(57)【要約】本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍に関し、かつ、原発性ＣＮＳ腫瘍を伴う哺乳動物における腫瘍体積を低下させかつ生存の長さを増大させてそれにより原発性ＣＮＳ腫瘍の処置を提供するための有用な組成物および方法を提供する。本発明はまた、腫瘍体積を低下させかつ動物の生存を増大させるための化合物の同定方法にも関し、それは従って原発性ＣＮＳ腫瘍を治療することに関する。本発明はまた腫瘍の検出および診断方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１３０ｋＤａの分子量を有する、単離されたラットグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項２】
該グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームをコードする単離された核酸が配列番号５の単離された核酸を含んでなる、請求項１に記載のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項３】
約１３０ｋＤａの分子量を有する、単離されたラット過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項４】
該過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームをコードする単離された核酸が配列番号５の単離された核酸を含んでなる、請求項３に記載の過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項５】
約１３０ｋＤａの分子量を有する、単離されたラット未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項６】
該未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームをコードする単離された核酸が配列番号５の単離された核酸を含んでなる、請求項５に記載の未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項７】
約１５０ｋＤａの分子量を有する、単離されたヒトグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項８】
該グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームをコードする単離された核酸が配列番号７の単離された核酸を含んでなる、請求項７に記載のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項９】
約１５０ｋＤａの分子量を有する、単離されたヒト過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項１０】
該過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームをコードする単離された核酸が配列番号７の単離された核酸を含んでなる、請求項９に記載の過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項１１】
約１５０ｋＤａの分子量を有する、単離されたヒト未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項１２】
該未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームをコードする単離された核酸が配列番号７の単離された核酸を含んでなる、請求項１１に記載の未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム。
【請求項１３】
ＢＥＨＡＢタンパク質をコードする単離された核酸で細胞をトランスフェクトすること、およびそれからグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを単離することを含んでなる、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの作成方法。
【請求項１４】
細胞がＯｌｉ−ｎｅｕ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＥＨＡＢタンパク質をコードする単離された核酸が配列番号５の単離された核酸を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物の生物学的サンプルを、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体と接触させること、および哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出する、該生物学的サンプルとの抗体の結合を検出することを含んでなる、哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの検出方法。
【請求項１７】
哺乳動物がヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体がＢ５、Ｂ６若しくはＢＣＲＰより成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
抗体がそれに共有結合された標識ポリペプチドを含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、該生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを評価すること、および該生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われない哺乳動物から得た生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルと比較して（ここで、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われない哺乳動物からの生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルと比較して原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物からの生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのより高レベルが、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物が原発性ＣＮＳ腫瘍を有することの指標である）それにより哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断することを含んでなる、哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法。
【請求項２１】
哺乳動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的サンプルが、血液、神経組織、脳脊髄液、尿、唾液および脳組織よりなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
有効量のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を治療することを含んでなる、哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法。
【請求項２４】
哺乳動物がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム阻害剤が、抗体、タンパク質およびペプチド模倣物よりなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
抗体がグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントに特異的に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物への原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施前、その間若しくは後の前記哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを評価して（ここで、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施前の該哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルと比較して原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施の間若しくは後の該哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのより低レベルが、該哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の該処置の有効性の指標である）それにより該哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性を評価することを含んでなる、哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性の評価方法。
【請求項２８】
哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
原発性ＣＮＳ腫瘍の処置が、化学療法、放射線治療および外科手術よりなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を試験化合物と接触させること、および、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと該細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルを比較して（ここで、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと比較して試験化合物と接触させた細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のより高い若しくは低いレベルが、該試験化合物が細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現に影響を及ぼすことの指標である）それにより細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現に影響を及ぼす化合物を同定することを含んでなる、細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現に影響を及ぼす化合物の同定方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法により同定される化合物。
【請求項３２】
試験化合物と細胞を接触させること、および、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと該細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルを比較して（ここで、該試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のより高い若しくは低いレベルが、該試験化合物が細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を低下させることの指標である）それにより細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を低下させる化合物を同定することを含んでなる、細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を低下させる化合物の同定方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法により同定される化合物。
【請求項３４】
哺乳動物から細胞を単離すること、該細胞をグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントと接触させること、およびそのように接触された細胞を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法。
【請求項３５】
細胞が抗原提示細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が樹状細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに対する抗体を含んでなり、その使用のための説明資料をさらに含んでなる、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出するためのキット。
【請求項３８】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに対する抗体を含んでなり、さらにアプリケーター、およびその使用のための説明資料を含んでなる、哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断するためのキット。
【請求項３９】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体、および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物を含んでなり、さらにアプリケーター、およびその使用のための説明資料を含んでなる、原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキット。
【請求項４０】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントを含んでなり、さらにアプリケーター、およびその使用のための説明資料を含んでなる、免疫治療で原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
原発性脳腫瘍、神経膠腫は制御および管理するのが悪名高く困難である。脳若しくは非神経膠性脳腫瘍に転移した二次性腫瘍と異なり、神経膠腫は癌性組織と健全な脳との間の明確な境界の欠如を特徴とする独特の浸潤能力を示す。外科手術、化学療法および放射線治療を包含する慣習的治療は、神経膠腫の浸潤的性質によりしばしば部分的のみに有効若しくは無効な処置である。従って、神経膠腫に苦しめられている患者の予後は一様に厳しい。
【０００２】
予後がしばしば不良であるのみならず、しかし神経膠腫の診断は同様に困難かつ高価な過程である。脳腫瘍の検出は、全部の医療施設で容易に利用可能であるわけではない高価な画像化機器を必要とし、そして画像化の結果の確認は通常、該腫瘍の浸潤性かつ危険な外科的サンプリングを必要とする。
【０００３】
脳中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の性質は癌細胞の浸潤能力においてある役割を演じているかもしれない。正常の発達の間に脳の細胞外マトリックスの組成は劇的に変化する。発達中の脳における細胞の増殖、移動、ニューロンおよび神経膠の生長ならびに新脈管形成は細胞の動きを許容する可溶性マトリックス中で起こる。成熟した発達した脳においては、しかしながら、細胞の移動性は顕著に低下されて成熟細胞から細胞への相互作用を安定化する（非特許文献１）。
【０００４】
発達した脳中の周囲組織へ浸潤するために悪性腫瘍により使用される機構は顕著に異なる。例えば、数種の悪性細胞はヒアルロン酸（ＨＡ）のようなそれら自身のＥＣＭ分子を産生してそれにより近隣の環境の均衡および構造を変化させることが可能である（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。加えて、腫瘍細胞は、それらの細胞受容体の組成を変えること、例えばＨＡ結合分子ＲＨＡＭＭおよびＣＤ４４のアップレギュレーションによりＥＣＭ分子とのそれらの相互作用を変え得る（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。さらに、悪性細胞は周囲のＥＣＭを消化するためのタンパク質分解酵素を産生することにより既存の正常マトリックスを分解し得る（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。隣接組織中への腫瘍細胞の浸潤を助長する機構は多彩であるが、浸潤性の表現型を最良に特徴づけるものはおそらく、マトリックス分子の産生および消化を包含する周囲マトリックスの組成を改変する悪性腫瘍の能力である。
【０００５】
浸潤過程におけるプロテアーゼの役割はほぼすべての組織型の腫瘍で示されており（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）、かつ、悪性神経膠腫（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ  ｇｌｉｏｍａｓ）の浸潤特性に強く関与している（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。多数の文献が、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、とりわけＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９が神経膠腫で高度にアップレギュレートされていること、およびこれらのプロテアーゼの阻害が神経膠腫の浸潤性を低下させ得ることを示した（非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。しかしながら、原発性腫瘍の処置のためにＭＭＰ阻害剤を使用する臨床試験は重篤かつ有害な副作用のため期待はずれである（非特許文献２７）。
【０００６】
神経膠腫の浸潤性および腫瘍の進行において重要な役割を演じている脳ＥＣＭ分子の１つは脳に豊富なヒアルロナン結合（ｂｒａｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）（ＢＥＨＡＢ）タンパク質である（特許文献１）。ＢＥＨＡＢはタンパク質のプロテオグリカンタンデム反復ファミリーの１メンバーであり、そして分泌型およびヒアルロナン結合ドメインを伴うＧＰＩアンカー型タンパク質の双方として存在する（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０）。最近の研究は、ＢＥＨＡＢがヒト脳において発達が進行する際にダウンレギュレートされる脳特異的タンパク質であることを示した（非特許文献３１）。重要なことに、ＢＥＨＡＢは、今日までアッセイされたほぼ全部の成体ヒト神経膠腫サンプルにおいて約７００％アップレギュレートされている（非特許文献３２；非特許文献３１）。
【０００７】
ＢＥＨＡＢ切断は神経膠腫の進行において顕著な役割を演じている。Ｍａｔｔｈｅｗｓらによる最近の研究（非特許文献３３）は、ＢＥＨＡＢがメタロプロテイナーゼ（しかしＭＭＰではない）によりＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６の間で５０ｋＤａおよび９０ｋＤａのフラグメントに切断されることを示した。代わりに、ＢＥＨＡＢは、メタロプロテイナーゼのトロンボスポンジンモチーフをもつディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）ファミリーの１メンバー、とりわけＡＤＡＭＴＳ４により切断される。
【０００８】
不幸なことに、有害な副作用により、伝統的なメタロプロテイナーゼ阻害剤は神経膠腫の無効な治療方法であることが判明している。慣習的技術での神経膠腫の診断および治療双方の固有のリスク、ならびにメタロプロテイナーゼ阻害剤のようなより新たな処置レジメンの失敗を考えれば、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍の診断および治療双方の方法に対する長い間の切実な必要性が存在する。本発明はこの必要性にかなう。
【特許文献１】Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄら、１９９７、米国特許第５，６３５，３７０号明細書
【非特許文献１】Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ、１９９０、Ｓｅｍｉｎ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１：５５−６３
【非特許文献２】Ｄｅｌｐｅｃｈら、１９９７、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２：９４２−９４８
【非特許文献３】Ｋｏｓａｋｉら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５９：１１４１−１１４５
【非特許文献４】Ｔｕｒｌｅｙ、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１：２１−３０
【非特許文献５】Ｔｚａｎａｋａｋｉｓら、１９９７  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．７９：３２３−３３２
【非特許文献６】Ｚｅｔｔｅｒ、１９９３、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：２１９−２２９
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｂｒｕｎｎｅｒら、１９９９、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ  １４１：２９５−３０５
【非特許文献８】ＨａｌｌとＴｕｒｌｅｙ、１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６：２２１−２２９
【非特許文献９】Ｈａｌｌら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８２：１９−２８
【非特許文献１０】Ｍｅｒｚａｋら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４：３９８８−３９９２
【非特許文献１１】Ｆｕｒｃｈｔら、１９９４、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７０：７８１−７８３
【非特許文献１２】ＭｉｇｎａｔｔｉとＲｉｆｋｉｎ、１９９３、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７３：１６１−１９５
【非特許文献１３】Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９３、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７：１４３４−１４４１
【非特許文献１４】ＤｅＣｌｅｒｃｋら、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：２１５１−２１５７
【非特許文献１５】Ｍｏｈａｎａｍら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２：１５３−１６０
【非特許文献１６】Ｎａｋａｇａｗａら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ８１：６９−７７
【非特許文献１７】Ｒａｏら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２２０８−２２１１
【非特許文献１８】Ｒａｏら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １８：１２９−１３８
【非特許文献１９】Ｖａｉｔｈｉｌｉｎｇｈａｍら、１９９２、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ７７：５９５−６００
【非特許文献２０】Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２：１３９−１５１
【非特許文献２１】Ｄｅｒｙｕｇｉｎａら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１０：２４７３−２４８２
【非特許文献２２】Ｆｏｒｓｙｔｈら、１９９９、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ７９：１８２８−１８３５
【非特許文献２３】Ｈａｍａｓｕｎａら、１９９９、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２：２７４−２８１
【非特許文献２４】Ｒａｏら、１９９６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｉｔａｓｉｓ  １４：１２−１８
【非特許文献２５】Ｓａｗａｙａら、１９９６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １４：３５−４２
【非特許文献２６】Ｕｈｍら、１９９６、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔａｓｉｔａｓｉｓ  １４：４２１−４３３
【非特許文献２７】ＨｅａｔｈとＧｒｏｃｈｏｗ、２０００、Ｄｒｕｇｓ  ５９：１０４３−１０５５
【非特許文献２８】Ｊａｗｏｒｓｋｉら、１９９４、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５：４９５−５０９
【非特許文献２９】Ｙａｍａｄａら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６９：１０１１９−１０１２６
【非特許文献３０】Ｓｅｉｄｅｎｂｅｃｈｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７２０６−２７２１２
【非特許文献３１】Ｇａｒｙら、２０００、Ｇｅｎｅ  ２５６：１３９−１４７
【非特許文献３２】Ｊａｗｏｒｓｋｉら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６：２２９３−２２９８
【非特許文献３３】Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３
【発明の開示】
【０００９】
［発明の要約］
本発明は単離されたラットグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを包含し、該グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは約１３０ｋＤａの分子量を有する。
【００１０】
一局面において、該グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは配列番号５の単離された核酸によりコードされる。
【００１１】
本発明は単離されたラット過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームを包含し、該過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは約１３０ｋＤａの分子量を有する。
【００１２】
一局面において、該過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは配列番号５の単離された核酸によりコードされる。
【００１３】
本発明は単離されたラット未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームを包含し、該未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは約１３０ｋＤａの分子量を有する。
【００１４】
一局面において、該未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは配列番号５の単離された核酸によりコードされる。
【００１５】
本発明は単離されたヒトグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを包含し、該グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは約１５０ｋＤａの分子量を有する。
【００１６】
一局面において、該ヒトグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは配列番号７の単離された核酸によりコードされる。
【００１７】
本発明は単離されたヒト過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームを包含し、該過小グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは約１５０ｋＤａの分子量を有する。
【００１８】
一局面において、該ヒト過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは配列番号７の単離された核酸によりコードされる。
【００１９】
本発明は単離されたヒト未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームを包含し、該未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは約１５０ｋＤａの分子量を有する。
【００２０】
一局面において、該ヒト未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームは配列番号７の単離された核酸によりコードされる。
【００２１】
本発明はグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの作成方法を包含する。該方法は、ＢＥＨＡＢタンパク質をコードする単離された核酸で細胞をトランスフェクトすること、およびそれからグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを単離することを含んでなる。
【００２２】
一局面において、細胞はＯｌｉ−ｎｅｕ細胞である。
【００２３】
別の局面において、ＢＥＨＡＢタンパク質をコードする単離された核酸は配列番号５の単離された核酸を含んでなる。
【００２４】
本発明は哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの検出方法を包含する。該方法は、哺乳動物の生物学的サンプルを、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体と接触させること、および該生物学的サンプルとの抗体の結合を検出することを含んでなり、ここで該サンプルとの抗体の結合が哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出する。
【００２５】
一局面において、哺乳動物はヒトである。
【００２６】
別の局面において、抗体はＢ５、Ｂ６若しくはＢＣＲＰより成る群から選択される。
【００２７】
なお別の局面において、抗体はそれに共有結合された標識（ｔａｇ）ポリペプチドを含んでなる。
【００２８】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法を包含する。該方法は、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、該生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを評価すること、および該生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われない哺乳動物から得た生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルと比較することを含んでなる。原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われない哺乳動物からの生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルと比較して原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物からの生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのより高レベルは、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物が原発性ＣＮＳ腫瘍を有することの指標であり、それにより哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断する。
【００２９】
一局面において、哺乳動物はヒトである。
【００３０】
なお別の局面において、生物学的サンプルは、血液、神経組織、脳脊髄液、尿、唾液および脳組織よりなる群から選択される。
【００３１】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を包含する。該方法は、有効量のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を治療することを含んでなる。
【００３２】
一局面において、哺乳動物はヒトである。
【００３３】
なお別の局面において、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム阻害剤は、抗体、タンパク質およびペプチド模倣物よりなる群から選択される。
【００３４】
さらに別の局面において、抗体はグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントに特異的に結合する。
【００３５】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性の評価方法を包含する。該方法は、哺乳動物への原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施前、間若しくは後の該哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを評価して（ここで、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施前の該哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルと比較して原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施の間若しくは後の該哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのより低レベルが、該哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の該処置の有効性の指標である）それにより前記哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性を評価することを含んでなる。
【００３６】
一局面において、哺乳動物はヒトである。
【００３７】
なお別の局面において、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置は化学療法、放射線治療および外科手術よりなる群から選択される。
【００３８】
本発明は細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現に影響を及ぼす化合物の同定方法を包含する。該方法は、細胞を試験化合物と接触させること、および、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと該細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルを比較して（ここで、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと比較して試験化合物と接触させた細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のより高若しくは低レベルが、該試験化合物が細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現に影響を及ぼすことの指標である）それにより細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現に影響を及ぼす化合物を同定することを含んでなる。
【００３９】
一局面において、本発明は上の方法により同定される化合物を包含する。
【００４０】
本発明は細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を低下させる化合物の同定方法を包含する。該方法は、試験化合物と細胞を接触させること、および、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと該細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルを比較して（ここで、該試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム発現のより高若しくは低レベルが、該試験化合物が細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を低下させることの指標である）それにより細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を低下させる化合物を同定することを含んでなる。
【００４１】
一局面において、本発明は上の方法により同定される化合物を包含する。
【００４２】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を包含する。該方法は、哺乳動物から細胞を単離すること、該細胞をグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントと接触させること、およびそのように接触された細胞を哺乳動物に投与することを含んでなる。
【００４３】
一局面において、細胞は抗原提示細胞である。
【００４４】
別の局面において、細胞は樹状細胞である。
【００４５】
本発明はグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出するためのキットを包含する。該キットはグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに対する抗体を含んでなる。該キットはさらにその使用のための説明資料を含んでなる。
【００４６】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断するためのキットを包含する。該キットはグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに対する抗体を含んでなる。該キットはさらに、アプリケーター、およびその使用のための説明資料を含んでなる。
【００４７】
本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキットを包含する。該キットは、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体、および製薬学的に許容できる担体を含んでなる組成物を含んでなる。該キットはさらに、アプリケーターおよびその使用のための説明資料を含んでなる。
【００４８】
本発明は免疫治療で原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキットを包含する。該キットは、  グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントを含んでなり、該キットはさらにアプリケーターおよびその使用のための説明資料を含んでなる。
［発明の詳細な記述］
脳の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の操作は原発性ＣＮＳ腫瘍の進行および浸潤性の表現型において重要な役割を演じる。ＥＣＭの一成分、脳に豊富なヒアルロナン結合（ＢＥＨＡＢ）タンパク質は神経膠腫細胞の移動性および従って浸潤性において不可欠である。本明細書に開示されるデータは、ＢＥＨＡＢ機能および／若しくは切断に影響を及ぼすことが原発性ＣＮＳ腫瘍を伴う動物における腫瘍の大きさの減少および生存時間の延長を媒介することを初めて示す。従って、本発明は、限定されるものでないが神経膠腫、乏突起膠腫、星状細胞腫、神経膠肉腫、多形グリア芽腫、リンパ腫および脳外傷後の反応性神経膠症を挙げることができる原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のための組成物および方法を包含する。
【００４９】
本発明はまた、哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断するための組成物および方法も包含する。すなわち、本明細書に開示されるデータは、限定されるものでないが神経膠腫、乏突起膠腫、星状細胞腫および神経膠肉腫を挙げることができる原発性ＣＮＳ腫瘍が本明細書に開示される方法を使用して哺乳動物において診断されうることを示す。
【００５０】
本発明はさらに、新規グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを包含する。本明細書に開示されるデータは、本新規グリコシル化バリアントアイソフォームが、以前に開示されていないカルシウム非依存性の様式で細胞膜に結合し、また、浸潤性神経膠腫において劇的にアップレギュレートされていることを初めて示す。従って、本発明は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの生成のための組成物および方法、ならびにグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに関する原発性ＣＮＳ腫瘍の検出、処置および診断のための組成物、方法およびキットを包含する。
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは本節でそれと関連した目的の範囲を有する。
【００５１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、該冠詞の文法上の目的語の１個若しくは１個以上（すなわち最低１個）を指すのに本明細書で使用する。例として「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は１要素若しくは１以上の要素を意味している。
【００５２】
「増幅」は、例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応によりポリヌクレオチド配列がコピーされかつ従って多数のポリヌクレオチド分子に拡大されるいかなる手段も指す。
【００５３】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特異的１エピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は天然の供給源若しくは組換え供給源由来の無傷の免疫グロブリンであり得、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を包含する多様な形態で存在してよい（Ｈａｒｌｏｗら、１９９９、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【００５４】
本明細書で使用されるところの「合成抗体」という用語により、例えば本明細書に記述されるところのバクテリオファージにより発現される抗体のような組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味している。該用語はまた、該抗体をコードしかつ抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子の合成により生成された抗体、若しくは該抗体を指定するアミノ酸配列を意味しているように解釈されるべきであり、ここで、該ＤＮＡ若しくはアミノ酸配列は、当該技術分野で利用可能かつ公知である合成ＤＮＡ若しくはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
【００５５】
「アンチセンス」はとりわけ、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列若しくは該非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列はタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分に単に相補的であることは必要でない。アンチセンス配列は、コーディング配列の発現を制御する、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上の指定された制御配列に相補的であってもよい。
【００５６】
該用語が本明細書で使用されるところの「アプリケーター」という用語により、本発明の変異体ＢＥＨＡＢ核酸、タンパク質および／若しくは抗ＢＥＨＡＢ抗体ならびにアンチセンスＢＥＨＡＢ核酸を哺乳動物に投与するための限定されるものでないが皮下シリンジ、ピペットなどを挙げることができるいかなる装置も意味している。
【００５７】
該用語が本明細書で同義的に使用されるところの「ＢＥＨＡＢ」「完全長ＢＥＨＡＢ」若しくは「内因性ＢＥＨＡＢ」は、そうでなければブレビカンとして知られる脳に豊富なヒアルロナン結合（Ｂｒａｉｎ−Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｈｕａｌｕｒｏｎａｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）分子を指す。完全長ＢＥＨＡＢはラットおよびマウスにおいて約１５０ｋＤａより大きい、ならびにヒトにおいて約１６０ｋＤａより大きい分子量を有し、かつ、それぞれラット完全長ＢＥＨＡＢについて配列番号５  配列番号６、ならびにヒト完全長ＢＥＨＡＢについて配列番号７および配列番号８に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列により例示される。
【００５８】
その用語が本明細書で使用されるところの「生物学的サンプル」は、ＢＥＨＡＢの発現のレベル、存在するＢＥＨＡＢタンパク質のレベル若しくは双方を評価するのに使用し得る哺乳動物から得られる若しくはそれ中のサンプルを意味している。こうしたサンプルは、限定されるものでないが血液サンプル、神経組織サンプル、脳サンプルおよび脳脊髄液サンプルを挙げることができる。
【００５９】
「切断」は、２アミノ酸を含んでなるポリペプチドを最低２フラグメントに分離する、ポリペプチド中の２アミノ酸間のペプチド結合の解離を指すのに本明細書で使用する。
【００６０】
「切断阻害剤」は、切断の原因であるプロテアーゼを滴定すること（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）、切断部位を封鎖すること、若しくは切断部位をプロテアーゼに対し別の方法で認識不可能にすることのいずれかによりポリペプチドの切断を予防する分子、化合物若しくは組成物を指すのに本明細書で使用する。
【００６１】
「切断阻害量」は切断阻害剤の有効量を指すのに本明細書で使用する。
【００６２】
「切断生成物」は、最初のポリペプチドの２個若しくはそれ以上のフラグメントへの切断から生じる最初のポリペプチドのフラグメントを指すのに本明細書で使用する。一例として、１４５ｋＤａのＢＥＨＡＢタンパク質の切断生成物は９０ｋＤａおよび５０ｋＤａのフラグメントを包含する。
【００６３】
「ＢＥＨＡＢをコードする核酸の一部分若しくは全部に相補的な」により、ＢＥＨＡＢタンパク質をコードしない核酸の配列を意味している。むしろ、細胞中で発現されている配列はＢＥＨＡＢタンパク質をコードする核酸の非コーディング鎖に同一であり、そして従ってＢＥＨＡＢタンパク質をコードしない。
【００６４】
本明細書で使用されるところの「相補的」および「アンチセンス」という用語は完全に同義ではない。「アンチセンス」はとりわけ、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは該非コーディング鎖に実質的に相同である配列を指す。
【００６５】
本明細書で使用されるところの「相補的な」は、２種の核酸、例えば２個のＤＮＡ分子間のサブユニット配列の相補性の広範な概念を指す。該分子の双方中の１ヌクレオチド位置が相互と塩基対形成することが通常可能なヌクレオチドにより占有される場合には、該核酸はこの位置で相互に相補的であるとみなされる。従って、２種の核酸は、該分子のそれぞれ中の対応する位置のかなりの数（最低５０％）が相互と通常塩基対形成する（例えばＡ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）ヌクレオチドにより占有される場合に相互に相補的である。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分に単に相補的であることは必要でない。アンチセンス配列は、コーディング配列の発現を制御する、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上の指定された制御配列に相補的であってもよい。
【００６６】
遺伝子の「コーディング領域」は、該遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド残基および該遺伝子の非コーディング鎖のヌクレオチドよりなり、それらは、該遺伝子の転写により産生されるｍＲＮＡ分子のコーディング領域とそれぞれ相同若しくはそれに対し相補的である。
【００６７】
ｍＲＮＡ分子の「コーディング領域」もまた、該ｍＲＮＡ分子の翻訳の間に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域とマッチされる若しくは終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基よりなる。コーディング領域は、従って、該ｍＲＮＡ分子によりコードされる成熟タンパク質中に存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質の輸出シグナル配列中のアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を包含してもよい。
【００６８】
「コードすること」は、ヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義された配列若しくはアミノ酸の定義された配列のいずれかおよびそれら由来の生物学的特性を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としてはたらくための遺伝子、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞若しくは他の生物学的系中でタンパク質を産生する場合にタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一でありかつ通常は配列表に提供されるコーディング鎖、および遺伝子若しくはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コーディング鎖の双方を、その遺伝子若しくはｃＤＮＡのタンパク質若しくは他の産物をコードすると称することができる。
【００６９】
オリゴヌクレオチドの第一の領域は、２領域が相互に隣接する場合、若しくは２領域が約１０００を超えないヌクレオチド残基、および好ましくは約１００を超えないヌクレオチド残基により分離されている場合に、該オリゴヌクレオチドの第二の領域に「隣接する」。
【００７０】
本明細書で使用されるところの、核酸に適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、長さが最低約２０ヌクレオチド、典型的には最低約５０ヌクレオチド、より典型的には約５０から約１００ヌクレオチド、好ましくは最低約１００ないし約５００ヌクレオチド、なおより好ましくは最低約５００ヌクレオチドないし約１０００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは最低約１０００ないし約１５００、なおより好ましくは最低約１５００ヌクレオチドないし約２０００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは最低約２０００ないし約２５００、なおより好ましくは最低約２５００ヌクレオチドないし約２６００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは最低約２６００ないし約２６５０であってよく、そして、最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約２６５２ヌクレオチドより大きいことができる。
【００７１】
タンパク質に適用されるところの、ＢＥＨＡＢの「フラグメント」は長さが約２０アミノ酸である。より好ましくは、ＢＥＨＡＢのフラグメントは長さが約１００アミノ酸、なおより好ましくは最低約２００、なおより好ましくは最低約３００、なおより好ましくは最低約４００、なおより好ましくは最低約５００、なおより好ましくは約６００、およびより好ましくは、なおより好ましくは最低約７００、なおより好ましくは最低約８００、なおより好ましくは約８５０、およびより好ましくは最低約８８４アミノ酸である。
【００７２】
本明細書で使用されるところの「グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム」および「グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ」は、完全長ＢＥＨＡＢのグリコシル化パターンに比較して変えられたグリコシル化パターンとラットで約１５０ｋＤａ未満およびヒトで約１６０ｋＤａ未満の分子量を有するＢＥＨＡＢタンパク質を意味している。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢという用語は、過少グリコシル化（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＢＥＨＡＢ、異なってグリコシル化されたＢＥＨＡＢおよび未グリコシル化ＢＥＨＡＢを包含する。
【００７３】
本明細書で使用されるところの「異なってグリコシル化されたＢＥＨＡＢ」および「異なってグリコシル化されたＢＥＨＡＢアイソフォーム」は、炭水化物および糖含量が完全長ＢＥＨＡＢのものに類似であるがしかしアミノ酸バックボーンと連合した糖の組成が変えられている、変えられたグリコシル化パターンを有するＢＥＨＡＢタンパク質を指す。
【００７４】
「過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム」および「過少グリコシル化ＢＥＨＡＢ」は、完全長ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはそのフラグメントの一次アミノ酸配列を有するがしかし完全長ＢＥＨＡＢタンパク質のグリコシル化含量未満を有し、しかし該タンパク質と連合した最低１個の糖若しくは炭水化物をなお有するＢＥＨＡＢタンパク質を指すのに本明細書で使用する。
【００７５】
「未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォーム」および「未グリコシル化ＢＥＨＡＢ」は、完全長ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはそのフラグメントの一次アミノ酸配列を有するがしかし該タンパク質と連合した糖若しくは炭水化物を有しないＢＥＨＡＢタンパク質を指すのに本明細書で使用する。
【００７６】
本明細書で使用されるところの「説明資料」は、本発明の組成物の指定される使用のためのその有用性を伝えるのに使用し得る刊行物、録音・録画、図、若しくはいかなる他の表現媒体も包含する。本発明のキットの説明資料は例えば組成物を含有する容器に添付されていてよいか、若しくは組成物を含有する容器と一緒に発送されてよい。あるいは、説明資料は、説明資料および組成物が受領者により共同して使用されるという意図を伴い容器と別個に発送してもよい。
【００７７】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸セグメント若しくはフラグメント、例えば、フラグメントに通常は隣接している配列、例えばそれが天然に存在するゲノム中でフラグメントに隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。該用語はまた、細胞中でそれに天然に付随する核酸例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡまたはタンパク質を天然に付随する他の成分から実質的に精製された核酸にも当てはまる。該用語は従って、例えば、ベクター、自律性に複製するプラスミド若しくはウイルス、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている、あるいは他の配列と独立に個別の分子として（例えばｃＤＮＡ若しくはゲノム、またはＰＣＲ若しくは制限酵素消化により生じられたｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを包含する。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
【００７８】
「変異体ＢＥＨＡＢ」は、プロテアーゼによる切断を阻害するようにアミノ酸配列が改変さられている脳に豊富なヒアルロナン結合（Ｂｒａｉｎ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）分子を指すのに本明細書で使用する。
【００７９】
ある対象に適用されるところの「天然に存在する」は、該対象が天然で見出され得るという事実を指す。例えば、天然の供給源から単離され得かつ人により意図的に改変されていない生物体（ウイルスを包含する）中に存在するポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００８０】
本発明の情況において、一般に存在する核酸塩基の以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシチジンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして「Ｕ」はウリジンを指す。
【００８１】
別の方法で明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンでありかつ同一アミノ酸配列をコードする全部のヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを包含してよい。
【００８２】
２種のポリヌクレオチドを「作動可能に連結される」として記述することにより、一本鎖若しくは二本鎖核酸部分が、該２種のポリヌクレオチドの少なくとも一方が特徴とする生理学的効果をそれが他者に対して発揮することが可能であるような様式で核酸部分内に配置された２種のポリヌクレオチドを含んでなることを意味している。例として、ある遺伝子のコーディング領域に作動可能に連結されたプロモーターは該コーディング領域の転写を促進することが可能である。
【００８３】
「ポリヌクレオチド」は核酸の一本鎖若しくは平行および反平行鎖を意味している。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖若しくは二本鎖いずれかの核酸であってよい。
【００８４】
「核酸」という用語は典型的に大型のポリヌクレオチドを指す。
【００８５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、一般に約５０ヌクレオチドより大きくない短いポリヌクレオチドを指す。あるヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表される場合にこれはまた「Ｕ」が「Ｔ」に置き換わっているＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も包含することが理解されよう。
【００８６】
ポリヌクレオチド配列を記述するために本明細書で慣習的表記を使用する。すなわち、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’の方向と称する。
【００８７】
新生ＲＮＡ転写物に対するヌクレオチドの５’から３’の付加の方向は転写方向と称する。ｍＲＮＡと同一の配列を有するＤＮＡ鎖を「コーディング鎖」と称し；該ＤＮＡ上の参照点に対し５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列を「上流配列」と称し；該ＤＮＡ上の参照点に対し３’であるＤＮＡ鎖上の配列を「下流配列」と称する。
【００８８】
ポリヌクレオチドの一「部分」は、該ポリヌクレオチドの少なくとも最低約２０の連続するヌクレオチド残基を意味している。ポリヌクレオチドの一部分は該ポリヌクレオチドのすべてのヌクレオチド残基を包含するかもしれないことが理解される。
【００８９】
「原発性ＣＮＳ腫瘍」は、癌性細胞が身体の別の部分で発しかつ脳に転移しなかったことにおいて脳中に起源をもつ新形成を指すのに本明細書で使用する。原発性ＣＮＳ腫瘍の例は、限定されるものでないが、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、反応性神経膠症、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、リンパ腫、血管腫およびリンパ腫を挙げることができる。
【００９０】
「原発性ＣＮＳ腫瘍を治療すること」は、腫瘍の体積を包含する原発性ＣＮＳ腫瘍の症状の重症度、または該腫瘍のいずれかの症状若しくは兆候が患者により経験される頻度、あるいは双方が低下される、あるいは腫瘍の進行までの時間若しくは生存時間が延長される状況を指すのに本明細書で使用する。
【００９１】
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしそして相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供することが可能であるポリヌクレオチドを指す。こうした合成は、合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための剤の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる場合に起こる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、しかし二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、しかし広範な合成および天然に存在するプライマーが多くの応用に有用である。プライマーは、それがハイブリダイズして合成の開始のための部位としてはたらくように指定されている鋳型に相補的であるが、しかし該鋳型の正確な配列を反映する必要はない。こうした場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは例えば色原体、放射活性若しくは蛍光部分で標識しかつ検出可能な部分として使用し得る。
【００９２】
「プローブ」は別のポリヌクレオチドの指定された配列に特異的にハイブリダイズすることが可能であるポリヌクレオチドを指す。プローブは標的の相補ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、しかし該鋳型の正確な相補配列を反映する必要はない。こうした場合、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは例えば色原体、放射活性若しくは蛍光部分で標識しかつ検出可能な部分として使用し得る。
【００９３】
「組換えポリヌクレオチド」は天然に一緒に結合されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅若しくは集成された組換えポリヌクレオチドを適するベクターに包含してよく、そして該ベクターを使用して適する宿主細胞を形質転換し得る。
【００９４】
組換えポリヌクレオチドは非コーディング機能（例えばプロモーター、複製基点、リボソーム結合部位など）を同様に提供しうる。
【００９５】
組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は「組換え宿主細胞」と称される。組換えポリヌクレオチドを含んでなる、組換え宿主細胞中で発現される遺伝子は「組換えポリペプチド」を産生する。
【００９６】
「組換えポリペプチド」は組換えポリヌクレオチドの発現に際して産生されるものである。
【００９７】
「ポリペプチド」はアミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造バリアント、ならびにペプチド結合を介して連結されたその合成の天然に存在しない類似物、関連する天然に存在する構造バリアント、およびその合成の天然に存在しない類似物を指す。合成ポリペプチドは例えば自動ポリペプチド合成機を使用して合成し得る。
【００９８】
「タンパク質」という用語は典型的に大型のポリペプチドを指す。
【００９９】
「ペプチド」という用語は典型的に短いポリペプチドを指す。
【０１００】
ポリペプチド配列を表現するのに慣習的表記を本明細書で使用する。すなわち、ポリペプチド配列の左端がアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右端がカルボキシル末端である。
【０１０１】
本明細書で使用されるところの「プロモーター／制御配列」という用語は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結された、遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味している。いくつかの例において本配列はコアプロモーター配列であってよく、また、他の例において本配列はエンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節要素もまた包含してよい。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的様式で遺伝子産物を発現するものであってよい。
【０１０２】
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、ＢＥＨＡＢタンパク質の１エピトープを認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子を実質的に認識若しくは結合しない抗体を意味している。
【０１０３】
「治療的」処置は、病理学の兆候を減少若しくは排除させる目的上それらの兆候を現す被験体に実施される処置である。
【０１０４】
化合物の「治療上有効な量」は、該化合物が投与される被験体に対する有益な効果を提供するのに十分である化合物の量である。
【０１０５】
本明細書で使用されるところの「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、アミノ酸配列をコードする核酸に作動可能に連結されているプロモーター／制御配列をコードする核酸を含んでなる外因性の核酸配列を意味しており、この外因性核酸は動物若しくは細胞によりコードされる。
【０１０６】
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなりかつ該単離された核酸を細胞の内側に送達するのに使用し得る物質の組成物である。限定されるものでないが直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性若しくは両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを挙げることができる多数のベクターが当該技術分野で既知である。従って「ベクター」という用語は自律性に複製するプラスミド若しくはウイルスを包含する。該用語はまた、例えばポリリシン化合物、リポソームなどのような細胞中への核酸の移入を助長する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するようにも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを挙げることができる。
【０１０７】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に効果的に連結された発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。発現ベクターは発現のための十分なｃｉｓに作用する要素を含んでなり；発現のための他の要素は宿主細胞により若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系中で供給し得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組込むコスミド、プラスミド（例えば裸の若しくはリポソーム中に含有される）およびウイルスのような当該技術分野で既知のもの全部を包含する。
記述
Ｉ．単離された核酸
Ａ．センス核酸
本発明は哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢ分子若しくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を包含し、ここで該核酸は配列番号４の配列を有する核酸と最低約９９．７％の同一性を共有する。哺乳動物は好ましくはヒトである。好ましくは、該核酸は本明細書に開示される配列番号４に約９９．８％相同、より好ましくは、そして最も好ましくは約９９．９％相同である。なおより好ましくは、該核酸は配列番号４である。本発明の単離された核酸は、本発明の変異体ＢＥＨＡＢタンパク質をコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡ配列、および該ヌクレオチド配列が細胞を含まない場合若しくはそれが細胞と会合されている場合にそれをより安定にするＤＮＡ若しくはＲＮＡの化学修飾を包含するそのいずれかの改変された形態を包含すると解釈されるべきである。ヌクレオチドの化学修飾はまた、ヌクレオチド配列が細胞により取り込まれる効率若しくはそれが細胞中で発現される効率を高めるのにも使用してよい。ヌクレオチド配列の修飾のいかなるおよび全部の組合せを本発明で企図している。
【０１０８】
本発明は、本明細書に開示される核酸およびアミノ酸配列に単に制限されるとして解釈されるべきでない。本発明で一旦備えをすれば、本明細書に開示されるところの変異体ＢＥＨＡＢポリペプチドをコードする他の哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢ核酸の生成について実験の詳細の節で本明細書に記述される手順（例えば部位特異的突然変異誘発、フレームシフト突然変異など）、および当該技術分野で公知若しくは開発されるべきである手順に従うことにより、変異体ＢＥＨＡＢタンパク質をコードする他の核酸を得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【０１０９】
さらに、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ＆Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク）に記述されるもののような当該技術分野で公知の組換えＤＮＡの方法論を使用する変異体ＢＥＨＡＢの誘導体若しくはバリアントの形態の生成のために、いずれかの他の数の手順を使用してよい。
【０１１０】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変えることによるタンパク質若しくはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入のための手順は、当該技術分野で公知でありかつまたＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、上記）；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９７、上記）にも記述されている。
【０１１１】
本発明は、標識ポリペプチドをコードする核酸が共有結合されている哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸を包含する。すなわち、本発明は、標識ポリペプチドをコードする核酸配列が変異体ＢＥＨＡＢポリペプチドをコードする核酸に共有結合されているキメラ核酸を包含する。こうした標識ポリペプチドは当該技術分野で公知であり、そして例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン標識ポリペプチド、ｆｌａｇ標識ポリペプチド（ＦＬＡＧ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識ポリペプチドを包含する。しかしながら、本発明は上に列挙された標識ポリペプチドをコードする核酸に制限されるといかなる方法でも解釈されるべきでない。むしろ、これらの標識ポリペプチドに実質的に類似の様式で機能しうるポリペプチドをコードするいかなる核酸配列も本発明に包含されると解釈されるべきである。
【０１１２】
標識ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸を使用して、細胞、組織および／若しくは生物体全体（例えば哺乳動物の胚）内での変異体ＢＥＨＡＢの位置を推定し（ｌｏｃａｌｉｚｅ）、細胞から分泌される変異体ＢＥＨＡＢを検出しそして細胞中での変異体ＢＥＨＡＢの役割（１種若しくは複数）を研究し得る。さらに、標識ポリペプチドの付加は、本発明のタンパク質が産生かつ容易に精製され得るような「標識（ｔａｇｇｅｄ）」タンパク質の単離および精製を助長する。
Ｂ．アンチセンス核酸
ある状況においては、ＢＥＨＡＢの発現を阻害することが望ましいかもしれず、そして、本発明は従ってＢＥＨＡＢ発現の阻害に有用な組成物を包含する。従って、本発明は、転写に関して核酸がアンチセンスの向きである哺乳動物のＢＥＨＡＢ分子をコードする核酸の一部分若しくは全部に相補的な単離された核酸を特徴とする。好ましくは、該アンチセンス核酸は配列番号５若しくはそのフラグメントとの最低約９９．７％の相同性を有する核酸と相補的である。好ましくは、該核酸は、転写に関してアンチセンスの向きである、配列番号５若しくはそのフラグメントの配列を有する哺乳動物のＢＥＨＡＢをコードする核酸の一部分若しくは全部に相補的な核酸に約９９．８％相同、および最も好ましくは約９９．９％相同である。最も好ましくは、該核酸は配列番号５若しくはそのフラグメントである核酸の一部分若しくは全部に相補的である。こうしたアンチセンス核酸はＢＥＨＡＢ分子の発現、機能若しくは双方を阻害するようにはたらく。
【０１１３】
あるいは、本発明のアンチセンス分子は合成で作成しそしてその後細胞に提供してもよい。約１０ないし約３０の間、およびより好ましくは約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。それらは容易に合成かつ標的細胞中に導入されるからである。本発明により企図している合成アンチセンス分子は、未修飾オリゴヌクレオチドに比較して改良された生物学的活性を有する、当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチド誘導体を包含する（Ｃｏｈｅｎ、１９８９、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカレイトン中；Ｔｕｌｌｉｓ、１９９１、米国特許第５，０２３，２４３号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
ＩＩ．単離されたポリペプチド
本発明はまた哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢ分子を含んでなる単離されたポリペプチドも包含する。好ましくは、哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢ分子を含んでなる単離されたポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはそのなんらかのフラグメントに最低約９９．６％相同である。好ましくは、単離されたポリペプチドは配列番号３若しくはそのなんらかのフラグメントに約９９．７％相同、より好ましくは約９９．８％相同、より好ましくは、および最も好ましくは約９９．９％相同である。最も好ましくは、変異体ＢＥＨＡＢ分子を含んでなる単離されたポリペプチドは配列番号３である。
【０１１４】
本発明はまた、本明細書に開示されるところの変異体ＢＥＨＡＢ分子を含んでなるタンパク質若しくはペプチドの類似物も提供する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異若しくは配列に影響を及ぼさない修飾または双方により、天然に存在するタンパク質若しくはペプチドと異なってよい。例えば、タンパク質若しくはペプチドの一次配列を変えるとは言えその機能を通常は変えない保存的アミノ酸変化を行ってよい。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群すなわち
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン
内の置換を包含する。修飾（通常は一次配列を変えない）は、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの化学的誘導体化、例えばアシル化若しくはカルボキシル化を包含する。グリコシル化の修飾、例えばポリペプチドの合成およびプロセシングの間若しくはさらなるプロセシング段階においてにそのグリコシル化パターンを改変することにより；例えばグリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば哺乳動物のグリコシル化若しくは脱グリコシル化酵素にポリペプチドを曝露することによりなされるものもまた包含する。リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン若しくはホスホトレオニンを有する配列もまた包含する。
【０１１５】
タンパク質分解性の分解に対するポリペプチドの抵抗性を改良する若しくは溶解性の特性を至適化する若しくはそれらを治療薬としてより適するようにするように通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたポリペプチドもまた包含する。こうしたポリペプチドの類似物は、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸若しくは天然に存在しない合成アミノ酸を含有するものを包含する。本発明のペプチドは本明細書に列挙される特定の例示的方法のいずれかの産物に制限されない。
【０１１６】
本発明はまた、生じるペプチド（若しくはＤＮＡ）が本明細書に列挙される配列に同一でないがしかし該ペプチドが本発明の変異体ＢＥＨＡＢペプチドの生物学的／生化学的特性を有するために本明細書に開示されるペプチドと同一の生物学的特性を有するような１個若しくはそれ以上のアミノ酸が変えられている（またはそれをコードするヌクレオチド配列に言及する場合は１個若しくはそれ以上の塩基対が変えられている）変異体ＢＥＨＡＢペプチドである、本発明のペプチド（若しくはそれをコードするＤＮＡ）の「誘導体」および「バリアント」を包含するとも解釈されるべきである。
【０１１７】
変異体ＢＥＨＡＢタンパク質の生物学的特性は、限定されるものでないが細胞から分泌される若しくはＧＰＩ結合を介して固定される該ペプチドの能力、プロテアーゼにより切断されない能力などを挙げることができると解釈されるべきである。
【０１１８】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、変異体ＢＥＨＡＢの生物学的活性が、限定されるものでないが、分子若しくは化合物の、脳組織中で発現される、脳組織中で検出される、細胞から分泌される、細胞に固定される、プロテアーゼにより切断されない、などの能力を挙げることができることを理解するであろう。「変異体ＢＥＨＡＢの活性」は、変異体ＢＥＨＡＢ（ＥＣＭ若しくは脳脊髄液中を循環するものまたは脳中で局所的に産生されるもののいずれか）の効果を包含する。変異体ＢＥＨＡＢの生物学的活性は、とりわけ、腫瘍の進行、腫瘍の浸潤性、腫瘍の体積および大きさ、動物の生存などを媒介するか、それらと関連するか、若しくは双方である。
ＩＩＩ．ベクター
他の関連する局面において、本発明は、好ましくは核酸によりコードされるタンパク質の発現を指図することが可能であるようなプロモーター／制御配列を含んでなる核酸に作動可能に連結された哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を包含する。従って、本発明は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されるもののような、細胞中での外因性ＤＮＡの付随する発現を伴う、細胞中への外因性ＤＮＡの導入のための発現ベクターおよび方法を包含する。
【０１１９】
なおかつ通常は正常なＢＥＨＡＢを発現する細胞中での単独で若しくは検出可能な標識ポリペプチドに融合されたのいずれかの変異体ＢＥＨＡＢの発現は、ベクターが導入される細胞中での標識を伴う若しくは伴わないタンパク質の発現を駆動するようにはたらくプロモーター／制御配列に作動可能に連結された所望の核酸を含んでなるプラスミド、ウイルス若しくは他の型のベクターを生成することにより達成しうる。遺伝子の構成的発現を駆動するのに有用な多くのプロモーター／制御配列が当該技術分野で利用可能であり、かつ、限定されるものでないが、例えばサイトメガロウイルス前初期プロモーターエンハンサー配列、ＳＶ４０初期プロモーター（その双方は本明細書に開示される実験で使用した）、ならびにラウス肉腫ウイルスプロモーターなどを挙げることができる。さらに、変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸の誘導可能なおよび組織特異的発現は、標識を伴う若しくは伴わない変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸を誘導可能な若しくは組織特異的プロモーター／制御配列の制御下に置くことにより達成しうる。本目的上有用である組織特異的若しくは誘導可能なプロモーター／制御配列の例は、限定されるものでないがＭＭＴＶ  ＬＴＲの誘導可能なプロモーターおよびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターを挙げることができる。加えて、金属、グルココルチコイドなどのような誘導剤に応答して誘導される当該技術分野で公知であるプロモーターもまた本発明で企図している。従って、本発明は、既知若しくは未知のいずれかでありかつ作動可能に連結された所望のタンパク質の発現を駆動することが可能であるいかなるプロモーター／制御配列の使用も包含することが認識されるであろう。
【０１２０】
ベクターを使用した変異体ＢＥＨＡＢの発現は大量の組換え的に産生されるタンパク質の単離を可能にする。さらに、完全長ＢＥＨＡＢ発現の発現がこうした発現と関連する疾患、障害若しくは状態を引き起こす場合は、プロモーター／制御配列により駆動される変異体ＢＥＨＡＢの発現は、限定されるものでないが、変異体ＢＥＨＡＢが提供される遺伝子治療を挙げることができる有用な治療法を提供し得る。変異体ＢＥＨＡＢの投与が有用であり得る、発現の増大されたレベル、タンパク質のレベル、またはタンパク質若しくはその切断生成物の切断および／若しくは活性の増大されたレベルと関連する疾患、障害若しくは状態は、限定されるものでないが、原発性ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫、リンパ腫などを挙げることができる。
【０１２１】
従って、本発明は、完全長ＢＥＨＡＢの発現、翻訳、切断および／若しくは活性の阻害方法を包含するのみならず、しかしそれはまたＢＥＨＡＢの発現、タンパク質レベル、切断および／若しくは活性を低下させることに関する方法も包含する。ＢＥＨＡＢの発現、切断および／若しくは活性を低下させること、または変異体ＢＥＨＡＢの発現および／若しくは活性を増大させることが有効な治療薬の提供において有用であり得るからである。
【０１２２】
いかなる特定のプラスミドベクター若しくは他のＤＮＡベクターの選択も本発明における制限要因でなく、また、非常に多数のベクターが当該技術分野で公知である。さらに、特定のプロモーター／制御配列を選ぶことおよびそれらのプロモーター／制御配列を所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結することが当業者の技能内に十分にある。こうした技術は当該技術分野で公知でありかつ例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されている。
【０１２３】
本発明は従って哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を含んでなるベクターを包含する。ベクター中への所望の核酸の組込みおよびベクターの選択は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記述されるとおり当該技術分野で公知である。
【０１２４】
本発明はまたこうしたベクターを含有する細胞、ウイルス、プロウイルスなども包含する。ベクターおよび／若しくは外因性核酸を含んでなる細胞の製造方法は当該技術分野で公知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）を参照されたい。
【０１２５】
変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸は多様なプラスミドベクター中にクローン化してよい。しかしながら、本発明はプラスミド若しくはいずれかの特定のベクターに制限されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、容易に入手可能かつ／若しくは当該技術分野で公知である非常に多数のベクターを包含すると解釈されるべきである。
ＩＶ．組換え細胞
本発明は、とりわけ変異体ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸、それに相補的なアンチセンス核酸、ＢＥＨＡＢ若しくはその切断生成物を特異的に結合する抗体をコードする核酸などを含んでなる組換え細胞を包含する。一局面において、該組換え細胞は変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸の一部分をコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトし得る。該核酸は細胞ゲノム中に組込まれる必要はなく、またそれは細胞中で発現される必要もない。さらに、該細胞は原核生物細胞であっても真核生物細胞であってもよく、そして、本発明はいずれかの特定の細胞株若しくは細胞型に制限されると解釈されるべきでない。こうした細胞は、限定されるものでないがニューロン、神経細胞、脳細胞、神経膠腫由来細胞株、グリア細胞株、非グリア細胞株、幹細胞株などを挙げることができる。
【０１２６】
本発明はさらに、とりわけＢＥＨＡＢタンパク質をコードする単離された核酸を含んでなる組換え細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの作成方法を包含する。すなわち、本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは、ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸若しくはそのフラグメントで細胞をトランスフェクトすること、およびそれからグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを単離することにより、組換え細胞中で産生させ得る。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの産生に有用な細胞は例えばＯｉｌ−ｎｅｕ細胞を包含する。さらに、細胞のトランスフェクト方法およびそれからのタンパク質の製造方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書の別の場所に詳細に記述されている。組換え細胞は、従って、完全長ＢＥＨＡＢを発現するものおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを発現するものを包含する。
【０１２７】
さらに、組換え細胞の目的は頭蓋内腫瘍の発生に制限されると解釈されるべきでないことに注意することが重要である。むしろ、本発明は、限定されるものでないが哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を含んでなる原核生物細胞および真核生物細胞を挙げることができる、哺乳動物の変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸が導入されるいかなる細胞型も哺乳動物すると解釈されるべきである。
【０１２８】
本発明は、本発明の組換え遺伝子が以前に存在しなかったか若しくは細胞中で発現されていなかった、またはそれが今やトランスジーンが導入される前のものと異なるレベルで若しくは環境下で発現されている、本発明の組換え遺伝子が導入されかつ該所望の遺伝子によりコードされるタンパク質が発現される場合に利益が得られる真核生物細胞を包含する。こうした利益は、所望の遺伝子の発現を実験室でｉｎ  ｖｉｔｒｏで若しくは細胞が存する哺乳動物中で研究し得る系、導入された遺伝子を含んでなる細胞を研究、診断および治療ツールとして使用し得る系、ならびに哺乳動物における選択された疾患状態の新たな診断および治療ツールの開発に有用である哺乳動物モデルが生成される系が提供されたという事実を包含しうる。
【０１２９】
変異体ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸を発現する細胞は、完全長ＢＥＨＡＢの発現、切断および／若しくは活性と関連する疾患、障害若しくは状態を治療若しくは軽減するのにより高レベルの変異体ＢＥＨＡＢが有用であり得る細胞、組織若しくは哺乳動物全体に変異体ＢＥＨＡＢを提供するのに使用し得る。こうした疾患、障害若しくは状態は、限定されるものでないが原発性ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫、リンパ腫などを挙げることができる。従って、本発明は、変異体ＢＥＨＡＢの発現、タンパク質レベルおよび／若しくは活性を増大させることが疾患、障害若しくは状態を治療若しくは軽減するのに有用であり得る、変異体ＢＥＨＡＢを発現させて完全長のＢＥＨＡＢの発現、翻訳、切断および／若しくは活性を低下若しくは阻害する細胞を包含する。
【０１３０】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の「ノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）」若しくは「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）」ベクターがそれぞれ置換若しくは欠失されるべきである核酸の２部分に相同な最低２種の配列を含んでなることを認識するであろう。該２配列は該遺伝子に隣接する配列と相同であり；すなわち、１配列は完全長ＢＥＨＡＢをコードする核酸のコーディング配列の５’部分の若しくはその近くの領域と相同であり、かつ、他の配列は第一のものからさらに下流である。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がいかなる特定の隣接核酸配列にも制限されないことを認識するであろう。代わりに、ターゲッティングベクターは、哺乳動物ゲノムから若しくはそれ中にそれぞれ例えば完全長ＢＥＨＡＢのいくらか若しくは全部を除去する（すなわち「ノックアウト」ベクター）または変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸若しくはそのフラグメントを挿入する（すなわち「ノックイン」ベクター）２配列を含んでよい。ターゲッティングベクターの決定的に重要な特徴は、それが、完全長ＢＥＨＡＢをコードする核酸の全部若しくは一部分が哺乳動物の染色体上の位置から欠失されているような相同的組換えによる欠失／挿入を起こさせるように「ノックアウト」ベクターの場合は完全長ＢＥＨＡＢの読み取り枠（ＯＲＦ）の相対するすなわち５’および３’端に向かって位置する２配列の十分な部分を含んでなることである。
【０１３１】
トランスジーンならびにノックインおよびノックアウトターゲッティングベクターの設計は当該技術分野で公知でありかつＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）のような標準的専門書およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）などに記述されている。ターゲッティングベクターで使用されるべきＢＥＨＡＢコーディング領域に隣接する若しくはそれ内の上流および下流部分は、既知の方法に基づき、かつ、哺乳動物のＢＥＨＡＢおよび変異体ＢＥＨＡＢの核酸およびアミノ酸配列を包含する本明細書に提供される開示に基づき本明細書に開示される教示に従って容易に選択しうる。これらの配列で備えをすれば、当業者は本発明のトランスジーンおよびノックアウトベクターを構築することが可能であろう。
【０１３２】
当業者は、本開示に基づき、低下されたレベルの完全長ＢＥＨＡＢタンパク質、低下されたレベルのＢＥＨＡＢおよび／若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物の活性、または双方を含んでなる細胞が、限定されるものでないがＢＥＨＡＢ発現の阻害剤（例えばアンチセンス若しくはリボザイム分子、合成抗体若しくはイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ））を発現する細胞を挙げることができることを認識するであろう。
【０１３３】
培養物中で哺乳動物細胞を維持するのに有用な方法および組成物は当該技術分野で公知であり、ここで哺乳動物細胞は限定されるものでないがマウス、ラット、ヒトなどから得られた細胞を包含する哺乳動物から得られる。
【０１３４】
本発明の組換え細胞は、腫瘍の進行および浸潤性に対するＢＥＨＡＢレベルの質的および量的変化の影響を研究するのに使用し得る。これは、ＢＥＨＡＢが分泌されかつヒアルロナン結合ドメインを有するという事実が、ＢＥＨＡＢがＥＣＭの機能、組成若しくは活性に関与していることを示すからである。さらに、該組換え細胞は治療および／若しくは診断目的上の使用のため変異体ＢＥＨＡＢを製造するのに使用し得る。すなわち、変異体ＢＥＨＡＢを発現する組換え細胞を使用して、ＢＥＨＡＢの発現、活性および／若しくは切断と関連する若しくはそれにより引き起こされる疾患、障害若しくは状態を治療若しくは軽減するために投与し得る大量の精製かつ単離された変異体ＢＥＨＡＢを製造し得る。
【０１３５】
あるいは、変異体ＢＥＨＡＢを発現する組換え細胞を、組換え細胞を投与することがそれにより細胞、組織および／若しくは哺乳動物に該タンパク質を投与するｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ療法で投与し得る。加えて、該組換え細胞はＢＥＨＡＢ受容体およびＢＥＨＡＢシグナル伝達経路の発見に有用である。
【０１３６】
細胞がＢＥＨＡＢを発現しないか若しくは切断可能性を欠く変異体ＢＥＨＡＢを発現するように工作されている本発明の組換え細胞はまた、哺乳動物自身の細胞（例えば神経細胞、脳細胞など）若しくは同系のマッチさせたドナーのもののいずれかが本明細書の別の場所に記述されるとおり（例えば、ＢＥＨＡＢの発現および／若しくはタンパク質のレベルがそれにより組換え細胞中で低下されるようなアンチセンス核酸若しくはノックアウトベクターの挿入により）組換え的に工作されかつ該組換え細胞がレシピエント哺乳動物に投与される、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞治療でも使用し得る。こうして、低下されたレベルでＢＥＨＡＢを発現する組換え細胞を、それ自身の細胞が増大されたレベルのＢＥＨＡＢを発現する哺乳動物に投与してそれにより本明細書の別の場所に開示されるところの増大されたＢＥＨＡＢ発現と関連する若しくはそれにより媒介される疾患、障害若しくは状態を治療若しくは軽減し得る。
Ｖ．抗体
ＢＥＨＡＢ、ＢＥＨＡＢの切断生成物若しくはそれらのフラグメントを特異的に結合する抗体もまた包含される。
【０１３７】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、ＢＥＨＡＢおよび／若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物を特異的に結合する抗体がＢＥＨＡＢタンパク質、若しくはその免疫原性の部分、好ましくは本明細書の別の場所で論考される切断部位と結合することを理解するであろう。一態様において、抗体はアミノ酸配列、配列番号６を含んでなる哺乳動物のＢＥＨＡＢに向けられる。
【０１３８】
当業者は、本開示で備えをする場合に、本発明が過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームおよび未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームを包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを結合する抗体をさらに含んでなることもまた理解するであろう。抗体の生成は本明細書の別の場所に記述され、そしてそれらの製造は当該技術分野で公知の技術および技能を使用して達成される。過少グリコシル化ＢＥＨＡＢおよび未グリコシル化ＢＥＨＡＢを包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを結合する抗体は、限定されるものでないが、本明細書の実験の詳細および当該技術分野の別の場所（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３）に記述されるＢ５、Ｂ６およびＢＣＲＰ抗体を挙げることができる。さらに、本明細書に記述される抗体は、ラットおよびヒトを包含する哺乳動物のＢＥＨＡＢの多様な形態を結合し得、そして従ってＢＥＨＡＢと関連する原発性ＣＮＳ腫瘍の検出、診断および処置のために本発明において有用である。
【０１３９】
本発明は本明細書に列挙される抗体に制限されず、しかしむしろ将来発見および生成される抗グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ抗体もまた包含する。異なってグリコシル化された、過少グリコシル化および未グリコシル化ＢＥＨＡＢを包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに対する抗体は当該技術分野で公知の多様な方法で生成し得る。制限しない一例として、ＢＥＨＡＢをコードする核酸若しくはそのフラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）のようなそれが産生するタンパク質をグリコシル化しない生物体に形質転換し得る。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）および他の原核生物種中でのタンパク質の産生方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書の別の場所に記述されている。グリコシル化しない原核生物種から単離したタンパク質をその後哺乳動物に投与して、本明細書に記述されるように抗体を生成させ得る。該抗体は未グリコシル化ＢＥＨＡＢを包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを特異的に結合する。
【０１４０】
さらに、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに対する抗体は、ＢＥＨＡＢタンパク質バックボーンと連合した糖および炭水化物のいくつか若しくは全部を除去するためにグリコシダーゼと完全長ＢＥＨＡＢタンパク質を接触させることにより生成させ得る。こうしたグリコシダーゼは当該技術分野で公知であり、そして多数の適切なグリコシダーゼが本明細書の別の場所に記述されている。さらに、当業者は、本開示および本明細書に開示されるデータで備えをする場合に、ＢＥＨＡＢ分子上の糖および炭水化物上の他のファミリーを場合によっては保持しつつ糖若しくは炭水化物のあるファミリーの除去のために特定のグリコシダーゼを選択することが容易に可能であろう。ＢＥＨＡＢ分子は、グリコシダーゼでの処理後、その後にグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに対する抗体の生成のため動物に投与し得る。哺乳動物へのタンパク質の投与方法および抗体の生成方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書に記述されている。
【０１４１】
本発明はさらにグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに特異的な抗体を生成させることを含んでなる。こうした抗体は本明細書の別の場所に開示される組成物、方法およびキットで有用である。制限しない一例として、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに特異的な抗体はＢＥＨＡＢの一次アミノ酸配列のフラグメントを含んでなるペプチド若しくはタンパク質を投与することにより生成させ得る。こうしたフラグメントはＢＥＨＡＢの一次アミノ酸配列中に存在するコンセンサスのグリコシル化部位を含み得る。当業者は、こうしたコンセンサスのグリコシル化部位をそれらの配列およびアミノ酸内容により容易に認識するであろう。一例として、Ｏ−結合糖は、通常、トレオニン若しくはセリン残基、およびいくつかの場合においてはヒドロキシリシン若しくはヒドロキシプロリン上のグリコシド結合を介して結合されている。さらに、Ｎ−結合糖は、しばしば、トレオニンに結合したいずれかのアミノ酸に結合したアスパラギンに結合したいずれかのアミノ酸の配列を有する部位で、アスパラギン残基に結合されている。従って、当業者は、本開示および本明細書に開示される方法で備えをする場合に、ＢＥＨＡＢの一次アミノ酸配列中のコンセンサスのグリコシル化部位を同定し、これらのコンセンサスのグリコシル化部位を含んでなる動物を免疫するためのペプチドを生成し、そしてグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを特異的に結合する抗体を生成させることが容易に可能であろう。こうした抗体は、限定されるものでないが原発性ＣＮＳ腫瘍の形成に対し哺乳動物を免疫すること、原発性ＣＮＳ腫瘍を治療すること、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで哺乳動物中の原発性ＣＮＳ腫瘍を検出すること、ならびに本明細書の別の場所に開示される他の方法および用途を挙げることができる治療的処置で有用である。
【０１４２】
ポリクローナル抗体の生成は、例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク中）に記述されるもののような標準的抗体製造方法を使用して所望の動物に抗原を接種することおよび該抗原を特異的に結合する抗体をそれから単離することにより達成される。こうした技術は、マルトース結合タンパク質の若しくはグルタチオン（ＧＳＨ）標識ポリペプチド部分ような別のタンパク質の一部分、ならびに／またはＢＥＨＡＢ部分が免疫原性にされているような部分（例えばキーホールリンペットヘモシアニンすなわちＫＬＨと複合されたＢＥＨＡＢ）ならびにそれぞれのげっ歯類および／若しくはヒトＢＥＨＡＢアミノ酸残基を含んでなる一部分を含んでなるキメラタンパク質で動物を免疫することを包含する。該キメラタンパク質は、ＢＥＨＡＢをコードする適切な核酸（例えば配列番号５を限定されるものでないがｐＭＡＬ−２若しくはｐＣＭＸを挙げることができる本目的上適するプラスミドにクローン化することにより製造する。ＢＥＨＡＢおよびその部分を特異的に結合する抗体の他の製造方法はＭａｔｔｈｅｗｓら（２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３）に詳述されている。
【０１４３】
しかしながら、本発明は完全長ＢＥＨＡＢを結合するポリクローナル抗体に単に制限されるとして解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、哺乳動物のＢＥＨＡＢ若しくはその部分に対する、その用語が本明細書の別の場所で定義されるところの他の抗体を包含するように解釈されるべきである。さらに、本発明は、とりわけ、ＢＥＨＡＢに結合し、かつウェスタンブロット上で、組織の免疫組織化学的染色（それにより組織中のＢＥＨＡＢの位置を推定する）において、およびＢＥＨＡＢの少なくとも一部分をコードする核酸で一過性に若しくは安定にトランスフェクトした細胞の免疫蛍光顕微鏡検査において存在するＢＥＨＡＢを結合することが可能である抗体を包含するように解釈されるべきである。
【０１４４】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、該抗体が該タンパク質のいずれかの部分と特異的に結合し得、また、完全長のタンパク質を使用してそれに特異的な抗体を生成させ得ることを認識するであろう。しかしながら、本発明は完全長のタンパク質を免疫原として使用することに制限されない。むしろ本発明は哺乳動物のＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体を製造するために該タンパク質の免疫原性部分を使用することを包含する。すなわち、本発明は、ＢＥＨＡＢタンパク質の免疫原性部分すなわち抗原決定子、例えば切断部位を含んでなるエピトープ若しくはタンパク質分解性の切断により生じられる新たな抗原性部位を使用して動物を免疫することを包含する。
【０１４５】
該抗体は、限定されるものでないがウサギ若しくはマウスのような動物をＢＥＨＡＢタンパク質若しくはその一部分で免疫することにより、またはＢＥＨＡＢの少なくとも一部分を含んでなるタンパク質若しくは例えば適切なＢＥＨＡＢアミノ酸残基を含んでなる一部分と共有結合されたマルトース結合タンパク質標識ポリペプチド部分を含んでなる標識ポリペプチド部分を包含する融合タンパク質を使用して動物を免疫することにより、産生し得る。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、これらのタンパク質のより小さいフラグメントもまたＢＥＨＡＢを特異的に結合する抗体を製造するのに使用し得ることを認識するであろう。
【０１４６】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、単離されたＢＥＨＡＢポリペプチドの多様な部分を使用して、ＢＥＨＡＢの切断部位を含んでなるエピトープ若しくはＢＥＨＡＢの切断生成物上に存在するエピトープのいずれかに対する抗体を生成させ得ることを認識するであろう。ＢＥＨＡＢの配列ならびに該タンパク質の多様なエピトープおよび切断生成物の位置を推定する詳述された分析で一旦備えをすれば、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、当該技術分野で公知の若しくは開発されるべき方法を使用して哺乳動物のＢＥＨＡＢポリペプチドの多様な部分に特異的な抗体を得る方法を理解するであろう。
【０１４７】
従って、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が、ＢＥＨＡＢ若しくはＢＥＨＡＢの切断生成物を認識し得る、ＢＥＨＡＢ活性を（例えば必要なＢＥＨＡＢ切断生成物受容体／リガンドの相互作用若しくはＢＥＨＡＢ切断を阻害することにより）中和かつ／若しくは阻害する抗体を包含することを認識するであろう。
【０１４８】
本発明は、本明細書に開示される抗体、若しくは本発明のタンパク質のいずれかの特定の免疫原性の部分に単に制限されるとして解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、ＢＥＨＡＢ若しくはその部分または配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドと最低約％の相同性を共有するタンパク質に対する、その用語が本明細書の別の場所で定義されるところの他の抗体を包含すると解釈されるべきである。好ましくは、該ポリペプチドはＢＥＨＡＢ（配列番号６）に約１％相同、より好ましくは約５％相同、より好ましくは約１０％相同、なおより好ましくは約２０％相同、より好ましくは約３０％相同、好ましくは約４０％相同、より好ましくは約５０％相同、なおより好ましくは約６０％相同、より好ましくは約７０％相同、なおより好ましくは約８０％相同、好ましくは約９０％相同、より好ましくは約９５％相同、なおより好ましくは約９９％相同、および最も好ましくは約９９．９％相同である。
【０１４９】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、細胞中の関連するタンパク質の位置を推定しかつ細胞過程においてそれにより認識される抗原の役割（１種若しくは複数）を研究するのに該抗体を使用し得ることを認識するであろう。さらに、限定されるものでないがウェスタンブロッティングおよび酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を挙げることができる公知の方法を使用して生物学的サンプル中に存在するタンパク質を検出かつ若しくはその量を測定するのに該抗体を使用し得る。さらに、当該技術分野で公知の方法を使用して該抗体のコグネイトの抗原を免疫沈降かつ／若しくは免疫アフィニティー精製するのに該抗体を使用し得る。加えて、細胞中のＢＥＨＡＢ若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物のレベルを低下させてそれにより細胞中のＢＥＨＡＢ若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物の効果（１種若しくは複数）を阻害するのに該抗体を使用し得る。従って、該抗体を細胞若しくは哺乳動物の組織若しくは哺乳動物それ自身に投与することにより、必要とされるＢＥＨＡＢ受容体／リガンドの相互作用が従って阻害され、その結果ＢＥＨＡＢ切断の影響もまた阻害される。当業者は、抗ＢＥＨＡＢ抗体を使用してＢＥＨＡＢ切断を阻害することが、限定されるものでないが減少された腫瘍の大きさ、増大された生存などを挙げることができることを理解するであろう。
【０１５０】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が、脳中のＢＥＨＡＢ切断を阻害するためにＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体を経口で、非経口で、脳室内に、硬膜下腔内に、脳実質内に若しくは複数の経路により投与することを包含することを認識するであろう。投与は、生物工作された（ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ポリマー、直接注入、Ｏｍｍａｙａ貯留槽（抗癌剤を脳脊髄液に送達するのに使用される頭皮下に埋植される装置により、若しくは神経外科学の当業者に公知の他のこうした手段による送達を包含し得る。
【０１５１】
本発明はポリクローナル、モノクローナル、合成抗体などを包含する。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の抗体の決定的に重要な特徴は該抗体がＢＥＨＡＢと特異的に結合することであることを理解するであろう。すなわち、本発明の抗体は、ウェスタンブロット上、細胞の免疫染色においてＢＥＨＡＢ若しくはそのフラグメント（例えばその免疫原性の部分すなわち抗原決定子）を認識しかつ当該技術分野で公知の標準的方法を使用してＢＥＨＡＢを免疫沈降させる。
【０１５２】
あるタンパク質若しくはペプチドの完全長若しくはペプチドフラグメントに対し向けられたるモノクローナル抗体は例えばＨａｒｌｏｗら（１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク中）およびＴｕｓｚｙｎｓｋｉら（１９８８、Ｂｌｏｏｄ、７２：１０９−１１５）に記述されるもののようないかなる公知のモノクローナル抗体製造手順を使用しても製造しうる。大量の所望のペプチドは化学合成技術を使用してもまた合成しうる。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローン化しかつ大量のペプチドの生成に適する細胞中で適切なプロモーター配列から発現させてよい。ペプチドに対し向けられたモノクローナル抗体は本明細書で引用されるところの標準的手順を使用して該ペプチドで免疫したマウスから生成させる。
【０１５３】
本明細書に記述される手順を使用して得られるモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該技術分野で利用可能でありかつ例えばＷｒｉｇｈｔら（１９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用される参考文献に記述される技術を使用してクローン化かつシークェンシングしてよい。さらに、本発明の抗体は例えばＷｒｉｇｈｔら（１９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用される参考文献、ならびにＧｕら（１９９７、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７：７５５−７５９）に記述される技術を使用して「ヒト化」してよい。本発明はＢＥＨＡＢのエピトープと特異的に反応性のヒト化抗体の使用もまた包含する。こうした抗体はＢＥＨＡＢ若しくはそのフラグメントを特異的に結合することが可能である。本発明のヒト化抗体はヒト枠組みを有しかつ抗体（限定されるものでないがＢＥＨＡＢ若しくはそのフラグメントと特異的に反応性のマウス抗体を挙げることができる）からの１個若しくはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。従って、例えば、ＢＥＨＡＢに対するヒト化抗体は、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫、リンパ腫などのような原発性ＣＮＳ腫瘍の処置で有用である。
【０１５４】
本発明で使用される抗体をヒト化する場合、該抗体はＱｕｅｅｎら（米国特許第６，１８０，３７０号明細書）、Ｗｒｉｇｈｔら（１９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用される参考文献、若しくはＧｕら（１９９７、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ  ７７（４）：７５５−７５９）に記述されるとおり生成させうる。Ｑｕｅｅｎらにて開示される方法は、部分的に、アクセプターヒト枠組み領域をコードするＤＮＡセグメントに結合されたＢＥＨＡＢのような所望の抗原に結合することが可能なドナー免疫グロブリンからのＨおよびＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする組換えＤＮＡセグメントを発現させることにより製造されるヒト化免疫グロブリンを設計することに向けられる。一般的に言って、Ｑｕｅｅｎの特許における発明は、実質的にいかなるヒト化免疫グロブリンの設計に対しても応用可能性を有する。Ｑｕｅｅｎは、該ＤＮＡセグメントが、天然に連合した若しくは異種のプロモーター領域を包含するヒト化免疫グロブリンのコーディング配列に作動可能に連結された発現制御ＤＮＡ配列を典型的に包含することができると説明している。発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系であり得るか、または、該発現制御配列は、原核生物宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクトすることが可能なベクター中の原核生物プロモーター系であり得る。ベクターが適切な宿主に一旦組込まれれば、導入されたヌクレオチド配列の高レベル発現に適する条件下で該宿主を維持し、そして、所望のとおり、ヒト化Ｌ鎖、Ｈ鎖、Ｌ／Ｈ鎖二量体若しくは無傷の抗体、結合フラグメントまたは他の免疫グロブリンの形態の収集および精製が後に続いてよい（Ｂｅｙｃｈｏｋ、Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（１９７９）、引用することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１５５】
多様なヒト細胞からのヒト定常領域（ＣＤＲ）ＤＮＡ配列は公知の手順に従って単離し得る。好ましくは、ヒト定常領域のＤＮＡ配列は、第ＷＯ８７／０２６７１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり不死化Ｂ細胞から単離する。本発明の抗体の製造で有用なＣＤＲは、同様に、ＢＥＨＡＢに結合することが可能なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ由来であってよい。こうしたヒト化抗体は、限定されるものでないがマウス、ラット、ウサギ若しくは他の脊椎動物を挙げることができる抗体を産生することが可能ないずれかの便宜的な哺乳動物の供給源で公知の方法を使用して生成させうる。定常領域および枠組みのＤＮＡ配列に適する細胞、ならびに抗体が発現かつ分泌される宿主細胞は多数の供給源、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサスから得ることができる。
【０１５６】
上で論考されたヒト化抗体に加え、天然の抗体配列に対する他の修飾は、当業者に公知の多様な組換えＤＮＡ技術を利用して容易に設計かつ製造し得る。さらに、多様な異なるヒト枠組み領域は、ＢＥＨＡＢに向けられた抗体をヒト化するための基礎として単独で若しくは組合せで使用してよい。一般に、遺伝子の修飾は部位特異的突然変異誘発（ＧｉｌｌｍａｎとＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ、８：８１−９７（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：７３１−７３４）のような多様な公知の技術を使用して容易に達成しうる。
【０１５７】
あるいは、ファージ抗体ライブラリーを生成させうる。ファージ抗体ライブラリーを生成させるために、最初に、該ファージ表面上で発現されるべき所望のタンパク質、例えば所望の抗体を発現する細胞例えばハイブリドーマから単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを得る。ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーは逆転写酵素を使用して調製する。免疫グロブリンフラグメントを指定するｃＤＮＡをＰＣＲにより得、そして、生じるＤＮＡを適するバクテリオファージベクターにクローン化して、免疫グロブリン遺伝子を指定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージＤＮＡライブラリーを生成させる。異種ＤＮＡを含んでなるバクテリオファージライブラリーの作成手順は当該技術分野で公知でありかつ例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）に記述されている。
【０１５８】
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、タンパク質の対応する結合タンパク質、例えば抗体が向けられる抗原に結合するためにそれが利用可能であるような様式でそれがその表面上に表示されるように工作してよい。従って、特異的抗体を発現するバクテリオファージを、対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートする場合に、バクテリオファージは該細胞に結合することができる。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しないことができる。こうしたパニング技術は当該技術分野で公知でありかつ例えばＷｒｉｇｈｔら（９９２、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）に記述されている。
【０１５９】
上述されたもののような方法はＭ１３バクテリオファージディスプレイを使用するヒト抗体の製造のため開発された（Ｂｕｒｔｏｎら、１９９４、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０）。本質的には、抗体産生細胞の一集団から得たｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを生成させる。該ｍＲＮＡは再配列された免疫グロブリン遺伝子をコードし、そして従って該ｃＤＮＡはそれをコードする。増幅されたｃＤＮＡをＭ１３発現ベクターにクローン化して、それらの表面上にヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリーを創製する。目的の抗体を表示するファージを抗原結合により選択し、そして細菌中で繁殖させて可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを産生させる。従って、慣習的モノクローナル抗体合成と対照的に、この手順は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞よりはむしろヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０１６０】
たった今提示された手順は抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの生成を記述する。しかしながら本発明はＦａｂ抗体をコードするファージの生成に単に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、一本鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）もまた本発明に包含する。Ｆａｂ分子は完全なＩｇ  Ｌ鎖を含んでなる。すなわち、それらはＬ鎖の可変および定常双方の領域を含んでなるが、しかしＨ鎖の可変領域および第一の定常領域ドメイン（ＣＨ１）のみを包含する。一本鎖抗体分子はＩｇ  Ｆｖフラグメントを含んでなるタンパク質の一本鎖を含んでなる。Ｉｇ  Ｆｖフラグメントは抗体のＨおよびＬ鎖の可変領域のみを包含し、その中に含有される定常領域を有しない。ｓｃＦｖ  ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーはＭａｒｋｓら（１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）に記述される手順に従って生成しうる。所望の抗体の単離のためそのように生成させたファージのパニングは、Ｆａｂ  ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーについて記述されたものに類似の様式で実施する。
【０１６１】
本発明はまた、ＨおよびＬ鎖可変領域がほぼ全部の可能な特異性を包含するようにそれらが合成されていてよい合成のファージディスプレイライブラリーを包含するとも解釈されるべきである（Ｂａｒｂａｓ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：８３７−８３９；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら  １９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５）。
ＶＩ．組成物
本発明は、限定されるものでないが異なってグリコシル化された、過少グリコシル化ＢＥＨＡＢおよび未グリコシル化ＢＥＨＡＢを挙げることができるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを包含する。本発明のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは、変えられた、すなわち完全長のＢＥＨＡＢ上で見出される糖および炭水化物の完全な補充（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）未満を伴うＢＥＨＡＢ分子を含んでなる。本明細書のデータにより開示されるとおり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは、限定されるものでないが神経膠腫を挙げることができる原発性ＣＮＳ腫瘍中のＢＥＨＡＢの主要なアップレギュレートされた形態である。従って、本発明は、とりわけ、原発性ＣＮＳ腫瘍の診断ツール、癌を引き起こす突然変異、機能不全との神経細胞外マトリックスの相互作用を解明するための研究ツールなどに有用であるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを包含する。さらに、本発明のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは原発性ＣＮＳ腫瘍の検出、処置および診断のための組成物、方法およびキット中の試薬として有用である。
【０１６２】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは本明細書に開示される方法に従って作成し得る。すなわち、本発明は脳ホモジェネートの微粒子分画からのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの単離方法を含んでなり、かつ、さらに、完全長のＢＥＨＡＢおよびＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢを包含する他のＢＥＨＡＢ分子とのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの識別方法を包含する。
【０１６３】
本発明は組換え細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの生成方法をさらに含んでなる。すなわち、当業者は、本開示および本明細書のデータで備えをする場合に、ＢＥＨＡＢをコードする単離された核酸若しくはそのフラグメントで細胞をトランスフェクトすること、および細胞からグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを単離することによりグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを製造し得る。本目的上単離された核酸は、トランスフェクション方法および細胞中のタンパク質の発現方法がそうであるように本明細書の別の場所に開示されている。好ましくは、細胞は限定されるものでないがおよびＯｌｉ−ｎｅｕ細胞を挙げることができるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを発現する細胞である。
【０１６４】
本明細書に開示されるデータにより記述されるとおり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは多様な方法により完全長のＢＥＨＡＢ若しくはＧＰＩアンカー型ＢＥＨＡＢと識別し得る。こうした方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、免疫蛍光および位置推定、免疫沈降などを包含する。さらに、当業者は、当該技術分野で既知かつ本明細書に記述される技術を使用してグリコシル化に基づきタンパク質の異なるアイソフォームを区別することが容易に可能であろう。
ＶＩＩ．方法
Ａ．原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法
本発明は、部分的に、脳腫瘍を伴う哺乳動物の原発性ＣＮＳ腫瘍の進行、浸潤性および生存時間においてＢＥＨＡＢが重要な役割を演じているという新規発見に基づく。本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、ＢＥＨＡＢの切断は原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を増強し、そして、切断の阻害ならびに／若しくはＢＥＨＡＢおよびその切断生成物の機能の阻害を哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置として使用し得る。全部の例において、原発性ＣＮＳ腫瘍の治療であろうと診断であろうと、最も好ましい哺乳動物はヒトである。
【０１６５】
本発明は哺乳動物、好ましくはヒトにおける原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を包含する。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、ＢＥＨＡＢの切断ならびに／若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物の機能、生物学的活性および発現が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行および浸潤性に決定的に重要であるからである。従って、本明細書に提示されるデータから明らかであるとおり、ＢＥＨＡＢの切断を阻害することならびに／若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物の機能、生物学的活性および発現を阻害することが、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置としてはたらき得る。当業者は、本開示に基づき、ＢＥＨＡＢの切断を阻害することが、とりわけ、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫、リンパ腫、反応性神経膠症などの処置のための重要かつ新規の治療薬を提供することを認識するであろう。当業者はまた、原発性ＣＮＳ腫瘍と同様に、グリア細胞の活性化および増殖がＣＮＳすなわち脳および脊髄に対する傷害から生じることを認識するであろう。これらの傷害に由来するこうしたグリア細胞の活性化および増殖は当該技術分野で公知でありかつしばしば反応性神経膠症と称される。反応性神経膠症は例えばＳｔｒｅｉｔ（２０００、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．、２８：２８−３０）に詳述されている。本発明は哺乳動物、好ましくはヒトにおける反応性神経膠症の治療方法を包含する。
【０１６６】
ＢＥＨＡＢ切断の阻害剤を哺乳動物に投与し、それによりＢＥＨＡＢ切断を低下させかつ治療的利益を提供する。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、既知の若しくは将来開発されるべき広範な技術を使用してＢＥＨＡＢ切断を阻害し得ることを認識するであろう。すなわち、本発明は哺乳動物におけるＢＥＨＡＢの切断を阻害すること、ならびにそれにより原発性ＣＮＳ腫瘍の進行および浸潤性を予防することを包含する。本発明は、哺乳動物におけるＢＥＨＡＢ切断の阻害、例えば切断部位の封鎖、切断の原因であるプロテアーゼの滴定、および切断不可能なＢＥＨＡＢ変異体の発現若しくは投与の方法を開示する。これは、本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、ＢＥＨＡＢの切断に影響を及ぼすことが、限定されるものでないが原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられている哺乳動物における低下された腫瘍の大きさおよび延長された生存時間を挙げることができる多様な効果を媒介し、そしてそれにより原発性ＣＮＳ腫瘍のための新規かつ強力な治療薬を提供するからである。
【０１６７】
当業者は、本開示および本明細書に提示されるデータで備えをする場合に、ＢＥＨＡＢおよび／若しくはその切断生成物の機能、生物学的活性および発現の阻害剤を哺乳動物に投与することが、原発性ＣＮＳ腫瘍を伴う哺乳動物に対する有益な治療薬を提供することをさらに理解するであろう。本発明は、ＢＥＨＡＢの発現ならびに切断生成物および／若しくはそれらのリガンドの結合の低下若しくは予防方法を包含する。本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、ＢＥＨＡＢの増大されたレベルおよびＢＥＨＡＢ切断生成物の生物学的活性が、原発性ＣＮＳ腫瘍の高められた進行を媒介して低下された生存率およびより大きな腫瘍をもたらす。従って、ＢＥＨＡＢの発現またはＢＥＨＡＢ切断生成物の発現および／若しくは機能の阻害方法が本発明に包含される。
【０１６８】
当業者は、ＢＥＨＡＢ切断を阻害することが、切断部位を封鎖すること、切断の原因であるプロテアーゼを滴定すること、および切断不可能なＢＥＨＡＢ変異体を発現かつ／若しくは投与することを包含することを理解するであろう。本発明はタンパク質上の切断部位を封鎖することによるＢＥＨＡＢの切断の阻害方法を包含する。本明細書に開示されるとおり、切断部位はＢＥＨＡＢタンパク質のＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ２９６を含んでなる。従って、本切断部位のプロテアーゼへの接近不能がＢＥＨＡＢの切断を予防し得る。本発明は従ってプロテアーゼによる切断部位への接近を封鎖することによるＢＥＨＡＢの切断の阻害方法を包含する。一例として、該切断部位を含んでなるタンパク質の一部分に対する抗体若しくは他のリガンド、または該切断部位と相互作用するペプチド若しくは小分子が、プロテアーゼによる該タンパク質への接近を封鎖してそれによりＢＥＨＡＢ切断を阻害するとみられる。当業者は、該開示および本明細書に開示されるデータで備えをする場合に、抗体が切断部位を含んでなる短いペプチドを若しくはＢＥＨＡＢタンパク質のより大きな部分に特異的に結合し得るが、但し該抗体若しくはリガンドが切断部位を封鎖することを認識するであろう。
【０１６９】
ＢＥＨＡＢに対する抗体の生成方法は当該技術分野で公知であり（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３）そして本明細書の別の場所に開示されている。さらに、タンパク質のあるエピトープを特異的に結合する抗体の製造方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書および別の場所（Ｈａｒｌｏｗら（１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）を参照されたい）に開示される標準的方法を使用して達成し得る。
【０１７０】
当業者は、タンパク質、タンパク質をコードする核酸構築物若しくは双方として抗体を投与し得ることを認識するであろう。タンパク質若しくはタンパク質をコードする核酸構築物を細胞若しくは組織に投与するための本明細書の別の場所に開示される多数のベクターおよび他の組成物ならびに方法が公知である。従って、本発明は、ＢＥＨＡＢに特異的である抗体若しくは抗体（合成抗体）をコードする核酸の投与方法を包含する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）。
【０１７１】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、哺乳動物中に存在するＢＥＨＡＢ上の切断部位を封鎖するような抗体を投与し得ることを理解するであろう。さらに、本発明はＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体若しくは該抗体をコードする核酸を投与することを含んでなり、ここで、該分子は抗体がＢＥＨＡＢと結合しかつそのＧＰＩアンカー型の発現若しくは分泌を予防するような細胞内保持配列をさらに含んでなる。頻繁に「イントラボディ」と称されるこうした抗体は当該技術分野で公知でありかつ例えばＭａｒａｓｃｏら（米国特許第６，００４，４９０号明細書）およびＢｅｅｒｌｉら（１９９６、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ３８：１１−１７）に記述されている。従って、本発明は、ＢＥＨＡＢが哺乳動物中に存在する場合にＢＥＨＡＢ切断を阻害することを含んでなる方法、ならびに、細胞膜上にそのＧＰＩで固定された形態若しくはその分泌された形態で存在しているＢＥＨＡＢを阻害することを含んでなるＢＥＨＡＢ切断の阻害方法、および将来既知になるような方法を包含する。
【０１７２】
本発明はさらに、有効量のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム阻害剤を哺乳動物に投与することによるヒトを包含する哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍若しくは反応性神経膠症の治療方法を含んでなる。すなわち、本発明は、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫、リンパ腫などを包含する哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を包含する。該方法は抗体を哺乳動物に投与することを含んでなり、ここで該抗体若しくは他のリガンドがグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに結合しかつ従って原発性ＣＮＳ腫瘍を治療する。これは、本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは神経膠腫などを包含する原発性ＣＮＳ腫瘍中に存在するＢＥＨＡＢの主要なアイソフォームであるからである。従って、本発明はＣＮＳ中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの活性の阻害および従って原発性ＣＮＳ腫瘍の治療において有用である。
【０１７３】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを特異的に結合する抗体の生成および投与方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書の別の場所に記述されている。本発明は、過少グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームおよび未グリコシル化ＢＥＨＡＢアイソフォームを包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを結合するイントラボディ、タンパク質として投与される抗体、および抗体をコードする核酸構築物として投与される抗体をさらに含んでなる。
【０１７４】
本発明はまた、ＢＥＨＡＢ切断の原因であるプロテアーゼを阻害することによるＢＥＨＡＢ切断の阻害方法も包含する。これは、本明細書に提示されるデータから明らかであるとおり、ＢＥＨＡＢが特定部位でプロテアーゼにより切断されるが、しかしＢＥＨＡＢの切断を阻害することがとりわけより小さな腫瘍体積および上昇された動物の生存率をもたらすからである。従って、本発明はＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼを阻害することによるＢＥＨＡＢ切断の阻害方法を包含する。
【０１７５】
当業者は、プロテアーゼを阻害することが有効量のプロテアーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することを含んでなることを認識するであろう。こうした阻害剤は、限定されるものでないが、メタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ３の組織阻害剤、ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼの阻害剤を包含する化合物、小分子、抗体、若しくはＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼを特異的に結合する他の分子などを挙げることができる。特異的プロテアーゼ阻害剤は当該技術分野で公知でありかつ例えばＭａｒｔｅｌ−Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら（２００１、Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１５：８０５−２９）に論考されている。当業者は、本開示および本明細書の教示で備えをする場合に、哺乳動物へのプロテアーゼ阻害剤の投与方法を容易に理解することができ、かつ、従って、本発明は、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置としてのプロテアーゼ阻害剤を包含する。
【０１７６】
本発明はまた、ＢＥＨＡＢ切断の原因であるプロテアーゼを滴定することによるＢＥＨＡＢ切断の阻害方法も包含する、これは、本明細書に提示されるデータから明らかであるとおり、ＢＥＨＡＢが特定部位でプロテアーゼにより切断されるが、しかし本発明の変異体ＢＥＨＡＢはｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ双方のアッセイで測定されるとおりプロテアーゼにより切断され得ないからである。さらに、ＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼは他のメタロプロテイナーゼに比較して制限された量および制限された位置で身体中に存在する。従って、切断不可能なＢＥＨＡＢは、プロテアーゼが内因性ＢＥＨＡＢを切断するために利用可能でないようにそれを滴定することが可能である。当業者は、プロテアーゼを滴定することが、ＢＥＨＡＢを切断するのに利用可能である哺乳動物、好ましくはヒト中のプロテアーゼの機能的濃度を低下させる基質を提供することを包含することを認識するであろう。プロテアーゼを滴定することは、プロテアーゼにより認識かつ結合される基質を提供してＢＥＨＡＢを切断するのに利用可能なプロテアーゼ若しくはプロテアーゼの活性部位の数の減少をもたらすことをさらに包含する。
【０１７７】
本明細書の別の場所により完全に記述されるとおり、変異体の切断不可能な形態のＢＥＨＡＢを発現する腫瘍は、内因性ＢＥＨＡＢの存在下であっても、動物においてとりわけより小さな腫瘍体積および増大された生存率をもたらす。これらのデータは、内因性ＢＥＨＡＢが細胞中に存在する場合でさえ、切断不可能なＢＥＨＡＢの付加的な存在が技術で許容できるｉｎ  ｖｉｖｏの原発性ＣＮＳ腫瘍モデルにおいて原発性ＣＮＳ腫瘍の低下された進行をもたらすことを示す。該データはさらに、外因性の変異体ＢＥＨＡＢを発現する腫瘍を外因性の完全長ＢＥＨＡＢを発現する腫瘍と比較する場合に、変異体ＢＥＨＡＢを発現する腫瘍がより小さくかつより長い動物の生存時間をもたらすの双方であることを示す。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わない一方で、本明細書に提示されるデータは、切断不可能なＢＥＨＡＢ変異体がＢＥＨＡＢ切断の原因であるプロテアーゼを滴定し、そして低下された切断の結果として低下された腫瘍の進行が続いて起こることを示す。
【０１７８】
当業者は、本開示および本明細書に開示されるデータに基づき、プロテアーゼの切断不可能な基質が原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられている動物における腫瘍の大きさを低下させかつ生存率を増大させることにより腫瘍の進行を阻害することを認識するであろう。従って、本発明は、ＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼを滴定することによる原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を包含する。
【０１７９】
ＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼを滴定するのに使用される化合物は、限定されるものでないがペプチド、タンパク質、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）およびペプチド模倣物を挙げることができる。本明細書の別の場所に開示されるとおり、切断不可能なＢＥＨＡＢ（変異体ＢＥＨＡＢ、配列番号３）は切断部位の周囲のアミノ酸配列中の１個の突然変異、とりわけＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＧｌｙのＧｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（それぞれ配列番号１および配列番号２）への突然変異を伴う天然のＢＥＨＡＢタンパク質を含んでなる。当業者は、完全長の変異体ＢＥＨＡＢ由来のペプチドが配列番号３に示される完全長の変異体ＢＥＨＡＢタンパク質と同一のプロテアーゼ滴定特性を表し得ることを容易に認識するであろう。それにより、本発明は完全長の変異体ＢＥＨＡＢタンパク質、およびプロテアーゼ滴定活性を含んでなる短縮変異体ＢＥＨＡＢペプチドを包含する。
【０１８０】
本明細書で使用されるところのアミノ酸は、以下の表に示されるところのそれらの完全な名称、それらに対応する三文字記号若しくはそれらに対応する一文字記号により表される：
【０１８１】
【表１】
2006523179.tif 000002
【０１８２】
本発明のペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｔら（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、１９８４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）により記述されるところの、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙとＢｏｄａｎｓｚｋｙ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク）により記述されるところの標準的な十分に確立した固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により容易に製造しうる。最初に、適して保護されたアミノ酸残基をそのカルボキシル基により架橋ポリスチレン若しくはポリアミド樹脂のような誘導体化した不溶性ポリマー支持体に結合する。「適して保護された」は、アミノ酸のα−アミノ基およびいずれかの側鎖官能基の双方上の保護基の存在を指す。側鎖保護基は一般に、合成を通じて使用される溶媒、試薬および反応条件に対し安定であり、そして最終的なペプチド生成物に影響を及ぼさないことができる条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、最初のアミノ酸からのＮ−保護基の除去、および所望のペプチドの配列中の次のアミノ酸のカルボキシル端のそれへの結合により実施する。このアミノ酸もまた適して保護されている。生じるアミノ酸のカルボキシルは、カルボジイミド、対称性酸無水物またはヒドロキシベンゾトリアゾール若しくはペンタフルオロフェニルエステルのような「活性エステル」基への形成のような反応性基への形成により、支持体に結合されたアミノ酸のＮ末端と反応するように活性化し得る。
【０１８３】
固相ペプチド合成方法の例は、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオクスカルボニルを利用したＢＯＣ法、およびアミノ酸残基のα−アミノを保護するために９−フルオレニルメチルオクスカルボニルを利用するＦＭＯＣ法を包含し、その双方の方法は当業者により公知である。
【０１８４】
Ｎおよび／若しくはＣ−封鎖基の組込みは固相ペプチド合成法に慣習的なプロトコルを使用してもまた達成し得る。Ｃ末端封鎖基の組込みのためには、例えば、所望のペプチドの合成は、典型的に、樹脂からの切断が所望のＣ末端封鎖基を有するペプチドをもたらすように化学的に修飾されている支持樹脂を固相として使用して実施する。Ｃ末端が一級アミノ封鎖基をもつペプチドを提供するためには、例えば、ペプチド合成が完了した場合にヒドロフッ素酸での処理が所望のＣ末端でアミデート化されたペプチドを遊離するようにｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を使用して合成を実施する。同様に、Ｃ末端でのＮ−メチルアミン封鎖基の組込みは、ＨＦ（ヒドロフッ素酸）処理に際してＮ−メチルアミデート化されたＣ末端をもつペプチドを遊離するＮ−メチルアミノエチル誘導体化ＤＶＢ樹脂を使用して達成される。エステル化によるＣ末端の封鎖はまた慣習的手順を使用しても達成し得る。これは、所望のアルコールとのその後の反応を見込むように樹脂からの側鎖ペプチドの遊離を可能にしてエステル官能基を形成させる樹脂／封鎖基の組合せの使用を必要とする。メトキシアルコキシベンジルアルコール若しくは同等のリンカーで誘導体化したＤＶＢ樹脂と組合せのＦＭＯＣ保護基をこの目的上使用し得、支持体からの切断はジクロロメタン中ＴＦＡにより遂げられる。その後、例えばＤＣＣでの適して活性化されたカルボキシル官能基のエステル化を、所望のアルコールの付加、次いで脱保護およびエステル化されたペプチド生成物の単離により進行させ得る。
【０１８５】
Ｎ末端封鎖基の組込みは、例えば適する無水物およびニトリルでの処理により、合成されたペプチドが未だ樹脂に結合されている間に達成し得る。Ｎ末端にアセチル封鎖基を組込むためには、例えば、樹脂に結合されたペプチドをアセトニトリル中２０％無水酢酸で処理し得る。その後、Ｎ−封鎖ペプチド生成物を樹脂から切断し、脱保護しかつその後単離し得る。
【０１８６】
化学的若しくは生物学的いずれかの合成技術から得たペプチドが所望のペプチドであることを確実にするために、ペプチド組成の分析を実施すべきである。こうしたアミノ酸組成分析は、高分解能質量分析計を使用して実施して、ペプチドの分子量を決定しうる。あるいは、若しくは付加的には、ペプチドのアミノ酸含量は、水性酸中でペプチドを加水分解すること、ならびにＨＰＬＣ若しくはアミノ酸分析機を使用して混合物の成分を分離、同定かつ定量することにより確認し得る。ペプチドを連続的に分解しかつアミノ酸を順序よく同定するタンパク質シークェンサーもまたペプチドの配列を決定的に決定するのに使用してよい。
【０１８７】
ペプチドはその使用前に精製して汚染物質を除去する。この点に関して、ペプチドは適切な規制当局により若しくは特定の用途のために設定された基準に合致するように精製することができることが認識されるであろう。例えばＣ４−、Ｃ８−若しくはＣ１８−シリカのようなアルキル化シリカカラムを使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を包含する多数の慣習的精製手順のいずれか１つを使用して必要とされるレベルの純度を達成しうる。増大する有機物含量の勾配移動相、例えば通常は少量のトリフルオロ酢酸を含有する水性緩衝液中のアセトニトリルを一般に使用して精製を達成する。イオン交換クロマトグラフィーもまた、それらの電荷に基づきペプチドを分離するのに使用し得る。
【０１８８】
当業者は、ＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼを滴定することが可能な変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドを変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドをコードする単離された核酸として哺乳動物に投与してよいことを容易に認識するであろう。細胞若しくは哺乳動物中での所望のタンパク質の発現方法は当該技術分野で公知であり、そして、本開示および本明細書のデータと組合せられる場合に、当業者は、過度の実験を伴わずに細胞若しくは哺乳動物中で変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドを発現させることが可能であろう。
【０１８９】
当業者は、所望のタンパク質若しくはペプチドをコードする単離された核酸を含んでなるベクター若しくは発現ベクターの細胞若しくは哺乳動物中への導入を包含する、細胞若しくは哺乳動物中でのタンパク質若しくはペプチドの発現のための多くの方法が存在することを認識するであろう。当業者はさらに、ベクターは配列番号４の単離された核酸若しくはそのなんらかの生物学的に活性の部分を含み得ることを認識するであろう。
【０１９０】
本発明はまた本発明の変異体ＢＥＨＡＢタンパク質およびペプチドのミメトープも包含する。本明細書で使用されるところの変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドのミメトープは、こうした変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドの活性（例えばＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼを滴定してそれにより天然のＢＥＨＡＢの切断を予防する能力）を模倣することが可能であるいかなる化合物も指す。しばしば、ミメトープは変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドを模倣する構造を有するからである。しかしながら、ミメトープは該ミメトープが変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドを機能的に模倣する限りは該タンパク質に類似の構造を有する必要はないことが注目されるべきである。ミメトープは、限定されるものでないが：分解に対するそれらの感受性を低下させるよう修飾されているペプチド；抗イディオタイプおよび／若しくは触媒的酵素またはそれらのフラグメント；単離されたタンパク質の非タンパク質性の免疫原性の部分（例えば炭水化物構造）；核酸を包含する合成若しくは天然の有機若しくは無機分子；ならびに／またはいずれかの他のペプチド模倣化合物を挙げることができる。本発明のミメトープは本発明の変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチドのコンピュータで生成させた構造を使用して設計し得る。ミメトープはまた、オリゴヌクレオチド、ペプチド若しくは他の有機分子のような分子の無作為サンプルを生成させること、および対応する結合パートナー（例えばＢＥＨＡＢを切断するプロテアーゼ若しくは抗ＢＥＨＡＢ抗体）を使用するアフィニティークロマトグラフィー技術によりこうしたサンプルをスクリーニングすることによっても得ることができる。好ましいミメトープは、本発明の変異体ＢＥＨＡＢタンパク質若しくはペプチド、とりわけ変異体ＢＥＨＡＢタンパク質の切断部位に構造的にかつ／若しくは機能的に類似であるペプチド模倣化合物である。ミメトープおよびペプチド模倣物の生成方法は当該技術分野で公知でありかつ例えばＫａｚｍｉｅｒｓｋｉ（１９９９、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．２３）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ）に詳述されている。
【０１９１】
本発明はまた、哺乳動物におけるＢＥＨＡＢの発現および／若しくは活性の阻害方法も包含する。当業者は、本開示および本明細書に開示されるデータで備えをする場合に、より高レベルのＢＥＨＡＢ発現が、原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられている哺乳動物において腫瘍の大きさを増大させかつ生存率を低下させることを理解するであろう。すなわち、本明細書の別の場所に提示されるデータは、ＢＥＨＡＢを過剰発現する原発性ＣＮＳ腫瘍を伴う哺乳動物が、正常レベルのＢＥＨＡＢを発現する哺乳動物若しくは変異体ＢＥＨＡＢを発現する哺乳動物と比較した場合により大きな腫瘍体積およびより短い生存時間を有することを最初に示す。従って、当業者は、原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法がＢＥＨＡＢ発現を阻害することを包含することを確実に認識するであろう。
【０１９２】
ＢＥＨＡＢの発現および／若しくは活性の阻害剤を哺乳動物に投与してそれによりＢＥＨＡＢを減少させかつ治療的利益を提供する。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、当該技術分野で公知の若しくは将来開発されるべき非常に多数の技術を使用してＢＥＨＡＢを阻害し得ることを認識するであろう。すなわち、本発明はＢＥＨＡＢ発現を阻害すること、例えば転写および／若しくは翻訳の阻害を包含する。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、低下されたレベルのＢＥＨＡＢ発現および／若しくは活性が、限定されるものでないが低下された腫瘍の大きさおよび上昇された生存率を挙げることができる多様な効果を媒介したからである。従って、ＢＥＨＡＢを阻害することは、限定されるものでないが該タンパク質をコードする核酸の翻訳および／若しくは転写を阻害することを挙げることができる。
【０１９３】
さらに、当業者は、本明細書の別の場所に提供される開示に基づき、ＢＥＨＡＢの阻害が限定されるものでないが該分子の生物学的活性を阻害することを挙げることができることを理解するであろう。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータが示すように、ＢＥＨＡＢ活性の阻害が、ＢＥＨＡＢが内因性プロテアーゼにより切断されないために、原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を制限するからである。これらのデータは、ＢＥＨＡＢ活性の阻害が限定されるものでないが原発性ＣＮＳ腫瘍などを挙げることができる疾患の処置に治療的利益を提供することを示す。
【０１９４】
本発明はＢＥＨＡＢをコードする核酸の発現を阻害することによりＢＥＨＡＢを阻害することを包含する。遺伝子の発現の阻害方法は当業者に公知であり、そしてリボザイム若しくはアンチセンス核酸分子の使用を包含する。
【０１９５】
アンチセンス核酸分子はｍＲＮＡ分子のなんらかの部分に相補的であるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子である。細胞中に存在する場合、アンチセンス核酸は既存のｍＲＮＡ分子にハイブリダイズしかつ遺伝子産物への翻訳を阻害する。アンチセンス核酸分子を使用して遺伝子の発現を阻害することは、アンチセンス核酸分子の細胞中での発現方法がそうであるように（Ｉｎｏｕｅ、１９９３、米国特許第５，１９０，９３１号明細書）当該技術分野で公知である（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ、１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２８９）。
【０１９６】
本発明はリボザイムを使用してＢＥＨＡＢの発現を阻害することを包含する。遺伝子発現を阻害するためにリボザイムを使用することは当業者に公知である（Ｃｅｃｈら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２；Ｈａｍｐｅｌら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：４９２９−４９３３；Ａｌｔｍａｎら、１９９２、米国特許第５，１６８，０５３号明細書）。リボザイムは他の一本鎖ＲＮＡ分子を切断する能力をもつ触媒的ＲＮＡ分子である。リボザイムは配列特異的であることが既知であり、そして従って特定のヌクレオチド配列を認識するよう改変し得（Ｃｅｃｈら、１９８８、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０−３０３４）、特定のｍＲＮＡ分子の選択的切断を可能にする。ＢＥＨＡＢのヌクレオチド配列が当該技術分野で公知である（Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄら、１９９７、米国特許第５，６３５，３７０号明細書）ことを考えれば、当業者は、本明細書に組込まれる開示および参考文献を提供されて、過度の実験を伴わずにアンチセンスポリヌクレオチド若しくはリボザイムを合成し得る。
【０１９７】
当業者は、本開示および本明細書に提示されるデータで備えをする場合に、ＢＥＨＡＢの切断が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を媒介することをさらに認識するであろう。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わない一方、ＢＥＨＡＢは通常は低レベルで内因性に発現されかつ正常の発現の間に原発性ＣＮＳ腫瘍を必ずしも引き起こさない一方で、ＢＥＨＡＢの切断若しくはより具体的には切断事象の産物が哺乳動物において原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を媒介すると理論上想定し得る。それにより、当業者により認識されるであろうとおり、ＢＥＨＡＢ切断生成物の活性を阻害することを、原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられている哺乳動物の治療方法として使用し得る。
【０１９８】
本発明はまた、本発明の方法を実施するための適切な抗体、タンパク質若しくはペプチド、ミメトープ、ペプチド模倣物、および／または単離された核酸の製薬学的組成物の使用も包含し、該組成物は適切な抗体、タンパク質若しくはペプチド、ミメトープ、ペプチド模倣物、および／または単離された核酸ならびに製薬学的に許容できる担体を含んでなる。
【０１９９】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、適切な抗体、タンパク質若しくはペプチド、ミメトープ、ペプチド模倣物、および／または単離された核酸を組合せることができかつ組合せ後に適切な抗体、タンパク質若しくはペプチド、ミメトープ、ペプチド模倣物、および／または単離された核酸を哺乳動物に投与するのに使用し得る化学的組成物を意味している。
【０２００】
本発明を実施するのに有用な製薬学的組成物は１ｎｇ／ｋｇ／日と１００ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量を送達するように投与しうる。一態様において、本発明は、哺乳動物において１μＭと１０μＭとの間の本発明の化合物の濃度をもたらす用量の投与を想像している。
【０２０１】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口の固体製剤、眼、坐剤、エアゾル剤、局所若しくは他の類似の製剤で全身に投与してよい。それらは硬膜下腔内に、脳室内に、脳実質内に、直接注入を介して、若しくは生物工作されたポリマーを介してＣＮＳ中に直接投与し得る。適切な抗体、タンパク質若しくはペプチド、ミメトープ、ペプチド模倣物、および／または単離された核酸に加え、こうした製薬学的組成物は、製薬学的に許容できる担体および薬物投与を高めかつ助長することが既知の他の成分を含有してよい。ナノ粒子、リポソーム、再封止赤血球および免疫学に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って適切なヒペリシン誘導体を投与するのに使用してよい。
【０２０２】
本明細書に記述される方法のいずれかを使用して同定される化合物を本明細書に開示される疾患の処置のため処方かつ哺乳動物に投与してよいを今や記述する。
【０２０３】
本発明は、有効成分として本明細書に開示される疾患の治療に有用な化合物を含んでなる製薬学的組成物の製造および使用を包含する。こうした製薬学的組成物は、被験体への投与に適する形態の有効成分単独よりなってよいか、あるいは、製薬学的組成物は、有効成分および１種若しくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、１種若しくはそれ以上の付加的な成分またはこれらのなんらかの組合せを含んでよい。有効成分は、当該技術分野で公知であるような生理学的に許容できる陽イオン若しくは陰イオンと組合せでのような生理学的に許容できるエステル若しくは塩の形態で製薬学的組成物中に存在してよい。
【０２０４】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、有効成分を組合せてよくかつ組合せ後に有効成分を被験体に投与するのに使用し得る化学的組成物を意味している。
【０２０５】
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステル若しくは塩という用語は、該組成物が投与されるべきである被験体に対し有害でない、製薬学的組成物のいずれの他の成分とも適合性である有効成分のエステル若しくは塩の形態を意味している。
【０２０６】
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は薬理学の技術分野で既知の若しくはこの後に開発されるいかなる方法により製造してもよい。一般に、こうした調製（ｐｒｅｐａｒａｔｏｒｙ）方法は、有効成分を担体または１種若しくはそれ以上の他の付属成分との連合にもたらす段階、およびその後必要な若しくは所望の場合は生成物を所望の単一若しくは複数用量単位に造形若しくは包装する段階を包含する。
【０２０７】
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は原則的にヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に向けられるとは言え、こうした組成物は全部の種類の哺乳動物への投与に一般に適することが当業者により理解されるであろう。製薬学的組成物を多様な動物への投与に適するようにするためのヒトへの投与に適する該組成物の改変は十分に理解されており、そして、通常に熟練した家畜薬理学者は単に通常の（あれば）実験でこうした改変を設計かつ実施し得る。本発明の製薬学的組成物の投与を企図している被験体は、限定されるものでないがヒトおよび他の霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連する哺乳動物を包含する哺乳動物、げっ歯類（ラットおよびマウスを包含する）、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウのような商業的に関連する鳥類を包含する鳥類を挙げることができる。
【０２０８】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬側、眼、硬膜下腔内、脳室内、脳実質内若しくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。他の企図している製剤は突起状ナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球および免疫学に基づく製剤を包含する。
【０２０９】
本発明の製薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として若しくは複数の単一単位用量として製造、包装若しくは販売してよい。本明細書で使用されるところの「単位用量」は予め決められた量の有効成分を含んでなる製薬学的組成物の個別の量である。有効成分の量は一般に、被験体に投与されるであろう有効成分の投薬量、または例えばこうした投薬量の１／２若しくは１／３のようなこうした投薬量の便宜的画分に等しい。
【０２１０】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容できる担体およびいずれかの付加的な成分の相対量は、治療される被験体の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさおよび状態に依存して、また、該組成物が投与されるべきである経路にさらに依存して変動することができる。例として、該組成物は０．１％と１００％（ｗ／ｗ）との間の有効成分を含んでよい。
【０２１１】
有効成分に加え、本発明の製薬学的組成物は１種若しくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含んでよい。とりわけ企図している付加的な剤は制吐薬、ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャーを包含する。
【０２１２】
本発明の製薬学的組成物の制御放出若しくは徐放性製剤を、慣習的技術を使用して作成してよい。
【０２１３】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、それぞれ予め決められた量の有効成分を含有する、限定されるものでないが錠剤、硬若しくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または舐剤を挙げることができる個別の固体の投与単位の形態で製造、包装若しくは販売してよい。経口投与に適する他の製剤は、限定されるものでないが粉末状若しくは顆粒状製剤、水性若しくは油性懸濁剤、水性若しくは油性溶液または乳剤を挙げることができる。
【０２１４】
本明細書で使用されるところの「油性」液体は炭素含有液体分子を含んでなりかつ水より小さい極性の特徴を表すものである。
【０２１５】
有効成分を含んでなる錠剤は、例えば、場合によっては１種若しくはそれ以上の付加的な成分とともに有効成分を圧縮若しくは成形することにより作成してよい。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、賦形剤、表面活性剤および分散助剤の１種若しくはそれ以上と場合によっては混合される粉末若しくは顆粒状調製物のような自由に流動する形態の有効成分を適する装置中で圧縮することにより製造してよい。成形錠剤は、有効成分、製薬学的に許容できる担体、および該混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を適する装置中で成形することにより作成してよい。錠剤の製造で使用される製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが不活性希釈剤、顆粒化剤および崩壊剤、結合剤ならびに滑沢剤を挙げることができる。既知の分散助剤は、限定されるものでないがバレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを挙げることができる。既知の表面活性剤は限定されるものでないがラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。既知の希釈剤は、限定されるものでないが炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。既知の顆粒化剤および崩壊剤は限定されるものでないがトウモロコシデンプンおよびアルギン酸を挙げることができる。既知の結合剤は、限定されるものでないがゼラチン、アラビアゴム、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを挙げることができる。既知の滑沢剤は限定されるものでないがステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを挙げることができる。
【０２１６】
錠剤はコーティングしなくてもよいか、若しくはそれらは被験体の胃腸管中での遅延崩壊を達成してそれにより有効成分の持続性の放出および吸収を提供するための既知の方法を使用してコーティングしてよい。例として、グリセリルモノステアレート若しくはグリセリルジステアレートのような物質を使用して錠剤をコーティングしてよい。さらに例として、錠剤は、米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記述される方法を使用してコーティングして浸透圧制御放出錠剤を形成してもよい。錠剤は、製薬学的に洗練されかつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、着香料、着色剤、保存剤若しくはこれらのなんらかの組合せをさらに含んでもよい。
【０２１７】
有効成分を含んでなる硬カプセルはゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成してよい。こうした硬カプセル剤は有効成分を含んでなり、そして例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンのような不活性の固体の希釈剤を包含する付加的な成分をさらに含んでもよい。
【０２１８】
有効成分を含んでなる軟ゼラチンカプセルはゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成してよい。こうした軟カプセル剤は、水またはラッカセイ油、流動パラフィン若しくはオリーブ油のような油媒体と混合されていてもよい有効成分を含んでなる。
【０２１９】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体の形態で、または使用前の水若しくは別の適するベヒクルとの再構成に意図されている乾燥生成物の形態でのいずれかで製造、包装かつ販売してよい。
【０２２０】
液体懸濁剤は、水性若しくは油性ベヒクル中の有効成分の懸濁の慣習的達成方法を使用して製造してよい。水性ベヒクルは例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性ベヒクルは、例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油、分画植物油および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。液体懸濁剤は、限定されるものでないが懸濁化剤、分散助剤若しくは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、着香料、着色剤および甘味料を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分をさらに含んでもよい。油性懸濁剤は増粘剤をさらに含んでもよい。既知の懸濁化剤は、限定されるものでないがソルビトールシロップ、硬化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を挙げることができる。既知の分散助剤若しくは湿潤剤は、限定されるものでないがレシチンのような天然に存在するホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸およびへキシトール由来の部分エステル、若しくは脂肪酸およびへキシトール無水物由来の部分エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物（例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を挙げることができる。既知の乳化剤は限定されるものでないがレシチンおよびアラビアゴムを挙げることができる。既知の保存剤は、限定されるものでないがパラヒドロキシ安息香酸メチル、エチル若しくはｎ−プロピル、アスコルビン酸およびソルビン酸を挙げることができる。既知の甘味料は例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンを包含する。油性懸濁剤のための既知の増粘剤は例えばミツロウ、固形パラフィンおよびセチルアルコールを包含する。
【０２２１】
水性若しくは油性溶媒中の有効成分の液体溶液は液体懸濁剤と実質的に同一の様式で製造してよく、主な差異は有効成分が溶媒に懸濁されるよりはむしろ溶解されることである。本発明の製薬学的組成物の液体溶液は液体懸濁剤に関して記述された化合物のそれぞれを含んでよく、懸濁化剤は溶媒中での有効成分の溶解を必ずしも補助するものではないことができることが理解される。水性溶媒は例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性溶媒は例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油、分画植物油および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。
【０２２２】
本発明の製薬学的製剤の粉末状および顆粒状製剤は既知の方法を使用して製造してよい。こうした製剤を被験体に直接投与してよく、例えば錠剤を形成するため、カプセルを充填するため、またはそれへの水性若しくは油性ベヒクルの添加により水性若しくは油性の懸濁剤若しくは溶液を製造するために使用してよい。これらの製剤のそれぞれは、分散助剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤および保存剤の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。増量剤および甘味料、着香料若しくは着色剤のような付加的な賦形剤もまたこれらの製剤中に包含してよい。
【０２２３】
本発明の製薬学的組成物は水中油型乳剤若しくは油中水型乳剤の形態で製造、包装若しくは販売してもまたよい。油相はオリーブ油若しくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組合せであってよい。こうした組成物は、アラビアゴム若しくはトラガカントガムのような天然に存在するガム、ダイズ若しくはレシチンホスファチドのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸およびへキシトール無水物の組合せ由来のエステル若しくは部分エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとのこうした部分エステルの縮合生成物のような１種若しくはそれ以上の乳化剤をさらに含んでもよい。これらの乳剤はまた、例えば甘味料若しくは着香料を包含する付加的な成分も含有してよい。
【０２２４】
本発明の製薬学的組成物は直腸投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした組成物は例えば坐剤、保持浣腸製剤および直腸若しくは結腸灌注のための溶液の形態にあってよい。
【０２２５】
坐剤製剤は、通常の室温（すなわち約２０℃）で固体でありかつ被験体の直腸温（すなわち健康なヒトで約３７℃）で液体である非刺激性の製薬学的に許容できる賦形剤と有効成分を組合せることにより作成してよい。適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないがカカオバター、ポリエチレングリコールおよび多様なグリセリドを挙げることができる。坐剤製剤は限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的な成分をさらに含んでもよい。
【０２２６】
保持浣腸製剤または直腸若しくは結腸灌注のための溶液は、製薬学的に許容できる液体担体と有効成分を組合せることにより作成してよい。当該技術分野で公知であるとおり、浣腸製剤は被験体の直腸の解剖学に適合された送達装置を使用して投与してよく、また、それ内に包装してよい。浣腸製剤は限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的な成分をさらに含んでもよい。
【０２２７】
本発明の製薬学的組成物は膣投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした組成物は例えば坐剤、含浸若しくは被覆されたタンポンのような膣に挿入可能な物質、灌注製剤、またはゲル剤若しくはクリーム剤あるいは膣灌注のための溶液の形態にあってよい。
【０２２８】
化学的組成物での物質の含浸若しくは被覆方法は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが、その後の乾燥を伴う若しくは伴わない、表面上への化学的組成物の堆積若しくは結合方法、物質の合成の間の物質の構造中への化学的組成物の組込み方法（すなわち生理学的に分解可能な物質を用いるような）、および吸収性素材中への水性若しくは油性の溶液若しくは懸濁液の吸収方法を挙げることができる。
【０２２９】
膣灌注のための灌注製剤若しくは溶液は、製薬学的に許容できる液体担体と有効成分を組合せることにより作成してよい。当該技術分野で公知であるとおり、灌注製剤は、被験体の膣の解剖学に適応された送達装置を使用して投与してよく、また、それ内に包装してよい。灌注製剤は限定されるものでないが抗酸化剤、抗生物質、抗真菌薬および保存剤を挙げることができる多様な付加的な成分をさらに含んでもよい。
【０２３０】
本明細書で使用されるところの製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的断裂および組織中の該断裂を通る製薬学的組成物の投与を特徴とするいかなる投与経路も包含する。非経口投与は、従って、限定されるものでないが組成物の注入、外科的創を通る組成物の適用、組織浸透性の非外科的創傷を通る組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることを企図している。
【０２３１】
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水若しくは滅菌の等張の生理的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組合せられた有効成分を含んでなる。こうした製剤は、ボーラス投与若しくは連続投与に適する形態で製造、包装若しくは販売してよい。注入可能な製剤は、アンプル若しくは保存剤を含有する複数用量の容器中のような単位投与剤形で製造、包装若しくは販売してよい。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、パスタ剤、および埋込可能な徐放性若しくは生物分解性の製剤を挙げることができる。こうした製剤は、限定されるものでないが懸濁化剤、安定剤若しくは分散助剤を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分をさらに含んでもよい。非経口投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与前に適するベヒクル（例えば滅菌の発熱性物質を含まない水）との再構成のための乾燥した（すなわち粉末若しくは顆粒状の）形態で提供される。
【０２３２】
製薬学的組成物は滅菌の注入可能な水性若しくは油性の懸濁剤若しくは溶液の形態で製造、包装若しくは販売してよい。この懸濁剤若しくは溶液は既知技術に従って処方してよく、そして、有効成分に加え、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤若しくは懸濁化剤のような付加的な成分を含んでよい。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水若しくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒を使用して製造してよい。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないがリンゲル液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成のモノ若しくはジグリセリドのような不揮発性油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、微晶質の形態で、リポソーム製剤中に、若しくは生物分解性のポリマー系の一成分として有効成分を含んでなるものを包含する。持続放出若しくは埋込のための組成物は乳剤、イオン交換樹脂、ほとんど不溶性のポリマー若しくはほとんど不溶性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー性若しくは疎水性物質を含んでよい。
【０２３３】
局所投与に適する製剤は、限定されるものでないが、リニメント剤、ローション剤のような液体若しくは半液体製剤、クリーム剤、軟膏剤若しくはパスタ剤のような水中油型若しくは油中水型乳剤、および溶液または懸濁剤を挙げることができる。局所で投与可能な製剤は例えば約１％から約１０％（ｗ／ｗ）までの有効成分を含んでよいが、とは言え有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解性の限界くらい高くてもよい。局所投与のための製剤は本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。
【０２３４】
本発明の製薬学的組成物は頬腔を介する肺投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした製剤は、有効成分を含んでなりかつ約０．５から約７ナノメートルまで、および好ましくは約１から約６ナノメートルまでの範囲の直径を有する乾燥粒子を含んでよい。こうした組成物は、便宜的に、噴射剤の流れが粉末を分散するように向けられてよい乾燥粉末貯留槽を含んでなる装置を使用する、または封止容器中の低沸点噴射剤に溶解若しくは懸濁された有効成分を含んでなる装置のような自己噴射性溶媒／粉末分注容器を使用する投与のための乾燥粉末の形態にある。好ましくは、こうした粉末は、粒子重量の最低９８％が０．５ナノメートルより大きい直径を有しかつ粒子数の最低９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含んでなる。より好ましくは、粒子重量の最低９５％が１ナノメートルより大きい直径を有しかつ粒子数の最低９０％が６ナノメートルより小さい直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは糖のような固体の微細な粉末希釈剤を包含しかつ単位投与剤形で便宜的に提供される。
【０２３５】
低沸点噴射剤は一般に大気圧で６５°Ｆより下の沸点を有する液体噴射剤を包含する。一般に、噴射剤は組成物の５０ないし９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してよく、そして有効成分は組成物の０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）を構成してよい。噴射剤は、液体の非イオン性若しくは固体の陰イオン性界面活性剤または固体の希釈剤（好ましくは有効成分を含んでなる粒子と同一次の粒子径を有する）のような付加的な成分をさらに含んでもよい。
【０２３６】
肺送達のため処方される本発明の製薬学的組成物は溶液、懸濁液若しくは遅延放出ポリマーの液滴の形態の有効成分もまた提供してもよい。こうした製剤は、有効成分を含んでなる場合によっては滅菌の水性若しくは希薄アルコール性の溶液若しくは懸濁剤として製造、包装若しくは販売してよく、そして、便宜的には、いかなる噴霧化（ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ）若しくは噴霧化（ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）装置を使用して投与してもよい。こうした製剤は、限定されるものでないが、サッカリンナトリウム、揮発性油のような着香料、緩衝剤、表面活性剤、若しくはヒドロキシ安息香酸メチルのような保存剤を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分をさらに含んでもよい。本投与経路により提供される液滴は、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均直径を有する。
【０２３７】
肺送達に有用であるとして本明細書に記述される製剤はまた、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にも有用である。
【０２３８】
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んでなりかつ約０．２から５００マイクロメートルまでの平均粒子を有する粗い散剤である。こうした製剤は嗅剤が服用される様式で、すなわち鼻孔近くに保持された散剤の容器からの鼻通路を通る急速な吸入により投与する。
【０２３９】
別の製剤は遅延放出ポリマー中に組込まれた有効成分である。こうしたポリマーは製薬学的技術で公知であり、そして例えば米国特許明細書（第４，７２８，５１２号；第４，７２８，５１３号；第５，０８４，２８７号；第５，２８５，１８６号）に詳述されている。
【０２４０】
鼻投与に適する製剤は、例えば約０．１％（ｗ／ｗ）および約１００％（ｗ／ｗ）の有効成分からを含んでよく、そして、本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。
【０２４１】
本発明の製薬学的組成物は頬側投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした製剤は、例えば慣習的方法を使用して作成される錠剤若しくは舐剤の形態にあってよく、かつ、例えば０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）の有効成分よく、該均衡は経口で溶解可能な若しくは分解可能な組成物および場合によっては本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上を含んでなる。あるいは、頬側投与に適する製剤は、有効成分を含んでなる散剤、またはエアゾル化若しくは噴霧化される溶液若しくは懸濁剤を含んでよい。こうした粉末状、エアゾル化若しくはエアゾル化される製剤は、分散される場合に好ましくは約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均粒子若しくは液滴径を有し、また、本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。
【０２４２】
本発明の製薬学的組成物は眼投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした製剤は例えば、例えば水性若しくは油性の液体担体中の有効成分の０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）の溶液若しくは懸濁剤を包含する点眼剤の形態にあってよい。こうした滴剤は緩衝剤、塩、または本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上の他者をさらに含んでもよい。有用である他の眼で投与可能な製剤は、微晶質の形態の若しくはリポソーム製剤中に有効成分を含んでなるものを包含する。
【０２４３】
本発明の製薬学的組成物は直接ＣＮＳ投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売し得る。こうした製剤は、例えば、Ｏｍｍａｙａ貯留槽、硬膜下腔内若しくは脳室内投与、直接脳実質内注入、遅延放出ポリマー、または製薬学的および神経学的分野で公知の他のこうした方法により投与される液体の形態にあってもよい。
【０２４４】
本明細書で使用されるところの「付加的な成分」は、限定されるものでないが以下すなわち賦形剤；表面活性剤；分散助剤；不活性希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；着香料；着色剤；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性ベヒクルおよび溶媒；油性ベヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散助剤若しくは湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；増量剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌薬；安定剤；ならびに製薬学的に許容できるポリマー性若しくは疎水性物質の１種若しくはそれ以上を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物に包含されうる他の「付加的な成分」は当該技術分野で既知でありかつ例えばＧｅｎａｒｏ編、１９８５、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、フィラデルフィア州イーストン（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
【０２４５】
典型的には、哺乳動物、好ましくはヒトに投与してよい本発明の化合物の投薬量は、動物の体重１キログラムあたり１μｇから約１００ｇまでの量の範囲にわたる。一方で、投与される正確な投薬量は、限定されるものでないが治療されている動物の型および疾患状態の型、動物の齢ならびに投与経路を挙げることができるいずれかの数の因子に依存して変動することができる。好ましくは、該化合物の投薬量は動物の体重１キログラムあたり約１ｍｇから約１０ｇまで変動することができる。より好ましくは、該投薬量は動物の体重１キログラムあたり約１０ｍｇから約１ｇまで変動することができる。
【０２４６】
該化合物は１日数回程度頻繁に哺乳動物に投与してよいか、あるいは、それは１日１回、週１回、２週ごとに１回、月１回のようにより少なく頻繁に、あるいは数ヶ月ごとに１回、または年１回若しくはより少なくさえのようななおより少なく頻繁に投与してよい。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、かつ、限定されるものでないが、治療されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などを挙げることができるいずれかの数の因子に依存することができる。
【０２４７】
本発明はさらに、免疫治療を使用する原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を含んでなる。すなわち、本発明は、免疫エフェクター細胞によるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを発現する腫瘍の認識を助長するために免疫系を調節してそれにより腫瘍を破壊することによる原発性ＣＮＳ腫瘍の治療方法を包含する。これは、本明細書に開示されるデータにより示されるとおり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはアッセイされる全部のヒト神経膠腫サンプルで独占的に発現されかつ健康なヒト脳組織で発現されないからである。従って、本発明は、健康な組織を害することを伴わない、原発性ＣＮＳ腫瘍の免疫治療に媒介される処置方法を提供する。
【０２４８】
免疫治療は抗腫瘍効果を直接若しくは間接的に媒介し得るエフェクター細胞のような確立した腫瘍免疫反応性を伴う剤の送達を含み得る。エフェクター細胞の例は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを発現するＴ細胞、Ｔリンパ球（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー腫瘍浸潤リンパ球のような）、キラー細胞（ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化型キラー細胞のような）、Ｂ細胞ならびに抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージのような）を包含する。Ｔ細胞受容体およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに特異的な抗体受容体を、養子免疫治療のために他のベクター若しくはエフェクター細胞中にクローン化し、それら中で発現させかつそれらに移入してよい。
【０２４９】
エフェクター細胞は、一般に、当該技術分野で公知の技術を使用して患者から得そして十分な量が免疫治療に利用可能となるまでｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させてよい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原認識の保持を伴う数十億の数までの抗原特異的エフェクター細胞の増殖のための培養条件は当該技術分野で公知である。こうしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養条件は、典型的には、しばしばサイトカイン（ＩＬ−２のような）および非分裂フィーダー細胞の存在下でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢでの間欠的刺激を含むとみられる。とりわけ、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞および／若しくはＢ細胞のような抗原提示細胞にグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを間欠的に投与しかつｅｘ  ｖｉｖｏ免疫治療のため増殖させ得る。抗原特異的免疫エフェクター細胞を得る方法および培養方法は当該技術分野で公知でありかつ例えばＣｈｅｅｖｅｒら（１９９７、Ｉｍｍ．Ｒｅｖ．１５７：１７７−１９４）に記述されている。
【０２５０】
あるいは、ＢＥＨＡＢタンパク質を発現するベクターは患者から採取した樹状細胞のような抗原提示細胞に導入しかつ同一患者に戻す移植のためｅｘ  ｖｉｖｏでクローン性に繁殖し得る。トランスフェクトした細胞は、当該技術分野で既知のいずれかの手段を使用して好ましくは静脈内、腔内、腹腔内若しくは腫瘍内投与により無菌形態で患者に再導入してよい。免疫エフェクター細胞のトランスフェクション、増殖および再導入方法は当該技術分野で公知でありかつ例えば米国特許第６，５００，６４１号明細書およびＣｈｅｅｖｅｒら（１９９７、Ｉｍｍ．Ｒｅｖ．１５７：１７７−１９４）に記述されている。
【０２５１】
本明細書に記述される免疫治療の投与の経路および頻度ならびに投薬量は個体ごとに変動することができ、かつ、当該技術分野で公知の標準的技術を使用して容易に確立しうる。原発性ＣＮＳ腫瘍の免疫治療に対する応答は、患者中の抗腫瘍抗体を測定することにより、若しくは免疫治療の実施後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで患者の腫瘍細胞を殺すことが可能な細胞溶解性エフェクター細胞の生成によりモニターし得る。こうした免疫治療はまた、治療した患者において未治療の患者に比較して改良された臨床転帰（例えばより高頻度の寛解、完全若しくは部分的またはより長い疾患を伴わない生存）に至る免疫応答を引き起こすことが可能でもあるはずである。
Ｂ．原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法
本発明はさらに、限定されるものでないが神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫、リンパ腫などを挙げることができる原発性ＣＮＳ腫瘍、他の中枢神経系の腫瘍、およびＢＥＨＡＢに関連する他の神経病理学的障害の診断方法を包含する。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、ＢＥＨＡＢの過剰発現が原発性ＣＮＳ腫瘍などの進行および浸潤性と高度に相関するからである。本発明は、従って、哺乳動物におけるＢＥＨＡＢの発現のレベルの測定方法および従って原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法を包含する。本明細書で列挙される全部の例において、原発性ＣＮＳ腫瘍の治療であろうと診断であろうと、最も好ましい哺乳動物はヒトである。
【０２５２】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法を包含する。該方法は、第一の哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、および、そのサンプル中のＢＥＨＡＢ（発現、量、活性）のレベルをそれ以外は第一の哺乳動物に同一であるがしかし原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられていない正常の第二の哺乳動物から得たサンプル中のＢＥＨＡＢのレベルと比較することを含んでなる。原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられていない第二のそれ以外は同一の哺乳動物から得たサンプル中のＢＥＨＡＢのレベルに比較して第一の哺乳動物からのサンプル中のＢＥＨＡＢのより高レベルは、第一の哺乳動物が原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられていることの指標である。これは、本明細書の別の場所で開示されるとおり、ＢＥＨＡＢ発現の増大されたレベルがとりわけより大きな腫瘍体積および低下された生存率と関連するからである。
【０２５３】
本発明はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトを包含する哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法も包含する。すなわち、本発明は哺乳動物若しくは哺乳動物からの生物学的サンプルいずれかでの原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法を包含する。該方法は、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルを評価しかつ原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われない哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルと比較することを含んでなる。原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われない哺乳動物に比較した場合の原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのより高レベルは、原発性ＣＮＳ腫瘍を有することが疑われる動物が実際に原発性ＣＮＳ腫瘍を有することの指標であり、それにより原発性ＣＮＳ腫瘍を診断する。
【０２５４】
生物学的サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルを比較することは、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング技術のような抗体での検出、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のようなタンパク質検出技術、ＰＣＲおよびＬＣＲのような核酸技術、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングを包含する核酸ハイブリダイゼーション技術、ならびに当該技術分野で公知の他の技術を包含する本明細書に開示される若しくは当該技術分野で既知の方法のいずれかを使用して達成し得る。一例として、生物学的サンプルを哺乳動物から得かつそのサンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルについて評価し得る。生物学的サンプルは、限定されるものでないが血液、尿、糞便、神経組織、脳脊髄液、唾液、脳組織などを挙げることができる。生物学的サンプルは得られるべき生物学的サンプルに依存して多様な方法により得ることができる。例えば血液は静脈穿刺により得ることができ；尿、糞便および唾液は試料容器に捕捉し得る、などである。限定されるものでないが脳組織および神経組織を挙げることができる組織サンプルは生検若しくは当該技術分野で公知の類似の方法により得ることができる。脳脊髄液は当該技術分野で公知の方法を使用する脊椎穿刺により収集し得る。
【０２５５】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのｉｎ  ｖｉｖｏ検出若しくはグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢに関係する原発性ＣＮＳ腫瘍の診断のために、当業者は、哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの検出のために標識抗体若しくは核酸を使用し得る。こうした抗体は本明細書の別の場所に記述される技術を使用して生成し得、そしてその後多数の方法により標識若しくは検出の可能な他の分子に複合し得る。標識若しくは他の分子の抗体への複合方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書の別の場所に記述されるタンパク質化学における技術を使用して達成し得る。一例として、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを結合する抗体を放射活性同位元素に複合し得、そして、同位元素標識抗体の結合をＸ線フィルムのような放射活性に感受性のフィルム上で検出し得る。抗体はまた、磁気共鳴画像化技術に対し可視的な標識にも結合し得る。さらに、本発明は、ルシフェラーゼ若しくは緑色蛍光タンパク質のような蛍光分子、またはワサビペルオキシダーゼ、蛍光分子、酵素、金、ビオチン、放射活性同位原子若しくはガドリニウムのような別の標識に抗体を複合し、そして標識を可視化することが可能な画像化系によりグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームへの該抗体の結合を検出する方法を包含する。蛍光標識のｉｎ  ｖｉｖｏ検出のためのバイオフォトニック（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ）画像化系の使用は当該技術分野で公知でありかつこうした系は商業的に入手可能である（Ｘｅｎｏｇｅｎ、カリフォルニア州アラメダ）。本発明はさらに哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の進行の診断方法を包含する。本開示および本明細書のデータで一旦備えをすれば当業者により認識されるであろうとおり、ＢＥＨＡＢ切断は脳腫瘍の進行を媒介し、とりわけより大きな腫瘍体積および短縮された生存時間をもたらす。従って、本発明は哺乳動物における脳腫瘍の進行の診断方法を包含する。該方法は、第一の哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、および、標準的神経学的指標を使用して当業者に容易に測定され得るとおり、そのサンプル中のＢＥＨＡＢ切断のレベルを、それ以外は第一の哺乳動物に同一であるがしかし原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられていない正常な第二の哺乳動物、若しくは該第二の哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍まで進行していない原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられているから得たサンプル中のＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較することを含んでなる。第二のそれ以外は同一の哺乳動物から得たサンプル中のＢＥＨＡＢ切断のレベルに比較して第一の哺乳動物からのサンプル中のＢＥＨＡＢ切断のより高レベルは、第一の哺乳動物がより高速で進行する原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられていることの指標である。これは、本明細書の別の場所で開示されるとおり、ＢＥＨＡＢ切断の増大されたレベルがより大きな腫瘍体積および低下された生存率などと関連するからである。
【０２５６】
当業者は、本開示および本明細書のデータで備えをする場合に、ＢＥＨＡＢ切断のレベルの測定方法が限定されるものでないがウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡおよび当該技術分野で公知の他の免疫検出アッセイを挙げることができることを認識するであろう。
【０２５７】
一局面において、生物学的サンプルは血液サンプル、神経学的組織生検、脳脊髄液サンプル、尿、唾液などより成る群から選択される。
【０２５８】
本発明は哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性の評価方法を包含する。該方法は、増大されたＢＥＨＡＢ発現により媒介される若しくはそれと関連する疾患、障害若しくは状態（例えば原発性ＣＮＳ腫瘍など）の指定された１クールの処置の前、間および後にＢＥＨＡＢ発現、量および／若しくは活性のレベルを評価することを含んでなる。これは、本明細書の別の場所に以前に述べられたとおり、増大されたＢＥＨＡＢ発現、量および／若しくは活性が、より大きな腫瘍体積および低下された動物の生存率と関連するか若しくはそれらを媒介するからであり、これは原発性ＣＮＳ腫瘍による増大された死亡の一特徴である。
【０２５９】
従って、ＢＥＨＡＢ発現／量／活性に対する１クールの処置の効果を評価することは、より低レベルのＢＥＨＡＢ発現、量若しくは活性が該処置方法が成功裏であることを示すような処置の有効性を示す。
【０２６０】
評価されるべき治療のクールは、限定されるものでないが、本明細書に開示される原発性ＣＮＳ腫瘍に対する外科手術、化学療法、放射線治療および／若しくは複数の治療様式を挙げることができる。
【０２６１】
本発明はまた哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性の評価方法も包含する。該方法は、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の実施の前、間若しくは後の哺乳動物におけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルを評価することを含んでなる。一例として、哺乳動物からの生物学的サンプルを原発性ＣＮＳ腫瘍の治療の実施前に得、そして他のサンプルは原発性ＣＮＳ腫瘍の治療が実施されている間および後に得る。生物学的サンプルの収集は当該技術分野で公知かつ本明細書の別の場所に記述される方法に従って達成される。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルを本明細書の別の場所に開示される方法に従って評価する。過少グリコシル化ＢＥＨＡＢおよび未グリコシル化ＢＥＨＡＢを包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのレベルを原発性ＣＮＳ腫瘍の治療の前、間および後に採取した生物学的サンプル間で比較して、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性の指標を提供する。
【０２６２】
本発明はまた、原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の前、間および後に哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性を評価することも包含する。原発性ＣＮＳ腫瘍の治療の有効性は、本明細書の別の場所に開示されかつ当該技術分野で公知の技術を使用して哺乳動物で評価し得る。すなわち、本発明は、本明細書の別の場所に開示される方法を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのレベルを比較することによる原発性ＣＮＳ腫瘍の処置の有効性の評価方法を包含する。
【０２６３】
本発明はＢＥＨＡＢ遺伝子の発現、量若しくは活性を検出するためのプローブおよびプライマーを包含する。当業者は、本開示および本明細書に開示されるデータで備えをする場合に、ＢＥＨＡＢ遺伝子のＤＮＡ若しくはＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能であるプローブが提供されることを認識するであろう。本発明の目的上、プローブは、高若しくは中程度いずれかのストリンジェンシー（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）を参照されたい）の条件下でそれらがＢＥＨＡＢ遺伝子にハイブリダイズするがしかし無関係の遺伝子には有意に若しくは検出可能にしない場合にＢＥＨＡＢのＤＮＡ若しくはＲＮＡに「ハイブリダイズすることが可能」である。好ましくは、プローブは、６５℃での５×ＳＳＰＥ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６５℃で０．２×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳの存在下でのハイブリダイズされないプローブを除去するための最低１回の洗浄のような高ストリンジェンシー条件下で適するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。それ以外は本明細書に提供されるところを除き、プローブの配列はＢＥＨＡＢ遺伝子へのハイブリダイゼーションを可能にするがしかし他の遺伝子からのＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列にはしないように設計する。プローブを使用して、例えば、患者から単離された限定されるものでないが血液、脳脊髄液、リンパ若しくは組織を挙げることができる生物学的サンプル中に存在する核酸にハイブリダイズさせる。その後、ハイブリダイズされたプローブを検出し、それにより所望の細胞性核酸の存在を示す。当業者は、該細胞性核酸をハイブリダイゼーションの前にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅処置にかけ得ることを認識するであろう。あるいは、ＢＥＨＡＢ遺伝子を増幅しかつ増幅産物をＤＮＡシークェンシングにかけ得る。ＢＥＨＡＢ遺伝子は、ＤＮＡ配列分析、若しくは、特定のアレルへのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下および時間の間のＢＥＨＡＢ特異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出し得る。典型的に、ハイブリダイゼーション緩衝液は塩化テトラメチルアンモニウムなどを含有し得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）を参照されたい。
【０２６４】
本発明の核酸プローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、核酸類似物（例えばペプチド核酸）若しくはそれらのいずれかの組合せのいずれかから構成されてよく、そして、長さが約１２ヌクレオチド、通常は長さが約１４ないし１８ヌクレオチド、およびおそらくほぼＢＥＨＡＢ遺伝子の配列全体であり得る。プローブの大きさの選択はプローブの使用にいくぶん依存し、そして当該技術分野の技能内に十分にある。
【０２６５】
適するプローブは当該技術分野で公知である技術を使用して構築かつ標識し得る。例えば１２塩基のより短いプローブを合成で生成させかつＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して３２Ｐで標識し得る。約７５塩基ないし１．５ｋｂ未満のより長いプローブは、好ましくは、例えば、限定されるものでないが［α３２Ｐ］ｄＣＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ若しくはビオチン−ｄＡＴＰを挙げることができる標識前駆体の存在下でのＰＣＲ増幅により生成させる。１．５ｋｂ以上のプローブは、一般に、適切なプローブを含有するプラスミドで細胞をトランスフェクトすること、トランスフェクトした細胞を大量に増殖させること、およびトランスフェクトした細胞から適切な配列を精製することにより最も容易に増幅される。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）を参照されたい。
【０２６６】
プローブは、例えば放射活性マーカー、蛍光マーカー、酵素マーカーおよび色原体マーカーを包含する多様なマーカーにより標識し得る。３２Ｐの使用は特定のプローブの標識（ｍａｒｋｉｎｇ）すなわち標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）のほんの一例である。
【０２６７】
プローブを利用してサンプル内のＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡ若しくはＤＮＡの存在を検出し得ることが本発明の本局面の一特徴である。しかしながら、関連するサンプルが制限された数のみで存在する場合には、該適切な配列がより容易に検出され若しくは得られうるようにそれを増幅することが有益であり得る。
【０２６８】
選択された配列を増幅するために、例えばＲＮＡ増幅（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７−１２０２；Ｋｒａｍｅｒら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：４０１−４０２；Ｌｏｍｅｌｉら、１９８９、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．３５：１８２６−１８３１；米国特許第４，７８６，６００号明細書を参照されたい）、ならびにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）若しくはＰＣＲを利用するＤＮＡ増幅（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号明細書）（断裂しやすい結合の使用を含んでなる代替の検出／増幅系を記述する米国特許第４，８７６，１８７号および同第５，０１１，７６９号明細書もまた参照されたい）、または当該技術分野の通常の技能のレベル内に十分にある他の核酸増幅手順を包含する多様な方法を利用してよい。例えば、ＰＣＲに関して、該方法は当該技術分野で既知のとおり改変し得る。ＰＣＲの転写増強は、主要なオリゴヌクレオチドの１つ中へのバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の組込みにより達成し得、また、高められた放出体（ｅｍｉｔｔｅｒ）からの生成物の免疫酵素検出は、抗ＲＮＡ：ＤＮＡ抗体（Ｂｌａｉｓ、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：３４８−３５２）を使用して遂げてよい。ＰＣＲは、逆ドットブロットハイブリダイゼーション（Ｉｉｄａら、１９９３、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１４：１６７−１７２）と組合せてもまた使用し得る。ＰＣＲ産物はｄＵＴＰの取り込みにより定量的に分析することができ（Ｄｕｐｌａａら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６）、そして、ＰＣＲ遺伝子プローブ検出のためサンプルをフィルターサンプリングしうる（Ｂｅｊら、１９９１、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：３５２９−３５３４）。
【０２６９】
本発明は、ＢＥＨＡＢ  ＤＮＡを検出するのにＰＣＲを使用する、ＢＥＨＡＢの過剰発現の検出方法、および従って原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法を包含する。一例として、一本鎖ＤＮＡを生成させるために、ＤＮＡサンプルを約９２°ないし９５℃で変性させる。ＤＮＡサンプルはＲＮＡから生成させたｃＤＮＡであり得る。その後、プライマー中のＡＴ／ＧＣの比率および当該技術分野で公知の他の因子に依存して約３７℃ないし約７０℃で特異的プライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせる。鋳型に対する反対鎖を生成させるために、プライマーを例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ若しくは別の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで約７２℃で伸長させる。これらの段階が１周期を構成し、選択した配列を増幅するためにこれを反復し得る。より大きな特異性のためにネステッドＰＣＲを実施し得る。ネステッドＰＣＲにおいては、第一の増幅産物内の配列由来のプライマーの第二の組を使用して第二の増幅を実施する。十分な数のプライマーを使用して例えばｃＤＮＡからＢＥＨＡＢのコーディング領域全体を増幅して、それらの配列を決定するのに便宜的な大きさであるフラグメント長さを生成させうる。必要なプライマーの数は当業者に公知であろう。
【０２７０】
本発明はさらに、ＬＣＲ増幅を増幅に利用する方法を包含する。上流プライマーの５’塩基が、ＢＥＨＡＢ遺伝子を特異的に検出するための所望の遺伝子中の唯一の塩基対にハイブリダイズすることが可能であるようなＬＣＲプライマーを合成し得る。
【０２７１】
本発明の態様内で、標的核酸配列をＰＣＲにより増幅し、そしてその後所望の産物を例えば比色的オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：８９２３−８９２７）により測定する自動化した非同位元素の戦略で、該プローブを使用し得る。
【０２７２】
選択した配列の増幅のためのプライマーは、ＢＥＨＡＢに高度に特異的でありかつ標的配列と安定な二重鎖を形成する配列から選択すべきである。当該技術分野で公知であるとおり、プライマーはまた、とりわけ３’端で非相補的であるべきであり、それら自身若しくは他のプライマーと二量体を形成するべきでなく、そしてＤＮＡの他の領域と二次構造若しくは二重鎖を形成すべきでない。一般に、約１８ないし約２０ヌクレオチドのプライマーが好ましく、そして当該技術分野で公知の技術を使用して容易に合成し得る。ＰＣＲ産物および他の核酸増幅産物は、当該技術分野で公知の技術（Ｄｕｐｌａａら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６；Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１０２６−１０３０）を使用して定量しうる。
【０２７３】
当業者は、本開示および本明細書に開示されるデータで備えをする場合に、哺乳動物におけるＢＥＨＡＢ核酸の過剰発現を検出することが可能である診断薬を開発し得ることを容易に理解するであろう。これは、本明細書の別の場所のデータにより示されるとおり、哺乳動物におけるＢＥＨＡＢの増大された発現は、正常な内因性ＢＥＨＡＢ発現を伴う哺乳動物若しくは切断不可能なＢＥＨＡＢ変異体の過剰発現を伴う哺乳動物と比較した場合により大きな腫瘍および減少された生存時間をもたらすからである。それにより、哺乳動物若しくは細胞中でのＢＥＨＡＢ発現のレベルを測定することは、とりわけ原発性ＣＮＳ腫瘍などの検出のための強力かつ新規の診断技術として使用し得る。
Ｃ．有用な化合物の同定方法
本発明はさらに、細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを包含するＢＥＨＡＢの発現に影響を及ぼす化合物の同定方法を包含する。該方法は、細胞を試験化合物と接触させること、および、そのように接触させた細胞中のＢＥＨＡＢの発現のレベルを該化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中のＢＥＨＡＢの発現のレベルと比較することを含んでなる。ＢＥＨＡＢの発現のレベルが、試験化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞中のＢＥＨＡＢの発現のレベルに比較して該試験化合物と接触させた細胞中でより高い若しくは低い場合、これは該試験化合物が細胞中のＢＥＨＡＢの発現に影響を及ぼすことの指標である。
【０２７４】
本発明はＢＥＨＡＢの発現に影響を及ぼす化合物の同定方法を包含する。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、ＢＥＨＡＢのレベルを評価することがプローブ（例えばＢＥＨＡＢのと特異的に結合する抗体および／若しくは核酸プローブ）を使用して実施し得、その結果該方法がＢＥＨＡＢの発現に選択的に影響を及ぼす化合物を同定し得ることを認識するであろう。こうした化合物はＢＥＨＡＢの発現を阻害するのに有用である。当業者は、こうした化合物がＢＥＨＡＢの増大された発現により媒介されかつ／若しくはそれと関連する（例えばＢＥＨＡＢの増大されたレベルは原発性ＣＮＳ腫瘍と関連し、また、ＢＥＨＡＢ発現は増大された腫瘍体積および低下された生存率と関連する）疾患、障害若しくは状態を阻害するのに有用であり得ることを理解するであろう。従って、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、ＢＥＨＡＢの発現を低下させることが有用でありうることを認識するであろう。
【０２７５】
同様に、本発明は、細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを包含するＢＥＨＡＢの発現を低下させる化合物の同定方法を包含する。該方法は、細胞を試験化合物と接触させること、および、該化合物と接触させた細胞中のＢＥＨＡＢの発現のレベルを該化合物と接触されていないそれ以外は同一の細胞中のＢＥＨＡＢの発現のレベルと比較することを含んでなる。ＢＥＨＡＢの発現のレベルが、該化合物と接触されなかった細胞中のレベルに比較して該化合物と接触させた細胞中でより低い場合には、それは該試験化合物が細胞中でのＢＥＨＡＢ若しくはグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの発現を低下させることの指標である。
【０２７６】
本発明はまた細胞中のＢＥＨＡＢの切断を減少させる化合物の同定方法も包含する。該方法は、細胞を試験化合物と接触させること、および、化合物と接触させた細胞中のＢＥＨＡＢ切断のレベルを該化合物と接触されていないそれ以外は同一の細胞中のＢＥＨＡＢ切断のレベルと比較することを含んでなる。ＢＥＨＡＢ切断のレベルが、該化合物と接触されなかった細胞中のレベルに比較して該化合物と接触させた細胞中でより低い場合には、それは該試験化合物が細胞中のＢＥＨＡＢの切断を減少させることの指標である。
【０２７７】
細胞中のＢＥＨＡＢの切断を減少させる化合物は、ＢＥＨＡＢ切断が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行および浸潤性と関連することが本明細書で示されているために、有用である。加えて、本明細書に開示されるデータは、ＢＥＨＡＢ切断がより大きな腫瘍体積および低下された動物の生存率を媒介若しくはそれと関連することを示している。従って、ＢＥＨＡＢ切断を減少させる化合物の同定方法は、限定されるものでないが原発性ＣＮＳ腫瘍を挙げることができる多様な疾患を治療するのに使用し得る。
【０２７８】
当業者は、本発明が細胞若しくは動物における有用な化合物の同定方法に制限されないことをさらに認識するであろう。すなわち、本発明は細胞を含まない系における有用な化合物の同定方法を包含する。本明細書で使用されるところの細胞を含まない系は、反応が起こるのに必要な成分が存在するがしかし細胞と会合していないｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを指す。こうした成分は、細胞性酵素、転写因子、タンパク質、核酸などを包含し得るが、但しそれらは実質的に細胞を含まない。本明細書のデータにより開示されるとおり、ＢＥＨＡＢ切断アッセイは、細胞若しくは動物を含まずに実施し得、免疫沈降アッセイなどの使用を包含する。それにより、本発明は、細胞を含まない系における原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するための有用な化合物の同定方法を包含する。
【０２７９】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、細胞中のＢＥＨＡＢの発現のレベルがＢＥＨＡＢをコードするｍＲＮＡの発現のレベルを測定することにより測定しうることを認識するであろう。あるいは、ＢＥＨＡＢの発現および／若しくは切断のレベルは、抗ＢＥＨＡＢ抗体を使用するウェスタンブロット分析を使用して本明細書で例示されるところのＢＥＨＡＢの産生および切断を評価するための免疫学的方法を使用することにより測定し得る。さらに、ノーザンブロットおよびＰＣＲアッセイなどのような核酸に基づく検出方法を同様に使用し得る。加えて、細胞中のＢＥＨＡＢ活性および／若しくは切断のレベルは、例えば腫瘍体積、腫瘍の浸潤性および動物の生存率のようなＢＥＨＡＢ活性および／若しくは切断により影響され得る多様なパラメータのレベルを測定することによってもまた評価し得る。従って、当業者は、該開示および本明細書に提供される実務への簡約（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）に基づき、本明細書に開示されるものを包含する細胞中のＢＥＨＡＢ活性および切断のレベルを評価するのに使用し得る当該技術分野で公知である多数の方法ならびに将来開発されるかもしれない他者が存在することを認識するであろう。
【０２８０】
加えて、ＢＥＨＡＢ若しくはその切断生成物と特異的に結合するタンパク質、例えば受容体若しくは他のＢＥＨＡＢ関連タンパク質は、例えば酵母２ハイブリッドアッセイを使用して同定し得る。酵母２ハイブリッドアッセイ法は当該技術分野で公知でありかつ十分に報告された技術、例えばＢａｒｔｅｌとＦｉｅｌｄｓ（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、コネチカット州ケアリー）に記述されるものを使用して実施し得る。従って、本明細書に提供される教示、例えばＢＥＨＡＢタンパク質の完全なアミノ酸および核酸配列で一旦備えをすれば、当業者は、限定されるものでないがＢＥＨＡＢ標的若しくは受容体タンパク質を挙げることができる、ＢＥＨＡＢ若しくはその切断生成物と特異的に結合するタンパク質を容易に同定し得る。
【０２８１】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が本明細書の別の場所で論考される方法を使用して同定されるいかなる分子も包含することを理解するであろう。すなわち、限定されるものでないがＢＥＨＡＢ受容体タンパク質若しくはＢＥＨＡＢ標的タンパク質を挙げることができるＢＥＨＡＢと会合する分子を使用して、原発性ＣＮＳ腫瘍、神経膠腫、十分に分化した星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形グリア芽腫、上衣腫、乏突起膠腫、節細胞腫、混合性神経膠腫、脳幹神経膠腫、視神経膠腫、髄膜腫、松果体腫、下垂体腫瘍、下垂体腺腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、神経鞘腫、血管腫およびリンパ腫のようなＢＥＨＡＢ関連タンパク質とのＢＥＨＡＢ切断生成物の相互作用により媒介される疾患、障害若しくは状態の治療薬および診断薬を開発し得る。すなわち、当業者は、ＢＥＨＡＢと特異的に結合する抗体の論考において本明細書の別の場所でより十分に示されるとおり、ＢＥＨＡＢ関連タンパク質を使用してＢＥＨＡＢ切断生成物受容体／リガンドの相互作用および他のＢＥＨＡＢ結合相互作用を阻害することにより細胞中のＢＥＨＡＢ切断生成物の活性を阻害する治療薬を開発し得ることを認識するであろう。
【０２８２】
上に開示された方法により同定されるＢＥＨＡＢ関連タンパク質は、ＢＥＨＡＢ関連タンパク質若しくはその一部分と細胞を接触させることによりＢＥＨＡＢの相互作用を阻害するのに直接使用し得るか、または、ＢＥＨＡＢとのＢＥＨＡＢ関連タンパク質の相互作用を阻害してそれによりＢＥＨＡＢの機能、活性および切断を阻害し得る抗体および／若しくはペプチド模倣物を開発するのにそれらを使用し得る。従って、ＢＥＨＡＢ受容体タンパク質若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物タンパク質を包含するＢＥＨＡＢ関連タンパク質は有用でありかつ本発明により包含される。
ＶＩＩＩ．キット
本発明は、変異体ＢＥＨＡＢをコードする核酸、変異体ＢＥＨＡＢポリペプチド、ＢＥＨＡＢを特異的に結合する抗体、ＢＥＨＡＢをコード核酸に相補的しかしアンチセンスの向きの核酸、ＢＥＨＡＢ切断生成物に対する抗体を包含する化合物、アプリケーター、および本発明の方法を実施するための化合物の使用を記述する説明資料を含んでなる多様なキットを包含する。モデルキットを下述するとは言え、他の有用なキットの内容は本開示に照らして当業者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれを本発明内で企図している。
【０２８３】
一局面において、本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキットを包含する。該キットは本発明について本明細書に開示される方法と同一の様式で使用する。簡潔には、該キットを使用して本発明の変異体ＢＥＨＡＢ分子をコードする核酸と細胞を接触させてよい。加えて、該キットは、アプリケーターおよび該キットの使用のための説明資料を含んでなる。これらの説明は単に本明細書に提供される例を例示する。
【０２８４】
該キットはさらに製薬学的に許容できる担体を包含する。該組成物は本明細書の別の場所に示されるところの適切な量で提供される。さらに、投与経路および投与頻度は本明細書の別の場所で以前に示されたとおりである。
【０２８５】
別の局面において、本発明は原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキットを包含する。該キットは本発明について本明細書に開示される方法と同一の様式で使用する。簡潔には、該キットを使用して本発明の変異体ＢＥＨＡＢポリペプチド分子と細胞を接触させてよい。加えて、該キットはアプリケーターおよび該キットの使用のための説明資料を含んでなる。これらの説明は単に本明細書に提供される例を例示する。該キットはさらに製薬学的に許容できる担体を包含する。該組成物は本明細書の別の場所に示されるところの適切な量で提供される。さらに、投与経路および投与頻度は本明細書の別の場所で以前に示されたとおりである。
【０２８６】
本発明はさらに原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットを包含する。当業者は、該キットを本明細書に示される方法に従って使用し得ることを認識するであろう。該キットは、抗体、小分子、若しくはＢＥＨＡＢを結合するペプチド、またはそれらのなんらかのフラグメント、アプリケーター、ならびに本明細書に提供される実施例に実質的に類似の説明資料を含んでなる。該キットはさらに製薬学的に許容できる担体を包含し、その組成、投与経路および投与頻度は本明細書の別の場所で以前に開示されたとおりである。
【０２８７】
さらに、本発明は、哺乳動物のＢＥＨＡＢ分子をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸若しくはその何らかのフラグメントを含んでなるキットを含んでなる。こうしたキットを本発明の方法に従って使用してＢＥＨＡＢの低下された発現を媒介させ得る。加えて、該キットはアプリケーターおよび該キットの使用のための説明資料を含んでなる。これらの説明は単に本明細書に提供される例を例示する。該キットはさらに製薬学的に許容できる担体を包含する。アンチセンス核酸および製薬学的に許容できる担体は本明細書の別の場所に示されるところの適切な量で提供される。さらに、投与経路および投与頻度は本明細書の別の場所で以前に示されたとおりである。
【０２８８】
本発明はさらに原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のためのキットを包含する。簡潔には、該キットは、抗体、小分子、若しくはＢＥＨＡＢ切断生成物に特異的に結合するペプチド、またはそれらのなんらかのフラグメントを含んでなり、そして本明細書の別の場所に示される方法に従って使用し得る。本発明のキットはさらにアプリケーターおよび該キットの使用のための本明細書に示される方法に類似の説明資料を含んでなる。該キットはまた製薬学的に許容できる担体も含んでなり、その組成、投与の経路および頻度ならびに投薬量は本明細書で以前に示されている。
【０２８９】
本発明はさらにグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出するためのキットを含んでなる。該キットはグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームに対する抗体を含んでなる。こうした抗体は本明細書の別の場所に開示されかつ示されている。該キットはさらに、本明細書の別の場所に示される方法を達成するための説明を包含するグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの検出のための抗体の使用法に関する情報を含んでなる説明資料を含んでなる。
【０２９０】
本発明はさらに哺乳動物における原発性ＣＮＳ腫瘍を診断するためのキットを含んでなる。該キットは、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを特異的に結合する抗体、アプリケーターおよび該キットの使用のための説明方法を含んでなる。アプリケーターの用途および原発性ＣＮＳ腫瘍の診断方法は本明細書の別の場所に開示されている。
【０２９１】
本発明はまた原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキットも包含する。該キットは、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを特異的に結合する抗体若しくはそのフラグメント、を含んでなる組成物、製薬学的に許容できる担体およびアプリケーターを包含する。抗体およびアプリケーターの使用方法は本明細書の別の場所に示されている。説明資料は原発性ＣＮＳ腫瘍の処置のための本明細書に開示される方法を含んでなる。
【０２９２】
本発明はさらに免疫治療を使用して原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するためのキットを包含する。該キットは原発性ＣＮＳ腫瘍を治療するための哺乳動物由来の細胞の刺激における使用のためのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム若しくはそのフラグメントを含んでなる。該キットはさらに、原発性ＣＮＳ腫瘍に苦しめられている哺乳動物に免疫治療を提供するように細胞が刺激された後の哺乳動物へのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢで刺激された細胞の投与のためのアプリケーターを含んでなる。該キットはまた、原発性ＣＮＳ腫瘍の免疫治療のための本明細書に開示される方法を含んでなる説明資料も包含する。
【実施例】
【０２９３】
［実験実施例］
本発明は今や以下の実施例に関して記述する。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして本発明はこれらの実施例に制限されるとしていかなる方法でも解釈されるべきでなく、しかしむしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいかなるおよび全部の変形も包含すると解釈されるべきである。
【０２９４】
本実施例で提示される実験で使用した材料および方法を今や記述する。
【０２９５】
部位特異的突然変異誘発：完全長ＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡを、Ｚｈａｎｇら（１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：２３７０−２３７６）に記述されるとおり真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバード）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。完全長ＢＥＨＡＢの発現ベクターを製造元のプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）に従ってクイックチェンジ（ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ）部位特異的突然変異誘発キットを使用して突然変異させた。適切な突然変異の組込みは蛍光標識ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーター法を使用するシークェンシングにより確認した。
【０２９６】
細胞培養およびトランスフェクション：ＣＮＳ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナサス）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ中で増殖かつ維持した。細胞は４日ごとに分割（１：６ないし１：１０）かつ再プレーティングした。７５％コンフルエントの細胞を６０ｍｍ組織培養プレートにプレーティングし、そして製造元のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）に従って４μｇの適切な発現構築物およびＦｕｇｅｎｅ  ６を使用してトランスフェクトした。簡潔には、ＤＮＡおよびＦｕｇｅｎｅ  ６をそれらの標準培地中の細胞とともに６時間インキュベートし、その後培地を除去しかつ新鮮培地で一夜置換した。翌日、Ｇ−４１８（８０μｇ／μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞をトランスジーンの発現について選択した。トランスフェクトした細胞の安定なプールは、Ｇ−４１８補充した培地中で細胞を２．５週間維持することにより生じさせた。選択後、安定にトランスフェクトされた細胞プールは（４０μｇ／μｌ）の濃度のＧ−４１８を含有する培地中で維持した。
【０２９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖および細胞死アッセイ：細胞増殖および細胞死に対するトランスフェクションの影響を評価した。双方のアッセイについて、細胞は、２００μｌの培地中ウェルあたり４×１０４細胞の初期プレーティング密度で９６ウェル組織培養プレート中で増殖させた。細胞増殖はＭＴＴ（臭化３，−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）の細胞の取り込みにより測定した。簡潔には、１００μｌの培地を除去しそして細胞死アッセイのため保存した。２５μｌのＭＴＴ（ダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水；ＤＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ）を残存細胞および培地に添加しそして加湿インキュベーター（空気中５％ＣＯ２）中３７℃で３時間インキュベートした。１００μｌのイソプロパノール中４０ｍＭ塩酸を添加して、生じる生成物を可溶化し、そしてサンプルを３７℃で２時間インキュベートした。サンプルはマイクロプレートリーダーを使用して５５０ｎＭでの吸光度を測定することにより四重で分析した。
【０２９８】
１００μｌの細胞を含まない培地を細胞死アッセイに使用した。培地は、製造元の説明書（Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）に従って細胞傷害性検出キットを使用して乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性についてアッセイした。簡潔には、培地を乳酸（ＬＤＨによりピルビン酸に酸化されかつＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する）とともにインキュベートした。ＮＡＤＨはジアフォラーゼの存在下で黄色のテトラゾリウム塩の赤色のホルマザン塩への転化を触媒する。サンプルは、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎＭでの吸光度を測定することにより四重で分析した。
【０２９９】
動物試験：雌性Ｌｅｗｉｓラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）を麻酔し（７５ｍｇ／ｋｇケタミン、５ｍｇ／ｋｇキシラジン）、そして耳内線の３．０ｍｍ下に切歯バーを設定した定位機器（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州タハンガ）中に配置した。約７０％〜８０％コンフルエントのＣＮＳ−１細胞を、トリプシンを使用して１００ｍｍ組織培養プレートから収集した。細胞をＤＰＢＳ中で１回洗浄し、そして１μｇ／μｌのＭｇＣｌ２、１μｇ／μｌのＣａＣｌ２および０．１％ブドウ糖を補充したリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中に、細胞の濃度が１×１０５細胞／μｌであった阻害剤を用いる生存曲線の場合を除き、５×１０４細胞／μｌの濃度で懸濁した。２６ゲージの面取りした針を取り付けた１０μｌハミルトンシリンジを使用して、ブレグマに対し２．８ｍｍ後方、正中線に対し２．２ｍｍ側方および硬膜に対し５．０ｍｍ腹側の座標で右視床に視床内注入を行った。合計３μｌの容量の細胞懸濁液を３分にわたり注入し、そして、針は、ゆっくりとした引き抜きの前に追加の１分間その場所に残した。
【０３００】
動物の健康状態および生存率を６時間ごとに評価した。それらの側に置かれた１５秒以内にそれら自身を立ち直らせることが可能でなかった動物は生存の終点に達したとみなしそして殺した。殺した日を生存の最終日として記録した。
【０３０１】
組織学：ラットを深く麻酔し、そしてＰＢＳ、次いで氷冷４％ＰＢＳ−パラホルムアルデヒドで経頭蓋灌流した。４０μＭの凍結切片をクライオスタット上で薄片に切断し、また、トランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞を埋植した動物からの脳は冠状に薄片に切断した。腫瘍体積の推定のため５切片ごとにクレシルバイオレットで染色した。
【０３０２】
画像解析および腫瘍体積推定：組織切片はＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／）を使用して解析した。腫瘍領域は、実験条件に対し盲検にされた研究者により５切片ごとに腫瘍全体で人的に境界を定めた。腫瘍体積は形態計測学的体積のＣａｌｖａｌｉｅｒｉの推定量（ＲｏｓｅｎとＨａｒｒｙ、１９９０、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１１５−１２４）を使用して再構成した。
【０３０３】
電気泳動およびウェスタン分析：サンプルを８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、そしてその後タンパク質をニトロセルロースに電気泳動的に転写した（Ｌａｅｍｍｌｉら、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５；Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７６：４３５０−４３５４）。ブロットはウサギアフィニティー精製抗血清（１：１０，０００）若しくはＢ５０（１：５０００）（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３）、次いでアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：４０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）とともにインキュベートした。免疫反応性のバンドをニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスファターゼで可視化した。
【０３０４】
統計学的解析：トランスフェクトした細胞株を埋植した動物間の比較の有意性は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖および細胞死アッセイからの結果は、４×７（細胞株Ｘ日）の対応のあるＡＮＯＶＡを使用して解析した。
【０３０５】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【０３０６】
ＢＥＨＡＢ切断に対するＮＶＹ突然変異の影響：原発性ＣＮＳ腫瘍におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を研究するために、ＢＥＨＡＢ切断を封鎖若しくは阻害した構築物を生成した。完全長タンパク質の切断に対するＢＥＨＡＢのＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６切断を突然変異させることの影響を検査した。ＢＥＨＡＢのＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６部位に非常に類似の切断部位を有するアグレカンでの以前の研究は、切断部位のすぐ下流の３アミノ酸のＡＲＧからＮＶＹへの突然変異が切断を完全に封鎖したことを示した（Ｆｏｓａｎｇら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３０２７−３３０３７）。従って、部位特異的突然変異誘発を使用して、ＢＥＨＡＢ切断に対するＮＶＹ突然変異の影響を検査した。この突然変異はアミノ酸切断部位を３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ３９８から３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ３９８（それぞれ配列番号１および配列番号２）に変えた。ＢＥＨＡＢ切断に対するＮＶＹ突然変異の影響を評価するために、ＣＮＳ−１細胞を完全長ＢＥＨＡＢ若しくは変異させたＢＥＨＡＢ構築物のいずれかで一過性にトランスフェクトし、そしてＢ６およびＢ５０抗体（それぞれＣ末端およびＢＥＨＡＢ切断により形成されるネオエピトープ（ｎｅｏ−ｅｐｉｔｏｐｅ）を特異的に結合する、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３）を用いるウェスタンブロットにより、生じるタンパク質を分析した。
【０３０７】
正常および変異させた双方のＢＥＨＡＢで一過性にトランスフェクトした細胞はＢ６抗体を用いて示されるとおり（図１Ａ）完全長の産物を産生した。正常の完全長ＢＥＨＡＢは、Ｂ５０抗体を用いて示されるとおり３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ３９８切断部位で切断された。非常に対照的に、ＮＶＹ変異体構築物でトランスフェクトした細胞により大量の完全長タンパク質が作成された一方で切断は検出されなかった（図１Ａ）。ＮＶＹ変異体のＢＥＨＡＢが切断されることが完全に不可能であったかどうかを決定するために、サンプルをＢ５０抗体で免疫沈降させて痕跡量のそうした切断生成物を検出した。このより高感度のアッセイを用いてさえ反応性産物は検出されず、ＮＶＹ突然変異が完全長タンパク質の切断を完全に阻害したことを示した。
【０３０８】
ＢＥＨＡＢの切断に対するＮＶＹ突然変異の影響を、正常の完全長ＢＥＨＡＢおよびＮＶＹ構築物でＣＮＳ−１細胞をコトランスフェクトすることによりさらに検討した。これらの実験は、ＮＶＹ変異体ＢＥＨＡＢが正常基質の切断を阻害し得るかどうかを決定するように設計した。細胞を、２μｇの完全長ＢＥＨＡＢ発現構築物および０、１、２若しくは４μｇいずれかの変異させたＢＥＨＡＢ構築物でコトランスフェクトした。ＮＶＹ変異体構築物の添加は完全長ＢＥＨＡＢの量を増大させた一方、それは完全長ＢＥＨＡＢタンパク質を切断するプロテアーゼの能力に対する影響を有しなかった（図１Ｂ）。これらの結果は、いずれかの特定の論理により束縛されることを願わないとは言え、変異体のＢＥＨＡＢはそれ自身で切断不可能である一方でそれは必ずしもプロテアーゼを阻害しないことを示唆する。
【０３０９】
細胞増殖および細胞死に対するＮＶＹ変異体の影響：細胞増殖および細胞死に対するＢＥＨＡＢのＮＶＹ切断部位突然変異の影響を評価するため、ＣＮＳ−１細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ベクター（ＣＮＳ−１−ＧＦＰ）、正常ＢＥＨＡＢ発現ベクター（ＣＮＳ−１−ＦＬ）若しくはＮＶＹ変異させたベクター（ＣＮＳ−１−ＮＶＹ）のいずれかで安定にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされた細胞のプールをＧ４１８中で選択しそして上述されたとおり分析した。一過性トランスフェクションを使用して観察されたとおり、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞のプールは完全長ＢＥＨＡＢを作成したがしかしそれを切断しなかった（図１Ｃ）。
【０３１０】
ＭＴＴアッセイを使用して、安定にトランスフェクトされた細胞で細胞増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析した。ＭＴＴはコハク酸−テトラゾリウム還元酵素系（ミトコンドリア呼吸鎖の酵素系）により色素に転化されてそれにより生存可能細胞の数の尺度を提供する。増殖は７日にわたって評価した。トランスフェクトした細胞のいずれでも細胞増殖に差異は存在しなかった（図２Ａ）。さらに、トランスフェクトしたプールのいずれも、トランスフェクトしていない親ＣＮＳ−１細胞とのいかなる差異も示さなかった。
【０３１１】
細胞死はＬＤＨアッセイを使用して評価した。ＬＤＨは通常細胞質中にのみ存在する酵素である。死んだ若しくは死につつある細胞により放出される場合にのみＬＤＨが存在する、培地中でＬＤＨ活性を測定した。全細胞株において、最初の４日にわたって約２％ないし約３％という低レベルの細胞死が存在した。細胞死はその後毎日わずかに増加したが、しかしながらいかなる時間点でもいかなる細胞株間でも細胞死パーセントの差異は存在しなかった（図２Ｂ）。従って、変異させた構築物は切断不可能である一方でそれはｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞の増殖若しくは死に対する明らかな影響を有しない。
【０３１２】
ＮＶＹ切断不可能ＢＥＨＡＢはＣＮＳ−１腫瘍の表現型に影響を及ぼさない：以前の研究は、正常の完全長ＢＥＨＡＢでトランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞がＧＦＰでトランスフェクトした対照より大きな腫瘍を形成することを示した。しかしながら、ＢＥＨＡＢを産生も切断もしない９Ｌ細胞においては、完全長ＢＥＨＡＢでのトランスフェクションは腫瘍の表現型を変化させない（Ｚｈａｎｇら、１９９８、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：２３７０−２３７６）。腫瘍の進行におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を検討するために、上述された発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＣＮＳ−１細胞のプールを頭蓋内移植片として増殖させた。腫瘍埋植８日後に動物（ｎ＝８）を灌流しかつそれらの脳を組織学のため処理した。５切片ごとにクレシルバイオレットで染色し、そして画像解析により腫瘍面積を推定した。体積はこれらの解析から再構成した。以前の結果と一致して、ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍はＣＮＳ−ＧＦＰより大きくかつより浸潤性であった。ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は大きさがＣＮＳ−１−ＧＦＰ腫瘍と有意に異ならなかった。しかしながら、重要なことに、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍より有意により小さかった（表１、図３）。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わない一方、これらの結果は、ＢＥＨＡＢ単独の産生が腫瘍の進行を増大させるのに不十分であるが、しかし完全長タンパク質の切断がこの過程で決定的に重要な役割を演じていることを示す。
【０３１３】
腫瘍の進行に対する変異させたＢＥＨＡＢの影響をさらに検討するために、動物（ｎ＝６）の生存に対する変異体ＢＥＨＡＢ構築物の影響を検討した。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍が動物の生存を低下させることが以前に発見された（Ｎｕｔｔら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７０５６−７０５９）。これらの結果に一致して、ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍を埋植した動物はＣＮＳ−１−ＧＦＰ腫瘍を埋植した動物より平均３日より早く生存の終点に達した。しかしながら、ＣＮＳ−１−ＮＶＹを埋植した動物は対照より早く生存の終点に達しなかった。事実、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍を伴う動物はＣＮＳ−１−ＧＦＰを埋植した動物よりわずかにより長く生存したが、とは言え今日までのこの研究における動物の数では該差異は有意でない。ＣＮＳ−１−ＮＶＹを埋植した動物はＣＮＳ−１−ＦＬを埋植した動物より平均４日より長く生存した（生存の２３％増加）（表１、図４）。
【０３１４】
【表２】
2006523179.tif 000003
【０３１５】
［実施例２］
ラット脳の細胞成分分画：
生後数日齢の雌性Ｌｅｗｉｓラットをハロタン下に深く麻酔しそして断頭により殺した。在胎齢１４ないし１８日の胚を氷上の終末麻酔妊娠ラットから迅速に取り出しかつ断頭した。前脳を氷上で迅速に切開しかつ０．３２Ｍショ糖（ＴＳ緩衝液）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（完全にＥＤＴＡを含まない、Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）を含有する１０容量の２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４中でホモジェナイズした。ホモジェネートを９５０ｇで１０分間遠心分離し、そして核ペレット（Ｐ１）をＴＳ緩衝液中での迅速な再ホモジェナイズにより１回洗浄しかつ上のとおり遠心分離した。後核上清（ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を合わせかつ１００，０００ｇで６０分間遠心分離して全微粒子および可溶性分画を調製した。
【０３１６】
成体ラット前脳サンプルからのさらなる細胞成分分画のため、上で示されたとおり得た後核上清を、確立したプロトコル（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｄｅ  Ｌｏｒｅｓら、１９６７、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １４：２１５−２２５）に従って遠心分離して、ミトコンドリア／シナプトソームペレット（Ｐ２）、軽ミトコンドリアペレット（Ｐ３）および最終可溶性分画を生じた。ミトコンドリアおよびシナプトソーム膜を分離するために、Ｐ２ペレットを例えば（ＪｏｎｅｓとＭａｔｕｓ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ３５６：２７６−２８７）に記述されるところの不連続的ショ糖勾配中で分離した。タンパク質の電気泳動のための細胞成分分画を調製するために、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する４０ｍＭトリスＨＣｌ／４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ８（ＣＨ緩衝液）中１〜２ｍｇ／ｍｌの最終総タンパク質濃度で膜および可溶性分画のアリコートを平衡化し、そして０．２５Ｕ／ｍｌのプロテウス  ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのプロテアーゼを含まないコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＥＣ  ４．２．２．４、生化学工業、マサチューセッツ州ファルマス）で３７℃で８時間処理した。コンドロイチナーゼの反応は１×ゲル負荷緩衝液の存在下でサンプルを沸騰させることにより停止した。
【０３１７】
脳膜からのＢＥＨＡＢアイソフォームの遊離：
多様なＢＥＨＡＢアイソフォームの細胞膜との会合を特徴づけるため、ラット前脳から得た全膜（１ないし２ｍｇ全タンパク質／ｍｌ）を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ若しくは０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在若しくは非存在下５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４に４℃で１時間再懸濁した。あるいは、膜は１００ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．３に４℃で３０分間再懸濁した。インキュベーション後に膜を２０，８００ｇで２０分間遠心分離した。遊離されたＢＥＨＡＢを上清中で回収し、そして保持されたＢＥＨＡＢを含有する膜を５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液で２回洗浄しかつ同一の初期容量に再懸濁した。最終的に全サンプルをＣＨ緩衝液で平衡化しかつタンパク質電気泳動前にコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した。免疫沈降研究のため、膜を０．６％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４中４℃で１時間抽出し、そして標準的プロトコルに従ってさらに処理した。
【０３１８】
ＰＩ−ＰＬＣ処理およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４での洗剤抽出：
ＢＥＨＡＢのＧＰＩアンカー型アイソフォームを示すため、ラット脳ミクロソーム膜を、０．２５Ｕ／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＢＣおよび１Ｕ／ｍｌのバチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、ＥＣ  ３．１．４．１０、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含むＣＨ緩衝液に３７℃で８時間再懸濁した。その後サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＢＥＨＡＢのＧＰＩアンカーを遊離させる前のＧＰＩアンカー型ＢＥＨＡＢの電気泳動移動度を測定するために、洗剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を使用して、コンドロイチナーゼ処理したラット脳膜でタンパク質抽出を実施した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４は、以前に確立した手順（Ｂｏｒｄｉｅｒ、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１６０４−１６０７）に従って、疎水性若しくはＧＰＩ結合型タンパク質からの水溶性の膜会合型タンパク質の分離を可能にする。簡潔には、ミクロソーム膜を２ｍｇ全タンパク質／ｍｌでＣＨ緩衝液に再懸濁し、そして前濃縮した１０％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を２％ｖ／ｖの最終濃度まで添加することにより氷上で６０分間洗剤抽出した。可溶化したタンパク質は、該抽出物を低温遠心機中２０，８００ｇで２０分間遠心分離した後に上清から回収した。この上清を３７℃で加温して水層および洗剤含有層を生じさせた。双方の層を室温で２０００ｇで１０分間の遠心分離により単離し、そして交差汚染を回避するため徹底的に洗浄した。洗剤層中の抽出されたタンパク質を−２０℃で酸性エタノールで沈殿させ、冷アセトンで洗浄し、そして０．６％ｗ／ｖのＣＨＡＰＳの存在下に少量のＣＨ緩衝液に再可溶化した。水層および洗剤層からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にＰＩ−ＰＬＣで３７℃で８時間処理した。
【０３１９】
細胞培養およびトランスフェクション：
ラットＣＮＳ−１神経膠腫細胞株（Ｄｒ．Ｗ．Ｈｉｃｋｅｙ、Ｄａｒｔｈｍｏｕｔｈ−Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、ニューハンプシャー州レバノンにより恵与さる）を、１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、５０μｇ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州ラホヤ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中５％ＣＯ２で増殖させた（Ｋｒｕｓｅら、１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２２：１９１−２００）。マウス乏突起細胞前駆細胞Ｏｌｉ−ｎｅｕ株（Ｄｒ．Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツにより恵与さる）は、２５μｇ／ｍｌジェネチシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州ラホヤ）を補充したサトウ培地（Ｊｕｎｇら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１２４５−１２６５）中ポリ−Ｄ−リシンプレコートプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）上で増殖させた。ＣＮＳ−１細胞は例えばＺｈａｎｇら（１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：２３７０：２３７６）に記述されたとおりに完全長ラットＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡ（ヌクレオチド１−２８６３、Ｄｒ．Ｙｕ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより恵与さる）を含有するｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）でトランスフェクトした（Ｙａｍａｄａら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１６：９５７−９６３）。対照細胞はＧＦＰをコードするｃＤＮＡ挿入物を含有するｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｄｒ．Ｔｏｍ  Ｈｕｇｈｅｓ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより恵与さる）でトランスフェクトした。安定なトランスフェクタントを１ｍｇ／ｍｌジェネチシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州ラホヤ）中で選択した。Ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞は同一のラットＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。加えて、完全長ラットＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−６ｘＨｉｓベクターにサブクローニングしてＶ５／６ｘＨｉｓ標識ＢＥＨＡＢを生じさせ、これもまたＯｌｉ−ｎｅｕ細胞に一過性にトランスフェクトした。全部の場合で、所望のトランスジーンの発現をノーザンブロット分析（Ｚｈａｎｇら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：２３７０：２３７６）により確認し、また、ＢＥＨＡＢタンパク質の存在は本明細書の別の場所に記述されるところのウェスタンブロット分析により確認した。
【０３２０】
細胞膜の調製および免疫細胞化学：
細胞はトランスフェクション後２４〜４８時間にルーチンで収集し、そしてプロテアーゼ阻害剤カクテル（完全、ＥＤＴＡを含まない、Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）および２Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）を含有する２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中でホモジェナイズした。全膜を２０，８００ｇ×３０分の遠心分離により得、そしてタンパク質の電気泳動のため調製した。
【０３２１】
トランスフェクトしたＯｌｉ−ｎｅｕ細胞の生存免疫細胞化学染色のため、培養物を、Ｖ５／６ｘＨｉｓ標識完全長ＢＥＨＡＢ  ｃＤＢＡでのトランスフェクション前に２４ウェルプレート中ガラス製カバーガラス上で２４〜４８時間増殖させた。未固定の浸透化されない培養物を、血清を含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州ラホヤ）ですすぎ、そしてその後モノクローナル抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。培養物をＤＭＥＭですすぎ、４％パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．４中２０分間固定し、すすぎ、そしてその後Ａｌｅｘａ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）とともに６０分間インキュベートした。培養物を最後にＰＢＳですすぎ、ヨウ化プロピジウム（０．２μｇ／ｍｌ）で短く対染色しそして蛍光顕微鏡検査のため調製した。
【０３２２】
頭蓋内移植片：
安定にトランスフェクトされたＣＮＳ−１細胞の頭蓋内移植片は例えばＪａｗｏｒｓｋｉら（１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２２９３−２２９８）に記述されるとおり実施した。簡潔には、細胞を８０％コンフルエンスで収集し、ＰＢＳで洗浄しそして注入緩衝液（１μｇ／ｍｌのＭｇＣｌ２、１μｇ／ｍｌのＣａＣｌ２および０．１％ｗ／ｖＤ（＋）ブドウ糖を補充したＰＢＳ）に５×１０４細胞／μｌの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液（３μｌ）を４５日齢雌性Ｌｅｗｉｓラットの視床中に５分の期間にわたって定位注入した。動物をそれらのケージに戻し、そして損なわれた神経学的機能の兆候について２週間の間モニターした。２週間後にラットを終末麻酔かつ断頭し、そして脳を迅速に切開し、ドライアイス上で凍結させかつさらなる処理のため−７０℃で保存した。脳を粗く切断しそして可視化した腫瘍ならびに腫瘍が検出されなかった脳の反対側の同等な領域からサンプルを得た。正常ラット脳およびラット脳神経膠腫の可溶性および微粒子分画を本明細書の別の場所に記述されるとおり調製した。
【０３２３】
グリコシダーゼ処理：
ＢＥＨＡＢアイソフォーム中に存在するＯ−結合オリゴ糖を除去するために、コンドロイチナーゼ処理したサンプルを１０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７中で平衡化し、そして肺炎双球菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの２０ｍＵ／ｍｌのＯ−グリコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９７、Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）およびアルトロバクター  ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）からの１００ｍＵ／ｍｌのノイラミニダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１８、Ｒｏｃｈｅ、インジアナ州インジアナポリス）で処理した。同様に、Ｎ−結合オリゴ糖は、クリセオバクテリウム  メニンゴセプチクム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からの１００Ｕ／ｍｌのグリコペプチダーゼＦ（ＥＣ  ３．５．１．５２、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）とのインキュベーションにより除去した。全部の場合で、サンプルはプロテアーゼ阻害剤の存在下３７℃で８時間酵素とともにインキュベートした。酵素消化はサンプルを１×ゲル負荷緩衝液中で沸騰させることにより停止した。
【０３２４】
ウェスタンブロット分析：
サンプルを還元７％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてタンパク質をニトロセルロースに電気泳動的に転写した。ブロットを、ラットＢＥＨＡＢのＧＡＧ結合領域（アミノ酸５０６−５２９）に対応する合成ペプチドに対し生じさせたアフィニティー精製したウサギポリクローナル抗体（Ｂ６）とともにインキュベートした。あるいは、ＢＥＨＡＢは、ラットＢＥＨＡＢのアミノ酸６０−７３（抗体Ｂ５）およびヒトＢＥＨＡＢのアミノ酸８５９−８７９（抗体ＢＣＲＰ）に対応する合成ペプチドに対し生じさせたアフィニティー精製したウサギポリクローナル抗体を使用することにより検出した。ＢＥＨＡＢの５０ｋＤａの切断生成物は、完全長タンパク質のタンパク質分解性プロセシングにより発生されたネオエピトープに対し向けられた抗体（Ｂ５０）で検出した。抗体Ｂ６、Ｂ５およびＢ５０は検出若しくはラット脳サンプル中のラットＢＥＨＡＢについて以前に記述されている（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８８８５−３８８９０）。Ｖ５／Ｈｉｓ標識組換え完全長ＢＥＨＡＢはモノクローナル抗体抗Ｂ５エピトープ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州ラホヤ）で検出した。全部の場合で、アルカリホスファターゼ結合二次抗体を使用した。免疫反応性のバンドをニトロブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートで可視化した。
【０３２５】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【０３２６】
ラット脳中の新規の発達的に調節されるＢＥＨＡＢアイソフォームの同定。
【０３２７】
ＢＥＨＡＢタンパク質はラット脳中で約胚第１８日（Ｅ１８）に検出され、レベルは生後の発達中に増大して生後第２１日（Ｐ２１）までに成体の発現レベルに達した（図５）。Ｅ１４での検出可能なタンパク質の欠如は、ＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡがＥ１６後にのみラット皮質中でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより最初に検出されたことを示す以前の観察結果（Ｊａｗｏｒｓｋｉら、１９９５、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：１３５２−１３６２）と矛盾しなかった。コンドロイチナーゼ処理によるＧＡＧ鎖の除去後に、ＢＥＨＡＢの最大のアイソフォームが約１５０ｋＤａで移動した（完全長ＢＥＨＡＢ）。完全長ＢＥＨＡＢアイソフォームは主として発達の早期に可溶性分画で検出されたが、しかし後には可溶性および微粒子双方の分画で見出された。
【０３２８】
発達の経過にわたる完全長ＢＥＨＡＢの発現の増大と同時に、完全長ＢＥＨＡＢの主要な切断生成物もまた増大した（図５）。完全長ＢＥＨＡＢおよびその切断生成物は最初に可溶性分画中で検出されるが、しかし、発達の経過にわたってラット脳ホモジェネートの微粒子分画にますます局在化する。
【０３２９】
本明細書に開示される免疫化学的分析はまた、微粒子分画中の約１３０ｋＤａの分子量をもつ新たなグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームも示す。該グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは早期の生後発達の間（Ｐ３からＰ１４まで）にアップレギュレートされた一方、完全長ＢＥＨＡＢの最大発現は発達の後のほう、すなわちＰ２１から成体までであった。
【０３３０】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームと異なる
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームおよびＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームはラット脳単離物の微粒子分画に共局在する。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームおよびＧＰＩ結合型アイソフォームの共通の微粒子局在化を考え、これら２種のアイソフォーム間の差異を検討した。完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの双方がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性洗剤（図６Ａ）およびＣＨＡＰＳのような双極性イオン性洗剤により微粒子分画から遊離された。実際、双方のアイソフォームは約０．２％ｗ／ｖのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の洗剤濃度により遊離され、膜とのそれらの疎水性相互作用の破壊に対する特段の感受性を示した。この観察結果はグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型タンパク質でないかもしれないことを示唆した。多くのＧＰＩ結合型タンパク質が原形質膜塊（ｒａｆｔ）中に存しかつＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で低い溶解性を有する傾向があるからである（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１２１３０−１２１３４）。しかしながら、ＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出に対し感受性であった（Ｓｅｉｄｅｎｂｅｃｈｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７２０６−２７２１２）。逆に、膜会合型の膜タンパク質を遊離させるがしかしＧＰＩ結合型若しくは内在性膜タンパク質はしないアルカリ性の炭酸ナトリウムでの短い処理もまた、微粒子分画から完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム双方を遊離させた（図６Ａ）。一緒にすれば、これらの結果は、完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの双方が細胞膜と周辺で会合していることがありそうであることを示す。
【０３３１】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームでありうるかどうかをさらに試験するため、成体ラット脳からの膜をＰＩ−ＰＬＣ（ＧＰＩ結合型タンパク質を遊離させ得る酵素）で処理した。ＰＩ−ＰＬＣ処理はおよそ１２０ｋＤａの１本のバンドを生成させ、こでは、非還元７％アクリルアミドゲル中で完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢと明確に識別された（図６Ｂ）。この１２０ｋＤａのバンドはＰＩ−ＰＬＣにより完全に遊離され、そして生じる微粒子（膜）分画中で検出されなかった（図６Ｃ）。脳ホモジェネートの可溶性分画のＰＩ−ＰＬＣでの処理は１２０ｋＤａのバンドを生じさせず、１２０ｋＤａのバンドをもたらすＧＰＩ結合型アイソフォームが、ＧＰＩ結合型タンパク質について予測されるであろうとおり、微粒子分画に特異的に局在したことを示した。生じる上清（ｓ）およびペレット分画（ｐ）をウェスタンブロットにより分析し、１２０ｋＤａのバンドがＰＩ−ＰＬＣ処理により膜から完全に遊離される一方で１３０ｋＤａのバンドは遊離されないことを示した。水層中のＢＥＨＡＢアイソフォームはＰＩ−ＰＬＣ処理（Ｈ２Ｏ＋ＰＬＣ）後に移動度を移動しないが、しかし洗剤層中の１５０ｋＤａのバンドはＰＩ−ＰＬＣ処理（Ｔｘ＋ＰＬＣ）後におよそ１２０ｋＤａに移動し、これがＢＥＨＡＢのＧＰＩ結合型スプライスバリアントであることを確認する（図６）。矢印は完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）およびＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームを示す。
【０３３２】
完全長ＢＥＨＡＢはＧＡＧ結合を伴いおよび伴わずに検出された（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、１９９６、Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：３０７−３１７）。従って、ＰＩ−ＰＬＣにより遊離される１２０ｋＤａのバンドの検出はコンドロイチナーゼＡＢＣでの前処理を必要としたため、該データは、ＧＰＩ結合型アイソフォームの大部分がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに付随していることを示唆した。
【０３３３】
ＰＩ−ＰＬＣ処理が１２０ｋＤａのバンドの発生に至った一方、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの免疫反応性は影響されなかった。この結果は、１２０ｋＤａのバンドがグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ由来ではなかったこと、および従ってグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームでなかったことを示した。ＧＰＩアンカー型ＢＥＨＡＢアイソフォームのＰＩ−ＰＬＣ処理後に免疫反応性のバンドのいずれの明らかな枯渇も存在しなかったため、ＧＰＩアンカー型ＢＥＨＡＢアイソフォームの脂質アンカーの除去前のその分子量を検討した。ＧＰＩアンカー型ＢＥＨＡＢアイソフォームの分子量を決定するために、ＧＰＩ結合型アイソフォームを脂質アンカーの除去前に全部の他のＢＥＨＡＢアイソフォームから単離した。その目的のため、膜分画を洗剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４で抽出した。
【０３３４】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４は４℃で水とともに均質な溶液を形成するがしかし３７℃で水層および洗剤層に分配する。内在型膜およびＧＰＩ結合型タンパク質を包含する大きな疎水性のドメインをもつタンパク質のみが洗剤層に分配する一方、膜会合型タンパク質は水層に分配する（Ｂｏｒｄｉｅｒ、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１６０４−１６０７）。従って、全部のＢＥＨＡＢアイソフォームは水層に分配してＧＰＩアンカー型アイソフォームのみを洗剤層に残すはずである。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４抽出は最終洗剤層中におよそ１５０ｋＤａのバンドの単一バンドのみをもたらした（図６Ｄ）。この層から沈殿されたタンパク質をＰＩ−ＰＬＣで処理した場合、１５０ｋＤａのバンドが消失しそしておよそ１２０ｋＤａのバンド（ＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームのアンカーを伴わないそれについて以前に観察された位置）により置換された。さらに、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを包含した水溶性層中のタンパク質のＰＩ−ＰＬＣ処理は１５０ｋＤａのバンドのいかなる喪失にも至らず、また、およそ１２０ｋＤａのバンドの出現に至らなかった。これらの結果は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＢＥＨＡＢのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型（ｇｌｙｐｉａｔｅｄ）アイソフォームでないことを確認した。さらに、該結果は、ＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢの脂質アンカーの除去前にそれが優勢な分泌型のアイソフォームすなわち完全長ＢＥＨＡＢと類似の分子量で泳動し、従って該２形態の同時検出は前抽出なしで困難であることを示す。
【０３３５】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは完全長ＢＥＨＡＢの切断生成物でない
本明細書に記述される結果は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＢＥＨＡＢのＧＰＩ結合型アイソフォームと異なることを示した。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの別の可能な起源は、それが完全長すなわち完全長ＢＥＨＡＢの切断生成物であることである。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ上の完全長ＢＥＨＡＢのＮおよびＣ末端エピトープの存在を使用して、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが完全長ＢＥＨＡＢの切断生成物であるかどうかを検討した。完全長ＢＥＨＡＢを、ラットＢＥＨＡＢのＧＡＧ結合領域中の１エピトープを認識する抗体Ｂ６を使用してラット脳膜調製物から免疫沈降させた（図７Ａ）。免疫沈降させたタンパク質を、ＢＥＨＡＢのＮ（Ｂ５）およびＣ（ＢＣＲＰ）末端の１０ｋＤａ以内に位置するエピトープに対する抗体でイムノブロットした（図７Ａ）。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが完全長ＢＥＨＡＢの末端短縮切断生成物を表す場合、Ｎ若しくはＣ末端抗体の一方がグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出することに失敗するとみられる。しかしながら、完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの双方が抗ＢＥＨＡＢ抗体の全３種により検出され（図７Ｂ）、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが完全長ＢＥＨＡＢの切断生成物でなかったことを示唆した。さらに、Ｃ末端ＢＣＲＰ抗体によるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの検出はグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型アイソフォームでなかったことの直接の証拠を提供した。ＣＲＰドメインはＧＰＩ結合型スプライスバリアントに存在しないからである。
【０３３６】
これらのデータは、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型アイソフォームでもなく、また、それが完全長転写物の切断生成物でもないことを示した。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの分子供給源をさらに検討するため、ラット神経膠腫細胞株ＣＮＳ−１を、完全長ラットＢＥＨＡＢタンパク質をコードするＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞は完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの双方を産生し、そして双方は全３種の抗ＢＥＨＡＢ抗体で検出された。さらに、完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームの分布はラット脳で観察されたものと緊密に一致し、完全長ＢＥＨＡＢは主として培地中で見出されかつグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは独占的に膜と会合して見出された（図７Ｃ）。
【０３３７】
完全長およびＧＰＩ結合型双方のＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡを内因性に発現するマウス乏突起細胞前駆細胞株Ｏｌｉ−ｎｅｕにおけるＢＥＨＡＢ発現もまた検討した。抗体はラットＢＥＨＡＢを認識したがしかしマウスＢＥＨＡＢはしなかったため、完全長のラットＢＥＨＡＢをコードするｃＤＮＡでＯｌｉ−ｎｅｕ細胞をトランスフェクトした。ＣＮＳ−１細胞と対照的に、われわれはトランスフェクトしたＯｌｉ−ｎｅｕ細胞中でグリコシル化バリアントアイソフォームのみを検出した。しかしながら、ＣＮＳ−１細胞と同様に、発現されたグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは膜分画に独占的に見出された（図７Ｄ）。これらの結果を確認するために、Ｃ末端Ｖ５／６ｘＨｉｓエピトープを伴う完全長ラットＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでＯｌｉ−ｎｅｕ細胞をトランスフェクトした。再度、Ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞は標識グリコシル化バリアントアイソフォームを発現したのみであり（抗ＢＥＨＡＢ抗体および抗Ｖ５抗体双方で検出された）（図７Ｄ）、膜会合型のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームが完全長ＢＥＨＡＢタンパク質を表すことのさらなる証拠を提供した。
【０３３８】
完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは単一コアタンパク質の差次的グリコシル化から生じる
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは完全長ＢＥＨＡＢと同一のｍＲＮＡ由来でありかつタンパク質分解性プロセシングの結果でなかったため、異なる翻訳後修飾がこれら２種のアイソフォーム間の大きさの差異の原因であるに違いないことが可能である。ＢＥＨＡＢはＮ−結合糖、コンドロイチン硫酸ＧＡＧ鎖および付加的なＯ−結合糖を運搬する。従って、グリコシル化の差異がグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢと完全長ＢＥＨＡＢとの間の大きさの差異を説明するかもしれない。完全長ＢＥＨＡＢと異なり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームはコンドロイチン硫酸鎖を欠くようであった。コンドロイチナーゼＡＢＣ処理はバンドの見かけの分子質量を移動も高めもせず、若しくはその免疫反応性を低下させた。さらに、Ｎ−およびＯ−結合糖を除去する酵素の組合せは、完全長ＢＥＨＡＢのバンドをグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの位置に向かって移動させた（図８）。対照的に、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの電気泳動移動度はグリコシダーゼでの処理により影響を受けず、このアイソフォームが完全長ＢＥＨＡＢ上に存在するＮ−およびＯ−結合糖の大部分を欠いたことを示した。これらの結果は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＢＥＨＡＢ／ブレビカンの別個の未グリコシル化若しくは過少グリコシル化アイソフォームであることを示した。
【０３３９】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはカルシウム非依存性の機構により脳膜と会合する
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ、および完全長ＢＥＨＡＢの膜会合成分が膜調製物から遊離された条件を検討した。ＢＥＨＡＢはカルシウム依存性の機構によりテナシン−Ｒおよび硫酸化糖脂質のサブセットに結合されている（Ａｓｐｅｒｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０１１６−１０１２１；Ｍｉｕｒａら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１４３１−１１４３８）。膜とＢＥＨＡＢのカルシウム依存性の会合を、二価の陽イオンキレート剤ＥＤＴＡを使用して検討した。完全長ＢＥＨＡＢはＥＤＴＡにより部分的に遊離され、膜とのカルシウム依存性の会合を確認した。極めて対照的に、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはＥＤＴＡにより遊離されず、カルシウム非依存性の機構による膜との会合を示した。細胞膜へのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのカルシウム非依存性の結合はＶ５／６ｘＨｉｓ−ＢＥＨＡＢでトランスフェクトしたＯｌｉ−ｎｅｕ（図９Ｂ）およびＣＮＳ−１細胞によりさらに支持された。これら２細胞株における細胞膜とのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの会合はまたＥＤＴＡ非感受性でもあり、ラット脳グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの挙動を模倣した。
【０３４０】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはミクロソーム膜分画中で濃縮されておりかつ細胞表面上に存在する
完全長ＢＥＨＡＢはラット脳の主要な細胞成分分画の大部分で検出された一方、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは軽ミクロソーム分画中で濃縮されており（図１０）、細胞膜との会合と矛盾しなかった。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはまた重ミトコンドリア／シナプトソーム分画でも検出されたが、しかし、不連続的ショ糖勾配中でのさらなる細分画は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがシナプトソーム細胞成分に制限されたことを示し、このアイソフォームが原形質膜に局在化されていることがありそうであることのさらなる証拠を提供した。
【０３４１】
シナプトソームおよびミクロソーム分画は小胞体膜を含有するため、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのオリゴ糖の欠如と一緒になったミクロソーム中でのその検出は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが翻訳後グリコシル化の欠如により細胞内分泌経路に保持される分泌型ＢＥＨＡＢの前駆体であるかもしれないという可能性を提起した。Ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞中でのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの細胞成分局在化の検査を使用して、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが細胞表面に輸送されたかどうかを決定した。本明細書に記述されるとおり、ＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＯｌｉ−ｎｅｕ細胞はグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのみを発現し（図７Ｄ）、それにより完全長ＢＥＨＡＢアイソフォームの非存在下でのその細胞の局在化を研究するためのモデルを提供する。生存のＶ５／６ｘＨｉｓ−ＢＥＨＡＢでトランスフェクトしたＯｌｉ−ｎｅｕ細胞の染色はこのアイソフォームが細胞外表面上で実際に検出されたことを示した（図１１）。これらの結果は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがそのグリコシル化の欠如にもかかわらず分泌経路を通って細胞表面に輸送されることを示す。
【０３４２】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは浸潤性神経膠腫のラットモデルにおいてアップレギュレートされているＢＥＨＡＢの主要なアイソフォームである
本明細書の別の場所に詳述されるとおり、ＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡはヒト神経膠腫ならびに浸潤性神経膠腫のラットモデルにおいて高度にアップレギュレートされている。完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが浸潤性神経膠腫のラットモデルにおいて差次的にアップレギュレートされたかどうかを決定するために、ＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞の定位的配置後に成体ラット脳で生じられた腫瘍中のＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を検査した。ラット脳神経膠腫組織はＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞を置いた大脳半球から得た一方、対照組織は反対の未処理の大脳半球から得た（図１２）。対照側でのＢＥＨＡＢアイソフォームの発現は完全長のラット脳について上述されたもの（図５）に同一であった。神経膠腫サンプルの可溶性分画中での完全長ＢＥＨＡＢ発現は対照に比較して低下されていたが、とは言えこれらの腫瘍は正常組織よりはるかに多くの汚染する血液タンパク質を含有し、偽性の全タンパク質示度により可溶性タンパク質の正確な評価を困難にしていた。しかしながら、神経膠腫サンプルの微粒子分画中では、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは対照に比較して劇的にアップレギュレートされており、また、完全長ＢＥＨＡＢは、それが対照に比較してほとんど検出不可能となったようにダウンレギュレートされていた。
【０３４３】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはヒト神経膠腫組織中でのみ検出されかつ健康な組織中でされない
ＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡはヒト神経膠腫ならびに浸潤性神経膠腫のラットモデルにおいて高度にアップレギュレートされている。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは、神経膠腫のラットモデルおよびまたヒト神経膠腫の外科的サンプル中での主要なアップレギュレートされたＢＥＨＡＢアイソフォームを代表する。完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがヒト神経膠腫中で差次的に調節されたかどうかを決定するために、ヒト神経膠腫の外科的サンプル中のＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を死後の正常ヒト脳サンプルと比較した。脳ホモジェネートは本質的に本明細書の別の場所に記述されるとおり調製した。正常ヒト脳サンプル中では、５５日齢から７２歳までの検査した全年齢で、完全長ＢＥＨＡＢアイソフォームが１６０ｋＤａ（コンドロイチナーゼでの処理後）のおよその分子量を伴い検出された（図１３）。ヒト完全長ＢＥＨＡＢはラット完全長ＢＥＨＡＢより１０ｋＤａより大きく泳動することに注意することが重要である。これは部分的にヒトＢＥＨＡＢの一次アミノ酸配列がラットのものより長いという事実による。ヒト神経膠腫サンプルからの可溶性分画において、ＢＥＨＡＢ発現は正常レベルを超えて検出可能に増大されなかった。神経膠腫におけるＢＥＨＡＢ  ｍＲＮＡの発現の顕著な増大（Ｊａｗｏｒｓｋｉら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６：２２９３−２２９８；Ｇａｒｙら、２０００、Ｇｅｎｅ  ２５６：１３９−１４７）は、神経膠腫サンプルからの微粒子（膜）分画中でのみ検出されるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの劇的なアップレギュレーション（図１３）の代わりに生じることがありそうである。ラットのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはラットの完全長ＢＥＨＡＢより２０ｋＤａより小さい一方、ヒトのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはヒトの完全長ＢＥＨＡＢより約１０ｋＤａのみより小さい。ラットおよびヒトの双方において、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは膜分画中でのみ見出される。しかしながら、成体ヒトのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは神経膠腫中でのみ検出されかつ正常脳中でされない一方、双方のアイソフォームは正常ラット脳中で検出される。ＢＥＨＡＢのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は成体ヒト脳中でダウンレギュレートされている（Ｇａｒｙら、２０００、Ｇｅｎｅ  ２５６：１３９−１４７）一方、発現レベルはラットにおいて成人期へ高いまま留まる。多様な年齢からのヒト脳の１５を超えるサンプルのアッセイにおいて、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは正常ヒト脳中で検出されていないが、しかしヒトグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはアッセイしたすべての神経膠腫サンプル中で検出された。これらのデータは、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが神経膠腫特異的アイソフォームを表しかつ神経膠腫におけるＢＥＨＡＢの主要なアップレギュレートされたアイソフォームであることを示す。
【０３４４】
ヒトのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームは、ラットでのように、完全長ＢＥＨＡＢの切断生成物でない。完全長ＢＥＨＡＢのＮおよびＣ末端エピトープもまたグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ上で検出された。完全長ＢＥＨＡＢを、ヒトＢＥＨＡＢのＧＡＧ結合領域中の１エピトープを認識する抗体Ｂ６を使用して正常ヒト脳および神経膠腫膜調製物から免疫沈降させた（図７）。免疫沈降させたタンパク質を、ＢＥＨＡＢのＮ（Ｂ５）およびＣ（ＢＣＲＰ）末端の１０ｋＤａ以内に位置するエピトープに対する抗体でイムノブロットした（図７Ａ）。グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが完全長ＢＥＨＡＢの末端短縮切断生成物を表した場合、Ｎ若しくはＣ末端抗体の一方は神経膠腫で見出されるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームを検出することに失敗するとみられる。しかしながら、ラットグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢでの実験で示されたとおり、ヒト完全長ＢＥＨＡＢおよびヒトグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの双方が抗ＢＥＨＡＢ抗体の全３種により検出され（図１４）、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが完全長ＢＥＨＡＢの切断生成物でないことを示した。さらに、Ｃ末端ＢＣＲＰ抗体による神経膠腫サンプル中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの検出は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームでなかったことの直接の証拠を提供した。ＣＲＰドメインはＧＰＩ結合型スプライスバリアントに存在しないからである。
【０３４５】
グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは完全長ＢＥＨＡＢと同一のｍＲＮＡ由来でありかつタンパク質分解性プロセシングの結果でなかったため、異なる翻訳後修飾がこれら２種のアイソフォーム間の大きさの差異の原因であるかもしれない。加えて、ラットのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはラットの完全長ＢＥＨＡＢより２０ｋＤａより小さい一方、ヒトのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは完全長のヒトＢＥＨＡＢより１０ｋＤａのみより小さく（図５および１３）、翻訳後修飾における種差を示唆する。ラットおよびヒト双方のＢＥＨＡＢはＮ−結合糖、コンドロイチン硫酸ＧＡＧ鎖および付加的なＯ−結合糖を運搬する。従って、グリコシル化の差異がグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢと完全長ＢＥＨＡＢとの間、ならびにラットからのＢＥＨＡＢとヒトからのＢＥＨＡＢの間の大きさの差異を説明するかもしれない。完全長ＢＥＨＡＢと異なり、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはコンドロイチン硫酸鎖を欠くようであった。コンドロイチナーゼＡＢＣ処理はバンドの見かけの分子質量を移動も高めもせず、若しくはその免疫反応性を低下させた（図１５）。さらに、Ｎ−およびＯ−結合糖を除去した酵素の組合せは、正常脳および神経膠腫双方において完全長ＢＥＨＡＢのバンドをグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの位置に向かって移動させた（図１５）。対照的に、神経膠腫中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの電気泳動移動度はグリコシダーゼでの処理により影響を受けず、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが、完全長ＢＥＨＡＢ上に存在するＮ−およびＯ−結合糖の全部でない場合は大部分を欠いたことを示した。これらの結果は、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＢＥＨＡＢの別個の未グリコシル化若しくは過少グリコシル化アイソフォームであることを示した。興味深いことに、ラット脳中では、完全長ＢＥＨＡＢが１５０ｋＤａのおよその分子量で泳動し、また、脱グリコシル化された場合に１３０ｋＤａのおよその分子量に移動する（図８）。対照的に、完全長のヒトＢＥＨＡＢは１６０ｋＤａのおよその分子量で泳動するが、しかし酵素的脱グリコシル化により１５０ｋＤａに対し１０ｋＤａのみだけ移動される（図１５）。これは、グリコシル化の種差がラットおよびヒトにおけるこれらのアイソフォームの大きさの差異を説明することを示す。さらに、これらの結果は、これらの大きさの差異にもかかわらず、ラットおよびヒトのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが、共通の機構により生じられるようでありかつ生化学的に類似の分子であることを示唆する。
【０３４６】
ヒトのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ、および完全長ＢＥＨＡＢの膜会合成分が正常ヒト脳および神経膠腫膜調製物から遊離された条件を検討した。ＢＥＨＡＢはカルシウム依存性の機構によりテナシン−Ｒおよび硫酸化糖脂質のサブセットに結合されている（Ａｓｐｅｒｇら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０１１６−１０１２１；Ｍｉｕｒａら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１１４３１−１１４３８）。膜とＢＥＨＡＢのカルシウム依存性の会合を、二価の陽イオンキレート剤ＥＤＴＡを使用して検討した。完全長ＢＥＨＡＢは正常ヒト脳および神経膠腫双方からのサンプル中でＥＤＴＡにより部分的に遊離され、ラットで立証されたところの膜とのカルシウム依存性の会合を確認した。極めて対照的に、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢは神経膠腫サンプル中ではＥＤＴＡにより遊離されず、カルシウム非依存性の機構による膜との会合を示した（図１６）。ヒト神経膠腫中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢはラット脳のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの挙動を模倣し、ラットおよびヒトからのグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが分子的に類似の若しくは同一の機構により細胞膜に結合していることを示唆する。
考察
以前の研究は、非浸潤性腫瘍として増殖する９Ｌ神経膠肉腫細胞株がＢＥＨＡＢの５’フラグメントでトランスフェクトされる場合に浸潤性となることを示した（Ｚｈａｎｇら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８：２３７０−２３７６）。しかしながら、完全長ＢＥＨＡＢでの９Ｌ細胞のトランスフェクションは腫瘍の表現型を野性型９Ｌ細胞から変化させない。極めて対照的に、完全長ＢＥＨＡＢでトランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞は腫瘍の大きさおよび浸潤性を増大させる。多様な細胞株の表現型の差異はこれら２細胞株のＢＥＨＡＢを切断する能力の差異により説明される。ＣＮＳ−１細胞は完全長タンパク質をＧｌｕ３９５−Ｓｅｒ３９６の切断部位で切断して９０ｋＤａおよび５０ｋＤａのフラグメントを創製する。対照的に、９Ｌ細胞は完全長タンパク質をタンパク質分解的にプロセシングしない。加えて、以前の研究は、ＣＮＳ−１細胞中でのＢＥＨＡＢ切断がＡＤＡＭＴＳ−４により媒介されることを示した（Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２２６９５−２２７０３）。神経膠腫の進行におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を、変異させた切断不可能な形態のＢＥＨＡＢでトランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞を使用して評価した。腫瘍の進行および動物の生存に対する本構築物の影響が研究され、そして、神経膠腫の進行におけるＢＥＨＡＢ切断の役割を初めて確実に示す。
【０３４７】
３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ３９８から３９３Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ３９８（それぞれ配列番号１および配列番号２）へのＢＥＨＡＢ／ブレビカン切断部位の突然変異は該タンパク質をＣＮＳ−１細胞により完全に切断不可能にした。重要なことに、この切断不可能な変異体はラットＣＮＳ−１腫瘍に対し正常な完全長の構築物と異なる影響を有した。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍は対照腫瘍を伴う動物に関してより大きくかつ動物の生存時間を減少させた一方、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は対照腫瘍と表現型上識別可能でなかった。これらの研究は、切断およびプロセシングの双方が原発性ＣＮＳ腫瘍におけるＢＥＨＡＢの機能において演じている決定的に重要な役割を明確に示す。
【０３４８】
ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍より小さかったがしかし対照腫瘍と表現型上同様であった。この結果は、とりわけ、脳中で増殖される場合に内因性ＢＥＨＡＢを発現するようにＣＮＳ−１細胞が誘導されるという事実に照らして、神経膠腫におけるＢＥＨＡＢ切断に媒介される影響の機構についての情報を提供する。従って、これらの実験で使用される細胞株の全３種が正常レベルの内因性ＢＥＨＡＢを発現し；ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍は内因性ＢＥＨＡＢに加え切断可能な形態の外因性ＢＥＨＡＢを発現し；そしてＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は内因性ＢＥＨＡＢに加え切断不可能な形態の外因性ＢＥＨＡＢを発現する。従って、ＮＶＹ変異体がＣＮＳ−１細胞腫瘍においてドミナントネガティブとして作用していた場合は、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍はＢＥＨＡＢの正常な機能を破壊することにより対照腫瘍（ＣＮＳ−１−ＧＦＰ）より有意により小さいとみられることが期待されようが、これは真実でない。むしろ、ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍は、対照腫瘍に比較してそれらの表現型の変化を生じさせない分子で代わりにトランスフェクトされていたようであり、ＢＥＨＡＢの切断生成物が完全長タンパク質により媒介されない独特の相互作用および／若しくは機能を媒介することを示唆する。一例として、ＢＥＨＡＢ切断生成物がマトリックスを単に可溶化しかつ細胞の動きを可能にした場合は、切断不可能なＢＥＨＡＢの産生はこの効果を打ち消すとみられる。しかしながら、切断不可能な基質を伴う若しくは伴わない腫瘍は非常に類似であるようである。これらの結果は、ＢＥＨＡＢ切断生成物が、完全長のタンパク質それ自身により媒介されない独特の機能を有することを示唆する。本明細書で明らかなデータは、ＢＥＨＡＢ切断が原発性ＣＮＳ腫瘍の進行を増強すること、およびＢＥＨＡＢ切断を阻害することが腫瘍の進行を低下させ得ることを示す。これらの研究は、ＢＥＨＡＢ切断の阻害が重要な新たな治療戦略を表すかもしれないことを強く示し、そして従って、ＢＥＨＡＢ切断若しくは切断生成物の機能の阻害が原発性ＣＮＳ腫瘍の有効かつ新規の治療方法としてはたらくであろう。
【０３４９】
本明細書で引用されるそれぞれのおよびすべての特許、特許出願および刊行物の開示はこれによりそっくりそのまま引用することにより本明細書に組込まれる。
【０３５０】
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形が本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により考案されうることが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部のこうした態様および同等の変形を包含すると解釈されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０３５１】
本発明を具体的に説明する目的上、本発明のある態様を図面に描く。しかしながら、本発明は図面に描かれる態様の正確な配置および手段に制限されない。
【図１】図１Ａから１Ｃを含んでなる、完全長および／若しくは変異体ＢＥＨＡＢで安定に（図１Ｃ）若しくは一過性に（図１Ａおよび１Ｂ）トランスフェクトした細胞からの培地のウェスタンブロット分析の像を描く。図１Ａは完全長（ＦＬ）および変異体（ＮＶＹ）ＢＥＨＡＢで一過性にトランスフェクトした細胞からの培地のウェスタンブロットを描く。双方の細胞株は１４５ｋＤａの完全長タンパク質の強い染色を表す。対照的に、切断生成物はＢ５０抗体を使用してＮＶＹ変異体で検出されなかった一方、５０ｋＤａの切断生成物がＦＬでトランスフェクトした細胞の培地中で検出された。図１Ｂは２μｇのＦＬ構築物および０、１、２若しくは４μｇのＮＶＹ変異体構築物で一過性にコトランスフェクトした細胞からの培地のウェスタンブロットを描く。ＮＶＹ変異体のトランスフェクションは完全長ＢＥＨＡＢの量を増大させたが、しかしＢ５０抗体を使用してみられるとおり正常ＢＥＨＡＢの切断に対する影響を有しなかった。図１Ｃは完全長（ＦＬ）および変異体（ＮＶＹ）ＢＥＨＡＢで安定にトランスフェクトされた細胞からの培地のウェスタンブロットを描く。ＢＥＨＡＢの発現を、Ｂ６およびＢ５０抗体を使用してＣＮＳ−１−ＦＬおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞中で検査した。一過性トランスフェクションでのように、ＣＮＳ−１−ＦＬで安定にトランスフェクトされた細胞はＢＥＨＡＢを産生かつ切断した一方、ＣＮＳ−１−ＮＶＹで安定にトランスフェクトされた細胞は完全長タンパク質を産生したがしかしそれを切断しなかった。
【図２】図２Ａおよび２Ｂを含んでなる、細胞増殖および細胞死に対する安定なトランスフェクションの影響を描く。ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹ安定細胞株を、細胞増殖（図２Ａ）および細胞死（図２Ｂ）に対するＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹトランスフェクションの影響について親ＣＮＳ−１細胞と比較した。図２ＡはＭＴＴアッセイを使用した７日にわたる細胞増殖を描くグラフである。データは吸光度の変化を示す。ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹを使用するトランスフェクションは細胞増殖に対する影響を有しなかった。図２ＢはＬＤＨアッセイを使用して評価したところの７日にわたる細胞死を描くグラフである。ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹを使用するトランスフェクションは細胞死に対する影響を有しなかった。
【図３】図３Ａから３Ｄを含んでなる、腫瘍体積に対するＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹを使用するトランスフェクションの影響を描く。安定にトランスフェクトされた細胞をラットに頭蓋内に８日間埋植し、そして生じた腫瘍の相対的大きさを組織学的に評価した。図３ＡはＣＮＳ−１−ＧＦＰ細胞由来の代表的腫瘍の像を描く。図３ＢはＣＮＳ−１−ＦＬ細胞由来の代表的腫瘍の像を描く。図３ＣはＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞由来の代表的腫瘍の像を描く。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍はＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍より大きくかつより浸潤性である。図３ＤはＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹ細胞由来の腫瘍の体積を描くグラフである。これらのデータは画像分析および体積再構成により定量化し、また、個々のデータ点を＊印により表す。
【図４】ＣＮＳ−１−ＦＬ、ＣＮＳ−１−ＧＦＰおよびＣＮＳ−１−ＮＶＹで安定にトランスフェクトした細胞由来の腫瘍の動物の生存に対する影響を描くグラフである。ＣＮＳ−１−ＦＬ腫瘍を伴う動物は、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ腫瘍若しくはＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍を伴う動物より有意により短時間生存した。ＣＮＳ−１−ＮＶＹ腫瘍を伴う動物における生存は、ＣＮＳ−１−ＧＦＰ対照腫瘍を伴う動物における生存と有意に異ならなかった。
【図５】図５Ａおよび５Ｂを含んでなる、ラットにおける胚（ｅ）、生後（Ｐ）および成体（Ａｄ）の発達段階にわたるＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を描く一連の像である。ラット脳からの全ホモジェネートを可溶性（ｓ）および膜微粒子（ｐ）分画に分離した。生じる分画をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理しかつウェスタンブロッティングのため処理した（図５Ａ）。完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）および９０ｋＤａのＢＥＨＡＢ切断生成物（Ｂ／ｂ９０）をＢ６抗体で検出し、５０ｋＤａの切断生成物（Ｂ／ｂ５０）はＢ５０抗体で検出した（図５Ｂ）。矢印は、完全長ＢＥＨＡＢアイソフォーム（Ｂ／ｂＦＬ）ならびに膜会合型グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム（Ｂ／ｂΔｇ）の位置を示す。
【図６】図６Ａから６Ｄを含んでなる、ＧＰＩアンカー型ＢＥＨＡＢとグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢとの間の差違を描く一連の像である。図６Ａは、トリスＨＣｌ緩衝液（Ｔｒｉｓ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むトリス緩衝液（Ｔｘ１００）若しくはＮａ２ＣＯ３（Ｎａ２ＣＯ３）に再懸濁した成体ラット脳の全膜（Ｍ）上清（ｓ）およびペレット（ｐ）を描く。図６ＢはＰＩ−ＰＬＣの非存在（Ｃｔｒｌ）若しくは存在（ＰＩ＿ＰＬＣ）下にコンドロイチナーゼＡＢＣを含むＣＨ緩衝液に再懸濁した成体ラット脳膜を描く。ＧＰＩアンカー型アイソフォームを表す新たな１２０ｋＤａのバンドがＰＩ−ＰＬＣ処理後に検出された。図６Ｃは上のように酵素で処理しかつその後遠心分離により分離したラット脳膜を描く。図６Ｄは、ＣＨ緩衝液（Ｓ）に再懸濁しかつＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４で抽出して不溶性ペレット（Ｉｎ）水層（Ｈ２Ｏ）および洗剤層（Ｔｘ）を生じたラット脳膜を描く。矢印は、完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）およびＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢアイソフォームを示す。
【図７】図７Ａから７Ｄを含んでなる、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢがＧＰＩ結合型ＢＥＨＡＢでないことを示す一連の画像である。図７ＡはＢＥＨＡＢの構造ならびに抗体Ｂ６、Ｂ５およびＢＣＲＰにより認識される免疫原性エピトープの位置を描く略図である。ＨＡＢＤ、ＨＡ結合ドメイン；ＧＡＧ、ＧＡＧ結合領域；ＥＧＦ、表皮増殖因子反復配列；ＣＲＰ、相補性制御タンパク質様ドメイン。図７ＢはＢ６抗体の非存在（ｍｏｃｋ）若しくは存在（Ｂ６）下で免疫沈降させた可溶化ラット脳膜（Ｍ）を描くブロットの像である。免疫沈降したサンプルはＢ６、Ｂ５およびＢＣＲＰ抗体を使用して免疫検出した。図７Ｃは、完全長のラットＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡで安定にトランスフェクトしかつＢ６、Ｂ５およびＢＣＲＰ抗体で検出したＣＮＳ−１ラット神経膠腫細胞株からの培地（ｍ）および細胞膜（ｃ）を描くブロットの像である。再度、全部の抗体は完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを検出し、これら２種のバンド間の大きさの差異が切断により生成されないことを示した。＊印はＢＣＲＰ抗体により検出されないＢＥＨＡＢのＣ末端短縮分解生成物に対応するバンドを示す。図７Ｄは、未標識若しくはＶ５／６ｘＨｉｓ標識ＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡを発現しかつＢ６若しくはＶ５抗体でそれぞれイムノブロットしたマウスＯｌｉ−ｎｅｕ細胞からの培地（ｍ）および細胞膜（ｃ）を描く像である。双方の場合において、ラットグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォームのみがこれらの細胞中で検出された。
【図８】完全長ＢＥＨＡＢおよびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが単一コアタンパク質の差次的グリコシル化から生じることを描く像である。矢印は、完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）アイソフォームを示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂを含んでなる、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの細胞膜とのカルシウム非依存性の会合を描く一連の像である。図９Ａは成体ラット脳からの全膜（Ｍ）を描き、また、図９ＢはＶ５／６ｘＨｉｓ−ＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしかつＥＤＴＡを含む（ＥＤＴＡ）若しくは含まない（Ｔｒｉｓ）トリスＨＣｌ緩衝液に再懸濁したＯｌｉ−ｎｅｕ細胞からの全膜を描く。生じる上清（ｓ）およびペレット分画（ｐ）をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理しかつＢ６（ラット脳）若しくはＶ５（Ｏｌｉ−ｎｅｕ細胞）抗体でイムノブロットした。矢印は完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）アイソフォームを示す。
【図１０】軽膜細胞成分分画中のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの濃縮を描く像である。全ラット脳ホモジェネート（Ｈ）を細胞成分分画にかけ、そして、生じる分画をＢ６抗体でのウェスタンブロッティング前にコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した。図１０中の分画は：核ペレット（Ｎｕｃ）、重ミトコンドリアペレット（ＨＭ）、軽ミトコンドリアペレット（Ｍｃ）および可溶性上清（Ｓｏｌ）である。重ミトコンドリアペレットは、不連続的ショ糖勾配中で以下の下位分画すなわち浮遊性ミエリン分画（Ｍｙ）、軽膜分画（ＬＭ）、シナプトソーム分画（Ｓｙｎ）およびミトコンドリアペレット（Ｍｉｔ）に細分画した。矢印は完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）アイソフォームを示す。
【図１１】細胞表面上のグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの位置を描く一連の像である。Ｖ５／Ｈｉｓ標識ラットＢＥＨＡＢ  ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＯｌｉ−ｎｅｕ細胞を抗Ｖ５抗体（Ｖ５）で生存染色して（ｌｉｖｅ  ｓｔａｉｎｅｄ）標識グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢを検出した。細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で対染色した。図１１Ａは、グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの細胞外の位置を示す、抗Ｖ５で染色したＢＥＨＡＢでトランスフェクトした細胞を描く。図１１Ｂは抗Ｖ５で染色した対照（ベクター）でトランスフェクトした細胞を描き；そして図Ｃは非免疫血清で染色したＢＥＨＡＢでトランスフェクトした細胞を描く。棒＝２０μｍ。
【図１２】神経膠腫のラットモデルにおけるグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢのアップレギュレーションを描く像である。トランスフェクトしたＣＮＳ−１細胞の頭蓋内注入により生じさせたラット脳神経膠腫腫瘍からのサンプル（Ｇｌｉ）を可溶性（ｓ）および微粒子（ｐ）分画に分画し、コンドロイチナーゼＡＢＣで処理しそしてウェスタンブロッティングのため処理した。脳の反対側に対応する対にした対照サンプル（Ｃｔｒｌ）ならびに未処理の成体動物からの別個の対照サンプル（Ａｄ）を同一に処理した。ＢＥＨＡＢはＢ６抗体を使用して検出した。矢印は完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）を示す。
【図１３】５５日（ｄ）から７２歳（ｙｒ）齢までの死後脳組織中および外科的神経膠腫（Ｇｌｉ）サンプル中でのヒトの発達にわたってのＢＥＨＡＢアイソフォームの発現を示すイムノブロットを描く像である。（Ｓ）はヒト脳ホモジェネートからの可溶性分画を示し、また、（Ｐ）はヒト脳ホモジェネートの膜微粒子分画を描く。生じる分画をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理しかつウェスタンブロッティングのため処理した。ヒト完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）はＢ６抗体で検出した。矢印は完全長ＢＥＨＡＢアイソフォーム（Ｂ／ｂＦＬ）および膜会合型グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム（Ｂ／ｂΔｇ）の位置を示す。
【図１４】ヒト神経膠腫特異的グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）が完全長ＢＥＨＡＢアイソフォームのタンパク質分解性切断の産物でないことを描くイムノブロットの像である。正常ヒト脳および神経膠腫からの可溶化膜（Ｍ）をＢ６抗体の非存在（ｍｏｃｋ）若しくは存在（Ｂ６）下で免疫沈降させた。免疫沈降したサンプルをＢ６、Ｂ５およびＢＣＲＰ抗体を使用して免疫検出した。矢印は完全長ＢＥＨＡＢアイソフォーム（Ｂ／ｂＦＬ）および膜会合型グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢアイソフォーム（Ｂ／ｂΔｇ）の位置を示す。
【図１５】ヒト完全長ＢＥＨＡＢおよび神経膠腫特異的グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢが単一コアタンパク質の差次的グリコシル化から生じることを描く像である。サンプルをコンドロイチナーゼ（ＣＨ’ａｓｅ）ＰＮＧアーゼＦ（Ｎ−ｇｌｙｃ  Ｆ）、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｏ−ｇｌｙｃｏｓ．）および／若しくはシアリダーゼで処理した。矢印は完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）を示す。
【図１６】グリコシル化バリアントＢＥＨＡＢの細胞膜とのカルシウム非依存性の会合を描く像である。成体ヒト脳および神経膠腫からの全膜（Ｍ）を、ＥＤＴＡを含む（ＥＤＴＡ）若しくは含まない（Ｔｒｉｓ）トリスＨＣｌ緩衝液に再懸濁した。生じる上清（ｓ）およびペレット分画（ｐ）をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理しかつＢ６抗体でイムノブロットした。矢印は完全長ＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂＦＬ）およびグリコシル化バリアントＢＥＨＡＢ（Ｂ／ｂΔｇ）アイソフォームを示す。
【配列表】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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