(57)【要約】本発明の第１態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する方法であって、細胞におけるステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節することを含む方法が提供される。本発明者らは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１により調節されるコレステロール流出によりコレステロールを除去しうることを見いだした。ＣＹＰ２７調節について、より意外なことに、流出したコレステロールはコレステロールの形のままであって、ＣＹＰ２７の存在下で予想されたような酸化形コレステロールではない。好ましくは、マクロファージのＣＹＰ２７が調節され、肝細胞のカベオリン−１が調節される。
2006513150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるコレステロール流出を調節する方法であって、
細胞におけるステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法。
【請求項２】
細胞が、肝臓の細胞または肝細胞、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、および他の血管壁細胞、ならびに幹細胞を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アテローム硬化斑に関連する血管壁に由来する細胞において、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
血管細胞、平滑筋細胞または内皮細胞において、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マクロファージにおいて、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞において、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肝臓の細胞または肝細胞において、カベオリン−１の発現および／または活性を調節する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
流出したコレステロールが実質的に非酸化形コレステロールである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
作動可能な状態で結合したＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１遺伝子あるいはその均等物を細胞にトランスフェクションして、細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞をさらに脱メチル化剤で処理する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
脱メチル化剤が５−アザシチジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞におけるコレステロール流出を増大させる方法であって、
細胞におけるステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を増大させる
ことを含む方法。
【請求項１４】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物をコードする遺伝子の発現を増大させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の活性を増大させる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物をコードする遺伝子をトランスフェクションし、該遺伝子の発現を増大させてコレステロール流出を増大させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
細胞をさらに脱メチル化剤で処理する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
脱メチル化剤が５−アザシチジンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子を誘導して、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を増大させる、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞が、肝臓の細胞または肝細胞、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、および他の血管壁細胞、ならびに幹細胞を含む群から選択される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
アテローム硬化斑に関連する血管壁に由来する細胞において、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血管細胞、平滑筋細胞または内皮細胞において、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞がマクロファージである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
幹細胞において、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
肝臓の細胞または肝細胞において、カベオリン−１の発現および／または活性を調節する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
流出したコレステロールが実質的に非酸化形コレステロールである、請求項１３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
コレステロール流出が調節された細胞であって、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の、調節された発現および／または活性を含む細胞。
【請求項２９】
細胞がＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物をコードする遺伝子をトランスフェクションされた、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
肝臓の細胞または肝細胞、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、血管壁細胞、および幹細胞を含む群から選択される、請求項２８または２９に記載の細胞。
【請求項３１】
肝細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
幹細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３３】
幹細胞が造血幹細胞である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
コレステロール流出が増大した請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の細胞であって、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の、増大した発現および／または活性を含む細胞。
【請求項３５】
患者において該患者の細胞からのコレステロール流出を調節することによりコレステロール関連状態を処置する方法であって：
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法。
【請求項３６】
患者の細胞におけるコレステロール流出を調節することにより該患者においてコレステロール関連状態を処置するための請求項３５に記載の方法であって、
遺伝子コンストラクトを導入して、患者の細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法。
【請求項３７】
遺伝子コンストラクトが、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子をコードする遺伝子を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させる、３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
患者のコレステロール流出を調節することにより該患者においてコレステロール関連状態を処置する方法であって、
調節された細胞を患者に導入し、その際、該細胞はＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の、調節された発現および／または活性を含む
ことを含む方法。
【請求項４０】
調節された細胞が、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物をコードする遺伝子をトランスフェクションされている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
調節された細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性が増大している、３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
細胞が、肝臓の細胞または肝細胞、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞、および他の血管壁細胞、ならびに幹細胞を含む群から選択される、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
細胞が肝細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞が幹細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
細胞が造血幹細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞がマクロファージである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
細胞が血管細胞、内皮細胞または平滑筋細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
細胞をコレステロール蓄積に関連する疾患の領域に導入する、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
細胞を、血管を内張りする血管細胞に導入する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
コレステロール関連状態が、心筋梗塞、アテローム硬化症、卒中、低アルファリポタンパク血症または末梢血管疾患を含む群から選択される、請求項３９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
コレステロール関連状態がアテローム硬化症である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
細胞におけるコレステロール流出を調節する化合物を同定する方法であって：
化合物を細胞に接触させ；
該細胞において、該化合物と接触させていない細胞と対比したＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１あるいはその均等物の発現および／または活性の変化を検出する
ことを含む方法。
【請求項５３】
細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞、および血管細胞、肝臓の細胞または肝細胞、マクロファージ、ならびに幹細胞を含む群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞が肝細胞である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
細胞が、カベオリン−１をトランスフェクションされた肝細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
細胞がＨｅｐＧ２細胞である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
コレステロール関連状態を処置する際に使用する組成物であって：
その状態を処置するのに有効な量の、請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の方法により同定された化合物を含み；
該化合物を混合した
組成物。
【請求項５８】
実質的に実施例および／または図面に関連して記載された、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に細胞代謝、特にコレステロールの代謝を調節すること、および細胞からのコレステロール流出を調節する方法に関する。本発明はまた、コレステロールの代謝および細胞からの流出を調節することにより、コレステロール関連状態、たとえばアテローム硬化症を予防および処置する方法に関する。これは、細胞におけるコレステロール蓄積を阻止し、コレステロール流出のための条件を増強することにより、アテローム硬化症の発症率を低下させるであろう。
【背景技術】
【０００２】
アテローム硬化症は、血管壁の内面に沿った脂肪性病変（アテローム斑としても知られる）の出現を特徴とする動脈疾患である。血管内腔が狭まるため円滑な血流に対する狭窄が生じ、最終的に生存臓器への血液供給が失われる。アテローム斑には、高い破裂傾向もある。破裂した斑の表面に形成された血栓が血管壁から外れて、心臓に供給する動脈内に停滞することにより、終末臓器にさらに損傷を与え、心筋梗塞を引き起こす（心臓発作）；あるいは脳の場合は卒中を引き起こす。この疾患の臨床的および社会的重大性は、西洋社会における年間死亡の半数が心臓および脳の血管疾患から起き、そのうちアテローム硬化症が主因であるという事実において明らかである。したがって、アテローム硬化症の原因を理解することは、この恐るべき統計に対処する有効な処置方策を設計する際に重要である。
【０００３】
初期アテローム硬化性病変の形成において重要な事象である脂肪線条（fatty streak）は、マクロファージが動脈壁に流入した後に異常なリポタンパク質粒子およびコレステロールを取り込んで、しばしば泡沫細胞（form cell）と呼ばれるものを形成したものである。したがって、アテローム硬化斑の主成分であるコレステロールは、処置方策の主要な標的となる。
【０００４】
コレステロールは人体の主要なステロールであり、細胞膜の構造統合がその主要な機能である。コレステロールは生体機能、ならびにエストロゲン、プロゲステロンおよびテストステロンを含めた多数のステロイドホルモンの合成にも関係することが示されている。肝臓においてコレステロールは胆汁酸の前駆物質でもあり、これは腸内へ分泌されると消化プロセスを補助する。
【０００５】
コレステロールは人の生理にとって重要ではあるが、コレステロールおよび血中でコレステロールを輸送するタイプのリポタンパク質の血中濃度の上昇は、明らかにアテローム硬化症の発症および進行を促進する。しかし、血中および細胞中のコレステロール濃度を低下させるために設計された現在の処置方策は、食事療法によるものであっても脂質低下薬によるものであっても、アテローム硬化症の進行を遅らせ、さらには停止させ、終末臓器損傷のリスクを低下させることは示されたが、既存のアテローム硬化斑の退縮には影響を与えなかった。
【０００６】
現在利用できる処置法はコレステロール低下療法であるので限界があり、アテローム硬化性病変の進行を減衰させ、最終的には退縮を促進し、または確立を阻止する、新規な療法の必要性が強調されている。そのような方法の一つは、泡沫細胞からコレステロールを除去してそれらの細胞が致死的な破裂を生じないよう安定化すること、そしてより重要な点は既存の病変の退縮および疾患重症度の逆転を促進することである。アテローム硬化斑のマクロファージ泡沫細胞からコレステロールを除去すること、すなわちコレステロール流出は、細胞内および細胞外の多数の要因により支配されると思われる。
【０００７】
コレステロールの蓄積は、コレステロールを細胞へ送達する経路とそれを除去する経路の不均衡により起きる。コレステロールを細胞へ送達するのに関与する経路は研究され、この知見に基づく処置法が適用されて著しい成果を得ている。アテローム硬化症の減少、結果的に心疾患および卒中のリスクの低下をさらに促進するために、細胞からのコレステロール除去に関係する経路を標的とすることもできる。この経路は、コレステロール逆輸送経路（ＲＣＴ）である。
【０００８】
ＲＣＴ経路は、血管壁を含めた肝臓外組織から過剰のコレステロールを除去し、これによりアテローム硬化症の発症を阻止する。他方でＲＣＴはＨＤＬの主供給源であり、これはＲＣＴにおけるその役割または他の機序によって強い抗アテローム形成作用をもつ。逆コレステロール輸送において第１の最も可能性の高い律速段階は、コレステロールを細胞から血漿中のアクセプターへ伝達するコレステロール流出である。現在、２つのコレステロール流出経路が知られている。一方は、無脂質または低脂質アポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）の脂質化を伴い、ＡＢＣＡ１トランスポーターにより仲介される可能性が最も高い。他方は、原形質膜カベオラから脂質化ａｐｏＡ−Ｉまたは成熟した高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）へのコレステロールの伝達を伴う。しかし、これらの流出機序の制御は依然として不明である。血管壁からのコレステロール流出を増大させると、血管壁におけるマクロファージのコレステロール含量が低下することによりアテローム硬化症の発症が予防されるであろう。肝臓からのコレステロール流出を増大させると、血中におけるＨＤＬ（多数の抗アテローム形成作用をもつ）濃度が上昇することによりアテローム硬化症の発症が予防されるであろう。これらの機序が単独で、または組み合わさって、体内のコレステロール濃度およびコレステロール関連状態のリスクを制御するのを助けると思われる。
【０００９】
肝臓におけるコレステロール酸化はコレステロール異化作用の主要な経路であり、コレステロールを胆汁酸に変換する。コレステロールの酸化は他の細胞、たとえばマクロファージおよび内皮細胞においても行われ、これはコレステロールを２７ヒドロキシコレステロールおよび３−ベータ−ヒドロキシ−５−コレステン酸に変換する酵素ステロール−２７ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）により触媒される。しかし、これらの酸化形コレステロールは細胞に対して有毒な可能性があり、しばしば細胞から放出される。酸化形コレステロールは、より親水性だからである。したがって、これらの副生物は有毒であるという理由で不都合であり、これらの酸化形コレステロールの沈着は斑形成、アテローム硬化症および冠動脈性心疾患を生じる可能性がある。酸化はコレステロールを細胞から放出されやすい形に変換するのには有益であろうが、この変換は細胞に対して有毒または有害でないレベルに調節されなければならない。したがって、有毒な酸化形コレステロール副生物を増加させずにコレステロール流出を増大させるのが望ましいであろう。
【００１０】
本発明の目的は、コレステロール流出を改善し、コレステロールの蓄積、アテローム硬化症および心疾患の発症に対する予防を向上させることである。
【００１１】
発明の概要
本発明の第１態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する方法であって、
細胞におけるステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００１２】
本発明者らは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１により調節されるコレステロール流出によりコレステロールを除去しうることを見いだした。ＣＹＰ２７調節について、より意外なことに、流出したコレステロールはコレステロールの形のままであって、ＣＹＰ２７の存在下で予想されたような酸化形コレステロールではない。
【００１３】
本発明の他の好ましい態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する方法であって、
細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションし；
細胞にトランスフェクションされたＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００１４】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現に直接影響を及ぼすことによりコレステロール排出を調節するこの方法は、好ましくはＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を自然レベルから調節するのに主として用いられる。好ましくは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１のための遺伝子を含むコンストラクトの導入により、発現の際ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１のレベルが増大し、これによりコレステロール流出に影響を及ぼすであろう。
【００１５】
好ましい態様においては、細胞におけるコレステロール流出を増大させる方法であって、
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させる
ことを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明のさらに好ましい態様においては、細胞からのコレステロール流出を増大させる方法であって、
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子で細胞をトランスフェクションし；
トランスフェクションされたＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を増大させる
ことを含む方法が提供される。
【００１７】
本発明の他の態様においては、コレステロール流出が調節された細胞であって、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性が調節された細胞が提供される。
【００１８】
好ましくは、細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションする。したがって細胞は調節することができ、好ましくはＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現が増大した場合はコレステロール流出が増大する。
【００１９】
本発明の他の態様においては、患者において患者の細胞からのコレステロール流出を調節することによりコレステロール関連状態を処置する方法であって：
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらに好ましい態様においては、患者においてコレステロール流出を調節することにより患者におけるコレステロール関連状態を処置する方法であって：
調節された細胞を患者に導入し、該細胞はＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性が調節されている
ことを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のさらに他の態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する化合物を同定する方法であって、
化合物を細胞と接触させ；
該細胞において、該化合物を接触させていない細胞と対比したＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の変化を検出する
ことを含む方法が提供される。
【発明の開示】
【００２２】
本発明の第１態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する方法であって、
細胞におけるステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００２３】
ステロール２７ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）は胆汁酸合成に関係することが示されており、主に肝細胞中にみられる。したがってその役割は、肝細胞においてコレステロールを胆汁酸に変換し、これによりコレステロールをこの方法で細胞から除去することである。しかしこの酵素はすべての細胞に一般的にみられるわけではなく、また特にマクロファージおよび上皮細胞におけるその役割はほとんど知られていない。これらの細胞において胆汁酸を産生する必要はないので、ＣＹＰ２７の役割は異なる。この酵素はマクロファージおよび平滑筋細胞中にみられ、一般にコレステロールを酸化してより流出性の形のコレステロール、たとえば２７ヒドロキシ−コレステロールおよび３−ベータ−ヒドロキシ−５−コレステン酸にすることによりコレステロールの除去に関与すると推定された。しかし、本発明者らは、ＣＹＰ２７が調節するコレステロール流出によりコレステロールを除去できることを見いだした。より意外なことに、流出したコレステロールはコレステロールのままであって、ＣＹＰ２７の存在下で予想されたように酸化形ではない。
【００２４】
血管壁においては過剰のコレステロールがコレステロール逆輸送経路で除去されるが、関与する実際の除去プロセスおよび段階は複雑である。本発明者らは、ステロール２７ヒドロキシラーゼにより仲介される細胞から血漿中のアポリポタンパク質Ａ−１などのアクセプターへのコレステロール流出が血管壁の細胞からのコレステロール除去に寄与すること、およびこのコレステロール流出は非酸化形で行われ、酵素ＣＹＰ２７により調節されることを見いだした。
【００２５】
カベオリン−１は細胞内コレステロール転送（trafficking）経路およびコレステロール流出経路に関与しており、細胞内コレステロール輸送に関係することが示されている。カベオリンはカベオラの必須成分であるので、多数のシグナリング経路にも関与する。カベオラは、多様な脂質およびタンパク質分子の封鎖に関係することが示される特殊な原形質膜ドメインである。これらの重要な細胞小器官は脂質代謝、成長調節、信号伝達、およびアポトーシスなど、多様な生化学プロセスにおいて中心的な役割をもつことが示唆された。カベオリンはヘテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用し、これを調節する。
【００２６】
現在、in vivoでカベオラ膜の主構造成分を構成する２１〜２４ｋＤａの膜内在性タンパク質をコードすることが知られているカベオリンマルチジーンファミリーのメンバーが３種類ある。カベオリン−２タンパク質は、線維芽細胞および分化した脂肪細胞、平滑筋および骨格筋細胞、ならびに内皮細胞に多量に発現する。カベオリン−１の発現はカベオリン−２と類似するが、カベオリン−３の発現は筋組織タイプに限定されると思われる。しかし、カベオリン発現と流出コレステロールのレベルの関係についての報告には一貫性がない。さらに、カベオリンの過剰発現によりコレステロール流出を刺激する試みは、多くのカベオラにおいて形成または変化が起きなかったので、これまで成功していない。
【００２７】
コレステロール流出を調節される細胞は、コレステロールを産生してコレステロール流出によりコレステロールを輸出できるいかなる細胞であってもよい。好ましい細胞には、肝細胞、マクロファージ、内皮細胞、平滑筋細胞および他の血管壁細胞が含まれるが、これらに限定されない。最も好ましくは、細胞はアテローム硬化斑に関連する血管壁に由来するもの、たとえばマクロファージ、またはＨＤＬ形成に関連する肝細胞である。しかし本発明においては、コレステロールを流出する体細胞に分化しうる幹細胞の使用も考慮される。好ましくは、その体細胞は、肝細胞、マクロファージ、内皮細胞および他の血管壁細胞から選択される；好ましくは幹細胞は造血幹細胞である。より好ましくは、肝細胞以外の細胞におけるコレステロール流出を、ＣＹＰ２７の発現および／または活性の調節により調節する。肝細胞におけるコレステロール流出を、好ましくはカベオリン−１の発現および／または活性の調節により調節する。コレステロール流出の機序および細胞に対する有益性は、種々の細胞タイプにおいて異なる可能性がある。コレステロール流出は一般に２つの機能をもつ。第１は、細胞からコレステロールを除去し、コレステロールの蓄積防止によりアテローム硬化症に対する予防をすることである。第２は、コレステロール流出の結果として形成される高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の産生である。ＨＤＬは、次いで細胞内のコレステロールをさらに減少させることにより、またコレステロールに無関係な他の機序により、アテローム防御性となる。マクロファージはコレステロールが蓄積して臨床的に重大な結果を生じる場であるので、重要な細胞である。肝細胞は大部分のＨＤＬが形成される場であるので、重要な細胞である。したがって、マクロファージのＣＹＰ２７を調節し、肝細胞のカベオリン−１を調節することが好ましい。これらの細胞は、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の調節により、最も利益を受けるであろう。しかし他の細胞にも、ＣＹＰ２７およびカベオリン−１の単独または組合わせの調節が有益であると思われる。
【００２８】
ステロール−２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７）は、コレステロールを酸化して２７ヒドロキシコレステロールおよび３−ベータ−ヒドロキシ−５−コレステン酸に変換するいかなる形のヒドロキシラーゼであってもよい。本明細書中で用いる”均等物”は、ＣＹＰ２７と類似の様式で挙動および機能しうるいずれかの化合物であり、これには該酵素の種々のアイソフォームを含めることができる。この酵素の機能には、コレステロールを酸化する能力のみならず、コレステロールの流出に影響を及ぼす可能性のある上流反応または下流反応にも関与する能力が含まれうる。
【００２９】
ＣＹＰ２７によるコレステロール酸化の生成物が非酸化形コレステロールの流出を調節すると考えられる。それらはコレステロール流出（またはその調節）に関与する遺伝子の調節因子の一つであるか、あるいは膜（または膜の特定部分）の特性を変化させてコレステロール流出を促進する可能性がある。細胞におけるＣＹＰ２７の活性は（トランスフェクション後ですら）かなり低く、ほとんどすべて酸化されたコレステロールが放出されるが、それは放出される全コレステロール（すなわち酸化形＋非酸化形）の約２〜３％を構成するにすぎない。したがって、コレステロール酸化におけるＣＹＰ２７の役割は変わらない。
【００３０】
特許請求の範囲および本明細書の記載全体において、”含む”（compriseならびにこの語の変形、たとえばcomprisingおよびcomprises）は、他の添加物、成分、整数または工程を除外するためのものではない。
【００３１】
カベオラは流出コレステロールの主供給源であると考えられ、カベオリンは、コレステロールを細胞内コンパートメントから、コレステロールが流出可能になる原形質膜プールへ輸送するのに関与する。カベオリンはすべてではないが多くの細胞タイプに発現し、カベオラを形成する場合と形成しない場合がある。肝細胞においてカベオリン−１を過剰発現させると実際にコレステロール流出および好ましくはカベオラ形成（これはコレステロール流出を刺激する）が増大するのが、本発明の好ましい態様である。肝細胞からのコレステロール流出はＨＤＬコレステロールの主供給源であり、これらの細胞からのコレステロール流出を刺激すると、抗アテローム形成性であるＨＤＬの血漿濃度が上昇する。
【００３２】
コレステロール流出はＲＣＴの第１段階であり、肝臓は通常はＲＣＴの起源ではなくむしろ到着地であると考えられている。しかし、肝細胞、たとえばＨｅｐＧ２細胞からのコレステロール流出速度は、ヒトの皮膚線維芽細胞からの流出ときわめて類似する。これは、コレステロール流出経路の特性がこれらの細胞タイプ間で類似することを示す。しかしＨｅｐＧ２細胞は自然にカベオリン−１を発現することはない。さらに、肝臓が血漿中ＨＤＬコレステロールの主供給源である可能性が最近示唆された。したがって肝臓は、この経路の起源および到着地の両方であることにより、ＲＣＴの調節において二重の役割を果たす可能性のあることが今回見いだされた。
【００３３】
本発明には、コレステロール流出の調節を改善するために両方の機序を利用することも含まれる。したがって細胞のコレステロール流出は、ＣＹＰ２７およびカベオリン−１または均等物の、単独または組合わせの発現および／または活性を調節することにより調節できる。コレステロール流出は、ある細胞のＣＹＰ２７および他の細胞のカベオリン−１を調節することにより増大させることができる。両者の発現により、一方はコレステロールを流出させ、他方はＨＤＬを提供し、これがコレステロール流出を増大させ、細胞からコレステロールが排除されるという相乗効果をもつ可能性がある。
【００３４】
本明細書中で用いる用語、コレステロール流出を”調節する（modulating）”は、コレステロールが細胞から除去される速度を変化させることを意味する。変化の程度は、細胞からの自然のコレステロール流出速度と対比することにより決定される。”調節する”には、流出を増大または低下させるようにコレステロール流出を調整することが含まれる。好ましくは、流出を増大させる。したがって、ＣＹＰ２７およびカベオリン−１をターゲティングすることにより、コレステロール流出を操作できる。
【００３５】
ＣＹＰ２７およびカベオリン−１がコレステロール流出にとって中心的であり、その際の流出は実質的に非修飾コレステロールの形であるという本発明者らの知見が、コレステロール流出を望まれるように変化、変更または調整しうる手段を提供した。”実質的に”とは、主に非酸化形コレステロールの形であって、２７ヒドロキシコレステロールおよび３−ベータ−ヒドロキシ−５−コレスタン酸を含めた非酸化形ではないことを意味する。コレステロールが流出する際、若干はこの酸化形で流出する。しかし、ＣＹＰ２７により調節する場合、主に非酸化形コレステロールが流出する。
【００３６】
細胞から流出するコレステロールの量は、その細胞に与えられる条件に依存するであろう。好ましくは、細胞内のコレステロールの５〜１５％が細胞から放出される。ただし、この量は異なる条件下では変動する可能性がある。放出されるコレステロールの形は、酸化形または非酸化形でありうる。好ましくは、この５〜１５％のうち、約０．１〜０．３％は酸化形で放出される可能性があり、残部は非酸化形で放出されうる。しかし、細胞内にある酸化形コレステロールはごく少量（２〜３％）であるので、放出されるこの相対的に少量の酸化形コレステロールは、ＣＹＰ２７により形成される酸化形コレステロールの量の約８０％を構成するであろう。
【００３７】
本明細書中で用いる用語”ＣＹＰ２７の発現および／または活性を調節する”または”カベオリン−１の発現および／または活性を調節する”には、非修飾レベルのＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１と比較して、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節または変更することが含まれる。コレステロール流出を増大または低下させるために、非修飾レベルと比較して発現および／または活性を増大または低下させることができる。好ましくは、コレステロール流出を増大させるために、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させる。
【００３８】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の調節は、直接法または間接法により達成できる。ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の調節は、当業者に既知の直接法により達成でき、これにはＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子の導入、ノックアウト技術、アンチセンス技術、三重らせん技術、ターゲティングした変異形成、遺伝子療法、および転写に作用する薬剤による調節が含まれるが、これらに限定されない。ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節するための間接法には、上流または下流の調節因子のターゲティングを含めることができる。
【００３９】
本明細書中で用いる用語”活性”は、細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の機能に関連するものであり、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１、ならびに／あるいはＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１により触媒される反応の生成物が、シャペロンあるいは上流または下流エフェクター分子に結合することにより、コレステロール流出に影響を及ぼす上流または下流経路を活性化または抑制する能力を含む。用語”活性”には、ＣＹＰ２７がコレステロールを酸化する能力および／またはカベオリン−１がコレステロールを流出させる能力も含まれる。
【００４０】
本発明の他の好ましい態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する方法であって：
細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションし；
細胞にトランスフェクションされたＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００４１】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現に直接作用することによりコレステロール流出を調節するこの方法は、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を自然レベルから調節するために主に用いられる。好ましくは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の遺伝子を含むコンストラクトの導入により、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現レベルを増大させ、これによりコレステロール流出に影響を及ぼす。
【００４２】
前記のように、コレステロールを流出させることができる細胞はいずれも、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子を受容できる。しかし、理想的には細胞は効率的なコレステロール流出が要求される細胞、またはＨＤＬ形成に関与する細胞である。すべての細胞がコレステロールを流出させるが、ＣＹＰ２７については血管壁の細胞が最も好ましく、最も重要である。これらの細胞におけるコレステロール流出が損なわれるとアテローム硬化症が起きるからである。肝細胞はＨＤＬ形成に関与するので、カベオリン−１については肝細胞が最も好ましい。幹細胞も本発明の範囲において考慮される。これらは遺伝子療法に特に有用であり、分化して身体の適宜な領域、たとえば血管壁、心臓組織または肝臓でその後ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１が発現した際に効率的にコレステロールを流出するように調節できる。
【００４３】
ＣＹＰ２７の遺伝子はBaker Medical Research Instituteから入手でき、哺乳動物発現ベクター、たとえばｐｃＤＮＡ３に挿入してコンストラクトまたはベクターを形成し、これを細胞にトランスフェクションしてＣＹＰ２７を発現させることができる。
【００４４】
カベオリン−１の遺伝子は、いずれかの業者、たとえばClontechから、または細胞にトランスフェクションできる発現ベクターとして入手できる。しかし、遺伝子配列を細胞に導入する方法はいずれも本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
好ましくは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の遺伝子配列は、細胞にコード配列を発現させることができる調節配列に、作動可能な状態で結合している。用語”作動可能な状態で結合している”は、記載された構成要素が意図した様式で機能できる関係にある傍位置を表わす。コード配列に”作動可能な状態で結合している”ある調節配列は、それらの制御配列に適合する条件下においてコード配列の発現が達成されるようにライゲートしている。
【００４６】
本明細書中で用いる用語”調節配列”には、プロモーターおよびエンハンサーならびに他の発現調節シグナルが含まれる。これらは、それに対する発現ベクターが設計される細胞と適合するように選択できる。哺乳動物プロモーター、たとえばβ−アクチンプロモーターおよびミオシン軽鎖プロモーターを使用できる。しかし、他のプロモーターを適用して同じ効果を達成することができる。これら他のプロモーターは一般に当業者に自明である。哺乳動物プロモーターにはメタロチオネインプロモーターも含まれ、これは重金属、たとえばカドミウムに応答して発現をアップレギュレートでき、したがって誘導性プロモーターである。組織特異的プロモーターも使用できる。ウイルスプロモーター、たとえばモロニー（Moloney）ネズミ白血病ウイルス末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）、プロモーターラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーターまたはアデノウイルスプロモーターも使用できる。これらのプロモーターはすべて当技術分野で容易に入手できる。
【００４７】
そのようなベクターを、コレステロール流出またはＨＤＬ形成を行わせたい適切な細胞にトランスフェクションして、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードするポリペプチドを発現させることができる。
【００４８】
ベクターは、たとえば複製起点、所望によりＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現のためのプロモーター、ならびに所望によりプロモーターの調節配列を備えた、プラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよい。ベクターは、１以上の選択性マーカー遺伝子、たとえば細菌性プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物ベクターについてはネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。ベクターは、in vitroでたとえばＲＮＡの産生のために使用でき、あるいは宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために使用できる。ベクターをin vivoで、たとえば遺伝子療法またはＤＮＡワクチン用に適合させることもできる。
【００４９】
最も好ましくは、ｐｃＤＮＡ３ベクターをＣＹＰ２７の発現に使用する。好ましくは、このベクターはＧ４１８（ゲネチシン（geneticin））耐性遺伝子を含む。
カベオリン−１の発現には、プラスミドｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ／カベオリン−１（Clontech）プラスミドを用いるのが好ましい。
【００５０】
ベクターをトランスフェクションされる細胞は、組換え発現生成物に最適な生物活性を付与するのに必要な翻訳後修飾（たとえばメチル化、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、ラピデーション（lapidation）、およびチロシン、セリンまたはトレオニンのリン酸化）を提供すると予想される。
【００５１】
好ましくは、ＣＹＰ２７の発現抑制を防止するために細胞を脱メチル化剤に暴露することができる。より好ましくは、５−アザシチジンを脱メチル化剤として用いる。ただし、いかなる脱メチル化剤も使用できる。
【００５２】
当業者が利用できるいずれかの手段でベクターを細胞にトランスフェクションすることができる。好ましくは、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション、バイオリスティック（biolistics）、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、またはアデノウイルスもしくはレトロウイルス感染により、ベクターを導入する。ただし本発明はこれらの方法に限定されない。
【００５３】
コレステロール流出またはＨＤＬ形成を促進および増大させるために、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を普通のＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現より高いレベルに増大させることができる。増大の程度は、実際に流出したコレステロールにより測定できる；たとえば、細胞コレステロールまたは特定のコレステロールプールを流出実験の前に標識した場合は標識コレステロールの放出量を測定し、あるいは細胞内および／または培地中のコレステロール量を市販の蛍光定量アッセイにより測定するが、これらに限定されない。
【００５４】
好ましい態様においては、細胞におけるコレステロール流出を増大させる方法であって、
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させる
ことを含む方法が提供される。
【００５５】
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させることによりコレステロール流出を増大させうることが、今回見いだされた。ＣＹＰ２７の場合、コレステロール流出の増大は、酸化形コレステロールではなく、大部分が非酸化形コレステロールの流出増大による。きわめて意外なことに本発明者らは、ＣＹＰ２７の発現および／または活性を増大させても酸化生成物は顕著には増加しないことを見いだした。少量の酸化形コレステロールはごく少量であり、この濃度では有毒ではない。高濃度は一般に有毒であると予想される。ところが、細胞からの非酸化形コレステロールの流出が顕著に増大する。
【００５６】
本発明の他の好ましい態様においては、細胞からのコレステロール流出を増大させる方法であって、
細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションし；
トランスフェクションされたＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を増大させる
ことを含む方法が提供される。
【００５７】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の、発現および／または活性を増大させるための調節は、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１遺伝子を含むコンストラクトのトランスフェクションによりＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を誘導するか、あるいは細胞における前記遺伝子の過剰発現により達成できる。外因性ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１、あるいは外因性ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１を発現するコンストラクトの導入により、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１がコレステロール流出を増大させる能力を調節できる。この設定で、アポリポタンパク質Ａ１、アポリポタンパク質Ｅを発現するプラスミドと共トランスフェクションすることにより、またはこれらのアポリポタンパク質を導入することにより、コレステロール流出をさらに増大させることもできる。
【００５８】
細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１遺伝子を導入するいずれかの手段で、細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をトランスフェクションすることが好ましい。好ましくは、発現ベクターを介して、当業者が利用できる方法または前記方法により、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子を細胞にトランスフェクションする。
【００５９】
好ましくは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１のコンストラクトを細胞に導入またはトランスフェクションしてＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を増大させ、これによりコレステロール流出を増大させる。発現の増大は、コンストラクト中へのプロモーターの誘導を含めた当業者に既知のいずれかの手段で達成できる。テトラサイクリン、ミフェプリストン（mifepristone）またはエクジソン（ecdysone）に応答する調節領域を含むベクターを使用できる。
【００６０】
コンストラクト、およびコンストラクトをトランスフェクションされる細胞は、組換え発現生成物に最適な生物活性を付与するのに必要な翻訳後修飾（たとえばメチル化、ミリストイル化、グリコシル化、トランケーション、ラピデーション、およびチロシン、セリンまたはトレオニンのリン酸化）を提供すると予想される。
【００６１】
ＣＹＰ２７の発現を増大させるために、細胞をさらに脱メチル化剤、たとえば５−アザシチジン（ただしこれに限定されない）で処理することができる。
しかし、遺伝子をアップレギュレートするための間接調節因子をターゲティングする間接法により、発現および／または活性を増大させることもできる。これらの調節因子は遺伝子を発現させるプロモーターに作用してもよく、あるいは前記酵素に影響を及ぼす上流分子または下流分子に作用してもよい。たとえばアドレノドキシンおよびアドレノドキシンレダクターゼをターゲティングすることができる。これらはＣＹＰ２７酵素反応中の電子の流れにとって重要だからである。トランスフェクション試験に際して、３種類のタンパク質をすべて融合させて単一キメラにし、あるいはタンデムな状態でトランスフェクションすると、ＣＹＰ２７遺伝子を単独で付加した場合より大きな酵素活性を生じる可能性がある。このキメラは、遺伝子療法作業に好ましい分子であろう。それは、好ましくは金属、テトラサイクリン、ミフェプリストンまたはエクジソンに応答する調節領域を含むプロモーターをもつベクター中で送達することができる。このキメラは、コレステロール流出を増大させることが示された他のタンパク質、たとえばアポリポタンパク質Ａ１（これに限定されない）を発現するベクターとタンデムな状態で送達することもできる。ＣＹＰ２７発現を増大させるデキサメタゾンにより、内因性遺伝子を調節することができる。プロモーター研究により、ＣＹＰ２７はデキサメタゾンによりアップレギュレートされ、サイクロスポリンＡおよびコール酸によりダウンレギュレートされることが示されている。したがって、デキサメタゾンならびにサイクロスポリンＡおよびコール酸をＣＹＰ２７発現の調節に効果的に使用できる。
【００６２】
カベオリン−１発現は、カベオリン−２との共発現、ＳＲＥＢＰ（ステロール調節エレメント結合タンパク質）またはリン酸化により調節することもできる。これらの調節因子のいずれをターゲティングすることによっても、カベオリン−１の発現を調節できる。
【００６３】
遺伝子発現の調節は、一般に遺伝子のプロモーターと、または遺伝子を調節する核因子のプロモーターと反応する分子を用いて、あるいはスプライシングおよび分解を含めたＲＮＡプロセシングにより、達成できる。リン酸化、またはアロステリック調節、またはプロテアーゼ阻害薬の使用などによる酵素分解の調節により、酵素自体の活性をターゲティングすることもできる。
【００６４】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の増大は、内因性のＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させることができるいずれかの手段で達成でき、これによりコレステロール流出が増大する。
【００６５】
好ましくは、コレステロールを原形質膜カベオラから伝達する機序によりコレステロール流出を増大させる。好ましくは、このコレステロール流出法は、原形質膜のより接近しやすい部位からコレステロールを放出することによって、コレステロールの”即時”流出を誘導する。したがって、本発明の他の態様においては、カベオラからのコレステロール流出を増大させる方法であって、
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させる
ことを含む方法が提供される。
【００６６】
より好ましくは、発現および／または活性の増大は、細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をトランスフェクションすることにより誘導される。したがって、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現が増大して、コレステロール流出が増大する。この設定で、前記のように、アポリポタンパク質Ａ１を発現するプラスミドとの共トランスフェクションにより、またはアポリポタンパク質の導入により、コレステロール流出をさらに増大させることもできる。
【００６７】
あるいは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１のアンタゴニスト、阻害薬、模倣体または誘導体を用いて、細胞における発現および／または活性を低下させるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１調節も達成できる。本明細書中で用いる用語”アンタゴニスト”または”阻害薬”は、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１に結合するとＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の活性を遮断または調節する分子を表わす。アンタゴニストおよび阻害薬には、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１に結合するタンパク質、核酸、炭水化物、抗体、またはリガンドを含めた他のいずれかの分子を含めることができる。ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の活性および／または発現の他の調節物質には、合理的に設計された広範な合成阻害薬が含まれる。
【００６８】
コレステロール流出は細胞増殖の有効な調節であることが示唆されている：流出が少ないほど増殖が大きく、多いほど増殖が小さい。したがってコレステロール流出の低下は、血管形成術後の再狭窄、流出の刺激による増殖阻害のための癌処置、または流出阻害により増殖を刺激することによる再生を含めた用途に有用であろう。
【００６９】
本発明の他の態様においては、コレステロール流出が調節された細胞であって、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性が調節された細胞が提供される。
【００７０】
好ましくは、細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションする。細胞はこのようにして調節することができ、好ましくは発現が増大した場合はコレステロール流出が増大する。アポリポタンパク質Ａ１もしくはアポリポタンパク質Ｅを発現するプラスミドと共トランスフェクションすることにより、またはこれらのアポリポタンパク質を導入することにより、コレステロール流出をさらに増大させることもできる。
【００７１】
細胞は、コレステロールを流出させることができるいかなる細胞であってもよい。好ましくは、細胞は肝細胞、マクロファージ、血管細胞、内皮細胞、平滑筋細胞または幹細胞よりなる群から選択される。好ましくは幹細胞は、肝細胞、マクロファージ、内皮細胞、および他の血管壁細胞ょ含む群から選択されるいずれかの細胞に分化することができる。好ましくは、幹細胞は造血幹細胞である。肝細胞は、大部分の血漿ＨＤＬを産生し、カベオリンの過剰発現に応答する細胞であり、したがって肝細胞におけるコレステロール流出を増大させるためにこれらの細胞にカベオリン−１を導入するのが最も好ましい。
【００７２】
本発明のさらに他の態様においては、患者の細胞からのコレステロール流出を調節することにより患者におけるコレステロール関連状態を処置する方法であって：
細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００７３】
本明細書において用語”処置”は、予防処置またはその状態のそれ以上の進行を阻止することを意図した処置を含めた最も広い意味で用いられる。この観点から、処置には、細胞からのコレステロール流出に影響を及ぼすことにより、コレステロール関連状態のそれ以上の進行を阻止するレベルにＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節することが含まれうる。
【００７４】
本明細書中で用いる用語”コレステロール関連状態”には、心筋梗塞、アテローム硬化症、卒中、低(hypo)アルファリポタンパク血症または末梢血管疾患を含めた、いずれかの血管状態を含めることができる。一般にこれらの状態は、斑内にコレステロールが蓄積することにより管（たとえば血管）腔が狭窄し、その結果しばしば組織の損傷または死として現われる状態になることにより起きる。好ましくは、コレステロール関連状態はアテローム硬化症である。
【００７５】
好ましくは、コレステロール流出を増大させるようにＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性が増大するよう調節する。
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を、１種類の細胞タイプまたは数種類の細胞タイプにおいて、個別にまたは組み合わせて、調節できる。ＣＹＰ２７の発現および／または活性の調節により、好ましくは非酸化形コレステロールのコレステロール流出が調節される。コレステロール流出が調節される有用な細胞タイプは、マクロファージである。カベオリン−１と組み合わせて調節すると、コレステロール流出を増大させることができる。カベオリン−１はＨＤＬ形成に能動的に関与しているので、コレステロール流出とＨＤＬ形成の組合わせによりコレステロールの蓄積を減らしてコレステロール関連状態を処置することができる。好ましくは、肝細胞においてカベオリン−１を調節する。
【００７６】
本発明のさらに好ましい態様においては、患者の細胞のコレステロール流出を調節することにより患者におけるコレステロール関連状態を処置する方法であって：
遺伝子コンストラクトを導入して患者の細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節する
ことを含む方法が提供される。
【００７７】
本発明は、患者においてＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子をコードする遺伝子を調節する遺伝子療法をも含む。遺伝子生成物であるタンパク質を発現させるためのＤＮＡを細胞に伝達または送達する種々の方法（あるいは遺伝子療法と呼ぶ）が、Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo，N.Yang, Crit.Rev.Biotechn. 12(4): 335-356 (1992)に示されており、これを本明細書に援用する。
【００７８】
好ましくは、アポリポタンパク質Ａ１もしくはアポリポタンパク質Ｅを発現するプラスミドと共トランスフェクションすることにより、またはこれらのアポリポタンパク質を導入することにより、コレステロール流出をさらに増大させることもできる。
【００７９】
好ましくは、ＣＹＰ２７およびカベオリン−１を単独で、または組み合わせて調節する。より好ましくは、それらを別個の細胞において組み合わせて調節する。最も好ましくは、それらをマクロファージおよび肝細胞において調節する。
【００８０】
これらの医療問題を遺伝子療法で処置するための方策には、欠陥のある遺伝子またはタンパク質を同定し、次いで機能性遺伝子を付加して欠陥遺伝子の機能を代替するかまたはわずかに機能のある遺伝子を補足する療法；あるいは予防法、たとえばその状態を処置するかまたは処置方式に対して組織もしくは臓器をより感受性にする生成タンパク質の遺伝子を付加する方法が含まれる。予防法の一例として、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子の遺伝子；あるいは細胞をコレステロール流出の調節に対してより感受性にする遺伝子を患者に導入し、これによりアテローム硬化症または関連状態を阻止することができる。
【００８１】
ＣＹＰ２７  ＤＮＡもしくはＣＹＰ２７調節因子配列、および／またはカベオリン−１  ＤＮＡもしくはカベオリン−１調節因子配列を伝達するための多数のプロトコルが本発明において考慮される。ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を調節しうるプロモーター配列又はその他の配列のトランスフェクションも、遺伝子療法の方法として考慮される。この方法の一例は、マサチュセッツ州ケンブリッジ、Transkaryotic Therapies, Inc.において見いだされた、細胞においてエリスロポエチン遺伝子を始動させる”遺伝子スイッチ”を挿入する相同的組換えを用いるものである。Genetic Engineering News, 1994年4月15日を参照。そのような”遺伝子スイッチ”を用いて、細胞においてＣＹＰ２７（またはＣＹＰ２７調節因子）および／またはカベオリン−１（またはカベオリン−１調節因子）を活性化することができる。
【００８２】
遺伝子療法のための遺伝子伝達法は、３つの広いカテゴリーに属する：物理的方法（たとえばエレクトロポレーション、遺伝子の直接伝達、および粒子衝突）、化学的方法（脂質ベースのキャリヤー、または他の非ウイルスベクター）および生物学的方法（ウイルス由来ベクターおよびレセプター取込み）。たとえば、ＤＮＡでコーティングしたリポソームを含めた、非ウイルスベクターを使用できる。そのようなリポソーム／ＤＮＡ複合体を、患者に直接、静脈内注入できる。さらに、ベクター、または遺伝子の”裸の”ＤＮＡを、療法用ＤＮＡをターゲティング送達したい臓器、組織または腫瘍に直接注入することができる。
【００８３】
遺伝子療法を送達部位により記述することもできる。遺伝子を送達するための基本的方法には、ex vivo遺伝子伝達、in vivo遺伝子伝達、およびin vitro遺伝子伝達が含まれる。
【００８４】
遺伝子療法のための化学的方法は、細胞膜を通してＤＮＡを運搬するために脂質ベースの化合物（必ずしもリポソームでなくてもよい）を使用できる。リポフェクチンまたはサイトフェクチンなど、負に荷電したＤＮＡに結合する脂質ベースの陽イオンを用い、細胞膜を通してＤＮＡを細胞内部へ供給することができる。他の化学的方法には、レセプターベースのエンドサイトーシスを含めることができる。これは、特異的リガンドを細胞表面レセプターに結合させ、封入し、そして細胞膜を通して輸送するものである。
【００８５】
多くの遺伝子療法が、細胞に遺伝子を挿入するためにウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクターを用いる。ウイルスベクターをたとえばカテーテルで直接in vivo部位へ送達できるので、特定領域のみをウイルス感染させて、長期の部位特異的遺伝子発現を得ることができる。レトロウイルスベクターを用いるin vivo遺伝子伝達は、哺乳動物組織および肝臓組織においても、変異ウイルスをそれらの臓器に通じる血管に注入することにより立証された。
【００８６】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、他のＲＮＡウイルス、たとえばポリオウイルスもしくはシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア、および他のＤＮＡウイルスを含む群から選択されるが、これらに限定されない。複製欠損ネズミレトロウイルスベクターは最も広く利用されている遺伝子伝達ベクターであり、好ましい。アデノウイルスベクターを抗体に結合させ、この抗体をコラーゲンコーティングしたステントに結合させて送達できる。
【００８７】
機械的なＤＮＡ送達方法を使用でき、これには下記の方法が含まれるが、これらに限定されない：融合誘導性の脂質小胞、たとえばリポソーム、または膜融合のための他の小胞、カチオン脂質を取り込むＤＮＡの脂質粒子、たとえばリポフェクチン、ポリリシン仲介によるＤＮＡ伝達、ＤＮＡの直接注入、たとえば生殖細胞または体細胞へのＤＮＡのマイクロシンジェクション、空気圧により送達されるＤＮＡコーティングした粒子、たとえば”遺伝子銃”に用いる金粒子、無機化学的方法、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、およびポリマーコーティングしたステントに取り込ませたプラスミドＤＮＡ。リガンド仲介による遺伝子療法、すなわちＤＮＡと特異的リガンドを複合体形成させてリガンド−ＤＮＡコンジュゲートを形成し、このＤＮＡを特定の細胞または組織へ指向させる方法も採用できる。
【００８８】
プラスミドのＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれてもよく、組み込まれなくてもよい。トランスフェクションしたＤＮＡが組み込まれない場合、トランスフェクションおよび遺伝子生成物タンパク質発現は、最終分化した非増殖性組織内で、細胞またはミトコンドリアのゲノムにおける変異挿入、欠失または改変の心配なしに、長期間にわたって可能となる。特定の細胞への長期間の（ただし永久的である必要はない）療法遺伝子伝達により、遺伝病の治療または予防処置を行うことができる。遺伝子生成物レベルを維持するためにＤＮＡを定期的に再注入しても、レシピエント細胞のゲノムに変異が起きることはない。外因性ＤＮＡが組み込まれない場合、１細胞内に数種類の異なる外因性ＤＮＡコンストラクトを存在させて、すべてのコンストラクトに多様な遺伝子生成物を発現させることができる。
【００８９】
ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子の遺伝子調節は、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１遺伝子に結合するか、あるいはＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１遺伝子に付随する制御領域に結合するか、あるいは対応するＲＮＡ転写体に結合する化合物を投与して、転写または翻訳の速度を変更することにより達成できる。さらに、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクションした細胞を患者に投与して、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子のin vivo源を供給することができる。たとえばＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子をコードする核酸配列を含むベクターを、細胞にトランスフェクションすることができる。本明細書中で用いる用語”ベクター”は、特定の核酸配列を収容または結合できるキャリヤーであって、特定の核酸配列を細胞へ輸送する機能をもつものを意味する。ベクターの例には、プラスミド、および感染性微生物、たとえばウイルス、または非ウイルスベクター、たとえばリガンド−ＤＮＡコンジュゲート、リポソーム、脂質−ＤＮＡ複合体が含まれる。ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子を含む組換えＤＮＡ分子が作動可能な状態で発現制御配列に結合して、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子を発現しうる発現ベクターを形成することが望ましいであろう。トランスフェクションした細胞は、患者の正常組織、患者の罹患組織に由来するもの、または患者以外の細胞であってもよい。たとえば患者から採取した血液、肝細胞または血管細胞に、本発明のＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子を発現しうるベクターをトランスフェクションし、そして患者に再導入することができる。トランスフェクションした細胞は、患者において調節されたＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を示し、これによりコレステロール流出が調節される。患者はヒトまたはヒト以外の動物であってよい。細胞を、ベクター以外の方法、すなわち当技術分野で既知の物理的方法もしくは化学的方法、たとえばエレクトロポレーション、取込み（incorporation）、または”遺伝子銃”によりトランスフェクションすることもできる。さらに、キャリヤーの補助なしに、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子のＤＮＡを患者に直接注入してもよい。特に、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子のＤＮＡを血液に注入することができる。
【００９０】
ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子を患者にトランスフェクションするための遺伝子療法プロトコルは、ＣＹＰ２７および／またはＣＹＰ２７調節因子および／またはカベオリン−１および／またはカベオリン−１調節因子のＤＮＡを細胞のゲノム、ミニクロモソームに組み込むことによるもの、あるいは細胞の細胞質または核質中で複製する、または複製しない、別個のＤＮＡコンストラクトとしてであってもよい。ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の調節は長期間持続してもよく、あるいは細胞、組織または臓器において目的レベルのＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を維持するために定期的に再注入してもよい。
【００９１】
本発明の更なる好ましい態様においては、患者において該患者のコレステロール流出を調節することによりコレステロール関連状態を処置する方法であって、
調節された細胞を患者に導入し、その際、該細胞はＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性が調節されている
ことを含む方法が提供される。
【００９２】
調節された細胞は既存の細胞と置換することにより細胞の既存のコレステロール流出を調節するためのものであり、あるいは調節された細胞はアテロームのような既存の罹患領域に浸潤させてアテロームの進行を停止させるために使用できる。好ましくは、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させることによりコレステロール流出を増大させる。より好ましくは、細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションすることにより、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させる。その際、遺伝子を過剰発現または始動させて、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現を増大させることができる。
【００９３】
置換された細胞は、コレステロールを流出させることができるいかなる細胞であってもよく、処置される状態について組織特異的であってもよい。好ましくは、細胞は肝細胞、マクロファージ、血管細胞、内皮細胞または幹細胞を含む群から選択されるが、これらに限定されない。好ましくは、幹細胞は肝細胞、マクロファージ、血管細胞または内皮細胞を含む群から選択されるいかなる細胞にも分化できる。好ましくは、幹細胞は造血幹細胞である。幹細胞を用いる場合、細胞にＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションすることが好ましく、これにより、処置を必要とする組織に移植すると幹細胞はその領域の細胞に分化することができる。細胞に導入されたベクターの配列を調節する調節配列は、コレステロール流出レベルに従ってＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現のスイッチを開閉することができる。これらの細胞は、最終的にはコレステロールが蓄積した罹患細胞を置換するであろう。
【００９４】
好ましくは、調節された細胞は単一細胞タイプであって、ＣＹＰ２７およびカベオリン−１が両方とも調節される。より好ましくは、調節された細胞は異なる細胞タイプであって、ＣＹＰ２７またはカベオリン−１の調節を受け入れて細胞からのコレステロール流出を増大させる。好ましくは、マクロファージおよび／または平滑筋細胞が調節されたＣＹＰ２７発現および／または活性を発現する。肝細胞が、調節されたカベオリン−１発現および／または活性を発現することも好ましい。
【００９５】
好ましくは、ターゲティングする細胞はその状態に直接関係するもの、たとえば血管細胞、および血管壁にみられるマクロファージであって、アテローム硬化症などの状態に直接関係するものであるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明のさらに他の態様においては、細胞におけるコレステロール流出を調節する化合物を同定する方法であって：
化合物を細胞と接触させ；
該細胞において、該化合物と接触させていない細胞と対比したＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の変化を検出する
ことを含む方法が提供される。
【００９７】
本発明者らは、細胞におけるコレステロール流出の指標となるターゲットを同定した。コレステロール流出は、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１により調節される。したがって、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１における変化を調節できる化合物は、コレステロール流出に影響を及ぼすことができる。
【００９８】
好ましくは、細胞はコレステロール流出を容易に測定できる細胞である。好ましくは、細胞には肝細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、および他の血管壁細胞が含まれる。ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１をコードする遺伝子をトランスフェクションした細胞も使用できる。導入したＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現をモニターすることにより、その化合物が発現に及ぼす影響を利用して、コレステロール流出に影響を及ぼすことができる化合物を判定できる。好ましくは、細胞はマクロファージまたは肝細胞である。より好ましくは、細胞はカベオリン−１をトランスフェクションした肝細胞である。より好ましくは、細胞はトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞である。
【００９９】
コレステロール流出の測定は、細胞におけるコレステロールなどの化合物の移動を測定できるいずれかの手段で実施できる。放射性標識によるコレステロールの標識などの方法を採用できるが、これらの方法は当業者に自明である。
【０１００】
未知化合物への細胞の接触は、細胞が被験化合物と相互作用し、その影響を受けることができる限り、化合物の特性に応じたいかなる手段によってもよい。たとえば化合物が可溶性である場合、細胞との直接接触による。しかし、不溶性の場合、化合物の懸濁液を使用できる。
【０１０１】
これらの技術は化合物を試験する者に自明であろう。
コレステロール流出を調節できる化合物の同定は、それが細胞におけるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を変化させる作用に依存するであろう。
【０１０２】
好ましくは、コレステロール流出を増大させる化合物を同定するためには、この変化はＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を増大させるものである。あるいは、細胞からのコレステロール流出を低下させるためには、これらの変化がＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を低下させることが好ましい。したがって、ＣＹＰ２７に対する作用に基づいて化合物を選択することができる。
【０１０３】
ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性の変化を検出する方法には、細胞におけるＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡの発現を含めて、ＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の遺伝子発現の測定を含めることができる。細胞におけるこれらのパラメーターの変化の測定法は、当業者に自明である。
【０１０４】
抗体を用いるＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の測定も、試験される未知化合物の存在下でのＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の変化を同定するために使用できる。
【０１０５】
ＣＹＰ２７の活性は、コレステロールを２７ヒドロキシコレステロールおよび３−ベータ−ヒドロキシ−５−コレステン酸に変換するコレステロール酸化の増加または減少により判定できる。
【０１０６】
化合物がＣＹＰ２７および／またはカベオリン−１の発現および／または活性を変化させると同定されると、コレステロール関連状態の処置のための医薬の製造にそれを使用できる。したがって本発明は、コレステロール関連状態を処置するために使用する組成物を得る方法であって、
その状態を処置するのに有効な量の、前記方法により同定された化合物を用意し；そして
該化合物を医薬的に許容できるキャリヤーと混合する
ことを含む方法を提供する。
【０１０７】
医薬的に許容できるキャリヤーは、患者に有毒でなく、かつ混合して医薬を調製できる、当業者に既知のいかなるキャリヤーであってもよい。
本発明に用いられる方法の例をより詳細に記載する。ただし、以下の記載は説明のためのものにすぎず、前記の本発明の一般性を制限するものと解釈すべきでないことを理解すべきである。
【０１０８】
実施例
【実施例１】
【０１０９】
ステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）の発現はコレステロール流出を増大させる
１．方法
ａ）細胞
１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（５０単位／ｍｌ）および０．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で、ＣＨＯＰ−Ｃ４細胞を増殖させた。トランスフェクションの前日、細胞を０．６×１０５個／ウェルの密度で１２ウェルプレートに接種した。ＤＥＡＥ−デキストランを用い、Albiston, A.L., Obeyesekere,V.R., Smith,R.E., and Krozowski,Z.S. (1994) Mol. Cell. Endocrinol. 105,R11-17の記載に従って、ウェル当たり２００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１中のＣＹＰ２７Ａ１、またはｐｃＤＮＡ１のみ）を用いてトランスフェクションを実施した。ＣＹＰ２７Ａ１は、プロゲステロン代謝の研究中に、１１βＨＳＤ２の単離のために記載されたスクリーニングプロトコルを用いてヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから単離された（Albiston,A.L. et al. (1994)）。
【０１１０】
ｂ）コレステロールアクセプター
健康な正常脂肪血のボランティアから、ストレプトキナーゼ（Sigma、最終濃度１５０単位／ｍｌ）を含有する食塩水中に血液を採取し、３０００ｒｐｍ、４０℃で１５分間の反復遠心分離により血漿を単離した。先のMorrison,J.R., Fidge,N.H., and Grego,B. (1990) Anal.Biochem. 186,145-152の記載に従って、アポリポタンパク質Ａ−１を単離した。
【０１１１】
ｃ）コレステロール流出
２方法を用いて細胞コレステロールを標識した。代謝標識法は、細胞を無血清培地中で［１−１４Ｃ］アセテート（Amersham-Pharmacia-Biotech（ＡＰＢ）、比放射能２．０７ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、最終放射能０．４ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、３７℃で２４時間、ＣＯ２インキュベーター内においてインキュベートすることにより実施された。あるいは、血清含有培地中で［1α,2α(n)-３Ｈ］コレステロール（ＡＰＢ、比放射能１．８１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、最終放射能０．２ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、４８時間、ＣＯ２インキュベーター内において細胞をインキュベートした。標識後、細胞をＰＢＳで６回洗浄し、さらに２時間または指示した期間、３７℃で、無脂質アポＡ−Ｉ（最終濃度３０μｇ／ｍｌ）または指示した濃度のヒト血清を含有する無血清培地と共にインキュベートした。次いで培地を採集し、３０，０００ｇ、４０℃で１５分間遠心分離して細胞屑を除去し、上清を計数し、または後続の分析に用いた。細胞を細胞掻取り器により収穫し、０．５ｍｌの蒸留水に分注し、アリコートを計数し、または後続の分析に用いた。コレステロール流出を、細胞から培地中へ移動した標識コレステロールの％として表わした。
【０１１２】
ｄ）脂質分析
脂質を３体積の酢酸エチルで抽出し、ＴＬＣにより分離した（クロロホルム／酢酸エチル  ４：１  ｖ／ｖ）（Penning,T.M., Burczynski,M.E., Jez,J.M., Hung,C.F., Lin, H.K., Ma,H., Moore,M.,Palackal,N., and Ratnam,K. (2000) Biochem.J. 351,67-77）。標識脂質を含むＴＬＣプレートをホスホイマージャー（phosphoimager）プレートに暴露し、Bioimager BAS-1000（Fuji）で分析し、各スポットの放射能を定量した。標準物質（Research Plus、米国）により同定したコレステロールおよび２７−ヒドロキシコレステロールのスポットを掻き取り、計数した。
【０１１３】
ｅ）ノーザンブロット法
ＲＮＡを１．２％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移し、３２Ｐ−標識マウスＡＢＣＡ１  ｃＤＮＡ（Chambenoit,O., Hamon,Y., Marguet,D., Rigneault,H., Rosseneu, M., and Chimini,G. (2001) J.Biol.Chem. 276,9955-9960）（Dr. G.Chiminiの寄贈）および内標準としての３２Ｐ−標識ＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡでプローブした。膜をホスホイマージャープレートに暴露し、Bioimager BAS-1000（Fuji）で分析した。
【０１１４】
ｆ）統計分析
スチューデントのｔ−検定を用いて、グループ間の統計的な有意差を判定した。
【０１１５】
２．結果
細胞を［１４Ｃ］アセテートで代謝標識した場合、ＣＨＯＰ細胞に２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７１）をトランスフェクションすると２７−ヒドロキシコレステロールを産生した。トランスフェクションした細胞中にある新たに合成された２７−ヒドロキシコレステロールの量はトランスフェクションしなかった細胞の５倍であったが、それはトランスフェクションした細胞中にある新たに合成されたコレステロールの量の１％にすぎなかった（図１）。トランスフェクションした細胞を血漿に２時間暴露すると、新たに合成された２７−ヒドロキシコレステロールのうち８０％（図１）、および新たに合成されたコレステロールのうち４５％（図示されていない）が血漿中へ放出された。したがって、血漿中へ放出されたステロールの全量に対して２７−ヒドロキシコレステロールが占めるのは１．５％であった。したがって、２７−ヒドロキシコレステロールはコレステロールより速やかに細胞から放出されたが、全ステロール流出に対して占めるのはわずかであった。細胞コレステロールプールを［３Ｈ］コレステロールで標識した場合、トランスフェクションした細胞またはトランスフェクションしなかった細胞のいずれにおいても、２７−ヒドロキシコレステロールの形成は検出されなかった（図示されていない）。ＣＹＰ２７によるトランスフェクションがコレステロール流出に及ぼす影響を調べるために、細胞コレステロールを［３Ｈ］コレステロールで標識し、細胞を全ヒト血漿または無脂質ヒトアポＡ−Ｉの存在下または不存在下でインキュベートした。細胞にＣＹＰ２７をトランスフェクションすると、トランスフェクションしなかった細胞および偽トランスフェクションした細胞の両方と比較して、全血漿へのコレステロール流出が３倍増大し、アポＡ−Ｉへの流出は倍増した（図２）。アクセプターを含まない培地へのコレステロール流出は、トランスフェクションにより影響されなかった。培地へ放出された脂質を分析すると、２７−ヒドロキシコレステロールはみられず、放出されたすべての放射能がコレステロール画分を占めていた（図示されていない）。ヒト血漿へのコレステロール流出の時間経過を図３Ａに示す。動態は、Gaus,K., Gooding,J.J., Dean,R.T., Kritharides,L., and Jessup,W. (2001) Biochemistry 40,9363-9373により報告されるように、”速い”相と”遅い”相からなる。細胞にＣＹＰ２７をトランスフェクションすると、流出の”速い”相が有意に刺激され、”遅い”相の刺激はわずかであった。流出の用量依存性を図３Ｂに示す。低い血漿濃度では、トランスフェクションした細胞から相対的に多量のコレステロールが放出され、血漿濃度が上昇するとトランスフェクションした細胞とトランスフェクションしなかった細胞の差は次第に消失した。２７−ヒドロキシコレステロールは、ＡＢＣＡ１を含む脂質代謝に関与する遺伝子の数を調節するＬＸＲレセプターのリガンドである（Fu,X., Menke,J.G., Chen,Y., Zhou,G., MacNaul,K.L., Wright,S.D., Sparrow,C.P., and Lund, E.G. (2001) J.Biol.Chem. 276, 38378-38387）。２７−ヒドロキシコレステロールの形成によりＡＢＣＡ１の発現が変化したかを調べるために、トランスフェクションした細胞とトランスフェクションしなかった細胞におけるＡＢＣＡ１の発現を評価した。マウスＡＢＣＡ１  ｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロット上に、ＡＢＣＡ１が単一バンドとして同定された（図示されていない）。トランスフェクションした細胞と偽トランスフェクションした細胞の間で、ＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの量にはほとんど差がなかった。ＧＡＰＨ  ｍＲＮＡに対するＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの比は、トランスフェクションした細胞および偽トランスフェクションした細胞について、それぞれ０．８４および１．３６であった。細胞中に存在するＡＢＣＡ１タンパク質の量を評価するために、細胞溶解物を用いてウェスタンブロット法を実施した。ＡＢＣＡ１タンパク質の量に有意差はみられなかった。
【０１１６】
主要な所見は、細胞にステロール２７−ヒドロキシラーゼをトランスフェクションするとコレステロール流出が刺激されることである。コレステロール流出の刺激は２つの機序により説明できる。この仮説に限定されるわけではないが、第１に、原形質膜中にヒドロキシコレステロールが出現すると膜の特性が変化してコレステロールおよび／または２７−ヒドロキシコレステロールの放出が促進される可能性がある。第２に、２７−ヒドロキシコレステロールは、コレステロール恒常性に関与する遺伝子（特にＡＢＣＡ１）の数を調節するＬＸＲレセプターのリガンドであるので（Fu,X. et al. (2001)）、２７−ヒドロキシコレステロールはこれらの遺伝子に対する影響によりコレステロール流出を増大させる可能性がある。これらの所見のうち幾つかは、第１機序の可能性を指摘する。第１に、トランスフェクションした細胞におけるＡＢＣＡ１の誘導はなかった。第２に、トランスフェクションの影響は無脂質アポＡ−Ｉより全血漿について、より顕著であった。流出の増大がＡＢＣＡ１発現の刺激により生じたのであれば、逆が予想されるであろう。さらに、トランスフェクションは主に”速い”相の流出、すなわち既に原形質膜中に存在していたコレステロール（Gaus,K. et al. (2001)）の放出を刺激した。これにより、細胞内コレステロールの移動のために必要な経路が関与する可能性はなくなる。細胞にＣＹＰ２７をトランスフェクションすると、２７−ヒドロキシコレステロールはステロールを代謝標識した場合には産生されたが、コレステロールプールを［３Ｈ］コレステロールで標識した場合には産生されなかった。これは、外因性コレステロールがミトコンドリア酵素に到達できないためであろう（Cali,J.J., and Russell,D.W. (1991) J.Biol.Chem., 266, 7774 - 7778）。代謝標識の場合ですら、新たに合成された２７−ヒドロキシコレステロールの割合は低く、流出増大は主に（全部ではないとしても）非酸化形コレステロール流出の刺激によることが認められた。
【実施例２】
【０１１７】
肝細胞におけるカベオリン−１の発現はコレステロール流出を増大させる
（ａ）細胞
ＨｅｐＧ２細胞をＤＭＥＭ中、１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミン中で培養した。細胞を１×１０６個／ウェルの密度で６ウェル組織培養プレートに接種し、細胞が６０〜８０％周密状態になるまで２４時間培養した。
【０１１８】
安定なトランスフェクション体を得るために、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ試薬（Invitrogen）を用い、無血清培地中、３７℃で５時間、製造業者の推奨に従ってＨｅｐＧ２細胞にｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ／カベオリン−１（Clontech）プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション培地を除去し、新鮮な完全増殖培地を添加した。トランスフェクションの２４時間後、１ウェルの細胞を９ｃｍの培養皿内で５００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を含有する培地中に分散し、Ｇ−４１８耐性コロニーが明瞭に見えるまで３〜４日間培養した。各コロニーを２４ウェルプレート中へ採取し、Ｇ−４１８選択培地と共にインキュベーションを続けた。各コロニーをカベオリン発現について評価し、独立したモノクローン系をすべての実験に用いた。
【０１１９】
（ｂ）電子顕微鏡検査
細胞を樹脂埋込み処理し、電子顕微鏡検査用の切片にした。
【０１２０】
（ｃ）共焦点顕微鏡検査
細胞を、無菌プラスチックカバーガラス上で約６０％周密状態になるまで増殖させた。細胞をアセトン中で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、抗カベオリン−１抗体（Transduction Laboratories、ケンタッキー州）と共に１時間インキュベートした。次いで細胞を再洗浄し、暗所で１時間、テキサス・レッド（Texas Red）標識抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。スライドガラスに固定した後、細胞をZeiss ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡により観察した。
【０１２１】
（ｄ）コレステロールアクセプター
健康な正常脂肪血（血漿総コレステロール値３．４〜５．０ｍｍｏｌ／Ｌ）のボランティアから、ストレプトキナーゼ（Sigma、最終濃度１５０単位／ｍｌ）を含有する食塩水中に血液を採取し、１５００ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により血漿を単離した。血漿試料をプールせず、個別に使用した。Morrison,J.R., Fidge,N.H., and Grego,B. (1990) Anal.Biochem. 186,145-152の記載に従って、アポリポタンパク質Ａ−Ｉを単離した。
【０１２２】
（ｅ）コレステロールおよびリン脂質の流出
ＨｅｐＧ２またはＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞を実験前に８０％周密状態になるまで増殖させた。培養物はコレステロールアクセプターと共にインキュベートするまでに１００％周密状態となった。細胞コレステロールを標識するために、血清含有培地中で［1α,2α(n)-３Ｈ］コレステロール（Amersham-Pharmacia-Biotech（ＡＰＢ）、比放射能１．８１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、最終放射能０．２ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、４８時間、ＣＯ２インキュベーター内において培養物をインキュベートした。細胞リン脂質を標識するために、［メチル-３Ｈ］コリン（ＡＰＢ、比放射能３．１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、最終放射能３７ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、２４時間、ＣＯ２インキュベーター内において細胞をインキュベートした。標識後、細胞をＰＢＳで６回洗浄し、さらに１８時間、無血清培地中でインキュベートした。細胞コレステロールの代謝標識のために、細胞を無血清Leibovitz  Ｌ−１５培地中で［３Ｈ］アセテート（ＩＣＮ、比放射能９５．２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ、最終放射能７．４ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、１５℃で３時間インキュベートした。細胞を洗浄し、３７℃で２時間、無脂質アポＡ−Ｉ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）またはシクロデキストリン（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）または指示した濃度のヒト血清を含有する無血清培地中で、さらにインキュベートした。次いで培地を採集し、３０，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離して細胞屑を除去し、上清を計数し、または後続の分析に用いた。細胞を細胞掻取り器により収穫し、０．５ｍｌの蒸留水に分注し、アリコートを計数し、または後続の分析に用いた。Sviridov,D., and Fidge,N. (1995) J.Lipid Res. 36,1887-1896およびSviridov,D., Pyle,L., and Fidge,N. (1996) J.Biol.Chem., 271,33277-33283の記載に従って、リン脂質および代謝標識コレステロールを細胞のアリコートおよび培地からＴＬＣにより単離した。コレステロールおよびリン脂質の流出を、細胞から培地中へ移動した標識コレステロールまたはリン脂質の％として表わした。
【０１２３】
（ｆ）コレステロール転送（trafficking）
総細胞コレステロールプールを標識するために、血清含有培地中で［３Ｈ］コレステロール（最終放射能０．２ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、３７℃で４８時間、ＣＯ２インキュベーター内において細胞をインキュベートした。洗浄後、細胞を無血清培地中、３７℃で１８時間、ＣＯ２インキュベーター内においてさらにインキュベートした。細胞を氷冷し、［１４Ｃ］アセテート（ＩＣＮ、最終放射能７．４ＭＢｑ／ｍｌ）を添加し、細胞をLeibovitz  Ｌ−１５培地中、１５℃で３時間、さらにインキュベートした。これらの条件下では、細胞内コレステロール転送は遮断され、一方コレステロール生合成は進行する（Kaplan,M.R., and Simoni,R.D. (1985) J.Cell Biol. 101,446-453およびUrbani,L., and Simoni,R.D. (1990) J.Biol.Chem. 265,1919-1923に記載）。インキュベーションが終了した時点で細胞を速やかに加温し、３７℃で２０分間インキュベートして、新たに合成されたコレステロールの一部を原形質膜へ移動させた。細胞を氷冷し、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。コレステロールオキシダーゼ（Roche）を最終濃度１単位／ｍｌで細胞に添加し、フラスコを４℃で３時間インキュベートした。これらの条件下では、原形質膜のコレステロールに富むドメイン中のコレステロールのみが酸化されてコレステノンが形成され、反応が完了するまで実施される。細胞から脂質を抽出し、ＴＬＣにより分析した。各実験には”非酸化”および”非加温”対照が含まれた。酸化性コレステロールの量を、試料中の総−非酸化形［３Ｈ］コレステロール（総コレステロールプール）のうちの画分としての［１４Ｃ］または［３Ｈ］オキシステロール量として計算し、こうして脂質分析中の損失に対して補正した。”非酸化”対照（”酸化形”試料の１０％）を実験値から差し引いた。
【０１２４】
（ｇ）コレステロールの生合成およびエステル化
コレステロールの生合成を評価するために、無血清培地中で［３Ｈ］アセテート（最終放射能７．４ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、３７℃で２０分間、ＣＯ２インキュベーター内において細胞をインキュベートした。コレステロールのエステル化を評価するために、ＢＳＡ（Sigma、本質的に無脂肪酸）に複合体形成した［１４Ｃ］オレイン酸（ＡＰＢ、比放射能２．２２ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；最終放射能０．１８５ＭＢｑ／ｍｌ）と共に、３７℃で２時間、細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、脂質を抽出し、ＴＬＣにより分析した（Sviridov,D., and Fidge,N. (1995) J.Lipid Res. 36,1887-1896に記載）。コレステロールおよびオレイン酸コレステリルのスポットを標準物質（Sigma）により同定し、掻き取り、β線計数器で計数した。
【０１２５】
（ｈ）逆転写ＰＣＲ
ＣＨＯＰ細胞から、チオシアン酸グアニジニウム法の変法により全ＲＮＡを抽出した。２６０ｎｍにおける吸光を測定することにより、ＲＮＡ濃度を測定した。２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ＵのＲＮＡｓｅ阻害薬および５０ＵのSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）を含有する２０μｌ中で、逆転写を実施した。ＰＣＲは、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭ（ＧＡＰＤＨ）または５ｍＭ（ＣＹＰ２７Ａ１）のＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰＳ、１００ｎｇ適宜なフォワードおよびリバースプライマー（カベオリン５’プライマー：ＧＡＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＧＴＴＣ；カベオリン３’プライマー：ＡＣＴＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴ）、２μｌの逆転写ｃＤＮＡ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen）を含有する全体積５０μｌ中で実施された。反応物をＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer）で３５サイクル増幅させた。増幅プロフィールは、９４℃で１５秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を伴うものであった。１０μｌの各ＰＣＲ反応物を２μｌの６倍濃縮した装填用緩衝液と混合し、臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルに装填した。一定の電圧で１時間、電気泳動を実施した。ＰＣＲにより増幅したフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１２６】
ＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞中のＡＢＣＡ１  ｍＲＮＡの量を、Su et al.,(31)に従ってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量した。プライマーは下記のものであった：フォワード：５’  ＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＡＧＣ  ３’；リバース：５’  ＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＣＴ  ３’；プローブ：５’  ＡＣＴＣＣ  ＡＣＡＴＡ  ＧＡＡＧＡ  ＣＴＡＣＴ  ３’。１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部対照として用い、結果を△Ｃｔ（ＡＢＣＡ１  ＲＮＡと１８Ｓ  ＲＮＡについてのＣｔ値間の差）として表わした。
【０１２７】
（ｉ）ウェスタンブロット法
細胞をＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、７．５％（ＡＢＣＡ１）または１０％（カベオリン）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、続いてウサギ抗ＡＢＣＡ１血清（ＡＢＣＡ１組換えフラグメント（1311-1450）に対して産生されたもの）、または抗カベオリン−１抗体（Transduction Laboratories）を用いて、イムノブロット法を実施した。化学発光によりバンドを可視化し、濃度測定により定量した。
【０１２８】
結果
（ａ）カベオリン−１によるＨｅｐＧ２細胞の安定トランスフェクション
トランスフェクションしなかったＨｅｐＧ２細胞には、カベオリン−１  ｍＲＮＡの発現またはカベオリンの存在が検出されなかった（図４、Ａ、Ｂ、列４）。カベオリン−１で安定トランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞系（ＨｅｐＧ２／ｃａｖ）が形成されると、カベオリンｍＲＮＡに対応する強いシグナルがＲＴ−ＰＣＲにより検出された（図４Ａ、列３）。カベオリンの発現を、特異的抗カベオリン抗体を用いるウェスタンブロットによっても分析した。内皮細胞由来のカベオリンと同一位置に移動する単一バンドがＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞に検出された（図４Ｂ、列１〜３）。トランスフェクションに用いたプラスミドは、トランスフェクション効率を評価しうるＧＦＰを含有していた。最終クローニングの後、９０％の細胞がＧＦＰを発現していた。
【０１２９】
カベオリン−１をトランスフェクションした細胞を、電子顕微鏡検査によっても調べた。典型的なカベオラの形態をもつ約６５ｎｍのサイズの表面結合したピットがトランスフェクションした細胞にはみられたが、対照細胞にはみられなかった（図５Ａ）。しかし、カベオラの量は少なく、平均して細胞プロフィール当たり１個未満のカベオラプロフィールであった。細胞を同様に抗カベオリン抗体で処理し、共焦点顕微鏡検査により調べた。ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞は抗カベオリン抗体で染色され（図５Ｂ）、これに対し対照ＨｅｐＧ２細胞は染色を示さなかった。ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞には２パターンの染色がみられた。約半数の細胞がそれらの原形質膜に多量のカベオリンを含有し、細胞質はバックグラウンド染色にすぎなかった。残り半数では、プライニュークリアスペース（preinuclear space）と原形質膜の間にカベオリンが分布していた。これは、カベオリンが原形質膜カベオラおよび脂質体中に存在するのと一致する。
【０１３０】
（ｂ）コレステロール流出
カベオリンの発現がコレステロール流出に及ぼす影響を評価するために、細胞コレステロールを［３Ｈ］コレステロールで標識し、細胞をヒト血漿、無脂質アポＡ−Ｉ、シクロデキストリンおよび培地のみと共にインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞と比較してＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞からの流出は、アクセプターとしてそれぞれ５％血漿、２％血漿または５０μｇ／ｍｌのアポＡ−Ｉを用いた場合、８０％、２８０％および４５％高かった（すべてについてｐ＜０．０１）（図６Ａ）。２細胞タイプから非特異的コレステロールアクセプターであるシクロデキストリン（２００μｇ／ｍｌ）へのコレステロール流出に差はなかった。細胞コレステロールを［３Ｈ］アセテートで代謝標識した場合、ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞から５％血漿への流出はＨｅｐＧ２細胞からの流出より２０％高かった（ｐ＜０．０１）（図６Ｂ）。
【０１３１】
リン脂質の流出を分析するために、それらを［３Ｈ］コリンで代謝標識し、細胞を無脂質アポＡ−Ｉ（５０μｇ／ｍｌ）と共に２時間インキュベートした。ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞からのリン脂質流出はＨｅｐＧ２細胞と比較して５０％高かった（ｐ＜０．０５）（図７）。
【０１３２】
（ｃ）細胞内コレステロール転送
細胞を［３Ｈ］コレステロールで標識して、標識コレステロールを全細胞プール間で平衡化した。次いで、細胞表面のコレステロールに富むドメイン（ラフト（raft）およびカベオラ）のみが酸化される条件において、細胞をコレステロールオキシダーゼで処理した。ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞のコレステロールに富むドメイン中のコレステロールの相対量は、ＨｅｐＧ２細胞と比較して４０％高かった（ｐ＜０．０２）（図８Ａ）。コレステロール転送速度を評価するために、細胞を［１４Ｃ］アセテートと共に１５℃で３時間インキュベートした。次いで細胞を３７℃に２０分間加温して、新たに合成されたコレステロールを原形質膜へ移動させた後、細胞をコレステロールオキシダーゼで処理した。新たに合成されて原形質膜のコレステロールに富むドメインへ移動した［１４Ｃ］コレステロールの量は、ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞においてはＨｅｐＧ２細胞と比較して６７％高かった（ｐ＜０．０２）（図８Ｂ）。
【０１３３】
（ｄ）コレステロールの生合成およびエステル化
ＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞におけるコレステロール生合成およびコレステロールエステル化を、細胞コレステロール含量の変化の間接的な尺度として評価した。ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞におけるコレステロール中への［３Ｈ］アセテートの取込み速度は、ＨｅｐＧ２細胞での速度のほとんど２倍であった（ｐ＜０．００１）（図９Ａ）。これに対し、ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞におけるコレステリルエステル中への［１４Ｃ］オレイン酸の取込み速度は、ＨｅｐＧ２細胞と比較して４０％遅かった（ｐ＜０．００１）（図９Ｂ）。
【０１３４】
（ｅ）細胞増殖
細胞のコレステロール含量は細胞の増殖と密接に関連し、コレステロール流出が増大すると細胞増殖が阻害される。同一密度で接種したＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞培養物において増殖速度を分析すると、ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞の方が速度は有意に遅かった。４日間の培養後、培養が周密状態に近づいた時点で、ＨｅｐＧ２／ｃａｖ培養物にはＨｅｐＧ２培養物より５１％少ない細胞がみられた（ｐ＜０．００１）（図１０）。
【０１３５】
（ｆ）アポＡ−Ｉの分泌
肝細胞系であるＨｅｐＧ２細胞は、細胞からのコレステロールの放出に関与すると思われるＶＬＤＬおよびアポＡ−Ｉを産生し、分泌する。本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞が実質量のアポＡ−Ｉを産生し、産生されたアポＡ−Ｉの大部分は培地へ分泌されることを見いだした（表１）。しかし、両方の細胞タイプが２時間のインキュベーション中に分泌するアポＡ−Ｉの量は、添加した外因性アポＡ−Ｉの量の約１０％であった（表１）。興味深いことに、ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞が合成して分泌するアポＡ−Ｉの量は、トランスフェクションしていない細胞による量より３倍多かった（表１）。したがって、観察されたコレステロール流出刺激は細胞が分泌するアポＡ−Ｉに関係するものではない。
【０１３６】
表１：  ＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞によるアポＡ−Ｉの合成および分泌
２時間のインキュベーション後の細胞および培地中のアポＡ−Ｉの量を競合ＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１３７】
【表１】
2006513150.tif 000003
【０１３８】
バックグラウンド流出（すなわち外因性アクセプターの不存在下での流出）は１０％未満であり、２つの細胞タイプについて類似していた。これにより、分泌されるＶＬＤＬおよびアポＡ−Ｉと共に放出されるコレステロールが観察されたコレステロール流出の差に有意に寄与するという可能性は考慮されなかった。
【０１３９】
（ｇ）ＡＢＣＡ１の発現
Orsoらにより、ＡＢＣＡ１の変異がカベオリン−１の発現およびプロセシングに影響を及ぼすことが証明された。カベオリンとＡＢＣＡ１の発現間の関連の可能性を考慮して、本発明者らはカベオリンによる安定トランスフェクションがＡＢＣＡ１発現に及ぼす影響を調べた。しかし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した場合、２つの細胞タイプ間のＡＢＣＡ１量に差はみられず、ＡＢＣＡ１タンパク質の量にも差はなかった。
【０１４０】
したがってこの試験から、ヒト肝細胞由来の細胞系であるＨｅｐＧ２細胞にカベオリン−１を安定トランスフェクションするとコレステロール流出が増大することが示される。
【実施例３】
【０１４１】
ステロール２７−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２７Ａ１）の発現はマクロファージにおけるコレステロール流出を増大させる
マクロファージを培養し、実施例１のＣＨＯＰ細胞の場合と同様にトランスフェクションし、ただしトランスフェクション後、さらにインキュベートする際に０．５μＭの５−アザシチジンを含有させた。マクロファージを高い効率でトランスフェクションするのは常に困難な作業であった。トランスフェクションされた細胞は２０％を超えなかった。ところが、大部分の細胞においてメチル化によりＣＭＶプロモーターが速やかに非作動性になることが見いだされた。したがって、脱メチル化剤５−アザシチジンを細胞に添加すると、細胞はＣＹＰ２７を発現した。図１１のパネルＡおよびＢは実際にトランスフェクションした細胞であるが、５−アザシチジンで処理しなかったものである。
【０１４２】
文献、研究、材料、装置、報文などについての考察は本発明を説明するために本明細書中に含めたものにすぎない。これらのいずれかまたはすべてが先行技術の一部をなすこと、あるいは本発明の技術分野で本出願の特許請求の範囲の各項目の優先権日付以前に一般的な知識であったことは示唆または提示されていない。
【０１４３】
最後に、本明細書に記載した本発明の精神から逸脱することなく他の修正および／または変更をなしうることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ＣＹＰ２７をトランスフェクションした細胞における２７−ヒドロキシコレステロールの合成を示す。ＣＨＯＰ細胞に４８時間、ＣＹＰ２７Ａ１をトランスフェクションし、またはｐｃＤＮＡ１を偽トランスフェクションした。トランスフェクション後、［１−１４Ｃ］アセテートを含有する無血清培地中で細胞を２４時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、５％ヒト血漿で２時間インキュベートした。両細胞からのステロールおよび培地を抽出し、ＴＬＣで分離し、計数した。
【図２】ヒト血漿および無脂質アポリポタンパク質Ａ−Ｉへのコレステロール流出を示す。ＣＹＰ２７トランスフェクションした、偽トランスフェクションした、およびトランスフェクションしなかったＣＨＯＰ細胞を、［３Ｈ］コレステロールで標識した。次いで、ヒト血漿（最終濃度５％）、ヒト無脂質ａｐｏＡ−Ｉ（最終濃度３０μｇ／ｍｌ）または無血清培地のみと共に、３７℃で２時間、ＣＯ２−インキュベーター内において細胞をインキュベートした。培地を採集し、細胞を洗浄し、細胞内および培地中の放射能をβ線計数器で測定した。コレステロール流出を、細胞から培地へ移動した標識コレステロールの％（すなわち培地中の放射能／培地中の放射能＋細胞内の放射能）として表わす。４回測定値の平均±ＳＤを示す。＊は偽トランスフェクション細胞および非トランスフェクション細胞に対比してｐ＜０．００１。
【図３】ヒト血漿へのコレステロール流出の時間経過（Ａ）および用量応答（Ｂ）を示す。ＣＹＰ２７トランスフェクションまたは偽トランスフェクションしたＣＨＯＰ細胞を［３Ｈ］コレステロールで標識した。次いで、最終濃度５％（Ａ）または指示した濃度（Ｂ）で添加したヒト血漿、または無血清培地のみと共に、指示した期間（Ａ）または２時間（Ｂ）、３７℃でＣＯ２−インキュベーター内において細胞をインキュベートした。次いで培地を採集し、細胞を洗浄し、細胞内および培地中の放射能をβ線計数器で測定した。コレステロール流出を、細胞から培地へ移動した標識コレステロールの％（すなわち培地中の放射能／培地中の放射能＋細胞内の放射能）として表わす。バックグラウンド値（すなわち培地のみへの流出）を差し引いた。３回測定値の平均±ＳＤを示す。
【図４】ＨｅｐＧ２およびＧｅｐＧ２／ｃａｖ細胞におけるカベオリン−１  ｍＲＮＡ（Ａ）およびタンパク質（Ｂ）の発現を示す。（Ａ）カベオリン−１  ｍＲＮＡの発現を、前記に従ってＲＴ−ＰＣＲにより分析した。アンプリコンの予想サイズは３９４塩基対（３９４ｂｐ）である。（Ｂ）抗カベオリン−１抗体を用いた、トランスフェクション細胞および非トランスフェクション細胞のウェスタンブロット。列１−内皮細胞；列２および３−異なる量のＧｅｐＧ２／ｃａｖ細胞；列４−ＨｅｐＧ２細胞。
【図５】トランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞のカベオラの超微細構造分析（Ａ）およびトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞の共焦点顕微鏡による分析を示す。（Ａ）−細胞をエポン（epon）に包埋処理し、基層に平行に切片を切り取った。トランスフェクション細胞には、カベオラに特徴的な、被覆されていないフラスコ形ピットまたは小胞プロフィールが顕著である（矢じり；矢印で示した、より大形のクラスリン被覆されたピットと対称的である）。バー、１００ｎｍ。（Ｂ）−細胞をアセトン中で２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、抗カベオリン−１抗体と共に１時間インキュベートし、洗浄し、暗所で１時間、テキサス・レッド（Texas Red）標識抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。
【図６】ヒト血漿および無脂質アポリポタンパク質Ａ−Ｉへのコレステロール流出を示す。トランスフェクション細胞および非トランスフェクション細胞を、前記に従って［３Ｈ］コレステロール（Ａ）または［３Ｈ］アセテート（Ｂ）で標識した。次いで、指示した濃度のヒト血漿、またはヒト無脂質ａｐｏＡ−Ｉ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）またはシクロデキストリン（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）または無血清培地のみと共に、３７℃で２時間、ＣＯ２−インキュベーター内において細胞をインキュベートした。（Ａ）−培地を採集し、細胞を洗浄し、細胞内および培地中の放射能を液体シンチレーション分光法により測定した。（Ｂ）−前記に従ってＴＬＣによりコレステロールを細胞および培地から単離した。コレステロール流出を、細胞から培地へ移動した標識コレステロールの％（すなわち培地中の放射能／培地中の放射能＋細胞内の放射能）として表わす。４回測定値の平均±ＳＤを示す（＊は非トランスフェクション細胞に対比してｐ＜０．００１）。
【図７】無脂質アポリポタンパク質Ａ−Ｉへのリン脂質流出を示す。トランスフェクション細胞および非トランスフェクション細胞を、前記に従って［３Ｈ］コリンで標識した。次いで、ヒト無脂質apoA-I（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で２時間、ＣＯ２−インキュベーター内において細胞をインキュベートした。前記に従ってリン脂質を細胞および培地からＴＬＣにより単離した。リン脂質流出を、細胞から培地へ移動した標識リン脂質の％（すなわち培地中の放射能／培地中の放射能＋細胞内の放射能）として表わす。４回測定値の平均±ＳＤを示す（＊は非トランスフェクション細胞に対比してｐ＜０．０５）。
【図８】コレステロールに富むドメインにおけるコレステロール量（Ａ）および小胞体からコレステロールに富むドメインへのコレステロール輸送速度の評価を示す。血清含有培地中で［３Ｈ］コレステロールと共に３７℃で４８時間、ＣＯ２−インキュベーター内において細胞をインキュベートすることにより、総細胞コレステロールプールを標識した。洗浄後、無血清培地中、３７℃で１８時間、ＣＯ２−インキュベーター内において細胞をさらにインキュベートした。細胞を氷冷し、［１４Ｃ］アセテートを添加し、１５℃で３時間、細胞をさらにインキュベートした。インキュベーション終了後、細胞を速やかに加温し、３７℃で２０分間インキュベートして、新たに合成されたコレステロールの一部を原形質膜へ移動させた。細胞を氷冷し、氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。コレステロールオキシダーゼ（Roche）を最終濃度１単位／ｍｌで細胞に添加し、フラスコを４℃で３時間インキュベートした。脂質を細胞から抽出し、”材料および方法”中の記載に従ってＴＬＣにより分析した。酸化性コレステロールの量を、試料中の非酸化形［３Ｈ］コレステロール全体（総コレステロールプール）のうちの画分としての［１４Ｃ］または［３Ｈ］オキシステロールの量として計算した。
【図９】トランスフェクション細胞および非トランスフェクション細胞におけるコレステロールの生合成（Ａ）およびエステル化（Ｂ）を示す。無血清培地中で、［３Ｈ］アセテートと共に２０分間（Ａ）または［１４Ｃ］オレイン酸と共に（Ｂ）２時間、３７℃でＣＯ２−インキュベーター内において細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、脂質を抽出し、前記に従ってＴＬＣにより分析した。
【図１０】トランスフェクション細胞または非トランスフェクション細胞の増殖速度を示す。細胞を同密度で６ウェルプレートに接種し、細胞数を毎日計数した。黒丸−ＨｅｐＧ２細胞、白丸−ＨｅｐＧ２／ｃａｖ細胞。
【図１１】ＣＹＰ２７によるＲＡＷマウスマクロファージ細胞系のトランスフェクションを示す。Ｄ中の赤色はミトコンドリアマーカー色素、Ｃ中の緑色はＣＹＰ２７である。Ａ、Ｂは発現の乏しい細胞、Ｃ、Ｄは発現の良好な細胞、ＥはＣとＤの重なり、すなわちＣＹＰ２７がミトコンドリア内にあることを示す。
【図１２】トランスフェクション細胞および偽トランスフェクション細胞から血漿およびａｐｏＡ−Ｉへのコレステロール流出を示す。
【図１】
2006513150.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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