(57)【要約】島細胞内でβTRPの発現を強化する。糖尿病の島細胞にβTRPをコードする発現カセットを導入することにより、グルコース応答性インスリン産生が改善された。したがって、本発明は、糖尿病の個体を治療するためにβTRP分子を同定する方法、および島細胞にβTRPを導入する方法を提供する。
2006523104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、動物においてグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する方法：
(i) 作用物質と配列番号：2に記載の少なくとも20個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを接触させる段階；
(ii) ポリペプチドに結合する作用物質またはポリペプチドの発現もしくは活性を増強する作用物質を選択する段階；および
(iii) グルコース応答性インスリン分泌に対する選択された作用物質の効果を決定する段階であって、それにより、動物においてグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する段階。
【請求項２】
段階(ii)が、ポリペプチドの発現を増強する作用物質を選択する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階(ii)が、ポリペプチドの活性を増強する作用物質を選択する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階(ii)が、ポリペプチドに結合する作用物質を選択する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドが配列番号：2を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが細胞において発現され、かつ接触段階が、作用物質と細胞を接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチド活性を増強する作用物質が選択され、かつポリペプチドの活性が、細胞内のカルシウム流の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチド活性を増強する作用物質が選択され、かつポリペプチドの活性が、細胞の膜電位の変化を測定することを含む段階によって決定される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
細胞の膜電位が、蛍光が細胞の脱分極に依存する色素における蛍光の変化を検出することによって測定され、かつ蛍光の変化が、ハイスループットスクリーニングのために十分な装置によって検出される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
細胞がインスリン分泌性細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
細胞が膵臓β細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが細胞内で組換え的に発現される、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
作用物質を糖尿病動物に投与する段階、および動物をグルコース応答性インスリン分泌の増加に関して試験する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
動物がZDFラットおよびdb/dbマウスより選択される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが配列番号：2と少なくとも80％の同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
動物においてグルコース応答性インスリン産生を誘導する方法であって、請求項1において選択された治療的有効量の作用物質を投与する段階を含む方法。
【請求項１９】
動物がヒトである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
ヒトが2型糖尿病を有する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
ヒトが2型糖尿病に対して素因のある、19記載の方法。
【請求項２２】
膵島細胞においてβTRPを発現させる方法であって、配列番号：2に記載の少なくとも20個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを島細胞に導入する段階を含む方法。
【請求項２３】
島細胞がグルコース応答性インスリン分泌を欠損している、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドがインビトロで導入される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドがインビボで導入される、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドが配列番号：2と少なくとも80％の同一性を有する、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドが配列番号：2を含む、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドが配列番号：1を含む、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
島細胞がβ細胞である、請求項22記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、すべての目的に関して参照により本明細書に組み入れられる2003年3月5日に出願された米国仮特許出願第60/452,596号の優先権の恩典を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
糖尿病は、1型糖尿病および2型糖尿病という2種類の臨床的症候群に分けることができる。1型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（IDDM）は、膵ランゲルハンス島におけるインスリン産生性のβ細胞の高度の損失を特徴とする慢性の自己免疫疾患である。これらの細胞は進行性に破壊されるため、分泌されるインスリンの量は減少し、分泌インスリン量が正常血糖（血中グルコース濃度が正常）に必要な濃度よりも減少すると最終的には高血糖（血中グルコース濃度の異常高値）に至る。この免疫応答の厳密な誘因は不明であるが、IDDMの患者では膵β細胞に対する抗体の値が高い。しかし、これらの抗体の値が高い患者のすべてがIDDMを発症するわけではない。
【０００３】
2型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）とも呼ばれる）は、筋肉、脂肪および肝細胞がインスリンに対して正常な応答を行えない場合に発症する。この応答性の障害（インスリン抵抗性と呼ばれる）は、これらの細胞の表面にあるインスリン受容体の数の減少、細胞内部のシグナル伝達経路の機能不全、またはその両方に起因すると考えられる。β細胞は最初のうちは、インスリン産生量を増加させることによってこのインスリン抵抗性を代償する。時間の経過に伴って、これらの細胞は正常な血糖値を維持するのに十分なインスリンを産生できないようになり、これは2型糖尿病への進行を意味する。
【０００４】
2型糖尿病は、ほとんど解明されていない遺伝的な危険因子と後天性危険因子―これには高脂肪食、運動不足および加齢が含まれる―の組み合わせによって生じる。2型糖尿病は、肥満および座りがちで運動不足のライフスタイルの増加、西洋風の食事習慣の普及、および多くの国での人口の全体的高齢化のために世界的に広がっている。1985年の時点で全世界に3000万人の糖尿病患者がいると推定されており、2000年までにこの数は推定1億5400万人と5倍に増加した。糖尿病患者の数は現在から2025年までに倍増し、約3億人に達すると予想されている。
【０００５】
2型糖尿病は、グルコース代謝および脂質代謝における欠陥を特徴とする複合的疾患である。空腹時血漿グルコース値、遊離脂肪酸値およびトリグリセリド値の上昇、ならびにHDL／LDL比の低下を含む、多くの代謝パラメーターの摂動がみられることが一般的である。以上に考察したように、糖尿病の基礎をなす主な原因の一つは、グルコース値を維持するのに十分なインスリンをβ細胞が産生できないことにある。このため、糖尿病の治療において重要な治療上の目標の一つは、インスリン産生を増加させることである。本発明はこれをはじめとする問題を取り扱う。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、動物においてグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(i) 作用物質と配列番号：2に記載の少なくとも20個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを接触させる段階； (ii) ポリペプチドに結合する作用物質またはポリペプチドの発現もしくは活性を増強する作用物質を選択する段階；および (iii) グルコース応答性インスリン産生に対する選択された物質の効果を決定する段階であって、それにより、動物においてグルコース応答性インスリン産生を誘導する作用物質を同定する段階を含む。
【０００７】
いくつかの態様において、段階(ii)は、ポリペプチドの発現を増強する作用物質を選択する段階を含む。いくつかの態様において、段階(ii)は、ポリペプチドの活性を増強する作用物質を選択する段階を含む。いくつかの態様において、段階(ii)は、ポリペプチドに結合する作用物質を選択する段階を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：2を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、ポリペプチドは細胞において発現され、かつ接触段階は、作用物質と細胞を接触させる段階を含む。いくつかの態様において、ポリペプチド活性を増強する作用物質が選択され、かつポリペプチドの活性は、細胞内のカルシウム流の変化を測定することを含む段階によって決定される。いくつかの態様において、ポリペプチド活性を増強する作用物質が選択され、かつポリペプチドの活性は、細胞の膜電位の変化を測定することを含む段階によって決定される。
【００１０】
いくつかの態様において、細胞の膜電位は、蛍光が細胞の脱分極に依存する色素における蛍光の変化を検出することによって測定され、かつ蛍光の変化が、ハイスループットスクリーニングのために十分な装置によって検出される。いくつかの態様において、細胞はインスリン分泌性細胞である。いくつかの態様において、細胞は膵臓β細胞である。
【００１１】
いくつかの態様において、ポリペプチドは細胞内で組換え的に発現される。いくつかの態様において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である。
【００１２】
いくつかの態様において、本方法は、作用物質を糖尿病動物に投与する段階、および動物をグルコース応答性インスリン分泌の増加に関して試験する段階をさらに含む。いくつかの態様において、動物は、ZDFラットおよびdb/dbマウスより選択される。
【００１３】
いくつかの態様において、ポリペプチドは少なくとも100個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：2と少なくとも80％の同一性を有する。
【００１４】
本発明はまた、動物においてグルコース応答性インスリン産生を誘導する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、(i) 作用物質と配列番号：2に記載の少なくとも20個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドを接触させる段階； (ii) ポリペプチドに結合する作用物質またはポリペプチドの発現もしくは活性を増強する作用物質を選択する段階；および (iii) グルコース応答性インスリン産生に対する選択された物質の効果を決定する段階を含む方法において選択された治療的有効量の作用物質を投与する段階を含む。いくつかの態様において、動物はヒトである。いくつかの態様において、ヒトは2型糖尿病を有する。いくつかの態様において、ヒトは2型糖尿病に対して素因がある。
【００１５】
本発明はまた、膵島細胞においてβTRPを発現させる方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、配列番号：2に記載の少なくとも20個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを島細胞に導入する段階を含む。いくつかの態様において、島細胞はグルコース応答性インスリン分泌を欠損している。
【００１６】
いくつかの態様において、ポリペプチドはインビトロで導入される。いくつかの態様において、ポリペプチドはインビボで導入される。
【００１７】
いくつかの態様において、ポリペプチドは少なくとも100個のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：2と少なくとも80％の同一性を有する。いくつかの態様において、ポリペプチドは配列番号：2を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは配列番号：1を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、島細胞はβ細胞である。
【００１９】
定義
ある人が糖尿病を発症するリスクが高い場合、その人は「糖尿病に対する素因」がある。多数の危険因子が当業者に知られており、これには以下のものが含まれる：遺伝要因（例えば、平均的な集団よりも糖尿病の発生率が高くなる対立遺伝子を有する、または糖尿病の親もしくは兄弟姉妹がいる）；過体重（例えば、肥満指数（BMI）が25kg／m2またはそれ以上である）；習慣的な運動不足、人種／民族（例えば、アフリカ系アメリカ人、スペイン系アメリカ人、アメリカ先住民、アジア系アメリカ人、太平洋諸島住民）；空腹時血糖障害もしくは耐糖能障害が以前に確認、高血圧（例えば、成人で140／90mmHgまたはそれ以上）；HDLコレステロール値が35mg／dlまたはそれ以上；トリグリセリド値が250mg／dlまたはそれ以上；妊娠時糖尿病もしくは9ポンドを上回る新生児の分娩の既往；および／または多嚢胞性卵巣症候群。例えば、「Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus」および「Screening for Diabetes」Diabetes Care 25(1): S5-S24 (2002)を参照されたい。
【００２０】
「βTRP」または「ベータTRP」ポリペプチドは、配列番号：2、配列番号：4または配列番号：6と実質的に同一であるカルシウムチャンネルを意味する。膜に挿入される、または細胞内で発現される場合に、βTRPポリペプチドは、典型的には機能的陽イオンチャンネルを形成する。いくつかの態様において、マウスとヒト（図7参照）、ラットとヒト、ラットとマウス、または3つ全ての配列間で保存されているアミノ酸残基が本発明のβTRP配列に存在する。幾つかの場合において、βTRPは、579位にグルタミン（例えば、コドンCAGによってコードされる）またはアルギニン（例えば、コドンCGGによってコードされる）を含む。βTRPポリペプチドは、典型的に「TRP」モチーフおよび膜貫通ドメインを有する。ヒトβTRP配列におけるモチーフおよびドメインを例示した図8を参照されたい。
【００２１】
本明細書に使用されるように「βTRP活性」とは、細胞の原形質膜の電位を設定または調節するためのタンパク質の能力を意味する。細胞内のチャンネル活性を検出するために、膜電位に対して感受性である蛍光色素または蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescent resonance energy transfer：FRET）試薬を用いることができる。例えば、Millerら、Eur J Pharmacol. 370(2): 179-85 (1999)；Fedidaら、Prog Biophys Mol Biol. 75(3): 165-99 (2000)を参照されたい。または、チャンネル活性を検出するために、カルシウム依存性蛍光色素を使用したカルシウム流アッセイ法を使用することができる。また、活性を例えば、パッチクランプ法を用いて測定することもできる。パッチクランプ分析は一般に、細胞膜とマイクロピペットのガラス壁との間に高抵抗の密封状態を形成させることを含む。次に、膜内のイオンチャンネルを通って流れる電流を測定する。
【００２２】
「βTRP活性化物質」とは、βTRPの活性または発現を開始、刺激、感作、またはアップレギュレートする作用物質を意味する。「増強されたβTRP活性」とは、対照（例えば、潜在的βTRP修飾物質を含まない試料）と比較して、開始、刺激、感作、またはアップレギュレートされるβTRPチャンネルの活性を意味する。
【００２３】
「蛍光が細胞脱分極に依存する色素」とは、蛍光の変化に付随する膜貫通分布における電位依存性変化を示す色素またはプローブを意味する。光学反応の大きさは、mV当たり約1％の蛍光変化であり得る。しばしば「遅い反応プローブ（slow-response probe）」とも呼ばれるこれらの色素には、例えば、陽イオン性のカルボシアニン、ローダミン、および陰イオン性のオキソノール、ならびにMolecular Devices（Sunnyvale, CA）FLEXstationおよびFLIPRsystemのために使用可能な特許所有の色素などが含まれる。膜電位および細胞の脱分極における変化に反応して蛍光を発する色素は、例えば、
2006523104.tif 000003
に記載されている。
【００２４】
膜電位の増加または減少はまた、それぞれ「膜過分極」および「膜脱分極」として呼ばれる。
【００２５】
「ハイスループットスクリーニングのために十分な装置」は、非常に多くの試料（例えば、日常的に、少なくとも96個、時には少なくとも200個、384個、500個、または1000個の試料）を分析するために、当業者により使用可能な装置を意味する。細胞の脱分極および膜電位の変化の測定において使用するためのハイスループット装置に例には、例えば、Molecular Devices (Sunnyvale, CA)からのFLIPRおよびFLEXstation装置などが含まれる。パッチクランプのような方法は、ハイスループット分析のために実用的ではない。
【００２６】
「抗体」とは、分析物（抗原）と特異的に結合してそれを認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドまたはその断片のことを指す。一般に認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子のほか、極めて多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεに分類され、これによってそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgBという免疫グロブリンのクラスが規定される。
【００２７】
例示的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体から構成される。各四量体は2つの同一なポリペプチド鎖の対から構成され、それぞれの対は1つの「軽鎖」（約25kDa）および1つの「重鎖」（約50〜70kDa）を有する。各鎖のN末端には、抗原認識を主に担う約100〜110アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域が定められている。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖のことを指す。
【００２８】
抗体は、例えば、完全な免疫グロブリン、または種々のペプチダーゼによる消化によって生じる、詳細に特徴づけられているさまざまな断片として存在する。すなわち、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で抗体を切断し、ジスルフィド結合によってVH-CH1と連結した軽鎖であるFabの二量体、F(ab)'2を生成する。ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断するためにF(ab)'2を穏和な条件下で還元し、それによってF(ab)'2二量体をFab'単量体に変換することもできる。Fab'単量体は本質的にはヒンジ領域の一部を伴うFabである（Paul（編）「Fundamental Immunology」第3版、Raven Press, NY (1993)を参照されたい）。さまざまな抗体断片が完全抗体の消化の見地から定義されているが、当業者は、このような断片を化学的または組換えDNA法を用いてデノボ合成しうることを理解すると考えられる。このため、本明細書で用いる抗体という用語には、抗体全体の改変によって生じる抗体断片、または組換えDNA法を用いてデノボ合成されたもの（例えば、一本鎖Fv）も含まれる。
【００２９】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントのことを意味する；これには、コード領域（リーダーおよびトレーラー）の前および後の領域、さらには個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）も含まれる。
【００３０】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然の状態でそれに付随する他の細胞成分を本質的に含まないことを表す。これは均一な状態にあることが好ましいが、乾燥していても水溶液中にあってもよい。純度および均一性は通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技術を用いて決定される。調製物中に存在する最も多数を占める種であるタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接して目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的には1つのバンドを生じることを表す。これは詳細には、核酸またはタンパク質の純度が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％であることを意味する。
【００３１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および、一本鎖または二本鎖の形態にあるそれらの重合体のことを指す。特に限定されない限り、この用語には、参照核酸と同程度の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体が含まれる。別に指示しない限り、個々の核酸配列には、明示的に指定された配列のほかに、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換物）および相補的配列が暗黙的に含まれる。詳細には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択した（またはすべての）コドンの第3の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基によって置換された配列を生じさせることによって行われうる（Batzerら、Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991)；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985)；およびCassolら(1992)；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと互換的に用いられる。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は、天然アミノ酸重合体および非天然アミノ酸重合体のほか、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物であるアミノ酸重合体に対しても適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語には、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結された、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖が含まれる。
【００３３】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸のほか、天然のアミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物のことも指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるもののほか、その後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンなどのこともいう。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびR基と結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムのことを指す。この種の類似体は、改変されたR基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。「アミノ酸模倣物」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するものの天然アミノ酸と類似した様式で機能する化合物のことを指す。
【００３４】
本明細書ではアミノ酸を、一般的に知られた三文字記号、またはIUPAC-IUBの生化学物質命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）が推奨している一文字記号のいずれかによって参照する。ヌクレオチドも同じく、一般的に認められている一文字記号によって参照する。
【００３５】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に対して適用される。個々の核酸配列に関して、「保存的に改変されたバリアント」とは、同一もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸のことを指し、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列のことを指す。遺伝暗号の縮重性のために、任意のタンパク質は多数の機能的に同一な核酸によってコードされうる。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべてアラニンというアミノ酸をコードする。このため、コドンによってアラニンが指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを変化させずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。このような核酸変形物は「サイレント変形物」であり、保存的に改変された変形物の一種である。何らかのポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、その核酸のあらゆる可能なサイレント変形物についても述べている。当業者は、核酸内の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンに対する唯一のコドンであるTGGを除く）を改変して、機能的に同一な分子を作製しうることを理解すると考えられる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変形物は、記載する各配列に黙示的に含まれる。
【００３６】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸が改変、付加または除去される、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換物、欠失物または付加物が、改変によってアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置換されるような「保存的に改変されたバリアント」であることを理解すると考えられる。機能的に類似したアミノ酸が得られる保存的置換の表も当技術分野で周知である。このような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間相同体および対立遺伝子に加わるものであり、それらが除外されるわけではない。
【００３７】
以下の8つの群はそれぞれ、互いに保存的なアミノ酸を含む：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）
（例えば、Creighton、「タンパク質（Proteins）」（1984）を参照されたい）。
【００３８】
「配列一致率（percentage of sequence identity）」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較域（comparison window）にわたって比較することによって決定され、この際、比較域中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでよい。この率は、両方の配列に同一の核酸塩基または残基が存在する位置の数を決定して一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較域における位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列一致率を求めることによって算出される。
【００３９】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「一致」率という用語は、同じである、2つまたはそれ以上の配列もしくは部分配列のことを指す。「実質的に同一である」という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントもしくは目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが指定された比率（すなわち、指定された領域にわたって60％の同一性、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の同一性）を有する2つまたはそれ以上の配列のことを指す。選択的には、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは100〜500ヌクレオチド長もしくは1000ヌクレオチド長またはそれ以上の領域にわたって存在する。本発明は配列番号：1、2、3、4、5、および6と実質的に同一であるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。
【００４０】
2つまたはそれ以上のポリペプチド配列の文脈において、「類似性」または「類似」率という用語は、一定の比較域にわたって、または以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いるかもしくは手作業によるアラインメントおよび目視検査によって指定された領域にわたって、最大の対応関係が得られるように比較およびアラインメントを行った場合に、同じである、または上に定義した8種の保存的アミノ酸置換の定義による類似性のあるアミノ酸残基が指定された比率である（すなわち、指定された領域にわたって60％、選択的には65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％の類似性）、2つまたはそれ以上の配列もしくは部分配列のことを指す。このような配列を「実質的に類似している」と言う。選択的には、この同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは少なくとも約100〜500アミノ酸長または1000もしくはそれ以上のアミノ酸長の領域にわたって存在する。本発明は配列番号：2、4、および6と実質的に類似しているポリペプチドを提供する。
【００４１】
配列比較のためには、1つの配列を、被験配列と比較するための参照配列として用いることが一般的である。配列比較アルゴリズムを用いる場合には、被験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを用いることもでき、別のパラメーターを指定することもできる。続いて、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列の配列一致率または類似率を配列比較アルゴリズムで計算する。
【００４２】
本明細書で用いる「比較域」は、2つの配列の最適なアラインメントを行った後に、ある配列を同じ数の連続した位置を持つ参照配列と比較しうるような、20〜600個、通常は約50〜約200個、より一般的には約100〜約150個からなる群より選択される数の連続した位置のいずれか1つの区域に対する言及を含んでいる。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、SmithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482cの局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci.USA 85: 2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Wisconsin Genetics Software Package（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）により、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」（1995年補遺）を参照されたい）
【００４３】
配列一致率および配列類似性の決定のために適した1つのアルゴリズムの例が、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977)およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)に記載されている。BLAST解析を行うためのソフトウエアは米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（http://www.ncbi.n1m.nih.gov/）に公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列化した場合に何らかの正値の閾値スコアTと一致する、またはそれを満たす、長さWの短いワードを検索配列中に同定することにより、高スコアの配列ペア（HSP）をまず同定する。Tは近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschulら、前記）。これらの初期の近隣ワードでのヒットは、それらを含む長いHSPを見いだすための検索を開始する源となる。ワードの検索は、累積アラインメントスコアが増加する限り、各配列の両方向に対して延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターM（一致する残基対に関する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合には、累積スコアの算出にスコア行列を用いる。各方向へのワード検索の延長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値に比べて量Xより低くなった場合：1つもしくは複数の負スコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアがゼロもしくはそれ未満になった場合；または配列のいずれかの端に達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、TおよびXは整列化の感度および速度を決定する。BLASTNプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォルトとしてワード長3および期待値（E）10、ならびにBLOSUM62スコア行列（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915 (1989)を参照されたい）のアラインメント（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝-4および両ストランドの比較を用いる。
【００４４】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性に関する統計分析も行う（例えば、KahnおよびAltschul (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい）。BLASTアルゴリズムによって得られる類似性の指標の1つは最小合計確率（smallest sum probability）（P(N)）であり、これは2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標となる。例えば、ある核酸は、被験核酸と参照核酸との比較による最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満の場合に、参照配列と類似しているとみなされる。
【００４５】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという指標の1つは、以下に述べるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換のみの点で異なる場合、ポリペプチドは一般に第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう1つの指標は、以下に述べるように、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう1つの指標は、配列の増幅に同じプライマーを用いうることである。
【００４６】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、ある分子の結合、二重鎖形成またはハイブリダイゼーションが、その配列が複合混合物（例えば、全細胞またはライブラリーのDNAまたはRNA）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみに対して起こることを指す。
【００４７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、一般的には核酸の複合混合物において、プローブがその標的部分配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。配列が長いほど高い温度で特異的にハイブリダイズすると考えられる。核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きは、Tijssen、「Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes」、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に記載がある。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の融点（Tｍ）よりも約5〜10℃低くなるように選択する。Tｍは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下で）である（標的配列が過剰に存在するため、Tｍでは平衡状態でプローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン濃度で約1.0M未満、一般的にはナトリウムイオン（または他の塩の）濃度で約0.01〜1.0M、pH7.0〜8.3であり、温度は短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）に関しては少なくとも約30℃であって、（例えば、50ヌクレオチドを上回るもの）に関しては少なくとも約60℃であると考えられる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定剤の添加によっても得られる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンド値の少なくとも2倍、選択的にはバックグラウンドでのハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては以下のものが考えられる：50％ホルムアミド、5×SSCおよび1％SDS、42℃でインキュベートを行い、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベートを行い、その上で0.2×SSCおよび0.1％SDS、65℃で洗浄する。このような洗浄は5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行われうる。
【００４８】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、それらをコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、やはり実質的に同一である。これは例えば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重性を用いて生じた核酸のコピーの場合に起こる。このような場合には、核酸は一般に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の例には、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS、37℃の緩衝液中でのハイブリダイゼーション、および1×SSC、45℃での洗浄が含まれる。このような洗浄は、5、15、30、60、120分またはさらに多くの分数にわたって行われうる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を用いて同様に厳密な条件が得られることを、当業者は容易に認識すると考えられる。
【００４９】
「〜をコードする核酸配列」という語句は、rRNA、tRNAなどの構造RNA、または特定のタンパク質もしくはペプチドの一次アミノ酸配列、またはトランス作用性調節因子の結合部位に関する配列情報を含む核酸のことを指す。この語句には特に、特定の宿主細胞におけるコドン選好性に適合するように導入しうる、1つまたは複数の天然配列の縮重コドン（すなわち、単一のアミノ酸をコードする複数種のコドン）が含まれる。
【００５０】
細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどに言及して用いる場合、「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸またはタンパク質の改変によって改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する。このため、例えば、組換え細胞は、天然型（非組換え型）の細胞に認められない遺伝子を発現する、または、通常であれば異常発現される、低発現される、もしくは全く発現されないような天然遺伝子を発現する。
【００５１】
核酸の部分に言及して用いる場合、「異種」という用語は、核酸が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する。例えば、核酸は一般に、例えば、1つの源からのプロモーターおよび別の源からのコード領域というように、関連のない遺伝子に由来する2つまたはそれ以上の配列が新たな機能的核酸を生じるように配置された形で、組換え法によって産生される。同様に、異種タンパク質とは、タンパク質が、自然下ではお互いに同じ関係では認められない2つまたはそれ以上の部分配列を含むことを意味する（例えば、融合タンパク質）。
【００５２】
「発現ベクター」とは、宿主細胞内での特定の核酸の転写を許容する一連の指定された核酸配列を有する、組換え法または合成によって作製された核酸構築物のことである。発現ベクターはプラスミド、ウイルスまたは核酸断片の部分であってもよい。発現ベクターは、プロモーターと機能的に結合した転写用の核酸を含むことが一般的である。
【００５３】
「抗体と特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「〜と特異的な（もしくは選択的な）免疫反応性がある」という語句は、タンパク質またはペプチドについて言及する場合、タンパク質および他の生体物質の不均一な集団の存在下でそのタンパク質の存在を決定づける結合反応のことを指す。すなわち、指示されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は試料中に存在するある特定のタンパク質と結合し、他のタンパク質とは有効な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性の点より選択された抗体が必要と思われる。例えば、本発明のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して産生された抗体を選択して、そのタンパク質とは特異的に免疫反応し、多型バリアントを除く他のタンパク質とは反応しない抗体を得ることができる。特定の抗体に対する特異的な免疫反応性のある抗原を選択するためには、さまざまなイムノアッセイ形式を用いうる。例えば、フローサイトメトリーおよびFACS分析または免疫組織化学が、あるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するためにルーチン的に用いられている。特異的免疫反応性の決定に用いうるイムノアッセイの形式および条件の記載については、例えば、HarlowおよびLane、「Antibodies, Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Publications, NY (1988)を参照されたい。通常、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドの信号または雑音の少なくとも2倍であると考えられ、より一般的にはバックグラウンドの10〜100倍を上回ると考えられる。
【００５４】
βTRPの発現またはβTRP活性の「阻害物質」「活性化物質」および「修飾物質」は、βTRPの発現またはβTRP活性に関するインビトロおよびインビボでのアッセイ法を用いて同定された、それぞれ阻害性、活性化性または修飾性の分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにそれらの相同体および模倣物を指して用いられる。「修飾物質」という用語には阻害物質および活性化物質が含まれる。阻害物質とは、例えば、βTRPの発現を阻害する、またはβTRPと結合する、賦活もしくは酵素活性を部分的もしくは完全に阻止する、βTRPの活性を低下させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化する、感受性を低下させる、もしくは活性をダウンレギュレートする作用物質、例えばアンタゴニストのことである。活性化物質とは、例えば、βTRPの発現を誘導もしくは活性化する、またはβTRPと結合する、それを賦活する、増加させる、開口させる、活性化する、促通する、活性化もしくは酵素活性を増強する、感受性を高める、もしくはその活性をアップレギュレートする作用物質、例えばアゴニストのことである。修飾物質には、天然および合成性のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子量化学分子などが含まれる。阻害物質および活性化物質に関するこの種のアッセイ法には、例えば、βTRP修飾物質の存在下または非存在下で、修飾性化合物と推定されるものを膵臓細胞または他のβTRP発現細胞に対して適用した後に、上記のように、βTRP活性に対する機能的な影響を判定することが含まれる。影響の程度を検討するには、活性化物質、阻害物質または修飾物質の候補によって処理したβTRPを含む試料またはアッセイ物を、阻害物質、活性化物質または修飾物質を含まない対照試料と比較する。対照試料（阻害物質で処理していないもの）をβTRPの相対活性値100％と指定する。βTRPの阻害は、βTRPの活性値が対照に比して約80％、選択的には50％または25〜1％である場合に達成される。βTRPの活性化は、βTRPの活性値が対照に比して110％、選択的には150％、選択的には200〜500％または1000〜3000％の高さである場合に達成される。
【００５５】
発明の詳細な説明
I．導入
本出願では、驚くべきことに、膵島細胞のβTRP発現がインスリン分泌を引き起こすことを示すものである。βTRPの発現は、比較的、島細胞特異的である。ZDFラット（糖尿病の動物モデル）において、βTRP発現は、野生型ラットと比較して減少する。重要なことに、βTRPがZDF島細胞で発現された場合、グルコース応答性インスリン分泌は、空ベクターの対照と比較して増加する。これらの結果から、インスリン分泌性細胞におけるβTRPの発現または活性の増強が、グルコース応答性インスリン産生を増加させることが示される。したがって、本出願は、インスリン分泌性細胞においてβTRPの発現または活性を増加させる作用物質を同定するための方法、ならびに糖尿病または前糖尿病を処置するこのような作用物質の使用を提供する。また、本出願は、βTRPを発現させるために、βTRPをコードするポリヌクレオチドを膵臓β細胞に導入するための方法も提供する。
【００５６】
II．本発明に使用するための一般的組換え核酸方法
本発明において使用される核酸組成物は、必要に応じて、βTRPポリペプチドの全てまたは一部をコードすることができ、通常、少なくとも実質的に全てをコードすることができる。DNA配列の断片は、常法に従ったオリゴヌクレオチドの化学合成、制限酵素切断、PCR増幅などにより得てもよい。大部分では、DNA断片は少なくとも約10個の連続するヌクレオチドであり、通常は、少なくとも約15個のヌクレオチドであり、より通常は、少なくとも約18個〜約20個のヌクレオチドであり、さらに通常は、少なくとも約25個〜約50個のヌクレオチドであると考えられる。このような低分子のDNA断片は、PCR、ハイブリダイゼーションスクリーニング、siRNAなどのためのプライマーとして有用である。大きなDNA断片、すなわち100個を超えるヌクレオチドは、コードされたポリペプチドを産生するために有用である。PCRのような増幅反応に使用するために、プライマー対を使用することが考えられる。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって重要ではないが、全ての適用に対して、プライマーは、当技術分野に公知のようにまたは本明細書に記載のように、ストリンジェントな条件下で本発明の配列にハイブリダイズすると考えられる。いくつかの態様において、少なくとも約50ヌクレオチドまたは少なくとも約100ヌクレオチドの増幅産物を生成するプライマー対が選択されると考えられる。プライマー配列を選択するためのアルゴリズムは一般的に知られており、市販のソフトウェアパッケージにおいて入手可能である。増幅プライマーはDNAの相補鎖とハイブリダイズして、互いに対してプライミングすると考えられる。
【００５７】
βTRPをコードするヌクレオチド核酸を単離し、実質的に純粋な状態で、一般的に無傷の哺乳動物染色体以外のものとして得た。通常、他の核酸配列を実質的に含まないDNAが得られると考えられ、これは、典型的には「組換え型」、すなわち天然に生じる染色体とは通常関係しない1つまたは複数のヌクレオチドと隣接してもよい。
【００５８】
βTRPポリペプチド（またはポリヌクレオチドコード領域もしくは隣接するプロモーター領域）の配列は、プロモーターの強度、コードされたタンパク質の配列などの標的化された変化を生じさせるために、当技術分野に公知の様々な方法で変異させることができる。そのような変異のDNA配列またはDNA産物は、本明細書に提供された配列と実質的に同等であると考えられ、すなわち少なくとも1つのヌクレオチドまたはアミノ酸がそれぞれ異なり、少なくとも2つ、または少なくとも約10個もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっていてもよい。一般的に、配列の変化は、置換、挿入または欠失であってよい。欠失は、ドメインもしくはエキソンの欠失のような、大きな欠失をさらに含むことができる。TRPチャンネル配列は、大部分は膜貫通ドメイン内に保存されており、したがって、このドメインの外側領域は、機能に影響しない変異誘発の標的となる可能性がある。例えば、図7は、マウスおよびヒトの配列のアラインメントを示す。いくつかの態様において、本発明のβTRP核酸は、ポリペプチドまたはその断片をコードし、これらはマウスとヒトの配列間で保存されたアミノ酸を含む。他の態様において、βTRP核酸は、ポリペプチドまたはその断片をコードし、これらは、ヒトとラットの配列間、またはラット、マウス及びヒトの配列間で保存されたアミノ酸を含む。
【００５９】
クローニングした遺伝子におけるインビトロ変異誘発の技術は公知である。変異を調査するためのプロトコールの例を、Gustinら、Biotechniques 14: 22 (1993); Barany、Gene 37: 111-23 (1985); Colicelliら、Mol Gen Genet 199: 537-9(1985) ; およびPrentkiら、Gene 29: 303-13(1984)に見出すことができる。部位特異的変異誘発の方法を、
2006523104.tif 000004
に見出すことができる。
【００６０】
本発明の数多くの態様においては、組換え方法を用いて、目的のβTRPをコードする核酸の単離およびクローニングを行う。この種の態様は、例えば、タンパク質発現のためまたはバリアント、誘導体、発現カセットもしくはβTRPポリペプチド（例えば、配列番号：2、配列番号：4、または配列番号：6）をコードする他の配列の作製時にβTRPポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1、配列番号：3、または配列番号：5）を単離するために、βTRP遺伝子の発現を観測するために、さまざまな種におけるβTRP配列の単離もしくは検出のために、患者における診断目的のために、例えば、βTRPにおける変異を検出するため、もしくはβTRP核酸もしくはβTRPポリペプチドの発現レベルを検出するために用いられる。いくつかの態様において、本発明のβTRPをコードする配列は、異種プロモーターと機能的に結合している。1つの態様において、本発明の核酸は、特に例えばヒト、マウス、ラットなどを含む、任意の哺乳動物に由来する。
【００６１】
本発明は、組換え遺伝学の分野におけるルーチン的な技術に依拠している。本発明における一般的な使用方法を開示している基本的なテキストには、Sambrookら、「Molecular Cloning、Laboratory Manual」（第3版、2001）；Kriegler、「Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual」（1990）；および「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編、1994）が含まれる。
【００６２】
一般に、主題タンパク質をコードする核酸は、cDNAまたはゲノムDNAをコードするように作製されたDNA配列ライブラリーからクローニングされる。特定の配列の位置はオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることによって決定可能であり、後者の配列はβTRPをコードする配列（例えば、配列番号：1）から導くことができ、これはPCRプライマー用の基準となる上に、βTRP特異的プローブを単離するのに適した領域を規定する。または、配列を発現ライブラリー中にクローニングする場合には、発現された組換えタンパク質を、目的のβTRPに対して作製された抗血清または精製抗体を用いて免疫学的に検出することもできる。
【００６３】
ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーの作製およびスクリーニングのための方法は当業者に周知である（例えば、GublerおよびHoffman、Gene 25: 263-269 (1983)；BentonおよびDavis、Science, 196: 180-182 (1977)；およびSambrook、前記を参照されたい）。膵細胞はβTRP RNAおよびcDNAを単離するのに適した細胞の一例である。
【００６４】
簡潔に述べると、cDNAライブラリーを作製するためには、mRNAを豊富に含む源を選択する必要がある。続いて、mRNAをcDNAにし、組換えベクター中に連結した上で、増殖、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主にトランスフェクトする。ゲノムライブラリーの場合には、DNAを組織または細胞から抽出し、機械的剪断または酵素消化のいずれかにより、好ましくは約5〜100kbの断片を得る。続いて勾配遠心によって断片を望ましくないサイズのものから分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージのパッケージングをインビトロで行い、組換えファージをプラークハイブリダイゼーションによって分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965 (1975)に一般的に記載された通りに行う。
【００６５】
代替的な1つの方法では、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用とmRNAまたはDNAテンプレートの増幅とを組み合わせる。適したプライマーは、特定のβTRP配列、例えば、配列番号：1に記載の配列から設計することができる。このポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法では、目的のタンパク質をコードする核酸を、mRNA、cDNA、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから直接増幅する。制限酵素部位をプライマーに組み入れることができる。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅法は、例えば、特定のタンパク質をクローニングして前駆タンパク質を発現させるため、生理的試料中の本発明のβTRPポリペプチドをコードするmRNAの存在を検出するためのプローブとして用いるための核酸を合成するため、核酸シークエンシングのため、またはその他の目的のためにも有用と思われる（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号を参照されたい）。PCR反応によって増幅された遺伝子はアガロースゲルから精製し、適したベクター中にクローニングすることができる。
【００６６】
本発明のβTRPポリペプチドをコードする遺伝子を哺乳動物組織から同定するために適切なプライマーおよびプローブは、配列番号：1のような、本明細書で提供する配列、またはβTRPポリペプチド、例えば配列番号：2の中のコードアミノ酸から導くことができる。PCRの一般的な概説については、Innisら、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications」、Academic Press、San Diego (1990)を参照されたい。
【００６７】
合成オリゴヌクレオチドを遺伝子の構築に用いることができる。これは、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方に相当する、通常は長さ40〜120bpの一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて行われる。続いて、これらのDNA断片のアニーリング、連結およびクローニングを行う。
【００６８】
本発明のβTRPポリペプチドをコードする遺伝子を、発現のために哺乳動物細胞への形質転換導入を行う前に、中間ベクター中にクローニングすることができる。これらの中間ベクターは原核生物ベクターまたはシャトルベクターであることが一般的である。タンパク質は、当業者に周知の標準的な方法を用いて原核生物に発現させることもでき、または以下に述べるように真核生物において発現させることもできる。
【００６９】
III．ポリペプチドをコードするβTRPの細胞への導入
細胞に送達されるβTRP核酸がDNAである場合、対象となるβTRP DNAに機能的に結合されているプロモーター（例えば、真核細胞で機能的なプロモーター）、またはゲノム中に導入される場合に内因性プロモーターに結合されているプロモーターを有する任意の構築物を、本発明において使用することができる。βTRP DNA配列（または対応するRNA配列）を含む構築物は、対象となるβTRP DNAまたはRNA配列を含む、任意の真核生物発現構築物であってもよい。例えば、プラスミドまたはウイルス構築物（例えばアデノウイルス）を切断して、連結可能な末端を有する直鎖状DNAを提供することができる。末端を相補性様の連結可能な末端を有する外因性DNAに結合して、無傷のレプリコンおよび所望の表現型特性を有する生物学的に機能性な組換えDNA分子を提供する。好ましくは、構築物は、真核生物宿主および／または原核生物宿主（真核生物においてはウイルス、原核生物においてはプラスミド）において複製が可能であり、このような構築物は当技術分野において公知であり、市販されている。
【００７０】
当技術分野において周知の技術を用いて、構築物を調製することができる。同様に、遺伝的に変更された宿主細胞における外因性DNA配列またはRNA配列を発現させるための技術も公知である（例えば、Kormalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2150-2154 (1987) ; Sambrookら、Molecular Cloning : a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yを参照されたい）。
【００７１】
いくつかの態様において、DNA構築物は、膵臓（例えば島）細胞内に対象となるDNAの発現を促進させるプロモーターを含む。プロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）またはアデノウイルス由来のプロモーターのような、真核細胞で機能する強力なウイルスプロモーターであってもよい。より具体的には、例示的なプロモーターには、ヒトCMVの極初期遺伝子由来のプロモーター（Boshartら、Cell 41 : 521-530 (1985)）およびRSVの末端反復配列（LTR）由来のプロモーター（Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777-6781 (1982)）が含まれる。
【００７２】
あるいは、使用されるプロモーターは、アクチン遺伝子プロモーターのような強力な一般的真核生物のプロモーターであってもよい。1つの態様において、使用されるプロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。例えば、構築物において使用されるプロモーターは、膵臓特異的プロモーター、導管特異的プロモーター、または幹細胞特異的プロモーターであってもよい。β細胞特異的プロモーターの例には、インスリンプロモーターおよびアミリンプロモーターが含まれる。本発明の構築物はまた、プロモーターに加えて、標的細胞の発現を増強する配列（例えばエンハンサー）を含んでもよい。
【００７３】
別の態様において、プロモーターは、テトラサイクリン調節プロモーターのような、調節されるプロモーターであり、それによる発現は、外因性の物質（例えば、テトラサイクリン）への曝露によって調節されてもよい。
【００７４】
他の構成要素は、構築物を含みおよび／または構築物を発現する細胞を選択または同定するのに役立つマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子など）またはβガラクトシダーゼ）、細菌細胞における構築物の安定な複製のための複製開始点（好ましくは、高コピー数の複製開始点）、またはDNA構築物の産生を促進する他の要素、それらによってコードされるタンパク質、またはその両方などである。
【００７５】
真核生物発現のために、構築物は、ポリアデニル化シグナル配列と機能的に順に結合する、対象となるDNAに機能的に結合する真核生物プロモーターを最小限含む必要がある。ポリアデニル化シグナル配列は、当技術分野に公知の様々なポリアデニル化シグナル配列のうち任意のものから選択してよい。例示的なポリアデニル化シグナル配列は、SV40初期ポリアデニル化シグナル配列である。この構築物はまた、1つまたは複数のイントロンを含んでもよく、必要に応じて、対象となるDNA、特に対象となるDNAがcDNAである（天然に生じる配列のイントロンを含まない）DNAの発現レベルを増加させることができる。当技術分野に公知の様々なイントロンのうち任意のものを使用することができる。 
【００７６】
また別の態様において、細胞に送達される核酸は、βTRPをコードするRNAである。この態様において、RNAは標的細胞において発現（すなわち、RNAの翻訳）されるために適合されている。対象となるタンパク質をコードするRNA（例えばmRNA）を産生する方法は、当技術分野に周知であり、本発明において有用なβTRPをコードするRNAの産物に容易に適用することができる。
【００７７】
A．βTRPコード核酸の送達
βTRPコード核酸の送達を、当技術分野に公知の任意の手段を用いて達成することができる。例えば、送達を、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを用いて達成することができる。いくつかの態様において、核酸をアデノウイルスのようなウイルス粒子内で送達する。他の態様において、核酸をウイルス粒子（例えば、アデノウイルス）または陽イオン性脂質もしくはリポソームのようなアジュバントと混合された裸のDNAを含む製剤において送達する。「アジュバント」とは、自身では所望の効果を生じないが、活性化合物の作用を増強または改良するように作用する物質である。使用される正確なベクターおよびベクター製剤は、送達されるDNAサイズ、使用される送達プロトコールなどのような、いくつかの因子に依存すると考えられる。非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの例を以下に詳細に記載する。
【００７８】
1．ウイルスベクター
一般的に、本発明に従って使用されるウイルスベクターは、ウイルスが複製欠損となり、本発明に従って標的細胞で発現される対象となる組換え遺伝子を送達するように遺伝子操作した、天然に生じるウイルスに由来するウイルス粒子から構成される。多くのウイルスベクターが当技術分野に周知であり、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス（HSV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ワクシニアおよびポリオウイルスベクターが含まれる。標的化された細胞の選択的な感染によって、ウイルスベクターを選択することができる。
【００７９】
ウイルスベクターとして、複製欠損ウイルスを使用する場合に、対象となるDNAに対応するDNAまたはRNAのいずれかを含む感染性ウイルス粒子は、ウイルス複製に不可欠な欠損している構成要素を提供する組換え細胞系にウイルス構築物を導入することにより、産生することができる。1つの態様において、組換えウイルスベクターによる組換え細胞系の形質転換の結果として、例えば、導入されたウイルスベクターへの組換え細胞系のウイルス配列の相同組換えによって、複製能を有するウイルスの産生または実質的な産生が起こらないと考えられる。対象となる核酸を含む複製欠損ウイルス粒子の産生方法は、当技術分野に周知であり、例えば、Rosenfeldら、Science 252: 431-434 (1991) およびRosenfeldら、Cell 68 : 143-155 (1992) (アデノウイルス)；米国特許第5,139,941号 (アデノ随伴ウイルス)；米国特許第4,861,719号 (レトロウイルス)；および米国特許第5,356, 806号 (ワクシニアウイルス)に記載されている。ムンプスウイルスゲノムの操作方法および材料、ウイルス融合およびウイルス複製のためのムンプスウイルス遺伝子の特徴付け、ならびにムンプスウイルスゲノムの構造および配列は、
2006523104.tif 000005
に記載されている。
【００８０】
2．非ウイルスベクター
対象となる核酸を、非ウイルスベクターを使用して細胞に導入することができる。本明細書で使用される「非ウイルスベクター」とは、裸のDNA（例えば、ウイルス粒子内に含まれず、脂質のようなキャリア分子を含まないDNA）、裸の核酸を含む化学製剤（例えば、DNA（および／またはRNA）の製剤および陽イオン化合物（例えば、硫酸デキストラン、陽イオン性脂質））、ならびにウイルス粒子のようなアジュバントと混合された裸の核酸（例えば、対象となるDNAは、ウイルス粒子内に含まれないが、製剤は裸のDNAとウイルス粒子（例えばアデノウイルス粒子）の両方から構成される）を含むことを意味する（例えば、Curielら、Am. J.Respir. Cell Mol. Biol. 6: 247-52 (1992)を参照されたい）。
【００８１】
いくつかの態様において、製剤は、投与前に裸のDNA構築物と混合されたウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、ウイルス粒子は、アデノウイルス粒子である。例えば、Curielら、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6: 247-52 (1992)を参照されたい。
【００８２】
代替的にまたは加えて、核酸を、ポリ-L-リジンもしくはDEAC-デキストラン、標的化リガンド、および／またはDNA結合タンパク質（例えばヒストン）のような、ポリ陽イオン性物質と複合化することができる。DNA-またはRNA-リポソーム複合製剤は、遺伝子物質（DNAまたはRNA）に結合し、かつ細胞への核酸の送達を促進させる脂質の混合物を含む。本明細書に従って使用可能なリポソームには、DOPE（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、CUDMEDA（N-(5-コレストラム-3-.β.-オール3-ウレシアニル)-N',N'-ジメチルエチレンジアミン（N-(5-cholestrum-3-.beta.-ol 3-urethanyl)-N',N'-dimethylethylene diamine））が含まれる。
【００８３】
例えば、裸のDNAは、リポフェクション（Lipofectin）（商標）(LTI/BRL)を約2.5％〜約15％の容量：容量、例えば約6％〜約12％の容量：容量の濃度範囲で含む溶液において投与されてもよい。本発明の方法に従う送達のためのDNA製剤化の方法および組成物は、米国特許第5,527,928号に例示されている。
【００８４】
対象となる核酸はまた、宿主細胞への送達を促進させるキャリア分子（例えば、抗体または受容体リガンド）に結合されたDNAまたはRNAの化学製剤として投与されてもよい。「化学製剤」という用語は、タンパク質もしくは脂質、またはそれらの誘導体のようなキャリア分子に核酸化合物を結合させる核酸の修飾を意味する。例示的なタンパク質キャリア分子には、標的化された膵臓細胞に特異的な抗体、または例えば、標的化された膵臓細胞に関連する受容体と相互作用可能な分子などの、受容体リガンドが含まれる。
【００８５】
B．インビトロにおける膵臓細胞内へのβTRP核酸の導入
βTRPをコードする核酸を、インビトロで細胞内に導入して、少なくとも一過性の発現を提供するように細胞内で発現させることができる。核酸を導入した細胞は、上皮細胞（例えば、膵臓細胞（例えば、β細胞のような島細胞を含む）、腸細胞、肝臓細胞、または管細胞）、多能性成人幹細胞もしくは胚性幹細胞、またはβ細胞もしくはインビトロにおいてインスリンの発現可能な細胞に成長することが可能な任意の哺乳動物細胞に分化させることができる。その後、島細胞置換療法による治療を受容できるインスリン欠損（例えば1型または2型糖尿病）に特徴付けられる疾患を有する被験体に、細胞を移植することができる。いくつかの態様において、βTRP発現を提供し、被験体に移植される宿主細胞は、移植片を受容する個体に由来する（例えば、自己移植片を提供するため）。あるいは、他の被験体（「ドナー」）由来の細胞は、βTRPを発現するために修飾されてもよく、その後細胞は、インスリン産生を提供するために罹患した被験体に移植される。
【００８６】
インビトロでの細胞内への核酸の導入は、当技術分野に周知の方法（例えば、組換え（好ましくは複製欠損）ウイルスとの、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション感染、および当技術分野に周知の他の手段）に従って達成することができる。核酸は、一般的に、所望のレベルでポリペプチドを発現させるプロモーター（例えば、CMV、SV40、アデノウイルス由来のプロモーター、または組織特異的もしくは細胞型特異的プロモーター）と機能的に結合される。組換え核酸を含む形質転換細胞を、例えば、導入された構築物中に存在する選択マーカーの発現、またはこの構築物とコトランスフェクションした核酸を存在させることなどを介して、選択および／または増加させることができる。典型的な選択マーカーは、テトラサイクリン、ハイグロマイシン、ネオマイシンなどの抗生物質に対して耐性を与える。他のマーカーには、チミジンキナーゼなどが含まれ得る。他のマーカーには、βガラクトシダーゼまたは緑色蛍光タンパク質のような、βTRP発現細胞を同定するために使用可能なマーカーが含まれ得る。
【００８７】
形質転換細胞内の導入された核酸の発現は、当技術分野に公知の様々な方法によって評価することができる。例えば、導入された遺伝子の発現を、ノーザンブロットによって試験して、関連遺伝子に由来するDNAプローブとハイブリダイズするmRNAを検出することができる。これらの所望の遺伝子を発現する細胞を、さらに、当技術分野に周知の方法を用いたインビトロ培養において、単離、増幅させることができる。形質転換のために選択される宿主細胞は、エクスビボ治療の目的（例えばインスリン産生）、細胞の移植部位、および当業者により認識される様々な因子によって変異する他の因子により、変異する。
【００８８】
形質転換細胞をインスリン産生に対して試験することもできる。例えば、インスリン発現を、PCR、ノーザンブロット、免疫細胞化学、ウエスタンブロット、またはELISAによって検出することができる。あるいは、緑色蛍光タンパク質、またはインスリン遺伝子プロモーターのような島特異的プロモーターに機能的に結合した抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を、形質転換した島細胞の同定または選択に使用することができる。
【００８９】
所望の遺伝子産物を発現させるために宿主細胞を操作する方法、および操作した細胞の埋め込みまたは移植のための方法（例えば、エクスビボ治療）は当技術分野に公知である（例えば、Gilbertら、Transplantation 56: 423-427 (1993)を参照されたい）。外因性細胞または自己細胞における所望の遺伝子の発現、および膵臓への細胞（例えば、島細胞）の移植については、例えば、
2006523104.tif 000006
を参照されたい。一般的に、細胞を、膵臓、または例えば皮下部位、肝臓、腹膜などの任意の実際的もしくは好都合な部位に移植することができる。
【００９０】
島細胞を移植する方法は、当技術分野に周知であり、例えば、
2006523104.tif 000007
を参照されたい。
【００９１】
一般的に、インビトロで形質転換細胞を増殖した後、当技術分野に周知の方法によって、細胞を哺乳動物被験体に移植することができる。移植された細胞の数は、低下した血中グルコースレベルとするのに十分なレベルのインスリンを発現させるために十分な多数の細胞である。移植される細胞の数は、インビトロで達成されるポリペプチドの発現レベル、および／または移植して生存する細胞の数などの因子に基づいて決定され得る。肝臓のような高密度な血管新生領域に被験体への外科的介入を最小限にした方法で、形質転換細胞を移植する。移植片拒絶の典型的徴候、すなわち移植部位の炎症および／または剥脱および発熱について哺乳動物被験体を試験することによって、ならびに血中グルコースレベルをモニターすることによって、形質転換細胞の移植片の移植をモニターする。
【００９２】
C．インビボにおける膵臓細胞内へのβTRP核酸の導入
標的細胞（例えば、膵島細胞）内でβTRPを発現させ、それによってグルコース応答性インスリン産生を促進させるために、βTRP核酸を被験体に直接的に送達することができる。標的細胞における発現のために、対象となる核酸をインビボで送達する方法は、当技術分野に公知である。例えば、遺伝子送達のインビボ法は、通常、標的細胞内へのDNAの導入の生物学的手段（例えば、対象となるDNAを含むウイルス）、または標的細胞内へDNAを導入するための機械的手段（例えば、細胞内へのDNAの直接的導入、リポソーム融合、または遺伝子銃を使用した空気圧注入）のいずれかを使用している。
【００９３】
一般的に、対象となるDNAによってコードされるタンパク質を発現する形質転換細胞は、島細胞、特にグルコース応答性インスリン産生が可能な哺乳動物患者のβ細胞を産生するために、治療的有効量のβTRPを産生する。いくつかの態様において、導入されたDNAはまた、島特異的転写因子または島細胞でインスリン産生を制御もしくは刺激する他のポリペプチドもコードする。
【００９４】
一般的に送達方法は、対象となる核酸を含むベクターを膵臓細胞に導入する段階を含む。一例として、βTRP DNA含有ベクターは、管系を介してインビボで膵臓に導入される、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（裸のDNAを含む）のいずれかを含んでもよい。管内投与は、例えば、胃腸管の管腔を介したカニューレの挿入、外部開口を介したカニューレの挿入、または総胆管を介したカニューレの挿入によるカニューレ挿入法によって達成され得る。逆行性の管投与は、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（endoscopic retrograde chalangio-pancreatography：ECRP）により、膵臓において達成され得る。膵臓への管内送達を達成するための例示的な方法は、米国特許第6,004,944号に記載される。
【００９５】
βTRPをコードする核酸の正確な投与量は、形質転換に対する標的細胞の感受性、被験体のサイズおよび体重、所望のタンパク質の発現レベル、ならびに治療される状態を含む、多くの因子によって大きく変動すると考えられる。標的組織に感染し、十分な数の細胞を形質転換し、かつ所望のレベルのインスリン産生を提供するために有効な核酸の量および／または感染性ウイルス粒子の数は、インビトロでの形質転換効率、および形質転換に対する標的細胞の感受性などの因子に基づいて容易に決定され得る。例えば、ヒトの膵管に導入されたDNAの量は、例えば一般的に、約1μg〜約750mg、例えば約500μg〜約500mg、例えば約10mg〜約200mg、例えば約100mgである。一般的にDNAの量は、動物モデルにおける所望の遺伝子の送達および発現に有効なDNAの量から推定され得る。例えば、ヒトにおける送達のためのDNAの量は、ラットに有効なDNA量の約100倍である。
【００９６】
本発明に従って修飾された膵臓細胞は、例えば、送達される核酸がDNAであり、かつ対象となるDNAが強力な真核生物プロモーター（例えば、CMV、MMTV）に機能的に結合されている場合に、対象となる核酸の十分に高レベルな発現を促進することができる。発現されたタンパク質は、島細胞においてグルコース応答性インスリン産生を誘導することができる。したがって、本発明の方法は、様々なインスリン関連状態を有する哺乳動物被験体の治療において有用である。
【００９７】
対象となるタンパク質の治療的レベルを達成するために必要とされる形質転換膵臓細胞の実際の数は、発現されるタンパク質、形質転換細胞によるタンパク質の発現レベル、タンパク質がインスリン産生を誘導する割合、および治療される状態を含む、いくつかの因子によって様々であると考えられる。
【００９８】
島転写因子をコードする核酸をインビボまたはエクスビボで導入するかどうかに関わらず、核酸（またはインビトロで産生された島細胞、またはインビボ移植後の島細胞に成長させるために移植されたβTRP核酸を発現する組換え細胞）を、他の遺伝子および他の作用物質と組み合わせて投与してもよい。
【００９９】
D．治療の評価
本発明の方法に従ってエクスビボまたはインビボの治療効果を、様々な方法においてモニターすることができる。一般的に、被験体由来の血液試料を、例えばグルコース、プロインスリン、c-ペプチドおよびインスリンのレベルについてアッセイすることができる。血液試料のプロインスリン、c-ペプチド、インスリンおよびグルコースのための適当なアッセイ法は、当技術分野で周知である。
【０１００】
IV．βTRPの修飾物質の同定
βTRPの修飾物質、すなわちβTRP活性またはβTRPポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、糖尿病を含む多くのヒト疾患の治療に有用である。βTRP活性化物質の投与は、糖尿病（例えば、2型）の個体の治療のために使用され得る。
【０１０１】
A．βTRPを調節する作用物質
βTRP修飾物質として試験される作用物質は、任意の低分子化合物、またはタンパク質、糖、核酸もしくは脂質などの生物的実体であってよい。典型的に、被験化合物は低分子化合物およびペプチドであると考えられる。本質的には、任意の化合物を、本発明のアッセイ法における修飾物質またはリガンドの候補として用いることができるが、水性溶液または有機溶液（特にDMSOをベースとするもの）中に溶解可能な化合物を用いることが最も多い。アッセイ法は、アッセイ法の工程を自動化し、任意の好都合な源から化合物をアッセイ法に提供し、典型的にはそれを平行して稼働させることにより（例えば、自動化アッセイ法でのマイクロタイタープレートのマイクロタイター形式による）、大規模化学ライブラリーをスクリーニングするように設計する。活性化物質には、直接的活性化（開放（opne））βTRP、ならびにβTRPを実質的に活性化させる調節物質（GPCR、Gタンパク質など）を活性化する分子を含むと考えられる。修飾物質には、βTRP mRNAのレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、アンチセンス分子、リボザイム、DNAザイム（DNAzyme）、短鎖抑制性RNA（small inhibitory RNA；siRNA）など）またはmRNAからの翻訳のレベルを低下させるように設計された作用物質（例えば、mRNA分子上の翻訳開始配列または他の配列に対して相補的なアンチセンス分子などの翻訳遮断物質）も含まれる。化合物の供給元が、Sigma社（St. Louis, MO）、Aldrich社（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich社（St. Louis, MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika社（Buchs, Switzerland）などを含め、数多くあることは知られているであろう。一般的に、試験される化合物は、1pMから100mMの範囲内で存在する。
【０１０２】
いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニング法は、数多くの治療的化合物の候補（修飾性化合物の候補）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはペプチドリガンドライブラリーを提供する段階を含む。続いて、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、望ましい特徴的な活性を示すライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定するために、本明細書に記載するような1つまたは複数のアッセイ法においてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ち、またはそれ自体を治療薬の候補もしくは実際の治療薬として用いることができる。
【０１０３】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬などの化学的「構成単位（building block）」を数多く組み合わせることにより、化学合成または生物的合成によって生成された多様な化合物からなる集成物である。例えば、ポリペプチドライブラリーなどの直鎖状コンビナトリアル化学ライブラリーは、一群の構成化学単位（アミノ酸）を所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関して考えられるすべてのやり方で組み合わせることによって生成される。構成化学単位のこのようなコンビナトリアル混合により、何百万もの化合物を合成することができる。
【０１０４】
コンビナトリアル化学ライブラリーの作製およびスクリーニングは当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991)およびHoughtonら、Nature 354: 84-88 (1991)を参照されたい）が非制限的に含まれる。多様性のある化学物質ライブラリーを作製するためにその他の化学物質を用いることもできる。このような化学物質には、ぺプトイド（例えば、国際公開公報第91／19735号）、コード化ペプチド（例えば、国際公開公報第93／20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、国際公開公報第92／00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（diversomer）（Hobbsら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）、ビニル性ポリペプチド（Hagiharaら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)）、グルコーススカフォールディングを有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Hirschmannら、J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成（Chenら、J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)）、オリゴカルバメート（Choら、Science 261: 1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbellら、J. Org. Chem. 59: 658 (1994)）、核酸ライブラリー（Ausubel、BergerおよびSambrook、いずれも前記、を参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996)および国際特許出願番号PCT／US96／10287を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangら、Science, 274: 1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照されたい）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C&EN, Jan 18, p.33(1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照されたい）が非制限的に含まれる。
【０１０５】
コンビナトリアルライブラリーの作製用の装置は市販されている（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照されたい）。加えて、数多くのコンビナトリアルライブラリーがそれ自体、市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなど）。
【０１０６】
B．βTRPの修飾物質に関するスクリーニングの方法
細胞における、特に哺乳動物細胞、とりわけヒト細胞におけるβTRPの発現または活性のレベルを変化させる作用物質を同定するためには、数多くの種類のスクリーニングプロトコールを利用することができる。一般的には、これらのスクリーニング方法は、βTRPポリペプチドと結合すること、阻害物質もしくは活性化物質がβTRPと結合するのを妨げること、阻害物質もしくは活性化物質とβTRPとの会合を増加させること、またはβTRPの発現もしくは活性を活性化もしくは阻害することなどによってβTRPの活性を変化させる作用物質を同定するために、複数の作用物質をスクリーニングすることを含む。
【０１０７】
いくつかの態様では、βTRPを調節するが少なくともひとつの他のTRPチャンネルは調節しない作用物質を同定するために、さまざまなTRPポリペプチド（例えば、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPV6、TRPM1、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPM7、およびTRPM8）のスクリーニングを平行して行う。
【０１０８】
1．βTRP結合アッセイ法
βTRPと結合しうる作用物質をスクリーニングすることにより、予備的なスクリーニングを行うことができるが、これはそのようにして同定された作用物質の少なくともいくつかはβTRP修飾物質である可能性が高いためである。結合アッセイ法は、例えば、βTRPと相互作用する内因性タンパク質を同定する目的にも有用である。例えば、βTRPと結合する抗体、受容体またはその他の分子を、結合アッセイ法で同定することができる。
【０１０９】
結合アッセイ法は通常、βTRPタンパク質を1つまたは複数の被験作用物質と接触させ、タンパク質および被験作用物質が結合複合体を形成するのに十分な時間をおく段階を含む。形成された結合複合体は、確立されたさまざまな分析技術のうち任意のものを用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイ法には、共沈、非変性SDS-ポリアクリルアミドゲル上での共移動、ウエスタンブロット上での共移動を測定する方法（例えば、Bennet, J.P.およびYamamura, H.I. (1985)「Neurotransmitter、Hormone or Drug Receptor Binding Methods」、「Neurotransmitter Receptor Binding」（Yamamura, H. I.ら編）中、pp. 61-89を参照されたい）が非制限的に含まれる。他の結合アッセイ法には、βTRPと結合した分子または標識基質の置換を同定するための質量分析法またはNMR法の使用が含まれる。この種のアッセイ法に用いるβTRPタンパク質は、自然下で発現されるβTRPでもクローニングされたものでも合成されたものでもよい。
【０１１０】
さらに、ほ乳類または酵母のツーハイブリッド法（例えば、Bartel, P. L.ら、Methods Enzymol, 254: 241 (1995)を参照されたい）を、細胞内で一緒に発現された場合に相互作用または結合を行うポリペプチドまたはその他の分子を同定するために用いることもできる。
【０１１１】
2．発現アッセイ法
βTRPの発現を調節する化合物のスクリーニングも提供される。スクリーニング法は、被験化合物がβTRPを発現する1つまたは複数の細胞と接触させた後に、βTRPの発現の増加または減少（転写物、翻訳産物のどちらか）を検出する細胞を用いたアッセイ法を行うことを含む。アッセイ法は、天然にβTRPを発現する細胞を用いて、またはβTRPを発現するように組み換え改変した細胞において行うことができる。。
【０１１２】
βTRPの発現はさまざまなやり方で検出することができる。以下で述べるように、細胞内でのβTRPの発現レベルは、βTRPの転写物（またはそれに由来する相補的核酸）と特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、細胞内で発現されるmRNAを検索することによって決定しうる。プローブ検索は、細胞を可溶化してノーザンブロット法を行うことによって、または細胞を可溶化せずにインサイチューハイブリダイゼーション法を用いることによって実施しうる。または、βTRPと特異的に結合する抗体を用いて細胞可溶化物を検索する免疫学的な方法を用いて、βTRPタンパク質を検出することもできる。
【０１１３】
別の細胞系アッセイ法に、標準的なレポーター遺伝子アッセイ法により細胞を用いて行われるレポーターアッセイ法が挙げられる。これらのアッセイ法は、βTRPを発現する、または発現しないいずれかの細胞において行うことができる。これらのアッセイ法のある種のものは、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子と機能的に結合したβTRPプロモーターを含む異種核酸構築物を用いて行われる。さまざまなレポーター遺伝子を利用しうる。いくつかのレポーターは内在的に検出可能である。この種のレポーターの一例は、蛍光検出器を用いて検出しうる蛍光を発する緑色蛍光タンパク質である。別のレポーターは検出可能な生成物を生じる。この種のレポーターはしばしば酵素である。酵素レポーターの例には、β-グルクロニダーゼ、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ；AltonおよびVapnek (1979) Nature 282: 864-869）、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（Tohら (1980) Eur. J. Biochem. 182: 231-238；およびHallら (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101）が非制限的に含まれる。
【０１１４】
これらのアッセイ法では、レポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させる。プロモーター発現の変化は、検出可能なレポーターのレベルを検出することによって観測される。さまざまな種類のβTRP修飾物質をこのアッセイ法で同定することができる。例えば、プロモーターをそれとの結合によって阻害する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを阻害する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを阻害する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することができる。同様に、例えば、プロモーターをそれとの結合によって活性化する、転写因子もしくは他の調節因子との結合によってプロモーターを活性化する、そのプロモーターと結合する、またはプロモーターを活性化する分子を生成するカスケードを誘発する被験化合物を同定することもできる。
【０１１５】
発現または活性のレベルはベースライン値との比較が可能である。ベースライン値は、対照試料に関する値、または対照集団（例えば、2型糖尿病でない、またはそのリスクがない正常血糖個体）もしくは細胞（例えば、βTRP修飾物質に曝露されない組織培養細胞）に関するβTRP発現レベルを代表する統計値であってよい。陰性対照として、βTRPを発現しない細胞に関する発現レベルを決定することもできる。この種の細胞は一般に、他の点では実質的に被験細胞と遺伝的に同一である。
【０１１６】
レポーターアッセイ法にはさまざまな異なる種類の細胞を用いうる。内因性βTRPを発現する細胞は、例えば膵細胞（島細胞、例えばβ細胞のような）を含む。βTRPを内因的に発現しない細胞は原核細胞であっても、真核細胞であってもよい。真核細胞は、組換え核酸構築物を有する細胞の作製に通常用いられる細胞のうち任意のものでよい。例となる真核細胞には、酵母、ならびにHepG2、COS、CHOおよびHeLa細胞株などの種々の高等真核細胞が含まれる。アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞を用いることもできる。
【０１１７】
観測された活性に信頼性があることを確認するためには、レポーター構築物を含まない細胞を用いた同時並行反応を行うこと、またはレポーター構築物を有する細胞を被験化合物と接触させないことを含め、さまざまな対照をおくことができる。化合物を以下のようにさらにバリデートすることもできる。
【０１１８】
3．活性
βTRPポリペプチド酵素活性の分析は、一般的な生化学的手順に従って行われる。この種のアッセイ法には、細胞系アッセイ法のほか、精製もしくは部分精製されたβTRPポリペプチドまたは粗細胞可溶化物を用いるインビトロアッセイ法が含まれる。いくつかの態様において、βTRPポリペプチドは細胞上に発現し、細胞は被験作用物質に接触する。
【０１１９】
細胞または他の試料におけるβTRP酵素活性のレベルを決定し、ベースライン値（例えば、対照値）と比較する。活性は試料からの粗抽出物または部分的もしくは本質的に精製されたβTRPに基づいて測定することができる。βTRP活性の測定は、例えば、Lesageら、Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 279：F793-F801 (2000)およびGiratdら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 282: 249-256 (2001)に記載されたように、陽イオン（例えばCa2+）チャンネル活性を測定することを含む。例えば、イオン流の変化を、βTRPポリペプチドを発現している細胞または膜の分極（すなわち、電位）の変化を定量することによって評価することもできる。いくつかの態様において、細胞の分極の変化は、電位固定法およびパッチクランプ法、例えば、「細胞密着（cell-attached）」モード、「インサイドアウト（inside-out）」モードおよび「ホールセル（whole cell）」モードなどにより（例えば、Ackermanら、New Engl. J. Med. 336: 1575-1595 (1997)を参照されたい）、電流の変化を測定すること（それによって分極の変化測定すること）によって観測される。全細胞電流は、標準的な方法を用いて首尾良く定量することができる（例えば、Hamilら、PFlugers. Archiv. 391: 85 (1981)を参照されたい）。その他の既知のアッセイ法には以下のものが含まれる：45Ca2+流アッセイ法、および、電位感受性色素またはイオン感受性色素を用いる蛍光アッセイ法（例えば、Vestergarrd-Bogindら、J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988)；Danielら、J. Pharmacol. Meth. 25: 185-193 (1991)；Holevinskyら、J. Membrane Biology 137: 59-70 (1994)を参照されたい）。βTRPポリペプチドを含むチャンネルタンパク質を通過する陽イオン流を抑制または増大させうる化合物に関するアッセイ法は、本発明のチャンネルを有する細胞と接しているとともにそれを含む浴液に対して化合物を適用することによって実施しうる（例えば、Blatzら、Nature 323: 718-720 (1986)；Park、J. Physiol. 481: 555-570 (1994)を参照されたい）。
【０１２０】
チャンネルの機能に対する被験化合物の影響は、電流もしくはイオン流の変化を測定することによって、または電流およびイオン流の変化に伴う結果によって測定することができる。電流またはイオン流の変化は、カルシウムイオンなどのイオンの流れの増加または減少によって測定される。イオンはさまざまな標準的な手法によって測定しうる。それをイオン濃度の変化、例えば、細胞内濃度の変化によって直接測定することもでき、または膜電位もしくはイオンの放射性標識、もしくはカルシウム依存性蛍光色素を用いることによって間接的に測定することもできる。
【０１２１】
図3に示されるように、膜電位は、βTRP活性を測定するためのカルシウム流の測定と比較した特定のクリーンシグナル：ノイズの割合を提供する。βTRP活性化時の細胞膜脱分極は、陽イオン性のカルボシアニン、ローダミン、および陰イオン性のオキソノール、ならびにMolecular Devices（Sunnyvale, CA）FLEXstation（登録商標）およびFLIPR（登録商標）システムから入手可能な特許所有の色素などの、膜電位依存性の蛍光色素により測定され得る。細胞脱分極により生じる蛍光を、例えばFLEXstation（登録商標）などの当技術分野に周知の装置を用いて検出することができる。
【０１２２】
被験化合物がイオン流に及ぼす結果は極めて多岐にわたりうる。このため、任意の適した生理的変化を利用して、本発明のチャンネルに対する被験化合物の影響を評価することが可能である。被験化合物の影響は毒素結合アッセイ法によって測定することができる。機能的な結果を無傷の細胞または動物を用いて評価する場合には、伝達物質の放出、細胞内カルシウムの変化、ホルモン放出（例えば、インスリン）、既知および未解明の遺伝マーカーの両者に関する転写の変化（例えば、ノーザンブロット法）、細胞体積の変化（例えば、赤血球）、免疫応答（例えば、T細胞の活性化）、細胞増殖またはpH変化などの細胞代謝の変化、環状ヌクレオチドなどの細胞内二次メッセンジャーの変化、およびアポトーシスの調節（例えば減少）といった、さまざまな影響を測定することもできる。
【０１２３】
4．バリデーション
前記の任意のスクリーニング方法によってまず同定された作用物質を、明らかな活性をバリデーションするためにさらに試験することができる。いくつかの態様において、βTRP活性化物質は、以下の基準の任意のものまたは全てによって選択される：(i)活性化物質が、異種βTRPポリペプチドを発現する細胞において特異的に脱分極反応を誘導する（しかし、βTRPを発現しない細胞においては脱分極反応を誘導しない）；(ii) 活性化物質が、PLC阻害物質によって抑制できない（すなわち、βTRPの上流調節物質によって活性化されない）；ならびに(iii) 活性化物質の活性化作用が、2-APBのようなTRP遮断物質によって抑制できる。
【０１２４】
バリデーションアッセイ法は、例えば、イオン流の効果を確認するための、インビトロ単細胞画像化またはパッチクランプ法を含んでもよい。候補活性化物質の存在または非存在下で、単離した島細胞（正常または糖尿病の島細胞）を用いてインビトロインスリン分泌アッセイ法を行うことができる。
【０１２５】
いくつかの態様において、バリデーション試験は、適した動物モデルを用いて行われる。このような方法の基本形式は、初期スクリーニングの際に同定されたリード化合物を、ヒトのモデルとして役立つ動物に投与し、その後、βTRPが実際に修飾作用を受けるか否かを判定する段階を含む。バリデーション試験に使用される動物モデルは一般に、任意の種類の哺乳動物である。適した動物の具体的な例には、霊長類、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されることはない。例えば、糖尿病の一遺伝子モデル（例えば、ob／obマウスおよびdb／dbマウス、ツッカー（Zucker）ラット、ならびにツッカー糖尿病肥満（Zucker Diabetic Fatty：ZDF）ラットなど）、または糖尿病の多遺伝子モデル（例えば、高脂肪食摂取マウスモデル）は、糖尿病動物におけるβTRPの修飾および糖尿病動物におけるその効果をバリデーションするのに有用である可能性がある。
【０１２６】
理想的に、βTRPの活性化は、高グルコースにおいてのみでインスリン分泌を増強すべきである。したがって、いくつかの態様において、選択された活性化物質は、ZDFラットおよびdb／dbマウスにおける高血糖を減少させて、かつ糖尿病または対照動物のいずれかにおける高血糖を減少させない。
【０１２７】
C．固相および溶質のハイスループットアッセイ法
本発明のハイスループットアッセイ法では、最大で数千種もの異なる修飾物質またはリガンドを1日でスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを、選択した修飾物質の候補に対して別々のアッセイ法を実行するために用い、または、濃度もしくはインキュベーション時間の影響を観察しようとする場合には、単一の修飾物質を試験するためにウェルを5〜10個ずつ用いることができる。このため、1枚の標準的なマイクロタイタープレートで、約100種（例えば、96種）の修飾物質をアッセイすることが可能である。1536穴のウェルプレートを用いれば、1枚のプレートで約100〜約1500種の異なる化合物をアッセイすることができる。1日当たり数枚の異なるプレートをアッセイできれば、本発明の統合システムを用いて最大で約6,000〜20,000種類またはそれ以上の異なる化合物をアッセイ法でスクリーニングすることが可能である。さらに、試薬操作のためのマイクロ流体（microfluidic）アプローチを用いることができる。
【０１２８】
目的の分子（例えばβTRPまたはその断片）を、共有結合またはタグを介した結合などの非共有結合により、直接的または間接的に固体成分に結合させることができる。タグは種々の成分のうち任意のものでよい。一般的には、タグと結合する分子（タグ結合剤）を固体支持体に固定し、タグの付いた目的の分子（例えば、βTRPまたはその断片）を、タグとタグ結合剤との相互作用によって固体支持体に結合させる。
【０１２９】
文献中に詳細に記載された既知の分子相互作用に基づき、さまざまなタグおよびタグ結合剤のうち任意のものを用いることができる。例えば、ビオチン、プロテインAまたはプロテインGのようにタグが天然の結合剤を有する場合には、それを適切なタグ結合剤（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、免疫グロブリンのFc領域、ポリ-Hisなど）との結合に用いることができる。ビオチンなどの天然の結合剤を備えた分子に対する抗体も広く入手可能であり、適切なタグ結合剤についても同様である；例えば、SIGMA Immunochemicals 1998年カタログ、SIGMA, St. Louis MOを参照されたい）。
【０１３０】
同様に、任意のハプテン性化合物または抗原性化合物を適切な抗体と組み合わせて用いて、タグ/タグ結合剤の対を形成させることもできる。数千種もの特異抗体が市販されており、ほかにも多くの抗体が文献中に記載されている。例えば、1つの一般的な構成において、タグは第1の抗体であり、タグ結合剤は第1の抗体を認識する第2の抗体である。抗体-抗原相互作用以外に、細胞膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニストなどの受容体-リガンド相互作用もタグおよびタグ結合剤の対として適している（例えば、トランスフェリン、c-kit、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどの細胞受容体-リガンド相互作用；例えば、Pigott & power, 「Adhesion Molecule Facts Book 1」 (1993)を参照されたい）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンD；ペプチドを含む、種々の低分子リガンドの作用を媒介するもの）、薬剤、レクチン、糖、核酸（直鎖状重合体および環状重合体の両方の形態）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質および抗体は、いずれも種々の細胞受容体と相互作用しうる。
【０１３１】
ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリールスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテートなどの合成重合体も適切なタグまたはタグ結合剤を形成しうる。その他の多くのタグ/タグ結合剤の対も本明細書に記載のアッセイ法に有用であり、これは本開示を吟味することによって当業者には明らかであると考えられる。
【０１３２】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5-200アミノ酸のポリgly配列などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheanvater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【０１３３】
タグ結合剤を、現在用いうる種々の方法のうち任意のものを用いて、固体基質に固定する。固体基質は一般に、タグ結合剤の一部と反応する化学基を表面に固定させる化学試薬に基質の全体または一部を曝露させることにより、誘導体化または官能性付与が行われる。例えば、比較的長い連鎖部分を付着させるのに適した基には、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基およびカルボキシル基が含まれると考えられる。ガラス表面などの種々の表面に官能性を付与するためには、アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランを用いることができる。このような固相バイオポリマーアレイの構築は文献に詳細に記載されている（例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)（ペプチドなどの固相合成を記載している）；Geysenら、J. Immun. Meth. 102: 259-274 (1987)（ピン上での固相成分の合成を記載している）；FrankおよびDoring、Tetrahedron 44: 60316040 (1988)（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載している）；Fodorら、Science, 251: 767-777 (1991)；Sheldonら、Clinical Chemistiy 39(4):718-719 (1993)；ならびにKozalら、Nature Medicine 2(7): 753759 (1996)（いずれも固体基質に固定したバイオポリマーのアレイを記載している）を参照されたい。タグ結合剤を基質に固定する非化学的アプローチには、加熱、UV照射による架橋などの他の一般的な方法が含まれる。
【０１３４】
本発明は、βTRPの発現または活性を変化させうる化合物をハイスループット形式で同定するためのインビトロアッセイ法を提供する。アッセイ系が高度に均一であるため、修飾物質の候補を含まない反応における細胞のβTRP活性を測定する対照反応を随意に選択してもよい。このような随意選択的な対照反応は適切であり、アッセイ法の信頼性を高める。したがって、ひとつの態様において、本発明の方法はこのような対照反応を含む。記載するアッセイ形式のそれぞれについて、修飾物質を含まない「修飾物質なしの」対照反応により、結合活性のバックグラウンドレベルが得られる。
【０１３５】
いくつかのアッセイ法においては、陽性対照を用いることが望ましいと考えられる。少なくとも2種類の陽性対照が適している。第1に、本発明のβTRPの既知の活性化物質を1つのアッセイ試料とインキュベートすることができ、βTRPの発現レベルまたは活性の上昇に起因する結果としての信号の増加を本明細書に記載の方法に従って決定する。例示的な活性化物質には、例えばカルシマイシンが含まれる。第2に、βTRPの既知の阻害物質を添加し、βTRPの発現または活性に関する結果としての信号の低下を同様に検出することができる。例示的な阻害物質には、例えば2-APBまたはU73122、Sigma ChemicalsのPLC阻害物質が含まれる。通常であればβTRPの既知の修飾物質の存在によって引き起こされる上昇または存在を阻害する修飾物質を見つけ出すために、修飾物質を活性化物質または阻害物質と組み合わせてもよいことは理解されると考えられる。
【０１３６】
D．コンピュータを用いるアッセイ法
βTRPの活性を変化させる化合物に関するさらにもう1つのアッセイ法は、アミノ酸配列にコードされた構造情報に基づいてβTRPの三次元構造を作成するためにコンピュータシステムを用いる、コンピュータ支援による薬物設計である。入力したアミノ酸配列がコンピュータプログラム内にあらかじめ設定したアルゴリズムと直接かつ能動的に相互作用して、タンパク質の二次、三次および四次構造モデルが生成される。続いて、リガンドとの、結合能を有する、そうでなければ調節される能力を有する構造領域（例えば、活性部位）を同定するためにタンパク質構造のモデルを検討する。同様の分析を、βTRPの推定受容体またはβTRP結合パートナーについて行うことができ、βTRPの相互作用領域を同定するために用いることができる。次にこれらの領域を利用して、βTRPと結合する化合物を同定する。
【０１３７】
ひとたび目的のタンパク質の3次構造が生成されれば、修飾物質候補をコンピュータシステムによって同定することができる。修飾物質候補の三次元構造は、化合物の化学式を入力することによって生成される。次に修飾物質候補の三次元構造をβTRPのものと比較して、βTRPの結合部位を同定する。エネルギー項を用いてタンパク質と修飾物質との間の結合親和性を決定し、どのリガンドがタンパク質と結合する確率が高いかを判定する。
【０１３８】
V．投与および薬学的組成物
βTRPの修飾物質（例えば、アンタゴニスト、またはアゴニスト）は、インビボでのβTRP活性の修飾のために、哺乳動物対象に対して直接投与することができる。投与は、修飾性化合物を導入して、治療しようとする組織に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路によるもので、当技術分野において周知である。個々の化合物の投与には複数の経路を用いることができるが、ある特定の経路によって別の経路よりも即時的かつより効果的な反応が得られることがしばしばである。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含みうる。薬学的に許容される担体は、一部には、投与する個々の組成物、さらには組成物の投与に用いる個々の方法によって決まる。したがって、本発明の薬学的組成物には適した製剤が広範囲にわたって存在する（例えば、「Remington 's Pharmaceutical Sciences」第17版、1985）を参照されたい）。
【０１４０】
βTRPの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて、注射用またはポンプ装置での使用のために調製することができる。ポンプ装置（「インスリンポンプ」としても知られる）は、インスリンを患者に投与するために一般的に用いられており、このため、本発明の組成物を含むように適合させることは容易である。インスリンポンプの製造元には、Animas、DisetronicおよびMiniMedが含まれる。
【０１４１】
βTRPの発現または活性に対する修飾物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独で、または他の適した成分と組み合わせて吸入によって投与するためのエアロゾル製剤（すなわち、それらは「噴霧」することが可能である）の形にすることができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧剤中に配合することができる。
【０１４２】
投与のために適した製剤には、水性および非水性の溶液、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を等張化する溶質を含みうる等張滅菌溶液、ならびに懸濁化剤、溶解補助剤、濃稠化剤、安定剤および保存料を含みうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践に際しては、組成物を例えば経口的、鼻腔内、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は単位用量または複数回の用量がアンプルまたはバイアルなどの容器内に密封された形式で提供することができる。溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。修飾物質を調製済みの食品または薬剤の一部として投与することもできる。
【０１４３】
患者に投与する用量は、本発明の状況においては、一定期間にわたって対象において有益な反応を誘導するのに十分である必要がある。用量は、用いる個々の修飾物質の有効性、対象の年齢、体重、身体活動性および食事内容を含むさまざまな要因、他の薬剤との併用の可能性、ならびに糖尿病症例の重症度に応じて決まると考えられる。修飾物質の一日投与量は、既知のインスリン組成物の場合と同様のやり方で、当業者により、個々の患者について決定することが推奨される。また、用量の程度は、個々の対象における特定の化合物またはベクターの投与に伴う何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によっても決まると考えられる。
【０１４４】
投与する修飾物質の有効量を決定する際に、医師は修飾因子の循環血漿中レベル、修飾物質の毒性および抗修飾物質抗体の産生を評価すると思われる。一般に、修飾物質当量としての用量は、一般的な対象の場合、約1ng/kg〜10mg/kgの範囲である。
【０１４５】
投与に関しては、本発明のβTRP修飾物質を、修飾物質のLD-50、および修飾物質の種々の濃度での副作用を対象の体重および全般的健康状態に当てはめることによって決定される速度で投与することができる。投与は単回投与または分割投与によって行われうる。
【０１４６】
本発明の化合物を、所望の標的療法に応じた1つまたは複数の別の薬剤と併用して効果的に用いることもできる（例えば、Turner, N.ら、Prog. Drug Res. (1998) 51: 33-94；Haffher, S., Diabetes Care (1998) 21: 160-178；およびDeFronzo, R.ら（編）、「Diabetes Reviews」(1997) Vol.5, No.4を参照されたい）。数多くの試験で、経口薬との併用療法の有益性が検討されている（例えば、Mahier, R., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1999) 84: 1165-71；United Kingdom Prospective Diabetes Study Group: UKPDS 28、Diabetes Care (1998) 21: 87-92；Bardin, C. W.（編）、「Current Therapy In Endocrinology and Metabolism」第6版（Mosby-Year Book, Inc., St. Louis, MO. 1997）；Chiasson, J.ら、Ann. Intern. Med. (1994) 121: 928-935；Coniff, R.ら、Am. Ther. (1997) 19: 16-26；Coniff, R.ら、Am. J. Med. (1995) 98: 443-451；およびIwamoto, Y.ら、Diabet. Med. (1996) 13365-370；Kwiterovich, P., Am. J. Cardiol (1998) 82 (12A): 3U-17Uを参照されたい）。これらの試験により、疾患の中でも特に糖尿病は、治療プログラムに第2の薬剤を加えることによってさらに改善されうることが示されている。併用療法には、本発明のβTRP修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を含む単一の医薬製剤の投与のほかに、βTRP修飾物質および別個の医薬製剤としての各々の薬剤の投与も含まれる。例えば、βTRP修飾物質およびチアゾリジンジオンを錠剤もしくはカプセル剤などの単一の経口投与用組成物としてヒト対象に投与することができ、または各々の薬剤を別個の経口投与用製剤として投与することもできる。別個の投与製剤を用いる場合には、βTRP修飾物質および1つまたは複数の別の薬剤を、本質的には同じ時に（すなわち、同時に）投与することができ、または別個に時間をずらして（すなわち、逐次的に）投与することもできる。併用療法にはこれらの治療プログラムのすべてが含まれるものと解釈される。
【０１４７】
併用療法の1つの例は、糖尿病を変化させる（または糖尿病およびそれに関連した症状、合併症および障害を治療する）場合にみられ、この場合には、βTRP修飾物質を例えば以下のものと効果的に併用することができる：スルホニル尿素（クロルプロパミド、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリブリド、グリクラジド、グリナーゼ、グリメピリドおよびグリピジドなど）、ビグアナイド系薬剤（メトホルミンなど）、PPARβδアゴニスト、PPARγのリガンドまたはアゴニスト、例えばチアゾリジノン（シグリタゾン、ピオグリタゾン（例えば、米国特許第6,218,409号を参照されたい）、トログリタゾンおよびロシグリタゾン（例えば、米国特許第5,859,037号を参照されたい）など）；クロフィブラート、ジェムフィブロジル、フェノフィブラート、シブロフィブラート、およびベザフィブラートなどのPPARαのアゴニスト、デヒドロエピアンドロステロン（DHEAまたはその抱合硫酸エステルであるDHEA-504とも呼ばれる）；アンチグルココルチコイド；TNFα阻害剤；α-グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ミグリトールおよびボグリボース）、アミリンおよびアミリン誘導体（プラムリンチド（pramlintide）など（米国特許第5,902,726号；第5,124,314号；第5,175,145号および第6,143,718号、第6,136,784号も参照されたい））、インスリン分泌促進物質（レパグリニド、グリキドンおよびナテグリニド（米国特許第6,251,856号；第6,251,865号；第6,221,633号；第6,174,856号も参照されたい））、およびインスリン。
【０１４８】
VI．βTRPを調節するポリペプチドの修飾物質を同定する方法
図3に示されるように、βTRPの活性化は、膜電位における変化を検出することによって、容易に測定され得る。膜電位依存性蛍光色素は、ハイスループットスクリーニングアッセイ法において有用な装置を使用して測定可能な顕著なシグナルを提供する。本発明者らの知る限り、TRPファミリーにおけるチャンネルについて、活性化時に膜電位／細胞脱分極シグナルがこのように明確で容易に測定可能であることは記載されたことがない。さらに、カルシウムチャンネルが、パッチクランプ法以外のアッセイ法において容易に測定されるように、膜電位における大きな変化を媒介することは予測不可能である。したがって、本発明は、βTRPを発現する細胞の膜電位における変化を誘導する作用物質を同定することによって、βTRPを調節するポリペプチドの修飾物質を同定する方法を提供する。
【０１４９】
いくつかの態様において、本方法は、βTRPおよびβTRPの上流調節物質を発現する細胞に作用物質を接触させる段階；および細胞の膜電位の変化を検出する段階であって、作用物質の非存在下と比較した作用物質の存在下での細胞の膜電位における変化により、作用物質が調節物質の活性を修飾することが示される段階を含む。βTRPの例示的な調節物質には、例えば、Gタンパク質結合受容体（G-protein coupled receptor：GPCR）およびGタンパク質が含まれる。例えば、いくつかの態様において、GPCRは、Gq受容体、Gi受容体およびGs受容体より選択される。例示的なGq受容体には、例えば、ムスカリンまたはPT2Y受容体が含まれる。Gi受容体を含む態様において、Gqi5、Gαl6、Gqs5、Gqo5のような乱交雑Gタンパク質もまた、GPCRとβTRPの間のシグナル伝達を媒介するために細胞内で発現される。
【０１５０】
本発明の方法は、ハイスループットスクリーニングのために十分な装置を使用した膜電位における変化を検出する段階を含むことができる。例えば、膜電位変化に対して蛍光的に応答する色素の存在下で細胞ベースのアッセイ法を使用して、膜電位における変化を検出することができる。βTRPの活性化によって誘導される膜電位における著しい変化のために、FLEXstation（登録商標）およびFLIPR（登録商標）システム（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）などの、蛍光を測定するための装置を使用して、βTRPの活性化を測定することができる。これらの装置は、パッチクランプ法と比べて、ハイスループットスクリーニングのための有用な装置である。したがって、一日に一人で著しい数（例えば、少なくとも96個、384個、500個、または1000個もしくはそれ以上）の潜在的な修飾物質（例えば、コンビナトリアルライブラリーにおいて）を、βTRPの調節物質の効果についてアッセイすることができる。したがって、調節物質の活性を修飾する低分子を同定するために、本明細書に記載されたような、大きなコンビナトリアルライブラリーの化合物をスクリーニングすることができる。
【０１５１】
いくつかの態様において、調節物質ポリペプチドおよび／またはβTRPポリペプチドを、細胞中で組換え的に発現させることができる。組換え発現のための例示的な細胞には、例えば、哺乳動物細胞（例えば、HEK293、CHO、Cos7）、昆虫細胞（例えば、sf21）、細菌細胞（例えば、大腸菌）、または酵母（例えば、ピチア属またはS.セレビシエ（S. cervisiae））などが含まれる。
【０１５２】
実施例
実施例1：
本実施例は、βTRPが膵島細胞において発現すること、および糖尿病動物の島細胞にβTRPを導入することにより、グルコース応答性インスリン分泌が改善されることを示す。
【０１５３】
島の遺伝子発現を調べるために、Custom Affymetrix（商標）オリゴヌクレオチドアレイを使用した。マイクロアレイプローブセットMBXRATISL12881は、Affymetrixジーンチップ（商標）解析ソフトウエア（Affymetrix GeneChipTM analysis software）により、5個の別々のラット島mRNA試料について「存在」、および試験された10個の他の組織について非存在と呼ばれた。マウスプローブセットMBXMUSISL22609もまた、他の組織と比較して、島および培養されたβ細胞系（βHC9）mRNA試料における高程度の増加が示された（図1B）。対応するcDNAのための複数クローンが、ヒト、ラット、およびマウスの島ライブラリーで見出され、配列決定により、コードされたタンパク質が推定TRPチャンネルであることが明らかとなった。本発明者らは、これらをβTRPと名付けた。βTRPのヒト遺伝子は、ベックウィズ-ヴィーデマン症候群の遺伝子座における試験の一環として配列決定されており、MTR1と名付けられていた。国際公開公報第0132693号を参照されたい。国際公開公報第0132693号における記述とは異なり、βTRP ESTは、ヒト、ラット、およびマウスの島ライブラリーにおいて十分に示されている。オリゴヌクレオチドアレイデータにより、膵島が非常にβTRPに富んでいることが確認された。インサイチューハイブリダ一ゼーションを使用して、βTRP mRNAがラット島のコア細胞の大部分において豊富であり、大部分のβ細胞ではないとしても多くのβ細胞がβTRPを発現することを示すことを明らかにした。
【０１５４】
糖尿病状態において変更されるインスリン分泌を適切に調節するために機能的に重要な遺伝子を同定する目的で、本発明者らはII型糖尿病のラットモデルを使用した。βTRPに対応するmRNAのためのカスタムラット島アレイハイブリダ一ゼーション（プローブセットMBXRATISL12881）では、非糖尿病（9週齢ZLC）対照動物と比べて、糖尿病（9週齢ZDF）の島において2.4倍減少した（図1B）。βTRP発現は、トログリタゾンとの並行処置により実質的に回復した（図1B）。高脂肪食を摂取したZDF雌ラットでも同様の結果が観察された。9週齢で雄ZDFにおけるβTRP mRNAはまた、痩せ（lean）対照ラットと比べて2倍を超えて減少した（データは示していない）。
【０１５５】
これらの糖尿病動物由来の島は、対照動物の島に関連するグルコース応答性インスリン分泌（GSIS）を欠損している。しかし、ZDF島におけるβTRPのアデノウイルス発現は、静的インスリン分泌アッセイまたは島灌流実験において、グルコースに対する反応性を回復した（図2）。βTRPの発現は、基礎インスリン分泌を増加させず、非糖尿病動物由来の島細胞への効果がほとんどなかった。これらのデータは、ZDF島において見出されたβTRP欠損が、これらの島におけるGSISの減少と機能的に結合されることを示す。
【０１５６】
実施例2：
本実施例は、βTRPの修飾物質のハイスループットスクリーニングのための方法を示す。
【０１５７】
膵臓β細胞陽イオンチャンネルβTRPの活性化（開放）は、II型糖尿病に罹患した個体におけるグルコース応答性インスリン分泌を増強するための新規の機序を示す。II型糖尿病は、膵臓β細胞が末梢性インスリン耐性によって引き起こされる増加したインスリン要求を補償することができない場合に生じる。スルホニルウレア（sulphonylurea）およびメグリチニド（meglitinide）などの治療物質は、グルコースがインスリン分泌を調節する主要な経路として、同じ分子機序（KATPチャンネル閉鎖）を介したインスリン分泌を促進する。これらの作用物質は広く使用されているが、これらは、低血糖を引き起こす内因性の電位を有し、かつ高い割合で原発性および続発性の機能不全が起こるという点で、理想的なものということはできない。自身ではインスリン分泌を生じないが、グルコース依存性KATPチャンネル閉鎖の後にCa++流入を増強するというβ細胞内の活性化の機序により、より生理学的に適切な方法においてインスリン分泌を増強させることができる。βTRP陽イオンチャンネルは、Ca++流入およびインスリン分泌を増強するためのこのような増強剤の機序の構成要素を示す。この種の治療方法は、スルホニルウレア/メグリチニドに失敗した糖尿病患者のための新規治療も提案する。
【０１５８】
TRPファミリー（βTRPはこのファミリーのメンバーである）は、チャンネル形成コアであるショウジョウバエTRP（一過性受容体電位（Transient Receptor Potential））、ハエ視覚系の光活性化Ca2+選択チャンネルと類似する共通のコアドメインを有する様々な群を含む。TRPチャンネルは、小胞体（ER）Ca2+の貯蔵が枯渇した場合、またはGqに結合した受容体とホスホリパーゼ-β（PLC）とを活性化した場合に、Ca2+の流入および／または他の陽イオンを媒介する。本発明者らは、HEK293細胞およびCOS-1細胞で発現させた場合に、βTRPがPLC活性化およびER Ca2+の貯蔵の枯渇に応答してCa2+流入が促進されることを証明した。
【０１５９】
βTRP（TRPM5）の活性化（開放）により、Ca2+および膜電位（MP）のための特異的蛍光色素により間接的に検出可能な強いCa2+の流入および膜脱分極が生じる。図3は、対照細胞およびβTRP-CHO細胞におけるATPに対する[Ca2+]iおよびMP反応の代表記録を示す。ATPに対するMP反応は、βTRP細胞においてのみ存在する。βTRP修飾物質についてハイスループットスクリーニングを実行するための1つの選択肢として、CHO-K1ベースのβTRP安定化細胞系を使用し、わずかに改変したMolecular DevicesのFLIPR（登録商標）（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）膜電位アッセイ法を用いて低分子修飾物質をスクリーニングする。 
【０１６０】
スクリーニング段階の最終目的は、βTRPチャンネルの特異的および方向付けの活性化物質（開放物質）を見出すことである。チャンネルの活性化は、理想的には完全であり、かつその宿主細胞の[Ca2+]iの上昇および原形質膜脱分極を生じさせることができる。
【０１６１】
FLEXStation（Molecular Devices）のMolecular DevicesのMembrane Potential Dye（Cat#R-8034）を用いた96ウェル形式における、膜電位（MP）の測定のために、以下のプロトコールを最適化する。これは、FLIPR384システムを用いる384ウェル形式のアッセイ法に応用可能または適用可能であると考えられる。
【０１６２】
以下のプロトコールに従って、βTRPハイスループットスクリーニングのために、βTRPを発現するCHO-K1ベースの安定化細胞系（本明細書において「A2-18系」と呼ばれる）を使用する：
1．96ウェルプレートにA2-18βTrp-CHO細胞および対照系（A1-5）を播種する。
2．DMEM培地中で24時間〜48時間、85％〜95％の密集度になるまで細胞を増殖させる。
3．アッセイの直前に以下の試薬を調製する：
i．アッセイ緩衝液：FLIPR（登録商標）アッセイキットのComponent Bを希釈し、 1N NaOHでpH 7.4に調整する。プロベネシドは必要なかった。
ii．MP色素：10mlのアッセイ緩衝液を含むFLIPR（登録商標）アッセイキットのComponent Aのバイアルを懸濁する。
iii．試験化合物のDMSOストックをアッセイ緩衝液により5倍の溶液で希釈する。1M CaCl2を含む12.5mMの化合物溶液において、Ca2+の濃度が上昇する。
4．全てのウェルから、培地を注意深く除去する。
5．50μlのアッセイ緩衝液と50μlのMP色素を添加する。
6．プレートを37℃で30分〜60分間インキュベーションする。
7．FLEXStationをMPアッセイ・モードおよび37℃にセットする。
8．細胞プレートと化合物プレートをFLEXStationにトランスファーする。
9．18秒間ベースラインを記録する（Ex530、Em560）。
10．細胞に対して5倍の化合物溶液を添加し、さらに100秒読み取る。
11．データを保存し、解析する。
【０１６３】
試薬の表
1．アッセイ緩衝液：20mM Hepesを含むpH 7.4のハンクス平衡塩溶液（Hank's Balanced Salt Solution：HBSS）。
2．MP色素：Molecular Devices Corporation、Cat#8034（FLIPR用）
3．陽性対照：
ATP 10〜100μM（プリン受容体アゴニスト）、
カルシマイシン（A23187） 5〜10μM（カルシウムイオノフォア）
4．アンタゴニスト対照：
i．2-APB 75μM（Tocris由来、TRPチャンネルおよびIP3受容体遮断物質）；
ii．U73122 10μM（Sigma Chemicals由来、PLC阻害物質）
【０１６４】
その他の実験条件
1．細胞：
iii．メンテナンス：10％ FCSおよび200μg／ml G418を含むDMEM；トリプシン-EDTAを添加し1〜2回／週で継代する。
iv．密集度：アッセイ時までに85％〜95％。
v．プレーティング：標準または予めコーティングされたプレート；アッセイ前24時間〜48時間。
vi．継代：10回目の継代まで。
2．アッセイ系におけるCa2+の濃度：
Molecular Deviceのオリジナル・アッセイ・システムにおける比較的低いCa2+（1.26mM）は、βTRP-CHO細胞におけるマイトトキシン（MTX）の作用の欠損によって示唆されるようなTRPチャンネルを介した細胞外Ca2+の流入、およびそれに伴う脱分極を制限する可能性がある。MTXは、非選択的陽イオンチャンネル（βTRPを含む）の直接的活性化であることが知られている海洋性ポリエーテル毒素である。アッセイ系における2.5mM〜5mMへのCa2+の濃度の上昇は、MTXにより誘導される[Ca2+]iまたはMPの上昇を検出するためのMPおよびカルシウムアッセイキットの能力を著しく増強させる（図4）。
【０１６５】
実施例3：
本実施例は、溶媒用量反応および他のチャンネル修飾物質に対する反応を示す。
【０１６６】
DMSOの効果
FLEXStationアッセイにおいて、試験化合物の添加時に（25μlの化合物溶液を100μlの希釈色素を含む各ウェルに添加した）、CHO-βTRP細胞は、蛍光シグナルの強度を幾らか失う傾向にある。アッセイ緩衝液と低濃度のDMSO（<0.5％）とではRFUシグナルの低下は区別できなかったが、2.5％DMSOによって著しく悪化した（図5）。一方、本発明者らは、DMSOに対する如何なる非特異的な脱分極反応も観察しなかった。
【０１６７】
実施例4：
本実施例は、本発明のアッセイにおいて有用な陽性対照を提供する。
【０１６８】
bTRP-CHO細胞のMPに対する他のチャンネル調節物質の効果
bTRP-CHO細胞におけるATPに対する脱分極反応の特異性を試験するために、本発明者らは、対照（A1-5）およびβTRP-CHO細胞系（A2-18）の両方において、シグマRBIイオンチャンネル・モジュレーター・リガンドセット（Sigma #L6912）からの80種の化合物の効果を試験した。シグマリガンドセットは、K+、Na+、Ca2+およびCl-チャンネル、ならびにアミノ酸トランスポーターを形成するいくつかのチャンネルの複数メンバーの修飾物質からなる。80種の化合物のうち、A23187（カルシマイシン）のみが、ATPと同様のβTRP細胞特異的な脱分極を誘導した。カルシマイシンは、細胞内Ca2+の貯蔵を枯渇させることができることが知られるCa2+イオノフォアである。加えて、クラスIII抗不整脈化合物であるクロフィリウム（Clofilium）は、対照細胞およびbTRP細胞の両方において脱分極を生じさせた。クロフィリウムの機序は不明である。
【０１６９】
TRPチャンネルのための活性化物質の制御
予想されたように、βTRP-CHO細胞では、ATPおよびカルシマイシンが用量依存的に脱分極を誘導したが、対照細胞では誘導しなかった（図6）。ATPおよびカルシマイシンの推定EC50は、それぞれ11μMおよび0.8μMである。ATPは、Gq結合P2Y受容体を介してIP3を産生することにより、TRPチャンネルを活性化するが、一方、カルシマイシンは、細胞内Ca2+の貯蔵の直接的枯渇によって作用する。
【０１７０】
実施例5：
本実施例は、本発明のアッセイにおいて有用な陰性（アンタゴニスト）対照を提供する。
【０１７１】
細胞に2つの刺激を同時に与えた場合に、ATPおよびカルシマイシンに反応するMPは、2-APBによって50％を超えて抑制された。2-APBは、ER上のIP3受容体（リガンドゲート型Ca2+チャンネル）および原形質膜のTRPチャンネルの遮断物質として公知である。βTRP-CHO細胞におけるMPに対するATPの効果もまた、細胞とPLC阻害物質U73122を30分間プレインキュベーションすることによって阻害された（図6）。
【０１７２】
本明細書中に説明した実施例および態様は例示のみを目的としており、当業者にはそれに鑑みてさまざまな修正または変更が想起されると考えられるが、これらは本出願の精神および範囲ならびに添付する特許請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体がすべての目的に関して参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７３】
配列表
2006523104.tif 000008
2006523104.tif 000009
2006523104.tif 000010
2006523104.tif 000011
2006523104.tif 000012
2006523104.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】βTRPのアレイ発現データを示す。図1Aは、プローブセットMBXMUSISL08907のカスタムマウス島オリゴヌクレオチドアレイ分析を示す。平均差分値は、マウス島およびインスリン分泌マウス細胞系βHC9におけるβTRPの相対存在量を反映する。図1Bは、糖尿病動物モデルにおける遺伝子の変化を調査するために、ラット島カスタムオリゴヌクレオチドアレイを使用した方法を示す。ZDF雌ラットのβTRP mRNA（プローブセットMBXRATISL12881）は、痩せ対照動物と比較して2〜3倍減少し（p = 0.002）、トログリタゾンとの併用治療によって実質的に回復される。
【図２】Ad-βTRPウイルスを感染させたZDF島におけるインスリン分泌を示す。雄ZDFラット由来の島にβTRPまたはeGFPを発現するアデノウイルスを感染させ、クレブス−リンガー炭酸水素培地で洗い流すことによって、16mMグルコースに対するインスリンの反応を測定した。ZDF島におけるβTRPの過剰発現は、グルコースによって刺激されたインスリン分泌の両方の相を増強した。
【図３】βTRPで安定にトランスフェクトされたCHO-K1細胞において、ATPに対する細胞内遊離カルシウム[Ca2+]iおよび膜電位反応を示す。アッセイ前に、対照およびβTRP-CHO細胞を96ウェルプレートに2-dで播種した。ATP（20秒で30μMを添加）に対する[Ca2+]iおよび膜電位反応（MP）を、Molecular Devices（Sunnyvale, CA）からのFLEXStation（登録商標）および対応する色素で測定した。
【図４】βTRP-CHO細胞において、異なるCa2+レベルでATPおよびMTXに対するMP反応を示す。図3に記載されるように、マイトトキシン（MTX）に対するMP反応をFlexstation（登録商標）によりモニターした。標準アッセイ緩衝液は1.26mMのCa2+を含む。カルシウム濃度を2.5mMまたは5mMに上昇させるために、過剰量のCaCl2を他の試験試薬として同時に添加した。
【図５】βTRP-CHO細胞における膜電位に対するATPとカルシマイシンの用量依存的効果を示す。図3のように、MPをFlexstation（登録商標）で測定した。対照細胞では、いずれの化合物に対しても効果は観察されなかった。
【図６】βTRP-CHO細胞におけるATP誘導性脱分極に対する既知のTRP遮断物質の効果を示す。図3のように、MPをFlexstation（登録商標）で測定した。阻害物質を、同時（右パネル）またはATP刺激の前（左パネル）のいずれかで添加した。
【図７】図7A〜Dは、ヒトおよびマウスのβTRPアミノ酸配列のアラインメントを提供する。
【図８】βTRPアミノ酸配列を示す。膜貫通ドメインに下線を引いている。TRPモチーフを太字で示す。
【配列表】
2006523104.tif 000014
2006523104.tif 000015
2006523104.tif 000016
2006523104.tif 000017
2006523104.tif 000018
2006523104.tif 000019
【図１】
2006523104.tif 000020
【図２】
2006523104.tif 000021
【図３】
2006523104.tif 000022
【図４】
2006523104.tif 000023
【図５】
2006523104.tif 000024
【図６】
2006523104.tif 000025
【図７Ａ】
2006523104.tif 000026
【図７Ｂ】
2006523104.tif 000027
【図７Ｃ】
2006523104.tif 000028
【図７Ｄ】
2006523104.tif 000029
【図８】
2006523104.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
βTRPポリペプチド（またはポリヌクレオチドコード領域もしくは隣接するプロモーター領域）の配列は、プロモーターの強度、コードされたタンパク質の配列などの標的化された変化を生じさせるために、当技術分野に公知の様々な方法で変異させることができる。そのような変異のDNA配列またはDNA産物は、本明細書に提供された配列と実質的に同等であると考えられ、すなわち少なくとも1つのヌクレオチドまたはアミノ酸がそれぞれ異なり、少なくとも2つ、または少なくとも約10個もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なっていてもよい。一般的に、配列の変化は、置換、挿入または欠失であってよい。欠失は、ドメインもしくはエキソンの欠失のような、大きな欠失をさらに含むことができる。TRPチャンネル配列は、大部分は膜貫通ドメイン内に保存されており、したがって、このドメインの外側領域は、機能に影響しない変異誘発の標的となる可能性がある。例えば、図7は、ラット、マウスおよびヒトの配列のアラインメントを示す。いくつかの態様において、本発明のβTRP核酸は、ポリペプチドまたはその断片をコードし、これらはマウスとヒトの配列間で保存されたアミノ酸を含む。他の態様において、βTRP核酸は、ポリペプチドまたはその断片をコードし、これらは、ヒトとラットの配列間、またはラット、マウス及びヒトの配列間で保存されたアミノ酸を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
ペプチド、ポリエーテルなどの一般的なリンカーもタグとして有用であり、これには約5-200アミノ酸のポリGly配列（配列番号：9）などのポリペプチド配列が含まれる。このような柔軟性のあるリンカーは当業者に周知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheanvater Polymers, Inc（Huntsville, Alabama）から販売されている。選択的には、これらのリンカーはアミド結合、スルフヒドリル結合またはヘテロ官能性結合を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】βTRPのアレイ発現データを示す。図1Aは、プローブセットMBXMUSISL08907のカスタムマウス島オリゴヌクレオチドアレイ分析を示す。平均差分値は、マウス島およびインスリン分泌マウス細胞系βHC9におけるβTRPの相対存在量を反映する。図1Bは、糖尿病動物モデルにおける遺伝子の変化を調査するために、ラット島カスタムオリゴヌクレオチドアレイを使用した方法を示す。ZDF雌ラットのβTRP mRNA（プローブセットMBXRATISL12881）は、痩せ対照動物と比較して2〜3倍減少し（p = 0.002）、トログリタゾンとの併用治療によって実質的に回復される。
【図２】Ad-βTRPウイルスを感染させたZDF島におけるインスリン分泌を示す。雄ZDFラット由来の島にβTRPまたはeGFPを発現するアデノウイルスを感染させ、クレブス−リンガー炭酸水素培地で洗い流すことによって、16mMグルコースに対するインスリンの反応を測定した。ZDF島におけるβTRPの過剰発現は、グルコースによって刺激されたインスリン分泌の両方の相を増強した。
【図３】βTRPで安定にトランスフェクトされたCHO-K1細胞において、ATPに対する細胞内遊離カルシウム[Ca2+]iおよび膜電位反応を示す。アッセイ前に、対照およびβTRP-CHO細胞を96ウェルプレートに2-dで播種した。ATP（20秒で30μMを添加）に対する[Ca2+]iおよび膜電位反応（MP）を、Molecular Devices（Sunnyvale, CA）からのFLEXStation（登録商標）および対応する色素で測定した。
【図４】βTRP-CHO細胞において、異なるCa2+レベルでATPおよびMTXに対するMP反応を示す。図3に記載されるように、マイトトキシン（MTX）に対するMP反応をFlexstation（登録商標）によりモニターした。標準アッセイ緩衝液は1.26mMのCa2+を含む。カルシウム濃度を2.5mMまたは5mMに上昇させるために、過剰量のCaCl2を他の試験試薬として同時に添加した。
【図５】βTRP-CHO細胞における膜電位に対するATPとカルシマイシンの用量依存的効果を示す。図3のように、MPをFlexstation（登録商標）で測定した。対照細胞では、いずれの化合物に対しても効果は観察されなかった。
【図６】βTRP-CHO細胞におけるATP誘導性脱分極に対する既知のTRP遮断物質の効果を示す。図3のように、MPをFlexstation（登録商標）で測定した。阻害物質を、同時（右パネル）またはATP刺激の前（左パネル）のいずれかで添加した。
【図７】図7A〜Dは、ヒト（配列番号：7）、ラット（配列番号：6）およびマウス（配列番号：4）のβTRPアミノ酸配列のアラインメントを提供する。コンセンサスβTRP配列＝配列番号：8。
【図８】ヒトβTRPアミノ酸配列（配列番号：2）を示す。膜貫通ドメインに下線を引いている。TRPモチーフを太字で示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006523104000001.app
【国際調査報告】
2006523104.tif 000031
2006523104.tif 000032
2006523104.tif 000033
2006523104.tif 000034
2006523104.tif 000035
2006523104.tif 000036
2006523104.tif 000037