(57)【要約】本出願は、CNSにおける神経軸索の髄鞘形成を促進するための材料および方法を提供する。これらは、第1に神経グリア接合部の成立および維持に際して分子NogoおよびCasprが互いに相互作用するという知見、第2に分子F3およびNB-3がNotchとの相互作用を介してオリゴデンドロサイトの成熟を促進しうるという知見に由来する。提供する材料および方法は、CNS障害の治療、特に脊髄損傷、多発性硬化症、てんかんおよび卒中の治療に用いられる可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NogoおよびCasprもしくはそれらの模倣体、またはNogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質が、担体と組み合わされたものを含む、組成物。
【請求項２】
NogoとCasprとの複合体、または複合体の模倣体を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
Nogo-66を含む、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
Caspr1を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
NogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質が抗体である、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
抗体がNogoおよびCasprの両方と結合しうる、請求項5記載の組成物。
【請求項７】
薬学的組成物である、請求項1〜6のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
インビボでの注射用に製剤化されている、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項９】
CNSへの直接注射用に製剤化されている、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
医療の方法に用いるための、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
CNSに対する損傷または疾患の治療に用いるための、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
SCI、MS、てんかんまたは卒中の治療に用いるための、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品であって、Casprまたはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるNogoの利用。
【請求項１４】
CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品であって、Nogoまたはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるCasprの利用。
【請求項１５】
CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品の調製における、NogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質の利用。
【請求項１６】
神経軸索の髄鞘形成を誘発する方法であって、ニューロンまたはオリゴデンドログリア細胞を、請求項1〜9のいずれか一項記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
中枢神経系の疾患または中枢神経系に対する損傷を有する対象を治療する方法であって、請求項7〜9のいずれか一項記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項１８】
対象がSCI、MS、てんかんまたは卒中を有する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
NogoとCasprとの間の相互作用を調節しうる物質に関するスクリーニングの方法であって、Nogo、Casprおよび候補物質を接触させること、ならびにNogoとCasprとの間の相互作用を判定することを含む方法。
【請求項２０】
NogoおよびCasprを、候補物質の非存在下において、それ以外は類似の条件下で接触させること、ならびにNogoとCasprとの間の相互作用を判定することをさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
NogoとCasprとの複合体を候補物質と接触させることを含む、請求項19または20記載の方法。
【請求項２２】
NogoおよびCasprの一方が細胞内または細胞表面に存在する、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
NogoおよびCasprの一方が、細胞に導入されたベクターから発現される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
NogoおよびCasprの一方が固体支持体上に固定化されている、請求項19〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
薬学的製剤を製造する方法であって、NogoとCasprとの間の相互作用を調節しうる物質を請求項19〜24のいずれか一項記載の方法によって同定した上で、物質を薬学的に許容される担体とともに製剤化するさらなる段階を含む方法。
【請求項２６】
物質をインビボ投与用に最適化するさらなる段階を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
オリゴデンドロサイトまたはその前駆体の分化を誘発する方法であって、オリゴデンドロサイトまたは前駆体を、F3、NB-3またはいずれかの模倣体と接触させることを含む方法。
【請求項２８】
神経軸索の髄鞘形成を誘発する方法であって、オリゴデンドロサイト、その前駆体またはニューロンを、F3、NB-3またはいずれかの模倣体と接触させることを含む方法。
【請求項２９】
オリゴデンドロサイト、前駆体またはニューロン（必要に応じて）を、F3およびNB-3またはそれらの模倣体と接触させることを含む、請求項27または28記載の方法。
【請求項３０】
F3およびNB-3が複合体として存在する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
F3、NB-3またはそれらの模倣体が、オリゴデンドロサイトまたはその前駆体の表面にあるNotchと結合する、請求項27〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
結合がNotchシグナル伝達を誘導する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
結合がNotch 1またはNotch 2シグナル伝達を誘導する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
Notchシグナル伝達がDeltex-1を介する、請求項32または33記載の方法。
【請求項３５】
前駆体がオリゴデンドログリア前駆細胞（OPC）または神経幹細胞（NSC）である、請求項27〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
インビトロまたはエクスビボで行われる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
接触の段階の後に、OPCまたはNSCを、中枢神経系の疾患または中枢神経系に対する損傷を有する対象に投与する、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
対象がSCI、MS、てんかんまたは卒中を有する、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
F3およびNB-3またはそれらの模倣体が担体と組み合わされたものを含む組成物。
【請求項４０】
F3とNB-3との複合体、またはその模倣体を含む、請求項39記載の組成物。
【請求項４１】
薬学的組成物である、請求項39または40記載の組成物。
【請求項４２】
インビボでの注射用に製剤化されている、請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
CNSへの直接注射用に製剤化されている、請求項42記載の組成物。
【請求項４４】
医療の方法に用いるための、請求項39〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４５】
CNSに対する損傷または疾患の治療に用いるための、請求項39〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４６】
SCI、MS、てんかんまたは卒中の治療に用いるための、請求項39〜43のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４７】
CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品の調製におけるF3および／またはNB-3の利用。
【請求項４８】
CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品であって、NB-3またはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるF3の利用。
【請求項４９】
CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品であって、F3またはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるNB-3の利用。
【請求項５０】
神経軸索の髄鞘形成を誘発する方法であって、ニューロンまたはオリゴデンドログリア細胞を、請求項39〜43のいずれか一項記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項５１】
中枢神経系の疾患または中枢神経系に対する損傷を有する対象を治療する方法であって、請求項41〜43のいずれか一項記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項５２】
対象がSCI、MS、てんかんまたは卒中を有する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
NotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を調節しうる物質に関するスクリーニングの方法であって、F3および／またはNB-3、Notchならびに候補物質を接触させること、ならびにNotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を判定することを含む方法。
【請求項５４】
NotchならびにF3および／またはNB-3を、候補物質の非存在下において、それ以外は類似の条件下で接触させること、ならびにNotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を判定することをさらに含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
NotchとF3および／またはNB-3との複合体を候補物質と接触させることを含む、請求項53または54記載の方法。
【請求項５６】
F3、NB-3およびNotchのうち1つが細胞内または細胞表面に存在する、請求項53〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
F3、NB-3およびNotchのうち1つが、細胞に導入されたベクターによって発現される、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
Notchが細胞表面に存在していて、Notchシグナル伝達を判定することを含む、請求項56または57記載の方法。
【請求項５９】
Deltex-1を介するNotchシグナル伝達を判定することを含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
F3、NB-3およびNotchのうち1つが固体支持体上に固定化されている、請求項53〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
薬学的製剤を製造する方法であって、NotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を調節しうる物質を請求項53〜59のいずれか一項記載の方法によって同定した上で、物質を薬学的に許容される担体とともに製剤化するさらなる段階を含む方法。
【請求項６２】
物質をインビボ投与用に最適化するさらなる段階を含む、請求項61記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、中枢神経系（CNS）の損傷および疾患を治療するための新規な方法および材料に関する。詳細には（しかし、限定的ではない）、本発明は、脊髄損傷（SCI）、卒中、または多発性硬化症（MS）およびてんかんなどの疾患の後の、脊髄の再生および髄鞘再形成のための方法および材料を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
米国では250,000人を上回る人々、全世界では数百万もの人々が脊髄損傷後遺症（慢性SCI）による永続的な機能障害に苦しんでおり、米国では毎年約12,000人に新たに損傷（急性SCI）が生じている。さらに、SCIに起因する麻痺は主として若年者にみられる状態である。脊髄損傷の60％は30歳未満で起こり、19歳での発生率が最も高い。ほとんどの損傷は自動車、スポーツもしくは仕事に関係した事故、または暴力に原因がある。SCI患者に対する医療費の推計値は米国だけでも毎年90億ドルを上回り、個々の患者には一生に150万ドルを上回る費用がかかる。
【０００３】
哺乳動物の成体の中枢神経系（CNS）に対する外傷の後、損傷ニューロンの断裂した軸索は再生しない。現在、脊髄損傷における治療法の主体は未だにリハビリテーションである。原発損傷に対して対処しうる事柄はほとんどない。脊髄損傷の後には、主に3種類の障害が同定されている。
【０００４】
1. 神経細胞死
損傷に起因する神経細胞の死滅は困難な問題であるが、これは神経細胞は我々の神経系を構成する高度に特化した細胞へと成熟しているため、細胞分裂を行う能力がないためである。一部の細胞は外傷損傷時に死滅し、また別のものは損傷から数時間後、数日後または場合によっては数週間後に死滅する。細胞が死滅する時期にかかわらず、神経細胞が存在しないのであれば機能的な連結は成立しえない。グリアの死滅も神経機能の妨げとなる。第1の治療目標はできるだけ多くの細胞を保存することであり、これは神経保護としても知られる。神経保護薬または神経保護療法を用いた場合でも、SCIではある程度の神経細胞死が依然として起こる可能性がある。したがって、神経細胞の補充が必要な可能性がある。
【０００５】
2. 神経経路の破壊
脊髄の上行路および下行路における長い軸索は損傷後にウォーラー変性を起こす。ニューロン回路を再構築するためには軸索の再生が起こらなければならない。
【０００６】
3. 脱髄
ミエリン鞘は長く細い軸索を絶縁して神経インパルスの伝達を助ける。ある種のSCI、さらに卒中およびてんかんでは、神経細胞および軸索が消失してもいず分断されてもいないことがある。この場合の神経機能障害はミエリン鞘の消失に起因する可能性がある。この種の障害は、複雑な回路の再配線が必要でないと思われる上に、軸索の髄鞘再形成は可能であることが知られているため、治療による是正の可能性が最も高いと思われる。
【０００７】
考えられる治療法
1. 神経細胞の補充
成熟した神経細胞は分裂して創傷を治癒させることができない。失われた神経細胞の補充には、移植した神経細胞が成熟して宿主神経系に組み込まれることを期待した損傷部位への移植が必要と考えられる。ヒト胎児組織の利用は有望であることがいくつかの研究で示されている。しかし、これにはドナー組織に関する倫理的および技術的な問題点、ならびに移植した細胞の免疫拒絶に関する重大な疑問がある。ごく最近、科学者らは、刺激を加えることによって分裂させてニューロンおよびグリアに分化させることが可能な成体神経幹細胞の存在を見いだした。この刺激に富む知見は、細胞療法に対する新たな可能性を切り開いた。
【０００８】
2. 障害を受けた軸索の再生
中枢神経系（CNS）および末梢神経系（PNS）のニューロンにはいずれもグリアが密接に付随している。損傷の後、CNSグリアは主として再生を抑制するが、PNS内のシュワン細胞は再生を促進する。細胞は特別に設計された「ガイダンスチャンネル（guidance channel）」内に供給され、これが切断されたラット脊髄において神経線維の再生を促進することが示されている。シュワン細胞およびニューロンは増殖因子を産生する。これらの因子を損傷部位に単独で、または移植片とともに導入することにより、これらはさらに脊髄再生を誘発しうることが示されている。シュワン細胞は増殖因子を産生するように遺伝子操作することができ、これらも再生を向上させる。移植後に後肢運動機能のある程度の改善が観察されているが、これらの結果は、これらの処置に対する臨床試験を行う根拠となるほどには十分な信頼性がない。刺激に富む2件の新たな研究により、嗅神経鞘グリアが、長い神経線維の生存脊髄領域への成長を、これらの線維がシュワン細胞ブリッジを抜けること、または損傷部位を通り越して成長することにより、SCI部位を越えて「先導」しうることを示している。これらの有望な研究は、SCI、卒中またはてんかんの後の機能回復がそのうち成功するだろうという希望を与えるものである。
【０００９】
3. 軸索の髄鞘再形成
シュワン細胞は、ミエリン鞘を形成する末梢神経内の細胞である。それらは通常は脳内にも脊髄内にも認められず、これらの部位ではオリゴデンドロサイトがミエリン産生を担っている。脳内に移植されたシュワン細胞が中枢軸索を有髄化しうることは研究者らによって示されている。ミエリンの喪失が損傷の重要部分である場合には、シュワン細胞の移植によって髄鞘再形成が誘発され、おそらくは機能も回復すると考えられる。他の研究センターで、脱髄した神経線維を経由するシグナル伝達を一時的に回復させるように思われる薬剤（4-AP）を試験するための多施設臨床試験が開始されている。
【００１０】
CNSミエリンおよび軸索再生時のその主な阻害作用
再生の重大な障壁となるのは軸索成長阻害活性であり、これはCNSミエリンに存在する上、CNS内でミエリンを合成する細胞であるオリゴデンドロサイトの原形質膜にもみられる。CNSミエリンの伸長阻害特性はさまざまな研究室で、ミエリン基質または白質のクリオスタット切片に対するニューロンのプレーティング、および軸索の成熟オリゴデンドロサイトとの接触の観察を含む多岐にわたる技法によって示されている。このため、成体ニューロンがインビトロでCNSミエリンを越えて神経突起を伸長させることができないことには文献的に十分に裏づけられている。また、インビボでミエリンを除去するとCNSの本来の範囲を越えて再生成長が得られる度合いが高まることにも文献的に十分な裏づけがある。オリゴデンドロサイトを死滅させるとともにミエリンタンパク質の出現を阻止する処置である放射線照射を新生ラットに行った後には再生が起こる。ラットに皮質脊髄路病変と組み合わせてこのような処置を行った後には、いくつかの皮質脊髄軸索が病変を越える長い距離にわたって再び成長する。また、脊髄修復のニワトリモデルでも、髄鞘形成の発生は切断された軸索の再性能力の低下と相関する。ニワトリ胚脊髄で抗ガラクトセレブロシド抗体および補体を用いてミエリンを除去すると軸索再生が可能な期間が延長される。ミエリン中に存在する既知の阻害分子には、ミエリン付随糖タンパク質（MAG）、テネイシン-R（TN-R）、アレチンおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）が含まれる。最近、3つのグループが、ラットおよびヒトにおいて阻害性ミエリンタンパク質をコードする遺伝子Nogoの同定を報告した（GrandPre et al, 2000；Prinjha et al, 2000；Chen et al, 2000）。ミエリンに対する免疫処置により、損傷後の高度の軸索再生が可能となることが明らかになっている―このことはミエリン性阻害を克服することに多大な価値があることを示している。これらの実験は、ミエリン中の阻害因子とCNS内で軸索が再生できないこととの間に高い相関があることを示している。
【００１１】
多発性硬化症
MSは中枢神経系の変性疾患であり、ミエリンとして知られる神経細胞周囲の絶縁性鞘の表面に瘢痕が形成されることによる神経機能低下を伴う。MSの原因は不明である。しかし、多くの研究者が、それはおそらくはウイルス感染が引き金となって起こる自己免疫性疾患であると考えている。MSの診断のための確定的な臨床検査はない。しかし、MRI（磁気共鳴画像化法）は、ミエリンが障害されている脳内領域を示すことができる。
【００１２】
米国では約250,000〜300,000人がMSに罹患している。これには主として女性、白人および温帯気候出身の人々が罹患する。一般にMSの発症は20〜40歳の人で診断される。
【００１３】
MS病変が髄鞘形成前のオリゴデンドロサイトをかなり数多く含むことは今日広く受け入れられており、このことは以下を示す。
・これらの細胞が失われても修復能力は限定されない。
・オリゴデンドロサイトとその周囲の環境との間の相互作用が修復プロセスの結果を決定する可能性がある。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の第1の局面
本発明の第1の局面の背景
Nogo-AはCNS再生との関連で詳細に研究されており、これは損傷後の軸索再生の阻害における中心的な因子である（Woolf, 2003）。CNSミエリンの成長阻害特性の原因である3種類の主な分子―Nogo-A、ミエリン付随糖タンパク質（MAG）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（OMgp）は、軸索の表面にあってグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）により係留されている同一のNogo-66受容体（NgR）と結合するように思われる（Woolf, 2003）。神経再生の阻害にかかわる分子相互作用の解明により、神経再生が増強されるようにCNS環境を操作することが可能であるという刺激的な可能性が生まれている。しかし、これらの知見のほかに、CNSにおけるNogo-Aの作用に関する他の枠組みも今後明らかにする必要がある。例えば、シナプスにNogo-Aが存在することの特定（Wang et al, 2002）は、それがシナプス可塑性の調節に役割を果たしていることを示唆する。
【００１５】
Nogoは3種類のアイソフォーム、Nogo-A、BおよびCとして発現され、これらはすべて、2つの膜貫通ドメインおよび1つの66アミノ酸細胞外ループ（Nogo-66）を備えた共通のC末端を有する（GrandPre et al, 2000；Fournier et al, 2001）。Nogo-Aには大きな細胞質N末端ドメイン（Nogo-N）があり、これはNogo-BにもNogo-Cにも存在しない（Grandpre et al, 2000；Prinjha et al, 2000；Brittis et al, 2001）。Nogo-AのNogo-66およびNogo-Nは独立した阻害活性を有する（Fournier et al, 2001；GrandPre et al, 2000）。オリゴデンドロサイト表面のNogo-66ループは、軸索成長の遅延を媒介するNogo-66受容体（NgR）と結合する（Fournier et al, 2001）。これに対して、Nogo-Nに関しては、受容体も相互作用タンパク質もこれまで認められていない。Nogo-Aは初期胚CNSの脳で発現されるが、初期胚ニューロンにおけるNgR発現はわずかであるか検出不能である（Wang et al, 2002）。このため、Nogo-Aは胚形成期にはNgRとは無関係な機能を有する可能性がある。ノックアウトマウスにおけるNogo-A非存在下の神経再生に関する表現型は特に明確なものではなく、CNSにおけるNogo-Aの厳密な役割についてはさらに検討が必要である（Woolf, 2003）。成体ではNogo-Aはオリゴデンドロサイトに位置し、NgRは成熟軸索に位置することが明らかになっているが、この2種類の分子の有髄軸索に沿った正確な分布パターンおよび相互の関係は詳細には特定されていない。ニューロンとオリゴデンドロサイトとの境界面でのNogo-AおよびNgRの分布はCNS発生におけるそれらの役割を理解する上で重要であると考えられる。
【００１６】
軸索ドメインの分子構造の成立および維持は、神経インパルスの高速な跳躍伝導を確保する上で極めて重要である（Pedraza et al, 2001）。髄鞘形成の過程では、特定のイオンチャンネルおよび他のタンパク質分子を軸索に沿って異なる区域に確実にクラスター化させる、複雑ではあるが正確で効率的なプロセスが存在する（Dupree et al, 1999；Rasband et al, 2000；2001a）。ランヴィエ絞輪にはNa＋チャンネルが多く存在するがK＋チャンネルはこの位置から排除されており、これは代わりにジャクスタパラノード（juxtaparanodal）領域を占めている。しかし、発生時の髄鞘形成および髄鞘再形成のいずれの早期にも、K＋チャンネルクラスターは節とジャクスタパラノード領域との間のパラノードに一過性に位置する（Rasband et al, 1998；Vabnick et al, 1999）。これはグリア細胞質ループが軸索鞘と接触する箇所である。F3／コンタクチン、ニューロファシン155およびCaspr（パラノジン（Paranodin））などの接着分子はパラノードに位置する（Einheber et al, 1997；Menegoz et al, 1997；Tait et al, 2000；Kazarinova-Noyes et al, 2001）。セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（CGT）（Ishibashi et al, 2002；Popko B, 2000）、F3／コンタクチン（Boyle et al, 2001）またはCaspr（Ehat et al, 2001）などのミエリン関連タンパク質および軸索タンパク質が欠失した脱髄性マウス変異体の研究により、軸索ドメイン構成要素のクラスター化およびイオンチャンネル、特にK＋チャンネルの正確な局在は、軸索とオリゴデンドログリアとの間の情報交換に依存することが示されている。しかし、K＋チャンネルの密集領域への蓄積を調節する分子機構は全く不明である。
【００１７】
コンタクチン結合タンパク質（Caspr）は、一連のラミニンG様ドメインおよびEGF反復配列を含む細胞外ドメイン（Peles et al, 1997）に加えて、SH3含有タンパク質および4.1ファミリータンパク質に対する結合部位と考えられるものを含む細胞質セグメント（Gollan et al, 2002）を有する膜貫通タンパク質である。Casprは、GPIにより係留された分子であるF3／コンタクチンとの複合体として存在する（Peles et al, 1997）。髄鞘形成過程では、CasprおよびNa＋チャンネルが細胞表面に適切に輸送されるためにCasprとF3／コンタクチンとの相互作用が必要である（Faivre-Sarrailh et al, 2000；Kazarinova-Noyes et al, 2001）。さらに、この複合体は神経グリア装置の構造を維持するために必須な足場でもある（Bhat et al, 2001；Boyle et al, 2001）。ニューロファシン155（NF155）はCaspr／F3複合体とトランス性に相互作用するが（Charles et al, 2002）、この相互作用の機能的な結果は未だに不明である。Casprの多ドメイン構造から判断して、髄鞘形成過程でこの分子と相互作用する他のグリア成分が存在するのではないかと考えられる。
【００１８】
本発明の第1の局面の概要
本発明者は、Nogo-Aが髄鞘形成期間中に神経グリア接合部で役割を果たしうるか否か―特に、Nogo-Aが軸索とオリゴデンドロサイトとの間の分子相互作用に関与するか否かについて検討した。本発明者は、Nogo-Aが特異的にパラノードに局在して認められ、そこでパラノード接合部タンパク質Casprと相互作用することを明らかにした。本発明者はまた、Nogo-AおよびCasprがともに電位依存性K＋チャンネルKv1.1と会合することも明らかにした。さらに、発生過程におけるNogo-A／Kv1.1およびCaspr／Kv1.1の共存パターンには密接な関連がみられた。本発明者はこのため、Nogo-AとCasprとの相互作用が、髄鞘形成の初期における軸索に沿ったK＋チャンネルの配置の調節に一定の役割を果たすと考えている。
【００１９】
詳細には、本発明者によって行われた研究により、オリゴデンドロサイトNogo-Aが特定の神経グリア接合部にクラスター化しており、そこでその細胞外Nogo-66ループを介して軸索Casprと直接的に、K＋チャンネルタンパク質と間接的に相互作用することが示された。これは今日までに記載された初めてのNgR非依存的なNogo-66相互作用であり、神経グリア接合部の構造の形成および維持におけるNogo-Aの役割に対して大きな意味を持つ。
【００２０】
したがって、最も一般的には、本発明は、Nogo-AおよびCasprが相互作用して髄鞘形成に一定の役割を果たすことを明らかにしたことによって生まれた材料および方法を提供する。これは特に脊髄損傷、またはミエリン鞘の障害を引き起こす他の疾患の分野において重要な意味を持つ。
【００２１】
本発明は、NogoおよびCasprもしくはそれらの模倣体、またはNogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質が、適した担体と組み合わされたものを含む、組成物を提供する。
【００２２】
組成物は、NogoとCasprとの複合体、または前記複合体の模倣体を含むことが好ましい。
【００２３】
組成物中に存在するNogo分子は、Nogo-Aまたはその1つの部分もしくはドメインであることが好ましい。これは、Nogoの既知の3種類のアイソフォーム（A、BおよびC）のすべてに認められるNogo-66を含むことが好ましい。これがさらに、そのようなアイソフォームの他のドメインを含んでもよい。または、Nogo-66ドメインがNogoタンパク質のそれ以外の部分を伴わずに存在してもよい。
【００２４】
組成物のCaspr分子は、Caspr1またはその1つの部分もしくはドメインであることが好ましい。
【００２５】
NogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質は、任意の分子種でよく、これにはタンパク質、ペプチドまたは低分子が非制限的に含まれる。
【００２６】
一般に、このような相互作用を促進しうる物質は、NogoおよびCasprの一方または両方と結合すると考えられる。例えば、NogoとCasprとの境界面などで、それが両方のタンパク質と結合してもよい。またはそれが、NogoおよびCasprのうち一方のみと結合し、複合体中でのそのタンパク質のコンフォメーションを安定化させ、それによって複合体の会合を促進すること、および／または解離を阻害することも可能である。
【００２７】
一例として、NogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質は、NogoおよびCasprの両方と結合しうる抗体（例えば、二重特異性抗体）のような抗体である。
【００２８】
組成物は薬学的組成物であってもよく、この場合には、担体は薬学的に許容されるタイプのものであると考えられる。薬学的組成物はインビボでの注射用に製剤化されることが好ましく、より好ましくはCNSへの直接的な注射用に製剤化される。具体的には、Nogo-AおよびCasprを含む薬学的組成物を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、医療（medical treatment）の方法に用いるための、特に脊髄損傷（SCI）、多発性硬化症（MS）、てんかんまたは卒中といったCNSに対する損傷またはCNSの疾患の治療に用いるための、上記の組成物を提供する。
【００３０】
本発明はさらに、CNSに対する損傷またはCNSの疾患の治療のための医薬品であって、Casprまたはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるNogoの利用も提供する。
【００３１】
同様に、本発明は、CNSに対する損傷またはCNSの疾患の治療のための医薬品であって、Nogoまたはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品の調製におけるCasprの利用も提供する。
【００３２】
このため、医薬品は、NogoおよびCasprの両方またはそれらの模倣体を含みうる（すなわち、それは上記の薬学的組成物であってもよい）。本発明はしたがって、薬学的組成物を製造する方法であって、NogoおよびCasprまたはそれらの模倣体を、薬学的に許容される担体と混合することを含む方法を提供する。または、2つの成分を別々に投与することもできる。
【００３３】
また、CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品の調製における、本明細書に記載したような、NogoとCasprとの間の相互作用を促進しうる物質の利用も提供する。
【００３４】
本発明はまた、ニューロンの、特に神経軸索の髄鞘形成を誘発するための方法であって、ニューロンまたはオリゴデンドロサイトを上記の組成物と接触させることを含む方法も提供する。これは、例えば本明細書の別の箇所に述べたような治療方法としてインビボで行ってもよく、またはインビトロで行ってもよい。
【００３５】
中枢神経系の疾患または中枢神経系に対する損傷を有する対象を治療する方法であって、上記のようなNogoおよびCasprを含む1つまたは複数の薬学的組成物を対象に投与することを含む方法も提供する。特に、SCI、MS、てんかんまたは卒中といったCNSに対する疾患または損傷を有する患者を治療する方法であって、Nogo-AおよびCasprを含む複合体を患者に投与することを含む方法が提供される。
【００３６】
上記の治療方法はいずれも、脊髄損傷（SCI）、多発性硬化症（MS）、てんかんまたは卒中の治療に特に適切であると考えられる。
【００３７】
本発明はさらに、NogoとCasprとの間の相互作用を調節しうる（好ましくは促進しうる）物質に関するスクリーニングの方法であって、NogoおよびCasprを候補物質と接触させること、ならびにNogoとCasprとの間の相互作用を判定することを含む方法を提供する。
【００３８】
本方法はさらに、NogoおよびCasprを前記候補物質の非存在下において、それ以外は類似の条件下で接触させること、ならびにNogoとCasprとの間の相互作用を判定することを含みうる。
【００３９】
本方法は、NogoとCasprとの複合体を候補物質と接触させることを含むことが好ましい。複合体は、それを候補物質と接触させる前に形成させることが好ましい。
【００４０】
本方法は任意の適した方法によって行いうる。当業者は多くの適したアッセイ形式を周知していると考えられ、適したプロトコールを十分に設計しうると考えられる。
【００４１】
NogoおよびCasprの一方または両方は、細胞内に存在しても細胞の表面に存在してもよい。タンパク質が発現される元となる遺伝子は当該細胞にとって内因性でもよく、または細胞内に導入されたベクター上に存在してもよい。タンパク質が細胞の表面に発現されることが好ましい。
【００４２】
補足的または代替的に、NogoおよびCasprの一方または両方を、固体支持体上に固定化してもよい。一方または両方が、以下にさらに詳細に述べるように、検出可能な標識を含んでもよい。
【００４３】
本発明はさらに、薬学的製剤を製造する方法であって、NogoとCasprとの間の相互作用を調節しうる物質を本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定した上で、前記物質を薬学的に許容される担体とともに製剤化するさらなる段階を含む方法も提供する。本方法は、前記の同定された物質を製剤化の前にインビボ投与用に最適化するさらなる段階を含みうる。
【００４４】
細胞
オリゴデンドロサイトという用語は、本明細書では、中枢神経系（CNS）において神経軸索の周囲にミエリン鞘を固着（lay down）させうるオリゴデンドログリア細胞のことを指す。
【００４５】
タンパク質配列
「Nogo」という用語は、Nogo-A、BおよびCを含む、Nogoタンパク質のすべてのアイソフォームのほか、それらの部分および単離されたドメイン（Nogo-66ドメインを含む）、さらには以下に示した配列に対する同一性が80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％を上回る、それらの変異体およびバリアントを含むものとして用いられる。他の哺乳動物種からのオーソロガスタンパク質も含まれる。Nogoタンパク質は、Casprタンパク質、特にCaspr-1との結合能力を有することが好ましい。Nogo-Aが特に好ましい。
【００４６】
「Caspr」という用語は、Caspr-1、2、3および4を含む、Nogoタンパク質のすべてのアイソフォームを含むものとして用いられれる。Caspr-1が特に好ましい。この用語はまた、このようなCasprタンパク質の単離されたドメイン（細胞外ドメインなど）のほかに、以下に示した配列に対する同一性が80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％を上回る、それらの変異体およびバリアントも含むものとする。他の哺乳動物種からのオーソロガスタンパク質も含まれる。Casprタンパク質は、Nogoタンパク質、特にNogo-Aとの結合能力を有することが好ましい。これはまた、電位依存性カリウムチャンネル、特にKv1.1および／またはKv1.2の少なくとも1つのサブユニットとの結合能力を有してもよい。
【００４７】
Nogoタンパク質およびCasprタンパク質のアミノ酸配列を、それらのGenBankアクセッション番号とともに以下に示す。
2006516965.tif 000002
2006516965.tif 000003
【００４８】
Nogo-66はNogo-Aのアミノ酸823から888までの範囲にわたり、以下の配列を有する。
2006516965.tif 000004
【００４９】
アッセイ方法
上記のように、当業者は、NogoとCasprとの間の相互作用を判定して、このような相互作用を調節する（好ましくは促進する）物質を同定するために適切であると思われる、数多くのアッセイ形式を周知している。
【００５０】
例えば、2つのタンパク質の間の相互作用は、一方を検出可能な標識で標識して、それを固体支持体上に固定化されたもう一方のものと接触させることにより、インビトロで検査することができる。適した検出可能な標識には、特にペプチジル物質に対するものとしては、組換え的に産生されるペプチドおよびポリペプチドに組み入れることが可能な35S-メチオニンが含まれる。または、固体支持体上に形成された複合体を、固体支持体上に固定化したものではないタンパク質上に存在するエピトープを標的とする抗体を用いる標識によって検出することもできる。適した抗体が得られない場合には、組換え的に産生されるペプチドまたはポリペプチドを、適した抗体が入手可能なエピトープを含む融合タンパク質として発現させることもできる。
【００５１】
固体支持体上に固定化されるタンパク質は、固体支持体に結合したタンパク質に対する抗体を用いて、またはそれ自体が知られている技術により、固定化することができる。好ましいインビトロ相互作用の1つは、グルタチオン-Sトランスフェラーゼ（GST）を含む融合タンパク質を利用する。これをグルタチオンアガロースビーズ上に固定化してもよい。上記のタイプのインビトロアッセイ形式では、固定化されたGST-融合ポリペプチドと結合する標識ペプチドまたはポリペプチドの量に影響を及ぼす能力を判定することにより、被験化合物をアッセイすることができる。これを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりグルタチオン-アガロースビーズを分画することによって判定してもよい。または、非結合タンパク質を除去するためにビーズをすすぎ洗いし、存在する標識の量を例えば適したシンチレーションカウンターで計数することにより、結合したタンパク質の量を判定することもできる。
【００５２】
また、本発明によるアッセイが、2種類のタンパク質のうち少なくとも1つを、適した細胞により、好ましくはその表面に発現させるという、細胞系（cell-based）アッセイの形式をとってもよい。本アッセイには、細胞内に導入された1つまたは複数のベクターから当該ポリペプチドまたはペプチドが発現されるような、酵母株または哺乳動物細胞系などの細胞系を利用してもよい。
【００５３】
記載した方法によって同定されたNogo-Caspr相互作用の調節因子（modulator）を、インビボ投与に対する適合性を高めるためにさらに改変することもできる。
【００５４】
製剤
本発明の組成物は、以上に定義した少なくとも1つの活性化合物を、薬学的に許容される担体、アジュバント、添加剤、緩衝剤、保存料および安定化剤を非制限的に含む、当業者に周知の1つまたは複数の他の薬学的に許容される成分とともに含む、薬学的製剤として製剤化することができる。製剤がさらに他の活性物質を含んでもよい。
【００５５】
したがって、本発明はさらに、以前に定義した薬学的組成物を作製する方法であって、本明細書に記載した少なくとも1つの活性物質を、当業者に周知の1つまたは複数の薬学的に許容される成分、例えば、担体、アジュバント、添加剤などと混合することを含む方法を提供する。
【００５６】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で用いる場合、正しい医学的判断の範囲内で、当該対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて用いるのに適していて、便益／リスク比が妥当となるように、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を伴わない、化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各々の担体、アジュバント、添加剤なども、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容される」ものでなければならない。
【００５７】
適した担体、アジュバント、添加剤などは、標準的な薬学のテキスト、例えば「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第20版、2000、pub. Lippincott, Williams & Wilkins；および「医薬添加剤マニュアル（Handbook of Pharmaceutical Excipients）」第2版、1994に記載されている。
【００５８】
製剤としては、注射用製剤、例えば、活性化合物が内部に溶解している、水性で等張性で発熱物質を含まない滅菌溶液が適している。このような液体が、抗酸化物質、緩衝剤、保存料、安定化剤、静菌薬、懸濁化剤、増粘剤および製剤を血液または脳脊髄液に対して等張性にする溶質といった、他の薬学的に許容される成分をさらに含んでもよい。この種の製剤に用いるのに適した等張性担体には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液または乳酸加リンゲル注射液が含まれる。一般に、液体中の活性化合物の濃度は約1ng／ml〜約10μg／ml、例えば約10ng／ml 〜約1μg／mlである。製剤は、単回投与量または多回投与量が封入された容器、例えばアンプルまたはバイアルとして提供することができ、使用の直前に滅菌液体、例えば注射用の水を添加するのみでよい凍結乾燥状態で保存することができる。即時調製による注射液および懸濁液を、滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製することもできる。
【００５９】
投与
本発明の組成物の投与は一般に、注射による、好ましくはCNSへの直接的な注射によると考えられる。注射は障害部位への直接的なものでもよい。または、注射が、一般的には疾患または損傷の付近での、脳脊椎液中へのものであってもよい。
【００６０】
配列同一性
参照配列に対するアミノ酸配列の一致度（percent identity）（％）は、最大の配列一致度が得られるように、配列のアラインメントを行い、必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、保存的置換は配列同一性の部分としては考慮されない。一致度の値を、WU-BLAST-2（Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480(1996)）によって決定してもよい。WU-BLAST-2はいくつかの検索パラメーターを用いるが、そのほとんどはデフォルト値に設定される。調整パラメーターは以下の値に設定される：オーバーラップ幅（overlap span）＝1、オーバーラップ率（overlap fraction）＝0.125、ワード閾値（word threshold）（T）＝11。アミノ酸配列の一致度の値は、WU-BLAST-2により決定された合致する同一残基の数を、参照配列の残基の総数（アラインメントスコアを最大化するためにWU-BLAST-2により参照配列に導入されたギャップは無視する）によって除算し、100を掛けることによって決定される。
【００６１】
アミノ酸の類似度（％）は、BLOSUM62マトリックスで正の値としてスコア化された残基を算入する点を除き、一致度と同じようにして定義される。したがって、同一ではないが類似した特性を有する残基（例えば、保存的置換の結果として）も算入される。
【００６２】
同様に、参照核酸に対する核酸配列の一致度（％）は、参照核酸配列中のヌクレオチド残基と同一な候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。本明細書で用いる一致度の値は、WU-BLAST-2のBLASTNモジュールをデフォルトのパラメーターに設定し、オーバーラップ幅（overlap span）およびオーバーラップ率（overlap fraction）をそれぞれ1および0.125に設定することによって生成される。
【００６３】
対象
発明の組成物および／または治療薬が投与される対象は、哺乳動物であり、好ましくは、齧歯類（例えば、ウサギ、ラットまたはマウス）、イヌ、ネコ、サルもしくは類人猿などの実験動物、またはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタもしくはヤギなどの家畜であると考えられる。より好ましくは、対象はヒトである。
【００６４】
一般に、対象は、頭部損傷などの疾患または損傷によって引き起こされるCNS障害を有すると考えられる。しかし、障害は脊髄に対するもの、例えばSCIであることがより好ましい。実験動物では、障害は実験的なものであってよい。CNS障害が、例えば、卒中、てんかんまたは神経変性疾患、学習記憶関連疾患および／またはアルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの痴呆といった疾患または障害に起因してもよい。
【００６５】
本発明の治療薬は一般に、外科手術および／またはリハビリテーションなどの他の治療法とともに用いることを意図している。
【００６６】
模倣体
インビボでの薬学的用途のためには、ペプチドまたはポリペプチドよりも非ペプチド性「低分子」の方がしばしば好ましい。したがって、Casprおよび／またはNogoの模倣体を、特に薬学的用途のために設計することができる。一般に、本発明のNogo模倣体は、Caspr分子と結合して、その分子に対するNogoの結合の影響を模倣することができると考えられる。同様に、Caspr模倣体は、Nogo分子と結合して、その分子に対するCasprの結合の影響を模倣しうると考えられる。
【００６７】
既知の薬学的活性化合物に対する模倣体の設計は、「リード」化合物に基づく医薬品の開発のための既知のアプローチである。これは、活性化合物を合成することが困難であるか費用がかかる場合、または具体的な投与方法に対して適していない場合に望ましいと考えられ、例えば、ペプチドは消化管内のプロテアーゼによって急速に分解される傾向があるため、経口投与用組成物に対しては適さない活性物質である。模倣体の設計、合成および試験は一般に、多数の分子を目標特性に関して無作為にスクリーニングすることを避けるために用いられる。
【００６８】
所定の目標特性を有する化合物からの模倣体の設計には一般に用いられる工程がいくつかある。まず、目標特性を決定する際に決定的および／または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合には、これはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって、例えば、各残基を順に置換することによって行いうる。このようなペプチドモチーフの精緻化にはペプチドのアラニンスキャンが一般に用いられる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られている。
【００６９】
ひとたびファルマコフォアが発見されれば、その構造を、その物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズおよび／または電荷に従って、一定範囲の源、例えば分光法、X線回折データおよびNMRを用いてモデル化する。このモデル化プロセスには、コンピュータ計算による解析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷および／または体積をモデル化する）および他の手法を用いることができる。
【００７０】
このアプローチの変法では、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造をモデル化する。これはリガンドおよび／または結合パートナーが結合時のコンフォメーションを変化させ、モデルが模倣体のデザインにこの点を考慮に入れることを可能にする場合には特に有用な可能性がある。
【００７１】
続いて、ファルマコフォアを模倣する化学基を接合させることが可能なテンプレート分子を選択する。テンプレート分子およびそれに対して接合された化学基は、模倣体が容易に合成可能であり、薬理学的に許容性があり、インビボで分解せず、同時にリード化合物の生物活性を保つように、都合の良いように選択することができる。または、模倣体がペプチドをベースとする場合には、ペプチドを環化してその剛性を高めることにより、さらなる安定性を得ることができる。続いて、このアプローチによって見いだされた1つまたは複数の模倣体を、目標特性を有するか否か、またはどの程度それを示すかについて調べるためにスクリーニングすることができる。続いて、インビボ試験または臨床試験用の1つまたは複数の最終的な模倣体を得るために、さらなる最適化または改変を行うことができる。
【００７２】
今回の場合には、他方のタンパク質と相互作用するために必要な一方のタンパク質の最小部分を同定するために、ペプチドマッピング試験を用いることもできる。続いて、このペプチドを、上記のように、模倣体の設計のためのリード化合物として用いることができる。
【００７３】
抗体
抗体はさまざまなやり方で改変しうるため、「抗体」という用語は、必要な特異性を備えた結合ドメインを有するあらゆる特異的結合物質を範囲に含むものとみなされるべきである。したがって、この用語は、天然性または合成性にかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物および相同体を範囲に含む。このため、免疫グロブリン結合ドメインまたは等価物が別のポリペプチドと融合されたものを含むキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694号およびEP-A-0125023号に記載されている。
【００７４】
完全抗体の断片が、抗原と結合する機能を果たしうることが示されている。結合性断片の例には以下のものがある：（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iii）単一の抗体のVLおよびVHドメインからなるFv断片；（iv）1つのVHドメインからなるdAb断片（Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546(1989)）；（v）単離されたCDR領域；（vi）連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；（vii）1つのVHドメインおよび1つのVLドメインが、2つのドメインを結合させて1つの抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Fv分子（scFv）（Bird et al, Science, 242, 423-426. 1988；Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988）；（viii）二重特異性一本鎖Fv二量体（PCT／US92／09965号）および（ix）遺伝子融合によって構築された多価断片または多重特異性断片である「ダイアボディ（diabody）」（W094／13804号；P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993）。
【００７５】
ダイアボディは、各ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第1のドメインおよび免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第2のドメインを含み、2つのドメインは連結されている（例えば、ペプチドリンカーによる）が互いに会合して1つの抗原結合部位を形成することはできないような、ポリペプチドの多量体である。抗原結合部位は、多量体内部の1つのポリペプチドの第1のドメインと多量体内部の別のポリペプチドの第2のドメインとの会合によって形成される（WO94／13804号）。
【００７６】
二重特異性抗体を用いようとする場合には、これらは、さまざまなやり方で製造しうる（例えば化学的にもしくはハイブリッド融合細胞から調製される）従来の二重特異性抗体でもよく（Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449(1993)）、または上述した二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。完全抗体よりもscFv二量体またはダイアボディを用いる方が好ましい。ダイアボディおよびscFvは可変ドメインのみを用いてFc領域を含まないように構築することができ、これによって抗イディオタイプ反応の影響が軽減されると考えられる。その他の形態の二重特異性抗体には、Traunecker et al, Embo Journal, 10, 3655-3659(1991)に記載された一本鎖「Janusin」が含まれる。
【００７７】
抗体の免疫原性を最小限に抑えながら、非ヒト抗体の抗原結合特性を有する抗体を得るためには（例えば、それらをヒトの治療法に用いる場合には）、非ヒト（例えば、マウス）抗体を「ヒト化」することが望ましいと考えられる。すなわち、ヒト化抗体は、1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特性（例えば、特異性、親和性または能力）を有するマウス、ラットまたはウサギ抗体などの非ヒト種（ドナー抗体）のCDRからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（アクセプター抗体）由来のフレームワーク領域を含む。ヒト抗体のフレームワーク残基のいくつかを、対応する非ヒト残基により、またはドナー抗体にもアクセプター抗体にも存在しない残基により、置換することもできる。これらの改変は、抗体の特性をさらに改良および最適化するために作製される。
【００７８】
以下に、本発明の第1の局面の具体的な態様を、添付した図面を参照しながら、例として示す。そのほかの態様も当業者には明らかであると考えられる。本文中で述べた文書はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【００７９】
本発明の第1の局面の詳細な説明
結果
Nogo-Aは有髄軸索のパラノードに局在している
成体ラット脳幹の白質路に沿ったNogo-Aの分布について調べた。縦断面では、2種類のNogo-A抗体を用いたところ、Nogo-Aの類似した局在パターンが観察された：一方は本発明者の研究室で開発したものであり（図1A、a〜f；Liu et al, 2002）、もう一方はDr. Stephen Stritmatter（Yale University）から寄贈されたものである（図1A、g〜i；Wang et al, 2002）。Nogo-A免疫反応（緑色）は、有髄軸索に沿ってパラノード区域に特異的に限局しており（図1A）、これはKv1.1（red；図1A、a〜c、g〜i）またはNa＋チャンネル（red；図1A、d〜f）を用いた二重免疫蛍光標識によって実証された。軸索ドメインにおけるNogo-Aの特異的標識は、Nogo-A抗血清（1：200）を100倍過剰モル濃度の抗原とあらかじめ混合した後には検出不能であった（図1Aj）。Nogo-A染色（緑色）は節性Na＋チャンネル標識（赤色）に隣接し、側面にジャクスタパラノードKv1.1標識（赤色）が位置することから、それがパラノードに位置することを表している。同様の観察所見は、脳梁および脊髄のように神経線維が豊富な他のCNS部位でも得られた（提示せず）。検討した切片では、Nogo-Aもニューロンおよびオリゴデンドロサイトの両方に検出され（提示せず）、このことは以前に発表された研究とも一致する（Huber et al, 2002；Wang et al, 2002；Liu et al, 2002）。これらの観察所見は、Nogo-Aがパラノードに豊富に存在し、パラノードタンパク質複合体の成分である可能性を示唆する。
【００８０】
Nogo-Aの詳細なパラノード上の位置を免疫電子顕微鏡（IEM）を用いてさらに調べた。以前の観察所見（Huber et al, 2002）と一致して、Nogo-A免疫反応はミエリン鞘の内部ループおよび外部ループで強く（図1Ba）、ラット脊髄の密なミエリンでは弱かった（図1Bb）。特に注目されることとして、縦断面では、Nogo-A免疫反応はパラノードの拡張した末端グリアループ（図1Bbおよびc）およびループと軸索鞘との間の神経グリア接合部（図1Bdおよびe）で強く、パラノード軸索には時折存在するのみであった（図1Bd）。これらの観察所見は、Nogo-AがCNSパラノードの成分であることを示している。
【００８１】
Nogo-Aは主としてオリゴデンドロサイトに由来するパラノード構成要素である
Nogo-Aはほとんど成体CNSのオリゴデンドログリア細胞体および白質で発現される（Huber et al., 2002）。パラノードNogo-Aの細胞由来を特定するために、本発明者らは2種類の動物モデルにおけるNogo-Aの分布を調べた：進行性CNS脱髄を伴う状態である実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）（Swanborg 2001）および、逆転した横向きループの存在を示す一方で横行性バンドが存在せず、軸索に沿ったK＋チャンネルの異常な局在が認められるCGT-/-マウス（Dupree et al, 1999）である。成体EAEラットにおける脱髄のピーク時点でその縦断方向の脊髄切片を調製し、Nogo-AまたはCaspr、およびKv1.1に対する二重免疫蛍光染色を行った。Nogo-A陽性パラノード集合物の密度はEAEラットからの切片（図2AおよびC）の方が対照動物のものよりも有意に低かった（90％前後）。Nogo-A陽性パラノードクラスターはまばらであり（矢印；図2A）、オリゴデンドログリア免疫反応は存続した（星印；図2A）。パラノード染色がみられないことと相関して、EAEラットでは脊髄でのNogo-A発現がダウンレギュレートされていた（図2D）。しかし、Caspr発現に関しては、脊髄におけるこの障害による影響の程度ははるかに少なかった（図2B〜D）。
【００８２】
P16野生型マウスでは、Nogo-A（緑色）はパラノードの集合性Na＋チャンネル（赤色）の近くにクラスターを形成した（図2E）。しかし、P16 CGT-/-マウスでは、Nogo-A（緑色）およびNa＋チャンネル（赤色）のいずれの集合も軸索に沿ってほとんど検出されなかった（図2F）。P21野生型マウスおよびCGT-/-マウスからの脊髄切片に対する免疫蛍光分析を、別の軸索マーカーである200kDaニューロフィラメントをNogo-A抗体とともに用いて行った。CGT-/-マウスではニューロフィラメントが標識された軸索に沿ってNogo-Aの疎ならせん状標識が検出された（図2H）。このかなり乱れた標識パターンは野生型動物におけるNogo-A標識の密なクラスター化パターン（図2EおよびG）とは明らかに異なり、このことから変異体では軸索に沿ったグリアNogo-Aの集合が著しく破壊されていることが判明した。IEM観察所見からは、これらの変異マウスではNogo-A免疫反応がパラノードの逆転した横向きループ内に明らかに存在することが示された（図2IおよびJ）。EAEラットにおける広範囲な脱髄およびオリゴデンドログリア障害、ならびにCGT-/-マウスにおける異常な節構造およびパラノード構造からみて、パラノードでのNogo-A集合の消失はパラノードNogo-Aが主としてOLに付随することを示唆している。
【００８３】
NgRは有髄軸索に沿って均一に分布している
本発明者は次に、有髄軸索においてドメイン特異的な集合パターンも示すか否かを明らかにする目的で、Nogo-66受容体（NgR）の発現および分布を調べた。NgR抗体を用いたイムノブロット分析により、NgR発現は成体の脳幹、海馬および大脳皮質で高く、脊髄でははるかに低いことが示された（図3Aa）。NgRは生後1日の時点で早くも検出可能であり、その発現レベルは生後14日まで保たれ、その後は3週齡から徐々に低下した（図3Ab）。用いたNgR抗体がニューロン上のNgRを標識しうることを確かめるために、本発明者はラット海馬切片を染色し、NgRが細胞体および突起においてニューロン特異的な微小管関連タンパク質2（MAP2）と共存することを示した（図3A、c〜e）。NgRおよびNogo-Aに対する二重標識は、いずれの抗体もウサギポリクローン由来であるため困難である。本発明者はその代わりに、NgRおよびKv1.1の二重標識を行った。脳幹の縦断面では、NgRは軸索に沿って均一に分布し、集合性のK＋チャンネル標識（図3A、f〜h）とは対照的であった。同様のNgR標識はP1、P5、P14およびP30日齢群でも観察された（提示せず）。NgRの局在パターンがパラノードに集合するNogo-Aとは明らかに異なるという観察所見は、Nogo-Aがこれらの特定の軸索グリアドメインにおいてNgR以外の軸索受容体と相互作用する可能性を示している。
【００８４】
Nogo-AはパラノードCaspr／F3複合体と相互作用する
Nogo-Aがパラノードに位置することから、本発明者は、Caspr、F3およびNB3（F3関連分子の1つ）（Lee et al, 2000）などのパラノード軸索成分が、Nogo-Aの結合パートナーであるか否かを調べた。Nogo-A、Caspr、F3およびNB3を成体ラット脳の膜抽出物から免疫沈降させた。SDS-PAGEで分離した免疫沈降物のウエスタンブロット分析により、Nogo-A、CasprおよびF3は、Nogo-A抗体またはCaspr抗体のいずれかによりプルダウンされた免疫複合体中に存在するが、NB3は存在しないことが明らかになった（図3Ba）。Nogo-A発現構築物を一時的にトランスフェクトしたCaspr／F3-CHO細胞、F3-CHO細胞および野生型CHO細胞に対する免疫沈降（IP）試験も行った。トランスフェクトされたCasprが細胞表面に適切に発現されるためにはF3が必要なため（Faivre-Sarrailh et al, 2000）、トランスフェクションはCaspr／F3発現細胞を用いて行った。ウエスタンブロット法により、F3-CHO細胞および野生型CHO細胞とは異なり、Caspr／F3-CHO細胞ではNogo-AおよびCasprが確かに互いに会合することが示された（図3Bb）。これらの観察所見は、Nogo-AがF3ではなくCasprと特異的に相互作用することを示唆している。
【００８５】
Nogo-AおよびCaspr／F3複合体の大半は脂質ラフトに共存しない
F3およびCasprは、ニューロン、トランスフェクトCHO細胞およびOLでは脂質ラフトに付随してみられる（Buttiglione et al, 1998；Kramer et al, 1999；Faivre-Sarrailh et al, 2000）。発生過程におけるNogo-AとCaspr／F3関連微小ドメインとの間の関係を調べるために、ラット大脳皮質を可溶化処理し、確立された手順に従ってショ糖密度勾配による分画を行った（Kramer et al, 1999）。既知のラフト関連タンパク質F3の大半は画分5に検出され、可溶化物中のすべてのCasprは事実上この画分に認められたことから、この両方の分子は神経ラフトに位置することが示唆された。一方、Nogo-Aの大半は細胞骨格関連タンパク質を多く含む画分8〜12に認められたが、画分5〜7にもわずかな割合が存在した（図3Bc）。同様の結果は、P15および成体のいずれの大脳皮質可溶化物を用いた場合にも得られた（提示せず）。これらの観察所見はインビボではNogo-Aの大半は神経ラフトに存在しないことを示しており、これはパラノードNogo-Aがオリゴデンドログリア膜に由来するという概念を間接的に裏づけている。
【００８６】
Nogo-Aは細胞外Nogo-66ループを介してCasprと直接的にトランス相互作用する
Nogo-Aの細胞外ドメインはその2つの膜貫通ドメインの間の66アミノ酸のループからなり、これはNogo-66ドメインとして知られている（Fournier et al, 2001）。Nogo-AとCasprとの間のいかなるトランス相互作用にもNogo-66ドメインが関与しているはずである。本発明者は次に、Nogo-AおよびCasprがF3に依存しないトランス様式で直接会合するか否かを、細胞接着アッセイを用いて調べた。種々のCHO細胞系（Casprを発現するもの、または別のもの）を、Nogo-66ペプチド、またはNogo-66（GST-Nogo-66）もしくはNogo-Aの細胞質N末端ドメイン（GST-Nogo-N）を含む組換えGST融合タンパク質、ならびにGSTをコーティングした基質に対してプレーティングした。Nogo-66（図4A〜C）またはGST-Nogo-66（図4E〜G）に直ちに接着したのはCaspr／F3を発現するCHO細胞のみであり、F3を発現するCHO細胞も野生CHO細胞もそうではなかった。これらのCHO細胞種はいずれも、GST（図4I〜K）またはGST-Nogo-N（提示せず）に対する接着性は良好でなかった。接着性細胞の定量により、Nogo-66およびGST-Nogo-66の両方と結合するCaspr／F3-CHO細胞の数は、他の実験群よりもはるかに多いことが示された（図4M）。
【００８７】
Nogo-66がCasprのみと相互作用するのか、それとも細胞表面Caspr／F3複合体によって生じた結合ポケットと相互作用するのかについて調べるために、本発明者は、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）を用いてGPI結合型F3を除去した。PI-PLC処理の後、Caspr／F3-CHO細胞はNogo-66およびGST-Nogo-66の両方には依然として接着したが、GSTをコーティングした基質には接着しなかった（図4D、H、LおよびM）。F3がPI-PLC処理後に細胞表面から完全に除去されたことを確かめるために、種々の濃度のPI-PLC（0.02、0.04および0.06単位／ml）を用いた。細胞の結合性はPI-PLCの3種類の濃度のいずれにおいても一定であった（図4N）。以前の研究（Faivre-Sarrailh et al, 2000）と同じく、F3抗体を用いたウエスタンブロット法（図4O）および免疫染色（提示せず）により、PI-PLCによる処理後にはF3のかなりの量が確かにCaspr／F3-CHO細胞から除去されたことが示された。このようにNogo-66基質への細胞接着性に対するPI-PLCの影響がみられなかったことは、F3がNogo-66とCasprとの間のトランス相互作用に直接的には関与しないことを示唆している。
【００８８】
Nogo-A／Caspr複合体はK＋チャンネルと相互作用する
髄鞘形成過程においてK＋チャンネルがジャクスタパラノードに正しく分離されるためには、完全な状態にあるパラノード神経グリア接合部が必要である（Vabnick and Shrager, 1998）。髄鞘形成および髄鞘再形成の過程において、この構造はCasprおよびF3などの軸索分子ならびにグリア特異的分子によって形成され、維持される（Girault and Peles, 2002）。本発明者は、Nogo-AとCasprとの相互作用によって軸索-グリアシグナル伝達の連結が生じ、それが髄鞘形成の初期におけるK＋チャンネルのジャクスタパラノードへの最終的な配置に影響を及ぼしうるという仮説を立てた。K＋チャンネルがCNSにおいてNogo-A／Caspr複合体と物理的に相互作用しうるか否かを調べるために、免疫沈降分析を行った。Nogo-A抗体およびCaspr抗体はともに、P7マウスおよび成体マウス（提示せず）脳抽出物からのKv1.1およびKv1.2とは相互に沈降したがKv2.1とは沈降せず（提示せず）、一方、NB3抗体および非免疫性IgGは沈降しなかった（図5Aa）。Kv2.1は一般に神経細胞体および近位樹状突起に認められが、軸索からは排除されている（Trimmer et al, 1991）。成体マウス脳の膜抽出物を用いたGSTプルダウンアッセイでは、CasprおよびKv1.1はいずれもGST-Nogo-66によるプルダウンが可能であったが、GST-Nogo-NおよびGST自体によるプルダウンはなされなかった（図5Ab）。これらの結果は、Nogo-66がCasprのトランス相互作用パートナーであること、およびK＋チャンネルがこれと相互作用する可能性があることを示唆している。
【００８９】
Nogo-66はCasprを介してK＋チャンネルと間接的に相互作用する
本発明者は次に、Nogo-66がK＋チャンネルと直接的に相互作用しうるか否かを調べた。Caspr／F3-CHO細胞、F3-CHO細胞および野生型CHO細胞に対してKv1.1 cDNAを一時的にトランスフェクトし、その膜抽出物を、GSTおよびGST-Nogo-66融合タンパク質のそれぞれを用いるGSTプルダウンアッセイにかけた。野生型CHO細胞およびF3発現性CHO細胞はCasprを発現しなかった（図5Ba）。ウエスタンブロット分析により、Kv1.1およびCasprはいずれも、F3を発現するCHO細胞および野生型CHO細胞ではなく、Caspr／F3を発現するCHO細胞からのGST-Nogo-66によってのみ沈降し、GSTとは沈降しないことが示された（図5Bb）。これらの結果は、Nogo-66が少なくともインビトロではCasprを介してK＋チャンネルと間接的に相互作用しうることを示している。
【００９０】
Nogo-AおよびCasprは有髄軸索に沿ってKv1.1と類似した空間的および時間的な関連を有する
以上に立証したようにパラノードNogo-A／CasprとKv1.1との間に相互作用が存在しうるという観点から、本発明者は、発生過程における有髄軸索に沿ったNogo-A／CasprとKv1.1の分布の間の動的な関係について調べた。CasprとKv1.1との、およびNogo-AとKv1.1との二重免疫蛍光標識を、種々の生後日数でのラット脳幹切片に対して行った。Caspr標識およびKv1.1標識のどちらの集合もほぼP5から認められた（図6Aa）。P5からP14まで（図6A、a-c）のパラノードでのCaspr染色はKv1.1と重複し、このことから髄鞘形成のこの重要な初期にこの2つの分子が共存することが示唆された。P30では（図6Ad）、Kv1.1標識はより明確にジャクスタパラノード性となり、パラノード-ジャクスタパラノード境界にCasprとの重複バンドがわずかにみられるのみとなる。成体では（図6Ae）、CasprおよびKv1.1は有髄軸索に沿って異なる微小ドメインへと分離される。P1でのNogo-AおよびKv1.1に対する二重免疫蛍光染色により（図6B、a〜c）、Nogo-Aは神経線維に沿って散在性に標識されることが判明した。P5では（図6B、d〜f）、Nogo-A染色のクラスター化および凝集がより明らかになった。しかし、染色パターンは依然として、範囲が明瞭なドメインまたは境界を有していなかった。節性ギャップ（nodal gap）がみられ、ヘミノード（hemi-node）も認められた。P7以後（図6B、g〜i）、Nogo-A分布はパラノードに対する明瞭なクラスター化を示した。P5からP14では（図6B、j〜l）、パラノード領域およびジャクスタパラノード領域の両方に、Nogo-AおよびKv1.1の免疫染色の集合物の間にさまざまな程度の重複がみられた。P30では（図6B、m〜o）、Kv1.1集合物は、成体動物での状態と同じようにジャクスタパラノードのみに限局していた。
【００９１】
Nogo-A／Kv1.1およびCaspr／Kv1.1の共存を、取り込み画像上のNogo-AおよびKv1.1.標識領域の長さを測定することによって定量した（図6Ca）。Nogo-A標識領域の平均長はP5では約9μm、P7では5μmであったが、これはP14〜成体では約2μmに短くなり、このことからNogo-Aが髄鞘形成の初期段階で、より狭いバンド内に徐々に集合することが示唆された。Kv1.1標識領域の平均長はこのような顕著な経時的変化を示さなかった：P5では6μmであり、成体では8μmであった。注目されることはNogo-AおよびKv1.1の標識間の重複の長さの変化であった：これはP5では4μm、P14では2μmであり、P30では1μm、成体ではほぼ0μmであった。この変化は、密なミエリンが完全に構築される前にNogo-AおよびKv1.1がパラノード領域に一時的に共存することを示している。Nogo-A／Kv1.1およびCaspr／Kv1.1間の共存の程度も比較した（図6Cb）。P5からP14では、すべての視野でパラノードの60％超がNogo-A／Kv1.1およびCaspr／Kv1.1のそれぞれに対して二重標識された。成体では、Nogo-AおよびCasprはKv1.1とは分離しており、完全な分離が観察された。K＋チャンネルがNogo-A／Caspr複合体と結合することからみて、これらの観察所見は、Nogo-A／Caspr複合体がK＋チャンネルと一時的に相互作用する可能性があり、これによって髄鞘形成の初期段階におけるKv1.1のパラノード局在を協調的に調節する可能性があることを意味する。
【００９２】
脱髄動物モデルにおけるNogo-AおよびK＋チャンネル
Shivererはミエリン塩基性タンパク質（MBP）が欠失した髄鞘形成障害性の変異マウスであり、軸索は正常なオリゴデンドログリア鞘を有するが、その軸索に沿って異常な神経グリア接合部およびK＋チャンネルの異常な局在が認められる（Rasband and Trimmer, 2001a）。有髄軸索でのK＋チャンネル局在の調節におけるグリア関連分子の役割について検討するために、EAEラットおよびShivererマウスの両方におけるNogo-A、CasprおよびKv1.1の分布を調べた。二重免疫蛍光染色により、無秩序なCaspr（緑色）およびKv1.1（赤色）標識が、正常ラット（図7B）脳幹とは対照的に、EAEラットのパラノード領域でも検出されることが示された（図7A）。正常マウスの脊髄切片におけるパラノードNogo-A（緑色）およびジャクスタパラノードKv1.1（赤色）の位置とは異なり（図7C）、Nogo-A染色は軸索に沿って散在しており、Shivererマウスのパラノード領域にはその集合物はほとんど検出されなかった（図7D〜G）。しかし、OLにおけるNogo-A免疫反応は完全な状態で明瞭なままであった（矢印；図7c、FおよびG）。以前の観察所見（Poliak et al, 2001）に一致して、正常マウスとは異なり（図7H）、Shivererマウスでは無秩序なCasprおよびKv1.1標識がパラノードに共存していた（図7I）。対をなすKv1.1免疫染色間の距離に関する定量分析により、対の間の距離は、EAEラットおよびShivererマウスともに正常動物と比較して有意に短かいことが示された（P＜0.01；図7J）。これらの観察所見は、パラノード接合部障害を呈するEAEラットおよびShivererマウスのいずれの病態においても、K＋チャンネルは実際にはパラノードに再び配置されることを示唆している。同時に、Nogo-Aのパラノードへの集合は著しく低下していた。このため、正常な成体動物でK＋チャンネルがジャクスタパラノードに正しく局在するためには、軸索分子のほかに、神経グリア接合部の形成にかかわるある種のグリア由来分子が必須であると思われる。現時点では、これらの変化に関する分子構造的な基盤は本発明者には不明であるが、おそらくK＋チャンネルとNogo-A／Caspr複合体との間の相互作用が関係すると思われる。
【００９３】
本発明の第1の局面に関する考察
Nogo-Aはパラノードの顕著な特徴であるが、Nogo-66受容体はそうではない
オリゴデンドログリアおよびCNSミエリンにおけるNogo-Aの位置はすでに記載されている（Huber et al, 2002；Liu et al, 2002；Wang et al, 2002）。具体的には、Nogo-Aはオリゴデンドロサイトの細胞体および突起、ならびにミエリン鞘の最内側ループおよび外部ループに局在している（Huber et al, 2002）。発生過程にある小脳では、Nogo-A mRNAおよびタンパク質の出現の経時的推移は髄鞘形成の期間と同時であり、ミエリン塩基性タンパク質の発現の直前の時期に起こる。これらの観察所見は、髄鞘形成過程においてNogo-Aが役割を果たすことを示唆する。
【００９４】
オリゴデンドロサイト分化（Barres et al, 1999；Marcus et al, 2000）および神経突起上でのイオンチャンネルクラスター化（Dupree et al, 1999；Ishibashi et al, 2002）の調節における軸索-グリア情報交換の重要性を示す証拠は増加しつつある。本発明者は、Nogo-Aがこのような細胞間シグナル伝達に関与する特徴的な部位に局在するか否かを調べ、Nogo-Aが主として軸索に沿ってNa＋チャンネルとK＋チャンネルとの間隙に局在すること、およびその免疫反応が成体CNSにおいてグリアループが軸索膜表面と接触する部位に明らかに位置することを示した。このことはNogo-Aがパラノード成分の1つであることを示唆しており、これはいくつかの病態動物モデルにおける観察所見によってさらに裏づけられる。EAE動物では、Nogo-Aのダウンレギュレーションと一致して、パラノードでのその集合物は有意に少ない。CGT-/-マウスではNogo-A免疫反応は逆転したパラノードループを呈するが、CGT-/-マウスおよびShivererマウスのいずれにおいても集合性Nogo-Aはパラノードにはほとんど検出されない。これらの観察所見は、Nogo-Aがパラノード性グリア成分であるという見解を支持する（図8）。
【００９５】
パラノードNogo-Aの染色パターンおよびそれがオリゴデンドログリア由来であることにより、それが軸索表面の成分と相互作用するか否かという疑問が生まれた。Nogo-Aに対する高親和性ニューロン受容体として現時点で知られている唯一のものは、Nogo-66受容体（NgR）である。以前の研究により、ニューロン内および有髄軸索に沿ってのNgR発現は主として成体動物で認められること、ならびに髄鞘形成過程におけるその発現はわずかであることが示されている（Fournier et al, 2001；Hunt et al, 2002；Wang at al, 2002）。本発明者の結果は、NgRが脳幹内の神経細胞体上に位置すること、および発生の初期段階から成体期に至るまで有髄軸索に沿って均一に分布することを示している点でこれらの知見と一致する。パラノードに顕著なNogo-Aクラスターが存在する一方で、軸索に沿ったNgR分布パターンは散在性のままであることは興味深い。Nogo-Aの集合は発生過程での髄鞘形成時期と一致するため、パラノードNogo-Aはこのプロセスに関与している可能性があり、軸索出芽の抑制とは異なる機能のために、NgR以外の分子と相互作用する可能性がある。
【００９６】
パラノードNogo-AはCasprのグリア性リガンドである
パラノードでは、GPIにより係留された軸索F3／コンタクチンが膜タンパク質Casprとの複合体として存在する。Caspr／F3複合体はグリア由来分子であるNF155とトランス性に相互作用し、これはパラノードでの神経グリア分子連結の一例である（Girault and Peles, 2002）。本発明者は、Nogo-AがCaspr／F3複合体と特異的に会合するが別のパラノード分子であるNB3とは会合しないことをco-IPアッセイで示しており、このことはインビボでNogo-Aとこの複合体との間に相互作用があることを意味する。CNS Nogo-Aの大半がニューロン脂質ラフトにおいて複合体と共存しないという観察所見は、この相互作用がおそらくトランス様式で起こり、OL膜からのNogo-Aが軸索膜からのCaspr／F3と相互作用すると考えられることを意味している。軸索Nogo-AがCaspr／F3複合体のシス結合パートナーであって、集合に関しては髄鞘形成に依存するという可能性も残るが、パラノードNogo-Aの大部分はCNSではOLによって発現されることからみて（Huber et al, 2002：Liu et al, 2002；Wang et al, 2002）、これは可能性が低いように思われる。この見解を裏づけるために、本発明者はさらに、Caspr／F3を発現するCHO細胞が、結合がトランス様式で起こる必要のある、Nogo-66ペプチドおよびGST-Nogo-66をコーティングした基質のいずれとも結合することを示した。PI-PLC処理によって細胞からF3を除去した後にもこの結合が起こったことは、Nogo-AがCasprと直接的に相互作用することをさらに示すものである（図8）。
【００９７】
Nogo-AはKv1.1の配置の調節においてCasprを補完する可能性がある
ジャクスタパラノードでのK＋チャンネルの蓄積が髄鞘形成性OLにより影響されることを示唆する強い証拠がある（Vabnick and Shrager, 1998）。Shaker型K＋チャンネルは、Kv1.1、Kv1.2およびKvβ2サブユニットから構成される多タンパク質複合体である（Rasband and Trimmer, 2001b）。CNSの有髄軸索におけるK＋チャンネル標識は、生後発生の進行過程でさらに顕著となり、初期にはジャクスタパラノードとともにパラノード性バンドにも局在し、Caspr免疫反応と交互にみられる（Rasband et al, 1999）。生後発生のさらに後期では、K＋チャンネルはパラノードから排除され、ジャクスタパラノード性のみとなる。本発明者は、Nogo-AがCasprを介してKv1.1と間接的に会合することを示している。しかし、Nogo-AおよびKv1.1ならびにCasprおよびKv1.1の分布パターンの発生過程での変化は類似しており、このことは、Kv1.1とNogo-A／Caspr複合体との間の相互作用が、髄鞘形成の初期段階においてNogo-A／CasprがKv1.1とパラノードに共存する時点で、少なくとも一過性に起こることを意味する。このため、Nogo-Aは成熟軸索ドメインの組織化に際してCasprに対する補完的または調節的な役割を果たし、そうすることによってK＋チャンネルのジャクスタパラノードへの協調的な局在を補助する可能性がある（図8）。
【００９８】
インビボのNogo-A（またはNogo-A／Caspr）条件的トランスジェニックまたはノックアウト動物（OL特異的プロモーターを用いることが考えられる）の検討は、髄鞘形成過程におけるNogo-Aの役割をさらに解明するのに役立つ可能性がある。本発明者の定量分析によれば、対をなすK＋チャンネルクラスター内部の間隙の距離は有意に短かった。これはEAEラットおよびShivererのいずれの脱髄性軸索においても、正常な有髄軸索と比較してNogo-Aクラスターの有意な減少を伴って起こる。これらの観察所見はK＋チャンネルは病的状態においてもCasprと共存することを意味するが、これはこの一過性の相互作用が髄鞘再形成過程でも起こるか否かを探ることは興味深いと考えられる。
【００９９】
同じくさらなる調査の根拠となる点は、Nogo-A、CasprおよびK＋チャンネルの間の相互作用の構造的および機能的な性質である。Casprファミリーメンバーの局在が有髄軸索において異なるドメインに区分けされることには注目すべきである。Casprとの一致度が約45％であるCaspr2は、成体有髄軸索のジャクスタパラノードに局在する。これは、PDZ結合部位と推定される部位を含むそのC末端を介してK＋チャンネルと間接的に会合する（Poliak et al, 1999）が、この特徴は哺乳動物Casprファミリーの最近記載された他の2つのメンバーであるCaspr3およびCaspr4も共通に備えている（Spiegel et al, 2002）。CasprのC末端はその長さの点でファミリーの他のメンバーと比較して特異であり、本発明者が産生させた抗体がCasprの他のアイソフォームと交差反応する可能性は低い。CasprのC末端はPDZ結合モチーフと推定されるものを有していないが、Caspr2と共通のバンド4.1結合ドメインは有する（Scherer and Arroyo, 2002）。CasprのこのドメインがKv1.1およびKv1.2とのその相互作用を媒介するか否かを明らかにすることは興味深いと考えられる。
【０１００】
CNSにおけるNogo-A相互作用
NgR以外に知られているNogo-Aの相互作用パートナーは、Nogo相互作用性ミトコンドリアタンパク質（NIMP）（Hu et al, 2002）、α-チューブリンおよびMBP（Taketomi et al, 2002）のみである。これらのすべての相互作用には、細胞間シグナル伝達リガンドとして機能する可能性が最も高いNogo-AドメインであるNogo-66細胞外ループではなく、Nogo-Aの細胞内ドメインがかかわる可能性が高い。本発明者の結果はオリゴデンドロサイト表面のNogo-66ループが軸索表面のCasprと直接結合することを示しており、これは神経グリア接合部でのNogo-Aのこれまで予想もされなかった機能であることを意味する。この相互作用にNgRは関与しないように思われる。実際には、正常な生理的条件下で、成体のオリゴデンドログリアNogo-Aと軸索NgRとの間に永続的で継続的に発生する相互作用が必要か否かははっきりしない。本発明者らは、Nogo-A／Caspr相互作用は何らかの様式で、髄鞘形成過程およびその後に神経グリア接合部の構造を形作り、維持するものと考えている（図8）。より詳細には、この相互作用は、他の分子の特定の接合部ドメインへの配置を組織化する際に役割を果たす可能性がある。
【０１０１】
以上をまとめると、本発明者は、オリゴデンドロサイトNogo-Aが特定の神経グリア接合部にクラスター化し、そこでその細胞外Nogo-66ループを介して軸索Casprと直接的に相互作用し、K＋チャンネルタンパク質と間接的に相互作用することを示した。これはこれまでに記載された初めてのNgR非依存的Nogo-66相互作用であり、神経グリア接合部の構造の形成および維持におけるNogo-Aの役割に対して大きな意味を持つ。
【０１０２】
本発明の第1の局面に関する材料および方法
抗体
Nogo-Aに対するポリクローナル抗体は以前に記載されている（Liu et al, 2002）。本発明者の実験には、NgRに対する2種類のポリクローナル抗体を用いた。そのうち一方は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）とヒトNgRのアミノ酸277〜430との融合タンパク質を用いてウサギで産生させ、もう一方はDr. Stephen Strittmatter（Yale University School of Medicine, New Haven；Wang et al, 2002）から寄贈された。F3およびNB-3に対する抗体は以前に記載されている（Ang et al, 2001）。
【０１０３】
Casprに対するポリクローナル抗体を産生させるためには、ヒトCaspr（Einheber et al, 1997）の細胞質領域（アミノ酸1308〜1377）をコードする230bp断片を、プライマー
2006516965.tif 000005
にそれぞれBamHl部位またはEcoRI部位を付加したものを用いてヒト脳cDNAから増幅した。増幅断片をBamHIおよびEcoRlで消化し、pGEX-3C中にインフレームにサブクローニングした上で、最終的な構築物の配列をDNAシークエンシングにより確認した。プラスミドを大腸菌BL21に形質転換導入し、誘導を行った上で予想されるサイズのCaspr-GST融合タンパク質をグルタチオン-アガロースビーズを用いて細菌可溶化物から回収した。還元型グルタチオンを用いてCaspr-GSTをビーズから溶出させ、凍結乾燥により濃縮した上で、ウサギの免疫処置に用いた。ウサギから採取した免疫血清がニワトリおよびマウスのCasprを認識する能力はイムノブロット法および免疫沈降実験により確認した。
【０１０４】
Kv1.1α-サブユニット（K20／78）およびNa＋チャンネル（K58／35）に対するマウスモノクローナル抗体はそれぞれUpstate Biotechnology社およびSigma社から購入した。Kv1.1、Kv1.2およびKv2.1に対するポリクローナル抗体はChemicon社から購入した。モノクローナル抗MAP2はSigma社から購入した。Cy2結合ヤギ抗ウサギ二次抗体およびCy3結合ヤギ抗マウス二次抗体はAmersham Pharmacia Biotech社から購入し、ABCキットはVector Laboratories社から購入した。
【０１０５】
EAEモデル
ラットの実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルは、以前の報告に従って作製した（Ahn et al, 2001）。手短に述べると、Lewisラット（2カ月齢、雌性）に対して、新鮮なラット脊髄ホモジネート（SCH）を完全フロイントアジュバント（CFA、1mg／ml結核菌を含む；Sigma）と合わせたもの（1：1）を0.5ml／匹ずつ両側の後肢足蹠に注射した。疾患の進行を判定するため、EAEに伴う症状に関してラットを十分に観察した。注射13日後（dpi）〜14dpiの時点で、EAEの極期にあるラットを以後の実験のために殺処理した。
【０１０６】
免疫組織化学および免疫電子顕微鏡検査
さまざまな生後日数（P1、P5、P7、P14、P30、P60および成体）のWistarラット、CGT-/-マウス（P16およびP21；Coetzee et al, 1996）およびShivererマウス（成体；Jackson Laboratories）に対して4％パラホルムアルデヒドによる灌流処理を行った。脊髄および脳幹を摘出し、4％パラホルムアルデヒド中での後固定を2hr行った後に、15％および30％スクロース中にて順次インキュベートした。クリオスタット切片（10μm）を、Nogo-A（1：200）もしくはCaspr（1：200）に対するポリクローナル抗体と、Kv1.1α-サブユニット（1：200）もしくはNa＋チャンネル（1：100）に対するモノクローナル抗体のそれぞれとの組み合わせ、またはポリクローナルNgR抗体とMAP2（1：100）もしくはKv1.1α-サブユニットに対するモノクローナル抗体との組み合わせにより二重標識した。免疫染色を画像化し、Carl Zeiss LSM5共焦点顕微鏡を用いて写真を撮影した。種々の生後日数でのNogo-AおよびKv1.1免疫標識の長さ、ならびにそれらの重複を計測した。種々の生後日数でのNogo-AおよびKv1.1またはCaspr／Kv1.1のパラノードでの共存に関して算定した。正常ラットおよびEAEラット、野生型マウスおよびshivererマウスの脳幹切片において、対をなすKv1.1免疫標識間の距離を計測し、Nogo-Aクラスターを算定した。値は平均±SEMとして提示した。統計分析は対応する群のT検定を用いて行った。
【０１０７】
電子顕微鏡検査に関しては、成体WistarラットおよびCGT-/-マウス（P16）からの試料を既発表のプロトコール（Huber et al, 2002）に従って調製した。ニッケルグリッド上に置いた90nm厚の超薄切片を、1％BSA、0.1％Tween 20、1％正常ヤギ血清および0.025％NaN3を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.3）により室温で40minブロックし、その後に同じ緩衝液中でそれぞれをNogo-Aポリクローナル抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。上記の緩衝液で十分に洗浄した後に、グリッドを、ヤギ抗ウサギIgGを10nm金（1：20、Aurion）に結合させたものとともに1hインキュベートし、2.5％グルタルアルデヒド水溶液により15min固定した。酢酸ウラシルおよびクエン酸鉛による二重染色の後に、Philips 208電子顕微鏡を用いてグリッドを観察した。
【０１０８】
ウエスタンブロットアッセイおよび免疫共沈アッセイ
成体、生後1日（P1）から30日（P30）までのWistarラットからはCNSの種々の領域（脳全体、脳幹、海馬、大脳皮質および脊髄）、EAEラットおよび対照ラットからは脊髄を採取し、1％ Triton X-l00およびプロテアーゼ阻害薬混合物を含むリン酸緩衝食塩液で抽出した。可溶化物をSDS-PAGEゲルによる電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜（Hybond C-extra、Amersham）に対してブロットした。同一のブロットを、Nogo-A、Caspr、Nogo-66受容体（NgR）およびγ-チューブリン（ローディングの標準化のため）に対する抗体によりプロービングし、Pierce化学発光検出試薬により描出した。
【０１０９】
免疫共沈（IP）実験に関しては、脳膜画分を以前の記載の通りに調製した（Lei et al, 2002）。手短に述べると、1％プロテアーゼ阻害薬混合物（Amersham）を加えた氷冷ホモジナイズ用バッファー（320mMスクロース、10mM Tris-HCl pH7.4、1mM NaHCO3 pH7.4、1mM MgCl2）中で脳組織をホモジネート化し、その後に5,000gで15min遠心した。上清を収集し、60,000g（Beckman超遠心分離機）の遠心処理を4℃で60min行った。続いてペレットを、以後の実験のために可溶化バッファー（10mM Tris-HCl pH9、150mM NaCl、0.5％ Triton X-l00、1％デオキシコール酸ナトリウム（DOC）、0.5％SDS、2mM EDTAおよび1％プロテアーゼ阻害薬混合物）中に溶解した。非免疫性IgG、Caspr抗体、Nogo-A抗体およびNB3抗体のそれぞれを用いて免疫沈降したタンパクを、Laemmliサンプルバッファーを用いてビーズから溶出させて、8％SDS-PAGEゲルで分離した後に、ニトロセルロース膜に移行させ、Caspr、Nogo-A、Kv1.1、Kv1.2、F3またはNB3に対するプロービングを行った。別の実験では、哺乳動物発現ベクターpCIneo（Promega）中にあるNogo-A発現構築物を、Caspr／F3を発現するCHO細胞（Faivre-Sarraih et al, 2000）、F3を発現するCHO細胞（Gennarini et al, 1991）または野生型CHO細胞に対して一時的にトランスフェクトし、免疫共沈試験に用いた。
【０１１０】
細胞接着アッセイおよびPI-PLC処理
Nogo-66ペプチド（KLSDVLDDVLFLRRLEKITCNVHGLASNSYKQVLEESIAVESELYARFPHGEDSKQIAQIVGKYIR）は、Loke Diagnostics ApS（Denmark）から購入した。Nogo-66-GSTおよびNogo-N末端-GST（Nogo-N-GST）の組換えタンパク質の作製のためには、Nogo-66およびNogo-N末端のコード配列を、以下のプライマーセット：
2006516965.tif 000006
（Nogo-N-GSTの場合）
を用いてヒト脳cDNAクローンHK07722（Nogo-A）から増幅させた。PCP産物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、EcoRI／HindIIIで消化したpGEX-KG（Guan and Dixon, 1991）中に連結した。続いて、これらの組換えプラスミドを大腸菌Top 10細胞に形質転換導入した。GST融合タンパク質を細菌可溶化物から回収し、グルタチオン-アガロースビーズを用いて精製した。細胞接着アッセイは以前の記載の通りに行った（Xiao et al, 1996）。タンパク質スポット（5μMのGST、Nogo-66-GST、または100μM Nogo-66を1.5μl）を、ペトリ皿（Becton Dickinson）のニトロセルロースをコーティングした表面に対して適用し、37℃の加湿雰囲気中で2時間インキュベートした。続いて、残った非特異的タンパク質結合部位をブロックするために、培養皿を2％熱失活脂肪酸非含有BSA（Sigma）を含むPBSとともに一晩インキュベートした。続いて、疑似トランスフェクトCHO細胞、F3トランスフェクトCHO細胞またはCaspr／F3同時トランスフェクトCHO細胞を、既知組成培地2ml中に2.5×105個／mlの密度で播き、37℃の加湿雰囲気中でインキュベートした。12時間後に、2.5％グルタルアルデヒドを含むPBSに浸すことによって細胞を固定した。種々のスポットに対する細胞接着の写真を撮影し、算定した。実験はすべて少なくとも3回行った。統計分析はStudent-t検定によって行った。有意水準にはp＜0.05を選択した。
【０１１１】
指示された場合には、Caspr／F3トランスフェクトCHO細胞をPI-PLC（0.02、0.04または0.06U／ml）（Sigma）で処理し、上記と同じ手順に従って2時間インキュベートした上で培養皿に播いた。PI-PLC処理細胞に対して、上記のようにしてF3／コンタクチンに関するウエスタンブロット分析および免疫化学検査を行った。
【０１１２】
GSTプルダウンアッセイ
ビーズに結合させたGST、GST-Nogo-66およびGST-Nogo-N（20μg）をそれぞれ、成体脳の膜抽出物、または0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）中にあるKv1.1（Dr. Trimmerより寄贈、Nakahira K et al, 1996）を一時的にトランスフェクトした野生型CHO細胞、F3発現CHO細胞およびCaspr／F3発現CHO細胞の膜抽出物1.5mlと混合し、4℃で一晩インキュベートした。結合したタンパク質を2×Laemmliサンプルバッファーで溶出させ、SDS-PAGEによって分離した上で、Caspr抗体およびKv1.1抗体によりプロービングした。
【０１１３】
脂質ラフト分析
ラット大脳皮質（15日齢および成体）からの界面活性剤抽出物の調製は、主として、Kramer et al, 1999によって記載された手順に従って行った。手短に述べると、解離したラット大脳皮質（総湿重量2g）を、2％ Triton-X 100、2mM過バナジン酸、プロテアーゼ阻害薬錠剤（Roche）を含むTBS（pH 7.4）12.5ml中でホモジネート化し、4℃で30min攪拌した。同容積の80％ショ糖TBS溶液を添加することによって界面活性剤抽出物を40％ショ糖に調整し、SW28ローター用の超遠心管に入れた。5％から30％までのショ糖の直線勾配（TBS中）を可溶化物試料の上に重ねた。この勾配を25,000rpmで18hr遠心した。最上層から最下層まで2mlずつ画分を収集した。各画分中のタンパク質を、SDS-PAGEの後にウエスタンブロット法を行うことによって分析した。界面活性剤で溶解しない浮遊材料の大部分は画分5に回収された。
【０１１４】
本発明の第2の局面
本発明の第2の局面に対する背景情報
髄鞘形成は複雑な多段階プロセスであり、その基礎をなす分子機構は未だに完全に明確にされたというにはほど遠い。しかし、パラノードでの軸索とミエリン受容細胞との間の相互作用が、らせん状に巻き付いたミエリン内の軸索区域の絶縁に重要な役割を果たすと考えられている。この軸索-グリア接触は無脊椎動物の中隔接合に準えられ、軸索とミエリンループとの間のアンカーポイントとして働いて、軸索周囲空隙への部分的な拡散障壁として作用するとともに、膜成分の側方拡散を防ぐことによって軸索をドメインに分離すると提唱されている（Rosenbluth, 1995）。近年、パラノード領域に特定の分子が位置することが明らかになった。
【０１１５】
F3／コンタクチンは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する神経細胞接着分子であるグリコシル-ホスファチジルイノシトール（GPI）結合型分子である（Gennarini et al, 1989；Faivre-Sarrailh et al, 2000）。この分子は、一連のモジュール式免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンIII型反復配列から構成される。本発明者は以前（Xiao et al, 1998、これは参照として本明細書に組み入れられる）、F3が、ランヴィエ絞輪に特異的に位置するグリア由来分子である細胞外マトリックス糖タンパク質、テネイシン-Rに対するニューロン受容体であることを示した（Wintergerst et al, 1993）。F3との相互作用におけるテネイシン-R側の結合部位は、EGF（上皮増殖因子）様反復配列にあることが突き止められている（Xiao et al, 1996, 1997、これは参照として本明細書に組み入れられる）。テネイシン-Rはナトリウムチャンネルサブユニットの機能調節因子である。F3はRPTPζ／β（受容体タンパク質チロシンホスファターゼ）とトランス性に相互作用して神経突起の成長を促進し（Sakurai et al, 1997）、RPTPα（Zeng et al, 1999）とシス性に相互作用して細胞外シグナルを髄鞘形成関連Fynキナーゼに伝達する（Umemori et al, 1994）。さらに、F3は、髄鞘形成に関して重要な神経グリア接触部位であるパラノードでCaspr／パラノジンと共存してシス性に相互作用し、グリアニューロファシン155とトランス性に相互作用する（Girault and Peles, 2002）。F3ヌルマウスは部分的に破壊されたパラノード構造を示し、P18までに死亡する（Berglund et al, 1999）が、このことはF3が発生のために決定的に重要であることを示唆している。
【０１１６】
F3結合タンパク質（Caspr）は、パラノジンとしても知られ、パラノードのもう1つの軸索成分である（Einheber et al, 1997；Menegoz et al, 1997）。Rios et al(2000)はさらに、F3およびCasprが髄鞘形成過程でパラノードに共存し、シス様式で相互作用することを示した。成体の座骨神経および視神経ではF3染色はパラノードに局在したが、染色は視神経内部の節まで伸びていた。
【０１１７】
NB-3は、F3と同じサブファミリーに属する神経細胞接着分子である（Lee et al, 2000）。NB-3 mRNA分析により、大脳における胚形成中の発現は低レベルであり、生後の時期になって急激に上昇し、髄鞘形成の期間に相当する生後7日に最高レベルに達することが明らかになった。その後、レベルはピークの5分の1に低下し、成体期の間は同じように保たれる。
【０１１８】
脊椎動物の中枢神経系（CNS）における髄鞘形成は、高速なインパルス伝導のために必須である。CNSにおいて、オリゴデンドロサイト（OL）分化はニューロン由来シグナルによって媒介される（Barres and Raff, 1999）。神経グリア相互作用の1つであるJagged1／Notch1は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）の遊走を促進し、OPCの分化を抑制する（Wang et al, 1998）。Notch／Jagged1シグナル伝達経路は、胎児前脳における放射状グリア細胞、後根神経節におけるシュワン細胞、および網膜におけるミュラーグリア細胞などのグリア発生（gliogenesis）の促進に非常に重要な役割を果たす（Furukawa at al, 2000；Hojo at al, 2000；Gaiano et al, 2000；Morrison et al, 2000；Wakamatsu et al, 2000；Tanigaki et al, 2001）。OPCにおけるNotch1の条件的除去が異所性未熟OLの出現およびそれに続くアポトーシス（Genoud et al, 2002）をもたらし、多発性硬化症における効率的な髄鞘再形成の不全が、一部には、アストロサイトによって発現されたJagged1によるOPC Notch受容体の活性化に起因することは（John et al, 2002）、Notch1が存在しないかJagged1によって不適切に活性化された場合にはOPCの分化が障害される可能性があることを示している。このため、抑制性Jagged1／Notch1シグナル伝達経路のほかに、Notch1を介する他の経路が指令的に働いてOPCのOLへの分化を媒介するように思われる。しかし、OPCのOLへの分化の時期およびその後のOL成熟を制御する分子的機序はほとんど明確にされていない。Jagged1がオリゴデンドロサイトの成熟前に有意にダウンレギュレートされていることからみて、他の分子が、髄鞘形成に継続的な役割を果たしているNotchと相互作用する可能性がある。軸索の明確な区域に集合している分子はNotch1リガンドの可能性がある。
【０１１９】
Notchは、側方抑制を介して細胞運命の選択を媒介するI型膜貫通タンパク質である。その中核的なシグナル伝達機構は、調節性膜内タンパク質分解（RIP）を必然的に含む（Ebinu and Yankner, 2002）。古典的リガンドであるDelta、Serrate／JaggedおよびLag-2（DSLと総称される）が結合すると、Notchは2回のタンパク質分解を受けてその細胞内ドメイン（NICD）を放出する。NICDは核に移行してRBP-J転写因子と相互作用し、例えばHes遺伝子を活性化する（Martinez Arias et al, 2002）。さらに、Deltex1（DTX1）はNotchシグナル伝達経路の細胞質下流エレメントとして同定されている。DTX相同体は共通の3つのドメイン、すなわちN末端領域、プロリンリッチモチーフおよびRING-H2フィンガーモチーフを有する（Kishi et al, 2001）。詳細には、N末端領域はNICDと相互作用する。DTX1を介するNotchシグナル伝達は、OL分化を調節する経路であるJNKシグナル伝達を抑制し、Winglessシグナル伝達と協調的に働く（Brennan and Gardner, 2002；Martinez Arias et al, 2002）。Notch／DTX1シグナル伝達を活性化する細胞外リガンドの存在が複数の研究によって示唆されているが、リガンドと推定されるものはまだ同定されていない。
【０１２０】
Notchはグリア分化を調節することが示されている（Wang et al, 1998；Gaiano et al, 2000；Morrison et al, 2000）。本発明者にとって意味のあったことは、Notchの細胞外部分が、テネイシン-Rがそうであるように、リガンド-受容体相互作用が起こりうる部位である多数のEGF様反復配列を含むことである（Rebay et al, 1991）。このため、本発明者は、グリア由来のNotchが軸索のF3およびNB-3の結合パートナーであると予想した。Wang et al(1998)は、ラット視神経において網膜神経節細胞の軸索上にJagged1が発現されることを示した。Jagged1はオリゴデンドロサイト前駆体の表面にあるNotchにシグナルを伝達し、その分化を抑制する。興味深いことは、髄鞘形成と平行して、Jagged1の発現パターンが発生過程で時間経過とともにダウンレギュレートされることである（Dugas et al, 2001）。これにより、Jagged1が、オリゴデンドロサイトの分化を調節し、そのようにして髄鞘形成を調節する限局的な時間調節機構の一部として、オリゴデンドロサイトに対してシグナルを伝達するという結論が得られた。しかし、ミエリン鞘の分節的な性質はいかにして保たれるのであろうか。髄鞘形成性オリゴデンドロサイトがランヴィエ絞輪と推定されるものに侵入するのを防ぐ停止シグナルは何であろうか。本発明者は、このような軸索停止シグナルが、節の両側、すなわちパラノードに論理的に存在する必要があるという仮説を立てた。以下に詳述するように、本発明者は、F3がオリゴデンドロサイト突起に対する停止シグナルとして作用すること、およびNB-3がオリゴデンドロサイト分化の誘発に関与している可能性があることを実際に示した。
【０１２１】
本発明の第2の局面の概要
本発明者は、F3およびNB-3がともにオリゴデンドログリアNotch受容体の生理的リガンドであることを初めて示し、髄鞘形成過程におけるイベントを協調的に行わせる、Deltex1を介するシグナル伝達経路の存在を実証した。
【０１２２】
すなわち、本発明者は、新たなパラノード分子であるNB-3を同定し、オリゴデンドログリアの表面にあるNotchに対するF3／NB-3シグナル伝達を伴う停止シグナルがパラノードに位置することを示した。OLN-93細胞とF3-トランスフェクトCHO細胞との共培養系において、オリゴデンドログリア細胞突起はF3-トランスフェクト細胞に対しては終端を形成して細胞体上に広がるが、対照CHO細胞は回避する。細胞接着アッセイ、免疫共沈アッセイおよびGSTプルダウンアッセイにより、F3／NB-3およびNotchが複合体として会合することが確認されている。MAGは、OLN-93細胞およびF3-トランスフェクトCHO細胞を共培養した場合、ならびにOLN-93細胞および初代オリゴデンドロサイトをF3およびNB-3タンパク質基質と接触させた場合にアップレギュレートされる。これらの結果は、髄鞘形成の調節に関与する、F3／NB-3とNotchとの間の新規かつ機能的に意味のあるシグナル伝達相互作用を示している。本発明者はまた、細胞接着試験および生化学的アッセイで、F3がNotch1およびNotch2と結合することも示している。さらに、この相互作用はオリゴデンドロサイト細胞系OLN-93の劇的な形態変化を誘導し、鞘形成性を獲得させるとともに、MAG（ミエリン付随糖タンパク質）、CNPアーゼ（2',3'-サイクリックヌクレオチド3'ホスホジエステラーゼ）およびPLPといったミエリン関連タンパク質を有意にアップレギュレートする。これらの結果は、F3がNotch受容体の生理的リガンドであり、このシグナル伝達がオリゴデンドロサイトの成熟に重要な役割を果たすことを示唆する。
【０１２３】
明らかにされたこのことは、F3およびNB-3のNotchとの相互作用がオリゴデンドロサイトの成熟に重要な役割を果たしていることを示している。
【０１２４】
本発明者はさらに、F3がNotchのS3部位での膜内切断を誘導すること、およびF3／Notchにより誘導されるMAGアップレギュレーションがHES1に非依存的であってDeltex 1（DTX1）を必要とすることを示した。DTX1は、Notchシグナル伝達経路の既知の細胞質下流エレメントである。DTX1を介するNotchシグナル伝達が、オリゴデンドロサイト分化を調節する経路であるJNKシグナル伝達を抑制することは以前に示されている。しかし、以前の研究では、Notch／DTX1シグナル伝達を活性化する細胞外リガンドは同定されていない。
【０１２５】
本明細書で、本発明者は、NB-3が発生過程でCNSパラノードにクラスター化するニューロン由来細胞認識分子であることを報告し、NB-3をNotch1の機能的リガンドとして特定する。NB-3／Notchシグナル伝達経路は、Deltex1を介してOPC分化およびOL成熟を促進する。さらに、Jagged1はジャクスタパラノードおよび絞輪間部（internode）に局在する。このため、オリゴデンドログリアの成熟を協調的に行わせる、Jagged1／Notch1からNB-3／Notch1への空間的シグナルスイッチ機構が軸索に沿って存在する可能性がある。
【０１２６】
脊椎動物CNSにおいて、ニューロンおよびグリアは、時間的には異なるものの部分的に重複した時期に生じる。ニューロンが最初に生じ、続いてアストロサイト、その後にオリゴデンドロサイト（OL）が共通の前駆細胞から生じる（Sauvageot and Stile, 2002）。OLの成熟ならびにミエリン形成を調節するために、軸索由来のシグナルが時間的および空間的に必要なことを示す証拠が増加しつつある（Barres and Raff, 1999；Hu et al, 2003）。しかし、神経幹細胞（NSC）からのOL生成に神経細胞分子がいかに関与するかについてはほとんどわかっていない。胚の神経幹細胞のOLへの分化をいかにして順調に導くかに関する本発明者の研究により、神経細胞認識分子であるNB-3がNotch1と結合し、幹細胞におけるNotch1細胞内ドメインの核移行を誘発することが示された。このNB-3／Notch1相互作用は胚の神経幹細胞からのオリゴデンドログリア発生を促進し、これはドミナントネガティブ性Notch1およびRing-H2モチーフを欠くDeltex1の欠失変異体によってブロックされうる。しかし、恒常的に活性のあるNotch1のみではOL生成を促進することはできず、このことはNB-3により誘導されるNICDがこのイベントに必要なことを示唆している。以上を総合すると、本明細書の観察所見は、Deltex1を介するNB-3／Notch1シグナル伝達経路がオリゴデンドログリア発生を指令することを示している。
【０１２７】
したがって、本発明は、オリゴデンドロサイトまたはその前駆体の分化を誘発する方法であって、前記オリゴデンドロサイトまたは前駆体を、F3、NB-3またはいずれかの模倣体と接触させることを含む方法を提供する。
【０１２８】
本発明はさらに、ニューロン、特に神経軸索の髄鞘形成を誘発する方法であって、オリゴデンドロサイト、その前駆体またはニューロンを、F3、NB-3またはいずれかの模倣体と接触させることを含む方法を提供する。
【０１２９】
上記の方法のいずれにおいても、オリゴデンドロサイト、前駆体またはニューロン（必要に応じて）を、F3およびNB-3の両方、またはそれらの模倣体と接触させることが好ましい。F3およびNB-3が複合体として存在してもよい。
【０１３０】
MAGなどのミエリンタンパク質の発現は、前記オリゴデンドロサイトまたは前駆体において、接触の段階に反応して通常はアップレギュレートされると考えられる。
【０１３１】
いかなる特定の理論にも拘束されることは望んでいないが、MAGのアップレギュレーションは、オリゴデンドロサイトまたはその前駆体の表面での、F3、NB-3またはそれらの模倣体と、Notchとの、特にNotch1または2との結合によって誘導されると考えられている。このような結合は、Deltex-1を介するNotchシグナル伝達を誘導すると考えられている。
【０１３２】
オリゴデンドロサイト前駆体は、オリゴデンドログリア前駆細胞（OPC）でも神経幹細胞（NSC）でもよい。OPCは一般に、CNpアーゼ、Gal CおよびMAGを表面に提示する。NSCはネスチンマーカーを提示する。OPCおよびNSCに関しては、Wang et al, 1998（Notch受容体の活性化はオリゴデンドロサイト分化を抑制する（Notch receptor activation inhibits oligodendrocyte differentiation）. Neuron 21, 63-75）；Morrison S.J., 2001（神経幹細胞によるニューロンの能力および系譜の決定（Neuronal potential and lineage determination by neural stem cells）. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 666-672）；Sauvageot、C.M. and Stiles, C.D., 2002（皮質グリア発生を制御する分子機構（Molecular mechanism controlling cortical gliogenesis）. Curr. Opin. Neurobiol.12, 244-249）；Xiao et al, 2003（F3／コンタクチンはnotchリガンドである（F3/Contactin is a notch ligand）. Cell、Vol 115, 163-175）。
【０１３３】
本方法はインビトロでもエクスビボでも行いうる。本方法は特に、治療目的に用いうる分化したオリゴデンドロサイトの生成に対して適用可能である。すなわち、前記接触の段階の後に、OPCまたはNSCを、中枢神経系の疾患または中枢神経系に対する損傷；例えば、多発性硬化症（MS）、てんかん、卒中および脊髄損傷（SCI）といったニューロンの脱髄を特徴とする任意の状態、を有する対象に導入または移植することができる。導入または移植の後に、これらの処理細胞は分化を続け、脱髄したニューロンに対して髄鞘形成を行うと思われる。
【０１３４】
オリゴデンドロサイト前駆細胞は、処理後にそれらを投与される対象から入手することが望ましいと思われる。
【０１３５】
本発明はさらに、F3およびNB-3またはそれらの模倣体が、担体と組み合わされたものを含む組成物も提供する。本組成物が、F3とNB-3との複合体、またはその模倣体を含んでもよい。
【０１３６】
ある種の態様において、本組成物は薬学的組成物であり、このため、薬学的に許容される担体を含む。薬学的組成物はインビボでの注射用に製剤化されることが好ましく、さらにより好ましくはCNSへの直接注射用に製剤化される。
【０１３７】
また、医療の方法に用いるための上記の組成物も提供される。特に、組成物は、CNSに対する損傷またはCNSの疾患の治療に用いるために提供される。それらは、SCI、MS、てんかんまたは卒中といった、ニューロンの脱髄を特徴とする任意の状態の治療のために用いることができる。
【０１３８】
また、CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品の調製におけるF3および／またはNB-3の利用も提供する。それらは個別に製剤化することも別々に製剤化することもできる。しかし、別々に製剤化されたNB-3およびF3を合わせて投与することもできる。
【０１３９】
したがって、CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品であって、NB-3またはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるF3の利用も提供する。
【０１４０】
同様に、CNSに対する損傷または疾患の治療のための医薬品であって、F3またはその模倣体と組み合わせて投与するための医薬品、の調製におけるNB-3の利用も提供する。
【０１４１】
本発明はさらに、ニューロン、特に神経軸索の髄鞘形成を誘発する方法であって、ニューロンまたはオリゴデンドログリア細胞を、本明細書に記載の組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【０１４２】
本発明はさらに、中枢神経系の疾患または中枢神経系に対する損傷を有する対象を治療する方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１４３】
前述の内容から明らかと思われるように、対象は一般に、SCI、MS、てんかんまたは卒中といった、脱髄を特徴とする状態を有すると考えられる。
【０１４４】
本発明はさらに、NotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を調節しうる（好ましくは促進しうる）物質に関するスクリーニングの方法であって、F3および／またはNB-3、Notchならびに候補物質を接触させること、ならびにNotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を判定することを含む方法を提供する。
【０１４５】
本方法はさらに、NotchならびにF3および／またはNB-3を、前記候補物質の非存在下において、それ以外は類似の条件下で接触させること、ならびにNotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を判定することも含みうる。
【０１４６】
方法は、NotchとF3および／またはNB-3との複合体を候補物質と接触させることを含むことが好ましい。複合体は、それを候補物質と接触させる前に形成させることが好ましい。
【０１４７】
本方法は任意の適した方法によって行いうる。当業者は多くの適したアッセイ形式を周知していると考えられ、そのほかの例を設計することもできると考えられる。
【０１４８】
NB-3、F3およびNotchのいずれかまたはすべては、細胞内に存在しても細胞の表面に存在してもよい。タンパク質が発現される元となる遺伝子は当該細胞にとって内因性でもよく、または細胞内に導入されたベクター上に存在してもよい。タンパク質が細胞の表面に発現されることが好ましい。
【０１４９】
補足的または代替的に、NB-3、F3およびNotchのいずれかまたはすべてを、固体支持体上に固定化してもよい。一方または両方が、以下にさらに詳細に述べるように、検出可能な標識を含んでもよい。
【０１５０】
特定の態様において、Notchは細胞表面に存在し、本方法は、Notchシグナル伝達、特にDeltex 1を介するものを判定することを含む。当該の細胞がオリゴデンドロサイトまたはその前駆体である場合には、本方法は、MAG発現のアップレギュレーションの判定を含みうる。
【０１５１】
本発明はさらに、薬学的製剤を製造する方法であって、NotchとF3および／またはNB-3との間の相互作用を調節しうる物質を本明細書に記載のスクリーニング方法によって同定した上で、前記物質を薬学的に許容される担体とともに製剤化するさらなる段階を含む方法を提供する。本方法は、前記の同定された物質を製剤化の前にインビボ投与用に最適化するさらなる段階を含みうる。
【０１５２】
特定の態様において、本発明はまず、個体における髄鞘形成を増強するための方法であって、Notch受容体の活性化物質を前記患者に投与することを含み、前記活性化物質がF3、NB-3またはその模倣体を含むような方法を提供する。
【０１５３】
本方法は、SCI、MS、てんかんまたは卒中の治療に用いることが好ましい。
【０１５４】
本発明はまた、Notch受容体の活性化物質を含む薬学的組成物であって、前記活性化物質がF3、NB-3またはその模倣体を含むような薬学的組成物も提供する。
【０１５５】
リガンドがF3、NB-3またはその模倣体であるような、リガンドとNotch受容体との間の相互作用を調節しうる物質に関するスクリーニングの方法であって、物質をリガンドおよび受容体と接触させること；リガンドと受容体との間の相互作用を判定すること、ならびにこれを、前記物質が存在しない同等の条件下での受容体とリガンドとの間の相互作用と比較することを含む方法も、同じく提供される。
【０１５６】
本方法はさらに、前記物質を含む薬学的組成物を生産することも含みうる。
【０１５７】
細胞
オリゴデンドロサイトという用語は、本明細書において、中枢神経系（CNS）において神経軸索の周囲にミエリン鞘を固着させうるオリゴデンドログリア細胞のことを指す。
【０１５８】
オリゴデンドロサイト前駆細胞という用語は、F3およびNB-3などの適した刺激物の投与によってオリゴデンドロサイトに分化させることができる細胞のことを指して用いられる。このような細胞には、オリゴデンドログリア前駆細胞（OPC）および神経幹細胞（NSC）が含まれる。
【０１５９】
タンパク質配列
「Notch」という用語は、Notch1、2および3を含む、Notchタンパク質のすべてのアイソフォームのほか、それらの部分および単離されたドメイン（細胞外ドメインなど）、さらには以下に示した配列に対する同一性が80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％を上回る、それらの変異体およびバリアントを含むものとして用いられる。好ましいタンパク質はNotch1および2である。他の哺乳動物種からのオーソロガスタンパク質も含まれる。Notchタンパク質は、NB-3および／またはF3タンパク質との結合能力を有することが好ましい。また、これがオリゴデンドロサイトまたはその前駆体において、Deltex 1シグナル伝達を介するMAGタンパク質発現のアップレギュレーションを誘導する能力を有してもよい。
【０１６０】
「F3」という用語は、F3タンパク質のアイソフォームおよびこの種のタンパク質の単離されたドメインのほか、以下に示した配列に対する同一性が80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％を上回る、それらの変異体およびバリアントを含むものとして用いられる。他の哺乳動物種からのオーソロガスタンパク質も含まれる。F3タンパク質は、Notchタンパク質の、特にNotch1および2の細胞外ドメインとの結合能力を有することが好ましい。
【０１６１】
「NB-3」という用語は、NB-3タンパク質のアイソフォームおよびこの種のタンパク質の単離されたドメインのほか、以下に示した配列に対する同一性が80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％を上回る、それらの変異体およびバリアントを含むものとして用いられる。他の哺乳動物種からのオーソロガスタンパク質も含まれる。NB-3タンパク質は、Notchタンパク質の、特にNotch1および2の細胞外ドメインとの結合能力を有することが好ましい。
【０１６２】
Notch、F3およびNB-3タンパク質のアミノ酸配列を、それらのGenBankアクセッション番号とともに以下に示す。
2006516965.tif 000007
2006516965.tif 000008
2006516965.tif 000009
2006516965.tif 000010
【０１６３】
アッセイ方法
上記のように、当業者は、NotchとNB-3および／またはF3との間の相互作用を判定して、このような相互作用を調節する（好ましくは促進する）物質を同定するために適切であると思われる、数多くのアッセイ形式を周知している。
【０１６４】
例えば、タンパク質間の相互作用は、その1つまたは複数を検出可能な標識で標識して、それを固体支持体上に固定化された別のものと接触させることにより、インビトロで検査することができる。適した検出可能な標識には、特にペチジル（petidyl）物質に対するものとしては、組換え的に産生されるペプチドおよびポリペプチドに組み入れることが可能な35S-メチオニンが含まれる。または、固体支持体上に形成された複合体を、固体支持体上に固定化したものではないタンパク質上に存在するエピトープを標的とする抗体を用いる標識によって検出することもできる。適した抗体が得られない場合には、組換え的に産生されるペプチドまたはポリペプチドを、適した抗体が入手可能なエピトープを含む融合タンパク質として発現させることもできる。
【０１６５】
固体支持体上に固定化されるタンパク質は、固体支持体に結合したタンパク質に対する抗体を用いて、またはそれ自体が知られている技術により、固定化することができる。好ましいインビトロ相互作用の1つは、グルタチオン-Sトランスフェラーゼ（GST）を含む融合タンパク質を利用する。これをグルタチオンアガロースビーズ上に固定化してもよい。上記のタイプのインビトロアッセイ形式では、固定化されたGST-融合ポリペプチドと結合する標識ペプチドまたはポリペプチドの量に影響を及ぼす能力を判定することにより、被験化合物をアッセイすることができる。これを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりグルタチオン-アガロースビーズを分画することによって判定してもよい。または、非結合タンパク質を除去するためにビーズをすすぎ洗いし、存在する標識の量を例えば適したシンチレーションカウンターで計数することにより、結合したタンパク質の量を判定することもできる。
【０１６６】
また、本発明によるアッセイが、2種類のタンパク質のうち少なくとも1つを、適した細胞によって好ましくはその表面に発現させるという、細胞系アッセイの形式をとってもよい。本アッセイには、細胞内に導入された1つまたは複数のベクターから当該ポリペプチドまたはペプチドが発現されるような、酵母株または哺乳動物細胞系などの細胞系を利用してもよい。
【０１６７】
記載した方法によって同定されたNotch／NB-3／F3相互作用の調節因子を、インビボ投与に対する適合性を高めるためにさらに改変することもできる。
【０１６８】
製剤
本発明の組成物は、以上に定義した少なくとも1つの活性化合物を、薬学的に許容される担体、アジュバント、添加剤、緩衝剤、保存料および安定化剤を非制限的に含む、当業者に周知の1つまたは複数の他の薬学的に許容される成分とともに含む、薬学的製剤として製剤化することができる。製剤がさらに他の活性物質を含んでもよい。
【０１６９】
したがって、本発明はさらに、以前に定義した薬学的組成物を作製する方法であって、本明細書に記載した少なくとも1つの活性物質を、当業者に周知の1つまたは複数の薬学的に許容される成分、例えば、担体、アジュバント、添加剤などと混合することを含む方法を提供する。
【０１７０】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で用いる場合、正しい医学的判断の範囲内で、当該対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて用いるのに適していて、便益／リスク比が妥当となるように、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応またはその他の問題もしくは合併症を伴わない、化合物、成分、材料、組成物、剤形などに関する。各々の担体、アジュバント、添加剤なども、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容される」ものでなければならない。
【０１７１】
適した担体、アジュバント、添加剤などは、標準的な薬学のテキスト、例えば「レミントン薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第20版、2000、pub. Lippincott, Williams & Wilkins；および「医薬添加剤マニュアル（Handbook of Pharmaceutical Excipients）」第2版、1994に記載されている。
【０１７２】
製剤としては、注射用製剤、例えば、活性化合物が内部に溶解している、水性で等張性で発熱物質を含まない滅菌溶液が適している。このような液体が、抗酸化物質、緩衝剤、保存料、安定化剤、静菌薬、懸濁化剤、増粘剤および製剤を血液または脳脊髄液に対して等張性にする溶質といった、他の薬学的に許容される成分をさらに含んでもよい。この種の製剤に用いるのに適した等張性担体には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液または乳酸加リンゲル注射液が含まれる。一般に、液体中の活性化合物の濃度は約1ng／ml〜約10μg／ml、例えば約10ng／ml 〜約1μg／mlである。製剤は、単回投与量または多回投与量が封入された容器、例えばアンプルまたはバイアルとして提供することができ、使用の直前に滅菌液体、例えば注射用の水を添加するのみでよい凍結乾燥状態で保存することができる。即時調製による注射液および懸濁液を、滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製することもできる。
【０１７３】
投与
本発明の組成物の投与は一般に、注射による、好ましくはCNSへの直接的な注射によると考えられる。注射は障害部位への直接的なものでもよい。または、注射が、一般的には疾患または損傷の付近での、脳脊椎液中へのものであってもよい。
【０１７４】
配列同一性
参照配列に対するアミノ酸配列の一致度（％）は、最大の配列一致度が得られるように、配列のアラインメントを行い、必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、保存的置換は配列同一性の部分としては考慮されない。一致度の値を、WU-BLAST-2（Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480(1996)）によって決定してもよい。WU-BLAST-2はいくつかの検索パラメーターを用いるが、そのほとんどはデフォルト値に設定される。調整パラメーターは以下の値に設定される：オーバーラップ幅＝1、オーバーラップ率＝0.125、ワード閾値（T）＝11。アミノ酸配列の一致度の値は、WU-BLAST-2により決定された合致する同一残基の数を、参照配列の残基の総数（アラインメントスコアを最大化するためにWU-BLAST-2により参照配列に導入されたギャップは無視する）によって除算し、100を掛けることによって決定される。
【０１７５】
アミノ酸の類似度（％）は、BLOSUM62マトリックスで正の値としてスコア化された残基を算入する点を除き、一致度と同じようにして定義される。したがって、同一ではないが類似した特性を有する残基（例えば、保存的置換の結果として）も算入される。
【０１７６】
同様に、参照核酸に対する核酸配列の一致度（％）は、参照核酸配列中のヌクレオチド残基と同一な候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。本明細書で用いる一致度の値は、WU-BLAST-2のBLASTNモジュールをデフォルトのパラメーターに設定し、オーバーラップ幅およびオーバーラップ率をそれぞれ1および0.125に設定することによって生成される。
【０１７７】
対象
発明の組成物および／または治療薬が投与される対象は、哺乳動物であり、好ましくは、齧歯類（例えば、ウサギ、ラットまたはマウス）、イヌ、ネコ、サルもしくは類人猿などの実験動物、またはウシ、ウマ、ヒツジ、ブタもしくはヤギなどの家畜であると考えられる。より好ましくは、対象はヒトである。
【０１７８】
一般に対象は、CNS障害、通常は髄鞘形成が不適切であることを特徴とする疾患または障害に起因するものを有すると考えられる。このような状態にはMSが含まれる。実験動物では、障害または疾患は実験的なものであってよい。CNS障害が、物理的損傷（例えば、脊髄損傷（SCI））、その他の疾患または障害（例えば、卒中、てんかんまたは神経変性疾患、学習記憶関連疾患および／またはアルツハイマー病もしくはパーキンソン病などの痴呆）に起因してもよい。
【０１７９】
本発明の治療薬は一般に、外科手術および／またはリハビリテーションなどの他の治療法とともに用いることを意図している。
【０１８０】
模倣体
インビボでの薬学的用途のためには、ペプチドまたはポリペプチドよりも非ペプチド性「低分子」の方がしばしば好ましい。したがって、F3および／またはNB-3ならびにそれらの複合体の模倣体を、特に薬学的用途のために設計することができる。一般に、F3およびNB-3の一方または両方の模倣体は、Notch分子、好ましくはNotch1または2の細胞外ドメインと結合して、その分子に対するこれらの1つまたは複数のタンパク質の結合の影響を模倣することができると考えられる。
【０１８１】
既知の薬学的活性化合物に対する模倣体の設計は、「リード」化合物に基づく医薬品の開発のための既知のアプローチである。これは、活性化合物を合成することが困難であるか費用がかかる場合、または具体的な投与方法に対して適していない場合に望ましいと考えられ、例えば、ペプチドは消化管内のプロテアーゼによって急速に分解される傾向があるため、経口投与用組成物に対しては適さない活性物質である。模倣体の設計、合成および試験は一般に、多数の分子を目標特性に関して無作為にスクリーニングすることを避けるために用いられる。
【０１８２】
所定の目標特性を有する化合物からの模倣体の設計には一般に用いられる工程がいくつかある。まず、目標特性を決定する際に決定的および／または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合には、これはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変化させることによって、例えば、各残基を順に置換することによって行いうる。このようなペプチドモチーフの精緻化にはペプチドのアラニンスキャンが一般に用いられる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られている。
【０１８３】
ひとたびファルマコフォアが発見されれば、その構造を、その物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズおよび／または電荷に従って、一定範囲の源、例えば分光法、X線回折データおよびNMRを用いてモデル化する。このモデル化プロセスには、コンピュータ計算による解析、類似性マッピング（原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷および／または体積をモデル化する）および他の手法を用いることができる。
【０１８４】
このアプローチの変法では、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造をモデル化する。これはリガンドおよび／または結合パートナーが結合時のコンフォメーションを変化させ、モデルが模倣体のデザインにこの点を考慮に入れることを可能にする場合には特に有用な可能性がある。
【０１８５】
続いて、ファルマコフォアを模倣する化学基を接合させることが可能なテンプレート分子を選択する。テンプレート分子およびそれに対して接合された化学基は、模倣体が容易に合成可能であり、薬理学的に許容性があり、インビボで分解せず、同時にリード化合物の生物活性を保つように、都合の良いように選択することができる。または、模倣体がペプチドをベースとする場合には、ペプチドを環化してその剛性を高めることにより、さらなる安定性を得ることができる。続いて、このアプローチによって見いだされた1つまたは複数の模倣体を、目標特性を有するか否か、またはどの程度それを示すかについて調べるためにスクリーニングすることができる。続いて、インビボ試験または臨床試験用の1つまたは複数の最終的な模倣体を得るために、さらなる最適化または改変を行うことができる。
【０１８６】
今回の場合には、他方のタンパク質と相互作用するために必要なF3またはNB-3の最小部分を同定するために、ペプチドマッピング試験を用いることもできる。続いて、このペプチドを、上記のように、模倣体の設計のためのリード化合物として用いることができる。
【０１８７】
抗体
抗体はさまざまなやり方で改変しうるため、「抗体」という用語は、必要な特異性を備えた結合ドメインを有するあらゆる特異的結合物質を範囲に含むものとみなされるべきである。したがって、この用語は、天然性または合成性にかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価物および相同体を範囲に含む。このため、免疫グロブリン結合ドメインまたは等価物が別のポリペプチドと融合されたものを含むキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694号およびEP-A-0125023号に記載されている。
【０１８８】
完全抗体の断片が、抗原と結合する機能を果たしうることが示されている。結合性断片の例には以下のものがある：（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFab断片；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iii）単一の抗体のVLおよびVHドメインからなるFv断片；（iv）1つのVHドメインからなるdAb断片（Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546(1989)）；（v）単離されたCDR領域；（vi）連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；（vii）1つのVHドメインおよび1つのVLドメインが、2つのドメインを結合させて1つの抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Fv分子（scFv）（Bird et al, Science, 242, 423-426. 1988；Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988）；（viii）二重特異性一本鎖Fv二量体（PCT／US92／09965号）および（ix）遺伝子融合によって構築された多価断片または多重特異性断片である「ダイアボディ（diabody）」（W094／13804号；P. Holliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993）。
【０１８９】
ダイアボディは、各ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第1のドメインおよび免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第2のドメインを含み、2つのドメインは連結されている（例えば、ペプチドリンカーによる）が、互いに会合して1つの抗原結合部位を形成することはできないような、ポリペプチドの多量体である。抗原結合部位は、多量体内部の1つのポリペプチドの第1のドメインと多量体内部の別のポリペプチドの第2のドメインとの会合によって形成される（WO94／13804号）。
【０１９０】
二重特異性抗体を用いようとする場合には、これらは、さまざまなやり方で製造しうる（例えば化学的にもしくはハイブリッド融合細胞から調製される）従来の二重特異性抗体でもよく（Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449(1993)）、または上述した二重特異性抗体断片のいずれかであってもよい。完全抗体よりもscFv二量体またはダイアボディを用いる方が好ましい。ダイアボディおよびscFvは可変ドメインのみを用いてFc領域を含まないように構築することができ、これによって抗イディオタイプ反応の影響が軽減されると考えられる。その他の形態の二重特異性抗体には、Traunecker et al, Embo Journal, 10, 3655-3659(1991)に記載された一本鎖「Janusin」が含まれる。
【０１９１】
抗体の免疫原性を最小限に抑えながら、非ヒト抗体の抗原結合特性を有する抗体を得るためには（例えば、それらをヒトの治療法に用いる場合には）、非ヒト（例えば、マウス）抗体を「ヒト化」することが望ましいと考えられる。すなわち、ヒト化抗体は、1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）からの残基が、所望の特性（例えば、特異性、親和性または能力）を有するマウス、ラットまたはウサギ抗体などの非ヒト種（ドナー抗体）のCDRからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（アクセプター抗体）由来のフレームワーク領域を含む。ヒト抗体のフレームワーク残基のいくつかを、対応する非ヒト残基により、またはドナー抗体にもアクセプター抗体にも存在しない残基により、置換することもできる。これらの改変は、抗体の特性をさらに改良および最適化するために作製される。
【０１９２】
以下に、本発明の第2の局面の具体的な態様を、添付した図面を参照しながら、例として示す。そのほかの態様も当業者には明らかであると考えられる。本文中で述べた文書はすべて参照として本明細書に組み入れられる。
【０１９３】
本発明の第2の局面の詳細な説明
結果
NotchはF3およびNB-3に対するオリゴデンドログリア表面受容体である
本発明者はF3およびNB-3に対するグリア受容体の同定に着手した。この2つの分子は、免疫グロブリンおよびフィブロネクチンIII型反復配列から構成される1つの基本構造を有する。以前の研究では、種々のインビトロモデルにおけるF3／テネイシン-R（TN-R）相互作用の影響について検討した（Xiao et al, 1996, 1997および1998、これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）。本研究にとって重要なことに、本発明者は、TN-Rの上皮増殖因子様反復配列がそのニューロン受容体F3に対する結合部位をなすことを示した。Notchの細胞外ドメインは主として上皮増殖因子様反復配列から構成されることからみて、これはF3およびNB-3のグリア受容体として十分に可能性のある候補である。この構造的な要因に加えて、軸索と接触した成熟過程にあるオリゴデンドロサイト上でのNotchの時間的および空間的な配置も、それがパラノードでのF3およびNB-3に対する受容体として適切であることの確証となる。実験にはオリゴデンドロサイト細胞系OLN-93を用いたため、これらの細胞が実際にNotch1およびNotch2の両方を表面に発現することを免疫細胞化学によって確かめた（図9c〜d）。
【０１９４】
本発明者はまず、F3およびNB-3がNotchの結合パートナーとなりうるか否かを明らかにするために基質接着アッセイを行った。これを行うために、OLN-93細胞をF3およびNB-3タンパク質基質上で、F3、NB-3およびNotchのそれぞれに対するブロッキング抗体の存在下または非存在下において培養した。その結果は、OLN93細胞がF3に対して容易に接着したこと、ならびにこの接着作用がF3基質ならびにNotch1およびNotch2のいずれに対する抗体によってもブロックされたことを示している（図9a〜j）。F3基質に対する細胞接着はNB-3抗体を添加した場合にも低下した。OLN-93細胞はNB-3に対しても接着し、NB-3、Notch1およびNotch2に対する抗体とのインキュベーションによって細胞の接着性は低下した。さらに、OLN-93細胞をNB-3上にプレーティングすると、それらは急速に顕著な形態変化を生じた。それらは拡大し、楕円形から、拡張性の細胞質シートを最も顕著な特徴とする環状の平坦な細胞へと転換した（図9c〜j）。この形態の変化は、OLN-93細胞をF3基質に対してプレーティングした時にも起こったが、これは長い時間を経た後のことであった（提示せず）。対照として、本発明者はウシ血清アルブミンおよび免疫グロブリンスーパーファミリーに属する別の神経細胞接着分子であるCHL1（Holm et al, 1996）を用いたが、いずれの基質もOLN-93の細胞接着を促進しなかった。このことは、F3／NB-3シグナルがオリゴデンドロサイトの分化を誘発する機構である可能性を示唆している。
【０１９５】
F3／NB-3とNotchとの間の相互作用に関する別の証拠を、マウスNotch1をトランスフェクトしたHeLa細胞をOLN-93細胞の代わりに用いることを除き、同じアッセイ系およびブロッキング抗体を用いて得た（図9k〜r）。この場合には、本発明者は興味深いことに、Notch1をトランスフェクトしたHeLa細胞がF3-Fcから反発され、F3およびNotch1に対する抗体を添加するとこの反発作用が逆転することを見いだした。NB-3-Hisの場合には、Notch1をトランスフェクトしたHeLa細胞の接着がみられ、これはNB-3およびNotch1に対する抗体を添加すると抑制された。これらの細胞試験は、NotchがF3およびNB-3に対する受容体であることを強く示唆する。
【０１９６】
F3およびNB-3はNotch上の特異な部位に結合する
F3とNotchとの会合およびNB-3とNotchとの会合の存在についてさらに分析するために、本発明者はいくつかの生化学的および分子的なアプローチを行った（図10）。ラット脳膜調製物を2％ Triton X-100中に溶解し、Notch1およびNotch2に対する抗体により免疫沈降させた。抗F3および抗NB-3を用いたウエスタンブロット分析により、抗Notch1抗体および抗Notch2抗体の沈降物がF3およびNB-3の両方を含むことが示された（図10a〜b）。非免疫性IgGによる対照免疫沈降物はF3およびNB-3のいずれに対しても陰性であった。逆免疫共沈実験において、抗F3および抗NB-3を同様の脳調製物の免疫沈降に用い、ブロットをNotch1およびNotch2に対する抗体によりプロービングした（図10c〜d）。これらの免疫共沈の結果から、F3／Notch相互作用およびNB-3／Notch相互作用がいずれも脳におけるタンパク質複合体の形成の基礎をなしている可能性が示された。
【０１９７】
この相互作用をさらに解明するために、Notch1の細胞外ドメインを、部分的に重複する同一サイズの4つの1.5kb断片に任意に分割し（図10e）、GST融合タンパク質を産生させるために、それぞれをpGEX-KG（Guan and Dixon, 1991）中にインフレームにサブクローニングした。この4種のタンパク質断片を形質転換大腸菌の誘導によって発現させた。この4種のNotch1タンパク質GST融合タンパク質断片に対する本発明者の命名はN末端からC末端の方向にN1.1、N1.2、N1.3およびN1.4とした。この4種の断片のクーマシーブルー染色およびイムノブロットを示している（図10f〜g）。Notch1に対する抗体はN1.3およびN1.4を特異的に認識した（図10g）。F3およびNB-3に対するOLN-93細胞の接着は同じNotch1抗体によってブロックされたという本発明者の所見からみて、F3およびNB-3は少なくともN1.3またはN1.4上に共通の結合部位を有すると思われる。
【０１９８】
本発明者は続いて、NotchとF3およびNB-3の両方との間に会合が存在するというさらなる生化学的証拠を得るためにGSTプルダウンアッセイを行った。4種類のNotch1 GST融合タンパク質を用いて、ラット脳可溶化物中のF3およびNB-3の両方と結合させた。ウエスタンブロット法による分析により、F3は2つの断片、すなわちN1.1およびN1.3（図10h）と会合するが、NB-3はN1.3としか会合しないことが見いだされた（図10i）。これらの結果は、F3およびNB-3がNotchの結合パートナーであって、それらがN1.3上に共通の結合部位を有するという本発明者の以前のデータを精緻化するのに役立つ。
【０１９９】
この生化学的相互作用をさらに裏づけるものとして、本発明者はこの4種のNotch1タンパク質断片を用いて、F3-トランスフェクトCHO細胞およびNB-3トランスフェクトCHO細胞をそれぞれの個々の断片に対してプレーティングする細胞接着アッセイを行った。これらの結果は、F3-トランスフェクト細胞は主としてN1.1およびN1.3と結合し（図10j）、NB-3-トランスフェクト細胞は主としてN1.3と結合する（図10k）という、GSTプルダウンアッセイによる所見を裏づけている。以上を総合すると、これらの結果は、NotchはF3およびNB-3に対する受容体として作用するという見解を裏づける生化学的証拠を与えるものである。
【０２００】
MAGの発現はNotchとF3／NB-3との間の相互作用によってアップレギュレートされる
以上の結果から、パラノードのF3およびNB-3とオリゴデンドログリアNotchとの間に分子相互作用が起こるという本発明者の仮説が、それらの物理的会合ならびにそれらがそれぞれ軸索（F3、NB-3）およびグリア（オリゴデンドロサイト表面でのNotch1発現）に位置することの証拠を提供したことにより、立証された。次に、本発明者は、このシグナル伝達イベントをいかにして髄鞘形成と関連づけられるかを検討した。髄鞘形成性オリゴデンドロサイトは軸索と接触して、それを多層性でらせん状の鞘の中に包み込むため、ミエリン鞘のタンパク質成分はイベントの進行に伴って必然的にアップレギュレートされるはずである。このため、本発明者は、OLN93細胞とF3またはNB-3をトランスフェクトしたCHO細胞との共培養物を用いて、F3／NB-3-Notch相互作用に関するこれらの細胞モデルにおけるミエリン特異的タンパク質の発現を調べた。OLN-93の純培養物ならびにOLN-93細胞と疑似トランスフェクト細胞、TAG-トランスフェクト細胞またはTAX-トランスフェクト細胞との共培養物を対照として用いた。これらの細胞培養物をホモジネート化して膜抽出物を調製し、CNSにおけるミエリン鞘の成分であるMAG（ミエリン付随糖タンパク質）およびPLP（プロテオリピドタンパク質）のレベルを確かめるために、それらをイムノブロット法により分析した。OLN-93細胞をF3-トランスフェクトCHO細胞またはNB-3-トランスフェクトCHO細胞（提示せず）と共培養するとMAGが特異的にアップレギュレートされることが示された（図11）。しかし、PLPレベルは検討したいずれの培養系でも同じであった。このことから、髄鞘形成環境ではF3／Notch相互作用またはNB-3／Notch相互作用が活動性であることが示唆された。この所見を裏づけるさらなる証拠を得るために、本発明者は次に、OLN-93細胞系の代わりに初代オリゴデンドロサイトを用いた場合にも、ミエリン特異的タンパク質に類似した変化が起こるか否かを分析することとした。すなわち、ラット（生後1日または2日）オリゴデンドロサイトの初代培養物を調製し、それらをF3-FcおよびNB-3-His融合タンパク質基質に対してプレーティングした。BSA（ウシ血清アルブミン）を対照基質として用いた。この場合も、この直接的な細胞-タンパク質接触は軸索リガンドとグリアとの接触を誘発した。細胞をタンパク質に対してプレーティングして2時間後に、これらの相互作用系のそれぞれから全RNAを単離し、MAGおよびPLPのmRNA発現レベルを測定するためにリアルタイムRT-PCRアッセイを行った。初代オリゴデンドロサイトをF3およびNB-3に対してプレーティングしたいずれの系においても、MAG発現レベルはBSAを基質として用いた対照系の約8倍の高さであることが認められた（表1）。しかし、PLPのmRNAレベルに関しては対照と比較して上昇は認められなかった。これらの所見はウエスタンブロット法の結果と一致しており、F3／NotchおよびNB-3／Notchシグナル伝達の結果としてミエリン特異的遺伝子のアップレギュレーションが生じることをさらに裏づける。
【０２０１】
NB-3およびJagged1は特異な軸索ドメインに局在する
Jagged1がいかにしてNotchを介してオリゴデンドロサイト分化に影響を及ぼすかについては説明されている（Wang et al, 1998）。オリゴデンドロサイト細胞突起がパラノードのF3およびNB-3に遭遇すると、別々の指令が、しかしながら同一の受容体Notchを介して伝えられると考えられる。F3およびNB-3がパラノード領域に限局していることが実証されたことにより、Jagged1がパラノードに囲まれた軸索区域、すなわち絞輪間部に限局しているならば、軸索髄鞘形成過程で作働するシグナルスイッチ機構が存在すると考えられることが明らかになった。このため、本発明者はラット脳幹矢状凍結切片におけるNB-3およびJagged1の分布を免疫蛍光を用いて調べた（図12）。動物の成熟に伴うNB-3の軸索分布パターンを調べられるように、生後2日、5日および14日の3種類の年齢群を分析した。P2ではNB-3の染色は観察されなかったが（図12a〜c）、P5までには（図12d〜f）NB-3がパラノードにクラスター化していることが認められた。この結果から、本発明者らは、NB-3が最初は軸索表面全体に散在性に分布し、その後の発生過程でパラノードに移行して明確なクラスターを形成する可能性が高いと推測した。重要なことに、Jagged1免疫反応は絞輪間部に限局し、パラノードとは分離していた（図12f）。これらの所見は、髄鞘形成性オリゴデンドロサイト上のNotch受容体は、それらが軸索に沿って絞輪間部から隣接パラノードに移動し、そのため異なるシグナルに順次曝露されると、軸索結合パートナーをJagged1からF3／NB-3に切り替える可能性があることを示唆する。
【０２０２】
NotchはF3のオリゴデンドログリア表面結合パートナーである
軸索のF3は、F3が髄鞘形成性グリアと相互作用すると考えられる部位であるパラノードに集合する（Girault and Peles, 2002）。Notchは、その細胞外部分が多くのEGF様反復配列を有し（Martinez Arias et：al, 2002）、成熟過程にあるOL上で高度に発現される（Lardelli et al, 1994；Wang et al, 1998）ことから、可能性の高い結合パートナーである。この相互作用について調べるためにOL細胞系OLN-93（OLN）を用いた。OLN細胞はラット脳グリア培養物中の自然形質転換細胞に由来し、成熟過程にあるOLとの類似性がある（Richter-Landsberg and Heinrich, 1996）。OLN細胞は前駆細胞表面マーカーA2B5をもはや発現せず、未熟OLの特徴であるミエリン塩基性タンパク質（MBP）の1つのアイソフォーム（14kDa）のみに対して陽性である。免疫細胞化学試験により、OLN細胞はNotch1およびNotch2を表面に発現することが確かめられた（図14Aa、b）。
【０２０３】
F3がNotchと結合しうるか否かを調べるために、細胞接着アッセイを以前の記載の通りに行った（Xiao et al, 1996）。OLN細胞をブロッキング抗体の存在下または非存在下においてF3-Fc（F3）基質に対してプレーティングした。OLN細胞はF3には容易に接着したが（図14Ac）、別の神経細胞接着分子であるCHL1-Fc（CHL1）に対しては接着しなかった（Holm et al, 1996）（図14Ad）。この接着はF3抗体（図14Aj）、Notch1抗体またはNotch2抗体（図14Ae、f、j）とのプレインキュベーションによってブロックされたが、免疫前血清および抗原除去したNotch1またはNotch2抗体によってはブロックされなかった（図14Ag、h、i）。また、マウスNotch1（mN1）をトランスフェクトしたHeLa細胞（Logeat et al, 1998）を、リガンド-受容体の関係性を調べるための別のアプローチである細胞反発アッセイに用いた（図14B）。mN1をトランスフェクトしたHeLa細胞は、疑似トランスフェクトHeLa細胞（図14Bb）とは対照的にF3から反発された（図14Ba）。この反発は細胞をF3抗体またはNotch1抗体で前処理することによって消失したが、免疫前血清による前処理ではこれはみられなかった（図14Bc）。これらの試験結果はNotch1がF3と相互作用することを示唆している。
【０２０４】
F3はNotch1上の特定部位と結合する
F3／Notch相互作用を確かめるために、ラット脳膜試料をNotch1抗体またはNotch2抗体により免疫沈降させた。F3抗体を用いた沈降物のイムノブロット法により、それらがF3を含むことが示された（図15Aa）。相互アッセイにおいて、F3抗体沈降物をNotch1抗体またはNotch2抗体によりプロービングした（図15Ab）。これらの結果はNotchおよびF3が複合体を形成しうることを示している。
【０２０５】
F3が結合するNotch1上の特定部位を同定するために、上記のように、マウスNotch1の細胞外ドメインをN1.1、N1.2、N1.3およびN1.4と命名した同一サイズの4つの断片に分割し（図15Ba）、それらを組換えGST融合タンパク質として産生させた（図15Bb、c）。前述の細胞試験に用いたNotch1抗体はN1.3およびN1.4を認識したが、N1.1もN1.2も認識しなかった。ラット脳可溶化物を用いたGSTプルダウンアッセイにより、F3がN1.1およびN1.3と会合することが判明した（図15Ca）。このことを確かめるために、F3-トランスフェクトCHO細胞（Gennarini et al, 1991）を、4種類のGST融合タンパク質をコーティングした培養皿に播いた。細胞は主としてN1.1およびN1.3と結合した。疑似トランスフェクトCHO細胞は結合しなかった（図15Cb）。
【０２０６】
F3およびNotch1は脂質ラフト中に共存しない
F3はOLの脂質ラフト中に局在する表面分子である（Kramer et al, 1999）。F3／Notch相互作用がこれらの微小ドメインでシス性に起こりうるか否かを確認するために、それらをP15ラット大脳皮質から単離した。報告されている通り（FaivreSarrailh et al, 2000）、F3およびCasprはともにショ糖密度勾配の画分5において検出された（図15D）。Notch1は細胞骨格関連タンパク質を多く含む画分9〜12のみに認められた（図15D）。成体ラット大脳皮質を用いた場合も同じ結果が得られた（提示せず）。したがって、F3およびNotch1が脂質ラフトの内部で側方性に複合体を形成する可能性は低いと思われる。以上を総合すると、これらの観察所見はF3がNotchのトランス性結合パートナーであることを示唆している。
【０２０７】
NICDはNotchがF3と相互作用した後に核に移行する
Notch活性化の直接的な結果は、NICDの放出および核への輸送である（Schroeter et al, 1998）。F3がこれらのイベントを開始させる機能的リガンドであるか否かを明らかにするために、myc標識した完全長マウスNotch1（mNotch1-myc）をOLN細胞に対してトランスフェクトした。細胞を種々のタンパク質で処理し、NICD抗体を用いてNICDに対して免疫標識した（Logeat et al, 1998）。F3処理細胞では、主として核内にNICDの濃染が観察され（図16Aa）、これはJagged1により誘導されるNICD移行と類似していた（図16Ab）。BSAはこのイベントを誘発することができなかった（図16Ac）。Notch1のEGF反復配列11-12に対する抗体（EGF 11-12抗体、これはNotch2と交差反応する。提示せず）とのプレインキュベーションにより、F3により誘導されるNICD移行は消失した（図16Ad）。Notch1の膜内挿入を阻害する化合物（Schroeter et al, 1998）であるブレフェルジンAおよびモネンシン（提示せず）も、NICD移行を阻止した。徐々に濃度を高めながらF3またはJagged1で細胞を処理したところ、NICDの核クラスター化は同じように増加し、このことから移行がF3またはJagged1の濃度に依存的な様式で起こることが示された（図16Ae）。F3またはJagged1をトランスフェクトしたCHO細胞と共培養したOLNではNotch2細胞内ドメイン（ICD）の産生も起こり、これは疑似トランスフェクトCHO細胞との共培養ではみられなかった（図16Af）。Notch2 ICD抗体はNotch1 ICDと交差反応しなかった（提示せず）。これらの結果は、F3がJagged1と同じようにNotch1およびNotch2を活性化し、その後のNICDの核移行を導くことを示している。
【０２０８】
F3はS3部位でのNotch膜内切断を誘導する
活性化のための前提条件として、Notchはプレセニリン依存性γ-セクレターゼによりS3部位（V1744）でRIPを受ける（Schroeter et al, 1998；Huppert et al, 2000）。F3により誘導される切断の性質を明らかにするために、mNotch1-mycをトランスフェクトしたOLN細胞をγ-セクレターゼ阻害薬とともにプレインキュベートし、その後にF3またはJagged1で処理した。いずれの場合にも、核内にNICD染色は観察されなかった（図16Ba、b）。さらに、タンパク質分解性の低下およびそれに平行した活性低下を示す2種類のS3切断変異体：V1744K-mycおよびV1744L-myc（Schroeter et al., 1998）をOLN細胞にトランスフェクトし、続いてそれをF3またはJagged1で処理した。細胞はc-myc免疫染色を、核内ではなく、主として細胞質中および細胞表面に示した（図16Bc〜f）。免疫沈降アッセイにおいて、F3またはJagged1で処理したV1744K-mycおよびV1744L-mycトランスフェクトOLN細胞からのc-myc抗体-沈降物は、NICD抗体（これは完全長Notch1（300kDa）も認識する）のみによって標識され（図16Bg、上図）、このことからこれらの変異型Notch1分子が完全な状態に保たれていることが示された。V1744抗体（これはS3から遊離したNICD（120kDa）のみを認識する）によるプロービングで反応性バンドを示したのは、F3またはJagged1で処理したmNotch1-mycトランスフェクトOLN細胞からの沈降物のみであった（図16Bg、下図）。以上を総合すると、これらの観察所見はF3がNotch1のS3部位でのRIPを誘導することを示唆している。
【０２０９】
F3／Notch相互作用はNotch1およびNotch2の発現をアップレギュレートする
F3はBSAとは異なり、核NICDの2倍の増加を誘導したが（図16Ca）、細胞質NICDには変化が認められず、このことはF3がNotch発現をアップレギュレートすることを示唆する。この点について調べるために、OLN細胞を疑似トランスフェクトCHO細胞、F3、TAG-1またはTAXをトランスフェクトしたCHO細胞と共培養した。TAG-1およびTAXはF3サブファミリーのメンバーである（Tsiotra et al, 1993）。OLN細胞をF3-トランスフェクトCHO細胞と共培養すると、Notch1およびNotch2の発現は増大したが、Notch3の増大はみられなかった（図16Cb）。リアルタイムPCRにより、可溶性F3はNotch1およびNotch2の転写物を増加させるが、Notch3転写物は増加させず（図16Cc）、一方、Jagged1はNotch2ではなくNotch1のみをアップレギュレートすることが確かめられた。このため、F3／Notch相互作用はNotch1およびNotch2を特異的にアップレギュレートするフィードバックループを成している可能性がある。
【０２１０】
オリゴデンドログリア突起はF3と接触すると形態が変化する
髄鞘形成過程における神経グリア接触の一連の筋書きをモデル化するために、細胞表面に発現されたF3と接触した時のOLN突起の形態を検討した。OLN細胞は初代OLよりも長い突起を伸ばすため、それらは接触時に起こるわずかな形態変化を観察するのに非常に適している。F3-トランスフェクトCHO細胞はパラノード軸索成分によく似ていた。疑似トランスフェクトCHO細胞、TAG-1-トランスフェクトCHO細胞およびTAX-トランスフェクトCHO細胞を対照として用いた。注目すべきことに、F3-トランスフェクトCHO細胞と接触すると、ほとんどのOLN突起は終端を形成し、平坦化して、細胞を包み込むかのようにCHO細胞の表面に広がる細胞質シートを形成した（図17a〜k）。しかし、これは疑似トランスフェクトCHO細胞（図17l、m）、TAG-1-トランスフェクトCHO細胞（図17n、o）およびTAXトランスフェクト細胞（図17p、q）では観察されなかった。伸びている突起の約80％はF3-トランスフェクトCHO細胞に達すると止まったが、他のCHO細胞ではその割合は20％に過ぎなかった（図17r）。これらの結果は、F3に遭遇するとオリゴデンドログリア突起に対して形態変化を誘導するシグナルが提示されることを示している。
【０２１１】
F3は、Jagged1とは異なり、MAGをアップレギュレートする
上記の形態変化をいかにしてF3／Notchシグナル伝達と関連づけられるかを検討するために、前述した共培養物におけるミエリン付随糖タンパク質（MAG）の発現を調べた。親CHO細胞およびトランスフェクトCHO細胞はDelta、Jagged1およびJagged2を発現しなかった（図18Aa）。共培養した細胞の膜抽出物のMAGに関するイムノブロット法を行った。OLN細胞におけるMAGの恒常的なレベルは極めて低く、さもなければ検出不能であった。しかし、OLN細胞をF3-トランスフェクトCHO細胞と共培養すると、MAGはアップレギュレートされた（図18Ab）。F3-トランスフェクトCHO細胞はMAGを発現しなかった（提示せず）。これに対して、リアルタイムPCRにおいて、F3基質に対してプレーティングした精製初代OLでは、BSAに播いた細胞と比較してMAG転写物が約16倍に増加した（図18Ac）。OLN細胞も同程度の効率のMAGアップレギュレーションを示した（提示せず）。
【０２１２】
免疫染色アッセイにおいて、mNotch1-mycをトランスフェクトしたOLN細胞を、MAGおよびOL特異的抗原の1つである2',3'-サイクリックヌクレオチド3'ホスホジエステラーゼ（CNPアーゼ）に対して免疫標識した。可溶性F3で処理したところ、Jagged1（図18Bb、c、e、f）またはBSA（提示せず）による処理と比較して、MAG染色の顕著な増加（図18Ba）およびCNPアーゼ染色の増加（図18Bd）が生じた。MAGおよびCNPアーゼの蛍光強度の定量により、F3処理した細胞では、Jagged1-またはBSAで処理した細胞（図18Bg）と比較してMAGが約300％に増加し、CNPアーゼ標識は約40％増加したことが明らかになった。Notch1 EGF 11-12抗体によるで細胞を前処理するとF3により誘導されるMAGおよびCNPアーゼの増加が阻止され（図18Bg）、このことからNotchがこのイベントに必要なことが示唆された。さらに、F3は細胞の平坦化およびシート様構造の形成を誘導した（図18Ba）。細胞によって覆われた基層面積の定量により、F3で処理した細胞によって覆われる面積はJagged1またはBSAで処理した細胞よりも2倍の多さであることが判明した（図18Bh）。これらの所見から、F3により誘導されるMAGアップレギュレーションが確かめられた
【０２１３】
MAGはF3／Notch相互作用によってアップレギュレートされる
このイベントにおけるNICDの関与をさらに解明するために、OLN細胞に対して、細胞内領域に欠損があるが細胞外リガンドとは結合しうる、V5標識ドミナントネガティブNotch1（dn-N1）またはNotch2（dn-N2）（Small et al, 2001）を一時的にトランスフェクトした。続いて細胞をF3で処理し、V5抗体およびMAG抗体により二重染色した。注目すべきことに、dn-N1-V5-陽性細胞（図18Ca）およびdn-N2-V5-陽性細胞（図18Cb）はいずれもMAGに関してほとんど標識されなかった。pcDNA4／V5／LacZ（LacZ）をベクター対照として用いた（図18Cc）。さらに、2種類のS3変異体、myc標識V1744K（図18Cd）およびV1744L（図18Ce）をトランスフェクトしたOLN細胞をF3で処理し、c-mycおよびMAGに対して二重染色した。いずれの場合にも、F3はc-myc陽性細胞においてMAGをアップレギュレートすることはできなかった。MAG蛍光強度の定量により、Notch1またはNotch2の機能障害、言い換えればNICDの欠如のために、F3により誘導されるMAGアップレギュレーションが起こらなくなったことが確かめられ（図18Cj）、このことからMAG発現にはNICDが必要であることが示唆された。
【０２１４】
このイベントにおけるF3の誘導的な役割について、細胞外ドメインに欠損があってリガンド非依存的な活性を有する（Small et al, 2001）、V5標識した構成的活性型Notch1（caN1）（図18Cf、g）およびNotch2（caN2）（図18Ch、i）をOLN細胞に導入することによってさらに調べた。すなわち、F3刺激が存在しなくても、NICDが生成されて核に移行する。OLN細胞では、caN1（図18Ac）およびcaN2（提示せず）は、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてHes1のトランス活性化をもたらした。トランスフェクション後に、細胞をV5およびMAGに対して二重染色した。免疫標識により、V5陽性細胞はMAGに対しては弱くしか染色されないことが示された（図18Cj）。Jagged1もNICD放出を誘導するがMAG発現は増加させないことからみて、これらの結果は、MAGアップレギュレーションにはF3により誘導されるNICDが必要なことを示している。
【０２１５】
F3／Notchにより誘導されるMAGアップレギュレーションはHes1には依存しない
Notchシグナル伝達の目立った特徴は、Hes遺伝子の振動的な様式での活性化である（Hirata et al, 2002）。このため、OLN細胞におけるHes1 mRNA発現について調べた。リアルタイムPCRにおいて、2mM EDTAによる細胞の非生理的な処理（Rand et al, 2000）は、最初の2時間でHes1 mRNAの急激な増加を誘発し、その後は3時間までに基礎レベルに戻るが（図19Aa）、これは内因性Hes1発現に対する精巧な内在的調節を反映している（Dale et al, 2003）。しかし、F3、Jagged1またはBSAによる処理は、内因性Hes1転写のベースライン振動レベルを、処理から短時間（最初の3時間）後にも長時間（12時間および24時間）後にも有意に変化させなかった（図19Aa）。
【０２１６】
F3により誘導されるMAGアップレギュレーションがHes1タンパク質の恒常的なレベルと関係するか否かを調べるために、Hes1アンチセンスオリゴヌクレオチド（Kabos et al, 2002）を用いてOLN細胞における基礎的なHes1タンパク質発現をブロックした（図19b）。MAGアップレギュレーションはこの処理によっても対照センスオリゴヌクレオチドによっても影響されなかった（図19Ad、e、g）。
【０２１７】
RBP-JはNotchにより調節される転写因子であり、Hes遺伝子を活性化することができる（Martinez Arias et al, 2002）。OLN細胞に対して、リジン218のヒスチジンへの変異を有し、Hes1プロモーター領域に対する有効な高親和性結合が起こらないドミナントネガティブRBP-J-myc（dn-RBP-J-myc）をトランスフェクトした（Kato et al, 1997）。Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、この変異体はcaN1によるHes1活性化を阻止することが示された（図19Ac）。トランスフェクションの後に、細胞をF3で処理し、c-mycおよびMAGに対して二重標識した。c-myc陽性細胞は近傍の非トランスフェクト細胞と同レベルのMAGを示した（図19Af、g）。これらの結果は、F3／Notchシグナル伝達により誘発されるMAGアップレギュレーションは内因性Hes1発現に依存しないことを示している。
【０２１８】
F3／Notchにより誘導されるMAGアップレギュレーションはDTX1を必要とする
蓄積されてきた多くの証拠により、DTX1がNotchシグナル伝達経路の別の細胞質下流エレメントであることが示されている（Martinez Arias et al, 2002）。F3により誘導されるMAGアップレギュレーションがHes1発現と関係しないことから、このイベントにおけるDTX1の役割を、myc標識した野生型DTX1（Yamamoto et al, 2001）および図示したその2つの欠失変異体（図19Ba）、すなわち、アミノ酸1〜411を含むHA標識DTX1変異体（DTX1-D1）（Yamamoto et al, 2001）およびアミノ酸1〜242を含むFlag標識DTX1変異体（DTX1-D2）（Izon et al, 2002）を用いて調べた。この2つの変異体は、DTX1の機能にとって必須の段階であるDTX1オリゴマー形成に働くRing-H2フィンガーモチーフを欠失している（Matsuno et al, 2002）。以前の観察と同じく（Yamamoto et al, 2001）、Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、過剰発現されたDTX1はcaN1によるHes1のトランス活性化を阻害することが示された（図19Bb）。これに対して、DTX1-D1およびDTX1-D2はともに、caN1に対するHes1応答を回復させた（図19Bb）。トランスフェクションの後にOLN細胞をF3で処理し、MAGおよび対応するタグに対して二重標識した。DTX1の過剰発現はF3により誘導されるMAGアップレギュレーションに対して何ら影響を及ぼさなかった（図19Bc〜e、l）。興味深いことに、MAGアップレギュレーションはHA陽性細胞またはFlag陽性細胞ではみられなかった（図19Bf〜l）。これらの観察所見は、F3／Notchにより誘導されるMAGアップレギュレーションがDTX1を必要とすることを強く示唆する。
【０２１９】
DTX1を介するF3／Notchシグナル伝達経路はOPCのOLへの分化を促進する
Jagged1／Notchシグナル伝達経路はOPCのOLへの分化を阻害する（Wang et al., 1998）。DTX1を介するF3／Notchシグナル伝達がOPC分化を指令するか否かを調べるために、前駆細胞マーカーNg2（Dawson et al., 2000）に対して陽性な精製OPC（図20a）を、BSA、F3またはJagged1により2日間処理し、その後にNg2およびOL特異的CNPアーゼに対して二重染色した（図20b〜d）。F3処理の後にはOPCの70％以上がCNPアーゼ陽性OLに分化し、BSA刺激後には約50％が分化したが、Jagged1処理ではほぼすべてのOPCが未分化のままっであった（図20k）。F3で刺激した細胞は、BSAで処理した細胞（図20b）よりも分枝化の度合いが高く、網状構造を呈する傾向がみられた（図20c）。OPCにdn-N1-V5（図20e、h）およびDTX1-D2-Flag（図20f、i）のそれぞれをトランスフェクトし、続いてF3で2日間処理することにより、NotchおよびDTX1の関与について検討した。他のOPCに対してはcaN1-V5をトランスフェクトし、その後の処理は行わなかった（図20g、j）。注目すべきことに、タグおよびCNPアーゼ（図20e〜g）またはNg2（図20h〜j）に対する免疫標識により、dn-N1（約75％）またはDTX1-D2（約67％）をトランスフェクトOPCのほとんどはF3の存在下でもNg2陽性のままであることが示された（図20k）。詳細には、dn-N1トランスフェクト細胞の約40％はCNPアーゼ陽性であったが、これらの細胞の分枝化の度合いは周囲の非トランスフェクト細胞よりも低く（図20e、挿入図）、このことから相対的に未熟な段階にあることが示された。しかし、CNPアーゼ陽性DTX-D2-トランスフェクト細胞はほとんど検出不能であった。以前の報告（Wang et al., 1998）に一致して、caN1-トランスフェクト細胞はNg2陽性のままに保たれ、CNPアーゼ陽性OLとなったものはほぼ皆無であり（図20k）、このことから、OPC分化を速めるためにはF3により誘導されるNICDが特異的に必要であることが示された。これらの結果は、DTX1を介するF3／Notchシグナル伝達がOPC発生を促進することを示している。
【０２２０】
NB-3はパラノードに位置する
本発明者の目的の中心を成すものは、伸長中のオリゴデンドロサイト細胞突起がランヴィエ絞輪となるように運命づけられた軸索ドメインに侵入するのを防ぐ停止シグナルとして作用する、パラノードでの軸索リガンドとオリゴデンドログリア受容体との間の相互作用を解明することである。その最初の段階は軸索リガンドの実体を示すことであった。可能性のある候補の中には、パラノードでCasprとの複合体として存在するF3がある（Rios et al, 2000）。ラット視神経線維におけるCasprとの二重標識によってパラノードおよび節の両方の位置にF3が存在することを示した以前の結果（Kazarinova-Noyes et al, 2001）もこの点で一致する。
【０２２１】
最近、GPI結合型細胞接着分子の1つであるNB-3が、F3／コンタクチンファミリーのメンバーとして同定された（Lee et al, 2000）。NB-3を発現する細胞の種類を明らかにするために、E17ラット小脳由来の精製した初代ニューロン、OLおよびアストロサイトを別々に培養し、NB-3および以下の特異的マーカーに対して二重染色した：ニューロンに対してはニューロフィラメント200（NF200）（図22Aa）、OLに対してはガラクトセレブロシド（Gal-C）（図22Pb）、アストロサイトに対してはグリア線維酸性タンパク質（GFAP）（図22Ac）。その結果から、NB-3を発現するのはニューロンのみであることが確かめられた。次にラット脳幹の発生過程におけるNB-3の発現をウエスタンブロット法によって調べた。F3とは異なり、NB-3の発現はE17から始まり、P0〜P21にプラトーに達してその後は低下したが（図22Ad）、これはMAGの発現亢進によって示されるようにOL発生期間と一致する。これらの観察所見はNB-3がニューロン由来分子であることを示している。これらの結果は、NB-3／Notchシグナル伝達がOL発生の複数の段階である特定の役割を果たしている可能性を示唆する。しかし、NB-3の厳密な位置および生理的な役割はまだ十分には解明されていない。
【０２２２】
F3／コンタクチンファミリーの2つのメンバーであるF3／コンタクチンおよびTAG-1は、節、パラノードおよびジャクスタパラノード領域に限定されて位置している（Girault and Peles, 2002）。詳細には、パラノードはランヴィエ絞輪に隣接し、神経グリア接合部のための接着部位を形成するが、これは髄鞘形成の開始およびミエリンループの安定化のために極めて重要である（Girault and Peles, 2002）。神経グリア相互作用におけるNB-3の役割を探るために、有髄軸索に沿ったNB-3分布を分析した。成体ラット脳幹矢状凍結切片に対して、モノクローナルNB-3抗体（これはF3とは交差反応しない（提示せず））およびCasprまたはナトリウムチャンネルに対するポリクローナル抗体を用いることによって二重免疫蛍光染色を行った。NB-3がCasprとまさに重複し（図22Ba〜c）、節性ナトリウムチャンネルに隣接していることに注目されたい（図22Bd〜f）。この空間的特異性を確かめるために、P15および成体（提示せず）ラット大脳皮質からの脂質ラフトにおけるNB-3分布を調べた。F3およびCasprは脂質ラフト中に共存した。以前の知見（Faivre-Sarrailh et al, 2000）と一致して、これらの2つのパラノード分子はショ糖密度勾配の画分5に共存した。興味深いことに、NB-3も主としてこの画分に位置していた（図22C）。以上を総合すると、これらの結果は、NB-3がパラノード成分として有髄軸索上でF3／Caspr複合体と共存する可能性があることを示している。
【０２２３】
NB-3はNotch1の機能的リガンドである
OL成熟過程におけるその発現プロファイルおよび特異的配置から、本発明者はNB-3がOL由来のNotch1と相互作用しうるか否かを明らかにすることに興味を抱いた。免疫沈降アッセイにより、成体ラット脳膜抽出物からのNB-3抗体沈降物中にはNotch1細胞外ドメイン（約190kDa）が検出され、一方、Notch1抗体沈降物はNB-3を含むことが示されたが（図23Aa）、このことはNB-3／Notch複合体の存在を意味する。成熟過程にあるOLに類似した永久細胞株であるOLN-93（OLN）細胞（Richter-Landsberg and Heinrich, 1996）を細胞接着アッセイに用いた。免疫細胞化学検査により、OLN細胞がNotch1を表面に発現することが示された（提示せず）。細胞はNB-3をコーティングした基質には結合したが、別の神経細胞接着分子であるCHL1（Holm et al, 1996）には接着しなかった。この接着はNB-3抗体またはNotch1抗体とのプレインキュベーションによってブロックされたが、F3抗体または免疫前血清とのプレインキュベーションではブロックされなかった（図23Ab）。Notch1をトランスフェクトしたHela細胞を用いた場合も同じ結果が得られた（提示せず）。Notch1上の結合部位をマッピングするために、マウスNotch1細胞外ドメインのサブクローニングされた同サイズの4つの連続した部分（N1.1、N1.2、N1.3およびN1.4と命名した）を、ラット脳可溶化物からのGSTプルダウンアッセイに用いた。イムノブロット法により、NB-3は、EGF反復配列22-34を含む領域であるN1.3のみと会合することが示された（図23Ac）。この特異性は、個々の組換え断片に対してプレーティングしたNB-3トランスフェクトCHO細胞は主としてN1.3と結合したが（図23Ad）、疑似トランスフェクトCHO細胞は結合しなかったという観察所見によって確かめられた。以上を総合すると、これらの結果はNB-3がNotch1のリガンドであるという見解を裏づけるものである。
【０２２４】
NB-3／Notch相互作用はOLN細胞におけるNICD核移行を誘導する
そのリガンドとの結合により、Notchの中核的なシグナル伝達機構はS3部位での調節性膜内タンパク質分解（RIP）にかかわり、これによってNICDが核内に放出される（Schroeter et al, 1998）。NB-3がNotch1の機能的リガンドであるか否かを探るために、myc標識した完全長マウスNotch1（mNotch1-myc）をトランスフェクトしたOLN細胞を、NB-3（図23Ba）、Jagged1（図23Bb）またはBSA（図23Bc）で処理し、NICD抗体により免疫染色した（Logeat et al, 1998）。NB-3およびJagged1はいずれもNICDの核内での濃縮を誘導したが、BSAは誘導しなかった。Notch1のEGF様反復配列を標的とするNotch1 EGF抗体は、NB-3により誘導されるNICD核クラスター化を阻止した（図23Bd）。NB-3により誘導されるNICD放出の特性を検討するために、OLN細胞をγ-セクレターゼ阻害薬とともにプレインキュベートし、その後にNB-3（図23Be）またはJagged1（提示せず）に曝露させた。いずれの場合にも核NICDクラスター化は消失し、このことからNB-3により誘導されるNICD放出にγ-セクレターゼが関与することが示された。さらに、S3切断を起こさない2つのS3変異体：myc標識V1744KおよびV1744L（Schroeter et al, 1998）をトランスフェクトしたOLN細胞は、NB-3（図23Bf、g）ならびにJagged1（図23Bh、i）によって誘導されるNICD核移行を首尾よく阻止することができた。ウエスタンブロット（図23Bj）では、NB-3またはJagged1で処理したV1744K-mycまたはV1744L-mycトランスフェクトOLN細胞のいずれからのc-myc抗体沈降物もNICD抗体（これは完全なNotch1（約250kDa）も認識する）のみによってブロットされ（上図）、V1744抗体（これはS3部位から遊離したNICDのみを認識する）によってはブロットされなかった。これに対して、mNotch-mycをトランスフェクトしたOLN細胞はNICD（約120kDa）を産生し、これはNB-3またはJagged1処理後にV1744抗体によりブロットされた（下図）。以上を総合すると、これらの結果は、NB-3がγ-セクレターゼ依存的なNotch1のS3部位でのRIPを誘導したことを示している。
【０２２５】
Hes1およびHes5はNB-3によっては活性化されない
核内でNICDはRBP-Jおよび／またはDeltex1（DTX1）などの転写因子と相互作用し、それによってHES遺伝子などの標的遺伝子を活性化する（Martinez Arias et al, 2002）。このため、OLN細胞におけるNB-3によるNotch1活性化と内因性Hes1 mRNAレベルとの相関を調べた。リアルタイムPCRにより、BSAとの比較で、NB-3誘導は同程度のレベルのHes1 mRNAおよび振動的発現パターンを生じさせることが示された（Ref）（図23Ca）。別の細胞接着分子であるL1を含む種々の処理の48時間後には、Hes1 mRNAは基礎レベルに保たれていた（図23Cb）。NB-3がHes1を活性化するか否かをさらに明らかにするために、Hesルシフェラーゼレポーターアッセイ（図23Cc）を用いた。Hes1もHes5もNB-3処理によっては活性化されなかったが、構成的活性型Notch1（caN1）（Small et al, 2001）はどちらのルシフェラーゼレポーターも活性化し、このことからNB-3がHes1およびHes5を活性化しないことが示された。
【０２２６】
NB-3／Notch相互作用はDTX1を介してMAGをアップレギュレートする
髄鞘形成におけるNB-3／Notch1シグナル伝達の影響をさらに検討した。OLN細胞とNB-3トランスフェクトCHO細胞または疑似トランスフェクトCHO細胞との共培養物からの膜抽出物を、OL成熟の顕著な特徴であるMAGに関してイムノブロットした。MAGは、NB-3-トランスフェクトCHO細胞と共培養したOLN細胞のみでアップレギュレートされた（図24Aa）。リアルタイムPCRにより、NB-3が、P5〜P7ラット大脳皮質からの初代OLにおけるMAG転写物を約24倍に増加させることが示された（図24b）。免疫染色からは、NB-3に応答してmNotch1-mycトランスフェクトOLN細胞のMAG染色が2.5倍に増加することが示され、Jagged1（図24Ad〜f）またはBSA（図24Af）とは対照的であった（図24Ac、f）。MAGのアップレギュレーションは細胞をNotch1 EGF抗体で前処理することによってブロックされた（図24Af）。MAGのアップレギュレーションにおけるNB-3／Notch1の役割を検討するために、細胞内部分に欠損があるがそれでも細胞外リガンドとは結合しうるドミナントネガティブNotch1（dn-N1）（Small et al, 2001）をOLN細胞にトランスフェクトした。このトランスフェクト細胞では、NB-3による処理後にMAGアップレギュレーションは観察されなかった（図24Ba、緑色）。さらに、V1744KまたはV1744LをトランスフェクトしたOLN細胞（緑色）でもMAGの増加は起こらなかった（図24Bb、c）。caN1単独ではトランスフェクト細胞におけるMAG発現を増加させることはできなかったことから（図24Bd、e、緑色）、これらの観察所見は、MAGのアップレギュレーションにはNB-3により生成されるNICDが必須であることを示している。
【０２２７】
NB-3により誘導されるMAGアップレギュレーションはDTX1を必要とする
このイベントに関与する転写因子を同定するために、OLN細胞に対して、DNAに対する有効な高親和性結合が起こらないドミナントネガティブRBP-J（dn-RBP-J）（Kato et al, 1997）（図24Bh）、DTX1（Yamamoto et al, 2001）（図24Bi）、またはDTX1のオリゴマー形成のために必要なRing-H2モチーフを欠いた2つのDTX1欠失変異体（図24Bf、j、k）：DTX1-D1（Yamamoto et al, 2001）およびDTX1-D2（Izon et al, 2002）をトランスフェクトした。Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、dn-RBP-JがcaN1によるHes1トランス活性化を阻害し、caN1に対するDTX1の競合的結合もこれに影響を及ぼした上、これがDTX1-D1またはDTX1-D2によって回復したことから、OLN細胞におけるこれらの構築物の有効性が確認された（図24Bg）。NB-3処理後に細胞をMAGに対して免疫染色し、蛍光強度を測定した（図24Bl）。dn-RBP-JによるOLN細胞におけるHes1の基礎的発現（緑色）の消失（図24Bh）は、NB-3により誘導されるMAGアップレギュレーションに影響を及ぼさないことが判明した。同様に、DTX1トランスフェクト細胞（図24Bi、緑色）はNB-3刺激に応答した。しかし、DTX1-D1およびDTX1-D2による内因性DTX1の機能障害（図24Bj、k、緑色）はこのイベントを消失させ、このことからDTX1がNB-3を介したMAG発現に関与することが示された。したがって、NB-3はNotch1受容体を活性化してNICDを放出させ、これが髄鞘形成過程においてDTX1を動員すると考えられる。
【０２２８】
発生過程でパラノードにクラスター化したNB-3はNotch1／DTX1シグナル伝達経路を介してOPC分化を促進する
NB-3はE17から発現されるため、初期発生段階の軸索では、二対の相互作用；Jagged1／Notch1およびNB-3／Notch1が共存する可能性がある。NB-3およびJagged1が段階的な様式で髄鞘形成に協調的に働くか否かを調べるために、発生過程におけるこれらの2つの分子間の軸索に沿った空間的相関についてまず検討した。P2、P5およびP14（提示せず）ラット脳幹の切片をJagged1（緑色）およびNB-3（赤色）に対して二重標識した。P2の時点では、Jagged1は軸索に沿って均一に分布し、集合性NB-3はほとんど検出されなかった（図25Aa）が、これはこの時期にはJagged1／Notch1シグナル伝達が優位に作用して軸索に沿った幼若OLループの移動を促進する可能性があるという以前の観察所見と一致する（Wang et al, 1998）。P5の時点では、NB-3はパラノードにクラスター化し（図25b、c）、Jagged1はジャクスタパラノードおよび絞輪間部を占めてパラノードNB-3とは分離した（図25A）。P6後にはJagged1発現が低下することから（Wang et al, 1998）、本発明者の観察所見は、OL成熟の後期にはこれらの二対の相互作用のバランスが壊れること、言い換えればNB-3／Notch1相互作用が優位に作用してCNSパラノードでのOL成熟を誘導することを示唆している。この見解を立証するために、P7 Wistarラット視神経由来の精製OPC（図25Ba）をBSA、NB-3またはJagged1で2日間処理した後に、前駆細胞マーカーであるNg2（赤色）および幼若OLマーカーであるCNPアーゼ（緑色）に対して免疫染色した（図25Bb〜d）。計数統計により、NB-3が、BSA（約50％）またはJagged1（約0％）処理に比して、OPCのCNPアーゼ陽性OLへの分化を促進すること（約75％）が示された（図25Bh）。NB-3により促進されるOPC分化におけるNotch1およびDTX1の関与についてさらに調べるために、OPCに対してdn-N1（図25Be）またはDTX1-D1（図25Bf）をトランスフェクトし、NB-3で同時に処理した。タグ（緑色）およびCNPアーゼ（赤色）に対する二重標識により、以前の研究（Wang et al, 1998）と同じく、いずれかの構築物の導入により、NB-3によって促進されるOPCのOLへの分化が有意にブロックされることが示された（図25Bh）。caN1をトランスフェクトしたOPCは未分化のままであった（図25Bg、h）。
【０２２９】
Deltex1を介するNB-3／Notchシグナル伝達は胚性神経幹細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を導く
NB-3／Notch1相互作用が神経幹細胞（NSC）からのオリゴデンドログリアの発生にも関与するか否かを探るために、NB-3およびNotch1の発生過程での発現パターンを調べた。ラット脳試料のウエスタンブロットにより、NB-3およびNotch1の両方が胚齢17日（E17）の時点で発現されており、出生後に急激に増加して、NSCからのオリゴデンドログリア発生期間に対応する生後0日（P0）〜21日（P21）に最高レベルに達することが示された（図26）。
【０２３０】
NSC：NB-3はNotch1の機能的リガンドである
次に、NSC上でのNotch1の発現を免疫蛍光法によって検討した。この検討に用いたNSCは、胚齢14日のBALB／cマウス胚線条体から単離した（Arsenijevic et al, 2001）。これらの細胞は、前駆細胞マーカーである中間径フィラメントタンパク質ネスチン（図27Aa）およびNotch1（図27Ab、c）を発現した。以前に観察したNB-3／Notch相互作用について確かめるために、プロテインAビーズに結合させたNB-3-Fc融合タンパク質を用いてNB-3の結合パートナーをNSC膜抽出物から沈降させた。沈降物はNotch1抗体により陽性にブロットされた（図27Ba）。さらに、P0ラット脳膜抽出物をNB-3抗体を用いて免疫沈降させてNotch1抗体によりブロットすること、およびその逆のことを行った（図27Ba）。ウエスタンブロットにより、NB-3およびNotch1が免疫共沈することが確かめられた。さらに、マウスNotch1（N1）をトランスフェクトしたHeLa細胞および疑似トランスフェクトHeLa細胞を、NB-3タンパク質をコーティングした基質にプレーティングすることにより細胞接着アッセイを行った。N1をトランスフェクトしたHeLa細胞はNB-3に接着したが（図27Bb）、疑似トランスフェクトHeLa細胞は結合しなかった（図27Bf）。この接着は細胞をNB-3抗体またはNotch1抗体とプレインキュベートすることによって阻止された（図27Bc、d）が、免疫前血清では阻止されなかった（図27Be）。これらの試験結果はNB-3がNotchの結合パートナーであることを裏づけている。
【０２３１】
NSC：NB-3はNICDの核移行を誘導するがHes1を活性化しない
リガンド結合によるNotch活性化はNICDの核移行によって特徴づけられる（Schroeter et al, 1998）。本発明者は、NB-3刺激に応答してNSCにおけるNICD核移行が起こりうるか否かを検討した。NB-3がOLN細胞におけるγ-セクレターゼ依存的なNICD核移行を誘導することは上記において観察されている。その試験と一致するように、三重染色の合成像により、ネスチン（緑色）陽性NSCのNB-3処理が、Hoechst 33258染色によって描出される核内でのNICDクラスター化（赤色）を引き起こすことが示され（青色）（図27Ca）、これはJagged1刺激によるものと類似していた（図27Cb）。しかし、BSAはこのイベントを誘発することができず（図27Cc）、このことから、NB-3がNotch1と特異的に相互作用して典型的なNICD核移行を引き起こすことが示唆された。古典的Notchシグナル伝達経路のもう1つの目立った特徴は、核NICDがHes遺伝子などの標的遺伝子をトランス活性化することである（Martinez Arias et al, 2002）。このため、Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、NB-3により生成されるNICDがHes1を活性化しうるか否かを調べた。その結果、NB-3はHes1をアップレギュレートしないが、Jagged1または構成的活性型Notch1（caN1）（Small et al, 2001）は予想通りHes1を活性化することが示された（図27Da）。蓄積されつつある証拠により、Deltex1（DTX1）が別のNotch下流エレメントであることが示されているため（Yamamoto et al, 2001）、pE7ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、DTX1を介するMash1転写活性に対するNB-3の影響を調べた（図27Db）。以前の報告（Yamamoto et al, 2001）に一致して、DTX1はpE7レポーターのMash1トランス活性化を阻害した。しかし、NB-3処理はこの阻害にある程度類似しており、これはDTX1欠失変異体の1つであり、機能的なDTX1ホモ二量体形成に必要なRingH2モチーフであるドメイン3を欠くFlagタグ標識DTX1-D2（Izon et al, 2002）によって起こらなくなった（Matsuno et al, 2002）（図29c）。これらの結果は、NB-3により生成されるNICDがDTX1に関連した転写イベントを媒介する可能性を示唆している。
【０２３２】
NSC：NB-3はOL発生を促進する
NB-3およびNotch1のいずれの発現もOL発生期間と同時に起こることから、本発明者は、NB-3／Notch相互作用がNSCからのオリゴデンドログリア発生に関与するか否かを調べた。これを行うために、分裂促進物質の非存在下ならびに血清およびNB-3（図28a、d）、BSA（図28b、e）またはJagged1（図28c、f）の存在下でNSCを7日間分化させた。Hoechst 33258によって染色された細胞（図28a〜f、青色）を、CLマーカー：CNPアーゼ（図28a〜c、赤色）；ニューロンマーカー：β-チューブリン（図28d〜f、赤色）；およびアストロサイトマーカー：GFAP（図28a〜f、緑色）に対して免疫染色した。その結果から、BSAおよびJagged1とは異なり、NB-3はOL発生を促進することが示された。一方、BSAと比較してNB-3は神経発生にはほとんど影響を及ぼさなかったが、Jagged1は以前の報告のようにこれを阻害した（Morrison et al, 2000）。フローサイトメトリーにより、NB-3はBSA処理に比してOLを2倍に増加させたが、Jagged1はOL発生を阻害したことから、これらの観察所見が裏づけられた（図28g）。
【０２３３】
NSC：DTX1を介するNB-3／Notchシグナル伝達経路はオリゴデンドログリア発生を指令する
Notch1のこのイベントにおける関与を確かめるために、NSCに対してV5標識ドミナントネガティブNotch1（dn-N1）（Small et al, 2001）をトランスフェクトした。dn-N1は細胞内領域に欠損があるものの細胞外リガンドとは結合可能である。Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、dn-N1はJagged1処理に応答してHes1を活性化することができないことが示された（図29h）。続いて分裂促進物質を除去し、NB-3を培地に添加した。V5とCNPアーゼまたはGFAPに対する二重標識により、dn-N1によるNotch1の機能障害はNB-3により促進されるオリゴデンドログリア発生を停止させ、アストロサイトの形成を促すことが示された（図29a、b、i）。DTX1がNB-3により誘導されるOL形成に関与するか否かをさらに調べるために、NSCに対してFlag標識DTX1-D2をトランスフェクトした（図29c）。Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、DTX1はcaN1によるHes1活性化を阻害するが、DTX1-D2はcaN1によるHes1増加を回復させることが示された（図29h）。NB-3の存在下で分化した後に、NSCをFlagおよびCNPアーゼまたはGFAPに対して免疫染色した。その結果から、DTX1-D2トランスフェクト細胞はNB-3刺激後にOLに分化することができず、アストロサイトへと誘導されることが示された（図29d、e、i）。さらに、以前の研究（Tanigaki et al, 2001）と同じく、NSCへのcaN1の導入はアストログリア発生を引き起こしたが、OL発生は抑制した（図29f、g、i）。これらの観察所見は、NB-3がNotch／DTX1シグナル伝達経路を介してオリゴデンドログリア発生を促進したことを示している（図30）。
【０２３４】
本発明の第2の局面に関する考察
分子的、細胞的および形態的アプローチを用いて、本発明者は、髄鞘形成における神経グリアシグナル伝達にとって極めて重要な部位であるパラノードでのNotchとF3／NB-3との間の機能的な分子相互作用を同定した。新たな軸索接着分子であるNB-3はパラノードに局在することが判明した。この相互作用は、軸索髄鞘形成過程における髄鞘形成性オリゴデンドロサイトの分化を調節し、ランヴィエ絞輪と推定される箇所にミエリンが侵入することを防ぐように作用する可能性がある。立証されているNotch／Jagged1シグナル伝達経路に加えて、本発明者は髄鞘形成過程の状況下での新規なNotchリガンド、すなわちF3およびNB-3に関する証拠も提供したが、これはJagged1およびF3／NB-3を介するシグナル伝達が協調的な様式で髄鞘形成をもたらす可能性を示唆している。
【０２３５】
本データは、接着分子F3がNotchの新たな機能的リガンドであることを示している。F3／Notch相互作用はNICDの生成および核移行を誘導し、Notch1およびNotch2の発現を高める。これはOPC分化を促進し、OLN細胞および初代OLにおいてMAGをアップレギュレートすることから、F3がOL成熟において調節的な役割を果たす可能性が示された。以上より、阻害因子としてのJagged1および正の指令物質（instructor）としてのF3を介するリガンド特異的Notchシグナル伝達は、髄鞘形成を協調的な様式で調節すると思われる（図21）。
【０２３６】
本データは、NB-3がNotchのもう1つの新たな機能的リガンドであることも示している。細胞外NB-3／Notch相互作用によって膜からNICDが放出され、これがDTX1を動員して核内に移行し、そこでこの複合体が直接的または間接的にCNPアーゼの発現を媒介することにより、オリゴデンドログリアの発生を促進させる（図30）。
【０２３７】
NotchはF3／NB-3のオリゴデンドログリア表面受容体である
髄鞘形成が適切に協調的になされるためには、直感的には、軸索およびオリゴデンドロサイトの両方が積極的に関与して双方向的な情報交換を行わなければならないと考えられる。新たに生まれてきた概念は、活動性の神経グリアシグナル伝達チャンネルがパラノードに位置し、そこに細胞質で満たされたグリアループがらせん状となって隣接する軸索鞘膜に陥入するというものである。パラノード性の軸索およびグリア分子のメンバーは記載されているが、髄鞘形成の調節におけるそれらの機能的相互作用はほとんど明確にされていない。グリアNotchが軸索F3およびNB-3の受容体として作用しうるという見解を裏づけるものとして、本発明者は免疫共沈実験およびGSTプルダウンアッセイにより、これらの分子が物理的に相互作用することを示した。さらに、本発明者は、Notch1の細胞外ドメインで、F3との相互作用が起こる2つの領域（N1.1およびN1.3）を同定したが、その一方（N1.3）はNB-3結合に関与するものと共通するか部分的に重複する。
【０２３８】
NotchはF3／NB-3の機能的受容体である
本研究は、成熟した髄鞘形成性オリゴデンドロサイトがランヴィエ絞輪と推定される箇所に侵入して髄鞘を形成することを防ぐ分子的停止シグナルが存在することを提唱する。本発明者は、OLN-93細胞から伸びたオリゴデンドログリア突起はF3-トランスフェクトCHO細胞の表面に終端を形成してそこに広がるという直接的な証拠を有する。このシグナルの分子的基盤はF3とNotchとの間の相互作用である。この裏づけとして、F3基質上で培養したOLN-93細胞およびNotch1をトランスフェクトしたHeLa細胞を用いる接着アッセイでは、提唱したリガンド受容体対に対する特異的抗体によって細胞相互作用が破壊されることが示されている。F3がパラノードに存在することを確かめた以前の形態学的データと、オリゴデンドロサイト表面にNotch受容体が発現されることを示した本発明者のデータを総合することにより、本発明者は、F3シグナル伝達相互作用がパラノードに実際に存在し、オリゴデンドログリア突起がさらに伸長するのを防ぐように作用することを示唆した。この興味深い成果は、有髄絞輪間部の側方制限を調節する機序の仮説を示している点でユニークである。F3と同様のやり方で、本発明者は、NB-3がNotch1のリガンドであるという証拠も提供した。F3またはNB-3に対するNotch1発現性HeLa細胞のプレーティングは相互作用の点で異なる結果をもたらした；NB-3基質に対しては接着性であり、F3基質に対しては反発性であった。これは、二部位（dual site）でのF3-Notch相互作用（細胞反発を引き起こす）および単一部位でのNB-3-Notch相互作用（接着を媒介する）によって異なるシグナルが生じることに起因する可能性がある。NB-3に対してプレーティングしたOLN-93細胞は急速な分化および形態変化を起こし、最終的には細胞体が平坦なシート様の外観を呈するが、これはおそらく、オリゴデンドロサイトが接触した軸索に髄鞘を形成する準備をする際の、髄鞘形成の多相的な過程における分化段階に相当すると思われる。しかし、F3／Notch相互作用およびNB-3／Notch相互作用の基礎をなす共通のテーマは、タンパク質およびmRNAの両方のレベルでのMAGのアップレギュレーションによって示されるように、この両方が髄鞘形成と結びついている点にある。
【０２３９】
複数のリガンドがグリア由来Notchにシグナルを伝達し、髄鞘形成に協調的に働く
髄鞘形成は複雑な性質を有するため、協調的で動的な一連の軸索-グリア相互作用が必要であり、これらはトランス相互作用性構成要素の時間的および空間的な分布によって調節されている可能性が高い。このような調節的相互作用の1つは、ラット視神経における軸索Jagged1とオリゴデンドロサイト由来Notch1との相互作用にかかわる（Wang et al, 1998）。Jagged1によるNotch受容体の活性化は、オリゴデンドロサイトの分化を阻害し、その細胞突起の軸索に沿った移動を促進する。ある視神経モデルでは、Jagged1は時間経過に伴ってダウンレギュレートされ、これは髄鞘形成と平行して起こる。髄鞘形成は標的の神経支配の後にはじめて起こるという知見（Schwab and Schnell, 1989）に一致して、ほかの研究でもJagged1のダウンレギュレーションは軸索が標的に到達してはじめて起こることが示されている（Dugas et al, 2001）。オリゴデンドロサイトを未熟な状態に維持させるJagged1／Notchシグナルはこれによって抑制され、オリゴデンドロサイトの成熟ミエリン形成細胞への分化が漸増的に起こる。この重要なシグナルは、続いてオリゴデンドログリア細胞突起の接触および軸索に沿った拡張を可能にする可能性がある。本発明者の結果は、Notch受容体が他のリガンド、例えばパラノードでの陽性シグナルとしてのクラスター化F3／NB-3などへのスイッチングを行い、髄鞘形成過程の開始を誘発するという見解を裏づける。このリガンドスイッチ機構は、軸索阻害シグナルによって抑止されている分化中のオリゴデンドロサイトがその後にミエリン形成細胞へと成熟するという相転移の基礎もなしている可能性がある。
【０２４０】
髄鞘形成の空間的調節は軸索に沿った分子のクラスター化によって行われる可能性がある。ナトリウムチャンネルのクラスター化は記載されている（Salzer, 1997）。成熟過程にある神経では、Caspr分子が徐々に節に集まり、その両側に密なバンドである「Casprらせん」を形成する（Pedraza et al, 2001）。
【０２４１】
オリゴデンドロサイト自体も、分子局在を導くことによるパラノード形成の促進に非常に重要であるように思われる。MBP-TKにおいてFIAUによりオリゴデンドロサイト除去を誘導すると、Casprの局在異常が起こる（Mathis et al, 2001）。重要なこととして、MBP-TK脳における少数の髄鞘形成性オリゴデンドロサイトは、MBP陽性ドメインに近接したCasprの限局的クラスターと会合していた。jimpyマウスでは、オリゴデンドロサイトの自然変性およびCasprの局在異常が起こる（Mathis et al, 2001）。本発明者の以前の研究も、髄鞘再形成性末梢神経において、F3が最初は脱髄神経線維に沿って散在性に分布し、髄鞘形成性シュワン細胞の作用によってパラノードにクラスター化する様式を示している。特に、F3クラスター化はシュワン細胞の伸長中の辺縁に認められる（Kazarinova-Noyes et al, 2001）。本明細書に示した結果は、NB-3も、それがP2軸索に沿ってはほとんど検出されないが、P5およびP14ではパラノード染色に対応する明瞭なバンドの対を形成することから（図12）、同様のクラスター化過程を受けることを示唆している。この結果も、オリゴデンドロサイトがCaspr、F3およびNB-3などの軸索分子のクラスター化のために必要な可能性があることを裏づけている。
【０２４２】
オリゴデンドログリア依存的なクラスター化は軸索タンパク質のドメインへの再分布を引き起こすだけでなく、以前は散在性に分布していた分子が高密度バンドに詰め込まれるという点で「用量効果」ももたらす。グリア受容体に有効にシグナルを伝達して「停止」作用を発揮するのは濃縮された軸索リガンドのみであると思われ、このことは軸索分子が散在性に分布している神経グリア接触の初期に停止シグナルが早まって活性化されることがない理由を説明すると思われる。このようにして、クラスター化は軸索の手がかり（cue）のスイッチング、例えば、Notch受容体の節間Jagged1からパラノードF3およびNB-3へのスイッチングを促進しうると考えられる。この手かがりのスイッチングは、軸索髄鞘形成における必須の調節機構であると考えられる。本質的には、髄鞘形成性オリゴデンドロサイトは、かなりの単純化になるが、側方先端に掘削機を備え、その動力エンジンを起動させ（オリゴデンドロサイト分化がJagged1／Notch阻害シグナルのダウンレギュレーションによって誘発されると）、前進するに伴ってますます大量の土砂を蓄え（節性およびパラノード性分子のクラスター化）、その後に組み込まれたフィードバック機構（クラスター化した「高用量」F3のオリゴデンドログリアNotchに対するシグナル伝達）を介してブレーキをかけて停止する、機械に準えることができる。
【０２４３】
数多くの研究が、髄鞘形成過程において役割を果たす可能性のあるシグナル伝達機構、例えばニューロファシン（Martin-Collinson et al, 1998）およびN-カドヘリン（Schnadelbach et al, 2001）の役割を取り扱っている。本発明者は、パラノードにある神経グリア接合部の膜タンパク質は、双方的シグナル伝達のための導管として、軸索ドメインの構造の組織化に働くことを目的とする選択的な分子篩および拡散障壁として作用するという、Pedraza et al(2001)によって提唱された見解を支持する。並んで位置した軸索鞘およびグリア膜ループの膜タンパク質は、接着分子を介して相互作用することにより、軸索鞘表面に沿って「移動」する分子篩および障壁の柔軟な構築物を形成し、ナトリウムチャンネルを押し出してそれらを節に集めるとともに、カリウムチャンネルを通過させてジャクスタパラノードに到達させる。軸索鞘分子およびグリア分子の細胞質ドメインと結合した細胞内タンパク質も、この障壁／篩分け作用に大きく貢献する可能性がある。F3およびNB-3はいずれも軸索表面に存在するGPI結合型分子であることから、それらと膜貫通タンパク質とのシス相互作用およびそれに伴う細胞内シグナル伝達経路を調べることは興味深いと考えられる。CasprはF3と会合し、その細胞内部分を介してタンパク質4.1ファミリーのメンバーと相互作用する（Baurngartner et al, 1996；Ward et al, 1998）。これによってCasprはスペクトリンおよび軸索細胞骨格と結びつけられる（Hoover and Bryant, 2000）。CGT欠損マウスにおいて、クラスター化したナトリウムチャンネルを含むがF3、Casprおよびカリウムチャンネルは異常に分布している完全な状態のランヴィエ絞輪が存在することは、他にも重要なシグナル伝達機構が存在するという事実の証拠となる（Coetzee et al, 1996；Bosio et al, 1998）。この酵素（UDP-ガラクトース-セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ）はガラクトリピドの合成に必要であるため、脂質分子も髄鞘形成の重要な調節因子である可能性がある。神経グリア接合部の構成および成分を明確にするためのさらなる研究は、障害されたCNSの髄鞘再形成を促進させる意味のある戦略が生まれる元になると期待される知識基盤を創出するのに疑いなく役立つと考えられる。
【０２４４】
本研究は、Notchシグナル伝達の新たな側面、すなわちシグナル伝達リガンドとしてのF3およびNB-3の存在も明らかにした。これらの神経細胞接着分子は神経系に比較的広範囲に分布し、Notchを介するプロセスを媒介している可能性がある。現在、Notch受容体は、DSL（Delta、Serrate、Lag-2）リガンド、CSL（CBF1、hairless抑制因子、Lag-1）転写補助因子、およびHES（Hairy/Enhancer of Split）ファミリーの塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス転写調節因子として分類されている遺伝子標的に関して最も研究されている。Notch受容体は古典的には、発生過程における細胞運命の選択に重要な役割を果たす（Artavanis-Tsakanos et al, 1999；Baker, 2000；Mumn and Kopan, 2000）。発生過程における神経発生のほかに、Notchはグリア発生にも関与し（Morrison et al, 2000）、Tリンパ球の発生（Robey et al, 1996）、血液悪性腫瘍（Ellisen et al, 1991）および家族性脳卒中症候群（Joutel et al, 1997）とも関連づけられている。Notchは調節的な膜内タンパク質分解を受ける少数のタンパク質の1つとしても独特である（Weinmaster, 2000）。このため、細胞接着分子によるこれらのプロセスの調節は新たな研究手段ともなっている。
【０２４５】
NotchはF3のオリゴデンドログリア表面受容体である
神経グリア接合部での接着性接触は、F3-Caspr-ニューロファシン155ヘテロ三量体に一部は起因する（Girault and Peles, 2002）が、この複合体の厳密な役割は今後さらに解明する必要がある。本明細書において、本発明者は、F3とNotchとの間の新規なリガンド受容体相互作用を明らかにした。細胞接着／反発アッセイおよび生化学的アプローチにより、NotchおよびF3が結合パートナーであることが示された。さらに、Notch1上のF3結合のための2つの細胞外部位、すなわちN1.1およびN1.3が同定された。このうち前者はDSL結合に関与するEGF反復配列11-12を含む（Rebay et al, 1991）。F3はOL表面にも発現され（Koch et al, 1997）、グリア細胞内Fynにシグナルを伝達し、続いてそれがTauタンパク質と相互作用して髄鞘形成を媒介する（Klein et al, 2002）。可溶性F3は十分にF3／Notchシグナル伝達を誘発する上、脂質ラフトアッセイによってNotch1がF3を豊富に含む画分には局在しないことが示されているため、F3はNotch1とシス性には相互作用しないと思われる。NotchおよびF3が脳の種々の領域、特に神経グリア接合部に共存することから（Lardelli et al, 1994；Revest et al, 1999）、これらの結果はNotchのトランス作用性リガンドとしてのF3の役割を示唆している。
【０２４６】
F3／Notchシグナル伝達はNICDのタンパク分解性放出を誘導し、Notch相同体をアップレギュレートする
RIPはNotchおよびAPPなどの非核内前駆体に由来する核シグナル伝達タンパク質の生成のことであり、これは細胞のシグナル伝達レパートリーに予期されなかった多様性を付与する可能性のあるシグナル伝達の新たなパラダイムである（Ebinu and Yankner, 2002）。本発明者は、DSLの場合と同じく、OLN細胞におけるF3結合がNotchのS3部位での膜内タンパク質分解およびその結果生じたNICDの核移行を誘発することを示した。Notch1 EGF（EGF 11-12）抗体またはブレフェルジンAおよびモネンシンがこのイベントを阻止しうることから、膜内切断によるNICDの生成および輸送のためには細胞外F3／Notch相互作用が必須であることが示唆された。すなわち、これはRIPの別の例である。さらに、F3／Notchシグナル伝達経路は、Notch1およびNotch2（Notch3ではなく）の発現を特異的に増加させる、またはNotch1およびNotch2を急速分解に対して防御するフィードバックループを活性化させる可能性がある。いずれの場合にも、これは消費された受容体を細胞表面に補給し、これによってシグナルを連続的に持続させる働きをすると考えられる。
【０２４７】
DTX1を介するF3／Notchシグナル伝達に関して考えられるモデル
F3およびJagged1はNotch1上に共通の結合ドメインを有することから、髄鞘形成の前に起こるJagged1のダウンレギュレーションはNotchのF3との相互作用の交替を可能にする可能性がある。OLN細胞において、Jagged1およびF3はいずれも、γ-セクレターゼを介しかつS3により導かれるNICDの放出およびその後の核移行を誘発する。さらに、caN1はHes1をトランス活性化し、これはdn-RBP-J-mycまたはDTX1の同時発現によってブロックされる。このため、F3により誘導されるNotch細胞内シグナル伝達にはRBP-Jが付随すると考えることができる。しかし、MAG発現を増大させるのはF3により誘導されたNICDのみであり、Jagged1により誘導されたNICDもcaN1およびcaN2も増大させないため、このことはこのイベントが特異的な細胞外リガンド-受容体相互作用を必要とする可能性を示唆する。さらに、dn-RBP-J-mycまたはHes1アンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを用いた実験により、内因性Hes1発現の阻止はF3／Notchにより誘導されるMAGアップレギュレーションに関与しないことが示されている。これに対して、機能的なホモ二量体性DTX1の形成に不可欠なRing-H2フィンガーモチーフを欠失したDTX1の2つの短縮型変異体（Matsuno et al, 2002）は、F3により促進されるOPC分化およびMAGアップレギュレーションの両方を阻止する。以上より、リガンドのスイッチングがNotch細胞内シグナル伝達エフェクターを変化させる可能性があることを提唱した（図21）。異なるリガンドの結合は異なるNotchコンフォメーションの形成を誘導する可能性がある。このようなコンフォメーション変化は、Jagged1およびF3によって認識される、異なるものの部分的には重複するNotch領域に起因すると考えられる。異なるコンフォメーションを有するNotch受容体は、切断の前または後に、異なる細胞質因子、例えばDTX1と相互作用する可能性がある。その後に核に到達したNICDの形態により、さらなる相互作用が特定され、その転写標的が決定される。この仮説を検討し、F3／Notchシグナル伝達に必要なDTX1関連転写補助因子を同定することには意味があると考えられる。
【０２４８】
DTX1を介するF3／Notchシグナル伝達のOL成熟における役割
Jagged1／Notchシグナル伝達はOPCを未分化段階に維持する一因となる（Wang et al, 1998）。多発性硬化症（MS）において効率的な髄鞘再形成がうまく起こらないことは、一部には、アストロサイトにより発現されたJagged1によるOPC Notchの活性化に起因する（John et al, 2002）。しかし、Jagged1発現はP6前後から急激に低下し（Wang et al, 1998）、これは髄鞘形成および軸索F3のパラノード（これは新たに生じたOL表面のNotch受容体と相互作用するには理想的な位置である）でのクラスター化が起こる時期と一致する（Kazarinova-Noyes et al, 2001）。OPCにおけるNotch1が選択的に除去された変異動物（Genoud et al, 2002）は異所性未熟OLを特徴とし、そのほとんどはアポトーシスを起こすが、このことはNotch受容体の非存在下での自律的分化は秩序に乱れがある可能性があること、ならびにOLの適切な分化および生存のためにはJagged1／Notch以外に他の調節シグナル伝達カスケードが必要と思われることを示している。本明細書では、F3がOPC分化を促進し、それをドミナントネガティブNotchおよびDTX1欠失変異体のいずれによってもブロックしうること、ならびにOLN細胞から伸びたオリゴデンドログリア突起がF3-トランスフェクトCHO細胞に終端を形成してその表面に広がり、それがMAGおよびCNPアーゼなどのミエリン特異的タンパク質のアップレギュレーションと関連したイベントであることが観察された。Notchが固定化されたF3または可溶性F3のいずれかと相互作用すると、成熟OLの特異的マーカーであるMAGがタンパク質およびmRNAの両方のレベルで有意にアップレギュレートされる。MAGのアップレギュレーションはNotch1およびNotch2のドミナントネガティブ構築物またはDTX1の欠失変異体によってブロックしうる。これらの観察所見は、OL成熟がDTX1を介するF3／Notchシグナル伝達を必要とすることを示している（図21）。
【０２４９】
以上をまとめると、本研究により、Notchシグナル伝達経路の新たな側面が明らかになった。F3によって活性化されると、DTX1を介するNotchシグナル伝達は、OPCのOLへの分化を抑制することのみに働くのではなく、ある種のミエリン関連タンパク質をアップレギュレートすることによってOL成熟に持続的に関与する。したがって、この知見は、Notchが内因性または外因性F3と優位に相互作用してF3／Notch／DTX1シグナル伝達経路を開始する環境を作り出すことによって、MSなどの変性疾患における髄鞘再形成を促進させるための効率的な分子的手がかりとなる可能性がある。
【０２５０】
NB-3はパラノード構造の新たな構成要素である
神経系の発生過程における有髄軸索の構築は高度に組織化された現象であるが、このプロセスの分子的詳細は未だに不明である。ミエリン髄鞘形成の分節的性質に加えて、軸索分子の再分布が起こることにより、成熟神経線維における明確な軸索ドメインが作られる。種々の軸索ドメインの分子的構成に関しては詳細な総説がある（Morell and Quarles, 1999；Arroyo et al, 2000；Peles and Saizer, 2000；Denisenko-Nehrbass et al, 2002）。パラノードの構成要素には、ニューレキシンスーパーファミリー分子Casprと会合した状態にある軸索F3、およびオリゴデンドログリアのニューロファシン155（NF-155）が含まれる（Rios et al, 2000；Tait et al, 2000）。F3ヌルマウスの研究により、F3は末梢神経系（PNS）における神経グリア装置の合成に重要な役割を果たすことが判明した。この変異マウスは生後18日までに死亡するが、その前に後肢筋力低下を伴う失調性表現型を示し、これは小脳介在ニューロンにかかわる結合障害、ならびに神経の伝導速度および興奮性の低下に起因するとされている（Berglund et al, 1999；Boyle et al, 2001）。神経インパルス伝導に関する後者の障害は、有髄末梢神経における神経グリア接合部の形成異常を反映している。F3のパラノード機能と一致して、これらの異常には神経グリア接合部の秩序の乱れ、およびF3のシス性結合パートナーであるCasprの軸索膜への輸送異常が含まれる（Boyle et al, 2001）。接着性の神経グリア相互作用がF3変異マウスでも依然として生じたという事実は他のパラノード分子の関与を示すものであり、NB-3はそのような候補の1つである。PNSにおけるNB-3の分布／局在は不明であるが、CNSではNB-3は嗅球、大脳皮質の第I層、III層およびV層、梨状皮質、視床前核、青斑核、中脳三叉神経核および小脳プルキンエ細胞で発現される（Lee et al, 2000）。本発明者は、NB-3がP5〜成体期にパラノードにクラスター化してCasprと共存することを示したが、このことはそれがPNSでも同じように局在している可能性が高いことを示唆する。
【０２５１】
NB-3のCNSパラノードでのクラスター化はNotch／Deltex1シグナル伝達経路を介してオリゴデンドロサイト前駆細胞の成熟を促進する
以上をまとめると、以上の研究により、ニューロン由来分子の1つであるNB-3がNotch1の機能的リガンドであることが示された。これは発生過程でCNSパラノードにクラスター化することによって空間的スイッチシグナルとして作用し、NICDをRIPによりS3部位で遊離させてNotch／DTX1シグナル伝達経路を誘発し、この経路がOPC分化およびOL成熟を促進して髄鞘形成に協調的に作用する。
【０２５２】
Deltex1を介するNB-3／Notchシグナル伝達は胚性神経幹細胞のオリゴデンドロサイトへの分化を導く
多発性硬化症（MS）はCNSの慢性脱髄性疾患である。神経幹細胞移植は、この種の疾患に対する有望な治療法である（Pluchino et al, 2003）。適切なドナー幹細胞をOPCまたはOLに選択的に前もって分化させるための信頼しうる方法を確立することには意味があると考えられる。本研究では、神経細胞認識分子の1つであるNB-3を用いてインビトロで神経幹細胞をOPCおよび／またはOL系譜に導くことを初めて可能にする、新規シグナル伝達経路の前臨床的なバリデーションを提示している。さらに、最近の研究により、MSにおいて効率的な髄鞘再形成がうまく行われないことは、一部には、アストロサイトにより発現されたJagged1によるOPC Notch受容体の活性化に起因することが示されている（John et al, 2002）。OPCにおけるNotch1シグナル伝達が選択的に阻害された変異マウスでは、異所性未熟OLが出現し、その後にアポトーシスが起こる（Genoud et al, 2002）。これらの観察所見は、Jagged1／Notch1相互作用のほかに、Notch1シグナル伝達経路を適切に活性化することによってOL分化を媒介する他の軸索由来Notch1リガンドが存在する可能性があることを意味する（Hu et al, 2003）。この見解を裏づけるものとして、NSCにおける本発明者の観察所見は、Deltex1を介するNB-3／Notchシグナル伝達がNSCからのOL分化を調節しており、このため髄髄性疾患における治療的介入の有望な標的であることを示している。
【０２５３】
本発明の第2の局面に関する材料および方法
抗体
モノクローナル抗体：Notch1 EGF反復配列11-12（Neomarker）、CNPアーゼ、Flag、β-チューブリンおよびMAP2（2a＋2b）（Sigma）、c-myc（9E10）およびHA（Santa Cruz Biotechnology）、核マトリックスタンパク質、Gal-Cおよびネスチン（Chemicon）、GFAP（DAKO）およびV5エピトープ（Invitrogen）；ポリクローナル抗体：V1744で切断されたNICD（Cell Signaling）、N2ICD、Jagged1、Jagged2、Delta（Santa Cruz Biotechnology）、γ-チューブリン（Sigma）、Ng2、ナトリウムチャンネル（NaCh）、NF200（Chemicon）、Hes1（Kaneta et al, 2000）、NICD（Logeat et al, 1998）、Notch1、Notch2、Notch3（Dr. Lendahlより寄贈）およびF3（Shimazaki et al, 1998）。
【０２５４】
ポリクローナルCaspr抗体は、ヒトCasprのアミノ酸277〜430とのGST融合タンパク質による免疫処置をウサギに行うことによって入手し、ポリクローナルMAG抗体（7610）は以下のペプチド：N'-CISCGAPDKYESREVST-C'（Eurogentec）による免疫処置をウサギに行うことによって入手した。
【０２５５】
Cy2、Cy3およびFITCを結合させた二次抗体はAmersham Pharmacia Biotech, Incから入手した。
【０２５６】
抗NB-3血清およびモノクローナル抗体は、IgドメインI-II（アミノ酸30〜227）をコードするラットNB-3 cDNAを含むpET15bベクター（Novagen）による形質転換を行った大腸菌で発現させた組換えタンパク質に対して産生させた。この発現ベクターを構築するためには、2つのオリゴヌクレオチドプライマーをPCR反応に用いて、ラット脳全RNAから合成したcDNAライブラリーから、対応領域をコードするcDNAを増幅した。この2つのオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りである。
2006516965.tif 000011
【０２５７】
PCRは、94℃ 3minの変性後に、94℃ 30s、60℃ 30sおよび72℃ 45sを30サイクル行った。増幅されたcDNA断片をBamHIで消化し、BamHIで切断したpET15bベクター中にDNAシークエンシング後に挿入した。タンパク質はIPTGで誘導することにより大腸菌BL21（DE3）pLysSで発現させた。これを封入体として部分的に精製し、これらを可溶化した上でSDS-PAGEにかけ、組換えタンパク質をゲルから電気泳動的に溶出させた。このタンパク質を、抗血清を得るためのウサギの免疫処置およびモノクローナル抗体を得るためのBALB／cマウスの免疫処置に用いた（Harlow, 1998）。
【０２５８】
細胞の共培養
F3-トランスフェクトCHO細胞（Gennarini et al, 1991）、TAXトランスフェクトCHO細胞、TAG-1トランスフェクトCHO細胞および疑似トランスフェクトCHO細胞（Furley et al, 1990；Tsiotra et al, 1993）を、オリゴデンドロサイト細胞系OLN-93（Richter-Landsberg and Heinrich, 1996）と、2：1の比で、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM、Gibco）、10％ウシ胎仔血清（Gibco）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）中において、加湿雰囲気中にて37℃で2日間共培養した。細胞をPKH26赤色蛍光細胞リンカーキット（Sigma）で前染色した。また、c-myc（Santa Cruz Biotechnology）およびCy-2標識ヤギ抗マウス二次抗体（Sigma）に対する初代モノクローナル抗体による細胞の染色も行った。共培養物における停止した突起の数を決定するために、3枚のカバースリップの各々において無作為に選択した3つの領域からのOLN-93細胞（細胞100個を上回る）を実験毎に算定した。少なくとも3回の独立した実験による生データを分散分析により、続いてNewman-Keuls検定により分析した上で、p＜0.05およびp＜0.01をそれぞれ有意および高度に有意とみなした。
【０２５９】
NB-3トランスフェクトCHO細胞または疑似トランスフェクトCHO細胞はOLNと2：1の比で2日間共培養した。共培養物の膜部分は以前の記載の通りに抽出した（Xiao et al, 1996）。
【０２６０】
NB-3-トランスフェクトCHO細胞のトランスフェクションおよび特性決定
CHO細胞に対して、リポフェクチン（GIBCO BRL）を製造元の指示に従って用いて、10μgのpcDNA3-NB-3をトランスフェクトした。G418（Life Technologies, Inc）による薬剤選択後に、生存している細胞クローンを増殖させ、表面NB-3発現に関してウエスタンブロット法および免疫組織化学染色により分析した。
【０２６１】
細胞のトランスフェクション
OLN細胞に対して、リポフェクタミン（Invitrogen）を用いて、一時的（V1744K-myc、V1744L-myc、dn-N1-V5、dn-N2-V5、pcDNA4／V5／LacZ（Invitrogen）、dn-RBP-J-myc、DTX1-myc、DTX1-D1-HA、DTX1-D2-Flag、caN1、caN2）または安定的（mNotch1-myc）なトランスフェクションを行った。CHO細胞に対しては、リポフェクタミンを用いて、完全長Jagged1（Small et al, 2001）の安定的なトランスフェクションを行った。安定的トランスフェクタントを400μg／ml G418（Sigma）または250μg／ml Zeocin（Invitrogen）によってスクリーニングし、免疫染色およびウエスタンブロット法によって同定した。
【０２６２】
免疫細胞化学
細胞を13mmカバースリップ（Nalge Nunc International）上で培養した。γ-セクレターゼ阻害薬（Sigma）を含む種々の処理の後に、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、1％ BSAでブロックした。続いて細胞を0.2％BSA中で一次抗体と1時間インキュベートし、その後にCy3標識またはCy2標識二次抗体（Sigma）とインキュベートした。蛍光用封入剤（DAKO）中に封入した後に、細胞をLeica DM RXA2蛍光顕微鏡で画像化した。写真は、明度が確実に同程度となるように同じ光学パラメーターで撮影した。NICD移行または分化を示す細胞のパーセンテージの算出には、3回の独立した実験による少なくとも10の視野を用いた。少なくとも3回の独立した実験による細胞200個を、Adobe Photoshop（商標）により蛍光強度に関して定量し（Jack et al, 2001）、Leica QFluoroソフトウエアにより細胞質面積に関して測定した。生データをStudentのt検定によって分析し、p＜0.05およびp＜0.01をそれぞれ有意差および高度の有意差とみなした。
【０２６３】
NF200、GFAPおよびGal-C一次抗体の検出に関しては、Alexa Fluor 488を結合させた抗マウスIgG、またはAlexa Fluor 546を結合させた抗ウサギIgG（1：1500；Molecular Probe）を用いた。トランスフェクトNSCに関しては、細胞にまずリポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いてプラスミドcaN1、DTX-D2、dnN1をトランスフェクタントし、増殖因子を含まない無血清培地中においてNB-3の存在下または非存在下で24時間処理した上で、細胞を1％FCS培地中にて13mmカバースリップ上で分化させた。
【０２６４】
細胞接着アッセイおよび反発アッセイ
これは以前の記載の通りに行った（Xiao et al, 1996）。手短に述べると、35mm組織培養用ペトリ皿（Becton Dickinson）に、メタノール中に溶解したニトロセルロース（Lagenaur and Lertimon, 1987）をコーティングし、無菌フード内で風乾させた。続いて、タンパク質（12μMのF3-Fc、CHL1-Fcまたはサブクローニングした種々のNotch1細胞外断片を2.5μl）をこれらの培養皿に適用し、加湿雰囲気中にて37℃で2時間インキュベートした。その後、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液（CMF-HBSS）で培養皿を3回洗浄し、2％熱失活脂肪酸非含有BSA（Sigma）を含むCMF-HBSSによるブロッキングを一晩行った（反発試験ではこのブロッキング段階を省いた）。続いて培養皿を再びすすぎ洗いし、それぞれの細胞、例えばOLN-93、マウスNotch1をトランスフェクトしたHeLa細胞（Logeat et. al., 1998）、F3-トランスフェクトCHO細胞およびNB-3トランスフェクトCHO細胞を、2mlの既知組成培地中に1.5×106個／mlの密度でプレーティングした。0.5時間後（接着試験の場合）または12時間後（反発試験の場合）に培養皿をCMF-HBSSで丁寧に3回洗浄し、2.5％グルタルアルデヒドを含むCMF-HBSS溶液で細胞を固定した。接着のブロッキングは、抗F3抗体（Gennarini et al, 1991；1：100）、ポリクローナル抗Notch1抗体（Mitsiadis et al, 1995；1：200）および抗Notch2抗体（Mitsiadis et al, 1995；1：200）を用いて行った。種々のスポットに対する細胞接着を写真撮影し、算定した。結果はStudentのt検定によって分析し、p＜0.05およびp＜0.01をそれぞれ有意差および高度の有意差とみなした。
【０２６５】
ウエスタンブロット分析
F3、TAX、TAG-1をトランスフェクトしたCHO細胞および疑似トランスフェクトCHO細胞とOLN-93細胞との共培養物を収集し、プロテアーゼ阻害薬混合物の錠剤を含むPBS中での超音波処理によって可溶化した。100,000g、4℃で1時間遠心した後に、ペレットをさらに2％ Triton X-100中に溶解した。続いて、細胞の膜部分を1つの細胞株当たりタンパク質約20μgずつ、SDS-PAGE（8％ゲル；Laemmli, 1970）、ならびにNotch1、Notch2、Notch3、ミエリン付随糖タンパク質、MAG（Yang et al, 1999）およびプロテオリピドタンパク質（PLP）（Jung et al, 1996）に対する抗体を用いるウエスタンブロット法（Towbin et al, 1979）によって分析した。
【０２６６】
発生過程での発現パターンに関するウエスタンブロット分析
脳幹をWistarラットのE17胚またはP0〜P21の新生仔から摘出した。標本を9倍容積の還元性サンプルバッファー中でホモジネート化し、5minにわたり沸騰下においた。ホモジネートの各々の10μlアリコートをウエスタンブロット法にかけた。検出はECL Western Bllotting System（Amersham Biosciences）を用いて行った。
【０２６７】
融合タンパク質
組換えF3-Fc、Jagged1-FcおよびCHL1-Fc融合タンパク質の作製
ヒトIgG Fcによって置換されたGPIアンカーを有するマウスF3をコードする組換えcDNAを、増幅促進配列（APS）（Hemann et al, 1994）を有するpDXのHindIII-NotI部位に挿入し、Ltk-／-細胞に導入した。Fc融合タンパク質は以前の記載の通りに精製した（Shimizu et al, 1999）。
【０２６８】
組換えNB-3-His融合タンパク質の作製
可溶型のNB-3組換えタンパク質であるNB-3-HisをHEK293細胞に産生させた。GPIアンカーのシグナル配列をコードするラットNB-3 cDNAの領域を6×Hisによって置換し、その後に終止コドンを置いた。このように操作したNB-3 cDNAをpREP4のHind III部位とBamHI部位との間に挿入し、その結果得られたベクターをHEK293細胞にトランスフェクトした。NB-3-Hisを発現する細胞が集密に達した時点で、それらを無血清培地で1週間培養した。培地を収集し、濃縮した上で50mM NaH2PO4、300mM NaCl、pH 8.0に対して透析した。Ni-NTA樹脂（Qiagen）を透析液に添加し、少なくとも30minインキュベートした。NB-3組換えタンパク質を50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾールを用いてNi-NTA樹脂から溶出させた。
【０２６９】
Notch1 GST融合タンパク質の作製
Notch1 GST融合タンパク質の作製については以前に記載されている（Hu et al, 2003）。マウスNotch1（mN1）の細胞外ドメインの種々の領域を含む組換えタンパク質を以下のようにして作製した。Hind III部位およびBspE1部位（以下の下線部）を加えたプライマーを、mN1 cDNA（Dr. Jeffrey Nyeより寄贈）の種々の領域をポリメラーゼ連鎖反応で増幅するために用いた。
2006516965.tif 000012
【０２７０】
増幅された領域は、N1.1（ヌクレオチド79〜1557；アミノ酸27〜519をコードする1478bp断片；EGF反復配列1-13）、N1.2（ヌクレオチド1324〜2808；アミノ酸442〜936をコードする1484bp断片；EGF反復配列11-24）、N1.3（ヌクレオチド2575〜4008；アミノ酸859〜1336をコードする1433bp断片；EGF反復配列22-34）およびN1.4（ヌクレオチド3751〜5247；アミノ酸1251〜1749をコードする1496bp断片；EGF反復配列32-36、LNR反復配列）であった。以前の記載の通りに、pGEX-KGベクターを用いて組換えGST融合タンパク質を作製し、精製した（Xiao et al, 1996）。
【０２７１】
PCRは1mM MgCl2の存在下でプラスミドDNAに対して行った。サイクルは以下の通りとした：最初に93℃ 1min、45℃ 30sおよび72℃ 1minを5サイクル；続いて93℃ 1min、50℃ 30sおよび72℃ 1minを30サイクル行った；最後に72℃で5min伸長させた。これらの増幅断片をそれぞれ用いて、それらの伸長したHindIII部位およびBspEI部位で制限消化し、同様に消化したpGEX-KGベクターと連結することにより、ベクターpN1.1、pN1.2、pN1.3およびpN1.4を作製した。形質転換された大腸菌JM 109細胞をIPTGで誘導し、発現されたGST-N1.1、GST-N1.2、GST-N1.3およびGST-N1.4融合タンパク質を、グルタチオン-アガロースビーズを用いて精製した。
【０２７２】
組換えNB-3-Fcタンパク質の作製
GPIアンカーのシグナル配列をヒトIgG Fcで置換し、その後に終止コドンを置いた。このようにして操作したcDNAをpREP4のHind III部位とBamHI部位との間に挿入し、293T細胞に形質転換導入した。プロテインA-アガロースビーズ（Roche）を用いてNB-3-Fcを馴化培地から精製した。
【０２７３】
免疫組織化学
成体Wistarラットに深麻酔をかけた後、Ringer塩類溶液、続いて4％パラホルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液（PB；pH 7.4）を経心臓的に灌流した。脳幹部分を採取し、後固定を2時間行った後に、15％スクロースを含む0.1M PBに移して一晩おいた。組織をO.C.T.コンパウンド（Tissue Tek）中で凍結し、ゼラチンをコーティングしたスライドに矢状凍結切片（10μm）を載せた。免疫染色に関しては、スライドを37℃で30min乾燥させた後に、透過化処理のために冷アセトン（-20℃）中に15分間浸漬した。特異的結合部位のブロッキングは10％ヤギ血清溶液（0.1M PB中）を用いて室温で30分間行った。抗体にかかわる各段階の間には、調製物を0.3％ Triton X-100（0.1M PBS中）で5分間ずつ3回洗浄した。抗体はすべて0.1M PB中に希釈した。切片は二重標識した。一般的には、組織切片をまずポリクローナル一次抗体とともに一晩インキュベートし、その後にヤギ抗ウサギ二次抗体とインキュベートした。続いて切片をモノクローナル一次抗体に対して曝露させ、抗マウス二次抗体で標識した。検査に関しては、スライドにカバースリップをかけた上でZeissレーザー走査型共焦点顕微鏡で観察した。
【０２７４】
免疫共沈アッセイおよびGSTプルダウンアッセイ
ラット脳膜試料を以前の記載の通りに調製し（Xiao et al, 1996）、抗体を結合させたプロテインAアガロースビーズ（Roche）、またはGST-N1.1、N1.2、N1.3もしくはN1.4を結合させたグルタチオンアガロースビーズ（Sigma）とともに4℃で一晩インキュベートした。捕捉されたタンパク質をSDS-PAGEサンプルバッファーを用いてビーズから溶出させ、ウエスタンブロット法にかけた上でECL試薬（Amersham）を用いて検出した。
【０２７５】
NSCおよびラット脳膜部分を以前の記載の通りに調製し（Xiao et al, 1996）、NB-3-Fcおよび抗体を結合させたプロテインA-アガロースビーズとともに4℃で一晩インキュベートした。捕捉されたタンパク質をSDS-PAGEサンプルバッファーを用いてビーズから溶出させ、ウエスタンブロット法にかけた上でECL試薬を用いて検出した。
【０２７６】
Casprの免疫沈降
以前の記載の通りに調製したニワトリまたはマウスの脳可溶化物（800μg）（Zeng et al, 1999）をウサギ免疫前血清（PI）または抗Caspr血清とともにインキュベートし、その後にプロテインA+G-セファロース（Sigma）とインキュベートした。免疫沈降物を洗浄し、SDS-PAGEで分離した上で抗Caspr血清によりプロービングした。イムノブロット法に関しては、免疫原および免疫血清を1：1000希釈して用いた。
【０２７７】
免疫共沈
脳膜を以前の記載の通りに調製した（Isom et al, 1995）。膜を2％ Triton X-100中に溶解し、可溶性画分をNotch抗体（抗Notch1および抗Notch2）とともに4℃で一晩インキュベートした。続いてプロテインAセファロースビーズ（1：1懸濁液50μl）を添加し、インキュベーションを4℃でさらに2時間または一晩行った。ビーズを、0.1％ Triton X-100およびプロテアーゼ阻害薬を含む50mM Tris HCL、pH 7.5で洗浄した。免疫沈降したタンパク質を、SDS-PAGEサンプルバッファーを用いてビーズから溶出させ、7.5％アクリルアミドSDS-PAGEゲルで分離した。タンパク質をニトロセルロースに移行させ、F3およびNB-3に対する抗体によってプロービングした。免疫反応性バンドの化学発光検出はECL試薬を用いて行った。抗F3および抗NB-3を用いて得られた免疫沈降物のプロービングに抗Notch1抗体および抗Notch2抗体を用いる相互実験も行った。
【０２７８】
GSTプルダウンアッセイ
精製したGST融合タンパク質（mNotch1.1、1.2、1.3および1.4）を、セファロース4Bビーズ（Amersham Pharmacia Biotech Inc）に対して、製造元の指示に従って結合させた。成体ラットの新鮮な大脳半球を採取し、2％ Triton X-100中に溶解させた。このホモジネートを13,000gで60分間遠心した。続いて、清澄化した可溶化物を、ビーズに結合させたGST融合タンパク質とともに室温で45minインキュベートした。ビーズを可溶化バッファーで3回洗浄し、タンパク質をSDS-PAGEゲルサンプルバッファーで溶出させ、7.5％ SDS-PAGEで分離した後にニトロセルロースに移行させて、抗F3および抗NB-3抗体を用いるウエスタンブロット法によって分析した。
【０２７９】
初代OLおよびOPCの培養
本発明者は、オリゴデンドロサイトをPercoll勾配遠心法によって分離するグリア細胞分離法を以前の記載の通りに用いた（Colello and Sato-Bigbee, 1998）。手短に述べると、細胞のプレーティングの1時間前に、培養皿（Falcon）にポリ-L-リジンをコーティングした。生後1日〜2日のラットを断頭によって屠殺し、その大脳半球を直ちに摘出した。顕微解剖用ピンセットを用いて髄膜および血管を注意深く取り除いた。半球を氷冷HEPES／HBSSを入れたペトリ皿に移し、手術用メスで細かく解離した。組織を50mlコニカルチューブに移し、200xgで5分間遠心した後に、上清を廃棄して細胞ペレットをl0μg／ml DNAアーゼI（HEPES／HBSS中）に再懸濁し、その後にそれをさらに遠心した。組織を70μmナイロンメッシュFalcon cell strainerに通すことによって単細胞浮遊液を調製し、Percoll勾配にかけた上で、オリゴデンドロサイト含有画分を遠心処理によって回収した。細胞浮遊液をHEPES／HBSSで希釈し、オリゴデンドロサイトを接着性の違いによって分離した。このようにして入手したオリゴデンドロサイトを既知組成DMEM／F12培地中に懸濁させた。
【０２８０】
初代ニューロン、Olおよびアストロサイトの培養
以前の記載の通りに（Itoh, 2002）、E17 Wistarラットのニューロン、OLおよびアストロサイトを単離して培養した。P5〜7 Wistarラット小脳のOLをPercoll勾配遠心法（Colello and Sato-Bigbee, 1998）によって入手し、OPCはP5〜7 Wistarラット視神経から単離した（Bogler, 1997）。
【０２８１】
NSCの培養
マウス線条体神経幹細胞を14日齢BALB／cマウス胚（IFFA Credo, L'Arbresle, France）から単離し、N2添加物質およびEGF（20ng／ml）（Invitogen）を加えたDMEM／F12中で培養した（Arsenijevic et al, 2001）。分化を誘導するためには、球体を解離して単細胞とし、増殖因子を含まない培地中でNB-3またはJagged1により24hr処理した上で、培地に1％ウシ胎仔培地を添加した。
【０２８２】
リアルタイムRT-PCR分析
初代オリゴデンドロサイトを、前記の細胞接着アッセイと同じように、F3-Fc、NB-3-HisおよびBSAのタンパク質スポットに対してプレーティングした。2時間の培養後に、QIAGEN RNAeasyキットを製造元の指示に従って用いて全RNAを抽出した。全RNA（0.5μg）をTaqMan RTキット（Applied Biosystems）を用いて逆転写した。mRNA発現レベルを測定するために、TaqManシステムをABI PRISM 7700配列検出システムで用いてリアルタイム定量PCRを行った。プライマーおよびプローブはすべて、プライマーExpressソフトウエア（ABI）を用いて設計した。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りである。
2006516965.tif 000013
【０２８３】
それぞれの標的RNAおよびGAPDH RNAの個別の増幅を、製造元の指示に従って行った。各転写物の相対的発現レベルは、ABIのユーザーマニュアルに概要が記載された比較CT法を用いることによって決定した。
【０２８４】
OLまたはOLN細胞からの全RNAをQIAGEN RNeasyキットを用いて抽出し、ゲノムDNAを除去するためにRNアーゼ非含有DNアーゼI（Invitrogen）で処理した。試料を、Superscript First-Strand Synthesis System（Invitrogen）（Notch相同体、Hes1）またはTaqMan RTキット（Applied Biosystems）（MAG）を用いる、ランダムヘキサマープライマーによる逆方向転写に用いた。β-アクチンおよびGAPDHを内部対照として用いた。リアルタイムPCRは、SYBR Green PCR Master Mix（Notch相同体、Hes1）またはTaqManシステム（MAG）をABI PRISM 7700配列検出システムで用いて行った。プライマーおよびTaqManプローブはPrimer Expressソフトウエア（ABI）を用いて設計したが、それらの配列は請求に応じて入手可能である。比較CT法（ABIユーザーマニュアル）を用いることによる、各転写物の相対的発現レベルの決定には、少なくとも4回の独立した実験による生データを用いた。
【０２８５】
脂質ラフトアッセイ
これは以前の記載の通りに行った（Kramer et al, 1999）。
【０２８６】
Hes1ルシフェラーゼレポーターアッセイ
12ウェルの培養皿に入れたOLN細胞（1.5×105個／ウェル）をHes1ルシフェラーゼレポーターアッセイに用いた。リポフェクタミンおよびリポフェクタミンPlus試薬（Invitrogen）を用いて、細胞に一時的なトランスフェクションを行った。各ウェルに、0.2μgのpGVB／Hes1ルシフェラーゼレポータープラスミドを、種々の発現プラスミド（0.1または0.2μgのcaN1；0.3または0.6μgのRBP-J、dn-RBP-J-myc、DTX1、DTX1-D1-HA、DTX1-D2-Flag）とともに添加した。トランスフェクション効率のモニタリングのために、β-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV／β-Galを内部対照として含めた。細胞をトランスフェクションの24時間後に可溶化し、Steady-Gloルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いてアッセイした。相対的レポーター活性の決定には、少なくとも4回の独立した実験による生データを用いた。
【０２８７】
NSC実験は以前の記載の通りに行った（Hu et al, 2003）。手短に述べると、24ウェル培養皿に入れたNSCに対して、指定された構築物を、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて一時的にトランスフェクトした。トランスフェクション効率のモニタリングのために、β-ガラクトシダーゼを発現するpCMV／β-Galを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をSteady-Gloルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を用いるルシフェラーゼアッセイにかけた。相対的レポーター活性の決定には少なくとも4回の独立した実験による生データを用いた。
【０２８８】
フローサイトメトリー分析
細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄した上で、FACSPerm（Becton Dickinson）により処理した。細胞を、MAP2（2a+2b）、GFAP、CNPアーゼに対する抗体、およびFITCを結合させた抗マウスIgG1および抗ウサギIgGによって染色した後に、フローサイトメーター（FACScalibur, Becton Dickinson）を、CELLQuestソフトウエアVersion（Becton Dickinson）とともに用いて分析した。
【０２８９】
本発明の第1の局面のための参照文献
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【０２９０】
表I
初代ラットオリゴデンドロサイトを、F3-Fc、NB-3-HisまたはBSA（対照）のそれぞれをコーティングした基質に対してプレーティングした。2時間培養した後に、全RNAを抽出し、MAGおよびPLP mRNA発現レベルのリアルタイムRT-PCR分析を行った。比較CT法（CT：サイクル閾値）を用いて相対的発現レベルを導き出した。
【図面の簡単な説明】
【０２９１】
【図１】CNSにおけるパラノードでのグリア由来Nogo-Aクラスターを示す。A. 成体ラット脳幹切片を、Nogo-A（緑色；a、c、d、f、gおよびi）およびKv1.1K＋チャンネルα-サブユニット（赤色；b、c、hおよびl）またはPAN Na＋チャンネル（赤色；eおよびf）に対して二重免疫染色した。陰性対照に関しては、Nogo-A抗血清（1: 200）を、成体脳幹切片の染色の前に抗原とあらかじめ混合した（j）。この試験には、2種類のNogo-A抗体（一方は本発明者の研究室で開発したもの（a〜f）、もう一方はDr. Stritmatterの研究室で開発されれたもの（g〜i））を用いた。c、fおよびiはそれぞれa-b、d-eおよびg-hの合成画像である。B. ラット脊髄におけるパラノードでのNogo-Aの超微視的局在（a）有髄軸索の断面の免疫金標識により、金粒子がミエリン鞘の内部および外部に検出されることが明らかになった。（bおよびc）Nogo-Aの免疫金粒子がグリアループおよび密なミエリンの内部に認められる。（dおよびe）パラノードの縦断面では、Nogo-Aの免疫金粒子が神経グリア接合部におけるグリアループの先端に位置し、dでは軸索内にもいくつか位置している。dおよびeの枠で囲んだ領域の高倍率像をd'およびe'に示した。ax：軸索；OL：オリゴデンドロサイト。金粒子は矢印で示されている。バー：Aa〜iに関しては5μm、Ajに関しては10μm、Ba、dおよびeに関しては200nm、Bb、c、d'およびe'に関しては100nm。
【図２】EAEラットおよびCGT-/-マウスからのCNS有髄軸索におけるNogo-Aの発現および局在を示す。AおよびB. EAEラットからの脊髄切片を、Nogo-A（緑色、A）、Caspr（緑色、B）およびKv1.1（赤色、AおよびB）に対して二重免疫染色した。星印はNogo-A陽性細胞体を表し、矢印は分断されていないパラノードNogo-A標識を示す。C. 正常ラットおよびEAEラット双方の脊髄切片のいくつかの顕微鏡視野におけるNogo-AクラスターおよびCasprクラスターの数を算定した。値は少なくとも3回の独立した実験による平均±SEMとして示されている。EAEにおけるNogo-Aクラスターは正常ラットと比較して劇的に少なかった。二重星印（**）は有意水準P＜0.01を示している。D. EAEラットの脊髄ではNogo-Aは有意にダウンレギュレートされているがCasprの発現はわずかな影響しか受けていないことを示す、ウエスタンブロット法の結果。単一星印は有意水準P＜0.05を示している。E、F、GおよびH. 野生型マウスおよびCGT-/-マウスからの脊髄切片をNogo-A（緑色）およびPAN Na＋チャンネルに対して二重標識した。野生型（P16）では、Nogo-Aがパラノードでクラスター化し、PAN Na＋チャンネルがランヴィエ絞輪に集合していた（H）。CGT-/-マウス（P16）では、パラノードでのNogo-A分離およびPAN Na＋チャンネルのクラスター化はほとんど検出されなかった（F）。CGT-/-マウス（P21；H）ではNogo-A標識は軸索の周囲に疎ならせんを描くように思われるが、野生型マウス（P21；G）ではパラノード領域で特異的にクラスターを形成している。バー：A〜Bに関しては10μm、E〜H. IおよびJに関しては5μm。P16 CGT-/-マウス脊髄からのパラノードの縦断面におけるNogo-Aの免疫金標識により、金粒子が異常な逆向きループとして認められた。パネルI'およびJ'はそれぞれIおよびJにおける枠で囲んだ領域の高倍率像である。矢印は金粒子を示す。星印は逆向きパラノードループを示す。ax：軸索、OL：オリゴデンドロサイト。バー：IおよびJに関しては200nm、I'およびJ'に関しては50nm。
【図３】CasprはインビトロでNogo-Aと会合する。A. NgRは有髄軸索に沿って散在性に分布する。（a）成体ラットのCNSの種々の領域からの組織可溶化物を、NgRおよびγ-チューブリンに対する抗体を用いるウエスタンブロット法にかけた。（b）生後1〜30日（P1〜P30）ラットの脳幹を、NgRおよびγ-チューブリンに対する抗体を用いるウエスタンブロット法にかけた。成体海馬（c〜e）および脳幹（f〜h）切片を、NgR（緑色、cおよびf）、MAP2（赤色、d）およびKv1.1（赤色、g）に対して二重染色した。eおよびhはそれぞれc、dおよびf、gの合成画像である。c〜hに関するスケールバー：10μm。B. Nogo-AはCaspr／F3と会合する。（a）成体マウスからの脳膜画分の界面活性剤可溶化物を、Caspr抗体、Nogo-A抗体およびNB3抗体ならびに非免疫性IgGにより免疫沈降させた。脳からの免疫沈降物および界面活性剤抽出物（脳）を、プロテインAビーズ（ビーズ）とともに、Caspr、Nogo-A、F3およびNB3に対する抗体を用いるウエスタンブロット法にかけた。（b）Nogo-A／Caspr／F3、Nogo-A／F3およびNogo-AをトランスフェクトしたCHO細胞の膜画分を、CasprおよびNogo-Aに対する抗体ならびに非免疫性IgGにより免疫沈降させた。免疫沈降物および脳抽出物（脳）を、Nogo-A、CasprおよびF3に対する抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけた。（c）P15ラット大脳皮質からの膜画分の界面活性剤可溶化物をショ糖直線勾配に対してローディングした。12個の勾配画分を集め、SDS-PAGEにかけた上で、Nogo-A、CasprおよびF3の分布に関してウエスタンブロット法により分析した。画分1は勾配の上端から回収した最も低密度の画分である。「全体」と表記された最後のレーンは、ショ糖勾配に対するローディングを行う前のホモジネート中のレベルを示している。
【図４】Caspr発現細胞はNogo-66と接着する。A〜L．Caspr／F3-CHO細胞（A、EおよびI）、F3-CHO細胞（B、FおよびJ）および疑似トランスフェクトCHO細胞（C、GおよびK）ならびにPI-PLC処理Caspr／F3-CHO細胞（D、HおよびL）を、Nogo-66ペプチド、組換えGST-Nogo-66タンパク質およびGSTのそれぞれをコーティングした基質にプレーティングした。スケールバー：8μm。M〜N. 種々の基質に対する細胞接着性の定量。Caspr／F3-CHO細胞（PI-PLC処理の存在下または非存在下）はNogo-66ペプチドおよびGST-Nogo-66と結合したが、F3-CHO細胞も野生型CHO細胞も結合しなかった。バーは少なくとも3回の独立した実験による接着細胞の数（平均±SEMとして表記）を示している（M）。O. PI-PLC処理後の細胞接着アッセイの最後に、Caspr／F3-CHO細胞およびF3-CHO細胞ならびにそれらの培養上清を収集し、全タンパク質に対して標準化した後にF3／コンタクチンを検出するためのウエスタンブロット分析にかけた。1、マウス脳；2、F3-CHO細胞可溶化物；3、PI-PLC処理後のCaspr／F3-CHO細胞可溶化物；4、PI-PLC処理後のCaspr／F3-CHO細胞培地。星印（*）は有意水準P＜0.05を示す。Caspr／F3-CHO細胞は、種々の濃度のPI-PLC（0.02、0.04および0.06U／ml）で処理した後にNogo-66およびGST-Nogo-66と等しい効率で結合した（N）。
【図５】Nogo-A／Caspr複合体はK＋チャンネルと相互作用する。A.（a）P7マウス脳膜抽出物を、Caspr、Nogo-A、Kv1.1、Kv1.2およびNB3に対する抗体ならびに非免疫性IgGにより免疫沈降させた。表記の免疫沈降物および脳抽出物（脳）を、Kv1.1、Kv1.2、Nogo-AおよびCasprに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析にかけた。（b）組換えGST-Nogo-66、GST-Nogo-Nおよび成体マウス脳抽出物由来のGSTを用いるGSTプルダウンアッセイを行った。表記の沈降物および脳抽出物（脳）を、SDS-PAGE分離後にCaspr抗体およびKv1.1抗体によりプロービングした。B.（a）CHO細胞、F3-CHO細胞およびCaspr／F3-CHO細胞の膜画分ならびに脳抽出物に対するイムノブロット法を、SDS-PAGE分離後にCaspr抗体を用いて行った。（b）Kv1.1発現構築物RBG4／Kv1.1による一時的トランスフェクションの後に、CHO細胞、F3-CHO細胞、Caspr／F3-CHO細胞の膜抽出物をGST-Nogo-66またはGSTのそれぞれとともにインキュベートした。溶出したタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、Caspr抗体およびKv1.1抗体によりプロービングした。IP：免疫沈降；WB：ウエスタンブロット。
【図６】ラット脳幹における種々の生後日数でのNogo-A、CasprおよびKv1.1の免疫組織化学標識を示す。A. P5ラットから成体ラットまでの脳幹切片を、Caspr（緑色）およびKv1.1（赤色）に対して二重標識した。スケールバー: 5μm。B. P1ラットからP30ラットまでの切片を、Nogo-A（緑色）およびKv1.1（赤色）に対して二重標識した。スケールバー（oにおける）: 5μm。C.（a）Nogo-A、Kv1.1免疫染色の長さおよびそれらの重複を顕微鏡写真から計測した（μm、平均±SEM）。（b）パラノードでの重複性Nogo-A／Kv1.1クラスターまたはCaspr／Kv1.1クラスターの数を算定した。
【図７】EAEラットおよびShivererマウスにおけるNogo-A、CasprおよびKv1.1の分布を示す。AおよびB. EAEラット（A）および対照ラット（B）の脳幹切片におけるCaspr（緑色）およびKv1.1（赤色）に対する二重免疫蛍光標識。挿入図はKv1.1標識の拡大像を表している。スケールバー：A〜Bに関しては10μm、A〜Bの挿入図に関しては5μm。C〜G. 野生型マウス（C）およびShivererマウス（D〜G）の脊髄切片におけるNogo-A（緑色）およびKv1.1（赤色）に対する二重標識。FはDおよびEの合成像である。C、FおよびGにおける矢印はNogo-A陽性細胞体を示している。バー：10μm。HおよびI. 野生型マウス（H）およびShivererマウス（I）の脳幹切片におけるCaspr（緑色）およびKv1.l（赤色）の二重免疫蛍光染色。バー：10μm。J. EAEラットと対照ラットとの、およびShiverer（Shi）マウスと野生型（WT）マウスとの、対をなすKv1.1染色の間の距離をそれぞれ顕微鏡写真から測定した（μm、平均±SEM）。EAEラットまたはShivererマウスにおける値はそれぞれ、それらの対照と比較して有意に小さかった（星印**は有意水準P＜0.01を示す）。
【図８】パラノードでのNogo-AとCasprとの間の相互作用は髄鞘形成過程で役割を果たしている可能性がある。本発明者の所見は、NF155に加えて、パラノードNogo-Aが神経性に発現されたCasprに対するグリアリガンドであることを示唆する。パラノードNogo-Aは軸索Casprとトランス相互作用を行い、これは髄鞘形成の初期（P5から）におけるK＋チャンネルの局在に役割を果たしている可能性がある。成体で神経グリア接合部がしっかりと確立されると、K＋チャンネルはNogo-A／Caspr相互作用が維持されているパラノードから排除されるが、この分離の詳細な機序はまだ解明されていない。N：ランヴィエ絞輪、PN：パラノード、JPN：ジャクスタパラノード。
【図９】ニトロセルロースに施したF3-Fc（a、k〜lおよびq）、CHL1-Fc（a）およびNB-3-His（b、e〜j、m〜pおよびr）などのタンパク質スポットに対する、OLN-93細胞またはマウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞の、抗体ブロック処理の存在下または非存在下での接着性を判定した。バー（a〜bおよびq〜r）は、少なくとも3回の独立した実験による接着細胞の数（平均±SD）を表している。*を付したバーは対照との間に大きな有意差（P＜0.05）がある。F3-FcおよびNB-3-Hisをコーティングした基質に対するOLN-93細胞の接着性。a. F3-Fc基質に対するOLN-93細胞の接着に対する抗体ブロックの影響。F3：F3タンパク質基質のみ（対照として）；CHL1：CHL1タンパク質基質のみ；抗F3または抗NB-3：F3-Fcをコーティングした基質を、OLN-93細胞のプレーティングの前にブロックするための、これらの2種類の抗体のそれぞれの添加；抗Notch1、抗Notch2または血清：F3-Fcをコーティングした基質に対するプレーティングの前に、これらの2種類の特異的ブロッキング抗体または免疫前血清のそれぞれにより前処理したOLN-93細胞。b. NB-3基質に対するOLN-93細胞の接着に対する抗体ブロックの影響。NB-3：NB-3。Hisタンパク質基質のみ（対照として）；抗NB-3または抗F3：NB-3-Hisをコーティングした基質を、OLN-93細胞のプレーティングの前にブロックするための、これらの2種類の抗体のそれぞれの添加；抗Notch1、抗Notch2または血清：NB-3-Hisをコーティングした基質に対するプレーティングの前に、これらの2種類の特異的ブロッキング抗体または免疫前血清のそれぞれにより前処理したOLN-93細胞。c〜d：抗Notch1抗体（c）および抗Notch2抗体（d）を用いて染色したOLN-93細胞の免疫蛍光顕微鏡写真。いずれの場合にも細胞表面染色が存在する。e〜j：NB-3-Hisコーティングした基質と接触させて0.5時間培養した（e）、ならびにさらにNotch1に対するブロッキング抗体（f）、NB-3（g）、Notch2（h）、F3（i）および免疫前血清（j）の存在下で培養した、OLN-93細胞の明視野顕微鏡写真。（j）におけるスケールバー：（c〜j）に関して8μm。F3-FcおよびNB-3-Hisをコーティングした基質に対する、マウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞の接着性。k〜p：F3-Fc（k〜l）またはNB-3-His（m〜p）と接触させた、ならびにさらにNB-3（n）、Notch1（o）および免疫前血清（p）に対するブロッキング抗体の存在下においた、疑似トランスフェクトHela細胞（k）およびマウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞（i〜p）の明視野顕微鏡写真。（p）におけるスケールバー：（k〜p）に対して8μm。q. マウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞のF3-Fc基質との相互作用に対する抗体ブロックの影響。F3：F3-Fcをコーティングした基質のみ；抗F3：F3-Fcをコーティングした基質を、マウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞のプレーティングの前にブロックするための、これらの抗体の添加；抗Notch1または血清：F3-Fcをコーティングした基質に対するプレーティングの前に、これらの特異的なブロッキング抗体または免疫前血清のそれぞれにより前処理した、マウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞；Hela細胞：F3-Fcをコーティングした基質に対する疑似トランスフェクトHela細胞のプレーティング（対照として）。r. NB-3-Hisをコーティングした基質に対するマウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞の接着性に対する抗体ブロックの影響。NB-3：NB-3.Hisをコーティングした基質のみ；抗NB-3：NB-3.Hisをコーティングした基質を、マウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞のプレーティングの前にブロックするための、これらの抗体の添加；抗Notch1または血清：NB-3.Hisをコーティングした基質に対するプレーティングの前に、これらの特異的なブロッキング抗体または免疫前血清のそれぞれにより前処理した、マウスNotch1をトランスフェクトしたHela細胞；Hela細胞：NB-3.Hisをコーティングした基質に対する疑似トランスフェクトHela細胞のプレーティング（対照として）。
【図１０】NotchとF3／NB-3との間の相互作用に関する生化学分析および細胞分析を示す。a〜d：F3およびNB-3の両者とNotch1およびNotch2との逆相関。ラット脳の可溶化物を、これらの4種類の抗体ならびにビーズおよび非免疫性IgG（対照として）を用いる免疫共沈によって分析した。それぞれのケースで、レーンは表記した抗体に対応する（抗N1：抗Notch1抗体、抗N2：抗Notch2抗体）。ウエスタンブロットを、F3（a）、NB-3（b）、Notch1（c）およびNotch2（d）に対する抗体によりプロービングした。e：サブクローニングした各断片に指定された名称を示した、Notch1分子の概略図。f〜g：4種類の断片のクーマシーブリリアントブルー染色（f）およびイムノブロット分析（g）を示している。抗Notch1抗体はN1.3およびN1.4を特異的に認識する。h〜i：プルダウンアッセイを用いることによる、Notch1断片とF3／NB-3との間の相互作用の分析。ラット脳可溶化物を、Sepharose 4Bビーズに結合させたGSTまたはGST-融合タンパク質（N1.l、N1.2、N1.3、N1.4）とともにインキュベートした。結合したタンパク質をSDSサンプルバッファーにより溶出させ、F3またはNB-3に対する抗体を用いるSDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により分析した。j〜l：4種類のNotch1断片およびGSTに対する、F3-トランスフェクトCHO細胞（j）、NB-3トランスフェクトCHO細胞（k）および疑似トランスフェクトCHO細胞（l）の接着性。タンパク質断片N1.1、N1.2、N1.3およびN1.4を対照としてのGSTとともにペトリ皿の表面にコーティングし、F3-トランスフェクトCHO細胞（j）、NB-3-トランスフェクトCHO細胞（k）および疑似トランスフェクトCHO細胞（l）を既知組成培地中にプレーティングして2時間保った。バーは少なくとも3回の独立した実験による接着細胞の数（平均±SD）を表している。*を付したバーは、対照（GST）とは大きな有意差（P＜0.05）がある。
【図１１】F3-トランスフェクトCHO細胞とOLN-93細胞との共培養物におけるMAGおよびPLPの発現に関するウエスタンブロット分析を示す。a：ラット脳ホモジネート（脳）および細胞共培養抽出物におけるMAGのイムノブロット分析。b：細胞共培養抽出物におけるPLPのイムノブロット分析。OLN：OLN-93細胞培養物のみ；F3／OLN：OLN-93細胞とF3-トランスフェクトCHO細胞との共培養物；CHO／OLN：OLN-93細胞と疑似トランスフェクトCHO細胞との共培養物；TAG／OLN：OLN-93細胞とTAG-lをトランスフェクトしたCHO細胞との共培養物；TAX／OLN：OLN-93細胞とTAX-トランスフェクトCHO細胞との共培養物。
【図１２】Jagged1およびNB-3の免疫蛍光局在を示す。a〜c：P2の時点では、NB-3染色はほとんど検出できなかった。Jagged1染色は軸索局在に一致する線状の縞として存在した。a〜cにおけるスケールバー：a〜iに関して20μm。d〜f：P5の時点では、NB-3がパラノード位置にクラスター化することを観察することができる。重要なことに、Jagged1およびNB-3の免疫蛍光の間には明瞭な境界がみられ、これはj〜oの拡大像で最もよく見てとれる。j〜lにおけるスケールバー：j〜oに関して2μm。g〜i：P14の時点では、NB-3およびJagged1の分布はP5パターンと不変のままであるが、軸索密度が高まり、このためにパラノードの数が増加している。
【図１３】中枢神経系におけるパラノードの分子成分の概略図を示す。この位置では、多数のオリゴデンドログリア細胞質ループ（ここでは単一のループのみとして図示している）が軸索鞘と密に接触している。本研究により、軸索F3／コンタクチンおよびCasprおよびグリアニューロファシン155（NF-155）に加えて、神経グリア接合部の他の構成要素に軸索NB-3およびグリアNotchが含まれることが明らかになった。また、F3／NB-3およびNotchとの間に機能的なシグナル伝達相互作用が存在することも示された（N：ランヴィエ絞輪、PN：パラ
【図１４】NotchおよびF3は結合パートナーである。（A）細胞接着アッセイ。OLN細胞をα-Notch1（a）またはα-Notch2（b）で標識した。OLN細胞を、F3（c、e〜i）またはCHL1（d）をスポッティングした培養皿にプレーティングした。細胞は処理しないままにするか、またはプレーティング前にα-Notch1（e）もしくはα-Notch2（f）、免疫原血清（血清）（g）により、または抗原除去したα-Notch1（D-α-Notch1）（h）もしくはα-Notch2（D-α-Notch2）（i）により前処理した。点線はタンパク質-Fcスポットの縁を示している。接着細胞はクーマシーブルーで染色することによって描出した。j：F3基質に対するOLN細胞の接着性およびブロッキング抗体の影響の定量。# CHL1との比較でp＜0.05、* 免疫前血清との比較でp＜0.05。（i）におけるスケールバー：a、bに関して20μm；c〜iに関して120μm。（B）細胞反発アッセイ。mN1をトランスフェクトしたHeLa細胞（a）または疑似トランスフェクトHeLa細胞（b）を、F3をコーティングした培養皿にプレーティングした。接着細胞をクーマシーブルーにより染色した。c：F3に対するHeLa細胞の接着性およびブロッキング抗体の影響の定量。いくつかの実験では、mN1をトランスフェクトしたHeLa細胞を、α-F3もしくはα-Notch1により、または免疫前血清（血清）により前処理した。# 疑似トランスフェクトHeLa細胞との比較でp＜0.05、* 免疫前血清との比較でp＜0.05。（b）におけるスケールバー：a、bに関して15μm。棒グラフ（Aj、Bc）は接着細胞の数（平均±SD）を表している。
【図１５】NotchおよびF3はタンパク質複合体として会合する。（A）F3は免疫共沈物Notch1またはNotch2と免疫共沈する。a：ラット脳可溶化物からの免疫沈降物を、α-Notch1、α-Notch2、非免疫性IgGまたは非結合型ビーズを用いて調製し、α-F3によりプロービングした。b：タンパク質複合体を捕捉するためにα-F3を用い、その後に結合パートナーを検出するためにα-Notch1もしくはα-Notch2によるイムノブロッティングを行った相互アッセイ。（B）Notch1細胞外ドメインのサブクローニング。a：Notch1およびそのサブクローニング断片の概略図。b、c：4種類の断片のそれぞれのクーマシーブルー染色およびα-Notch1イムノブロット。（C）F3はNotch1の特定ドメインと結合する。a：GST-Notch1細胞外断片（N1.1、N1.2、N1.3およびN1.4）またはGSTのみを、ラット脳可溶化物を用いるGSTプルダウンアッセイに用いた。沈降物およびラット脳可溶化物（右のレーン）をF3に関してプロービングした。b：4種類のGST融合断片またはGSTのみをコーティングした培養皿に対する、疑似トランスフェクトCHO細胞およびF3-トランスフェクトCHO細胞の接着性の定量。バーは接着細胞の数を表している（平均±SD）。* GSTとの比較でp＜0.05。（D）脂質ラフト分析。F3は主として第5画分に局在し、一方、Notch1は画分9〜12に多かった。Casprを、脂質ラフト画分を標識するための陽性対照として用いた。H：全ホモジネート。
【図１６】NICDの移行を示す。（A）F3により誘導されるNICDの核移行。mNotch1-mycをトランスフェクトしたOLN細胞を、11.2nMのF3（a）、Jagged1（b）、BSA（c）で処理するか、またはF3処理の前にα-Notch1 EGF（11-12）とプレインキュベートし（d）、その後にα-NICDで染色した。e：種々の濃度のF3およびJagged1による処理後にNICDの核染色がみられる細胞の定量。データは平均±SEMである。f：OLN細胞をJagged1-トランスフェクトCHO細胞、F3-トランスフェクトCHO細胞または疑似トランスフェクトCHO細胞とともに培養し、可溶化物をα-Notch1、α-Notch2およびα-チューブリンによりイムノプロービングした。（B）F3で誘導されるRIPをγ-セクレターゼによりS3部位で実施した。OLN細胞を200μMのγ-セクレターゼ阻害薬で前処理し、F3（a）またはJagged1（b）で刺激した上でα-NICDにより染色した。F3（c、d）またはJagged1（e、f）で処理した後に、myc標識したV1744K変異体またはV1744L変異体をトランスフェクトしたOLN細胞をc-mycに関して免疫標識した。g：myc標識した野生型Notch1またはV1744KおよびV1744L変異体を発現しているOLN細胞からのα-c-myc免疫沈降物を、イムノブロットted with α-NICD（これは約300kDaの完全長Notch1およびその約120kDaの細胞内部分の両方を認識する）またはα-V1744（これはS3部位での切断後のNICDのみを認識する）。（Bf）におけるスケールバー：Aa〜d、Ba〜fに関して15μm。（C）Notch1およびNotch2のアップレギュレーション。F3およびBSAで処理したmNotch1-mycトランスフェクトOLN細胞における総（細胞質＋核）NICD染色強度を定量した（a）。単独で、またはF3トランスフェクトCHO細胞、疑似トランスフェクトCHO細胞、TAG-1トランスフェクトCHO細胞もしくはTAXトランスフェクトCHO細胞とともに培養したOLN細胞を溶解させ、α-Notch1、α-Notch2およびα-Notch3によりプロービングした（b）。c：11.2nMのF3、Jagged1またはPBSで処理したOLN細胞におけるNotch mRNAレベルに関するリアルタイムPCRアッセイ。Notch mRNAレベルはβ-アクチンに対して標準化した。バーは平均±SEMである。* PBSとの比較でp＜0.05。
【図１７】F3-トランスフェクトCHO細胞と接触するとOLN細胞の突起は停止し、形態が変化する。OLN細胞の細胞突起（aおよびbにおける矢印）はF3-トランスフェクトCHO細胞の細胞体に向かって伸び、それに接触すると終端を形成し、細胞体を包む平坦な細胞質シートを生成する。この現象は星印（*）により示されている。a：OLN細胞およびF3-トランスフェクトCHO細胞の両方をPKH26赤色蛍光色素により前染色した。b：（a）に対応する明視野顕微鏡写真。c、f、i：OLN細胞をPKH26赤色蛍光色素により前染色した。d、g、j：OLN細胞およびF3-トランスフェクトCHO細胞の両方をc-myc（緑色）に関して染色した。e、h、k：（c、d）（f、g）（i、j）のそれぞれの合成画像。l〜q：対照の系において、OLN細胞の細胞突起（矢印）はトランスフェクトCHO細胞の細胞体を通り越して伸長した。（l、m）（n、o）および（p、q）は、OLN細胞と疑似トランスフェクトCHO細胞（l、m）、TAX（n、o）およびTAG-1（p、q）をトランスフェクトしたCHO細胞との共培養物の、対応するPKH26赤色蛍光および明視野顕微鏡写真である。r：共培養物においてトランスフェクトCHO細胞の細胞体を通り越して伸長するOLN細胞突起の定量。データは平均±SDである。 * 対照との比較でp＜0.01。（q）におけるスケールバー：（a、b、l〜q）に関して25μm、（c〜k）に関して15μm。
【図１８】MAGはF3／Notch相互作用によってアップレギュレートされる。（A）MAGはF3によってアップレギュレートされる。CHO細胞およびトランスフェクト派生物は、Notch、Delta、Jagged1およびJagged2の古典的リガンドを発現しない（a）。ラット脳の可溶化物、OLN のみおよび表記の共培養細胞を、α-MAG（上の図）またはa-γ-チューブリン（下の図）によりプロービングした（b）。（c）リアルタイムPCRにより測定したところ、初代OLにおけるMAG mRNAは、F3により、BSA処理と比較して有意に上昇した。比較CT方法を用いて、生データをGAPDHに対して標準化した。（B）F3は、Jagged1とは異なり、MAGをアップレギュレートする。mNotch1-mycをトランスフェクトしたOLN細胞を11.2nMのF3-Fc（a、d）またはJagged1（b、c、e、f）で処理し、α-MAG（a、b）またはα-CNPアーゼ（d、e）を用いて標識した。（b、e）における矢印は細胞体を示し、これは明視野像でより良好に見てとれる（c、f）。g：F3、Jagged1、BSAで処理した細胞、またはα-Notch1 EGF（11-12）で前処理した後にF3で処理した細胞における、MAGおよびCNPアーゼ染色の蛍光強度。データは平均±SEMである。h：F3、Jagged1またはBSAで処理した細胞によって占められる表面積の定量（平均±SEM）。* BSAとの比較でp＜0.05；** p＜0.01。（C）MAGのアップレギュレーションはF3／Notch相互作用に依存的である。a〜j：Notch ICD欠失変異体dn-N1（a）、dn-N2（b）；LacZ（c）；S3切断変異体V1744K（d）およびV1744L（e）；Notch ECD欠失変異体caN1（f、g）およびcaN2（h、i）をトランスフェクトしたOLN細胞を、11.2nMのF3で処理するか（a〜e）または処理せずに（f〜i）、MAG（赤色）およびV5（a〜c、f、h）（緑色）またはc-myc（d、e）（緑色）に対して二重標識した。f、hにおけるトランスフェクト細胞はそれぞれ、明視野画像g、iで、矢印によって示されているようにさらに良好に見てとれる。j：表記した種々の構築物をトランスフェクトし、その後に種々のタンパク質処理を行った細胞におけるMAG蛍光強度。データは平均±SEMである。ECD：細胞外ドメイン；TM：膜貫通ドメイン：ICD：細胞内ドメイン。V1744KおよびV1744L構築物におけるS3部位の変異は膜貫通領域内の三角印によって示されている。* F3処理OLN細胞との比較でp＜0.01。（Ci）におけるスケールバー：（Ba〜f）に関して20μm；（Ca〜i）に関して40μm。
【図１９】MAG発現はHes1には依存せず、DTX1に依存する。（A）MAGのアップレギュレーションはHes1発現には依存しない。（a）OLN細胞を表記のリガンドまたは化合物によって処理した。図示した時点で、Hes1転写物をリアルタイムPCRを用いて定量し、時間経過の開始時点のものに対して標準化した。（b、d、e）OLN細胞を処理しないままにするか、またはHes1センス（Hes1-S）もしくはアンチセンス（Hes1-AS）オリゴヌクレオチドで前処理し、その後に11.2 nM F3で処理した。細胞可溶化物をα-Hes1（上の図）もしくはα-核マトリックスタンパク質（N-マトリックス）（下の図）によりプロービングするか（b）、または細胞をMAGに関して標識した（d、e）。また、pGVB／Hes1レポーターを単独で、またはcaN1、RBP-Jもしくはmyc標識dn-RBP-Jを発現する構築物とともにトランスフェクトしたOLN細胞に対してルシフェラーゼアッセイも行った（c）。データは平均±SDである。f：dn-RBP-J-mycをトランスフェクトしたOLN細胞を11.2nMのF3で処理し、MAG（赤色）およびc-myc（緑色）に対して二重染色した。g：上に示した種々の処理を行ったOLN細胞におけるMAG染色強度。データは平均±SEMである。* F3のみで処理した細胞との比較でp＜0.01。（B）MAGのアップレギュレーションはDTX1を必要とする。a：ルシフェラーゼレポーターアッセイおよび免疫染色試験に用いたDTX1構築物。N末端：N末端ドメイン；Pro：プロリンリッチモチーフ；リングフィンガー：Ring-H2フィンガーモチーフ。OLN細胞に対して、pGVB／Hes1レポーターを単独で、または表記の発現構築物とともにトランスフェクトした。b：これらの細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性。データは平均±SDである。DTX1（c〜e）、DTX1-D1-HA（f〜h）またはDTX1-D2-Flag（i-k）をトランスフェクトしたOLN細胞を、11.2nMのF3で処理し、MAG（赤色）および関連タグ（緑色）に対して二重標識した。1：表記の構築物をトランスフェクトした後に種々のタンパク質処理を行ったOLN細胞におけるMAG蛍光強度。データは平均±SEMである。* F3処理OLN細胞との比較でp＜0.01。（Bk）におけるスケールバー：Ac〜f、Bc〜kに関して30μm。
【図２０】DTX1を介するF3／Notchシグナル伝達はOPC分化を促進する。精製したNg2＋／CNPアーゼ-OPC（a）を、BSA（b）、F3（c）またはJagged1（d）で2日間処理し、Ng2（赤色）およびCNPアーゼ（緑色）に対して二重標識した上で算定した（k）。また、OPCに対してタグ標識したdn-N1（e、h）およびDTX1-D2（f、i）をトランスフェクトし、その後にF3またはcaN1で処理するか、処理しないままとした（g、j）。細胞を適切なタグ（緑色）およびCNPアーゼ（赤色；e〜g）またはNg2（赤色；h〜j）に対して二重染色し、算定した（k）。（j）におけるスケールバー：（a、eの挿入図）に関して25μm、（b〜j）に関して100μm。
【図２１】発生過程における独特のリガンド依存的Notchシグナル伝達経路に関して提案したモデルを示す。F3は対向する細胞表面のNotch受容体と相互作用してNotch／RBP-Jシグナル伝達経路を刺激し、NICDが細胞質中に放出される前または後にDTX1を動員させる。NICD／RBP-J／DTX1複合体は、核内に移行する前に特異的ではあるがまだ同定されていない修飾を受け、核内でMAGなどの標的遺伝子を活性化すると思われる。このシグナル伝達は、Jagged1発現低下がF3／Notchシグナル伝達の開始に促進的に作用する時期であるP6以後のOL成熟の原因である可能性がある。これに対して、P6の前には、Jagged1／Notchシグナル伝達がHes1などの標的遺伝子のNICD／RBP-J依存的転写を活性化し、これは主としてOPC分化を抑制する。ECM：細胞外マトリックス；C：細胞質；N：核；NICDJag1、NICDF3：それぞれJagged1およびF3の活性化によって放出されるNICD；E：胚；P6、P15：それぞれ生後6日および15日；A：成体；OPC：オリゴデンドロサイト前駆細胞；O：オリゴデンドロサイト；右下の略画：軸索を鞘で覆っている髄鞘形成性オリゴデンドロサイト。
【図２２】NB-3はパラノード性ニューロン分子である。A. NB-3はニューロンによって発現される。E17ラットの精製ニューロン、OLおよびアストロサイトを、NB-3および対応する表面マーカー：それぞれNF200（a）、Gal-C（b）およびGFAP（c）に対して二重染色した。（c）におけるスケールバー：（a〜c）に関して30μm。（d）NB-3はE17から発現される。表記の年齢のラットの脳幹をホモジネート化し、NB-3、F3、MAGに対するイムノブロット法を行った。（B）NB-3はパラノードに局在する。90日齢ラットの脳幹切片を、NB-3およびCaspr（a〜c）、またはNB-3およびナトリウムチャンネル（d〜f）に対して二重標識した。（f）におけるスケールバー：（a〜f）に関して15μm。（C）脂質ラフトアッセイ。NB3は、F3およびCasprと同じ画分である画分5に多く存在した。H：全ホモジネート。
【図２３】NB-3はNotch1の機能的リガンドである。（A）NB-3はNotch1と結合する。（a）NB-3はNotch1と免疫共沈する。α-Notch1およびα-NB-3を用いたラット脳可溶化物からの免疫沈降物を、α-NB-3またはα-Notch1のそれぞれによりプロービングした。（b）細胞接着アッセイ。OLN細胞をNB-3基質に播き、それに対して接着させた。接着はα-Notch1またはα-NB-3によって特異的にブロックされた。# CHL1との比較でp＜0.05；* 免疫前血清との比較でp＜0.05。（c）NB-3はNotch1の特定領域と結合する。Notch1 GST融合タンパク質またはGSTのみを、ラット脳可溶化物からのGSTプルダウンアッセイに用いた。沈降物および脳可溶化物をNB-3に関してプロービングした。（d）4種類のNotch1 GST融合断片に対する接着性NB-3トランスフェクトCHO細胞および疑似トランスフェクトCHO細胞の定量。* GSTとの比較でp＜0.05。棒グラフ（b、d）は接着細胞の数を表している（平均±SD）。（B）NB-3／Notch相互作用はOLN細胞におけるNICD核移行を誘導する。NB-3（a）、Jagged1（b）およびBSA（c）で処理したmNotch1-mycトランスフェクトOLN細胞を、NICDに対して免疫染色した。一部の細胞は、NB-3刺激の前にEGF抗体（d）またはγ-セクレターゼ阻害薬（e）で処理した。また、OLN細胞に対してV17441K-myc（f、h）またはV1744L-myc（g、i）をトランスフェクトし、NB-3（f、g）またはJagged1（h、i）で処理した上で、NICDの位置を特定するためにc-myc抗体で免疫染色した。（a）におけるスケールバー：（a〜i）に関して20μm。（j）NB-3またはJagged1で処理した後に、mNotch1-myc、V1744K-mycまたはV1744L-mycをトランスフェクトしたOLN細胞からのα-c-myc沈降物のイムノブロッティングを、α-NICD（上の図）またはα-V1744（下の図）を用いて行った。（C）Hes1およびHes5はNB-3によっては活性化されない。表記した種々の期間にわたってNB-3で処理したOLN細胞を溶解させ、抽出したmRNAをリアルタイムPCRにかけた（a）。データは開始時点でのmRNAレベルに対して標準化した。他の細胞はPBS、BSA、L1またはNB-3で48時間処理し、リアルタイムPCRにより分析した（b）。（c）OLN細胞に対してHes1またはHes5ルシフェラーゼレポーターのみをトランスフェクトし、その後にNB-3またはcaN1構築物による処理を行った。トランスフェクションから24時間後に、細胞をルシフェラーゼアッセイにかけた。データは平均±SDである。
【図２４】NB-3／Notch相互作用はDTX1を介してMAGをアップレギュレートする。（A）MAGはOLN-93細胞とNB-3-トランスフェクトCHO細胞との共培養物においてアップレギュレートされた。（a）N-マトリックス：核マトリックスタンパク質。CHO／OLN、NB-3／OLN：OLN-93細胞と、疑似トランスフェクトCHO細胞またはNB-3トランスフェクトCHO細胞のそれぞれとの共培養物。（b）初代OLにおけるMAG mRNAは、リアルタイムPCRによるモニタリングによれば、NB-3刺激後に約24倍に増加する。GAPDHを内部対照として用いた。OLN細胞をNB-3（c）、Jagged1（d、e）およびBSA（提示せず）で処理し、MAGに対して免疫染色した。MAGの蛍光強度を測定した（f）。データは平均±SEMである。（B）NB-3により誘導されるMAGアップレギュレーションはDTX1を必要とする。OLN細胞に対してdn-N1-V5（a）、V1744K-myc（b）、V1744L-myc（c）、caN1（d、e）、dn-RBP-J-myc（h）、DTX1-myc（i）、DTX1-D1-HA（j）およびDTX1-D2-Flag（k）をトランスフェクトし、NB-3で処理した。続いて細胞をMAGおよび対応するタグに対して免疫染色した。トランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞におけるMAGの蛍光強度を測定した（l）。データは平均±SDである。（f）DTX1およびその2種類の欠失変異体の構造の概略図。数字1、2、3はそれぞれN末端、プロリンリッチ領域およびRing-H2フィンガーモチーフに対応する。（g）表記の構築物の妥当性を確かめるためのHes1ルシフェラーゼレポーターアッセイ。データは平均±SDである。（k）におけるスケールバー：（Ac〜e、Ba〜k）に関して30μm。
【図２５】発生過程でパラノードにクラスター化したNB-3はNotch1／DTX1シグナル伝達経路を介してOPC分化を促進する。（A）NB-3およびJagged1は発生過程において異なる分布をとる。P2（a）、P5（b、c）ラットの脳幹をJagged1（緑色）およびNB-3（赤色）に対して二重染色した。（c）におけるスケールバー：（a、b）に関して30μm、（c）に関して5μm。（B）NB-3／NotchはDTX1を介してOPC分化を促進する。P7ラットの視神経から精製したNg2陽性OPC（a）を、BSA（b）、NB-3（C）またはJagged1（d）で2日間処理し、Ng2（赤色）およびCNPアーゼ（緑色）に対して二重標識した。他の細胞に対してはdn-N1（e）、DTX1-D1（f）をトランスフェクトした後に、NB-3で刺激するかcaN1（g）のみで処理した。続いて細胞をタグ（緑色）およびCNPアーゼ（赤色）に対して免疫染色した。CNPアーゼ陽性細胞のパーセンテージを算出した（h）。データは平均±SEMである。（g）におけるスケールバー：（a〜g）に関して40μm。
【図２６】NSC：表記の齢のラット脳幹に対して、NB-3およびNotch1の発現パターンに関するウエスタンブロット法を行った。
【図２７】NSC：NB-3はNotch1の機能的リガンドである。（A）NSCはNotch1を発現する。NSCを前駆体マーカーであるネスチン（a）およびNotch1（b）に対して二重染色した。（c）は合成画像である。（c）におけるスケールバー：（a〜c）に関して60μm。（B）NB-3はNotch1と結合する。P0ラット脳試料を、NB-3-Fc融合タンパク質、α-Notch1またはα-NB-3を結合させたプロテインAビーズによって沈降させ、沈降物のブロッティングを表記の通りに行った（a）。N1をトランスフェクトしたHela細胞（N1）を、NB-3をコーティングした基質に対して、ブロッキング抗体の非存在下（b）またはα-NB-3（c）、α-Notch1（d）もしくは免疫前血清（e）の存在下で播いた。接着細胞を算定した（f）。データは平均±SDである。* 疑似トランスフェクトHela細胞との比較でp＜0.05；# 免疫前血清との比較でp＜0.05。（C）NB-3はNICDの核移行を誘導する。NSCを個別にNB-3（12.5nM）（a）、Jagged1（5OnM）（b）またはBSA（c）で24時間処理した後に固定し、NICDの位置を特定するためにネスチン（緑色）、NICD（赤色）およびHoechst 33258（青色）に対する三重染色を行った。（c）におけるスケールバー：（a〜c）に関して20μm。（D）NB-3はHes1を活性化しない。NSCに対してHes1ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトした後にNB-3もしくはJagged1で処理するか、またはcaN1との同時トランスフェクションを行った。トランスフェクションから24時間後に、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼアッセイにかけた（a）。他のNSCに対してpE7ルシフェラーゼレポーターを表記の構築物とともにトランスフェクトし、NB-3処理を行うか行わずにルシフェラーゼアッセイにかけた（b）。データは平均±SDである。
【図２８】NSC：NB-3はOL生成を促進する。NB-3（a、d）、BSA（b、e）またはJagged1（c、f）を加えたマイトジェン除去培地中でNSCを継代した。7日（7 DIV）分化させた後に、細胞をCNPアーゼ（a〜c、赤色）またはβ-チューブリン（d〜f、赤色）、GFAP（a〜f、緑色）およびHoechst 33258（a〜f、青色）に対して三重染色した。他のNSCはマーカー抗体で個別に免疫標識した上でフローサイトメトリーにかけた。各種の細胞：OL、ニューロンおよびアストロサイトのパーセンテージを算出した（g）。データは平均±SEMである。（f）におけるスケールバー：（a〜f）に関して40μm。
【図２９】DTX1を介するNB-3／Notchシグナル伝達経路はオリゴデンドログリア発生を指令する。NSCにdn-N1（a、b）、DTX1-D2（d、e）をトランスフェクトした後にNB-3またはcaN1（f、g）で処理し、適切なタグおよびCNPアーゼ（a、d、f）またはGFAP（b、e、g）に対して二重染色した。（c）DTX1およびDTX1-D2構築物の構造の概略。ここで用いた構築物の妥当性はHes1ルシフェラーゼレポーターアッセイで確かめた（h）。CNPアーゼまたはGFAPに対して陽性であったトランスフェクト細胞のパーセンテージを算出した（i）。データは平均±SDである。（g）におけるスケールバー：（a、b、d〜g）に関して20μm。
【図３０】推定されるモデルを示す。細胞外NB-3／Notch相互作用によって膜からNICDが放出され、これがDTX1を動員して核内に移行し、そこでこの複合体が直接的または間接的にCNPアーゼ発現を媒介することにより、オリゴデンドログリアの発生を促進する。NSC：神経幹細胞；O：OL；M：膜；N：核；CNP：CNPアーゼ。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年8月9日(2005.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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