(57)【要約】本発明は、特に転写因子MarA、およびMarAの相同体、例えばRobおよびSoxSが、病原性因子であるという知見に基づいている。従って、本発明は化これらの病原性因子を調節する能力について化合物をスクリーニングするための方法を開示する。本発明は、転写因子の発現および／または活性を調節することによって細菌感染症を治療および予防するための方法をさらに記載する。加えて、本発明はその他の病原性因子を同定するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物による被検者の感染を予防するための方法であって、被検者の感染が予防されるように、微生物の転写因子の発現または活性を調節する化合物を、感染症を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項２】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
微生物による被検者の尿路感染症を予防するための方法であって、被検者の感染が予防されるように、微生物の転写因子の発現または活性を調節する化合物を、尿路感染症を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項６】
微生物による被検者の前立腺炎を予防するための方法であって、被検者の感染が予防されるように、微生物の転写因子の発現または活性を調節する化合物を、前立腺炎を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項７】
微生物の病原性を減少させるための方法であって、微生物の病原性が減少させられるように、微生物の転写因子の発現または活性を調節する化合物を、微生物を有する、感染症を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項８】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
被検者の微生物感染症を治療するための方法であって、被検者の感染症が治療されるように、転写因子の発現または活性を調節する化合物を、微生物感染症を有する被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項１２】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項11記載の方法
【請求項１５】
被検者の尿路感染症を治療するための方法であって、被検者の感染症が治療されるように、転写因子の発現または活性を調節する化合物を、尿路感染症を有する被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項１６】
被検者の前立腺炎を治療するための方法であって、被検者の感染症が治療されるように、転写因子の発現または活性を調節する化合物を、前立腺炎を有する被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項１７】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
微生物の病原性を減少させるための方法であって、微生物の病原性を減少させるように、転写因子の発現または活性を阻害する化合物を、微生物感染症を有する被検者に対して投与することを含む方法。
【請求項２１】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
微生物の病原性を阻害する際の、微生物の転写因子の発現または活性を調節する化合物の有効性を評価するための方法であって、非ヒト動物を微生物に感染させること（ここで微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；非ヒト動物に、微生物の転写因子の発現または活性を調節する化合物を投与すること；および非ヒト動物の感染レベルを決定すること（ここで化合物が動物の感染レベルを減少させる能力は、化合物が微生物の病原性を阻害するために有効なことを示す）、を含む方法。
【請求項２５】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
非ヒト動物の感染レベルは、微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される、請求項24記載の方法。
【請求項２９】
非ヒト動物の感染レベルが非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される、請求項24記載の方法。
【請求項３０】
微生物感染症を治療するための化合物を同定するための方法であって、非ヒト動物に微生物を接種すること（ここで微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；微生物の転写因子の発現または活性を減少させる化合物を動物に投与すること；および微生物が動物にコロニーを形成する能力における試験化合物の効果を決定すること、を含み、その結果微生物感染症を治療するための化合物が同定される方法。
【請求項３１】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
非ヒト動物の感染レベルが微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
非ヒト動物の感染レベルが非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される、請求項30記載の方法。
【請求項３５】
微生物の病原性を減少させるための化合物を同定するための方法であって、非ヒト動物に微生物を接種すること（ここで微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；微生物の転写因子の発現または活性を減少させる化合物を動物に投与すること；および、微生物が動物にコロニーを形成する能力における試験化合物の効果を決定すること、を含み、その結果微生物の病原性を減少させる化合物が同定される方法。
【請求項３６】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
非ヒト動物の感染レベルが微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
非ヒト動物の感染レベルが非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
微生物の病原性を促進する転写因子を同定するための方法であって、試験される転写因子が誤って発現される（misexpressed）微生物を作製すること；微生物を非ヒト動物に導入すること（ここで微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；および微生物が動物にコロニーを形成する能力を決定すること、を含み、ここで、野生型微生物の細胞と比較した、微生物が動物にコロニーを形成する能力の減少により、微生物の病原性を促進する転写因子としての転写因子が同定される方法。
【請求項４１】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
非ヒト動物の感染レベルが微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
非ヒト動物の感染レベルが非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される、請求項40記載の方法。
【請求項４５】
微生物が非生物的な表面に接着する能力を減少させるための方法であって、微生物が非生物的な表面に接着する能力が減少されるように、転写因子の活性を調節する化合物と非生物的な表面または微生物を接触させることを含む方法。
【請求項４６】
転写因子が転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
転写因子が転写因子のMarAファミリーのメンバーである、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
微生物の増殖を制御するために有効な第2の薬剤と非生物的な表面または微生物を接触させることをさらに含む、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
非生物的な表面が、ステント、カテーテル、および補綴装置からなる群より選択される、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
微生物の転写因子の活性または発現を調節する化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、化合物が微生物の病原性を減少させる、薬学的組成物。
【請求項５１】
微生物の転写因子の活性または発現を調節する化合物および薬学的に許容される担体中の抗生物質を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2003年3月31日に出願された、表題「Methods for Preventing and Treating Microbial Infections by Modulating Transcription Factors」の米国特許出願第60/458,935号；2002年11月26日に出願された、表題「Methods for Preventing and Treating Microbial Infections by Modulating Transcription Factors」の米国特許出願第60/429,142号；2002年10月25日に出願された、表題「Methods for Preventing and Treating Microbial Infections by Modulating Transcription Factors」の米国特許出願第60/421,218号；および2002年6月24日に出願された、表題「Methods of Preventing and Treating Bacterial Infections by Inhibiting Virulance Factors」の米国特許出願第60/391,345号に対する優先権を主張する。また、本出願は、2002年11月1日に出願された、表題「Transcription Factor Modulating Compounds and Method of Use Thereof」の米国特許出願第60/423,319号、および2002年11月13日に出願された、表題「Transcription Factor Modulating Compounds and Method of Use Thereof」の米国特許出願第60/425,916号に関連する。また、本出願は、2002年5月6日に出願された、表題「Transcription Factor Modulating Compounds and Methods of Use Thereof」の米国特許出願第10/139,591号に関連する。また、本出願は、1999年5月21日に出願された、表題「MarA Family Helix-Turn-Helix Domains and Their Methods of Use」の米国特許出願第09/316,504号に関連する。また、本出願は、2001年3月8日に出願された、表題「NIMR Compositions and Their Methods of Use」の米国特許出願第09/801,563号に関連する。これらの出願の全ての内容は、本明細書において参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
細菌感染を治療するために現在使用され、および開発中の多くの抗生物質は、微生物に対して選択圧を課しており、広範な抗生物質耐性の発症を引き起こしている。したがって、微生物感染を治療し、および／または予防するための代わりのアプローチの開発は、優れた利点を有すると考えられる。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は、微生物の転写因子、たとえば、AraC-XylSファミリーの転写因子を、微生物の病原性因子として同定し、これらの因子の阻害が微生物細胞の病原性を減少させることを示す。これらの転写因子は、必須な細胞プロセス以外にも病原性を制御しているので、微生物の転写因子の発現および／または活性を調節する化合物に対する耐性の発生は、非常に可能性が低い。
【０００４】
従って、一つの側面では、本発明は、微生物による被検者の感染を予防するための方法であって、被検者の感染が予防されるように、微生物の転写因子の発現および／または活性を調節する化合物を、感染を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法に向けられる。
【０００５】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【０００６】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【０００７】
もう一つの態様において、本方法は、抗生物質を投与することをさらに含む。
【０００８】
もう一つの側面において、本発明は、微生物による被検者の尿路感染症を予防するための方法であって、被検者の感染が予防されるように、微生物の転写因子の発現および／または活性を調節する化合物を、尿路感染症を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法に属する。
【０００９】
さらにもう一つの側面において、本発明は、微生物の病原性を減少させるための方法であって、微生物の病原性が減少されるように、微生物の転写因子の発現および／または活性を調節する化合物を、微生物を有する感染を発病するリスクがある被検者に対して投与することを含む方法に属する。
【００１０】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００１１】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００１２】
さらにもう一つの態様において、本方法は、抗生物質を投与することをさらに含む。
【００１３】
もう一つの側面において、本発明は、被検者の微生物感染症を治療するための方法であって、被検者の感染が治療されるように、転写因子の発現および／または活性を調節する化合物を、微生物に感染した被検者に対して投与することを含む方法に属する。
【００１４】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００１５】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００１６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、抗生物質を投与することをさらに含む。
【００１７】
もう一つの側面において、本発明は、被検者の尿路感染症を治療するための方法であって、被検者の感染が治療されるように、転写因子の発現および／または活性を調節する化合物を、尿路感染症を有する被検者に対して投与することを含む方法に属する。
【００１８】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００１９】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００２０】
もう一つの態様において、本方法は、抗生物質を投与することをさらに含む。
【００２１】
もう一つの側面において、本発明は、微生物の病原性を減少させるための方法であって、微生物の病原性を減少させるように、転写因子の発現および／または活性を阻害する化合物を、微生物に感染した被検者に対して投与することを含む方法に属する。
【００２２】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００２３】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００２４】
さらにもう一つの態様において、本方法は、抗生物質を投与することをさらに含む。
【００２５】
もう一つの側面において、本発明は、微生物の病原性を阻害時における微生物の転写因子の発現および／または活性を調節する化合物の有効性を評価するための方法であって、非ヒト動物を微生物に感染させることと（微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；非ヒト動物に微生物の転写因子の発現および／または活性を調節する化合物を投与することと；並びに、非ヒト動物の感染レベルを決定することと（化合物が動物の感染レベルを減少させる能力は、化合物が微生物の病原性を阻害するために有効なことを示す）を含む方法に属する。
【００２６】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００２７】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００２８】
さらにもう一つの態様において、本方法は、抗生物質を投与することをさらに含む。
【００２９】
さらにもう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される。
【００３０】
もう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される。
【００３１】
もう一つの側面において、本発明は、微生物感染症を治療するための化合物を同定するための方法であって、非ヒト動物に微生物を接種すること（innoculating）と（微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；微生物の転写因子の発現および／または活性を減少させる化合物を動物に投与することと、並びに微生物が動物にコロニーを形成する能力における試験化合物の効果を決定することとを含み、その結果、微生物感染症を治療するための化合物が同定される方法に属する。
【００３２】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００３３】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００３４】
さらにもう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される。
【００３５】
もう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定されるる。
【００３６】
もう一つの側面において、微生物の病原性を減少させるための化合物を同定するための方法であって、非ヒト動物に微生物を接種することと（微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；微生物の転写因子の発現および／または活性を減少させる化合物を動物に投与することと、並びに微生物が動物にコロニーを形成する能力における試験化合物の効果を決定することとを含み、その結果、微生物の病原性を減少させる化合物が同定される方法。
【００３７】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００３８】
さらにもう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００３９】
さらにもう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される。
【００４０】
もう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される。
【００４１】
もう一つの側面において、本発明は、微生物の病原性を促進する転写因子を同定するための方法であって、試験される転写因子が誤って発現される（misexpressed）微生物を作製することと；微生物を非ヒト動物に導入することと（微生物が非ヒト動物における感染を確立する能力は、微生物が動物にコロニーを形成することを必要とする）；微生物が動物にコロニーを形成する能力を決定することとを含み、野生型微生物の細胞と比較して、微生物が動物にコロニーを形成する能力の減少により、微生物の病原性を促進する転写因子として転写因子を同定する方法に属する。
【００４２】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００４３】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００４４】
もう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、微生物が非ヒト動物の組織にコロニーを形成する能力を測定することによって決定される。
【００４５】
もう一つの態様において、非ヒト動物の感染レベルは、非ヒト動物の組織に存在する微生物の数を数え上げることによって決定される。
【００４６】
もう一つの側面において、本発明は、微生物が非生物的な表面に接着する能力を減少させるための方法であって、微生物が非生物的な表面に接着する能力が減少されるように、転写因子の活性を調節する化合物と非生物的な表面または微生物を接触させることを含む方法に属する。
【００４７】
一つの態様において、転写因子は、転写因子のAraC-XylSファミリーのメンバーである。
【００４８】
もう一つの態様において、転写因子は、転写因子のMarAファミリーのメンバーである。
【００４９】
さらにもう一つの態様において、本方法は、微生物の増殖を制御するために有効な第2の薬剤と非生物的な表面または微生物を接触させることをさらに含む。
【００５０】
さらにもう一つの態様において、非生物的な表面は、ステント、カテーテル、および補綴装置からなる群より選択される。
【００５１】
一つの側面において、本発明は、微生物の転写因子の活性または発現を調節する化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、化合物は、微生物の病原性を減少させる薬学的組成物に属する。
【００５２】
もう一つの側面において、本発明は、微生物の転写因子の活性または発現を調節する化合物および薬学的に許容される担体中の抗生物質を含む薬学的組成物に属する。
【００５３】
詳細な説明
本発明は、微生物の転写因子、たとえばAraC-XylSファミリーの転写因子を微生物の病原性因子として同定し、これらの因子の阻害が微生物細胞の病原性を減少させることを示す。これらの転写因子は、必須な細胞プロセス以外にも病原性を制御しているので、これらの因子の調節は、耐性を促進するはずはない。
【００５４】
細菌で見いだされた転写因子の一部の主要なファミリーは、AraC、MarA、Rob、SoxS、およびLysRなどのヘリックス-ターン-ヘリックス転写因子（HTH）（Harrison, S. C., および A. K. Aggarwal 1990. Annual Review of Biochemistry. 59：933-969）；翼状のヘリックス転写因子（Gajiwala, K. S., および S. K. Burley 2000. 10：110-116）、たとえば、MarR、Sar/Rotファミリー、およびOmpR（Huffman, J. L., および R. G. Brennan 2002. Curr Opin Struct Biol. 12： 98-106, Martinez-Hackert, E., および A. M. Stock 1997. Structure. 5：109-124）；並びにループ状ヒンジ・ヘリックス転写因子（Huffman, J. L., および R. G. Brennan 2002 Curr Opin Struct Biol. 12：98-106）、たとえば、AbrBタンパク質ファミリーを含む。
【００５５】
AraC-XylSファミリーの転写因子は、多くのメンバーを含む。MarA、SoxS、Rma、およびRobは、AraC-XylSファミリーの転写因子内のタンパク質の例である。これらの因子は、歴史的に多くの抗生物質に対する耐性を促進する役割を果たすと考えられているAraC-XylSファミリーのサブセットに属し、病原性因子であるとは考えられていない。事実、病原性におけるmarAの役割は、マウス感染モデルにおいてサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）血液型亜型ネズミチフス菌（S.typhimurium）のmarAヌル変異体を使用して試験されたが（Sulavikら、1997. J. Bacteriology 179：1857）、このような役割は見いだされなかった。もう一つのモデル（共感染実験または粗統計（crude statistics）を使用する）では、ニワトリのmarAヌル変異体の弱い効果のみが示された（Randallら、2001. J. Med. Microbiol. 50：770）。この以前の研究とは対照的に、本発明は、少なくとも一部において、微生物が宿主に感染を引き起こす能力は、微生物の転写因子、たとえば、AraC-XylSファミリーの転写因子またはMarAファミリーの転写因子の発現および／または活性を阻害することによって阻害することができるという知見に基づいている。したがって、本発明では、治療標的として微生物の転写因子の使用を確認する。
【００５６】
I.定義
本発明のさらなる記述の前に、本明細書、実施例、および添付の請求の範囲において使用される特定の用語を、便宜のためにここに集めた。
【００５７】
本明細書において使用されるものとして、「調節する」の用語は、上方および下方の調節の両方を含む。
【００５８】
本明細書において使用されるものとして、「感染力」または「病原性」の用語は、病原性微生物が宿主にコロニーを形成する能力を含み、宿主における増殖を確立するために必要とされる第一段階である。感染力または病原性は、微生物が病原体であるために必要とされる。加えて、病原性の微生物は、重篤な感染を引き起こすことができるものである。典型的な病原性因子には：外膜タンパク質発現に関与する因子、微生物の毒素、バイオフィルム形成に関与する因子、炭水化物輸送および代謝に関与する因子、細胞エンベロープ合成に関与する因子、および脂質代謝に関与する因子を含む。
【００５９】
本明細書において使用されるものとして、「病原体」の用語は、真正および日和見性の生物体を含む。また、微生物が抗生物質耐性となる能力は、宿主中での増殖を促進するために重要であるが、一つの態様において、抗生物質耐性は、本明細書に使用される「感染力」または「病原性」の用語に含まれない。従って、一つの態様において、本発明は、抗生物質抵抗性に影響を及ぼす（たとえば、増大または減少する）ことなく微生物の感染力または病原性を減少させる方法に属する。好ましくは、本明細書に使用されるものとして、「感染力または病原性」の用語は、生物体が、宿主のバリヤーおよび免疫防御を避けることにより、宿主においてそれ自体を確立する能力を含む。
【００６０】
「転写因子」の用語は、原核生物および真核生物の遺伝子調節に関与するタンパク質を含む。一つの態様において、転写因子は、遺伝子発現に対してポジティブな効果を有することができ、したがって、「活性化因子」または「転写活性化因子」ともいわれる。もう一つの態様において、転写因子は、遺伝子発現にネガティブに作用することができ、したがって、「リプレッサー」または「転写抑制因子」ともいわれる。
【００６１】
「AraCファミリー・ポリペプチド」、「AraC-XylSファミリー・ポリペプチド」の用語は、異なる何百ものタンパク質を含む当業者が認識する原核生物の転写因子群を含む（Gallegosら、（1997） Micro. Mol. Biol. Rev. 61：393； Martin および Rosner, （2001） Curr. Opin. Microbiol. 4：132）。AraCファミリー・ポリペプチドは、PROSITE（PS）データベースにおいてプロフィールPS01124として定義されるタンパク質を含む。また、AraCファミリー・ポリペプチドは、PS0041、HTH AraCファミリー1、およびPS01124、およびHTH AraCファミリー2に記載されているポリペプチドを含む。典型的なAraC-XylSファミリー・ポリペプチドの多くの配列アラインメントを図1に示してある。また、典型的なAraCファミリー・ポリペプチドを表1に示してある。ある態様において、AraCファミリー・ポリペプチドは、一般に一次配列のレベルで、約100個のアミノ酸の保存されたひと配列で構成されており、これがこれらのタンパク質のDNA結合活性を担っていると考えられている（Gallegosら、（1997） Micro. Mol. Biol. Rev. 61：393； Martin および Rosner, （2001） Curr. Opin. Microbiol. 4：132）。また、AraCファミリー・ポリペプチドは、2つのヘリックス-ターン-ヘリックスDNA結合モチーフを含む（Martin および Rosner, （2001） Curr. Opin. Microbiol. 4：132； Gallegosら、（1997） Micro. Mol. Biol. Rev. 61： 393； Kwonら、（2000） Nat. Struct. Biol. 7：424； Rheeら、（1998） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95：10413）。本用語は、MarAファミリー・ポリペプチドおよびHTHタンパク質を含む。
【００６２】
AraCファミリー・ポリペプチドを定義する典型的な特徴パターンは、たとえば、PROSITEに示されており、以下の配列によって表される。
2006504677.tif 000002
式中、Xは、任意のアミノ酸である。
【００６３】
一つの態様において、本発明は、DNA結合に関与するポリペプチドの一部と相互作用する試験化合物とAraCファミリー・ポリペプチドを接触させることによって、AraCファミリー・ポリペプチドを調節するための方法に属する。AraCファミリーの転写因子は、単量体または二量体として活性であることができる。一つの態様において、本発明の転写因子は、AraCファミリーに属し、単量体として活性である。もう一つの態様において、本発明の転写因子は、AraCファミリーに属し、二量体として活性である。
【００６４】
一つの態様において、本発明の転写因子は、以下の1つまたは複数を除外する。
2006504677.tif 000003
【００６５】
AraCファミリー・メンバーは、ヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメインを含む転写因子の大規模な群に属する。「ヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメイン」は、当技術分野において既知でり、DNA結合に関係していた（Ann Rev. of Biochem. 1984. 53：293）。ヘリックス-ターン・ドメインの共通配列の例は、BrunelleおよびSchleif （1989. J.Mol. Biol. 209：607）において見いだすことができる。ドメインは、配列
2006504677.tif 000004
であって、Xは、任意のアミノ酸であり、Phoは疎水性アミノ酸である配列によって例示されている。
【００６６】
ヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメインは、最初に認識されたDNA結合性タンパク質モチーフであった。本来、HTHドメインは、細菌タンパク質で同定されたが、HTHドメインは、以後真核生物および原核生物の両者から何百ものDNA結合タンパク質において見いだされた。これは、「ターン」を構成するアミノ酸の短い伸長鎖によって接続された2つのαヘリックスから構築されている。一つの態様において、本発明の転写因子は、少なくとも1つのヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメインを含む。
【００６７】
一つの態様において、本発明の転写因子は、Mar Aファミリー・ポリペプチドである。「MarAファミリー・ポリペプチド」の専門用語は、MarAに配列類似性を有し、AraCの特徴パターンを含む転写調節タンパク質などの多くの天然に存在するHTHタンパク質を含む。MarAファミリー・ポリペプチドは、2つの「ヘリックス-ターン-ヘリックス」ドメインを有する。この特徴パターンは、第1に、大部分のアミノ末端、ヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメイン（HTH1）に続く領域に由来し、第2に、大部分のカルボキシ末端のヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメイン（HTH2）の全体を含む。（PROSITE PS00041を参照されたい）。
【００６８】
MarAファミリーのタンパク質（「MarAファミリー・ポリペプチド」）は、AraC-XylSファミリー・ポリペプチドの1つのサブセットを表し、MarA、SoxS、Rob、Rma、AarP、PqrA、その他様のタンパク質を含む。MarAファミリー・ポリペプチドは、一般に、抗生物質、有機溶剤、および酸化的ストレス薬剤に対する耐性の調節に関与する（Alekshun および Levy, （1997） Antimicrob. Agents. Chemother. 41：2067）。その他のAraC-XylSファミリー・ポリペプチドの様に、MarA様のタンパク質も、一般にMarAおよびRob結晶構造によって例示される2つのHTHモチーフを含む（Kwonら、（2000） Nat. Struct. Biol. 7：424； Rheeら、（1998） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95：10413）。MarAファミリーのメンバーは、当業者によって同定することができ、MarA（配列番号1）のアミノ酸30〜76および77〜106に対して相同性を有するタンパク質によって一般に表される。
【００６９】
好ましくは、MarAファミリー・ポリペプチドまたはこれらの部分は、第1のMarAファミリーHTHドメイン（HTH1）を含む（Brunelle, 1989, J Mol Biol； 209 （4）：607-22）。もう一つの態様において、MarAポリペプチドは、第2のMarAファミリーHTHドメイン（HTH2）を含む（Caswell, 1992, Biochem J.； 287：493-509.）。好ましい態様において、MarAポリペプチドは、第1および第2のMarAファミリーHTHドメインの両方から構成されている。
【００７０】
典型的なMarAファミリー・ポリペプチドは、たとえば、表2、図1、およびProsite（PS00041）に示してあり、たとえば
2006504677.tif 000005
を含む。
【００７１】
特に好ましい態様において、MarAファミリー・ポリペプチドは、：MarA、RamA、AarP、Rob、SoxS、およびPqrAからなる群より選択される。大腸菌Rob分子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：3および4に示してある。
【００７２】
（表２）一部の細菌性MarA相同体a
2006504677.tif 000006
aより小さなMarA相同体、87（U34257）〜138の（OrfR）アミノ酸残基のサイズの範囲を太字で表してある。参照は、括弧内に与えてあり、以下に列記してある。
表2のための参照：
2006504677.tif 000007
2006504677.tif 000008
【００７３】
転写因子ファミリーのメンバーは、共通の特性、たとえば特定の構造を共有し、機能的な特徴は、ファミリー・メンバー間で共有されている。従って、以下に記載した構造上の関連性の調査（たとえば、一次核酸もしくはアミノ酸配列相同性（または、特定の特徴ドメインの存在に）にまたはこのような核酸相同性の指示薬としてのハイブリダイゼーションに基づくか）、またはアミノ酸の三次元対応に基づく）は、種々の転写因子ファミリーのメンバーを同定するために使用することができることが当業者によって理解されている。
【００７４】
特定のファミリーに属する転写因子は、1つまたは複数の既知のファミリーに「構造的に関連があり」、たとえば、転写因子のMarAファミリーのメンバーは、構造的にMarAに関連がある。この関連性は、2つのポリペプチド配列の間、または2つのこのようなポリペプチドを特定するヌクレオチド配列の間の配列または構造上の類似によって示すことができる。配列類似は、たとえば、対応する位置の比較および比較するためのアラインメント・プログラムを使用して配列を最適にアラインさせることによって示すことができる。配列間の類似の程度を決定するためには、これらを最適な比較目的のためにアラインさせる（たとえば、その他のタンパク質または核酸分子との最適なアラインメントのために、核酸分子の1つのタンパク質の配列に、ギャップを導入してもよい）。次いで、アミノ酸の残基または塩基、および対応するアミノ酸の位置または塩基を比較する。1つの配列の位置が、その他の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基によって、または同じ塩基によって占められているときは、分子はその位置において同一である。アミノ酸残基が同一でない場合、これらは、類似する可能性がある。本明細書において使用されるものとして、2つのアミノ酸残基が類似する側鎖を有する残基の同じファミリーのメンバーである場合、アミノ酸残基は、もう一つのアミノ酸残基に「類似する」。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており（たとえば、Altschulら、1990. J Mol. Biol. 215：403を参照されたい）、塩基性側鎖（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷をもたない極性の側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性の側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を含む。従って、配列間の類似性の程度（割合）は、2つの配列によって共有される統一または類似の位置の数の関数である（すなわち、%相同性=同一または類似の位置の数/位置の総数×100）。アラインメント・ストラテジーは、当技術分野において周知であり、最適な配列のための、たとえば前記Altschulらを参照されたい。
【００７５】
また、特定のファミリーに属する転写因子は、そのファミリーの既知のメンバーといくつかのアミノ酸配列類似性を共有するであろう。転写因子の典型的なメンバーの核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野において利用できる。例えば、MarAの核酸およびアミノ酸配列は、たとえば、GeneBank上で（アクセッション番号M96235またはCohenら、1993. J. Bacteriol. 175：1484において）または配列番号：1および配列番号：2において見いだすことができる。
【００７６】
転写因子ファミリーの既知のメンバーの核酸および／またはアミノ酸配列は、データベース（たとえば、一般のまたは個人的なもの）に対して検索を行うための「クエリー配列」として使用して、たとえば関連した配列を有するその他のファミリーのメンバーを同定することができる。このような検索は、たとえばAltschulら、（1990） J. Mol. Biol. 215：403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）を使用して行うことができる。BLASTヌクレオチド検索をスコア=100、語長（word length）=12でNBLASTプログラムによって行い、MarAファミリー核酸分子に相同的なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索をスコア=50、語長=3でXBLASTプログラムによって行い、本発明の転写因子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップを作製したアラインメントを得るためには、Altschulら、（1997） Nucleic Acids Res. 25 （17）：3389-3402に記載されているように、ギャップBLASTを利用することができる。BLASTおよびギャップBLASTプログラムを利用するときには、それぞれのプログラム（たとえば、XBLASTおよびNBLAST）のデフォルト・パラメータを使用することができる。
【００７７】
また、転写因子ファミリーのメンバーは、これらが特に転写因子ファミリーの既知のメンバーを特定する核酸配列に特異的にハイブリダイズする能力に基づいて同様に同定することができる。このようなストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. （1989）, 6.3.1-6.3.6に見いだすことができる。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定の例は、約45℃で6×塩化ナトリウム／クエン酸（SSC）ナトリウム中でのハイブリダイゼーション、続く0.2×SSC、0.1%のSDS、50〜65℃での1回または複数回の洗浄である。ハイブリダイゼーションのための条件は、主に二本鎖の核酸の実質的に純粋な集団の約半分の分子において観察される融解温度Tmに依存的である。Tmは、所与の配列の半分の分子が溶解するか、または一本鎖になる温度℃である。11〜23塩基の核酸配列については、Tmは、2（A+T残基の数）+4（C+G残基の数）℃程度と推定することができる。核酸分子のハイブリダイゼーションまたはアニーリングは、Tmより低い温度、たとえば、Tmより低い15℃、20℃、25℃、または30℃で行うべきである。また、塩濃度（NaClのMにおいて）の効果を算出することもでき、例えばBrown, A., “Hybridization“ pp. 503-506, in The Encyclopedia of Molec. Biol., J. Kendrew, Ed., Blackwell, Oxford （1994） を参照されたい。
【００７８】
好ましくは、このような方法で同定される転写因子ファミリーのメンバーの核酸配列は、問い合わせのヌクレオチド配列と少なくとも約10%、20%、より好ましくは少なくとも約30%で、より好ましくは少なくとも約40%同一、および好ましくは少なくとも約50%、または60%同一である。好ましい態様において、ファミリーのメンバーの核酸配列は、問い合わせのヌクレオチド配列と少なくとも約70%、80%、好ましくは少なくとも約90%、より好ましくは少なくとも約95%同一である。好ましくは、ファミリーのメンバーは、問い合わせのアミノ酸配列と少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約30%、より好ましくは少なくとも約40%同一、および好ましくは少なくとも約50%、または60%以上同一のアミノ酸配列を有する。好ましい態様において、ファミリーのメンバーの核酸配列は、問い合わせのヌクレオチド配列と少なくとも約70%、80%、より好ましくは少なくとも約90%、またはより好ましくは少なくとも約95%同一である。
【００７９】
しかし、遺伝子転写の微生物の調節因子の間の配列類似性のレベルは、同じファミリーのメンバーであっても、必ずしも高い必要はないことが理解される。配列同一性のレベルが低く、たとえば、20%より少なく（たとえば、枯草菌（B.subtilis）に対して、たとえば、B.ブルグドルフェリ（B.burgdorferi）を比較）互いに異なるゲノムの場合に、これは特にあてはまる。従って、転写因子ファミリーの構造上の類似は、また、アミノ酸残基の「三次元対応」に基づいて決定することができる。本明細書において使用されるものとして、「三次元対応」の専門用語は、空間的に一致すること、たとえば、X線結晶学によって決定された既知の転写因子ファミリーのメンバーの位置と同じである残基を含むことを意味するが、これは直線的なアラインメント・プログラムを使用してアラインしたときに一致しなくてもよい。また、「三次元対応」は、たとえば、変異解析によって決定すると、同じ機能を行う、たとえばDNAに結合するか、または同じ補因子を結合する残基を含む。このような解析は、公的に利用できる比較プログラムを使用して行うことができる。
【００８０】
「転写因子調節化合物」または「転写因子調節因子」の用語は、転写を調節する、すなわち、1つまたは複数の転写因子の発現および／または活性に影響を及ぼし、その結果転写因子の発現および／または活性を調節する、たとえば増強または阻害する化合物を含む。本用語は、たとえばAraCファミリーを調節する化合物、翼状ヘリックスを調節する化合物、ループ状のヒンジ・ヘリックスを調節する化合物、およびMarAファミリーを調節する化合物を含む。一つの態様において、転写因子を調節する化合物は、微生物の転写因子、たとえば原核生物の転写因子または真核生物の転写活性化因子を阻害する化合物である。もう一つの態様において、調節化合物は、微生物細胞に存在する転写因子を優先して調節するが、微生物細胞を収容する宿主生物の転写因子を調節しない。一つの態様において、調節化合物は、原核生物の転写因子を調節し、真核生物の転写因子を調節しない。典型的な真核細胞転写因子は、当技術分野において教示される（たとえば、Warren. 2002. Current Opinion in Structural Biology. 12：107）。
【００８１】
一つの態様において、化合物は、HTHタンパク質を調節する化合物である。「HTHタンパク質調節化合物」または「HTHタンパク質調節因子」の用語は、HTHタンパク質の活性が調節されるように、たとえば増強または阻害されるように、HTHドメインを含む1つまたは複数のタンパク質と相互作用する化合物を含む。一つの態様において、HTHタンパク質を調節する化合物は、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物である。一つの態様において、HTHタンパク質の活性は、HTHタンパク質を調節する化合物と相互作用するときに増強される。好ましい態様において、HTHタンパク質の活性は、HTHタンパク質を調節する化合物との相互作用により減少する。本明細書に記載される値に含まれる、および／または中間の値および範囲は、また、本発明の範囲内であることが企図される。
【００８２】
「MarAファミリー・ポリペプチド調節化合物」または「MarAファミリーを調節する化合物」の用語は、MarAファミリー・ペプチドの活性が増強され、または阻害され、好ましくは阻害されるように、1つまたは複数のMarAファミリー・ポリペプチドと相互作用する化合物を含む。ある態様において、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物は、阻害化合物である。さらなる態様において、MarAファミリーを阻害する化合物は、MarA、Rob、および／またはSoxSの阻害剤である。
【００８３】
「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質をいう。「ポリペプチド」は、一般にペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーと称される短鎖および一般にタンパク質と称される長鎖の両方のものを含む。ポリペプチドは、20個の遺伝子でコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」は、プロセシングおよびその他の翻訳後修飾などの天然のプロセスによるだけでなく、化学的修飾技術によって修飾されたものも含む。このような修飾は、基本的テキストに、およびより詳細な研究書に、並びに大部の研究文献に十分に記載されており、これらは当業者には周知である。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同様または様々の程度で存在してもよいことはいうまでもない。また、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
【００８４】
修飾は、ペプチド・バックボーン、アミノ酸側鎖、並びにアミノまたはカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどこにでも生じさせることができる。修飾は、たとえばアセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性の付着、ヘム部分の共有結合性の付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合性の付着、脂質または脂質誘導体の共有結合性の付着、ホスファチジルイノシトール（phosphotidylinositol）の共有結合性の付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性の架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、糖鎖形成、GPI錘形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化反応、タンパク分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、糖鎖形成、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、水酸化およびADP-リボシル化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、アルギニル化（arginylation）などの転移RNAを媒介したタンパク質に対するアミノ酸の付加、およびユビキチン結合を含む。たとえば、Proteins--Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman および Company, New York （1993） および Wold, F., Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York （1983）； Seifterら、Meth. Enzymol. 182：626-646 （1990） および Rattanら、Protein Synthesis： Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663：48-62 （1992）を参照されたい。ポリペプチドは、分岐しているか、または分岐を有しもしくは有さない環状であってもよい。環状、分枝、および分枝した環状のポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスによって生じてもよく、同様に完全に合成法によって作製されてもよい。
【００８５】
本明細書において使用されるものとして、「翼状ヘリックス」の用語は、それぞれの単量体がヘリックス-ターン-ヘリックス・モチーフに続いて、1つまたは2つのβ-ヘアーピンウイング（wing）を含む二量体の転写因子を含む（Brennan. 1993. Cell. 74：773； Gajiwala および Burley. 2000. Curer. Opin. Struct. Biol. 10：110）。古典的な翼状ヘリックス・モチーフは、配列Hl-B1-H2-T-H3-B2-W1-B3-W2（Hは、ヘリックスであり、βは、βストランドであり、Tは、ターンであり、およびWは、翼である）において、2つの翼、3つのαヘリックス、および3つのβストランドを含むが、構造には、いくつかのバリエーションが示されている（Huffman および Brennan. 2002. Current Opinion in Structural Biology. 12：98）。
【００８６】
本明細書において使用されるものとして、「環状ヒンジ・ヘリックス」の用語は、DNAの非存在下において、4つのストランドのβシートからなる二量体のN末端領域、並びに1つのαヘリックスおよび「環状ヒンジ」を含むC末端DNA結合領域を露呈しているAbrBなどの転写因子を含んだ（たとえば、Huffman および Brennan. 2002 Current Opinion in Structural Biology 12：98を参照されたい）。AbrBのR23およびR24に対応する残基は、DNA認識に重要であり、DNA結合領域の陽電気を帯びた性質に寄与する。
【００８７】
好ましいポリペプチド（およびこれらをコードする核酸分子）は、「天然に存在する」。本明細書において使用されるものとして、「天然に存在する」分子は、天然に存在するアミノ酸またはヌクレオチド配列を有する分子をいう（たとえば、天然のポリペプチド）。さらに、同じ機能的活性（標的核酸分子に（たとえば、marboxを含む）または天然に存在するポリペプチドを有するポリペプチド（たとえば、RNAポリメラーゼ）に結合する能力など）を保持するポリペプチドおよび核酸分子の天然に存在するかまたは天然に存在しない変種が提供され、本アッセイ法に使用することができる。このような免疫性の交差反応性は、たとえば、変種が転写因子応答配列に結合する能力によって示すことができる。このような変種は、たとえば当技術分野において既知の技術を使用する突然変異によって作製することができる。または、変種は、化学的に合成することができる。
【００８８】
本明細書において使用されるものとして、「変種」の用語は、参照の核酸分子またはポリペプチドと異なるが、その必須な性質を保持する核酸分子またはポリペプチドを含む。変種の配列のヌクレオチドの変化は、参照の核酸分子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもよく、または変更しなくてもよい。ヌクレオチドまたはアミノ酸の変化は、天然に存在する参照配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および切り詰めを生じてもよい。ポリペプチドの典型的な変種は、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般に、相違は、参照ポリペプチドおよび変種の配列が全体的によく似ており、多くの領域において同一であるように制限される。変種および参照ポリペプチドは、任意の組み合わせにおける1つまたは複数の置換、付加、および／または欠失によってアミノ酸配列が異なっていてもよい。
【００８９】
核酸分子またはポリペプチドの変種は、対立形質の変種など、天然に存在してもよく、または天然に存在することが既知でない変種であってもよい。核酸分子およびポリペプチドの天然に存在しない変種は、突然変異誘発技術によって、直接の合成によって、および当業者に既知のその他の組換え方法によって、参照核酸分子またはポリペプチドから作製してもよい。または、変種は、化学的に合成することができる。たとえば、機能的に同等の自己ポリペプチドの人工または変異体の形態（たとえば、転写因子応答配列と相互作用する能力を有するもの）は、当技術分野において周知の技術を使用して作製することができる。
【００９０】
突然変異は、たとえば、置換を生じることができるか、または少なくとも1つの欠失もしくは挿入による、少なくとも1つの分離した点突然変異を含むことができる。たとえば、突然変異は、ランダムな突然変異誘発によるか、またはカセット突然変異誘発を使用して作製することもできる。前者のものについては、分子の全てのコード領域がいくつかの方法（化学的、PCR、ドーピングしたオリゴヌクレオチド合成）のうちの1つによって変異誘発され、ランダムに変異された分子のそのコレクションが選択またはスクリーニング法に供される。後者においては、定義された構造または機能的な決定因子のいずれかに対応するポリペプチドの分離した領域を飽和またはセミランダム突然変異誘発に供し、これらの変異誘発されたカセットを別の野生型対立遺伝子の前後関係に再導入されている。一つの態様において、PCR突然変異誘発を使用することができる。たとえば、メガプライマーPCR（Megaprimer PCR）を使用することことができる（O. H. Landt, 1990. Gene 96：125-128）。
【００９１】
「転写因子の活性」の専門用語は、転写因子がDNAと相互作用する、たとえば転写因子応答性プロモーターに対して結合する、またはこのようなプロモーターからの転写を開始する能力を含む。
【００９２】
「MarAファミリー・ポリペプチドの活性」の専門用語は、MarAファミリー・ポリペプチドがDNAと相互作用する、たとえばMarAファミリー・ポリペプチドに応答性のプロモーターと結合する、またはこのようなプロモーターからの転写を開始する能力を含む。MarAは、転写性の活性化因子として（たとえば、inaA、galT、micFなどの遺伝子をアップレギュレートする）およびリプレッサーとして（たとえば、fecA、purA、guaBなどの遺伝子をダウンレギュレートする）両方に機能する（Alekshun, 1997, Antimicrob. Agets Chemother. 41：2067-2075； Barbosa & Levy, J. Bact. 2000, Vol. 182, p.3467-3474； Pomposielloら、J. Bact. 2001, Vol 183, p.3890-3902）。
【００９３】
「転写因子応答配列」の専門用語は、微生物においてオペロンの転写の開始に関与する転写因子と相互作用することができる核酸配列（たとえば、プロモーターまたはエンハンサーまたは作動遺伝子）を含む。種々の転写因子に応答する転写因子応答配列は、当技術分野において既知であり、さらなる応答配列は、当技術分野の当業者によって同定することができる。たとえば、マイクロアレイ解析は、関心対象の転写因子によって調節される遺伝子を同定するために使用することができる。たとえば、転写因子によって調節される遺伝子は、転写因子を欠失する細胞よりも、野生型の細胞において高レベルで発現される。加えて、所与の転写因子に応答する遺伝子は、これらのプロモーター領域の転写因子に応答する1つまたは複数の標的配列を含む（Lyonsら、2000. PNAS 97：7957）。典型的な応答配列には、以下が含まれる：araBAD、araE、araFGH（AraCに応答する）；melBAD（MelRに応答する）；rhaSR（RhaRに応答する）；rahBAD、rhaT（RhaSに応答する）；Pm（XylSに応答する）；fumC、inaA、micF、nfo、pai5、sodA、tolC、acrAB、fldA、fpr、mar、poxB、ribA、およびzwf（MarA、SoxS、Robに応答する）；およびcoo、rns（Rnsに応答する）。
【００９４】
「marAファミリー・ポリペプチド応答配列」の専門用語は、marAと相互作用することができる核酸配列、たとえば、微生物の核酸配列の転写の調節に関与するプロモーターまたはエンハンサーを含む。MarA応答配列は、その標的に対するMarAの結合のために重要な配列である約16塩基対のmarbox配列を含む。加えて、一次marboxの上流のアクセサリーmarboxである二次サイトは、基礎および脱抑制（derepressed）されたmar転写に関与する。marboxは、前方または後方のいずれの方向に位置していてもよい（Martin, 1999, Mol. Microbiol. 34：431-441）。marRABオペロンにおいて、marboxは、後方方向であり、したがってmarRABに関してセンス鎖上に位置する（Martin, 1999, Mol. Microbiol. 34：431-441）。特定のプロモーターのmarbox配列内の微妙な相違は、MarAおよびその他の関連する、たとえばSoxSおよびRob、転写因子によるディファレンシャルな制御の原因となる（Martin, 2000, Mol Microbiol； 35 （3）：623-34）。一つの態様において、MarAファミリー応答配列は、構造的にまたは機能的にmarAプロモーターに関連があるプロモーターであり、たとえば、MarAまたはMarAに関連したタンパク質と相互作用する。
【００９５】
好ましくは、markファミリー・ポリペプチド応答配列は、mar RABプロモーターである。たとえば、marオペロンにおいて、いくつかのプロモーターは、本明細書で定義した通りのmarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターであり、たとえば、marO領域由来の405-bpのThaI断片は、markファミリー応答性プロモーターである（Cohenら、1993. J. Bact. 175：7856）。加えて、MarAは、16bpのMarA結合部位に結合することが示された（marO内の「marbox」と称する（Martinら、1996. J. Bacteriol. 178：2216）。また、MarAは、acrAB；micF；mlr1,2,3；slp；nfo；inaA；fpr；sodA；soi-17,19；zwf；fumC；またはrpsFプロモーターからの転写に影響を及ぼす（Alekshun and Levy. 1997. Antimicrobial Agents and Chemother. 41：2067）。その他のmarAファミリー応答性プロモーターは、当技術分野において既知であり、AraCによって活性化されるaraBAD、araE、araFGH、およびaraC；XylSによって活性化されるPm；MelRによって活性化されるmelAB；並びにRobによって結合されるoriCが含まれる。
【００９６】
「MarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーター」の専門用語は、MarAファミリー・メンバータンパク質と相互作用することにより転写を活性化するために十分な、上記プロモーターの部分を含む。これらの活性に最小限必要とされるMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターのいずれの部分も、当技術分野の当業者によって、たとえば突然変異誘発を使用して容易に決定することができる。例示的な技術は、Gallegosら、（1996, J. Bacteriol. 178：6427）によって記載されている。また、「MarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーター」は、天然に存在するMarAファミリー・プロモーターと同じ機能を有するMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターの天然に存在しない変種を含む。好ましくは、このような変種は、天然に存在するMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターと少なくとも30%以上、40%以上、または50%以上のヌクレオチド配列同一性を有する。好ましい態様において、このような変種は、天然に存在するMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターと少なくとも約70%のヌクレオチド配列同一性を有する。より多くの好ましい態様において、このような変種は、天然に存在するMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターと少なくとも約80%のヌクレオチド配列同一性を有する。特に好ましい態様において、このような変種は、天然に存在するMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターと少なくとも約90%のヌクレオチド配列同一性、および好ましくは少なくとも約95%のヌクレオチド配列同一性を有する。さらにその他の態様において、MarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターの変種をコードする核酸分子は、天然に存在するMarAファミリー・ポリペプチド応答性プロモーターをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【００９７】
一つの態様において、本明細書に記載されている方法は、本発明の転写因子に反応するものとして同定された分子、すなわち発現が転写因子によって制御されているレギュロンの分子を使用することができる。たとえば、微生物の転写因子によって直接調節される遺伝子（たとえば、marAファミリー転写因子）の転写を調節する化合物は、微生物の病原性を調節するか、または微生物による感染を調節するために使用することができる。もう一つの態様において、このような遺伝子は、本明細書に記載されている方法を使用して、病原性を制御する際に重要なものとして同定することができる。本明細書において使用するものとして、「レギュロン」の用語は、その発現が共通のリプレッサーまたは活性化因子タンパク質によって調節される2つ以上の異なるオペロン中の2つ以上の座を含む。
【００９８】
「相互作用する」の用語は、測定できる効果を生じる分子間の近接した接触、たとえば、1つの分子のもう一つとの結合を含む。たとえば、転写因子は、転写因子応答配列と相互作用して、DNAの転写のレベルを変えることができる。同様に、化合物は、転写因子と相互作用して、転写因子の活性を変えることができる。
【００９９】
「誘導性プロモーター」の用語は、これらが制御する遺伝子の合成を誘導するために活性化されるプロモーターを含む。本明細書において使用するものとして、「構成的プロモーター」の用語は、誘導因子の存在を必要とせず、たとえば連続的に活性であるプロモーターを含む。
【０１００】
「微生物」の用語は、転写因子、たとえばHTH含有転写因子、AraCファミリー・ポリペプチド、またはmarAファミリー・ポリペプチドを発現するか、または発現するために作製された微生物を含む。「微生物」は、いくらかの経済的な重要性があり、たとえば環境的に重要であるか、またはヒト病原体として重要である。たとえば、一つの態様において、微生物は、環境問題、たとえば汚損もしくは腐敗を引き起こすか、または植物物質の分解などの有用な機能も行う。もう一つの態様において、微生物は、哺乳類の内または上に生存し、医学的に重要である生物体である。好ましくは、微生物は単細胞であり、細菌、真菌、または原生動物を含む。もう一つの態様において、本発明に使用する適切な微生物は、多細胞、たとえば寄生生物または真菌である。好ましい態様において、微生物は、ヒト、動物、または植物に対して病原性である。微生物は、無処置の細胞としてまたは無細胞アッセイ法のための材料の供与源として、および／または治療方法の標的として、使用されてもよい。一つの態様において、微生物は、原核生物を含む。その他の態様において、微生物には、真核生物を含む。表1および3は、MarA相同体を含む細菌の部分的な一覧を提供する。
【０１０１】
（表３）MarA相同体を有する種の部分的な一覧
MarA
大腸菌
UPEC（尿路病原性）
EPEC（腸管病原性）
ETEC（腸内毒素原性）
EHEC（腸管出血性）
EAEC（腸内凝集性）
EIEC（腸内浸潤性）
ETEC（腸内毒素原性）
DHEC（下痢に付随した溶血性）
CTD（細胞致死的な膨張毒素を産生）
サルモネラ・エンテリカ
コレラスイス（Cholerasuis）（敗血症）
エンテリティディス（Enteritidis）
チフィムリウム（Typhimurium）
チフィムリウム(多剤耐性)
チフィムリウムDT104
サルモネラ・チフィ（Typhi）
エンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica）
ペスト菌（Yersinia pestis）
偽結核エルシニア菌（Y. pseudotuberculosis）
緑膿菌
エンテロバクター種
クレブシエラ種
プロテウス種
炭疽菌
バークホルデリア・プソイドマレイ（Burkholderia pseudomallei）
ブルセラ・スイス（Brucella suis）
ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）
シトロバクター種
赤痢菌種
フレクスナー赤痢菌（S.flexneri）
ゾンネ赤痢菌（S.sonnei）
志賀赤痢菌（S.dysenteriae）
プロビデンシア・スチュアルチ（Providencia stuartii）
髄膜炎菌（Neisseria meniyagitidis）
結核菌
ライ菌
黄色ブドウ球菌
化膿連鎖球菌
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）
百日咳菌（Bordetella pertussis）
ボルデテラ・ブロンキセプチカータ（Bordetella bronchisepticatas）
【０１０２】
一つの態様において、本明細書に記載されているアッセイ法は、選択マーカーおよびリポーター遺伝子などの指標を使用することができる。選択マーカーの用語は、指標として役立つポリペプチドを含み、たとえば細胞によって発現されたときに、選択可能なまたはスクリーン可能な（screenable）形質を提供する。「選択マーカー」の用語は、選択可能なマーカーおよび対比選択可能な（counter selectable）マーカーを含む。本明細書において使用されるものとして、「選択可能なマーカー」の用語は、アッセイ法の試験パラメータを満たす化合物または分子が存在するときに、増殖優位性を生じるマーカーを含む。「対比選択可能なマーカー」の用語は、対比選択可能なマーカーの発現を引き起こす条件を破壊させる化合物または分子が存在しない限り、増殖優位性を生じるマーカーを含む。典型的な選択マーカーには、細胞障害性の遺伝子産物、抗生物質抵抗性を与える遺伝子産物、増殖のために必須である遺伝子産物、特定の代謝の基質の存在下で発現されときに選択的な増殖優位性を与える遺伝子産物（たとえば、URA3遺伝子の発現は、5-フルオロオロト酸の存在下で増殖優位性を与える）が含まれる。
【０１０３】
本明細書において使用されるものとして、「リポーター遺伝子」の用語は、動作可能に制御配列に、たとえば転写因子応答性プロモーターに結合された容易に検出可能な産物をコードする任意の遺伝子を含む。動作可能に結合されたとは、適切な条件下で、リポーター遺伝子が転写されるように、RNAポリメラーゼが制御領域のプロモーターに結合して、ヌクレオチド配列を転写し続けるであろうことを意味する。好ましい態様において、リポーター遺伝子は、リポーター遺伝子にフレームで結合された転写因子応答性プロモーターからなる。特定の態様において、しかし、リポーター遺伝子構築物にその他の配列、たとえば転写性の制御配列を含むことも望ましいであろう。たとえば、プロモーターの活性の調節は、プロモーター領域に対するRNAポリメラーゼの結合を変えることによって、または代わりに、転写の開始もしくはmRNAの伸長を妨げることによって生じさせてもよい。したがって、本明細書においてひとまとめにして転写調節エレメントまたは配列と称する配列は、リポーター遺伝子構築物に含まれていてもよい。加えて、構築物は、生じるmRNAの翻訳を変化させることにより、リポーター遺伝子産物の量を変化させるヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１０４】
リポーター遺伝子の例は、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Alton および Vapnek （1979）, Nature 282：864-869）ルシフェラーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼなどのその他の酵素検出システム；蛍ルシフェラーゼ（deWetら、（1987）, Mol. Cell. Biol. 7：725-737）；細菌ルシフェラーゼ（Engebrecht および Silverman （1984）, PNAS 1：4154-4158； Baldwinら、（1984）, Biochemistry 23：3663-3667）；PhoA、アルカリホスファターゼ（Tohら、（1989） Eur. J. Biochem. 182：231-238、 Hallら、（1983） J. Mol. Appl. Gen. 2：101）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（Cullen および Malim （1992） Methods in Enzymol. 216：362-368）、並びに緑色蛍光タンパク質（米国特許第5,491,084号；国際公開公報第96/23898号）を含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明の特定の態様において、「単離されたか、または組換え型の」核酸分子転写因子、またはこれらの変異体を得ることが望ましいであろう。「単離されたか、または組換え型の」の用語は、たとえば、（1）たとえばインビトロでポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって増幅され；（2）クローニングによって組換えで産生され、または（3）切断およびゲル分離によって精製され；または（4）たとえば化学合成によって合成された核酸分子を含む。このような核酸分子は、ゲノム中に天然にこれに隣接する配列から、および細胞成分から単離される。
【０１０６】
本発明のさらにその他の態様において、実質的に精製されたか、または組換えの転写因子を得ることが望ましいであろう。このようなポリペプチド、たとえば、転写因子をコードする単離されるか、または組換えの核酸分子を発現するように設計された細胞から精製することができる。たとえば、より詳細を下記に説明したように、転写因子をコードするプラスミドで細菌細胞を形質転換することができる。次いで、転写因子を細菌細胞から精製して、たとえば本明細書に記載されているか、または当技術分野において既知の無細胞アッセイ法に使用する。
【０１０７】
本明細書において使用するものとして、「抗生物質」の用語は、天然の供与源から単離されたか、または化学的に合成された抗菌薬を含む。「抗生物質」の用語は、ヒトの治療に使用する抗菌薬をいう。好ましい抗生物質には、テトラサイクリン、フルオロキノロン、クロラムフェニコール、ペニシリン、セファロスポリン、ピューロマイシン、ナリジクス酸、およびリファンピンが含まれる。
【０１０８】
「試験化合物」の用語は、本発明のアッセイ法に使用され、たとえばこれが相互作用するポリペプチドに、または分子に対して結合することによって、転写因子の活性に影響を及ぼすその能力についてアッセイされる任意の試薬または試験薬剤、たとえばAraCファミリー・ポリペプチド、HTHタンパク質、および／またはMarAファミリー・ポリペプチドを含む。スクリーニングするアッセイ法において、1つ以上の化合物、たとえば複数の化合物を、これらが転写因子の活性、たとえばAraCファミリー・ポリペプチド、HTHタンパク質、またはMarAファミリー・ポリペプチドの活性を調節する能力について同時に試験することができる。「スクリーニングアッセイ法」の用語は、好ましくは、1つの化合物が読み出しに影響を及ぼす能力を試験する試験以外の複数の化合物が選択の読み出しに影響を及ぼす能力を試験するアッセイ法をいう。一つの態様において、化合物の活性をアッセイするためにハイスループットスクリーニング法を使用することができる。一つの態様において、試験化合物は、MarAファミリーを調節する化合物である。
【０１０９】
活性をスクリーニングすることができる例示的な試験化合物は、ペプチド、非ペプチド性の化合物、核酸、炭水化物、小有機分子（たとえば、ポリケチド）、および天然物抽出物ライブラリーを含むが、これらに限定されない。「非ペプチド性の試験化合物」の用語は、少なくとも一部において、天然のペプチド結合によって結合された天然に存在するL-アミノ酸残基とは異なる分子構造で構成される化合物を含む。しかし、「非ペプチド性の試験化合物」は、全体的にあるいは部分的に、D-アミノ酸、天然に存在しないL-アミノ酸、修飾されたプチド・バックボーン、などのペプチド擬態性の構造で構成される化合物、並びに全体的にあるいは部分的に、天然のペプチド結合によって結合され天然に存在するL-アミノ酸残基とは無関係な分子構造で構成される化合物を含む。また、「非ペプチド性の試験化合物」は、天然物を含むことが企図される。
【０１１０】
一つの態様において、小分子は、試験化合物として使用することができる。「小分子」の用語は、本技術分野の用語であり、約7500未満、約5000未満、約1000未満の分子量、または約500未満の分子量の分子を含む。一つの態様において、小分子は、ペプチド結合を含むだけではない。もう一つの態様において、小分子は、オリゴマーではない。活性をスクリーニングすることができる例示的な小分子化合物は、ペプチド、ペプチド擬態、核酸、炭水化物、小有機分子（たとえば、ポリケチド）（Caneら、1998. Science 282：63）、および天然物抽出物ライブラリーを含むが、これらに限定されない。もう一つの態様において、化合物は、小さな有機物の非ペプチド性の化合物である。さらなる態様において、小分子は、生合成されない。たとえば、小分子は、望ましくはそれ自体、転写または翻訳の産物はない。
【０１１１】
「アンタゴニスト」の用語は、化合物を調節する転写因子（たとえば、AraCファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、HTHタンパク質を調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、その他）を含み、これらは転写因子（たとえば、AraCファミリーを調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、その他）に結合して不活性化することによって、たとえば、転写因子が相互作用する核酸標的（たとえば、MarAについては、marbox）に結合することによって、特定のレギュロンの活性化の原因となるシグナル伝達経路（たとえば、Marについては、MarRの不活性化もしくはMarA合成の活性化）を破壊させることによって、および／または重要なタンパク質-タンパク質相互作用（たとえば、MarAが転写因子として機能するために必要とされるMarA-RNAポリメラーゼの相互作用）を破壊することによって、転写因子の活性を阻害する。アンタゴニストは、たとえば小さな細胞浸透性有機分子、核酸インターキレーター、ペプチドなどの天然に（たとえば、TrpR-トリプトファンおよびLacI-ラクトース）または化学的に合成された化合物を含んでいてもよい。
【０１１２】
「アゴニスト」の用語は、転写因子を調節する化合物（たとえば、AraCファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、HTHタンパク質を調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、その他）を含み、これらは転写因子（たとえば、AraCファミリーを調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、その他）に結合して活性化することによって、転写因子が相互作用する核酸標的（たとえば、MarAについては、marbox）に結合することによって、特定のレギュロンの活性化の原因となるシグナル伝達経路（たとえば、Marについては、MarRの不活性化もしくはMarA合成の活性化）を容易にすることによって、および／または重要なタンパク質-タンパク質相互作用（たとえば、MarAが転写因子として機能するために必要とされるMarA-RNAポリメラーゼの相互作用）を容易にすることによって、転写因子の活性を促進する。アゴニストは、小さな細胞浸透性有機分子、核酸インターキレーター、ペプチドなどの天然にまたは化学的に合成された化合物を含んでいてもよい。
【０１１３】
転写因子が転写を活性化または抑制することができることは、当業者にはよく理解されているであろう。従って、修飾因子（たとえば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、調節されない転写因子の活性に応じて、転写を増加または減少するであろう。
【０１１４】
II.微生物の転写因子または転写因子ドメインを含むポリペプチド
転写因子または転写因子ドメインを含むポリペプチドは、天然に存在するタンパク質であることができ、またはたとえば、少なくとも1つの転写因子の一部を含む融合タンパク質（たとえば、全長ポリペプチドの活性を保持するドメイン、たとえばこれらは、転写因子応答配列に結合できるか、もしくはこれらの指標となる機能を保持しており、たとえば、ヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメインである）および非転写因子タンパク質であることができる。
【０１１５】
ポリペプチド転写因子またはこれらの機能的なドメインをコードする核酸分子は、ベクターを使用して細胞に発現させることができる。ほとんど全ての従来のデリバリーベクターを使用することができる。このようなベクターは商業的に広く入手でき、所与の微生物細胞での使用に適したベクターを選択することは、当業者の裁量の範囲内である。これらのポリペプチドをコードする配列は、自己再生するベクター上で細胞内に導入することができ、または相同的組換えを使用して微生物の染色体に、もしくはトランスポゾンなどの挿入配列によって導入されてもよい。
【０１１６】
ほとんど全ての従来のデリバリーベクターを使用することができる。このようなベクターは商業的に広く利用でき、所与の微生物細胞での使用に適したベクターを選択することは、当業者の裁量の範囲内である。これらのドメインをコードする配列は、細胞内に自己再生するベクター上で導入することができ、または相同的組換えを使用して微生物の染色体に、もしくはトランスポゾンなどの挿入配列によって導入されてもよい。
【０１１７】
これらの核酸は、標準的な技術を使用して、たとえば塩化カルシウムまたは電気穿孔法を使用する形質転換によって、微生物細胞に導入することができる。このような微生物へのDNAの導入のための技術は、当技術分野において周知である。
【０１１８】
一つの態様において、たとえばポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）；クローニングによって組換えで産生され、もしくは切断およびゲル分離によって精製されたものとして；または合成、たとえば化学合成によってインビトロで増幅された核酸分子を、MarAファミリー・ポリペプチドを産生するために使用することができる（George, A. M. & Levy, S. B. （1983） J. Bacteriol. 155, 541-548； Cohen, S. P.ら、（1993） J Infect. Dis. 168, 484-488； Cohen, S. Pら、（1993） J Bacteriol. 175, 1484-1492； Sulavick, M. C.ら、（1997） J. BacterioL 179, 1857-1866）。
【０１１９】
宿主細胞は、本発明の核酸分子を組み込むために遺伝的に操作することができる。一つの態様において、核酸分子を特定する転写因子は、ベクターに配置することができる。「ベクター」の用語は、結合された別の核酸分子を輸送することができる核酸分子をいう。「発現ベクター」または「発現系」の用語は、細胞による発現のために適した形態の（たとえば、プロモーターに結合された）遺伝的構築物を含む任意のベクター（たとえば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む。、プラスミドは、ベクターの共通に使用される形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たすその他のベクターを含むことが企図される。本発明のポリペプチドを産生するために、多くの種類の発現系を使用することができる。このようなベクターは、とりわけ、染色体、エピソーム、およびウイルスに由来するベクター、たとえば、細菌のプラスミドに由来、バクテリオファージに由来、トランスポゾンに由来、酵母エピソームに由来、挿入配列に由来、酵母染色体のエレメントに由来、バキュロウイルス、SV40などのパポバ・ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター、並びにコスミドおよびファージミドなどのプラスミドとバクテリオファージの遺伝因子に由来するものなどのこれらの組み合わせに由来するベクターを含む。
【０１２０】
適切なベクターは、商業的に広く入手でき、所与の宿主細胞での使用に適したベクターを選択することは、当業者の裁量の範囲内である。たとえばMarAファミリー・ポリペプチドなどの転写因子をコードする配列は、細胞内に自己再生するベクター上で導入することができ、または相同的組換えを使用して微生物の染色体に、もしくはトランスポゾンなどの挿入配列によって導入されてもよい。
【０１２１】
これらのタンパク質を特定する遺伝子は、PCRおよび細菌ゲノムDNAを使用して増幅することができる。次いで、これらのPCR産物は、pET15b（Novagen, Madison, WI）にクローン化してそれぞれのタンパク質に6-Hisタグを組み込むことができ、タンパク質を発現させて、標準的な方法に従って精製されるであろう。
【０１２２】
発現系構築物は、発現を調節する制御領域を含んでいてもよい。「転写制御配列」は、開始シグナル、エンハンサー、作動遺伝子、およびプロモーターなどのDNA配列をいう総称語であり、これらは、動作可能に結合されたポリペプチド・コード配列の転写を誘導するまたは制御する。また、転写因子遺伝子をコードする組換遺伝子、たとえばHTHタンパク質遺伝子もしくはAraCファミリー・ポリペプチド、たとえばMarAファミリー・ポリペプチドは、天然に存在する転写因子遺伝子の転写を制御する配列と同じか、または異なる転写制御配列の制御下にあることができることが理解される。例示的な制御配列は、Goeddel； Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA （1990）に記載されている。たとえば、任意の多種多様な発現制御配列であって、これに機能的に結合されたときにDNA配列の発現を制御する配列を、ポリペプチドをコードするDNA配列を発現させるために、これらのベクターに使用してもよい。
【０１２３】
一般に、この点に関しては、核酸分子を維持、伝播、もしくは発現するために、および／または宿主中にポリペプチドを発現するために適した任意のシステムまたはベクターを発現のために使用してもよい。適切なDNA配列は、たとえばSambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（前記）などの周知かつルーチンの種々の任意の技術によって発現系に挿入されてもよい。
【０１２４】
ポリペプチドをコードし、細菌、たとえばグラム陽性、グラム陰性において、またはサッカロマイセスもしくはピチア（Pichia）などの単純な真核生物の真菌細胞において、または昆虫、鳥類、哺乳類、または植物などの真核生物の細胞において複製できる遺伝子の発現のための例示的な発現ベクターは、当技術分野において既知である。このようなベクターは、発現のために宿主、たとえばストレプトミセスのための、および遺伝子操作およびベクター構築のための宿主、たとえば大腸菌のための、両方のための複機能的な製特定配列（レプリコン）を有していてもよい。たとえば、米国特許第4,745,056号を参照されたい。種々の生物体に適したベクターは、Ausubel, F.ら、Short Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York （1995）に記載されており、たとえばピチアについては、Invitrogen（Carlsbad, CA）から得ることができる。
【０１２５】
有用な発現制御配列は、たとえばSV40初期および後期プロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、lacシステム、trpシステム、TACまたはTRCシステム、その発現がT7 RNAポリメラーゼによって誘導されるT7プロモーター、λファージの主要作動遺伝子およびプロモーター領域、fd外殻ポリペプチドのための制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、たとえばPho5、酵母のα-接合因子プロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、並びに原核もしくは真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが既知のその他の配列、並びにこれらの種々の組み合わせを含む。有用な翻訳のエンハンサー配列は、米国特許第4,820,639号に記載されている。
【０１２６】
一つの態様において、本発明のポリペプチドを発現するために誘導性プロモーターを使用する。たとえば、一つの態様において、trp（トリプトファンによって誘導される）、tac（ラクトースによって誘導される）、もしくはtet（テトラサイクリンによって誘導される）を細菌細胞において使用することができ、またはGAL1（ガラクトースによって誘導される）を宿主細胞において使用することができる。
【０１２７】
もう一つの態様において、構成的プロモーターは、本発明のポリペプチドを発現させるために使用することができる。
【０１２８】
発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが望まれるポリペプチドのタイプの因子などに依存してもよいことが理解されるはずである。適切な宿主の代表例は、グラム陽性、グラム陰性細胞などの細菌細胞；酵母細胞およびコウジカビ属細胞などの真菌の細胞；ショウジョウバエS2およびSpodoplera Sf9細胞などの昆虫細胞；CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、およびBowes黒色腫細胞などの動物細胞；並びに植物細胞を含む。
【０１２９】
一つの態様において、本発明の異種ポリペプチドを発現するために使用する細胞は、AraCファミリー・ポリペプチドもしくはMarAファミリー・ポリペプチドなどの1つまたは複数の内因性の転写因子を機能しなくするか、または1つまたは複数の内因性のポリペプチドを発現させないようにする突然変異を含む。この方法での遺伝的背景の操作により、MarAファミリーもしくはAraCファミリーのメンバーなどの特異的な転写因子、または複数の転写因子を調節する化合物をスクリーニングすることができる。
【０１３０】
その他の態様において、内因性の宿主座からの干渉がないように、突然変異を宿主細胞のその他の関連した遺伝子にも作製してもよい。さらにもう一つの態様において、従属栄養体を作製するために、突然変異を染色体遺伝子に作製してもよい。
【０１３１】
宿主細胞への核酸分子の導入（「形質転」）は、Davisら、Basic Methods In Molecular Biology, （1986）、およびSambrookら、Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd Ed.  Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （1989）などの多くの標準的な研究室マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。例には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランを媒介したトランスフェクション、トランスベクション（transvection）、微量注入、陽イオン性の脂質を媒介したトランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、掻爬充填（scrape loading）、弾道導入（ballistic introduction）、および感染を含む。
【０１３２】
ポリペプチド、たとえば組換えで発現されたポリペプチドの精製は、当技術分野において既知の技術を使用して達成することができる。たとえば、細胞から分泌された形態でポリペプチドが発現される場合、培地を収集することができる。代わりに、細胞によって保持される形態でポリペプチドが発現される場合、ポリペプチドを放出させるために宿主細胞を溶解することができる。このような使用済みの培地または細胞可溶化物は、ポリペプチドを濃縮し、精製するために使用することができる。たとえば、培地または可溶化液は、カラム、たとえばポリペプチドに特異的な抗体が結合されたカラムを通すことができる。代わりに、このような抗体は、第1のポリペプチドの精製を容易にするために、第1のポリペプチドに融合された第2のポリペプチド（たとえば、タグに）に特異的であることができる。ポリペプチドを精製するその他の手段も当技術分野において既知である。
【０１３３】
III.転写因子の活性を調節する抗感染性化合物を同定するための方法
転写因子アゴニストおよびアンタゴニストは、種々の方法でアッセイすることができる。たとえば、一つの態様において、本発明は、たとえば化合物が転写因子核酸分子または転写因子ポリペプチドと相互作用する能力、または化合物が転写因子ポリペプチドの活性および／または発現を調節する能力を測定することによって転写因子を調節する化合物を同定するための方法を提供する。
【０１３４】
さらに、転写因子ポリペプチドまたは転写因子核酸分子が通常結合する分子、たとえば核酸、補因子、もしくはタンパク質分子に対するこれらの結合を調節する化合物の能力を試験することができる。
【０１３５】
一つの態様において、転写因子およびその同族のDNA配列は、無細胞系、たとえば細胞可溶化物に存在することができ、化合物の相互作用に対する効果は、当技術分野において既知の技術を使用して測定することができる。
【０１３６】
好ましい態様において、アッセイ系は、細胞に基づいた系である。本方法を使用して同定される化合物は、たとえば微生物の病原性を減少させるために、およびこれにより、微生物が宿主における感染を引き起こす能力を減少させるために有用である。
【０１３７】
本試験化合物が、転写因子の発現および／または活性を調節する能力は、種々の方法で決定することができる。本アッセイ法に使用することができる例示的な方法は、当技術分野において既知であり、たとえば第5,817,793号および国際公開公報第99/61579号に記載されている。その他の例示的な方法も、以下に更に詳細に記載されている。
【０１３８】
一つの態様において、本発明は、試験化合物と転写因子（または、これらの部分）を発現する細胞を、細胞と試験化合物の相互作用が可能な条件下で接触させることにより、転写因子（たとえば、HTHタンパク質、MarAファミリー・ポリペプチド、AraCファミリー・ポリペプチド、その他）の発現および／または活性を調節する試験化合物を同定する方法を提供する。
【０１３９】
細胞に基づいたアッセイ法は、自動液体ディスペンサーおよびロボット計測を使用する比較的ハイスループットな方法で行うことができる。任意に、細胞増殖抑制性である化合物を同定するために、対照を含めることもできる。また、ロボット計測並びに種々のグラム陽性およびグラム陰性の生物体の標準的なパネルを使用して達成されるMICアッセイ法を、標準的な方法を使用して同定される任意の化合物に対して行うことができる。好ましくは、転写因子修飾性の化合物は、内因性の抗菌活性を有さない。
【０１４０】
インビトロアッセイ法のためには、化合物の非特異的な相互作用、たとえばDNAインターキレーターを検出するために、対照分子、たとえば非MarAまたはAraCタンパク質を任意に含めることができる。
【０１４１】
好ましくは、本アッセイ法を使用して同定される化合物は、少なくとも1つの転写因子を調節するために有効である。一つの態様において、化合物は、複数の転写因子を調節するために有効である。一つの態様において、化合物は、関連した複数の転写因子を調節するために有効である。もう一つの態様において、化合物は、無関係な複数の転写因子を調節するために有効である。もう一つの態様において、化合物は、特異的に1つの転写因子を調節する。
【０１４２】
本発明のアッセイ法は、組み合わせることができる。たとえば、化合物は、予備的な無細胞スクリーニングアッセイ法で同定することができる。有望な化合物は、細胞に基づいて、および／または動物アッセイ法でさらに試験することができる。
【０１４３】
1.全細胞体アッセイ法
本発明の一つの態様において、本スクリーニングアッセイ法は、全細胞を使用して行うことができる。本発明の一つの態様において、化合物が転写因子の活性または発現を減少させるかどうかを決定する工程は、化合物と転写因子を発現する細胞を接触させることと、化合物が転写因子の活性および／または発現を調節する能力を測定することとを含む。
【０１４４】
もう一つの態様において、転写因子の発現の修飾因子は、細胞を候補化合物と接触させて、細胞における転写因子のmRNAまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下における転写因子のmRNAまたはタンパク質の発現レベルを候補化合物の非存在下で転写因子のmRNAまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、転写因子発現の修飾因子として候補化合物を同定することができる。たとえば、転写因子のmRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下においてその非存在よりも大きい（たとえば、統計学的に有意に大きい）ときは、候補化合物は、転写因子のmRNAまたはタンパク質発現の刺激剤として同定される。代わりに、転写因子のmRNAまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下においてその非存在よりも少ない（たとえば、統計学的に有意に少ない）ときは、候補化合物は、転写因子のmRNAまたはタンパク質発現の阻害剤として同定される。細胞における転写因子のmRNAまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載されている転写因子のmRNAまたはタンパク質を検出するための方法によって決定することができる。
【０１４５】
転写因子の発現を測定するために、転写因子遺伝子の転写を化合物で処理されていない対照細胞において測定して、化合物で処理した試験細胞のものと比較することができる。たとえば、内因性の転写因子を発現するか、または組換え転写因子を発現もしくは過剰発現するように設計された細胞により、関心対象の試験調節薬剤の存在下および非存在下で組換え転写因子を発現もしくは過剰発現させて、試験薬剤によって媒介される標的細胞による転写因子応答の調節について、アッセイをスコアリングすることができる。たとえば、無細胞アッセイ法と同様に、変化、たとえば統計学的に有意な変化（増加または減少）を生じさせる調節薬剤を同定することができる。
【０１４６】
転写因子の発現のために使用することができる組換え発現ベクターは、当技術分野において既知である（上記の議論を参照されたい）。一つの態様において、発現ベクター内の転写因子コード配列は、機能的に制御配列に結合させて、指標細胞で転写因子を構成的または誘導性に発現させることができる。転写因子の活性を増強するまたは阻害する化合物の同定のためには、細胞に転写因子を構成的または誘導性に発現させることができる組換え発現ベクターの使用が好ましい。別の態様において、発現ベクター内において、転写因子をコードする配列は、内因性の転写因子遺伝子（すなわち、内因性の遺伝子に由来するプロモーター制御領域）の制御配列に機能的に結合される。転写因子の転写性の発現を増強するまたは阻害する化合物の同定のためには、転写因子発現が内因性の制御配列によって制御される組換え発現ベクターの使用が好ましい。
【０１４７】
一つの態様において、転写のレベルは、細胞によって産生されるRNAの量を測定することによって決定することができる。たとえば、RNAは、転写因子を発現しており、かつ化合物の存在下または非存在下でインキュベートされた細胞から単離することができる。次いで、検出される配列に特異的なプローブを使用するノーザンブロットを、当技術分野において既知の技術を使用して行うことができる。その他の多くの当技術分野において認識される技術を使用することができる。たとえば、転写因子について試験するために、ウエスタンブロット解析を使用することができる。たとえば、もう一つの態様において、特異的なRNA分子の転写は、たとえば測定されるRNA転写物のcDNAのコピーを作製し、これらを増幅して測定することによって、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用して検出することができる。もう一つの態様において、遺伝子の転写のレベルを検出するために、S1ヌクレアーゼマッピングまたはRNaseマッピングなどのRNAse保護アッセイ法を使用することができる。もう一つの態様において、プライマー伸張を使用することができる。
【０１４８】
さらにその他の態様において、化合物が転写因子の転写または翻訳の変化を誘導する能力は、細胞によって産生される転写因子の量を測定して達成することができる。検出することができるポリペプチドは、たとえば内因性の配列およびリポーター遺伝子配列を含む、転写因子応答性のプロモーターの活性化によって産生される任意のポリペプチドを含む。一つの態様において、細胞によって作製されるポリペプチドの量は、そのポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。その他の態様において、このようなポリペプチドの活性を測定することができる。
【０１４９】
一つの態様において、転写因子によって調節されるその他の配列を検出することができる。一つの態様において、転写因子によって通常は調節されない配列を、これらを転写因子によって調節されるプロモーターに結合してアッセイすることができる。
【０１５０】
好ましい態様において、プロモーターから転写の便利な読み出しを提供するために、このようなプロモーターをリポーター遺伝子に結合させて、その転写を容易に検出することができる。たとえば細菌細胞、たとえば大腸菌細胞は、Cohenら 1993. J. Bacteriol. 175：7856に教示されているように形質転換することができる。
【０１５１】
リポーター遺伝子の例は、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）（Alton および Vapnek （1979）, Nature 282：864-869）ルシフェラーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼなどのその他の酵素検出システム；蛍ルシフェラーゼ（deWetら （1987）, Mol. Cell. Biol. 7：725-737）；細菌ルシフェラーゼ（Engebrecht および Silverman （1984）, PNAS 1：4154-4158； Baldwinら （1984）, Biochemistry 23：3663-3667）；PhoA、アルカリホスファターゼ（Tohら （1989） Eur. J. Biochem. 182：231-238, Hallら （1983） J. Mol. Appl. Gen. 2：101）、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（Cullen および Malim （1992） Methods in Enzymol. 216：362-368）、並びに緑色蛍光タンパク質（米国特許第5,491,084号；国際公開公報第96/23898号）を含むが、これらに限定されない。
【０１５２】
一つの態様において、選択的な増殖優位性または死亡率を与える選択可能なマーカーの発現は、転写因子を発現する細胞の転写因子応答配列の直接の制御下に配置される。
【０１５３】
一つの態様において、転写因子は、プラスミドでコードされる。一つの態様において、宿主生物の遺伝的背景を操作して、たとえば1つまたは複数の染色体の転写因子遺伝子または転写因子相同体遺伝子を欠失させる。
【０１５４】
一つの態様において、転写因子の発現は、高度に調節性および誘導性のプロモーターによって制御されている。たとえば、一つの態様において、細菌細胞のinaA、galT、micF、trp、tac、もしくはtet、または酵母細胞のGAL1などのプロモーターを使用することができる。
【０１５５】
たとえば、全細胞においてMarA（AraC）ファミリー・メンバーの活性をモニターするために、遺伝子プロモータールシフェラーゼ（luc）融合アッセイ法を以下の構築物で行うことができる：bfpT[BfpT（PerA）およびGadX活性を測定するために]、invF[HilCおよびHilD機能をモニターするために]、sicA[InvF活性を測定するために]、mxiC[VirFおよびMxiE機能をモニターするために]、並びにctxA、tcpA、およびacfA[ToxT活性を測定するために]。V.コレラ（V. cholerae）株AC-V1225は、転写性のctxA-lacZ融合物を有し、全細胞におけるCtxA発現をモニターするために使用することができる。この株をMar阻害剤と共誘導条件下で培養し、処理された細菌のβ-ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。96ウェルプレート形式のハイスループットスクリーンとしてこのアッセイ法を行うためには、Griffithらの技術を使用することが考えられる（Griffith, K.L,ら、（2002） Biochem. Biophys. Res. Commun. 290：397-402）。本アッセイ法では、全細胞をMar阻害剤の10倍の段階希釈中で培養する。MarA（AraC）ファミリーのメンバーの活性にネガティブな影響を及ぼす化合物は、lucリポーター遺伝子の発現を減少させることによって検出する。
【０１５６】
もう一つの態様において、転写因子の発現は、構成的である。
【０１５７】
一つの態様において、細胞障害性の遺伝子産物をコードする選択マーカー（たとえば、ccdB）を使用する。
【０１５８】
もう一つの態様において、選択マーカーは、抗生物質抵抗性を与える遺伝子である（たとえば、kan、cat、またはbla）。
【０１５９】
もう一つの態様において、選択マーカーは、必須遺伝子である（たとえば、プリンまたはグアニン従属栄養体において、purAまたはguaB）。
【０１６０】
さらにもう一つの態様において、選択マーカーは、特定の代謝の基質の存在下において、選択的な増殖優位性を与える遺伝子である（たとえば、酵母における5-フルオロト酸（fluoroorotic acid）[5-FOA]の存在下でのURA3の発現）。
【０１６１】
さらにもう一つの態様において、化合物が転写因子結合分子（たとえば、DNAまたはタンパク質）に対する転写因子の結合を調節する能力を決定することができる。転写因子と結合するポリペプチドは、当技術分野において既知の技術を使用して同定することができる。たとえば、転写因子と相互作用する結合ポリペプチドの場合、相互作用トラップ・アッセイ法またはツー・ハイブリッド・スクリーニング・アッセイ法を使用することができる。
【０１６２】
一つの態様において、転写因子（たとえば、HTHタンパク質、AraCファミリー・ポリペプチド、またはMarAファミリー・ポリペプチド）を調節する化合物は、ワン-ハイブリッド・スクリーニング・アッセイ法を使用して同定される。本明細書において使用するものとして、「ワン-ハイブリッド・スクリーン」の用語は、本明細書に使用する、タンパク質-核酸の相互作用の破壊を検出するアッセイ法を含む。これらのアッセイ法では、標的自体のレベルで、たとえばMarA、marboxのDNAを含む特定の標的に対する転写因子（たとえば、HTHタンパク質、AraCファミリー・ポリペプチド、またはMarAファミリー・ポリペプチド）の結合を妨げる薬剤を、たとえば標的に結合し、転写活性化因子がこの部位と相互作用または結合するのを防止することによって同定する。
【０１６３】
もう一つの態様において、本発明の化合物は、ツー・ハイブリッド・スクリーニング・アッセイ法を使用して同定される。本明細書に使用されるものとして、本明細書に使用される「ツー・ハイブリッド・スクリーン法」は、タンパク質-タンパク質の相互作用の破壊を検出するアッセイ法を含む。このようなツー・ハイブリッド・アッセイ法は、重要なタンパク質-転写因子の相互作用（たとえば、HTHタンパクの相互作用、AraCファミリー・ポリペプチドの相互作用、MarAファミリー・ポリペプチドの相互作用）を妨げるために使用することができる。一つの例は、MarAファミリー・ポリペプチドが転写因子（ポジティブな作用またはネガティブな作用）として機能するために必要であるRNAポリメラーゼ-MarAファミリー・ポリペプチドの相互作用を防止するであろう。
【０１６４】
さらにもう一つの態様において、本発明の化合物は、スリー・ハイブリッド・スクリーニング・アッセイ法を使用して同定される。本明細書において使用されるものとして、本明細書に使用される「スリー・ハイブリッド・スクリーン法」の用語は、特定の関心対象のレギュロンの活性化のために必要とされるシグナル伝達経路の破壊を検出するアッセイ法を含む。一つの態様において、スリー・ハイブリッド・スクリーン法は、Marレギュロンの活性化、たとえばMarAの合成のために必要とされるシグナル伝達経路の破壊を検出するために使用される（Li および Park. J. Bact. 181：4824）。本アッセイ法は、転写因子の発現を活性化するための原因であろう化合物を同定するために使用することができ、たとえば、抗生物質によるMar誘導は本様式で開始されるであろう。
【０１６５】
本アッセイの一つの態様において、選択マーカー（たとえば、ccdB、cat、bla、kan、guaB、URA3）の発現は、転写因子に応答性のプロモーター（たとえば、inaA、galT、micF）の直接の制御下に置かれる。転写因子の非存在下において、選択マーカーの発現は、サイレントであろう。たとえば、細胞障害性遺伝子ccdBの調節の場合、遺伝子は、サイレントであり、細胞が生存すると考えられる。適切な宿主中での誘導性プラスミドからの転写因子の合成により、選択マーカーの転写因子に応答性の活性化可能な（activatable）プロモーターの活性化および発現を生じるであろう。ccdBの場合、遺伝子が発現されて、細胞死を生じるであろう。転写活性化因子を阻害する化合物は、活性化因子の発現の条件下において細胞を生存可能にするものとして同定される。
【０１６６】
もう一つの態様において、たとえば、転写因子に応答性の活性化可能な（activatable）プロモーターの発現により、URA3などの遺伝子を調節する場合は、異なる結果を得ることができる。この場合、転写因子の非存在下で、したがってURA3発現の非存在下では、細胞が5-FOAの存在下において増殖するであろう。転写因子の発現の活性化、したがってURA3の合成により、細胞は、5-FOAをURA3による有毒な代謝産物に変換した後に死滅するであろう。
【０１６７】
もう一つの態様において、選択可能なマーカーは、転写因子に応答性の抑制可能なプロモーター（たとえば、fecA）の直接の制御下に置かれる。この例において、構成的に転写因子の合成条件下で、たとえば構成的な変異体において選択可能なマーカーの発現は、サイレントであろう。ccdBの場合、これは、細胞が生存したままであろうことを意味すると考えられる。転写因子の不活性化に続き、選択可能なマーカーのスイッチが入り、細胞死を生じる。
【０１６８】
もう一つの態様において、大腸菌の染色体のguaBまたはpurA遺伝子の不活性化によって、プリンまたはグアニン従属栄養体を構築することができる。次いで、guaBまたはpurA遺伝子を適切なベクター内のその天然のプロモーターの制御下にクローン化する。次いで、この構築物を従属栄養性の宿主に形質転換する。転写因子発現が構成的な場合、および細胞がプリンまたはグアニンを欠いている培地中で増殖する場合、従属栄養体は増殖しない。これは、転写因子を媒介したguaBまたはpurA合成の抑制に起因し得る。転写因子の候補阻害化合物は、増殖を回復させる化合物、すなわち転写因子によって媒介されるguaBおよびpurA発現の抑制の軽減として同定することができる。
【０１６９】
一つの態様において、病原体からの転写因子の活性を調節する化合物を同定するために、非病原体または病原性のより少ない生物体に由来する転写因子を使用することができる。たとえば、エルシニア種の遺伝子プロモーターの機能を評価するための代用物として大腸菌がすでに使用されており、配列比較では、psnプロモーター領域がUPEC（大腸菌株CFT703）、ペスト菌（Y.pestis）、および偽結核エルシニア菌において同一であることが見いだされたことを示した。従って、大腸菌CFT703 psnプロモーターは、ルシフェラーゼ（luc）リポータープラスミドにPCRを使用してクローン化することができ、全細胞スクリーニングアッセイ法に使用することができる。
【０１７０】
好ましい態様において、本アッセイ法を使用して同定されたいずれかの化合物が、これらがタンパク質合成を阻害することによって単に転写因子の活性を調節するように見えるだけではないことを確認するために、対照を含めてもよい。たとえば、化合物が、転写因子応答配列の活性化によって転写されるRNAから翻訳されるタンパク質の合成を阻害することが明らかな場合、対照、たとえば転写因子応答配列の活性化によって転写されないRNAから翻訳されているタンパク質の合成は、同じ化合物の添加による影響を受けない。たとえば、作製されている転写因子の量を、作製されている内因性のタンパク質の量と比較する。もう一つの態様において、転写因子に応答しないプロモーターを含むもう一つのプラスミドおよび動作可能にそのプロモーターに結合されたタンパク質によって、微生物を形質転換することができる。対照タンパク質の発現は、化合物の存在下および非存在で産生されるタンパク質の量を規準化するために使用することができる。
【０１７１】
もう一つの態様において、活性が転写因子によって調節される分子の酵素活性に対する化合物の効果を測定することができる。たとえば、全細胞のYopH活性に対するYbtA阻害の効果を測定することができる。YopHは、チロシン・ホスファターゼであり、病原体のTTSSによって分泌されるエルシニア種病原性因子である。本アッセイ法は、全細胞におけるYopH活性に対する、MarA（AraC）ファミリー・メンバーのLcrF（VirF）の活性を阻害する効果を測定するために使用することができる。p-ニトロフェニルホスフェートのYopHの活性（pNPP、ホスファターゼ活性の指標）により、分光測定で測定することができる着色された基質の形成を生じる。YopHのホスファターゼ活性に対する化合物自体の阻害効果を測定するために、偽結核エルシニア菌（Y.pseudotuberculosis）をMar阻害剤の存在下および非存在下、並びに対照を含めてインキュベートすることができる。エルシニア種に由来するYopsのインビトロ発現は、37℃において、カルシウムの非存在下で誘導することができる。偽結核エルシニア菌の一晩培養物をシュウ酸ナトリウム（二価の金属イオンのキレート剤、低カルシウム含有培地）または過剰なカルシウム（YopHの発現を抑制するため）のいずれかを含む新しいLB培地に希釈して、27℃で培養することができる。引き続いて、これらの細胞の一定分量を、Mar阻害剤または対照として化合物溶媒（DMSO）のいずれかを含むウェルに入れることができる。培養温度を37℃に移して（低カルシウム含有培地中でYopH発現を誘導するため）、しばらくの間細胞を培養することができる。細胞増殖に対する化合物の阻害効果は、同一のプレートにおいて別々に測定することができる。好ましくは、内因性の抗菌活性を有さない化合物が選択される。
【０１７２】
アッセイプレートを遠心し、上清の一定分量をp-ニトロフェニル・ホスフェート（ホスファターゼ活性の指標）を含むアッセイ緩衝液に添加することができる。混合後、410nMのODを決定することができる。YopHのホスファターゼ活性に対する化合物の阻害効果を測定するために、対照を含めることができる。このような効果を有する化合物は、さらなる解析から除くことができる。このアッセイ法は、おそらくLcrF（VirF）のレベルでYopHの活性（発現または分泌）を阻害する多くの化合物を同定するために使用されてきた。
【０１７３】
もう一つの態様において、微生物がバイオフィルムを形成する能力における化合物自体の影響を、標準的な技術を使用して測定することができる（たとえば、O’Tooleら、1999 Methods Enzymol 310：91）。
【０１７４】
もう一つの態様において、試験化合物の存在下および非存在下において、微生物が組織培養細胞に浸透し、および／または接着する能力を測定することができる。Mar阻害剤の存在下または非存在下における培養細胞に対する病原菌の浸透（サルモネラ菌および赤痢菌）および接着（大腸菌、サルモネラ菌、および赤痢菌）をモニターするために、たとえばサルモネラ種（Darwinら （1999） J. Bacteriol. 181：4949-54）、赤痢菌種（Andrews,ら、（1992） Infect. Immun. 60：3287-95）、および大腸菌（Gomez-Duarteら、（1995） Infect. Immun. 63：1767-76））について前述したように、96ウェルマイクロタイタープレートにおいてアッセイ法を行うことができる。HeLa、Henle-407、またはMDCKなどの上皮細胞の侵入および複製は、ゲンタマイシン（GM）保護アッセイ法によって測定することができる。種々の病原体に対する侵襲をモニターするアッセイ法は、本質的に同じであるが、軽微な修飾がなされる。たとえば、ネズミチフス菌（S.typhimurium）は、マウス・マクロファージおよび多くの上皮株化細胞によってとり込まれる。細胞内の細菌は、複製し（上皮細胞において）、および細胞障害性（マクロファージにおいて）を生じることができる。どちらの現象にも、TTSSを介した細菌タンパク質の分泌が必要であり、タンパク質分泌は、調節カスケードにおいて機能する少なくとも3つのMarA（AraC）タンパク質（HilC、HilD、およびInvF）によって制御されている。これらの活性化因子の阻害は、取込みおよび細胞障害性を減少させる。従って、細胞、たとえばHEp-2細胞（ATCC CCL23）は、培養および維持することができる。24時間以内に90%コンフルエントな単層を得るために、2×105個のHEp-2細胞をマイクロタイタープレートに播種することができる。ネズミチフス菌（S.typhimurium）の野生型の単一のコロニーを0.3MのNaClを含むLBブロースに放置して一晩培養し、希釈して、〜10-20の感染効率（MOI）で培養細胞を含むウェルに添加することができ、細胞を37℃で1時間インキュベートして、細菌を侵入させることができる。その後、単層をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、100μg/mlのGMと共にインキュベートし（細胞内以外の細胞外の細菌を死滅させるため）、再びPBSで洗浄し、次いでPBS+0.5%トリトンX-100を使用して溶解した。可溶化液の段階希釈を作製して、LBもしくはマッコンキィ寒天板上で、または最確数法を使用することによって、生存細菌数が得られるであろう。パーセント侵入は、次のように算出される：100×（GMR細菌数／投入細菌の総数）。粘着アッセイ法は、多くの洗浄を細菌-組織培養細胞の相互作用の最初の段階に含め、およびGMを除いたことを除いては、侵入アッセイ法と同じ方法で行う。
【０１７５】
もう一つの態様において、特定の微生物細胞の病原性の測定には、これらがコンゴレッドに結合する能力を使用することができる。赤痢菌種のvirFヌル変異体は、インビトロでの組織培養細胞において非侵入型であり、これらが色素コンゴレッド（CR）と結合する能力に欠陥がある。CR結合表現型は、臨床的な赤痢菌属隔離集団の診断としてルーチンで使用されており、ずなわちCRに結合することができない細菌（Cbr細胞）は、インビボでセレニー試験において非侵入型である。この試験では、この生物体の病原性が高い信頼性で予知される。CR結合表現型を利用することにより、全細胞において転写因子（たとえば、VirF）阻害剤を同定するために、簡単なスクリーン法を使用することができる。簡単には、0.025%のCRを含むトリプシン性大豆ブロース寒天プレート（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）上で、コンフルエントなS.フレキシネリ（S.flexneri）2aを培養することができる。Cbr-細胞を産生する化合物を同定するために、50μg/mlの濃度の種々のMar阻害剤をこれらのプレート上にロボットでスポットする。IC50／EC50値を決定するために、Cbr-表現型を生じる化合物の段階希釈により、次のアッセイ法で解析する。
【０１７６】
もう一つの態様において、アピラーゼ酵素電気泳動像アッセイ法を使用することができる。S.フレキシネリおよびvirFを欠損するEIECがアピラーゼ活性が不十分であることが最近決定された。したがって、全細胞可溶化液でapy活性の減少を測定するために、Mar阻害剤の存在下におけるS.フレキシネリの培養において前述したように（Berluttiら （1998） Infect. Immun. 66：4957-4964）、酵素電気泳動像技術を使用することができる。簡単には、細胞を栄養性豊富なブロース中で一晩培養し、洗浄し、OD600〜40に濃縮し、次いで超音波処理により破壊する。細胞片を遠心分離によって除去し、可溶化液をSDS-PAGEに供する。次いで、変性ゲルを再生緩衝液（50mMのTris-HCl [pH7.0]、1% [vol/vol]トリトンX-100）に浸漬して、アピラーゼ活性を回復させ、100mMのTris-HCl [pH7.5]で1時間、次いで100mMのトリス-HCl-10mMのEDTA-1mMのATPで10℃において30分間平衡化した。続いて、ゲルを新鮮な酸性化したモリブデン酸アンモニウム（5mMのモリブデン酸アンモニウム、0.12M硫酸）およびアスコルビン酸（10%、wt/vol）の4：1（vol/vol）溶液に浸漬して、アピラーゼ活性を視覚化する。
【０１７７】
もう一つの態様において、ネズミチフス菌TTSSアッセイ法を使用することができる。ネズミチフス菌は、TTSSを介してSptPを分泌し、SptPおよびTTSSの両者の発現は、InvFによって調節される。TTSSは、おそらく感染の間の宿主細胞と接触することによって誘導され、また培地へのSptPの分泌を促進する培養条件は、同定されている。最適な条件は、0.3MのNaClを含むLB培地中で低通気にして37℃において培養する（Fu, Y.,ら （1999） Nature 401：293-7）。SptPのホスファターゼ活性は、32Pのラベルしたペプチドを使用して、溶解細胞において生化学的に測定されており（Fu, Y.,ら （1999） Nature 401：293-7； Kaniga, K.,ら （1996） Mol Microbiol. 21：633-41）、インビトロでInvF機能をモニターするために使用される。
【０１７８】
簡単には、細胞を培地中で培養してSptP分泌を促進し、タンパク質のホスファターゼ活性を、エンテロコリチカ菌（Y.enterocolitica） YopHについて記載したように、および化学発光（たとえば、CSPD）または比色（たとえば、pNPP）基質を使用してモニターする。分泌されるSptPのレベルに応じて、（Fu, Y.,ら （1999） Nature 401：293-7； Kaniga, K.,ら （1996） Mol Microbiol. 21：633-41）に記載されているように、これらのアッセイ法を細胞可溶化物および32Pでラベルしたペプチド基質で行ってもよい。これらのアッセイ法では、可溶化液を調製して、ラベルされたペプチド基質とインキュベートし、トリクロロ酢酸でホスファターゼ反応を終了させて、酸で可溶した32Pを96ウェルマイクロタイタープレートにおいてマルチチャネル・シンチレーションカウンターで測定する。
【０１７９】
もう一つの態様において、ビブリオ酵素結合抗体免疫吸着アッセイ法（ELISA）を行うことができる。MarA（AraC）ファミリー・メンバーToxTは、コレラ毒素（CT）のサブユニットをコードするctxAおよびctxBを含むToxRビルロン（virulon）のいくつかの遺伝子の発現を活性化する。ToxT（toxTHTH）のヘリックス-ターン-ヘリックスDNA結合ドメインを欠いている古典的およびエルトール生物型バックグラウンドの変異体の両者は、CTを産生することができないので、CT産生は、ToxTに依存的である。CTサブユニットBは、インビボにおいて標的細胞表面のGM1-ガングリオシドに強く結合し、V.コレラ培養液上清のCTを検出するために、GM1に基づいたELISAアッセイ法が開発されている。このアッセイ法は、インビトロにおいてToxT機能をモニターするために使用することができる。
【０１８０】
簡単には、Mar阻害剤の存在下において、細菌を、コレラ毒素産生を促進することが知られる条件下で培養することができる：古典的な株O395は、30℃においてLB（pH6.5）振盪で培養し、エルトール株E7946は、AKI条件下で培養することができる。マイクロタイタープレートのウェルは、精製したGM1-ガングリオシド（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）で被覆することができ、V.コレラ培養液上清と共にインキュベーションする前にプレートを洗浄して、BSAでブロックする。プレートに結合したコレラ毒素サブユニットBは、マウス一次抗体（US Biological, Swampscott, MA）でラベルし、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウスの二次抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）でラベルすることができる。次いで、西洋わさびペルオキシダーゼは、化学発光基質を使用して検出することができ、およびシグナルはプレートリーダーを使用して検出することができる。培養試料中のCTの量を決定するために、段階希釈した精製CT（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を使用する。さらなる対照には、V.コレラO395（O395：toxTHTH）およびV.コレラE7946（E7946：toxTHTH）のToxTヌル変異体を含むことができる。
【０１８１】
CTは、2つのサブユニットCtxAおよびCtxBからなり、両者の発現は、MarA（AraC）ファミリー・メンバーのToxTによって支配されている。V.コレラのtoxTヌル変異体の古典的な（O395）およびエルトール生物型バックグラウンドの両者は、CTを産生することができず、感染の乳児マウス・モデルにおいて非病原性である。
【０１８２】
CtxBは、インビボにおいて標的細胞の表面上のGM1-ガングリオシドに高親和性で結合し、V.コレラ培養液上清のCTを検出するために、GM1に基づいたELISAアッセイ法が開発されている。このアッセイ法は、野生型およびtoxTヌル変異体のインビトロでのToxT機能をモニターするために使用することができる。簡単には、細菌をコレラ毒素産生を促進するような既知の条件下で培養することができる[O395、LBブロース（pH6.5）、30℃で、およびエルトール、AKI培地（1.5%のバクトペプトン（Bacto Peptone）、0.4%の酵母抽出物、0.5%のNaCl、および0.3%の炭酸水素ナトリウム）、37℃で放置し、次いで続いて37℃で振盪]。培養液上静を精製したGM1-ガングリオシド（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）で被覆してBSAでブロックしたマイクロタイタープレートに添加することができる。プレートに結合したCtxBは、マウス一次抗体（US Biological, Swampscott, MA）による第1のラベリングによって、次いで西洋わさびペルオキシダーゼに結合した抗マウス二次抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）によるラベリングによって検出した。西洋わさびペルオキシダーゼは、化学発光基質を使用して検出することができ、シグナルは、プレートリーダーを使用して検出した。
【０１８３】
野生型V.コレラでは、強いシグナルを生じるが、toxTヌル変異体では、反応を引き出すことができなかった。次いで、培養試料中のCTの量を精製したCTの段階希釈を使用して定量した（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）。図示したように、野生型V.コレラは、収率〜225ng/ml CTであるが、toxTヌル変異体は、バックグラウンドレベルのCTを産生する。
【０１８４】
例示的なもう一つの態様において、化合物が病原性を減少する能力を調査するために、細胞障害性アッセイ法を使用することができる。たとえば、マクロファージ細胞障害性は、商業的に入手可能なキットを使用して、細胞質のハウスキーピング酵素の乳酸脱水素酵素（LDH）の放出によって測定することができる（Promega, Madison, WI）。本実験は、生物体、たとえば偽結核エルシニア菌の新しい一晩培養物をシュウ酸ナトリウムを含むLBに最初に希釈し（誘導条件）、37℃で1時間培養して転写因子の合成および分泌機構を誘導することによって行うことができる。次いで、細菌細胞をDMEM中で洗浄して、マクロファージ細胞のほぼコンフルエントな単層に、50細菌細胞／マクロファージ細胞の感染効率で添加する。試験化合物を適切な濃度で添加し、加湿された5%のCO2雰囲気中において37℃でインキュベーションを続ける。5〜6時間後に、培地中のLDHは、比色定量アッセイ法を使用して測定する。いくつかの対照：非感染性のマクロファージ細胞のネガティブな対照、界面活性剤で溶解した非感染細胞における最大放出対照、および細菌細胞がLDH活性を欠いていることを示す対照をアッセイ法に含めることができる。化合物の存在下で微生物細胞が毒性を生じる能力の減少は、化合物が転写因子の発現および／または活性を調節することを示す。
【０１８５】
2.無細胞アッセイ法
また、本スクリーニング方法は、たとえばハイスループット技術法を使用する無細胞アッセイ法を含むことができる。たとえば、アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーンのために、転写因子分子およびラベルされた基質またはこのようなポリペプチドのリガンドを含む合成の反応混合物を、アゴニストまたはアンタゴニストの可能性のある候補分子の非存在下または存在下においてインキュベートする。一つの態様において、反応混合物は、膜、細胞エンベロープ、もしくは細胞壁、またはこれらの組み合わせなどの細胞コンパートメントをさらに含むことができる。試験化合物が転写因子をアゴナイズまたはアンタゴナイズする能力は、転写因子結合ポリペプチドに対する転写因子の結合の減少または転写因子活性の減少に反映される。
【０１８６】
調節薬剤および天然の抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査を受ける調節薬剤の数を最大にするためには、ハイ・スループット・アッセイ法が望ましい。精製したまたは半精製したタンパク質に由来するであろうものなどの、無細胞系において行われるアッセイ法は、これらが、迅速な展開および試験調節薬剤によって媒介される分子標的の変化の比較的簡単な検出ができるように作製することができるという点で、「一次」スクリーンとして好ましいことが多い。さらに、試験調節薬剤の細胞毒性および／または生物学的利用能の効果は、一般にインビトロ系では無視することができる。
【０１８７】
一つの態様において、化合物が転写因子の活性を調節する能力は、無細胞系において単離された転写因子または転写因子核酸分子を使用して達成される。このようなアッセイ法では、化合物が転写因子の活性を調節する能力を測定する工程は、たとえば転写因子もしくは転写因子核酸分子に対する化合物の直接の結合を、または転写因子が、転写因子が通常結合する分子（たとえば、タンパク質またはDNA）に結合する能力を化合物が変化させる能力を測定することによって達成される。
【０１８８】
さらにもう一つの態様において、本発明のアッセイ法は、転写因子またはこれらの一部が、試験化合物と接触する無細胞アッセイ法であり、試験化合物が転写因子またはこれらの生物学的に活性な部分に結合する能力が決定される。試験化合物が転写因子の活性を調節する能力の決定は、たとえば、直接の結合を決定するために上記した方法のうちの1つによって転写因子が転写因子の標的分子に結合する能力を決定することによって達成することができる。また、転写因子が転写因子の標的分子に結合する能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用解析法（BIA）. Sjolander, S. および Urbaniczky, C. （1991） Anal. Chem. 63：2338-2345 および Szaboら （1995） Curr. Opin. Struct. Biol. 5：699-705などの技術を使用して達成することができる。本明細書において使用するものとして、「BIA」は、いずれの反応体をラベルすることもなく、リアルタイムで生物特異的な相互作用を研究するための技術である（たとえば、BIAcore）。表面プラスモン共振（SPR）の光学現象の変化を、生体分子間のリアルタイムの反応の指標として使用することができる。
【０１８９】
さらにもう一つの態様において、無細胞アッセイ法は、転写因子またはこれらの生物学的に活性な部分を転写因子に結合してアッセイ混合物を形成することが既知の化合物と接触させることと、試験化合物とアッセイ混合物を接触させることと、および試験化合物が転写因子と相互作用する能力を決定することを含み、試験化合物が転写因子と相互作用する能力の決定は、転写因子が転写因子の標的分子に優先して結合し、または活性を調節する能力を決定することを含む。
【０１９０】
本発明の無細胞アッセイ法は、タンパク質（たとえば、転写因子または転写因子結合ポリペプチド）の可溶型および／または膜結合型の形態の両者の使用が適用できる。ポリペプチドの膜結合型の形態を使用する無細胞アッセイ法の場合、ポリペプチドの膜結合型の形態が溶液に維持されるように溶解剤を利用することが望ましいであろう。このような溶解剤の例は、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマルトシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、トリトン（登録商標）X-100、トリトン（登録商標）X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコール・エーテル）n、3-[（3-クロラミドプロピル）ジメチルアミニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[（3-クロラミドプロピル）ジメチルアミニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）、またはN-ドデシル=N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナートなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１９１】
たとえば、化合物は、これらが転写因子核酸分子もしくは転写因子、またはこれらの部分に直接結合する能力について、たとえばラベルされた化合物、たとえば放射性ラベルされた化合物を使用することによって試験することができる。たとえば、転写因子配列は、バクテリオファージによって発現させることができる。本態様において、次いで、転写因子を示すファージを、ポリペプチドが化合物と相互作用して潜在的に複合体を形成することができるように化合物と接触させる。次いで、化合物と複合体を形成したファージを形成していないものから分離することができる。次いで、ポリペプチドおよび化合物の複合体を化合物からバクテリオファージを分離する薬剤と接触することができる。次いで、ポリペプチドに結合した任意の化合物を単離して同定する。
【０１９２】
また、蛍光共鳴エネルギー移転（FRET）に関与する読み出しを本アッセイ法に使用することができる。FRETは、一つのフルオロフォアのドナーが光子を吸収し、もう一つのフルオロフォアのアクセプターに非放射性に吸収エネルギーを移動する時に生じる。次いで、アクセプターは、その特徴的な波長でエネルギーを放射する。効率的なエネルギー移転を生じるためには、ドナーおよびアクセプター分子がほぼ10nm未満の距離に近接しなければならない（Methods Enzymol. 211, 353-388 （1992）； Methods Enzymol. 246, 300-334 （1995）を参照されたい）。近接の要求は、ドナー-アクセプター対の間のわずかな分離に対して感受性のアッセイ法を構築するために使用することができる。FRETは、典型的には単一の励起波長および2つの発光波長が必要であり、ドナーおよびアクセプターの発光強度の比からなる解析である。FRETのドナーアクセプター対は、ビーズに基づいたアッセイ法および細胞に基づいたアッセイ法の両方で構築することができる。増強された蛍光および変化した発光波長を示すいくつかの緑色蛍光タンパク質（GFP）変異体は、1つのタンパク質、たとえば転写因子に対してGFP FRETドナーを融合し、転写因子が結合するプロモーター配列に対してGFP FRETアクセプターを融合することによってFRETの細胞に基づいたアッセイ法のために組み合わせることができる。
【０１９３】
たとえば、種々のMarA（AraC）ファミリーのメンバーのインビトロでのDNA結合活性を測定するための、時間分解蛍光共鳴エネルギー移転（TR-FRET）技術（たとえば、Hillischら2001. Curr Opin Struct Biol 11：201）。この技術では、ビオチン化された二本鎖DNA分子が6-ヒスチジン（6-His）残基に融合されたMarA（AraC）タンパク質とインキュベートされ、これによりニッケル・アガロースおよび抗6-His抗体をそれぞれ使用して精製および免疫沈降が容易になる。ユーロピウムでラベルした抗6His抗体をタンパク質に結合して、ストレプトアビジン抱合型のアロフィコシアニン（APC）複合体をDNAに結合する。ユーロピウム分子は、340nmで励起され、これがAPCの近くに近接する場合（10-100Å）、615nmのユーロピウムの発光からAPCにFRETがおこる。次いで、励起されたAPCから放射されるエネルギーを665nmで記録する。（ユーロピウムおよびAPCは、FRET対と呼ばれる。）DNAに対するタンパク質の結合を阻害し、したがって、FRET対の物理的な分離を生じる化合物は、665nmの発光の減少によって同定される。このアッセイ法は、エルシニア種に由来するMarA（AraC）ファミリーのメンバーの機能を調査するために特によく適している。
【０１９４】
発光は、たとえばビクターVプレートリーダー（PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA）を使用して読み込むことができる。DNAに対するタンパク質の結合を阻害する化合物は、最初の洗浄工程でプレートからのタンパク質の減少を生じ、減少した発光シグナルによって同定される。50%までシグナルを減少させるために必要な化合物の濃度（EC50/IC50）は、阻害剤の化合物の段階希釈を使用して算出することができる。
【０１９５】
結合対のメンバー（たとえば、転写因子またはDNA分子）に対して、蛍光マーカーを直接または間接的に付着することができる。たとえば、関心対象の分子に対してマーカーを共有結合性に付着することができる。オリゴヌクレオチドおよびまたはタンパク質の間で結合を形成させる方法は、当業者に既知である。1つの適切な方法は、アミノ-dT残基をマーカーに（好ましくは、ループ部分に）組み込むことを含む。次いで、化学的リンカーを使用して、これを関心対象の分子の官能基（たとえば、アミン基）に結合することができる（たとえば、Partisら （1983） J. Prot. Chem. 2：263-277を参照されたい）。または、マーカーは、非共有結合性の手段によって、間接的に関心対象の分子に付着することができる。たとえば、分子ビーコンは、関心対象の結合対メンバーに結合する結合成分（たとえば、抗体）に付着することができる。
【０１９６】
タンパク質がDNAに結合する能力をアッセイするその他の方法、たとえばDNAフットプリント法、およびヌクレアーゼの保護は、また、当技術分野において周知であり、化合物が転写因子のヌクレオチド配列に結合する能力を試験するために使用することができる。
【０１９７】
もう一つの態様において、本発明は、転写因子の核酸分子に結合し、たとえば遺伝子転写を妨げる試験化合物をアッセイすることによって、抗生物質抵抗性を調節する化合物を同定するための方法を提供する。
【０１９８】
もう一つの態様において、転写因子核酸分子および通常そのヌクレオチド配列に結合する転写因子結合ポリペプチドを、転写因子核酸分子および転写因子結合ポリペプチドの相互作用を遮断する化合物を同定するための試験化合物と接触させる。たとえば、一つの態様において、転写因子ヌクレオチド配列および／または転写因子結合ポリペプチドを、化合物が転写因子核酸分子および転写因子結合ポリペプチドのうちの少なくとも1つと相互作用できる条件下で接触させる。化合物が転写因子結合ポリペプチドと転写因子ヌクレオチド配列の相互作用を調節する能力は、これが転写因子活性を調節する能力を表す。
【０１９９】
転写因子が転写因子結合ポリペプチドに結合するか、または相互作用する能力の決定は、たとえば直接の結合によって達成することができる。直接の結合アッセイ法において、転写因子は、転写因子標的分子に対する転写因子の結合を複合体中のラベルされた転写因子を検出することによって決定することができるように、放射性同位元素または酵素ラベルと結合することができる。たとえば、125I、35S、14C、または3Hで直接または間接的に転写因子をラベルして、放射線放出（radioemmission）の直接の計数によって、またはシンチレーション計数によって放射性同位元素を検出することができる。または、転写因子分子を、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的にラベルして、適切な基質の生成物への変換を決定することによって酵素ラベルを検出することができる。
【０２００】
一つの態様において、化合物が転写因子核酸分子に結合する能力を測定することができる。たとえば、ゲルシフト法または制限酵素保護アッセイ法を使用することができる。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、遊離DNAからポリペプチド-DNA複合体をゲルシフト法で分離する。このような実験において、DNAに対する化合物の結合レベルを決定して、化合物の非存在下のものと比較することができる。この結合レベルを変化させる化合物は、スクリーンにおいて転写因子の活性を調節するとして選択される。もう一つの態様において、候補転写因子調節化合物の、インビトロでこれらがDNAタンパク質の相互作用を調節する能力を測定することによる活性の定性的なアッセイ法を使用することができる。簡単には、5nMのMarA（AraC）ファミリー・メンバー（または、〜50%の放射標識された（33P）二本鎖DNAプローブがタンパク質に結合される濃度）を、試験化合物の非存在下（DMSO（溶媒）単独で）または存在下でのいずれかにおいて、室温で30分間インキュベートする。その後、0.1nMの（33P）ラベルされたDNAプローブを添加して、混合物を室温で15分間平衡化させる。次いで、混合物を非変性ポリアクリルアミドゲル上で分離して、ゲルをオートラジオグラフィで解析する。
【０２０１】
典型的には、複合体を形成していない形態から複合体の分離を容易にするために、並びにアッセイ法の自動操作に対応するために、転写因子、転写因子結合ポリペプチド、または化合物のいずれかを固定することが望ましい。候補薬剤の存在下および非存在下における、上流または下流に結合するポリペプチドに対する転写因子の結合は、反応物を含むために適した任意の容器中で達成することができる。例には、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管を含む。一つの態様において、融合タンパク質は、ポリペプチドがマトリックスに結合できるようにするドメインを付加して提供することができる。
【０２０２】
たとえば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／転写因子（GST／転写因子）融合タンパク質は、グルタチオン・セファロース・ビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着することができ、次いでこれを細胞可溶化物、たとえば35S-ラベルされたもの、および試験調節薬剤と合わせて、複合体形成に貢献する条件下で、たとえば塩およびpHについて生理学的条件で（しかし、わずかによりストリンジェントな条件が要求されてもよい）混合物をインキュベートする。インキュベーションに続いて、ビーズを洗浄して、あらゆる未結合ラベルを除去し、マトリックスを固定して、直接（たとえば、シンチラント（scintilant）に配置したビーズ）、またはその後に複合体が解離された後の上清の放射標識を決定する。または、複合体をマトリックスから解離させて、SDS-PAGEによって分離し、ビーズ画分に見いだされる転写因子-結合ポリペプチドのレベルを標準的な電気泳動的な技術を使用してゲルから定量することができる。
【０２０３】
また、マトリックス上にタンパク質を固定するためのその他の技術を、本アッセイ法に使用するために利用することができる。たとえば、転写因子またはこれが結合するポリペプチドをビオチンおよびストレプトアビジンの抱合を利用して固定することができる。たとえば、ビオチン化された転写因子分子は、当技術分野において周知の技術（たとえば、ビオチン標識キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）を使用してビオチン-NHS（N-ヒドロキシ-スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジンコートされた96ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定することができる。または、転写因子と反応するが、上流または下流のエレメントの結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、抗体の抱合によって転写因子をウェルにトラップすることができる。上記のように、転写因子結合ポリペプチドおよび試験調節薬剤の標品をプレートの転写因子を示すウェルにおいてインキュベートして、ウェルにトラップされた複合体の量を定量することができる。このような複合体を検出するための例示的な方法は、GSTで固定された複合体について上記したものに加えて、転写因子結合ポリペプチドと反応性の抗体、または転写因子と反応性であり、かつ結合ポリペプチドと競合する抗体を使用する複合体の免疫検出；並びに結合ポリペプチドの内因性または外因性の活性と関係する酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイ法を含む。後者の例において、酵素を化学的に抱合すること、または転写因子結合ポリペプチドとの融合タンパク質として提供することができる。例示として、転写因子は、化学的に架橋すること、または西洋わさびペルオキシダーゼと遺伝的に融合することができ、複合体にトラップされたタンパク質の量は、色素生産性の酵素基質、たとえば3,3’-ジアミノ-ベンザジンテトラヒドロクロリドまたは4-クロロ-1-ナフトールによって評価することができる。同様に、タンパク質およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を提供し、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンを使用してGST活性（Habigら、（1974） J Biol Chem 249：7130）を検出することによって複合体形成を定量することができる。
【０２０４】
複合体にトラップされたタンパク質のうちの1つを定量するための免疫検出に依存するプロセスのためには、抗転写因子抗体などのポリペプチドに対する抗体を使用することができる。または、複合体中で検出されるポリペプチドは、転写因子配列に加えて、抗体が容易に利用できる第2のポリペプチド（たとえば、商業的な供与源からのもの）を含む融合タンパク質の形態の「タグを付けたエピトープ」であることができる。たとえば、上記したGST融合タンパク質は、GST部分に対する抗体を使用して結合を定量するために使用することができる。その他の有用なエピトープ・タグには、c-myc由来の10残基配列を含むmyc-エピトープ（たとえば、Ellisonら （1991） J Biol Chem 266：21150-21157を参照されたい）、並びにpFLAGシステム（International Biotechnologies, Inc.）、またはpEZZ-プロテインAシステム（Pharamacia, NJ）が含まれる。
【０２０５】
任意の反応体でラベリングせずに、化合物が転写因子とその標的分子の間の相互作用を調節する能力を決定することも、本発明の範囲内である。たとえば、転写因子または標的分子をラベルすることなく標的分子と転写因子の相互作用を検出するために、微小生理機能測定装置（microphysiometer）を使用することができる。McConnell, H. M.ら （1992） Science 257：1906-1912。本明細書に使用されるものとして、「微小生理機能測定装置」（たとえば、Cytosensor）は、光でアドレス指定できる電位差測定センサー（light-addressable potentiometric sensor：LAPS）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物と受容体の間の相互作用の指標として使用することができる。
【０２０６】
また、本発明は、1つまたは複数の転写因子（たとえば、原核または真核生物）と結合または相互作用することができる転写因子調節化合物、たとえばHTHタンパク質を調節する化合物、AraCファミリーを調節する化合物、MarAファミリーを調節する化合物、またはMarAを調節する化合物をデザインするための分子デザイン技術の使用に属する。本発明は、本方法並びにモデリング方法によって同定される転写因子調節化合物、および本方法によって同定される化合物を含む組成物の両方に属する。
【０２０７】
ある態様において、本発明は、転写因子調節化合物を同定する方法に属する。本方法は、関心対象の転写因子の構造を得ることと、および転写因子の一部と-20以下（たとえば、-40以下、たとえば-60以下）の相互作用エネルギースコアを有する骨格を同定するためにGLIDEを使用することとを含む。
【０２０８】
3.構造に基づいたドラッグデザイン
また、本発明は、少なくとも一部において、HTHタンパク質、AraCファミリー・ポリペプチド、MarAファミリー・ポリペプチド、たとえばMarAなどの転写因子に対して、全体において、または一部において結合することができる化学的実体または化合物についての小分子データベースの計算的スクリーニングに属する。このスクリーニングにおいて、結合部位に対するこのような実体または化合物の適合特性は、形状の相補性によって、または推定される相互作用エネルギーによって判断してもよい（Meng, E. C.ら、1992, J. Coma. Chem., 13：505-524）。このような手順により、選択されたタンパク質またはクラスまたはタンパク質と適当な分子的および化学的な相補性について、潜在的な転写因子調節化合物性の非常に大規模なライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０２０９】
計算的スクリーニングによって同定された転写因子調節化合物は、その後に、さらなるスクリーンとして本明細書に記載されているインビボ・アッセイ法を受けさせることができる。たとえば、計算的スクリーニングによって同定された転写因子阻害化合物は、転写因子で活性化されるプロモーター制御下に対比選択可能なマーカーを含む細胞系において、これが細胞生存を促進する能力を試験することができる。前述のアッセイ法における細胞生存の促進は、転写因子を阻害する化合物を示していると考えられる。その他の適切なアッセイ法が当技術分野において既知である。
【０２１０】
MarA（PDB ID code 1BL0）およびその相同体Rob（PDB ID code 1DY5）の結晶構造は、タンパク質データバンクで入手できる。これらの構造を、小分子化学の阻害化合物によってターゲットすることができるタンパク質上の部位を同定するために使用した。MarA（表4）上の合計で少なくとも8つおよびRob（表5）上の4部位の潜在的な小分子結合部位を潜在的な小分子結合部位として同定した。本発明は、少なくとも一部において、MarA（配列番号2に与えられた配列に基づく）の以下の部位の任意の1つと相互作用するMarA調節化合物に属する。
【０２１１】
（表４）
2006504677.tif 000009
次いで、GLIDEドッキング方法を使用して、コンビナトリアル・ケミストリーの骨格をこれらの部位にフィットさせて、それぞれについて相互作用エネルギーを算出した。8つの骨格が、アミノ酸トリプトファン42〜リジン50を含む部位1に結合することが予測され、-60以下の相互作用エネルギースコアを有する。これらの骨格を以下に示してある。
2006504677.tif 000010
MarAの部位2について3つの骨格が同定された（たとえば、残基ヒスチジン54〜セリン62）。
2006504677.tif 000011
MarAの部位3について4つの骨格が同定された（たとえば、残基セリン55〜メチオニン65）：
2006504677.tif 000012
部位6について、6つの骨格が同定された（たとえば、残基ロイシン24〜グルタミン酸35）。
2006504677.tif 000013
次いで、これらの骨格を使用して、600,000以上の独占権権下にない化学構造のCambridge Soft ACX-SCデータベースを検索し、骨格に似た化学物質の数を決定した。
【０２１２】
「骨格」の用語は、コンピューター・モデリング・プログラムによって同定される化合物を含む。これらの化合物は、それ自体が転写因子調節化合物であってもよく、またはそうでなくでもよい。当業者であれば、コンピューター・モデリング・プログラムから得られた骨格を解析し、生じる化合物が初期の骨格化合物以上に増強された化学的性質を有するように、たとえば投与のためにより安定して、より毒性が少ない、特定の転写因子に対して増強された親和性を有するなどのように、骨格を修飾することができるであろう。本発明は、同定された骨格だけでなく、骨格を使用して開発される転写因子調節化合物にも属する。
【０２１３】
表5には、調節化合物に対する相互作用部位の可能性があると同定されたRobの部分を列記する。本発明は、少なくとも一部において、Robのこれらの領域に結合するようにモデル化された任意の化合物に属する。番号付けは、配列番号4に与えられたものに対応する。
【０２１４】
（表５）
2006504677.tif 000014
これらの骨格は、Robの部位1（残基37-45）MarAファミリー・ポリペプチドと、調節化合物の可能性があると同定された。
2006504677.tif 000015
これらの骨格は、Robの部位2（残基43-52）MarAファミリー・ポリペプチドと相互作用する可能性のある小分子として同定された。
2006504677.tif 000016
【０２１５】
転写因子を結合し、調節し、または阻害する化合物のデザインには、一般に2つの因子の考慮を含む。第1に、化合物は、特定の転写因子と物理的におよび構造的に結合することができなければならない。調節化合物と転写因子の結合に重要な非共有結合性の分子相互作用は、水素結合、ファンデルワールス、および疎水的相互作用を含む。
【０２１６】
第2に、調節化合物は、これが選択された転写因子と結合することができるコンホメーションと仮定することができなければならない。阻害化合物の一定部分は、転写因子とのこの結合に直接参加しないと考えられるが、これらの部分は、分子の全体的コンホメーションに依然として影響を及ぼしているであろう。次に、これは、能力に対して有意な影響を有しているかもしれない。このようなコンホメーションの要求は、結合部位、たとえばMarAなどの特定の転写因子の活性部位もしくは付属の結合部位の全てまたは一部に関しての化学的実体または化合物の全体的な三次元構造および向き、または特定の転写因子と直接相互作用するいくつかの化学的実体を含む化合物の官能基の間のスペーシングを含む。
【０２１７】
さらなる態様において、選択された転写因子（たとえば、HTHタンパク質、AraCファミリー・ポリペプチド、MarAファミリー・ポリペプチド、たとえばMarA）に対する化学物質の潜在的な調節効果を、これを実際の合成および試験の前に、コンピュータ・モデリング技術の使用によって解析する。所与の化合物の理論的な構築が、これと選択された転写因子との間の不十分な相互作用および結合を示差する場合は、化合物の合成および試験を避ける。しかし、コンピュータ・モデリングで強い相互作用を示す場合は、次いで分子を合成して、これが選択された転写因子に結合し、転写因子の活性を調節する能力について試験する。
【０２１８】
転写因子調節化合物またはその他の結合化合物（たとえば、HTHタンパク質を調節する化合物、AraCファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、または化合物を阻害するMarAファミリー、たとえばMarAを阻害する化合物）は、これらが個々の小分子結合部位またはその他の転写因子の領域と結合する能力について化学的実体または断片をスクリーニングおよび選択することによって計算的に評価し、およびデザインしてもよい。
【０２１９】
当業者は、化学的実体または断片を、これらが選択された転写因子と、および特に特定の転写活性化因子の個々の小分子結合部位と結合する能力をスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの1つを使用してもよい。この方法は、転写因子の結晶の原子座標に基づいてコンピュータ・スクリーン上で転写因子の構造を視覚的に検査することによって開始してもよい。次いで、選択された化学的実体を、転写因子の個々の結合部位内において種々の向きに配置し、またはドッキングしてもよい。ドッキングは、QuantaおよびSybylなどのソフトウェアを使用し、続いてCHARMM（Brooks, B. R.ら、1983, J.Comp. Chem., 4：187-217）またはAMBER（Weiner, S. J.ら、1984, J. Am. Chem. Soc., 106：765-784）などのプログラムで標準的な分子力学力場または動態力学によりエネルギーの極小化を行ってもよい。
【０２２０】
また、特定のコンピュータプログラムにより、選択した転写因子（たとえば、HTHタンパク質、AraCファミリーのポリペプチド、またはMarAファミリーのポリペプチド、たとえばMarA）に結合する選択分子のプロセスを補助する。本プログラムは以下を含むが、これらに限定されない：
1.GRID（Goodford, P. J., 1985, “A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules” J. Med. Chem., 28：849-857）。GRIDは、Oxford University, Oxford, UKから入手可能である。
2．AUTODOCK（Goodsell. D. S. および A. J. Olsen, 1990,”Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing” Proteins： Structure. Function, and Genetics, 8：195-202）。AUTODOCKは、Scrippes Research Institute, La Jolla, Califから入手可能である。AUTODOCKは、モンテカルロシミュレートされたアニーリングアプローチを使用して柔軟な方法で選択された転写因子に対する阻害化合物のドッキングを助ける。本方法により、研究者は、バイアスが導入されることなく研究の探索ができる。
3．MCSS（Miraker, A. および M. Karplus, 1991, “Functionality Maps of Binding Sites： A Multiple Copy Simultaneous Search Method.“ Proteins： Structure, Function and Genetics, 11：29-34）。MCSSは、Molecular Simulations, Burlington, Massから入手可能である。
4.MACCS-3D（Martin, Y. C., 1992, J. Med. Chem., 35：2145-2154）は、MDL Information Systems, San Leandro, Calif. から入手可能な3Dデータベース・システムである。
5.DOCK（Kuntz, I. D.ら、1982, “A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions“ J. Mol. Biol., 161：269-288）。DOCKは、University of California, San Francisco, Calif.から入手可能である。DOCKは、化合物を阻害することによって満たされるべきである分子（すなわち、選択された転写因子）の間隔を満たす図のネガティブ画像の記述に基づく。DOCKは、エネルギー評価のための力場、制限されたコンホメーションの柔軟性、およびエネルギー評価の疎水性の考慮を含む。
6.MCDLNG（モンテカルロ新規リガンド発生装置）（D. K. Gehlhaarら、1995. J. Med. Chem. 38：466-472）。MCDLNGは、構造（すなわち、X線結晶構造）で開始して、一般的な原子の最密なアレイで結合部位を満たす。次いで、モンテカルロ法を使用して、ランダムに：回転させ、移動させ、結合タイプを変化させ、原子タイプを変化させ、原子を出現させ、結合を出現させ、原子を消滅させ、結合を消滅させ、その他を行う。MCDLNGによって使用されるエネルギー関数は、環および特定の結合配置の形成に有利である。脱溶媒和ペナルティー（penalties）がヘテロ原子に与えられるが、ヘテロ原子は、結合部位との水素結合から得ることができる。
【０２２１】
本発明の態様において、ドッキングは、Insight II内のAffinityプログラム（Molecular Simulations Inc., 1996, San Diego, Calif., now Accelrys Inc.）を使用して行われる。Affinityは、受容体（すなわち、転写因子）にリガンド（すなわち、転写因子調節化合物）を自動的にドッキングさせるためのプログラムのセットである。Affinityのコマンドは、リガンド／受容体の複合体のエネルギーに基づいて、受容体に対するリガンドの最適な結合構造を自動的に見いだす。後述するように、
【０２２２】
Affinityは、可動性-可動性のドッキングのシミュレーションができる。Affinityは、Insight IIプログラムのドッキング・モジュールの新たなプルダウンAffinityの下の2つのコマンド、グリッド・ドッキング（Grid Docking）および固定ドッキング（fixed Docking）からなる。両方のコマンドは、ホスト（すなわち、転写因子）に対するゲスト分子（すなわち、HTHタンパク質調節化合物）をドッキングするためのモンテカルロ・タイプの手順と同じものを使用する。また、これらは、「バルク」の受容体（すなわち転写因子）の特徴を共有し、特定した結合（活性）部位にない原子は、ドッキングプロセスの間に強固に保持されるが、結合部位の原子およびリガンド原子は、可動性であるものとして定義される。しかし、コマンドは、これらの非結合の相互作用の処理において異なる。グリッド・ドッキングでは、バルクと可動性の原子の間の相互作用は、非常に正確かつ効率的な分子力学的／グリッド（MM/Grid）法が、Lutyら、1995. J Comp. Chem. 16：454によって開発されたことによって概算され、一方で可動性の原子の相互作用が正確に処理される。また、グリッド・ドッキングには、Stoutenら、1993. Molecular Simulation 10：97の溶媒和法を含む。他方、固定ドッキングコマンドでは、Discoverプログラム（カットオフ法（cutoff method）および細胞多重法（the cell multiple method））を使用して非結合の相互作用を計算し、これには溶媒和期間を全く含まない。Affinityでは、一般に、ドッキングの間に使用者からのなんらかの介入を必要とする。これは、自動的にリガンド（すなわち、調節化合物）を移動し、エネルギーを評価し、および構造が許容されるかどうかを調べる。さらに、リガンドおよび受容体の結合部位（すなわち、選択された転写修飾因子）は、検索の間に柔軟である。
【０２２３】
大部分の文献のドッキング方法は、記述または経験則に基づく（総説については、Kuntzら、1994. Acc. Chem. Res. 27：117を参照されたい）。これらは、いくつか例を挙げると、DOCK（Kuntzら 1982. J： Mol. Biol. 161：269., Shoichetら、1992. J. Compt. Chem. 13：380., Oshiroら、1995. J. Comp. Aided Molec. Design 9：113.）、CAVEAT（Bartlettら、1989. “Chemical and Biological Problems in Molecular Recognition“ Royal Society of Chemistry： Cambridge, pp. 182-196., Lauri & Bartlett. 1994. J. Comput. Aided Mol. Design 8：51）、FLOG（Millerら、1994. J. Comp. Aided Molec. Design 8：153）、およびPRO_LIGAND（Clarkら 1995. J. Comp. Aided Molec. Design 9：13）を含む。Affinityは、いくつかの側面においてこれらの方法とは異なる。
【０２２４】
第1に、これは、ドッキング構造を捜し、評価する際に完全な分子力学を使用する。対照的に、記述に基づいた方法では、通常、水素結合、疎水的相互作用、および立体効果だけを考慮した経験則を使用する。この簡略なリガンド／受容体の相互作用の記述では、場合によっては不十分である。たとえば、Mengら、1992. J. Compt. Chem. 13：505は、DOCKによって作製されたドッキング構造を評価する際の3つのスコアリング法を研究した。彼らは、分子力学からの力場スコアだけが、実験的に結合する幾何学的配置に最も近い構造を正確に同定することを見いだしたが、立体因子のみまたは静電因子のみを考慮するスコアリング関数では、あまりうまくいかない。Mengら、1992. J. Compt. Chem. 13：505による研究では、ディスクリプタを使用してドッキングをさらに行ったことに留意されたい。他方、Affinityでは、ドッキングおよびスコアリングの両者において分子力学を使用し、したがってより整合される。
【０２２５】
第2に、Affinityでは、受容体のバルクが固定されるが、定義された結合部位は、自由に移動し、これにより異なるリガンドの結合または同じリガンドの異なる結合様式に受容体を適応させることができる。対照的に、記述に基づいた方法のほぼ全てでは、全ての受容体が固定されている。
【０２２６】
第3に、リガンド自体は、Affinityでは柔軟であり、受容体（すなわち、転写因子）にドッキングするリガンド（すなわち、転写因子調節化合物）の種々のコンホメーションが可能になる。最近Oshiroら（1995 J. Comp. Aided Molec. Design 9； 113）は、柔軟なリガンドを扱うためにDOCKに拡張した。また、FLOGは、データベースのそれぞれの構造について異なるコンホメーションを含めることによって柔軟なリガンドを処理することが可能である（Millerら 1995. J. Comp. Aided Molec. Design. 8：153）。大部分のその他の方法では、強固なリガンドに限定される。
【０２２７】
また、いくつかのエネルギーに基づいたドッキング方法もある（Kuntzら 1994. Acc. Chem Res. 27：117）。これらの方法では、分子動力学（特に、アニーリングをシミュレートする）またはモンテカルロ法を使用する。たとえば、Caflischら 1992. Proteins： Struct. Funct. and Genetics 13：223は、柔軟なリガンドをドッキングするために2工程の手順を開発した。これらの手順では、まず、効率的にリガンドと受容体の間の不正な接触を除去するように設計されている特別なエネルギー関数を使用してリガンドをドッキングさせる。次いで、モンテカルロ極小化（Li & Scheraga. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84：6611）を行って、分子力学を使用してドッキングした構造を洗練させる。Hart and Read. 1992. Proteirzs： Struct. Funct. and Genetics 13：206も、リガンドをドッキングするために2工程を使用する。彼らは、第一工程でほぼリガンドをドッキングさせるために受容体の幾何学的配置に基づいたスコアリング関数を使用し、次いで、第二工程でCaflischら 1992. Proteins： Struct. Funct. and Genetics 13：223のものと同様のモンテカルロ極小化を使用する。Mizutaniら（1994. J. Mol. Biol. 243：310）による方法は、この2工程のもう一つの変法である。
【０２２８】
Affinityは、リガンドをドッキングする際にモンテカルロ法を使用するが、従来技術の方法以上の重要な特徴がある。第1に、Affinityにおけるモンテカルロ法は、エネルギー極小化と共に（Li & Scheraga. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84：6611のモンテカルロ極小化方法を模倣するために）または分子動力学と共に（複合型モンテカルロ法、Clampら 1994. J. Comput. Chem. 15：838、もしくはスマートなモンテカルロ法、Senderowitzら 1995. J. Am. Chem. Soc. 117：8211を模倣するために）、いずれかと組み合わせて使用することができる。この柔軟性により、Affinityは、種々のドッキング問題に適用することができる。第2に、ドッキング構造の最初のスクリーニングの際に、Affinityでは、分子力学から得られるエネルギーの相違を使用するが、上記論議した方法では、経験則または記述を使用する。したがって、Affinityは、ドッキング構造の最初のスクリーニングおよび最終的な洗練の両方に分子力学を使用するという点で、より整合する。第3に、Affinityは、受容体の結合部位がゆるめることができるが、上記論議した方法は、全ての受容体を固定する。第4に、Affinityは、ドッキングを実用的に作製するための正確かつ効率的な2つの新しい非結合技術を使用する。一方は、グリッドによって受容体のバルクを表すLutyら（Lutyら、1995. J. Comp. Chem. 16：454）のGrid／MM法である。この方法は、カットオフなしの方法よりも10〜20倍早く、ほとんど精度の減少がない。また、Stoutenら（1993. Molecular Simulation 10：97）の溶媒和法も組み込む。その他のものは、細胞多重法である。この方法は、Grid／MM法よりも約50%遅い方法であるが、グリッドの準備が必要ではない。したがって、典型的なドッキング計算は、Indigo R4400ワークステーション上でのCPU時間約1〜3時間である。
【０２２９】
一旦、適切な化学的断片が選択されると、これらを単一化合物または阻害化合物に組み立てることができる。構築は、特定の転写因子、たとえばMarAの構造の座標に関してコンピュータ・スクリーン上の三次元イメージ・ディスプレイにおいて互いに対する断片の関係を目視検査することによって処理してもよい。これは、QuantaまたはSybylなどのソフトウェアを使用するマニュアルのモデル成形を伴ってもよい。個々の化学的断片を結合する際に、当業者を補助するために有用なプログラムは、以下を含む：
1.MACCS-3Dなどの3Dデータベースシステム（MDL Information Systems, San Leandro, Calif.）この領域は、Martin, Y. C., 1992, “3D Database Searching in Drug Design“, J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154において概説されている。
2.CAVEAT（Bartlett, P. A.ら、1989, “CAVEAT： A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules“. In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems“, Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196）。CAVEATは、University of California, Berkeley, Calif.から入手可能である。CAVEATは、所望の結合ベクターに基づいてMarAに対する阻害化合物を示唆する。
3.HOOK（Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手可能である）。HOOKは、同時検索で多数の官能基のコピーを用いてドッキング部位を提案する。
【０２３０】
もう一つの態様において、転写因子調節化合物は、空の活性部位または任意に既知の阻害化合物（群）の一部の部分（群）を含むもののいずれかを使用する全部または「新規」として設計されてもよい。これらの方法は、以下を含む：
1.LUDI（Bohm, H.-J., “The Computer Program LUDI： A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibiting compounds“, J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 （1992））。LUDIは、Biosym Technologies, San Diego, Califから入手可能である。LUDIは、記述よりもむしろ断片に基づくプログラムである。LUDIは、巨大分子の相互作用部位とマッチするようにいくぶん大きな断片を提唱し、ケンブリッジ構造データベース（CSD）、タンパク質データバンク（PDB）から得られる幾何的基準に、および結合データに基づいた基準に基づいてそのヒットをスコアする。LUDIは、結合部位上に断片をドッキングするためのライブラリーに基づいた方法である。断片を4方向性の相互作用部位（親油性の脂肪族、親油性の芳香族、水素供与体、および水素受容体）で整列させ、これらの重なりの程度をスコアする。次いで、断片を接続させる（すなわち、適当な長さのリンカーを断片のそれぞれの末端原子に付着させる）。コンホメーションの柔軟性は、ライブラリーに特定の断片の多くのコンホメーションを含むことによってのみ説明することができることに留意されたい。
2.LEGEND（Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron, 47, p. 8985 （1991））。LEGENDは、Molecular Simulations, Burlington, Massから入手可能である。
3.CoMFA（Conformational Molecular Field Analysis）（J. J. Kaminski. 1994. Adv. Drug Delivery Reviews 14：331-337）。CoMFAは、疎水性領域、立体構造、および静電気などの性質を表すための三次元分子形状の記述を定義する。次いで、データベースからの化合物を3Dファルマコフォア・モデルに重ね合わせて、これらの重なりの程度をスコアする。検索されるデータベース化した小分子は、以下を含む：ACD（1,000,000化合物以上）、Maybridge（約500,000化合物）、NCI（約500,000化合物）、およびCCSD。フィット性の長所を測定する際には、分子を3D分子形状の記述に対して、または既知の阻害化合物の活性なコンホメーションに対して、いずれかにフィットさせることができる。
4.LeapFrog（Tripos Associates, St. Louis, Mo.から入手可能である）。
【０２３１】
情報技術のためのFlexX（(著作権) 1993-2002 GMD German National Research Center for Information Technology； Rarey, M.ら、 J. Mol. Biol., 261：407-489）は、リガンドを入れるためのインクリメンタル構築アルゴリズムおよび転写因子の活性部位を使用する柔軟なドッキング方法である。次いで、活性部位に「フィッティング」できるリガンド（たとえば、転写因子調節化合物）を活性部位とリガンドの間の相補性（complimentarity）の質を決定するために利用できる多くのスコアリングスキームに従ってスコアする。
【０２３２】
また、その他の分子モデリング技術を本発明に従って使用してもよい。たとえば、Cohen, N. C.ら、“Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry”, J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 （1990）を参照されたい。また、Navia, M. A. and M. A. Murcko, “The Use of Structural Information in Drug Design“, Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 （1992）を参照されたい。
【０２３３】
候補転写因子調節化合物は、所与の部分の位置および結合付近、結合阻害化合物で占められた空間、所与の化合物の結合のエネルギーおよび静電的相互作用エネルギーの変形を決定することに関与する従来の技術を使用して、これらの調節する活性、たとえば抑制性のまたは刺激性の、活性を評価することができる。上記の評価に有用な従来技術の例は、量子力学、分子動力学、モンテカルロ標本抽出、系統学の検索、および遠位幾何学方法（Marshall, G. R., 1987, Ann. Ref. Pharmacol. Toxicol., 27：193）を含むが、これらに限定されない。このような使用のためのコンピュータプログラムの例は、ガウス92（Gaussian 92）、改訂E2（Gaussian, Inc. Pittsburgh, Pennsylvania）、AMBERバージョン4.0（University of California, San Francisco）、QUANTA／CHARMM（Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass.）、およびInsight II／Discover（Biosym Technologies Inc., San Diego, Calif.）を含むが、これらに限定されない。これらのプログラムは、たとえばシリコングラフィックスIndigo2ワークステーションまたはIBM RISC/6000ワークステーション・モデル550を使用して行ってもよい。当業者には、その他のハードウエアシステムおよびソフトウエアパッケージが既知であり、明らかに適用されるであろう。
【０２３４】
一旦、化合物が上記の方法によって設計され、選択されたならば、化合物が特定の転写因子に結合するであろうときの効率を試験して、計算評価によって最適化させる。有効な転写因子調節化合物は、その結合した状態としない状態の間のエネルギーで比較的小さな相違を示すはずである（すなわち、小さな結合の変形エネルギー）。転写因子調節化合物は、全体的結合エネルギーが同じである複数のコンホメーションで選択された転写因子と相互作用するであろう。これらのケースにおいて、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと阻害化合物が酵素に結合するときに観察されるコンホメーションの平均エネルギーの間の相違であると解釈される。
【０２３５】
選択された転写因子、たとえばMarAファミリー・ポリペプチド、たとえば、MarA、Rob、もしくはSoxSと相互作用するように設計され、または選択された化合物は、その結合状態において好ましくは標的タンパク質との反発的静電的相互作用を欠いているように、さらに計算的に最適化させてもよい。このような非相補的（たとえば、静電気）相互作用は、反発的な電荷-電荷、双極子-双極子、および電荷-双極子の相互作用を含む。特に、調節化合物と酵素の間の全ての静電的相互作用の合計は、調節化合物が選択された転写因子に結合するときに、好ましくは、結合エンタルピーに対して中性または有利に寄与する。
【０２３６】
化合物変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するために、特定のコンピュータ・ソフトウェアを当該技術分野において利用できる。このような使用のために設計されたプログラムの例は：ガウス92（Gaussian 92）、改訂C[M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa. (著作権)1992]；AMBER, バージョン4.0[P. A. Kollman, University of California at San Francisco, (著作権)1994]、QUANTA／CHARMM[Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. (著作権)1994]；およびInsight II／Discover（Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif. (著作権)1994）を含む。これらのプログラムは、たとえばシリコングラフィックスワークステーション、IRIS 4D/35またはIBM RISC/6000ワークステーション・モデル550を使用して行ってもよい。当業者には、その他のハードウエアシステムおよびソフトウエアパッケージが既知であろう。
【０２３７】
一旦、転写因子調節化合物が至適に選択され、または設計されたならば、次いで、上記の通りにその結合性質を改善し、または修飾するために、そのいくつかの原子または側鎖に置換を作製してもよい。最初の置換は、保存的である、すなわち置換基が本来の基とほぼ同じ大きさ、形状、疎水性、および電荷を有することが好ましい。コンホメーションを変更することが当該技術分野において既知の置換は、避けられるべきである。次いで、このような置換された化学物質を上記したものと同じコンピュータ法によって、選択された転写因子に対してフィットする効率について解析してもよい。
【０２３８】
化合物のファンデルワールス面と結合部位の残基によって定義される面の間の空いた（水性）間隔を同定するためにコンピュータプログラムを使用することができる。原子-原子の接触におけるこれらの間隙は、リード化合物の修飾されたバージョン上の新たな官能基によって占められ得る体積を表す。このような変化の全体的エネルギーが有利な場合、結合部位の空いた間隔をより効率的に利用することにより、より強く結合する化合物を導くことができよう。共有結合で結合した炭素原子と同じか、または大きな体積の基に適応するのに十分大きな空き体積を有する結合ポケットの領域は、官能基置換のために有望な位置として同定することができる。この領域での官能基置換により、酸素などの炭素原子以外をいくらか置換するものを構成することができる。体積が、炭素原子よりも大きな基に適応するために十分に大きい場合、この領域のタンパク質残基と相互作用する可能性が高い異なる官能基を選択してもよい。タンパク質残基との相互作用に関与する特徴および有望な置換の同定には、疎水性、大きさ、硬性、および方向性を含む。ドッキングの組み合わせ、Ki推定、および改善のための立体的に許される余地の視覚による提示により、強力な誘導体の予測が可能になる。
【０２３９】
一旦、転写因子調節化合物が選択され、または設計されたならば、その他の分子に対するその全体的な類似点または類似性を評価する計算方法を使用して同様の生化学的挙動を有するさらなる化合物を検索することができる。このような方法では、たとえば、HTSに由来するヒットは、これらが特定の活性部位に対する本物のリガンドであることを確認するために、および特定のヒットがスクリーニング法の人為的結果であるという可能性をなくすために試験することができる。化合物の仮想データベースのメンバーに類似する特定の化合物を決定するために、現在いくつかの方法およびアプローチがある。一つの例は、OPTISIM法であり、Tripos package, SYBYL（(著作権) 1991-2002 Tripos, Inc., St. Louis, MO）において配給されている。OPTISIMは、分子のそれぞれの3次元の表現を2次元の断片のセットに分類して、予め定義された二成分の紐（string）にコードすることができるという事実を利用する。結果は、特定のセット内のそれぞれの化合物がソーティングおよび比較などの数学的操作に適応される独特の数値的コードまたはフィンガープリントによって表されるものである。OPTISIMは、たとえばタニモト係数として既知の数学的表現形式の使用に従って、それぞれの化合物のフィンガープリントのパーセント相違を評価して報告するように自動化されている。たとえば、構造が別のものに類似する化合物は、高い係数を共有すると考えられる。商業的に入手可能な化合物または仮定的化合物の大規模な仮想データベースにより、高いタニモト係数を有する化合物を同定するために迅速にスクリーニングすることができる。
【０２４０】
一旦、一連の転写因子調節化合物が記載されている方法によって同定され、拡大されたならば、これらの実験的に決定された生物活性を、多くの利用できる統計パッケージを使用してこれらの構造上の特徴と相関させることができる。産業における典型的なプロジェクトでは、プログラムのSYBYLセット（Tripos Associates, St. Louis, MO）内のCoMFA（COmparative Molecular Field Analysis：比較分子場解析）およびQSAR（Quantitative Structure Activity Relationship：定量的構造活性相関）が利用される。CoMFAでは、特定の一連の測定された活性を有する化合物は、これらが活性部位と相互作用するように、これらの配置を模倣すると考えられている方法で同時に整列させる。次いで、非常に整列された化合物のコレクションを含むように3次元の格子またはグリッドを構築する。格子の上のそれぞれの点で、位置エネルギーの評価を決定し、電場および立体的場をシミュレートする表にした典型的な位置を決定するが、その他の位置機能も利用できる。PLS（Partial Least Squares）などの統計学的方法を使用して、格子-点における測定された活性と位置エネルギー値の間の相関を決定して、全体の分子相関またはQSARモデルを作製するために一次方程式に計算することができる。CoMFAの特に有用な特徴は、それぞれの格子-点についての個々の貢献が既知であるということであり；全体の相関による格子点の重要性をCoMFA場として視覚的に視覚化することができる。この場を本来の化合物のアラインメントと組み合わされると、モデルが由来する個々の化合物の活性を合理化するための、および参照化合物の化学修飾によりどのような影響をうけるかを予測するための、強力なツールとなる。例として、QSARモデルでは、上記された方法を使用して92個のベンゾジアゼピンのセットが開発された。
【０２４１】
本明細書に記載され、または従来技術において既知の構造に基づいたドラッグデザインは、候補化合物を同定するため、または本明細書に記載されているスクリーニングアッセイ法で同定された化合物を最適化するために使用することができる。
【０２４２】
本発明は、それ自体は、転写因子調節化合物を同定するための方法だけでなく、本発明の方法によって同定された化合物並びに同定された化合物を使用するための方法に属する。
【０２４３】
IV.微生物の病原性に関与する分子を同定するための方法
もう一つの側面において、本発明は、分子、たとえば転写因子または転写因子によって発現が調節される分子が、病原性因子であるかどうかを、転写因子が誤って発現される（misexpressed）微生物を作製することと、微生物を哺乳類、たとえば非ヒト動物またはヒト被験者に導入することとによって決定する方法に属する（Bieber, D.ら1998 Science 280：2114）。一つの態様において、分子は、転写因子である。一つの態様において、転写因子は、HTHドメインを含む。もう一つの態様において、転写因子は、AraCファミリーのメンバーである。もう一つの態様において、転写因子は、MarAファミリーのメンバーである。
【０２４４】
試験のための分子は、当該技術分野において既知の標準的な方法を使用して誤って発現させることができる。誤った発現は、分子が機能しない形態で発現されるとき、または分子が細胞によって全く発現されないときに、生じる。たとえば、一つの態様において、1つまたは複数の突然変異を試験される遺伝子に、または分子の発現を制御する制御領域に導入することができる。ライブラリー形式の変異タンパク質を作製するための広く使われている現在の方法は、誤りがちなポリメラーゼ鎖およびカセット突然変異誘発であって、変異誘発される特異的な領域は、合成的に変異誘発されたオリゴヌクレオチドによって置換される。
【０２４５】
もう一つの態様において、遺伝子を欠失させることができる。破壊または欠失の形態の遺伝的変化は、抗生物質抵抗性マーカーを使用する相同的組換えを含む当業者に既知のいくつかの手段によって達成することができる。これらの方法は、制限酵素を使用して、遺伝子の一部または全体が崩壊もしくは除去されるように、または正常な転写および翻訳が妨害されるように、遺伝子および表現型スクリーニングのための抗生物質抵抗性マーカーを破壊すること含む。好ましい態様において、特異的な転写因子のインフレームでの欠失は、交差PCRおよび対立遺伝子の交換を使用して構築することができる。
【０２４６】
次いで、この種のアッセイ法で微生物の病原性に重要であると同定された分子を使用して、たとえば本明細書に記載されている方法を使用して、分子の発現および／または活性の修飾因子を同定することができる。
【０２４７】
一つの態様において、一次スクリーン（たとえば、無細胞もしくは細胞全体のアッセイ法またはドラッグデザイン技術を使用して）において同定された試験化合物は、二次スクリーニングアッセイ法で、たとえば動物モデルにおいて試験することができる。
【０２４８】
一つの態様において、動物感染モデルが使用され、微生物が非ヒト動物において感染を確立する能力は、微生物が動物においてコロニーを形成することを必要とする。次いで、動物モデルにおいて、微生物が動物に感染する能力についてこれを試験する。感染がないことは、動物には微生物によるコロニーが作製されないことを意味し、遺伝子が病原性プロセスに関与することを示す。
【０２４９】
たとえば、微生物が宿主にコロニーを形成する能力について試験する非ヒト動物モデルが、当該技術分野において既知である。コロニーを形成することが厳密には必要でないモデル（たとえば、非ヒト動物に微生物を注射して、LD50または死亡時間を測定するモデル）を本方法に使用することができるが、このような方法は、好ましくない。好ましいモデルは、微生物が宿主および原因病原において増殖するために宿主にコロニーを形成することができることが必要である（Alksne, L.E. and Projan, S.J., 2000 Current Opinion in Biotechnology 11：625-636）。
【０２５０】
典型的なモデルは、細菌（たとえば、大腸菌の毒性株）を齧歯類またはウサギの小腸に注射して、細菌が、候補病原性因子の存在下および非存在下で、または試験化合物の存在下および非存在下で、腸に症状を引き起こす能力を測定するモデルを含む。
【０２５１】
もう一つの態様において、ナイセリア属株が尿生殖路にコロニーを形成する能力を、候補病原性因子の存在下および非存在下で、または試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。
【０２５２】
さらにもう一つの態様において、H.ピロリ菌が腸にコロニーを形成する能力を、候補病原性因子の存在下および非存在下で、または試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。
【０２５３】
さらにもう一つの態様において、生物体、たとえば緑膿菌が非ヒト動物やけどモデルまたは上腿創傷モデルにおいて感染を引き起こす能力を、候補病原性因子の存在下および非存在下で、または試験化合物の存在下および非存在下で測定することができる。また、角膜の外傷に関与するモデルを使用することができる。
【０２５４】
さらにもう一つの態様において、インビボでのモデルを、たとえば微生物が上皮細胞単層に付着し、炎症反応を誘発する能力について試験することによって微生物の病原性を試験するために使用することができる（Tangら 1996. Infection and Immunity. 64：37）。
【０２５５】
さらにもう一つの態様において、非ヒト動物を、一種類以上の細菌で同時感染させることができる（たとえば、Rippere-Lampeら 2001. Infection and Immunity 69：3954を参照されたい）。
【０２５６】
もう一つの態様において、エルシニアによる非ヒト感染モデル（たとえば、ペスト菌（Y. pestis）またはペスト菌のモデル、たとえば、エンテロコリチカ菌（Y. enterocolitica）または偽結核エルシニア菌）を使用することができる。例示的な動物モデルにおいて、エンテロコリチカ菌または偽結核エルシニア菌は、経口または腹腔内接種を経由して投与することができる。経口摂取に続き、細菌を遠位の回腸および近位の結腸に局在化し、次いでパイエル板のM細胞に侵入して、下にあるリンパ組織にコロニーを形成する。次いで、細菌は腸間膜リンパ節まで、最終的に脾臓および肝臓まで広がる。組織における細菌数（たとえば、盲腸、パイエル板、腸間膜リンパ節、および脾臓）を決定することができる（Mecsasら 2001. Infection and Immunity. 67：2779；Monackら 1998. J. Exp. Med. 188：2127）。
【０２５７】
たとえば、LcrF（VirF）を欠いている偽結核エルシニア菌のインビボの病原性を評価するために、ｌcrF（virF）の単一の無発現変異を、先に述べた遺伝学的技術を使用してYPIIIpIBI株に作製する。野生型および突然変異株を使用して、以下に記載したようにマウスに感染させる。
【０２５８】
簡単には、8〜10週齢のBALB／c雌マウスを、野生型または変異体偽結核エルシニア菌の10倍の段階希釈に経口的に感染させることができる。感染したマウスを30日の期間モニターし、すでに記載したように、50%の死亡率（LD50）の点を算出する。
【０２５９】
一旦、LD50が決定されれば、致死量以下の野生型または変異体偽結核エルシニア菌を、マウスを感染させるために使用することができる。感染の5日後、マウスを屠殺して、小腸内腔、盲腸内腔、大腸内腔、パイエル板、腸間膜リンパ節、脾臓、肝臓、肺、および腎臓、並びに血液を含む組織を、確立されたプロトコルに従って細菌負荷について検査する。実験では、2つの株の感染力を比較して、次の実験のために重要なパラメータである病原性のより微妙な変化を同定することができる。
【０２６０】
例示的なさらにもう一つの動物モデルにおいて、ペスト菌をマウスの宿主の皮下に投与して、マウス個体群の50%を死滅させるために必要な用量[50%致死量（LD50）]を決定することができる（Rossiら 2001. Infection and Immunity. 69：6707； Thompsonら 1999. Infection and Immunity. 67：38779）。
【０２６１】
さらにもう一つの態様において、前立腺炎の非ヒト動物モデルを使用することができる。前立腺炎のラット・モデルは、当該技術分野において既知である（たとえば、 Rippere-Lampe. 2001. Infection and Immunity 69：6515を参照されたい）。動物には、生物体を感染することができる（たとえば、経尿道カテーテルまたは膀胱内接種を経て尿路疾患性の大腸菌を）。前立腺を除去して、生物体の数を決定することができる（たとえば、組織をホモジナイズして、これらを段階希釈し、コロニー数のためにこれらをプレートに蒔く）。
【０２６２】
さらにもう一つの態様において、尿路感染症非ヒト動物モデル（上行性の腎盂腎炎モデル）を使用することができる。このようなモデルは、以前に記載されており、文献において見出すことができる。総説については、Mulvyら（（2000） Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97：8829-35）またはSchillingら（（2001） Urology 57：56-61）を参照されたい。具体例は、Hagbergら（（1983） Infection and Immunity 40：273-283）、Johnsonら（（1993） Molec. Micro. 10：143-155）、Mobleyら（（1990） Infection and Immunity 58：1281-1289）、およびRippere-Lampeら（（2001） Infection and Immunity 69：3954-64）において見出すことができる。このようなモデルの使用は、本実施例に記載されている。
【０２６３】
非ヒト動物に存在する細菌数は、たとえば感染した器官を収集し、標準的な技術を使用して細菌の混入レベルを決定することによって直接定量することができる。もう一つの態様において、宿主における微生物の増殖は、たとえば宿主の器官における病原性の病変を定量化することによって、または微生物に対する宿主の免疫応答レベルを測定することによって、間接的に決定することができる。
【０２６４】
これらのモデル、並びに本明細書に記載され、または当該技術分野において既知のその他のいずれも、転写因子活性を調節する化合物を同定するために使用することができることが、当該技術分野の当業者によって認識されるであろう。
【０２６５】
V.転写因子調節化合物および試験化合物
本方法で試験するための化合物は、種々の異なる供与源に由来することができ、既知（転写因子の活性および／または発現を調節することが以前に既知でないが）であることができ、または新規であることができる。一つの態様において、転写活性化因子を調節する化合物、たとえば、HTHタンパク質を調節する化合物、AraCファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、その他を同定するために、化合物のライブラリーを本方法で試験する。もう一つの態様において、転写因子を調節する化合物（たとえば、HTHタンパク質を調節する化合物、AraCファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物など）を同定するために、既知の化合物を本方法で試験する。ある態様において、環境保護局によって安全であると一般に考えられている（GRAS）化合物の一覧の中の化合物を本方法で試験する。もう一つの態様において、調節化合物によって調節される転写因子は、原核生物の微生物の転写因子である。
【０２６６】
一つの態様において、複数の試験化合物が、開示された方法を使用して試験される。もう一つの態様において、本スクリーニングアッセイ法で試験される化合物は、転写因子活性を調節することが以前に既知ではない。
【０２６７】
医薬品化学の最近の傾向は、ライブラリーと称される化合物の混合物の生成を含む。ペプチドのライブラリーの使用は、当該技術分野において確立されているが、ベンゾジアゼピン（Buninら、1992.J. Am. Chem. Soc. 114：10987； DeWittら、1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6909））ペプトイド（peptoids）（Zuckermann. 1994. J.Med. Chem. 37：2678） オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Choら、1993. Science. 261：1303）、およびヒダントイン（DeWittら、前記）などのその他の化合物の混合物を生成できる新たな技術も開発された。Rebekらは、104〜105の多様性を有する小有機分子の分子ライブラリーの合成のためのアプローチを記載した（Carellら 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2059； Carellら Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994. 33：2061）。
【０２６８】
本発明の化合物は、以下を含む当該技術分野において既知のコンビナトリアルライブラリー法の多くのアプローチのいずれを使用して得ることもできる：生物学的なライブラリー；空間的にアドレス指定可能な平行した固相または液相ライブラリー、逆たたみこみ（decomvolution）を必要とする合成物ライブラリー法、「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成物ライブラリー法。生物学的なライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4アプローチをペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小分子の化合物ライブラリー（Lam, K.S. Anticancer Drug Des. 1997. 12：145）に適用できる。
【０２６９】
活性についてスクリーニングすることができる例示的な化合物は、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子、および天然物抽出物ライブラリーを含むが、これらに限定されない。一つの態様において、試験化合物は、ペプチドまたはペプチド擬態である。もう一つの好ましい態様において、化合物は、小さな有機非ペプチド性化合物である。
【０２７０】
分子ライブラリーの合成のためのその他の例示的な方法は、当該技術分野において、たとえば：Erbら 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11422；Horwellら 1996 Immunopharmacology 33：68；およびGallopら 1994. J Med. Chem. 37：1233において見いだすことができる。
【０２７１】
化合物のライブラリーは、溶液中に（たとえば、Houghten （1992） Biotechniques 13：412-421）、またはビーズ（Lam（1991） Nature 354：82-84）、チップ（Fodor （1993） Nature 364：555-556）、細菌（Ladner 米国特許第5,223,409号）、芽胞（Ladner 米国特許’409）プラスミド（Cullら （1992） Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869）、もしくはファージ（Scott and Smith （1990） Science 249：386-390）に；（Devlin （1990） Science 249：404-406）；（Cwirlaら （1990） Proc. Natl. Acad. Sci. 87：6378-6382）；（Felici （1991） J. Mol. Biol. 222：301-310）；（Ladner、前記）示されてもよい。また、ペプチドライブラリーのその他のタイプを発現させてもよく、たとえば米国特許第5,270,181号および第5,292,646号を参照されたい。さらにもう一つの態様において、コンビナトリアルポリペプチドをcDNAライブラリーから作製することができる。
【０２７２】
その他の態様において、化合物は、核酸分子であることができる。好ましい態様において、試験のための核酸分子は、小さなオリゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、ランダムに作製されたオリゴヌクレオチドのライブラリーであることができ、または転写因子、たとえばHTHタンパク質、MarAファミリー・ポリペプチド、またはAraCファミリー・ポリペプチドの活性を減少させるように特に設計することもできる。たとえば、1つの態様において、これらのオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドである。一つの態様において、試験のためのオリゴヌクレオチドは、特定の転写因子の結合部位、たとえばMarAファミリー・ポリペプチド・ヘリックス-ターン-ヘリックス・ドメインに対してセンスである。MarAファミリー・ポリペプチドなどの特定の転写因子ポリペプチドの配列を与えるこのようなオリゴヌクレオチドを設計する方法は、当該技術分野の範囲内である。
【０２７３】
さらにもう一つの態様において、転写因子活性、たとえばHTHタンパク質、AraCファミリー・ポリペプチド、もしくはMarAファミリー・ポリペプチド活性を調節する可能性が増大された個々の化合物または化合物のクラスを同定するために、コンピュータプログラムを使用することができる。このようなプログラムでは、選ばれた転写因子と適切な分子的および化学的な相補性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このように、上記したアッセイ法において転写因子調節化合物をスクリーニングする効率を増強することができる。
【０２７４】
VI.アッセイ法において試験し、および／または同定された化合物で処理するために適した微生物
多くの異なる微生物は、本アッセイ法の試験に適しており（たとえば、試験のための転写因子の供与源として）、またはこれらの微生物による感染は、本明細書に記載されているアッセイ法を使用して同定された化合物によって処理することができる。アッセイ法に使用するために、これらは、無処理の細胞として、またはたとえば、本明細書に記載されている核酸分子もしくはポリペプチド材料の供与源として使用されてもよい。
【０２７５】
一つの態様において、細胞は、転写因子、たとえばAraC/XylSまたはMarAファミリー転写因子を含む。
【０２７６】
一つの態様において、請求した方法に使用するための微生物は、転写因子を構成的に発現する。
【０２７７】
好ましい態様において、請求した方法に使用するための微生物は、細菌、グラム陰性またはグラム陽性菌のいずれかである。より詳細には、たとえばMar表現型を表示するための抗生物質に耐性になることが示されているか、または感染性のもしくは潜在的に感染性である任意の細菌を請求した方法に使用することが好ましい。
【０２７８】
試験または治療に適した微生物の例は、緑膿菌、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovorans）、シュードモナス・アルカリジェネス（Pseudomonas alcaligenes）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、バルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、アエロモナス・ヒドロフィリア（Aeromonas hydrophilia）、大腸菌、シトロバクター・フレウンジ（Citrobacter freundii）、サルモネラ・エンテリカ・チフィムリウム（Salmonella enterica Typhimurium）、サルモネラ・エンテリカ・チフィ（Salmonella enteric Typhi）、サルモネラ・エンテリカ・パラチフィ（Salmonella enterica Paratyphi）、サルモネラ・エンテリカ・エンテリドチジス（Salmonella enterica Enteridtidis）、ジセンテリア赤痢菌（Shigella dysenteriae）、フレキシネリ赤痢菌（Shigella flexneri）、ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトーカ（Klebsiella oxytoca）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、野兎病菌（Francisella tularensis）、モルガン菌（Morganella morganii）、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）、尋常変形菌（Proteus vulgaris）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、プロビデンシア・レットゲリ（Providencia rettgeri）、プロビデンシア・スチュアルチ（Providencia stuartii）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、アシネトバクター・ヘモリティカス（Acinetobacter haemolyticus）、エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌、偽結核エルシニア菌(Yersinia Pseudotuberculosis)、エルシニア・インターメディア(Yersinia intermedia)、百日咳菌、パラ百日咳菌（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・ブロルズキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・ヘモリティカス（Haemophilus haemolyticus）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Haemophilus parahaemolyticus）、軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）、カタル球菌（Branhamella catarrhalis）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、カンピロバクター・フェタス（Campylobacter fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ガルデネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス・ジスタソニス（Bacteroides distasonis）、バクテロイデス属3452A相同性群（Bacteroides 3452A homology group）、バクテロイデス・ブルガタス（Bacteroides vulgatus）、バクテロイデス・オバラス（Bacteroides ovalus）、バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、バクテロイデス・ユニホーミス（Bacteroides uniformis）、��クテロイデス・エゲルチ（Bacteroides eggerthii）、バクテロイデス・スプランキニカス（Bacteroides splanchnicus）、クロストリジウム・ディフィシール（Clostridium difficile）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルレア（Mycobacteriurm intracellulare）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Corynebacterium ulcerans）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクティア（Streptococcus agalactiae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・ヘシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、スタフィロコッカスインターメジウス（Staphylococcus intermedius）、スタフィロコッカス・ハイカス亜種ハイカス（Staphylococcus hyicus subsp. hyicus）、スタフィロコッカス・ヘモリティクス（Staphylococcus haemolyticus）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、およびスタフィロコッカス・サッカロリチカス（Staphylococcus saccharolyticus）を含むが、これらに限定されない。
【０２７９】
一つの態様において、試験または処理するために適した微生物は、腸内細菌科のファミリーに由来する細菌である。好ましい態様において、化合物は、エシェリヒア、プロテウス、サルモネラ、クレブシエラ、プロビデンシア、エンテロバクター、バークホリデリア、シュードモナス、アエロモナス、ヘモフィルス、エルシニア、ナイセリア、およびマイコバクテリアからなる群より選択される族の細菌に対して有効である。
【０２８０】
さらにその他の態様において、試験される微生物は、グラム陽性菌であり：乳酸桿菌（Lactobacillus）、アゾルルチゾビウム（Azorhizobium）、ストレプトミセス（Streptomayces）、ペジオコックス（Pediococcus）、発光菌（Photobacterium）、バチルス（Bacillus）、腸球菌（Enterococcus）、ブドウ球菌（Staphylococcus）、クロストリジウム（Clostridium）、および連鎖球菌（Streptococcus）からなる群より選択される属に由来する。
【０２８１】
その他の態様において、試験されまたは治療される微生物は、真菌である。好ましい態様において、真菌は、ケカビまたはカンジダ、たとえばケカビ・ラクメオサス（Mucor racmeosus）またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に由来する。
【０２８２】
さらにその他の態様において、試験され、または治療される微生物は、原生動物である。好ましい態様において、微生物は、マラリアまたはクリプトスポリジウム寄生生物である。
【０２８３】
もう一つの態様において、試験される微生物は、潜在的なバイオテロリズム薬として重要である。たとえば、一つの態様において、1つまたは複数の微生物が：炭疽菌（炭疽）；ボツリヌス菌；ペスト菌；野兎病菌（野兎病）；バークホルデリア・プソイドマレイ（Burkholderia pseudomallei）；コクシエラ・バーネッティ（Coxiella burnetti）（Q熱）；ブルセラ種（ブルセラ症）；バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）（鼻疽）；ウェルシュ菌のε毒素；ブドウ球菌のエンテロトキシンB；発疹チフス（発疹チフスリケッチア）；下痢性大腸菌；病原性ビブリオ（たとえば、炎ビブリオ菌、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）、V.ミミカス（V.mimicus）、V.ホリサエ（V.hollisae）、V.フルビアリス（V.fluvialis）、V.アルギノリティカス（V.alginolyticus）、V.メトシニコビ（V.metschnikovii）、およびV.デムセラ（V.damsela））；赤痢菌種；サルモネラ種；リステリア菌；カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）；エンテロコリチカ菌；多種薬剤耐性TB；その他のリケッチア（たとえば、斑点熱リケッチア、R.コノリ（R.conorii）、ツツガムシ病菌（R.tsutsugamushi）、発疹熱リケッチア（R.typhi）、および痘瘡リケッチア（R.akari））；からなる群より選択され、本アッセイ法において、試験され、または本発明の化合物を使用して治療される。
【０２８４】
もう一つの態様において、Mar様の系を有するバイオテロリズムの薬剤として潜在的に重要である生物体は、本アッセイ法において試験され、または本発明の化合物を使用して治療される。典型的な生物体には、以下が含まれる：大腸菌（腸管病原性大腸菌（EPEC）、腸内毒素原性大腸菌（ETEC）、腸管出血性（EHEC）、腸管凝集性（enteroaggregative）（EAEC）、志賀毒素産生大腸菌（STEC））、サルモネラ・エンテリカ血清型コレラスイス（Salmonella enterica serovar Choleraesuis）、サルモネラ・エンテリカ血清型エンテリティディス（Salmonella enterica serovar Enteritidis）、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar Typhimurium）、サルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウム（Salmonella enterica serovar Typhimurium）DT104、エルシニア種（ペスト菌、エンテロコリチカ菌、偽結核エルシニア菌）、赤痢菌種（フレクスナー赤痢菌、ゾンネ赤痢菌、志賀赤痢菌）、ビブリオ・コレラ、およびバチルス種。
【０２８５】
VII.薬学的組成物
転写因子の活性または発現を調節する薬剤は、被検者に、このような投与のために適切な薬学的組成物を使用して投与することができる。このような組成物は、典型的には薬剤（たとえば、核酸分子、タンパク質、または抗体）および薬学的に許容されるキャリアを含む。
【０２８６】
一つの態様において、このような組成物は、第2の薬剤と組み合わせて投与することができる。たとえば、転写因子の活性または発現を調節する薬剤は、微生物の増殖または病原性の制御に有効である第2の薬剤とともに被検者に投与することができる。典型的な薬剤には、抗生物質または生物致死剤が含まれる。このような第2の薬剤は、別々にまたは転写因子の活性もしくは発現を調節する薬剤を含む薬学的組成物の一部として、投与すること、または微生物もしくは表面と接触させることができる。
【０２８７】
本明細書において使用される専門用語として、「薬学的に許容されるキャリア」は、医薬品の投与に適合性を持つ溶媒、分散媒、コーテング、抗菌薬および抗真菌薬、等張性および吸収遅延薬などのいずれかおよび全てを含むことが企図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体類および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体類または薬剤が活性化合物に不適合である場合を除き、組成物におけるこれらの使用が想定される。また、補充性の活性化合物を組成物に組み込むことができる。
【０２８８】
本発明の治療的な方法に使用する薬学的組成物は、その企図される投与経路に適合性を持つように処方される。投与の経路の例は、非経口的、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば、吸入）、経皮（局所的）、経壁、および直腸の投与を含む。非経口的、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射のための水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、またはその他の合成溶媒などの無菌の希釈液；ベンジルアルコールまたはメチル・パラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化物；エチレンジアミン四酢酸などのキレート薬；酢酸、クエン酸、またはホスフェートなどの緩衝液、および塩化ナトリウムもしくはデキストロースなどの緊張度調節のための薬剤。pHは、塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調節することができる。非経口的標品は、アンプル、ディスポーザブルな注射器、またはガラスもしくはプラスチックでできている多回投与バイアルに密封することができる。
【０２８９】
注射用の使用のために適した薬学的組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散剤、および無菌の注射用の溶液または分散剤を即座に調製するための無菌粉末を含む。静脈内投与のためには、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌性の水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, NJ）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）を含む。全ての例において、組成物は、無菌でなければならず、簡単にシリンジに入れることができる程度に液体であるべきである。製造および貯蔵の条件下で安定していなければならないし、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存されなければならない。キャリアは、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセリン、プロピレングリコール、および液状のポリエチレングリコールなど）を含む、溶媒または分散媒、およびこれらの適切な混合物であることができる。適切な液性は、たとえば、レシチンなどのコーテングの使用によって、分散剤の場合に必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌薬および抗真菌薬によって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張性の薬剤、たとえば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用の組成物の延長された生体吸収は、生体吸収を遅延させる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０２９０】
無菌の注射剤溶液は、転写の発現および／または活性を調節する薬剤を、列挙された成分の1つまたは組み合わせと共に、必要とされる量で適切な溶媒に組み込むことによって、必要に応じて、続いて滅菌フィルターをかけて調製することができる。一般に、分散剤は、活性化合物を基本的な分散媒および上記に掲げたものからの必要とされるその他の成分を含む無菌の媒体に組み込むことによって調製される。無菌の注射用の溶液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、これらの前に滅菌フィルターをかけた溶液から、活性成分とさらに任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２９１】
経口組成物は、一般に不活性な希釈液または食用のキャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに密封すること、またはタブレットに圧縮することができる。経口治療的な投与のためには、活性化合物を賦形剤に組み込むことができ、タブレット、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。また、経口組成物は、うがい薬として使用するための液体キャリアを使用して調製することができ、液体キャリア中の化合物は、経口的に適用され、音を立てて喀痰され、または飲み込まれる。薬学的に適合性を持つ結着剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。タブレット、ピル、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分または同様の性質の化合物を含むことができる：微結晶性のセルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチ、などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterotes）などの潤滑剤；コロイド性の二酸化ケイ素などの滑沢剤（glidant）；シュークロースまたはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香料。
【０２９２】
吸入による投与のためには、化合物は、適切な噴射剤、たとえば二酸化炭素などの気体を含む加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾル噴霧の形態でデリバリーされる。また、全身投与は、経粘膜または経皮の手段によって行うことができる。経粘膜または経皮の投与のためには、浸透させるバリヤーに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、一般に当該技術分野において既知であり、たとえば、経粘膜な投与のためには、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻薬または坐薬の使用によって達成することができる。経皮の投与のためには、活性化合物は、当該技術分野において一般に既知の傷薬、軟膏、ゲル、またはクリームに処方される。
【０２９３】
また、転写因子の活性を調節する薬剤は、坐薬（たとえば、カカオ脂およびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤と共に）または直腸デリバリーのための保持浣腸の形態で調製することができる。
【０２９４】
一つの態様において、転写因子の発現および／または活性を調節する薬剤は、インプラントおよびマイクロカプセル化されたデリバリー形を含む徐放製剤などの、体からの迅速な排除から化合物を保護するキャリアと共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性の、生体適合性の重合体を使用することができる。このような製剤を調製する方法は、当業者には明らかであろう。また、材料は、商業的にAlza社およびNova Pharmaceuticals Inc.から得ることができる。また、リポソームの懸濁液（ウイルスの抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞にターゲットされるリポソームを含む）を薬学的に許容されるキャリアとして使用することができる。これらは、たとえば米国特許第4,522,811号に記載されているように、周知の方法に従って調製することができる。
【０２９５】
投与の容易さおよび用量の均一性のために、用量単位剤形で経口または非経口的組成物を処方することも特に有利である。本明細書に使用されるものとして、用量単位剤形は、治療される被検者のための単位用量として適した物理的に分離した単位をいい；予め定められた量の活性化合物を含むそれぞれの単位は、必要とされる薬学的キャリアと結合させて所望の治療的な効果を生じるように算出される。本発明の用量単位形についての詳細は、転写因子の発現および／または活性を調節する薬剤の独特の特徴、および達成される特定の治療的な効果、および当該技術分野において被検者を治療するためのこのような薬剤の合成における固有の限界に従い、および直接依存する。
【０２９６】
このような薬剤の毒性および治療効果は、たとえば、LD50（集団の50%に対する用量致死）およびED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。
【０２９７】
新しく合成された全てのMar阻害剤の予備的なインビトロ細胞障害性（Tox）を標準的な方法に従って、および自動の液体ディスペンサーおよびロボット計測を使用する比較的ハイスループットの方法で、アフリカミドリザル腎臓COS-1およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO-Kl）細胞株に対して行う。簡単には、細胞培養を洗浄し、トリプシン処理して、収集する。次いで、細胞懸濁液を、調製し、96ウェル黒い壁の（black-walled）マイクロタイタープレートをまくために使用して、37℃で組織培養条件下で一晩インキュベートした。翌日、Mar阻害剤の段階希釈をプレートに移し、次いで24時間インキュベートする。培地／薬物を吸引して、50μlのレザズリンを添加する。レサズリンは、細胞の代謝の指標として使用され、これらのタイプの細胞障害性アッセイ法のために通常使用される可溶性の無毒の色素である。
【０２９８】
次いで、プレートを組織培養条件下で2時間、次いでさらに30分間暗闇でインキュベートする。蛍光測定（励起535nm、発光590nm）を記録して、毒性対対照細胞を算出するために使用する。最終的に、Tox50およびTox100の値が決定され、これらの値は、それぞれ細胞の増殖を50%および100%まで阻害するために必要な化合物の濃度を表す。対照細胞障害性および無細胞毒性の化合物を全てのアッセイ法に通常含ませる。これらの実験の目標は、化合物のTox50およびTox100値≧50-100μg/mlとして定義される、インビトロで細胞障害性をほとんどまたは全く測定できない化合物を同定することである。
【０２９９】
細胞のToxアッセイ法において有利に機能するMar阻害剤を急性毒性のマウス・モデルで研究する。簡単には、雌のCD1マウス群（n=5）を皮下の投与経路を経て試験化合物または対照化合物（媒体）で、3用量レベルで5日間処理する。動物窮迫の顕性な徴候、たとえば、一般的な臨床的な観察、重量減少、フィード消費量、その他を毎日モニターする。動物を研究終了後にCO2／O2窒息で安楽死させ、血液学的および病理学的な組織解析、並びに血清化学を行うことができる。目標は、検出可能な急性毒性（≧15-25mg/kg）のない化合物を同定することである。
【０３００】
中毒性および治療的な効果の間の用量比は、治療係数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療係数を示す薬剤が好ましい。中毒性の副作用を示す薬剤を使用してもよいが、非感染細胞に対する潜在的なダメージを最小にし、これにより副作用を減少させるために、患部組織の部位にこのような薬剤をターゲットするデリバリー系を設計するための治療がなされるべきである。
【０３０１】
細胞培養アッセイ法および動物試験から得られるデータは、ヒトに使用する用量の範囲を打ち立てる際に使用することができる。このような転写因子調節薬剤の用量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性がないED50を含む循環濃度内にある。用量は、使用される剤形、患者の感受性、および投与の経路に依存して、この範囲内で変化させてもよい。本発明の治療的な方法に使用する任意の薬剤については、治療的に有効な用量は、初めに細胞培養アッセイ法から推定することができる。用量は、細胞培養において決定されるIC50（すなわち、症状の最大半減の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルに処方されてもよい。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、たとえば高速液体クロマトグラフィによって測定されてもよい。
【０３０２】
本明細書で定義されるものとして、タンパク質またはポリペプチドの治療的に有効な量（すなわち、有効な用量）は、約0.001〜30mg/kg体重、好ましくは約0.01〜25mg/kg体重、より好ましくは約0.1〜20mg/kg体重、およびさらにより好ましくは約1〜10mg/kg、2〜9mg/kg、3〜8mg/kg、4〜7mg/kg、または5〜6mg/kg体重の範囲である。当業者であれば、疾患または障害の重篤さ、以前の治療、被検者の一般的な健康および／または年齢、並びに存在するその他の疾患を含む（しかし、これらに限定されない）特定の因子が効率的に被検者を治療するために必要とされる用量に影響を及ぼすであろうことを認識するであろう。さらに、タンパク質、ポリペプチド、または抗体の治療的に有効な量での被検者の治療は、単一の治療を含むことができ、または好ましくは一連の治療を含むことができる。また、それは、治療のために使用する抗体、タンパク質、またはポリペプチドの有効な用量は、特定の治療経過を通じて増減してもよいことが認識されるであろう。用量の変化は、本明細書に記載されているような診断アッセイ法の結果から生じて、または明らかになるであろう。
【０３０３】
本発明は、発現および／または活性を調節する薬剤を含む。薬剤は、たとえば小分子である。たとえば、このような小分子は、ペプチド、ペプチド擬態、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モルにつき約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物（すなわち、ヘテロ有機および有機金属の化合物を含む）、モルにつき約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、モルにつき約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、モルにつき約500グラム未満の分子量を有する有機または無機の化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル、およびその他の薬学的に許容される形態を含むが、これらに限定されない。小分子薬剤の適切な用量は、通常の技術を有する医師、獣医、または研究者の限界の範囲内の多くの因子に依存することが理解されている。小分子の用量は、たとえば、治療される被検者または試料の同一性、大きさ、および症状に応じて、さらに組成物が投与される経路、および適用できる場合には、本発明の核酸またはポリペプチドにより開業医が要求する小分子の有する効果に応じて変化される。
【０３０４】
例示的な用量は、被検者または試料の重量のキログラムにつき、小分子のミリグラムまたはマイクログラムの量を含む（たとえば、約1μg/kg〜約500mg/kg、約100μg/kg〜約5mg/kg、または約1μg/kg〜約50μg/kg）。小分子の適切な用量は、調節される発現および／または活性に関する小分子の能力に依存することがさらに理解される。このような適切な用量は、本明細書に記載されているアッセイ法を使用して決定されてもよい。これらの小分子の1つまたは複数を、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現および／または活性を調節するために動物（たとえば、ヒト）に投与するときに、医師、獣医、または研究者は、たとえば最初は比較的低用量を処方し、その後に適切な反応が得られるまで用量を増大する。加えて、任意の特定の動物被検者のための特定の用量レベルは、使用する特異的な化合物の活性、被検者の年齢、体重、一般的な健康、性、および食餌、投与の時間、投与の経路、排出の割合、任意の薬物組み合わせ、並びに調節される発現の程度および／または活性を含む種々の因子に依存することが理解される。
【０３０５】
VIII.治療方法
本発明は、転写因子の発現および／または活性を調節する薬剤を投与することにより、微生物の感染のリスクのある（または感受性の高い）または感染を有する被検者、たとえばヒトを予防法および治療的に治療する方法を提供する。「治療」の用語は、本明細書に使用されるものとして、感染、感染の症状、または感染に対する素因を有する患者に対して、感染（たとえば細菌感染）、感染の症状、または感染に対する素因を治療する、回復する、軽減する、楽にする、変わる、治癒する、改善する、寛解させる、または影響を及ぼす目的で治療薬を適用または投与することとして定義すされる。
【０３０６】
一つの態様において、本発明は、感染のリスクのある被検者または患者集団、たとえば長期療養施設の個人、重要なおよび集中的な看護ユニット、移植（腎臓）サービス、術後（泌尿器）または腫瘍ユニット、性的に活発な若い女性、または再発性UTIを経験した閉経婦人の予防的または治療的のいずれかの治療方法を提供する。加えて、本方法および化合物は、妊婦および泌尿器外科または腎臓移植を受けた患者の無症候性細菌尿の予防的治療において使用することができる。また、免疫易感染性（immnunocompromised）またはカテーテル処置された患者は本方法および化合物を使用して治療することができる。
【０３０７】
一つの態様において、本発明の化合物および方法は、尿生殖器-尿路感染症（たとえば、膀胱炎、併発性を伴わないUTI、急性の併発性を伴わない腎盂腎炎、併発UTI、女性のUTI、男性のUTI、再発性のUTI、および無症候性細菌尿）を治療するために使用することができる。
【０３０８】
一つの態様において、本発明は、転写因子の発現および／または活性を調節することにより、バイオテロリズムの薬剤として潜在的に重要な生物体に曝露されたか、または曝露されるリスクのある被検者または患者集団の予防法または治療的な治療のいずれかの治療方法を提供する。
【０３０９】
例示的な治療薬は、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【０３１０】
一つの側面において、本発明は、転写因子の発現および／または活性を調節する薬剤またはこのような薬剤の組み合わせを被検者に投与することにより、被検者において微生物の感染を予防するための方法を提供する。感染のリスクのある被検者は、たとえば、被検者の状態に基づいて（たとえば、被検者が免疫不全であることを決定する）または被検者が曝露される環境条件に基づいて（たとえば、被検者が特定の薬剤に曝露される可能性があることを決定する）同定することができる、。予防薬の投与は、感染が予防され、またはその進行が遅延されるように、感染の症状の特徴が現れる前に行うことができる。適切な薬剤は、たとえば本明細書に記載されているスクリーニングアッセイ法に基づいて決定することができる。
【０３１１】
もう一つの本発明の側面は、既存の微生物の感染に罹患している被検者を治療するための方法に属する。これらの方法は、被検者に転写因子の発現および／または活性を調節する（たとえば、阻害する）薬剤またはこのような薬剤の組み合わせを投与することを含む。
【０３１２】
一つの態様において、第2の薬剤を、本発明の転写因子を調節する薬剤と組み合わせて投与しもよい。たとえば、第2の薬剤は、微生物の治療のために臨床的に使用するものであることができる。たとえば、1つの態様において、抗生物質は、転写因子を調節する薬剤と同時投与される（たとえば、同じ処理プロトコルの一部として投与する）またはを転写因子調節する薬剤と同じ表面に存在させる。
【０３１３】
一つの態様において、このような併用療法は、繰り返される感染（たとえば、繰り返される尿路感染症）またはバイオフィルムに関する感染を予防するために投与される。もう一つの態様において、このような併用療法は、抗生物質の量を減少させるため、または予防または治療のために1つまたは複数の抗生物質の必要を除去するために投与される。もう一つの態様において、このような併用療法は、微生物において発生する抗生物質に対する耐性を防止する。
【０３１４】
一つの態様において、本発明は、転写因子調節化合物、たとえばHTHタンパク質を調節する化合物、AraCファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、MarAファミリー・ポリペプチドを調節する化合物、または、MarAを阻害する化合物の有効な量を投与することによって、表面（たとえば、非生物的な、すなわち、生きていない表面、または領域に）におけるバイオフィルムの形成を分散させ、または防止するための方法に属する。
【０３１５】
MarAおよびその相同体の非存在下では、大腸菌のバイオフィルム形成に対してネガティブな効果を有するということが発見された。遺伝的にこの知見を確認するために、marAをコードするプラスミドをmarA、soxS、およびrobを欠失した大腸菌株（3重ノックアウト）に形質転換した。この3重ノックアウトにおけるMarAの発現により、この宿主のバイオフィルム形成を野生型宿主のものに匹敵するレベルに回復した。
【０３１６】
「バイオフィルム」の用語は、水溶性またはその他の環境において表面に発生し、持続する生物学的なフィルムを含む。バイオフィルムは、常駐の微生物によって分泌される1つまたは複数のマトリックス重合体から構成された有機ゲル状構造に包埋される微生物から構成される。また、「バイオフィルム」の用語は、検出されるのに十分な数で表面に付着したる細菌または表面に付着した微生物の共同体を含む（Costerton, J. W.ら （1987） Ann. Rev. Micobiol. 41：435-464； Shapiro, J. A. （1988） Sci Am. 256：82-89； O’Toole, G.ら （2000） Annu Rev Microbiol. 54：49-79）。
【０３１７】
もう一つの態様において、本発明は、バイオフィルム関連した状態が治療されるように、被検者のバイオフィルム関連した状態を、該被検者に転写因子調節化合物、たとえばMarAファミリーを阻害する化合物の有効な量を投与することによって治療する方法に属する。
【０３１８】
「バイオフィルム関連した状態」の用語は、細菌バイオフィルムの存在または潜在的な存在によって特徴づけられる障害を含む。多くの医学的に重要な病原体がバイオフィルムを形成し、バイオフィルム形成が、感染プロセスの1つの成分であることが多い（Costerton, J. W.ら、（1999） Science 284：1318-1322）。バイオフィルムに関連した状態の例は、中耳感染、嚢胞性繊維症、骨髄炎、座瘡、歯腔、および前立腺炎含むが、これらに限定されない。また、バイオフィルムに関連した状態は、1つまたは複数の細菌、たとえば緑膿菌による被検者の感染を含む。バイオフィルム形成の1つの結果は、バイオフィルム内の細菌が一般にこれらのプランクトンの対応物と比較して種々の抗生物質の範囲に対して感受性が低くなることである。
【０３１９】
さらに、また、本発明は、表面または領域におけるバイオフィルムの形成を、転写因子調節化合物、たとえばMarAファミリーを阻害する化合物、その他の有効な量と領域を接触させることによって防止するための方法に属する。
【０３２０】
工業施設では、工業用水系の生物汚染を防止する多くの方法を使用している。多くの微生物の生物体は、工業用水中におけるバイオフィルム形成に関与する。工業用水系での粘液産生する細菌の増殖は、熱伝導を減少し、系およびバルブを粘液化および遮断し、かつ表面の侵食または分解を含む問題を引き起こす。過去における細菌増殖の制御は、生物致死剤によって達成されていた。多くの生物致死剤および生物致死剤製剤が当該技術分野において既知である。しかし、これらの多くは、環境的に有害または有毒でであろう成分を含み、分解に耐性であることが多い。
【０３２１】
本発明のAraCファミリー阻害化合物およびMarAファミリー阻害化合物（しかし、これらに限定されない）などの転写因子阻害化合物は、工業、臨床面、家庭、およびパーソナルケアを含む種々の環境において有用である。本発明の組成物は、標的生物に対して単独で、相乗的に、または相加的に作用する活性成分として本発明の1つまたは複数の化合物を含んでいてもよい。
【０３２２】
本発明の化合物は、工業、薬剤学、家庭、およびパーソナルケアを含む環境に使用するために適した組成物において処方されてもよい。ある態様において、本発明の化合物は、水に可溶性である。調節化合物は、許容される担体系とともに適用され、またはデリバリーされてもよい。組成物は、活性成分（たとえば、MarAファミリー調節化合物などの本発明の転写因子調節化合物、たとえば、MarAファミリー・ポリペプチド阻害化合物）が、これが直接または間接的に投与されるときに、活性成分が有利な方法で利用できる形態で存在するように、安定した方法で分散され、または溶解されるように、適切なキャリア系とともに適用され、またはデリバリーされてもよい。
【０３２３】
また、本発明の組成物の分離した成分は、予めブレンドされてもよく、またはそれぞれの成分は、所望の治療成分の濃度レベルを達成するために、および成分が最終的に互いと本質的に混合される限り、予め定められた用量にしたがって同じ環境に別々に添加されてもよい。さらに、本発明は、連続的または間欠的に毎回投与され、またはデリバリーされてもよい。
【０３２４】
転写因子調節化合物が組成物中に存在するときに、一般に約0.000001%〜約100%、より好ましくは、約0.001%〜約50%、最も好ましくは約0.01%〜約25%の量で存在する。
【０３２５】
キャリアを含む本発明の組成物については、組成物は、たとえば、重量の約1%〜約99%、好ましくは約50%〜約99%、最も好ましくは約75%〜約99％の少なくとも1つのキャリアを含む。
【０３２６】
本発明の転写因子調節化合物は、任意の適切なキャリアと共に処方され、および溶液、マイクロエマルジョン、懸濁液、またはエアロゾルなどの形態でデリバリーするために調製されてもよい。本発明のエアロゾルの生成または任意のその他のデリバリー手段は、当該技術分野において既知の任意の方法、たとえばエアロゾル送達の場合、化合物を噴射剤で任意の適切なキャリアとともに微細に分割された形態で出力させて達成されてもよい。液化された噴射剤は、典型的には周囲条件で気体であり、圧力下で凝集される。噴射剤は、プロパンおよびブタン、または5炭素までのものなどのその他のより低級なアルカンを含む任意の許容され、かつ当該技術分野において既知のものであってもよい。組成物は、適切な噴射剤およびバルブを有する容器内に保持され、バルブの作用によって放出されるまで高い圧力で維持される。
【０３２７】
本発明の組成物は、安定剤、浸透剤、および当該技術分野において既知の技術に従って化合物とキャリアまたは希釈液を含むことによって、軟膏、ペースト、ゲル、噴霧、および液体など（しかし、これらに限定されない）の局所的または局部的な適用に適した従来の形態で調製されてもよい。これらの標品は、腸内の、非経口的、局所的、または吸入の適用に適した従来の形態で調製されてもよい。
【０３２８】
本発明は、家庭での使用のために適した組成物中で使用されてもよい。たとえば、本発明の化合物は、また、クレンザー、洗浄剤、消毒剤、皿洗い溶液、セッケン、および洗浄剤などの家庭製品の活性抗菌の成分として有用である。ある態様において、本発明の転写因子調節化合物は、微生物の予防、除去、または終結に有効な量および形態でデリバリーされてもよい。
【０３２９】
家庭での使用のための本発明の組成物は、たとえば少なくとも1つの本発明の転写因子調節化合物および少なくとも1つの適切なキャリア含む。たとえば、組成物は、総組成物の重量百分率に基づいて、調節化合物の重量の約0.00001%〜約50%、好ましくは約0.0001%〜約25%、最も好ましくは約0.0005%〜約10％を含んでもよい。
【０３３０】
また、本発明の転写因子調節化合物は、パーソナルケアのための衛生組成物に使用されてもよいことをする。たとえば、本発明の化合物は、顔のクレンザー、収斂剤、体の洗浄液、シャンプー、コンディショナー、化粧、およびその他の衛生製品パーソナルケア製品の活性成分として使用することができる。衛生組成物には、本発明の化合物の効果が障害されない限り、所望の形態（固体、液体、半流動、またはエアロゾルなど）を得るために当該技術分野において既知の任意のキャリアまたは媒体を含んでいてもよい。衛生組成物の調節法は、詳細に本明細書に記載されていないが、当該技術分野において既知である。このような方法のその議論については、The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Second Edition, 1992, 及びA Formulary of Cosmetic Preparations の5−484ページ（Vol. 2, Chapters 7-16）が参照として本明細書に組み入れられる。パーソナルケアに使用する衛生組成物は、一般に少なくとも1つの本出願の調節化合物および少なくとも1つの適切なキャリアを含む。たとえば、組成物は、総組成物の重量百分率に基づいて、転写因子調節化合物の重量の約0.00001%〜約50%、好ましくは約0.0001%〜約25%、最も好ましくは約0.0005%〜約10％を含んでもよい。
【０３３１】
本発明の転写因子調節化合物は、工業において使用されてもよい。産業的な設定において、微生物は、産業的な混入および生物汚損の原因であることが多いので、微生物の存在は、問題を含み得る。
【０３３２】
工業的応用のための本発明の組成物は、このような系の処理に有用であることが当該技術分野において既知の少なくとも1つの許容されるキャリアまたは媒体と共に、工業用に使用するための組成物中に本発明の化合物の有効な量を含んでいてもよい。このようなキャリアまたは媒体は、希釈液、解膠剤、浸透剤、展着剤、界面活性物質、懸濁剤、湿潤剤、安定化剤、適合薬剤、固着剤、ワックス、油、共存溶媒、カップリング剤、泡、消泡剤、天然または合成の重合体、エラストマ、および共働薬を含んでいてもよい。このような組成物の調節法、デリバリー系、およびキャリアは、本明細書に詳細に記載されていないが、当該技術分野において既知である。このような方法のその議論については、米国特許第5,939,086号が本明細書に参照として組み入れられる。さらに、使用される組成物の好ましい量は、組成物が適用されている活性成分および状況に従って変化してもよい。
【０３３３】
本発明の転写因子調節化合物は、非水系の環境において有用であろう。このような非水系の環境は、化合物または組成物が、状況に適した様式および量で適用される陸生の環境、乾いた面または半乾燥の表面を含んでもよいが、これらに限定されない。
【０３３４】
本発明の転写因子調節化合物は、パーソナルケア製品（歯ブラシ、コンタクトレンズ・ケース、および歯科器械など）、保健医療製品、家庭製品、食品標品表面およびパッケージング、並びに研究室および科学的な設備を含む種々の基体上に接触致死コーテングまたは層を形成するために使用されてもよい。さらに、他の基体には、カテーテル、医療用具、泌尿器科の装置、血液採取および導入装置、気管切開装置、人工水晶体、創傷包帯剤、縫合糸、外科用ステープル、膜、シャント、手袋、組織パッチ、補綴装置（たとえば、心臓弁）および、創傷ドレナージ管が含まれる。なおさらに、その他の基体には、カーペットおよび布地などの織物製品、ペイント、およびジョイントのセメントが含まれる。さらに、抗菌性の土壌燻蒸剤として使用される。
【０３３５】
また、本発明の化転写因子調節合物は、多糖体（セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ペクチン、アルギン酸、キチン、グアー、カラゲナン）、グリコール重合体、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアクリラート、ポリアクリロニトリル、ポリアミド（たとえば、ナイロン）、ポリオレフィン、ポリスチレン、ビニル重合体、ポリプロピレン、絹、または生体高分子などの重合体に組み込まれてもよい。調節化合物は、以下の特定の機能を有するものなどの任意の重合物質と抱合されていてもよい：1）カルボキシ酸、2）アミノ基、3）ヒドロキシ基、および／または4）ハロアルキル基。
【０３３６】
非水系の環境での治療のための組成物は、少なくとも1つの本出願の転写因子調節化合物および少なくとも1つの適切なキャリアを含んでいてもよい。ある態様において、総組成物の重量百分率に基づいて、転写因子調節化合物の重量の約0.001%〜約75%、有利には約0.01%〜約50%、好ましくは約0.1%〜約25％含む。
【０３３７】
また、本発明の転写因子調節化合物および組成物は、水性環境においても有用であろう。「水性環境」は、上記のものは、湖または池などの水の天然の集まり；プールおよび温水浴槽などの水の人工の、レクリエーションの集まり；および井戸などの飲用貯蔵所を含む（しかし、これらに限定されない）水を含む任意のタイプの系を含む。本発明の組成物は、これらの水性環境における微生物の増殖を治療するために有用であろうし、たとえば、水の表面で、又はその近くで適用されてもよい。
【０３３８】
水性環境を処理するための本発明の組成物は、少なくとも1つの本出願の転写因子調節化合物および少なくとも1つの適切なキャリアを含んでいてもよい。ある態様において、組成物は、総組成物の重量百分率に基づいて、転写因子調節化合物の重量の約0.001%〜約50%、有利には約0.003%〜約15%、好ましくは約0.01%〜約5%含む。
【０３３９】
また、本発明は、工業用のための抗生物付着性（antibiofouling）組成物を製造するための方法を提供する。このような方法は、少なくとも1つの当該技術分野において既知の任意の産業的に許容されるキャリアを本発明の転写因子調節化合物と本質的な混合させることを含む。キャリアは、上で論議され、または当該技術分野において既知の任意の適切なキャリアであってもよい。
【０３４０】
適切な抗生物付着性組成物は、少なくとも1つの生きた微生物を有する可能性があるか、または有する部位に組成物をデリバリーするための任意の許容される形態であってもよい。抗生物付着性組成物は、標準的な製剤を使用して、先に論議し多様に少なくとも1つの適切に選択されたキャリアと共にデリバリーされてもよい。デリバリー方法により、少なくとも1つの生きた微生物を有する可能性があるか、または有する部位に抗生物付着性組成物の結合阻害に有効な量がもたらされるであろう。本発明の抗生物付着性組成物は、生物汚損に水性環境における浮きかすまたは粘液形成などの、これらが関与する微生物の増殖を治療するために有用であろう。これらの化合物が有効であるもしれない産業的な方法の例は、水系の冷却、逆浸透膜、パルプおよびペーパー・システム、空気洗浄システム、および食品加工産業を含む。抗生物付着性組成物は、微生物の予防、除去、または終結のために有効な量および形態でデリバリーされてもよい。
【０３４１】
本発明の抗生物付着性組成物は、一般に本発明の少なくとも1つの化合物を含む。組成物は、総組成物の重量百分率に基づいて、化合物の重量の約0.001%〜約50%、より好ましくは約0.003%〜約15%、最も好ましくは約0.01%〜約5%含む。
【０３４２】
抗生物付着性組成物の量は、約1mg/l〜約1000mg/l、有利には約2mg/l〜約500mg/l、および好ましくは約20mg/l〜約140mg/lの量でデリバリーされてもよい。
【０３４３】
水処理のための抗生物付着性組成物は、一般に総組成物の重量の約0.001%〜約50重量%の量の中の本発明の転写因子調節化合物を含む。抗生物付着性組成物のその他の成分（0.1%〜50%で使用）は、たとえば、2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール（BNPD）、P-ニトロスチレン（BNS）、ドデシルグアニジンヒドロクロリド、2,2-ジブロモ-3-ニトリロプロピオンアミド（DBNPA）、グルタルアルデヒド、イソチアゾリン、メチレン・ビス（チオシアンネート）、トリアジン、n-アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、リン酸三ナトリウムに基づいたもの、抗微生物薬、トリブチルスズオキシド、オキサゾリジン、テトラキス（ヒドロキシメチル）ホスホニウムスルフェート（THPS）、フェノール、クロム化されたヒ酸銅、亜鉛または銅ピリチオン、カルバメート、次亜塩素酸ナトリウムまたはカルシウム、臭化ナトリウム、ハロヒダントイン（Br、Cl）、またはこれらの混合物を含んでもよい。
【０３４４】
その他の本発明の組成物の可能性のある成分は、生物分散剤（総組成物の約0.1%〜約15重量%）、水、グリコール（約20〜30%）、またはプルロニック（Pluronic）（総組成物の約7重量%）を含む。連続的または準連続的な使用のための抗生物付着性組成物の濃度は、約5〜約70mg/lである。
【０３４５】
工業用水の処理のための抗生物付着性組成物は、総組成物の重量に基づいて、約0.001%〜約50%の量で本発明の化合物を含む。水性水処理のための抗生物付着性組成物における本発明の化合物の量は、特定の環境に応じて調節されてもよい。ショック用量範囲は、一般に約20〜約140mg/lであり；準連続的な使用のための濃度は、これらの濃度の約0.5×である。
【０３４６】
また、本発明は、少なくとも一部において、バイオフィルム発生を調節する方法に属する。本方法は、本発明の転写因子調節化合物を含む組成物を投与することを含む。また、組成物は、組成物がバイオフィルムを分解させる能力を増強するその他の成分を含むことができる。
【０３４７】
組成物は、洗浄製品、たとえばバイオフィルム発生を除去する、防止する、阻害する、または調節するための家庭または産業的な洗浄剤として処方することができる。有利には、バイオフィルムは、本発明の化合物の投与によって悪影響を受け、たとえば、バイオフィルム発生が減弱される。これらの組成物は、消毒剤、セッケン、洗浄剤、並びにその他の界面活性剤などの化合物を含んでいてもよい。界面活性剤の例は、たとえばドデシル硫酸ナトリウム；四級アンモニウム化合物；ヨウ化アルキルピリジニウム；TWEEN80、TWEEN85、TRITON X-100；BRIJ 56；生物学的な界面活性剤；ラムノリピド、サーファクチン（surfactin）、ヴィスコンシン（visconsin）、およびスルホナートを含む。本発明の組成物は、排水管、シャワー・カーテン、グラウト、トイレ、およびフローリングを含む（しかし、これらに限定されない）消毒が必要とされる既知の領域および表面に適用されてもよい。病院の表面および医療機器に対して特に適用がなされる。本発明の消毒剤は、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）、アザトバクテリア科（Azatobacteraceae）、リザビア科（Rhizabiaceae）、ムシロコッカ科（Mthylococcaceae）、ハロバクテリウム科（Halobacteriaceae）、アセトバクター科（Acetobacteraceae）、レジオネラ科（Legionellaceae）、ナイセリア科（Neisseriaceae）、およびその他の属など（しかし、これらに限定されない）の細菌のために消毒剤として有用でもよい。
【０３４８】
また、本発明は、コンタクトレンズを洗浄および消毒するための方法に属する。本方法は、本発明の少なくとも1つの化合物の許容されるキャリア溶液とコンタクトレンズを接触させることを含む。また、本発明は、コンタクトレンズを洗浄するための溶液を使用するための説明書と共にパックされた、化合物を含む溶液に属する。
【０３４９】
また、本発明は、医学的な留置装置を処理する方法を含む。本方法は、バイオフィルムの形成を防止または実質的に阻害するなどのために、医学的な留置装置と本発明の少なくとも1つの化合物を接触することを含む。医学的な留置装置の例は、カテーテル、整形装置、およびインプラントを含む。
【０３５０】
本発明の化合物を含む歯磨剤およびうがい薬製剤は、たとえばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., 1990, Chapter 109（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているように、歯磨剤またはうがい薬に本発明の化合物を添加して処方されてもよい。歯磨剤は、ゲル、ペースト、粉末、またはスラリーとして処方されてもよい。歯磨剤は、結合剤研削材、香料、発泡剤、および湿潤剤を含んでいてもよい。うがい薬製剤は、当該技術分野において既知であり、本発明の化合物は、都合よくこれらに添加されてもよい。
【０３５１】
（表１）AraC-XylSファミリーの例示的な細菌の転写因子
2006504677.tif 000017
2006504677.tif 000018
2006504677.tif 000019
2006504677.tif 000020
2006504677.tif 000021
2006504677.tif 000022
2006504677.tif 000023
2006504677.tif 000024
2006504677.tif 000025
2006504677.tif 000026
2006504677.tif 000027
2006504677.tif 000028
2006504677.tif 000029
2006504677.tif 000030
2006504677.tif 000031
【０３５２】
特に明記しない限り、本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当業者の範囲内である。このような技術は、文献に完全に説明されている。たとえば、Genetics； Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. Sambrook, J.ら （Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989））； Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Ed., ed. Ausubel, F.ら （Wiley, NY （1995））； DNA Cloning, Volumes I and II （D.N. Glover ed., 1985）； Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait ed. （1984））； Mullisら、米国特許第4,683,195号； Nucleic Acid Hybridization （B. D. Hames & S. J. Higgins eds. （1984））； the treatise, Methods In Enzymology （Academic Press, Inc., N.Y.）； Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology （Mayer and Walker, eds., Academic Press, London （1987））； Handbook Of Experimental Immunology, VolumesI-IV （D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. （1986））；および Miller, J. Experiments in Molecular Genetics （Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （1972））を参照されたい。
【０３５３】
この出願の全体にわたって引用される全ての参照、継続中の特許出願および公表された特許の内容は、本明細書に明白に参照として組み入れられる。
【０３５４】
本発明は、以下の実施例によってさらに図示されが、これらはさらなる限定として解釈されるべきでない。
【０３５５】
実施例
実施例1：ノックアウト細菌の作製
親株（KM-DおよびC189）は、内瘻（Maneewannakul and Levy. 1996. 40：1695）および膀胱炎感染患者（Rippere-Lampe. 2001 Infect. Immunity 69：3954）からそれぞれ単離した。KM-Dの特異的な遺伝子のインフレームでの欠失は、交差PCRおよび対立遺伝子の交換によって構築した（Linkら J. Bacteriol. 1997 179：6228）。欠失のターゲットとした配列の上流および下流部分に隣接する500bpからなる1kbのDNA断片（33ヌクレオチドのスペーサーによって分離されている）を交差PCRによって構築して、自殺ベクターpSR47sのNotI-BamHI部位にクローン化した。pSR47sは、R6K複製開始点を含んでおり、これをPn903由来のカナマイシン耐性遺伝子のπタンパク質、および対抗選択マーカーとして使用される枯草菌sacB遺伝子に依存的にさせた。クローン化されたクロスオーバーPCR断片を有するプラスミドを抱合によって大腸菌S17.1 λpriからKM-Dに移し、接合完了体を、0.2%のグルコースおよび30μg/mlカナマイシンを含むM9最少培地上で選択した。次いで、KM-D接合完了体を抗生物質のないLB中で37℃において一晩培養した。一晩培養物を再蒸留水に希釈し、105〜106のコロニー形成単位を5%のシュークロースを含むL寒天上にまいて、30℃で一晩インキュベートした。生じるコロニーをLBプラスカナマイシンおよびLB単独上にまいた。カナマイシン感受性のコロニーを対立遺伝子特異的なプライマーでPCRすることによって、野生型および欠失対立遺伝子の有無について試験した。
【０３５６】
インフレーム欠失のために使用したクロスオーバーPCR産物は、SpeI制限部位を含む33ヌクレオチドのスタッファ配列（stuffer sequence）を有する。これらの本来の座内の欠失した遺伝子を回復させるために、野生型遺伝子をオープンリーディングフレームの両方の末端のSpeI制限部位に作製したプライマーによってKM-Dコロニーから増幅した。これらの断片をSpeIによって制限して、対応するインフレーム欠失を作製するために使用したプラスミドに結合した。この手順により、アミノ末端にさらなる7アミノ酸MVINLTGを有する本来の遺伝子を再現する。この相補性プラスミドを上記の通りに対立遺伝子の交換によって適切な突然変異株の染色体に再び結合させて、野生型対立遺伝子の存在をPCRによって確認した。
2006504677.tif 000032
2006504677.tif 000033
【０３５７】
実施例2 化合物の同定
構造解析のために適したMarAおよびRob-DNAの共結晶を作製して、それぞれタンパク質データバンクIDコード（Protein Data Bank ID codes）1BL0および1D5Y下で利用できる。
【０３５８】
これらのタンパク質の阻害剤を同定するために、構造に基づいた薬物設計的アプローチを使用した。簡単には、MarAおよびRob DNA結合ドメインの部分の原子座標を、コンピュータ補助による小分子ドッキング実験の「活性部位」の鋳型として使用した。次いで、一組のコンビナトリアル・ケミストリー骨格をこれらの鋳型に対してドッキングさせ、多くの高いスコアリングの骨格を同定した。次いで、これらの骨格を構造的に類似する分子の化学構造を同定するために使用した。5つの構造的に独特な分類されたMar阻害剤が同定された。
【０３５９】
これらの化合物の2つのクラスの構造を示してある：
2006504677.tif 000034
式中、T1、T2、T3、T4、T5、およびT6は、それぞれ独立して置換もしくは非置換の炭素、酸素、置換もしくは非置換の窒素、またはイオウであり；
Mは、水素、アルキル、アルケニル、複素環、アルキニル、もしくはアリール、または薬学的に許容されるこれらの塩であり、
2006504677.tif 000035
式中、Gは、置換または非置換の芳香俗部分、複素環、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボニル、または水素であり；並びに、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、およびL10は、それぞれ独立して、酸素、置換もしくは非置換の窒素、イオウ、およびまたは、置換もしくは非置換の炭素、および薬学的に許容されるこれらの塩である。
【０３６０】
好ましい態様において、構造Iは、以下のものなどの、2,6-置換されたベンゾイミダゾールであり、
2006504677.tif 000036
式中、T5は、NOH、NOCOCO2H、または置換もしくは非置換の直鎖または分枝のC1-C5アルキルオキシ置換された窒素原子であり；
R1は、電子供与性もしくは電子吸引性の基、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基、または置換もしくは非置換の複素環（hetelocylic）基であり；並びに、
R2は、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアシル基、または置換もしくは非置換の複素環基である。さらなる例示的R1およびR2基を、下の実施例5に図示してある。
【０３６１】
他の好ましい例として、構造IIは、以下などの置換されたトリアジンオキサゼピン（triazineoxazepine）である：
2006504677.tif 000037
式中、R1、R2、およびR3のそれぞれは、電子供与性もしくは電子吸引性の基、置換もしくは非置換のアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基、または置換もしくは非置換の複素環（hetelocylic）基である。
【０３６２】
実施例3.式Iaの化合物の修飾
同定された化合物のクラスを、これらの活性を最適化するために修飾する。たとえば、式Iのコア構造は、式Iaに示すように2つの多様性の主要部分（R1およびR2）を含み、これは種々の化学修飾（下記を参照）を介して広範囲に探査することができる。構造活性相関を確立するために、R1を種々の電子供与性、電子吸引性、アルキル、アリール、および複素環側鎖での置換によって修飾する。R2のさらなる修飾には、多種多様な置換されたアリール基、複素環、およびアシル側鎖を含む。この一連から得られる潜在的な誘導体の大規模な化学的多様性により、いくつかの予備的な転写因子修飾因子の最適化が非常に容易になる。
2006504677.tif 000038
【０３６３】
合成物医薬品化学により、Mar阻害剤構造クラスIのまわりの構造活性相関の開発を計画する。
【０３６４】
実施例4：DNAタンパク質結合アッセイ法の開発
本発明者らの転写因子修飾因子の活性を定性的に評価して、インビトロでDNAタンパク相互作用を妨害するかどうか決定するために、電気泳動移動度変化アッセイ法（EMSA）を開発した。簡単には、5nMのMarA（AraC）ファミリー・メンバー（または、放射ラベルされた（33P）二本鎖DNAプローブの50%がタンパク質に結合される濃度）をMar阻害剤の非存在下（DMSO（溶剤）単独で）または存在下のいずれかで室温において30分間インキュベートする。その後、0.1nMの（33P）ラベルされたDNAプローブを添加して、混合物を室温で15分間平衡化することができる。次いで、混合物を非変性ポリアクリルアミドゲルの上で分離して、ゲルをオートラジオグラフィによって解析する。図3に図示したように、異なる転写因子修飾因子は、EMSAにおいてインビトロでSoxSに対する様々の活性を有し：化合物Aは、非常に活性であり、化合物Cは、適度に活性であり、化合物Dは、活性がない（図3）。これらのデータは、次の阻害剤能力を増大するための医薬品化学の試みを進める際に有用である。
【０３６５】
実施例5：発光アッセイ法の開発
定量的化学発光に基づいたアッセイ法は、種々のMarA（AraC）ファミリー・メンバーのDNA結合活性を測定するために使用されている。この技術については、ビオチン化された二本鎖DNA分子（2nM）を、ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロタイター（白）プレート（Pierce Biotechnology、Rockford, IL）において、6-ヒスチジン（6-His）残基に融合されたMarA（AraC）タンパク質（20nM）とインキュベートする。結合していないDNAおよびタンパク質を洗浄によって除去し、その後に一次モノクローナル抗-6His抗体を添加する。2回目の洗浄を行い、次いで二次HRP-複合化抗体を混合物に添加する。過剰な抗体を3回目の洗浄工程によって除去して、化学発光基質（Cell Signaling Technology, Beverly, MA）をプレートに添加する。発光は、ビクターVプレートリーダー（PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA）を使用して直ちに読み込む。DNAに対するタンパク質の結合を阻害する化合物は、最初の洗浄工程でプレートからのタンパク質の減少を生じ、発光シグナルの減少によって同定される。50%までシグナルを減少させるために必要な化合物の濃度（EC50／IC50）は、阻害化合物の段階希釈を使用して算出することができる。たとえば、SoxSおよびSlyA（無関係なタンパク質およびMaRファミリー・メンバー）に対する化合物AのEC50は、それぞれ9.2および150μMであり、化合物の特異性を示す。また、異なる転写因子に影響を及ぼす単一の転写因子修飾因子は、以下に示すように同定された：
【０３６６】
（表１０）異種のMarA（AraC）ファミリー・メンバーに対する選択した転写因子修飾因子の活性
2006504677.tif 000039
【０３６７】
実施例6：感染の動物モデルの開発
CD-1雌マウスを手術前にケージに収容した。マウスは、5%のグルコースを含む水からなる食餌で利尿させて、固体の食品を制限した。実験の日に、それぞれのマウスをイソフルランで麻酔し、腹の領域を剃って、ヨウ素およびアルコールで入浴させた。尿道のすぐ上の外側のほとんどの皮膚層を介して小さな切開（約15mm）を作製した。一旦内側皮膚層が曝露されると、小さなもう一つの切開を腹膜を介して作製し、内側の腔および膀胱を曝露した。過剰な尿を吸引し、感染性の細菌の種菌を導入するために、小さな穿刺を膀胱に作製した。一晩培養物から細菌を洗浄し、希釈し、100μlのこの培養（〜107コロニー形成単位）を使用してマウスに接種した。
【０３６８】
指定された期間の感染後、通常24時間〜11日の間に、マウスを屠殺して、これらの腎臓を取り除いた。個々のマウスの腎臓重量を記録し、次いで、腎臓を5mlの無菌のPBSに懸濁した。腎臓をホモジナイズして、マッコンキー寒天プレート上に段階希釈をまいて、腎臓のCFU／グラムを決定した。代表的なデータを図4〜6に示してある。
【０３６９】
最初に、3つ全ての転写因子を欠いている野生型臨床分離株の感染力を試験した。図4に示したように、soxS、rob、およびmarを欠いている細菌（PC1012 3重ノックアウト株）では、1および3日に動物の腎臓に細菌が存在することによって示されるように、宿主に感染することができるが、感染を維持することができない（5、7、および11日を参照されたい）。対照的に、野生型細菌（KM-D）は、研究の経過の全体にわたって感染を維持する。
【０３７０】
単一の転写因子、すなわちsoxSまたはrobの欠失後の病原性に対する効果を研究するために、適切な細菌株を構築し（実施例1の表を参照されたい）、UTIモデルにおいて試験した。図5は、robノックアウト株（PC1003）が、KMD野性株よりも病原性がないことを示す。PC1012の3重ノックアウト株（PC1038）でrobを回復するように、robノックアウトにおけるrobの回復により、病原性（PC1040）を回復する。図6は、soxSについての同様の結果を示す。KMDsoxSノックアウト株（PC1005）は、KMD野性株よりも病原性がない。soxSノックアウト（PC1035）または3重ノックアウト（PC1037）に対するsoxSの回復により、病原性が回復する。加えて、図6は、3重ノックアウト（PC1033）に対するmarAの回復により病原性を回復することを示す。
【０３７１】
図7および8は、臨床分離株C189においてsoxSまたはrobをノックアウトする効果を検査する。図7は、soxSノックアウト（PC0124-90S）は、野生型単離株よりも病原性ではないことを示す。同様に、図8は、robノックアウト（PC0124-90R）がC189臨床分離株よりも病原性ではないことを示す。
【０３７２】
したがって、robまたはsoxS単独の欠失は、非病原性の表現型を与えるために十分である。さらに、単一（PC1037およびPC1038）または3重（SRM）ノックアウトバックグラウンドのいずれにおいてもこれらの本来の染色体の位置にrobまたはsoxSのいずれかを供給することによって、これらの株の病原性を完全に回復する。これらのデータは、SoxSおよびRobが病原性因子であることを納得がいくように証明する。marAに関して、marAが3重のノックアウトバックグランド（PC1012）のその本来の染色体の位置に供給されると、病原性が完全に回復する。
【０３７３】
さらに、大腸菌SRMを感染の腎盂腎炎モデルに使用して、3重ノックアウトが、その親株よりも有意に感染性ではないことを示した（図9A〜B）。
【０３７４】
したがって、SoxSおよびRobの様に、MarAは、このモデルにおいて病原性因子とみなすことができる。
【０３７５】
実施例7.インビボでの転写因子阻害剤の活性
AraCファミリーの転写因子の小さな有機阻害剤が感染を予防する能力を試験した。これらの有機分子は、MarA、SoxS、Rob、およびその他のMarAファミリー分子、たとえばサルモネラ・エンテリカ血清型チフィムリウムに由来するRmaおよびプロテウス・ミラビリスに由来するPqrAを阻害する。阻害剤の2つの構造的に無関係な分類に由来する2つの有機分子は、インビトロでよく機能することが見いだされ、一方をインビボ尿路感染症モデルにおいて試験した。第1の実験において、感染したマウスを感染時、および感染の6、24、30、48、54、72、および96時間後に投薬に供した。マウスは、感染120時間後に屠殺した。
【０３７６】
2つの代表的な実験データを以下に示してある：
2006504677.tif 000040
【０３７７】
以後の実験において、マウスを感染の0および24時間後に処理した。代表的な実験からのデータを以下に示してある。
2006504677.tif 000041
【０３７８】
最終的な実験において、感染時にマウスを一度処理した。代表的な実験からのデータを以下に示してある。
2006504677.tif 000042
【０３７９】
実施例8.バイオフィルム形成に対する効果
以前のデータは、MarAおよびSoxSレギュロン内の遺伝子がバイオフィルム形成に関与することを示している。少数の例示的なヒットがインビトロでのバイオフィルム形成を防止する能力を示した。これらのアッセイ法は、公開されたプロトコルに従って行い（O’ Tooleら 1999 Methods Enzymol 310 ：91）、大腸菌が96ウェルポリスチレン（非生物的）マイクロタイタープレートの壁に接着する能力を測定した。図示したように、インビトロでのDNA結合アッセイ法で阻害活性を有し、かつ抗菌活性を欠いている化合物は全て、生菌のバイオフィルム形成に影響を及ぼす。これらの知見はどちらも、転写因子修飾因子が無処理の細菌細胞を透過することができることを示す。
【０３８０】
実施例9.マウスの感染モデルにおける転写因子修飾因子の有効性の評価
急性毒性および予備的なPKのデータを使用して、下記のマウスの感染モデルにおける有効性の評価のために、化合物を優先順に配置し、選択する。最初に、感染生物体の50%致死用量（LD50）を決定する（下記を参照されたい）。その後、転写因子修飾因子を標的器官のコロニー形成を生じるために必要な感染性の用量および一定の濃度（研究の期間にわたって1日に一度、25mg/kgの経口投与（p.o.））の転写因子修飾因子または対照としての媒体のみを使用して、有効性について試験する。次いで、有利に機能する、たとえば器官のCFU/g＞2-logの減少を生じる化合物を用量反応解析に供する。これらの実験において、マウス（n=6）群を転写因子修飾因子の2倍段階希釈（0〜50mg/kgで変動）で処理して、ED50（投与群の50%の感染を予防するために必要な薬物濃度）をこれらのデータから算出する。抗生物質でのED50の決定をそれに応じて行い、これらの薬剤では、全ての実験において対照を使用する。
【０３８１】
転写因子修飾因子は、上行性腎盂腎炎マウス・モデルの感染における有効性解析に供することができる（上記を参照されたい）。簡単には、雌CD1マウス（n=6）群を利尿させて、膀胱内接種を介して大腸菌UPEC株C189に感染させる。その後、マウスには、転写因子修飾因子（25mg/kg）、対照化合物、たとえばSXT（Qualitest Pharmaceuticals, Huntsville, AL）、または媒体単独（0mg/kg）を、感染時、およびマウスにおける薬物を一定レベルに維持するために、その後、1日に一度4日間、経口投与の経路を経て投与する。感染の5日後およびCO2／O2窒息で屠殺する前に、腹部を優しく圧迫することによって尿試料を採取する。窒息させた後、膀胱および腎臓を前述したように無菌的に取り除く。尿量および個々の器官重量を記録して、器官を0.025%のトリトンX-100を含む無菌のPBSに懸濁し、次いでホモジナイズする。尿試料およびホモジネートの10倍の段階希釈をマッコンキィ寒天板上へまいて、尿のCFU/mlまたは器官のCFU/グラムを決定する。
【０３８２】
これらの実験の有効性は、尿のCFU/mlまたは器官のCFU/gの≧2-log減少として定義される。これらの値は、マウスにおけるUTIの処理を調査する以前の実験と一致する。
【０３８３】
有利に機能する、たとえば器官のCFU/gの≧2-log減少を生じる転写因子修飾因子を用量応答解析に供する。これらの実験において、マウス（n=6）群を転写因子修飾因子の2倍段階希釈（0〜50mg/kgで変動）で処理して、ED50（投与群の50%の感染を予防するために必要な薬物濃度）をこれらのデータから算出する。標準的な抗生物質、たとえばSXTでのED50の決定をそれに応じて行う。最高5つの化合物がこの感染モデルで評価されるであろう。加えて、同様のモデルは、リード化合物のより広い抗菌スペクトルを評価するためにS.サプロフィチカス（S.saprophyticus）およびP.ミラビリス（P.mirabilis）に使用することができる。
【０３８４】
C.ローデンチウム（C.rodentium）
C.ローデンチウム（C.rodentium）（MPEC）は、EPECおよびEHECによって引き起こされるヒト感染症の相当物であるマウスの疾患を生じる。この生物体は、A／E病変部のみにマウスに感染を引き起こす細菌を生じ、したがってEPECおよびEHECの病原を調査する研究のための代用物として一般に使用されている。
【０３８５】
MPECに対する本発明者らの転写因子修飾因子の有効性を検査する。生物体を10倍段階希釈してスイスウェブスターマウス（Taconic Laboratories, Germantown, NY）（n=7）群の経口感染（p.o.）に続いて、ローデンチウム（C.rodentium）DBS100（ATCC51459）のLD50を当該技術分野において既知の方法を使用して決定する。一旦LD50が確認されると、記載したように、結腸にコロニー形成を生じるために十分な種菌にマウスを感染させる。大便を感染3、5、および7日後（p.i.）で収集して、重量を量り、無菌のリン酸緩衝液塩類溶液（PBS）中でホモジナイズして、選択培地に段階希釈することによって細菌負荷を決定する。p.i.10日において、マウスを屠殺して、全ての結腸を無菌的に取り除き、PBS中でホモジナイズし、その後に細菌負荷を決定する。次いで、有効性の評価を行う。
【０３８６】
フレクスナー赤痢菌（S.flexneri）
マウスは、フレクスナー赤痢菌（S.flexneri）による感染後に腸疾患を発病しないので、マウス肺感染モデルをこの生物体の病原性を評価するために使用した。ヒト感染の直接の擬態ではないが、小さな齧歯類の使用では、ウサギセレニーまたは結紮した回腸ループモデルまたはマカクサルの使用よりも扱いにくくない。
【０３８７】
このモデルにおいて、4〜6週間齢のBALB／cJマウス（The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）（n=7）群を麻酔して、以前に記載したとおりに、鼻腔内の経路でフレクスナー赤痢菌（S.flexneri）の10倍の段階希釈（〜108 CFU/mlまで）に感染させる。マウスを感染の24、48、および72時間後に屠殺して、肺を無菌的に取り除き、確立された手順に従って選択培地の上のプレーティングを経て細菌負荷を数え上げる。これらの予備実験から、適切な肺感染を得る感染性の用量を決定して、次の解析のために使用する。次いで、有効性評価を行う。
【０３８８】
ネズミチフス菌
サルモネラ種による感染に対して様々な感受性を示す近交系のマウスがよく確立されている。この性質は、マクロファージ・タンパク質1（Nramp1）に関する天然の抵抗性の非存在（すなわち、感染に極めて影響されやすいBALB/cマウス[Charles Ricer Labs, Wilmington, MA]において）または存在（すなわち、感染に適度に耐性であるSv129マウス[The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME]において）に起因する。それでもなお、サルモネラ症のマウスのモデルは、全身性のサルモネラ感染を研究するために一般に使用されている。したがって、転写因子修飾因子の有効性の最初の評価は、マウスの両方の株を使用して行う。
【０３８９】
LD50の決定は、ネズミチフス菌SL1344によるBALB/c（8〜9週間目）またはSv129マウス（n=7）のp.o.感染後に、上記の通りに算出される。一旦LD50が決定されると、全身性の感染モデルを生じるために十分な種菌にマウスを感染させる。これらの研究において、マウスは感染の経過の間に、重量の減少およびその他の総異常についてモニターする。感染の3および6日後、マウスを屠殺して、公開されたプロトコルに従って、盲腸、パイエル板、腸間膜リンパ節、脾臓、および肝臓を含む組織を細菌負荷について検査する。これらの研究の結果に応じて、単一のマウス株を次の実験のために選択する。全体的な目標は、転写因子修飾因子の有効性の評価を可能にする種菌および宿主、すなわち迅速に死亡を生じない組み合わせを見つけることである。次いで、有効性評価を行う。
【０３９０】
V.コレラ
V.コレラに対する転写因子修飾因子のインビボでの有効性を評価するために、コロニー形成および致死感染モデルを使用する。V.コレラO395（古典的な生物型）、およびE7946（エルトール生物型）、および乳児（3〜5日齢）CD-1およびBALB/cマウスを前述したように両方のモデルにおいて最初に使用する。LD50を決定するために、乳児マウス（n=7）の群には、V.コレラの一晩培養物の10倍の段階希釈（〜104〜108CFU/ml）を経口的に感染させる。感染したマウスを5日間モニターし、すでに記載したようにLD50を算出する。コロニー形成モデルにおいて、乳児マウス（n=7）群を予め飢えさせて、次いで小腸にコロニー形成を生じるために十分な種菌を胃内に感染させる。コロニー形成（〜24〜36時間）期間に続いて、小腸を無菌的に取り除き、ホモジナイズして、段階希釈を選択培地上にまいて細菌負荷を数え上げる。次いで、有効性評価を行う。
【０３９１】
実施例10：細胞全体の偽結核エルシニア菌YopH病原性アッセイ法
無処理の細菌細胞に対する転写因子修飾因子の効果を研究するために、全細胞におけるYopH活性に対する、MarA（AraC）ファミリー・メンバーのLcrF（VirF）の活性阻害の効果を測定するためのアッセイ法を開発した。YopHは、チロシン・ホスファターゼであり、病原体のTTSSによって分泌されるエルシニア種の病原性因子である。p-ニトロフェニルホスフェートに対するYopHの活性（pNPP、ホスファターゼ活性の指標）により、色のついた基質が形成され、これを分光光度的に測定することができる。偽結核エルシニア菌を転写因子修飾因子の存在下および非存在下でインキュベートし、YopHのホスファターゼ活性に対する化合物自体の阻害作用を測定するために対照を含めた。効果を有した化合物をさらなる解析から除外した。このアッセイ法により、おそらくLcrF（VirF）のレベルでYopH（タンパク質の発現または分泌）に悪影響を与える多くの化合物を同定した。これらの知見は、転写因子修飾因子が無処理の細菌細胞を透過することができることも示す。
【０３９２】
実施例11. 偽結核エルシニア菌のマウス感染モデルにおける転写因子修飾因子の効果の測定
作製した急性毒性および予備的な薬理動態学的な（pharmokinetic）データにより、全身性偽結核エルシニア菌感染のマウス・モデルにおける有効性評価のための化合物を選択することができる。簡単には、8〜10週間齢のBALB/c雌マウスを全ての感染のために使用し、BL-2施設で感染する前に1週間収容する。全てのマウスに、オロガストリック（orogastric）感染の前に16時間食品を与えない。2つの処理群（n=6）は、致死用量以下（5×1010CFU/ml）の偽結核エルシニア菌株YPIIIpIBI（Mecsas, 2001 #1233）に経口的に感染させる。感染に続いて、マウスには、マウスにおける薬物を一定レベルに維持するために、研究の間に1日に一度0（媒体単独）または25mg/kgの転写因子修飾因子を経口経路を経て投与する。感染の経過の間、重量の減少およびその他の総異常についてマウスをモニターする。感染の5日後、マウスを屠殺して、小腸内腔、盲腸内腔、大腸内腔、パイエル板、腸間膜リンパ節、脾臓、肝臓、肺、および腎臓、並びに血液を含む組織を確立されたプロトコルに従って細菌負荷について検査する。
【０３９３】
有利に機能する、たとえば器官のCFU/gの≧2-logの減少を生じる転写因子修飾因子を用量反応解析に供する。これらの実験において、マウス（n=6）群を転写因子修飾因子の2倍段階希釈（0〜50mg/kgで変動）で処理して、ED50（投与群の50%の感染を予防するために必要な薬物濃度）をこれらのデータから算出する。標準的な抗生物質、たとえばストレプトマイシンまたはドキシサイクリンでのED50の決定をそれに応じて行い、これらの薬剤では、全ての実験において対照を使用する。
【０３９４】
実施例12.感染のマウス・モデルにおける転写因子修飾因子機能の解析
一つの原型の阻害剤の有効性を、上行性腎盂腎炎の感染モデルにおいて調査した（上記を参照されたい）。図示したように、感染時における阻害剤の単一用量の皮下投与では、このインビボ・モデルの感染を予防するためには十分であった（図10）。100mg/kgの単一用量（図10）によって得られたものと同様の結果は、多回投与療法（×4dで得た、データ示さず）においてより少ない用量を使用しても見られた。これらのデータは、本発明者らのアプローチが可能であることを示す小分子の原理の証拠となる。近年、予備的なPKデータでは、この化合物およびその他の同様の分子が経口的に生物が利用できることを示す。
【０３９５】
実施例13.薬理動態学的な（Pharmokinetic）研究
次いで、無毒の転写因子修飾因子のPKパラメータを評価する。簡単には、投薬前に雌CD1マウス（n=3）群を一晩絶食させて、重さを量って用量レベルを算出する。実験日に、マウスには、100μlの検出可能な急性毒性を伴わない例示的な転写因子修飾因子を含む試験物品溶液を、経口および／または皮下の投与経路を経て与える。対照として、媒体単独で処理したマウスの1群を使用してベースライン尿および血清レベルを決定する。処理に続いて、マウスには、食品および水に無制限にアクセスさせる。血漿および尿試料、並びに個々の器官、たとえば腎臓、肺、脾臓、その他を種々の時点で収集し、化合物濃度を標準的な生物分析用の（bioanalytical）LC／MS／MS法を使用して決定する。PKパラメータ、すなわち最大薬物濃度（Cmax）、（Tmax）、薬物曲線下面積（AUC）、薬物半減期（Tl/2））をこれらのデータから算出する。注射に失敗した任意の動物は、研究から除いて、「余分の」マウスの群からの新たな動物と置きかえる。投薬後および5時間以前に自発的に死亡した動物は、全くを研究から除いて置き換えない。
【図面の簡単な説明】
【０３９６】
【図１】図1A〜1Eは、PROSITE PS01124 AraCファミリー・ポリペプチドの複数の配列のアラインメントである。
【図２】大腸菌由来のMarA、Rob、およびSoxSのアミノ酸配列並びに対応するアクセッション番号を示す。
【図３】移動度変化アッセイ法でのMar阻害剤セットの代表的な活性を表す。レーン1-6は、全て0.1nM（33P）DNAを含み、レーン2-6は、全て5nMのSoxSを含む。レーン1および2、化合物なし；レーン3-6、それぞれ50μg/mlの化合物A、化合物B、化合物C、および化合物D。化合物Aおよび化合物Bは、同じ化合物の2つの異なる合成物バッチを示す。A、遊離DNA；B、SoxS-複合体DNA。
【図４】上行性腎盂腎炎感染モデルの病原性に対する、臨床分離株からのsoxS、Rob、およびmarA欠失（3重ノックアウト）の効果を示す。
【図５】上行性腎盂腎炎感染モデルの病原性に対する、臨床分離株からのrob欠失およびrob発現の回復の効果を示す。
【図６】上行性腎盂腎炎感染モデルのインビボでの病原性に対する、臨床分離株からの単一soxS欠失およびsoxS発現の回復の効果、並びに3重ノックアウトでのmarA発現の回復の効果を示す。
【図７】上行性腎盂腎炎感染モデルのインビボでの病原性に対する、臨床分離株からのsoxS欠失の効果を示す。
【図８】上行性腎盂腎炎感染モデルのインビボでの病原性に対する、臨床分離株からのrob欠失の効果を示す。
【図９】図9A-Bは、上行性腎盂腎炎感染マウスの感染モデルでの多薬剤抵抗性大腸菌の病原性を示す。パネルAは、野生型KM-D大腸菌を示し、パネルBは、同質遺伝子的であるが、MarA、SoxS、およびrobを欠いている大腸菌SRMを示す。
【図１０】上行性腎盂腎炎マウス・モデルにおける大腸菌C189（臨床的な膀胱炎隔離集団）に対する化合物1の活性を示す。
【図１Ａ】
2006504677.tif 000043
【図１Ｂ】
2006504677.tif 000044
【図１Ｃ】
2006504677.tif 000045
【図１Ｄ】
2006504677.tif 000046
【図１Ｅ】
2006504677.tif 000047
【図２】
2006504677.tif 000048
【図３】
2006504677.tif 000049
【図４】
2006504677.tif 000050
【図５】
2006504677.tif 000051
【図６】
2006504677.tif 000052
【図７】
2006504677.tif 000053
【図８】
2006504677.tif 000054
【図９】
2006504677.tif 000055
【図１０】
2006504677.tif 000056
【配列表】
2006504677000001.app
【国際調査報告】
2006504677.tif 000057
2006504677.tif 000058
2006504677.tif 000059
2006504677.tif 000060