(57)【要約】本発明は、マトリックス材料および形態形成タンパク質を含んでなる改良された骨誘導材料であって、主題に応じてタンパク質が二量体または単量体タンパク質であってもよい上記骨誘導材料に関する。本発明による骨誘導材料は改良された特性を有する。本発明はさらにそれぞれの改良された骨誘導材料を生産する方法に関する。
2006521135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス材料ならびに該マトリックス材料の内側および／または外側表面上に吸着された形態形成タンパク質を含んでなる骨誘導材料であって、タンパク質を安定させかつ溶液中に溶解して保つために好適な条件下でマトリックス材料と形態形成タンパク質を接触させ、それによりマトリックス材料が形態形成タンパク質により均一にコーティングされるようにすることにより得ることができる骨誘導材料。
【請求項２】
形態形成タンパク質が少なくともTGF-βスーパーファミリータンパク質の特徴である7システイン領域を含有する、請求項１に記載の骨誘導材料。
【請求項３】
形態形成タンパク質が成熟タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体である、請求項１または２に記載の骨誘導材料。
【請求項４】
形態形成タンパク質がTGF-β-ファミリー、BMP-ファミリー、GDF-ファミリー、アクチビン-ファミリーまたはGDNF-ファミリーに属する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項５】
形態形成タンパク質が二量体タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項６】
形態形成タンパク質がBMP2、BMP7、BMP12、BMP13、MP52（GDF5）またはその生物学的活性部分もしくは変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項７】
形態形成タンパク質がそれぞれの天然タンパク質の二量体形成に関与するシステイン残基を欠くタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項８】
形態形成タンパク質が
式I：C(Y)25-29CYYYC(Y)25-35XC(Y)27-34CYCまたは
式II：C(Y)28CYYYC(Y)30-32XC(Y)31CYC
［式中、Cはシステインを表し、Yはいずれかのアミノ酸を表しそしてXはシステインを除くいずれかのアミノ酸を表す］
で表されるコンセンサス配列を含有する、請求項１〜４および７のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項９】
タンパク質がMP52の単量体型である、請求項１〜４、７および８のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１０】
タンパク質がMP52-Ala83またはその生物学的活性部分もしくは変異体である、請求項９に記載の骨誘導材料。
【請求項１１】
マトリックス材料が生体適合性材料である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１２】
マトリックス材料が天然材料、改変された天然材料または合成材料である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１３】
マトリックス材料が多孔質材料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１４】
マトリックス材料が少なくとも次の物質：a）コラーゲン、b）Ca(OH)2、c）ポリラクチドまたはポリラクチド誘導体、d）ヒアルロン酸、e）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、f）リン酸カルシウム、g）ヒドロキシアパタイトとコラーゲンの組合わせ、h）ポリグリコール酸とポリ乳酸もしくはポリラクチド誘導体の組合わせ、の１つを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１５】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒が150mmol/l以下、100mmol/l以下、80mmol/l以下、40mmol/l以下、20mmol/l以下、10mmol/l以下、または5mmol/lのイオン濃度を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１６】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がさらに糖類を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１７】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がさらにアルコールまたは他の有機溶媒を含有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１８】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がさらに石鹸または合成洗剤を含有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１９】
形態形成タンパク質がポリエチレングリコールと共有結合または非共有結合で結合している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項２０】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がpHを5.2未満に維持することができる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項２１】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がHClまたは酢酸ナトリウムを含有する、請求項２０に記載の骨誘導材料。
【請求項２２】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がpHを9.5より高く維持することができる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項２３】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がNaOHまたは炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウムを含有する、請求項２２に記載の骨誘導材料。
【請求項２４】
マトリックス材料を少なくとも１つの形態形成タンパク質の溶液と接触させるステップを含んでなる請求項１〜２１のいずれか１項に記載の骨誘導材料を生産する方法であって、上記溶液に含有される物質がマトリックス材料と接触したときでも溶液のpHを5.2より低く調節できるように選択されることを特徴とする上記方法。
【請求項２５】
マトリックス材料を少なくとも１つの形態形成タンパク質の溶液と接触させるステップを含んでなる請求項１〜１９、２２および２３のいずれか１項に記載の骨誘導材料を生産する方法であって、上記溶液に含有される物質がマトリックス材料と接触したときでも溶液のpHを9.5より高く調節できるように選択されることを特徴とする上記方法。
【請求項２６】
単量体または二量体形態形成タンパク質が有用であることが証明されている適応症に対する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の骨誘導材料の使用。
【請求項２７】
骨誘導材料を軟骨、骨、腱および／または靱帯を含む結合組織、歯周または歯組織、神経組織、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚、粘膜、内皮、または上皮の疾患または異常な症状の症候群または症状を予防、軽減または治療するために使用する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
神経増殖、組織修復および再生、脈管形成、潰瘍、火傷、外傷または植皮を含む創傷治癒の促進または誘導、結合組織と骨の間の機能的結合を再生させるための前駆細胞または骨髄細胞の増殖の誘導、軟骨修復、骨粗しょう症または骨関節炎の治療、非結合骨折、後天性もしくは先天性の頭蓋顔面、骨格または歯科異常を矯正するため、プラスチックまたは再形成手術における非骨格組織置換えのための、請求項２６または２７に記載の使用。
【請求項２９】
疾患または異常な症状が虚血または外傷傷害、変性疾患、心筋症、アテローム血栓性または心塞栓卒中、潰瘍形成、肝硬変、肺気腫、細胞老化または静止により引き起こされる、請求項２６〜２８のいずれか１項による骨誘導材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックス材料および形態形成タンパク質を含んでなる改良された骨誘導材料であって、主題に応じて上記タンパク質が二量体または単量体タンパク質である上記骨誘導材料に関する。本発明はさらに、それぞれの改良された骨誘導材料を生産する方法に関する。
【０００２】
TGF-βスーパーファミリーに属する多くの増殖因子（Kingsley, Genes and Development 8, 133-146(1994)、並びにその文献中に引用された参考文献）は、特に外傷治癒や組織再生を含む細胞増殖と組織形成の促進に関係する広範囲の医学的治療法ならびに適用に関係がある。特に、そのような増殖因子には、TGF-β（トランフォーミング増殖因子；例えば、RobertsおよびSporn, 「実験薬理学ハンドブック（Handbook of Experimental Pharmacology）」 95 (1990), pp.419-472, SpornおよびRoberts編を参照）、DVRグループ（Hottenら、 Biochem. Biophys. Res. Comm. 206 (1995), pp.608-613およびその文献に引用されたさらなる文献）例えばBMP（骨形態形成タンパク質；例えば、RosenおよびThies, 「周産発生における増殖因子（Growth Factors in Perinatal Development）」 (1993), pp.39-58、編者：Tsang、LemonsおよびBalistreriを参照）およびGDF（増殖分化因子）、インヒビン／アクチビン（例えば、Valeら、「生殖の生理学（The Physiology of Reproduction）」, 第2版 (1994), pp.1861-1878、編者：KnobilおよびNeillを参照）、ならびにGDNFタンパク質ファミリー(Rosenthal, Neuron 22 (1999), pp.201-203；Airaksinenら、Mol Cell Neurosci 13 (1999), pp.313-325)のメンバーが含まれる。TGF-βスーパーファミリーのメンバーは、タンパク質の成熟部分において、高いアミノ酸相同性を特に７個の保存されたシステインにおいて示すが、それらの正確な機能は非常に多様である。多くの場合、これらのファミリーの個々の増殖因子は同時に複数の機能を示すので、それらの適用は様々な医学的適応症において関心がもたれる。これらの多機能性タンパク質のいくつかはまた、多くの細胞型における増殖および分化の調節などの機能の他に、ニューロンに対する生存促進効果も有する（RobertsおよびSporn, 前掲; Sakurai ら、J. Biol. Chem. 269(1994), pp.14118-14122）。従って、例えば、胚の運動ニューロンおよび感覚ニューロンに対する栄養効果がTGF-βに対してin vitroで実証された（Martinouら、Dev. Brain Res. 52, pp.175-181(1990)およびChalazonitisら、Dev. Biol. 152, pp.121-132(1992)）。さらに、ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進する効果がTGF-β-1、-2、-3、アクチビンA、およびGDNF（TGF-βスーパーファミリーのメンバーと構造的類似性を有するタンパク質）に対して示されている（Krieglsteinら、EMBO J. 14, pp.736-742 (1995)）。
【０００３】
TGF-βスーパーファミリーのタンパク質の様々な組織段階や発生段階における出現は、それらのタンパク質の正確な機能ならびに標的部位、寿命、補助因子の要件、必要な細胞の生理的環境および／または分解に対する耐性についての差異に対応するものである。
【０００４】
TGF-βスーパーファミリーのタンパク質は、元来、単一のジスルフィド結合を有するホモ二量体またはヘテロ二量体として存在する。しかし、二量体形成に関与するシステインを欠く複数のタンパク質も、二量体野生型タンパク質の特性を少なくとも実質的な程度で維持することが発見された。そのような型のタンパク質は、特に、遺伝子工学の方法による生産の容易さ、すなわち、再現性、簡単、そして安価な生産が可能であるときは、二量体タンパク質を越える利益を有しうる。そのようなタンパク質およびそれらの生産ならびにそれらの用途の例はWO01/11041に記載されている。
【０００５】
主に、例えば骨欠損の修復または骨再生、疾患、外傷もしくは手術または変性骨欠損などにより生じた骨欠損の充填のような骨関連分野における適用についてだけでなく軟骨、腱または靭帯などの結合組織、歯科、神経学的、血管新生またはその他の適用についても、形態形成タンパク質をマトリックス材料と組合わせることは有用である。形態形成タンパク質をコーティングしたまたは浸漬したそのようなマトリックス材料は、形態形成タンパク質を連続放出し、それにより前駆体細胞を絶えず刺激して分化させ、そして組織の損傷した種類の新細胞を形成させるデバイスを提供することができる。さらに上記マトリックス材料は、増殖細胞の接着および内殖に好都合な環境を提供することができ、それにより新組織、特に骨組織の形成を加速させる。
【０００６】
形態形成タンパク質のマトリックス材料と組合わせたこのような用途は、例えばWO98/21972などに広汎に報じられかつ記載されている。しかし、大量の形態形成タンパク質を連続的にタンパク質を放出する形態で含有する材料に対するニーズはなお存在する。マトリックス材料の形態形成タンパク質による均質かつ最大限のコーティングは、骨誘導材料を成功させる非常に重要な因子であって、なお解決せねばならない目的である。１つの大きな問題は、形態形成タンパク質の溶解度が限られていることである。現在の技術水準では、多くの場合、骨誘導材料はごく小量の活性な形態形成タンパク質しか含有しない、その理由はタンパク質が不安定であるかまたはマトリックス表面と不均一に結合しているためである。特に、多孔質のマトリックス材料の内側表面のコーティングが不十分である。
【０００７】
従って、本発明の目的は、製薬分野で利用するための改良された骨誘導材料を提供すること、そして特に、形態形成タンパク質によって効率的にコーティングされたマトリックス材料を得る方法を提供することである。
【０００８】
この問題は、本発明によって、本明細書および添付した請求の範囲に記載の骨誘導材料を提供することにより解決される。
【０００９】
誤解と曖昧さを避けるために、本明細書においてしばしば使用した用語を、以下に定義しかつ例示する：
本明細書で使用する用語「形態形成タンパク質」はTGF-βスーパーファミリーのタンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体を意味する。この用語は、少なくともTGF-βスーパーファミリータンパク質の特徴である7システイン領域を含有する全てのタンパク質を含むものであって、このドメインに存在する二量体形成に関与するシステインが他のアミノ酸により置換されているかいないかに関係ない。TGF-βスーパーファミリーの関心あるメンバーまたはその生物学的活性部分もしくは変異体は、例えばTGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5などのTGF-βタンパク質（U.S. 5,284,763；EP 0376785；U.S. 4,886,747；DNA 7 (1988), pp.1-8；EMBO J. 7 (1988), pp.3737-3743；Mol. Endo. 2 (1988), pp.1186-1195；J. Biol. Chem. 265 (1990), pp.1089-1093）、OP1、OP2およびOP3タンパク質（U.S. 5,011,691、U.S. 5,652,337、WO 91/05802）ならびにBMP2、BMP3、BMP4（WO 88/00205、U.S. 5,013,649およびWO 89/10409、Science 242 (1988), pp.1528-1534）、BMP5、BMP6およびBMP-7（OP1）（Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), pp.9841-9847、WO 90/11366)、BMP8（OP2）（WO 91/18098）、BMP9（WO 93/00432）、BMP10（WO 94/26893）、BMP11（WO 94/26892）、BMP12（WO 95/16035）、BMP13（WO95/16035）、BMP15（WO 96/36710）、BMP16（WO 98/12322）、BMP3b（Biochem. Biophys. Res. Comm. 219 (1996), pp.656-662）、GDF1（WO 92/00382およびProc. Natl. Acad. Sci. 88 (1991), pp.4250-4254）、GDF8（WO 94/21681）、GDF10（WO95/10539）、GDF11（WO 96/01845）、GDF5（CDMP1、MP52）（WO 95/04819；WO96/01316；WO 94/15949、WO 96/14335およびWO 93/16099およびNature 368 (1994), pp.639-643）、GDF6（CDMP2、BMP13）（WO 95/01801、WO 96/14335およびWO95/16035）、GDF7（CDMP3、BMP12）（WO 95/01802およびWO 95/10635）、GDF14（WO 97/36926）、GFD15（WO 99/06445）、GDF16（WO 99/06556）、60A（Proc.Natl. Acad. Sci. 88 (1991), pp.9214-9218）、DPP（Nature 325 (1987), pp.81-84）、Vgr-1（Proc. Natl. Acad. Sci. 86 (1989), pp.4554-4558）Vg-1、(Cell 51 (1987), pp.861-867）、ドーサリン（Cell 73 (1993), pp.687-702）、MIS（Cell 45 (1986), pp.685-698）、pCL13（WO 97/00958）、BIP（WO 94/01557）、インヒビンa、アクチビンβAおよびアクチビンβB（EP 0222491）、アクチビンβC（MP121）（WO 96/01316）、アクチビンβEおよびGDF12（WO 96/02559およびWO 98/22492）、アクチビンβD（Biochem. Biophys. Res. Comm. 210 (1995), pp.581-588）、GDNF (Science 260 (1993), pp.1130-1132, WO 93/06116）、Neurturin（Nature 384 (1996), pp.467-470）、Persephin（Neuron 20 (1998), pp.245-253、WO 97/33911）、Artemin（Neuron 21 (1998), pp.1291-1302）、Mic-1（Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 (1997), pp.11514-11519）、Univin（Dev. Biol. 166 (1994), pp.149-158）、ADMP（Development 121 (1995), pp.4293-4301）、Nodal（Nature 361 (1993), pp.543-547）、Screw（Genes Dev. 8 (1994), pp.2588-2601）である。さらにまた非天然の、従って人工的に生産されたTGF-βスーパーファミリーのタンパク質も用語「形態形成タンパク質」に含まれ、そのようなタンパク質としては、例えばWO 01/11041に記載の二量体形成に関与するシステインを欠いて、好ましくは単量体タンパク質として存在するかまたはさらなる単量体と水素結合のような非共有結合による弱い結合しか持たないTGF-βスーパーファミリーのタンパク質が挙げられる。定義「形態形成タンパク質」に含まれる他の有用なタンパク質はまた、生物学的活性をもつ生合成構築物であって、上記構築物には、２種以上の公知の形態形成タンパク質由来の配列を用いて設計した生合成タンパク質が含まれる。生合成構築物の例は、U.S. 5,011,691に開示されている（例えばCOP-1、COP-3、COP-4、COP-5、COP-7およびCOP-16）。特許または特許出願を含む引用した刊行物の開示は、本明細書に参照により組み入れられる。TGF-βタンパク質スーパーファミリーのメンバーのほとんどは、細胞または前駆体細胞の分化と増殖の調節が重要である治療に対して有用な形態形成タンパク質である。この形態形成タンパク質は、損傷したおよび／または罹患した組織、例えば、骨格（骨、軟骨）組織、結合組織、歯周または歯組織、神経組織、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、皮膚および腎臓組織、子宮または甲状腺組織などの置換をもたらすことができる。形態形成タンパク質はしばしば、潰瘍、火傷、外傷または皮膚移植の治癒促進などの、潰瘍性または炎症性組織損傷の治療およびいずれの種類の創傷治癒にも有用である。
【００１０】
本明細書で使用する用語「その生物学的活性部分もしくは変異体」は、活性を保持するタンパク質断片、成熟型に対する活性部位で切断されたかもしくはそれ自体が生物学的活性を示す前駆体タンパク質、または野生型タンパク質の生物学的活性をなお本質的に維持するタンパク質変異体を意味する。そのような変異体は好ましくは保存アミノ酸置換を含有するが、特に成熟タンパク質のN末端部においてたとえ相当な欠失または置換があっても相当な生物学的活性の消失は起こらない。当業者は、ある特定のタンパク質が所要の生物学的活性を示すかどうかを決定することは十分可能である。成熟野生型タンパク質に対して少なくとも70％、そして好ましくは少なくとも80％相同性を示すタンパク質は本発明に包含されると理解されるべきである。
【００１１】
本明細書で使用する用語「相同性」は、次の「」内のグループのアミノ酸は相同的であると考えることを意味する：「S、T、P、A、G」および「N、Q、D、E」および「H、R、K」および「M、I、L、V」および「F、Y、W」（ここで相同性は、応用できる場合はギャップを含む、最適な配列対応性に対するアラインメントを用いて決定される）。
【００１２】
本明細書で使用する用語「マトリックス材料」は、細胞の補充、付着、浸潤、増殖および分化のための足場（スカフォールド）としておよび／または形態形成タンパク質の送達および貯蔵の潜在的デバイスとして作用する担体マトリックスを意味する。本発明によれば、全てのタイプのマトリックス材料は、それらが生体適合性でありかつ意図する使用の分野または適応症に対して選択されている限り有用である。マトリックス材料は天然材料、改変した天然材料だけでなく合成材料であってもよい。全ての公知の形態形成タンパク質用マトリックスが包含される。天然材料の例は、例えば自家（autolog）、異種（heterolog）または異物（xenolog）骨材料、コラーゲン、例えばコラーゲンI型およびIII型、またはチタニウムのような金属である。また、細胞外マトリックスの他の成分を利用することもできる。細胞外マトリックスには、例えば様々なコラーゲン、例えばコラーゲンI、II、V、IX、X、XIおよびXIII型、さらにヒドロキシルアパタイト、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン、例えばコンドロイチン硫酸、ビグリカン、デコリンおよび／またはヒアルロン酸、または非コラーゲン性タンパク質、例えばオステオポンチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、軟骨マトリックスタンパク質および象牙質リンタンパク質が含まれる。全ての記載した天然材料はまた、人工的に改変した形態で利用してもよい。
【００１３】
改変した天然材料の例は、鉱質除去した骨、加熱灰化した骨鉱質、焼結した骨もしくは化学的に架橋したヒアルロン酸（ヒドロゲル）、または金属合金である。
【００１４】
合成材料の例はポリマーであり、例えばポリグリコール酸、ポリラクチドおよびポリラクチド誘導体、例えばポリ酢酸、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ乳酸-ポリエチレングリコールまたはグリコリドL-ラクチドコポリマー、さらに、ポリリン酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、またはリン酸カルシウム、例えばβ-リン酸三カルシウム（Ca3(PO4)2）、α-リン酸三カルシウムを含有する材料、およびヒドロキシルアパタイトである。
【００１５】
上記グループの１つに属する他の有用な担体マトリックスのさらなる例は、Ca(OH)2、サンゴ、天然骨鉱質、キチン（chitin）、脱鉱質されてない骨粒子、セラミック骨粒子、セラミック象牙質、照射済み海綿状骨チップ、焼石膏、生体活性ガラス、アパタイト-珪灰石（wollastonite）を含有するガラスセラミックである。また、上記担体マトリックスの組合わせもマトリックス材料を形成することができ、例えば、ヒドロキシアパタイトとコラーゲンの組合わせ（例えば、先のOrquest, Inc., CA, USA［現在はDePuy Acromed, MA, USA］から入手しうるHealos）、ポリグリコール酸とポリ乳酸もしくはポリラクチド誘導体の組合わせ、またはサンゴ-コラーゲン複合体が挙げられる。限定するものでない有用な担体マトリックスのリストについては、さらにKirker-Head, Advanced Drug Delivery 43 (2000), pp.65-92.を参照されたい。
【００１６】
本明細書で使用する用語「骨誘導材料」は、少なくともマトリックス材料ならびに上記マトリックス材料中におよび／または表面上に一時的に固定された形態形成タンパク質を含んでなる生物学的デバイスを意味する。さらに、上記デバイスは意図する適用に有用である添加剤を含有してもよい。そのような物質には、限定されるものでないが、抗生物質、抗線維素溶解薬、ビタミン、安定化剤、バッファー、乳濁化剤、抗炎症性物質、または他の添加剤、例えば形態形成タンパク質の溶解度を向上する物質などが含まれる。そのような物質にとって必須の要件は、患者に無害であって、意図する医薬の適用を妨害しないことである。本発明による用語「骨誘導材料」は、骨修復の分野における利用に限定されることを意味しない。他の適応症、例えば軟骨、腱および／または靱帯を含む結合組織、歯周または歯組織、神経組織、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚、粘膜、内皮、上皮の修復または増殖のためにも；神経増殖、組織修復および再生、脈管形成、潰瘍、火傷、外傷または植皮を含む創傷治癒の促進または誘導、前駆細胞または骨髄細胞の増殖の誘導のためにもタンパク質とマトリックス材料の組合わせの使用は有用であって、例えば、タンパク質の緩慢な連続放出および／または細胞を内殖させる環境を提供する利点があり、このようにして新しい健康な組織の形成を支援する。むしろ用語「骨誘導材料」を使用するのは、この用語が当技術分野ではマトリックス材料と形態形成タンパク質の組合わせとしての意味を得ているからである。
【００１７】
本発明による骨誘導材料は、形態形成タンパク質を適用することが好都合である全ての場合に有用であり、特に、形態形成タンパク質をマトリックス材料と一緒に適用して、タンパク質の緩慢なかつ持続した放出を提供しおよび／または細胞増殖および組織再生をさらに促進しかつ増強する環境を提供する場合である。本発明による骨誘導材料は、例えば、軟骨、骨、腱および／または靱帯を含む結合組織、歯周または歯組織、神経組織、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚、粘膜、内皮または上皮の疾患の症候群もしくは症状または異常な症状を予防し、軽減しまたは治療するために用いることができる。本材料は、限定されるものでないが、神経増殖、組織修復および再生、脈管形成、潰瘍、火傷、外傷または植皮を含む創傷治癒の促進または誘導、結合組織と骨の間の機能的結合を再生させるための前駆細胞または骨髄細胞の増殖の誘導、軟骨修復、骨粗しょう症または骨関節炎の治療、非結合骨折、後天性もしくは先天性の頭蓋顔面、骨格または歯科異常を矯正するため、プラスチックまたは再形成手術における非骨格組織置換えに使用することができる。さらに、骨誘導材料により治療する疾患または異常な症状は、虚血または外傷傷害、変性疾患、心筋症、アテローム血栓性または心塞栓卒中、潰瘍形成、肝硬変、肺気腫、細胞老化または静止によって引き起こされるものであってもよい。さらに、骨形成材料を、炎症性応答をモジュレートすることおよびそれに関連する組織破壊効果を軽減するためにならびに損傷したまたは傷害を受けた組織の生存度を向上するために用いることができる。さらに線維症の軽減または瘢痕組織形成を避けることができ、そして本材料を好都合なように用いて虚血修復癒合傷害を治療することができ、例えば、心停止、肺閉塞、動脈閉塞、冠動脈閉塞または閉塞卒中に関連する傷害、手術または他の必要な血流の中断に関連する傷害、または脳梗塞、心筋梗塞、仮死または心肺停止に関連する傷害が挙げられる。さらに可能性のある適応症は、例えばWO 96/39169に記載された結合組織取付けの治癒および修復である。本発明による骨形成材料を使用することができる適応症は、単なる例示であってそれに本発明を限定しようとするものではない。本発明による骨誘導材料は、最大用量の形態形成タンパク質を生物学的に活性かつ有効な形態で好ましくは多孔質のマトリックス材料の内部および／または表面に含有する。
【００１８】
本明細書に使用する用語「均一にコーティングされた」および「コーティングの均一性」は、骨誘導材料の表面のどの部分も基本的に1mm2当たり等量の形態形成タンパク質を含有することを意味する。
【００１９】
当技術分野で記載される骨誘導材料は多くの場合、担体上の生体活性形態形成タンパク質の分布が不均一である。ほとんどのこれらの事例において、マトリックスのある部分と結合しているタンパク質がより少ないかまたは結合タンパク質の相当なパーセントが低い生体活性を示す。本発明によれば、この不均一性は主にマトリックス材料をコーティング中に起こる局部的沈降事象ならびにタンパク質分解プロセスの影響によるものであることが見出された。このようにしてデバイスの骨誘導能力は著しく低下する。そのような不均一な分布とタンパク質分解はコーティングプロセス中のタンパク質安定性と溶解度を改変または増強することにより避けることができ、これは熟達したpH条件の選択と制御ならびに好適なバッファーまたは溶媒特性と特定の添加剤の使用により達成することができる。
【００２０】
液中の形態形成タンパク質の溶解度は、本明細書でも開示した他の重要な因子に加えて溶媒のpH値に依存する。もしコーティング操作の全期間中、タンパク質がコーティング溶液内に安定な方法で完全に溶解していれば、マトリックス材料の形態形成タンパク質によるコーティングは最も効率的である。しかし、ほとんどのマトリックス材料は水素イオンの供与体または受容体であるので、マトリックス材料自体がコーティングプロセス中のpHに影響を与える。ほとんどのマトリックス材料の表面は最大化されていて、無数の空洞と細孔を含有し、時々、タンパク質が沈降しがちである色々なpH条件をもつ局部的ミクロ環境を示す。本発明の方法は、タンパク質溶液が担体材料の外側および内側表面全体に均一に分布し、そしてタンパク質のpH誘導性沈降のリスクなしに、均一かつ安定してこれらの表面と結合することを可能にする。
【００２１】
このコーティングの均一性および特に形態形成タンパク質のマトリックス材料への効果的な吸着は、本発明によれば、従って、溶液中に安定かつ完全に溶解したタンパク質を提供することにより達成される。概して、コーティング操作に使用される形態形成タンパク質用溶媒は、タンパク質を安定化しかつ担体により引き起こされる重要なpHシフトを補償しなければならない。本発明によれば、形態形成タンパク質のpH依存性溶解度の正確な知識ならびにマトリックス特性の基本的知識によって、コーティング操作に好適な溶媒またはバッファーを選ぶことが可能になる。例えば、もし形態形成タンパク質は4.5より低いpHで可溶であるがより高いpH値で沈降し、かつマトリックス材料自体はアルカリ性を有するのであれば、形態形成タンパク質を全コーティングプロセスの間、効率的に溶液中に保持するために、コーティング操作に使用する溶媒またはバッファーは担体により引き起こされるpHシフトを補償するのに好適な物質、好ましくは弱酸を含有しなければならない。もし形態形成タンパク質が10より高いpHで可溶であるがより低いpHで沈降し、かつマトリックス材料自体が酸性を有するのであれば、コーティング操作中に使用する溶媒またはバッファーは効率的な補償をするために他の好適な物質、好ましくは弱塩基を含有しなければならない。色々なマトリックスのpHに対する影響ならびに複数の形態形成タンパク質のpH依存性溶解を記載する実施例が本明細書に与えられている。本発明の他の実施形態によって、明示されていないが、当業者は任意の他のマトリックスのpHに与える影響ならびに任意の他の形態形成タンパク質に対する特定のpH依存性溶解度を容易に決定することが十分にできる。
【００２２】
本発明の形態形成タンパク質は通常、生理学的（ほぼ中性）または若干酸性／塩基性のpH値において沈降するが、もし溶媒が100mmol/l以上のイオン濃度であれば、4.5より低いおよび10.3より高いpHにおいて可溶である。意外なことに、形態形成タンパク質のこのpH依存性溶解度は、バッファーまたは溶媒の組成または濃度を変えることによりさらに改変することができ、従ってマトリックス材料の均一かつ安定なコーティングが可能であるpH範囲を明らかに拡大することができる。例えば10または20mmol/lなどの低いイオン濃度をもつ溶媒中では、少なくとも75μg/ml、好ましくは100μg/ml、さらに好ましくは150μg/mlのそして最も好ましくは200μg/mlより高いタンパク質溶解度を、5.2より低いおよび9.5より高いpH値において達成することができる。このpH範囲の拡大は、もしpH感受性マトリックス、例えば天然材料を含んでなるマトリックスをコーティングするのであれば、特に好都合である。
【００２３】
本発明のこの態様によれば、形態形成タンパク質のpH依存性溶解度およびマトリックス材料の安定なコーティングは、使用するバッファーまたは溶媒のイオン濃度に依存し、そして低イオン濃度のバッファーまたは溶媒を用いることにより著しく改良することができる。好ましくは、上記バッファーまたは溶媒は150mmol/l以下、好ましくは100mmol/l以下、80mmol/l以下、40mmol/l以下、20mmol/l以下、10mmol/l以下、または5mmol/l以下のイオン濃度を有する。さらに好ましくは、バッファーまたは溶媒は20mmol/lの濃度を有する。最も好ましくは、バッファーまたは溶媒は10mmol/lの濃度を有する。
【００２４】
さらに溶媒組成も、形態形成タンパク質のpH依存性溶解度およびマトリックス材料の安定なコーティングに影響を与えることが見出された。クエン酸ナトリウム、2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール-HClまたはグリシンナトリウムを含有するするバッファーは形態形成タンパク質用の溶媒としてあまり適しないことが立証されたが、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウムを含有する溶媒中またはHClもしくはNaOHを含有する非緩衝化溶液中では著しく良いタンパク質安定性または溶解度を得た。さらに、良いタンパク質溶解度が、意外にも、トリフルオロ酢酸（TFA）、TFA/エタノール組成物、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシドまたはアセトンなどの有機溶媒を含有する溶液中で見出された。
【００２５】
本発明のこの態様によれば、形態形成タンパク質用のバッファーまたは溶媒は、好ましくは酢酸もしくは塩酸などの酸またはNaOHなどの塩基を含有する。さらに好ましくは、溶媒は酢酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムを含有するバッファーである。また、好ましくは、溶媒は25％、30％、40％、50％、75％を越える、またはさらに100％の有機溶媒を含有する。
【００２６】
さらに全く意外だったのは、形態形成タンパク質が生理学的条件下で滅多に出現しない強酸性（pH 5.2より低い）ならびに強塩基性（pH 9.5より高い）において単に溶解するだけでなく、その生物学的活性を保持することであった。これらの結果は、特定のマトリックス材料およびそのコーティング方法の開発を可能にする。これらの極度のpH値を有する活性形態形成タンパク質の溶液は無菌性を支援している。この故に、望ましくない生存微生物による汚染の危険が著しく低下するので、これらをコーティング操作中に好都合に使用することができる。その上さらに、例えば9.5〜12の間の塩基性pHにおけるコーティングは複数の事例において有利である、何故なら、複数のマトリックスは酸性媒質中で分解するので塩基性pH条件をコーティング中に必要とするからである。さらに、それ自体が中性または塩基性であるマトリックス材料のコーティングは高いpH値で実施することができるので、一般的にコーティング中のタンパク質沈降のリスクを排除する。例えば、Ca(OH)2は日常的に歯修復操作に使用されるが、約12のpH値を水溶液中で示し、通常、タンパク質によるコーティングができない。Ca(OH)2は従来、小量の二次象牙質の生成を刺激することが示されている。この効果は、Ca(OH)2をpH 12で本発明による形態形成タンパク質とともにコーティングすることにより著しく増強することができる。
【００２７】
以上にまとめたデータは、本発明の特定の実施形態において、マトリックス材料の生物学的活性形態形成タンパク質による5.2より低いpH値および特に9.5〜13の高いpH値におけるコーティングを可能にする。好ましいpH値は12〜13である。特に好ましいpH値は2〜4.5、4.5〜5.2、9.5〜10.3、10.3〜12および12〜13である。
【００２８】
マトリックス材料のコーティングは、その分解を阻止するかまたはその溶解度を向上する安定化剤、乳濁化剤ならびに他の助剤および添加剤を用いることによりさらに著しく改良することができる。特に好ましいのはポリエチレングリコールであり、もしタンパク質と共有結合もしくは非共有結合により結合すれば形態形成タンパク質の溶解度を著しく向上する。他の有用な添加剤および助剤は、マトリックス材料上のタンパク質の均一な吸着に好都合な物質ならびに溶液中のタンパク質を安定化する物質でありうる。さらに、その物質がいずれの方法でもポジティブな効果を与えるかまたは少なくとも患者に対して無害である限り、任意の物質を含むことができる。有用な物質の例は、Tween80のような非イオン界面活性剤、塩基性アミノ酸、血清アルブミンのような担体タンパク質、脂肪酸のアルカリ塩（石鹸）または合成洗剤（またはシンデット）（石鹸以外の合成洗剤）、スクロース、マンニトール（WO98/33514）、エタノールまたはイソプロパノールのような糖類またはアルコールである。特に糖類およびアルコールならびに石鹸および合成洗剤は、コーティングの均一性を改良することが見出されている。アルコール、石鹸および／または合成洗剤を含有するこれらの溶液は、非常に低い界面張力を有してコーティングの有効性を改良するので、非常に好都合である。非経口投与用に有用な注射用マトリックス材料および製剤において、石鹸と合成洗剤はミセル構造を形成するので役立つ。これらのミセルは疎水性の形態形成タンパク質を取囲んで乳濁化し、それによりタンパク質送達を支援しかつ沈降を阻止する。石鹸は8を越えるpH値の塩基性を有するので、この塩基性pH値で生物学的活性を持続することが立証されている本発明の形態形成タンパク質と容易に組合わせることができる。5.2より低い酸性pH範囲においては、石鹸の代わりに合成洗剤を形態形成タンパク質と組合わせて使用することができる。また、抗生物質、防腐薬、ビタミン、抗フィブリン溶解薬などのような他の物質も所望であれば加えることができる。
【００２９】
詳しく説明すると、本発明によれば、マトリックス材料のコーティングを、１種以上の糖類を添加剤として用いることにより著しく改良することができる。好ましくは、上記糖類はスクロースである。また好ましくは、上記糖類はマンニトールである。特に好ましくは、8％、10％、12％、15％または20％以下の糖類を含有するコーティング溶液である。
【００３０】
さらに、マトリックス材料のコーティングを、１種以上のアルコールを添加剤として用いることにより著しく改良することができる。好ましくは、上記アルコールはエタノールである。また好ましくは、上記アルコールはイソプロパノールである。特に好ましくは、50％、55％、60％または65％以下のアルコールを含有するコーティング溶液である。
【００３１】
さらに、マトリックス材料のコーティングならびに形態形成タンパク質の注射用担体または非経口製剤の組成を、脂肪酸のアルカリ塩（石鹸）を添加剤として用いることにより改良することができる。好ましくは、上記石鹸はステアリン酸ナトリウム、ミリスチン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウムまたはパルミチン酸ナトリウムである。特に好ましくは、10％、20％、30％、40％、50％または75％以下の石鹸を含有する溶液である。
【００３２】
マトリックス材料のコーティングならびに形態形成タンパク質の注射用または非経口製剤の組成を、合成洗剤のアルカリ塩を添加剤として用いることにより改良することができる。好ましくは、上記合成洗剤は直鎖アルキルスルホン酸、アルキル硫酸、またはアルキルベンゼンスルホン酸である。さらに好ましくは、上記合成洗剤はラウリル硫酸またはラウレト硫酸（laureth sulfate）である。最も好ましくは、合成洗剤はラウリル硫酸ナトリウムまたはアンモニウムである。特に好ましくは、10％、20％、30％、40％、50％または75％以下の合成洗剤を含有する溶液である。
【００３３】
本発明の一態様は、マトリックス材料およびこのマトリックス材料の外側または内側表面上に吸着された１種以上の形態形成タンパク質を含んでなる骨誘導材料であって、タンパク質を溶液中に溶解したまま保つのに好適な条件下でマトリックス材料と形態形成タンパク質を接触させてそれによりマトリックス材料が形態形成タンパク質により均一にコーティングされるようにすることにより得られる上記骨誘導材料である。このマトリックス材料は細胞補充、付着、増殖および／または分化の足場（スカフォールド）としてかつ形態形成タンパク質の潜在的送達および貯蔵デバイスとして作用する。好ましい実施形態においては、マトリックス材料は多孔質材料であって、材料の内側表面へのタンパク質溶液の貫入を可能にする。また好ましくは、マトリックス材料は天然材料、改変した天然材料または合成材料である。なおさらに好ましくは、マトリックス材料はリン酸カルシウムの或るタイプ、特にβ-リン酸三カルシウム（Ca3(PO4)2）、α-リン酸三カルシウムおよびヒドロキシルアパタイトを含有する。また特に好ましいのは、次のマトリックス材料：a）コラーゲン、b）Ca(OH)2、c）ポリラクチド誘導体：ポリラクチド、ポリ乳酸、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ乳酸-ポリエチレングリコール、d）ヒアルロン酸、e）ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーである。また、特に、ヒドロキシアパタイトとコラーゲンの組合わせ（例えば、先のOrquest, Inc., CA, USA,［現在はDePuy Acromed, MA, USA］）から入手しうるHealosも好ましい。
【００３４】
骨誘導材料中に含まれる形態形成タンパク質はTGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体であり、二量体であってもまたは二量体形成に関与するシステインを欠いてもよい
全てのTGF-βスーパーファミリーメンバーは「7システイン領域」と呼ばれる特異的ドメインを含有する。この特異的7システイン領域は生物学的活性の視点では、このタンパク質の最も重要な部分であると考えられる。従って、この重要な領域を保持するタンパク質は本発明による好ましいタンパク質である。この領域においては、システイン残基のお互いに対するそれぞれの位置は重要であり、生物学的活性を失わないためにごく僅かの変化しか認められない。そのようなタンパク質のコンセンサス配列は当技術分野において公知であり、そのようなコンセンサス配列に従う全てのタンパク質は本発明により包含されると考えられる。特に好ましいのは、本発明のこの態様によるタンパク質が少なくともTGF-βタンパク質スーパーファミリーの特徴である7システイン領域を含有することであって、このドメインに存在する二量体形成に関与するシステインが他のアミノ酸により置換されているか否かは関係がない。
【００３５】
好ましい実施形態においては、形態形成タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体は、成熟タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体である。
【００３６】
また好ましくは、形態形成タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体は、TGF-βファミリー、BMP-ファミリー、GDF-ファミリー、アクチビン-ファミリーまたはGDNF-ファミリーと呼ばれるTGF-βスーパーファミリーサブグループのメンバーである。
【００３７】
骨形成を誘導する能力により元来発見された数種のBMPタンパク質が記載されている。一方、複数のさらなる機能が見出されていて、GDFのメンバーについても同様である。これらのタンパク質は非常に広い応用分野があり、特にその骨および軟骨増殖促進活性（例えば、WO 88/00205、WO 90/11366、WO 91/05802を参照）に加えて、歯周病において歯周および歯組織の消失を阻止するために、歯の空洞をシールするために、歯槽における歯の組込みを促進するために（例えば、WO 96/26737、WO 94/06399、WO 95/24210を参照）、腱または靭帯などの結合組織にとって（例えば、を参照WO 95/16035）、神経細胞の生存度を改良するために、神経細胞の増殖を誘導しかつ神経欠損を修復するために、脳卒中、外傷または変性疾患によって損傷したCNS組織にとって（例えば、WO 97/34626、WO 94/03200、WO 95/05846を参照）、感覚知覚を維持または回復するために（例えば、WO 98/20890、WO 98/20889を参照）、腎不全腎のために（例えば、WO 97/41880、WO 97/41881を参照）、肝再生のために（例えば、WO 94/06449を参照）、心筋再生のために（例えば、WO 98/27995を参照）、器官もしくは組織移植のための組織または細胞の治療または保存のために、胃腸管内層の完全性のために（例えば、WO 94/06420を参照）、例えば造血性前駆細胞のような前駆細胞集団をex vivo刺激により増加するために（例えば、WO 92/15323を参照）などに有用である。
【００３８】
さらに好ましくは、形態形成タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体はTGF-βファミリー、BMP-ファミリー、GDF-ファミリー、アクチビン-ファミリーまたはGDNF-ファミリーに属する二量体タンパク質である。なおさらに好ましくは、二量体形態形成タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体はBMP2、BMP7、BMP12またはBMP13である。
【００３９】
最も好ましくは、本発明により骨誘導材料中に含有される二量体タンパク質は、タンパク質MP52（GDF5またはCDMP-1とも呼ばれる）またはその生物学的活性部分もしくは変異体である。MP52配列は配列番号1（DNAおよびタンパク質配列）および配列番号2（タンパク質配列のみ）に示したが、位置465のXaaはシステインを表す。配列番号2はWO 95/04819に既に開示されたヒトMP52のプレプロタンパク質の完全なタンパク質配列を示す。成熟タンパク質の出発点は、好ましくは、アミノ酸352〜400の領域に、特に好ましくはアミノ酸381または382に位置する。従って、成熟タンパク質はアミノ酸381〜501または382〜501を含有する。成熟タンパク質の最初のアラニンは欠失してもよく、従って成熟タンパク質は好ましくはアミノ酸383〜501を含有する。
【００４０】
MP52の適用は、既に記載したBMP/GDF familyファミリーの適用のいくつかを反映する。MP52は、骨および軟骨形成ならびに結合組織形成の非常に効果的なプロモーターであると考えられる（例えば、WO 95/04819、Hoettenら, (1996), Growth Factors 13, 65-74、Stormら, (1994) Nature 368, 639-643、Changら, (1994) J. Biol. Chem. 269 (45), 28227-28234を参照）。この関係で、MP52は骨格エレメント間の接合部に関する適用に有用である（例えば、Storm & Kingsley (1996) Development 122, 3969-3979を参照）。結合組織に対する一例は腱および靭帯である (Wolfmanら, (1997), J. Clin. Invest. 100, 321-330、Aspenberg & Forslund (1999), Acta Orthop Scand 70, 51-54、WO 95/16035)。MP52は歯（歯および歯周）適用にも有用である（例えば、WO 95/04819、WO 93/16099、Morotomeら, (1998), Biochem Biophys Res Comm 244, 85-90を参照）。MP52はいずれの種類の創傷修復にも有用である。MP52はさらに、例えば神経系における組織増殖の促進およびドーパミン作動性ニューロンの生存にも非常に有用である。MP52はこの関係で例えばパーキンソン病および恐らくまたアルツハイマー病のような神経変性疾患における適用に対して、ハンチントン舞踏病組織に対して有用である（例えば、WO 97/03188, Krieglsteinら, (1995) J. Neurosci Res. 42, 724-732、Sullivanら, (1997) Neurosci Lett 233, 73-76、Sullivanら (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681-3688を参照）。MP52は神経機能を維持させ、または既に損傷した組織の神経機能を保持させる。MP52はそれ故に神経栄養性因子に全般的に適用することができると考えられる。MP52はまた、眼、特に網膜、角膜および視神経の疾患に（例えば、WO 97/03188、Youら (1999), Invest Opthalmol Vis Sci 40, 296-311を参照）、ならびに発毛および皮膚関連障害の治療および診断（WO 02/076494）にも有用である。
【００４１】
既に上述したこれらの用語の定義のように、MP52は、例えば成熟型で用いることができるが、MP52はまた少なくとも7システイン領域を含有するその断片としてまたは前駆的形態で利用することもできる。成熟MP52のN末端部の逸脱はその活性に大きな影響を与えない。従って、タンパク質の最初の9個のアミノ酸内の置換もしくは欠失またはN末端部の付加は、なお本発明の範囲内に包含される。タンパク質のN末端部にペプチドを付加することは、例えば精製するために有用でありうる。この付加されたペプチドをタンパク質の発現および精製後に切断除去する必要はないであろう。タンパク質のNまたはC末端部のさらなるペプチドはまた、神経または骨組織などの特殊な組織に対するタンパク質のターゲティングまたは血液／脳関門の進入に対しても役立ちうる。
【００４２】
またさらに好ましくは、形態形成タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体はTGF-βファミリー、BMP-ファミリー、GDF-ファミリー、アクチビン-ファミリーまたはGDNF-ファミリーに属するがそれぞれの天然タンパク質の二量体形成に関与するシステイン残基を欠くタンパク質である。本発明のこの態様によるタンパク質は、野生型のタンパク質に存在するジスルフィド架橋を形成することができない。WO01/11041に記載のように、通常、タンパク質の二量体化の作用をするシステインを置換または欠失すると、二量体型の生物学的活性を保持する単量体タンパク質の発現と正しいフォールディング（分子内ジスルフィド架橋の適当な形成）をもたらす。一般的に、本発明のこの態様による単量体タンパク質と他のペプチドまたはグループの融合タンパク質も、ここでこれらの他のペプチドまたはグループが例えばある特定の組織型に対する親和性の故に融合タンパク質の局在化を指示する場合、本発明の範囲に包含されると考えられる。そのような融合タンパク質の例はWO 97/23612に記載されている。そのような付加を含有するタンパク質は、少なくともそのような付加がタンパク質の生物学的に活性なコンフォメーションの形成を害わない限り、その生物学的活性を保持しうる。
【００４３】
単量体と（野生型）二量体タンパク質の生物学的活性は比較しうるが、多くの場合、二量体タンパク質はいくらか偏りのある化学的および生物物理学的特性を示す。その２倍の分子量ならびに２個の単量体サブユニット間の強固な共有結合および分子間力の故に、二量体はその単量体同等物より多くのそしてまたいくつかの異なるアミノ酸残基を、周囲の媒質に曝す。二量体は共有結合で接続された２個のサブユニットから構成され、サブユニットは全ての生理学的環境下でお互いに近接した距離にあるので、それら自身とならびに溶媒と多タイプの相互作用を生じる。当技術分野では、二量体形成についてどのアミノ酸がある特定のタンパク質ファミリーまたはタンパク質に関わるかが開示されている（例えば、Schlunegger & Grutter (1992) Nature 358, 430-434；Daopinら, (1992) Science 257, 369-373；およびGriffithら, Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), pp.878-883を参照）。特に、このサブユニット間の連結点に近接した距離のアミノ酸は決して溶媒と直接接触しない。一方、単量体は通常液体によりすっかり取り囲まれていて、永久に他の単量体分子と相互作用しない。単量体と二量体形態形成タンパク質の間のこれらの相違は単量体分子のpH依存性溶解度の変化をもたらすことが理論的に予想される。溶解度の変化に対するさらなる１つの指標は、両方のタンパク質の等電点（pI）の実験的測定により得られる。等電点（pI）はタンパク質の正味電荷がゼロであるpHとして定義され、そしてタンパク質の溶解度はpIで最小値に達する。実施例１および図１に示したように、本発明による単量体タンパク質のpIは測定されていて、明らかに二量体タンパク質のpIと異なる。
【００４４】
この理論および実験の両方に基づく単量体形態形成タンパク質の溶解度変化の予想を考慮すると、単量体形態形成タンパク質のpH依存性溶解度がそれにも関わらずそれらの二量体同等物のそれと等価であることは絶対に予想されなかった。
【００４５】
本発明は、これらの単量体タンパク質がまた、極度のpH値においてその生物学的活性を維持しかつ活性および効率に悪影響を与えることなくマトリックス材料上に吸着されうるという、さらなる意外な結果に基づく。本発明者らは、本発明に至る研究中に、ある特定のpH条件を与えることによりマトリックス材料の存在のもとでも単量体タンパク質を溶液中に保つことが可能であることを発見した。そのような条件下で、可溶タンパク質は可溶タンパク質が到達しうる全ての表面に均一に吸着されうる。多かれ少なかれ多孔質の材料の内側表面の利用度は細孔サイズに依存しうる。本発明に記載の条件を用いると、タンパク質を、可溶タンパク質にとってその分子サイズに応じて利用可能である全ての表面上に吸着することが可能でありうる。本発明は、さらなるタンパク質溶液の進入のために沈降物の生成および細孔の閉塞を避ける。この方法はマトリックス材料の全ての利用可能な表面の最適コーティングを達成し、そして本発明の骨誘導材料は従来技術の材料と比較して改良された効力を示す。
【００４６】
先に述べた特許公開WO01/11041に記載の通り、これらの単量体タンパク質の少なくともいくつは、タンパク質重量を基準にして、それらのそれぞれの二量体型と比較しうるかまたはより高い活性をすら示すことが見出された。さらなる重要な利点は、上記タンパク質は原核生物宿主で大量に発現させ得ることおよび単量体の簡便なリフォールディングで、二量体化してない（単量体）タンパク質から二量体タンパク質を分離する必要なしに上記タンパク質を高純度かつ非常に高収率で得ることができるという事実にある。本発明のこの態様によるタンパク質は、少なくともTGF-βタンパク質スーパーファミリー特徴である7システイン領域を含有することが好ましい。当技術分野では、二量体形成に対してどのシステインがある特定のタンパク質ファミリーまたはタンパク質に関わるかが開示されている（例えば、Schlunegger & Grutter (1992) Nature 358, 430-434；Daopinら, (1992) Science 257, 369-373およびGriffithら, Proc. Natl. Acad. Sci. 93 (1996), pp.878-883を参照）。本発明のこの態様のフレームワーク内で用いるタンパク質を生成するためには、このシステインを欠失するかまたは他のアミノ酸と置換しなければならない。
【００４７】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態において、二量体形成に関与するシステイン残基を欠くタンパク質は、次の配列：
CC(Y)25-29CYYYC(Y)25-35XC(Y)27-34CYC(式I)
［式中、Cはシステインを表し、Yはシステインを含む任意のアミノ酸を表し、Xはシステイン以外の任意のアミノ酸を表す］
で示されるコンセンサス配列を含有する。
【００４８】
さらに好ましくは、本発明のこの態様によって二量体形成に関与するシステイン残基を欠くタンパク質は、次の配列：
C(Y)28CYYYC(Y)30-32XC(Y)31CYC(式II)
［式中、C、XおよびYは先に定義したのと同じ意味を有する］
で示されるコンセンサス配列を含有する。
【００４９】
なおさらに好ましくは、本発明のこの態様によって二量体形成に関与するシステイン残基を欠くタンパク質は、次の配列：
C(X)28CXXXC(X)31-33C(X)31CXC(式III)
［式中、C、XおよびYは先に定義したのと同じ意味を有する］
で示されるコンセンサス配列を含有する。
【００５０】
これらのコンセンサス配列において、それぞれのシステイン残基間は特に好ましい距離を有し、ここで既に二量体を形成するシステインも他のアミノ酸により置換されている。上記タンパク質スーパーファミリーの全てのタンパク質と同様に、システイン間の位置と距離はこの領域に含有される他のアミノ酸の同一性より重要である。それ故に、コンセンサス配列はシステインのそれぞれの位置を示すが他のアミノ酸の同一性を示すものではない、というのは、これらの他のアミノ酸はTGF-βタンパク質スーパーファミリーのタンパク質中で大幅に変化しうるからである。
【００５１】
特に好ましい実施形態において、骨誘導材料が含有するタンパク質はMP52の単量体型であって、少なくとも配列番号1（DNAとタンパク質配列）および配列番号2（タンパク質配列だけ）［配列中、位置465のXaaにより示されるアミノ酸は欠失しているかまたはシステインを除く任意のアミノ酸である］に記載のアミノ酸配列の成熟部分を含んでなる。特に、グリシン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンなどの他の疎水性アミノ酸が位置465に存在してもよい。成熟タンパク質の出発点は好ましくはアミノ酸352〜400、特に好ましくは381もしくは382の領域にある。従って、成熟タンパク質はアミノ酸381〜501または382〜501を含んでなる。成熟タンパク質の最初のアラニンは欠失していてもよく、従って成熟タンパク質は好ましくはアミノ酸383〜501を含んでなる。
【００５２】
本発明で使用する最も好ましいタンパク質はMP52-Ala83、配列番号1または2のアミノ酸383で出発するタンパク質であり、ここで位置465の天然システインは疎水性アミノ酸のアラニンにより置換されている。またMP52-Ala83についても、成熟タンパク質は好ましくはアミノ酸352〜400の間、特に好ましくはアミノ酸381または382で出発する。成熟タンパク質の最初のアミンは欠失していてもよく、従って、好ましくはアミノ酸383〜501を含んでなる。
【００５３】
この文脈において使用する単量体タンパク質の定義に対応するタンパク質は、溶液中である種の凝集体を生成することは理論的に可能である。しかし、この凝集体は定義した分子間架橋および共有結合により形成されるタンパク質の二量体または多量体に対応するものではない。それに関わらず、ファン・デル・ワールス引力および他の形態の弱い結合が生じうるのであって、そのような凝集体は本発明に包含されると考えられる。
【００５４】
本発明の他の態様は本発明の骨誘導材料を生産する方法である。上記方法は、タンパク質を安定にかつ緩衝化溶液中に溶解して保持するのに好適な条件のもとでマトリックス材料を形態形成タンパク質の溶液と接触させ、それによりマトリックス材料が形態形成タンパク質により均一にコーティングされるようにするステップおよび次いでコーティングされたマトリックス材料を乾燥するステップを含んでなる。上記方法はまた、マトリックス材料と接触するときに、タンパク質溶液のpHを5.2以下または9.5以上の値に選択しかつ調節するステップも提供する。好ましいのは12〜13のpH値である。特に好ましいのは2〜4.5、4.5〜5.2、9.5〜10.3および10.3〜12のpH値である。本発明の他の主題に対して骨誘導材料を形成することができるタンパク質およびマトリックス材料、ならびにまた全ての好適な溶媒／バッファー、添加剤および助剤も上記の通りである。
【００５５】
以下の限定するものでない実施例ならびに図および配列プロトコルは、本発明をさらに説明することを意図するものである。
【実施例】
【００５６】
実施例１：等電点電気泳動
等電点電気泳動を非還元条件下で「CleanGel IEF」ゲル（Pharmacia, Cat.No. 18-1035-32）を用いて実施した。使用前に、乾燥ゲルを8時間、19.2g尿素、400μl NP-40（10％溶液）、100μlアンホライン（Ampholine）pH 3.5〜10.0（Pharmacia, Cat. No. 80-1125-87）および2.5mlアンホライン（Ampholine）pH 7.0〜9.0（Pharmacia, Cat. No. 80-1125-94）を含有する40ml水溶液中で再水和した。試験条件は次の通りであった：
【表１】
2006521135.tif 000003
【００５７】
１レーン当たり500ngタンパク質を適用した。泳動後、ゲルを2回、それぞれ15分間、固定溶液（115g/lのトリクロロ酢酸および35g/lの5-スルホン酸サリチル酸二水和物）中に置き、蒸留水中で洗浄し、そして銀で染色した（図１を参照）。pIを決定するために、IEF後、１枚のゲルをアノード側から切り取って複数の1cm切片とし、これを注射用水中に浸漬して抽出した。抽出物のpHをアノード側からの距離に対してプロットすると、pH勾配の直線性がアノード側から2.5〜7.5cmにわたって観察された。pI値を、アノードと主バンド（pH 7）間の距離を測定し、pIとアノードと主バンド間の距離の直線関係を利用して決定した。アノードへの距離（x）は、MP52二量体バンドに対してx＝5.5cmであり、MP52-Ala83に対してx＝3.2cmであった。用いた直線式は、y＝0.217 * x + 6.416である。従って、実験的に決定したMP52二量体のpIはほぼ7.65であり、MP52-Ala83のpIはほぼ7.1である。
【００５８】
実施例２：タンパク質溶解度の測定
予め10mmol/l HClに溶解したMP52および／またはMP52-Ala83を凍結乾燥した。凍結乾燥物を、5分間の等しい時間、色々な溶媒（図２および３）に溶解して0.4mg/mlの最終タンパク質濃度とした。次いでサンプルをRP-HPLCにより分析し、溶解したタンパク質の回収率／量を計算した。
【００５９】
実施例3：タンパク質サンプルの逆相HPLC分析
タンパク質分解を測定するために、サンプルのいわゆる逆相HPLC分析（RP-HPLC）を実施した。色々な製造業者のRP-HPLCデバイスを用いた。十分な試験条件のための好適な一例は次の通りである：カラム：Vydac C18；5μm；300オングストローム；2.1 x 250 mm；相218TP52；相A：水中の0.15％ TFA；相B：0.15％アセトニトリル/TFA；速度：0.3 ml/min。
【００６０】
実施例4：色々な溶媒のタンパク質溶解度に与える影響
予め10mmol/l HClに溶解したMP52を凍結乾燥した。凍結乾燥物を、5分間の等しい時間、色々な溶媒に溶解して0.4mg/mlの最終タンパク質濃度とした。溶解度を、pH依存性溶解度の境界に位置する２つの固定したpH値（それぞれpH 10およびpH 4.6）を用いて比較した。サンプルを次いでRP-HPLCにより分析し、溶解したタンパク質の回収率／量を計算した。
【００６１】
下表により、もしAMP（2-アミノ-2-メチル-1,3-プロパンジオール-HCl；Dawsonら：「生化学研究用データ（Data for biochemical research）」（第3版） 1986, 437, Clarendon Press, Oxfordを参照）またはグリシンナトリウムを溶媒として使用すると、pH 10における溶解度は測定されなかった。良い溶解度は炭酸ナトリウムバッファーまたは非緩衝化NaOH溶液（pH 10）中で得られた。pH 4.6では、酢酸ナトリウムが、クエン酸ナトリウムと比較してより良い溶媒であることが立証された。
【表２】
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【００６２】
実施例５：色々な溶媒のタンパク質安定性に与える影響
MP52とMP52-Ala83を3種類の異なる溶媒、すなわち1種類の非緩衝化溶液（10 mM HCl）および2種類の緩衝化溶液（10mM酢酸ナトリウムpH 4.0、10mMクエン酸ナトリウムpH 4.0）に溶解した。全てのサンプルを20℃にて貯蔵した。2週間後、サンプルを逆相HPLC分析（実施例３）にかけて、タンパク質の分解を測定した。図４に結果を示す。-80℃で貯蔵したMP52またはMP52-Ala83対照標準と比較して、タンパク質は、もしクエン酸ナトリウムに溶解すると有意な分解パターンを示すが、10mM HCl中でははるかに少ない分解が観察される。最も良い結果は10mM酢酸ナトリウムバッファー中の貯蔵によって得た。
【００６３】
実施例６：色々なイオン強度を有するバッファーのタンパク質安定性に与える影響
MP52およびMP52-Ala83を、10もしくは20mM酢酸ナトリウム、pH 4、または10もしくは20mMクエン酸ナトリウム、pH 4中に溶解した。全てのサンプルを20℃にて貯蔵した。1または2週間後、サンプルを逆相HPLC分析（実施例３）にかけてタンパク質の分解を測定した。結果を図５に示す。タンパク質安定性は10mM酢酸ナトリウム中で良いが、もしタンパク質を中度のイオン強度（20mM酢酸ナトリウム）によるバッファー中で貯蔵すれば有意に向上した。一般的に形態形成タンパク質の貯蔵に適しないバッファー（クエン酸ナトリウム）中でも、より高いイオン強度によるバッファー中でタンパク質安定性の向上を達成しうる。
【００６４】
実施例７：MP52およびMP52-Ala83のpH 11、pH12、pH13における安定性
塩基性pHにおける形態形成タンパク質の安定性を測定するため、MP52およびMP52-Ala83をNa2HPO4バッファーに溶解した。pHをNaOHを用いて、pH11、pH12またはpH13のいずれかに調節した。0および90分後、サンプルを逆相HPLC分析にかけてタンパク質の分解を測定した。図６にMP52またはMP52-Ala83対照標準と比較して示したように、pH 11およびpH 12においてピークプロファイルの大きな変化は0および90分後に見られなかったが、pH 13において分解産物を表す前ピークの有意な増加が90分後に明らかに観察された。しかし、pH 13においてMP52主ピークの主要部分はなお存在する。従ってこの実施例は、少なくともpH 12までの高いpH値における形態形成タンパク質の安定性を立証した。さらに、これらのタンパク質はpH 13において90分間を越えない短期間についても安定である。
【００６５】
実施例８：均一なタンパク質分布を作るためのマトリックス材料の酸性コーティング
この一般的なコーティング操作は、好ましくは中性または塩基性を持つマトリックス材料のコーティングに有利であるが、酸性担体のコーティングに利用することもできる。
【００６６】
MP52-Ala83を、10mM HCl、10mM酢酸ナトリウム（pH 4）、もしくは20mM酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせに溶解して最終濃度1μg/mlを得た。場合によっては、その溶液は１種以上の次の添加剤：8〜15％糖類、50〜60％アルコール、10〜75％合成洗剤を含有した。溶液を次いでβ-TCPマトリックス材料にピペットを用いて加えた。100ng MP52-Ala83を100mgマトリックス材料のコーティングに使用した。コーティングしたβ-TCPを1時間20℃にて空気乾燥し、最後に空気乾燥または真空乾燥して残留する液体を除去した。
【００６７】
実施例９：コラーゲン担体の酸性コーティングおよび骨誘導in vivoの実証
吸収性止血用コラーゲンスポンジ（型式「Helistat」、Integra Life Sciences、Plainsboro、USA）を小片（0.6cm x 0.6cm）に切断した。続いて、スポンジの粗面側を、ネガティブ対照としての希釈バッファー単独（10mM HCl/20mM酢酸ナトリウム、pH4.0）、単量体MP52-Ala83（希釈バッファー中、500μg/ml）または二量体MP52（希釈バッファー中、500μg/ml）のいずれかの60μlを用いてコーティングした。スポンジ材料を無菌条件下で空気乾燥した。これらの骨誘導材料の新しい骨成長をin vivoで誘導する能力を、次いでラット頭蓋欠損研究を用いて評価した。この十分確立された動物モデルにおいては、円形骨欠損をラットの頭蓋に穿孔し、そして形態形成タンパク質を用いてコーティングしたマトリックス移植片を自然治癒しない孔内に置く。２週間後、骨誘導材料の新しい骨成長を誘導する効力を、欠損サイズ減少の測定により計算することができる。
【００６８】
スポンジコラーゲン材料を移植前にリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）30μl中で10分間再水和した。移植片を最終的に、Mulliken, J.B.およびGlowacki, J. Plast. Reconstr. Surg. 65: 553-559 (1980)の先の記載に従いラットの頭頂骨に作っておいた、両側の欠損（それぞれ直径6mm）中に挿入した。形態形成タンパク質を含まない純粋なコラーゲンを含有する移植片、ならびに移植片を挿入しない欠損をネガティブ対照とした。8週後、動物を犠牲にして接触ラジオグラフを撮影した。ラット頭蓋欠損のラジオグラフは有意な差異を示した（図７）。無処置欠損（7A）またはコラーゲンスポンジ単独で処置した欠損（7B）に骨再生は観察されなかった。頭蓋欠損をコラーゲン＋二量体MP52を充填しておいた頭蓋欠損（7C）の動物は、欠損境界から出発する強い骨成長を示した。比較しうる骨誘導効果がコラーゲン＋単量体MP52（MP52-Ala83）を用いて処置した標本（7D）に認められた。
【００６９】
実施例10：均一なタンパク質分布を作るためのマトリックス材料の塩基性コーティング
この一般的な塩基性コーティング操作は、好ましくは酸性または中性のマトリックス材料をコーティングするのに有利であるが、塩基性担体のコーティングにも使用することができる。さらに、MP52およびMP52-Ala83を10もしくは20mM炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウムバッファーまたはNaOH（pH 12）に溶解して1μg/mlの最終濃度を得た。場合によっては、溶液は１種以上の次の添加剤：8〜15％糖類、50〜60％アルコール、10〜75％石鹸もしくは合成洗剤を含有した。溶液を次いでβ-TCPマトリックス材料にピペットを用いて加えた。この方法において、100ng MP52-Ala83を100mgマトリックス材料のコーティングに使用した。コーティングしたβ-TCPを1時間20℃にて空気乾燥し、最後に真空乾燥して残留する液体を除去した。
【００７０】
実施例11：pH 12におけるCa(OH)2担体のコーティングと生物学的活性in vivoの測定
歯修復作業にマトリックス材料として日常的に使用される通常のCa(OH)2粉末を、コーティングの前に1時間180℃にて殺菌した。Ca(OH)2は水溶液中で12の強塩基性pHを示す。コーティング操作において、殺菌したCa(OH)2粉末71mgを、溶解したMP52（3,15mg/ml）71μlまたは対照としてのH20 71μlと1：1で混合し、そしてインキュベートして12のpH値をもつ骨誘導材料を作った。
【００７１】
MP52の塩基性pH値における安定性を立証するため、コーティングしたMP52の生物学的活性をコーティング操作後に試験した。骨誘導材料を1M HClを用いて中和し、次いで細胞培地を用いて希釈して形態形成タンパク質を遊離させ、そして400ng/mlおよび133.2ng/ml MP52の最終タンパク質濃度とした。これらのMP52溶液の生物学的活性を、確立されたマウス培養細胞株MCHT-1/26を用いて、アルカリホスファターゼ（ALP）活性の数値化によりin vitroで測定した。細胞を、10％FCS、L-グルタミン（20mM）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含有するα-MEM培地中で3日間インキュベートして95％より低いコンフルエンスとした。洗浄し、トリプシン処理した細胞を同じ培地中に再懸濁しそして96ウエルマイクロタイタープレート中に配った（4.5x103細胞／ウエル）。細胞を24時間接着させ、洗浄し（L-グルタミン（20mM）を含有するα-MEM）、そして培地で希釈したMP52の濃度で処理した。全てのMP52サンプルの値を、in vivo骨形成活性を決定しておいたMP52の標準と比較した。細胞を72時間インキュベートし、洗浄し、そして0.2％ノニデットP-40界面活性剤および1mM MgCl2中の一夜にわたるインキュベーションにより溶解した。上清をアルカリホスファターゼの基質であるp-ニトロフェニルリン酸と混合し、そして反応1時間後37℃にて停止した。405nmにおける吸収の変化を測定し、相対的生物学的活性の指標として用いた。Ca(OH)2コーティング操作に使用したMP52のOD405値（400ng/ml：0.629；133.2ng/ml：0.378）は、MP52標準のOD405値（400ng/ml：0.684；133.2ng/ml：0.438）と比較しうるものであったが、対照は450nmにおいて吸収を示さなかった。従ってこの実施例は、マトリックス材料を形態形成タンパク質により、高pH値において生物学的活性の消失なしにコーティングする可能性を立証した。
【００７２】
実施例12：コーティングの均一性を検出するためのクーマシー染色
マトリックス材料上に結合したタンパク質の量をクーマシーブルー染色により可視化した。クーマシーブリリアントブルーは合成複素環式有機色素であり、非特異的であるがほぼ化学量論的な方法で実質的に全てのタンパク質と結合する。酸性クーマシーブルー色素は、タンパク質と結合すると赤褐色から青色に変わる。従って、マトリックス材料上の不均一なタンパク質分布はスポット状の青いパターンにより表わされる。
【００７３】
コーティングされたマトリックス材料をクーマシー染色溶液（40％メタノール、60％PBS中の0.5％クーマシーブリリアントブルーR-250）とともに、20分間室温でインキュベートした。同一のコーティングされてないマトリックス材料も染色して対照とした。過剰の色素は40％メタノール/60％PBSを用いて対照の完全な脱色素が起こるまで洗浄して除去した。
【００７４】
青色スポットが全然無いマトリックス材料上の全く均一なタンパク質分布を、多糖類、特にスクロースの存在のもとでのコーティングにより認知した。アルコール、特にエタノール、石鹸または合成洗剤の存在のもとでも同様な結果を得た。  
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１はDNAおよびタンパク質配列を、そして配列番号２はMP52およびMP52-Ala83プレプロペプチドを示す［配列中、位置465のXaaにより示したアミノ酸はシステイン（MP52の場合）またはアラニン（MP52-Ala83の場合）のいずれかである］。天然の成熟タンパク質MP52およびMP52-Ala83はアミノ酸382〜501を含んでなる。MP52およびMP52-Ala83の好ましい組換え体において、成熟タンパク質の最初のアラニンは欠失していて成熟タンパク質はアミノ酸383〜501を含んでなる。全ての以下の図および実施例において、MP52およびMP52-Ala83のこの組換え体バージョンを用いている。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例１による等電点電気泳動の結果を示す。MP52-Ala83はレーン1に存在し、一方MP52はレーン2に存在する。MP52のpIはほぼ7.65であり、MP52-Ala83のpIはほぼ7.1である。
【図２】実施例２および３ならびに下表によるMP52とMP52-Ala83のpH依存性溶解度の比較を示す。バッファー（0.1M酢酸ナトリウム-酢酸（p.429）および0.1M炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム（p.439））を、Dawsonら：「生化学研究用データ（Data for biochemical research）」 (第3版) 1986, p.429およびp.439, Clarendon Press, Oxfordに従って調製した。従って、pH依存性溶解度に関して、MP52とMP52-Ala83はほぼ同一特性を示すということができる。
【表３】
2006521135.tif 000005
【図３】実施例２および３ならびに下表による、MP52の溶解度の溶媒イオンの強度への依存性の比較を示す。バッファー（酢酸ナトリウム-酢酸および炭酸ナトリウム-炭酸水素ナトリウム）は、Dawsonら：「生化学研究用データ（Data for biochemical research）」 (第3版) 1986, p.429およびp.439, Clarendon Press, Oxfordに従って調製した。高イオン強度の溶媒（0.1M、図２に対応する表も参照すること）において、200μg/ml以上のタンパク質溶解度が4.5より低いおよび10.3より高いpH値にて達成可能である。低いイオン強度（0.01M、下表も参照）においては、約200μg/ml以上のタンパク質溶解度が5.2より低いおよび9.5より高いpH値にて達成可能である。
【表４】
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【図４−１】実施例３および５による、色々なバッファー（10mM HCl、10mM酢酸ナトリウムpH 4.0および10mMクエン酸ナトリウムpH 4.0）中に2週間20℃で貯蔵後にRP-HPLC分析により測定したMP52-Ala83の安定性を示す。MP52-Ala83を表す高い主ピークは約11〜18min（MP52-Ala83）に存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。有意なタンパク質分解が10mMクエン酸ナトリウムに現れるが、タンパク質安定性は10mM HClおよび特に10mM酢酸ナトリウムバッファーにおいて改良される。
【図４−２】実施例３および５による、色々なバッファー（10mM HCl、10mM酢酸ナトリウムpH 4.0および10mMクエン酸ナトリウムpH 4.0）中に2週間20℃で貯蔵後にRP-HPLC分析により測定したMP52の安定性を示す。MP52を表す高い主ピークは約17〜23min（MP52）に存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。有意なタンパク質分解が10mMクエン酸ナトリウムに現れるが、タンパク質安定性は10mM HClおよび特に10mM酢酸ナトリウムバッファーにおいて改良される。
【図５−１】実施例３および６による、RP-HPLC分析により測定したMP52-Ala83の安定性の、使用バッファー／溶媒のイオン強度への依存性を示す。20℃で1週間保存後の10mMおよび20mMクエン酸ナトリウムpH 4.0中のMP52-Ala83の分解を、限定するものでない実施例として示す。MP52-Ala83を表す高い主ピークは約15〜20minに存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。タンパク質安定性は10mM酢酸ナトリウム中で良いが、もしタンパク質を中度のイオン強度（20mM酢酸ナトリウム）を有するバッファーに貯蔵すればさらに良くなる。一般的に形態形成タンパク質の貯蔵に適しないバッファー（クエン酸ナトリウム）中でも、中度のイオン強度（20mM）を有するバッファー中においてタンパク質安定性の向上を達成しうる。
【図５−２】実施例３および６による、RP-HPLC分析により測定したMP52の安定性の、使用バッファー／溶媒のイオン強度への依存性を示す。20℃で2週間保存後の10mMおよび20mM酢酸ナトリウムpH 4.0中のMP52の分解を、限定するものでない実施例として示す。MP52を表す高い主ピークは約15〜20minに存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。タンパク質安定性は10mM酢酸ナトリウム中で良いが、もしタンパク質を中度のイオン強度（20mM酢酸ナトリウム）を有するバッファーに貯蔵すればさらに良くなる。一般的に形態形成タンパク質の貯蔵に適しないバッファー（クエン酸ナトリウム）中でも、中度のイオン強度（20mM）を有するバッファー中においてタンパク質安定性の向上を達成しうる。
【図６−１】実施例３および７による、pH11、pH12およびpH13における0および90min後にRP-HPLC分析により測定したMP52とMP52-Ala83の安定性を示す。MP52（またはMP52-Ala83、それぞれ）を表す高い主ピークが約15〜20minに存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。タンパク質は高いpH、少なくともpH 12まで、また90minを越えない短期間ではpH 13においても安定である。
【図６−２】実施例３および７による、pH11、pH12およびpH13における0および90min後にRP-HPLC分析により測定したMP52とMP52-Ala83の安定性を示す。MP52（またはMP52-Ala83、それぞれ）を表す高い主ピークが約15〜20minに存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。タンパク質は高いpH、少なくともpH 12まで、また90minを越えない短期間ではpH 13においても安定である。
【図６−３】実施例３および７による、pH11、pH12およびpH13における0および90min後にRP-HPLC分析により測定したMP52とMP52-Ala83の安定性を示す。MP52（またはMP52-Ala83、それぞれ）を表す高い主ピークが約15〜20minに存在する。主ピークの前方および無処理の対照標準に対して逸脱して現れるさらなるピーク（前ピーク）はタンパク質の分解産物を示す。タンパク質は高いpH、少なくともpH 12まで、また90minを越えない短期間ではpH 13においても安定である。
【図７】実施例９による手術後8週の骨誘導材料を充填したラット頭蓋欠損のラジオグラフを示す。A：無処置の欠損、B：コラーゲンスポンジだけを用いて処置した欠損；C：コラーゲン＋二量体MP52を充填した欠損；D：コラーゲン＋単量体MP52（MP52-Ala83）を充填した欠損。無処置（7A）またはマトリックス処置（7B）した欠損では骨再生が見えないが、コラーゲンと形態形成タンパク質を充填した頭蓋欠損（7Cおよび7D）には骨再生が認められた。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
2006521135.tif 000024
【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリックス材料ならびに該マトリックス材料の内側および／または外側表面上に吸着された形態形成タンパク質を含んでなる骨誘導材料であって、タンパク質を安定させかつ溶液中に溶解して保つために好適な条件下でマトリックス材料と形態形成タンパク質を接触させ、それによりマトリックス材料が形態形成タンパク質により均一にコーティングされるようにすることにより得ることができ、前記好適な条件が
(a)  コーティング過程におけるpHを4.5未満または10.3より大きく維持し得るバッファーまたは溶媒を使用するか、または
(b)  100mmol/l以下のイオン濃度を有し、コーティング過程におけるpHを5.2未満または9.5より大きく維持し得るバッファーまたは溶媒を使用するという条件から選択される骨誘導材料。
【請求項２】
形態形成タンパク質が少なくともTGF-βスーパーファミリータンパク質の特徴である7システイン領域を含有する、請求項１に記載の骨誘導材料。
【請求項３】
形態形成タンパク質が成熟タンパク質またはその生物学的活性部分もしくは変異体である、請求項１または２に記載の骨誘導材料。
【請求項４】
形態形成タンパク質がTGF-β-ファミリー、BMP-ファミリー、GDF-ファミリー、アクチビン-ファミリーまたはGDNF-ファミリーに属する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項５】
形態形成タンパク質が二量体タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項６】
形態形成タンパク質がBMP2、BMP7、BMP12、BMP13、MP52（GDF5）またはその生物学的活性部分もしくは変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項７】
形態形成タンパク質がそれぞれの天然タンパク質の二量体形成に関与するシステイン残基を欠くタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項８】
形態形成タンパク質が
式I：C(Y)25-29CYYYC(Y)25-35XC(Y)27-34CYCまたは
式II：C(Y)28CYYYC(Y)30-32XC(Y)31CYC
［式中、Cはシステインを表し、Yはいずれかのアミノ酸を表しそしてXはシステインを除くいずれかのアミノ酸を表す］
で表されるコンセンサス配列を含有する、請求項１〜４および７のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項９】
タンパク質がMP52の単量体型である、請求項１〜４、７および８のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１０】
タンパク質がMP52-Ala83またはその生物学的活性部分もしくは変異体である、請求項９に記載の骨誘導材料。
【請求項１１】
マトリックス材料が生体適合性材料である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１２】
マトリックス材料が天然材料、改変された天然材料または合成材料である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１３】
マトリックス材料が多孔質材料である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１４】
マトリックス材料が少なくとも次の物質：a）コラーゲン、b）Ca(OH)2、c）ポリラクチドまたはポリラクチド誘導体、d）ヒアルロン酸、e）ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、f）リン酸カルシウム、g）ヒドロキシアパタイトとコラーゲンの組合わせ、h）ポリグリコール酸とポリ乳酸もしくはポリラクチド誘導体の組合わせ、の１つを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１５】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒が80mmol/l以下、40mmol/l以下、20mmol/l以下、10mmol/l以下、または5mmol/lのイオン濃度を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１６】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がさらに糖類を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１７】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がさらにアルコールまたは他の有機溶媒を含有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１８】
コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がさらに石鹸または合成洗剤を含有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項１９】
形態形成タンパク質がポリエチレングリコールと共有結合または非共有結合で結合している、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項２０】
酸性コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がHClまたは酢酸ナトリウムを含有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項２１】
塩基性コーティングに使用されるバッファーまたは溶媒がNaOHまたは炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウムを含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の骨誘導材料。
【請求項２２】
マトリックス材料を少なくとも１つの形態形成タンパク質の溶液と接触させるステップを含んでなる請求項１〜２０のいずれか１項に記載の骨誘導材料を生産する方法であって、上記溶液に含有される物質がマトリックス材料と接触したときでも溶液のpHを5.2より低く調節できるように選択されることを特徴とする上記方法。
【請求項２３】
マトリックス材料を少なくとも１つの形態形成タンパク質の溶液と接触させるステップを含んでなる請求項１〜１９および２１のいずれか１項に記載の骨誘導材料を生産する方法であって、上記溶液に含有される物質がマトリックス材料と接触したときでも溶液のpHを9.5より高く調節できるように選択されることを特徴とする上記方法。
【請求項２４】
単量体または二量体形態形成タンパク質が有用であることが証明されている適応症に対して使用される医薬の製造のための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の骨誘導材料の使用。
【請求項２５】
骨誘導材料を軟骨、骨、腱および／または靱帯を含む結合組織、歯周または歯組織、神経組織、感覚系の組織、肝臓、膵臓、心臓、血管、腎臓、子宮および甲状腺組織、皮膚、粘膜、内皮、または上皮の疾患または異常な症状の症候群または症状を予防、軽減または治療するために使用する、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
神経増殖、組織修復および再生、脈管形成、潰瘍、火傷、外傷または植皮を含む創傷治癒の促進または誘導、結合組織と骨の間の機能的結合を再生させるための前駆細胞または骨髄細胞の増殖の誘導、軟骨修復、骨粗しょう症または骨関節炎の治療、非結合骨折、後天性もしくは先天性の頭蓋顔面、骨格または歯科異常を矯正するため、プラスチックまたは再形成手術における非骨格組織置換えのための、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】
疾患または異常な症状が虚血または外傷傷害、変性疾患、心筋症、アテローム血栓性または心塞栓卒中、潰瘍形成、肝硬変、肺気腫、細胞老化または静止により引き起こされる、請求項２４〜２６のいずれか１項による骨誘導材料の使用。
【国際調査報告】
2006521135.tif 000028
2006521135.tif 000029
2006521135.tif 000030