(57)【要約】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のエンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２の立体構造エピトープについて、ＨＣＶ感染者由来のモノクローナル抗体群を用いて同定し特徴を調べた。ＨＣＶタンパク質Ｅ１又はＥ２のこれらの保存立体構造及び直鎖状エピトープは、ＨＣＶに対するヒトの免疫応答において重要であり、ウイルスの中和に特に重要であると考えられる。これら立体構造エピトープの同定に基づいて、完全立体構造エピトープを有するペプチド及びミモトープを含むワクチンを調製し、ＨＣＶ感染予防及び／又は治療のために患者に投与することができる。それぞれ特定のＥ１又はＥ２エピトープに対する、４種の異なるモノクローナル抗体グループを同定することで、ＨＣＶに対する感染者の応答に基づいて感染者を分類することができ、適当な治療投与計画を決めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸２０６〜３１３内の立体構造エピトープに対する抗体。
【請求項２】
多重ＨＣＶ遺伝子型に由来するＨＣＶ  Ｅ１タンパク質のアミノ酸１９４〜２０４内の直鎖状エピトープに対する抗体。
【請求項３】
Ｈ−１１４により認識されるエピトープに対する抗体。
【請求項４】
Ｈ−１１１により認識されるエピトープに対する抗体。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の抗体を発現する細胞系。
【請求項６】
Ｂ細胞系である、請求項５に記載の細胞系。
【請求項７】
ヒト細胞系である、請求項５に記載の細胞系。
【請求項８】
哺乳類細胞系である、請求項５に記載の細胞系。
【請求項９】
真核細胞系である、請求項６に記載の細胞系。
【請求項１０】
ハイブリドーマである、請求項５に記載の細胞系。
【請求項１１】
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されている、請求項５に記載の細胞系。
【請求項１２】
ウイルスで感染されている、請求項５に記載の細胞系。
【請求項１３】
ファージで感染されている、請求項５に記載の細胞系。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載の抗体を提示するウイルス。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１６】
人体に適応させた抗体である、請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１７】
哺乳類の抗体である、請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１８】
ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドを請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体に、抗体がＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドに結合するのに十分な時間、接触させ；
Ｅ１の推定受容体を発現する細胞とＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドと抗体とを、タンパク質又はペプチドによる推定受容体への結合を可能にするのに充分な時間、接触させ；
タンパク質又はペプチドによる細胞への結合を検出する（抗体の非存在下における結合と比較して細胞表面への結合が低下していた場合、受容体をＨＣＶ  Ｅ１受容体と同定する）
段階を包含する、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドに対する受容体を同定する方法。
【請求項１９】
請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体を固体支持体に付着し；抗体をＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドに、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドが抗体に結合してタンパク質又はペプチド−抗体複合体を形成するのに十分な時間、接触させ；
ライブラリータンパク質又はペプチドが複合体に結合するのに十分な時間、複合体をライブラリータンパク質又はペプチドと接触させ；
未結合のライブラリータンパク質又はペプチドを複合体から除去し；
複合体に結合するライブラリータンパク質又はペプチドを同定する（ここで結合したライブラリータンパク質又はペプチドは推定ＨＣＶ  Ｅ１受容体である）
段階を包含する、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質又はペプチドに対する受容体を同定する方法。
【請求項２０】
請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体と、薬剤として許容される賦形剤とを含む薬剤組成物。
【請求項２１】
抗体が、ＨＣＶのＥ１及びＥ２タンパク質に対するものであることを特徴とする、２種以上のモノクローナル抗体の組み合わせを含む薬剤組成物。
【請求項２２】
抗体が、単一ＨＣＶ遺伝子型のＥ１及びＥ２タンパク質に対するものであることを特徴とする、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
抗体が、多重ＨＣＶ遺伝子型のＥ１及びＥ２タンパク質に対するものであることを特徴とする、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
抗体が直鎖状エピトープに対するものである、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
抗体が立体構造エピトープに対するものである、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
抗体が直鎖状及び立体構造エピトープに対するものである、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−５を含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−７を含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２９】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−４Ｇを含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−８Ｃを含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−１７を含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項３２】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−２を含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項３３】
ＨＣＶに感染した又はＨＣＶに感染しやすい患者を提供し；そして
患者に請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体を投与する
段階を包含する、ＨＣＶに感染した患者を治療する方法。
【請求項３４】
ＨＣＶに感染した又はＨＣＶに感染しやすい患者を提供し；そして
患者に請求項１、２、３又は４のいずれかに記載の抗体を投与する
段階を包含する、ＨＣＶに接触した患者を治療する方法。
【請求項３５】
１種以上の異なる抗体を投与することを包含する、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
２種以上のモノクローナル抗体を患者に投与することを包含し、抗体がＨＣＶのＥ１及びＥ２タンパク質に対するものであることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗体が、単一ＨＣＶ遺伝子型のＥ１及びＥ２タンパク質に対するものであることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
抗体が、多重ＨＣＶ遺伝子型のＥ１及びＥ２タンパク質に対するものであることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
抗体が直鎖状エピトープに対するものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
抗体が立体構造エピトープに対するものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
抗体が直鎖状及び立体構造エピトープに対するものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−５を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−７を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−４Ｇを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−８Ｃを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−１７を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−２を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
ＨＣＶ１ｂＥ１タンパク質のアミノ酸２０６〜３１３を含む、ＨＣＶのＥ１タンパク質の立体構造エピトープを含むペプチド。
【請求項４９】
アミノ酸が、ＨＣＶ１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸２０６〜３１３に類似していることを特徴とする、ＨＣＶ  Ｅ１のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項５０】
ＨＣＶ１ｂＥ１タンパク質のアミノ酸２０６〜３１３に類似したアミノ酸を含む非ＨＣＶタンパク質又はペプチド。
【請求項５１】
ＨＣＶ１ｂＥ１タンパク質のアミノ酸２０６〜３１３が天然の立体構造である、請求項５０に記載の非ＨＣＶタンパク質又はペプチド
【請求項５２】
請求項４９に記載のペプチドに少なくとも６０％の同一性を有するペプチド。
【請求項５３】
請求項４９に記載のペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するペプチド。
【請求項５４】
請求項４９に記載のペプチドに少なくとも８０％の同一性を有するペプチド。
【請求項５５】
請求項４９に記載のペプチドに少なくとも９０％の同一性を有するペプチド。
【請求項５６】
アミノ酸２０６〜３１３を含むＨＣＶ  Ｅ１の１ｂ遺伝子型の立体構造エピトープに対して十分な三次元構造的類似性を有する作用物にして、該作用物の存在下で抗体へのエピトープの結合と競合させ、該作用物の非存在下での結合と比較するための作用物。
【請求項５７】
ペプチドである、請求項５６に記載の作用物。
【請求項５８】
小分子である、請求項５６に記載の作用物。
【請求項５９】
化合物である、請求項５６に記載の作用物。
【請求項６０】
有機分子である、請求項５６に記載の作用物。
【請求項６１】
無機分子である、請求項５６に記載の作用物。
【請求項６２】
ミモトープである、請求項５６に記載の作用物。
【請求項６３】
ＨＣＶ１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸２０６〜３１３内の立体構造エピトープを含む、ＨＣＶ  Ｅ１のペプチド断片を含むワクチン。
【請求項６４】
請求項１又は３に記載の抗体によって認識されるエピトープを含むＨＣＶ  Ｅ１ペプチド断片を含むワクチン。
【請求項６５】
Ｈ−１１４及びＨ−１１１からなる群より選ばれてなるヒトモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むＨＣＶ  Ｅ１のペプチド断片を含むワクチン。
【請求項６６】
請求項４８に記載のペプチドを含むワクチン。
【請求項６７】
請求項５６に記載の作用物を含むワクチン。
【請求項６８】
ヒトモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むＨＣＶ  Ｅ１のペプチド断片少なくとも１個とヒトモノクローナル抗体により認識されるエピトープを含むＨＣＶ  Ｅ２のペプチド断片少なくとも１個との組み合わせを含むワクチン。
【請求項６９】
ペプチド断片が単一ＨＣＶ遺伝子型のものである、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７０】
ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２のペプチド断片が多重ＨＣＶ遺伝子型のものである、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７１】
エピトープが、ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２のペプチド断片上の直鎖状エピトープである、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７２】
エピトープが、ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２のペプチド断片上の立体構造エピトープである、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７３】
エピトープが、ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２のペプチド断片上の直鎖状エピトープと立体構造エピトープとの組み合わせである、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７４】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−５を含む、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７５】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−７を含む、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７６】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−４Ｇを含む、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７７】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−８Ｃを含む、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７８】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−１７を含む、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項７９】
Ｈ−１１１及びＣＢＨ−２を含む、請求項６８に記載のワクチン。
【請求項８０】
ＨＣＶ感染患者から血清を得て；
請求項１又は２に記載の抗ＨＣＶモノクローナル抗体によるそのエピトープへの結合について、患者血清による阻害を測定し；そして
治療投与の候補者として患者を同定する
段階を含む、ＨＣＶ感染患者を分類する方法。
【請求項８１】
患者に抗体を投与する段階を更に包含する請求項４４に記載の方法。
【請求項８２】
個人を用意し；
請求項１又は２に記載の抗体を、抗体がその抗原に結合するのに好適な条件下で、該個人から得た体液に接触させ；そして
抗体によるペプチドへの結合を検出する
段階を含む、ＨＣＶ感染を検出する方法。
【請求項８３】
個人を用意し；
請求項１に記載の抗体少なくとも２種を、抗体／抗原結合するのに好適な条件下で、該個人から得た体液に接触させ；
抗体によるペプチドへの結合を検出し；そして
抗体結合の特性を分析してＨＣＶの遺伝子型を決定する
段階を含む、ＨＣＶの遺伝子型を同定する方法。
【請求項８４】
体液が血液である、請求項８２又は８３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府は本発明について一括払いライセンスを有し、又、国立衛生研究所(ＮＩＨ)により授与された付与番号ＤＡ６０５９６及びＡＩ４７３５５の条件によって規定される正当な条件で、特許権所有者が他人に使用を許諾する必要のある限られた状況における権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、特許出願U.S.S.N.０９／１８７，０５７(１９９８年１１月５日出願)の一部継続出願である、U.S.S.N.０９／４３０，４８９(１９９９年１０月２９日出願)の一部継続出願である、同時継続出願U.S.S.N.０９／７２８，７２０(２０００年１２月１日出願)の一部継続出願である。これら出願はそれぞれここに参照して説明に代える。
【０００３】
技術分野
本発明は、構造が保存されたＨＣＶエピトープに対するヒトモノクローナル抗体(ＨＭＡｂ)の調製に関する。このような抗体は患者内に多く見られるが、例えばＨＣＶ感染の診断と治療に有用であり、患者にとって特定の治療法が有効であるかどうかを同定するのに用いられる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)はエンベロープに包まれたウイルスであり、その遺伝子情報は９．５ｋｂの正のＲＮＡゲノム鎖によってコードされている。高度に保存された３４１ｂｐの非コード領域はこのウイルスゲノムの５’末端に位置しており、それに約３，０１０アミノ酸のポリプロテインをコードする長い読み取り枠が続いている。エンベロープ糖タンパク質と推定されるＥ１(ｇｐ３５)及びＥ２(ｇｐ７２)の２種に、それぞれ５又は６個、及び１１個のＮ結合型グリコシル化部位があることが分かっている。エンベロープ遺伝子には高レベルの遺伝子可変性がある。この可変性はＥ２遺伝子の５’末端で特に顕著であり、２個の超可変部(ＨＶＲ１及びＨＶＲ２)が報告されている。細胞培養及びチンパンジーにおける予防研究で、ＨＶＲ１に対する抗体がウイルス中和反応を引き起こすことが示されている(Farciら、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15394-15399；Shimizuら、1994 J.Virol.68：1494-1500；それぞれここに参照して説明に代える)。残念なことにＨＶＲ１に対する抗体は単離体に特異的であり、既存の免疫応答が認識しない新たなウイルス変異体の複製をやがて引き起こす傾向がある(Farciら、1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7792-7796；Weinerら、1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3468-3472；Katoら、1993 J.Virol.67：3923−3930；それぞれここに参照して説明に代える)。とはいえ、ＨＶＲ１関連配列に対して広く免疫応答を誘導することについては研究が進んでいる(Puntorieroら、1998 EMBO Journal 17：3521-3533；ここに参照して説明に代える)。グリコシル化した形状で発現したＨＣＶエンベロープ抗原は、高い免疫原性を持つようである(da Silva Cardosoら、1997 Ann.Hematol.74：135-7；ここに参照して説明に代える)。予備データは、Ｅ２タンパク質内に保存エピトープが存在することを示唆している(Lesniewskiら、1995 J.Med.Virol.45：415-22；ここに参照して説明に代える)。感染者の血清中に中和抗体が存在することが示唆されている。
【０００５】
哺乳類細胞内で発現したＨＣＶ  Ｅ１−Ｅ２タンパク質を用いた研究の結果、天然の状態で立体構造と直鎖状の両方をとりうるエピトープで部分的に構成されるＨＣＶ  Ｅ２に対して、感染者が抗体応答を有するということが示された(Haradaら、1994 J.Gen.Virol.76：1223-1231；ここに参照して説明に代える)。ＨＣＶ  Ｅ２蛋白質に対するヒトモノクローナル抗体又は組み換え抗体の単離に関する研究の結果、これら抗体の実質的な断片が立体構造エピトープを認識することが分かった(da Silva Cordosoら、1998 J.Med.Virol.55：28-34；それぞれここに参照して説明に代える)。これら領域の生物学的機能に関してであるが、生体外でウイルスが増殖しないので、代理アッセイを用いることでウイルス中和反応の研究がなされている(Houghton,“Hepatitis C viruses”.Fields,Knipe,Howley(編)Virology.Lippincott-Raven,フィラデルフィア、pp.1035-1058；ここに参照して説明に代える)。代理アッセイの一つ、結合中和(ＮＯＢ)アッセイを用いて、所与の抗体又は血清がＨＣＶ  Ｅ２タンパク質とヒトＴ細胞系との結合を阻害する能力について評価が行われている(Rosaら、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1759-1763；ここに参照して説明に代える)。予防接種したチンパンジーから得た血清抗体がＮＯＢアッセイにおいて強い陽性を示したという知見は、このアッセイがウイルス中和反応活性を測定する手段として適当であるということを支持している(Rosaら、上記；Ishiiら、1998 Hepatology 28：1117-1120；それぞれここに参照して説明に代える)。
【０００６】
ヒトテトラスパニン細胞表面タンパク質ＣＤ８１(ＴＡＰＡ−１。詳しくはLevyら、1998 Ann.Rev.Immunol.16：89-109参照；ここに参照して説明に代える)は、ＮＯＢアッセイにおいてＨＣＶ  Ｅ２が結合する標的タンパク質である(Pileriら、1998 Science.282：938-941；ここに参照して説明に代える)。更にヒトＣＤ８１は遊離ビリオンに結合するので、ＨＣＶ受容体と考えられる(Pileriら、上述)。しかし異なる遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質中のＮＯＢ陽性抗体によって認識されるエピトープの保存については、詳しいことが分かっていない。
【０００７】
ＨＣＶを検出及び予防する他の方法には、ペプチドミメティックを作製するものがある。例えば検出アッセイ及び予防接種治療を目的とした、ランダムに作製した合成ペプチド及びファージディスプレーペプチドライブラリーを通じて、Ａ型及びＣ型肝炎ウイルスタンパク質のペプチドミメティックが作り出されている(Mattioliら、1995 J.Virology 69：5294-5299；Prezziら、1996 J.Immunol.156：4504-4513；それぞれここに参照して説明に代える)。しかし効率的に行われているこれらミモトープ(mimotope)の抗体結合は、直鎖状に規定されたウイルスエピトープと比較されているにすぎない。診断アッセイにおいて、直鎖状に規定された免疫優性ＨＣＶエピトープ複数を配列組換え融合することが記載されている(Cheinら、1999 J.Clin.Microbiol.37：1393-1397；ここに参照して説明に代える)。しかし、直鎖状エピトープから設計したこの複数エピトープの融合抗原は、立体構造と類似の機能を有するように作られたものではない。すなわち、標的受容体への結合を阻害することを意図しているものではない。
【０００８】
従って感染者由来の血清中にある中和抗体を同定することが重要である。ヒト細胞に由来する抗体は、診断や受動免疫療法において使用可能であり、特定の地域内での幅広い遺伝子型のウイルスを中和することが可能になる。治療上有効な中和抗体に重要なのは、複数のＨＣＶ遺伝子型に対する広い反応性と、ＨＣＶビリオンによる対象細胞への結合を阻害する能力との両方である。ＨＣＶエンベロープタンパク質の、ペプチド又は非ペプチド(有機)構造ミメティックの設計も又、重要である。
【０００９】
関連の参考文献
ＨＣＶに関する背景情報の文献としては、Abrignani 1997 Springer Semin.Immunopathology 19：47-55；Simmonds,1995 Hepatology 21：570：583；及びMahaneyら、1994 Hepatology 20：1405-1411が挙げられる(それぞれここに参照して説明に代える)。
【００１０】
Deleersnyderら、1997 J.of Virology 71：697-704には、Ｅ２反応性モノクローナル抗体についての記載がある。ＨＣＶに対する抗体の使用に関する他の文献としては、Akatsukaら、1993 Hepatology 18：503-510；DeLallaら、1993 J. Hepatol.18：163-167；Mondelliら、1994 J Virol.68：4829-4836；Siemoneitら、1994 Hybridoma 13：9-13；及びMoradpourら、1996 J.Med.Virol.48：234-241；ヒト抗体の産生については、Foungら、1990 J.Immunol.Methods 70：83-90；Zimmermannら、1990 J.Immunol.Methods 134：43-50；組合せライブラリーを用いた改変抗体の産生については、Burton及びBarbas,Dixon,FJ(編)Advances in Immunology,Vol.57,Vi+391p.Academic Press,Inc.,カリフォルニア州サンディエゴ、191-280,1994；Plaisantら、1997 Res.Virol.148-169；及びBarbas及びBurton,Monoclonal Antibodies from Combinatorial Libraries.Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor,ニューヨーク、1994が挙げられる。改変抗体は、突然変異誘発を行い、次いで望ましい特性(例えば標的抗原に対する高い親和性や広い又は狭い特異性)について生体外で選択することで産生できる。抗体は毒素や他の対生物作用のある分子によっても改変できる。もちろん、Ｅ１かＥ２のいずれかに対する抗体を産生することもできる。本章で引用した文献は、それぞれここに参照して説明に代える。
【００１１】
ＨＣＶ  Ｅ２に結合する抗体のアッセイは、Rosaら、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1759-1763に記載がある(ここに参照して説明に代える)。
【００１２】
ＨＣＶゲノムの部分を含むワクシニアウイルス又はバキュロウイルスコンストラクトについては、Ralstonら、1993 J.Virology 67：6733-6761及びLanfordら、1993 Virology 197：225-235に記載がある(それぞれここに参照して説明に代える)。
【００１３】
発明の概要
本発明の一つの形態は、殆どの地域で優性な型のＨＣＶに結合する、ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を提供する。特にＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２タンパク質の保存された立体構造及び直鎖状エピトープに結合するモノクローナル抗体群を提供する。この抗体群は米国において優性な遺伝子型に結合する抗体を含むが、米国で診断されたＨＣＶ感染の殆ど全ての症例だけでなく他地域における症例の少なくともかなりの割合において結合可能な、実質的に汎用のモノクローナル抗体として用いることを企図する。モノクローナル抗体は、様々な診断アッセイに用いることができる。それに加えて、組換えＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２タンパク質及びその断片の保存発現は、アッセイ、薬剤のスクリーニング、ワクチン、診断アッセイや他の目的に用いることができる。本発明の抗体を受動免疫療法に用いて、感染者のウイルス量を減らし標的細胞の感染を阻害することができる。保存エピトープを認識する抗体は更に、ペプチド及び構造の判明したエピトープミメティック(例えば有機化合物、有機金属化合物、無機化合物、小分子)を理論的に設計する場合の鋳型として用いることができる。
【００１４】
特に好ましい態様において本発明の抗体は、ＨＣＶのＥ２又はＥ１タンパク質の立体構造と直鎖状の両方のエピトープに対するものである。Ｅ２の立体構造及び直鎖状エピトープは、モノクローナル抗体群及びＥ２の欠失コンストラクト群を用いて同定されている。ある抗体群は、ＨＣＶ１ｂ由来のＥ２アミノ酸４１１−６４４の間の立体構造エピトープに結合することが分かっている。この群の抗体は、Ｅ２とＣＤ８１との相互作用を阻害することが知られている。又、別の抗体群は、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸４７０−６４４の間の立体構造エピトープに結合することが分かっている。第３の抗体群は、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸４７０−６４４の間の立体構造エピトープに結合するが、Ｅ２とＣＤ８１との結合を阻害しない。第４の抗体群は、ＨＣＶ１ｂのＥ２アミノ酸６４４−６６１の間のエピトープに結合する。第５の抗体群は、ＨＣＶ１ｂのＥ１アミノ酸２３０−３１３の間の立体構造エピトープに結合する。第６の抗体群は、多重遺伝子型に由来する直鎖状ＨＣＶのＥ１エピトープに結合する。特に好ましい態様において、抗体に対する立体構造エピトープがＨＣＶ系統の間で保存されている。本発明の抗体は、薬剤として許容される賦形剤と組み合わせて薬剤配合物として提供してもよい。
【００１５】
本発明の別の形態は、ＨＣＶタンパク質における立体構造エピトープを規定し、そのようなエピトープを含む組成物及び化合物を更に提供する。例えば本発明はＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２タンパク質の立体構造及び直鎖状両方のエピトープを含むタンパク質、ペプチド及び小分子を提供する。ペプチドは、図２３に示すような欠失コンストラクトであってもよい。ペプチドは本発明の抗体により認識されるエピトープを１個以上含んでいても良い。ある好ましい態様においてタンパク質は連結したペプチド鎖であり、そのうち少なくとも１つがＨＣＶの立体構造エピトープを含んでいる。ペプチド鎖は様々な立体構造又は直鎖状のＨＣＶエピトープを含んでいてもよいし、同一型のエピトープを含んでいてもよい。ペプチド鎖は、天然に存在するのと実質的に同じ立体構造エピトープを提示するように、適切に折りたたまれているのが好ましい。このようなタンパク質とペプチドを用いて、ワクチンの配合や診断テストを行うことができる。
【００１６】
本発明は又、ＨＣＶに対する免疫応答に基づいて患者を分類する方法、及びＨＣＶ免疫療法を行えば効果があると思われる患者を同定する方法を提供する。例えば患者の血清を用いて特定のＨＣＶエピトープに対する抗体の有無を調べ、そのエピトープに対する抗体が適当なレベルで血清に含まれていなければ、そのエピトープに対するヒトモノクローナル抗体を患者に投与する。
【００１７】
定義
「動物」：本明細書でいう動物とは、ヒト及び非ヒト動物(例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類)のことをいう。好ましくは、非ヒト動物は哺乳類(例えば齧歯類、ネズミ、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類又はブタ)である。動物は、トランスジェニック動物であってもよい。
【００１８】
「抗体」：本明細書でいう抗体とは、天然に存在するか、全体又は部分を合成した免疫グロブリンのことを意味する。特異的な結合能を保持するその誘導体及び断片も全て、この語に含まれる。この語は又、免疫グロブリン結合領域に相同性を有する又はおおよその相同性を有する結合領域を有する全てのタンパク質を含むものとする。これらのタンパク質は天然源由来のものであってもよいし、部分又は全体を合成したものであってもよい。抗体は単クローン性であってもよいし、多クローン性であってもよい。抗体は、ヒトの抗体クラス(ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ)を含む、どのような免疫グロブリンクラスに属するものであってもよい。しかしＩｇＧクラスの派生物が、本発明では好ましい。
【００１９】
「ペプチド」：本発明によると「ペプチド」とはペプチド結合で連結した少なくとも３個のアミノ酸の鎖が含むものとする。「ペプチド」は個々のペプチドを意味することもあるし、ペプチド群を意味することもある。本発明のペプチドは好ましくは天然アミノ酸のみを含むが、非天然アミノ酸(すなわち天然には起こりえないが、ポリペプチド鎖に組み込むことのできる化合物；例えばhttp://www.cco.caltech.edu/~dadgrp/Unnatstruct.gif参照。機能性イオンチャネルに組み込むことができた非天然アミノ酸の構造が開示されている)及び／又は当分野で公知のアミノ酸類似体を用いてもよい。又、本発明のペプチドに含まれる１種以上のアミノ酸を、例えば炭水化物類、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸類等の化学物質の添加や、結合用、機能化用又は他の改変用リンカー等によって改変してもよい。好ましい態様においては、ペプチドの改変はより安定したペプチドを作る(例えば生体内での半減期が長くなる等)ものである。これらの改変にはペプチドの環化、Ｄアミノ酸の組み込み等が含まれる。改変はいずれも、ペプチドの望ましい生物学的活性を実質的に阻害するものであってはならない。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」：ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとは、ヌクレオチドの重合体のことをいう。重合体は、天然に存在するヌクレオシド(すなわちアデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシジチン)、ヌクレオシド類似体(例えば２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロール−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ(６)−メチルグアニン及び２−チオシチジン)、化学的修飾塩基、生物学的修飾塩基(例えばメチル化塩基)、分子挿入塩基、改変糖(例えば２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース及びヘキソース)又は改変リン酸基(例えばホスホロチオ酸類及び５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合)を含んでもよい。
【００２１】
「小分子」：本明細書でいう「小分子」とは、比較的低い分子量であり、タンパク質、ポリペプチド又は核酸ではない、天然に存在するか又は(例えば化学合成によって)合成した有機化合物のことを意味する。通常、小分子の分子量は約１５００ｇ／モル未満である。又、小分子は通常、複数の炭素−炭素結合を有する。天然に存在する小分子で公知のものとしては、ペニシリン、エリスロマイシン、タキソール、シクロスポリン及びラパマイシンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。合成の小分子で公知のものとしてはアンピシリン、メチシリン、サルファメトキサゾール及びスルホンアミドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の好ましい態様の詳細な説明
診断、治療及びワクチン開発に使用できる、１種以上の遺伝子型のＣ型肝炎ウイルスに結合するモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体(ＨＭＡｂ)が提供される。無症候のＨＣＶ感染者の末梢Ｂ細胞から得た、高い血清中和反応の結合価を有するヒトモノクローナル抗体(ＨＭＡｂ)群を産生し特徴を調べた。ＨＣＶ  Ｅ２に対するＨＭＡｂ１１種と、ＨＣＶ  Ｅ１に対するＨＭＡｂ２種が産生された。ある抗体群はＨＣＶの遺伝子型１及び２に結合し、別の抗体群は結合する遺伝子型の数が少なかった。ＨＣＶ遺伝子型１と２は併せて、西半球と他地域において優性的に見られるウイルス型である。本抗体は立体構造及び直鎖状エピトープに結合するが、様々なウイルス型及び遺伝子型にわたってそれが保持されている。遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に結合する抗体及びこれらの抗体のサブセットは、これらＥ２タンパク質とヒトＣＤ８１との相互作用を阻害する。又、ＨＣＶ  Ｅ１に対する２種のＨＭＡｂのうち１種は、多重遺伝子型のＨＣＶに結合する。
【００２３】
抗体に様々な結合特性があるので、複数の型と遺伝子型を検出する診断アッセイが可能になり、米国でみられるＨＣＶに対する汎用抗ＨＣＶ抗体が提供され、又、同時にサブトラクティブ(subtractive)解析により個々の遺伝子型を詳細に分析できるようになる。加えて、ＨＣＶ感染の危険性のある者に対する予防治療又はＨＣＶ血清陽性者の治療として、ヒト抗体を用いた受動免疫を行うことができる。
【００２４】
本発明のＨＭＡｂはＨＣＶに対する既存のＨＭＡｂに比べ、幾つかの利点を有する。非相同的一次アミノ酸配列が免疫学的に同一の三次元タンパク質構造を規定しうるので、構造的に保存されたエピトープに結合するＨＭＡｂは、天然構造の様々な配列の多数のＨＣＶ遺伝子型を認識できる。これに対して、直鎖状又は変性エピトープのみを認識する抗体は上記を認識できない。特に抗ＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２ＨＭＡｂの立体構造依存性かつ選択的直鎖依存性エピトープは、天然ＨＣＶとその細胞標的受容体との相互作用に効果的に干渉することができる。ＨＭＡｂの立体構造依存性及び選択的直鎖依存性エピトープを用いて標的細胞受容体(ＣＤ８１等)への天然ＨＣＶの結合能を能動的に阻害することで、感染者内のウイルス量を低減し、非感染者(特に臓器移植を行ったばかりのレシピエント、腎臓透析を行っている者、及び血友病又は他の血液凝固疾患の治療を受けている者)の器官の感染及び再感染を防ぐ、特異的な治療が行える(例えばａ)異なるＨＣＶ遺伝子型によってコードされたＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２タンパク質を認識し；ｂ)ＨＣＶ粒子に結合し；ｃ)ＨＣＶウイルス粒子の標的細胞への付着及び侵入を防ぐことで行う)。他のレシピエントとしてはＨＣＶ含有体液に接触して間もない者が挙げられる。個々のＨＣＶ  ＨＭＡｂと、数種のエピトープを認識する数種のＨＣＶ  ＨＭＡｂ混合物との両方を、使用することができる。
【００２５】
特定のＨＭＡｂサブセットは、ＣＤ８１との直接の相互作用を阻害する以外のメカニズムで、Ｅ２関連ウイルス感染に干渉する。この抗体サブセットは、例えば共受容体タンパク質へのＥ２の結合の阻害、標的細胞への結合に必要なＥ１及び／又はＥ２タンパク質の立体構造変化、Ｅ１及びＥ２を媒介する標的細胞へのウイルス融合、そしてＨＣＶビリオンのコーティング除去といった、多くの考えられうるメカニズムによってウイルスの伝染性に干渉する。Ｅ２によるＣＤ８１への結合を直接阻害するＨＭＡｂサブセットは別々のエピトープに結合するので、治療、ワクチン、診断に用いるものとして、他のメカニズムで伝染性に干渉するサブセットのＨＭＡｂを補うことができる。
【００２６】
ＨＭＡｂはウイルスエピトープを認識し、ウイルス／標的受容体の相互作用とＨＭＡｂに結合するウイルスエピトープとに干渉するが、ウイルスエピトープのペプチド及び他の構造ミミックを理論的に設計する鋳型としても用いることができる。これらの抗ＨＣＶ  ＨＭＡｂにより規定される構造的分子ミミックは、それら自体が標的受容体に結合して天然ウイルスによる標的受容体への結合を阻害する能力があるので有用である。
【００２７】
ヒトモノクローナル抗体を産生することで、ＨＣＶに対するヒトの免疫応答を直接解析することが可能になる。重要なことに、ヒトモノクローナル抗体を用いた場合、抗体自身に対する異質抗原としての免疫応答は最小限であるが、非ヒト由来のモノクローナル抗体を用いた場合には、異質抗原として認識されるので激しい免疫応答が引き起こされる。ウイルス立体構造保存エピトープを認識するＨＭＡｂを選択することで、直鎖状又は変性エピトープにのみ結合することのできる抗体に比べ、これら抗体試薬をより幅の広いより効果的なＨＣＶ感染の改善又は予防治療に用いることが可能になる。ＨＣＶによる感染又は標的細胞内への侵入を阻害する特性を有すると上で説明した抗体は全て、超可変部として知られる、非常に変わりやすいＨＣＶ  Ｅ２配列を認識する。これに対して、上記した抗体は立体構造と直鎖状エピトープの両方を認識するが、それらエピトープの殆どは、複数の異なる遺伝子型において高度に保存されたＨＣＶ  Ｅ２タンパク質である。従って本明細書に記載する抗体には、文献にある中和抗体よりもより広い範囲のＨＣＶ単離体に対して作用するという利点がある。別の利点であるが、本明細書で説明する抗体により認識されるエピトープが高い保存性を有するということは、これらの抗体がＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２タンパク質内の機能的及び／又は構造的重要性を持つ配列を認識するということを示している。したがって、これらの抗体を用いて単離されるペプチド又は小分子は、高い確率でＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２内の機能領域を標的にすることができる。これは今日までに説明されてきた他のＨＣＶ抗体には当てはまらない。
【００２８】
上記の検出抗体のうちＣＢＨ−４Ｇは、多重ＨＣＶ遺伝子型を有するＨＣＶ  Ｅ２−ＣＤ８１複合体に対して本質的に等しい反応性を有するが、ＣＢＨ−４Ｂは、ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂを認識する。ＨＣＶ抗血清中に存在する阻害抗体のレベルは、きわめて低いことも示されている。従ってマイクロタイタープレートフォーマット内の試料中に存在する中和抗体のレベルを、複数のフローサイトメトリー解析に頼ることなく検定する簡単な手段を提供する。
【００２９】
本発明のＨＭＡｂを作製するのに用いたアプローチの概要は以下の通りである。(１)ＨＣＶに接触したと分かっている者を同定し；(２)その末梢血液から抗原特異的Ｂ細胞を得て培養し生体外で活性化し；(３)好適なマウス−ヒトヘテロ骨髄腫で電気融合して、これらの細胞を不死化し；(４)ハイブリドーマを分泌する適当なヒト抗体を同定し；そして(５)適当なハイブリドーマをクローニングして安定化させた。このアプローチによって、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に特異的なＨＭＡｂを同定した。それらの多くがＨＣＶ遺伝子型１ａ及び１ｂ及びＨＣＶ遺伝子型２ａ及び２ｂのＥ２の立体構造エピトープに結合しており、米国及び他地域で最もよく見られる遺伝子型を１種類の抗体で認識できる。これに対して他の抗体は表記した遺伝子型の全てには結合しないので、上記抗体はＨＣＶ型又は遺伝子型の同定に有用である。本明細書に記すように、更に上記アプローチによって、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質に特異的なＨＭＡｂも同定した。
【００３０】
例えば、無症候のＨＣＶ感染者の末梢Ｂ細胞と高い血清中和結合価とを用いて、ヒトモノクローナル抗体群を産生し特徴を調べた。ＨＣＶ−１単離体の同じ領域に９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含む遺伝子型１ａＥ２タンパク質を用いて最初のスクリーニングを行った(Lanfordら、1993 Virology 197：225-235；ここに参照して説明に代える)。ドナーは１ｂ単離体に感染していたので、遺伝子型１ａ及び１ｂの間に保存されたエピトープに対する抗体を選択する、偏ったスクリーニングアプローチをこの段階に用いた。全てのＨＭＡｂは、Ｑ１ｂ(ＨＭＡｂの選択に用いたＨＣＶ１ａ単離体に７９％の相同性を有する異種ＨＣＶ１ｂ単離体)のＥ２にも反応した。組換えＥ２を変性したところ１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂのうち１０種の反応性が完全に失われた。従ってＨＭＡｂの殆どが立体構造エピトープを認識した。
【００３１】
５種のＨＭＡｂ(ＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−９及び−１７)はＮＯＢアッセイにおいて陰性を示し、ＨＣＶ  Ｅ２−ＣＤ８１複合体に反応した。これらの抗体のうちＣＢＨ−４Ｇ及びＣＢＨ−９の２種が、ＧＮＡ及びＣＤ８１捕捉アッセイの両方において、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に反応した。他の３種の抗体ＣＢＨ−４Ｂ、−４Ｄ及び−１７は、遺伝子型１ａ及び１ｂのＥ２タンパク質に限られた反応性を示した。ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４ＤはそれぞれカッパＬ鎖及びラムダＬ鎖を有するが、おそらく異なるエピトープを認識する。ＨＭＡｂＣＢＨ−１７は、変性に無反応のエピトープを認識した唯一の抗体であった。従って各ＮＯＢ陰性抗体が個別のエピトープを認識すると思われる。
【００３２】
立体構造エピトープを認識する６種のＨＭＡｂであるＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−１１は、ＨＣＶ１ａＥ２タンパク質を用いた結合中和アッセイで試験したところ陽性であった。これらの抗体のうちＨＭＡｂＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ及び−８Ｅの５種が、試験した全ての遺伝子型のＥ２タンパク質と反応した。上記と同じ６種の抗体は、ＣＤ８１−ＬＥＬとの複合体を形成した遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ又は２ｂのＥ２に結合しなかった。従ってＨＣＶ  Ｅ２内でＣＤ８１結合部位に部分的又は完全に重なるエピトープは、天然状態で立体構造であり、かつ高度に保存されている。ＣＤ８１結合部位において配列が高度に保存されているということは、ＨＣＶ  Ｅ２とＣＤ８１との間の相互作用が生物学的に関連しているという仮説に一致している。試験した４種のＮＯＢ陽性抗体のうちＨＭＡｂＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５の２種が、未反応ＨＣＶビリオンによるＣＤ８１への結合を阻害することができた。複数の抗体がＮＯＢアッセイにおいて同等の活性を示したにもかかわらず、ＨＭＡｂＣＢＨ−７及びＣＢＨ−１１はＨＣＶビリオンによるＣＤ８１への結合を顕著に阻害した。このことは、ＨＣＶビリオンが表面にＥ１−Ｅ２複合体を有しており、そのような複合体ではＥ２に存在するエピトープの全てが外部に晒されているわけではない、という事実を反映していると思われる。これはＨＭＡｂとＥ１−Ｅ２複合体との試験によって解明されるであろう。あるいはＮＯＢとビリオン阻害アッセイの結果の差は、ＨＭＡｂによるＥ２タンパク質又はＥ１−Ｅ２複合体への親和性の差を反映しているとも考えられる。いずれにせよ、それ自体に強い結合中和活性があることが、抗体が完全ＨＣＶビリオンに結合することの確証にはならない。従っておそらく、Ｅ２タンパク質によるＣＤ８１−ＬＥＬとの相互作用を生体外で阻害する抗体全てが生体内での伝染性を中和するわけではない。
【００３３】
これら６種のＮＯＢ陽性抗体のうち５種が、本研究で用いた５種のＨＣＶ単離体の間で共通のエピトープに対するものである。残りの抗体ＣＢＨ−１１は２個の１ａ単離体に異なる反応性を示し、おそらくは他の抗体とは別のエピトープを認識する。実際、異なる１ａ単離体に対するＣＢＨ−１１の反応が異なることが、ビリオン結合実験で得られた陰性の結果を説明している。ＣＢＨ−２とＣＢＨ−７によるＨＣＶビリオンへの異なる反応性、並びに競合実験の結果の両方が、ＣＢＨ−２とＣＢＨ−７が別のエピトープを認識することを示している。競合実験は更に、ＨＭＡｂＣＢＨ−５とＣＢＨ−２により認識されたエピトープは別のものであることを示唆している。しかしながら、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−８Ｅが同一の又は非常に類似したエピトープを認識する可能性も残っている。別個のエピトープの総数を調べるには、ハイブリドーマで産生した抗体遺伝子の配列決定、競合研究や更に他のＨＣＶ単離体を用いた試験が必要であろう。
【００３４】
競合解析(図２２)を用いて、ＨＣＶ  Ｅ２の類似の結合部位に対する抗体を調べた。７種のＨＭＡｂをビオチン化し、様々な量の競合ＨＣＶ  ＨＭＡｂの存在下でのビオチン化抗体によるＨＣＶ  Ｅ２への結合を調べた。顕著な交差競合を示した抗体を同じグループに分類した。結合部位を含むＨＣＶ  Ｅ２領域の位置を、ＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクト群(図２３)を用いて調べた。その結果４種の競合群が規定された。グループＩは５種のＨＭＡｂ、ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１から構成される。このグループの抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２によるＣＤ８１への結合を阻害し、ＨＣＶ  Ｅ２アミノ酸４１１〜６４４に位置する保存エピトープを認識する。グループＩＩはＨＭＡｂＣＢＨ−７からなるが、ＨＣＶ  Ｅ２アミノ酸４７０〜６４４の間に位置する高度に保存されたエピトープを認識する。グループＩ及びＩＩの抗体は、最小の交差競合を示した。グループＩＩＩは３種の抗体ＣＢＨ−４Ｇ、−４Ｂ及び−４Ｄより構成されるが、ＨＣＶ  Ｅ２によるＣＤ８１への結合を阻害せず、ＨＣＶ  Ｅ２アミノ酸４７０〜６４４の間のエピトープを認識する。グループＩＶは１種の抗体ＣＢＨ−１７から構成されるが、これはＨＣＶ  Ｅ２アミノ酸６４４〜６６１間に位置するエピトープを認識する。グループＩ及びＩＩの抗体は、小動物モデルにおいてＨＣＶ複製を阻害しＥ２の超可変部外の２個の異なる保存結合部位を認識することが分かっている。グループＩ及びＩＩの抗体間の競合は程度が低いのでウイルス中和反応活性は増加するはずであり、これらの抗体が生体内で相乗的に作用する可能性を示している。
【００３５】
これらの結果は、ＨＣＶ  Ｅ２内の幾つかの立体構造エピトープが様々なＨＣＶ遺伝子型の中で高度に保存されていることを示している。これらのエピトープを認識する抗体はＨＣＶ  Ｅ２の構造をより詳しく規定する試薬として有用である。その上更に、ＨＣＶビリオンによるヒトＣＤ８１への結合を阻害する抗体ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５は、ウイルス中和反応を媒介する第１の候補である。しかしウイルス中和反応には真の意味での生体外モデルは存在しないので、選択したＨＭＡｂには適当な動物モデルにおいてＨＣＶ感染を予防する又は改善する能力がある、という基本的な証拠を示す必要がある。もしこれがうまくいけば、幅広い反応性を有する中和抗体を治療に用いることができるであろう。肝臓移植においてＢ型肝炎免疫グロブリンを用いて成功した例(Dickson,1998 Liver Transpl.Surg.4(5 Suppl 1)：S73-S78；Markowitzら、1998 Hepatology 28：585-589；それぞれここに参照して説明に代える)と同様に、用途の一つとして、幅広い反応性を有する中和ヒトモノクローナル抗体を用いた肝臓移植レシピエントのＨＣＶ感染抑制が考えられる。
【００３６】
上記した方法でＨＭＡｂを単離した結果、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質に特異的なＨＭＡｂが同定された。これらのＨＭＡｂは、Ｅ２に対するＨＭＡｂと同様に、ＨＣＶ  Ｅ１の立体構造と直鎖状の両方のエピトープに結合した。ＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ１に対するＨＭＡｂが１種(Ｈ−１１４)が同定された。Ｅ１に対する他の抗体であるＨ−１１１は、４種以上の遺伝子型(１ａ、１ｂ、２ｂ及び３ａ)のエピトープを認識した。この幅広い特異性は、上記した診断及び治療用途に特に好ましい。Ｈ−１１４及びＨ−１１１ＨＭＡｂの単離と特長については実施例１０に記載する。
【００３７】
本発明のＨＣＶ  Ｅ１に対するＨＭＡｂはこれまでに同定されている抗Ｅ１抗体とは異なるエピトープを認識する。Ｈ−１１４は、Ｅ１の推定融合ペプチドを含むと思われる非直鎖状アミノ酸配列を認識する。ウイルスエンベロープと細胞膜との融合はウイルス感染開始において重要な段階であるので、Ｈ−１１４抗体を用いてこの段階に干渉し、細胞内侵入、脱外被及びビリオン組み立ての段階を含むＨＣＶ生活環を阻害できる。抗体Ｈ−１１１は、多重遺伝子型にわたって個々のアミノ酸を認識するという独特の特長を持っている。
【００３８】
Ｈ−１１１及びＨ−１１４により認識されるエピトープは、ウイルス中和反応に新たな可能性を与える。Ｅ１及びＥ２は相互作用の結果、最終的にはビリオンエンベロープを構成する異質二量性無価Ｅ１−Ｅ２複合体を形成すると考えられている。Ｈ−１１１及びＨ−１１４には独特な結合活性があるので、これらの抗体を用いてビリオンにおけるＥ１／Ｅ２相互作用と成熟エンベロープの形成について詳しく調べることができる。
【００３９】
本発明ではヒトモノクローナル抗体が提供されるが、本明細書に説明したヒト抗体が認識するのと同じエピトープを認識しうるので、他の供給源由来の他の抗体も用いることが可能である。一般にネズミ、マウス、ラット、ウサギ目及び家畜動物由来の抗体が用いられる。これら哺乳動物由来の保存領域を有する抗体を産生することができる。例えば遺伝子工学を用いて本明細書で提供するＨＭＡｂの定常領域を置換するか、あるいは動物を免疫化する免疫原として下に述べるタンパク質を用い、次いで得られるＢ細胞を不死化し、類似の幅広い結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生する不死化細胞について下に述べるようにスクリーニングする。本発明のＨＭＡｂを用いた競合アッセイでスクリーニングすることによって、非ヒト抗体が同じエピトープに結合するかどうかを調べることができる。
【００４０】
診断用途としては、様々な方法で抗体を用いて、循環ＨＣＶビリオン、Ｅ１又はＥ２タンパク質、あるいは抗Ｅ１又は抗Ｅ２抗体を捕捉及び／又は同定することができる。抗体は免疫療法、予防又は治療に用いることができる。抗体は又、ＨＣＶに対するワクチンの開発に用いることもできる。
【００４１】
単離した抗体はＩｇＧクラスのものであった。ＨＭＡｂのいくつかは、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対して良好な親和性を示した(抗体は１〜２０μｇ／ｍｌの濃度で最大のシグナルを示した)。これらの抗体はＩｇＧクラス、特にＩｇＧ1κのものである。以下に抗体と抗体が認識するＨＣＶ遺伝子型とを示す。下記のＨＭＡｂはＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２タンパク質に対して良好な親和性を示した。
【００４２】
【表１】
2006504645.tif 000002
【００４３】
抗体は天然に存在する形状で用いてもよいし、末端を切断してＦａｂ又はＦ(ａｂ’)2断片としてもよい。Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子を単離して様々な方法で改変しても良い。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、以後の操作に都合のよいコンストラクト内にｃＤＮＡとして遺伝子を作製するのが一般的である。Ｈ及びＬ鎖の可変領域のヌクレオチド配列は単離することもできるし、直接に又は間接に又は３ｎヌクレオチド鎖を通じて(ここでｎは少なくとも１かつ約６０未満、通常約４０未満であり、２個の可変領域間のアミノ酸リンカーを提供する)結合することもできる。鎖の長さは、最適な親和性や他の特性(例えばメルカプト基、カルボキシル基やアミノ基を介したキレート化の連結や、表面又は他の分子への結合等)を得られるように経験によって決定することができる。加えて、表面への付着、同定用の標識、親和性単離のための配列等を提供するために、少なくとも可変領域を含む遺伝子の全体又は部分を他の配列に融合させてもよい。これら試薬のいずれも、例えばプロテアーゼ部位又は化学的リンカーといった切断可能なアームを持つ抗体に付加することができる。
【００４４】
抗体をコードする遺伝子に標識を付加して、発現された抗体について特異的親和性単離を行えるようにしてもよい。あるいは標識化することで、単離抗体遺伝子の有用性を改善するようにしてもよい。標識の例としては、大腸菌ビオチンカルボキシラーゼ運搬タンパク質のビオチン化配列；固定化二価陽イオンを含むカラムへの抗体による付着に好適な６ヒスチジン配列又はヒスチジンとアスパラギン酸との交互配列；ＦＬＡＧエピトープDYKDDDDK、Ｔ７タグ配列MASMTGGQMG、Ｓタグ配列KETAAAKFERQHMDS等、親和性の高い公知の抗体エピトープのいずれかの配列、或いは特異的抗体との結合を可能にする公知のあらゆる配列；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ストレプトアビジン、又は望ましい標的細胞に見られる細胞表面受容体に対するリガンドといった、融合蛋白質パートナー；及び蛍光性、放射性、発光性のあるいは酵素で検出可能な成分が挙げられる。
【００４５】
標識がポリペプチドの場合、配列は抗体鎖のうちの１本の遺伝子に直接融合できる。いずれの場合も、マレイミド基とチオエーテルを形成するシステイン、金属をキレート化し様々な分子に結合するポリヒスチジン／システイン又はポリヒスチジン／アスパラギン酸、還元的アミノ化反応でアルデヒドと反応させるポリリジン等の、標識を連結する部位を備えた配列が提供できる。標識は酵素、キレート基、リガンド結合蛋白質(例えばビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシゲニン及び抗ジゴキシゲニン等)へ結合するリガンド、緑色蛍光タンパク質等を含んでいてもよい。大腸菌ビオチンカルボキシラーゼ運搬タンパク質(ＢＣＣＰ)のビオチン化配列を用いて、大腸菌内に発現された又は大腸菌溶解物に導入されたタンパク質の生体内ビオチン化を行うことができる。固定化二価陽イオンを含むカラムへの抗体による結合を可能にするのに好適な６ヒスチジン配列又はヒスチジンとアスパラギン酸との交互配列を用いることもできる。親和性の高いエピトープをコードする配列、例えばＦＬＡＧエピトープDYKDDDDK(配列番号１３)、Ｔ７タグ配列MASMTGGQMG(配列番号１４)、Ｓタグ配列KETAAAKFERQHMDS(配列番号１５)を用いてもよいし、或いは相関する結合体又はタンパク質試薬への高い親和性結合を可能にする配列であれば他にどのようなものを用いてもよい。上記したものの他に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼや、肝細胞、Ｔ細胞又は他に望ましい細胞標的の表面受容体に対するリガンド等の融合蛋白質を挙げることができる。このような融合体は一般にタンパク質の複機能性を促進する３〜５０アミノ酸のリンカー配列を介して連結される。これらの分子は切断可能なアーム(プロテアーゼ部位)又は他の手段を介して抗体に連結することができる。抗体は様々な毒素、例えばジフテリア毒素、リシン、アブリン、リボソーム不活化タンパク質、アポトーシスシグナリングタンパク質、穿孔タンパク質(例えばパーフォリン)等に化学的に連結又は融合してもよい。或いは、抗体をキレート化毒性重金属又は放射性同位体、特にテクネチウム、放射性ヨー素等に連結させてもよい。抗体はフルオロフォア又は化学発光分子に化学的に連結させてもよい。化学的カップリングとしては、システインと反応する活性化カルボン酸類又はビオチン−Ｃ１１−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いたビオチン化；様々なビーズ(セファロース、アガロース、磁性、ポリスチレン等)又は表面のＣＮＢｒ活性化を介した抗体とのカップリング；抗体を有用な化学基に架橋することを含む他のあらゆる方法(通常、リジン又は他の基本的残基を改変することによって、又は遊離スルフヒドリル基に特異的な試薬の使用を通じて達成される)が挙げられる。
【００４６】
Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域の遺伝子の使用に際して、特に可変領域の超可変部を公知の方法で突然変異させ、抗体の結合親和性を強化したり反応性を幅広いものにすることができる。ファージディスプレー法、配列のランダム又は定方向突然変異誘発、又は他の類似の方法を用いて、最適な結合抗体を同定する生体外選択を行ってもよい。或いは超可変部のアラニン又はグリシン歩行を用いて必須アミノ酸を同定し、それら又は他の部位のアミノ酸を改変して、エピトープ結合の改善を同定するようにしてもよい。当分野で公知の他の方法を用いて突然変異誘発抗体を得てもよい。
【００４７】
抗体供給源としてハイブリドーマを用いる代わりに、遺伝子を単離して適当な哺乳類宿主細胞、例えばＣＨＯ、ヒーラ、ＣＶ１等に導入してもよい。好適な発現プラスミドの例としては、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ、ｐＩＮＤ(ＳＰ１)、ｐＲＥＰ８(いずれもカリフォルニア州カールスバッドInvitrogen社)(実施例１１参照)等が挙げられる。抗体遺伝子はウイルス又はレトロウイルスベクターを介して発現できるが、例としてはＭＬＶから作られるベクター、ワクシニアウイルスから作られるベクター等が挙げられる。同様に、抗体遺伝子は一連のｐＣＯＭＢベクターを用いて、後に復元して完全な抗体を形成しうる２個の独立した鎖としてＭ１３ファージ表面上に発現してもよい。或いは、少なくとも可変領域を含む単鎖として抗体を発現してもよい。遺伝子は、リンパ球、筋細胞、繊維芽細胞等の適当な細胞に導入して遺伝子療法に用いることができる。この場合、抗体が構成的に又は誘導的に発現分泌され、宿主細胞の寿命に基づいて所与の連続時間又は間欠に抗体供給源となる。本発明の遺伝子は(例えば抗生物質耐性の)標識遺伝子と共に、対象者から細胞を得て、マーカーにより改変細胞を選択し、宿主に標識付き細胞を戻すことで導入できる。ＤＮＡは、様々なプラスミドＤＮＡ、裸ＤＮＡ、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又はワクシニアウイルス等のＤＮＡウイルスコンストラクト、あるいは水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルス等のＲＮＡウイルス(これらは僅かな例に過ぎないが)を用いて細胞に導入することができる。ＤＮＡは、対象の細胞に転写因子が存在するあるいは誘導又は導入可能であるプロモーターを含むコンストラクトと、そのようなプロモーターの転写調節下にある遺伝子とを有していてもよい。例えば分泌リーダー、エンハンサー、ＲＮＡ安定化配列等、他の調節配列が存在してもよい。
【００４８】
診断目的として、抗体を様々なフォーマットで用いて、Ｅ１又はＥ２タンパク質を検出し、ＨＣＶ遺伝子型を識別し、ビリオンと抗体を検出することができる(例えば米国特許第５，６９５，３９０号参照。ここに参照して説明に代える)。抗体は個別に用いてもよいし、他の本発明の抗体群又は他の抗体、Ｅ１又はＥ２に存在するグリコシル基と結合するレクチン、ビリオンエンベロープタンパク質又は、ＨＣＶ  Ｅ１又はＨＣＶ  Ｅ２が複合する他のタンパク質(例えばＨＣＶ  Ｅ１−ＨＣＶ  Ｅ２複合体)と組み合わせて用いてもよい。診断目的として、これまでに述べたような様々な標識を用いることができる。例としてはフルオロフォア、化学発光体、放射性同位体、酵素、粒子(例えばコロイド状炭素及び金、ラテックス粒子等)、高い親和性の受容体が存在するリガンド、活性化すると検出可能なシグナルを発するプロラベル(prolabels)等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００４９】
一つの態様において、表面をタンパク質でコーティングする。この表面は、遊離又は循環タンパク質としての、又は完全なビリオンの部分又は部分的に完全なビリオンとしての、ＨＣＶ抗原に結合する。１型及び２型両方のＨＣＶ又はレクチン(例えばGalanthus nivalisレクチン)に結合することのできる本発明の抗体を用いることができる。１、２及び３型に結合する本発明の抗体を用いてもよい。特に好ましい態様においては、本発明の抗体を少なくとも４種の遺伝子型に結合させる。特に好ましい態様において、本発明の抗体は遺伝子型ＨＶＣ１ａ、１ｂ、２ｂ及び３ａのＥ１に結合する。そのアッセイは、遊離又はビリオン関連タンパク質を含む媒体に表面を接触させる段階を含む。この媒体は試料であってもよいし、又は１種以上の公知の遺伝子型のＥ１又はＥ２の溶液であってもよい。保温し洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後は、検定するものに応じてアッセイは様々な段階を行うことができる。血清陽性と思われる血液試料を検定する場合には、試料をＥ１又はＥ２タンパク質層に接触させ、保温し、洗浄し、タンパク質層に結合したヒト抗体の存在を調べる。標識化抗ヒト抗体(本発明の抗体が最初に用いられた場合には、本発明の抗体のアイソタイプに対するもの以外のもの)を用いることができる。血清陽性を示した対象体の抗体を検定する場合、本発明の抗体は、そのような対象体の血清中のヒト抗ＨＣＶの検出に使用したのと同じ試薬と共に、対照として用いることができる。試料中の抗体の特異性は、抗ヒト抗体とは異なる標識を付けた本発明の抗体を用い、試料中の抗体によってブロックされたかどうかを調べることによって確認することができる。
【００５０】
試料をＨＣＶ  Ｅ１又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質について検定する場合、検出には標識化した本発明の抗体を用いる。選択する抗体は、興味の対象がＥ１又はＥ２タンパク質の遺伝子型を調べる場合と検出する場合とによって異なる。非特異的に結合した抗体を洗い流した後、公知の方法に従い標識の存在を検出することによって、標識化抗体の存在を調べた。あるいは、本発明の抗体が表面に結合している場合には、Ｅ１又はＥ２に対する標識化レクチンを用いてＥ１又はＥ２タンパク質の存在を検出してもよい。
【００５１】
本発明の抗体を用いて、血清中の抗体、モノクローナル抗体、遺伝子工学操作の結果発現した抗体等、他の抗体の反応性を測定することができる。望ましくはＨＣＶタンパク質ではなく完全ビリオンを用いるが、立体構造が保存されたエンベロープタンパク質を用いることもできる。ビリオン捕捉については、例えばKimuraら、1998 J.Med.Virology 56：25-32；Moritaら、1996 Hapato-Gastroenterology 43：582-585；Sataら、1993 Virology 196：354-357；及びHijikataら、1993 J.Virology 67：1953-1958が参照できる(それぞれここに参照して説明に代える)。実験手順の一例としては、まず固体支持体をレクチン(例えばＧＮＡ)でコーティングし、完全ＨＣＶビリオンを含む培養基(例えば血清陽性患者の血清)に支持体表面を接触させる。ビリオンを破壊しうる成分(例えば洗剤等)は添加してはならない。培養基を保温し洗浄して非特異的結合成分を除去した後、ビリオンを本発明の抗体と試料の抗体に接触させる。これは同時に行ってもよいし連続的(ただし試料を最初に添加する)に行ってもよい。本発明の抗体の量は、別の抗体による置き換えに対して感度の高い量を用いる。この量は、本発明の抗体を様々な量で用いる一連の試験を行って、経験的に決定することができる。試料の非存在下又は存在下で得たシグナルを調べることによって、試料中の抗体の反応性又は結合親和性を決定することができる。様々な方法を用いて、ビリオンに結合した本発明の抗体の量を調べることができる。本発明の抗体が標識化されている場合、例えばビオチン又はジゴキシゲニン、ストレプトアビジン又はフルオロフォア標識化抗ゴキシゲニン又は検出可能なシグナルを発する基質に対する酵素は、主題の抗体の量を決定するのに用いることができる。
【００５２】
受容体(抗体又はレクチン)をＤＮＡ配列で標識化する場合、標識配列に相同性を有するプライマーを用いてＰＣＲの標準的条件下で、直接的又は間接的(間接的とは、ビリオンに結合した受容体の空いた部位に結合することのできるリガンド−核酸配列複合体の使用を意味する)のいずれにせよ、配列を伸長することができる。ＤＮＡは個別のハイブリダイゼーション反応又はアガロースゲル電気泳動によって検出できる。あるいは、一端に発光性標識(フルオロフォア又は発光体)を有し他端に消光基を有する、増幅した配列に相同性を有する内側標識化オリゴヌクレオチドプローブを使用するＴａｑｍａｎ法を用いることもできる。断片が増幅されるにつれて、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がハイブリダイズオリゴヌクレオチドを分解してフルオロフォアが消光基から外れ、培養基に適当な波長の光を照射することでフルオロフォアを検出できるようになる。
【００５３】
あるいは、サイクリングプローブ法を行うのに適当な標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いることもできる。オリゴヌクレオチドを、標識に相同性を有しＴＭ４５℃の約１５−２０デオキシヌクレオチド、標識に相同性を有しＴＭ４５℃の約５以上のリボヌクレオチド配列から構成する。完全なオリゴヌクレオチドはＴＭ＞６０℃である。オリゴヌクレオチドを上記したよう発光標識と消光標識でに更に修飾する。過剰なオリゴヌクレオチドコンストラクトを結合標識に添加し、約５５℃で結合標識にハイブリダイズさせた後、５５℃で活動的なリボヌクレアーゼＨを添加してリボヌクレオチドを分解する。変性時に発光標識は消光標識から解放され、光照射又は活性化により発光が調べられる。
【００５４】
あるいは、転写媒介増幅(ＴＭＡ)を用いてもよい。この場合、結合オリゴヌクレオチド標識は、Ｔ７ポリメラーゼ又は他の都合の良いポリメラーゼにより認識されるプロモーターを含んでいる。適当な条件下でＴ７又は他の適当なポリメラーゼ及びｒＮＴＰを添加すると、結合オリゴヌクレオチドによるオリゴリボヌクレオチドへの転写が起こり、これを例えば電気泳動法等の簡単な手段で検出することができる。
【００５５】
標識化した主題の抗体を用いて、生検物質からＨＣＶの存在を検定することができる。標識化抗体を、肝臓スライス等の固定化生検物質と主題の標識化抗体１種以上の溶液と共に保温する。非特異的結合抗体を洗い流した後、生検組織の細胞に結合した抗体の存在を、標識の性質に従って検出することができる。
【００５６】
立体構造の保存された遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＥ２タンパク質(後者２種は新規に発現された構成物である)が、ワクシニアウイルスコンストラクトから発現したタンパク質として提供される。これらの調製については実施例で説明する。Ｅ１タンパク質のアミノ酸を含まないタンパク質を得るが、これはＥ１及びＥ２の両方をコードする遺伝子からも調製できる。この場合、得られる融合蛋白質を処理し、共有結合していないが複合体として存在する２つのタンパク質を得る。立体構造の保存されたＥ１遺伝子型タンパク質を、実施例で述べるｐＤｉｓｐｌａｙ(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)等の哺乳類発現ベクターによって同様に調製することができる。タンパク質を溶解物から単離することができる。タンパク質は親和性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又は非変性ゲル電気泳動によって容易に精製できる。タンパク質は９５ｗｔ％を超える、通常は少なくとも９９ｗｔ％の純度で得ることができる。タンパク質は、ＨＣＶ感染患者から得た血清の遺伝子型決定アッセイ、親和性及び特異性についてのモノクローナル抗体のスクリーニング、タンパク質を標的とする薬剤の評価、抗血清及びモノクローナル抗体を産生させる哺乳類宿主の免疫化等に用いることができる。診断アッセイにおけるこれらの使用は今までに論じられてきたことである。
【００５７】
抗体は、結合対象であるＥ１又はＥ２タンパク質上の構造エピトープを同定するのに用いることができる。モノクローナル抗体を用いた立体構造エピトープの同定には２つの基本的な方法が考えられる。第一に、ＨＣＶ単離体の天然変異体又は突然変異体解析を用いて領域を同定し、モノクローナル抗体により認識されるエピトープに含まれる個々のアミノ酸を最終的に同定する(Schwartzら、1999 J.Mol.Biol.287：983-999；ここに参照して説明に代える)。多くの異なるＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２単離体について抗体をスクリーンし、個々の抗体に選択的に反応しない単離体を同定する。例えばＨＭＡｂＣＢＨ−１１によるＨＣＶ  Ｅ２タンパク質Ｑ１ａに対する反応性はＨＣＶ  Ｅ２Ｑ２ａに対する反応性よりも低い(図９)。ある部分があるＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質由来であり、他の部分が他のＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質由来である「キメラ」Ｅ２エンベロープタンパク質を作製する。オーバーラップ断片をＰＣＲ増幅することによって及び／又は両方のＥ２タンパク質に共通の制限酵素切断部位を利用して、これらのキメラＥ２タンパク質が作製できる。別法として生物工学会社Ｍａｘｙ−Ｇｅｎの開発したＤＮＡシャッフリングがある。異なるキメラＥ２タンパク質による異なるモノクローナル抗体への結合反応性を調べることによって、立体構造エピトープの形成に欠かせないＥ２タンパク質のアミノ酸領域を同定する。不可欠な領域を同定した後は、異なる遺伝子型間で異なる個々のアミノ酸を突然変異させ、反応性Ｅ２配列を作製する。突然変異体が完全な反応性を再現すれば、エピトープの形成に関与するアミノ酸であるとわかる。
【００５８】
立体構造エピトープを規定する第二の基本的な方法は、まず望ましいＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２配列をコードする１０−１５残基長のオーバーラップペプチド群を合成する。次いで、高濃度の抗体(多くの場合１００μｇ／ｍｌ以上)に対してペプチドをスクリーンする。立体構造エピトープ全体を含む個々の領域は、検出可能な抗体に対する結合活性を持つ残基を保持していることが多い。これらの領域を同定した後は、１０−１５残基のペプチドを含む突然変異を調べて、ペプチドの前後関係によって或いは立体構造的に完全なＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２タンパク質内の置換によって、領域を確認することができる。この方法を改変したものが文献に説明されている(Reinekeら、1999 Nature Biotechnology,17：271-275；ここに参照して説明に代える)。
【００５９】
主題の抗体は、ミモトープのスクリーニングにも用いることができる。ミモトープはファージディスプレーを用い、主題の抗体でペプチドをスクリーンして調製することができる(Livnahら、1996 Science 273：464-471；Prezziら、1996 J.Immunol.156：4504-4513；それぞれここに参照して説明に代える)。立体構造の保存されたＨＣＶエピトープを認識する抗体は、立体構造エピトープ又はミモトープのペプチド又は非ペプチド構造ミミックを理論的に設計するための鋳型として用いることができる。
【００６０】
ミモトープの作製は、生物学的に重要である。立体構造の判明したウイルスエピトープにミモトープの構造を似せることによって、ミモトープが受容体自体に結合し、ウイルスによる標的受容体への結合能を阻害することができる。例えば、モノクローナル抗体と腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)との界面を規定する結晶構造の分析によって、ＴＮＦ受容体への結合を介してＴＮＦの生物学的機能に拮抗することのできる、非ペプチドミメティックの理論的設計が可能になる(Takasakiら、1997 Nat.Biotech.15：1266-1270；ここに参照して説明に代える)。ペプチド構造ミメティックの設計用として、コンピューターを用いて、タンパク質内の一次アミノ酸配列の折り畳みを理論的に推定することができる。これについてはTeichmannら、1999 Curr.Opin.Struct.Biol.9：390-399に記載がある(ここに参照して説明に代える)。立体構造保存エピトープの構造モデル作製にコンピュータープログラムを用いた実例は、Schwartzら、1999 J.Mol.Biol.287：983-999を参照できる(ここに参照して説明に代える)。抗体エピトープのペプチド構造ミミックを理論的に作製する別の方法としては、合成ペプチドを系統的に置換して不連続な抗体結合部位を線形に表現するもの(Reinekeら、1999 Nat.Biotech.17：271-275；ここに参照して説明に代える)が挙げられる。
【００６１】
モノクローナル抗体に対し特異的親和性を有するペプチド又はその他の小分子は、立体構造的に完全なＥ１又はＥ２タンパク質のエピトープと競合する。或いはペプチド又はその他の小分子は、モノクローナル抗体に対し特異的親和性を有し、かつＥｌのエピトープがＥ２と複合したもの又はＥ２のエピトープがＥ１と複合したものと競合するものであってもよい。このようなペプチドはワクチンとして使用可能で、診断アッセイでは免疫化を行い特異的ＨＣＶエピトープに対する抗体を産生するのに用い、競合アッセイでは遺伝子型を決定するのに用いる(例えばPuntorieroら、1998 EMBOJ.17：3521-3533；Meolaら、1995,J.Immunol.154：3162-3172；Tafiら、1997 Biol.Chem.378：495-502参照)。
【００６２】
立体構造の保存されたＨＣＶエピトープの構造ミメティックを効率的に作製する別の方法としては、立体構造依存性抗ＨＣＶ  ＨＭＡｂに対する抗イディオタイプ抗体の作製がある。抗イディオタイプ抗体は、天然ウイルスとその標的受容体との結合を効果的に阻害しうる(Chanhら、1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3891-3895；Kopeckyら、1999 Intervirol.42：9-16；Xueら、1993 J.Gen.Virol.74：73-79；それぞれここに参照して説明に代える)。抗ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−２、５、４Ｂ、４Ｄ、４Ｇ、７、８Ｃ、８Ｅ、９又は１１のいずれかの立体構造結合部位を認識する抗イディオタイプ抗体は、Ｅ２による標的細胞タンパク質への結合に干渉することによって、あるいはビリオンによる標的細胞への付着に干渉することによって、ウイルス伝染性を阻害することができる。同様に、ＨＣＶ  ＨＭＡｂＨ−１１４又はＨ−１１１のいずれかの立体構造結合部位を認識する抗イディオタイプ抗体も又、Ｅ２による標的細胞タンパク質への結合に干渉することによって、あるいはビリオンによる標的細胞への付着に干渉することによって、ウイルス伝染性を阻害することができる。
【００６３】
本発明の抗体は、ウイルス量を低減したり、ウイルスによる標的タンパク質への結合を阻害したり、標的細胞とのウイルス媒介融合を阻害したり、細胞感染性に必要なウイルスエンベロープタンパク質の構造変化に干渉することができるので、予防治療又はＨＣＶ感染治療に有用である。組成物としては、単一立体構造エピトープに対するモノクローナル抗体、又は１種以上のウイルスエンベロープタンパク質上の個々の立体構造エピトープを認識する相補的モノクローナル抗体の混合物を用いることができる。これらを用いて、感染過程中、複数のメカニズムに同時に干渉できる。
【００６４】
体の部分、特にＨＣＶ感染患者の体の部分のウイルス量を低減するために、表面に抗体を結合した装置に患者血液を通過させ、ＨＣＶを捕捉する。例えば米国特許第５，６９８，３９０号及び第４，６９２，４１１号が参照できる(それぞれここに参照して説明に代える)。同様の結果を得るために、文献にある他の様々な装置を本発明の抗体と共に用いることができる。体の部分としては、生物的液体、組織、器官(例えば肝臓)等が挙げらる。
【００６５】
抗体は受動免疫療法又は他の生体内療法にも用いることができる。例えばPiazziら、1997 Arch Intern Med.157：1537-1544；Farciら、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93：15394-15399；al-Hemsiら、1996 Clin.Transplant.10：668-675；Krawczynskiら、1996 J.Infect.Dis.173：822-828が参照できる(それぞれここに参照して説明に代える)。このような治療で使用できるように、抗体を注射又は静脈内投与に都合のよいように調合することができる。リン酸緩衝食塩水、生理食塩水等の様々な媒体を用いることができる。抗体の量は、感染のレベル、抗体の親和性、投与方法、投与の頻度、患者の応答性、他の治療法の併用等によって異なる。一般に抗体の投与量は約０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。例えばAndrusら、1998 J.Infect.Dis.177及びKreilら、1988 J.Virology 72：3076-3081が参照できる(それぞれここに参照して説明に代える)。
【００６６】
チンパンジーはＨＣＶのワクチンスクリーニング及び治療について一般に認められている動物モデルである(例えばFarciら、1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15394-15399；Farciら、1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7792-7796；Farciら、1992 Science 258：135-140；Krawczynskiら、1996 J.Infect.Dis.173：822-828；Bassettら、J.Virology 72：2589-2599；それぞれここに参照して説明に代える)。抗体の効力は、定量ＰＣＲ法を用いてＨＣＶ  ＲＮＡの存在と力価をモニターすることで調べることができる。試験動物又は対象体についてウイルス量が減少したり感染予防が成功した場合、それは血清のＨＣＶ  ＲＮＡを低減又は除去したことを意味する。アラニンアミノトランスフェラーゼの測定といった酵素試験及び／又は針を逐次刺す肝生検を用いて効力を調べることもできる。いずれにせよ評価が向上した場合、それはウイルスにより誘導された肝損傷が減少したことを意味する。
【００６７】
ワクチン
ＨＣＶに対するワクチンを調合する場合、ＨＣＶ  Ｅ１又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質のうち少なくとも１つの立体構造エピトープに似せたあらゆる作用物(agent)を用いることができる。例えば作用物は、ペプチド、タンパク質、小分子、ミモトープ、有機化合物、有機金属化合物、無機化合物等であってもよい。好ましい態様においては、ワクチンに含まれるエピトープは、感染を防ぐことが知られる抗体に対するエピトープを含む。他の好ましい態様においては、ワクチンに含まれるエピトープは、異なるウイルス遺伝子型間で又は異なるウイルス株間で保存されているエピトープを含む。本発明の特に好ましい態様において、立体構造の判明したＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２エピトープを含むペプチド又はタンパク質が、ＨＣＶ感染を防ぐ又は治療するためのワクチンの調合に用いられる。他の特に好ましい態様において、立体構造の判明したエピトープ(ＨＣＶの立体構造が判明したＥ１エピトープ少なくとも１個及び立体構造が判明したＥ２エピトープ少なくとも１個)を含むペプチド又はタンパク質が、ワクチンの調合に用いられる。或いはＥ１及びＥ１エピトープは直鎖状エピトープであってもよい。更に別の好ましい態様においては、Ｅ１及びＥ２エピトープは直鎖状及び立体構造エピトープの混合物であってもよい。ペプチド又はタンパク質の長さは好ましくは１００アミノ酸未満、より好ましくは５０アミノ酸未満である。特に好ましい態様において、ワクチン調合に用いられるペプチドはＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２タンパク質のペプチド断片である。好ましくはペプチドを、天然Ｅ１又はＥ２タンパク質の折り畳みと同様に折り畳んで、立体構造エピトープの３次元構造を保持する。
【００６８】
ワクチンは更に、望まれる抗体に対する立体構造エピトープを有する連結したペプチドを含むタンパク質を含んでいてもよい。各ペプチドが異なるエピトープを含むように、あるいは同じペプチドがマルチマー内で１回以上用いられるように、数種のペプチドからなるマルチマーを用いてもよい。
【００６９】
本発明のペプチドはメリフィールド固相化学等、当分野で公知の方法を用いて合成することができる。ペプチドはＥ１又はＥ２タンパク質の切断と精製によって得てもよい。当分野で公知の技術を用いて、ペプチドを組換えで作製し、大腸菌、酵母菌(例えばS.cerevisiae)、昆虫細胞(例えばＳｆ９細胞)、又は哺乳類細胞(例えばＣＨＯ細胞)内に産生してもよい(Sambrookら；Miller&Calos編,Gene Transfer vectors for Mainmalian Cells,1987；Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology,1987；それぞれここに参照して説明に代える)。免疫原性、水溶液への溶解性を増加させるために、あるいは正しく折り畳まれる性質を高めるために、ペプチドを修飾してもよい。例えばペプチドをグリコシル化してもよいし、ファルネシル化、水酸化、還元、酸化してもよい。
【００７０】
特に好ましい態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４１１〜６４４を含む。別の態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸４７０〜６４４を含む。更に別の態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ２タンパク質のアミノ酸６４４〜６６１を含む。当業者には理解できることであろうが、他の遺伝子型のＨＣＶ由来のＥ２タンパク質の類似アミノ酸配列を用いることもできる。類似配列は、異なるＨＣＶ株又は遺伝子型から得た複数のＥ２タンパク質配列を整列させることによって、調べることができる。望ましいエピトープを保存する相同配列もワクチンの調合に用いることができる。好ましくは配列は、ＨＣＶ１ｂＥ２タンパク質由来の天然配列に対して、少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも６０％の相同性、最も好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する。
【００７１】
特に好ましい態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸１９２〜３８３を含む。別の態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸１９２〜３４０を含む。更に別の態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸１９２〜３５２を含む。更に別の態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸１９２〜３６６を含む。更に別の態様において、ペプチドはＨＣＶ遺伝子型１ｂのＥ１タンパク質のアミノ酸１９２〜３７０を含む。当業者には理解できることであろうが、他の遺伝子型のＨＣＶ由来のＥ１タンパク質の類似アミノ酸配列を用いることもできる。類似配列は、異なるＨＣＶ株又は遺伝子型から得た複数のＥ１タンパク質配列を整列させることによって、調べることができる。望ましいエピトープを保存する相同配列もワクチンの調合に用いることができる。好ましくは配列は、ＨＣＶ１ｂＥ１タンパク質由来の天然配列に対して、少なくとも５０％の相同性、より好ましくは少なくとも６０％の相同性、最も好ましくは少なくとも７０％の相同性を有する。
【００７２】
特に好ましい態様において、ヒトに投与する前に、ペプチド又はペプチド群をアジュバントと、又は更に、薬剤として許容される他の賦形剤と混合する。
【００７３】
アジュバント
本発明の実施に用いられる組成物は、１種以上のアジュバント又はサイトカインを含んでいてもよいし、或いはそれらを含むプロトコルの一部として投与してもよい。本発明に従ってどのようなアジュバントを用いてもよい。多くのアジュバント化合物が知られており、そうした化合物の有用な目録に国立衛生研究所が作成したものがあり、インターネットで閲覧できる(http://www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf、ここに参照して説明に代える；更にAllison Dev.Biol.Stand.92：3-11,1998；Unkelessら、Annu.Rev.Immunol.6：251-281,1998；及びPhillipsら、Vaccine 10：151-158,1992参照。それぞれここに参照して説明に代える)。数百種の様々なアジュバントが当分野で公知であり本発明の実施に用いることができる。
【００７４】
投与
本発明に従って対象者に投与される抗体又はワクチンは、あらゆる種類の経路、プロトコル、用量配分で投与できることは、当業者に理解されよう。既知の投与経路の例としては、静脈内(ＩＶ)、腹腔内(ＩＰ)、胃内(ＩＧ)、皮下(ＳＱ)、筋肉内(ＩＭ)、経口(ＰＯ)、直腸(ＰＲ)、髄腔内、膣内、鼻腔内、経皮、皮内が挙げられる。静脈内、筋肉内、経皮、皮内、鼻腔内及び経口投与が一般に好ましい。
【００７５】
薬剤組成物
本発明に従って用いられる薬剤組成物は、薬剤として許容される賦形剤又は担体を含んでいてもよい。本明細書でいう「薬剤として許容される担体」とは、あらゆる種類の非毒性かつ不活性の固体、半固体又は液体のフィラー、希釈液、カプセル化材料又は調合補助剤を意味する。薬剤として許容される担体として使用できる材料の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース等の糖；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉等の澱粉；ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース等のセルロースとその誘導体；粉末トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；カカオ脂や座薬蝋等の賦形剤；ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油等の油類；プロピレングリコール等のグリコール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンを含まない水；等張性食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール、リン酸緩衝液；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム等の非毒性で他に作用を及ぼさない潤滑剤；着色剤、解除剤、コーティング剤、甘味料、調味料、香料剤、保存料、酸化防止剤が挙げられ、調合者の判断で組成物に含ませることができる。本発明の薬剤組成物はヒト及び／又は動物に、経口、直腸、非経口、大槽内、膣内、鼻腔内、腹腔内、局所(粉末、クリーム、軟膏又は滴剤として)、口腔経由で、あるいは経口又は鼻腔スプレーとして投与することができる。
【００７６】
経口投与用の液体形状としては、薬剤として許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。活性化合物に加えて、液体形状投与は例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤(エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類(特に綿実、ラッカセイ、コーン、胚種、オリーブ、ヒマシ及びゴマ油)、グリセロル、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルやそれらの混合物等)といった、当分野で一般的に用いられている不活希釈液を含んでいてもよい。経口用組成物は、不活希釈液のほか、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、調味料、香料剤等のアジュバントを含んでいてもよい。
【００７７】
注射可能な調製物、例えば無菌で注射可能な水性又は油質懸濁液を、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、公知の技術で調合することができる。無菌の注射可能な調製物は、非毒性の非経口で許容可能な希釈液又は溶媒に混合した、無菌の注射可能な溶液、懸濁液又はエマルジョン(例えば１，３−ブタンジオールに混合した溶液)の形状をとることができる。使用できる許容可能な賦形剤及び溶媒の例としては、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。更に一般には、無菌の不揮発性油が溶媒又は懸濁用媒体として用いられている。これには合成モノ又はジ−グリセリド等の刺激の低い不揮発性油であればどのようなものを用いてもよい。更に、オレイン酸等の脂肪酸を注射可能物質の調製に用いることができる。
【００７８】
注射可能な調合物は、例えばバクテリア捕捉フィルターによる濾過によって、又は使用前に無菌水又は他の無菌の注射可能な媒体に溶解又は分散することのできる、無菌の固体組成物形状の殺菌剤の添加によって、殺菌することができる。
【００７９】
作用物の効果を長引かせるために、皮下又は筋肉内注射した薬剤の吸収を遅延させることが望まれる場合が多々ある。その場合には水溶性が低い結晶又はアモルファス材料の液体懸濁を使用する。すなわち作用物の吸収速度はその溶解速度、ひいては結晶の大きさと結晶の形状に依存することになる。或いは、油賦形剤に薬剤を溶解又は懸濁することによって非経口投与薬剤の吸収を遅延させることができる。ポリラクチド−ポリグリコリド等の生物分解性重合体内に薬剤をマイクロカプセル化した基質を形成することで注射可能な持続性薬剤が作製できる。重合体に対する作用物の割合や使用される特定の重合体の性質に応じて、作用物の放出速度を制御できる。他の生物分解性重合体の例としては、ポリオルトエステル及びポリ無水物が挙げられる。体組織に影響を与えないリポソーム又はマイクロエマルジョン内に薬剤を封じ込めることで、注射可能な持続性薬剤調合物を調製することもできる。
【００８０】
直腸又は膣内投与用の組成物は好ましくは座薬であり、本発明の化合物をカカオ脂、ポリエチレングリコール、又は座薬蝋等の好適な無刺激の賦形剤又は担体に混合して調製する。これらは周囲温度で固体だが体温で液体であり、すなわち直腸又は膣腔内で溶けて活性化合物を放出する。
【００８１】
経口投与用の固体投薬形態としてはカプセル、タブレット、錠剤、粉末及び顆粒が挙げられる。このような固体投薬形態においては、活性化合物を少なくとも１種の、不活で薬剤として許容される賦形剤又は担体と混合する。例としてはクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム及び／又はａ)澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトル及びケイ酸等のフィラー又は増量剤、ｂ)カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース及びアラビアゴム等の結合剤、ｃ)グリセロル等の湿潤剤、ｄ)寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩及び炭酸ナトリウム等の崩壊剤、ｅ)パラフィン等の難溶(solution retarding)剤、ｆ)第四アンモニウム化合物等の吸収促進剤、ｇ)セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセリン等の湿潤剤、ｈ)カオリン及びベントナイトクレー等の吸着剤及びｉ)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム等の潤滑剤、及びそれらの混合物が挙げられる。カプセル、タブレット及び錠剤の場合、服用形状は緩衝剤を更に含んでいてもよい。
【００８２】
同タイプの固体組成物を、ラクトース又は乳糖、高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を用いた軟及び硬ゼラチンカプセルに入れるフィラーとして用いてもよい。
【００８３】
固体投薬形態のタブレット、糖衣錠、カプセル、錠剤及び顆粒は、腸溶性コーティング又は薬剤調合の分野で公知の他のコーティングといった、コーティング及びシェルを用いて調製できる。これらは更に乳白剤を含んでいてもよく、好ましくは腸管の特定の部位で場合によっては遅延するように、活性成分のみを放出する組成物から構成される。使用することのできる包埋組成物の例としては、重合体物質及び蝋が挙げられる。
【００８４】
同タイプの固体組成物を、ラクトース又は乳糖、高分子量ポリエチレングリコール等の賦形剤を用いた軟及び硬ゼラチンカプセルに入れるフィラーとして用いてもよい。
【００８５】
化合物は上記した賦形剤１種以上を用いたマイクロカプセルの形状をしていてもよい。固体投薬形態のタブレット、糖衣錠、カプセル、錠剤及び顆粒は、腸溶性コーティング、放出制御コーティング又は薬剤調合の分野で公知の他のコーティングといった、コーティング及びシェルを用いて調製できる。そのような固体投薬形態において、活性化合物を、スクロース、ラクトース又は澱粉等の少なくとも１種の不活希釈液と混合してもよい。そのような投薬形態は、一般に実施されているように、不活希釈液以外の物質、例えば錠剤化潤滑剤や他の錠剤化補助剤(ステアリン酸マグネシウム及び微結晶セルロース等)を含んでいてもよい。カプセル、タブレット及び錠剤の場合、投薬形態は緩衝剤を更に含んでいてもよい。あるいは更に乳白剤を含んでいてもよく、好ましくは腸管の特定の部位で場合によっては遅延するように、活性成分のみを放出する組成物からなる。使用することのできる包埋組成物の例としては、重合体物質及び蝋が挙げられる。
【００８６】
本発明の薬剤組成物を局所又は経皮投与する場合の投薬形態の例としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、スプレー、吸入剤又はパッチが挙げられる。活性成分は、無菌条件下で、薬剤として許容される担体及び必要な保存料又は必要に応じて緩衝剤と混合する。眼用調合物、点耳剤及び点眼薬も本発明の範囲に含まれる。
【００８７】
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、本発明の活性化合物のほかに、動物及び植物油脂、油類、蝋、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛又はそれらの混合物等の賦形剤を含んでいてもよい。
【００８８】
粉末又はスプレーは、本発明の化合物のほかに、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、又はこれらの混合物等の賦形剤を含んでいてもよい。スプレーは更に、クロロフルオロ炭化水素等の一般的な噴霧体を含んでいてもよい。
【００８９】
経皮パッチには、体内への化合物の取り込みが制御されるという利点がある。このような投薬形態は、適当な媒体に化合物を溶解する又は分散することによって作製することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通過する化合物の流れを増加させることもできる。速度は、速度制御膜を用いるか、重合体マトリックス又はゲルに化合物を分散することによって制御することができる。
【００９０】
患者の治療
本発明は、ＨＣＶ感染患者を分類し或いは更に治療する方法を提供する。特に好ましい態様において、患者に対しては治療投与計画が特に好適である。治療する患者を用意し、血清試料を患者から得る。中和抗体又はＨＣＶタンパク質の特定の領域又はエピトープに結合する抗体等、特定の抗体の存在について血清を分析する。本明細書で説明したものを含む当分野で公知の方法(例えばＥＬＩＳＡや競合アッセイ)を用いて、検出対象の抗体の存在を調べることができる。患者の血清中の抗体レベルに基づいて、その患者に対する治療を計画することができる。例えば、ビリオンによる天然受容体への結合を阻害するとわかっている抗体を持っていない患者を、このタイプのモノクローナル抗体で処理することができる。特に好ましい態様において、患者血清を１／２００以上、より好ましくは１／５００以上、もっとも好ましくは１／１０００以上の希釈率で希釈して５０％以上のＥ２結合阻害が得られた場合、ＨＣＶ感染患者の血清に競合抗体が存在する(陽性である)とみなす。
【００９１】
本方法の利点の一つとして、治療を個人にあわせて調整できるということにある。患者に必要とされているが患者が自然に産生できない抗体のみを投与する。これによって不必要な投与治療によって起こりうる有害な反応を回避するかあるいは低減させることができる。本方法は又、そのような治療の利益を得られない患者に経費をかけなくて済むという利点もある。例えば、患者が特定のＥ２エピトープに対する抗体を既に産生している場合、エピトープに対する外生ヒトモノクローナル抗体を投与する必要はない。
【００９２】
新しい細胞に感染する可能性のある循環ＨＣＶビリオンの量を低減できる、１種又は数種のＨＣＶ  ＨＭＡｂを患者に注入可能である、ということは当業者には理解されよう。この抗体治療は単独で行ってもよいし、他の治療と同時に行ってもよいし、他の抗ウイルス化合物による治療を終えてから行ってもよい。又、ＨＣＶ  ＨＭＡｂは、アポトーシス又は他の細胞死過程を誘導できる公知の毒素又はタンパク質に結合してもよい。ＨＣＶ感染細胞を破壊する手段として、ＨＣＶを原因とする肝臓病の患者に上記改変ＨＣＶ  ＨＭＡｂを投与することができる。
【００９３】
別の特に好ましい態様において、本発明の治療には、患者に存在しないと判明した抗体の産生を誘導するように設計したワクチンを投与することが含まれる。最も効果的なワクチンは好ましくは、天然構造を有し、保護応答(相補的活性化又はウイルス中和反応等)を引き起こすか強い抗体応答を誘導できる抗原から構成される。特に好ましい態様において、対応する抗体を対象者が自然の状態では産生しない、エピトープ又はそのミモトープを、ワクチンが含んでいる。例えばＨＣＶ  ＨＭＡｂ、特に多重遺伝子型を認識するＨＣＶ  ＨＭＡｂで単離した合成ペプチドミモトープは、ミモトープの最初の単離に用いた抗体に類似した強力な免疫応答を誘導する能力を持っている。そのようなワクチンを投与することで、患者の免疫系が投与エピトープに対する抗体群を産生し始める。本発明のミモトープ(又はエピトープ)は単独で用いてもよいし、組換えタンパク質と組み合わせて用いてもよいし、或いは数種類の異なるミモトープの混合物として用いてもよいことは理解されよう。
【００９４】
本発明において、ＨＣＶ  Ｅ１又はＨＣＶ  Ｅ２タンパク質のいずれか１種に対するＨＭＡｂを含む薬剤組成物が提供される。ある好ましい態様において、薬剤組成物はＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２の両方に対する抗体を含む。他の好ましい態様において、薬剤組成物はＨＣＶ  Ｅ１及びＨＣＶ  Ｅ２に対する抗体を２種類以上含む。本明細書に記載するように、ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２抗体は、単一ＨＣＶ遺伝子型又は多重ＨＣＶ遺伝子型のＥ１又はＥ２エピトープに対するものとすることができる。本明細書に記すように、抗体を直鎖状又は立体構造エピトープのいずれかに対するものとすることができる、ということは理解されよう。特に好ましい抗体の組合せとしては、Ｈ−１１１といずれかの抗Ｅ２ヒトモノクローナル抗体との組合せが挙げられる。特に好ましい抗体の組合せとしては、Ｈ−１１１ＨＭＡｂとＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ−１７又はＣＢＨ−２のいずれかから１種以上との組合せが挙げられる。
【００９５】
用途
本発明のＨＣＶ抗体を用いて、ＨＣＶ受容体を同定することができる。これには多くの方法が使用できるということが当業者には理解されよう(Sambrook J.,Fritsch E.及びManiatis T.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989；Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology,1987；それぞれここに参照して説明に代える)。通常、タンパク質及びペプチド受容体、そして本発明の場合はＨＣＶタンパク質及びペプチド(好ましくはＥ１及びＥ２)受容体を同定するには、ＨＣＶ感染しやすい細胞へのＨＣＶビリオンによる付着を、Ｅ１又はＥ２に対する抗体が阻害できるかどうかを調べる。感染しやすい細胞をＨＣＶ及び抗ＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２抗体と共に保温して細胞結合アッセイを行い、抗体の存在下で付着が減少したかどうかを調べる。
【００９６】
ＨＣＶに対する推定受容体を発現する細胞、又はＨＣＶに対する推定受容体のライブラリーを、ＨＣＶに対する結合能についてスクリーニングすることもできる。例えば、推定ＨＣＶ受容体(例えばＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２に対する受容体)を発現する細胞を、抗体の存在下、ＨＣＶタンパク質又はペプチドが細胞表面上の推定受容体に結合するのに十分な時間及び条件下で、ＨＣＶタンパク質又はペプチドに接触させる。あるいはＨＣＶタンパク質又はペプチド、ＨＣＶビリオンを、細胞表面にある推定受容体に接触させる前に、抗体と共に予め保温することができる。結合は、例えばフローサイトメトリーといった当分野で公知のどのような技術を用いて検出してもよい(Ausubelら又はSambrookら、上述参照)。抗体が存在しない場合の細胞への結合と比べて、抗体の存在下における細胞表面への結合が減少していれば、それがＨＣＶ受容体であるということになる。
【００９７】
Ｅ１又はＥ２受容体等のＨＣＶ受容体を同定する他の方法としては、ビーズやカラム等の固体支持体を使用するものが挙げられる。例えば、ＨＣＶ抗体を固体支持体に付着させ次いで抗体とＨＣＶタンパク質又はペプチドとを、ＨＣＶタンパク質又はペプチドが抗体に結合するのに十分な時間、接触させることによって、ＨＣＶタンパク質、ペプチド又はＨＣＶビリオンの受容体を同定することができる。これにより受容体によるＨＣＶタンパク質又はペプチドへの結合を可能にするのに十分な時間と条件下で、固体支持体上の抗体−リガンド複合体に接触させることのできる推定ＨＣＶ受容体に対するＨＣＶタンパク質リガンドを提供することができる。タンパク質はライブラリーから発現することもできるし、天然又は組換え細胞から調製した細胞抽出物又は精製タンパク質として提供することもできる。ＨＣＶタンパク質又はペプチドとの特異的結合複合体を形成した後、未結合のＨＣＶタンパク質又はペプチド(例えばＨＣＶタンパク質又はペプチドに特異的に結合しなかったライブラリータンパク質又はペプチド)を、例えば標準的な洗浄手順によって除去する。次いで結合タンパク質を、例えばゲル電気泳動法によって溶出及び同定する。
【００９８】
理解を深めるために本発明の上記及び他の形態を以下の実施例により更に詳しく述べるが、実施例は本発明の特定の態様を例証することを企図するものであって、請求項に規定される範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００９９】
ワクシニアウイルス中の多重遺伝子型からのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の産生
ＨＣＶ血清の反応性を解析しＨＣＶ  ＨＭＡｂ反応性の広さを調べるために、ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂの単離体からＨＣＶの全コード配列をクローニングし、ＨＣＶ陽性血清からＰＣＲ増幅し、ｐＶＯＴＥ(Wardら、1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6773-6777；ここに参照して説明に代える)転移ベクター(ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂそれぞれについてコンストラクトＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ及びＱ２ｂ)を用いてワクシニアウイルスで発現した。遺伝子型の選択は米国でのＨＣＶ感染者間におけるタイプと頻度(Mahaneyら、1994 Hepatology 20：1405-1411；ここに参照して説明に代える)に基づいて行った。オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｅ１の最後の３９アミノ酸、Ｅ２／ｐ７の全て、及びＮＳ２のＮ末端の９８アミノ酸を発現する断片を増幅するように設計した(表２の配列番号１８〜２７参照)。
【０１００】
詳しく述べると、ＨＣＶ  ＲＮＡについてＰＣＲ陽性の者から血漿アリコートを得て、ＩｎｎｏＬｉｐａＨＣＶ遺伝子型アッセイ(Innogenetics、ベルギー国ヘント)をマニュアルに従って用い、遺伝子型を特定した。ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂ感染者の血漿１２５μｌから、Puerescript ＲＮＡキット(Gentra Systems、ミネソタ州ミネアポリス)をマニュアルに従って用い、ＲＮＡを調製した。Ｈ2Ｏを含まない２５μｌのリボヌクレアーゼにＲＮＡペレットを再懸濁し、１０μｌについて逆転写酵素ＰＣＲを行った。逆ＨＣＶ特異的プライマーＨＣＶ  Ｅ２−Ｒ１  ５’−CGC GCA CrA AGT AsG GyA CT−３’(配列番号１６)を用い、ＭＭＬＶ逆転写酵素によって、逆転写反応を行った。逆転写は４０℃で６０分行った。逆転写されたｃＤＮＡを９８℃で５分間保温して変性し、４℃に冷却し、０．１５ｍＭｄＮＴＰ、３μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、３ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑポリメラーゼ及び正方向プライマーＨＣＶ  Ｅ２−Ｆ１  ５’−CGC ATG GCi TGG GAy ATG ATG−３’(配列番号１７)を含むＰＣＲ混合物を添加した。増幅は９４℃で１分間、５５℃で３分間、そして７２℃で３分間のサイクルを３０回行った。各遺伝子型のクローニングに適した正方向プライマーと内側逆方向プライマーＩＮＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅ(表２、配列番号１８−２７)、或いは各遺伝子型に適した逆方向プライマー及びＩＮＴ−Ｆｏｒｗａｒｄを用いた、２順目のＰＣＲ増幅に２〜８μｌの増幅産物を供した。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分間、６０℃で２．５分間、そして７２℃で２分間のサイクルを３０回行った。適当なサイズのバンド(遺伝子型特異的正方向プライマー及びＩＮＴ−Ｒｅｖｅｒｓｅの場合は〜８２０ヌクレオチド、ＩＮＴ−Ｆｏｒｗａｒｄ及び遺伝子型特異的逆方向プライマーの場合は〜１０８０ヌクレオチド)を臭化エチジウム染色したアガロースゲルから切り取り、一般に入手可能な樹脂(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて精製した。各遺伝子型に適した正方向及び逆方向プライマー(表２)と、約５０ｎｇの各バンドを混合して再増幅した。ＰＣＲ増幅は、９４℃で１分間、５５℃で２．５分間、そして７２℃で２分間のサイクルを３０回行った。増幅した産物を臭化エチジウム染色したアガロースゲルから切り取り、精製し、適当な制限酵素で切断した。この三段階増幅の結果、標準的な二段階増幅より高い収率で全長挿入物を得た。切断したＤＮＡを、同様に切断したｐＶＯＴＥ１又はｐＶＯＴＥ２ベクター(Wardら、1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6773-6777；ここに参照して説明に代える)内に連結した。連結したプラスミドをコンピテント大腸菌内にトランスフェクトし、挿入部分を含むクローンを標準法により同定し増殖した(Sambrook J.,Fritsch E.及びManiatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,1989；ここに参照して説明に代える)。ＨＣＶ遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂの全長Ｅ２及びｐ７を発現するコンストラクトについて、得られたクローンをそれぞれＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ及びＱ２ｂと称した。
【０１０１】
【表２】
2006504645.tif 000003
【０１０２】
ワクシニアウイルスコンストラクトＱ１ａ及びＱ２ｂによる完全Ｅ２タンパク質の発現を一時的発現アッセイで確認した。ＣＶ−１細胞を、５プラーク形成単位(ｐｆｕ)の野生型ワクシニアウイルス株ＶＷＡ(Wardら、上述)で感染し、次いでＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ(Promega、ウイスコンシン州マディソン)をマニュアルに従って用いてｐＶＯＴＥプラスミドでトランスフェクトした。１ｍＭイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)を追加した培養基で細胞を培養し、ＨＣＶタンパク質の発現を誘導した(Ward他、上述)。トランスフェクションの４８時間後、培養細胞をＰＢＳで洗浄して細胞を回収した。プロテアーゼ抑制剤Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス)、アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチンを最終濃度がそれぞれ０．５ｍｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌになるように添加した溶解緩衝液(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．５)、０．５％デオキシコレート、１．０％ノニデット−Ｐ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ)に細胞を再懸濁した。回収した細胞３×１０6個それぞれにつき１００μｌの溶解緩衝液を添加した。１８，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して核をペレット状にし、上澄みを直接用いるか、あるいは使用まで最長２日間、４℃で保存した。
【０１０３】
ウェスタンブロット法として、１０μｌの溶解緩衝液抽出物を１０μｌの２×ＳＤＳ試料緩衝液(２０％グリセロル、１０％β−メルカプトエタノール、４．８％ＳＤＳ、０．１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ(ｐＨ６．８))と混合し、９５℃で５分間加熱し、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)(Laemmliら、1970 Nature 227：680-685；ここに参照して説明に代える)で分別した。分別したタンパク質をニトロセルロースに通電転写し、ウェスタンブロットしたＨＣＶ  Ｅ２(スタンフォード大学H.Greenberg博士より入手)を認識するネズミモノクローナル抗体(ｍＭＡｂ)２Ｃ８と共に一晩保温した。ｍＭＡｂ２Ｃ８をＢＬＯＴＴＯ(２．５％脱脂粉乳、２．５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０(Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス)、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５)で１：５００に希釈した。精製したＨＣＶ又は対照抗体又はＨＭＡｂを含む培養基をＢＬＯＴＴＯでＩｇＧ濃度５μｌ／ｍｌに希釈した。ブロットをＴＢＳで３回洗浄し、ＥＣＬウェスタンブロットキット(Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ)をマニュアルに従って用い、結合抗体を検出した。
【０１０４】
コンストラクトＱ１ａ及びＱ２ｂは、ＭＡｂ２Ｃ８に対して免疫反応性を有する約７０ｋｄａｌのタンパク質を産生した(図１)。ｐＶＯＴＥ系(Wardら、1995 Proc.Natl.Acad.Sci USA 92：6773-6777；ここに参照して説明に代える)について予想されるように、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の発現は誘導因子ＩＰＴＧの存在に強く依存していた。遺伝子型の特定された１０種のＨＣＶ血清群を用いたＩＦＡにより、４種のコンストラクト全てからも発現タンパク質を検出した(データ示さず)。コンストラクトはいずれもＨＣＶ陰性血清に対して反応性を示さず、ＨＣＶ抗血清はいずれも野生型ワクシニアウイルスで感染した細胞に反応しなかった。
【０１０５】
４種のクローンそれぞれのＨＣＶ  Ｅ２の中央部から得た１６０ｂｐ内側断片(ＨＣＶ−１のヌクレオチド２００９〜２１６８)のＤＮＡ配列決定を行って、クローニングしたＥ２タンパク質の遺伝子型を確認した。図２(配列番号９〜１２)、又はダイターミネーター法及び自動ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を用いた挿入全体(コンストラクトＱ１ｂ)を参照されたい。この挿入体は、フレームシフトやナンセンス突然変異(termination mutations)を含まず、様々なデータベースから入手できる適当なＨＣＶ  Ｅ２配列に高い相同性を有していた(図３、配列番号１〜８参照)。これにより、ｐＶＯＴＥコンストラクトによって４種全ての遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２が正確に発現されたことが明確に示された。完全ＨＣＶを産生したプラスミドを用いてワクシニアウイルス株ＶＷＡのヘマグルチニン座内に相同遺伝子組み換えすることによって、組換えワクシニアウイルスを産生した(Wardら、上述；Moss及びEarl,In F.Ausubel及びR Brent及びR Kingston(編),Current Protocols in Molecular Biology,Vol.2,John Wiley&Sons,New York, NY,1994；それぞれここに参照して説明に代える)。標準法にてＢＳＣ−１細胞を感染し、キサンチン及びヒポキサンチンを含む媒体でグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ含有ウイルスを選択し、組換えワクシニアウイルスを同定した(Mossら、上述)。各組換えウイルスについて精製ウイルスストックを得た。ＢＳＣ−１細胞を用いて測定した力価は５〜１０×１０8ｐｆｕ／ｍｌの範囲にわたった。
【実施例２】
【０１０６】
ＨＣＶ  Ｅ２陽性の可能性があるＢ細胞ドナーの抗体スクリーニング
ＨＣＶの増殖は生体外では確実ではないので、ＨＣＶタンパク質に対する強い力価を持つ個人を同定するためには、真核細胞内で発現される組換えエンベロープタンパク質を用いる必要がある。そのスクリーニングには、エンベロープタンパク質の天然構造を保存して立体構造エピトープに対する抗体の検出を可能にする方法を用いる必要がある。ＨＣＶ  ＨＭＡｂ産生用の血清の同定には、免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)を用いる。アセトン固定した細胞を用いるこのアッセイは、ヒトＴリンパ球向性ウイルスエンベロープタンパク質の立体構造エピトープに対する中和ＨＭＡｂを産生する際に用いる方法に類似している(Hadlockら、1997 J.Virology 71：5828-5840；ここに参照して説明に代える)。ＨＣＶ用に、ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープタンパク質を発現するアセトン固定細胞を用いた。Ｅ２タンパク質は、組換えバキュロウイルスを用いてＳｆ９細胞内で、前述のように組換えワクシニアウイルスを用いてヒーラ細胞内で、又は市販のベクター(ｐＤｉｓｐｌａｙ、In Vitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)を用いてチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞内で、様々な時点で発現した。昆虫由来細胞は純粋な天然形状のウイルス性エンベロープタンパク質を発現しないので(Rosaら、上述；Arpら、1996 J.Virology,70：7349-7359；それぞれここに参照して説明に代える)、ワクシニアウイルス又は哺乳類細胞発現系の使用が好ましい。所与の血清に現れる蛍光を蛍光顕微鏡法により目視で数えるか、又、ある場合には様々な希釈度の血清を評価して、ドナー血清の希釈力価の終点を得た。
【０１０７】
免疫蛍光法で得た結果を確認するために、ＨＣＶ  Ｅ２に対する血清の反応性を評価するマイクロタイタープレートアッセイを行った。ヒーラ細胞の単層を８０％コンフルエンスまで培養し、５ｐｆｕ／細胞のＶＷＡ及び５ｐｆｕ／細胞の組換えワクシニアウイルス、又は５ｐｆｕのＶＷＡのみで感染した。ヘマグルチニンを持たないウイルスについて観察されたワクシニアウイルス誘導細胞変性効果を最小限におさえるために、完全なヘマグルチニン遺伝子を有する野生型ワクシニアとＨＣＶ組換えウイルスとを混合した(Sekiら、1990 Virology 175：372-384；ここに参照して説明に代える)。感染の２４時間後、細胞を回収した。ＰＢＳで細胞を洗浄して抽出物を調製し、３０×１０6個の細胞を１ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．５)、０．５％デオキシコレート、１．０％ノニデット−Ｐ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｅｆａｂｌｏｃｋ(Boehringer Mannheim、インディアナ州、インディアナポリス)、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び１μｇ／ｍｌペプスタチン)に再懸濁した。１８，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して核をペレット状にした。抽出物を４℃で保存し、調製後２４時間以内にＥＬＩＳＡを行った。５００ｎｇの精製Galanthus nivalisレクチン(SIGMA、ミズーリ州セントルイス)を含む１００μｌのＰＢＳを用いて、マイクロタイタープレート(Maxisorp、Nalge Nunc International、ニューヨーク州ロチェスター)の各ウェルを３７℃で１時間コーティングした。次いでウェルをＴＢＳ(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)で洗浄し、１５０μＬのＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５％正常ヤギ血清、２．５％脱脂粉乳を加えたもの)と共に室温で１時間保温してブロッキングした。プレートをＴＢＳで２回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯで１：５に希釈したワクシニアウイルス感染ヒーラ細胞からの抽出物２０μｌを添加した。室温で１．５時間保温した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯ９５μｌにワクシニアウイルスＶＷＡ感染ヒーラ細胞からの溶解性抽出物５μｌを加えたもので様々なレベルに希釈したＨＣＶ血清を添加した。溶解性抽出物の導入は、ＧＮＡレクチンによっても捕捉されうるワクシニアウイルスタンパク質への反応性を抑制した。プレートを１．５時間保温し、ウェルをＴＢＳで３回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯで１／５０００に希釈した抗ヒト−アルカリホスファターゼ複合体(Promega、ウィスコンシン州マディソン)１００μｌを添加した。室温で１時間保温した後、プレートをＴＢＳで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのリン酸ｐ−ニトロフェニル(ＰＮＰＰ)溶液と共に保温した。基質の反応を３０〜４５分進行させ、４０５ｎｍにおけるウェルの吸光度をマルチウェルプレートリーダー(Du Pont Co.、デラウェア州ウィルミントン)で調べた。
【０１０８】
典型的な結果を図４に示す。この実験において、遺伝子型の特定されたＨＣＶ血清５種及びＨＣＶ陰性の血液ドナー由来の血清１種を、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ及び２ｂのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質、ならびに非組換えワクシニアウイルスＶＷＡで感染した抽出物から捕捉したタンパク質について滴定した。ＨＣＶ  Ｅ２に対する反応性が最小だったのは、非感染者の血清(陰性血清と記したグラフ)であった。加えてＨＣＶ感染者の血清５種全てが、野生型ワクシニアウイルスで感染した抽出物から捕捉したタンパク質に対する反応性を殆ど或いは全く示さなかった(全てのグラフにおける細い黒線)。ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する様々な血清反応性が試験した５種の血清について得られ、ＨＣＶ２ａ血清が全体で最も高い反応性を示したことがわかる。
【０１０９】
ＨＣＶ遺伝子型２ｂ感染者から得た１２種の血清について得た結果を図５に示す。このグラフでは、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質４種全てについて比ＯＤ値０．５の結果になる血清希釈度を比較した(比ＯＤとはＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトの抽出物でコーティングしたウェルで得たＯＤと、非組換えワクシニアウイルスからの抽出物でコーティングしたウェルで得たＯＤとの比である)。血清１２種全てについて、ＨＣＶ２ｂ又は２ａＥ２タンパク質への反応性がＨＣＶ１ａ又は１ｂＥ２タンパク質への反応性に比べて顕著に大きかった。この結果は、ＨＣＶ遺伝子型２ａ又は２ｂの感染者からＨＣＶエンベロープを認識する抗体を検出するには、ＨＣＶ遺伝子型２のＥ２タンパク質が優れていることを示している。又、グラフ右側に示した血清のドナーからは、遺伝子型２ａ又は２ｂＥ２タンパク質に存在するエピトープに特異的なＨＣＶ  ＨＭＡｂの単離がより確実である。
【０１１０】
自己由来の抗体を投与する際に、第一世代ＨＣＶスクリーニングアッセイを行って、ＨＣＶ  ＨＭＡｂの産生に用いたドナーがＨＣＶ血清陽性であることを確認した。投与グループについてアラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)試験を行った結果、７種の投与のうち６種が正常範囲内(＜４５ＩＵ)だった。投与の１つはＡＬＴ値が４９であり、正常限界値を丁度上回っていた。それ以外については、ドナーは肝炎の外的徴候を示していなかった。このドナーは後にＲｏｃｈｅアンプリコアＨＣＶアッセイ(Roche Diagnostics、ニュージャージー州ブランチバーグ)を用いたＰＣＲによりＨＣＶ陽性であることが確認され、ＩｎｎｏＬｉｐａプローブアッセイ(Innogentics、ベルギー国ヘント)により１ｂ遺伝子型のＨＣＶに感染していたことが確認された。このドナーは、ＨＣＶ  Ｅ２を認識することのできる抗体の力価が高いことがＩＦＡによって判明した。結合中和アッセイ(下記参照)を行ったところ、このドナーが潜在的な中和抗体について高い力価を有することが示された。末梢血液Ｂ細胞をこの個人から単離し、ヒトハイブリドーマを分泌するＨＣＶ抗体の産生に用いた(下記参照)。
【実施例３】
【０１１１】
Ｅ２抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の産生
Ｔ細胞ロゼッティング(rosetting)によりドナーＴ細胞から末梢Ｂ細胞を精製した(Foungら、1984 J.Immunol.Methods 134：35-42参照；ここに参照して説明に代える)。１×１０4個のＢ細胞を含む培養それぞれをマイクロタイタープレート内にてＥＢＶで活性化した。ＨＣＶ特異的抗体を免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)で検出した。ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス、ＨＣＶ  Ｅ２を発現する組換えバキュロウイルスで感染した細胞、及び／又は自身のＤＮＡからＨＣＶ  Ｅ２を発現するように遺伝子工学処理した哺乳動物細胞系を、ＨＴＣ  ＳｕｐｅｒＣｕｒｅｄ２４スポットスライド上に固定した。細胞を１００％アセトンで室温にて１０分間定着させた。固定細胞を、希釈していないＥＢＶ活性化Ｂ細胞又はハイブリドーマの培養基と共に３７℃で３０分間保温し、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)ｐＨ７．４で５分間洗浄した。次いでスライドを、エバンスブルー対比染色０．００１％溶液及びフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Zymed、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)と共に３７℃で３０分保温した。蛍光顕微鏡法によって結合抗体を検出した。
【０１１２】
ＨＣＶ  Ｅ２に対する顕著な免疫蛍光を示した９９ウェルを５４０培養から同定し(収率〜１８％)、異なる免疫蛍光パターンを示した３０個のＥＢＶ活性化培養を、マウス−ヒトヘテロ骨髄腫への電気融合用に選択した(Foundら、1990 J.Immunol.Methods 134：35-42；Zimmermanら、1990 J.Immunol.Methods 134：43-50；Perkinsら、1991 Hum.Antibod.Hybridomas 2：155-159参照；それぞれここに参照して説明に代える)。１２の融合体(幾つかの融合体は、１以上の陽性ＥＢＶ活性化培養を含む)について、最初のハイブリドーマ培養４５６個のうち１８２が、ＩＦＡでＨＣＶ  Ｅ２との反応性を示した(全体の収率４０％)。ＨＣＶ  Ｅ２に対する反応性がウェスタンブロットで示された最初のＥＢＶ活性化培養の２種について、６種の融合体を追加で得た。(ＩＦＡでの反応性に加え)ウェスタンブロットで反応性を示すハイブリドーマ分泌ＨＣＶ  Ｅ２抗体を、２種の融合体から単離した。全部で３０種のヒトハイブリドーマを冷凍した。１２種の親ハイブリドーマから限界希釈クローンを単離し、１１種のハイブリドーマからのＨＣＶ  ＨＭＡｂを後の研究用として大量に産生した。ＨＣＶ  ＨＭＡｂのうち８種がカッパＬ鎖を有するＩｇＧ1であり、２種がラムダＬ鎖を有するＩｇＧ１であった。ＨＭＡｂＣＢＨ−９はＩｇＧ1であったが、ラムダ又はカッパＬ鎖のいずれであるかは分からなかった。１０種のＨＭＡｂ(ＨＭＡｂＣＢＨ−９を例外とする)のＰＣＲ及びＤＮＡ配列解析の結果、全てのＨＭＡｂがそれぞれ別のＨ鎖及びＬ鎖を発現したことが確認された。融合パートナー、ＩｇＧサブタイプ、並びにハイブリドーマを用いたＩＦＡの結果を表３に示す。
【実施例４】
【０１１３】
ＨＣＶ  Ｅ２  ＥＬＩＳＡ
これまでの研究の結果、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質は高度にグリコシル化されており、Galanthus nivalis(ＧＮＡ)、Tiriticum vulgaris(ＷＧＡ)及びRicinus communis等、数種のレクチンのいずれかに結合できることが示されている(Ralstonら、1993、上述；da Silva Cardosa、1998、上述；Satoら、1993 Virology 196：354-357；それぞれここに参照して説明に代える)。そこで試薬としての２種のレクチンＧＮＡ及びＷＧＡの有用性を、マイクロタイタープレート上でのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の捕捉で評価した。このアッセイの概要を図６に示す。
【０１１４】
ヒーラ細胞の単層を８０％コンフルエンスまで成長させ、５ｐｆｕ／細胞のＶＷＡ及び５ｐｆｕ／細胞の組換えワクシニアウイルス、又は５ｐｆｕのＶＷＡのみで感染した。ヘマグルチニンを有さないウイルスについて観察されたワクシニアウイルス誘導細胞変性効果を最小限におさえるために、完全なヘマグルチニン遺伝子を有する野生型ワクシニアとＨＣＶ組換えウイルスとを混合した(Sekiら、1990,Virology 175：372-384；ここに参照して説明に代える)。感染の２４時間後、細胞を回収した。ＰＢＳで細胞を洗浄して抽出物を調製し、３０×１０6個の細胞を１ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．５％デオキシコレート、１．０％ノニデット−Ｐ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス)、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び１μｇ／ｍｌペプスタチン)に再懸濁した。１８，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して核をペレット状にした。抽出物を４℃で保存し、調製後２４時間以内にＥＬＩＳＡを行った。
【０１１５】
【表３】
2006504645.tif 000004
【０１１６】
５００ｎｇの精製レクチンを含む１００μｌのＰＢＳを用いて、マイクロタイタープレート(Maxisorp,Nalge Nunc International、ニューヨーク州ロチェスター)の各ウェルを３７℃で１時間コーティングした。次いでウェルをＴＢＳ(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)で洗浄し、１５０μＬのＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５％正常ヤギ血清、２．５％脱脂粉乳を加えたもの)と共に室温にて１時間保温してブロッキングした。プレートをＴＢＳで２回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯで１：５に希釈したワクシニアウイルス感染ヒーラ細胞からの抽出物２０μｌを添加した。室温で１．５時間保温した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、様々な濃度で非標識化抗体を含むＢＬＯＴＴＯ１００μｌを添加した。プレートを１．５時間保温し、ウェルをＴＢＳで３回洗浄し、ＢＬＯＴＴＯで１／５０００に希釈した抗ヒト−アルカリホスファターゼ複合体(Promega、ウィスコンシン州マディソン)１００μｌを添加した。室温で１時間保温した後、プレートをＴＢＳで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのリン酸ｐ−ニトロフェニル(ＰＮＰＰ)溶液と共に保温した。基質の反応を３０〜４５分進行させ、４０５ｎｍにおけるウェルの吸光度をマルチウェルプレートリーダー(Du Pont Co.、デラウェア州ウィルミントン)で調べた。
【０１１７】
組換えＱ１ａワクシニアウイルスにより産生したＨＣＶ１ａＥ２をＨＣＶ  Ｅ２の供給源として用い、６種のＨＣＶ  ＨＭＡｂを検出試薬として用いた(図７)。対照モノクローナルの場合、どのレクチンで捕捉されたタンパク質に対しても反応性が見られず、ＷＧＡで捕捉されたタンパク質について全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂはバックグラウンドレベルの反応性を示しただけだった。これに対して、ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−２、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７は全て、ＧＮＡで捕捉されたタンパク質に強い反応性を示した。更に、ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−１７及びＣＢＨ−４Ｄは、ＧＮＡ捕捉タンパク質に対する反応レベルが低かった。これはＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−１１がこの特定のＥ２を認識しなかったことを示唆する。しかしＨＭＡｂによるＨＣＶ  Ｅ２に対する反応性を分析するためには、ＧＮＡ捕捉ＥＬＩＳＡが極めて有用であることが明らかである。
【０１１８】
そこでＨＣＶ  ＨＭＡｂの反応性を、様々な遺伝子型のＥ２タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスで評価した(図８)。１１種全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂが２種以上のＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトに結合し、対照ＨＭＡｂについては特異的信号は得られなかった(Ｒ０４と記した表)。４種全ての遺伝子型のＥ２タンパク質に対して最も高い相対親和性と最も高い反応性を有するＨＭＡｂは、ＣＢＨ−７及びＣＢＨ−８Ｃであり、次にＨＭＡｂＣＢＨ−５、−２及び−８Ｅであった。ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ及びＣＢＨ−９は遺伝子型２ａ及び２ｂのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対してより顕著な反応性を示したが、ＨＭＡｂＣＢＨ−１１はＱ１ａＥ２タンパク質に対する反応性が明らかに低かった。ＨＭＡｂＣＢＨ−１７と、又、より低いレベルであるがＣＢＨ−４Ｄ及びＣＢＨ−４Ｂは、遺伝子型２ａ又は２ｂのＥ２タンパク質に比較して遺伝子型１ａ及び１ｂのＥ２タンパク質に優先的に結合した。異なるＥ２タンパク質について得られた最大シグナルは全ての実験においてほぼ同等だったので、上記の多様性は異なるＥ２タンパク質を捕捉する効率の違いに由来するものではない。上記の結果は、同一のコンストラクトを用いたＩＦＡの結果と一致した(表３上参照)。７種の抗体ＣＢＨ−２、−４Ｇ、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−９は試験した全てのＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトに対して顕著な反応性を示したので、広い反応性を有するといえる。
【０１１９】
試験した全てのＨＭＡｂに、少なくとも２種のＨＣＶ遺伝子型への反応性があることは、ＨＣＶ  ＨＭＡｂにより認識されるエピトープが高度に保存されていることを示唆している(図９参照)。ＨＭＡｂにより認識されるエピトープが天然状態で立体構造であるか直鎖状であるかを調べることが重要である。これはＨＣＶ  ＨＭＡｂによる天然及び変性両方のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する反応性を比較することによって直接調べられる(図９参照)。予想通り、１１種全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂがＨＣＶ１ｂＥ２を認識する。ＨＣＶ  Ｅ２を０．５％ＳＤＳ及び５ｍＭジチオスレイトールの存在下５６℃で加熱処理した結果、１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂのうち１０種の反応性が完全になくなった。唯一の例外がＨＭＡｂＣＢＨ−１７で、変性Ｅ２タンパク質に対して反応性の約９０％を保持した。ウェスタンブロット解析によりＨＭＡｂＣＢＨ−１７が、ｖＱ１ａ又はｖＱ１ｂによって発現されたＨＣＶエンベロープタンパク質に対して弱い反応性を示すことが確認された(データ示さず)。残り１０種のＨＭＡｂのいずれについても、ウェスタンブロットでのｖＱ１ａに対する反応性は見られなかった(データ示さず)。従って１１種のうち１０種のＨＣＶ  ＨＭＡｂが立体構造エピトープを認識する。
【０１２０】
最後に、競合解析を用いて、どのＨＣＶ  ＨＭＡｂが同一の(又は空間的に非常に近い)エピトープを認識するかを調べた。このアッセイの概要を図１０に示す。ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−５、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を標準法でビオチン化し、選択したＨＭＡｂの過剰な存在下におけるビオチン化ＨＭＡｂによるＨＣＶ１型又は２型Ｅ２に対する反応性を、全く抗体を添加しない試料における反応性と比較した。図１１に見られるように、対照ＨＭＡｂＲ０４及びＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ、−４Ｇ、−７、−９及び−１７は全てＨＭＡｂＣＢＨ−５結合を本質的に阻害しなかった。これに対して、ＨＭＡｂＣＢＨ−５はそれ自身の過剰分により８５％、ＨＭＡｂＣＢＨ−８Ｅは約７５％が阻害された。ＨＭＡｂＣＢＨ−８Ｃ及びＣＢＨ−１１によるＨＭＡｂＣＢＨ−５の阻害は他よりムラがあり、ＨＭＡｂＣＢＨ−２によっては約５０％だけ阻害された。特に、ＨＭＡｂＣＢＨ−２で見られた競合は比較的曖昧で、ＣＢＨ−２が低い親和性で同じエピトープをＣＢＨ−５として認識したのか、空間的に近い別のエピトープを認識したのかははっきりしない。
【０１２１】
ＨＭＡｂＣＢＨ−２による抗体競合解析(図１２)を行ったところ、ＨＭＡｂＣＢＨ−２結合が、それ自身並びにＨＭＡｂＣＢＨ−５、−８Ｃ及び−８Ｅによって７５％以上阻害された。これに対して、ＣＢＨ−７はＱ１ａタンパク質のみに対する結合を６０％阻害し、ＣＢＨ−１１はＱ１ｂ及びＱ２ａタンパク質のみに対する結合を阻害した。ＨＭＡｂＣＢＨ−５に関して、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ、−４Ｄ、−４Ｂ、−９又は−１７との競合は見られなかった。ＨＭＡｂＣＢＨ−７の競合結果(図１３)を解析したところ、ＣＢＨ−７の結合を顕著に阻害した唯一のＨＭＡｂはそれ自身であったことが分かった。これらのデータは、幅広い反応性を示すＨＭＡｂのうち、ＣＢＨ−２、−５、−１１及び−７が別個のエピトープを認識することを実証している。又、ＣＢＨ−２、−８Ｃ及び−８Ｅが同一のエピトープあるいは２種の異なるエピトープのいずれかを認識するという可能性が残っている。加えてＣＢＨ−９及びＣＢＨ−４Ｇが同じエピトープ又は２種の異なるエピトープを認識する可能性があるが、ＣＢＨ−２、−５等と競合しなかったので、幅広い反応性を有する他のＨＭＡｂのように同じエピトープを認識するというわけではないことが確認された。従って、幅広い反応性を有するＨＭＡｂは少なくとも５種の異なるエピトープを認識する。
【実施例５】
【０１２２】
結合中和アッセイにおけるＥ２特異的ＨＭＡｂ活性の評価
結合中和(ＮＯＢ)アッセイは、所与の抗体又は血清が、ヒトＴ細胞系に発現した推定受容体に対するＨＣＶ  Ｅ２タンパク質による結合を阻害することができるかどうかを調べるものである。文献の方法及びＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を用いてＮＯＢアッセイを行った(Rosaら、上述；Ishiiら、上述)。以下簡単に述べると、哺乳類細胞で産生した１μｇのＨＣＶ  Ｅ２  １ａタンパク質(Rosaら、上述)を様々な希釈率の抗体(０．１〜３００μｇ／ｍｌ)と混合し、３７℃で３０分保温した。Ｍｏｌｔ−４細胞(１０5)を混合物に添加し、氷上で１時間保温した。洗浄後、Ｍｏｌｔ−４細胞に結合したＨＣＶ  Ｅ２の量を文献のようにフローサイトメトリーで評価した(Rosaら、上述)。ＮＯＢ力価は、Ｅ２結合を５０％中和する血清希釈として定義した。
【０１２３】
ＣＤ８１を発現する標的細胞へのＨＣＶ１ａＥ２による結合を阻害するＨＭＡｂの能力を、結合中和(ＮＯＢ)アッセイ(Rosaら、上述)で評価した。ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｄ、４Ｂ、４Ｇ及び１７は、２５μｇ／ｍｌ未満の濃度ではＥ２による標的細胞への結合をブロックしなかった。複数の実験において、ＨＭＡｂＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−１１は、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で５０％の阻害を達成した(表４)。
【実施例６】
【０１２４】
Ｅ２によるＣＤ８１への結合にＨＣＶ  ＨＭＡｂが与える影響：マイクロタイタープレートアッセイ
近年、ヒトテトラスパニンタンパク質ＣＤ８１は、ＨＣＶの潜在的受容体かつＨＣＶ  Ｅ２の細胞標的タンパク質としてＮＯＢアッセイで同定されている。ＣＤ８１内のＨＣＶ  Ｅ２に対する結合部位は、以前は細胞外ドメイン２又はＬＥＬと称されていた、大きな細胞外ドメインＣＤ８１−ＬＥＬに位置することが分かっている(Pileriら、1998 Science 282：938-941；ここに参照して説明に代える)。Ｅ２とＬＥＬとの混同を避けるために、この領域を大細胞外ドメイン(ＬＥＬ)と称することにする。ヒトＣＤ８１の細胞外ドメイン(ＣＤ８１−ＬＥＬ)を、ｐＧＥＸベクター(ＧＳＴ−２Ｔ)を用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白質として発現した。タンパク質の作製と精製は文献に従って行った(Flintら、1999 J.Virology 73：6235-6244；ここに参照して説明に代える)。このＣＤ８１−ＬＥＬ−ＧＳＴ融合蛋白質を用いて、どのＨＭＡｂがＣＤ８１−ＨＣＶ  Ｅ２複合体を認識できるかを調べた。このアッセイの概要を図１４に示す。マイクロタイタープレートウェルを、ＰＢＳで希釈した精製ＣＤ８１−ＬＥＬ又は非組換えＧＳＴ１００ｎｇでコーティングした。３７℃で２時間おいた後、ウェルをＴＢＳで一回洗浄し、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯと共に室温で１時間保温してブロッキングした。ＨＣＶ  Ｅ２発現ワクシニアウイルスで感染したＢＳＣ１細胞からの抽出物を、試験抗体を含む１００μｌのＢＬＯＴＴＯと共にコーティングプレート内で合わせ、緩やかに撹拌しながら４℃で一晩保温した。ウェルをＴＢＳで３回洗浄し、実施例４と同様に適当なアルカリホスファターゼ結合二次抗体及びＰＮＰＰ基質を添加した。
【０１２５】
多重遺伝子型のＥ２タンパク質を用いたＮＯＢの結果を確認するために、ＨＣＶ  Ｅ２とＣＤ８１との相互作用をＨＣＶ  ＨＭＡｂが阻害できるかどうかを評価した。まずマイクロタイタープレートを精製ＣＤ８１−ＬＥＬグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合蛋白質でコーティングしＨＣＶ  ＨＭＡｂの存在下に、過剰なＨＣＶ  Ｅ２を添加した。ＨＣＶ  Ｅ２はヒトＣＤ８１と特異的に結合するが他のほぼ全ての霊長類のＣＤ８１タンパク質とは結合しないので(Rosaら、上述)、Ｅ２タンパク質をミドリザル肝細胞系ＢＳＣ−１内で産生し、内因性のＣＤ８１による影響を最小限に抑えた。抗ＨＣＶ及び対照抗体の両方が、精製非組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼによって捕捉されなかった。野生型ワクシニアウイルスに感染させたＢＳＣ−１細胞の抽出物と併せた時、ＣＤ８１によっても、ＨＣＶ又は対照抗体は捕捉されなかった(データ示さず)。
【０１２６】
試験した４種全ての遺伝子型のＥ２タンパク質を同程度に含むＣＤ８１コートプレートにＮＯＢ陰性ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇを捕捉した。ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｂ、−４Ｄ及び−１７はＨＣＶ１ａ又は１ｂＥ２タンパク質によって様々な程度でＣＤ８１コートプレート上に捕捉されたが、ＨＣＶ２ａ又は２ｂＥ２タンパク質によっては捕捉されなかった。この結果は、これらＨＭＡｂが示したＧＮＡ捕捉Ｅ２タンパク質に対する反応性と一致する(図１５)。４種のＮＯＢ陰性ＨＭＡｂの滴定解析を行ったところ、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度にて最大５０％の結合率で全てがＨＣＶ１ｂＥ２タンパク質に結合した(表４)。ＮＯＢ陽性抗体ＣＢＨ−２、−５、−７、−８Ｃ、−８Ｅ及び−１１はいずれもＣＤ８１及び試験した４種全ての遺伝子型のＥ２タンパク質によって捕捉されなかった(図１５)。ＨＣＶ１ｂＥ２タンパク質がＣＤ８１−ＬＥＬにすでに結合したウェルにＨＣＶ抗体を添加したときにも同様の結果が得られた(データ示さず)。このことは、得られた結果がＥ２タンパク質及びＨＣＶ  ＨＭＡｂの添加とはそれぞれ関係がないことを意味する。ＨＭＡｂＣＢＨ−２及び７はＧＮＡ捕捉Ｅ２に対して強い反応性を示しＣＤ８１結合Ｅ２に対して陰性であるが、これら抗体の滴定解析を行ったところ、これらは２５μｇ／ｍｌの濃度までＣＤ８１−ＬＥＬ  Ｅ２複合体に結合しなかったことが確認された(データ示さず)。従って６種のＨＭＡｂが、多重遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２によるＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を阻害した。
【０１２７】
【表４】
2006504645.tif 000005
【実施例７】
【０１２８】
ＨＣＶ中和抗体のマイクロタイタープレートアッセイ
ＨＣＶ感染者の治療と管理を補助するものとして、感染者が強力な抗ウイルス免疫応答を有するかを調べることが望ましい。上記した結合中和アッセイやチンパンジー接種前に行うエクスビボ中和等、中和抗体力価を測定できるアッセイが幾つかあるが、これらのアッセイはいずれも煩雑であり大量の試料を検査するのに適していない。従って、ヒト血清中の抗体等の結合を中和するレベルを調べる阻害アッセイにおいて、多重遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質とのＣＤ８１複合体に対して同等の反応性を持つＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇを用いた。マイクロタイタープレートの各ウェルを、５００ｎｇの精製ＧＮＡレクチン又は１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ融合蛋白質のいずれかで、３７℃にて１時間コーティングした。ウェルをＴＢＳで１回洗浄し、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯで室温にて１時間ブロッキングした。次いでウェルをＴＢＳで１回洗浄し、様々な希釈率の試験血清又はモノクローナル抗体を適当なウェルに添加して合計５０μｌとした。それとは別に各ウェル用に、１５μｌのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質含有抽出物をＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇのビオチン化調製物４μｇ／ｍｌと併せ、ＢＬＯＴＴＯで合計５０μｌとした。４℃で２０分保温した後、すでに試験抗体を含んでいるマイクロタイタープレートウェルにＥ２とＣＢＨ−４Ｇの混合物を添加した。プレート全体を緩く攪拌しながら４℃で一晩保温した。翌朝ウェルの内容物を捨て、ＴＢＳで３回洗浄した。次に０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０(Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス)を含むＰＢＳで１／１０００に希釈したストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ(Amersham−Pharmacia、ニュージャージー州ピスキャタウェイ)１００μｌを添加した。プレートを室温で１時間保温した後、ウェルをＴＢＳで４回洗浄し、実施例２及び４で述べたように、結合したビオチン化抗体をＰＮＰＰ基質と共に保温して検出した。
【０１２９】
１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂ群を試験抗体として用いた結果を図１８に示す。この実験においては、２０μｇ／ｍｌ濃度のＨＣＶ  ＨＭＡｂが、ＨＣＶ遺伝子型１ａＥ２タンパク質によるヒトＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を阻害するかどうかを評価した。ＣＤ８１−ＬＥＬでコーティングしたウェルにおける結合阻害を、ＧＮＡレクチンでコーティングしたウェルにおいて同じ抗体で得た結果と比較した。ＧＮＡコーティングウェルにいてＥ２結合が阻害されたことは、ＣＢＨ−４Ｇ検出抗体と競合抗体との相互作用が阻害されていることを反映している。ＣＤ８１−ＬＥＬコーティングウェルにおける特異的阻害は、ＣＤ８１とＥ２との相互作用の阻害を反映している。１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂ又は対照抗体Ｒ０４のいずれもが、ＧＮＡに捕捉されたＥ２へのＣＢＨ−４Ｇによる結合を５０％以上阻害しなかった。これに対して、既に結合中和陽性であることが示された６種のＨＣＶ  ＨＭＡｂのうち５種がＣＢＨ−４Ｇ−Ｅ２複合体によるＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を強く阻害した。唯一の例外はＨＭＡｂＣＢＨ−１１で、遺伝子型１ａＥ２タンパク質のＱ１ａ単離体を効率よく認識しなかった。ＣＤ８１−ＬＥＬ−Ｅ２複合体を認識するＨＭＡｂＣＢＨ−４ｂ、−４Ｇ、−４Ｄ、−９及び−１７は全て、ＣＢＨ−４Ｇ結合Ｅ２によるＣＤ８１−ＬＥＬへの結合に最小限の影響しか与えなかった。従ってＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇは、ＨＣＶ  Ｅ２とＣＤ８１との相互作用を阻害可能な抗体と可能でない抗体とを効果的に識別することができる。
【０１３０】
【表５】
2006504645.tif 000006
【０１３１】
ＨＣＶと、ＨＣＶ  ＨＭＡｂの代わりに対照血清とを用いて上記実験を繰り返した(図１９)。６種の遺伝子型の特定されたＨＣＶ血清(遺伝子型１ａ血清３種及び遺伝子型２ｂの血清３種)及び２種のＨＣＶ陰性血清を、１／１０００の希釈率で相同的Ｅ２タンパク質に対して試験した。ＨＣＶ  ＨＭＡｂについてみられたように、ＧＮＡに対するＨＣＶ  Ｅ２による結合の阻害は殆ど或いは全く見られなかった。陰性血清のいずれもが、ＨＣＶ  Ｅ２によるＣＤ８１−ＬＥＬへの結合に顕著な影響を与えなかった。これに対してＨＣＶ血清は、Ｅ２によるＣＤ８１−ＬＥＬへの結合を幅広く阻害した。従ってマイクロタイタープレートにおいては、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇが推定受容体ＣＤ８１に結合したといえる。
【０１３２】
上記結果から明らかなように、ＨＣＶ感染の診断法と治療法の開発には、モノクローナル抗体も重要な役割を担う。遺伝子型１及び２を認識できるので、陰性の誤認がより少ないＨＣＶアッセイを行うことができ、ＨＣＶ感染を同定するアッセイは多量の抗体を必要としない。抗体は幅広い治療プログラムへの用途が期待できる。更に抗体を用いて、遺伝子型を同定し、ビリオン粒子を単離し、ＨＣＶ  ＲＮＡを単離し、血清又は他の試料から抗原を捕捉し、(例えばランダムペプチドファージライブラリーをスクリーニングすることによって)ミモトープを同定又は単離することができる。ヒト由来なので、ウイルスに接触したと考えられる個人を保護する予防治療や、患者内の有効ウイルス量を低減させる治療に用いることができる。
【実施例８】
【０１３３】
ＨＣＶ感染小動物モデルにおいてＨＣＶ複製を阻害するＨＣＶ  Ｅ２に対するヒトモノクローナル抗体の競合解析及びエピトープの位置解析
材料及び方法
細胞系及びウイルス。１０％牛胎児血清(ＦＣＳ)及び２ｍＭグルタミンを追加した最小必要培地(ＭＥＭ、Life Technologies、メリーランド州ベセズダ)でヒーラ細胞を培養した。１０％牛胎児血清(ＧＩＢＣＯ)及びＬ−グルタミン(２ｍＭ)(ＧＩＢＣＯ)を追加したダルベッコ改変最小必要培地(ＤＭＥＭ、Life Technologies、メリーランド州ゲーサーズバーグ)で、５％ＣＯ2にてヒト胚性腎臓(ＨＥＫ−２９３)細胞を維持した。ＨＣＶエンベロープタンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを作製して増殖させた(ＨＣＶ  ＪｏＶ参照)。ＨＣＶ１ａＨ株の構造タンパク質を発現するワクシニアウイルス１４８８はCharles Rice博士より入手した。
【０１３４】
モノクローナル抗体。ＨＣＶ  ＨＭＡｂの産生、精製及びビオチン化を行った(ＨＣＶ  ＪｏＶ参照)。Jane McKeating博士より得たＨＣＶ  Ｅ２に対するラットモノクローナル抗体３／１１を前述のように培養した。インフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)エピトープに対するラットモノクローナル抗体はRoche Diagnostics(インディアナ州インディアナポリス)より入手した。ｃ−ｍｙｃエピトープに対するネズミモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology(カリフォルニア州サンタクルーズ)より入手した。
【０１３５】
競合アッセイ。ヒーラ細胞の単層を８０％コンフルエンスまで培養し、ＨＣＶ  Ｅ２を発現する組換えワクシニアウイルスで感染し、細胞質抽出物を調製した(ＨＣＶ  ＪｏＶ参照)。５００ｎｇの精製Galanthus nivalis(ＧＮＡ)レクチン(ＳＩＧＭＡ、ミズーリ州セントルイス)を含む１００μｌのＰＢＳを用いて、マイクロタイタープレートのウェルを３７℃で１時間コーティングした。ウェルをＴＢＳ(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)で洗浄し、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５％正常ヤギ血清、２．５％脱脂粉乳を加えたもの)と共に室温で１時間保温してブロッキングした。プレートをＴＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＢＬＯＴＴＯに１５μｌの抽出物を加えたものを、各ウェルに添加した。室温で１．５時間おいた後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、様々な濃度の競合抗体を合計５０μｌ／ウェルとなるように添加した。プレートを３０分保温し、ビオチン化試験抗体溶液８μｇ／ｍｌ(ＣＢＨ−４Ｇ)又は４μｇ／ｍｌ(他のＨＭＡｂ全て)を５０μｌ／ウェルとなるように添加した。室温で１．５時間保温した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、１／１０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン(Amersham-Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスキャタウェイ)１００μｌを添加した。室温で１時間おいた後、プレートをＴＢＳで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのリン酸ｐ−ニトロフェニル(ＰＮＰＰ)溶液と共に３０分間保温した。４０５ｎｍにおけるウェルの吸光度をマルチウェルプレートリーダー(BioTek Instruments、バーモント州ウィヌースキ)で調べた。競合抗体が存在する場合にビオチン化試験抗体及びＥ２から得たシグナルを、競合抗体が存在しない場合に試験抗体及びＥ２から得たシグナルと比較した。
【０１３６】
ＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトの単離とクローニング。PureScript(Gentra systems、ミネソタ州ミネアポリス)をマニュアルに従って用い、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ感染者の血清からＨＣＶ１ｂＲＮＡを単離した。ワクシニアウイルス組換えＱ１ｂと全てのＨＣＶ１ｂ欠失コンストラクトの両方を同じ個人由来とした。ランダムプライマーと逆転写酵素(Perkin-Elmer Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)をマニュアルに従って４２℃、３０分の条件で用い、ＨＣＶ  ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＨＣＶ  Ｅ１の断片をポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)で増幅した。ＰＣＲにはｐｆｕ  ｔａｑポリメラーゼ (Stratageneカリフォルニア州ラホーヤ)と、ＢｇｌＩＩ又はＰｓｔＩ制限酵素切断部位に挟まれた適当なオリゴヌクレオチドプライマー、ｃＤＮＡ(Integrated DNA Technologies、アイオワ州コールビルより入手)を用いた。ＨＣＶ  Ｈ株コンストラクトをワクシニアウイルスコンストラクトｖｖ１４８８のウイルスストックからＰＣＲで増幅した。次いで増幅したＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで切断したｐＤｉｓｐｌａｙプラスミド(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)内に連結した。全てのプラスミドは、標準的な工程を用いて作製した(２８)。自動シーケンサー(PE-Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Dye terminator cycle配列決定を行い、枠内ＨＣＶ挿入の存在を確認した。
【０１３７】
ＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトの発現。ヒト胚性腎臓(ＨＥＫ)２９３細胞を培養して翌日までに６０−７０％コンフルエンスを得た。Ｔ−７５フラスコのトランスフェクション用に、  μｇの適当なプラスミドＤＮＡと  μｇのＰｅｒＦｅｃｔ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｆｘ−２(InVitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)との混合物を、  ｍｌの血清を含まない媒体と、１：６のＤＮＡ：脂質比(ｗ／ｗ)で混合した。３７℃で４時間保温した後、トランスフェクション溶液を２．５ｍｌの完全培地で置き換え、更に２４時間、細胞を培養した。ＰＢＳで細胞を洗浄して細胞抽出物を調製し、１ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．５％デオキシコレート、１．０％ノニデット−Ｐ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス)、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び１μｇ／ｍｌペプスタチン)に再懸濁した。１８，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して核をペレット状にした。ウェスタンブロット解析用に、抽出物を１対１で２×硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド電気泳動試料緩衝液(ＳＤＳ−ＳＢ；２０％グリセロル、１０％β−メルカプトエタノール、４．８％ＳＤＳ、０．１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８)と混合した。タンパク質を９５℃で５分加熱して変性し、変性した抽出物の２０μｌアリコートについて１２％ポリアクリルアミドゲルで硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続くウェスタンブロットには、標準法を用いた。
【０１３８】
マイクロタイタープレートアッセイ用に、５００ｎｇの精製Galanthus nivalis(ＧＮＡ)レクチン(ＳＩＧＭＡ、ミズーリ州セントルイス)を含む１００μｌのＰＢＳを用いて、マイクロタイタープレートのウェルを３７℃で１時間コーティングした。ウェルをＴＢＳ(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５)で洗浄し、１５０μｌのＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５％正常ヤギ血清、２．５％脱脂粉乳を加えたもの)と共に室温で１時間保温してブロッキングした。ウェルをＴＢＳで２回洗浄した後、７５μｌのＢＬＯＴＴＯで希釈したＥ２欠失コンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞の抽出物２５μｌを添加した。室温に１．５時間おいた後、プレートをＴＢＳで３回洗浄し、様々な濃度でモノクローナル抗体を添加した。プレートを１．５時間保温し、ＴＢＳで３回洗浄し、マニュアルに従ってＢＬＯＴＴＯで希釈した１００μｌの適当なアルカリホスファターゼ結合二次抗体を添加した(抗ヒト及び抗マウス抗体についてはPromega(ウィスコンシン州マディソン)、抗ラット抗体についてはKirkegard and Perry(カリフォルニア州サウスサンフランシスコ))。室温で１時間おいた後、プレートをＴＢＳで４回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌリン酸ｐ−ニトロフェニル(ＰＮＰＰ)溶液で３０分保温した。マルチウェルプレートリーダー(Du Pont Co、デラウェア州ウィルミントン)を持ちいて、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【０１３９】
フローサイトメトリー解析。様々な希釈率で試験抗体を含む総量１００μｌの染色溶液(ＰＢＳに１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを加えたもの)を、生存能力があるＨＣＶ  Ｅ１発現又は対照ＨＥＫ−２９３細胞１０6個と混合し、１００μｌの染色溶液に再懸濁し、４℃で４５分保温した。３ｍｌの染色溶液を更に添加した後、５００×ｇ、室温にて１０分間遠心分離して細胞をペレット状にした。ペレットを保存し、製造元のマニュアルにしたがって染色溶液で希釈したＦＩＴＣ結合二次抗体１００μｌに再懸濁した(Jackson Immunoresearch laboratories、ペンシルバニア州ウエストグローブ)。４℃で４５分間おいた後、９００μｌの染色溶液を添加し、上記したように細胞をペレット状にした。次いで細胞を１ｍｌの定着溶液(３．８％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ)に再懸濁し、細胞表面に結合したＨＭＡｂの量をFACScalibur(Becton-Dickinson、カリフォルニア州サンホゼ)で解析した。２色染色用に二次抗体をＲフィコエリトリンと複合して蛍光を６０６ｎｍでモニターする一方、ＥＧＦＰ蛍光を５４５ｎｍでモニターした。
【０１４０】
結果
ＨＣＶ  Ｅ２を認識するヒトモノクローナル抗体を２つの供給源から得た。１０種のＨＭＡｂ(ＣＢＨ−２、ＣＢＨ−４Ｂ、ＣＢＨ−４Ｄ、ＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７、ＣＢＨ−８Ｃ、ＣＢＨ−８Ｅ、ＣＢＨ−１１及びＣＢＨ−１７)を、無症候な遺伝子型１ｂＨＣＶ感染者から得た。抗体は異なる遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２に対して様々な反応性を示し、ＨＣＶ  Ｅ２とヒトＣＤ８１との相互作用に対する阻害能は様々であった。ＨＣＶ  ＨＭＡｂの呼称、反応性、特性を表６にまとめた。
【０１４１】
【表６】
2006504645.tif 000007
【０１４２】
競合アッセイを用いて、ＨＭＡｂに反応性を有するＥ２内の異なる部位の数を調べた。各ＨＭＡｂを精製し、ビオチン化し、様々な濃度の競合抗体の存在下での抗体の結合を調べた。典型的な結合曲線を図２１に記す。ＨＭＡｂＣＢＨ−２、ＣＢＨ−５、ＣＢＨ−８Ｃ及びＣＢＨ−１１とＨＣＶ１ｂＥ２との結合は、過剰なＨＭＡｂＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１によって全て顕著に阻害された。概してＨＭＡｂＣＢＨ−５が最も高い阻害レベルを示し、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−８Ｅの阻害が最も低かった。ＨＭＡｂＣＢＨ−２、−５、−８Ｃ及び−１１については、対照ＨＭＡｂＲ０４又はＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−７、ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｇでの顕著な阻害が観察されなかった。これに対して、ＨＭＡｂＣＢＨ−７はそれ自身により強く阻害され、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｂによっては非常に弱く阻害され、ＨＭＡｂＣＢＨ−２、−５、−８Ｃ、−８Ｅ、−１１、−４Ｇ又は他の対照抗体の存在には影響を受けなかった。同様にＨＭＡｂＣＢＨ−４ＢはＨＭＡｂＣＢＨ−７、ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｇについて中程度の阻害を示した。ＨＭＡｂＣＢＨ−２、−５、−８Ｃ、−１１及び８Ｅは互いにきわめて近接したエピトープ群を認識し、ＨＣＶ  Ｅ２の抗体結合部位であると考えられる。
【０１４３】
一連の阻害実験の結果を図２２に示す。立体構造エピトープを認識しＥ２とＣＤ８１−ＬＥＬとの結合を阻害することのできる５種の抗体ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１は全て、顕著に交差競合し、１つの競合群を形成する(グループＩ)。第二の競合群(グループＩＩ)にはＨＭＡｂＣＢＨ−７が含まれる。第三の競合群はＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ、ＣＢＨ−４Ｂ及びＣＢＨ−４Ｄにより構成され、第四の競合群は抗体群の中で直鎖状エピトープを認識する唯一の抗体、ＣＢＨ−１７より構成される。グループＩ抗体の結合はグループＩＩ抗体による影響を僅かに受け、グループＩＩＩ又はＩＶ抗体による影響を全く受けなかった。グループＩＩ抗体によるＥ２への結合は他グループ抗体の存在によって影響を受けなかった。グループＩＩＩ抗体はグループＩ抗体の存在によって影響を受けず強く阻害もされず、ＣＢＨ−７存在下でのＣＢＨ−４Ｇ結合の場合はグループＩＩＩ抗体の存在によって刺激された。ＨＭＡｂＣＢＨ−１７は他の抗体の結合に影響を与えなかった。従って１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂによって、ＨＣＶ  Ｅ２における４個の比較的はっきりした抗体結合部位が規定された。
【０１４４】
現在のところ、効率よくＨＣＶを増殖できる培養系は存在しない。ＨＣＶ構造タンパク質が哺乳類由来細胞で発現された場合、タンパク質は通常、細胞内に保持される。しかし近年、いくつかのグループが哺乳類細胞表面でのＨＣＶ  Ｅ２発現に成功したと報じている。細胞表面で発現されるＨＣＶ  Ｅ２が、感染性ビリオン表面のＨＣＶ  Ｅ２の構造をより忠実に再現するであろうことから、ｐＤｉｓｐｌａｙベクターでＨＣＶ１ｂＥ２細胞外領域(アミノ酸３８４〜６６１)を発現させた。ＨＣＶ  Ｅ２配列は、血小板由来成長因子受容体(ＰＤＧＦＲ)の経膜領域と枠内で発現された。ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質のカルボキシル末端のシグナル配列を、ネズミＩｇＫリーダー配列で置き換えた。インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)及びｃ−ｍｙｃの非常にまっすぐなエピトープを、ＨＣＶ配列のそれぞれ直前と直後に位置させた。グリコシル化前のＨＣＶ１ｂコンストラクトｓｆ１ｂ(ＨＣＶ１ｂＥ２のアミノ酸３８４−６６１を発現する)の予想分子量は４２ｋｄであった。タンパク質発現をウェスタンブロットで解析したところ異なる２個の免疫反応性タンパク質がｓｆ１ｂ−Ｅ２細胞系で産生されていた。第一のタンパク質は６８〜７０ｋｄａｌに泳動した比較的薄いバンドである。これはＧＮＡレクチンを用いた親和性クロマトグラフィーで効率的に精製された。得られたのはマンノースに富んだ炭水化物鎖を有する、細胞内形状のＥ２であった。第二の免疫反応性タンパク質は７０〜９８ｋｄの範囲にわたる不均一な染色である。これはＧＮＡレクチンクロマトグラフィーによって効率的に精製されなかった。このタンパク質は複雑な炭水化物鎖を有し細胞表面に存在する種類のうち主要なものであると推定される。ＤＮＡ配列決定を行ったところ、フレームシフトやナンセンス突然変異のない、期待通りの挿入物がクローニングされたことが確認された。
【０１４５】
ＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトｓｆ１ｂ−Ｅ２をＣＨＯ細胞に導入し、タンパク質を発現する細胞系を得た。ｓｆ１ｂ−Ｅ２発現細胞をＨＣＶ  ＨＭＡｂ又は対照抗体と混合し、細胞表面に発現されるＨＣＶ  Ｅ２へのＨＭＡｂによる結合能を調べた。ＨＡエピトープに対するモノクローナル抗体で染色したところ、９５％以上の細胞から強いシグナルが得られた。親ＣＨＯ細胞からは特異的なシグナルは得られず、ｓｆ１ｂ−Ｅ２発現細胞系又は対照抗体からは全くシグナルが得られなかった。ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−２、ＣＢＨ−７及びＣＢＨ−４Ｂは全てｓｆ１ｂ−Ｅ２細胞系を染色したが、これはＨＡエピトープについての観察と一致した。これに対してＨＭＡｂＣＢＨ−１１及びＣＢＨ−１７は、細胞表面に発現されたＥ２タンパク質と反応性を有するが、他のＨＭＡｂと比較して染色は１０分の１と低かった(表７)。従って１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂのうち９種が細胞表面に発現されたＥ２タンパク質と強く反応し、２種のＨＭＡｂが細胞表面に発現されたＥ２に顕著に低い反応性を示した。
【０１４６】
【表７】
2006504645.tif 000008
【０１４７】
次に、異なる４つのグループの抗体により認識される結合部位を含むＨＣＶ  Ｅ２領域の位置を調べた。ｓｆ１ｂ−Ｅ２のアミノ末端とカルボキシル末端から末端欠失を作製した。欠失の一つｐＤＮ４１１ではＨＣＶｓｆ１ｂ−Ｅ２の超可変部を取り除いた。他の欠失ではｓｆ１ｂ−Ｅ２のアミノ又はカルボキシル末端から大部分を取り除いた。欠失Ｅ２をｐＤｉｓｐｌａｙベクター内に再クローニングし、挿入部の細胞表面発現を可能にした。遺伝子型１ｂからの配列を発現するＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクト及びＨＣＶ１ａのＨ単離体を作製した(配列番号２８〜３５)(図２３)。ＨＥＫ−２９３細胞内へトランスフェクトし、ＨＡエピトープに対するモノクローナル抗体を用いた細胞質抽出物のウェスタンブロット解析を行って、Ｅ２欠失コンストラクトの発現を確認した(図２４)。対照抗体によるＣＭＶタンパク質に対する反応は観察されなかった(データ示さず)。ｓｆ１ｂ−Ｅ２において見られたように、早く移動した薄いバンドと、ゆっくり移動した不均一な染色の両方が、全てのコンストラクトについて観察された。同様の結果がｓｆＨ１ａ−Ｅ２及びｐＤＮＨ−４１１について得られた(データ示さず)。ＤＮＡ配列決定を行ったところ、コンストラクトそれぞれがフレームシフト又はナンセンス突然変異のない、期待通りの配列を発現したことが確認された。
【０１４８】
従って、ＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトをＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクトし、細胞質抽出物を調製し、ＧＮＡレクチンを用いたマイクロタイタープレート上に細胞内形状のＥ２を捕捉した。次いで、ＧＮＡに捕捉されたＥ２に対するＨＣＶ  ＨＭＡｂによる反応性を調べた。予想通り、全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂがｓｆ１ｂＥ２タンパク質と反応し、ｍｏｃｋトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞の抽出物から捕捉したタンパク質には反応しなかった(図２５)。又、全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂはｐＤＮ−４１１により産生されたＥ２と強く反応した。これは、ＨＭＡｂにより認識されたエピトープがＨＶＲ−１を含んでいなかったことを示している。次に、同じ抗体群を、(ｓｆＨ１ａ−Ｅ２)(配列番号２９)を有する又は(ｐＤＮＨ−４１１)ＨＶＲ１(配列番号３０)を有さないＨ株に由来するＨＣＶ  Ｅ２の細胞外領域について試験した。ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−８Ｃ及びＣＢＨ−１１はｓｆＨ１ａ−Ｅ２とｐＤＮＨ−４１１のいずれも認識しなかった。このことは、これら２個のＨＭＡｂにより認識されるエピトープがＨ株に由来するＥ２タンパク質において突然変異していたことを示唆している。ＨＭＡｂＣＢＨ−２、ＣＢＨ−８Ｅ及びＣＢＨ−５によるＨ株Ｅ２タンパク質への反応性も顕著に低下していた。これらのＨＭＡｂはＨＶＲ１コンストラクトｐＤＮＨ−４１１との反応性を保持しており、これらのＨＭＡｂにより認識されるエピトープがＨＶＲ１の外側にあることが確認された。他のＨＣＶ  ＨＭＡｂ及び対照抗体はＨ株由来Ｅ２タンパク質及び遺伝子型１ｂＥ２タンパク質に対して同等の反応性を示した。従って、１１種のＨＣＶ  ＨＭＡｂのうち９種が、ｓｆ１ｂ−Ｅ２とｓｆＨ１ａ−Ｅ２に保存されたエピトープを認識した。
【０１４９】
更にｓｆ１ｂ−Ｅ２配列からアミノ酸３８４−４４６(ｐＤＮ−４４７)(配列番号３１)又は３８４−４６９(ｐＤＮ−４７０)(配列番号３２)を欠失させたところ、グループＩの全てのＨＭＡｂ(ＣＢＨ−２、−８Ｅ、−５、−８Ｃ及び−１１)の反応性が失われた。又、これまでにＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸３８４〜４４５からなる直鎖状エピトープを認識することが判明しているラットＭＡｂ３／１１は、ｐＤＮ−４４７及びｐＤＮ−４７０に対して反応しなかった。これに対し、グループＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶのＨＣＶ  ＨＭＡｂは両方のコンストラクトｐＤＮ−４４７及びｐＤＮ−４７０に対する反応性を保持した。このことは、これらのグループのＨＭＡｂにより認識されるエピトープが、ＨＣＶ  Ｅ２のカルボキシル末端領域の中央に位置することを示している。最後に、カルボキシル末端領域に欠失を有するＥ２タンパク質を、ＨＣＶ  ＨＭＡｂで評価した。ＣＢＨ−１７を除く全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂが、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸３８４−６４４(ｐＤＣ−６４４)(配列番号３３)を発現するＥ２タンパク質に反応した。これに対して、いずれのＨＣＶ  ＨＭＡｂも、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸３８４−５７９(ｐＤＣ−５７９)(配列番号３４)を発現するコンストラクトに反応しなかった。ＨＡ又はｃ−ｍｙｃエピトープに対して反応性を保持したように、ラットＭＡｂ３／１１は両方のカルボキシル末端欠失Ｅ２タンパク質に反応性を保持した。従ってアミノ酸６４４〜５７９の間のＨＣＶ  Ｅ２配列の欠失は、立体構造エピトープを認識する１０種全てのＨＣＶ  ＨＭＡｂの反応性を失わせるのに充分であった。
【０１５０】
ＧＮＡアッセイを行って、細胞内に存在する欠失に対するＨＣＶ  ＨＭＡｂの反応性を確認した。同一の欠失コンストラクトＥ２で細胞表面に発現されたものに対するＨＣＶ  ＨＭＡｂの反応性を確認するために、Ｅ２欠失コンストラクトを発現する細胞へのＨＭＡｂの結合をフローサイトメトリーで評価した。ＨＭＡｂグループＩのＣＢＨ−５、ＨＭＡｂグループＩＩのＣＢＨ−７、ＨＭＡｂグループＩＩＩのＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｂでコンストラクトを評価した。対照抗体にはラットＭＡｂ３／１１及びＨＡを用いた。Ｅ２欠失コンストラクトｐＤＮ４１１及びｐＤＮ４４７を用いた結果を図２５に示す。全てのＥ２欠失についての結果は表７に示す。一過性トランスフェクションによってＥ２欠失をＨＥＫ−２９３細胞に導入したので、約５０−６０％の細胞だけがプラスミドを取り込みＥ２タンパク質を発現した。従って、観察された蛍光の幾何平均(geometric means)は、クローンしたＣＨＯ細胞系について得られた結果に比べ、著しく低かった。にもかかわらず、フローサイトメトリーによりＨＭＡｂＣＢＨ−５、ＣＢＨ−７及びＣＢＨ−４Ｂについて得られた結果はＧＮＡ捕捉アッセイの結果と完全に一致した(表７)。従ってグループＩＩ及びＩＩＩのＨＭＡｂはＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４７０〜６４４の間に位置するエピトープを認識する。グループＩのＨＭＡｂはＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４１１〜６４４の間に位置するエピトープを認識する。
【実施例９】
【０１５１】
ＨＣＶ感染を中和できる高レベルの抗体の、ＨＣＶ感染者における希少性
患者及び方法
患者。１９９１〜１９９９年のＣ型肝炎感染の調査分析又は追跡分析のために核酸検査を受けている個人から評価対象の血清を得た。全ての患者がサンフランシスコ湾地域の診療所で肝炎の治療を受けていた。被験者はポリメラーゼ連鎖反応によるＨＣＶ  ＲＮＡについては陽性であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の存在については陰性であり、遺伝子型が特定されており、試料を採取した時点では抗ウイルス治療を受けていなかった。年齢、性別、診断の日付、これまでに受けたインターフェロン治療、アラニントランスアミナーゼ(ＡＬＴ)値、及び可能性のある感染経路を含む、医療記録から人口統計的情報を得た。被験者の殆どについて、ＨＣＶ感染の危険因子が少なくとも１つあることが報告されていた。全ての情報が全ての被験者から入手できたわけではなかった。肝生検を行った場合には、組織学的活性指数(ＨＡＩ)で記録した。ＩｎｎｏＬＩＰＡアッセイ(Innogenetics、ベルギー国ルヴェン)をマニュアルに従って用い、遺伝子型解析を行った。ＨＣＶウイルス量は、COBAS Amplicor ＨＣＶモニターキット(Roche molecular systems、カリフォルニア州アラメダ)を用いて調べた。ＨＣＶ陰性対照血清はStanford Medical School血液センターへ提供された血液の血漿から得たものであり、標準的な抗体を用いたスクリーニングアッセイで調べたところ、輸血で伝染したウイルスの存在について陰性であった。
【０１５２】
ＨＣＶ血清のＥ２抗体スクリーニング。ヒーラ細胞の単層を８０％コンフルエンスまで培養し、ＨＣＶ  Ｅ２発現ワクシニアウイルスで感染した。感染の２４時間後、細胞を回収し、抽出物を調製した(Hadlockら、２０００参照)。下記の要領で、ＨＣＶ  Ｅ２の反応性についてＥＬＩＳＡアッセイを行った。５００ｎｇの精製Galanthus nivalisレクチンを含む１００ｍｌのＰＢＳを用いて、マイクロタイタープレートウェルを３７℃で１時間コーティングした。次いでウェルをＴＢＳで洗浄し、ＢＬＯＴＴＯ(ＴＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２．５％正常ヤギ血清、２．５％脱脂粉乳を加えたもの)と共に保温してブロッキングした。プレートを洗浄し、各ウェルにＢＬＯＴＴＯで希釈したＨＣＶ  Ｅ２含有抽出物１５ｍｌを入れた。２５℃で１．５時間保温した後、ウェルをＴＢＳで洗浄し、ＢＬＯＴＴＯで様々なレベルに希釈したＨＣＶ感染者又は非感染者の血清を添加した。３０分保温した後、ビオチン化した試験ＨＭＡｂを添加して最終濃度２ｍｇ／ｍｌとした。プレートを２５℃で１．５時間保温し、ウェルをＴＢＳで３回洗浄し、１００ｍｌのストレプトアビジン−ＡＰ複合体を２５℃で１時間添加した。ウェルをＴＢＳで４回洗浄した後、ＰＮＰＰを入れて保温した。基質の反応を３０分進行させ、次いで４０５ｎｍにおけるウェルの吸光度をマルチウェルプレートリーダーで調べた。
【０１５３】
競合血清の希釈それぞれについて、測定した光学濃度(ＯＤ)を、競合抗体を用いなかった場合のウェルについて得られたＯＤと比較した。希釈に対する結合抗体のパーセントをグラフにし、試験ＨＭＡｂ結合を５０％阻害した血清の希釈を計算した。５０％阻害を達成しなかった血清は力価４０が割り当てられたが、これは試験したうちで最低の希釈よりも低かった。試料血清反応性を評価した被験者には、試験試料中のウイルス量や治療状態は公開しなかった。InStat及びPrismソフトウェアパッケージ(Graph Pad Software Inc、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて統計分析を行った。
【０１５４】
結果
この研究では、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７によるＨＣＶ  Ｅ２への結合を阻害することのできる抗体の存在について、ＨＣＶ感染者からの血清を評価した。ヒトモノクローナル抗体ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を精製しビオチン化し、遺伝子型のマッチしたＥ２タンパク質へのＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７による結合を５０％阻害した血清希釈率を調べた。ＨＣＶ陰性者からの血清を用いて、非特異的結合を測定し、臨界値を定めた。１／２００以上の希釈率で５０％以上のＥ２結合阻害が得られた場合には、競合抗体の存在についてＨＣＶ感染者の血清は陽性であるとみなした(図２６及び２７)。ウイルスＲＮＡに陽性なＨＣＶ感染者から得た７４種の血清のうち、３５種(４７％)がＣＢＨ−２結合を阻害する抗体について陽性であり、３２種(４３％)がＣＢＨ−７結合を阻害する抗体について陽性であった(図２８及び２９)。１５種の血清(２０％)がＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７の両方を阻害する抗体の存在について陰性であった。１９種(２７％)がＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７の結合を阻害する抗体について高い力価(＞１／１０００)を有していた(表８参照)。これらの者のウイルス量中央値は顕著に低かった(２．４×１０6対４．７×１０6、ｐ＝０．０３５)が、他の点では他のＨＣＶ感染者と同じだった。従って最もＨＣＶ感染レベルが高い者は、推定中和活性を有する血清抗体レベルが低いということで特徴づけられる。ＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７等のＨＭＡｂの量が低い個人は、簡単な阻害アッセイによって同定することができる。ＣＢＨ−２やＣＢＨ−７等のＨＣＶ中和反応を有するヒトモノクローナル抗体を治療に用いれば、これらの感染者に有用であろう。
【０１５５】
【表８】
2006504645.tif 000009
【実施例１０】
【０１５６】
スクリーニング標的としてのＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２抗原の調製及びＨＣＶ  Ｅ１タンパク質を標的とするヒトモノクローナル抗体の産生
材料及び方法
細胞系及び試薬。１０％牛胎児血清(ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク州グランドアイランド)及びＬ−グルタミン(２ｍＭ)(ＧＩＢＣＯ)を追加したダルベッコ改変最小必要培地(ＤＭＥＭ)(ＧＩＢＣＯ)で、５％ＣＯ2にてＨＥＫ−２９３細胞を維持した。１０％牛胎児血清及びＬ−グルタミン(２ｍＭ)を追加したハムのＦ１２培地にＣＨＯ−Ｋ１細胞を保持した。様々な遺伝子型のＨＣＶを含む臨床血清試料は、Gish博士より入手した。オリゴヌクレオチドプライマーをＩＤＴ(アイオワ州コールビル)によって合成した。
【０１５７】
抗体及び患者血清。インフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)エピトープに対するモノクローナル抗体を、ラット中に産生し、Roche Diagnostics(インディアナ州インディアナポリス)を用いて採取した。ＨＣＶ  Ｅ１(ＨＣＭ−Ｅ１)に対するモノクローナル抗体をAustral Biologicals(カリフォルニア州サンラモン)から得た。ｃ−ｍｙｃエピトープに対するモノクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology(カリフォルニア州サンタクルーズ)より入手した。標準的な抗体を用いたスクリーニングアッセイによりＨＣＶの存在について陽性であると評価された血液ドナーから、８種のＨＣＶ血漿試料を得た。ＩｎｎｏＬＩＰＡアッセイ(Innogenetics、ベルギー国ルヴェン)をマニュアルに従って用い、遺伝子型解析を行った。１９９６〜１９９８年のＣ型肝炎感染の調査分析又は追跡分析のために核酸検査を受けている個人から１６種のＨＣＶ１ｂ血漿試料を追加で得た。被験者はポリメラーゼ連鎖反応によるＨＣＶ  ＲＮＡについては陽性であり、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の存在については陰性であり、ＨＣＶ遺伝子型が特定されており、試料を得た時点では抗ウイルス治療を受けていなかった。ＩｎｎｏＬＩＰＡアッセイ(Innogenetics、ベルギー国ルヴェン)をマニュアルに従って用い、遺伝子型解析を行った。ＨＣＶ陰性試料はStanford Medical School血液センターへ提供された血液の血漿から得たものであり、標準的な抗体を用いたスクリーニングアッセイで調べたところ、ＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の存在について陰性であった。
【０１５８】
ＨＣＶ  ＲＮＡの単離、増幅及びプラスミド作製。ＰｕｒｅＳｃｒｉｐｔ(Gentra systems、ミネソタ州ミネアポリス)をマニュアルに従って用い、ＨＣＶ  ＲＮＡをヒト血清(遺伝子型１ｂ)から単離した。ランダムプライマーとＲＴ(Perkin-Elmer、コネチカット州ノーウォーク)をマニュアルに従って４２℃、３０分の条件で用いてＨＣＶ  ＲＮＡの逆転写を行った。ＢｇｌＩＩ又はＰｓｔＩ制限酵素切断部位に挟まれた適当なオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡからＰＣＲ(pfu、Stratagene)でＨＣＶ  Ｅ１又はＥ２の断片を増幅した。全てのプラスミドを、標準的手順を用いて作製した(Maniatesら、1982)。親プラスミドｐＤｉｓｐｌａｙ(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)は、ＣＭＶプロモーターにより転写が引き起こされる、ネズミＩｇカッパ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチドと血小板由来成長因子受容体経膜領域(ＰＤＧＦＲ−ＴＭ)とをコードする配列と、それらの間の複数のクローニング部位とを含んでいた。ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩクローニング部位を用いて、ヘマグルチニンＡ及びｍｙｃエピトープをコードする配列と同じ枠内にＯＲＦがあるＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２プラスミドを作製した。アミノ酸３８４〜６６１に相当するＥ２断片をＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ(New England Nuclear、マサチューセッツ州ボストン)クローン部位に挿入して、ＨＣＶ  Ｅ２配列を含むプラスミド＃３８を作製した。アミノ酸１９２〜３８３、１９２〜３７０、１９２〜３６６、１９２〜３５２、１９２〜３４０及び１９２〜３２１に相当するＥ１断片をＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩクローニング部位に導入して、様々な長さのＨＣＶ  Ｅ１を含むプラスミド４６、１１５、１１３、１０７、１０２及び９８を作製した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Dye terminators cycle 配列決定キット(Beckman center、Stanford)を用いて配列を確認した。
【０１５９】
ＨＥＫ２９３から全ＲＮＡを単離したことを除いては、上記と同じ方法を用いてＣＤ８１コンストラクトを作製した。ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位で挟まれたオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡからＰＣＲ(ｐｆｕ、Stratagene)でＣＤ８１の断片を増幅した。ヌクレオチド２３９−９５０に相当する断片をＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩ(New England Nuclear、マサチューセッツ州ボストン)クローニングサイト内に挿入して、プラスミドＣＤ８１を作製した。
【０１６０】
トランスフェクション。トランスフェクションに先立って、ＨＥＫ２９３細胞を培養し翌日までに細胞密度５０−６０％コンフルエンスを得た。PerFect Lipids(Invitrogen)(商品名)をマニュアルに従って用い一過性トランスフェクションを行った。６ウェルプレートトランスフェクション用に、５ｕｇのＤＮＡと脂質(Ｐｆｘ−２)との１：６(ｗ／ｗ)混合物を、血清を含まない媒体に入れたものを用いた。トランスフェクションの４時間後、細胞を完全培地に移し変えた。トランスフェクションの２４〜４８時間後、細胞表面発現についてアッセイを行った。ＥＧＦＰ(Clontech、カリフォルニア州パロアルト)はトランスフェクション効率の内部制御として用いた。
【０１６１】
安定した細胞系の作製(薬剤選択)。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をプレートに入れて培養し、１日後に５０−６０％コンフルエンスを得た。PerFect Lipid Ｐｆｘ−８(Invitrogen)(商品名)をマニュアルに従って用い細胞をトランスフェクトした。１００ｍｍプレートトランスフェクション用に、血清を含まないハムのＦ１２−Ｋ培地中で２９ｕｇのＤＮＡをLipid Ｐｆｘ−８と１：６(ｗ／ｗ)で混合し、細胞に添加した。５時間後、細胞を完全培地に移し変えた。３７℃で５％ＣＯ2にて一晩保温した後、完全培地に４５０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８(Gibco BRL、メリーランド州ロックビル)を加えた選択培地で、完全培地を置き換えた。選択培地に２週間置いた後、多数の選択クローンを１つの個体群として回収した。次いで、様々な細胞密度の選択培地を含む１００ｍｍプレートに細胞を入れ、単離クローンの成長を促進した。１０日後、単離クローンを標準法で２４ウェルプレートに移した(Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology 2000,John Wiley&Sons Inc.)。等量の０．２％トリプシン及びヴェルセン１：５０００(Gibco BRL)で飽和した、無菌の１／８インチクローニングディスク(PGC Scientific、メリーランド州ゲーサーズバーグ)を選択したクローン上に置いて転写した。室温で数分置いた後、回収した細胞を含むトリプシン／ヴェルセン飽和フィルターそれぞれを、２４ウェルプレート上の選択培地を含むウェルに移した。細胞がほぼコンフルエンスに達したとき、細胞を回収し、１２ウェルプレートに移し、ほぼコンフルエンスに達したとき再度回収した。回収した細胞をスライド上に置き、ＩＦＡを行った。最も強いＩＦＡ陽性を示したクローンを増殖し、培養基に保持した。なお、時間の経過と共にタンパク質発現レベルは低下したので、限界希釈によるクローニングを標準法で行った。簡単に述べると、選択培地を含む複数９６ウェルの平底プレートに５、２、０．５及び０．１細胞／ウェルにて細胞を培養した。単クローンを含むウェルからの細胞を２４ウェルプレートに移し、ほぼコンフルエンスとなるまで培養し、上記したＩＦＡ用に回収した。最も強いＩＦＡ陽性を示したクローンは下記に記す標準法を用いたフローサイトメトリー解析によっても試験した。すなわち、１０ｕｇ／ｍｌのＣＢＨ−５及びＣＢＨ−４Ｇ、一次抗体としての２種の抗Ｅ２ＨＣＶヒトモノクローナル抗体、二次抗体としてのＦＩＴＣヤギ抗ヒトＩｇＧ(Ｈ及びＬ鎖)(Jackson Immunoresearch Laboratories,Inc.、ペンシルバニア州ウエストグローブ)で細胞を染色した。最も強い陽性を示したクローンの一つ、３８−１９／５Ｇ３をアッセイ用に増幅した。これは数ヶ月間高いレベルのＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を発現し続けた。
【０１６２】
ウェスタンブロット。ＨＥＫ−２９３細胞を６ウェル組織培養プレートで培養し、上記したように様々なＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５ｍｌの溶解緩衝液(１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、０．５％デオキシコレート、１．０％ノニデット−Ｐ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ(Boehringer Mannheim、インディアナ州インディアナポリス)、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び１μｇ／ｍｌペプスタチン)に再懸濁した。１８，０００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離して核をペレット状にし、得られた細胞質抽出物を、１対１で２×硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド電気泳動試料緩衝液(ＳＤＳ−ＳＢ；２０％グリセロル、１０％β−メルカプトエタノール、４．８％ＳＤＳ、０．１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８)と混合した。あるいは、トランスフェクションの２４時間後に細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、１００μｌの２×ＳＤＳ−ＳＢを添加した。タンパク質を９５℃で５分加熱して変性し、変性抽出物の２０μｌアリコートについて１２％ポリアクリルアミドゲルで硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド電気泳動法(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)を行った。
【０１６３】
フローサイトメトリー。一過的にトランスフェクトした細胞をヴェルセン１：５０００(Gibco BRL)を含むウェル又はフラスコから取り出し、染色溶液(１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ)で洗浄し、約１０(１０6)細胞／ｍｌで再懸濁した。様々な希釈率で試験抗体を含む総量１００μｌの染色溶液を、１００μｌの染色溶液に再懸濁した１０6個の生存能力があるトランスフェクト又は対照細胞と混合し、４℃で４５分保温した。全ての希釈と洗浄は染色溶液で行った。一次試験抗体は抗ＨＡ(Boehringer−Mannheim)、抗Ｅ２(Austral Biologicals)をいずれも５ｕｇ／ｍｌで用い、更に対照抗体の抗Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ(Novagen、ウィスコンシン州マディソン)及び精製全ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)をいずれも１０ｕｇ／ｍｌで用いた。３ｍｌの染色溶液を更に添加した後、５００×ｇ、室温にて１０分間遠心分離して細胞をペレット状にした。ペレットを保存し、染色溶液で１対５０に希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ１００μｌに再懸濁した。４℃で４５分間置いた後、３ｍｌの染色溶液を添加して細胞を上記したようにペレット状にした。第二段階の抗体はＲ−フィコエリトリン(Ｒ−ＰＥ)結合抗ラット、抗マウス及び抗ヒトＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)(全てJackson ImmunoResearch Laboratoriesより入手)を用いた。標的抗原の表面発現をＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター(Becton−Dickinson、カリフォルニア州サンホゼ)で解析した。次いで細胞を１ｍｌの定着溶液(３．８％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ)に再懸濁し、細胞表面に結合したＨＭＡｂの量をBecton−Dickinson FACS Vantageフローサイトメーター(Becton−Dickinson、カリフォルニア州サンホゼ)で解析した。
【０１６４】
免疫蛍光アッセイ。ＨＥＫ−２９３細胞を上記した様々なＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトし、１００％アセトンで室温にて１０分間おいてＨＴＣSuper Cured２４−スポットスライド(Cel−Line Associates、ニュージャージー州ニューフィールド)上に固定した。固定細胞を、３〜５μｇ／ｍｌの精製したモノクローナル抗体又は１〜４０倍にＰＢＳで希釈したヒト血清と共に３７℃で３０分保温した。次いでスライドをリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)ｐＨ７．４で５〜１０分洗浄し、エバンスブルー対比染色０．００１％溶液及び適当なフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合二次抗体(Jackson Immunoresearch laboratories、ペンシルバニア州ウェストグローブ)と共に３７℃で３０分間保温した。Zeiss Universal顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡法によって結合抗体を検出した。
【０１６５】
結果
ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ１Ｅ２組換えタンパク質の作製。ＨＣＶの増殖は生体外では確実ではないので、ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質を発現する哺乳類細胞に対する抗体の結合差異を利用して、ドナー血漿から抗Ｅ１抗体をスクリーニングした。通常、哺乳類細胞の発現したＨＣＶ  Ｅ１タンパク質は細胞表面に発現されたときに天然により近い形状をとる。これらの研究で用いられたＨＣＶコンストラクトにより発現されたタンパク質配列を表す、ＨＣＶゲノムの構造タンパク質地図を図３０に示す。Ｅ１及びＥ２遺伝子のアミノ及びカルボキシル末端欠失変異体群をＰＣＲで合成し、ヘマグルチニンＡをコードする配列の３’末端とｍｙｃエピトープをコードする配列の５’末端に融合した。配列決定により配列を確認した。プラスミドベクターｐＤｉｓｐｌａｙ(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)は、ネズミＩｇカッパ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチドと血小板由来成長因子受容体経膜領域(ＰＤＧＦＲ−ＴＭ)とをコードする配列を含んでいる。各プラスミドをＨＥＫ２９３細胞内に一過的にトランスフェクトした後、コンストラクトの発現をウェスタンブロットで確認し、コンストラクトの細胞表面発現をフローサイトメトリー解析で確認した。
【０１６６】
ＨＣＶ遺伝子型１ｂ感染者の血漿からＨＣＶ配列を増幅した。Ｅ１領域のＤＮＡ配列決定(図３１)の結果、ＨＣＶ１ｂ(２)のＨＰＣＪ４９１単離体のアミノ酸配列と９２％の同一性があり、ＨＣＶ１ａＨ株について報告されている配列と８１％の同一性があることが分かった(Ogataら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88：3329-3396)。これについてはこれまでにＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２発現及びプロセッシングの研究が数多くなされている(Cocquerelら、J.Virol.(1999)73：2641-2649；Deleersnyderら、J.Virol.(1997)71：697-704；Dubuissonら、J.Virol.(1994)68：6147-6160；Duvetら、J.Biol.Chem.(1998)273：32088-32095；Flintら、J.Virol.(1999)73：6782-6790；Flintら、J.Gen.Virol.(1999)80：1943-1947；Meunieら、J.Gen.Virol.(1999)80：887-896)。Ｅ１配列は、５個の潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位と、配列ＮＷＳＰを有するがグリコシル化しないことが実証されている６番目の部位とを含んでいた(Meunieら、J.Gen.Virol.(1999)80：887-896)。内側の疎水性部位(アミノ酸２６５−２８７)とカルボキシル末端疎水性部位(アミノ酸３５４−３７７)は、はっきりと同定することができる。
【０１６７】
ｐＤｉｓｐｌａｙベクターを用いて、ＨＣＶアミノ酸１９２〜３２１、１９２〜３４０、１９２〜３５２、１９２〜３６６、１９２〜３７０及び１９２〜３８３をそれぞれ発現する、６種のコンストラクトＥ１−３２１、Ｅ１−３４０、Ｅ１−３５２、Ｅ１−３６６、Ｅ１−３７０及びＥ１−３８３を発現させた。全てのＨＣＶ配列が血小板由来成長因子受容体(ＰＤＧＦＲ、表９参照)の経膜領域と枠内で発現された。コンストラクトＥ１−３２１、Ｅ１−３４０及びＥ１−３５２はＥ１のカルボキシル末端疎水性部位を含んでいなかったが、他のコンストラクトはその部位の全て又は部分を含んでいた(表９)。ＨＣＶキャプシドのカルボキシル末端におけるシグナル配列をネズミＩｇＫリーダー配列と置き換えた。インフルエンザウイルスヘマグルチニン(ＨＡ)及びｃ−ｍｙｃの非常にまっすぐなエピトープを、ＨＣＶ配列のそれぞれＮ末端及びＣ末端の直ぐ隣に位置させた。コンストラクトの全てをＤＮＡ配列決定したところ、フレームシフトやナンセンス突然変異のない、期待通りの挿入物が含まれていた。
【０１６８】
【表９】
2006504645.tif 000010
【０１６９】
ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ１Ｅ２組換えタンパク質の特徴付け
タンパク質発現解析。ヒト胚性腎臓(ＨＥＫ−２９３)細胞を、ＨＣＶ  Ｅ１ｐＤｉｓｐｌａｙコンストラクトで又は負の対照としてＨＣＶ  Ｅ１ベクターのみでトランスフェクトした。２４時間後、細胞質抽出物を調製し、等量アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別し、ニトロセルロース上にブロッティングし、ＨＣＶ１ａＥ１タンパク質に対するＨＣＭ−Ｅ１ネズミモノクローナル抗体１μｇ／ｍｌと共に一晩培養してウエスタンブロット解析を行った(図３２Ａ)。同様の結果が、インフルエンザヘマグルチニン(ＨＡ)エピトープに対するラットモノクローナル抗体について得られた。全てのＥ１コンストラクトについて、見かけ上４０〜４６ｋｄの分子量で移動した複数の免疫反応性バンドを得た。ベクターのみでトランスフェクトした細胞には反応性タンパク質が観察されなかった。ＣＭＶタンパク質を認識する対照モノクローナル抗体に対して反応性を有するコンストラクトもなかった(データ示さず)。観察されたサイズは、タンパク質のアミノ酸成分から予想されたサイズより約１２−１５ｋｄ大きかった。これはタンパク質が顕著にグリコシル化されていたことを示している。驚くべきことに、コンストラクトのうち最大のＥ１−３８３は約３８ｋｄで、見かけ上の分子量が最も小さかった。アミノ酸３８４で終わっているＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトは短いコンストラクトよりも早く移動しうるという報告もある(Fournillier−Jacobら、J.Gen.Virol.(1996)77：1055-1064)。あるいは、ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ２が同一直線上に発現された場合、Ｅ１とＥ２との間の切断部位、グリシン３８３又はその近辺で、Ｅ１−３８３コンストラクトが蛋白質分解切断されうる(Dubuissonら、J.Virol.(1994)68：6147-6160；Lanfordら、Virology(1993)197：225-235；Matsuuraら、Virology(1994)205：141-150；Ralstonら、J.Virol.(1993)67：6753-6761；Spaeteら、Virology(1992)188：819-830)。
【０１７０】
ＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトのグリコシル化。グリコシル基の存在を確認するために、ＨＥＫ−２９３細胞をＥ１コンストラクトでトランスフェクトし、Ｎ結合型グリコシル化の開始段階を阻害するツニカマイシン(Kornfield and Kornfield Ann.Rev.Biochem.(1985)54：631-664)の存在下又は非存在下で２４時間培養した。ＨＥＫ−２９３細胞をｐＤｉｓｐｌａｙベクター又は表記のＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトし、２μｇ／ｍｌツニカマイシンの存在下又は非存在下で培養した。トランスフェクションの２４時間後、全細胞抽出物を調製し、アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別し、ニトロセルロース上にブロッティングした。ＨＡエピトープに対する１μｇ／ｍｌのＨＡｒＭＡｂと共に一晩培養して、ウェスタンブロット解析によってＨＣＶ  Ｅ１タンパク質を検出した(図３３Ｂ)。
【０１７１】
ツニカマイシンの非存在下で得たＥ１コンストラクトの分子量は４０〜４６ｋｄであったが、上記のように複数の免疫反応性バンドの発現はＨＡモノクローナル抗体についてあまり目立たなかった。グリコシル化を阻害した結果、反応性タンパク質Ｅ１−３２１、Ｅ１−３４０、Ｅ１−３５２、Ｅ１−３６６及びＥ１−３７０について観察された分子量は２５〜３２ｋｄであり、予想された５種の非グリコシル化形状コンストラクトそれぞれについて予想された分子量２５、２８、２９、３０及び３１ｋｄと一致した(表９)。ツニカマイシンの非存在下では、Ｅ１−３８３はあまり発現されず、見かけの分子量は約３８ｋｄであった。ツニカマイシンの存在下では、コンストラクトＥ１−３８３について非グリコシル化タンパク質は検出されなかった。この結果は、非グリコシル化Ｅ１−３８３が不安定であることを示している。
【０１７２】
ＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトの細胞表面発現。ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ１Ｅ２コンストラクトが細胞表面上で発現される能力について、ＦＡＣＳｃａｎ解析によって調べた。ＨＥＫ−２９３細胞をＨＣＶ  Ｅ１又はＥ１Ｅ２コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、様々なモノクローナル抗体と共に保温し、フローサイトメトリーによって細胞表面染色の量を調べた。緑色蛍光タンパク質を発現するプラスミドで細胞を同時トランスフェクションすることによってトランスフェクションの効力をモニターした(データ示さず)。
【０１７３】
図３３は、Ｅ１欠失コンストラクトでトランスフェクトしたＨＫＥ２９３細胞内で発現されたＥ１組換えタンパク質のＦＡＣＳｃａｎ解析を示す。ｘ軸は蛍光強度を示し、ｙ軸は蛍光細胞の数を示す。ＨＫＥ２９３及びＲ０４(抗ＣＭＶ)は、特異的一次抗体が存在しない条件で得られた蛍光を示す。右側へのエリアシフトは細胞表面でのタンパク質発現を示す。マーカー(Ｍ１)を用いてバックグラウンドを超えたと考えられる蛍光の範囲(０−１００％)を示した。組換えのピークはＨＣＭ−Ｅ１ネズミＭＡｂで検出した。
【０１７４】
図３３に示すように、対照抗体Ｒ０４(抗ＣＭＶ)についてはバックグラウンドレベルの染色しか観察されなかった。組換えＥ１タンパク質に対するマウスＨＣＶ  Ｅ１抗体(ＨＣＭ−Ｅ１ｍＭＡｂ)については、コンストラクトＥ１−３２１、Ｅ１−３４０、Ｅ１−３５２及びＥ１−３６６で高いレベルの細胞表面発現が得られた。中程度の表面発現がコンストラクトＥ１−３７０について観察され、Ｅ１−３８３については細胞表面発現が観察されなかった。全てのコンストラクトについて得られたトランスフェクション効率は同様であり(〜４０％)、従ってＥ１−３７０及びＥ１−３８３について見られた低いレベルの細胞表面発現はトランスフェクション効率の違いによるものではないことが示唆される。加えて、固定細胞免疫蛍光により測定したコンストラクトの細胞内発現と同等であった(図３４)。
【０１７５】
ＨＣＶ陽性血清におけるＥ１ヒト抗体に対する免疫反応性。６種のＥ１コンストラクトのうち５種で有意な細胞表面発現を行った後、遺伝子型１ＨＣＶ感染者の血清群についてＥ１コンストラクトへの免疫反応性を評価した(表１０)。ＨＥＫ−２９３細胞を各Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトし、ＩＦＡ用にガラススライド上に固定した。固定細胞をＨＡモノクローナル抗体と共に保温し、おおよそのトランスフェクション効率を調べた。
【０１７６】
図３４は、ＨＣＶ血清を用いたＩＦＡデータを示す。表記のコンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又はトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞をアセトンでスライド上に固定し、ＨＡに対するラットモノクローナル抗体５ｍｇ／ｍｌ又は１：５０の希釈度のＨＣＶ血清で染色した。スライドをエバンスブルー０．００１％溶液で対比染色し、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合ヤギ−抗ヒト又は抗ラットＩｇＧで結合抗体を検出した。各コンストラクトについて、トランスフェクト細胞の約５０％が濃く染色された。Ｅ１コンストラクトの全てについて、ＨＣＶ陰性血液ドナーからの血清８種ではいずれも染色が見られなかった(表１０)。Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトした細胞を、１：４０の希釈度のＨＣＶ１ｂ感染者血清で調べたところ、中レベルの陽性染色が得られた。血清について得られた染色を図３４に示す。
【０１７７】
血清のうち１種はトランスフェクトしていないＨＥＫ−２９３細胞に対して強い反応性を示した(表１０)。６種のＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトのうち５種は試験したＨＣＶ１ｂ血清の５４〜７１％に反応性を有した(図３５追加)。コンストラクトＥ１−３８３は少なくとも３３％(２４血清のうち８)が反応性を示した。Ｅ１−３８３を除いて、Ｅ１コンストラクトによるＨＣＶ遺伝子型１抗血清に対する反応性は、分泌Ｅ１タンパク質を用いた研究で観察された反応性と同様であった(Ganeら、Transplantation.(1999)67：78-84)。Ｅ１−３５２は、ＨＣＶ陽性血清に対して高い反応性(７１％)を示したので、Ｅ１ＨＭＡｂスクリーニング用の抗体として選択した。
【０１７８】
ＨＣＶ  Ｅ１ＨＭＡｂスクリーン用の血液ドナーの選択。試験した１７種のＨＣＶ１ｂ陽性血清(表１０)のうち、ＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトに対する血清抗体の力価が高かったのはドナーＨＣ２９であった。このドナーから末梢血液Ｂ細胞を単離し、ヒトハイブリドーマを分泌するＨＣＶ  Ｅ１抗体の産生に用いた。
【０１７９】
【表１０】
2006504645.tif 000011
【０１８０】
抗原特異的ヒトモノクローナル抗体の産生。Ｅ１コンストラクトの２種で有意な細胞表面発現を行った後、より大きなタンパク質Ｅ１−３５２を用いて、ＨＣＶ感染者によるＥ１への血清反応を評価した。すなわちＥ１−３５２を発現するプラスミドをＨＥＫ−２９３細胞に導入し、Ｅ１−３５２を発現する細胞系を得た。間接蛍光アッセイ(ＩＦＡ)用にＥ１−３５２発現細胞をガラススライド上に固定した。ＨＣＶ遺伝子型１についてＰＣＲ陽性であると判明した血液ドナーからの血清群に対する、細胞の反応性を調べた。ＨＣＶ遺伝子型１で感染した血液ドナー２３種のうち１１種(４８％)がＥ１−３５２タンパク質に対して反応性を示した。これに対してＨＣＶ陰性血液ドナーは８人のうち０人、Ｃ型肝炎患者の場合は９人に６人(６７％)であった。Ｅ１−３５２に対する最も強い抗体応答を示したドナー(図３４のＨＣＶ１ｂの画像)を、ハイブリドーマ単離のための末梢Ｂ細胞供給源として用いた。このドナーから第二の血液アリコートを得て、血漿及び単核細胞の両方を単離した。このドナーは無症候の５１歳のヒスパニック系男性で、血液提供するまでＨＣＶ感染について気づかなかった。１１ヵ月後に再度試料を得て試験したところ、Ｅ１−３５２に対する強い抗体反応を維持していることが確認された。
【０１８１】
末梢Ｂ細胞を単離し、エプスタイン−バーウイルスで活性化し、１６〜３０日間培養した。Ｅ１−３５２発現細胞についてＩＦＡを行った結果、４１７ウェル中７個(〜２％)に、Ｅ１−３５２に対する抗体が含まれることが判明した。７個のＥ１反応性ウェルから得たＥＢＶ活性化細胞(２〜１３×１０5)とマウス−ヒトヘテロ骨髄腫融合パートナーであるＫ6Ｈ6／Ｄ５とを、ＥＢＶ活性化細胞１個：Ｋ6Ｈ6／Ｄ５細胞２個の比で、低浸透圧(１２５Ｌ３又は１８０Ｌ３)又は等浸透圧(３００Ｌ３)融合媒体内で融合した。クローニング後に１ｍｌあたり１〜８０ｕｇヒトＩｇＧを分泌した２種のハイブリドーマが単離された。ＩＦＡで両方の抗体がＥ１−３５２に強い反応性を示した(図３６)。図３６に示す実験において、同じ親ベクターのＥ１−３コンストラクト又はＣＤ４コンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１：２の比でアセトンを用いてスライドに固定し、Ｈ−１１１、Ｈ−１１４、Ｒ０４(抗ＣＭＶ  ＨＭＡｂ)１０ｕｇ／ｍｌ又はＨＡに対するラットモノクローナル抗体５ｕｇ／ｍｌで染色した。スライドをエバンスブルー０．００１％溶液で対比染色しフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合ヤギ抗ヒト又は抗ラットＩｇＧで結合抗体を検出した。ハイブリドーマＨ−１１１はＩｇＧ１(Ｋ１)を発現したが、Ｈ鎖の配列決定を行ったところ、ＶＨ３−３０生殖細胞系配列に対して最も大きな相同性を示した。ハイブリドーマ１１４(Ｈ−１１４)はＩｇＧ１(Ｋ２)を発現し、Ｈ鎖はＶＨ１−３生殖細胞系配列に最も大きな相同性を示した。
【０１８２】
Ｅ１ＨＭＡｂによるＨＣＶエンベロープタンパク質への反応性。固定細胞についてのＩＦＡの結果を確認するために、ウェスタンブロット及び免疫沈降アッセイを用いて、ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４による様々なＥ１タンパク質／Ｅ１−３５２に対する反応性を調べた(図３７)。ＨＥＫ−２９３細胞をｍｏｃｋトランスフェクト(０)あるいは表記したＨＣＶ  Ｅ１コンストラクト又はｐＤｉｓｐｌａｙＥ２(任意)でトランスフェクトし、２４時間後に細胞質抽出物を調製した。材料と方法の項で述べたように、５ｕｇのＨ−１１１又はＨ−１１４ＨＭＡｂで抽出物のアリコートを免疫沈降した。次いで結合タンパク質をＳＤＳ試料緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。ブロッティングしたＥ１タンパク質を２ｕｇ／ｍｌのＥＣＭ  Ｅ１ネズミ抗体で検出した。ウェスタンブロットとして、ＨＥＫ−２９３細胞を表記のＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトしたか、あるいはｍｏｃｋトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞質抽出物を調製し、等量アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分別し、ニトロセルロース上にブロッティングした。５μｇ／ｍｌのＨＭＡｂ  Ｈ−１１１又はＨ−１１４と一晩培養して、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質を検出した。
【０１８３】
図３７に示すように、ＨＭＡｂＨ−１１１はウェスタンブロット及び免疫沈降の両方でＥ１−３５２、Ｅ１−３４０及びＥ１−３２１に対して強い反応性を見せた。ＨＭＡｂＨ−１１４は免疫沈降でＥ１タンパク質に強く反応したがウェスタンブロットでは弱い陽性であった。アイソタイプ対照ＨＭＡｂは、ウェスタンブロット又は免疫沈降でＥ１コンストラクトのいずれにも反応しなかった。従ってＨＭＡｂＨ−１１１は、Ｅ１−３２１内の変性に反応しないエピトープを認識した。ＨＭＡｂＨ−１１４は、部分的に変性したように見えるＥ１−３２１内のエピトープを認識した。
【０１８４】
細胞表面に高レベルで発現するＥ１コンストラクトを用いて、Ｅ１ＨＭＡｂを単離した。しかしＩＦＡを用いてＨＭＡｂを同定したところ、ＨＭＡｂが細胞内形状のＥ１−３５２タンパク質に特異的であったという可能性が出てきた。ＨＣＶ  ＨＭＡｂが細胞表面のＥ１−３５２も認識することを示すために、Ｅ１−３５２を発現するＨＥＫ−２９３細胞に対するＥ１ＨＭＡｂの反応性を、フローサイトメトリーにより調べた。図３８は、ＨＥＫ２９３細胞内に一過性発現されたＥ１−１組換えタンパク質に対するＨＣＶ  ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４のＦＡＣＳｃａｎ解析を示す。ｘ軸は蛍光強度を示し、ｙ軸は蛍光細胞の数を示す。Ｒ０４(抗ＣＭＶ)は、特異的一次抗体が存在しない条件で得られた蛍光を示す。右側へのエリアシフトは抗体結合を意味し、抗ＨＡは融合蛋白質としてのＨＡタグ発現を表す。マーカー(Ｍ１)を用いてバックグラウンドを超えたと考えられる蛍光の範囲(０−１００％)を示した。図３８のデータは、Ｈ−１１１及びＨ−１１４の両方が、細胞表面発現Ｅ１−３５２を認識したことを示している。
【０１８５】
多重遺伝子型から得たＨＣＶエンベロープタンパク質単離体に対するＨＣＶ  ＨＭＡｂの反応性。ＨＭＡｂエピトープの保存を調べるために、様々なＨＣＶ遺伝子型から単離したＨＣＶ  ＲＮＡを逆転写し、アミノ酸１９２〜３５２領域を増幅し、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター内にクローニングした。組換えプラスミドをＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクトし、コンストラクトに対するＨＭＡｂの反応性をＩＦＡで評価しウェスタンブロット解析で確認した。表記のＨＣＶ遺伝子型からクローニングしたＥ１遺伝子を含むＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、免疫蛍光アッセイ(ＩＦＡ)で解析した。トランスフェクションの２４時間後に調製した、トランスフェクト細胞のタンパク質抽出物をアセトンでスライドに固定し、ＨＡに対するラットモノクローナル抗体２ｕｇ／ｍｌ、ＨＭＡｂ５ｕｇ／ｍｌ、或いはＣＭＶに対するヒトモノクローナル抗体５ｕｇ／ｍｌで染色した。スライドをエバンスブルー０．００１％溶液で対比染色しフルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合ヤギ抗ヒト又は抗ラットＩｇＧで結合抗体を検出した。Ｅ１タンパク質群全てについて得られた結果を表１１及び表１２に示す。
【０１８６】
【表１１】
2006504645.tif 000012
【０１８７】
【表１２】
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【０１８８】
トランスフェクトしたタンパク質の存在をＨＡ  ＭＡｂで確認した。２０〜４０％の細胞がＨＡ  ＭＡｂについて陽性であった。両方のＨＭＡｂが、Ｂ細胞ドナー(ＨＣ−２９)から単離されたＥ１タンパク質に対して反応性を有した。ＨＭＡｂＨ−１１１は様々な感染者のＥ１タンパク質(遺伝子型１ａ、１ｂ、２ｂ及び３ａ全てのタンパク質を含む)１９種のうち１７種に対して反応性を有していた。ＨＭＡｂＨ−１１１は、５人の感染者から単離された遺伝子型２ａのＥ１タンパク質１０種とは反応性を示さなかった。従ってＨＭＡｂＨ−１１１により認識されるエピトープは、遺伝子型２ａにおいて突然変異したと考えられる。ＨＭＡｂＨ−１１１は遺伝子型４のＥ１タンパク質に対しても反応性を示さなかった。Ｅ１−３５２及びＢ細胞ドナー(ＨＣ−２９)に対して単離されたものを除いて、ＨＭＡｂＨ−１１４はどのＥ１タンパク質とも反応しなかった。従ってＨＭＡｂＨ−１１４はＨＣＶ１ｂ特異的エピトープを発現する。
【０１８９】
Ｅ１ＨＭＡｂのエピトープ位置決定。一連の欠失をＥ１−３５２のカルボキシル及びアミノ末端に導入して２個のＨＭＡｂに認識されるエピトープの位置を調べた。Ｅ１欠失コンストラクトをＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクトし、タンパク質を含む抽出物を、ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４を用いるウェスタンブロット及びＩＦＡに供した。ＨＡ  ＭＡｂを用いてタンパク質の発現を確認した。得られた結果の概要を図３９に示す。ＨＭＡｂＨ−１１１は、Ｅ１−３５２のアミノ末端の２０アミノ酸に限られたコンストラクトを含むカルボキシル末端欠失コンストラクトの全てに反応性を示した。これに対し、ＨＭＡｂＨ−１１４はＥ１−３２１及びアミノ酸１９２〜３１３を発現するコンストラクトに対して反応性を示したが、他のいずれのカルボキシル末端コンストラクトに対しても反応性を示さなかった。Ｅ１−３５２のアミノ末端からの僅か５アミノ酸が欠失しただけで、ＨＭＡｂＨ−１１１の反応性が失われた。従ってＨＭＡｂＨ−１１１のエピトープは、Ｅ１−３５２のアミノ末端に隣接した位置にある。これに対して、ＨＭＡｂＨ−１１４はアミノ酸１９２〜３１３、１９９〜３２１及び２０６〜３２１を発現するコンストラクトに反応したが、アミノ酸２１２〜３１３、２４４〜３１３及び２６２〜３１３を発現するコンストラクトには反応しなかった。従ってＨＭＡｂＨ−１１４のエピトープはＥ１−３５２のアミノ酸２０６〜３１３の間に位置するが、それ以上は判明しなかった。
【０１９０】
ＨＭＡｂＨ−１１１エピトープのペプチド競合解析。ＨＭＡｂＨ−１１１の結合したＨＣＶ  Ｅ１エピトープ(アミノ酸１９２−２１１)は２個のグリコシル化配列を含んでいる。このエピトープは、Ｅ１アミノ末端アミノ酸配列に比較的広い多様性があるにもかかわらず、多くのＨＣＶサブタイプにも保存されている。このことから、Ｅ１アミノ末端のグリコシル基が、ＨＭＡｂＨ−１１１によって認識されるエピトープに関係しているという可能性がある。この可能性を調べるためにＨＣＶ  Ｅ１のアミノ末端の７〜１４アミノ酸を含む合成ペプチドを作製した(表１３)。
【０１９１】
【表１３】
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【０１９２】
合成ペプチドはグリコシル化されないので、ＨＭＡｂ結合についての競合がうまくいったことは、グリコシル化が抗体結合には必要ではなかったことを示している。トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞から産生したＥ１−３５２を、ＧＮＡレクチンを用いたマイクロタイタープレート上に捕捉した。ＨＭＡｂＨ−１１１の結合を、様々な量の様々な合成ペプチドの存在下で評価した。ＨＥＫ−２９３細胞をＥ１−３５２でトランスフェクトし、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上にＥ１糖タンパク質を捕捉した。ウェルを洗浄しブロッキングし、結合タンパク質を様々な量(ｘ軸)の対照合成ペプチド(μ対照ＨＴＬＶペプチド；σＥ１ペプチドYEVRNVS；νＥ１ペプチドYEVRNVSGYHVTN)の存在下、１０ｕｇ／ｍｌのＨＭＡｂＨ−１１１と保温した。ｙ軸は複製ウェルから得た平均ＯＤ値を示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【０１９３】
ペプチドの非存在下で、ＨＭＡｂＨ−１１１はＧＮＡ捕捉Ｅ１−３２１に強い反応性を示した(図４０)。ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６由来の関係のないペプチドを添加したところ、ＨＭＡｂＨ−１１１によるＥ１−３２１に対する結合に影響はなかった。７アミノ酸ペプチドも、ＨＭＡｂＨ−１１１の結合に影響を与えなかった。これに対して、１４アミノ酸ペプチドを添加した場合、ＨＭＡｂＨ−１１１によるＥ１−３２１への結合は投与量に応じて阻害された。従って、ＨＭＡｂＨ−１１１エピトープが認識されるのにグリコシル化は不必要であった。
【０１９４】
アラニンスキャニングによるＨＭＡｂＨ−１１１のエピトープ地図作製。Ｅ１糖タンパク質のアミノ酸１９２−２０４にわたる１４量体ペプチド上の、ＨＭＡｂＨ−１１１エピトープの細かい地図を得るために、この１４量体競合ペプチドの１１個の位置で保存的(アラニン)アミノ酸置換を導入した(位置１９２−Ｔｙｒ、１９３−Ｇｌｕ、１９４−Ｖａｌ、１９５−Ａｒｇ、１９６−Ａｓｎ、１９７−Ｖａｌ、１９８−Ｓｅｒ、１９９−Ｇｌｙ、２００−Ｖａｌ、２０１−Ｔｙｒ及び２０２−Ｈｉｓ)(表１４)。
【０１９５】
【表１４】
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【０１９６】
Ｅ１糖タンパク質上のＨ−１１１エピトープのアミノ酸配列を表１４の上部に１文字コードで記した。４番目のＲ、５番目のＮ及び１０番目のＹは必須アミノ酸であり、３、７、８番目のＶＳＧはＨＭＡｂＨ−１１１によるＥ１糖タンパク質への結合に重要なアミノ酸である。突然変異部位の数字は各コンストラクトにより発現されたアミノ酸を示し、全ＨＣＶポリプロテインを基準にしている。ＩＦＡにおいて、ＨＡｍＭＡｂ(正の対照)、ＨＭＡｂＲ０４(負の対照)又はＨ−１１１ＨＭＡｂによる各タンパク質への反応性を、陽性(＋)又は陰性(−)で表した。突然変異Ｅ１をＣＨＯ細胞で発現し、ＨＭＡｂＨ−１１１及びｍＭＡｂＨＡを正の対照として、又、抗ＣＭＶヒトモノクローナルである抗体Ｒ０４を負の対照として用いて、ＩＦＡ(表１４)とウェスタンブロット(図４１)の両方で解析した。全ての突然変異体は、野生型Ｅ１−３５２糖タンパク質とほぼ同じ分子量にて、いずれもほぼ等しい量でＣＨＯ細胞において発現された(図参照)。１９５−Ａｒｇ、１９６−Ａｓｎ及び２０１−Ｔｙｒにおけるアミノ酸置換はＨＭＡｂＨ−１１１によるＥ１糖タンパク質への結合活性に顕著に影響を与え、１９４−Ｖａｌ、１９８−Ｓｅｒ及び１９９−Ｇｌｙの置換はＨＭＡｂＨ−１１１によるＥ１糖タンパク質への結合活性を顕著に弱めたが、完全に結合活性を失わせたわけではなかった。このことは１４量体競合ペプチドの中央領域が、抗体とＨＣＶ  Ｅ１エンベロープタンパク質との相互作用に重要であることを示している。アミノ酸１９２−Ｔｙｒ、１９３−Ｇｌｕ、１９７−Ｖａｌ、２００−Ｖａｌ及び２０２−Ｈｉｓに対応する置換は、ＨＭＡｂＨ−１１１によるＥ１糖タンパク質への結合活性に影響を与えなかった。これらの結果は、ＨＭＡｂＨ−１１１のエピトープは少なくとも５個のアミノ酸残基１９４−Ｖａｌ、１９５−Ａｒｇ、１９６−Ａｓｎ、１９８−Ｓｅｒ、１９９−Ｇｌｙ及び２０１−Ｔｙｒから構成され、アミノ酸１９４〜２０４の中に位置することを示唆している。
【０１９７】
ＨＭＡｂＨ−１１４エピトープのペプチド競合解析。２個の不連続ＨＭＡｂＨ−１１４エピトープ(Ｃ末端のCSIYPGHV及びＮ末端のDCSNSS)は、上記した欠失地図により、１個のグリコシル化配列(２０９−ＮＳＳ)と、約１００アミノ酸離れている２個のシステイン残基(Ｃｙｓ−３０６及びＣｙｓ−２０７)から構成されると規定された。このことから、Ｅ１アミノ末端のグリコシル基がＨＭＡｂＨ−１１４により認識されるエピトープに関係している及び／又は分子内ジスルフィド結合形成がＨＭＡｂＨ−１１４のエピトープ認識に必要である、という可能性が考えられる。これらの可能性を調べるために、ＨＣＶ  Ｅ１のアミノ末端の６又は１２アミノ酸を含む２種の合成ペプチドを作製した(表１３)。合成ペプチドはグリコシル化されないので、ＨＭＡｂ結合について競合があったことは、グリコシル化が抗体結合には必要ではなかったことを示している。
【０１９８】
末端を切断したＥ１−３５２及びＥ１糖タンパク質。トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞で産生した糖タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンを用いてマイクロタイタープレート上に捕捉した。様々な濃度の２種の合成ペプチドの存在下、ＨＭＡｂＨ−１１４の結合を評価した。具体的には、ウェルを洗浄し、ブロッキングし、様々な量の対照合成ペプチド(ｘ軸)の存在下、結合タンパク質を１０ｕｇ／ｍｌのＨＭＡｂＨ−１１４と共に保温した。(Ｅ１糖タンパク質のアミノ酸３０４〜３１５のＣ末端領域に相当するペプチドＨ−１１４−１２−Ｃ、及びＥ１糖タンパク質のアミノ酸２０６〜２１１のＮ末端領域に相当するペプチドＨ−１１４−１４−Ｎ)。これら２種の合成ペプチドを添加したところ、末端切断Ｅ１−３５２タンパク質に対するＨＭＡｂＨ−１１４の結合活性に明らかな影響はなく(図４２)、ＨＴＬＶ−１ｇｐ４６の免疫優性領域に相当する対照ペプチドに対しても影響がなかった。これらのデータは以下のことを示している。(ｉ)２個の不連続のＨＭＡｂＨ−１１４エピトープは認識されるのにグリコシル化を必要とする；(ｉｉ)２個の不連続のＨＭＡｂＨ−１１４エピトープは抗体結合部位ではなく、結合部位はアミノ酸２１６〜３０３にわたる２個のエピトープの間にある；そして(ｉｉｉ)欠失コンストラクトにより規定された１０８個のアミノ酸配列は、ＨＭＡｂＨ−１１４により認識されるエピトープの提示に必要な折り畳み領域やジスルフィド結合といった構造上の特徴を有する。
【０１９９】
ＨＭＡｂＨ−１１４エピトープのアミノ及びカルボキシル末端領域のセリン又はアラニンスキャン。上記の可能性を区別するために、一連のセリン又はアラニン置換をアミノ酸２０６−２１１及び３０６−３１３に導入した。改変Ｅ１をＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクトし、ＧＮＡレクチンでＥ１タンパク質をマイクロタイタープレートに捕捉した。ＨＭＡｂＨ−１１４による結合Ｅ１タンパク質に対する反応性を、アミノ末端のアミノ酸２０６〜２１１又はカルボキシル末端のアミノ酸３０６〜３１３の突然変異解析によって調べた(図４３)。図４３に示す置換体と共にＥ１タンパク質でＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトし、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上にＥ１糖タンパク質を捕捉した。ウェルを洗浄しブロッキングし、結合タンパク質を５ｕｇ／ｍｌのＨＡｍＭＡｂ(黒棒線)又は１０ｕｇ／ｍｌのＨＭＡｂＨ−１１４と共に保温した。結合抗体を、適当なアルカリホスファターゼ結合二次抗体及びＰＮＰＰ基質で検出した。ｘ軸は、野生型Ｅ１配列について得られたシグナルのパーセントとして表した、各突然変異体について得られたシグナルを示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。点突然変異に由来するタンパク質発現の多様性を調節するために、ＨＡ  ＭＡｂとのコンストラクトの反応性も調べた。得られたシグナルを非改変タンパク質Ｅ１−３２１のシグナルと比較した。
【０２００】
図４３に示すように、アミノ末端配列DCSNSSのシステイン残基の置換は、ＨＭＡｂＨ−１１４の結合を特異的に阻害したが、ＨＡ抗体についてはしなかった。これに対して、グリコシル化部位NSSのアスパラギン又はセリン残基の突然変異を行った結果、ＨＡ及びＨ−１１４抗体の両方においてシグナルの同等な低下が見られた。従って、アミノ末端グリコシル化部位はおそらくＨＭＡｂＨ−１１４エピトープに関与していない。同様に、配列CSIYPGHVについて、システイン残基の突然変異も、ＨＡの結合に影響を与えず、ＨＭＡｂＨ−１１４の結合を阻害した。配列CSISPGHVがＨＡ結合を刺激する理由はわからなかった。しかしＨＭＡｂＨ−１１４の結合は影響を受けておらず、Ｙ−３０９がＨ−１１４エピトープの部分ではないことを示唆している。
【０２０１】
Ｅ１に対するＨＭＡｂＨ−１１４結合のジスルフィド依存性。ＨＭＡｂＨ−１１４エピトープ保持に２個のシステインが必要であるということは、ジスルフィド結合形成がエピトープ提示に必要だということを示唆している。これらの条件下では、ジスルフィド結合がＨＭＡｂＨ−１１４結合を阻害するはずである。ＨＭＡｂＨ−１１４による免疫沈降の前に、Ｅ１−３２１の細胞溶解物をＤＴＴで予め処理することで上記を確認した(図４４)。ＨＥＫ−２９３細胞をＥ１−３２１でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に細胞質抽出物を調製した。抽出物のアリコートは、未処理のままにしたか、或いは５ｍＭジチオスレイトールと共に５６℃で１５分間保温した。抽出物を氷冷ＢＬＯＴＴＯで１：５に希釈し、様々な抗体(レーン上に表記)を用いた免疫沈降にかけた。次いで結合タンパク質をＳＤＳ試料緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに供した。
【０２０２】
Ｅ１−３２１の沈降は対照ＨＭＡｂでは観察されなかった。ＤＴＴ前処理を行わない場合、ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４の両方が、Ｅ１に対するモノクローナル抗体に反応する４６ｋｄａｌのタンパク質を沈降した。５６℃で５ｍＭ  ＤＴＴにて予処理した後は、Ｅ１へのＨＭＡｂＨ−１１１の結合は影響を受けなかった。これに対して、ＨＭＡｂＨ−１１４の結合は完全に阻害された。従ってＨＭＡｂＨ−１１４に認識されるエピトープは、Ｃ−２０７及びＣ−３０６を含むジスルフィド結合の形成に依存する。
【０２０３】
内側Ｅ１システイン残基のアラニンスキャニング。Ｅ１糖タンパク質は、細胞内ジスルフィド結合を形成できる８個のシステイン残基を２０７、２２６、２２９、２３８、２７２、２８１、３０４及び３０６の位置に含んでいる。ＡをＣに置換したＥ１突然変異体６種の発現を解析し(図４５)、２０７−ｃｙｓ及び３０６−ｃｙｓ内側のシステイン残基が、ＨＭＡｂＨ−１１４により認識されるエピトープの構造形成に関与するかどうかを調べた。まず対応するプラスミドで一過性トランスフェクトした後にＥ１突然変異体をＣＨＯ細胞内で発現し、ＩＦＡによって解析した。図４５に示すように、全ての突然変異タンパク質が発現され正の対照としての標識エピトープを標的とするマウスＭＡｂＨＡによって認識された。全ての突然変異タンパク質は、上記したように、アミノ酸１９２〜２１１の間に位置するエピトープを標的とするＨＭＡｂＨ−１１１によって認識された。Ｅ１Ｃ／Ａ突然変異体のうち２０７Ｃ、２２９Ｃ、２３８Ｃ及び３０４ＣはＨＭＡｂ  Ｈ−１１４の結合活性を実質的に全て除去したが、一方２７２Ｃ及び２８１Ｃは、ＨＭＡｂＨ−１１４によるＥ１突然変異タンパク質への結合活性に影響を与えなかった。
【０２０４】
ＨＣＶ  Ｅ１のＨＭＡｂＨ−１１４結合部位におけるアラニン突然変異の免疫沈降解析を行った。ＨＥＫ−２９３細胞を突然変異体でトランスフェクトし、その２４時間後に細胞質抽出物を調製した。抽出物を、ＨＭＡｂＨ−１１４を用いた免疫沈降に供した。結合タンパク質をＳＤＳサンプル緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。ブロッティングしたＥ１タンパク質を２μｇ／ｍｌのＥＣＭ  Ｅ１ネズミ抗体で検出した。図４６に示すように、各レーン上の数字は、アラニンで置換したＥ１糖タンパク質上のシステイン残基の位置を示す。分子量標準の移動は左側に示す。タンパク質発現は、ウェスタンブロットによるＨＡ標識化発現で評価した。これらの免疫沈降研究の結果、突然変異体２０７Ｃ、２２９Ｃ、２３８Ｃ及び３０４Ｃは明らかにＨ−１１４により検出されなかったが、２７２Ｃ及び２８１ＣはＨＭＡｂＨ−１１４によるＥ１突然変異タンパク質に対する結合活性に影響を与えなかったことが確認された(図４６)。
【実施例１１】
【０２０５】
抗体産生
以下の実施例はＨＣＶ  ＨＭＡｂを産生する様々な方法を提供する。
プラスミドベクターからの抗体の発現及び精製。全抗体分子をコードする遺伝子をＲＴ−ＰＣＴにより親ハイブリドーマから増幅し、構成的に又は誘導的に真核細胞系内で抗体を発現させることのできる異種発現カセット内にクローニングすることができる。例えば、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ、ｐＩＮＤ(ＳＰ１)又はｐＲＥＰ８(いずれもカリフォルニア州カールスバッドInvitrogen社)及びそれらの同等物といった、発現プラスミド中で抗体遺伝子を発現させることができる。あるいはＭＬＶから作られたベクター、ワクシニアウイルスから作られたベクター又はアデノウイルスから作られたベクターといった、ウイルス又はレトロウイルスベクターを介して抗体遺伝子を発現させることもできる。同様に、抗体遺伝子はバキュロウイルスベクター等の昆虫ウイルスベクターにおいて発現することができる。一連のｐＣＯＭＢベクター等の他のベクターを用いても、Ｍ１３ファージ又はバクテリア表面における抗体Ｈ及びＬ鎖対又は単鎖抗体の発現が可能である。
【０２０６】
発現された抗体は、例えばタンパク質−Ａ又はタンパク質−Ｇセファロースを用いて精製できる。例えばビオチン−Ｃ１１−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いたビオチン化；臭化シアンを介した様々なビーズ(例えばセファロース、アガロース、磁性、ポリスチレン)とのカップリング；或いは、例えばリジン又は他の基本的残基の改変による又は遊離スルフヒドリル基に特異的な試薬の使用を通じた、抗体の有用な化学基への架橋といった方法を用いて、精製抗体を化学的に又は酵素を用いて改変できる。
【０２０７】
他の態様
当業者は、これまでの記述が、単に本発明の特定の好ましい態様に過ぎないということを容易に理解できるであろう。上記した手順及び組成物の様々な改変が、請求の範囲に記す本発明の精神及び範囲から離れることなく達成可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】本明細書に記載の幾つかのワクシニアウイルスコンストラクトによる、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の発現を示すウエスタンブロットである。野生型ワクシニアウイルスに感染させ次いでｐＶＯＴＥ(ｗｔ)又は遺伝子型１ａ又は２ｂのＨＣＶ  Ｅ２を発現する組換えｐＶＯＴＥ(Ｑ１ａ又はＱ２ｂ)でトランスフェクトしたＣＶ１細胞から、細胞質抽出物を得た。誘導物質ＩＰＴＧの存在下(＋)又は非存在下(−)で細胞を２４時間培養した。２×１０5個の細胞に相当する抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分別し、ニトロセルロース上にブロッティングした。ＥＣＬ検出システム(Amersham)を用い、腹水で１／５００希釈したｍＭＡｂ  Ｅ２Ｇと共に培養して、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を検出した。分子量移動の標準を右に示した。
【図２】(配列番号９〜１２)は、ＨＣＶ  Ｅ２ワクシニアウイルスクローンの中央領域から増幅した配列を示す。適当なＨＣＶ遺伝子型の代表的配列と比較した、ＨＣＶ  Ｅ２ワクシニアコンストラクトＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ及びＱ２ｂの中央断片配列を示す。各遺伝子型の代表的配列の登録番号は下記の通りである。ＨＣＶ１ａ＝Ｍ６２３２１、ＨＣＶ１ｂ＝Ｄ１０７５０、ＨＣＶ２ａ＝Ｄ００９４４、ＨＣＶ２ｂ＝Ｄ１０９８８。ＰＨＹＬＩＰパッケージのＣＬＵＳＴＡＬＶ及びＤＮＡＰＡＲＳプログラムを用いて系統発生解析を行った。
【図３Ａ】(配列番号１〜８)は、最小の変化関係を示す(most parsimonious)樹形図を用いた、下記ＨＣＶの配列比較である。１ａ、Ｑ１ａ−ＦＲ、１ｂ、Ｑ１ｂ−ＦＲ、２ａ、Ｑ２ａ−ＦＲ、２ｂ、Ｑ２ｂ−ＦＲ。
【図３Ｂ】(配列番号１〜８)は、最小の変化関係を示す(most parsimonious)樹形図を用いた、下記ＨＣＶの配列比較である。１ａ、Ｑ１ａ−ＦＲ、１ｂ、Ｑ１ｂ−ＦＲ、２ａ、Ｑ２ａ−ＦＲ、２ｂ、Ｑ２ｂ−ＦＲ。
【図４Ａ】様々な遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対するＨＣＶ血清の反応性を示すグラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ、Ｑ２ｂ又は非組換えワクシニアウイルスＶＷＡに感染させた６×１０5個のヒーラ細胞により発現されたＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたウェルに捕捉した。ウェルを洗浄し、ブロッキングし、次いで結合したタンパク質を、遺伝子型の特定されたＨＣＶ血清又はＨＣＶ陰性血清(グラフ上部に記載)の様々な希釈(ｘ軸)と共に保温した。数値は複製ウェルの平均吸光度である。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図４Ｂ】様々な遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対するＨＣＶ血清の反応性を示すグラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ、Ｑ２ｂ又は非組換えワクシニアウイルスＶＷＡに感染させた６×１０5個のヒーラ細胞により発現されたＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたウェルに捕捉した。ウェルを洗浄し、ブロッキングし、次いで結合したタンパク質を、遺伝子型の特定されたＨＣＶ血清又はＨＣＶ陰性血清(グラフ上部に記載)の様々な希釈(ｘ軸)と共に保温した。数値は複製ウェルの平均吸光度である。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図５】ＨＣＶ遺伝子型２ｂ感染者から得た血清の、多重遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対する反応性を示す棒グラフである。ＨＣＶ遺伝子型２ｂ感染者から得た血清１２種(ｘ軸)を、遺伝子型１ａ(濃青の棒線)、１ｂ(マゼンタの棒線)、２ａ(黄色の棒線)及び２ｂ(薄青の棒線)のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質に対して滴定した。平均比吸光度(ＶＷＡ抽出物について得られた平均比吸光度から、ＨＣＶ  Ｅ２を含む抽出物について得られた平均吸光度を引いたもの)が０．５となった血清の希釈をｙ軸に示す。この値は図４に示した滴定曲線データと類似のものから計算した。
【図６】図７、８及び９で説明する実験に用いた、ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープタンパク質の立体構造エピトープを認識する抗体を評価する直接結合アッセイの概要を示す。ＧＮＡレクチンで固体表面をコーティングし、Ｅ２含有タンパク質抽出物を添加しレクチンで捕捉する。捕捉したＥ２に試験抗体を結合させ、過剰な未結合抗体を除去し、結合抗体を標識化二次抗体で検出する。
【図７】ＨＣＶ  ＨＭＡｂによる、レクチンに捕捉されたＨＣＶ  Ｅ２に対する反応性の棒グラフである。野生型ワクシニアウイルス(ＶＷＡと表記した棒線)又はＨＣＶ１ａＥ２を発現するワクシニアウイルス(ＨＣＶ１ａ)(ＨＣＶと表記した棒線)に感染させた６×１０5個の細胞の細胞質抽出物から得たタンパク質を、５００ｎｇのGalanthus nivalis(ＧＮＡ)又はTririticum vulgaris(ＷＧＡ)でコーティングしたマイクロタイタープレートに入れた。捕捉したタンパク質を表記のＨＭＡｂ(ｘ軸)５μｇ／ｍｌと保温した。Ｒ０４はアイソタイプが一致した対照である。抗ヒト抗体−アルカリホスファターゼ及び適当な基質で結合ＨＭＡｂを検出した。棒線は複製ウェルの平均ＯＤ値を示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図８Ａ】様々なＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質に対するＨＣＶ抗体反応性を示すグラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ、Ｑ２ｂに感染させた６×１０5個のヒーラ細胞によって発現されたＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたウェル上に捕捉した。ウェルを洗浄しブロッキングし、表記したＨＣＶ  ＨＭＡｂ(図９Ａ−９Ｊそれぞれに記したＨＭＡｂ)及びＣＭＶタンパク質に対する対照ＨＭＡｂ(Ｒ０４)(図９Ｋ)と共に捕捉タンパク質を保温した(Wardら、1995,Proc Natl Acad Sci USA.92：6773-6777；ここに参照して説明に代える)。数値は複製ウェルの特異的結合(ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を発現するワクシニアウイルスで感染した細胞の抽出物と野生型ワクシニア抽出物との比)の平均値である。野生型ワクシニアウイルスで感染した細胞から得たタンパク質に対する、ＨＣＶ  ＨＭＡｂ及び対照ＨＭＡｂの反応性は、吸光度０．０４を超えなかった。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図８Ｂ】様々なＨＣＶ遺伝子型のＥ２タンパク質に対するＨＣＶ抗体反応性を示すグラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ、Ｑ１ｂ、Ｑ２ａ、Ｑ２ｂに感染させた６×１０5個のヒーラ細胞によって発現されたＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたウェル上に捕捉した。ウェルを洗浄しブロッキングし、表記したＨＣＶ  ＨＭＡｂ(図９Ａ−９Ｊそれぞれに記したＨＭＡｂ)及びＣＭＶタンパク質に対する対照ＨＭＡｂ(Ｒ０４)(図９Ｋ)と共に捕捉タンパク質を保温した(Wardら、1995,Proc Natl Acad Sci USA.92：6773-6777；ここに参照して説明に代える)。数値は複製ウェルの特異的結合(ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を発現するワクシニアウイルスで感染した細胞の抽出物と野生型ワクシニア抽出物との比)の平均値である。野生型ワクシニアウイルスで感染した細胞から得たタンパク質に対する、ＨＣＶ  ＨＭＡｂ及び対照ＨＭＡｂの反応性は、吸光度０．０４を超えなかった。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図９】ＨＣＶ  ＨＭＡｂによる天然(ＮＡＴ)及び変性(ＤＮＴ)ＨＣＶ１ｂＥ２タンパク質に対する反応性を示す棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ｂ及びＶＷＡ又はＶＷＡのみに感染させた６×１０5個のヒーラ細胞に由来する細胞質抽出物を、未処理のままにした(青の棒線)か、或いは０．５％ＳＤＳ及び５ｍＭジチオスレイトールと共に５６℃で１５分保温して変性した(黄の棒線)。処理後、タンパク質をＢＬＯＴＴＯで１：５に希釈し、５００ｎｇのＧＮＡレクチンでコーティングしたウェル上に捕捉した。ウェルを洗浄しブロッキングし、表記した濃度のＨＣＶ  ＨＭＡｂ及び対照ＨＭＡｂ(Ｒ０４)と共に捕捉タンパク質を保温した。結合抗体を抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体及びＰＮＰＰで検出した。発色を４５分間行った。天然及び変性ＨＣＶ１ｂの数値は複製ウェルから得たシグナル平均値である。ＶＷＡ感染ヒーラ細胞に由来する天然及び変性タンパク質の単ウェルからの信号は区別が付かず、これも平均値をとった(赤の棒線)。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図１０】図１１、１２及び１３で説明する実験に用いた、競合結合解析の概要を示す。ＧＮＡレクチンで固体表面をコーティングし、次いでＥ２含有タンパク質抽出物を添加しレクチンで捕捉する。捕捉Ｅ２に競合抗体を結合させ、過剰な未結合を除去し標識化試験抗体を添加する。
【図１１】ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−５を用いた競合解析の棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ(青い棒線)又はＱ１ｂ(赤い棒線)に感染させたヒーラ細胞の細胞質抽出物から得たＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡで捕捉した。表記したＨＭＡｂ(ｘ軸)２５μｇ／ｍｌの存在下、５μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＨ−５で捕捉ＨＣＶ  Ｅ２を検出した。結果を、競合体の全く存在しない場合のビオチン化ＣＢＨ−５の結合と比較した。棒線は複製ウェルから得た平均値を示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図１２】ＨＭＡｂＣＢＨ−２による多重遺伝子型のＨＣＶ  Ｅ２タンパク質への結合を阻害する、ＨＣＶ  ＨＭＡｂの能力を示す競合解析である。ワクシニアウイルスＱ１ａ(青い棒線)、Ｑ１ｂ(赤い棒線)、Ｑ２ａ(黄色い棒線)又はＱ２ｂ(薄青の棒線)に感染させたヒーラ細胞の細胞質抽出物から得たＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンで捕捉した。ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｄ、−４Ｂ及び−１７は、遺伝子型２のＥ２タンパク質への反応性が限られているため、ＨＣＶ１ａ又は１ｂＥ２タンパク質についてのみ評価した。捕捉ＨＣＶ  Ｅ２を、表記したＨＭＡｂ(ｘ軸)２０μｇ／ｍｌの存在下に、２μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＨ−２で検出した。棒線は、競合抗体が全く存在しない状態でのビオチン化ＣＢＨ−２によるＨＣＶ  Ｅ２への結合に対する、表記した抗体の存在下での結合を示す(ｙ軸)。Ｒ０４はサイトメガロウイルスタンパク質を認識する対照ＨＭＡｂである。棒線は複製ウェルから得た平均値を示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図１３】ＨＣＶ  ＨＭＡｂＣＢＨ−７が独特なエピトープを認識することを示す競合解析である。ワクシニアウイルスＱ１ａ(青い棒線)又はＱ１ｂ(赤い棒線)に感染させたヒーラ細胞の細胞質抽出物から得たＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を、５００ｎｇのＧＮＡレクチンで捕捉した。表記したＨＭＡｂ(ｘ軸)２０μｇ／ｍｌの存在下、２μｇ／ｍｌのビオチン化ＣＢＨ−７で捕捉ＨＣＶ  Ｅ２を検出した。棒線は、競合抗体が全く存在しない場合のビオチン化ＣＢＨ−７によるＨＣＶ  Ｅ２への結合に対する、表記した抗体の存在下での結合を示す(ｙ軸)。Ｒ０４はサイトメガロウイルスタンパク質を認識する対照ＨＭＡｂである。棒線は複製ウェルから得た平均値を示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図１４】図１で説明する実験に用いた、Ｅ２タンパク質へのＣＤ８１の結合を阻害する抗体の能力評価の概要を示す。組換えＣＤ８１で固体表面をコーティングする。次いでＥ２含有タンパク質抽出物を直接添加するか、試験抗体と共に予め保温した後に添加する。適当な標識化二次抗体を用いて、結合した試験抗体−Ｅ２複合体を検出する。
【図１５】ＨＣＶ  ＨＭＡｂのサブセットがＣＤ８１−ＬＥＬと結合したとき、ＨＣＶ  Ｅ２と反応することを実証した棒グラフである。ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させたＢＳＣ−１細胞からの抽出物を、表記したＨＭＡｂ(ｘ軸)５μｇ／ｍｌと混合して総量１００μｌとし、１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ融合蛋白質又は非組換えＧＳＴでコーティングしたマイクロタイタープレートウェル内で一晩保温した。ウェルを洗浄し、実施例６に更に記述するように、適当なアルカリホスファターゼ結合二次抗体及びＰＮＰＰ基質を用いて結合抗体を検出した。数値は、１ａ(紫の棒線)、１ｂ(赤い棒線)、２ａ(黄色い棒線)又は２ｂ(緑の棒線)のＥ２タンパク質の存在下における、ＣＤ８１に捕捉された抗体の平均ＯＤ値をＧＳＴに捕捉された抗体の平均ＯＤ値で割ったものである。ＧＳＴコーティングウェルのＯＤ値は、０．０２１〜０．０８１の範囲であった。
【図１６】図１７で説明する実験に用いた、ＨＣＶビリオンへのＣＤ８１の結合を阻害する抗体の能力評価の概要を示す。組換えＣＤ８１で固体表面をコーティングする。ＨＣＶビリオンを試験抗体と共に予め保温し、次いで固定ＣＤ８１に結合させる。結合ＨＣＶビリオンの検出を、定量ＰＣＲにより測定する。
【図１７】ＨＭＡｂＣＢＨ−２及びＣＢＨ−５がＨＣＶビリオンによるＣＤ８１への結合を阻害することを実証する棒グラフである。ＨＣＶ１ａチンパンジー血清を表記の抗体(ｙ軸)１０μｇと混合し、ＣＤ８１−ＬＥＬでコーティングしたポリスチレンビーズに結合させた後の、ビーズに結合したＨＣＶ  ＲＮＡ分子の数を示す(ｘ軸)。
【図１８】ＨＣＶ  Ｅ２によるＣＤ８１への結合を阻害する抗体の検出に、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇが使用可能なことを示す棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａに感染させたＢＳＣ−１細胞の抽出物に由来するＨＣＶ１ａＥ２タンパク質を、ビオチン化したＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ調製物４μｇ／ｍｌと共に４℃で２０分間保温した。次いでＥ２−ＣＢＨ−４Ｇ複合体の５０μｌアリコートを、５００ｎｇのＧＮＡ(青い棒線)又は１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ(赤い棒線)のいずれかでコーティングしたウェルに、４０μｇ／ｍｌの表記した抗体(ｘ軸)５０μｌの存在下で添加した。Ｒ０４はサイトメガロウイルスタンパク質を認識する対照ＨＭＡｂである。実施例７で説明するように、４℃で一晩保温した後、ウェルを洗浄し、結合したビオチン化ＣＢＨ−４Ｇを検出した。棒線は、競合抗体が全く存在しない状態で得たシグナルに対する、表記の抗体の存在下で複製ウェルから得た平均シグナルを示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図１９】ＨＣＶ感染者由来の血清からＨＣＶ  Ｅ２によるＣＤ８１への結合を阻害する抗体を検出するために、ＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇが使用可能なことを示す棒グラフである。ワクシニアウイルスＱ１ａ又はＱ２ｂに感染させたＢＳＣ−１細胞の抽出物に由来するＨＣＶ１ａ又は２ｂＥ２タンパク質を、ビオチン化したＨＭＡｂＣＢＨ−４Ｇ調製物４μｇ／ｍｌと共に４℃で２０分間保温した。左側の血清４種はＨＣＶ１ａＥ２タンパク質で試験したものであり、右側の血清４種はＨＣＶ２ｂＥ２タンパク質で試験したものである。Ｅ２−ＣＢＨ−４Ｇ複合体を、５００ｎｇのＧＮＡ(青い棒線)又は１００ｎｇのＧＳＴ−ＣＤ８１−ＬＥＬ(赤い棒線)のいずれかでコーティングしたウェルに、遺伝子型の特定されたＨＣＶ感染者(１ａ又は２ｂ)又は非感染者(ＮＥＧ)由来の表記の血清(ｘ軸)を１／５００希釈したものの存在下で添加した。実施例７で説明するように、４℃で一晩保温した後、ウェルを洗浄し、結合したビオチン化ＣＢＨ−４Ｇを検出した。棒線は、競合血清が全く存在しない状態で得たシグナルに対する、表記の血清(最終希釈１／１０００)の存在下で複製ウェルから得た平均シグナルを示す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図２０】競合アッセイを示す図である。プレートをまずＧＮＡレクチンでコーティングする。このＧＮＡレクチンにＣＨＯ基を結合させることによって、マイクロタイタープレート上に細胞内Ｅ２全長を捕捉する。ＧＮＡに捕捉されたＥ２に競合ＨＭＡｂを接触させる。ビオチン化した試験ＨＭＡｂをプレートに添加し、ビオチン化試験ＨＭＡｂによるＥ２への結合を、ストレプトアビジン−ＡＰ複合体を用いて検出する。試験ＨＭＡｂの結合が阻害されたことは、同じ抗体結合領域にエピトープあることを示唆する。
【図２１Ａ】４種のＨＣＶヒトモノクローナル抗体の競合解析を示す。ＧＮＡレクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上にＨＣＶ  Ｑ１ｂＥ２タンパク質を捕捉した。ビオチン化した試験抗体(各グラフの上に表記)２μｇ／ｍｌを、表記した濃度(ｘ軸)の競合ヒトモノクローナル抗体を含むウェルに添加した。結合したビオチン化試験抗体を、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体で検出した。競合抗体の存在下で得られたシグナルは、競合抗体の非存在下で得たシグナルに対する、ビオチン化試験抗体により得られたシグナルのパーセントとして表した(ｙ軸)。各点は２個の複製ウェルから得た平均値を示す。棒線は平均からの標準偏差の一つを示す。競合抗体は右に示す記号表の通りである。
【図２１Ｂ】４種のＨＣＶヒトモノクローナル抗体の競合解析を示す。ＧＮＡレクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上にＨＣＶ  Ｑ１ｂＥ２タンパク質を捕捉した。ビオチン化した試験抗体(各グラフの上に表記)２μｇ／ｍｌを、表記した濃度(ｘ軸)の競合ヒトモノクローナル抗体を含むウェルに添加した。結合したビオチン化試験抗体を、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体で検出した。競合抗体の存在下で得られたシグナルは、競合抗体の非存在下で得たシグナルに対する、ビオチン化試験抗体により得られたシグナルのパーセントとして表した(ｙ軸)。各点は２個の複製ウェルから得た平均値を示す。棒線は平均からの標準偏差の一つを示す。競合抗体は右に示す記号表の通りである。
【図２２Ａ】ヒトモノクローナル競合解析の結果を示す。示した結果は、競合抗体が全く存在しないウェルに対する、試験抗体の平均結合パーセントである。２−５回の異なる実験から得た平均値を示す。遺伝子型１ａ及び１ｂＥ２タンパク質の両方を試験した。ＮＤは試験を行っていないという意味である。
【図２２Ｂ】ヒトモノクローナル競合解析の結果を示す。示した結果は、競合抗体が全く存在しないウェルに対する、試験抗体の平均結合パーセントである。２−５回の異なる実験から得た平均値を示す。遺伝子型１ａ及び１ｂＥ２タンパク質の両方を試験した。ＮＤは試験を行っていないという意味である。
【図２３】本明細書に述べるＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトを表す。Ｅ２コンストラクトの呼称を左側に記した。ｐＤｉｓｐｌａｙベクターに由来する配列を黒い太線で示した。ｐＤｉｓｐｌａｙベクターに存在するＨＡエピトープ及びｃ−ｍｙｃエピトープの位置も併せて記した。ＨＣＶ１ｂＥ２由来の配列を白い四角で示す。ＨＣＶ１ｂＥ２由来の配列を薄グレーの四角で示す。ｘ軸下部の数字は、ＨＣＶ−１単離体のポリプロテインに準ずるものである。
【図２４】ＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトのウエスタンブロット分析を示しており、コンストラクトが効果的に発現されたことを示している。レーン上側に表記したＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトをＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞質抽出物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分別した。分別したタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＨＡエピトープに対するラットモノクローナル抗体(ＨＡｒＭＡｂ)又はＣＭＶタンパク質に対するＨＭＡｂ(対照)のいずれかと共に保温した。結合抗体を適当なＡＰ結合抗血清で検出した。ＨＥＫはｍｏｃｋトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞である。分子量マーカーの泳動を左側に記す。
【図２５Ａ】本発明の特定のヒトモノクローナル抗体による、様々なＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトに対する反応性を示す。ＨＥＫ−２９３細胞をｍｏｃｋトランスフェクトした(白い棒線)、あるいは表記のＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトでトランスフェクトした(各グラフの記号表参照)。トランスフェクションの２４時間後、細胞質抽出物を調製し、同等のアリコートを上記したようにＧＮＡレクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕捉した。捕捉されたＥ２タンパク質をｘ軸に表記のＨＣＶ  ＨＭＡｂと共に保温し、結合抗体の量を調べた。棒線は複製ウェルから得た平均吸光度を表す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図２５Ｂ】本発明の特定のヒトモノクローナル抗体による、様々なＨＣＶ  Ｅ２欠失コンストラクトに対する反応性を示す。ＨＥＫ−２９３細胞をｍｏｃｋトランスフェクトした(白い棒線)、あるいは表記のＨＣＶ  Ｅ２コンストラクトでトランスフェクトした(各グラフの記号表参照)。トランスフェクションの２４時間後、細胞質抽出物を調製し、同等のアリコートを上記したようにＧＮＡレクチンでコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕捉した。捕捉されたＥ２タンパク質をｘ軸に表記のＨＣＶ  ＨＭＡｂと共に保温し、結合抗体の量を調べた。棒線は複製ウェルから得た平均吸光度を表す。エラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図２６】ＨＣＶ感染者の血清が、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を阻害する抗体を様々なレベルで含むことを実証するグラフである。相同ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質をウェル上に捕捉し、様々な希釈段階のＨＣＶ１ａ、１ｂ、２ａ又は２ｂ血清と共に保温した。数値は、個々の血清から得た、ビオチン化ＣＢＨ−２又はＣＢＨ−７結合の特異的阻害を表す。所与の希釈(ｘ軸)について、複数の決定材料から得た阻害の平均パーセント(ｙ軸)をプロットした。８種の陰性血清について得た特異的阻害の平均値も示した(用いたＥ２タンパク質の遺伝子型を記載した)。陰性血清上のエラーバーは平均からの標準偏差の一つを示す。
【図２７】ＨＣＶ感染者の血清が、ＣＢＨ−２及びＣＢＨ−７を阻害する様々なレベルの抗体を含むことを実証したスキャッタグラムを示す。スキャッタグラムは試験ＨＭＡｂの阻害パーセントを示す。ｘ軸に表記した遺伝子型のＨＣＶ血清又は対照血清(ＮＥＧ)を１：２００に希釈し、遺伝子型がマッチし特定されたＥ２タンパク質でコーティングしたウェル内でビオチン化試験ＨＭＡｂ(グラフの上に表記)と共に保温した。ストレプトアビジン結合ＡＰを用いて試験ＨＭＡｂの結合を検出した。得られた結果を、競合物が存在しない場合の試験ＨＭＡｂの結合と比較した。記号はそれぞれ、一人の血清から得た結果を示す。線は阻害中央値パーセントを意味する。点線は、試験ＨＭＡｂの存在について血清が陽性であるとみなす限界値を示す。
【図２８】慢性肝炎患者７４人から得たＣＢＨ−２阻害価のヒストグラムである。個々の血清について得たＣＢＨ−２阻害価を１００につき２０個の容器に入れこの１セットを＞２０００の力価まで全て用意した。棒線は、所与の容器セット中にあるＣＢＨ−２阻害価を有する血清の数を示す。ＨＣＶ１ａ／１ｂ血清の数を黒で示した。ＨＣＶ２ａ／２ｂ血清の数を灰色で示した。低い阻害価(＜２００)、中間の阻害価(２００−１０００)、高い阻害価(＞１０００)を有する血清の数を、グラフの下に示した。
【図２９】慢性肝炎患者７４人から得たＣＢＨ−７阻害価のヒストグラムである。個々の血清について得たＣＢＨ−２阻害価を１００につき２０個の容器に入れこの１セットを＞２０００の力価まで全て用意した。棒線は、所与の容器中にあるＣＢＨ−７阻害価を有する血清の数を示す。ＨＣＶ１ａ／１ｂ血清の数を黒で示した。ＨＣＶ２ａ／２ｂ血清の数を灰色で示した。低い阻害価(＜２００)、中間の阻害価(２００−１０００)、高い阻害価(＞１０００)を有する血清の数を、グラフの下に示した。
【図３０】ＨＣＶ  Ｅ１及びＥ１Ｅ２コンストラクトの概要を示す。
【図３１】ＨＣＶ  Ｅ１  １ｂ(ＺＹＫ−Ｅ１)；全長ＨＣＶ１ｂ(ＨＰＣＪ４９１)；及びＨＣＶ１ａのＨ単離体(ＨＰＣＳＴ９０)から得たＥ１コンストラクトのアミノ酸配列の整列を示す。保存アミノ酸を点で示す。数字は、ＨＣＶポリプロテインの開始メチオニンから数えたものである。
【図３２Ａ】グリコシル化及び非グリコシル化Ｅ１コンストラクトのウェスタンブロット写真である。Ａ．ＨＥＫ−２９３細胞を、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター(ＶＥＣ)又は表示のＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトした。Ｂ．ＨＥＫ−２９３細胞を、ツニカマイシンの存在下(＋)又は非存在下(−)、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター(ＶＥＣ)又は表示のＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトした。
【図３２Ｂ】グリコシル化及び非グリコシル化Ｅ１コンストラクトのウェスタンブロット写真である。Ａ．ＨＥＫ−２９３細胞を、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター(ＶＥＣ)又は表示のＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトした。Ｂ．ＨＥＫ−２９３細胞を、ツニカマイシンの存在下(＋)又は非存在下(−)、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター(ＶＥＣ)又は表示のＨＣＶ  Ｅ１コンストラクトでトランスフェクトした。
【図３３】Ｅ１欠失コンストラクトでトランスフェクトしたＨＫＥ２９３細胞内で発現されたＥ１組換えタンパク質の、ＦＡＣＳｃａｎ解析を示すグラフである。
【図３４】ＨＣＶ血清を用いたＩＦＡデータの写真である。
【図３５】Ｅ１及びＥ１／Ｅ２コンストラクトによる、ＨＣＶ陽性血清中のヒト抗体への免疫反応性を示す表である。
【図３６】ＨＣＶ抗Ｅ１ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４のＩＦＡデータの写真である。
【図３７】ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４を用いた、Ｅ１タンパク質のウェスタンブロットである。Ａ．免疫沈降反応。Ｂ．ウェスタンブロット。
【図３８】ＨＣＶ  ＨＭＡｂＨ−１１１及びＨ−１１４と、ＨＥＫ−２９３細胞において一過性発現されたＥ１−１組換えタンパク質とのＦＡＣＳｃａｎの解析を表すグラフである。
【図３９】Ｅ１ＨＭＡｂのエピトープ地図作成実験を示す図表である。
【図４０】ＨＭＡｂＨ−１１１エピトープのペプチド競合解析を例証するグラフである。
【図４１】Ｈ−１１４によって認識された突然変異Ｅ１のウェスタンブロット写真である。
【図４２】ＨＭＡｂＨ−１１４のペプチド競合解析を例証するグラフである。
【図４３Ａ】ＨＭＡｂＨ−１１４エピトープのアミノ及びカルボキシル末端領域における点突然変異の効果を例証しているグラフである。Ａ．アミノ酸２０６〜２１１の突然変異解析。Ｂ．アミノ酸３０６〜３１３の突然変異解析。
【図４３Ｂ】ＨＭＡｂＨ−１１４エピトープのアミノ及びカルボキシル末端領域における点突然変異の効果を例証しているグラフである。Ａ．アミノ酸２０６〜２１１の突然変異解析。Ｂ．アミノ酸３０６〜３１３の突然変異解析。
【図４４】ＤＴＴの存在下又は非存在下での、ＨＭＡｂＨ−１１４によるＥ１への結合の免疫沈降解析の写真である。
【図４５】内側Ｅ１システイン残基についてのアラニンスキャニング実験の結果を示す表である。
【図４６】様々なＥ１突然変異体のウエスタンブロットである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【国際調査報告】
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