(57)【要約】本発明は、伝染性亜急性海綿状脳症の原因となるプリオンの病原性形状の検出方法であって、ＰｒＰｓｃを含み得る生体試料中に、遊離又は担体に結合した補助的大環状配位子（ＡＭＬ）を添加し、次に結果として生じた懸濁液を抗ＰｒＰｓｃ抗体と反応させ、かつＰｒＰの存在を検出することを特徴とする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰｒＰｓｃを含み得る生体試料中に、遊離又は担体に結合した補助的大環状配位子（ＡＭＬ）を添加し、次に結果として生じた懸濁液を抗ＰｒＰｓｃ抗体と反応させ、かつＰｒＰの存在を検出することを特徴とするＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項２】
ＡＭＬとの接触前又は接触後に、プロテイナーゼＫにより試料を処理する補足ステップを含むことを特徴とする請求項１に記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項３】
前記生体試料は、ヒトを含む動物に由来することを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項４】
前記試料は、組織又は生物学的流体、特に頭脊柱液又は血清であることを特徴とする請求項３に記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項５】
前記固体担体は、好ましくはＮＨＳ基又はＮＨ２基によって官能化され、かつ好ましくは磁気ボール又はマイクロプレートであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項６】
前記補助的大環状配位子は、ＰｒＰｓｃの抗体との結合部位の空間内の近い又は隣接する部位で結合されることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項７】
補助的大環状配位子は、メタシクロファン系、及び特にはカリックス−アレンから選択されることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項８】
好ましいカリックス−アレンは、フェノール面上で官能化されたパラ−スルホナト−カリックス−アレン、好ましくはｐ−スルホナト−カリックス−［４］−アレン、ｐ−スルホナト−カリックス−［６］−アレン、ｐ−スルホナト−カリックス−［８］−アレン、又はそれらの誘導体の１種であることを特徴とする請求項７に記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項９】
補助的大環状配位子は、下記一般式（Ｉ）
【化１】
2006510914.tif 000017
［式中、
Ｒ１は、水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基を表し、Ｒは、以下に定義する通りであり、
Ｒ２は、水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ、ＣＨ２Ｐｏｌ基（式中、Ｐｏｌは、リン酸、硫酸、アミン、アンモニウム、カルボン酸基を表し、かつＲは、以下に定義する通りである）を表し、
Ｒ３は、水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは、以下に定義する通りである）を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは、以下に定義する通りである）を表し、
Ｙは、炭素、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ５及びＲ６は、各々別個に、不在であるか、又は水素原子、ＣＨ２基又は以下に定義するようなＲを表すか、又は
Ｒ５及びＲ６は、共に酸素又は硫黄原子を表し、
Ｘは、ＣＨ２基、又は酸素若しくは硫黄原子を表し、
ｍは、０又は１に等しい整数を表し、
Ｒは、水素原子、又は飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状、ハロゲン基によって置換される又は置換されない、かつ極性又は非極性基を有する炭化水素鎖を表し、
ｎは、３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１からＲ５、Ｒ、Ｘ、Ｙ及び整数ｍは、モチーフに応じて異なる性質であり得る］に対応することを特徴とする請求項７又は８のいずれかに記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項１０】
前記補助的大環状配位子は、下記一般式（Ｉａ）
【化２】
2006510914.tif 000018
［式中、
別個に解釈される各Ｒ２基は、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ７は、（ＣＨ２）ｒ−Ｚ基（式中、Ｚは、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＮ又はＮＨ２基である）であり、
ｒは、１〜２０の整数であり、
ｐは、１〜１０の整数であり、
ｎは、２〜１０の整数である］に対応することを特徴とする請求項９に記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項１１】
前記配位子は、下記一般式（Ｉｂ）
【化３】
2006510914.tif 000019
［式中、
ｎは、４〜８の整数であり、
別個に解釈される各Ｒ２基は、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ８は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは、０〜６の整数であり、かつｓは、０〜６の整数である）を表す］に対応することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記配位子は、式（Ｉｂ）（式中、２個のＲ２基は、各々硫酸基であり、ｎは、４、６又は８であり、かつＲ８は、水素原子、ＣＨ２ＣＯＯＨ基、ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基である）カリックス−アレンであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記配位子は、２個のＲ２基が、各々硫酸基であり、ｎが、６に等しい整数であり、かつＲ８が、（ＣＨ２）２−ＮＨ２基であるようになっていることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記カリックスアレンが、特にＮＨＳ又はＮＨ２基によって官能化される担体に結合されることを特徴とする請求項７から１２のいずれかに記載のＰｒＰ、及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項１５】
配位子は、式（Ｉｂ）
【化４】
2006510914.tif 000020
［式中、ｎは、４〜８の整数であり、
別個に解釈される各Ｒ２基は、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ８は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは、０〜６の整数であり、かつｓは、０〜６の整数である）を表し、
かつ担体は、好ましくはＮＨＳ基又はＮＨ２基によって官能化される固体担体タイプであり、かつ好ましくは磁気ボール又はマイクロプレートである］に対応する、官能化した担体上にグラフトされる補助的大環状配位子。
【請求項１６】
生理的又は病原性、ウシ又はヒト又はその他の種のＰｒＰ、組換えＰｒＰ、ＰｒＰｓｃを生体試料、特に生物学的流体中で検出するための組成物を製造するための補助的大環状配位子、及び特には遊離又は担体に結合した、請求項９、１０及び１５に定義するような、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の配位子の使用。
【請求項１７】
ＢＳＥ、小型反芻動物の振戦病、クロイツフェルト・ヤコブタイプの、ＰｒＰｓｃが原因となる疾患の診断キットであって、補助的大環状配位子、及び特には遊離又は担体に結合した、請求項９、１０及び１５に定義するような、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の配位子を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
ＰｒＰｓｃの免疫学的定量キットであって、補助的大環状配位子、及び特には遊離又は担体に結合した、請求項９、１０及び１５に定義するような、式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の配位子を含むことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝染性亜急性海綿状脳症の原因となるプリオンの病原性形状の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰｒＰ又は細胞プリオン蛋白に関してＰｒＰｃと示される天然又は正常プリオン蛋白は、哺乳動物のリンパ系及びニューロン細胞中で広く発現する糖タンパクである。
【０００３】
ＰｒＰｃの構造変化は、プロテイナーゼＫに耐性を有する病原性ＰｒＰｓｃ蛋白の出現及び増殖に至らせる。この病原性蛋白は、ＰｒＰｓｃ又はＰｒＰｒｅｓと区別なく呼ぶことができる。動物器官中にＰｒＰｓｃが蓄積することは、多数の疾病、特に小型反芻動物の振戦病、大鹿及び羚羊の慢性消耗病（又はｃｈｒｏｎｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ「ＣＷＤ」）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）及びヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の原因である。
【０００４】
ＢＳＥに感染した家畜において、２〜６年の潜伏期後に遅発出現すること、及び症状発展が遅いことにより、疫学的モデルの発展は、著しく遅れた。ＢＳＥは、摂取によってヒトに伝染可能であり、かつクロイツフェルト・ヤコブ病の新規な形状（ｖＣＪＤ）の出現に至らせた。
【０００５】
病原性ＰｒＰｓｃ蛋白の検出は、感染した健康な動物において、疾病の発展前には困難であり、かつ特に病気の動物において血液及び尿中では困難である。現在のところ、ヒトの食料用の動物において存在するＰｒＰｓｃは、感染した組織の摂取時にヒトに伝染することが明らかである。従って公衆衛生の主要な目標は、
−  ヒトの消費用の動物を食物連鎖から取り出すために、ヒトの消費用の動物において、
−  ヒトにおける輸血用の献血及び血液製剤で。実際、脳発作の遥か以前の、かつそれ故に臨床的に宣言されるプリオンの疾患を想起させる神経徴候が現れる可能性の遥か以前の、血液及びリンパ液中の病原性ＰｒＰｓｃ蛋白の存在が示すように、ヒトにおける生理病理学は、知られておらず、かつヒツジのように実験感染ができないので、血液及びその他の生物学的流体中の検出テストが無いことのため、それを研究すること、及びそれ故に献血によるヒト間伝染を予防すること、又は脳損傷が始まる前に感染者を治療することが可能にならない；かつ
−  屠殺場に到着する前に、感染した動物を早期に除去することを可能にする、神経段階以前に動物の群においてＰｒＰｓｃの存在を検出して、この伝染を回避することである。
【０００６】
従って、生体試料又は動物におけるＰｒＰｓｃの存在検出は、極めて重要になっており、幾つもの研究者チームが、免疫学的検出方法を発展させている（国際公開第０２／０８６５１１号パンフレット）。その上、ｖＣＪＤ治療のためにペプチド、小分子又は阻害物質のＰｒＰｓｃでの複合体生成方法が、活発な研究の対象となっている。しかしながら、先行技術の方法は、ＰｒＰｓｃが、生体試料中で、かつ特に生物学的流体中で少量である時、ＰｒＰｓｃを信頼に値するように同定するという困難な問題に絶えず遭う。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、ＰｒＰ及び特にＰｒＰｓｃ蛋白を、現在使用される方法を以っては検出可能でない希釈物で検出することを可能にする方法を対象とし、この検出は、発明者がテストした１１９件の試料に対して１００％の信頼性である。好適には、本発明による方法は、ＰｒＰｓｃ検出を因子４（ｆａｃｔｅｕｒ  ４）だけ増幅することを可能にする。
【０００８】
より正確には、本発明は、ＰｒＰを含み得る生体試料中に、遊離又は担体に結合した補助的大環状配位子（ＡＭＬ）を添加し、次に結果として生じた懸濁液を抗ＰｒＰ抗体と反応させ、次にＰｒＰの存在を同定することを特徴とするＰｒＰ及び特にはＰｒＰｓｃの検出方法を対象とする。
【０００９】
担体への大環状配位子の結合は、吸着又は共有結合によるような、当業者に公知であるように行われ得るが、別名グラフトと呼ばれる共有結合が好まれる。
【００１０】
ＰｒＰｓｃを検出することを試みる際に、本発明は、ＡＭＬとの接触前又は接触後に、プロテイナーゼＫにより試料を処理する補足ステップを同様に含み得る。
【００１１】
ＰｒＰの存在は、当業者に公知であるあらゆる方法、かつ特にサンドイッチ法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、免疫マイクロカンチレバー（ｉｍｍｕｎｏ  ｍｉｃｒｏ−ｃａｎｔｉｌｅｖｅｒ）検出、質量分析法又は光学及び分光分析によって、抗ＰｒＰ／ＰｒＰ抗体反応の検出により利用され得る。ＡＭＬ−ＰｒＰ複合体の同定は、走査型反射顕微鏡、近視野走査型顕微鏡、又は共焦点走査型顕微鏡のようなプロフィロメトリ走査技術（ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｄｅ  ｂａｌａｙａｇｅ  ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｒｉｑｕｅ）によって行われる。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様によれば、生体試料は、ヒトを含む動物に由来する。好ましくは、この試料は、脳、中枢神経系組織、又は器官及び特に脾臓又は腸に由来する。本発明の好ましい実施態様によれば、この試料は、生物学的流体、特に頭脊柱液又は血清である。
【００１３】
大環状配位子とは、ＰｒＰ、及び特にＰｒＰｓｃに結合されることが可能であり、かつマクロサイクルを形成する一連のサイクルからなる化合物を意味する。大環状配位子は、当業者に公知である。非限定的な例として、シクロファン、メタシクロファン、シクロデキストリン、シクロ（テトラ−クロモトロープ酸）、スフェランド及びシクロ［ｎ］ベラトリレンを挙げることができる。
【００１４】
好適には、補助的大環状配位子は、抗体との結合部位の空間内の近い又は隣接する部位で結合されることが可能であり、かつＰｒＰｓｃ抗体結合を増加させることを作用とする。
【００１５】
好適には、補助的大環状配位子は、メタシクロファン系から選択される。メタシクロファンの中では、フェノール面上で官能化されたパラ−スルホナト−カリックス−アレンが特に好適である。これらの化合物は、Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｃｈｅｍ  １、（２００１）、１３５−１３８に記載された方法論に従って得ることができる。
【００１６】
好適には、補助的大環状配位子は、下記一般式（Ｉ）
【００１７】
【化５】
2006510914.tif 000002
【００１８】
［式中、
Ｒ１は、水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基を表し、Ｒは、以下に定義する通りであり、
Ｒ２は、水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ、ＣＨ２Ｐｏｌ基（式中、Ｐｏｌは、リン酸、硫酸、アミン、アンモニウム、カルボン酸基を表し、かつＲは、以下に定義する通りである）を表し、
Ｒ３は、水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは、以下に定義する通りである）を表し、
Ｒ４は、水素原子、水酸基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基（式中、Ｒは、以下に定義する通りである）を表し、
Ｙは、炭素、窒素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ５及びＲ６は、各々別個に、不在であるか、又は水素原子、ＣＨ２基又は以下に定義する通りのＲを表すか、又は
Ｒ５及びＲ６は、共に酸素又は硫黄原子を表し、
Ｘは、ＣＨ２基、又は酸素若しくは硫黄原子を表し、
ｍは、０又は１に等しい整数を表し、
Ｒは、水素原子、又は飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状、ハロゲン基によって置換される又は置換されない、かつ極性又は非極性基を有する炭化水素鎖を表し、
ｎは、３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１からＲ５、Ｒ、Ｘ、Ｙ及び整数ｍは、モチーフに応じて異なる性質であり得る］に対応する。
【００１９】
このように、式（Ｉ）の化合物は、１個のベンゼン環の存在を特徴とする一連のｎのモチーフの形状を呈し、かつこの環の置換基は、上記定義の限度内で、モチーフによって可変であり得る。
【００２０】
大環状配位子は、当業者に公知の、例えばＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９６に記載された技術により調製され得る。
【００２１】
飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状、ハロゲン基によって置換される又は置換されない、かつ極性又は非極性基を有する炭化水素鎖は、当業者に広く知られている。例として、アルキル、アルケン、アリール、及びシクロヘキサンのような飽和環を挙げることができる。非極性基の一例は、ＣＦ３であり、極性基の例は、上記に定義したような置換基Ｐｏｌである。
【００２２】
本発明の特殊な実施態様によれば、補助的大環状配位子は、上記一般式（Ｉ）に、かつ更に正確には下記一般式（Ｉａ）
【００２３】
【化６】
2006510914.tif 000003
【００２４】
［式中、
別個に解釈される各Ｒ２基は、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ７は、（ＣＨ２）ｒ−Ｚ基（式中、Ｚは、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯＨ、ＣＮ又はＮＨ２基である）であり、
ｒは、１〜２０の整数であり、
ｐは、１〜１０の整数であり、
ｎは、２〜１０の整数である］に対応する。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、補助的大環状配位子は、ｐ−スルホナト−カリックス−［４］−アレン、ｐ−スルホナト−カリックス−［６］−アレン、ｐ−スルホナト−カリックス−［８］−アレン、又はそれらの誘導体の１種である。
【００２６】
本発明の第２の実施態様によれば、補助的大環状配位子は、上記一般式（Ｉ）に、かつ更に正確には下記一般式（Ｉｂ）
【００２７】
【化７】
2006510914.tif 000004
【００２８】
［式中、ｎは、４〜８の整数であり、
別個に解釈される各Ｒ２基は、硫酸基又はリン酸基であり、
Ｒ８は、（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基（式中、ｔは、０〜６の整数であり、かつｓは、０〜６の整数である）を表す］に対応する。
【００２９】
好適には、式（Ｉｂ）のカリックス−アレンは、２個のＲ２基が、各々硫酸基であり、ｎが、４、６又は８であり、かつＲ８が、水素原子、ＣＨ２ＣＯＯＨ基、ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又はＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基であるようになっている。
【００３０】
好ましくは、式（Ｉｂ）のカリックス−アレンは、２個のＲ２基が、各々硫酸基であり、ｎが、６に等しい整数であり、かつＲ７が、（ＣＨ２）２−ＮＨ２基であるようになっている。
【００３１】
本発明の特殊な実施態様によれば、本発明の配位子は、固体担体上にグラフトされる。この担体は、配位子によって担持される官能基との結合を形成する可能性がある官能基によって官能化される。好ましい実施態様によれば、固体担体は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）結合又はＮＨ２基によって官能化される。この官能基は、配位子上に担持される官能基と反応し得る。この実施態様において、固体担体の官能基結合との結合を形成するために反応する可能性がある官能基を担持するカリックス−アレン、特にＮＨ２又はＣＯＯＨ結合を担持するカリックス−アレンが、特に好ましい。
【００３２】
本発明は、配位子が、上記に定義したような式（Ｉｂ）（式中、ｎは、４〜８の整数である）に対応し、かつ担体が、好ましくはＮＨＳ基又はＮＨ２基によって官能化される固体担体タイプであり、かつ好ましくは磁気ボール又はマイクロプレートである、官能化した担体上にグラフトされる補助的大環状配位子も同様に対象とする。かかるグラフトは、蛋白及び配位子間の後続の相互作用、並びに抗ＰｒＰ抗体による検出用のエピトート（ｅｐｉｔｏｔｅ）の立体化学的外観を保護し、担体上でグラフトによる標的となる部位は、ＰｒＰとの相互作用に役立つ部位と異なる。
【００３３】
本発明のもう一つの実施態様によれば、前記補助的大環状配位子は、シクロデキストリン系、及び特には一般式（ＩＩ）
【００３４】
【化８】
2006510914.tif 000005
【００３５】
（式中、
Ｒ９は、水素原子、又はＣＨ２、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＲ、ＣＨ２Ｐｏｌ、ＯＣＨ２Ｒ、ＳＲ、ＮＲ基を表し、Ｐｏｌ及びＲは、以下に定義し、
Ｒ１０及びＲ１１は、各々別個に、水素原子、又はＣＨ２、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＲ、ＣＨ２Ｐｏｌ、ＯＣＨ２Ｒ基を表し、Ｐｏｌ及びＲは、以下に定義し、
Ｐｏｌは、リン酸、硫酸、アミン、アンモニウム、又はカルボン酸基を表し、
Ｒは、飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状、ハロゲン基によって置換される又は置換されない、かつ極性又は非極性基を有する炭化水素鎖を表し、
ｎは、６〜８の整数であり、
置換基Ｒ９からＲ１１は、モチーフに応じて異なる性質であり得る）に対応するシクロデキストリン系から選択される。このように、式（ＩＩ）の化合物は、１個の環の存在を特徴とする一連のｎのモチーフの形状を呈し、かつこの環の置換基は、上記定義の限度内で、モチーフによって可変であり得る。
【００３６】
本発明の実施応用例によれば、前記補助的大環状配位子は、シクロ−テトラ−クロモトロープ酸系、及び特には一般式（ＩＩＩ）
【００３７】
【化９】
2006510914.tif 000006
【００３８】
（式中、
Ｒ１２及びＲ１３は、各々別個に、水素原子、又は以下に定義するようなＲ若しくはＰｏｌ基を表し、
Ｒ１４及びＲ１５は、各々別個に、水素原子、ＣＨ２基、又は以下に定義するようなＲ基を表すか、又は
Ｒ１４及びＲ１５は、共に酸素又は硫黄原子を表し、
Ｒ１６及びＲ１７は、各々別個に、水素原子、又は水酸基、又はＯＲ、ＯＣＨ２Ｒ、ＯＣＯＲ、ＳＲ、ＳＣＨ２Ｒ、ＳＣＯＲ基を表し、Ｒは、以下に定義する通りであり、
Ｍは、水素原子、又はＮａ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃｓ、Ｒｂ、Ｍｇ及びＣａから選択される原子を表し、
Ｐｏｌは、リン酸、硫酸、アミン、アンモニウム、又はカルボン酸基を表し、
Ｒは、飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状、ハロゲン基によって置換される又は置換されない、かつ極性又は非極性基を有する炭化水素鎖を表し、
ｎは、３〜１５の整数であり、
置換基Ｒ１２からＲ１７、Ｍ、Ｐｏｌ、及びＲは、モチーフに応じて異なる性質であり得る）に対応するシクロ−テトラ−クロモトロープ酸系から選択される。このように、式（ＩＩＩ）の化合物は、１個の環の存在を特徴とする一連のｎのモチーフの形状を呈し、かつこの環の置換基は、上記定義の限度内で、モチーフによって可変であり得る。
【００３９】
本発明のもう一つの実施態様によれば、前記補助的大環状配位子は、一般式（ＩＶ）
【００４０】
【化１０】
2006510914.tif 000007
【００４１】
（式中、
Ｒ１８は、水素原子、又はＣＨ２、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＲ、ＣＨ２Ｐｏｌ、ＯＣＨ２Ｒ、ＳＲ、ＮＲ基を表し、Ｐｏｌ及びＲは、以下に定義し、
Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、各々別個に、水素原子、又はＣＨ２、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＣＯＲ、ＣＨ２Ｐｏｌ、ＯＣＨ２Ｒ基を表し、Ｐｏｌ及びＲは、以下に定義し、
Ｐｏｌは、リン酸、硫酸、アミン、アンモニウム、又はカルボン酸基を表し、
Ｒは、飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状、ハロゲン基によって置換される又は置換されない、かつ極性又は非極性基を有する炭化水素鎖を表し、
ｎは、１〜１０の整数であり、
置換基Ｒ１８からＲ２２、Ｒ、Ｐｏｌ、及びＲは、モチーフに応じて異なる性質であり得る）に対応するシクロ［ｎ］ベラトリレン系から選択される。このように、式（ＩＶ）の化合物は、１個の環の存在を特徴とする一連のｎのモチーフの形状を呈し、かつこの環の置換基は、上記定義の限度内で、モチーフによって可変であり得る。
【００４２】
本発明のもう一つの対象は、生体試料中でプリオンＰｒＰｓｃを検出するための補助的大環状配位子（ＡＭＬ）、及び特には遊離又は担体に結合した上記式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の配位子の使用にある。
【００４３】
本発明は、ＢＳＥ、小型反芻動物の振戦病、クロイツフェルト・ヤコブタイプの、ＰｒＰｓｃが原因となる疾患の診断キットであって、補助的大環状配位子、及び特には遊離又は担体に結合した上記式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の配位子の使用を含むことを特徴とするキットも同様に対象とする。
【００４４】
本発明は、ＰｒＰｓｃの免疫学的定量キットであって、補助的大環状配位子、及び特には遊離又は担体に結合した上記式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）の配位子の使用を含むことを特徴とするキットも同様に対象とする。
【００４５】
本発明のその他の利点及び特性は、生体試料が、遊離又はグラフトした補助的大環状配位子の存在下に置かれる際の、ＰｒＰｓｃの検出増幅に関する、以下に続く実施例を読めば、現れるであろう。
【００４６】
これらの実施例において、添付図面を参照する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
実施例１：補助的大環状配位子の調製
【００４８】
１．１  ｐ−スルホナト−３，７−（２−カルボキシ−メトキシ）−カリックス−［６］−アレン（ＡＭＬ１と名付ける）の調製
【００４９】
この補助的大環状配位子ＡＭＬ１は、一般式（Ｖ）を有する：
【００５０】
【化１１】
2006510914.tif 000008
【００５１】
この配位子は、次のように合成する：１当量の塩基（Ｋ２ＣＯ３）の存在下でのアセトニトリル中のカリックス［６］アレンの懸濁液を、還流で攪拌する。３０分後、０．５当量のアルキル化剤（ブロモ酢酸エチル）を、還流で、かつ攪拌して２４時間維持する反応混合物中に添加する。懸濁液の冷却後、溶剤を減圧下で蒸発させ、かつ結果として生じた固体を、２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、かつ塩酸溶液（１Ｍ）により２回、かつ脱塩水により１回洗浄する。硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）上で乾燥させた後、有機溶剤を減圧下で蒸発させ、かつ白色粉末を得ることが可能になる。それを、シリカクロマトグラフカラム上で精製する（溶出剤：ＣＨ２Ｃｌ２：ヘキサン；４：１）。精製した生成物を、１Ｈ、１３ＣのＮＭＲ及びエレクトロスプレー質量分析で分析する。カルボン酸エステルの鹸化は、２４時間、周囲温度で攪拌して、水：エタノール（３０：７０）混合物中で、溶解水酸化カリウムによって行う。形成された沈殿物を濾過し、次に５０ｍＬの塩酸（１Ｍ）及び５０ｍＬの水で洗浄し、次にシリカクロマトグラフカラム上で精製し（溶出剤  クロロホルム：メタノール：酢酸；９５：５：０．１％）、かつ溶剤の蒸発後に白色かつ結晶質の固体を得ることが可能になる。この生成物を、１Ｈ、１３ＣのＮＭＲ及びエレクトロスプレー質量分析で分析する。スルホン化は、２４時間、５０℃で硫酸を用いた処理によって行われる。生成物を、エーテルにより沈殿させ、かつ白色の結晶質粉末の形状でＡＭＬ１を得ることが可能になる。
【００５２】
１．２  ｐ−スルホナト−３，７−（２−アミノ−エチルオキシ）−カリックス−［６］−アレン（Ｃ６Ｓと名付ける）の調製
【００５３】
この補助的大環状配位子Ｃ６Ｓは、一般式（ＶＩ）を有する：
【００５４】
【化１２】
2006510914.tif 000009
【００５５】
この配位子は、Ｅｒｉｃ  Ｄａ  Ｓｉｌｖａ及びＡｎｔｈｏｎｙ  Ｗ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐ−ｓｕｌｐｈｏｎａｔｏ−ｃａｌｉｘ−［ｎ］−ａｒｅｎｅ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５９（２００３）７３５７−７３６４に記載された方法により調製される。
【００５６】
１．３  プレート及びボール上の配位子Ｃ６Ｓのグラフト
【００５７】
この配位子は、活性化表面を担持する固体担体（ボール又はプレート）と結合する。
【００５８】
プレート上のグラフト：
９６ウェルのプレート「ＮＨＳ活性化プレート」は、Ｃｏｖａｌａｂ社（フランス、リヨン）に由来する。１００μＬの配位子溶液を、リン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ８．２中で様々な濃度で溶解させる。ウェルは、３７℃での２時間のインキュベーション後、ＭｉｌｌｉＱ水で３回（３×２００μＬ）洗浄する。プレートは、その使用前に周囲温度で乾燥させる。
【００５９】
グラフトの概要：
【００６０】
【化１３】
2006510914.tif 000010
【００６１】
幾つかのプレートが様々な配位子Ｃ６Ｓ濃度で作られた。これらのプレートは、明細書全体で「プレートＣ６Ｓ」と定義する。
【００６２】
ボール上のグラフト：
４ｍＬの活性化ＮＨＳボール溶液（２×１０９ボール／ｍＬ；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ２７０Ａｍｉｎｅ、Ｄｙｎａｌｓ社、ノルウェー）を、１ｍＬの管で分取する。ボールを遠心分離し、かつ磁化によって沈殿させる。上清を取り除き、かつボールを１ｍＬの水で３回洗浄する。ボールの残渣を、リン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ８．２中で様々な量のカリックスアレン溶液により取る。５０ｍｇ／ｍＬ（リン酸緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ８．２）での６００μＬ、１２０μＬ、６０μＬ、及び１２μＬの配位子溶液を添加する。ボールを、周囲温度で２４時間、攪拌する。反応しなかった配位子を除去するために、ボールをＭｉｌｌｉＱ  １８Ω水で３回洗浄する。２×１０９ボール／ｍＬの最初の濃度を復元するために、ボールを、１ｍＬの水中に保存する。ボールの溶液は、すぐに使用できる。これらのボールは、明細書全体で「ボールＣ６Ｓ」と定義する。
【００６３】
ボール上のＣ６Ｓのグラフトの概略：
【００６４】
【化１４】
2006510914.tif 000011
【００６５】
１．４  改質鉱物表面上のＡＭＬ１のグラフト
【００６６】
１ｍＬの３−アミノプロピルトリ−メトキシシラン（ＡＢＣＲ社）を、５分間、５０ｍＬの溶液（９５％のエタノール及び５％のＨ２Ｏ）中で溶解させる。シリコンプレートを、攪拌して４分間、この溶液中に浸す。シリコンプレートをエタノールですすぎ、次にプレートを１５分間、１３０℃で乾燥させる。結合剤（ＤＣＣ／ＨＯＢＴ）を使用して、ＤＭＳＯ中の１０μＬの溶解ＡＭＬ１、０．１Ｍを、改質シリコンプレート上に結合した。試料は、２３℃で１２時間、乾燥させた。
【００６７】
結合の概要：
【００６８】
【化１５】
2006510914.tif 000012
【００６９】
実施例２：固体担体に結合されないＡＭＬ１を使用した、ＰｒＰの検出
【００７０】
２．１  試料の調製
【００７１】
図１及び２の実施例の実施に役立った試料は、次のように調製した：
【００７２】
ＡＭＬ無しの試料：１０重量％／容量で懸濁液を得るために、０．５ｇの脳組織を４．５ｍＬのブドウ糖溶液５％中で破砕する。（１０ｍｇの脳に等しい）５％のブドウ糖中の１００μｌの１０％の脳ホモジェネートに関して、１０μｌ中の１μｇのプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を添加する。溶液は、渦巻き状にし、かつもう１時間、３７℃でインキュベートする。１００μｌのＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加した後、１００℃で５分間、加熱し、５分間１２０００Ｇで遠心分離し、かつ上清をＳＤＳ  ＰＡＧＥに対し遊走させるために回収する。
【００７３】
ＡＭＬ有りの試料：１０重量％／容量で懸濁液を得るために、０．５ｇの脳組織を４．５ｍＬのブドウ糖溶液５％中で破砕する。（１０ｍｇの脳に等しい）５％のブドウ糖中の１００μｌの１０％の脳ホモジェネートに関して、１μｌのＡＭＬ、０．１Ｍを添加する。３７℃で１時間後、１０μｌ中の１．５μｇのプロテイナーゼＫ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を添加する。溶液は、渦巻き状にし、かつもう１時間、３７℃でインキュベートする。１００μｌのＬａｅｍｍｌｉの変性緩衝液を添加した後、１００℃で５分間、加熱し、５分間１２０００Ｇで遠心分離し、かつ上清をＳＤＳ  ＰＡＧＥに対し遊走させるために回収する。
【００７４】
２．２  免疫ブロットによる検出方法
【００７５】
Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０）、６８０−６８５で記載されたように、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）の存在下で１５％のポリアクリルアミドの一次元電気泳動ゲルに対する遊走後、蛋白は、ニトロセルロース膜上に電気泳動によって転移し、かつアミノ酸１２６−１６０からなる特異エピトープを認識するモノクローナル抗体により、６０分間、周囲温度で免疫ブロットされる。二次抗体（１／５０００）は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ）と結合したマウスの免疫グロブリンの重及び軽鎖に向けられるヤギ抗体である。
【００７６】
ブロットは次に洗浄され、かつ信号が、フィルム（Ｂｉｏｍｅｘ  ｌｉｇｈｔ、Ｋｏｄａｋ）上にＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によるか、ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ）、及びＦｌｕｏｒ  Ｓ．Ｍｕｌｔｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上の視覚化による化学発光で検出される。
【００７７】
図１は、ＡＭＬ１の無い同じ蛋白の検出と比較して、本発明の方法が実施される際にプリオンの検出が少なくとも４倍に増幅されることを示す比較例である。ＡＭＬ１が無い場合、１／８を超える希釈に関していかなるＰｒＰｓｃも検出されない。ＡＭＬの存在下で、同じ試料中のＰｒＰｓｃ検出は、１／３２の希釈まで可能である。図２の結果は、検出を示す。
【００７８】
２．３  顕微鏡検査の結果
【００７９】
図３及び４で報告した走査型プローブ顕微鏡での実験に供した試料は、次のように調製した：
【００８０】
補助的大環状配位子のみを含む試料：補助的大環状配位子（５０ｍＭ）を含む試料を、新たに分割した雲母上のそれぞれ１０μｌのＡＭＬ溶液及び１０μｌの水の沈殿によって調製し、かつ３７℃で２４時間の乾燥させる。
【００８１】
組換えＰｒＰ蛋白（ｒｅｃＰｒＰ）のみを含む試料：ｒｅｃＰｒＰ（５０ｍＭ）を含む試料を、新たに切断した雲母上のそれぞれ１／１０（ｖ／ｖ）のＡＭＬ１／ｒｅｃＰｒＰ、１／１００（ｖ／ｖ）のＡＭＬ１／ｒｅｃＰｒＰ、及び１／１０００（ｖ／ｖ）のＡＭＬ１／ｒｅｃＰｒＰの１０μｌの溶液及び１０μｌの水の沈殿によって調製し、かつ３７℃で２４時間の乾燥させる。
【００８２】
補助的大環状配位子及びｒｅｃＰｒＰを同時に含む試料：１）補助的大環状配位子及びｒｅｃＰｒＰを同時に含む試料は、新たに分割した雲母上のそれぞれ１μｌのＡＭＬ溶液及び１０００μｌのｒｅｃＰｒＰの沈殿によって調製し、かつ３７℃で２４時間の乾燥させる；２）補助的大環状配位子（ＡＭＬ１）及びｒｅｃＰｒＰを同時に含む試料は、新たに切断した雲母上のそれぞれ１μｌのＡＭＬ溶液及び１００μｌのｒｅｃＰｒＰの沈殿によって調製し、かつ３７℃で２４時間の乾燥させる；３）補助的大環状配位子及びｒｅｃＰｒＰを同時に含む試料は、新たに切断した雲母上のそれぞれ１μｌのＡＭＬ溶液及び１０μｌのｒｅｃＰｒＰの沈殿によって調製し、かつ３７℃で２４時間の乾燥させる。
【００８３】
非接触モードで、三脚スキャナ１００μｍを備えた、１Ｈｚの走査周波数のシリコーンプローブを有する、高い共振周波数（Ｆ０＝３２０ｋＨｚ）のピラミッド型カンチレバーを使用するＴｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＡＦＭを用いた映像技術による分析を行う。映像処理は、ソフトウェアＳＰＭｌａｂ  ５．１によって行い、かつフィルタをかけずに示す。
【００８４】
図３及び４から、ｒｅｃＰｒＰの映像のみが、特徴を示す円形凝集体の構造を示しているということになる。ＡＭＬの存在下で、ｒｅｃＰｒＰに関して観察した構造は、順次改質され、ＡＭＬ量の増加関数であり、かつ丸いモチーフ及び場合により直交結晶子を示す。補助的大環状配位子のみ（ＡＭＬ１）の画像は、ｒｅｃＰｒＰ−ＡＭＬのフィルムのモチーフと似通っているが、より小さい構造を示す。
【００８５】
その他の実験が、原子間力顕微鏡によって行われた。
【００８６】
粗度の表面分析による後続の分析を、表Ｉに示す。これらの粗度測定の使用は、プロフィロメトリ分析技術に広げられ得る。
【００８７】
【表１】
2006510914.tif 000013
【００８８】
【数１】
2006510914.tif 000014
【００８９】
【数２】
2006510914.tif 000015
【００９０】
【数３】
2006510914.tif 000016
【００９１】
計算した粗度値は、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＳＰＭＬ  ５．０１のソフトウェアによって得られる。平均粗度Ｒａは、高さ偏差の算術平均として定義され（式Ａ）、粗度二乗平均（ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ  ＲＭＳ）は、画像の平均値への点からの距離の二乗の平均値の平方根（式Ｂ）及び試料の平均高さ（式Ｃ）として定義される。
【００９２】
実施例３：固体担体にグラフトされたＣ６Ｓを使用した、組換えＰｒＰの検出
【００９３】
３．１  プレート上のウシ組換えＰｒＰの検出
【００９４】
ａ）手順
この実験で使用する手順は、従来のＥＬＩＳＡにおいて行われる手順を真似る。
【００９５】
実施例１により、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）のグラフトは、ＰＢＳ溶液５０ｍＭ（リン酸緩衝食塩水）中で希釈された、広い段階のスルホン化カリックス−６−アレン（Ｃ６Ｓ）により６時間、行われる。次にＰＢＳＴ（ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ）溶液（０．０５％、乳５％）によって飽和する前に、プレートを周囲温度で１時間蒸留水ですすぐ。すすぎ後、ＰＢＳＴ０．０５％中で０．２５μｇ／ｍｌの濃度で希釈されたウシ組換えプリオン蛋白（ＰｒＰ）が沈殿する。それを周囲温度で１時間インキュベートする。プレートを、再び３回すすぐ。次にそれをＰＢＳＴ０．０５％中で０．５μｇ／ｍｌの濃度で希釈されたペルオキシダーゼでマークされる抗ＰｒＰ抗体溶液によって周囲温度で１時間インキュベートする。使用する抗体は、ヒトＰｒＰのアミノ酸１４５−１５４によって定義される領域、及び動物ＰｒＰの相同的領域を認識する（ＡＣ２３）。最後に、新規なサイクルのすすぎの後、顕色剤（ｒｅｖｅｌａｔｅｕｒ）、光を避けて周囲温度で１０分間インキュベートしたＯＰＤ（オルト−フェニレンジアミン）溶液を添加する。反応は、Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて停止させる。得られた信号の読み取りは、４９５ｎｍの分光光度計を用いて行う。
【００９６】
ｂ）結果
結果は、縦座標で測定された光学濃度値（ＤＯ）が、Ｃ６Ｓによって捕獲され、かつ洗浄後に引っ掛かったままであるＰｒＰ量を反映することを示す図５に示す。様々なグラフトに関して得られた信号は、ウシ組換えＰｒＰが、Ｃ６Ｓによって大いに捕獲されることを示す。ウシ組換えＰｒＰは、ＮＨＳプレート上にグラフトされたＣ６Ｓに固定される。
【００９７】
３．２  ボール上のヒト組換えＰｒＰの検出
【００９８】
ａ）実験条件：
実施例１により、ＮＨＳボールを、Ｃ６Ｓのボール上へのグラフトのために、蒸留水中で希釈されたＣ６Ｓ溶液と最初に接触させる。この期間後、ボールを蒸留水で、次にＰＢＳＴ０．０５％で洗浄する。ＰＢＳＴ０．０５％中で、０．２５μｇ／ｍｌに定量したヒト組換えＰｒＰ溶液を、並行して調製する。次に１００μｌのＰｒＰ溶液に対して、それぞれ：０；０．１；１；５及び１０μｌのボール溶液の添加によって、広い段階のＣ６Ｓボールを製作する。インキュベーションは、３７℃で１時間続き、次にボールを磁化により上清から分離する。ボールに固定されたＰｒＰは、ＥＬＩＳＡ法に近いサンドイッチ法によりマークされる抗体を用いて直接定量する。
【００９９】
ペルオキシダーゼでマークされる顕色抗体を、ＰＢＳＴ溶液０．０５％によるボールの洗浄後、３７℃で１時間インキュベートする。再び洗浄され、次に１０分間インキュベートされるＯＰＤ溶液によって顕色される前に、ボールを磁化により上清から分離する。反応は、Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて停止させる。用いた顕色抗体は、８Ｄ１１Ｇ１２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、フランス）である。
【０１００】
得られた信号の読み取りは、４９５ｎｍの分光光度計を用いて行う。
【０１０１】
ｂ）結果
ボール上の顕色結果は、図６に示し、かつＣ６Ｓが、ＮＨＳ担体上で官能基が損失せず、正確にグラフトされ、様々な種の組換えＰｒＰの捕獲特性をとりわけ保っており、かつこの蛋白の特異抗体によって得られる信号を再現可能に増幅しさえすることを示している。
【０１０２】
実施例４：固体担体にグラフトされるＣ６Ｓを使用した、生理的ＰｒＰの検出
【０１０３】
４．１  ボール上のヒト血清
【０１０４】
ａ）手順：
実施例１により、ＮＨＳボールを、グラフトのために、蒸留水中で希釈されたＣ６Ｓ溶液と最初に接触させる。この期間後、ボールを蒸留水で、次にＰＢＳＴ０．０５％で洗浄する。
【０１０５】
広い段階の血清を、ＰＢＳ中の希釈によって調製する。並行してＰＢＳ中の０．２５μｇ／ｍｌに定量したヒト組換えＰｒＰ溶液を、並びにＰＢＳＴ溶液０．０５％、乳５％を調製し、それらはそれぞれ陽性及び陰性対照の役を果たす。
【０１０６】
ボールを、２５０μｌの試料に対して２×１０９ボール／ｍｌの５μｌの溶液の割合で添加する。インキュベーションは、攪拌して、３７℃で１時間続く。次にボールを磁化により上清から分離する。ボールに固定されたＰｒＰは、マークされる抗体を用いて直接定量する。
【０１０７】
ボール上の顕色は、ＥＬＩＳＡに近い手順を使用する。ペルオキシダーゼでマークされる顕色抗体を、ＰＢＳＴ溶液０．０５％によるボールのすすぎ後、３７℃で１時間、かつ軽く攪拌してインキュベートする。再び洗浄され、次に１０分間インキュベートされるＯＰＤ溶液によって顕色される前に、ボールを磁化により上清から分離する。反応は、Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて停止させる。用いた顕色抗体は、８Ｄ１１Ｇ１２である。
【０１０８】
得られた信号の読み取りは、４９５ｎｍの分光光度計を用いて行う。
【０１０９】
ｂ）結果
結果を図７に示すが、図７は以下のことを明らかにしている：
−  乳中の陰性対照が、ノイズを算定することを可能にし、他方でＰｒＰ溶液０．２５μｇ／ｍｌ中の陽性対照が、実験が機能したこと及び解釈可能であることを確認することを可能にしている。
−  ＮＨＳボール上にグラフトされるＣ６Ｓは、ヒト血清中に存在する生理的ＰｒＰを捕獲する。更に、血清の希釈が、希釈に関して１／５及び１／１０に達する飽和トレーによって増大する時に、捕獲は、更に良好である。
【０１１０】
ｃ）結論
驚くべきことに、ＮＨＳボール上にグラフトされるＣ６Ｓは、ヒト血清に存在する生理的ＰｒＰを捕獲する。血清の希釈は、ボール上で得られる信号を増大させることを可能にする。
【０１１１】
４．２  プレート上のヒト頭脊柱液（ＬＣＲ）
【０１１２】
ａ）実験条件：
ＬＣＲ試料を、最初に等しい容量の管に配分する。２つの希釈点：純粋及び２／１が、各試料に関して作られる。次にそれらに、３つのタイプの熱処理を受けさせる：５６℃で３０分間、７５℃で１５分間又は９５℃で５分間である。加熱をしない対照が、純粋な試料に関して並行して作られた。
【０１１３】
実施例１により、並行してＮＨＳプレートを、グラフトのために、ＰＢＳ溶液５０ｍＭ中で希釈されたＣ６Ｓ溶液と６時間、接触させる。
【０１１４】
次に、プレートを蒸留水で、次にＰＢＳＴ０．０５％ですすぐ。
【０１１５】
試料を、次に沈殿させ、かつ２〜８℃で一晩インキュベートする。次にプレートを６回すすぐ。次にそれを、周囲温度で１時間、ＰＢＳＴ０．０５％中で、０．５μｇ／ｍｌに希釈されるビオチンでマークされる抗ＰｒＰ抗体溶液によりインキュベートする。使用する抗体は、ＡＣ２３である。
【０１１６】
新規なサイクルのすすぎの後、周囲温度で２０分間インキュベートしたストレプタビジン−ＰＡＬ（アルカリホスファターゼ）溶液を添加する。プレートを最後にすすぎ、かつＰＮＰＰ顕色溶液を、沈殿させ、かつ３７℃で３０分間インキュベートする。反応は、ＮａＯＨ溶液０．４Ｎを用いて停止させる。
【０１１７】
得られた信号の読み取りは、４９０ｎｍでのフィルタに対して４０５ｎｍで分光光度計を用いて行う。
【０１１８】
ｂ）結果：
結果を図８に示すが、図８は、生理的ＰｒＰが、ＬＣＲ中で定量され得ることを明らかにしている。
【０１１９】
実施例５：固体担体にグラフトされるＣ６Ｓを使用した、脳中のＰｒＰｓｃの検出
【０１２０】
５．１  プレート上の検出
【０１２１】
ａ）実験条件：
第１ステップは、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）に罹患した又は罹患しない患者の脳から抽出によって精製するＰｒＰｓｃを得ることからなる。各脳の２６０ｍｇの試料を採取し、次にブドウ糖溶液５％のホモジェネート１０％を得るために破砕される。破砕生成物は、次に針を用いて濾過される。次にプロテイナーゼＫによる消化ステップが来る。それを、１時間３７℃で１００ｍｇの組織に対して２０μｇの濃度で使用する。次に、６５０μｌのサルコシル溶液３０％を添加する。並行して、４００μｌのショ糖のクッション（ｃｏｕｓｓｉｎ）を、超遠心分離のために管底部に沈殿させる。試料を、次にこのクッション上に沈殿させる。管は、溶接され、次に１０００００ｒｐｍ、２０℃で２時間、超遠心分離される前に仕上げられる。上清を除去し、かつ管の仕切り壁を吸い取り紙によって大雑把に乾燥させる。次に残渣をトリス−マレエート中に戻す。試料を、９５℃で５分間加熱し、次に２０℃、１２０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離する。試料を次に使用するまで−８０℃で保存する。この第１ステップの成功は、ウェスタンブロットによって確認された。
【０１２２】
ｂ）カリックス−６−スルホネートプレートに対するテスト
実施例１により、ＮＨＳプレートのグラフトを、ＰＢＳ溶液５０ｍＭ中で希釈される広い段階のＣ６Ｓにより６時間、行う。プレートを最初に、周囲温度で６時間、ＰＢＳＴ溶液０．０５％、乳５％によって飽和させる。次にそれらをＰＢＳＴ溶液０．０５％によって３回洗浄する。トリスマレエートで予め希釈した試料を、プレート上に沈殿させ、かつ２〜８℃で一晩インキュベートする。次にプレートをＰＢＳＴ０．０５％で６回すすぐ。顕色抗体溶液を、周囲温度で１時間インキュベートする。新規な一連の洗浄後、ストレプタビジン−ＰＡＬを２０分間インキュベートする。３７℃で３０分間インキュベートされるＰＮＰＰ（パラ−ニトロフェニルリン酸）沈殿前に、プレートを最後に洗浄する。次に顕色反応は、硫黄を添加して停止させる。
【０１２３】
ＤＯの読み取りは、４９０ｎｍでのフィルタに対して４０５ｎｍで分光光度計を用いて行う。
【０１２４】
ｃ）結果
結果を図９に示すが、図９は、驚くべきことに、クロイツフェルト・ヤコブ病に罹患した患者に由来する試料のＰｒＰｓｃが、ＮＨＳプレート上にグラフトされるＣ６Ｓによる捕獲及びＰｒＰタンパク質に特異的に向けられる抗体による検出を使用して、本発明の方法によって検出可能であることを示しており、このことは、陽性対照、ヒト組換えＰｒＰ及び陰性対照、ＰＢＳＴ０．０５％によって立証される。
【０１２５】
実施例６：固体担体にグラフトされるＣ６Ｓを使用した、ＬＣＲ中のＰｒＰｓｃの検出
【０１２６】
６．１  試料の調整
【０１２７】
試料は、好ましくは非溶血、かつ細胞片の無い頭脊柱液（ＬＣＲ）の採取見本からなる。これらの採取見本は、匿名であり、かつ蛋白に対して僅かに吸着性である仕切り壁を有する管中で−（８０℃）で冷凍して保存する（「予潤滑マイクロ遠心管、１．７ｍＬ」、Ｍａｒｓｈ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ｒｅｆ．Ｔ６０５０Ｇ）。
【０１２８】
採取見本は、２つのカテゴリーに分類される：
【０１２９】
一方で、ＣＪＤに対して陽性の試料。
【０１３０】
これらは、脳槽中の穿刺による死体解剖の際に回収され、かつウェスタンブロットによる脳組織中のＰｒＰｓｃの研究が、（ある種の場合）ＣＪＤの診断を確認することを可能にした、死後ＬＣＲである。死体解剖の際、採取したＬＣＲを、（細胞片を多量に有する試料を除き）予め遠心分離せずに前述の管中に直ちに配分し、かつアリコートを、−８０℃で冷凍する。
【０１３１】
他方で、ＣＪＤに対して陰性の試料。それらは、２タイプである：
【０１３２】
死体解剖の際に回収され、かつウェスタンブロットによる脳組織中のＰｒＰｓｃの研究が、ＣＪＤの診断を除去することを可能にした、死後ＬＣＲ（ＣＪＤに関する陰性対照）。
【０１３３】
ＣＪＤに罹患していない患者の、かつ外部脳室誘導（ＤＶＥ）に由来するＬＣＲ。これらの採取見本の保存条件は、前記のそれと同一である。
【０１３４】
６．２  ＥＬＩＳＡのアプローチ
【０１３５】
ａ）分析原則
試料を、一定時間、高温で単にインキュベートし、次に冷却後、免疫量分析（ＥＬＩＳＡ）と適合できる緩衝液中で１／２又は１／５に希釈する（トリス−マレエート緩衝液、ｐＨ８）。プロテイナーゼＫによる消化が、プレートＣ６Ｓ上の沈殿前に起きる時、試料は、１５分間、プロテイナーゼＫによって消化され、次に予めの阻害無しに、プレートＣ６Ｓ上にこのように沈殿する。
【０１３６】
捕獲は免疫学的ではないが、免疫学的顕色による、配位子／アフィナントタイプの反応が問題であるので、用語ＥＬＩＳＡを使用する。
【０１３７】
ＥＬＩＳＡ技術は、測定可能な、かつ試料中に存在する抗原の量と比例した可溶性生成物に基質を変えることにより、探求する抗原を定量することを可能にする、量的免疫酵素学的技術である。ここで使用する技術は、杯状部分（ｃｕｐｕｌａ）の感作を除き、従来の競争力の無いサンドイッチＥＬＩＳＡと同じステップを含む。実際、捕獲の抗プリオン抗体は、そのアミン基によってマイクロプレートのＮＨＳ基上にグラフトされる、スルホン化カリックス−６−アレンによって代えられる。
【０１３８】
マイクロプレートの杯状部分底部でのＣ６Ｓの固定化、及び抗原固定の非特異部位の飽和後に、試料を沈殿させ、かつＣ６Ｓとの抗原の結合を可能にするために、プレートをインキュベートする。次に、何回かの洗浄後に、プリオン抗体に特異で、かつマークされる抗体を、添加する。形成された複合体は、吸光度が、マイクロプレート読取装置（自動化分光光度計）を用いて決定される、着色生成物に変わる酵素基質の添加後に、比色法によって視覚化される。
【０１３９】
ｂ）作業方法
大量のＬＣＲを、１５分間７５℃で乾燥湯浴（ｂａｉｎ−ｍａｒｉｅ  ｓｅｃ）で、インキュベートする。冷却後、試料をトリス−マレエート緩衝液０．２Ｍ、ｐＨ８中で５倍に希釈し（４倍の量の緩衝液添加）、かつＣ６Ｓによって予め感作したマイクロプレート上に直接沈殿させるか、３７℃で１５分間プロテイナーゼＫによって消化し、次にマイクロプレート上に沈殿させる。
【０１４０】
免疫量分析の連続的ステップを、以下に、時系列順で列挙する：
１  −  活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上のスルホン化カリックス−６−アレンＣ６Ｓのグラフトは、ＰＢＳ溶液５０ｍＭ中で希釈される、広い濃度段階、又は固定濃度に応じて、周囲温度で６時間、以上に言及した方法により行う。
２  −  次にプレートをＰＢＳＴ０．０５％で３回洗浄し、次に３７℃で１時間、ＰＢＳＴ０．０５％−乳５％で飽和させる。
３  −  洗浄後、上記の分析原則により調製した１００μＬのＬＣＲを、ウェル毎に沈殿させる；プレートを、３７℃で１時間３０分インキュベートする。
４  −  洗浄後、１００μＬの顕色抗体を、ウェル毎に沈殿させる（０．５μｇ／ｍＬでＡＣ２３−ＨＲＰ、ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼ、又は０．５μｇ／ｍＬでＡＣ２３−ビオチン）。プレートを周囲温度で１時間インキュベートする。
５  −  洗浄後、形成した複合体は、顕色される：
５．１  −  顕色抗体が、ビオチンに結合されるならば、ＰＢＳＴ緩衝液０．０５％で１／２００００に希釈される１００μＬのＳＡ−ＰＡＬ溶液を、ウェル毎に沈殿させる。プレートを、周囲温度で２０分間インキュベートする。洗浄後、１００μＬのＰＮＰＰを、ウェル毎に沈殿させる。プレートを、３７℃で１０〜３０分間インキュベートする。インキュベーション後、比色反応を、０．４Ｎで５０μＬのＮａＯＨを各ウェル中に添加することによって停止させる。次に光学濃度を、４５０ｎｍでのフィルタに対して４０５ｎｍで分光光度計で測定する。
５．２  −  顕色抗体が、ペルオキシダーゼに結合されるならば、１００μＬのＯＰＤを、ウェル毎に沈殿させる。プレートを、暗所でかつ周囲温度で１０分間インキュベートする。
【０１４１】
インキュベーション後、比色反応を、１．８Ｎで５０μＬのＨ２ＳＯ４を各ウェル中に添加することによって停止させる。次に光学濃度を、４９５ｎｍで分光光度計で測定する。
【０１４２】
ｂ）結果
１  −  頭脊柱液（ＬＣＲ）のプリオン蛋白とのマイクロプレート上にグラフトされるスルホン化カリックス−６−アレンモノアミン（Ｃ６Ｓ）の結合の確認：
クロイツフェルト・ヤコブ病に罹患しない患者の脳頭脊柱液を、７５℃で１５分間加熱し、かつ次にＥＬＩＳＡ免疫学的顕色に適合する緩衝液中で１／２又は１／６に希釈する。試料は、プロテイナーゼＫによって消化されず、かつこのようにして１．８〜１８μｇ／ｍＬの広い濃度範囲に応じてＣ６Ｓによってグラフトされるプレート上に沈殿する。インキュベーション後、Ｃ６Ｓ上に捕獲される抗原の免疫学的顕色は、０．５μｇ／ｍＬで使用されるペルオキシダーゼに結合される抗体ＡＣ２３によって確実に行われる。結果を、図１０に示す。
【０１４３】
信号が、杯状部分底部で固定化されるＣ６Ｓの第１の濃度から観察されるので、これらの結果は、Ｃ６Ｓが、ＬＣＲ中でプリオン蛋白の形状と、大いに結合することを示す。
【０１４４】
２  −  プロテイナーゼＫを使用しない異種段階の病原性プリオン蛋白とのＣ６Ｓの結合の確認：
非希釈又は１／２に希釈したＣＪＤ（ＭＪＪ）に罹患しない患者のＬＣＲ（ＬＣＲ−）及びＣＪＤで死亡した患者のＬＣＲ（ＭＪＣ＋）に、様々なタイプの熱処理を受けさせる。次にそれらを、７．２μｇ／ｍＬでＣ６Ｓによりグラフトしたプレート上に沈殿させる。洗浄後、免疫学的顕色が、ビオチンに結合される抗プリオン抗体ＡＣ２３によって確実に行われる。
【０１４５】
結果をグラフによって図１１に表す。
【０１４６】
これらの結果は、陰性試料よりも陽性試料に有効であるプロテイナーゼＫによる処理無しで、プレート上にグラフトされるＣ６Ｓ上のプリオン蛋白の吸着を示している。様々な熱処理は、希釈の無いＣ６Ｓ上のプリオン蛋白の吸着効率に僅かな影響を、かつ試料を希釈した時に一層の影響を及ぼす。このように、異種段階でのＣ６Ｓ  ＭＮ上のプリオン蛋白の吸着を促進する実験条件は、試料の希釈及び９５℃で５分間の処理であるように見える。
【０１４７】
３  −  プロテイナーゼＫを使用する異種段階の病原性プリオン蛋白とのＣ６Ｓの結合の確認：
３７℃で１時間、消化混合物のプレートＣ６Ｓ上の捕獲前に、事前分析処理で、３７℃で１５分間、プロテイナーゼＫによる消化ステップを使用した。残留プロテイナーゼＫの除去を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液０．０５％での連続洗浄によって確実に行う。
【０１４８】
結果を図１２に示す。
【０１４９】
これらの結果は、プロテイナーゼＫによる消化後に、ＣＪＤ陽性試料に有利になるような光学濃度の差を示す。この差異は、テストされるプロテアーゼＫ（０．５μｇ／ｍＬ）の第１の濃度から見ることができる。
【０１５０】
ｄ）結論
ＬＣＲ中のプリオン蛋白の検出は、本発明の方法により可能になる。実際、プロテイナーゼＫによる消化が無ければ、（細胞及び病原性の）ＰｒＰ全体の検出は、スルホン化カリックス−６−アレンの存在下で増幅され、かつ予期せぬことに、ＰｒＰｓｃは、優先的に検出される。プロテイナーゼＫによる試料の消化後に捕獲状態のこれらのＣ６Ｓを使用することは、ＣＪＤに罹患しない患者に由来するＬＣＲ及びＣＪＤに罹患した患者に由来するＬＣＲの間で著しく異なる信号を供給しながら、ＬＣＲのＰｒＰｓｃを検出することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】一方が調製法を別途記載する特異補助的大環状配位子（ＡＭＬ１）の存在下に置いた試料中の、かつ他方がＡＭＬ１の存在下に置かれない試料中のＰｒＰｓｃの免疫ブロットによる検出の比較例である。
【図２】一方がＡＭＬ１の存在下に置かれた試料中の、かつ他方がＡＭＬ１の存在下に置かれない試料中のＰｒＰｓｃ検出の光学濃度のグラフを表す。
【図３】組換えプリオン蛋白（ｒｅｃＰｒＰ）のみ（Ａ）、ＡＭＬ１の存在下に置かれるｒｅｃＰｒＰ（Ｂ）及びＡＭＬ１のみ（Ｃ）の乾燥フィルムに関する非接触モードでの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）画像を示す。
【図４】様々な比率:１／１０００  ＡＭＬ１／ｒｅｃＰｒＰ、１／１００  ＡＭＬ１／ｒｅｃＰｒＰ、１／１０  ＡＭＬ１／ｒｅｃＰｒＰでの、ＡＭＬの存在下に置かれたｒｅｃＰｒＰの乾燥フィルムに関する非接触モードでの走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）画像を示す。
【図５】ウシ組換えＰｒＰ溶液のインキュベーション、及びペルオキシダーゼでマークされる抗ＰｒＰ抗体ＡＣ２３による顕色後、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓの濃度に応じて得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図６】ペルオキシダーゼでマークされる抗ＰｒＰ抗体８Ｄ１１Ｇ１２を用いた直接顕色による、０．２５μｇ／ｍｌで定量されるヒト組換えＰｒＰ溶液のインキュベーション後、活性化アミンボール（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓの濃度に応じて得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図７】ペルオキシダーゼでマークされる抗ＰｒＰ抗体８Ｄ１１Ｇ１２を用いた直接顕色による、活性化アミンボール（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓと接触させるＰＢＳＴ０．０５％中のヒト血清の広い希釈段階によるインキュベーション後に得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図８】アルカリホスファターゼでマークされる抗ＰｒＰ抗体ＡＣ２３を用いた顕色による、加熱に応じたＣＪＤに関する陽性（ＬＣＲ＋）及び陰性（ＬＣＲ−）のヒト頭脊柱液の試料と、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓを接触させた後に得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図９】アルカリホスファターゼでマークされる抗ＰｒＰ抗体ＡＣ２３を用いた顕色による、クロイツフェルト・ヤコブ病に罹患した又は罹患しない患者の脳（ＣＪＤ＋／ＣＪＤ−）から抽出したＰｒＰｓｃと、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓを接触させた後に得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図１０】１／２又は１／６に希釈し、かつプロテイナーゼＫによる消化の無い、ＣＪＤに罹患していない患者のＬＣＲの試料と接触させた後に、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓの濃度に応じて得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図１１】場合により１／２に希釈し（ＬＣＲ＋１／２又はＬＣＲ−１／２）、プロテイナーゼＫによる消化の無い、ＣＪＤに罹患していない（ＬＣＲ−）又はこの疾患に罹患した（ＬＣＲ＋）患者のＬＣＲの試料と接触させた後に、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓの濃度に応じて得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図１２】ＣＪＤに罹患していない（ＬＣＲ−）又はこの疾患に罹患した（ＬＣＲ＋）患者のＬＣＲの試料と、活性化アミンプレート（ＮＨＳ）上にグラフトされるカリックス−アレンＣ６Ｓを接触させた後に、プロテイナーゼＫの濃度に応じて得られる光学濃度値（ＤＯ）を示すグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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