRNA(DNAよりもむしろ)を使用することによって高めることができる。一つの態様では、対象の方法は電気泳動移動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二量体分子を分離するためにヘテロ二量体解析を利用する(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5)。
【０２４０】
他の態様では、変性剤の濃度勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異型または野生型断片の移動を変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495)により検定する。DGGEを解析の方法として使用する場合、DNAを修飾して、例えば、約40 bpの高融点のGCに富むDNAのGCクランプを付加することによってDNAがPCRで完全に変性しないことを確実とすることができる。さらなる態様では、温度勾配を変性剤濃度勾配の代わりに使用して、対照および試料DNAの移動度の相違を同定する(Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753)。
【０２４１】
点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長(Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6230)を含むが、これらに限定されることはない。
【０２４２】
または、選択的なPCR増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と組み合わせて使用することができる。特異的増幅用のプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、対象とする突然変異を分子の中央に(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448)または、適当な条件の下で、ミスマッチによりポリメラーゼ伸長が阻止されるかまたは低下される、一方のプライマーの極端な3'末端に(Prossner (1993) Tibtech 11:238)持つことができる。さらに、突然変異の辺りに新たな制限部位を導入して、切断に基づく検出をもたらすことが望ましいことがある(Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1)。ある種の態様では、増幅は増幅用のTaqリガーゼを用いて行われてもよいものと思われる(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189)。そのような場合には、5'配列の3'末端で完全に一致する場合にだけ連結が起こるはずであり、増幅の有無を調べることによって特定部位に公知の突然変異が存在するのを検出することが可能になる。
【０２４３】
他の態様では、タンパク質レベルまたは細胞内局在性の変化を、例えば、Acheronに特異的に結合する検出可能な薬剤を利用して検出する。そのような薬剤は本明細書に記載の抗Acheron抗体を含むことができる。その抗体を検出可能な物質に結合させること(すなわち、物理的に連結させること)(すなわち、抗体の標識化)により、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる; 適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられる; 適当な蛍光物質の例としては、量子ドット、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる; 発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる; 生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる、ならびに適当な放射性物質の例としては、とりわけ125I、131I、35Sまたは3Hが挙げられる。
【０２４４】
本明細書に記載される方法を、例えば、本明細書に記載される少なくとも一つのプローブ用核酸または抗体試薬を含む包装済みの診断用キットを利用することにより行ってもよく、そのキットを好都合に、例えば、臨床場面で使用して、Acheron遺伝子に関わる疾病または病気の症状または家族歴を示す患者を診断してもよい。
【０２４５】
薬学的組成物
本明細書に記載される新たな核酸分子、ポリペプチド、およびその断片、ならびに本発明の抗Acheron抗体(本明細書では「活性化合物」ともいわれる)を薬学的組成物の中に組み入れることができる。そのような組成物は典型的には、その核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書では「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含む。補完的な活性化合物を組成物の中に組み入れることもできる。
【０２４６】
薬学的組成物はその意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口(例えば、吸入)投与、経皮(局所)投与、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる: 注射用蒸留水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤; ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤; アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤; エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤; 酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調整用の作用物質。pHは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与用バイアルの中に封入することができる。
【０２４７】
注射可能な用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液(水溶性の場合)または滅菌分散液および注射可能な滅菌溶液または滅菌分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL(商標) (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。いかなる場合でも、この組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性とするべきである。これは製造および保存の条件下で安定とするべきであり、これは細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。この担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、ならびに同様のもの)、およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる。その適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によりおよび界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用からの保護は様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、および同様のものにより達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含有させることができる。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含有させることにより実現することができる。
【０２４８】
注射可能な滅菌溶液は、必要とされる量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙した成分の一つまたは組み合わせとともに組み入れ、続けてろ過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散液は活性化合物を、基本的な分散媒および上記に列挙したものより必要とされるその他の成分を含む滅菌媒体の中に組み入れることによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製用の滅菌粉末の場合、可能な調製方法としては、活性成分に加えて所望とされる付加的な任意の成分の粉末を予め滅菌ろ過したその溶液からもたらす真空乾燥法および凍結乾燥法が挙げられる。
【０２４９】
経口用組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。治療的な経口投与を目的に、活性化合物を賦形剤とともに組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤の形態で使用することができる。経口用組成物はうがい薬として用いるために液体担体を利用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および/または補助物質を組成物の一部として含有させることができる。この錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤および同様のものは以下の成分のいずれか、または似通った性質の化合物を含むことができる: 微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤; でんぷんまたは乳糖などの賦形剤; アルギン酸、Primogel(商標)、またはとうもろこしでんぷんなどの崩壊剤; ステアリン酸マグネシウムまたはSterotes(商標)などの滑沢剤; コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤; ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤; あるいはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味などの香料添加剤。
【０２５０】
吸入による投与の場合、その化合物は適当な高圧ガス、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧式容器もしくは分注器、または噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０２５１】
全身投与を経粘膜的なまたは経皮的な手段によるものとすることもできる。経粘膜投与または経皮投与の場合、浸透される障壁に適した浸透剤が製剤中に使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に知られており、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用により達成することができる。経皮投与の場合、その活性化合物は当技術分野において一般に知られているように軟膏剤(ointment)、膏薬(salve)、ゲル剤、またはクリーム剤の中に製剤化される。
【０２５２】
直腸送達の場合、その活性化合物は坐剤(例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤とともに)または停留浣腸の形態で調製されてもよい。
【０２５３】
一つの態様では、その活性化合物はインプラントおよびマイクロカプセル化した送達系を含めて、制御放出製剤のような、体内からの迅速除去から化合物を防御できる担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解・生体適合性高分子を使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。その材料はAlza社およびNova Pharmaceuticals社から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的とするリポソームを含めて)を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは当業者に知られている方法、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されている方法により調製することができる。
【０２５４】
投与の簡便性および投与量の均一性を目的に、経口用または非経口用組成物を投与単位剤形として製剤化することが好都合である。投与単位剤形とは本明細書では、被験体を治療するために単一の投与量として適応される物理的に分離した単位であって、各単位が必要とされる薬学的担体との関連で所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の組成物を含有するものを指す。
【０２５５】
そのような化合物の毒性および治療効力は細胞培養物または実験動物で、例えば、LD50(集団の50%に対する致死用量)およびED50(集団の50%で治療的に有効な用量)を決定するための標準的な製薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物が使用されてもよいが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限にし、それによって、副作用を小さくするために、そのような化合物を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計するには注意を払うべきである。
【０２５６】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータをヒトで用いる投与量の範囲を決定する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性なしにED50を含む血中濃度の範囲内に位置付けることができる。この投与量は採用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化する可能性がある。本明細書に記載の方法で使用されるいずれかの化合物の場合、治療的に有効な用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。ある用量を動物モデルで試験して、細胞培養物で決定されたIC50(すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度の範囲を達成することができる。そのような情報を使用して、ヒトで有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２５７】
本明細書で定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量(すなわち、有効な投与量)は、約0.001〜30 mg/kg体重、約0.01〜25 mg/kg体重、約0.1〜20 mg/kg体重、または約1〜10 mg/kg、2〜9 mg/kg、3〜8 mg/kg、4〜7 mg/kg、もしくは5〜6 mg/kg体重に及ぶ。このタンパク質またはポリペプチドは1日につき1回または数回、1日おきに、あるいは約1〜10週間、約2〜8週間、約3〜7週間、または約4、5、もしくは6週間にわたって週に1回投与することができる。疾病または疾患の重症度、以前の処置、被験体の全般的健康状態および/または年齢、ならびに他に抱えている疾病を含むがこれらに限定されない、ある種の要因が被験体を効果的に治療するのに必要とされる投与量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があることを当業者なら理解するであろう。さらに、被験体をタンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療的に有効な量によって処置することには単回の処置が含まれてもよく、または一連の処置が含まれてもよい。
【０２５８】
抗体の場合、その投与量は約0.1〜100 mg/kg体重(一般に10 mg/kg〜20 mg/kg)とすることができる。抗体を脳内で作用させたいなら、50 mg/kg〜100 mg/kgの投与量が適切であるかもしれない。一般に、部分的なヒト抗体および完全なヒト抗体は、その他の抗体よりもヒトの体内で長い半減期を有する。したがって、少ない投与量および少ない投与回数が可能になることが多い。脂質付加などの修飾を使用して、抗体を安定化させることや取込みおよび組織透過性(例えば、脳内への)を高めることができる。抗体の脂質付加のための方法はCruikshank et al((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)により記述されている。
【０２５９】
本発明は発現または活性を調節する薬剤を包含する。薬剤は、例えば、小分子とすることができる。例えば、そのような小分子としては、ペプチド、ペプチド模倣薬(例えば、ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似体、ヌクレオチド類似体、1モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含めて)、1モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、1モルあたり約5,00グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにそのような化合物の塩、エステル、およびその他の薬学的に許容される形態が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【０２６０】
典型的な用量は、被験体または試料重量1キログラムあたり小分子をミリグラム量またはマイクログラム量(例えば、1キログラムあたり約1マイクログラムから約500ミリグラム、1キログラムあたり約100マイクログラムから約5ミリグラム、または1キログラムあたり約1マイクログラムから1キログラムあたり約50マイクログラム)含む。小分子の適切な用量は、調節される発現または活性に対する小分子の効力に依存することがさらに理解されよう。これらの小分子の一つまたは複数を本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物(例えば、ヒト)に投与するなら、医師、獣医師、または研究者は、例えば、最初に比較的低い用量を処方し、その後に適切な反応が得られるまでその用量を増加させていくことができる。さらに、いずれかの特定の動物被験体に対する具体的な用量レベルは、採用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、全般的健康状態、性別、および食事制限、投与の時間、投与経路、排泄速度、任意の複合薬、ならびに調節される発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解されよう。
【０２６１】
米国特許第4,676,980号の中でSegalが記述しているように抗体を二次抗体に結合させて、抗体異種結合体を形成させることができる。
【０２６２】
本明細書に記載されるAcheron核酸分子をベクター中に挿入し、これを遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与により(米国特許第5,328,470号を参照されたい)または定位注射により(例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照されたい)被験体に送達することができる。遺伝子治療用ベクターの薬学的製剤は遺伝子治療用ベクターを許容される希釈剤の中に含むことができ、またはその薬学的製剤は遺伝子送達媒体が埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞からそのまま産生させることができる場合(例えば、レトロウイルスベクター)、この薬学的製剤は遺伝子送達系を産生する一つまたは複数の細胞を含むことができる。
【０２６３】
この薬学的組成物は投与のための使用説明書とともに容器、パック、または分注器の中に入れることができる。
【０２６４】
異常な細胞の分化、増殖、または変性と関係する疾患を治療する方法
本発明は異常な細胞の分化、増殖、または変性と関係する疾患の危険性がある(またはその影響を受けやすい)またはその疾患を患う被験体を治療する予防法および治療法の両方を提供する。
【０２６５】
細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患
細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患の例としては、がん、例えば、がん腫、肉腫、転移性疾患または造血性新生物疾患、例えば、白血病が挙げられる。転移性腫瘍は前立腺、結腸、肺、乳房および肝臓由来のものを含むがこれらに限定されない多数の原発腫瘍のタイプから生じる可能性がある。
【０２６６】
本明細書では「がん」、「過剰増殖の」および「新生物の」という用語は、自律的増殖能を有する細胞、すなわち、急速増殖性の細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態または状況を指す。過剰増殖のおよび新生物の病態は病理性、すなわち、病態の特性を示すまたは病態を構成するとして分類される場合があり、または非病理性、すなわち、正常から逸脱しているが、病態とは関係がないとして分類される場合がある。この用語は組織病理学的タイプまたは侵襲性のステージに関係なく、あらゆるタイプのがん性増殖または発がん過程、転移組織あるいは悪性に形質転換された細胞、組織、または臓器を含むように意図される。「病理的な過剰増殖」細胞は悪性腫瘍増殖により特徴付けられる病態で発生する。非病理的な過剰増殖細胞の例としては、創傷修復と関係する細胞の増殖が挙げられる。
【０２６７】
「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺、胃腸管、および尿生殖路に影響を及ぼすような、様々な臓器系の悪性腫瘍のほかに大部分の結腸がん、腎細胞がん、前立腺がんおよび/または精巣腫瘍、肺の非小細胞がん、小腸のがんならびに食道のがんなどの悪性腫瘍を含む腺がんを含む。
【０２６８】
「がん腫」という用語は当技術分野において認識されており、この用語は呼吸器系がん、胃腸系がん、泌尿器生殖器系がん、睾丸がん、乳がん、前立腺がん、内分泌系がん、および黒色腫を含めて、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。典型的ながん腫としては、頚部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸および卵巣の組織から形成されているものが挙げられる。この用語はがん肉腫も含んでおり、例えば、がん肉腫はがん腫性および肉腫性の組織からなる悪性腫瘍を含んでいる。「腺がん」とは、腺組織から生じるがん腫または腫瘍細胞が認識可能な腺状構造を形成するがん腫を指す。
【０２６９】
「肉腫」という用語は当技術分野において認識されており、この用語は間葉由来の悪性腫瘍を指す。
【０２７０】
増殖性疾患および/または分化性疾患のさらなる例としては、悪性のおよび良性の筋肉の新生物疾患が挙げられる。本明細書では「筋肉の新生物疾患」という用語は、筋肉由来の過形成/新生細胞を含む、例えば、筋芽細胞から生ずる疾病を含む。このような疾病としては、横紋筋腫、平滑筋腫、横紋筋肉腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。増殖性疾患および/または分化性疾患のさらなる例としては、神経由来の腫瘍、例えば、中枢神経系および/または末梢神経系に起源があるかまたは位置する腫瘍、例えば、神経芽細胞腫、網膜芽細胞種、頭蓋内胚細胞腫、胚細胞腫瘍、小児脳幹部神経膠腫、神経芽細胞腫、内因性橋膠腫、網膜芽細胞種、髄芽細胞腫、星状細胞腫、聴神経腫、膠芽細胞腫、髄膜腫、および乏突起膠腫が挙げられる。Acheronは乏突起膠細胞で発現されるので、Acheronは様々な膠芽細胞腫の処置で特に有用な標的となる可能性がある。
【０２７１】
ヒトAcheronの発現の陽性染色は神経節細胞層の神経節細胞の細胞質、内顆粒層および外核層の神経細胞の一部の核ならびに錐体外側部で観測される。ヒト網膜では、Acheronの発現は神経節細胞層の神経節細胞の細胞質、内顆粒層および外核層の神経細胞の一部の核ならびに錐体外側部で観測される。マイスネル粘膜下神経叢の神経節細胞は強力な細胞質ヒトAcheron染色を示す。アウエルバッハ筋層間神経叢の神経節細胞で類似の染色が観測された。陽性の細胞質染色は血管の内皮細胞および平滑筋細胞にも存在していた。したがって、Acheron活性の阻害は網膜症、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症および活性酸素による網膜症の処置で、例えば、細胞(例えば、錐体細胞)のアポトーシスによる消失を阻害するのに有用になるはずである。
【０２７２】
横紋筋肉腫(RMS)は最も多く見られる小児軟部組織悪性腫瘍であり、全小児腫瘍の4〜8%を占めている。三つの主要な組織型がある: 胞巣型(症例の15%)、これは侵攻性の臨床経過をたどり予後不良である; 胎児型(症例の85%)、これは胞巣型よりも侵攻性が低く予後が良好である、および多形型、これは非常に稀少である。胞巣型は症例の約68%において染色体転座t(2; 13)または約14%においてt(1;13)が存在することによって特徴付けられる。Acheronは多くのRMS細胞系で発現されており、したがって、Acheron活性を増加させることにより、例えば、Acheronの核酸、ポリペプチド、またはその機能的な断片を細胞に導入するなどの、本明細書に記載される方法によりRMSを治療することができる。
【０２７３】
増殖性疾患および/または分化性疾患の他の例としては、皮膚疾患が挙げられる。この皮膚疾患は真皮層、表皮層、または皮下層中の細胞または一群の細胞もしくは層の異常な活性、あるいは真皮と表皮との間の接合部の異常を含むことができる。例えば、この皮膚疾患は角化細胞(例えば、過剰増殖性の基底層および基底層直上の角化細胞)、メラニン形成細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、および表皮層、例えば、基底層(基底層(stratum germinativum))、有棘層、顆粒層、透明層または角質層の一つまたは複数で見られるその他の細胞の異常な活性を含むことができる。他の態様では、この疾患は真皮層、例えば、乳頭層または網状層で見られる真皮細胞、例えば、真皮の内皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞(例えば、肥満細胞またはマクロファージ)の異常な活性を含むことができる。
【０２７４】
皮膚疾患の例としては、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎(湿疹)、例えば、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、バラ色粃糠疹、類乾癬、苔癬状粃糠疹、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様皮膚炎、角皮症、皮膚病、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、白斑、類天疱瘡(例えば、眼瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡)、じんま疹、汗孔角化症、関節包を裏打ちする上皮関連細胞の過剰増殖および炎症を含む関節リウマチ; 脂漏性皮膚炎および日光皮膚炎などの皮膚炎; 脂漏性角化症、老人性角化症、光線性角化症、光誘発角化症、および毛包性角化症などの角化症; 尋常性座瘡; ケロイドおよびケロイド形成に対する予防; 母斑; いぼ(verruca)、コンジロームまたは尖圭コンジロームを含めたいぼ(wart)、および性病いぼなどのヒトパピローマウイルス(HPV)感染症; 白板症; 扁平苔癬; ならびに角膜炎が挙げられる。
【０２７５】
いくつかの態様では、この疾患は乾癬である。「乾癬」という用語はその医学的意味、すなわち主に皮膚を悪化させる病気であって、隆起し、肥厚した、落屑性で、非瘢痕性の病変をもたらす病気を含むように意図される。この病変は通常、境界が極めて明瞭な紅斑性丘疹であり、重なり合った光沢のある鱗屑で覆われている。この光沢は典型的には、銀色であるかまたはわずかに乳白色である。爪が巻き込まれることも頻繁にあり、くぼみ、爪の剥離、肥厚および変色を引き起こす。乾癬に関節炎が合併することもあり、これは害が大きくなる可能性がある。角化細胞の過剰増殖は、角化細胞の表皮性の炎症および分化の低下とともに乾癬性表皮過形成の重要な特徴である。乾癬を特徴付ける角化細胞の過剰増殖を説明するのに多重機構が引き合いに出されている。無秩序な細胞性免疫も乾癬の発症機序に関与しているとされている。乾癬疾患の例としては、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性(gluttate)乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬(Von Zumbusch)、環状膿疱性乾癬、および限局性膿疱性乾癬が挙げられる。
【０２７６】
細胞変性疾患
細胞変性疾患の例としては、神経変性疾患、筋肉変性疾患、および神経筋変性疾患が挙げられる。ある種の細胞群、例えば、関連する神経細胞または筋肉細胞(例えば、筋管)の消失による緩徐進行性の機能喪失によって通常特徴付けられる、そのような変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋委縮性側索硬化症、多発性硬化症、特発性/症候性捻転ジストニー、筋失調症、痙性斜頸、眼瞼痙攣、遺伝性進行性ジストニア、分節性ジストニアおよび運動障害、オリーブ橋小脳変性症、遺伝性運動失調症、脊髄小脳変性症、進行性球麻痺、急性特発性多発神経障害、シャルコーマリーツース病、レット症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィー、進行性筋委縮症、悪液質、ならびにサルコぺニアが挙げられる。
【０２７７】
処置方法: Acheron媒介性アポトーシスの調節
細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患を治療するために、Acheron活性を増加させることにより、例えば、本明細書に記載のAcheron活性を増加させる薬剤、例えば、Acheronの核酸分子、ポリペプチド、もしくはその断片、またはCASK-C活性を増加させる薬剤、例えば、CASK-Cのポリペプチドもしくは核酸、またはAriadne活性を減少させる薬剤、例えば、Ariadneを標的とするアンチセンス核酸、siRNA、リボザイム、阻害抗体、もしくはドミナントネガティブを投与することにより、アポトーシスを促進させることができる。
【０２７８】
反対に、細胞変性疾患を治療するために、Acheron活性を減少させることによりアポトーシスを阻害することができる。そのような方法では、Acheron活性を減少させることにより、例えば、本明細書に記載のAcheron活性を減少させる薬剤、例えば、Acheronのアンチセンス核酸、siRNA、リボザイム、阻害抗体、ドミナントネガティブ、またはAriadne活性を増加させる薬剤、例えば、Ariadneのポリペプチドもしくは核酸、またはCASK-C活性を減少させる薬剤、例えば、CASK-Cを標的とするアンチセンス核酸、siRNA、リボザイム、阻害抗体、もしくはドミナントネガティブ、例えば、本明細書に記載のAcheronと相互作用するCASK-Cの断片(実施例13を参照されたい)の投与により、アポトーシスの阻害を達成することができる。
【０２７９】
アポトーシスの阻害は、核へのAcheronの移行の阻止または阻害によりAcheron活性を減少させる薬剤、例えば、抗体; Acheronのドミナントネガティブ形、例えば、tAchまたは、あるいは、以下の一つまたは複数に対応する配列番号:4の領域を含むペプチド: 残基1-33、残基34-491; Acheron機能ドメインの一つまたは複数の全部または一部; 小分子、例えば、Ach-CASK-C、Ach-Ariadne、またはAch-Parkin結合を妨害するもの; キナーゼ阻害剤、例えば、Acheron上の一つまたは複数のリン酸化部位、例えば、そのN末端中の一つまたは複数のリン酸化部位のリン酸化を減少させるキナーゼ阻害剤; あるいはCASK-Cのドミナントネガティブ形、例えば、CASK-Cのアミノ酸1-304を含むペプチドの投与によって達成することもできる。
【０２８０】
本明細書では「処置」という用語は、疾病、疾病の症状または疾病に対する素因を治療する(cure)、治癒する(heal)、軽減する(alleviate)、緩和する(relieve)、変化させる(alter)、治療する(remedy)、改善する(ameliorate)、好転させる(improve)またはそれらに影響を与える(affect)という目的で、患者に治療薬を適用することまたは投与すること、あるいは疾病、疾病の症状または疾病に対する素因を抱える患者から単離された組織または細胞系に治療薬を適用することまたは投与することと定義される。治療薬としては、例えば、タンパク質、核酸、小分子、ペプチド、抗体、siRNA、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２８１】
処置上の予防的方法と治療的方法の両方に関して、そのような処置を薬理ゲノム学の分野から得られる知識に基づいて、個別的に調整するかまたは変化させることができる。「薬理ゲノム学」とは本明細書では、遺伝子配列決定、統計遺伝学、および臨床開発中の薬物や市場に出回っている薬物に対する遺伝子発現解析などのゲノム科学技術の適用を指す。より具体的には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対する患者の反応をどのように決定しているのか(例えば、患者の「薬物反応の表現型」または「薬物反応の遺伝子型」)を研究することを指す。このように、本発明の他の局面は、本発明のAcheron分子またはAcheronの調節因子による個体の予防的または治療的処置をその個体の薬物反応の遺伝子型に応じて調整する方法を提供する。薬理ゲノム学により、臨床医または医師が、予防的または治療的処置をその処置から最も恩恵を得ることになる患者に向けることや薬物に関連する有毒な副作用を経験することになる患者の処置を回避することが可能とされる。
【０２８２】
一つの局面では、本発明は被験体にAcheronまたはAcheronの発現もしくは少なくとも一つのAcheron活性を調節する薬剤を投与することにより、被験体において異常な細胞の分化、増殖、または変性と関係する疾病または病状を予防する方法を提供する。異常な細胞の分化、増殖、または変性あるいは活性と関係する疾病に対する危険性がある被験体は、例えば、当技術分野において知られている診断アッセイまたは予後アッセイのいずれかまたはその組み合わせにより同定することができる。予防薬の投与は、疾病または疾患を予防するようにまたは、あるいは、その進行を遅らせるように、Acheronの異常に特徴的な症状が顕在化する前に行うことができる。例えば、Acheronの異常のタイプに応じて、Acheronのポリペプチドもしくは核酸、Acheronアゴニスト、またはAcheronアンタゴニスト剤を被験体の治療に使用することができる。適切な薬剤は、例えば、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定することができる。C2C12細胞による実験から、Acheronがインテグリンの発現を調節することが示唆される。このことはインテグリンの機能の変化ががん細胞の転移能に大きな役割を果たしている可能性があることを意味している。正常細胞は、これらが基質との接触を失うとアポトーシスを開始する。アノイキス(定着場所のないこと(homelessness))と呼ばれるこの現象は、転移を阻止するための主要な防御機構である。細胞がアノイキスを克服し得る場合、それらはかなり自由に組織面の外に向かって増殖し他の遠くの組織に定着することができる。Acheronの活性化または妨害はこの過程に影響を与えることができる。
【０２８３】
Acheron分子は、細胞の増殖性疾患および/または分化性疾患、ならびに細胞の変性と関係する疾患の一つまたは複数を制御するための新たな診断標的および治療薬として機能を果たすことができる。例えば、半定量逆転写PCRにより、Acheronの発現をヒトがんの大部分に相当する異なる60種の細胞系で調べた(NCI60細胞系; 米国立がん研究所により維持されている; Scherf et al. (2000) Nat. Genet. 24(3):236-44); Acheronはこの系のほとんど全てで発現していた(表1を参照されたい)。
【０２８４】
（表１）ヒト腫瘍由来細胞系におけるAcheronの相対的発現
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2006525031.tif 000004
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【０２８５】
いくつかの疾患は、少なくとも一つには、異常に高いレベルのAcheron遺伝子産物と、または異常に高い活性を示すAcheron遺伝子産物の存在により関連付けることができる。したがって、そのような遺伝子産物のレベルおよび/または活性の低下は、疾患症状の改善をもたらすはずである。そのような疾患は細胞の変性、例えば、神経変性疾患、または筋肉変性疾患と関係している。異常な細胞の増殖または分化と関係している疾患のような、その他の疾患は、少なくとも一つには、異常に低いレベルのAcheron遺伝子産物と、または異常に低い活性を示すAcheron遺伝子産物の存在により関連付けることができる。そのような遺伝子産物のレベルおよび/または活性の増加は、疾患症状の改善をもたらすはずである。
【０２８６】
既に述べたように、異常な細胞の分化、増殖、または変性と関係する疾患の成功的処置は、Acheron遺伝子産物の発現または活性を調節する役割を果たす技術によるものとすることができる。例えば、Acheron活性を高める化合物、例えば、本明細書に記載されるアッセイを利用して同定される薬剤を本発明により使用して、細胞の増殖性疾患の症状を予防するおよび/または改善することができる。そのような分子としては、Acheron核酸もしくはその活性な断片、ペプチド、リン酸化ペプチド、小さな有機もしくは無機分子、Ariadne活性を減少させる薬剤(例えば、アンチセンス、siRNA、およびリボザイム分子、ドミナントネガティブ、ペプチド、リン酸化ペプチド、小さな有機もしくは無機分子、または抗体)、またはCASK-C活性を増加させる薬剤(例えば、CASK-Cの核酸もしくはタンパク質またはその活性な断片)を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【０２８７】
さらに、Acheron活性を阻害する化合物、例えば、前述のアッセイを利用して同定される薬剤を本発明により使用して、細胞変性疾患の症状を予防するおよび/または改善することができる。そのような分子としては、Acheronのドミナントネガティブ変異体、ペプチド、リン酸化ペプチド、小さな有機もしくは無機分子、または抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体、ならびにFab、F(ab')2およびFab発現ライブラリー用断片、scFV分子、およびその抗原決定基結合断片を含めて)、Ariadne活性を増加させる薬剤(例えば、Ariadneの核酸もしくはタンパク質またはその活性な断片)、またはCASK-C活性を減少させる薬剤(例えば、アンチセンス、siRNA、およびリボザイム分子、ドミナントネガティブ、ペプチド、リン酸化ペプチド、小さな有機もしくは無機分子、または抗体)を挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【０２８８】
さらに、Acheron遺伝子の発現を阻害する本明細書に記載のアンチセンス(例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド)、siRNA、およびリボザイム分子を本発明により使用して、Acheron発現のレベルを低下させること、したがって、Acheron活性のレベルを効果的に低下させることもできる。さらに、Acheron活性のレベルを低下させるのに、三重らせん分子を利用することができる。
【０２８９】
異常な細胞の分化、増殖、または変性により特徴付けられる疾患を治療するかまたは予防するのに核酸分子を利用できる別の方法は、Acheronタンパク質に特異的なアプタマー分子を利用することによるものである。アプタマーは三次構造を有する核酸分子であり、この三次構造によりアプタマーはタンパク質リガンドに特異的に結合することができる(例えば、Osborne, et al. Curr. Opin. Chem Biol. 1:5-9 (1997); およびPatel, Curr Opin Chem Biol 1:32-46 (1997)を参照されたい)。核酸分子は多くの場合、治療用タンパク質分子が標的細胞中に導入可能とされるよりも好都合に標的細胞中に導入可能とされるので、アプタマーによって、薬物または多能性の効果を有し得るその他の分子を導入しなくともAcheronタンパク質の活性を特異的に減少させられる方法が提供される。
【０２９０】
Acheronに特異的でもありAcheron活性を低下させもする抗体を作製することができる。このような抗体は、したがって、負の調節技術がAcheron性疾患の処置に適切である場合に投与することができる。抗体および抗体を作製する方法は当技術分野において知られており、それらは本明細書に記述されている。
【０２９１】
抗体産生を刺激するためにAcheronのタンパク質または抗原決定基を動物またはヒト被験体に注射することがその被験体にとって有害となる状況では、抗イディオタイプ抗体を使用することによって、Acheronに対する免疫反応を生じさせることが可能である(例えば、Herlyn, Ann Med 31:66-78 (1999); およびBhattacharya-Chatterjee and Foon, Cancer Treat Res. 94:51-68 (1998)を参照されたい)。抗イディオタイプ抗体を哺乳類またはヒト被験体内に導入する場合、これは抗-抗イディオタイプ抗体の産生を刺激するはずであり、その抗-抗イディオタイプ抗体はAcheronタンパク質に特異的となるはずである。Acheron発現により特徴付けられる疾患を対象とするワクチンは、このやり方で作製することもできる。
【０２９２】
標的抗原が細胞内にあり抗体全体を使用する場合には、内在化(internalizing)抗体を使用することができる。リポフェクチンまたはリポソームを使用して、細胞内の標的抗原に結合する抗体またはFab領域の断片を送達することができる。抗体の断片を使用する場合、標的抗原に結合する最も小さな阻害断片を使用することができる。例えば、抗体のFv領域に相当するアミノ酸配列を有するペプチドを使用することができる。または、細胞内の標的抗原に結合する一本鎖中和抗体を投与することもできる。そのような一本鎖抗体は、例えば、一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を標的細胞集団内で発現させることによって投与することができる(例えば、Marasco et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 (1993)を参照されたい)。
【０２９３】
他の局面では、本発明は、本明細書に記載されるように、Acheron活性の低下を示す細胞、すなわち、Acheronのアンチセンスもしくはドミナントネガティブ形、shRNA、またはリボザイムを発現する細胞の移植によって、異常な細胞変性と関係する疾病を処置する他の方法を提供する。一般に、この細胞は幹細胞または部分的に分化した細胞、例えば、筋芽細胞または神経幹細胞とすることができる。一例として、筋ジストロフィーを患う被験体内にAcheron活性がないかまたは活性が低下している筋芽細胞を移植することを含めて、本明細書に記載される方法によって筋ジストロフィーを治療することができる。第二の例として、Acheron活性がないかまたは活性が低下しているシュワン細胞またはシュワン細胞の前駆細胞を移植することによって、脱髄障害を治療することができる。この細胞は変性が進んでいる領域に直接的に移植することができる。この細胞は、自家性、例えば、対象とする移植者から採取することができ、または異種性、例えば、適当な供与者、例えば、免疫適合性の供与者から採取することができる。いくつかの態様では、この細胞はさらなる異所性の遺伝子または遺伝子群、例えば、移植細胞の生着をさらに促進させるための遺伝子、または対象とする移植者を治療するための遺伝子、例えば、ジストロフィン遺伝子を発現する。
【０２９４】
Acheron遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定化合物を患者に治療的に有効な用量で投与して、細胞変性と関係する症状を治療する、例えば、改善することができる。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物のその量を指す。そのような化合物の毒性および治療効力は、前述の標準的な製薬学的手順により決定することができる。
【０２９５】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータをヒトで用いる投与量の範囲を決定する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性なしにED50を含む血中濃度の範囲内に位置付けることができる。この投与量は採用する剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化する可能性がある。本明細書に記載の方法で使用されるいずれかの化合物の場合、治療的に有効な用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。ある用量を動物モデルで処方して、細胞培養物で決定されたIC50(すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度の範囲を達成することができる。そのような情報を使用して、ヒトで有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２９６】
個体に対し有効な用量を決定する他の例は、試験被験体の血清中の「遊離」および「結合」化合物のレベルを直接的に検定する能力である。そのようなアッセイでは、分子インプリンティング技術により作製されている抗体模倣体および/または「バイオセンサー」を利用することができる。Acheron活性を調節する化合物を鋳型、または「インプリンティング分子」として使用して、触媒試薬によるその重合の前に、重合可能な単量体を空間的に組織化することができる。インプリントされた分子を続いて除去することにより、その化合物の複製「ネガ像」を含んでいて、生物学的検定条件の下でその分子を選択的に再結合することができる重合体マトリックスが残される。この技術の詳細な総説はAnsell et al Current Opinion in Biotechnology 7:89-94 (1196)でおよびShea, Trends in Polymer Science 2:166-173 (1994)で見出すことができる。そのような「インプリントされた」親和性マトリックスは、固定化モノクローナル抗体成分が適切にインプリントされたマトリックスに置換されたリガンド結合アッセイに従順である。そのようなマトリックスをこのように使用する例は、Vlatakis et al Nature 361:645-647 (1993)で見出すことができる。同位体標識の利用により、Acheronの発現または活性を調節する化合物の「遊離」濃度を容易にモニターしIC50の計算に使用することができる。
【０２９７】
そのような「インプリントされた」親和性マトリックスは、標的化合物の局所的および選択的結合により光子放出特性が測定可能な程度に変化する蛍光基を含むように設計することもできる。これらの変化を適切な光ファイバー機器によりリアルタイムで容易に検定することができることから、試験被験体における用量をその個体のIC50に基づいて素早く最適化することが可能になる。そのような「バイオセンサー」の一例がKriz et al Analytical Chemistry 67:2142-2144 (1995)に論じられている。
【０２９８】
細胞移植
近年、細胞移植の方法が疾病の処置を目的に開発されている。その最も基本的な形式では、この方法は幹細胞または部分的に分化した細胞を損傷した組織および臓器の中に、それらの細胞が生着して修復をもたらすようになるという望みをもって移植する段階を含む。例えば、パーキンソン病で交感神経ニューロンを使用して、欠損したドーパミン作動性ニューロンの代わりとすることに成功している(Nakao et al (2001) J. Neurosurg. 95(2):275-84)。実際に、治療型クローニングおよび幹細胞における目下の関心は、損傷した臓器を修復できる細胞移植への期待から生まれている。
【０２９９】
幹細胞生物学に対する興奮の多くは、老化組織または損傷組織を修復するかまたは若返らせるその大きな可能性から生まれている(Mombaerts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 Suppl 1:11924-5 (2003); Roccanova and Ramphales, Tissue Cell. 35(1):79-81 (2003))。胚幹(ES)細胞は全能細胞であり、この細胞は胚形成の初期に発生し体内の異なる組織全てを生み出す能力を持っている。この能力がヒトの病気を治療する万能薬として研究者と一般大衆の両者の興味をかき立てている。
【０３００】
治療型クローニングの目的は、患者の損傷組織を修復するのに利用できる特殊化した細胞を提供するために、特定の系統に分化するようになる前駆細胞を作り出すことである。実例として、ES細胞を使用して、I型糖尿病を治療するために新たな膵臓β細胞(Hori et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(25):16105-10 (2002))をまたはパーキンソン病もしくはアルツハイマー病による害を覆すために新たな神経細胞(Ostenfeld and Svendsen, Adv. Tech. Stand. Neurosurg. 28:3-89 (2003); Borlongan et al. Drug Discov Today 7(12): 674-82 (2002))を作り出すことができる。
【０３０１】
戦略の一つは成人由来の幹細胞を使用することである(Hirai, Hum. Cell. 15(4):190-8. 2002)。これらの細胞はES細胞に比べて数多くの利点をもたらす。それらは自家性、すなわち、患者自身から回収することができ、したがって、拒絶反応の問題を除外することができる。さらに、それらは特定の系統に制限されることが多く、これによりこれらの有糸分裂能を有する細胞が新生物を生み出すという可能性が少なくなる。心血管疾患を治療する分野では、いくつかの最近の論文により、ヒトにおいて心筋機能障害を修復するために自家筋肉由来の衛星細胞を使用することが実証されている(Hagege et al., Lancet. 361(9356):491-2 (2003); Menasche et al., J. Am. Coll. Cardiol. 41(7):1078-83 (2003))。これらの異所性細胞を受けた患者は生着およびいっそう高い左心室駆出分画率を示した。
【０３０２】
ヒトの病気を治療するために使用される最も研究が進んだ幹細胞集団は骨髄から得られており、それを各種のリンパ腫および白血病に対する治療計画の一部として使用することができる。
【０３０３】
細胞移植に伴う問題の一つは、移植細胞がアポトーシスを起こす傾向である。アポトーシスを起こすこの自然な傾向を阻止できるような阻止により、生着も臨床的有用性も高まるはずである。Acheronの作用を阻害することで、移植の前および後に細胞の生着を高めることができるので、本明細書に記載される方法を使用して、実質的にあらゆる細胞型を利用した細胞に基づく治療の成功率を高めることができる。より多くの細胞が生着することはそれだけ移植効率が高いことを意味し、したがってずっと少ない細胞が提供されるだけでよく、およびずっと少ない細胞が移植されるだけでよい。
【０３０４】
本明細書に記載される方法の技術的な利点の一つは、その方法により、細胞を回収するのとそれらの細胞を患者内へ再び導入し戻す間の時間を短縮できるということであり、これはインビトロで産生された一層多くの細胞がインビボに導入された場合に生着することができるためである。患者は恐らく、より迅速な処置から恩恵を受けるはずであり、これはその処置により、1) 入院および関連費用を削減することができる; 2) 心臓(またはその他の臓器)に対する虚血性障害およびその他の二次障害を減らすことができる; 3) 培養細胞が感染または突然変異を起こす危険性を減らすことができる; ならびに4) 長期細胞培養に関する労働および関連費用を削減することにより患者に特異的な自己移植片を作り出す費用を削減することができるからである。
【０３０５】
このように、本発明は、外来性Acheronを(その他の外来性遺伝子を伴いまたは伴わずに)発現する細胞、あるいはAcheronの発現または活性のレベルが低下されている細胞、例えば、Acheronの発現または活性の阻害剤、例えば、本明細書に記載のAcheron抗体、アンチセンス、siRNA、またはドミナントネガティブを発現するかまたはそれらで処理されている細胞、例えば、自己筋肉細胞を移植する段階を含んだ細胞に基づく治療の成功率を高める方法を含む。
【０３０６】
この方法は、Acheron活性が低下しているかまたは全くない細胞、例えば、Acheron活性が、例えば、本明細書に記載される方法の一つまたは複数により阻害されている細胞を提供する段階、およびその細胞を被験体内に移植する段階を含む。例えば、多発性硬化症または脊髄損傷のような、脱髄と関係する疾患を患う被験体の場合には、Acheron活性が低下しているかまたは全くない、髄鞘産生細胞、例えば、乏突起膠細胞または乏突起膠細胞前駆細胞の集団を被験体の一箇所または複数箇所の適切な部位の中に移植することにより、その髄鞘を再生させることができる。例えば、いくつかの細胞、例えば、約103、104、105、106またはそれ以上の個数の細胞を一部位または複数部位に注射することができる。筋肉の変性と関係する疾患を患う被験体の場合には、Acheron活性が低下しているかまたは全くない筋芽細胞(例えば、Acheronの発現または活性の阻害剤、例えば、本明細書に記載のAcheron抗体、アンチセンス、siRNA、またはドミナントネガティブを発現するかまたはそれらで処理されている細胞)の集団を被験体の一箇所または複数箇所の適切な部位の中に移植することにより、その筋肉を再生させることができる。例えば、いくつかの筋芽細胞、例えば、約103、104、105、106またはそれ以上の個数の細胞を一部位または複数部位に注射することができる。
【０３０７】
ドットブロットを通じて、73種の異なるヒト組織をRNAのレベルでスクリーニングして、Acheronの分布を決定した(図7を参照されたい)。最高レベルの発現は神経系で認められた。CNSのうちで、Acheronが最高レベルとなった組織は脳梁であった。これは脳内で脳半球を結び付けている主要な線維束である。その組織内において顕著なレベルが認められた唯一の細胞型は乏突起膠細胞、つまり髄鞘による神経細胞の被覆の形成に関与している細胞である。このことは、Acheronがその正常機能に必要とされる可能性があることを示唆している。多発性硬化症のような脱髄疾患は主要な臨床問題であり、軸索の髄鞘形成/脱髄に影響を与える因子が主要な焦点になっている。ラットによるインサイチューハイブリダイゼーション研究に基づいて、脊髄で極端に高いレベルのAcheron mRNAの発現が認められている。髄鞘再形成は、脊髄損傷後の脊髄運動神経細胞の効果的な機能において鍵になる要因である。このように、本発明は、変性疾患を患う被験体を治療する方法を含む。
【０３０８】
遺伝子治療
相当な割合のヒトの病気は、胚細胞または体細胞の変異がタンパク質の構造および機能に異常をもたらす場合に発生している。これらの欠陥タンパク質は発生過程またはホメオスタシス過程に撹乱を引き起こし、続いて病変を引き起こす。細胞培養と動物モデルの両方から得られた実験データから、ある場合には、これらの遺伝的欠陥の矯正により正常な生理学的反応が回復されて病態が抑止されることが実証されている。これらの結果によって、ヒトの病気の処置に遺伝子治療を利用するための戦略の開発に極めて強い焦点があたることとなった。
【０３０９】
遺伝子治療を利用することに関する問題の一つは、所望のDNA配列を細胞に侵入可能として遺伝子発現を命令可能とする方法を見つけることである。
【０３１０】
遺伝子治療に対する戦略の一つは、当技術分野において知られる方法を利用して第IX因子、赤血球生成促進因子、成長ホルモン、プロインスリン、および顆粒球コロニー刺激因子-1のような、外来性のホルモンまたは因子を産生するように遺伝子操作された移植細胞を使用することである。これらの細胞はいずれも移植細胞の生着を高めるために、Acheronの発現または活性の阻害剤、例えば、Acheronのアンチセンス、siRNA、またはドミナントネガティブ形を発現するように遺伝子操作することもできる。
【０３１１】
幹細胞は患者内に再導入する前に、例えば、所望の治療遺伝子を持つように遺伝子操作することができ、例えば、遺伝子治療で用いる異所性遺伝子を発現するように5'調節配列を含むことができる。例えば、この細胞を遺伝子操作して、細胞中でのAcheronの発現または活性を減少させる遺伝子、例えば、Acheronのアンチセンス、siRNA、またはドミナントネガティブ形を、単独でまたは治療遺伝子に加えて保有させることができる。
【０３１２】
遺伝子治療ではウイルスベクターに比べて細胞移植に付随するいくつかの利点がある。第一に、導入できるDNAのサイズに実質的上限がないということである。実際に、多数の異なる遺伝子を、その通常の調節配列を備えた状態でコードする過剰染色体を保有するようにこれらの細胞を遺伝子操作することが可能である(Saffery and Choo, J. Gene Med. 4(1):5-13 (2002))。
【０３１３】
筋芽細胞の発生および移植
成熟骨格筋は衛星細胞として知られる静止状態の幹細胞プールを含んでいる。衛星細胞はその位置が筋線維の外側であるものの、筋細胞膜の下部であるためにその名がついた。衛星細胞は、これらが骨格筋損傷後の種々の局所シグナルによって活性化するまでは、細胞周期のG0期に静止したままである。それから、これらの細胞は細胞周期に再び入り数多くの子孫を産生し、そのなかには損傷した筋線維と融合して修復をもたらし得るものもあれば、その一方で細胞周期から抜け出て衛星細胞プールを再構成するものもある。健常者では、衛星細胞は一生を通じて存続し、高齢者においてさえも修復に影響を及ぼすことができる。しかしながら、これはデュシェンヌ型筋ジストロフィーを患う患者には当てはまらない。
【０３１４】
衛星細胞は、例えば、Decary et al., Hum. Gene. Ther. 8(12):1429-38 (1997)におよびBlau et al., Exp. Cell. Res. 144(2): 495-503 (1983)に記載されているように、筋生検を行ってその組織を増殖因子が豊富に入った培地中で培養することによりほとんどの供与者から容易に単離することができる。インビトロで、衛星細胞は活性化されるようになり、損傷した筋線維を避けて移動する。これらの活性化細胞は筋前駆細胞(MPC)と呼ばれており、それらはインビトロで多世代にわたって培養することができる。実際に、これらの非形質転換幹細胞は、体内から得られるその他のほとんどの細胞の用途を制限している、つまりその用途をさらに助長する要因である、ヘイフリック(Hayflick)の限界を超えて十分に増殖することができる。これらの増殖細胞をそのまま組織修復に使用することができ、またはそれらを、例えば、所望の遺伝子、および5'調節配列を保有するように、例えば、遺伝子治療で用いる異所性遺伝子を発現するように遺伝子操作することができる。これらの異所的に発現したタンパク質を使用して、筋ジストロフィーでジストロフィンなどの筋機能を促進させることができ(Skuk et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 59(3):197-206 (2002))、または第IX因子(Chen et al., Hum. Gene. Ther. 9(16):2341-51 (1998))および顆粒球コロニー刺激因子-1(Moisset et al., Hum. Gene Ther. 11(9):1277-88 (2000))などの因子を代わりに全身に分泌させることができる。所望の細胞集団がインビトロで回収されたら、それらをインビボの骨格筋の中に注射して戻すことができる。これらの遺伝子操作されたMPCはその後、成熟筋線維と融合し、衛星細胞プールを再構成し、所望の遺伝子(例えば、Acheron阻害遺伝子、例えば、ドミナントネガティブ)を発現することができる。このように、これらのMPCは筋芽細胞移植法で用いるのに適している。
【０３１５】
衛星細胞は遺伝子治療および組織修復に対し理想に近い媒体であるように思われるが、実験的な研究からほんのわずかな異所性の筋芽細胞が生着して宿主の筋線維と融合するだけであるということが実証されている(Gussoni et al., Nat. Med. 3(9):970-7 (1997); Fan et al., Muscle Nerve 19(7):853-60 (1996); Qu et al., J. Cell. Biol. 142(5):1257-67 (1998))。ほかの研究室のデータでは移植後の細胞喪失が根本的に異なるレベルであることを示しているが、その最良のシナリオでさえ、本発明者らは最初に移植されたプールのうちの70%を超える喪失があることを報告している(Skuk et al., (2002)、前記)。その後の有糸分裂によって異所性細胞の集団を増大させることができたとしても、これは二つの理由で依然として厄介な統計値である。第一に、これらの死滅細胞が生着していたなら、その後の修復および衛星細胞の形成に寄与できる細胞の数が劇的に増加するはずである。第二に、恐らく最も厄介なのは、その活性化した衛星細胞がその表現型特性に関して極めて異種性であるという所見である(Qu et al., (1998)、前記)。特定の亜集団の選択的喪失には実質的な臨床的帰結がある可能性があり、具体的にはそれらは分裂し、移動しまたは融合する素因がある細胞である。
【０３１６】
移植細胞がアポトーシスを起こす自然な傾向を阻止できるなら、生着と臨床的有用性の両方が同時に増加するはずである。本明細書で実証されるように(以下の実施例3を参照されたい)、Acheronのドミナントネガティブ形の発現によって筋芽細胞が栄養補助のない状態で生着することが可能とされており、したがってAcheronは細胞に基づく治療を開発するうえで理想的な標的とされる。すなわち、本発明はAcheron活性を阻害することにより、移植された筋芽細胞の生着および取込みを増大させるようにアポトーシスを阻止する方法および組成物を含む。例えば、その衛星細胞を遺伝子操作して、細胞中でのAcheronの発現または活性を減少させる遺伝子、例えば、Acheronのアンチセンス、siRNA、またはドミナントネガティブ形を発現させることができる。あるいは、その細胞を移植前にAcheronのアンチセンス(例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド)、抗体、siRNA、またはドミナントネガティブのような、Acheronの発現または活性の阻害剤で処理することができる。したがって、その細胞はAcheronの発現または活性のレベルが低下している。
【０３１７】
前述のように、RNAiまたはアンチセンス手法(例えば、モルホリノオリゴ、Heasman, Dev. Biol. 243:209-14(2002); Iversen, Curr. Opin. Mol. Ther. 3:235-8 (2001); Summerton, Biochim. Biophys. Acta. 1489:141-58 (1999))を利用することの魅力的な特徴の一つは、外来遺伝子が体内への再導入前の細胞の中に導入されないということである。これには、Acheronを阻害する効果が当然ながら一過性であるという利点がある。Acheronは死滅も分化も阻害するため、このことが問題となる。Acheronが一過性に阻害されるだけなら、その細胞は初期には生着し、その後、時間とともに分化する能力またはその他の細胞と融合する能力を獲得するようになるはずである。これらの段階のどちらかが起きてしまえば、その細胞は生存プログラムを活性化しAcheronの恩恵を必要とはしないであろう。
【０３１８】
これらの方法を筋芽細胞の移植に即して本明細書で詳細に記述しているが、それらは、変性病状を治療するための神経細胞の移植、血液学的に関連する病状を治療するための造血細胞の移植、ならびに皮膚およびその他の病状を治療するための線維芽細胞の移植を含めて、その他の移植シナリオに等しく適用可能である。変性疾患を患う被験体を治療する方法は、Acheron活性が低下しているかまたは全くない細胞、例えば、Acheron活性が、例えば、本明細書に記載される方法により阻害されている細胞を提供する段階、およびその細胞を被験体内に移植する段階を含む。例えば、多発性硬化症または脊髄損傷のような、脱髄と関係する疾患を患う被験体の場合には、Acheron活性が低下しているかまたは全くない、髄鞘産生細胞、例えば、乏突起膠細胞または乏突起膠細胞前駆細胞の集団を被験体の一箇所または複数箇所の適切な部位の中に移植することにより、その髄鞘を再生させることができる。例えば、いくつかの細胞、例えば、約103、104、105、または106個の細胞を一部位または複数部位に注射することができる。筋肉の変性と関係する疾患を患う被験体の場合には、Acheron活性が低下しているかまたは全くない筋芽細胞の集団を被験体の一箇所または複数箇所の適切な部位の中に移植することにより、その筋肉を再生させることができる。例えば、いくつかの筋芽細胞、例えば、約103、104、105、または106個の細胞を一部位または複数部位に注射することができる。
【０３１９】
筋ジストロフィー
様々なヒトの病気を治療するのに筋芽細胞に基づく遺伝子治療を利用することができるが、その主な用途は臨床的には、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)の処置に向けられている。DMDは遺伝性疾患であり、これは5歳頃から症状を現し始め、進行性筋力低下によって特徴付けられる。10歳までに患者は通常、車いす生活を余儀なくされ、18歳までに上肢の脱力により電動車いすまたはコンピュータのマウスの制御でさえも困難になる。もうこの時には、呼吸筋力低下により機械的人工換気が夜間ひいては全時間必要になる。ほとんどの患者は17歳から24歳までの間に呼吸困難または二次的な心疾患で死亡する。
【０３２０】
ジストロフィン遺伝子のサイズが大きいため、研究者らはウイルスベクターで用いるのに切断型のミニ遺伝子を作製しなければならなかった。いくらかの肯定的なデータが得られてはいるが、この手法は臨床的な応用では期待はずれであった(Roberts and Dickson, Curr. Opin. Mol. Ther. 2002 August;4(4):343-8 (2002))。筋芽細胞の導入による他の手法は、病変した筋線維との融合により、野生型の筋芽細胞が正常遺伝子およびその5'調節配列の両方を提供できるので、より確実である。恐らく、これらの線維中での正常なDysの持続発現により、それらがさらなる損傷から保護されるものと思われる。さらに、供与者の筋芽細胞がさらなる衛星細胞および後の筋損傷を修復する可能性をもたらす。
【０３２１】
DMDに適したモデルはC57BL10J mdx/mdx (mdx)系マウス(Vilquin et al., J. Cell Biol. 131(4):975-88 (1995); Cox et al., Nature. 364(6439):725-9 (1993))であり、このマウスにはDys遺伝子の3185位の突然変異により筋細胞膜下のDysがない(Sicinski et al. Science. 244(4912):1578-80 (1989))。DMDはヒトでは早期に発症するが、mdx系マウスは18月齢前にはDMDの臨床症状をほとんど示さない。しかしながらこの時を超えると、mdx系マウスは次第にジストロフィーの表現型を示すようになり、心筋およびいくつかの平滑筋を含めて、ほとんど全ての筋肉が線維化組織により侵されて、萎縮症になる。呼吸筋が特に影響を受けて、mdx系マウスは正常マウスが示すよりも短い生涯を示す。その齢および系統に応じ、mdx系マウスにおいて筋線維の0.1〜1%が復帰突然変異体(revertent)となり、Dysの切断型を発現する。
【０３２２】
筋芽細胞の移植(MT)の有益な効果を支持するいくつかの証拠が既に存在する。mdx系マウスをMTから1ヶ月後に遠心性収縮運動に供した場合、筋損傷、つまり筋原線維の損傷に至る歪みをもたらすことが知られている筋肉の伸張性収縮がMTから生じたDys陽性の線維においてではなくDys陰性の線維においてのみ観測された(Partridge et al., Nat. Med. 4(11): p. 1208-9 (1998)。このように、MTによって、DMDで筋原線維の壊死のきっかけとなる機械的歪みからmdx系マウスの筋肉組織が保護された。Morganら(Morgan et al., J. Neurol. Sci. 115(2):191-200 (1993))により、Dys陽性の線維の数はMTから35〜250日後まで変化しないのに対し、Dys陰性の線維の数は次第に減少することが観測された。これは供与者のDysの保護的役割によるものとされた。
【０３２３】
本発明は筋ジストロフィーを患う被験体に、例えば、本明細書に記載の、Acheron活性が低下している細胞を投与する段階を含む、筋ジストロフィーの処置方法を提供する。その細胞が自家性である場合、Acheron活性が低下している細胞は、例えば、当技術分野において知られるように、ジストロフィン遺伝子またはその生物学的に活性な断片を発現することもできる。
【０３２４】
本発明を以下の実施例でさらに記述するが、それらは特許請求の範囲に記述される本発明の範囲を限定するものではない。
【０３２５】
実施例
材料および方法
細胞培養
C2C12細胞は、15%(vol/vol)ウシ胎児血清(FCS)、5%のウシ胎児血清(FBS Atlanta Biologicals, Norcross, GA)および100単位/mlのペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)からなる増殖用培地(GM)中で培養した。分化を誘発するため、サブコンフルエントな培養物を、2%ウシ血清および100単位/mlのペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEMからなる分化用培地(DM)に移した。
【０３２６】
形質移入
リポフェクトアミン(商標)(Gibco)を製造元のプロトコルにしたがって使用して、C2C12細胞にhAch、tAch、As-Achまたは空のベクターを形質移入した。抗生物質耐性の安定な形質転換体をG418(500 μg/ml)またはピューロマイシン(3 μg/ml)の入ったGM中で選択した。形質移入のたびに約10種の単クローン性の(細胞)系列を無作為に選択し、さならる解析を典型的な個々の系列で行った。
【０３２７】
いくつかの実験では、形質移入細胞にpBabe-hygro-MyoDまたは空のpBabe-hygroベクターを再び形質移入し、安定な細胞をハイグロマイシンB 250 μg/ml (Sigma)で選択した。同様に、pBabe-puro-tAchまたはpBabe-puro-As-Achを、完全長のAcheronを過剰発現しているネオマイシン耐性細胞中に安定的に形質移入し、これをピューロマイシン(3 μg/ml)により選択した。
【０３２８】
ウエスタンブロット
C2C12細胞をGMおよびDMに入れてからの様々な時間で回収し、これをDTTまたはβ-MEの入っていないレムリ(Laemmi)緩衝液中に抽出した。タンパク質濃度をBSAアッセイ(Pierce)により決定し、その後、DTTまたはβ-MEをその試料に添加した。各試料に対しタンパク質20 μgを10% SDS-PAGEにより分画し、これをImmobilon P膜(Millipore)に転写し、これを一次抗体と反応させた。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗血清を高感度化学発光(ECL)キット(Amersham Pharmacia)およびX-線フィルム(Eastman Kodak)で検出した。
【０３２９】
使用した一次抗体には、tAch (2,000倍希釈)、抗-FLAGモノクローナル抗体(M5 500倍希釈, Sigma)、MyoD (500倍希釈, Pharmingen、または200倍希釈, C-20, Santa Cruz)、Myf5 (200倍希釈, C-20, Santa Cruz)、Bcl-2 (400倍希釈, Santa Cruz)およびBax (800倍希釈, Oncogene)が含まれた。
【０３３０】
免疫細胞化学染色
C2C12細胞を12ウェルプレートまたはカバースリップ(Fisher Scientific)上で増殖させ、その後、これを新たに作製したアセトンおよびメタノール(1:1 V/V)中で室温にて1分間(筋芽細胞)または3分間(筋管)固定した。この固定細胞を風乾し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で再水和した。または、細胞を4%パラホルムアルデヒドのPBS溶液中で室温にて20分間固定し、これをPBSで2回洗浄し、これを0.3% Triton X-100のPBS溶液で10分間透過化処理した。PBSで3回洗浄後、細胞を一次抗体のウシ血清アルブミン(10 mg/ml)含有PBST溶液と室温で1〜2時間または4℃で一晩インキュベートした。適切なビオチン標識二次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジン(Vector Laboratories)を製造元のプロトコルにしたがって検出のために使用した。一次抗体には、tAch (400倍希釈)、デスミン(200倍希釈, Sigmaから得られるポリクローナル抗体)、ミオゲニン(F5D, 50倍希釈)およびミオシン重鎖(MF20, 100倍希釈, Development Studies Hybridoma Bank)が含まれた。
【０３３１】
トリパンブルー試験による細胞致死率の決定
細胞をDM中で24時間または48時間インキュベートし、その後、トリプシン処理し、DMEM中に再懸濁し、製造元のプロトコルにしたがって1容量の0.1% Trypan Blue Stain (Sigma)で染色した。各細胞系を3重でカウントすることにより、細胞死の割合を決定した。
【０３３２】
酵母菌株および操作
サッカロマイセスセレヴィシェ(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株Y190およびCG1945(Clontech Matchmaker GAL4 Two-Hybrid User Manual)をライブラリースクリーニングに使用した。標準的な微生物学的技術および培地をこの菌株の増殖に用いた。培地表示は以下の通りである: YPDは2%グルコースの入ったYP(酵母抽出物に加えてペプトン)培地である。SD培地には2%グルコースおよび適切な栄養素が不足しているDO Supplement (例えば、SD/-ura/-trp/-leu培地にはウラシル、トリプトファンおよびロイシンが不足している)が含まれる。標準的なLiOAc媒介性の形質転換により、プラスミドDNAを酵母中に導入した。
【０３３３】
酵母ツーハイブリッドスクリーン
公知のAcheronコード領域(N末端の小部分を欠いている)を制限部位の入ったプライマーを用いてPCRにより増幅し、これをpAS2-1のSalI部位に読み枠を合わせてクローニングし、ベイトとしてpAS2-1-Acheronを形成させた。pAS2-1-Acheronを酵母CG1945中に形質転換し、次いで、融合タンパク質の発現をウエスタンブロットによりAcheron抗体(Larry Schwartz's lab)を用いて検出した。ベイトのpAS2-1-Acheronに、自己活性化は認められなかった。マウス17日齢胚cDNAライブラリー(Clontech)を十分に高い密度でLB/ampプレート上に直接的に蒔くことにより、そのライブラリーを増幅させた。そのクローンを回収し、pACT2ライブラリープラスミドをQiagenプラスミドDNA精製(Mega)キットにより単離した。pAS2-1-Acheronを含む菌株CG1945にpACT2ライブラリープラスミドを形質転換し、計4.8×106個の独立したコロニーをSD/-ura/-trp/-leu/-his + 3 mM 3-AT (3-アミノ-1,2,4-トリアゾール)上に蒔いた。大きなコロニーをストリークし、これをβ-ガラクトシダーゼ・コロニーリフト・フィルターアッセイに供した。HIS3およびLacZの両レポーター遺伝子の活性化を示す酵母コロニーを選択した。これらのHIS3+およびLacZ+コロニー由来のライブラリープラスミドは、酵母プラスミドDNAを大腸菌KC8中に形質転換し、続けてロイシンを欠いたM9最小培地上で選択することによりレスキューした。ベイトのAcheronと相互作用したタンパク質をコードするレスキュー済みのライブラリープラスミドを配列決定し、これを米国立バイオテクノロジー情報センターのインターネットサイトを通じてBLASTにより評価した。相互作用を確認するため、レスキューされたライブラリープラスミドおよびベイトのpAS2-1-Acheronを酵母菌株Y190中に共形質転換し、これをSD/-ura/-trp/-leu/-his + 50 mM 3-AT上での増殖およびβ-ガラクトシダーゼ・コロニーリフト・フィルターアッセイに供した。
【０３３４】
GST-タンパク質およびインビトロでのタンパク質結合アッセイ
mCASK-C cDNAのCaMキナーゼIIドメインをPCRにより増幅し、これをpGEX-2TのSmaI中に読み枠を合わせてクローニングし、これを大腸菌BL21細胞中に形質転換した。大腸菌培養物を0.4 mM IPTGで誘導し、組換えタンパク質をグルタチオン-セファロース4Bビーズ(Pharmacia Biotech)により細菌溶解物からアフィニティー精製した。プルダウンアッセイの場合、製造元の使用説明書に従い、インビトロTNT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega)をメチオニンの唯一の供給源として35S-メチオニンとともに用いて、放射標識したAcheronおよびルシフェラーゼをpET-25b(+)-Acheronおよびルシフェラーゼ制御プラスミド(Promega)から産生させた。5 μlの35S-メチオニン-Acheronおよび35S-メチオニン-ルシフェラーゼをそれぞれ、グルタチオン-セファロース4Bビーズに結合させた等量のGSTまたはGST-mCASK-C (CaMキナーゼIIドメイン)とともに、NETN結合用緩衝液2 ml中で45分間絶えず揺り動かしながらインキュベートした。35S-メチオニン-ルシフェラーゼおよびGSTは、結合アッセイで対照として使用した。セファロースビーズをペレット状にし、これを結合用緩衝液で徹底的に洗浄し、これをSDS/PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。
【０３３５】
欠失解析用の構築体
Acheronの欠失変異体を鋳型のpAS2-1-Acheronに相補的なプライマーを用いてPCR増幅により作製した。このPCR産物をSalIで消化し、これをpAS2-1のSalI部位に読み枠を合わせてクローニングした。作製された構築体は、それらが含むアミノ酸の領域にちなんで命名された。それらをpAS2-1-Acheron (14-347)、pAS2-1-Acheron (14-372)、pAS2-1-Acheron (14-399)、pAS2-1-Acheron (14-439)およびpAS2-1-Acheron (340-447)とした。pAS2-1-Acheron由来のBamHI断片をpAS2-1のBamHI部位に読み枠を合わせてクローニングし、pAS2-1-Acheron (14-205)を形成させた。このBamHI消化したpAS2-1-Acheronベクターを自己連結させて、pAS2-1-Acheron (205-447)を形成させた。mCASK-Cの欠失変異体を鋳型のpACT2-mCASK-Cに相補的なプライマーを用いてPCR増幅により作製した。このPCR産物をEcoRIおよびXhoIで消化し、次いでこれをpACT2に読み枠を合わせてクローニングした。作製された構築体を
2006525031.tif 000006
とした。
【０３３６】
実施例1. Acheronのクローニング
マンデュカ由来の18日齢ISM RNAから作製されるcDNAライブラリーをλZapII (Stratagene)ベクター中に構築し、これをプラス/マイナススクリーニングによりスクリーニングして、差別的に発現されたcDNAを単離した(Schwartz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(17):6594-98 (1990); Schwartz et al., J. Neurobiol. 23:1312-1326 (1992))。
【０３３７】
ヒトAcheron cDNAを単離するため、マンデュカAcheronに高い配列同一性を有するタンパク質をコードするヒト海馬EST (M79107) (結果に記述)をプローブとして用い、サブトラクションしたヒト海馬のオリゴdTおよびランダムプライミングによる、lZAP IIベクター(Stratagene)中に構築されたcDNAライブラリーをスクリーニングした。このオリジナルライブラリーには2×106個の組換え体が含まれており、これをスクリーニング前に高密度に増幅させた。およそプラーク5×104個/150 mmディッシュを大腸菌ローン上に蒔いて、これをニトロセルロース膜に移しとった(Magna Lift, Osmonics)。80℃で2時間架橋後、この膜をランダムプライミングによるその[α-32P]dCTP標識cDNAと高いストリンジェンシーでハイブリダイズさせた。陽性プラークをオートラジオグラフィーにより同定し、これを再スクリーニングし、cDNAクローンをin vivo excisionによりpBluescriptベクター内に回収した。
【０３３８】
DNA配列解析により、このスクリーニングで単離された最初の組換え体はその5'末端で切断されていることが分かった。完全長のヒトAcheronを得るため、改良型反転(inverse) RT-PCR法を使用して、その5'末端の高いGC含量による強固な二次構造を克服した。手短に言えば、総RNAをヒトRD横紋筋肉腫細胞から単離し、判明した5'末端に近接する遺伝子特異的プライマー
2006525031.tif 000007
を用いた逆転写によりcDNAを作製した。cDNA合成は、組換えTthポリメラーゼ(Promega)を5%ホルムアミドおよび1 mM MnCl2の存在下で52℃にて10分間、その後、75℃にて20分間使用することにより行った。得られたcDNAを環状化し、これをどちらもP1の上流にある遺伝子特異的プライマー: P3
2006525031.tif 000008
およびP2
2006525031.tif 000009
を使用して増幅させた。PCRは5%ホルムアミドの存在下でTthおよびTaqポリメラーゼ(Promega)の1:1混合物を用い、ホットスタートPCR反応で行った。95℃で5分間の最初の変性段階後、その試料を95℃で1分、70℃で1分、72℃で1分を30サイクル、その後、72℃で7分の最後の伸長段階に供した。このPCR産物を平滑末端化し、これをDNA配列決定の前にpKS (Stratagene)中にクローニングした。
【０３３９】
Ioannouら(Nat. Genet. 6(1):84-9 (1994))によりpCYPAC2Nベクター中に作製されており、MRC Human Genome Project Resource Centre (Hinxton, Cambridge, UK)から得られるヒトPACライブラリー(RPCI1)をスクリーニングすることにより、ヒトゲノムAcheronクローンを単離した。このライブラリーは7枚の22.2×22.2 cmの二重スポットフィルター(double spotted filter)上に並べられており、これを996 bp(ヌクレオチド459-1454間の領域でPCR増幅されたヒトAcheron cDNA)からなる32P-dCTP放射標識プローブでスクリーニングした。二つの陽性PAC(304E10および261E2)を回収し、配列解析によってこれらがhAcheron遺伝子を含むことが示された。このPACクローンからのPCR増幅断片の直接的配列解析によりまたはGenomeWalkerキット(Clontech)を使用して、これらのクローンから制限酵素消化された断片を解析することにより、ヒトAcheronのイントロン-エクソンの境界を同定した。
【０３４０】
完全長のhAcheron cDNAを同様にpFLAG-CMV2-neoベクター中に読み枠を合わせてクローニングし、N末端にFLAGタグの付いたhAcheronタンパク質(FLAG-hAch)を産生させた。わずかにN末端(1-33アミノ酸)の切断されたhAcheron (tAch)をpFLAG-CMV2-neoベクター中にクローニングしてFLAG-tAch融合タンパク質を作製し、その後、pBabeレトロウイルスベクターに移した。センスおよびアンチセンス両方の構築体を単離した。
【０３４１】
実施例2: Acheronポリクローナル抗体の作製
コード領域97-1398 (tAch)に相当するhAch cDNAの断片をPCRにより増幅し、これを発現ベクターpET-25b(+) (Novagen)中にサブクローニングした。この結果得られる構築体は、その断片のC末端でHSVタグおよび6×His残基と融合した434アミノ酸をコードする。この融合タンパク質を大腸菌BL21(DE3-pLysS)中で発現させて、これをNi-NTAアガロースビーズ(Qiagen)上でのアフィニティークロマトグラフィーにより、製造元の使用説明書に従い、もともとこの系用につくられた条件の下で精製した。ポリクロール抗血清は、ゲル精製した融合タンパク質およそ100 μgの完全フロインドアジュバント液の注射によりウサギで作製した。追加免疫は2週間ごとに、タンパク質およそ100 μgの不完全フロインドアジュバント液の皮下注射により行った。血清を5回目の追加免疫後に採血し、免疫前血清を対照として採血した。
【０３４２】
実施例3: C2C12細胞に対するAcheron異所性発現の生物学的効果
Acheronは骨格筋で最初に同定されたので、マウスC2C12筋芽細胞、つまり筋形成に関して定着したインビトロモデルを使用して、細胞レベルでhAchの機能を特徴付けた。C2C12細胞は、栄養因子に富む増殖用培地(GM)中で培養されると、素早く増殖する。C2C12は血清濃度の低い分化用培地(DM)に移されると、三つの発生的運命の一つを選択した。細胞の大部分はMyoDを上方制御し、ミオゲニンの発現、細胞周期からの離脱および筋管への最終分化が続けて起こった。これらの筋芽細胞が細胞周期から抜け出ると同時に、それらは、生存およびMyoDの安定性の両方を促進させるのに貢献する網膜芽細胞腫タンパク質(Rb)およびcdk(サイクリン依存性キナーゼ(cycle-dependent kinase))阻害因子p21の発現を上方制御する。筋芽細胞の第二の集団は、MyoDではなくMyf5を発現し、その後、筋管に分化せずにG0に入る。これらの細胞は、自己再生する能力およびGMに戻されると分化反応能をもつ筋芽細胞を産生する能力を備えた「補充細胞」のプールに相当する。Myf5は補充細胞の自己再生能で重要な役割を果たすと考えられる。抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の発現は、補充細胞に限られており、この亜集団にとって主要な生存機構であると思われる。細胞の最後の集団はどの生存プログラムを活性化することにも失敗し、アポトーシスを起こす。
【０３４３】
ウエスタンブロッティングによって、Acheronは分裂中の筋芽細胞および筋管の両方で構成的に発現しており、推定上の核局在シグナルを含んでいるにもかかわらず、主に細胞質に局在していることが分かった。細胞の増殖、分化およびアポトーシスの制御におけるhAchの役割を研究するため、完全長のhAch、N末端で切断されており最初の33アミノ酸がないドミナントネガティブ形(tAch)をコードするFLAGエピトープタグの付いた発現ベクター、アンチセンスAcheron (As-Ach)または空のベクターを安定的に形質移入した単クローン性のC2C12細胞系を作製した。異所性タンパク質の発現は抗FLAG抗体を用いてウエスタンブロッティングにより確認し、その一方で、As-Ach mRNAの発現はRT-PCR解析により検証した。天然タンパク質と同様に、異所性hAchも主に細胞質に局在していた。
【０３４４】
形質移入細胞系は全て、GM中で培養したときに同程度の細胞死を示した。DMに移入後、対照細胞は細胞死の通常の増加を示し、その増加は第2日目にピークに達し、その後、筋管の分化が第3日目と第4日目との間に完了(ミオシン重鎖(MHC)-陽性多核細胞)したときに減少した。hAch細胞はDMに移入後、第2日目に対照細胞に対する細胞死の3〜5倍の増加を示した(図2)。過剰な細胞喪失にもかかわらず、わずかな単核細胞が残存していたものの、多くの生着細胞は実際に融合し筋管に分化した。
【０３４５】
対照的に、tAchまたはAs-Achの発現により、DM中でインキュベートされた培養細胞で分化と細胞死の両方が大幅に阻害された。MHCの免疫染色により、10%未満の細胞が最終分化を遂げたことが分かった。これらのデータから、hAchの過剰発現は、DMへの曝露時に、細胞が分化する能力を阻害せずに細胞死のレベルを増加させるのに対し、As-AchおよびtAchはアポトーシスも分化も遮断し、多数の単核補充細胞の停留を引き起こしたことが示唆される。これらの単核補充細胞はGMに戻されると、その細胞は増殖することおよび集団を再生することができた。類似の結果がtAchおよびAs-Achで得られたことから、tAchはhAch機能のドミナントネガティブな調節因子として機能する可能性がある。この仮説を検証するため、hAchを発現するC2C12細胞にFLAG-tAchをコードするベクター、As-Achまたは空のベクターを形質移入し、各構築体に対し、5つの単クローン性の形質移入細胞系を単離した。tAchまたはAs-Achの異所性発現によって、tAchはAs-Achよりも効果的に、Ach誘発性のアポトーシスの増加および筋管形成の低下を遮断したことから、tAchはhAchのドミナントネガティブな調節因子として実際に機能することが示唆された。さらに、Achの最初の33アミノ酸は正常な機能にとって必須であると思われる。この領域内には公知の構造モチーフが存在していないが、潜在的なリン酸化部位である3つのスレオニン残基と1つのセリン残基が存在している。
【０３４６】
このように、hAchの過剰発現は、DMへの曝露時に、細胞が分化する能力を阻害せずに細胞死のレベルを増加させるのに対し、As-AchおよびtAchはアポトーシスも分化も遮断し、多数の単核補充細胞の停留を引き起こす。さらに、tAchはhAchのドミナントネガティブな調節因子として機能することから、Acheron活性を阻害する方法、したがって、アポトーシスを阻害する方法および細胞の生存を高める方法を提供する。
【０３４７】
実施例4: Acheronの異所性発現により影響を受ける筋原性経路
分裂中の筋芽細胞はMyoDとMyf5の両方を発現するが、その細胞は、DMへの移入後、それぞれ筋管と補充細胞に制限される。実施例3に記載されるデータから、異所hAchはC2C12細胞を分化の方向に押し進めるが、As-Achおよび/またはtAchによるhAchの阻害は細胞を補充細胞のプールに押し進めることが示唆される。Achがこれらのヘリックス-ループ-ヘリックス型の筋原性転写因子を介して機能しているかどうかを確認するため、MyoDおよびMyf5の発現を4群の遺伝子操作C2C12細胞(対照用ベクター、hAch、t-AchおよびAs-Ach)で調べた。ウエスタンブロット解析から、DMに移入後に対照細胞およびhAch細胞で観測されたMyoDの通常の増加がtAchにより完全に遮断されることが実証された(図3A〜3C)。
【０３４８】
このように、tAchはMyoDの誘導および引き続く分化を抑制するものと思われる。AcheronがMyoDの上流で機能しているかどうかを確認するため、tAchを発現するC2C12細胞にMyoD発現構築体を安定的に形質移入し、MyoDの強制発現をウエスタンブロッティングにより確認した。DMに移入後、これらの細胞は多数のMHC陽性の筋管を産生したことから、Acheronは筋芽細胞において通常のMyoDの発現に必要であることが示唆される。
【０３４９】
表現型の研究に一致して、異所hAchはMyf5の発現を遮断し、結果的に対照細胞に比べてこの筋原性因子の40%の減少をもたらした(図3B)。浮遊していたアポトーシス細胞をhAch発現細胞から取り除いた場合、Myf5はほとんど検出不能であった(レーンA; 図3B)。これらのデータから、AcheronはMyf5の発現を抑制するように機能することが示唆される。この仮説に一致して、tAchおよびAs-Achは対照に比べて、内在性Myf5の発現を2〜5倍増加させた。総合すれば、これらのデータから、AchはMyoDの発現には許容的であるが、しかしMyf5の発現を抑制することが示唆される。
【０３５０】
実施例5: AcheronはBaxおよびBcl-2の発現を変化させることでアポトーシスを誘発する
hAchはMyf5の発現および単核細胞の生存を遮断することから、インビトロの補充細胞およびインビボの衛星細胞にとって重要な生存因子であるBcl-2の発現を調べた。報文に一致して、DMに移入後の対照細胞ではBcl-2の一過性増加が認められた(上段、図4A)。全般的に同じBcl-2発現様式がhAch細胞(上段、図4B)で観測されたが、発現の絶対レベルは対照細胞で認められたものをはるかに下回っていた。対照的に、DMに移入後3日までに、tAch細胞のBcl-2レベルは対照細胞よりも4倍高く、hAch発現細胞におけるよりも8〜10倍高かった(上段、図4C)。As-Achを形質移入した細胞もBcl-2発現レベルの増強を示した(上段、図4D)。
【０３５１】
Bcl-2はBaxのプロアポトーシス活性に拮抗することによって機能するので、図4A〜Dの上段に示されるウエスタンブロットをストリップし、これを抗Baxモノクローナル抗体で再プローブした(中段、図4A〜D)。対照細胞では、Baxタンパク質のレベルは、DMに移入後に観測されたアポトーシスの様式に類似していた(中段、図4A)。Baxは最初の2日間に増加し、その後、3日目までに基礎レベルまで減少した。hAch細胞は類似のBax発現様式を示したが、そのタンパク質の絶対レベルは、対照細胞で認められたもののほぼ2倍であった(中段、図4B)。浮遊していたアポトーシス細胞をウエスタンブロッティングの前に培養物から取り除いた場合には、わずか約3分の1の総Baxタンパク質が存在するにすぎなかったことから、Baxの発現はアポトーシス細胞で最大であったことが示唆された。
【０３５２】
Acheronの遮断によって生存度が高められるという本発明者らの観測結果に一致して、Baxタンパク質のレベルは、DMへの移入から2日後、対照細胞と比較した場合にtAchおよびAs-Ach系でそれぞれ70%および30%低かった(中段、図4C〜4D)。Bcl-2 対 Bax(Bcl-2-to-Bax)の比率は生存における重要な決定因子であるため、tAchおよびアンチセンス細胞におけるBcl-2 対 Baxの比率が対照細胞に比べて3〜5倍高く、hAch細胞におけるよりも10〜19倍高かったということは注目に値する(図4E)。
【０３５３】
限定することを意図するわけではなく、一つの仮説として、本明細書に記載されるデータから、Acheronは、筋肉細胞の生存および分化で重要な役割を果たす系統発生的に保存された調節タンパク質であることが示唆される。マンデュカでは、ISMが死滅に傾倒するようになるとAcheronは高レベルにまで誘導され、細胞死の進行ががホルモン処置により妨げられるとAcheronは遮断される。マンデュカの生態は遺伝子操作に寄与しないので、哺乳類の筋芽細胞を使用してhAchを研究した。これらの実験のデータから以下の理論モデル(図5に描かれている)が示唆される: AchはMyoD、Myf5、Bcl-2およびBaxの発現を制御することにより、栄養因子の除去後の分化決定で重要な調節的役割を果たす可能性がある。AchはMyoDの発現に必要でありMyf5の誘導を抑制し、したがって細胞を分化のプールの方向に押し進める。AchはBcl-2を減少させる一方でBaxの発現を促進させることによって、余分な細胞のアポトーシスを促進させる。Achの遮断は、MyoDの発現の遮断およびMyf5の発現の促進によって、補充細胞の形成を促進させる。これらの細胞の生存は、Bcl-2の発現の上方制御およびBaxの発現の抑制によってさらに確実にされる。
【０３５４】
このように、Acheronは系統発生的に保存された新規のタンパク質であり、それは細胞の分化および生存を制御する働きをし、したがって、インビトロの補充細胞およびインビボの衛星細胞の形成および生存を促進させるために計画される処置の標的となる。
【０３５５】
実施例6: 遺伝子操作筋芽細胞の作製
CD-1系マウスを屠殺し、一次培養筋芽細胞をRando and Blau (1994) J. Cell Biol. 125(6):1275-87; Rando and Blau (1997) Methods Cell Biol. 52:261-72の方法にしたがい出生後2〜3日の産仔の脚筋から調製して98%の純度の筋芽細胞を超える培養物を作製する。一次培養筋芽細胞は20% FBS、0.5%ニワトリ胚抽出液および抗生物質を添加したDMEM中で培養する。筋芽細胞の純度は培養物をデスミン、つまり筋芽細胞のマーカー(参照基準)に対する抗体で染色することにより決定する。筋肉をコラゲナーゼ(0.2%)とトリプシン(0.25%)で酵素的に分離させた後、細胞を高濃度グルコース含有DMEM中、37℃で3日間培養する。
【０３５６】
培養物を増殖させ、分注し、新たなプレートに移す。Acheron活性は、Acheronのドミナントネガティブ変異体をコードするレトロウイルスを用いた感染により、ドミナントネガティブなAcheron変異体をコードするプラスミドによるリポフェクションを利用した形質移入により、またはAcheronを標的とするアンチセンスもしくはsiRNAを当技術分野において知られる方法を利用して導入することにより阻害される。ウイルス感染の場合には、各プレートにAchの変異体、例えば、N末端が切断されたAch(tAch)をコードする複製欠損型pBabe-ピューロマイシンレトロウイルスを感染させる。ワールドワイドウェブ上のstanford.edu/group/nolan/protocols/pro_helper_dep.htmlで利用可能なNolan laboratoryのプロトコルに従い、レトロウイルスをPhoenix細胞にパッケージングし(Yang et al. 1999)、99%を超える感染効率を報告したSpringerとBlauの手順(Springer and Blau、Somat Cell Mol Genet. 23(3):203-9(1997))に従い、一次培養筋芽細胞に導入する。このpBabe構築体には、高レベルの遺伝子発現を推進するためにMMLV LTR(長い末端反復配列)が使われている。あるいは、レトロウイルスよりはむしろアデノウイルス感染またはこれらの構築体をプラスミドとして用いたリポフェクトアミン媒介性の形質移入を行う。
【０３５７】
一次培養マウス筋芽細胞をこれらの構築体に感染させるかまたは形質移入させた後、細胞を40%コンフルエントで96ウェルプレート中にてプレート培養した後、85%コンフルエントに到達させてから、増殖用培地(GM)を2%ウマ血清/DMEM分化用培地(DM)と交換する。移動後0時間、12時間、24時間、48時間、72時間および96時間目を含めた様々な時点で、プレートをアッセイする。一セット分のプレートをカルセイン-AMおよびエチジウムブロマイド・ヘテロ二量体(「Live/Dead」 Molecular Probes)で染色し、これを蛍光プレートリーダーで測定する。カルセインAMは、生細胞に入り込んで脱エステル化されると、これが細胞内に保持されて蛍光を誘発する。エチジウムブロマイド・ヘテロ二量体は、死細胞に入り込んでゲノムDNA中に挿入されると強い蛍光を発し、したがって、生細胞は細胞質が緑色になるのに対し、死細胞は核が赤色になる。アポトーシスに対するその他のいくつかのアッセイが当技術分野において知られており、例えば、Schwartz and Osborne, eds. Methods Cell Biol., CELL DEATH. Academic Press 46:459, xv-xviii (1995); Schwartz and Ashwell, eds., Methods in Cell Biology Series, CELL DEATH II. Academic Press, volume 66, pp533 (2001)を参照されたい。
【０３５８】
空のベクターを含めて、適切な対照、Acheron遺伝子の完全長形、および細菌J-ガラクトシダーゼのような、アポトーシスに影響を与えない対照配列を同時に行うことができる。
【０３５９】
実施例7: 筋芽細胞の遊走および融合の評価
CD-1産仔由来の一次培養マウス筋芽細胞を実施例6で前述したように単離し、筋管の接着を促進させるためにコラーゲン処理されたプレート上に蒔く。90%コンフルエントに到達後、細胞をDM中で定期的に培地を交換しながら1週間インキュベートして、大きい多核筋管を産生させる。別の培養物として、感染させた筋芽細胞(上述)をGM中で増殖させて、その後、PKH26 (これは赤色の蛍光を与える)またはPKH67 (これは緑色の蛍光を与える)とともにインキュベートする(Torrente et al., Cell Transplant. 9(4):539-49 (2000))。これらの色素は、細胞の膜の中に取り込まれて分裂後の娘細胞に等しく配分される。標識細胞をトリプシン処理して、上記の筋管培養物に加える。様々な濃度の標識細胞を評価して、個々の細胞の運命を追跡するのに用いる最適な光学濃度を決定することができる。培養物を倒立蛍光顕微鏡で検査し等間隔で写真に撮影して、1) 生着する; 2) 筋管に接着する; 3) 線維に沿って遊走する; および4) 筋管と融合する細胞の割合を決定する。全てのアッセイを盲目的に行って、観察者によるバイアスを最小化する。
【０３６０】
並行実験として、筋管培養物中に残存する単核細胞を、Ara-Cでこれらの培養物を一時的に処理することによって死滅させる。処理から2日後、培養物を生理食塩水で徹底的に洗浄し、その後、通常のDMに戻す。次いで、標識された遺伝子操作筋芽細胞をこの培養物に加えて長時間にわたり視覚的にモニターし、補充細胞と比べて筋芽細胞との選択的な接着または相互作用が存在するかどうかを決定する。
【０３６１】
移植された筋芽細胞が野生型ジストロフィン遺伝子に寄与する可能性を評価するため、C57BL/10ScSnJマウス(Jackson Labs)、つまり未成熟終止コドンおよび切断型ジストロフィンタンパク質を作り出す点突然変異を保持するMDX系マウス(Sicinski et al., Science. 244(4912):1578-80 (1989))から作製された筋管を宿主細胞として使用することができる。野生型筋芽細胞も変異筋芽細胞もインビトロで筋管に分化する。遺伝子操作野生型筋芽細胞およびMDX一次培養筋芽細胞をCM-DiIで標識し、これをMDX筋管培養物に加える。上記のように、筋管に沿って遊走する細胞の割合および移動した相対距離ならびに筋管と融合する細胞の割合を決定する。さらに、筋管をジストロフィンの発現がないか染色して、発現のレベルおよびその細胞内局在性の両方を決定する。これらの筋線維に対するジストロフィンの機能的貢献は、当技術分野において知られているアッセイ、例えば、免疫組織化学、生体染色色素排除、強制的な張力測定(force-tension measurement)、または運動誘発性の損傷により評価することができる。遊走に対するbFGF、フィブロネクチン、TGF-βおよび肝細胞増殖因子などの増殖因子による筋芽細胞の処理の効果も評価する。
【０３６２】
実施例8: 移植片生着のインビボ評価
Acheron発現の阻害が移植細胞の生着に及ぼす影響を評価するために、上記と同様にして、CD-1系一次培養マウス筋芽細胞を雄性供与体から単離し、調製する。とくに雄性を使用するのは、細胞を雌性宿主に移植した場合に、Y染色体特異的配列に対するプライマーによる定量的PCR法を実施することによって、異所性細胞数を概算できるようにするためである。その一次培養筋芽細胞を増殖培地中にてインビトロで増殖させた後、実施例6と同様にして、pBabeレトロウイルスベクターに感染させる、すなわちプラスミドを形質移入させる。このタイプの移植試験では、複製欠損レトロウイルスを使用しても、免疫反応を誘導しないものと思われる(Rando and Blau, 1994, 前記)。レトロウイルスベクターが宿主動物に免疫応答を引き起こす場合は、全ての発現ウイルス遺伝子を欠いたアデノウイルス系ベクターを使用することができる。非感染細胞と空ベクターを対照とする。
【０３６３】
一部の実験では、細胞を、0.25 μCi/mlの[メチル-14C]チミジンの存在下、増殖培地で16〜24時間培養してから移植を行い、その後の細胞死をインビボで測定できるようにする(Skuk論文)。別の実験では、細胞遊走および融合を評価するために、筋芽細胞を、上記蛍光系統マーカーの一つPKH26で染色する。どちらの場合も、標識筋芽細胞を3500 rpmで5分間遠心分離し、15%ウマ血清に再懸濁し、4000 rpmで10分間遠心分離し、10 μlのハンクス平衡化塩溶液(HBSS)に再懸濁して、注射に備える。
【０３６４】
2〜4カ月齢の雌性CD-1系マウスを上記遺伝子操作細胞の宿主とする。両側の前脛骨筋(TA筋)を、既報(Torrente et al., Cell Transplant. 9(4):539-49(2000))に従いマイクロチューブ法で移植する。すなわち、静脈内カニューレを用いて、直径0.28 mmのポリエチレンプラスチック製チューブを、線維方向に平行になるように、筋肉に挿入する。チューブの遠位末端を封鎖し、チューブの長手方向に2 mm間隔で4個の小穴を設ける。先端部が50 μmのガラス製マイクロピペット(Drummond Scientific 社、Broomall, PA)を用いて、細胞を、ポリエチレン製マイクロチューブの近位末端からゆっくりと注射する。細胞の注射量は10 mlとするが、この量は、以下の2つの条件を満たすものである。まず、この量は、組織の変形や膨潤を引き起こすことなく容易に注射可能であり、次に、マイクロチューブの容量(5 μl)より5 μl多いため、一部の細胞をチューブからすぐに追い出すことができる。標識しているが遺伝子操作を受けていない対照筋芽細胞を対側のTA筋に注射する。
【０３６５】
筋芽細胞移入後の様々な時点で筋肉を単離し、以下のようにしてアッセイする。
【０３６６】
1. 生着: 筋芽細胞移入後の様々な時点で、宿主動物を屠殺し、TA筋を採取する。細胞生着を判定するために、ゲノムDNAを筋肉から抽出し、14Cのレベルを求める。細胞を高度麻酔動物に注射し、ただちにDNAを抽出することによって、「ゼロ」時間基準を設定する。これにより、細胞移入時の標識体の喪失、および試料中で起こりうるクエンチングを補正する。組織学的評価と併用すれば、放射活性の喪失が、細胞死およびその後のマクロファージなどの細胞によるクリアランスの指標になる。
【０３６７】
2. 増殖: 筋芽細胞移入後の様々な時点で、宿主動物を屠殺し、TA筋を採取する。既報(Pugatsch T, Oppenheim A, Slavin S.、「同種異型雌雄ミスマッチBMT後の雌雄判定のための改良型シングルステップPCRアッセイ法」、Bone Marrow Transplant.、1996年2月、17(2):273-5)に従い、Y染色体特異的プライマーを用いて定量的PCRを行なう。宿主細胞はこの配列を欠失しているため、PCR産物の量は、試料中の標的DNAのコピー数に比例するはずであり、生着して増殖する移植筋芽細胞の数と良く相関するはずである。14C-チミジンアッセイと併用すれば、これらのPCRアッセイにより、同じ試料中の細胞死と増殖の両方について妥当な指標が得られるはずである。
【０３６８】
3. 組織学的検査: 筋芽細胞移入後の様々な時点で、宿主動物を屠殺し、TA筋を採取し、凍結させたものを用いて、10 μmのクリオスタット凍結切片を作成する。ヨウ化プロポジウムを用いて核を標識し、蛍光顕微鏡を用いて異所性筋芽細胞を観察して、PKH26を検出する。ピクセラ(Pixera)カメラを用いて解析画像を取り込み、NIH Imageで解析する。既報(Torrente et al., Cell Transplant. (4):539-49(2000))に従い、×100の倍率で遊走距離を測定する。各筋肉における最大遊走距離を示した連続断切片を用いて、マイクロチューブが描出した注射部位からの遊走距離を測定する。このようにして選んだ筋肉断面の写真に等距離(50 μm)同心円を重ね合わせ、マイクロチューブの外側表面に対応する太線円から最大遊走範囲内の最遠位にある蛍光細胞群までの遊走距離を測定する。有意差は、Stat View 512ソフトウエア(Brain Power, Calabasas, Ca)用いて分散分析法(ANOVA)で評価し、p<0.05の場合に有意差ありと判定する。アッセイ実施者は、被験動物に加えられる分子遺伝子操作について盲検化されている。
【０３６９】
実施例9: 移植細胞の修復促進性の評価
上記(Rando and Blau, 1997、前記)と同様にして、一次培養筋芽細胞をC57BL/10ScSnJ系マウス(Jackson Labs)から単離し、本明細書に記載される構築体による遺伝子操作を加えて、Acheron活性を変化させる。次いで、遺伝子操作筋芽細胞を野生型およびC57BL/10ScSnmdx/J系のマウスに導入する。これらの動物は完全に組織適合性であるため(Vilquin et al., J. Cell Biol. 131(4):975-88(1995))、拒絶に関連する問題はほとんど生じない。おもしろいことに、これらの動物は血液中に抗ジストロフィン抗血清を生成するが(Vilquin et al., 1995、前記)、これが補体固定や拒絶につながることはない。実際、mdx系マウスをジストロフィンペプチドで前処理すると、動物は耐性化され、この応答が遮断される。対照として、標識した野生型筋芽細胞を対側のTA筋に注射する。
【０３７０】
筋芽細胞注射後5日目と3週目に、筋肉のジストロフィン免疫反応性とPKH26蛍光を調べる。これらの動物では内在性ジストロフィンは発現しないので(mdx系マウスのなかにはジストロフィン反応性ペプチドを発現する個体があるので、適切な対照と試料数を確保することに注意されたい(Hoffman et al., J Neurol Sci. 99(1):9-25 1990)、mdx系マウスの筋肉中にジストロフィンが存在していれば、機能に及ぼす移植細胞の影響を評価することができる。
【０３７１】
これらの解剖学的アッセイ以外にも、Acheron阻害によって、どの程度まで筋芽細胞の生着を向上させ、mdx系マウスの筋肉に物理的保護をもたらすことができるか判定する。mdx表現型 はDMD患者で見られるものほど重度ではないのに、これらの動物に強制的にトレッドミル運動を行なわせると、筋肉アポトーシス(Sandri et al. Neurosci. Lett. 252(2):123-6(1998))および二次的線維壊死を示す(Brussee et al. Neuromuscul. Disord. 7(8):487-92(1997);Vilquin et al. Muscle Nerve. 21(5):567-76(1998))。Acheron遺伝子操作を加えた筋芽細胞が線維生着および使用性の向上に寄与するかどうかを判定するために、動物を、傾斜度15度のモーター駆動トレッドミル上で10 m/分の速度で運動させる(Brussee et al., 1997、前記)。TUNELおよび/または抗カスパーゼ3染色によってアポトーシスを検出する。屠殺の24時間前に動物にエバンスブルーを注射することによって壊死を評価し、この強力な染色剤の取り込み量による筋鞘完全性の破壊度を明らかにする。試験側の筋肉と対側の筋肉を比較することにより、各被験動物中のTUNELおよびエバンスブルー染色のレベルを求める。
【０３７２】
実施例10: 酵母ツーハイブリッドスクリーニングによるAcheronとの相互作用によるmCASK-Cの同定
Acheronと相互作用を示すタンパク質を同定するために、公知のマウスAcheronコード領域全体(N末端の短い部分のみを欠失)を、読み枠を合わせて、GAL4のDNA結合ドメインのC末端にクローニングして、プラスミドpAS2-1中にベイトを作製した。ベイトpAS2-1-Acheronを、2種類のレポーター遺伝子HIS3とLacZを保持する酵母株CG1945に形質転換させた。抗Acheron抗体を用いるウエスタンブロットにより、融合ベイトタンパク質の発現を調べた。ベイトプラスミドはそれ自体では、上記2種類のレポーター遺伝子の発現を活性化させなかった。Acheronとタンパク質相互作用を示す可能性のある相手を同定するために、マウス17日胚cDNAライブラリー(Clontech)を増幅し、ベイトpAS2-1-Acheronを組み込んだ酵母株CG1945に形質転換させた。約4.8×106個の形質転換体をプレート培養したところ、2個のクローンがHIS3とlacZの両者の発現に陽性であることが確認された。この2個のプレイプラスミドをレスキューし、単離した。配列解析とBLAST検索を行ったところ、プレイプラスミドのうちの一方は、CAMGUKファミリーに属する全長マウスタンパク質(Genomics 53, 29-41 1998)をコードすることが判明し、N末端CaMキナーゼIIドメインとC末端MAGUKドメインをともに含有していた。このタンパク質は、DNAとタンパク質のいずれのレベルでも、ヒトCASKと非常に高い相同性を示すことから、mCASK-Cと命名した。もう一方のプレイプラスミドは、Ariadnenのc末端をコードし、第二のリングフィンガーの一部を含有している。
【０３７３】
マウスAcheronとmCASK-Cの相互作用をさらに確認するために、別のツーハイブリッド法アッセイを酵母株Y190で行なった。単離したプレイプラスミドpACT2-mCASK-C、ベイトプラスミドpAS2-1-Acheron、ベクタープラスミドpAS2-1、およびpACT2を組み合わせ別に、酵母株Y190に共形質転換させた。形質転換体をSD/-ura/-trp/-leu/-his + 50mM 3-ATで培養し、β-ガラクトシダーゼコロニーリフトフィルターアッセイを行なった。pAS2-1-AcheronとpACT2-mCASK-Cの両方を保持する酵母株Y190のみがHIS3およびLacZ発現に陽性であった。これ以外のプラスミドの組み合わせによって生じた形質転換体はいずれも、陽性発現を示さなかった。このことから、GAL4-BD-Acheron融合タンパク質はGAL4-ADタンパク質と相互作用しないこと、およびGAL4-AD-mCASK-C融合タンパク質はGAL4-BDタンパク質と相互作用しないことが判明した。LacZおよびHIS3レポーター遺伝子は、GAL4-BD-Acheron融合タンパク質とGAL4-AD-mCASK-C融合タンパク質が同時に酵母細胞で発現された場合に限り、活性化されるものと思われる。
【０３７４】
すなわち、AcheronはmCASK-Cと特異的に相互作用する。
【０３７５】
実施例11: マウスCASK-Cのクローニング
mCASK-Cをさらに特徴付けるために、上記のようにベイトAcheronと相互作用するタンパク質をコードするライブラリープラスミドをレスキューしたものについて、配列決定を行い、BLASTによって評価した。一方のプラスミドは推定CAMGUKsタンパク質の全長をコードするものと判定され、後にmCASK-Cと命名された。mCASK-Cのコード化領域は2694個のヌクレオチド(配列番号:9)にまたがり、897個のアミノ酸のタンパク質(配列番号:10)をコードする。このものは、ヒトCASK(「hCASK」)に対して、DNAレベルで95%の相同性を示し、タンパク質レベルで99.6%の相同性を示し、3個のアミノ酸が異なるだけである(Pro395とLeu395の違い、Ser777とLeu777の違い、Val852とIle852の違い)。hCASK、マウスCASK-B、およびラットCASKと同様に、推定mCASK-Cは、タンパク質キナーゼサブドメイン(アミノ酸12-276)とカルモジュリン結合サブドメイン(アミノ酸305-315)を含有するN末端CaMキナーゼIIドメイン(アミノ酸1-339)、C末端PDZドメイン(アミノ酸483-558)、SH3ドメイン(アミノ酸587-652)、およびコアMAGUKモチーフを形成するGUKドメイン(アミノ酸710-831)という一連のタンパク質ドメインで構成されている。N末端CaMキナーゼIIドメインとC末端MAGUKドメインのこの組み合わせは、最近、新規のタンパク質ファミリーCAMGUKsとして記載された(Genomics 53, 29-41 1998)。mCASK-C、hCASK、マウスCASK-B、およびラットCASKのCaMキナーゼIIドメインおよびPDZドメインは、マウスCASK-Bとその他のものとの間で1個のアミノ酸(L298とF298の違い)が異なる点を除いて、相同である。これら4種類のタンパク質のSH3ドメインとGUKドメインは高度に保存されている。しかし、mCASK-Bと比べると、mCASK-Cは、CaMキナーゼIIドメインの直下流に存在する6個のアミノ酸(アミノ酸340-345)が欠失し PDZドメインの下流に存在する23個のアミノ酸(アミノ酸580-602)も欠失している。アミノ酸340-345の欠失は、mCASK-AとmCASK-Bの全ての単離物において代替エクソンとして利用されていると判断された。
【０３７６】
実施例12: インビトロ結合アッセイ
AcheronとmCASK-Cの物理的相互作用をさらに確認するために、インビトロのタンパク質結合アッセイを行なった。まず、35S標識タンパク質をインビトロの転写および翻訳によって合成した後、グルタチオン-セファロース4Bビーズに固定化したGSTまたはGST-mCASK-C(アミノ酸1-339のCaMキナーゼIIドメイン)の存在下で培養した。ビーズをペレット状にし、よく洗浄してから、結合タンパク質複合体をSDS/PAGEによって分離し、オートラジオグラフィーで検出した。Acheronは、GST-mCASK-Cと結合するが、GSTとは結合しないことがわかり、GST-mCASK-Cは対照タンパク質ルシフェラーゼと結合しなかった。
【０３７７】
これらの知見から、AcheronはインビトロでmCASK-Cと物理的に会合することが確認される。
【０３７８】
実施例13: AcheronとmCASK-Cの相互作用領域の決定
AcheronとmCASK-Cの相互作用に関与する領域を決定するために、一連のAcheron由来欠失変異体を作成し、読み枠を合わせて、pAS2-1中でGal4のDNA結合ドメインと融合させた。生じた各構築体を、pACT2-mCASK-Cとともに酵母株Y190に共形質転換した。形質転換体を、β-ガラクトシダーゼコロニーリフトフィルターアッセイによって評価した。
【０３７９】
mCASK-CとAcheronの相互作用に関与する領域を決定するために、一連のmCASK-C由来欠失変異体を作成し、読み枠を合わせて、pACT2中でGal4のDNA活性化ドメインと融合させた。生じた各構築体を、pAS2-1-Acheronとともに酵母株Y190に共形質転換した。形質転換体を、β-ガラクトシダーゼコロニーリフトフィルターアッセイによって評価した。
【０３８０】
欠失解析により、Acheronのカルボキシ末端領域(アミノ酸340-439)はmCASK-CのCaMキナーゼIIドメイン(アミノ酸1-304)の一部と物理的相互作用を示すのに必要かつ十分であることがわかった。CaMキナーゼIIドメイン中のカルモジュリン結合サブドメインは、AcheronとmCASK-Cの会合には不要である。CaMキナーゼIIドメインはCASKタンパク質間で非常に高い相同性を示すので、Acheronは他のCASKタンパク質と相互作用する可能性がある。
【０３８１】
CASKは、細胞の特定の領域中で特定のマルチタンパク質複合体を会合させる複数のタンパク質結合ドメインを含んでいる(Cell 93, 495-498:1998;Curr. Biol. 6, 382-384:1996)。CASKタンパク質は、推定CaMキナーゼIIドメインを含み、Acheronのカルボキシ末端は、キナーゼ基質として作用する可能性がある推定モチーフを含んでいる。したがって、mCASK-CがAcheronをリン酸化すると予想するのが妥当である。限定することを意図するわけではなく、一つの仮説として、Acheronは核局在化配列を含み、かつCASKは膜関連タンパク質であることから、AcheronがCASKの核トランスローケーションの担体として働く可能性がある。
【０３８２】
実施例14: Acheronが転移性に及ぼす影響
EGFRを正常レベルで発現するCHO(ハムスター卵巣線維芽細胞)とEGFRを高レベルで発現するA431(ヒト類表皮種がん腫細胞)を100 ng/mlのEGFで5分間、30分間および2時間、処理した。無処理CHO細胞においては、Acheron染色は、細胞質を染色し、拡散性で、弱いが、処理後2時間目には、細胞核が高濃度のAcheron染色を示した。一方、A431細胞は、処理とは無関係に、非常に高濃度の核Acheron染色を示した。本明細書に記載されるようにして一次抗体を作製し、フルオレセイン結合ヤギ抗ウサギ抗体を二次抗体とした。
【０３８３】
2種類の横紋筋肉腫細胞系RH-1とRH-39は、大幅に異なるAcheron発現パターンを示した。Rh-1細胞は核染色のみを示すのに対して、Rh-39細胞は細胞質と核の両方で発現する。細胞を15%FBS添加DMEMで培養した。染色は、Vector染色キット、発色原としてDAB、ならびに合成ペプチドおよびN末端切断型に対するポリクローナル抗体を用いるICCによって行なった(希釈率1:100〜1:500)。
【０３８４】
すなわち、Acheronは、EGF感受性CHO細胞中で栄養因子の添加に応答して核にトランスローケーションされ、いくつかの細胞系において核に局在するが、この核へのトランスローケーション/局在パターンは、浸潤性や発がん性の増大と相関する。
【０３８５】
実施例15: Acheron発現または活性の阻害方法
B-mybプロモーターに由来する切断(ドミナントネガティブ)Acheronを発現するcDNA構築体が作製されている。B-myb調節配列が細胞周期のG1/S相で効果的に誘導された後、G0期には転写抑制を受ける(Joaquin M, Watson RJ. (2003)、「B-Myb転写因子による細胞周期の調節」、Cell Mol Life Sci. 60:2389-401)。このことは、細胞周期が進行しているときには、ドミナントネガティブAcheronが発現され、生着に影響を及ぼしうることを意味する。
【０３８６】
pGLHB-myb-ルシフェラーゼプロモーターレポーター構築体を利用した、ルシフェラーゼcDNAとリンカー結合Acheron遺伝子を含むcDNA構築体(Lam et al., Gene 160(2):277-81(1995))が作製されている。2種類の構築体、すなわち全長Acheron(pB-myb-FL-44a)と切断ドミナントネガティブ形(pB-myb-TR-44a)を作製した。
【０３８７】
これらの構築体を、Nucelofectinを用いて一次培養筋芽細胞に導入し、ピューロマイシンの存在下で3日間培養することによって、形質移入細胞の集団を選択する。細胞を数日間、増殖用培地(GM)で培養してから、分化用培地(DM)に移し、次いでアッセイする。B-mybプロモーターからのレポーター遺伝子の発現をモニターすることで、細胞をDMに移すと、プロモーター-レポーターアッセイから予想される異所性発現が実質的に低下することを確認することができる。DMへの移入後も相当期間にわたり発現が持続する場合は、Cdk2やテトラサイクリンなど他のプロモーターを使用する。次いで、細胞をアッセイして、栄養補助非存在下での生着性および移植後のインビボ筋肉繊維取り込まれ性を調べる。
【０３８８】
細胞をインビボで栄養欠乏環境に移植すると、発現が抑制される。異所性タンパク質レベルが低下すると、ドミナントネガティブAcheronに起因する分化の予定遮断が排除される。予備試験で、細胞周期にあるC2C12 筋芽細胞中で、B-myb-プロモーター-ルシフェラーゼ-レポーター構築体が10倍以上良好に誘導されることが明らかになった。細胞をコンフルエントになるまで増殖用培地で培養するか、分化用培地に移したところ、ルシフェラーゼ活性がプロモーター不含ルシフェラーゼ対照レポーター構築体のレベルまで低下した。
【０３８９】
実施例16: Acheron発現のプロファイルの決定
Acheronまたは切断型Acheronのいずれかを安定的に発現するマウス衛星細胞組織培養細胞系を作製し、遺伝子発現プロファイル決定を行なった。
【０３９０】
RNAハイブリダイゼーション
Acheronまたは切断型Acheronのいずれかを安定的に発現するマウス衛星細胞組織培養細胞系から全RNAを単離した。精製した全RNAの完全性を、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を用いて確認した。Affymetrix GeneChip発現解析マニュアル(Affymetrix, Santa Clara, CA)に従い、ハイブリダイゼーション試料を作製した。すなわち、10 mgの全RNAを用いて、第一らせんcDNAを作製した。第二らせんを合成した後、ビオチン化して増幅したRNAを、GeneChip試料クリーンアップモジュール(Affymetrix, Santa Clara, CA)を用いて精製し、分光光度計で定量した。次いで、ビオチン化cRNA試料を AffymetrixマウスMOE 430Aアレイにハイブリダイズさせた。これらのアレイは、22690個の転写物およびESTクローンのプローブセットを含んでいる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄し、スキャンし、GENECHIPソフトウエアで解析した(Affymetrix, Santa Clara, CA)。
【０３９１】
データのチェックと解析
1)データのチェック: Affymetrix Microarray Suite(MAS)バージョン5.0によって作製した24.CELファイルを、2種類のプロット法、すなわちボックスプロット法とヒストグラム法を用いてチェックした。両方のプロットによって、3個のチップが同群内の対応する複製物と異なっていることが確認された。すなわち、PGM8、FDM16、およびPDM24である。そこで、これら3つの試料を以後の解析から除外した。
【０３９２】
2)解析: PM(完全マッチ)プローブ強度をRMAによって補正し、クオンタイル変異値正規化法によって正規化し、メジアンポリッシュ法を用いて要約した(これらの作業はいずれも、Bioconductor社のAffyパッケージに入っているRMA法によって簡便に実施できる;同社のホームページから入手可能)。グローバル遺伝子発現プロファイルの比較は、正規分布と2群間の不均一分散を仮定した2標本t検定を用いて行なった。偽陽性率(FDR)<0.05を基準として、発現が有意に変化した遺伝子を選んだ。
【０３９３】
結果:
7通りの比較のいずれかにおいて有意差あり(FDR<0.05の場合)と判定された遺伝子を全て表4に示す。各比較には、比較対象となった試料にちなんだ名称を付けた。Fは全長Acheronを表し、Pは切断型Acheronを表し、Cは対照Babeを表し、GMは増殖条件を表し、DMは分化条件を表す。各比較について、6個の結果欄がある。たとえば、FGM対CGMはGM中の全長Acheronと増殖用培地中の対照Babeの比較を表し(通常は正常培地中のAcheronの過剰発現によって変化する遺伝子);PGM対CGMは、切断型ドミナントネガティブAcheronと増殖用培地中の対照の比較(通常は正常培地中のAcheronの過剰発現によって変化する遺伝子);FDM対CDMは、Acheronと分化用培地中の対照の比較(通常はおそらく正常組織により類似した条件下でAcheronの過剰発現によって変化する遺伝子);PDM対CDMが、切断型ドミナントネガティブAcheronと分化用培地中の対照の比較(通常はおそらく正常組織により類似した条件下でAcheronの過剰発現によって変化する遺伝子);FDM対FGMが、分化用培地中のAcheronと増殖用培地中のAcheronの比較(切断型Acheronによって顕著に抑制され、全長Acheronによって誘導されるマウスCORS-26遺伝子のゲノム形成、染色体局在化、および脂肪細胞発現などの顕著な変化が筋肉特異的遺伝子ならびに脂肪遺伝子に生じる);PDM対PGMが、分化用培地中の切断型Acheronと増殖用培地中の切断型Acheronの比較。
【０３９４】
下記の結果は、それぞれ、倍数変化率(平均CGMオリジナル発現レベルに対する平均FGMオリジナル発現レベルの比率)、およびその変化が増加(すなわち、倍数変化率>1)なのか低下(すなわち、倍数変化率<1)なのかを示す。
【０３９５】
（表４）Acheron発現のプロファイリング結果
2006525031.tif 000010
2006525031.tif 000011
2006525031.tif 000012
【０３９６】
すなわち、本明細書に記載される方法には、Acheronポリペプチド、核酸、およびそれらの断片を使用することによるこれらの遺伝子の一つの発現または活性を調節することが含まれる。
【０３９７】
これらの結果から、がん、細胞分化、および細胞死などの複数の重要な生物学的過程に影響を及ぼすことが示唆される。重要所見の一部をここに示す。
【０３９８】
1)本明細書に記載されるように、最高レベルのAcheron発現を示す組織は神経系である。インサイチューハイブリダイゼーションから、発生中の脳で、最高レベルの発現は分裂後の神経細胞に認められることが示唆される。この点に関して、Acheronに応答して最大の発現変化率を示す遺伝子はがん遺伝子の神経芽細胞腫myc関連発がん遺伝子であることが興味深い。このことから、Acheronは脳のがんおよび脳発生の障害と関連していることが示唆され、具体例としては神経芽細胞腫、膠芽腫、髄芽腫、髄膜腫、ダウン症、および自閉症などが挙げられるが、これらに限定されることはない。後者の2つの疾患は、Acheronの影響下で神経細胞の細胞分裂と細胞死と関連している可能性がある。
【０３９９】
2)Acheronは、ビグリカン、スタニオカルシン1、およびプロコラーゲンVI型α2など複数の骨関連遺伝子の発現を抑制する働きがある。このことから、Acheronの標的化は、変形性関節炎、骨粗鬆症、骨修復、骨転移、および骨肉腫など(ただしこれらに限定されない)の骨疾患と関連していることが示唆される。
【０４００】
3)Acheronはほとんど全ての組織で発現するが、骨髄、胸腺、脾臓、およびリンパ腫などの正常および悪性リンパ系組織には通常は存在しない。この所見は、Acheronがリンパ系統の分化に対してネガティブ調節剤として機能するがゆえに、白血病やリンパ腫ならびに関連疾患において何らかの役目を果たしている可能性を示唆するものである。AcheronがC2C12細胞において、塩基性らせん-ループ-らせん(bHLH)転写因子であるMyoDとMyf5の発現をそれぞれ強化および抑制する働きをするのであれば、ABF-1(Massari et al., Mol Cell Biol. 18(6), 3130-9(1998))やE2A(Greenbaum and Zhuang、Semin Immunol. 14:405-414(2002))などのリンパ系組織の必須bHLHタンパク質に対しても同様の機能を示す可能性が出てくる。
【０４０１】
4)Acheronはいくつかのプロテアーゼ類の発現も調節する。たとえば、グランザイムDおよびEの8〜10倍増加を誘導する。
【０４０２】
これらのデータから、Acheronはがん、炎症、細胞死、自己免疫、および動脈硬化疾患など(ただしこれらに限定されない)の障害において機能しうること、およびAcheronの発現または活性の阻害はこれらの病態の治療に有用であることが示唆される。
【０４０３】
実施例17: 内在性Acheronの遮断の最適化
根拠:本明細書に記載されるように(実施例3を参照されたい)、ドミナントネガティブ型(tAcheron)またはアンチセンスAcheronによる内在性Acheronタンパク質の遮断は、衛星細胞の形成を強化し、栄養因子除去後のアポトーシスを遮断する。これらの性質ゆえに、Acheronは、移植衛星細胞の有用性の向上を図る遺伝子操作の標的として理想的である。
【０４０４】
どの方法がAcheron機能の阻害に最適であるかを判定するために、野生型一次培養筋芽細胞を、4種類の実験構築体、すなわち1)構成的に発現させたtAcheron、2)サイクリン(cyclic)依存性タンパク質キナーゼ2(cdc2)またはB-mybプロモーターから一過性に発現させたtAcheron、3)アンチセンスAcheron、および4) small interfering Acheron RNA(siRNA)のいずれか一つに感染させる。これらの方法のそれぞれによって、内在性Acheronが減少し、細胞生着が促進される。
【０４０５】
A)構成的に発現させたドミナントネガティブtAcheron: 複製欠損pBabe-ピューロマイシンレトロウイルスを用いて、筋芽細胞に異所性tAcheronを発現させる。これらのベクターは、MoMLV LTR(長い末端反復配列)を利用して高構成レベルの発現を引き起こす。この試験では、本明細書に記載されるpBabe-tAcheron構築体を使用する。
【０４０６】
B)アンチセンスAcheron: 本明細書に記載されるように、pBabeアンチセンスAcheron(AS-Acheron)は、筋芽細胞を栄養補助の喪失から防御する(実施例3、図2参照)。しかしながら、この構築体は、ドミナントネガティブtAcheronよりも効果が弱い。したがって、AS-Acheronを使用するのが、筋芽細胞の生着の向上と分化の促進という相反する要求の良い妥協点かもしれない。
【０４０７】
C)一過性に発現させたtAcheron: 本明細書に記載されるように、ドミナントネガティブtAcheronは衛星細胞の細胞死と分化の両者を遮断する。このことから、Acheronを構成的に遮断すると、移植後の異所性細胞の生着が向上する一方で、最適な筋形成が阻害される可能性があるという懸念が生じる。この問題を検討するために、pBabe-tAcheronに由来するMoMLV LTRを、細胞周期のG2/S期には活性を示し、その後の静止期細胞では抑制されるB-mybまたはcdc2プロモーターのいずれに由来する5'配列と置換する(Joaquin and Watson., J. Biol. Chem. 278(45):44255-64(2003);Dalton, EMBO J. 11(5):1797-804(1992);Liu et al., Circ. Res. 82(2):251-60(1998))。これらの遺伝子操作は、細胞が増殖用培地中にあるときにはtAcheronの発現を引き起こすが、細胞が低血清分化用培地に曝露されているときには引き起こさないはずである。
【０４０８】
対照として、cdc2プロモーター-緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター構築体を構築し、本明細書に記載される細胞ベースアッセイで試験する。これにより、細胞分裂を停止させる低血清分化用培地へ移すと、cdc2プロモーター活性の低下が起きることが確認される。リアルタイムでより正確にプロモーター活性をモニターするためには、ユビキチン/プロテアソーム依存性分解が増強されているがゆえに細胞内の半減期が非常に短い人工GFPタンパク質(Dantuma et al., Nat Biotechnol. 18(5):538-43(2000))を使用する。
【０４０９】
D)siRNA: Acheron遺伝子の19個のヌクレオチドからなる配列とその相補配列をpSUPER(商標)(OligoEngine Co.)哺乳類発現ベクターにサブクローニングさせる。ショートヘアピン配列が2個の自己相補配列に分かれる。ベクター中のRNAポリメラーゼIII H1プロモーターが、哺乳類細胞に高レベルの発現を引き起こし、短いRNAiが開裂し、遺伝子発現が配列依存的に抑制される(Brummelkamp et al., Cancer Cell. 2(3):243-7(2002); Brummelkamp et al., Science. 296(5567):550-3(2002))。別の実験では、Silencer(商標) siRNA構築キット(Ambion)を用いて、Acheronに対するインビトロ合成二本鎖siRNAiを使用する。
【０４１０】
インビトロ細胞アッセイ: 上記A〜Dで説明した核酸構築体のそれぞれを、以下の実施例16で説明するインビボ移植試験に使用するものと同じ一次培養マウス筋芽細胞中で分析する。C57BI10Jマウスを屠殺し、RandoとBlauの方法(1994、前記;1997、前記)に従い、出生後2ないし3日目の仔獣の脚部筋肉から一次培養筋芽細胞を調製して、純度98%以上の筋芽細胞培養物を作製する。一次培養筋芽細胞を、20%FBSと0.5%ヒヨコ胚抽出物と抗生物質を加えたDMEMで培養する。筋芽細胞純度は、 筋芽細胞マーカーのデスミンに対する抗体で培養物を染色することによって、測定する(Morris and Head、Exp Cell Res. 158(1):177-91(1985))。筋肉をコラゲナーゼ(0.2%)とトリプシン(0.25%)で酵素的に分離させた後、細胞を高濃度グルコース含有DMEM中、37℃で3日間培養する。
【０４１１】
培養物を増殖させ、分注し、新しいプレートに移す。各プレートを、上記発現構築体の一つに感染させる。2種類の対照ウイルス、すなわち、空ベクターと無関係遺伝子発現pBabe(GFP; Green Fluorescent Protein)も使う。GFPを使用すると、感染効率を評価できる利点もある。Nolan laboratoryのプロトコルに従い、レトロウイルスをPhoenix細胞にパッケージングし(Yang et al. 1999)、99%を超える感染効率を報告したSpringerとBlauの手順(Springer and Blau、Somat Cell Mol Genet. 23(3):203-9(1997))に従い、一次培養筋芽細胞に導入する。これらの方法の効率は確認済みである。
【０４１２】
一次培養マウス筋芽細胞をこれらの構築体のそれぞれに感染させた後、細胞を40%コンフルエントで96ウェルプレート中にてプレート培養した後、85%コンフルエントに到達させてから、増殖用培地(GM)を2%ウマ血清/DMEM分化用培地(DM)と交換する。移動後0時間、12時間、24時間、48時間、72時間、および96時間目を含めた様々な時点で、プレートをアッセイする。一セット分のプレートをカルセイン-AMおよびエチジウムブロマイド・ヘテロ二量体(「Live/Dead」 Molecular Probes)で染色し、これを蛍光プレートリーダーで測定する。カルセインAMは、生細胞に入り込んで脱エステル化されると、これが細胞内に保持されて蛍光を誘発する。エチジウムブロマイド・ヘテロ二量体は、死細胞に入り込んでゲノムDNA中に挿入されると強い蛍光を発する。したがって、生細胞は細胞質が緑色になるのに対し、死細胞は核が赤色になる(プレートアッセイの読み取り値が細胞の外観を正確に反映することを保証するために肉眼計数も行なう)。これらの実験により、これらの培養物における細胞死の定量的測定によって、これらの遺伝子操作が栄養補助除去後の細胞生着を向上させるかどうかを評価することができる。
【０４１３】
各実験で得られた2枚目のプレートの遺伝子操作細胞を固定し、筋肉形成のマーカーである抗ミオシン重鎖モノクローナル抗体と反応させる。ウェルをセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体および基質2,2-アジノ-ジ(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)とともに保温する。ShumwayとSchwartzの方法(Biotechniques.; 31(5):996, 998, 1000(2001))を用いて、分化の指標としてのMHC発現レベルをマイクロタイタープレートリーダーで定量する。この段階を経た後で、ABTSを洗い落とし、細胞をHRP基質DABと反応させる。これにより、MHCに染まった筋管が見えるようになり、筋管の数や含まれる核の平均数などを計測することによって、筋肉形成の程度を評価することができる(Shumway and Schwartz, 2001、前記)。
【０４１４】
結果:内在性Acheron発現を遮断する遺伝子操作はいずれも、DMへの移動後の対照細胞と比べて細胞死を減少させる。Acheronに対する遮断は一過性であるがゆえに、cdc2またはB-MybプロモーターからtAcheronを発現する培養物は、DM中で最高レベルの筋管形成を示す可能性が高い。これらの実験から、移植筋芽細胞の生着と分化を最も向上させるのはどの遺伝子操作であるのかが示される。
【０４１５】
実施例18: Acheron機能の遮断がインビボにおける筋芽細胞の生着と増殖に及ぼす影響
根拠: 本明細書に記載されるように、Acheron機能を遮断すると、栄養補助の非存在下でも衛星細胞が生着できる。この所見を潜在的治療用途に応用するために、これらの試験をインビボの動物モデルで追試する。
【０４１６】
方法: 上記と同様にして、C57Bl10J系一次培養マウス筋芽細胞を雄性新生仔から単離し、調製する。とくに雄性を使用するのは、細胞をC57BL10J系雌性宿主に移植した場合に、Tremblay laboratoryの手法(Caron et al., Biotechniques 27(3):424-6、428(1999))を用いて、Y染色体特異的配列に対するプライマーによる定量的PCR法を実施することによって、異所性細胞の数を概算できるようにするためである。
【０４１７】
その一次培養筋芽細胞をGM中にてインビトロで増殖させた後、目的Iで説明しているpBabeレトロウイルスベクターの一つに感染させる。対照筋芽細胞は感染させないか、空ベクターまたはGFP発現ベクターのいずれかに感染させる。レトロウイルス感染後、筋芽細胞をインビトロで増殖させ、0.25 μCi/mlの[メチル-14C]チミジンの存在下、増殖用培地で16〜24時間培養してから、移植する。次いで、その放射標識した遺伝子操作雄性筋芽細胞を3500 rpmで5分間遠心分離し、15%ウマ血清に再懸濁し、4000 rpmで10分間遠心分離し、10 μlのハンクス平衡化塩溶液(HBSS)に再懸濁して、注射に備える。
【０４１８】
高度麻酔下の雌性C57BL10J系マウスの前脛骨筋(TA筋)に100万個の細胞を注射する。基本的には、静脈内カニューレを用いて、直径280ミクロンのポリエチレンプラスチック製チューブを、線維方向に平行になるように、筋肉に挿入する(El Fahime et al. 2000)。チューブの遠位末端を封鎖し、チューブの長手方向に2 mm間隔で4個の小穴を設ける。先端部が50 μmのガラス製マイクロピペット(Drummond Scientific Co.、Broomall, PA.)を用いて、細胞を、ポリエチレン製マイクロチューブの近位末端からゆっくりと注射する。遺伝子操作細胞の注射量は10 μlとするが、この量は以下の2つの条件を満たすものである。まず、この量は、組織の変形や膨潤を引き起こすことなく容易に注射可能であり、次に、マイクロチューブの容量(5 μl)より5 μl多いため、一部の細胞をチューブからすぐに追い出すことができる。無操作の対照筋芽細胞を対側のTA筋に注射する。
【０４１９】
これらのマウスのうち10匹の筋肉をただちに採取して、注射筋芽細胞数の100%値を設定する。これにより、細胞移入時の標識体喪失および試料中で起こりうるクエンチングを補正する。各処理群につき10匹のマウスを1、3、および5日後に屠殺する。TA筋を切除し、競合的PCRオリゴヌクレオチドを筋肉に添加してから、DNA抽出を行なう。シンチレーション計数により、14Cチミジン放射活性を細胞死の指標として測定する(Beauchamp et al. 1999; Skuk et al. 2002)。筋肉中の雄性細胞の存在量をリアルタイムPCRによって定量化する。上記競合的オリゴヌクレオチドをY染色体配列と同じプライマーを用いて増幅し、これを競合相手として用いて、定量結果を得る(Caron et al. 1999を参照されたい)。
【０４２０】
この一連の実験で、同じ試料における様々な時点での注射筋芽細胞の細胞死と生細胞の増殖が確認される。筋芽細胞の細胞死は、ゼロ時間で存在する放射活性に対する様々な時点での残留放射活性量の百分率で確認する。このマーカーは、増殖時に娘細胞に分配されるので、増殖の指標として使用できない。その代わり、生着した移植雄性筋芽細胞の増殖を、Y染色体の競合的PCRによって定量化する。宿主細胞はこの配列を欠失しているため、PCR産物の量は試料中の標的DNAのコピー数に比例し、生着して増殖する移植筋芽細胞の数と良好な相関を示すはずである。これらの結果を分散分析法によって評価して、細胞を様々な遺伝子による細胞の遺伝子操作が細胞のインビボにおける生着と増殖を向上させるかどうかを確認する。
【０４２１】
結果: 本発明者らのインビトロ試験に基づけば、Acheronを遮断すると、より多くの細胞をインビボで生着させ増殖させることができる。これは、対照と比較した遺伝子操作筋芽細胞中の14Cの保持量およびY染色体特異的DNAレベルの上昇の両方として見られる。これらの試験は、異所性細胞の生着の向上を図るAcheron標的化に関する機能検査法として最初のものである。
【０４２２】
実施例19: AcheronはAriadneやParkinと相互作用する
COS-1細胞を、1)c-mycタグ付きAriadneおよびFLAGタグ付きAcheron、または2)c-mycタグ付きParkinおよびFLAGタグ付きAcheronをコードするcDNA構築体で共形質移入した。48時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、室温で溶解した。試料を遠心分離にかけて清澄化し、抗c-mycモノクローナル抗体(クローン9e10モノクローナル)を加えた。試料を一夜保温した後、プロテインGセファロース(商標)4ファーストフロービーズを加えた。試料を室温で1時間振盪し、遠心分離し、PBSで2回洗った後、4〜15%のTris-HCLポリアクリルアミドゲル上で分画した。タンパク質をImmobilon Pに移し、Westernで1000倍希釈の抗フラッグM5モノクローナル抗体と反応させた。ParkinまたはAriadneの免疫沈降でもAcheronが沈降した。
【０４２３】
これらのデータから、AcheronはParkinとAriadneに結合するという仮説が裏付けられる。
【０４２４】
他の態様
以上、本発明について詳細な説明と合わせて説明したが、上記説明はあくまで説明を目的とするものであって、附属の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものでない。他の態様、長所、および変更も下記請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４２５】
（図１Ａ）Acheron cDNAとハイブリダイズしたマンデュカ・セクスタの体節間の筋肉(ISM)由来RNAのノーザンブロットの複製である。第17日目の動物をステロイドの20-ヒドロキシエクダイソン(20-HE) 25 μgで処理することにより、ISMの死滅の進行が妨げられている。d = 蛹から成虫までの発生の日数; hrs = 成虫出現後の時間。
（図１Ｂ）図1Aに示されるマンデュカ・セクスタの体節間の筋肉(ISM)由来RNAの同一ノーザンブロットを、ストリップし、添加(量)の対照として構成的に発現させたユビキチン-融合80 cDNA 23遺伝子で再プローブしたものの複製である。
（図１Ｃ）Acheron cDNAでプローブした第18日目の各蛾組織のノーザンブロットの複製である。ISM =体節間の筋肉; FM =飛翔筋; FB =脂肪体; MT = マルピーギ管; MAC = 男性器付属腺; OV =卵巣。
（図２）増殖用培地(GM)中で培養した、あるいは分化用培地中で1日間または2日間培養した対照細胞およびAcheron過剰発現細胞においてトリパンブルーアッセイにより測定した細胞死のレベルを示す棒グラフである。
（図３Ａ〜３Ｃ）空のベクター(3A)、Acheron (3B)またはtAcheron (3C)構築体を形質移入したC2C12細胞におけるMyoD(上段)およびMyf5(下段)タンパク質の時間的な発現様式を示す一連のウエスタンブロットの複製である。タンパク質試料をGM (G)中で培養した細胞、あるいはDM中で1日、2日または3日培養した細胞から回収した。各試料からタンパク質20 μgをウエスタンブロット用に解析した。図3BのレーンAがDM中で3日後のAcheron過剰発現細胞から回収した試料であり、浮遊していたアポトーシス細胞はPBS洗浄によって取り除いた。
（図３Ｄ）切断型Acheronを発現するC2C12筋芽細胞では異所性MyoDが発現されることを示すウエスタンブロットの複製である。付随の顕微鏡写真のMHC染色は、これらの細胞が筋管に分化することを実証している。
（図３Ｅおよび３Ｆ）DM中で3日後のtAch細胞(3E)およびtAch-MyoD共発現細胞(3F)におけるMHCのICC染色に関する一対の顕微鏡写真である。MyoDの強制発現(F)は、tAch (E)により阻害された分化をもとどおりにしている。
（図４Ａ〜４Ｄ）空のベクター(4A)、Acheron (4B)、切断型Acheron (tAch; 4C)またはアンチセンスAcheron (4D)を形質移入したC2C12細胞におけるBcl-2(上段)およびBax(中段)タンパク質の発現を解析している一連のウエスタンブロットの複製である。総タンパク質をGM (G)のものから、およびDM中で1日、2日、または3日間のものから回収した。下段はタンパク質の添加(量)に対する内部対照として、M56、つまり26Sプロテオソームのサブユニットで再プローブした同一ブロットを示す。
（図４Ｅ）Bcl-2/Bax発現の比率の定量解析の結果を示す棒グラフである。
（図５）C2C12細胞に対するAcheron異所性発現の効果のモデルに関する略図である。分化条件の下で、Acheronの過剰発現はMyf5の発現を減らし、Bcl-2の上方制御を抑制しアポトーシスを引き起こすが、それにより、細胞が分化を起こして筋管を形成することが可能になる。対照的に、ドミナントネガティブなAcheron、つまりtAchは、著しく増加した「補充」細胞集団および分化の低下をもたらす。
（図６）推定上のAcheronタンパク質構造の略図である。LA: Lupus抗原; RBD: RNA結合ドメイン; NLS: 核局在シグナル。Acheronタンパク質はLaタンパク質と構造的に関連しているが、しかし新たなサブファミリーを規定する。
（図７）ヒト胎児および成人組織ならびに代表的な腫瘍細胞系における相対的Acheron mRNAレベルを示す棒グラフである。このヒストグラムは、正規化されたmRNAドットブロットの放射線画像解析装置(ホスフォイメージャー)によるデンシトメトリー解析により得られた。
（図８）マンデュカAcheronのcDNA(配列番号:1)配列および推定されるアミノ酸(配列番号:2)配列を示す配列表である。このヌクレオチド配列には5'-UTRまたは翻訳開始コドンは含まれていない。終結シグナル(TAG)は1186位(太字下線)にあり、3'UTRは1061 bpからなっており、ポリアデニル化シグナルを2230位(下線)に有する。このタンパク質配列は一部であり、395アミノ酸からなっている。これにはLAドメイン(囲み)、Acheronモチーフ(濃い網掛け)および推定上の二分された核局在シグナル(薄い網掛け)が含まれている。RNA結合ドメイン(RBD)は破線で囲われている。354位の潜在的アミド化部位には二重線が引かれている。
（図９）ヒトAcheron (hAch)のcDNA配列(配列番号:3)および推定されるアミノ酸配列(配列番号:4)を示す配列表である。このヌクレオチド配列には恐らく切断された5'-UTR (70 bp)、Kozak共通配列(下線)内の翻訳開始コドン(太字の)、1474位の終結シグナル(太字下線)ならびにポリアデニル化シグナルおよびポリ(A+)部位(両方とも下線)を有する3'-UTRが含まれている。この読み取り枠は1473ヌクレオチド(配列番号:5)からなっており、491アミノ酸のタンパク質をコードする。Laドメインは囲われており、La-1、La-2およびLa-3モチーフには点線が引かれている。高度に保存されたAcheronモチーフは網掛けにされている(配列番号:11、12、および13)。非標準RNA結合ドメイン(配列番号:14)は破線で囲まれている。推定上の核局在シグナル(配列番号:16)には太線で下線が引かれており、推定上の核移行シグナルは太字斜体となっておりRBD内で下線が引かれている。推定上のアミド化部位(配列番号:15)には二重線が引かれている。3×SPリピートは二重に囲われている。エクソン連結部が示されている。
（図１０）ヒト(配列番号:4)、マウス(配列番号:7)、ハエ(配列番号:22)および蛾(配列番号:2)由来のAcheronタンパク質の配列アライメントである。保存アミノ酸残基は黒い囲みの濃淡で示されており、その一方、同類アミノ酸置換は灰色の囲みの濃淡で描かれている。AcheronモチーフI、II、およびIIIには下線が引かれている。LaモチーフI、II、IIIおよびRBD (RNA結合ドメイン)が示されている。キイロショウジョウバエ(D. melanogaster)のAcheronタンパク質は、N末端およびC末端が切断されている。最適なアライメントのために、ギャップが導入されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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