(57)【要約】本発明は、Ｃ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミド立体異性体、Ｎ−置換誘導体およびそれらの製造方法を提供する。また、かかる化合物を活性成分として含有する医薬組成物、および老化治療用薬剤および記憶改良用薬剤の製造のためのそれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式ＩＩで表されるクローゼンアミドの光学活性Ｃ５−ヒドロキシル誘導体であって、
【化１】
2006516248.tif 000015
ラセミＩＩ１、配置（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）、または
ラセミＩＩ２、配置（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｒ＊、６Ｓ＊）、または
ラセミＩＩ３、配置（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）、または
光学活性ＩＩ１、配置（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ）または（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｓ）、または、
光学活性ＩＩ２、配置（３Ｓ、４Ｓ、５Ｒ、６Ｓ）または（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｒ）、または、
光学活性ＩＩ３、配置（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）または（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｓ）であるクローゼンアミドの光学活性Ｃ５−ヒドロキシル誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のクローゼンアミドの光学活性Ｃ５−ヒドロキシル誘導体の製造方法であって、
【化２】
2006516248.tif 000016
（ａ）（ｒａｃ）−３−Ｏ−アセチル−クローゼンアミド（１）またはその光学異性体の脱水であって脱水剤はＰＯＣｌ３／Ｐｙでよい脱水；またはクローゼンアミドのメチルスルホネートの製造、次いでメチルスルホネート基のＤＢＵによる切断；
（ｂ）（ｒａｃ）−３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド（２）またはその光学異性体の加水分解であって、従来の酸性または塩基性の条件下で実施することができる加水分解；
（ｃ）（ｒａｃ）−Δ５，６−アセチルクローゼンアミド（３）またはその光学異性体の二ヒドロキシル化であって、ＯｓＯ４／ＮＭＯ、ＫＨＳＯ５／ＣＨ３ＣＯＣＦ３、ＷＯ３／Ｈ２Ｏ２を用いて達成できる二ヒドロキシル化；
（ｄ）（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ１）またはその光学活性異性体の酸化であって、酸化剤、例えばＫＭｎＯ４／ＣｕＳＯ４、ＭｎＯ２、ＤＭＳＯ／ＣｌＣＯＣＯＣｌ／ＴＥＡ、ＤＭＳＯ／ＴＦＡＡ／ＴＥＡなどで実施することができる酸化；
（ｅ）（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ１ケトン）またはその光学活性異性体の還元であって、様々なホウ化水素、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたはトリｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウムで実施することができる還元；
（ｆ）（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ３）またはその光学活性異性体の加水分解であって、様々な酸もしくは塩基またはＳｍ／Ｉ２／ＣＨ３ＯＨを使用して実施することができる加水分解
を含む製造方法。
【請求項３】
一般式（ＩＩＩ）によって表されるＮ−置換クローゼンアミド誘導体であって、
【化３】
2006516248.tif 000017
式中、
相対配置は（３Ｓ＊、４Ｒ＊、５Ｒ＊、６Ｓ＊）であり、
ＲはＣＨ２ＣＯＲ１、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＲ２およびＣＨ２Ｒ３から選択され、
Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ１〜８アルコキシ、
【化４】
2006516248.tif 000018
から選択され、
Ｒ２はＣ１〜８アルコキシから選択され、
Ｒ３は
【化５】
2006516248.tif 000019
から選択されることを特徴とするクローゼンアミド誘導体。
【請求項４】
ＲがＣＨ２Ｒ３から選択される場合は、Ｎ−ベンジル−またはＮ−ｐ−メトキシベンジル−クローゼンアミドンの還元により得ることができ；
ＲがＣＨ２ＣＯＲ１またはＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＲ２から選択される場合は、以下の工程：
【化６】
2006516248.tif 000020
（ａ）ピリジニウムｐ−トルエンスルホネートの触媒作用の下でノルクローゼンアミド（１）とジヒドロピランとを反応させて、３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−ノルクローゼンアミドを得る工程と；
（ｂ）３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−ノルクローゼンアミド（２）を無水ベンゼンに溶解し、水素化ナトリウムを加え、加熱し、ブロモアセテートを加え、テトラヒドロピランの保護基を脱保護して、Ｎ−（アルコキシ／アルキルアミノカルボニルメチレン）ノルクローゼンアミドを得る工程と；
（ｃ）Ｎ−（エトキシカルボニルメチレン）ノルクローゼンアミドを非常に過剰な量のＮＨ３／ＣＨ３ＯＨ溶液で処理して、Ｎ−（アミノカルボニルメチレン）ノルクローゼンアミドを得る工程と；
（ｄ）ノルクローゼンアミドとパラホルムアルデヒドおよび炭酸カリウムとを反応させて、Ｎ−（ヒドロキシメチル）−ノルクローゼンアミドを得る工程と；
（ｅ）Ｎ−（ヒドロキシメチル）ノルクローゼンアミドと対応する酸無水物とを反応させて、対応するＮ−（アシルオキシメチレン）−ノルクローゼンアミドを製造する工程とを含むことを特徴とする請求項３に記載のＮ−置換クローゼンアミド誘導体の製造方法。
【請求項５】
請求項１または３に記載のいずれかの化合物の薬理学的有効量および薬剤として許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
向知性薬および老化防止薬としての薬剤の製造のための、請求項１または３に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クローゼンアミドのＣ５−ヒドロキシル置換立体異性体、Ｎ−置換誘導体およびその調製方法、およびこれらを含む医薬組成物、ならびに向知性薬および老化防止薬としての薬剤の調製のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
今まで、中国では平均余命は７０歳を超え、これは１９４９年（中華人民共和国の建国）時の２倍である。外国の研究結果は、２０２５年までに１５歳未満の子供の比率は総人口の１８．６％になり、総人口に対する６５歳以上の高齢者の比率は１８．８％になり、総人口に対する子供の比率を上回ることが示唆されている。データは、２０年後には５人中１人の高齢者がいることを示す。アルツハイマー病は、５０歳を超える人々でしばしば診断される。脳血管障害によって誘発される多重梗塞性痴呆症または老人性痴呆は、６０歳以上の人々で診断される。したがって、アルツハイマー病および老人性痴呆の羅病率は、人口の老年化に伴い増加するであろう。典型的神経退化障害（例えば痴呆）を有する高齢者は二段階の死を経験する。最初は魂の死で、肉体の死が後に続き、これらは患者に言いようのない非嘆をもたらし、社会や家族には大きな重苛となっている。加齢は、戦争、疫病、飢饉およびエネルギーや資源の不足に次いで、社会の発達や安定に影響を及ぼす最も危険な因子の１つと考えられている。
【０００３】
老化の防止および老人性痴呆の治療のためには、多数の薬剤がある。脳血管拡張薬は脳血流量を改善して、エネルギーの供給および認識力を活かすことができる。しかし、価値ある血管拡張薬とは、非常に選択的で脳代謝に影響を及ぼさず、「血液奪取」効果を有さず、さらには抗血小板凝集および抗血栓効果を有するものでなければならない。カルシウム拮抗薬であるニモジピンは、上記の基準の一部に適合するが、Ｌ形電圧依存性カルシウムチャンネルだけに有効で、Ｎ型およびＴ型カルシウムチャンネルには無効である。コリン作動系の機能を強化する薬剤の中で、Ａｃｈ前駆体は中程度の治療効果を有するだけで、Ａｃｈ受容体作用薬ならびにコリンエステラーゼ阻害剤は一定の効果を有するが、効果の持続性は短く、副作用ならびに毒性は比較的強い。いくつかの神経ペプチドおよび神経成長因子が痴呆治療薬として期待されたが、しかし臨床研究から得られたデータは患者への利益をほとんど示さず、この理由はおそらくこれらの物質が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して脳内で役割を果たすことがほとんどできないためである。２−ピロリドンアセトアミド（ピラセタム、中国ではＮａｏ−Ｆｕ−Ｋａｎｇの商品名で生産されている）は、かつては初期の刊行物では論争のない新規の向知性薬と考えられていた。近年、中国または海外で、それは記憶障害および老人性痴呆に中等度またはほんのわずかな効果を示すことが報告されている。１つの主な理由は、水溶性であるのでこの薬剤はＢＢＢの透過速度が低く、標的に有効となるまで濃度を高めることができないということである。
【０００４】
本発明者は、ピラセタムのγ−ラクタム骨格を含んでいる植物のＲｏｔａｃｅａｅ科のＣｌａｕｓｅｎａ  ｌａｎｓｉｕｍ（ｌｏｕｒ．）Ｓｋｅｅｌｓから最初に向知性活性剤を単離し、それをクローゼンアミド（Ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ）と命名した。クローゼンアミドは、４つのキラル中心を有するγ−ラクタムであり、天然体はラセミ体である。（±）クローゼンアミドの調製法はＥＰ０４１４０２０として特許が認められ、その中国の同等物特許はＣＮ８６１０７０９０、ＺＬ９０１０７１４５．５およびＺＬ９０１０７１４４．７である。（−）クローゼンアミドは有効な向知性活性を示し、その化合物自体、その化合物の調製法および医薬としての使用の可能性は、係属中の中国特許出願第００１２４６３０．５号で開示されている。
クローゼンアミドの分子には４つのキラル中心があるので１６個の立体異性体があり、それらはそれぞれジアステレオマーの８対の鏡像異性体を形成するはずであり、その配置および命名法は表１に示されている。
【化１】
2006516248.tif 000002
【０００５】
【表１】
2006516248.tif 000003
【０００６】
この内、１対のクローゼンアミド（Ｉ１）は係属中の中国特許出願（中国特許出願第００１２４６３０．５号）に開示されている。ラセミ体のネオクローゼンアミド（Ｉ２）およびエピネオクローゼンアミド（Ｉ４）は公知の化合物であるが、光学活性のネオクローゼンアミド（Ｉ２）およびエピネオクローゼンアミド（Ｉ４）ならびにその調製方法は過去の刊行物では知られていない。（＋）および（−）クローゼンアミド（Ｉ１）のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける代謝の研究によると、両化合物の代謝産物はかなり類似しているが、（−）クローゼンアミドの代謝産物中の（−）Ｎ−ヒドロキシメチルノルクローゼンアミド［（−）ＣＭ１］および（−）５−ヒドロキシクローゼンアミド［（−）ＣＭ２］の含量は、（＋）クローゼンアミドの代謝産物中の対応する（＋）異性体（＋）ＣＭ１および（＋）ＣＭ２のそれより有意に高いことが証明されている。薬理学的試験によると、（−）クローゼンアミドは有効な向知性活性を有するが、（＋）クローゼンアミドはそのような効果を有さずに拮抗作用を示すことが明らかにされている。これらの発見に基づいて、代謝産物ＣＭ１およびＣＭ２の鏡像異性体ならびにそれらの誘導体が合成され、ＣＭ１の合成は発明者によって発表されている。
【０００７】
先行技術には、光学活性クローゼンアミドおよびその誘導体の合成は開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、クローゼンアミドの一連の新規Ｃ５−ヒドロキシル誘導体およびＮ−置換誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、クローゼンアミドのＣ５−ヒドロキシル誘導体およびＮ−置換誘導体の製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、向知性薬および老化防止薬としての薬剤の製造のための、クローゼンアミドのＣ５−ヒドロキシル誘導体およびＮ−置換誘導体の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、一般式（ＩＩ）によって表されるクローゼンアミドのＣ５−ヒドロキシ誘導体に関する：
【化２】
2006516248.tif 000004
（ｒａｃ）−ＩＩ１、（相対）配置（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）；または
（ｒａｃ）−ＩＩ２、配置（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｒ＊、６Ｓ＊）；または
（ｒａｃ）−ＩＩ３、配置（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）。
または、（＋）ＩＩ１、（絶対）配置：（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ）、または、（−）ＩＩ１、配置（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｓ）；または、（＋）ＩＩ２、配置：（３Ｓ、４Ｓ、５Ｒ、６Ｓ）、または、（−）ＩＩ２、配置：（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｒ）；または、（＋）ＩＩ３、配置：（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）、または、（−）ＩＩ３、配置：（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｓ）。
【００１１】
本発明は、また、下記スキーム１で示す、一般式（ＩＩ）によって表される光学的活性クローゼンアミドＣ５−ヒドロキシ誘導体の製造方法を提供する。
【化３】
2006516248.tif 000005
【００１２】
（１）（ｒａｃ）−３−Ｏ−アセチルクローゼンアミド（１）またはその光学異性体の脱水。脱水剤はＰＯＣｌ３／Ｐｙであってもよい；あるいは、クローゼンアミドのメチルスルホネートの製造、次いでメチルスルホネート基のＤＢＵによる切断。ＰＯＣｌ３／Ｐｙ法が好ましい。
【００１３】
（２）（ｒａｃ）−３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド（２）の加水分解は、従来の酸性または塩基性の条件下で実施することができる。
（３）Δ５，６−クローゼンアミド（３）の二ヒドロキシル化は、ＯｓＯ４／ＮＭＯ、ＫＨＳＯ５／ＣＨ３ＣＯＣＦ３、ＷＯ３／Ｈ２Ｏ２などにより達成することができる。ＯｓＯ４／ＮＭＯ法が好ましい。
【００１４】
（４）（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ１）またはその光学活性異性体の酸化は、酸化剤、例えばＫＭｎＯ４／ＣｕＳＯ４、ＭｎＯ２、ＤＭＳＯ／ＣｌＣＯＣＯＣｌ／ＴＥＡ、ＤＭＳＯ／無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡＡ）／ＴＥＡなど、好ましくはＤＭＳＯ／ＣｌＣＯＣＯＣｌ／ＴＥＡで実施することができる。
【００１５】
（５）（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミドン（ＩＩ１ケトン）またはその光学活性異性体の還元は、様々なホウ化水素、好ましくは水素化ホウ素ナトリウムおよびトリｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウムで実施することができる。
【００１６】
（６）（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）−３−アセトキシ−５−ヒドロキシクローゼンアミド（ＩＩ３）またはその光学活性異性体の加水分解は、酸性または塩基性の条件下で、あるいはＳｍ（サマリウム）／Ｉ２／ＣＨ３ＯＨ、好ましくはＳｍ／Ｉ２／ＣＨ３ＯＨで実施することができる。
【００１７】
本発明は、一般式（ＩＩＩ）で表される、クローゼンアミドのＮ−置換誘導体のラセミ体または光学活性異性体にも関する：
【化４】
2006516248.tif 000006
式中、相対配置は（３Ｓ＊、４Ｒ＊、５Ｒ＊、６Ｓ＊）であり、置換基ＲはＣＨ２ＣＯＲ１、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＲ２およびＣＨ２Ｒ３から選択され、
これら式中、
Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ１〜８アルコキシ、
【化５】
2006516248.tif 000007
から選択され、
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルコキシから選択され、
Ｒ３は、
【化６】
2006516248.tif 000008
から選択される。
【００１８】
ＲがＣＨ２ＣＯＲ１、ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＯＲ２から選択されるときのＮ−置換クローゼンアミド誘導体の製造方法を、スキーム２に示す。
【化７】
2006516248.tif 000009
【００１９】
ピリジニウムｐ−トルエンスルホネートの触媒作用の下でノルクローゼンアミド（１）とジヒドロピランとを反応させて、３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−ノルクローゼンアミド（２）を得る。３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラン−ノルクローゼンアミド（２）を無水ベンゼンに溶解し、水素化ナトリウムを加え、次に混合物を３０分間油浴加熱し、室温で１０分間撹拌する。ブロモアセテートの無水ベンゼン溶液を加え、６０℃の油浴で２０分間反応させ、次に、反応溶液を室温に戻させ、水を加えて撹拌する。混合物をジクロロメタンで希釈し、塩酸で中性に調整し、有機層を分離、洗浄、乾燥する。溶媒を蒸発させて油性物質を得、これをエチルアルコールに溶解し、ｐ−トルエンスルホン酸を１０ｍｇ加える。テトラヒドロピラン保護基を６０℃の油浴で切断し、テトラヒドロピランの保護基を脱離させる。反応が終了した後、化合物を直ちにカラムクロマトグラフィーによって精製し、Ｎ−（アルコキシ／アルキルアミノカルボニルメチレン）ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ４）を達成する。
【００２０】
６０ｍｇのＮ−（エトキシカルボニルメチレン）ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ４）を大過剰な量のＮＨ３／ＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、混合物を朝まで放置する。カラムクロマトグラフィーによる精製の後、Ｎ−（アミノカルボニル−メチレン）ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ１）が得られる。
【００２１】
ノルクローゼンアミド（１）をアセトンに溶かし、水を滴下し、次にパラホルムアルデヒドおよび炭酸カリウムを加える。混合物を６０℃の外部温度に加熱する。２５分後、加熱を中止して反応混合物を氷水で速かに冷却し、減圧下で溶媒を蒸発させて粘着性の液体を得る。カラムクロマトグラフィーによりＮ−（ヒドロキシメチル）ノルクローゼンアミド（３）が得られる。Ｎ−（ヒドロキシメチル）ノルクローゼンアミド（３）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、氷塩浴で２０分間撹拌し、対応する無水物およびピリジンの無水ＴＨＦ溶液を滴下してその温度で３時間撹拌する。少量の水を加え、混合物をジクロロメタンで薄める。有機層を分離して洗浄する。対応するＮ−（アシルオキシメチレン）−ノルクローゼンアミドは、溶媒の蒸発後カラムクロマトグラフィーを行って得られる。
【００２２】
ＲがＣＨ２Ｒ３から選択されるときに一般式ＩＩＩで表されるＮ−置換クローゼンアミド誘導体は、ＣＭ１、Ｎ−ベンジルまたはＮ−ｐ−メトキシベンジル−クローゼンアミドンの中間体の還元により製造することができる（スキーム３で示す）：
【化８】
2006516248.tif 000010
【００２３】
本発明は、有効成分として本化合物を、また通常の薬剤として許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物にも関する。通常、本医薬組成物は、本化合物を０．１〜９５重量％含んでもよい。
【００２４】
本医薬組成物は、当技術分野で周知の通常の方法によって調製することができる。そのような目的のために、必要に応じて本化合物を１つまたは複数の固体または液体の医薬用の担体および／または賦形剤と組み合わせて、人間または動物での使用に適した投与形態または剤形を調製することができる。
【００２５】
本化合物または同化合物を含む本医薬組成物は、単位剤形で投与してもよい。また、投与経路は腸管でも腸管外でもよく、例えば経口、筋肉内、皮下、経鼻、経皮、腹膜内、または経直腸、好ましくは経口でよい。
【００２６】
本化合物または同化合物を含む本医薬組成物は、皮内、筋肉内、皮下または皮内などの注射により投与してもよい。
剤形は通常の剤形、徐放性剤形、放出制御剤形、ターゲッティング放出剤形または様々な微粒剤デリバリー系であってもよい。
【００２７】
当技術分野で一般に使用されている各種の担体を、錠剤の調製のために使用することができる。担体、例えば希釈液および吸収剤、例えばデンプン、デキストリン、硫酸カルシウム、ラクトース、マンニトール、ショ糖、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、炭酸カルシウム、チャイナクレー、微結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムなど；湿潤剤および接着剤、例えば水、グリセリン、ポリエチレングリコール、エチルアルコール、プロパノール、デンプンのり、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、アラビアガム、ゼラチン液体、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなど；崩壊剤、例えば乾燥デンプン、アルギナート、寒天粉、アルギンデンプン、重炭酸ナトリウムおよびクエン酸、炭酸カルシウム、ポリエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデカニルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなど；崩壊阻害剤、例えばショ糖、トリステアリン酸グリセリン、カカオ脂、水素化油など；吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム塩、ドデカニルスルホン酸ナトリウムなど；潤滑剤、例えばタルク、シリカ、トウモロコシ澱粉、ステアラート、ホウ酸、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなど。錠剤は、例えば糖衣錠、薄膜コート錠、腸溶剤、または二層もしくは多層錠など、更にコーティングすることができる。
【００２８】
当技術分野で一般に使用されている担体は、投薬単位からのペレットの調製のために使用することができる。例えば希釈液および吸収剤、例えばグルコース、ラクトース、デンプン、カカオ脂、水素化植物油、ポリビニルピロリドン、ゲルシレ（Ｇｅｌｕｃｉｒｅ）、カオリン、タルクなど；接着剤、例えばアラビアガム、トラガカントゴム、ゼラチン、エチルアルコール、蜂蜜、糖液、ライスペーストまたは小麦粉ペーストなど；崩壊剤、例えば寒天粉、乾燥デンプン、アルギナート、ドデカニルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなど。
【００２９】
投薬単位からカプセルを調製するためには、本発明の化合物を上記の担体と混合し、混合物を硬質ゼラチンカプセルまたは軟カプセルに詰める。有効成分、即ち本発明の化合物はマイクロカプセルに封入することもでき、これらは水性媒体に懸濁して懸濁液を調製するか、または、硬カプセルに詰めるか注射剤として調製することができる。
【００３０】
液剤、懸濁液、乳剤および注射用凍結乾燥粉末などの注射剤の調製では、これらは水和または無水でよく、また１つまたは複数の薬剤として許容される担体、希釈液、接着剤、湿潤剤、潤滑剤、保存料、界面活性剤および分散剤を含んでもよい。希釈液としては、水、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、トリメチレングリコール、エトキシル化イソステアロール、多酸素化イソステアロール、ポリエチレンオキシドソルビトールアルカナートなどでよい。更に、等張注射剤を作製するために、適量の塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセリンを注射剤に加えることができる。更に、従来の溶解剤、緩衝およびｐＨ調整剤も加えることができる。これらは全て当業者には公知である。
【００３１】
更に、必要に応じて、着色剤、防腐剤、芳香剤、香料、甘味料その他の材料を剤形に加えることができる。
薬剤または医薬組成物は、治療目的を達成しかつ治療効果を強化するために、一般に公知のいかなる方法によっても投与することができる。
【００３２】
本発明の化合物またはその医薬組成物の投与薬量はいくつかの因子、例えば予防または治療する障害の性格および程度、患者の性別、年齢、体重および個々の反応、具体的な化合物、投与の経路および頻度などによって異なる。本化合物の適当な投薬量は１日につき０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から１５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日につき０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１日につき０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から６０ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは１日につき０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、これらは医師の裁量および他の治療手段によって１日１回または複数回に分けて（例えば２回、３回もしくは４回）投与することができる。
【００３３】
各々の治療手段の総投薬量は一度に投与しても複数回に分けてもよく、また本発明の化合物および組成物は単独で投与してもまたは他の治療薬と併用してもよいが、後者の場合には投薬量はそれ相応に調節してもよい。
【００３４】
ヒト胎児神経幹細胞のクローン形成率のアッセイにおいて、本化合物はヒト胎児神経幹細胞クローンの形成を強化する効果を示し、このことは本化合物が老人性痴呆のような老人の神経変性疾患を治療する効果を有することを示している。
【００３５】
ラット海馬における長期活性化（ＬＴＰ）のアッセイにおいて、本化合物はＬＴＰを増進する効果を示した。更に、本発明の化合物はニューロンの基本的シナプス伝達を増強する効果を有することがわかり、本化合物の向知性薬効果が示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
実施例
以下の実施例により本発明を更に説明するが、本発明を限定するものでは決してない。
【実施例１】
【００３７】
ラセミ体（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｒ＊、６Ｓ＊）−５−ヒドロキシクローゼンアミド（ＩＩ２）の調製（経路１）
１．００ｇのラセミ３−Ｏ−アセチル−クローゼンアミド（１）を乾燥条件下で６ｍｌの無水ピリジンに溶かし、氷水浴で２０分間冷やし、１．０ｍｌの蒸留オキシ塩化燐と４ｍｌの無水ピリジンとの溶液を３０分にわたって滴下し、氷水浴で２４時間撹拌した。混合物全体を氷水へ注いだ。固体が完全に沈殿した後、固体を濾過により分離した。濾過ケーキをメチレンジクロリドに溶かし、水および塩化ナトリウム溶液で連続して洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて固体を得た。固体をカラムクロマトグラフィーで分離して７４６ｍｇのラセミ３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド（２）を得た。白色固体、収率：７１％、ｍｐ：１４８〜１５０℃。
【００３８】
４００ｍｇのラセミ３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド（２）を１５ｍＬのメチレンジクロリドに溶かし、混合物に３ｍＬの１０％水酸化ナトリウムアルコール溶液を加え、３分後、混合物を２ｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌで中性に中和し、２０ｍＬのメチレンジクロリドで希釈し、１モル／Ｌの重炭酸ナトリウム溶液および塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させて３３０ｍｇのΔ５，６−クローゼンアミド（３）を得た。白色固体、収率：９５％、ｍｐ：１６２〜１６３℃。
【００３９】
２６０ｍｇのΔ５，６−クローゼンアミド（３）を１ｍｌのアセトンおよび５ｍｌのＴＨＦに溶かし、これに５４５ｍｇのＮ−オキソ−Ｎ−メチル−モルホリンおよび０．６ｍｌの４％ＯｓＯ４水溶液を注射器で加え、室温で２４時間撹拌し、混合物に６５０ｍｇの無水亜硫酸ナトリウムおよび３ｍｌの水を加えて１時間撹拌し、メチレンジクロリドで希釈した。有機層を分離した。水層をメチレンジクロリドで抽出し、有機相と合わせて塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて２８０ｍｇの油性残留物を得、これをクロマトグラフィーで精製して１５０ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｒ＊、６Ｓ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ２）、白い固体、ｍｐ：１３４〜１３６℃、収率：５０％、および副生成物として７０ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ１）、白い固体、ｍｐ：１２７〜１２９℃、収率：２４％を得た。
【実施例２】
【００４０】
（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｒ＊、６Ｒ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ１）の調製（経路２）
２４０ｍｇのラセミ３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド（２）を４ｍｌのＴＨＦ／アセトン（５／１）に溶かし、これに５８１ｍｇのＮ−オキソ−Ｎ−メチル−モルホリンおよび１．９ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＯｓＯ４水溶液を加え、室温で４８時間撹拌し、混合物に５００ｍｇの無水亜硫酸ナトリウムおよび１０ｍｌの水を加えて１時間撹拌し、分液漏斗に移してメチレンジクロリドで洗浄した。有機層を塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて３００ｍｇの油性残留物を得、これをエチルアセテートで再結晶させ、分取薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（エチルアセテート）で分離して２１７ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ２）、白色固体、ｍｐ：１３４〜１３６℃、収率：５０％、および７０ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチル−ＩＩ１）、収率：８２％、ｍｐ：１６３〜１６５℃を得た。
（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ１）は、Ｓｍ／Ｉ２／ＣＨ３ＯＨで脱アセチル化して、（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ１）、ｍｐ：１２７〜１２９℃を得た。具体的な操作は、実施例７に示す最終加水分解工程で説明した通りである。
【００４１】
光学活性（３Ｓ、４Ｓ、５Ｒ、６Ｓ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ２）、（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｒ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ２）、（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ１）、（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｓ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ１）の調製。
【００４２】
方法は、出発物質が光学活性３−Ｏ−アセチル−クローゼンアミド（１）であることを除いて、ラセミ化合物の調製について上述したものと同じである。各工程の収率は、ラセミ化合物の調製におけるそれらと類似していた。生成物および中間体の融点および［α］値を、以下に記載する。
（−）−３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド、ｍｐ：１１９〜１２０℃、［α］Ｄ１８＝−３３０（ｃ、０．８７０、ＣＨＣｌ３）
（＋）−３−Ｏ−アセチル−Δ５，６−クローゼンアミド、ｍｐ：１１９〜１２０℃、［α］Ｄ１８＝＋３２６（ｃ、０．８７０、ＣＨＣｌ３）
（−）−Δ５，６−クローゼンアミド、ｍｐ：１２５〜１２７℃、［α］Ｄ１８＝−１７．１（ｃ、０．７００、ＣＨＣｌ３）
（＋）−Δ５，６−クローゼンアミド、ｍｐ：１２５〜１２７℃、［α］Ｄ１８＝＋１６．７（ｃ、０．７３８、ＣＨＣｌ３）
（＋）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド、油、［α］Ｄ２５＝＋１１３（ｃ、０．５０５、ＣＨ３ＯＨ）
（−）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｓ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド、油、［α］Ｄ２５＝−１１７（ｃ、０．２００、ＣＨ３ＯＨ）
（＋）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｒ、６Ｓ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド、ｍｐ：１４７〜１４９℃、［α］Ｄ２５＝＋２０２（ｃ、０．５１０、ＣＨ３ＯＨ）
（−）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｒ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド、ｍｐ：１４５〜１４７℃、［α］Ｄ２５＝−２０８（ｃ、０．６２０、ＣＨ３ＯＨ）
（−）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ１）、ｍｐ：１２５〜１２８℃、［α］Ｄ１５＝−３２３（ｃ、０．８７０、ＣＨ３ＯＨ）
（＋）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｓ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ１）、ｍｐ：１２５〜１２７℃、［α］Ｄ１５＝＋３２７（ｃ、０．４７０、ＣＨ３ＯＨ）
【実施例３】
【００４３】
Ａ：ラセミ（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ３）の調製（経路３）
乾燥三つ口フラスコに５ｍＬのＴＨＦを加えて−５０〜−６０℃に冷却した。４５３μｌの再蒸留した塩化オキサリルをＮ２雰囲気下で加えて１分間撹拌し、７６７μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（分子篩いで乾燥）を−５０〜−６０℃で徐々に加えて５分間撹拌し、１５０ｍｇ（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｒ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ１）のＴＨＦ溶液１０ｍｌを徐々に加えた。添加の終了後、生じた混合物をその温度で２時間撹拌し、次に１ｍｌのトリエチルアミンを加えた。その温度で０．５時間放置し、次に徐々に室温まで暖めた。１０ｍｌの水を加え、ＴＨＦを減圧下で蒸留させた。生成物が水層に検出されなくなるまで残留物を酢酸エチルで抽出した。有機層を１モル／ｌの塩酸、重炭酸ナトリウム水、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、溶媒を蒸留して２５０ｍｇの油を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製により、９５ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミドン（３−Ｏ−アセチルＩＩ１ケトン）、収率：７１％、を得た。
【００４４】
８２ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミドン（３−Ｏ−アセチルＩＩ１ケトン）を３ｍｌのメタノールに溶かし、氷水浴で２０分間撹拌した。混合物に３０ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを加えて、１０分間氷水浴で撹拌した。反応混合物を１モル／ｌの塩酸で慎重に中和し、次に少量の水を加えた。有機溶媒を減圧下で蒸留した。残留物をエチルエーテルで溶かし、エーテル層を分離し、水層はエチルエーテルで洗浄した。エーテル層を合わせて塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて油を得た。カラムクロマトグラフィーによる精製により、６０ｍｇの（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ３）、ｍｐ：１４４〜１４７℃、収率：７３％、を得た。
【００４５】
５０ｍｇの（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミド（３−Ｏ−アセチル−ＩＩ３）を５０ｍｌの無水メタノールに溶かし、混合物に３８ｍｇのヨウ素および２３ｍｇのサマリウムを加えた。生じた混合物を空気中で１２時間撹拌し、酢酸エチルで希釈し、分液漏斗に移して２５％の次亜硫酸ナトリウム溶液で洗浄し、有機層を分離して塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーにより精製して２５ｍｇの（±）−（３Ｓ＊、４Ｓ＊、５Ｓ＊、６Ｓ＊）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ３）を得、これを酢酸エチル／石油エーテルで再結晶させて白い固体、ｍｐ：１１４〜１１６℃、収率：５６％、を得た。
Ｂ：（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｓ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ３）および（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（ＩＩ３）の調製。
【００４６】
Ａで説明したラセミ化合物の調製方法と同じであるが、出発物質として（−）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミド（３−Ｏ−アセチル−ＩＩ１）、または、（＋）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｓ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシクローゼンアミド（３−Ｏ−アセチル−ＩＩ１）を使用し、化合物は、各工程での収率がラセミ化合物の調製におけるそれと同じ収率で合成された。化合物の融点および旋光値は、以下に記載する。
（−）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミドン（３−Ｏ−アセチル−ＩＩ１ケトン）、ｍｐ：１２５〜１２８℃、［α］Ｄ１５＝−３１０（ｃ、０．３６０、ＣＨＣｌ３）
（＋）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミドン（３−Ｏ−アセチル−ＩＩ１ケトン）、ｍｐ：１２７〜１２９℃、［α］Ｄ１８＝＋３１２（ｃ、０．４４２、ＣＨＣｌ３）
（−）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｓ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ３）、ｍｐ：１５３〜１５７℃、［α］Ｄ１５＝−３１．９（ｃ、０．４５５、ＣＨ３ＯＨ）
（＋）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−３−Ｏ−アセチル−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド（３−Ｏ−アセチルＩＩ３）、ｍｐ：１５２〜１５６℃、［α］Ｄ１８＝＋３１．７（ｃ、０．４８０、ＣＨ３ＯＨ）
（−）−（３Ｓ、４Ｓ、５Ｓ、６Ｓ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド、油、［α］Ｄ１８＝−５３．６（ｃ、０．４７０、ＣＨ３ＯＨ）
（＋）−（３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−ヒドロキシ−クローゼンアミド、油、［α］Ｄ１８＝＋５４．１（ｃ、０．４８０、ＣＨ３ＯＨ）
【化９】
2006516248.tif 000011
【実施例４】
【００４７】
Ｎ−（エトキシカルボニル−メチレン）−ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ４）の調製（スキーム３に示す）
（１）光学活性３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラニル−ネオクローゼンアミドンの調製
４４３ｍｇの（−）−（３Ｒ、４Ｓ、５Ｒ）−ネオクローゼンアミドン（１．５ｍｍｏｌ）、２８０ｍｇの３，４−ジヒドロピラン（４．５ｍｍｏｌ）および３８ｍｇのピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（０．１５ｍｍｏｌ）を一晩撹拌し、１０ｍＬのメチレンジクロリドで希釈し、塩化ナトリウム水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して０．５１ｇの（＋）−３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラニル−ネオクローゼンアミドン、収率：８９．６％、ｍｐ：１８１〜７℃、［α］Ｄ１５＋１３．４６（ｃ、０．４２、ＣＨＣｌ３）を得た。
【００４８】
０．３５ｇの（＋）−（３Ｓ、４Ｒ、５Ｓ）−ネオクローゼンアミドンを出発物質として用い、前記方法により４１６ｍｇの（−）−３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラニル−ネオクローゼンアミドン、収率：９１．４％、ｍｐ：１９４〜２００℃、［α］Ｄ１５−１１．９（ｃ、０．２４、ＣＨＣｌ３）が得られた。
１２０ｍｇの３，６−ジ−Ｏ−テトラヒドロピラニル−ノルクローゼンアミド（２）を５ｍｌの無水ベンゼンに溶かし、２１ｍｇの水素化ナトリウムを加えた。混合物を油浴で３０分間加熱し、次に室温で１０分間撹拌し、６６ｍｇのブロモ酢酸エチルと５ｍｌの乾燥ベンゼンの溶液を加え、６０℃の油浴で２０分間加熱し、反応溶液を室温まで冷やし、３ｍｌの水を加えて撹拌し、ジクロロメタンで希釈し、２Ｎ塩酸で中和した。有機層を分離して塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて油性生成物を得た。油性生成物をエチルアルコールに溶かし、１０ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸で処理し、次に６０℃の油浴で加熱してテトラヒドロピラン部を取り除き、反応の完了後、カラムクロマトグラフィーによって生成物を直接精製して標記化合物７９ｍｇ、油状、収率８２％、を得た。
【００４９】
［実施例１０］
Ｎ−（アミノカルボニル−メチレン）−ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ１）の調製
６０ｍｇのＮ−（エトキシカルボニル−メチレン）−ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ４）を大過剰な量のＮＨ３／ＣＨ３ＯＨ溶液で処理して一晩放置し、カラムクロマトグラフィーで精製して４０ｍｇの標記化合物、白色固体、ｍｐ：１４６〜１４８℃、収率７２％、を得た。
【実施例５】
【００５０】
Ｎ−アセトキシメチレン−ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ３）の調製。
２００ｍｇのノルクローゼンアミド（１）を７．５ｍｌのアセトンに溶かし、３滴の水を加え、次に３３ｍｇのパラホルムアルデヒドおよび９ｍｇの炭酸カリウムを加えた。反応混合物を６０℃の外部温度に加熱し、２５分後に加熱を中止し、氷水で直ちに冷やし、減圧下で溶媒を蒸発させて２０８ｍｇのスラリーを得、これをカラムクロマトグラフィーで精製して１６２ｍｇのＮ−ヒドロキシメチル−ノルクローゼンアミド（３）、白色固体、ｍｐ：１９９〜２０１℃、収率：７３％、を得た。
【００５１】
１５５ｍｇのＮ−ヒドロキシメチルノルクローゼンアミド（３）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦで溶かし、氷塩水浴（−８℃）で２０分間撹拌し、２ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶かした７５ｍｇの無水酢酸および５９ｍｇのピリジンを滴下し、その温度で３時間撹拌し、少量の水を加え、ジクロロメタンで希釈した。有機層を分離し、水および塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ一度洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸留させ、カラムクロマトグラフィーで精製して６０ｍｇのＮ−アセトキシメチレン−ノルクローゼンアミド（ＩＩＩ３）、ｍｐ：１３７〜１３９℃、収率：３２％、を得た。
【００５２】
薬理学的試験
実験例１  Ｃ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミドの立体異性体およびＮ−置換クローゼンアミド誘導体のマウス脳神経幹細胞の増殖に及ぼす影響。
１．目的および意義
神経幹細胞の数の増加または生存の延長は、ニューロンの増加およびニューロン減少の予防のために非常に重要である。Ｃ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミドおよびＮ−置換クローゼンアミド誘導体の細胞増殖効果を評価するために、マウス脳神経肝細胞を使用した。
【００５３】
２．方法
Ｃ１７−２マウス脳神経幹細胞（Ｃ１７−２細胞）を、１０％馬血清および１０％ウシ胎児血清を含む１６４０培地で５％ＣＯ２および３７℃の条件下で連続的に培養し、０．１％トリプシン溶液で単一細胞浮遊液に解離し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地で洗浄した。１群当り３つのウェル、ウェル当り１×１０３細胞数で細胞を９６穴プレートに播種し、連続的に培養した。２４時間後に試験化合物を加えたが、Ｃ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミドおよびＮ−置換クローゼンアミド誘導体の各々の用量は、それぞれ０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭであった。細胞の増殖状況は、１日１回顕微鏡下で観察した。第４日目、各々のウェルの培地をピペットで取り、ＭＴＴを含む燐酸緩衝液を加えた。４時間後、液体を捨ててＤＭＳＯ溶液を加えた。振盪させながら細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。各ウェルの４９０ｎｍにおけるＯＤ値を検出した。対照群の増殖速度を１００％に設定し、各用量における増殖速度は対照群との比較により得、ｔ−検定で検定した。
【００５４】
３．結果
表１は、Ｃ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミドおよびＮ−置換クローゼンアミド誘導体のマウス脳神経幹細胞の増殖に関する評価結果を示す。
１６個の化合物の中で、２つのＣ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミド立体異性体（Ｎｏ．５、（−）ＩＩ１（Ｃ１８Ｈ１９ＮＯ４  ３１３．３６）およびＮｏ．８、（＋）ＩＩ３（Ｃ１８Ｈ１９ＮＯ４  ３１３．３６））ならびに１つのＮ−置換クローゼンアミド誘導体（Ｎｏ．１２、（±）ＩＩＩ５（Ｃ２７Ｈ２８Ｎ２Ｏ４  ４４４．５４）は、０．１μＭおよび１μＭの量でマウス脳神経幹細胞の増殖に対して著しい促進効果を示した。
【００５５】
【表２】
2006516248.tif 000012
2006516248.tif 000013
【００５６】
４．結論
本発明のＣ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミドおよびＮ−置換クローゼンアミド誘導体の立体異性体は、マウス脳神経幹細胞の増殖を促進する効果を示す。化合物の中で、２つのＣ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミド立体異性体（Ｎｏ．５、（−）ＩＩ１およびＮｏ．８、（＋）ＩＩ３）ならびに１つのＮ−置換クローゼンアミド誘導体（Ｎｏ．１２、（±）ＩＩＩ５）は、マウス脳神経幹細胞の増殖に対して著しい効果を示す。
【００５７】
実験例２  Ｃ５−ヒドロキシル置換クローゼンアミドの立体異性体およびＮ−置換クローゼンアミド誘導体のラット海馬におけるＬＴＰ誘発に及ぼす影響
１．目的および意義
クローゼンアミドの有意な向知性薬効果がいくつかの行動研究において観察された。しかし、シナプス伝達に対するその影響は、まだ推定の段階にある。シナプスはメッセージの処理および神経系での細胞から細胞への転送の基本単位であり、シナプスの構造、活性および機能の変化は学習および記憶研究のための神経生物学的基礎である。したがって、クローゼンアミドの向知性薬効果は、電気生理学的技術を使用することによりシナプスのレベルで研究された。
【００５８】
２．方法
雄成体ＳＤラット（１群につき５匹）を２０％（ｗ／ｖ）のウレタンカルバメート（１．０ｇ・ｋｇ−１、ｉｐ）で麻酔し、定位頭部ホルダーに固定した。ラットのペルグリーノ定位スペクトルの参照に従い、導出電極（直径０．２ｍｍのステンレス針を、先端０．２ｍｍ除き絶縁した）を歯状回顆粒細胞層に設置した。４対の光学活性クローゼンアミドを表９に示すように側脳室に作用させた。刺激電極（先端０．２ｍｍを除いてテフロンでコーティングされた直径０．１５ｍｍのステンレス針２本であり、２本の針の間の距離は０．５ｍｍであった）をラットの貫通線維（ＰＰ）の間に植えた。連続パルスが電気刺激により与えられ、刺激アイソレーターおよび刺激電極を通してＰＰに送られた。次に、電極深度を典型的興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）が観察されるまで調節した。電流は増幅器で拡大してコンピュータで集め、次にＤａｔａＷａｖｅソフトウェアで処理した。刺激強度は、最大値の〜５０％の傾きを有する集合スパイク（ＰＳ）を生じるように調節した。実験中の単一パルスの検査刺激は、３０秒間隔であった。集合スパイク振幅（ＰＳＡ）を記録し、ＰＳＡの相対百分率を公式（ＰＳＡ／基準値）に従って計算した。
【００５９】
３．結果
表２に示すように、基本的なシナプス伝達は本発明の化合物によってある程度改善された。その中では、化合物Ｎｏ．１（（−）Δ５，６−Ｉ）、Ｎｏ．２（（＋）ＩＩ１）、Ｎｏ．７（（＋）ＩＩ３）およびＮｏ．９（（±）ＩＩＩ３）はシナプス伝達に対して有意な増強効果を示す（対対照Ｐ＜０．０５、ｎ＝５）。
【００６０】
【表３】
2006516248.tif 000014
【国際調査報告】
2006516248.tif 000021
2006516248.tif 000022
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