(57)【要約】【解決手段】  式Ｉで表わされる化合物（Ｒ及びＲ1は明細書に記載の通り）。式Ｉの本化合物はＰＤＥ４阻害剤である。【化１】2006516127.tif 000019
2006516127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2006516127.tif 000017
（式中、Ｒはメチル又はジフルオロメチル基；
Ｒ1はフェニル又は５若しくは６員で窒素、酸素及びイオウから選択されＣ−Ｃ結合によってフタラジン骨格に結合される１〜３個のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環（ここで前記フェニルもヘテロ環もカルボキシル基で置換されており、また任意にメトキシ、ニトロ、Ｎ−アセチルアミノ、Ｎ−メタンスルフォニルアミノから選択される第二の官能基で置換されてもよい））で表わされる化合物、式Ｉの化合物のＮ−酸化誘導体又は医薬的に許容されるそれらの塩。
【請求項２】
Ｒ1がカルボキシル基で置換されており、また任意にメトキシ、ニトロ、Ｎ−アセチルアミノ、Ｎ−メタンスルフォニルアミノから選択される第二の官能基で置換されてもよいフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ1がカルボキシル基で置換されたフェニルであり、カルボキシル基がフタラジン骨格に関しメタ位にある、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ1が５若しくは６員の、窒素、酸素及びイオウから選択されＣ−Ｃ結合によってフタラジン骨格に結合される１〜３個のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環で、該環はカルボキシル基で置換されていると共に更に任意にメトキシ、ニトロ、Ｎ−アセチルアミノ、Ｎ−メタンスルフォニルアミノから選択される第二の官能基で置換されてもよい、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
４−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−ニトロ安息香酸；
５−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−２−メトキシ安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−４−メトキシ安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メタンスルフォニルアミノ安息香酸；
３−アセチルアミノ−５−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メトキシ安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−ジフルオロメトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］オキサゾール−４−カルボン酸；
２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］チオフェン−３−カルボン酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸の（２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール）塩；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸のＮ−メチルグルカミン塩から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
パラジウム等の触媒存在下、次式化合物：
【化２】
2006516127.tif 000018
（式中、Ｒは式Ｉの化合物で述べたものと同義である）とスズ誘導体やボロン酸誘導体等の反応剤とを芳香族求核置換反応又はカップリング反応に付すことによって請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、
前記反応剤は、カルボキシル基で置換されていると共に更に式ＩのＲ1で定義した第二の官能基で任意に置換されていても良いヘテロ環或いはフェニルを有するフタラジン骨格と直接結合しているハロゲン原子の置換に好適な反応剤である方法。
【請求項７】
前記式ＩＩの化合物と適切なボロン酸との間のカップリング反応は、パラジウム、トリフェニルホスフィン及び炭酸カリウム水溶液の存在下で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物の治療有効量を医薬的に許容しうる担体と混合して含有する医薬組成物。
【請求項９】
アレルギー性又は炎症性の疾患を治療するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
呼吸器疾患を治療するための、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フタラジン誘導体、これを含有する医薬組成物、及びホスホジエステラーゼ４阻害剤としての該誘導体の使用に関する。
【０００２】
ホスホジエステラーゼ（Phosphodiesterases）は、ｃＡＭＰ（サイクリック・アデノシン−３’，５’−モノホスフェート）の加水分解不活化の主要機構の基礎となっているイソ酵素ファミリーである。ｃＡＭＰは、多くのホルモン、神経伝達物質、薬剤に対する生物学的応答を仲介するセカンドメッセンジャーであることが知られている(例えば、非特許文献１参照)。適切なアゴニストが細胞表面に結合すると、アデニレートサイクラーゼの作用によりＭｇ2+−ＡＴＰは活性化されｃＡＭＰとなる。ｃＡＭＰは、アレルギー性であると非アレルギー性であるとを問わず各種呼吸器疾患の生理病理学的症状に関与する全ての細胞ではないにしろ多くの細胞の活性を調節する。従ってｃＡＭＰ濃度の上昇は、気道平滑筋の弛緩、肥満細胞メディエーター放出の阻止（好塩基性顆粒細胞(basophil granulose cells)）、好中球及び好塩基球の脱顆粒化(degranulation)の抑制、単球やマクロファージの活性化の阻止等、好ましい効果をもたらす。よって、アデニレートサイクラーゼを活性化できる、或いはホスホジエステラーゼを阻害できる化合物は、気道平滑筋や多くの炎症細胞の望ましくない活性化を抑制しうるであろう。
【０００３】
ホスホジエステラーゼ・ファミリーにおいては、ホスホジエステラーゼ４（以下、ＰＤＥ４と略記する）という特に注目される一群のイソ酵素が存在する。これは気道平滑筋及び炎症細胞中のｃＡＭＰの加水分解に特異性を示す酵素である（例えば、非特許文献２参照）。この酵素に関する研究の結果、この酵素の阻害は、気道平滑筋を弛緩させるのみならず肥満細胞や好塩基球、好中球の脱顆粒化を抑制し、また、単球や好中球の活性化を阻止することが判明している。よって、ＰＤＥ４阻害剤は喘息の治療に有効である。
【０００４】
ＰＤＥ４の選択的阻害により、好中球、肺胞マクロファージ、Ｔ細胞等、ＣＯＰＤ（chronic obstructive pulmonary disease；慢性閉塞性肺疾患）において重要な役割を果たしていることが知られている各種炎症細胞の機能が弱化されるので、この活性は上記特定化合物が上のような疾病に対する有効な治療法を提供しうることを示唆している（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
このような化合物はアレルギー性或いは非アレルギー性の各種呼吸器疾患の治療にユニークなアプローチを提供するものであり、現行の治療と比較して顕著な治療上の利点を有する。
【０００６】
腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor）（以下、ＴＮＦαと称する）は様々な種類の細胞で産生されプロ炎症活性(pro-inflammatory activity)を有するサイトカインであるが、該因子の過剰生成や異常生成は成人呼吸逼迫症候群（adult respiratory distress syndrome）（ＡＲＤＳ）や慢性炎症性肺疾患(chronic pulmonary inflammatory disease)等、多くの疾患の緩解や悪化に影響する。
【０００７】
よって、ＴＮＦαのネガティブな効果を抑えることができる化合物、即ちサイトカインの阻害剤は多くの疾病に対し有用であると考えられる。
【０００８】
特許文献１（エーザイ名義）が請求している化合物は、特に次式：
【０００９】
【化１】
2006516127.tif 000003
【００１０】
（式中ｎ＝０〜４；Ｒ1は任意に置換されていても良い低級アルコキシ、任意に置換されていても良いシクロアルキル、又は基−ＯＲ9（ここでＲ9は任意に置換されていても良いアリールアルキル基）；Ｘは−Ｎ＝又は−ＮＲ6−（ここでＲ6は水素、低級アルキル基、又は任意に置換されていても良いアリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキル基）；Ｙは−ＣＯ又は−ＣＢ＝（ここでＢは−ＮＲ7Ｒ8；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に水素原子、任意に置換されていても良い低級アルキル基、任意に置換されていても良いヘテロアリールアルキル基、或いはＲ7とＲ8はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していても良く、この環は置換されていても良い）、Ｂは水素原子又は任意に置換されていても良いアリール、ヘテロアリール、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキル基；Ａは水素若しくはハロゲン原子又は任意にモノ−若しくはジ−置換されていても良いアミノ基、任意に置換されていても良いアリール、ヘテロアリール、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキル基である）で表わされるものである。
【００１１】
上述の残基を任意的に置換しうる基の例として、ハロゲン原子及び任意に保護されていても良いカルボキシル基が挙げられている。
【００１２】
非常に広範な一般式で表されるものの中から例示されている化合物において第一に注目されるのは、フタラジン骨格を置換する基がＡで表わされる（３−クロロ−４−メトキシ）ベンジルアミノや３，４−メチレンジオキシベンジルアミノ基；Ｒ1で表わされるハロゲン、ニトロ基或いはシアノ（ｎ＝１）；Ｂで表わされる基−ＮＲ7Ｒ8（ここでＲ7、Ｒ8は各々独立して水素原子、任意に置換されていても良い低級アルキル基、任意に置換されていても良いヘテロアリールアルキル基を表わすか、或いはＲ7及びＲ8はそれらが結合する窒素原子と共に置換されても良い環を形成しても良い）であるという点である。
【００１３】
従って、上掲公報の開示や実施例からは、Ｒ1がメトキシやジフルオロメトキシ（ｎ＝１）；Ａがフェニル又はカルボキシル基で置換され任意に他の官能基で置換されていても良いヘテロ環；そしてＢが（３，５−ジクロロ）ピリジン−４−イル−メチル基を表わす特定の化合物は想到されない。
【００１４】
更に、これら化合物はｃＧＭＰ−ＰＤＥ（即ちＰＤＥ５；ｃＧＭＰ−依存性の機構によって作用するホスホジエステラーゼで、用途が心血管系であることに注目される）の阻害剤として活性であるといえる（例えば、非特許文献４参照）。
【００１５】
特許文献２（ザンボン・グループ  Ｓ．p．Ａ．名義）で請求している化合物は、特に次式：
【００１６】
【化２】
2006516127.tif 000004
【００１７】
（式中、置換基Ｒ2が結合している炭素原子とこれに隣接する窒素原子との間の結合は単結合又は二重結合；Ｒは（Ｃ1−Ｃ6）アルキル又はポリフルオロ（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基；置換基Ｒ2が結合している炭素原子とこれに隣接する窒素原子との間の結合が二重結合であるときにはＲ1は存在せず、一方、同じ結合が単結合であるときにはＲ1は水素原子、任意に置換されていても良い（Ｃ1−Ｃ6）アルキル基又は（Ｃ1−Ｃ4）アルキルスルフォニル基；Ｒ2は、置換基Ｒ2が結合している炭素原子とこれに隣接する窒素原子との間の結合が二重結合のとき水素原子、シアノ基、アミド、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、或いは（Ｃ2−Ｃ8）アルキニル、アルコキシ、又は任意に置換されていても良いアリール若しくはヘテロ環；Ｒ3は水素又は（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、（Ｃ2−Ｃ8）アルケニル、或いは（Ｃ2−Ｃ8）アルキニルで、これらの基は任意に置換されていても良く；ＺはＮＨ、メチレン又は（Ｃ2−Ｃ6）アルキレン鎖で任意に分岐していても良く、及び／又は不飽和、及び／又は（Ｃ5−Ｃ7）シクロアルキル残基が介在していても良く；Ａは一以上の置換基で任意に置換されていても良いヘテロ環又はフェニルである）で表わされる化合物である。
【００１８】
これらの化合物はＰＤＥ４阻害剤及びＴＮＦα放出阻害剤として非常に高活性であり、且つＰＤＥ３及び５酵素に対し活性を示さない。
【００１９】
活性に関するこの特異性と選択性により、これらの化合物は、ＰＤＥ４やＴＮＦαが関与する疾患の治療に好適な化合物であることは明白である。
【００２０】
とはいうものの、上の特許出願に例示された化合物が示す物理化学的特性のあるもの（例えば水溶性）は、少数の組成物の調製にしか適切とはいえない。
【００２１】
事実、活性本体の溶解性が限定されていることが、十分に高い生物学的利用能を保証可能な組成物を調製することの困難性の主因である。
【００２２】
更に、インビトロ及びインビボの前臨床モデルにおける溶解性の低さを回避するため、通常、非生理的賦形剤を利用した特別な組成物が用いられるので、その結果、化合物の活性と生物学的利用能のどちらについても評価が困難である。
【００２３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第０７２２９３６号明細書
【特許文献２】国際公開第００／０５２１８号パンフレット
【非特許文献１】クレブス内分泌学会第４回国際会議Excerpta  Medicaプロシーディング，１９７３年，１７〜２９頁
【非特許文献２】トルフィー(Torphy)，「ホスホジエステラーゼイソ酵素：新たな抗喘息剤としての有力な標的（Phosphodiesterase Isoenzymes: Potential Targets for novel Anti-asthmatic Agents）」，バーンズ(Barnes)編，「喘息の新薬（New drugs of Asthma）」，ＩＢＣテクニカルサービス社，１９８９年
【非特許文献３】ダグラス・ＷＰ・ヘイ(Duglas WP Hay)，Curr. Opin. Chem. Biol.，２０００年，４巻，ｐ．４１２〜４１９
【非特許文献４】シュッツ・シー(Schudt C.)等，「ホスホジエステラーゼ阻害剤（Phosphodiesterase Inhibitors）」、アカデミック・プレス(Academic Press)社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
意図した用途においてこれらの化合物を用いるには、幅広い組成が実現可能であることが望まれるが、古典的使用形態の多くの場合、活性成分が十分に水溶性であることが必要とされる。
【００２５】
例えば、経口投与は医薬の投与において最も便利且つ広く用いられている。よって、活性成分として機能しうる成分の溶解性を改善し、組成処方に関する格別の技能がなくても経口組成物を開発できることが重要である。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
驚くべきことに、本発明者らは、Ｒ2（特許文献２参照）で定義されるフェニルやヘテロ環置換基上にカルボキシル基を導入すれば、ＰＤＥ４やＴＮＦα放出に関し強い阻害活性を示し、ＰＤＥ１、２、３、５に関し不活性であり、従って換言すれば選択的であり、また、最適な水溶性を示す化合物が得られることを見出した。
【００２７】
それら化合物はザンボン・グループ名義の上記特許出願に記載された一般式の範囲に入るサブクラスでは示されない群を構成するものであり、よって自体新規である。
【００２８】
カルボキシル基によって分子に新たに導入された極性により、処方の観点から操作性のよい物理的及び化学的性質を備えた化合物を得ることができ、また、医薬組成物に適した賦形剤に担持させた場合の式Ｉの化合物の生物学的利用能を評価することが可能となる。この生物学的利用能は、予期せぬことに、上述の特許出願中に記載の化合物に見出されているレベルと同等あるいは遥かに高いことが判明したのであるが、この評価は非生理学的賦形剤中に同化合物を溶解させることによって行ったものである。
【００２９】
特定の極性を有するカルボキシル基をフェニル又はヘテロ環（１位）に導入することで、式Ｉの化合物は、液に溶解されうるために必要な正しい親水性親油性分子バランスを持つことができると共に、ＰＤＥ４酵素に関する高い阻害活性を保ちつつ、吸収・分配のプロセスにおいて、生物学的膜を透過することができる。
【発明の効果】
【００３０】
かくして、カルボキシル置換基を導入することによって、最適な溶解特性を有し、調製が容易で、選択対象化合物と比肩し得る或いはより優れた阻害剤活性、選択性及び生物学的利用能を示す化合物を得た。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
従って、本発明の目的物は次式：
【００３２】
【化３】
2006516127.tif 000005
【００３３】
（式中、Ｒはメチル又はジフルオロメチル基；
Ｒ1はフェニル又は５若しくは６員で窒素、酸素及びイオウから選択されＣ−Ｃ結合によってフタラジン骨格に結合される１〜３個のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環（ここで前記フェニルもヘテロ環もカルボキシル基で置換されており、また任意にメトキシ、ニトロ、Ｎ−アセチルアミノ、Ｎ−メタンスルフォニルアミノから選択される第二の官能基で置換されてもよい））で表わされる化合物、式Ｉの化合物のＮ−酸化誘導体及び医薬的に許容されるそれらの塩である。
【００３４】
式Ｉの化合物はＰＤＥ４及びＴＮＦα阻害剤としての活性を有するので、ＡＲＤＳ、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー性鼻炎等のアレルギー性或いは炎症性の疾患に対する治療剤として有用である。
【００３５】
前記５若しくは６員で窒素、酸素及びイオウから選択される１〜３個のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環とは、ピロール、チオフェン、フラン、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、オジサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアゾール、チアジアゾール等の芳香族ヘテロ環をいう。
【００３６】
Ｎ−酸化体は、これが存在する場合についてではあるが、フタラジン環上に存在する窒素原子とピリジル環上に存在する窒素原子の両者を含むことができる。
【００３７】
式Ｉの化合物の医薬的に許容される塩としては、アルカリ金属やアルカリ土類金属の塩、亜鉛塩、及び医薬的に許容される有機塩基の塩、例えばトロメタモール（２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール）やＮ−メチルグルカミンが挙げられる。
【００３８】
式Ｉの化合物の内、好ましいものはＲ1がカルボキシル基で置換されたフェニルであるものであり、中でもカルボキシル基がフタラジン骨格に関しメタ位にあるものである。
【００３９】
本発明の目的化合物の具体例としては次のものが挙げられる。
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
４−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−ニトロ安息香酸；
５−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−２−メトキシ安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−４−メトキシ安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メタンスルフォニルアミノ安息香酸；
３−アセチルアミノ−５−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メトキシ安息香酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−ジフルオロメトキシフタラジン−１−イル］安息香酸；
２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］オキサゾール−４−カルボン酸；
２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］チオフェン−３−カルボン酸；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸の（２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール）塩；
３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸のＮ−メチルグルカミン塩。
【００４０】
本発明の目的物である式Ｉの化合物は、パラジウム等の触媒存在下、芳香族求核置換反応又はカップリング反応によって、次式の化合物：
【００４１】
【化４】
2006516127.tif 000006
【００４２】
（式中、Ｒは式Ｉの化合物で述べたものと同義である）とスズ誘導体やボロン酸誘導体等の反応剤とから製造されるが、後者の反応剤は、カルボキシル基で置換されていると共に更に式ＩのＲ1で定義した第二の官能基で任意に置換されていても良いヘテロ環或いはフェニルを有するフタラジン骨格と直接結合しているハロゲン原子の置換に好適なものである。
【００４３】
式ＩＩのフタラジン誘導体は、特許文献２（ザンボン・グループ Ｓ．ｐ．Ａ．）の実施例４５（ページ３５）及び実施例９９（ページ５７）に記載の合成反応式に従って調製することができる。
【００４４】
スズ誘導体をカップリング反応において使用する場合は、例えばシアノ基やエステル基等、フリーなカルボキシル基の前駆体を有することが好ましい。また、式ＩＩの化合物と適切なボロン酸との間のスズキカップリング反応は、パラジウム、トリフェニルホスフィン及び炭酸カリウム水溶液の存在下で行われることが好ましい。
【００４５】
使用されるボロン酸は、例えば、任意に置換されていても良いカルボキシル（フェニル若しくはヘテロ環）ボロン酸や、任意に置換されていても良いホルミル（フェニル若しくはヘテロ環）ボロン酸で、これらが酸化されることにより、それぞれに対応する式Ｉの化合物を得る。
【００４６】
或いは、Ｒ1が置換ヘテロ環である誘導体の場合には、適切に官能化したフタラジン骨格を基質として用い、通常の合成技法による多段階反応によってヘテロ芳香環を形成する。
【００４７】
式Ｉの化合物のＮ−酸化体は、ｍ−クロロ過安息香酸等の過酸で処理することによって得られる。
【００４８】
酸化反応がピリジン環上の窒素原子に向けられたものである場合は、本プロセスに対して選択性を保証するため、これは特許文献２の記載に従い、イソベンゾフラノール核（フタラジン骨格の前駆体）上で行われる。
【００４９】
式Ｉの化合物の塩は、公知の方法によって調製される。
【００５０】
式Ｉの化合物は、酵素阻害活性試験（実施例１８）が示すようにＰＤＥ４阻害剤であると共に、ＴＮＦα放出を阻害することもできる（実施例１９）。
【００５１】
更に、本発明の化合物は酵素阻害試験の実施結果から分るように、ＰＤＥ１、２、３、５の酵素には何ら阻害活性を示さない。
【００５２】
このような酵素選択性及び特異性という性質が心血管系における活性欠如と結び付けられた場合、如何に式Ｉの化合物がＰＤＥ４やＴＮＦαが関与する疾病、例えば喘息、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、アレルギー性鼻結膜炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、リウマチ様関節炎、敗血症ショック、潰瘍性大腸炎等（本発明においては特に呼吸器疾患に重点を置くものではあるが）の治療に特に好適なものとなるかは明らかであろう。とりわけ本発明化合物はアレルギー性や炎症性の疾患の治療、中でも特にＡＲＤＳ、ＣＯＰＤ、喘息、アレルギー性鼻炎の治療に有用である。
【００５３】
治療用量（therapeutic doses）は一般に０．１〜１，０００ｍｇ／日で、経口単回投与の場合１〜２００ｍｇである。
【００５４】
治療有効量は患者の年齢や一般的生理状態、投与経路、更には用いる医薬組成物によって異なる。
【００５５】
上述の疾病に対し本発明化合物を治療目的あるいは予防目的で使用する場合、経口、直腸経由、舌下、非経口、局所、経皮、吸入による投与に適した医薬組成物とすることが好ましい。
【００５６】
よって、本発明の更なる目的は、式Ｉの化合物又はその塩を治療有効量において医薬的に許容しうる担体と混合して含有する医薬組成物を提供することである。
【００５７】
本発明の目的物である医薬組成物は、経口及び／又は非経口投与に適した液状（ドロップ、シロップ、溶液、即使用可能な注射用溶液や凍結物を希釈して使用する注射用溶液等）、固形状や半固形状（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤、ペレット、膣錠、座薬、クリーム、軟膏、ジェル、軟薬等）、スチル溶液、懸濁液、乳液、その他、吸入や経皮投与に好適な剤形とすることができる。
【００５８】
組成物のタイプに応じ、治療有効量の一種（以上）の式Ｉの化合物の外、固状や液状の医薬用補形剤や希釈剤を本組成物に含有させることができ、また、医薬組成物の調製において通常使用されるその他の添加剤（増粘剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、矯味剤、着色剤等）を任意に含有させることができる。
【００５９】
本発明の目的物である医薬組成物は、通常の技法によって調製することができる。
【実施例】
【００６０】
本発明を更によく説明するため、次に実施例を掲げる。
【００６１】
実施例１
＜４−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］安息香酸（化合物１）の合成＞
４−クロロ−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−６−メトキシフタラジン（中間体１；特許文献２の実施例４５（ページ３５）の記載に従って調製したもの）（３００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１当量）と４−カルボキシフェニルボロン酸（１５５ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１．１当量）とパラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（５０ｍｇ、５ｍｏｌ％）の混合物に、２Ｎ炭酸カリウム水溶液（１．２６ｍＬ）、ＤＭＥ（１０ｍＬ）及び予め窒素を通したエタノール（０．５ｍＬ）をアルゴンの不活性雰囲気下、室温で添加した。反応液を９０℃で４〜１６時間、攪拌した。反応はｐＨ＝６になるまで５％クエン酸水溶液でクエンチした。カップリング反応生成物を酢酸エチル（２×１５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して化合物１を淡黄色固体として得た（２１６ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ、収率５８％）。
【００６２】
MS: 440［M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.70（s, 2H, Py); 8.58（d, 1H, JHH=9.1 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.14（d-broad, 2H, JHH=8.3 Hz, C-（*CH=CH)2-C), 7.87（d-broad, 2H, JHH=8.3 Hz, C-（CH=*CH)2-C); 7.79（dd, 1H, CH=*CH-C-OMe); 7.29（d, 1H, JHH=2.5 Hz, C=*CH-C); 5.04（s, 2H, *CH2-Py); 3.89（s, 3H, OMe).
【００６３】
実施例２
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−安息香酸（化合物２）の合成＞
化合物１に関して記載したように手続きを行い、化合物２を合成した。なおこれには、基質として中間体１（５ｇ、１４ｍｍｏｌ）と３−カルボキシフェニルボロン酸（２．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）とを用いた。カップリング反応生成物を酢酸エチル（２×１５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で溶出させながらセライトで濾過した。ろ液を濃塩酸でｐＨ４まで酸性化し、１時間攪拌した。析出物を濾取し５０℃で乾燥して、化合物２を淡黄色固体として得た（３．４ｇ、８ｍｍｏｌ、収率５７％）。
【００６４】
MS: 440［M+H]+
NMR DMSO_d6: 13.20（s-broad, 1H, OH); 8.71（s, 2H, Py); 8.58（d, 1H, JHH=8.7 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.25（s-broad, 1H, C=*CH-C-CO2H); 8.14（d-broad, 1H, JHH=8.1 Hz, *CH), 8.02（d-broad, 1H, JHH=8.1 Hz, *CH); 7.80（dd, 1H, CH=*CH-C-OMe); 7.77-7.69（m, 1H, CH=*CH-CH); 7.29（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C=*CH-C); 5.04（s, 2H, *CH2-Py); 3.88（s, 3H, OMe).
【００６５】
実施例３
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−ニトロ安息香酸（化合物３）の合成＞
化合物１に関して記載したように手続きを行い、化合物３を合成した。なおこれには、基質として中間体１（３００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）と３−カルボキシ−５−ニトロ−フェニルボロン酸（１９６ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）とを用いた。カップリング反応生成物を酢酸エチル（２×１５ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、酢酸エチル（１０ｍＬ）で溶出させながらセライトで濾過した。ろ液を減圧下で濃縮し、化合物３を淡黄色固体として得た（２３５ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、収率５７％）。
【００６６】
MS: 485［M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.78-8.73（m, 2H, *CH, *CH); 8.71（s, 2H, Py); 8.64-8.60（m, 2H, *CH=CH-C-OMe, *CH); 8.84（dd, 1H, JHH=9.2 Hz, 2.5 Hz, CH=*CH-C-OMe); 7.32（d, 1H, JHH=2.5 Hz, MeO-C=*CH-C); 5:07（s, 2H, *CH2-Py); 3.89（s, 3H, OMe).
【００６７】
実施例４
＜５−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−２−メトキシベンズアルデヒド（中間体２）の合成＞
化合物１に関して記載したように手続きを行い、中間体２を合成した。なおこれには、基質として中間体１（４５０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）と２−ホルミル−４−メトキシフェニルボロン酸（２４８ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）とを用いた。反応液をＶａｒｉａｎ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ  ＣＥ１００Ｓに注ぎ、ジクロロメタンで洗浄した（３×１０ｍＬ）。ろ液を減圧下で濃縮し、生成物をＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ（ＳｉＯ2）で精製した（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール（１００：０〜９７：３ｖ／ｖ））。最終的に生成物をメタノールから再結晶して中間体２を淡黄色固体として得た（２６０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、収率４８％）。
【００６８】
MS: 455［M+H]+
NMR DMSO_d6: 10.40（s, 1H, CHO); 8.70（s, 2H, Py); 8.57（d, 1H, JHH=9.1 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.10（dd, 1H, JHH=2.3 Hz, 8.5 Hz, C-*CH=CH-C（OMe)-C-CHO); 8.04（d, 1H, JHH=2.3 Hz, *CH-C-CHO); 7.79（dd, 1H, JHH=2.5 Hz, 9.1 Hz, CH-*CH=C-OMe); 7.46（d, 1H, JHH=8.7 Hz, *CH=C（OMe)-C-CHO); 7.32（d, 1H, JHH=2.6 Hz, C=*CH-C); 5.02（s, 2H, *CH2-Py); 4.04（s, 3H, OMe); 3.89（s, 3H, OMe).
【００６９】
実施例５
＜５−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−２−メトキシ安息香酸（化合物４）の合成＞
中間体２（７０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）をｔｅｒｔ−ブチルアルコール（３ｍＬ）と２−メチル−２−ブテンのＴＨＦ（０．７７ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ、１０当量）溶液（２Ｎ溶液）に加え急速に攪拌した。得られた溶液に、塩化ナトリウム（１６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１．２当量）の１Ｎリン酸二水素カリウム水溶液バッファー（ｐＨ＝３．５、１ｍＬ、１．１２ｍｍｏｌ、７．５当量）溶液を、窒素による不活性雰囲気下、室温で滴下した。反応液を室温で５時間攪拌し、減圧下で濃縮した。これを水で希釈した（５ｍＬ）。生成物をジクロロメタンで抽出し（２×７ｍＬ）、減圧下で濃縮し、次いでＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ（ＳｉＯ2）で精製した（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール（１００：０〜９７：３ｖ／ｖ））。この精製後、１００％メタノールで溶出し、化合物４を黄色固体として得た（４７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、収率６７％）。
【００７０】
MS: 471［M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.69（s, 2H, Py); 8.53（d, 1H, JHH=9.3 Hz, *CH=CH-C-OMe); 7.80-7.70（m, 3H, C-C-CH=*CH-C, C=*CH-C-COOH, CH=*CH-C-OMe); 7.36（d, 1H, JHH=2.5 Hz, C=*CH-C); 7.20（d, 1H, JHH=8.7 Hz, C-C-*CH=CH-C); 5.00（s, 2H, *CH2-Py); 3.88（s, 3H, OMe); 3.85（s, 3H, OMe).
【００７１】
実施例６
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−４−メトキシベンズアルデヒド（中間体３）の合成＞
化合物１に関して記載したように手続きを行い、中間体３を合成した。なおこれには、基質として中間体１（４５０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）と５−ホルミル−２−メトキシフェニルボロン酸（２４８ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）とを用いた。反応液をＶａｒｉａｎ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ  ＣＥ１００Ｓに注ぎ、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮し、生成物をＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ（ＳｉＯ2）で精製した（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール（１００：０〜９７：３ｖ／ｖ））。最終的に生成物をメタノールから再結晶して中間体３を淡黄色固体として得た（２１４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、収率４０％）。
【００７２】
MS: 455［M+H]+
NMR DMSO_d6: 9.96（s, 1H, CHO); 8.71（s, 2H, Py); 8.54（d, 1H, JHH=9.2 Hz, C=C-*CH=CH-C-OMe); 8.15（dd, 1H, JHH=2.3 Hz, 8.5 Hz, CHO-C-*CH=CH); 7.94（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C-*CH=C-CHO); 7.75（dd, 1H, JHH=2.6 Hz, 9.2 Hz, C=C-CH=*CH-C-OMe); 7.47（d, 1H, JHH=8.5 Hz, C-*CH=CH-C-CHO); 6.83（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C=*CH-C-OMe); 5.05（s, 2H, *CH2-Py); 3.83（s, 3H, OMe); 3.82（s, 3H, OMe).
【００７３】
実施例７
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−４−メトキシ安息香酸（化合物５）の合成＞
化合物４に関して記載したように手続きを行い、化合物５を合成した。なお、これには、基質として中間体３（１５０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を用いた。生成物をＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ（ＳｉＯ2）で精製して（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール／酢酸（９９：１：０．０５ｖ／ｖ／ｖ）化合物５を黄色固体として得た（７８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ、収率５０％）。
【００７４】
MS: 470［M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.70（s, 2H, Py); 8.53（d, 1H, JHH=9.1 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.16（dd, 1H, JHH=2.2 Hz, 8.7 Hz, CH-*CH=C-COOH); 7.90（d, 1H, JHH=2.2 Hz, C-*CH-C-CO2H); 7.74（dd, 1H, JHH=2.5 Hz, 9.1 Hz, CH=*CH-C-OMe); 7.36（d, 1H, JHH=8.7 Hz, *CH-CH=C-COOH); 6.82（d, 1H, JHH=2.5 Hz, C=*CH-C-OMe); 5.04（s, 2H, *CH2-Py); 3.81（s, 3H, OMe); 3.79（s, 3H, OMe).
【００７５】
実施例８
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メタンスルホニルアミノ安息香酸（化合物６）の合成＞
３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸（２５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）をパラジウム担持チャーコール（１２ｍｇ）のメタノール（１５ｍＬ）懸濁液に加え水素雰囲気下（４０ｐｓｉ）で還元した。１．５時間後、反応液をセライトろ過し、ろ液を減圧下で濃縮し、次いで粗生成物（２００ｍｇ、約１．１ｍｍｏｌ）を水（２ｍＬ）−ジオキサン（１ｍＬ）に溶解した。この溶液に、水酸化ナトリウム（０．３３ｍＬ、３当量）の１０Ｎ水溶液を添加した。この混合物に、塩化メタンスルホニル（０．１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ、１．１当量）のジクロロメタン（１ｍＬ）溶液を０℃で滴下した。次いで、反応液を２時間室温で撹拌し、５％クエン酸水溶液で酸性化した。生成物を酢酸エチルで抽出した（２×１０ｍＬ）。有機層を合一し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。次いで、化合物１に関して記載したように手続きを行い、スズキ条件（Suzuki conditions）下で粗生成物（１３０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を中間体１（１７８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）とカップリングした。生成物を酢酸エチルで抽出し（２×１５ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この生成物をＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール／酢酸（９９：１：０．０５ｖ／ｖ／ｖ））化合物６を淡黄色固体として得た（１３ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、収率５％）。
【００７６】
MS：534［M+H]+
HPLC/MS：ギルソン（Gilson）社製機器（Ｃ１８カラムＺｏｒｂａｘＳＢＣ１８（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）、ダイオードアレイＵＶ検出器（２２０ｎｍ）及びフィニガン（Finnigan）Ａｑａ質量分析計（エレクトロンスプレー、正イオン化））：設定条件は次のとおり。流速：１ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；グラジエント溶離Ａ／Ｂ（溶出液Ａ：０．５％ギ酸の水溶液；溶出液Ｂ：０．５％ギ酸のアセトニトリル溶液）；ｔ＝０分、Ａ／Ｂ＝９５：５、ｔ＝８分、Ａ／Ｂ＝５：９５；Ｒｔ４．３６分。
【００７７】
実施例９
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メトキシ−安息香酸メチルエステル（中間体４）の合成＞
窒素による不活性雰囲気下、３，５−ジニトロ安息香酸エチルエステル（５ｇ、０．０２ｍｏｌ、１当量）のメタノール（５０ｍＬ）懸濁液にメチルリチウム（１．６６ｇ、０．０４ｍｏｌ、２．１当量）を添加した。この反応液を還流温度で１６時間加熱し、氷冷塩酸水溶液（２５ｍＬ）に注いだ。生成物をエーテルで抽出し（３×２５ｍＬ）、水（１０ｍＬ）で洗浄した。これを硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この生成物をＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｏｎｄ  ＣｈｅｍＥｌｕｔ（ＳｉＯ2）で精製した（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル（９：１ｖ／ｖ））。
【００７８】
得られた３−メトキシ−５−ニトロ安息香酸メチルエステル（１ｇ、５ｍｍｏｌ）をメタノール（３０ｍＬ）−酢酸エチル（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液に濃塩酸水溶液（０．４ｍＬ）とパラジウム担持チャーコール（５０ｍｇ）とを添加した。この反応液を水素雰囲気下（４０ｐｓｉ）室温で維持した。１時間後、パラジウム触媒をセライトろ過して回収し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた３−アミノ−５−メトキシ安息香酸メチルエステルは精製せずに用いた。粗製の３−アミノ−５−メトキシ安息香酸メチルエステル（９６０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ、１当量）を水−濃塩酸の混合液（１：１（ｖ／ｖ）、５ｍＬ）に懸濁させた。この懸濁液にＮａＮＯ2（３６５ｍｇ、５．３ｍｍｏｌ、１．２当量）水溶液（水５ｍＬ）を０℃で滴下し、この混合物を０℃で１０分間撹拌した。次いでヨウ化カリウム（１．４７ｇ、８．８ｍｍｏｌ、２当量）水溶液（水３ｍＬ）を徐々に添加した。同時にトルエン（８ｍＬ）を反応液に注いだ。氷浴を外し反応液を室温で３時間、次いで還流温度で１時間撹拌した。水（１０ｍＬ）を添加し生成物を酢酸エチルで抽出した（２×１０ｍＬ）。有機層を合一し食塩水（５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル９：１（ｖ／ｖ））、３−ヨード−５−メトキシ安息香酸メチルエステルを得た（７３０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ、収率５０％（２段階））。
【００７９】
アルゴンによる不活性雰囲気下、３−ヨード−５−メトキシ安息香酸メチルエステル（５００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ、１当量）をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（２０ｍｇ、４ｍｏｌ％）のトルエン（２５ｍＬ）溶液に添加した。この反応液にヘキサメチルジスタンネート（０．４１ｍＬ、２ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加しこの混合物を還流温度まで加熱した。３時間後、これに酢酸エチル（１０ｍＬ）を添加した。反応液をＮａＯＨ／ＫＨ2ＰＯ4水溶液バッファー（ｐＨ＝７、１５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた生成物をトルエン（３０ｍＬ）で希釈し、中間体１（６１０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ、１当量）とパラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（９０ｍｇ、５ｍｏｌ％）との混合物にアルゴンによる不活性雰囲気下、添加した。この混合物を１１０℃で１８時間加熱した。生成物を酢酸エチルで抽出し（２×１５ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。これをフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル／メタノール５０：５０：１（ｖ／ｖ／ｖ））中間体４を淡黄色固体として得た（４８３ｍｇ、１ｍｍｏｌ、収率６０％）。
【００８０】
MS: 484[M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.71(s, 2H, Py); 8.59(d, 1H, JHH=9.2 Hz, *CH=CH-C-OMe); 7.84-7.81(m, 1H, *CH); 7.78(d, 1H, JHH=2.6 Hz, *CH); 7.64-7.59(m, 2H, *CH, *CH); 7.31(d, 1H, JHH=2.5 Hz, C-C=*CH-C); 5.04(s, 2H, *CH2-Py); 3.90(s, 3H, OMe); 3.89(s, 3H, OMe); 3.88(s, 3H, OMe).
【００８１】
実施例１０
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−５−メトキシ−安息香酸（化合物７）の合成＞
中間体４（４３０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ／水（３：１（ｖ／ｖ））混合液（２８ｍＬ）溶液に水酸化リチウム（６５ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ、３当量）を室温で添加した。この反応液を４時間撹拌し氷冷水（１０ｍＬ）に注いだ。この混合物を５％クエン酸水溶液で酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出した（２×１０ｍＬ）。有機層を合一し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、精製せずに化合物７を淡黄色固体として得た（４２０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、１００％収率）。
【００８２】
MS: 471［M+H]+
NMR DMSO_d6: 13.21（s-broad, 1H, OH); 8.70（s, 2H, Py); 8.58（d, 1H, JHH=9.1 Hz, *CH=CH-C-OMe); 7.82-7.80（m, 1H, *CH); 7.77（d, 1H, JHH=2.5 Hz, *CH); 7.63-7.61（m, 1H, *CH); 7.56-7.54（m, 1H, *CH); 7.31（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C-C=*CH-C); 5.03（s, 2H, *CH2-Py); 3.88（s, 6H, OMe, OMe).
【００８３】
実施例１１
＜３−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−ジフルオロメトキシフタラジン−１−イル］−安息香酸（化合物８）の合成＞
化合物４−クロロ−１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−６−ジフルオロメトキシフタラジン（特許文献２の実施例９９（ページ４５）の記載に従って調製したもの）（５ｇ、１２．８ｍｍｏｌ、１当量）、３−カルボキシフェニルボロン酸（２．３４ｇ、１４ｍｍｏｌ、１．１当量）及びパラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（４５０ｍｇ、５ｍｏｌ％）の混合物に、予め窒素を通した炭酸カリウム（５．３ｇ、３９ｍｍｏｌ、３当量）の水（３０ｍＬ）、ＤＭＥ（１００ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）溶液をアルゴンの不活性雰囲気下、室温で添加した。この反応液を８０℃で１６時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し水（２５０ｍＬ）を添加した。過剰の反応物質を酢酸エチルで抽出した（３×５０ｍＬ）。また、水層は濃塩酸でｐＨ＝３に酸性化した。この混合物を１時間撹拌した。析出物をろ取し、５０℃で乾燥して、化合物８を淡黄色固体として得た。更にクロロホルムから再結晶し、純粋な化合物８を得た（３．９ｇ、８．７ｍｍｏｌ、収率６８％）。
【００８４】
MS: 477［M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.77（d, 1H, JHH=9.0 Hz, *CH=CH-C-O-CHF2); 8.72（s, 2H, Py); 8.24（m, 1H, *CH=C-COH); 8.19-7.97（m, 3H, *CH=CH-CH=C-COOH, CH=*CH-C-COOH, CH=*CH-C-OCHF2); 7.74（m, 1H, CH-*CH=CH); 7.61（d, 1H, JHH=2.4 Hz, CHF2-O-C-*CH=C); 7.51（t, 1H, JHF=73.4 Hz, *CHF2); 5.10（s, 2H, *CH2-Py).
【００８５】
実施例１２
＜１−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］カルボン酸メチルエステル（中間体５）の合成＞
中間体１（９．７ｇ、２７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（８０ｍＬ）及びメタノール（４０ｍＬ）に加え懸濁液とした。この懸濁液に炭酸カリウム（７．４ｇ、５４ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（０．３１ｇ、１．４ｍｍｏｌ）及び１，３−ビスジフェニルホスフィンプロパン（０．７５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応液を一酸化炭素（８．５ｂａｒ）雰囲気下で維持し、数時間５０℃に加熱した。反応液を水（１Ｌ）に注いだ。この生成物を酢酸エチルで抽出した（４×２００ｍＬ）。飽和食塩水溶液（３００ｍＬ）で洗浄し乾燥後、減圧濃縮した。この生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：石油エーテル／酢酸エチル（１：１ｖ／ｖ）中間体５を白色固体として得た（５．０ｇ、１３ｍｍｏｌ、収率４９％）。
【００８６】
NMR CDCl3: 8.42 e 7.97（2s, 2H, Py); 7.90（d, 1H, JHH=8.6 Hz, *CH=CH-C-OMe); 7.31-7.23（m, 2H, Ar); 7.19（dd, 1H, CH-*CH=C-OMe); 7.11-7.09（m, 2H, Ar); 7.02（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C=*CH-C=CH); 5.62（s, 1H, CH); 5.08（s, 1H, CH); 3.95（s, 4H, OCH2CH2O); 3.91（s, 3H, OCH3); 3.42（bs, 1H, OH).
【００８７】
実施例１３
＜１−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］カルボン酸（中間体６）の合成＞
中間体５（７５０ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）をメタノール（２７ｍＬ）及び水（３ｍＬ）に懸濁し、この懸濁液に８５％水酸化カリウム（２１０ｍｇ、３ｍｏｌ）を添加した。１時間後、この反応液を濃縮し、水（１０ｍＬ）を添加した。この溶液をジクロロメタンで洗浄し（２×５ｍＬ）、濃塩酸水溶液で酸性化した。得られた析出物をろ過し、水で洗浄し（２×５ｍＬ）、中間体６を白色固体として得た（０．６６ｇ、１．８ｍｍｏｌ、収率９２％）。
【００８８】
NMR DMSO_d6: 10.13（s, 1H, CHO); 8.70（s, 2H, Py); 8.57（d, 1H, JHH=9.0 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.29-7.80（m, 4H, Ar-CHO); 7.82-7.76（dd, 1H, CH-*CH=C-Ome); 7.28（d, 1H, JHH=2.65 Hz, MeO-C-*CH=C); 4.96（s, 2H, *CH2-Py); 3.88（s, 3H, OMe).
【００８９】
実施例１４
＜２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］オキサゾール−４−カルボン酸（化合物９）の合成＞
セリンエチルエステル塩酸塩（２３３ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、中間体６（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液とトリエチルアミン（０．２２ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ、１．１当量）と１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．１当量）とを添加した。この反応液を０℃に冷却し、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（３１０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．１当量）を１０分間かけて添加した。この反応液を室温に戻し３６時間撹拌し、次いで、５％クエン酸水溶液で酸性化した。層分離し、有機層を５％重炭酸ナトリウム水溶液（５ｍＬ）及び水（２ｍＬ）で洗浄した。この有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル／メタノール６０：４０：１（ｖ／ｖ／ｖ））、中間体化合物を得た（３５０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５５％収率）。得られた化合物（３００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、１当量）を窒素による不活性雰囲気下、ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。バージェス（Burgess）試薬（１６０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加し、この反応液を３時間還流温度で加熱し、次いで水（５ｍＬ）を加えた。生成物を酢酸エチルで抽出し（２×１５ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル／メタノール５０：５０：１（ｖ／ｖ／ｖ））、２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］−４，５−ジヒドロオキサゾール−４−カルボン酸エチルエステルを得た。この中間体エステル（１００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却した。この溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（０．０３６ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ、１．１当量）及びブロモトリクロロメタン（０．０２４ｍＬ、０．２４ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下した。この反応液を０℃で６時間撹拌した。塩化アンモニウム飽和水溶液（１０ｍＬ）を添加し層分離した。有機層を合一し、食塩水（５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。得られたエステル（８５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１当量）を、次にＴＨＦ／水（３：１（ｖ／ｖ）、６ｍＬ）混合液に溶解し、水酸化リチウム（１４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。２時間後、５％クエン酸水溶液（５ｍＬ）を添加した。生成物を酢酸エチルで抽出し（２×１５ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。次いでメタノールから再結晶し、化合物９を白色固体として得た（６５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、収率８０％）。
【００９０】
MS: 431［M+H]+
NMR DMSO_d6: 9.08（s, 1H, O-*CH=C); 8.86（d, 1H, JHH=2.5 Hz, C=*CH-C); 8.71（s, 2H, Py); 8.63（d, 1H, JHH=9.3 Hz, *CH=CH-C-OMe); 7.87（dd, 1H, CH=*CH-C-OMe); 5.08（s, 2H, *CH2-Py); 4.04（s, 3H, OMe).
【００９１】
実施例１５
＜２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］チオフェン−３−カルボン酸（化合物１０）の合成＞
化合物１に関して記載したように手続きを行い，化合物１０を合成した。なおこれには、基質として中間体１（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）と３−ホルミル−２−チオフェンボロン酸（２２０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）とを用いた。カップリング反応生成物を酢酸エチルで抽出し（２×１５ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：シクロヘキサン／酢酸エチル／メタノール６０：４０：１（ｖ／ｖ／ｖ））中間体化合物２−［４−（３，５−ジクロロピリジン−４−イルメチル）−７−メトキシフタラジン−１−イル］チオフェン−３−カルボキシアルデヒドを得た（１５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、収率２５％）。次いで、化合物５に関して記載したように手続きを行い、この中間体アルデヒド（８０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を酸化して対応する酸を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ2）で精製し（溶出液：ジクロロメタン／メタノール／酢酸９５：５：９５（ｖ／ｖ／ｖ））、次いでジクロロメタン／メタノール（９９：１（ｖ／ｖ））から再結晶し、化合物１０を白色固体として得た（４０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、収率５０％）。
【００９２】
MS: 446［M+H]+
NMR DMSO_d6: 8.70（s, 2H, Py); 8.58（d, 1H, JHH=9.1 Hz, *CH=CH-C-OMe); 7.97（d , 1H, JHH=4.1 Hz, CH-S); 7.85-7.80（m, 2H, S-CH=*CH, CH=*CH-C-OMe); 7.75（d, 1H, JHH=2.5 Hz, C-*CH=C); 5.02（s, 2H, *CH2-Py); 4.03（s, 3H, OMe).
【００９３】
実施例１６
＜化合物２のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン塩（化合物１１）の合成＞
窒素による不活性雰囲気下、化合物２（５００ｍｇ、１．１３６ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）懸濁液を還流温度まで加熱した。得られた懸濁液にＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（２３３ｍｇ、１．１９ｍｍｏｌ）のメタノール（１．２ｍＬ）−水（１．５ｍＬ）溶液を添加した。完全に溶解させた後、この混合物を室温、減圧下で濃縮した。エタノール（１０ｍＬ）を添加し、溶液を４℃で４日間維持した。析出物をろ取し、エタノール（５ｍＬ）及びジエチルエーテル（５ｍＬ）で洗浄した。減圧下、１５時間５０℃で乾燥し、化合物１１を淡黄色固体として得た（４００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、収率５４％）。
【００９４】
NMR DMSO_d6: 8.68（s, 2H, Py); 8.54（d, 1H, JHH=8.7 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.17（s-broad, 1H, C=*CH-C-CO2H); 8.06（d-broad, 1H, JHH=8.1 Hz, *CH), 7.78（d-broad, 1H, JHH=8.1 Hz, *CH); 7.72（dd, 1H, CH=*CH-C-OMe); 7.58-7.50（m, 1H, CH=*CH-CH); 7.29（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C=*CH-C); 5.04（s, 2H, *CH2-Py); 3.91-3.82（m, 4H, OMe, *CHH-OH); 3.58-3.33（m, 5H, HO-*CHH-*CH（OH)-*CH（OH)-*CH（OH)-*CH（OH)), 3.06-2.84（m, 2H, CH2-NH), 2.09（s, 3H, NHMe).
【００９５】
実施例１７
＜化合物２の２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール塩（化合物１２）の合成＞
窒素による不活性雰囲気下、化合物２（５００ｍｇ、１．１３６ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）懸濁液を還流温度まで加熱した。得られた懸濁液に２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（１３８ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）を添加した。完全に溶解後、溶液の温度を室温に戻した。２時間後、析出物をろ取し、エタノール（５ｍＬ）及びジエチルエーテル（５ｍＬ）で洗浄した。減圧下、１５時間５０℃で乾燥し、化合物１２を淡黄色固体として得た（４００ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、収率６３％）。
【００９６】
NMR DMSO_d6: 8.68（s, 2H, Py); 8.54（d, 1H, JHH=8.7 Hz, *CH=CH-C-OMe); 8.17（s-broad, 1H, C=*CH-C-CO2H); 8.05（d-broad, 1H, JHH=8.1 Hz, *CH), 7.79（d-broad, 1H, JHH=8.1 Hz, *CH); 7.77-7.70（m, 1H, CH=*CH-C-OMe); 7.60-7.51（m, 1H, CH=*CH-CH); 7.29（d, 1H, JHH=2.3 Hz, C=*CH-C); 5.01（s, 2H, *CH2-Py); 3.86（s, 3H, OMe), 3.46（s, 6H, C（CH2)3).
【００９７】
実施例１８
＜ＰＤＥ４酵素の阻害＞
ａ）ＰＤＥ４酵素精製
ニールソン（Nielson）らの方法（J.Allergy Clin.Immunol.，１９９０年，８６巻，８０１〜８０７頁）を一部ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）技法用に変更した方法に従ってＰＤＥ４酵素をＵ９３７細胞株から単離した。
【００９８】
Ｕ９３７細胞株（ゾープロフィラッティコ・スペリメンターレ研究所（Istituto Zooprofilattico Sperimentale）、イタリア国ブレシア）は、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０に細胞密度１×１０6〜８×１０6個／ｍＬで添加し、インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ2で維持した。
【００９９】
Ｕ９３７浮遊液は、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ（トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、５ｍＭ  ＭｇＣ１2、４ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラ酢酸）、５ｍＭ  □−メルカプトエタノール、１μＭ  ロイペプチン、１μＭ  ペプスタチン、１％ＴＲＩＴＯＮ  ｘ−１００及び１００μＭ  フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）を含有する緩衝液（ｐＨ７．８）中でホモジナイズした。
【０１００】
ホモジネートは遠心分離し、上清からＰＤＥ４酵素を精製した。即ち、これを、生体クロマトグラフィーシステム（ＦＰＬＣ、BIO  RAD）に接続したカラムに添加した。
ＰＤＥ４酵素は、直線勾配の０．０５Ｍ〜１Ｍ酢酸ナトリウムで溶出させ、溶出画分を回収してＰＤＥ４活性測定を行った。
ＰＤＥ４活性を有する画分を回収し、酢酸ナトリウムを除去するため一晩水で透析した後、体積が３０％となるまでアミコン濾過システム（Amicon filtration system）（ＹＭ１０膜フィルタ使用）を用いて濃縮した。
エチレングリコール（３０％ｖ／ｖ）を添加し、この試料をシングルアリコートとして使用時まで−２０℃で保存した。
【０１０１】
ｂ）ＰＤＥ４活性測定
ＰＤＥ４活性測定は、シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assay:SPA）アマシャムキット（3Ｈ−ｃＡＭＰトレーサー、ＰＤＥアッセイ緩衝液（１０×溶液：５００ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、８３ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１７ｍＭ  ＥＧＴＡ）、及びイットリウムＳＰＡ  ＰＤＥビーズ（１８ｍＭ硫酸亜鉛含有））を用いて行った。
ビーズの放射能はシンチレーションカウンタ（パッカード（Packard）モデルＭＩＮＡＸＩ  β  ＴＲＩ−ＣＡＲＢ４０００シリーズ）を用いて測定した。
【０１０２】
ＩＣ50値は、ＯＲＩＧＩＮ３．５プログラム（マイクロカル（MICROCAL）ソフトウェア社）を用いた非線形回帰分析により濃度−阻害曲線から計算し、各データは、異なるＰＤＥ４調製物を用いた３連の実験の平均±ＳＥＭで表した。
【０１０３】
式Ｉで表される各本発明化合物は、ＰＤＥ４酵素を選択的に阻害することが示された。
結果を表１に示す。
【０１０４】
【表１】
2006516127.tif 000007
【０１０５】
実施例１９
＜ヒト全血におけるＴＮＦαの放出＞
健常ボランティアから血液試料をヘパリンチューブに採取し、無血清ＲＰＭＩ１６４０で１：５に希釈した。
９６ウェルプレートを用いて試験を実施した。希釈血液（１５０μＬ）とＲＰＭＩ１６４０（１５０μＬ）に対照用の溶媒或いは種々の濃度の本発明化合物を添加して試料を調製し、これを３７℃で、５％ＣＯ2の湿潤雰囲気下３０分間インキュベートした。
測定試料中の全血は１：１０（ｖ／ｖ）に希釈した。
試料は、ＬＰＳ（大腸菌セロタイプＢ０：５５由来のリポ多糖、シグマ）（０．２５μｇ／ｍＬ）で刺激し、２４時間インキュベートした。
【０１０６】
遠心分離後、上清を回収し、市販のＥＬＩＳＡキット（バイオソース（Biosource））によりＴＮＦα濃度を測定した。
被検物質をＤＭＳＯ（１０-2Ｍ）に溶解し、ＲＰＭＩ１６４０で更に希釈した。
ＤＭＳＯにおける終濃度は０．１％を超えなかったため、ＴＮＦα放出に影響を及ぼさなかった。
【０１０７】
各化合物は９種の濃度を用いて２連で試験し、得られたデータは、別の提供者からの血液試料を用いて更に確認した。
各濃度におけるＴＮＦα産生阻害率を計算し、４パラメータロジスティック等式（4-parameters logistic equation）（オリジン計算（Origin calculation）プログラム、マイクロカルソフトウェア社）を用いてＩＣ50を求めた。
【０１０８】
式Ｉで表される各本発明化合物は、ＴＮＦα放出を阻害することが示された。
結果は、異なる２種の濃度におけるＩＣ５０として表２に示す。
【０１０９】
【表２】
2006516127.tif 000008
【０１１０】
実施例２０
＜ＰＤＥ３酵素及びＰＤＥ５酵素の阻害＞
ａ）ＰＤＥ３酵素及びＰＤＥ５酵素の精製
ＰＤＥ３酵素及びＰＤＥ５酵素を、健常ボランティアから得た多血小板血漿（PRP）から精製した。
シンプソン（Simpson）Ａ．Ｗ．Ｍらの方法（Biochem．Pharmacol.，１９８８年，３７巻，ｐ．２３１５〜２３２０）を一部ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）技法用に変更した方法に従ってＰＤＥ３酵素及びＰＤＥ５酵素を精製した。
ＰＲＰを生理食塩水溶液を用いて１：２に希釈し、１５分間室温で遠心分離（２０００×ｇ）した。
ペレットを１０ｍＬの溶解液（１５５ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭ  Ｎａ2ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）に懸濁し、氷浴上で１０分間インキュベートし、混入した赤血球を除去した。
【０１１１】
遠心分離後、血小板を１０ｍＬの２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ（β−メルカプトエタノール、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭベンズアミジンに浮遊させ、ポリトロン（Polytron）ホモジナイザーを用いて氷浴上でホモジナイズした。
ホモジネートを遠心分離し、上清を、生体クロマトグラフィーシステム（ＦＰＬＣ、BIO  RAD)に接続したＵＮＯ  Ｑ１２カラムに通した。
ＰＤＥ３酵素及びＰＤＥ５酵素を直線勾配の０．０５〜１Ｍ酢酸ナトリウムで溶出させ、溶出画分を回収してＰＤＥ酵素活性測定に用いた。
ＰＤＥ活性を示す画分をプールし、蒸留水で一晩透析し、アミコン濾過システム（ＹＭ１０膜フィルタ使用）を用いて１０倍濃縮した。
エチレングリコールを添加し終濃度３０％ｖ／ｖとし、この溶液を−２０℃で保存した。
これら条件において酵素活性は数週間安定していた。
【０１１２】
ｂ）ＰＤＥ３及びＰＤＥ５の活性測定
各酵素の活性測定は、シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assay：ＳＰＡ）アマシャムキット（ＰＤＥ３の場合は3Ｈ−ｃＡＭＰトレーサー、ＰＤＥ５の場合は3Ｈ−ｃＧＭＰトレーサー、ＰＤＥアッセイ緩衝液（１０×溶液：５００ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、８３ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１７ｍＭ  ＥＧＴＡ）、及びイットリウムＳＰＡ  ＰＤＥビーズ（１８ｍＭ硫酸亜鉛含有））を用いて行った。
ビーズの放射能はシンチレーションカウンタ（パッカード（Packard）モデルＭＩＮＡＸＩ  β  ＴＲＩ−ＣＡＲＢ４０００シリーズ）を用いて測定した。
【０１１３】
結果は、化合物クラス全体を代表する幾つかの化合物のＩＣ５０として表３に示す。
【０１１４】
【表３】
2006516127.tif 000009
【０１１５】
実施例２１
＜ＰＤＥ２酵素阻害＞
ａ）ＰＤＥ２酵素の精製
ＰＤＥ２は、ウェイリン（Whalin）ら（Molecular Pharmacol，１９９１年，３９巻，ｐ．７１１〜７１７）の方法に従ってマウスＰＣ１２細胞から精製した。
ＰＣ１２細胞（ゾープロフィラッティコ・ブレシア研究所（Istituto Zooprofilattico Brescia：イタリア国）を、５％ＦＣＳ、１５％ウマ血清、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び１％グルタミンを含有するＤＭＥＭを含む１５０ｃｍ3フラスコに入れ、３７℃、５％ＣＯ2で保持した。
この細胞を、コンフルエンシーに達して初めて分割するように注意しながら増殖させた。
細胞を洗浄した後、０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いてばらばらにし、清浄な試験管に入れた。
【０１１６】
遠心分離後、細胞を、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭ、２−メルカプトエタノール  ５ｍＭ、ロイペプチン  １μＭ、ペプスタチンＡ  １μＭ、ＰＭＳＦ  １００μＭを含有する緩衝液（ｐＨ６．５）に浮遊させ、ポリトロン（Polytron）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。
遠心分離後、上清画分を、生体クロマトグラフィーシステム（ＦＰＬＣ、BIO RAD）に接続したＵＮＯ  Ｑ−１２カラムに通した。
ＰＤＥ２酵素を直線勾配の０．０５〜１Ｍ酢酸ナトリウムで溶出させ、溶出画分を回収してＰＤＥ２酵素活性測定に用いた。
ＰＤＥ２酵素活性を示す画分をプールし、蒸留水で一晩透析し、アミコン濾過システム（ＹＭ１０膜フィルタ使用）を用いて１０倍濃縮した。
エチレングリコールを添加し終濃度３０％ｖ／ｖとし、この溶液を−２０℃で保存した。
これら条件において酵素活性は数週間安定していた。
【０１１７】
ｂ）ＰＤＥ２活性測定
ＰＤＥ２活性測定は、シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assay：ＳＰＡ)アマシャムキット（3Ｈ−ｃＡＭＰトレーサー、ＰＤＥアッセイ緩衝液（１０×溶液：５００ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、８３ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１７ｍＭ  ＥＧＴＡ）、及びイットリウムＳＰＡ  ＰＤＥビーズ（１８ｍＭ硫酸亜鉛含有））を用いて行った。
ビーズの放射能はシンチレーションカウンタ（パッカード（Packard）モデルＭＩＮＡＸＩ  β  ＴＲＩ−ＣＡＲＢ４０００シリーズ）を用いて測定した。
【０１１８】
結果を化合物クラス全体を代表する幾つかの化合物のＩＣ５０として表４に示す。
【０１１９】
【表４】
2006516127.tif 000010
【０１２０】
実施例２２
＜ＰＤＥ１酵素阻害＞
ａ）ＰＤＥ１酵素の精製
凍結乾燥ＰＤＥ１酵素は、一部はウシ心臓から精製したものであるが、シグマから購入した（Ｐ０５２０）。
この酵素は、ホー（Ho）ら（Biochim Biophys Acta，１９７６年，４２９（２）巻、ｐ．６１〜４７３）．により報告されたＰ１フラクションからなる。
凍結乾燥酵素を３０％ｖ／ｖエチレングリコールを用いて戻し濃度５００ｇ／ｍＬとし、−２０℃で保存した。
【０１２１】
ｂ）ＰＤＥ１活性測定
ＰＤＥ１活性は、シンチレーション近接アッセイ（Scintillation Proximity Assay：ＳＰＡ）アマシャムキット（3Ｈ−ｃＡＭＰトレーサー、ＰＤＥアッセイ緩衝液（１０×溶液：５００ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、８３ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び１７ｍＭ  ＥＧＴＡ）、及びイットリウムＳＰＡ  ＰＤＥビーズ（１８ｍＭ硫酸亜鉛含有））を用いて測定した。
ビーズの放射能はシンチレーションカウンタ（パッカード（Packard）モデルＭＩＮＡＸＩ  β  ＴＲＩ−ＣＡＲＢ４０００シリーズ）を用いて測定した。
【０１２２】
結果を化合物クラス全体を代表する幾つかの化合物のＩＣ５０として表５に示す。
【０１２３】
【表５】
2006516127.tif 000011
【０１２４】
実施例２３
式Ｉで表される本発明の各化合物と特許文献２に例示された各化合物の溶解性を比較したデータについて次に述べる。
溶解性試験にはＨＰＬＣを用いた。
溶解性試験は、標準に対するＨＰＬＣ分析（カラム４．６×１５ｍｍ、水／０．１％ＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮ／０．０６％ＴＦＡ勾配）により行った。
基質の１０Ｍ  ＤＭＳＯ溶液を調製した。
試料は、ＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）（１９０μＬ）を上の溶液（１０μＬ）に添加して調製した。標準は、ＤＭＳＯ（１９０μＬ）を上の溶液（１０μＬ）に添加して調製した。
【０１２５】
式Ｉの各化合物についての結果を表６に示す。
【０１２６】
【表６】
2006516127.tif 000012
【０１２７】
特許文献２の各化合物についての結果を表７に示す。
【０１２８】
【化５】
2006516127.tif 000013
【０１２９】
Ｒは、特段の説明がない場合は−ＣＨ3基である。
【０１３０】
【表７】
2006516127.tif 000014
【０１３１】
特許文献２の番号７５の化合物はＰＤＥ４阻害活性を示すが、その活性は本発明の各化合物よりも低い。
【０１３２】
実施例２４
＜ラットを用いた薬物動態研究＞
ワード（Ward）Ｋ．Ｗ．ら（Drug Metab． Dispos，２００１年，２９巻，ｐ．８２〜８８）に記載の３〜５種の化合物を含有する混合物をラットに投与した。投与は、１０ｍｇ／ｋｇ（３％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する２０％ＰＧ及び７７％Ｎ−メチルグルコサミン２５ｍＭの１ｍＬ中に１ｍｇ）を経口投与或いは３ｍｇ／ｋｇ（１５％ＤＭＳＯ／８５％ＰＥＧの１ｍＬ中に３ｍｇ）を静脈内投与して行った。
一実験あたり、動物への処置は１回だけとした。
恒久的に頚部カテーテル（SilasticR、ダウコーニング）を埋め込んだラットに、試験混合物を静脈内ボーラス投与（カテーテル経由）或いは強制経口投与し処置した。
頚部カテーテルから血液試料を採取した。採取は、投与６時間後までの間に数回行った。
２倍量のＣＨ3ＣＮを用いてタンパク質沈殿を行った後、血漿試料を分析し、ＬＣ／ＭＳにより血漿濃度を測定した。
【０１３３】
式Ｉの化合物の内の幾つかから得られた結果を表８に示す。
【０１３４】
【表８】
2006516127.tif 000015
【０１３５】
本発明の各化合物は溶解度が高いため、最も一般的な医薬組成物に通常使用される生理学的賦形剤を用いて生物学的利用能研究を行うことができた。
特許文献２の一般式に包含される各化合物に対して生理学的賦形剤を用いて試験を行ったところ、生物学的利用能の値は０であった。
特許文献２の一般式に包含される各化合物は溶解性が低いため、静脈経路においても経口経路においても、薬物動態研究を行うにあたっては１５％ＤＭＳＯ／８５％ＰＥＧに溶解させて、即ち生理学的賦形剤を全く用いないで行わなければならなかった。
表９に、このような条件で得た生物学的利用能の値を示す。
【０１３６】
【表９】
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【０１３７】
本発明の目的物である式Ｉで表される各化合物は、生理学的賦形剤に担持させて投与すると、前記特許出願の一般式に包含される各化合物に比肩しうる良好な生物学的利用能の値を示し、多くの場合においてこれら化合物よりも高い値であった。尚、本発明化合物は前記特許出願の化合物から選択されたものであり、前記特許出願における生物学的利用能は、非生理学的なＤＭＳＯ／ＰＥＧ溶液の状態で測定したものである。
【国際調査報告】
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