(57)【要約】水溶液からＤＮＡを単離および増幅し、側方フロー検出ストリップ上でそのＤＮＡを検出するための微小流体システムが、本願において開示される。この微小流体システムは、血漿中での細菌の分析および尿中での性感染病（ＳＴＤ）の分析において使用するための、使い捨て微小流体カードを備える。このカードは、細胞および細胞破片を濾過する埋め込み膜を備える。この膜上のあらゆる生物学的破片が、溶解され、そのＤＮＡは、適切な試薬および熱サイクリング条件を含むＰＣＲ増幅プロトコルを介して、増幅される。増幅されたＤＮＡは、視覚的診断読み取りのために、側方フロー検出ストリップ上に移される。代替的実施形態は、アンチグロブリンを型分類するアッセイにおいて使用するための微小流体カードを包含する。
2006520190.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体サンプルの微小流体分析のための方法であって、
微小流体カードに、流体サンプルを充填する工程；
該流体サンプルを溶解して、該流体サンプルの成分を分離する工程；
該分離した成分を、固体基材上に捕捉する工程；
該分離した成分を、洗浄緩衝液で洗浄する工程；
該洗浄した成分を、増幅温度プロフィールに対して増幅チャンバ中で増幅する工程；および
該増幅した成分を、検出のために側方フローストリップ上にポンピングする工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記分離した成分は、細菌である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記洗浄する工程は、前記洗浄した成分を増幅する工程との干渉を防ぐために核酸を除去する工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、β‐Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓである、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記分離した成分を、ＤＮＡプライマーでプライミングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記ポンピングする工程は、前記側方フローストリップ上にある細菌ＤＮＡの存在を視覚的に検出する工程を包含する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記微小流体カードを、前記流体サンプルを該カードに通してポンピングするための機器のマニホルドと係合させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項８】
微小流体カード上での流体サンプルの微小流体分析方法であって、
流体サンプルを収集する工程；
該流体サンプルを膜モジュールに通して濾過する工程であって、該膜モジュールにおいて、標的細胞物質が膜上に保持される、工程；
洗浄緩衝液を該膜に通して通過させて、標的細胞物質が該膜上に残るようにする工程；
誘導溶液を該膜に通して通過させる工程；
溶解溶液を該膜に通して通過させる工程；
洗浄緩衝液を該膜に通して通過させて、該膜から該溶解溶液を洗浄する工程；
第一ＮＡＳＢＡ溶液を、該膜に通して通過させる工程；
洗浄緩衝液を該膜に通して通過させて、該膜から該第一ＮＡＳＢＡ溶液を洗浄する工程；
第二ＮＡＳＢＡ溶液を該膜に通して通過させる工程；
洗浄緩衝液を該膜に通して通過させて、該膜から該第二ＮＡＳＢＡ溶液を洗浄する工程；
検出溶液を該膜に通して通過させる工程；
該細胞物質を熱サイクリングすることによって、ＲＮＡシグナルを増幅する工程；
該膜から該検出プローブ溶液を洗浄する工程；および
該洗浄した検出プローブ溶液を、ＲＮＡの視覚的検出のために側方フローストリップに暴露する工程；
を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記膜モジュールが、濾過装置から取り外されて、前記微小流体カードに挿入される、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記誘導溶液が、前記カード上にピペッティングされる、方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、前記第二ＮＡＳＢＡ溶液は、酵素を含む、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、前記微小流体カードは、前記カード全体を通して前記流体をポンピングするための流体機器のマニホルドと流体連絡している、方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、前記微小流体カードは、前記マニホルドとの流体連絡から取り外されて、前記ＲＮＡシグナルの増幅のための熱電対と取り外し可能に接続される、方法。
【請求項１４】
アッセイの微小流体分析のためのシステムであって、
使い捨て診断微小流体カードであって、該カードは、相互接続しているフローチャネルと、バルブと、レザバと、入口ポートと、フィルター膜と、熱電対と、該微小流体カード内に収容された側方フロー検出ストリップとを備え、該側方フロー検出ストリップは、ＤＮＡ細菌またはＲＮＡ細菌の存在を検出するために使用され得る、カード；および
機器であって、該機器は、該微小流体カードと流体接続するためのマニホルドを供え、該機器は、該使い捨てカード上での流体フローを制御する、機器；
を備える、システム。
【請求項１５】
アンチグロブリン型分類アッセイをするための微小流体システムであって、
第一表面、第二表面、および該第一表面と該第二表面との間に収容されているフローチャネルを備える基材であって、該フローチャネルは、上流端と下流端とを備える、基材；
第一流体サンプルを受容するための入口ポートであって、該入口ポートは、該第一表面を通って延びており、かつ入口フローチャネルに流体接続している、入口ポート；
該入口フローチャネルから下流に位置するフィルターであって、該フィルターの下流に該フィルターと流体接続している第一フローチャネルおよび第二フローチャネルがあり、該フィルターは、第一流体を、粒子を含まない流体と粒子を含む流体とに分離し、該粒子を含まない流体は、該第一フローチャネルに入り、該粒子を含む流体は、該第二フローチャネルに入る、フィルター；
該第一フローチャネルに流体的に相互接続している混合チャンバであって、該混合チャンバは、第二流体を受容するためのポートを備える、混合チャンバ；
該混合チャンバに熱接続しているヒーターであって、該ヒーターは、該混合チャンバを加熱する、ヒーター；
該混合チャンバに流体接続している、分離デバイス；
該分離デバイスに流体接続している指標フローチャネルであって、該指標チャネルは、第三流体サンプルを受容するための入口ポートを備え、該指標チャネルは、該アッセイ結果の視覚的解明のために、該入口ポートの下流に透明な窓をさらに備える、指標フローチャネル；
を備える、微小流体システム。
【請求項１６】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記第一流体は、血液である、微小流体システム。
【請求項１７】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記粒子を含まない流体は、血漿である、微小流体システム。
【請求項１８】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記第二流体は、試薬と、赤血球と、ＳＩとして示される希釈された赤血球と、ＳＩＩとして示される希釈された赤血球とを含む混合物である、微小流体システム。
【請求項１９】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記第三混合物は、アンチグロブリン血清である、微小流体システム。
【請求項２０】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記ヒーターは、電気抵抗器である、微小流体システム。
【請求項２１】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記フィルターは、拡散ベースのフィルターである、微小流体システム。
【請求項２２】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記フィルターは、接線フローフィルターである、微小流体システム。
【請求項２３】
請求項１５のアンチグロブリンを型分類するための微小流体システムであって、前記フィルターは、沈降フィルターである、微小流体システム。
【請求項２４】
血液を微小流体的に型分類するための方法であって、
赤血球および血漿を、拡散ベースの分離によって微小流体的に分離する工程；
該赤血球から血液タンパク質を除去する工程；
該赤血球を生理食塩水中に希釈する工程；
該希釈した赤血球を３つの部分に分割し、該第一部分を抗Ａと反応させ、該第二部分を抗Ｂと反応させ、該第三部分を抗Ｄと反応させる工程；
該血漿を２つの部分に分割し、該血漿の該第一部分をＡ１赤血球と反応させ、該血漿の第二部分をＢ赤血球と反応させる工程；ならびに
該反応を視覚的に解明する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
本願は、２００３年１月２１日に出願した米国仮特許出願番号６０／４４１，９０６および２００３年１月２１日出願した同６０／４４１，８７３（両方とも、その全体が本明細書中に参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、微小流体デバイスおよび分析方法に関し、より具体的には、流体サンプルの操作、増幅、および分先（例えば、血液血小板細菌アッセイおよびアンチグロブリン試験）のための微小流体デバイスおよび微小流体方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の説明）
微小流体デバイスは、分析試験を実施するために近年流行している。エレクトロニクスを小型化するために半導体産業によって開発されたツールを使用して、安価に大量生産され得る複雑な流体システムを製造することが、可能になっている。情報の獲得および処理のために種々の分析技術を実施するためのシステムが、開発されている。
【０００４】
微小流体的に分析を実施する能力によって、スループット、試薬消費、および自動化可能性についてかなりの利点が提供される。微小流体システムの別の利点は、分析および／または合成のために反応物処理を実施するために、１つの「ラップ・オン・チップ（ｌａｐ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」デバイス中に複数の異なる操作を組み込むことができる点である。
【０００５】
微小流体デバイスは、多層積層構造の状態で構築され得、そこでは、各層が、流体が流れる微小規模の間隙またはチャネルを形成するように積層材料から製造されたチャネルおよび構造体を有する。微小規模チャネルまたは微小流体チャネルは、一般的に、５００μｍ未満（代表的には、約０．１μｍと約５００μｍとの間）である少なくとも１つの内部断面寸法を有する、流体通路として規定される。
【０００６】
米国特許第５，７１６，８５２号（この特許は、本明細書中にその全体が参考として援用される）は、微小流体デバイスの例である。この’８５２特許は、少なくとも２つの入口チャネル（これらは、指標ストリームとサンプルストリームとを提供する）を有する積層フローチャネルを使用してサンプル中の分析物粒子の存在を検出するための微小流体システムを教示し、そのシステムにおいて、積層フローチャネルは、そのストリームの側方フローを可能にするために充分に小さい深さと、分析物粒子がその指標ストリーム中へと拡散して検出領域を形成するのを可能にするのに充分な長さとを備え、かつそのチャネルから出て１つの混合ストリームを形成するための出口を備える。このデバイス（これは、Ｔ−Ｓｅｎｓｏｒとして公知である）は、チャネル中で互いに隣り合う種々の流体層が、拡散によって以外は混合することなく移動するのを可能にする。サンプルストリーム（例えば、白血球）、レセプターストリーム（例えば、指標溶液）、および参照ストリーム（これは、既知の分析物標準物であり得る）が、このＴ―Ｓｅｎｓｏｒ内に共通微小流体チャネル中に導入され、それらのストリームは、このチャネルから出るまで互いに隣り合って流れる。小さめの粒子（例えば、イオンまたは小さいタンパク質）は、流体境界を越えて迅速に拡散し、一方、大きめの分子は、もっとゆっくり拡散する。大きな粒子（例えば、血球）は、２つのフローストリームが接触する時間内では、有意な拡散は示さない。
【０００７】
代表的には、微小流体システムは、機能にするために、いくつかの型の外部流体ドライバー（例えば、圧電ポンプ、微小シリンジポンプ、電気浸透ポンプなど）を必要とする。しかし、米国特許出願番号０９／６８４，０９４（この出願は、本発明の譲受人に譲渡され、その全体が参考として本明細書中に援用される）において、本質的に利用可能な内力（例えば、重力、静水圧、毛管力、多孔物質による吸収、または化学誘導圧、または真空）によって完全に駆動される、微小流体システムが記載される。
【０００８】
さらに、微小規模デバイスにおいて流体を制御する際に使用するための多くの種々の型のバルブが、開発された。例えば、米国特許第６，４３２，２１２号は、積層微小流体構造体において使用するための一方向バルブを記載する。米国特許第６，５８１，８９９号は、積層微小流体構造体において使用するためのボールベアリングバルブを記載し、米国特許出願番号１０／１１４，８９０（この出願は、本発明の譲受人に譲渡されている）は、積層微小流体構造体において使用するための空気圧バルブインターフェース（ゼロ死空間バルブとしても公知）を記載する。上記の特許および特許出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００９】
この分野において多くの進歩が存在しているが、流体サンプルを操作、増幅、および分析するための、新規かつ改善された微小流体デバイスについての必要性が存在する。
【００１０】
新規かつ改善された微小流体デバイスを必要する領域の一例は、細菌分析およびアンチグロブリン分析に関する。細菌が混入した血小板によって引き起こされる細菌性敗血症は、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、または西ナイルウイルスの２５０倍までの血液輸血により伝達される感染症の原因である。米国において毎年輸血される４００万血小板単位のうち、１，０００〜４，０００単位が、細菌汚染されており、臨床的敗血症の結果が１６７〜１，０００症例である。臨床的症状を有する患者のうちの２０〜４０％が、死亡する。
【００１１】
（現在の血小板細菌アッセイ）
血小板スクリーニングは、米国では輸血前に慣用的には実施されない。しかし、ＡＡＢＢは、細菌汚染についての輸血前血小板試験を必要とする新しい基準を提唱している。
【００１２】
いくつかの方法が、米国外で現在使用されている：
・（標準的細胞培養）：血小板をペトリ皿で培養し、染色した後で細菌を検出する。この方法は、非常に時間がかかり、自動化されておらず、かなりの血小板数を必要とする。
・ポール細菌検出システム（Ｐａｌｌ  ＢＤＳ）：細菌増殖の結果としての酸素消費の変化を使用する。細菌は酸素を消費するので、血小板サンプルにおける異常に低い酸素レベルは、細菌の存在を示す。
・ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔシステム：細菌の二酸化炭素産生を追跡することによって、細菌の存在を検出する。
・Ｈｅｍｏｓｙｓｔｅｍ：蛍光マーカーで細菌標識した後の蛍光検出に基づいて、血小板濃縮物における細菌検出のためのシステムを開発している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の簡単な要旨）
本発明の局面は、尿および全血の分析のための血小板特異的細菌アッセイシステムを包含する。このシステム（ＢＡＣ  Ｃａｒｄシステムとして知られる）は、細菌溶解とその後の等温ＤＮＡ増幅および検出を介する、細菌ＤＮＡ検出の同定に基づく。本発明のなお別の実施形態は、性感染病の存在を決定するための尿の分析および検出を提供する。
【００１４】
以下の例示的工程が、本発明の局面に従う微小流体カードにおいて実施される：実験（ｌａｂ）カードの入口上に配置した血液血小板バッグからサンプルを収集する：溶解チャネルにおいて細菌（および残存する白血球）を溶解する；細菌ＤＮＡを増幅チャンバ中の固体基材上に捕捉する；リボソームのＲＮＡ分子の小サブユニットをコードする遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子）から設計されたＤＮＡプライマーを、この固体基材上にポンピングした後、洗浄緩衝液をポンピングし、増幅チャンバを、等温増幅温度プロフィールに暴露する；増幅した１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを側方フローストリップ上にポンピングする；細菌ＤＮＡの存在を視覚的に指示する。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、アンチグロブリン型分類アッセイのための微小流体システムを包含し、このシステムは、中にフローチャネルを備える基材と、血液サンプルを受容するための入口ポートと、赤血球および血漿を分離するためのフィルターと、その血漿の一部を適切な試薬と混合するためのシステムと、加熱源と、アンチグロブリン血清を添加するためのポートと、試験結果を視覚的に調べるための窓とを、備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、流体サンプルのフローを操作して、分析のためにそのようなサンプルを調製するため、およびその流体サンプルを分析するために、種々の構成で配置された複数の微小流体チャネル、入口、バルブ、膜、ポンプ、液体障壁、および他の要素を利用する、微小流体デバイスおよび方法に関する。以下の説明において、本デバイスおよび方法の特定の具体的実施形態が示されるが、下記の種々の実施形態および要素が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく合わされ得るかまたは改変され得ることを、当業者は理解する。
【００１７】
図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、本発明の一実施形態は、尿および全血の分析のための細菌アッセイシステムである、使い捨て実験（ｌａｂ）カード１００デバイスを包含する。このシステムは、溶解およびＤＮＡ捕捉を実施するための流体小型化能力を備える。その後、カード上での等温増幅が、サンプル中の細菌を検出および同定するために実施される。
【００１８】
本発明のさらなる局面は、水溶液からＤＮＡおよび単離および増幅するため、そしてストリップリーダー（例えば、水中でのＥ．ｃｏｌｉの分析および性感染病（ＳＴＤ）の分析における使用のための、使い捨てカードが挙げられる）上でそのＤＮＡを検出するための、微小流体システムを包含する。本発明の一局面に従って、上記カードは、埋め込み膜を備え得、この埋め込み膜は、一定量の流体（例えば、約１００ｍｌの水または１０ｍｌの尿）がこの膜を通るのを可能にする。この膜を流体が通過すると、この膜は、細胞および細胞破片を濾過する。この膜上のいかなる生物学的破片も、溶解され得、そしてそのＤＮＡが、ＰＣＲ増幅プロトコル（適切な試薬および熱サイクリング条件）を介して増幅され得る。その後、増幅されたＤＮＡは、診断用読出しのために側方フロー検出ストリップに移され得る。
【００１９】
本発明のさらなる局面は、アンチグロブリン型分類アッセイのための微小流体システムを包含する。アンチグロブリンカード（ＡＨＧカード）は、多くの赤血球抗体がＩｇＧであり、感作された赤血球を直接には凝集しないという問題に取り組む。一旦、これらの抗体またはこれらの抗体により活性化された補体が、感作された赤血球に結合すると、これらは、抗ヒトグロブリンまたは抗補体試薬の添加によって除去される。この実施形態は、３つの領域（微小流体分離器；室温微小流体回路；および３７℃微小流体回路）を備える。
【００２０】
（細菌アッセイ微量流体カード）
本発明の局面は、尿および全血の分析のための血小板特異的細菌アッセイシステムを包含する。このシステム（ＢＡＣ  Ｃａｒｄシステムとして公知である）は、細菌の溶解、ならびにその後の等温ＤＮＡ増幅および検出を介する、細菌ＤＮＡ検出の同定に基づく。
【００２１】
すべての工程は、この微小流体カード上で実施される。先行技術の方法と比較して、本発明の全プロセスは、時間が減少し（例えば、９０分間未満）、感度が増加する（例えば、約１００細菌／ｍＬの感度）。以下は、このプロセスにおける例示的工程を挙げる：
・サンプルが、実験カードの入口に配置された血液血小板バッグから収集される
・細菌（ならびに残存白血球）が、溶解チャネルにおいて溶解される
・細菌ＤＮＡが、増幅チャンバ中の固体基材上に捕捉される
・ＤＮＡプライマー（リボソームのＤＮＡ分子の小サブユニットをコードする遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子またはＳＳＵ  ｒＲＮＡ遺伝子）から設計される）が、上記固体基材上全体にポンピングされ、その後、洗浄緩衝液がポンピングされ、その時、増幅チャンバが、等温増幅温度プロフィールに暴露される
・その後、増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡが、側方フローストリップ上にポンピングされ、そこで、細菌ＤＮＡの存在が視覚的に示される。
【００２２】
図２は、細菌アッセイカード（ＢＡＣ）を示し、このＢＡＣは、ＢＡＣカード１００を作動するために使用され得る計測システム２００とインターフェースしている。
【００２３】
（アンチグロブリン（ＡＨＧ）カード）
本発明のなお別の実施形態は、アンチグロブリン試験用のアッセイカード（ＡＨＧカード）である。
【００２４】
このＡＨＧカードは、多くの赤血球抗体がＩｇＧであり、感作された赤血球を直接には凝集しないという問題に取り組む。一旦、これらの抗体またはこれらの抗体により活性化された補体が、感作された赤血球に結合すると、これらは、抗ヒトグロブリンまたは抗補体試薬の添加により除去される。
【００２５】
図３に示されるように、本発明の一実施形態に従って、微小流体ベースのカードは、そのカード上でのＡＢＯ／ＲｈおよびＡＨＧアッセイに必要なすべての機能を実施する。この実施形態は、３つの領域：
Ｉ．微小流体血漿分離器
ＩＩ．室温微小流体回路、および
ＩＩＩ．３７℃微小流体回路
を備える。
【００２６】
領域ＩＩおよび領域ＩＩＩは、特別仕様の加熱パッドインキュベーターを使用して、種々の温度でインキュベートされる。このＡＨＧカードは、いかなる外部ポンピング手段も外部検出手段も必要としない。流体は、２００４年１月１４日出願した本出願人の同時係属中の出願「ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＣ  ＤＥＶＩＣＥＳ  ＦＯＲ  ＦＬＵＩＤ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ」（出願番号は未だ割り当てられていない）（これは、本明細書中に全体が参考として援用される）に記載されるような、一体型オン・カード（ｏｎ−ｃａｒｄ）ベローポンプを使用して、このカードに通される。結果は、視覚的に解明される。
【００２７】
（本発明の一局面に従い、図３に示されるフローチャートに従って、以下の工程が、上記カード上で実施され得る）
１．領域Ｉにおいて、全血サンプルが、遠心分離することなく、赤血球（サンプル１）と血漿（サンプル２）との微小流体的に分離される。
【００２８】
２．サンプル２が、２つのアリコート（サンプル２ａおよびサンプル２ｂ）に分離される。サンプル２ａは、領域ＩＩに移動され、サンプル２ｂは、領域ＩＩＩに移動される。
【００２９】
３．領域ＩＩにおいて、残留血漿タンパク質が、拡散ベースの分離によって、赤血球が豊富なアリコートから除去され、そのアリコートが、生理食塩水中で３〜５％赤血球濃度まで希釈される。その後、３つの個別のマイクロチャネルにおいて、サンプル１が、抗Ａ試薬、抗Ｂ試薬および抗Ｄ試薬と反応され、これらの試薬は、反応窓において視覚的に解明される。同時に、サンプル２ａは、２つの個別のマイクロチャネル中で、Ａ１赤血球およびＢ赤血球と反応され、これらの反応もまた、視覚的に解明される。
【００３０】
４．領域ＩＩＩにおいて、上記カードは、３７℃にされ、試薬、赤血球、ＳＩおよびＳＩＩ（希釈した赤血球）が、上記血漿とともに１５〜６０分間インキュベートされる。その血清が、上記赤血球上の抗体に特異的な抗体を含む場合、その抗体は、上記細胞を感作する（が、その抗体がＩｇＧである場合は、上記細胞を凝集はしない）。この混合物は、分離媒体を通って流れ、ここで、タンパク質が、上記サンプルから除去される。洗浄工程の後、ＡＨＧ血清が、マイクロチャネルに添加され、試験結果が、視覚的に解明される。
【００３１】
上記の工程に関して、工程１は、遠心分離することなく、血液サンプルを赤血球と血漿とに微小流体的に分離することを考察する。これは、多数の異なる様式で達成され得る。一実施形態において、拡散ベースの分離が、米国特許第５，９３２，１００号（本明細書中で参考として援用される）に考察されるように使用される。その差次的輸送には、上記のフローダイアグラムから省略された抽出流体が必要である。
【００３２】
なお別の実施形態において、粒子リフト効果が、使用され得る。マイクロチャネル中を流れる粒子は、その壁から離れるように流れて、このチャネルに隣接する粒子を含まない層を残す。この粒子を含まない薄層は、いくつかの手段（このチャネルの壁に穿孔すること、排出口を提供すること、または類似する手段を含む）によって、流体フローから剥がされ得る。これらの粒子は、粒子を含まない流体を剥ぎ取ることにも関わらず、中心に向かって移動し続け、従って、このプロセスは、フローチャネルを輪の状態で提供することによって反復され得る。
【００３３】
代替的実施形態において、フィルターが使用されて、粒子を含まない粒子を濾過し得る。代表的には、フィルターが使用される場合、フィルターは、理想的には、赤血球を詰まらせるが、本発明に従って、少量の血漿だけが、上記操作を実施するために必要され、従って、フィルターは充分である。
【００３４】
ねお別の代替的実施形態において、赤血球と血漿とを分離する手段は、接線フローフィルターを使用することを包含する。上記分離手段のなお別の実施形態において、沈降が、血液サンプルを沈めさせるために使用され得、それにより、赤血球が、ゆっくり沈む間に頂部から薄層を得ることを可能にする。また、必要な血漿が少量であることに起因して、沈降は、実行可能な選択肢である。
【００３５】
本発明のなお別の実施形態において、工程３および工程２は、拡散ベースの分離が赤血球アリコートから血漿および血漿タンパク質を完全に除去するために使用されるように、合わされ得る。
【００３６】
工程３は、抗体Ａ試薬、抗体Ｂ試薬および抗体Ｄ試薬と、血液サンプルとの反応を必要とする。これらの合わせたフローは、米国特許第６，１３６，２７２号（その全体が参考として本明細書中に援用される）に開示されるように、拡散、沈降、および凝固を介して混合され得る。
【００３７】
図４にあるフローチャートにさらに示されるように、血液型分類微小流体システムに関して上記含まれる開示と組み合わせて、上記アンチグロブリンアッセイに関して概説された工程が、単一のカード上で実施され得るか、あるいは、２つ以上のカードにて実施され得る。例えば、領域３において実施される機能を除去してインキュベーションを提供すると同時に、領域２における機能のために室温を維持することは、有利であり得る。しかし、代替的実施形態において、領域１、領域２、および領域３において概説された機能すべてを実施し、オン・カード（ｏｎ−ｃａｒｄ）加熱要素（例えば、上記血漿混合物を特異的に加熱してインキュベートする抵抗器）を提供することが、可能である。
【００３８】
微小流体診断システムのこの実施形態において、赤血球および希釈された赤血球（ＳＩおよびＳＩＩとして公知である）の不安定な性質に起因して、これらの試薬は、上記カード上に、例えば、抗体Ａ試薬、抗体Ｂ試薬、および抗体Ｄ試薬が事前ローディングされ得るので、事前ローディングされ得ない。
【００３９】
血漿混合物を含むカード部分を３７℃にするための加熱手段は、任意の加熱手段（フラットメタル抵抗器、赤外加熱手段、放射加熱手段、ペルチエ加熱手段、液体加熱手段、または他の適切な手段が挙げられる）であり得る。
【００４０】
（細菌アッセイの一般的説明）
本発明の一実施形態に従って、単一分析物診断デバイス／システム（ＳＡＤＤ／Ｓ）によって、水溶液サンプルからのＤＮＡの単離および増幅が可能になる。増幅したＤＮＡは、フィルター膜から、診断読み取りのために使用される側方フロー検出ストリップへと移される。
【００４１】
ある例示的使用において、上記デバイス／システムは、細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、β‐Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）の検出のために、水性サンプル中で見出されるＤＮＡの単離および増幅のために使用される。
【００４２】
上記の単離および熱増幅用の流体調製は、上記機器に代わって上記使い捨てカード上で生じる。上記カードは、上記ＤＮＡ増幅を完了するために必要なインキュベーションのために、上記機器から取り外される。インキュベーションの後、上記カードは、上記機器に戻され、ここで、増幅されたＤＮＡが、診断読み取り用の検出ストリップに移される。
【００４３】
本発明の別の使用は、性感染病の検出のための、尿からのＤＮＡの単離および増幅である。
【００４４】
図４Ａおよび図４Ｂは、ＢＡＣカードの実施形態を示す模式的フローチャートを示す。図４Ｃは、図４Ａおよび図４Ｂのフローチャートに示される各工程の記載された説明を提供する。図４Ａは、分析用のサンプルを捕捉した後にカード中にスナップ留めされ得る、フィルター膜モジュール（ＦＭＭ）を有する実施形態を示す。図４Ｂは、微小流体カード中に取り付けられるＦＭＭを有する実施形態を示す。
【００４５】
上記ＳＡＤＤシステムは、３つの主要成分：
・使い捨て診断微小流体カード（これは、水性サンプルから濾過された標的細胞を有するフィルター膜と、試験される水性サンプルにおけるＥ．ｃｏｌｉまたは他の細菌の存在を検出するために使用される側方フロー検出ストリップとを含む）；
・上記使い捨てカード上に上記流体を支持して制御する、機器；および
・増幅および検出用に機器制御により上記流体を駆動させる、ソフトウェア；
を備える。
【００４６】
上記微小流体カード、機器、ソフトウェアは、以下にさらに詳細に記載される。
【００４７】
（使い捨て微小流体カードの説明）
ＳＡＤＤ／Ｓ使い捨て微小流体カードは、多層微小流体カードである。図１Ａ、図１Ｂ、および図５は、上記微小流体カードの実施形態を示す。図１Ａは、微小流体カード１００を示し、このカードは、そのカード上に収容された膜またはフィルター１２０を有する。上記カード上には、廃棄物チャンバまたはレザバ１３０、側方フロー検出ストリップ１１０、および微小流体バルブ１７０、および微小流体フローチャネル１７０もまた、収容される。上記微小流体カード１００は、上記カードにサンプルをピペッティングまたは他の方法により分配するためのポート１４０を収容し得る。上記微小流体カード１００は、本発明の一実施形態に従う微小流体ポンプインターフェースポート１５０をさらに含む。これらのインターフェースポート１５０は、本明細書中にさらに詳細に記載される機器システムとインターフェースする。本発明の一局面に従って、上記微小流体カードは、増幅チャンバ１８０をさらに含み得る。
【００４８】
図１Ｂは、図１Ａの微小流体カードの線１Ｂ−１Ｂに沿った断面である。図１Ｂは、上記カードの種々の成分の、上記カードの厚み中での例示的位置を示す。微小流体フローチャネル１７０は、バルブ、レザバ、およびポートとインターフェースするように、上記カード中に種々の高さで配置される。光学的入力ポート１４０が、上記カードの表面の外側に延びて開放する。レザバ、側方フローストリップ、フローチャネル、バルブなどが、上記微小流体カード内に収容される。
【００４９】
図５は、上記カード上に収容される膜またはフィルター１２０を有する微小流体カード１００を示す、別の実施形態である。また、廃棄物チャンバまたは廃棄物レザバ１３０、側方フロー検出ストリップ１１０、微小流体レザバ５２０、５２２、５２４、５２６、微小流体フローチャネル１７０、および増幅チャンバまたは増幅レザバも、上記カード上に収容される。上記微小流体レザバ５２０、５２２、５２４、５２６は、例えば、シリーズＩＩの溶解溶液、酵素を含まないＮＡＳＢＡ溶液、酵素を含むＮＡＳＢＡ溶液、誘導溶液、検出溶液、洗浄溶液、または他の適切な物質を収容し得る。
【００５０】
図６は、本発明の原理に従う、流体サンプルの収集、溶解、洗浄、増幅、および検出のための多重独立システムを含む微小流体カードの例示的模式的な例を示す。
【００５１】
図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の原理に従う微小流体カード７００のなお別の例を示し、これは、微小流体カード７００中に入口ポート７１０をさらに含む。シリンジ７２０が、流体サンプルを微小流体カードに導入するために、図７Ｂに示される。あるいは、ピペットまたは他の適切なデバイスが、使用され得る。一実施形態において、シリンジ７２０の出口７３０が、微小流体カード７００の入口ポート７４０と係合するように構成される。
【００５２】
ＢＡＣカードは、本発明の一実施形態に従って以下の成分からなり得る：
（積層体層）  この層は、記載されるようなカードを通る協調したフローを促進するための微小作製された積層体である。集合した積層体は、大きさが約３．２５インチ×２．５インチであるカードを形成する。このカードの厚みは、層の数に依存して変化する。
【００５３】
（側方フローストリップ）  この側方フローストリップ（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｓｔｒｉｐ）は、上記カードの積層体構造中に埋め込まれて、標的細胞の単離および増幅されたＤＮＡの検出を促進する。ある例示的検出ストリップは、１．２５ｍｍ厚（０．５０インチ）×約２．５〜３．０ｍｍ幅×２５ｍｍ長さである。
【００５４】
（溶液レザバ）  ５つの溶液レザバが、カード上にあり、ユーザーが、標的ＤＮＡの単離、検出、および増幅のために上記溶液をカード上にピペッティングするのを可能にする。例示的実施形態において、３つのレザバにより、最小限４０μＬの溶液をローディングするのが可能である。２つのレザバにより、約１０μＬの溶液のローディングが可能である。
【００５５】
（廃棄物レザバ）  廃棄物レザバは、上記プロセスの単離および増幅工程の間に使用される、流体の収集および拘束を可能にする。例示的実施形態において、この廃棄物レザバは、約７５０μＬの廃棄物溶液を収集する。
【００５６】
（フィルター膜モジュール）  このフィルター膜モジュールは、サンプルの標的細胞を収集（結合）するために使用されるフィルター膜を収容する要素である。例示的実施形態において、上記モジュールは、上記カード上で実施される増幅およびインキュベーションプロセスの前に、１００ｍＬの水性サンプルの濾過を可能にする。この実施形態において、上記フィルター物質は、０．１７ｍｍ（０．００７インチ）厚の直径１３ｍｍのナイロン膜である。上記水性サンプルを濾過した後、上記フィルター膜モジュール（ＦＭＭ）は、濾過装置から取り外され、さらなる処理のために使い捨てカード中に挿入される。
【００５７】
（微小流体カードの性能／適合性の要件）
例示的実施形態において、微小流体カードの設計上の一目的は、本明細書中に概説されたような一連のサンプルアッセイ全体にわたる上記カードの微小流体機能が、８０％を超える信頼度で９５％信頼度を有することである。
【００５８】
上記カードの操作は、開始および検出プロセスの間に、流体が、上記カード上に収容されたままであるようであるべきである。上記カードから漏出がないことが、可能であるはずである。
【００５９】
使い捨てカードの設計および製造において使用される物質は、
水性流体が、実験カードの首尾良い機能に有意に影響を与える泡および間隙を形成することなく、チャネルを満たすのを可能にする。
【００６０】
上記物質は、標的サンプルの濾過、増幅、および決定のために使用される溶液および物質と適合性である。上記積層体は、上記溶液によって溶解も磨耗もされるべきではなく、暴露後にその流体を光学的に濁らせないものであるべきである。
【００６１】
上記物質は、本明細書の熱サイクリング組織化において概説されたインキュベーション時間および暴露時間と適合性であるべきである。
【００６２】
上記物質は、標的物質の濾過、増幅、および診断検出に干渉する成分を滲出すべきではない。
【００６３】
上記使い捨てカードは、標的物質の視覚的検出を読み取るために使用される領域において、光学的に透明であるべきである。
【００６４】
使い捨てカードは、熱サイクリングプロセス以外は通常の実験室条件（１０〜３０℃および５％〜９０％相対湿度）下で使用され得、かつ海抜１０，０００フィートまでで操作可能であり得るべきである。
【００６５】
上記微小流体カードは、清潔であるが滅菌はせずに提供される。カードは、濾過、増幅、および検出を妨害する、粒子状物質および他の混入物を含まない。
【００６６】
（本発明の一実施形態に従う製品の仕様）
【００６７】
【表１】
2006520190.tif 000003
（上記機器システムの説明）
図２に示されるような微小流体カード上で流体を支持および制御する機器は、持ち運び可能であるために充分に小さいものであり得る。上記機器は、上記微小流体カードとインターフェースするマニホルドを備える。上記ＳＡＤＤ／Ｓ機器は、コンピューターにより制御されるプラットフォームである。本発明の一実施形態に従って、上記機器は、以下の要素を含む：
（マニホルドアセンブリ）  このマニホルドは、診断試験の間に使用される使い捨てカードを固定する。このマニホルドは、操作の間に開閉するために微小流体バルブに送達される圧力および真空を制御する、選択された数のソレノイド作動式空気バルブを有する。
【００６８】
（ポンプアセンブリ）  ４つの２５０μＬポンプを備えるポンプアセンブリである。これらのポンプは、非拍動性フローの、自己開始式の、精密な、微小シリンジ様ポンプである。１ストローク当たりの最大ポンプ体積は、２５０μＬであり、最大流量は８μＬ／秒であり、最小流量は、５ｎＬ／秒である。
【００６９】
（ポンプアセンブリエレクトロニクス）  このポンプアセンブリエレクトロニクスは、上記ポンプと上記マニホルドの選択された数の空気バルブとを作動するために使用される個々のステッパーモーターを制御するためのモーターコントローラーハードウェア、ならびにシステム電源を収容する。
【００７０】
（試薬レザバ）  この実施形態の機器上には、２つのレザバが存在する。一方のレザバは、必要な洗浄緩衝液を収容する。第二のレザバは、フルオリナート（ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ）緩衝液を収容する。
【００７１】
（試薬供給ライン）  この試薬供給ラインは、上記機器の作動の間に使用される試薬貯蔵レザバに接続される。
【００７２】
（真空／圧力バルブコントローラー）  上記実施形態におけるカード上のバルブは、空気により作動される。上記真空／圧力バルブコントローラーユニットは、一群のコンピューター制御電子バルブから構成されており、これらは、真空ポンプと空気圧ポンプとを収容するユニットにより供給される真空または圧力のいずれかに、オン・チップ（ｏｎ−ｃｈｉｐ）バルブが暴露されるのを可能にする。
【００７３】
（シリアルポート）  シリアルポートが、初期実行性機器のために使用される。このポートは、上記機器のプラットフォームと、マイクロプロセッサとの間の連絡のために使用される。
【００７４】
（性能の要件）
カードの挿入時から試薬のローディング後に、上記単離および結合工程は、数分間以上を必要としない。熱サイクリング（インキュベーション）プロセスの後、上記診断試験は、数分間以上を必要としない。
【００７５】
上記機器は、すべての要素が、通常の実験室条件（１０〜３０℃および５％〜９５％相対湿度）下で使用され得かつ海抜１０，０００フィートまでで操作可能であり得るように、構築されるべきである。上記機器は、通常の洗浄剤に耐え、かつ上記アッセイの間に使用される溶液への暴露に耐えることが可能であるべきである。
【００７６】
上記機器の信頼度は、上記システムが、サービスと必要する前に平均１００個のカートリッジを実行するようであるべきである。一日一回、上記ポンプアセンブリから空気を除去するリンスプロセスが、実施されるべきである。リンスカートリッジが、この予防的メンテナンス工程のために供給される。
【００７７】
ＰＣを備えていない機器は、２５ｌｂｓ未満の重量であるべきであり、手で持ち運び可能であるような構成であるべきである。
【００７８】
（適合性の要件）
上記機器は、以下の仕様のＰＣと適合性であるべきである：最低限１２８ＭＢ  ＲＡＭを備えた、最低限Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）またはＣｅｌｅｒｏｎ  ３３３ＭＨｚのマイクロプロセッサ；最低限１ギガバイトのハードドライブ；ソフトウェア設定のためのＣＤ  ＲＯＭ；最低限１つのシリアルポート；オペレーションシステムＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＮＴ（Ｓｅｒｖｉｃｅパック３．０以降）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ２０００またはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ＭＥ。
【００７９】
上記機器は、ｐＨ１〜１３の水性流体と適合性であるべきである。ポンプは、フルオリナート（ｆｌｏｕｒｉｎｅｒｔ）プッシャー流体およびＴＲＩＳ洗浄緩衝液と適合性であるべきである。上記機器は、電力条件１００〜２４０ＶＡＣ  ５０／６０Ｈｚを有し、２つの１５Ａアウトレットを備える。上記機器は、通常の実験室洗浄剤と適合性であるべきである。
【００８０】
（ソフトウェアの説明）
ＳＡＤＤ／Ｓオペレーションソフトウェアは、ユーザーが、上記機器を制御するのを可能にし、上記機器の機能を制御する。上記ＳＡＤＤ／Ｓオペレーションソフトウェアは、モーションコントローラー、パーソナルコンピューター（ＰＣ）、カートリッジマニホルド、およびカートリッジを備える、完全な機器システムのうちの一要素である。
【００８１】
このソフトウェアは、流体のポンピングを制御するためのＰＣ中のオフ・ザ・シェル（ｏｆｆ−ｔｈｅ‐ｓｈｅｌｌ）モーションコントローラー、およびカートリッジバルブ起動のための真空および加圧空気を提供するための真空／圧力ボックスを備える、既存のモーションコントロールシステム（例えば、Ｏｌｓｓｏｎモーションコントロールシステム）とインターフェースする。
【００８２】
（性能要件）
そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、そのグラフィカルユーザーインターフェース（ＲＳ２３２ケーブルを介する既製のコントローラーまたはＰＣコンピューター後面を介するモーションコントローラー（ｍｏｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）のいずれかにつながる）およびユーザーの安全性からなる。
【００８３】
そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、ユーザーが、その動作制御システムからモーター増幅器ボードへと通り抜けるシグナルを制御することを可能にする。そのポンプ状態および動作増幅器ボードからの制御シグナルは、その動作制御システムへと通過し、ここでユーザーに、そのシステム状態が知らされる。
【００８４】
そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、そのカードバルブを制御するために使用される真空および加圧空気のオン／オフ制御をさらに提供しうる。そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、全ての要素の完全なユーザー制御を提供する。そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、キーボードによって利用可能な隠されたイン・ハウスモード（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｍｏｄｅ）を有し得、維持を可能にする。
【００８５】
（互換性要件）
そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、以下の仕様を有するPCと互換性があることとする：（最低限）１２８ＭＢ  ＲＡＭを備えた（最低限）Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）またはＣｅｌｅｒｏｎ（登録商標）３３３ＭＨｚ（最低限）マイクロプロセッサ；（最低限）１Ｇバイトハードドライブ；ソフトウェアインストールのためのＣＤ  ＲＯＭ；（最低限）１つのシリアルポート；Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴ（サービスパック３．０以降）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００もしくはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＭＥのオペレーティングシステム。
【００８６】
そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、標準Ｉ／Ｏコントローラーおよびモーションコントローラー（例えば、Ｏｌｓｓｏｎ  I／ＯコントローラーおよびＭｏｔｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）と互換性があることとする。そのＳＡＤＤ／Ｓオペレーティングソフトウェアは、既製のＰＣ常駐モーションコントローラーと互換性があることとする。
【００８７】
（推奨される種々の互換性要件）
そのＯ／Ｓは、緊急停止ボタンを明確に規定するものする。そのＯ／Ｓメニューレイアウトは、マイクロソフト製品において使用される標準レイアウト（左側にファイル、右側にヘルプなど）に従うこととする。全ての制御は、非国際的アクチベーションを避けるために、容易に操作され、区切られるように十分大きい。
【００８８】
制御およびディスプレイの状態は、白黒スクリーン上で認識可能であることとする。ポップアップ情報が提供されることとする。ヘルプファイルが提供されることとする。しばしば使用されるメニュー項目は、キー操作として規定されることとする。２段階の深さを超えてネストされるメニューはない。Ｏ／Ｓユーザースクリーンは、眼精疲労を軽減するためにカラー化されることとする。可能な場合は常に、ユーザーによる不正確な値に入力または不正確な制御の作動が防止されることとする。可能な場合は常に、最小フォントサイズは、１２ポイントであることとする。
【００８９】
（用途および操作）
そのＳｉｎｇｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ／Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＤＤ／Ｓ）の１つの興味深い用途は、細菌の存在（例えば、水中のＥ．ｃｏｌｉ）を決定することである。濾過水サンプルは、その診断カード上に導入され、ここでデバイスシステムは、水サンプルからＤＮＡを単離および増幅する。その増幅されたＤＮＡは、次いで、診断読み取りのために使用される所有側方フロー検出ストリップに曝される。
【００９０】
図４Ａおよび４Ｂのフローチャートに、ならびに図４Ｃにおいて表形式で例示されるように、そのシステムの操作は、以下のとおりである：
ユーザーは、まず、フィルタモジュールおよび濾過プロセスを介してサンプルを捕捉する。そのフィルタモジュールは、そのカードへのそのモジュールの取り付けまたはそのカードにおけるそのモジュールの製造のいずれかによって、使い捨て診断微小流体カードに適合性である（図７Ａおよび７Ｂを参照のこと）。
【００９１】
サンプルの獲得後、ユーザーは、濾過装置からフィルタモジュールを取り出し、そのフィルタを使い捨て微小流体カードに挿入する。あるいは、そのフィルタモジュールまたは膜は、その微小流体カードに取り付けられ得る。
【００９２】
ユーザーは、次いで、サンプルを含むそのカードを、膜上に含まれる標的材料の診断評価を行う目的でそのコンピューター制御機器のマニホルドに挿入する。
【００９３】
機器のプロセスを実行する前に、ユーザーは、機器が最小量の洗浄緩衝液を有することをチェックするべきである。この洗浄緩衝液は、各試験サンプルが実行されている間に消費される。
【００９４】
診断試験を行う前に、ユーザーは、機器は、ポンプ２、３および４のために最小量のプッシング緩衝液（代表的には、フルオリナート（ｆｌｕｏｒｉｎｅｒｔ））を有するべきである。
【００９５】
プロセスを開始する前に、ユーザーは、以下の溶液をその試験前にカード上にピペットで移す（充填する）：
・誘導溶液−２０〜４０μｌ（推定容量）
・Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ溶解溶液−２０〜４０μｌ（推定容量）
・酵素溶液非含有ＮＡＳＢＡ−４〜４０μｌ（推定容量）
・ＮＡＳＢＡ酵素溶液−４〜８μｌ（推定容量）
・検出プローブ溶液−２．５〜５．０μｌ（推定容量）。
【００９６】
ユーザーは、機器を初期化し、そのＲＵＮプロセスを初期化する。そのＲＵＮプロセスは、流体プロセスを開始して、洗浄緩衝液、誘導溶液および検出溶液の流れを制御し、このことは、フィルタ膜材料に標的ＤＮＡを単離および結合する。例示的なＲＵＮプロセスは、図３Ｂに概説される。その流速およびポンプ輸送容積は、表に列挙される。そのＲＵＮプロセスからの全ての廃棄物は、そのカード上に収容される。
【００９７】
そのＲＵＮプロセス（単離および結合工程）を完了した後、その技術者は、ＤＮＡシグナルを増幅するために使用されるサーモサイクリング／インキュベーションプロセスを始める。その使い捨てカードは、機器マニホルドから外され、そのサーモサイクリングプロセスは、市販のサーマルサイクラーで完了される。
【００９８】
代替的実施形態において、そのサーマルサイクラーは、その機器の一部ではなく、なお別の実施形態において、その機器マニホルドは、既存の市販のサーマルサイクラーと適合するように設計され、要件によってサーマルサイクルされている間にそのマニホルドにおいて保持されるそのカードの性能を提供する。
【００９９】
図８は、本発明と共に使用するためのサーモサイクラーの一実施形態を例示する。図８は、本発明の原理に従う、熱伝達ロッドおよびヒートブロックに取り付けられるプレートの断面図である。図８の熱伝達システムは、ロッド８１０、ロッド８１０における温度制御センサ孔８２０、熱ロックドライバスヒートブロック８５０を備える。そのロッド８１０は、ヒートブロック８５０の中へと延びる。プレート８３０は、そのロッド８１０を取り囲み、シリコーン熱化合物（ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）８４０は、そのロッド８１０とそのヒートブロック８５０との間にいかなる隙間をも埋める。温度制御プローブ（示されず）は、温度制御センサ孔８２０に挿入され、その熱電対は、プレート８３０に接続され、そのプラテンの上部の表面温度がモニターされる。そのロッド８１０およびプレート８３０は、ガラスまたは任意の他の熱伝導性金属から作成されうる。図９は、本発明の原理に従う絶縁およびプラテンアセンブリの断面である。
【０１００】
図１０〜１４は、上記のサーモサイクラーに従って、本発明の原理を例示するグラフである。図１０は、本発明の原理に従うシステムを加熱するための温度  対  時間のチャートである。図１１は、本発明の原理に従う温度  対  時間のグラフである。図１２は、本発明の原理に従う温度  対  時間のグラフである。図１３は、本発明の原理に従う温度  対  時間のグラフである。図１４は、本発明の原理に従う温度  対  時間のグラフである。
【０１０１】
そのサーモサイクリングプロセスは、以下であるように同定される：
【０１０２】
【表２】
2006520190.tif 000004
そのサーモサイクリングプロセスの後に、ユーザーは、検出プロセス工程のための機器にそのカードを再インストールする。これは、側方フロー検出ストリップへのチャネルを開き、膜を横切って洗浄緩衝液をポンプ輸送する。このことは、検出ストリップを検出のための化学製品に曝す。
【０１０３】
適切な曝露時間を与えた後、ユーザーは、その側方フロー検出ストリップを読み取って、その標的の存在または非存在を決定する。
【０１０４】
その検出ストリップを読み取った後、そのカードは、その機器から取り外され、廃棄される。サンプルからの全ての廃棄物は、カード上に収容される。
【０１０５】
そのＳｉｎｇｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ／Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＤＤ／Ｓ）のなお別の用途は、尿から性感染症の存在を決定することである。尿サンプルは、その診断カード上に導入され、ここでそのデバイスシステムは、性感染症の検出のために、尿からＤＮＡを単離および増幅する。
【０１０６】
以下の実施例は、例示目的で提供されるのであって、本発明を限定するとは決して意図されない。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１：Ｔｈｅｒｍａｌ−Ｌｏｋ  Ｄｒｙ−ＢａｔｈからＭＩＣＲＯＮＩＣＳ積層体への熱伝達を試験するカード／マニホルド）
目的：
Ｔｈｅｒｍａｌ−Ｌｏｋ  Ｄｒｙ−Ｂａｔｈ熱プレートから局所化界面へ、微小流体積層体へ熱を伝達する効率および方法を決定する。
【０１０８】
・Ｍｉｃｒｏ  Ｈｙｄｒｏ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ（ＭＨＭ）によって保持される積層体。
【０１０９】
・積層体の小さな局所化領域への熱伝達。温度は、６０〜９５℃。カードの残りは、可能な限り、熱から分離される
・可能な限り積層体に近いように、温度制御される
・Ｍｉｃｒｏ  Ｈｙｄｒｏ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ（ＭＨＭ）およびその取り付けプラットフォームは、その熱源から是膣炎されるべきである。
【０１１０】
要旨：
４ｍｉｌ積層体層を介する制御された様式で熱を伝達する能力は、明らかに実現可能である。その最良の結果は、ポリエステル表面を真鍮に結合するために、「ウェット」シリコーン熱グリースの薄い層を使用することによって達成された。さらなる試験は、使用される大きさの湿潤流体充填チャンバの温度を確立するために行われるべきである。本発明者らの過去の経験では、その液体が、マイラーより遙かに良好に熱を伝達し、このような少量に対する熱拡散がほぼ均一な温度を与えるので、これは、底部ポリエステル温度を非常に類似してまねるはずであることが示された。試験は、このことを確認しうる。
【０１１１】
推奨：
Ｔｈｅｒｍａｌ−Ｌｏｋ  Ｄｒｙ−Ｂａｔｈを、ＤＮＡを増幅し、ＤＮＡの鎖をほどく（ｄｅ−ｓｔｒａｎｄｉｎｇ）ために温度源として使用し得る。
【０１１２】
装置：
・外部温度制御プローブを備えたＴｈｅｒｍａｌ−Ｌｏｋ  Ｄｒｙ−Ｂａｔｈ
・ＵＳＡ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．
・Ｆｌｕｋｅ  ５２  温度計
・Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ  μ流体カード上に取り付けられた０．００５直径Ｔｙｐｅ  Ｋ熱電対。０．００４マイラーにより覆われる
・Ｔｈｅｒｍｏｌｉｎｋ  １０００  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ。Ｐ／Ｎ  ０００００６  ＡＡＶＩＤ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．Ｌａｃｏｎｉａ  ＮＨ。
【０１１３】
・真鍮加熱ロッドおよび絶縁プレート。界面直径  ０．２５０インチ。
【０１１４】
・Ｍｉｃｒｏ  Ｈｙｄｒｏ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ
絶縁プラテン。
【０１１５】
（行われる試験）
・そのシステムを加熱するための総時間
＊ヒーターの温度
＊積層体端部での熱伝達ロッドの温度
＊積層体の温度
＊プラテンの温度
＊プラテンの最大温度
＊操作温度に予め温められたシステムにより積層体を加熱するための時間。積層体をヒーターの上に置いて、試験を開始する。
【０１１６】
＊接触界面を乾燥させる。
【０１１７】
＊シリコーン化合物界面を「ぬらす」
＊ロッド上のシリコーンエラストマー
＊積層体上のシリコーンエラストマー。
【０１１８】
（設定）
そのＴｈｅｒｍａｌ−Ｌｏｋ  Ｄｒｙ−Ｂａｔｈ熱プレート中の孔の１つに合うように、真鍮熱伝達ロッドを製造した。熱伝達がより効率的であることが必要であると決定した後、ヒーター全体を覆う平坦な真鍮プレートを、熱伝達ロッドに対してハンダ付けした。
【０１１９】
そのロッドは、０．２５０インチの上部直径およびその側面にその温度制御プローブ用の小さな孔を有する。そのロットはまた、プレートを絶縁して、そのマニホルドおよびカードの残りを遮蔽するための空間を与えるために十分長い。
【０１２０】
そのプラテン絶縁材料は、ポリスチレンである。そのＭＨＭ（Ｍｉｃｒｏ  ｈｙｄｒｏ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ）を保持するためのプラテン上部プレートは、絶縁材料を使用して製作される。
【０１２１】
熱伝達ロッドおよび絶縁の詳細については、図を参照のこと。
【０１２２】
継続されるデータ：
センサプローブにおけるその熱伝達ロッドとその積層体との間のΔ温度、すなわちその温度差は、本発明らは、その界面において有意な量の熱を失っていることを示す。サンプルを、開いた空間で３０秒間に記録した。そのカードを覆い、その真鍮加熱ロッドへのその気流経路をブロックして、結果に影響を及ぼす周囲の室温変動および気流を防止することによって、いくつかの改善が得られた。
【０１２３】
【表３】
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その「ウェット」Ｔｈｅｒｍｏｌｉｎｋ  １０００化合物は、その最小の温度Δによって見られるように、最も効率的である。そのカートリッジを上に置く前にその化合物を付与しなければならないという観点から少々乱雑であるが、予備的実現可能性試験については、それは適切であるはずである。
【０１２４】
そのエラストマーは、乾燥接触に対する改善である。電子部品のためにヒートシンクパッドとして使用されるいくつかの型が容易に利用可能である。このパッドは、その積層体上またはその中にまたはロッド端部上に取り付けられ得る。さらなる試験は、この適用のために最良であることを決定するために異なる材料で行われ得る。
【０１２５】
温度におけるΔは、重要な測定値である。なぜなら、それは、ヒーターと積層体との間の連結バリエーションが変化し、よって温度変動を与える可能性を排除するからである。しかし、他の重要なパラメーターは、温度安定性である。そのヒーターおよびカードを連結した後４分で始まるそのサンプルの標準偏差およびΔ温度を計算し、上記の表において示す。４つの場合のうちの３つにおいて、そのポリエステル温度は、そのロッド温度よりも実際に安定であった。そのΔ標準偏差をみることによってその制御されたロッドにおけるバリエーションを抽出すると、全ての場合において、マイラー温度のバリエーションが、そのロッド温度と異なる程度未満であったことが明らかになる。そのロッド温度が十分に制御されれば、そのポリエステル温度が同様に安定である。
【０１２６】
任意の連結方法が十分に安定であるようであるが、明らかに、その「ウェット」シリコーン化合物連結は、最もよく制御され、かつ真鍮チップにおける設定温度に最も近い。
【０１２７】
注意：
その熱伝達ロッド端部のサイズは、その積層体流体チャンバのサイズに対する大まかな推測に基づいた。より小さなまたはより大きな界面面積は、それに応じて、熱伝達速度に影響を及ぼす。
【０１２８】
ロッド上のシリコーンパッドからのデータは、そのポリエステル温度において見えない温度の減少を示す。ここで、ヒーターロッドにおける熱電対の接触が、ずれて、熱的接続効率的でなくしている可能性があることが推測される。
【０１２９】
積層体に埋め込まれた熱電対は、固体マイラーをその後ろに有することにもまた注意すべきである。「チャンバ」における温度を測定することでなく、ヒーターの表面の０．００４インチ上で積層体の温度を測定することである。
【０１３０】
プロセス：
全てのポンプについて：
１）サンプルレザバをピペットを用いて満たす。（Ｖ３、Ｖ４バルブを閉じ、そしてＶ５バルブを開ける）
２）「Ａ」増幅チャンバを満たす（Ｖ４、Ｖ５バルブを閉じ、そしてＶ３バルブを開ける）
３）「Ｂ」増幅チャンバを満たす。（Ｖ３、Ｖ５バルブを閉じ、そしてＶ４バルブを開ける）
４）特別に設計したヒートブロック上にカードを置く
５）Ａ増幅チャンバとＢ増幅チャンバとの間で交互に、低速（約１０μＬで動く）で前後にポンプを振動させる
６）９０分間加熱した後、増幅混合物を移動させて、ピペットで取り出すために排出する。
【０１３１】
本明細書中で言及され、そして／または出願データシート中に列挙される上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０１３２】
前述から、本発明の特定の実施形態が例示目的で本明細書中に記載されてきたものの、種々の改変が、発明の趣旨および範囲から逸脱することなく成されうることが理解される。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるとおりであることを除いて、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の原理に従う微小流体分析の模式図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、線１Ｂ−１Ｂに沿った図１Ａの断面である。
【図２】図２は、本発明の原理に従う微小流体分析カードにおいて流体フローを作動するための機器の模式図を示す。
【図３】図３は、本発明の原理に従う微小流体アンチグロブリン分析を実施する診断デバイスのためのプロセスフローチャートを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の原理に従って血小板中の細菌を検出するための細菌診断デバイスについてのプロセスフローチャートを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の原理に従って血小板中の細菌を防御するための細菌診断デバイスを処理するためのフローチャートを示す、本発明のなお別の実施形態である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図４Ｂに含まれるフローチャートの工程を示すチャートである。
【図５】図５は、図４のフローチャートに従う微小流体デバイスの模式図である。
【図６】図６は、本発明の原理に従う例示的細菌アッセイのフローチャートである。
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の原理に従うシリンジの接続ポートを示す細菌アッセイカードの一実施形態を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の原理に従うシリンジの接続ポートを示す細菌アッセイカードの一実施形態を示す
【図８】図８は、本発明の原理に従うヒーターブロック中に取り付けられた熱移動ロッドおよびプレートの断面図である。
【図９】図９は、本発明の原理に従う絶縁およびプラテンアセンブリの断面である。
【図１０】図１０は、本発明の原理に従う、システムを加熱するための時間に対する温度のチャートである。
【図１１】図１１は、本発明の原理に従う、時間に対する温度のグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の原理に従う、時間に対する温度のグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の原理に従う、時間に対する温度のグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の原理に従う、時間に対する温度のグラフである。
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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