(57)【要約】本発明は、インテグリン−ＭＭＰ複合体の阻害剤となるペプチド化合物に関する。上記ペプチド化合物はペプチド配列 Ｄ／Ｅ−／Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ を含み、αMインテグリンのＩドメインに特異的に結合することによりαMインテグリンとｐｒｏＭＭＰ−９との間の複合体の形成を阻害し、こうして好中球遊走及び白血球遊走を阻止する。上記ペプチド化合物は、炎症性病態及び白血病の治療において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物と薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２】
該テトラペプチド配列がＤＤＧＷであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
白血球遊走に起因する病態の治療用医薬組成物の製造における、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物の用途。
【請求項４】
白血球遊走に起因する病態が白血病であることを特徴とする、請求項３に記載の用途。
【請求項５】
医薬組成物が、プロゼラチナーゼのβ2インテグリンへの接着の阻害剤であることを特徴とする、請求項３に記載の用途。
【請求項６】
好中球遊走に起因する病態の予防用及び治療用医薬組成物の製造における、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物の用途。
【請求項７】
医薬組成物が、炎症性病態の予防剤及び治療剤であることを特徴とする、請求項６に記載の用途。
【請求項８】
該テトラペプチド配列がＤＤＧＷであることを特徴とする、請求項３〜７のいずれかに記載の用途。
【請求項９】
白血球遊走に起因する病態の治療処置または予防処置のための方法であって、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、白血球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項１０】
好中球遊走に起因する病態の治療処置または予防処置のための方法であって、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
白血病の治療処置または予防処置のための方法であって、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、白血病細胞の遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項１２】
炎症性病態の治療処置または予防処置のための方法であって、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｋ−Ｗを有する化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法。
【請求項１３】
該テトラペプチド配列がＤＤＧＷであることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インテグリン−ＭＭＰ複合体の阻害剤となるペプチド化合物に関する。具体的には、上記ペプチド化合物は、αMインテグリンのＩドメインに結合することによりαMインテグリンとｐｒｏＭＭＰ−９との間における複合体の形成を阻害し、こうして好中球遊走及び白血球遊走を阻止する。上記ペプチド化合物は、炎症性病態及び白血病の治療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
白血球インテグリンファミリーは、特徴的なα鎖（αL、αM、αX及びαD）と共通のβ2鎖（ＣＤ１８）を有する４種のヘテロ二量体糖タンパク質からなり、免疫系における細胞接着の仲介において非常に重要な役割を担う（参考文献１）。インテグリンの主要なリガンド結合部位は、α鎖中の、２００個のアミノ酸配列からなる「Ｉドメイン」又は「挿入ドメイン」と呼ばれる部分に位置し、軟骨基質タンパク質やコラーゲンの繰返し配列であるフォンビルブラント因子（von Willebrand factor）のＡドメインと相同である（参考文献２）。
【０００３】
β2インテグリン類のうち、αMβ2インテグリンは多種の無関連のリガンドと相互作用することができる、最も幅広い結合対象を持つ結合タンパク質である。結合対象となるリガンドの例としてはＩＣＡＭ−１〜５、補体断片ｉＣ３ｂ、フィブリノゲン、ｕＰＡＲ、Ｅ−セレクチンや様々な細胞外基質タンパク質などが挙げられる（参考文献３及びそこに記載の引用文献を参照）。インテグリンには特定の酵素に対する結合能力があることもわかっているが、それが白血球接着と免疫反応のいずれにおいて重要なのかは明らかではない。そのようなインテグリン結合活性を示す酵素としては、カタラーゼ（参考文献４）、ミエロペルオキシダーゼ（参考文献５）、及びエラスターゼ（参考文献６）やウロキナーゼ（参考文献７）などのプロテイナーゼが挙げられる。
【０００４】
β2インテグリンのＩドメインのリガンド結合部位の特定に関しては鋭意研究がなされたのに対し、相互作用相手となるリガンド側の結合領域についてはあまり知られていない（参考文献８及び９）。近年、αLのＩドメインとＩＣＡＭ−１からなる複合体の構造に関する報告がなされている（参考文献１０）。β2インテグリンに結合する低分子量ペプチドはインテグリン機能の研究にとって有用な試薬であり、ＩＣＡＭ−２（参考文献１１）、フィブリノゲン（参考文献１２）及びＣｙｒ６１（参考文献１３）に由来する。本発明者らはファージディスプレイライブラリーを用い、インテグリンのペプチド結合特異性についての研究や、医薬としての可能性を有する先導化合物の開発を行った。本発明者らは過去の研究において、精製したαMβ2インテグリンに対する結合活性が最も高い結合ペプチドであるビス環状ペプチドＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（ＬＬＧ−Ｃ４）を単離した（本発明者らによる未発表の考察）（参考文献１４）。白血球は、固定化したＬＬＧ−Ｃ４ペプチドに対しαMβ2インテグリンとαXβ2インテグリンを介して効率よく接着することができる。
【０００５】
発明の概要 
本発明者らは今回、精製したαMのＩドメインにファージディスプレイスクリーニング法を応用した。その結果、Ｉドメインに結合する新規なテトラペプチド配列であるＤ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗを同定するに至った。この配列は公知のいくつかのβ2インテグリンリガンド中や、興味深いことにＭＭＰの触媒ドメイン上にも見られるものである。本発明者らは、Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ 配列がＭＭＰとβ2インテグリンとの間の結合を仲介すること、また、白血球の主要なＭＭＰとして知られるｐｒｏＭＭＰ−９ゼラチナーゼが、白血病細胞系の活性化に伴いαMβ2インテグリンやαLβ2インテグリンとの複合体として現れることを本明細書中に示す。インテグリン−ＭＭＰ複合体に対する上記ペプチド阻害剤は白血病細胞の遊走を阻止するが、このことは細胞運動において上記複合体の果たす役割を示唆している。本発明のペプチド化合物はまた、in vitro 及び in vivo において多形核好中球（ＰＭＮ）の遊走を弱めたが、このことはＰＭＮの運動においてＭＭＰ−インテグリン複合体の果たす役割を示唆している。
【０００６】
発明の詳細な説明 
αMのＩドメインに結合するペプチドについて分析を行ったところ、ＭＭＰ群、特にＭＭＰ−９プロゼラチナーゼとＭＭＰ−２プロゼラチナーゼが、β2インテグリンに対する強力なリガンドであることを知見した。本発明者らの研究により、活性白血球の主要なＭＭＰであるｐｒｏＭＭＰ−９はβ2インテグリンと共に細胞表面上に局在することが分かっている。細胞表面への標識付けと共免疫沈降を行うと、白血病細胞系中に上記複合体が産生されることがより確かに実証できる。こうして本発明者らは、このプロテイナーゼ−インテグリン複合体が白血病細胞の遊走に関与する証拠を得たのである。
【０００７】
全長インテグリンにファージディスプレイ法を応用した広範な分析がなされてきたが、本発明者らの知る限り、単離したインテグリンＩドメインに関してファージディスプレイ法による選別が成功したケースは今回が初めてである。αMのＩドメインは様々なリガンドを結合できるが、濃縮することができた結合配列はただ１つであった。本発明者らが単離したペプチド配列はＩＣＡＭ−１、フィブリノゲン、ＬＬＧ−Ｃ４などのリガンドと競合するものではなかった。ファージディスプレイ法の成功は、用いるライブラリーの種類やバイオパニング（biopanning）の条件に左右されるものである。本発明者らの用いた方法に関しては、Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ 配列を選別できる環状ペプチドとの「高親和性」相互作用を用いるのが有利であった。興味深いことに、この配列はＲＧＤ配列を結合するペプチドとしてファージディスプレイで単離されたＣＷＤＤ（Ｇ／Ｌ）ＷＬＣペプチド（参考文献１５）に酷似している。ＣＷＤＤＧＷＬＣペプチドは、リガンドのＲＧＤ配列を認識することによって、構造的かつ機能的に極小インテグリンのようなはたらきをする。なお本明細書では、ＤＤＧＷペプチドを逆の方向、即ちインテグリンに対するリガンドとして同定している。しかし、ＲＧＤ配列はαMのＩドメインと競合するものではない。理由は、濃度１ｍＭのＧＲＧＤＳＰペプチドではｐｒｏＭＭＰ−９のＩドメインへの結合を阻害することができなかったためである（本発明者らによる未発表の考察）。
【０００８】
ＤＤＧＷの結合部位に関しては、ｉＣ３ｂとαMβ2インテグリンとの間の相互作用からヒントが得られる。本発明者らが行ったpepspot分析の結果、ｉＣ３ｂペプチドＡＲＳＮＬＤＥＤＩＩＡＥＥＮＩはαMのＩドメインに結合し、ＤＤＧＷペプチドがその結合を阻害したが、対照ペプチドＡＲＳＮＬＤＡＡＩＩＡＥＥＮＩの方はαMのＩドメインに結合しなかった。ｉＣ３ｂペプチドがαMβ2インテグリンに効率よく結合するためには、複数の負電荷が隣り合う構造を有する配列ＤＥＤＩＩＡＥＥＮＩが必要となる。Ｉドメインの中の補体タンパク質ｉＣ３ｂ結合部位をマッピングしたところ、正に帯電したアミノ酸残基Ｋ245がｉＣ３ｂの結合に関与することが示された。この残基を変異させても、フィブリノゲンを認識するこのペプチドの結合作用には影響しない。このことは、ＤＤＧＷペプチドがＩＣＡＭ−１やフィブリノゲンによって仲介される細胞接着を阻害できない理由となり得る。これらの知見から、残基Ｋ245がＤＤＧＷペプチド及びＤ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ 配列に対する、正に帯電した接触部位であることが示唆される。
【０００９】
本発明者らが行ったpepspot分析の結果、β2インテグリンリガンドの中には、活性配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗを含む種類があることがわかる。そのようなリガンドの例としては、既に同定されているαMβ2リガンドであるｉＣ３ｂ、トロンボスポンジン−１、及びミエロペルオキシダーゼやカタラーゼなどの酵素が挙げられる。本発明者らの実験では、数種の分泌型ＭＭＰ（膜結合型ＭＴ１−ＭＭＰではない）に由来するペプチドもまた活性を有していた。Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ 配列が分泌型ＭＭＰ中の比較的多くに保存されていることは注目に価する。
【００１０】
ｐｒｏＭＭＰ−９の触媒ドメイン内に主要なインテグリン結合部位が発見できたのは意外だったが、それは過去の研究の結果、ＭＭＰの別のドメインであるヘモペキシンドメインがインテグリン結合において重要な役割を担うことが示唆されていたためである。ヘモペキシンドメインはＭＭＰ−２のαVβ3インテグリンへの結合、及びＭＭＰ−１のα2β1インテグリンへの結合を仲介する。また、ＭＭＰ−２から切り離されたヘモペキシンドメインも、in vivoにおいて脈管形成を阻害することが示されていたためである。もちろん、ファージペプチドディスプレイやpepspot技術で出来ることにも限界があり、ペプチド一次配列の分析は可能でもタンパク質の立体構造までは分析できない。従って、今回の研究では個々のＭＭＰ−９ドメインがインテグリン結合において果たす機能について結論付けることはできず、ＭＭＰ−９の切断産物である断片がin vivoに存在するとして、β2インテグリンのリガンドとしてはたらくことが可能か否かについてはまだ分からない。本発明者らの研究の結果、合成ＤＤＧＷペプチドがインテグリン結合を完全に阻害することができたため、全長ｐｒｏＭＭＰ−９がβ2インテグリンに結合するには触媒ドメイン中のペプチド配列が必須不可欠であることがわかる。αMβ2は変性タンパク質に結合することが知られているが、細菌を用いて発現されたタンパク質の場合しばしば変性が起こり得るため、今回天然のｐｒｏＭＭＰ−９を用いることは重要であった。また、ＤＥＬＷ（Ｔ／Ｓ）ＬＧ配列は活性酵素中では変化しないはずだが、活性化したＭＭＰ−２やＭＭＰ−９とインテグリンとの間の結合は見られなかった。むしろ、ｐｒｏＭＭＰ−９の活性化剤であるＡＭＰＡとトリプシンがＴＨＰ−１細胞からＭＭＰ−９を脱離させ、インテグリン複合体に影響を及ぼすらしいことを知見した（本発明者らによる未発表の考察）。これらの結果は、活性酵素に比べ酵素前駆体の方がより効率良くインテグリン結合部位を提示できること、また、β2インテグリンは酵素前駆体の活性化を制御する可能性さえ秘めていることを示唆している。
【００１１】
ｐｒｏＭＭＰ−２とｐｒｏＭＭＰ−９の３次元構造においては、Ｉドメイン結合部位は触媒ドメインとII型フィブロネクチン繰返し配列の間の、亜鉛結合触媒配列であるＨＥＦＧＨＡＬＧＬＤＨの近傍に位置する。Ｉドメイン結合部位がこの位置にあることで、ＭＭＰの組織性阻害剤（tissue inhibitors of MMPs）（ＴＩＭＰｓ）やα2−マクログロブリンによるｐｒｏＭＭＰ−９の阻害を回避するメカニズムが説明できる。阻害剤が存在しないとき、細胞表面に局在するｐｒｏＭＭＰ−９は容易に活性化されて基質を加水分解するが、これは全長（intact）のプロペプチドの存在下でも起き得る現象である。また、Ｉドメインの結合部位は触媒溝（catalytic groove）の近傍に位置するため、ＣＴＴやＩｎｈ１など小さな分子からなるＭＭＰ阻害剤がＭＭＰ−９とβ2インテグリンとの間の相互作用を阻害するメカニズムも説明できる。
【００１２】
ＴＨＰ−１細胞遊走アッセイにおけるＤＤＧＷペプチドの活性は、白血球遊走におけるインテグリン−プロゼラチナーゼ複合体の果たす重要な役割を示唆している。ただし、ＤＤＧＷペプチドがゼラチナーゼ以外のリガンドの結合を阻害することによって白血球遊走を阻害する、という可能性は明らかに除外できない。しかし、ゼラチナーゼ特異的阻害剤であるＣＴＴもＴＨＰ−１細胞遊走を阻害するため、上記の結果はｐｒｏＭＭＰ−９とβ2インテグリンとの複合体がＤＤＧＷの主な標的であることを強く示唆するものである。興味深いことに、ＤＤＧＷペプチドは培地中のｐｒｏＭＭＰ−９のレベルを高めたにも関わらずＴＨＰ−１細胞遊走を阻害した。これは即ち、ＭＭＰ−９の総合レベルよりも細胞表面接着の方が細胞遊走における決定要素となることを示唆している。
【００１３】
ＤＤＧＷとＨＦＤＤＤＥ（略語については下記参照）はマウスのin vivoにおける腹膜炎モデルにおいて高い活性を示したが、いずれのペプチドも別な種類のβ2インテグリンリガンドを阻害する潜在能力も有するため、上記の活性がどの程度までｐｒｏＭＭＰ−９の阻害に起因するのかは不明である。β2インテグリンリガンドの中にはＤＤＧＷ様配列を有するものがあり、そのようなリガンドにはＭＭＰの他に少なくとも補体ｉＣ３ｂとトロンボスポンジン−１が含まれる。ＤＤＧＷペプチドの優れたin vivo活性は、白血球遊走に関与する成分の研究手段として有用であるが、このペプチドは抗炎症剤化合物の開発のための先導化合物と見なすこともできる。本発明者らの得た結果から、特定のβ2インテグリンが指揮する好中球の運動機構の一部を、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2との複合体が構成している可能性が示唆される。
【００１４】
従って本発明は、新規なペプチド化合物に関し、さらに詳しくは、テトラペプチド配列 Ｄ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗを有するペプチド化合物に関する。上記ペプチド化合物は、白血球遊走及び好中球遊走を阻害するための医薬として用いることができる。そのような阻害活性はin vitro とin vivo の実験の両方で示された。従って、上記ペプチド化合物は白血病の治療及び炎症性病態の予防と治療において有用である。
【００１５】
本発明の１つの態様においては、好中球遊走に起因する病態の予防用及び治療用医薬組成物の製造における、本発明の化合物の用途が開示される。
【００１６】
本発明の他の１つの態様においては、白血球遊走に起因する病態の治療用医薬組成物の製造における、本発明の化合物の用途が開示される。
【００１７】
本発明のさらなる１つの態様においては、有効成分としての本発明の化合物と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物が開示される。
【００１８】
本発明のさらなる１つの態様においては、白血球遊走または好中球遊走に起因する病態の治療処置または予防処置のための方法であって、白血球遊走または好中球遊走の阻害剤である本発明の化合物を、処置を必要とする哺乳類に対し、白血球遊走または好中球遊走を阻害するのに有効な量を投与することを含む方法、が開示される。本発明の具体的態様には、白血病及び炎症性病態の治療方法が含まれる。
【００１９】
本願で使用する略語 
ＡＰＭＡ            酢酸アミノフェニル第二水銀
αMβ2              ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８またはＭａｃ−１インテグリン
ＣＴＴ              ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド
ＤＤＧＷ            ＡＤＧＡＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣＧＡＡＧペプチド
ＧＰＡ              グリコールホリンＡ
ＧＳＴ              グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
ＨＭＥＣ            ヒト微小血管内皮細胞
ＩＣＡＭ            細胞間接着分子
Ｉｎｈ１            マトリックスメタロプロティナーゼ阻害剤１
ＫＫＧＷ            ＡＤＧＡＣＩＬＷＭＫＫＧＷＣＧＡＡＧペプチド
ＬＬＧ−Ｃ４        ＣＰＣＦＬＬＧＣＣペプチド
ＭＭＰ              マトリックスメタロプロティナーゼ
ＮＧＡＬ            好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
ＰＭＮ              多形核好中球
ＲＧＤ−Ｃ４        ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧペプチド
ＳＴＴ              ＳＴＴＨＷＧＦＴＬＣペプチド
ＴＡＴ−２          腫瘍関連トリプシノゲン−２
Ｗ→Ａ  ＣＴＴ      ＣＴＴＨＡＧＦＴＬＣペプチド
【００２０】
なお本明細書中、発明の背景技術を説明するため、また、特に本発明の実施態様に関する詳細を補うために言及又は使用する各種刊行物及びその他の文献は、言及したことにより本明細書中に組み込まれたものとする。以下、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
抗体と試薬 
抗体ＭＥＭ１７０とＬＭ２／１は、αMインテグリンサブユニットに対する抗体であり、抗体ＭＥＭ−８３とＴＳ２／４は、αLインテグリンサブユニットに対する抗体である（参考文献１９、２０）。モノクローナル抗体７Ｅ４（参考文献２１）は白血球インテグリンの共通β2鎖と反応した。αM抗体ＯＫＭ１０はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（メリーランド州、ロックビル、ＡＴＣＣ）より入手した（参考文献２２）。ＩＣＡＭ−５に対するモノクローナル抗体（ＴＬ３）（参考文献２３）は対照抗体として用いた。抗ＭＭＰ−９モノクローナル抗体（ＧＥ−２１３）はLab Vision Corporation（カルフォルニア州、フリーモン）から入手し、抗ＭＭＰ−２モノクローナル抗体（Ａｂ−３）はOncogeneTM research productsから入手した。アフィニティ精製されたウサギ抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体はBorregaard laboratory（参考文献２４）から入手した。対照モノクローナル抗体として、マウスＩｇＧ（オーストラリア国、ホーソン、Silenius製）および抗グリコホリンＡ（ＧＰＡ）（ＡＴＣＣ）を用いた。抗トリプシノゲン−２（ＴＡＴ−２）抗体をウサギポリクローナル抗体の対照とした（参考文献３２）。ペルオキシダーゼ結合抗ＧＳＴモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnologyから入手した。ウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体はDakopatts a/s （デンマーク国、コペンハーゲン）から入手した。Ｉｎｈ１（２Ｒ−２−（４−ビフェニルイルスルフォニル）アミノ−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド）はカリフォルニア州、ラ・ホーヤ、Calbiochemより購入した。ヒト組換えＩＣＡＭ−１はR&D systems（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入した。ＩＣＡＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞に発現させ、公知の方法（参考文献１４）で精製した。合成ペプチドＣＴＴ、ＳＴＴ、ＬＬＧ−Ｃ４およびＲＧＤ−４Ｃは公知の方法（参考文献１４、２５）で得た。Ｗ→Ａ ＣＴＴはフランス国、ストラスブール、Neosystemから入手した。ＰｒｏＭＭＰ−２およびｐｒｏＭＭＰ−９は購入した（Roche製）。ザイモグラフィーでは、市販のｐｒｏＭＭＰ−９が９２ｋＤａのモノマーのバンド、２００ｋＤａのホモダイマーのバンドおよび１２０ｋＤａのＮＧＡＬ複合体のバンドを示した。インテグリンα1β1およびα3β1はChemicon International（カルフォルニア州、テメキュラ）から購入した。ヒトプラズマフィブリノゲンおよびロバスタチンはCalbiochemから入手した。
【００２２】
ファージディスプレイ法 
ファージディスプレイ法による選択をランダムペプチドＣＸ7-10ＣおよびＸ9-10（但し、Ｃはシステインを表し、Ｘは任意のアミノ酸を表す（参考文献１４、２５））のプールを用いて行った。端的に言うと、αM Ｉドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質を、２０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイターウェルに固定化し、ウェルをＢＳＡでブロッキングした。ファージライブラリーのプールをまずＧＳＴで被覆したウェルでサブトラクションに付し、その後結合していないファージを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５ｍＭ ＣａＣｌ2／１μＭ ＺｎＣｌ2／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２％ ＢＳＡ（ｐＨ７.５）を入れたαMＩドメイン−ＧＳＴ−被覆ウェルに移しかえた。サブトラクションと選択を３回行った後、個々のファージクローンを結合特異性について試験し、Ｉドメインに特異的に結合するファージの配列を決定した（参考文献１４）。
【００２３】
ペプチドの生合成および化学合成 
まず、ファージペプチドをインテイン融合体として生合成的に調製する。上記ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ファージを含有する細菌コロニー（−２０℃で保存）の１μｌからＰＣＲでクローニングした。フォワードプライマーは５’−ＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡＣＧＧＧＧＣＴ−３’、リバースプライマーは５’−ＡＣＴＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＣＣＣＡＧＣＧＧＣＣＣＣ−３’であった。ＰＣＲ条件は、初期変性を９４℃で２分間行い、その後９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を３０サイクル行うことを包含した。ＰＣＲ産物をQIAGEN製ヌクレオチド除去ユニット（Nucleotide removal kit）を用いて精製した。その後、ＰＣＲ産物をSapI制限酵素およびPstI制限酵素で消化し、同様に消化してフォスファターゼで処理したｐＴＷＩＮベクター（New England Biolabs製）にライゲートした。ＤＮＡ配列決定によって、正しく挿入されていることを確認した。インテイン融合タンパク質をE. coli ＥＲ２５６６株において製造し、実質的に公知の方法（参考文献２６）によりキチンカラムでアフィニティ精製した。ペプチドを上記カラムで開裂、溶出させ、最後にＨＰＬＣで精製した。化学的ペプチド合成は公知のＦｍｏｃ化学手法（Fmoc-chemistry）を用いて行い、配列は質量分析（参考文献２６）によって確認した。
【００２４】
ファージ結合アッセイ 
５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／５ｍＭ ＣａＣｌ2／１μＭ ＺｎＣｌ2／０.５％ ＢＳＡ（ｐＨ ７.５）に入れたファージ（１０8個の感染粒子／ウェル）をＩドメイン−ＧＳＴ融合体またはＧＳＴ（２０ｎｇ／ウェル）で被覆したマイクロタイターウェルに注入した。ファージを競合ペプチド（１５μＭ）の存在下または非存在下で１時間結合させ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳで洗浄した。結合したファージは、１：３０００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ファージモノクローナル抗体（Amersham Biosciences製）および基質としてｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライドを用いて検出した。反応を１０％ Ｈ2ＳＯ4を添加することによって停止し、４９２ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【００２５】
Pepspot 
ペプチドを公知の方法（参考文献２７）でセルロース膜上に合成した。この膜を３％ ＢＳＡの０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＴＢＳ溶液でブロッキングし、０．５〜５μｇ／ｍｌのαMＩドメインと共に、室温で２時間インキュベートした。ＤＤＧＷペプチドを競合ペプチドとして５０μＭの濃度で用いた。結合したαM Ｉドメインをモノクローナル抗体であるＬＭ２／１（１μｇ／ｍｌ）またはＭＥＭ−１７０（５μｇ／ｍｌ）およびペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス抗体（１：５０００希釈）を用いて検出し、続いて化学発光検出（chemiluminescence detection）を行った。
【００２６】
細胞培養物 
ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞系およびＴＨＰ−１白血病細胞系およびジャーカット白血病細胞系はＡＴＣＣから入手し、公知の方法で維持した（参考文献２０、２５、２８）。ＡＭＬ患者の初期芽球（primary blasts）由来のＯＣＩ／ＡＭＬ−３（参考文献２９）をＬ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加１０％ ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中で維持した。細胞生存率を、製造者（Roche）の説明書に従ってＭＴＴ（３−［４,５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロマイド）アッセイで評価した。
【００２７】
インテグリンの精製 
αLβ2インテグリン（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＬＦＡ−１）、αMβ2インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、Ｍａｃ−１）およびαXβ2インテグリン（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）をヒト血液バフィーコート細胞溶解物から、プロテインＡ−セファロース ＣＬ ４Ｂに連結した抗ＣＤ１１ａ抗体（ＴＳ２／４）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＭＥＭ１７０）、または抗ＣＤ１１ｃ抗体（３.９）への吸着によって精製した。インテグリンを、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および１％のｎ−オクチルグルコシドの存在下に、ｐＨ１１．５で、公知の方法（参考文献２８）で溶出した。
【００２８】
ＧＳＴ融合タンパク質の発現と精製 
αL、αM、およびαXのＩドメインをＧＳＴ融合タンパク質としてE. coli株 ＢＬ２１またはＪＭ１０９を用いて製造し、グルタチオン結合ビーズ（glutathione-coupled beads）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した（参考文献３０、３１）。Ｃ末端にＣＴＴを含むＧＳＴを、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴに関する公知のプロトコール（参考文献１４）を用いて構築し、精製にはグルタチオン結合ビーズを用いた。ＧＳＴ−融合タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクマシーブルー染色、およびウェスタンブロット分析により確認した。Pepspot分析のために、トロンビンを用いてＧＳＴをαMＩドメインから切り離した。
【００２９】
精製したインテグリンへのＭＭＰの結合 
精製したＩドメイン（ＧＳＴ−αM、ＧＳＴ−αL、ＧＳＴ−αX）またはインテグリン（αMβ2、αLβ2、αXβ2、α1β1）（１μｇ／ウェル）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１ｍＭ ＣａＣｌ2／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／１ｍＭ ＭｎＣｌ2(ｐＨ７.４)中で固定化した。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する１０ｍＭ リン酸塩／１４０ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ ７.４)）で洗浄し、３％ ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液でブロッキングした。ｐｒｏＭＭＰ−２、ｐｒｏＭＭＰ−９、またはｐ−酢酸アミノフェニル第二水銀（ＡＰＭＡ）或いはトリプシン活性型（参考文献３２）を室温で２時間インキュベートした。阻害実験においては、ＣＴＴおよびＩｎｈ１をまずｐｒｏＭＭＰと共に室温で３０分間プレインキュベートした。ウェルを３回洗浄し、２μｇ／ｍｌの濃度の抗ＭＭＰ−９抗体（ＧＥ−２１３）または抗ＭＭＰ−２抗体（Ａｂ−３）と共に、ＰＢＳＴ中で１時間インキュベートした。結合した抗体をペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（デンマーク国、グロストルップ、ＤＡＫＯ）と、基質としてｏ−フェニレンジアミン ジヒドロクロライドを用いて検出した。
【００３０】
β2インテグリンおよびプロゼラチナーゼの共沈 
ｐｒｏＭＭＰ−２およびｐｒｏＭＭＰ−９を含有する無血清ならし培地を、１００ｎＭ ホルボールエステルである４β−ホルボール １２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）（ミズーリ州、セントルイス、Sigma-Aldrich製）の存在下に＋３７℃で一晩生育したヒトＨＴ−１０８０繊維肉腫細胞から採取した。５００μｌ量の上清を１００ｎｇのＧＳＴ−αMＩドメイン、ＧＳＴ−αLＩドメインまたはＧＳＴ−αXＩドメイン、或いはαMβ2インテグリンと共に２５℃で３時間インキュベートした。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＬＬＧ−Ｃ４を非特異的結合を測定するために用いた。ＣＴＴ、ＳＴＴ、ＬＬＧ−Ｃ４およびＩＣＡＭ−１を２００μｇ／ｍｌの濃度で競合ペプチドとして用い、そして抗体ＬＭ２／１およびＴＬ３を４０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。＋４℃で１時間インキュベートした後、Ｉドメインとゼラチナーゼの複合体をグルタチオンセファロースと共にペレット化した。インテグリン複合体を、まずＯＫＭ１０抗体と共に＋４℃で３時間、次にプロテインＧ セファロースと共に１時間インキュベートすることによって捕捉した。遠心分離および洗浄の後、試料を、０．２％ ゼラチン含有８％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いたゼラチンザイモグラフィーで分析した（参考文献３２）。
【００３１】
ｐｒｏＭＭＰ−９の細胞からの脱離に対するペプチドの効果 
ＴＨＰ−１細胞（４０,０００個／１００μｌ）を無血清ＲＰＭＩ培地で、２００μＭの本発明のペプチドの存在下または非存在下で４８時間、公知の方法でインキュベートした。ならし培地の一部をゼラチンザイモグラフィーで分析した。
【００３２】
ＣＴＴとｐｒｏＭＭＰ−９との相互作用 
ＣＴＴ−ＧＳＴおよび対照ＧＳＴ（５μｇ／ウェル）を一晩かけて５０μｌのＴＢＳ中で９６−ウェルマイクロタイタープレートに被覆し、ＢＳＡでウェルをブロッキングした。ｐｒｏＭＭＰ−９またはＡＰＭＡ活性型（８０ｎｇ／ウェル）を１％ ＢＳＡ／５ｍＭ ＣａＣｌ2／１μＭ ＺｎＣｌ2を含有する５０μＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、競合ペプチドの存在下または非存在下で２時間インキュベートした。洗浄の後、抗ＭＭＰ−９およびＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧを用いて、結合したＭＭＰ−９を上記のように測定した。細胞培養におけるＣＴＴのｐｒｏＭＭＰ−９との複合体形成を試験するために、ＴＨＰ−１細胞をＰＤＢｕで３０分間活性化させ、その後ＣＴＴ、 Ｗ→Ａ ＣＴＴまたはＩｎｈ１（それぞれ２００μＭ）と共に＋３７℃で無血清培地でインキュベートした。０、１、２、３、４、および５時間の時点で培地から試料を取り、ザイモグラフィーと抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法で分析した。ＨＴ−１０８０細胞を用いた実験を、培地試料を６時間後に採取した以外は同様に行った。
【００３３】
細胞表面標識化（Cell surface labelling）、免疫沈降および免疫ブロット法 
非活性化またはＰＤＢｕにより活性化したＴＨＰ−１細胞（１ｘ１０7個）を、トリチウム化ホウ水素化ナトリウムの過ヨウ素酸塩（periodate tritiated sodium borohydride）を用いて表面標識化した（参考文献３３）。［3Ｈ］標識細胞を１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のＰＢＳ溶液で溶解し、遠心分離で澄ませて、プロテインＧ−セファロースで予備清掃（preclear）した。上記で得た溶解物を抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体、αM抗体（ＯＫＭ−１０）またはβ2抗体（７Ｅ４）で免疫沈降した。プロテインＧ−セファロースと共に１時間＋４℃でインキュベートした後、免疫複合体をペレット化し、洗浄し、８〜１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（カリフォルニア州、ハーキュリーズ、Bio-Rad製）上でほぐした。ゲルをエンハンサー（Amplify、Amersham Biosciences製）で処理し、乾燥して曝露した。非標識ＴＨＰ−１細胞（１×１０7個）を上記と同様に溶解し、免疫沈降した。得られた試料を４〜１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でほぐし、ニトロセルロース膜に転写した。免疫検出をαM抗体（ＭＥＭ１７０）（１０μｇ／ｍｌ）を用いておこなった後、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧと化学発光による検出（Amersham Biosciences製）を行った。結合した抗体を膜から除去し、αL鎖モノクローナル抗体（ＴＳ２／４）または抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体でリプローブした。
【００３４】
免疫蛍光法 
免疫蛍光法を休止細胞またはＰＤＢｕで３０分間活性化した細胞に対して行った。これらの細胞の一部を、ＩＣＡＭ−１で処理してβ2インテグリンを、またはＣＴＴで処理してゼラチナーゼをブロッキングした。細胞をポリ−Ｌ−リシンで被覆したカバーガラスに結合させ、メタノールを用いて−２０℃で１０分間、或いは４％パラホルムアルデヒドを用いて＋４℃で１５分間固定化し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００のＰＢＳ溶液を用いて、室温で１０分間透過処理し、数回洗浄した。上記カバーガラスを、１：５００に希釈したウサギ抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体およびマウス抗αM抗体（ＯＫＭ−１０）と共にインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体であるローダミン（ＴＲＩＴＣ）結合ブタ抗ウサギ抗体、またはＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｆａｂ’）2（デンマーク国、コペンハーゲン、Dakopatts a/s製）を１：１０００に希釈したものと室温で３０分間インキュベートした。試料をモヴィオール（moviol）で封入し、暗所で２日間インキュベートし、共焦点顕微鏡（ライカ マルチバンド共焦点イメージングスペクトロフォトメーター（Leica multi band confocal imagine spectrophotometer））で４００倍の倍率で、或いは蛍光顕微鏡（Olympus Provis 70）で６０倍の倍率で調べた。
【００３５】
好中球調製物および細胞系 
多形核好中球（ＰＭＮ）を、クエン酸デキストロース中で抗凝固処理された末梢血から単離した。赤血球を２％デキストランＴ−５００を用いて遠心分離で沈殿させ、得られた白血球を多く含有する上清をペレット化し、生理食塩水に再懸濁し、リンホプレップ（Lymphoprep）（ノルウェー国、オスロ、Nyegaard製）を用いて、４００ｇで３０分間遠心分離し、多形核細胞を血小板および単核球から分離した（参考文献１６）。ＰＭＮの純度は９５％より高く、典型的に好酸球の比率は２％より低い。細胞生存率を、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル テトラゾリウムブロマイド）アッセイを製造者（Roche）の説明書に従って用いて測定した。
【００３６】
S. Mustjoki（ヘルシンキ大学、ハートマン  インスティテュート）より寄贈されたヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）（参考文献１７）を、ＲＰＭＩ １６４０中で、２ｍＭ グルタミン／１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン／１００ μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含有する１０％ ＦＢＳの存在下で生育した。ヒト単球性ＴＨＰ−１細胞を公知の方法（参考文献１４、２５）で維持した。１型白血球接着不全症（ＬＡＤ−１）細胞、野生型およびαMβ2−トランスフェクト型Ｌ９２９マウス線維芽細胞はDr. Jean-Pierre Cartron（フランス国、パリ、INSERM）からの寄贈である。これらの細胞を、公知の方法（参考文献１８）で維持し、αMβ2の発現を蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ、カルフォルニア州、サンホセ、Becton Dickinson）によって試験した。
【００３７】
細胞接着および細胞遊走 
フィブリノゲンおよびＩＣＡＭ−１−Ｆｃを４０μｇ／ｍｌで、＋４℃のＴＢＳ中で被覆した。ペプチド（２μｇ／ウェル）を、＋３７℃で、０．２５％ グルタルアルデヒド含有ＴＢＳ中で被覆した。ウェルを１％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロッキングした。ＰＤＢｕにより活性化した、またはしていないＴＨＰ−１細胞（５０，０００個／ウェル）を、５０ μｇ／ｍｌの２００μＭ ペプチドまたはモノクローナル抗体の存在下または非存在下に、０．１％ ＢＳＡ−ＲＰＭＩ培地に添加する。３０〜３５分後に、ウェルをＰＢＳで洗浄して非接着細胞を除去し、接着細胞をフォスファターゼアッセイで定量した。細胞遊走アッセイを、公知の血清含有培地（参考文献１４）でトランスウェル遊走チェンバー（transwell migration chambers）（孔サイズ：８μｍ、Costar製）を用いて行った。端的に言うと、膜の上部表面と下部表面を４０μｇ／ｍｌのＧＳＴまたはＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴで被覆するか、或いは被覆しなかった。ウェルを１０％ 血清含有培地で２時間ブロッキングした。ＴＨＰ−１細胞（５０，０００個／１００μｌ）またはＨＴ１０８０（２０，０００／１００μｌ）をペプチドと共に１時間プレインキュベートし、上室に移した。下室はペプチドを有さない５００μｌの培地を含有する。細胞を膜の下部表面へ１６時間遊走させ、クリスタルバイオレットで染色して数えた。
【００３８】
ＭＭＰ−９タンパク質（２００ｎＭ ＰＢＳ溶液）を＋４℃で１６時間被覆し、マイクロタイターウェルを３％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液で、室温で１時間ブロッキングした。αMβ2インテグリン Ｌ−細胞トランスフェクタントおよびＰＭＮ（１×１０5 細胞／ウェル）を２ｍＭ ＭｇＣｌ2と０．１％ＢＳＡを添加したＲＰＭＩ培地に懸濁し、ＰＭＡ（２０ｎＭ）で２０分間活性化、或いはＣ５ａ（５０ｎＭ）またはＴＮＦ−α （１０ｎＭ）で＋３７℃で４時間活性化する。Ｌ９２６野生型およびＬＡＤ−１細胞を対照として用いた。細胞を、上記の抗体（２０μｇ／ｍｌ）またはペプチド（５０μＭ）で、＋３７℃で３０分間処理し、無血清倍地で２回洗浄し、マイクロタイターウェル中で、＋３７℃で３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、接着細胞の数をフォスファターゼアッセイで定量した（参考文献１４）。
【００３９】
ＰＭＮには孔サイズが３μｍの、ＴＨＰ−１細胞には８μｍのCostar製２４−トランスウェル遊走チェンバー（24-transwell migration chambers）を用いて細胞遊走を行った。β2インテグリンに指揮される遊走を研究するため、チェンバーの膜の両面をＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴインテグリンリガンド（４０μｇ／ｍｌ）または対照としてＧＳＴで被覆し、上記の１０％血清含有培地でブロッキングした。内皮貫通遊走を研究するために、コンフルエントなＨＭＥＣ（４×１０5 細胞／ウェル）をゼラチンで被覆した膜の上側で５日間生育した。３日後に培地を交換した。ＰＢＳでＨＭＥＣ層を２回洗浄した後、Ｃ５ａ（５０ｎＭ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみを下室に添加して化学走性活性化を＋３７℃で４時間行った。その後、培養物を再度２回洗浄して全ての試薬を除去した。ＰＭＮまたはＴＨＰ−１細胞を、研究したペプチド阻害剤または抗体と１時間プレインキュベートし、上室へ移動した（１００μｌ ＲＰＭＩ／０．１％ＢＳＡまたは１０％ＦＣＳ含有完全培地中に１×１０5個）。ＰＭＮをＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ被覆膜を通して２時間、ＨＭＥＣ単分子層を通して３０分間遊走させた。ＴＨＰ−１細胞を１６時間遊走させた。遊走しなかった細胞を上部表面から綿棒で除去し、フィルターを通過した細胞をクリスタルバイオレットで染色して数えた。
【００４０】
マウス炎症モデル 
３１〜３２週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、３％（ｗ／ｖ）チオグリコレートの無菌生理食塩水を注射した（参考文献３６）。ペプチド（１００μｌ中に５〜５００μｇ）を尾静脈に注射した。３時間後に動物を安楽死させ、腹膜細胞を、１０ｍｌの無菌ＰＢＳを腹膜壁より注射することによって採取した。洗浄液中に存在する赤血球細胞を低張溶解法（hypotonic lysis）により除去した。細胞を遠心分離機にかけ、１ｍｌの無菌０．２５％ ＢＳＡ／クレブズ−リンガー溶液に再懸濁した。上清も採取しゼラチンザイモグラフィーで分析した。０．１％クリスタルバイオレットで染色し、１００倍の対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて好中球の数を定めた。免疫蛍光染色をするために、細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆カバーガラスに結合させ、２．５％ パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を用いて＋４℃で３０分間固定化し、数回洗浄した。Ｆｃレセプターを２０％のウサギ血清および３％ ＢＳＡのＰＢＳ溶液の存在下でブロッキングした。その後細胞を抗ＭＭＰ−９ポリクローナル抗体およびαMモノクローナル（ＭＣＡ７４）抗体と３０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体であるローダミン（ＴＲＩＴＣ）結合抗ウサギ抗体またはＦＩＴＣ結合抗ラット抗体（Ｆａｂ’）2とさらに３０分間インキュベートした。試料を共焦点顕微鏡で調べた。動物実験はヘルシンキ大学倫理委員会の承認を得た。
【００４１】
結果
αMＩドメイン結合ペプチド配列Ｄ／Ｅ−／Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗの同定 
本発明者らは、ファージペプチドディスプレイライブラリーを用いて、αMＩドメインと相互作用するペプチドを選択した。まず、ＧＳＴ結合ファージをＧＳＴで被覆したウェル上で除去し、結合していないファージ調製物をαMＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質で被覆したウェルでインキュベートした。αMＩドメイン結合ファージをバイオパニングを３回行って濃縮し、ペプチド配列を決定した。１つの線状ペプチドを除けば、ペプチドは環状のＣＸ7ＣライブラリーおよびＣＸ8Ｃライブラリーに由来するものであった。Ｉドメイン結合配列は、保存された配列を１つだけ示したが、これはＩドメインが幅広いリガンドに結合することが知られているという点から見るといくぶん意外な発見であった。結合したペプチドは２個の連続した負に帯電したアミノ酸、即ち、グルタミン酸残基および／またはアスパラギン酸残基、続いてグリシン残基およびトリプトファン残基（図１−１のＡ）を含んでいた。この方法で決定したコンセンサス配列 Ｄ／Ｅ−／Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗは、ＬＬＧ−Ｃ４およびこれまで報告されている他のβ2インテグリン結合ペプチドとは、明確に異なっていた。
【００４２】
本発明者らは、まずファージディスプレイペプチドをインテイン融合タンパク質として調製し、そこからペプチドを開裂させた。これによって、大規模な化学的ペプチド合成を行う前に、ペプチドの可溶性および結合特異性について速やかに試験することができた。ファージベクターからペプチドライブラリー挿入物を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いてペプチドをクローニングした。その結果、調製した全てのペプチドがベクターに由来する配列ＡＤＧＡをＮＨ2末端に、ＧＡＡＧをＣＯＯＨ末端にそれぞれ含む。可溶性ペプチドを競合ペプチドとして用いたファージ結合実験では、２つの隣り合った負電荷を有するペプチドが共通の部位に結合することが示された（図示しない）。本発明者らは、ＡＤＧＡ−ＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣ−ＧＡＡＧ（ＤＤＧＷ）をさらなる実験に用いるために選択した。このペプチドは、強い結合を示し、水性緩衝液中で非常によく溶解した（１０ ｍＭより高い濃度の５０ｍＭ ＮａＯＨ中で溶解）ためである。上記ペプチドを化学的合成でも調製した。ＤＤＧＷ配列を担持するファージはαMＩドメインに非常によく結合した。これは低濃度のＤＤＧＷペプチドによって簡単に阻害されたが、ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドにはわずかに影響されるだけであった。この結果により、ＤＤＧＷとＬＬＧ−Ｃ４の結合部位が異なることが示された（図１−１のＢ）。他のペプチド配列を有する対照ファージは結合しなかった。ＤＤＧＷを担持するファージもαLＩドメインに対する特異的な結合を示し、この結合はＤＤＧＷによって阻害できたが、相互作用はαMＩドメインに対するものよりも低かった（図１−２のＣ、データは示さない）。αXＩドメインまたは対照として用いたＧＳＴとの結合は見られなかった（図１−２のＣ）。
【００４３】
β2インテグリンＩドメインとの相互作用を仲介するゼラチナーゼの触媒ドメイン上でのＤＥＬＷ配列の特徴
本発明者らは、新規なＤ／Ｅ−／Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ配列に適合する配列をタンパク質データベースから探した。ファージライブラリー由来のペプチドの１つ、ＣＰＥＥＬＷＷＬＣが、ＭＭＰ−２ゼラチナーゼおよびＭＭＰ−９ゼラチナーゼの触媒ドメインに存在するＤＥＬＷ（Ｓ／Ｔ）ＬＧ配列に非常に類似していた（図１−１のＡ）。２つの負電荷を有するＤＥＬＷ−様配列は他の分泌型ＭＭＰにも存在するが、ＭＭＰ−１４などの膜型ＭＭＰには存在しない。
【００４４】
白血球β2インテグリンに結合するＭＭＰはこれまで報告されていなかった。そこで本発明者らは、特にＭＭＰ−９がβ2インテグリンのリガンドとなりうるかどうかを調べる研究に着手した。なぜならＭＭＰ−９ゼラチナーゼは主要な白血球ＭＭＰであり、β2インテグリン活性化の間に誘発されるからである。初めのステップとして、pepspot膜上に、２０量体のオーバーラップするペプチドとして全ｐｒｏＭＭＰ−９配列を合成した。αMＩドメインとの結合アッセイによって、ＭＭＰ−９触媒ドメインに位置する単一の活性ペプチドを明らかにした（図１−２のＤ）。Ｉドメインが省かれていて、膜を抗体のみでプローブした場合、結合は見られなかった。Ｉドメイン結合ペプチドの配列はＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬＷＳＬＧＫＧＶＶＶであり、この配列はファージディスプレイによって同定された結合配列を含んでいた（図１−２のＤ）。
【００４５】
活性型ＭＭＰ−９ペプチドは、負電荷を有する４つの連続したアミノ酸、ＤＤＤＥを含んでいた。この残基の重要性を調べるために、トリプトファンに最も近いアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基をアラニンと置換した。同時に、ペプチドの長さを１５量体に短縮した。アラニン変異生成は、pepspotフィルター上のＩドメイン結合を大幅に無効にした。ＯＤ値は２，０１０から４７６に低下した（表１−１および１−２）。他のＭＭＰ由来の負に帯電したペプチドも活性であるかどうかを調べるため、対応する１５量体を合成し、二重アラニン変異生成を行った。ＭＭＰ−１、２、３、７、８、９および１３由来の配列はαMＩドメインに結合したが、膜に固定されたＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）は結合しなかった。アラニン変異は常に結合を減少させた。
【００４６】
本発明者らは同様のpepspot分析を、Ｄ／Ｅ−／Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ様配列を含む公知のＩドメインリガンドのいくつかに対しても行った。ミエロペルオキシダーゼ、カタラーゼ、トロンボスポンジン−１および補体タンパク質ｉＣ３ｂに由来するペプチドは、このアッセイにおいて強くＩドメインに結合し、二重アラニン変異は結合を減少させた（表１−１および１−２参照）。試験した３つのｉＣ３ｂペプチド配列（peptide permutations）のうち、ＡＲＳＮＬＤＥＤＩＩＡＥＥＮＩが活性であった。このペプチドにおいては、酸性残基の後に疎水性のイソロイシンクラスターが続いていた。可溶性のＤＤＧＷペプチドはこのペプチドがＩドメインに結合するのを効率的に阻害した。補体Ｈ因子に由来するペプチドの１つおよびフィブロネクチンに由来するペプチドの１つがＩドメインに対する弱い結合を示した。ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、好中球阻害因子、Ｃｙｒ６１、フィブリノゲン、ＧＰ１ｂ、第Ｘ因子またはＥ−セレクチンに由来するペプチドは活性がなかった。
【００４７】
Pepspotシステムを用いたＤＤＧＷペプチドのアラニンスキャニング変異誘導法（alanine-scanning mutagenesis）によって、同様にグルタミン酸残基がＩドメインに対する結合に重要であることが示された（図１−３のＥ）。グリシンのアラニン変異またはトリプトファン残基のうちのひとつのアラニン変異もペプチドを不活化した。イソロイシン残基、ロイシン残基またはメチオニン残基の変異は許容された。Ｎ末端からＡＤＧＡ配列を削除してもＩドメインに対する結合には影響はなかったが、Ｃ末端のＧＡＡＧ配列の除去は結合を完全に阻止した。ペプチドはＣ末端でフィルターに固定化されるため、ＧＡＡＧのような充分なリンカー配列が重要と考えられた。本発明者らは、最短の活性配列を同定するために一連の短縮された環状ペプチドを試験した。この分析により、ＡＤＧＡ−ＣＤＤＧＷＣ−ＧＡＡＧではなく、ＡＤＧＡ−ＣＥＤＧＷＣ−ＧＡＡＧがαMＩドメインに対する結合を支持する最小のペプチドであることが明らかになった。負に帯電したカルボキシル基を、Ｉドメインに結合するのに正しい位置に配置するためには、アスパラギン酸塩と比べ、グルタミン酸塩のより長い側鎖がおそらく必要である。
【００４８】
プロゼラチナーゼは精製したαMβ2インテグリンおよびαLβ2インテグリン、ならびにそれらのＩドメインに結合する 
次に、マイクロタイターウェルをベースにしたサンドイッチアッセイを用いて、精製したインテグリンに対するゼラチナーゼの結合を調べた。プロゼラチナーゼは塗布したαMβ2インテグリンに、濃度依存的に結合した（図２のＡ）。興味深いことに、トリプシンまたはＡＰＭＡで活性化すると、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はインテグリンに対する結合能を失った。ｐｒｏＭＭＰ−２とｐｒｏＭＭＰ−９はαMβ2インテグリンおよびαLβ2インテグリンの両方、ならびにそれらに対応するＩドメイン（図２のＢおよびＣ）に結合した。αXＩドメインまたはα1β1インテグリンおよびα3β1インテグリンに対する結合は検出されなかった。
【００４９】
ＤＤＧＷペプチドは効率的な阻害剤であり、ｐｒｏＭＭＰ−９のαMＩドメインに対する結合を阻害し、ＩＣ50は２０μＭであった（図３−１のＡおよびＢ）。アスパラギン酸の負電荷がペプチドの活性に不可欠であることを実証するために、アスパラギン酸の位置にリシンを有するペプチド、ＡＤＧＡＣＩＬＷＭＫＫＧＷＣＧＡＡＧ（ＫＫＧＷ）を調製した。予想した通り、ＫＫＧＷペプチドは不活性であり、ｐｒｏＭＭＰ−９結合と競合しなかった。本発明者らはまた、αLＩドメインにおけるロバスタチンの結合部位が知られていたため（参考文献３４、３５）、ロバスタチンを試験することにも興味を持ったが、ロバスタチンは高濃度でもｐｒｏＭＭＰ−９と競合できなかった。
【００５０】
ｐｒｏＭＭＰ−９は、真のインテグリンのリガンドのように結合したが、カチオンキレート剤ＥＤＴＡ（５ｍＭ）はほとんど完全に結合を阻止した（図３−２のＣおよびＤ）。サンドイッチアッセイにおけるバックグラウンドの測定には抗体のみ（対照）、或いはＩＣＡＭ−１または野生型ＧＳＴのコーティングを用いた。ゼラチナーゼ結合ペプチドＣＴＴ（２００μＭ）はｐｒｏＭＭＰ−９とインテグリンの相互作用を、ＥＤＴＡと同様の効率で阻害した。ゼラチナーゼ阻害活性を欠いた対照ペプチドＳＴＴＨＷＧＦＴＬＳ（ＳＴＴ）およびＣＴＴＨＡＧＦＴＬＣ（Ｗ→Ａ ＣＴＴ）（参考文献２６）は効果がなかった。非ペプチド化学的ＭＭＰ阻害剤（Ｉｎｈ１）もｐｒｏＭＭＰ−９の結合を阻害した。ＥＤＴＡがゼラチナーゼとインテグリンの両方を阻害したため、インテグリンを阻害する抗体とリガンドペプチドを用いてβ2 インテグリンの特異的結合活性を実証した。公知のリガンド結合阻害抗体ＭＥＭ１７０、ＭＥＭ８３およびＬＭ２／１はｐｒｏＭＭＰ−９の結合を阻害した。対照抗体ＴＬ３は効果がなかった。Ｉドメイン結合ペプチドであるＬＬＧ−Ｃ４は不完全な阻害効果を示した。対照ペプチドとして用いたαVインテグリンリガンドであるＲＧＤ−４Ｃは、ｐｒｏＭＭＰ−９の結合には影響を与えなかった。インテグリンの純度は典型的に９０％を超え、Ｉドメインの純度は９５％であり、プロゼラチナーゼが調製物中の不純物に結合したとは考えられない。
【００５１】
プロゼラチナーゼ−インテグリン複合体も、ｐｒｏＭＭＰ−９およびｐｒｏＭＭＰ−２のソースとしてＨＴ１０８０ならし培地を用いた共沈実験によって得、ザイモグラフィーによって分析した。プロゼラチナーゼは、αMβ2 インテグリンまたはαMＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質をベイト（bait）として用いた時、これらと共沈した。培地に添加されたインテグリンはαM抗体ＯＫＭ１０と免疫沈降した（図４のＡ）。αMＩドメイン−ＧＳＴタンパク質はグルタチオンビーズで沈降（pull down）した（図４のＢ）。ＣＴＴは阻害効果を有したが、ＳＴＴは有さなかった。ＬＭ２／１、ＩＣＡＭ−１またはＬＬＧ−Ｃ４によるＩドメインの阻害もプロゼラチナーゼの沈降（pull-down）に影響した。対照ＧＳＴはゼラチナーゼと共沈しなかった。ＡＰＭＡで処理したＨＴ−１０８０培地またはＡＰＭＡ活性化ＭＭＰ−９を用いた時、αMβ2またはＩドメインと共沈するゼラチナーゼの活性型は検出されなかった（図示しない）。
【００５２】
ゼラチナーゼ阻害剤ＣＴＴおよびＩｎｈ１はｐｒｏＭＭＰ−９のインテグリンに対する結合を阻止したため、ＣＴＴおよびＩｎｈ１がｐｒｏＭＭＰ−９に強く結合することが予想された。これについてさらに理解するために、固定化したＣＴＴペプチドに対するｐｒｏＭＭＰ−９の結合を調べた。ｐｒｏＭＭＰ−９はＣＴＴ−ＧＳＴ融合タンパク質に特異的に結合した（図５のＡ）が、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴには結合しなかった。ＣＴＴおよびＩｎｈ１は１００μＭの濃度で結合において効率的に競合したが、Ｗ→Ａ ＣＴＴは競合しなかった。ｐｒｏＭＭＰ−９調製物はザイモグラフィー分析で検出可能な量の活性型ＭＭＰ−９を含有しておらず、ｐｒｏＭＭＰ−９をＡＰＭＡで活性化した後ＣＴＴ−ＧＳＴ結合が増加した。ＣＴＴおよびＩｎｈ１もまたＰＤＢｕにより活性化したＴＨＰ−１白血病細胞（図５のＢ）またはＨＴ１０８０線維肉腫細胞（図示しない）の培地に分泌されたｐｒｏＭＭＰ−９に結合した。ｐｒｏＭＭＰ−９のゼラチン分解活性の時間依存性の減少がＣＴＴ （パネル１）およびＩｎｈ１（パネル３）で見られたが、Ｗ→Ａ ＣＴＴペプチド（パネル４）では見られなかった。ウェスタンブロット分析によってＣＴＴは、細胞によるｐｒｏＭＭＰ−９の分泌を減少させないことが示された（パネル２）。さらに、ＣＴＴ複合体は可逆的であり、試料の凍結・解凍を繰返すと消滅した。
【００５３】
プロゼラチナーゼとβ2 インテグリンの細胞表面複合体の実証 
白血球表面上でプロゼラチナーゼがβ2インテグリンとの複合体として存在するかどうかを調べるために、免疫沈降および共局在化を行った。まず、休止状態のＴＨＰ−１単球性白血病細胞を、in vivoでの白血球活性化を模したＰＤＢｕによる誘導を経て試験した。ＰＤＢｕによるＴＨＰ−１細胞刺激により、ＭＭＰ−９が上向きに調節された（データは示さない）。ＴＨＰ−１細胞の細胞表面糖タンパク質をトリチウム［3Ｈ］で標識し、β2インテグリン抗体およびＭＭＰ−９抗体で免疫沈降した。ＰＤＢｕで活性化した細胞の中から、αM鎖抗体ＯＫＭ１０およびβ2鎖抗体７Ｅ４は、インテグリンのαM鎖（１６５ｋＤａ）およびβ2鎖（９５ ｋＤａ）に対応する２つの［3Ｈ］標識タンパク質を免疫沈降した（図６のＡ、レーン９〜１０）。重要なことに、ポリクローナルＭＭＰ−９抗体は同じ２つのインテグリン鎖を免疫沈降した（レーン７）。非活性化細胞においては、αM鎖およびβ2鎖は存在したが、αMおよびβ2のＭＭＰ−９抗体との共沈は実質的に見られなかった。ＭＭＰ−９抗体によるインテグリン鎖の共沈は、ＣＴＴペプチドによって阻止された（レーン８）。対照抗体（ＴＬ３）はタンパク質を沈降しなかった。
【００５４】
［3Ｈ］標識細胞では、ｐｒｏＭＭＰ−９に対応するバンドは見られなかった。これはおそらく、ｐｒｏＭＭＰ−９の炭水化物が十分に標識されていないためであろう。そこで、ＰＤＢｕにより活性化したＴＨＰ−１細胞をウェスタンブロット法で分析した（図６のＢ）。ｐｒｏＭＭＰ−９は、ＭＭＰ−９、αMまたはαLに対する抗体とたやすく免疫沈降したが、対照抗体とは免疫沈降しなかった。ＭＭＰ−９抗体も同様にαMを免疫沈降したが、αL鎖を免疫沈降しなかった。ＭＭＰ−２抗体も同様に、αMを共沈したが、αLを共沈しなかった。細胞溶解産物をαM抗体ＯＫＭ−１０で予備清掃すると、免疫沈降するαMおよびｐｒｏＭＭＰ−９の量は明らかに減少した（レーン６）。αL抗体ＴＳ２／４を用いた予備清掃ではαMまたはｐｒｏＭＭＰ−９をそれほど除去しなかったが、αLの沈降を完全に阻止した（レーン７）。
【００５５】
ＴＨＰ−１細胞はαL鎖を多量に発現しない（参考文献２０）ため、αMよりもαLを多く発現するジャーカットＴ細胞系を試験した（参考文献２８）。ＰＤＢｕで活性化した後、ＭＭＰ−９抗体およびＭＭＰ−２抗体によるαLの著しい免疫沈降が見られた（図６のＣ）。さらに、αL抗体は、αM抗体と比べ、ｐｒｏＭＭＰ−９をより共沈させた。ジャーカット細胞またはＴＨＰ−１細胞において、ｐｒｏＭＭＰ−９は、ＭＭＰ−２抗体と共沈しなかった。
【００５６】
蛍光と共焦点顕微鏡で調べたところ、ＴＨＰ−１細胞をＰＤＢｕで活性化するとｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2が細胞表面に共局在化することが明らかになった（それぞれ、図７のＡとＢ）。より高い倍率を用いると、上記の共局在化は主として細胞表面クラスターに見られ（図７のＢ）、それほどではないが細胞どうしが接触する領域にみられた（図示しない）。活性型ＭＭＰ−９がαMβ2と結合しなかったため、αMβ2と共局在化するＭＭＰ−９はｐｒｏＭＭＰ−９であると考える。ＰＤＢｕで活性化しなければ、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2はほとんど共局在化しなかった。一次抗体を省いたときには、二次抗体は細胞を染色しなかった（データは示さない）。ｐｒｏＭＭＰ−９またはαMβ2をブロッキングするために、細胞をＣＴＴペプチドまたは組換え可溶性ＩＣＡＭ−１とプレインキュベートした場合、細胞表面クラスターは形成されず、ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2の共局在化は見られなかった（図示しない）。ｐｒｏＭＭＰ−９とαMβ2の共局在化はホルボールエステル刺激の後にジャーカット細胞上にも見られた（図示しない）。
【００５７】
ＤＤＧＷを用いたプロゼラチナーゼ／β2インテグリン複合体の阻害は細胞に結合したｐｒｏＭＭＰ−９を脱離させて細胞遊走を阻害するが、接着は阻害しない
ＤＤＧＷペプチドはインテグリンリガンドであるが、それが、白血球の接着を支持するかどうかが１つの疑問であった。そこでヒト骨髄単核細胞であるＴＨＰ−１細胞の接着を、固定化したグルタルアルデヒドで分子架橋したペプチドで調べた。ホルボールエステルにより活性化した細胞はＤＤＧＷペプチドに効率的に結合したが、細胞の活性化なしには結合は見られなかった（図８のＡ）。正の対照である、組換えインテインにより製造したＡＤＧＡ−ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ−ＧＡＡＧペプチドは接着を支持したが、ＤＤＧＷペプチドとは違って、インテグリンの活性化がなくとも接着を支持した。急性骨髄性白血病細胞系ＯＣＩ／ＡＭＬ−３もＤＤＧＷに非常によく結合したが、β2インテグリンを欠くヒト線維肉腫 ＨＴ１０８０細胞は結合しなかった（図示しない）。ＴＨＰ−１細胞は、ＤＤＧＷに接着したので、次にフィブリノゲンおよびＩＣＡＭ−１に対するβ2インテグリン依存性接着へのペプチドの影響を調査した。興味深いことに、ＤＤＧＷはフィブリノゲンに対する細胞接着を阻害しないが、ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドはこれまでに報告されているように接着を阻害した（図８のＢ）。同様に、ＤＤＧＷは、組換えαMＩドメインの固定化したフィブリノゲンに対する結合を阻害しなかった（図示しない）。ＤＤＧＷはまた、ＩＣＡＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質に対する接着も阻害しなかった。対照として用いた、β2インテグリンに対する阻害抗体７Ｅ４はＩＣＡＭ−１の結合を阻止し、これはＴＨＰ−１細胞がβ2インテグリン依存的に結合していたことを示す（図８のＣ）。また、ＤＤＧＷがＴＨＰ−１のＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ融合タンパク質に対する接着を阻害する効果がないことも明らかになった（図示しない）。
【００５８】
上記の研究によって生じた２つ目の疑問は、ＤＤＧＷペプチドが細胞に結合したｐｒｏＭＭＰ−９を脱離することができるかどうかであった。ＴＨＰ−１細胞をＤＤＧＷの存在下に４８時間培養した場合、ゼラチンザイモグラフィーで調べた結果、ならし培地においてｐｒｏＭＭＰ−９レベルの増加が見られた（図８のＤ）。ペプチドは、培地中で、単量体のｐｒｏＭＭＰ−９および二量体のｐｒｏＭＭＰ−９の両方を増加させた。これに対して、ＣＴＴは活性型ｐｒｏＭＭＰ−９をわずかに減少させるか、阻害した。ＫＫＧＷおよびＷ→Ａ ＣＴＴは影響を及ぼさなかった。
【００５９】
本発明者らはまた、白血球遊走におけるプロゼラチナーゼ／β2インテグリン複合体の役割を、トランスウェルアッセイを用いて調べた。トランスウェルアッセイにおいては、塗布された基質タンパク質またはリガンドタンパク質の選択によって白血球遊走を調節することができる。ＣＴＴペプチド、ＬＬＧペプチドおよびＤＤＧＷペプチドが、２００μＭを超える濃度で、４８時間の時間枠において毒性がないことをＭＴＴアッセイを用いて試験した。細胞培地中の１０％血清で被覆したトランスウェルを用いて、まず、ホルボールエステル刺激または接着性基質タンパク質の非存在下でのＴＨＰ−１細胞の基礎遊走（basal migration）に対するペプチドの影響を調べた。上記の条件下で、ＣＴＴ、ＬＬＧ−Ｃ４またはゼラチナーゼ阻害剤Ｉｎｈ１は、２００μＭの濃度でＴＨＰ−１の遊走に影響せず、これは、ゼラチナーゼまたはβ2インテグリンの積極的な関与がなかったことを示している（図９のＡ）。本発明者らは以前、トランスウェルがＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ融合タンパク質で被覆されている場合、ＴＨＰ−１細胞はβ2インテグリン依存的に接着および遊走することを示した（参考文献１４）。したがって、トランスウェルをＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ融合タンパク質またはＧＳＴのみで被覆した。ＤＤＧＷおよびＣＴＴペプチドの両方は、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ層上でＴＨＰ−１細胞の遊走を阻害したが、ＫＫＧＷは阻害しなかった（図９のＢ）。可溶性のＬＬＧ−Ｃ４ペプチドも遊走を阻害した。ＧＳＴ被覆の存在下では、細胞遊走はごくわずかであった。ＤＤＧＷペプチドの効果がβ2インテグリンに依存していることを検証するために、これらのインテグリンを欠くＨＴ１０８０線維肉腫細胞をＣＴＴ、ＤＤＧＷ、ＫＫＧＷまたはＬＬＧ−Ｃ４の存在下で遊走させた。これらのペプチドのうち、ＣＴＴのみが細胞遊走を阻害する能力があった（図９のＣ）。
【００６０】
ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2インテグリン複合体のペプチド阻害剤は好中球遊走を阻害する 
上記のようにpepspot分析により、ｐｒｏＭＭＰ−９がインテグリンと相互作用する部位はｐｒｏＭＭＰ−９の触媒ドメインに存在する２０個のアミノ酸配列（ＱＧＤＡＨＦＤＤＤＥＬＷＳＬＧＫＧＶＶＶ）であることが示された。pepspotシステムによる更なるスクリーニングにより、この配列をヘキサペプチドＨＦＤＤＤＥにまで短縮しても充分なインテグリン結合活性が達成されることが分かった（データは示さない）。そのような短い配列がｐｒｏＭＭＰ−９の生物活性部位であることを確認するために、まず、細菌で発現させたＭＭＰ−９の組換えドメインを作成した（図１０のＡ）。ΔＭＭＰ−９はｐｒｏドメイン（Ｐｒｏ）と触媒ドメインからなるが、ヘモペキシンドメインを欠いている。ＩＩ型フィブロネクチン繰返し配列（ＦｎＩＩ）は重要な基質結合領域なので、これも別の組換えタンパク質として作成した。ｐｒｏ触媒ドメイン構築体ΔＭＭＰ−９は、野生型ｐｒｏＭＭＰ−９とほぼ同じ効率でαMのＩドメインと結合した（図１０のＢ）。ＦｎＩＩタンパク質は活性をほとんど欠いていた。固相pepspot分析で同定されたＨＦＤＤＤＥペプチドをペプチド合成で製造すると高い活性を示し、ｐｒｏＭＭＰ−９のαMＩドメインへの結合を阻害し、その際、２０μＭでＩＣ50を達成した（図１０のＣ）。結合されたｐｒｏＭＭＰ−９の決定は、ＦｎＩＩドメインにあるエピトープを認識するＧＥ−２１３抗体を用いて行なった（データは示さない）。配列を乱したスクランブルペプチドＤＦＥＤＨＤ（同じ負に帯電したアミノ酸を有する）は活性を示さなかった。ＨＦＤＤＤＥは、ファージディスプレイで発見した上述のαMＩドメイン結合性ペプチドであるＤＤＧＷと同様に活性であった。ＤＤＧＷの対照用ペプチドであるＫＫＧＷは効果を示さなかった。ＭＭＰファミリーのペプチドにはＨＦＤＤＤＥ配列が高度に保存されているので、本発明者らは、αMＩドメインの好中球コラゲナーゼＭＭＰ−８への結合についても調べた。Ｉドメインは、ｐｒｏＭＭＰ−９に対するのと同様に、ｐｒｏＭＭＰ−８に対して、ＤＤＧＷで阻害可能な結合を示した（図１０のＤ）。ＩＣＡＭ−１とフィブリノゲンはいずれのｐｒｏＭＭＰとも競合せず、このことは、Ｉドメインにおいては、基質タンパク質とｐｒｏＭＭＰに対する結合部位は異なることを示唆する。
【００６１】
インテグリンが活性化された後、ＰＭＮはｐｒｏＭＭＰ−９への接着能力を示した。ＰＭＡで刺激したＰＭＮは、ｐｒｏＭＭＰ−９に対するのとほとんど同じ強度で、マイクロタイターウェルに塗布したΔＭＭＰ−９に結合した（図１１のＡ）。ＰＭＮをＣ５ａまたはＴＮＦ−αで刺激すると同様の結果が得られ、ＰＭＮの接着が３倍となった（図１１のＢ）。ＦｎＩＩドメインはＰＭＮの接着を支持しなかった。ＰＭＮの接着はＨＦＤＤＤＥ（５０μＭ）、ＤＤＧＷ（５０μＭ）、可溶性αMＩドメイン、ＭＥＭ１７０抗体により阻害され（図１１のＣ）、β2インテグリンの関与する結合であることを示した。対照ペプチド（ＤＦＥＤＨＤ、ＫＫＧＷ）および無関係なモノクロナール抗体（抗ＧＰＡ）は効果を示さなかった。ＣＴＴペプチドはＭＭＰ−９の触媒ドメインに結合したが、ＭＭＰ阻害活性を欠くＷ→Ａ ＣＴＴ対照ペプチドは結合せず（未公開の結果）、また、ＣＴＴペプチドはＰＭＮの接着を阻害した。ＭＭＰ−９抗体は部分的に阻害した。
【００６２】
本発明者らはまた、トランスフェクトによりαMβ2を発現したＬ細胞についても調べてみた。αMβ2発現Ｌ細胞トランスフェクタントは、ＰＭＮと同様に、ｐｒｏＭＭＰ−９とΔＭＭＰ−９に結合し、そして、ＩドメインリガンドとＭＭＰ−９阻害剤は結合を弱めた（図１１のＤ）。トランスフェクトした細胞はまた、ＦｎＩＩドメインに弱い接着を示したが、調べたペプチドと抗体はこの結合を阻害しなかった。野生型のＬ細胞とＬＡＤ−１のいずれもｐｒｏＭＭＰ−９やそのドメインには結合しなかった。
【００６３】
ＰＭＮのin vitroでの遊走をトランスウェルフィルターアッセイで研究した。人工的なβ2インテグリンリガンドＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴで被覆することにより、細胞遊走がβ2インテグリンに依存するようになる（参考文献１４）。ＰＭＡで活性化したＰＭＮのＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ層中での遊走は、ＧＳＴ層中における遊走の５倍であった（図１２のＡ）。ＨＦＤＤＤＥ（２００μＭ）は、ＰＭＡで刺激された細胞の遊走を阻害したが、不活性化細胞の基礎的遊走は阻害しなかった。ＤＤＧＷ、ＣＴＴ、ＭＥＭ１７０（２０μｇ／ｍｌ）および抗ＭＭＰ−９ポリクロナール抗体（２０μｇ／ｍｌ）は類似の活性を示し、ＰＭＡで活性化した細胞の遊走のみに影響を与えた。対照ペプチドと対照抗体（抗ＴＡＴ−２）は効果を示さなかった。内皮貫通遊走アッセイ（transendothelial migration assay）からも同様の結果が得られた（図１２のＢ）。Ｃ５ａまたはＴＮＦ−αによる化学走性によりＰＭＮのトランスマイグレーション（transmigration）が５〜１０倍に増加し、また、それをＤＤＧＷ、ＨＦＤＤＤＥおよびＣＴＴが阻害したが、対照ペプチドは阻害しなかった。同様に、αM抗体とＭＭＰ−９抗体は阻害したが、対照抗体（抗ＧＰＡ）は阻害しなかった。本発明者らはまた、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴで被覆したトランスウェルフィルターを通過するＴＨＰ−１白血病細胞の遊走に対して各種ペプチドが与える影響を調べた。結果はＰＭＮの場合におけるのと同じであった。ＨＦＤＤＤＥ、ＤＤＧＷおよびＣＴＴはＴＨＰ−１の遊走を阻害したが、対照ペプチドは阻害しなかった（図１２のＣ）。
【００６４】
上記のように本発明者らは、ＤＤＧＷペプチドは、ＴＨＰ−１細胞からｐｒｏＭＭＰ−９を脱離させることができることを示した。本発明者らはまた、ＨＦＤＤＤＥペプチドもｐｒｏＭＭＰ−９を脱離させることができるが、ＤＤＧＷペプチドを用いた場合ほど有効性が高くないことを見出した（図１２のＤ）。配列を乱したスクランブルペプチドはｐｒｏＭＭＰ−９の脱離を誘導しなかった。１６時間のインキュベーションの間、各種ペプチドはｐｒｏＭＭＰ−２の分泌に影響しなかった。
【００６５】
ＰＭＮのin vivoでの遊走を調べるために、本発明者らはチオグリコレートで誘発したマウス腹膜炎モデルを用いた。チオグリコレートで刺激してから３時間以内に腹腔に浸潤した細胞の大部分は、クリスタルバイオレット染色によりＰＭＮであると判定された。この炎症モデルにおいては、ＤＤＧＷペプチドとＨＦＤＤＤＥペプチドは強いin vivo活性を示した（図１３のＡ）。ＤＤＧＷペプチドまたはＨＦＤＤＤＥペプチドを尻尾へ静脈注射することでＰＭＮの腹腔内蓄積を阻害した。対照として用いたＫＫＧＷペプチドとＤＦＥＤＨＤペプチドは効果を示さなかった。ＤＤＧＷペプチドとＨＦＤＤＤＥペプチドの効果は濃度依存性であり、ＤＤＧＷペプチドの投与量５０μｇ／マウスとＨＦＤＤＤＥペプチドの投与量５００μｇ／マウスで、９０％までの阻害を達成できた。ＤＤＧＷペプチドは、５μｇ／マウスの投与量（０．１ｍｇ／マウス組織１ｋｇの有効量に相当する）でさえも活性を示した。チオグリコレートで刺激した後、ＰＢＳを用いた対照と比較して約２０倍のＰＭＮが腹腔内に存在していた。採取した炎症性ＰＭＮは、ｐｒｏＭＭＰ−９／αMβ2複合体の存在により二重免疫蛍光法で染色された（図１３のＢ）。ＰＢＳ注射の後に採取した細胞は上記複合体を欠いており、インテグリンを発現していたが、細胞表面ＭＭＰ−９を有さなかった（図１３のＣ）。採取した腹腔液の上清をザイモグラフィーで分析したところ、ＰＢＳの場合と比較して、チオグリコレートがゼラチナーゼレベルの上昇を誘導したことが示された（図１３のＤ）。ＤＤＧＷペプチドとＨＦＤＤＤＥペプチドは、細胞遊走の阻害にともない、ゼラチナーゼレベルの上昇を防止したが、スクランブルペプチドはそのような活性を示さなかった。
【００６６】
【表１−１】
2006527740.tif 000002
【００６７】
【表１−２】
2006527740.tif 000003
【００６８】
参考文献 
1.    Gahmberg, C.G. (1997) Curr. Opin. Cell Biol. 9, 643-650.
2.    Colombatti, A., and Bonaldo, P. (1991) Blood 77, 2305-2315.
3.    Yakubenko, V. P., Lishko, V. K., Lam, S. C., and Ugarova, T. P. (2002) J. Biol. Chem. 107, 1
4.    Davis, G.E. (1992) Exp. Cell Res. 200, 242-252.
5.    Johansson, M. W, Patarroyo, M., Oberg, F., Siegbahn, A., and Nilsson, K. (1997) J Cell Sci. 110, 1133-1139.
6.    Cai, T. Q., and Wright, S. D. (1996) J. Exp. Med. 184, 1213-1223.
7.    Pluskota, E., Soloviev, D. A., and Plow, E. F. (2003) Blood 101, 1582-1590.
8.    Staunton, D. E., Dustin, M. L., Erickson, H. P., and Springer, T. A. (1990) Cell 61, 243-254.
9.    Berendt, A. R., McDowall, A., Craig, A. G., Bates, P. A., Sternberg, M. J., Marsh, K., Newbold, C. I., and Hogg, N. (1992) Cell 68, 71-81.
10.   Shimaoka, M., Xiao, T., Liu, J. H., Yang, Y., Dong, Y., Jun, C. D., McCormack, A., Zhang, R., Joachimiak, A., Takagi, J., Wang, J. H., and Springer, T. A. (2003) Cell 112, 99-111.
11.   Li, R., Xie, J., Kantor, C., Koistinen, V., Altieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995) J. Cell Biol. 129, 1143-1153.
12.   Ugarova, T. P., Solovjov, D. A., Zhang, L., Loukinov, D. I., Yee, V. C., Medved, L. V., and Plow, E. F. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22519-22527.
13.   Schober, J.M., Lau, L.F., Ugarova, T.P., Lam, S.C. (2003) J. Biol. Chem. In press May 6, PMID:12736251.
14.   Koivunen, E., Ranta, T. M., Annila, A., Taube, S., Uppala, A., Jokinen, M., van Willigen, G., Ihanus, E., and Gahmberg, C. G. (2001) J. Cell Biol. 153, 905-916.
15.   Pasqualini, R., Koivunen, E., and Ruoslahti, E. (1995) J. Cell Biol. 130, 1189-1196. 
16.   Boyum, A. (1968). Scand. J. Clin. Lab Invest.  97, 77.
17.   Mustjoki, S., R. Alitalo, E. Elonen, O. Carpen, C. G. Gahmberg, and A. Vaheri. (2001). Br. J. Haematol. 113, 989. 
18.   Hermand, P., M. Huet, I. Callebaut, P. Gane, E. Ihanus, C. G. Gahmberg, J. P. Cartron, and P. Bailly. (2000). J. Biol. Chem. 275, 26002. 
19.   Li, R., Nortamo, P., Valmu, L., Tolvanen, M., Huuskonen, J., Kantor, C., and Gahmberg, C.G. (1993) J. Biol. Chem. 268, 17513-17518.
20.   Li, R., Xie, J., Kantor, C., Koistinen, V., Altieri, D. C., Nortamo, P., and Gahmberg, C. G. (1995) J. Cell Biol. 129, 1143-1153.
21.   Nortamo, P., Patarroyo, M., Kantor, C., Suopanki, J., and Gahmberg, C.G. (1988) Scand. J. Immunol. 28, 537-546.
22.   Wright, S.D., Rao, P.E., Van Voorhis, W.C., Craigmyle, L.S., Iida, K., Talle, M.A., Westberg, E.F., Goldstein, G., and Silverstein, S.C. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5699-5703.
23.   Tian, L., Kilgannon, P., Yoshihara, Y., Mori, K., Gallatin, M., Carpen, O., and Gahmberg, C.G. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 810-818.
24.   Kjeldsen, L., Johnsen, A. H., Sengelov, H., and Borregaard, N. (1993) J. Biol. Chem. 268, 10425-10432.
25.   Koivunen, E., Arap, W., Valtanen, H., Rainisalo, A., Medina, O. P., Heikkila, P., Kantor, C., Gahmberg, C. G., Salo, T., Konttinen, Y. T., Sorsa, T., Ruoslahti, E., and Pasqualini, R. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 768-774.
26.   Bjorklund, M., Valtanen, H., Savilahti, H., and Koivunen, E. (2003) Comb. Chem. High Throughput Screen. 6, 29-35.
27.   Heiskanen, T., Lundkvist, A., Soliymani, R., Koivunen, E., Vaheri, A., and Lankinen, H. (1999) Virology 262, 321-332. 
28.   Tian, L., Yoshihara, Y., Mizuno, T., Mori, K., and Gahmberg, C. G. (1997) J. Immunol. 158, 928-936.
29.   Wang, C., Curtis, J. E., Minden, M. D., and McCulloch, E. A. (1989) Leukemia 3, 264-269.
30.   Griggs, D.W., Schmidt, C.M., and Carron, C.P. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22113-22119.
31.   Michishita, M., Videm, V., and Arnaout, M.A. (1993) Cell 72, 857-867.
32.   Sorsa, T., Salo, T., Koivunen, E., Tyynela, J., Konttinen, Y. T., Bergmann, U., Tuuttila, A., Niemi, E., Teronen, O., Heikkila, P., Tschesche, H., Leinonen, J., Osman, S., and Stenman, U.H. (1997) J. Biol. Chem. 272, 21067-21074.
33.   Gahmberg, C. G., and Andersson, L. C. (1977) J. Biol. Chem. 252, 5888-5894.
34.   Kallen, J., Welzenbach, K., Ramage, P., Geyl, D., Kriwachi, R., Legge, G., Cottens, S., Weitz-Schmidt, G., and Hommel, U. (1999) J. Mol. Biol. 292, 1-9.
35.   Weitz-Schmidt, G., Welzenbach, K., Brinkmann, V., Kamata, T., Kallen, J., Bruns, C., Cottens, S., Takada, Y., and Hommel, U. (2001) Nat. Med. 7, 687-692.
36.    Ajuebor, M. N., A. M. Das, L. Virag, R. J. Flower, C. Szabo, and M. Perretti. (1999). J. Immunol. 162, 1685.
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１−１】プロゼラチナーゼのＩドメイン結合部位の同定。（Ａ）αMのＩドメインに特異的に結合したファージディスプレイペプチドの配列。コンセンサス配列は太字で示す。最も結合力の強いペプチド（ＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣ）と最も類似性の高いペプチド（ＣＰＥＥＬＷＷＬＣ）を、ヒトＭＭＰ（括弧内はアクセッション番号）に対してアラインメントさせた。（Ｂ）ＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣペプチドを担持するファージまたは対照ペプチドを担持するファージを、固定化したαMのＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質（２０ｎｇ／ウェル）に対し、１５μＭのＤＤＧＷペプチドまたはＬＬＧ−Ｃ４ペプチドの存在下または非存在下で結合させた結果である。結合したファージは抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体を用いて検出した。結果を３つの試料の平均吸光度±標準偏差で示す。
【図１−２】プロゼラチナーゼのＩドメイン結合部位の同定。（Ｃ）αL、αMまたはαXのＩドメインとＧＳＴの融合体でマイクロタイターウェルを図１−１（Ｂ）と同様に被覆し、ＣＩＬＷＭＤＤＧＷＣペプチド担持ファージまたは対照ペプチド担持ファージの結合を測定した。（Ｄ）ｐｒｏＭＭＰ−９の全配列をカバーするペプチドをpepspot膜上にオーバーラップペプチドとして合成した。０．５μｇ／ｍｌのαMＩドメインをペプチドに結合させ、抗αMＩドメイン抗体ＬＭ２／１を用いて免疫検出を行った。αMＩドメイン結合ペプチド１３（矢印で示したもの）を太字で示し、亜鉛結合酵素配列には下線を付した。ｐｒｏＭＭＰ−９のドメイン構造をわかりやすくするため、プロドメイン（Ｐｒｏ）、II型フィブロネクチン繰返し配列を有する触媒ドメイン（Ｃａｔ）およびヘモペキシンドメイン（Ｐｅｘ）のそれぞれを書き込みで示した。
【図１−３】プロゼラチナーゼのＩドメイン結合部位の同定。（Ｅ）短縮したアラニン変異ペプチドをpepspotフィルター上に合成し、５μｇ／ｍｌの組換えαMＩドメインでプローブした。結合したＩドメインは５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体 ＭＥＭ−１７０を用いて測定後、ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体とＥＣＬで検出した。結合は濃度計でスキャニングして定量した。棒線は、単一のペプチドスポットへのαMＩドメインの結合を、平方ミリメートル当たりの任意の光学濃度単位（optical density units/mm2）で示したもの。別々に行った３回の実験から、同様の結果が得られた。
【図２】精製したインテグリンとＩドメインに対するプロゼラチナーゼの結合。（Ａ）ｐｒｏＭＭＰ−９、ｐｒｏＭＭＰ−２またはそれぞれのトリプシン活性型を、αMβ2インテグリンで被覆したウェルに対し、図に記載の濃度で結合させた。結合は適当なＭＭＰ抗体を用いて測定した。測定結果を、３つのウェルの測定値の平均値±標準偏差で示す（（Ｂ）、（Ｃ）についても同様））。（Ｂ）インテグリン（αLβ2、αMβ2、α1β1、α3β1）またはＩドメイン（αL、αM、αX）で被覆したマイクロタイターウェルへの、８０ｎｇ／ウェルのｐｒｏＭＭＰ−９の結合実験を行った。結合は抗ＭＭＰ−９抗体を用いて測定した。（Ｃ）８０ｎｇ／ウェルのｐｒｏＭＭＰ−２をインテグリンαLβ2、αMβ2、α1β1またはＩドメインαL、αM、αXに結合させた。結合は抗ＭＭＰ−２抗体を用いて測定した。
【図３−１】ｐｒｏＭＭＰ−９／β2インテグリン複合体の阻害剤。（Ａ）αMＩドメインとＧＳＴの融合体およびαLＩドメインとＧＳＴの融合体をマイクロタイターウェルに固定した。２００μＭの異なる種類のペプチドまたは１００μＭのロバスタチンを含んだ０．５％ＢＳＡ含有緩衝液の存在下または非存在下、１００ｎｇ／ウェルのｐｒｏＭＭＰ−９を注入した。ｐｒｏＭＭＰ−９の結合は抗ＭＭＰ−９モノクローナル抗体を用いて検出した。検出結果は、阻害剤の非存在下での結合を１００％、ｐｒｏＭＭＰ−９を注入しなかった場合を０％とした場合のパーセンテージで示す。（Ｂ）ＤＤＧＷペプチドがαMへのｐｒｏＭＭＰ−９の結合を投与量依存的に阻害することを示す。競合させるために濃度の異なるペプチドを投与した以外は、（Ａ）と同様にアッセイを行った。３つの試料を一組として行うアッセイによって得られた結果を、代表的な実験によって得られた数値の平均値±標準偏差で示した。
【図３−２】ｐｒｏＭＭＰ−９／β2インテグリン複合体の阻害剤。（Ｃ）５ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭのＭＭＰ阻害剤−１、２００μＭのＣＴＴ、２００μＭのＳＴＴ、４０μｇ／ｍｌのＭＥＭ−１７０、および対照となる４０μｇ／ｍｌのＴＬ３抗体の存在下または非存在下で、αMβ2インテグリンまたはαLβ2インテグリンへのｐｒｏＭＭＰ−９の結合を実験した。一次抗体と二次抗体のバックグラウンド値は、ウェルへのｐｒｏＭＭＰ−９注入を省略するか或いはウェルをＩＣＡＭ−１で被覆して測定した。（Ｄ）精製したαMＩドメインとＧＳＴとの融合タンパク質およびαLＩドメインとＧＳＴとの融合タンパク質、または野生型ＧＳＴへのｐｒｏＭＭＰ−９の結合を、図に記載の競合ペプチドの存在下または非存在下で調べた。ｐｒｏＭＭＰ−９を省略した場合のバックグラウンド値を対照として示す。
【図４】プロゼラチナーゼとβ2インテグリンの共沈降。（Ａ）３μｇのαMβ2インテグリンを、２００μＭのＣＴＴまたはＳＴＴの存在下または非存在下、ｐｒｏＭＭＰ−９とｐｒｏＭＭＰ−２を含むＨＴ１０８０培地試料５００μｌ中で２時間インキュベートした。上記インテグリンをＯＫＭ１０抗体で免疫沈降し、得られた免疫沈降物をゼラチンザイモグラフィーで分析した。対照実験では、インテグリンの替わりにＩＣＡＭ−１を培地中でインキュベートした。（Ｂ）ｐｒｏＭＭＰ−９とｐｒｏＭＭＰ−２を含むＨＴ１０８０培地試料５００μｌを３μｇのαMＩドメイン−ＧＳＴ融合体、または対照であるＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ融合体と共にインキュベートした。ＩＣＡＭ−１、ＬＭ２／１、ＣＴＴ、ＳＴＴまたはＬＬＧ−Ｃ４を競合ペプチドとして用いた。ＧＳＴはグルタチオンビーズを使って沈降（pull down）させ、結合したタンパク質をザイモグラフィーで分析した。図中の挿入箇所中のレーン１：未処理のＨＴ１０８０培地中に存在する酵素原ｐｒｏＭＭＰ−２とｐｒｏＭＭＰ−９。レーン２：対照ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴと共に沈降したゼラチナーゼ無し。レーン３：αMＩドメイン−ＧＳＴ融合タンパク質によって共沈降したｐｒｏＭＭＰ−９とｐｒｏＭＭＰ−２。
【図５】ＣＴＴペプチドは潜伏型ＭＭＰ−９と活性型ＭＭＰ−９の両方に結合することを示す。（Ａ）ｐｒｏＭＭＰ−９またはＡＰＭＡ活性型ＭＭＰ−９のＣＴＴ−ＧＳＴへの結合を、競合ペプチドとして１００μＭのＣＴＴ、１００μＭのＷ→Ａ変異ＣＴＴおよび１００μＭのＩｎｈ１の存在下または非存在下で実験した。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴを対照ＧＳＴとした。結合は図２および図３−１、３−２と同様の方法で測定した。ｐｒｏＭＭＰ−９が存在しないときのバックグラウンド値を示す。（Ｂ）濃度２００μＭのＣＴＴ、Ｉｎｈ１またはＷ→Ａ ＣＴＴを含む無血清培地中でＴＨＰ−１細胞をインキュベートした。図に記載の経過時間において採取した培地の試料をザイモグラフィー（パネル１、３および４）またはウェスタンブロット法（パネル２）で分析した。
【図６】ＰＤＢｕにより活性化したＴＨＰ−１細胞やジャーカット細胞中にαMβ2インテグリンやαLβ2インテグリンとの複合体として現れるプロゼラチナーゼ。（Ａ）トリチウム化ホウ水素化過ヨウ素酸塩を用いてＴＨＰ−１細胞表面タンパク質を［3Ｈ］標識し、免疫沈降で分析した。競合ペプチドとして２００μＭのＣＴＴを用いた。免疫沈降にかけた試料を８〜１６％ポリアクリルアミドゲル上でほぐし、得られたフィルムを３日間曝露した。レーン１〜４は不活性な細胞のもの、レーン６〜１０はＰＤＢｕにより活性化した細胞のものである。レーン５は分子量マーカーを示す。（Ｂ）ＰＤＢｕにより活性化したＴＨＰ−１細胞の溶解産物をインテグリン抗体またはＭＭＰ抗体を用いて免疫沈降させ、続いてαM抗体（ＯＫＭ１０）、αL抗体（ＴＳ２／４）またはＭＭＰ−９抗体を用いてウェスタンブロット法で分析した。細胞溶解産物の予備清掃はαM抗体（レーン６）とαL抗体（レーン７）を用いて行った。（Ｃ）ＰＤＢｕにより活性化したジャーカット細胞の溶解産物を免疫沈降させ、続いてαL抗体（ＭＥＭ８３）とＭＭＰ−９抗体を用いてブロッティング法で分析した。
【図７】ＰＤＢｕにより誘導した、αMβ2インテグリンとｐｒｏＭＭＰ−９のＴＨＰ−１細胞内局在化。５０ｎＭのＰＤＢｕを用い、＋３７℃で３０分間細胞をプレインキュベートした。（Ａ）細胞を抗αMＯＫＭ１０抗体と抗ＭＭＰ−９抗体で処理し、続いてＦＩＴＣ（グリーン蛍光物質）標識二次抗体とＴＲＩＴＣ（レッド蛍光物質）標識二次抗体で処理した。黄色はαMβ2インテグリンとｐｒｏＭＭＰ−９が共局在化していることを示す。各バーは８．５μｍ。（Ｂ）ＭＭＰ−９（ポリクローナル抗体）とαMβ2インテグリン（ＯＫＭ−１０）がＰＤＢｕにより活性化したＴＨＰ−１細胞表面に強く局在するのを免疫蛍光染色し、共焦点顕微鏡で高倍率で可視化したもの。（バーは２．５μｍ）。
【図８】ＤＤＧＷペプチドはＴＨＰ−１細胞の接着を支持し、ｐｒｏＭＭＰ−９の脱離を誘導するが、主要なβ2インテグリンリガンドであるフィブリノゲンやＩＣＡＭ−１への接着は阻害しないことを示す。（Ａ）グルタルアルデヒドで分子架橋したペプチドを固定化したものに、ＴＨＰ−１細胞を５０ｎＭのホルボールエステルで活性化して或いは未活性のままで結合させ、接着した細胞をフォスファターゼアッセイで定量した。ＴＨＰ−１細胞を、２００μＭの可溶性ペプチドの存在下または非存在下、固定化したフィブリノゲン（Ｂ）または組換えＩＣＡＭ−１−Ｆｃ（Ｃ）に結合させた。３つの試料を一組として行うアッセイによって得られた結果を、得られた数値の平均値±標準偏差で示した。さらに２回別々に実験を行ったところ、結果はいずれも同じであった。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞を濃度２００μＭのペプチドの存在下または非存在下で４８時間インキュベートした。ならし培地（conditioned medium）を分取し、ゼラチンザイモグラフィーで分析した。矢印は、９２ｋＤａのｐｒｏＭＭＰ−９と２２０ｋＤａのｐｒｏＭＭＰ−９二量体を示す。
【図９】ＴＨＰ−１細胞遊走のペプチドによる阻害。ＴＨＰ−１細胞を、図に記載の濃度２００μＭの各種ペプチドと共に１時間、室温でプレインキュベートし、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴコーティングの非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）でトランスウェルに塗布した。細胞を＋３７℃で１６時間遊走させた。フィルター下部表面に遊走した細胞を染色し、顕微鏡を使って細胞数を数えた。（Ｃ）ＨＴ１０８０線維肉腫細胞の遊走アッセイをＬＬＧ−Ｃ４コーティングの非存在下で同様に行った。エラーバーは３つのウェルの測定値の平均値±標準偏差を示す。
【図１０】組換えＭＭＰ−９ドメインへのαMＩドメインの結合。（Ａ）ＭＭＰ−９、およびE. coliを用いて発現させたＭＭＰ−９の組換え体を模式的に示す。（Ｂ）ｐｒｏＭＭＰ−９、その組換え体またはＢＳＡでマイクロタイターウェルを８０μｇ／ウェルとなるように被覆し、可溶性ＧＳＴ−αMＩドメインを図に記載の濃度で結合させた。結合は抗ＧＳＴモノクローナル抗体で測定した。測定結果を、３つのウェルからの測定値の平均値±標準偏差で示す（（Ｃ）、（Ｄ）についても同様）。（Ｃ）図に記載の濃度の各種ペプチドの存在下における、固定化したＧＳＴ−αMＩドメインへのｐｒｏＭＭＰ−９の結合の調査結果。結合は、抗ＭＭＰ−９抗体ＧＥ−２１３を用いて測定した。（Ｄ）固定化したｐｒｏＭＭＰ−８、ｐｒｏＭＭＰ−９、ＩＣＡＭ−１およびフィブリノゲンへのＧＳＴ−αMＩドメインの結合を、５０μＭのＩＣＡＭ−１、ＤＤＧＷまたはＫＫＧＷを競合ペプチドとして用いて調べた。対照ウェルには、ＧＳＴ−αMＩドメインの代わりにＧＳＴを注入した。実験を３回繰返し、同様の結果が得られた。
【図１１】αMβ2インテグリン発現型細胞による、組換えＭＭＰ−９ドメインの認識。ここで用いた細胞は以下の通りである：ＰＭＮ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、αMβ2発現Ｌ細胞トランスフェクタント（Ｄ）、非トランスフェクタント（Ｄ）およびＬＡＤ−１細胞（Ｄ）。ｐｒｏＭＭＰ−９またはそのドメインに対する結合の実験前、ＰＭＮは休止状態か、或いはＰＭＡ（Ａ、Ｃ）またはＣ５ａまたはＴＮＦα（Ｂ）で刺激された状態にある。細胞は、図に記載の各種ペプチド（５０μＭ）、抗体（２０μｇ／ｍｌ）またはαMＩドメインを用いて前処理した。結合しなかった細胞は洗浄除去し、接着した細胞の数をフォスファターゼアッセイによって定量した。実験を３回繰返し、同様の結果が得られた。
【図１２】ゼラチナーゼとβ2インテグリンに対する阻害剤による、in vitroにおけるＰＭＮやＴＨＰ−１の細胞遊走の阻害。図に示す２００μＭのペプチドまたは２０μｇ／ｍｌの抗体の存在下または非存在下、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴまたはＧＳＴで被覆した表面（Ａ）またはＨＭＥＣ単分子層（Ｂ）上に、ＰＭＮ（１００ μｌ中に１×１０5個）を塗布した。ＰＭＮは２０ｎＭのＰＭＡ（Ａ）、５０μＭのＣ５ａまたは１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含むＨＭＥＣで処理するか、或いは未処理のまま（Ｂ）で用いた。ＴＨＰ−１細胞（１００ μｌ中に５×１０4個）に５０ｎＭのＰＭＡで刺激を与え、図に記載の２００μＭのペプチドと共に被覆表面上に塗布した（Ｃ）。トランスウェルフィルターを貫通して遊走した細胞を染色し、顕微鏡を使って細胞数を数えた。実験は全て、最低２回繰り返し行った。（Ｄ）ホルボールエステルで活性化したＴＨＰ−１細胞（１００ μｌ中に５×１０4個）を、図に記載のペプチドの存在下または非存在下、＋３７℃で１６時間インキュベートした。ならし培地をゼラチンザイモグラフィーで分析した。
【図１３】炎症を起こした組織に対する好中球の遊走の阻害。（Ａ）マウスにチオグリコレートまたはＰＢＳを腹膜注射によって投与し、図に記載の分量の各ペプチドを静脈注射した。３時間経過後、腹膜内から白血球を採取し、細胞数を数えた。得られた結果を、平均値±１グループ当たり２〜４匹の標準偏差で示す。アスタリスク（＊）は統計的に有意な差（ｐ＜０．００１）を示す。実験は最低３回繰返し行った。チオグリコレート（Ｂ）またはＰＢＳ（Ｃ）を投与したマウスの組織中で浸潤した好中球細胞を、抗ＭＭＰ−９抗体および抗αM抗体と共に３時間インキュベートすることで染色した。蛍光性は共焦点顕微鏡を使って調べた。バーは（Ｂ）が９．１μｍ、（Ｃ）が４．８μｍである。（Ｄ）マウス腹腔から（Ａ）に記載の方法で採取した上清液のゼラチン分解活性。レーン１〜４：チオグリコレートを投与したマウスから採取した試料。レーン５：ＰＢＳを投与したマウスから採取した試料。ＤＤＧＷ、ＨＦＤＤＤＥおよびＤＦＥＤＨＤをマウス１匹当たり各々０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２ｍｇの投与量で静脈注射した。矢印はｐｒｏＭＭＰ−９二量体、ｐｒｏＭＭＰ−９およびｐｒｏＭＭＰ−２を示す。実験を３回繰返し、同様の結果が得られた。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１      ＬＬＧ−Ｃ４ペプチド
配列番号２      ファージディスプレイによって単離されたＤ／Ｅ−Ｄ／Ｅ−Ｇ／Ｌ−Ｗ配列、１位または２位のＸａａはＡｓｐまたはＧｌｕ、３位のＸａａはＧｌｙまたはＬｅｕ
配列番号３      ＲＧＤ結合ペプチド、５位のＸａａはＧｌｙまたはＬｅｕ
配列番号４      拡張したＲＧＤ
配列番号５      ｉＣ３ｂペプチド
配列番号６      Ａｌａ−Ａｌａ置換した対照ペプチド
配列番号７      効率的な結合のための最小配列
配列番号８      ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９に由来するペプチド、５位のＸａａはＴｈｒまたはＳｅｒ
配列番号９      亜鉛結合触媒配列
配列番号１０    インテグリンＩドメイン結合ヘキサペプチド
配列番号１１    環状ＣＴＴペプチド
配列番号１２    ＤＤＧＷ全長ペプチド
配列番号１３    ＤＤＧＷの対照ペプチド
配列番号１４    ＫＫＧＷ全長ペプチド
配列番号１５    ＲＧＤ−Ｃ４ペプチド
配列番号１６    鎖式ＳＴＴペプチド
配列番号１７    ＣＴＴペプチドのＡｌａ置換体
配列番号１８    最も結合力の強いペプチド
配列番号１９    最も類似性の高いペプチド
配列番号２０    ファージに含まれるＤＤＧＷ配列
配列番号２１    ＨＦＤＤＤＥ配列に対する、スクランブル（配列並べ替え）による対照ペプチド
配列番号２２    ＰＣＲのための、フォワードヌクレオチドプライマー
配列番号２３    ＰＣＲのための、リバースヌクレオチドプライマー
配列番号２４〜２５    ファージ由来ペプチド
配列番号２６    触媒ドメインに存在する、Ｉドメイン結合ペプチド
配列番号２７    負に帯電した活性ＭＭＰ−９ペプチド
配列番号２８    Ｉドメイン結合を支持する最小ペプチド
配列番号２９    Ｉドメイン結合を支持する最小ペプチドのＡｓｐ置換体
配列番号３０    組換えインテインによって製造された対照ペプチド
配列番号３１    ＭＭＰ−１由来ペプチド
配列番号３２    ＭＭＰ−１由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号３３    ＭＭＰ−２由来ペプチド
配列番号３４    ＭＭＰ−２由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号３５    ＭＭＰ−３由来ペプチド
配列番号３６    ＭＭＰ−３由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号３７    ＭＭＰ−７由来ペプチド
配列番号３８    ＭＭＰ−７由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号３９    ＭＭＰ−８由来ペプチド
配列番号４０    ＭＭＰ−８由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号４１    ＭＭＰ−９由来ペプチド
配列番号４２    ＭＭＰ−９由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号４３    ＭＭＰ−１３由来ペプチド
配列番号４４    ＭＭＰ−１３由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号４５    ＭＭＰ−１４由来ペプチド
配列番号４６    ＭＭＰ−１４由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号４７    ＭＭＰ−１由来ペプチド
配列番号４８    ＭＭＰ−１由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号４９    ＭＭＰ−３由来ペプチド
配列番号５０    ＭＭＰ−３由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号５１    ＭＭＰ−８由来ペプチド
配列番号５２    ＭＭＰ−８由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号５３    ＭＭＰ−１３由来ペプチド
配列番号５４    ＭＭＰ−１３由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号５５    ＭＭＰ−１４由来ペプチド
配列番号５６    ＭＭＰ−１４由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号５７    フィブロネクチン由来ペプチド
配列番号５８    フィブロネクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号５９    ＩＣＡＭ−３由来ペプチド
配列番号６０    ＩＣＡＭ−３由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号６１    補体Ｈ因子由来ペプチド
配列番号６２    補体Ｈ因子由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号６３    ＴＳＰ−１由来ペプチド
配列番号６４    ＴＳＰ−１由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号６５    ＮＩＦ由来ペプチド
配列番号６６    ＮＩＦ由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号６７    ＩＣＡＭ−２由来ペプチド
配列番号６８    ＩＣＡＭ−２由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号６９    フィブロネクチン由来ペプチド
配列番号７０    フィブロネクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号７１    フィブロネクチン由来ペプチド
配列番号７２    フィブロネクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号７３    Ｃｙｒ６１由来ペプチド
配列番号７４    Ｃｙｒ６１由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号７５    ミエロペルオキシド由来ペプチド
配列番号７６    ミエロペルオキシド由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号７７    カタラーゼ由来ペプチド
配列番号７８    カタラーゼ由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号７９    フィブリノゲンアルファ由来ペプチド
配列番号８０    フィブリノゲンアルファ由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号８１    フィブリノゲンベータ由来ペプチド
配列番号８２    フィブリノゲンベータ由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号８３    フィブリノゲンアルファ由来ペプチド
配列番号８４    フィブリノゲンアルファ由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号８５    ＧＰ１ｐ由来ペプチド
配列番号８６    ＧＰ１ｐ由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号８７    ＩＣＡＭ−１由来ペプチド
配列番号８８    ＩＣＡＭ−１由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号８９    第Ｘ因子由来ペプチド
配列番号９０    第Ｘ因子由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号９１    Ｅ−セレクチン由来ペプチド
配列番号９２    Ｅ−セレクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号９３    Ｅ−セレクチン由来ペプチド
配列番号９４    Ｅ−セレクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号９５    Ｅ−セレクチン由来ペプチド
配列番号９６    Ｅ−セレクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号９７    フィブロネクチン由来ペプチド
配列番号９８    フィブロネクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号９９    フィブロネクチン由来ペプチド
配列番号１００  フィブロネクチン由来ペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号１０１  ｉＣ３ｂペプチド
配列番号１０２  ｉＣ３ｂペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号１０３  ｉＣ３ｂペプチド
配列番号１０４  ｉＣ３ｂペプチドのＡｌａ−Ａｌａ置換体
配列番号１０５〜１１６  αMＩドメイン結合ペプチド
配列番号１２５〜１３６  ｐｒｏＭＭＰ−９の２０量体ペプチド
配列番号１３７  インテグリンＩドメイン結合ペプチド
配列番号１３８〜１６７  ｐｒｏＭＭＰ−９の２０量体ペプチド
配列番号１６８  ｐｒｏＭＭＰ−９の１３量体ペプチド
配列番号１６９  Ｎ末端のＡＤＧＡを欠如したＤＤＧＷペプチド
配列番号１７０  Ｃ末端のＧＡＡＧを欠如したＤＤＧＷペプチド
配列番号１７１〜１７４  ＤＤＧＷペプチドの短縮改変体
【図１−１】
2006527740.tif 000004
【図１−２】
2006527740.tif 000005
【図１−３】
2006527740.tif 000006
【図２】
2006527740.tif 000007
【図３−１】
2006527740.tif 000008
【図３−２】
2006527740.tif 000009
【図４】
2006527740.tif 000010
【図５】
2006527740.tif 000011
【図６】
2006527740.tif 000012
【図７】
2006527740.tif 000013
【図８】
2006527740.tif 000014
【図９】
2006527740.tif 000015
【図１０】
2006527740.tif 000016
【図１１】
2006527740.tif 000017
【図１２】
2006527740.tif 000018
【図１３】
2006527740.tif 000019
【配列表】
2006527740000001.app
【国際調査報告】
2006527740.tif 000020
2006527740.tif 000021
2006527740.tif 000022