(57)【要約】本発明はデキストラン硫酸及びゼラチンの共沈殿により例示される硫酸化多糖及び線維状タンパク質の共沈殿を含む組織工学並びにバイオテクノロジーにおいてインプラントを含む臨床的応用に有用な凝集性生体高分子ゲルに関するものである。本発明による凝集性生体高分子ゲルはそれ自身で又は細胞含むインプラントの足場として、生物活性薬物の持続放出のためのデポとして臨床的に、又は研究及びバイオテクノロジーのために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの線維状タンパク質と、少なくとも一つの硫酸化多糖との共沈殿物を含む、生体適合凝集性生体高分子ゲル(A biocompatible cohesive biopolymer gel)。
【請求項２】
前記共沈殿物が、外来性架橋結合剤は存在せず揮発性有機溶剤の存在下に形成される、請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項３】
前記共沈殿が、中性pHの少なくとも2 pH単位上又は下のpHにおいて形成される、請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項４】
前記共沈殿が、pH 2.0及びpH 5.0 の間の酸性pHで形成される、請求項3に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項５】
前記共沈殿が、pH 9.0及びpH 12.0 の間の塩基性pHで形成される、請求項3に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項６】
前記タンパク質が、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルブミン及びゼラチンからなる群から選択される、請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項７】
前記タンパク質が、ゼラチンである請求項6に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項８】
前記硫酸化多糖が、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、藻類の硫酸化ポリグリカン、又は合成硫酸化多糖からなる群から選択される、請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項９】
前記硫酸化多糖がデキストラン硫酸である、請求項8に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１０】
前記デキストラン硫酸が、約4,000ダルトンから約500,000ダルトンの範囲の分子量を持つ、請求項9に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１１】
前記デキストラン硫酸が、約300,000ダルトンから約500,000ダルトンの範囲の分子量を有する高分子量重合体である、請求項10に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１２】
前記デキストラン硫酸が、約5,000ダルトンから約10,000ダルトンの範囲の分子量を有する低分子量重合体である、請求項10に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１３】
前記凝集性生体高分子が、ゼラチン及びデキストラン硫酸を含む請求項1〜12のいずれか一つに記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１４】
30％から70％のデキストラン硫酸を含む請求項13に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１５】
30％から70％のゼラチンを含む請求項13に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１６】
抗凝固剤、接着分子、増殖因子、酵素、抗酸化剤、抗線維化物質、陽性荷電分子、陽性荷電アミノ酸に富むペプチド、及び栄養素をさらに含む、請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１７】
形成した共沈殿に後から架橋結合剤を加えることにより形成される架橋をさらに含む請求項2に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項１８】
前記架橋結合剤が、単糖、第XIII因子、リシルオキシダーゼ、カルボジイミド、及び酸化剤から選択される請求項17に記載の共沈殿。
【請求項１９】
前記架橋結合剤が、リボース、グルコース、マンノース及びキシロースからなる群から選択される単糖である、請求項18に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２０】
ホルモン、増殖因子、タンパク分解酵素、抗繊維化剤、凝固剤、細胞外マトリックス成分、抗酸化剤、天然又は合成重合体からなる群から選択された生物活性化合物をさらに含む請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２１】
前記共沈殿が、線維、シート、スポンジ、織物又はチューブに成型される請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２２】
前記共沈殿が、線維、シート、スポンジ、織物又はチューブに成型される請求項13に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２３】
前記共沈殿が、神経細胞を包むための足場に成型される請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２４】
前記ゲルが、神経細胞を包むための足場に成型される請求項13に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２５】
神経細胞を包む足場の中にヒアルロン酸-ラミニンゲルをさらに含む請求項23〜24のいずれか一つに記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２６】
細胞含有インプラントとして使用するために足場の中に成型される請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲル。
【請求項２７】
請求項1に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲルを含むインプラント。
【請求項２８】
請求項13に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲルを含むインプラント。
【請求項２９】
線維状タンパク質の溶液を準備し；
硫酸化多糖の溶液を準備し；
適当なpHにおいて外来性の架橋結合剤を存在させずに二つの溶液を混合して凝集性ゲルの共沈殿を形成させ；
揮発性有機溶剤で凝集性ゲルを沈殿させる
ヒト又は動物におけるインプラントとして適する生体適合凝集性生体高分子ゲルの調製方法。
【請求項３０】
前記線維状タンパク質がゼラチンである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記硫酸化多糖がデキストラン硫酸である、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
前記デキストラン硫酸が、約4,000ダルトンから約500,000ダルトンの範囲の分子量を持つ、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記デキストラン硫酸が、約300,000ダルトンから約500,000ダルトンの範囲の分子量を有する高分子量重合体である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記デキストラン硫酸が、約5,000ダルトンから約10,000ダルトンの範囲の分子量を有する低分子量重合体である、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
前記凝集性ゲルの共沈殿を形成するpHが、中性pHの少なくとも2 pH単位上か又は下である、請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
前記pHがpH 2.0及び5.0の間の酸性pHである請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記pHがpH 9.0及びpH 12.0の間の塩基性pHである請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記揮発性有機溶剤がアルコールである、請求項29に記載の方法。
【請求項３９】
マトリックスを成型することをさらに含む請求項29〜38のいずれか一つに記載の生体適合マトリックスの調製方法。
【請求項４０】
前記生体高分子の中に生物活性物質を取り込むことをさらに含む、請求項29〜39のいずれか一つに記載の方法。
【請求項４１】
請求項29に記載の方法を即座に行うためのキットであって、
生体適合凝集性生体高分子ゲルを形成する共沈殿を得るために必要な各成分の溶液の少なくとも1回量を含むキット。
【請求項４２】
請求項1又は請求項13に記載の生体適合凝集性生体高分子ゲルの中に生物活性物質を含む生物活性物質の持続放出のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デキストラン硫酸及びゼラチンの共沈殿により例示される硫酸化多糖及び線維状タンパク質の共沈殿物を含む組成物に関し、この組成物は、組織工学用のインプラントを含む臨床応用のための広範囲のバイオマトリックス又は足場として並びにバイオテクノロジーにおいて有用な独特の物理化学的特性を持つ凝集性生体高分子を形成する。本発明によるマトリックスは、それ自体で又は細胞を包含するインプラントの足場として臨床的に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
誘導組織再生のために有用なマトリックス及び/又は組織培養又は組織インプラントに有用な生体適合表面としてのマトリックスは当業者によく知られている。従ってこれ等のマトリックスは、インビトロ又はインビボにおける細胞増殖のための基体として考えることができる。組織増殖及び/又は再生及び/又はインプラントに適するマトリックスは、生物分解性のもの及び生物安定性のもののいずれも含む。組織の増殖又は再生を支持することが要求される有用なマトリックスとして役立つことができる多くの候補には、種々の密度及び種々の形態及び形状に作製された、ゲル、泡、シート、及び多孔性粒子構造が含まれる。
【０００３】
多くの例においてマトリックスは、ポリペプチド又はタンパク質、並びにプロテオグリカン、硫酸化ポリグリカンなどを含む種々の多糖体を含む、生体高分子で有利に構成することができる。さらにこれ等の生体高分子は、その物理化学的性質が変わるように選択又は操作することができる。例えば、生体高分子は、酵素的に、化学的に又はその他の手段のいずれかにより架橋結合させることができ、これにより剛性又は分解の受け易さの程度を大きくも小さくもすることができる。
【０００４】
組織工学又は培養に有用であることが示されている種々の天然高分子の中で、フィブロネクチン、種々のタイプのコラーゲン、及びラミニン、並びにケラチン、フィブリン及びフィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸などを含む細胞外マトリックスの種々の成分を列挙することができる。
【０００５】
米国特許5,955,438及び4,971,954は、組織再生に有用な、糖により架橋結合したコラーゲンベースのマトリックスを開示している。
【０００６】
米国特許5,948,429は、細胞外マトリックス微粒子を含む泡状生体高分子の製法及び使用法を開示している。
【０００７】
米国特許6,083,383及び5,411,885は、フィブリン又はフィブリノーゲン糊及びその使用法を開示している。米国特許5,279,825及び5,173,295は、傷害を受けた神経の再生の促進方法及びフィブリンを含む粘着性医薬製剤を開示している。米国特許4,642,120は、軟骨及び骨の欠陥の修復を促進するためのフィブリン又はフィブリノーゲン糊の使用を開示している。
【０００８】
米国特許6,124,265及び6,110,487は、ケラチンベースフィルム及びシートの製造方法及び架橋方法並びに多孔度ケラチン足場の製法及びその製品を開示している。
【０００９】
ヒアルロン酸（HA）は、天然に存在するグリコサミノグリカンファミリーに属する高分子量の線状高分子であり、グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミンの繰り返し単位により構成されている。HAは、インビボで空間充填物質として寄与する水和ゲルを容易に形成する。ヒアルロン酸及び増殖因子を用いた骨成長の促進方法を開示している米国特許5,942,499に例示されるように、組織増殖を支持するために有益な成分としてのヒアルロン酸の有用性は当業者に十分に認められている。米国特許5,128,326及び5,783,691は、組織修復を促進するための、及び薬物又は増殖因子を含む生物活性物質の貯蔵剤としての架橋結合ヒアルロナンの製造方法及び使用方法を開示している。
【００１０】
ラミニン（LN）は高分子量の接着性糖タンパク質であり、主要な細胞マトリックス結合成分として知られている。米国特許4,829,000及び5,158,874はラミニンを含むゲル又はマトリックスの使用を例示している。
【００１１】
国際特許 92/21354は、繊維化、瘢痕形成及び術後癒着を抑制する生体適合アニオン性高分子を開示している。この発明に使用されるアニオン性高分子は、天然のプロテオグリカンを含むがこれに限定されず、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン（GAG）部分も含んでいる。アニオン性高分子であるデキストラン硫酸及びペントサンポリ硫酸が好ましく、より好ましい態様によると、硫黄含量が重量で約10％より多い、分子量40,000から500,000ダルトンのデキストラン硫酸が使用される。
【００１２】
米国特許5,861,382及び米国特許6,020,323はカルボキシル化又は硫酸化されたオリゴ糖を実質的に純粋な形で含む物質及び宿主におけるサイトカイン活性の調節にそれを使用する方法を開示している。
【００１３】
本発明者の中の一人は以前に、生細胞、組織及び合成インプラントを維持する定常的な潅流系を持つ装置を開示した（国際特許01/02030）。この開示はさらに、HA, プロテオグリカン、GAG.コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン及びデキストラン硫酸の１つと架橋結合した天然由来の結合組織又は骨格組織を含む、種々の細胞及び組織外植体の増殖支持基盤として使用される足場に関係している。
【００１４】
細胞外マトリックスの高分子間の架橋結合は天然にも生じる（Laurent, 1964; Wang and Bozos, 1985）。インビトロにおいてヘパリンはアミロイドのような天然に存在する哺乳動物タンパク質（Cohlbery et al., 2002）又はS-100（Robinson et al., 2002）と相互作用することが報告されている。
【００１５】
多糖及び線維状タンパク質のある特殊な組み合わせは、細胞増殖を促進するために使用されている。例えば、非硫酸化多糖体であるキトサンは、インビトロにおける軟骨細胞の増殖及び分化を支持する足場としてゼラチンと組み合わされている（Risbud M. et al. 2001）;血管細胞はインビトロ及びインビボにおいてキトサン及びデキストラン硫酸に応答する（Chupa et al., 2000）;そして耳の弾性軟骨の軟骨細胞は、コラーゲンとポリマンヌロン酸からなる非硫酸化多糖体であるアルギン酸とのヒドロゲル中で増殖することが示されている（de-Chalain et al., 1999）。
【００１６】
米国特許4,280,954は、コラーゲンとムコ多糖を接触させ、次いで生じた高分子を共有結合により架橋結合することにより形成される合成物質を開示している。米国特許4,448,718は、架橋結合がガス状アルデヒドにより行われることを開示し、米国特許4,350,629はさらに、コラーゲン原線維がグリコサミノグリカンと接触する前に架橋結合剤と接触した場合には、生成した物質は血栓形成能が極めて低いことを開示している。
【００１７】
米国特許5,866,165及び5,972,385は、マトリックスの調製方法であって、多糖体を酸化剤と反応させて多糖の糖リングを開いてアルデヒド基を形成し、そして生成したアルデヒド基を反応させてコラーゲンと共有結合を形成することを含む方法、並びに骨、軟骨又は軟組織のような組織の増殖を支持するための当該マトリックスの使用法を開示している。米国特許6,309,670は、骨の腫瘍を治療するためにさらに分化因子を含む当該マトリックスの使用を開示している。
【００１８】
米国特許6,624,245は、それぞれ反応性がある高分子成分の混合により調製される組成物であって、当該混合によって急速に架橋結合そしてゲル形成が開始される組成物を開示する。そのような組成物は、組織への急速な接着及びゲル形成が望まれる用途に使用するのに適しており、そのような用途には、生体接着剤として、組織を増大するため、手術の癒着を防ぐため、合成インプラントの表面をコーティングするためなどにおけるその組成物の使用が含まれる。
【００１９】
デキストラン硫酸は単独で、抗菌剤として（Christensen et al., 2001）そして腹膜癌転移の予防薬（Hagiwara et al., 2001）として作用することが認められている。それはタンパク質の制泡剤としても使用された（Ibanoglu et al., 2001）。
【００２０】
背景技術のどこにも、一般的には硫酸化多糖、特にはデキストラン硫酸と共沈殿した線維状タンパク質を含む生体高分子が新規な物理化学的性質を持つことを教示し又は示唆するものはない。さらに、それ自体で移植に適するインプラントとして又は細胞を包含するインプラントとしてこの足場マトリックスを使用することはこれまでに開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
発明の要約
本発明の目的は、生体適合性であり、組織修復にとってふさわしい環境を付与する凝集性生体高分子ゲルを提供することである。本発明のその他の目的は、インビトロ又はインビボにおいて便利に使用することができる多数の細胞を包含するインプラントに適する万能の生体高分子の足場を提供することである。本発明のもう一つの目的は、組織再生を促進する独特の性質に基づき臨床適用に有用な足場又はゲルを提供することである。
【００２２】
凝集性生体高分子は、ゲル、鞘、カフ、スポンジ、膜の形態又はその他の組織修復のための足場として有用な形状に造ることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明のこのような又はその他の目的は、少なくとも一つの硫酸化多糖及び少なくとも一つの線維状タンパク質の共沈殿物を含む凝集性生体高分子ゲルにより達成され、その共沈殿物は外来性の架橋結合剤は存在せずに揮発性有機溶剤の存在下に形成される。驚くべきことに、線維状タンパク質とポリアニオン性多糖の共沈殿物は、インビボで使用するために非常に有利な性質を持つゲルを提供する。一部の態様によると、ポリアニオン性硫酸化多糖は、当業者に既知の、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、並びに藻類のポリグリカン硫酸、又は合成硫酸化多糖からなる群から選択される。一部の態様によると、線維状タンパク質はコラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルブミン及びゼラチンからなる群から選択される。
【００２４】
ここに例示される最近のより好ましい一態様によると、デキストラン硫酸はゼラチンと共沈殿される。
【００２５】
ヒトのコラーゲンから得たゼラチンを使用することは可能であるが、ヒト資源から得られるコラーゲンの使用に関する安全性の考慮のために、ヒト由来でない原料がより好ましい。他の哺乳動物種も使用することができるが、ある態様によると本発明の共沈殿物を形成するためにブタ又はウシゼラチンが使用される。
【００２６】
本発明の原理に従っていずれのタイプのデキストラン硫酸を使用することができ、使用するデキストラン硫酸の分子量にしたがって異なる生体高分子の性質が得られる。本発明の一態様によると、デキストラン硫酸は約4,000ダルトンから約500,000ダルトンの分子量を有する。
【００２７】
一部の態様によると、高分子量のデキストラン硫酸が好ましく、特に300,000ダルトンを超える分子量のデキストラン硫酸が好ましく、400,000ダルトンを超える分子量のデキストラン硫酸がより好ましく、約500,000ダルトンのデキストラン硫酸が最も好ましい。
【００２８】
その他の態様によると、低分子量のデキストラン硫酸が好ましく、特に10,000ダルトン未満の分子量のデキストラン硫酸が好ましく、8,000ダルトン未満の分子量のデキストラン硫酸がより好ましく、約5,000ダルトンのデキストラン硫酸が最も好ましい。
【００２９】
本発明の凝集性生体高分子ゲルの性質は、デキストラン硫酸とゼラチンが共沈殿する条件、特に共沈殿する際のpHによる。一態様によると共沈殿は中性pHの少なくとも2 pH単位上又は下のpHにおいて形成される。
【００３０】
一部の態様によると、高分子量デキストラン硫酸（すなわち、300,000ダルトンを超える）は、酸性pH条件下にゼラチンと共沈殿する。好ましい一態様によると、酸性pH条件は約2.0から約5.0の範囲、より好ましくは約2.0から約4.0の範囲のpH を含む。
【００３１】
その他の態様によると、低分子量デキストラン硫酸（すなわち、10,000ダルトン未満のデキストラン硫酸）は、塩基性pH条件下にゼラチンと共沈殿する。好ましい一態様によると、塩基性pH条件は、約8.0から約12.0の範囲、好ましくは約9.0から約12.0、最も好ましくは約9.0から約11.0の範囲のpHである。
【００３２】
酸性及び塩基性pH条件は、線維状タンパク質及び硫酸化多糖の共沈殿を可能にする。共沈殿はさらに、揮発性、好ましくは毒性のない有機溶剤の存在において促進される。一態様によれば揮発性溶剤はアルコールである。
【００３３】
一態様によると、本発明は、
線維状タンパク質の溶液を準備し；
硫酸化多糖の溶液を準備し；
外部から架橋結合剤を加えずに適当なpHにおいて二つの溶液を混合して凝集性生体高分子の共沈殿物を形成し；
揮発性有機溶剤により凝集性生体高分子を沈殿させる
ことを含む、本発明の生体適合凝集性生体高分子ゲルを調製する方法を提供する。
【００３４】
好ましい態様によると、共沈殿物はいずれかの望む形に形成若しくは成型することが出来る。ある態様によるとゲルを乾燥し、使用するまで保存することができる。この態様においてゲルは使用前に適当な液で再加水される。
【００３５】
所望の性質、例えば、引張り強さ、表面電荷、密度、多孔度、破れずに縫合に耐える能力などを持つ凝集性生体高分子共沈殿物を提供するために、分離した層として又は本発明の新規な生体高分子の中に散在又は分散させて、任意の成分を加えることができる。
【００３６】
本発明の凝集性生体高分子共沈殿物を生じる硫酸化多糖及び線維状タンパク質の間の相互作用は、共有結合的、非共有結合的、又は静電的なものであってよいことは理解されるべきである。架橋結合共重合体は製品に一層の改良を付与する。本発明の任意の特徴によると、硫酸化多糖線維状タンパク質共沈殿物の性質を変える又は安定化するためには、架橋結合剤を使用することが有利であると思われる。架橋結合剤は当業者には既知であり、ペントース又はヘキソースを含む単純な糖：グルタルアルデヒドを含むアルデヒド：又は適当ならば合成架橋結合物質を含むことができる。現在の好ましい一態様に従うと、架橋結合剤はリボースである。
【００３７】
本発明の最初の態様に従って、われわれはゼラチン及びデキストラン硫酸から作られ、そして独特の優れた性質を有する革新的物質を開示する。この新規付着性生体高分子は、限定はしないが、管及びシート、及びその他の望まれる形状又は形態を含む種々の形の品物を造ることを可能にする。成型された品物を直ちに使用しない場合は、保存のためにそれらを脱水し、そして後に使用する前に再加水すればよい。
【発明の効果】
【００３８】
ここに例示するように、本発明に従って開示する新規の共沈殿物は、末梢神経再生の支持体又はガイドとして、脊髄をコーティング又は包むための鞘として、組織の障害を修復するためのパッチとして、気管の損傷を修復する膜として、血管又は気管のステントの外被としてのような用途を含めて多数の臨床的応用に適している。
【００３９】
この発明の新規生体高分子は医療装置の製造に有用であり、これらの装置の形状又は形態はその特別に意図された使用に依存する。これ等の装置の製造方法は意図された使用に応じて極めてまちまちであろう。
【００４０】
これ等の生体高分子は線維として使用するのに適しており、その線維は乾燥押し出し、ゲル押し出し、溶融押し出し、溶液押し出し又は紡績押し出し、電磁場を伴う又は伴わないナノ原線維のスプレーのような通常の方法又はこれ等の方法の組合せにより製造することができる。この線維は次いで乾燥しそして糸巻きに巻き取ることができる。繊維産業の工業的応用から知られている方法によりこの線維は複雑な形又は構造に織り、編み、束ね又は紐に組むことができる。
【００４１】
本発明による生体高分子マトリックスの種々の水性または有機性溶媒における溶解性の程度は、選択したタンパク質と相互作用するために使用される特定の硫酸化多糖、及び共沈殿条件に依存する。一部の態様によると、本発明の生体高分子は分解して水性溶媒に溶解する代謝分解性の物質となる。
【００４２】
本発明の生体高分子は、異なる成分、性質が有機または無機で高分子性又は他の性質の成分と押し出すまたは共押し出しするのに適しており、これには、多成分、多層型の線維並びに中空繊維および管が含まれる。
【００４３】
本発明の現在のより好ましい一態様によると、デキストラン硫酸はゼラチンにより共沈殿される。これは生体適合性、調節可能な生物分解速度、培養細胞に対する親和性、及び細胞増殖促進といったその生物学的性質に加えて、予期しない優れた化学的及び物理的性質を凝集性生体高分子ゲルに与える。新規凝集性生体高分子は組み合わせる前の原料物質の性質と異なる、MRI分析、赤外スペクトル、ゲル分離カラムからの溶出及び当業者既知の他の分析機器により評価することができるような物理化学的性質を有する。
【００４４】
本発明の最初の態様によると、これ等の生体高分子はそれ自体が誘導組織再生または組織工学のための生体適合性インプラントとして有用である。本発明のその他の態様においてこれ等の生体高分子は、それが傷害の部位に移植されるかまたは組織損傷を改善するために細胞を有するインプラントを含む場合に有用である。本発明のその他の態様によると凝集性生体高分子ゲルはさらに組織修復または再生を促進するための追加の生物活性分子を含む。
【００４５】
臨床応用においてインビボでこの凝集性生体高分子を使用する方法が開示された。それによって本発明による凝集性生体高分子ゲルは、それ自体でまたは細胞を包含するインプラントの足場として、単独でまたは追加の成分の層と共に、臨床的に使用することができる。本発明による凝集性生体高分子は、インビトロ並びにインビボにおける細胞選別、細胞増殖、細胞拡大及び分化を支持するために適した基体として有利に使用することができる。
【００４６】
本発明による凝集性生体高分子は、約30％から約70％（w/w）の範囲のデキストラン硫酸及び約30％から70％（w/w）の範囲のゼラチンを含む。この範囲の構成成分は、柔軟性及び弾力性に関して望ましい特徴を持つ足場を提供する。典型的には、本発明の生体高分子は、ほぼ等量のデキストラン硫酸及びゼラチンを相互作用させてうまく形成することができる。一態様によると本発明の生体高分子は、70％のゼラチンと30％のデキストラン硫酸を相互作用させて形成される。
【００４７】
本発明は、デキストラン硫酸及びゼラチンを含む生体高分子にさらに活性成分を追加することもできる。このような追加成分としては、これに限定されないが、フィブリン、アルブミン、コラーゲン、エラスチン及びリゾチームのような他のタンパク質；種々の多糖、プロテオグリカン及びヒアルロン酸の一つ；第XIII因子、リシルオキシダーゼのような架橋結合剤；抗凝固薬；増殖因子；抗酸化剤などを含む。この追加の添加物は望ましい薬物動態プロフィールが付与されるように組み入めばよい。インビボにおいて生物活性成分の持続的放出のためにデキストラン硫酸-ゼラチン生体高分子ゲルを使用する方法を提供することは本発明の範囲内にある。他の例ではそこに取り込まれた生物活性分子の短時間の最適局所濃度を提供するように添加物を取り込むことができる。
【００４８】
凝集性生体高分子ゲルの物理化学的パラメーターは、足場の意図する使用に従って容易に最適化することができ、そしてその方法は当業者に最適化の際のガイダンスを提供するために開示される。
【００４９】
本発明は説明、図及び以下の請求項において更に詳細に説明される。
【００５０】
好ましい態様の詳細な説明
硫酸化多糖-タンパク質共沈殿物
本発明は、新規な高分子物質を含む生体適合足場ゲルを提供する。本発明の生体高分子は、独特の化学的及び機械的性質並びに細胞増殖を可能にする性質を有し、それゆえに細胞とともに又は細胞なしで、インプラントとして使用するのに適している。
【００５１】
他の生体適合高分子と結合しているタンパク質から作られる種々のゲル又はマトリックスは、組織工学の領域において非常に有望であることが示されている。今度、本発明により、少なくとも一つの線維状タンパク質及び少なくとも一つの硫酸化多糖を含む新規な共沈殿物が開示される。これ等の新規共沈殿物は、外来性の架橋結合剤の非存在下で揮発性有機溶媒の存在下に得られる。そのように得られた共沈殿物は、次いで個別の適用のために必要に応じて望ましい形状のいずれか又は幾何学的に成型される。それらは最初の共沈殿が形成された後に追加の架橋結合剤により架橋することができる。種々の態様により、その形成の前又はその使用の前に種々の添加物をゲルに有利に加えることができる。
【００５２】
代表的一態様によれば、本発明の共沈殿はゼラチン及びデキストラン硫酸を含む。ゼラチン-デキストラン硫酸（G-D）共沈殿は、誘導組織再生のために並びに種々の臨床応用又は他の分野における細胞担体として有用である。
【００５３】
本発明の凝集性生体高分子ゲルを構成する高分子は、一般的結合組織のマトリックスの二つの主な構成成分、すなわちコラーゲン及びグリコサミノグリカンを模倣して選択された。本発明の凝集性生体高分子ゲルは、硫酸化多糖及びゼラチン又は他の繊維性タンパク質の共沈殿物を含む。一態様によると硫酸化多糖は、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、並びに藻類のポリグリカン硫酸、又は当業者に知られているような合成硫酸化多糖を含む。現在好ましい一態様によると、本発明の生体高分子ゲルを形成する際に、ゼラチンがコラーゲンを模倣するために使用され、デキストラン硫酸がグリコサミノグリカンを模倣するために使用される。用語「ゲル」は本明細で通常の意味で使用され、かなりの量の水を吸収して弾力のあるゲルを形成することができる水-膨潤性高分子マトリックスを言う。ゲルは乾燥ゲルを得るために水和(hydrate)されてもよい。水性環境に置かれると、乾燥ゲルはゲル形成高分子の間の相互作用の程度により許容される程度まで膨潤する。
【００５４】
デキストランはグルコースの重合体であり、デキストラン硫酸は繰り返し単位として硫酸化グルコースからなる多糖である。グルコース1分子当り3個までの硫酸基を持ち、約17％〜20％の硫黄を含有する。デキストラン硫酸の分子量は4,000から500,000 kDの範囲にある。本明細書で使用される用語「分子量」は当業者により一般的に使用されているように、いずれかの所与検体中の多数の分子の平均的分子重量の重量のことである。従って、デキストラン硫酸5,000 kDの検体は重量で、例えば、4,500から5,500 kDの範囲の重合体の統計的混合物を、範囲内の別の分子とは若干異なっている一つの分子と共に含有することがあるかもしれない。デキストラン硫酸の分子量の変動は、その生物学的活性の相違と関連している。
【００５５】
本発明のゼラチン-硫酸化多糖生体高分子を製造する際に種々の分子量の硫酸化多糖を使用すること及び異なる共沈殿条件を適用することにより異なる性質を持つゲルを生じる。
【００５６】
本発明によるGDマトリックスの製造に際して高分子量のデキストラン硫酸を使用することにより容易に生物分解しうるマトリックッスを生じる。低分子量のデキストラン硫酸を使用することによりインビトロ及びインビボにおける生体高分子ゲルの保持時間を延長し、増加した強度及び弾力性のある生体高分子を生じる。
【００５７】
本発明の一態様によれば、デキストラン硫酸は約4,000ダルトンから約500,000ダルトンの分子量を有する。別の態様によれば、本発明のGD生体高分子は300,000ダルトンを超える分子量を有する高分子量デキストラン硫酸、好ましくは400,000ダルトンを超える分子量を有する高分子量デキストラン硫酸、最も好ましくは約500,000ダルトンの分子量を有するデキストラン硫酸から製造される。
【００５８】
その他の態様によれば、本発明のGD生体高分子は、10,000ダルトン未満の分子量を持つ低分子量のデキストラン硫酸、好ましくは8,000未満の分子量を持つ低分子量のデキストラン硫酸、最も好ましくは約5,000ダルトンの分子量を持つデキストラン硫酸から製造される。
【００５９】
本発明によると、そのような資源としては、市販から入手できるデキストラン硫酸、合成的に調製されたデキストラン硫酸、又は天然資源から単離されたデキストラン硫酸を含む。デキストラン硫酸はいずれの資源からのものでも使用することができ、一態様によると、本発明に従って使用されるデキストラン硫酸は細菌由来であり、これは最もよくグリコサミノグリカンを模倣している。
【００６０】
ゼラチンは高い平均分子量の水溶性タンパク質の不均一な混合物である。ゼラチンは天然には発見されず、加水分解作用によりコラーゲンから誘導される。ゼラチンは皮膚、腱、靭帯、骨などを水と煮沸することにより得られる。ゼラチンのおおよそのアミノ酸含量は：グリシン〜25.5％、アラニン8.7％、バリン2.5％、ロイシン3.2％、イソロイシン1.4％、シスチン及びシステイン0.1％、メチオニン1.0％、フェニルアラニン2.2％、トレオニン1.9％、チロシン0.5％、アスパラギン酸6.6％、グルタミン酸11.4％、アルギニン8.1％、リシン4.1％、及びヒスチジン0.8％である。個々の酸の分子の中に水が取り込まれているので合計は100％を超える。
【００６１】
本発明によれば、ヒトコラーゲンから得られるゼラチンを使用することは可能であるが、ヒト資源から得られるコラーゲンの使用に関する安全性の考慮により、非ヒト由来の原料がより好ましい。一態様により、ゼラチンはヒト以外の哺乳動物種のものである。現在好ましい一態様により使用されるゼラチンは、ブタ又はウシのゼラチンである。
【００６２】
デキストラン硫酸及びゼラチンの共沈殿は、一般的に、管理された状態、すなわち、ゼラチンに対するデキストラン硫酸の特定の比率、一定の分子量のデキストラン硫酸、特定のpH条件及び一定のインキュベーション時間を使用して行われ、これにより二つの重合体の間の相互作用の程度を調節する。共沈殿は、外来性の架橋結合剤は存在せずそして揮発性有機溶剤の存在下に形成される。生成した本発明のGD凝集性生体高分子は、約30％から約70％（w/w）の範囲のデキストラン硫酸及び約30％から約70％（w/w）の範囲のゼラチンを含む。成分のこの範囲は、柔軟性、弾力性および生物分解性に関して望ましい性質を持つ足場を提供する。一態様によれば、本発明の生体高分子はほぼ同量のデキストラン硫酸及びゼラチンを共沈殿することにより形成される。その他の態様によれば、本発明の生体高分子は70％ゼラチンと30％デキストラン硫酸とを相互作用させることにより形成される。本発明の共沈殿生体高分子を生じるデキストラン硫酸及びゼラチンの間の相互作用は、共有結合的、非共有結合的又は静電的でありうる。
【００６３】
本発明の凝集性生体高分子ゲルの性質は、デキストラン硫酸及びゼラチンの共沈殿が行われる条件、特に相互作用媒体のpH範囲に依存する。
【００６４】
一態様によれば、共沈殿は天然(natural)pHよりも少なくとも2 pH単位上か又は下のpHにおいて行われる。一態様によれば、ゼラチン及び高分子量のデキストラン硫酸の共沈殿は酸性のpH条件下に行われる。現在好ましい一態様によれば、ゼラチンと300,000ダルトンを超える分子量を有するデキストラン硫酸の共沈殿は約2.0から約5.0、好ましくは約2.0から約4.0の範囲のpHにおいて行われる。
【００６５】
その他の態様によれば、ゼラチン及び低分子量のデキストラン硫酸の共沈殿は塩基性のpH条件下に行われる。一態様によれば、ゼラチン及び10,000ダルトン未満の分子量を有するデキストラン硫酸の共沈殿は、約8.0から約12.0、好ましくは約9.0から約12.0、最も好ましくは約9.0から約11.0の範囲のpHにおいて行われる。
【００６６】
本発明の新規凝集性生体高分子ゲルは、酸性か又は塩基性の極端なpH条件下の水性溶液でゼラチン及びデキストラン硫酸を共沈殿することにより得られる。この自然に生じる共沈殿をさらに促進するために、揮発性有機溶剤をこの溶液に加えることができる。一態様によれば、この揮発性有機溶剤は、アルコール、特にエタノールである。生じた共沈殿は溶液から取り出され次いで最初に成型されるか又は直接脱水される。このマトリックスは室温又は高温で乾燥することができる。脱水操作の間に有機溶剤は揮発する；こうして生成したゲルの生物利用性を妨げる可能性のある化学試薬は最終製品中には存在しない。一態様によれば、揮発性有機溶剤は非毒性であり、好ましくはアルコール類である。脱水されたマトリックスは保存が容易でありそして使用に先立って再加水しなければならない。
【００６７】
一態様により、本発明は、
線維状タンパク質の溶液を準備し；
硫酸化多糖の溶液を準備し：
適当なpHにおいて外来性架橋結合剤を存在させずに二つの溶液を合わせて凝集性生体高分子の共沈殿を形成し；
揮発性有機溶剤により凝集性生体高分子を沈殿させる
本発明の生体適合凝集性生体高分子ゲルを調製する方法を提供する。
【００６８】
他の望ましい性質、例えば、引張り強さ、表面電荷、密度、多孔度、破れずに縫合に耐える能力などを持つ共沈殿マトリックスを提供するために、分離した層としての又は本発明の新規な生体高分子の中に散在若しくは分散させる、任意の成分を加えることができる。
【００６９】
一態様によれば、本発明のゼラチン-デキストラン硫酸マトリックスは、限定はしないが、ペントース又はヘキソースを含む単純な糖、グルタルアルデヒド、ジビニルスルホン、エポキシド、カルボジイミド、及びイミダゾールを含む多数の通常の化学的な架橋結合剤のいずれかによりさらに架橋してGD高分子の性質を変更又は安定化することができる。必要な化学的架橋結合剤の濃度は使用される特定の薬物及び求める架橋結合の程度に依存する。架橋重合体は再現性の増加並びにインビトロ及びインビボにおける保持時間の増大及び強度の増加を含む他の改良を製品に与えることができる。現在好ましい一態様によれば、架橋結合剤はリボースである。
【００７０】
本発明の新規凝集性生体高分子は、結合する前の原料の性質とは異なる物理化学的性質を有する。下記に例示されるように、ゲルろ過クロマトグラフィー、核磁気共鳴スペクトル（NMR）及び赤外スペクトルによるGD生体高分子の分析により、本発明によるGD共沈殿凝集性生体高分子は単独のゼラチン又はデキストラン硫酸とは明らかに区別されることが示される。
【００７１】
このGD凝集性生体高分子は容易に滅菌されそして室温で保存され、大量生産することができ、そして、種々の形に成型することができる。そのような形としては、これらに限らないが、末梢神経再生のガイドを支持するのに適したチューブ及びシート、脊髄をコーティング又は包むための鞘、組織の穴、特に気管の穴を修復するためのパッチ、及び血管及び気管のステントのコーティング又は外被が含まれる。この生体高分子は医療用具の製造に有用であり、これらの用具の形態又は形状はその意図された用途による。それらの用具の製造方法は使用目的に応じて広範囲で変わるであろう。本発明のGD生体高分子による物理化学的性質を調節する能力は、この足場生体高分子ゲルの広範囲での形状及び利用を可能にする。GD-生体高分子はより硬く又はより柔軟に；容易に生物分解されるように又は長い保持時間を持つように；水に不溶又は適度に溶解性を持つように、などに設計することができる。下記に例示するように、GD生体高分子はチューブへと成型され、それは神経再生を導く橋として働くことにより末梢神経傷害（部分的完全損失）のある患者の機能回復を補助するように設計された（図1，2，3も参照）。膜の形にも設計され、この膜はウサギの気管の穴を覆うために使用された。この膜は気管に縫い付けられ、そして使用された特別なGD生体高分子タイプは膜を破ることなく縫うことが可能であった。
【００７２】
この生体高分子は線維として使用するのに適しており、その線維は乾燥押し出し、ゲル押し出し、溶融押し出し、溶液押し出し又は紡績押し出しのような通常の方法又はこれ等の方法の組合せにより製造することができる。この線維は次いで乾燥しそして糸巻きに巻き取ることができる。繊維産業の工業的応用から知られている方法によりこの線維は複雑な形又は構造に織り、編み、束ね又は紐に組むことができる。
【００７３】
この生体高分子は、異なる成分、性質が有機若しくは無機で高分子性の又は他の特性の成分と押し出すまたは共押し出しするのに適している。このようなものには、多成分、多層型の線維並びに中空繊維および管が含まれる。
【００７４】
当業者に既知の適当な方法を使用することにより、生体適合性、細胞毒性の様相、及び生物分解速度、線維の引張り強さ、シート及びチューブの柔軟性、多孔度などを含む他の望ましいパラメーターに関してこの物質を最適化することができる。
【００７５】
凝集性生体高分子製品の生物分解速度を調節する（すなわち、その生物分解性を増大するか又は減少させる）ために、生体適合性が既知で分解時間が既知である重合性高分子を加えることが可能である。このようなものとしては、これらに限られるものではないが例えば、コラーゲン、ポリウレタン、ポリグリコール酸/ポリ乳酸、炭酸トリメチレンなどがある。例えば炭酸結合及び/又はジオキサノン結合を取り込んだ改良物質は、物質の種々な性質を改良するため、特に生物分解性を延長するものの依然保持しながら粘度、粘弾性及び保持時間を増加するために選択される。
【００７６】
さらに、われわれはこの生体高分子物質の中に孔を存在させることを可能とする方法及び好ましい孔の大きさを決定する方法を提供する。細胞の接着、増殖、及び分化の促進に関しては孔は望ましいであろう。逆に、気管ステントの形成のようなある応用については無傷なことが必要であろう。
【００７７】
一態様によれば、上記のいずれかの形に作られた本発明のマトリックスは、限定はしないが、血管移植組織、人工臓器、心臓の弁を含む種々の医学的応用に使用するため、並びに誘導組織再生又は組織工学のための生体適合インプラントとしてそれ自体で有用である。
【００７８】
その他の態様によれば、これ等のマトリックスは、傷害部位に移植されるか又は組織障害を改善するための細胞を包含するインプラントを含む場合に、有用である。本発明による凝集性生体高分子は、インビトロ並びにインビボにおける細胞選別、細胞増殖、細胞拡大及び分化を支持するために適する基質体として有利に使用することができる。
【００７９】
本発明のその他の態様によりこのマトリックスはさらに組織修復又は再生を促進するための追加の生物活性分子を含む。ここに使用する生物活性分子は、限定はせずに、治癒又は正常組織の再成長を助ける増殖因子、サイトカイン及び活性ペプチド（天然に存在するか又は合成されたものであっても良い）により例示される分子のことである。該生物活性分子の機能は新しい組織をつくるために局所の細胞を刺激すること及び/又は修復を必要とする部位へ細胞を遊走させることを含む。本発明の凝集性重合体に関連して有用な生物学的活性分子は、限定せずに、サイトカイン；インターフェロン（IFN）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン、コロニー刺激因子（CSF）；増殖因子；骨形成因子抽出物（OFE）、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォーミング増殖因子（TGF）アルファ、TGF-β（TGF-βのいずれかの組み合わせ）、TGF-β1，TGF-β2，血小板由来成長因子（PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB）、酸性線維芽細胞増殖因子（FGF）、塩基性FGF、結合組織活性化ペプチド（CTAP）、β-トロンボグロブリン、インスリン様増殖因子、エリトロポイエチン（EPO）、及び神経増殖因子（NGF）；タンパク質：フィブリン、アルブミン、コラーゲン、エラスチン及びリゾチームを含む。ここに使用された用語「生物活性分子」はさらに抗生物質、抗炎症薬、抗血栓薬、など；さまざまな多糖プロテオグリカン及びヒアルロン酸の一つ；第XIII因子、リシルオキダーゼのような架橋結合剤；抗凝固薬；及び抗酸化剤のような薬物を包含することが意図されている。これ等の任意の添加物は望ましい薬物動態プロフィールを提供するように組み入れることができる。本発明の範囲内でインビボにおいて生物活性化合物を持続放出するためにデキストラン硫酸-ゼラチン生体高分子ゲルを使用する方法が提供される。その他の例において、その中に取り込まれた生物活性分子の短時間の最適局所濃度が提供されるように添加物を取り込むことができる。
【００８０】
以下の実施例は本発明の原理を例証することが目的であり、非限定的なものと解釈されるべきものである。
【実施例】
【００８１】
実施例1：GD生体高分子の製造
A.ゼラチン-高分子量デキストラン硫酸生体高分子、酸性pH−NVR-3
ゼラチンの溶液（Gibco，Catalog#14025-50のHanks Balanced Slat Solution(HBSS)中20 mg/ml）及びデキストラン硫酸の溶液（M.W. 500,000ダルトン、HBSS中10 mg/ml）を重量で（w/w）30％のデキストラン硫酸に対して70％のゼラチンの比率で、最終濃度がゼラチン20 mg/ml及びデキストラン硫酸10 mg/mlになるように、70℃において混合した。デキストラン硫酸対ゼラチンの比率30/70（w/w）はゼラチン-デキストラン硫酸の組み合わせについて最適であることが判明した。3分後、5N酢酸（混合物1 ml当り0.1 mlの酢酸溶液）を使用して溶液のpHを3.0に調整し、そして溶液を振とうにより注意深く混合した。さらに3分後共沈殿ゲルが形成しそして無水エタノールを使用してさらに溶液から沈殿させた。重合しない分子は溶液に残り、他方凝集性生体高分子は沈殿物として液体から分離する。この沈殿ゲルを集めてスパーテルにより溶液から取り出した。採取したゲル様マトリックスを、マトリックスの重量が一定になるまで室温で空気乾燥した。この乾燥ゲル様物質を80％エタノール中の1％リボース溶液の中に浸してさらに架橋結合するために7日間室温でインキュベートした。そのほかには、生体高分子は熱処理によるか又は他の化学薬品、例えば、アセトン、エチル-3(3-ジメチルアミノ)プロピルカルボジイミド（EDC）、アルデヒドのような活性基を形成することができる酸化剤により架橋結合することができる。例えば、過ヨウ素酸ナトリウムは遊離アミノ基と容易に反応するアルデヒドを形成することができ、次いでナトリウムボロヒドリドで還元される。最終的重合体は約70〜75 MPaの高い湿引張り強さ及び機械的切断に対する高い抵抗性（例えば、20Nの外科縫合糸による）を持つ高い粘度、殆ど半固体となる。
【００８２】
B.ゼラチン-低分子量デキストラン硫酸生体高分子、酸性pH−NVR-5
ゼラチンの溶液（HBSS中20 mg/ml）及びデキストラン硫酸の溶液（M.W.5,000ダルトン、HBSS中20 mg/ml）を重量で50/50の比率で、最終濃度がゼラチン5 mg/ml及びデキストラン硫酸5 mg/mlになるように、70℃において混合した。混合物を3分間インキュベートした。5N酢酸（重合体混合物1 ml当り0.1 mlの酢酸溶液）を使用してpHを3.0に調整した。さらに3分間分散液を振とうにより注意深く混合した。生成した共沈殿ゲルをさらに無水エタノールにより沈殿させてスパーテルにより取り出した。高分子ゲルを重量が一定になるまで室温で乾燥した。乾燥生体高分子ゲルはさらに架橋結合するために80％無水エタノール中の1％リボース溶液の中でさらに7日間インキュベートした。
【００８３】
NVR-3及びNVR-5の製造工程の後に残るわずかの酸性は細胞包含マトリックスとしてのゲルの適合性を妨害する。得られたゲルは水性溶液に比較的溶解するので、容易に分解する。従って低分子量のデキストラン硫酸を使用してNVR-6及びNVR-7を製造した。
【００８４】
C.ゼラチン-高分子量デキストラン硫酸生体高分子、塩基性pH−NVR-6
ゼラチンの溶液（20 mg/ml HBSS）及びデキストラン硫酸の溶液（M.W. 500,000ダルトン、HBSS中20 mg/ml）を重量により（w/w）50％のデキストラン硫酸に対して50％のゼラチンの比率で、最終濃度がゼラチン10 mg/ml及びデキストラン硫酸10 mg/mlになるように混合した。pHを10 N水酸化アンモニウム（1 mlの混合物当り0.0125 mlの水酸化アンモニウム）を使用して11.0に調整した。混合物を120〜150 rpmで24時間室温にて撹拌した。生成した共沈殿ゲルをさらに無水エタノールで沈殿させ、ついでスパーテルにより溶液から取り出した。得られたゲルを室温で乾燥し、そして水性溶液に不溶であることを認めた。
【００８５】
D.ゼラチン-低分子量デキストラン硫酸生体高分子−NVR-7
ゼラチンの溶液（HBSS中20 mg/ml）及びデキストラン硫酸の溶液（M.W.5,000ダルトン、HBSS中20 mg/ml）を重量で50/50の比率で、最終濃度がゼラチン10 mg/ml及びデキストラン硫酸10 mg/mlになるように混合した。pHを10 N水酸化アンモニウム（1 mlの混合物当り0.0125 mlの水酸化アンモニウム）を使用して11.0に調整した。そのほかに、他の塩基、例えばジイソプロピレンアミンを使用することもできる。混合物を120〜150 rpmで24時間室温にて撹拌した。生成した共沈殿ゲルをさらに無水エタノールで沈殿させ、ついでスパーテルにより溶液から取り出した。典型的に、生成したNVR-7マトリックスは高い強度を示したので、追加の架橋結合は適用しなかった。しかし、より強いマトリックスが必要な場合は、上記のように架橋結合を行うことができる。
【００８６】
上記のNVR製品は全てインビトロ及びインビボにおいて生体適合性であることが認められたので、医療用具（この用具の形態及び形状はその使用目的による）を製造するのに有用であり、そして使用に応じた製造方法は非常にまちまちであろう。NVR-3及びNVR-5生体高分子は、多分陰性SO4-2電荷の高い密度のために、細胞増殖、特に神経細胞増殖には余り適さないことが認められたが、他方NVR-6及びNVR-7は細胞増殖に非常に適することが認められた。例えば、胚性ラット脊髄細胞はよく増殖しそして構造の表面に発育することが認められた（図11）。膜に成型されたNVR-7マトリックスは細胞増殖の45日後に変化しないことが認められた。膜による細胞増殖に対する妨害は認められなかった。
【００８７】
この生体高分子は繊維として使用することにも適しており、それは乾燥押し出し、ゲル押し出し、溶融押し出し、溶液押し出し又は紡績押し出しのような通常の方法又はこれ等の方法の組合せにより製造することができる。この線維は次いで乾燥しそして糸巻きに巻き取ることができる。繊維産業の工業的応用から知られている方法によりこの線維は複雑な形又は構造に織り、編み、束ね又は紐に組むことができる。
【００８８】
この生体高分子は、性質が有機または無機または高分子性の異なる成分または多成分、多層型の線維並びに中空繊維および管を含むその他の物と押し出すまたは共押し出しをするのに適している。
【００８９】
実施例2：GD-チューブの形成
上記実施例1に記述したように得た凝集性生体高分子ゲルをガラス製ペトリ皿に移し、そしてエタノールが完全に蒸発するまで乾燥オーブン中100℃で1〜2時間加熱した。次いで重合物質を室温に冷却し、加圧成型法により鞘又は膜を調製するために加熱（100℃）鋳型に入れた。冷却した後形成した品物を鋳型から取り出して一定重量になるまで乾燥した。
【００９０】
NVR-7 が製造された場合には、水に不溶であることが認められたので、NVR-3及びNVR-5 に比較して生物分解までにより長い保持時間を有する。NVR-7マトリックスを滅菌PBS中37℃で4ヶ月間インキュベートしたが構造の外観、完全な状態及び/又は重量に変化を全く生じなかった。
【００９１】
実施例3：ステント外被又はコーティングとして役立つGDチューブの試験
冠動脈ステントを運ぶバルーン上に5 mmの長さと2 mmの直径のGD-チューブを被せた。バルーンを水で16気圧に膨らませた。16気圧の二回の膨張によりこの鞘は無傷であった。この凝集性生体高分子の伸長に対するこの能力は、血管形成術後の再狭窄及び血栓の率を下げるためのステント外被として役に立つ可能性を示している。
【００９２】
実施例4：神経インプラントを包む種のGDチューブの使用
神経培養の維持、増殖及び分化の方法論は最も精巧なものであることが知られている。したがって、神経細胞のインビボにおける基質及び条件を模倣した細胞外マトリックス（ECM）環境が最も望ましい。
【００９３】
組織培養法はインビボ動物モデルの使用に代るものとして注目を集めた。一つの方向は培養細胞又は外植体のために細胞外マトリックス（ECM）のインビボ環境、性質及び成分をインビトロにおいて創造又は模倣することに向けられた。本発明者らの一人によって既に開示されているように（WO 02/39948）、二つの主成分、すなわちヒアルロン酸（HA）及びラミニン（LN）が特に神経細胞及びグリア細胞の培養に必須の候補として現れた。
【００９４】
粘着性ゲルへのHA及びLNの結合（HA-LNゲル）により中枢及び末梢神経系の両者に由来する神経細胞及び外植体の増殖のための生体マトリックスが提供される。ECMの主成分であるHA及びLNの結合は中枢及び末梢神経系の両者に由来する神経細胞及び外植体の増殖のための基質としてその発明者らにより導入された。
【００９５】
インビトロにおける広範囲の細胞型に対する有用な基質マトリックスを提供することに加えて、HA-LNゲルは非常に有利な生体適合インプラント及び移植の供給担体として役に立つことが既に開示されていた（WO 02/39948）。
【００９６】
しかし、機械的性質を改善するために患者に移植するのに先立ってより硬い足場の中にHA-LNゲルを包むことが望ましいことが明らかになる。これは、細胞を含むか又は含まないHA-LNゲルインプラントを包む足場として本発明のデキストラン硫酸-ゼラチン凝集性生体高分子を使用することにより達成される。
NVR案内チューブ（ここではGDチューブと呼ぶ）は細胞を含む又は含まないNVR-N-ゲルが充填されるであろう。
【００９７】
実施例5：気管の穴を閉じるためのGD膜の使用
空気漏出、構造の萎縮、気流障害、気道閉塞、脈管圧縮、低緊張、筋弾性及び呼吸困難は小児の喉頭-気管-気管支軟化及び/又は狭窄における特徴的症状である。
【００９８】
気管支軟化は気管又は気管支の壁の軟骨の欠損により、6ヶ月未満の小児に生じる。呼気の際に主幹気管支の虚脱がある。二つのタイプの気管支軟化がある。原発性気管支軟化は軟骨リングの欠損による。二次気管支軟化は拡張した管、脈管リング又は気管支嚢胞の外部からの圧縮により生じることがある。両タイプともにMRI又はCT検査により確認することができる圧縮性の障害を生じることがある。気管支軟化は小児科においては生命を脅かす病気である。
【００９９】
気管支軟化の同様の症状は、気管内の瘢痕及び線維化を誘発する長期間の挿管（チューブ療法）によっても生じ、上記の致死的病気に至ることがある。
【０１００】
NVR-7膜を変形した気管の治療について試験した。実験は健康なウサギから取りだした肺においてインビトロで、並びに、ウサギ肺気管に計画的に切り傷を作ってインビボで行った。切り傷を作った後、1.0 cm x 0.5 cmのNVR-7膜を縫い付けて切り傷を覆った。両実験において膜は呼吸系を完全に被い、そして正常な肺機能を可能にした。手術後ウサギは正常に呼吸することができた。
【０１０１】
実施例5：GD生体高分子の特徴
GD生体高分子は二つの単純な重合分子：デキストラン硫酸及びゼラチンの共沈殿として製造される。元の原料物質と新たに生成された凝集性生体高分子ゲルを比較するために下記に記述するように一連の試験を行った：
【０１０２】
ゲルろ過クロマトグラフィー（GFC）
物質のゲルろ過クロマトグラフィー（GFC）プロフィールは分子の分子量並びに3次元の形状に依存する。2回蒸留水に溶解した10 mgの重合物質をセファロースCL-6Bのカラムに乗せそして2回蒸留水で溶出した。排除体積（ボイドボリューム）は2ｘ106ダルトンのデキストランブルーを使用し、チューブ＃7（11.5 ml）中に1.5 ml/tubeずつ溶出して測定した。
【０１０３】
1ｘ106以上の多糖が排出された。糖は中性糖のためのフェノール法（1 ml検体＋1 ml 5％フェノール溶液＋5 mlの濃硫酸）により測定した。発色したオレンジ色を490 nmの波長で分光光度計により測定した。図4に示すように、デキストラン硫酸のみのクロマトグラム（図4a）及び新規GD生体高分子のクロマトグラム（図4c）は著しく異なった。
【０１０４】
同様に、ゼラチンのみ及びGD生体高分子を比較するためにゲルろ過クロマトグラフィーを行った。
【０１０５】
0.5 mlのDMSOに溶解した10 mgの重合物質をセファロースCL-6Bカラムに乗せた。溶出は10％ DMSO溶液で行い、1.5 mlずつのフラクションを採取した。4ｘ106ダルトン以上の分子量を持つタンパク質はボイドボリュームに溶出した。タンパク質は280 nmの波長において分光光度計により検出した。もう一度、ゼラチンのクロマトグラムプロフィール（図4b）は生体高分子のプロフィール（図4c）とは明らかに異なった。
【０１０６】
核磁気共鳴スペクトル（NMR）
図5a〜cはゼラチン、デキストラン硫酸及び新規GD生体高分子のNMR分析を記述している。結果は、新しい生体高分子は元の原料物質とは異なることを明らかに示している。
【０１０７】
赤外線スペクトル
図6はGD生体高分子のスペクトルと比較した原料のゼラチン及びデキストラン硫酸の赤外線スペクトルを示す。
【０１０８】
GD生体高分子のスペクトルは原料分子のそれとは異なることを示すスペクトルの総合的分析により、上記の他の試験の結果により示されているように新しい重合物質の形成が示された。
【０１０９】
実施例6：異なる架橋度のGD生体高分子の特徴
重合体の分解速度は重合体分子間の架橋の程度及びタイプにより調節することができる。本発明の方法、生体高分子の還元糖との反応により、生体高分子の著しい架橋を生じる。多数の架橋結合剤を比較して最善の試薬としてペントース単糖リボースが示された。架橋の程度は糖濃度、温度及び反応の長さにより調節可能である。
【０１１０】
架橋の前後でGDの性質を比較してGD生体高分子の性質に及ぼす架橋度の影響を調べた。
【０１１１】
膨潤試験
膜膨潤試験は二つの培地、すなわち、蒸留水及び唾液模倣溶液を使用して行われた。各膜検体（NVR-3、表面積40 mm2）を4時間真空により乾燥し、重さを量りそして予め重量を測定した約200 μmの網目のステンレススチールワイヤーの網の中に入れた。このフィルム検体の入った網をプラスチックビーカー中の25 mlの培地中に沈めた。一定の重量に達するまで、連続する時間間隔で膜の重量の増加を測定した。それぞれの測定を3回繰り返した。膨潤度は次のパラメーターを使用して計算した：
2006506110.tif 000002
式中Wtは時間tにおける膜の重量；そしてW0は時間0における膜の重量である。
【０１１２】
検体は熱脱水処理による架橋の前、架橋の後及び熱脱水処理及び糖による架橋の後に試験された。
【０１１３】
図7及び8は蒸留水及び唾液模倣溶液中におけるそれぞれ架橋の前後のGD膜の膨潤度を示している。膨潤度は唾液溶液に比較して蒸留水において高かった。この知見から、膜の膨潤への影響に於いてイオン強度及びpHが重要な役割を演じていることが示された。架橋前のGD膜の膨潤速度は熱架橋後の膜に比較して早く、そして熱処理及び糖による架橋を組み合わせた後の膜は有意に遅かった。これ等のデータは、架橋の程度が増加した結果として、加熱法及び糖架橋のいずれも水の取り込み及び加水の速度を減少させることを示している。
【０１１４】
インビトロの生物分解
ゼラチン-デキストラン硫酸-膜（GD膜、NVR-3）を調製しそしてリボースで架橋した。試験のために調製した検体を4時間真空により乾燥し、重量を測定し、そして20％ウシ胎児血清を加えた生理的溶液中に37℃で特定の時間完全に浸漬した。インキュベーション時間を通して特定の時間ごとに溶液を置換しそして検体を取り出し、乾燥しそして重量を測定した。30日の検定期間中の重量変化を測定することにより、分解速度を計算した。図9は、リボース架橋調製品は1日当り2〜2.5％の率で分解することを示している。
【０１１５】
実施例7：GD生体高分子の多孔度
24日間神経細胞培養培地中での膜のインキュベーション前後において、乾燥GD膜（NVR-3）の構造を走査電子顕微鏡（SEM）により検査した。図10に示すように、乾燥膜は無秩序な多孔度構造のある連続的な密度の高い固体のように見えた；孔の大きさは20〜70 μmであった。
【０１１６】
以上の特定の態様の記述は、現在の知識を適用することにより、不適当な実験をすることなく、そして一般的概念から離れることなく、該特定の態様を修飾しそして/又は種々の応用のために適合させることが第三者に容易にできるほど本発明の一般的本質を十分に明らかにしているので、該適合及び修飾は開示した態様と同等の意味及び範囲内に包含されると考えられるべきであり、又意図される。ここに使用された表現法及び用語は説明の目的であり限定の目的ではないことは理解されるべきものである。種々の開示した化学構造及び機能を行うための手段、物質及び段階は本発明から離れることなく種々の代替形態をとることができる。
【０１１７】
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【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】本発明によるゼラチンと組み合わせたデキストラン硫酸の生体高分子（GD生体高分子）から作られた神経カフの種々の外観。
【図２】本発明によるゼラチンと組み合わせたデキストラン硫酸の生体高分子（GD生体高分子）から作られた神経カフの種々の外観。
【図３】本発明によるゼラチンと組み合わせたデキストラン硫酸の生体高分子（GD生体高分子）から作られた神経カフの種々の外観。
【図４】a)デキストラン硫酸対ゼラチン及びデキストラン硫酸の共沈殿生体高分子（GD生体高分子）、b)ゼラチン対GD生体高分子のセファロースCL-6Bカラム上におけるゲルろ過プロフィール。
【図５】a)デキストラン硫酸；b)ゼラチン；c)ゼラチンとデキストラン硫酸の共沈殿生体高分子の核磁気共鳴スペクトル。
【図６】a)デキストラン硫酸；b)ゼラチン；c)ゼラチンとデキストラン硫酸の結合生体高分子の赤外線スペクトル。
【図７】架橋結合前後における蒸留水中のGD膜NVR-3の膨潤度。
【図８】架橋結合前後における唾液模倣溶液中のGD膜NVR-3の膨潤度。
【図９】リボースで架橋したGD-膜NVR-3の経時的分解速度。
【図１０】走査電子顕微鏡により示された、乾燥GD生体高分子膜の多孔度。
【図１１】増殖45日後のNVR-7チューブ上のラット胚性脊髄細胞。（拡大：x100）
【図１】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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