(57)【要約】本発明はプロスタグランジンＥ２受容体のＥＰ４サブタイプの強力な選択的アゴニストと、緑内障及び患者の眼の眼圧上昇に関連する他の症状の治療におけるその使用又は製剤に関する。本発明は更に骨芽細胞及び破骨細胞の骨モデリング及びリモデリングプロセスを媒介するための本発明の化合物の使用に関する。
2006505572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｉ：
【化１】
2006505572.tif 000031
［式中、Ｙ１は
１）ＣＨ２ＣＨ２、
２）ＣＨＣＨ、又は
３）
【化２】
2006505572.tif 000032
であり；
ＹはＣ（Ｏ）又はＣＨ（ＯＨ）であり；
Ａは（ＣＨ２）ｎであり；
ｎは１、２、３、又は４であり；
Ｗは結合、非置換Ｃ１−６アルキレン、又は１、２、３、もしくは４個のハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキレンであり；
Ｚは
１）Ｏ、
２）Ｓ、
３）
【化３】
2006505572.tif 000033
４）ＨＣ＝ＣＨ、
５）Ｃ≡Ｃ、又は
６）結合であり；
Ｑはジ置換アリール又はヘテロアリール環であり、環の１個の環原子は部分：
【化４】
2006505572.tif 000034
に結合しており、別の環原子は部分：
【化５】
2006505572.tif 000035
に結合しており；
Ｒ１は
ＣＯＲ５、
ＯＨ、
ＣＮ、
（ＣＨ２）１−３ＣＯ２Ｒ６、
Ｃ（Ｏ）ＮＨＳＯ２Ｒ８、
ＳＯ２Ｒ７、
（ＣＨ２）０−４ＳＯ３Ｒ６、
ＣＦ２ＳＯ２ＮＨ２、
ＳＯ２ＮＨ２、
ＳＯ２ＮＨＣＯＲ８、
ＰＯ（ＯＲ７）２、
Ｃ１−４アルコキシ、
ヒドロキシメチルケトン、又は
（ＣＨ２）０−４Ｒｋであり、ここでＲｋは置換されていないか又は１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ２は
１）Ｃ１−６アルキル、
２）（ＣＨ２）０−８Ｃ６−１０アリール、
３）（ＣＨ２）０−８Ｒｍ、
４）（ＣＨ２）０−８Ｃ３−８シクロアルキル、
５）Ｏ−Ｃ１−１０アルキル、
６）Ｏ−Ｃ６−１０アリール、
７）Ｏ−Ｒｍ、
８）Ｏ−Ｃ３−１０シクロアルキルであり、ここでアリール、Ｒｍ、及びシクロアルキルは置換されていないか又は１〜３個のＲｂ基で置換されており；
Ｒ３及びＲ４は
１）ハロゲン、及び
２）Ｃ１−６アルキルから構成される群から独立して選択されるか、又は
Ｒ３及びＲ４はそれらが結合する炭素原子と一緒にＣ３−７シクロアルキル環を形成し；
Ｒ５は
１）水素、
２）ＯＨ、
３）ＣＨ２ＯＨ、
４）Ｃ１−６アルコキシ、
５）ＮＨＰＯ２Ｒ６、
６）ＮＨＲ９、
７）ＮＨＳＯ２Ｒ８、又は
８）ＮＲ６Ｒ７はであり；
Ｒ６及びＲ７は水素、Ｃ１−６アルキル、及びＣ３−８シクロアルキルから構成される群から独立して選択され；
Ｒ８は水素、Ｃ６−１０アリール、Ｒｎ、及びＣ１−４アルキルから構成される群から選択され；
Ｒ９はＣ（Ｏ）Ｒ１０又はＳＯ２Ｒ１０であり；
Ｒ１０は水素、Ｃ６−１０アリール、又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒａ及びＲｂは
１）Ｃ１−６アルコキシ、
２）置換されていないか又は
ａ）Ｃ１−６アルコキシ、
ｂ）Ｃ１−６アルキルチオ、
ｃ）ＣＮ、
ｄ）ＯＨ、もしくは
ｅ）ＣＦ３
で置換されたＣ１−６アルキル、
３）ＣＦ３、
４）ニトロ、
５）アミノ、
６）シアノ、
７）Ｃ１−６アルキルアミノ、
８）ハロゲン、
９）ＯＲｃ、
１０）ＯＣＨ２ＲＣ、及び
１１）ＣＨ２ＯＲｃから構成される群から独立して選択され；
Ｒｃは
１）Ｃ６−１０アリール、
２）Ｒｓ、又は
３）Ｃ３−８シクロアルキルであり；
Ｒｋ、Ｒｍ、Ｒｎ及びＲｓは
１）Ｏ、ＳもしくはＮから構成される群から独立して選択される１、２、３、もしくは４個のヘテロ原子をもつ環原子数５、６もしくは７の安定な単環式ヘテロアリール環、又はＯ、ＳもしくはＮから構成される群から独立して選択される１、２、３、もしくは４個のヘテロ原子をもつ環原子数８、９、１０、もしくは１１の安定な二環式ヘテロアリール環、および
２）１、２、３、もしくは４個の環原子がＯ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子である環原子数３〜１０の安定な単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキル環系又は安定な飽和単環式もしくは二環式環系から構成される群から独立して選択される。］をもつ化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項２】
Ｙ１がＣＨＣＨであり、ＹがＣＨ（ＯＨ）である請求項１に記載の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項３】
Ａが（ＣＨ２）１−３であり、Ｗが結合又は（ＣＨ２）１−３である請求項２に記載の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項４】
１）Ｒ１がＣＯＯＨ又はテトラゾールであり、２）Ｒ２がフェニルであり、３）Ｒ３及びＲ４が水素及びハロゲンから構成される群から独立して選択されるか、又はＲ３及びＲ４はそれらが結合する炭素と一緒にシクロプロピル環を形成する請求項３に記載の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項５】
Ｑが
【化６】
2006505572.tif 000036
から構成される群から選択される請求項４に記載の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項６】
Ｑが
【化７】
2006505572.tif 000037
から構成される群から選択される請求項５に記載の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項７】
（１）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸、
（２）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）チエン−２−イル］プロピル｝ピロリジン−２−オン、
（３）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−チアゾール−２−カルボン酸、
（４）２−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−チアゾール−５−カルボン酸、
（５）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１，３−チアゾール−２−イル］プロピル｝ピロリジン−２−オン、
（６）２−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−チアゾール−４−カルボン酸、
（７）［５−（２−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝エチル）チエン−２−イル］酢酸、
（８）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛２−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）チエン−２−イル］エチル｝ピロリジン−２−オン、
（９）２−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−オキサゾール−５−カルボン酸、
（１０）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−３−（１−フェニルシクロプロピル）プロプ−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸、
（１１）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−３−（１−フェニルシクロプロピル）プロプ−１−エニル］−１−｛３−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）チエン−２−イル］プロピル｝ピロリジン−２−オン、
（１２）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３，４−チアジアゾール−２−カルボン酸、
（１３）４−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）安息香酸、
（１４）３−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）安息香酸、
（１５）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］プロピル｝ピロリジン−２−オン、
（１６）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］プロピル｝ピロリジン−２−オン、
（１７）３−［５−（｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝メチル）チエン−２−イル］プロパン酸、
（１８）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛５−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］チエン−２−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン、
（１９）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛４−［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）プロピル］チエン−３−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン、
（２０）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛４−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］チエン−２−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン、
（２１）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛４−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−１，３−チアゾール−２−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン、及び
（２２）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］ベンジル｝ピロリジン−２−オン、並びに、
医薬的に許容可能なその塩から構成される群から選択される請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
高眼圧症を治療、緑内障を治療、黄斑浮腫を治療、黄斑変性を治療、網膜及び視神経乳頭血流速度を増加、網膜及び視神経圧を増加、神経保護効果を提供又はドライアイを治療することにより眼圧上昇に関連する疾患を治療する方法であって、前記治療を必要とする患者に治療有効量の請求項１に記載の化合物、又は医薬的に許容可能なその塩を投与することを含む前記方法。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物又は医薬的に許容可能なその塩、および医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する局所組成物。
【請求項１０】
組成物がキサンタンガム又はゲランガムを含有する請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が溶液又は懸濁液である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
β−アドレナリン遮断薬、副交感神経興奮薬、Ｍａｘｉ−Ｋチャネル遮断薬、交感神経興奮薬、炭酸脱水酵素阻害剤、プロスタグランジン、降圧脂質、神経保護剤、及び５−ＨＴ２受容体アゴニストから構成される群から選択される活性成分を製剤に添加して患者に投与することを更に含む請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
β−アドレナリン遮断薬がチモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、又はレボブノロールであり、副交感神経興奮薬がピロカルピンであり、Ｍａｘｉ−Ｋチャネル遮断薬がペニトレムＡ、パスパリシン、カリブドトキシン、又はイベリオトキシンであり、交感神経興奮薬がエピネフリン、ブリモニジン、アイオピジン、クロニジン、又はパラアミノクロニジンであり、炭酸脱水酵素阻害剤がドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド又はブリンゾラミドであり、プロスタグランジンがラタノプロスト、トラボプラスト、ウノプロストン、レスキュラ又はＳ１０３３であり、降圧脂質がルミガンであり、神経保護剤がエリプロディル、Ｒ−エリプロディル又はメマンチンであり、５−ＨＴ２受容体アゴニストが１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−オールフマレート又は２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾール−１−イル）−１−メチル−エチルアミンである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
薬物療法に使用するための請求項１から７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、又は医薬的に許容可能なその塩。
【請求項１５】
眼圧上昇に関連する疾患の治療用医薬の製造における請求項１から７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、又は医薬的に許容可能なその塩の使用。
【請求項１６】
選択的ＥＰ４受容体アゴニストとしての請求項１から７のいずれか一項に記載の式Ｉの化合物、又は医薬的に許容可能なその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
緑内障は過度の眼圧上昇により眼の正常な機能が得られなくなる眼の変性疾患である。その結果、視神経乳頭が損傷し、視覚機能の不可逆的低下に至る恐れがある。治療しないと、緑内障は最終的に失明に至ることがある。高眼圧症、即ち視神経乳頭損傷又は特徴的緑内障視野欠損を伴わない眼圧上昇症状は現在では緑内障発病の最初期に過ぎないと大多数の眼科医に考えられている。
【０００２】
過去に緑内障の治療に使用されていた薬剤の多くは不十分であることが分かっている。初期の緑内障治療法はピロカルピンを使用していたが、局所副作用があるため、この薬剤は有益であるにも拘わらず、第一選択薬剤としては不十分である。より最近では、多くのβ−アドレナリンアンタゴニストが眼圧低下に有効であることが臨床医に認められている。これらの薬剤の多くはこの目的に有効であるが、患者によっては有効でなかったり、十分有効でない場合もある。これらの薬剤の多くは用量を増すと他の特徴（例えば膜安定化作用）も現われるため、慢性眼科用には許容できず、心血管作用を生じる場合もある。
【０００３】
炭酸脱水酵素阻害剤と呼ばれる薬剤は炭酸脱水酵素を阻害することにより房水形成を低下させる。このような炭酸脱水酵素阻害剤は全身及び局所経路により眼圧上昇を治療するために現在使用されているが、これらの薬剤を特に全身経路で使用する現在の治療はまだ副作用がある。局所的に有効な炭酸脱水酵素阻害剤は米国特許第４，３８６，０９８号；４，４１６，８９０号；４，４２６，３８８号；４，６６８，６９７号；４，８６３，９２２号；４，７９７，４１３号；５，３７８，７０３号；５，２４０，９２３号及び５，１５３，１９２号に開示されている。
【０００４】
プロスタグランジンとプロスタグランジン誘導体も眼圧を下げることが知られている。プロスタグランジンにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ及びＪ系列を含む数種のタイプがある（ＥＰ０５６１０７３Ａ１）。米国特許第４，８８３，８１９号（Ｂｉｔｏ）は眼圧低下におけるＰＧＡ、ＰＧＢ及びＰＧＣの使用と合成について記載している。米国特許第４，８２４，８５７号（Ｇｏｈら）は眼圧低下におけるＰＧＤ２とその誘導体（Ｃ−１０を窒素で置換した誘導体を含む）の使用と合成について記載している。米国特許第５，００１，１５３号（Ｕｅｎｏら）は眼圧を低下させるための１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトプロスタグランジンとプロスタグランジン誘導体の使用と合成について記載している。米国特許第４，５９９，３５３号は眼圧低下におけるエイコサノイド及びエイコサノイド誘導体（プロスタグランジン及びプロスタグランジン阻害剤を含む）の使用について記載している。ＷＯ００／３８６６７、ＷＯ９９／３２４４１、ＷＯ９９／０２１６５、ＷＯ００／３８６６３、ＷＯ０１／４６１４０、ＥＰ０８５５３８９、ＪＰ２０００−１４７２、米国特許第６，０４３，２７５号及びＷＯ００／３８６９０も参照。
【０００５】
プロスタグランジン及びプロスタグランジン誘導体はブドウ膜強膜流出量を増加することにより眼圧を下げることが知られている。Ｆ型及びＡ型両者のプロスタグランジンがこれに該当する。本発明はブドウ膜強膜流出経路とＥ系列プロスタグランジン（ＰＧＥ２）によりＩＯＰ低下を助長することができる他のメカニズムを介してＩＯＰを低下させる化合物に特に着目する。ＥＰ受容体の４種の公認サブタイプがＩＯＰを低下させる効果を調節すると考えられている（ＥＰ１，ＥＰ２，ＥＰ３及びＥＰ４；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｖｏｌ．１４，ｐａｇｅｓ  ８３−８７（１９９６））。Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，１，ｐａｇｅｓ  １３−１８（１９８８）；Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１１，３，ｐａｇｅｓ  ４４７−４５４（１９９５）；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ，Ｖｏｌ．６，ｐａｇｅｓ  ５４５−５５３（１９９３）；米国特許第５，６９８，５９８号及び５，４６２，９６８号並びにＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３１，１２，ｐａｇｅｓ  ２５６０−２５６７（１９９０）も参照。本発明はＥＰ４サブタイプ受容体のアゴニストである化合物に特に着目する。
【０００６】
眼圧を下げるためにプロスタグランジン又はその誘導体を使用する際の一つの問題はこれらの化合物が眼圧の初期増加を誘導することが多く、眼の色が変化し、眼の周囲の一部の組織が増殖する場合があることである。
【０００７】
以上のように、緑内障及び眼圧上昇の治療薬は現在数種のものがあるが、これらの薬剤の効力と副作用プロフィルは理想的ではない。従って、副作用が殆ど又は全くない有効な新規治療薬が依然として必要とされている。
【０００８】
ヒト及び他の哺乳動物では種々の疾患が異常又は過剰な骨量減少に関係がある。このような疾患としては限定されないが、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、骨代謝回転異常亢進、歯周病、歯欠損、骨折、リウマチ様関節炎、人工器官周囲の骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、及び多発性骨髄腫が挙げられる。これらの疾患のうちで最も一般的なものの１つは骨粗鬆症であり、閉経後の女性に最も多発する。骨粗鬆症は低骨量と骨組織の微小構造変質を特徴とし、その結果として骨が脆くなり、骨折し易くなる全身性骨格疾患である。骨粗鬆症による骨折は高齢者の罹患率と死亡率の主要原因である。骨粗鬆症による骨折は女性の５０％と男性の３分の１に及ぶ。高齢者の多くは骨密度が低下しており、骨折の危険が大きい。骨粗鬆症及び骨吸収に関連する他の疾患は予防と治療の両面が大いに必要とされている。骨粗鬆症及び骨量低下に関連する他の疾患は一般に慢性症状であるため、適切な療法は一般に慢性治療が必要であると考えられる。
【０００９】
骨形成及び吸収プロセスには骨芽細胞及び破骨細胞と呼ばれる２種類の細胞が夫々関与している。参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＨ．Ｆｌｅｉｓｃｈ，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  Ｉｎ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｒｏｍ  Ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｐａｔｉｅｎｔ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｈｅｎｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９７）参照。
【００１０】
骨芽細胞は骨表面に位置する細胞である。これらの細胞から有機性骨基質が分泌され、その後、石灰化する。フッ化物、副甲状腺ホルモン、及び所定のサイトカイン（例えばプロスタグランジン）等の物質が骨芽細胞に刺激作用を与えることが知られている。しかし、現在の研究の目的は骨芽細胞の骨形成活性を選択的に増加又は刺激する治療薬を開発することである。
【００１１】
破骨細胞は通常は皮質骨もしくは小柱骨の表面又は皮質骨の内側に位置する大型の多核細胞である。破骨細胞は細胞と骨の間に配置された閉鎖密閉微小環境内に骨を吸収する。破骨細胞の動員と活性は一連のサイトカインとホルモンにより誘導されることが知られている。ビスホスホネートは破骨細胞骨吸収の選択的阻害剤であるため、異常骨吸収に起因又は関連する種々の全身又は局所骨疾患の治療又は予防に重要な治療薬であることもよく知られている。しかし、ビスホスホネートは有用であるが、破骨細胞の骨吸収活性を阻害する他の治療薬を開発することも研究者に望まれている。
【００１２】
ＰＧＥ２系列等のプロスタグランジンはヒトを含む哺乳動物で骨形成を刺激し、骨量を増加することが知られている。ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、及びＥＰ４と呼ばれる４種の異なる受容体サブタイプが骨芽細胞と破骨細胞の骨モデリング及びリモデリングプロセスを媒介すると考えられている。骨における主要プロスタグランジン受容体はＥＰ４であり、サイクリックＡＭＰによるシグナリングによりその効果を発揮すると考えられている。
【００１３】
本発明では、更に式ＩのＥＰ４サブタイプ受容体のアゴニストが骨形成の刺激に有用であることが判明した。
【００１４】
ＷＯ０２／２４６４７、ＷＯ０２／４２２６８、ＥＰ１１３２０８６、ＥＰ８５５３８９、ＥＰ１１１４８１６、ＷＯ０１／４６１４０及びＷＯ０１／７２２６８はＥＰ４アゴニストを開示している。
【発明の開示】
【００１５】
（発明の要約）
本発明はプロスタグランジンＥ２受容体のＥＰ４サブタイプの強力な選択的アゴニスト、その製剤、並びに緑内障及び患者の眼の眼圧上昇に関連する他の症状の治療におけるその使用に関する。本発明は哺乳動物種、特にヒトの眼に神経保護効果を提供するための前記化合物の使用にも関する。本発明は更に骨芽細胞及び破骨細胞の骨モデリング及びリモデリングプロセスを媒介するための前記化合物の使用に関する。
【００１６】
特に、本発明は構造式Ｉ：
【００１７】
【化８】
2006505572.tif 000003
［式中、Ｙ１は
１）ＣＨ２ＣＨ２、
２）ＣＨＣＨ、又は
３）
【００１８】
【化９】
2006505572.tif 000004
であり；
ＹはＣ（Ｏ）又はＣＨ（ＯＨ）であり；
Ａは（ＣＨ２）ｎであり；
ｎは１、２、３、又は４であり；
Ｗは結合、非置換Ｃ１−６アルキレン、又は１、２、３、もしくは４個のハロゲン原子で置換されたＣ１−６アルキレンであり；
Ｚは
１）Ｏ、
２）Ｓ、
３）
【００１９】
【化１０】
2006505572.tif 000005
４）ＨＣ＝ＣＨ、
５）Ｃ≡Ｃ、又は
６）結合であり；
Ｑはジ置換アリール又はヘテロアリール環であり、環の１個の環原子は部分：
【００２０】
【化１１】
2006505572.tif 000006
に結合しており、別の環原子は部分：
【００２１】
【化１２】
2006505572.tif 000007
に結合しており；
Ｒ１は
ＣＯＲ５、
ＯＨ、
ＣＮ、
（ＣＨ２）１−３ＣＯ２Ｒ６、
Ｃ（Ｏ）ＮＨＳＯ２Ｒ８、
ＳＯ２Ｒ７、
（ＣＨ２）０−４ＳＯ３Ｒ６、
ＣＦ２ＳＯ２ＮＨ２、
ＳＯ２ＮＨ２、
ＳＯ２ＮＨＣＯＲ８、
ＰＯ（ＯＲ７）２、
Ｃ１−４アルコキシ、
ヒドロキシメチルケトン、又は
（ＣＨ２）０−４Ｒｋであり、ここでＲｋは置換されていないか又は１〜３個のＲａ基で置換されており；
Ｒ２は
１）Ｃ１−６アルキル、
２）（ＣＨ２）０−８Ｃ６−１０アリール、
３）（ＣＨ２）０−８Ｒｍ、
４）（ＣＨ２）０−８Ｃ３−８シクロアルキル、
５）Ｏ−Ｃ１−１０アルキル、
６）Ｏ−Ｃ６−１０アリール、
７）Ｏ−Ｒｍ、
８）Ｏ−Ｃ３−１０シクロアルキルであり、ここでアリール、Ｒｍ、及びシクロアルキルは置換されていないか又は１〜３個のＲｂ基で置換されており；
Ｒ３及びＲ４は
１）ハロゲン、及び
２）Ｃ１−６アルキルから構成される群から独立して選択されるか、又は
Ｒ３及びＲ４はそれらが結合する炭素原子と一緒にＣ３−７シクロアルキル環を形成し；
Ｒ５は
１）水素、
２）ＯＨ、
３）ＣＨ２ＯＨ、
４）Ｃ１−６アルコキシ、
５）ＮＨＰＯ２Ｒ６、
６）ＮＨＲ９、
７）ＮＨＳＯ２Ｒ８、又は
８）ＮＲ６Ｒ７はであり；
Ｒ６及びＲ７は水素、Ｃ１−６アルキル、及びＣ３−８シクロアルキルから構成される群から独立して選択され；
Ｒ８は水素、Ｃ６−１０アリール、Ｒｎ、及びＣ１−４アルキルから構成される群から選択され；
Ｒ９はＣ（Ｏ）Ｒ１０又はＳＯ２Ｒ１０であり；
Ｒ１０は水素、Ｃ６−１０アリール、又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒａ及びＲｂは
１）Ｃ１−６アルコキシ、
２）置換されていないか又は
ａ）Ｃ１−６アルコキシ、
ｂ）Ｃ１−６アルキルチオ、
ｃ）ＣＮ、
ｄ）ＯＨ、もしくは
ｅ）ＣＦ３
で置換されたＣ１−６アルキル、
３）ＣＦ３、
４）ニトロ、
５）アミノ、
６）シアノ、
７）Ｃ１−６アルキルアミノ、
８）ハロゲン、
９）ＯＲｃ、
１０）ＯＣＨ２ＲＣ、及び
１１）ＣＨ２ＯＲｃから構成される群から独立して選択され；
Ｒｃは
１）Ｃ６−１０アリール、
２）Ｒｓ、又は
３）Ｃ３−８シクロアルキルであり；
Ｒｋ、Ｒｍ、Ｒｎ及びＲｓは
１）Ｏ、ＳもしくはＮから構成される群から独立して選択される１、２、３、もしくは４個のヘテロ原子をもつ環原子数５、６もしくは７の安定な単環式ヘテロアリール環、又はＯ、ＳもしくはＮから構成される群から独立して選択される１、２、３、もしくは４個のヘテロ原子をもつ環原子数８、９、１０、もしくは１１の安定な二環式ヘテロアリール環、および
２）１、２、３、もしくは４個の環原子がＯ、Ｓ及びＮから選択されるヘテロ原子である環原子数３〜１０の安定な単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキル環系又は安定な飽和単環式もしくは二環式環系から構成される群から独立して選択される。］をもつ新規ＥＰ４アゴニスト、又は医薬的に許容可能なその塩に関する。
【００２２】
本発明の化合物はキラル中心をもつことができ、ラセミ化合物、ラセミ混合物及び個々のジアステレオマー、又はエナンチオマーとして存在することができ、全異性形が本発明に含まれる。本発明の化合物は多形結晶形でもよく、全多形結晶形が本発明に含まれる。本発明の化合物は互変異性形でもよく、全互変異性形が本発明に含まれる。
【００２３】
本発明は上記化合物のプロドラッグ形も含む。活性薬剤のエステル誘導体等のプロドラッグは、温血動物の血流に吸収されると分解して薬剤形を放出し、改善された治療効果を薬剤に発揮させる化合物誘導体である。プロドラッグはアンタゴニストの通常投与量よりも少量を投与すればよい。プロドラッグは経口投与することができる。プロドラッグは胃腸系を通過する間に構造的完全性を維持し、細胞に有効に送達される。プロドラッグは代謝反応により活性酸を形成した後、血小板受容体部位と相互作用する。
【００２４】
本発明の上記及び他の側面は本発明全体を精査することにより理解されよう。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明の化合物及び医薬的に許容可能なその塩の１クラスでは、Ｙ１はＣＨＣＨであり、ＹはＣＨ（ＯＨ）である。
【００２６】
このクラスのサブクラスでは、Ａは（ＣＨ２）１−３であり、Ｗは結合又は（ＣＨ２）１−３である。
【００２７】
このサブクラスの１グループでは、１）Ｒ１はＣＯＯＨ又はテトラゾールであり、２）Ｒ２はフェニルであり、３）Ｒ３及びＲ４はハロゲンであるか、又はＲ３及びＲ４はそれらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル環を形成する。
【００２８】
このグループのサブグループでは、Ｑは
【００２９】
【化１３】
2006505572.tif 000008
から構成される群から選択される。
【００３０】
このサブグループの１ファミリーでは、Ｑは
【００３１】
【化１４】
2006505572.tif 000009
から構成される群から選択される。
【００３２】
上記ファミリーの構造において、
【００３３】
【化１５】
2006505572.tif 000010
はＱにおいて上記に定義した変数Ｚ及びＷが結合している原子を表す。
【００３４】
上記サブグループの例を以下に挙げる。
【００３５】
【化１６】
2006505572.tif 000011
2006505572.tif 000012
（１）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
（２）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）チエン−２−イル］プロピル｝ピロリジン−２−オン
（３）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−チアゾール−２−カルボン酸
（４）２−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−チアゾール−５−カルボン酸
（５）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−１，３−チアゾール−２−イル］プロピル｝ピロリジン−２−オン
（６）２−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−チアゾール−４−カルボン酸
（７）［５−（２−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝エチル）チエン−２−イル］酢酸
（８）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛２−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）チエン−２−イル］エチル｝ピロリジン−２−オン
（９）２−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３−オキサゾール−５−カルボン酸
（１０）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−３−（１−フェニルシクロプロピル）プロプ−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸
（１１）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−３−ヒドロキシ−３−（１−フェニルシクロプロピル）プロプ−１−エニル］−１−｛３−［５−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）チエン−２−イル］プロピル｝ピロリジン−２−オン
（１２）５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）−１，３，４−チアジアゾール−２−カルボン酸
（１３）４−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）安息香酸
（１４）３−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）安息香酸
（１５）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］プロピル｝ピロリジン−２−オン
（１６）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル］プロピル｝ピロリジン−２−オン
（１７）３−［５−（｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝メチル）チエン−２−イル］プロパン酸
（１８）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛５−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］チエン−２−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン
（１９）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛４−［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）プロピル］チエン−３−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン
（２０）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛４−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］チエン−２−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン
（２１）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（｛４−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］−１，３−チアゾール−２−イル｝メチル）ピロリジン−２−オン
（２２）（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−｛３−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］ベンジル｝ピロリジン−２−オン。
【００３６】
以下、特に指定しない限り、以下に定義する用語を使用して本発明を詳細に説明する。
【００３７】
本明細書で使用する「治療有効量」なる用語は所望治療レジメンに従って投与した場合に所望治療効果もしくは応答を誘発するか又は所望効果を提供する本発明の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニスト、又は他の活性剤の量を意味する。異常骨吸収の治療に関する好ましい治療有効量は骨形成を刺激する量である。同様に、高眼圧症又は緑内障の治療に関する好ましい治療有効量は眼圧を低下及び／又は高眼圧症及び／又は緑内障を治療するために有効な量である。
【００３８】
本明細書で使用する「医薬的に許容可能」なる用語は毒性又は安全性の観点からヒトを含む哺乳動物に投与するのに一般に適していることを意味する。
【００３９】
「プロドラッグ」なる用語は投与及び吸収後に所定代謝プロセスを介して本発明の薬剤をｉｎ  ｖｉｖｏ放出する薬剤前駆体である化合物を意味する。本発明の化合物のプロドラッグの非限定的な１例は酸官能基が患者に投与後に容易に加水分解されるような構造をもつピロリジノン基の酸である。代表的なプロドラッグとしては遊離ＣＨ２ＣＯＯＨ基（場合により、例えば−ＣＨ２ＣＯＯ−Ｎａ＋等の医薬的に許容可能な塩の形態でもよい）が一般に環系、好ましくは芳香族又は複素環式芳香族環系に結合した非麻酔性鎮痛剤／非ステロイド系抗炎症薬である酢酸誘導体が挙げられる。
【００４０】
「アルキル」なる用語は特に指定しない限り、１価アルカン（炭化水素）から誘導される基を意味し、特に指定しない限り、炭素原子数１〜１０である。直鎖、分枝鎖又は環式のいずれでもよい。好ましいアルキル基としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルが挙げられる。アルキル基がアルキル基で置換されていると言う場合には、「分枝鎖アルキル基」と同義に使用する。対応する２価基を「アルキレン」基と言い、例えばメチレン、エチレン等が挙げられる。
【００４１】
エチニレン（例えば−ＣＨ＝ＣＨ−）等のアルケニレンを含む変数は特に指定しない限り、「ＣＨＣＨ」により表される。
【００４２】
「アルコキシ」なる用語はＣ１−Ｃ６アルキル−Ｏ−を意味し、アルキル基は場合により本明細書に記載するように置換されている。アルコキシ基の例はメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ及びその異性基である。
【００４３】
「ハロゲン」又は「ハロ」なる用語は塩素、フッ素、ヨウ素又は臭素を意味する。
【００４４】
「アリール」なる用語は芳香族環を意味し、例えば、フェニル、置換フェニル等と縮合環（例えば、ナフチル、フェナントリル等）が挙げられる。従って、アリール基は少なくとも６個の原子をもつ少なくとも１個の環を含み、このような環が５個まで存在し、２２個までの原子を環に含み、隣接炭素原子又は適切なヘテロ原子間に交互（共振）二重結合をもつ。好ましいアリール基はフェニル、ナフチル及びフェナントリルである。特に指定しない限り、アリール環は置換されていなくてもよいし、−ＣＦ３、−ＣＮ、Ｃ１−４アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）、−ＮＯ２、−ＮＲｄＲｆ、−ＳＯ２Ｒｄ、ＳＯ２ＮＲｄＲｆ、−ＣＯＮＲｄＲｆ又はＣＯＲｄの１種以上で置換されていてもよく、Ｒｄ及びＲｆは水素及びＣ１−４アルキルから独立して選択される。好ましい置換アリールとしてはフェニルとナフチルが挙げられる。
【００４５】
「ヘテロシクロアルキル」なる用語は特に指定しない限り、環原子数３〜１０の安定な飽和単環式又は二環式環系を意味し、２〜６個の環原子は炭素原子であり、１〜４個の環原子はＯ、Ｓ又はＮから選択されるヘテロ原子である。特に指定しない限り、シクロアルキル環は置換されていなくてもよいし、Ｃ１−４アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、及びハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）の１種以上で置換されていてもよい。
【００４６】
「シクロアルキル」なる用語は特に指定しない限り、指定炭素原子数の環式アルキル基（非芳香族）を意味し、例えば、Ｃ３−７シクロアルキルは炭素原子数３、４、５、６、又は７である。特に指定しない限り、シクロアルキル環は置換されていなくてもよいし、Ｃ１−４アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、及びハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）の１種以上で置換されていてもよい。例としてはシクロプロピル、シクロブチル、及びシクロペンチルが挙げられる。
【００４７】
「ヘテロ原子」なる用語は独立して選択されるＯ、Ｓ又はＮを意味する。
【００４８】
「ヘテロアリール」なる用語は特に指定しない限り、Ｏ、Ｓ又はＮから構成される群から独立して選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含み、炭素又は窒素原子が結合点である環原子数５、６もしくは７の不飽和単環式芳香族炭化水素基、又は環原子数８、９、１０、もしくは１１の不飽和二環式芳香族基を意味する。この種の例は、ピロール、ピリジン、オキサゾール、チアゾール、テトラゾール、及びオキサジンである。特に指定しない限り、ヘテロアリール環は置換されていなくてもよいし、Ｃ１−４アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、アミノ、及びハロゲン（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）の１種以上で置換されていてもよい。本発明の目的では、テトラゾールは全互変異性形を含む。第１の窒素及び酸素又は硫黄と共に付加窒素原子が存在していてもよい（例えば、チアジアゾール）。
【００４９】
二環式ヘテロアリール環としては、一方又は両方の環がヘテロ原子を含む二環式環系が挙げられる。限定するものではないが、この用語は一方の環が１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含み、他方の環がベンゼン環である系を含む。
【００５０】
二環式ヘテロシクロアルキル環としては、一方又は両方の環がヘテロ原子を含む二環式環系が挙げられる。限定するものではないが、この用語は一方の環が１、２、３、又は４個のヘテロ原子を含み、他方の環がヘテロ原子を含まない系を含む。
【００５１】
ヘテロシクロアルキル又はヘテロアリール環は任意ヘテロ原子又は炭素原子に結合し、安定な構造を形成することができる。このような環の例としては限定されないが、アゼピニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾキサゾリル、クロマニル、シンノリニル、ジヒドロベンゾフリル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾチオピラニル、ジヒドロベンゾチオピラニルスルホン、１，３−ジオキソラニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、イソクロマニル、イソインドリニル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、キノキサリニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシド、チアゾリル、チアゾリニル、チエノフリル、チエノチエニル、チエニル、及びトリアゾリルが挙げられる。
【００５２】
「ジ置換アリール又はヘテロアリール環」なる用語は２個の環炭素原子に置換基が結合しており、水素原子が結合していないアリール及びヘテロアリール環を意味し、例えば２，５−置換チオフェン、フラン、及びチアゾールや、１，２−、１，３−及び１，４−置換ベンゼンが挙げられる。このようなジ置換環としては限定されないが、下記構造のものが挙げられる。
【００５３】
【化１７】
2006505572.tif 000013
【００５４】
１好適態様では、ジ置換アリール環は、
【００５５】
【化１８】
2006505572.tif 000014
である。
【００５６】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００５７】
【化１９】
2006505572.tif 000015
である。
【００５８】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００５９】
【化２０】
2006505572.tif 000016
である。
【００６０】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００６１】
【化２１】
2006505572.tif 000017
である。
【００６２】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００６３】
【化２２】
2006505572.tif 000018
である。
【００６４】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００６５】
【化２３】
2006505572.tif 000019
である。
【００６６】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００６７】
【化２４】
2006505572.tif 000020
である。
【００６８】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００６９】
【化２５】
2006505572.tif 000021
である。
【００７０】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００７１】
【化２６】
2006505572.tif 000022
である。
【００７２】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００７３】
【化２７】
2006505572.tif 000023
である。
【００７４】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００７５】
【化２８】
2006505572.tif 000024
である。
【００７６】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００７７】
【化２９】
2006505572.tif 000025
である。
【００７８】
別の好適態様では、ジ置換ヘテロアリール環は、
【００７９】
【化３０】
2006505572.tif 000026
である。
【００８０】
Ｑが下式：
【００８１】
【化３１】
2006505572.tif 000027
に示すような置換ヘテロアリール環を含むと定義する場合には、「（Ｚ）」及び「（Ｗ）」は変数「Ｚ」及び「Ｗ」を表し、Ｑにおいてこれらの変数が結合している原子を明示する。
【００８２】
本明細書で使用する「置換」なる用語は指定原子上の１個以上の任意水素が指定原子の通常の原子価を越えない範囲で指定基から選択された基で置換されており、置換の結果として安定な化合物を形成していることを意味する。置換基がケト（即ち＝Ｏ）である場合には、原子上の２個の水素が置換されている。
【００８３】
本明細書で使用する「アゴニスト」なる用語は式ＩのＥＰ４サブタイプ化合物がＥＰ４受容体と相互作用し、天然アゴニストＰＧＥ２に比較して最大、最大以上又は最大以下の効果を生じることを意味する。Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６，ｃｈａｐｔｅｒ  ２参照。
【００８４】
本発明の別の態様は式ＩのＥＰ４アゴニストと場合により医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する組成物に関する。
【００８５】
本発明の更に別の態様は式ＩのＥＰ４アゴニストと場合により医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する組成物の投与、好ましくは局所又は洞内投与により眼圧上昇を低下又は緑内障を治療するための方法に関する。眼圧上昇又は緑内障又はその併発症の治療用医薬の製造のための式Ｉの化合物の使用も本発明に含まれる。
【００８６】
本発明は更に式Ｉの化合物を含有する医薬組成物の製造方法に関する。
【００８７】
本発明は更に式Ｉの化合物と医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する医薬組成物の製造方法に関する。
【００８８】
本発明の化合物はＰＧＥ２受容体、特にＥＰ４サブタイプ受容体と強く結合してこれに作用するため、緑内障と高眼圧症の予防及び／又は治療に有用である。
【００８９】
ドライアイは数百万人が罹患している一般眼表面疾患である。ドライアイは多数の無関係の病因に起因すると思われるが、共通の結果として涙液膜が破れ、眼の外側露出表面から水分が蒸発する。（Ｌｅｍｐ，Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  Ｄｒｙ  Ｅｙｅｓ，Ｔｈｅ  ＣＬＡＯ  Ｊｏｕｒｎｅｌ，２１（４）：２２１−２３１（１９９５））。眼の表面はムチンにより保護され、潤滑にされているが、結膜細胞及び／又は角膜上皮細胞によるムチン産生の低下がドライアイの原因の１つである（Ｇｉｐｓｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎａｔｏｍｉ，Ｍｕｃｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｏｃｕｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：８１−９８（１９９７））。ヒト結膜上皮細胞で機能的ＥＰ４受容体が発見されており（参照によりその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第６，３４４，４７７号参照）、ヒト角膜上皮細胞（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：８１−９８（１９９７））及び結膜細胞（Ｄａｒｔｔら  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｒｖｅｓ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：９９３−１０００（１９９５））のどちらもムチンを分泌できることが認められている。従って、式Ｉの化合物はドライアイの治療に有用である。
【００９０】
黄斑浮腫は眼の後極の非常に重要な中心視覚野における網膜内の腫脹である。網膜内に液が溜まると、神経成分が相互に分離すると共に局所血液供給源から分離し、その領域の視覚機能が休止する傾向がある。ＩＯＰを低下させるＥＰ４アゴニストは黄斑浮腫又は黄斑変性等の黄斑疾患の治療に有用であると考えられる。従って、本発明の別の側面は黄斑浮腫又は黄斑変性の治療方法である。
【００９１】
緑内障は視神経の進行性萎縮であり、眼圧（ＩＯＰ）上昇に関連していることが多い。しかし、神経保護効果をもつ薬剤を使用することにより必ずしもＩＯＰを悪化させずに緑内障を治療することが可能である。Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｏｌ．１１２，Ｊａｎ  １９９４，ｐｐ．３７−４４；Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ．＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２，５，Ａｐｒｉｌ  １９９１，ｐｐ．１５９３−９９参照。ＩＯＰを低下させるＥＰ４アゴニストは神経保護効果を提供するのに有用であると考えられる。また、これらのアゴニストはＩＯＰを低下させることにより網膜及び視神経乳頭血流速度を増加し、網膜及び視神経酸素量を増加させるためにも有用であると考えられ、総合的に視神経健康に有益である。従って、本発明は式ＩのＥＰ４アゴニストを使用することにより網膜及び視神経乳頭血流速度を増加するため、又は網膜及び視神経酸素圧を増加するため、又は神経保護効果を提供するため、又はその組み合わせ効果を提供するための方法にも関する。
【００９２】
本発明で製造される化合物は医薬的に許容可能な適切な公知賦形剤と容易に配合し、有効なＩＯＰ低下を達成するためにヒトを含む哺乳動物に投与可能な組成物とすることができる。従って、本発明は治療を必要とする患者に式Ｉの化合物の１種を単独又はβ−アドレナリン遮断薬（例えばチモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール）、副交感神経興奮薬（例えばピロカルピン）、交感神経興奮薬（例えばエピネフリン、アイオピジン、ブリモニジン、クロニジン、パラアミノクロニジン）、炭酸脱水酵素阻害剤（例えばドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド又はブリンゾラミド）；プロスタグランジン（例えばラタノプロスト、トラボプラスト、ウノプロストン、レスキュラ、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号；５，２９６，５０４号；５，４２２，３６８号；及び５，１５１，４４４号に記載されている化合物））；降圧脂質（例えばルミガン及び米国特許第５，３５２，７０８号に記載されている化合物）；米国特許第４，６９０，９３１号に開示されている神経保護剤、特にＷＯ９４／１３２７５に記載されているようなエリプロディル及びＲ−エリプロディル（メマンチンを含む）；又はＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されているような５−ＨＴ２受容体のアゴニスト、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−オールフマレート及び２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾール−１−イル）−１−メチル−エチルアミンと併用投与することによる高眼圧症又は緑内障の治療方法に関する。
【００９３】
本発明は更に治療を必要とする患者に式Ｉの化合物の１種を単独又はβ−アドレナリン遮断薬（例えばチモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール）、副交感神経興奮薬（例えばピロカルピン）、交感神経興奮薬（例えばエピネフリン、アイオピジン、ブリモニジン、クロニジン、パラアミノクロニジン）、炭酸脱水酵素阻害剤（例えばドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド又はブリンゾラミド）；プロスタグランジン（例えばラタノプロスト、トラボプラスト、ウノプロストン、レスキュラ、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号；５，２９６，５０４号；５，４２２，３６８号；及び５，１５１，４４４号に記載されている化合物））；降圧脂質（例えばルミガン及び米国特許第５，３５２，７０８号に記載されている化合物）；米国特許第４，６９０，９３１号に開示されている神経保護剤、特にＷＯ９４／１３２７５に記載されているようなエリプロディル及びＲ−エリプロディル（メマンチンを含む）；又はＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されているような５−ＨＴ２受容体のアゴニスト、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−オールフマレート及び２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾール−１−イル）−１−メチル−エチルアミンと併用投与することにより、網膜及び視神経乳頭血流速度を増加するため、又は網膜及び視神経酸素圧を増加するため、又は神経保護効果を提供するため又はその組み合わせ効果を提供するための方法に関する。網膜及び視神経乳頭血流速度を増加するため、又は網膜及び視神経酸素圧を増加するため、又は神経保護効果を提供するため又はその組み合わせ効果を提供するための医薬の製造における式Ｉの化合物の使用も本発明に含まれる。
【００９４】
本発明は更に治療を必要とする患者に式Ｉの化合物の１種を単独又はβ−アドレナリン遮断薬（例えばチモロール、ベタキソロール、レボベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール）、副交感神経興奮薬（例えばピロカルピン）、交感神経興奮薬（例えばエピネフリン、アイオピジン、ブリモニジン、クロニジン、パラアミノクロニジン）、炭酸脱水酵素阻害剤（例えばドルゾラミド、アセタゾラミド、メタゾラミド又はブリンゾラミド）；プロスタグランジン（例えばラタノプロスト、トラボプラスト、ウノプロストン、レスキュラ、Ｓ１０３３（米国特許第５，８８９，０５２号；５，２９６，５０４号；５，４２２，３６８号；及び５，１５１，４４４号に記載されている化合物））；降圧脂質（例えばルミガン及び米国特許第５，３５２，７０８号に記載されている化合物）；米国特許第４，６９０，９３１号に開示されている神経保護剤、特にＷＯ９４／１３２７５に記載されているようなエリプロディル及びＲ−エリプロディル（メマンチンを含む）；Ｍａｘｉ−Ｋチャネル遮断薬（例えばペニトレムＡ、パスパリシン、カリブドトキシン、イベリオトキシン又はいずれも参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＵＳＳＮ６０／３８９，２０５（出願日２００２年６月１７日、代理人整理番号２１１２１ＰＶ）、６０／３８９，２２２（出願日２００２年６月１７日、代理人整理番号２１０９２ＰＶ）、６０／４５８，９８１（出願日２００３年３月２７日、代理人整理番号２１１０１ＰＶ４）、６０／４２４７９０（出願日２００２年１１月８日、代理人整理番号２１２６０ＰＶ）、６０／４２４８０８（出願日２００２年１１月８日、代理人整理番号２１２８１ＰＶ）、０９／７６５７１６（出願日２００１年１月１７日）、０９／７６４７３８（出願日２００１年１月１７日）並びにＰＣＴ公開ＷＯ０２／０７７１６８及びＷＯ０２／０２０６０８６３に開示されているもの）；又はＰＣＴ／ＵＳ００／３１２４７に記載されているような５−ＨＴ２受容体のアゴニスト、特に１−（２−アミノプロピル）−３−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−オールフマレート及び２−（３−クロロ−６−メトキシ−インダゾール−１−イル）−１−メチル−エチルアミンと併用投与することにより、黄斑浮腫又は黄斑変性を治療するための方法に関する。黄斑浮腫又は黄斑変性用医薬の製造における式Ｉの化合物の使用も本発明に含まれる。
【００９５】
本発明の化合物は神経障害性疼痛の治療にも使用することができる。神経障害性疼痛症候群は神経損傷後に発病し、元の損傷が治癒した後も数カ月又は数年間にわたって疼痛が続くこともある。神経損傷は末梢神経、後根、脊髄又は脳の所定領域に発生する可能性がある。神経障害性疼痛症候群は疼痛を誘発する疾患又はイベントに従って伝統的に分類されている。神経障害性疼痛症候群としては糖尿病性神経症；座骨神経痛；非特異的腰痛；多発性硬化症疼痛；線維筋肉痛；ＨＩＶ関連神経症、ヘルペス後神経痛；三叉神経痛；及び物理的外傷、切断、癌、毒素又は慢性炎症症状に起因する疼痛が挙げられる。これらの症状は治療が困難であり、数種の薬剤が制限された効力をもつことは知られているが、完全な疼痛抑制が達成されることは稀である。神経障害性疼痛の症状は驚くほど多様であり、自然衝撃及び電撃痛、又は持続灼熱痛などと表現されることが多い。更に、「チクチクする感じ」（知覚異常及び知覚不全）、非毒性刺激に対する過敏症（熱、冷温、機械的痛覚過敏）、刺激の除去後の持続疼痛感覚（痛覚過敏）又は選択感覚経路の欠失もしくは欠損（痛覚鈍麻）等の通常無痛感覚に関連する疼痛もある。
【００９６】
本発明の化合物は急性腎不全、慢性腎不全、結腸癌、大腸炎、及びＨＩＶ潜伏の治療にも使用することができる。
【００９７】
本発明で使用されるＥＰ４アゴニストは治療有効量を静脈内、皮下、局所、経皮、非経口、又は当業者の公知の他の任意方法により投与することができる。眼科用医薬組成物は溶液、懸濁液、軟膏、クリーム又は固体インサートとして眼に局所投与できるように製造することが好ましい。この化合物の眼科用製剤は０．００１〜５％、特に０．００１〜０．１％の医薬を含有することができる。眼圧低下、緑内障治療、血流速度又は酸素圧増加に有効な用量であるならば、例えば約１０％以上の高用量を使用することもできる。単独投与では、０．００１〜５．０ｍｇ、好ましくは０．００５〜２．０ｍｇ、特に０．００５〜１．０ｍｇの化合物をヒトの眼に投与することができる。
【００９８】
化合物を含有する医薬製剤は非毒性医薬有機キャリヤー、又は非毒性医薬無機キャリヤーと配合すると使用し易い。典型的な医薬的に許容可能なキャリヤーは例えば水、水と水混和性溶媒（例えばアルカノール又はアラルカノール、植物油、落花生油、ポリアルキレングリコール、石油系ゼリー、エチルセルロース、オレイン酸エチル、カルボキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドン、ミリスチン酸イソプロピル及び他の許容可能な慣用キャリヤー）の混合物である。医薬製剤は更に乳化剤、防腐剤、湿潤剤、結合剤（例えば、ポリエチレングリコール２００、３００、４００及び６００、カーボワックス１，０００、１，５００、４，０００、６，０００及び１０，０００）、抗細菌成分（例えば第四級アンモニウム化合物、低温殺菌性をもつことが知られており、使用に無害なフェニル水銀塩、チメロサール、メチル及びプロピルパラベン、ベンジルアルコール、フェニルエタノール）、緩衝成分（例えば硼酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グルコン酸緩衝液）及び他の慣用成分（例えばモノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、オレイン酸塩、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、スルホ琥珀酸ジオクチルナトリウム、モノチオグリセロール、チオソルビトール、エチレンジアミン四酢酸等）等の非毒性助剤も添加することができる。更に、本発明の目的には慣用リン酸緩衝液ビークルシステム、等張硼酸ビークル、等張塩化ナトリウムビークル、等張硼酸ナトリウムビークル等の適切な眼科用ビークルをキャリヤー媒体として使用することができる。医薬製剤は微粒子製剤の形態でもよい。医薬製剤は固体インサートの形態でもよい。例えば、固体水溶性ポリマーを医薬用キャリヤーとして使用することができる。インサートを形成するために使用されるポリマーは任意水溶性非毒性ポリマーとすることができ、例えば、セルロース誘導体（例えばメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、（ヒドロキシ低級アルキルセルロース）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；アクリレート（例えばポリアクリル酸塩、エチルアクリレート、ポリアクリルアミド）；天然物質（例えばゼラチン、アルギン酸塩、ペクチン、トラガカントガム、カラヤガム、コンドラス、寒天、アラビアガム）；澱粉誘導体（例えば酢酸澱粉、ヒドロキシメチル澱粉エーテル、ヒドロキシプロピル澱粉）、並びに他の合成誘導体（例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキシド、中和カルボポール及びキサンタンガム、ゲランガム、及び前記ポリマーの混合物）とすることができる。
【００９９】
本発明の製剤を投与するのに適した対象としては霊長類、ヒト及び他の動物、特にヒトと家畜（例えばネコ、ウサギ及びイヌ）が挙げられる。
【０１００】
医薬製剤は使用に無害な抗細菌成分（例えばチメロサール、塩化ベンズアルコニウム、メチル及びプロピルパラベン、臭化ベンジルドデシニウム、ベンジルアルコール、又はフェニルエタノール）；緩衝成分（例えば塩化ナトリウム、硼酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸緩衝液）；及び他の慣用成分（例えばモノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、エチレンジアミン四酢酸等）等の非毒性助剤を添加することができる。
【０１０１】
眼科用溶液又は懸濁液は眼内に許容可能なＩＯＰレベルを維持するために必要な頻度で投与することができる。哺乳動物の眼には１日１〜３回投与することが予想される。
【０１０２】
局所眼内投与には、本発明の新規製剤は溶液、ジェル、軟膏、懸濁液又は固体インサートの形態とすることができ、単位用量が治療有効量の活性成分又は併用療法の場合には所定の複数成分を含むように製剤化される。
【０１０３】
本発明の化合物は骨芽細胞と破骨細胞の骨モデリング及びリモデリングプロセスを媒介するためにも有用である。参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＰＣＴ  ＵＳ９９／２３７５７（出願日１９９９年１０月１２日）参照。骨における主要プロスタグランジン受容体はＥＰ４であり、サイクリックＡＭＰを介するシグナリングによりその効果を発揮すると考えられている。参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＩｋｅｄａ  Ｔ，Ｍｉｙａｕｒａ  Ｃ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ａ，Ｎａｒｕｍｉｙａ  Ｓ，Ｙｏｓｈｉｋｉ  Ｓ  ａｎｄ  Ｓｕｄａ  Ｔ  １９９５，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ（ＥＰ１，ＥＰ３  ａｎｄ  ＥＰ４）ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｎ  Ｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｍｉｃｅ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １０（ｓｕｐ  １）：Ｓ  １７２参照。骨モデリング及びリモデリングプロセスを媒介するための医薬の製造における式Ｉの化合物の使用も本発明に含まれる。
【０１０４】
従って、本発明の別の目的は治療を必要とする哺乳動物に治療有効量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストを投与することを含む、哺乳動物における骨形成（即ちｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）の刺激方法を提供することである。
【０１０５】
本発明の更に別の目的は治療有効量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストとビスホスホネート活性剤を哺乳動物に投与することを含む、必要とする哺乳動物における骨形成の刺激方法を提供することである。骨形成の刺激用医薬の製造における式Ｉの化合物の使用も本発明に含まれる。
【０１０６】
本発明の更に別の目的は治療有効量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストとビスホスホネート活性剤を含有する医薬組成物を提供することである。
【０１０７】
本発明の別の目的は治療有効量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストを哺乳動物に投与することを含む、該当治療又は予防を必要とする哺乳動物における異常骨吸収に関連する疾患状態もしくは症状を治療するか又はこのような症状に罹患する危険を減らす方法を提供することである。異常骨吸収に関連する疾患状態もしくは症状を治療するか又はこのような症状に罹患する危険を減らすための医薬の製造における式Ｉの化合物の使用も本発明に含まれる。
【０１０８】
異常骨吸収に関連する疾患状態又は症状としては限定されないが、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、骨代謝回転異常亢進、歯周病、歯欠損、骨折、リウマチ様関節炎、人工器官周囲の骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、及び多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１０９】
治療有効量の式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストとビスホスホネート活性剤を投与することを含む方法では、式ＩのＥＰ４受容体サブタイプアゴニストとビスホスホネート活性剤の同時及び順次投与のいずれも本発明の範囲に含むものとする。一般に、ビスホスホネート活性剤基準で５又は１０ｍｇのビスホスホネート活性剤を含有する製剤を製造する。順次投与では、アゴニストとビスホスホネートのどちらを先に投与してもよい。順次投与のサブクラスでは、アゴニストとビスホスホネートを一般に２４時間以内に投与する。更に別のサブクラスでは、アゴニストとビスホスホネートを一般に相互に約４時間以内に投与する。
【０１１０】
本発明で有用なビスホスホネート活性剤の非限定的な例としては以下のものが挙げられる。
【０１１１】
アレンドロン酸，４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸；
アレンドロネート（アレンドロン酸ナトリウム又はアレンドロン酸一ナトリウム三水和物とも言う），４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン−１，１−ビスホスホン酸一ナトリウム三水和物；
アレンドロン酸とアレンドロネートはいずれも参照によりその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第４，９２２，００７号（Ｋｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉら，発行日１９９０年５月１日）；５，０１９，６５１号（Ｋｉｅｃｚｙｋｏｗｓｋｉら，発行日１９９１年５月２８日）；５，５１０，５１７号（Ｄａｕｅｒら，発行日１９９６年４月２３日）；５，６４８，４９１号（Ｄａｕｅｒら，発行日１９９７年７月１５日）に記載されている；
参照によりその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第４，９７０，３３５号（Ｉｓｏｍｕｒａら，発行日１９９０年１１月１３日）に記載されているようなシクロヘプチルアミノメチレン−１，１−ビスホスホン酸，ＹＭ１７５，Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ（シマドロネート）；
１，１−ジクロロメチレン−１，１−ジホスホン酸（クロドロン酸）とその二ナトリウム塩（クロドロネート，Ｐｒｏｃｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｌｅ）はいずれも参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むベルギー特許第６７２，２０５号（１９６６）とＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ  ３２，４１１１（１９６７）に記載されている；
１−ヒドロキシ−３−（１−ピロリジニル）−プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（ＥＢ−１０５３）；
１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（エチドロン酸）；
１−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）プロピリデン−１，１−ビスホスホン酸はＢＭ−２１０９５５，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ（イバンドネート）とも呼ばれ、参照によりその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第４，９２７，８１４号（発行日１９９０年５月２２日）に記載されている；
６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン−ｌ，１−ビスホスホン酸（ネリドロネート）；
３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（オルパドロネート）；
３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン−１，１−ビスホスホン酸（パミドロネート）；
［２−（２−ピリジニル）エチリデン］−１，１−ビスホスホン酸（ピリドロネート）は参照によりその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第４，７６１，４０６号に記載されている；
１−ヒドロキシ−２−（３−ピリジニル）−エチリデン−１，１−ビスホスホン酸（リセドロネート）；
参照によりその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第４，８７６，２４８号（Ｂｒｅｌｉｅｒｅら，発行日１９８９年１０月２４日）に記載されているような（４−クロロフェニル）チオメタン−１，１−ビスホスホン酸（チルドロネート）；並びに
１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン−１，１−ビスホスホン酸（ゾレンドロネート）。
【０１１２】
本発明で有用なビスホスホネート活性剤の非限定的なクラスはアレンドロネート、シマドロネート、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート、リセドロネート、ピリドロネート、パミドロネート、ゾレンドロネート、医薬的に許容可能なその塩、及びその混合物から構成される群から選択される。
【０１１３】
この場合の上記クラスの非限定的なサブクラスはアレンドロネート、医薬的に許容可能なその塩、及びその混合物から構成される群から選択される。
【０１１４】
サブクラスの非限定的な１例はアレンドロン酸一ナトリウム三水和物である。
【０１１５】
本発明では、骨刺激に関しては、一般に所望治療効果が達成されるまで十分な期間にわたってアゴニストを投与する。本明細書で使用する「所望効果が達成されるまで」なる用語は媒介される疾患又は症状に求められる臨床又は医学的効果が臨床医又は研究者により観察される時点まで選択した投与スケジュールに従って１又は複数の治療剤を連続投与することを意味する。本発明の方法では、骨量又は構造に所望変化が観察されるまで化合物を連続投与する。このような場合には、骨量の増加の達成又は異常骨構造を正常骨構造で置換することが所望目的である。疾患状態又は症状の危険を減らす方法では、望ましくない症状を予防するために必要な期間にわたって化合物を連続投与する。このような場合には、骨量密度の維持を目的とすることが多い。投与期間の非限定的な例は約２週間から哺乳動物の終生とすることができる。ヒトでは、投与期間は約２週間からヒトの終生とすることができ、好ましくは約２週間〜約２０年間、より好ましくは約１か月〜約２０年間、より好ましくは約６か月〜約１０年間、最も好ましくは約１年間〜約１０年間である。
【０１１６】
本発明の化合物は骨量低下、骨折、骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、骨代謝回転異常亢進、歯周病、歯欠損、骨折、リウマチ様関節炎、人工器官周囲の骨溶解、骨形成不全症、転移性骨疾患、悪性高カルシウム血症、及び多発性骨髄腫の治療又は予防に有用な公知薬剤と併用しても有用である。骨粗鬆症及び他の骨疾患の治療又は予防に有用な他の薬剤と本発明で開示する化合物の併用も本発明の範囲に含まれる。当業者は薬剤と該当疾患の特定特徴に基づいてどの薬剤組み合わせが有用であるかを判断することができよう。このような薬剤としては、有機ビスホスホネート；カテプシンＫ阻害剤；エストロゲン又はエストロゲン受容体モジュレーター；アンドロゲン受容体モジュレーター；破骨細胞プロトンＡＴＰアーゼ阻害剤；ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤；インテグリン受容体アンタゴニスト；骨芽細胞同化剤（例えばＰＴＨ）；カルシトニン；ビタミンＤ又は合成ビタミンＤ類似体；及び医薬的に許容可能なその塩及び混合物が挙げられる。好ましい組み合わせの１例は本発明の化合物と有機ビスホスホネートである。別の好ましい組み合わせは本発明の化合物とエストロゲン受容体モジュレーターである。別の好ましい組み合わせは本発明の化合物とエストロゲンである。別の好ましい組み合わせは本発明の化合物とアンドロゲン受容体モジュレーターである。別の好ましい組み合わせは本発明の化合物と骨芽細胞同化剤である。
【０１１７】
異常骨吸収及び眼疾患の治療に関して、式Ｉのアゴニストは一般に約０．００１ｎＭ〜約１００μＭのＥＣ５０値をもつが、用量と投与経路によってはこの範囲外の活性のアゴニストでも有用な場合もある。本発明のサブクラスでは、アゴニストは約０．０１μＭ〜約１０μＭのＥＣ５０値をもつ。本発明の別のサブクラスでは、アゴニストは約０．１μＭ〜約１０μＭのＥＣ５０値をもつ。ＥＣ５０は当業者に周知のアゴニスト活性の一般尺度であり、最大効果の２分の１、即ち５０％を生じるために必要なアゴニストの濃度又は用量として定義される。いずれも参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９６，ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ｅ．Ｍ．Ｒｏｓｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔ、及びＰＣＴ  ＵＳ９９／２３７５７（出願日１９９９年１０月１２日）も参照。
【０１１８】
以下、実施例により本発明を例証するが、以下の実施例により本発明を制限するものではない。本発明の各化合物はＥＰ４アゴニストであり、多数の生理的眼及び骨疾患に有用である。
【０１１９】
本明細書では以下の略称を使用する場合がある。
【０１２０】
略称
表記
ＣＤＩ：１，１’−カルボニルジイミダゾール
ＤＨＰ：４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン
ＬｉＯＨ：水酸化リチウム
ＮａＢＨ４：ホウ水素化ナトリウム
ＮａＨ：水素化ナトリウム
ｎＢｕ３ＳｎＮ３：アジドトリブチル錫
ＰＧ：保護基
ＴＢＳＣＩ：塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴｓＯＨ：ｐ−トルエンスルホン酸。
【０１２１】
本発明に記載する化合物は以下の一般スキームに従って製造することができる。全変数は特に指定しない限り、上記に定義した通りである。
【０１２２】
【化３２】
2006505572.tif 000028
【０１２３】
以下、特定実施例により本発明の化合物の製造を更に例証する。上記一般手順と実施例に例示する手順に従い、規定変数の代替基をもつ本発明の化合物を製造することもでき、例えば下記手順に従い、５−（３−ブロモプロピル）チオフェン−２−カルボン酸メチルの代わりに５−（３−ブロモプロピル）ベンジル−２−カルボン酸メチル又は５−（３−ブロモプロピル）チアゾール−２−カルボン酸メチルを使用し、対応するピロリジノンを製造することができる。
【実施例１】
【０１２４】
５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸（９及び１０）
以下のスキームに従って化合物９及び１０の製造を行った。
【０１２５】
【化３３】
2006505572.tif 000029
2006505572.tif 000030
１の製造は文献手順に従って実施した（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９４，６２２１参照）。
【０１２６】
（５Ｒ）−５−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−オキソ−４−フェニルブト−１−エニル］−１−（４−メトキシベンジル）ピロリジン−２−オン（２）
−７２℃で塩化オキサリル（５４４μＬ）をジメチルスルホキシド（４８０μＬ）のＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍｌ）溶液に滴下し、混合物をこの温度で２０分間撹拌した。次に（５Ｒ）−５−（ヒドロキシメチル）−１−（４−メトキシベンジル）ピロリジン−２−オン（７１４ｍｇ，３．０４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）溶液をゆっくりと加え、−７２℃で１時間撹拌した。次にトリエチルアミン（２．０ｍｌ）を滴下し、混合物を０℃まで昇温させた。水を加え、生成物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾涸した。これを次段階でそのまま使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）δ９．５０（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｄ，２Ｈ），６．９０（ｄ，２Ｈ），４．８０（ｄ，１Ｈ），４．１４（ｄ，１Ｈ），４．０６（ｍ，１Ｈ），３．７９，（ｓ，３Ｈ），２．２０−２．４５（ｍ，３Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ）。
【０１２７】
３，３−ジフルオロ−２−オキソ−３−フェニルプロピルホスホン酸ジメチル（１９８２年３月１６日発行米国特許第４，３２０，１３６号）（２．０７６ｇ）の０℃ＴＨＦ（１７ｍＬ）溶液にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（９６３ｍｇ）を加え、混合物を更に１時間０℃で撹拌した。次に混合物に（２Ｒ）−１−（４−メトキシベンジル）−５−オキソピロリジン−２−カルボアルデヒドのＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液をカニューレで加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチした。次に混合物を酢酸エチル（３ｘ）で抽出し、有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮した。２０％アセトン／トルエンを溶出溶媒として残渣をクロマトグラフィーにより精製すると、所望生成物２が得られた。
【０１２８】
５−（４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニル−ブト−１−エニル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−ピロリジン−２−オン（３）
２（８．２ｇ，２１．２ｍｍｏｌ）の８０ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２溶液にトルエン（１０．６ｍＬ，１０．６ｍｍｏｌ）中１Ｍ（Ｓ）−ＣＢＳを加え、−４０℃まで冷却し、カテコールボラン（６．８ｍＬ，６３．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液を滴下した。溶液を−４０℃で１時間撹拌した後、−２０℃まで２時間昇温させた。反応混合物を−２０℃にて１Ｎ  ＨＣｌでクエンチし、４時間室温で撹拌した。相分離し、有機相を１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、１Ｎ  ＮａＯＨ、ブラインで順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。４０−５０％酢酸エチル／ヘキサンを使用して化合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると、所望生成物３が薄黄色油状物として得られた。ＭＳ（Ｍ＋１）３８８．２。
【０１２９】
（５Ｒ）−５−（（１Ｅ）−３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−４，４−ジフルオロ−４−フェニルブト−１−エニル）−１−（４−メトキシベンジル）ピロリジン−２−オン（４）
３（３６５ｍｇ）の室温ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液にイミダゾール（１３９ｍｇ）を加え、次いでＴＢＳＣｌ（２２０ｍｇ）を加えた。混合物を週末の間撹拌した後、水でクエンチした。混合物をエーテル（３ｘ）で抽出し、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル：ヘキサン）により精製すると、化合物４が得られた。
【０１３０】
（５Ｒ）−５−（（１Ｅ）−３−｛［ｔｅｔｒ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−４，４−ジフルオロ−４−フェニルブト−１−エニル）ピロリジン−２−オン（５）
４（３５９ｍｇ）の０℃アセトニトリル（２０ｍＬ）溶液にＣＡＮ（２ｇ）、水（２ｍＬ）を加え、混合物を室温まで４時間昇温させた。混合物をエーテル（３ｘ）で抽出し、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％−７５％−１００％酢酸エチル）により精製すると、化合物５が得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．５０−７．４０（ｍ，５Ｈ），５．７０−５．６５（ｍ，２Ｈ），４．５０−４．４２（ｍ，１Ｈ），４．２０−４．１３（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．３０（ｍ，３Ｈ），１．８０−１．７０（ｍ，１Ｈ），０．８７（ｓ，９Ｈ），−０．０５（ｄ，６Ｈ）。
【０１３１】
５−｛３−［（２Ｒ）−２−（（１Ｅ）−３−｛［ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝−４，４−ジフルオロ−４−フェニルブト−１−エニル）−５−オキソピロリジン−１−イル］プロピル｝チオフェン−２−カルボン酸メチル（６）
ＮａＨ  ６０％（３０ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に５（１８２ｍｇ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液と、５−（３−ブロモプロピル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（２００ｍｇ）のＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液と、ＮａＩ（３０ｍｇ）を加えた。混合物を５０℃で３時間撹拌した。室温まで冷却後、混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、酢酸エチル（３ｘ）で抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ヘキサン中５０％酢酸エチルで溶出すると、所望生成物６が得られた。
【０１３２】
５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（７及び８）
６（２３０ｍｇ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液にＴＢＡＦ（ＴＨＦ，０．６ｍＬ中１．０Ｍ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製すると、化合物７（低極性）及び８（高極性）の混合物が得られた。ヘキサン中３０％イソプロパノールを使用して異性体をＨＰＬＣ（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ（登録商標））により分離した。異性体７  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．６５（ｄ，１Ｈ），７．４９−７．４２（ｍ，５Ｈ），６．８３（ｄ，１Ｈ），５．７２−５．６０（ｍ，２Ｈ），４．６１−４．５５（ｍ，１Ｈ），４．０８−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．５４−３．４６（ｍ，１Ｈ），２．８９−２．７８（ｍ，３Ｈ），２．４０−２．３２（ｍ，２Ｈ），２．２１−２．１４（ｍ，１Ｈ），１．８７−１．７７（ｍ，２Ｈ），１．７０−１．６３（ｍ，１Ｈ）。異性体８  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．６５（ｄ，１Ｈ），７．４９−７．４３（ｍ，５Ｈ），６．８３（ｄ，１Ｈ），５．７２−５．６１（ｍ，２Ｈ），４．６１−４．５４（ｍ，１Ｈ），４．０７−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ），２．８７−２．７９（ｍ，３Ｈ），２．４４−２．２８（ｍ，２Ｈ），２．２２−２．１３（ｍ，１Ｈ），１．８９−１．７６（ｍ，２Ｈ），１．７２−１．６４（ｍ，１Ｈ）。
【０１３３】
標記化合物：５−（３−｛（２Ｒ）−２−［（１Ｅ）−４，４−ジフルオロ−３−ヒドロキシ−４−フェニルブト−１−エニル］−５−オキソピロリジン−１−イル｝プロピル）チオフェン−２−カルボン酸（９及び１０）
メタノール（４．７ｍＬ）、水（１ｍＬ）及びＬｉＯＨ（０．５ｍＬ，１．０Ｍ）中のエステル７又は８の混合物を室温でＮ２下に一晩撹拌し、濃縮すると、標記化合物がリチウム塩として得られた。塩をエーテルで洗浄し、ＨＣｌ（１．０Ｎ）で酸性化し、酢酸エチル（３ｘ）で抽出した。抽出液を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮すると、標記化合物９（低極性）又は１０（高極性）が得られた。ＭＳ（−ＥＳＩ）：ｍ／ｚ  ４３４．１（Ｍ−１）。
【０１３４】
ウサギ及びサルの眼圧（ＩＯＰ）に対するＥＰ４アゴニストの効果
動物−本試験では投薬を受けたことがない雄Ｄｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄウサギと雌カニクイザルを使用する。本試験の動物実験は米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）と米国視覚眼科学会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）の決議による研究用動物の使用に関するガイドラインに従う。全実験手順はＭｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙの所内動物実験委員会に承認された。
【０１３５】
薬剤製造及び投与−薬剤濃度は活性成分（基準）で表す。本発明の化合物を生理食塩水に溶かし、ウサギ試験では０．０１、０．００１、０．０００１％とし、サル試験では０．０５、０．００５％とする。薬剤又はビークルアリコート（２５μｌ）を片眼又は両眼に局所投与する。片眼投与では、反対側の眼に等容量の食塩水を投与する。不快感を最小限にするために、眼圧測定の前にプロパラカイン（０．５％）を角膜に投与する。空気眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｐｎｅｕｍａｔｏｎｏｇｒａｐｈ）又は同等装置を使用して眼圧（ＩＯＰ）を記録する。
【０１３６】
統計分析−薬剤又はビークル投与直前に測定した基線レベルからのＩＯＰの変化として結果を表し、平均±標準偏差を求める。同等時間間隔で薬剤投与動物とビークル投与動物の応答の間の対応のないデータと、同側と対側の眼の間の対応のあるデータについてスチューデントのｔ検定を使用して統計比較を行う。ダネットの「ｔ」検定を使用して「ｔ−０」値からの差としてデータの有意差も調べる。星印はｐ＜０．０５の有意差レベルを示す。
【０１３７】
ウサギの眼圧測定−体重２．５〜４．０ｋｇの雄Ｄｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄウサギを１２時間明／暗サイクルとウサギ飼料で飼育する。全実験は日周リズムに関する変動を最小限にするように同一時刻に実施する。投与前にＩＯＰを測定した後、本発明の化合物又はビークル（１滴２５μｌ）を片眼又は両眼に滴下し、点眼から３０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、及び３６０分後にＩＯＰを測定する。場合により、ビークルのみを両眼に投与した同数の動物を評価し、平行対照として薬剤投与動物と比較する。
【０１３８】
サルの眼圧測定−Ｌｅｅら（１９８５）の方法を使用してアルゴンレーザーシステム（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ＮＯＶＵＳ  ２０００，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，米国）で線維柱帯網の光凝固により体重２〜３ｋｇの雌カニクイザルに右眼の片側高眼圧症を誘発する。眼圧（ＩＯＰ）の長期上昇の結果、緑内障患者と同様の視神経乳頭変化が生じる。ＩＯＰ測定のために、実験の間はサルを拘束椅子で座位に保つ。各ＩＯＰ測定の約５分前に塩酸ケタミン（３〜５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により動物を軽く麻酔し、ＩＯＰを記録する前に０．５％プロパラカイン１滴を滴下した。ＩＯＰは空気眼圧計（Ａｌｃｏｎ  Ａｐｐｌａｎａｔｉｏｎ  Ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ）又はＤｉｇｉｌａｂ空気眼圧計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，米国）を使用して測定する。ＩＯＰは投与前と一般に投与から３０、６０、１２４、１８０、３００、及び３６０分後に測定する。一般に投与の２又は３日前に同時点の基線値も取得する。投与は本発明の化合物（０．０５及び０．００５％）又はビークル（食塩水）１滴２５μｌを滴下する。同一動物の試験前には少なくとも１週間の休薬期間を設ける。正常眼圧（高眼圧の対側）の眼も高眼圧の眼と全く同様に処置する。両眼のＩＯＰ測定値を同一時点の対応する基線値と比較する。結果を平均±標準偏差（ｍｍＨｇ）として表す。本発明の化合物の眼科用活性範囲は０．０１〜１００，０００ｎＭである。
【０１３９】
放射性リガンド結合アッセイ−これらの化合物を試験するために使用したアッセイは以下に記載するように、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ  Ｍ，Ａｄａｍ  Ｍ，Ｂｏｉｅ  Ｙ，Ｃａｒｒｉｅｒｅ  Ｍ，Ｄｅｎｉｓ  Ｄ，Ｇｏｄｂｏｕｔ  Ｃ，Ｌａｍｏｎｔａｇｎｅ  Ｓ，Ｒｏｃｈｅｔｔｅ  Ｃ，Ｓａｗｙｅｒ  Ｎ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ＮＭ，Ｂｅｌｌｅｙ  Ｍ，Ｇａｌｌａｎｔ  Ｍ，Ｄｕｆｒｅｓｎｅ  Ｃ，Ｇａｒｅａｕ  Ｙ，Ｒｕｅｌ  Ｒ，Ｊｕｔｅａｕ  Ｈ，Ｌａｂｅｌｌｅ  Ｍ，Ｏｕｉｍｅｔ  Ｎ，Ｍｅｔｔｅｒｓ  ＫＭ．Ｔｈｅ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２０００  Ｊａｎ  １７；１４８３（２）：２８５−２９３の記載にほぼ従って実施した。
【０１４０】
ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３（ＥＢＮＡ）細胞株におけるプロスタノイド受容体の安定発現−全長コーディング配列に対応するプロスタノイド受容体（ＰＧ）ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の適当な部位にサブクローニングした。Ｑｉａｇｅｎプラスミド作製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｐＣＥＰ４ＰＧプラスミドＤＮＡを作製し、製造業者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用してＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞にトランスフェクトした。１０％熱不活化胎仔ウシ血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン−Ｇ、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、２５０μｇ／ｍｌ活性ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標）（Ｇ４１８）（いずれもＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．／ＢＲＬ製品）及び２００μｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でｃＤＮＡとハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を選択した。クローニングリング法を使用する選択下に２〜３週間増殖後に個々のコロニーを単離した後にクローン細胞株に増殖させた。受容体ｃＤＮＡの発現を受容体結合アッセイにより評価した。ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞を空気中６％ＣＯ２の加湿雰囲気下に３７℃にて補充ＤＭＥＭ完全培地で増殖させた後に回収し、分画遠心（いずれも４℃にて１０００ｘｇで１０分間の後に１６０，０００ｘｇで３０分間）により膜調製した後にプロテアーゼ阻害剤（２ｍＭ弗化フェニルメチルスルホニル，１０μＭ  Ｅ−６４，１００μＭロイペプチン及び０．０５ｍｇ／ｍｌペプスタチン）の存在下に氷上で３０分間８００ｐｓｉにて窒素キャビテーションにより細胞を溶解した。１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）にＤｏｕｎｃｅホモジナイザー（Ｄｏｕｎｃｅ  Ａ；１０ストローク）により１６０，０００ｘｇペレットを約５〜１０ｍｇ／ｍｌ蛋白質で再懸濁し、液体窒素で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０１４１】
プロスタノイド受容体結合アッセイ−プロスタノイド受容体結合アッセイは１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ＥＰサブタイプ）又は１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２（ＤＰ，ＦＰ，ＩＰ及びＴＰ）及び放射性リガンド［ＥＰサブタイプには０．５〜１．０ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＥ２（１８１Ｃｉ／ｍｍｏｌ），ＤＰには０．７ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＤ２（１１５Ｃｉ／ｍｍｏｌ），ＦＰには０．９５ｎＭ［３Ｈ］ＰＧＦ２α（１７０Ｃｉ／ｍｍｏｌ），ＩＰには５ｎＭ［３Ｈ］イロプロスト（１６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＴＰには１．８ｎＭ［３Ｈ］ＳＱ  ２９５４８（４６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）］を添加した１０ｍＭ  ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ６．０）（ＥＰサブタイプ，ＦＰ及びＴＰ）又は１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）（ＤＰ及びＩＰ）中で最終インキュベーション容量０．２ｍｌとなるように実施した。ＥＰ３アッセイには１００μＭ  ＧＴＰγＳも添加した。１６０，０００ｘｇフラクションからの膜蛋白質（ＥＰ１には約３０μｇ、ＥＰ２には２０μｇ、ＥＰ３には２μｇ、ＥＰ４には１０μｇ、ＦＰには６０μｇ、ＤＰには３０μｇ、ＩＰには１０μｇ、ＴＰには１０μｇ）を添加することにより反応を開始した。リガンドをジメチルスルホキシド（Ｍｅ２ＳＯ）に加え、全インキュベーションで１％（ｖ／ｖ）の一定に維持した。対応する非放射性プロスタノイド１μＭの存在下で非特異的結合を測定した。６０分間（ＥＰサブタイプ，ＦＰ及びＩＰ）又は３０分間（ＤＰ及びＴＰ）３０℃（ＥＰサブタイプ，ＤＰ，ＦＰ及びＴＰ）又は室温（ＩＰ）でインキュベーションを行い、ＥＤＴＡ非添加アッセイインキュベーション緩衝液（４℃）で予め湿潤させた９６ウェルＵｎｉｆｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）で迅速濾過し、Ｔｏｍｔｅｃ  Ｍａｃｈ  ＩＩＩ  ９６ウェル半自動セルハーベスターを使用して回収した。フィルターを同一緩衝液３〜４ｍｌで洗浄し、９０分間５５℃で乾燥し、Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｏｌｄ  Ｆ（Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｐａｃｋａｒｄ）５０μｌを添加し、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（Ｗａｌｌａｃ）を使用してシンチレーション計数により個々のフィルターに結合した残留放射能を測定した。非特異的結合を合計結合から差し引くことにより特異的結合を計算した。特異的結合は合計結合の９０〜９５％であり、使用した放射性リガンドと蛋白質の濃度に対して直線的であった。合計結合はインキュベーション培地に添加した放射性リガンドの５〜１０％であった。本発明の化合物の骨用活性範囲は０．０１〜１００，０００ｎＭである。
【０１４２】
骨吸収アッセイ
動物手順−ｍＲＮＡ局在実験では、５週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をＣＯ２により安楽死させ、その脛骨と頭蓋冠を摘出し、軟組織を除去し、すぐに液体窒素で凍結させる。ＥＰ４調節実験では、６週齢ラットにビークル（滅菌水中７％エタノール）又は同化用量のＰＧＥ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，同一ビークル中３〜６ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に単回注射する。動物を注射後の数時点で安楽死させ、その脛骨及び頭蓋冠と、肺及び腎組織試料を液体窒素で凍結させる。
【０１４３】
細胞培養−ＲＰ−１骨膜細胞は４週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脛骨由来骨膜細胞初代培養物から自然に不死化し、１０％胎仔ウシ血清（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を添加したＤＭＥＭ（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で培養する。これらの細胞は初期培養では骨芽細胞表現型マーカーを発現しないが、コンフルエントに達すると、Ｉ型コラーゲン、アルカリホスファターゼ及びオステオカルシンを発現し、鉱化細胞外基質を産生する。ＲＣＴ−１とＲＣＴ−３はコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ併用消化により胎仔ラット頭蓋冠から遊離した細胞からＳＶ−４０ラージＴ抗原により不死化したクローン細胞株である。ＲＣＴ−１細胞は最初の１０分の消化中に遊離した細胞（フラクションＩ）に由来し、１０％胎仔ウシ血清と０．４ｍｇ／ｍｌＧ４１８（ＢＲＬ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（ＢＲＬ）で培養する。これらの細胞はレチノイン酸処理後に分化し、骨芽細胞形質を発現する。ＲＣＴ−３細胞は骨芽細胞集積フラクションＩＩＩ細胞から不死化し、５％胎仔ウシ血清と０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加したＦ−１２培地（ＢＲＬ）で培養する。ＴＲＡＢ−１１細胞も成体ラット脛骨からＳＶ４０ラージＴ抗原により不死化し、１０％ＦＢＳと０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養する。ＲＯＳ１７／２．８ラット骨肉腫細胞は５％ＦＢＳを添加したＦ−１２で培養する。骨芽細胞集積（フラクションＩＩＩ）初代胎仔ラット頭蓋冠細胞は１９日齢ラット胎仔の頭蓋冠のコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ消化により得られる。参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＲｏｄａｎら，Ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃａｌｖａｒｉａ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｃｉｄｉｃ  ＦＧＦ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２１，１９１９−１９２３（１９８７）参照。３０〜５０分間消化中に細胞（フラクションＩＩＩ）が遊離し、５％ＦＢＳを添加したＦ−１２培地で培養する。Ｐ８１５（マウス肥満細胞腫）細胞は１０％ＦＢＳを添加したイーグルＭＥＭで培養し、ＮＲＫ（正常ラット腎繊維芽細胞）細胞は１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで培養し、夫々ＥＰ４発現の陽性及び陰性対照として使用する。いずれも参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＡｂｒａｍｏｖｉｔｚら，Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｓａｍｕｌｅｓｓｏｎ  Ｂ．ら編，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｚｎｅｓ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．４９９−５０４（１９９５）及びｄｅ  Ｌａｒｃｏら，Ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ：ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，９４，３３５−３４２（１９７８）参照。
【０１４４】
ノーザンブロット分析−凍結骨試料を組織ホモジナイザーにより粉砕後にイソチオシアン酸グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法を使用して脛骨骨幹端又は骨幹と頭蓋冠から全ＲＮＡを抽出する。参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＰ．Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．，Ａｎａｌｙｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２，１５６−１５９（１９８７）参照。ＲＮＡ試料（２０ｍｇ）を０．９％アガロース／ホルムアミドゲルで分離し、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）に転写する。０．５ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を添加したＨｙｂｒｉｓｏｌ  Ｉ（Ｏｎｃｏｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で膜を４２℃で３時間プレハイブリダイズさせ、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してランダムプライミングにより［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，英国）で標識したラットＥＰ２及びマウスＥＰ４ｃＤＮＡプローブと４２℃でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後に、膜を室温にて合計１時間２ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで４回及び５５℃にて１時間０．２ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで１回洗浄した後、増感紙を使用して−７０℃でＫｏｄａｋ  ＸＡＲ  ２フィルムに感光させる。フィルムを現像後、結合したプローブを８０℃の０．１％ＳＤＳで２回除去し、膜をローディング対照としてヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）ｃＤＮＡプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから購入）とハイブリダイズさせる。
【０１４５】
ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション−凍結した脛骨を７ｍｍ厚に冠状に切断し、切片を荷電スライド（Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎ  Ｐｌｕｓ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ）にマウントし、ハイブリダイゼーションまで−７０℃に維持する。Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  ＩＩキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してｃＲＮＡプローブを３５Ｓ−ＵＴＰｇＳ（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）で標識する。５０℃で一晩ハイブリダイゼーションを行う。いずれも参照によりその開示内容全体を本明細書に組込むＭ．Ｗｅｉｎｒｅｂら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｒａｔ  ｂｏｎｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｉｎ−ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．，５，８３１−８４２（１９９０）及びＤ．Ｓｈｉｎａｒら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａν  ａｎｄ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８，４０３−４１４（１９９３）参照。ハイブリダイゼーションと洗浄後に、４２℃水中６％グリセロールで２：１に希釈したＩｌｆｏｒｄ  Ｋ５エマルションに切片を浸漬し、４℃の暗所で１２〜１４日間露出する。１５℃の水で１：１に希釈したＫｏｄａｋＤ−１９でスライドを現像し、定着させ、蒸留水で洗浄し、ヘマトキシリン染色後にグリセロール−ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）でマウントする。明視野又は暗視野法を使用して染色切片を顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｈａｍｂｕｒｇ，ドイツ）で観察する。
【０１４６】
骨芽細胞株と骨組織におけるＥＰ４の発現−骨芽細胞集積初代ラット頭蓋冠細胞、胎仔ラット頭蓋冠もしくは成体ラット脛骨に由来する不死化骨芽細胞株及び骨芽細胞骨肉腫細胞株を含む種々の骨由来細胞でＥＰ４及びＥＰ２ｍＲＮＡの発現を試験する。ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８を除き、骨芽細胞及び細胞株の殆どは有意量の３．８ｋｂ  ＥＰ４ｍＲＮＡを示す。この知見に一致して、ＲＯＳ  １７／２．８細胞ではＰＧＥ２は細胞内ｃＡＭＰに効果がないが、ＲＣＴ−３及びＴＲＡＢ−１１細胞では顕著に誘導される。その分化を促進するレチノイン酸でＲＣＴ−１細胞を処理すると、ＥＰ４ｍＲＮＡレベルは低下する。ＮＲＫ繊維芽細胞はＥＰ４ｍＲＮＡを発現しないが、陽性対照として使用したＰ８１５肥満細胞腫細胞は多量のＥＰ４ｍＲＮＡを発現する。ＥＰ４ｍＲＮＡとは対照的に、骨芽細胞及び細胞株は全ＲＮＡ試料で検出可能な量のＥＰ２ｍＲＡを発現しない。骨芽細胞におけるＥＰ４ｍＲＮＡの発現と同様に、ＥＰ４は５週齢ラットの脛骨と頭蓋冠から単離した全ＲＮＡでも発現される。他方、脛骨軸に由来するＲＮＡにＥＰ２ｍＲＮＡは検出されない。
【０１４７】
ＰＧＥ２はＲＰ−１骨膜細胞と成体ラット脛骨でＥＰ４ｍＲＮＡの発現を誘導する。−ＰＧＥ２は骨芽細胞と骨組織におけるシクロオキシゲナーゼ２発現のアップレギュレーションによりそれ自体の産生を促進し、従って、それ自体の効果を自己増幅する。ＰＧＥ２はＥＰ４ｍＲＮＡレベルも増加する。成体ラット脛骨骨膜の初代培養物から不死化したＲＰ−１細胞を試験する。これらの細胞はコンフルエントに達すると、骨芽細胞表現型マーカーを発現し、ヌードマウスに移植すると、鉱化骨基質を形成する。試験した他の骨芽細胞と同様に、ＲＰ−１骨膜細胞は３．８ｋｂ  ＥＰ４転写産物を発現する。ＰＧＥ２（１０−６Ｍ）で処理すると、ＥＰ４ｍＲＮＡレベルは迅速に増加し、処理後２時間でピークに達する。ＰＧＥ２は分化の進んだＲＣＴ−３細胞ではＥＰ４ｍＲＮＡレベルに効果がなく、ＰＧＥ２によるＥＰ４発現の細胞型特異的調節を示唆している。ＥＰ２ｍＲＮＡはＰＧＥ２処理前又は後にＲＰ−１細胞で発現されない。ＰＧＥ２がＥＰ４ｍＲＮＡレベルを骨組織でｉｎ  ｖｉｖｏ調節するか否かを試験するために、５週齢雄ラットにＰＧＥ２（３〜６ｍｇ／Ｋｇ）を注射する。ＰＧＥ２の全身投与により脛骨骨幹のＥＰ４ｍＲＮＡレベルは迅速に増加し、注射後２時間でピークに達した。脛骨骨幹端と頭蓋冠でもＥＰ４ｍＲＮＡに対するＰＧＥ２の同様の効果が観察される。ＰＧＥ２は骨形成骨膜細胞でｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び骨組織でｉｎ  ｖｉｖｏのＥＰ４ｍＲＮＡレベルを細胞型特異的及び組織特異的に誘導する。ＰＧＥ２はＲＰ−１細胞でも骨組織でもＥＰ２ｍＲＮＡを誘導しない。
【０１４８】
骨組織におけるＥＰ４ｍＲＮＡ発現の局在−骨でＥＰ４を発現する細胞を局在するためにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用する。対照実験（ビークル注射）ラットでは、骨髄細胞で低レベルのＥＰ４発現しか検出されない。単一同化用量のＰＧＥ２を投与すると、骨髄細胞におけるＥＰ４の発現は増加した。骨髄上の銀粒子の分布は均一ではなく、骨幹端の多くの領域に塊状又はパッチ状で存在する。脛骨骨幹端内では、ＥＰ４発現は二次海綿質領域に限定されており、一次海綿質領域には認められない。同様の切片とセンスプローブ（陰性対照）のハイブリダイゼーションはシグナルを全く示さない。ＥＰ４は骨芽細胞ではｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現され、骨髄細胞ではｉｎ  ｖｉｖｏ発現され、そのリガンドであるＰＧＥ２によりアップレギュレートされる。
【０１４９】
アゴニスト活性−アゴニスト活性を測定するための標準方法を使用して、細胞培養とＥＰ４受容体細胞を含まないシステムで本発明の化合物を評価し、化合物のアゴニスト活性をそのＥＣ５０値として測定した。
【国際調査報告】
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