(57)【要約】本発明は、1以上のコード配列に機能しうる形で連結されており、内皮細胞内で該配列を発現するIRESエレメントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞リガンドと、1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のIRESエレメントとを含んでなり、前記IRESエレメントが内皮細胞内で前記1以上のコード配列を発現することを特徴とするベクター。
【請求項２】
IRESエレメントが配列番号1または配列番号2を含む、請求項1記載のベクター。
【請求項３】
IRESエレメントがHC-IRESエレメントである、請求項1または請求項2記載のベクター。
【請求項４】
1以上のIRESエレメントが2以上のコード配列に機能しうる形で連結されている、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項５】
コード配列が治療用遺伝子を含む、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項６】
コード配列がin vitroまたはin vivoにおいて内皮細胞内で発現される、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項７】
内皮細胞が疾患に罹っている、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項８】
疾患が血管新生依存的疾患である、請求項7記載のベクター。
【請求項９】
血管新生依存的疾患が、過剰な血管新生または不十分な血管新生により引き起こされるものである、請求項8記載のベクター。
【請求項１０】
疾患が、癌、虚血、糖尿病性網膜症、炎症疾患、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延から選ばれるものである、請求項7〜9のいずれか1項記載のベクター。
【請求項１１】
内皮細胞リガンドが腫瘍内皮細胞リガンドである、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項１２】
内皮細胞がヒト内皮細胞である、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項１３】
コード配列の少なくとも1つが上流プロモーターの制御下にある、前記請求項のいずれか1項記載のベクター。
【請求項１４】
（a）内皮細胞内で1以上のコード配列を発現するIRESエレメントを同定し、
（b）ベクター内にIRESエレメントを挿入し、
（c）前記ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトし、
（d）前記内皮細胞内で前記1以上のコード配列を発現させる工程を含んでなる、1以上のコード配列を発現させるための方法。
【請求項１５】
IRESエレメントが配列番号1または配列番号2を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
IRESエレメントがHC-IRESエレメントを含む、請求項14または請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記1以上のコード配列が治療用遺伝子である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記1以上のコード配列がin vitroまたはin vivoにおいて内皮細胞内で発現される、請求項14〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
内皮細胞が疾患に罹っている、請求項14〜18のいずれか1項記載の方法。
【請求項２０】
疾患が血管新生依存的疾患である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
血管新生依存的疾患が、過剰な血管新生または不十分な血管新生により引き起こされるものである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
疾患が、癌、虚血、糖尿病性網膜症、炎症疾患、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延から選ばれるものである、請求項20または請求項21記載の方法。
【請求項２３】
内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項14〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
ベクターがウイルスベクターである、請求項14〜23のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
コード配列の少なくとも1つが上流プロモーターの制御下にある、請求項14〜24のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
ベクター内でIRESエレメントを1以上のコード配列に機能しうる形で連結する工程を含んでなる、内皮細胞内での1以上のコード配列の発現のためのベクターの製造方法。
【請求項２７】
（a）前記ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトし、
（b）1以上のコード配列を発現させ、
（c）前記内皮細胞内で前記1以上のコード配列が発現されたかどうかを判定する工程を更に含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が請求項14〜25の特徴のいずれか1以上を有する、請求項26または請求項27記載の方法。
【請求項２９】
（a）ベクター内でIRESエレメントを1以上のコード配列に機能しうる形で連結し、
（b）前記ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトし、
（c）前記1以上のコード配列を発現させ、
（d）前記内皮細胞内で前記1以上のコード配列が発現されたかどうかを判定する工程を含んでなる、内皮細胞内で1以上のコード配列を発現するIRESエレメントを同定するための方法。
【請求項３０】
前記方法が請求項14〜25の特徴のいずれか1以上を有する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
請求項1〜13のいずれか1項記載のベクターを内皮細胞に形質導入する工程を含んでなる、内皮細胞に1以上のコード配列を送達するための方法。
【請求項３２】
内皮細胞内での1以上のコード配列の発現における、IRESエレメントの使用。
【請求項３３】
IRESエレメントが配列番号1または配列番号2を含む、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
IRESエレメントがHC-IRESエレメントである、請求項33記載の使用。
【請求項３５】
1以上のHC-IRESエレメントが2以上のコード配列に機能しうる形で連結されている、請求項32〜34のいずれか1項記載の使用。
【請求項３６】
コード配列が治療用遺伝子である、請求項32〜35のいずれか1項記載の使用。
【請求項３７】
コード配列がin vitroまたはin vivoにおいて内皮細胞内で発現される、請求項32〜36のいずれか1項記載の使用。
【請求項３８】
内皮細胞が疾患に罹っている、請求項32〜37のいずれか1項記載の使用。
【請求項３９】
疾患が血管新生依存的疾患である、請求項32〜38のいずれか1項記載の使用。
【請求項４０】
血管新生依存的疾患が、過剰な血管新生または不十分な血管新生により引き起こされる、請求項39記載の使用。
【請求項４１】
疾患が、癌、虚血、糖尿病性網膜症、炎症疾患、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延から選ばれる、請求項39または請求項40記載の使用。
【請求項４２】
内皮細胞がヒト内皮細胞である、請求項32〜41のいずれか1項記載の使用。
【請求項４３】
請求項1〜13のいずれか1項記載のベクターを対象に投与する工程を含んでなる、対象における疾患の治療または予防方法。
【請求項４４】
請求項1〜13のいずれか1項記載のベクターの治療的有効量と、場合によっては、製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤もしくはアジュバントまたはそれらの任意の組合せとを含んでなる医薬組成物。
【請求項４５】
疾患の治療における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項記載のベクター。
【請求項４６】
疾患の治療のための医薬組成物の製造における、請求項1〜13のいずれか1項記載のベクターの使用。
【請求項４７】
疾患が血管新生依存的疾患である、請求項43記載の方法、請求項45記載のベクターまたは請求項46記載の使用。
【請求項４８】
血管新生依存的疾患が、過剰な血管新生または不十分な血管新生により引き起こされる、請求項47記載の方法またはベクターまたは使用。
【請求項４９】
疾患が、癌、虚血、糖尿病性網膜症、炎症疾患、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延から選ばれる、請求項47または請求項48記載の方法またはベクターまたは使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部リボソーム進入シグナル（internal ribosome entry site）（IRES）エレメント（element）に関する。
【０００２】
特に、本発明は、1以上のコード配列に機能しうる形で連結されており、内皮細胞内で該コード配列を発現するIRESエレメント（例えば、1以上のIRESエレメント）に関する。
【０００３】
本発明は更に、IRESエレメントのベクター、方法、組成物および使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
標的細胞への送達後の遺伝子の特異的発現は、分子に基づく療法の重要な目標であり、血管内皮細胞は種々の臨床適応症における重要な標的である。確立された血管系のリモデリング（血管新生）は、創傷治癒または月経のような正常な状態ならび癌、虚血、糖尿病性網膜症および炎症疾患のような多数の病態における特定の時点で生じる（1）。また、血管新生、虚血疾患における副行循環の確立および炎症疾患における肉芽組織の形成はこれらの病態の特徴である（1, 2）。
【０００５】
癌においては、原発固形腫瘍のin situ増殖の支持に、また、腫瘍細胞が浸潤血管を越え（3）、血流に侵入し、最終的には遠隔部位に転移性沈着を形成する転移において、血管新生が重要である。増殖中の腫瘍から血液供給を絶てば、その増殖が抑制されうるため、血管新生の過程は、癌における重要な治療的介入点であると提示されている（4）。
【０００６】
多数の分子標的は、細胞の内部への分子的治療剤の接近を要する細胞内位置に限局されるであろう。これは、アデノウイルス（5）のようなウイルスベクター、または細胞膜を越えてDNAベクターを送達する脂質製剤（6）を使用することにより達成されうる。このため、これらは、通常、標的細胞内で単一の遺伝子を発現するよう設計されるという制限が課される。ビシストロン（bicistronic）mRNAにおける内部リボソーム進入シグナル（IRES）の使用は二重遺伝子発現のための一般的な方法となっているが、mRNA中のこれらの構造エレメントは発生特異性および細胞型特異性を示す（7, 8）。
【０００７】
細胞内での治療用遺伝子の持続的発現のためには、しばしば、2以上の遺伝子（例えば、選択マーカー）を準備することが必要である。したがって、複数の遺伝子を共発現させうることが、重要な考慮事項となる。
【０００８】
一般には、2以上の遺伝子を共発現させうるためには3つの方法がある。（1）別々のプロモーターを使用して、同じベクター内で異なる遺伝子の発現を駆動することが可能である。しかし、そのような構築物では、しばしば、プロモーター減衰（promoter attenuation）の問題が生じる。（2）2つの異なる遺伝子をインフレームで融合させてキメラタンパク質を産生させることが可能であるが、このアプローチは、すべてのタンパク質に対して有効であるわけではなく、例えばミスフォールディングまたはミスターゲッティングを引き起こしうる。（3）IRESエレメントにより分離された2つの遺伝子が、共通の上流プロモーターの制御下で、単一の転写カセットとして発現されるビシストロン構築物を調製することが可能である。介在するIRES配列は、効率的なキャップ非依存的内部転写開始のためのリボソーム結合部位として機能する。
【０００９】
ベクター内にIRESエレメントを組込むことは、数個の遺伝子産物を例えば治療場面において効率的に共発現させるための有望な方法の1つである。
【００１０】
しかし、2以上の遺伝子の共発現のためのIRESエレメントの使用にも幾つかの問題がある。例えば、脳心筋炎ウイルス（EMCV）IRESエレメントは、上流遺伝子のキャップ依存的翻訳より低い効率でしか、下流遺伝子の発現をもたらさない（Hum Gene Ther (1995) 6, 905-915; Hum Gene Ther (1998) 9, 287-293）。また、ほとんどのIRESエレメントは一般には組織特異的であり、ほとんどは内皮細胞内ではうまく働かない。これは、これらの細胞内には、IRESエレメントに結合するタンパク質因子が存在しないことによるものであろう。
【００１１】
したがって、内皮細胞内でコード配列を効率的に発現するIRESエレメントが当技術分野で必要とされている。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、部分的には、内皮細胞内のコード配列の発現がIRESエレメント、例えばHC-IRESの使用により媒介されうるという知見に基づくものである。驚くべきことに、内皮細胞内のコード配列の発現は、HC-IRESエレメントの使用によっては媒介されうるが、他のウイルスIRESエレメント、例えばEMC-IRESの使用によっては媒介されない。
【００１３】
したがって、内皮細胞内のタンパク質合成に、EMC-IRESではなくHC-IRESを使用することが可能であり、これは、血管新生に基づく臨床状態の血管内皮においてタンパク質を共発現させるための手段となりうる。
【００１４】
第1の態様において、本発明は、内皮細胞リガンドと、1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のIRESエレメントとを含んでなり、該IRESエレメントが内皮細胞内で該コード配列を発現することを特徴とするベクターに関する。
【００１５】
1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のIRESエレメントの、ベクター内への組込みは、内皮細胞内のコード配列の発現を可能にする。さらに、内皮細胞リガンドを含有させることは、内皮細胞内での1以上のコード配列の特異的発現を可能にする。
【００１６】
好都合なことに、本発明のIRESエレメントは、1以上のコード配列（例えば、1以上の治療用遺伝子）に機能しうる形で連結されている場合には、内皮細胞が関わる臨床状態において1以上のコード配列を発現させるための手段となる。例えば、本発明は、新生血管内の血管新生状態においてコード配列が発現されるのを可能にする。
【００１７】
第2の態様において、本発明は、（a）内皮細胞内で1以上のコード配列を発現するIRESエレメントを同定し、（b）ベクター内にIRESエレメントを挿入し、（c）該ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトし、（d）該内皮細胞内で前記1以上のコード配列を発現させる工程を含んでなる、1以上のコード配列を発現させるための方法を提供する。
【００１８】
第3の態様において、本発明は、ベクター内でIRESエレメントを1以上のコード配列に機能しうる形で連結する工程を含んでなる、内皮細胞内での1以上のコード配列の発現のためのベクターの製造方法に関する。
【００１９】
本発明の第3の態様の方法は、該ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトし、1以上のコード配列を発現させ、内皮細胞内で該コード配列が発現されたかどうかを判定する工程を更に含みうる。
【００２０】
第4の態様において、本発明は、（a）ベクター内でIRESエレメントを1以上のコード配列に機能しうる形で連結し、（b）該ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトし、（c）1以上のコード配列を発現させ、（d）該内皮細胞内で該コード配列が発現されたかどうかを判定する工程を含んでなる、内皮細胞内で1以上のコード配列を発現するIRESエレメントを同定するための方法に関する。
【００２１】
この方法は、内皮細胞内で1以上のコード配列を発現する他のIRESエレメント（例えば、ウイルス由来または細胞由来のIRESエレメント）を同定するために用いることが可能である。
【００２２】
第5の態様において、本発明は、本発明のベクターを内皮細胞に形質導入する工程を含んでなる、内皮細胞に1以上のコード配列を送達するための方法に関する。
【００２３】
第6の態様において、本発明は、内皮細胞内での1以上のコード配列の発現における、IRESエレメントの使用に関する。
【００２４】
第7の態様において、本発明は、本発明のベクターを対象に投与する工程を含んでなる、対象における疾患の治療または予防方法に関する。
【００２５】
第8の態様において、本発明は、本発明のベクターの治療的有効量と、場合によっては、製薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤もしくはアジュバントまたはそれらの任意の組合せとを含んでなる医薬組成物に関する。
【００２６】
第9の態様において、本発明は、疾患の治療における使用のための、本発明のベクターに関する。
【００２７】
第10の態様において、本発明は、疾患の治療のための医薬組成物の製造における、本発明のベクターの使用に関する。
【００２８】
前記態様においては、好ましくは、IRESエレメントは配列番号1または配列番号2を含む。  
好ましくは、IRESエレメントはHC-IRESエレメントである。  
好ましくは、1以上のIRESエレメントが2以上のコード配列に機能しうる形で連結されている。これは内皮細胞内の複数のコード配列の発現を可能にし、これは疾患の治療に特に有利であろう。
【００２９】
好ましくは、コード配列は治療用遺伝子である。  
好ましくは、コード配列はin vitroまたはin vivoにおいて内皮細胞内で発現される。
【００３０】
好ましくは、内皮細胞が疾患に罹っている。
【００３１】
好ましくは、疾患は血管新生依存的疾患である。より好ましくは、血管新生依存的疾患は、過剰な血管新生または不十分な血管新生により引き起こされる。最も好ましくは、疾患は、癌、虚血、糖尿病性網膜症、炎症疾患、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延から選ばれる。
【００３２】
好ましくは、内皮細胞リガンドは腫瘍内皮細胞リガンドである。  
好ましくは、内皮細胞はヒト内皮細胞である。  
好ましくは、コード配列の少なくとも1つは上流プロモーターの制御下にある。  
好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。
【００３３】
図面の説明
図1：
マウス胚血管内皮におけるIRESエレメントの活性。（A）相同組換えのための構築物。最上部の棒線：マウスLmo2遺伝子の部分制限地図は、相同組換えを検出するために使用する2つのプローブ（AおよびB）と共に、Lmo2エキソン2および3の位置を示している（10）。中央の棒線は、Lmo2内への外因性エレメントのクローニングを促進するためにエキソン2内に導入されたBamHI制限部位を有する標的化ベクターpKO5tk（10）の地図を示す。最下部の棒線は、Lmo2-lacZ（Lmo2の5'末端とのインフレーム融合体）（20）、HC-IRESおよびEMC-IRESに関する、エキソン2 BamHI部位内にクローニングされたlacZ遺伝子挿入の地図を示す。（B）マウス胚発生中のde novo毛細血管形成（血管形成）および内皮リモデリング（血管新生）におけるLmo2遺伝子からのβガラクトシダーゼの発現を示す胚期E9.5、E10.5およびE12.5におけるマウス胚のホールマウントX-gal染色。Wt＝野生型C57Bl6.
図2：
Lmo2 lacZノックインE10.5胚の組織学は、βガラクトシダーゼと全（pan）内皮マーカーCD31との共発現を示している。E10.5胚標本をX-galでホールマウント染色し（図2）、切片化し（4μM）、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。抗CD31抗体およびペルオキシダーゼを使用して、連続切片においてCD31タンパク質の発現を検出した。モンタージュは、Xgalのみで染色された（左）またはXgalと抗CD31とで共染色された（右）示されている各Lmo2ノックインマウス系統または野生型（wt）対照からの胚切片を示している。矢じりは、血管壁を裏打ちする内皮細胞を示す。
【００３４】
図3：
ルイス（Lewis）肺固形腫瘍におけるC型肝炎IRESからのβガラクトシダーゼの発現。ルイス肺癌細胞をLmo2 HC-IRESノックインマウス系統およびLmo2-lacZまたは野生型（wt）対照の皮下に移植した。（A）レシピエントマウスにおいて増殖する腫瘍の血管系は後者から生じる。したがって、内皮細胞はレシピエントのLmo2-レポーターを発現しているであろう。Lmo2-lacZおよびHC-IRESマウス系統の場合には、Xgal基質を使用してβガラクトシダーゼの発現を検出する。（B）腫瘍増殖後、固形腫瘍をX-galでホールマウント染色し、4μM切片を作製して、レシピエントマウスからの既存内皮の出芽により形成する腫瘍血管内皮の検査を行った。矢じりは、血管壁を裏打ちする内皮細胞を示す。
【００３５】
発明の詳細な説明
IRESエレメント
ほとんどの真核生物mRNAは主としてリボソーム走査（ribosome scanning）により翻訳される。まず、40Sリボソームサブユニットが、その付随開始因子と共に、翻訳されるmRNAの5'7-メチルグアノシン-キャップ構造に結合する。ついで該複合体が、好ましいコンテクストの開始コドンに遭遇するまで、3'方向に走査し、この地点で、タンパク質の翻訳が開始される。このモデルに従えば、強力な二次構造および多数の開始コドンを伴う5'非翻訳領域（UTR）の存在は重大な障害となり、リボソーム走査による非効率的な翻訳につながるであろう。リボソーム再開始、シャンティング（shunting）および内部リボソーム結合は、リボソーム走査の要件を緩和しキャップ非依存的な翻訳の進行を可能にする、翻訳開始の二次メカニズムである。
【００３６】
IRESエレメントは、ウイルスがmRNA当たり2以上の遺伝子を発現するのを可能にするよう生じたのである。この活性が生じる細胞型は様々であり、ウイルスによって異なる。IRESエレメントは細胞タンパク質因子に結合し、これらは細胞型特異的であり、内部特異性を系に付与しうる。
【００３７】
IRESエレメントはピコルナウイルスの非翻訳5'末端において最初に見出されたものであり、この部位において、それはウイルスタンパク質のキャップ非依存的翻訳を促進する（Jangら (1990) Enzyme 44: 292-309）。IRESエレメントは、RNA中のオープンリーディングフレーム間に位置する場合には、IRESエレメントにおけるリボソームの進入およびそれに続く下流の翻訳開始を促進することにより下流オープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
【００３８】
IRESエレメントの概説は、MountfordおよびSmith（TIG May 1995 vol 11, No 5:179-184）により記載されている。
【００３９】
WO-A-97/14809によれば、IRESエレメントは、典型的には、遺伝子の5'非コード領域内に見出される。文献中のものに加えて、それは、発現に影響を及ぼす遺伝的配列を探し、ついで、その配列がDNAに影響を及ぼす（すなわち、プロモーターまたはエンハンサーとして作用する）のか又はRNAのみに影響を及ぼす（IRESエレメントとして作用する）のかを判定することにより実験的に見出されうる。
【００４０】
「IRESエレメント」なる語は、IRESエレメントとして働く又はIRESエレメントの機能を改善する任意の配列または配列の組合せを含む。
【００４１】
多種多様なIRESエレメントが公知であり、それらには、以下に由来するものが含まれる：脳心筋炎ウイルス（EMCV）（Ghattas, I.R.ら, Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991)）、ポリオウイルス（PV）（PelletierおよびSonenberg, Nature 334: 320-325 (1988)）およびC型肝炎ウイルス（GallegoおよびVarani (2002) Biochem. Soc. Transac. 30 p140-145を参照されたい）、BiPタンパク質（MacejakおよびSarnow, Nature 353:91 (1991)）、ショウジョウバエ（drosphilia）のアンテナペディア遺伝子（エキソンdおよびe）（Ohら, Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)）、真核生物開始因子4G（EIF4G）（J. Biol. Chem. (1998) 273, 5006-5012）および血管内皮増殖因子（VEGF）（Mol Cell Biol (1998) 18, 3112-3119）。この一覧は網羅的なものではないと当業者は認識するであろう。
【００４２】
本発明においては、1以上のIRESエレメントが1以上のコード配列に機能しうる形で連結されている。
【００４３】
この配置を用いた場合、1以上の核酸配列に機能しうる形で連結された1以上のIRESエレメントを染色体内（例えば、染色体座）に組込むための相同組換えに、IRESエレメントを使用することが可能である。これは、例えば、IRES-コード配列カセットおよびIRES-選択マーカーエレメントポリシストロン標的化ベクターの両方を使用することにより達成することができる。非発現遺伝子の場合には、選択マーカーはプロモーターにより駆動されうる。ついで選択マーカーカセットは、Jungら, (1993) Science 259, 984-897に記載のとおりに部位特異的組換えにより切り出されうる。
【００４４】
連続的標的化（Jungら, (1993) Science 259, 984-897）を用いることも可能であり、この場合、最初の相同組換え事象において抗選択マーカーが組込まれ、ついで第2工程においてIRES-コード配列との置換が生じる。したがって、ヌクレオチド配列、例えばコード配列を、内因性ゲノム座の完全な調節制御下に配置することが可能である。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態においては、1以上のIRESエレメントが2以上のコード配列に機能しうる形で連結されている。
【００４６】
IRESエレメントがコード配列の翻訳を開始しうるためには、IRESエレメントは、共通の上流プロモーターの制御下にあるコード配列間に位置すべきである。IRESのメチオニン開始コドンは投入コード領域に対してインフレームで存在すべきである。両方のコード配列の共役転写が生じ、ついで第1コード配列の翻訳のキャップ非依存的開始、および第2コード配列のIRES誘導性キャップ非依存的翻訳が生じる。すなわち、コード配列より1個少ないIRESエレメントが常に存在することになる。例えば、バイシストロン配列およびトリシストロン配列では、その順序は以下のとおりとなりうる。  
プロモーター-コード配列1-IRES1-コード配列2
プロモーター-コード配列1-IRES1-コード配列2-IRES2-コード配列3
【００４７】
癌療法の血管新生標的の場合のように1以上の異なるプロモーターの送達が要求される治療場面においては、IRESエレメントの使用が望ましい。  
IRESエレメントはウイルス由来または細胞由来でありうる。  
好ましくは、IRESエレメントはウイルス由来である。より好ましくは、IRESエレメントはフラビウイルス（Flaviviridae）科に由来する。より好ましくは、IRESエレメントはヘパシウイルス（Hepacivirus）属に由来する。最も好ましくは、IRESエレメントはC型肝炎ウイルスに由来する（HC-IRES）。
【００４８】
HC-IRESエレメント
好ましくは、IRESエレメントは配列番号1を含む。より好ましくは、IRESエレメントは配列番号1よりなる。  
好ましくは、IRESエレメントは配列番号2を含む。より好ましくは、IRESエレメントは配列番号2よりなる。  
これらの配列はC型肝炎ウイルスIRES（HC-IRES）エレメントをコードする。
【００４９】
C型肝炎ウイルス（HCV）は、ウイルスメッセージの翻訳のキャップ非依存的開始を駆動するゲノムRNAの5'非翻訳領域内に位置するIRESエレメントを含有する。HCV IRESエレメントの大体の二次構造および最小限の機能長が公知であり、ほぼすべての二次構造ドメインが活性に決定的に重要であることが、広範な突然変異誘発から確認されている。
【００５０】
HCV-IRESエレメント媒介翻訳開始は、IRESエレメントと43S粒子、40SサブユニットおよびeIF3の2つの成分との相互作用を要するに過ぎない。この相互作用はウイルス開始コドンの直接的認識およびタンパク質合成の開始をもたらす。
【００５１】
IRESエレメントはHCV RNAの5'UTRのほとんどを包囲（encompass）し、ウイルスゲノムの残部と比較して高度に保存されており、このことは、それがウイルスの生活環において基本的な役割を果たしていることを示唆している。HCV IRESエレメントは、4つの保存された二次構造ドメインを含有する。電子顕微鏡検査による研究はHCV IRESエレメントの全体的な構造体制の理解を深めている（Spahnら (2001) Science 291, 1959-1962; Bealesら (2001) RNA 7, 661-670）。
【００５２】
HCV IRESエレメントは、例えば、Biochem. Soc. Transac. (2002) 30 p140-145; J Viral Hepat 1999 6(2), 79-87; Princess Takamatsu Symp 1995;25:99-110; およびJ Virol 1992 Mar;66(3):1476-83に記載・概説されている。
【００５３】
ヌクレオチド配列
本発明は、データベースにおいて入手可能なヌクレオチド配列の使用を含む。これらのヌクレオチド配列を使用して、アミノ酸配列を発現させることが可能である。
【００５４】
したがって、ヌクレオチド配列は、例えば合成RNA/DNA配列、組換えRNA/DNA配列（すなわち、組換えDNA技術の利用により調製されるもの）、cDNA配列または部分ゲノムDNA配列（それらの組合せを含む）でありうる。
【００５５】
ヌクレオチド配列は二本鎖または一本鎖でありうる。また、RNA/DNA配列はセンス配向またはアンチセンス配向でありうる。好ましくは、それはセンス配向である。
【００５６】
好ましくは、ヌクレオチド配列はコード配列、すなわち、タンパク質に翻訳されるヌクレオチド配列部分である。
【００５７】
好ましくは、コード配列は治療用遺伝子を含む。
【００５８】
本明細書中で用いる「治療用遺伝子」なる語は、疾患、例えば内皮細胞の疾患のモジュレーションおよび／または治療および／または予防に使用しうる任意の遺伝子を意味する。
【００５９】
適当な治療用遺伝子には、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗参加分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、アンチセンスRNA、毒素、条件（conditional）毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質および増殖因子、膜タンパク質、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイムならびにそれらの誘導体（例えば、結合したレポーター基を伴うもの）をコードする配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。コード配列はプロドラッグ活性化酵素をもコードしうる。
【００６０】
適当な治療用遺伝子には、血管新生増殖因子、例えばアンギオゲニン、アンジオポイエチン（Angiopoietin）-1、Del-1、繊維芽細胞増殖因子（酸性（aFGF）および塩基性（bFGF））、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、肝細胞増殖因子（HGF）／細胞分散因子（SF）、インターロイキン8（IL-8）、レプチン、ミドカイン（Midkine）、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（PD-ECGF）、血小板由来増殖因子BB（PDGF-BB）、プレイオトロフィン（Pleiotrophin）（PTN）、プロリフェリン（Proliferin）、トランスフォーミング増殖因子α（TGF-α）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）および／または血管内皮増殖因子（VEGF）／血管透過性因子（VPF）が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
適当な治療用遺伝子には、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管新生アンチトロンビンIII、軟骨由来インヒビター（CDI）、CD59補体断片、エンドスタチン（コラーゲンXVIII断片）、フィブロネクチン断片、Gro-β、ヘパリナーゼ（Heparinase）、ヘパリンヘキサ糖（Heparin hexasaccharide）断片、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）、インターフェロンα/β/γ、インターフェロン誘導性タンパク質（IP-10）、インターロイキン12、クリングル5（プラスミノーゲン断片）、メタロプロテイナーゼインヒビター（TIMP）、2-メトキシエストラジオール、胎盤リボヌクレアーゼインヒビター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、血小板因子4（PF4）、プロラクチン16kD断片、プロリフェリン関連タンパク質（PRP）、レチノイド、テトラヒドロコルチゾールS、トロンボスポンジン1（TSP-1）、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-b）、バスキュロスタチン（Vasculostatin）および／またはバソスタチン（Vasostatin）（カルレチクリン（calreticulin）断片）も含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明における少なくとも1つのIRESエレメント（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または更には10個以上のIRESエレメント）の使用は、1以上のコード配列（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または更には10個以上のコード配列）が内皮細胞内で発現されうることを意味する。
【００６３】
コード配列は、タンパク質またはその突然変異体、ホモログもしくは変異体の全部または一部をコードしうる。例えば、コード配列は、野生型タンパク質と同様にin vivoで機能しうるタンパク質の断片をコードしうる。
【００６４】
調節配列に機能しうる形で連結された2つの異なるコード配列を互いにインフレームで融合して、キメラタンパク質を発現させることが可能である。
【００６５】
機能しうる形で連結
本明細書中で用いる「機能しうる形で連結（された）」なる語は、例えば、IRESエレメントまたはプロモーター、および1以上のコード配列が、該コード配列の発現をもたらす様態でそれらが機能するのを可能にする関係にあることを意味する。
【００６６】
1以上のコード配列に「機能しうる形で連結された」調節配列は、該調節配列に適合しうる条件下で該コード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００６７】
典型的には、調節配列はコード配列にインフレームで連結される。
【００６８】
内皮細胞
本明細書中で用いる「内皮細胞」は、血管およびリンパ管を裏打ちする細胞を意味する。  
内皮細胞は、典型的には、血液と管壁との境界に位置する。それらの細胞同士は密接に接触しており、血液が血管腔を移動する際の血液細胞と血管壁との相互作用を防ぐ滑らかな層を形成している。
【００６９】
内皮細胞は以下の機能を果たしうる：それは血液と周囲の身体組織との間の分子および細胞の通過の選択的関門（例えば、血液脳関門および中枢神経系と身体の残部との間の関門）として働きうる；それは感染部位への白血球の呼び出し及び捕捉において基本的な役割を果たしうる；それは血流の力学において重要な役割を果たしうる；そして、それは外傷部位における血液の凝固を調節しうる。
【００７０】
内皮細胞は、例えば内皮細胞系として、in vitroで提供されうる。そのような細胞系の具体例には、ヒト臍帯内皮細胞およびBend3細胞（ラット脳内皮細胞系）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
好ましくは、内皮細胞はin vivoで提供される。  
好ましくは、内皮細胞はヒト細胞である。  
血管内皮細胞は、種々の分化レベルの細胞（例えば、CD31+）でありうる。ES細胞培養の分化をFLK1+ CD31-細胞で達成することが可能であり、したがって、この表現型のin vivo細胞も内皮細胞である。
【００７２】
内皮細胞リガンド
本明細書中で用いる「内皮細胞リガンド」なる語は、内皮細胞により発現される表面マーカーまたは受容体のような標的部位に結合しうる1以上の部分を意味する。
【００７３】
好ましくは、標的部位は疾患に罹っている内皮細胞（罹患内皮細胞により発現される。
【００７４】
内皮細胞（例えば、罹患内皮細胞）へのベクターの特異的標的化は、遺伝的、化学的、生物学的または免疫学的方法によりベクター内に組込まれた1以上の内皮細胞リガンドにより媒介されうる。特異的標的化の成功は多数の要因（例えば、標的化される内皮細胞に対する内皮細胞リガンドの特異性、および結合反応のアフィニティーの度合）に左右される。
【００７５】
内皮細胞リガンドは単一体でありうる。あるいはそれは複数体の組合せでありうる。内皮細胞リガンドは有機化合物または他の化学物質でありうる。内皮細胞リガンドは、天然物または人工物を含む任意の適当な起源から入手可能な又は製造される化合物でありうる。内皮細胞リガンドはアミノ酸分子、ポリペプチド、ペプチドまたはそれらの化学誘導体またはそれらの組合せでありうる。内皮細胞リガンドは更には、センスまたはアンチセンス分子でありうるポリヌクレオチド分子でありうる。内皮細胞リガンドは更には、抗体でありうる。
【００７６】
内皮細胞リガンドが抗体である場合には、それは完全抗体、抗体フラグメントまたは抗体ペプチドでありうる。したがって、例えば、内皮細胞リガンドには、Fv、ScFv、Fab'およびF(ab')2、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、操作された抗体、例えばキメラ抗体、CDRグラフティング抗体およびヒト化抗体、ファージディスプレイまたは代替技術により製造された人工的に選択された抗体が含まれうる。
【００７７】
好ましくは、罹患内皮細胞以外の細胞は、内皮細胞リガンドが結合する構造体を露出または提示しているべきではなく、あるいは細胞当たり非常に少数のそれらの構造体のみを露出または提示しているべきである。
【００７８】
好ましくは、罹患内皮細胞当たりの構造体の数は、十分な量の内皮細胞リガンドの高アビディティでの結合を可能にするのに十分な程度に多数であるべきである。
【００７９】
10:1のトランスフェクション効率（ベクター標的細胞比）を仮定すると、好ましくは、細胞膜上の内皮細胞リガンド特異的標的部位の数は10/細胞より高くなるべきである。結合反応のアビディティを増加させるために、ベクター粒子は、可能な限り多くの内皮細胞リガンドを担持すべきであり、標的細胞は、過剰な膜受容体構造体を発現すべきである。好ましくは、細胞当たりの受容体の数は102/細胞またはそれ以上である。
【００８０】
例えば、腫瘍内皮細胞の場合には、腫瘍組織の外部の内皮細胞または血液細胞または血流中に突出した他の実質細胞は、内皮細胞リガンドが結合する細胞膜構造体を露出しているべきではなく、あるいは細胞当たり非常に少数のそれらの構造体のみを露出しているべきである。
【００８１】
天然リガンドは内皮細胞リガンドのその標的部位への結合を競合的に抑制しうる。好ましくは、選択される内皮細胞リガンドは、その標的部位への結合に関して、いずれの天然リガンドよりも有意に高いアフィニティを有するか、あるいは競合性天然リガンドは血液中に微量でしか存在しない。
【００８２】
好ましくは、内皮細胞リガンドを含む本発明のベクターは罹患内皮細胞においてインターナリゼーションされる。
【００８３】
内皮細胞リガンドが結合しうる多数の表面マーカーが報告されている。それらの内皮細胞マーカーの多くの発現の増強は、IL-1またはTNFαのようなメディエーターによる内皮細胞の活性化を要する。その結果、活性化内皮細胞により発現された多数の表面マーカーは、罹患内皮細胞においては、正常（非罹患）細胞におけるより強力に発現される。
【００８４】
表面マーカーは、罹患内皮細胞により発現されうるだけでなく、マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、組織細胞または種々の器官または腫瘍細胞によっても発現されうる。しかし、正常内皮細胞と罹患内皮細胞（例えば、腫瘍内皮細胞）との間の細胞表面マーカーの発現における有意な相違、および腫瘍を裏打ちする内皮細胞に対する血管内適用クターへの直接的な接近性は、罹患内皮細胞の特異的標的化のためのこれらのマーカーの使用をもたらす。
【００８５】
活性化内皮細胞上で発現される多種多様な表面マーカーが報告されており、それらには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：増殖因子の受容体：TIE-2、VEGF R-I, -II, -III、PDECGF-R、FGF-R-I, -II, -III, -IV、EGF-R、PDGF-R、TGFβ-R-I, -II、HGF-R；サイトカイン／ケモカインの受容体：IL-I-R-I, -II、IL-3-R、IL-4-R、IL-6-R、IL-8-R-I, -II、IL-12-R、LIF-R、TNF-R、IFNγ-R、IFNα, β-R、G-CSF-R、M-CSF-R、GM-CSF-R、オンコスタチン-M-R；血症成分の受容体：CNTF、Fcγ-RII、LPS-R、オキシLDL-R、Tsp-1-R、pgp IV、uPA-R、トロンボモジュリン、アンジオスタチン rec、VIII因子関連抗原；細胞接着分子：PECAM-1、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、β3インテグリン、H-CAM、sLex、VCAM-1、GMP-140、ELAM-1、MCP、細胞CAM-105、VLA-1, -2, 5；ならびに他の細胞膜タンパク質：TFおよびThy-1。
【００８６】
罹患腫瘍内皮細胞上で発現される多種多様な表面マーカーも報告されており、それらには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：TAL-1 (J. Pathol. (1996) 178, 311-5)、VEGF/VEGR R-II複合体 (Cancer Res. (1998) 58, 1952-9)、VEGR-I (Am J. Pathol. (1998) 153, 1239-48)、VEGR-II (Mol. Endocrinol (1995) 9, 176-70)、Tie-2 (PNAS  (1998) 95, 8829-34)、エンドグリン（Endoglin） (J. Immunol. (1996) 156, 565-73)、α3/β3インテグリン (Int J Cancer (1997) 71, 320-4)、アンジオスタチン受容体 (PNAS (1999) 96, 2811-6)、E-セレクチン/ELAM-1 (Gene Ther. (1999) 6, 801-7)、PSMA (Cancer Res (1999) 148, 465-72)、CD44 (Blood (1997) 90, 1150-9)、ICAM-3 (Am J Pathol (1996) 148, 465-72)、CD40 (Cancer Res. (1997) 57, 891-9)、およびTF (PNAS USA (1999) 96, 8161-6)。
【００８７】
疾患
本発明の好ましい実施形態においては、内皮細胞は疾患に罹っている。  
本明細書中で用いる「疾患」なる語は、内皮細胞の任意の解剖学的異常または正常機能の障害を意味する。
【００８８】
疾患は、環境的要因、例えば栄養不良または毒性因子、感染性因子、例えば細菌またはウイルス、遺伝的疾患あるいはこれらの要因の任意の組合せにより引き起こされうる。  
好ましくは、疾患は血管新生依存的疾患である。  
多数の重大な病態においては、身体は血管新生に対する制御を喪失する。血管新生依存的疾患は、新たな血管が過剰または不十分に成長する場合に生じうる。
【００８９】
多数の重要な臨床適応症においては、血管新生が、重要な結果となる。例えば、迅速に分裂している細胞に、十分な酸素を供給するために、悪性腫瘍の周囲には血管新生が生じる。慢性炎症疾患、例えば慢性関節リウマチにおいては、持続的炎症が、血管に富む顆粒組織の形成を滑膜内に引き起こす。したがって、これらの状況においては、血管リモデリングおよび血管新生を妨げることが潜在的な治療アプローチとなる。
【００９０】
固形腫瘍の治療においては、異なる方法（例えば、細胞内抗体フラグメントおよびペプチドアプタマーの使用）で標的タンパク質の機能を妨げるための標的化二重阻止剤を発現するベクターの導入により、内部血管新生タンパク質標的（例えば、LMO2）に接近可能であろう。特定の細胞へのin vivoでのベクターの送達方法は、より有効になりつつあり、内皮細胞へのベクターの送達のための特異的方法が報告されている（Sedlacek (2001), Critical Reviews in Oncology/Hematology 37 169-215）。これらの送達方法を、特異的標的の機能を妨げうる1以上のタンパク質を効率的に発現する能力と組合せることは、抗血管新生療法に対する非常に魅力的なアプローチである。
【００９１】
過剰な血管新生は、癌、糖尿病性失明、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチおよび乾癬のような疾患において生じうる。これらの状態においては、新たな血管が罹患組織に栄養供給し、正常組織を破壊し、癌の場合には、新たな血管が、癌が循環中に逃れ他の器官に定着すること（腫瘍転移）を可能にする。罹患細胞が、天然血管新生インヒビターの作用に勝る異常量の血管新生成長因子を産生する場合にも、過剰な血管新生が生じうる。
【００９２】
したがって、内皮細胞内での1以上のコード配列の発現においてIRESエレメントを使用することにより、過剰な血管新生をモジュレーションするコード配列を発現させることが可能である。
【００９３】
不十分な血管新生は、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延のような疾患において生じうる。これらの状態においては、不適切な血管が成長し、循環が適切には回復せず、組織死のリスクを招く。適当な量の血管新生成長因子を組織が産生し得ない場合にも、不十分な血管新生が生じる。
【００９４】
したがって、内皮細胞内での1以上のコード配列の発現においてIRESエレメントを使用することにより、成長因子による新たな血管の成長を刺激することが可能である。
【００９５】
より好ましくは、疾患は、癌、虚血、糖尿病性網膜症、炎症疾患、加齢性黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、冠状動脈疾患、卒中および創傷治癒の遅延から選ばれる。
【００９６】
ベクター
1以上のコード配列に機能しうる形で連結されたIRESエレメントを製造し、および／または遺伝的ベクターを使用して標的部位（例えば、罹患内皮細胞）へ送達することが可能である。
【００９７】
当技術分野においてよく知られているとおり、ベクターは、1つの環境から別の環境への物質の転移を可能にする又は促進するための手段である。例えば、組換えDNA技術において使用されるいくつかのベクターは、ヌクレオチド配列を含むベクターの複製および／またはヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の発現のために、DNAのセグメント（例えば、異種DNAセグメント、例えば異種cDNAセグメント）のような物質が宿主および／または標的細胞内に導入されるのを可能にする。組換えDNA技術において使用されるベクターの具体例には、プラスミド、染色体、人工染色体またはウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
「ベクター」なる語は、発現ベクターおよび／または形質転換ベクターを含む。  
「発現ベクター」なる語は、in vivoまたはin vitroで発現されうる構築物を意味する。  
「形質転換ベクター」なる語は、1つの種から別の種へ転移されうる構築物を意味する。
【００９９】
本発明のベクターを適当な宿主細胞、例えば内皮細胞内に形質転換またはトランスフェクトして、1以上のヌクレオチド配列を発現させることが可能である。この方法は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列のベクターによる発現をもたらす条件下、ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、場合によっては、発現されたタンパク質を回収することを含みうる。いくつかの場合には、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を誘導プロモーターの制御下で行うことが可能であり、それにより、発現は例えばIPTGで誘導されるに違いない。
【０１００】
ベクターは、例えばプラスミドまたはウイルスベクターでありうる。  
好ましい実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。  
近年、ウイルス、例えばレトロウイルスの、遺伝子治療における使用が提示されている。  
遺伝子治療は、1以上のヌクレオチド配列の付加、置換、欠失、補足、操作などのいずれか1以上を含む。遺伝子治療に関する一般的教示が当技術分野で入手可能である。  
ベクターは、本明細書に記載の内皮細胞リガンドを含みうる。
【０１０１】
典型的には、ベクターは、1以上の複製起点、例えばpUC ori、SV40 oriおよびf1 oriを含む。
【０１０２】
典型的には、ベクターは、1以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳類ベクターの場合にはネオマイシン耐性遺伝子を含有する。
【０１０３】
場合によっては、ベクターは、選択マーカーまたはレポーターのような1以上のコード配列の発現のための1以上のプロモーター、および場合によっては、該プロモーターの調節因子を含みうる。
【０１０４】
第1コード配列に機能しうる形で連結されたプロモーターと、第2コード配列に機能しうる形で連結されたIRESエレメントとを含むベクターにおいては、本明細書に記載のとおり、該プロモーターはIRESエレメントの上流に位置する。典型的には、このタイプのベクターにおいては、2以上のコード配列が発現される。
【０１０５】
2以上のコード配列の発現のために、2以上のIRESエレメントを同一ベクター内に含有させることが可能である。
【０１０６】
さらに、2つの異なるコード配列を互いにインフレームで融合させて、キメラタンパク質を得、両方のコード配列を同時に発現させることが可能である。
【０１０７】
また、第1コード配列に機能しうる形で連結されたプロモーターと本発明に従い第2コード配列に機能しうる形で連結されたIRESエレメントとを含むクローニングベクターおよびトランスジーン発現ベクターは、（1）cDNAライブラリーの機能的スクリーニングのためのベクターとして、（2）ツーハイブリッドクローニング系における融合相手の共発現、および（3）レポーターおよび選択マーカー融合遺伝子の共発現（TIG (1995) 11, 179-184）に使用することが可能である。
【０１０８】
プロモーターを含まない、IRESに基づくベクターの使用は、遺伝子ターゲッティングにおける相同組換え事象の著しい増加をもたらしうる（Genes Dev (1988) 2, 1353-1363）。典型的には、各IRESは1つのコード領域のタンパク質合成を支持するに過ぎない。したがって、2以上のコード配列の発現には、2以上のIRESエレメントが必要となる。例えば、2つのコード配列の発現には、典型的には2つのIRESエレメントが必要となる。
【０１０９】
1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のIRES配列の利用は、例えば、標的化ベクターの設計を単純化することにより、この状況を改善しうる。例えば、IRESに連結された選択マーカーの利用は、構造上または調節上の微妙な改変が特定の遺伝子内に導入されるのを可能にしうる。そのような改変には、遺伝子の欠失または破壊、突然変異の導入および遺伝子発現のアップレギュレーション（TIG (1995) 11 p179-184）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
例えば、相同組換え用のベクターを以下のとおりに構築することが可能である。プラスミドは、エキソン2内に突然変異した唯一のBamHI制限部位を有するpKO5tkに基づくものでありうる。HC-IRES-LacZ-MC1neopAカセットをpKO5tkのBamHI部位内に挿入することにより、該ベクターを調製する。まず、C型肝炎ウイルスベクターpRT8からのIRESエレメントを含む400bpのBamHI断片を修飾pBSptベクター（pBspt-BGB4）のBglII-BamHI部位内にクローニングして、唯一のBamHI部位を有する前駆体pBSpt-HC-IRESエレメントを作製し、該BamHI部位内にlacZ遺伝子およびpMC1-neo-pAをクローニングする。
【０１１１】
プロモーター
本発明においては、例えば選択された宿主細胞によるコード配列の発現をもたらしうるプロモーターに、1以上のコード配列が、機能しうる形で連結されている。
【０１１２】
「プロモーター」なる語は、当技術分野における通常の意味（例えば、RNAポリメラーゼ結合部位）で用いられている。
【０１１３】
適当なプロモーター配列は、細菌、真菌および酵母を含む（これらに限定されるものではない）種々の起源に由来しうる。好ましくは、適当なプロモーター配列は、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス40（SV40））のゲノムに由来する強力なプロモーター、または異種哺乳類プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたはリボソームタンパク質プロモーター）である。  
好ましくは、プロモーターはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターである。  
発現構築物の誘導性調節を改善するために、ハイブリッドプロモーターも使用することが可能である。
【０１１４】
プロモーターは更に、適当な宿主内での発現を確保または増強するための特徴を含みうる。例えば、該特徴は、保存された領域、例えばプリブナウボックスまたはTATAボックスでありうる。プロモーターは更に、第1ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を及ぼす（例えば、維持する、増強する、減少させる）他の配列を含有しうる。例えば、適当な他の配列には、Sh1-イントロンまたはADHイントロンが含まれる。他の配列には、誘導可能な素、例えば温度、化学、光またはストレスにより誘導可能なエレメントが含まれる。コード配列の転写は更に、ベクター内にエンハンサー配列を挿入することによっても増強することが可能である。エンハンサーは、相対的に、配向および位置に依存的であるが、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサー、例えば、複製起点の後期側のSV40エンハンサー（bp 100-270）およびCMV初期プロモーターエンハンサーが使用される。エンハンサーはプロモーターの5'側または3'側の位置においてベクター内に挿入されうるが、好ましくは、プロモーターの5'側の部位に位置する。
【０１１５】
IRESエレメントの同定
もう1つの態様において、本発明は、内皮細胞内で1以上のコード配列を発現するIRESエレメントの同定方法に関する。
【０１１６】
内皮細胞内で1以上のコード配列を発現する能力に関して試験されるIRESエレメントは任意のコード配列に機能しうる形で連結されうる。
【０１１７】
好ましくは、コード配列は、検出されうる1以上のタンパク質を発現する。そのようなタンパク質はレポーターとして公知かもしれない。例えば、コード配列はβガラクトシダーゼを発現したり、あるいは蛍光タンパク質、例えば赤色蛍光タンパク質またはシアンブルー色蛍光タンパク質を発現しうる。
【０１１８】
好ましくは、ベクターは、哺乳類細胞および／または細菌細胞内での複製のための複製起点、ならびに選択マーカー、例えば抗生物質耐性カセットを含み、したがって、プラスミドが選択されうる。
【０１１９】
有利には、ベクターは1以上のプロモーター、例えばCMVプロモーターを含みうる。IRESエレメントがコード配列の翻訳を開始しうるためには、IRESエレメントは、共通の上流プロモーターの制御下にあるコード配列間に位置すべきである。これは、両方のコード配列の共役転写、およびそれに続く、第1コード配列の翻訳のキャップ非依存的開始、および第2コード配列のIRES誘導性キャップ非依存的翻訳を可能にする。
【０１２０】
好ましくは、プロモーターにより発現される1以上のコード配列が検出されうる。より好ましくは、プロモーターにより発現されるコード配列は、検出されうる1以上のタンパク質を発現し、1以上のIRESエレメントから発現されるコード配列とは異なる。
【０１２１】
有利なことに、ベクターにおける1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のプロモーターの使用は、プロモーターからのコード配列の発現のレベルと被検IRESエレメントからのコード配列の発現のレベルとを比較するための対照となりうる。
【０１２２】
ベクターは更に、複数のコード配列に機能しうる形で連結された複数のIRESエレメントを含みうる。好ましくは、IRESエレメントの少なくとも1つは、検出されうる1以上のタンパク質を発現するコード配列に融合されたHC-IRESエレメントである。
【０１２３】
好ましくは、HC-IRESエレメントに融合されたコード配列から発現されるタンパク質は、発現されるその他のタンパク質のいずれとも異なり、したがって、該タンパク質の発現はHC-IRESエレメントに帰されうる。このように、HC-IRESエレメントは、本発明のHC-IRESエレメントより多少なりとも効率的にコード配列を発現するIRESエレメントを同定するための適当な対照となる。
【０１２４】
本明細書に記載されている当技術分野で公知の種々の方法を用いて、ベクターを内皮細胞内にトランスフェクトする。例えば、リポフェクタミン2000を使用する、発現ベクターのリポソーム送達を用いて、細胞をトランスフェクトすることが可能である。
【０１２５】
内皮細胞内のコード配列の発現のレベルは、当技術分野で公知の種々の方法を用いて測定することが可能である。用いる厳密な方法は、発現される検出可能なタンパク質のタイプに左右されるであろう。例えば、発現されるタンパク質がβガラクトシダーゼである場合には、細胞をX-galでホールマウント染色することが可能である。
【０１２６】
IRESエレメントに融合したタンパク質のin vitroでの内皮細胞内の発現のレベルを測定することに加えて、in vivoでも発現のレベルを測定することが可能である。
【０１２７】
例えば、内皮細胞内で発現される遺伝子（例えば、Lmo2が挙げられるが、これに限定されるものではない）における相同組換えのためのプラスミドを構築することが可能である。ノックイン標的化クローンは、HC-IRES-LacZ-MC1neopAカセットを適当なベクター（例えば、pKO5tk）のBamHI部位内に挿入することにより調製することが可能である。細胞を該ベクターでトランスフェクトし、標的化クローンをサザンフィルターハイブリダイゼーションにより特徴づけし、ついで胚盤胞内に注入することが可能である。ついでキメラマウスを作製することが可能であり、それより、雄キメラを雌と交配させることにより生殖細胞系伝達を得る。ヘテロ接合マウスと野生型マウスとの間で、時限（timed）交配を準備することが可能である。適当な時点で、妊娠した雌を安楽死させ、胚を摘出し、例えばβガラクトシダーゼを検出するためのX-galでのホールマウント染色により、発現を測定する。ロウ包埋の後、固定後胚を切片化することが可能である。ついで切片を顕微鏡スライド上にマウントし、対比染色する。PECAM（CD31）のような種々の内皮細胞マーカーを使用して、内皮細胞の検出を達成することが可能であり、これは、アビジン-ビオチン共役ペルオキシダーゼ法によりMEC13.3抗CD31抗体（Pharmingen）を使用して行う。
【０１２８】
レポーター
本発明においては、多種多様なレポーターを使用することが可能であり、好ましいレポーターは、（例えば分光法により）簡便に検出可能なシグナルを与えうる。例えば、レポーター遺伝子は、光吸収特性を改変する反応を触媒する酵素をコードしうる。
【０１２９】
レポーター分子の具体例には、βガラクトシダーゼ、インベルターゼ、グリーン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼ、エキソ-グルカナーゼおよびグルコアミラーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、放射能標識または蛍光タグ標識ヌクレオチドを新生転写産物内に取り込ませることが可能であり、これは後に、オリゴヌクレオチドプローブに結合した際に同定される。
【０１３０】
例えば、レポーター分子の産生は、βガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子産物の酵素活性により測定することが可能である。
【０１３１】
種々のプロトコール（例えば、検出すべきタンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の使用）が利用可能である。具体例には、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）および蛍光標示式細胞分取（FACS）が含まれる。ポリペプチド上の2つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を使用する、モノクローナル抗体に基づく2部位イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイを用いることも可能である。これらの及び他のアッセイは、とりわけ、Hampton Rら (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) およびMaddox DEら (1983) J. Exp. Med. 15 8:121 1)に記載されている。
【０１３２】
Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)、Promega (Madison, WI) およびUS Biochemical Corp (Cleveland, OH) のような多数の企業がこれらの手法のための市販キットおよびプロトコールを供給している。適当なレポーター分子または標識には、それらの放射性核種、酵素、蛍光、化学発光または発色剤、および基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが含まれる。そのような標識の使用を教示している特許には、US-A-3817837、US-A-3850752、US-A-3939350、US-A-3996345、US-A-4277437、US-A-4275149およびUS-A-4366241が含まれる。また、US-A-4816567に示されているとおり、組換え免疫グロブリンを製造することが可能である。
【０１３３】
特定の分子の発現を定量するための更なる方法は、放射能標識（Melby PCら 1993 J Immunol Methods 159:235-44）またはビオチン化（Duplaa Cら 1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチド、対照核酸の共増幅（coamplification）、および実験結果が外挿される標準曲線を含む。アッセイをELISA形式で行うことにより、複数のサンプルの定量を加速することが可能であり、この場合、関心のあるオリゴマーが種々の希釈度で与えられ、分光光度的または熱量測定的応答が迅速な定量をもたらす。
【０１３４】
送達
本発明のいくつかの態様は、in vivoでの内皮細胞内での1以上のコード配列の発現に使用するIRESエレメントを含むベクターの送達に関する。
【０１３５】
該ベクターは、単独で又は1以上の更なる物質と組合せて送達されうる。
【０１３６】
本明細書中で用いる「送達」なる語は、ウイルス技術または非ウイルス技術による送達を含む。
【０１３７】
非ウイルス送達
非ウイルス送達メカニズムには、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、カチオン表面両親媒性物質（cationic facial amphiphile）（CFA）およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３８】
細胞内への核酸の物理的注入は、最も単純な遺伝子送達系の1つである（Vile & Hart (1994) Ann. Oncol, suppl. 5, 59）。したがって、ヌクレオチド配列を含むベクターを「裸核酸構築物」として直接投与することが可能であり、それは更に、宿主ゲノムに相同なフランキング配列を含みうる。
【０１３９】
注入後、核酸は細胞内に取り込まれ、核に移行し、この部位において、それはエピソーム位置から一過性に発現され、あるいは宿主ゲノム内への組込みが生じた場合には安定に発現されうる。物理的介入（例えば、集中的な超音波）はトランスフェクション効率を増加させうる。in vivoでの細胞のトランスフェクションの効率は、DNA被覆金粒子を遺伝子銃で注入することにより増加させることが可能である（Fyanら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11478）。
【０１４０】
リポソームは、核酸などの種々の物質を封入しうるリン脂質二重膜から構成される小胞である。脂質と核酸との混合物は、in vitroおよびin vivoで細胞内にトランスフェクトされうる複合体（リポプレックス（lipoplex））を形成する。脂質媒介遺伝子送達は、特異的受容体との相互作用、複数回投与を促進する脂質成分の最小免疫原性、大きなDNA配列を送達しうる大容量ベクターおよび製造の容易さが要求されることなく、種々の細胞をトランスフェクトしうる。脂質膜内へのポリエチレングリコール誘導体の挿入またはペジル化（pegylation）は、投与後のリポソームの循環半減期を増加させうる。リポソームの薬物動態学、生物分布および融合誘導性（fusogenicity）は、脂質膜の組成を変化させることにより様々となりうる。特に、中性または補助脂質（例えば、コレステロールまたはDOPE）を伴うDMRIE、DOSPAおよびDOTAPのような或るカチオン脂質のリポソーム内取り込みは、それらが細胞膜と融合しそれらの内容物を細胞に送達する能力を増強しうる。
【０１４１】
多数の非脂質ポリカチオン重合体は、細胞内への送達を促進する、核酸との複合体を形成する（LiおよびHuang (2000) Gene Ther. 7, 31）。好ましくは、非脂質ポリカチオン重合体には、ポリ-L-リシン、ポリエチレンイミン、ポリグルコサミンおよびペプトイドが含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリエチレンイミンはエンドソーム内での複合体化核酸の分解を防ぎ、それは、エンドソーム区画からの核酸の放出、およびそれに続く、核へのその移行を促進する手段となる（Boussifら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7297）。ペジル化ポリエチレンイミン重合体は血清蛋白質との相互作用、延長された循環半減期を減少させることが可能であり、有意な毒性を伴うことなく遺伝子を細胞に送達しうる。
【０１４２】
生物治療用分子を放出するよう遺伝的に操作された細胞、例えば自己細胞、同種細胞および異種細胞の移植を用いることも可能である。移植細胞は、それを完全に収容しそれが宿主免疫系により攻撃されるのを防ぐ選択透過膜で包囲されうる。この封入方法は、同種源および異種源の両方からの初代細胞または細胞系の神経移植を可能にする。種々のタイプの封入（カプセル化）技術が当技術分野で公知である。マイクロカプセル化方法は、典型的には高分子電解質から構成される薄い球状半透膜内への小さな細胞塊の捕捉を可能にする。
【０１４３】
ウイルス送達
好ましい実施形態においては、IRESエレメントはウイルスベクター内で1以上のヌクレオチド配列に機能しうる形で連結されている。
【０１４４】
ウイルス送達メカニズムはヒト細胞の侵入およびその遺伝子の発現の特異的かつ効率的な手段を発展させているため、それは遺伝子送達のための魅力的なビヒクルである。
【０１４５】
好ましくは、ウイルスの複製および病原性に必要な配列を除去するために、ウイルスゲノムを修飾する。より好ましくは、ウイルスヌクレオチド配列を1以上の外因性遺伝子、例えばIRESエレメントおよび1以上のヌクレオチド配列により置換する。
【０１４６】
ウイルス送達メカニズムには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルスベクター、バキュロウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アルファウイルスおよび水疱性口炎ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４７】
レトロウイルスは一本鎖二倍体RNAウイルスであり、これは、env遺伝子によりコードされる表面エンベロープタンパク質に結合することにより細胞に侵入する。細胞に侵入した後、pol遺伝子によりコードされる逆転写酵素がウイルスゲノムを二本鎖DNAコピーに転写し、これは分裂細胞の核に侵入し、宿主ゲノム内にランダムに組込まれうる。好ましくは、ウイルス送達に使用するレトロウイルスを、そのgag、polおよびenv遺伝子を除去することにより、それが複製欠損型となるよう操作する。したがって、パッケージング配列を欠くプラスミドからレトロウイルスgag、polおよびenv遺伝子を発現するパッケージング細胞系において、感染性ではあるが非複製型であるレトロウイルス粒子が産生される。
【０１４８】
レトロウイルスベクター内へのIRESエレメントの挿入はレトロウイルス複製周期に適合し、単一プロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Kooら (1992) Virology 186:669-675; Chenら 1993 J. Virol 67:2142-2148）。
【０１４９】
レトロウイルスの亜型であるレンチウイルスはレトロウイルスの代替物の1つとなりうる。レンチウイルス、例えばHIV、サルおよびネコ免疫不全ウイルスは非分裂細胞に感染し、他のレトロウイルスと同様に組込まれうる。複製欠損型および多重弱毒化レンチウイルスベクターは、げっ歯類および霊長類の両方のCNSにおける種々のトランスジーンの長期的発現をもたらすことが示されている（Bensadounら (2000) Exp. Neurol. 164, 15-24; Kordowerら (2000) Exp. Neurol. 160, 1-16）。レンチウイルスベクターは注入部位から2〜3mm拡散し、これは、少なくとも1年までの持続的な遺伝子発現を伴う相当な数のニューロンの形質導入を可能にする。
【０１５０】
更に他のウイルスとして、アデノウイルスが挙げられ、これは二本鎖DNAウイルスを含む。6つの群（A〜F）における40を超えるアデノウイルス亜型が同定されている。C群ウイルス（血清型Ad2およびAd5）は遺伝子送達の候補として最も詳細に評価されている（Zhang (1999) Cancer Gene Ther. 6, 11）。アデノウイルスは、ウイルス抗原-グリシン-アスパラギン酸（RGD）配列と細胞インテグリンとの相互作用を促進するコクザッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体に結合することにより細胞に侵入する。インターナリゼーション後、ウイルスは細胞エンドソームから逃れ、部分的に分解し、核へ移行し、この部位で、ウイルス遺伝子の発現が始まる。好ましくは、アデノウイルスは複製不能である。これは、アデノウイルス遺伝子の1以上（例えば、初期アデノウイルス遺伝子E1〜E4）を欠失させることにより達成することができる。これは、アデノウイルスゲノムの全ヌクレオチド配列を除去するよう拡張されうる。そのようなウイルスは、ヌクレオチド配列をパッケージングするために使用することが可能であるが、該ヌクレオチド配列を含有する感染性の複製不能アデノウイルスのパッケージングを促進するのに必要なすべてのウイルス遺伝子機能を供給するヘルパーウイルスの存在下、プロデューサー細胞系内で増殖させなければならない。
【０１５１】
アデノ随伴ウイルスは、いずれの疾患を引き起こすことも知られていない天然ヒトウイルスである一本鎖DNAウイルスである。それは、ヘパラン硫酸に結合することにより細胞に侵入するが、複製には、いわゆるヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染を要する。アデノ随伴ウイルスベクターは多数の潜在的利点を有する。それは非分裂細胞に感染し、宿主ゲノム内に安定に組込まれ、維持される。組込みは第19染色体の部位依存的遺伝子座において優先的に生じ、挿入突然変異誘発のリスクが減少する。しかし、アデノ随伴ウイルスベクターにおいては、複製可能アデノ随伴ウイルスの出現のリスクを減少させるためにrepタンパク質を欠失させると、この特徴的組込みが失われる。
【０１５２】
単純ヘルペスウイルスは、70個を超えるウイルスタンパク質をコードする約150kbpの直鎖状二本鎖DNAゲノムを有する大きなウイルスである。これらのウイルスは、ウイルス糖タンパク質を細胞表面ヘパラン硫酸残基に結合させることにより細胞に侵入する。好ましくは、少数の遺伝子（ICPD、ICP4、10P22およびICP27）を不活性化することにより、単純ヘルペスウイルスを複製欠損型にする。多数の単純ヘルペスウイルス遺伝子は、ウイルスベクターを産生する能力に影響が及ぶことなく欠失されうるため、複数の遺伝子およびそれらの調節エレメントを含有する大きな核酸配列が単純ヘルペスウイルスベクター内にパッケージングされうる。
【０１５３】
ポックスウイルスは、ワクシニアおよびカナリア痘ウイルスまたはALVACを含む二本鎖DNAウイルスである。好ましくは、ポックスウイルスは、ヌクレオチド配列を含有する組換えポックスウイルスである。
【０１５４】
ウイルス技術による送達方法を以下に更に詳しく説明する。
【０１５５】
アデノウイルス
1つの送達方法はアデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNA内への、低い組込み能力を有することが知られているが、この特徴は、これらのベクターによりもたらされる高い遺伝子導入効率により相殺される。
【０１５６】
本明細書中で用いる「アデノウイルス発現ベクター」なる語は、（a）構築物のパッケージングを支持するのに、および（b）その中にクローニングされた構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を包含する意である。
【０１５７】
該ベクターは、遺伝的に操作されたアデノウイルス形態を含む。36kbの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝的体制は、7kbまでの外来配列による大部分のアデノウイルスDNAの置換を可能にする。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体組込みを引き起こさない。なぜなら、アデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝毒性を伴うことなくエピソーム様式で複製されうるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、徹底的な増幅の後にもゲノム再配列は見出されていない。
【０１５８】
アデノウイルスは中サイズのゲノムを有し、操作が容易であり、高力価を有し、広い標的細胞域を有し、高い感染性を有するため、遺伝子導入ベクターとして特に適している。該ウイルスゲノムの両端は100〜200塩基対の逆方向反復配列（ITR）を含有し、これは、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（E）および後期（L）領域は、ウイルスDNAの複製の開始により分割される種々の転写単位を含有する。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節をもたらすタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現はウイルスDNAの複製のためのタンパク質の合成を引き起こす。これらのタンパク質はDNAの複製、後期遺伝子の発現および宿主細胞の遮断（shut-off）に関与する（Renan (1990) Radiother. Oncol. 19, 197-218）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（MLP）によりもたらされる単一の一次転写産物の有意なプロセシングの後でしか発現されない。MLP（16.8 m.u.に位置する）は感染の後期において特に効率的であり、このプロモーターからもたらされるmRNAのすべては、これを、翻訳に好ましいmRNAにする5'-三分節（tipartite）リーダー（TPL）配列を有する。
【０１５９】
組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同組換えにより作製することが可能である。2つのプロウイルスベクター間での組換えの可能性があるため、この方法により野生型アデノウイルスが生じうる。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離し、そのゲノム構造を調べることが決定的に重要である。
【０１６０】
複製欠損型のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、E1タンパク質を構成的に発現するヘルパー細胞系に依存する。E3領域はアデノウイルスゲノムに存在しなくてもいいため（JonesおよびShenk (1978) Cell 131, 81-8）、ヘルパー細胞の補助を伴うアデノウイルスベクターはE1、D3またはそれらの両方において外来DNAを担持しうる。事実上、アデノウイルスは野生型ゲノムの約105％をパッケージングして、約2kb余剰のDNAの容量をもたらす。E1およびE3領域において置換可能であるDNA約5.5kbと組合わされて、現在のアデノウイルスベクターの容量は約7.5kb、すなわち、該ベクターの全長の約15％である。アデノウイルスゲノムの80％以上はベクターバックボーン内に残存する。
【０１６１】
ヘルパー細胞系は、ヒト細胞、例えばヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚間葉もしくは上皮細胞に由来しうる。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳類種の細胞に由来しうる。そのような細胞には、例えばVero細胞または他のサル胚間葉もしくは上皮細胞が含まれる。
【０１６２】
ヘルパー細胞を培養しアデノウイルスを増殖させるためには、種々の方法を用いることが可能である。1つの方法においては、100〜200mlの培地を含有する1リットルのシリコーン化遠心フラスコ（Techne, Cambridge, UK）内に個々の細胞を接種することにより、天然細胞塊を増殖させる。40rpmで攪拌した後、細胞生存度をトリパンブルーで推定する。もう1つの方法においては、Fibra-Celマイクロキャリアー（microcarrier）（Bibby Sterilin, Stone, UK）（5g/l）を以下のとおりに使用する。5mlの培地に再懸濁させた細胞接種物を250ml エーレンマイヤーフラスコ内の担体（50ml）に加え、時々攪拌しながら1〜4時間静置する。ついで培地を50mlの新鮮な培地と交換し、振とうを開始させる。ウイルス産生のために、細胞を約80％のコンフルエンスまで増殖させ、ついで培地を（最終体積の25％まで）交換し、アデノウイルスを0.05のMOIで加える。培養を一晩静置し、ついで体積を100％に増加させ、振とうを更に72時間行う。
【０１６３】
アデノウイルスは、42個の異なる公知血清型または亜群A〜Fのいずれであってもよい。いくつかの場合には、血清群Cのアデノウイルス5型が、条件的（conditional）複製欠損型アデノウイルスベクターを得るため好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス5型が、膨大な生化学的および遺伝的情報が判明しているヒトアデノウイルスであり、アデノウイルスをベクターとして使用するほとんどの構築物にそれが歴史的に使用されているからである。
【０１６４】
したがって、典型的なベクターは複製欠損型であり、アデノウイルスE1領域を有さないであろう。したがって、E1コード配列が除去された位置に形質転換用構築物を導入することが最も簡便であろう。しかし、アデノウイルス配列内の該構築物の挿入の位置は本発明において重要ではない。関心のある遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、E4領域において（この場合、ヘルパー細胞系またはヘルパーウイルスがE4欠損を補う）、またはE3置換ベクターにおいて、欠失E3領域の代わりに挿入することも可能である。
【０１６５】
アデノウイルスの増殖および操作は当業者に公知であり、in vitroおよびin vivoで広い宿主域を示す。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノム内への組込みを要しない。アデノウイルスベクターにより送達される外来遺伝子はエピソーム性であり、したがって、宿主細胞に対する低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスのワクチン接種の研究においては副作用は報告されておらず（Topら (1971) J Infect Dis. 124, 148-54）、このことは、in vivo遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および治療能を示している。
【０１６６】
アデノウイルスベクターは真核生物遺伝子発現（Levreroら (1991) Gene 101, 195-202; Gomez-Foixら (1992) J Biol Chem. 267, 25129-34）およびワクチン開発（Graham & Prevec (1992) Biotechnol. 20. 363-90）において使用されている。種々の組織への組換えアデノウイルスの投与における研究は、気管点滴、筋肉注射、末梢静脈内注射および脳内への定位固定接種（Le Gal La Salleら (1993) Science 12, 988-90）を含む。
【０１６７】
アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（AAV）は高い組込み頻度を有し、非分裂細胞にも感染しうるため、AAVも本発明において使用することが可能である。AAVベクターの作製および使用に関する詳細は米国特許第5,139,941号および米国特許第4,797,368号に記載されている。
【０１６８】
組換えAAV（rAAV）ベクターは、マーカー遺伝子（Kaplittら (1994) Nat Genet 8, 148-54）およびヒト疾患に関わる遺伝子のin vitroおよびin vivo形質導入に成功裏のうちに使用されている。
【０１６９】
AAVは、培養細胞内で生産的感染を引き起こすためには別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーメンバー）の共感染を要する点で、それは依存性パルボウイルスである。ヘルパーウイルスの共感染の非存在下では、野生型AAVゲノムはその末端を介してヒト第19染色体内に組込まれ、この部位において、それはプロウイルスとして潜伏状態で残留する。しかし、rAAVの組込みは、AAV Repタンパク質も発現されない限り、第19染色体には限局されない。AAVプロウイルスを保持する細胞がヘルパーウイルスに重感染すると、AAVゲノムは該染色体から又は組換えプラスミドから「レスキュー」され、正常な生産的感染が確立される（Muzyczka (1992) Curr. Top. Microbiol Immunol. 158, 97-129）。
【０１７０】
典型的には、rAAVは、2つのAAV末端反復配列に隣接する関心遺伝子を含有するプラスミドと、末端反復配列を伴わない野生型AAVコード配列を含有する発現プラスミドとをコトランスフェクトすることにより作製する。該細胞に、アデノウイルス、またはAAVヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を保持するプラスミドも感染または形質導入する。そのようにして作製したrAAVストックをアデノウイルス（これは、例えば塩化セシウム密度遠心分離により、rAAV粒子から物理的に分離されていなければならない）で汚染（contaminate）させる。あるいは、AAVコード配列を含有するアデノウイルスベクター、またはAAVコード領域とアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部または全部とを含有する細胞系を使用することが可能であろう。
【０１７１】
AAVベクターは、げっ歯類および非ヒト霊長類の脳内への遺伝子導入に成功裏のうちに使用されている（Peel & Kelin (2000) J. Neurosci. Methods 98, 95-104）。その低い炎症性のため、それは、非常に反応性であることが判明している領域（例えば、脊髄）内のニューロンに感染させるために使用することが可能である。
【０１７２】
レトロウイルス
前記のとおり、レトロウイルスは、そのRNAを感染細胞内で逆転写の過程により二本鎖DNAに変換する能力により特徴づけられる一本鎖RNAウイルスの一群である。ついで、生じたDNAはプロウイルスとして細胞染色体内に安定に組込まれ、ウイルスタンパク質の合成を導く。組込みは受容細胞およびその後代におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をコードする3つの遺伝子gag、polおよびenvを含有する。gagの上流に見出される配列はビリオン内へのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含有する。ウイルスゲノムの5'および3'末端には、2つの長末端反復配列（LTR）配列が存在する。これらは、強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノム内への組込みにも必要とされる。
【０１７３】
医薬組成物
本発明の医薬組成物はベクターの治療的有効量を含みうる。
【０１７４】
医薬組成物は、ヒト医薬および獣医薬においてはヒトまたは動物用でありうる。それは、典型的には、製薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤の任意の1以上を含む。治療用の許容される担体または希釈剤は薬学分野でよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.  (A. R. Gennaro編 1985) に記載されている。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬プラクティスに応じて行われうる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として又はそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤を含みうる。
【０１７５】
保存剤、安定剤、着色剤および香味剤を医薬組成物に加えることが可能である。保存剤の具体例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁化剤も使用されうる。
【０１７６】
送達系によって異なる組成物／製剤要件が存在するかもしれない。例えば、本発明の医薬組成物は、小型ポンプ（mini-pump）を使用して、または粘膜経路により、例えば、鼻腔内噴霧剤もしくは吸入用エアゾール剤もしくは摂取可能な溶液として、または非経口的（この場合、該組成物は、例えば静脈内、筋肉内または皮下経路による送達のための注射可能な形態として製剤化される）に投与されるように製剤化されうる。あるいは、該製剤は、多数の経路により投与されるように設計されうる。
【０１７７】
ベクターを胃腸粘膜から粘膜投与しようとする場合には、それは胃腸管内で一時的に安定に維持されうるべきである。例えば、それはタンパク質分解に抵抗性であり、酸性pHに安定であり、胆汁の浄化（detergent）作用に抵抗性であるべきである。
【０１７８】
適当な場合には、医薬組成物は、吸入により、または坐剤もしくはペッサリーの形態で、またはローション剤、水剤、クリーム剤、軟膏剤もしくは散布剤の形態で局所的に、または皮膚パッチの使用により、またはデンプンもしくはラクトースのような賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、またはカプセル剤もしくは膣坐剤として（単独で又は賦形剤と混合して）、または香味剤もしくは着色剤を含有するエリキシル剤、水剤もしくは懸濁剤の形態で投与することが可能である。あるいは、医薬組成物は、例えば静脈内、筋肉内または皮下に非経口的に注射することが可能である。非経口投与の場合には、該組成物は、他の物質（例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖）を含有しうる無菌水性溶液の形態で最も好ましく使用されうる。頬側または舌下投与の場合には、該組成物は、通常の方法で製剤化されうる錠剤またはロゼンジの形態で投与することが可能である。
【０１７９】
本発明のベクターを含む医薬組成物は、疾患の通常の治療（例えば、血管新生依存的疾患に対する通常の治療）と組合せて使用することも可能である。
【０１８０】
成分は単独で投与されうるが、一般には、例えば、意図される投与経路および標準的な医薬プラクティスに応じて選択される適当な医薬賦形剤、希釈剤または担体と該成分が混合されている場合には、医薬組成物として投与される。
【０１８１】
例えば、成分は、即時放出、遅延放出、修飾放出、徐放、パルス放出またはコントロールリリース適用のための、香料または着色剤を含有しうる錠剤、カプセル剤、膣坐剤、エリキシル剤、水剤または懸濁剤の形態で投与されうる。
【０１８２】
医薬が錠剤である場合には、該錠剤は微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基リン酸カルシウムおよびグリシンのような賦形剤、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび或る複合シリカートのような崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロール（HPMC）、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、スクロース、ゼラチンおよびアカシアのような顆粒化結合剤を含有しうる。また、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘナートおよびタルクのような滑沢剤を加えることが可能である。
【０１８３】
同様のタイプの固体組成物を、ゼラチンカプセル剤中の充填剤として使用することも可能である。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁剤および／またはエリキシル剤の場合には、種々の甘味または香味剤、着色剤または色素を、乳化および／または懸濁化剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンのような希釈剤ならびにそれらの組合せと共に使用することが可能である。
【０１８４】
投与（送達）経路には、経口（例えば、錠剤、カプセル剤または摂取可能な溶液）、局所、粘膜（例えば、鼻腔内噴霧剤または吸入用エアゾール剤）、鼻腔内、非経口（例えば、注射可能な形態によるもの）、胃腸、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼球内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、大脳内、皮下、眼内（硝子体内または腔内を含む）、経皮、直腸、頬側、膣、硬膜外、舌下の1以上が含まれうるが、これらに限定されるものではない。
【０１８５】
用量レベル
典型的には、個々の対象に最も適した実際の投与量は医師により決定される。いずれかの特定の患者に対する具体的な用量レベルおよび投与頻度は様々であり、使用する具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用持続時間、年齢、体重、全身健康状態、性別、食事、投与の方法および時間、排泄の速度、薬物の組合せ、個々の状態の重症度ならびに個々の現在受けている療法を含む種々の要因に左右される。
【０１８６】
製剤
成分は、当技術分野で公知の技術を用いることにより、適当な担体、希釈剤または賦形剤の1以上と混合することにより医薬組成物に製剤化することが可能である。
【０１８７】
宿主細胞
本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語は、本発明において有用なヌクレオチド配列を含む任意の細胞を意味する。
【０１８８】
ベクター（例えば、クローニングベクター）内に含有されるヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることが可能である。ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列の複製および／または発現のためのベクター内に担持されうる。該細胞は該ベクターに適合しうるよう選択され、真核細胞（例えば、哺乳類）、例えば内皮細胞、または原核細胞（例えば、細菌）、真菌、酵母または植物細胞でありうる。
【０１８９】
トランスフェクション
宿主細胞内へのベクターの導入は種々の方法により行うことができる。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染を用いることが可能である。そのような方法は多数の標準的な実験マニュアル、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。
【０１９０】
発現ベクターを含有する宿主細胞は、ネオマイシン耐性選択マーカーを保持する発現ベクターでトランスフェクトされた細胞に関して、例えばG418を使用することにより選択することができる。
【０１９１】
形質転換
細胞の形質転換に関する教示は当技術分野で十分に記載されている。例えば、Sambrookら (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) およびAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。
【０１９２】
原核宿主を使用する場合には、形質転換の前に、例えばイントロンを除去することにより、ヌクレオチド配列を適切に修飾する必要があるかもしれない。
【０１９３】
宿主細胞をヌクレオチド配列で形質転換することが可能である。ヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、該ヌクレオチド配列の複製または発現に適した条件下で培養することが可能である。
【０１９４】
変異体／ホモログ／誘導体
本明細書中で用いる、配列番号1および配列番号2に対する参照は、それらの変異体、ホモログ、誘導体および断片をも含む。
【０１９５】
「変異体」なる語は、野生型配列とは異なるが機能的に同等である天然に存在するポリペプチドまたはヌクレオチド配列を意味するものとして用いられる。
【０１９６】
「断片」なる語は、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列が野生型配列（例えば、野生型HC-IRES配列）の一部を含むことを示す。それは、1以上の大きな連続的配列断片または複数の小さな断片を含みうる。該配列は、配列の他のエレメントをも含みうる。例えば、それは別のタンパク質との融合タンパク質でありうる。好ましくは、該配列は、野生型配列の少なくとも50％、より好ましくは少なくとも65％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％を含む。
【０１９７】
「ホモログ」なる語は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列に対して或る相同性を有するものを意味する。この場合、「相同性」なる語は「同一性」と同等とみなされうる。好ましくは、ホモログは対象アミノ酸配列と機能的に同等である。
【０１９８】
この場合、相同配列は、対象配列に対して少なくとも75％、85％または90％、好ましくは少なくとも95％または98％同一でありうるアミノ酸配列を含むとみなされる。相同性は類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の点においても考慮されうるが、本発明においては、配列同一性の点で相同性を表すのが好ましい。
【０１９９】
この場合、相同配列は、対象配列に対して少なくとも75％、85％または90％、好ましくは少なくとも95％または98％同一でありうるアミノ酸配列を含むとみなされる。相同性は類似性（すなわち、類似した化学特性／機能を有するアミノ酸残基）の点においても考慮されうるが、本発明においては、配列同一性の点で相同性を表すのが好ましい。
【０２００】
相同性の比較は、視覚的に、あるいはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けにより行うことが可能である。これらの商業的に入手可能なコンピュータープログラムは2以上の配列間の相同性（％）を算出しうる。
【０２０１】
相同性（％）は、連続的な配列にわたって算出されうる。すなわち、1つの配列をその他の配列と整列させ、1つの配列中の各アミノ酸をその他の配列中の対応アミノ酸（一度に1つの残基）と直接的に比較する。これは「非ギャップ化（ungapped）」アライメントと称される。典型的には、そのような非ギャップ化アライメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【０２０２】
これは非常に単純かつ一貫した方法であるが、それは、例えば、1つの挿入または欠失以外の点では同一である配列ペアにおいて、その1つの挿入または欠失が後続アミノ酸残基のアライメントを妨げて、全体的なアライメントを行った場合の相同性（％）における大きな減少を引き起こしうることを考慮していない。したがって、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを不当に犠牲にすることなく、考えられうる挿入および欠失を考慮に入れて、最適なアライメントが得られるように設計されている。これは、局所相同性（ローカルホモロジー）を最大にするために配列アライメントにおいて「ギャップ」を挿入することにより達成される。
【０２０３】
しかし、これらの、より複雑な方法は、アライメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割当てる。その結果、同じ数の同一アミノ酸に対しては、可能な限り少数のギャップを伴う配列アライメント（これは、それらの2つの比較配列間の、より高い関連性を表す）が、多数のギャップを伴うものより高いスコアを示す。典型的には、ギャップの存在に対しては比較的高いコストを課し、該ギャップにおける各後続残基には、より小さなペナルティーを課す「アフィン・ギャップ・コスト（Affine gap cost）」が用いられる。これは、最も一般に用いられているギャップ・スコア系である。もちろん、高いギャップ・ペナルティーは、より少数のギャップを伴う最適化アライメントを与える。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティーの修飾が可能である。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合には、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用する場合には、アミノ酸配列のデフォルト・ギャップ・ペナルティーはギャップ当たり-12であり、各伸長につき-4である。
【０２０４】
したがって、最大相同性（％）の計算には、まず、ギャップ・ペナルティーを考慮した最適アライメントの生成を要する。そのようなアライメントを行うための適当なコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereuxら, 1984, Nucleic Acids Research 12:387）である。配列比較を行いうる他のソフトウェアの具体例には、BLASTパッケージ（Ausubelら, 1999 前掲 Chapter 18を参照されたい）、FASTA（Atschulら, 1990, J. Mol. Biol., 403-410）およびGENEWORKS比較ツール一式が含まれるが、これらに限定されるものではない。BLASTおよびFASTAは共に、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である（Ausubelら, 1999 前掲, pages 7-58 から 7-60）。しかし、いくつかの用途には、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい。BLAST 2 Sequencesと称される新規手段も、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8）。
【０２０５】
最終的な相同性（％）は同一性に関して測定されうるが、アライメント過程自体は、典型的には、オール・オア・ナシング（all-or-nothing）ペア比較に基づくものではない。実際には、化学的類似性または進化的距離に基づいて各ペアごとの比較にスコアを割当てるスケールド（scaled）類似性スコアマトリックスが一般には用いられる。一般に用いられるそのようなマトリックスの一例は、BLOSUM62マトリックスであり、これはBLASTプログラム一式のデフォルトマトリックスである。GCG Wisconsinプログラムは、一般には、公開（public）デフォルト値または特製シンボル（custom symbol）比較表を、それらが供給されている場合には用いる（更に詳しくは、取扱い説明書を参照されたい）。いくつかの用途には、GCGパッケージには公開デフォルト値を、あるいは他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス（例えば、BLOSUM62）を使用するのが好ましい。
【０２０６】
ソフトウェアが最適アライメントを与えたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数的結果を与える。
【０２０７】
また、配列は、サイレントな変化をもたらし機能的に等価な物質を与える、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しうる。その物質の二次的結合活性が保有される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づき、意図的なアミノ酸置換を行うことが可能である。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ、類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。
【０２０８】
保存的置換を、例えば以下の表に従い行うことが可能である。第2列の同じ欄中、好ましくは、第3列の同じ欄のアミノ酸同士で互いに置換することが可能である。
【表１】
2006516402.tif 000002
【０２０９】
本発明は、相同置換（置換は、本明細書中では、既存アミノ酸残基を別の残基と交換することを意味するものとして用いられている）を含む。すなわち、性質が類似したもの同士の置換、例えば、塩基性のもの同士、酸性のもの同士、極性のもの同士などの置換が生じうる。非相同置換、すなわち、1つのクラスの残基から別の残基への置換、あるいは非天然アミノ酸、例えばオルニチン（以下、Zと称される）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Bと称される）、ノルロイシンオルニチン（以下、Oと称される）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンを含む置換も生じる。
【０２１０】
置換は、例えば以下のものを含む非天然アミノ酸によっても生じうる：α*およびαジ置換*アミノ酸、N-アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、例えばトリフルオロチロシン*、p-Cl-フェニルアラニン*、p-Br-フェニルアラニン*、p-I-フェニルアラニン*、L-アリル-グリシン*、β-アラニン*、L-α-アミノ酪酸*、L-γ-アミノ酪酸*、L-α-アミノイソ酪酸*、L-ε-アミノカプロン酸#、7-アミノヘプタン酸*、L-メチオニンスルホナート#*、L-ノルロイシン*、L-ノルバリン*、p-ニトロ-L-フェニルアラニン*、L-ヒドロキシプロリン#、L-チオプロリン*、フェニルアラニン（Phe）のメチル誘導体、例えば4-メチル-Phe*、L-Phe(4-アミノ)#、L-Tyr(メチル)*、L-Phe(4-イソプロピル)*、L-Tic(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸)*、L-ジアミノプロピオン酸*およびL-Phe(4-ベンジル)*。記号*は、（相同または非相同置換に関する）前記考察の目的のために、該誘導体の疎水性を示すものとして用いられており、一方、#は、該誘導体の親水性を示すために用いられており、#*は、両親媒性を示す。
【０２１１】
変異体アミノ酸配列は、該配列の任意の2つのアミノ酸残基の間に挿入されうる適当なスペーサー基、例えば、アミノ酸スペーサー、例えばグリシンまたはβ-アラニン残基に加えて、アルキル基、例えばメチル、エチルまたはプロピル基を含みうる。変異のもう1つの形態は、ペプトイド形態の1以上のアミノ酸残基の存在を含み、これは当業者に十分に理解されるであろう。疑義を避けるために説明すると、「ペプトイド形態」は、α炭素置換基が該残基のα炭素ではなく窒素原子上に存在する変異アミノ酸残基を意味するものとして用いられている。ペプトイド形態におけるペプチドの製造方法は当技術分野で公知である（例えば、Simon RJら, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 およびHorwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134）。
【０２１２】
本発明で使用するヌクレオチド配列は、該配列内に合成または修飾ヌクレオチドを含みうる。オリゴヌクレオチドに対する多種多様なタイプの修飾が当技術分野で公知である。これらには、メチルホスファートおよびホスホロチオアートバックボーン、および／または該分子の3'および／または5'末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が含まれる。本発明の目的においては、核酸配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法により修飾されうると理解されるべきである。そのような修飾は、本発明において有用なヌクレオチド配列のin vivo活性または半減期を増加させるために行うことが可能である。
【０２１３】
本発明は、該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、断片もしくは誘導体の使用をも含みうる。該配列がその断片に相補的である場合には、その配列は、他の生物における類似ヌクレオチド配列を同定するためのプローブとして使用することが可能である。
【０２１４】
キット
本発明はまた、内皮細胞内で1以上のコード配列を発現させるためのキットに関する。  
特に、本発明は、内皮細胞内で1以上のコード配列を発現させるための本発明の1以上のベクターを含んでなるキットに関する。
【０２１５】
1つの実施形態においては、該キットは、1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のIRESエレメントを含む1以上のベクターを含み、該IRESエレメントは、内皮細胞内で該コード配列を発現する。
【０２１６】
もう1つの実施形態においては、該キットは、内皮細胞リガンドと、1以上のコード配列に機能しうる形で連結された1以上のIRESエレメントとを含む1以上のベクターを含み、該IRESエレメントは内皮細胞内で該コード配列を発現する。
【０２１７】
本発明はまた、本発明の方法において使用しうるキットを提供する。  
本発明のキットは、1以上の対照ベクターを含みうる。例えば、該キットは、内皮細胞内で発現されるIRESエレメント（例えば、HC-IRESエレメント）を含む陽性対照を含みうる。該キットはまた、内皮細胞内で発現されない又は僅かしか発現されないIRESエレメントを含む陰性対照を含みうる。
【０２１８】
本発明のキットは、内皮細胞内での1以上のコード配列の発現を検出するための手段（例えば、検出可能な基質、例えば蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物）をも含有しうる。
【０２１９】
一般的な組換えDNA法／技術
本発明は、特に示さない限り、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は文献中に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. FritschおよびT. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M.ら (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. CrabtreeおよびA. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons;  M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; ならびにD. M. J. LilleyおよびJ. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的テキストのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。
【０２２０】
つぎに、以下の実施例により本発明を更に詳しく説明することとする。これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのを助けるためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０２２１】
実施例
【実施例１】
【０２２２】
材料および方法
プラスミドの調製および遺伝子ターゲッティング
Lmo2遺伝子における相同組換えのためのプラスミドは、エキソン2内に突然変異した唯一のBamHI制限部位を有するpKO5tkを基にしたものであった（12）。HC-IRES-LacZ-MC1neopAカセットをpKO5tkのBamHI部位内に挿入することにより、HC-IRES-lacZ Lmo2ノックインターゲッティングクローンを調製した。まず、C型肝炎ウイルスからのIRES（18）（配列番号1および配列番号2）を含む400bpのBamHI断片を修飾pBSptベクター（pBspt-BGB4）のBglII-BamHI部位内にクローニングして、唯一のBamHI部位を有する前駆体pBSpt-HC-IRESを作製し、該BamHI部位内にlacZ遺伝子およびpMC1-neo-pAをクローニングした（19）。pEMC IRES内へのlacZ遺伝子断片の挿入およびpMC1neo-pAの付加により、EMC-IRES Lmo2ノックインターゲッティングクローンを調製し、このカセットをpKO5tk内にクローニングした。lacZとLmo2遺伝子のエキソン2とのインフレーム融合体、ならびに標的化（targeted）対立遺伝子の生殖細胞系マウス保持体の作製および特徴づけは既に記載されている（20）。
【０２２３】
遺伝子標的化マウスの作製および分析
ES細胞（CCB）をトランスフェクトし、記載（12）されているとおりにG418耐性およびガンシクロビル感受性に関して選択し、2つの外的プローブAおよびB（図1A）を使用する標的化クローンをサザンフィルターハイブリダイゼーションにより特徴づけした。標的化クローンをC57Bl6胚盤胞内に注入し、キメラマウスを作製し、それより、雄キメラをC57Bl6雌と交配させることにより生殖細胞系伝達を得た。3つのLmo2ノックイン対立遺伝子の1つを保持するヘテロ接合マウスと野生型C57Bl6マウスとの間で、時限（timed）交配を準備した。適当な時点で、妊娠した雌を安楽死させ、胚を摘出し、X-galでホールマウント染色してβガラクトシダーゼを検出した（記載（10）されているとおりに行った）。ロウ包埋の後、固定後胚（10％ ホルマリン）を切片化した。4μM切片を顕微鏡スライド上にマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。既に記載（21）されているとおりにアビジン-ビオチン共役ペルオキシダーゼ法によりMEC13.3抗CD31抗体（Pharmingen）を使用して、内皮細胞マーカーPECAM（CD31）の検出を行った。
【０２２４】
腫瘍内皮細胞分析
ルイス（Lewis）肺癌細胞をLmo2ノックインマウス系統またはC57Bl6対照のそれぞれからのマウスの両方のフラスコ内に注入した（〜106細胞/部位）。原発部位固形腫瘍が約1cmのサイズに達したら、レシピエントマウスを安楽死させ、腫瘍を切除し、胚の場合と同様にしてホールマウントX-gal染色を行った。10％ ホルマリン中で固定した後、ロウ包埋標本から切片を調製し、4μM切片をマウントし、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。
【実施例２】
【０２２５】
胚発生中の血管内皮におけるHC-IRESの効率
肺発生中の血管内皮細胞内のタンパク質合成をC型肝炎ウイルスIRESエレメント（HC-IRES）およびEMCウイルスIRESが促進する能力を調べた。Lmo2遺伝子は内皮において発現され、胚発生（9）および腫瘍増殖（10）における内皮の出芽に必要である。本発明者らは、in vivoにおいて内皮細胞内でビシストロンmRNA種を発現させるための試験状況としてこの遺伝子を選択した。なぜなら、マウスLmo2遺伝子は胚性幹細胞（ES）における遺伝子ターゲッティングを受けやすいからである（12）。mRNAにおけるIRESエレメントからのlacZの発現が制御される2つの系統のマウスを作製している（すなわち、C型肝炎ウイルスIRESまたは脳心筋炎ウイルスIRES（それぞれHC-IRESおよびEMC-IRES系統；図1A））。また、lacZ遺伝子とLmo2との間でインフレーム融合体が生じているLmo2-lacZマウス系統（9）を比較した。それらの3つの系統に対して時限（timed）交配を確立し、胚日数E9.5、10.5および12.5において、βガラクトシダーゼ活性を検出するために、胚をXgalでホールマウント染色した（図1B）。既に報告されているとおり（9）、Lmo2-lacZ胚の、発生中の血管は、βガラクトシダーゼレポーターにより容易に検出されうるLmo2遺伝子を発現する。野生型胚同腹きょうだいにおいてはβガラクトシダーゼ活性は検出されなかった（図1B）。発生中のLmo2-lacZ胚においては、血管を発生している全身に広く見出される血管内でβガラクトシダーゼは広く発現されており、これは、E10.5の胚の組織学的切片においてCD31抗体で検出された全（pan）内皮マーカーPECAM/CD31の発現と符合した（図2、最上パネル）。
【０２２６】
Lmo2-HC-IRES-lacZ遺伝子を有するノックインマウス系統におけるβガラクトシダーゼレポーター発現のレベルは、Lmo2内への直接的なlacZ遺伝子ノックインより低かったが（図1B）、EMC-lacZマウスの血管内皮細胞における検出可能なβガラクトシダーゼは非常に低く、実際には、胚日数E10.5においては実質的に検出不能であった（図1Bおよび2）。このことは、EMCウイルスIRESがin vivoでの内皮発現には不適当であることを示唆している。一方、C型肝炎ウイルスIRESは、容易に検出可能なレベルのβガラクトシダーゼ活性を示した。胚日数E12.5までに、顕著なレベルの内皮発現が生じ、このことは、HC-IRESがマウス胚の内皮細胞のタンパク質合成装置により効率的に使用されうることを示している。
【実施例３】
【０２２７】
HC-IRESは腫瘍血管新生における内皮タンパク質合成を媒介する
血管新生は癌療法の標的であり（4, 13, 14）、これは、これらの特定の細胞への抗内皮剤の標的化を要する。宿主からの既存血管の出芽により血管化する腫瘍移植片の増殖を裏付けるためにlacZノックインマウス系統を使用して、腫瘍血管におけるHC-IRESの効力を試験した。ルイス（Lewis）肺癌細胞をLmo2-lacZおよびHC-IRESマウス（およびC57Bl6野生型対照）に皮下注射し、固形腫瘍を注射部位にin situで発生させた。これらの腫瘍の血管化はレシピエントマウスによりもたらされるため、血管内皮は、Lmo2に基づくLacZレポーターを発現すると予想された（図3A）。単離された腫瘍をXgalで染色し、組織学的切片化を行って、内皮発現を調べることにより、これを分析した。図3Bは、3種類のマウスのXgal染色腫瘍から調製した切片の比較を示し、Lmo2-lacZおよびHC-IRES移植腫瘍が、この状況において、比較しうるレベルのβガラクトシダーゼ活性を有していたことを示している。したがって、HC-IRESは、腫瘍の血管系の発生において、有意な活性を有する。
【０２２８】
考察
多数の重要な臨床適応症においては、血管新生が、重要な結果となる。迅速に分裂している細胞に、十分な酸素およびCO2交換を供給するために、悪性腫瘍の周囲には血管新生が生じる（14）。慢性炎症疾患、例えば慢性関節リウマチにおいては、持続的炎症が、血管に富む顆粒組織の形成を滑膜内に引き起こす（1）。したがって、これらの状況においては、血管リモデリングおよび血管新生を妨げることが潜在的な治療アプローチとなる（2, 4, 13）。治療のために標的内皮細胞内にタンパク質を導入する手段として遺伝子送達が予想される状況においては、HC-IRESエレメントは非常に貴重であると判明しうるであろう。抗血管新生療法においては、ウイルスまたは他の発現ベクターは、2つの異なる細胞内標的に対する治療用タンパク質（例えば、細胞内抗体フラグメント（15））をコードし、所望の治療効果に有効性を付加しうるであろう。あるいは、固形腫瘍の治療においては、異なる方法（例えば、細胞内抗体フラグメントおよびペプチドアプタマーの使用（16））で標的タンパク質の機能を妨げるための2つの阻止剤をコードするベクターの導入により、血管新生の内部タンパク質標的（例えば、LMO2（10））が捕らえられうるであろう。特定の細胞へのin vivoでのベクターの送達方法は、より有効になりつつあり、内皮細胞へのベクターの送達のための特異的方法が報告されている（17）。これらの送達方法を、特異的標的の機能を妨げうる2以上のタンパク質を効率的に発現する能力と組合せることは、抗血管新生療法に対する可能なアプローチである。
【０２２９】
本明細書中に記載の全ての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神からの逸脱を伴わない、本発明の記載されている方法および系の種々の修飾および変更が当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して説明されているが、特許請求されている本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されている形態の種々の修飾が、特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０２３０】
参考文献
1.  Carmeliet, P.およびJain, R. K. (2000) Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature, 407, 249-257.
2.  Folkman, J. (2001) Angiogenesis-dependent diseases. Semin Oncol, 28, 536-540.
3.  Chang, Y. S., Di Tomaso, E., McDonald, D. M., Jones, R., Jain, R.およびMunn, L. L. (2000) Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 97, 14608-14613.
4.  Kerbel, R.およびFolkman, J. (2002) Clinical translation of angiogenesis inhibitors. Nat Rev Cancer, 2, 727-739.
5.  Einfeld, D. A.およびRoelvink, P. W. (2002) Advances towards targetable adenovirus vectors for gene therapy. Curr Opin Mol Ther, 4, 444-451.
6.  Allen, T. M. (2002) Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy. Nat Rev Cancer, 2, 750-783.
7.  Creancier, L., Morello, D., Mercier, P.およびPrats, A. C. (2000) Fibroblast growth factor 2 internal ribosome entry site (IRES) activity ex vivo and in transgenic mice reveals a stringent tissue-specific regulation. J Cell Biol., 150, 275-281.
8.  Creancier, L., Mercier, P., Prats, A. C.およびMorello, D. (2001) c-myc Internal ribosome entry site activity is developmentally controlled and subjected to a strong translational repression in adult transgenic mice. Mol Cell Biol, 21, 1833-1840.
9.  Yamada, Y., Pannell, R.およびRabbitts, T. H. (2000) The oncogenic LIM-only transcription factor Lmo2 regulates angiogenesis but not vasculogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 320-324.
10.  Yamada, Y., Pannell, R., Forster, A.およびRabbitts, T. H. (2002) The LIM-domain protein Lmo2 is a key regulator of tumour anogiogenesis: a new anti-angiogenesis drug target. Oncogene, 21, 1309-1315.
11.  Garton, K. J., Ferri, N.およびRaines, E. W. (2002) Efficient expression of exogenous genes in primary vascular cells using IRES-based retroviral vectors. Biotechniques, 32, 830-834.
12.  Warren, A. J., Colledge, W. H., Carlton, M. B. L., Evans, M. J., Smith, A. J. H.およびRabbitts, T. H. (1994) The oncogenic cysteine-rich LIM domain protein rbtn2 is essential for erythroid development. Cell, 78, 45-58.
13.  Folkman, J. (1971) Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N.Eng.J. Med., 285, 1182-1186.
14.  Hanahan, D.およびFolkman, J. (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell, 86, 353-364.
15.  Cattaneo, A.およびBiocca, S. (1999) The selection of intracellular antibodies. Trends Biotechnol, 17(3), 115-21.
16.  Colas, P., Cohen, B., Jessen, T., Grishina, I., McCoy, J.およびBrent, R. (1996) Genetic selection of peptide aptamers that recognise and inhibit cyclin-dependent kinase 2. Nature, 380, 548-550.
17.  Hood, J. D., Bednarski, M., Frausto, R., Guccione, S., Reisfeld, R. A., Xiang, R.およびCheresh, D. A. (2002) Tumor regression by targeted gene delivery to the neovasculature. Science, 296, 2404-2407.
18.  Gallego, J.およびVarani, G. (2002) The hepatitis C virus internal ribosome-entry site: a new target for antiviral research. Biochem Soc Trans, 30, 140-146.
19.  Thomas, K. R.およびCapecchi, M. R. (1987) Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell, 51, 503-512.
20.  Yamada, Y., Pannell, R., Forster, A.およびRabbitts, T. H. (2000) The oncogenic LIM-only transcription factor Lmo2 regulates angiogenesis but not vasculogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 320-324.
21.  Taniere, P., Martel-Planche, G., Maurici, D., Lombard-Bohas, C., Scoazec, J.-Y., Montesano, R., Berger, F.およびHainaut, P. (2001) Molecular and Clinical Differences between Adenocarcinomas of the Esophagus and of the Gastric Cardia. Am. J. Pathol., 158, 33-40.
【０２３１】
配列
配列番号1
HC-IRES BamHI断片のヌクレオチド配列
ggatccggcgacactccaccatgaatcactcccctgtgaggaactactgtcttcacgcagaaagcgtctagccatggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagcgccatagtggtctgcggaaccggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttgataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaaggccttgtggtactgcctgatagggtgcttgcgantgccccgggaggtctcgtanaccgtgcaccatgagcacgaatctggatcc
配列番号2
HC-IRES BamHI断片のアミノ酸配列
GSGDTPPITPLGTTVFTQKASSHGVSMSVVQPPGPPLPGAPWSAEPVSTPELPGRPGPFLDKPAQCLEIWACPRKTASRVVLGRERPCGTAGACXCPGRSRXPCTMSTNPGS
【図面の簡単な説明】
【０２３２】
【図１】マウス胚血管内皮におけるIRESエレメントの活性。（A）相同組換えのための構築物。最上部の棒線：マウスLmo2遺伝子の部分制限地図は、相同組換えを検出するために使用する2つのプローブ（AおよびB）と共に、Lmo2エキソン2および3の位置を示している（10）。中央の棒線は、Lmo2内への外因性エレメントのクローニングを促進するためにエキソン2内に導入されたBamHI制限部位を有する標的化ベクターpKO5tk（10）の地図を示す。最下部の棒線は、Lmo2-lacZ（Lmo2の5'末端とのインフレーム融合体）（20）、HC-IRESおよびEMC-IRESに関する、エキソン2 BamHI部位内にクローニングされたlacZ遺伝子挿入の地図を示す。（B）マウス胚発生中のde novo毛細血管形成（血管形成）および内皮リモデリング（血管新生）におけるLmo2遺伝子からのβガラクトシダーゼの発現を示す胚期E9.5、E10.5およびE12.5におけるマウス胚のホールマウントX-gal染色。Wt＝野生型C57Bl6.
【図２】Lmo2 lacZノックインE10.5胚の組織学は、βガラクトシダーゼと全（pan）内皮マーカーCD31との共発現を示している。E10.5胚標本をX-galでホールマウント染色し（図2）、切片化し（4μM）、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。抗CD31抗体およびペルオキシダーゼを使用して、連続切片においてCD31タンパク質の発現を検出した。モンタージュは、Xgalのみで染色された（左）またはXgalと抗CD31とで共染色された（右）示されている各Lmo2ノックインマウス系統または野生型（wt）対照からの胚切片を示している。矢じりは、血管壁を裏打ちする内皮細胞を示す。
【図３】ルイス（Lewis）肺固形腫瘍におけるC型肝炎IRESからのβガラクトシダーゼの発現。ルイス肺癌細胞をLmo2 HC-IRESノックインマウス系統およびLmo2-lacZまたは野生型（wt）対照の皮下に移植した。（A）レシピエントマウスにおいて増殖する腫瘍の血管系は後者から生じる。したがって、内皮細胞はレシピエントのLmo2-レポーターを発現しているであろう。Lmo2-lacZおよびHC-IRESマウス系統の場合には、Xgal基質を使用してβガラクトシダーゼの発現を検出する。（B）腫瘍増殖後、固形腫瘍をX-galでホールマウント染色し、4μM切片を作製して、レシピエントマウスからの既存内皮の出芽により形成する腫瘍血管内皮の検査を行った。矢じりは、血管壁を裏打ちする内皮細胞を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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