(57)【要約】本発明は，非生理学的に増加した細胞内レベルのの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法に関し，該方法は，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に薬学的有効量のＭＩＤ１またはＭＩＤ２の群より選択される蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸を投与することを含む。本発明はさらに，非生理学的に減少した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法に関し，該方法は，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量のＭＩＤ１またはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメント，または，α４に対する結合部位を含む有効量のＰＰ２Ａｃのフラグメント，または，有効量のアミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチドフラグメント，または，有効量の前記ペプチドフラグメントをコードする核酸分子，または，有効量のＭＩＤ１とα４との相互作用を妨害する分子，または，有効量のＭＩＤ１および／またはα４の発現または活性を妨害する分子を投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非生理学的に増加した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法であって，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量のＭＩＤ１またはＭＩＤ２の群より選択される蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸を投与することを含む方法。
【請求項２】
非生理学的に減少した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法であって，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量のＭＩＤ１またはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメント，または，α４に結合するが固有のホスファターゼ活性を有しない有効量のＰＰ２Ａｃのフラグメント，または，ＰＰ２Ａｃに対する結合部位を含むα４のペプチド性フラグメント（好ましくは，アミノ酸１１１−２０２），または，アミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメント，または，前記ペプチドフラグメントをコードする有効量の核酸分子，または，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２とα４との相互作用を妨害するか，またはα４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用を妨害する有効量の分子，または，これらの相互作用の制御を妨害する有効量の分子，または，ＭＩＤ１および／またはα４の発現または活性を妨害する有効量の分子を投与することを含む方法。
【請求項３】
前記疾患が骨粗鬆症である，請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が神経変性性疾患であるか，またはアポトーシスと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患である，請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記疾患がアルツハイマー病またはタウロパシーである，請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記疾患が癌または転移である，請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記疾患が炎症性疾患である，請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記蛋白質または前記ペプチドフラグメントがＴＡＴに融合されている，請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＭＩＤ１および／またはα４の発現を妨害する分子がＲＮＡｉである，請求項２記載の方法。
【請求項１０】
ＭＩＤ１とα４との相互作用を妨害する前記分子が小分子である，請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患がオピッツ疾患である，請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＭＩＤ１またはＭＩＤ２の群より選択される蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸を含む組成物。
【請求項１３】
ＭＩＤ１またはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであってＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメント，または，α４に結合するが固有のホスファターゼ活性を有しない有効量のＰＰ２Ａｃのフラグメント，または，ＰＰ２Ａｃに対する結合部位を含むα４のペプチド性フラグメント（好ましくは，アミノ酸１１１−２０２），または，アミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメント
または前記ペプチドフラグメントをコードする有効量の核酸分子，または，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２とα４との相互作用を妨害するか，または，α４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用を妨害する有効量の分子，または，これらの相互作用の制御を妨害する有効量の分子，またはＭＩＤ１および／またはα４の発現または活性を妨害する有効量の分子を含む組成物。
【請求項１４】
医薬組成物である，請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＭＩＤ１とα４との相互作用を妨害する分子を同定する方法であって，
（ａ）候補分子の存在下で，適当な条件下で，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２，またはＭＩＤ１もしくはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメントを，α４または好ましくはアミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメントと接触させ，または，α４または好ましくはアミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメントを，ＰＰ２ＡｃまたはＰＰ４ＣまたはＰＰ６Ｃ，またはＰＰ２ＡｃもしくはＰＰ４ＣもしくはＰＰ６ｃのペプチド性フラグメントと接触させ；そして
（ｂ）前記候補分子が前記相互作用を妨害するか否かを評価する，
ことを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本明細書においては種々の文献が引用される。これらの従来技術文献および製造元のマニュアルの開示内容は，その全体を本明細書の一部としてここに引用する。ただし，これらの文献が本発明の特許性に関連する従来技術を構成すると認めるものと解釈すべきではない。
【０００２】
発明の背景
種々の疾患が蛋白質の過剰リン酸化または過少リン酸化に関連することが知られている。これらの蛋白質は，構造蛋白質であってもよく制御蛋白質であってもよい。
【０００３】
構造的蛋白質の過剰リン酸化が観察される疾患の一例はアルツハイマー病である。この場合には，微小管結合タウ蛋白質は非生理学的に高い量のリン酸化残基を含み，これは対になった螺旋フィラメントの形成の原因となりうる。非生理学的レベルのリン酸化微小管結合蛋白質が観察される別の疾患には，脳回欠損Ｉおよびオピッツ症候群が含まれる。
【０００４】
オピッツＧ／ＢＢＢ症候群（ＭＩＭ３０００００）は，主として腹側正中に影響を及ぼす先天的な疾患である。顕著な症状発現には，脳梁，両眼隔離症，唇裂および口蓋の形成異常を伴う精神遅滞，気管食道のフィステルおよび尿生殖器欠陥が含まれる。さらに，無孔肛門および処女膜および心臓奇形，例えば，ファロー四徴候が記載されている（１）。条件は遺伝的に不均質である：Ｘ連鎖（Ｘｐ２２．３）および常染色体座（２２ｑ１１．２；ＭＩＭ１４５４１０）の両方が記述されている（２）。２つの型の疾患は臨床的に区別できない。我々は先に，ポジショナルクローニング法を用いてＸ連鎖型の候補遺伝子を同定してＭＩＤ１と命名し，これがＯＳを有する個体において選択的に変異していることを見出した（３）。
【０００５】
ＭＩＤ１によりコードされる蛋白質は，ＲＩＮＧフィンガー蛋白質ファミリーに共通する５つの別々のドメインを含む。第６のＣ末端Ｂ３０．２ドメインはこれらの蛋白質のサブセットで生ずる。これまでに患者で同定されている変異のほとんどは，ＭＩＤ１遺伝子のその部分のＯＳクラスターと連鎖している。最近，ＭＩＤ１が微小管と結合することが示され，このことは，これが微小管の動力学において生理学的役割を果たすことを示す。変異型のＭＩＤ１は微小管と結合しないが，その代わりに細胞質クロットを形成する（４）。
【０００６】
ＭＩＤ１のＮ末端は，４つの独立したドメイン，すなわち，ＲＩＮＧフィンガー，２つのＢ−ｂｏｘおよびコイルドコイルドメインから構成されるモチーフ（ＲＢＣＣ）を特徴とする。このドメイン構造は，ＲＩＮＧフィンガー蛋白質の拡大しつつあるファミリーの間で保存されている。これらの蛋白質のいくつかにおいて高分子蛋白質複合体の形成が記述されており（５，６），一方，異種蛋白質−蛋白質相互作用は，ＲＢＣＣモチーフに起因する（７）。ＲＩＮＧフィンガードメインにより媒介される標的蛋白質のユビキチン化は，多くの蛋白質の翻訳後制御において重要である（８−１１）。
【０００７】
ＭＩＤ１をおとりとして用いる酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより，蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）（１２）の制御サブユニットであるα４蛋白質（Ｓｏｎｔａｇ，Ｅ．．；２００１）がＭＩＤ１のＮ末端領域と相互作用することが示された。さらに，ＯＳを有する個体に由来する胚性線維芽細胞株において微小管結合ＰＰ２Ａ（１３）が著しくアップレギュレートされることが示された。我々のデータは，ＭＩＤ１がその制御サブユニットα４に結合することによりＰＰ２Ａに向かうユビキチン化機構をターゲティングすることに関与していること，および，微小管結合蛋白質のＳｅｒ／Ｔｈｒ過少リン酸化がオピッツ症候群の病因に極めて重要であるかもしれないことを示す。
【０００８】
さらに，ＭＩＤ１およびＭＩＤ２は，ホモおよびヘテロ二量体化してα４を微小管につなげることができ，このことにより，ＭＩＤ１およびＭＩＤ２のＢ−ｂｏｘがα４との相互作用を媒介しうることが示されている（Ｓｈｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）。ＭＩＤ１の微小管との結合は，ＭＡＰキナーゼおよび蛋白質ホスファターゼが関与する動的リン酸化により制御されている（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０００９】
従来技術は，ＭＩＤ１がα４を介してＰＰ２Ａｃと相互作用することを確立したが，これまでのところ，どのようにして微小管と結合するＰＰ２Ａｃの細胞内の量を有効に変化させることができるかの手がかりはない。上述したように，多くの疾患が非生理学的レベルの微小管結合ＰＰ２Ａｃと関連するかまたはこれにより引き起こされるため，そのような疾患を治癒するための有効な方法を得るために，ＰＰ２Ａｃのこのような非生理学的細胞内レベルを生理学的レベルに有効に変化させるための手段および方法を提供することが求められている。
【００１０】
この技術的課題は，特許請求の範囲にその特徴が示される態様を提供することにより解決される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は，非生理学的に増加した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法に関する。該方法は，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量の，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２の群より選択される蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸を投与することを含む。本発明はさらに，非生理学的に減少した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法に関する。該方法は，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量のＭＩＤ１またはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメント，または，α４に結合するが固有のホスファターゼ活性を有しない有効量のＰＰ２Ａｃのフラグメント，または，ＰＰ２Ａｃに対する結合部位を含むα４のペプチド性フラグメント（好ましくは，アミノ酸１１１−２０２），または，アミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメント，または，前記ペプチドフラグメントをコードする有効量の核酸分子，または，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２とα４との相互作用を妨害するか，またはα４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用を妨害する有効量の分子，または，これらの相互作用の制御を妨害する有効量の分子を投与することを含む。さらに，本発明は，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２とα４との相互作用を妨害する分子を同定する方法に関し，該方法は，適当な条件下で，候補分子またはＭＩＤ１，ＭＩＤ２および／またはα４の活性の発現を妨害する有効量の分子の存在下で，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２またはＭＩＤ１もしくはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメントを，α４またはα４のペプチドフラグメントと接触させ；そして，前記候補分子が前記相互作用を妨害するか否かを評価する，ことを含む。最後に，本発明は，上述の蛋白質またはそのペプチドフラグメントまたは対応する核酸の１またはそれ以上を含む組成物，好ましくは医薬組成物に関する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は，非生理学的に増加した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法に関する。該方法は，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量の，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２の群より選択される蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸を投与することを含む。
【００１３】
本発明における，"・・・と関連するかまたはこれにより引き起こされる"との用語は，一方は，表現型として観察される，細胞内で増加したレベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａの触媒サブユニットと疾患との相関の現象と（ただし，この疾患が，前記増加したレベルの酵素により引き起こされると結論づける必要はない（増加したレベルが原因であることを排除するものではないが）），他方は，増加したレベルのＰＰ２Ａｃが疾患の発症に及ぼす原因となる影響との間を区別する。したがって，場合によっては，相関関係は原因となる影響に基づくが，別の場合には，原因となる影響はＰＰ２Ａｃの増加したレベルまたは活性とは異なるかもしれない。
【００１４】
"非生理学的に増加した細胞内レベル"との用語は，レベルが，上述した疾患に罹患していない被験者の細胞に見いだされるレベルより増加していることを表す。ＰＰ２Ａｃレベルは，標的蛋白質のリン酸化のレベルを評価することにより慣用的に測定することができる。しかし，多くの例においては，ＰＰ２Ａｃレベルの直接測定は必要ではない。これは，ある種の疾患に伴って非生理学的レベルが生ずることは確立されているかまたは少なくとも疑われているためである。非生理学的に増加したレベルは，同じタイプの同じ発生段階の細胞における蛋白質の正常な生理学的レベルと比較して，少なくとも２０％，好ましくは少なくとも３０％，より好ましくは少なくとも５０％，さらにより好ましくは少なくとも８０％，最も好ましくは少なくとも１００％の増加であり，ここで，測定は両方の細胞において本質的に同じ条件下で行う。
【００１５】
本発明にしたがえば，"ＰＰ２Ａｃ"との用語は，蛋白質ホスファターゼ２Ａの触媒サブユニットのアルファおよびベータアイソフォームの両方を表す（Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｈｅｍｍｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；添付の参考資料にさらに記載される）。
【００１６】
好ましくは哺乳動物であり最も好ましくはヒトである被験者への投与は，担当医師の推奨にしたがって行う。通常は，上述した蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸は，薬学的に許容しうる担体または希釈剤と一緒に処方する。本明細書において用いる場合，"組成物"との用語は，上で簡単に述べた少なくとも１つの蛋白質および／または少なくとも１つの核酸分子を含む。
【００１７】
組成物は，固体，液体または気体のいずれの形態であってもよく，とりわけ，粉体，錠剤，溶液またはエアロゾルの形であることができる。
【００１８】
適当な薬学的担体，賦形剤および／または希釈剤の例は当該技術分野においてよく知られており，例えば，リン酸緩衝化食塩水溶液，水，乳濁液，例えば油／水乳濁液，種々のタイプの湿潤剤，滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物は，よく知られる慣用的な方法により処方することができる。これらの医薬組成物は，適当な投与量で被験者に投与することができる。適当な組成物の投与は，種々の方法により，例えば，静脈内，腹腔内，皮下，筋肉内，局所，皮膚内，鼻腔内または気管支内投与により行うことができる。前記投与は，脳動脈内の部位に，または脳組織内に直接，注射および／またはデリバリーすることにより行うことが特に好ましい。本発明にしたがって製造される組成物はまた，例えば，脳等の外部または内部標的部位へのバイオリスティックデリバリーにより，標的部位に直接投与してもよい。投与計画は，担当の医師および臨床的因子により決定されるであろう。医療の分野においてよく知られているように，任意の１人の患者についての投与量は，多くの因子，例えば，患者のサイズ，表面積，年齢，投与すべき特定の化合物，性別，投与の時間および経路，一般的健康状態，および同時に投与される他の薬剤により異なる。蛋白質性の薬学的に活性な物質は，１回投与あたり１ｎｇ−２５ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在することができる。しかし，特に上述因子を考慮して，この例示的範囲の下または上の投与量も想定される。また，投与計画が連続注入である場合，体重１ｋｇあたり１分あたり１μｇ−２５ｍｇユニットの範囲内であるべきである。核酸分子，好ましくはＤＮＡ分子の投与量，特に静脈内投与における投与量は約１０6−１０12である。ＤＮＡはまた，標的部位に直接投与してもよく，例えば，バイオリスティックデリバリーにより内部または外部標的部位に，またはカテーテルにより動脈内の部位に投与してもよい。
【００１９】
定期的な評価により進行をモニターすることができる。本発明の組成物は，局所的に投与してもよく，全身的に投与してもよい。非経口投与用の製剤には，滅菌した水性または非水性の溶液，懸濁液，および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は，プロピレングリコール，ポリエチレングリコール，植物油，例えばオリーブ油，および注射可能な有機エステル，例えばオレイン酸エチルである。水性担体には，水，アルコール性／水性溶液，乳濁液または懸濁液，例えば，食塩水および緩衝化媒体が含まれる。非経口用ベヒクルには，塩化ナトリウム溶液，リンゲルデキストロース，デキストロースおよび塩化ナトリウム，乳酸化リンゲルまたは固定油が含まれる。静脈内用ベヒクルには，液体および栄養補給剤，電解質補給剤（例えば，リンゲルデキストロース系のもの）等が含まれる。また，保存剤および他の添加剤，例えば，抗微生物剤，抗酸化剤，キレート剤，および不活性ガス等が存在していてもよい。さらに，本発明にしたがって製造される医薬組成物は，医薬組成物の意図される特定の用途に応じて，さらに別の薬剤を含んでいてもよい。そのようなさらに別の薬剤は，細胞レベルで作用する薬剤であってもよい。前記医薬組成物がさらに別の薬剤，例えば，アセチルコリン，コリン作用性アゴニスト，非ステロイド性抗炎症剤，エストロゲン，抗酸化剤，ビタミンおよびコレステロール低下剤を含むことがさらに好ましい。
【００２０】
"前記疾患を発症する危険のある"との用語は，疾患に対する素因があると担当の医師が診断するであろうことを表す。そのような素因は，オピッツ症候群，ミラー・ディーカー型のＩ型脳回欠損およびＸ連鎖二重皮質症候群等の遺伝に基づくものであってもよく，患者で観察されるある種の症状に基づいてその発症が予測されるものであってもよい。
【００２１】
"ＭＩＤ１"との用語は，微小管結合ＰＰ２Ａｃのα４サブユニットと相互作用する蛋白質を表す。この蛋白質は，Ｑｕａｄｅｒｉら（１９９７）に，アミノ酸配列を含む生物物理学／パラメータが記述されている。
【００２２】
"ＭＩＤ２"との用語は，Ｂｕｃｈｎｅｒら（１９９９）に，そのアミノ酸配列を含む生物物理学的／パラメータに関して記述されている蛋白質を表す。
【００２３】
α４蛋白質は，添付の文献，例えばＴｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒら，およびこれらに引用される文献に記載されている。
【００２４】
本発明にしたがえば，驚くべきことに，ＭＩＤ１および／またはＭＩＤ２が微小管と結合しているＰＰ２Ａｃのレベルに制御的な影響を有することが見い出された。ＭＩＤ１／２蛋白質のＮ末端領域は，本発明にしたがって検出されたように，α４蛋白質と相互作用する。さらに，ＭＩＤ１は，その制御サブユニットα４に結合することにより，ＰＰ２Ａｃに向かうユビキチン化機構のターゲティングに関与することが示された。機能的ＭＩＤ１のＥ３リガーゼ活性の標的特異性は，ＲＩＮＧフィンガー蛋白質ファミリーに共通する５つの別々のドメインの１つであるＢ−ｂｏｘ１ドメインのα４への選択的結合により規定され，これは次にＰＰ２Ａｃへの結合を媒介する。
【００２５】
ＰＰ２Ａｃはこれまで，中心的細胞レギュレータとして，その細胞内レベルを外部から操作することができなかったため，本発明にしたがうこの知見は特に驚くべきものでありかつ有益である。さらに，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２の投与は，微小管結合ＰＰ２Ａｃレベルの特異的ターゲティングを可能とするため，本発明は驚くべきものでありかつ有益である。これまでのところ，細胞内の他の場所におけるＰＰ２Ａ活性の妨害はない。これは，鍵となる細胞レギュレータとしてのＰＰ２Ａの全体的活性を妨害することなく，非生理学的レベルの微小管結合ＰＰ２Ａｃに伴う疾患を標的とすることができるという効果を有する。
【００２６】
ある種の態様においては，異種蛋白質との融合蛋白質の形であってもよい蛋白質またはペプチド部分を，医薬組成物の処方中で用いることができるが，別の態様においては，核酸分子，好ましくはＤＮＡ分子を投与のために用いることができる。前記核酸分子をこれを必要とする患者に投与するための種々の方法が存在する。これらの方法には，粒子衝撃（遺伝子銃技術），弾道法，および／またはベクター，例えばウイルスベクターをベヒクルとして用いる方法が含まれる。有利には，前記蛋白質をコードするＤＮＡをベクター，好ましくは発現ベクター中に含ませる。
【００２７】
前記ベクターは，例えば，ファージ，プラスミド，ウイルスまたはレトロウイルスベクターでありうる。レトロウイルスベクターは，複製可能であっても複製不可能であってもよい。後者の場合，ウイルス増殖は一般に補足性の宿主／細胞においてのみ生ずるであろう。
【００２８】
ポリヌクレオチドまたは遺伝子は，宿主中での増殖のために選択マーカーを含むベクターに連結させることができる。一般に，プラスミドベクターは，沈殿，例えばリン酸カルシウム沈殿または塩化ルビジウム沈殿中で，または荷電脂質を有する複合体中で，または炭素系クラスター，例えばフラーレン中で導入する。ベクターがウイルスである場合には，宿主細胞に適用する前に，適当なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングすることができる。
【００２９】
ベクターのより好ましい態様においては，ポリヌクレオチドを発現制御配列に動作可能なように連結させて，原核生物または真核生物細胞またはその単離された画分中で発現しうるようにする。前記ポリヌクレオチドの発現には，ポリヌクレオチドの転写，好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写が含まれる。真核生物細胞，好ましくは，哺乳動物細胞における発現を確実にするための制御要素は当業者によく知られている。これらは通常は，転写の開始を確実にするための制御配列，および任意に転写の終止および転写産物の安定化を確実にするためのポリＡシグナルを含む。追加の制御要素としては，転写のおよび翻訳のエンハンサーが含まれる。原核生物の宿主細胞における発現を可能とする制御要素には，例えば，Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｌａｃ，ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが含まれ，真核生物宿主細胞における発現を可能とする制御要素の例は，酵母におけるＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーター，または哺乳動物および他の動物細胞におけるＣＭＶ−，ＳＶ４０−，ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス），ＣＭＶ−エンハンサー，ＳＶ４０−エンハンサー，またはグロビンイントロンである。転写の開始を担う要素に加え，そのような制御要素にはまた，ポリヌクレオチドの下流の転写終止シグナル，例えばＳＶ４０ポリＡ部位またはｔｋポリＡ部位が含まれる。この点に関して，適当な発現ベクターとしては，Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＣＤＭ８，ｐＲｃ／ＣＭＶ，ｐｃＤＮＡ１，ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ），ｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）等が当該技術分野において知られている。好ましくは，前記ベクターは発現ベクターおよび／または遺伝子移転またはターゲティングベクターである。ウイルス，例えばレトロウイルス，ワクチニアウイルス，アデノ随伴ウイルス，ヘルペスウイルス，またはウシパピローマウイルスに由来する発現ベクター等を，ポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団にデリバリーするために用いることができる。当業者によく知られる方法を用いて，組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載される手法を参照。あるいは，標的細胞へのデリバリーのために，本発明のポリヌクレオチドおよびベクターをリポソーム中に再構築することができる。
【００３０】
本発明はさらに，非生理学的に減少した細胞内レベルの微小管結合蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａｃ）の触媒サブユニットと関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患を予防または治療する方法に関する。該方法は，前記疾患に罹患しているかまたは前記疾患を発症する危険のある被験者に，薬学的有効量のＭＩＤ１またはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメント，または，α４に結合するが固有のホスファターゼ活性を有しない有効量のＰＰ２Ａｃのフラグメント，または，ＰＰ２Ａｃに対する結合部位を含むα４のペプチド性フラグメント（好ましくは，アミノ酸１１１−２０２）またはアミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメント，または，前記ペプチドフラグメントをコードする有効量の核酸分子，または，ＭＩＤ１／ＭＩＤ２とα４との相互作用を妨害するか，またはα４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用を妨害する有効量の分子，または，これらの相互作用の制御を妨害する有効量の分子，例えばラパマイシンを投与することを含む。
【００３１】
"非生理学的に減少した細胞内レベル"との用語は，レベルが，言及される疾患に罹患していない被験者の細胞に見出される正常なレベルと比較して減少していることを表す。ＰＰ２Ａｃのレベルは，標的蛋白質のリン酸化のレベルを評価することにより慣用的に測定することができる。ただし，ある種の疾患に伴って非生理学的レベルが生ずることは確立されているかまたは少なくとも推測されているため，多くの場合にはＰＰ２Ａｃレベルの直接の測定は必要ではない。非生理学的に減少したレベルは，同じタイプの同じ発達段階の細胞における蛋白質の正常な生理学的レベルと比較して，少なくとも２０％，好ましくは少なくとも３０％，より好ましくは少なくとも５０％，さらにより好ましくは少なくとも８０％，最も好ましくは９０，９５，９８，９９または１００％減少しており，ここで，測定は両方の細胞について本質的に同じ条件下で行う。
【００３２】
"ペプチド性フラグメント"（または"ペプチドフラグメント"）との用語は，全長蛋白質の対応する部分と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する，完全な蛋白質のフラグメントを表す。ペプチド性フラグメントは種々の長さのものでありうるが，最小の長さは好ましくは上述した長さであり，好ましくは上述した長さおよびアミノ酸組成を有する。本発明はまた，変更された一次アミノ酸配列を有するが，本発明に必要な機能を保持しているかまたは本質的に保持している，これらのペプチドフラグメントの変種を含む。改変は，ＤＮＡレベルで，例えば部位特異的変異誘発を行い，続いて変異した配列を発現させることにより行うことができる。次に，発現した配列の結合を，例えば，下記の実施例に記載される方法論を用いて確認することができる。
【００３３】
上述の態様および本明細書に記載されるさらに別の態様の全体の変形として，疾患はまた，ＰＰ２Ａｃのレベルの低下ではなく，ＰＰ２Ａｃの活性の低下と関連するかまたはこれにより引き起こされるものであってもよい。本発明の種々の方法，組成物および用途は，必要な変更を加えて，前記減少した活性と関連するかまたはこれにより引き起こされる疾患に適用される。
【００３４】
本発明のこの態様は，医学療法において広範な用途を有すると予測される。すなわち，本発明にしたがえば，それぞれの結合パートナーとの相互作用，すなわちＭＩＤ１−α４，ＭＩＤ２−α４，およびα４−ＰＰ２Ａｃの相互作用を可能とする，ＭＩＤ１，ＭＩＤ２およびα４，ならびにＰＰ２Ａｃのフラグメントを同定することができる。驚くべきことに，上述のペプチド性フラグメントは，対応する全蛋白質の投与と逆の効果を有することを示すことができた。したがって，ＭＩＤ１／ＭＩＤ２，α４またはＰＰ２Ａｃの上述のいずれかのフラグメントの投与は，細胞内部における微小管結合ＰＰ２Ａｃレベルの増強につながると予測される。したがって，本発明のこの態様は，減少したＰＰ２Ａｃレベルにより引き起こされるかまたはこれと関連する疾患の予防または治療に適している。本発明のこの驚くべき観点はまた，ＭＩＤ１／ＭＩＤ２がＰＰ２Ａｃをαサブユニットを介してユビキチン関連分解経路に入るようにするという知見にも基づくことに注目すべきである。
【００３５】
あるいは，ＭＩＤ１とα４またはα４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用は，これらの２つの細胞成分の相互作用を妨害する分子により妨げるかまたは破壊することができる。また，ＭＩＤ１および／またはα４の発現または活性を妨害する有効量の分子，例えば，ＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドヌクレオチドを，本発明の方法にしたがって，前記被験者に投与することができる。これらの種々の投与モードはすべて，微小管結合ＰＰ２Ａｃの細胞内レベルに対するＭＩＤ１／ＭＩＤ２の制御的役割に影響を及ぼすため，同じ結果，すなわち，細胞内微小管結合ＰＰ２Ａｃレベルの増加をもたらすであろう。
【００３６】
いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが，現在のところ，全蛋白質および上述の（その蛋白質の）ペプチド性フラグメントの投与により得られる逆の効果は，ペプチド性フラグメントが，全蛋白質構造中に含まれ，ＰＰ２Ａｃのユビキチン関連分解を担う構造的成分（ＭＩＤ１／２の場合には環構造）の完全な構成を含まないためであると仮定される。その結果，上述のペプチド性フラグメントは，完全な対応する全長蛋白質とその結合パートナーについて競合し，前記全長蛋白質に勝つ。これらのペプチド性フラグメント中ではユビキチン関連分解経路に入る正常なターゲティングを担う必須の蛋白質構造が欠失しているため，微小管結合ＰＰ２Ａｃは細胞内で蓄積される。最も重要なことには，かつ本発明の第１の態様にしたがえば，細胞内の他の場所のＰＰ２Ａレベルは，上述の化合物の投与により影響を受けない。さらにこのことにより，細胞内におけるＰＰ２Ａの全体的活性を妨害することなく，減少したレベルの微小管結合ＰＰ２Ａｃにより引き起こされるかまたはこれに関連する疾患を標的とする治療が可能となる。
【００３７】
上述の態様の変形においては，α４に対する結合部位を含むＰＰ４ＣまたはＰＰ６Ｃのフラグメントを投与してもよい。これらのＰＰ２Ａｃ関連ホスファターゼの結合部位は著しく異なりうるため，これはＰＰ２ＡｃまたはＰＰ４ＣまたはＰＰ６Ｃ分解のいずれかを特異的に妨害することを可能とし，これらのホスファターゼは異なる細胞機能を有するため，このことはより特異的な効果につながりうる。
【００３８】
本発明の方法の好ましい態様においては，前記疾患はオピッツ病である（増加したレベル）。
【００３９】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記疾患は神経変性性疾患または骨粗鬆症である（減少したレベル）。
【００４０】
"神経変性性疾患"との用語は，異常なアポトーシスまたはパーキンソン病におけるような毒性の事象によるニューロンの変性を伴う疾患を表す。
【００４１】
本発明の方法の特に好ましい態様においては，前記疾患はアルツハイマー病またはタウロパシーである。
【００４２】
"タウロパシー"との用語は，主として遺伝的に変化した形のタウ蛋白質または変化したレベルのタウ蛋白質を伴う（ただしこれらに限定されない）疾患を表す。
【００４３】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記疾患は転移を含む癌である。ＰＰ２Ａｃは腫瘍サプレッサーの候補であり，多くの発癌経路および細胞運動性の強力な拮抗剤であるため，この酵素のレベルまたは活性の上昇は，一般に腫瘍疾患に予防的にまたは治療的に適用しうる可能性がある。
【００４４】
この点に関して，ＰＰ２Ａｃ／ＭＩＤ１複合体が，ソニックヘッジホッグシグナリング経路，すなわち最も重要な発癌性経路の１つであると仮定されている経路（Ｗｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ＭｃＧｌｉｎｎ，２００１）の制御に関与することを実験的に示すことができた。
【００４５】
ｓｈｈ／Ｇｌｉ３経路を介するオンコジンＧｌｉ１の過剰発現につながるｓｈｈ／Ｇｌｉシグナリングの過剰活性は，従来技術において，基底細胞癌および多様な脳腫瘍の発達の原因であることが示されている（Ｒｕｉｚｉ  Ａｌｔａｂａ，２００２）。さらに，前立腺癌腫および黒色腫の進行における重要な役割を有することが示されている（Ｍｕｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。オピッツＢＢＢ／Ｇ症候群とグレーグ脳症の患者を比較すると，いずれの症候群も隔離症および広い鼻梁により特徴づけられるため，これらの２つの患者群の脳顔面頭蓋の類似性は印象的である。ソニックヘッジホッグ経路の中心的シグナリング分子であるＧｌｉ３遺伝子における変異は，グレーグ脳障害を有する患者における遺伝的障害の基礎をなす。さらにＧｌｉ３蛋白質のショウジョウバエのホモログであるｃｕｂｉｔｕｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓは微小管結合蛋白質である。前記蛋白質の亜細胞局在化および転写活性は，多様な工程のセリン／トレオニンリン酸化を介して制御されている。これらの知見から出発して，ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体がＧｌｉ３機能に，したがってソニックヘッジホッグ経路に及ぼす制御的影響についての仮説を立てた。
【００４６】
微小管結合ＰＰ２Ａ（中心的セリン／トレオニンホスファターゼ）の活性は，ＰＰ２ＡとＭＩＤ１との相互作用を妨害する種々の分子（例えば，ラパマイシン，ＭＩＤ１とα４との相互作用ドメインに由来する小ペプチド，ＲＮＡｉおよびアンチセンス分子等，下記も参照）により影響されうる。さらに，免疫蛍光実験において，Ｇｌｉ３転写因子の細胞内局在化がこれらの分子により影響されうることを示すことができた。
【００４７】
α４結合を担うＭＩＤ１ドメインに由来するペプチドであるＢ−Ｂｏｘ１の過剰発現，ならびにＧＦＰタグ付きＧｌｉ３を過剰発現するＨｅＬａ細胞のラパマイシン処理およびＲＮＡｉによるα４のダウンレギュレーションにより，サイトゾルにおける活性型のＧｌｉ３の顕著な停留が生じたことを示すことができた。ＧＦＰ−Ｇｌｉ３およびＢ−Ｂｏｘを過剰発現する細胞をＰＰ２Ａ特異的阻害剤であるフォストリエシンで処理すると，観察された効果が逆転し，Ｇｌｉ３の局在化がＰＰ２Ａ活性に依存することが確認された。
【００４８】
さらに，一方では，α４の過剰発現によりＧＦＰ−Ｇｌｉ３が核に有意に放出されることが示された。
【００４９】
Ｇｌｉ３転写因子の最も重要な標的の１つはパッチド遺伝子である。ＨｅＬａ細胞を別の分子で処理した後のＧｌｉ３活性について分析するために，Ｂ−Ｂｏｘ１およびα４蛋白質を過剰発現する細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨｅＬａ細胞を，Ｇｌｉ３，Ｇｌｉ１（これはＧｌｉ３転写因子の別の標的である）およびパッチドの発現について試験した。予測されたように，Ｂ−Ｂｏｘ１の発現によりパッチドのメッセージが有意に減少し，一方α４の過剰発現によりパッチドのメッセージが増加した。
【００５０】
したがって，ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ相互作用を妨害し，ＰＰ２Ａｃの蓄積をもたらす分子がソニックヘッジホッグ経路のネガティブエフェクターであることを示すことができた。したがって，この知見は，この中心的発癌経路を妨害する抗発癌剤の開発の有望な標的を提供する。
【００５１】
ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体の特異的妨害が推定的な抗発癌性効果を示すことを調べるために，ＨｅＬａ細胞を特異的抗α４ＲＮＡｉ分子でトランスフェクトした。曝露時間に依存して，抗α４ＲＮＡｉ分子を含む細胞において，疑似トランスフェクト細胞および非特異的ＲＮＡｉ分子で処理した細胞と比較して，これらの通常は急速に成長する腫瘍細胞の増殖の劇的な減少が検出された。ＢｒｄＵ標識および続くＦＡＣＳ分析により，細胞数の減少はアポトーシスの増加ではなくＧ１期停止によるものであることが明らかとなった。
【００５２】
これに対し，ＭＩＤ１蛋白質のダウンレギュレーション，例えばＲＮＡｉによるダウンレギュレーションにより，アポトーシスの顕著な誘導が生じた。
【００５３】
すなわち，ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体を妨害することにより，少なくとも２つの異なる抗発癌性メカニズム（細胞の停止およびアポトーシス）を誘導することができる。
【００５４】
したがって，ＭｌＤ１／ＰＰ２Ａｃ複合体の機能を妨害する分子によりＰＰ２Ａｃの蓄積（下記も参照）を薬理学的に誘導することは，新規な強力な抗癌剤の開発の有力な経路である。
【００５５】
この点に関して，ヘッジホッグシグナリング経路に関与し，Ｇｌｉ３の核移行を誘発しうるキナーゼ様蛋白質であるｈＦｕｓｅｄが，ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体の標的であることを示すこともできた。ＭＩＤ１／α４／ＰＰ２Ａ複合体を介する微小管結合ＰＰ２Ａの活性の操作により，ｈＦｕｓｅｄのリン酸化状態に影響を及ぼしうることを明らかに示すことができた。
【００５６】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記疾患は炎症性疾患である。炎症性疾患には，急性炎症性状態，例えば，敗血症および急性肺障害が含まれる。
【００５７】
本発明はまた，前記蛋白質または前記ペプチドフラグメントが，インビボで蛋白質を細胞内に直接導入することを可能とするＴＡＴまたは機能的に類似するペプチド性フラグメントに融合されている，本発明の方法に関する（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００５８】
ＴＡＴは，ＨＩＶ１−ＴＡＴ蛋白質のペプチド性フラグメントである。このペプチドを別の蛋白質と融合させると，これはこの蛋白質を生きた細胞に効率的に直接伝達することを誘発することができ，したがって，本発明にしたがって投与される特に有益な活性成分である。
【００５９】
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，ＭＩＤ１および／またはα４の発現を妨害する分子はＲＮＡｉである。
【００６０】
ＲＮＡｉは，例えば，ＷＯ０１／７５１６４またはＷＯ９９／３２６１９に記載されている干渉ＲＮＡ分子である。本発明にしたがって用いられるＲＮＡｉ分子は，好ましくは，標的遺伝子の約１９−２３，より好ましくは約２１−２３個の連続するヌクレオチドと相同の領域を有する。ヌクレオチドは，この相同の領域中で，標的遺伝子の対応する領域と同一であるか，または本質的に同一である。ＲＮＡｉ分子の投与は，当該技術分野において記述されている。例えば，先に引用した参考文献を参照。
【００６１】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，ＭＩＤ１とα４の相互作用を妨害する前記分子は小分子である。
【００６２】
小分子は，無機小分子であっても有機小分子であってもよい。小分子のライブラリは市販されている。
【００６３】
好ましい態様においては，小分子はラパマイシンである。
【００６４】
α４とＰＰ２Ａｃとの相互作用は，キナーゼｍＴＯＲにより制御されているようである。活性なｍＴＯＲシグナリングは，α４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用を促進し，ラパマイシンによりｍＴＯＲを阻害すると，α４がＰＰ２Ａｃから解離し，ＰＰ２Ａｃ活性が増加する（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。α４−ＰＰ２Ａｃ相互作用がＰＰ２Ａｃの分解に重要であるという本発明の知見にしたがえば，観察されたＰＰ２Ａｃ活性の増加は，ユビキチン依存性分解の傷害によるＰＰ２Ａｃのレベルの増加により引き起こされたものであるかもしれない。すなわち，ラパマイシンまたはその密接な類似体は，ＰＰ２Ａｃの分解経路を妨害する候補分子であり，これは親油性分子であるため血液脳関門を容易に通過し，ほとんど全身的毒性を示さないため，これはアルツハイマー病において治療的に用いて，タウの脱リン酸化を増強しうるかもしれない。興味深いことに，ラパマイシンの既知の効果のいくつか（抗増殖，抗運動）は，ＰＰ２Ａｃ分解を妨害する化合物のプロファイルによく適合する。
【００６５】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記疾患は，アポトーシスと関連するかまたはこれにより引き起こされる。これらの疾患には，特に，特定の細胞のアポトーシスの増強が関与する発達性疾患等の疾患のみならず，円錐角膜，網膜変性，変性性関節炎，中毒，ハンチントン病およびパーキンソン病等の変性性疾患が含まれる。
【００６６】
本発明はさらに，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２の群より選択される蛋白質または前記蛋白質をコードする核酸を含む組成物に関する。
【００６７】
本発明の組成物は，１またはそれ以上の容器の中に上述の成分を単独でまたは組み合わせで含む。蛋白質性物質は，凍結乾燥形であってもよく，水性の，好ましくは緩衝化溶液中に含まれていてもよい。適当な緩衝液としては生理学的食塩水が挙げられる。いずれの場合も，本発明の組成物の成分を無菌的環境中で維持することが好ましい。核酸分子はまた，凍結乾燥して，または水性の，好ましくは，緩衝化溶液中の組成物中で維持してもよい。
【００６８】
本発明はまた，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメント，または，α４に結合するが固有のホスファターゼ活性を有しない有効量のＰＰ２Ａｃのフラグメント，または，ＰＰ２Ａｃへ結合部位のを含むα４のペプチド性フラグメント（好ましくは，アミノ酸１１１−２０２），または，アミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメント，または，前記ペプチドフラグメントをコードする有効量の核酸分子，または，ＭＩＤ１／ＭＩＤ２とα４との相互作用を妨害するか，またはα４とＰＰ２Ａｃとの間の相互作用を妨害する有効量の分子，または，これらの相互作用の制御を妨害する有効量の分子，好ましくは，ラパマイシン，または，ＭＩＤ１，ＭＩＤ２および／またはα４の発現または活性を妨害する有効量の分子を含む組成物に関する。
【００６９】
本発明の方法の好ましい態様においては，前記組成物は医薬組成物である。
【００７０】
医薬組成物と任意のさらに別の成分との特定の処方に関しては，上述の記述を参照のこと。
【００７１】
さらに，本発明は，ＭＩＤ１とα４と，またはα４とＰＰ２ａｃ（またはＰＰ４Ｃ／ＰＰ６Ｃ）とのいずれかの間の相互作用を妨害する分子を同定する方法に関する。該方法は，
（ａ)候補分子の存在下で，適当な条件下で，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２またはＭＩＤ１もしくはＭＩＤ２のペプチド性フラグメントであって，ＭＩＤ１のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）またはＭＩＤ２のアミノ酸１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）を含むペプチド性フラグメントを，α４または好ましくはアミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメントと接触させ，または，α４または好ましくはアミノ酸２３６−２７９を含むα４のペプチド性フラグメントを，ＰＰ２ＡｃまたはＰＰ４ＣまたはＰＰ６Ｃ，またはＰＰ２ＡｃもしくはＰＰ４ＣもしくはＰＰ６ｃのペプチド性フラグメントと接触させ；そして
（ｂ）前記候補分子が前記相互作用を妨害するか否かを評価する，
ことを含む。
【００７２】
"適当な条件"との用語は，種々の分子の相互作用を可能とする条件を表す。そのような条件の一例は，生理学的条件，例えば，５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）および１５０ｍＭの塩化ナトリウム，または同様のイオン強度およびｐＨの溶液である。さらに，適当な条件とは，ペプチドまたは化合物のいずれかが固相に結合することができる可能性を表す。工程（ｂ）の評価は，任意の適当な出力システムを用いて行うことができる。例えば，酵母においてツーハイブリッドシステムを用いて蛋白質−蛋白質相互作用を分析することが可能である。この場合の出力は，通常はそれぞれの相互作用蛋白質を含む酵母細胞の成長である。同様に，２つの所与の（通常は相互作用する）蛋白質がもはや相互作用しない場合に成長することを出力として有するツーハイブリッドシステムが存在する。すなわち，これらの酵母細胞を種々の化合物とともにインキュベーションすることにより，この化合物の存在下における酵母細胞の成長により，所与の相互作用を妨害する化合物を同定することが可能である（Ｖｉｄａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｈ，１９９９）。別の可能性は，ペプチドが化合物と相互作用したときにそのレーザービーム反射が変化することを出力として用いるウルトラハイスループットスクリーニングにより，例えばＭＩＤ１のペプチド性フラグメント１０８−１６５（好ましくは，１１０−１６５）と相互作用する化合物をスクリーニングすることである。次に，そのような化合物を，ＭＩＤ１とα４との相互作用を妨害するか否かについて試験することができる。
【００７３】
本発明の方法にしたがって同定された分子は，医薬組成物として処方し，上述したようにして用いることができる。あるいは，これらの分子は，上述した疾患を治療するのに有用な薬剤を開発するためのリード化合物として働くことができる。そのような下流の開発を行う適当な方法もまた本発明に含まれ，以下に説明される。
【００７４】
すなわち，本発明はさらに，上述の方法により同定された化合物を洗練する方法に関し，この方法は，前記方法の各工程，および
（１）部位特異的変異誘発またはキメラ蛋白質実験により化合物とＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子の結合部位を同定し；
（２）化合物の結合部位およびＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子の結合部位の両方の分子モデリングを行い；そして
（３）化合物を改変してＤＮＡまたはｍＲＮＡに対するその結合特異性を改良する，
ことを含む。
【００７５】
本発明の方法の種々の工程において用いられるすべての手法は，慣用的なものであるか，または当業者が慣用の手法からさらなる苦心を要することなく導くことができる。すなわち，本発明において同定された性質の蛋白質／（ポリ）ペプチドに基づく生物学的アッセイを用いて，薬剤の特異性または効力を評価することができ，ここでは，蛋白質／（ポリ）ペプチドの１またはそれ以上の活性の増加を用いて前記特異性または効力をモニターすることができる。工程（１）および（２）は，慣用のプロトコルにしたがって実施することができる。部位特異的変異誘発のプロトコルは，Ｌｉｎｇ  Ｍ  Ｍ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂ  Ｈ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４：１５７−１７８に記載されている。構造−機能相関の分析のためにホモロジーモデリングを部位特異的変異誘発と組み合わせて使用することは，Ｓｚｋｌａｒｚ  ａｎｄ  Ｈａｌｐｅｒｔ（１９９７）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６１：２５０７−２５２０に概説されている。キメラ蛋白質は，Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）（上記引用文中）に記載される慣用のクローニング手法を用いて，ユニーク制限部位を介して対応するＤＮＡフラグメントをライゲーションさせることにより生成する。２つのＤＮＡフラグメントを融合させてキメラ蛋白質をコードするキメラＤＮＡフラグメントを生成することはまた，ゲートウエー−システム（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），すなわち組換えによるＤＮＡ融合に基づくシステムを用いて行うことができる。分子モデリングの顕著な例は，ＨＩＶリバーストランスクリプターゼに結合する化合物の構造に基づく設計であり，これはＭａｏ，Ｓｕｄｂｅｃｋ，Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ  ａｎｄ  Ｕｃｋｕｎ（２０００）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０：１２５１−１２６５に概説されている。
【００７６】
例えば，部位特異的変異誘発およびキメラ蛋白質実験による前記薬剤の結合部位の同定は，（ポリ）ペプチドの一次配列中で薬剤親和性に影響を及ぼす改変を行うことにより，実施することができる。このことにより，通常は薬剤の結合ポケットを詳細にマッピングすることができる。
【００７７】
工程（２）に関しては，以下のプロトコルが考えられる：いったん，薬剤のためのエフェクター部位がマッピングされれば，変異誘発実験（工程（１））から得られた情報と，薬剤の詳細な三次元構造が既知の場合には結合部位の構造のコンピュータシミュレーションとを組み合わせることにより（そうでない場合には，コンピュータシミュレーションにより推定することができる），薬剤の種々の部位と相互作用する詳細な残基を同定することができる。前記薬剤がそれ自体ペプチドである場合，これを変異させて，いずれの残基が目的とする（ポリ）ペプチド中の他の残基と相互作用するかを判定することもできる。
【００７８】
最後に，工程（３）においては，薬剤を修飾して，その結合親和性またはその効力および特異性を改善することができる。例えば，目的とする（ポリ）ペプチドの特定の残基と薬剤分子のある領域との間に静電的相互作用がある場合，その領域の全体的電荷を改変してその特定の相互作用を増加させることができる。
【００７９】
結合部位の同定は，コンピュータプログラムの支援により行うことができる。すなわち，適当なコンピュータプログラムを用いて，相補的な構造モチーフについてのコンピュータ支援検索により，推定阻害剤と（ポリ）ペプチドとの相互作用部位を同定することができる（Ｆａｓｓｉｎａ，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ５（１９９４），１１４−１２０）。蛋白質およびペプチドのコンピュータ支援設計のためのさらに別の適当なコンピュータシステムは，先行技術文献，例えば，Ｂｅｒｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２（１９９４），１０３３−１０３６；Ｗｏｄａｋ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５０１（１９８７），１−１３；Ｐａｂｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（１９８６），５９８７−５９９１に記載されている。薬剤の修飾は，例えばペプチド模倣体により行うことができ，また他の阻害剤も，一連の化学的修飾によりペプチド模倣体コンビナトリアルライブラリを合成し，得られた化合物を試験することにより同定することができる。ペプチド模倣体コンビナトリアルライブラリの生成および使用の方法は，先行技術文献，例えば，Ｏｓｔｒｅｓｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６７（１９９６），２２０−２３４およびＤｏｒｎｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６），７０９−７１５に記載されている。さらに，本発明の（ポリ）ペプチドの発現のアクチベータの三次元および／または結晶構造を，例えば，本発明の（ポリ）ペプチドと組み合わせて，ペプチド模倣体アクチベータの設計に用いることができる（Ｒｏｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５（１９９６），１２９３３−１２９４４；Ｒｕｔｅｎｂｅｒ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６），１５４５−１５５８）。
【００８０】
上述にしたがえば，本発明の方法の好ましい態様においては，前記化合物はペプチド模倣体によりさらに洗練される。
【００８１】
本発明はさらに，本明細書に記載される方法により同定または洗練された化合物を改変して以下を達成する方法に関し，該方法は，リード化合物として上述した方法の工程を任意に含んでいてもよい：（ｉ）作用部位，活性スペクトル，臓器特異性の変更，および／または（ｉｉ）効力の改善，および／または（ｉｉｉ）毒性の低下（治療指数の改善），および／または（ｉｖ）副作用の低下，および／または（ｖ）治療作用の開始，効果の持続の変更，および／または（ｖｉ）薬物動力学的パラメータ（再吸収，分布，代謝および排出）の改変，および／または（ｖｉｉ）物理化学的パラメータ（溶解性，吸湿性，色，味，臭い，安定性，状態）の改変，および／または（ｖｉｉｉ）一般的特異性，臓器／組織特異性の改善，および／または（ｉｘ）適用および経路の最適化。これは以下の方法により行う：（ｉ）カルボキシル基のエステル化，または（ｉｉ）カルボン酸によるヒドロキシル基のエステル化，または（ｉｉｉ）ヒドロキシル基のエステル化による，例えば，リン酸，ピロホスフェートまたは硫酸またはヘミスクシネートの形成，または（ｉｖ）薬学的に許容しうる塩の形成，または（ｖ）薬学的に許容しうる複合体の形成，または（ｖｉ）薬学的に活性なポリマーの合成，または（ｖｉｉ）親水性成分の導入，または（ｖｉｉｉ）芳香族または側鎖の置換基の導入／交換，置換基パターンの変更，または（ｉｘ）等比体積のまたは生物学的等比体積の成分の導入による改変，または（ｘ）類似化合物の合成，または（ｘｉ）分枝鎖側鎖の導入，または（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への変換，または（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール，アセタールへの誘導，または（ｘｉｖ）アミド，フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化，または（ｘｖ）マンニッヒ塩基，イミンの合成，または（ｘｖｉ）ケトンまたはアルデヒドの，シッフ塩基，オキシム，アセタール，ケタール，エノールエステル，オキサゾリジン，チオゾリジンまたはこれらの組み合わせへの変換。前記方法は任意に上述の方法の工程をさらに含む。上述した種々の工程は当該技術分野において一般に知られている。これらには，定量的構造−作用相関（ＱＳＡＲ）分析（Ｋｕｂｉｎｙｉ，"Ｈａｕｓｃｈ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ"，ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９２），コンビナトリアル生化学，伝統的化学および他のもの（例えば，Ｈｏｌｚｇｒａｂｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ａｐｏｔｈｅｋｅｒ  Ｚｅｉｔｕｎｇ１４０（８），８１３−８２３，２０００を参照）が含まれるかまたはそれに依存する。
【００８２】
本発明はまた，組成物，好ましくは医薬組成物の製造に関し，妨害分子を同定するか，または同定された分子を洗練させるかまたは修飾するための上述の方法の工程，および，得られた分子を薬学的に許容しうる担体または希釈剤とともに処方する工程を含む。
【００８３】
（医薬）組成物の製造は，とりわけ，上に提供される教示にしたがって，標準的なプロトコルにしたがって行うことができる。
【００８４】
最後に，本発明は，ＭＩＤ１またはＭＩＤ２とα４との相互作用，またはα４とＰＰ２Ａｃとの相互作用を妨害する上述の蛋白質またはペプチド性フラグメント，そのペプチド模倣体，または分子，またはＭＩＤ１および／またはα４の発現または活性を妨害する分子，またはそれらの修飾されたまたは洗練された誘導体のいずれかを，上述の疾患の治療用の医薬組成物を製造するために用いることに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
図面
図１：ＭＩＤ１とポリユビキチン化蛋白質との結合
ａ），プロテオソーム阻害剤ＬＬｎＬの存在下（レーン２，４および６）または非存在下（レーン１，３および５）において，Ｖ５タグ付きＭＩＤ１（レーン５および６），Ｖ５タグ付き蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）（レーン１および２）または空ベクター（レーン３および４）でトランスフェクトした細胞からのＣＯＳ７細胞抽出物を抗Ｖ５で沈殿させ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，示される抗体で免疫ブロッティングした。アスタリスクはＩｇＧ重鎖を示す。
ｂ），ラクタシスチンの存在下（レーン２および４）または非存在下（レーン１および３）において，ｍｙｃタグ付きＭＩＤ１（レーン３および４）または空ベクター（レーン１，２）を過剰発現する細胞からのＣＯＳ７抽出物を，抗ｍｙｃで沈殿させ，抗ユビキチン（上パネル），次に抗ｍｙｃ（下パネル）を用いるウエスタンブロットにより分析した。先に議論されているように（２０），抗ｍｙｃおよび抗Ｖ５は，いずれもＣ末端にタグ付けされたＭＩＤ１を示す異なるサイズの２つの特異的バンドを検出する。アスタリスクはＩｇＧ重鎖を示す。
【００８６】
図２ａ），ＭＩＤ１をおとりとして用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて見出された胎児脳ライブラリ中のポジティブクローン。β−Ｇａｌレポーター遺伝子活性により定量した相互作用の強度は，３回の独立した実験の平均および標準偏差により右に示される。比較のために全長α４が示されている。’ＰＰ２Ａｃ−ｂｓ’は報告されているα４上のＰＰ２Ａｃ結合部位を表す。すべてのポジティブクローンに残基１７２−２９０が存在する。
ｂ），欠失変異体をおとりとして用いるＭＩＤ１上のα４の結合部位のマッピング。略号：ＲＦ，ＲＩＮＧフィンガー；ＢＢ１，Ｂ−ｂｏｘ１；ＢＢ２，Ｂ−ｂｏｘ２；ＦＮＩＩＩ，フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン；Ｂ３０．２，保存Ｃ末端ドメイン。
ｃ），α４とＭＩＤ１およびＭＩＤ２とのツーハイブリッドの組み合わせでは選択的成長が見られ，３つの他のＲＩＮＧフィンガー蛋白質との組み合わせでは成長が見られないことを示す酵母ｈｉｓ-ｌｅｕ-ｔｒｐ-プレート。ｐ５３／ＳＶ−４０Ｔ抗原は，組み合わせた２つの融合蛋白質の間の強い相互作用の陽性対照として働く。
【００８７】
図３：ＣＯＳ７細胞におけるＭＩＤ１−α４相互作用。
ａ），過剰発現したｍｙｃタグ付きα４（ｍｙｃ／α４）の細胞質分布。抗ｍｙｃを用いる免疫蛍光により検出した。
ｂ，ｃ），ｍｙｃタグ付きα４と野生型ＧＦＰ−ＭＩＤ１（ｂ）または変異体ＧＦＰ−ＭＩＤ１（ｃ）との共発現。抗ｍｙｃ（左列，赤色パターン），ＧＦＰ（中列，緑色パターン）または両方（右列，黄色パターン）の免疫蛍光検出。
ｄ），ｍｙｃ−ＭＩＤ１（レーン１），ｍｙｃ−ＭＩＤ１およびＶ５−α４（レーン２），ｍｙｃ−ＭＩＤ１およびＶ５−ＭＩＤ１（レーン３）またはＭＩＤ１（ｅｘ１）のｍｙｃタグ付きＲＢドメインおよびＶ５−α４（α４／Ｖ５，レーン４）でトランスフェクトしたＣＯＳ７抽出物におけるＶ５タグ付きα４（α４／Ｖ５）の免疫沈殿（ＩＰ）。沈殿物を７．５％ポリアクリルアミドゲルで分離し，抗ｍｙｃ（上パネル）で，次に抗Ｖ５（下パネル）でブロットした。
ｅ），ＭＩＤ１（ｅｘ１）のｍｙｃタグ付きＲＢドメインおよびＶ５−α４（α４／Ｖ５，レーン１），ＭＩＤ１のｍｙｃタグ付きＢ−ｂｏｘ１およびＶ５−α４（α４／Ｖ５，レーン２），空ｐＢｕｄベクター（レーン３），ｍｙｃ−ＭＩＤ１およびＶ５−α４（α４／Ｖ５，レーン４），またはｍｙｃタグ付きＭＩＤ１単独（レーン５）でトランスフェクトしたＣＯＳ７抽出物におけるｍｙｃタグ付きＭＩＤ１の免疫沈殿。沈殿をＰＡＧＥにより分離し，ブロットし，抗α４（抗α４，上パネル）および次に抗ｍｙｃ（下パネル）でプローブした。アスタリスクはＩｇＧ重鎖および軽鎖を表す。
ｆ），抗体特異性対照：内因性α４を含む細胞溶解物を，α４（ｆ，レーン１）の最初の４０アミノ酸を検出するポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析した。シグナルは，抗原性ペプチドを添加することにより抑制される（ｆ，レーン２）。アスタリスクは，内因性α４の変異型蛋白質の特異的検出を示す。
【００８８】
図４：胚性線維芽細胞におけるユビキチン媒介性蛋白質溶解によるＰＰ２Ａの制御。
ａ），プロテオソーム阻害剤ＬＬｎＬの存在下（レーン２および４）または非存在下（レーン１および３）における，Ｖ５タグ付きＭＩＤ１を発現する２９３細胞（レーン１，２），ならびに対照細胞（レーン３，４）における，ＰＰ２ＡのＣサブユニットに対する抗体を用いるＰＰ２Ａの検出。各レーンには５２μｇの蛋白質が負荷された。蛋白質負荷量が同等であることを確認するための対照として，同じブロット上のアクチンの検出（下パネル）を用いた。
【００８９】
ｂ），胚性線維芽細胞株１８／９８を増加する量のＬＬｎＬ（上部に示される）に曝露した後に溶解した。ＰＰ２Ａの触媒サブユニットを検出する抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った（中パネル）。同じブロットを延長して曝露すると（上パネル），ポリユビキチン化されたＰＰ２Ａｃ種が認められた。蛋白質負荷量が同等であることを確認するためにアクチン検出（下パネル）を用いた（５０μｇ／レーン）。下の棒はＰＰ２Ａｃ対アクチンの密度比を示す。
【００９０】
ｃ），ＯＳを有する年齢のマッチした胎児に由来する胚性線維芽細胞株からの細胞を用いて（ｂ）と同じ実験を行った。
【００９１】
ｄ），（ｂ）において用いた胚性線維芽細胞株１８／９８を，変異体ＭＩＤ１（ｄｅｌ４）または空ｐＭＡＣＳＫk．ＩＩベクター（模擬）でトランスフェクトした。ポジティブにトランスフェクトした細胞を，コトランスフェクトしたＨ−２Ｋkを用いるＭＡＣＳソーティングにより濃縮した。トランスフェクトし，ＬＬｎＬで処理していない（左）または処理した（右）細胞を，抗ＰＰ２Ａｃを用いてウエスタンブロッティングにより分析した（中パネル）。Ｈ−２Ｋk（上パネル）のウエスタンブロット検出は，トランスフェクションおよび細胞ソーティングの成功を示す。アクチン検出（下パネル）を用いて蛋白質負荷量（１０μｇ／レーン）が同等であることを確認した。
【００９２】
ｅ），（ｃ）で用いたものと同じＯＳ由来細胞株を用いて，野生型ＭＩＤ１または空ＰＭＡＣＳＫk．ＩＩベクター（模擬）でトランスフェクトして（ｄ）と同じ実験を行った。
【００９３】
ｆ），ＬＬｎＬで処理した（右）または処理していない（左），対照胚性線維芽細胞（ａ，ｂおよびｄにおけるものと同じ）およびＯＳ由来胚性線維芽細胞（ｃおよびｅにおけるものと同じ）の溶解物からの，モノクローナル抗ユビキチンを用いるユビキチンの免疫沈殿
抗ＰＰ２Ａｃ（上パネル）および次に抗ユビキチン（下パネル）を用いて沈殿物をウエスタンブロッティングにより分析して，免疫沈殿が成功したことを確認した。
【００９４】
図５：ＭＩＤ１発現に対するＰＰ２Ａｃ量の依存。
ａ），ＯＳ由来胚性線維芽細胞（１７／９８；左）または年齢のマッチした対照細胞株（１８／９８；右）から一連の遠心分離（方法を参照）により調製した亜細胞画分の抗ＰＰ２Ａｃを用いるウエスタンブロット分析。ペレットＰ１は核コンパートメントが濃縮されており，一方，ペレットＰ２は主として膜結合画分を表し，Ｐ３は不溶性細胞成分を含み，Ｓ３はサイトゾル画分である。抗アクチンブロッティング（下パネル）を用いてレーン間の蛋白質量を標準化した。棒グラフはＰＰ２Ａｃ／アクチン密度シグナルの比を示す。アスタリスクで示されるバンドは抗ＰＰ２Ａｃの非特異的交叉反応，または，ペレットＰ１およびＰ２においては触媒サブユニットのダイマー形成のいずれかを表す。
ｂ），同じ抗ＰＰ２Ａｃ（上パネル）を用いる（ａ）と同じ細胞の精製微小管のウエスタンブロット分析。同様の蛋白質負荷（２μｇ／レーン）を確認するためにチューブリンの検出（下パネル）を含めた。
ｃ），各画分におけるバンド強度のアクチンに対する比率を，３回の独立した実験の平均およびＳＤとして計算した。
【００９５】
図６：ＯＳ由来胚性線維芽細胞におけるサイトゾルおよび微小管結合蛋白質の過少リン酸化。年齢のマッチした３つの対照に由来する細胞株およびＯＳを有する胎児からの精製微小管（２０μｇ蛋白質／ブロット）の，プールしたリン酸化残基特異的抗体４Ｈ４および１６Ｂ４を用いる２次元ウエスタンブロット（上の３つのパネル）。ブロットをアルカリホスファターゼでプレインキュベーションして，リン酸化残基に対する抗体の特異性を確認した（下パネル）。蛋白質負荷量が同様であることを確認するため，アクチンも検出した（右の拡大図）。
【００９６】
図７：ＰＰ２ＡのＭＩＤ１媒介性ユビキチン依存性制御経路およびＯＳにおけるその破壊の仮想モデル。微小管およびまだ明確にされていない結合しているリン酸化された（Ｐ）蛋白質（ＭＡＰｘ，ｙ）が下に示されている。Ｐｉ，無機リン酸；Ｕｂ，ユビキチン；ＲＩＮＧ，ＲＩＮＧフィンガードメイン；ＢＢ１，Ｂ−ｂｏｘ１；ＡおよびＢ，微小管結合ＰＰ２Ａとともに見いだされるＰＰ２Ａサブユニット（タイプの都合により一定の縮小率で描かれていない）；ユビキチントランスフェラーゼ，ユビキチンコンジュゲート化酵素およびおそらくは他の補助的蛋白質を有する蛋白質複合体。アスタリスクはＭＩＤ１のＣ末端における変異を示す。
【００９７】
図８：培養Ｕ３７３ＭＧ細胞におけるＧＦＰ−ＧＬＩ３の局在化。Ｕ３７３ＭＧ細胞を，ＧＦＰ−ＧＬＩ３，ＧＦＰ−ＧＬＩ３およびｍｙｃタグ付きＭＩＤ１で，およびＧＦＰ−ＧＬＩ３およびｍｙｃタグ付きＢ−ＢＯＸ１でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にＧＦＰ−ＧＬＩ３の局在を調べた。実験１回あたり１００個の細胞を計数した。Ｂ−ＢＯＸ１とともに共発現させたとき，ＧＦＰ−ＧＬＩ３の核からサイトゾルへの有意な変化が観察された。
【００９８】
図９：Ｔａｕ−１免疫反応性は，出生後交感神経ニューロンにおいて，インビトロでＢ−ＢＯＸ１をコードするプラスミドでトランスフェクションした後に有意に増加する（*ｐ＜０．０００１，アンペアドｔ検定，トランスフェクトしていないニューロンの平均神経蛍光強度＝１００％）。不活性な変異型のＢ−ＢＯＸ１をコードするプラスミドでトランスフェクトした，ＥＧＦＰのみを発現するニューロンは，トランスフェクトしていないニューロンと比較して，異なる蛍光レベルを示さない。ｐａｎ−Ｔａｕ免疫反応性の強度は調べたすべての群において変化していない。
【００９９】
図１０：減少したＰＰ２Ａｃ分解が転写因子Ｇｌｉ３の局在化に及ぼす影響。
左上：ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰタグ付きＧｌｉ３の発現。棒は細胞の数を示し，それぞれ，核，サイトゾルまたはその両方におけるＧＦＰ蛍光の細胞局在化を示す；右上：前と同様に処理した細胞と，ｓｉＲＮＡ処理のためより少ないα４を発現する細胞におけるＧｌｉ３局在化の比較；中段左：上段左と同様，ただしα４−ｓｉＲＮＡの代わりに優性ネガティブに作用するＢｂｏｘ１の過剰発現によりＰＰ２Ａｃのアップレギュレーションが誘導されている；中段右：中段左と同様に，ただし，高度に特異的なＰＰ２Ａｃ阻害剤であるフォストリエシンの存在下で処理したＨｅＬａ細胞；下段：免疫抑制剤ラパマイシンの存在下におけるＧｌｉ３発現。これは，おそらくはＰＰ２Ａｃ−α４結合を間接的に阻害することにより，ＰＰ２Ａｃ活性を誘導することが知られている。
【０１００】
図１１：ＲＮＡｉによるα４のダウンレギュレーションがＨｅＬａ細胞の増殖に及ぼす影響。Ｈｅｌａ細胞を抗α４ＲＮＡｉ分子でトランスフェクトし，成長条件下で２４，４８および７２時間インキュベーションした後に細胞を計数した。対照としては，未処理細胞，対照ｓｉＲＮＡで処理した細胞，および模擬トランスフェクト細胞を用いた。
【０１０１】
図１２：ＨｅＬａ細胞における過剰発現したＧＦＰ−タグ付きＧｌｉ３の局在に及ぼすα４の過剰発現の影響。棒は細胞の数を示し，これはそれぞれ核，サイトゾルまたは両方におけるＧＦＰ蛍光の細胞の局在を示す。すべての実験は，Ｇｌｉ３のＣ末端およびＮ末端にタグ付けしたＧＦＰ，ならびにＧｌｉ３のＣ末端およびＮ末端にタグ付けしたＶ５抗原を用いて行った。
【０１０２】
図１３：Ｇｌｉ３の局在化の変化がパッチド遺伝子の転写に及ぼす影響。α４（レーン１）またはＢｂｏｘ１（レーン２）または模擬トランスフェクト（レーン３）を過剰発現するＨｅＬａ細胞のパッチド特異的半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。
【０１０３】
図１４：−ｈｕｍａｎＦｕｓｅｄ−リン酸化（ｈＦｕｓｅｄ−Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）：
ａ），Ｖ５タグ付きｈＦｕｓｅｄを過剰発現する細胞のサイトゾルをフォストリエシンの非存在下（レーン１）および存在下（レーン２）で３０℃で４時間インキュベートした。次に，蛋白質をＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離し，ブロットし，抗Ｖ５抗体とともにインキュベートした。フォストリエシンとインキュベーションした後，脱リン酸化されたバンドと比較して，リン酸化されたｈＦｕｓｅｄバンド（上のバンド）の明らかな濃縮が見られた。
【０１０４】
ｂ），ａに示されるウエスタンブロットのＩｍａｇｅ−ｑｕａｎｔ定量。対照（フォストリエシンなしでインキュベーション）においては，リン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は，フォストリエシン処理サンプルと明らかに異なる。
【０１０５】
ｃ），リン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は，対照（フォストリエシンなしでインキュベーション）におけるものと１．８倍の相違を示したが，フォストリエシン処理の後には１８倍の相違が測定された。
【０１０６】
図１５：−ｈＦｕｓｅｄ−リン酸化。
ａ），ｈＦｕｓｅｄのみ（ｃｏｎ）およびｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１（＋Ｂ−Ｂｏｘ１）とを一緒に発現する細胞の細胞溶解物をＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離し，ブロットし，抗Ｖ５−抗体とともにインキュベートした。細胞溶解直後にすべてのキナーゼおよびホスファターゼを停止させるために，ＳＤＳおよび尿素を含有する緩衝液中で細胞を溶解した。ウエスタンブロットにおいては，ｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１とを共発現する細胞において，対照（ｈＦｕｓｅｄのみを発現）と比較して，脱リン酸化した形のｈＦｕｓｅｄの明らかな濃縮を検出することができる。
【０１０７】
ｂ），ａに示されるウエスタンブロットのＩｍａｇｅ−ｑｕａｎｔ分析。対照におけるリン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は，ｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１とを共発現する細胞において検出された比率と明らかに異なる。
【０１０８】
ｃ），対照（ｃｏｎ−ａ，ｈＦｕｓｅｄのみを過剰発現する細胞）におけるリン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は１０．３であり，ｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１とを共発現する細胞におけるリン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は３である。
【０１０９】
図１６：−ｈｆｕｓｅｄ−リン酸化：図１５の実験の再現。ｃ：対照（ｃｏｎ−ａ，ｈＦｕｓｅｄのみを発現する細胞）におけるリン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は８．３であり，ｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１とを共発現する細胞におけるリン酸化された形およびリン酸化されていない形のｈＦｕｓｅｄの比率は３である。
【０１１０】
方法：
酵母ツーハイブリッドスクリーニング
酵母ツーハイブリッドスクリーニングのためには，全長ＭＩＤ１  ｃＤＮＡをｐＢＴＭ１１６ベクター中にクローニングした。次に，これをｐＧＡＤ１０ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のヒト胎児脳ｃＤＮＡマッチマーカー（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ）ライブラリとともに酵母Ｌ４０株にコトランスフェクションした。ヒスチジン，ロイシンおよびトリプトファンを欠失し（ｈｉｓ-ｌｅｕ-ｔｒｐ-），３−アミノ−１，２，４，トリアゾールを含む合成培地に形質転換体を播種し，プレートを３０℃で５日間インキュベートした。フィルターアッセイ（４７）を用いて，ヒスチジン陽性コロニーをβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。β−ガラクトシダーゼ陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し，これを再びＭｌＤ１−ｐＢＴＭ１１６および対照とともにＬ４０酵母にコトランスフェクションした。ＭＩＤ１−ｐＢＴＭ１１６との組み合わせにおいてのみ選択プレート上での成長を与えたプラスミド（ＭＩＤ１と相互作用する物質をコードすると想定される）を選択し，配列決定した。
【０１１１】
酵母液体培養物におけるβ−ガラクトシダーゼの活性
細胞をｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）法（４７）によりβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。
【０１１２】
組織培養
胚性線維芽細胞はｔｈｅ  Ｍａｘ−Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌａｄｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し，ＣＯＳ７細胞はｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。ＯＳに罹患した胎児からの胚性線維芽細胞株の樹立は先に記載されている（４）。ＣＯＳ７細胞はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥを用いてＣｌｏｎｔｅｃｈのプロトコルにしたがってトランスフェクトした。発現はトランスフェクションの２４−４８時間後に最適であった。細胞はＩＰ１緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０），ｐＨ７．０）またはＲＩＰＡ緩衝液（１ｘＰＢＳ，１％ＮＰ−４０，０．５％デオキシコール酸ナトリウム，０．１％ＳＤＳ）および阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）中で溶解し，次に溶解物を一連の遠心分離（１７，５００ｇ，次に１００，０００ｇ）により透明にした。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｔｅｔ−ｏｆｆシステムを用いて安定に発現する細胞株を樹立した。インテグレーションのコピー数はサザンブロット分析により決定した。胚性線維芽細胞は，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒで２００Ｖおよび１２．５μＦｄでトランスフェクトした。
【０１１３】
プロテオソーム阻害のためには，胚性線維芽細胞を種々の濃度（１０−５０μＭ）のＬＬｎＬ（Ｓｉｇｍａ）とともに２時間，または１０μＭのラクタシスチン（Ｓｉｇｍａ）とともに５時間インキュベートした。１．６ｘ１０7個の初代胚性線維芽細胞（ＯＳを有する個人に由来する細胞株から，および年齢のマッチした対照から）の亜細胞画分を，先に記載されたようにして３回の異なる遠心分離工程（１，０００ｇ，１７，５００ｇ，および１００，０００ｇ）により調製した（４７）。蛋白質濃度はブラッドフォードアッセイを用いて決定した。
【０１１４】
コンストラクト
ＭＩＤ１−Ｖ５  ｃＤＮＡの安定なゲノムインテグレーションのために，ＭＩＤ１  ｃＤＮＡ（オープンリーディングフレーム）をｐｃＤＮＡ４．１−Ｖ５−ＨＩＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし，次にこれをＶ５−ＨＩＳタグで再増幅した。次に，融合コンストラクトをｐＴＲＥベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。単一のベクターから２つの蛋白質を同時に発現させるために，ｐＢｕｄＣＥ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＭＩＤ１  ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩを用いてＰCMVプロモーターのマルチクローニング部位にクローニングし，ＭＩＤ１，α４およびＰＫＣｃＤＮＡをＮｏｔＩおよびＢｇｌＩを用いてＰEF-1αプロモーターのマルチクローニング部位にライゲーションした。ＧＦＰ−ＭＩＤ１は先に記載されるようにして発現させた（４）。Ｃ末端にｐＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのｍｙｃペプチドをタグ付けしたα４蛋白質を発現させた。ＭＡＣＳについては，ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いてＭＩＤ１をｐＭＡＣＳＫk．ＩＩベクター中にクローニングした。
【０１１５】
細胞ソーティング
ｐＭＡＣＳＫk．ＩＩでトランスフェクトした２ｘ１０7個の胚性線維芽細胞から出発して，ＭｉｄｉＭＡＣＳ分離ユニットおよびＭＡＣＳｅｌｅｃｔ  Ｋｋマイクロビーズを用いて製造元の指針にしたがって細胞ソーティングを行った。
【０１１６】
免疫沈殿，ウエスタンブロッティングおよび免疫蛍光
ＣＯＳ７細胞については，それぞれのｃＤＮＡを有するｐＢｕｄＣＥ４ベクターでトランスフェクトした８ｘ１０6個の細胞をＩＰ１緩衝液中で溶解した。溶解物を５０μｌのプロテインＡ−アガロース（スラリー）で予備洗浄した後，上清を２μｇの抗Ｖ５とともに４℃で一晩，次に７５μｌ（スラリー）のプロテインＡ−アガロースとともに２時間インキュベートした。ＩＰ１緩衝液で３回洗浄した後，蛋白質を１ｘＬａｅｍｍｌｉ緩衝液で９５℃で溶出した。ＭＩＤ１−Ｖ５発現は，２９３ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞株からドキシサイクリンを除去して４８時間後に最適であった。次に細胞をＩＰ１緩衝液中で溶解し，２μｇの抗Ｖ５を用いて免疫沈殿を行った。蛋白質を１ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中で煮沸し，１０％および１２％ＳＤＳゲルで分離し，ＰＶＤＦ膜（Ｒｏｃｈｅ）にブロットし，ブロッキングし，製造元の指針にしたがってそれぞれの一次抗体とともにインキュベートした。
【０１１７】
胚性線維芽細胞については，８ｘ１０6個の細胞をＩＰ１緩衝液中で溶解した。溶解物を５０μｌのプロテインＧ−アガロースで予備洗浄した後，上清を２μｇのモノクローナル抗ユビキチンとともに４℃で一晩，次に７５μｌ（スラリー）のプロテインＧ−アガロースとともに４℃で２時間インキュベートした。溶出および蛋白質分析は上述のようにして行った。密度の定量はＰＣＢコンピュータプログラムを用いて行った。
【０１１８】
１．５ｘ１０5個のＣＯＳ７細胞をカバースリップ上で成長させ，それぞれのベクターでトランスフェクトし，ＰＥＭ緩衝液中４％パラホルムアルデヒドで固定した。抗体インキュベーションは標準的な方法にしたがって行った。
【０１１９】
抗体
ポリクローナル抗ＰＰ２ＡｃはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから，抗ホスホセリンおよび抗ホスホトレオニンはＢｉｏｍｏｌから，モノクローナル抗Ｖ５はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから，モノクローナル抗ｃ−ｍｙｃはＣｌｏｎｔｅｃｈから，抗ユビキチンはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから，抗アクチンはＳｉｇｍａから購入した。抗ＭＩＤ１は先に記載されるように（３）可視化した。ブロットを腸アルカリホスファターゼ（２００Ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）とともにプレインキュベートすることにより抗体特異性を試験した。
【０１２０】
α４に対するポリクローナル抗血清は，２匹のウサギを蛋白質のＮ末端に由来するペプチドＡＡＥＤＥＬＱＬＰＲＬＰＥＬＦＥＴＧＲＱＬＬＤＥＶＥＶＡＴＥＰＡＧＳＲＩＶＱＥＫＣで免疫することにより調製した。３週間の間隔で４回ブーストした後，免疫の１２週間後に高タイターの血清を回収した。Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋカップリングゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合させた固定化ペプチドのアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を精製した。抗体は約４０ｋＤの特定のバンドを認識し，これは抗原性ペプチドを加えることにより特異的に抑制された。ウエスタンブロット用にはアフィニティー精製抗体を１：１００希釈で用いた。
【０１２１】
微小管のインビトロでのアセンブリ
微小管アセンブリは先に記載されるようにして行った（４）。簡単には，１．６ｘ１０7個の胚性線維芽細胞を微小管アセンブリ緩衝液（０．１ｍＭ  ＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．８，１ｍＭ  ＭｇＳＯ4，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，２ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍＭ  ＧＴＰ）中で溶解し，溶解物を超遠心分離（６０，０００ｇ，４℃，１時間）により透明とした。次に，上清をＧＴＰおよびタキソールとともに３７℃で３０分間インキュベートし，４０，０００ｇで３７℃で３０分間遠心分離した。ペレットをタキソールを含むアセンブリ緩衝液で１回洗浄し，微小管をタキソールを含まないアセンブリ緩衝液に４℃で再溶解した。
【０１２２】
二次元ウエスタンブロッティング
二次元電気泳動は，以下のようにして両性電解質法により行った（４８）。２０ｍｇの尿素（最終濃度９Ｍ），１．４μｌの１ＭＤＴＴ（最終濃度７０ｍＭ）および２μｌの両性電解質（ｐＨ２−４）をＩＰ１緩衝液中に再懸濁した２０μｌの免疫沈殿蛋白質と混合した。サンプルを５分間脱気した後に負荷した。先の記載（４９）に正確にしたがってゲル溶液を調製し，０．９ｍｍ幅の２Ｄチューブ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でゲルを重合させた。脱気したサンプルを重合したゲルに直接負荷し，２５μｌのサンプル保護溶液（４９）を重層した。以下の勾配を用いて等電点電気泳動を行った：１００Ｖで４５分間，２００Ｖで１時間，４００Ｖで１時間，６００Ｖで１時間，８００Ｖで１０分間，１，０００Ｖで５分間。次に，平衡溶液（３９）で１０分間ゲルを平衡化し，０．９８ｍｍ厚の１０％ＳＤＳミニゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に重層し，アガロース緩衝液（４９）中の１％アガロースを重層した。第二次元ゲルは，標準的な方法にしたがって，セミドライブロッター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で１５Ｖで３０分間平衡化し，ブロットし，次に上述したようにして抗体インキュベーションを行った。
【０１２３】
細胞培養
末梢交感神経は出生後１−３日のラットから得た。上頸神経節（ＳＣＧ）を切除し，０．２５％のトリプシンで３７℃で２０分間処理した。細胞懸濁液を機械的に分離した後，４０μｍのナイロンメッシュを通して濾過し，前プレーティングの目的で未被覆のＦａｌｃｏｎディッシュに６ＳＣＧ／ウエルで播種した。４時間後，ニューロンをポリ−Ｄ−リジン／ラミニンで被覆したガラス床ディッシュ（Ｗｉｌｌｃｏ  Ｗｅｌｌｓ  Ｂ．Ｖ．，ｇｗｓｔ  ３５２２，３．８ｃｍ2面積／ディッシュ）に移した。ニューロンは，抗生物質，Ｎ２添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１００ｎｇ／ｍｌ神経成長因子（ＮＧＦ；Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ培地で，５％ＣＯ2を含む湿潤雰囲気中で３７℃で維持した。
【０１２４】
ニューロンのトランスフェクション
ニューロンは，バイオリスティック法を応用して，播種の２時間後にトランスフェクションした。この方法では，ＤＮＡを負荷したミクロンのサイズの高速の金粒子を，解離させたニューロンに手持ち型銃を用いて射撃した。金粒子のＤＮＡでのコーティングは，製造元の指針（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を改変して行った。３５個のカートリッジを調製するために，２５ｍｇの金粒子（直径１．６μｍ）を５０μｌの０．０５Ｍスペルミジンに懸濁した。ボルテックスし，５秒間超音波処理した後，５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した５０μｇのプラスミドＤＮＡを加えた（コトランスフェクション実験用，８０μｇ，すなわち，４０μｇのプラスミド１＋４０μｇのプラスミド２を用いた）。金粒子およびＤＮＡの量は，１回のトランスフェクション実験について，約０．７（ｍｇ／カートリッジ）のマイクロキャリア負荷量（ＭＬＱ）および２（μｇ／ｍｇ）のＤＮＡ負荷比（ＤＬＲ）に対応する。次に，ＤＮＡ，スペルミジンおよび金を速度可変のボルテクサーで５秒間混合した。低いボルテックス速度で，５０μｌの１ＭＣａＣｌ2を混合物に滴加して，ＤＮＡを金粒子と結合させ，次に，室温で１０分間沈殿させた。上清を除去し，ペレットを８００μｌの１００％エタノールですすいだ。洗浄は２回行い，各洗浄工程の間に３０００ｇでの遠心分離工程を行った。最後に，ペレットを５００μｌのＰＶＰ溶液（１００％エタノール中０．０５ｍｇのポリビニルピロリドン）に再懸濁し，２ｍｌのＰＶＰ溶液を含む１５ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移した。金粒子を特別のＴｅｆｚｅｌチューブ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れ，これを窒素ガスを用いて少なくとも１５分間乾燥させた後に負荷した。マイクロキャリア／ＤＮＡ懸濁液を１０秒間ボルテックスし，１０ｃｃのシリンジを用いてチューブに入れた。金粒子は３分間着定させた。管からエタノールを除去した後，管の内表面を粒子で被覆するために，管を一定の窒素流の下で５分間回転させた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ製の切断道具を用いて管を小片（カートリッジ）に切断し，乾燥環境下で４℃で保存した。
【０１２５】
ニューロンのトランスフェクションのためには，培地を吸引し，銃のバレル・ライナーをディッシュの上部に直接置き，不活性ヘリウムガス（圧力１２０ｐｓｉ）を用いて金粒子を加速した。衝撃波により誘導される障害を制限し，均一な粒子分布を得るために，遺伝子銃とバレル・ライナー培養ディッシュとの間に４０μｍのナイロンメッシュを置いた。
【０１２６】
免疫蛍光
トランスフェクションの２日後，細胞培養物を４％パラホルムアルデヒドで４℃で１０分間固定し，ＰＢＳ中０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５分間透過性とした。ヒトタウ（マウスモノクローナル，１：５０，州北部）または過少リン酸化した形のタウ（マウスモノクローナル，１：１００）に対する一次抗体を，０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳに溶解し，３７℃で２時間培養物に加えた。ニューロンは，ＰＢＳ中で３回洗浄した後，Ｃｙ３コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに室温で１時間インキュベートし，次にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１２７】
顕微鏡および形態計測学的分析
ニューロンの可視化には反転させた蛍光を備えた完全電動Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００Ｍ顕微鏡蛍光を用いた。相互に排他的な励起／放出特性を有する適当なフィルターセットはＣｈｒｏｍａから入手した（ＥＧＦＰについては＃４１０１７，Ｃｙ３については＃４１００２Ｃ）。ディッシュ全体を蛍光細胞について系統的にスクリーニングし，各実験について，すべてのトランスフェクションしたニューロンを同一の曝露時間で記録した。画像はＰＣに接続したデジタルカメラ（ＳｐｏｔＲＴ）を用いて４０倍で取得し，Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（商標）ソフトウエア（ｖｅｒｓｉｏｎ４．５ｒ５，Ｖｉｓｉｔｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。各画像のトランスフェクションしていないまたはトランスフェクションしたニューロンの平均免疫蛍光強度は，細胞質上にランダムに配置した円領域を用いて決定した。それぞれの無傷のニューロン細胞体について３回の測定を行い，平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を決定した（最大強度＝２５６）。トランスフェクションしたニューロンの蛍光強度は，各実験において種々のＴａｕ抗体の１つとともにインキュベートして，すべてのトランスフェクションしていないニューロンの平均蛍光強度（＝１００％）に対して標準化した。
【０１２８】
クローニング
ＭＩＤ１  Ｂｂｏｘ１（アミノ酸１０８−１６５）は，ｐｉＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限部位にクローニングした。それぞれのＤＮＡ−フラグメントは，以下のオリゴデオキシヌクレオチドプライマー：
５’：ＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＧＣＣ
３’：ＡＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＡＣＧＡＴＧＧ
を用いて，ＰＣＲによりヒトＭＩＤ１−ｃＤＮＡから生成した。
【０１２９】
ＭＩＤ１  Ｂｂｏｘ変異体は，ＰＣＲのテンプレートとして，アラニン１３０をトレオニンに交換した（コドン変化：ＧＣＴからＡＣＴ）ＭｌＤ１−ｃＤＮＡを用いて，同様にクローニングした。この変異は，すべての種類の疾患を有するオピッツ患者において見出されたものであり，ＭＩＤ１のＢｂｏｘ１とα４蛋白質との正常な結合を破壊することが示されている（未発表所見）。
【０１３０】
以下の実施例は，本発明を例示するために提供され，本発明を制限するものと解釈すべきではない。特に，本発明の教示に基づいて，上述の疾患の治療において医薬品として処方するためのペプチド性または蛋白質性化合物，またはこれらから誘導される化合物を，その薬学的活性を失うことなく改変しうることが理解されるであろう。実施例に対するこれらの改変および変種は，本発明の精神および範囲の範囲内であると考えられる。
【０１３１】
方法
Ｇｌｉ３−実験：
ＣＯＳ７，ＨＥＬＡ，およびＵ３７３ＭＧ細胞は，Ｐｏｌｙ  Ｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．３０１１０７）を用いて，製造元の指針にしたがってトランスフェクトした。Ｇｌｉ３  ｃＤＮＡは，それぞれｐＥＧＦＰ−Ｃ１およびｐＥＧＦＰ−Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。１回の実験（Ｇｌｉ３−ＧＦＰ，ＧＦＰ−Ｇｌｉ３，Ｇｌｉ３ＧＦＰ＋ｍｙｃ−ＭＩＤ１，ＧＦＰ−Ｇｌｉ３＋ｍｙｃ−ＭＩＤ１，Ｇｌｉ３−ＧＦＰ＋ｍｙｃ−ＢＢｏｘ１，ＧＦＰ−Ｇｌｉ３＋ｍｙｃ−ＢＢｏｘ１）あたり１００個のトランスフェクトした細胞を計数し，Ｇｌｉ３の局在について分析した。実験は２回繰り返して行った。ＢＢｏｘ１とコトランスフェクションしたとき，ＧＦＰ−Ｇｌｉ３およびＧｌｉ３−ＧＦＰの両方について，核からサイトゾルへの顕著な変化が認められた。ｍｙｃ−ＭＩＤ１およびｍｙｃ−ＢＢｏｘ１の過剰発現にはＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰＣＭＶ−Ｔａｇ３ベクターを用いた。
【０１３２】
免疫蛍光ＩＩ
６ウエルプレートのウエルあたり１ｘ１０5個のＨＥＬＡ細胞を，Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて製造元の指針にしたがってトランスフェクトした。ｐｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬の量に対するＤＮＡの量の比率は３μｇＤＮＡ／１０μｌ  Ｐｏｌｙｆｅｃｔであった。ＨＥＬＡにおける発現に用いたコンストラクトは以下のとおりであった：ＧＦＰ−ＧＬＩ３（ａａ１８−１５４９），ＧＬＩ３−ＧＦＰ（ａａ１−１５２２），ＭＹＣ−ＧＬＩ３（ａａ１８−１５９６），ＦＬＡＧ−ＧＬＩ３（ａａ１８−１５９６），ＭＹＣ−Ｂ−ＢＯＸ１（ＭＩＤ１蛋白質のａａ１１０−１６７），ＡＬＰＨＡ４−Ｖ５（ａａ１−３３９）。トランスフェクションの２４時間後に免疫蛍光を行った。ＧＦＰコンストラクトはＳｃｈｗｅｉｇｅｒら（１９９９）に記載されるようにして処理した。ＭＹＣタグ付きおよびＦＬＡＧタグ付きコンストラクトを用いる免疫蛍光は，Ｔｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒら（２００１）にしたがって行った。ＦＬＡＧタグ付きコンストラクトは１：５００に希釈した抗ＦＬＡＧ−抗体で検出し，二次抗体ＦＩＴＣ−抗マウスは１：１０００に希釈した。ＭＹＣタグ付きコンストラクト用には，抗ＭＹＣ−抗体（１：３００）およびＣＹ３−抗ウサギ（１：１０００）を用いた。
【０１３３】
ウエスタンブロットおよびフォストリエシンとのインビトロインキュベーション
Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて製造元の指針にしたがって，８ｘ１０5個の細胞をｈＦｕｓｅｄ−Ｖ５（ａａ１−１３３５）でトランスフェクトした。ｈＦｕｓｅｄ−Ｖ５を過剰発現する細胞のサイトゾルを，フォストリエシン（５００ｎＭ）の存在下または非存在下で３０℃で４時間インキュベートした。蛋白質（２００μｇ蛋白質／レーン）を６％ＳＤＳゲルで分離し，ＰＶＤＦ膜にブロットし，抗Ｖ５−抗体（１：３０００）とともにインキュベートした。二次ＨＲＰ抗マウス抗体は１：２０００で希釈した。
【０１３４】
ウエスタンブロット：ｈＦｕｓｅｄリン酸化
Ｑｉａｇｅｎ  ｐｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて，製造元の指針にしたがって，８ｘ１０5個の細胞を，ＭＹＣ−Ｂ−ＢＯＸ１（ＭＩＤ１蛋白質のａａ１１０−１６７）の存在下および非存在下で，ｈＦｕｓｅｄ−Ｖ５（ａａ１−１３３５）でトランスフェクトした。細胞ペレットをｍａｇｉｃ  ｍｉｘ（４８％尿素，１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，８，７％グリセリン，１％ＳＤＳ，０，００４％ブロモフェノールブルー，１４３ｍＭβ−メルカプトエタノール）に再懸濁した。超音波処理した後，ｈＦｕｓｅｄおよびｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１とを発現する細胞の細胞溶解物を６％ＳＤＳ−ゲル（各レーンにつき２００μｇの蛋白質を負荷）で分離し，ＰＶＤＦ−膜にブロットし，抗Ｖ５−抗体（１：３０００）とともにインキュベートした。二次ＨＲＰ抗マウス抗体は１：２０００に希釈した。
【０１３５】
α４ノックダウン
Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造元の指針にしたがって，６ウエルプレートのウエルあたり５ｘ１０4個のＨｅＬａ細胞をウエルあたり２，６μｇの合成ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした。α４ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの配列は，ＧＵＡＣＣＵＵＵＵＧＧＵＧＣＣＡＧＣＧｄＴｄＴ（センス）およびＣＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＧＧＵＡＣｄＴｄＴ（アンチセンス）であった。各一本鎖ｓｉＲＮＡの３’末端の最後の２つのヌクレオチドは，デスオキシチミジン（ｄＴ）であった。対照実験のためには，先に公表されたラミンＡ／Ｃを標的とするｓｉＲＮＡ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）および配列ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ（センス）およびＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡｄＴｄＴ（アンチセンス）を有する非標的対照ｓｉＲＮＡ（Ｘｅｒａｇｏｎ）を用い，上述のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクト効率は，ＦＩＴＣ標識対照ｓｉＲＮＡ（Ｘｅｒａｇｏｎ）を用いてモニターした。約９５％の細胞がｓｉＲＮＡの取り込みを示し，慣用の蛍光顕微鏡で見ることができた。
【０１３６】
ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした２４時間後，ＱｉａｇｅｎＰｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬を用いて製造元の指針にしたがって，細胞をＧＦＰ−ＧＬＩ３でトランスフェクトした。免疫蛍光はＳｃｈｗｅｉｇｅｒら（１９９９）に記載されるようにして行った。
【０１３７】
α４のノックダウンを確認するために，２０μｇの総蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）で分離し，ＰＶＤＦ膜（Ｒｏｃｈｅ）にブロッティングした。膜をウサギポリクローナル抗α４抗体（１：３００希釈）とともにインキュベートした。二次ＨＲＰ−抗ウサギ抗体は１：２０００に希釈した。
【０１３８】
実施例
実施例１：ポリユビキチン化蛋白質はＭＩＤ１免疫複合体中に蓄積する
いくつかのＲＩＮＧフィンガー蛋白質は標的蛋白質と相互作用し，このことによりそのユビキチン依存性分解を引き出すため，ＭＩＤ１とポリユビキチン化蛋白質との相互作用を調べた。それぞれＭＩＤ１  ｃＤＮＡまたは対照として蛋白質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のいずれかをコードするｃＤＮＡ（いずれもＣ末端Ｖ５エピトープがタグ付けされている）または空ベクターでＣＯＳ７細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を２５μＭのＬＬｎＬ（プロテオソーム阻害剤）で処理して，ユビキチン化蛋白質を濃縮させた。細胞抽出物を抗Ｖ５で沈殿させ，ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ユビキチンを用いるウエスタンブロッティングを行った。プロテオソーム阻害剤で前処理した細胞からのＭＩＤ１含有沈殿物は，種々の程度にユビキチン化された豊富な量の蛋白質を含み，これは免疫ブロッティングで高分子量蛋白質スメアとして見られた（図１ａ，レーン６）。この蛋白質スメアは，疑似トランスフェクト細胞またはＶ５タグ付きＰＫＣを発現する細胞からの沈殿物には見られなかった（図１ａ，レーン１−４）。
【０１３９】
ＭｌＤ１−ｍｙｃ−過剰発現細胞および模擬トランスフェクト細胞を第２の阻害剤として２０Ｓプロテオソーム特異的阻害剤であるラクタシスチン（１４）で処理することにより，この結果を確認した。この場合も，ラクタシスチンとインキュベーションした後にＭＩＤ１−ｍｙｃ−含有沈殿物において高分子量の蛋白質の蓄積が検出されたが，模擬トランスフェクト細胞では検出されなかった（図１ｂ）。
【０１４０】
実施例２：ＭＩＤ１は，ＰＰ２Ａの制御サブユニットであるα４と相互作用する
ＭＩＤ１媒介性蛋白質ユビキチン化の標的を同定するために，ヒト胎児脳ライブラリの１０6個のコロニーの酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて，全長ＭＩＤ１蛋白質コーディング領域をおとりとして用いた。異なる長さの２つの挿入物を含む４つの独立したポジティブクローン（ａ−ｄ）が得られた。すべてのクローンは，ＰＰ２Ａと結合することが既に示されているα４−ａ蛋白質（１２，１５，１６）をコードするヒトＩＧＢＰ１遺伝子に対応する配列を含む。クローンａおよびｂは，Ｃ末端の１６８アミノ酸（ａａ）をコードしており，クローンｃおよびｄは，Ｎ末端配列を含む。この配列はコドン２９０の後でイントロンにより中断されているため，α４とは無関係の１７個の追加のアミノ酸の後に翻訳が未成熟に停止する。すなわち，ＭＩＤ１と相互作用するα４蛋白質ドメインは，両方のタイプのクローンに共通の残基１７２−２９０（図２ａ）にわたる１１９アミノ酸にマップされる。図２ｃはＭＩＤ１−α４相互作用の特異性を示す。ツーハイブリッドアッセイにおいて試験した別の蛋白質のうちでは，アミノ酸配列がＭＩＤ１と高度に類似する（８３％）ＭＩＤ２（文献１７）のみがα４と結合するが，３つの別のＲＩＮＧフィンガー蛋白質，すなわち，ＲＢＣＣ７２８（文献１８），ＨＨＡＲＩ（文献１９）およびＰＡＲＫＩＮ（文献１０）は結合しない。
【０１４１】
実施例３：ＭＩＤ１上のα４結合部位のマッピング
ＭＩＤ１は，ＲＩＮＧフィンガー，２つのＢ−ｂｏｘ，コイルドコイル領域，フィブロネクチンタイプＩドメインおよびＢ３０．２ドメイン（これらはすべて特異的蛋白質−蛋白質相互作用の候補領域である）を有するマルチドメイン蛋白質である（３）。いずれのドメインがα４に特異的に結合するかを明らかにするために，酵母ツーハイブリッドシステムにおいてＭＩＤ１のいくつかの欠失変異体をα４との相互作用について試験した。結果は，α４との強い相互作用にはＢ−ｂｏｘ１（残基１１０−１６５）で十分であることを示す（図２ｂ）。実際，他のドメインを含むより長いコンストラクトは，より弱くα４に結合する（図２ａ，ｂ）。
【０１４２】
実施例４：無傷の細胞においてＭＩＤ１はα４とともに局在化する
次に，ＣＯＳ７細胞においてグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）タグ付きＭＩＤ１（文献４）およびＮ末端ｍｙｃタグ付きα４を過剰発現させることにより，無傷の細胞においてＭＩＤ１およびα４の局在化を調べた。α４は，単独で発現させたとき，拡散した細胞質分布を示す（図３ａ）。両方の蛋白質を共発現させると，α４は野生型ＧＦＰ−ＭＩＤ１蛋白質とともに局在化し，細胞骨格構造に沿って１００％重複した（図３ｂ）。ＯＳを有する個体を模倣するＣ末端の変異を有する変異体ＧＦＰ−ＭＩＤ１を発現させると，両方の蛋白質を含む細胞質クランプが形成される（図３ｃ）。
【０１４３】
実施例５：ＭＩＤ１はα４とともに免疫沈殿する
独立した方法として免疫沈殿を用いて，観察された蛋白質相互作用を確認した。２つの異なるプロモーターから両方の蛋白質を発現する単一のベクターを用いて，ＭＩＤ１およびα４のｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞で過剰発現させた。続くウエスタンブロットおよび免疫沈殿実験におけるシグナルの検出のために，ＭＩＤ１にはＣ末端ｍｙｃタグ（ＭＩＤ１−ｍｙｃ）を付け，α４はＣ末端Ｖ５タグと融合させた（α４−Ｖ５）。トランスフェクトした溶解物のウエスタンブロッティングは，予測されたサイズにバンドを示した（ＭＩＤ１−ｍｙｃについては７５ｋＤ，α４−Ｖ５については４５ｋＤ；データ示さず）。次に，α４−Ｖ５およびＭｌＤ１−ｍｙｃ発現細胞の溶解物を抗ｍｙｃおよび抗Ｖ５で沈殿させた。それぞれの補足抗体による沈殿物のウエスタンブロット分析は，ＭＩＤ１がＶ５タグ付きα４と共沈殿したことを示した（図３ｄ，レーン２；図３ｅ，レーン３）。さらに，ｍｙｃタグ付きおよびＶ５タグ付きＭＩＤ１の両方を発現する細胞を抗Ｖ５で免疫沈殿させ，次に抗ｍｙｃを用いるウエスタンブロット分析を行うと，特異的ＭＩＤ１バンドおよび７５ｋＤのバンドが生じ（図３ｄ，レーン３），このことからＭＩＤ１がホモダイマーを形成することができるという先の知見（２０）が確認された。ＭＩＤ１−ｍｙｃのみを発現する細胞からの抗Ｖ５沈殿物は，特異的ＭＩＤ１のサイズを示さなかった（図３ｄ，レーン１）。これに対し，内因性α４蛋白質を検出する抗体は，ＭｌＤ１−ｍｙｃおよび内因性α４蛋白質が共沈殿することを確認した（図３ｅ，レーン５）。すなわち，ＭＩＤ１−ｍｙｃとα４−Ｖ５蛋白質との共発現により，過剰発現されたα４−Ｖ５により内因性α４はＭＩＤ１結合部位から置き換えられる（図３ｅ，レーン４）。
【０１４４】
α４結合を担うＭＩＤ１蛋白質ドメインをより詳細に同定し，酵母ツーハイブリッド実験からの結果を確認するために，Ｖ５タグ付きα４を，それぞれｍｙｃタグ付きＲＢドメイン（ＲＩＮＧフィンガーおよび２つのＢ−ｂｏｘ）と，およびＭＩＤ１蛋白質のｍｙｃタグ付きＢ−ｂｏｘ１と共発現させた。抗ｍｙｃによる沈殿および続く抗α４によるウエスタンブロッティングは，α４（Ｖ５タグ付きおよび内因性）と，ＲＢドメイン（図３ｅ，レーン１）および第１のＢ−ｂｏｘ（図３ｅ，レーン２）の両方との強い相互作用を示した。逆の実験，すなわちＶ５タグ付きα４の沈殿においては，ウエスタンブロットでｍｙｃタグ付きＲＢドメインが検出された（図３ｄ，レーン４）。用いた電気泳動条件ではＢ−ｂｏｘ１含有ポリペプチドを分離することはできなかったが，これはおそらくその分子量が非常に低い（５ｋＤ）ためである。
【０１４５】
実施例６：ＰＰ２ＡのＭＩＤ１依存性ユビキチン化
ＭＩＤ１蛋白質のユビキチンリガーゼ活性およびそのα４との特異的相互作用が観察されたため，α４のユビキチン特異的分解について調べた。胚性線維芽細胞のサイトゾル抽出物はＬＬｎＬによる前処理の後にα４の濃縮を示さず，α４のユビキチン特異的修飾の証拠もなかった（データ示さず）。同様に，ウエスタンブロット分析に特異的抗ＭＩＤ１を用いた類似の実験は，ＭＩＤ１蛋白質のユビキチン特異的修飾の証拠を示さなかった（データ示さず）。
【０１４６】
α４はＰＰ２Ａの制御サブユニットとして機能することが示されているため（１５），この酵素がＭＩＤ１−α４ユビキチンリガーゼ活性の標的であると推測することができる。そうであれば，ＭＩＤ１発現の増加はサイトゾルＰＰ２Ａの減少と同時に生ずるはずである。この仮説を調べるために，ＭＩＤ１−Ｖ５を発現する２９３細胞（図４ａ，レーン１）および対照細胞（図４ａ，レーン３）からの等量の蛋白質を含む溶解物を，ＰＰ２ＡのＣサブユニットを検出するポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。結果は，ＭＩＤ１−Ｖ５を発現する細胞においてサイトゾルのホスファターゼ２Ａが実際にダウンレギュレートされていることを示した。プロテオソーム阻害剤ＬＬｎＬで前処理すると（図４ａ，レーン２），このＰＰ２Ａのダウンレギュレーションは完全にブロックされ，このことは，この効果がユビキチン依存性分解により生ずることを示す。
【０１４７】
サイトゾルＰＰ２Ａのユビキチン依存性制御の直接の証拠を得るために，大量の内因性ＭＩＤ１を含むことが先に示されている（文献２）胚性線維芽細胞において，プロテオソーム阻害剤ＬＬｎＬ（図４ｂ）で処理した後のサイトゾルＰＰ２Ａの量を分析した。ＬＬｎＬの濃度を増加させると，ユビキチン修飾により制御される蛋白質について予測されるように，ＰＰ２Ａ（図４ｂ，中パネル）およびポリユビキチン化形の酵素（図４ｂ，上パネル）が濃縮された。対照として，機能不全ＭＩＤ１を発現するＯＳ由来線維芽細胞（上述を参照）にＬＬｎＬを加えたところ，ＰＰ２Ａの濃縮もポリユビキチン化形の酵素の蓄積も引き起こされなかった（図４ｃ）。このことは，ＯＳを有する個人においては，ＭＩＤ１変異のためにＰＰ２ＡのＣサブユニットの蛋白質溶解が減少することを示す。
【０１４８】
実施例７：ＭＩＤ１の過剰発現によるＯＳ由来細胞におけるＰＰ２Ａｃ分解のレスキュー
対照細胞株を変異体ＭＩＤ１でトランスフェクションすることにより，これらの知見を確認した。ここでは，ＰＰ２Ａｃのユビキチン特異性分解が根絶され（図４ｄ），このことは，大量の変異体ＭＩＤ１蛋白質が優性ネガティブ効果を有することを示す。ＯＳ由来細胞を野生型ＭＩＤ１でトランスフェクションし，ただしユビキチン媒介性蛋白質ターンオーバーは復帰させることにより，ＰＰ２Ａｃの量を標準化した（図４ｅ）。
【０１４９】
ＰＰ２Ａｃのユビキチン化をさらに確認するために，対照またはＯＳ由来細胞のいずれかのサイトゾル抽出物を抗ユビキチンで免疫沈殿した。抗ＰＰ２Ａｃで検出すると，対照細胞株においてモノユビキチン化ＰＰ２Ａｃの予測サイズである４４ｋＤに特異的バンドが生成した。このバンドはＬＬｎＬで前処理した後に濃縮された（図４ｆ）。これに対し，ＯＳ由来の個体の細胞の対応する沈殿物においては，同じサイズの明確なバンドは認められなかった（図４ｆ）。
【０１５０】
実施例８：ＯＳ由来細胞における微小管結合ＰＰ２Ａのアップレギュレーション
変異体ＭＩＤ１がＯＳ由来胚性線維芽細胞中に蓄積するため，ＭＩＤ１が内因性ＰＰ２Ａの量に影響を及ぼすか否かを試験するために，これらの細胞を用いることとした。ＯＳ由来胚性線維芽細胞株および年齢のマッチした対照細胞株を用いて一連の細胞分画実験を行った。ＯＳ由来細胞のサイトゾル画分においてＰＰ２Ａ濃度が増加したことが認められ（図５ａ，Ｓ３），これはデンシトメトリ分析により定量して２．６倍であったが（図５ｃ），他の細胞画分では増加しなかった（図５ｃ，Ｐ１−Ｐ３）。ＰＰ２Ａ亜画分をさらに特性決定するために，両方の細胞株から微小管を精製し，等量（２μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し，ウエスタンブロッティングを行ってＰＰ２Ａｃを検出した（図５ｂ）。ＯＳ由来細胞と対照細胞との間のＰＰ２Ａ発現の相違は（比率４．４，図５ｃ），これらの亜画分においてサイトゾルにおけるよりさらに顕著であった。すなわちＯＳ由来細胞における微小管結合ＰＰ２Ａのターンオーバーの欠陥は，サイトゾル酵素の量の観察された相違の大きな原因であるようである。
【０１５１】
実施例９：ＯＳ由来細胞における蛋白質リン酸化の変化
さらに，ＯＳ由来線維芽細胞において検出された増加したＰＰ２Ａ発現の生物学的重要性を調べた。上昇したＰＰ２Ａにより標的蛋白質のリン酸化が変化するはずである。蛋白質リン酸化パターンを調べるために，ＯＳ由来線維芽細胞株および３つの異なる年齢のマッチした対照細胞株の細胞から，２次元ＰＡＧＥにより精製した微小管を分離し，抗ホスホセリンおよび抗ホスホトレオニンの組み合わせを用いてウエスタンブロッティングを行った。ＯＳ由来線維芽細胞は，微小管結合蛋白質の顕著な全体的過少リン酸化を示す（図６）。アルカリホスファターゼで前処理することにより，この知見および抗体の特異性を確認したところ，すべての関連するスポットは消失した。
【０１５２】
実施例１０：ＰＰ２Ａｃの分解に及ぼす優性ネガティブ効果
上述の実施例では，ＰＰ２Ａｃのユビキチン特異的分解が胚性線維芽細胞における変異体ＭＩＤ１蛋白質の異所性発現により影響されうることが示されたが（Ｔｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１），ここでは，真核生物細胞系において単離されたＢ−ｂｏｘ１を導入することにより，ＰＰ２Ａｃの分解に及ぼす顕著な優性ネガティブ効果が得られることを示す。
【０１５３】
まず，ＭＩＤ１ペプチドのα４親和性を比較する酵母ツーハイブリッド実験は，単離されたＢ−Ｂｏｘ１の親和性が全長ＭＩＤ１蛋白質と比較して１０倍増加することを示し（Ｔｒｏｃｋｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１），したがって細胞における全長ＭＩＤ１−α４相互作用に及ぼす顕著な優性ネガティブ効果が推定される。このため，単離されたＢｂｏｘ１の過剰発現により蓄積されたＰＰ２Ａｃが特異的標的蛋白質，すなわち転写因子Ｇｌｉ３に及ぼす影響を分析した。Ｇｌｉ３は，遺伝的ヒト疾患，すなわち，興味深いことにオピッツ症候群表現型と重複する表現型を表すグレーグ頭部多合趾症（ｃｅｐｈａｌｏｐｏｌｙｓｙｎｔａｃｔｙｌｙ）症候群において変異しており，このことは，類似の経路が影響を受けていることを示唆する。Ｇｌｉ３は，ヘッジホッグシグナリング経路に関与するショウジョウバエ蛋白質ｃｕｂｉｔｕｓ  ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｕｓと相同の転写因子であり（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９），細胞増殖および細胞の運命の詳細を制御する。Ｇｌｉ３は通常は微小管装置への直接アンカリングにより細胞質内に隔離されている。興味深いことに，ヘッジホッグシグナリングの非存在下では，このＧｌｉ３はリン酸化され，次にプロセシングされて核に移行し，ここで特定の標的遺伝子の転写を抑制する。Ｇｌｉ３の微小管結合およびＰＰ２Ａｃのレベルの増加が活性なヘッジホッグシグナリングを模倣することが示されているため（Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７），Ｂｂｏｘ１過剰発現によるＰＰ２ａｃの上昇が全長Ｇｌｉ３の局在化に及ぼす影響を分析しようとした。Ｕ３７３ＭＧ細胞において細胞内Ｇｌｉ３を検出する免疫蛍光実験においては，実際にＧｌｉ３の局在化の変化の有意なＢｂｏｘ１依存性を見出すことができ，このことは，単離されたＢ−Ｂｏｘ１が過剰発現された後にＰＰ２Ａ活性が増加することを明らかに象徴する（図８）。野生型ＭＩＤ１蛋白質を過剰発現する細胞においては変化は検出されなかった。
【０１５４】
これらのデータは，ＰＰ２Ａｃレベルのみならず，標的蛋白質のＰＰ２Ａｃ依存性修飾も，記載されるメカニズムをブロックすることにより影響を受けることができることを示す。ヘッジホッグ経路の中心的標的遺伝子であるＧｌｉ３を用いたこの結果はまた，Ｇｌｉ３により影響を受ける経路が知られているため，骨の発達および骨粗鬆症における微小管結合ＰＰ２Ａｃの重要な役割を指摘する。
【０１５５】
実施例１１：ＰＰ２Ａｃ活性およびアルツハイマーとの密接な関係
ＰＰ２Ａｃ活性はまた，最も頻繁に生ずる神経変性性疾患の１つであることが示されているアルツハイマー病と重要な密接な関係を有する（Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，１９９５）。アルツハイマー病患者の脳においては，細胞内（対螺旋フィラメント）および細胞外（ベータアミロイド）プラークが見出されている。２種類のプラークの間の種々の相互作用が見出されているが，アルツハイマー病に特徴的な事象はなお議論されている（Ｍａｃｃｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。しかし，ニューロン特異的微小管結合蛋白質であるタウ蛋白質の過リン酸化により，タウが微小管から放出され，細胞内プラークが形成されることが示されている。
【０１５６】
タウの種々の変種を過剰発現し，また過リン酸化されたタウ蛋白質から構成される細胞内プラークを示すトランスジェニックマウスは，興味深いことに，アルツハイマー病患者の表現型と非常に重複する表現型を示す（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｎｓ，２００２）。これらのマウスから，細胞内プラークの出現がアルツハイマー病の発達の決め手となる現象であると結論づけることができる。さらに，これらの細胞内タウ−プラークは細胞外プラーク形成を誘導しうることが示されている。最近の報告は，言及されるタウの過リン酸化がセリン−トレオニンのリン酸化に基づくものであり，セリン−トレオニンホスファターゼ２Ａにより影響を受けることができることを示しており，インビトロでＰＰ２Ａで処理すると細胞内タウ−プラークは解離しうることが示されている（Ｉｑｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらに，タウはベータ−アミロイド誘導性神経毒性に必須であることが最近報告されたため（Ｒａｐｏｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２），ＰＰ２Ａが細胞において生理学的レベルを越えて上昇することは，予防的ならびに治療的なアルツハイマー病の治療に広範な密接な関係を有する。ＰＰ２Ａは細胞の主要なレギュレータであるため，そのレベルおよび活性は厳密に制御されており，このため過剰発現は実際上は不可能である。我々は，上述のメカニズムを阻害することにより，亜画分，すなわち微小管結合ＰＰ２Ａｃのレベルを実質的に増加させうることを初めて示すことができた。微小管結合タウの脱リン酸化に必要なものは，確かにＰＰ２Ａｃのこの亜画分であることに言及する価値がある。このＰＰ２Ａｃ分解を妨害する別の可能性も考えられる。
【０１５７】
Ｕ３７３ＭＧ細胞において過剰発現したＢｂｏｘ１の優性ネガティブ効果のため，初代ニューロンにおける同様の過剰発現によっても微小管結合ＰＰ２Ａｃが蓄積され，次にタウ蛋白質の脱リン酸化が生ずことが推測された。そのような効果を分析するために，出生後１−３日のラットからの末梢交感神経ニューロンを用いた。これらのニューロンをＢｂｏｘ１およびＥＧＦＰをコードする２シストロンＲＮＡを生成する高発現ベクターでトランスフェクトした（"遺伝子銃"方法を用いて，Ｋｌｉｍａｓｃｈｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。次に，トランスフェクトした細胞は，そのＥＧＦＰ蛍光により容易に識別することができる。タウおよび脱リン酸化されたタウは，それぞれｐａｎ−ＴａｕまたはＴａｕ１抗体を用いる免疫蛍光により可視化することができる（Ｔａｕ１は脱リン酸化タウを特異的に認識する）。Ｔａｕ１でトランスフェクトされた細胞の免疫蛍光強度は，トランスフェクトされていない，または模擬トランスフェクトされた細胞と比較して，Ｂｂｏｘ１を発現する細胞における蛍光の明白な増加を示した（図９）。さらに，ＯＳの原因であると認識されα４−Ｂｂｏｘ１相互作用に障害を与える変異を有するＢｂｏｘ１を用いた類似の実験はこの効果を示さない。すなわち，初代ニューロン組織培養において，ＭＩＤ１蛋白質のα４結合部位を含むペプチドの過剰発現により，明らかにタウの脱リン酸化が生ずることを示すことができた。ＭＩＤ１またはα４のアミノ酸配列に由来する他のペプチド，ならびに細胞のＭＩＤ１複合体と相互作用し，ＭＩＤ１のユビキチンリガーゼ機能を制御する他の蛋白質を適用することにより，同様の効果を誘導することが可能であるはずである。α４を用いる欠失実験からの予備的データは，α４の小さい部分（４４アミノ酸）がＢｂｏｘ１に結合するのに十分であり，Ｂｂｏｘ１の場合と同様に，酵母ツーハイブリッドシステムで観察された相互作用が全長α４の１０倍以上強く，したがって，これも強力な優性ネガティブエフェクターとしての有力な候補であることを示す。これらの知見は，α４およびＢｂｏｘ１およびこれらの複合体の３Ｄ構造の決定とともに，α４−Ｂｂｏｘ１相互作用を妨害する分子の構築にコンピュータモデリングを使用することを可能とする。ＭＩＤ１複合体の成分またはレギュレータに結合することによりＰＰ２Ａ分解を妨害する分子のウルトラハイスループットスクリーニングにより，他の妨害物質を検出することができる。
【０１５８】
実施例１２：ＰＰ２Ａｃが転写因子Ｇｌｉ３の局在化に及ぼす影響
ＭｌＤ１−α４−ＰＰ２Ａｃ複合体および続くＰＰ２Ａｃの分解が，発癌経路，特にソニックヘッジホッグシグナリング経路に関与することを示すために，過剰発現させたＧＦＰタグ付きＧｌｉ３のＨｅＬａ細胞における局在化を分析した（図１０）。過剰発現させたＧｌｉ３は主として核に局在していた（図１０，左上）。
【０１５９】
ＭＩＤ１ドメインに由来する，α４結合を担うペプチドであるＢ−Ｂｏｘ１の過剰発現（図１０，左中），ならびにラパマイシン処理（図１０，下），およびＧＦＰタグ付きＧｌｉ３を過剰発現するＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉを介するα４のダウンレギュレーション（図１０，右上）により，活性型のＧｌｉ３がサイトゾル中に有意に保持された。ＧＦＰ−Ｇｌｉ３およびＢ−Ｂｏｘを過剰発現する細胞をＰＰ２Ａ特異的阻害剤であるフォストリエシンで処理すると（図１０，右中），観察された結果を逆転させることができた。一方，α４の過剰発現により，ＧＦＰ−Ｇｌｉ３が核に有意に放出された（図１２）。すべての実験は，Ｇｌｉ３のＣ末端およびＮ末端にタグ付けしたＧＦＰ，ならびにＧｌｉ３のＣ末端およびＮ末端にタグ付けしたＶ５−抗原を用いて行った。
【０１６０】
すなわち，Ｇｌｉ３の局在化はＰＰ２Ａ活性に依存することを示すことができた。
【０１６１】
実施例１３：ＨｅＬａ細胞のＧＩｉ３活性の分析
Ｇｌｉ３転写因子の最も重要な標的の１つはパッチド遺伝子である。ＨｅＬａ細胞を種々の分子で処理した後にＧｌｉ３活性について分析するために，Ｂ−Ｂｏｘ１およびα４蛋白質を過剰発現する細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った（図１３）。ＨｅＬａ細胞は先にＧｌｉ３，Ｇｌｉ１（Ｇｌｉ３転写因子の別の標的）およびパッチドの発現について試験した。予測されたように，Ｂ−Ｂｏｘ１の発現（図１３，レーン２）は，パッチドのメッセージを有意に減少させたが，α４の過剰発現（図１３，レーン１）は模擬トランスフェクト細胞と比較してＰＣＲ産物の量を増加させた（レーン３）。
【０１６２】
すなわち，α４／ＭＩＤ１複合体の阻害によるＰＰ２Ａｃの蓄積により誘発されるＧｌｉ３の細胞分布の変化により，既知のＧｌｉ３標的遺伝子，すなわちパッチドの発現が減少することを示すことができた。
【０１６３】
実施例１４：ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体による妨害は細胞の停止を引き起こす
推定される抗発癌性効果のためにＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体の特異的妨害を調べるために，ＨｅＬａ細胞を特異的抗α４ＲＮＡｉ分子でトランスフェクトした（図１１）。抗α４ＲＮＡｉ分子を含む細胞においては，模擬トランスフェクトした細胞および非特異的ＲＮＡｉ分子で処理した細胞と比較して，曝露の時間に依存して，これらの通常は急速に成長する腫瘍細胞の増殖の劇的な減少が検出された。
【０１６４】
ＢｒｄＵ標識および続くＦＡＣＳ分析は，細胞数の減少がアポトーシスの増加ではなくＧ１期停止によるものであることを明らかにした。これに対し，例えばＲＮＡｉによるＭＩＤ１蛋白質のダウンレギュレーションにより，アポトーシスの劇的な誘導が生じた。
【０１６５】
すなわち，ＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体を妨害することにより，少なくとも２つの異なる抗発癌性メカニズム（細胞停止およびアポトーシス）を誘導することができた。
【０１６６】
実施例１５：ｈＦｕはＰＰ２Ａのインビトロ標的である
ｈＦｕｓｅｄが微小管結合ＰＰ２Ａ（ホスファターゼ２Ａ）の標的であることを示すために，インビトロでフォストリエシンの存在下および非存在下で，ｈＦｕｓｅｄのリン酸化を分析した（図１４）。フォストリエシンはＰＰ２Ａ活性の高度に特異的な阻害剤である。
【０１６７】
Ｖ５タグ付きｈＦｕｓｅｄを過剰発現する細胞のサイトゾルをフォストリエシンの非存在下（レーン１）および存在下（レーン２）で３０℃で４時間インキュベートした。次に，蛋白質をＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離し，ブロッティングし，抗Ｖ５抗体とともにインキュベートした。フォストリエシンとのインキュベーションの後に，脱リン酸化バンドと比較してリン酸化されたｈＦｕｓｅｄのバンド（上方のバンド）の明らかな濃縮が見られる（図１４ａ）。
【０１６８】
ａに示されるウエスタンブロットのＩｍａｇｅ−ｑｕａｎｔ定量。対照（フォストリエシンなしでインキュベーション）においては，リン酸化されたｈＦｕｓｅｄと脱リン酸化されたｈＦｕｓｅｄとの間の比率は，フォストリエシン処理サンプルとは明らかに異なる（図１４ｂ）。
【０１６９】
リン酸化された形と脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの比率は，対照（フォストリエシンなしでインキュベーション）において１．８倍の相違を示すが，フォストリエシン処理の後には１８倍の相違が測定された（図１４ｃ）。
【０１７０】
これらのインビトロ実験は，フォストリエシンによりインビトロでｈＦｕｓｅｄの脱リン酸化を阻害しうること，したがって，ｈＦｕｓｅｄはＰＰ２Ａの標的であることを明確に示した。
【０１７１】
実施例１６：Ｂ−Ｂｏｘ１の過剰発現によりｈＦｕｓｅｄが脱リン酸化される
ｈＦｕｓｅｄのリン酸化がＭＩＤ１／ＰＰ２Ａ複合体を妨害することにより調節しうることを示すために，Ｖ５タグ付きｈＦｕｓｅｄをＭＩＤ１蛋白質のα４結合部位を含むＢ−Ｂｏｘ１とともに共発現させた。ＭＩＤ１／α４の阻害につながるＢ−Ｂｏｘ１−ペプチドの優性ネガティブ効果は，微小管結合ＰＰ２Ａのユビキチン化を誘導し，微小管結合ＰＰ２Ａの濃縮が生ずることは先に示されている。
【０１７２】
ｈＦｕｓｅｄのみを発現する細胞（ｃｏｎ）およびＢ−Ｂｏｘ１とともにｈＦｕｓｅｄを発現する細胞（＋Ｂ−Ｂｏｘ１）の細胞溶解物をＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離し，ブロットし，抗Ｖ５−抗体とともにインキュベートした。細胞溶解直後にすべてのキナーゼおよびホスファターゼを停止させるために，ＳＤＳおよび尿素を含有する緩衝液中で細胞を溶解した。ウエスタンブロットにおいては，ｈＦｕｓｅｄおよびＢ−Ｂｏｘ１を共発現する細胞において，対照（ｈＦｕｓｅｄのみを発現）と比較して，脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの明らかな濃縮を検出することができる（図１５ａ）。
【０１７３】
ａに示されるウエスタンブロットのＩｍａｇｅ−ｑｕａｎｔ分析。対照におけるリン酸化された形と脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの比率は，ｈＦｕｓｅｄおよびＢ−Ｂｏｘ１を共発現する細胞において検出された比率と明らかに異なっていた（図１５ｂ）。
【０１７４】
対照（ｃｏｎ−ａ，ｈＦｕｓｅｄのみを過剰発現する細胞）におけるリン酸化された形と脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの比率は１０．３であり，一方，ｈＦｕｓｅｄとＢ−Ｂｏｘ１を共発現する細胞におけるリン酸化された形と脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの比率は３であった（図１５ｃ）。
【０１７５】
これらの結果は再現性があった（図１６）。
【０１７６】
対照（ｃｏｎ−ａ，ｈＦｕｓｅｄのみを過剰発現する細胞）におけるリン酸化された形と脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの比率は８．３であり，ｈＦｕｓｅｄおよびＢ−Ｂｏｘ１を共発現する細胞におけるリン酸化された形と脱リン酸化された形のｈＦｕｓｅｄの比率は３であった（図１６ｃ）。
【０１７７】
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【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】図１は，ＭＩＤ１とポリユビキチン化蛋白質との結合を示す。
【図２】図２は，ＭＩＤ１をおとりとして用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて見出された胎児脳ライブラリ中のポジティブクローンおよび欠失変異体をおとりとして用いるＭＩＤ１上のα４の結合部位のマッピングを示す。
【図３】図３は，ＣＯＳ７細胞におけるＭＩＤ１−α４相互作用を示す。
【図４】図４は，胚性線維芽細胞におけるユビキチン媒介性蛋白質溶解によるＰＰ２Ａの制御を示す。
【図５】図５は，ＭＩＤ１発現に対するＰＰ２Ａｃ量の依存を示す。
【図６】図６は，ＯＳ由来胚性線維芽細胞におけるサイトゾルおよび微小管結合蛋白質の過少リン酸化を示す。
【図７】図７は，ＰＰ２ＡのＭＩＤ１媒介性ユビキチン依存性制御経路およびＯＳにおけるその破壊の仮想モデルを示す。
【図８】図８は，培養Ｕ３７３ＭＧ細胞におけるＧＦＰ−ＧＬＩ３の局在化を示す。
【図９】図９は，Ｔａｕ−１免疫反応性を示す。
【図１０】図１０は，減少したＰＰ２Ａｃ分解が転写因子Ｇｌｉ３の局在化に及ぼす影響を示す。
【図１１】図１１は，ＲＮＡｉによるα４のダウンレギュレーションがＨｅＬａ細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図１２】図１２は，ＨｅＬａ細胞における過剰発現したＧＦＰ−タグ付きＧｌｉ３の局在に及ぼすα４の過剰発現の影響を示す。
【図１３】図１３は，Ｇｌｉ３の局在化の変化がパッチド遺伝子の転写に及ぼす影響を示す。
【図１４】図１４は，−ｈｕｍａｎＦｕｓｅｄ−リン酸化を示す。
【図１５】図１５は，−ｈＦｕｓｅｄ−リン酸化を示す。
【図１６】図１６は，−ｈｆｕｓｅｄ−リン酸化を示す図１５の実験の再現である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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