(57)【要約】血液または血液成分中に含有される白血球、細菌およびウイルスといった病原体の核酸を損傷する方法および該核酸に対する損傷を維持する方法。本プロセスは、病原体を含む血液または血液成分に有効量のリボフラビンを添加することを含み、適切な波長の光に液体をさらし、病原体の核酸を損傷させ、かつ病原体の核酸に対する損傷を実質的に維持し、レシピエントへの爾後の輸液を可能にさせる。
2006501978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体および血液成分を含む液体中で病原体の核酸に対する損傷を実質的に維持する方法であって：
リボフラビンを含む光増感剤を液体に添加する工程と；
病原体の核酸に損傷を引き起こさせるように、光増感剤を活性化させる適切な波長の光で液体および光増感剤を照射する工程と；
病原体の核酸に対する損傷を実質的に維持する工程とを含んでなり；
光増感剤および光によって引き起こされる病原体の核酸に対する損傷が、照射後の液体の貯蔵中で実質的に維持される方法。
【請求項２】
レシピエントへの輸液後に病原体の核酸に対する損傷を実質的に維持することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項３】
病原体の核酸が、望ましくない細胞および／または微生物からの核酸をさらに含む請求項１の方法。
【請求項４】
失活剤を液体に添加することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項５】
失活剤が、本質的にグルタチオン、n-アセチル-システイン、システイン、アデニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、アスコルベート、ビタミンE、トロロクス、TPGSおよびそれらの混合物からなる群から選択される失活剤をさらに含む請求項４の方法。
【請求項６】
血液成分の生存能力を増強させる添加剤を含む溶液を液体に添加することをさらに含む請求項１の方法。
【請求項７】
血液成分が血小板をさらに含む請求項１の方法。
【請求項８】
血液成分が赤血球をさらに含む請求項１の方法。
【請求項９】
液体および光増感剤を照射するのに使用される光がUVB範囲にある請求項１の方法。
【請求項１０】
リボフラビンが約50〜500μMの最終濃度で液体に添加される請求項１の方法。
【請求項１１】
液体中に含まれる白血球を不活性化させる方法であって：
白血球を含む液体に有効量のリボフラビンを添加することと；
リボフラビンを活性化しかつ白血球の核酸に損傷を引き起こすのに適切な波長の光に液体およびリボフラビンをさらすことと；
白血球の再活性化を妨げるように、白血球の核酸に対する損傷を実質的に維持することとを含んでなる方法。
【請求項１２】
液体が赤血球をさらに含む請求項１１の方法。
【請求項１３】
液体が血小板をさらに含む請求項１１の方法。
【請求項１４】
液体が血漿をさらに含む請求項１１の方法。
【請求項１５】
液体およびリボフラビンをさらす光がUVB範囲にある請求項１１の方法。
【請求項１６】
リボフラビンが約50〜500μMの最終濃度で液体に添加される請求項１１の方法。
【請求項１７】
患者への輸液に適した液体であって、請求項１１の方法によって処理された赤血球を含む液体。
【請求項１８】
患者への輸液に適した液体であって、請求項１１の方法によって処理された血小板を含む液体。
【請求項１９】
患者への輸液に適した液体であって、請求項１１の方法によって処理された血漿を含む液体。
【請求項２０】
患者に輸液される血液製剤中に含まれるウイルスを不活性化させる方法であって：
ウイルスを含む血液製剤に有効量のリボフラビンを添加することと；
リボフラビンを活性化しかつウイルスの核酸に損傷を引き起こすのに適切な波長の光に血液製剤およびリボフラビンをさらすことと；
病原体の減少した血液製剤の患者への爾後の輸液を可能にさせるように、ウイルスの核酸に対する損傷を実質的に維持することとを含んでなる方法。
【請求項２１】
患者への再輸液に適した血液または血液成分を含む病原体の減少した液体を提供する方法であって：
血液または血液成分とともに存在する可能性がある任意の病原体の核酸を損傷させることと；
血液または血液成分および何等かの病原体を含む液体にリボフラビンを添加することと；
病原体の核酸の損傷を維持するように、リボフラビンを活性化する光に液体をさらすこととを含んでなる方法。
【請求項２２】
液体を光にさらす工程が、液体をUVB範囲にある光にさらすことをさらに含む請求項２１の方法。
【請求項２３】
リボフラビンが約50〜500μMの最終濃度で液体に添加される請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本出願は、現在は放棄されている2000年6月2日に出願された米国特許出願09/586,147の継続出願である、2003年2月28日に出願された米国特許出願10/377,524の継続出願であって；2002年8月23日に出願された米国仮特許出願60/319,488；および2002年10月22日に出願された米国仮特許出願60/319,641の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
レシピエントに輸液するためにボランティア提供者から集められた全血は、典型的にはその成分：赤血球、白血球、血小板、血漿および血漿タンパク質にアフェレーシスまたは他の既知の方法によって分離される。これらの血液成分の各々は、典型的には個別に貯蔵され、多数の特定の状態および疾患状態を治療するために使用される。例えば、赤血球成分は貧血症を治療するために使用され、濃縮された血小板成分は出血を制御するために使用され、血漿成分は血友病の治療のためにClotting Factor VIIIの供給源として頻繁に使用される。
【０００３】
成分が分離された後、白血球成分は、その細胞が特定の用途、例えば光免疫療法または光泳動のために必要とされない限り、典型的には廃棄される。細胞分離手順は100%有効ではない。分離された血液成分中にキャリーオーバーされた他の種類の細胞がある小さい％比率でまれに存在する。望ましくない細胞は、典型的には望ましい成分に若干の％比率でキャリーオーバーされた異なるタイプの細胞である。HIVおよびCMVを含む感染症に伝染させ、他の輸液に関連した合併症、例えば移植片対宿主病および異種免疫症を引き起こす可能性がある細胞(例えば白血球)は、望ましくないものと考えられる。白血球に由来するこれらの輸液に関連した合併症の危険を減らす方法は、レシピエントに移入する白血球の数を減らし、および／または何等かの移入された白血球の生存能力および輸液後に機能する能力を効果的に破壊することである。白血球は、顆粒球、単球およびリンパ球を含む。
【０００４】
輸液される血液製剤中の白血球汚染をなくすために使用される現在の方法は、白血球濾過法、血小板濃縮物のUV照射ならびに赤血球および血小板濃縮物のガンマ照射を含む。しかしながら、これらの方法は白血球を完全には除去せず、ガンマおよびUV照射は所望の血液成分、例えば血小板および赤血球の細胞品質に影響を及ぼす。
【０００５】
輸液される血液または血液成分はまた、輸液レシピエントの中で感染症または望ましくない免疫反応を引き起こす可能性をもった微生物で汚染されるおそれがある。微生物は、ウイルス(細胞外および細胞内の両方)、細菌、真菌、血液伝染された寄生体および原生動物を含むがこれらに限定されない。
【０００６】
光増感剤、または一定の波長の光を吸収し、その吸収したエネルギーを電子受容体に移す化合物は、血液の望ましい成分に損傷を与えることなく血液製剤を汚染している病原体を不活性化させることによって、上記の問題に対する解決法となる可能性がある。本発明の目的のために、一般用語「病原体」は、血液または血液製剤に見出され得る任意の望ましくない生物体を包含する。病原体は、望ましくない細胞例えば白血球であってもよいが、微生物、例えば細菌、寄生体またはウイルスを含んでもよい。
【０００７】
微生物または他の感染性粒子を不活性化させるために有用な、当該技術において知られた多くの病原体低減化合物がある。このような光増感剤の例は、ポルフィリン、ソラレン、色素例えばニュートラルレッド、メチレンブルー、アクリジン、トルイジン、フラビン（塩酸アクリフラビン）およびフェノチアジン誘導体、クマリン、キノロン、キノン、およびアントロキノンを含む。
【０００８】
Dardare et al.は、いくつかの一般的な光増感剤の結合親和力の研究において、ソラレンおよびメチレンブルーの両方が、典型的な病原体の根絶実験において核酸、リン脂質膜およびタンパク質と実質的に結合することを示した。
【０００９】
多くの刊行物は、核酸に対する損傷が光増感剤および光によって引き起こされ得ることを示してきたが、病原体および望ましくない細胞の核酸に対する損傷の誘導が長時間にわたって維持されるかどうか、および病原体を低減された細胞群がレシピエントに注入された後に維持されるかどうかの問題は、取り組まれてこなかった。
【００１０】
R. Mababagloob et al.によって行われた1つの研究は、S-59およびS-303（ソラレン）が、D. radiodurans（複数のゲノムコピーおよび余分な修復メカニズムをもつ細菌）のDNA修復メカニズムについてどんな効果を有するかを調べようとした。著者は、UVA光またはpH変化との組み合わせに係る上記処理が、114ゲノムDNA塩基対あたり1つのS-303付加物および58ゲノムDNA塩基対あたり1つのS-59付加物を生じることを発見した。しかしながら、この研究は、DNAに対する損傷が処理後に維持されるかどうか、または細菌によって修復されるかどうかを調べなかった(Mababangloob, R., Castro, G., Stassinopoulos, A. ; Helinx Technology, Utilized in the Intercept Blood System, Effectively Inactivates Deinoccus radiodurans, a Bacterium with Highly Efficienty DNA Repair; Abstract presented at the 44th Annual Meeting of the American Society of Hematology, 2002)。
【００１１】
本発明が目的とするところは、病原体の核酸に永続的な損傷を誘導することによる、血液および血液成分の病原を低減する方法に関する。永続的な損傷とは、不活性化された病原体が貯蔵または患者への注入で再活性化することができないことを意味する。
【本発明の概要】
【００１２】
本発明は、病原体例えば白血球、および微生物、例えばレシピエントに輸液される液体に存在している可能性がある細菌およびウイルスを、実質的に不活性化させる方法に向けられている。本発明は、病原体および血液成分を含む液体において光増感剤および光によって引き起こされる病原体の核酸に対する損傷を実質的に維持する方法であって、リボフラビンを含む光増感剤を液体に添加する工程と；病原体の核酸に損傷を引き起こすようにリボフラビンを活性化する適切な波長の光で液体および光増感剤を照射する工程と；貯蔵中および／またはレシピエントへの液体の輸液後に病原体の核酸に対する損傷を実質的に維持する工程とを含んでなる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
本発明の有用な「光増感剤」は、１以上の一定の波長での放射を吸収し、かつ吸収されたエネルギーを実質的に利用して化学プロセスを行う任意の化合物として定義される。この場合において、所望の光増感剤は、光増感剤が添加された除染されるべき液体中に存在する何れかの核酸と結合するだろう。液体中に存在する可能性がある何れかの核酸に損傷を起こす化学プロセス。液体は、血液または血液製剤を含んでもよく、無菌性を必要とする溶媒であってもよい。
【００１４】
内因性の光増感剤が本発明の使用に好ましい。用語「内因性」は、身体による合成の結果として、あるいは主要な栄養素(例えばビタミン)としての摂取、またはインビボの代謝物質および／または副産物の形成の故に、ヒトまたは哺乳類の体の中に自然に見出されることを意味する。内因性の光増感剤が使用されるとき、特にこのような光増感剤が本来的に有毒でないかまたは光照射後に有毒な光産物を産生しないとき、汚染除去後の除去工程または精製工程は必要とされず、除染された製品を、患者の体に直接的に戻すか、または当該治療の効果を必要とする患者に直接的に投与することができる。
【００１５】
本発明において使用され得るこのような内因性の光増感剤の例は、アロキサジン例えば7,8-ジメチル-10-リビチルイソアロキサジン(リボフラビン)、7,8,10-トリメチルイソアロキサジン(ルミフラビン)、7,8-ジメチルアロキサジン(ルミクロム）、イソアロキサジン-アデニンジヌクレオチド(フラビン アデニン ジヌクレオチド[FAD]）およびアロキサジンモノヌクレオチド(フラビン モノヌクレオチド[FMN]およびリボフラビン-5-ホスフェートとしても知られている)である。用語「アロキサジン」はイソアロキサジンを含む。
【００１６】
血液および血液成分に対する病原体低減のための光増感剤としての、内因性イソアロキサジンの使用は、米国特許6,258,577および6,277,337（両方ともGoodrich et al.に発行）に記載されており、矛盾しない範囲で参照として本明細書中に組み込まれる。
【００１７】
内因性に基づく誘導体光増感剤は、合成的に誘導された内因性光増感剤のアナログおよびホモログであって、光増感剤から誘導されかつその機能および実質的な無毒性を保存した、光増感剤の低級(1〜5)アルキル置換基またはハロゲン置換基があるかまたは欠いているアナログおよびホモログを含む。本発明に使用されるこのような内因性に基づく誘導体光増感剤は、血液または血液成分中に含まれる微生物を不活性化させるために使用されてもよいアロキサジン誘導体を開示したPlatz et al.の米国特許6,268,120の中で開示されている。この特許は、本発明と矛盾しない範囲で参照によって本発明に組み込まれる。
【００１８】
光増感剤化合物であるリボフラビン(7,8-ジメチル-10-リビチルイソアロキサジン）は、核酸を攻撃すると報告されている。核酸はデオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を含む。リボフラビンの存在下での核酸の光変性は、Tsugita, A, et al.(1965),"Photosensitized inactivation of ribonucleic acids in the presence of riboflavin, "Biochimica et Biophysica Acta 103: 360-363; and Speck, W. T. et al. (1976),"Further Observations on the Photooxidation of DNA in the Presence of Riboflavin, "Biochimica et Biophysica Acta 435: 39-44.で議論されている。ルミフラビン（7,8,10-トリメチルイソアロキサジン）のDNAとの結合は、Kuratomi, K., et al. (1977), "Studies on the Interactions between DNA and Flavins, "Biochimica et Biophysica Acta 476: 207-217. Hoffmann, M. E., et al. (1979), DNA strand breaks upon exposure to proflavine and light are reported in Piette, J. et al.(1979), "Production of Breaks in Single- and Double-Stranded Forms of Bacteriophage ΦX 174 DNA by Proflavine and Light Treatment, "Photochemistry and Photobiology 30:369-378, and alteration of guanine residues during proflavine-mediated photosensitization of DNA is discussed in Piette, J., 
et al.(1981), "Alteration of Guanine Residues during Proflavine Mediated Photosensitization of DNA, "Photochemistry and Photobiology 33:325-333.で議論されている。
【００１９】
本発明前に既に知られておらず、または探究されていなかったことは、リボフラビンの光分解によって引き起こされる核酸の鎖の破壊が永続的であるかどうか、すなわち、病原体の核酸修復メカニズムがリボフラビンおよび光によって引き起こされる損傷を修復することができず、それゆえに病原体が複製を行うのを妨げるかどうかということである。これに関して、修復は、病原体再活性化のための基礎である分子プロセスとして定義される。再活性化、または同義の用語である回復は、損傷を受けた病原体がコロニーを増殖および形成する能力を回復することとして定義される。
【００２０】
実質的に損傷を維持するとは、病原体の核酸によって受けた何等かの損傷が長時間にわたって維持され、リボフラビンおよび光で処理された血液製剤がレシピエントに輸液されたときに、不活性化された病原体が、損傷を受けた核酸を自己修復せずかつ輸液レシピエント中で繁殖しないことを意味する。従って、病原体を低減した血液または血液製剤中に含まれる可能性がある生存可能な病原体により引き起こされる輸液に関連した合併症は、実質的に減少するであろう。
【００２１】
本発明の方法は、光増感剤を、除染すべき全血または分離された血液成分に混合することを必要とする。混合は、単に、除染された液体に対して光増感剤または光増感剤を含む溶液を添加することによって行われてもよい。１つの実施形態において、光増感剤が添加された除染すべき物質は、光照射源を通り過ぎるように流れ、該物質の流れは一般に十分な乱流を提供して、除染される液体全体に光増感剤を分布させる。他の実施例において、液体および光増感剤は光透過性容器中に入れられ、バッチモードで、好ましくは光増感剤を完全に分布させて液体全部を照射にさらすように、容器を撹拌しながら照射を受ける。
【００２２】
液体と混合される光増感剤の量は、液体中に存在する可能性がある任意の病原体核酸を十分に不活性化させるのに十分な量であろうが、所望の成分に対して有害な量または溶けなくなる量よりは少ない。リボフラビンを光増感剤として使用する場合、約50〜500uMの最終濃度で液体に添加してもよい。病原の核酸は、任意の望ましくない核酸例えば白血球、細菌またはウイルスからの核酸を含む。核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)またはその両方を含む。
【００２３】
光増感剤を含む液体は、光増感剤を活性化しかつ病原体の核酸に永続的な損傷を実質的に引き起こすように適切な波長の光にさらされる。その後、病原体の減少した液体は、レシピエントに輸液する前に一定期間貯蔵されてもよいし、病原体を低減化する手順の後に、レシピエントに直接的に輸液されてもよい。
【実施例】
【００２４】
例１
赤血球または血小板の溶液中に含まれる可能性がある白血球の核酸に損傷を与え、かつ損傷を維持するイソアロキサジン(リボフラビン）光増感剤および光の効果を決定するために、Jurkat細胞（モデルT-リンパ球細胞株）を、赤血球または血小板を含む溶液中にスパイクした。Jurkat細胞を、RPMI細胞増殖培地37℃、5%CO2中で最初に増殖させた。
【００２５】
赤血球を含む溶液中の任意の汚染白血球の核酸に損傷を引き起こし、かつ該損傷を維持するリボフラビンおよび光の効果を決定するために、本発明において使用され得る1つのプロトコルを以下に示す。
【００２６】
赤血球を含みかつ5%の血漿キャリーオーバーをもつ液体を、当該技術において知られた任意の容器中に入れることができる。1Lバッグは1つのそのような例であるが、これに限定することを意味しない。また、失活剤を任意的に液体に添加してもよい。このような失活剤は、所望の液体成分に対する損傷を防ぐかまたは微生物の不活化の割合を向上させる酸化防止剤または他の薬剤を含んでもよい。本発明に有用な失活剤は、グルタチオン、n-アセチル-システイン、システイン、アデニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン、アスコルベート、ビタミンE、トロロクス、TPGSおよびそれらの混合物によって例示される。500μMの最終濃度のリボフラビンを、失活剤とともに(任意的に加えられる場合)または個別に細胞に加えた。除染される液体に光増感剤を添加するための当該技術において知られた任意の手段、および該液体を容器中に入れるための当該技術において知られた任意の手段を使用してもよい。このような手段は、典型的にはフローコンジット、ポート、リザーバ、バルブ等を含む。また、リボフラビンおよび光での処理後に血液成分の生存能力を強化する添加剤を、照明前または後に添加してもよい。液体に添加され得る添加剤の例は、メチルキサンチンおよび／またはPGE1を含んでもよい。
【００２７】
266mLの液体あたり133mLの容量で、空気を赤血球およびリボフラビンを含む液体に加えた。空気を、バッグ中に含まれる液体に当該技術において知られた任意の手段によって加えてもよい。回収手順における白血球キャリーオーバーを模擬するために、106/mLの濃度でのJurkat細胞で赤血球を含む液体を「スパイク」した。赤血球およびスパイクされたJurkat細胞を含む液体を、可視(447nmのピーク放射を有する照射源からの)スペクトルの光を190J/cm2の強度で照射した。処理した細胞および未処理の対照を、24時間37℃で増殖培地中でインキュベートし、照射プロセスの間に殺されなかった細胞の長期間の生存を評価した。処理後、Jurkat細胞を回収し、細胞生存能力マーカー、例えばIL-2の産生、細胞増殖およびDNAの断片化に関してアッセイを行った。
【００２８】
同様の手順を使用して、白血球細胞を不活性化させかつ血小板を含む溶液中の該細胞の不活化を維持する効果を決定した。50μMの最終濃度のイソアロキサジンを、アフェレーシスによって90%の血漿キャリーオーバーで収集された血小板に添加した。白血球汚染を模擬するために、血小板を含む液体を106/mL濃度のJurkat細胞で「スパイク」した。血小板およびスパイクされたJurkat細胞を含む液体を、320nmの紫外線(UV)スペクトルかつ強度7J/cm2の光で照射した。処理後、Jurkat細胞を回収し、細胞生存能力のマーカー、例えばIL-2の産生、細胞増殖およびDNAの断片化に関してアッセイを行った。
【００２９】
Jurkat細胞の死は、Molecular Probe Live/Dead Cytotoxicity/Viabilityアッセイで評価した。生存不可能な(死にかかっているか死んでいる)細胞を橙色/赤色に染色するエチジウムホモダイマー-1、および生存可能な(生きている)細胞を緑色に染色するカルセインAMを含む染色溶液に細胞をさらした。細胞膜に細孔を有する細胞は、染色液が495nm光で励起されると赤色/橙色に見える。無傷の細胞は緑色に染まる。橙色に見えかつ緑色を含まない細胞は死んだ細胞としてカウントされ；橙色を含まない緑色細胞は生存しているものとしてカウントされる。サンプル中の死んだ細胞は、サンプル中に存在する細胞の総数の百分率として表わされる。
【００３０】
図1および2は、PMAおよびPHAによる刺激後のJurkat細胞による時間経過のIL-2の放出を示す。Jurkat細胞を、リボフラビン（これらの図中Rbと表記）およびUV（紫外光）（図1を参照）または可視光(図2を参照)で処理し、その後にIL-2の産生をシミュレートした。生理食塩水のみ(リボフラビンなし、光なし)またはリボフラビンのみ(光なし)の添加は、実験の対照群としての役目を果たす。リボフラビンおよびUV光への曝露の後、PMAおよびPHAでの刺激に基づくJurkat細胞によるIL-2の産生は、T細胞の生存能力の指標である。リボフラビンおよび光で細胞を処理した後、IL-2の産生を誘導するためにPMAおよびPHAを添加し、細胞を終夜インキュベートした。上清中のIL-2はELISAアッセイを使用して検出される。
【００３１】
図1は、リボフラビンおよびUV光にさらした後のJurkat細胞からのIL-2の放出を示す。実質的に似たような結果なので見分けることが困難であるが、UV単独およびUV光との組み合わせのリボフラビンは細胞の生存能力を喪失を引き起こしかつIL-2の放出の十分な減少を引き起こした。
【００３２】
図2は、リボフラビンおよび可視光にさらした後のJurkat細胞からのIL-2の放出を示す。図2bから見てとれるように、リボフラビンおよび可視光で処理された細胞は、生存能力の十分な喪失とIL-2放出の十分な減少を引き起こす。可視光単独でも細胞生存能力の量の減少とIL-2の十分な放出を引き起こすが、リボフラビンおよび可視光の組み合わせと同じ程度ではない。
【００３３】
例２
図3aおよび3bは、処理されかつ制御のJurkat細胞の酸素消費を示すグラフである。酸素消費は細胞生存能力の指標である。健康な細胞は呼吸して酸素を消費するが、不健康なおよび／または死んだ細胞は酸素を消費しない。BD酸素バイオセンサシステムを使用してJurkat細胞の代謝を処理後4日間にわたりモニターした。酸素は、大気から細胞培地中に拡散する。酸素の存在は、細胞が増殖するウェルの底に位置する蛍光マーカーを消光させる。細胞によって消費された酸素の量は、生み出される蛍光の量によって測定される。酸素が呼吸のために健康な細胞によって使用される場所では、蛍光が生み出される。
【００３４】
図3aは、リボフラビン(これらの図中Rfとして表記)およびUV光で処理したJurkat細胞中で生成された蛍光の量(NFRU)を時間経過で測定したグラフである。リボフラビンおよびUV光で処理された細胞は、当該プロセスによって損傷を受ける。その結果、細胞は代謝的に活性化されず、従って酸素を消費せず、従ってほとんど蛍光を産生しない。
【００３５】
図3bは、リボフラビンおよび可視光で処理されたJurkat細胞中で生成された蛍光（NFRU）を時間経過で測定するグラフである。リボフラビンおよび可視光で処理された細胞は当該プロセスによって損傷を受ける。図3bに示したように、処理された細胞は、代謝的に活性化されず、4日間にわたって酸素を消費しない。わずかな蛍光も産生しない。
【００３６】
例３
図4は、リボフラビンおよび可視光または紫外光での処理後の2日間にわたるJurkat細胞のDNAの断片化を示す。Jurkat細胞のDNA中の鎖の切断を、リボフラビン(この図中Rfで表記）および光での処理後にフローサイトメトリーによって測定した。％ポジティブは、ポジティブなDNA損傷を示す。表に示すように、1日目、UV光単独で細胞の85.5%がDNA損傷を引き起こした。しかしながら、2日目には、UV光単独にさらされた細胞のたった0.4%のみがDNAの損傷を示した。図4に示すように、UV光単独での細胞の曝露は、DNA損傷を長時間維持しない。1つの仮説は、UV光単独でさらされた細胞は損傷を修復するということである。他の仮説は、UV単独は新しい健康な細胞の増殖を妨げないということである。
【００３７】
しかしながら、リボフラビンおよびUV光での処理では、処理された細胞中のDNAの36.1%が損傷を受け、2日すると処理された細胞の87.5%にDNA損傷があった。リボフラビンの追加は、UV光への曝露によって引き起こされるDNAに対する損傷を維持するように見える。
【００３８】
可視光単独ではDNA損傷を引き起こさないが、リボフラビンを追加すると、DNAが損傷を受けかつその損傷が実質的に2日間にわたって維持されたことを図4は示している。
【００３９】
上記に示されたデータから、リボフラビンまたは他の内因性のアロキサジン誘導体の追加は、白血球DNAに対する損傷を維持するように見える。
【００４０】
図4から、可視光またはUV光への曝露と組み合わされたリボフラビンの追加は、Jurkat のDNAの断片化を生じさせるだけでなく、長時間にわたる損傷を維持することが見てとれる。
【００４１】
図5は、アガロースゲル上における、ヒト白血球ゲノムDNAのDNA断片化の百分率を示すグラフである。3.8×105自家細胞/mL90%血漿を、1L ELPバッグに添加した。
【００４２】
400μMの最終濃度でリボフラビンを添加し、細胞を、320nm、5J/cm2の合計強度で、照射した。このグラフから分かるように、自家白血球のDNAは、光単独にさらした細胞と比較して、リボフラビンおよび光でさらした後には完全性について約50%の変化を示した。この結果は、Jurkat細胞で得られた結果と一致する。
【００４３】
例４
リボフラビンおよび光の細菌DNA殺傷についての効果を測定するために、大腸菌を90%血漿中にスパイクした。リボフラビンを50μMの最終濃度で添加し、混合物を0 J/cm2, 10 J/cm2, 17 J/cm2 および 20 J/cm2の強度範囲で光にさらした。光曝露後、細菌のゲノムDNAを標準DNA精製技術を使用して精製し、DNA断片を標準アガロースゲル電気泳動によって分析し、DNA断片を標準イメージング技術を使用して定量化した。
【００４４】
図6bは、リボフラビン有りまたは無しでUV光に曝露後の、大腸菌のDNA断片化の百分率（処理後に無傷のDNAの百分率によって測定）を示すグラフである。
【００４５】
ゲル(図6aを参照）およびグラフ(図6bを参照)の両方で見てとれるように、リボフラビンとUV光との組み合わせは、UV光単独によって誘導されるものよりも非常に大きな細菌DNA断片化を誘導した。リボフラビンが有るものでは、無いものよりも、より小さいエネルギーでより多くのDNA分解が起こった。
【００４６】
例５
本研究は、リボフラビンおよび320nmの広帯域UVB光が、ウイルスのDNAに対して修復不可能な損傷を引き起こすかどうかを決定するために行われた。
【００４７】
UV光が核酸の損傷を細胞に引き起こすことは知られている。しかしながら、UV光に対する曝露はまた、細胞修復メカニズムのアップレギュレーションを引き起こす。文献においてUV光単独で不活性化させたウイルスは、宿主細胞の核酸修復メカニズムの同時のアップレギュレーションのためにほんの数時間で再活性化するであろうということが報告されている。
【００４８】
リボフラビンおよび光が、ウイルスの核酸に対して白血球および細菌で行ったときと同じくらいの不活性化効果をもっているかどうかを試験するために、λ-ファージウイルスのための宿主細胞として大腸菌(E.coli)を選択した。大腸菌をUV光で照射し宿主細胞核酸修復メカニズムを最初にアップレギュレーションさせた。この実験において、宿主細胞の核酸修復メカニズムがUV光への最初の曝露でアップレギュレーションされた場合、任意のウィルス再活性化効果が増幅されるはずである。任意のウィルス再活性化の防止が、容易に定量化されるはずである。
【００４９】
UV光への最初の曝露後、宿主大腸菌をLuria Broth増殖培地に1〜2時間入れた。その間、λ-ファージウイルスを、PBSおよび最終濃度0〜300μMのリボフラビン中で2logウイルス殺傷が達成されるまで、320nmのUVB光を0.08J/cm2の強度で照射した。その後、照射されたウイルスを照射または未照射の大腸菌宿主細胞とともに20分間インキュベートして、ウイルス吸収を行わせた。ウイルスに感染した大腸菌サンプルをプレーティングして、終夜増殖させた。この時点でプラークをカウントし、感染粒子の数を決定した。
【００５０】
図7は、リボフラビンの濃度を増加させたときのlog ウイルス再活性化の量を示す。ウイルスの再活性化を妨げることに関するリボフラビンの効果は、投与量依存性であった。約0.8logのウイルス再活性化は、0〜100μMのリボフラビンの濃度にわたって起こった。100μMを越えるリボフラビン濃度で、反応は進行的に妨げられ、300μMで再活性化は起こらなくなった。
【００５１】
これらの結果は、リボフラビンおよび光の両方でのウイルスの照射はウィルスDNAの再活性化を妨げることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】リボフラビンおよびUV光での処理後のJurkat細胞からのIL-2の産生を示すグラフ。
【図２】リボフラビンおよび可視光での処理後のJurkat細胞からのIL-2の産生を示すグラフ。
【図３ａ】リボフラビンおよびUV光での処理後のJurkat細胞の酸素消費を示すグラフ。
【図３ｂ】リボフラビンおよび可視光での処理後のJurkat細胞の酸素消費を示すグラフ。
【図４】リボフラビンおよびUV光または可視光での処理後に2日間にわたるJurkat細胞DNAの断片を示す表。
【図５】紫外光、並びにリボフラビン有りおよび無しでの処理後に、分離されたヒト白血球のゲノムDNAの完全性のパーセント変化を測定したグラフ。
【図６ａ】紫外光、並びにリボフラビン有りおよび無しでの処理後に、DNAのラダーリングを示しているアガロースゲル。
【図６ｂ】図6aに示されたゲルからの無傷の(断片化していない)DNAの百分率を数量化したグラフ。
【図７】リボフラビンおよび紫外光での処理後のλ-ファージウイルスの再活性化の対数値。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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