(57)【要約】複数のDNA結合ドメインを含む転写調節ポリペプチドが提供される。このポリペプチドは任意に、1個又は複数の転写調節ドメインを含む。このポリペプチドをコードするポリヌクレオチド並びにこのポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
5〜50個のアミノ酸残基配列を有する可変性ペプチドリンカーに機能的に連結された複数のDNA結合ドメインを含む、天然に存在しない転写因子ポリペプチド。
【請求項２】
2又は3個のDNA結合ドメインを含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
リンカーが、5〜30個のアミノ酸残基を有する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
リンカーが、5〜15個のアミノ酸残基配列を有する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項５】
更に転写調節因子を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項６】
転写調節因子が、転写を抑制する、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項７】
転写調節因子が、転写を活性化する、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項８】
転写調節因子が、ポリペプチドのN-末端に位置する、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項９】
転写調節因子が、ポリペプチドのC-末端に位置する、請求項5記載のポリペプチド。
【請求項１０】
更に複数の転写調節因子を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１１】
各DNA結合ドメインが、3〜6個のジンクフィンガーDNA結合ペプチドを含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１２】
各DNA結合ドメインが、6個のジンクフィンガーDNA結合ペプチドを含む、請求項11記載のポリペプチド。
【請求項１３】
更に1個又は複数の転写調節ドメインを含む、請求項12記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項1記載のポリペプチドをコードしている、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項14記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項14記載のポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞。
【請求項１７】
結合モチーフを含むヌクレオチド配列の発現を変更する方法であって、結合モチーフと、このモチーフに結合する請求項1記載のポリペプチドの有効量とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項１８】
第一の結合モチーフを含む第一のヌクレオチド配列及び第二の結合モチーフを含む第二のヌクレオチド配列の発現を同時に変更する方法であって、結合モチーフと、第一及び第二の両方の結合モチーフに結合する請求項1記載のポリペプチドの有効量とを接触させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、2002年6月11日に出願された、米国特許仮出願第60/388,055号の一部継続出願であり、これは本願明細書に参照として組入れられている。
【０００２】
発明の技術分野
本発明の分野は、遺伝子転写である。より詳細に述べると、本発明は、1個又は複数の遺伝子内の異なる標的ヌクレオチド配列に対する複数のDNA結合ドメインを含む、遺伝子転写調節ポリペプチドを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
人工的転写因子の構築体に、過去数年にわたり大きな関心が寄せられている。遺伝子発現は、調節ドメインに融合されたポリダクチル(polydactyl)ジンクフィンガー蛋白質により、特異的に調節することができる(例えば、米国特許第6,242,568号；第6,140,466号；及び、第6,140,081号参照、これらの開示は本願明細書に参照として組入れられている。)。
【０００４】
Cys2-His2ファミリーのジンクフィンガードメインは、それらのモジュラー構造のために、人工的転写因子の構築に関して最も嘱望されている。各ドメインは、およそ30個のアミノ酸からなり、並びに疎水性相互作用及び保存されたCys2-His2残基による亜鉛イオンのキレート化により安定化されたββα構造に折り畳まれている。現在まででこのジンクフィンガー蛋白質ファミリーの最も良く特徴付けられた蛋白質は、マウス転写因子Zif268である[Pavletichら、Science、252(5007): 809-817 (1991)；Elrod-Ericksonら、Structure、4(10): 1171-1180 (1996)]。Zif268/DNA複合体の分析は、DNA結合が、位置-1、3及び6でのα-ヘリックスのアミノ酸残基の、各々、3bp DNAサブサイトの3'側、中間、及び5'側ヌクレオチドとの相互作用により主に実現されることを示唆している。位置1、2及び5は、DNAリン酸骨格への直接的又は水が媒介した接触を生じることが示されている。ロイシンは、通常4位に認められ、及びこのドメインの疎水性コアへパック(pack)している。α-ヘリックスの2位は、他のヘリックス残基と相互作用することが示されており、加えて、3bpサブサイトの外側のヌクレオチドとの接触を形成することができる[Pavletichら、Science、252(5007): 809-817 (1991)；Elrod-Ericksonら、Structure、4(10): 1171-1180 (1996)；Isalan, M.ら、Proc Natl Acad Sci USA、94(11): 5617-5621 (1997)]。
【０００５】
ジンクフィンガーDNA結合ドメインは、ヒト又はいずれか他のゲノム内に特有である伸長された18bp DNA配列を認識するジンクフィンガー蛋白質へ集成することができる。加えてこれらの蛋白質は、転写因子として機能し、及び調節ドメインに融合された場合に、遺伝子発現を変更することが可能であり、並びに核ホルモン受容体のリガンド-結合ドメインへの融合により、ホルモン依存性を形成することさえできる。しかし現在までのところ、1個又は複数のジンクフィンガー結合ドメインを含むポリペプチドは、単独の遺伝子を標的化するか、又は単独の転写調節ドメインを含むかである。従って当該技術分野において、1種よりも多い遺伝子を標的化するために使用することができる、又は転写調節ドメインを1種よりも多く含む転写調節するポリペプチドが必要とされている。
【０００６】
本発明の開示は、複数のDNA結合ドメイン及び1個又は複数の転写調節ドメインを含むポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドを使用し、1種よりも多い標的遺伝子の転写を調節するか、又は単独の遺伝子の活性化もしくは抑制を増強することができる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の簡単な概要
本発明は、互いに機能的に連結された複数のDNA結合ドメイン(DNB)を含む天然に存在しない人工的転写因子ポリペプチドを提供する。このDNA結合ドメインは、同じ又は異なるヌクレオチド配列に互いに独立して結合する。このポリペプチドは更に、1個又は複数の転写調節ドメインを含み、その各々は、DNA結合ドメインのひとつに機能的に連結されている。
【０００８】
これらの異なるヌクレオチド配列は、同じ遺伝子又は異なる遺伝子の転写制御領域に位置している。ヌクレオチド配列が、単独の遺伝子の転写制御領域に位置している場合は、このようなヌクレオチド配列は、互いに少なくとも10個の塩基対により分離されている。このポリペプチドは、2個又はそれよりも多いDNA結合ドメイン(DNB)を含む。ひとつの態様において、ポリペプチドは、2又は3個のDNA結合ドメインを含む。各DNA結合ドメインは、好ましくは、3〜6個のジンクフィンガーペプチド、及びより好ましくは6個のジンクフィンガーペプチドを含む。
【０００９】
このDNA結合ドメインは、5〜50個のアミノ酸残基、好ましくは5〜40個のアミノ酸残基、より好ましくは5〜30個のアミノ酸残基、及び更により好ましくは5〜15個のアミノ酸残基のアミノ酸残基配列と互いに機能的に連結されていることが好ましい。
【００１０】
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びそのようなポリヌクレオチド又は発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００１１】
更に別の局面において、本発明は、遺伝子転写を調節する方法を提供する。ひとつの態様において、本発明は、細胞における複数のDNA標的遺伝子の転写を同時に調節することに関する。このような方法は、その各々においてDNA結合ドメインが異なるDNA標的遺伝子の転写制御領域においてヌクレオチド配列に特異的に結合するような、複数の機能的に連結されたDNA結合ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドで細胞を形質転換する工程、及びこのポリペプチドの発現に十分な条件下及び十分な期間細胞を維持する工程を含む。第二の態様において、方法は、単独遺伝子の転写を調製することに関する。このような方法は、その各々においてDNA結合ドメインがDNA標的遺伝子の転写制御領域において異なるヌクレオチド配列に結合するような、複数の機能的に連結されたDNA結合ドメインを有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドで細胞を形質転換する工程、及びこのポリペプチドの発現に十分な条件下及び十分な期間細胞を維持する工程を含む。好ましくは、本発明の方法は、1個又は複数の転写調節するドメインも含むポリペプチドを使用する。
【００１２】
発明の詳細な説明
I.本発明
本発明は、遺伝子転写の調節に有用な天然に存在しない転写因子ポリペプチド、このようなポリヌクレオチドをコードしているポリヌクレオチド、並びに遺伝子転写の調節におけるこのようなポリペプチド及びポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００１３】
II.ポリペプチド
本発明は、複数のDNA結合ドメイン(DNB)を含む天然に存在しないポリペプチドを提供し、その結合ドメインは、ジンクフィンガーDNA結合ペプチドに由来している(図1参照)。本発明のポリペプチドは、天然に存在しない。本願明細書において使用される用語「天然に存在しない」とは、例えば、下記の1種又は複数を意味する：(a)天然に存在しないアミノ酸配列で構成された、ポリペプチド；(b)それが天然に存在するようにそのポリペプチドに会合しない天然に存在しない二次構造を有する、ポリペプチド；(c)そのポリペプチドが天然に存在する生物の種と通常は会合しない1個又は複数のアミノ酸を含む、ポリペプチド；(d)その立体異性体は、それが天然に存在するようにはそのポリペプチドと会合しないポリペプチドを含む1個又は複数のアミノ酸の立体異性体を含む、ポリペプチド；(e)天然のアミノ酸のひとつ以外の化学部分を1個又は複数含む、ポリペプチド；又は、(f)天然に存在するアミノ酸配列の単離された部分(例えば、切断された配列)。本発明のポリペプチドは、夾雑物質を実質的に含まない、単離及び精製された形で存在する。ポリペプチドは、現実には合成することができる。すなわちこのポリペプチドは、当該技術分野において周知の技術を用い、天然の給源から単離及び精製されるか、もしくは新規に作成される。本発明のポリペプチドは、様々な当該技術分野において周知の標準技術を用いて作成することができる。
【００１４】
ポリペプチドのアミノ酸残基は、標準の1又は3-文字コードを用いて、本願明細書において発現される(下記表1参照)。
【００１５】
表1
2006513694.tif 000002
【００１６】
ある種の態様において、ポリペプチド変種は、保存的に置換されたアミノ酸残基を含む。各アミノ酸置換は、関心のあるアミノ酸の、下記表2に列記したような、類似のアミノ酸(複数)の群からのアミノ酸との置換により作成されることが好ましい。(Biochemistry、第3版、Stryer、Freeman Publisher社(1988)、16-40頁、本願明細書に参照として組入れられている。)。
【００１７】
表2を参照し、例えばある態様において、所望のポリペプチドのGアミノ酸残基は、A、V、L、又はIにより置換される。別の例において、所望のポリペプチドのN残基は、D、E、又はQにより置換される。一般に、オープンリーディングフレームの第一のアミノ酸(又は基礎となる(underlying)ポリヌクレオチドのコドン)は、メチオニンである。
【００１８】
表2
保存的置換の好ましいアミノ酸群
2006513694.tif 000003
【００１９】
本ポリペプチドのDNA結合ドメインは、当該技術分野において周知であるジンクフィンガーDNA結合ペプチドに由来するか又はそれから単離されている。好ましくは、ジンクフィンガーDNA結合ペプチドは、Cys2-His2型ジンクフィンガーに由来している。ジンクフィンガーDNA結合ペプチド誘導体は、切断もしくは伸長により、又は位置指定突然変異誘発のプロセスによる野生型-由来のペプチドの変種として、又はこれらの手法の組合せにより、野生型ジンクフィンガー蛋白質に由来するかもしくはこれから生成することができる(例えば、米国特許第6,242,568号；第6,140,466号；及び、第6,140,081号参照、これらの開示は本願明細書に参照として組入れられている。)。用語「切断された」とは、未変性のジンクフィンガー結合蛋白質において認められたジンクフィンガーの完全数よりも少ないものを含むか、又は望ましくない配列が欠失されている、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドを意味する。例えば、天然には9個のジンクフィンガーを含むジンクフィンガー-ヌクレオチド結合蛋白質TFIIIAの切断は、1個から3個のジンクフィンガーのみを伴うポリペプチドであることができる。伸長は、追加のジンクフィンガーモジュールが追加されているような、ジンクフィンガーポリペプチドを意味する。例えば、TFIIIAは、3個のジンクフィンガードメインの添加により、12個のフィンガーに延長することができる。
【００２０】
加えて、切断されたジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドは、1種よりも多い野生型ポリペプチドからのジンクフィンガーモジュールを含んでもよく、その結果、「ハイブリッド」ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドを生じる。用語「突然変異誘発された」とは、蛋白質をコードしているDNAのランダム突然変異誘発又は位置指定突然変異誘発を実現するために公知の方法のいずれかを行うことにより得られるジンクフィンガー由来のヌクレオチド結合ポリペプチドを意味する。例えば、TFIIIAにおいて、突然変異誘発は、コンセンサス配列の1個又は複数の反復単位の保存されない残基との置換により実現することができる。切断型ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合蛋白質も、突然変異誘発することができる。ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合モチーフのヌクレオチド配列の機能を阻害するために、本発明に従い切断、伸長及び／又は突然変異誘発することができる公知のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドの例は、TFIIIA及びZif268を含む。他のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合蛋白質は、当業者に公知であろう。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、複数のDNA結合ドメインを含む。好ましくは、このポリペプチドは、2〜10個のこのようなドメインを、より好ましくは2〜5個のこのようなドメインを、及び最も好ましくは2又は3個のこのようなドメインを含む。このDNA結合ドメインは、互いに機能的に連結されている。「機能的に連結された」とは、各DNA結合ドメインの構造及び機能は、いずれか他のこのようなドメインの連結により影響を受けないことを意味する。ひとつの態様において、DNA結合ドメインは、周知のペプチド連結を介して、一緒に直接連結又は結合される。別の態様において、DNA結合ドメインは、5〜50個のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを用い、機能的に連結されている。好ましくはこのリンカーは、5〜40個のアミノ酸残基、より好ましくは5〜30個のアミノ酸残基、及び更により好ましくは5〜15個のアミノ酸残基を含む。これらのリンカーは、好ましくは可変性（flexible）である。このようなリンカーの例を、以下に示す：
リンカー1：TGEKP(配列番号:1)
リンカー2：PGGGGSGGGGTGSSRSSSTGEKP(配列番号:2)
リンカー3：PGSSGGGGSGGGGGGSTGGGSGGGGTGSSRSSSTGEKP(配列番号:3)
リンカー4：TGGGGSGGGGTGEKP(配列番号:4)
【００２２】
本発明の転写因子ポリペプチドが、2個のDNA結合ドメインを含む場合、これらのドメインに単独のリンカーが機能的に連結している。2個よりも多いDNA結合ドメインが存在する場合、リンカーは各結合ドメインを機能的に連結するために使用される。このような態様において、同じ又は異なるリンカーを、各連結位置で使用することができる。
【００２３】
本転写因子において使用されるDNA結合ドメインは、天然に存在するか又は天然に存在しないことができる。天然に存在するジンクフィンガーDNA結合ドメインは、当該技術分野において周知である。好ましい態様において、本転写因子の少なくとも1種のDNA結合ドメインは、天然に存在しない。これらのDNA結合ドメインの各々は、式5'-NNN-3'に相当するヌクレオチド標的配列に特異的に結合するようにデザインされ及び作成されることが好ましく、ここでNはいずれかのヌクレオチド(すなわち、A、C、G又はT)である。このようなDNA結合ドメインは、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,242,568号、第6,140,466号及び第6,140,081号を参照し、これらの開示は本願明細書に参照として組入れられている。)。本発明のジンクフィンガーDNA結合ペプチドは、このペプチドのα-ヘリックスドメイン内に独自のヘプタマー(7個のアミノ酸残基のコンティグ配列)を含み、このヘプタマー配列は、標的ヌクレオチドに対する結合特異性を決定する。このヘプタマー配列は、α-ヘリックスドメイン内のどこかに位置することができるが、このヘプタマーは、当該技術分野において慣習的に番号付けられた残基の-1位から6位へと伸びることが好ましい。ペプチドは、ジンクフィンガーペプチドの一部として機能するための当該技術分野において公知のβ-シート配列及びフレームワーク配列を含むことができる。
【００２４】
先に本発明者らは、マウス転写因子Zif268の変種であるC7を基にしたファージディスプレイ選択により単離され及び位置指定突然変異誘発により純化された、5'-GNN-3'型DNA配列を各々特異的に認識する16個のジンクフィンガードメインの特徴を報告した[米国特許第6,140,081号、その開示は本眼明細書に参照として組入れられている。]。簡単に述べると、ジンクフィンガー蛋白質のファージディスプレイライブラリーを作成し、配列特異性蛋白質の濃厚化に好ましい条件下で選択した。多くの配列を認識するジンクフィンガードメインは、ファージ選択データ及び構造情報の両方により導かれた位置指定突然変異誘発による純化が必要であった。類似のシステムは、5'-TNN-3'型DNA配列を認識するドメインを同定するために使用される。
【００２５】
人工的転写因子の構築のためのジンクフィンガードメインの利用可能性を拡大するために、5'-ANN-3'型及び5'-CNN-3'型のDNA配列を特異的に認識するドメインが選択されている。簡単に述べると、フィンガー2位置においてトリプレット5'-GAT-3'に高い特異性で結合し、C7のフィンガー1及び2並びにフィンガー-3位置に5'-GAT-3'-認識ヘリックスを含むことを特徴とするヘリックスTSG-N-LVR(配列番号:5)を、多-標的ELISAにより、当初のC7蛋白質と比較され、異なるフィンガー-2サブサイトを標的とするDNA-結合特異性について分析された[例えば、Dreier, B.ら、J Biol Chem、8月3日；276(31): 29466-78 (2001)]。
【００２６】
本発明のポリペプチドは更に、1個又は複数の転写調節ドメインを含むことができる。転写調節ドメインは、当該技術分野において周知であるように、活性化ドメイン又は抑制ドメインであることができる。抑制ドメインペプチドの例は、ets2リプレッサー因子(est2 repressor factor (ERF))のアミノ酸473〜530により定義される、ERF抑制ドメイン(ERD)である(Sgouras, D. N.、Athanasiou, M. A.、Beal, G. J. Jr.、Fisher, R. J.、Blair, D. G.及びMavrothalassitis, G. J.、EMBO J.、14: 4781-4793 (1995))。このドメインは、etsファミリーの転写因子の活性に対するERFの拮抗作用を媒介する。第二のリプレッサー蛋白質は、KruEpel-asociated box(KRAB)ドメインを用い調製される(Margolin, J. F.、Friedman, J. R.、Meyer, W., K.-H.、Vissing, H.、Thiesen, H.-J.及びRauscher III, F. J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91:4509-4513 (1994))。この抑制ドメインは、ジンクフィンガー蛋白質のN-末端に共通して認められ、RINGフィンガー蛋白質KAP-1との相互作用により(Friedman, J. R.、Fredericks, W. J.、Jensen, D. E.、Speicher, D. W.、Huang, X.-P.、Neilson, E. G.及びRauscher III, F. J.、Genes & Dev.、10: 2067-2078 (1996))、おそらく距離-及び方向-非依存式にTATA-依存型転写に対するその抑制活性を発揮するであろう(Pengue, G.及びLania, L.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:1015-1020 (1996))。本発明者らは、ジンクフィンガー蛋白質KOX1のアミノ酸1〜97の間に認められたKRABドメインを利用した(Margolin, J. F.、Friedman, J. R.、Meyer, W., K.-H.、Vissing, H.、Thiesen, H.-J.及びRauscher III, F. J.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91: 4509-4513 (1994))。この場合、ジンクフィンガーポリペプチドとのN-末端融合体が構築される。最後に、抑制のためのヒストン脱アセチル化の有用性を調べるために、Mad mSIN3相互作用ドメイン(interaction domai)(SID)のアミノ酸1〜36がジンクフィンガー蛋白質のN-末端に融合される(Ayer, D. E.、Laherty, C. D.、Lawrence, Q. A.、Armstrong, A. P.及びEisenman, R. N.、Mol. Cell. Biol.、16: 5772-5781 (1996))。この小さいドメインは、転写因子MadのN-末端で認められ、並びにmSIN3と相互作用することによりその転写抑制の媒介を引き起こし、これは次にコ-リプレッサーN-CoR及びヒストン脱アセチル化酵素mRPD1と相互作用する(Heinzel, T.、Lavinsky, R. M.、Mullen, T.-M.、Ssderstrsm, M.、Laherty, C. D.、Torchia, J.、Yang, W.-M.、Brard, G.、Ngo, S. D.ら、Nature、387: 43-46 (1997))。遺伝子-特異的活性化を試験するために、転写アクチベーターが、ジンクフィンガーポリペプチドの単純ヘルペスVP16蛋白質のアミノ酸413〜489への融合(Sadowski, I.、Ma, J.、Triezenberg, S.及びPtashne, M.、Nature、335: 563-564 (1988))、又はVP64と称されるVP16の最小活性化ドメインの人工的テトラマー反復単位への融合(Seipel, K.、Georgiev, O.及びSchaffner, W.、EMBO J.、11: 4961-4968 (1992))により作成される。転写調節ドメインは、結合ドメインのN-又はC-末端のいずれかで、 DNA結合ドメインに機能的に連結することができる。
【００２７】
転写調節ドメインが存在する場合、これは、本ポリペプチドのN-もしくはC-末端のいずれか、及びDNA結合ドメインとリンカーに隣接するか又はその間に位置することができる(図2参照)。本発明のポリペプチドは、1個又は複数の転写調節ドメインを含むことができる。複数の転写調節ドメインが存在する場合、各ドメインは同じ又は異なることができる。同様に、単独のポリペプチドは、抑制及び活性化ドメインの両方を含むことができる。図2は、2個のDNA結合ドメイン及び1個の抑制ドメインもしくは1個の活性化ドメインのいずれか、又はそのような抑制及び活性化ドメインの組合せを含む本発明の例証的ポリペプチドを示している。
【００２８】
III. ポリヌクレオチド及び発現ベクター
本発明は、ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。未変性の、切断され及び伸長されたポリペプチドを含む、本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードしているDNA配列は、いくつかの方法で得ることができる。例えば、このDNAは、当該技術分野において周知のハイブリダイゼーション手法を用い単離することができる。これらは以下を含むが、これらに限定されるものではない：
(1)共有されたヌクレオチド配列を検出するための、ゲノム又はcDNAライブラリーへのプローブのハイブリダイゼーション；(2)共有された構造的特徴を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニング；及び、(3) ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による合成。本発明のRNA配列は、当該技術分野において公知の方法により得ることができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編集、1989年参照)。
【００２９】
本発明のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合ポリペプチドをコードしている特異的DNA配列の開発は、以下により得ることができる：(1)ゲノムDNAから二本鎖DNA配列の単離；(2)関心のあるポリペプチドに必要なコドンを提供するための、DNA配列の化学的製造；及び、(3)真核ドナー細胞から単離されたmRNAの逆転写による、二本鎖DNA配列のin vitro合成。後者の場合、一般にcDNAと称されるmRNAの二本鎖DNA相補体が実質的に形成される。組換え手法において使用するための特異的DNA配列を開発するこれら3種の方法の、ゲノムDNAの単離は、最も一般的でない。これは特に、イントロンの存在に起因した哺乳類ポリペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合に該当する。
【００３０】
ジンクフィンガー由来のDNA結合ポリペプチドを得るためのDNA配列の合成は、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が公知である場合の選択法であることが多い。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が不明である場合には、DNA配列の直接合成は不可能であり、この場合の選択法は、cDNA配列の形成である。中でも関心のあるcDNA配列を単離する標準手法は、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞において豊富であるmRNAの逆転写に由来するプラスミド-保持するcDNAライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と組合せて使用される場合、例え稀な発現産物であってもクローニングすることができる。このポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分が既知であるようなこれらの場合において、標的cDNAに存在すると推定される配列を複製する標識された一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAプローブ配列の作成には、一本鎖型に変性されているcDNAのクローニングされたコピーについて実施されるDNA/DNAハイブリダイゼーション手法を用いることができる(Jayら、Nucleic Acid Research、11:2325 (1983))。
【００３１】
IV. 医薬組成物
別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを治療有効量、又はそのようなポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を治療有効量、医薬として許容できる担体と組合せて含有する医薬組成物を提供する。
本願明細書において使用される用語「医薬として許容できる」、「生理的に忍容性がある」及びそれらの文法上の変形は、それらが組成物、担体、希釈剤及び試薬について言及される場合は互換的に使用され、並びにそれらの物質が、本組成物の投与を禁止する程度であるような悪心、眩暈、胃の不調などのような望ましくない生理的作用を生じることなくヒトへ又はヒトに投与が可能であることを表す。
【００３２】
その中に溶解又は分散された活性成分を含有する医薬組成物の調製は、当該技術分野において良く理解されている。典型的にはこのような組成物は、液体の液剤又は懸濁剤、水性又は非水性のいずれかの滅菌注射剤として調製されるが、しかしながら、使用前に液体である液剤又は懸濁剤とするのに適した固形剤形も調製される。この調製物は、乳化することもできる。
【００３３】
この活性成分は、医薬として許容でき及び活性成分と相溶性のある賦形剤と、本願明細書に説明された治療的方法において使用するのに適している量で混合することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及びそれらの組合せである。加えて、望ましいならば、この組成物は、湿潤剤又は乳化剤、更には活性成分の有効性を増強するpH緩衝剤などのような佐剤を少量含有することができる。
【００３４】
本発明の治療的医薬組成物は、その中の成分の医薬として許容できる塩を含有することができる。医薬として許容できる塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸により、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により、形成される酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される)を含む。遊離のカルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第２鉄の水酸化物などの無機塩基、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来することもできる。
【００３５】
生理的に忍容性のある担体は、当該技術分野において周知である。液体担体の例は、活性成分及び水に加えていかなる物質も含有しないか、又は生理的pH値でのリン酸ナトリウム、生理的食塩水もしくは両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液を含有する滅菌水溶液である。更に依然として、水性担体は、1種よりも多い緩衝液の塩、更には塩化ナトリウム及び塩化カリウム、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及び他の溶質のような塩類を含有することもできる。液体組成物は更に、水に加えた及び水を排除した液相を含有することもできる。このような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油、オレイン酸エチルのような有機エステル、及び油中水型乳剤である。
【００３６】
V. 用途
ひとつの態様において、本発明の方法は、結合モチーフを含むヌクレオチド配列の発現を変調(阻害又は抑制)するプロセスを含み、この方法は、結合モチーフを、このモチーフに結合する対象ポリペプチドの有効量と接触する工程を含む。この結合モチーフは、好ましくは標的遺伝子の転写制御領域に位置している。転写制御領域は、転写を調節することに関連した遺伝子のいずれかの領域である。このような領域の例はプロモーターである。ヌクレオチド配列がプロモーターである場合、この方法は、ジンクフィンガー-DNA結合モチーフを含む遺伝子の転写トランス活性化を阻害することを含む。用語「阻害する」は、例えばジンクフィンガー-ヌクレオチド結合モチーフを含む構造遺伝子の転写の活性化のレベルを抑制することを意味する。加えて、遺伝子転写調節ポリペプチドは、構造遺伝子内又はRNA配列内のモチーフに結合することができる。
【００３７】
用語「有効量」は、先に活性化されたプロモーターの非活性化を生じる量もしくはジンクフィンガー-ヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの不活性化を生じる量、又は構造遺伝子転写又はRNA転写をブロックする量を含む。必要とされる遺伝子転写調節ポリペプチドの量は、存在する蛋白質／プロモーター複合体中の未変性のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合蛋白質をいずれか置換するために必要な量、又は未変性のジンクフィンガー-ヌクレオチド結合蛋白質と競合し、プロモーターそれ自身と複合体を形成するために必要な量である。同様に、構造遺伝子又はRNAをブロックするために必要な量は、各々、RNAポリメラーゼに結合し、及びその遺伝子を通じての読取りをブロックする量、又は翻訳を阻害する量である。好ましくはこの方法は、細胞内で行われる。プロモーター又は構造遺伝子の機能的不活性化により、転写又は翻訳は抑制される。ジンクフィンガー-ヌクレオチド結合蛋白質モチーフを含む細胞ヌクレオチド配列との結合又は「接触」のための有効量の阻害蛋白質の送達は、レトロウイルスベクター又はリポソームによるような、本願明細書に記載された機構、又は当該技術分野において周知のその他の方法のひとつにより実現することができる。
【００３８】
用語「変調する」は、機能の抑制、増強又は誘導を意味する。例えば、本発明の遺伝子転写調節ポリペプチドは、そのプロモーター内のモチーフへの結合により、プロモーター配列を変調することができ、これによりプロモーターヌクレオチド配列に機能的に連結された遺伝子の転写を増強又は抑制する。あるいは変調は、遺伝子転写調節ポリペプチドが、構造遺伝子に結合し及びDNA依存型RNAポリメラーゼをその遺伝子を通じての読取りからブロックするような遺伝子転写の阻害を含むことができる。この構造遺伝子は、例えば、正常細胞遺伝子又は癌遺伝子であってよい。あるいは、変調は、転写産物の翻訳の阻害を含むことができる。
【００３９】
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造遺伝子に対し5'側に存在する調節エレメントを含む。遺伝子が活性化される場合は、転写因子として知られている蛋白質は、その遺伝子のプロモーター領域に結合する。この集成体は、酵素がDNAからRNAへ第二の遺伝的セグメントに転写することを可能にすることにより、「スイッチオン(on switch)」に似ている。ほとんどの場合において、得られるRNA分子は、特異的蛋白質の合成の鋳型として利用され；時には、RNAそれ自身が最終生成物である。
【００４０】
このプロモーター領域は、正常細胞プロモーターであるか、又は例えば、腫瘍特異的-プロモーター(onco-promoter)であることができる。腫瘍特異的-プロモーターは一般に、ウイルス由来のプロモーターである。例えば、レトロウイルスの末端反復配列(LTR)は、本発明のジンクフィンガー結合ポリペプチド変種の標的であることができるプロモーター領域である。ヒトT-リンパ球向性ウイルス(HTLV)1及び2、又はヒト免疫不全ウイルス(HIV)1もしくは2のように病原性のものを含む、レンチウイルス群のメンバー由来のプロモーターは、本発明のポリペプチドによる転写の変調を標的化することができるウイルスプロモーター領域の例である。
【００４１】
下記実施例は、本発明のポリペプチドの利用が、特定の遺伝子産物をコードしているポリヌクレオチドの発現を変更することを示している。これらの実施例は、本発明の具体的態様を表わしており、及び決して本願明細書及び／又は特許請求の範囲を限定するものではない。
【００４２】
実施例1：転写因子ポリペプチド
特定の遺伝子を標的化する一連の転写因子ポリペプチドを作成し、及び遺伝子産物の発現を変更するために使用した。E2c及びE2xは、融合蛋白質として両方向にerbB2発現を調節するエフェクタードメインvp64及びSKDを伴う、erbB2遺伝子の転写後及び翻訳前領域において結合する6個のフィンガー蛋白質である[Beerli, R.ら：PNAS、95:14628-14633(1998)；及び、Dreier, B.ら：J Biol Chem、8月3日；276(31):29466-78(2001)]。E3及びE3Yは、融合蛋白質として両方向にerbB3発現を調節するエフェクタードメインvp64及びSKDを伴う、erbB3遺伝子の転写後及び翻訳前領域において結合する6個のフィンガー蛋白質である[Beerli, R.ら：PNAS、95:14628-14633(1998)；及び、Dreier, B.ら：J Biol Chem、8月3日；276(31):29466-78(2001)]。例証的ポリペプチドを、そのポリペプチドのDNA標的配列と共に以下に記す。6個のフィンガー蛋白質は、他所に説明されたように作成した(Segal, Dら：PNAS、96: 2758-2763 (1999))。
【００４３】
E2cJ15E3Y
MAQAALEPGEKPYACPECGKSFSRKDSLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTHTGGGGSGGGGTGEKPYACPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQLAHLRAHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALRVHQRTHTGKKTSGQAG (配列番号:6)
DNA標的配列：E2c：GGG GCC GGA GCC GCA GTG (配列番号:7)；
E3Y：ATC GAG GCA AGA GCC ACC (配列番号:8)
【００４４】
E2xJ15E3
MAQAALEPGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDHLAEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTHTGGGGSGGGGTGEKPYACPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGKKTSGQAG (配列番号:9)
DNA標的配列：E3：GGA GCC GGA GCC GGA GTC (配列番号:10)；
E2X：ACC GGA GAA ACC AGG GGA (配列番号:11)
【００４５】
E3J15E2x
MAQAALEPGEKPYACPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGGGGSGGGGTGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDHLAEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTGKKTSGQAG (配列番号:12)
DNA標的配列：E3：GGA GCC GGA GCC GGA GTC (配列番号:10)；
E2X：ACC GGA GAA ACC AGG GGA (配列番号:13)
【００４６】
E2cJ15E3
MAQAALEPGEKPYACPECGKSFSRKDSLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTHTGGGGSGGGGTGEKPYACPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGKKTSGQAG (配列番号:14)
DNA標的配列：E2c：GGG GCC GGA GCC GCA GTG (配列番号:7)；
E3：GGA GCC GGA GCC GGA GTC (配列番号:10)
【００４７】
E2xJ15E3y
MAQAALEPGEKPYACPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDHLAEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSSNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQSSHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTHTGGGGSGGGGTGEKPYACPECGKSFSDKKDLTRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDCRDLARHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQLAHLRAHQRTHTGEKPYACPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALRVHQRTHTGKKTSGQAG (配列番号:15)
DNA標的配列：E2X：ACC GGA GAA ACC AGG GGA (配列番号:13)；
E3Y：ATC GAG GCA AGA GCC ACC (配列番号:8)
【００４８】
E2c、E2x、E3及びE3y(短い又は長いリンカーに連結された)の様々な組合せは、抑制ドメイン(SKD)又は活性化ドメイン(VP64)のいずれかに結合された。下記チャートはそのようなポリペプチドをまとめている。
【００４９】
短いリンカー構築体：J15
2006513694.tif 000004
【００５０】
2006513694.tif 000005
【００５１】
長いリンカー構築体：J30
2006513694.tif 000006
【００５２】
2006513694.tif 000007
【００５３】
12個のフィンガーは、6個のフィンガー蛋白質に連結するために、Zifドメイン間の通常の標準的(canonical)リンカー(TGEKP)の代わりに、より長いリンカーを含む。これらはフォワードプライマーJ15F又はJ30F及びリバースプライマーとしてpMalseq Backを使用するPCRにより導入した。このPCR鋳型は、pMal内の通常3個又は6個のフィンガーであることができる(下記スキーム1参照)：
【００５４】
配列プライマー短いリンカーJ15：
配列範囲：1から90
>SmaI
|
>XmaI|
|  |
|  |  10           20           30
TGA GCC CGG GGG CGG TGG CTC GGG CGG TGG
ACT CGG GCC CCC GCC ACC GAG CCC GCC ACC
>BsrFI          >BglII
|               |
>AgeI       >XbaI |
|           |   |
|     40    |   |  50           60
TGG GAC CGG TTC CTC TAG ATC TTC CTC CAC
ACC CTG GCC AAG GAG ATC TAG AAG GAG GTG
70           80           90
CGG GGA GAA GCC CTA TGC TTG TCC GGA ATG (配列番号:16)
GCC CCT CTT CGG GAT ACG AAC AGG CCT TAC (配列番号:17)
【００５５】
配列プライマー長いリンカーJ30F：
配列範囲：1から99
>XmaI
|
|          10           20           30
CCC GGG TCC TCT GGT GGC GGT GGC TCG GGC
GGG CCC AGG AGA CCA CCG CCA CCG AGC CCG
40           50           60
GGT GGT GGG GGT GGT TCC ACT GGC GGT GGC
CCA CCA CCC CCA CCA AGG TGA CCG CCA CCG
>AgeI
|
70       |   80           90
TCG GGC GGT GGT GGG ACC GGT TCC TCT AGA
AGC CCG CCA CCA CCC TGG CCA AGG AGA TCT
TCT TCC TCC (配列番号:18)
AGA AGG AGG (配列番号:19)
【００５６】
スキーム1：pMal内の6個のフィンガー蛋白質のクローニングに関連した制限位置
【００５７】
2006513694.tif 000008
【００５８】
このPCR産物は、XmaI及びSpeIで切断し、並びに当初のZif蛋白質は、AgeI及びSpeIで切断した。次にジンクフィンガーを含む長いリンカーを、AgeI及びSpeIの間に挿入した。付着末端に適合するXmaI/AgeI型及び両方の制限部位(XmaI/AgeI)は、このクローニング工程の間に消失した。新規フィンガーは、この構築体AgeI/SpeI並びに当初のフィンガーXmaI/SpeIの切断により挿入することができる。従って得られる12個のフィンガーは、6個のフィンガー(スキーム2)と同じ制限部位を有する。結果的に、この集成体は、n個のフィンガーに延長することができ、並びに3個のフィンガーを6個のフィンガーなどと組合せることもできる。
【００５９】
スキーム2：12個のフィンガー蛋白質のクローニングに関連した制限位置
【００６０】
2006513694.tif 000009
【００６１】
実施例2：標的DNAへの結合及び転写調節
実施例1のポリペプチドを、特異的DNA標的配列へのそれらの結合及びそれらの転写を変更する能力について試験した。結果を今にまとめる。
e2c/e2x及びe3/E3yの間の12個のフィンガー融合蛋白質は、両方の遺伝子を一度に調節することができる。この仮説は、293-Gag-Pol細胞における異なるpMXSKD-12フィンガー及びpMX12フィンガーvp64構築体のトランスフェクション、並びにA431細胞の得られるウイルスによる感染により検証した。感染の3日後、細胞を収集し、erbB2及びerbB3発現レベルについてFACSにより分析した。この手法は既報のように行った(Segal, Dら：PNAS、96:2758-2763(1999))。e2cJ15/30E3及びe2cJ15/30e3yの粗(raw)抽出物のELISAデータは、4種全ての構築体が、それらの各々の標的に結合することを示している。
【００６２】
7種の異なる構築体を、erbB2及びerbB3に対する調節作用について分析した。基底レベルへのerbB2及びerbB3の両方のダウンレギュレーションが、pMXSKDE2cJ15E3について観察された。erbB2及びerbB3の両方の最も効果的なアップレギュレーションは、構築体pMX E2cJ15E3vp64について観察され、pMX E2xJ15E3vp64は、更に両方の遺伝子に加え、e2cE3yvp64にも影響を及ぼした。
【００６３】
pMXe2cJ15e3は、erbB2及びerbB3を基底レベルにまで抑制した。他の3種の構築体は作用不良であり、これらはerbB2を抑制することなく、単にerbB3発現に影響を及ぼした。これは、その標的に低い親和性を有する(Km=15nM)e2x、及び高い親和性(Km=0.5nM)のe2cを含む構築体の両方について真実である。e2xは一旦(once)N-末端上にあり、及び一旦はC-末端にあるので、12個のフィンガー内の異なる位置は、erbB2抑制を改善しない。これは、GFP発現により推定されるように、ジンクフィンガー蛋白質発現レベルの問題ではない。pMXe2cJ15e3は、より弱い発現因子(expressor)及び最も効果的リプレッサーのひとつである。
【００６４】
アクチベーターについても、pMXe2cJ15e3vp64は、erbB2及びerbB3を明らかに活性化することにより、最良の作用を示した。しかしリプレッサーとは対照的に、これらふたつ以外の構築体も、両方の遺伝子を活性化した。ErbB3は、erbB2と比較しやや強力に活性化されるように見える。
【００６５】
ひとつのプロモーター内の二重標的化は、ジンクフィンガーの全般的に弱い活性化作用を増強することができる。その目的のために、pcDNAe2cJ15e2xvp64及びpcDNASKDe2cJ15e2xを、ルシフェラーゼリポーター構築体E2pと共に、一過性にHela細胞にトランスフェクションした。SKDe2cJ15e2xについての8倍の抑制と比べ、SKDe2cについて36倍の抑制が観察された。活性化については、vp64e2cによる78倍の活性化と比べ、これら12個のフィンガーについて45倍の活性化が観察された。
【００６６】
12個のフィンガー構築体pMXe2cJ15CD144#5は、A431細胞において、erbB2を活性化したが、CD144は活性化しなかった。2種の独立したクローンを試験し、同じ作用が示された。一旦クローンが完全に配列決定され、及び最後のヘリックスの1個のアミノ酸のみが読取り不能又は不明瞭であった。
【００６７】
erbB2で試験した抑制ドメインの概要
2006513694.tif 000010
【００６８】
実施例3：一般的手法
ジンクフィンガーライブラリーの構築及びファージディスプレイによる選択−
ジンクフィンガーライブラリーの構築は、C-7蛋白質(米国特許第6,140,081号)を基にした。5'-GCG-3'サブサイトを認識するフィンガー3を、フィンガー3をコードしているプライマー(5'-GAG- GAAGTTTGCCACCAGTGGCAACCTGGTGAGGCATACCAAAATC-3')(配列番号:20)及びベクター-特異的プライマー(5'-GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGC-3')(配列番号:21)を使用するPCR重複戦略により、5'-GAT-3'サブサイトへのドメイン結合により交換した。ジンクフィンガーライブラリーのPCR重複延長による無作為化は、本質的に当該技術分野において周知である。このライブラリーは、ファージミドベクターpComb3Hにライゲーションした。ファージの増殖及び沈降は、標準の技術を用いて行った。結合反応は、100mlの沈殿したファージ(1013コロニー形成単位)を含有する亜鉛緩衝液A(ZBA：10mM Tris、pH7.5、90mM KCl、1mM MgCl2、90mM ZnCl2)、0.2％ウシ血清アルブミン、5mMジチオスレイトール、1％Blotto(Bio-Rad社)、20mgの二本鎖剪断したニシン精子DNAの容量500mlにおいて行った。ファージは、ビオチン化された標的オリゴヌクレオチドが添加される前に、1時間4℃でのビオチン化されない競合オリゴヌクレオチドへ結合させた。結合は、4℃で一晩継続した。ストレプトアビジン-被覆した磁気ビーズ(Dynal社；ZBA中の5％Blottoでブロック)の50mlとの1時間のインキュベーション後、ビーズを、500mlのZBA、2％Tween20、5mMジチオスレイトールで10回、及びTweenを含まない緩衝液で1回洗浄した。結合したファージの溶離は、Tris-緩衝生理食塩水中のトリプシン25ml(10mg/ml)中で室温で30分間のインキュベーションにより行った。
【００６９】
ヘアピン競合オリゴヌクレオチドは、配列5'-GGCCGCN'N'N'ATCGAGTTTTCTCGATNNNGC GGCC-3'(配列番号:22)を有し、ここでNNNはフィンガー-2サブサイトオリゴヌクレオチドを、及びN'N'N'はその相補的塩基を表している。標的オリゴヌクレオチドは、ビオチン化し、通常最初の3回の選択には72nMで添加し、その後、6回目及び最終回は36及び18nMへ減少した。競合者として、5'-TGG-3'フィンガー-2サブサイトオリゴヌクレオチドを使用し、親クローンと競合した。標的位置を除き、15種のフィンガー-2 5'-ANN-3'サブサイトの等モル混合物、及び5'-CNN-3'、5'-GNN-3'、及び5'-TNN-3'型の各フィンガー-2サブサイトの競合混合物を、選択の連続ラウンドの各々に漸増量で添加した。通常非特異的5'-ANN-3'競合混合物を、第一のラウンドに添加した。
【００７０】
多標的特異性アッセイ及びゲル移動シフト−
ジンクフィンガー-コード配列はpComb3Hから修飾した細菌発現ベクターpMal-c2(New England Biolabs社)へとサブクローニングした。XL1-Blue(Stratagene社)への形質転換後、このジンクフィンガー-マルトース-結合蛋白質(MBP)融合体を、1nMイソプロピルb-D-チオガラクトシド(IPTG)の添加により発現した。これらの細菌培養物の凍結／解凍抽出物を、ストレプトアビジンで被覆した96-ウェルプレート(Pierce社)に、1:2で連続希釈し塗布し、並びに16種の5'-GAT ANN GCG-3'標的部位の各々に対しDNA結合特異性について試験した。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。マウス抗-MBP抗体(Sigma社、1:1000)と共にインキュベーションした後、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗-マウス抗体(Sigma社、1:1000)を適用した。検出は、アルカリホスファターゼ基質(Sigma社)の添加により行い、及びA405を、SOFTMAX2.35 (Molecular Devices社)を使うマイクロタイタープレートリーダーにより決定した。ゲルシフト分析は、精製した蛋白質(Protein Fusion and Purification System、New England Biolabs社)により行った。
【００７１】
フィンガー2の位置指定突然変異誘発−
フィンガー-2突然変異体は、PCRにより構築した。PCR鋳型として、C7.GATをコードしているpMalベクターを使用した。突然変異誘発されたフィンガー2及び5'-GAT-3'フィンガー3を含むPCR産物は、C7 (5'-GCG-3')のフィンガー1のフレーム内でNsiI及びSpeI制限部位で、修飾されたpMal-c2ベクター(New England Biolabs社)へとサブクローニングした。
【００７２】
ポリダクチルジンクフィンガー蛋白質の構築−
3種のフィンガー蛋白質を、SP1Cフレームワークを使用する、フィンガー-2ステッチェリー(stitchery)により構築した。この作業により作成された蛋白質は、5'-ANN-3'及び5'-TAG-3'ヘリックスに加え、 5'-GNN-3'DNA配列を認識するヘリックスを含んだ。6個のフィンガー蛋白質が、適合するXmaI及びBsrFI制限部位により集成された。DNA-結合特性の分析は、IPTG-誘導した細菌からの凍結／解凍抽出物を用いて行った。これらの蛋白質の遺伝子発現を調節する能力を分析するために、これらは、Kox-1の活性化ドメインVP64又は抑制ドメインKRABに融合し；VP64(単純ヘルペスウイルスVP16最小活性化ドメインのテトラマー反復単位)を、pcDNA3(Invitrogen社)又はレトロウイルスのpMX-IRES-GFPベクターの内部リポソーム結合部位(IRES)及びグリーン蛍光蛋白質(GFP)へとサブクローニングした。
【００７３】
転写及びルシフェラーゼアッセイ−
HeLa細胞を、集密度40〜60％で使用した。24-ウェルプレートにおいて、細胞を、ジンクフィンガー-結合部位を伴うプロモーター配列を含有するリポータープラスミド(pGL3；Promega社)の160ng及びエフェクタープラスミド(pcDNA3内のジンクフィンガー-エフェクタードメイン融合体)40ngでトランスフェクションした。細胞抽出物を、トランスフェクション後48時間で調製し、MicroLumat LB96Pルミノメーター(EG & Berthold社、ガイザーバルグ、MD)において、ルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega社)により測定した。
【００７４】
レトロウイルス遺伝子標的化及びフローサイトメトリー−
一次抗体として、ErbB-1-特異的mAb EGFR(Santa Cruz Biotechnology社)、ErbB-2-特異的mAb FSP77(Nancy E. Hynesからの贈与)、及びErbB-3-特異的mAb SGP1(Oncogene Research Products社)を使用した。蛍光標識したロバF(ab9)2抗-マウスIgGを、二次抗体として使用した(Jackson ImmunoResearch社)。
【００７５】
ELISAアッセイのためのpMal-融合蛋白質の細菌抽出物
選択されたジンクフィンガー蛋白質を、発現のためにpMalベクター(New England Biolabs社)にクローニングした。この構築体を、電気穿孔によりE. coli株XL1-Blueへと導入し、カルベネシリン(carbenecillin)の503g/mlを含有するLBプレート上に画線した。各突然変異体の4個の単独のコロニーを、503g/mlのカルベネシリン及び1％グリコースを含有する SB培地3mlに接種した。培養物を、37℃で一晩増殖した。これらの培養物1.2mlを、503g/mlのカルベネシリン、0.2％グリコース、903g/ml ZnCl2を含有する新たなSB培地20mlに形質転換し、及び37℃で更に2時間増殖した。IPTGを最終濃度0.3mMになるよう添加した。インキュベーションを、2時間継続した。これらの培養物を、Beckman GPR遠心機において、3500rpmで、4℃で5分間遠心した。細菌ペレットを、5mMの新鮮DTTを含有する亜鉛緩衝液Aの1.2ml中に再浮遊した。蛋白質抽出物を、ドライアイス／エタノール及び温水を使用する、凍結／解凍手法により分離した。この手法を、6回繰り返した。試料を、Eppendorf遠心機において、4℃で5分間遠心した。上清を、清浄な1.5ml遠心管に移し、ELISAアッセイに使用した。
【００７６】
ELISAアッセイ−
C7.GATのフィンガー-2変種を、マルトース-結合蛋白質(MBP)との融合体として、細菌発現ベクターへサブクローニングし、及び蛋白質を、1mM IPTGによる誘導により発現した(蛋白質(p)には、それらに対し選択されたフィンガー-2サブサイトの名称を与えた)。蛋白質を、5'-GAT CNN GCG-3'型の16種のフィンガー-2サブサイトの各々に対する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により試験し、それらのDNA-結合特異性を調べた。
【００７７】
加えて、5'-ヌクレオチド認識を、ジンクフィンガー蛋白質を特異的標的オリゴヌクレオチド及び中央トリプレットの5'-ヌクレオチドのみが異なる3種のサブサイトに曝露することにより分析した。例えば、pCAAは、5'-AAA-3'、5'-CAA-3'、5'-GAA-3'、及び5'-TAA-3'サブサイトについて試験した。多くの試験した3-フィンガー蛋白質は、それらが選択されたものに対するフィンガー-2サブサイトについて精巧なDNA-結合特異性を示した。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図1は、本発明の転写因子ポリペプチドの概略図を示す。DNBは、DNA結合ドメインを表す。Nは、1〜10である。〜は、アミノ酸残基リンカーを表す。
【図２】図2は、可変性リンカーにより連結された2個のDNBから集成されたDNB及び抑制(SKD)又は活性化(VP64)転写調節ドメインの例証的配列を示している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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