(57)【要約】本発明はＶＰＡＣ２受容体のアゴニストとしてｉｎ  ｖｉｖｏで機能する新規ペプチドを提供する。これらのインスリン分泌促進性ポリペプチドはグルコース攻撃に際して対照よりも大きくｉｎ  ｖｉｖｏの血糖を低下させることが示されている。本発明のポリペプチドはまた製剤中で安定でありかつ長い半減期を有する。本発明のペプチドは低下された内因性のインスリン分泌、とりわけ２型糖尿病を伴う患者に新たな療法を提供する。とりわけ、本発明は特定の一群のＶＰＡＣ２関連ポリペプチド若しくはそれらの機能的同等物から選択されるポリペプチドである。本発明はまた、哺乳動物に治療上有効な量のインスリン分泌促進性ペプチドを投与することを含んでなる、前記哺乳動物における代謝性疾患の治療方法にも向けられる。組換えおよび合成双方の該ペプチドの作成方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１から１５２、ならびにそれらの機能上同等なフラグメント、誘導体およびバリアントよりなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド若しくはその縮重バリアント。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項５】
ａ）ポリペプチドの発現に適する条件下で請求項４に記載の宿主細胞を培養すること；および
ｂ）宿主細胞培養物からポリペプチドを回収すること
を含んでなる、前記ポリペプチドの製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。
【請求項７】
前記ポリペプチドが配列番号１、２、３、４および５よりなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号１１５、１１６、１１７、１１８および１１９よりなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１５４から２６４よりなる群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
製薬学的に許容できる担体とともに、治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチド若しくはその機能上同等なフラグメント、誘導体およびバリアントを含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、約２％ないし約３０％のＤＭＳＯ、ならびに場合によっては、プロピレングリコール、ジメチルホルムアミド、プロピレンカーボネート、ポリエチレングリコールおよびトリグリセリドよりなる群から選択される溶媒を含んでなる、請求項１０に記載の製薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、１１５、１１６、１１７、１１８および１１９よりなる群から選択される、請求項１０に記載の製薬学的組成物。
【請求項１３】
製薬学的に許容できる担体、および１種若しくはそれ以上の製薬学的作用物質とともに、治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチド若しくはその機能上同等なフラグメント、誘導体およびバリアントを含んでなる製薬学的組成物。
【請求項１４】
前記製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬物、非スルホニル尿素分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作薬、インスリン分泌促進薬、肝グルコース出力低下化合物、インスリン、抗肥満薬、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸抑制薬、フィブリン酸誘導体、および降圧薬よりなる群から選択される、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１５】
不活性担体と組合せの有効量の請求項１に記載のポリペプチド若しくはその機能上同等なフラグメント、誘導体およびバリアントを含んでなる組成物。
【請求項１６】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病の治療方法。
【請求項１７】
前記糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、若年者の成人発症型糖尿病、不顕性自己免疫性成人糖尿病および妊娠糖尿病よりなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、シンドロームＸの治療方法。
【請求項１９】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病関連障害の治療方法。
【請求項２０】
前記糖尿病関連障害が、高血糖、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、脂質代謝異常、高トリグリセリド血症およびインスリン抵抗性よりなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１種若しくはそれ以上の製薬学的作用物質と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病の治療方法。
【請求項２２】
前記製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬物、非スルホニル尿素分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作薬、インスリン分泌促進薬、肝グルコース出力低下化合物、インスリンおよび抗肥満薬よりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記糖尿病が、１型糖尿病、２型糖尿病、若年者の成人発症型糖尿病、不顕性自己免疫性成人糖尿病および妊娠糖尿病よりなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１種若しくはそれ以上の製薬学的作用物質と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、シンドロームＸの治療方法。
【請求項２５】
前記製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬物、非スルホニル尿素分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作薬、インスリン分泌促進薬、肝グルコース出力低下化合物、インスリンおよび抗肥満薬よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
１種若しくはそれ以上の製薬学的作用物質と組合せの治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病関連障害の治療方法。
【請求項２７】
前記糖尿病関連障害が、高血糖、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、脂質代謝異常、高トリグリセリド血症およびインスリン抵抗性よりなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬物、非スルホニル尿素分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作薬、インスリン分泌促進薬、肝グルコース出力低下化合物、インスリンおよび抗肥満薬よりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸抑制薬、フィブリン酸誘導体および降圧薬よりなる群から選択される１種若しくはそれ以上の作用物質とともに治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病、シンドロームＸ若しくは糖尿病関連障害の治療方法。
【請求項３０】
前記糖尿病関連障害が、高血糖、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、脂質代謝異常、高トリグリセリド血症およびインスリン抵抗性よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１に記載のポリペプチドおよび１種若しくはそれ以上の製薬学的作用物質が単一の製薬学的投薬製剤として投与される、請求項２１ないし３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病の二次的原因の治療若しくは予防方法。
【請求項３３】
前記二次的原因が、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、褐色細胞腫および薬物性糖尿病よりなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
１種若しくはそれ以上の製薬学的作用物質とともに治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、糖尿病の二次的原因の治療若しくは予防方法。
【請求項３５】
前記製薬学的作用物質が、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬物、非スルホニル尿素分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作薬、インスリン分泌促進薬、肝グルコース出力低下化合物、インスリンおよび抗肥満薬よりなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、呼吸器疾患の治療方法。
【請求項３７】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、肥満の治療方法。
【請求項３８】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、食欲の調節方法。
【請求項３９】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、心血管系疾患の治療方法。
【請求項４０】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、脂質および炭水化物代謝の障害の治療方法。
【請求項４１】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、睡眠障害の治療方法。
【請求項４２】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、男性の生殖障害の治療方法。
【請求項４３】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、成長障害若しくはエネルギー恒常性の障害の治療方法。
【請求項４４】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、免疫疾患の治療方法。
【請求項４５】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、自己免疫疾患の治療方法。
【請求項４６】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、急性および慢性炎症性疾患の治療方法。
【請求項４７】
治療上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与する段階を含んでなる、敗血症ショックの治療方法。
【請求項４８】
請求項１に記載のポリペプチドをそれの必要な被験体に投与することによる、前記被験体におけるグルコース依存性の様式でのインスリン放出の刺激方法。
【請求項４９】
治療上有効な遺伝子治療ベクターとともに請求項２に記載のポリヌクレオチドを含んでなる遺伝子治療組成物。
【請求項５０】
糖尿病および糖尿病関連障害の処置および／若しくは予防のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
最低１種の製薬学的に許容できる製薬学的に安全な担体若しくは賦形剤とともに請求項１に記載の最低１種のポリペプチドを含有する医薬。
【請求項５２】
糖尿病および糖尿病関連障害の処置および／若しくは予防のための医薬の製造のための請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５３】
糖尿病の処置および／若しくは予防のための請求項５１に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００２年７月１２日出願の米国仮出願第６０／３９５，７３８号明細書（その内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は新たに同定されたポリペプチドおよび治療目的上のこうしたポリペプチドの使用に関する。より具体的には、本発明のポリペプチドは膵β細胞からのインスリンの放出をグルコース依存性の様式で刺激してそれにより糖尿病若しくは耐糖能異常（前糖尿病状態）のような代謝障害に苦しめられている個体に処置の選択肢を提供することにおいて有用である。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病はとりわけ糖尿病患者における上昇された血糖値によりそれ自身を明示する糖代謝障害を特徴とする。根底にある欠陥が、２つの主要な群、すなわち患者が彼らの膵腺中のインスリンを産生するβ細胞を欠く場合に生じる１型糖尿病すなわちインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、ならびにβ細胞機能障害およびインスリン作用の変化を伴う患者で発生する２型糖尿病すなわちインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）への糖尿病の分類に至っている。
【０００４】
１型糖尿病患者は現在インスリンで治療されている一方、２型糖尿病患者の大多数はβ細胞機能を刺激する作用物質若しくはインスリンに対する患者の組織感受性を高める作用物質で治療されている。時間とともに、２型糖尿病被験体のほぼ半分はこれらの作用物質に対する彼らの応答を喪失し、そしてその場合はインスリン療法に置かれなければならない。２型糖尿病を治療するのに現在使用されている薬物を下述する。
【０００５】
α−グルコシダーゼ阻害剤（例えばプレコース［Ｐｒｅｃｏｓｅ］（Ｒ）、ボグリボース［Ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ］ＴＭおよびミグリトール［Ｍｉｇｌｉｔｏｌ］（Ｒ））は腸からのグルコースの吸収を遅らせることにより食後血糖値の上昇を低下させる。これらの薬物は安全であり、そして軽度ないし中程度に冒された糖尿病被験体に処置を提供する。しかしながら胃腸の副作用が文献で報告されている。
【０００６】
インスリン感作薬はインスリンに対する身体の応答を高める薬物である。アバンディア［Ａｖａｎｄｉａ］ＴＭ（ロシグリタゾン）およびアクトス［Ａｃｔｏｓ］ＴＭのようなチオゾリジンジオン類はペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）γサブタイプを活性化し、かつ、十分に記述されていない一組の遺伝子の活性を調節する。この分類の最初の薬物レズリン［Ｒｅｚｕｌｉｎ］ＴＭ（トログリタゾン）は上昇した肝酵素レベルおよび薬物性の肝毒性のため回収された。これらの肝への影響はアバンディア［Ａｖａｎｄｉａ］ＴＭおよびアクトス［Ａｃｔｏｓ］ＴＭを使用している患者では重大な問題であるようには思われない。そうであっても、肝酵素検査が治療の最初の年には２か月ごと、およびその後は定期的に推奨される。アバンディア［Ａｖａｎｄｉａ］ＴＭおよびアクトス［Ａｃｔｏｓ］ＴＭは液体貯留および浮腫と関連するようである。アバンディア［Ａｖａｎｄｉａ］ＴＭはうっ血性心不全についての懸念のためインスリンを伴う使用には指示されない。別の潜在的副作用は体重増加である。
【０００７】
インスリン分泌促進薬（例えばスルホニル尿素（ＳＦＵ）およびＡＴＰ依存性Ｋ＋チャンネルにより作用する他の作用物質）は２型糖尿病を治療するために現在使用されている別の型の薬物である。ＳＦＵは軽度ないし中程度の空腹時血糖症を有する２型糖尿病のための標準的治療である。ＳＦＵは低血糖、体重増加、ならびに高い一次および二次不成功率を誘発する潜在性を包含する限界を有する。初めて治療される患者の１０ないし２０％が有意の処置効果を示すことに失敗する（一次不成功）。二次不成功はＳＦＵ使用６か月後の処置効果の追加の２０〜３０％の喪失により示される。インスリン処置は５〜７年の治療後のＳＦＵ応答体の５０％で必要とされる（非特許文献１）。
【０００８】
グルコファージ［Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ］ＴＭ（メトホルミンＨＣｌ）は肝グルコース出力を減少させかつ末梢のグルコースの取込みおよび利用を増大させることにより血糖を低下させるビグアニドである。該薬物は軽度および中程度に冒された被験体で血糖を低下させるのに有効であり、かつ、体重増加若しくは低血糖を誘発する潜在性という副作用を有しない。しかしながら、グルコファージ［Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ］ＴＭは胃腸の障害および乳酸アシドーシスを包含する多数の副作用を有する。グルコファージ［Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ］ＴＭは７０歳を超えた糖尿病患者および腎若しくは肝機能の障害を伴う被験体で禁忌である。最後に、グルコファージ［Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ］ＴＭはＳＦＵと同一の一次および二次不成功率を有する。
【０００９】
インスリン処置は、食餌、運動および経口医薬が血糖を十分に制御することに失敗した後に開始する。この処置は、それが注入可能物（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）である、それが低血糖を生じさせ得る、およびそれが体重増加を引き起こすという欠点を有する。
【００１０】
現在の処置での問題のため、２型糖尿病を治療するための新たな療法が必要とされている。とりわけ、正常な（グルコース依存性の）インスリン分泌を保持するための新たな処置が必要とされている。こうした新たな薬物は、以下の特徴、すなわちインスリン分泌を促進するためにグルコースに依存性（すなわち上昇された血糖の存在下でのみインスリン分泌を生じさせる）；低い一次および二次不成功率；ならびに島細胞機能を保存する、を有するべきである。本明細書に開示される新たな療法を開発するための戦略は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）シグナル伝達機構およびインスリン分泌に対するその効果に基づく。
【００１１】
環状ＡＭＰはインスリン分泌過程の主な調節物質である。このシグナル伝達分子の上昇はプロテインキナーゼＡ経路の活性化後のＫ＋チャンネルの閉鎖を促進する。Ｋ＋チャンネルの閉鎖は細胞の脱分極およびその後のＣａ＋＋チャンネルの開放を引き起こし、それは順にインスリン顆粒のエキソサイトーシスにつながる。インスリン分泌に対するあったとしてもほとんどない影響が低グルコース濃度の非存在下で起こる（非特許文献２）。下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（「ＰＡＣＡＰ」）およびＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）のような分泌促進薬はｃＡＭＰ系を使用してグルコース依存性の様式でインスリン分泌を調節する（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＧＬＰ−１およびＰＡＣＡＰのようなｃＡＭＰの上昇により作用するインスリン分泌促進薬はまた、インスリン放出に加えインスリン合成を高めることも可能である（非特許文献６；非特許文献７）。
【００１２】
ＰＡＣＡＰは膵β細胞からのグルコース依存性のインスリン分泌の強力な刺激物質である。３種の異なるＰＡＣＡＰ受容体型（ＰＡＣ１、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２）が記述されている（非特許文献８；非特許文献９）。ＰＡＣＡＰは受容体選択性を表さず、全３種の受容体で匹敵する活性および効力を有する。ＰＡＣ１はＣＮＳ中に優勢に位置する一方、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２はより広範に分布されている。ＶＰＡＣ１はＣＮＳならびに肝、肺および腸に位置する。ＶＰＡＣ２はＣＮＳ、膵、骨格筋、心、腎、脂肪組織、精巣および胃に位置する。最近の研究はＶＰＡＣ２がβ細胞からのインスリン分泌の原因であることを議論している（非特許文献１０；非特許文献１１）。ＰＡＣＡＰのこのインスリン向性の作用はＧＴＰ結合タンパク質Ｇｓにより媒介される。細胞内ｃＡＭＰの蓄積は順に［Ｃａ＋＋］を増加させるβ細胞中の非選択的陽イオンチャンネルを活性化し、そしてインスリンを含有する分泌顆粒のエキソサイトーシスを促進する。
【００１３】
ＰＡＣＡＰは、ｃＡＭＰ媒介性のシグナル伝達経路によりそれらの作用を発揮する代謝性、神経内分泌および神経伝達物質ペプチドホルモンのスーパーファミリーの最も新しいメンバーである（非特許文献１２）。生物学的に活性のペプチドは、２種の分子形態で、すなわち３８アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）および／若しくはアミデート化されたカルボキシル末端をもつ２７アミノ酸のペプチド（ＰＡＣＡＰ−２７）のいずれかとして生合成前駆体から遊離される（非特許文献１２）。
【００１４】
該ペプチドの２形態の最高濃度は脳および精巣で見出される（非特許文献１２）。該ペプチドの短い形態すなわちＰＡＣＡＰ−２７は血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）に対する６８％の構造的相同性を示す。しかしながら、中枢神経系におけるＰＡＣＡＰおよびＶＩＰの分布は、これらの構造的に関係するペプチドが個別の神経伝達物質機能を有することを示唆する（非特許文献１３）。
【００１５】
最近の研究は、生殖における役割（非特許文献１４）からインスリン分泌を刺激する能力（非特許文献１５）までのＰＡＣＡＰ−３８の多彩な生物学的影響を示した。加えて、ＰＡＣＡＰは、脂質および炭水化物代謝のホルモン性の調節（非特許文献１６）；概日機能（非特許文献１７）；ならびに免疫系、成長、エネルギー恒常性および男性の生殖機能（非特許文献１８）；食欲の調節（非特許文献１９）；ならびに急性および慢性の炎症性疾患、敗血症ショックならびに自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス）（非特許文献２０）で役割を演じているようである。
【００１６】
血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）は、最初にブタ上部小腸から単離された２８アミノ酸のペプチドである（非特許文献２１；特許文献１）。このペプチドは、ヘロデルミン、セクレチン、ソマトスタチン類およびグルカゴンを包含する構造的に関係した小型のポリペプチドの１ファミリーに属する。ＶＩＰの生物学的影響は、細胞内ｃＡＭＰシグナル伝達系と共役している膜結合型受容体タンパク質の活性化により媒介される。これらの受容体は、元はＶＩＰ−Ｒ１およびＶＩＰ−Ｒ２として知られていたが、しかしながらそれらはＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２と同一の受容体であることが後に見出された。ＶＩＰはＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２で匹敵する活性および効力を表す。
【００１７】
ヒト肺水中でのＶＩＰの安定性を改善させるために、Ｂｏｌｉｎら（非特許文献２２）は、このペプチドのらせん状の性向を高めかつタンパク質分解性の分解を低下させるよう設計した一連のＶＩＰバリアントを作成した。受容体結合に重要でないように関係していた位置８、１２、１７および２５−２８に置換を集中させた。さらに、らせんをより効率的にキャッピングする（ｃａｐｐｉｎｇ）という希望をもってＶＩＰムテインのＣ末端に「ＧＧＴ」配列をタギングした。最後に、らせんをさらに安定化するために数種の環状バリアントを合成した（特許文献２）。これらの努力は受容体の選択性に向けられなかったとは言え、それらは１００倍より大きいＶＰＡＣ２選択性を有する２種の類似物を生じた（非特許文献２３；非特許文献２４）。
【００１８】
ＧＬＰ−１は食事の後で腸Ｌ細胞から放出され、そしてインクレチンホルモンとして機能する（すなわち、それは膵β細胞からのグルコース誘発性のインスリン放出を増強する）。それは、組織型に依存してグルカゴン遺伝子により差別的に発現される３７アミノ酸のペプチドである。β細胞中のｃＡＭＰレベルを上昇させるという有益な影響を裏付ける臨床データがＧＬＰ−１で収集されている。不十分に管理されている２型糖尿病患者におけるＧＬＰ−１の注入が彼らの空腹時血糖値を正常化し（非特許文献２５）、また、より長い注入はβ細胞の機能を正常被験体のものまで改善した（非特許文献２６）。最近の報告は、ＧＬＰ−１が耐糖能異常を伴う被験体でグルコースに応答するβ細胞の能力を改善することを示した（非特許文献２７）。これらの影響の全部はしかしながら該ペプチドの短い半減期のため短命である。
【００１９】
Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、元はアメリカドクトカゲで同定された３９アミノ酸のペプチド、エキセンジン  ４［Ｅｘｅｎｄｉｎ  ４］ＴＭ（ＡＣ２９９３）を用いるフェーズＩＩＩ試験を実施している。Ａｍｙｌｉｎは、臨床試験がエキセンジン  ４［Ｅｘｅｎｄｉｎ  ４］ＴＭで治療した２型糖尿病患者で改善された血糖症制御を示したことを報告した。しかしながら悪心および嘔吐の発生率が有意であった。
【００２０】
発明者は、特許文献３（その明細はそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）で、ＶＰＡＣ２受容体のアゴニストとしてｉｎ  ｖｉｖｏで機能する新規ポリペプチドを開示し、また、とりわけ、発明者はＲ３Ｐ６６として同定されるＶＰＡＣ２アゴニストを開示した。Ｒ３Ｐ６６を包含するその中で記述されたポリペプチドは、しかしながら、製剤中の該ポリペプチドと関連する安定性の問題ならびに該ポリペプチドの短い半減期を伴う問題を考えれば適する商業的候補でない。
【００２１】
ＰＡＣＡＰ、ＧＬＰ−１若しくはエキセンジン  ４［Ｅｘｅｎｄｉｎ  ４］ＴＭの、しかしより少ない副作用を伴うグルコース依存性のインスリン分泌促進活性を有する、かつ、好ましくは製剤中で安定でありかつ長い血漿半減期を有する改良されたペプチドに対する必要性が存在する。さらに、血漿グルコースレベルのより厳格な制御が長期の糖尿病合併症を予防するかもしれない。従って、新たな糖尿病薬物は、向上した患者の生活の質を提供するはずである。
【特許文献１】米国特許第３，８７９，３７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７７，４１９号明細書
【特許文献３】第ＷＯ  ０１／２３４２０号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｅｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．６：５３３−５４３、１９８９
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｈａｕｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１４２６−１４３５、１９９８
【非特許文献３】Ｋｏｍａｔｓｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６：１９２８−１９３８、１９９７
【非特許文献４】Ｆｉｌｉｐｓｓｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：１９５９−１９６９、２００１
【非特許文献５】Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：５２１−５２７、２００１
【非特許文献６】Ｓｋｏｇｌｕｎｄら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１１５６−１１６４、２０００
【非特許文献７】Ｂｏｒｂｏｎｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：５５３０−５５３７、１９９９
【非特許文献８】Ｈａｒｍａｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５０：２６５−２７０、１９９８
【非特許文献９】Ｖａｕｄｒｙら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５２：２６９−３２４、２０００
【非特許文献１０】Ｉｎａｇａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２６７９−２６８３、１９９４
【非特許文献１１】Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１４５３−１４６０、２００２
【非特許文献１２】Ａｒｉｍｕｒａ、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３７：２８７−３０３、１９９２
【非特許文献１３】Ｋｏｖｅｓら、Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ５４：１５９−１６９、１９９１
【非特許文献１４】ＭｃＡｒｄｌｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５：８１５−８１７、１９９４
【非特許文献１５】Ｙａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９０−１２９３、１９９４
【非特許文献１６】Ｇｒａｙら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５：１７３９−４７、２００１
【非特許文献１７】Ｈａｒｍａｒら、Ｃｅｌｌ  １０９：４９７−５０８、２００２
【非特許文献１８】Ａｓｎｉｃａｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４３：３９９４−４００６、２００２
【非特許文献１９】Ｔａｃｈｉｂａｎａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３３９：２０３−２０６、２００３
【非特許文献２０】Ｐｏｚｏ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９：２１１−２１７、２００３
【非特許文献２１】ＳａｉｄとＭｕｔｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６９：１２１７−１２１８、１９７０
【非特許文献２２】Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３７：５７−６６、１９９５
【非特許文献２３】Ｇｏｕｒｌｅｔら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８：４０３−４０８、１９９７
【非特許文献２４】Ｘｉａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２８１：６２９−６３３、１９９７
【非特許文献２５】Ｇｕｔｎｉａｋら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１３１６−１３２２、１９９２
【非特許文献２６】Ｒａｃｈｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４５：１５２４−１５３０、１９９６
【非特許文献２７】Ｂｙｒｎｅら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４７：１２５９−１２６５、１９９８
【発明の開示】
【００２２】
［発明の要約］
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＶＰＡＣ２受容体（下でＶＰＡＣ２）のアゴニストとして機能しかつＶＰＡＣ２アゴニスト活性を有する作用物質により軽減し得る疾患および状態の処置において有効である新規ポリペプチドを提供する。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＶＰＡＣ１およびＰＡＣ１よりＶＰＡＣ２でより大きな効力を有する選択的ＶＰＡＣ２アゴニストである。例えば、しかし制限としてでなく、これらのポリペプチドは、インスリンの合成およびグルコース依存性の様式での膵β細胞からの放出、ならびにその後の血漿グルコース低下を刺激する。これらの分泌促進ポリペプチドは、グルコース攻撃に際してベヒクル対照よりも大きくｉｎ  ｖｉｖｏで血糖を低下させることが示されている。なおより好ましくは、本発明のポリペプチドは製剤中で安定であり、かつ、誘導体化される場合にｉｎ  ｖｉｖｏで長い血漿半減期および長い作用持続時間を有する。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、例えば、減少した内因性インスリン分泌から生じるもののような代謝障害、とりわけ２型糖尿病を伴う患者、若しくは耐糖能異常（インスリン分泌の軽度の変化を有する前糖尿病状態）を伴う患者に新たな治療を提供する。加えて、本発明のポリペプチドは、１型糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）、不顕性自己免疫性成人糖尿病（ＬＡＤＡ）、および関連する糖尿病性脂質代謝異常ならびに他の糖尿病合併症、ならびに高血糖、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、脂質代謝異常、高トリグリセリド血症、シンドロームＸおよびインスリン抵抗性の予防および／若しくは処置において有用でありうる。
【００２４】
本発明のポリペプチドはまた、肥満（例えば食欲および食物摂取の調節）、アテローム硬化性疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心血管系疾患（アテローム硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患および高血圧を包含する）、脳血管系疾患ならびに末梢血管疾患の予防および／若しくは処置において；ならびに、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌、ならびに過形成、喘息、男性の生殖の問題、潰瘍、睡眠障害、脂質および炭水化物代謝の障害、概日機能不全、成長障害、エネルギー恒常性の障害、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス）を包含する免疫疾患、ならびに急性および慢性の炎症性疾患、敗血症ショック、ならびに本明細書で同定される他の状態、若しくは本明細書で後に記述されるところのそれ以外の機能の予防および／若しくは処置に利用してもまたよい。
【００２５】
とりわけ、本発明の一局面は、配列番号１から１５２よりなる群から選択されるポリペプチド、ならびにそれらの機能的同等物を包含する列挙された配列番号のポリペプチドと実質的に同一である最低１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体およびバリアント（集合的に「本発明のポリペプチド」）である。本発明の好ましい一態様は、配列番号１から３８および配列番号１１５から１５２よりなる群から選択されるポリペプチド、ならびに列挙される配列番号のポリペプチドと実質的に同一である最低１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体およびバリアントである。本発明のより好ましい一態様は、配列番号１から５および配列番号１１５から１１９よりなる群から選択されるポリペプチド、ならびに列挙される配列番号のポリペプチドと実質的に同一である最低１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体およびバリアントである。本発明の最も好ましい一態様は、配列番号１、２、１１５および１１６よりなる群から選択されるポリペプチド、ならびに列挙される配列番号のポリペプチドと実質的に同一である最低１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体およびバリアントである。
【００２６】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドをコードするポリペプチド、ならびに本発明のポリペプチドを組換え的に発現するのに必要な付随したベクターおよび宿主細胞である。これらのポリヌクレオチド配列は配列番号１５４〜２６４を包含する。
【００２７】
本発明のポリペプチドを選択的に結合する抗体および抗体フラグメントもまた提供される。こうした抗体は本発明のポリペプチドの検出において有用であり、かつ、当該技術分野で公知の手順により同定かつ作成し得る。本発明のポリペプチドを認識するポリクローナルＮ末端ＩｇＧ抗体およびモノクローナルＣ末端Ｆａｂ抗体が生成されている。
【００２８】
本発明はまた、治療上有効な量の配列番号１から１５２のような本発明のポリペプチドのいずれか若しくはＶＰＡＣ２で活性のいずれかのポリペプチドを哺乳動物に投与することを含んでなる、前記哺乳動物における糖尿病、糖尿病関連障害、および／または本発明のポリペプチドにより影響を及ぼされる、好ましくは本発明のポリペプチドのＶＰＡＣ２アゴニスト機能により遂げられる他の疾患若しくは状態の治療方法にも向けられる。
【００２９】
組換えおよび合成双方の本発明のポリペプチドの作成方法もまた開示される。
［発明の詳細な記述］
本発明は、図１ａ−１ｄの新規ポリペプチド、ならびに該ポリペプチドと実質的に同一である最低１種の生物学的機能を示すそれらのフラグメント、誘導体およびバリアント（集合的に「本発明のポリペプチド」）を提供する。本発明のポリペプチドは、ＶＰＡＣ２アゴニストとして、そうでなければ１型および２型双方の糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：４０、１９９４）；不顕性自己免疫性成人糖尿病（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｄ．１１：２９９、１９９４）を包含する糖尿病；ならびに関連する糖尿病性脂質代謝異常および他の糖尿病合併症、ならびに高血糖、高インスリン血症、耐糖能異常、空腹時血糖異常、脂質代謝異常、高トリグリセリド血症、シンドロームＸおよびインスリン抵抗性のような疾患若しくは状態の予防および／若しくは処置においてｉｎ  ｖｉｖｏで機能する。
【００３０】
加えて、本発明のポリペプチドは、肥満（例えば食欲および食物摂取の調節）、アテローム硬化性疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心血管系疾患（アテローム硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患および高血圧を包含する）、脳血管系疾患ならびに末梢血管疾患の予防および／若しくは処置において；ならびに、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌、ならびに過形成、喘息、ヒト精子運動性を包含する男性の生殖の問題、潰瘍、睡眠障害、ならびに本明細書で同定される他の状態若しくは本明細書で後に記述されるところのそれ以外の機能の予防および／若しくは処置にもまた利用しうる。
【００３１】
好ましくは、本発明のポリペプチドはグルコース依存性の様式で膵β細胞からのインスリン放出を刺激することができる。なおより好ましくは、本発明のポリペプチドは水性および非水性双方の製剤中で安定でありかつ１時間より長い血漿半減期を表す。
【００３２】
本発明のポリペプチドはＶＰＡＣ２アゴニストである。好ましくは、それらはＶＰＡＣ１および／若しくはＰＡＣ１を上回るＶＰＡＣ２に対する最低１０倍の選択性を伴う選択的ＶＰＡＣ２アゴニストである。より好ましくは、それらはＶＰＡＣ１および／若しくはＰＡＣ１を上回るＶＰＡＣ２に対する最低１００倍の選択性を伴う選択的ＶＰＡＣ２アゴニストである。最も好ましくは、それらは、例えば２型糖尿病の処置に対し逆効果である血漿グルコースのレベルの静止状態若しくは増大を誘発することなくグルコース依存性の様式で血漿中へのインスリン放出を刺激する。加えて、本発明のポリペプチドがＶＰＡＣ２受容体の選択的アゴニストでありそれにより胃腸の水保持のような不快な若しくは危険な副作用および／または増大された心拍数のような望ましくない心血管系の影響の原因である他の受容体に対して選択的である一方で例えば血漿中へのインスリン放出の増大を引き起こすことが好ましい。
【００３３】
本発明のポリペプチドは水性および非水性製剤中でもまた安定である。好ましくは、本発明のポリペプチドは、水（７〜８の間のｐＨの）若しくは非水性有機溶媒に溶解される場合に１週間の期間にわたって３７〜４０℃で１０％未満の分解を表すことができる。なおより好ましくは、本発明のポリペプチドは水（７〜８の間のｐＨの）若しくは非水性有機溶媒に溶解される場合に１週間の期間にわたって３７〜４０℃で５％未満の分解を表すことができる。さらに、本発明の組成物および製剤は本発明のポリペプチドおよび約２％ないし約３０％のＤＭＳＯを含んでもよい。本発明の別の態様において、該組成物および製剤は場合によっては約０．２％ないし約３％（ｗ／ｖ）のプロピレングリコール、ジメチルホルムアミド、プロピレンカーボネート、ポリエチレングリコールおよびトリグリセリドのような付加的溶媒を包含してもよい。
【００３４】
最後に、本発明の誘導体化されたポリペプチドがＩＶ注入後にラットで最低１時間の血漿半減期を表すことが好ましく、より好ましくは、血漿半減期は最低２時間であることができ、そして、なおより好ましくは、血漿半減期は最低３時間であることができる。
【００３５】
本発明のポリペプチドは、減少された内因性インスリン分泌若しくは耐糖能異常、とりわけ２型糖尿病を伴う患者に新たな治療を提供する。すなわち、本発明のポリペプチドは、グルコースに刺激されるインスリン分泌を維持、改善かつ復帰させるのに使用しうる長時間作用型のＶＰＡＣ２アゴニストである。さらに、ＶＰＡＣ２受容体の選択的ペプチドアゴニストは、他のＰＡＣＡＰ受容体の非選択的活性化と関連する副作用を引き起こすことなく、膵におけるグルコース依存性のインスリン分泌を高めることができる。
【００３６】
本明細を通じて使用されるある種の用語を今や定義することができ、そして他者は紹介される際に定義されるであろう。特定のアミノ酸の一文字略語、その対応するアミノ酸および三文字略語は後に続くとおりである。すなわち、Ａ、アラニン（ａｌａ）；Ｃ、システイン（ｃｙｓ）；Ｄ、アスパラギン酸（ａｓｐ）；Ｅ、グルタミン酸（ｇｌｕ）；Ｆ、フェニルアラニン（ｐｈｅ）；Ｇ、グリシン（ｇｌｙ）；Ｈ、ヒスチジン（ｈｉｓ）；Ｉ、イソロイシン（ｉｌｅ）；Ｋ、リシン（ｌｙｓ）；Ｌ、ロイシン（ｌｅｕ）；Ｍ、メチオニン（ｍｅｔ）；Ｎ、アスパラギン（ａｓｎ）；Ｐ、プロリン（ｐｒｏ）；Ｑ、グルタミン（ｇｌｎ）；Ｒ、アルギニン（ａｒｇ）；Ｓ、セリン（ｓｅｒ）；Ｔ、トレオニン（ｔｈｒ）；Ｖ、バリン（ｖａｌ）；Ｗ、トリプトファン（ｔｒｐ）；Ｙ、チロシン（ｔｙｒ）。
【００３７】
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディング配列のみを包含するポリヌクレオチド、ならびに付加的なコーディングおよび／若しくは非コーディング配列を包含するポリヌクレオチドを包含する。本発明はさらに、配列間で最低約７０％、好ましくは最低約９０％、およびより好ましくは最低約９５％の同一性が存在する場合に上述された配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は、とりわけ、上述されたポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用されるところの「ストリンジェントな条件」という用語は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を意味している。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、配列間の最低約９０％、および好ましくは約９５％から９７％の同一性が存在する場合にのみ発生することができる。好ましい一態様において上述されたポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能若しくは活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００３８】
「機能的同等物」および「実質的に同一の生物学的機能若しくは活性」は、それぞれ、各ポリペプチドの生物学的活性が同一手順により測定される場合にそれが比較されているポリペプチドにより示される生物学的活性の約３０％以内ないし約１００％若しくはそれ以上である生物学的活性の程度を意味している。例えば、図１のポリペプチドに機能上同等であるポリペプチドは、実施例７の環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）シンチレーション近接アッセイで試験される場合にヒトＶＰＡＣ２受容体を発現するＣＨＯ細胞株中でｃＡＭＰの蓄積を示すものである。
【００３９】
ＶＰＡＣ２アゴニストである本発明のポリペプチドは、実施例７のプロトコルで試験される場合に最大のＰＡＣＡＰ−２７  ＶＰＡＣ２アゴニスト活性の約３０％ないし約１００％若しくはそれ以上を示すものである。ＰＡＣＡＰ、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ１受容体を上回るＶＰＡＣ２に対する選択的アゴニストである本発明の好ましいポリペプチドは、適切な受容体を発現する細胞を使用して実施例７のプロトコルで該ポリペプチドを試験する場合に約１０：１若しくはそれ以上、およびより好ましくは約１００：１若しくはそれ以上のＶＰＡＣ１活性に対するＶＰＡＣ２アゴニスト活性の比を示し、かつ／または約１０：１若しくはそれ以上、およびより好ましくは約１００：１若しくはそれ以上のＰＡＣ１受容体活性に対するＶＰＡＣ２アゴニスト活性の比を示すポリペプチドである。
【００４０】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍＬ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中での４２℃でのハイブリダイズさせるべき２種のポリヌクレオチド（若しくはフラグメント）の一夜インキュベーション、次いでフィルターを０．１×ＳＳＣ中約６５℃で洗浄することを指す。
【００４１】
「フラグメント」、「誘導体」および「バリアント」という用語は、図１のポリペプチドを指す場合に、さらに下述されるようなポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能若しくは活性を保持するこうしたポリペプチドのフラグメント、誘導体およびバリアントを意味している。
【００４２】
類似物は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列をそれ内に包含するプロポリペプチドを包含する。本発明の活性ポリペプチドは、天然のｉｎ  ｖｉｖｏの過程または酵素的若しくは化学的切断によるような当該技術分野で公知の手順によりプロポリペプチド分子を完成させる付加的なアミノ酸から切断され得る。例えば、２８アミノ酸の天然のペプチドＶＩＰは、天然にははるかにより大きなポリペプチドとして発現され、それがその後ｉｎ  ｖｉｖｏでプロセシングされて２８アミノ酸の活性の成熟ペプチドを遊離する。
【００４３】
フラグメントは、本明細書に開示されるｉｎ  ｖｉｖｏモデルに記述されるところの実質的に類似の機能的活性を保持するポリペプチドの一部分である。
【００４４】
誘導体は、本明細書に開示される機能を実質的に保存しかつ付加的な構造および付随した機能を包含するポリペプチドに対する全部の改変（例えばより長い半減期を有するＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ポリペプチド）、さらに下述されるところの、ターゲッティング特異性若しくは毒性のような付加的な活性を意図した標的に付与する融合ポリペプチドを包含する。
【００４５】
本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然の精製されたポリペプチド若しくは合成ポリペプチドであってよい。
【００４６】
本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体若しくはバリアントは、（ｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上が保存された若しくは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換されておりかつこうした置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によりコードされるものであっても若しくはなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）アミノ酸残基の１個若しくはそれ以上が置換基を包含するもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが該ポリペプチドの半減期を増大させるための化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されているもの、あるいは（ｉｖ）リーダーすなわち分泌配列または成熟ポリペプチド若しくはプロポリペプチド配列の精製に使用される配列のような付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているもの、あるいは（ｖ）ポリペプチド配列がより大きなポリペプチド（例えば効果の増大された持続時間のためのヒトアルブミン、抗体若しくはＦｃ）と融合されているものであってよい。こうしたフラグメント、誘導体およびバリアントならびに類似物は本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００４７】
好ましくは、本発明の誘導体は１個若しくはそれ以上の予測された、好ましくは不可欠でないアミノ酸残基でなされる保存的アミノ酸置換（下でさらに定義される）を含有することができる。「不可欠でない」アミノ酸残基は、生物学的活性を変えることなくあるタンパク質の野性型配列から変えられ得る残基である一方、「不可欠の」アミノ酸残基は生物学的活性に必要とされる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の一族が当該技術分野で定義されている。これらの一族は、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝状側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を包含する。非保存的置換は、保存されたアミノ酸残基、またはこうした残基がＶＰＡＣ２の活性および／若しくはＶＰＡＣ２の選択性のようなタンパク質活性に不可欠である残基１９および２７のような保存されたタンパク質ドメイン内に存するアミノ酸残基についてなされないことができる。フラグメント、すなわち生物学的に活性の部分は、医薬として、抗体を生成させるため、研究試薬としてなどの使用に適するポリペプチドフラグメントを包含する。フラグメントは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似の若しくはそれ由来のアミノ酸配列を含んでなりかつそのポリペプチドの最低１種の活性を表すがしかし本明細書に開示される完全長のポリペプチドより少ないアミノ酸を包含するペプチドを包含する。典型的には、生物学的に活性の部分は該ポリペプチドの最低１種の活性をもつ１ドメイン若しくはモチーフを含んでなる。ポリペプチドの生物学的に活性の一部分は、例えば長さが５若しくはそれ以上のアミノ酸であるペプチドであり得る。こうした生物学的に活性の部分は合成で若しくは組換え技術により製造し得、そして、本明細書に開示されるおよび／若しくは当該技術分野で公知の手段により本発明のポリペプチドの機能的活性の１種若しくはそれ以上について評価し得る。
【００４８】
さらに、本発明の好ましい誘導体は、該ポリペプチドの半減期を延長しかつ／若しくは該ポリペプチドの潜在的免疫原性を低下させる化合物（例えばポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」）のような別の化合物と融合されている成熟ポリペプチドを包含する。ＰＥＧ化の場合、ＰＥＧへのポリペプチドの融合は当業者に既知のいずれかの手段により達成し得る。例えば、ＰＥＧ化は最初にシステイン突然変異をポリペプチドに導入してそれにＰＥＧを結合するリンカーを提供すること、次いでＰＥＧ−マレイミドでの部位特異的誘導体化により達成し得る。システインはペプチドのＣ末端に付加し得、そして本発明で好ましい部位である（例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（１５）：８５４８−５３、２０００；Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２：４０５−４１７、２００１；ＧｏｏｄｓｏｏｎとＫａｔｒｅ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３−３４６、１９９０を参照されたい）。本発明のポリペプチドのバリアントは、図１の配列番号のアミノ酸配列若しくはその１ドメインに十分に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。「十分に類似の」という用語は、第一および第二のアミノ酸配列が共通の構造的ドメインおよび／若しくは共通の機能的活性を有するような第二のアミノ酸配列に関して十分なまたは最小限の数の同一の若しくは同等なアミノ酸残基を含有する第一のアミノ酸配列を意味している。例えば、最低約４５％、好ましくは約７５％から９８％同一である共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列は本明細書で十分に類似と定義される。好ましくは、バリアントは本発明の好ましいポリペプチドのアミノ酸配列に十分に類似であることができる。バリアントは、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチド若しくはその相補物にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのバリアントを包含する。こうしたバリアントは一般に本発明のポリペプチドの機能的活性を保持する。ポリヌクレオチドのフラグメントのライブラリーを使用して、スクリーニングおよびその後の選択のためのフラグメントの多彩な集団を生成し得る。例えば、フラグメントのライブラリーは、ニッキングが分子あたり約１回のみ起こる条件下でヌクレアーゼでポリヌクレオチドの二本鎖ＰＣＲフラグメントを処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生して多様なニッキングされた産物からのセンス／アンチセンス対を包含し得る二本鎖ＤＮＡを形成させること、再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼでの処理により一本鎖部分を除去すること、および生じるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより生成し得る。この方法により、本発明のポリペプチドのＮ末端および多様な大きさの内的フラグメントをコードする発現ライブラリーを導き得る。
【００４９】
バリアントは突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なるポリペプチドを包含する。ＶＰＡＣ２アゴニストとして機能するバリアントは、本発明のポリペプチドの変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアルライブラリーをＶＰＡＣ２アゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。
【００５０】
一態様において、類似物の多彩なライブラリーが核酸レベルのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。バリアントの多彩なライブラリーは、例えば、潜在的バリアントのアミノ酸配列の縮重組が個々のポリペプチドとして、あるいはその中に配列の組を含有する一組のより大きな融合タンパク質（例えばファージディスプレイのため）として発現可能であるような遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造し得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的バリアントのライブラリーを生じさせるのに使用し得る多様な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機で実施し得、そして合成遺伝子をその後適切な発現ベクターに連結し得る。遺伝子の縮重組の使用は、所望の一組の潜在的バリアント配列をコードする配列の全部の１混合物での提供を見込む。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３、１９８３；Ｉｔａｋｕｒａら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、１９８４；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６、１９８４；Ｉｋｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７、１９８３を参照されたい）。
【００５１】
点突然変異若しくは短縮により作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および、選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該技術分野で既知である。こうした技術は、Ｒ−アゴニストポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応可能である。大型の遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に容易に従う最も広範に使用されている技術は、典型的に、複製可能な発現ベクターへ遺伝子ライブラリーをクローン化すること、ベクターの生じるライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望の活性の検出がその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を助長する条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技術、ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイとともに使用して所望のバリアントを同定し得る。
【００５２】
本発明はまたキメラ若しくは融合ポリペプチドも提供する。潜在的副作用を最小限にするために該ポリペプチドの送達を膵に局在化するようにターゲッティング配列を設計する。本発明のポリペプチドは、ペプチド結合若しくは改変ペプチド結合（すなわちペプチドアイソスター）により相互に結合されたアミノ酸より構成され得、そして、２０種の遺伝子にコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。該ポリペプチドは翻訳後プロセシングのような天然の過程、若しくは当該技術分野で公知である化学的修飾技術のいずれにより修飾してもよい。こうした修飾は基本的教科書およびより詳細なモノグラフ、ならびに多量の研究文献に十分に記述されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノ若しくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のどの場所でも起こり得る。同一の型の修飾が所定の１ポリペプチド中のいくつかの場所で同一の若しくは異なる程度で存在してよい。また、所定の１ポリペプチドが多くの型の修飾を含有してよい。ポリペプチドは例えばユビキチン化の結果として分枝していてよく、また、それらは分枝を伴う若しくは伴わない環状であってよい。環状、分枝状および分枝環状のポリペプチドは翻訳後の天然の過程由来であってよいか、若しくは合成的方法により作成されてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミデート化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介性の付加およびユビキチン化を包含する（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１−１２ページ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６、１９９０；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２、１９９２を参照されたい）。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、図１（配列番号１から１５２）のポリペプチド、ならびにそれからの配列中にわずかな変異を有する配列を包含する。「わずかな変異」は、本発明のポリペプチドの実質的に最低１種の生物学的機能、好ましくはＶＰＡＣ２アゴニスト活性、およびより好ましくは選択的ＶＰＡＣ２アゴニスト活性、そして最も好ましくは本明細書に示されるインスリン分泌活性を維持するいかなる配列の付加、置換若しくは欠失バリアントも包含することができる。これらの機能的同等物は、好ましくは図１のポリペプチドに対する最低約９０％の同一性、およびより好ましくは図１のポリペプチドに対する最低９５％の同一性、そしてなおより好ましくは図１のポリペプチドに対する最低９７％の同一性を有するポリペプチドを包含してよく、かつまた実質的に同一の生物学的活性を有するこうしたポリペプチドの部分も包含してよい。しかしながら、本明細書にさらに記述されるところの機能的同等性を示す図１のポリペプチドからのアミノ酸配列中のわずかな変異を有するいかなるポリペプチドも本発明の記述に包含される。
【００５４】
当該技術分野で既知のとおり、２ポリペプチド間の「類似性」は、１ポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換物を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定する。こうした保存的置換は上でならびにＤａｙｈｏｆｆ（Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５、１９７８）およびＡｒｇｏｓ（ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７７９−７８５、１９８９）により記述されるものを包含する。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化を表す：
−ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
−ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
−ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
−ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；
−ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；および
−ａｓｐ、ｇｌｕ。
【００５５】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドを包含するベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子的に工作されている宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞は、例えばクローニングベクター若しくは発現ベクターであってよい本発明のベクターで遺伝子的に工作（形質導入、形質転換若しくはトランスフェクト）されていてもよい。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態にあってよい。工作された宿主細胞はプロモーターを活性化する若しくは形質転換体を選択するのに適切なように改変した慣習的栄養培地中で培養し得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は発現のため選択した宿主細胞で以前に使用されたものでありかつ当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によりポリペプチドを製造するために使用してよい。従って、例えばポリヌクレオチド配列を多様な発現ベヒクル、とりわけポリペプチドを発現するためのベクター若しくはプラスミドのいずれか１つに包含してよい。こうしたベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列（例えばＳＶ４０の誘導体）；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合せ由来のベクター；ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡを包含する。しかしながら、いかなる他のベクター若しくはプラスミドもそれらが宿主中で複製かつ生存可能である限りは使用してよい。
【００５６】
適切なＤＮＡ配列は多様な手順によりベクター中に挿入しうる。一般に、ＤＮＡ配列は当該技術分野で既知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。こうした手順および他者は当業者の範囲内にあると思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成を指図する適切な発現制御配列（１種若しくは複数）（プロモーター）に効果的に連結される。こうしたプロモーターの代表的な例は、限定されるものでないが、ＬＴＲ若しくはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ若しくはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター、および原核生物若しくは真核生物細胞またはそれらのウイルス中での遺伝子の発現を制御することが既知の他のプロモーターを挙げることができる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターもまた含有しうる。該ベクターはまた発現を増幅するための適切な配列を包含してもよい。加えて、発現ベクターは、好ましくは、真核生物細胞培養のためのデヒドロ葉酸還元酵素若しくはネオマイシン耐性のような、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特質を提供する遺伝子を含有する。本明細書で上述されたところの適切なＤＮＡ配列ならびに適切なプロモーター若しくは制御配列を含有するベクターを使用して適切な宿主を形質転換して該宿主に該タンパク質を発現させてもよい。適切な宿主の代表的な例は、限定されるものでないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ若しくはボーズメラノーマのような動物細胞；アデノウイルス；植物細胞などを挙げることができる。適切な宿主の選択は本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００５７】
本発明はまた、広範に上述されたところの配列の１種若しくはそれ以上を含んでなる組換え構築物も包含する。該構築物は、その中に本発明の配列が順若しくは逆の向きで挿入されているプラスミド若しくはウイルスベクターのようなベクターを含んでなる。本態様の好ましい一局面において、構築物は、例えば該配列に作動可能に連結されているプロモーターを包含する制御配列をさらに含んでなる。多数の適するベクターおよびプロモーターが当業者に既知でありかつ商業的に入手可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＢＳ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ、ｐＴＲＣ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびＰＲＩＴ５。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびＰＳＶＬ。しかしながら、いかなる他のプラスミド若しくはベクターもそれらが宿主中で複製かつ生存可能である限りは使用してよい。プロモーター領域は、選択可能なマーカーを含むＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）ベクター若しくは他のベクターを使用するいかなる所望の遺伝子からも選択し得る。２種の適切なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。とりわけ言及される細菌プロモーターは、ｌａｃｉ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモーターはＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は当業者の水準内に十分にある。
【００５８】
本発明はまた、上述された構築物を含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞若しくは酵母細胞のような下等真核生物細胞であり得るか、または、宿主細胞は細菌細胞のような原核生物細胞であり得る。宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性のトランスフェクション、若しくは電気穿孔法により遂げることができる（Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８６）。宿主細胞中の構築物を慣習的な様式で使用して、該組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させ得る。あるいは、本発明のポリペプチドは慣習的ペプチド合成機により合成で製造し得る。
【００５９】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下に哺乳動物細胞、酵母、細菌若しくは他の細胞中で発現させ得る。細胞を含まない翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用してこうしたタンパク質を製造するのに使用し得る。原核生物および真核生物宿主とともにの使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）（その開示はこれにより引用することにより組み込まれる）により記述されている。
【００６０】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写はベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる通常は約１０から約３００ｂｐまでのＤＮＡのｃｉｓに作用する要素である。例は、複製起点の後側（ｌａｔｅ  ｓｉｄｅ）のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００ないし２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。一般に、組換え発現ベクターは複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子若しくはビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指図する高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを包含することができる。こうしたプロモーターは、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸ホスファターゼ若しくは熱ショックタンパク質のような解糖酵素をコードするオペロン由来であり得る。異種構造配列が、適切な期に、翻訳、開始および終止配列、ならびに好ましくはペリプラズム間隙若しくは細胞外媒体中への翻訳されたタンパク質の分泌を指図することが可能なリーダー配列と集成される。場合によっては、異種配列は所望の特徴（例えば発現される組換え産物の安定化若しくは単純化された精製）を賦与するＮ末端同定ペプチドを包含する融合タンパク質をコードし得る。
【００６１】
細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと作動可能な読取り相（ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）で適する翻訳、開始および終止シグナルと一緒に所望のタンパク質をコードする構造的ＤＮＡ配列を挿入することにより構築してよい。該ベクターは、１個若しくはそれ以上の表現型の選択可能なマーカー、およびベクターの維持を確実にしかつ所望の場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を含んでよい。形質転換のための適する原核生物宿主は、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な種を包含するが、とは言え他者もまた選択上使用してよい。細菌の使用のための有用な発現ベクターは、選択可能なマーカー、および、公知のクローンニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝因子を含んでなる商業的に入手可能なプラスミド由来の細菌の複製起点を含んでもよい。こうした商業的ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサラ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「バックボーン」区分を、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組合せてよい。
【００６２】
適する宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖後に、選択されたプロモーターを適切な手段（例えば温度移動若しくは化学的誘導）により抑制解除し、そして細胞を付加的な期間培養する。細胞は典型的に、遠心分離により収集し、物理的若しくは化学的手段により破壊し、そして生じる粗抽出物をさらなる精製のため保持する。タンパク質の発現で使用される微生物細胞は、凍結−融解の循環、超音波処理、機械的破壊若しくは細胞溶解剤の使用を包含するいずれかの便宜的方法により破壊し得る。
【００６３】
多様な哺乳動物細胞培養物系もまた組換えタンパク質を発現させるのに使用してよい。哺乳動物発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎにより記述されたサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Ｃｅｌｌ  ２３：１７５、１９８１）、および適合性のベクターを発現させることが可能な他の細胞株、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株を包含する。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適するプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまたいかなるなる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列ならびに５’の隣接する転写されない配列も含んでよい。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を使用して必要とされる転写されない遺伝因子を提供してもよい。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含するこのために使用される方法により組換え細胞培養物から回収かつ精製しうる。成熟タンパク質の配置の完成において、タンパク質の再フォールディング段階を必要なとおり使用し得る。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終生成段階に使用してもよい。
【００６５】
本発明のポリペプチドは、化学的合成処置の産物であってよいか、または原核生物若しくは真核生物宿主（例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞）から組換え技術により製造してもよい。組換え製造手順で使用される宿主に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳動物若しくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されてよいか、またはグリコシル化されなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニンアミノ酸残基も包含してよい。本発明の単離若しくは精製されたポリペプチド、またはその生物学的に活性の部分は、組換え技術により製造される場合は他の細胞物質若しくは培地を実質的に含まないか、または、化学的に合成される場合は化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドは細胞物質を実質的に含まず、かつ、約３０％（乾燥重量）未満の非ポリペプチドすなわち汚染する物質を有する。本発明のポリペプチド若しくはその生物学的に活性の部分を組換え的に製造する場合、好ましくは、培地はポリペプチド調製物の容量の約３０％未満に相当する。本発明が化学合成により製造される場合、好ましくは、該調製物は約３０乾燥重量％未満の化学的前駆体若しくは非発明化学物質を含有する。
【００６６】
本発明のポリペプチドは下の特定の実施例で記述されるとおり便宜的に単離しうる。精製されたポリペプチドの調製物は最低約７０％純粋であり；好ましくは、該調製物は約８５％から約９９％純粋である。調製物の純度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および質量スペクトル／液体クロマトグラフィーのような当該技術分野で既知のいずれかの手段により評価し得る。
【００６７】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知の化学的方法を使用して全体で若しくは部分的に合成してよい（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５−２２３、１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５−２３２、１９８０を参照されたい）。その後、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにクローン化してポリペプチドを発現させてよい。
【００６８】
当業者により理解されるであろうとおり、天然に存在しないコドンを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を製造することが有利であるかもしれない。例えば、特定の一原核生物若しくは真核生物宿主により好まれるコドンを選択して、ポリペプチド発現の速度を増大させ得るか、若しくは天然に存在する配列から生成される転写物のものより長い半減期のような所望の特性を有するＲＮＡ転写物を製造し得る。
【００６９】
本明細書に開示されるヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知の方法を使用して工作して、限定されるものでないがクローニング、プロセシングおよび／または該ポリペプチド若しくはｍＲＮＡ産物の発現を改変する変化を挙げることができる多様な理由上ポリペプチドをコードする配列を変えてもよい。無作為断片化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集成を使用してヌクレオチド配列を工作してよい。例えば、部位特異的突然変異誘発を使用して、新たな制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの好みの変更、スプライスバリアントの作製、突然変異の導入、などを行なうことができる。
【００７０】
化学物質模倣物、有機模倣物若しくはペプチド模倣物のような当業者の理解内の関連化合物もまた提供される。本明細書で使用されるところの「模倣物」、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ）」、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）」、「有機模倣物」および「化学物質模倣物」という用語は、本発明のペプチドのものに同等である三次元の向きの原子の配置を有するペプチド誘導体、ペプチド類似物および化合物を包含することを意図している。本明細書で使用されるところの「に同等な」という句は、本発明のペプチドの生物学的機能を有する前記原子および部分の同一若しくは十分に類似の配置若しくは向きを生じさせる模倣化合物中の結合長さ、結合角および配置を有する前記ペプチド中のある原子若しくは化学的部分の置換（１個若しくは複数）を有する化合物を包含することを意図していることが理解されるであろう。本発明のペプチド模倣物において、化学的構成要素の三次元配置は、該ペプチド中のペプチドバックボーンおよび成分のアミノ酸側鎖の三次元配置に構造的かつ／若しくは機能的に同等であり、実質的な生物学的活性を有する本発明のペプチドのこうしたペプチド、有機および化学物質模倣物をもたらす。これらの用語は、例えばＦａｕｃｈｅｒｅ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９、１９８６）；ＶｅｂｅｒとＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（ＴＩＮＳ  ｐ．３９２、１９８５）；およびＥｖａｎｓら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９、１９８７）（引用することにより本明細書に組み込まれる）により具体的に説明されるように当該技術分野における理解に従って使用される。
【００７１】
本発明の各ペプチドの生物学的活性についてファルマコフォアが存在することが理解されている。ファルマコフォアは、生物学的活性に対する構造的要件の理想化された三次元の定義を含んでなるとして当該技術分野で理解されている。ペプチド、有機、および化学物質模倣物は現在のコンピュータモデル化ソフトウェア（コンピュータ支援薬物設計）を用いて各ファルマコフォアを適合させるように設計してよい。前記模倣物は、本発明のペプチド中の置換基原子からの位置情報に基づく構造−機能解析により生じさせてよい。
【００７２】
本発明により提供されるところのペプチドは、有利には、当該技術分野で既知の化学合成技術のいずれか、とりわけ、例えば商業的に入手可能な自動ペプチド合成機を使用する固相合成技術により合成し得る。本発明の模倣物はペプチドの合成に慣習的に使用される固相若しくは液相法により合成し得る（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４、１９６３；Ｃａｒｐｉｎｏ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．６：１９１−９８、１９７３；Ｂｉｒｒ、Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：ハイデルベルク、１９７８；Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ．１、２、３および５（ＧｒｏｓｓとＭｅｉｎｈｏｆｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、１９７９；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：イリノイ州ロックフォード、１９８４；Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７−８９、１９８８；ならびにＧｒｅｇｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．５５：１６１−２１４、１９９０（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００７３】
固相の方法論の使用が好ましい。簡潔には、Ｎ保護されたＣ末端アミノ酸残基を、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン、ポリアクリルアミド樹脂、キーゼルグール／ポリアミド（ペプシンＫ）、細孔性ガラス、セルロース、ポリプロピレンメンブレン、アクリル酸被覆ポリエチレンロッドなどのような不溶性支持体に結合する。脱保護、中和および連続して保護されたアミノ酸誘導体のカップリングの周期を使用して、アミノ酸をアミノ酸配列に従ってＣ末端から結合する。数種の合成ペプチドについては、酸感受性樹脂を使用するＦＭＯＣ戦略を使用してよい。この点に関して好ましい固体支持体は、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、パラアセトアミドメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂、オキシム樹脂、４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Ｗａｎｇ樹脂）、４−（２’，４’−ジメトキシフェニルアミノメチル）−フェノキシメチル樹脂、２，４−ジメトキシベンズヒドリル−アミン樹脂、および４−（２’、４’−ジメトキシフェニル−ＦＭＯＣ−アミノ−メチル）−フェノキシアセトアミドノルロイシル−ＭＢＨＡ樹脂（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂）を包含する多様な官能性化された形態で商業的に入手可能であるジビニルベンゼン架橋ポリスチレン樹脂である。加えて、酸感受性樹脂は所望の場合はＣ末端酸もまた提供する。α−アミノ酸にとりわけ好ましい一保護基は塩基不安定性の９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）である。
【００７４】
ＢＯＣ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）およびＦＭＯＣ基と化学的に適合性のアミノ酸の側鎖の官能性に適する保護基は当該技術分野で公知である。ＦＭＯＣ化学を使用する場合、以下の保護されたアミノ酸誘導体、すなわちＦＭＯＣ−Ｃｙｓ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ａｓｎ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｌｅｕ、ＦＭＯＣ−Ｔｈｒ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｖａｌ、ＦＭＯＣ−Ｇｌｙ、ＦＭＯＣ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、ＦＭＯＣ−Ｇｌｎ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ｈｉｓ（Ｔｒｉｔ）、ＦＭＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（ＰＭＣ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル））、ＦＭＯＣ−Ａｒｇ（ＢＯＣ）２、ＦＭＯＣ−ＰｒｏおよびＦＭＯＣ−Ｔｒｐ（ＢＯＣ）が好ましい。アミノ酸残基は、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＤＣＣ（ジクロロヘキシルカルボジイミド）、ＢＯＰ（ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾリル−Ｎ−オキシトリスジメチルアミノホスホニウム）、ＰｙＢＯＰ（ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリスピロリジノホスホニウム）、ＰｙＢｒＯＰ（ヘキサフルオロリン酸ブロモトリスピロリジノホスホニウム）との直接カップリングのような当該技術分野で既知の多様なカップリング剤および化学を使用することにより；実施された対称的無水物を介して；ペンタフルオロフェニルエステルのような活性エステルを介して；または実施されたＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）活性エステルを介して、若しくはＦＭＯＣ−アミノ酸フッ化物および塩化物を使用することにより、若しくはＦＭＯＣ−アミノ酸−Ｎ−カルボキシ無水物を使用することによりカップリングしてよい。ＨＯＢｔ若しくはＨＯＡｔ（７−アザヒドロキシベンゾトリアゾール）の存在下でのＨＢＴＵ（ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル），１，１，３，３−テトラメチルウロニウム）若しくはＨＡＴＵ（ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル），１，１，３，３−テトラメチルウロニウム）での活性化が好ましい。
【００７５】
固相法は人的に実施してもよいが、とは言え商業的に入手可能なペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａなど；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）での自動合成が好ましい。典型的な合成においては、最初の（Ｃ末端）アミノ酸をクロロトリチル樹脂に負荷する。ＡＢＩ  ＦａｓｔＭｏｃプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従った連続的脱保護（２０％ピペリジン／ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）を用いる）およびカップリング周期を使用してペプチド配列を生成させてよい。無水酢酸によるキャッピングを用いる二重および三重カップリングもまた使用してよい。
【００７６】
合成模倣物ペプチドは、適切な捕捉剤を含有するＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）での処理により樹脂から切断しかつ脱保護してよい。Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋ（０．７５ｇ結晶フェノール、０．２５ｍＬエタンジチオール、０．５ｍＬチオアニソール、０．５ｍＬ脱イオン水、１０ｍＬ  ＴＦＡ）および他者のような多くのこうした切断試薬を使用してよい。ペプチドは濾過により樹脂から分離しかつエーテル沈殿により単離する。ゲル濾過および逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のような慣習的方法によりさらなる精製を達成しうる。本発明の合成模倣物は製薬学的に許容できる塩、とりわけ有機塩基および無機塩基の塩を包含する塩基付加塩の形態にあってよい。酸性アミノ酸残基の塩基付加塩は、当業者に公知の手順に従って適切な塩基若しくは無機塩基でのペプチドの処理により製造するか、または、所望の塩は適切な塩基の凍結乾燥により直接得てよい。
【００７７】
一般に、当業者は、本明細書に記述されるところのペプチドを多様な化学的技術により修飾して、未修飾ペプチドと本質的に同一の活性を有しかつ場合によっては他の所望の特性を有するペプチドを製造しうることを認識するであろう。例えば、ペプチドのカルボン酸基が製薬学的に許容できる陽イオンの塩の形態で提供されうる。ペプチド内の陰イオン基は、ＨＣｌ、ＨＢｒ、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸のような製薬学的に許容できる酸付加塩、および他の有機塩の形態にあってよいか、若しくはアミドに転化されてもよい。チオールはアセトアミド基のような多数の十分に認識された保護基のいずれか１つで保護してよい。当業者はまた、天然の結合配置がより近くに近づけられることができるような本発明のペプチドへの環状構造の導入方法も認識するであろう。例えば、酸化された場合にペプチドがジスルフィド結合を含有してそれにより環状ペプチドを生成することができるように、カルボキシル末端若しくはアミノ末端のシステイン残基をペプチドに付加してもよい。他のペプチド環化方法は、チオエーテルならびにカルボキシルおよびアミノ末端のアミドおよびエステルの形成を包含する。
【００７８】
とりわけ、多様な技術が、対応するペプチド化合物と同一若しくは類似の所望の生物学的活性をもつがしかし溶解性、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関して該ペプチドより好都合な活性をもつペプチド誘導体および類似物を構築するために利用可能である。こうした誘導体および類似物は、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基で修飾されたペプチド、および／またはペプチド中のアミド結合の１個若しくはそれ以上を非アミド結合に変えることを包含する。２個若しくはそれ以上のこうした修飾を１個のペプチド模倣物構造中で組合せてよいことが理解されるであろう（例えば、Ｃ末端カルボキシル基での修飾およびペプチド中の２個のアミノ酸間での−ＣＨ２−カルバメート結合の包含）。
【００７９】
アミノ末端の修飾は、アルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基を付加すること、およびスクシンイミド基を形成することを包含する。とりわけ、Ｎ末端アミノ基を反応させて、Ｒがアルキル、好ましくは低級アルキルでありかつ酸ハロゲン化物ＲＣ（Ｏ）Ｃｌ若しくは酸無水物との反応により付加される式ＲＣ（Ｏ）ＮＨ−のアミド基を形成させうる。典型的には、該反応は、約等モル若しくは過剰量（例えば約５等量）の酸ハロゲン化物を、反応の間に生成される酸を捕捉するための好ましくは過剰の（例えば約１０等量）ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンを含有する不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中のペプチドに接触させることにより実施し得る。反応条件はそれ以外は慣習的（例えば室温３０分間）である。低級アルキルＮ置換を提供するための末端アミノのアルキル化、次いで上述されたところの酸ハロゲン化物との反応が式ＲＣ（Ｏ）ＮＲ−のＮ−アルキルアミド基を提供することができる。あるいは、アミノ末端を無水コハク酸との反応によりスクシンイミド基に共有結合してもよい。およそ等モル量の若しくは過剰の無水コハク酸（例えば約５等量）を使用し、そして、末端アミノ基を、Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（米国特許第４，６１２，１３２号明細書）に記述されかつそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれるところの適する不活性溶媒（例えばジクロロメタン）中過剰の（例えば１０等量）ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンの使用を包含する当該技術分野で公知の方法によりスクシンイミドに転化する。コハク酸基は、例えば、ペプチドのＮ末端の置換スクシンイミドを提供するための慣習的様式で製造されるＣ２−からＣ６−アルキル若しくは−ＳＲ置換基で置換されてもよいこともまた理解されるであろう。こうしたアルキル置換基は、Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、上記により記述される様式での無水マレイン酸との低級オレフィン（Ｃ２−からＣ６−アルキル）の反応により製造してよく、また、−ＳＲ置換基はＲが上で定義されたようであるＲＳＨの無水マレイン酸との反応により製造してよい。別の有利な態様において、アミノ末端をベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−若しくは置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基を形成するように誘導体化してもよい。この誘導体は、好ましくは反応の間に生成される酸を捕捉するための三級アミンを含有する適する不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中、およそ同等な量の若しくは過剰の塩化ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ−Ｃｌ）若しくは置換ＣＢＺ−Ｃｌとの反応により製造してよい。なお別の誘導体においては、Ｎ末端は三級アミンをスルホンアミドに転化するための適する不活性希釈剤（ジクロロメタン）中での同等な量の若しくは過剰の（例えば５等量）Ｒ−Ｓ（Ｏ）２Ｃｌ（式中Ｒはアルキルおよび好ましくは低級アルキルである）との反応によるスルホンアミド基を含んでなる。好ましくは、不活性希釈剤は、反応の間に生成される酸を捕捉するための過剰の（例えば１０等量）ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンを含有する。反応条件はそれ以外は慣習的（例えば室温３０分間）である。カルバメート基は、三級アミンをカルバメートに転化するための適する不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中での同等な量若しくは過剰の（例えば５等量）Ｒ−ＯＣ（Ｏ）Ｃｌ若しくはＲ−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４−ｐ−ＮＯ２（式中Ｒはアルキル、好ましくは低級アルキルである）との反応によりアミノ末端に生じさせうる。好ましくは、不活性希釈剤は、反応の間に生成されるいかなる酸も捕捉するための過剰の（例えば約１０等量）ジイソプロピルエチルアミンのような三級アミンを含有する。反応条件はそれ以外は慣習的（例えば室温３０分間）である。末端アミンを尿素（すなわちＲＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）基（式中Ｒは上で定義されるとおりである）に転化するための適する不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中での同等な量若しくは過剰の（例えば５等量）のＲ−Ｎ＝Ｃ＝Ｏとの反応により、尿素基をアミノ末端に形成してもよい。好ましくは、不活性希釈剤は過剰の（例えば約１０等量）ジイソプロピルメチルアミンのような三級アミンを含有する。反応条件はそれ以外は慣習的（例えば室温約３０分間）である。
【００８０】
Ｃ末端カルボキシル基がエステル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、式中Ｒはアルキルおよび好ましくは低級アルキルである）により置換されていてよいペプチド模倣物の製造において、ペプチド酸を調製するために使用される樹脂を使用してよく、また、側鎖が保護されたペプチドは塩基および適切なアルコール（例えばメタノール）で切断しうる。側鎖保護基は、所望のエステルを得るためのフッ化水素との反応により通常の様式で除去しうる。Ｃ末端カルボキシル基がアミド−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４により置換されているペプチド模倣物の製造において、ベンズヒドリルアミン樹脂をペプチド合成のための固体支持体として使用する。合成の完了に際して、支持体からペプチドを遊離させるためのフッ化水素処理が遊離のペプチドアミド（すなわちＣ末端が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である）を直接もたらす。あるいは、支持体から側鎖が保護されたペプチドを切断するためのアンモニアとの反応と組合されたペプチド合成の間のクロロメチル化樹脂の使用が遊離のペプチドアミドを生じ、また、アルキルアミン若しくはジアルキルアミンとの反応は、側鎖が保護されたアルキルアミド若しくはジアルキルアミド（すなわちＣ末端が−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ１であり、式中ＲおよびＲ１はアルキルおよび好ましくは低級アルキルである）を生じる。その後、側鎖の保護をフッ化水素での処理により通常の様式で除去して遊離のアミド、アルキルアミド若しくはジアルキルアミドを生じる。
【００８１】
別の代替の態様において、Ｃ末端カルボキシル基若しくはＣ末端エステルを導入して、Ｎ末端アミノ基でのカルボキシル基若しくはエステルのそれぞれ−ＯＨ若しくはエステル（−ＯＲ）の置換により環化して環状ペプチドを形成してよい。例えば、合成およびペプチド酸を生じさせるための切断の後に、例えばジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）若しくはそれらの混合物中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような適切なカルボキシル基活性化物質により、溶液中で遊離酸を活性化されたエステルに転化する。その後、Ｎ末端アミンでの活性化されたエステルの置換により環状ペプチドを形成する。当該技術分野で公知の方法に従った非常に希薄な溶液の使用により、多量体化よりもむしろ環化が高められるかもしれない。
【００８２】
当該技術分野で理解されかつ本発明により提供されるところのペプチド模倣物は、本発明のペプチドに構造的に類似であるが、しかし、１個若しくはそれ以上のペプチド結合が、当該技術分野で既知かつ以下の参考文献すなわちＳｐａｔｏｌａ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：ニューヨーク、ｐ．２６７、１９８３；Ｓｐａｔｏｌａ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  １：３、１９８３；Ｍｏｒｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ．４６３−４６８、１９８０；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５、１９７９；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９、１９８６；Ｈａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４、１９８２；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８、１９８０；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２５３３、１９８２；Ｓｚｅｌｋｅら、第ＥＰ０４５６６５Ａ号明細書；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４、１９８３；およびＨｒｕｂｙ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９、１９８２（そのそれぞれは引用することにより本明細書に組み込まれる）にさらに記述される方法により場合によっては：−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ双方のコンホマー）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−よりなる群から選択される結合により置換されている。こうしたペプチド模倣物は、例えば製造するのがより経済的、より大きな化学的安定性若しくは高められた薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性などのような）、低下された抗原性および他の特性を有することを包含する、ポリペプチドの態様を上回る大きな利点を有しうる。
【００８３】
本発明のペプチドの模倣類似物はまた、慣習的な若しくは合理的な薬物設計の原理を使用しても得てよい（例えば、Ａｎｄｒｅｗｓら、Ｐｒｏｃ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｂｅｎｚｏｎ  Ｓｙｍｐ．２８：１４５−１６５、１９９０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２４、１９９０；Ｈｏｌら、、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、（Ｒｏｂｅｒｔｓ編）中；Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ｐｐ．８４−９３、１９８９ａ；Ｈｏｌ、Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．３９：１０１６−１０１８、１９８９ｂ；Ｈｏｌ、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２５：７６７−７７８，１９８６（その開示は引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００８４】
慣習的薬物設計方法によれば、所望の模倣物分子は、その構造が「天然の」ペプチドの構造と共通の属性を有する分子を無作為に試験することにより得られるかもしれない。特定の一群の結合分子の変化から生じる量的な寄与は、推定の模倣物の生物学的活性をペプチドの活性と比較して測定することにより決定してよい。合理的な薬物設計の好ましい一態様において、模倣物はペプチドの最も安定な三次元コンホメーションの属性を共有するよう設計される。従って、例えば、模倣物は、本明細書に開示されるところの本発明のペプチドにより表されるものに類似であるイオン性、疎水性若しくはファンデルワールス相互作用を引き起こすのに十分な様式で配置される化学基を有するよう設計されうる。
【００８５】
合理的な模倣物設計の好ましい実施方法は、Ｈｏｌ、１９８９ａ；Ｈｏｌ、１９８９ｂ；およびＨｏｌ、１９８６により例示されるもののようなペプチドの三次元構造の表示を形成することが可能なコンピュータシステムを使用する。本発明のペプチドのペプチド、有機および化学物質模倣物の分子構造は、当該技術分野で商業的に入手可能なコンピュータ支援設計プログラムを使用して生じさせうる。こうしたプログラムの例は、ＳＹＢＹＬ  ６．５（Ｒ）、ＨＱＳＡＲＴＭおよびＡＬＣＨＥＭＹ  ２０００ＴＭ（Ｔｒｉｐｏｓ）；ＧＡＬＡＸＹＴＭおよびＡＭ２０００ＴＭ（ＡＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、テキサス州サンアントニオ）；ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭおよびＣＥＲＩＵＳＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）；ＣＡＣＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳＴＭ、ＴＳＡＲＴＭ、ＡＭＢＥＲＴＭおよびＣＨＥＭ−ＸＴＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州オックスフォード）ならびにＣＨＥＭＢＵＩＬＤＥＲ３ＤＴＭ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含する。
【００８６】
例えば技術に認識された分子モデル化プログラムを使用して本明細書に開示されるペプチドを使用して製造されるペプチド、有機および化学物質模倣物は、最も好ましくは、コンビナトリアルケミストリー法を包含するハイスループットスクリーニングを適応させるよう設計された、慣習的化学合成技術を使用して製造してよい。本発明のペプチド、有機および化学物質模倣物の製造で有用なコンビナトリアル法は、ファージディスプレイアレイ、固相合成、および例えばＳＩＤＤＣＯ（アリゾナ州トゥーソン）；Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（カリフォルニア州サンディエゴ）；Ｓｙｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンタクララ）；Ｍｅｄｉｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（イリノイ州レモント）；Ｐｈａｒｍ−Ｅｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（フィラデルフィア州ベツレヘム）；若しくはＮ．Ｖ．Ｏｒｇａｎｏｎ（オランダ・オス）により提供されるところのコンビナトリアルケミストリーアレイを包含する。本発明のペプチド、有機および化学物質模倣物のコンビナトリアルケミストリー製造は、限定されるものでないが、Ｔｅｒｒｅｔｔ、（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ロンドン、１９９８）；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−５１、１９９４；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１、１９９４；Ｌｏｏｋら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：７０７−１２、１９９６；Ｒｕｈｌａｎｄら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：２５３−４、１９９６；Ｇｏｒｄｏｎら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１４４−５４、１９９６；ＴｈｏｍｐｓｏｎとＥｌｌｍａｎ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：５５５−６００、１９９６；ＦｒｕｃｈｔｅｌとＪｕｎｇ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１７−４２、１９９６；Ｐａｖｉａ、“Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ”、Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、ｗｗｗ．ｎｅｔｓｃｉ．ｏｒｇ、１９９５；Ａｄｎａｎら、“Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｌｅａｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ＳＡＲ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ”、Ｉｄ．、１９９５；ＤａｖｉｅｓとＢｒｉａｎｔ、“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ”、Ｉｄ．、１９９５；Ｐａｖｉａ、“Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｇｅｎｅｒｔｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ”、Ｉｄ．、１９９６；ならびに米国特許第５，８８０，９７２号；同第５，４６３，５６４号；同第５，３３１５７３号；および同第５，５７３，９０５号に開示される技術を挙げることができる当該技術分野で既知の方法に従って製造してよい。
【００８７】
新たに合成されたポリペプチドは、調製的高速液体クロマトグラフィーにより実質的に精製してよい（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８３を参照されたい）。本発明の合成ポリペプチドの組成はアミノ酸分析若しくは例えばエドマン分解手順（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記）によるシークェンシングにより確認してよい。加えて、該ポリペプチドのアミノ酸配列のいかなる部分も、直接合成の間に変えかつ／または化学的方法を使用して他のタンパク質からの配列と組合せてバリアントのポリペプチド若しくは融合ポリペプチドを製造しうる。
【００８８】
本発明のポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子治療」と称されるこうしたポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現により本発明に従って使用してもよい。従って、例えば、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を用いて細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで工作してよく、その後、該工作された細胞を該ポリペプチドで治療されるべき患者に提供してよい。こうした方法は当該技術分野で公知である。例えば、細胞を本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用による当該技術分野で既知の手順により工作してよい。
【００８９】
遺伝子治療を使用するインスリン分泌促進薬の局所送達は標的領域（例えば膵）に治療薬を提供しうる。例えば、膵特異的プロモーターを使用してβ細胞膵腫瘍マウスモデルが創製された（Ｈａｎａｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５（６０１５）：１１５−２２、１９８５）。
【００９０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ双方の遺伝子治療の方法論が企図されている。規定された細胞集団への潜在的に治療的な遺伝子のいくつかの移入方法が既知である（例えばＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−３１、１９９３を参照されたい）。これらの方法は、例えば：
１）直接遺伝子移入（例えばＷｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−６８、１９９０を参照されたい）；
２）リポソーム媒介性のＤＮＡ移入（例えばＣａｐｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：３９−４６、１９９５；Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１５−１７、１９９５；ＧａｏとＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０−８５  １９９１を参照されたい）；
３）レトロウイルス媒介性のＤＮＡ移入（例えば、Ｋａｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１７−１９、１９９３；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−１３、１９９２を参照されたい）；
４）ＤＮＡウイルス媒介性のＤＮＡ移入。こうしたＤＮＡウイルスは、例えば、アデノウイルス（好ましくはＡｄ−２若しくはＡｄ−５に基づくベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは単純疱疹ウイルスに基づくベクター）、およびパルボウイルス（好ましくは「欠損」若しくは非自律性パルボウイルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡＡＶ−２に基づくベクター）を包含する（例えば、Ａｌｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−８４、１９９４；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）
を包含する。
【００９１】
目的の遺伝子を移入するための特定の一ベクター系の選択は多様な因子に依存することができる。１つの重要な因子は標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターが広範囲に研究されかつ多数の遺伝子治療の応用で使用されているとは言え、これらのベクターは一般に非分裂細胞を感染させるのに適していない。加えて、レトロウイルスは発癌性の潜在性を有する。しかしながら、レンチウイルスベクターの分野での最近の発展はこれらの制限のいくつかを迂回するかもしれない（例えばＮａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−６７、１９９６を参照されたい）。
【００９２】
レトロウイルスプラスミドベクターがそれに由来しうるレトロウイルスは、限定されるものでないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルスを挙げることができる。
【００９３】
アデノウイルスは、それらが広範な宿主範囲を有し、休止期またはニューロン若しくは肝細胞のような終末分化した細胞を感染させ得、かつ、本質的に非発癌性と思われるという利点を有する（例えばＡｌｉら、１９９４を参照されたい）。アデノウイルスは宿主ゲノム中に組込むようには思われない。それらは染色体外に存在するため、挿入突然変異誘発の危険が大きく低下されている。Ａｌｉら、１９９４。
【００９４】
アデノ随伴ウイルスはアデノウイルスに基づくベクターと類似の利点を表す。しかしながらＡＡＶはヒト第１９染色体上で部位特異的組込みを表す（例えばＡｌｉら、１９９４を参照されたい）。
【００９５】
好ましい一態様において、本発明のポリペプチドインスリン分泌促進薬をコードするＤＮＡが、糖尿病および糖尿病関連障害のような障害の遺伝子治療で使用されている。
【００９６】
本態様によれば、本発明のポリペプチドインスリン分泌促進薬若しくはムテインをコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療は、それの必要な患者に診断とともに若しくはその直後に提供される。
【００９７】
当業者は、ポリペプチドインスリン分泌促進薬、ポリペプチドインスリン分泌促進薬のＤＮＡ若しくはＤＮＡフラグメント、誘導体またはバリアントを含有するいかなる適する遺伝子治療ベクターも本態様により使用してよいことを認識するであろう。こうしたベクターを構築するための技術は当該技術分野で公知である（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０、１９９８；Ｖｅｒｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：２３９−２４２、１９９８を参照されたい）。ポリペプチドインスリン分泌促進薬のＤＮＡを含有するベクターの標的部位への導入は既知の技術を使用して達成しうる。
【００９８】
ベクターは１種若しくはそれ以上のプロモーターを包含してよい。使用してよい適するプロモーターは、限定されるものでないが、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター；ならびにヒトサイトメガロウイルス（ＣＮＶ）プロモーター（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７（９）：９８０−９９０、１９８９）若しくはいずれかの他のプロモーター（例えば、限定されるものでないがヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーターを挙げることができる真核生物細胞プロモーターのような細胞プロモーター）を挙げることができる。使用してよい他のウイルスプロモーターは、限定されるものでないがアデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターを挙げることができる。適するプロモーターの選択は本明細書に含有される教示から当業者に明らかであろう。
【００９９】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適するプロモーターの制御下にある。使用してよい適するプロモーターは、限定されるものでないが、アデノウイルス主後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；若しくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーターのような異種プロモーター；ＭＭＴ（メタロチオネイン）プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡｌプロモーター；ヒトグロビンプロモーターのような誘導可能なプロモーター；単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（上述された改変されたレトロウイルスＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターを挙げることができる。プロモーターはまた、該ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであってもよい。
【０１００】
レトロウイルスプラスミドベクターを使用してパッケージング細胞株を形質導入して産生体（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）細胞株を形成してもよい。トランスフェクトされうるパッケージング細胞の例は、限定されるものでないが、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＭｉｌｌｅｒ（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：５−１４、１９９０、そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されているところのＤＡＮ細胞株を挙げることができる。ベクターは当該技術分野で既知のいかなる手段でパッケージング細胞を形質導入してもよい。こうした手段は、限定されるものでないが電気穿孔法、リポソームの使用およびＣａＰＯ４沈殿法を挙げることができる。一代替において、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム中に被包化若しくは脂質に結合されてそしてその後宿主に投与されてよい。産生体細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（１種若しくは複数）を包含する感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。こうしたレトロウイルスベクター粒子をその後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで真核生物細胞を形質導入するのに使用してよい。形質導入された真核生物細胞は該ポリペプチドをコードする核酸配列（１種若しくは複数）を発現することができる。形質導入されうる真核生物細胞は、限定されるものでないが、胚幹細胞、胚性腫瘍細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上皮細胞を挙げることができる。
【０１０１】
遺伝子治療への異なるアプローチは、患者の細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理して患者への再導入後に目的のタンパク質を産生するように休眠染色体遺伝子を誘導する、「経核質（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ）治療」である。経核質治療は、個体が活性化に必要な遺伝子の正常な相補物を有すると想定している。経核質治療は、プロモーター若しくは新生遺伝子を活性化させることが可能な他の外因性調節配列をｅｘ  ｖｉｖｏで患者の細胞の染色体ＤＮＡに導入すること、活性のタンパク質を産生する細胞を培養しかつそれについて選択すること、およびその後それらがその後完全に樹立されたようになるという意図を伴い活性化された細胞を患者に再導入することを必要とする。「遺伝子活性化された」細胞はその後、目的のタンパク質をいくらかのかなりの量の時間の間、おそらく該患者の生涯くらい長く製造する（例えば米国特許第５，６４１，６７０号および同第５，７３３，７６１号明細書を参照されたい、かつ、これによりそっくりそのまま引用することにより組み込まれる）。
【０１０２】
本発明のポリペプチドを選択的に結合する抗体および抗体フラグメントもまた本発明に包含される。当該技術分野で既知のいかなる型の抗体も、当該技術分野で公知の方法を使用して生成しうる。例えば、本発明のポリペプチドの１エピトープに特異的に結合する抗体を生成しうる。本明細書で使用されるところの「抗体」は無傷の免疫グロブリン分子、ならびに本発明のポリペプチドの１エピトープを結合することが可能であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのようなそのフラグメントを包含する。典型的には、最低６、８、１０若しくは１２の連続するアミノ酸がエピトープを形成するのに必要とされる。しかしながら、連続しないアミノ酸を巻き込むエピトープがより多くのアミノ酸、例えば最低１５、２５若しくは５０アミノ酸を必要とするかもしれない。
【０１０３】
本発明のポリペプチドの１エピトープに特異的に結合する抗体を、治療的に、ならびにウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降法のような免疫化学的アッセイ、若しくは当該技術分野で既知の他の免疫化学的アッセイにて使用してよい。多様なイムノアッセイを使用して所望の特異性を有する抗体を同定しうる。競合結合若しくは免疫放射計測アッセイのための多数のプロトコルが当該技術分野で公知である。こうしたイムノアッセイは、典型的には、免疫原と、該免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成の測定を伴う。
【０１０４】
典型的には、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイで使用される場合に他のタンパク質で提供される検出シグナルより最低５、１０若しくは２０倍より高い検出シグナルを提供する。好ましくは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的アッセイで他のタンパク質を検出せず、そして本発明のポリペプチドを溶液から免疫沈降させ得る。
【０１０５】
本発明のポリペプチドを使用して、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル若しくはヒトのような哺乳動物を免疫してポリクローナル抗体を産生させうる。所望の場合は、本発明のポリペプチドを、ウシ血清アルブミン、サイログロブリンおよびキーホールリンペットヘモシアニンのような担体タンパク質に複合させてもよい。宿主の種に依存して、多様なアジュバントを使用して免疫学的応答を増大させ得る。こうしたアジュバントは、限定されるものでないがフロイントのアジュバント、鉱物ゲル（例えば水酸化アルミニウム）ならびに表面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノール）を挙げることができる。ヒトで使用されるアジュバントのうち、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム  パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）がとりわけ有用である。
【０１０６】
本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養物中での連続細胞株による抗体分子の産生を提供するいかなる技術を使用しても製造しうる。これらの技術は、限定されるものでないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶハイブリドーマ技術を挙げることができる（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７、１９８５；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１４２、１９８５；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−３０、１９８３；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２：１０９−２０、１９８４）。
【０１０７】
加えて、「キメラ抗体」の製造のため開発された技術、すなわち、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライスして適切な抗原特異性および生物学的活性をもつ分子を得ることを使用してよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５、１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−０８、１９８４；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−５４、１９８５）。モノクローナルおよび他の抗体もまた「ヒト化」して、それが治療的に使用される場合に患者が該抗体に対する免疫応答を装備することを予防し得る。こうした抗体は、治療で直接使用されるべきヒト抗体に配列が十分に類似であるかもしれないか、若しくは数個の重要な残基の変化を必要とするかもしれない。げっ歯類抗体とヒト配列との間の配列の差異は、ヒト配列中でそれらと異なる残基を個々の残基の部位特異的突然変異誘発により、若しくは相補性決定領域全体の移植（ｇｒａｔｉｎｇ）により置換することにより最小限にされうる。あるいは、ヒト化抗体を組換え方法（例えば第ＧＢ２１８８６３８Ｂ号明細書を参照されたい）を使用して製造してよい。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号明細書に開示されるところの部分的に若しくは完全にのいずれかでヒト化されている抗原結合部位を含有してよい。
【０１０８】
あるいは、一本鎖抗体の製造について記述された技術を、当該技術分野で既知の方法を使用して採用して本発明のポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体を製造しうる。関連した特異性をもつがしかし別個のイディオタイプ組成の抗体を、ランダムコンビナトリアル免疫グロビンライブラリーからの鎖シャッフリングにより生成し得る（Ｂｕｒｔｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−２３、１９９１）。
【０１０９】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲのようなＤＮＡ増幅方法を使用して構築してよい（Ｔｈｉｒｉｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５：５０７−１１、１９９６）。一本鎖抗体は一若しくは二特異性であり得かつ二価若しくは四価であり得る。四価の二特異性一本鎖抗体の構築は例えばＣｏｌｏｍａとＭｏｒｒｉｓｏｎ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１５９−６３、１９９７）に教示されている。二価の二特異性一本鎖抗体の構築はＭａｌｌｅｎｄｅｒとＶｏｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６、１９９４）に教示されている。
【０１１０】
一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、下述されるとおり、人的若しくは自動ヌクレオチド合成を使用して構築し、標準的組換えＤＮＡ方法を使用して発現構築物にクローン化し、そしてコーディング配列を発現させるため細胞に導入してよい。あるいは、一本鎖抗体は、例えば繊維状ファージ技術を使用して直接製造し得る（Ｖｅｒｈａａｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６１：４９７−５０１、１９９５；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５：８１−９１、１９９３）。
【０１１１】
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、リンパ球集団中でｉｎ  ｖｉｖｏ産生を誘導すること、または免疫グロブリンライブラリー若しくは文献に開示されるところの高度に特異的な結合試薬の一団をスクリーニングすることにより製造してもよい（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３３−３７、１９８９；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−９９、１９９１）。
【０１１２】
他の型の抗体を構築しかつ本発明の方法で治療的に使用してもよい。例えば、キメラ抗体を第ＷＯ  ９３／０３１５１号明細書に開示されるとおり構築してもよい。「ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｙ）」のような、免疫グロブリン由来でありかつ多価かつ多特異性である結合タンパク質もまた製造し得る（例えば第ＷＯ  ９４／１３８０４号明細書、を参照されたい）。
【０１１３】
本発明のポリペプチドに結合する能力をもつヒト抗体は後に続くとおりＭｏｒｐｈｏＳｙｓのＨｕＣＡＬ（Ｒ）ライブラリーからもまた同定しうる。本発明のポリペプチドをマイクロタイタープレート上に被覆しかつＭｏｒｐｈｏＳｙｓのＨｕＣＡＬ（Ｒ）Ｆａｂファージライブラリーとともにインキュベートしてよい。本発明のポリペプチドに結合しないファージに結合されたＦａｂをプレートから洗い流して本発明のポリペプチドにきつく結合するファージのみを残し得る。結合したファージを例えばｐＨの変化若しくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での溶出により溶出しかつ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主の感染により増幅し得る。このパニング方法を１若しくは２回反復して、本発明のポリペプチドにきつく結合する抗体の集団を濃縮し得る。その後、濃縮されたプールからのＦａｂを発現させ、精製しかつＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングする。
【０１１４】
本発明の抗体は当該技術分野で公知の方法により精製してよい。例えば、抗体は、本発明のポリペプチドが結合するカラムの通過によりアフィニティー精製してもよい。その後、結合した抗体を、高塩濃度を伴う緩衝液を使用してカラムから溶出し得る。
【０１１５】
本発明のポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵島細胞からのインスリン分泌を刺激する能力の結果として、およびｉｎ  ｖｉｖｏで血糖の低下を引き起こすことにより、１型および２型（インスリン非依存性糖尿病）双方の糖尿病を包含する糖尿病の処置に使用してよい。こうした処置はまた糖尿病および糖尿病の合併症の発症も遅らせるかもしれない。該ポリペプチドは、耐糖能異常を伴う被験体が進行して２型糖尿病を発症することを予防するのにも使用しうる。本発明の方法で本発明の化合物を使用して治療若しくは予防しうる他の疾患および状態は：若年者の成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）（Ｈｅｒｍａｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３：４０、１９９４）；不顕性自己免疫性成人糖尿病（ＬＡＤＡ）（Ｚｉｍｍｅｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｄ．１１：２９９、１９９４）；耐糖能異常（ＩＴＧ）（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５、１９９９）；空腹時血糖異常（ＩＦＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４０：７９６、１９９１）；妊娠糖尿病（Ｍｅｔｚｇｅｒ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４０：１９７、１９９１）；および代謝性シンドロームＸを包含する。
【０１１６】
本発明のポリペプチドはまた肥満のような障害において、ならびにアテローム硬化性疾患、高脂血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬレベル、高血圧、心血管系疾患（アテローム硬化症、冠動脈心疾患、冠動脈疾患および高血圧を包含する）、脳血管疾患ならびに末梢血管疾患の処置において；ならびに、狼瘡、多嚢胞性卵巣症候群、発癌、ならびに過形成、喘息、男性の生殖の問題、潰瘍、睡眠障害、脂質および炭水化物代謝の障害、概日機能不全、成長障害、エネルギー恒常性の障害、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス）を包含する免疫疾患、ならびに急性および慢性の炎症性疾患、ならびに敗血症ショックの処置にも有効でありうる。
【０１１７】
本発明の化合物はまた、例えば脂質蓄積細胞を生じさせる細胞分化、例えば異常な膵β細胞機能、インスリン分泌性腫瘍および／若しくはインスリンに対する自己抗体、インスリン受容体に対する自己抗体若しくは膵β細胞に対し刺激性である自己抗体による自己免疫性低血糖に関与するインスリン感受性および血糖レベルの調節）、アテローム硬化性斑の形成に至るマクロファージ分化、炎症性応答、発癌、過形成、脂肪細胞の遺伝子発現、脂肪細胞分化、膵β細胞量の減少、インスリン分泌、インスリンに対する組織感受性、脂肪肉腫細胞増殖、多嚢胞性卵巣疾患、慢性無排卵、アンドロゲン過剰症、プロゲステロン産生、ステロイド産生、細胞中の酸化還元電位および酸化的ストレス、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）産生、増大したγ−グルタミルトランスペプチダーゼ、カタラーゼ、血漿トリグリセリド、ＨＤＬおよびＬＤＬコレステロールレベルなどに関する生理学的障害を治療するのにも有用であるかもしれない。
【０１１８】
本発明の化合物はまた、糖尿病の二次的原因を治療するために本発明の方法で使用されるかもしれない（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２２（Ｓｕｐｐ．１）：Ｓ５、１９９９）。こうした二次的原因は、グルココルチコイド過剰、成長ホルモン過剰、褐色細胞腫および薬物性糖尿病を包含する。糖尿病を誘発しうる薬物は、限定されるものでないが、ピリミニル、ニコチン酸、グルココルチコイド、フェニトイン、甲状腺ホルモン、β−アドレナリン作動薬、α−インターフェロンおよびＨＩＶ感染症を治療するのに使用される薬物を挙げることができる。
【０１１９】
加えて、本発明のポリペプチドは、喘息の処置（Ｂｏｌｉｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ３７：５７−６６、１９９５；米国特許第５，６７７，４１９号明細書；ポリペプチドＲ３Ｐ０がモルモット気管平滑筋の弛緩において活性であることを示す）；低血圧誘導（ＶＩＰは喘息患者において低血圧、頻脈および顔面紅潮を誘発する（Ｍｏｒｉｃｅら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７：２７９−２８０、１９８６；Ｍｏｒｉｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ  ２：１２２５−１２２７、１９８３）；男性の生殖の問題（Ｓｉｏｗら、Ａｒｃｈ．Ａｎｄｒｏｌ．４３（１）：６７−７１、１９９９）；抗アポトーシス／神経保護剤として（Ｂｒｅｎｎｅｍａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２０７−１２、１９９８）；虚血事象の間の心保護（Ｋａｌｆｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１２６８（２）：９５２−８、１９９４；Ｄａｓら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：２９７−３０８、１９９８）、概日時計の操作およびその関連する障害（Ｈａｍａｒら、Ｃｅｌｌ  １０９：４９７−５０８、２００２；Ｓｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１１５７５−８０、２０００）に、ならびに最後に抗潰瘍薬として（Ｔｕｎｃｅｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６５：３０９−２２、１９９８）使用しうる。
【０１２０】
本発明のポリペプチドは糖尿病および関連する障害の処置において、単独でまたは当業者に既知の付加的な治療および／若しくは化合物とともに使用してよい。あるいは、本明細書に記述される方法および化合物は部分的に若しくは完全に併用療法で使用してよい。
【０１２１】
本発明のポリペプチドはまた、ＰＰＡＲアゴニスト、スルホニル尿素薬物、非スルホニル尿素分泌促進薬、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感作薬、インスリン分泌促進薬、肝グルコース出力低下化合物、インスリンおよび抗肥満薬を包含する糖尿病の処置のための他の既知の治療とともに投与してもよい。こうした治療は、本発明のポリペプチドの投与の前、それと同時に若しくはその後に投与してよい。インスリンは長時間作用型および短時間作用型双方の形態ならびにインスリンの製剤を包含する。ＰＰＡＲアゴニストはＰＰＡＲサブユニットのいずれかのアゴニスト若しくはそれらの組合せを包含してよい。例えば、ＰＰＡＲアゴニストは、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲ−δまたはＰＰＡＲのサブユニットの２若しくは３種のいずれかの組合せのアゴニストを包含してよい。ＰＰＡＲアゴニストは例えばロシグリタゾンおよびピオグリタゾンを包含する。スルホニル尿素薬物は例えばグリブリド、グリメピリド、クロルプロパミドおよびグリピジドを包含する。本発明のポリペプチドとともに投与される場合に糖尿病の治療において有用でありうるα−グルコシダーゼ阻害剤は、アカルボース、ミグリトールおよびボグリボースを包含する。糖尿病の治療において有用でありうるインスリン感作薬はチアゾリジンジオン類および非チアゾリジンジオン類を包含する。本発明のポリペプチドとともに投与される場合に糖尿病の治療において有用でありうる肝グルコース出力低下化合物は、グルコファージ（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）およびグルコファージ（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）ＸＲのようなメトフォルミンを包含する。本発明のポリペプチドとともに投与される場合に糖尿病の治療において有用でありうるインスリン分泌促進薬は、スルホニル尿素および非スルホニル尿素薬物、すなわちＧＬＰ−１、ＧＩＰ、セクレチン、ナテグリニド、メグリチニド、レパグリニド、グリベンクラミド、グリメピリド、クロロプロパミド、グリピジドを包含する。ＧＬＰ−１は例えば脂肪酸誘導体化ＧＬＰ−１およびエキセンジンのような天然のＧＬＰ−１より長い半減期をもつＧＬＰ−１の誘導体を包含する。本発明の一態様において、本発明のポリペプチドは、インスリン分泌促進薬に対する膵β細胞の感受性を増大させるためにインスリン分泌促進薬とともに使用する。
【０１２２】
本発明のポリペプチドはまた抗肥満薬とともに本発明の方法で使用してもよい。抗肥満薬は、β−３アゴニスト、ＣＢ−１アンタゴニスト、例えばシブトラミン（メリディア（Ｍｅｒｉｄｉａ））のような食欲抑制薬、および例えばオルリスタット（ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ））のようなリパーゼ阻害剤を包含する。
【０１２３】
本発明のポリペプチドはまた、糖尿病患者において脂質障害を治療するのに普遍的に使用される薬物とともに本発明の方法で使用してもよい。こうした薬物は、限定されるものでないがＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、ニコチン酸、胆汁酸抑制薬およびフィブリン酸誘導体を挙げることができる。本発明のポリペプチドはまた、例えばβ−遮断薬およびＡＣＥ阻害剤のような降圧薬とともに使用してもよい。
【０１２４】
こうした共治療（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）は、２種若しくはそれ以上の薬物のいかなる組合せ（例えばインスリン感作薬および抗肥満薬と組合せの本発明の化合物）で投与してもよい。こうした共治療は上述されるところの製薬学的組成物の形態で投与してよい。
【０１２５】
本明細書で使用されるところの多様な用語を下に定義する。
【０１２６】
本発明の要素若しくはそれらの好ましい態様（１個若しくは複数）を紹介する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ（該）」および「ｓａｉｄ（前記）」は該要素の１個若しくはそれ以上が存在することを意味することを意図している。「含んでなること」、「包含すること」および「有すること」という用語は包括的であることを意図しており、かつ、列挙された要素以外に付加的な要素が存在しうることを意味している。
【０１２７】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は哺乳動物（例えばヒトおよび動物）を包含する。
【０１２８】
「処置」という用語は、ヒトを包含する被験体が、該被験体の状態を直接若しくは間接的に改善するまたは該被験体中の状態若しくは障害の進行を遅らせるという目的を伴い医学的補助を提供される、いかなる方法、動作、応用、治療なども包含する。
【０１２９】
「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）」若しくは「共治療（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、糖尿病の状態および／若しくは障害を治療するための２種若しくはそれ以上の治療薬の投与を意味する。こうした投与は、固定された比の有効成分を有する単一のカプセルで、若しくは各阻害剤について複数の別個のカプセルでのような実質的に同時の様式での２種若しくはそれ以上の治療薬の共投与を包含する。加えて、こうした投与は連続的様式での各型の治療薬の使用を包含する。
【０１３０】
「治療上有効な」という句は、所定の治療的処置と関連する有害な副作用を回避若しくは最小限にしつつ糖尿病の状態若しくは障害の重症度の改善という最終目標を達成することができる投与される各作用物質の量を意味している。
【０１３１】
「製薬学的に許容できる」という用語は、主題の品目が製薬学的製品中での使用に適切であることを意味している。
【０１３２】
哺乳動物における上で同定された状態の処置についての有効性を決定するのに使用される公知のアッセイに基づき、かつ、これらの状態を治療するのに使用される既知の医薬の結果とこれらの結果の比較により、本発明のポリペプチドの有効投薬量を各所望の適応症の処置のために容易に決定し得る。これらの状態の１つの処置で投与されるべき有効成分（例えばポリペプチド）の量は、使用される特定の化合物および投薬単位、投与様式、処置期間、治療される患者の齢および性、ならびに治療される状態の性質および程度のような考慮により広範に変動し得る。
【０１３３】
投与されるべき有効成分の総量は、一般に１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで、および好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲にわたってよい。単位投薬量は約０．０５ｍｇから約１５００ｍｇまでの有効成分を含有してよく、また、１日あたり１回若しくはそれ以上投与してよい。静脈内、筋肉内、皮下および非経口注入を包含する注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ならびに注入（ｉｎｆｕｔｉｏｎ）技術の使用による投与のための１日投薬量は約０．０１から約２００ｍｇ／ｋｇまでであってよい。１日直腸投薬レジメンは０．０１から２００ｍｇ／ｋｇ総体重までであってよい。経皮濃度は０．０１から２００ｍｇ／ｋｇまでの１日用量を維持するために必要とされるものであってよい。
【０１３４】
もちろん、各患者のための特定の初期および継続投薬レジメンは、主治医である診断医により決定されるところの状態の性質および重症度、使用される特定のポリペプチドの活性、患者の齢、患者の食餌、投与時間、投与経路、薬物の排泄速度、薬物の組合せなどにより変動することができる。所望の処置様式および本発明のポリペプチドの投与回数は慣習的処置試験を使用して当業者により確かめられうる。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは適切に処方された製薬学的組成物でのそれの必要な患者への投与により所望の薬理学的効果を達成するのに利用しうる。患者は、本発明の目的上、特定の状態若しくは疾患についての処置が必要なヒトを包含する哺乳動物である。従って、本発明は、製薬学的に許容できる担体および治療上有効な量のポリペプチドから構成される製薬学的組成物を包含する。製薬学的に許容できる担体は、担体に帰されるいかなる副作用も有効成分の有益な効果を損なわないように有効成分の効果的活性と矛盾しない濃度で患者に対し比較的非毒性かつ無害であるいずれかの担体である。ポリペプチドの治療上有効な量は、結果を生じさせる若しくは治療されている特定の状態に対する影響を発揮する量である。本明細書に記述されるポリペプチドは、例えば即時および調時放出製剤、経口で、非経口で、局所でなどを包含するいずれかの有効な慣習的投薬単位形態を使用して製薬学的に許容できる担体とともに投与してよい。
【０１３６】
経口投与のためには、ポリペプチドは例えばカプセ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、舐剤、溶融物、散剤、溶液、懸濁剤若しくは乳剤のような固体若しくは液体製剤に処方してよく、かつ、製薬学的組成物の製造のための当該技術に既知の方法に従って製造してよい。固体の単位投与剤形は、例えば界面活性剤、滑沢剤、ならびに乳糖、ショ糖、リン酸カルシウムおよびトウモロコシデンプンのような不活性増量剤を含有する通常の硬若しくは軟殻ゼラチン型のものであり得るカプセルであってよい。
【０１３７】
別の態様において、本発明のポリペプチドは、アラビアゴム、トウモロコシデンプン若しくはゼラチンのような結合剤；バレイショデンプン、アルギン酸、トウモロコシデンプンおよびグアールガムのような投与後の錠剤の崩壊および溶解を補助することを意図されている崩壊剤；錠剤顆粒の流動を向上させかつ打錠ダイおよびパンチの表面への錠剤材料の付着を予防することを意図している滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム、カルシウム若しくは亜鉛；色素；着色剤；ならびに錠剤の審美的質を高めかつそれらを患者により許容できるようにすることを意図している着香料とともに乳糖、ショ糖およびトウモロコシデンプンのような慣習的錠剤基剤を用いて打錠してよい。経口の液体投薬形態での使用に適する賦形剤は、製薬学的に許容できる界面活性剤、懸濁化剤若しくは乳化剤の添加を伴うか若しくは伴わないかのいずれかの水ならびにアルコール、例えばエタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコールのような希釈剤を包含する。多様な他の物質がコーティングとして若しくは投薬単位の物理的形態を別の方法で改変するために存在してよい。例えば、錠剤、丸剤若しくはカプセル剤はセラック、糖若しくは双方で被覆されていてよい。
【０１３８】
分散可能な粉末および顆粒は水性懸濁剤の製造に適する。それらは分散助剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤、および１種若しくはそれ以上の保存剤との混合状態で有効成分を提供する。適する分散助剤若しくは湿潤剤ならびに懸濁化剤は既に上に挙げられたものにより例示される。付加的な賦形剤、例えば上述された甘味料、着香料および着色剤もまた存在してよい。
【０１３９】
本発明の製薬学的組成物はまた水中油型乳剤の形態で存在してもよい。油相は流動パラフィン若しくは植物油の混合物のような植物油であってよい。適する乳化剤は、（１）アラビアゴムおよびトラガカントガムのような天然に存在するガム、（２）ダイズおよびレシチンのような天然に存在するホスファチド、（３）脂肪酸およびへキシトール無水物由来のエステル若しくは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびに（４）前記部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。乳剤はまた甘味料および着香料も含有してよい。
【０１４０】
油性懸濁剤は、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油中；または流動パラフィンのような鉱物油中に有効成分を懸濁することにより処方してよい。油性懸濁剤は例えばミツロウ、固形パラフィン若しくはセチルアルコールのような増粘剤を含有してよい。懸濁剤はまた１種若しくはそれ以上の保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル若しくはｎ−プロピル；１種若しくはそれ以上の着色剤；１種若しくはそれ以上の着香料；およびショ糖若しくはサッカリンのような１種若しくはそれ以上の甘味料を含有してもよい。
【０１４１】
シロップ剤およびエリキシル剤は例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール若しくはショ糖のような甘味料とともに処方してよい。こうした製剤はまた緩和剤、ならびに保存剤、着香料および着色剤も含有してよい。
【０１４２】
本発明のポリペプチドはまた、石鹸若しくは洗剤のような製薬学的に許容できる界面活性剤、ペクチン、カーボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロースのような懸濁化剤または乳化剤および他の製薬学的補助物質の添加を伴う若しくは伴わない、水、生理的食塩水、水性Ｄ−ブドウ糖および関連糖溶液；エタノール、イソプロパノール若しくはヘキサデシルアルコールのようなアルコール；プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールのようなグリコール；２，２−ジメチル−１，１−ジオキソラン−４−メタノールのようなグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００のようなエーテル；油；脂肪酸；脂肪酸エステル若しくはグリセリド；またはアセチル化脂肪酸グリセリドのような滅菌の液体若しくは液体の混合物であってよい製薬学的担体を含む生理学的に許容できる希釈剤中の化合物の注入可能な投薬量として、非経口で、すなわち皮下に、静脈内に、筋肉内に、若しくは腹腔内に投与してもよい。
【０１４３】
石油、動物、植物若しくは合成起源のもの、例えばラッカセイ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリンおよび鉱物油が本発明の非経口製剤で使用し得る油を具体的に説明する。適する脂肪酸はオレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸を包含する。適する脂肪酸エステルは例えばエチルオレエートおよびイソプロピルミリステートである。適する石鹸は脂肪アルカリ金属、アンモニウムおよびトリエタノールアミン塩を包含し、また、適する洗剤は陽イオン性洗剤、例えばジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、アルキルピリジニウムハロゲン化物およびアルキルアミン酢酸塩；陰イオン性洗剤、例えばアルキル、アリールおよびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテルおよびモノグリセリド硫酸塩およびスルホコハク酸塩；非イオン性洗剤、例えば脂肪アミン酸化物、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー；ならびに両性洗剤、例えばアルキル−β−アミノプロピオン酸塩および２−アルキルイミダゾリン四級アンモニウム塩、ならびに混合物を包含する。
【０１４４】
本発明の非経口組成物は、典型的には溶液中に約０．５％から約２５重量％までの有効成分を含有してよい。保存剤および緩衝剤もまた有利に使用してよい。注入の部位での刺激を最小限にする若しくは排除するために、こうした組成物は約１２から約１７までの親水−親油バランス（ＨＬＢ）を有する非イオン性界面活性剤を含有してよい。こうした製剤中の界面活性剤の量は約５％から約１５重量％までの範囲にわたる。界面活性剤は上のＨＬＢを有する単一成分であり得るか、または所望のＨＬＢを有する２種若しくはそれ以上の成分の混合物であり得る。
【０１４５】
ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノオレエート、およびプロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性基剤とのエチレンオキシドの高分子量付加物が、非経口製剤で使用される界面活性剤を具体的に説明する。
【０１４６】
製薬学的組成物は滅菌の注入可能な水性懸濁剤の形態にあってよい。こうした懸濁剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアラビアゴムのような適する分散助剤若しくは湿潤剤および懸濁化剤；レシチンのような天然に存在するホスファチド、アルキレンオキシドの脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシエチレンステアレート、エチレンオキシドの長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのような脂肪酸由来の部分エステルおよびへキシトールとのエチレンオキシドの縮合生成物、または脂肪酸由来の部分エステルおよびへキシトール無水物とのエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい分散助剤若しくは湿潤剤を使用して既知の方法に従って処方してよい。
【０１４７】
滅菌の注入可能な製剤はまた非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒中の滅菌の注入可能な溶液若しくは懸濁剤であってもよい。使用してよい希釈剤および溶媒は、例えば水、リンゲル液および等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌の固定油が溶媒若しくは懸濁媒体として慣習的に使用される。この目的上、合成モノ若しくはジグリセリドを包含するいかなる無刺激性の固定油も使用してよい。加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注入可能物の製造で使用してよい。
【０１４８】
本発明の組成物はまた薬物の直腸投与のための坐剤の形態でも投与してよい。これらの組成物は、通常温度で固体であるがしかし直腸温度で液体でありかつ従って直腸で融解して薬物を放出することができる、適する非刺激性の賦形剤と薬物（例えばポリペプチド）を混合することにより製造しうる。こうした物質は例えばカカオバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１４９】
本発明の方法で使用される別の製剤は経皮送達装置（「貼付剤」）を使用する。こうした経皮貼付剤を使用して、本発明の化合物の連続的若しくは不連続的注入を制御された量で提供しうる。製薬学的作用物質の送達のための経皮貼付剤の構成および使用は当該技術分野で公知である（例えば米国特許第５，０２３，２５２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。こうした貼付剤は、製薬学的作用物質の継続的、拍動性若しくは要求に応じた送達のため構成してよい。
【０１５０】
機械的送達装置を介して患者に製薬学的組成物を導入することが望ましいか若しくは必要であるかもしれない。製薬学的作用物質の送達のための機械的送達装置の構成および使用は当該技術分野で公知である。例えば、脳に直接薬物を投与するための直接技術は、通常、血液脳関門を迂回するための患者の脳室系への薬物送達カテーテルの留置を必要とする。身体の特定の解剖学的領域への作用物質の輸送に使用される１つのこうした埋込可能な送達系が米国特許第５，０１１，４７２号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【０１５１】
本発明の組成物は、一般に担体若しくは希釈剤と称される他の慣習的な製薬学的に許容できる調合成分もまた必要な若しくは所望のように含有してよい。本発明の組成物のいずれも、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加若しくは他の適する保存剤により保存されうる。適切な投薬形態のこうした組成物を製造するための慣習的手順を利用し得る。
【０１５２】
その意図されている投与経路のため組成物を処方するために適切なように使用してよい普遍的に使用される製薬学的成分は：限定されるものでないが酢酸、クエン酸、フマル酸、塩酸、硝酸を挙げることができる酸性化剤；および限定されるものでないがアンモニア溶液、炭酸アンモニウム、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、水酸化カリウム、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエタノールアミン、トロールアミンを挙げることができるアルキル化剤を包含する。
【０１５３】
他の製薬学的成分は、例えば、限定されるものでないが、吸着剤（例えば粉末状のセルロースおよび活性炭）；エアゾル噴射剤（例えば、二酸化炭素、ＣＣｌ２Ｆ２、Ｆ２ＣｌＣ−ＣＣｌＦ２およびＣＣｌＦ３）；空気置換剤（例えば窒素およびアルゴン）；抗真菌性保存剤（例えば安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム）；抗菌性保存剤（例えば塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀およびチメロサール）；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム）；結合物質（例えばブロックポリマー、天然および合成ゴム、ポリアクリレート、ポリウレタン、シリコーンおよびスチレン−ブタジエンコポリマー）；緩衝剤（例えばメタリン酸カリウム、リン酸一カリウム、酢酸ナトリウム、無水クエン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム二水和物）；運搬剤（例えばアラビアゴムシロップ、芳香シロップ、芳香エリキシル、チェリーシロップ、カカオシロップ、オレンジシロップ、シロップ、トウモロコシ油、鉱物油、ラッカセイ油、ゴマ油、静菌性塩化ナトリウム注射剤および静菌性注射用水）；キレート剤（例えばエデト酸二ナトリウムおよびエデト酸）；着色剤（例えばＦＤ＆Ｃ赤色３号、ＦＤ＆Ｃ赤色２０号、ＦＤ＆Ｃ黄色６号、ＦＤ＆Ｃ青色２号、Ｄ＆Ｃ緑色５号、Ｄ＆Ｃ橙色５号、Ｄ＆Ｃ赤色８号、カラメルおよび酸化鉄赤色）；澄明化剤（例えばベントナイト）；乳化剤（限定されるものでないがアラビアゴム、セトマクロゴール、セチルアルコール、グリセリルモノステアレート、レシチン、ソルビタンモノオレエート、ポリエチレン５０ステアレート）；被包化剤（例えばゼラチンおよびセルロースアセテートフタレート）；着香料（例えばアニス油、ケイヒ油、カカオ、メントール、オレンジ油、ペパーミント油およびバニリン）；湿潤剤（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよびソルビトール）；ゲル化剤（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば鉱物油およびグリセリン）；油（例えばラッカセイ油（ａｒａｃｈｉｓ  ｏｉｌ）、鉱物油、オリーブ油、ラッカセイ油（ｐｅａｎｕｔ  ｏｉｌ）、ゴマ油および植物油）；軟膏基剤（例えばラノリン、親水軟膏、ポリエチレングリコール軟膏、ワセリン、親水ワセリン、白色軟膏、黄色軟膏、およびローズウォーター軟膏（ｒｏｓｅ  ｗａｔｅｒ  ｏｉｎｔｍｅｎｔ））；浸透増強剤（経皮送達）（例えばモノヒドロキシ若しくはポリヒドロキシアルコール、飽和若しくは不飽和脂肪アルコール、飽和若しくは不飽和脂肪エステル、飽和若しくは不飽和ジカルボン酸、精油、ホスファチジル誘導体、セファリン、テルペン、アミド、エーテル、ケトンおよび尿素）；可塑剤（例えばフタル酸ジエチルおよびグリセリン）；溶媒（例えばアルコール、トウモロコシ油、綿実油、グ��セリン、イソプロピルアルコール、鉱物油、オレイン酸、ラッカセイ油、精製水、注射用水、注射用滅菌水および灌注用滅菌水）；硬化剤（例えばセチルアルコール、セチルエステル蝋、微晶質蝋、パラフィン、ステアリルアルコール、白蝋および黄蝋）；坐剤基剤（例えばカカオバターおよびポリエチレングリコール（混合物））；界面活性剤（例えば塩化ベンザルコニウム、ノノキシノール１０、オキシトキシノール９、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウムおよびソルビタンモノパルミテート）；懸濁化剤（例えばアガー、ベントナイト、カーボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カオリン、メチルセルロース、トラガカントおよびビーガム）；甘味料例えばアスパルテーム、Ｄ−ブドウ糖、グリセリン、マンニトール、プロピレングリコール、サッカリンナトリウム、ソルビトールおよびショ糖）；錠剤付着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウムおよびタルク）；錠剤結合剤（例えばアラビアゴム、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、圧縮可能な糖、エチルセルロース、ゼラチン、液状ブドウ糖、メチルセルロース、ポビドンおよび糊化済デンプン）；錠剤およびカプセル剤の希釈剤（例えば第二リン酸カルシウム、カオリン、乳糖、マンニトール、微晶質セルロース、粉末セルロース、沈降炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ソルビトールおよびデンプン）；錠剤コーティング剤（例えば液状ブドウ糖、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、セルロースアセテートフタレートおよびセラック）；錠剤直接圧縮賦形剤（例えば第二リン酸カルシウム）；錠剤崩壊剤（例えばアルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、微晶質セルロース、ポラクリリンカリウム、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウムおよびデンプン）；錠剤流動促進剤（例えばコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンおよびタルク）；錠剤滑沢剤（例えばステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、ステアリン酸およびステアリン酸亜鉛）；錠剤／カプセル剤不透明化剤（ｏｐａｑｕａｎｔ）（例えば二酸化チタン）；錠剤光沢剤（例えばカルナウバロウおよび白蝋）；増粘剤（例えばミツロウ、セチルアルコールおよびパラフィン）；張度剤（例えばＤ−ブドウ糖および塩化ナトリウム）；粘度増大剤（例えばアルギン酸、ベントナイト、カーボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポビドン、アルギン酸ナトリウムおよびトラガカント）；ならびに湿潤剤（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、レシチン、ポリエチレンソルビトールモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、およびポリオキシエチレンステアレート）を挙げることができる。
【０１５４】
本明細書に記述されるポリペプチドは単独の製薬学的作用物質として、若しくは組合せが許容できない有害な影響を引き起こさない１種若しくはそれ以上の他の製薬学的作用物質と組合せで投与してよい。例えば、本発明のポリペプチドは、既知の抗肥満薬、または既知の抗糖尿病薬若しくは他の適応症の作用物質などと、ならびにそれらの混合物および組合せと組合せ得る。
【０１５５】
本明細書に記述されるポリペプチドは遊離の形態で若しくは組成物で、研究および診断において、または分析の参照標準などとして利用してもまたよい。従って、本発明は不活性の担体および有効量の本明細書に記述される方法により同定される化合物またはその塩若しくはエステルから構成される組成物を包含する。不活性の担体は、運搬されるべき化合物と相互作用せず、かつ、運搬されるべき化合物に支持、運搬の手段、嵩、追跡可能な物質などを与えるいずれかの物質である。化合物の有効量は、結果を生じさせるか若しくは実施されている特定の処置に対する影響を発揮する量である。
【０１５６】
ポリペプチドは、水性および非水性環境中で加水分解、脱アミノ化、酸化、ラセミ化および異性体化を受けることが既知である。加水分解、脱アミノ化若しくは酸化のような分解はキャピラリー電気泳動により容易に検出し得る。酵素的分解にもかかわらず、延長された血漿半減期若しくは生物学的在留時間を有するポリペプチドは、少なくとも水性溶液中で安定であるべきである。ポリペプチドが体温で１日の期間にわたって１０％未満の分解を表すことが不可欠である。ポリペプチドが体温で１日の期間にわたって５％未満の分解を表すことがなおより好ましい。慢性糖尿病患者における生涯の処置のため、はるかに好ましくは、これらの治療薬は、非経口経路による場合はさらにより少なく投与することが便宜的である。体温での数週間の期間にわたっての安定性（すなわち数パーセント未満の分解）はより少なく頻繁な投与を可能にすることができる。冷蔵庫温度での数年の規模での安定性は製造者が液体製剤を与えることを可能にし、従って再構成の不便を回避することができる。加えて、有機溶媒中での安定性は、ポリペプチドが埋込物のような新規投薬形態に処方されることを提供するとみられる。
【０１５７】
皮下、静脈内、筋肉内などに適する製剤；適する製薬学的担体；ならびに処方および投与のための技術は当該技術分野で公知の方法のいずれかにより準備されうる（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、フィラデルフィア州イーストン、第２０版、２０００を参照されたい）。
【０１５８】
以下の例は本明細書に記述される本発明を具体的に説明するために提示するが、しかし、いかなる方法でも本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。
カプセル剤の処方
カプセル剤の製剤は：
本発明のポリペプチド            １０ｍｇ
デンプン                      １０９ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム          １ｍｇ
から製造する。
【０１５９】
成分を混和し、適切なメッシュの篩を通過させ、そして硬ゼラチンカプセルに充填する。
錠剤の処方
錠剤を：
本発明のポリペプチド            ２５ｍｇ
セルロース、微晶質            ２００ｍｇ
コロイド状二酸化ケイ素          １０ｍｇ
ステアリン酸                      ５．０ｍｇ
から製造する。
【０１６０】
成分を混合しかつ圧縮して錠剤を成形する。味の良さを増大させるため、雅味および安定性を向上させるため、若しくは吸収を遅らせるために適切な水性および非水性コーティングを適用してもよい。
滅菌ＩＶ溶液
本発明の所望の化合物の１ｍｇ／ｍＬの溶液を、滅菌の注入可能な水を使用して作成し、そして必要な場合はｐＨを調節する。溶液を投与のため滅菌５％Ｄ−ブドウ糖で希釈しかつＩＶ注入剤として投与する。
筋肉内懸濁剤
以下の筋肉内懸濁剤を製造する：
本発明のポリペプチド                        ５０μｇ／ｍＬ
カルボキシメチルセルロースナトリウム          ５ｍｇ／ｍＬ
ＴＷＥＥＮ  ８０                              ４ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム                                ９ｍｇ／ｍＬ
ベンジルアルコール                            ９ｍｇ／ｍＬ
該懸濁剤は筋肉内に投与する。
硬殻カプセル剤
多数の単位カプセルを、それぞれ粉末状の有効成分、１５０ｍｇの乳糖、５０ｍｇのセルロースおよび６ｍｇのステアリン酸マグネシウムで標準的な二片の硬ゼラチンカプセルを充填することにより製造する。
軟ゼラチンカプセル
ダイズ油、綿実油若しくはオリーブ油のような消化されやすい油中の有効成分の混合物を調製しかつ容積移送式ポンプによって溶融ゼラチン中に注入して、有効成分を含有する軟ゼラチンカプセルを成形する。該カプセルを洗浄かつ乾燥する。有効成分はポリエチレングリコール、グリセリンおよびソルビトールの混合物に溶解して水と混合可能な医薬混合物を調製し得る。
即時放出錠剤／カプセル剤
これらは慣習的および新規方法により作成される固体の経口投薬形態である。これらの単位は医薬の即時溶解および送達のために水なしで経口で服用する。有効成分を糖、ゼラチン、ペクチンおよび甘味料のような液体含有成分に混合する。これらの液体を凍結乾燥および固体状態抽出技術により固体の錠剤若しくはカプレット剤に固化する。薬物化合物を粘弾性かつ熱弾性糖およびポリマー若しくは起泡性成分とともに圧縮して、水の必要を伴わない即時放出に意図されている多孔質マトリックスを生じさせてよい。
【０１６１】
それが本明細書に示されているところの本発明の技術思想若しくは範囲から離れることなく本発明に対し変更および改変を行い得ることが、当業者に明らかであるはずである。
［実施例］
本発明がより良好に理解されうるために以下の実施例を示す。これらの実施例は具体的説明のみの目的上でありかついかなる様式でも本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。本明細書で挙げられる全部の刊行物はそっくりそのまま引用することにより組み込まれる。
【実施例１】
【０１６２】
ペプチド合成の方法論
本発明のポリペプチドはこれらのペプチドの安定性を向上させかつ半減期を延長するよう設計した。具体的には、これらのペプチドの変異されていない形態（例えば第ＷＯ  ０１／２３４２０号明細書（そっくりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい）は、水性および非水性環境中でＮ末端加水分解、脱アミノ化ならびに二量体化および三量体化を示した。安定性を向上させかつ加水分解、脱アミノ化および二量体化／三量体化を最小限にするために、アスパラギン残基（位置９および２８）をグルタミン残基に変異させた。加えて、位置１７のバリン、位置１９のアラニン、位置２９のリシン、位置３０のアルギニンおよび位置３１のチロシンもまた変異させた。さらに、下述されるとおり、本発明のポリペプチドはＰＥＧ化もして半減期を延長させた。
【０１６３】
以下の一般的手順に従って本発明のポリペプチドのいくつかを合成した：
ペプチド合成は、Ｒａｐｐ−ＰｏｌｙｍｅｒｅのＰＥＧ−ポリスチレン樹脂（Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ・チュービンゲン）を使用して連続流条件下でＦＭＯＣ／ｔ−ブチル戦略（ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎとＤｕｎｎ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ３５、１９９４）により実施した。合成の完了時にペプチドを樹脂から切断しかつＴＦＡ／ＤＴＴ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（８８／５／５／２）を使用して脱保護した。冷ジエチルエーテルを使用してペプチドを切断カクテルから沈殿させた。沈殿物を冷エーテルで３回洗浄し、そしてその後凍結乾燥前に５％酢酸に溶解した。ペプチドは、０％から１００％までのアセトニトリル勾配として３％ＴＦＡを含む水／アセトニトリルを使用するＷａｔｅｒｓ  ＡＬＬＩＡＮＣＥ（Ｒ）系（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）上ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（ＹＭＣ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ウィルミントン）での逆相クロマトグラフィーにより、また、ＶＯＹＡＧＥＲ  ＤＥＴＭ  ＭＡＬＤＩ質量分析計（モデル５−２３８６−００、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州フラミンガム）でのＭＡＬＤＩ質量分析により確認した。ペプチドサンプルを１／１の比でマトリックス緩衝液（３％ＴＦＡを含む５０／５０のｄＨ２Ｏ／アセトニトリル）に添加した。＞９５％の純度基準に合致しないペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ４０００  ＨＰＬＣ系（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ミルフォード）での逆相クロマトグラフィーにより精製する。
【実施例２】
【０１６４】
ペプチドのＰＥＧ化
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの半減期をペプチドへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の結合により増大させ、それにより腎による該ペプチドの消失を抑制しかつ該ペプチドのプロテアーゼ分解を低下させてもよい。ＶＰＡＣ２受容体アゴニストペプチドの使用はｉｎ  ｖｉｖｏでのその非常に短い半減期によりひどく制限されるが；しかしながら、ＰＥＧ部分のペプチドへの結合（ＰＥＧ化）は、１日１回ないし週１回の処置を見込むのに十分にペプチドの半減期を延長した。
【０１６５】
ＰＥＧ化は当業者に既知のいずれの方法により実施してもよい。しかしながら、本実施例においては、唯一のシステイン突然変異をペプチドに導入すること、次いでペプチドのスルフヒドリルとメトキシ−ＰＥＧ−マレイミド試薬（Ｎｅｋｔａｒ（Ｉｎｈａｌｅ／Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ）、カリフォルニア州サンカルロス）のマレイミド基との間の安定なチオエーテル結合を介して該システインをＰＥＧ化することにより実施した。ＰＥＧ化による活性の潜在的低下を最小限にするためにペプチドのＣ末端に唯一のシステインを導入することが好ましい。
【０１６６】
具体的には、２倍モル過剰のｍＰＥＧ−ｍａｌ（ＭＷ  ２２ｋＤおよび４３ｋＤ）試薬を１ｍｇのペプチド（例えばペプチドのＣ末端に１個のシステイン突然変異を有する配列番号１）に添加し、そしてｐＨ６の反応緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム／０．１Ｍ  ＮａＣｌ／０．１Ｍ  ＥＤＴＡ）に溶解した。室温で０．５時間後に、ｍＰＥＧ−ｍａｌに対し２倍モル過剰のＤＴＴを用いて反応を終了した。ペプチド−ＰＥＧ−ｍａｌ反応混合物を陽イオン交換カラムに適用して残余のＰＥＧ試薬を除去し、次いでゲル濾過カラムに適用して残余の遊離ペプチドを除去した。純度、質量およびＰＥＧ化部位の数をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定した。２２ｋＤのＰＥＧを本発明のペプチドに結合した場合、強力なＶＰＡＣ２受容体活性化が保持された。さらに、ＶＰＡＣ１およびＰＡＣ１に対するＶＰＡＣ２の受容体活性化の選択性もまた保持された。より小さいＰＥＧ（例えば直鎖状の２２ｋＤのＰＥＧ）でのＰＥＧ化が該ペプチドの活性を低下させることはより少なくありそうであることができる一方、より大きなＰＥＧ（例えば分枝状の４３ｋＤのＰＥＧ）は活性を低下させることがよりありそうであることができることが可能である。しかしながら、より大きなＰＥＧは、週１回の注入を可能としうるように血漿半減期をさらに増大させることができる（Ｈａｒｒｉｓら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４０：５３９−５５１、２００１）。
【実施例３】
【０１６７】
ペプチドのクローン化
これらのペプチドを組換え的に発現するために、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、単量体ペプチドおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を分離する単一の第Ｘａ因子認識部位とともにＧＳＴに対しＣ末端にクローン化した。産生されるべきペプチドのＤＮＡ配列に融合された第Ｘａ因子認識部位をコードする遺伝子は、クローン化されるべき遺伝子のＤＮＡ配列に対しすぐ５’にＢａｍ  ＨＩ若しくはＸｈｏ  Ｉ制限酵素部位を含有する２本のオーバーラップ一本鎖ＤＮＡフラグメント（７０〜９０ｍｅｒ）をハイブリダイズすること、次いでＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイタースバーグ）の大型フラグメントを介する反対鎖のＤＮＡ合成により合成した。各遺伝子について選ばれたＤＮＡ配列は各ペプチドの設計されたアミノ酸配列の逆翻訳に基づいた。いくつかの場合においては、ペプチドをコードする遺伝子は、上述された方法により既に作成した遺伝子のＰＣＲ突然変異誘発（Ｐｉｃａｒｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：２５８７−９１、１９９４；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９）により生成させた。その後、二本鎖産物をＢａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉにより消化し、そして、またＢａｍ  ＨＩおよびＸｈｏ  Ｉで消化したｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に連結した。例えば、配列番号１をＧＳＴとの融合物として発現するために、設計したＤＮＡ配列（図２）をｐＧＥＸ−６Ｐ−１にクローン化した。
【実施例４】
【０１６８】
ペプチドの組換え発現および精製
ＧＳＴ−ペプチド融合物を含有するプラスミドで形質転換したＢＬ２１細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を、ＯＤ６００が０．６ないし１．０に達するまで３７℃で増殖させ、そしてその後細胞を１ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバード）とともに３７℃で２時間インキュベートした。細胞（２Ｌ）を７，７００ｇで１５分間遠心分離し、重量測定しかつ−２０℃で最低３時間保存した。凍結細胞ペレットを、細胞１ｇあたり２５０μＬのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス）を含有する１００ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、１５秒の中断を伴い１分間３回超音波処理した。その後細胞を１０，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を２ｍＬの５０％グルタチオンセファロース４Ｂ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに振とう機上４℃で一夜混合した。上清／樹脂を１，５００ｇで１５分間遠心分離し、空のＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）に充填し、３０ｍＬのＰＢＳ、次いで１０ｍＬの第Ｘａ因子緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄した。１ｍＬの第Ｘａ因子緩衝液中の６０単位の第Ｘａ因子（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加することによりペプチドをカラムから切断し、４℃で一夜インキュベートし、そして、２ｍＬのループならびに以下のプログラムすなわち１０分の緩衝液Ａ（０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）、３０分の緩衝液Ｂへの勾配、１０分の緩衝液Ａ、１０分の勾配、および１０分の（０．１％ＴＦＡ／ＡＣＮ）緩衝液Ａを用いる２ｍＬ／分の流速を使用してＣ１８  ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）により分離した。ピーク画分（各１ｍＬ）を収集しそして１０〜２０％トリシン−ＳＤＳゲル電気泳動によりスクリーニングした。図１のペプチドを含有する画分をプールしかつ乾燥した。典型的な収量は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物１リットルあたり数百マイクログラムの遊離ペプチドであった。組換えペプチドはそれらの合成バージョンと同一の活性を有することが示された。
【実施例５】
【０１６９】
分散ラット島細胞からのインスリン分泌
本発明の多数のペプチドにより媒介される、分散ラット島のインスリン分泌を後に続くとおり測定した。ＳＤラット（２００〜２５０ｇ）から単離したランゲルハンス島はコラゲナーゼを使用して消化した。分散させた島細胞をトリプシンで処理し、９６Ｖ底プレートに接種しそしてペレットにした。その後、本発明のペプチドを含む若しくは含まない培地中で細胞を一夜培養した。培地を吸引し、そして３ｍＭグルコースを含有するクレブス・リンゲル・ＨＥＰＥＳ緩衝液とともに細胞を３７℃で３０分間前インキュベートした。前インキュベーション緩衝液を除去し、そして、ペプチドを含む若しくは含まない適切なグルコース濃度（例えば８ｍＭ）を含有するクレブス・リンゲル・ＨＥＰＥＳ緩衝液とともに細胞を３７℃で適切な時間インキュベートした。いくつかの研究では適切な濃度のＧＬＰ−１もまた包含した。上清の一部分を取り出しそしてそのインスリン含量をＳＰＡにより測定した。結果は「対照を上回る倍数（ｆｏｌｄ  ｏｖｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」（ＦＯＣ）として表した。３００ｎＭの濃度で、アミノ酸配列、配列番号１＋ｃｙｓ＋ＰＥＧ（４３ｋＤ）を有するポリペプチドは、分散島細胞からのインスリン分泌をおよそ１．７倍だけ増大させた（図３）。
【０１７０】
本アッセイにおいて、分散ラット島細胞からのインスリン分泌の増大は最低１．４倍の増大と定義した。本発明のポリペプチドのＶＰＡＣ２受容体アゴニスト成分は、分散島細胞からのインスリン分泌の最低１．４倍ないし約１．７倍だけの増大を生じさせた。
【実施例６】
【０１７１】
ラットにおける腹腔内耐糖能に対するＰＥＧ化ペプチドの影響
皮下に投与された場合の本発明のＰＥＧ化ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性をラットで検査した。一夜絶食ラットに対照若しくはＰＥＧ化ペプチド（１〜１００μｇ／ｋｇ）の皮下注入を与えた。３時間後に基礎血糖を測定し、そしてラットに２ｇ／ｋｇのグルコースを腹腔内に与えた。血糖を１５、３０および６０分後に再度測定した。本発明の代表的ＰＥＧ化ペプチドは、グルコースＡＵＣの１７％〜２８％の低下を伴い、ＩＰＧＴＴ（腹腔内耐糖能試験）後にベヒクルに関して血糖値を有意に低下させた（図４）。これは、ＰＥＧ化ペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏで持続的グルコース低下活性を有することを示す。本発明のＰＥＧ化ペプチドのグルコース低下活性に加え、それはまたｉｎ  ｖｉｖｏの延長されたペプチド半減期も示す。ＰＡＣＡＰ−２７はｉｎ  ｖｉｖｏで非常に短い半減期（＜１０分）を有する。本発明のＰＥＧ化ペプチドのペプチド投与３時間後の血糖を低下させる能力は、該ペプチドがこの時点で循環中に存在しかつこれゆえにＰＡＣＡＰ−２７に関して延長された半減期を有することの明確な表示である。
【実施例７】
【０１７２】
環状ＡＭＰ  ＳＰＡ
ＶＰＡＣ２ペプチドを発現するＣＨＯ細胞を８×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、そしてαＭＥＭ、ヌクレオシド、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、メリーランド州ロックビル）、５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、０．４ｍｇ／ｍＬヒグロマイシンおよび１．５ｍｇ／ｍＬジェネチシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中３７℃で２４時間増殖させた。培地を除去しそしてプレートをＰＢＳで洗浄した。細胞をペプチド（１％ＢＳＡおよび１００μＭ  ＩＢＭＸを含む１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣＬ、５ｍＭ  ＫＣＬ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．４）中）とともに３７℃で１５分間インキュベートした。細胞抽出物中の環状ＡＭＰを、ｃＡＭＰ  ＳＰＡ直接スクリーニングアッセイ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して定量した。ライセート中に存在するｃＡＭＰの量を、このキットとともに提供される説明書に従って測定した。ペプチドの各濃度で生じさせたｃＡＭＰの量（ｐｍｏｌで）をプロットし、そしてＰｒｉｚｍソフトウェアを使用する非線形回帰により解析して各ペプチドについてＥＣ５０を決定した。
【０１７３】
本発明のポリペプチドは、ＰＡＣ１で活性を欠くことが示されている（Ｖａｕｄｒｙら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５２：２６９−３２４、２０００）ＶＩＰに基づいて設計されている。従って、本発明のポリペプチドはＰＡＣ１で認識可能な活性を有しないと考えられる。
【０１７４】
本発明の代表的ポリペプチドでの本アッセイの結果を下の表１に示す。Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ１２およびＰ１２＋ＰＥＧとして同定されるペプチドは全部ＶＰＡＣ２受容体の強力なアゴニストであり、内因性ペプチドＰＡＣＡＰ−２７により達成される受容体活性化の最大レベルの１００％まで受容体を活性化する。さらに、Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ１２およびＰ１２＋ＰＥＧとして同定されるペプチドは選択的ＶＰＡＣ２受容体アゴニストであり、ＶＰＡＣ１に対する非常に弱いアゴニスト活性を有する。ＰＡＣＡＰ−２７はＶＰＡＣ１の強力なアゴニストである。
【０１７５】
【表１】
2006506969.tif 000002
【実施例８】
【０１７６】
製薬学的組成物−ＩＶおよびＳＣ製剤
滅菌のＩＶ注入可能な製剤は、当該技術分野で公知のいずれかの製造方法を使用して、４ｍｇの配列番号１のポリペプチド、若しくは４ｍｇのポリペプチド含量の同等物を有する誘導体化ポリペプチド、および１Ｌの滅菌生理的食塩水を用いて製造する。より高濃度のペプチドをＳＣ製剤に使用してよい。配列番号１として同定されるポリペプチド若しくは誘導体化ポリペプチドの場合には、４ｍｇを１００ｍＬの生理的食塩水若しくはＤＭＳＯに溶解し、そして滅菌バイアルに無菌濾過後に組成物を充填する。
【実施例９】
【０１７７】
本発明のペプチドを含んでなる製剤の安定性
実施例８に記述される製剤を一定の安定性チャンバーに入れた。これらの製剤中のポリペプチドの分解の最も感受性の高い検出方法であるキャピラリー電気泳動による分析のためサンプルを定期的に取り出した。多様なピークの面積を合計し、そして親ポリペプチドのピークの面積を全ピーク面積により割る（図５および６）。該商が純度％である。新鮮なポリペプチド中に不純物が存在するため、異なる時間点での純度を最初の純度により割ることにより純度変化を正規化する。
【実施例１０】
【０１７８】
ペプチド特異的抗体の生成およびＥＬＩＳＡによるペプチドの測定
本発明のポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、ＡＢＩ  ４３３Ａペプチド合成機を使用して本発明のポリペプチドの特定の一フラグメントを合成することにより生成させた。その後ペプチドを樹脂から切断し、そしてＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ分析および調製的ＨＰＬＣ系で精製した。Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ＭＡＬＤＩ質量分析システムを使用して正しい生成物を同定した。凍結乾燥機を使用してペプチドを乾燥した。その後、ペプチド（２ｍｇ）を、Ｃｙｓ上の遊離スルフヒドリル基を介してキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に複合した。
【０１７９】
雌性ニュージーランドホワイトラビットを第０、１４、３５、５６および７７日に免疫した。第０日に、各ウサギに２５０μｇのペプチドおよびフロイントの完全アジュバントを皮下注入した。その後の免疫感作はウサギあたり１２５μｇのペプチドを利用した。採血を第２１日に開始しそしてその後２１日間隔で継続した。抗ペプチド抗体の精製は、粗血清に特異的ペプチドアフィニティー精製カラムを通過させることにより実施した。抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１８０】
９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  ４ＨＢＸプレートを本発明のペプチドに特異的なＣ末端Ｍｏｒｐｏｓｙｓ  Ｆ（ａｂ）抗体で被覆し、そして４℃で一夜インキュベートさせた。その後、プレートをブロッキングして非特異的結合を予防した。その後、ペプチド標準（２５００ｎｇ／ｍＬ〜１６０ｐｇ／ｍＬ）を３３％血漿で希釈し、また、サンプルは緩衝液で３倍に希釈し、次いで室温で１．５時間インキュベートした。洗浄した後に本発明のペプチドに特異的なポリクローナルＮ末端抗体をプレート上で１時間インキュベートした。これに次いでワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ロバ抗ウサギ抗体を添加し、そしてサンプルおよび標準をもう１時間インキュベートした。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液とのインキュベーション後に検出を評価し、そしてプレートをＯＤ４５０で読取る（図７）。
【０１８１】
本発明のポリペプチドの活性の立証は当該技術分野で公知であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより達成されうる。例えば、糖尿病、ならびにシンドロームＸ、耐糖能異常、空腹時血糖異常および高インスリン血症のような関連障害；アテローム硬化性疾患ならびに高トリグリセリド血症および高コレステロール血症のような関連障害；ならびに肥満の処置のための製薬学的作用物質の有効性を示すのに以下のアッセイを使用しうる。
血糖値の測定方法
ｄｂ／ｄｂマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メーン州バーハーバーから得た）を採血し（眼若しくは尾静脈のいずれかにより）、そして同等な平均血糖値に従ってグループ分けする。それらに試験ポリペプチドを経口で（製薬学的に許容できるベヒクル中胃管栄養法により）１日１回１４日間投与する。この時点で動物を眼若しくは尾静脈により再度採血しそして血糖値を測定した。各場合で、血糖値はＧｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インジアナ州エルカート）を用いて測定する。
トリグリセリドレベルの測定方法
ｈＡｐｏＡ１マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メーン州バーハーバーから得た）を採血し（眼若しくは尾静脈のいずれかにより）、そして同等な平均血清トリグリセリドレベルに従ってグループ分けする。それらに試験ポリペプチドを経口で（製薬学的に許容できるベヒクル中胃管栄養法により）１日１回８日間投与する。その後動物を眼若しくは尾静脈により再度採血しそして血清トリグリセリドレベルを測定する。各場合で、トリグリセリドレベルはＴｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｘｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州タリータウン）を使用して測定する。
ＨＤＬコレステロールレベルの測定方法
血漿ＨＤＬコレステロールレベルを測定するために、ｈＡｐｏＡ１マウスを採血し、そして同等な平均血漿ＨＤＬコレステロールレベルでグループ分けする。マウスにベヒクル若しくは試験ポリペプチドを経口で１日１回７日間投与し、そしてその後第８日に再度採血する。血漿はＳｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＸ４）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）を使用してＨＤＬコレステロールについて分析する。
総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリドおよび血糖値の測定方法
別のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、肥満サルを採血し、その後ベヒクル若しくは試験ポリペプチドを経口で１日１回４週間投与し、そしてその後再度採血する。Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＸ４）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）を使用して血清を総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリドおよびグルコースについて分析する。リポタンパク質のサブクラス分析をＯｌｉｖｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：５３０６−５３１１、２００１）により記述されるとおりＮＭＲ分光法により実施する。
心血管パラメータに対する影響の測定方法
心血管パラメータ（例えば心拍数および血圧）もまた評価する。ＳＨＲラットにベヒクル若しくは試験ポリペプチドを経口で１日１回２週間投与する。血圧および心拍数はＧｒｉｎｓｅｌｌら（Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１３：３７０−３７５、２０００）により記述されるところの尾カフ法を使用して測定する。サルにおいて、血圧および心拍数はＳｈｅｎら（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．２７８：１４３５−１４４３、１９９６）により記述されたとおりモニターする。
痩身一夜絶食ラットにおける飼料摂取の低下（食欲の抑制）に対する化合物の有効性の評価
絶食−再給餌（ｆａｓｔｅｄ−ｒｅｆｅｄ）急性摂食アッセイ
本プロトコルの目的は、痩身一夜絶食ラットの飼料消費に対する未知化合物の単回投与の影響を決定することである。絶食−再給餌ラットモデルは、肥満の分野で食欲不振の影響に対する潜在能力をもつ化合物を同定するために頻繁に使用される。本動物モデルは、肥満のヒトにおける体重の管理で使用されている若しくは使用されてきた化合物の有効性プロファイルの同定および特徴付けで成功裏に使用されている（例えば、Ｂａｌｖｅｔら、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３：２９３−２９７、１９８２；Ｇｒｉｇｎａｓｃｈｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２７：１１９０−１１９４、１９９９；ＭｃＴａｖｉｓｈとＨｅｅｌ、Ｄｒｕｇ  ４３：７１３−７３３、１９９２；Ｒｏｗｌａｎｄら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３６：２２９５−２３００、１９８５を参照されたい）。
【０１８２】
典型的な試験はおよそ２８０ｇの平均体重を伴う６０〜８０匹の雄性ラット（ｎ＝１０／処置群）を包含する。ラットは、標準的動物室中で制御された温度および湿度ならびに１２／１２の明暗周期下で飼育する。ラットは金網床付きの懸垂形ケージに単独で住まわせる。水および飼料は、動物が試験のため絶食させられていない限り継続的に入手可能とする。
【０１８３】
ベヒクル試験：ラットはベヒクル試験に対するそれらの成績に基づいてグループ分けする。ベヒクル試験は有効性試験の２と７日前との間に実施する。ラットを暗期の間（合計およそ１６〜１８時間）一夜絶食させる。動物に０．５ｍＬの脱イオン水を投与する。投与１時間後に、予め秤量した飼料瓶を動物の自分の（ｈｏｍｅ）ケージに戻す。ラットに１時間の摂食時間を許可する。１時間後にこぼれたものを飼料瓶に戻し、そして消費された飼料の量を測定する。ラットは、１時間の飼料消費の平均および平均の標準誤差が群間で類似であるように群に割り当てる。
【０１８４】
有効性試験：ラットを暗期の間（合計およそ１６〜１８時間）一夜絶食させる。動物を割り当てられた用量のポリペプチドで処理する。投与１時間後に、予め秤量した飼料瓶をケージに戻す。飼料を戻した３０、６０、９０、１８０および２４０分後に飼料摂取を記録する。各時点で、こぼれたものを飼料瓶に戻し、そしてその後飼料瓶を秤量する。消費された飼料の量を各時点について決定する。適切な統計学的解析を使用して処置群間の差違を決定する。
肥満Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットにおける体重ならびに飼料および水消費の減少に対する化合物の有効性の評価
慢性給餌アッセイ
本プロトコルの目的は、肥満Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットにおける体重ならびに飼料および水消費に対する未知化合物の慢性投与の影響を決定することである。肥満Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットは、減量における化合物の有効性の決定において頻繁に使用されている。本動物モデルは、肥満ヒトにおける体重の管理において使用されている若しくは使用されてきた化合物の有効性プロファイルの同定および特徴付けで成功裏に使用されている（例えば、Ａｌ−Ｂａｒａｚａｎｊｉら、Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ．８：３１７−３２３、２０００；Ａｓｓｉｍａｃｏｐｏｕｌｏｓ−Ｊｅａｎｎｅｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０（２  Ｐｔ  ２）：Ｒ２７８−２８３、１９９１；Ｄｒｙｄｅｎら、Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．３１：３６３−３６６、１９９９；ＥｄｗａｒｄｓとＳｔｅｖｅｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．４７：８６５−８７２、１９９４；Ｇｒｉｎｋｅｒら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．１２：２６５−２７５、１９８０を参照されたい）。
【０１８５】
典型的な試験は、およそ５５０ｇの平均体重を伴う６０〜８０匹の雄性Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａ（ｎ＝１０／処置群）を包含する。ラットは、標準的動物室中で制御された温度および湿度ならびに１２／１２の明暗周期下で飼育する。水および飼料は継続的に入手可能とする。ラットは格子床を含有する大型ラット用シューボックスに単独で住まわせる。動物を格子床に順応させ、そして体重の２日の基礎測定ならびに２４時間の飼料および水消費の記録の前に最低４日間試験ベヒクルを疑似投与する。ラットを基礎でのそれらの体重に基づき６〜８処置群の１つに割り当てる。群は、体重の平均および平均の標準誤差が類似であったように設定する。
【０１８６】
動物に、それらの割り当てられた用量のポリペプチドを予め決められた日数（典型的には６〜１４日）の間、ＬＤ／周期の暗期の前に毎日経口で胃管投与（ｇａｖａｇｅ）する。この時点で体重、飼料および水消費量を測定する。最終日に動物をＣＯ２吸入により安楽死させ、そして体重を測定する。
【０１８７】
体重の低減若しくは管理に対する本発明のポリペプチドの有効性は、この慢性給餌アッセイを使用することにより測定しうる。
【０１８８】
上の明細で挙げられた全部の刊行物および特許は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明の記述された組成物および方法の多様な改変および変動は、本発明の範囲および技術思想から離れることなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい態様に関連して記述したとは言え、特許請求されるところの本発明はこうした特定の態様に過度に制限されるべきでないことが理解されるはずである。事実、分子生物学の分野若しくは関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための上述された様式の多様な改変は、後に続く請求の範囲の範囲内にあることを意図している。当業者は、本明細書に記述される本発明の特定の態様に対する多くの同等物をただ慣例の実験を使用して認識するか若しくは確かめることが可能であろう。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１ａ−１ｄ】配列番号１から１５２のポリペプチドのアミノ酸配列を描く。配列番号１１５〜１５２はマレイミド結合を介してＣ末端のシステインでＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）されているペプチドを指す。ＰＥＧは２２ｋＤの直鎖状ＰＥＧであっても４３ｋＤの分枝状ＰＥＧであってもよい。
【図２】配列番号１のアミノ酸配列を生じさせるためｐＧＥＸ−６Ｐ−１にクローン化したＤＮＡ配列（配列番号１５３）を描く。下線を付けた制限酵素部位ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ  ＩはｐＧＥＸ−６Ｐ−１発現ベクター中へのインフレームでのクローン化を可能にする。第Ｘａ因子認識部位および２個の終止コドンをコードする１２ｍｅｒのＤＮＡ配列が太字で強調されている。中央の強調されていない配列は配列番号１（アミノ酸配列）をコードする。ＶＩＰからの変異されたコドンは小文字のヌクレオチドにより描く。
【図３ａ−３ｈ】核酸配列、配列番号１５４から２６４を描く。これらの核酸配列は本発明のポリペプチドをコードする。
【図４】本発明のＰＥＧ化ペプチドへの曝露後の分散ラット島細胞のインスリン分泌を具体的に説明する棒図である。
【図５】本発明のＰＥＧ化ペプチドの皮下（ＳＣ）投与経路によるラットにおける高められたグルコース配置を示す棒図である。
【図６】４０℃のインキュベーションの間のｐＨ８．０の１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭリン酸を含有する水性溶液中１ｍｇ／ｍＬの３種のＶＰＡＣ２類似物（Ｐ５、Ｐ７および対照Ｒ３Ｐ６６）の安定性の傾向を描く。サンプルをキャピラリー電気泳動により分析してペプチドの純度を決定した。２および４週の時点での純度を最初の純度パーセントにより正規化した。
【図７】４０℃でのインキュベーションの間のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中２ｍｇ／ｍＬの３種のＶＰＡＣ２類似物（Ｐ７、Ｐ８および対照Ｒ３Ｐ６６）の安定性の傾向を描く。サンプルをキャピラリー電気泳動により分析してペプチドの純度を決定した。２および４週の時点での純度を最初の純度パーセントにより正規化した。
【図８】Ｎ末端に単一アミノ酸欠失が存在する類似のＰＥＧ化ペプチドを上回る完全長のＰＥＧ化ペプチドの選択的認識を具体的に説明する。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図３ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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