(57)【要約】【課題】少なくとも部分的には蛍光スペクトルの分光分解検出が行われ、その場合スペクトル成分の分解に参照スペクトルが利用される、特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光検鏡のための方法【解決手段】参照スペクトルの撮影が、時間毎および／またはスペクトル毎に変化する色素および／または色素配合によって行われ、その結果が画像の評価に利用されることを特徴としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的には蛍光スペクトルの分光分解検出が行われ、その場合スペクトル成分の分解に参照スペクトルが利用される、特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光検鏡のための方法であって、
参照スペクトルの撮影が時間毎および／またはスペクトル毎に変化する色素および／または色素配合によって行われ、その結果が画像の評価に利用されることを特徴とする方法。
【請求項２】
有機反応の捕捉のための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞内反応の捕捉のための、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞間反応の捕捉のための、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
細胞および／または細胞母集団の捕捉のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
光変換型色素の参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
光活性型色素の参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
インジケータ色素の参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞内反応によってそのスペクトルを動力学的に変化させる色素の参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光強度の上昇に差異がある場合に、色素の参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光タンパク質カエデの参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＡ−ＧＦＰの参照スペクトルの撮影が行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光検鏡法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物プレパラート検査用光学顕微鏡の従来からの適用領域の１つに蛍光検鏡がある（文献：Pawley,
"Handbook of biological confocal Microscopy"; Plenum Press 1995年）。この場合では、組織、細胞または部分細胞あるいは材料の特殊マーキングのために特定色素が使用される。
色素分子は、特定エネルギーを持つ光子が照射されると、光子１つの吸収によって基底状態から励起状態へと遷移する。この励起は多くの場合一光子吸収と称される（図１ａ）。そのように励起された色素分子は、様々な方法で基底状態に逆戻りさせることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放出下における移行が最も重要である。放出される光子の波長は、ストークスシフトのため励起光線に比べて一般には赤側にずれているので長波長側になる。ストークスシフトが蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。
【０００３】
図１ｂには多光子励起が描かれている。
蛍光光線はブロックフィルタと組み合わされた適当なダイクロイック・ビームスプリッタにより分割され、別々に観察される。それにより、異なった色素で着色された細胞部分を個別に描画することが可能になる。しかし原則としては、プレパラートの複数部分をそれぞれ特殊な堆積の仕方をする異なった色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個別色素から放出される蛍光信号の区別にも、特殊なダイクロイック・ビームスプリッタが使用される。
【特許文献１】ＤＥ  １９７０２７５３  Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以下では現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）のモデル例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて次の４モジュールから成っている：光源、走査モジュール、検出ユニットおよび顕微鏡。以下にこれらのモジュールについてより詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考にする。
【０００５】
プレパラート中にある様々な色素の個別励起のため、ＬＳＭ内では様々な波長のレーザが使用される。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性如何に依存する。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合、様々なレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは波長の選択および必要とする励起波長の強度調整が、たとえば音響光学結晶の使用により行われる。それに続き、レーザビームがファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。
【０００６】
光源で生成されたレーザビームは、対物レンズによる回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、鏡筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。試料に焦点を合わせた状態で、スキャナによりｘ−ｙ方向にドット走査される。試料走査における画素上滞留時間は多くの場合マイクロ秒未満〜数秒の範囲とする。
【０００７】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦点面（試料）からおよびその上下にある平面から放射された光はスキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、焦点面と正しく共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。絞りのサイズを変化させることにより顕微鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後方に別なダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）が配置されていて、これが再度励起光線を遮断する。蛍光は、ブロックフィルタの通過後に点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【０００８】
多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は励起強度の特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りは使用せずに省くことができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
【０００９】
さらに、多光子吸収によって励起される色素蛍光の検出に用いられるまた別な装置であってデスキャン検出を行うものもあるが、しかしその場合では対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。
【００１０】
３次元照明による像のうち、対物レンズの焦点面内に存在する平面（光学的断面）だけが、対応の一光子吸収または多光子吸収と接続している両検出装置によって再現される。それに続いて、試料の様々な深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、試料の３次元像がコンピュータのサポート下で生み出される。したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の持つ固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合わせたダイクロイックフィルタの利用により、それぞれの色素からの放出蛍光だけに絞られた、点像検出器における測定対象の限定が確保される。
【００１１】
バイオメディカルの分野では、現在異なったいくつかの細胞領域が異なった色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素は吸収特性または放射特性（スペクトル）の違いに基づき別々に検出されている。そのため、複数色素の蛍光に対する追加分割がサブビームスプリッタ（ＤＢＳ）により、個々の色素の放射検出が別々の点像検出器（ＰＭＴ  ｘ）で行なわれる。
【００１２】
上記装置ではオペレータが検出および励起操作を、新たな当該色素特性に対してフレキシブルに適合させることは不可能である。その方法によるのではなく、それぞれの（新しい）色素ごとに新たなダイクロイック・ビームスプリッタおよびブロックフィルタを創出することが必要になってくる。
【００１３】
従来の検出装置では、２色素の放出スペクトルが重なり合うと機能の限界に達してしまう。両色素間の重畳を避けるためには、スペクトルの検出領域を制限しなければならない。そのため両色素が重なり合う領域は簡単に切り取られて検出から外される。したがって、検出ユニットの効率は低レベルである。同等の信号対雑音比の達成は励起性能を高めて初めて可能である。ただし、それによりプレパラートに損傷が生じかねない。それ故、今日では最高６種類までの色素ゾンデが同時に使用されている。それは、放出帯が強く重なり合うため、そうしないと色素の分離ができないからである。
【００１４】
従来、色素はその吸収特性か放出特性が互に異なるように改変されてきた。図３は様々な色素タイプの放出スペクトルを示している。そこには放出信号が波長別に描かれている。１と４の色素間ではその放出スペクトルの位置および形態に違いがあるのが認められる。しかしこれらの色素は、殆どの場合、生体プレパラートに対して有毒である。したがって、生体プレパラート内細胞群の発育検査には使用不可能である。９０年代の末には自然界に存在する色素、いわゆる蛍光性タンパク質（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＴＯＰＡＳ、ＧＦＴ、ＲＦＰ）が発見された（Clonetech社、ＵＳＡ）。
プレパラートの特殊マーキングには上記すべてのシステムにおいて蛍光性色素が使用されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ツアイス社のレーザ走査型顕微鏡ＭＥＴＡでは蛍光がスペクトル分割される。それによると、放出光は走査モジュールまたは顕微鏡（多光子吸収の場合）においてメインカラースプリッタ（ＭＤＢ）により励起光から分離される。続いての検出ユニットについては、そのブロック構成図が図５に描かれている。
【００１６】
共焦点検出の場合、試料からの光はまず結像光学系ＰＯにより絞り（ピンホール）ＰＨを通されて集束する。それにより、焦点外で発生した蛍光は遮断される。ノンデスキャン検出では絞りは不要である。その場合、光は角分散素子Ｇによりそれぞれのスペクトル成分に分割される。角分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってそれぞれのスペクトル成分に分割された光は、続いてライン検出器ＤＥに結像する。つまり、このライン検出器ＤＥは波長ごとに放出信号を計測してそれを電気信号に変換する。検出ユニットには励起波長の遮断のために、加えてラインフィルタを前置接続することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図示された構造は大枠でCerny Turner構造に一致する。共焦点検出の場合、試料からの光Ｌはピンホール光学系ＰＯにより共焦点絞りＰＨを通されて集束する。多光子吸収でのノンデスキャン検出の場合この絞りは省略できる。第１の結像ミラーＳ１は蛍光光線をコリメートする。続いて光はライン格子Ｇ、例えばライン数がｍｍ当り６５１本の格子に達する。格子は光をその波長に応じて様々な方向に回折させる。
【００１８】
第２の結像ミラーＳ２は、スペクトル分割された個々の波長成分をライン検出器ＤＥの対応チャネルに集束させる。浜松ホトニクスのライン型二次電子増倍管Ｈ７２６０の使用が特に有利である。当検出器は３２のチャネルを持ち、高い感度を有している。上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。この装置では自由なスペクトル領域をライン検出器の３２のチャネルに均等に分布させているので、その光学的分解能は約１０ｎｍとなる。
【００１９】
そのため、この装置は分光測定には限られた範囲でしか適していない。しかし画像形成システムでの使用の場合は有利である。それは、検出されるスペクトル帯が比較的広いため検出チャネル当りの信号はなお比較的大きいからである。自由なスペクトル領域は、例えば格子の角度変化により追加的にシフトさせることもできる。
【００２０】
また別な実施態様として、マトリックス型検出器（例えばＣＣＤ）の使用も考えられよう。この場合では分散素子により座標内で様々な波長成分への分割が行われる。マトリックス型検出器上のそれ以外の残された方向では、走査画像の完全なライン（またはスリット）が結像している。この実施態様はラインスキャナが構成される場合には特に有利である（文献：Corle, Kino; "Confocal Scanning Optical Microscopy and Related
Imaging Systems"; Academic Press 1996年）。その原理構造は本質的には図２のＬＳＭに一致している。しかし、その場合は点フォーカスでなくてラインがフォーカス結像し、被検試料は一方向で走査されるだけである。そのような構成では、共焦点絞りとしてはホール型絞りの代わりにスリット型絞りが用いられる。この装置でも多光子吸収適用の場合ではノンデスキャン検出を実施することができる。その場合でも共焦点絞りは省略可能である。
【００２１】
蛍光光線のスペクトル分割により、すなわち純形態の蛍光マーカーについての蛍光スペクトルの捕捉および複数マーカーの蛍光成分を含むスペクトルについての「成分分解」法による捕捉に基づき、スペクトル成分の分離捕捉を行うことができる（ＤＥ  １９９１５１３７  Ａ１）。
【００２２】
本発明の内容から認識されるように、純形態での蛍光スペクトルだけを参照スペクトルとして使用するのではなく、混合形態の参照スペクトルも記録に用いるのであれば、蛍光マーキングに使用される蛍光マーカーの数を減らすことが、あるいは組み合せを十分に活かすことが可能になる。
【００２３】
この混合形態については、蛍光マーカーが緩慢な変色の仕方をするのであれば、例えば経時的に変化する生物材料の着色状態から特徴付けすることができる。
さらに、このような混合状態は、蛍光マーカーがその色または励起特性を変えるのであれば、混合色によって特徴付けすることもできる。
【００２４】
この種の混合状態は次のように様々な形で生じる可能性がある：試料中に存在する場合、試料の照射によって生成される場合、または照射によって励起されたバイオプロセスの結果として生じる場合である。
混合スペクトルは、例えば濃度変化などのバイオプロセスを特徴付けることができる。その場合第１のスペクトルが低い濃度状態に、少なくとも１つのまた別なスペクトルがより高い濃度状態に相当する。
【００２５】
画像チャネルは様々な参照スペクトルの利用によって定義付けされ、それに対応して評価される。この種参照サンプルの生成は画像全体を通じて、または有利な方法として、マーキングされた「対象領域」（ＲＯＩ）を通じて行うことができる。また、この種ＲＯＩを通じ、定義付けされた照射による照準的操作を行うこともできる。さらに、第１の領域で参照サンプルを決定し、少なくとも１つのまた別な領域で照準的照射および混合スペクトルからの抽出測定を行うこともできる。スペクトルの成分分離および描画は撮影後または撮影中に行うことができる。
【００２６】
驚いたことに、照射時に緑から赤へ変色する蛍光性タンパク質カエデなどの新型マーカー（文献：Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H.,およびMiyawaki, A.(2002年), An optical marker based
on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. PNAS
99/20, 12651〜12656ページ）は、例えば細胞間および細胞内反応など有機反応の捕捉時に、および個々の細胞または細胞母集団のマーキングに使用してスペクトル検出し得ることが明らかになっている。
細胞内反応によってそのスペクトルを動力学的に変化させる光変換型色素、ＦＲＥＴ実験に使用される色素、あるいはその他のインジケータ色素も本発明に基づく方法により有利な形で使用することができる。
【００２７】
例えば、色素カエデでマーキングされた細胞母集団では様々な細胞または細胞群をＵＶまたは紫光により様々な作用時間で照射することが、つまり変換させることができる。それによって様々な色混合状況が生まれ、それらは参照スペクトルとして捕捉される。
これは細胞培養の場合に当てはまるだけでなく、副細胞構造や生体全体にも適用することができる。その場合、特定の細胞母集団を照射してその成長を観察することが可能である。ただし、それは得られた参照サンプルを特定の画像チャネルに割り当てて追跡できるようにして行う。
【００２８】
ＲＯＩのそれぞれに関して１つずつ領域を選択することができる。運搬プロセスは細胞および副細胞のレベルで分析することができる。色素としては、モデル例で言えば、参照形成のもと、照射またはその他の作用により、明確に同定の可能な様々な状態に移行するものに限り有利に使用できる。
【００２９】
ＰＡ−ＧＦＰ（光活性型ＧＦＰ、文献：Patterson, G. H.およびLippincott-Schwartz, J.（2002年）, A photoactivatable GFP for selective photobleaching of proteins
and cells. Science 297巻, 1873〜1877ページ）の場合と同様、紫光により励起させた場合の蛍光強度上昇における差異も参照として利用することができる。ツアイス社のＬＳＭ  ＭＥＴＡによれば、画像において直接ＲＯＩの定義付けを相互比較により行うことができる。選択されたレーザは、これら領域の境界においてピクセル単位で接続および遮断される。
【００３０】
タイムシリーズ・ダイアログではタイムシリーズの開始および終了が、さらに撮影間のインターバルおよびディレイが決定される。この場合、光活性または光変換の特徴により、例えば反復率、波長、強度、ポジションなど色素特性に変化をもたらす照射パラメータも自動的に結合させることができる。
評価は、実験後に、または実験経過に直接関与できるよう既に撮影中にオンラインで行うことができる。
【００３１】
時間を函数とするＲＯＩの平均強度、および光活性と変換の時間が表示される。
ＭＥＴＡ検出器によれば、例えばカエデからの放出スペクトルの全体的捕捉、それぞれの混合形態の測定中でのスペクトル分離、および分解チャネルの表示が可能になる。
【００３２】
図４には様々な画像チャネルＣＨ１〜ＣＨ３がいかに形成されるかが図式化されている。図に示されているように、この場合混合成分の様々なスペクトル分布ＣＨ１〜ＣＨ３が参照として使用され、画像評価に利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】励起、一光子吸収の場合（ａ）、多光子吸収の場合（ｂ）
【図２】共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）のモデル例
【図３】放出スペクトル
【図４】画像チャンネル形成のスペクトル分布
【図５】検出ユニット／光学系の構成例
【符号の説明】
【００３４】
Ｌ        試料からの光
ＰＯ      ピンホール光学系
ＰＨ      ピンホール
Ｓ１      結像ミラー
Ｇ        格子
Ｓ２      結像ミラー
ＤＥ      検出ユニット
【図１】
2006527858.tif 000002
【図２】
2006527858.tif 000003
【図３】
2006527858.tif 000004
【図４】
2006527858.tif 000005
【図５】
2006527858.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月15日(2006.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
少なくとも部分的には蛍光スペクトルの分光分解検出が行われ、その場合スペクトル成分の分解に参照スペクトルが利用される、特にレーザ走査型顕微鏡による蛍光検鏡のための方法であって、
参照スペクトルの形成が、時間毎および／またはスペクトル毎に変化する色素および／または色素配合の使用により、異なった照明時間のもとで、またはビームの励起によって発現するプロセスのもとで、または試料内で進行する、特に細胞内で進む過程のもとで、時間毎に異なるスペクトル分布に対応して複数の画像チャンネルで行われること、およびその参照スペクトルが画像の評価に利用されることを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2006527858.tif 000007
2006527858.tif 000008
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