(57)【要約】変種インテグリンαサブユニットAドメインおよびそのフランキング領域の全てまたは一部を含むポリペプチドについて開示する。溶液中で、または膜結合型において、本発明のAドメインポリペプチドは、主に高親和性高次構造で存在する。変種インテグリンポリペプチドと称される本発明のポリペプチドにおいて、重要なイソロイシンまたはグルタミン酸残基は改変される。たとえば、グルタミン酸残基は、欠失させるか、または異なるアミノ酸残基、たとえばグルタミン、アスパラギン酸、もしくはアラニンで置換することができる。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、結合または活性化に依存的なリガンドを選択的に障害するが、非依存的なリガンドは傷害しない。これらは、結合が障害された変種ポリペプチドの結合を増強する分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法に有用である。加えて、これらは、活性化依存的なリガンドと活性化非依存的なリガンドとを区別する際に有用である。またこれらは、インテグリンの障害された形態に結合する抗体、たとえばモノクローナル抗体を作製するために有用である。このような抗体のいくつかは、高親和性高次構造で存在するインテグリン上に在存しないか、または接近できないエピトープを認識する。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、治療的に使用することができる任意のインテグリンαサブユニット由来でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の他のアミノ酸で置換された配列番号:30の336位にGluを有する、変種CD11bαサブユニットをコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
CD11bαサブユニットの配列番号:30のアミノ酸144〜335を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項３】
CD11bαサブユニットの配列番号:30のアミノ酸144〜336を含むポリペプチドであって、アミノ酸336位のGluが、Gln、Asp、およびAlaから選択されるアミノ酸で置換されているポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項４】
CD11bαサブユニットの配列番号:30のアミノ酸144〜336を含むポリペプチドであって、336位のGluが、Gln、Asp、およびAlaから選択されるアミノ酸で置換されているポリペプチド。
【請求項５】
配列番号:30の336位のGluが、Ala、Cys、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、およびTyrからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号:30の336位のGluが、塩基性側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項７】
配列番号:30の336位のGluが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項８】
配列番号:30の336位のGluが、芳香族側鎖を有するアミノ酸で置換されている、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項９】
配列番号:30の336位のGluが、非酸性アミノ酸で置換されている、請求項1記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
試験化合物がCD11bに結合する候補化合物であるかどうかを決定する方法であって、
(a)CD11bαサブユニットのアミノ酸144〜336を含むポリペプチドであって、配列番号:30のアミノ酸336位のGluが、任意の他のアミノ酸で置換されたポリペプチドと、試験化合物を接触させる段階；および
(b)該試験化合物がポリペプチドに結合するかどうかを決定する段階
を含み、ポリペプチドに結合する化合物はCD11bに結合する候補化合物である方法。
【請求項１１】
試験化合物が、CD11bの結合親和性を増強するかどうかを決定する方法であって、
(a)CD11bαサブユニットのアミノ酸144〜336を含むポリペプチドであって、配列番号:30のアミノ酸336位のGluが、任意の他のアミノ酸で置換されたポリペプチドと、試験化合物を接触させる段階；および
(b)該試験化合物がポリペプチドの結合親和性を増強するかどうかを決定する段階
を含み、変種ポリペプチドの結合を増強する化合物はCD11bの結合親和性を増強する候補化合物である方法。
【請求項１２】
化合物が、活性化依存的リガンドまたは活性化非依存的リガンドであるかどうかを決定するための方法であって、
(a)CD11bαサブユニットのポリペプチドと試験化合物を接触させる段階；
(b)CD11bαサブユニットの変種ポリペプチドであって、配列番号:30のアミノ酸336位のGluが、任意の他のアミノ酸で置換されたポリペプチドと、試験化合物を接触させる段階；
(c)該試験化合物が、ポリペプチドCD11bαサブユニットおよび／または変種ポリペプチドに結合するかどうかを決定する段階
を含み、該化合物がCD11bαサブユニットのポリペプチドに結合し且つ変種ポリペプチドに結合しない場合は、該化合物が活性化依存的リガンドであることを示す方法。
【請求項１３】
任意のアミノ酸で置換された配列番号:30の332位にIleを有する変種CD11bαサブユニットをコードする単離核酸分子。
【請求項１４】
置換するアミノ酸がGlyおよびAlaから選択される、請求項13記載の単離核酸。
【請求項１５】
CD11bαサブユニット(配列番号:30)のアミノ酸144〜331を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１６】
CD11bαサブユニットのアミノ酸144〜332を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、配列番号:30のアミノ酸332位のIleがGlyおよびAlaから選択されるアミノ酸によって置換された核酸分子。
【請求項１７】
CD11bαサブユニットのアミノ酸144〜332を含むポリペプチドであって、配列番号:30の332位のIleが任意の他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
【請求項１８】
置換するアミノ酸がGlyおよびAlaから選択される、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項１９】
CD11bαサブユニット(配列番号:30)のアミノ酸144〜331を含むポリペプチドであって、CD11b(配列番号:30)のアミノ酸332〜1152を含んでいないポリペプチド。
【請求項２０】
GlyおよびAlaから選択されるアミノ酸で置換された331位にIleを有する変種CD11aαサブユニットをコードする単離核酸分子。
【請求項２１】
CD11aαサブユニットのアミノ酸144〜330を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項２２】
CD11aαサブユニットのアミノ酸150〜331を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、アミノ酸331位のIleがGlyおよびAlaから選択されるアミノ酸によって置換された核酸分子。
【請求項２３】
CD11aαサブユニットのアミノ酸150〜331を含むポリペプチドであって、331位のIleがGlyおよびAlaから選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
【請求項２４】
CD11aαサブユニットのアミノ酸150〜330を含むポリペプチドであって、CD11aのアミノ酸331〜1223を含んでいないポリペプチド。
【請求項２５】
試験化合物が、CD11bに結合する候補化合物であるかどうかを決定する方法であって、
(a)CD11bαサブユニット(配列番号:30)のアミノ酸144〜332を含むポリペプチドであって、アミノ酸332位のIleがGlyおよびAlaから選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドと、試験化合物を接触させる段階；並びに
(b)該試験化合物が該ポリペプチドに結合するかどうかを決定する段階
を含み、該ポリペプチドに結合する化合物はCD11bに結合する候補化合物である方法。
【請求項２６】
試験化合物がCD11aに結合する候補化合物であるかどうかを決定する方法であって、
(a)CD11aαサブユニットのアミノ酸150〜331を含むポリペプチドであって、アミノ酸332位のIleがGlyおよびAlaから選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドと、試験化合物を接触させる段階；並びに
(b)該試験化合物が該ポリペプチドに結合するかどうかを決定する段階
を含み、該ポリペプチドに結合する化合物はCD11aに結合する候補化合物である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府に支援された研究についての記載
合衆国政府は、米国国立衛生研究所によって与えられるグラント番号 に従って、本発明に特定の権利を有する(NIDDK、NIAID、およびNHLBI)。
【０００２】
関連出願情報
本出願は、2001年1月11日に提出された一部継続米国特許出願第09/758,493号であり；2000年7月31日に提出された仮出願第60/221,950号の優先権を主張し、その内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
インテグリンは、リガンドの結合によって細胞間の、および細胞と細胞外マトリクスとの双方の多様な重要な相互作用を媒介するヘテロダイマー受容体である。全てのインテグリンはαサブユニットとβサブユニットとを有する。αサブユニット内において、Aドメイン(またはＩドメイン)と呼ばれる領域は、リガンド結合の重要なメディエータであることが知られている。類似の領域、A様ドメインが多くのβサブユニットに存在する。これらのヘテロ二量体のαβインテグリンは、これらのβサブユニット中に、ファン・ウィルブランド因子(von Willberand Factor： vWF)AドメインのβAを含み；9つのインテグリンは、これらのαサブユニット中に第2のこのようなドメインのαAも含む。多くのインテグリンは二つの高次構造、すなわち低親和性状態(「閉鎖(closed)」または「非リガンド結合(unliganded)」高次構造)と高親和性状態(「開放(open)」、または「リガンド結合(liganded)」高次構造)で存在すると考えられており、後者が高親和性リガンド結合に関与している。
【０００４】
インテグリンは、細胞の生理活性(たとえば、運動性、増殖、および分化)に及ぼすマトリクスの作用を媒介するシグナルを伝達する。さらに、インテグリンは、炎症において、並びに腫瘍細胞の形質転換、転移、およびアポトーシスにおいて役割を果たす。したがって、1つまたは複数のインテグリンの活性を活性化または阻害することができる化合物を同定することにかなりの関心が集まっている。
【０００５】
有効なインテグリン-リガンド結合が生じるためには、インテグリンは、その高親和性立体配置でなければならないと考えられる。細胞が、多様な刺激によって活性化される場合に産生される内から外へのシグナルは、インテグリンを低親和性状態から高親和性へと切り替えるように思われる。この機能的アップレギュレーションは、αサブユニットのAドメインおよびβサブユニットのA様ドメインを含むインテグリンの細胞外領域における高次構造の変化に関連している(Smithら、1988 J. Biol. Chem. 263： 18726)。
【０００６】
インテグリンAドメインは、その上部に金属イオン依存的接着部位(MIDAS)を有するジヌクレオチド結合の折りたたみ形状を持つと想定され(Leeら、1995 Cell 80： 631； Emsleyら、1997 J. Biol. Chem. 272： 28512； Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523； Nolteら、1999 FEBS Lett. 452： 379；および Leggeら、2000 J. Mol. Biol. 295： 1251)、並びにその底部でc末端のα７ヘリックスを介してインテグリンの本体に結合している。MIDASおよびその周辺の露出した側鎖は、生理的リガンド(Liら、前記； Michishitaら、1993 Cell 72： 857-867； Kamataら、1994 J. Biol. Chem. 269： 26006- 26010； Kern ら、1994 J. Biol. Chem. 269： 22811-6； Edwardsら、1998 J. Biol. Chem. 273： 28937-44 ； Zhangら、1999 Biochemistry 38： 8064-71)および特定のアンタゴニスト(Rieuら、1996 J. Biol. Chem. 271： 15858-15861)のための結合部位を形成する。「開放」高次構造の場合、タンパク質の3つの非荷電残基は、MIDASの金属イオンに直接配位結合し、偽リガンドまたはリガンドグルタメート残基(Leeら、前記； Liら、前記； Emsleyら、2000 Cell 100： 47-56)が、金属の配位結合を完成させる。「閉鎖」型では、両親媒性C末端のα７ヘリックスが「開放」型と比較して10Å上方に移動しており、ドメインの残りを取り巻いている。この大きな移動は、金属配位結合の変化に関連し、この場合、3つの配位結合残基の1つであるスレオニンがアスパラギン酸に置換され、金属イオン配位結合の球を完成させる際に、水分子がグルタミン酸に取って代わる(Leeら、1995 Structure 3： 1333-1340)。金属配位結合のこれらの変化およびMIDASの形態は、構造的に相同なGタンパク質において記述されたものと同様である(Leeら、前記)。
【０００７】
4つのインテグリンAドメイン(CD11b、CD11a、CD49a、およびCD49b)の結晶構造が現在までに報告されている(Leeら、前記； Leeら、1995 Structure 3： 1333； Emsleyら、前記； Liら、前記； Emsleyら、1997 J. Biol. Chem. 272： 28512)。インテグリンCD11b Aドメイン(11bA)を除いて、全てが「閉鎖」型のみで見出されることから、「開放」型は、情報価値のない結晶人為産物であることが示唆された(Baldwinら、1998 Structure 6： 923-935)。インテグリンAドメインの「開放」型は、「高」親和性状態と等しいという考えは、3つの研究によって支持されている(Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523； Rieuら、前記； Oxvigら、1999 Proc. Nat'l Acad.Sci. USA 96： 2215-20)。第1に、「閉鎖」構造を脱安定化させることが構造の基礎において予想されるCD11bAの点突然変異により、溶液中の「高親和性」型の比率が増加した(Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523)。第2に、「活性化依存的」モノクローナル抗体の結合部位は、Aドメインの高次構造感受性領域にマップされた(Oxvigら、前記)。第3の研究では、短いコラーゲンペプチドとの複合体においてAドメインが「開放」高次構造の形態をとることが想定され、「開放」型は、リガンドの存在下においてのみ得ることができることを示唆した(Emsleyら、前記)。リガンドは、インテグリンの高次構造の変化を引き起こすことが示唆されているが、インテグリンがリガンドの非存在下においても高親和性状態で存在し得ることが、少なくとも1つの研究によって示唆されている(Smith and Cheresh 1988 J. Biol. Chem. 263： 18726-31)。さらに、いくつかの研究により、ヘテロダイマーインテグリンのリガンド結合親和性をアロステリックな様式で変化させることができることが示唆された(Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523； Edwardsら、1998 J. Biol. Chem. 273： 28937-28944； Calderwoodら、1998 J. Biol. Chem. 273： 5625； Zhangら、1996 J. Biol. Chem. 271： 29953-7)。
【発明の開示】
【０００８】
概要
本発明は、変種インテグリンαサブユニットAドメインまたは変種インテグリンβサブユニットA様ドメインの、全てまたは一部を含むポリペプチドを特徴とする。変種インテグリンポリペプチドと呼ばれる本発明のポリペプチドでは、重要なイソロイシンまたはグルタミン酸残基(後でさらに詳細に記載)が存在しない。
【０００９】
重要なイソロイシン残基は、欠失させるか、または異なるアミノ酸残基、好ましくはより小さいもしくはより疎水性が低いアミノ酸残基、たとえばアラニンまたはグリシンに置換することができる。本発明の変種インテグリンポリペプチドは、溶液中において高親和性高次構造で存在する傾向があるため、これらはインテグリンに結合する(および／またはその活性を調節する)分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法に有用である。また、これらは、インテグリンの高親和性型に選択的に結合する抗体、たとえばモノクローナル抗体を作製するためにも有用である。このような抗体のいくつかは、低親和性高次構造であるインテグリンに存在しないか、または近づくことができないエピトープを認識する。したがって、本発明は、対応する野生型インテグリンよりも、本発明の変種インテグリンに対して優れた親和性で結合する抗体を特徴とする。また、重要なイソロイシンを欠いている変種インテグリンは、活性化特異的なリガンドを同定するために使用することができ、スクリーニングアッセイ法において、リガンドの同定のための野生型インテグリンよりも感受性が高い。
【００１０】
重要なグルタミン酸残基は、任意の他のアミノ酸、たとえばグルタミン、アラニン、またはアスパラギン酸残基によって置換することができる。特定の態様において、置換するアミノ酸は、非酸性である。このような変種インテグリンポリペプチドは、活性化依存的なリガンドに対する結合親和性を損なわせたが、活性化非依存的なリガンドについては損なわせなかった。
【００１１】
本発明の種々の変種インテグリンポリペプチドは、任意のインテグリンαサブユニットまたは任意のインテグリンβサブユニットに由来することができる。変種インテグリンポリペプチドは、好ましくはAドメインまたはA様ドメインのリガンド結合部分を含む。
【００１２】
また、本発明は、本発明の変種インテグリンポリペプチドに結合する化合物を同定する方法を特徴とする。このようなスクリーニング方法は、関心対象の試験化合物にポリペプチドを曝露すること、および化合物がポリペプチドに結合するかどうかを決定することを含みうる。したがって、アッセイ法は、単純な結合アッセイ法(たとえば、化合物の結合をリガンドの非存在下のみで測定する)、または競合的結合アッセイ法(たとえば、化合物の結合をリガンドの存在下で測定する)であり得る。
【００１３】
また、本発明は、インテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を妨げる化合物を同定するための方法、およびインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を増強する化合物を同定するための方法を特徴とする。本方法は、試験化合物の存在下および非存在下で変種インテグリンポリペプチドに対するインテグリンリガンドの結合を測定することを含みうる。また、試験化合物がインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を妨害するまたは増強する能力を試験してもよい。さらに、試験化合物の存在下および非存在下で、第2のインテグリンに対するインテグリンリガンドの結合を測定することによって(またはインテグリンに対する第2のリガンドの結合を測定することによって)、化合物の結合特異性を評価することができる。
【００１４】
また、本発明は、本発明の変種インテグリンポリペプチド、または本発明の変種インテグリンポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与することによって、インテグリンリガンドに対するインテグリンの結合を妨害する方法を特徴とする。たとえば、結合が障害された変種CD11bαサブユニットは、配列番号:30の336位のグルタミン酸を、その他の任意のアミノ酸、たとえばグリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、およびメチオニンで置換して構築される。したがって、1つの態様において、ポリペプチドは、336位のGluが置換された配列番号:30のアミノ酸144〜336を含むことができる。同様に、変種ポリペプチドは、任意のその他のアミノ酸によって置換されたCD11aの335位にグルタミン酸を有するCD11aαサブユニットであることができる。たとえば、もう1つの態様において、変種ポリペプチドは、CD11aαサブユニットのアミノ酸150〜335であって、アミノ酸335のグルタミン酸は、特に、グルタミン、アスパラギン酸、およびアラニンから選択されるアミノ酸によって置換されたものを含む。
【００１５】
重要なグルタミン酸残基を欠いている本発明の変種ポリペプチドは、活性化依存的なリガンドに結合する能力がそこなわれているが、活性化非依存的なリガンドに結合する能力は損なわれてない。このような変種ポリペプチドは、活性化非依存的なリガンドと活性化依存的である化合物の間を区別するために使用することができる。
【００１６】
また、本発明は、活性インテグリンに結合するリガンドの存在を同定する目的のために、本発明の変種インテグリンポリペプチドまたは本発明の変種インテグリンポリペプチドに選択的に結合する抗体を投与する方法を特徴とする。このようなアッセイ法は、炎症、たとえば潜在的な炎症(たとえば、膿瘍または活性アテローム硬化型の傷害)を診断するために有用である。したがって、重要なグルタミン酸残基を欠いている変種ポリペプチドは、活性化依存的なリガンドからほとんどまたは全く妨害を受けずに活性化非依存的なリガンドの存在を検出することにより、より感受性の高い手段として役立つことができる。
【００１７】
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸分子(たとえば、mRNAおよびDNA)をさらに特徴とする。また、本発明は、本発明のポリペプチドおよび第2のポリペプチド、たとえば免疫グロブリン定常ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００１８】
下記に記載されている特定の実験は、CD11bの野生型形態よりも活性なCD11b(インテグリンαサブユニット)の変種形態の標品のデザインに関する。いかなる特定の理論によっても縛られないが、溶液において、開放(活性)高次構造であるこの変種サブユニットの量は、対応する野生型サブユニットよりも多いようである。
【００１９】
また、活性化依存的なリガンドに結合する能力が損なわれているが、活性化非依存的なリガンドに結合する能力には効果を及ぼさないCD11bの変種型の標品のデザインに関する特定のその他の実験が、以下に記載してある。
【００２０】
変種CD11bの作製は、特定のIle残基または特定のGlu残基の欠失または置換を含む。Ile残基の欠失または置換は、単離されたCD11bAドメインの、並びに無処理のインテグリンの高親和性表現型を与える。さらに、Ile修飾されたAドメインは、「開放」高次構造で結晶化することができる。したがって、任意の特定の理論によって縛られないが、Ileに基づいたアロステリックな切り替えがインテグリンAドメインの親和性および高次構造を制御するようである。したがって、変種のその他のインテグリンαサブユニット(およびβサブユニット)の高親和性形態は、対応する非常に保存されたIle残基を欠失または置換することによって作製することができる。他方、特定のGlu残基の欠失または置換は、活性化依存的なリガンドに対する障害された親和性を与えるが、活性化非依存的なリガンドについては、与えない。
【００２１】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細を添付の図面および下記の説明に記述する。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、説明と図面、および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
【００２２】
詳細な説明
実施例1：欠失による安定な高親和性CD11b変種Aドメインの作製
CD11bのアミノ酸E123〜K315を含む変種CD11b Aドメイン(11bA123-315；11bAE-Kともいう)を作製した。これらの実施例において、アミノ酸番号付けは、成熟タンパク質の番号付けを参照し、一方で、下記の表2、3、および4のアミノ酸番号付けは、完全に未成熟のタンパク質(シグナル配列を含む)の番号付けを参照することに留意されたい。CD11bは、16アミノ酸のシグナル配列を有する。したがって、成熟したタンパク質のE123は、完全に未成熟のタンパク質のE139と一致し、成熟したタンパク質のI316は、完全未成熟のタンパク質のI332に一致する。この変種116A123-315ドメインを特徴づけて、アミノ酸E123〜G321(11bA123-321；11bAE-Gともいう)を含むCD11bAドメインと比較した。また、残基316のIleがGlyへ変化した変種Aドメイン(11bAI→G)も作製した。3つ全てのタンパク質をGST融合タンパク質として発現させて、これを切断して関心対象のタンパク質を放出させた。
【００２３】
変種ポリペプチドは、標準的な組換え技術を使用して作製した。制限および修飾酵素は、New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)、Boehringer Mannheim (Germany)、またはGIBCO BRL (Gaithersburd, MD)から購入した。部位特異的変異誘発を、記述されるように(Rieuら、1996 J. Biol. Chem. 271： 15858)pGEX-4T-1ベクターにおいて行った。以下の変異誘発プライマーを使用した：
2006510387.tif 000002
それぞれの変異の導入は、直接DNAシーケンシングによって確認した。変異を含むAドメインのPvuI-BspEI-制限処理したcDNA断片を、PvuI-BspEI-制限処理したCD11b cDNAにサブクローニングして、完全長のヒトCD11b(Rieuら、1996 J. Biol. Chem. 271： 15858)を含む、pcDNA3プラスミドにクローニングした。11bA123-321および11bA123-315、並びに11bA1→GAドメインは、大腸菌にGST融合タンパク質として発現させ(Michishitaら、1993 Cell 72： 857)、トロンビンによって切断して、Liら、1999 J. Cell Biol. 143： 1523に記載されるように精製した。C129は、トロンビン切断後に溶液中でジスルフィド結合二量体の形成を防止するために(示さず)、発現された全てのGST-Aドメイン融合形態でSに置換された。純度はSDS-PAGE分析によって確認した。
【００２４】
11bA123-321および11bA123-315の構造は、X線結晶学によって決定した。結晶は、10 mg/ml保存タンパク質溶液、およびLiら、(1998 J. Cell Biol. 143： 1523)に記載されるように、懸滴蒸気拡散法を使用して成長させた。いくつかの結晶状態をそれぞれのAドメインについて試行した。11bA123-315および11bAI→Gは、15%ポリエチレングリコール8K、0.10Mトリス、pH8.2、150mMのCaCl2を含むリザーバー溶液の存在下において室温で結晶を形成した。結晶は1週間以内に形成し始め、2週間で典型的な大きさ0.3 mm×0.05 mm×0.04 mmに成長して、正方晶系空間群P4に属し、単位格子はa=b=45.7Åであった。11bA123-321はこれらの条件では結晶化しなかったが、10%ポリエチレングリコール4000、0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH4.5、5mMのMnCl2をリザーバー緩衝液に使用すると室温で結晶を形成した。11bA123-321は、P212121空間群で結晶化して、単位格子はa=48.1Å、b=121.5Å、c=74.5Åであった。
【００２５】
11bA123-315単結晶を使用して、100Kで、ブルックヘイブン国立研究所の国立シンクロトロン光源の光線X12B上で、CCD検出器を使用して2.3Å分解能のデータセットを収集した。11bA123-321単結晶は、施設内X線を使用して造影板上に100Kで2.6Å分解能データを収集した。データは、DENZOおよびSCALEPACKによって処理して、それぞれ8.8%、7.7%のRsymを得た。開始モデルは、それぞれ、残基D132〜K315を含む洗練された1.8ÅのMg2+構造(pdbアクセッションコードlido)(Lee 1995 Cell 80： 631)、および残基D132〜A318を含む洗練された2.0ÅのMg2+構造(pdbアクセッションコードljlm)(Leeら、1998 Structure 6： 923)であり、それぞれ金属および水分子を除去した。予備的な剛体の洗練は、X-plorを使用して行い、回折データは、Rフリー計算において5%反射で8.0〜3.0Å分解能の範囲であった。位相を徐々に高分解能にして、構造をねじれ角の動力学と個々の拘束等方性B因子洗練プロトコールとを交互に数サイクル行うことによって洗練し、全ての回折データは、11bA123-321および11bA123-3151構造に関して、それぞれ分解能8.0および2.6Å並びに8.0および2.3Åとなった(表1)。モデルの点検および手動での調節をSGIグラフィックスワークステーション上でO(Jonesら、1991 Acta Crystallogr. 47： 110)を使用して行った。溶媒分子の添加は、相違するマップの適切なピーク、合理的な水素結合、および50Å2未満の洗練された温度因子に基づいた。構造は、11bA123-315構造について、最終的なR因子が20.3%(Rフリー：25.6%)、および11bA123-321構造について、21.9%(Rフリー：30.0%)となるように精製した。最終モデルは11bA123-315に関して、残基D132〜K315の全ての非水素原子、水分子30個、およびCa2+イオン1個、並びに11bA123-321に関して残基D132〜G321、水分子44個、およびMn2+イオン1個を含む。結晶学的データを表1に示す。
【００２６】
【表１】
2006510387.tif 000003
* Rマージ=Σ|I-<I>|ΣI、式中Iは認められた強度、<I>は、対称性に関連した反射の複数回観察の平均強度である。
§ ｛｝内の数値は、最も高い0.1Å解像ビンにおける値を示す。
† R因子=Σ|Fo-Fc|Σ Fo
‡ Rフリー=ΣT|Fo-Fc|ΣT Fo、式中、Tは微細な点を省略した反射のうちの、無作為に選択した5%を含む試験セットである。
【００２７】
結晶構造11bA123-321は、「閉鎖」高次構造の結晶構造であった(図2A、2C、および2E)。対照的に11bA123-315は、「開放」型で結晶化した(図2B、2D、および2F)。
【００２８】
BIAcore (BIAcore AB, Uppsala, Sweden)に既に記述されているように(Liら、前記)表面プラズモン共鳴を使用して、11bA123-321および11bA123-315のリガンド結合特性を決定した。IC3b、フィブリノーゲンまたはCD54をそれぞれ、異なるCM5センサーチップ(BIAcore AB)のデキストランマトリクスに1級アミン基を介して共有結合によって結合した。同じように固定したBSAを対照表面として使用した。11bA123-321、11bA123-315、および11bAI-GAドメインは、5ml／分でチップ上を異なる時間流した。2mMのMgCl2および0.005% P20(BIAcore AB)を含むTBS(20mMトリスHCl、pH8.0、150mM NaCl)を実施緩衝液として使用した。1M NaClの20mMトリス-HCl、pH8.0を使用して結合タンパク質を除去して表面を再生した。結合は、時間の関数として測定した。結合データ(BSAコーティングチップに対してバックグラウンドの結合を差し引いた後)は、記述されているように(Dall' Acquaら、1996 Biochemistry 35： 9667-9676)スキャッチャードプロットを使用して分析した。〜70%コンフルエンスのCOS M7サル線維芽細胞に、記載されているように(Michishitaら、前記)WTまたはCD11bI→GをコードするスーパーコイルcDNAを完全長のCD18と共にトランスフェクトした。
【００２９】
トランスフェクトしたCOS細胞を、10% FBS、2mMグルタミン、50 IU/mlペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したイスコブ改変ダルベッコ培地(BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD)中で37℃で24時間増殖させた。細胞を洗浄して、0.1%トリプシン-EDTAによって剥離させ、24もしくは48ウェルプレート(Costar Corp., Cambridge, MA)、または100mmペトリ皿に播種して24時間培養した。24または48ウェルプレートのコンフルエント単層を細胞表面抗原定量およびリガンド結合実験のために使用し、ペトリ皿で培養したものを免疫沈降試験に使用した。ヘテロダイマー形成並びに野生型およびCR3I→Gハロ受容体に対するiC3b被覆した赤血球の結合は、記載したとおりに実施した(Rieuら、1996 J. Biol. Chem. 271： 15858)。ハロ受容体に対するiC3bの特異的結合は、偽トランスフェクトCOS細胞に対してバックグラウンド結合を差し引くことによって得た。CR3I→Gに対する結合は、mAb904の結合を使用して表面発現の程度を修正した後、野生型に対する結合の百分率として表した(Rieuら、1996 J. Biol. Chem. 271： 15858)。
【００３０】
図3A〜3Ｊに示すように、11bA123-321は、活性化依存的「生理的」リガンド、補体iC3b、フィブリノーゲン、およびCD54(ICAM-1)に対する結合を示さなかった。対照的に、11bA123-315は、3つ全てのリガンドに対して高親和性の結合を示した(図3A〜3J)。双方のドメインは、活性化非依存的「リガンド」NIF(好中球阻止因子)(図3D、および3Ｉ)、ならびにmAb904(図3Eおよび3J)に対して等しく十分に結合し、認められた差がAドメイン濃度の変化によって引き起こされたものではないことを示した。これらのデータは、「開放」および「閉鎖」結晶構造がインテグリン11bAの「高」および「低」親和性状態にそれぞれ対応することを決定的に確立する。
【００３１】
実施例2：置換による安定な高親和性状態CD11b変種の作製
Ile316は、現在までにクローニングされた全てのインテグリンαAドメインにおいて不変である(図5)。Ileからグリシンへの置換を有するAドメイン(11bAI→G)は、「高親和性」状態を示した(図4A)。ハロ受容体に同じ置換を作製すると、そのリガンド結合活性は劇的に増加した(図4B)。結晶構造11bAI→Gは、「開放」11bA123-315型のものと同一であった。これらのデータは、「開放」高親和性高次構造が、ドメインに固有のIleに基づくスイッチによって主に指示され、MIDAS面上のリガンド結合親和性をアロステリックに調節するように作用することを確固として確証する。インテグリンの不活性および活性な不活性および活性な高次構造ががリガンドの非存在下で存在することが知られている(Smithら、前記； Yanら、J. Biol. Chem. 275： 7249-60, 2000)。上記の結果に基づいて、リガンドの役割は、最近提唱されているように(Emselyら、前記)、高親和性状態を開始することではなく、低親和性と高親和性状態との平衡が後者に都合がよいように移動することによって高親和性状態を安定化することであるように思われる(Liら、前記)。内側から外側へのシグナル伝達によってインテグリンが活性化されると、この平衡が移動して、リガンドの結合に関して「利用可能」になる細胞表面上の高親和性受容体の比率が増加すると考えられる。次いで、リガンドが結合すると、おそらくAドメインに対して外因性の新しいエピトープを形成し、外側から内側へのシグナル伝達を開始させると考えられる。
【００３２】
保存された疎水性分子内ソケット(SILEN、イソロイシン用ソケット；Socket for Isoleucine)は、「閉鎖」高次構造におけるI316のフィンガーを固定し；「開放」構造においてI316がL312に置換される(図1Aおよび1F)。SILENは、「閉鎖」および「開放」高次構造の双方においてI135、L164、I236、およびY267の疎水性側鎖によって形成される(図1Cおよび1D)。いくつかのインテグリンにおいて、外側のMIDASに存在する特定の変異は、ハロ受容体において機能獲得作用を生じ、アロステリックに作用すると考えられる(Zhangら、前記； Oxvigら、前記； Zhangら、前記)。これらの研究は、ハロ受容体において行われており、ドメイン内相互作用および／またはその他の第4の作用の可能性があるために、機構の解釈を提供することが困難となる。これらの変異は、SILENにおいて、またはその周辺で起こる。たとえば、CD11bのα1-βBループをCD11aのものに置換すると、構成的に活性なインテグリンを生じる(Zhangら、前記)。この領域は、SILEN残基L164の1つに及ぶ。また、インテグリンの活性化も、L164-F置換(Oxvigら、前記)において起こり、これはSILENを予測可能により小さくして、したがって、Ｉ316により適応しにくくなる。E131、D132、K231、およびF234を含むその他の活性化変異は、SILENの非常に近位の構造の底部に存在し(Oxvigら、前記)、したがって、SILENにおいてIleの「フィンガー」の適切な配位を妨害することによって、このような作用を発揮する可能性がある。MIDASの反対側上のエピトープでの特定のmAb(たとえば、mAb 44a、そのエピトープがSILENの上部の残基に及ぶ)の阻害作用は、同様に、SILENポケットの安定化を通して説明される可能性がある。
【００３３】
N末端伸張が存在すると、あまり好ましくない高親和性状態へのAドメインの切り替えが促進される(Liら、前記)。N末端伸長部のいずれの残基も、由来する3-D構造に含まれていないことから、この作用の基礎となる構造の基礎は分かっていない。しかし、この伸長部内の残基は、Aドメインにおけるリガンド結合を調節することが観察された。最初に、vWF A1ドメインのこのセグメントにおける天然に存在する点突然変異は、IIB型vWf疾患を有する患者において機能獲得表現型を引き起こす(Matsushitaら、1995 J. Biol. Chem. 279： 13406-14)。また、この領域は、CD11b Aドメインに活性化変異を含む(Oxvigら、前記)。第3に、N末端の伸長部からの合成ペプチドは、CD11a-依存的な接着を阻害した。また、CD49b Aドメインからの構造データでは、α7ヘリックスを超えて伸張する3つの残基は、N末端伸長部における残基によって一部が形成されたくびれた部分に詰めることができ、NおよびC末端を非常に近くに存在させることを示している(Emsleyら、前記)。また、α7のC末端残基の柔軟性は、CD11a Aドメインの結晶およびNMR構造においても観察された。併せて考慮すると、これらのデータは、N末端伸長部がSILENからIleを離すように誘導するための不完全な「競合的」表面による代用物を提供し、いくつかの分子を「開放」型で存在させるであろうことを示唆している。本発明のデータは、このような機構がハロ受容体において作動するであろうことを示唆し、内側から外側へのシグナルによってインテグリンが活性化する機構の基礎を提供する。
【００３４】
実施例3：障害された結合を有するCD11b変種Aドメインの作製
「内側から外側」への活性化に応答して、インテグリンに対するリガンドの結合は、存在する場合は、αAによって、およびもしそうでなければβAによって媒介される。両方の例において、リガンドに由来する酸性残基は、αAまたはβAのMIDASにおいて結合する(Michishitaら、前記； Xiongら、Science (Published online March 7, 2002, Science Express)； Leeら、1995 Cell 80： 631-638)。同様の外側から内側のシグナルは、反応の際に生じる。αAを含みおよびαAを欠くインテグリンにおいて共有される内側から外側および外側から内側へのシグナリング機能は、活性化およびシグナリングの共通の経路を示す。αAを欠いたインテグリンαVβ3のリガンド結合部位(Xiongら、前記)およびαAの既知の構造活性相関(Leeら、前記； Emsleyら、2000 Cell 100： 47-56； Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523-1534； Huthら、2000 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97： 5231-5236； Xiongら、2000 J. Biol. Chem. 275： 38762-38767； Luら、2001 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 98： 2393-2398)の構造に基づくと、αAは、βA(図8Aおよび8B)の内因性のリガンドとして役立つことが示唆され、刺激-応答の連関において共有される特徴の説明を提供する。理論では、βAは、αAを欠いているインテグリンにおいて直接的に、またはαAを含む変種において間接的に、全てのインテグリンのリガンド結合を媒介する。
【００３５】
図8Aは、インテグリン頭部の領域を欠いているαAの漫画表現を示し、αサブユニットのプロペラおよびβ-サブユニットのβAドメインを示す。プロトタイプのリガンドRGD(Arg-Gly-Asp)は、βA MIDASの金属イオンを調整するAspおよびプロペラのD3-A3ループのからの残基によって一部が形成されるポケットにフィットするArgの両方のサブユニットに接触する。図8Bは、αAを含有するインテグリンの頭部の領域を示す。αAは、プロペラのD3-A3ループから突出している。図8Bにおいて、αAおよびβA MIDASの金属イオンは、それぞれ文字FおよびHによって示される。C末端のリンカーは、αAをプロペラに接続する。N末端リンカーは、示されていない。ドットのボックスは、αAリガンドGlu(E)を表す。
【００３６】
3つの観察は、βAは、αAを欠いているインテグリンにおいて直接的に、またはαAを含有する変種において間接的に、全てのインテグリンのリガンド結合を媒介するという理論のための基礎を提供する。まず真先に、αAは、プロペラのD3-A3ループから現れ、これが、αVβ3のリガンド結合界面の一部を形成する。したがって、αAのNおよびC末端は、βA MIDASに非常に近いと思われる。第2に、単離されたαAは、生理的なリガンドとの高親和性の相互作用を媒介する(Xiongら、2000 J. Biol. Chem. 275： 38762-38767； Luら、前記)。しかし、β1、β2、またはβ3インテグリンのβA MIDAS残基の突然変異は、αAを媒介したリガンド結合および活性化感受性のエピトープの発現を著しく減少したので、この相互作用は、ホロ受容体(holoreceptors)のβAによって調節される(Luら、前記； Goodmanら、前記； Puzon-McLaughlinら、1996 J. Biol. Chem. 271： 20438-20443)。第3に、インテグリンリガンドは、一様に金属イオンを介してインテグリンに接触する、柔軟で溶剤曝露された酸性残基を有する(Xiongら、オンラインで刊行された、2002年3月7日、Science Express； Leeら、前記； Emsleyら、前記)。
【００３７】
図9は、αAインテグリンの不変異Gluの保存を示す。ヒトαサブユニットの配列は、CLUSTALW 1.8.によってアラインした。保存されたテトラペプチド(かっこに入れた配列)内の不変異Glu(矢印によって示した)と共にαAのC末端のα7ヘリックスを図9に示してある。「閉鎖」αAのα7ヘリックスには、下線を引いてある。種々のインテグリン(下線を引いてある)のプロペラ・ドメインのカップ・テトラペプチド(cup tetrapeptide)およびA4鎖の二次構造アラインメントは、CD11bからのαVβ3およびαAの結晶構造に基づく(Leeら、1995 Structure 3： 1333-1340； Xiongら、2001 Science 294： 339-345)。
【００３８】
図10Aおよび10Bは、それぞれαAドメインの「閉鎖」(左)および「開放」(活性)(右)状態のGlu320を示すαA-インテグリンCD11b/CD18の仮定的モデルを示す。αAが、その不活性な「閉鎖」からその活性な「開放」状態にスイッチすると、α7の下方への10Åの変化により、βA MIDASに関して劇的に不変異Gluの位置を変える。この変化により、「リガンド結合」したαVβ3におけるリガンドAspのものと同様の方法で、Glu側鎖はβA MIDASの金属イオンと連係して働かせることができるのであろう。不変異Gluを含むリンカー配列内に延長するα7ヘリックスの最後の3つのアミノ酸は、ヘテロ二量体に関してさえ(Luら、前記)、αAの「開放」形態に障害が生じ、およびおそらく柔軟となる(Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523-1534； Xiongら、2000 J.Biol. Chem. 275： 38762-38767； Leeら、1995 Structure 3： 1333-1340)。加えて、αAに隣接するNおよびC末端リンカーは、これらが機能遮断mAbsのためのエピトープを含むので、溶媒にアクセスできるようである(Luら、前記； Binnertsら、1996 J. Biol. Chem. 271： 9962-9968)。
【００３９】
図10Bでは、βA MIDAS、ADMIDAS、およびLIMBSの金属イオンをそれぞれ文字J、K、およびLによって示してある。αA MIDAS金属は、文字Mによって示してある。図10Aは、「非リガンド結合」状態のβAの特徴であり、図10Bは、「リガンド結合」状態のβAを示す。また、2つのその他の組み合わせ、αA「閉鎖」+βA「リガンド結合」およびαA「開放」+βA「非リガンド結合」も可能である。プロペラに対するαAのNおよびC末端を接続するリンカーの構造上の情報は、現在利用できず、したがって、αAの正確な四次配置は、実験による構造上の情報を待たなければならない。現在のモデルは、αVβ3構造を使用してModeller 4.0(Saliら、1993 J. Mol. Biol. 234： 779-815)で構築し、配列アラインメントによって指示された幾何学的な要求を満たすαAの1つの可能な位置を示す。仮説と一致したその他の可能な配置も残っている。C末端のリンカーは、第2の保存されたGlu(CD11bのGlu333を含む)が；このモデルにおいて、この残基は、あまりにβA MIDASから遠く離れており、したがって、これと相互作用することができない。
【００４０】
不変のGluの突然変異は、活性化非依存的なリガンドとこれらの相互作用に影響を及ぼすことなく、活性化依存的リガンドに対するαAインテグリンの結合を障害することが予想される。前者の条件は、CD11a/CD18について確立されている(Huthら、2000 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97： 5231-5236)。後者の条件およびその他のインテグリンに対するこの予測の適応性を評価するために、インテグリン-リガンド相互作用における不変異Gluの役割を別のαA-インテグリンCD11b/CD18を使用して試験した。このGlu(成熟したCD11bのGlu320)のAla(E320A)、Gln(E320Q)、またはAsp(E320D)への置換を導入し、生じる受容体の発現および機能を、内因性のCD11b/CD18を欠如するヒト293上皮細胞において評価した。
【００４１】
本突然変異は、CD11b/CD18またはヘテロ二量体形成の表面発現を障害しなかった。図11Aおよび11Bは、WTまたは変種CD11b/CD18を発現する293細胞からの抗CD11b(mAb 44aを使用)免疫沈降物におけるCD18の存在を示す実験に由来する2つのウェスタンブロットを示す。鏃は、205kDa、97.4kDa、および68kDaの分子量マーカーを示す。それぞれの試料について2回行い、44aまたは抗CD18 mAbsによってプローブした(Liら、1998 J. Cell Biol. 143： 1523-1534)。mAb 44a(上記の点線)によってプローブしたゲルを上部に、およびポリクローナル抗CD18によってプローブした二毎のゲルを下部に示してある。モック・トランスフェクトした293細胞(モック)からの抗CD11b免疫沈降物中には、CD18は見られなかった。
【００４２】
また、変異型および野性型(WT)受容体も、mAbs KIM185およびKIM127と同等に反応した。mAbs KIM185は、活性化抗体(すなわち、高親和性へのスイッチを誘導する)であるが、mAbs KIM127は、活性化感受性の抗体(すなわち、受容体の活性型に結合する)であるように見える。図11Cは、抗CD11b mAb 44a、並びに野生型(WT)および変種CD11b/CD18を発現する293細胞に対する抗CD18 mAbs(TS1/18、KIM185、およびKIM127)の相対的な結合を示すヒストグラムを表す。結合は、前述したように(CD18の脚部分の内の領域を認識する)(Liら、前記)、抗CD11b mAb 903(これは外側のαAに結合する)のものに対して正常化した。
【００４３】
図11Dは、Ca2++Mg2+(それぞれ1mM)を含む緩衝液、Mn2+(0.5mM)を含む緩衝液、または活性化mAbs KIM127もしくはKIM185を含むCa2+ + Mg2+緩衝液中でのWTおよび変種CD11b/CD18に対する活性化依存的な生理学的リガンドiC3bの相対的な結合を示すヒストグラムを表す。また、WTおよびE320Aに対するCa2+ + Mg2+緩衝液中でのNIFおよびmAbl07の相対的な結合を示すヒストグラムを表す。全てのヒストグラムは、代表的な実験(3回行ったうちの1回)からの4回の決定の平均±SDを示す。使用した方法は、293細胞をトランスフェクトし、種々の結合アッセイ法を行う前にポリ-L-リジン被覆プラスチックウェルに付着させたことを除いて、上記Liら、前記に記載されたとおりであった。mAbs24(Goodmanら、前記)、mAb107(Liら、2002 J. Immunol. 168： 1219-1225)、並びにKIM12、および185(Luら、2001 J. Immunol. 166： 5629-5637)の結合は、記載されたとおりに行った。
【００４４】
ヒストグラムは、天然のCD11b/CD18の中のαA MIDAS表面に結合するリガンドiC3bを使用する結合研究の結果を示す。iC3bに対するE320AおよびE320Q受容体の結合は、著しく減少していた。E320D突然変異では、より許容的であり、アミノ酸側鎖の電荷は、結合の鍵となる決定因子であることを示唆する。KIM185またはKIM127 mAbsによるE320Aインテグリンのさらなる活性化は、iC3bに対するその結合を増大したが、WTインテグリンのものよりも一貫して低レベルであった。有意に、3つの突然変異はいずれも、好中球阻害因子(NIF)およびリガンド擬態mAb107に対する結合に影響を与えず、これらは両方ともCD11b MIDASに結合する活性化非依存的なリガンドである。E320A受容体は、活性化およびmAb 24に対する陽イオン感受性のエピトープを発現することができず(Dransfieldら、1989 EMBO. J. 8： 3759)、αAが「開放」高次構造にロックされたときに、βAに結合した(Luら、2001 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 98： 2393-2398)。また、結合するmAb 24の減少は、同じインテグリンのβA MIDAS残基のアラニン置換においても見られた(Goodmanら、前記)。mAb 24の結合データは、提唱されたαAをβAに結合する「グルタミン酸ブリッジ」が、外側から内へのシグナリングを容易にしているのであろうことを示唆する。E320A突然変異が完全にiC3b結合を消失させないという事実は、驚くことではなく、おそらく保存されたテトラペプチドおよび隣接したリンカー残基を含むαAとβAのさらなる接触の指標である(Huthら、2000 Proc. Nat'l Acad. Sci USA 97： 5231-5236)。
【００４５】
変種インテグリンポリペプチド
インテグリンαサブユニットのAドメイン間の配列類似性を考慮すると、CD11bのIle316に対応する選択されたインテグリンαサブユニットのIleの欠失または置換により、サブユニットの野生型よりも活性な(すなわち、溶液中でリガンド結合型ポリペプチドの比率がより高くなる)変種インテグリンαサブユニットが形成されるはずである。図5は、9個のインテグリンαサブユニット(CD11b、CD11c、CD11ｄ、CD11a、α1、α2、α10、α11、およびαE)のAドメインのC末端α７ヘリックスのアラインメントを示す。このアラインメントにおいて、その他のインテグリンαサブユニットにおける、CD11bのIle316に対応する不変のIleを概説してある(矢印)。不変異IleをAlaもしくはGlyまたは他のいくつかの適切なアミノ酸に置換すると、活性が増加した変種インテグリンポリペプチドが得られるはずである。本発明者らは、CD11a Aドメインにこれが当てはまることを示した(図6)。IからGへの置換を含む変種CD11a Aドメインは、ELISAアッセイにおいて活性化依存的リガンドICAM-1に対する結合を示す。この置換がない野生型タンパク質では、結合が観察されなかった。または、不変異IleおよびC末端から不変異Ileまでの全てのアミノ酸残基を含むインテグリンαサブユニット(またはAドメイン)の一部を欠失させることができる。以下の表2は、図5に示したインテグリンαサブユニットのそれぞれの不変異Ileの位置の一覧を示す。
【００４６】
【表２】
2006510387.tif 000004
【００４７】
本発明は、不変異Ile(表2に一覧を示した)が、Gly、Aｌa、またはその他のいくつかのアミノ酸(たとえば、Val)に置換されている変種インテグリンαサブユニットポリペプチドを特徴とする。ポリペプチドは、表示のAドメインの一部または全て、たとえば不変異Ileの位置を含むAドメインの10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200連続アミノ酸を含むことができる。本発明には、Ileが欠失している変種インテグリンαサブユニットも含まれる。また、不変異Ileを除くインテグリンαの完全なAドメインを含むポリペプチドも本発明の範囲内である。たとえば、CD11bのアミノ酸144〜132、CD11cのアミノ酸145〜332、CD11dのアミノ酸144〜331、CD11aのアミノ酸150〜330を含むが、インテグリンαサブユニットの残りの部分は含まない。また、本発明は、不変異Ileまでを含むが不変異Ileを含まず、さらに不変異Ile以降の5つのアミノ酸を欠失するインテグリンαサブニットのAドメインを含むポリペプチド(たとえば、CD11bのアミノ酸144〜331を有するが332〜336は有さない；CD11cのアミノ酸145〜332を有するが333〜337は含まない；CD11dのアミノ酸144〜331を有するが332〜336は有さない；CD11aのアミノ酸150〜330を有するが331〜335は有さない；ヒトα1のアミノ酸139〜330を有するが331〜335は有さない；ヒトα2のアミノ酸169〜360を有するが361〜335は有さない；ヒトα10のアミノ酸57〜248を有するが249〜253は有さない；ヒトα11のアミノ酸159〜348を有するが349〜353は有さない；またはヒトαEのアミノ酸196〜381を有するが385〜389は有さない)を特徴とする。
【００４８】
インテグリンβサブユニットのA様ドメインの間の配列類似性を考慮すると、CD11bのIle316に対応する選択されたインテグリンβサブユニットにおけるIleの欠失または置換により、サブユニットの野生型よりも活性である(すなわち、溶液中でポリペプチドのリガンド結合型がより大きな比率で存在する)変種インテグリンβサブユニットの生成を生じるはずである。図7は、インテグリンβサブユニットのA様ドメインのアラインメントである。保存されたIleをAlaもしくはGly、またはその他の適切なアミノ酸に置換すると、活性が増加した変種インテグリンポリペプチドを生じるはずである。または、保存されたIleおよびC末端から不変異Ileまでの全てのアミノ酸残基を含むインテグリンβサブユニット(またはサブユニットのA様ドメイン)の一部を欠失させることができる。下記の表3には、図7に示すインテグリンβサブユニットのそれぞれの保存されたIleの位置の一覧を示す。
【００４９】
【表３】
2006510387.tif 000005
【００５０】
また、インテグリンαサブユニットのAドメインの配列類似性は、CD11bのGlu320に対応する選択されたインテグリンαサブユニットの不変異Gluの欠失または置換を提供し、活性化依存的なリガンド(活性化非依存的なリガンドでない)に対するサブユニットの野生型形態よりも活性の弱い変種インテグリンαサブユニットの生成を生じるはずである。図9は、9のインテグリンαサブユニットのAドメインのC末端α7ヘリックスのアラインメントである(CD11b(配列番号:21)、CD11c(配列番号:22)、CD11d(配列番号:23)、CD11a(配列番号:24)、α11(配列番号:25)、α10(配列番号:26)、α1(配列番号:27)、α2(配列番号:28)、およびαE(配列番号:29))。不変異GluをAla、Gln、もしくはAsp、またはその他の適切な一部のアミノ酸で置換すると、活性化依存的なリガンドに対して減少した活性を有する変種インテグリンポリペプチドが生成されるはずである。下記の表4は、図9に示すそれぞれのインテグリンαサブユニットの不変異Gluの位置の一覧を示す。
【００５１】
【表４】
2006510387.tif 000006
【００５２】
本発明は、不変異Glu(すなわち、未成熟CD11bのアミノ酸336に対応するGlu)が、Gln、Ala、またはAspを含むいずれかのアミノ酸に置換されている変種インテグリンαサブユニットポリペプチドを特徴とする。ポリペプチドは、表示されたAドメインおよびフランキング領域の一部または全て、たとえば、不変異Gluの位置を含むAドメインおよびフランキング領域の10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、または200連続アミノ酸を含むことができる。フランキング領域は、Aドメインのいずれかの側の5、10、15、20、または30アミノ酸であることができる。したがって、ポリペプチドは、また、保存されたテトラペプチドおよび／または隣接したリンカー残基を含むことができる(図9)。また、本発明は、Gluが欠失された変種インテグリンαサブユニットを含むことができる。また、保存されたテトラペプチドのアミノ酸が置換または欠失されているポリペプチドも本発明の範囲内である。保存されたテトラペプチドの少なくとも1、2、3、または4つのアミノ酸の全てをその他のいずれかのアミノ酸で置換して結合を障害することができる。また、リンカー領域のアミノ酸を置換して障害された結合にしてもよい。また、本発明は、保存されたテトラペプチドおよび／または隣接したリンカー配列までのインテグリンαサブユニットのAドメインを含むポリペプチドを特徴とする。
【００５３】
変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子
本発明は、変種インテグリンポリペプチド、たとえば完全長の変種インテグリンサブユニットまたはその断片(たとえば、不変異IleもしくはGluが、欠失もしくは置換されている)、たとえば生物学的に活性な変種インテグリンポリペプチドをコードする単離または精製された核酸分子を特徴とする。
【００５４】
1つの態様において、本発明の単離核酸分子は、CD11bαサブユニット(配列番号:1)のアミノ酸123〜315またはその一部をコードするヌクレオチド配列を含む。核酸分子は、非コード配列またはインテグリン以外のタンパク質の全てもしくは一部をコードする配列を含むことができる。
【００５５】
もう1つの態様において、本発明の単離核酸分子は、CD11bαサブユニットのアミノ酸123〜315をコードするヌクレオチド配列の相補体である核酸分子を含む。
【００５６】
本発明の核酸分子は、配列番号:1の核酸配列の一部のみを含んでいてもよい。たとえば、このような核酸分子は、インテグリンAドメインまたはA様ドメインの全てもしくは一部(たとえば、免疫原性もしくは生物学的に活性な部分)をコードする断片を含むことができる。
【００５７】
変種インテグリンポリペプチド
また、本発明は、変種インテグリンポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、組換えDNA法を使用して、化学合成法によって、またはその他の技術を使用して産生することができる。ポリペプチドは、インテグリンAドメインまたはA様ドメインの活性型に結合する抗体を作製するための免疫原または抗原として使用することができる。ポリペプチドは、翻訳後修飾、たとえばグリコシル化することができる。
【００５８】
変種インテグリンポリペプチドは、変種インテグリンポリペプチドではない第2のポリペプチドの全てまたは一部を含む融合タンパク質の一部となり得る。この第2のポリペプチドは、変種インテグリンポリペプチドのC末端またはN末端に融合させることができる。また、第3のペプチドの全てまたは一部が存在してもよい。したがって、変種インテグリンポリペプチドは、たとえば、GST、免疫グロブリン定常領域、異種シグナル配列に融合することができる。
【００５９】
本発明の変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質は、薬学的組成物に組み入れて、インビボで被験者に投与することができる。たとえば、変種インテグリンポリペプチドは、骨格筋傷害を減少させるために使用することができる。単離されたCD11b Aドメインは、この型の傷害の動物モデルにおいてダメージを減少させることが既に判明している。簡単には、機械的に骨格筋傷害を誘導する30分前に、精製した組換え型ラットCD11b Aドメインの1回量(1mg/kg)を、ルイスラットの7群(1群当たり5匹)に静脈内投与した。同数のラットを機能遮断の抗CD11b/CD18 mAb(1mg/kg)で処理した。対照ラット(PBSで処理)における創傷領域の定量的組織学的検査によって、浮腫、筋繊維の破壊、壊死、および赤血球の血管外遊走が示された。好中球の流入は、創傷の30分後に検出され、続いて3時間後に第2波が起こった。また、直接の創傷領域(5mm域)の外側には、活性化好中球の存在に付随して有意な組織壊死があった。AドメインまたはmAbで処理したラットでは、浸潤PMN数(75±10%、n=35)、および直接の壊死領域外の筋繊維の保護(80±8%、n=35)において、匹敵する有意な減少を示した。これらのデータは、Aドメインがこの筋傷害モデルにおいて有効な組織保護剤となり得ることを示している。変種Aドメインも同様に有効となり得る。
【００６０】
変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質を使用して、変種インテグリンポリペプチドリガンドの生物学的利用率に影響を及ぼすことができる。
【００６１】
変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質は、たとえば、虚血-再灌流傷害(Stroke 30： 134-9, 1999)、免疫複合体(J. Exp. Med. 186： 1853-63, 1997)、再狭窄、および寄生虫疾患(たとえば、鉤虫種(Ancylostoma spp)；J. Cell Biol. 127： 2081-91, 1994)によって引き起こされる障害の治療のために、治療的に有用となりうる。
【００６２】
さらに、本発明の変種インテグリンポリペプチド-融合タンパク質は、被験者において抗変種インテグリンポリペプチド抗体を産生するため、変種インテグリンポリペプチドリガンドを精製するため、および変種インテグリンポリペプチドリガンドと変種インテグリンポリペプチドとの相互作用を阻害する分子を同定するためのスクリーニングアッセイ法において、免疫原として使用することができる。
【００６３】
融合部分(たとえば、GSTポリペプチド)をコードする発現ベクターが既に市販されている。変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸は、融合部分が変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質にインフレームで結合するように、このような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００６４】
変種インテグリンポリペプチドは、発現ベクター(たとえば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター)を使用して産生することができる。ベクターは、自律的に増幅することができるか、または宿主ゲノムに組み入れることができる。発現ベクターは、発現される核酸配列に機能的に結合された少なくとも1つの調節配列(たとえば、プロモーター、エンハンサー、ポリA部位、または細胞もしくは組織特異的な転写因子結合部位)を含むことができる。発現ベクターは、原核または真核細胞、たとえば植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、および大腸菌(E.coli)において発現されるように設計することができる。変種インテグリンポリペプチドを発現させるために使用する宿主に依存して、宿主細胞に最適なコドンを使用してポリペプチドをコードすることが望ましい。場合によっては、組織特異的に発現させることができる発現ベクターを使用することが望ましい。
【００６５】
また、本発明は、変種インテグリンポリペプチドをコードする核酸分子を有する、宿主細胞または組換え細胞を特徴とする。核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み入れることができ、または自律的に複製するベクター中に存在させることができる。宿主細胞は、任意の原核または真核細胞、たとえば大腸菌(E.coli)、昆虫細胞、酵母、もしくは哺乳類細胞であることができる。核酸分子は、形質転換またはトランスフェクション技術によって宿主細胞に導入することができる。
【００６６】
本発明の宿主細胞は、ポリペプチドが産生されるような条件下で宿主細胞を培養することと、次いで細胞または培養培地からポリペプチドを単離することとによって、変種インテグリンポリペプチドを産生(すなわち、発現)するために使用することができる。
【００６７】
変種インテグリンポリペプチドを認識する抗体
また、本発明は、変種インテグリンポリペプチドに対して作製された抗体を特徴とする。このような抗体は、これらが対応する野生型インテグリンポリペプチドに結合するよりも優れた親和性で変種ポリペプチドに結合する。抗体は、標準的な方法を使用して作製することができ、変種インテグリンポリペプチドに対する抗体の結合を、対応する野生型ポリペプチドに対する抗体の結合と比較することによってスクリーニングすることができる。
【００６８】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、またはその免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分の例には、F(ab)およびF(ab')2断片を含み、これらはペプシンのような酵素によって抗体を処理することによって作製することができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え型、たとえばキメラもしくはヒト化、完全ヒト、非ヒト、たとえば、マウス、または一本鎖抗体であることができる。好ましい態様において、これは、エフェクター機能を有する。抗体は、潜在的な炎症(たとえば、膿瘍、または活性アテローム斑)の診断に使用するために、毒素または造影剤に結合させることができる。
【００６９】
キメラ、ヒト化、しかし最も好ましくは、完全ヒト抗体は、反復投与、たとえばヒト患者の治療的処置(およびいくつかの診断的応用)を含む適用のために望ましい。
【００７０】
抗変種インテグリンポリペプチド抗体は、一本鎖抗体であることができ、これは多価抗体を作製するために選択的に二量体または多量体にすることができる。抗体は、Fc受容体にほとんどまたは全く結合しないようにデザインすることができる。
【００７１】
本発明の抗体は、活性な高次構造であるインテグリンサブユニットを検出または精製するために使用することができる。したがって、これらを使用して、臨床検査技法の一部としてインテグリンの活性型の量および発現パターンを評価することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合させる(すなわち、物理的に連結させる)ことによって(すなわち、抗体の標識)、容易に行うことができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、および放射活性材料(たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン、125I、131I、35S、および3H)を含む。
【００７２】
変種インテグリンポリペプチドと相互作用する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ法
本発明は、化合物が変種インテグリンポリペプチドに結合する能力またはインテグリンリガンド(たとえば、天然に存在するインテグリンリガンド)の変種インテグリンポリペプチドに対して結合する能力の阻害を評価する方法を特徴とする。本方法は、リガンドの存在下または非存在下において、化合物を変種インテグリンポリペプチドに接触させることと、および化合物またはリガンドが変種ポリペプチドに対して結合する能力を測定することとを含み得る。さらに、本方法は、障害された変種インテグリンポリペプチドに対するリガンドの結合を増強すること、または活性化依存的なリガンドと活性化非依存的リガンドの間をスクリーンすること、もしくは区別することができる化合物を評価することを含み得る。
【００７３】
本方法は、インビトロで、たとえば無細胞系において、またはインビボで、たとえばツーハイブリッド相互作用捕獲アッセイ法において実施することができる。本方法は、インテグリンと相互作用する天然に存在する分子を同定するために使用することができる。また、インテグリンとインテグリンリガンドとの相互作用の天然または合成の阻害剤を発見するために使用することもできる。
【００７４】
試験される化合物は、たとえば、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬態、ペプトイド、および低分子であることができる。試験化合物は、生物ライブラリー；ペプトイドライブラリー；空間的に位置特定可能な平行固相または液相ライブラリー；逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリーを含むライブラリーの組み合わせから得ることができる。
【００７５】
化合物のライブラリーは、溶液中(たとえば、Houghten 1992 Biotechniques 13： 412-421)、またはビーズ(Lam 1991 Nature 354： 82-84)、チップ(Fodor 1993 Nature 364： 555-556)、細菌(Ladner 米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cullら、 1992 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89： 1865-1869)、またはファージ(Scott and Smith 1990 Science 249： 386-390； Devlin 1990 Science 249： 404-406； Cwirlaら、 1990 Proc. Nat'l Acad. Sci. 87： 6378-6382； Felici 1991 J. Mol. Biol. 222： 301-310； Ladner, 前記)に存在するであろう。
【００７６】
スクリーニングアッセイ法は、変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物に接触させて、試験化合物が変種インテグリンポリペプチド活性を調節する能力を決定するという細胞に基づくアッセイ法であることができる。試験化合物が変種インテグリンポリペプチド活性を調節する能力の決定は、たとえばインテグリンリガンドとの結合能をモニターすることによって達成できる。
【００７７】
試験化合物が、化合物、たとえばインテグリンリガンドに対する変種インテグリンポリペプチドの結合を調節する能力、または変種インテグリンポリペプチドに結合する能力も同様に評価することができる。これは、たとえば化合物、たとえば基質の、変種インテグリンポリペプチドに対する結合を複合体中の標識化合物、たとえば基質を検出することによって決定することができるように、化合物、たとえば基質を放射性同位元素または酵素標識に結合させることによって行うことができる。または、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドは、試験化合物がインテグリンリガンドに対する変種インテグリンポリペプチドの結合を調節する能力をモニターするために、放射性同位元素または酵素標識に結合させることができる。たとえば、化合物は、125I、35S、14C、または3Hによって直接または間接的に標識することができ、および放射性同位元素は、放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出することができる。または、化合物は、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識して、酵素標識を適当な基質の産物への変換を決定することによって検出することができる。
【００７８】
さらにもう1つの態様において、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させ、試験化合物が変種インテグリンポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合する能力を評価する、無細胞アッセイ法が提供される。本発明のアッセイ法に使用される変種インテグリンポリペプチドの好ましい生物学的に活性な部分は、インテグリンリガンドに結合する断片を含む。
【００７９】
単離されたタンパク質(たとえば、変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質またはその生物学的に活性な部分)の可溶型および／または膜結合型は、本発明の無細胞アッセイ法に使用することができる。タンパク質の膜結合型を使用するときは、可溶化剤を用いることが望ましいであろう。このような可溶化剤の例は、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、Triton(登録商標)X-100、Triton(登録商標)X-114、Thesit(登録商標)、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)n、3-［(3-コラミドプロピル)ジメチルアミニオ］-1-プロパンスルホネート(CHAPS)、3-［(3-コラミドプロピル)ジメチルアミニオ］-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート(CHAPSO)、またはN-ドデシル=N，N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネートなどの非イオン性洗浄剤が含まれる。
【００８０】
無細胞アッセイ法は、標的遺伝子タンパク質と試験化合物との反応混合物を、2つの成分が相互作用して結合するために十分な条件および時間で調製することと、これにより除去および／または検出することができる複合体を形成することとを含む。
【００８１】
また、2つの分子間の相互作用は、蛍光エネルギー移動(FET)(たとえば、Lakowiczら、米国特許第5,631,169号；Stavrianopoulosら、米国特許第4,868,103号を参照されたい)を使用して検出することができる。第1の「ドナー」分子の蛍光体標識は、その放出された蛍光エネルギーが第2の「アクセプタ」分子の蛍光標識によって吸収され、次に吸収されたエネルギーによって蛍光を発することができるように選択される。または、「ドナー」タンパク質分子は、単にトリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを利用してもよい。「アクセプタ」分子の標識は、「ドナー」の標識と区別されるように、異なる波長の光を放出する標識を選択する。2つの標識間でのエネルギー移転効率は、分子が離れている距離に関連があるため、分子間の空間的関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況では、アッセイ法における「アクセプタ」分子標識の蛍光放出は、最大でなければらなない。FET結合イベントは、当該技術分野において周知の標準的な蛍光検出手段(たとえば、蛍光計を使用して)によって従来のように測定することができる。
【００８２】
もう1つの態様において、変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質が、標的分子、たとえばインテグリンリガンドに結合する能力を決定することは、上記のようにリアルタイム生体分子相互作用分析(BIA)(たとえば、Sjolander and Urbaniczky 1991 Anal. Chem. 63： 2338-2345、およびSzaboら、 1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5： 699-705を参照されたい)を使用して達成することができる。「表面プラズモン共鳴」または「BIA」は、いかなる相互作用物質も標識せずに、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する(たとえば、BIAcore)。結合表面における質量の変化(結合イベントを示す)によって、表面近傍の光の屈折指数の変化が生じ(表面プラズモン共鳴の光学現象(SPR))、検出可能なシグナルが得られ、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
【００８３】
1つの態様において、ポリペプチドまたは試験化合物を固相上にアンカーする。固相にアンカーしたポリペプチド／試験化合物複合体は、反応終了時に検出することができる。好ましくは、ポリペプチドを固相表面にアンカーすることができ、試験化合物(アンカーされていない)を検出可能な標識によって直接または間接的に標識することができる。
【００８４】
一方または双方のタンパク質の非複合体型からの複合体型の分離を容易にするため、並びにアッセイ法を自動化に適応させるために、変種インテグリンポリペプチド、抗変種インテグリンポリペプチド抗体、またはその標的分子を固定することが望ましい。変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質に対する試験化合物の結合、または候補化合物の存在下および非存在下における標的分子と変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質との相互作用は、反応物質を含む適切な任意の容器において達成することができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管を含む。1つの態様において、一方または双方のタンパク質がマトリクスに結合させるためのドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。たとえば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／変種インテグリンポリペプチド融合タンパク質またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸収させることができ、次いでこれを試験化合物、または試験化合物および吸収されない標的タンパク質もしくは変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質のいずれかと合わせて、混合物を複合体が形成される条件下(たとえば、塩およびpHに関して生理的条件)でインキュベートする。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、未結合の化合物、ビーズの場合には固定したマトリクスを除去し、たとえば上記のように直接または間接的に複合体を決定することができる。または、複合体をマトリクスから解離させて、変種インテグリンポリペプチド結合または活性のレベルを標準的な技術を使用して決定することができる。
【００８５】
変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子のいずれかをマトリクスに固定するためのその他の技術は、ビオチンおよびストレプトアビジンの使用を含む。ビオチン化変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子は、当該技術分野において既知の技術(たとえば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL)を使用してビオチン-NHS(N-ヒドロキシ-スクシンイミド)から調製して、ストレプトアビジン被覆96ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェルに固定することができる。
【００８６】
アッセイを行うために、固定成分を含む被覆表面に非固定成分を加える。反応が終了した後、形成されたあらゆる複合体が固相表面上に固定されたままであるような条件下で未反応成分を除去する(たとえば、洗浄によって)。固相表面にアンカーされた複合体の検出は、多くの方法によって行うことができる。固定されていない成分が以前に予め標識されている場合、表面上に固定された標識の検出は、複合体が形成されたことを示している。固定されていない成分が以前に予め標識されていない場合、間接的な標識、たとえば固定された成分に対して特異的な標識抗体(抗体を、たとえば標識された抗Ig抗体で直接的または間接的に標識することができる)を使用して、表面上にアンカーされた複合体を検出することができる。
【００８７】
1つの態様において、このアッセイ法は、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子と反応するが、変種インテグリンポリペプチドのその標的分子に対する結合を妨げない抗体を利用して行われる。このような抗体は、プレートのウェルに誘導体化することができ、未結合の標的または変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質は、抗体の結合によってウェルに捕獲される。このような複合体を検出する方法は、GST固定複合体に関して上述した方法の他に、変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子に反応する抗体を使用して複合体を免疫学的に検出すること、並びに変種インテグリンポリペプチドまたは標的分子に関連した酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイ法が含まれる。
【００８８】
または、無細胞アッセイを液相中で行うこともできる。このようなアッセイ法では、反応産物をクロマトグラフィー、電気泳動、および免疫沈降を含む多くの標準的な技術によって未反応成分から分離する。好ましい態様において、アッセイ法は、変種インテグリンポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分を、変種インテグリンポリペプチドに結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物に接触させること、および試験化合物が変種インテグリンポリペプチドタンパク質と相互作用する能力を決定することを含み、試験化合物が変種インテグリンポリペプチドと相互作用する能力を決定することは、試験化合物が、既知の化合物と比較して、選択的に変種インテグリンポリペプチドもしくはその生物学的に活性な部分に結合する能力、または標的分子の活性を調節することができる能力を決定することを含む。
【００８９】
変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとの相互作用を妨害する化合物を同定するために、変種インテグリンポリペプチドとリガンドとを含む反応混合物を、2つの産物が複合体を形成するために十分な条件および時間でインキュベートする。阻害剤を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下および非存在下に提供する。試験化合物は、最初に反応混合物に含めることができ、または一度加えてその後、標的遺伝子およびその細胞内もしくは細胞外結合パートナーを加えることができる。対照反応混合物は、試験化合物を加えず、またはプラセボを加えてインキュベートする。次いで、変種インテグリンポリペプチドとインテグリンリガンドとのあらゆる複合体形成を検出する。対照反応において複合体が形成されるが、試験化合物を含む反応混合物において形成されないことは、化合物が相互作用を妨害することを示している。さらに、試験化合物および変種インテグリンポリペプチドを含む反応混合物における複合体形成を、試験化合および対応する野生型インテグリンポリペプチドを含む反応混合物における複合体形成と比較することができる。これらのアッセイ法は、不均一または均一な形式で行うことができる。不均一アッセイ法は、変種インテグリンポリペプチドまたは結合パートナー(すなわち、インテグリンリガンド)のいずれかを固相上にアンカーすること、および反応終了時に固相上にアンカーされた複合体を検出することを含む。均一アッセイ法では、反応全体を液相で行う。いずれのアプローチにおいても、反応物質を添加する順序は、試験される化合物に関して異なる情報が得られるように変更することができる。たとえば、変種インテグリンポリペプチドと結合パートナー(たとえば、インテグリンリガンド)との相互作用を、たとえば競合によって妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって同定することができる。または、予め形成された複合体を破壊する試験化合物、たとえば複合体から成分の1つを置換するより高い結合定数を有する化合物は、複合体が形成された後に反応混合物に試験化合物を添加することによって試験することができる。様々な形式を以下に簡単に説明する。
【００９０】
不均一アッセイ系では、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドのいずれかを固相表面(たとえば、マイクロタイタープレート)にアンカーして、非結合種を直接または間接的に標識する。アンカーされた種は、非共有または共有結合によって固定することができる。または、アンカーされる種に特異的な固定抗体を使用して固相にその種をアンカーすることができる。
【００９１】
本アッセイ法を行うために、固定種のパートナーを試験化合物と共に、または試験化合物の非存在下で被覆表面に曝露する。反応が終了した後、未反応の成分は除去されるが(たとえば、洗浄によって)、形成されたあらゆる複合体は、固相表面に固定されたままであると考えられる。非固定種が予め標識されている場合、表面上に固定された標識が検出されると、複合体が形成されたことを示している。非固定種が予め標識されていない場合、間接的な標識を使用して、たとえば最初の非固定種に対して特異的な標識抗体(次に、抗体を、たとえば標識抗Ig抗体によって直接または間接的に標識することができる)を使用して、表面上にアンカーされた複合体を検出することができる。反応成分を添加する順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。
【００９２】
または、反応は、試験化合物の存在下または非存在下で液相で行うことができ、反応産物を未反応成分から分離して、並びに、たとえば溶液中で形成されたあらゆる複合体をアンカーするための結合成分の1つに対して特異的な固定抗体、およびアンカーされた複合体を検出するためのその他のパートナーに対して特異的な標識抗体を使用して、複合体を検出することができる。この場合も、反応物質を液相に添加する順序に応じて、複合体を阻害するか、または予め形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
【００９３】
本発明のもう1つの態様において、均一アッセイを使用することができる。たとえば、変種インテグリンポリペプチドまたはインテグリンリガンドのいずれかが標識されているが、標識によって産生されるシグナルが複合体形成によって消光するような、変種インテグリンポリペプチドおよびインテグリンリガンドの予め形成された複合体を調製する(たとえば、このアプローチを免疫アッセイ法に利用する米国特許第4,109,496号を参照されたい)。予め形成された複合体に由来する種の1つに競合する、および置換する試験物質を添加すると、バックグラウンドを超えるシグナルが生じると考えられる。このようにして、変種インテグリンポリペプチド-結合パートナーの相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【００９４】
さらにもう1つの局面において、変種インテグリン・ポリペプチド・タンパク質は、変種インテグリンポリペプチドに結合または相互作用するその他のタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドアッセイ法またはスリーハイブリッドアッセイ法における「ベイト(bait)タンパク質」として用いることができる(たとえば、米国特許第5,283,317号； Zervosら、1993 Cell 72： 223-232； Maduraら、 1993 J. Biol. Chem. 268： 12046-12054； Bartelら、 1993 Biotechniques 14： 920-924； Iwabuchiら、 1993 Oncogene 8： 1693-1696；およびBrent、国際公開公報第94/10300号を参照されたい)。
【００９５】
ツーハイブリッドアッセイ法は、ベイトタンパク質として変種Aドメインを使用して行うことができる。簡単には、変種AドメインをLexA DNA結合ドメインに融合させて、ベイトとして使用する。プレイ(prey)は、N末端核局在シグナル、LexA活性化ドメイン、およびエピトープタグを有する融合タンパク質として、TrxA発現の活性部位ループ内にクローニングしたアプタマーライブラリーである(Colasら、1996 Nature 380： 548；およびGyurisら、Cell 1993, 75： 791)。酵母細胞をベイトおよびプレイ遺伝子によって形質転換する。アプタマーが変種Aドメインに結合すれば、LexA活性化ドメインは、LexA DNA結合ドメインと近位になり、適切に配置されたLexA結合部位を有する遺伝子の発現が増加する。
【００９６】
この系を試験するために、酵母株EGY48をベイトプラスミドおよびpSH18-34(URA3、lacZに融合したGAL1プロモーターを含む、2μmプラスミドであって、その中のGAL1エンハンサー様の上流活性化配列(UASG)が、8個のLexA二量体の結合部位に置換されている)によって形質転換した。酵母株は、2つのレポーター遺伝子、LexAop-LEU2(酵母染色体LEU2遺伝子を置換)およびLexAop-lacZを2μm HIS3+プラスミド上に含む。形質転換細胞をX-galを含む培地上で播種した。ベイトの存在は、β-ガラクトシダーゼの発現は引き起こさなかった。形質転換細胞は、Leu欠損プレートにおいて増殖しなかったことから、ベイト自身も同様にEGY48においてLexAop-Leu2遺伝子を活性化しなかった。次に、抑制型のアッセイ法において、ベイトプラスミドおよびpJK101レポーターを使用して、ベイトの核輸送を評価した。このアッセイ法では、転写的に不活性なLexA融合タンパク質によるDNA結合を検出することができる。pJK101レポーターは、URA3、すなわちUASGのほとんどを含む2μｍのプラスミドである。LexAの高親和性部位は、Gal1転写開始とUASGとの間に存在する。CD11bA-LexAベイトは、ガラクトース培地で増殖させると、pJK101プラスミドを有する酵母のガラクトシダーゼ活性を障害し、このベイトが核に入ることを示している。
【００９７】
アプタマーライブラリーをLeuおよびlacZレポーターを含む酵母細胞に導入した。ライブラリータンパク質の合成は、ガラクトース培地中で酵母を増殖させることによって誘導した。ベイトに結合する適切なプレイが存在しない場合、酵母細胞は、Leu-培地上で増殖せず、β-ガラクトシダーゼ活性を有さない。適切なプレイを発現する細胞は、Leu-培地上でコロニーを形成して、β-ガラクトシダーゼ活性を有する。選択的なガラクトース(しかし、グルコースではない)誘導性発現では、明らかにライブラリータンパク質によるLeuおよびLacZ表現型にさせることができ、その後の分析によって除外しなければならないライブラリープラスミドの数が減少される。陽性コロニー(すなわち、ガラクトース上で増殖することができるコロニー、Ura-、Trp-、His-、Leu-プレート)由来のプラスミドを救出した(Hoffmanら、1987 Gene 57： 267)。それぞれのクローンをさらに特徴づける前に、ベイトとの相互作用の特異性を試験した。これは、無関係なまたは非機能的なベイト(たとえば、それぞれCD11a Aドメイン-LexAおよび11bA-D242A-LexA)と、ベイトのDNA結合ドメイン部分と、または非特異的にプロモーターもしくはその他の転写機構のエレメントと、相互作用しないことを示すことによって行われた。ライブラリープラスミドをガラクトース依存的Leu+ lacZ+酵母から救出して、もとの選択株および異なるベイトを含むその他の株に再度導入した。特異的相互作用物質は、ガラクトース依存的Leu+およびlacZ+表現型を、もとのベイトを含む酵母に付与するが、無関係なベイトを含む酵母には付与しない。相互作用交配アッセイ法を使用して特異性を試験することができる。簡単には、プレイを含む株をもとのベイトタンパク質または対照ベイトタンパク質のいずれかを発現する異なる酵母株と交配させる。レポーターは、もとのベイトを含む二倍体のみで活性となるはずである(Finleyら、(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91： 12980)。
【００９８】
本発明の変種インテグリンに結合するか、または活性化する化合物の同定を含むスクリーニングアッセイ法は、さらなるアッセイ工程と組み合わせることができる。したがって、本発明は、変種インテグリン結合化合物を同定するために、本発明の変種インテグリンに結合する化合物を同定することと、および次いで、化合物が、対応する野生型インテグリン(または、異なる変種インテグリン)に結合する能力を評価することとを含む。変種インテグリンに結合する化合物を、インテグリンを含むプロセスの動物モデルにおいて活性をスクリーンすることができる。このようなモデルの例は、以下に記載されている。
【００９９】
変種インテグリンおよび対応するサブユニットであって通常はヘテロ二量体を形成するものを両方とも発現する細胞を使用してスクリーニングアッセイ法を行うことが望まれ得る。したがって、CD11a、CD11b、およびCD11cをCD18と共に細胞に発現させることができる。
【０１００】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイ法によって同定される新規薬剤に関する。したがって、このような薬剤による治療の有効性、毒性、副作用、または作用機序を決定するために、本発明に記載されるように同定された薬剤(たとえば、変種インテグリンポリペプチド調節薬)を適当な動物モデルにさらに使用することは、本発明の範囲内である。さらに、上記のスクリーニングアッセイ法によって同定された新規薬剤は、本明細書に記載された治療のために使用することができる。
【０１０１】
薬学的組成物
変種インテグリンポリペプチド、その断片と共に、並びに本発明の抗変種インテグリンポリペプチド抗体(本明細書において「活性化合物」とも呼ばれる)は、薬学的組成物に組み入れることができる。このような組成物は、典型的にはタンパク質または抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に使用されるものとして、「薬学的に許容される担体」の専門用語は、薬学的投与に適合性の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、並びにその他を含む。また、補助活性化合物も組成物に組み入れることができる。
【０１０２】
薬学的組成物は、その企図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：注射用水、生理食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール、またはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、または燐酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多数回投与バイアルに封入することができる。
【０１０３】
注射可能な使用に適した薬学的組成物には、滅菌水溶液(水溶性の場合)または分散剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調合調製物のための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体は、生理食塩液、静菌水、クレモフォアEL(Cremophor EL；商標)(BASF, Parsippany, NJ)または燐酸緩衝生理食塩液(PBS)が含まれる。全ての場合において、組成物は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性である程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール(たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、その他)を含む溶媒または分散媒体、並びにこれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、たとえばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、その他によって行うことができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいと考えられる。注射可能な組成物は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって持続的に吸収させることができる。
【０１０４】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に活性化合物の必要量を組み入れて、必要であれば濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基礎分散媒体および先に列挙した必要なその他の成分を含む滅菌溶媒に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に濾過滅菌したその溶液から、活性成分プラスさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１０５】
一般的に、経口組成物には不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセルの形態で使用することができる。また、経口組成物は、マウスウォッシュとして使用される液体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分、または類似の特性を有する化合物のいかなるものも含むこともできる：微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステローテスなどの潤滑剤；二酸化珪素コロイドなどの滑り剤；蔗糖もしくはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香料。
【０１０６】
吸入投与のためには、化合物は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態でデリバリーされる。
【０１０７】
また、全身投与は、経粘膜または経皮手段によっても行うことができる。経粘膜または経皮投与のためには、浸透すべき障壁に対して適当な浸透剤を製剤中で使用する。このような浸透剤は、一般的に当該技術分野において既知であり、たとえば、経粘膜投与のためには、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を使用して行うことができる。経皮投与のためには、活性化合物は、当該技術分野において一般的に既知のように軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１０８】
また、化合物は、直腸デリバリーのための坐剤(たとえば、カカオバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤と共に)または浣腸の形態で調製することができる。
【０１０９】
1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化されたデリバリー系を含む徐放性製剤などの、化合物が体から迅速に消失しないようにする担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、多価無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方を調製する方法は、当業者に明らかである。また、材料は、アルザ社(Alza Corporation)およびノバファーマシューティカルズインク(Nova Pharmaceuticals, Inc.)から購入することができる。また、リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む)も薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、たとえば米国特許第4,522,811号に記載されるように、当業者に既知の方法に従って調製することができる。
【０１１０】
投与を容易にするため、および用量を均一にするために、単位用量で経口または非経口組成物を処方することが有利である。用量単位形態は、本明細書に使用されるものとして、治療される被験者に関して単位用量として適している物理的に個別の用量であって；各単位が必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の規定量を含むものを意味する。
【０１１１】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的技法、たとえばLD50(集団の50%に対して致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療的に有効な用量)を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表記することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非罹患細胞に対する損傷の可能性を最小限にして、これにより副作用を減少させるために、このような化合物を罹患組織の部位にターゲティングするデリバリー系を設計するように注意しなければならない。
【０１１２】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて用いられる幅広い用量を処方するために使用することができる。このような化合物の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有さないED50を含む循環中の濃度範囲内に存在する。用量は、用いる投与剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動してもよい。本発明の方法に使用されるいずれの化合物に関しても、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養において決定されたIC50(すなわち、症状の最大阻害の半量を得る試験化合物の濃度)を含む循環中の血漿濃度範囲を得るように動物モデルにおいて処方してもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０１１３】
本明細書において定義されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療的有効量(すなわち、有効量)は、約0.001〜30 mg/kg体重、好ましくは約0.01〜25 mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜20 mg/kg体重、およびさらにより好ましくは約1〜10 mg/kg、2〜9mg/kg、3〜8mg/kg、4〜7mg/kg、または5〜6mg/kg体重の範囲である。タンパク質またはポリペプチドは、約1〜10週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは3〜7週間、およびさらにより好ましくは約4、5、または6週間の間に週1回投与することができる。当業者は、疾患または障害の重症度、これまでの治療、被験者の全身健康および／または年齢、および存在するその他の疾患を含む(しかし、これらに限定されない)特定の要因が、被験者を有効に治療するために必要な用量および時期に影響を及ぼす可能性があることを認識すると考えられる。その上、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療的有効量による被験者の治療には、一回治療が含まれ得る、または好ましくは一連の治療が含まれ得る。
【０１１４】
抗体に関して、好ましい用量は、0.1 mg/kg体重(一般的に10 mg/kg〜20 mg/kg)である。抗体が脳において作用する場合、50 mg/kg〜100 mg/kgの用量が通常適当である。一般的に、部分的なヒト抗体および完全なヒト抗体は、他の抗体よりもヒトの体内において長い半減期を有する。したがって、より低い用量およびあまり頻繁でない投与が可能なことが多い。脂質付加などの修飾を使用して抗体を安定化させ、組織の(たとえば、脳への)取り込みおよび浸透を増強することができる。抗体の脂質付加方法は、Cruikshankら、 1997 J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14： 193に記載されている。
【０１１５】
本発明は、発現または活性を調節する薬剤を含む。薬剤は、たとえば低分子であってもよい。たとえば、そのような小分子には、ペプチド、ペプチド擬態(たとえば、ペプトイド)、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、1モルあたりの分子量が約10,000グラム未満の有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機または有機金属化合物を含む)、1分子あたりの分子量が約5,000グラム未満の有機または無機化合物、1分子あたりの分子量が約1,000グラム未満の有機または無機化合物、1分子あたりの分子量が約500グラム未満の有機または無機化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル、およびその他の薬学的に許容される形態を含むがこれらに限定されない。
【０１１６】
用量の例は、被験者または試料重量1キログラムあたり小分子のミリグラムまたはマイクログラム量を含む(たとえば、約1μg/kg〜約500 mg/kg、約100 μg/kg〜約5mg/kg、または約1μg/kg〜約50 μg/kg)。小分子の適当な用量は、調節すべき発現または活性に関する小分子の有効性に依存することが、さらに理解される。これらの小分子の1つまたは複数を、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物(たとえば、ヒト)に投与するときは、医師、獣医師、または研究者は、たとえば、最初に比較的低用量を処方して、その後に適当な反応が得られるまで用量を増加させてもよい。さらに、任意の特定の動物被験者の特定の用量レベルも、使用する特定の化合物の活性、被験者の年齢、全身体重、全身健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および調節すべき発現または活性の程度を含む様々な要因に依存することが理解される。
【０１１７】
抗体(またはその断片)は、細胞毒、治療薬、または放射活性金属イオンなどの治療部分に結合してもよい。細胞毒または細胞障害性の薬剤には、細胞にとって有害な任意の薬剤も含む。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにこれらの類似体または相同体を含む。治療薬は、抗代謝剤(たとえば、メソトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン)、アルキル化剤(たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス-ジクロロジアミンプラチナ(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(たとえば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)、およびドキソルビシン)、抗生物質(たとえば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、並びに抗分裂剤(たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)を含む。
【０１１８】
本発明の結合体は、所与の生物反応を修飾するために使用することができ、薬剤部分は、古典的な化学治療物質に限定されるものと解釈すべきではない。たとえば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質は、たとえば、アブリン、リシンA、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、ジフテリア毒素、またはサイトカインもしくはインターロイキンなどのタンパク質を含んでもよいが、これらに限定されない。
【０１１９】
または、抗体は、Segalらによって米国特許第4,676,980号に記載されるように、第2の抗体に結合して抗体のヘテロ結合体を形成することができる。
【０１２０】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、たとえば、静脈内注射、局所投与(米国特許第5,328,470号を参照されたい)によって、または定位注射(たとえば、Chenら、 1994 Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91： 3054〜3057)によって被験者にデリバリーすることができる。遺伝子治療ベクターの薬学的製剤は、許容される希釈剤における遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子デリバリー媒体が抱埋された徐放性マトリクスを含むことができる。または、完全な遺伝子デリバリーベクターを、組換え型細胞、たとえばレトロウイルスベクターから無処置で作製することができる場合、薬学的製剤には、遺伝子デリバリー系を生じる1つまたは複数の細胞を含むことができる。
【０１２１】
薬学的組成物は、投与のための説明書と共に容器、パック、ディスペンサーを含むことができる。
【０１２２】
インテグリンを含むプロセスの動物モデル
可能性がある治療的組成物を試験するために有用となり得る血管損傷モデルは、Simonら(2000 J. Clin. Invest. 105： 293)によって記述される。Tangら(1997、J. Exp. Med 186： 1853)は、様々なスクリーニングアッセイ法に有用となり得るCD11bノックアウトマウスを記述している。火傷の損傷に関する動物モデルも有用となる可能性がある(Plast Reconstr Surg. 1995 96： 1177)。
【０１２３】
治療方法
本発明は、異常または望まれないインテグリン発現または活性に関連した障害のリスクを有する(または感受性がある)か、または障害を有する被験者を治療する予防的および治療的方法を提供する。
【０１２４】
「治療」または「患者を治療すること」とは、本明細書に使用されるものとして、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、軽減、変化、治療、改善、和らげる、改善もしくは影響を及ぼす目的で、治療薬を患者に適用もしくは投与すること、または疾患、疾患の症状、もしくは疾患に対する素因を有する患者から単離された組織もしくは細胞株に対する治療薬の適用もしくは投与であると定義される。治療薬には、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２５】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法によって、たとえば、LD50(集団における50%に致死的な用量)、およびED50(集団における50%において治療的に有効な用量)を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の用量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表記することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することができるが、非罹患細胞に対する損傷の可能性を最小限にして、これにより副作用を減少させるために、このような化合物を罹患組織の部位にターゲティングするデリバリー系を設計するように注意しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図1Aおよび1Bは、CD11b Aドメインの結晶構造の表面の略図をその「閉鎖」(図1A)および「開放」(図1B)状態で示し、C末端のα７ヘリックスを灰色のリボンで示し、イソロイシン(Ｉ316)残基を黒色で示す。矢印は、MIDAS表面を指す。MIDASおよびSILEN(イソロイシンのためのソケット)は、Aドメイン構造のほぼ正反対の末端に存在する。  図1Cおよび1Dは、SILEN残基(Ｉ316から半径4Å内に存在するＩ135、Ｌ164、Ｉ236、Y267)の拡大表面図を「閉鎖」(図1C)および「開放」(図1D)立体配置で示す。「閉鎖」型(図1C)では、Ｉ316側鎖は、SILENに入り込んでおり；Ｌ312は、上部に見られる。Ｌ312は、「開放」構造(図1D)ではSILENを覆うように移動する。図1A〜1DはGRASP(Barry Honig, Columbia University, NY)を使用して作製した。  図1Eおよび1Fは、「閉鎖」(図1E)および「開放」(図1F)高次構造におけるI316配位結合ソケットの立体図を示す。SILEN残基およびI316およびL312を標識してある。
【図２】図2Aおよび2Bは、11bA123-321(図2A)および11bA123-315構造からのα７のC末端部分の2F0-Fc電子密度マップを示す。マップは、1.1σで輪郭を示し、Oによって作製する。  図2Cおよび2Dは、CD11b Aドメインについてそれぞれ報告された「閉鎖」(図2C、緑の追跡)および「開放」(図2D、緑の追跡)型に対して、11bA123-321(図2C、赤い追跡)および11bA123-315(図2D、赤い追跡)構造を完全に重ね合わせて示す、リボン略図を示す。金属イオンを紫の球として示す。  図2Eおよび2Fは、MIDASの立体図を11bA123-321(図2E)および11bA123-315(図2F)構造で表す。直接的D242金属結合、および間接的なT209-水-金属結合(図2E)は、「閉じた」高次構造の特徴である。金属イオンは、この場合Mn2+である。MIDAS高次構造(直接的T209-金属結合、間接的なD242-水-金属結合、および緑色で示す活性部位を占有する偽リガンドグルタメート、並びに直接配位結合する金属イオン(Ca2+)は、「開放」高次構造のものである)。図2Eおよび2Gにおいて、金属イオンは、紫に示してあり、水素結合は、黄色の点線として示してある。
【図３】図3A〜3Jは、11bAE-G(図3A〜3E)および11bA123-315(図3F〜3J)、並びに活性化依存的リガンドiC3b(図3Aおよび3F)、フィブリノーゲン(図3Bおよび3G)、またはCD54(図3Cおよび3H)との相互作用を記録するために、BIAcore(商標)を使用した11bAE-Gおよび11bA123-321Aドメインの機能的分析の結果を示す。3つのリガンド全てが11bA123-315に結合したが、11bA123-321には結合しなかった。活性化非依存的リガンド、NIF(図3Dおよび3I)、並びにmAb 904(図3Eおよび3J)に対する結合が同等であったことから、観察された結合の差はタンパク質濃度の差が原因ではなかった。親和性を定量的に決定するために、Aドメインペプチドの様々な濃度を使用した。結合データは、一次変換によって分析し、解離定数(Kd、平均値±SD、n=2)0.46±0.15μM(iC3bに関して)、0.25±0.07μM(フィブリノーゲンに関して)、および0.22±0.04μM(CD54に関して)を得た。
【図４】図4Aは、iC3bに対する11bA1→Gの結合の解析結果を表す。点線は、同じリガンドに対する11bA123-321の結合が存在しないことを表す。計算されたKdは0.66±0.3μM(平均値±SD、n=2)である。  図4Bは、野生型受容体と比較して、COS細胞上に発現された1→GCR3のiC3bに対する相対的結合を示すヒストグラム(平均値±SD、n=3)を示す。
【図５】9個のαインテグリンαサブユニットのAドメインのアラインメントを示すCD11b(配列番号:1)、CD11c(配列番号:2)、CD11d(配列番号:3)、CD11a(配列番号:4)、α1(配列番号:5)、α2(配列番号:6)、α10(配列番号:7)、α11(配列番号:8)、およびαE(配列番号:9))。このアラインメントにおいて、不変のIle(I316)を矢印で示す。
【図６】CD11a Aドメインにおける不変のイソロイシンのIからGへの変異が、このインテグリンにおいて活性化ドメインを誘導することを示し、CD11b Aドメインにおけるこの知見を他のインテグリンAドメインに適用可能であることを強調する。
【図７】8個のインテグリンβサブユニットのA様ドメインのアラインメントである(b3(配列番号:10)、b5(配列番号:11)、b6(配列番号:12)、b1(配列番号:13)、b2(配列番号:14)、b7(配列番号:15)、b8(配列番号:16)、およびb4(配列番号:17))。このアラインメントにおいて、βサブユニットにおける不変のIleに対応する残基を矢印で示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、それぞれαAを欠損するインテグリンおよびαAを含むインテグリンの、αサブユニットプロペラおよびβサブユニットβAドメインの漫画表現を表す。
【図９】9つのαインテグリンサブユニットのAドメインのアラインメントを表す(CD11b(配列番号:21)、CD11c(配列番号:22)、CD11d(配列番号:23)、CD11a(配列番号:24)、α11(配列番号:25)、α10(配列番号:26)、α1(配列番号:27)、α2(配列番号:28)、およびαE(配列番号:29))。
【図１０】図10Aおよび10Bは、αAインテグリンCD11b/CD18の仮定的モデルを表し、それぞれ「閉鎖」および「開放」状態のGlu320を有する。
【図１１】図11Aおよび11Bは、WTまたは変種CD11b/CD18を発現する293細胞からの抗CD11b免疫沈降物中のCD18の存在を示すウェスタンブロットを表す。  図11Cは、WTおよび変種CD11b/CD18を発現する293細胞に対する抗CD11b mAb 44aおよび抗CD18 mAbs(TS1/18、KIM185、およびKIM127)の相対的な結合を示すヒストグラムを表す。  図11Dは、Ca2++Mg2+(それぞれ1mM)を含む緩衝液、Mn2+(0.5mM)を含む緩衝液、または活性化するmAbs KIM127もしくはKIM185を含むCa2++Mg2+緩衝液中でのWTおよび変種CD11b/CD18に対するiC3bの相対的な結合、並びにWTおよびE320Aに対するCa2++Mg2+を含む緩衝液中でのNIFおよびmAbl07の相対的な結合を示すヒストグラムを表す。
【図１２】シグナル配列を含む完全に未成熟のCD11bαサブユニット(配列番号:30)を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月23日(2005.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006510387000001.app
【国際調査報告】
2006510387.tif 000032
2006510387.tif 000033