(57)【要約】本発明は、脂肪族α、ω−ジニトリルの対応するω−カルボン酸ニトリルへの変換のための生体触媒による新規な方法を目的とする。より特別には、本発明は、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルの、ガバペンチン合成における有用な中間体である1−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドへの変換方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを水性の反応混合物中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；そして
（ｂ）上記水性の反応混合物から１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを回収する；
を含む、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルから１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを調製する方法。
【請求項２】
微生物全細胞の形態の前記酵素触媒が、以下の：アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis） 72W (ATCC 55746)、アシドボラックス・ファシリス 72-PF-15 (ATCC 55747)、アシドボラックス・ファシリス 72-PF-17 (ATCC 55745)、エシェリシア・コリ（Esherichia coli）SS1001 (ATCC PTA-1177)、エシェリシア・コリ SW91 (ATCC PTA-1175)及びバシラス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）(ATCC)から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素触媒が、以下の：アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis） 72W (ATCC 55746)、エシェリシア・コリ（Esherichia coli）SS1001 (ATCC PTA-1177)、及びエシェリシア・コリ SW91 (ATCC PTA-1175)からなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素触媒が、以下の：NIT-104、NIT-105及びNIT-106から成る群から選ばれる部分精製された酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素触媒が、ポリマーマトリクス中に固定されている、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素触媒が、アルギン酸カルシウム中に固定されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）における１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルが、水混和性の不活性有機溶媒中に予め溶解されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ｂ）における前記回収ステップが、有機溶媒で上記水性の反応混合物を抽出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記有機溶媒が酢酸エチル又はメチル３級ブチルエーテルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記水混和性の有機溶媒が、ＤＭＦ又はＤＭＳＯである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪族α、ω−ジニトリルの対応するω−カルボン酸ニトリルへの変換のための生体触媒による新規な方法を目的とする。より特別には、本発明は、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルの、ガバペンチン合成における有用な中間体である１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドへの変換方法を提供する。ガバペンチンは、一定の脳の病気、例えば、ある形態のてんかん、失神発作、運動低下及び頭蓋外傷、の治療のために使用されることができる。ガバペンチンは脳機能を改善するのに有効であるため、老人患者の治療においても有用である。
【背景技術】
【０００２】
対応するニトリルからカルボン酸を調製するためのニトリラーゼ酵素の使用は、ＰＣＴ国際特許出願公開第WO 02/072856号に開示されている。該酵素の架橋ポリマーマトリックスへの取り込みは、物理的及び生化学的統合性の改善された触媒を提供する。
【０００３】
生体触媒による脂肪族α、ω−ジニトリルからのω−カルボン酸ニトリルの位置選択的な調製は、米国特許第5,814,508号（’508特許）中に開示された。例えば、ニトリラーゼ活性を有する触媒は、２−メチルグルタロニトリルの４−シアノペンタン酸への変換に使用された。
【０００４】
K.Yamamoto, et al., J. Ferment. Bioengineering, 1992, vol. 73, 125-129は、トランス１，４−ジシアノシクロヘキサンをトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸に変換するためのニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼ活性の両方を有する微生物細胞の使用を記載する。
【０００５】
ジニトリルからシアノ置換カルボン酸への位置選択的な生体触媒による変換が、一連の脂肪族α、ω−ジニトリル化合物について、脂肪族ニトリラーゼ活性、又はニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼ活性の組み合わせを有する微生物細胞を用いて報告された（J.E. Gavagan et al., J. Org. Chem., 1998, vol. 63, 4792-4801）。上記の参考文献は、そっくりそのまま本明細書中に援用されている。
【０００６】
一般に、対応するカルボン酸へのニトリルの酵素触媒による変換は、強い酸性又は塩基性条件及び高温を使用する化学的方法よりも有利である。より穏やかな反応条件下で行うことに加えて、ジニトリルからカルボン酸ニトリルへの酵素触媒による変換は、2つのニトリル基のうちの1つのみが反応を受けるように高い位置選択性をもって行われる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明の方法においては、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドへの位置選択的な生体触媒による変換は、脂肪族ニトリラーゼ活性を有する酵素触媒を用いて達成される。
【０００８】
本発明は、以下のステップ：
（ａ）１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを水性の反応混合物中でニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させ；そして
（ｂ）上記水性の反応混合物から１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを回収する；
を含む、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルから１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを調製する方法を含む。
【０００９】
脂肪族ニトリラーゼ活性を有し、本発明において有用な微生物全細胞酵素触媒は、アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis） 72W (ATCC 55746)、アシドボラックス・ファシリス 72-PF-15 (ATCC 55747)、アシドボラックス・ファシリス 72-PF-17 (ATCC 55745)、エシェリシア・コリ（Esherichia coli）SS1001 (ATCC PTA-1177)、エシェリシア・コリ SW91 (ATCC PTA-1175)及びバシラス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）(ATCC)を含む。
【００１０】
好ましくは、酵素触媒は以下の：アシドボラックス・ファシリス（Acidovorax facilis） 72W (ATCC 55746)、エシェリシア・コリ（Esherichia coli）SS1001 (ATCC PTA-1177)、及びエシェリシア・コリ SW91 (ATCC PTA-1175)からなる群から選ばれる。
【００１１】
他の実施態様においては、酵素触媒はポリマーマトリックス内に固定化される。ポリマーマトリックスはアルギン酸カルシウムであることが好ましい。
【００１２】
脂肪族ニトリラーゼ活性を有し、そしてＩＩからＩへの変換に有用な、部分精製された酵素の調製物は、NIT-104、NIT-105及びNIT-106（Biocatalytics Inc., Pasadena, CA）を含む。
【００１３】
好ましい実施態様においては、酵素触媒と１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを接触させるステップは、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを水混和性有機溶媒中に予め溶解させるステップを含む。最も好ましくは、上記溶媒はジメチルホルムアミド（DMF）又はジメチルスルホキシド（DMSO）である。
【００１４】
本発明の他の実施態様においては、１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドは、有機溶媒による抽出によって水性反応混合物から回収される。好ましくは、抽出ステップにおいて使用される有機溶媒は酢酸エチル又はメチル３級ブチルエーテルである。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される以下の用語又は略語が以下において説明されるが、当業者は本発明を説明するために本明細書中で使用される用語を完全に理解するであろう。
“℃”は、摂氏温度を意味する。
“酵素触媒”は、ニトリラーゼ活性、又はニトリルヒドラターゼ活性及びアミダーゼ活性の組み合わせのいずれかに特徴を有する触媒を意味する。触媒は、微生物全細胞、透過化微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つ以上の細胞成分、部分精製された酵素又は精製酵素の形態であることができる。
“水性反応混合物”は、大部分が水性の媒体中の基質と酵素触媒の混合物を意味する。
“ニトリラーゼ活性”は、ニトリル基をカルボン酸基に変換する酵素活性を意味する。
“ニトリルヒドラターゼ活性”は、ニトリル基をアミド基に変換する酵素活性を意味する。
“アミダーゼ活性”は、アミド基をカルボン酸基に変換する酵素活性を意味する。
【００１６】
ATCCは、10801 University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, U.S.A.にあるAmerican Type Culture Collection である。Biocatalytics Inc. は、129 N. Hill Avenue, Suite 103, Pasadena, CA, 91106, U.S.A.にある。Zylepsis Ltd.は、Henwood Business Estate, Ashford, Kent, U.K. TN24 8DHにある。
【００１７】
本発明は１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル（II）から１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（I）を以下のように調製するための生体触媒による方法を提供する。
【化１】
2006527595.tif 000002
【００１８】
この生体触媒による方法は、式IIにより表される化合物をニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させることによって実施され、そして式Iにより表される化合物を高収率及び高い位置選択性をもって生成する。
【００１９】
この生体触媒による方法は、式IIにより表される化合物をニトリルヒドラターゼ活性及びアミダーゼ活性の組み合わせを有する酵素触媒と接触させることによっても実施されることができる。式IIにより表される化合物をニトリラーゼ活性を有する酵素触媒と接触させることが、1つのステップにおいてIを形成させるにもかかわらず、ニトリルヒドラターゼ活性及びアミダーゼ活性を有する酵素触媒を使用するIの形成は、IIをニトリルヒドラターゼ活性と接触させて２−（１−シアノ−シクロヘキシル）−アセタミドを形成し、続いてアミダーゼ活性によって２−（１−シアノ−シクロヘキシル）−アセタミドをIに加水分解することを含む。Zyanotase（商標）（Zylepsis Ltd., Ashford, Kent, U.K.）は、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを２−（１−シアノ−シクロヘキシル）−アセタミドへ変換するための好適な酵素触媒である。
【００２０】
ニトリラーゼ活性、又はニトリルヒドラターゼ活性及びアミダーゼ活性の組み合わせのいずれかを有する本発明の多様な酵素は、濃縮ニトリルを含む培地中で増殖することのできるその能力に基づいて微生物を最初に選択する、濃縮単離技術などのスクリーニングプロトコールを通して見出されることができる。濃縮単離技術は、典型的に、所望の生物変換のニトリル基質又は構造的に類似するニトリル化合物であることのできる濃縮ニトリルを補充した炭素制限又は窒素制限培地を使用することを含む。ニトリラーゼ活性を有する微生物は、濃縮ニトリル含有培地中で増殖するそれらの能力に基づいて最初に選択されることができる。Gavagan et al.,(Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) vol. 52, 654-659)は、２−エチルサクシノニトリルを唯一の窒素源として用いて、土からグラム陰性細菌、アシドボラックス・ファシリス 72W（ATCC 55746）を単離するための濃縮技術を用いた。アシドボラックス・ファシリス 72W（ATCC 55746）は、２−メチルグルタロニトリルから４−シアノペンタン酸への選択的変換に有用であることが示された。濃縮技術はまた、３−シアノピリジンのニコチン酸への変換を触媒する好熱性細菌、バシラス・パリダス（Bacillus pallidus）Dac521を単離するためにも使用された（Almatawah and Cowan, Enzyme Microb. Technol. (1999) vol. 25, 718-724）。濃縮技術によって単離された微生物は、微生物細胞の懸濁液をニトリル化合物と接触させ、そして高速液体クロマトグラフィー、ガス液体クロマトグラフィー、又は液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（LCMS）などの分析法を用いて対応するカルボン酸の存在について試験することによって、ニトリル加水分解活性について試験されることができる。アシドボラックス・ファシリス 72W（ATCC 55746）のニトリル加水分解活性を試験するための技術は、米国特許第5,814,508号中に報告されている。濃縮技術は、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを窒素源として増殖することのできる１つの微生物を土から単離するのに使用された。Vitek代謝アッセイを用いてバシラス・スフェリカス（ATCC）として同定されたこの微生物は、IIをIへ変換することが示された。
【００２１】
ニトリラーゼ活性又はニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼ活性を有する微生物が単離されたら、上記酵素の多様な側面を改善するために、酵素工学が採用されることができる。これらの改善は、本発明にとって有用であり、そして酵素の触媒効率を増加させ、高温、より広いpH範囲に対する安定性を増加させ、及び酵素が水性緩衝液及び有機溶媒の混合物を含む反応媒体中で作用することを可能とすることを含む。
【００２２】
改善された収率、スループット、及び特別な生物変換プロセスに好適な生成物の質に加えて、ニトリラーゼ活性又はニトリルヒドラターゼ及びアミダーゼ活性を有する酵素触媒を生成するために、本発明において採用されることのできる多様な技術は、部位特異的突然変異及びランダム突然変異又はDNAシャッフリング技術を利用する定方向進化技術などの合理的設計方法などの酵素工学技術を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
IIからIへの変換に好適な酵素触媒は、微生物全細胞、透過化微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製された酵素又は精製酵素の形態であり、そのような触媒は支持体上に固定化されることができる。
【００２４】
この方法は、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルと酵素触媒を、蒸留水中又は反応の最初のpHを５．０及び１０．０の間、好ましくは６．０と８．０の間に維持する緩衝剤の水溶液中で接触させることによって実施されることができる。好適な緩衝剤は、リン酸カリウム及び酢酸カルシウムを含む。反応が進行すると、反応混合物のpHは、ジニトリルの対応するニトリル官能基からのカルボン酸アンモニウム塩の形成によって変化することができる。反応はpH制御なしにジニトリルの完全な変換まで進むことができるか、又は所望のpHを維持するために反応の中で好適な酸又は塩基が添加されることができる。しかしながら、上記のように、より広いpH範囲にわたって有効に機能する酵素工学及び定方向進化などの技術をもちいて酵素触媒を精製することが可能である。
【００２５】
1つの特別な実施態様においては、微生物全細胞が触媒として使用される。微生物全細胞は前処理なしに使用されることができるが；しかし、アシドボラックス・ファシリス細胞は、約５０℃で約１時間熱処理され、それによって望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を非活性化し、そしてIIからIへの変換のための高い位置選択性を有する全細胞触媒を生成することが好ましい。アシドボラックス・ファシリス  72-PF-15（ATCC 55747）及び代わりのアシドボラックス・ファシリス  72-PF-17（ATCC 55745）は、非常に低レベルの望ましくないニトリルヒドラターゼ活性を生じ、そしてしたがってIIからIへの変換のための酵素触媒としての使用の前に熱処理を必要としない。微生物全細胞酵素触媒の湿細胞重量は、典型的には、約０．００１g/mL〜約０．５g/mLの範囲、そして好ましくは約０．１g/mL〜約０．３g/mLの範囲である。
【００２６】
場合により、触媒はポリマーマトリックス中に固定されることができる。固定化酵素触媒は、繰り返して及び連続的な方法において使用可能であり、そして非固定化酵素触媒よりも容易に酵素によるプロセスの生成物から分離可能である。特に、本発明においては、全細胞はアルギン酸カルシウム又はポリアクリルアミドなどのポリマーマトリックス中に捕捉されることによって固定化可能である。セライトなどの無機固体支持体も使用される。ポリマーマトリックス中での細胞の固定化方法は、当業者に周知である。アシドボラックス・ファシリス  72W（ATCC 55746）、エシェリシア・コリ  SW 91（ATCC PTA-1175）、及びエシェリシア・コリ  SS1001（ATCC PTA-1177）の固定化された細胞はIIからIへの変換のために特に有用であり、それは、それらがバッチプロセス又は連続的なプロセスにおいて繰り返し使用可能だからである。アルギン酸カルシウム又はカラギーナン中に固定化されたアシドボラックス・ファシリス  72W（ATCC 55746）、エシェリシア・コリ  SW 91（ATCC PTA-1175）、及びエシェリシア・コリ  SS1001（ATCC PTA-1177）の細胞（PCT国際特許出願公開第WO 01/75077 A2号）は、IIからIへの変換に有用である。好ましくは、ポリマーマトリックス中に捕捉された全細胞からなる酵素触媒は、反応体積１mLあたり約０．０１ｇ〜０．６ｇの湿重量、好ましくは０．１〜０．５g/mLの範囲で使用される。
【００２７】
さらに、微生物細胞から調製され、NIT-104、NIT-105及びNIT-106（Biocatalytics Inc., Pasadena, CA）と名づけられたいくつかの凍結乾燥ライゼートも、IIからIへの変換に有用である。NIT-104、NIT-105及びNIT-106とIIとの水性反応混合物中での接触は、Iの形成を引き起こす。０．０１〜１０g/L、好ましくは０．１〜５g/Lの基質及び触媒濃度が使用可能である。全細胞及び固定化全細胞酵素触媒について記載された反応条件（温度及びpH範囲）も、凍結乾燥ライゼートを用いるIIからIへの変換に使用可能である。
【００２８】
加水分解反応の温度は、反応速度及び酵素触媒活性の安定性の両方を最適化するために選択される。反応温度は、懸濁液の凍結温度（約０℃）のすぐ上から６０℃までの範囲、好ましくは５℃〜３５℃の反応温度の範囲であることができる。
【００２９】
IIからIへの酵素触媒による変換は、IIと酵素触媒を水性の反応混合物中で接触させることによって実施されることができる。中程度にのみ水に可溶性である（約１０mM、２５℃、２０mMリン酸緩衝液、pH７）、出発物質である化合物IIは、その水溶解性限度を超えるレベルで酵素触媒を含む水性反応液に添加されることができる。したがって、反応混合物は最初は、溶解したII及び酵素触媒を含む水相と溶解していないIIを含む固体相の２つの相から成る。IIが完全に変換したら、化合物I及び酵素触媒を含む1つの相が残る。酵素により触媒されるIIからIへの変換は、約０．１g/L〜１４８g/L、好ましくは約０．１g/L〜９０g/Lの範囲の化合物IIのレベルで実施可能である。本発明において使用される酵素触媒濃度は、酵素触媒の比活性に依存し、そして所望の反応速度を得るために選択される。
【００３０】
変換の次には、酢酸エチル又はメチル３級ブチルエーテルなどの有機溶媒による抽出によって反応生成物を単離することが好ましい。１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドの収率は、約２９％〜約９７％の範囲である。
【００３１】
当業者には周知であるとおり、式Iのカルボン酸を回収するために、多様な方法が使用されることができる。
【００３２】
本発明の実施例９に記載され、かつ米国特許第5,362,883号に開示されたとおり、本発明の方法によって生成された式Iの化合物、１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドは、さらに反応させられて、１−アミノメチル−１−シクロヘキサンアセティックアシッド（ガバペンチン、式IIIの化合物）を生成することができる。
【００３３】
触媒による１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（Ia）の塩又はエステルのガバペンチン（III）への水素化は、以下のように実施される：
【化２】
2006527595.tif 000003
｛式中、
Xは、アルカリ金属又はアルカリ土類金属又はC1-C6アルキルである。｝
【００３４】
式（III）の化合物であるガバペンチンの調製のための他の合成法は、（ａ）１，１−シクロヘキサン−ジアセティックアシッドのモノアルキルエステルをアジドに変換し、これをカーチス転位に供し；そして（ｂ）１，１−シクロヘキサン−ジアセティックアシッドモノアミドを、米国特許第4,024,175号に開示されたホフマン転位に供する；を含む。
【００３５】
米国特許第5,693,845号に開示された、式IIIの化合物であるガバペンチンの調製のための他の方法においては、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルがin situで対応するシアノイミドエステルに変換され、これが加水分解及び水素化されてガバペンチンを生じる。
【００３６】
ガバペンチンは、一定の精神医学的及び神経学的疾患を含むさまざまな中枢神経系の障害の治療において有用な薬物である。ガバペンチンはヒトにおいて極めて低い毒性を伴う抗痙攣作用及び鎮攣作用を示す。さらに、ガバペンチンは慢性の疼痛及び脳機能の全般的な改善のための広い用途を見出し、老人患者の治療における薬物の選択肢となった（M.P. Davis and M. Srivastava, Drugs & Aging, 2003, 001.20, 23-57）。
【００３７】
式IIIの化合物は広い用量範囲内の液体又は固体形態で経腸的に又は非経腸的に投与されることができる。注射溶液としては、水が好ましく採用され、安定化剤、溶解剤及び／又は緩衝剤などの注射溶液のための通常の添加剤を含む。
【００３８】
この種類の添加剤は、例えば、酒石酸及びクエン酸緩衝剤、エタノール、（エチレンジアミン四酢酸及びその無毒性の塩などの）錯体形成剤、並びに粘度調節のための（液体ポリエチレンオキサイドなどの）高分子量ポリマーを含む。固体担体物質は、例えば、でんぷん、ラクトース、マンニトール、メチルセルロース、タルク、高分散性珪酸、（ステアリン酸などの）高分子量脂肪酸、ゼラチン、寒天、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、動物性及び植物性脂肪並びに（ポリエチレングリコールなどの）固体高分子量ポリマーを含み；経口投与に好適な組成物は、所望により、フレーバー剤及び／又は甘味剤を含むことができる。
【００３９】
ガバペンチンの個別用量は、非経腸で５mg〜５０mgであり、経腸では２０mg〜２００mgであることができる。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例は、本発明を例示する目的で提供される。
【００４１】
実施例１
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（NIT-104、NIT-105及びNIT-106）
５ｍｇのNIT-104、NIT-105又はNIT-106（Biocatalytics Inc., Pasadena, CA）及び１mLの５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．５、２mMジチオスレイトール（DTT））を含む3つの８mLねじ蓋つきガラスバイアルのそれぞれに１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル（０．０５mLのジメチルスルホキシド中、５mg）を添加した。得られた混合物をマグネティックスターラーを用いて２１℃で攪拌した。２４時間後、サンプルを各反応混合物から取り出し、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（LCMS）で分析した。LCMS分析は、NIT-104、NIT-105及びNIT-106を用いた１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドの１００％の収率を示した。
【００４２】
実施例２
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（NIT-104）
５mLの５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．５、２mM DTT）中の２５mgのNIT-104を含む８mLのねじ蓋つきガラスバイアルに、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル（０．２５mLのDMF中２５mg）を添加し、そして２１℃で２４時間攪拌した。そして、反応混合物を7mLずつの酢酸エチルで２回抽出し、これを捨てた。水層を４N HCｌでpH２まで酸性化し、７ｍLずつの酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を併合し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空下で濃縮して１４mgの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを得た（収率５０％）。
【００４３】
実施例３
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（アシドボラックス・ファシリス 72W ATCC 55746）
参考文献として本明細書中に援用されている、米国特許第5,858,736号及びPCT国際特許出願公開第WO 01/75077 A2号に記載された方法に類似する方法を用いて調製したアシドボラックス・ファシリス 72W（ATCC 55746）細胞によって１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルから１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドへの生物変換を実施した。特別には、Ａ．ファシリス 72W細胞を大豆トリプシン寒天プレート（Tryptic soy agar plate）に接種し、一夜２９℃でインキュベートした。それぞれ２５ｍＬの培地Ａ（リン酸カリウム１塩基酸、０．３９g/L；リン酸カリウム２塩基酸、０．３９g/L；Difco酵母抽出物、５．０g/L；pH６．９）を含む3つの３００ｍL Erlenmeyerフラスコに、寒天プレートからのＡ．ファシリス 72W細胞を接種し、回転式シェーカー（２３０rpm）上で一夜２７℃でインキュベートした。３つのフラスコの内容物をプールし、それぞれ２５ｍＬの培地Ａ（フラスコあたり１．５mLの接種材料）を含む１０個の３００ｍL Erlenmeyerフラスコ及びそれぞれ３５mLの培地A（フラスコあたり１．７５mLの接種材料）を含む１６個の５００ｍL Erlenmeyerフラスコに接種するために使用した。これらのフラスコを回転式シェーカー（２３０rpm）上で２７℃、４８時間インキュベートし、その後、内容物を併合し、グリセロール（１０％ｖ／ｖ）で処理し、遠心分離した。ペレットを１００mLの２０mMリン酸カリウム（１０％グリセロール）中に再懸濁し、５０℃で５０分インキュベートした。熱処理後、細胞を遠心分離によって回収し、ドライアイス中で凍結し、−８０℃で保存した。
【００４４】
2つの１グラム（湿細胞重量）のアリコートの凍結された熱処理済みＡ．ファシリス72W細胞を１２mLの１００mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０、緩衝液A）中で別々に融解し、遠心分離し、そして２０mLの緩衝液A中に再懸濁した。細胞懸濁液を２つの３０℃に維持した１００mLのジャケットつき反応容器（A及びB）に移した。各反応容器に１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル（２９６mg）を添加した。容器Aでは、基質を１mLのDMSOに溶解した一方、容器Bでは、基質を溶媒なしで添加した。反応物を両方とも攪拌用付属品を備えたGraphix DL50滴定装置（Mettler-Toledo, Columbus, OH）を用いて２２時間攪拌した。反応混合物をそれぞれ２０mLアリコートの酢酸エチルで２回抽出し、これを捨てた。水層を４N HCｌでpH２に酸性化し、酢酸エチルで抽出した（３×４０mL）。酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして真空下で濃縮した。反応A及びBからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドの収率は、それぞれ、３２４mg（９７％）及び２７３mg（８２％）であった。
【００４５】
実施例４
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（アシドボラックス・ファシリス 72W ATCC 55746）
凍結した、熱処理済みＡ．ファシリス 72W細胞（２ｇ湿細胞重量）を実施例３に記載のとおりに調製し、２０mLの緩衝液Aに再懸濁し、そして、３０℃に維持した１００mLのジャケットつき反応容器に移した。細胞懸濁液に１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル（１．４８ｇ）を添加し、得られた混合物を７２時間攪拌した。反応混合物を遠心分離し、そしてペレットを２０mLの２０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）に再懸濁し、再び遠心分離した。両方の遠心分離からの上清を併合し、実施例３に記載のとおりに酢酸エチルで抽出して、１．３０ｇの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを得た（収率７７．８％）。
【００４６】
実施例５
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（アシドボラックス・ファシリス 72W ATCC 55746）
凍結した、熱処理済みＡ．ファシリス 72W細胞を実施例３に記載されたものと類似する手順を用いて調製した。それぞれが３０mLの培地B（Difco 酵母抽出物、５g/L；リン酸カリウム１塩基酸、１．１９g/L；リン酸カリウム２塩基酸、２．８３g/L、Nutrient Feed溶液、２６mL（本明細書中に参考文献として援用されているPCT国際特許出願公開第WO 01/75077 A2号）、pH７．０）を含む、９個の３００mL Erlenmeyerフラスコに、Ａ．ファシリス 72W細胞を接種し、回転式シェーカー（２２０rpm）上で２７℃、７２時間インキュベートした。それぞれの３００mLフラスコの内容物を別々に、３００mLの培地Bを含む９個のFernbachフラスコに添加した。Fernbachフラスコを回転式シェーカー（２２０rpm）上で２７℃でインキュベートした。７２時間後、Fernbachフラスコの内容物を遠心分離してペレットを得て、これを３１０mLの２０mMリン酸カリウム（pH７．０）に再懸濁し、５０℃の水浴中に１時間置いた。熱処理した細胞懸濁液を遠心分離してペレットを得て、ドライアイス中で凍結し、−８０℃で保存した。
【００４７】
上記のように調製した、凍結した、熱処理済みＡ．ファシリス 72W細胞（２７ｇ）を、１００mLの１００mMリン酸緩衝液（pH７．０）に再懸濁し、そして、７．４gの１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを含む１００mLのジャケットつき反応容器に加えた。得られた混合物を３０℃で２３時間攪拌した。反応混合物を遠心分離し、そして得られたペレットを５０mLの２０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７）に再懸濁して、再度遠心分離した。上清を併合し、そして２００mLの酢酸エチルで抽出すると、エマルジョンが形成した。燐酸緩衝液（２００mL、０．５M、pH７）及び１００mLの水を上記エマルジョンに添加した。水層を分離し、４N HClでpHを２にあわせ、酢酸エチル（３×５００mL）で抽出した。併合した酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過し、そして真空下で濃縮して７．４７ｇの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを得た（収率８９．４％）。
【００４８】
実施例６
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（アルギン酸カルシウムに固定化されたＥ． コリ形質転換体 SS1001）
アルギン酸カルシウムに固定化されたＥ．コリ形質転換体 SS1001（DuPont, Wilmington, DE）を用いて１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドに変換した。３０℃に維持した１００mLのジャケットつきガラス反応容器に、１．４８ｇの１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル、２mLの５０mM酢酸カルシウム緩衝液（pH７．０）、及び水を加えて、反応容器内容物の総重量を２０ｇとした。Ｅ．コリ SS1001/アルギン酸ビーズ（１０ｇ、参考文献として本明細書中に援用されているＰＣＴ国際特許出願公WO 01/75077 A2号）を反応容器に添加し、得られた混合物を磁性スターバーで攪拌した。７時間後、生成物の混合物を傾け、そして生体触媒ビーズを１０mLのアリコートの５mM酢酸カルシウム緩衝液（pH７．０）で２回洗浄した。リサイクルした生体触媒ビーズを用いて上記のようにさらに１７回のバッチ反応を行った。２４時間内におよそ2つの反応を実施した。朝に開始した反応物を７時間後にデカントし、一方、午後に開始した反応は一夜進行させ、そして１６時間後にデカントした。デカントした生成物混合物及びビーズの洗液を合わせて酢酸エチルで抽出した(捨てた)。水層を分離し、４N HCｌでpH２に酸性化し、そして酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして真空下で濃縮して１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを２６．４ｇ得た（収率８７．８％）。最初の１７の連続したバッチ反応後に、リサイクルされた生体触媒ビーズを他の１８の連続したバッチ反応に使用した。０．７４ｇの基質（１バッチ、７時間の反応時間）、１．４８ｇの基質（８バッチ、７時間又は１６時間の反応時間）、又は２．２２ｇの基質（８バッチ、２４〜３１時間の反応時間）で、これらの反応を上記のように実施した。併合した生成物の混合物を上記のように酢酸エチルで抽出して、３１．３ｇの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドを得た（収率９１．４％）。
【００４９】
実施例７
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド（バシラス・スフェリカス（ATCC））
０．２％の１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを補充した基本培地（KH2PO4 1.5g/L, KH2PO4 3.4g/L, KCl 0.5g/L, NaCl 1.0g/L, MgSO4 0.24g/L, クエン酸ナトリウム0.2g/L, HCl, 0.01mL/L, CaCl2.H2O 0.11g/L, MnSO4.H2O 0.01g/L, CuSO4.5H2O 0.006g/L, ホウ酸0.009g/L, ZnSO4.7H2O 0.018g/L, NaMoO4.2H2O 0.0005g/L, VnSO4.H2O 0.0008g/L, NiNO3.6H2O 0.0004g/L, Na2Se 0.0004g/L, FeSO4.7H2O 0.06g/L, ビオチン0.0002g/L, 葉酸 0.0002g/L, ピリドキシン.HCl 0.001g/L, リボフラビン 0.0005g/L, チアミン.HCl 0.00005g/L, ニコチン酸 0.0005g/L, パントテン酸 0.0005g/L, ビタミンB12 0.00001g/L, p-アミノ安息香酸 0.0005g/L）を用いて標準的な濃縮技術によって、Groton, Connecticutにおいて収集した土からバシラス・スフェリカス（ATCC）を単離した。バシラス・スフェリカス（ATCC）は、補充された基本培地中での増殖に基づいて選択し、同じ培地の寒天プレートでの反復継代によって単離した。選択されたコロニーを純度を確認するためにBrain Heart Infusion 寒天上で増殖させた。バシラス・スフェリカス（ATCC）は、Brain Heart Infusion寒天プレート上で、丸い、つやのあるオレンジ色の１〜２mmのコロニーとして増殖し、そしてVitek代謝アッセイを用いて同定した。
【００５０】
バシラス・スフェリカス（ATCC）を、０．５％酵母抽出物を補充した基本培地上で振とうフラスコ培養（３００mlフラスコ、３５ml培地）中で増殖させた。２９℃で１８時間の後、細胞を遠心分離によって収穫し、２０ｍMリン酸カリウム（pH７．０）で洗浄し、そして同じ緩衝液中に５０mg/mLで再懸濁した。１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルを細胞懸濁液に１．４８g/Lの濃度で添加し、そして２６℃で５日間振とうした。水性反応混合物を酢酸エチルで抽出し、そしてLCMSで分析して、１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドの収率が２９％であることが明らかとなった。
【００５１】
実施例８
１−シアノシクロヘキサンアセトニトリルからの２−（１−シアノ−シクロヘキシル）−アセタミド（Zyanotase）
１２５mLの丸底フラスコに、１−シアノシクロヘキサンアセトニトリル（０．５９ｇ、4ミリモル）、Zyanotase（商標）（１２０mg、Zylepsis Ltd）、及び４０mLのリン酸カリウム（１００ｍM、pH７）を添加した。反応混合物を２１℃で４８時間攪拌し、そして、４０mLアリコートの酢酸エチルで２回抽出した。併合した酢酸エチル抽出物をロータリーエバポレーター上で濃縮して、５５０mgの２−（１−シアノ−シクロヘキシル）−アセタミドを得た（収率８２．７％）。
【００５２】
実施例９
１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッドからの１−アミノメチル−シクロヘキサンアセティックアシッド（米国特許第5,362,883号）
５００mLのParr粉砕機に、２３．５ｇ（０．１モル）の１−シアノシクロヘキサンアセティックアシッド、２８％水分含量；１６ｇの５０％含水Raneyニッケル＃３０、及び冷（２０℃）メチルアルコール（１６０mL）及び５０％水酸化ナトリウム水溶液（８．８ｇ、０．１１モル）を加える。反応混合物を２２℃〜２５℃で２１時間、１平方インチゲージあたり１８０ポンド（psig）の水素において攪拌した。２１時間後、水素を抜き、そして還元された混合物に窒素を流す。
【００５３】
反応混合物をセライト上で加圧ろ過し、メチルアルコール（１００mL）で洗浄し、ロータリーエバポレーター上、３５℃で５０mLの体積まで減少させる。イソプロピルアルコール（１００mL）を添加し、次に６．６ｇ（０．１１モル）の酢酸を滴下して加える。テトラヒドロフラン（１２５mL）を濃縮された生成物の溶液に加え、該溶液を氷浴中で冷却し、吸引ろ過し、そして５０mLのテトラヒドロフランを用いて洗浄する。粗生成物ケーキを真空下、４５℃で１６時間乾燥する。
【００５４】
粗生成物をメチルアルコール、脱ミネラル水及びイソプロピルアルコールから再結晶化させて１０．３ｇの１−（アミノメチル）−シクロヘキサンアセティックアシッドを結晶性の白色固体として得る。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の結果は、９７．２％の重量／重量（w/w）純度で有機不純物の検出されないことを示す。
【国際調査報告】
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