(57)【要約】【課題】  バイオフィルムを除去するための方法、キット及び組成物を提供する。【解決手段】  少なくとも次の工程を同時に又は引き続き行う。  ａ）プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物を含む溶液を作成する工程。  ｂ）アルカリ性の洗浄剤を有する溶液を作成する工程。  ｃ）前記の溶液を、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）又は循環により、処理すべき表面に適用する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも次の工程が同時に又は引き続き行われることを特徴とするバイオフィルムの除去方法。
ａ）プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物を含む溶液を作成する工程。
ｂ）アルカリ性の洗浄剤を有する溶液を作成する工程。
ｃ）前記の溶液を、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）又は循環により、処理すべき表面に適用する工程。
【請求項２】
さらに次の工程が同時に又は引き続き行われる事を特徴とする、請求項１記載のバイオフィルムの除去方法。
ｄ）ミネラル塩の沈着物を溶解しうる酸を有する溶液を作成する工程。
ｅ）前記の溶液を、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）又は循環により、処理すべき表面に適用する工程。
【請求項３】
前記プロテアーゼのグループから選択された酵素が、エキソペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼからなるグループから選択された酵素、例えばトリプシンであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項４】
前記エステラーゼのグループから選択された酵素が、カルボキシルエステル加水分解酵素、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ及び／又はホスホジエステラーゼ、例えばリボヌクレアーゼであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項５】
前記酵素混合物がさらにオシダーゼ又はカルボヒドラーゼからなるグループから選択された酵素、例えばグリコシダーゼ及びガラクトシダーゼを含むことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項６】
前記酵素混合物がパンクレアチンであることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項７】
前記洗浄剤が界面活性剤を含むアルカリ溶液であることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項８】
前記洗浄剤が界面活性剤及び第４級アンモニウムを含むアルカリ溶液であることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項９】
前記洗浄剤溶液ががさらに消毒剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム又は次亜塩素酸カリウム溶液を含むことを特徴とする前記請求項のいずれかに記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項１０】
ミネラル塩の沈着物を除去するための酸において、前記酸が、クエン酸、過酢酸、グリコール酸及びヒドロキシ酢酸からなるグループから選択されることを特徴とする前記請求項２記載のバイオフィルムの除去方法。
【請求項１１】
プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む、少なくとも１種類の酵素混合物の溶液を有し、また少なくとも１種類のアルカリ性の洗浄剤溶液を有することを特徴とするバイオフィルム除去のためのキット。
【請求項１２】
前記プロテアーゼのグループから選択された酵素が、エキソペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼからなるグループから選択された酵素、例えばトリプシンであることを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記エステラーゼのグループから選択された酵素が、カルボキシルエステル加水分解酵素、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ及び／又はホスホジエステラーゼ、例えばリボヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１１又は１２記載のキット。
【請求項１４】
前記酵素混合物がさらにオシダーゼ又はカルボヒドラーゼからなるグループから選択された酵素、例えばグリコシダーゼ及びガラクトシダーゼを含むことを特徴とする前記請求項１１から１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
前記酵素混合物がパンクレアチンであることを特徴とする前記請求項１１から１４のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
前記洗浄剤が界面活性剤を含むアルカリ溶液であることを特徴とする前記請求項１１から１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１７】
前記洗浄剤が界面活性剤及び第４級アンモニウムを含むアルカリ溶液であることを特徴とする前記請求項１１から１５のいずれかに記載のキット。
【請求項１８】
前記キットがさらに消毒剤溶液、例えば次亜塩素酸ナトリウム又は次亜塩素酸カリウム溶液を含むことを特徴とする前記請求項１１から１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
前記キットがミネラル塩例えば炭酸カルシウムの沈着物を溶解しうる酸を含むことを特徴とする前記請求項１１から１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
前記酸が、クエン酸、過酢酸、グリコール酸及びヒドロキシ酢酸からなるグループから選択されることを特徴とする前記請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物、並びにアルカリ性洗浄剤を有することを特徴とするバイオフィルム除去用の組成物。
【請求項２２】
前記酵素混合物がパンクレアチンであることを特徴とする請求項２１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオフィルムの付着する支持体となりやすい表面を有する器具及び装置の消毒及び汚染除去の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
そのような器具及び／又は装置としては、医療分野においては、例えば分析装置、透析装置等の再使用される医療器具、及び移植片（角膜、心臓の弁）、人工組織などがある。歯科医療分野においては、天然又は人工の粘液膜や歯それ自体がバイオフィルム沈着部位となりうる。食品及び／又は製薬分野で使用される器具、空調プラント、さらにより一般的には、細菌が浮遊しうる水媒体に接触するあらゆる器具が対象となる。
【０００３】
これらに関し、器具、装置、及び／又は粘液膜の表面に付着したバイオマスから形成され持続的感染及び／又は汚染の原因となるバイオフィルムの除去が大きな問題となっている。これは水媒体中に浮遊する細菌が、バイオフィルムを形成するため出会った支持物に対して付着する性質を有することによる。バイオフィルムは物体表面に生じる細菌の塊りであり、これらの細菌は細胞外多糖類のマトリックスに取り囲まれている。バイオフィルムの形成は自然現象である。バイオフィルムが一度形成されると除去することは容易でない。
【０００４】
バイオフィルム対策のために現在提案されている消毒及び／又は汚染除去の方法は、抗菌的な見地からはある程度の効率を有しているが、バイオフィルムそのものを支持体から取り除かないので、細菌が容易に再発生し、特に血液透析の場合には物体表面に発熱物質の支持物が残るという問題がある。
【０００５】
ある装置又は器具では、炭酸カルシウム又は炭酸マグネシウムからなるスケールの沈着によりバイオフィルムが増強される。
【０００６】
ある器具の処理に関して、純粋な消毒溶液の作用を高めるために脱灰液が使用されているが、この使用は漂白剤のような薬剤を用いる場合を除けばバイオフィルムを完全に除去しない。漂白剤はバイオフィルムに有効であるけれども医療装置や器具をしばしば損傷する。またこれらの溶液は組織に接触する面に使用できず、及び／又は粘液膜上に直に使用できない。
【０００７】
非特許文献１は、バイオフィルムの破壊のために、酵素とフェノール消毒剤を順次使用することを教示している。非特許文献２は、グルコースオキシダーゼとラクトペルオキシダーゼのような酵素の組合せを使用することを教示している。特許文献１は、酵素によるバイオフィルムの除去方法を教示しており、この方法はカルボヒドラーゼ及びプロテアーゼのグループに属する酵素の使用、それらを順次使用すること、及びそれらと組合せて、又は別個に殺生物剤(biocides)、キレート剤及び他の洗浄剤のグループに属する薬剤を使用することを含む。また特許文献２は、酵素活性を用いた洗浄工程と、酵素混合剤の作用で解離した細菌を殺すための消毒剤による洗浄工程を含むことを特徴とする、水と接触する表面からバイオフィルムを除去する方法を教示している。しかし結果は不十分なものであり、これらのバイオフィルムを除去できる方法又は製品は現在のところ存在しないといえる。
【特許文献１】国際特許出願０１／５３０１０号公報
【特許文献２】欧州特許第１１８６５７４号公報
【非特許文献１】Ｌ．Ｆ．ジャケリン（Ｌ．Ｆ．Ｊａｃｑｕｅｌｉｎ）著「病理微生物学（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ）」１９９４年５月、４２５ページ
【非特許文献２】Ｃ．ヨハンセン（Ｃ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ）著「応用環境微生物学（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」１９９７年９月、３７２４ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、これまで得られなかった除去効率を達成する新規な方法の実施及び製品の選択により、上記の課題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、バイオフィルムを除去するための方法において、少なくとも次の工程を同時に又は引き続き行うことを特徴とする方法により、上記の課題を解決する。
ａ）プロテアーゼのグループから選択された少なくとも一種の酵素、エステラーゼのグループから選択された少なくとも一種の酵素、及びアミラーゼを含む酵素混合物を有する溶液を調製する工程と、
ｂ）アルカリ性のｐＨを有する洗浄剤を有する溶液を調製する工程と、
ｃ）ａ，ｂの溶液を洗浄(washing)又は循環により処理すべき表面に適用する工程。
【００１０】
本発明の他の実施例は、前記発明の方法が、さらに次の工程を同時に又は引き続き行うことを特徴とする。
ｄ）ミネラル塩の沈着物を溶解できる酸を有する溶液を調製する工程と、
ｅ）ｄの溶液を洗浄(washing)又は循環により処理すべき表面に適用する工程。
【００１１】
本発明はまた、次の各方法に関連する。
−前記プロテアーゼのグループから選択される酵素が、エキソぺプチダーゼ又はエンドペプチダーゼのグループから選択される酵素、例えばトリプシンである前記バイオフィルム除去方法。
−前記エステラーゼのグループから選択された酵素が、カルボキシルエステル加水分解酵素、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はホスホジエステラーゼ、例えばリボヌクレアーゼであることを特徴とする前記バイオフィルム除去方法。
−前記酵素混合物がさらにオシダーゼ(osidase)又はカルボヒドラーゼのグループから選択される酵素、例えばグリコシダーゼ及びガラクトシダーゼを含むことを特徴とする前記バイオフィルム除去方法。
−前記酵素混合物がパンクレアチンであることを特徴とする前記バイオフィルム除去方法。
−前記洗浄剤が界面活性剤を含有するアルカリ溶液であることを特徴とする前記バイオフィルム除去方法。
−前記洗浄剤が界面活性剤及び第４級アンモニウムをを含有するアルカリ溶液であることを特徴とする前記バイオフィルム除去方法。
−前記洗浄剤がさらに次亜塩素酸ナトリウム又は次亜塩素酸カリウム溶液等の消毒剤を含有することを特徴とする前記バイオフィルム除去方法。
【００１２】
前記方法がミネラル塩の沈着を除去するために酸性溶液で洗浄する工程を含む実施例においては、前記酸はクエン酸、過酢酸、グリコール酸及びヒドロキシ酢酸のグループから選択されることを特徴とする。
【００１３】
本発明はまたバイオフィルムを除去するためのキットにおいて、該キットが、プロテアーゼのグループから選択される少なくとも一種の酵素と、エステラーゼのグループから選択される少なくとも一種の酵素と、アミラーゼとを含有する酵素混合物の溶液、並びにアルカリ性のｐＨを有する少なくとも一種の洗浄剤とを有することを特徴とする。
【００１４】
本発明はまた、次のキットに関連する。
−前記プロテアーゼのグループから選択される酵素が、エキソぺプチダーゼ又はエンドペプチダーゼのグループから選択される酵素、例えばトリプシンである前記キット。
−前記エステラーゼのグループから選択された酵素が、カルボキシルエステル加水分解酵素例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、及び／又はホスホジエステラーゼ、例えばリボヌクレアーゼであることを特徴とする前記キット。
−前記酵素混合物がさらにオシダーゼ又はカルボヒドラーゼのグループから選択される酵素、例えばグリコシダーゼ及びガラクトシダーゼを含むことを特徴とする前記キット。
−前記酵素混合物がパンクレアチンであることを特徴とする前記キット。
−前記洗浄剤が界面活性剤を含有するアルカリ溶液であることを特徴とする前記キット。
−前記洗浄剤が界面活性剤及び第４級アンモニウムを含有するアルカリ溶液であることを特徴とする前記キット。
−前記洗浄剤がさらに次亜塩素酸ナトリウム又は次亜塩素酸カリウム溶液等の消毒剤を含有することを特徴とする前記キット。
−前記方法がミネラル塩の沈着を除去するために酸性溶液で洗浄する工程を含む実施例においては、前記酸がクエン酸、過酢酸、グリコール酸及びヒドロキシ酢酸のグループから選択されることを特徴とする前記キット。
【００１５】
前記酵素混合物は、好ましくは０．１ないし１０％の重量／体積濃度で使用され、前記洗浄剤は好ましくは０．１ないし３０％の体積／体積濃度で使用され、後者がさらに消毒剤を含む場合には、該消毒剤は好ましくは０．０１ないし２％の濃度で添加される。
【００１６】
本発明に係る方法における酵素混合物を含む溶液の適用時間は、バイオフィルムの種類、その古さ、処理する素材等により５分ないし１時間であり、好ましくは室温ないし４０℃、さらに好ましくは３７℃の温度下で行われる。
【００１７】
アルカリ性洗浄剤を含む溶液の適用時間は、バイオフィルムの種類及び処理する素材等により５分ないし２４時間であり、室温ないし９０℃の温度下で行われる。
【００１８】
また本発明は、プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物、並びにアルカリ性洗浄剤を有することを特徴とするバイオフィルム除去用の組成物に関する。
【００１９】
より詳細には、本発明に係る組成物は、酵素混合物がパンクレアチンであることを特徴とする。
【００２０】
本発明の一実施例において、酵素混合物と、洗浄剤を含む溶液とは、単一の溶液を形成する。本発明はまた、前記方法が、プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物、並びにアルカリ性洗浄剤を有することを特徴とする、バイオフィルム除去用の組成物に関する。
【００２１】
一実施例において、本発明の方法は、前記洗浄剤が界面活性剤を含む中性又は酸性の溶液であることを特徴とする。この実施例において、前記洗浄剤が酸性溶液である場合、スケーリング現象が顕著に起こるので、ミネラル塩を溶解するための追加の工程が必要ない。
【００２２】
「バイオフィルム」の語は、支持物の上に成長した微生物、特に細菌、ウイルス、寄生体及び真菌類の集合という意味に理解される。バイオフィルムが成長すると微生物は細胞外ポリマー特に細胞外多糖類等のマトリックスを排泄し、これが「スライム」又は「グリコカリックス」と呼ばれ壁体の表面にゼラチン状の沈着をなす生物フィルムを形成する。
【００２３】
「パンクレアチン」の語は、膵臓が分泌する消化酵素、特にたん白質分解酵素又はプロテアーゼ、加水分解酵素特にエステラーゼ、例えばリパーゼ、アミラーゼ及びリボヌクレアーゼ、及びトリプシンを含む膵臓抽出物という意味に理解される。欧州薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ）の定義を参照されたい。
【００２４】
「洗浄剤」の語は、洗浄現象を進展させるように特にデザインされた組成物であり、必須成分として界面剤すなわち界面活性剤を含有し、任意に添加成分（アジュバント、補強剤、充填剤及び添加剤）を含有する製品という意味に理解される。界面活性剤は、液体に加えられたときに、湿潤性を高めることにより表面張力を低下させる化合物である。
【００２５】
「アルカリ性ｐＨ」の語は、水溶液のｐＨが７よりも大きく、本発明においては好ましくは９又はそれよりも大きいという意味に理解される。
【００２６】
「バイオフィルムの除去」という語は、バイオフィルムを支持物から分離するという意味に理解される。
【００２７】
本発明に係る方法の有効性は、下記の実験によりテストされた。
【００２８】
本方法は５種類のバイオフィルムに関して検査され実験的に実施された。バイオフィルム１、２、３及び５は透析装置を模倣したインビトロのモデルを使用して作成された。
−  バイオフィルム１：成長促進用の栄養素を添加して成長させ（３日間）、中程度の厚み（約１０５ＣＦＵ／ｃｍ２）で、スライムに非常に富む。
−  バイオフィルム２：栄養素を添加せず１年以上成長させ、透析装置で実際に生じるのと同等の厚み（約１０３ＣＦＵ／ｃｍ２）で、スケール結晶に非常に富む。
−  バイオフィルム３：成長促進用の栄養素を添加して成長させ（５日間）、厚く（約１０９ＣＦＵ／ｃｍ２）、スライムに非常に富む。
−  バイオフィルム４：透析用の給水チューブの中央部分から取り出した標本で、バイオフィルムの厚さは約１０３ＣＦＵ／ｃｍ２）であり、１年以上成長させた。
−  バイオフィルム５：成長促進用の栄養素を添加、「予防的」モデルの中で３週間以上成長させた。
【００２９】
インビトロモデルの作成
滅菌済みのアピロジェニック血液透析濃縮製剤（Ｃｅｌａｒｆｌｅｘ、Ｂｉｅｆｆｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ社の登録商標）を研究室で連続生産されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＦｌａｖｉｍｏｎａｓ ｏｒｉｚｉｂｉｔａｎｓを含む滅菌されていない浸透水で希釈して得た、滅菌されていない透析液を、２５０ｍｌの反応容器に充填した。
長さ１．５ｍ、内径５ｍｍのシリコンチューブの環からなる閉回路に、ペリスタルティックポンプで加圧した汚染媒体を５００ｍｌ／分の流速で循環させた。すべてのチューブ及び反応容器は、予めオートクレーブにより１２１℃で３０分間滅菌された。したがって水中の細菌で自然に汚染された透析液が微生物の唯一の供給源である。
【００３０】
反応容器をホットプレートの上に置くことにより、全システムの温度は３７℃に維持された。
【００３１】
バイオフィルム１、３、５の場合は、細菌の成長とそれによるバイオフィルムの発達は５０倍に希釈されたＬＢ培地を加えることにより促進された。ＬＢ培地の５０倍希釈は、５倍に希釈したＬＢ培地を、透析液の１／１０の流速で充填することにより実行された。この透析液と培地の充填速度は、ペリスタルティックポンプによりそれぞれ５及び０．５ｍｌ／分に調節された。
【００３２】
バイオフィルム５の場合、モデルは次の方法で調整された。
培地を添加した滅菌されていない透析液を、ポリプロピレン継手で接続されたシリコンチューブに４時間流した。４時間毎にチューブを外して消毒装置に接続した（下記参照）。処理の後、チューブを再接続し汚染媒体を再度４時間循環させた。それと並行して、消毒されていない対照チューブを回路中に配置した。従って、消毒セッションによる中断を１回ずつはさんで、毎日２回の透析セッションを行うことができる。夜間及び週末には、最後の消毒の後で装置は停止され、チューブは室温で空のまま維持された。装置は対照チューブに成熟したバイオフィルムが形成されるまで運転された。
【００３３】
製品及び組合せの検査
６個の異なる系統に属する１７個の製品が検査された。これらの製品のリストを表１に示す。これらの製品は単体で及び組合せで評価された。従って、バイオフィルム１上では６０個の組合せの完全なスクリーニングが行われ、バイオフィルム２上では９個の組合せが評価され、最後に、選択された最良の組合せがバイオフィルム３、４、５上で検査された。
【００３４】
【表１】
2006504835.tif 000002
【００３５】
標本抽出
バイオフィルム１、２及び３で覆われたチューブは長さ５ｃｍのセグメントに切断された。バイオフィルム１、２のスクリーニングに関して、各セグメントはいずれかの処理を受けるためくじ引きにより選択された。対照標本はシリコン環から無作為に抽出され処理せずに維持された。
【００３６】
標本の処理
処理すべきチューブセグメントは、２本のチューブ（一方は上向き、他方は下向き）からなる組立体の上向きの枝管に接続され、さらにペリスタルティックポンプ及び水槽（２０℃以上の温度で行われる処理のため）に接続された。「再循環」モードで検査すべき製品は、１００ｍｌのフラスコ中で溶解させ、ペリスタルティックポンプで駆動して、表２に示す接触期間に相当する時間だけ５００ｍｌ／分の流速でチューブの閉回路を循環させた。「静置」モードで検査すべき製品は、１００ｍｌのフラスコ中で溶解させ、チューブが充満するまでペリスタルティックポンプで駆動した。その後ポンプを停止し、製品は所望の接触時間の間静止状態に置かれた。所定の製品による処理が終わる毎に、チューブの標本は浸透水で５分間すすがれた。
【００３７】
処理効果の評価方法
処理の有効性を評価するために次の３個の基本パラメータが使用された。
・被覆領域の減少
・培養可能（ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）な細菌の数の減少
・エンドトキシンのレベルの減少
【００３８】
バイオフィルム１及び２のスクリーニングは第一のパラメータのみを考慮した。その後適用された最良の組合せについて、細菌の死亡率及びエンドトキシンの除去に関する有効性をさらに評価した。
【００３９】
被覆領域の定量方法
対照群及び処理されたバイオフィルムが次のように染色された。
・０．２５％のクリスタルバイオレット溶液で染色
・又はＢａｃｌｉｇｈｔ（登録商標）蛍光色素溶液（Ｓｙｔｏ９及びヨウ化プロピジウムで）で染色
生存可能な細菌は緑、死滅した細菌は黄又は赤に呈色した。
【００４０】
バイオフィルムが染色されたシリコンチューブの標本をガラススライドに取付け、光学顕微鏡で観察した。この顕微鏡にはカメラが接続され、「Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅｓ」画像解析ソフトウエアが適用された。それから同一の標本につき数枚（６から１０）の写真が撮られ、染色された領域が画像解析ソフトウエアにより定量的に評価され、標本当たりの平均被覆面積が計算された。この平均値は未処理の対照標本の被覆面積と比較され、被覆面積の減少率（百分率）が計算された。
【００４１】
また、さらに正確な検査のため、最も有効性の高い組合せで処理された標本をレーザー共焦点顕微鏡で観察した。
【００４２】
培養可能な細菌の定量方法
チューブ標本を覆うバイオフィルムを、完全、均一かつ再生産可能となるように機械式スクレーパーを使用して基層から分離した。このスクレーパーは動力式スクリュードライバーからなり、その先端に火炎滅菌可能なステンレス鋼のスパチューラが固定された。このスパチューラをチューブの内腔の中で回転させることにより、バイオマスを滅菌されたチューブの底に押出した。この操作は滅菌水の蒸気により促進された。細菌の凝集体はすべて注射器の針を介して分離された。得られた細菌懸濁液をＲ２Ａ寒天培地にプレートし室温で７日間培養した後、ＣＦＵ（コロニー形成単位）を数えることにより培養可能な細菌の数が決定された。
【００４３】
さらに正確を期すため、プレート後に汚染されていなかった標本を完全に濾過し濾過膜をＲ２Ａ寒天培地上で室温で７日間培養した。
【００４４】
エンドトキシンの定量方法
細菌性エンドトキシンは、上で述べた分離の結果得られた細菌性懸濁液の中で、標準的なリファレンステスト即ちＬＡＬカイネティック比色試験（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ）により定量された。
【００４５】
バイオフィルム１及び２の試験結果
バイオフィルム１及び２上のスクリーニングの結果は、表２−４及び表５に示される。
【００４６】
【表２】
2006504835.tif 000003
【表３】
2006504835.tif 000004
【表４】
2006504835.tif 000005
【表５】
2006504835.tif 000006
【００４７】
これらのスクリーニング試験の後で２種のバイオフィルムの除去に最も好成績を挙げた組合せ、即ち下記組合せＫが選抜された。
【００４８】
製品Ａ＝パンクレアチン（Ｓｉｇｍａ社の販売する研究用試薬の登録商標）。ブタ膵臓抽出物、すなわちリパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、トリプシン、リボヌクレアーゼ等を含む酵素混合物（欧州薬局方参照）。
【００４９】
製品Ｂ＝クエン酸
特に透析装置の消毒の場合には、この製品は脱灰剤として作用し、細菌を捕捉して基材へのバイオフィルムの付着を促進するスケール結晶を除去する。
【００５０】
製品Ｃ＝ＲＢＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社の販売する発泡性アルカリ洗浄剤溶液の登録商標）。殺菌性、抗ウイルス性、抗真菌性を有し、界面活性剤及び第４級アンモニウム（消毒剤）を含む。
【００５１】
定性的及び定量的データ
組合せＫの作用前後におけるバイオフィルム１及び２の写真から、組合せの作用を外観的に定量することができる。
【００５２】
表６及び７は組合せＫの作用前後に測定されたパラメータの値を示す。
【００５３】
【表６】
2006504835.tif 000007
【表７】
2006504835.tif 000008
【００５４】
ＲＢＳの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
この組合せの殺菌能力はＲＢＳによるものであり、実験したバイオフィルムを構成する微生物に対するその最小発育阻止濃度が決定された。
【００５５】
汚染された新しい透析液（上記の微生物を含む滅菌されていない浸透水から調製された）及びＬＢ培地の５０／５０（体積／体積）混合物が作成された。カスケード希釈により濃度１００％、５０％、１０％、５％、１％、０．５％及び０．１％のＲＢＳ溶液を作成し、これらの溶液をそれぞれ汚染された混合物３ｍｌに対し３００μｌずつ加えた。これらを室温で１２時間培養した後、テストした各ＲＢＳ濃度につきＣＦＵ（コロニー形成単位）をＲ２Ａ寒天培地上でカウントした。
【００５６】
最小発育阻止濃度は、微生物の成長を阻止できる最低の濃度として定義される。その結果は表８に示される。
【００５７】
【表８】
2006504835.tif 000009
【００５８】
安全のため、この選択は１．５の最小発育阻止濃度を得るような希釈形式のＲＢＳ溶液を使用して行われた。
【００５９】
最初の適用された実験計画
０．５％／ｐＨ７．３のパンクレアチン１００ｍｌの作成は、パンクレアチン粉末５００ｍｇ＋ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ社）１ｇを血液透析水（ＨＤＷ）１００ｍｌで希釈した。
【００６０】
この溶液をチューブの閉回路に温度３７℃、流速５００ｍｌ／分で５分間循環させた。
【００６１】
すすぎ：開路の状態で５００ｍｌ／分のＨＤＷを５分間流した。
【００６２】
３％／ｐＨ２．２のクエン酸１００ｍｌの作成は、３ｇのクエン酸粉末（Ｍｅｒｃｋ）を血液透析水１００ｍｌで希釈した。
【００６３】
この溶液をチューブの閉路に温度２０℃、流速５００ｍｌ／分で５分間循環させた。
すすぎ：開路の状態で５００ｍｌ／分のＨＤＷを５分間流した。
【００６４】
７％／ｐＨ１０のＲＢＳ（登録商標）１００ｍｌの作成は、濃縮溶液７ｍｌ＋炭酸ナトリウム粉末５６６ｍｇ＋重炭酸ナトリウム粉末３８８ｍｇを血液透析水で希釈して１００ｍｌとした。
この溶液をチューブの閉路に温度２０℃、流速５００ｍｌ／分で３０分間循環させた。
すすぎ：開路の状態で５００ｍｌ／分のＨＤＷを５分間流した。
【００６５】
バイオフィルム３及び４の試験結果
上で述べた最初の態様における組合せＫは、特に厚い又は古いバイオフィルム３及び４に付着した少量の細胞を残した。これらのバイオフィルムの除去のため、組合せＫの「強化処方」が開発された。
【００６６】
「強化処方」
１％／ｐＨ７．３のパンクレアチン１００ｍｌの作成は、パンクレアチン粉末１ｇ＋ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）緩衝剤（Ｓｉｇｍａ社）１ｇを血液透析水１００ｍｌで希釈した。
【００６７】
この溶液をチューブの閉路に温度３７℃、流速５００ｍｌ／分で５分間循環させた。
【００６８】
すすぎ：開路の状態で５００ｍｌ／分のＨＤＷを５分間流した。
【００６９】
５％／ｐＨ２．２のクエン酸１００ｍｌの作成は、クエン酸粉末（Ｍｅｒｃｋ社）５ｇを血液透析水１００ｍｌで希釈した。
【００７０】
この溶液をチューブの閉路に温度２０℃、流速５００ｍｌ／分で５分間循環させた。
【００７１】
すすぎ：開路の状態で５００ｍｌ／分のＨＤＷを５分間流した。
【００７２】
１５％／ｐＨ１０のＲＢＳ（登録商標）１００ｍｌの作成は、濃縮溶液１５ｍｌ＋炭酸ナトリウム粉末５６６ｍｇ＋重炭酸ナトリウム粉末３８８ｍｇ＋５．２％濃縮漂白剤（最終次亜塩素酸ナトリウム濃度０．３ｇ）を血液透析水で希釈して１００ｍｌとした。
この溶液をチューブの閉路に温度２０℃、流速５００ｍｌ／分で３０分間循環させた。
すすぎ：開路の状態で５００ｍｌ／分のＨＤＷを５分間流した。
【００７３】
定性的及び定量的データ
組合せＫの作用前後におけるバイオフィルム４の写真から、本発明に係る方法の有効性を外観的に定量することができる。
【００７４】
表９は組合せＫのバイオフィルム４への作用前後に測定されたパラメータの値を示す。
【表９】
2006504835.tif 000010
【００７５】
バイオフィルム５の試験結果
未処理の対照標本の表面には、スライム及び細菌エンドトキシンに富み標本（３０平方インチ）の表面を完全に覆う非常に厚い（３×１０９ＣＦＵ／ｃｍ２以上）バイオフィルムが成長した。他方、強化されていない組合せＫ（最初の処方）で４時間毎に処理された標本の表面には、少数の付着性の死んだ細胞のみが沈着した。
【００７６】
定量的データを表１０に示す。
【表１０】
2006504835.tif 000011
【００７７】
対照バイオフィルム及び処理された標本の写真から、本発明の方法の有効性を検証できた。
【００７８】
本発明に係る方法、キット及び組成物は、血液透析器具の回路の消毒や、温水回路、空調システムおよび冷却塔などのレジオネラ症対策、農産物食品産業、クライメートコントロール室又は閉鎖環境室、歯科医療器具の清掃、再使用可能でオートクレーブに適さない医療用装置の洗浄などに使用できる。
【００７９】
本発明に係る方法を流体装置に適用するには、バイオフィルムを除去すべき回路に前記溶液を同時に又は引き続き注入して、バイオフィルムの除去に必要な時間だけ溶液を循環させ、必要に応じ取り除き及びすすぎを行う。
【００８０】
本発明に係る方法により表面、作業面及び人工器官を処理するには、順次に又は同時に本発明の方法を適用するか、又は対象物を同時に又は順次に本発明の溶液に浸し、必要に応じてすすぎを行うことにより本発明に係る方法を実行できる。
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月20日(2004.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
少なくとも次の工程が引き続き行われることを特徴とするバイオフィルムの除去方法。
ａ）プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物を含む溶液を作成する工程。
ｂ）アルカリ性の洗浄剤を有する溶液を作成する工程。
ｃ）前記の溶液を、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）又は循環により、処理すべき表面に適用する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
さらに次の工程が引き続き行われることを特徴とする、請求項１記載のバイオフィルムの除去方法。
ｄ）ミネラル塩の沈着物を溶解しうる酸を有する溶液を作成する工程。
ｅ）前記溶液を、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）又は循環により、処理すべき表面に適用する工程。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２１】
プロテアーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、エステラーゼのグループから選択された少なくとも１種類の酵素と、アミラーゼとを含む酵素混合物を使用することを特徴とするバイオフィルム除去用の組成物の製造方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
非特許文献１は、バイオフィルムの破壊のために、酵素とフェノール消毒剤を順次使用することを教示している。非特許文献２は、グルコースオキシダーゼとラクトペルオキシダーゼのような酵素の組合せを使用することを教示している。特許文献１は、酵素によるバイオフィルムの除去方法を教示しており、この方法はカルボヒドラーゼ及びプロテアーゼのグループに属する酵素の使用、それらを順次使用すること、及びそれらと組み合わせて、又は別個に殺生物剤(biocides)、キレート剤及び他の洗浄剤のグループに属する薬剤を使用することを含む。特許文献３はまた産業用水道システムにおいてプロテアーゼ、アミラーゼ及び界面活性剤と同時又は順次に接触させることによりバイオフィルムの形成を除去及び予防する組成物及び方法を教示している。しかし、この接触時間（数時間）は他の用途例えば応用生物医学に使用するには長すぎて実用的でない。また特許文献２は、酵素活性を用いた洗浄工程と、酵素混合剤の作用で解離した細菌を殺すための消毒剤による洗浄工程を含むことを特徴とする、水と接触する表面からバイオフィルムを除去する方法を教示している。しかし結果は不十分なものであり、これらのバイオフィルムを除去できる方法又は製品は現在のところ存在しないといえる。
【特許文献１】国際特許出願０１／５３０１０号公報
【特許文献２】欧州特許第１１８６５７４号公報
【特許文献３】国際特許出願９２／１３８０７号公報
【非特許文献１】Ｌ．Ｆ．ジャケリン（Ｌ．Ｆ．Ｊａｃｑｕｅｌｉｎ）著「病理微生物学（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ）」１９９４年５月、４２５ページ
【非特許文献２】Ｃ．ヨハンセン（Ｃ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ）著「応用環境微生物学（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」１９９７年９月、３７２４ページ
【国際調査報告】
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2006504835.tif 000014
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