(57)【要約】細胞を含むサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染を増強するための組成物は、該サンプル中の特異的結合部位および非特異的結合部位に結合し得る第一蛍光色素を含有する。この第一色素は、第一波長で蛍光を放射する。該組成物は、少なくとも更なる成分を含有し、これは、該組成物中、該非特異的結合部位への結合について該第一色素と拮抗する第二非インターカレーティング色素、または該細胞への該色素の浸透を増強するための浸透化剤、あるいは両方である。該第二色素と該第一色素のモル比は、少なくとも約２０：１である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含むサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染を増強するための組成物であって、以下：
該サンプル中の特異的結合部位および非特異的結合部位に結合し得る第一蛍光色素（該第一色素は、第一波長で蛍光を放射する）；ならびに
以下からなる群から選択される成分の少なくとも１つ
（ａ）該非特異的結合部位への結合について該第一色素と拮抗する第二非インターカレーティング色素（ここで、該第二色素と該第一色素のモル比は、少なくとも約２０：１である）；および
（ｂ）該細胞への該色素の浸透を増強するための浸透化剤
を含む、組成物。
【請求項２】
前記第一色素が異染性色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記異染性色素が、アクリジンオレンジ色素、ノニルアクリジンオレンジ色素、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ色素、トルイジンブルー色素、ＳＹＴＯＴＭ色素、ＴＯＴＯＴＭ色素、ＹＯＹＯＴＭ色素、およびＢＯＢＯＴＭ色素からなる群から選択される色素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記異染性色素が細胞浸透性である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記異染性色素が細胞非浸透性色素であり、そして前記組成物が前記細胞浸透化剤を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記異染性色素がインターカレーティング色素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記インターカレーティング色素が、ヨウ化プロピジウムまたはＴｈｉａｚｏｌｅ  ＯｒａｎｇｅＴＭ色素である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記異染性色素が非インターカレーティング色素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記第一色素が非異染性色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第一色素が細胞浸透性色素である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第一色素が細胞非浸透性色素であり、前記組成物が前記浸透化剤を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記非異染性色素が、Ｎｅｕｔｒａｌ  ＲｅｄＴＭ色素、Ｂａｓｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ２１ＴＭ色素、ＤｉＯＣＴＭ色素、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記第二色素を含み、ここで該第二色素が蛍光色素である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記第二蛍光色素が、前記第一波長と異なる波長で蛍光を発する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第二色素を含み、ここで、該第二色素が、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ＴＭ色素、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３４５８０色素、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＴＭ色素、４’，６−ビス−［２−イミダゾオキソリニル−４Ｈ，５Ｈ］−２−フェニル−インドール、ＰｅｎｔｏｘｉｐｈｉｌｌｉｎｅＴＭ色素、ＰｈｌｏｘｉｎｅＴＭＢ色素、ＥｏｓｉｎＴＭＹ色素、ＱｕｉｎａｃｒｉｎｅＴＭ色素、ＯｒｃｅｉｎＴＭ色素、ビス−ベンズイミド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第二色素を含み、ここで、前記第二色素と前記第一色素のモル比が約２０：１〜約５００：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第二色素を含み、ここで、前記第二色素と前記第一色素のモル比が約５０：１〜約３００：１である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記第二色素と前記第一色素のモル比が約１００：１である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記第二色素を含み、そして更に第三色素を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記浸透化剤を含み、ここで該浸透化剤がスフェリング剤（sphering agent）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第一色素および前記浸透化剤を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項２２】
更に溶媒を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記サンプル中の前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記細胞が、赤血球、白血球、網状赤血球、芽細胞、有核赤血球（nucleated red blood cells）、好塩基球、肥満細胞、好中球、リンパ球、単球、好酸球、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第一色素および第二色素を含み、ここで該第一色素がアクリジンオレンジ色素であり、そして該第二色素がＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８ブロッキング剤およびＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３３４２ブロッキング剤からなる群から選択され、ここで前記モル比が約１００：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
更に前記浸透化剤を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
アクリジンオレンジ色素またはＴＯＴＯＴＭ色素である前記第一色素、および前記浸透化剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
細胞を含むサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染を増強するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該サンプルと請求項１〜２７のいずれかの組成物とを接触させる工程；および
（ｂ）該サンプルを分析して、該サンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の発現差異を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
更に、接触工程（ａ）の前に、前記組成物中の色素の浸透のために前記細胞を浸透化させる工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が網状赤血球、芽細胞、および有核赤血球からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、赤血球、白血球、網状赤血球、芽細胞、有核赤血球（nucleated red blood cells）、好塩基球、肥満細胞、好中球、リンパ球、単球、好酸球、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
細胞を含むサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染を増強するための診断キットであって、以下：
該サンプル中の特異的結合部位および非特異的結合部位に結合し得る第一蛍光色素（該第一色素は、第一波長で蛍光を放射する）；ならびに
以下からなる群から選択される成分の少なくとも１つの成分
（ａ）該非特異的結合部位への結合について該第一色素と拮抗する第二非インターカレーティング色素（ここで、該第二色素と該第一色素のモル比は、少なくとも約２０：１である）；および
（ｂ）該細胞への該色素の浸透を増強するための浸透化剤
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
いくつかの特徴は、診断および研究目的のために、細胞タイプによる、種々の供給源から得られる異なる細胞の同定および識別を可能にする。このような特徴としては、中でも、細胞のサイズ、細胞の前方光散乱特性（forward light scattering properties）、細胞の９０°光散乱、細胞中に含まれる好酸性または好塩基性顆粒の数およびタイプ、細胞中に含まれるＲＮＡ量、細胞の核クロマチンの濃縮、細胞の核に対する細胞質の比、細胞の核小体の物理的外観、および細胞中に含まれるミトコンドリア数が挙げられる。
【０００２】
細胞（特に、全血中に見られる細胞）を識別するための蛍光色素の伝統的な使用は、通常、細胞の核またはＤＮＡを染色することと関連している。多くの細胞は、同量のＤＮＡを有し、そしてこのような細胞が蛍光色素を使用して染色されると、各細胞中のＤＮＡは同様に染色される。従って、異なる血液細胞（例えば、中でも、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、および有核赤血球（nucleated red blood cells）が挙げられる）を識別することは、不可能でないとしても、困難である。
【０００３】
細胞を分析するために使用されている数種の蛍光色素があり、そして異染性色素が挙げられる。異染性色素（metachromatic dyes）は、化合物または細胞が色素を結合する様式に依存してシフトする励起（excitation）および発光（emission）波長を有する。例えば、異染性色素は、それがＲＮＡを結合する場合に１つの波長を、そしてそれがＤＮＡを結合する場合には別の波長を、発光し得る。１つの一般的な異染性色素は、アクリジンオレンジ色素（Acridine Orange dye；ＡＯ）であり、これは、二本鎖ＤＮＡへ結合される場合、５０２ｎｍの吸収最大値および５２０〜５２４ｎｍの発光最大値を有する。ＡＯが一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡへ結合される場合、それは、５２６〜５５８ｎｍの吸収最大値および６３０〜６４４ｎｍの発光最大値を有する。ＡＯはまたリソソーム顆粒中に蓄積し得、ここでそれは約６３０ｎｍの発光波長を有する。ＡＯはまた、血小板のアルファ顆粒および肥満細胞の顆粒中に蓄積することが知られている。異染性色素を使用しての細胞同定における波長差異の分離および同定が観察された（Melamed et al. 1972 Amer. J. Clin. Path., 57; 95-102）。特に、有核細胞（nucleated cells）において、赤色波長での有核細胞の異染性染色を分解する能力は減少したかまたは失われた（即ち、５２０〜５２４ｎｍ発光最大値は、ＲＮＡまたは顆粒のより弱い赤色蛍光へとオーバーラップした）。これらの著者は、このことが、大量のＤＮＡ染色、それから得られた強い蛍光、および得られたブロードな発光スペクトルに起因すると仮説を立てた。網状赤血球について、弱いＲＮＡ染色が、細胞材料への色素の非特異的な相互作用および蛍光に重ねられた。
【０００４】
アクリジンオレンジ異染性色素はまた、赤色蛍光および前方散乱を使用して網状赤血球を検出し、細胞とノイズを識別し、そして血小板と網状赤血球および赤血球とを区別するために使用された。米国特許第4,325,706号を参照のこと。
【０００５】
ＡＯを含む色素を使用することにおける困難性は、当業者によって知られている。”Flow Cytometry and Cell Sorting” Acridine Orange: A Versatile Probe of Nucleic Acids and Other Cell Constituents; 2nd Ed., Wiley-Liss, Inc.: pages 291-314 (1990) を参照のこと。特に、異染性色素（例えば、ＡＯ）は、それらの染色において単純な質量作用の法則に従わないことが知られている。該色素は、しばしば、標的材料へ結合する際に、相転移（濃縮または沈降）を引き起こす。更に、このような色素は、再現性を得るために、色素濃度、遊離色素濃度（free dye concentration）、細胞濃度、ｐＨ、時間、および温度の正確な制御を必要とする。正確な制御は、ルーチンの適用を得るには困難または不可能である。
【０００６】
ＡＯを使用する平衡染色法（Equilibrium staining methods）は、ＤＮＡ／ＲＮＡ含有量測定のために使用されてきたが、インタクトな細胞へ適用することが困難であること、および細胞表面構造の実証のための蛍光性抗体またはリガンドとの使用が非実用的であることが注意される。従って、他の人は、他の色素の組合せ、例えば、２：１〜１：１比のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびピロニンＹ（即ち、ＡＯのキサチンアナログ）、ならびに５：１比のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびＡＯに頼って、デュアルソースフローサイトメーター（dual source flow cytometer）を用いてＤＮＡ／ＲＮＡ含有量についてインタクトな細胞を染色している（H. M. Shapiro, 1981 Cytometry, 2(3): 143-150）。しかし、報告されるところでは、該ＡＯ組合せで不安定な結果が得られた。これらの著者は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２／ピロニンＹ組合せを用いて、ＤＮＡ含有量の正確な見積もりおよびＲＮＡ含有量の先入観を伴う見積もりを報告した。
【０００７】
有効な細胞同定のための分染蛍光色素および／またはその組合せに好適な色素および色素組合せについての必要性が、当該分野において存在している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
１つの局面において、本発明は、細胞を含有するサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染（differential staining）を増強するための組成物を提供する。該組成物は、該サンプル中の特異的結合部位および非特異的結合部位の両方に結合しそして第一波長で蛍光を放射する第一蛍光色素（first fluorescent dye）を含む。１つの実施形態において、該組成物は、更に、該非特異的結合部位への結合について該第一色素と拮抗する第二非インターカレーティング色素（second non-intercalating dye）を含む。更なる成分、浸透化剤（permeabilizing agent）が、サンプル中の細胞への第一色素の浸透を増強させるために、該組成物中に含まれ得る。いくつかの実施形態において、第二色素と第一色素のモル比は、少なくとも約２０：１である。別の実施形態において、該組成物は、本明細書中で記載されるような第一色素、第二色素および浸透化試薬を含有する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、細胞を含むサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染を増強するための方法を提供する。この方法は、該サンプルと本明細書中に記載される色素組成物とを接触させること、および該サンプルを分析して、該サンプル中の核酸および顆粒の発現差異（differential expression）を検出することを包含する。
【００１０】
本発明の他の局面および利益は、以下のその好ましい実施形態の詳細な説明において更に記載される。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞含有サンプル中の核酸および顆粒の分染を増強する色素組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、好ましくは、当該分野において公知のフローサイトメトリーまたはヘマトロジー装置を使用しての血液細胞の識別に使用される。本発明のこれら組成物および方法は、サンプルの細胞間の分析および識別を可能にし、そして、本発明が蛍光色素の非特異的相互作用を軽減または排除する点で、当該分野において使用される色素および方法に対して利点を提供する。本発明は、細胞中への色素組成物の迅速な取り込み（rapid uptake）を可能にする。本発明の他の利点としては、非限定的に、未成熟および成熟赤血球の改善された光散乱および蛍光分解能（fluorescent resolution）（これは、一貫した自動分析のための正確なアルゴリズムの定式化の能力を増強する）、核酸と色素との反応の速度論における増加、インキュベーション時間の短縮、および非特異的結合を除去するために先行技術において実施された追加の洗浄工程の排除が挙げられる。
【００１２】
Ｉ．本発明の組成物
本発明の組成物は、サンプル中の特異的結合部位および非特異的結合部位に結合し得る第一蛍光色素（一次色素）を含有する。第一色素は、第一の所定の波長で蛍光を放射する。この組成物は、細胞の選択される成分［非限定的に、中でも、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、好酸性顆粒、好塩基性顆粒、赤血球インクルージョン、および／または細胞内寄生生物（例えば、ウイルスが挙げられる）が挙げられる］を特異的にまたは優先的に染色する該一次色素に加えて、他の蛍光色素を含有し得る。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、非特異的結合部位へ結合することについて該第一色素と拮抗する、第二非−インターカレーティング色素（second non-intercalating dye）またはブロッキング剤（blocking agent）を含む。ブロッキング剤は、一次色素の非特異的相互作用を最小化または排除する。より詳細には、本発明者は、少なくとも２０：１のモル比という該組成物において過剰量のブロッキング剤を使用することによって、該ブロッキング剤が、該弱い結合部位（the weak binding sites）について一次色素と拮抗することを発見した。この過剰量で提供される場合、低い結合親和性の非特異的結合部位よりも優先的に細胞中のその高い親和性結合部位への一次色素の結合が、増加される。一次色素の結合の選択性のこの増加は、従って、特異的結合部位を有する細胞と、一次色素について非特異的結合部位を有する細胞との識別を増加させる。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法におけるブロッキング試薬と一次色素の比は、少なくとも５０：１である。別の実施形態において、本発明の組成物および方法におけるブロッキング試薬と一次色素の比は、少なくとも１００：１である。なお別の有用な実施形態において、本発明の組成物および方法におけるブロッキング試薬と一次色素の比は、少なくとも１５０：１である。なお別の有用な実施形態において、本発明の組成物および方法におけるブロッキング試薬と一次色素の比は、少なくとも３００：１である。なお別の有用な実施形態において、本発明の組成物および方法におけるブロッキング試薬と一次色素の比は、少なくとも５００：１である。全ての比は、特に示されない限り、モルである。
【００１４】
別の実施形態において、該組成物は、第一および第二色素と浸透化剤（permeabilizing agent）とを組み合わせる。細胞浸透性第一色素を使用するいくつかの実施形態において、浸透化剤は、識別を増加させるために、第二色素の非存在下においてでさえ使用され得る。いずれかの実施形態において、浸透化剤、例えばスフェリング剤（sphering agent）は、細胞への一次色素および／またはブロッキング試薬の浸透化を増強させる。
【００１５】
Ａ．第一色素成分
本発明によれば、好ましくは、本発明において使用される一次色素は、蛍光色素である。１つの実施形態において、該蛍光色素は、本質的に、非結合状態（unbound state）で非蛍光性であり、従って、最小のバックグラウンド蛍光を提供する。一次色素は、好ましくは、細胞上の特異的または非特異的結合部位または標的へ結合する際に、所定の波長で蛍光を放射する。本発明に有用な任意の更なるまたは“第二”一次色素は、好ましくは比色的または視覚的手段によって、鑑別的に識別可能である、非蛍光性色素から選択され得る。“第二”一次色素は、選択される分析における細胞タイプおよび成分識別を改善するその能力のために選択され得る。本発明において使用される一次色素は、高い特異性で、細胞および／または選択される細胞性成分を検出する。
【００１６】
照射されると、一次色素が、該組成物中の包含について選択される他の色素およびブロッキング試薬の波長とは異なる波長で発光する（即ち、蛍光を発する、または励起される）ことが望ましい。好ましくは、検出のために選択される波長で、他の色素またはブロッキング剤と一次色素の蛍光の間で重なりが存在しない。当該分野において利用可能な方法および情報を使用して、当業者は、どの色素が重なる波長で蛍光を発するかを容易に決定することができる。The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 6thEd., R.P. Haugland, Molecular Probes, Eugene, ORを参照のこと。各々が蛍光性であるかもしれないまたは蛍光性でないかもしれない、２またはそれ以上の一次色素を含有する組成物の場合でさえ、そうである。蛍光性である唯一の一次色素を含有する１つの実施形態において、該一次色素は、５００ナノメートル超、そしてより好ましくは、５２０超〜６３０ｎｍの波長で蛍光を発する。しかし、他の好適な波長で蛍光を発する色素が、容易に選択され得る。１またはそれ以上の一次色素を使用する組成物または方法において、追加の色素は、第一の一次色素のものとは異なる波長で蛍光を発する。
【００１７】
１つの実施形態において、選択される一次色素は、異染性色素である。語句“異染性色素”によって、細胞または細胞成分へ結合されると、その発光スペクトルにおいて２またはそれ以上のピークを含む蛍光色素を記載することが意味される。典型的に、異染性色素は、細胞の異なるタイプ（即ち、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または他の細胞成分）へ結合されると、異なる波長で蛍光を発する。例えば、本発明に従って使用される１つの異染性色素は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡへ結合されると、異なる波長で蛍光を発する。
【００１８】
種々の異染性色素が当該分野において知られており、そしてこれらとしては、非限定的に、中でも、キサンテン色素、カルボシアニン色素、ポリメチン色素、例えば、Ａｓｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＦＲ、チオファルビンＴ（thiofalvine T）、シュードイソシアニン（psuedoisocyanine）、オキサカルボシアニン色素、アクリジン色素、アジン色素、ジフェニルメタン色素、メチン色素、オキサジン色素、シアニン色素、およびスチリル色素が挙げられる。例えば、Urban et al., 2000 Acta. Histochem. 102:259-272に記載の異染性色素を参照のこと。本発明の１実施形態における使用のために好ましい異染性色素は、アクリジンオレンジ色素（Acridine Orange dye）（“ＡＯ”、Polysciences, Warrington, PA）である。本発明において有用である更に他の異染性色素としては、中でも、ノニルアクリジンオレンジ色素（３，６−ビス−（ジメチルアミノ）−１０−ノニルアクリジニウムブロミド、Molecular Probes, Eugene, OR）；Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ色素（また、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｂとして市販、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、トルイジンブルー色素（２−アミノ−７−ジメチルアミノ−３−メチルフェノチアジニウムクロリド、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ヒドロキシスチルバミジン（hydrosystilbamidine）（Molecular Probes, Eugene, OR）およびシアニン色素、例えば、ＳＹＴＯＴＭ色素（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＴＯＴＯＴＭ色素（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＹＯＹＯＴＭ色素（Molecular Probes, Eugene, OR）、ＢＯＢＯＴＭ色素（Molecular Probes, Eugene, OR）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。より好ましくは、異染性色素はアクリジンオレンジ色素である。
【００１９】
更なる実施形態において、一次色素は、非異染性色素である。用語“非異染性色素”によって、所定の波長で照射された場合、単一の波長の励起および／または発光を提供する蛍光色素を記載することが意味される。このような色素は、複数の細胞タイプを識別するための方法において、あるいはサンプルの分析を妨げる異染性波長を有する第二の蛍光色素または抗体が存在する状況において、有用である。このような色素は、好酸性顆粒、好塩基性顆粒を含む細胞の細胞性成分、および細胞の細胞膜を染色することにおいて有効である。このような色素は、特に、細胞の好酸性顆粒、細胞の好塩基性顆粒および細胞膜の少なくとも１つのメンバーを染色するための組成物において“第二”一次色素として有用である。
【００２０】
非異染性色素の例としては、非限定的に、中でも、Ｎｅｕｔｒａｌ  ＲｅｄＴＭ色素（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジンヒドロクロリド、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、Ｂａｓｉｃ  ＯｒａｎｇｅＴＭ２１色素（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ＤｉＯＣ色素（１，１’−ジメチルオキサカルボシアニン、Molecular Probes, Eugene, OR）、ＰｙｒｏｎｉｎＴＭＹ色素（Polysciences, Inc., Warrington, PA）、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ＢｌｕｅＴＭ色素（３−ビス−（ジメチルアミノ）−フェノチアジン−５−イウムクロリド、Molecular Probes, Eugene, OR）、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ色素（４，４’−（イミドカルボニル）−ビス−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）モノヒドロクロリド、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ＬＤＳＴＭ７５１色素（キノリニウム、６−（ジメチルアミノ）−２−［４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］−１，３−ブタジエニル］−２−エチルペルクロレート、Molecular Probes, Eugene, OR）、Ｒｅｄシリーズ色素、ならびにそれらの組合せが挙げられる。例えば、種々のＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒカタログ；The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 6thEd., R.P. Haugland, Molecular Probes, Eugene, ORを参照のこと。ある状況下では異染性でありそして他では非異染性であり得る色素が存在することに注意されるべきである。当業者は、容易に、ここに含まれる更なる技術を考慮して、本組成物および方法における使用のために好適な色素を選択する。
【００２１】
本発明の方法および組成物における一次色素または更なる一次色素としての使用のために好適な更に他の色素としては、非限定的に、中でも、臭化エチジウム（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ヨウ化プロピジウム（３，８−ジアミノ−５−（３−ジエチルアミノプロピル）−６−フェニル−フェナントリジニウムヨージドメチオジド、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ヨウ化ヘキシジウム（hexidium iodide）（Molecular Probes, Eugene, OR）、ジヒドロエチジウム（Molecular Probes, Eugene, OR）、エチジウムモノアジド（Molecular Probes, Eugene, OR）、Ｔｈｉａｚｏｌｅ  ＯｒａｎｇｅＴＭ色素（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。上記で引用したShapiroらを参照のこと。
【００２２】
本組成物または方法の異染性または非異染性一次色素は、細胞浸透性色素または細胞非浸透性一次色素のいずれかであり得る。用語“細胞浸透性”によって、浸透化剤の更なる存在を要求することなしに容易に細胞壁を透過しそしてその成分を染色する色素を記載することが意味される。典型的に、細胞浸透性色素は、溶解していない細胞の成分または生存している細胞を染色するために使用される。好ましくは、細胞浸透性色素は、全血を含むサンプルを分析するために使用される。従って、本発明の組成物および方法において、一次色素が細胞浸透性である場合、該組成物または方法は、必要に応じて、色素に対する細胞の浸透性を増強させるために細胞浸透化剤を使用し得る。しかし、本発明の組成物および方法において、一次色素が細胞非浸透性（cell impermeant）である場合、該組成物または方法は、該非浸透性色素が細胞壁に侵入して入りそしてその中のその標的に結合することを可能にするために、細胞浸透化剤を使用する。
【００２３】
なお更なる実施形態において、一次色素は、インターカレーティング色素（intercalating dyes）中から選択され得る。ここおよび本明細書に渡って使用される場合、語句“インターカレーティング色素”は、核酸分子間にインターカレート（intercalate）する色素を記載することが意味される。インターカレーティング色素は、ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖ＤＮＡの核酸分子間にインターカレートし得る。好ましくは、インターカレーティング色素の分子立体配置は平面である。あるいは、一次色素は、非インターカレーティング色素（non-intercalating dye）であり得る。例として、インターカレーティング一次色素としては、ヨウ化プロピジウムまたはチアゾールオレンジ色素が挙げられる。本発明のなお別の実施形態は、インターカレーティングである一次色素およびインターカレーティングでない第二の一次色素を使用する。
【００２４】
Ｂ．第二色素またはブロッキング剤
本発明の組成物は、更に、細胞中の非特異的結合部位への結合について一次色素と拮抗する、非インターカレーティング色素または試薬を含む。従って、この成分は、一次色素と細胞または細胞成分との非特異的相互作用をブロックする。典型的に、ブロッキング剤は、分析される細胞上の結合部位について、該組成物中に存在する他の色素と拮抗する。より典型的には、ブロッキング剤は、細胞上の特異的部位について低親和性色素と拮抗する。そのようにすることによって、該組成物中に存在する他の成分（即ち、他の色素）の非特異的結合が、減少または排除される。ブロッキング剤は、それ自体が色素であり得；このような状況下において、該色素は、それが一次色素および他の色素成分と鑑別的に検出可能であるように、選択される。あるいは、ブロッキング剤は、一次色素のその標的への特異的結合に影響を与えることなしに、一次色素の非特異的相互作用をブロックする、任意の化合物であり得る。
【００２５】
好適には、ブロッキング剤は、非蛍光性であるか、または該組成物中の一次色素の波長とは異なる波長で蛍光を発する色素の中から選択される。好ましくは、ブロッキング剤は、一次色素の蛍光を活性化させる波長で、非蛍光性である。１つの実施形態において、ブロッキング剤は、サンプルに蛍光を発せさせるために使用される励起レーザーの波長に等しいかまたはそれ以下の波長で蛍光を発する。別の実施形態において、該波長は、約４８８ｎｍ以下である。
【００２６】
１つの実施形態において、ブロッキング剤は、非インターカレーティング色素である。好ましくは、該非インターカレーティング色素は、ＤＮＡ−特異的色素である。ここにおいておよび本明細書に渡って使用される場合、用語“非インターカレーティングＤＮＡ−特異的”は、外部からＤＮＡへ結合する色素を記載することを意味する。好ましくは、該非インターカレーティング色素は、ＤＮＡ縮合によって影響を受けず、そしてＡ−Ｔ塩基対およびＤＮＡの副溝について強い優先を有する。非インターカレーティング色素の選択は、特に、インターカレーティング色素である一次色素を含有する組成物において望ましい。しかし、このような非インターカレーティング色素は、非インターカレーティングである一次色素を含有する本発明の組成物においてブロッキング剤として使用され得る。
【００２７】
多くの好適なブロッキング剤が、当該分野において公知であり、そして本発明の組成物において容易に使用され得、非限定的に、中でも、ビスベンズアミド（Ｎ，Ｎ’−（ジチオジ−２，１−フェニル）−ビスベンズアミド、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ＴＭ色素（ビスベンズイミド、２’−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５−ビ−１Ｈ−ベンゾイミダゾールトリヒドロクロリド五水和物；Molecular Probes, Eugene, OR）、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３４５８０色素（Molecular Probes, Eugene, OR）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＴＭ色素（ビスベンズイミド、２’−（エトキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５−ビ−１Ｈ−ベンズイミダゾールトリヒドロクロリド三水和物；Molecular Probes, Eugene, OR）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニル−インドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ、Molecular Probes, Eugene, OR）、４’，６−ビス−［２−イミダゾオキソリニル−４Ｈ，５Ｈ］−２−フェニル−インドール（ＤＩＰＩ、Molecular Probes, Eugene, OR）、ＥｏｓｉｎＴＭＹ色素（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ＯｒｃｅｉｎＴＭ色素（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ＰｈｌｏｘｉｎｅＴＭＢ色素（２’，４’，５’，７’−テトラブロモ−４，５，６，７−テトラクロロフルオレセイン二ナトリウム塩、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ＰｅｎｔｏｘｉｐｈｉｌｌｉｎｅＴＭ色素（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ＱｕｉｎａｃｒｉｎｅＴＭ色素（６−クロロ−９−（４−ジエチル−１−メチルブチルアミノ）−２−メトキシアクリジンジヒドロクロリド、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、ならびにそれらの組合せが挙げられる。
【００２８】
限定数のブロッキング剤が文献に記載されているが、これらのブロッキング剤の組合せが、単一組成物中に一次色素と組合され得、これが満足できる鑑別蛍光を提供するという示唆は、当該分野において欠如している。より詳細には、実質的に過剰量のブロッキング剤に使用が、弱い結合部位について他の色素をアウトコンピートし（out-compete）、それによって細胞中の強い結合部位への両方の色素の結合を増加させる、即ち、非特異的結合に対して特異的結合を増加させるために必要とされるということが、本発明の発見である。
【００２９】
本発明において使用されるブロッキング剤の過剰量は、染色が必要とされる速度に依存する。典型的に、サンプルを短時間で染色することが必要である場合、より多くのブロッキング剤が必要である。あるいは、短時間でサンプルを染色する必要が無い場合、より少量のブロッキング剤が使用され得る。好ましくは、ブロッキング剤は、該組成物中の実質的に過剰量の他の成分で、該組成物中に存在する。より好ましくは、ブロッキング剤は、少なくとも２０倍のモル過剰で、即ち、少なくとも２０：１のモル比のブロッキング剤対一次蛍光色素で存在する。なおより好ましくは、ブロッキング剤は、少なくとも約２０〜約５００倍のモル過剰で、即ち、約２０：１〜約５００：１のモル比のブロッキング剤対一次蛍光色素で存在する。
【００３０】
なお別の実施形態において、ブロッキング剤は、少なくとも２０倍のモル過剰で、即ち、少なくとも２０：１のモル比のブロッキング剤対一次蛍光色素で存在する。他の実施形態については、ブロッキング剤は、少なくとも１００倍のモル過剰で、即ち、少なくとも１００：１のモル比のブロッキング剤対一次蛍光色素で存在する。なお他の実施形態において、ブロッキング剤は、１５０倍のモル過剰で、即ち、１５０：１のモル比のブロッキング剤対一次蛍光色素で存在する。
【００３１】
本発明の方法における使用のために好適なブロッキング剤と好適な一次色素との組合せの選択は、簡易な実験を使用し得るか、または十分に当該分野の知識内である。１実施形態としては、実験は、細胞膜およびヘモグロビンを含有するネガティブコントロールとして正常なヒトＲＢＣ（ＤＮＡまたはＲＮＡサンプルでない）と、核を有するトリＲＢＣとを使用する。慣用的な溶解剤への暴露後、トリＲＢＣは溶解され、細胞膜およびＤＮＡのみを残す（ＤＮＡサンプル）。第三のサンプルは、ヒトＲＢＣへＲＮＡを慣用的に化学的に付着することによって調製され、それによって細胞膜、ヘモグロビンおよびＲＮＡを含有するサンプル（ＲＮＡサンプル）が提供される。第一の一次色素は、公知の蛍光性、好ましくは異染性色素の中から選択される。その後、第二のブロッキング剤が、そのＤＮＡを結合する能力、該一次色素との構造（例えば、平面配向、変化など）におけるその類似性について選択される。種々の濃度の一次色素およびブロッキング試薬が、２０：１を超えるブロッキング剤対色素の比に従って、該３つの試験サンプル中へ導入され、そして該サンプルをフローサイトメトリーによって分析して、いずれの組合せが該３つのサンプル間の分染を可能とするかを決定する。この様式で、好適な一次色素、ブロッキング試薬組成物が、本発明に従って、過度または複雑な実験無しに選択され得る。
【００３２】
従って、色素およびブロッキング剤の種々の異なる組合せが、当業者に容易に明らかとなる。例えば、１つの実施形態において、一次蛍光色素および非蛍光ブロッキング剤を含有する、細胞を染色するための組成物が提供される。ブロッキング剤と一次蛍光色素のモル比は、少なくとも約２０：１である。
【００３３】
Ｃ．浸透化試薬
なお他の実施形態において、本発明の組成物は、上記で規定の比で、色素と共に浸透化または細胞浸透化剤を含む。いくつかの実施形態において、第一浸透性色素は、第二色素の非存在下において、浸透化試薬と混合される。典型的に、該色素の迅速な取り込み（rapid uptake）を実施するために、本発明の組成物は、当業者によって容易に選択され得る、非溶解性浸透性増強剤（non-lytic permeant enhancer）、即ち、浸透化試薬またはスフェリング試薬を含有するように処方される。驚くべきことに、細胞浸透性第一色素と組み合わされる場合、浸透化剤は色素機能を増強する。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、語句“迅速な取り込み”は、自動化フローサイトメトリーのために望ましい時間枠内で細胞膜を横断する分子の能力をいう。一般的に、迅速な取り込みは、該色素分子が、本発明の組成物を使用する場合、約５分未満、好ましくは約１分未満、そして最も好ましくは約３０秒未満で細胞膜を浸透することを示す。しかし、当業者は、例えばインキュベーション時間を９０秒まで増加させることによってまたはインキュベーション時間を例えば約３０秒まで減少させることによって、必要に応じて望ましいようにこの時間を調節し得る。
【００３５】
従って、本発明の組成物は、定常状態反応速度論（steady state kinetics）が得られることを可能にし、それによって、迅速な蛍光色素取り込みが、蛍光強度によって測定される場合、５分を超える分析間隔に渡って線形であること、そして第一色素／ブロッキング剤組成物は、ブロッキング剤を含有する組成物よりもより有効にかつ速く平衡に達することを示す。
【００３６】
１つの実施形態において、非溶解性浸透性増強剤は、血液サンプル中の網状赤血球および赤血球を等積的にスフェアする（isovolumetrically spheres）双性イオン界面活性剤または両性洗浄剤である。このような増強剤は、浸透性および非浸透性色素の両方と共に使用され得、そして典型的に赤血球および網状赤血球を分析するために使用される。典型的な等積スフェリング試薬（isovolumetric sphering）は、当業者に選択され得、そして、非限定的に、以下が挙げられる：アニオン性界面活性剤、例えば、アンモニウムペルフルオルアルキルカルボキシレート（ＦｌｕｏｒａｄＴＭＦＣ−１４３として市販、3M Company, St. Paul, MN）、ソディウムラウロイルミリストイルラクチレート（ＰａｔｉｏｎｉｃＴＭ１３８Ｃとして市販、R.I.T.A Corp, Woodstock, IL）；非イオン性界面活性剤、例えば、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス−［３−Ｄ−グルコンアミドプロピル］コラミド（N,N-bis-[3-D-gluconamidopropyl]cholamide）、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマー、Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ダコニル−Ｎ−メチル−グルカミド（Daconyl-N-methyl-glucamide）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ステアリン酸のポリエチレングリコールエステル、エトキシル化ココモノグリセリド（ethoxylated cocomonoglyceride）、オクチフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、エトキシル化オクチルフェノール、および直鎖アルコール、あるいはカチオン性界面活性剤の中から、ココヒドロキシエチルイミダゾリン、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、あるいは双性イオン界面活性剤の中から、ラウラミドプロピルベタイン、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ココアミドプロピルベタイン、ココアミドスルホベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート。
【００３７】
該組成物中の浸透化剤またはスフェリング試薬の濃度は、約３μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲である。別の実施形態において、血液サンプル中の網状細胞（reticulated cells）およびＲＢＣを有効に等積的にスフェアするための、該組成物中の浸透化剤の範囲は、約１５〜２５μｇ／ｍＬの範囲である。該組成物のオスモル濃度は、好ましくは、有効に等積的スフェリングを可能にするために、約２５０〜約３５０ｍＯＳｍの範囲である。例えば、米国特許第6,060,322号に記載の濃度およびオスモル濃度値を参照のこと。このような濃度およびオスモル濃度は、当該分野において容易に利用可能である。しかし、当業者は、塩および他のオスモル濃度的に有効な薬剤を使用して、細胞を等積的にスフェアするために必要とされるかまたは望ましいように、該濃度およびオスモル濃度を容易に調節し得る。好適なオスモル濃度薬剤としては、組成物中の色素を沈降させたりまたはこれと不利に反応したりしない、一価、または二価のアルカリ塩が挙げられる。
【００３８】
上述のように、このような浸透化剤は、その中の色素およびブロッキング剤それ自体が細胞壁に対して浸透性である組成物において使用され得る。その中の一次色素および／またはブロッキング試薬が非浸透性である組成物において、このような浸透化剤が組成物中に必要とされる。
【００３９】
Ｄ．組成物の他の成分
更なる成分が、本発明の組成物に添加され得る。例えば、緩衝液または溶媒が、組成物のｐＨを維持することが必要である状況において使用され得る。好ましくは、非溶解性浸透化剤（non-lytic permeabilizing agent）が本発明の組成物中に含まれる場合、該色素組成物のｐＨは、約５〜約７．５の生理学的ｐＨ範囲で維持される。あるいは、溶解性試薬が本発明の組成物中に含まれる場合、ｐＨは約３〜約８のｐＨで維持される。緩衝液は、当業者に公知の種々の緩衝液から選択されて本発明の組成物中に使用され得、そして、非限定的に、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline; PBS）あるいは等張性生理食塩水、例えば、米国特許第3,962,125号におけるＩＳＯＴＯＮ（登録商標）ＩＩ緩衝液（Beckman, Coulter, Inc., Miami, FL）などが挙げられる。更に、このような緩衝液はまた、本発明の組成物の１以上の成分の濃度を調節するために使用され得る。
【００４０】
保存剤（preservatives）もまた、本発明の組成物に添加され得、そして５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン（ＰｒｏＣｌｉｎＴＭ３００およびＰｒｏＣｌｉｎＴＭ１５０として市販、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）から選択され得るが、これらに限定されない。
【００４１】
好適な界面活性剤がまた、本発明の組成物中に含まれ得、そして当業者によって容易に選択される。１つの実施形態において、該組成物は、細胞に対してスフェリング剤としても作用する第二界面活性剤および洗浄剤を含む。別の実施形態において、該組成物は、洗浄剤およびスフェリング剤の両方として機能する単一の界面活性剤を含むように設計され得る。なお更なる実施形態において、該組成物は、必要な界面活性剤作用を提供する単一の界面活性剤を含有し得るが、スフェリング試薬作用は必要とされない。
【００４２】
洗浄剤もまた、本発明の組成物中に含まれ得る。洗浄剤は、非イオン性洗浄剤の中から容易に選択され得る。望ましくは、これらの洗浄剤は、約０〜約１％の濃度で使用される。本発明の１つの実施形態において、洗浄剤は、約０．００１％〜約０．１％の濃度で使用される。好適な洗浄剤の例としては、オクチペノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（octypenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol）（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０、Ｎ−６５０７として市販、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO、またはＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０として市販、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、エチオキシル化オクチルフェノール（ethyoxylated octylphenol）（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，Ｔ９２８４として市販、Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、および直鎖アルコールアルコキシレート（Ｐｌｕｒａｆａｃ  Ａ−３８またはＰｌｕｒａｆａｃ  Ａ−３９として市販、BASF Corp., Ludwigshafen, Germany）が挙げられる。他の好適な洗浄剤が、当業者によって容易に選択され得る。典型的に、これらの洗浄剤は、サンプル（例えば、１〜２μｌの全血など）と混合されるか（または逆も同様）、あるいは本発明の組成物中に別に処方される。
【００４３】
更に、スルホン酸、またはその塩が、本発明の組成物中に含まれ得る。このような塩のいくつかの例は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Biochemicals and Reagents for Life Science Research, Sigma-Aldrich Corporation, 2002）から市販されている。
【００４４】
本発明の組成物はまた、選択された溶媒を含有し得る。本明細書中で規定される場合、溶媒は、固体、液体、または気体を溶解し得る任意の液体を記載することが意味される。本発明の組成物の調製に好適な溶媒としては、非限定的に、水ベースまたは混和性液体、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、およびその混合物が挙げられる。しかし、好適な溶媒の選択は、本発明において限定ではない。
【００４５】
種々の任意の成分を含む望ましさは、選択される色素およびブロッキング剤、保存条件などのような因子を考慮して、当業者によって容易に決定される。
【００４６】
Ｅ．選択される本発明の組成物
１つの実施形態において、第一蛍光色素と、該第一色素の波長とは異なる波長で蛍光を発しそして該第一色素の非特異的結合を減少させる第二色素とを含有する、細胞を染色する組成物が提供され、ここで、該第二色素と該第一色素のモル比は少なくとも約２０：１である。好ましくは、ブロッキング剤は、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８ブロッキング剤またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＴＭブロッキング剤である。第一色素は、上記のリストから選択される、異染性色素、非異染性色素、細胞浸透性色素、インターカレーティング色素、またはそれらの組合せであり得る。好ましい一次色素は、アクリジンオレンジである。
【００４７】
別の実施形態にておいて、異染性蛍光色素（例えば、アクリジンオレンジ）と、該異染性色素の波長とは異なる波長で蛍光を発しそして該異染性色素の非特異的結合を減少させる第二ブロッキング色素とを含有する、細胞を染色するための組成物が提供され、ここで、該第二色素と該異染性色素のモル比は、少なくとも約１００：１である。第二色素／ブロッキング剤は、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８ブロッキング剤またはＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ＴＭブロッキング剤である。必要に応じて、この組成物は、浸透化剤を含有する。例えば、このような組成物は、スフェリング試薬１ｍｌ、アクリジンオレンジの１ｍＭ溶液２μｌ、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８試薬１０μｌを含有する。この組成物は、２μｌのサンプル（例えば、全血）への添加に好適である。以下の実施例を参照のこと。
【００４８】
更なる実施形態において、非異染性色素と、該非異染性色素の波長とは異なる波長で蛍光を発しそして該異染性色素の非特異的結合を減少させる第二色素／ブロッキング剤とを含有する、細胞を染色するための組成物が提供され、ここで、該第二色素と該非異染性色素のモル比は、少なくとも約１００：１である。
【００４９】
なお別の実施形態において、蛍光性細胞浸透性色素と、該細胞浸透性色素の波長とは異なる波長で蛍光を発しそして該細胞浸透性色素の非特異的結合を減少させる第二色素とを含有する、細胞を染色するための組成物が提供され、ここで、該第二色素と該細胞浸透性色素のモル比は、少なくとも約１００：１である。
【００５０】
なお更なる実施形態において、アクリジンオレンジ色素とＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８ブロッキング剤とを含有する、細胞を染色するための組成物が提供され、ここで、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８ブロッキング剤とアクリジンオレンジ色素のモル比は、約１００：１である。以下の実施例において実証されるように、ＡＯおよびこれらのＨｏｅｃｈｓｔ色素は異なる様式でＤＮＡに結合するが、それらはなお拮抗的である。洗浄された浸透化トリ赤血球細胞（permeabilized avian red cells）（ＤＮＡリファレンス材料）で試験される場合、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素およびＡＯを１００：１の比で含有する本発明の組成物は、ＡＯのみに起因する〜５２６ｎｍ蛍光を７５％超減少させる。同様に、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素およびＡＯを１００：  の比で含有する本発明の組成物は、ＡＯにのみ起因する〜５２６ｎｍ蛍光を５０％超減少させる。従って、蛍光的に励起された一次色素ＡＯのモル過剰量での、４８８ｎｍレーザーによって蛍光的に励起されていないブロッキング色素の存在は、該蛍光性一次色素の特異性および蛍光識別を改善する。これは、ブロッキング試薬無しでは生じていた一次色素の非特異的結合および蛍光の減少によって達成される。該組合せの更に驚くべき結果は、高濃度でのＨ３３２５８ブロッキング試薬が、核蛋白質およびポリヌクレオチド複合体の凝集（condensation）および沈降（precipitation）に起因して、増加された光散乱（＞１５度）を生じることが示されたということである。これは、Ｈ３３２５８複合体の存在に起因して細胞の反射の内部インデックスにおける増加という効果を生じさせる。この効果は、ＡＯを含有する組成物中において観察されない。従って、本発明の組成物はまた、一次色素の異染性分離を改善することに加えて、種々の細胞タイプの光散乱識別を増強させる。
【００５１】
本発明のなお別の組合せは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素およびＡＯの上記組合せを、好酸性顆粒を染色する更なる色素（例えば、Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄ）と共に使用する。
【００５２】
本発明のなお別の組合せは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素およびＡＯの上記組合せを、好塩基性顆粒を染色する更なる色素（例えば、Ｂａｓｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ  ２１）と共に使用する。
【００５３】
別の実施形態において、本発明の組合せは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８色素およびＡＯの上記組合せを、細胞膜を染色する更なる色素（例えば、ＤｉＯＣ）と共に使用する。
【００５４】
別の実施形態において、細胞浸透性第一色素（例えば、ＡＯまたはＴＯＴＯ色素）は、細胞浸透化試薬と共に処方される。
【００５５】
本発明の多くの他の望ましい組成物が、上記の成分の説明を考慮して、記載され得ることが、当業者に容易に明らかとなるであろう。このような組合せは、一次色素励起波長（例えば、ＡＯについては４８８ｎｍ）のレーザーで励起された場合、散乱特性を改善すること、一次色素の非特異的蛍光結合を減少させること、および改善された蛍光ピーク分離特性という利点を有する。一次色素の強烈な核発光染色（nuclear emission staining）（例えば、ＡＯの５２６ｎｍ発光染色）に対するブロッキング色素の効果は、ＲＮＡまたは顆粒に結合された一次色素の赤色発光へのスペクトラルオーバーラップ（spectral overlap）を減少させる。このＤＮＡ染色減少は、ＤＮＡ凝集の識別を増強させる。ブロッキング色素の存在は、核結合蛋白質の凝集および沈降を引き起こし、非蛍光性光散乱に基づく細胞分離を増強させる。非特異的結合部位についてのブロッキング色素および一次色素の組合せは、色素蛍光のノイズ値に対するシグナルを改善させ、そして一次色素の迅速な反応速度平衡結合を可能にする。
【００５６】
Ｅ．本発明の組成物の調製
色素および必要に応じての非溶解性浸透性増強剤は、好適な溶媒中に溶解されて、混合物または溶液を形成し得る。保存のために、典型的に、比較的高濃度の該色素が好適な溶媒中に溶解されて、ストック溶液が得られる。好ましくは、該色素は、該色素の飽和点までの範囲の総色素濃度で、溶媒中に溶解される。このような濃度は、当業者に容易に選択され得る。
【００５７】
該ストック溶液は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または等張性生理食塩水を含む、他の試薬または緩衝液中で希釈され得る。このような組成物における最終色素濃度は、用途に依存して変化し得る。１つの実施形態において、約２μｌの全血のサンプルへ添加される最終組成物中の色素濃度は、１ｍＭ溶液約１〜５μｌの範囲内であり、より好ましくはその溶液約２μｌが好適である。しかし、好適な濃度または希釈溶媒の選択は、本発明において限定ではない。他の濃度が、当業者によって選択され得る。
【００５８】
好適には、本発明の組成物は、標準の混合技術を使用して、添加される色素、ブロッキング剤および任意の成分を組み合わせることによって、調製され得る。
【００５９】
ＩＩ．本発明の方法
本発明の組成物および方法は、種々の目的のために使用され得る。本発明の１つの実施形態は、好適な生物学的サンプル中の細胞の染色、検出、および分析のための組成物の使用である。細胞は、種々のホストから得ることができ、そして哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を含み得る。最も好ましくは、細胞としては、ヒト細胞が挙げられる。しかし、当業者は、容易に、本発明の色素組成物の使用は細胞タイプに限定されないことを理解する。有利なことには、本発明の色素、方法および組成物は、細胞固定を必要とせず、そして従って、生存している細胞の分析における用途に特によく適している。しかし、細胞集団（cell population）の選択は、本発明において限定ではない。
【００６０】
従って、典型的な生物学的サンプルとしては、全血、血漿、唾液、尿、他の生物学的分泌物および排出物、ならびに細胞を含有する実験室調製物（例えば、緩衝液、生理食塩水中の細胞など）が挙げられる。分析のために好適なサンプル（例えば、網状赤血球細胞集団を含有するもの）が、本発明の組成物での染色の前にある更なる処理によって富化または欠乏された全血または血液サンプルから選択され得る。このような富化（enrichment）または欠乏（depletion）処理としては、中でも、遠心分離、フィコール補助比重分離（ficoll assisted gravity separation）または磁気分離が挙げられ得る。このようなサンプルはまた、ＲＮＡｓｅおよびＤＮＡｓｅでまたは必要に応じて処理され得る。あるいは、サンプルは、溶解された細胞を除去するために洗浄され得る。
【００６１】
核酸を含む細胞成分を有する細胞は、本発明の組成物を使用して分析され得る。好ましくは、分析され得る細胞としては、非限定的に、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、ＷＢＣのクラス（例えば、リンパ球）、芽細胞、有核ＲＢＣ（nucleated RBC）、好塩基球、肥満細胞、好中球、単球、好酸球、網状赤血球、およびそれらの組合せが挙げられる。分析され得る細胞の細胞成分としてはまた、とりわけ、非限定的に、ＲＮＡ、ＤＮＡ、好酸性顆粒、好塩基性顆粒、赤血球インクルージョン、および細胞内寄生生物（例えば、ウイルスを含む）が挙げられる。
【００６２】
本発明の組成物および方法は、従って、血小板および白血球（ＷＢＣ）分析、成熟、ＷＢＣ同定、網状赤血球ヘモグロビン分析、ならびに赤血球（ＲＢＣ）インクルージョンについて有用である。更に、該組成物は、網状赤血球分析において非常に成功的かつ信頼性が高い。
【００６３】
別の実施形態において、本発明の組成物は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸を染色することにおいて有用である。遊離の核酸（例えば、細胞または非細胞源のインタクトな細胞膜によって囲まれていない核酸）を含有するサンプルにおいて、本発明の組成物は、核酸を染色し得る。本発明の１つの実施形態において、本発明の組成物と、核酸を含有するサンプルとを接触させるための方法が提供される。
【００６４】
更なる実施形態において、本発明の組成物は、ＲＮＡを含有する、網状赤血球の検出および計数（enumeration）における使用に好適である。従って、本発明の方法は、本発明の組成物と、網状赤血球を有する細胞を含有するサンプルとを接触させることを包含する。
【００６５】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、非限定的に、リンパ球、単球、好中球、好酸球、および好塩基球を含む細胞性成分を同定するために使用される。
【００６６】
別の実施形態において、本発明の組成物は、細胞の迅速な染色を促進するために使用され得る。典型的に、本発明の方法は、約５分未満での染色を可能にする。好ましくは、本発明の方法は、約１〜約６０秒、約５秒〜約４５秒、約４〜約５秒、および約１０〜約４０秒での染色を可能にし得る。好ましくは、網状赤血球は約１０〜約３０秒未満で染色され、そして白血球は約５分未満で染色される。
【００６７】
本発明の方法は、その特定の意図および同定される細胞または成分に関わらず、細胞を含有する選択されたサンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の分染を増強する。該方法は、該サンプルと本発明の組成物、必要に応じてスフェリング剤および／または溶媒とを接触させることによって、該サンプル中の細胞を染色することを包含する。該方法は、必要に応じて、該サンプルと本発明の組成物とを接触させる前に、色素の浸透のために細胞の浸透化させる工程を包含する。例えば、上述のもののような浸透化剤が、本発明の色素含有組成物との接触前に、該サンプルと混合され得る。この工程は、該組成物自体が浸透化剤を含有するかどうかに関わらず、使用され得る。該サンプルと本発明の組成物との混合後、次いで、該混合物は、好適な時間の間インキュベートされ、例えば、本発明の方法の１つの実施形態において、該色素組成物は、約１秒〜約５分間、選択されたサンプルと共にインキュベートされる。好ましくは、該色素組成物は、約１秒〜約１分間、サンプルと共にインキュベートされる。しかし、簡便の目的のために望ましい場合、このインキュベーション期間は、延長または短縮され得る。別の実施形態において、インキュベーション時間は、完全に排除される（即ち、０秒）。望ましくは、この混合およびインキュベーションは、室温で行われ得る。好ましくは、約２０℃〜約４０℃の温度が使用される。より好ましくは、約２２℃〜約２７℃の温度が使用される。
【００６８】
本発明の方法に従って、該色素で染色された細胞は、次いで、サンプル中のＲＮＡ、ＤＮＡおよび顆粒の発現差異（differential expression）を検出するために分析される。このような分析方法は、好ましくは、自動フローサイトメーター（automatic flow cytometer）または従来のヘマトロジーアナライザー（hematology analyzer）における計数（enumeration）および検出を包含する。しかし、これらの染色された細胞はまた、手動手段または自動化顕微鏡（automated microscopy）によってカウントされ得る。自動フローサイトメーターは、当該分野において周知であり、そして本発明は、特定のフローサイトメーターの使用に限定されない。このようなフローサイトメーターとしては、中でも、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＸＬＴＭ、ＨｍＸＴＭ、Ｇｅｎ＊ＳＴＭ、ＬＨ７５０ＴＭ、ＬＨ７５５ＴＭ、およびＲｅｔｉｃＯＮＥＴＭフローサイトメーター（Beckman Coulter, Inc., Miami, FL）、ＳＹＳＭＥＸ−ＲＡＭ１ＴＭ９５００、ＳＦ−３０００、ＸＥ２１００、およびＸＥ２１００−Ｌヘマトロジーアナライザー（Sysmex Corporation of America, Long Grove, IL）、ＣＥＬＬ−ＤＹＮＴＭ、３２００、３７００、および４０００ヘマトロジーアナライザー（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL）、ＰＥＮＴＲＡＴＭ６０および１２０Ｒｅｔｉｃヘマトロジーアナライザー（ABX Diagnostics, Montpellier Cedex, France）、ならびにＡＤＶＩＡＴＭ７０および１２０ヘマトロジーアナライザー（Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
異なる分析技術が、フローサイトメトリック測定による網状赤血球の計数において使用され得、以下が挙げられるがこれらに限定されない：光散乱（前方、側方および後方）、蛍光、偏光蛍光光識別（polarized fluorescent light discrimination）、偏光散乱光識別（polarized scattered light discrimination）、光学吸収（optical absorption）、軸光損失（axial light loss）、直流（ＤＣ）電気インピーダンス（direct current (DC) electrical impedance）、および高周波（ＲＦ）伝導（radio frequency (RF) conductivity）。本発明の１つの実施形態において、このようなフローサイトメーターを使用することにおいて、光散乱ゲート（light scatter gates）が赤血球を単離するために使用され、そして次いで蛍光ゲート（fluorescent gates）が、成熟赤血球から網状赤血球を線引きしそして網状赤血球を計数するために使用される。フローサイトメーターを使用する、更なる実施形態において、ＤＣおよび光散乱  光散乱ゲートが赤血球を単離するために使用され、そして次いで蛍光ゲートが、成熟赤血球から網状赤血球を線引きしそして網状赤血球を計数するために使用される。フローサイトメーターを使用する、本発明のなお別の実施形態において、ＤＣおよび蛍光測定のみが、成熟赤血球から網状赤血球を線引きしそして網状赤血球を計数するために使用される。Peebles et al., 1981 Am. J. Clin. Pathol.. 76:713-717; Davis et al. 1994 Am. J. Clin. Pathol., 102:486-487; “Flow Cytometric Reticulocyte Quantification in the Evaluation of Hematologic Recovery”. Spanish Multicentric Study Group for Hematopoietic Recovery. 1994 Eur. J. Hematol., 53(5): 293-297; および米国特許第4,957,870号および第4,971,917号を参照のこと。
【００７０】
フローサイトメーターのための励起源として使用され得る種々のレーザーが、当業者に公知である。レーザーは、網状赤血球の検出のために選択される本発明の色素の励起波長に依存して、アルゴン、ヘリウム−ネオン、ダイオード、およびダイオードパンプトソリッド−ステートレーザー（diode pumped solid-state lasers）から選択され得るが、これらに限定されない。好適な光源、および好適な励起波長の選択は、本発明において限定でない。
【００７１】
好適な励起波長は、当業者に容易に決定され得る。赤色スペクトル範囲における好適な励起波長の例としては、６００ｎｍ〜７２５ｎｍ、そして好ましくは６３０ｎｍ〜６７０ｎｍの範囲内のものである。また、下記の実施例を参照のこと。他の好適な励起源および波長は、本発明の方法および組成物における使用について選択される色素を考慮して、当業者に容易に選択され得る。
【００７２】
１つの実施形態において、細胞を含有するサンプルと上述の本発明の組成物とを接触させること、および該サンプルを分析して該細胞を検出することを包含する、細胞の分析方法が提供される。
【００７３】
なお別の実施形態において、分染を増強するための方法は、別個の工程を包含し得る。例えば、細胞を含有するサンプルは、先ず、上述のブロッキング試薬（例えば、一次色素の波長とは異なる波長で蛍光を発する第二色素）の１つと、一次色素に対して少なくとも２０モル過剰で、接触され得る。独立してその後、該サンプルは、選択された一次色素と接触され得る。第一接触工程は、ブロッキング試薬が、一次色素が通常非特異的に結合する（または、低親和性で結合する）部位へ結合することを可能にする。第二工程は、一次色素が、それが高親和性で特異的に結合する部位へのみ結合することを可能にする。この様式で行われたとしても、該方法は、一次色素の非特異的結合を減少させる。この方法は、必要に応じて、初期浸透化工程（initial permeabilization step）を包含し得る。最後に、サンプルは、該サンプル中の細胞タイプおよび／または細胞成分の分染について本明細書中で記載されるように分析される。
【００７４】
更なる実施形態において、網状赤血球を含有するサンプルと本発明の組成物とを接触させること、および該サンプルを分析して網状赤血球を検出することを包含する、網状赤血球を分析するための方法が提供される。
【００７５】
なお別の実施形態において、サンプルと本発明の組成物とを接触させて混合物を形成させること、および該混合物をインキュベートすることを包含する、細胞膜を介しての色素分子の迅速輸送を促進するための方法が提供される。
【００７６】
更なる実施形態において、細胞を含有するサンプルと本発明の組成物とを接触させること（ここで、第二色素は、細胞の第二成分への第一色素の非特異的結合を減少させる）を包含する、細胞の１成分への色素の結合を増強させるための方法が提供される。
【００７７】
ＩＩＩ．本発明のキット
本発明はまた、研究的または薬学的または診断的医学用途のためのキットを包含する。診断アッセイおよびキットにおける使用のために、上述の一次色素およびブロッキング試薬は、好ましくは、上述のような、好適な溶媒、緩衝液、保存剤、および浸透化剤と共に含まれる。
【００７８】
所望の標的細胞または細胞タイプ上の他の結合部位（例えば、ＷＢＣ上の細胞表面決定部位）に対する抗体もまた、このようなキットにおいて有用である。このような抗体は、単独でまたは他の組成物もしくは化合物と組み合わせて、検出可能なシグナルを提供し得る、検出可能な標識と結合され得る。１またはそれ以上の抗体が診断方法において使用される場合、標識は、望ましくは相互作用的（interactive）であり、検出可能なシグナルを作成する。最も望ましくは、標識は、視覚的に（例えば、比色的に）検出可能である。種々の酵素システムが、アッセイにおいて比色シグナルを顕在化するために作動し、例えば、グルコースオキシダーゼ（これは、基質としてグルコースを使用する）は、生成物として過酸化物を放出し、これは、ペルオキシダーゼおよび水素供与体（例えば、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））の存在下で、青色として見える酸化ＴＭＢを生成する。他の例としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ならびに、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼと組み合わせてのヘキソキナーゼ（これは、ＡＴＰ、グルコース、およびＮＡＤ＋と反応して、他の生成物の中でも、３４０ｎｍ波長で増加した吸光度とし検出されるＮＡＤＨを生成する）が挙げられる。
【００７９】
本発明の方法に有用であり得る他の標識システムは、他の手段、例えば、着色ラテックス微粒子（Bangs Laboratories, Indiana）（ここで、埋め込まれた色素が、酵素の代わりに使用されて、インヒビター配列またはリガンドとの結合体を形成し、そして適用可能なアッセイにおいて得られる複合体の存在の指標である視覚的シグナルを提供し得る）によって検出可能である。なお他のラベルとしては、蛍光性化合物、放射性化合物または元素が挙げられる。好ましくは、各試薬またはリガンドは、蛍光検出可能な蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、コリホスフィン−Ｏ（coriphosphine-O；ＣＰＯ）またはタンデム色素（tandem dyes）、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）、およびＰＥ−テキサスレッド（ＥＣＤ）と結合されるか、またはこれへと複合体化される。これらの蛍光色素の全ては、市販されており、そしてそれらの使用は、当該分野において公知である。
【００８０】
本発明の診断アッセイにおいて有用な、抗体および支持体への結合について検出可能な標識は、診断アッセイの当業者に公知でありかつ容易に入手可能である多数の組成物の中から容易に選択され得る。本発明の試薬およびリガンドは、使用される特定の検出可能な標識または標識システムによって限定されない。
【００８１】
標識と抗体とをカップリングまたは結合させるための方法は、同様に、当業者に慣用的かつ公知である。標識結合の公知方法は記載されている（例えば、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Ed., R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 1996; Pierce Catalog and Handbook, Life Science and Analytical Research Products, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1994/1995を参照のこと）。従って、標識およびカップリング方法の選択は、本発明を限定しない。
【００８２】
簡便のために、本発明に従う有用な高スループットアッセイまたは他の診断アッセイのための慣用的な試薬は、キットの形態で提供され得る。このようなキットは、血液細胞の不適切なタイプまたは数と関連した疾患状態、血液細胞タイプあるいはその成分を測定するために、血液サンプルを評価することについて有用である。従って、このようなキットは、本明細書中で議論される診断アッセイを実施することにおいて、例えば、血液サンプル中の不適切な細胞タイプ発現によって特徴付けられる病気の処置の状態を測定することにおいて、有用である。このような診断キットは、本発明の組成物の色素、ブロッキング剤、浸透化剤および他の成分を含有する。このようなキットはまた、実施される特定のアッセイの他の成分へ予め結合されているか、あるいは選択された成分（例えば、支持体）への結合のために別個に提供された、上記で例示した、標識を含む。あるいは、このようなキットは、このような組成物のシンプルな混合物、あるいはシンプルな混合物を調製するための手段を含み得る。
【００８３】
キットはまた、特定のアッセイを実施するための使用説明書、本発明の組成物の成分が予め吸着されているマイクロタイタープレート、種々の希釈液および緩衝液、特異的に結合された組成物の検出のための標識化複合体および他のシグナル発生試薬（例えば、酵素基質、補因子および色原体）を含む。他の成分としては、比色比較のためのインジケータチャート、使い捨てグローブ、除染使用説明書（decontamination instructions）、アプリケータスティックまたは容器、およびサンプル調製カップが挙げられ得る。
【００８４】
このようなキットは、本発明に従って、血液サンプルまたは細胞を含有する他の生物学的サンプルをスクリーニングするための簡便かつ有効な方法を臨床検査室に提供する。
【００８５】
当業者は、本開示と合わせた当該分野における知識に基づく自明の様式で、これら診断キットの成分を変化させることを予期し得る。このような変化された成分は、本発明のこの実施形態に含まれる。
【００８６】
実施例
これらの実施例は、サンプルを分析しそして細胞を検出するための本発明の組成物の使用を実証する。これらの実施例において報告されるデータは、本発明の組成物および方法が、現在の器具および方法論において有用であり、かつ、サンプルの改善された血液学的分析を可能にするパフォーマンスパラメータを有することを実証する。これらの実施例は、例示的であり、かつ、それに該範囲を限定しない。当業者は、特定の試薬および条件が以下の実施例において概説されるが、上述のような改変が、本発明の組成物またはその使用方法を提供するために成され得ることを理解する。
【実施例１】
【００８７】
実施例１
この実施例は、赤血球  網状赤血球の計数（enumeration）および成熟度ステージング（maturity staging）についての、当該分野において公知の色素と本発明の組成物との比較を提供する。詳細には、本発明の組成物を、公知のヘマトロジーおよびフローシステム（flow systems）および色素を使用して、現存する網状赤血球計数方法と比較した。
【００８８】
正常なドナーからの全血の１５試料および種々の地方病院からの４３患者試料を、全部で５８の全血試料のために集めた。インキュベーション後、各サンプルを、％網状赤血球について分析した。推測網状赤血球カウント（estimated reticulocyte count）を、当該分野において公知の標準技術を使用して、ＬＨ７５０ＴＭ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．ヘマトロジーを使用して、各試料について測定し、そして結果を表１に報告した。０．００％〜２７．１％の範囲の網状赤血球を得、そして結果を、サンプル中に存在する網状赤血球のパーセントに基づいて３つのカテゴリー（低、正常および高）に整理した。詳細には、表１に規定されるように、約０．９％未満網状赤血球の網状赤血球カウントが、低網状赤血球カウントを示し；約０．９〜約２．０％網状赤血球の網状赤血球カウントが、正常網状赤血球カウントを示し；そして約２．０％超網状赤血球の網状赤血球カウントが、高網状赤血球カウントを示した。
【００８９】
【表１】
2006520612.tif 000002
【００９０】
一旦、該ヘマトロジーアナライザーによって発生される場合の推測％網状赤血球カウントに従って、該サンプルをグループ分けし、次いで、本発明の組成物および当該分野において現在使用されている色素（例えば、表２に示されるもの）を使用して、より正確な網状赤血球および未成熟網状赤血球フラクション（immature reticulocyte fractions；ＩＲＦ）カウントについて、該サンプルを分析した。
【００９１】
【表２】
2006520612.tif 000003
【００９２】
ＩＲＦは、ＩＲＦ値に大きく影響を与える網状赤血球測定技術を用いての、最低ＲＮＡ含有網状赤血球と最高ＲＮＡ含有網状赤血球との距離の測定値である。サンプルのＩＲＦを測定するために、以下の式を使用した：
ＩＲＦ＝高蛍光性網状赤血球の＃＋（中央範囲の蛍光性網状赤血球の＃）／総網状赤血球
網状赤血球カウントの更なる測定値を、標準の試験技術を使用し、表３の色素を使用して測定した。これらの分析結果を表３に報告し、色素名によって同定した。
【００９３】
本発明の組成物を調製するために、約２μＬの全血サンプルを、約２μＬのアクリジンオレンジ（一次色素）１ｍＭ溶液、１ｍｌのスフェリング剤（マルトシド）、および１０μｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８試薬２０ｍＭ溶液と混合した。該サンプル混合物を、室温で約１〜５分間インキュベートした。次いで、本発明の組成物を含有するこの混合物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−ＭＣＬＴＭフローサイトメーターを使用して分析した。
【００９４】
Ａ．低網状赤血球カウントを有するサンプル
以下のデータは、低網状赤血球カウントを有する上述のサンプルのうちの１つの１０回の別個に成された測定に基づいた。ＲｅｔｉｃＯＮＥＴＭ、ＸＬ−ＭＣＬＴＭフローサイトメトリーに基づくシステムは、９回の別個に成された測定に基づき、これは容積制約（volume constraints）に起因した。表３〜４は、本発明の組成物および当該分野において公知の４つの色素を使用して、サンプル中に含まれる％網状赤血球および％ＩＲＦをそれぞれ報告する。得られたデータを、ＳｙｓｍｅｘＴＭＲＭＡ−１フローサイトメーターを使用してのＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ色素の分析について得られた結果と比較した。
【００９５】
表３は、全ての試験器具および全ての範囲（これは、上記で規定された低、正常および高網状赤血球を包含する）についてのサンプルの反復精度（replicate precisions）の結果を示す。カラムにおける色素名はまた、上記表２におけるような色素で同定される器具を示す。
【００９６】
【表３】
2006520612.tif 000004
【００９７】
【表４】
2006520612.tif 000005
【００９８】
これらのデータは、本願発明の組成物が、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料と比較した場合、サンプル中の％網状赤血球の十分な分析を提供し、そしてまた、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料と比較した場合、より低い％細胞容積（% cell volume；％ＣＶ）を生じさせたことを示す。
【００９９】
これらのデータは、％ＩＲＦが、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料、本発明の組成物、およびＣｙａｎｉｎｅＴＭ色素の平均値間で類似性を実証したことを示している。しかし、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ＢｌｕｅＴＭ色素およびＲｅｔｉｃＯＮＥＴＭ色素について得られた結果が、本発明の組成物とは異なったことに注意される。
【０１００】
Ｂ．正常網状赤血球カウントを有するサンプル
以下のデータは、正常網状赤血球カウントを有するサンプルの１０回の別個に成された測定に基づいた。表５〜６は、本発明の組成物および当該分野において公知の４つの色素を使用して、サンプル中に含まれる％網状赤血球および％ＩＲＦをそれぞれ報告している。得られたデータを、ＳｙｓｍｅｘＴＭＲＡＭ−１フローサイトメーターを使用してのＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ色素の分析について得られた結果と比較した。
【０１０１】
【表５】
2006520612.tif 000006
【０１０２】
【表６】
2006520612.tif 000007
【０１０３】
これらのデータは、本願発明の組成物が、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料と比較した場合、サンプル中の％網状赤血球の十分な分析を提供し、そしてまた、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料と比較した場合、最小および最大網状赤血球値間でより低い％ＣＶおよび差異を生じさせたことを示す。
【０１０４】
これらのデータはまた、％ＩＲＦが、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ＢｌｕｅＴＭ色素、本発明の組成物、およびＣｙａｎｉｎｅＴＭ色素の平均値間で類似性を実証したことを示している。しかし、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料について得られた平均は、本発明の組成物の平均よりも低かった。更に、ＲｅｔｉｃＯＮＥＴＭ色素は、最大および最小網状赤血球値間で最も低い差異を有した。
【０１０５】
Ｃ．高網状赤血球カウントを有するサンプル
高網状赤血球分析について利用可能な試料の制限された量に起因して、以下のデータは、本発明の組成物についての１０回の別個に成された測定、ＡｕｒａｍｉｅＴＭＯ染料についての９回の測定、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ＢｌｕｅＴＭ色素についての３回の測定に基づき、そして１回の測定は、ＣｙａｎｉｎｅＴＭ色素を用いて行った。ＲｅｔｉｃＯＮＥＴＭ色素を使用してはサンプルを分析しなかった。表７〜８は、上記の５つの器具を使用しての、サンプル中に含まれる％網状赤血球および％ＩＲＦをそれぞれ報告している。データを、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料について得られた結果と比較した。
【０１０６】
【表７】
2006520612.tif 000008
【０１０７】
【表８】
2006520612.tif 000009
【０１０８】
これらのデータは、本願発明の組成物が、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料と比較した場合、サンプル中の％網状赤血球のより高い分析を提供したことを示している。理論に拘束されることなしに、これは、網状赤血球細胞がネガティブ、成熟赤血球集団からより十分に分離されることを可能にしそしてより十分な計数を可能にする、本発明の色素の特異性を反映し得る。
【０１０９】
これらのデータはまた、本発明の組成物を使用した場合、ＩＲＦのより高い平均値および％ＣＶを示し、これは、本発明の組成物の特異的染色特性に起因し得る。
【０１１０】
全体的に考慮すると、これらのデータは、本発明の組成物が、血液学的分析においてより有効であったこと示している。
【実施例２】
【０１１１】
実施例２
この実施例は、本発明の組成物が、対精度（paired precision）および網状赤血球パラメータ精度（reticulocyte parameter accuracy）を測定することにおいて、当該分野において公知の組成物および方法よりも有効であることを実証する。
【０１１２】
実施例１に記載されるように、本発明の組成物を調製し、そして全血サンプルを処理した。％網状赤血球および％ＩＲＦを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ−ＭＣＬＴＭヘマトロジーアナライザーを使用して測定した。
【０１１３】
本発明の組成物について得られた結果を、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料およびＳｙｓｍｅｘＴＭＲＡＭ−１ヘマトロジーアナライザー、ならびにＭｅｔｈｙｌｅｎｅ  ＢｌｕｅＴＭ色素およびＬＨ７５０ＴＭヘマトロジーアナライザーを使用して得られた結果と比較した。
【０１１４】
Ａ．対精度（Paired Precision）
対精度を、本発明の組成物およびＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料を使用して、表９におけるラン１および２についての％網状赤血球および％ＩＲＦ間の差異を測定することによって測定した。
【０１１５】
【表９】
2006520612.tif 000010
【０１１６】
これらのデータは、本発明の組成物が、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料と比較した場合、％網状赤血球の平均差および差の標準偏差を得ることにおいて、より有効であることを実証している。
【０１１７】
Ｂ．網状赤血球パラメータ精度（Reticulocyte Parameter Accuracy）
網状赤血球パラメータ精度を、約０．００〜約３０％網状赤血球を有するサンプル（即ち、低、正常および高範囲の網状赤血球サンプル）を使用して精度の変数の合計を測定することによって測定した。各組成物についての平均差を、本発明の色素組成物のラン２からの結果について、ＡｕｒａｍｉｎｅＴＭＯ染料のラン２についての結果を引くことによって算出し、そして下記表１０に報告した。
【０１１８】
【表１０】
2006520612.tif 000011
【０１１９】
一旦測定すると、これらの値を、Ｍｅｔｈｙｌｅｎ  ＢｌｕｅＴＭ色素を使用してのＬＨ７５０ＴＭヘマトロジーシステム（Beckman Coulter Corp）についての製品要件仕様書に記載の値と比較した。表１１を参照のこと。
【０１２０】
【表１１】
2006520612.tif 000012
【０１２１】
これらのデータは、％網状赤血球についての平均差および差のＳＤが、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＨ７５０ＴＭヘマトロジーシステムの性能仕様書と類似していることを実証している。
【実施例３】
【０１２２】
実施例３
この実施例は、網状赤血球含有量について全血を分析する本発明の組成物の効果を実証している。詳細には、ブロッキング剤有りまたは無しの組成物を調製し、そして網状赤血球について分析した。
【０１２３】
本発明の１つの組成物を、アクリジンオレンジ色素の１ｍＭ溶液２μｌおよび全血２μｌ中のスフェリング剤マルトシド１ｍｌを混合して混合物を形成させることにより調製し、該混合物を約１〜５分間室温でインキュベートし、そして該混合物を網状赤血球含有量について分析した。
【０１２４】
本発明の第２の組成物を、ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８ブロッキング剤の２０ｍＭ溶液１０μｌ、アクリジンオレンジ色素の１ｍＭ溶液２μｌ、および全血２μｌ中のスフェリング剤マルトシド１ｍｌを混合して混合物を形成させることにより調製し、該混合物を約１〜５分間室温でインキュベートし、そして該混合物を網状赤血球含有量について分析した。
【０１２５】
結果を図１Ａ〜１Ｄのサイトグラム（cytograms）に示す。これらのデータは、ブロッキング剤がアクリジンオレンジ色素およびスフェリング剤と組み合わせて使用される場合、赤血球集団の反応速度論および非特異的染色の両方が減少され、それによって網状赤血球の蛍光ポジティブ集団の分離が増強されることを例示している。詳細には、ブロッキング剤無しかつ反応速度論が生じている場合、前半の間隔（the first interval）は０．６２％網状赤血球を示し、そして該間隔の後半（the second half of the interval）は２．９６％網状赤血球を示し、該間隔に渡って２．１％網状赤血球の平均を有することに注意される。図１Ａおよび１Ｂを参照のこと。
【０１２６】
同一の時間間隔に対してのブロッキング剤の添加は、ポジティブ網状赤血球のパーセンテージが該間隔のセグメント間隔に渡って類似していることを示している。図１Ｃおよび１Ｄを参照のこと。本発明の組成物を使用することによって、結合反応速度論（binding kinetics）はブロッキング剤によって促進され（driven）、そして一次色素の非特異的結合が最小化される。
【実施例４】
【０１２７】
実施例４
この実施例は、ＤＮＡリファレンス材料（例えば、洗浄された、浸透化されたトリ赤血球およびＲＮＡｓｅで処理されたこのような細胞）へ結合することにおける本発明の組成物の効果を議論している。詳細には、本発明の組成物の結合特性および発光スペクトルを測定した。
【０１２８】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に１．４５×１０４オンドリ全血細胞／μＬを含有するサンプル（ＤＮＡサンプル）を、ストック溶液として調製した。希釈液１ｍｌ中の１０％の該オンドリ全血細胞ストック溶液を、４０μｇ／ｍＬのＲＮＡｓｅストック溶液で処理し、そして該溶液を４８時間プレインキュベートし、その後、本実施例に従って使用した。
【０１２９】
本発明の組成物のストック溶液を、表１２に記載の濃度で調製した。次いで、本発明の組成物を、特定量の各ストック溶液（表１２を参照のこと）と、ＩｓｏｆｌｏｗＴＭ希釈液、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（マルトシド−非イオン性洗浄剤）、フルコピラノシドスフェリング試薬（flucopyranoside sphering reagent）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（両性洗浄剤−偽イオン性洗浄剤（pseudo-ionic detergent））、または水から選択される希釈液１ｍＬとを混合することによって調製した。これらの組成物を次いで、上述のサンプルと別個に混合し、そして蛍光スペクトルを得た。
【０１３０】
蛍光スペクトルおよびデータを、４８８ナノメートル（ｎｍ）の励起波長（excitation wavelength；ＥＸ）、４９０〜８００ｎｍの発光波長範囲（emission wavelength range；ＥＭ範囲）、５３２ｎｍのＥＸ、５５０〜８００ｎｍのＥＭ、高感度、および該ＥＸおよびＥＭ値で１．５のバンド幅を有するＲＦ５０００μ ＳｈｉｍａｄｚｕＴＭスペクトロフルオロフォトメーターを使用して得た。
【０１３１】
【表１２】
2006520612.tif 000013
【０１３２】
Ａ．アクリジンオレンジおよびアクリジンオレンジ／ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８組成物
データは、表１３に記載の色素、希釈液、およびＤＮＡサンプルを有する８つのサンプルについて得た。マルトシドはまた、スフェリング試薬として役立つ。
【０１３３】
【表１３】
2006520612.tif 000014
【０１３４】
ＲＮＡｓｅ処理細胞有りおよび無しのサンプルＡ〜Ｈの蛍光スペクトルを得た。５２６ｎｍでのシングルピークが各サンプルについて観察され、そして蛍光強度は経時的に減少した。ＲＮＡｓｅ処理細胞を含有したサンプルＡ〜Ｄについて、蛍光強度の減少が観察された。詳細には、ブロッキング剤を含有しなかったサンプルＡ〜Ｂについて、経時的に８．６％強度減少がサンプルＡについて見られ、そして６．３％減少がサンプルＢについて見られた。ブロッキング剤を含有したサンプルＣおよびＤについて、サンプルＡおよびＢと比較して、蛍光強度における顕著な減少が見られた（サンプルＣについては約１０倍低く、そしてサンプルＤについては約５倍低い）。蛍光強度はまた、サンプルＣ〜Ｄについて経時的に減少した（サンプルＡについて約８．６％減少、サンプルＢについて６．３減少、サンプルＣについて５２％減少、そしてサンプルＤについて約５１％減少）。サンプルＣおよびＤにおける結果は、ＲＮＡが、本発明の組成物によって優先的に染色されたことを示している。
【０１３５】
ＲＮＡｓｅを含まないＤＮＡ含有細胞について、ブロッキング剤を含有するサンプルＧ〜Ｈの自己蛍光は減少し（サンプルＧについて約１０倍低く、そしてサンプルＨについて約２．４倍低い）、それによって、蛍光強度の減少を例示している。更に、サンプルＦ〜Ｈの自己蛍光は経時的に変化しなかったが、サンプルＥおよびＨの自己蛍光は経時的に約３．８％減少したことがわかった。
【０１３６】
Ｂ．ＴｈｉａｚｏｌｅＴＭオレンジおよびＴｈｉａｚｏｌｅＴＭオレンジ／ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８組成物
データは、表１４に記載の色素、希釈液、および細胞を有する８つのサンプルについて得た。
【０１３７】
【表１４】
2006520612.tif 000015
【０１３８】
ＲＮＡｓｅ有りおよび無しの処理細胞のサンプルＩ〜Ｌの蛍光スペクトルを得た。５２６ｎｍでのシングルピークおよび蛍光強度における変化が、各サンプルについて観察された。サンプルＩ〜Ｊについて、蛍光強度は、最初の１分の後に増加し、そしてその後一定のままであった。しかし、サンプルＫ〜Ｌについての蛍光強度は、サンプルＩ〜Ｊと比較した場合、蛍光強度において顕著な減少を示した（サンプルＫについては約１０倍低く、そしてサンプルＬについては約７倍低い）。更に、サンプルＫ〜Ｌの蛍光強度は、経時的に減少することがわかった（サンプルＫについては３４．５％減少、そしてサンプルＬについては１２．１％減少）。サンプルＫおよびＬにおける結果は、ＲＮＡは、本発明の組成物によって優先的に染色されたことを示している。
【０１３９】
ＲＮＡｓｅ処理細胞を含有しなかったサンプルＭ〜Ｐは、自己蛍光を示さなかった。
【０１４０】
Ｃ．ＰｙｒｏｎｉｎＴＭＹおよびＰｙｒｏｎｉｎＴＭＹ／ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８組成物
データは、表１５に記載の色素、希釈液、およびＤＮＡ細胞を有する８つのサンプルについて得た。
【０１４１】
【表１５】
2006520612.tif 000016
【０１４２】
サンプルＱ〜Ｘの蛍光スペクトルを得た。５６３．２ｎｍでのシングルピークが各サンプルについて観察され、経時的に蛍光強度が減少した。ＲＮＡｓｅ処理細胞を含有したサンプルＱ〜Ｔについて、サンプルＱ〜Ｒと比較した場合、蛍光強度における顕著な減少が、サンプルＳ〜Ｔについて観察された（サンプルＳについて約１０倍低く、そしてサンプルＴについて約５倍低い）。サンプルＳおよびＴにおける結果は、ＲＮＡが本発明の組成物によって優先的に染色されたことを示している。ＲＮＡｓｅ処理細胞を含有しなかったサンプルＵ〜Ｘについて、サンプルＵ〜Ｖについての自己蛍光は同一であった。しかし、サンプルＷ〜Ｘについて、自己蛍光はより低く（サンプルＷについて約１０倍低く、そしてサンプルＸについて約２倍低い）、これは蛍光強度の減少を示した。
【０１４３】
Ｄ．ＬＤＳ７５１およびＬＤＳ７５１／ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３２５８組成物
データは、表１６に記載の色素、希釈液、およびＤＮＡ細胞を有する８つのサンプルについて得た。
【０１４４】
【表１６】
2006520612.tif 000017
【０１４５】
ＲＮＡｓｅ処理したＤＮＡ細胞有りおよび無しのサンプルＡＡ〜ＡＨの蛍光スペクトルを得た。７１０．４ｎｍでのシングルピークが得られた。サンプルＡＡについての蛍光強度は非常に低く、即ち、約１．３、そしてサンプルＡＤについては、サンプルＡＣについての蛍光強度よりも約３倍低かった。自己蛍光がサンプルＡＥ〜ＡＨについて観察されなかった。
【０１４６】
Ｅ．濃度研究
この実施例は、サンプルの細胞を着色する濃度の範囲での本発明の組成物の能力を議論する。詳細には、ＲＮＡｓｅ処理したＤＮＡ含有細胞への色素結合の効果を評価して、色素の結合特性および発光スペクトルを測定した。
【０１４７】
ＨＯ３３２５８ブロッキング剤のストック溶液を、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、４００μＭ、および８００μＭの濃度で調製した。同様に、ＡＯ、ＴＯ、またはＰＹから選択される色素を０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭおよび８μＭの濃度で含有する、ストック溶液を調製した。それによって、組成物を、各色素溶液と各ブロッキング剤ストック溶液とをそれぞれ１：１００の比で混合することによって調製した。この組成物へ、１μｌのマルトシドスフェリング試薬を添加した。
【０１４８】
データ（示さず）は、ＡＯ：ＨＯ組成物について、最適濃度が約２μＭ：２００μＭ〜約４μＭ：４００μＭであることを示した。８μＭ：８００μＭ溶液は濁り、そして発光波長は、約５２６．４から約５２８．０へ増加した。ＨＯ３３２５８を含有しなかった溶液について、即ち、ＡＯのみを使用した場合、発光波長は増加しなかった。
【０１４９】
ＴＯ：ＨＯ組成物について、８μＭ：８００μＭ溶液は濁り、そして約５２６．４ｎｍから５２８．０ｎｍへ発光波長の増加を示した。ＨＯ３３２５８を含有しなかった溶液について、即ち、ＴＯのみを使用した場合、発光波長は増加しなかった。
【０１５０】
ＰＹ：ＨＯ組成物について、最適作用範囲は、約２μＭ：２００μＭ〜約４μＭ：４００μＭであり、そして平衡が維持された。８μＭ：８００μＭ溶液は濁り、そして発光波長は、約５６３．２から約５６４．８へ増加した。ＨＯ３３２５８を含有しなかった溶液について、即ち、ＰＹのみを使用した場合、発光波長は増加しなかった。
【０１５１】
Ｆ．Ｈｏｅｃｈｓｔ当量研究
この実施例は、ＨＯ３３２５８ブロッキング剤と本発明の組成物中の他のブロッキング剤との比較を議論する。詳細には、ＤＡＰＩおよびＨＯ３３３４２を含むブロッキング剤を使用した。
【０１５２】
（ｉ）ＤＡＰＩブロッキング剤
組成物を、ＤＡＰＩストック溶液、ＡＯ、ＴＯ、またはＰＹを含有する色素ストック溶液、およびマルトシドスフェリング試薬もしくは水のいずれかを混合することによって調製した。次いで、これらのサンプルを、ＲＮＡｓｅでの処理有りおよび無しのトリＲＯＧ細胞へ添加し、そして該組成物の結合の効果を評価して、その結合特性を測定した。
【０１５３】
データ（示さず）は、ＲＮＡｓｅでの処理有りおよび無しのＤＮＡ含有細胞を、ＡＯ、ＤＡＰＩおよびマルトシドスフェリング剤もしくは水を含有する組成物で処理した場合、経時的な発光波長または蛍光強度のトレンドは見られなかったことを示した。しかし、発光波長は、ＲＮＡｓｅ処理されたＤＮＡ細胞についてより高かった（マルトシドスフェリング剤を含有する溶液について５２８ｎｍ、そして水を含有する溶液については５２９．６ｎｍ）。従って、これらのデータは、蛍光強度がＤＡＰＩの添加時に低下し（dampened）、しかしＨＯ３３２５８を使用した場合ほど多くは低下しなかったことを示している。
【０１５４】
これらのデータはまた、ＲＮＡｓｅ処理されたＤＮＡ細胞を、ＴＯ、ＤＡＰＩ、およびスフェリング剤を含有する組成物と混合した場合、発光波長は増加し、そして蛍光強度は経時的にトレンドを示さなかった。しかし、同様の細胞を、ＴＯ、ＤＡＰＩ、および水を含有する組成物で処理した場合、発光波長はトレンドを示さず、そして蛍光強度は経時的に増加した。
【０１５５】
これらのデータは、更に、ＲＮＡｓｅ処理したＤＮＡ含有トリ細胞を、ＰＹ、ＤＡＰＩ、およびスフェリング剤もしくはＨ２Ｏと混合した場合、発光波長においてもまたは蛍光強度においてもトレンドは経時的に観察されなかったことを示している。蛍光強度は、ＤＡＰＩの添加時に低下し、しかしＨＯ３３２５８が使用された場合ほど多くは低下せず、そしてこれらの組成物の自己蛍光よりも低かった。
【０１５６】
（ｉｉ）ＨｏｅｃｈｓｔＴＭ３３３４２ブロッキング剤
組成物を、ＨＯ３３３４２ストック溶液、ＡＯまたはＰＹを含有する色素ストック溶液、およびマルトシドスフェリング試薬もしくは水のいずれかを混合することによって調製した。次いで、これらのサンプルを、ＲＮＡｓｅでの処理有りおよび無しのＲＯＧ細胞へ添加し、そして細胞への組成物結合の効果を評価して、その結合特性を測定した。
【０１５７】
データ（示さず）は、ＲＮＡｓｅで処理されたＤＮＡ細胞を、ＡＯ、ＨＯ３３３４２、およびスフェリング剤もしくは水で処理した場合、蛍光強度における僅かな減少が観察されたことを示した。また、色素の自己蛍光を引いた（subtracting）後、ＨＯ３３３４２ブロッキング剤およびＨＯ３３２５８ブロッキング剤の蛍光強度は同様であったことがわかった。これらのデータはまた、ＲＮＡｓｅ処理されたＤＮＡ細胞がＡＯ、ＨＯ３３３４２、およびスフェリング剤もしくは水と混合された場合、発光波長においても蛍光強度においてもトレンドは経時的に観察されなかったことを示している。
【０１５８】
データは、更に、ＲＮＡｓｅ処理したＤＮＡリファレンストリ赤血球を、ＰＹ、ＨＯ３３３４２、およびスフェリング剤もしくはＨ２Ｏと混合した場合、発光波長におけるトレンドは経時的に見られなかったが、蛍光強度は、ＨＯ３３３４２の添加時に低下したことを示した。更には、変更されていないＤＮＡ含有トリ細胞について、発光波長においてもまたは蛍光においてもトレンドは経時的に観察されず、そしてＰＹおよびＰＹ／ＨＯ３３３４２組成物の自己蛍光は、ＲＯＧ細胞へ結合されていない場合のこれらの色素の蛍光強度よりも高かった。
【０１５９】
Ｇ．特異性研究
この実施例は、ＤＮＡリファレンストリ赤血球およびＲＮＡｓｅ処理細胞を使用しての、ＨＯ３３２５８ブロッキング剤を含有する本発明の組成物の特異性を議論する。
【０１６０】
ＨＯ３３２５８ブロッキング剤、マルトシドスフェリング剤、ならびにＡＯ、ＴＯ、およびＰＹから選択される色素を含有する組成物を、上述のように調製した。次いで、これらのサンプルを、ＲＮＡｓｅでの処理有りおよび無しのＤＮＡリファレンストリ細胞へ添加し、そして細胞への組成物結合の効果を評価して、結合特性を測定した。
【０１６１】
データは、ＡＯおよびＴＯ組成物を使用した場合、該処理細胞へのＲＮＡｓｅの添加時に蛍光強度に対する効果は無かったことを示している。しかし、ＰＹ色素を含有する組成物を使用した場合、より高い蛍光強度が見られた。
【０１６２】
Ｈ．スフェリング試薬浸透化研究
この実施例は、マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（グルコピラノシド  −  非イオン性洗浄剤）および両性洗浄剤３−１２を包含する種々のスフェリング試薬を含有する本発明の組成物の、ＲＮＡｓｅでの処理有りおよび無しの両方のＤＮＡリファレンス材料（ＲＯＧ細胞）へ結合する効果を評価する。
【０１６３】
ＨＯ３３２５８、ＡＯまたはＰＹから選択される色素、およびスフェリング剤を含有する組成物を、上述のように調製した。次いで、これらのサンプルを、ＲＮＡｓｅでの処理有りおよび無しのＤＮＡリファレンス細胞へ添加し、細胞への組成物結合の効果を評価して、結合特性を測定した。
【０１６４】
データ（示さず）は、各々異なるスフェリング剤を有する組成物全てが、組成物中に使用した色素および試験したＤＮＡ細胞に関わらず、同様の強度のピークを生じたことを示した。
【実施例５】
【０１６５】
実施例５
この実施例は、異なる比でＤＮＡリファレンス細胞およびＲＮＡｓｅ処理細胞へ結合することにおける本発明の組成物の効果を議論する。詳細には、本発明の組成物の結合特性および発光スペクトルを測定した。
【０１６６】
本発明の組成物を、表１７に記載されるように、ＩｓｏｆｌｏｗＴＭＡ３８希釈液中で、ＴＯ−ＰＲＯ−３ＴＭヨージド色素、Ｒ１色素およびＲ２色素を含む赤色色素と、ＯｒｃｅｉｎＴＭ色素、ＰｅｎｔｏｘｉｆｉｌｌｉｎｅＴＭ色素、ビス−ベンズイミド、ＰｈｌｏｘｉｎｅＴＭ色素、またはＱｕｉｎａｃｒｉｎｅＴＭ色素を含むブロッキング剤とを混合することによって調製した。次いで、表１７に記載の各混合物を、ＲＮＡを含有するサンプルへ添加し、そして該混合物を１〜５分間室温でインキュベートし、そして蛍光スペクトルを得た。表１７は、組成物の処方およびサンプル中で検出された％網状赤血球を提供している。蛍光スペクトルおよびデータは、慣用的な装置を使用して得た。
【０１６７】
【表１７】
2006520612.tif 000018
【０１６８】
これらのデータは、赤血球の非特異的染色が、１５０倍過剰量でＲ１赤色色素と組み合わせてのＰｈｌｏｘｉｎｅＴＭ色素の添加によって、約５７％減少されることを示している。
【０１６９】
上記で引用した全ての文献は、本明細書中で参考として援用される。本発明の組成物および方法は、本明細書に添付の特許請求の範囲によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１Ａ】図１Ａは、蛍光 対 光散乱をプロットするサイトグラムであり、第２非インターカレーティング色素／ブロッキング剤無しにＡＯ色素および浸透化剤で処理された網状赤血球のサンプル中の核酸（例えば、ＲＮＡ）からの蛍光シグナルを示す（上記の実施例３を参照のこと）。網状赤血球の同定は、サイトグラムの明るく染色された箇所と薄暗く染色された箇所との差異によって理解され得るように、ネガティブが終了しそしてポジティブが開始する箇所を測定する能力に依存する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、経時的な、図１Ａに示されるのと同一のサンプル中の核酸からの蛍光シグナルを示すサイトグラムである。明るい染色と薄暗い染色との間の識別ポイントは、分析時間に渡って変化している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、第一色素ＡＯ、第二色素（ブロッキング試薬）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８を含有する本発明の組成物と、浸透化剤（スフェリング剤）とで処理した網状赤血球のサンプル中の核酸からの蛍光シグナルを示すサイトグラムである。蛍光 対 前方散乱をプロットするこの図は、薄暗い網状赤血球（ＲＢＣネガティブ集団に近い）および明るい網状赤血球の総集団を実証している。上記の実施例３を参照のこと。本発明の使用は反応速度論を減少させ、インキュベーション時間を改善し、そしてサンプルのより正確な分析を可能にする。
【図１Ｄ】図１Ｄは、経時的な、図１Ｃにおけるような網状赤血球のサンプル中の核酸からの蛍光シグナルを示すサイトグラムである。この図は、一定のままである細胞タイプ間の識別の能力を実証している。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の組成物、即ち、第一色素ＡＯ、第二色素（ブロッキング試薬）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、および浸透化剤で処理したサンプル中の血小板およびＲＢＣの低角光散乱（前方散乱）を使用しての差異識別（differential discrimination）を示すサイトグラムである。このサンプル中、血小板抗体は使用しなかった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａ中におけるように染色されそして６７５〜７２５ｎｍの波長での蛍光について測定された、明るい蛍光性の血小板を示すサイトグラムである。本発明は、核酸を識別可能にする。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ｂにおけるように染色されそして６１０〜６７５ｎｍの波長での蛍光について測定された、明るい蛍光性の血小板を示すサイトグラムである。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｆは、スフェリング試薬（浸透化剤）のみ、第一色素および浸透化剤を含有する組成物、または第一色素、第二色素および浸透化剤を含有する組成物で処理したＲＯＧ細胞を比較するサイトグラムである。サイトグラムは、特に多数のより軽い質量の血小板のこれらの場合、ＲＯＧ細胞の種々の核酸成分の識別を増大することを示している。サンプルが血小板についてゲートされる（gated）場合、同様の結果が得られ得る（示さず）。図３Ａは、浸透化剤（スフェリング試薬）で処理されたＲＯＧ細胞中の血小板、ＲＢＣ、ＲＢＣダブレット（RBC doublets）およびＷＢＣの分布を示すサイトグラム（光散乱 対 光散乱）である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、第一色素（例えば、チアゾールオレンジ）および浸透化剤で処理されたＲＯＧ細胞中の血小板、ＲＢＣ、ＲＢＣダブレットおよびＷＢＣの分布を示すサイトグラム（光散乱 対 光散乱）である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、第一色素（例えば、チアゾールオレンジ）、第二色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ色素）および浸透化剤で処理されたＲＯＧ細胞中の血小板、ＲＢＣ、ＲＢＣダブレットおよびＷＢＣの分布を示すサイトグラム（光散乱 対 光散乱）である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、浸透化剤（スフェリング試薬）で処理されたＲＯＧ細胞中の血小板、ＲＢＣ、ＲＢＣダブレットおよびＷＢＣの分布を示すサイトグラム（光散乱 対 蛍光）である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、第一色素（例えば、チアゾールオレンジ）および浸透化剤で処理されたＲＯＧ細胞中の血小板、ＲＢＣ、ＲＢＣダブレットおよびＷＢＣの分布を示すサイトグラム（光散乱 対 蛍光）である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、第一色素（例えば、チアゾールオレンジ）、第二色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ色素）および浸透化剤で処理されたＲＯＧ細胞中の血小板、ＲＢＣ、ＲＢＣダブレットおよびＷＢＣの分布を示すサイトグラム（光散乱 対 蛍光）である。
【図１Ａ】
2006520612.tif 000019
【図１Ｂ】
2006520612.tif 000020
【図１Ｃ】
2006520612.tif 000021
【図１Ｄ】
2006520612.tif 000022
【図２Ａ】
2006520612.tif 000023
【図２Ｂ】
2006520612.tif 000024
【図２Ｃ】
2006520612.tif 000025
【図３Ａ】
2006520612.tif 000026
【図３Ｂ】
2006520612.tif 000027
【図３Ｃ】
2006520612.tif 000028
【図３Ｄ】
2006520612.tif 000029
【図３Ｅ】
2006520612.tif 000030
【図３Ｆ】
2006520612.tif 000031
【国際調査報告】
2006520612.tif 000032