(57)【要約】本発明は、染色体遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣの少なくと１つの中に突然変異を有する、細菌内のの変更されたプラスミド含有量の獲得方法、ならびにプラスミドのレベルを変えることができる、個々にまたは様々な実現しうる組み合わせの変異染色体遺伝子をもつその細菌株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣの少なくとも１つに突然変異を有する細菌内の変更されたプラスミド含有量を得る方法であって、以下のステップ：
（ａ）宿主細菌の上記染色体遺伝子中に突然変異を導入し、
（ｂ）上記細菌内の条件付きレプリコン上に上記染色体遺伝子の機能性のコピーを維持し、
（ｃ）細胞内複製および条件付きレプリコンの維持を許容する条件下で上記細菌を培養し、
（ｄ）上記条件付きレプリコンのさらなる細胞内複製を許容しない制限条件下に上記細菌を移し、
（ｅ）許容条件下と制限的条件下の細菌内のプラスミドベクターのレベルを評価し、そして
（ｆ）上記遺伝子による、許容条件下と制限的条件下との細菌内のプラスミドベクターのレベルの違いを計算する、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ｎｕｓＧ遺伝子が、同族アミノ酸でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらす、１４６番コドンでのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｒｈｏ遺伝子が、同族アミノ酸でのアラニンからグルタミン酸塩への置換をもたらす、２４３番コドンでのＧＣからＴＡへのトランジション突然変異を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｄｎａＣ遺伝子が、同族アミノ酸でのアラニンからスレオニンへの置換をもたらす、８３番コドンでのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
腸内細菌科の細菌が宿主細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
好ましくは、宿主細菌がＥ．コリである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
好ましくは、前記プラスミドベクターが、ＣｏｌＥ１由来プラスミドおよびｐ１５Ａ由来プラスミドを含む群由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣｏｌＥ１由来プラスミドが、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＵＣシリーズのプラスミド、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズのプラスミド、およびその誘導体を含む不和合性群のメンバーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐ１５Ａ由来プラスミドが、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４およびｐＡＣＹＣ１７７、ならびにその誘導体を含むｐ１５Ａ不和合性群のメンバーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｎｕｓＧ遺伝子の突然変異が、プラスミドのレベルの上昇をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｒｈｏ遺伝子の突然変異が、プラスミドのレベルの上昇をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｄｎａＣ遺伝子の突然変異が、プラスミドのレベルの低下をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミドのレベルの違いが約１０倍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記条件付きレプリコンが、プラスミドｐＨＹＤ７５１、ｐＨＹＤ７６３、およびｐＨＹＤ１２０１を含む群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記条件付きレプリコンが、個々のまたは実現しうる組み合わせの、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣを含む非突然変異遺伝子を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
所望のレベルで着目の遺伝子を獲得するのに役立つ、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
英国スコットランドのNCIMB Limitedに寄託された登録番号ＮＣＩＭＢ４１１３２の遺伝子型MC4100 nusG argE86::Tn10 dnaC zjj901::Tn10dKanのＥ．コリ株。
【請求項１８】
前記菌株が、Ｐ１ファージ形質導入によるｎｕｓＧと約２５％関連したargE86::Tn10突然変異に従って、コードされたタンパク質の同族アミノ酸の位置でグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらす、ｎｕｓＧ染色体遺伝子の１４６番コドンにおけるＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を担持する、請求項１７に記載の菌株。
【請求項１９】
前記菌株が、Ｐ１ファージ形質導入によるｄｎａＣと約８８％関連したzjj-901::Tn10dKan挿入に従って、コードされたタンパク質の同族アミノ酸の位置でアラニンからスレオニンへの置換をもたらす、ｄｎａＣ染色体遺伝子の８３番コドンにおけるＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を担持する、請求項１７に記載の菌株。
【請求項２０】
プラスミドｐＨＹＤ７５１。
【請求項２１】
前記プラスミドが、ｎｕｓＧ遺伝子のＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）依存性条件付きレプリコンである、請求項２０に記載のプラスミド。
【請求項２２】
プラスミドｐＨＹＤ７６３。
【請求項２３】
前記プラスミドが、ｎｕｓＧ遺伝子の温度感受性条件付きレプリコンである、請求項２２に記載のプラスミド。
【請求項２４】
プラスミドｐＨＹＤ１２０１。
【請求項２５】
前記プラスミドが、ｒｈｏ遺伝子の温度感受性条件付きレプリコンである、請求項２４に記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細菌細胞中の高いプラスミド含有量、そしてプラスミドＤＮＡの高い収量、または宿主細菌細胞の低いプラスミド含有量を可能にするプラスミドＤＮＡの処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドは細菌の安定した染色体外遺伝因子であり、それは通常（しばしば、数キロ・ベースペア［ｋｂ］サイズの）環状ＤＮＡから成っており、そして細菌細胞内において自律増殖が可能である。組み換えＤＮＡ技術の出現により、プラスミドは、細菌宿主細胞内への外来ＤＮＡの導入および維持のための担体またはベクターとしての種々の処理における用途を増した。最近になって、プラスミドが、医療行為および獣医学診療におけるＤＮＡワクチンの形態で、製品としても重要になっている。そのような適用のほとんどで、細菌宿主はエッシェリシア・コリ（Escherichia coli）である。
【０００３】
プラスミドに関して重要な特徴は、細菌細胞内でのそれらのコピー数調節である。普通の成長条件下で、各々のプラスミドは、プラスミドＤＮＡの複製を制御するフィードバック調節ループの働きによって細胞の特有のコピー数にて維持される。バイオテクノロジーに広く利用されるプラスミドの１つのクラスは、天然のプラスミドＣｏｌＥ１、ｐ１５Ａ、ＲＳＦ１０３０、ＣｌｏＤＦ１３およびｐＭＢ１、ならびにクローニングベクターｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７およびプラスミドのｐＵＣおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズを含む「ＣｏｌＥ１様」プラスミドである。Ｅ．コリ中のＣｏｌＥ１様プラスミドの複製において、フィードバック調節ループは、複製を活性化する、プラスミドに特異的なＲＮＡ種（ＲＮＡ−ＩＩ）、ならびに複製を抑えるように作用する、２次プラスミドに特異的なＲＮＡ種（ＲＮＡ−Ｉ）とタンパク質（Ｒｏｐ）に関与する［Polisky (1988年) Cell 55:929-932］。
【０００４】
−上流及び下流の両方への−プラスミドのコピー数の変異は、以下に簡単に記載の通り、先行技術において関係フィードバック調節ループの操作によって達成されると考えられた。プラスミド・コピー数を増やすための操作は、当業者の目的が、（ｉ）例えば、日常的な組み換えＤＮＡ実験で、またはＤＮＡワクチンの製造で、培養物からのプラスミドＤＮＡの収量を増やすこと；（ｉｉ）あるいはプラスミドに保持された遺伝子によってコードされた産物の発現を高めることの場合、一般的に望ましい。
【０００５】
プラスミド・コピー数の増加は、フィードバック制御サーキット不活化する突然変異によって（例えば、一般に使用される非常に高いコピー数をもつＣｏｌＥ１由来のｐＵＣシリーズのプラスミドベクター、例えばｐＵＣ１８かｐＵＣ１９の存在）、またはランナウェイ・プラスミド複製システムと呼ばれた誘導方法［Lin-Chao et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:3385-3393; Nordstrom及びUhlin (1992) Bio/Technology 10:661-666］によって構成的に達成された。
【０００６】
プラスミド・コピー数を減少させるための操作は、プラスミド上に保持された遺伝子が宿主細菌細胞に投与量依存的な増殖の問題点を有する状況下で有益である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の染色体遺伝子、ｐｃｎＢの突然変異が、おそらくプラスミド複製の負の制御に関係しているＲＮＡ−Ｉ転写産物の安定化を通して、ＣｏｌＥ１由来およびｐ１５Ａ由来プラスミドのコピー数を減らすことが示された［Lopilato et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:285-290］。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的
【０００８】
本発明の主な目的は、少なくとも１つの染色体遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣ中に突然変異を有する細菌内の変異プラスミド含有量の獲得方法を開発することである。
本発明の他の主な目的は、遺伝子ｎｕｓＧの突然変異がプラスミド・レベルの上昇をもたらす方法を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、遺伝子ｒｈｏの突然変異がプラスミド・レベルの上昇をもたらす方法を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、遺伝子ｄｎａＣの突然変異がプラスミド・レベルの低下をもたらす方法を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、プラスミド・レベルの違いが約１０倍であるプラスミド・レベルの変更方法を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、MC4100 nusG argE86::Tn10 dnaC zjj901::Tn10dKanの遺伝子型をもつＥ．コリ株を開発することである。
【０００９】
本発明のさらに他の主な目的は、コードされたタンパク質の同族アミノ酸部位でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらすｎｕｓＧ遺伝子の１４６番コドンに突然変異があるＥ．コリ株を開発することである。
本発明のさらなる目的は、コードされたタンパク質の同族アミノ酸部位でのアラニンからグルタミン酸塩への置換をもたらすｒｈｏ遺伝子の２４３番コドンに突然変異があるＥ．コリ株を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、コードされたタンパク質の同族アミノ酸部位でのアラニンからスレオニンへの置換をもたらすｄｎａＣ遺伝子の８３番コドンに突然変異があるＥ．コリ株を開発することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、個々にまたは実現しうる様々な組み合わせで、条件付きのレプリコン・プラスミド、ｐＨＹＤ７５１、ｐＨＹＤ７６３、およびｐＨＹＤ１２０１により形質転換したＥ．コリ株を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、ｎｕｓＧ遺伝子のＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）依存性条件付きレプリコン・プラスミドとしてのｐＨＹＤ７５１を開発することである。
本発明のさらに他の目的は、ｎｕｓＧ遺伝子の温度感受性条件付きレプリコンとしてのｐＨＹＤ７６３プラスミドを開発することである。
本発明のさらに他の目的は、ｒｈｏ遺伝子の温度感受性条件付きレプリコンとしてのｐＨＹＤ１２０１プラスミドを開発することである。
【００１１】
本発明の概要
本発明は、染色体遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣの少なくとも１つの中に突然変異を有する、細菌内の変更されたプラスミド含有量の獲得方法、ならびにプラスミド・レベルを変えることができる、個々にまたは実現しうる様々な組み合わせで前記変異染色体遺伝子を有するその細菌株に関する。
【００１２】
本発明の詳細な説明
したがって、本発明は、染色体遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣの少なくとも１つに突然変異をもつ、細菌内の変更されたプラスミド含有量の獲得方法、ならびにプラスミド・レベルを変えることができる、個々にまたは実現しうる様々な組み合わせで変異染色体遺伝子を有する細菌株に関する。
【００１３】
本発明、染色体遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣの少なくとも１つの中に突然変異を有する、細菌内の変更されたプラスミド含有量の獲得方法の態様において、前記方法は、以下のステップ：
（ａ）宿主細菌の上記染色体遺伝子の中に突然変異を導入し、
（ｂ）上記細菌中の条件付きレプリカ上に、上記染色体遺伝子の機能性コピーを維持し、
（ｃ）細胞内複製を許容し、かつ、条件付きレプリカを維持する条件下で上記細菌を培養し、
（ｄ）細菌を条件付きレプリカのさらなる細胞内複製を許さない制限された条件に移し、
（ｅ）許容条件下と制限条件下の両方で細菌内のプラスミドベクター・レベルを評価し、そして
（ｆ）上記遺伝子の、許容条件下と制限条件下の上記細菌内のプラスミドベクター・レベルの違いを計算する、
を含む。
【００１４】
本発明の他の態様において、ｎｕｓＧ遺伝子は、同族アミノ酸のグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらす、１４６番コドンでのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を示す。
本発明のさらに別の態様において、ｒｈｏ遺伝子は、同族アミノ酸のアラニンからグルタミン酸塩への置換をもたらす、２４３番コドンのＧＣからＴＡへのトランジション突然変異を示す。
本発明のさらに別の態様において、ｄｎａＣ遺伝子は、同族アミノ酸のアラニンからスレオニンへの置換をもたらす、８３番コドンのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を示す。
本発明のさらに別の態様において、腸内細菌（Enterobacteriaceae）ファミリーの細菌が宿主細菌である。
本発明のさらに別の態様において、宿主細菌は好ましくはＥ．コリである。
【００１５】
本発明のさらに別の態様において、プラスミドベクターは、好ましくはＣｏｌＥ１由来プラスミドと、ｐ１５Ａ由来プラスミドを含む群からである。
本発明のさらに別の態様において、ＣｏｌＥ１由来プラスミドは、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＵＣシリーズのプラスミド、pBluescriptシリーズのプラスミド、およびその誘導体を含む、不和合性群のメンバーである。
本発明のさらに別の態様において、前記ｐ１５Ａ由来プラスミドが、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４およびｐＡＣＹＣ１７７、ならびにその誘導体を含むｐ１５Ａ不和合性群のメンバーである。
本発明のさらに別の態様において、ｎｕｓＧ遺伝子の突然変異がプラスミド・レベルの上昇をもたらす。
本発明のさらに別の態様において、ｒｈｏ遺伝子の突然変異がプラスミド・レベルの上昇をもたらす。
本発明のさらに別の態様において、ｄｎａＣ遺伝子の突然変異がプラスミド・レベルの低下をもたらす。
【００１６】
本発明のさらに別の態様において、プラスミド・レベルの違いが約１０倍である。
本発明のさらに別の態様において、条件付きレプリカは、プラスミドｐＨＹＤ７５１、ｐＨＹＤ７６３、およびｐＨＹＤ１２０１を含む群から選ばれる。
本発明のさらに別の態様において、条件付きレプリカは、個々にまたは実現しうる様々な組み合わせで、ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣを含む突然変異なしの遺伝子を示す。
本発明のさらに別の態様において、前記方法は、所望のレベルで着目の遺伝子を得る助けとなる。
本発明のさらに別の態様において、登録番号ＮＣＩＭＢ４１１３２の、遺伝子型MC4100 nusG argE86::Tn10 dnaC zjj901::Tn10dKanのＥ．コリ株を、NCIMB Limited, Scotland, U.K.に寄託した。
【００１７】
本発明のさらに別の態様において、前記菌株は、ファージＰ１形質導入によってｎｕｓＧに約２５％関連したargE86::Tn10突然変異にしたがって、コードされたタンパク質の同族アミノ酸位置でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらす、ｎｕｓＧ染色体遺伝子の１４６番コドンのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を担持する。
本発明のさらに別の態様において、前記菌株は、ファージＰ１形質導入によってｄｎａＣに約８８％関連したzjj-901::Tn10dKan突然変異にしたがって、コードされたタンパク質の同族アミノ酸位置でのアラニンからスレオニンへの置換をもたらす、ｄｎａＣ染色体遺伝子の８３番コドンのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を担持する。
本発明のさらに別の態様において、プラスミドは、ｐＨＹＤ７５１である。
本発明のさらに別の態様において、プラスミドは、ｎｕｓＧ遺伝子のＩＰＴＧ（イソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）依存性条件付きレプリコンである。
本発明のさらに別の態様において、プラスミドは、ｐＨＹＤ７６３である。
【００１８】
本発明のさらに別の態様において、前記プラスミドは、ｎｕｓＧ遺伝子の温度感受性条件付きレプリコンである。
本発明のさらに別の態様において、プラスミドは、ｐＨＹＤ１２０１である。
本発明のさらに別の態様において、前記プラスミドは、ｒｈｏ遺伝子の温度感受性条件付きレプリコンである。
本発明の他の態様において、先に触れた先行技術の進歩にもかかわらず、ＤＮＡワクチンとしてのプラスミドの使用によって課せられる収量の要望としても、プラスミド・ベースの組み換えＤＮＡ技術の幅広い適用を考えると、プラスミドＤＮＡコピー数と収量の上げるまたは下げる、追加のおよび改善された手法に対する必要性が存在し続ける。
【００１９】
本発明の他の態様において、新規方法は、以下の遺伝子、ｎｕｓＧ、ｒｈｏまたはｄｎａＣの少なくとも１つの中に突然変異を有する菌株の利用によって、宿主細菌細胞内のプラスミドＤＮＡ含有量と、宿主細菌細胞からの収量の改変のために我々が構築した。好ましくは、細菌細胞は、腸内細菌・ファミリー、例えば大腸菌、に属する細菌である。ｎｕｓＧおよびｒｈｏ遺伝子産物は、細菌細胞内の転写停止および／または抗停止反応に関係し［Sullivan et al. (1992) Cell 68:989-994; Martinez et al. (1996) J. Mol. Biol. 257:895-908］、一方で、ｄｎａＣ遺伝子産物は、生体内で染色体およびプラスミドＤＮＡの複製に加わる［Marians (1996) "Replication Fork Progression", in Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology, 2edition" (Neidhardt et al., eds), ASM Press, Washington D.C., USA, Chapter 50, pp. 749-763］。同族の宿主細菌細胞内のプラスミドＤＮＡ含有量、および同族の宿主細菌細胞からの収量の改変のためにこれらの遺伝子のいずれかにおける突然変異を利用した方法の先行技術の中での記載が存在しなかった。
本発明の他の態様において、本発明の１つの側面は、ｎｕｓＧ遺伝子の突然変異により宿主細菌細胞内のプラスミドのコピー数を増やす方法を特色とする。
【００２０】
本発明の他の態様において、本発明は、
（ｉ）宿主細菌細胞が、ｎｕｓＧ染色体遺伝子における突然変異を担持し、
（ｉｉ）上記細胞が、条件付きレプリコン上の機能性ｎｕｓＧ+遺伝子を同様に担持し、
（ｉｉｉ）上記細菌を、細胞内複製、かつ、条件付きレプリコンの維持を許容する条件下で培養し、そして
（ｉｖ）培養物を、上記条件付きレプリコンのさらなる複製を許容しない制限的条件に移す、
プラスミドのコピー数を増やすための方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の態様において、本発明は、ｒｈｏ遺伝子の突然変異を用いて、宿主細菌細胞内でプラスミドのコピー数を増やす方法を提供する。
本発明の他の態様において、本発明は、以下のステップ：
（ｉ）宿主細菌細胞が、ｒｈｏ染色体遺伝子における突然変異を担持し、
（ｉｉ）上記細胞が、条件付きレプリコン上の機能性ｒｈｏ+遺伝子を同様に担持し、
（ｉｉｉ）上記細菌を、細胞内複製、および条件付きレプリコンの維持を許容する条件下で培養し、そして
（ｉｖ）培養物を、上記条件付きレプリコンのさらなる複製を許容しない制限的条件に移す、
を含むプラスミドのコピー数を増やす方法を提供する。
本発明の他の態様において、本発明は、ｄｎａＣ遺伝子における突然変異を用いた、宿主細菌細胞内でのプラスミド・コピー数、および宿主細菌細胞からの収量を減少させる方法を提供する。
本発明の他の態様において、本発明の好ましい側面は、ＣｏｌＥ１由来プラスミドとｐ１５Ａ由来プラスミドへのその適応性である。
【００２２】
本発明の他の態様において、本明細書中に使用される場合、「ＣｏｌＥ１由来プラスミド」は、ＣｏｌＥ１不和合性群のメンバー・プラスミドであり、そして、例えばプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２９、ｐＵＣシリーズのプラスミド、およびpBluescriptシリーズのプラスミド、ならびにその誘導体を含む。
本発明の他の態様において、本明細書中に使用される場合、「ｐ１５Ａ由来プラスミド」は、ｐ１５Ａ不和合性群のメンバー・プラスミドであり、そして、例えばプラスミドｐＡＣＹＣ１８４およびｐＡＣＹＣ１７７、ならびにその誘導体を含む。
本発明の他の態様において、本明細書中に使用される場合、「条件付きレプリコン」は、「許容状態」と言われる細菌培養物の増殖するある条件下、宿主細菌細胞内で自律増殖が可能な、しかし「制限的」と言われる、ある他の培養条件下自律増殖不可能な、染色体外の遺伝子要素である。
【００２３】
本発明の他の態様において、別段の規定のない限り、本明細書中に使用される技術用語および科学用語は、本願発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を持つ。不一致の場合には、規定を含む当該出願が統制する。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許、および他の参考文献が本明細書中に援用される。
本発明の他の態様において、本明細書中に記載される方法および材料に類似するか、または同じものが本発明の実施および試験に使用されうるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は、一例に過ぎず、制限することを目的としていない。
本発明の他の態様において、完全な開示の要求にしたがって、本願発明の以下の菌株を、当該出願の出願日前に、ブダペスト条約規則の下で、the NCIMB Ltd., 23 St Machar Drive, Aberdeen AB24 3RY, Scotland, United Kingdom, under the Budapest Treaty Rulesに寄託した。寄託は、２００２年５月２４日に、登録番号ＮＣＩＭＢ４１１３２のもとに、エッシェリシア・コリ（Escherichia coli）株ＧＪ３１５８としてなされる。ＧＪ３１５８株は、ファージＰ１を介在した形質導入のいくつかのステップによってＭＣ４１００株から構築された。ＧＪ３１５８株の遺伝子型を以下に記載する。
【００２４】
本発明の他の態様において、種々の組み換えＤＮＡ処理におけるプラスミドの広範囲にわたる利用は、宿主細菌細胞内のそのようなプラスミドのコピー数を、上流および下流の両方で、操作するさらなる新しい、そして改善された方法の必要性を生み出した。プラスミドＤＮＡ含有量を増やす方法は、ＤＮＡワクチンの工業的製造の状況において特に有用でもある。したがって、本発明は、宿主細菌細胞内のプラスミドＤＮＡ含有量を増やす、および減らすいくつかの方法を提供する。これらの方法は、本明細書中に記載したｎｕｓＧ、ｒｈｏ、またはｄｎａＣ遺伝子の突然変異による細菌細胞のある新規特性の発見に基づく。
本発明の他の態様において、当該技術分野において、エッシェリシア・コリは、様々な組み換えＤＮＡ処理のために好ましい宿主細菌であり；そしてＣｏｌＥ１由来プラスミドとｐ１５Ａ由来プラスミドは、これらの処理に利用される好ましいプラスミドベクターの１つである。ＤＮＡワクチンの製造において、宿主細菌細胞の高いプラスミド・コピー数に通じる（複製プライマーＲＮＡ−ＩＩ内の）ある突然変異、および／または（小さいタンパク質の所定のＲｏｐまたはＲｏｍをコードする遺伝子の）削除を持つＣｏｌＥ１由来プラスミド、例えばｐＵＣまたはpBluescriptシリーズのプラスミドの誘導体が好ましい。
【００２５】
本発明の他の態様において、宿主細菌としてのＥ．コリの使用が本発明の好ましい側面でもある。同様に、ＣｏｌＥ１由来プラスミドとｐ１５−Ａ由来プラスミドの使用は、本発明の他の好ましい側面である。本発明のさらに好ましい側面は、ＲＮＡ−ＩＩ中の突然変異、および／またはＲｏｍの欠失を有する非常に高いコピー数のＣｏｌＥ１由来プラスミド、例えばｐＵＣまたはpBluescriptシリーズのプラスミドの使用である。
本発明の他の態様において、本発明の１つの側面によると、ｎｕｓＧ突然変異は、コードされたタンパク質の機能を低下させるものである。以下の実施例１は、その宿主細菌細胞内でｐ１５Ａ由来プラスミド、ｐＡＣＹＣ１８４との組み合わせによって、コードされたタンパク質の同族アミノ酸の位置でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらすｎｕｓＧ染色体遺伝子の１４６番コドンにおけるＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を有するＥ．コリ宿主細菌の利用に関する本発明のこの側面を説明する。ｎｕｓＧにコードされたタンパク質の同じ変異が、当該技術分野に知られている種々の方法のいずれかによっても得られることができ、そしてｎｕｓＧの他の突然変異か、ｐＡＣＹＣ１８４以外のプラスミド誘導体が類似した結果を期待して当業者に使用されることに留意。
【００２６】
本発明の他の態様において、本発明の他の側面によると、ｎｕｓＧ染色体に突然変異を有する宿主細菌細胞は、機能性ｎｕｓＧ+遺伝子を伴う条件付きレプリコンをも担持する。前記方法に含まれるステップは、最初に、細菌を細胞内複製および条件付きレプリコンの維持を許容する条件下で培養するステップ、その後続いて上記培養物を上記条件付きレプリコンのさらなる複製を許さない制限的な条件下でインキュベートするステップを含む。以下の実施例２は、プラスミドｐＨＹＤ７６３、ｎｕｓＧ+を有する温度感受性条件付きレプリコンの構築、そしてｐ１５Ａ由来プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のプラスミド含有量を操作するための、コードされたタンパク質の同族のアミノ酸の位置でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらすｎｕｓＧ染色体遺伝子の１４６番コドンでのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を有する宿主細菌細胞におけるその利用を説明する。以下の実施例３は、プラスミドｐＨＹＤ７５１、その複製が培地中のイソプロピル  β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の存在に依存するｎｕｓＧ+を伴う条件付きレプリコンの構築、そしてｐＵＣシリーズのプラスミドの１つ、ｐＵＣ４Ｋのプラスミド含有量を操作するための、コードされたタンパク質の同族のアミノ酸の位置でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらすｎｕｓＧ染色体遺伝子の１４６番コドンでのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を有する宿主細菌細胞におけるその利用を説明する。あるいは、先行技術の教示に基づき、無発現変異またはノックアウト突然変異を含むｎｕｓＧの他の染色体突然変異、ｐＨＹＤ７６３またはｐＨＹＤ７５１に相当するプラスミドを構築する他の方法、ｎｕｓＧ+遺伝子を伴う他の条件付きレプリコン、あるいはｐＡＣＹＣ１８４またはｐＵＣ４Ｋ以外のプラスミドが、本発明のこれらの側面の実施に当業者によって利用されることに留意。
【００２７】
本発明の他の態様において、ｒｈｏ突然変異は、コードされたタンパク質の機能を低下させる突然変異である。以下の実施例４は、その宿主細菌細胞内にｐ１５Ａ由来プラスミドｐＡＣＹＣ１８４との組み合わせで、Ｅ．コリ宿主細菌のｒｈｏ−４突然変異の使用を含む、本発明のこの側面の実施の１つの実施例を説明する。ｒｈｏの他の突然変異、またはｐＡＣＹＣ１８４以外のプラスミド誘導体が、似通った結果を期待して当業者によって利用されることに留意。
【００２８】
本発明の他の態様において、本願発明のさらに他の態様によると、ｒｈｏ染色体の突然変異を有する宿主細菌細胞は、機能性ｒｈｏ+遺伝子を伴う条件付きレプリコンを担持する。前記方法に含まれたステップは、最初に、細菌を細胞内複製と条件付きレプリコンの維持を許容する条件下で培養するステップ、その後続いて上記培養物を条件付きレプリコンのさらなる複製を許容しない制限的条件下でインキュベートするステップを含む。以下の実施例５は、ｐ１５Ａ由来プラスミドｐＡＣＹＣ１８４のプラスミド含有量を操作するための、ｒｈｏ−４染色体の突然変異を有する宿主細菌細胞における、ｒｈｏ+を伴う温度感受性条件付きレプリコン、プラスミドｐＰＭｒｈｏＣａｍの利用について説明する。以下の実施例６は、プラスミドｐＨＹＤ１２０１、その複製が培地中のＩＰＴＧの存在に依存するｒｈｏ+を伴う条件付きレプリコンの構築、そしてｐＵＣシリーズのプラスミドの１つ、ｐＵＣ４Ｋのプラスミド含有量を操作するための、ｒｈｏ−４染色体突然変異の宿主細菌細胞におけるその利用を説明する。先行技術の教示に基づき、無発現変異またはノックダウン突然変異を含むｒｈｏにおける他の染色体変異、ｐＨＹＤ１２０１に相当するプラスミドの構築のための他の方法、ｒｈｏ+を伴う他の条件付きレプリコン、あるいはｐＡＣＹＣ１８４またはｐＵＣ４Ｋ以外のプラスミドが、本発明のこれらの側面の実施に当業者によって利用されることに留意。
【００２９】
本発明の他の態様において、ｄｎａＣ遺伝子中のミスセンス突然変異を提供する。以下の実施例７は、その宿主細菌細胞内、以下のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２９、またはｐＵＣ１９との組み合わせで、コードされたタンパク質の同族アミノ酸の位置でのアラニンからスレオニンへの置換をもたらすｄｎａＣ染色体遺伝子の８３番コドンでのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を有するＥ．コリ宿主細菌の利用を含む本発明のこの側面の実施の１つの実施例について説明する。ｄｎａＣにコードされたタンパク質の同じ変異が当該技術分野に知られている種々の方法のいずれかによっても得られ、およびｄｎａＣにおける他の突然変異、あるいはｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２９、またはｐＵＣ１９以外のプラスミド誘導体が、似通った結果を期待されて当業者によって利用されることに留意。
【００３０】
本発明の他の態様において、プラスミド遺伝子によってコードされた産物の発現を増やして、そして高いコピー数のある遺伝子に関係する中毒性を減らすために、本発明に記載の処理はプラスミドＤＮＡの収量を増やすために使用される。
本発明の他の態様において、挙げられた実施例は、本願発明において特許請求される用途、処理、および産物、例えばベクターおよび菌株の単なる説明に過ぎず、本発明の実施自体は、記載の実施例に、または実施例によって制限されない。同じ発明の追加の設定、および／またはそれによる実施にまで減らされる代替手段は、当該技術分野ですでに知られ、そして確立された材料および処理を伴う変異によって達成されるであろう。ｎｕｓＧ、ｒｈｏ、およびｄｎａＣ遺伝子のオルソロガスが、種々のグラム陰性菌およびグラム陽性菌で確認されたことも、この状況において留意のこと。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例において、以下の材料および方法を、全体を通して使用した：
１．実施例で使用した大腸菌株の遺伝子型を以下の表中に挙げる。
【００３２】
【表１】
2006501837.tif 000002
【００３３】
菌株ＣＡＧ１８４３１、ＣＧＳＣ５０７２、ＪＢＫ２４６、およびＭＣ４１００は、Coli Genetic Stock Center, 830 Kline Biology Tower, MCD Biology Department（266 Whitney Ave., P.O. Box 20813, Yale University, New Haven, Conn. 06520-8193, USA）から入手可能である。ＭＣ４１００ recA::Kan菌株は、School of Biological Sciences, Madurai Kamaraj University（Madurai 625 014, India）のR. Jayaraman教授から入手した。菌株ＧＪ３１５８は、NCIMB Ltd, Scotlandに、登録番号ＮＣＩＭＢ４１１３２として寄託した本願発明の菌株である。先に挙げた他の菌株は、実施例において説明される。
【００３４】
２．バクテリオファージＰ１を、Dept. of Microbiology and Immunology, University of Melbourne（Parkville, Victoria 3052, Australia）のA. J. Pittard教授から入手し、そしてＮＣＣＢ／ＣＢＳ（The Netherlands Culture Collection of Bacteria）（P.O. Box 85167, 3508 AD Utrecht, the Netherlands（http://www.cbs.knaw.nl/Nccb））からも入手可能である。Ｅ．コリのゲノムのオーダードλファージ・ライブラリのバクテリオファージλのクローン５５６は、Dept. of Biology, Faculty of Science, Kobe University（Japan）のK. Isono博士から入手し、そしてKoharaらの[Cell (1987) 50:495-508]に記載されている；それは、先に示したのと同じアドレスのＮＣＣＢ／ＣＢＳ（The Netherlands Culture Collection of Bacteria）から入手可能である。
【００３５】
３．プラスミドｐＣＬ１９２０とｐＣＬ１９２１は、Dept. of Biochemistry, UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School（Piscataway, 08854-5635, USA）のM. Inouye博士から入手し、そしてLerner and Inouyeの[Nucleic Acids Res. (1990) 15:4631]に記載される；これらの２つのプラスミドは、先に示したのと同じアドレスのＮＣＣＢ／ＣＢＳ（The Netherlands Culture Collection of Bacteria）から入手可能である。プラスミドｐＡＭ３４は、Centre de Recherche de Biochimie et de Genetique Cellulaires, CNRS（31062 Toulouse, France）のJ. P. Bouche博士から入手し、そしてGil and Boucheの[Gene (1991) 105:17-22]に記載される；それは、the American Type Culture Collection (ATCC)（P.O. Box 1549, Manassas, Va. 20108, USA）においても入手可能である。プラスミドｐＭＡＫ７０５は、Dept. of Genetics, University of Georgia（Athens, Ga. 30602, USA）のS. R. Kushner博士から入手し、Hamiltonらの[J. Bacteriol. (1989) 171:4617-4622]に記載される。プラスミドｐＵＣ４Ｋは、先に示したのと同じ住所のS. R. Kushner博士から入手し、そしてそれは、Amersham Biosciences Inc.（800 Centennial Avenue, P.O. Box 1327, Piscataway, N.J. 08855-1327, USA）からも入手可能である。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２９、およびｐＵＣ１９は、それぞれChang and Cohenの(1978) J. Bacteriol. 134:1141-1156、Covarrubias and Bolivarの(1982) Gene 17:79-89、およびYanisch-Perronらの(1985) Gene 33:103-119に記載され；これらの３つのプラスミド全てが、先に示したそれらのそれぞれの住所のthe American Type Culture Collection (ATCC)およびthe NCCB/CBSから入手可能であり；プラスミドｐＡＣＹＣ１８４とｐＵＣ１９は、New England Biolabs Inc.（32 Tozer Road, Beverly, Mass. 01915-5599, USA）からも入手可能である。プラスミドpBluescriptＩＩ−ＫＳは、Stratagene Inc.（11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, Calif. 92037, USA）から入手可能である。プラスミドｐＰＭｒｈｏＣａｍは、Dept. of Chemistry, Indiana University（Bloomington, 47405, USA）のJ. P. Richardson博士から入手し、Martinezらの[J. Mol. Biol. (1996) 257:895-908]に記載されている。
【００３６】
４．細菌培地材料を、Difco Laboratories（P.O. Box 331058, Detroit, Mich. 48232-7058, USA）から購入した。抗生物質および精製化学薬品を、Sigma（P.O. Box 14508, St. Louis, Mo. 63178, USA）から購入した。制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡクローニングの間に使用する酵素を、New England Biolabs（32 Tozer Rd, Beverly, Mass. 01915-5599, USA）から入手した。
【００３７】
５．栄養およびグルコース最小成長培地を、J. H. Millerによる(1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor, N.Y., USA）からの「A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria」に記載のＬＢおよび最小Ａ培地からそれぞれ得た。必要とされる場合、栄養要求性の要求を満たすための特定のアミノ酸による最小成長培地の補給は、各４０ μg/mlの終濃度であった。（必要とされる場合）以下の最終の濃度（μg/ml）：アンピシリン（Ａｍｐ）、１００；テトラサイクリン（Ｔｅｔ）、１５；クロラムフェニコール（Ｃｍ）、３０；カナマイシン（Ｋａｎ）、５０；およびスペクチノマイシン（Ｓｐ）、５０、で抗生物質を使用した。スーパースクリプトｒおよびｓを、それぞれ耐性および感受性の発現型を示すために使用した。Ａｍｐ、Ｋａｎ、およびＳｐの原液を、水で準備し、ＴｅｔとＣｍの原液をエタノールで準備した。ＩＰＴＧを、水中、１００ｍＭの原液として準備し、１ｍＭの終濃度で使用した。
【００３８】
６．Ｐ１形質導入のための手順、および他の日常的な微生物遺伝子技術のほとんどが、先に引用されたMillerの参考文献に記載の通りであった。Ｌセリン、Ｌメチオニン、およびグリシン（加えて適当適切で、かつ、示された他の栄養要求性の要求）の各々を０．０５ ｍｇ/ml補給したグルコース最小Ａ寒天平板上、３７℃でのそれらの増殖の能力（または無能力）に基づいてＳＭＧ耐性（またはＳＭＧ感受性）として菌株を分類した。別段言及されない限り、プラスミドおよびλファージＤＮＡの製造、およびＤＮＡフラグメントの製造およびクローニング、そしてプラスミドの形質転換のための手順は、Sambrookらによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press（Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., USA）中に記載の標準的な技術による。特に示されない限り、ＩＰＴＧ依存性条件付きレプリコン・プラスミドｐＡＭ３４を担持する菌株誘導体またはその誘導体を、ＡｍｐとＩＰＴＧを補った培地中で培養した。特に示されない限り、温度感受性条件付きレプリコン・プラスミドｐＭＡＫ７０５を担持する菌株誘導体またはその誘導体を、３０℃の温度で培養した。
【００３９】
７．ＤＮＡ塩基配列上のデータおよびＥ．コリのゲノムの物理的地図を、それぞれ、Blattnerらの［Science (1997) 277:1453-1462］およびRuddの［Microbiol. Mol. Biol. Rev. (1998) 62:985-1019］から入手した。Ｅ．コリの全ゲノム、およびｎｕｓＧとｒｈｏを担持する部分のＧｅｎＢａｎｋの配列データベース登録番号（ＵＲＬサイトのアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank）は、それぞれＮＣ−０００９１３、ＡＥ０００４７２、およびＡＥ０００４５４である。
本発明は、以下の実施例を参照することによって本明細書中、以下の部分で説明される。実施例は、一例に過ぎず、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【００４０】
実施例１
ｎｕｓＧ+菌株ＭＣ４１００と同質遺伝子ｎｕｓＧの変異株ＧＪ１５０４の培養物からのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の収量の比較
菌株ＧＪ３１５８は、ブダペスト条約規則の下、ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．（Scotland）で登録番号ＮＣＩＭＢ４１１３２として寄託された本願発明の菌株である。菌株ＧＪ３１５８は、Ｐ１ファージ形質導入によりｎｕｓＧに約２５％関連したargE86::Tn10突然変異による、コードされたタンパク質の同族アミノ酸部位でのグリシンからアスパラギン酸塩への置換をもたらす染色体のｎｕｓＧ遺伝子の１４６番コドンのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を担持する。菌株ＧＪ３１５８により準備されたＰ１ライセートを、３７℃にてＬＢ−Ｔｅｔ寒天平板上での、Ｔｅｔrへの菌株ＭＣ４１００の形質導入のために使用した。ｎｕｓＧ突然変異を同時に受け継いだＴｅｔr形質導入体を、それらがＳＭＧ耐性であるの対して、ｎｕｓＧ+形質導入体がＳＭＧ感受性であるという事実に基づいて確認した；この試験を（栄養要求性の要求を満たすための）Ｌ−アルギニンを補った平板によっておこなった。その後、ＴｅｔrＳＭＧ耐性形質導入体の１つを、菌株ＭＣ４１００を用いて準備したＰ１ライセートによる形質導入の受容菌として使用し、そして選ばれたＡｒｇ+形質導入体を、ＴｅｔsおよびＳＭＧ耐性に関して選別した。Ａｒｇ+ＴｅｔsＳＭＧ耐性形質導入体の１つを確保し、そしてＧＪ１５０４と規定した。そのため、菌株ＧＪ１５０４は、菌株ＭＣ４１００の同質遺伝子ｎｕｓＧ変異株誘導体である。
【００４１】
菌株ＭＣ４１００とＧＪ１５０４を、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４により形質転換し、形質転換体コロニーを、Ｃｍを補ったＬＢ寒天平板上での３０℃１４時間のインキュベーションによって選んだ。ＭＣ４１００／ｐＡＣＹＣ１８４とＧＪ１５０４／ｐＡＣＹＣ１８４の各々の単一コロニーを、変異プレートから選び、３０mlの１５０ml容エルレンマイヤーフラスコ中のＣｍを補ったＬＢ培地の中に別々に接種して、３０℃でジャイロータリー（ｇｙｒｏｔａｒｙ）水浴振とう機を用いてインキュベートした。培養物からの３mlのアリコートを、接種の６時間後から始まって１８時間、２時間間隔で採取した。各々のアリコートについて、６００ｎｍ（Ａ600）の吸光度を計測し、プラスミド調製物を２．５mlの容量から作製した。前記２つの培養物のＡ600の全ての得られた値について、ＧＪ１５０４／ｐＡＣＹＣ１８４からのｐＡＣＹＣ１８４ＤＮＡの収量が、ＭＣ４１００／ｐＡＣＹＣ１８４の収量より高く、そしてこの違いが、約１．０〜１．２のＡ600値で非常に大幅（約１０倍以上）であることが観察された。同様に、誘導体ＧＪ１５０４／ｐＡＣＹＣ１８４中、これらの条件下のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の支配的な種が、当該技術分野において「共有結合性閉環スーパーコイル型モノマー」と呼ばれる形態であることも観察された。
【００４２】
菌株ＧＪ１５０４のｐＡＣＹＣ１８４形質転換体内のプラスミド含有量の実質的増加は、上記コロニーの生存率の急落と相互関係があり、そして３０℃での２４〜３６時間のインキュベーションで培養をおこなった。
同様に、我々は、前記培養物において、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４上の遺伝子によってコードされた酵素クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの活性が実質的に高められた証拠を得た。
２つの他のプラスミドｐＵＣ１９またはpBluescriptＩＩ−ＫＳのいずれかによる、しかしＭＣ４１００のではないＧＪ１５０４の形質転換体の誘導体は、同様に、３０℃、２４時間のインキュベーション後に非常に低い生存率を示すことが判明した。
【００４３】
実施例２
ｎｕｓＧ+遺伝子を担持した温度感受性条件付きレプリコン・プラスミドｐＨＹＤ７６３の構築と、３０℃から４３℃への温度シフトアップ後の、GJ1504/pHYD763/pACYC184中のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４のコピー数の増加の実証
ｒｐｏＢ２（Ｔｓ）菌株ＪＢＫ２４６を、ＭＣ４１００recA::Kanを用いて準備したＰ１ライセートによって、Ｋａｎrへと形質転換し、そして、得られたＪＢＫ２４６recA::Kan形質導入体をＧＪ１５１４と規定した。
【００４４】
菌株ＭＣ４１００から単離した染色体ＤＮＡを、ＢａｍＨＩによって消化し、ＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＣＬ１９２０ＤＮＡとライゲートした。ライゲーション・ミックスを、ＧＪ１５１４を４２℃でＳｐｅｃrに形質転換するのに使用した。そうして得られた形質転換体コロニーは、４２℃での培養のためのＧＪ１５１４中のｒｐｏＢ（Ｔｓ）突然変異を補完するために、ベクターｐＣＬ１９２０の中にクローニングされたＭＣ４１００染色体からのｒｐｏＢ+遺伝子を担持した２２ ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドを持つことが見込まれた。そのように確認された、所望の挿入断片を有する１つのプラスミドを、ｐＨＹＤ５４１と規定した。
【００４５】
プラスミドｐＨＹＤ５４１をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化し、そしてｎｕｓＧ+遺伝子を担持することが見込まれる７．８ ｋｂのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法に続くアガロースゲルの一部からの溶出によって精製した。その７．８ ｋｂのフラグメントを、ｐＣＬ１９２０のＨｉｎｄＩＩＩサイトとＢａｍＨＩサイトの中にクローニングしてプラスミドｐＨＹＤ５４５を作製した。同様に、プラスミドｐＨＹＤ５４５をＳｍａＩで消化し、そしてｎｕｓＧ+遺伝子を担持することが見込まれる３．８ ｋｂのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法に続くアガロースゲルの一部からの溶出によって精製した。その３．８ ｋｂのフラグメントを、ｐＣＬ１９２０のＳｍａＩサイトの中にクローニングしてプラスミドｐＨＹＤ５４７を作製した。続いて、ｐＨＹＤ５４７から、ｎｕｓＧ+を担持する３．８ ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩフラグメントをＣｍrプラスミドｐＭＡＫ７０５のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩサイトの中にサブクローニングして、プラスミドｐＨＹＤ７６３を作製した。
【００４６】
菌株ＭＣ４１００とＧＪ１５０４を、それぞれｐＨＹＤ７６３形質転換に対してＣｍr、およびｐＡＣＹＣ１８４形質転換に対してＴｅｔrについて選択することで、各々続けてプラスミドｐＨＹＤ７６３、そしてｐＡＣＹＣ１８４によって形質転換した。GJ1504/pHYD763/pACYC184とMC4100/pHYD763の/pACYC184の各々の単一形質転換体コロニーを、ＣｍとＴｅｔを補った２mlのＬＢ中に接種し、そしてその培養物を、３０℃で一晩インキュベーションすることによって静止期まで培養した。そして、その培養物の各々から準備した１００ μl量の１：１００希釈物を、１５０ ml容のエルレンマイヤーフラスコ中、Ｔｅｔを補った１０ mlのＬＢ培地中に接種した。両方のフラスコを、それぞれの培養物のＡ600値が約１．３に達するまで、ジャイロータリー水浴振とう機により４３℃で振盪しながらインキュベートし、それに続いて、プラスミド調製物を各々のフラスコから採取した２．５ mlの容量の培養物から作製した。ＧＪ１５０４誘導体の培養物からのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の収量が、ＭＣ４１００誘導体の培養物からの収量より実質的に多かったことが観察された。収穫時点で、ＧＪ１５０４由来培養物の生存率の大幅な低下があったが、ＭＣ４１００由来培養物には低下がなかったことが同様に観察された。
【００４７】
実施例３
ｎｕｓＧ+遺伝子を担持するＩＰＴＧ依存性条件付きレプリコン・プラスミドｐＨＹＤ７５１の構築と、ＩＰＴＧ中止後のGJ1504/pHYD751/pUC4KにおけるプラスミドｐＵＣ４Ｋのコピー数の増加の実証
プラスミドｐＨＹＤ５４７から始まって、ｎｕｓＧ+を担持する２．１ ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ＩＰＴＧ依存性ＡｍｐrプラスミドベクターｐＡＭ３４のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトの中にサブクローニングして、プラスミドｐＨＹＤ７５１を作製した。
【００４８】
菌株ＭＣ４１００とＧＪ１５０４を、それぞれｐＨＹＤ７５１形質転換に対して（ＩＰＴＧの存在下で）Ｋａｎr、およびｐＵＣ４Ｋ形質転換に対してＡｍｐrについての選択を用いて、各々続けてプラスミドｐＨＹＤ７５１、そしてｐＵＣ４Ｋにより形質転換した。GJ1504/pHYD751/pUC4KとMC4100/pHYD751/pUC4Kの各々の単一形質転換体コロニーを、Ａｍｐ、Ｋａｎ、およびＩＰＴＧを補った２ mlのＬＢ中に接種し、その培養物を、３０℃で一夜インキュベーションすることによって静止期まで培養した。各々の培養物中の細胞を、卓上遠心分離機を用いて１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離することでペレットにし、そして２mlの新しいＬＢ中に再懸濁した。各々の懸濁液から１０ μl量を、１５０ ml容のエルレンマイヤーフラスコ中、Ｋａｎを補った１０ mlのＬＢ培地中に接種した。両方のフラスコを、それぞれの培養物のＡ600値が約１．３に達するまで、ジャイロータリー水浴振とう機により３０℃で振盪しながらインキュベートし、それに続いて、各々のフラスコから採取した２．５ ml量の培養物からプラスミド調製物を作製した。ＧＪ１５０４誘導体の培養物からのプラスミドｐＵＣ４Ｋの収量が、ＭＣ４１００誘導体の培養物からの収量より実質的に高かったことが観察された。収穫時点において、ＧＪ１５０４由来培養物の生存率の大幅な低下があったが、ＭＣ４１００由来培養物の低下がなかったことが同様に観察された。
【００４９】
実施例４
同質遺伝子ｒｈｏ+菌株ＧＪ８６２と、ｒｈｏ−４変異株ＧＪ８６３の培養物からのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の収量の比較
同質遺伝子ｒｈｏ菌株ＧＪ８６２およびＧＪ８６３を、以下の通り２ステップのＰ１形質導入によって構築した。第１ステップにおいて、菌株ＣＡＧ１８４３１により準備したＰ１ライセートを、ＭＣ４１００のＴｅｔrＩｌｖ-への形質導入に使用した。そのような形質導入体の１つを、ｒｈｏ−４変異菌株でＣＧＳＣ５０７２によって準備したＰ１ライセートの感染のための第２ステップにおける受容菌として使用し、そしてＩｌｖ+形質導入体を選択した（その全てがＴｅｔsにもなる）。Ｉｌｖ+Ｔｅｔs形質導入体の約２０％が、それらがＳＭＧ感受性であったＭＣ４１００のように振る舞うのに対し、残りの８０％が、ＳＭＧ耐性となり、つながれたｒｈｏ−４対立遺伝子を受け継いだと推測された。第２の交雑からＳＭＧ感受性形質導入体１つとＳＭＧ耐性形質導入体１つをさらなる研究に使用し、そしてそれぞれＧＪ８６２とＧＪ８６３と規定した。ＧＪ８６３のｒｈｏ染色体遺伝子のＤＮＡ配列決定は、ｒｈｏ−４突然変異がコードしたタンパク質の同族アミノ酸位置でのアラニンからグルタミン酸塩への置換をもたらす２４３番コドンのＧＣからＴＡへの塩基転換突然変異であることを示した。
【００５０】
菌株ＧＪ８６２とＧＪ８６３を、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４によって形質転換し、形質転換体コロニーを、Ｃｍを補ったＬＢ寒天平板上、３０℃で１４時間インキュベーションすることによって選択した。ＧＪ８６２／ｐＡＣＹＣ１８４とＧＪ８６３／ｐＡＣＹＣ１８４の各々の単一コロニーを、形質転換プレートから選び、１５０ ml容のエルレンマイヤーフラスコ中、Ｃｍを補った３０ mlのＬＢ培地中に別々に接種し、そしてジャイロータリー水浴振とう機を用いて３０℃でインキュベートした。その培養物から３ mlのアリコートを、接種の６時間後から始まって１８時間まで２時間間隔で採取した。各々のアリコートについて、（Ａ600）を計測し、プラスミド調製物を２．５ mlの容量から作製した。前記２つの培養物に関する得られた全てのＡ600値について、ＧＪ８６３／ｐＡＣＹＣ１８４からのｐＡＣＹＣ１８４ＤＮＡの収量は、ＧＪ８６２／ｐＡＣＹＣ１８４からの収量より高く、そして約１．０〜１．２のＡ600値において、この違いが非常に大きかった（約１０倍以上）ことを観察した。
【００５１】
菌株ＧＪ８６３のｐＡＣＹＣ１８４形質転換体内のプラスミド含有量の実質的増加は、３０℃、２４〜３６時間のインキュベーション後の上記コロニーおよび培養物の生存率の急落とも相関関係があった。
２つの他のプラスミドｐＵＣ１９またはpBluescriptＩＩ−ＫＳのいずれかによる、しかしＧＪ８６２のではないＧＪ８６３の形質転換体の誘導体が、３０℃、２４時間のインキュベーション後に非常に低い生存率を示すことも判明した。
【００５２】
実施例５
３０℃から４３℃への温度シフトアップ後のGJ863/pPMrhoCam/pACYC184におけるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４のコピー数の増加の実証のための、ｒｈｏ+遺伝子を担持する温度感受性条件付きレプリコン・プラスミドｐＰＭｒｈｏＣａｍの使用。
菌株ＭＣ４１００とＧＪ８６３を、それぞれｐＰＭｒｈｏＣａｍ形質転換に対するＣｍrとｐＡＣＹＣ１８４形質転換に対するＴｅｔrについての選択を用いて、各々続けてプラスミドｐＰＭｒｈｏＣａｍ（ｒｈｏ+遺伝子を担持する温度感受性条件付きレプリコン）、そしてｐＡＣＹＣ１８４により形質転換した。GJ863/pPMrhoCam/pACYC184とMC4100/pPMrhoCam/pACYC184の各々の単一形質転換体コロニーを、ＣｍおよびＴｅｔを補った２ mlのＬＢ中に接種し、そしてその培養物を３０℃で一晩インキュベーションすることによって静止期まで培養した。各々の培養物から準備した１００ μl量の１：１００希釈物を、１５０ ml容のエルレンマイヤーフラスコ中、Ｔｅｔを補った１０ mlのＬＢ培地中に接種した。両方のフラスコを、それぞれの培養物のＡ600値が約１．３に達するまで、ジャイロータリー水浴振とう機により４３℃で振盪しながらインキュベートし、それに続いて、各々のフラスコから採取した２．５ ml量の培養物からプラスミド調製物を作製した。ＧＪ８６３誘導体の培養物からのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の収量が、ＭＣ４１００誘導体の培養物からの収量より実質的に高かったことが観察された。収穫時点において、ＧＪ８６３由来培養物の生存率の大幅な低下があったが、ＭＣ４１００由来培養物の低下がなかったことが同様に観察された。
【００５３】
実施例６
ｒｈｏ+遺伝子を担持するＩＰＴＧ依存性条件付きレプリコン・プラスミドｐＨＹＤ１２０１の構築と、ＩＰＴＧ中止後のGJ863/pHYD1201/pUC4KにおけるプラスミドｐＵＣ４Ｋのコピー数の増加の実証
ＩＰＴＧ依存性条件付きレプリコン・プラスミドｐＨＹＤ１２０１を、以下の通り３ステップにより構築した。Ｋｏｈａｒａら［Cell (1987) 50:495-508］によって記載のＥ．コリのゲノムのオーダードλファージ・ライブラリからのλファージ・クローン５５６のＤＮＡから始まって、ｒｈｏ+遺伝子を担持する６．７ ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、プラスミドベクターｐＣＬ１９２１のＨｉｎｄＩＩＩサイトの中にサブクローニングし、そうして得られた１つのプラスミドをｐＨＹＤ５５２と規定した。第２ステップで、ｒｈｏ+遺伝子を担持するｐＨＹＤ５５２からの３．３ ｋｂのＮｓｉＩフラグメントを、プラスミドベクターｐＣＬ１９２０のＰｓｔＩサイトの中にクローニングしてプラスミドｐＨＹＤ５６７とｐＨＹＤ５６８（上記ベクターに関して挿入断片の２つの方向性を意味する）を得る。ｐＨＹＤ５６７の挿入断片ＤＮＡを、（特に）（ｒｈｏプロモーターに最も近い）一方の端でＳａｌＩ部位と、そして他方でＨｉｎｄＩＩＩ部位と隣接する。第３ステップで、プラスミドｐＨＹＤ１２０１を作製するために、ｐＨＹＤ５６７（ｒｈｏ+を担持する）からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩフラグメントをプラスミドベクターｐＡＭ３４のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩサイトの中にクローニングした。第３ステップにおけるＡｍｐr形質転換体は、ＩＰＴＧを補ったプレートによって選択された。
【００５４】
菌株ＧＪ８６２（ｒｈｏ+）とＧＪ８６３（ｒｈｏ−４）を、それぞれｐＨＹＤ１２０１形質転換に対して（ＩＰＴＧの存在下で）Ｋａｎr、およびｐＵＣ４Ｋ形質転換に対してＡｍｐrについての選択を用いて、各々続けてプラスミドｐＨＹＤ１２０１、そしてｐＵＣ４Ｋにより形質転換した。GJ862/pHYD1201/pUC4KとGJ863/pHYD1201/pUC4Kの各々の単一形質転換体コロニーを、Ａｍｐ、Ｋａｎ、およびＩＰＴＧを補った２mlのＬＢ中に接種し、その培養物を、３０℃で一夜インキュベーションすることによって静止期まで培養した。各々の培養物中の細胞を、卓上遠心分離機を用いて１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離することでペレットにし、そして２mlの新しいＬＢ中に再懸濁した。各々の懸濁液から１０ μl量を、１５０ ml容のエルレンマイヤーフラスコ中、Ｋａｎを補った１０ mlのＬＢ培地中に接種した。両方のフラスコを、それぞれの培養物のＡ600値が約１．３に達するまで、ジャイロータリー水浴振とう機により３０℃で振盪しながらインキュベートし、それに続いて、各々のフラスコから採取した２．５ ml量の培養物からプラスミド調製物を作製した。ＧＪ８６３誘導体の培養物からのプラスミドｐＵＣ４Ｋの収量が、ＧＪ８６２誘導体の培養物からのそれより実質的に高かったことが観察された。収穫時点において、ＧＪ８６３由来培養物の生存率の大幅な低下があったが、ＧＪ８６２由来培養物の低下がなかったことが同様に観察された。
【００５５】
実施例７
ｄｎａＣ+菌株ＧＪ３１４１と同質遺伝子ｄｎａＣの変異株ＧＪ３１４０の誘導体の培養物からのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２９、およびｐＵＣ１９の収量の比較
菌株ＧＪ３１５８は、ブダペスト条約規則の下、ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．（Scotland）で登録番号ＮＣＩＭＢ４１１３２として寄託された本願発明の菌株である。菌株ＧＪ３１５８は、Ｐ１ファージ形質導入によりｄｎａＣに約８８％関連したzjj-901::Tn10dKan挿入による、コードされたタンパク質の同族アミノ酸部位でのアラニンからスレオニンへの置換をもたらす染色体のｄｎａＣ遺伝子の８３番コドンのＧＣからＡＴへのトランジション突然変異を担持する。菌株ＧＪ３１５８により準備されたＰ１ライセートを、３７℃にてＬＢ−Ｋａｎ寒天平板上での、Ｋａｎrへの菌株ＧＪ３１４１の形質導入のために使用した。ｄｎａＣ突然変異を同時に受け継いだＫａｎr形質導入体を、続いてプラスミドｐＵＣ１９により３０℃でＡｍｐrに形質転換された時、その形質転換体の誘導体は４２℃で培養することも可能であるのに対し、親のｄｎａＣ+対立遺伝子を持ち続けたそれらのＫａｎ形質導入体は、４２℃で培養できないｐＵＣ１９−Ａｍｐr形質転換体を生み出す、という事実に基づいて確認した。そうして確認されたＫａｎrｄｎａＣ+およびＫａｎrｄｎａＣ形質導入体の各々１つを、それぞれＧＪ３１４１およびＧＪ３１４０と規定した。
【００５６】
菌株ＧＪ３１４１とＧＪ３１４０を、それぞれ、３０℃でのＣｍr、Ａｍｐr、またはＡｍｐrコロニーに対する選択を用いて、各々プラスミドｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２９、またはｐＵＣ１９により形質転換した。形質転換体の誘導体を、３０℃で適当な抗生物質を補ったＬＢ中でＡ600値約１．６まで培養し、そしてプラスミド調製物を各々の培養物２．５ mlの容量から作製した。３つのプラスミドの各々の収量は、対応するＧＪ３１４１誘導体からの収量よりもＧＪ３１４０誘導体からの方が実質的に低いことを観察した。
【００５７】
宿主細菌細胞内のプラスミド含有量を変更するために、ｄｎａＣ突然変異が、ｎｕｓＧおよびｒｈｏ突然変異と無関係に働くことを示す証拠となる２つの系統を得、それにより、上記細胞からプラスミド収量を調節するために、当業者が（一方にｎｕｓＧまたはｒｈｏ、そして他方にｄｎａＣから成る）様々な突然変異の組み合わせを利用することを可能にした：（ｉ）（ファージＰ１を介在した形質導入によって）ｄｎａＣ突然変異を菌株ＧＪ３１５８からｎｕｓＧ菌株ＧＪ１５０４内またはｒｈｏ菌株ＧＪ８６３内のいずれかに導入し、そして続いてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を得られた誘導体内に形質転換した場合に、上記形質転換体からのプラスミド収量は、ＧＪ３１４０／ｐＡＣＹＣ１８４からの収量より高いが、しかしＧＪ１５０４／ｐＡＣＹＣ１８４またはＧＪ８６３／ｐＡＣＹＣ１８４のいずれかからの収量より低かった。（ｉｉ）ＧＪ１５０４およびＧＪ８６３のｐＡＣＹＣ１８４形質転換体が３０℃、２４〜３６時間のインキュベーション後に生存率の急落を示すのに対して、ＧＪ１５０４およびＧＪ８６３のｄｎａＣ変異株の誘導体の類似の形質転換体は、生存率の少しの損失も示さなかった。様々な菌株のプラスミドｐＵＣ１９形質転換体を試験した時、同様に非常に類似した結果が得られた。
【国際調査報告】
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