(57)【要約】過酸化物耐性を有するグルコースオキシダーゼの調製方法およびその方法で調製されたグルコースオキシダーゼ酵素である。この酵素調製方法により、改良された過酸化物耐性を有し、そのため改良された酸化不活性化耐性を有するグルコースオキシダーゼ酵素が生じる。この方法は、定向進行法を用いてグルコースオキシダーゼを生じ、所望の特性を達成する。過酸化物耐性グルコースオキシダーゼは、例えば、過酸化物耐性グルコースオキシダーゼを内蔵するグルコースバイオセンサの寿命を延長する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の調製方法であって、
少なくとも一つのグルコースオキシダーゼ遺伝子を得る工程と、
少なくとも一つの突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子を作製する工程と、
各々の突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子を別個の発現ベクトルに導入する工程と、
前記発現ベクトルをホスト微生物に装入する工程と、
前記ホスト微生物のコロニを培養する工程と、および、
望ましい性質を求めて前記コロニを選別する工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の酵素の調製方法であって、
望ましい性質を求める前記コロニの選別は、
前記コロニが活性グルコースオキシダーゼを含むか否かの判定をする工程と、
前記コロニが過酸化物耐性を有するか否かの判定をする工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３】
請求項２に記載の酵素の調製方法であって、
望ましい性質を求める前記コロニの選別は、
さらに、機能性を求める前記コロニからのグルコースオキシダーゼの試験を行う工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項４】
請求項２に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニが過酸化物耐性を有するか否かの判定は、前記コロニが活性グルコースオキシダーゼを含むか否かの判定結果が陽性であるときにのみ行われることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項５】
請求項３に記載の酵素の調製方法であって、
機能性を求める前記コロニからのグルコースオキシダーゼの試験は、前記コロニが活性グルコースオキシダーゼを含むか否かの判定結果が陽性で、また前記コロニが過酸化物耐性を有するか否かの判定結果が陽性である場合にのみ行われることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項６】
請求項２に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニが活性グルコースオキシダーゼを含むか否かの判定は、活性グルコースオキシダーゼの存在下で変色する物質を用いる工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の酵素の調製方法であって、
前記物質は、ロイコクリスタルバイオレットであることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項８】
請求項２に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニが活性なグルコースオキシダーゼを含むか否かの判定は、蛍光をチェックする工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項９】
請求項２に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニが過酸化物耐性を有するか否かの判定は、
過酸化物中で前記コロニを培養する工程と、
前記コロニを過酸化物中で培養した後にコロニが活性グルコースオキシダーゼを有するか否かの判定する工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１０】
請求項２に記載の酵素の調製方法であって、
機能性を求める前記コロニからのグルコースオキシダーゼの試験は、前記コロニからのグルコースオキシダーゼをセンサに用いる工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからのグルコースオキシダーゼをセンサに用いる工程は、
前記コロニからグルコースオキシダーゼを抽出する工程と、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの抽出の後のグルコースオキシダーゼを固定化する工程と、
前記固定化グルコースオキシダーゼをセンサ内に設置する工程と、
前記センサの試験を行う工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからのグルコースオキシダーゼの抽出は、イオン性カラムを用いてグルコースオキシダーゼを前記コロニから抽出する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからのグルコースオキシダーゼの抽出は、
前記コロニから前記グルコースオキシダーゼを除去する工程と、
前記グルコースオキシダーゼを精製する工程と、
前記グルコースオキシダーゼを特徴付ける工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、ホモジナイザ内で前記コロニを細胞成分にすり潰す工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、さらに、ホモジナイザ中で前記コロニをすり潰した後に遠心分離および溶解度差によって前記細胞成分を分別する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、超音波処理により前記コロニを細胞成分へ崩壊する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、さらに、超音波処理により前記コロニを崩壊した後に遠心分離および溶解度差を用いて前記細胞成分を分別する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の酵素の調製方法であって、
前記グルコースオキシダーゼの精製は、クロマトグラフ法を用いることにより前記グルコースオキシダーゼを精製する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の酵素の調製方法であって、
前記グルコースオキシダーゼは微生物から得られ、前記微生物はAspergillus Niger、Penecillium funiculosum、Saccaromyces cerevisiae、およびEscherichia Coliからなる群から選択されることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の酵素の調製方法であって、
少なくとも一つの前記突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子の作製は、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて少なくとも一つの突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子を作る工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の酵素の調製方法であって、
少なくとも一つの前記突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子の作製は、変異性ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて少なくとも一つの突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子を作る工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の酵素の調製方法であって、
少なくとも一つの前記突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子の作製は、遺伝子シャフリング法を用いて少なくとも一つの突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子を作る工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の酵素の調製方法であって、
前記方法は、さらに、望ましい性質を求めて前記コロニの選別を行った後に次世代の突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子を作製する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の酵素の調製方法であって、
前記次世代の突然変異グルコースオキシダーゼ遺伝子の作製は、およそ２ないし６回繰り返されることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２５】
請求項１に記載の方法により調製されることを特徴とする酵素。
【請求項２６】
酵素の調製方法であって、
グルコースオキシダーゼ遺伝子を有する微生物を取得する工程と、
前記微生物の多様なコロニを培養する工程と、
前記コロニの環境を変える工程と、
前記コロニの環境を変えた後に前記コロニを選別して活性グルコースオキシダーゼを有するコロニを特定する工程と、
を含む酵素の調製方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の酵素の調製方法であって、
前記微生物は、Aspergillus Niger、Penecillium funiculosum、Saccaromyces cerevisiae、およびEscherichia Coliからなる群から選択されることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニの環境の変更は、前記コロニへ過酸化物を導入する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項２９】
請求項２６に記載の酵素の調製方法であって、
活性グルコースオキシダーゼを有するコロニを特定するための前記コロニの選別は、活性グルコースオキシダーゼの存在下に変色する物質を使用する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の酵素の調製方法であって、
前記物質は、ロイコクリスタルバイオレットであることを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の酵素の調製方法であって、
活性グルコースオキシダーゼを有するコロニを特定するための前記コロニの選別は、蛍光をチェックする工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３２】
請求項２６に記載の酵素の調製方法であって、
前記方法は、さらに、活性グルコースオキシダーゼを有するコロニを特定するための前記コロニの選別の後、活性グルコースオキシダーゼを有する前記コロニの機能性の試験を行う工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の酵素の調製方法であって、
前記方法は、さらに、活性グルコースオキシダーゼを有する前記コロニの機能性の試験に進むのに適した数に、活性グルコースオキシダーゼを有する前記コロニが達するまで前記コロニの環境を変え続ける工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の酵素の調製方法であって、
活性グルコースオキシダーゼを有する前記コロニの機能性の試験は、前記コロニからのグルコースオキシダーゼをセンサに用いる工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の酵素の調製方法であって、
活性グルコースオキシダーゼを有する前記コロニの機能性の試験は、
前記コロニからグルコーシオキシダーゼを抽出する工程と、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの抽出の後に前記グルコースオキシダーゼを固定化する工程と、
前記固定化されたグルコ−スオキシダーゼをセンサ内へ設置する工程と、および
前記センサを試験する工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからのグルコースオキシダーゼの抽出は、イオン性カラムを用いて前記コロニからグルコースオキシダーゼを抽出する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからのグルコースオキシダーゼの抽出は、
前記コロニから前記グルコースオキシダーゼを除去する工程と、
前記グルコースオキシダーゼを精製する工程と、および
前記グルコースオキシダーゼを特徴付ける工程と、
を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、ホモジナイザ内で前記コロニを細胞成分にすり潰す工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、さらに、ホモジナイザ中で前記コロニをすり潰した後に遠心分離および溶解度差によって前記細胞成分を分別する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項４０】
請求項３７に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、超音波処理により前記コロニを細胞成分へ崩壊する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の酵素の調製方法であって、
前記コロニからの前記グルコースオキシダーゼの除去は、さらに、超音波処理により前記コロニを崩壊した後に遠心分離および溶解度差を用いて前記細胞成分を分別する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の酵素の調製方法であって、
前記グルコースオキシダーゼの精製は、クロマトグラフ法を用いることにより前記グルコースオキシダーゼを精製する工程を含むことを特徴とする酵素の調製方法。
【請求項４３】
請求項２６に記載の方法によって調製されることを特徴とする酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、２００１年１０月２３日出願、出願番号60/335,585、名称「一つ以上の所望の特性を有するグルコースオキシダーゼ酵素の調製方法および所望の特性を有するグルコースオキシダーゼ酵素（Method For Formulating A Glucose Oxidase Enzyme With A Desired Property Or Properties And A Glucose Oxidase Enzyme With The Desired Property）」の米国仮出願により優先権を主張し、その内容はここにおける引用に含まれる。
【０００２】
本発明は一般に定向進行法（directed evolution techniques）を用いて、ある一つ以上の所望の特性を有するグルコースオキシダーゼ酵素を調製し、また特定の実施形態において、例えばセンサデバイスに用いる過酸化物耐性を有するグルコースオキシダーゼ酵素を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオセンサとマイクロエレクトロニクスの組み合わせは、携帯型の診断用医療器具の利用を可能にし、無数の人々の生活の質を改善した。病気や身体障害に苦しみ、過去には診察のために病院や医院に通わなければならなかった多くの人々が、現在は実験室設備に匹敵する精度を有する装置を用いて自宅の快適さの中で自身の診察を行う。それでもなお、バイオセンサ分野における課題が残っている。例えば、今日多くの糖尿病患者は自宅の快適さの中で診断用医療器具を用いるが、そのような装置の大部分は未だに糖尿病患者が自分自身の血を採り、自分自身のインシュリンを注射することを必要とする。採血は通常指を刺すことを必要とする。若いときに糖尿病で診断を受けた人の場合、生涯の自分で作った指の刺し傷とインシュリン注射の数は数万に達し得る。何千回もの採血とインシュリン注射は明らかに侵襲的かつ不便であり、また苦痛で精神的に消耗させる可能性がある。病気や障害を持つ人の診断の必要は、体内に埋め込まれ長期間体内にとどまることができるセンサ装置を用いることによって解決できるであろう。
【０００４】
埋め込み可能なセンサシステムの例が、参照によりここに含まれる審査中の米国特許出願第60/318,060号明細書に開示されている。その出願に記載された、埋め込み可能なタイプのセンサシステムの一例は、静脈、動脈、または埋め込み環境の所望のパラメータを感知することのできるその他のいかなる人体部分にも装入されるセンサ素子（sensing device）を含む。酵素がセンサ素子の中に入れられ、感知に利用される。例えば、生理学的パラメータの感知が所望であるときは、一つ以上の蛋白質がマトリックスとして用いられる。素子がグルコース感知素子の場合は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて、センサマトリックス蛋白質を形成することができる。例えば、グルコース感知バイオセンサにおいては、センサマトリックス蛋白質は、電気化学的に酸素を検知する一つ以上の金属電極に隣接してまたは近くに配置される。グルコースセンサ内で、グルコースオキシダーゼは、酸素を用いてグルコースをグルコン酸に変換することによって働く。
【０００５】
この反応の提案されているメカニズムを図１に示す。図１に示すように、グルコースは、酸化された形のグルコースオキシダーゼ（Ｉ）と錯形成する。この錯体は自らを、グルコン酸と、還元された形の不活性なグルコースオキシダーゼ（ＩＩaおよびＩＩb）とに変換する。この変換の詳細なメカニズムは知られていない。二つの提案されたメカニズムを図１に示す。一つのメカニズムは、フラビンアデニンジヌクレオチド補酵素（ＦＡＤ）からのハイドライド移動を含む。別のメカニズムは、グルコシド結合の形成を含む。グルコースは、活性型の還元されたグルコースオキシダーゼ（ＩＶ）を作る触媒として作用する。この活性型は次に酸素と反応し、結果的にグルコースオキシダーゼが酸化（Ｖ）される。グルコースオキシダーゼの酸化はまた、ヒドロペルオキシアダクトの生成を起こし、これは過酸化水素に変換する。この変換の結果として酸化されたグルコースオキシダーゼは不活性（ＶＩ）になる。不活性型は最終的に活性（ＶＩＩ）になり、サイクルは別のグルコース分子の反応に繰り返される。この過程の詳細なメカニズムは知られていない。
【０００６】
寿命が長く長時間安定なセンサを作ることへの障害は、グルコースオキシダーゼが（例えばセンサに用いるため）固定化されると時間が経つにつれて前記の過酸化物により酸化的不活性化を起こすことである。グルコースセンサの寿命はグルコースオキシダーゼの寿命に依存するのであるから、グルコースオキシダーゼに対する過酸化物の影響はグルコースセンサの寿命を厳しく制限しうる。過酸化物は基質またはFADのどちらかの結合に関与するアミノ酸を攻撃するので、固定化グルコースオキシダーゼは過酸化物により酸化的不活性化を起こすと信じられている。例えば、メチオニン561は、FADとグルコースオキシダーゼの結合に関与するアミノ酸である。メチオニン561は、過酸化物により容易に酸化されるので過酸化物の主要な標的となりうる。さらに、グルコースオキシダーゼは、グルコースと結合し酸素を使ってグルコン酸と過酸化物を作る。ハイドロペルオキシ付加物は、この過程におけるいくつかの中間物である。酸素および過酸化物と共にそのような付加物の存在は超酸化物ラジカルを生じる結果となり、それが事実上グルコースおよびFADの結合部を攻撃する。例えば、ヒスチジン516および559は主要な過酸化物の標的である。これらのアミノ酸は両者ともグルコースの結合に関与する。このようなアミノ酸の酸化はグルコースオキシダーゼの不活性化を生じうる。したがって、過酸化物に耐性のグルコースオキシダーゼ酵素の需要が産業界にある。そのような酵素は、その過酸化物耐性が酵素の寿命を延長し、ひいては長期間のセンサの安定性を強化し得るので、例えばグルコースバイオセンサに用いるのに適している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明の実施形態の利点は、過酸化物耐性などの所望の性質を有するグルコースオキシダーゼ酵素を調製する方法を提供することである。本発明の実施形態のさらなる利点は、応力のない環境では発生に何年もかかるのに、本発明の実施形態において発生を操作して特定の生物学的特性または酵素機能を持たせることができる。本発明の実施形態において、例えば、改善された酸化劣化耐性、改善された過酸化物耐性、または別の望ましい性質を有するグルコースオキシダーゼを調製するために、定向進行法として知られるこの技法を用いてグルコースオキシダーゼを発生させることができる。本発明の実施形態のさらなる利点は、例えば、グルコースバイオセンサに用いられる、改善された過酸化物耐性を有するグルコースオキシダーゼを調製するための方法を提供することである。本発明において提供される方法に従って調製される改善された過酸化物耐性を発揮するグルコースオキシダーゼは、それを用いたバイオセンサの寿命を、ここに提供される方法に従わないで調製されたグルコースオキシダーゼに比して改善することができる。
【０００８】
本発明の一実施形態において、一つの方法は、一つ以上のグルコースオキシダーゼ遺伝子を収得し、その一つ以上の遺伝子を用いて突然変異遺伝子のライブラリまたは変異遺伝子のライブラリを作る。突然変異のライブラリのそれぞれは、個別の発現ベクトルに装入される。各々の発現ベクトルは次いで宿主微生物に装入され、ここでその宿主微生物のコロニが成長することができ、それにより突然変異遺伝子が複製される。次いでコロニのライブラリの所望の性質を選別する。一つの実施形態において、選別操作は活性グルコースオキシダーゼへの選別、過酸化物耐性への選別、次いで機能性への選別を含む。一つの実施形態において、選別操作の後、コロニがいずれも満足でないことが分かったときは、これらのコロニの一つ以上からのグルコースオキシダーゼを突然変異させて第二世代の突然変異体ライブラリを作ることができる。次いで操作は第二世代の突然変異で再開する。別の実施形態において、好適な性質の遺伝子が得られるまで、この同じ操作を次々の世代の突然変異遺伝子に多数回繰り返してもよい。
【０００９】
本発明のもう一つの実施形態は、例えば、すべてグルコースオキシダーゼを含む微生物のライブラリに関わる。一つの実施形態において、この微生物ライブラリは、従来の培地で別個のコロニに培養される。この実施形態において、それぞれのコロニの環境は引き続いて変更される。例えば、それぞれのコロニの環境は過酸化物を導入することによって変更されてもよい。コロニの環境を変更した後に選別操作を行ってもよい。選別操作は、どのコロニが活性グルコースオキシダーゼを含むかを測定する過程を含んでもよい。環境が変更された後でも活性なグルコースオキシダーゼを含むコロニは、望ましい過酸化物耐性を有するかもしれない。活性グルコースオキシダーゼを保っているこれらのコロニからのグルコースオキシダーゼは、例えばそのグルコースオキシダーゼをセンサに固定して機能性が試験されてもよい。本発明の別の実施形態において、望めば選別操作の少なくとも一部に続いてコロニの環境をもう一度変更してもよい。例えば、一つの実施形態において、さらに過酸化物を加えてコロニの環境を変化させることにより機能性試験に進むコロニの数を減らすことができる。
【００１０】
以下の本発明の実施形態の詳細な説明を図面および添付した請求項とともに読めば、本発明の実施形態のこれらおよびその他の目的、特徴、および利点は同業者には明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の実施形態は、例えば、改良された過酸化物耐性などの特定の望ましい性質を有するグルコースオキシダーゼを調製するプロセスを目指している。本発明の実施形態は、改良された過酸化物耐性などの改良された性質を有するまたは有しないグルコースオキシダーゼを生じる強制突然変異を用いる。選別、試験またはその両者は、過酸化物耐性などの特定の望ましい性質を有する可能性のある変異した酵素の特定における補助に用いることができる。本発明の実施形態から得られる酵素は、バイオセンサなどに用いるのに好適である。これらの実施形態から得られる酵素は、センサの性能と安定性を改善するであろう。種々のバイオセンサがセンサ構造の一部として活性な酵素を利用している。本発明の実施形態は、種々の型のセンサのための活性な酵素を作るのに用いることができる。しかし、実施形態の一例において、2001年12月27日出願の同時係属米国特許出願  ”Method for Formulating And Immobilizing A Matrix Protein And A Matrix Protein For Use In A Sensor”（代理人整理番号047711-0288）に記載のように、一操作がセンサに用いられる酵素を製造する。
【００１２】
図２は、本発明の実施形態に従う、改良された過酸化物耐性を有する酵素の調製に定向進行法を利用するための方法のフローチャートダイアグラムを示す。図２に示した実施形態には、始めにいくつかのグルコースオキシダーゼ遺伝子の選別または取得が含まれる。グルコースオキシダーゼ遺伝子は例えば、イーストまたはバクテリアから取得することができる。実施形態の一例において、グルコースオキシダーゼ遺伝子はAspergillus Niger（“A.Niger”）から得られる。しかし、他の実施形態において、遺伝子はA.Niger、Penecillium funiculosum、Saccharomyces cerevisiae、escherichia coli （E.Coli）などを含むがこれに限定されない群のいずれかから得ることができる。グルコースオキシダーゼ遺伝子が他の類似のイーストまたはバクテリアからも得られることを同業者は理解するであろう。
【００１３】
次に、図２に示す実施形態例において、突然変異遺伝子または変異体のライブラリが作られる。この場合、突然変異は、継承され得る新しい形質または特徴を生じる遺伝子または染色体の乱雑な変化を意味する。突然変異種のライブラリを作る操作は、酵素の変化を意味する。突然変異は有益な遺伝子の変化でありうるが、実際に無益または有害でもありうる。これらの実施形態において、突然変異種のどれかが所望の性質を持つかどうかを必ずしも予め知ることなく突然変異種のライブラリを作ることができる。突然変異種または変異体のライブラリは、いくつかの方法のいずれかで作ることができる。例えば、突然変異種のライブラリは、変異性ポリメラーゼ連鎖反応（“変異性PCR”）、遺伝子シャフリング、およびその他の類似の方法などの方法で作ることができるが、これらに限定されない。一実施形態において、突然変異遺伝子のライブラリを作るのに変異性PCRを用いることができる。変異性PCRはPCRに比べて突然変異率が比較的高い。他の実施形態において、突然変異種のライブラリは遺伝子シャフリング法で作られる。遺伝子シャフリングの場合、変異体のライブラリは二つ以上の親遺伝子の再結合によって作られる。再結合遺伝子の連鎖は機能性酵素を生じることも生じないこともある。しかし、酵素の機能性は選別操作の間に試験される。より重要なのは、遺伝子シャフルで作った変異体ライブラリが好適な遺伝子の多様性を生じることである。
【００１４】
図５は突然変異種のライブラリを作るのに遺伝子シャフリング法を用いる定向進行法のフローダイアグラムを示す。突然変異種のライブラリの少なくとも一部が作られた後、あるいは集められた後、図２の実施形態例は、突然変異種ライブラリの変異遺伝子のそれぞれの別個の発現ベクトルへの装入を含む。一般に、遺伝子は元のあるいは親の微生物から直接ホスト微生物に移すことはできない。しかし、突然変異遺伝子をホスト微生物に導入する一つの方法は、始めに遺伝子をベクトルに導入することである。ベクトルは遺伝子をホスト微生物に運びこむことができる。したがって、実施形態例の方法のこの点において、突然変異遺伝子のそれぞれは発現ベクトルに装入することができる。
【００１５】
図２の実施形態例において、別個の発現ベクトルに装入された突然変異遺伝子のそれぞれは、別個のホスト微生物に装入される。例えば、ホスト微生物は、再結合または突然変異遺伝子を大量に複製することができる微生物を急速に再生してもよい。好適なホスト微生物の例にはE.Coli、A.Nigerその他が含まれる。当業者は他の好適なホスト微生物もまたありうることを理解するであろう。実施形態例において、E.Coliをホストバクテリアとして用いることができる。
【００１６】
その実施形態例において、それぞれの（発現ベクトル内の）突然変異種のライブラリをホスト微生物またはバクテリアに導入した後は、それぞれのホスト微生物またはバクテリアをプレートまたはトレイの別個のセルに入れることができる。これらの別個のセル内で何らかの通常の培地を用いてそれぞれのホスト微生物またはバクテリアのコロニを培養することができる。別個のセルを有するプレートまたはトレイが実施形態例で用いられるが、ホスト微生物またはバクテリアが培養できる他の好適なホルダまたは容器も使用できるであろう。例えば、別の実施形態において、それぞれのホスト微生物またはバクテリアをそれら自身の別個のプレートまたはトレイに入れることができる。
【００１７】
ホスト微生物またはバクテリアのコロニを培養した後、実施形態において選別操作が用いられる。実施形態例において、選別操作は図３に示される。始めに、選別操作にはグルコースオキシダーゼの試験が含まれる。あるコロニが遺伝子突然変異、バクテリアへの注入、および培養操作に続いて活性名グルコースオキシダーゼを生成するとは限らない。したがって、実施形態例は、ホスト微生物またはバクテリア中で培養された突然変異遺伝子が活性グルコースオキシダーゼを生成するかどうかの測定を含む。
【００１８】
あるコロニが活性グルコースオキシダーゼを含むかどうかを決める試験は、種々の方法のどれで行ってもよい。一実施形態例において、活性グルコースオキシダーゼがあるコロニ中にあるか否かの試験は、過酸化物の生成の試験が含まれる。過酸化物はグルコースオキシダーゼのグルコースとの反応で生成する。一実施形態例において、活性過酸化物の存在で変色するロイコクリスタルバイオレットが用いられる。しかし、他の実施形態において、アミノアンチピリンなどの物質も使用できるがこれに限定されない。
【００１９】
別の実施形態において、活性グルコースオキシダーゼの存在の試験に他の方法を用いることができる。例えば、活性グルコースオキシダーゼの存否は、蛍光を調べることによって確認してもよい。あるコロニの蛍光が強いほど活性グルコースオキシダーゼが含まれる可能性が大きい。別の実施形態において、グルコースオキシダーゼの存在を試験する更なる方法が本発明の展望および精神を逸脱することなく用いることができることを当業者は理解するであろう。
【００２０】
図３に示すように、あるコロニが活性グルコースオキシダーゼを含まないことが分かったなら、この方法の目的が過酸化物耐性のグルコースオキシダーゼを調製することなので、そのコロニ内のサンプルは条件を満たしていない。したがって、その実施形態例において、活性なグルコースオキシダーゼが存在するコロニについては、選別操作の次のステップに進む。活性なグルコースオキシダーゼが存在しないコロニについては操作を終了する。
【００２１】
図２に示すように、実施形態例における選別操作は、選別操作の最初の試験をパスしたコロニ内の活性なグルコースオキシダーゼが過酸化物耐性を有するか否かの判定を行う。実施形態例において、選別操作のこの部分は、それぞれの残留コロニの過酸化物中での最初の培養を含む。これは例えば、コロニを培養したトレイのセルに適量の過酸化物を加えることによって行われてもよい。別の実施形態は、他の方法で種々のコロニに適量の過酸化物を導入してもよい。例えば、過酸化物は別個のトレイまたは他の容器内で種々のコロニに添加されてもよい。
【００２２】
それぞれの残りのコロニを過酸化物と共に十分に培養した後、選別操作はグルコースオキシダーゼの活性を再検査する。特に、過酸化物培養の後、それぞれのコロニの活性グルコースオキシダーゼを上記と同様の方法で調べてもよい。したがって、それぞれの残留コロニの過酸化物中での培養の後、例えば、グルコースオキシダーゼの存在で変色するロイコクリスタルバイオレットを用いてグルコースオキシダーゼを再検査してもよい。別の実施形態は、本発明の展望と精神を逸脱することなく、活性グルコースオキシダーゼの試験の異なる方法を用いることができる。同様に、別の実施形態において、コロニは過酸化物中で培養され、グルコースオキシダーゼ活性を一回に一コロニずつまたはそれ以上試験される。換言すれば、コロニをグルコースオキシダーゼの試験ができるようになる前に、まず全てのコロニを過酸化物中で培養することは本発明にとって重要ではない。一実施形態例において、過酸化物培養操作の後、残留コロニの活性グルコースオキシダーゼ試験が陰性である場合、それらは不適合と判定される。過酸化物中で培養された後に活性グルコースオキシダーゼを保留しているコロニは、望ましい過酸化物耐性を発揮するであろう。
【００２３】
図２に示すように、望ましい過酸化物耐性を発揮する可能性のあるコロニについて、選別操作は機能性を調べる次のステップに進む。選別操作は次に、あるグルコースオキシダーゼが望ましい機能性を有するか否かの判定を行う。したがって、バイオセンサ用に酵素を調製する実施形態において、あるグルコースオキシダーゼ酵素がセンサ素子中で働くか否かの試験が行われてもよい。実施形態例において、選別操作のこの部分は一般に、それぞれの残留コロニからのグルコースオキシダーゼの抽出を必要とする。実施形態例において、グルコースオキシダーゼは精製カラムを用いてコロニから抽出されてもよい。本発明の別の実施形態において、コロニからグルコースオキシダーゼを抽出する他の方法があることを当業者は理解するであろう。
【００２４】
別の実施形態において、あるグルコースオキシダーゼ酵素の機能性を評価する方法は以下のように進行することができる。始めに細胞融解、すなわちソースからの蛋白質の除去は、ホモジナイザ中で穏やかに細砕することによって達成される。これはまた超音波による破砕で達成することができる。別の実施形態は、ソースから蛋白質を除去する別の方法を採用してもよい。次に、細胞成分について遠心分離法および溶解度差を用いる分画を行ってもよい。次に蛋白質を標準クロマトグラフィ法を用いて精製してもよい。次に抽出した酵素は特徴付けられてもよい。これは抽出物の活性と濃度を測定することによって行われてもよい。酵素は十分に単離された後固定化され、センサ内に設置されてもよい。次にセンサを加速試験環境に入れて、特定の酵素が真に機能的であるかまたはセンサ素子に用いるのに適しているかを調べてもよい。センサ内での酵素の試験の結果が満足であれば、試験を終了することができる。培養期間の後、過酸化物耐性グルコースオキシダーゼを出す全てのコロニについて試験を繰り返してもよい。
【００２５】
別の実施形態において、この試験は、他の要因または特徴に応じたこれらのコロニの小集団について行われる。選別操作の後、満足なグルコースオキシダーゼ酵素が確認されなければ、図２に示す実施形態において、別の世代の突然変異遺伝子を作ることによって操作を続けてもよい。図２の実施形態例において、全サイクルを望みの回数だけ繰り返してもよい。
【００２６】
過酸化物耐性の酵素を調製するプロセスの別の実施形態を図４に示す。図４に示す実施形態例は、強制突然変異法を採用する。この実施形態において、PCRまたは遺伝子シャフリングの代わりに、微生物を厳しい環境にさらすことによって突然変異種を作ってもよい。図４の実施形態は始めに、A.Niger、penecillium、E.Coli、またはその他の好適な微生物などの微生物を得ることを含む。この実施形態は上述のように最終的に突然変異種のライブラリを作るので、微生物はプレートまたはトレイの多重セル内に置いてもよい。他の実施形態は、微生物が個別のコロニ内に置かれる限り、微生物を培養する別の種類のホルダまたは容器を用いることができる。本発明の別の実施形態は、単一のセルまたはコロニを用いてもよい。
【００２７】
次に、この実施形態は、いくつかの微生物を入れたセルの各々に培地を加えることを含む。培地は、微生物を養うことができるいかなる通常の培地でもよい。図４の実施形態は、次に分割された微生物のそれぞれの環境を変えることを含む。増強された過酸化物耐性を有するグルコースオキシダーゼ酵素の調製が目的である実施形態において、微生物の環境は、各コロニに適量の過酸化物を加えることによって変えてもよい。この実施形態例において、微生物の環境への過酸化物の導入は非常にゆっくり行われる。別の実施形態において、微生物の環境への過酸化物の導入はより突然に行われてもよい。
【００２８】
図４の実施形態は次に選別操作を含む。種々のコロニの環境に過酸化物を加えた後、どのコロニがまだ生きているかを決めるために選別操作を行ってもよい。この実施形態において、上述の試験は、各コロニ内のグルコースオキシダーゼの活性が保持されているかどうかを調べるために行ってもよい。他の実施形態は、あるコロニが活性なグルコースオキシダーゼを含むかどうかを調べるための他の方法を用いてもよい。操作のこの点において、活性なグルコースオキシダーゼを有するコロニの数が、センサ素子内でのグルコースオキシダーゼの試験に進むまでになっているかどうかを評価してもよい。残留コロニの数が有効であるか否かは多くの要因に依存し、本発明の異なる実施形態について変化する。センサ素子の試験に進むには残留コロニの数が多すぎると判定されたなら、より多くの過酸化物を徐々に加えて環境をより厳しくしてもよい。この実施形態において、必要なだけこのサイクルを繰り返すことにより、環境を継続的かつ徐々に厳しくして生存可能なあるいは活性なコロニの有効な数のみが残るようにしてもよい。
【００２９】
図４の実施形態例において、プロセスが有効な数の活性グルコースオキシダーゼを有する残留コロニを生じた後、プロセスは機能性評価のためにセンサ素子内のグルコースオキシダーゼの試験に進むことができる。望ましい過酸化物耐性を有する残留コロニには上述の機能性の試験を行ってもよい。その実施形態例において、この試験は、酵素からグルコースオキシダーゼを抽出し、センサ内にこのグルコースオキシダーゼを組み込み、次いで酵素の機能性確認のためセンサの加速試験を行うことにより、行われてもよい。
【００３０】
ここに開示する実施形態は、全ての観点において本発明を説明するものであって、本発明を制限するものでないと考えるべきである。本発明の展望はこれまでの記述よりむしろ、添付する請求項に示される。請求項の意味および均等性の範囲内のすべての変更は、したがってこの中に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】グルコースオキシダーゼ反応連鎖のフローダイアグラムを示す図である。
【図２】定向進行法を用いて改良された過酸化物耐性を有する酵素を調製する方法の実施形態のフローチャートダイアグラムを示す図である。
【図３】改良された過酸化物耐性を有する酵素を調製する方法の実施形態に用いられる選別操作のフローチャートを示す図である。
【図４】定向進行法を用いて改良された過酸化物耐性を有する酵素を調製する方法の別の実施形態のフローチャートを示す図である。
【図５】遺伝子シャフリングを利用する本発明の一つの実施形態に従う定向進行法操作のフローを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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