(57)【要約】有効量のＢａｘ阻害性ペプチドを細胞に供給するステップを含む、細胞死から細胞を保護する方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｘ阻害性ペプチドを含む有効量の組成物を細胞に供給するステップを含む、細胞死から細胞を保護する方法。
【請求項２】
前記ペプチドが、ＶＰＭＬＫＥ、ＶＰＭＬＫ、ＰＭＬＫＥおよびＰＭＬＫから成る群より選択されるペプチドを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ペプチドが、ＶＰＭＬＫＥを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、ＶＰＭＬＫを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、ＰＭＬＫＥを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、ＰＭＬＫを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、下記式：
Ｘ1ＰＸ2ＬＸ3Ｘ4
のペプチドである、請求項１の方法。
（式中、
Ｘ1は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｘ2は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｘ3は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｘ4は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；および
Ｘ1またはＸ4のいずれかは、なくてもよい）
【請求項８】
ａ）ＶＰＭＬＫＥ、ＶＰＭＬＫ、ＰＭＬＫＥまたはＰＭＬＫのＢａｘ抑制機能を模倣するようにペプチドまたは化学物質を設計するステップ；および
ｂ）有効量の前記化学物質またはペプチドを細胞に供給するステップ
を含む、細胞死から細胞を保護する方法。
【請求項９】
ペプチドがＶＰＭＬＫＥである、単離ペプチド。
【請求項１０】
ペプチドがＶＰＭＬＫである、単離ペプチド。
【請求項１１】
ペプチドがＰＭＬＫＥである、単離ペプチド。
【請求項１２】
ペプチドがＰＭＬＫである、単離ペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが、Ｂａｘ阻害性ペプチドと製薬用担体とを含む医薬組成物であって、下記式：
Ｘ1ＰＸ2ＬＸ3Ｘ4
のペプチドである医薬組成物。
（式中、
Ｘ1は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｘ2は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｘ3は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；
Ｘ4は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；および
Ｘ1またはＸ4のいずれかは、なくてもよい）
【請求項１４】
ペプチドが請求項１３のペプチドである、単離ペプチド。
【請求項１５】
有効量の請求項１のペプチドの中で細胞または臓器を保管することを含む、輸液用または移植用の細胞および臓器を保存する方法。
【請求項１６】
有効量の請求項１のペプチドの中で細胞を保管することを含む、損傷細胞を再生させる方法。
【請求項１７】
有効量の請求項１のペプチドの中で細胞を保管することを含む、細胞への遺伝子またはタンパク質のトランスフェクション効率を改善する方法。
【請求項１８】
前記Ｂａｘ阻害性ペプチドを患者に投与する、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記患者が、卒中患者である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記患者が、心臓発作患者である、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記患者が、虚血患者である、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記患者が、変性疾患患者である、請求項１の方法。
【請求項２３】
前記患者が、細菌、ウイルス（複数を含む）および原生動物から成る群より選択される因子によって生じた感染を有する、請求項１の方法。
【請求項２４】
前記患者が、抗癌剤から成る群より選択される薬物の副作用および紫外線／Ｘ線照射を有する、請求項１の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／３６０，７５５号および同第６０／３８４，２０４号ならびに米国出願第１０／２４７，０４５号に対して優先権を主張するものである。前記三件の出願は、すべて、本明細書に参照として組み込まれている。
【連邦政府により援助を受けた研究または開発に関する記述】
【０００２】
−−
【背景技術】
【０００３】
Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質が、プログラム細胞死の進化的保存経路における末端段階を調節し、それらのメンバーにはアポトーシスのサプレッサとして機能するものあれば、細胞死のプロモータとして機能するものあることは、知られている（グロス（Ｇｒｏｓｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１８９９−１９１１，１９９９；リード（Ｒｅｅｄ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：７７３−７７６，１９９７）。哺乳動物の細胞において、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質が、ミトコンドリア依存性細胞死カスケードを制御することは、知られている（アダムス（Ａｄａｍｓ）およびコリー（Ｃｏｒｙ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３２２−１３２６，１９９８；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）およびリード（Ｒｅｅｄ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９−１３１２，１９９８；リード（Ｒｅｅｄ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．４  Ｓｕｐｐｌ．１：Ｓ８−１４，１９９８）。ミトコンドリアは、アポトーシスの間に、シトクロムｃアポトーシス誘発因子（ＡＩＦ）、およびＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯなどのアポトーシス発生因子を放出し（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、２０００）、ミトコンドリアからサイトゾル空間に放出されたシトクロムｃは、細胞を死に導くＡｐａｆ−１依存性カスパーゼの活性化を引き起こす（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、Ｃｅｌｌ  １０２：１−４，２０００；ツオウ（Ｚｏｕ）ら、Ｃｅｌｌ  ９０：４０５−４１３，１９９７）。Ｂａｘなどの前アポトーシス性(pro-apoptotic)Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を促進する（ジャーゲンスマイアー（Ｊｕｒｇｅｎｓｍｅｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５:４９９７−５００２，１９９８）。一方、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス性(anti-apoptotic)Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑制し、それによって、幾つかの刺激により誘発されるアポトーシスシグナルから細胞を保護する（クルック（Ｋｌｕｃｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５:１１３２−１１３６，１９９７；ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５:１１２９−１１３２，１９９７）。Ｂｃｌ−２ファミリーのこれらの様々な前アポトーシス性メンバーと抗アポトーシス性メンバーの相対比が、様々なアポトーシス刺激に対する細胞の感受性を決定することは知られており（オルティバイ（Ｏｌｔｉｖａｉ）およびコルスマイヤー（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ）、Ｃｅｌｌ  ７９：１８９−１９２，１９９４）、そうした刺激には、化学療法薬および放射線、成長因子欠如、細胞外基質への細胞付着の喪失、低酸素（大きな腫瘍の中心部において一般に発生する）、および細胞毒性Ｔ細胞による溶解が挙げられる（アダムス（Ａｄａｍｓ）およびコリー（Ｃｏｒｙ）、上記、１９９８；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）およびリード（Ｒｅｅｄ）、上記、１９９８；Ｇｒｏｓｓ（グロス）ら、上記、１９９９；リード（Ｒｅｅｄ）、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：９−１９，１９９７）。
【０００４】
前アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの中で、ＢａｘおよびＢａｋは、アポトーシスの誘発に重要な役割を果たす。マウスにおけるこれらの遺伝子の二重ノックアウトは、ミトコンドリア依存性アポトーシスを誘発することが知られている幾つかの細胞死刺激（ＵＶ照射、スタウロスポリン（汎キナーゼ阻害剤）および一部の抗癌薬など）に対する細胞の抵抗を結果として生じさせる（ウェイ（Ｗｅｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：７２７−７３０，２００１）。Ｂａｘは、静止状態のサイトゾルの中に通常はある。アポトーシス刺激を受けると、Ｂａｘは、ミトコンドリア内に転移(translocate)し（ウォルター（Ｗｏｌｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：１２８１−１２９２，１９９７）、そしてことによるとミトコンドリアの外膜に細孔を形成することにより、シトクロムｃの放出を促進する（コルスマイヤー（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：１１６６−１１７３，２０００；サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：５５３−５５５，２０００）。一方、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬなどの抗アポトーシス性ファミリーのタンパク質は、ミトコンドリア膜内にあり、サイトゾルから移動したＢａｘの細胞毒活性に拮抗する（アダムス（Ａｄａｍｓ）およびコリー（Ｃｏｒｙ）、上記、１９９８；グリーン（Ｇｒｅｅｎ）およびリード（Ｒｅｅｄ）、上記、１９９８；リード（Ｒｅｅｄ）ら、上記、１９９８）。Ｂａｘのミトコンドリア転移は、アポトーシスの誘発に重要な段階の一つであるが、そのメカニズムは、まだ充分に理解されていない。サイトゾルからミトコンドリアへのＢａｘの転移は、カスパーゼ阻害剤前処理がこのプロセスに干渉しないので、カスパーゼ非依存性である（ゴーピング（Ｇｏｐｉｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４３：２０７−２１５，１９９８）。Ｂａｘの九番目のαヘリックスを形成するＣ末端疎水性残基が、ミトコンドリア膜へのＢａｘの転移に関与することは、報告されている（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、Ｃｅｌｌ  １０３：６４５−６５４，２０００）。一方、ＢａｘのＮ末端は、この領域の欠失により、アポトーシス刺激が不在の状態でミトコンドリア膜へのＢａｘの蓄積が可能となるので、サイトゾル保持ドメインとして機能する（ゴーピング（Ｇｏｐｉｎｇ）ら、上記、１９９８）。過去の知見は、未確認のサイトゾル性因子（複数を含む）が、ＢａｘのＮ末端と相互作用して、アポトーシス刺激不在の状態でのミトコンドリアへの転移を阻害することを示唆している。
【０００５】
米国出願第１０／２４７，０４５号は、ＢａｘのＮ末端に結合し、そのミトコンドリア転移を防止する因子、Ｋｕ−７０によるＢＡＸの抑制を記載している。本発明は、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制する膜透過性ペプチドの開発を含む。
【発明の概要】
【０００６】
一つの実施態様において、本発明は、Ｂａｘ阻害性ペプチドを含む有効量の組成物を細胞に供給するステップを含む、細胞死から細胞を保護する方法である。一つの特定の実施態様において、前記ペプチドは、ＶＰＭＬＫ、ＰＭＬＫＥおよびＰＭＬＫから成る群より選択されるペプチドを含む。
【０００７】
もう一つの実施態様において、前記ペプチドは、次の式：Ｘ1ＰＸ2ＬＸ3Ｘ4（式中、Ｘ1は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ2は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ3は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ4は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；およびＸ1またはＸ4のいずれかは、なくてもよいが、両方不在であってはいけない）のペプチドである。
【０００８】
一つの好ましい実施態様において、前記Ｂａｘ阻害性ペプチドが、患者に投与される。
【０００９】
一つの実施態様において、本発明は、上記したペプチドを含む組成物の一つの調製である。
【００１０】
もう一つの実施態様において、本発明は、（ａ）ＶＰＭＬＫ、ＰＭＬＫＥまたはＰＭＬＫのＢａｘ抑制機能を模倣するペプチドまたは化学物質を含む組成物を設計するステップ；および（ｂ）有効量の前記組成物を細胞に供給するステップを含む、細胞死から細胞を保護する方法である。
【００１１】
もう一つの実施態様において、本発明は、次の式：Ｘ1ＰＸ2ＬＸ3Ｘ4（式中、Ｘ1は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ2は、非極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ3は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；Ｘ4は、荷電極性側鎖を有するアミノ酸から選択され；およびＸ1またはＸ4のいずれかは、なくてもよいが、両方不在であってはいけない）のペプチドであるＢａｘ阻害性ペプチドと製薬用担体とを含む医薬組成物である。
【００１２】
本発明は、有効量の上記で特定したペプチドの中で細胞または臓器を保管することを含む、輸液用または移植用の細胞および臓器を保存する方法でもある。
【００１３】
本発明は、有効量の前記ペプチドの中で細胞を保管することを含む、損傷細胞を再生させる方法でもある。
【００１４】
本発明は、有効量の前記ペプチドの内で細胞を保管することを含む、細胞への遺伝子またはタンパク質のトランスフェクション効率を改善する方法でもある
【発明の詳細な説明】
【００１５】
一般
Ｂａｘは、タンパク質のＢｃｌ−２ファミリーの前アポトーシス性メンバーであり、ミトコンドリア依存性アポトーシスにおいて重要な役割を果たす。Ｂａｘは、静止性タンパク質としてサイトゾル中にあり、アポトーシス刺激を受けるとミトコンドリア内に転移する。Ｋｕ７０は、核におけるＤＮＡ二本鎖切断修復において重要な役割を果たすＫｕ複合体(complex)の７０ｋＤａサブユニットであることが知られている。本発明者らは、Ｋｕ７０が、サイトゾル中の前アポトーシス性タンパク質Ｂａｘと相互作用して、Ｂａｘのミトコンドリア転移を防止し、従って、Ｋｕ７０が、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制することを報告している（米国特許出願番号１０／２４７，０４５参照）。
【００１６】
本発明において、本発明者らは、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制し、Ｂａｘ分子との相互作用に関してはＫｕ７０を模倣するように見える新規膜透過性ペプチド（Ｂａｘ阻害性ペプチド；ＢＩＰ）の開発を開示する。一つの実施態様において、ＢＩＰは、Ｋｕ７０のＢａｘ結合ドメインから設計した五個のアミノ酸から構成され、Ｂａｘのミトコンドリア転移を抑制する。ＢＩＰは、下記の実施例で開示するような幾つかのタイプの細胞において、スタウロスポリン、ＵＶＣ照射および抗癌薬によって誘発されるＢａｘ媒介アポトーシスを抑制する。
【００１７】
Ｋｕ７０タンパク質の欠失変異体を幾つかの試験をすることにより、本発明者は、Ｋｕ７０におけるＢａｘ結合ドメインを特定した。このドメインは、６個のアミノ酸（ＶＰＭＬＫＥ）を含む。このペプチド（Ｋｕ７０ペプチドＶ６）は、ヒト培養細胞（ＨｅＬａ細胞およびヒト腎臓上皮２９３細胞）から調製した溶解産物中、２０〜８０ｕＭの濃度でＫｕ７０とＢａｘの相互作用を阻害する。Ｋｕ７０のこれら６個のアミノ酸のスクランブルド配列とすぐ隣の６個のアミノ酸の配列（Ｋｕ７０  ５７３−５７８ペプチド、「Ｋｕ７０ペプチドＮＣ」と名づける）を使用する陰性対照実験は、Ｋｕ７０とＢａｘの相互作用に影響を及ぼさなかった。これは、Ｋｕ７０ペプチドＶ６活性の特異性を示している。それらの細胞へのＫｕ７０ペプチドＶ６の送達は、ＵＶ照射およびスタウロスポリン処理などの幾つかのアポトーシス性ストレスにより処理された細胞におけるＢａｘのミトコンドリア転移も阻害する。
【００１８】
Ｋｕ７０ペプチドＶ６は、ＵＶ照射およびスタウロスポリンによって処理されたヒト培養細胞（ＨｅＬａ細胞）の細胞死も抑制する。欠失変異体であるＶＰＭＬＫ（Ｖ５）およびＰＭＬＫＥ（Ｐ５）も、抗細胞死活性を示した。重要なことは、Ｖ５およびＰ５が、膜透過性であり、Ｖ６の場合のようにリポソームなどの細胞送達系を必要としないことである。一つの実施態様において、本発明は、細胞の死を防止することができるＢａｘ阻害性ペプチド、好ましくはＶＰＭＬＫＥ、ＶＰＭＬＫおよびＰＭＬＫＥ（それぞれ、Ｖ６、Ｖ５およびＰ５）ならびに細胞の死を防止するための前記ペプチドの使用である。これらのペプチドの配列は、Ｋｕ７０タンパク質におけるＢａｘ結合ドメイン（アミノ酸５７８−５８３）から設計した。
【００１９】
元の６個のアミノ酸のペプチドＶ６（ＶＰＭＬＫＥ）およびそれより短いアミノ酸ペプチドを含むその変異体（例えば、ＶＰＭＬＫ（Ｖ５）、ＰＭＬＫＥ（Ｐ５））および変性ペプチド（例えば、より良好な膜透過性またはより長期の安定性のために変性されたもの）は、Ｂａｘ阻害性ペプチドでもあり、細胞および組織の病的損傷の防止に適する薬物でもあり得、本発明の範囲に包含される。
【００２０】
本発明は、記載したＫｕ７０ペプチドを模倣するように設計されたペプチド（好ましくは６−３個の残基）および化学物質（天然および合成化合物）も包含する。「模倣する」とは、下記の実施例の方法により測定した場合、そのペプチドが、Ｖ５およびＰ５のＢａｘ抑制機能の少なくとも９０％を有することを意味するものとする。ペプチドまたは化合物が、Ｂａｘのミトコンドリア転移を阻止することによりアポトーシスを抑制する場合、これらの化学物質またはペプチドは、Ｋｕ７０ペプチドを首尾よく「模倣している」。
【００２１】
模倣体を作るために適する方法は、国際公開公報第００／２１９８０号、欧州特許第１０７７２１８Ａ２号、国際公開公報第０１／６０８４４号、同第０１／１４４１２号、同第０１／５５０９１号、同第０１／４６１９７号、同第０２／２００３３号、同第０２／２００３４号、同第０２／２０５５７号で見出すことができ、これらは参照として本明細書に取り込まれる。参照として取り込まれている以下の文献も、Ｋｕ７０模倣体を作るためのガイドである:ピー・シー・エー・カム（Ｐ．Ｃ．Ａ．Ｋａｍ）、「血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）」、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ  ９６：１２３７−１２４９，２００２；エス・ムーサ（Ｓ．Ｍｏｕｓａ）、「抗血小板療法：アスピリンからＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤およびそれらを超えるものまで（Ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｔｏ  ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ）」、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：５５２−５６１，１９９９；アール・エス・マクドーウェル（Ｒ．Ｓ．ＭｃＤｏｗｅｌｌ）ら、「ペプチドから非ペプチドまで。２．ベンゾジアゼピン骨格に基づく血小板凝集の効力ある非ペプチド阻害剤の新たなる設計（Ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ．２．Ｔｈｅ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ，ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：５０７７−５０８３，１９９４；およびビー・ケイ・ブラックバーン（Ｂ．Ｋ．Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）ら、「ペプチドから非ペプチドまで。３．３，４−ジヒドロ−１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン核を含有するアトロプ異性体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬（Ｆｒｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ．３．Ａｔｒｏｐｉｓｏｍｅｒｉｃ  ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−１，４−ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ−２，５−ｄｉｏｎｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）」、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．４０：７１７−７２９，１９９７。
【００２２】
本明細書に記載されているペプチド配列をわずかに変性（例えば、類似した荷電アミノ酸の置換またはいずれかの末端における１、２もしくは３個の無害なアミノ酸の付加または無害な単位または部分の付加による変性）したペプチドは、適するＢＩＰであると考えている。「無害な」とは、中核ペプチド配列ＰＭＬＫのＢａｘ阻害活性を実質的に低下させないアミノ酸（複数を含む）または単位を意味するものとする。従って、本発明のＢａｘ阻害性ペプチドを含む組成物は、いずれかの末端における１、２、３個の無害なアミノ酸の付加、無害なアミノ酸置換、無害な部分または単位の付加を伴う本明細書に記載されているペプチド（例えば、ＰＭＬＫ、ＰＭＬＫＥ、ＶＰＭＬＫ、ＶＰＭＬＫＥおよび下の式）、およびこれらのペプチドの模倣体を包含する。
【００２３】
ペプチド薬物送達および治療的投与は、細胞膜に関わる透過性および選択性の問題によって制限される（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１２）：１１７３−１１７６，２００１）。細胞にペプチドおよびタンパク質を送達するための戦略によって、これらの問題を解決することができる。タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）と呼ばれる多数の小さなタンパク質ドメインは、生体膜を横断し、輸送体または特異的受容体とは無関係に作用して、細胞へのペプチドおよびタンパク質の送達を促進することが証明された。ホーイガー（Ｈａｗｉｇｅｒ）の研究（ホーイガー，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３（１）：８８−９４，１９９９）は、位置Ｘ1もしくはＸ4においてＰＴＤドメインを付加させて、特定の標的細胞に対するＢＩＰの輸送を助長またはその分子の安定性を助長することから成るペプチド変性を含むこの技術が、ＢＩＰを含む組成物の生成に適用できるということを、本発明者らがどのように考えているかの一つの例である。
【００２４】
本発明は、上記した配列が複数回反復されているペプチドも包含する。
【００２５】
アミノ酸配列ＶＰＭＬＫおよびＰＭＬＫＥは、同じ程度に、Ｂａｘの抑制に有効であるため、アミノ酸配列ＰＭＬＫが、ＢＩＰの生物活性のための中核構造であると考えられる。実際、インビトロでのＢａｘへの結合には、ＰＭＫＥだけで充分である。しかし、これら四個のアミノ酸は細胞内に保有されないため、ＰＭＬＫは生物活性でない。ＰＭＬＫのＰの前にＶ、またはＫの後にＥを付加させると、ペプチド（複数を含む）は細胞内に有効に保有されるようになる。従って、これらのペプチド（ＶＰＭＬＫまたはＰＭＬＫＥ）は、細胞内で抗Ｂａｘ活性を発現し、Ｂａｘ阻害性ペプチドである。
【００２６】
本発明者は、ＰＭＬＫへの第五のアミノ酸の付加は、サイトゾルへのＢＩＰの溶解性、または細胞膜を通したＢＩＰの移出の防止のいずれかに必要であると考える。従って、類似した極性を保有する他のアミノ酸は、ＶおよびＥに適する代用品であると予想される。
【００２７】
ＰＭＬＫにおいて、ＰおよびＬは、有効性に必要であるように思われる。Ｐは、アミノ酸の中でも非常にユニークな構造を有するため、ＩでのＬの置換（ＬおよびＩは、非極性アミノ酸である）は、ＢＩＰの生物活性を減弱させる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＢＩＰ  ｐａｐｅｒに記載されている）。
【００２８】
ＰＭＬＫにおいて、ＭおよびＫは、類似した極性を有する同じグループの他のアミノ酸と交換可能であり得る。
【００２９】
上の論理に基づき、本発明者らは、ＢＩＰの好ましい実施態様の将来的変形の式を、ペプチドＸ1ＰＸ2ＬＸ3Ｘ4を含むものと、説明する。
（式中、
Ｘ1＝グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）などの、非極性側鎖を有するアミノ酸；
Ｘ2＝グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）などの、非極性側鎖を有するアミノ酸；
Ｘ3＝リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）などの、荷電極性側鎖を有するアミノ酸；および
Ｘ4＝リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）などの、荷電極性側鎖を有するアミノ酸；
Ｘ1またはＸ4のいずれかは、なくてもよい）
【００３０】
本発明者は、１、２または３個の無害なアミノ酸または無害な単位もしくは部分を、そのＢａｘ阻害活性を有意に低下させることなくそのペプチドのいずれかの末端またはそのペプチド自体に付加させることができると考えている。これらは、Ｂａｘ阻害性ペプチドを含む適する組成物である。
【００３１】
好ましい実施態様において、本発明は、ＢＩＰおよび製薬用担体を含む医薬組成物である。本発見に基づく薬物または製剤の可能性ある用途は、卒中、心臓発作、虚血、変性疾患、（ニューロンおよび筋肉、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋細胞変性など）、寄生生物（ウイルス、細菌、酵母または原生動物など）による感染、他の薬物（例えば、抗癌薬）の副作用、紫外線／Ｘ線照射、および細胞死シグナルを誘発する他の幾つかの病的状態によって損傷した細胞および組織の死を防止するための薬物である。他の可能性ある用途には、損傷細胞（ニューロンおよび筋肉細胞を含む）の再生の支援；細胞への遺伝子およびタンパク質のトランスフェクション効率の改善；ならびに輸液または移植用の細胞および臓器の保存が挙げられる。
【００３２】
以下の参考文献には、様々な疾病において重要な役割を果たすＢａｘタンパク質が記載されている：外傷誘発性ニューロン死−デクウェルス（Ｄｅｃｋｗｅｒｔｈ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ．１７：４０１−４１１，１９９６；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４３３：２９９−３１１，２００１；カークランド（Ｋｉｒｋｌａｎｄ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６４８０−９０，２００２；アルツハイマー病−マックギボン（ＭａｃＧｉｂｂｏｎ）ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７５０：２２３−２３４，１９９７；セルズニック（Ｓｅｌｚｎｉｃｋ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５９：２７１−２７９，２０００；カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２１：３２１−３３３，２００１；チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５６：５１９−５２９，２００２；虚血誘発性細胞損傷−カネダ（Ｋａｎｅｄａ）ら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８１５：１１−２０，１９９９；ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：６４４−６５５，２００１；ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）およびＢａｘ：カステド（Ｃａｓｔｅｄｏ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：１０９７−１１１０，２００１；薬物誘発性ニューロン死−ダーガッシュ（Ｄａｒｇｕｓｃｈ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７６：２９５−３０１，２００１；パーキンソン病−プロア（Ｐｌｏｉｘ）およびスピア（Ｓｐｉｅｒ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：２５５，２００１；ハンチングトン病−アントナウィッチ（Ａｎｔｏｎａｗｉｃｈ）ら、Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．５７：６７４−６４９，２００２。
【００３３】
ＢＩＰは、経口的に、静脈内注入、筋肉内もしくは皮下注射により、または吸入もしくは頭蓋内注射により投与される可能性が、最も高い。
【実施例】
【００３４】
Ｋｕ７０から設計した新規ペプチドの抗Ｂａｘ活性。本発明者らは、幾つかのタイプの細胞において、Ｂａｘに結合し、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制するには、Ｋｕ７０のＣ末端７４アミノ酸だけで充分であることを見い出した。Ｋ７０の最近の構造分析により、７４アミノ酸Ｃ末端部分は、３つのαヘリックスドメインと４つのフレキシブルループドメインから構成されることが判明した（図１Ａ）。Ｋｕ７０の一連の欠失変異体のさらなる分析により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢａｘ誘発性アポトーシスの抑制には、Ｃ末端３２アミノ酸だけで充分であることが判明した（図１Ａ〜Ｃ）。Ｋｕ７０のアミノ酸５７８−６０９を発現しているＦｌａｇ標識Ｋｕ７０変異体（Ｋｕ７０578-609）は、内在性Ｂａｘに結合するのに対して、これらのアミノ酸を削除したＫｕ７０変異体（Ｋｕ７０1-577）はしない（図１Ｂ）。Ｋｕ７０1-577でなく、Ｋｕ７０578-609が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＢａｘ誘発性アポトーシスを抑制する（図１Ｃ）。これらの結果は、Ｋｕ７０のＢａｘ阻害性ドメインが、Ｋｕ７０のアミノ酸５７８−６０９に局在していることを示唆している。
【００３５】
以前の報告によると、これらの３２アミノ酸には、二つのαヘリックスが存在する（図１Ａ）。これら二つのαヘリックスに対応する合成ペプチドを作り、Ｂａｘ誘発性アポトーシスを抑制するそれらの活性を試験した（図１Ｄ）。これらのペプチドは、膜透過性でないので、ＦＩＴＣ標識ペプチドをリポソーム（ＢｉｏＰｏｒｔｅｒ）により細胞に送達し、細胞内のペプチドの存在を、ＦＩＴＣ蛍光法により確認した（示されていない）。５９６−６００ではなく、５７８−５８７のペプチドが、Ｂａｘ誘発性アポトーシスを抑制した。これは、Ｂａｘ阻害ドメインが、Ｋｕ７０のＣ末端からの第二のαヘリックスであることを示唆している（図１Ｄ）。
【００３６】
Ｋｕ７０におけるＢａｘ阻害性ドメインから設計したペプチドのさらなる分析により、Ｂａｘ媒介アポトーシス（Ｂａｘの過剰発現、スタウロスポリン（ＳＴＳ）またはＵＶＣにより誘発されるアポトーシス）を抑制するには、Ｋｕ７０のＢａｘ阻害性ドメイン（アミノ酸５７８−５８７）における６個のアミノ酸（ＶＰＭＬＫＥ；Ｖ６ペプチド）だけで充分であることが判明した（データは、示されていない）。しかし、Ｖ６ペプチドは、膜透過性でなく、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制するためには、このペプチドのリポソーム媒介送達が必要である。興味深いことに、Ｎ末端またはＣ末端においてＶＭＰＬＫＥからアミノ酸を一個削除すると、これらのペプチドは膜透過性となり、且つ、Ｂａｘ阻害活性は排除されない（図１Ｅ、Ｆ）。図１Ｅ、１Ｆおよび図８に示されているように、五個のアミノ酸のペプチドＶＰＭＬＫ（Ｖ５）およびＰＭＬＫＥ（Ｐ５）は、Ｂａｘによって誘発されるアポトーシスを同じ程度に抑制する。Ｖ５またはＰ５は、膜透過性であるので、培地にこれらのペプチドを添加するだけで、充分、Ｂａｘ媒介アポトーシスを阻止することができる。しかし、アミノ酸を一個さらに削除すると、Ｂａｘ阻害活性がなくなる（図１Ｆ）。Ｖ５ペプチド（ＶＰＭＬＫ）におけるアミノ酸ＶおよびＬを別の非極性アミノ酸Ｉと交換すると、そのペプチド（ＩＰＭＩＫ）は、アポトーシスを抑制するその活性を喪失する（図１Ｅ、Ｆ）。この変異ペプチドＩＰＭＩＫを、以下の実験において陰性対照（ＮＣ）ペプチドとして使用する。
【００３７】
ＢＩＰは、Ｂａｘにより媒介される様々なアポトーシス刺激を抑制する。ＢＩＰは、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（カスパーゼ阻害剤）と同じく、５０ｕＭ〜２００ｕＭの濃度で抗アポトーシス活性を示した（図１Ｅ）。ＢＩＰで１時間、細胞を前処理するだけで、充分、ＨｅＬａ細胞におけるそれらのＳＴＳおよびＵＶＣ誘発性アポトーシスを防止することができた（図２Ａ、Ｂ）。注目すべきことに、ＢＩＰは、培地内で、三日間、アポトーシスを抑制する能力を保持した（図２Ａ、Ｂ）。図２Ｃに示されているように、ＢＩＰは、ＵＶＣ放射ならびにＳＴＳ（示されていない）により誘発されたアポトーシスに対するｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの抑制を強化しなかった。ＢＩＰは、カスパーゼ活性化の上流のＢａｘを阻害するので、ＢＩＰは、カスパーゼ阻害剤のものに追加的な作用を発揮することができない。ＢＩＰは、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、神経膠腫細胞（Ｕ８７−ＭＧ）および前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）を含む癌細胞系統において、抗癌薬（エトポシド、シスプラチンおよびドキソルビシン）により誘発されたアポトーシスも抑制した（図２Ｄ〜Ｌ）。ＢＩＰがＢａｘ媒介アポトーシスを抑制することを確認するために、Ｂａｘ欠失細胞（Ｄｕ１４５）におけるＢＩＰの効果を検査した（図３Ａ〜Ｄおよび図７Ａ〜Ｂ）。ＢＩＰは、Ｂａｘ欠失細胞においてＳＴＳおよびＵＶＣ誘発性アポトーシスを抑制しなったが、Ｂａｘの発現がプラスミドトランスフェクションにより回復されると、ＢＩＰは、これらの細胞において抗アポトーシス活性を示した（図３Ａ〜Ｄ）。これらの結果は、ＢＩＰが、アポトーシスにおけるＢａｘ媒介シグナルを特異的に阻害することを示唆している。これらの結果は、Ｋｕ７０がＢａｘ欠失細胞においてＳＴＳおよびＵＶＣ照射に対して細胞保護作用を示さなかたという観察、およびＫｕ７０がＢａｋ誘発性アポトーシスを阻止しなかったという観察と一致する。同様に、ＢＩＰは、ＦａｓおよびＴＲＡＩＬ誘発性アポトーシスを抑制しなかった（示されていない）。ＦａｓおよびＴＲＡＩＬは、ミトコンドリア非依存性細胞死経路を開始させることができ、そのため、ＢＩＰは、これらの因子により誘発されたアポトーシスを抑制することはできない。これらの結果は、ＢＩＰは、Ｂａｘ媒介アポトーシスのみを抑制することを示唆している。一方、ＢＩＰは、Ｋｕ７０欠失マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）においてＳＴＳおよびＵＶＣ誘発性アポトーシスを抑制した。これは、ＢＩＰが、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制するために内在性Ｋｕ７０を必要としないことを示唆している（図３Ｅ、Ｆ）。
【００３８】
ＢＩＰは、Ｂａｘと相互作用し、Ｂａｘのミトコンドリア転移を阻害する。ＢＩＰは、Ｋｕ７０タンパク質と同じく、ＳＴＳおよびＵＶＣ照射により刺激されたＢａｘのミトコンドリア転移を阻害した（図４Ａ）。別の論文に報告されているように、アポトーシス刺激は、サイトゾル中のＫｕ７０レベルを低下させた。ＢＩＰは、このＫＵ７０の消失を抑制しなかった（図４Ｂ）。これは、ＢＩＰの抗アポトーシス活性が、内在性Ｋｕ７０の分解の抑制に起因しないことを示唆している。ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出およびアポトーシス刺激により誘発されたカスパーゼ活性化も、ＢＩＰにより有意に抑制された（図４Ｃ、Ｄ）。これは、ＢＩＰが、Ｂａｘ媒介ミトコンドリア依存性アポトーシス経路を阻害することにより細胞を保護することをさらに支持している。ＢＩＰとＢａｘの相互作用は、ビオチン標識ＢＩＰおよびストレプトアビジンビーズの系を使用する実験によって確認した。陰性対照ペプチド（ビオチン−ＩＰＭＩＫ）ではなく、ビオチン標識ＢＩＰ（ビオチン−ＶＰＭＬＫ）は、ストレプトアビジンビーズをサンプルに添加すると、その細胞溶解産物からＢａｘを沈殿させる（図４Ｅ）。一方、Ｂａｋは、ビオチン−ＶＰＭＬＫによって沈殿しなかった（図７Ｅ）。これは、ＢＩＰが、Ｂａｘに特異的に結合するが、Ｂａｋにはしないことを示している。ＩＰＭＩＫ（図中の陰性対照（ＮＣ）ペプチド）が、Ｂａｘ媒介細胞死を抑制しなかった理由は、この変性ペプチドが、Ｂａｘと相互作用できないことである。Ｋｕ７０欠失ＭＥＦ細胞溶解産物においてＦＩＴＣ標識ＢＩＰ（ＶＰＭＬＫ）および内在性Ｂａｘを使用してスキャッチャード分析を行った時のＢＩＰとＢａｘの相互作用についてのＫｄの値は、１．３ｕＭであった（図４Ｆ）。
【００３９】
ＦＩＴＣ標識ＢＩＰ（ＶＰＭＬＫ）で処理した細胞を図５ＡおよびＢに示す。ＦＩＴＣ−ＢＩＰは、ＨｅＬａ細胞ではサイトゾル中に主として局在していた（図５Ａ）が、Ｂａｘ欠失Ｄｕ１４５細胞ではサイトゾルと核の両方に分布していた（図５Ｂ）。Ｄｕ１４５細胞におけるＢａｘの発現は、サイトゾルのＦＩＴＣ−ＢＩＰを増加させた（図５Ｃ〜Ｆ）。これは、ＢＩＰがサイトゾルのＢａｘに結合することを示唆している。ＢａｘとＢＩＰの共局在化も観察された（図５Ｇ〜Ｉ）。これらの結果は、ＢＩＰが、サイトゾル中でＢａｘと相互作用することにより、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制することをさらに支持している。それは、Ｂａｘの構造変化（Ｎ末端露出）がミトコンドリア転移前に起こること、およびＫｕ７０がこの事象を阻害することを示唆している。モノクローナル抗体クローン６Ａ７は、ＢａｘのＮ末端の露出を検出することが知られている。ＢＩＰは、アポトーシス刺激により処理された細胞において、６Ａ７抗体により認識されるＢａｘタンパク質の量を低下させた（図５Ｊ）。これは、ＢＩＰが、Ｋｕ７０と同じようにＢａｘの構造の変化を阻害することを示唆している。
【００４０】
ペプチドによる内在性Ｋｕ７０とＢａｘの間の相互作用の阻害。ＢＩＰ（ＶＰＭＬＫ（Ｖ５）およびＰＭＬＫＥ（Ｐ５））は、用量依存的に内在性ＢａｘとＫＵ７０との相互作用（免疫共沈降）を阻害した（図６Ａ、Ｂ）。一方、ＢＩＰは、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０の相互作用またはＢａｘ／Ｂｃｌ−２ヘテロダイマー化に干渉しなかった（図７Ａ〜Ｂ）。これらの結果は、ＢＩＰが、ＢａｘにおけるＫｕ７０結合ドメインによりＢａｘと特異的に相互作用すること、およびＢＩＰが、Ｋｕ７０と競争してＢａｘに結合することを示唆している。興味深いことに、ＰＭＬＫ（Ｐ４）は、細胞溶解産物に添加した時、ＢａｘとＫｕ７０の相互作用を阻害した（図６Ｃ）が、ＰＭＬＫ（Ｐ４）は、細胞培養ではアポトーシスを抑制することができなかった。一方、ＭＬＫＥ（Ｍ４）は、Ｂａｘ−Ｋｕ７０相互作用に干渉しなかった（図６Ｄ）。これらの結果は、少なくとも細胞溶解産物におけるＢａｘへの結合には、ＰＭＬＫの四個のアミノ酸だけで充分であり得ることを示唆している。図１に示されているように、ＶＰＭＬＫおよびＰＭＬＫＥは、Ｂａｘ誘発性アポトーシスを抑制することができた。さらなる分析が必要とされるが、培養ではＰＭＬＫがアポトーシスを抑制できないのは、生細胞でのこのペプチドの急速な分解、変性または逸脱の結果であり得る。ＰＭＬＫへのＶ（Ｎ末端）またはＥ（Ｃ末端）の付加により、ペプチドの膜透過性またはサイトゾル保有を改善することもできる。さらなる生物学的研究により、この問題に回答することができよう。
【００４１】
要約すると、本発明者らは、Ｂａｘ媒介アポトーシスを抑制するＫｕ７０のＢａｘ結合ドメイン由来の膜透過性ペプチド（ＢＩＰ）を同定した。本発明者らは、アポトーシス刺激によって誘発されるＢａｘのＮ末端の露出を、ＢＩＰが抑制することも見い出した。Ｂａｘの活性化プロセスのメカニズムは、未だ不可解である。ＢＩＰは、Ｂａｘの構造変化のメカニズムを解明するための新しいツールとなり得る。現在、ＢＩＰがＢａｘに直接結合することができるか否かは、不明である。他の因子がこの相互作用に関与する可能性が残る。精製された不活性Ｂａｘタンパク質およびペプチドの複合形成を分析する将来的な生物学的研究により、これらの問題に回答することができよう。Ｂａｘ媒介細胞死は、幾つかのタイプの変性疾患、および培養細胞の生存力の喪失に関与することが知られている（ウォルター（Ｗｏｌｔｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：１２８１−１２９２，１９９７；サイトウ（Ｓａｉｔｏ）ら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：５５３−５５５，２０００；コルスマイヤー（Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ）ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：１１６６−１１７３，２０００）。本研究において開発した膜透過性Ｂａｘ阻害性ペプチドによって、アポトーシスを調節することで作用する新しい治療法の開発につながる情報を提供することができる。
【００４２】
方法
細胞培養およびアポトーシス検出
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＭＥＭ中でＨＥＫ２９３ＴおよびＨｅＬａ細胞を培養し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でＤｕ１４５細胞およびマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を培養した。製造業者のマニュアルに従ってＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によるプラスミドのトランスフェクションを行った。ｐｃＤＮＡ３−ヒトＢａｘ（Ｂａｘをコードしているプラスミド）のトランスフェクション、スタウロスポリン（ＳＴＳ）での処理およびＵＶＣ照射によりアポトーシスを誘発した。プラスミドの量、ＳＴＳの濃度、およびＵＶＣ照射のエネルギーは、図の説明(figure legend)に記載されている。トランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスは、以下のように分析した：トランスフェクトされた細胞をマーキングするために、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードしているプラスミド（細胞数１０6に対して０．５ｕｇ）を、すべてのグループにトランスフェクトした。処理後、細胞をヘキスト色素で染色し、マツヤマ（Ｍａｔｓｕｙａｍａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０９９５−３１００１，１９９８が記載しているように、蛍光顕微鏡のもとで、ＧＦＰを発現している細胞の中、アポトーシス核を有する細胞を計数した。アポトーシスのパーセンテージを示す図中の各ポイントは、三回の実験の平均値＋／−ＳＥを表している。細胞のカスパーゼ活性は、以前に記載されたように、カスパーゼの蛍光原基質（ＤＥＶＤ−ａｆｃ）の切断(cleavage)により測定した。
【００４３】
プラスミド
プラスミドｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（ヒト）は、記載されている（シュー（Ｘｕ）およびリード（Ｒｅｅｄ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １：３３７−３４６，１９９８）。プラスミドベクターｐＣＭＶ−２ＢおよびｐＥＧＦＰは、それぞれ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＣｌｏｎｅｔｅｃｈから購入し、ヒト全長Ｋｕ７０およびそのＫｕ７０の欠失変異体を、ｐＣＭＶ−２ＢベクターのＢａｍＨ１およびＳａｌ１部位にサブクローニングし、Ｂａｘの欠失変異体を、ｐＥＧＦＰプラスミドのＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１部位にサブクローニングした。全長Ｋｕ７０  ｃＤＮＡは、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを使用してＲＴ−ＰＣＲにより作成した。この論文に記載されているＫｕ７０の変異構成体は、第二段階ＰＣＲ変異誘発法により作成された（シュー（Ｘｕ）およびリード（Ｒｅｅｄ）、上記、１９９８）。
【００４４】
細胞へのペプチドの送達
膜透過性ペプチドのために、ＰＢＳを用いて保存溶液を調製し、それらのペプチドを培地に直接添加して、１時間または図の説明（図２Ａ、Ｂ）に示されている時間、３７℃でインキュベートした後、アポトーシスの誘発を行った。製造業者のマニュアルに従ってＢｉｏＰｏｒｔｅｒ試薬（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、非膜透過性ペプチドを送達した。ＢｉｏＰｏｒｔｅｒに基づくペプチド送達を４時間行った後、アポトーシスの誘発を行った。
【００４５】
シトクロムｃ検出
プラスミドのトランスフェクションの一日後、またはＳＴＳもしくはＵＶＣ照射での細胞の処理の一日後、細胞を、２００ｕＬの均質化バッファ（２５０ｍＭ  スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル）に再懸濁させ、以前に報告されたようにサイトゾルと重膜画分（ミトコンドリアおよびＥＲを含有）の分離を行った14、15。２０ｕｇのタンパク質のサイトゾル画分および（全５０ｕＬのうちの）１ｕＬの膜画分を、シトクロムｃ抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ希釈１：１０００）でのウエスタンブロットにより分析した。
【００４６】
免疫沈降
内在性タンパク質：以前に報告された方法（シュー（Ｈｓｕ）およびユール（Ｙｏｕｌｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０７７７−１０７８３，１９９８）に従って、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルの百倍希釈液；Ｓｉｇｍａ）を含有する２００ｕＬの「ＣＨＡＰＳ系バッファ」（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１．０％ＣＨＡＰＳ）にＨＥＫ２９３Ｔ（細胞数１０7）を溶解した。５０ｕＬのプロテインＧ−セファロースを用いて、４℃で１時間、６００ｕＬのサンプルを前洗浄した後、２ｕｇの抗Ｂａｘポリクローナル抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または抗Ｋｕ７０モノクローナル抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に予め吸着させた２０ｕＬのプロテインＧセファロースと２００ｕＬの溶解産物とを４℃で２時間インキュベートすることにより、免疫沈降を行った。場合によっては、２ｕｇの抗Ｂａｘモノクローナル抗体（クローン６Ａ７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、Ｂａｘの活性形を検出した。前記バッファ中でよく洗浄した後、ビーズを４０ｕＬのＬａｅｍｍｌｉバッファ中で煮沸し、その溶出タンパク質２０ｕＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ストレプトアビジンビーズを使用するビオチン標識ペプチドと内在性Ｂａｘの共沈：ＣＨＡＰＳ系バッファ２００ｕＬに溶解したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０7）を、ビオチン標識陰性対照（ＮＣ）ペプチドまたはＶＰＭＬＫ（Ｖ５）ペプチドとともに１時間インキュベートした。ビオチンで標識したＮＣおよびＶ５の濃度は、図の説明に記載されている。共沈は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のマニュアルに従って、７５％ストレプトアビジンセファロース対２５％ＣＨＡＰＳバッファの比率で調製したストレプトアビジンビーズを用いて行った。Ｆｌａｇ標識Ｋｕ７０および内在性Ｂａｘ：５０ｕＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが存在する状態で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０6）を、１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘおよび１．０ｕｇのｐＣＭＶ−２Ｂ−対照ベクター（Ｆｌａｇ標識ホタルルシフェラーゼ）、ｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０ｗｔ（Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０ｗｔ）、ｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０1-577（Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０1-577）、またはｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０578-609（Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０578-609）で同時トランスフェクトした。抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；サンプル２００ｕＬにつき２ｕｇ）を用いて免疫共沈降を行い、抗ヒトＢａｘポリクローナル抗体（Ｂｄ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてＢａｘのウエスタンブロット（１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。
【００４７】
細胞内分画
処理の一日後、細胞を、２００ｕＬの氷冷均質化バッファ（２５０ｍＭ  スクロース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル）で均質化した。適切なマーカータンパク質で各画分を確認しながら（サイトゾル画分；抗ヒトＬＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ）により乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、核画分；抗ＰＣＮＡ抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）によりＰＣＮＡ、ミトコンドリア含有重膜画分；抗Ｆ１αサブユニット抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）によりＦ１−ＡＴＰアーゼαサブユニット）、報告されている（ヘテルマンズ（Ｈｏｅｔｅｌｍａｎｓ）ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．７：３８４−３９２，２０００）ように、細胞内分画を行った。全細胞溶解産物については、サンプルは、氷冷溶解バッファ（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０ｕｇ／ｕＬ  Ｅ−６４、および１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有）を用いて調製した。一部の実験では、全細胞溶解産物またはサイトゾル画分からのタンパク質２０ｕｇを含有するサンプルを、ＢａｘまたはＫｕ７０のウエスタン分析に付した。重膜および核の画分のペレットを５０ｕＬのＬａｅｍｍｌｉバッファに溶解し、ウエスタンブロット分析には、同じ容積比（その全容積中のサイトゾルサンプルの比率に等しい）を使用した。
【００４８】
蛍光顕微鏡画像
ＨｅＬａ細胞、およびｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘでトランスフェクトされた、またはトランスフェクトされていないＤｕ１４５細胞を、１時間、２００ｕＭのＦＩＴＣ標識ＶＰＭＬＫ（Ｖ５）ペプチドとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡による顕微鏡分析を行った。免疫染色のために、ＦＩＴＣ−Ｖ５ペプチドとともに１時間インキュベートした細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、ＰＢＳ中０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で透過性にした。固定した細胞を、５％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、３７℃でインキュベートし、抗Ｂａｘモノクローナル抗体（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１：５０希釈）で染色し、その後、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１００希釈）の検出を行った。
【００４９】
ＦＩＴＣ−Ｖ５とＢａｘの結合のスキャッチャード分析
Ｋｕ７０欠失ＭＥＦ（細胞数１０7）を、以前に報告された方法（シュー（Ｈｓｕ）およびユール（Ｙｏｕｌｅ）、上記、１９９８）に従って、プロテアーゼ阻害剤（プロテアーゼ阻害剤カクテルの百倍希釈液；Ｓｉｇｍａ）を含有する２００ｕＬの「界面活性剤非含有低張バッファ（低張（５ｍＭ  ＮａＣｌ）リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）に溶解した。スキャッチャード分析のために、以前に報告されたように（シュー（Ｈｓｕ）およびユール（Ｙｏｕｌｅ）、上記、１９９８）、免疫沈降の前にサイトゾル画分を使用し、ＮａＣｌを添加して、等張条件を整えた。２５、５０、１００および２００ｕＭなどの様々な濃度のＦＩＴＣ標識ＶＰＭＬＫ（Ｖ５）ペプチドとサンプルを３７℃で１時間インキュベートした後、２時間２ｕｇの抗Ｂａｘ抗体に予め吸着させた２０ｕＬのプロテインＧ−セファロースとともに、２００ｕＬの溶解産物をインキュベートすることにより、３７℃、界面活性剤非含有条件下で、免疫沈降を行った。免疫沈降前のＦＩＴＣ蛍光（「Ｂ」＋「Ｆ」）および免疫沈降後の上清のＦＩＴＣ蛍光（「Ｆ」）を、蛍光マイクロプレート読取機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定し、「Ｂ＋Ｆ」および「Ｂ」の値を計算した。Ｋｄは、スキャッチャードプロットにより計算した。対照実験については、ＦＩＴＣ−Ｖ５および細胞溶解産物のインキュベーション前に、Ｂａｘの免疫を枯渇させた。Ｂａｘの免疫枯渇のために、２００ｕＬの細胞溶解産物を４ｕｇの抗Ｂａｘ抗体と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。Ｂａｘ免疫枯渇サンプルでは、細胞成分へのＦＩＴＣ−Ｖ５の有意な結合は検出されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
図１は、Ｋｕ７０から設計した新規ペプチドが抗Ｂａｘ活性を示すことを説明している。図１Ａ：Ｋｕ７０全長（Ｋｕ７０ｗｔ）、Ｋｕ７０1-577（Ｋｕ７０Δ５７８−６０９）またはＫｕ７０578-609（Ｋｕ７０Δ１−５７７）の模式図。図１Ｂ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０6）を、１．０ｕｇのｐＣＭＶ−２Ｂ−対照ベクター（Ｆｌａｇ−対照）、ｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０ｗｔ（Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０ｗｔ）、ｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０1-577（Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０1-577）またはｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０578-609（Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０578-609）でトランスフェクトした。トランスフェクションの一日後、Ｆｌａｇ−Ｋｕ７０とＢａｘの免疫共沈降を行った。図１Ｃ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２．０ｕｇのｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０ｗｔ（Ｋｕ７０ｗｔ）、ｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０1-577（Ｋｕ７０1-577）またはｐＣＭＶ−２Ｂ−Ｋｕ７０578-609（Ｋｕ７０578-609）とともに、１．０ｕｇのｐＣＭＶ−２Ｂ−対照ベクター（対照）またはｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（Ｂａｘ）でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をマーキングするために、前記細胞すべてを０．５ｕｇのｐＥＧＦＰでも同時トランスフェトした。トランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスは、トランスフェクションの２４時間後、「方法」の項に記載したように核のヘキスト(Hoechst)色素染色で分析した。図１Ｄ：ＢｉｏＰｏｒｔｅｒ試薬を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｋｕ７０578-587またはＫｕ７０596-600から成る２００ｕＭのペプチドとともに、４時間インキュベートし、その後、１．０ｕｇのｐＣＤＮＡ３−対照ベクター（対照）またはｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（Ｂａｘ）をトランスフェクトした。アポトーシス細胞の数は、図１Ｃに記載したように測定した。図１Ｅ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０6）を、２００ｕＭのＩＰＭＩＫ（陰性対照ペプチド）または示されている濃度のＶＰＭＬＫ（Ｖ５）およびＰＭＬＫＥ（Ｐ５）ペプチドとともに１時間インキュベートし、その後、インキュベートした細胞を１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘでトランスフェクトした。また、インキュベートしなかった細胞を、２００ｕＭのｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが存在する状態または不在の状態で、１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘでトランスフェクトした。アポトーシス細胞の数は、図１Ｃに記載したように測定した。図１Ｆ：使用したすべてのペプチドの抗Ｂａｘ活性および配列の要約である。
【００５１】
図２Ａ〜Ｌは、様々なアポトーシス刺激に対するＢａｘ阻害性ペプチド（ＢＩＰ）の阻害作用を示すグラフである。図２Ａおよび２Ｂ：ＨｅＬａ細胞（細胞数１０6）を、２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドとともに１時間、またはＶ５ペプチドとともに示されている時間、プレインキュベートし、その後、２００ｎＭのＳＴＳ（Ａ）または１２００Ｊ／ｍ2のＵＶＣ照射（Ｂ）で処理した。アポトーシス処理の２４時間後のアポトーシス細胞は、図１に記載したようにカウントした。図２Ｃ：ＨｅＬａ細胞を、示されている濃度のＶ５ペプチドおよび／またはｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、汎カスパーゼ阻害剤とともに、１時間、プレインキュベートし、その後、１２００Ｊ／ｍ2のＵＶＣ照射に曝露した。ＵＶＣ照射の一日後のアポトーシス細胞の数は、図１に記載したように測定した。図２Ｄ〜Ｌ：Ｕ８７−ＭＧ神経膠腫細胞（Ｄ〜Ｆ）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（Ｇ〜Ｉ）およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞（Ｊ〜Ｌ）を、２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドまたは示されている濃度のＶ５ペプチドとともにプレインキュベートし、その後、２０ｕＭのエトポシド（Ｄ、Ｇ、Ｊ）、２０ｕＭのシスプラチン（Ｅ、Ｈ、Ｋ）または１ｕＭのドキソルビシン（Ｆ、Ｉ、Ｌ）で処理した。アポトーシス細胞を、図１に記載したように、抗癌薬での処理後、示されている時点で分析した。
【００５２】
図３Ａ〜Ｆは、Ｂａｘ−またはＫｕ７０−欠失細胞におけるＢＩＰの影響を説明する一連のグラフである。図３Ａ〜Ｄ：トランスフェクトされた細胞をマーキングするために０．５ｕｇのｐＥＧＦＰとともに、１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−対照ベクター（対照）または０．１２５ｕｇのｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（Ｂａｘ）で、Ｄｕ１４５細胞（細胞数１０6）をトランスフェクトした。トランスフェクションの一日後、細胞を、２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチド、Ｖ５ペプチドまたはＰ５ペプチドとともに１時間インキュベートし、その後、２００ｎＭのＳＴＳ（Ａ、Ｂ）または１２００Ｊ／ｍ2のＵＶＣ照射（Ｃ、Ｄ）で処理した。アポトーシス処理の２４時間後のアポトーシス細胞は、図１に記載したようにカウントした。ＢＩＰは、アポトーシスを抑制するためにＫｕ７０を必要としない（Ｅ、Ｆ）。Ｋｕ７０欠損（Ｋｕ７０−／−）マウス由来のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドまたはＶ５ペプチドが存在する状態で、２００ｎＭのＳＴＳ（Ｅ）または１２００Ｊ／ｍ2のＵＶＣ照射（Ｆ）で処理した。図１に記載したように、ＳＴＳまたはＵＶＣ照射での処理後、示されている時点でアポトーシス細胞を分析した。
【００５３】
図４Ａ〜Ｆは、ＢＩＰが、Ｂａｘのミトコンドリア転移を阻害することを示している（Ａ、Ｂ）。図４Ａ：ＵＶＣ照射またはＳＴＳ処理を、陰性対照（ＮＣ）ペプチドもしくはＶ５ペプチドが不在の状態（ＵＶおよびＳＴＳ）、または２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドが存在する状態（ＵＶ＋ＮＣおよびＳＴＳ＋ＮＣ）もしくはＶ５ペプチドが存在する状態（ＵＶ＋Ｖ５およびＳＴＳ＋Ｖ５）で行った一日後、ＨｅＬａ細胞（細胞数１０6）の細胞内分画を行った。ＦｏＦ１  ＡＴＰシンターゼサブユニットα（Ｆ１α）を使用して、そのミトコンドリア画分をマーキングした。ＨＭは、ミトコンドリアを含有する「重膜」画分を表す。図４Ｂ：２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドが存在する状態（ＳＴＳ＋ＮＣ）、またはＶ５ペプチドが存在する状態（ＳＴＳ＋Ｖ５）で、ＨｅＬａ細胞（細胞数１０6）を、２００ｎＭのＳＴＳで処理した。ＳＴＳ処理の一日後、細胞内分画を行い、Ｋｕ７０およびＢａｘのレベルを検査した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、ＰＣＮＡおよびＦ１αを、サイトゾル画分、核画分およびミトコンドリア画分、それぞれのマーカーとして使用した。図４Ｃ：ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出は、ＢＩＰによって阻害されるが、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによって阻害されない。２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチド、Ｖ５ペプチドまたはｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが存在する状態または不在の状態で、ＨｅＬａ細胞（細胞数１０6）を、２４時間、２００ｎＭのＳＴＳで処理した。ミトコンドリアからサイトゾルに放出されたシトクロムｃは、「方法」の項に記載したように、細胞内分画、続いてシトクロムｃ（ｃｙｔ  ｃ）ならびにミトコンドリアＦｏＦ１−ＡＴＰ−シンターゼサブユニットＦ１α（Ｆ１α）のウエスタンブロット分析により分析した。図４Ｄ：ＢＩＰは、ＳＴＳ誘発性カスパーゼ活性化ならびにｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを抑制する。２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチド、Ｖ５ペプチドまたはｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが存在する状態または不在の状態で、ＨｅＬａ細胞（細胞数１０6）を、２４時間、２００ｎＭのＳＴＳで処理した。「方法」の項に記載したようにカスパーゼ活性を評価した。図４Ｅ：ＢＩＰは、用量に依存的に、内在性Ｂａｘに結合する。内在性ＢａｘとＢＩＰの共沈。２００ｕＭのビオチン標識陰性対照（ＮＣ）ペプチドおよび示されている濃度のビオチン標識Ｖ５ペプチドが不在の状態（ペプチドなし）または存在する状態で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０7）をＣＨＡＰＳバッファに溶解した。「方法」の項に記載したように、ＣＨＡＰＳバッファを使用してストレプトアビジンビーズまたは抗Ｂａｘポリクローナル抗体との共沈試験を行った。抗Ｂａｘモノクローナル抗体を使用して、沈殿前サンプル（インプット）および沈殿したサンプル（ＩＰ）のウエスタンブロット分析を行った。図４Ｆ：ＢＩＰとＢａｘの相互作用のスキャッチャード(Scatchard)分析。Ｋｕ７０欠失ＭＥＦにおけるＦＩＴＣ標識ＢＩＰ（ＶＰＭＬＫ）と内在性Ｂａｘの結合のスキャッチャード分析を、「方法」の項に記載したように行った。解離定数（Ｋｄ）は、この相互作用について１．３ｕＭ（１／Ｋａ）であると概算された。Ｂａｘ免疫枯渇細胞溶解産物では、細胞成分へのＦＩＴＣ−ＢＩＰの有意な結合が、全く検出されなかった。
【００５４】
図５Ａ〜Ｊは、膜透過性ＢＩＰの細胞内分布および内在性Ｂａｘとの共局在性を示している。図５Ａ〜Ｂ：ＨｅＬａ（Ａ）またはＤｕ１４５細胞（Ｂ）（細胞数１０6）を、ＦＩＴＣで標識した２００ｕＭのＶ５ペプチドとともに１時間インキュベートし、その後、蛍光顕微鏡のもとで写真を撮った。ＦＩＴＣ−ＢＩＰの局在性は、Ｂａｘ欠失Ｄｕ１４５細胞におけるＢａｘタンパク質の復元に従って変化する。図５Ｃ〜Ｆ：ＦＩＴＣで標識した２００ｕＭのＶ５ペプチドが存在する状態で、Ｂａｘ欠失Ｄｕ１４５細胞（細胞数１０6）を、１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−対照ベクター（Ｄｕ１４５／ベクター）または１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（Ｄｕ１４５／Ｂａｘ）でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収し、全細胞溶解産物（タンパク質２０ｕｇ／レーン）を使用してＢａｘならびにβ−チューブリンのレベルを検査した（Ｆ）。その後、トランスフェクトされた細胞も、「方法」の項に記載したようにＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識Ｂａｘにより免疫染色し、蛍光顕微鏡により写真を撮った（Ｃ〜Ｅ）。図５Ｇ〜Ｉ：ＨｅＬａ細胞を、２００ｕＭのＦＩＴＣ−Ｖ５ペプチドとともに１時間インキュベートし（Ｇ）、その後、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄで標識したＢａｘにより免疫染色した（Ｈ）。マージした画像（Ｉ）を含む写真を蛍光顕微鏡によって撮った。図５Ｊ：ＢＩＰは、Ｂａｘの活性化を抑制する。陰性対照（ＮＣ）ペプチドもしくはＶ５ペプチドが不在の状態（ＵＶ）で、または２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドが存在する状態（ＵＶ＋ＮＣ）もしくはＶ５ペプチドが存在する状態（ＶＵ＋Ｖ５）で、ＨｅＬａ細胞（細胞数１０6）を１２００Ｊ／ｍ2のＵＶＣ照射で処理した。ＵＶＣ照射の一日後、「方法」の項に記載したように、ＣＨＡＰＳバッファを使用して抗Ｂａｘモノクローナル抗体（クローン６Ａ７）と免疫共沈降を行った。
【００５５】
図６Ａ〜Ｄは、Ｋｕ７０由来ペプチドが、Ｂａｘに結合し、ＢａｘからＫｕ７０を解離させることを示している。図６Ａ〜Ｄ：ＣＨＡＰＳバッファに溶解したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０7）を、２００ｕＭの陰性対照（ＮＣ）ペプチドまたは示されている濃度の（Ａ）ＶＰＭＬＫ（Ｖ５）、（Ｂ）ＰＭＬＫＥ（Ｐ５）、（Ｃ）ＰＭＬＫ（Ｐ４）および（Ｄ）ＭＬＫＥ（Ｍ４）とともに１時間インキュベートした。「方法」の項に記載したように、ＣＨＡＰＳバッファを使用して抗Ｋｕ７０モノクローナル抗体または抗Ｂａｘポリクローナル抗体で免疫沈降を行った。マウスＩｇＧおよび免疫前ウサギ血清（ＮＲＳ）を陰性対照として使用した。
【００５６】
図７は、Ｄｕ１４５細胞へのＢａｘ−プラスミドトランスフェクションの最適化を示している。図７Ａ：Ｂａｘ欠失Ｄｕ１４５細胞（細胞数１０6）を、１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３−対照ベクター（Ｄｕ１４５／ベクター）または示されている濃度のｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（Ｄｕ１４５／Ｂａｘ）でトランスフェクトした。二十四時間後、細胞を回収し、全細胞溶解産物（タンパク質２０ｕｇ／レーン）を使用してＢａｘならびにβ−チューブリンのレベルを検査した。図７Ｂ：トランスフェクトされた細胞をマーキングするために、図１Ａにあるすべての細胞を、０．５ｕｇのｐＥＧＦＰでも同時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞におけるアポトーシスは、トランスフェクションの２４時間後、「方法」の項に記載したように核のヘキスト色素染色で分析した。Ｄｕ１４５細胞中のＢａｘの非毒性レベルを回復するために、０．１２５ｕｇ（細胞数１０6）の濃度を選択した。図７Ｃ：ＢＩＰは、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０の相互作用に干渉しない。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０7）をＣＨＡＰＳバッファに溶解し、「方法」の項に記載したように、ＣＨＡＰＳバッファを使用し、２００ｕＭのＶ５ペプチドが存在する状態（抗Ｋｕ８０＋ＢＩＰ）または不在の状態（抗Ｋｕ８０）で、抗Ｋｕ８０マウスモノクローナル抗体または抗Ｋｕ７０ウサギポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。免疫前ウサギ血清（ＮＲＳ）およびマウスＩｇＧを陰性対照として使用した。抗Ｋｕ７０ウサギポリクローナル抗体または抗Ｋｕ８０マウスモノクローナル抗体により、免疫沈降前サンプル（インプット）および免疫沈降したサンプル（ＩＰ）のウエスタンブロット分析を行った。図７Ｄ：ＢＩＰは、Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２ヘテロダイマー化に影響を及ぼさない。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０7）をＮＰ４０バッファに溶解し、以前の報告（シュー（Ｈｓｕ）およびユール（Ｙｏｕｌｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：１０７７７−１０７８３，１９９８）に記載されているように、ＮＰ４０バッファを使用し、抗Ｂａｘウサギポリクローナル抗体を用い、２００ｕＭのＶ５ペプチドが存在する状態（抗Ｂａｘ＋ＢＩＰ）または不在の状態（抗Ｂａｘ）で免疫沈降を行った。免疫前ウサギ血清（ＮＲＳ）を陰性対照として使用した。抗Ｂａｘマウスモノクローナル抗体または抗Ｂｃｌ−２マウスモノクローナル抗体により、免疫沈降前サンプル（インプット）および免疫沈降したサンプル（ＩＰ）のウエスタンブロット分析を行った。図７Ｅ：ＢＩＰは、Ｂａｋと相互作用しない。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０7）を、２００ｕＭのビオチン標識陰性対照（ＮＣ）ペプチドまたはビオチン標識Ｖ５ペプチド（ＢＩＰ）が存在する状態で、ＣＨＡＰＳバッファに溶解した。「方法」の項に記載したように、ＣＨＡＰＳバッファを使用してストレプトアビジンビーズで共沈を行った。抗Ｂａｘポリクローナル抗体または抗Ｂａｋポリクローナル抗体により、沈殿前サンプル（インプット）および沈殿したサンプル（ＩＰ）のウエスタンブロット分析を行った。
【００５７】
図８は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除によって測定した場合、ＢＩＰが、Ｂａｘ媒介アポトーシスを阻害することを示している。２００ｕＭのＶ５ペプチドが不在の状態または存在する状態（Ｂａｘ＋ＢＩＰ）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞数１０6）を、１．０ｕｇのｐｃＤＮＡ３（対照）またはｐｃＤＮＡ３−Ｂａｘ（Ｂａｘ）でトランスフェクトした。ＨＢＳＳ（ハンクスの平衡塩類溶液）で洗浄した生細胞を、暗所で、１ｕｇ／ｍＬのＰＩ（Ｓｉｇｍａ）とともに１０分間、４℃でインキュベートした。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ装置を使用して、フローサイトメトリーを行った。この図に示されているパーセンテージは、「死」細胞（ＰＩ陽性）のパーセンテージを示している。
【図１ａ】
2006501812.tif 000002
【図１ｂ】
2006501812.tif 000003
【図１ｃ】
2006501812.tif 000004
【図１ｄ】
2006501812.tif 000005
【図１ｅ】
2006501812.tif 000006
【図１ｆ】
2006501812.tif 000007
【図２ａ】
2006501812.tif 000008
【図２ｂ】
2006501812.tif 000009
【図２ｃ】
2006501812.tif 000010
【図２ｄ】
2006501812.tif 000011
【図２ｅ】
2006501812.tif 000012
【図２ｆ】
2006501812.tif 000013
【図２ｇ】
2006501812.tif 000014
【図２ｈ】
2006501812.tif 000015
【図２ｉ】
2006501812.tif 000016
【図２ｊ】
2006501812.tif 000017
【図２ｋ】
2006501812.tif 000018
【図２ｌ】
2006501812.tif 000019
【図３】
2006501812.tif 000020
【図４ａ】
2006501812.tif 000021
【図４ｂ】
2006501812.tif 000022
【図４ｃ】
2006501812.tif 000023
【図４ｄ】
2006501812.tif 000024
【図４ｅ】
2006501812.tif 000025
【図４ｆ】
2006501812.tif 000026
【図５ａ】
2006501812.tif 000027
【図５ｂ】
2006501812.tif 000028
【図５ｃ】
2006501812.tif 000029
【図５ｄ】
2006501812.tif 000030
【図５ｅ】
2006501812.tif 000031
【図５ｆ】
2006501812.tif 000032
【図５ｇ】
2006501812.tif 000033
【図５ｈ】
2006501812.tif 000034
【図５ｉ】
2006501812.tif 000035
【図５ｊ】
2006501812.tif 000036
【図６ａ】
2006501812.tif 000037
【図６ｂ】
2006501812.tif 000038
【図６ｃ】
2006501812.tif 000039
【図６ｄ】
2006501812.tif 000040
【図７−１】
2006501812.tif 000041
【図７−２】
2006501812.tif 000042
【図８】
2006501812.tif 000043
【国際調査報告】
2006501812.tif 000044