(57)【要約】本発明は、ターゲッティング残基と治療残基を含む様々な癌細胞をターゲットするための改善された能力を有する治療接合体に関する。ターゲッティングと治療残基とは、免疫接合体の治療効力を増強する酸開裂可能な結合を介して結合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) ターゲッティング残基、
(b) 化学療法薬残基、および
(c) チオール基を介してターゲッティング残基へ結合し、かつヒドラゾン以外の細胞内で開裂可能な残基を介して化学療法薬残基へ結合するリンカー
を含んでなる、免疫接合体。
【請求項２】
前記細胞内で開裂可能な残基が、細胞内エステラーゼによって開裂可能なものである、請求項１に記載の免疫接合体。
【請求項３】
前記細胞内で開裂可能な残基がエステル残基である、請求項１または２に記載の免疫接合体。
【請求項４】
前記エステル残基が、アミノ酸のα-カルボン酸から形成されるエステルである、請求項３に記載の免疫接合体。
【請求項５】
前記細胞内で開裂可能な残基が、細胞内酵素によって開裂可能なペプチド結合を含んでなるものである、請求項１に記載の免疫接合体。
【請求項６】
前記細胞内で開裂可能な残基が、酸性ｐＨにて細胞内コンパートメントの開裂を受けやすいエーテル結合を含んでなるものである、請求項１に記載の免疫接合体。
【請求項７】
前記エーテル結合が、化学療法薬と前記細胞内で開裂可能な残基との間で形成されるエーテル結合である、請求項６に記載の免疫接合体。
【請求項８】
前記細胞内で開裂可能な残基が、テトラヒドロピラン残基、テトラヒドロフラン残基、またはオルソエステル残基を含んでなるものである、請求項７に記載の免疫接合体。
【請求項９】
前記リンカーが、前記ターゲッティング残基のチオール基に結合するチオール反応性基を含んでなるものである、請求項１に記載の免疫接合体。
【請求項１０】
前記チオール反応性基が、ターゲッティング残基のチオール基に結合するマレイミドまたはビニルスルホンである、請求項９に記載の免疫接合体。
【請求項１１】
前記リンカーが、前記ターゲッティング残基のリシン側鎖のマレイミド残基と反応するチオール基を含んでなるものである、請求項１に記載の免疫接合体。
【請求項１２】
前記化学療法薬残基とターゲッティング残基との間に、水可溶化残基をさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項１３】
前記水可溶化残基がアミノポリカルボキシレートである、請求項１２に記載の免疫接合体。
【請求項１４】
前記アミノポリカルボキシレートが、DTPA、EDTA、TTHA、ベンジル-DTPA、DOTA、ベンジル-DOTA、NOTA、ベンジル-NOTA、TETA、およびN,N'-ジアルキル置換ピペラジンからなる群から選択される、請求項13に記載の免疫接合体。
【請求項１５】
前記化学療法薬残基が、ドキソルビシン(DOX)、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン(モルホリノ-DOX)、シアノモルホリノ-ドキソルビシン(シアノモルホリノ-DOX)、2-ピロリノ-ドキソルビシン(2-PDOX)、CPT、CPT-11、SN-38、トポテカン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、およびエポチロンからなる群から選択されるものである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項１６】
前記ターゲッティング残基が、抗体、またはその断片と結合する抗原である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項１７】
前記抗体がモノクローナル抗体(mAb)である、請求項１６に記載の免疫接合体。
【請求項１８】
前記抗体が、多価および／または多重特異性であるモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の免疫接合体。
【請求項１９】
前記ターゲッティング残基がネズミ、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体であり、前記抗体が完全な、断片(Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2)または小断片(一本鎖構築物）形態である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２０】
前記ターゲッティング残基が、癌または悪性細胞上で発現した、抗原または抗原のエピトープと反応性のモノクローナル抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２１】
前記癌細胞が、造血腫瘍、癌、肉腫、黒色腫、またはグリア腫瘍由来の細胞である、請求項２０に記載の免疫接合体。
【請求項２２】
前記ターゲッティング残基が、B細胞系抗原、T細胞系抗原、骨髄系抗原、およびHLA-DR抗原に結合するモノクローナル抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２３】
前記ターゲッティング残基が、CD74、CD22、上皮糖タンパク質-1、MUC1、癌胎児性抗原(CEAまたはCD66e)、結腸特異性抗原-p、α-フェトプロテイン、CC49、前立腺特異性膜抗原、カルボニックアンヒドラーゼIX、HER-2/neu、BrE3、CD19、CD20、CD21、CD23、CD33、CD45、CD74、CD80、VEGF、EGF受容体、P1GF、MUC2、MUC3、MUC4、ガングリオシド、HCG、EGP-2、CD37、HLA-DR、CD30、Ia、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、S100、PSA、テネイシン、葉酸受容体、Thomas-Friedreich抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、Ga 733、IL-2、IL-6、T101、MAGE、L243に結合する抗原、CD66a-d (それぞれ、BGP、CGM6、NCAおよびCGM1)、抗TAC、およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原に結合するモノクローナル抗体である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２４】
前記ターゲッティング残基が、LL1、LL2、hA20、1F5、L243、RS7、PAM-4、MN-14、Mu-9、AFP-31、G250、J591、CC49、およびImmu 31からなる群から選択されるものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２５】
前記ターゲッティング残基が、LL1、LL2、hA20、1F5、L243、RS7、PAM- 4、MN-14、Mu-9、AFP-31、G250、J591、CC49、およびImmu 31からなる群から選択される1種類以上の抗体を含んでなる二重特異性および/または二価抗体構築物である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２６】
前記ターゲッティング残基が少なくとも１つの化学療法薬残基に結合するものである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２７】
前記ターゲッティング残基が約７〜１２個の前記化学療法薬残基に結合するものである、請求項２６に記載の免疫接合体。
【請求項２８】
前記リンカーが、ターゲッティング残基に結合するためのそのN末端におけるチオール反応性残基と、少なくとも１つの化学療法薬残基に結合するための１以上の側鎖アミノ基とを含むペプチドを含んでなる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項２９】
前記リンカーが、N末端における官能基と、C末端における水可溶化残基と、前記化学療法薬残基に結合するのに利用可能な側鎖を有する１以上の内部塩基性アミノ酸とを含んでなる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項３０】
前記水可溶化残基が、DTPA、EDTA、TTHA、ベンジル-DTPA、DOTA、ベンジル-DOTA、NOTA、ベンジル-NOTA、またはN,N'-ジアルキル置換ピペラジンである、請求項29に記載の免疫接合体。
【請求項３１】
前記リンカーが、下式に示されるものである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【化１】
2006511526.tif 000012
【請求項３２】
前記免疫接合体が非経口投与に適した形態とされた、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項３３】
前記化学療法薬残基が、ドキソルビシン(DOX)、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン(モルホリノ-DOX)、シアノモルホリノ-ドキソルビシン(シアノモルホリノ-DOX)、2-ピロリノ-ドキソルビシン(2-PDOX)、CPT、CPT-11、SN-38、トポテカン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、およびエポチロンからなる群から選択される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の免疫接合体。
【請求項３４】
患者の悪性腫瘍、自己免疫疾患、感染症、または感染性病変の治療のための、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の免疫接合体の治療上有効量の使用。
【請求項３５】
前記悪性腫瘍が悪性固形腫瘍または造血新生物である、請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
前記免疫接合体が、前記感染症または感染性病変と関連した病原体上の抗原またはエピトープまたは鉄−シデロフォアキレート受容体をターゲットとする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
前記病原体が、細菌、真菌、ウイルス、リケッチア、マイコプラズマ、および原生動物からなる群から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記病原体が、Streptococcus agalactiae、Legionella pneumophilia、Streptococcus pyogenes、Escherichia coli、Neisseria gonorrhosae、Neisseria meningitidis、Pneunaococcus、Hemophilis irfluenzae B、Treponema pallidum、ライム病スピロヘータ、Pseudomonas aeruginosa、Mycobacterium leprae、Brucella abortus、Mycobacterium tuberculosis、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器シンシチウムウイルス、帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Toxoplasma gondii、Trypanosoma rangeli、Trypanosoma cruzi、Trypanosoma rhodesiensei、Trypanosoma brucei、Schistosoma mansoni、Schistosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、Onchocerca volvulus、Leishmania tropica、Trichinella spiralis、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、Taenia saginata、Echinococcus granulosus、Mesocestoides corti、Mycoplasma arthritidis、M. hyorhinis、M. orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M. salivarium、およびM. pneumoniaeからなる群から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
前記自己免疫疾患がクラスIIIの自己免疫疾患である、請求項34に記載の使用。
【請求項４０】
前記クラスIIIの自己免疫疾患が、免疫依存性血小板減少症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎(pose-streptococcal nephlitis)、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グットパスチャー症候群、血栓性血管炎（thromboangitis ubiterans）、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ロウ、巨細胞性動脈炎/多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸状体腎炎および繊維化肺胞炎からなる群から選択される、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
非経口投与のための、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、様々な癌細胞、感染性疾患生物をターゲットし、自己免疫疾患を治療するための改善された能力を有する治療接合体であって、ターゲッティング残基および治療残基を含む接合体に関する。ターゲッティングと治療残基とは、治療効力を増強する、細胞内で開裂可能な結合を介して結合している。
【０００２】
背景技術
長年にわたり、ヒト癌に毒性因子を特異的に送達するためのモノクローナル抗体(mAb)の使用は、特異的にターゲッティングした薬物療法の分野における科学者の目標となっている。腫瘍関連mAbと適当な毒性因子との接合体が開発され、癌の治療において複合的に成功しているが、他の疾患には実質的に応用されていない。毒性因子は、最も一般的には化学療法薬であるが、粒子放射放射性核種や、細菌性または植物性毒素もmAbに接合されている。
【０００３】
mAb-化学療法薬接合体の使用の利点は、(a) 化学療法薬自体が構造的に明確に規定され、(b) 化学療法薬が、明確に規定された接合化学を用いて結合され、多くの場合にはmAb抗原結合領域とは離れた特異的部位によりmAbタンパク質に結合され、(c) mAb-化学療法薬接合体は、mAbおよび細菌性または植物性毒素を含む化学的接合体よりも再現性よく作製することができ、かつそれ自体商業的開発および規制認可を得やすく、(d) mAb-化学療法薬接合体は放射性核種mAb接合体より毒性が遙かに小さい。
【０００４】
mAb-化学療法薬接合体に関連する初期の研究では、イン・ビトロおよびイン・ビボでの前臨床試験中、用いた化学結合が薬剤の失効をしばしば招くことがが見いだされた。これらの結果は、mAb-化学療法薬接合体を有用な治療薬とするためには、薬剤をターゲット細胞中に一担置いたならば、薬剤は理想的には元の形態で放出される必要があることを示していた。従って、1980年代および1990年代初期の研究は、主として化学療法薬とmAbとの間の化学的リンカーの性質に集中した。特に、穏和な酸で開裂可能なリンカーを用いて調製したmAb-化学療法薬接合体は、腫瘍内部のpHが正常な生理学的pHより低いことが多いという観察に基づいて開発された(米国特許第4,542,225号明細書、第4,569,789号明細書、第4,618,492号明細書および第4,952,394号明細書)。この方法は、適当なリンカーを用いて調製したmAb-ドキソルビシン(DOX)接合体を用い、前臨床研究における様々なヒト腫瘍異種移植片を担持するマウスを治療することができることを示したTrail et al.(Science 261: 212-215 (1993))の画期的論文において、一つの頂点に達した。この有望な結果は、ターゲッティングを行う腫瘍細胞上の非常に多数の受容体に結合した抗体にて達成され、そのmAb-化学療法薬接合体はmAbの単位当たり6-8個のDOX残基で置換された。さらに、mAb-化学療法薬接合体は、反復的投薬スケジュールにおいて大用量にて投与された。
【０００５】
上記のmAb-化学療法薬接合体の開発にあっては、化学療法薬とmAbの間のリンカーは、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれにおいても良好な抗腫瘍活性を保持する上で重要であると考えられた。幾つかの場合には、mAb-化学療法薬接合体は、化学療法薬とmAbとの間を酸に不安定な結合(例えば、ヒドラゾン)および還元的に不安定な(例えば、ジスルフィド)結合として作製された。ヒドラゾン結合はイン・ビボでの血清条件に対しては明らかに安定であるが、通常のジスルフィド結合は実用に十分なほど安定ではないことが分かった。従って、標準的ジスルフィド結合の代わりに、ヒンダードジェミナルジメチルジスルフィド結合またはメチルジスルフィド結合を用いるmAb-化学療法薬接合体が開発された。
【０００６】
当該技術分野における他の研究が、開裂可能な残基としてのヒドラゾン、およびジスルフィド結合の代わりのチオエーテル基の使用に集中して行われた。Willner et al.は、開裂可能な単位としてヒドラゾンを組込み、ジスルフィドの代わりにチオエーテル基を介し、DOXをmAbに結合することによって優れた結果が得られることを見出した(米国特許第5,708,146号明細書)。このような手法でかつmAb置換部位当たりのDOX単位の数を二倍にしうる分岐リンカーを用いて結合すると、新たなDOX-mAb接合体の効力はほぼ10倍に増加した(King et al., Bioconjugate Chem. 10: 279-288 (1999))。
【０００７】
検討されたもう一つの開裂可能な残基は、抗体と化学療法薬との間のリンカーに組込まれたエステル結合である。Gillimard and Saragoviは、パクリタキセルのエステルを抗ラットp75mAb、MC192または抗ヒトTrkAmAbである5C3に接合すると、接合体はターゲット特異的毒性を示すことを見出した(Gillimard and Saragovi, Cancer Res. 61 : 694-699(2001))。
【０００８】
mAb-化学療法薬接合体の構築におけるリンカーの重要性に鑑み、本発明者らは様々な化学療法薬および他の毒性物質とともに一般的に使用可能な新規リンカーを開発した。
【発明の概要】
【０００９】
一つの態様によれば、本発明は、
(a) ターゲッティング残基、
(b) 化学療法薬残基、および
(c) チオール基を介してターゲッティング残基へ結合し、かつヒドラゾン以外の細胞内で開裂可能な残基を介して化学療法薬残基へ結合するリンカー
を含んでなる、免疫接合体に関する。他の態様によれば、本発明は、
(a) ターゲッティング残基、
(b) 化学療法薬残基、および
(c) チオール基を介してターゲッティング残基へ結合し、かつヒドラゾン以外の細胞内で開裂可能な残基を介して化学療法薬残基へ結合するリンカー
を含んでなる、免疫接合体であって、上記リンカーがアミノ酸残基とチオール反応性残基とを含んでなり、アミノ酸残基を介して化学療法薬残基におよびチオール反応性残基を介してターゲッティング残基に結合している免疫接合体に関する。
【００１０】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の免疫接合体を用いる、癌、悪性腫瘍、自己免疫疾患、感染症、または感染性病変の治療方法である。
【発明の具体的説明】
【００１１】
特に断らない限り、単数の単語への言及は「その1個以上」を意味する。
【００１２】
以下の説明では、本発明を理解しやすくする目的で多数の用語が用いられておりかつ以下の定義が提供される。
【００１３】
本明細書に記載の抗体は、完全長の(すなわち、天然に存在するまたは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換え法によって形成された)免疫グロブリン分子(例えば、IgG抗体)、または抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫活性(すなわち、特異結合性)部分を表す。
【００１４】
抗体断片は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv(一本鎖Fv)のような抗体の部分などである。構造には関係なく、抗体断片は完全な抗体によって認識される同一抗原と結合する。
【００１５】
また、「抗体断片」という用語は、特異抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のような作用を行う任意の合成または遺伝子工学処理を施したタンパク質を包含する。例えば、抗体断片は重鎖および軽鎖の様々な利用域からなる「Fv」断片のような可変領域からなる単離断片、軽および重可変領域がペプチドリンカー(「scFvタンパク質」)によって結合されている組換え一本鎖ポリペプチド分子、および超可変領域に類似しているアミノ酸残基からなる最小認識単位を包含する。Fv断片は、多価および/または多重特異的結合形態の生成に関する様々な方法で構築することができる。前者の多価の場合には、それらは特異的エピトープに対する2個以上の結合部位と反応し、多重特異的形態では、(抗原の、または特異抗原および異なる抗原に対する)2個以上のエピトープが結合する。
【００１６】
本明細書で用いられる抗体成分という用語は、完全な抗体、融合タンパク質およびそれらの断片のいずれをも包含する。
【００１７】
裸の抗体は、一般的には治療薬に接合していない完全な抗体である。そう呼ばれるのは、抗体分子のFc部分が、補体固定およびADCC(抗体依存性細胞傷害)のようなエフェクターまたは免疫学的機能を提供して、機構を作動させて細胞リーシスを生じることができるからである。しかしながら、Fc部分は抗体の治療機能には必要とせず、むしろ、アポトーシス、抗血管新生、抗転移活性、異型または同型接着の阻害のような抗接着活性、およびシグナリング経路における干渉のようなむしろ他の機構が効果を示し、疾患の進行を干渉することがある。裸の抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体およびそれらの断片であって、ネズミ抗体、並びにキメラ、ヒト化またはヒト抗体およびそれらの断片のようなある種の組換え抗体を包含するものを包含する。本発明において定義されるように、「裸の」は「接合していない」と同義であり、一緒に投与する治療薬には結合または接合していないことを意味する。
【００１８】
キメラ抗体は、一種、好ましくは齧歯類抗体由来の抗体の相補性決定領域(CDR)などの重および軽抗体鎖の可変ドメインを含む組換えタンパク質であり、一方抗体分子の定常ドメインはヒト抗体に由来する。動物への応用には、キメラ抗体の定常ドメインはネコまたはイヌのような他の種のものから誘導することができる。
【００１９】
ヒト化抗体は、一種からの抗体、例えば、齧歯類抗体からのCDRが、齧歯類抗体の重および軽可変鎖からヒト重および軽可変ドメインに導入されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインから誘導される。
【００２０】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するように「人工的に処理された」トランスジェニックマウスから得られた抗体である。この手法では、ヒト重および軽鎖座の要素が、内在性重鎖および軽鎖座のターゲッティングされた崩壊を含む、胚幹細胞系由来のマウスの系統に導入される。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体-抗原ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994)、Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)に記載されている。また、完全なヒト抗体は、遺伝子または染色体トランスフェクション法、並びにファージディスプレー法、当該技術分野で知られているいずれもによって構築することができる。例えば、免疫していないドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリー由来の、ヒト抗体およびその断片のイン・ビトロでの産生については、McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)を参照されたい。この手法では、抗体可変ドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子のインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として表示する。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択により、その特性を示す抗体をコードする遺伝子もまた選択される。この方法において、ファージは、B細胞の特性に幾分類似している。ファージディスプレーは様々なフォーマットで行うことができ、それらの総説については、例えば、Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)を参照されたい。
【００２１】
ヒト抗体は、イン・ビトロで活性化されたB細胞によって生成することもできる。米国特許第5,567,610号明細書および第5,229,275号明細書を参照されたい。上記特許明細書の内容は、引用することによって本明細書の開示の一部とされている。
【００２２】
治療薬は、抗体成分、すなわち、抗体または抗体断片、またはそれらの小断片とは別個に、同時にまたは逐次的に投与される分子または原子であり、疾患の治療に有用なものである。治療薬の例としては、抗体、抗体断片、免疫接合体、薬剤、細胞傷害性物質、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、キレート化剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、放射性同位体または放射性核種、免疫接合体、またはそれらの組合せが挙げられる。
【００２３】
免疫接合体は、治療薬に接合した抗体成分である。適当な治療薬は、上記に記載されている。
【００２４】
本明細書で用いられる抗体融合タンパク質という用語は、組換えによって産生した抗原結合分子であって、2個以上の同一または異なる特異性を有する同一または異なる天然抗体、一本鎖抗体または抗体断片セグメントが結合しているものである。融合タンパク質は、少なくとも1個の特異結合部位を含んでなる。
【００２５】
融合タンパク質の原子価は、融合タンパク質が(複数の)抗原または(複数の)エピトープに対して有する結合アームまたは部位の総数、すなわち、一価、二価、三価または多価を示している。抗体融合タンパク質が多価であることは、抗原への結合における複合相互作用を利用し、抗原または異なる抗原への結合のアビディティーを増加させることができることを意味する。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの異なる種類の抗原またはエピトープに結合することができるか、すなわち、単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義を用いれば、天然抗体、例えばIgGは、2本の結合アームを有するので二価であるが、1種類の抗原またはエピトープに結合するので単一特異性である。単一特異性の多価融合タンパク質は、同一抗原またはエピトープに2個以上の結合部位を有する。例えば、単一特異性ジアボディーは、同一抗原と反応する2個の結合部位を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、異なる抗体成分の多価または多重特異性を組み合わせたもの、または同一抗体成分の複数のコピーを含んでなることができる。融合タンパク質は、さらに治療薬を含んでなることもできる。
【００２６】
免疫調節剤は、本発明で定義されている通りの治療薬であり、存在するときには身体の免疫系を変更し、抑制しまたは刺激する。典型的には、本発明で有用な免疫調節剤は、免疫細胞を刺激し、マクロファージ、B細胞、および/またはT細胞のような免疫応答カスケードにおいて増殖させまたは活性化させる。本明細書に記載の免疫調節剤の一例は、サイトカインであり、サイトカインは特異抗原と接触した際に1個の細胞個体群(例えば、感作Tリンパ球)によって放出される約5-20kDの可溶性の小タンパク質でありかつ細胞間において細胞間メディエーターとして作用する。熟練技術者であれば理解し得るように、サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン、および腫瘍壊死因子(TNF)およびインターフェロンのような幾つかの関連シグナリング分子が挙げられる。ケモカインは、サイトカインのサブセットである。ある種のインターロイキンおよびインターフェロンは、T細胞または他の免疫細胞増殖を刺激するサイトカインの例である。
【００２７】
好ましい態様によれば、細胞内で開裂可能な残基は、場合によっては、細胞内エステラーゼによって開裂可能なものである。好ましい態様によれば、細胞内で開裂可能な残基はエステル残基である。好ましい態様によれば、エステル残基は、アミノ酸のα-カルボン酸から形成されたエステルである。好ましい態様によれば、細胞内で開裂可能な残基は、細胞内酵素によって開裂可能なペプチド結合を含んでなる。好ましい態様によれば、リンカーは、上記ターゲッティング残基のチオール基に結合する、チオール反応性基を含んでなる。チオール反応性基は、場合によっては、上記ターゲッティング残基のチオール基に結合する、マレイミドまたはビニルスルホンである。好ましい態様によれば、リンカーは、上記ターゲッティング残基のリシン側鎖においてマレイミド残基と反応するチオール基を含んでなる。また、免疫接合体は、好ましくは化学療法薬残基とターゲッティング残基との間にアミノポリカルボキシレート残基を含んでなる。アミノポリカルボキシレートは、好ましくはDTPA(ジエチレントリアミン五酢酸)、EDTA(エチレンジアミン四酢酸)、TTHA(トリエチレンテトラミン六酢酸)、ベンジル-DTPA、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"'-四酢酸)、ベンジル-DOTA、NOTA(1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N',N"-三酢酸)、ベンジル-NOTAおよびTETA(1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸)からなる群から選択される。
【００２８】
化学療法薬残基は、好ましくはドキソルビシン(DOX)、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン(モルホリノ-DOX)、シアノモルホリノ-ドキソルビシン(シアノモルホリノ-DOX)、2-ピロリノ-ドキソルビシン(2-PDOX)、カンプトテシン(CPT)、イリノテカン(CPT-11)、SN-38(イン・ビボではプロドラッグCPT-11から代謝的に産生される活性薬剤)、トポテカン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、およびエポチロンからなる群から選択される。ターゲッティング残基は、モノクローナル抗体(mAb)である。
【００２９】
一つの態様によれば、ターゲッティング残基は、モノクローナル抗体(mAb)である。もう一つの態様によれば、ターゲッティング残基は多価および/または多重特異性mAbであってもよい。ターゲッティング残基は、ネズミ、キメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体であり、かつ上記抗体は、完全な断片(Fab、Fab'、F(ab)2、F (ab')2)、または小断片(一本鎖構築物)の形態である。
【００３０】
好ましい態様によれば、ターゲッティング残基は、癌または悪性細胞上で発現した抗原または抗原のエピトープと反応性のモノクローナル抗体である。
癌細胞は、好ましくは造血腫瘍(hematopoietic tumor)、癌、肉腫、黒色腫、またはグリア腫瘍由来の細胞である。
【００３１】
ターゲッティング残基は、好ましくは少なくとも1つの化学療法薬残基に結合し、さらに好ましくは約7-12個の上記化学療法薬残基に結合する。好ましいリンカーは、下式を有する。
【化１】
2006511526.tif 000002
【００３２】
リンカーは、場合によってはN末端における官能基と、C末端における水可溶化残基と、上記化学療法薬残基に結合するのに利用可能な側鎖を有する1以上の内部塩基性アミノ酸とを含んでなる。水可溶化残基は、場合によってはDTPA、EDTA、TTHA、ベンジル-DTPA、DOTA、ベンジル-DOTA、NOTA、ベンジル-NOTA、またはN,N'-ジアルキル置換ピペラジンである。官能基は、場合によってはチオール反応性またはアミン反応性基である。
【００３３】
好ましい化学療法薬残基は、ドキソルビシン(DOX)、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン(モルホリノ-DOX)、シアノモルホリノ-ドキソルビシン(シアノモルホリノ-DOX)、2-ピロリノ-ドキソルビシン(2-PDOX)、CPT、CPT-11、SN-38、トポテカン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、およびエポチロンからなる群から選択される。
【００３４】
免疫接合体を用いて、癌、悪性腫瘍および感染性病変など様々な疾患および疾病を治療することができる。本発明によって治療される好ましい悪性腫瘍は、悪性固形腫瘍または造血新生物(hematopoietic neoplasm)である。この方法を感染性病変の治療に向ける場合に、免疫接合体の好ましいターゲットは、抗原またはエピトープ、または病原体上の鉄-シデロフォアキレート受容体(ion-siderophore chelate receptor)とされる。病原体は、好ましくは細菌、真菌、ウイルス、リケッチア、マイコプラズマ、および原生動物からなる群から選択される。特に、病原体は、Streptococcus agalactiae、Legionella pneumophilia、Streptococcus pyogenes、Escherichia coli、Neisseria gonorrhosae、Neisseria meningitidis、Pneunaococcus、Hemophilis irfluenzae B、Treponema pallidum、ライム(Lyme)病スピロヘータ、Pseudomonas aeruginosa、Mycobacterium leprae、Brucella abortus、Mycobacterium tuberculosis、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器シンシチウムウイルス、帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタイン‐バー(Epstein-Barr)ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータング(bluetongoe)ウイルス、センダイ(Sendai)ウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Toxoplasma gondii、Trypanosoma rangeli、Trypanosoma cruzi、Trypanosoma rhodesiensei、Trypanosoma brucei、Schistosoma mansoni、Schistosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、Onchocerca volvulus、Leishmania tropica、Trichinella spiralis、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、Taenia saginata、Echinococcus granulosus、Mesocestoides corti、Mycoplasma arthritidis、M. hyorhinis、M. orale、M.arginini、Acholeplasma laidlawii、M. salivarium、およびM. pneumoniaeからなる群から選択することができる。
【００３５】
免疫接合体を用いて、クラスIIIの自己免疫疾患などの自己免疫疾患を治療することも可能である。本発明による治療に好ましいクラスIIIの自己免疫疾患は、免疫依存性血小板減少症、皮膚筋炎、シェーグレン(Sjogren)症候群、多発性硬化症、シデナム(Sydenham)舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス(systemic lvpus erythematosus)、ループス腎炎、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン(Henoch-Schonlein)紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎(post-streptococcal nephritis)、結節性紅斑、高安(Takayasu)動脈炎、アジソン(Addison)病、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グットパスチャー(Goodpasture)症候群、血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、原発性胆汁性肝硬変、橋本(Hashimoto)甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー(Wegener)肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ロウ、巨細胞性動脈炎/多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸状体腎炎、および繊維化肺胞炎からなる群から選択される。
【００３６】
免疫接合体は、好ましくは非経口投与される。
本発明の好ましい態様の一側面によれば、本発明は、ターゲッティング残基、化学療法薬残基、およびチオール基を介してターゲッティング残基へ、およびヒドラゾン以外の細胞内で開裂可能な残基を介して化学療法薬残基へ結合するリンカーを含んでなる、免疫接合体に関する。
【００３７】
好ましい態様によれば、ヒドラゾン以外の細胞内で開裂可能な残基は、mAbが認識しかつ受容体に結合する細胞にインターナリゼーションしたならば、開裂することができ、特にエステラーゼおよびアミダーゼによって開裂することができる残基である。
【００３８】
好ましい態様によれば、化学療法薬残基を中性pHで別個に活性化し、チオール反応性基を含むようにする。チオール反応性基を任意の化学療法薬残基に組込みうる化学的方法の開発は、通常の熟練技術者の技術の範囲内にある。しかしながら、好ましい態様によれば、化学療法薬残基を活性化し、チオール反応性基を有する基がアミノ酸基によって化学療法薬残基から、間隔を空けるようにすることができる。好ましい態様によれば、アミノ酸のα-アミノ基を、マレイミド、クロロアセタミド、ブロモアセタミド、ヨードアセタミド、およびビニルスルホンのようなチオール反応性基を有する試薬と反応させることができる。好ましくは、上記のチオール反応性基を有する試薬は、スクシンイミジル[4-マレイミドメチル]シクロヘキサン-l-カルボキシレート(SMCC)である。SMCCの場合には、チオール反応性基はマレイミド基である。SMCCとアミノ酸基を含んでなる化学療法薬残基との反応から生じる生成物は、下記に示される一般的化合物である。
【化２】
2006511526.tif 000003
(式中、Rは任意のアミノ酸の側鎖である)
【００３９】
この理論によって本発明を束縛しようとするものではないが、マレイミドシクロヘキシルカルボキシレート基は、二つの理由により、本発明の好ましい態様に関して特に有用であると思われる。第一には、リンカーのシクロヘキシル基が、SMCCとアミノ酸のα-アミノ基との反応から形成されるアミド官能基を安定化すると思われる。第二には、薬剤とアミノ酸カルボキシレートとの間に形成されたエステルは、免疫接合体が細胞中にインターナリゼーションされると、開裂する。細胞内開裂したエステル結合の一例は、パクリタキセル-MC192免疫接合体である(Gillimard and Saragovi,上記引用)。
【００４０】
本発明の好ましい態様によれば、上記に示したアミノ酸基を含んでなる化学療法薬残基はリンカー、すなわちチオール基を介してターゲッティング残基に結合するリンカーを含む。リンカーは、下記の分子の一部である。
【化３】
2006511526.tif 000004
しかしながら、本発明の好ましい態様の範囲は、それだけに限定されない。リンカーは、単にアミノ酸基とチオール反応性基とを含んでなる残基であってもよい。アミノ酸基とチオール反応性基は、上記に示した4-メチレンシクロヘキサン-l-カルボニル残基など熟練技術者に知られている任意の残基によって、その間隔を空けることができる。
【００４１】
本発明の好ましい態様の免疫接合体は、当該技術分野で周知の方法を用いて活性化した化学療法薬残基と抗体との反応から得られる。化学療法薬残基は、mAb鎖間ジスルフィド結合の還元後にチオール反応性基を介してmAbに結合させることができる。この方法は、抗体1分子当たり平均して8個の遊離チオール基を生成し、そして還元反応に用いられる範囲内のチオールの再現的にその通りとなる。
【００４２】
抗体のリシン基への接合のために、抗体を最初に誘導化し、チオール反応性基を含むようにして、チオール基を含む化学療法薬残基を用いる。mAbのリシン基の修飾によって抗体にチオール基を導入する方法は、当該技術分野で周知である(Govindan et al. Bioconjugate Chemistry, 7:290-297, 1996; Wong 「タンパク質接合および架橋の化学(Chemistry of protein conjugation and cross-linking)」, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1991), pp 20-22)。この方法では、二官能価化学療法薬残基を抗体断片および一本鎖構築物などの小断片に接合させる。逆に、化学療法薬残基は、還元したmAbの(複数の)チオールと反応するチオール反応性基を含む。
【００４３】
ターゲッティング残基は、好ましくは抗体(完全なヒト、非ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体など)または抗体断片(酵素的にまたは組換えによって産生した断片など)、および抗体または抗体断片からの配列を組込む結合性タンパク質である。抗体、断片、および結合性タンパク質は、上記で定義したように多価および多重特異性、または多価および単一特異性であることができる。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、ターゲット細胞上で高水準で発現しかつ正常組織と対比して主として疾患細胞にて発言するかまたは疾患細胞でのみ発現するマーカーまたは腫瘍関連抗原を認識しまたはに結合するmAbのような抗体、および速やかにインターナリゼーションする抗体を用いる。本発明の範囲内で有用な抗体としては、上記のような特性を有する(および細胞および微生物中への様々なレベルのインターナリゼーションの顕著な特性を示す)mAbが挙げられ、癌においては以下のmAb、すなわちLL1(抗CD74)、LL2(抗CD22)、RS7(抗上皮糖タンパク質-l(EGP-l))、PAM-4およびKC4(いずれも抗MUC1)、MN-14(抗癌胎児性抗原(CEA、CD66eとしても知られる)、Mu-9(抗結腸特異性抗原-p)、Immu 31(抗α-フェトプロテイン)、TAG-72(例えば、CC49)、Tn、J591(抗PSMA(前立腺特異性膜抗原))、G250(抗カルボニックアンヒドラーゼIX mAb)、およびL243(抗HLA-DR)の使用が意図されるが、これらに限定されない。これらの接合体を用いてターゲッティングすることができる他の有用な抗原としては、HER-2/neu、BrE3、CD19、CD20(例えば、C2B8、hA20、1F5 Mab)、CD21、CD23、CD80、α-フェトプロテイン(AFP)、VEGF、EGF受容体、P1GF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4, PSMA、ガングリオシド、HCG、EGP-2(例えば、17-1A)、CD37、HLA-DR、CD30、Ia、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、S100、PSA(前立腺特異性抗原)、テネイシン、葉酸受容体、Thomas-Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、Ga 733、IL-2、IL-6、T101、MAGE、L243が結合する抗原、CD66抗原、すなわち、CD66a-d、またはそれらの組合せが挙げられる。CD66抗原は、類似構造を有する5つの異なる糖タンパク質CD66a-eからなり、これらは、それぞれ癌胎児性抗原(CEA)遺伝子ファミリーBCG、CGM6、NCA、CGM1およびCEAによってコードされるこれらのCD66抗原は、主として顆粒球、消化管の正常な上皮細胞、および様々な組織の腫瘍細胞で発現する。多数の上記抗原は、2002年11月15日出願の「治療薬の標的設定送達のための多重特異性の非共有複合体の使用」という標題の米国仮出願連続番号第60/426,379号明細書に開示されている。
【００４５】
本発明の他の好ましい態様によれば、速やかにインターナリゼーションした後に細胞表面上で再発現し、加工され、提供される抗体を用いて、循環する免疫接合体の細胞による連続的摂取および癒着を可能とする。最も好ましい抗体/抗原対の一例は、抗CD74 mAb(不変鎖のクラスII特異性シャペロン、Ii)であるLL1である。CD74抗原は、B細胞リンパ腫、ある種のT細胞リンパ腫、黒色腫、およびある種の他の癌(Ong et al., Immunology 98:296-302 (1999))、並びにある種の自己免疫疾患にて高度に発現する。
【００４６】
抗CD74抗体で好ましく治療される疾患としては、非Hodgkinリンパ腫、黒色腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。CD74抗原をターゲット細胞の表面上で短時間連続発現した後、その抗原をインターナリゼーションし、その抗原を再発現することによって、ターゲッティングされたLL1抗体を、「ペイロード」として含む任意の化学療法薬残基と共にインターナリゼーションすることができる。これにより、高治療濃度のLLl-化学療法薬免疫接合体をこれらの細胞内に蓄積させることができる。インターナリゼーションしたLL1-化学療法薬免疫接合体はリソソームおよびエンドソーム中循環し、化学療法薬残基をターゲット細胞中において活性形態で放出する。
【００４７】
他の態様によれば、本発明は、本発明の好ましい態様の治療薬接合体の治療上有効量を患者に投与することを含んでなる、患者の治療方法に関する。本発明の好ましい態様の治療薬接合体で治療することができる疾患としては、B細胞悪性腫瘍(例えば、LL2 mAbを用いる非Hodgkinリンパ腫および慢性リンパ性白血病、米国特許第6,183,744号明細書参照)、内胚葉由来の消化管上皮の腺癌、乳癌および非小細胞肺癌のような癌、および他の癌、肉腫、グリア腫瘍、骨髄性白血病などが挙げられるが、これらに限定されない。特に、抗原、例えば、消化器、肺、乳、前立腺、卵巣、精巣、脳またはリンパ腫瘍のような悪性固形腫瘍または造血新生物によって産生されるまたはと関連した腫瘍胎児性抗原）、に対する抗体が有利に用いられる。
【００４８】
本明細書で用いられる「患者」という用語は、哺乳類などこれらに限定されない任意の動物(すなわち、脊椎動物および無脊椎動物)を表す。患者という用語は、齧歯類(例えば、マウス、ラットおよびモルモット)も包含する。この用語は特定の年齢または性別に限定されることを意味しない。従って、成熟したおよび新生患者、並びに胎児は、雄または雌に関わらずこの用語によって包含される。
【００４９】
他の好ましい態様によれば、本発明の好ましい態様のMu-9 mAbを含んでなる治療薬接合体を用いて、2002年4月5日出願の米国特許出願連続番号第10/116,116号明細書およびGold et al.(Cancer Res. 50:6405 (1990)、およびそこに引用されている文献)に開示されている結直腸並びに膵臓および卵巣の癌を治療することができる。さらに、2002年6月14日出願の米国仮出願連続番号第60/388,314号明細書に開示されているように、本発明の好ましい態様のPAM-4mAbを含んでなる治療薬接合体を用いて、膵臓癌を治療することができる。
【００５０】
他の好ましい態様によれば、2002年3月1日出願の米国仮出願連続番号第60/360,229号明細書およびStein et l. (Cancer Res. 50:1330 (1990)、およびAntibody Immunoconj. Radiopharm. 4:703 (1991))に開示されているように、好ましい態様のRS-7 mAbを含んでなる治療薬接合体を用いて、肺、胃、膀胱、乳、卵巣、子宮、および前立腺の癌などの癌を治療することができる。
【００５１】
他の好ましい態様によれば、2002年8月1日出願の米国仮出願連続番号第60/399,707号明細書に開示されているように、好ましい態様の抗AFP mAbを含んでなる治療薬接合体を用い、ヒト化、キメラおよびヒト抗体形態を用いて、肝細胞癌、生殖細胞腫瘍、および他のAFP産生腫瘍を治療することができる。
【００５２】
他の好ましい態様によれば、抗テネイシン抗体を含んでなる治療薬接合体を用いて造血および固形腫瘍を治療することができ、Le(y)に対する抗体を含んでなる接合体を用いて、固形腫瘍を治療することができる。
【００５３】
他の好ましい態様によれば、本発明の好ましい態様の治療薬接合体を用いて治療することができる疾患としては、2002年3月1日出願の米国仮出願連続番号第60/360,259号明細書に開示されているように、急性の特発性血小板減少性紫斑病および慢性の特発性血小板減少性紫斑病のような免疫依存性血小板減少症、皮膚筋炎、シェーグレン(Sjogren)症候群、多発性硬化症、シデナム(Sydenham)舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ‐シェーンライン(Henoch-Schonlein)紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎(post-streptococcal nephritis)、結節性紅斑、高安(Takayasu)動脈炎、アジゾン(Addison)病、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グットパスチャー(Goodpasture)症候群、血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、シェーグレン(Sjogren)症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本(Hashimoto)甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活性肝炎、慢性関節リウマチ、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェグゲナー(Wegener)肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ロウ、巨細胞性動脈炎/多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸状体腎炎、および繊維化肺胞炎のようなクラスIII自己免疫疾患などの免疫調節不全疾患および関連自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。これらの疾患に有用な典型的抗体としては、HLA-DR抗原B細胞抗原(例えば、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、CD80、CD126、B7、MUC1、Ia、HM1.24、およびHLA-DR)と反応性であるものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの自己免疫疾患の多くは異常型B細胞個体群によって作製された自己抗体によって影響を受ける。本発明で用いられる薬剤と結合した抗体
を伴う治療薬接合体によってこれらB細胞を涸渇させることは、特にB細胞抗体をある情況においてHLA-DR抗体および/またはT細胞抗体(抗TAC抗体のようなIL-2を抗原としてターゲットとするものなど)と結合させるときには、自己免疫疾患治療において好ましい方法である。
【００５４】
他の好ましい態様によれば、病原体に対する抗体が知られているので、好ましい態様の治療薬接合体を病原体に対して用いることができる。感染性病変(例えば、細菌、リケッチア、マイコプラズマ、原生動物、真菌およびウイルスのような病原体によって引き起こされるウイルス、細菌、真菌および寄生生物の感染症など)によって産生されるかまたは感染性病変と、関連したマーカーを、特異的に結合する抗体および抗体断片、および上記のような微生物と関連した抗原および産物は、とりわけHansen et al.の米国特許第3,927,193号明細書およびGoldenbergの米国特許第4,331,647号明細書、第4,348,376号明細書、第4,361,544号明細書、第4,468,457号明細書、第4,444,744号明細書、第4,818,709号明細書、および第4,624,846号明細書に開示されている。好ましい態様によれば、病原体は、米国特許第6,440,416号明細書に開示されているように、Streptococcus agalactiae、Legionella pneumophilia、Streptococcus pyogenes、Escherichia coli、Neisseria gonorrhosae、Neisseria meningitidis、Pneumococcus、Hemophilis influenzae B、Treponema pallidum、ライム(Lyme)病スピロヘータ、Pseudomonas aeruginosa、Mycobacteriuna leprae、Brucella abortus、Mycobacterium tuberculosis、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器シンシチウムウイルス、帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタイン‐バー(Epstein-Barr)ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、疣ウイルス、ブルータングウイルス、センダイ(Sendai)ウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Toxoplasma gondii、Trypanosoma rangeli、Trypanosoma cruzi、Trypanosoma rhodesiensei、Trypanosoma brucei、Schistosoma mansoni、Schistosoma japanicum、Babesia bovis、Elmeria tenella、Onchocerca volvulus、Leishmania tropica、Trichinella spiralis、Theileria parva、Taenia hydatigena、Taenia ovis、Taenia saginata、Echinococcus granulosus、Mesocestoides corti、Mycoplasma arthritidis、M. hyorhinis、M. orale、M. arginini、Acholeplasma laidlawii、M. salivarium、およびM. pneumoniaeからなる群から選択される。
【００５５】
一つの態様によれば、抗体はグラム陰性菌病原体による感染に対して用いるためのシデロフォア(shiderophore)成分を組込む化学接合体として送達される。シデロフォアは鉄とキレート形成する、ジまたはトリアミンのビスカテコレートであり、送達ビヒクルとして用いられる。シデロフォアの鉄キレートは細菌膜状の特異的受容体によって認識され、細菌細胞内部の活性輸送をもたらす(Heinisch et al., J. Medicinal Chemistry, 45:3032-3040, 2002)。本発明に関しては、ペプチドは、N末端として保護されたリシンを有するものが構成される。次に、樹脂支持体から遊離するペプチドのカルボキシル末端を活性化して、ペニシリンNのようなアミンを含む抗生物質にカップリングさせる。N末端の保護基を開裂した後、N末端リシンのアミノ基を2,3-ジアセトキシベンゾイルクロリドに接合させて、必要なビスカテコレートを付加したペニシリン接合体を最終的に生じる。カテコール残基のジアセチル誘導体は、シデロフォア成分としても有効である(Heinisch et al., 上記引用)。
【００５６】
好ましい態様によれば、ヒトの疾患の治療に用いられる抗体は、抗体のヒトまたはヒト化(CDRを移植した)誘導体であるが、抗体のネズミおよびキメラ誘導体を用いることができる。家畜での使用には、同一種のIgGが最も効果的なベクターであると思われるが、交差種IgGも有用である。送達剤と同じ種のIgG分子は、免疫応答を最小限にするのに一般に好ましい。これは、反復治療を考えるときには特に重要である。ヒトにおいては、ヒトまたはヒト化IgG抗体は患者から抗IgG免疫応答を余り生成しない。インターナリゼーション抗原をターゲッティングすると、hLL1およびhLL2のような抗体はターゲット細胞に結合した後に速やかにインターナリゼーションするが、これは、運ばれる化学療法薬が細胞に速やかにインターナライズされることを意味している。しかしながら、インターナリゼーションの速度が遅い抗体を用いて、本発明による選択的療法を行うこともできる。
【００５７】
本発明の好ましい態様によれば、細胞および病原体への一層効果的な組込みを多価で多重特異性または多価で単一特異性の抗体を用いることによって行うことができる。多価とは、細胞上で発現した同一または異なる抗原またはエピトープに対して数本の結合アームを用いることを意味し、一方、多重特異性抗体はターゲッティングした細胞または病原体に含まれる少なくとも2個の異なる抗原またはエピトープをターゲッティングするのに複数の結合アームを用いること含む。このような二価で二重特異性の抗体の例は、2002年8月1日出願の米国特許出願第60/399,707号明細書、2002年3月1日出願の第60/360,229号明細書、2002年6月14日出願の第60/388,314号明細書、および2002年4月5日出願の第10/116,116号明細書に見出され、上記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００５８】
本発明の好ましい態様によれば、カンプトテシン(CPT)およびその誘導体は好ましくは化学療法薬残基であるが、本発明はそれに限定されない。本発明の範囲内にある他の化学療法薬残基は、タキサン(例えば、バカチンIII、タキソール)、エポチロン、アントラサイクリン薬(ドキソルビシン(DOX)、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン(モルホリノ-DOX)、シアノモルホリノ-ドキソルビシン(シアノモルホリノ-DOX)、および2-ピロリノドキソルビシン(2-PDOX); Priebe W(監修), ACSシンポジウムシリーズ574, American Chemical Society刊, Washington D.C., 1995. (332pp)、およびNagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2464-2469, 1996参照)、ゲルダナマイシンのようなベンゾキノイドアンサマイシン(DeBoer et al., Journal of Antibiotics 23:442-447, 1970; Neckers et al., Invest. New Drugs 17:361-373, 1999)などである。好ましくは、本発明の好ましい態様の免疫接合体において、ターゲッティング残基は少なくとも1つの化学療法薬残基、好ましくは1-約5個の化学療法薬残基、最も好ましくは、約7-約12個の化学療法薬残基に結合する。
【００５９】
CPT誘導体は、1つのクラスの強力な抗腫瘍薬である。イリノテカン(CPT-11とも表される)およびトポテカンは、認可された癌治療薬であるCPT類似体である(Iyer and Ratain, Cancer Chemother. Phamcol. 42:S31-S43 (1998))。CPTは、トポイソメラーゼI-DNA複合体を安定化することによりトポイソメラーゼI酵素を阻害することによって作用する(Liu, et al.「カンプトテシン: その抗癌力の解明(The Camptothecins: Unfolding Their Anticancer Potential)」, Liehr J.G., Giovanella, B.C. and Verschraegen (監修), NY Acad. Sci., NY (2000), pp 1-10)。
【００６０】
CPTについて、免疫接合体の調製において一組の補足説明を示す。一つの補足説明とは、水性緩衝液でほとんどのCPT誘導体が不溶性であることである。第二には、CPTは、高分子に接合するのに構造的変更の選択肢が極めて少ない。例えば、CPT自身は、環Eに第三ヒドロキシル基を1個しか含まない。CPTの場合のヒドロキシル官能基は、その後のタンパク質接合に適用されるリンカーにカップリングさせなければならない。第三には、それらの構造におけるE環のδラクトン残基が生理学的条件下では不安定であり、これら物質における抗腫瘍能が著しく減少する。従って、接合法は7以下のpHで行い、ラクトン環の開環を回避するように行われる。活性エステルのようなアミン反応性基を有する二官能価CPTの典型的な接合には、pHが8以上である必要がある。第四には、細胞内で開裂可能な残基は、CPTと抗体とを接続するリンカー/スペーサーに組込む必要がある。
【００６１】
生理学的条件下でのδラクトン開環の問題は、以前に説明した。一つの方法は、C-20ヒドロキシル基をアミノ酸でアシル化し、そのアミノ酸のα-アミノ基をポリ-L-グルタミン酸にカップリングすることであった。この方法は、ポリマー分子の腫瘍部位への受動拡散に依存している。このグリシン接合は、CPTの水溶性誘導体の作製方法(米国特許第4,943,579号明細書)として、およびCPTのPEG-誘導体形成の調製(Greenwald, et al., J. Med. Chem. 39:1938-1940 (1996))においても報告されている。後者の場合には、この方法は、水溶性で長期作用性形態のCPTの開発において発明され、これによってCPTのイン・ビボでの半減期が増し、薬剤がイン・ビボで循環している間にその接合体から徐々に放出される。
【００６２】
好ましい態様によれば、本発明は、上記の4つの補足説明を考慮した、CPTの免疫接合体の調製方法を提供する。本発明の好ましい態様は、下記の方法で補足説明を扱うものである。第一に、CPTの水溶性は、アミノポリカルボキシレートを化学療法薬残基(すなわち、CPT)と抗体の間に配置することによって増加する。好ましい態様によれば、アミノポリカルボキシレートは、DTPA(ジエチレントリアミン五酢酸)、NOTA(1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N',N"-三酢酸)、DOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N",N"'-四酢酸)、およびTETA (1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸)からなる群から選択される。
【００６３】
好ましい態様によれば、アミノポリカルボキシレートはDTPAである。特に好ましい態様によれば、DTPAは、これを有する試薬を介して化学療法薬残基に結合している。好ましくは、アミノポリカルボキシレートを有する上記試薬は、
【化４】
2006511526.tif 000005
(式中、「Trt」はトリチル基であり、カルボキシレート上のR基は水素またはアルキルであり、アルキルは直鎖状または分岐鎖状のC1-C6-アルキル基を意味する)である。通常の熟練技術者であれば、本発明の好ましい態様の実施に有用なアミノポリカルボキシレートを有する他の試薬を開発することができる。ハプテンを有する試薬は、当該技術分野で周知の方法により、チオ尿素残基のカルボン酸を介して化学療法薬残基に結合させることができる。当該技術分野で周知のこのような方法を、実施例8に記載する。Rがアルキルである場合には、エステルを脱保護して、最終的に相当するDTPA誘導体を得る。
【００６４】
アミノポリカルボキシレートを有する試薬は、直接またはアミノ酸スペーサーを介して化学療法薬残基に結合させることができる。好ましい態様では、アミノポリカルボキシレートは、グリシンスペーサーを介して、さらに好ましくはバリンスペーサーを介して化学療法薬残基に結合される。さらに立体傷害の大きいバリネートを用いることによって、加水分解的に安定な残基が提供されることが示されている(Lerchen H-G et al., J. Med. Chem. 44:4186-4195 (2001))。C-20ヒドロキシルのエステルとしての誘導体形成は、ジペプチドまたはポリペプチドを伴うこともできる。化学療法薬残基が10-ヒドロキシCPTであるときには、グリシルスペーサーを下記の実施例7に示されるようにA環のヒドロキシル基またはC-20ヒドロキシル基に結合させ、最も好ましくは、上記したグリシルまたは他のスペーサーはC-20ヒドロキシル基に結合している。
【００６５】
好ましい態様では、化学療法薬残基の水溶性は、化学療法薬残基上のヒドロキシル基に下記の残基(A)
【化５】
2006511526.tif 000006
(式中、「PEG」はポリエチレングリコールを表す)を組込むことによって増加する。この残基は化学療法薬残基の水溶性を増加させるだけでなく、チオール反応性基も組込む。10-ヒドロキシCPTの場合には、上記残基をA環ヒドロキシル基またはC-20ヒドロキシル基で結合させることができる。
【００６６】
C-20ヒドロキシルに結合させるには、C-10ヒドロキシルを最初に保護する。次に、C-20ヒドロキシルを、例えば、グリシネートエステルに転換させる。この時点で、C-10ヒドロキシルは脱保護してよい。次いで、C-20グリシネートエステルの遊離アミノ基を適当に合成して、例えば、細胞内Cathepsin B酵素によって認識されかつ開裂する細胞内で開裂可能な「Phe-Lys」ジペプチド結合を含むようにすることができる。次に、上記で示されたPEG含有残基を、C-20グリシネート-Phe-Lysジペプチドの末端の遊離アミノ基に組込む。
【００６７】
第二に、δ-ラクトンを、アミノ酸基でC-20ヒドロキシル基を誘導体形成することによって安定させる。CPTのC-20ヒドロキシルにおけるアミノ酸リンカー/スペーサーの使用は、チオール反応性残基を有するアミンのさらなる合成に有利である。さらに、アミノ酸リンカー/スペーサーは、細胞内で開裂可能な残基として作用する。この時点で、免疫接合体は、細胞内で活性化されるプロドラッグに事実上なる。すなわち、免疫接合体からの化学療法薬残基の放出は、免疫接合体の腫瘍特異性抗原への結合、その後のインターナリゼーション、リソソームコンパートメントへのルーティング、およびリソソーム酵素による接合体の最終処理による薬剤の放出によって変化する。
【００６８】
最後に、この接合法は、中性または酸性pHで容易に起こるチオール-マレイミドまたはチオール-ビニルスルホン反応に基づいている。これにより、例えば、活性エステルを用いるときに必要とされるような接合のためにpH条件を一層高くする必要がなくなる。
【００６９】
他の態様によれば、本発明は、水可溶化残基とチオール反応性残基(例えば、マレイミド基)を本発明の好ましい態様の免疫接合体へ導入するためのモジュール法に関する。水可溶化残基とチオール反応性残基は、MCC-Gly-Lys-Lys(R')-NH2(上記式中、MCCは4-マレイミドメチル-シクロヘキシル-1-カルボニル(SMCCから誘導された特別なマレイミド誘導体)であり、R'はアミノポリカルボキシレート(例えば、DTPA)またはピペラジンの誘導体のような水可溶化物質である)のような鋳型上に好適に導入される。上記態様で既に示されたようにアミノ酸またはジペプチドを用いることによるC-20ヒドロキシルでのエステルとしてのCPTまたはその類似体の誘導体形成によって、活性化に利用可能なアミノ基が生じる。このアミノ基を当該技術分野で周知の方法によってイソチオシアナート基に転換し、後者を上記のペプチド鋳型の内部リシン残基の側鎖アミノ基に結合させる。この方法で、水可溶化基と抗体反応性基が単一段階で付加される。さらに、ペプチド鋳型を変更して2個以上の中心リシンまたはアルギニンのような他の側鎖アミンを含むアミノ酸を含むようにすることによって、複数の化学療法薬残基を付加することができる。
【００７０】
上記方法を用いて、1-5個、さらに好ましくは1-2個の化学療法薬残基をリンカーに導入することができると考えられる。
【００７１】
さらに他の好ましい態様によれば、pHに感受性の細胞内で開裂可能な残基を、ターゲッティング残基を化学療法薬残基に結合するリンカーとして用いる。この方法の利点は、化学療法薬残基の腫瘍内放出が、ターゲッティング残基を化学療法薬残基に結合させる細胞内で開裂可能な残基の結合を開裂させるための特異的酵素の発現の程度によらないことである。
【００７２】
例えば、CPTの20-ヒドロキシル基を、ジヒドロピラン残基、テトラヒドロフラン残基、またはチオール反応性残基(例えば、マレイミド)および水可溶化基(例えば、ピペラジン)をも含んでなるオルトエステルを含んでなるpH感受性の細胞内で開裂可能な残基に酸触媒下で結合させることができる。チャート1を参照されたい。ジヒドロピラン、テトラヒドロフラン、またはオルソエステル残基を含んでなるpH感受性の細胞内で開裂可能な残基は、総て細胞内コンパートメントの酸性pHで開裂されやすいエーテル結合を含んでなる。
【００７３】
下図の構造1のリンカーを用いる。この実施例では、中心のピペラジン部分は水溶性を考慮している。この分子の「左端」における置換ジヒドロピランはCPT誘導体における(複数の)ヒドロキシル基へカップリングするためのものであり、この分子の「右端」のマレイミドはジスルフィドで還元した抗体へ接合するためのプロトタイプのチオール反応性基である。本明細書において、「CPT」は一般的用語として用いられ、チャートに示されるように、CPT、10-ヒドロキシ-CPT、またはSN-38となることができる。10-ヒドロキシ-CPTおよびSN-38の場合には、誘導体形成は10-ヒドロキシおよび20-ヒドロキシ位の両方で予想することができる。CPTは、テトラヒドロピラン残基を介して架橋剤に結合する。この結合はpH 4-6で徐々に開裂するが、6を上回るpHでは安定である(Greene TW, Wuts PGM著「有機合成における保護基(Protective groups in organic synthesis)」, 第2版; John Wiley & Sons: New York, 1991; pp 413-416)。この方法は、細胞内コンパートメントが酸性であり、通常は約5であることを利用している(Poznansky MJ and Juliano RL, Pharmacol Rev 36:277-336, 1984)。細胞内コンパートメントにおけるこの酸性pHによって、抗体から薬剤を無傷で放出される。
【００７４】
上記のように、テトラヒドロフラニル残基は、pH感受性の細胞内で開裂可能な残基の不可欠な部分と考えられる(Greene TW, Wuts PGM著「有機合成における保護基(Protective groups in organic synthesis)」, 第2版; John Wiley & Sons: New York, 1991; pp 267-269)。pH感受性の細胞内で開裂可能な残基がテトラヒドロフラニル残基を含んでなるときには、CPT C20-酸素-テトラヒドロフラン結合はテトラヒドロピラニル残基を用いるときより速やかに開裂する。
【００７５】
【化６】
2006511526.tif 000007
本発明の好ましい態様の免疫接合体の投与の適当な経路としては、経口、非経口、直腸、経粘膜、腸投与、筋肉内、皮下、骨髄内、髄腔内、直接心室内、静脈内、ガラス体内、腹腔内、経鼻、または眼内投与が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路は非経口である。あるいは、化合物を例えば固形腫瘍に直接注射することによって、化合物を全身的よりは局所的に投与することができる。
【実施例】
【００７６】
本発明を下記の実施例によって説明するが、発明の範囲を制限するものではない。
実施例
実施例1：10ヒドロキシカンプトテシンのC-20-O-(N-'MCC')グリシネート誘導体であって、MCCが4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-l-カルボニル残基であるものの調製
【化７】
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10-ヒドロキシカンプトテシン(0.2081g; 0.57ミリモル)を、無水ジメチルホルムアミド(DMF)20mlおよびジイソプロピルエチルアミン(DIEA)0.22mlに加えた。これに4-ニトロフェニルクロロホルメート0.1248g(0.619ミリモル)を加え、反応混合物をアルゴン下室温にて4時間攪拌した。4-ピペリジノピペリジン(0.2403g)をDMF 4mlに溶解したものを一度に加え、混合物をさらに2時間攪拌した。溶媒を留去すると粗生成物が得られ、これをシリカゲル(230-400メッシュ)上でフラッシュクロマトグラフィーによってメタノール-ジクロロメタングラディエント溶出を用いて精製し、中間体2 52.8mgを得た。電子スプレー質量スペクトルでは、ポジティブイオンモードでm/e 559に明確なピーク(M+H)を示し、ネガティブイオンモードでm/e 557に(M-H)および593に(M+Cl)のピークを示した。中間体2 (25mg)を、ジクロロメタン(DCM)10ml中でBOC-グリシン(8.9mg)、N,N-ジメチルアミノピリジン(DMAP) (2mg)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(DIC)(1Mジクロロメタン溶液0.058ml)と18時間(室温、アルゴン下で)反応させた。反応混合物を処理して、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、C-20-O-(BOC)グリシネートを約50%の収率で得た。この生成物をトリフルオロ酢酸(TFA)の10% DCM溶液と1-2時間反応させ、20-O-グリシネート誘導体を得た。これを、1.2モル当量のスクシンイミジルマレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)および1.5当量のDIEAを用いてDMF中で約3時間(室温、アルゴン下で)誘導体形成させた。溶媒を留去し、フラッシュクロマトグラフィーを行ったところ、7.8mgの純粋な3をゴム状固形物として回収した。分析用HPLC(C18カラム、3ml/分で10分間で溶液Aから溶液「B」に変化するグラディエント溶出の後、100%「B」に5分間保持;「A」: 0.1% TFA水溶液;「B」:90% CH3CN/0.1% TFA)は、単一ピーク9.48分(360nmの吸光度)を示した。電子スプレー質量スペクトルは、m/e 835に(M+H)の質量ピークを示した。
【００７７】
実施例2：イリノテカン(CPT-11)のC-20-O-(N-'MCC')グリシネート誘導体であって、MCCが4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボニル残基であるものの調製
【化８】
2006511526.tif 000009
CPT-11 (4)から出発して、BOC-グリシンと反応させ(精製生成物は電子スプレー質量スペクトルにおいてm/e 744にM+Hを示した)、TFAで脱保護し(質量スペクトルにおいてm/e 644にM+Hピーク)、実施例1と同様にしてSMCCにカップリングすることによって、3段階処理法で生成物5を調製した。生成物は、実施例1と同様にして精製した。最終生成物5は、ポジティブイオンモード電子スプレー質量スペクトルにおいてm/e 863に強いピークを示し、分析用HPLCでは9.69分に明瞭なピークを示した。純粋な生成物5は白色固形物として得られ、25mgの量で生成した。
【００７８】
実施例3：10-ピペラジノカルボニルオキシカンプトテシン(6)の調製およびヘテロ二官能価ポリ(エチレングリコール),マレイミド-PEG-NHSへのそのカップリング
【化９】
2006511526.tif 000010
図3における中間体6の調製は、図1における2の調製の行程に沿ってピペリジノピペリジンの代わりにピペラジンを用いて行った。フラッシュクロマトグラフィー精製の後、6を43.3%の収率(橙色固形物)で得た。電子スプレー質量スペクトルは、m/e 477にM+Hを示し、m/e 475にM-H (ネガティブイオンモード)を示した。7を調製するため、前駆体6を0.5モル当量のポリ(エチレングリコール-α-N-ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート,(β-マレイミド, MW 3400 (Shearwater Polymers, Huntsville, ALから入手)とDMF中で混合し、30分間インキュベーションした。反応混合物は、そのまま精製せずに用いた。活性化したCPTのモル含量は、使用した限定的PEG試薬のモル含量と等しいと考えた。
【００７９】
実施例4：CPT誘導体3または5または7をモノクローナル抗体と接合させるための一般的手順
抗体を、20-40倍モル過剰量のジチオトレイトールおよびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)(約5mM最終濃度)でpH 7.4で処理し、アルゴンを流し、37℃で45分間インキュベーションした。冷却した内容物を、遠心分離溶出条件(遠心分離SEC)下にて50mM酢酸ナトリウム-150mM塩化ナトリウム, pH 5.3(「ABS緩衝液」)中Sephadex G50/80の2本の連続した3mlカラムで精製した。溶出液を280nmでの吸光度を用いてタンパク質濃度について分析し、チオール含量をEllman分析法によって分析した。還元抗体は7-9チオール基を含んでいた。還元抗体を20倍モル過剰量のCPT誘導体とDMF中で反応させ、接合混合物中のDMFの最終濃度が≦5%v/vとなるようにし、氷上(約4℃)で20-30分間インキュベーションした。Sephadex G50/80上ABS緩衝液で2回連続して遠心分離-SEC精製を行った後、溶出液を疎水性カラムを通過させて非共有結合CPT誘導体を除去し、最終的接合体を得た。7を用いる接合体の場合には、さらに30K MWCO遠心分離フィルター上での限外濾過による精製が必要であった。総ての調製物において、反応混合物並びに精製接合体は透明溶液であり、CPT誘導体の水溶性が用いられたことを示していた。SE-HPLCによる分析は、ガードカラムとイン・ライン吸光度検出器を備えた分析用SEC250カラム上で溶離剤として0.2Mリン酸ナトリウムpH 6.8および流速として1ml/分を用いて行った。生成物は、260-540nmの領域で分光光度法による吸光度掃引によっても分析した。360nmでの吸光度をCPT-11標準品で得られた吸光度で補正して、接合体におけるCPT濃度を決定した。CPT誘導体からのスピルオーバー(spillover)について補正した280nmでの吸光度を用いて、抗体濃度を計算した。この方法で、CPT誘導体対IgGのモル比を決定した。生成物を10 %(v/v)の1Mスクロースと混合し、1mgおよび0.1mgずつのロットに等分し、凍結乾燥した。凍結乾燥した調製物をアルゴン置換した後、冷凍庫に保管した。
【００８０】
実施例5：10-ヒドロキシCPT, 3の誘導体のMAb接合体
接合体は、実施例4に記載の方法で調製した。下記のものは、様々な接合体に関するデーターである。
【００８１】
3のネズミLL2 (抗CD-22 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾LL2の保持時間に溶出する単一ピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 1.6%。接合体における3のモル置換(すなわち、3対IgG比)は、吸光度掃引により8.3であり、MALDI質量スペクトル分析により6であった。
【００８２】
3のネズミLL1 (抗CD-74 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾LL1の保持時間に溶出する単一ピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 2.5%。接合体における3のモル置換(すなわち、3対IgG比)は、吸光度掃引により7.9であった。
【００８３】
3のネズミRS7(抗EGP-1 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾RS7の保持時間に溶出する単一ピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 1.4%。接合体における3のモル置換(すなわち、3対IgG比)は、吸光度掃引により6.9であった。
【００８４】
3のヒト化LL2(抗CD-22 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾hLL2の保持時間に溶出する単一ピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 0%。接合体における3のモル置換(すなわち、3対IgG比)は、吸光度掃引により7.1であった。
【００８５】
3のヒト化AFP31(抗AFP MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾hAFP31の保持時間に溶出する単一ピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 0%。接合体における3のモル置換(すなわち、3対IgG比)は、吸光度掃引により8.0であった。
【００８６】
実施例6：CPT-11, 5の誘導体のMAb接合体
接合体は、実施例4に記載の方法で調製した。下記のものは、様々な接合体に関するデーターである。
【００８７】
5のネズミLL2 (抗CD-22 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾LL2の保持時間に溶出する単一ピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 2.2%。接合体における5のモル置換(すなわち、5対IgG比)は、吸光度掃引により9.7であった。
【００８８】
5のネズミLL1 (抗CD-74 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、未修飾LL1の保持時間に溶出するピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 8.8%。接合体における5のモル置換(すなわち、5対IgG比)は、吸光度掃引により10.9であった。
【００８９】
5のネズミ MN-14 (抗CEA MAb)接合体: 360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、未修飾MN-14の保持時間に溶出するピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 9.3%。接合体における5のモル置換(すなわち、5対IgG比)は、吸光度掃引により10.0であった。
【００９０】
5のヒト化LL2(抗CD-22 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、主として未修飾hLL2の保持時間に溶出するピークを示し、後者は280nmに設定した検出により同一条件下で分析した。総含量: 0%。接合体における5のモル置換(すなわち、5対IgG比)は、吸光度掃引により8.4であった。
【００９１】
実施例7：10-ヒドロキシCPT, 7のPEG-誘導体のMAb接合体
接合体は、実施例4に記載の方法で調製した。下記のものは、様々な接合体に関するデーターである。
【００９２】
7のネズミLL2 (抗CD-22 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、未修飾LL2の保持時間附近に溶出するピーク(83%)を示し、総含量は16.3%であった。接合体における7のモル置換(すなわち、7対IgG比)は、吸光度掃引により8.0であった。
【００９３】
7のネズミLL1 (抗CD-74 MAb)接合体:  360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、未修飾LL1の保持時間附近に溶出するピーク(94%)を示し、総含量は6.0%であった。接合体における7のモル置換(すなわち、7対IgG比)は、吸光度掃引により8.1であった。
【００９４】
7のネズミ RS7 (抗EGP-1 MAb)接合体: 360nmのCPT最大吸光度に設定した吸光度検出によるSE-HPLC分析は、未修飾RS7の保持時間附近に溶出するピークを示し、総含量は9.3%であった。接合体における7のモル置換(すなわち、7対IgG比)は、吸光度掃引により8.0であった。
【００９５】
実施例8：抗体上のリシンまたはチオール基への接合に適するアミノポリカルボキシレートを付加した二官能価CPTの調製の一般的方法
一般的方法は、図4に示す。簡単に説明すれば、CPTおよび10-ヒドロキシ-CPTをSingerの方法(上記引用)によって相当するC-20-O-グリシネートに転換した。平行合成において、イソチオシアナトベンジルDTPAペンタ第三ブチルエステルを相当するアミン前駆体から生成させた後、S-トリチルシステインにカップリングした。フラッシュクロマトグラフィー精製により、中間体11(質量スペクトル: M+Na m/e 1207; M-H:1183)を得た。
【００９６】
次に、中間体11をCPT誘導体9にカップリングさせた。第三ブチルカチオンを捕捉するためのスカベンジャーを用いてカルボキシレートの第三ブチル基とS-トリチル基をTFAによる脱保護を行った後、IgGに付加したマレイミド基への接合に適するDTPAを付加した二官能価CPT誘導体(R = HまたはOH)を得た。
【００９７】
チオール基は、過剰のジビニルスルホンで誘導体形成して、ビニルスルホン基を有する中間体を生成させ、これはジスルフィド還元した抗体のチオール基への接合に適する。
【００９８】
中間体13は、これらの変換においてイソチオシアナトベンジルDTPAの代わりに用いることができるアミノポリカルボキシレートのもう一つの例である。
【化１０】
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【００９９】
実施例9：SN-38接合体の調製方法
SN-38は、プロドラッグCPT-11からイン・ビボで代謝により転換される活性薬剤である(Liehr, Giovanella, Verschraegen (監修)(上記引用))。SN-38は、トポイソメラーゼI活性の阻害においてCPT-11より3桁強力な活性化学療法薬である。抗体接合に適する二官能価SN-38は、下記の通りに簡単に調製される。すなわち、[CPT-11]-20-O-バリネートを、そのバリンN末端をBOCとして保護したものを、水酸化物のような塩基1当量を用いてそのC-10-カルバメートで選択的に開裂させる。カリウム第三ブトキ2当量と水1当量とから誘導されるような「無水水酸化物」(Gassman and Schenk, J. Org. Hem., 42:918-920 (1977))は、この目的に有利に用いられる。CPTのバリネートエステルは、1N水酸化ナトリウム水溶液の1当量に少なくとも1時間安定であることが示されている。この方法により、C-10-カルバメートを選択的に開裂する。次に、バリン残基のアミノ基をイソチオシアネートに転換し、ペプチド鋳型MCC-Gly-Lys-Lys(R')-NHにカップリングする。あるいは、SN-38自身を、最初にメトキシトリチル誘導体のような酸感受性誘導体としてC10-ヒドロキシル基を保護することによって誘導体形成する。次に、C20-ヒドロキシル基をバリネートエステルに転換する。この時点で、C-10位のメトキシトリチル基を除去する。別の方法は、最初に相当する「BOC」エステルとしてC-10ヒドロキシルを保護し、20-ヒドロキシル基を誘導体形成し、脱保護することによってすることによってSN-38の20-バリネートエステル(または任意の他のエステル)誘導体を調製する。次に、これに続いてトリメチルシリルクロリドで処理して、C-10ヒドロキシルとC-20のエステルのアミノ基を誘導体形成させ、マレイミド-PEG-NHSのようなアミン反応性のヘテロ二官能価架橋剤と反応させ、C-10位のトリメチルシリル基を脱保護する。
【０１００】
上記の方法はCPT誘導体に限定されず、パクリタキセル、ゲルダナマイシンなどのような他の疎水性薬剤にも応用することができる。
【０１０１】
上記の説明から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を容易に突き止めることができ、発明の精神および範囲から離反することなく発明の様々な変化および変更を行い、過度の実験を行うことなく様々な用法および条件に適合させることができる。本明細書に引用した総ての特許明細書、特許出願明細書および公表文献の内容は、引用することに本明細書の開示の一部とされている。
【国際調査報告】
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