(57)【要約】本発明は、一般に、ＣＤ２０及び／又は好ましくはＣＤ１６を含むヒト細胞マーカーを発現する非ヒトトランスジェニック動物に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ２０をコードする第一ヌクレオチド配列と、異種性ＦｃγＩＩＩレセプターのサブユニットをコードする第二ヌクレオチド配列とをゲノムが含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
上記第一ヌクレオチド配列がヒト内因性プロモーターに作用可能に結合している請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
細胞がヒトＣＤ２０を発現する請求項２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
ヒトＣＤ２０がＢリンパ球の表面に発現される請求項３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
上記第二ヌクレオチド配列がヒト内因性プロモーターに作用可能に結合している請求項２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
上記第二ヌクレオチド配列がヒトＣＤ１６α鎖サブタイプＡをコードする請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
上記レセプターが白血球の表面に発現される請求項６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
上記レセプターがＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞又は胸腺細胞又はそれらの混合物を含む細胞の表面に発現される請求項７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
ゲノムが、異種性ＦｃγＩＩＩレセプターに実質的に相同なレセプターのサブユニットをコードする内因性遺伝子に破壊を更に含む請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
内因性遺伝子がマウスＣＤ１６α鎖をコードする請求項９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
Ｂ細胞リンパ腫を治療可能な薬剤を同定する方法において、
ａ）請求項１又は９に記載の動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｂ）請求項１又は９に記載の動物に上記薬剤を投与し、
ｃ）上記動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定することを含み、
薬剤で治療した後の動物におけるヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球数の減少により、Ｂ細胞リンパ腫を治療可能な薬剤が同定される方法。
【請求項１２】
請求項１１によって同定された薬剤。
【請求項１３】
ヒトＣＤ２０を発現する細胞を枯渇させ又は殺すことが可能な薬剤を同定する方法において、
ａ）請求項１又は９に記載の動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｂ）請求項１又は９に記載の動物に上記薬剤を投与し、
ｃ）上記動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定することを含み、
動物におけるヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球数の減少により、ＣＤ２０を発現する細胞を枯渇させ又は殺すことができるものとして薬剤が同定される方法。
【請求項１４】
上記細胞が癌細胞である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４によって同定された薬剤。
【請求項１６】
請求項１又は９に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞又は組織。
【請求項１７】
上記動物が齧歯類である請求項１又は９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
上記齧歯類がマウスである請求項１７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
Ｆｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤を同定する方法において、
ａ）請求項１に記載のトランスジェニック動物においてＦｃ媒介エフェクター細胞応答に関連する一又は複数のサイトカインのベースラインレベルを測定し、
ｂ）トランスジェニック動物に上記薬剤を投与し、
ｃ）上記動物においてサイトカインのレベルを測定することを含み、
投与後のサイトカインのレベルの増加により、該薬剤がＦｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能であるとして同定される方法。
【請求項２０】
ヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球に対してＦｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤を同定する方法において、
ａ）第一トランスジェニック動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｂ）第一トランスジェニック動物に上記薬剤を投与し、
ｃ）第一トランスジェニック動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｄ）工程（ａ）と工程（ｃ）の間のＢリンパ球のレベルの減少割合を決定し、
ｅ）請求項１に記載の第二トランスジェニック動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｆ）請求項１に記載の第二トランスジェニック動物に上記薬剤を投与し、
ｇ）第二トランスジェニック動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｈ）工程（ｅ）と工程（ｇ）の間のＢリンパ球のレベルの減少割合を決定することを含み、
工程（ｈ）において決定された減少割合が工程（ｄ）において決定された減少割合よりも大きいならば、該薬剤がヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球に対してＦｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤として同定される方法。
【請求項２１】
抗ヒトＣＤ２０療法の安全性を試験する方法において、
ａ）請求項１又は９に記載の動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｂ）請求項１又は９に記載の動物に上記薬剤を投与し、
ｃ）上記動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ここで、動物におけるヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球数の減少により、ＣＤ２０を発現する細胞を枯渇させ又は殺すことができるものとして薬剤が同定され、
ｄ）短期間又は長期間の副作用について動物をモニターすることを含む方法。
【請求項２２】
抗ヒトＣＤ２０療法の有効性を試験する方法において、
ａ）請求項１又は９に記載の一群の動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｂ）上記群の各動物に異なった用量の薬剤を投与し、
ｃ）各用量後の上記動物においてヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し、
ｄ）最もＢ細胞枯渇の多い薬剤の少なくとも一の用量を決定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この出願は、全ての国を指定し、２００２年１２月１６日出願の米国仮出願番号第６０／４３４１１５号及び２００３年６月５日出願の米国仮出願番号第６０／４７６４８１号に基づく優先権を主張して、米国籍の国内企業のジェネンテック・インク（米国を除く全ての国に対しての出願人）、米国在住米国市民アンドリュー・チー-イェン・チャン（米国に対してのみ出願人）、米国在住中国市民キアン・ゴン（米国に対してのみ出願人）、及び米国在住ルーマニア市民フラビウス・マーチン（米国に対してのみ出願人）の名義で２００３年１２月１１日にＰＣＴ国際特許出願として出願されたものである。
【０００２】
発明の背景
Ｔ細胞とＢ細胞は共に分化と同定のためのマーカーとして利用することができる細胞表面タンパク質を含む。一つのそのようなヒトＢ細胞マーカーは「ＣＤ２０」としても知られているヒトＢリンパ球制限的分化抗原Ｂｐ３５である。ＣＤ２０は初期プレＢ細胞発生中に発現し、形質細胞の分化まで残る。ＣＤ２０分子は、細胞分裂周期開始と分化に必要な活性化プロセスの工程を調節し通常は腫瘍性Ｂ細胞に非常に高いレベルで発現されると考えられている。
ＣＤ２０は正常なＢ細胞並びにその衰えない増殖がＢ細胞リンパ腫を生じうる悪性Ｂ細胞の双方に存在する。よって、ＣＤ２０表面抗原は抗原に特異的な抗体を用いてＢ細胞リンパ腫のターゲティングの候補となる可能性がある。これらの抗ＣＤ２０抗原は正常及び悪性Ｂ細胞双方のＣＤ２０細胞表面抗原に特異的に結合し、Ｂ細胞の破壊と枯渇を生じる。腫瘍を破壊する可能性を有する化学薬剤又は放射標識を該薬剤が腫瘍性Ｂ細胞に特異的に送達されるように抗ＣＤ２０抗体に結合させることができる。
【０００３】
ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体の使用は記載されている（例えば、Weiner, Semin. Oncol., 26, 43-51 (1999); Gopal及びPress, J. Lab. Clin. Med., 134, 445-450 (1999); White等, Pharm. Sci. Technol. Today, 2, 95101 (1999)を参照）。リツキサンＴＭは、リンパ腫と新しく診断された患者及びリンパ腫が再発した患者に対して単一の薬剤としてまた化学療法と併用して広く使用されているキメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である（Davis等, J. Clin. Oncol., 17, 1851-1857 (1999); Solal-Celigny等, Blood, 94, abstract 2802 (1999); Foran等, J. Clin. Oncol., 18, 317-324 (2000)）。放射標識抗体のコンジュゲートの利用もまた記載されている（例えば、BexxarTM; Zelenetz等, Blood, 94, abstract 2806 (1999)）。
免疫系細胞との抗体-抗原複合体の相互作用は、例えば抗体依存性細胞傷害性、肥満細胞脱顆粒、及びファゴサイトーシスのようなエフェクター機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌の調節のような免疫調節シグナルの範囲の広範囲の応答を生じる。これらの相互作用は全て造血細胞上の特化した細胞表面レセプターへの免疫複合体又は抗体のＦｃドメインの結合を通じて開始される。抗体及び免疫複合体によって惹起される細胞応答の多様性はＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）の構造的不均一性から生じることが今は明確にされている。
【０００４】
これらのレセプターの一グループＦｃγＲｓは、造血性系統の殆どの細胞に見出され、ＩｇＧに対して高親和性と低親和性の双方を媒介する（例えば、出典明示によりここに取り込む米国特許第５８７７３９６号を参照のこと）。高親和性レセプターＦｃγＲＩは単量体ＩｇＧに結合し、専らマクロファージと好中球に発現される。これは、抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）とファゴサイトーシスを抗体による架橋に応答して媒介することができる。ＩｇＧ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に対する低親和性レセプターは免疫複合体に対するエフェクター細胞応答の原因であり、インビボにて炎症反応に主に関与するＦｃγＲｓを提示する。ＦｃγＲＩＩは造血細胞に広く発現され、Ｂ細胞上で阻害レセプターとして機能する一方、骨髄系統の細胞及び血小板では、ＦｃγＲＩＩはＡＤＣＣ、ファゴサイトーシス及び炎症媒介物質の放出を免疫複合体により架橋したときに惹起する。ＦｃγＲＩＩＩは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞を含む様々な白血球上に発現され、免疫複合体により架橋されるとエフェクター応答を媒介する。その細胞上で抗体依存性応答を媒介するのはＮＫ細胞上の唯一のＦｃＲである。ナチュラルキラー細胞は明白な抗原特異性又は組織適合分子による制限なしに腫瘍細胞を溶解的に破壊する自然発生的に細胞傷害性リンパ球のサブセットである。これらの十分に特徴付けられたエフェクター細胞経路に加えて、ＦｃγＲＩＩＩは未熟の胸腺細胞に見出されており、そこで、初期の胸腺細胞発生に機能すると推論されている。
【０００５】
免疫グロブリンＦｃ部分の他のレセプター（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃεＲＩ）では、ＣＤ１６は自己免疫及び炎症応答の媒介に重要な役割を果たしている。ＣＤ１６に対するモノクローナル抗体を使用する研究では、免疫複合体を循環から除去しＡＤＣＣを媒介するこのレセプターの役割が証明されている（例えば、Van de Winkel等, Immunol. Today, 14, 215-221 (1993)を参照）。ＣＤ１６とのＩｇＧの結合はＮＫ／ＬＧＬ細胞活性化を誘発しＡＤＣＣを惹起する。ＡＤＣＣは高レベルの可溶型ＣＤ１６の存在下で停止されうる。
可溶型ＣＤ１６のレベルは健常な志願者と比較して多発性骨髄腫の患者で有意に減少したことが見出されている（Mathiot等, J. Clin. Immunol., 13, 41-8 (1993)を参照）。また、可溶型ＣＤ１６の段階依存的減少が観察され、多発性骨髄腫のＩ期とＩＩ＋ＩＩＩ期の患者の間で非常に有意な差がある。従って、血清中の可溶型ＣＤ１６の測定値は骨髄腫の診断及び予後の双方のマーカーであり、疾患を判定しその新規な免疫調節療法を導くのに有用でありうる。
【０００６】
ＣＤ１６はヒトの血清及び他の体液中に存在し、炎症の部位で増加することが更に見出されている（Fleit等, Blood, 79, 27218 (1992)を参照）。ヒトＣＤ１６には少なくとも２つの型、つまりＡ型とＢ型があるようである。ＣＤ１６-Ａはマクロファージ、ナチュラルキラー細胞及び大型顆粒リンパ球（ＮＫ／ＬＧＬ）の表面に優勢に発現する一方、ＣＤ１６-Ｂは好中球及び単球の表面に優勢に発現する。
ヒトリンパ腫及び重要な免疫応答の誘発におけるＣＤ２０及びＣＤ１６の重要な役割にも拘わらず、ヒトマーカーを同時発現する動物モデルは欠けている。よって、疾患の研究及び医薬薬剤開発のために関連する動物モデルが必要である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、一般にヒト細胞マーカー、特にＣＤ１６及びＣＤ２０を発現する非天然に生じる非ヒトトランスジェニック動物に関する。一側面では、トランスジェニック動物は、癌のようなＣＤ２０関連疾患又は症状のための新規治療剤を同定し試験する系を提供する。一実施態様では、トランスジェニック動物はＣＤ２０に向けられた治療法の有効性と毒性を試験するのに有用である。
本発明は、異種性ＣＤ２０、好ましくはヒトＣＤ２０をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムが含む非天然に生じるトランスジェニック動物を提供する。ヌクレオチド配列は、好ましくはヒト内因性プロモーターに作用可能に結合しており、よってヒトＣＤ２０はＢリンパ球の表面に発現せしめられる。一実施態様では、ヒトＣＤ２０トランスジェニック動物は、発現細胞に結合した抗ヒトＣＤ２０抗体が細胞の死滅化に影響を及ぼすのに十分なレベルでの細胞上のヒトＣＤ２０の発現によって特徴付けられ、少なくとも約７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、そして更には１００％の末梢及び／又は循環Ｂ細胞のＢ細胞枯渇を生じる。
【０００８】
本発明の一実施態様では、非天然に生じる非ヒトトランスジェニック動物のゲノムは、異種性ＦｃγＩＩＩレセプター、好ましくはヒトＣＤ１６と、好ましくはヒトＣＤ１６のα鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、好ましくはヒト内因性プロモーターに作用可能に結合しており、これによって、異種性レセプターは、次のもの：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、胸腺細胞、及び肥満細胞の一又は複数を含む白血球の表面に発現せしめられる。
好適な実施態様では、動物のゲノムが相同の内因性遺伝子（ＣＤ２０又はＣＤ１６の何れか又は双方）を含む場合、その遺伝子は、内因性分子が細胞表面に発現されないように破壊又はノックアウトされる。
本発明は、更に、Ｂ細胞リンパ腫を治療可能な薬剤を同定する方法を提供し、その方法は、Ｂリンパ球上にヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニック動物に薬剤を投与し、Ｂリンパ球数の減少があるかどうかを決定することを含む。本発明はまたヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニック動物に薬剤を投与し、そのような細胞の数の減少があるかどうかを決定することを含む、ヒトＣＤ２０を発現する細胞を枯渇させ又は殺すことが可能な薬剤を同定する方法を提供する。更に提供されるのは、このような方法によって同定された薬剤である。
【０００９】
本発明の動物モデルは、ＡＤＣＣ又はＮＫ細胞媒介免疫応答のようなエフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤を同定するためにまた使用することができる。薬剤の投与後に、例えばサイトカインレベルの増減を決定することにより、免疫応答について動物をモニターすることができる。薬剤の投与後のサイトカインレベルの増加により、Ｆｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導する薬剤が同定される。ＣＤ１６に対する推定上の薬剤の結合はまた好適なマーカー又は標識を使用して評価することができる。また、薬剤は、薬剤の投与後にＣＤ２０＋トランスジェニック動物におけるＢ細胞の枯渇をＣＤ１６＋ＣＤ２０＋トランスジェニック動物中のものと比較することによって、ＣＤ１６媒介免疫応答を介してヒトＣＤ２０を発現するＢ細胞の枯渇に影響を及ぼすその能力についてスクリーニングすることができる。本発明の動物はまた今記載したトランスジェニック動物への投与によって抗ＣＤ２０治療剤の毒性を評価するのに有用である、
【００１０】
治療特異性、毒性及び効果は、薬剤の効果を野生型動物又は未処置のトランスジェニック動物における効果と比較することによって決定することもまたできる。本発明の非ヒトトランスジェニック動物は更にヒトへ投与される特定の薬剤の安全性の指標を提供することができる。例えば、ヒト化抗体又は他の薬剤をトランスジェニック動物に投与することができ、動物への薬剤の投与の結果生じるあらゆる毒性又は副作用を、インビボでヒトに使用される薬剤又はヒト化抗体の安全性と耐容性の指標としてモニターすることができる。短期の基準で生じうる有害事象には、頭痛、感染、発熱、悪寒、痛み、吐き気、無気力、咽頭炎、下痢、鼻炎、注入反応、及び筋肉痛が含まれる。短期の有害事象は治療後何日間かしばらく測定される。長期の有害事象には、ある細胞型の細胞傷害性、血小板減少による出血事象、免疫及び／又はアレルギー反応によるメディエータの放出、免疫系の阻害及び／又は抗治療剤抗体の発生、終末器官毒性、及び感染又は悪性腫瘍の発生増加が含まれる。長期の有害事象は治療後何ヶ月間も測定される。
本発明の他の側面は、抗ＣＤ２０薬剤の効果を決定する方法を含む。効果は、ある範囲の用量の薬剤を、ヒトＣＤ２０及び／又はヒトＣＤ１６α鎖を有するトランスジェニック動物群に投与し、ヒトＣＤ２０を有する細胞の減少を生じせしめる薬剤の少なくとも一の用量を決定することによって、決定することができる。
【００１１】
（詳細な説明）
次の用語は別に特定しない限り以下に基づく意味を持つ。
「コンストラクト」又は「ターゲティングコンストラクト」という用語は、ターゲティング領域を含むポリヌクレオチド分子を意味する。ターゲティング領域は、標的組織、細胞又は動物中の内因性配列に実質的に相同であり、標的組織、細胞又は動物のゲノム中へのターゲティングコンストラクトの組込みをもたらす配列を含む。典型的には、ターゲティングコンストラクトは特に興味のある遺伝子又は核酸配列、マーカー遺伝子及び適切な制御配列をまた含むであろう。
「ＣＤ１６」又は「ＦｃγＲＩＩＩ」という用語は同義に用いられ、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域の細胞表面レセプタータンパク質を意味する。このレセプターはＩｇＧに対する低親和性レセプターであり、免疫複合体中のＩｇＧに優先的に結合する。ＦｃγＲＩＩＩレセプターはリガンド結合鎖となるα鎖とホモ二量体又はヘテロ二量体から構成される。ＦｃγＲＩＩＩがマクロファージ上に発現される場合、α鎖はγ鎖のホモ二量体に結合する。ＦｃγＲＩＩＩがナチュラルキラー細胞上に発現される場合、α鎖はδ鎖を持つγ鎖のヘテロ二量体に結合する。γ鎖はＦｃγＲＩＩＩの細胞表面発現に関連している。「天然に生じるＣＤ１６」は自然から得られた細胞表面レセプタータンパク質のアミノ酸配列を有し、対立遺伝子変異体、アイソタイプ及び切断型を含む天然に生じる変異体型を含む。ヒトＣＤ１６はＣＤ１６又はＦｃγＲＩＩＩ-Ａ（ジェンバンク受託番号第Ｚ４６２２２号）とＣＤ１６又はＦｃγＲＩＩＩ-Ｂ（ジェンバンク受託番号第Ｚ４６２２３号）の双方を含むα鎖の全てのアイソタイプを含む。ＦｃγＲＩＩＩのα鎖の代表的なアミノ酸及びヌクレオチド配列は図２２Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ／Ｅに示される。ヒトγ鎖の代表的な配列は図２５に示される（ジェンバンク受託番号第Ｐ３０２７３及びＭ３３１９５号）。本発明はまたＣＤ１６又はＦｃγＲＩＩＩ変異体を考慮する。変異体は一般に知られている方法によって供給源配列と比較して変化させられ、好ましくは天然に生じるヒトＣＤ１６又はＦｃγＲＩＩＩの生物学的活性を保持する。ＦｃγＲＩＩＩの幾つかの変異体が当業者に知られている。
【００１２】
「ＣＤ２０」という用語は免疫系のある種の細胞に発現される細胞表面タンパク質、特にＢリンパ球制限分化抗原Ｂｐ３５を意味する。「天然に生じるＣＤ２０」は自然から得られたタンパク質のアミノ酸配列を有し、対立遺伝子変異体、アイソタイプ及び切断型のような天然に生じる変異体を含む。より詳細には、「ＣＤ２０」はヒトＣＤ２０（ＡＨ００３３５３；ジェンバンク受託番号Ｍ２７３９５、Ｊ０３５７４）を含む。ヒト及びマウスＣＤ２０の代表的なアミノ酸配列、ｃＤＮＡ配列及びゲノム配列を図２３に示す。本発明はまたＣＤ２０変異体を考慮する。変異体は一般に知られている方法によって供給源配列と比較して変化させられ、好ましくは天然に生じるヒトＣＤ２０の生物学的活性を保持する。好ましくは、変異体は天然に生じるヒトＣＤ２０のアミノ酸位置１７０及び１７２は変化させないが、これは、Polyak等, Blood 99:3256 (2002)に記載されているように、これらの位置が数種の異なった抗ヒトＣＤモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの一部であることが示されているからである。
遺伝子の「破壊」は、ＤＮＡの断片が位置し、内因性相同配列と再結合する場合に生じる。これらの配列破壊又は修飾には、挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、又は置換、又はＤＮＡ配列の交換、又はそれらの任意の組み合わせが含まれうる。挿入は、動物、植物、真菌、昆虫、原核生物、又はウイルス由来でありうる全遺伝子の挿入を含む。破壊は、例えば、その生産を部分的に又は完全に阻害するか又は正常な遺伝子産物の活性を向上させることによって正常な遺伝子産物を改変し得る。好適な実施態様では、破壊は遺伝子の有意な発現がない無発現破壊である。
【００１３】
「内因性遺伝子座」とはトランスジェニックになることになる宿主動物に見出される天然に生じる遺伝子座を含むことを意味する。
ポリペプチド又は遺伝子との関連で使用される場合の「異種」という用語は非ヒトトランスジェニック宿主動物には見出されないポリペプチドをコードするＤＮＡ又はアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。よって、ヒトＣＤ２０遺伝子を有するトランスジェニックマウスは異種ＣＤ２０遺伝子を有するものと記述することができる。導入遺伝子は、ＰＣＲ、ウェスタンブロット又はサザンブロットを含む様々な方法を使用して検出することができる。「ヒト内因性プロモーター」という用語は、トランスジェニック動物を形成するために動物中に導入されることになるヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に天然に伴っているプロモーターを意味する。
「非ヒト動物」という用語は、哺乳類、鳥類、爬虫類、及び両生類のような任意の脊椎動物を含むことを意図している。好適な哺乳類には、齧歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ及びウシが含まれる。好適な鳥類にはニワトリ、ガチョウ、及びシチメンチョウが含まれる。好適な非ヒト動物はラットとマウス、最も好ましくはマウスを含む齧歯類ファミリーから選択される。
物に適用されるここで使用の「天然に生じる」又は「天然に付随する」という用語は、物を自然に見出すことができることを意味する。例えば、天然の供給源から単離することができ、実験室において人によって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然に生じている。
【００１４】
核酸に対して、「実質的な相同性」という用語は、二つの核酸又はその示された配列が、最適に整列させ、適切にヌクレオチドを挿入又は欠失して比較した場合に、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは約８１％の配列同一性、より好ましくは約８２％の配列同一性、より好ましくは約８３％の配列同一性、より好ましくは約８４％の配列同一性、より好ましくは約８５％の配列同一性、より好ましくは約８６％の配列同一性、より好ましくは約８７％の配列同一性、より好ましくは約８８％の配列同一性、より好ましくは約８９％の配列同一性、より好ましくは約９０％の配列同一性、より好ましくは約９１％の配列同一性、より好ましくは約９２％の配列同一性、より好ましくは約９３％の配列同一性、より好ましくは約９４％の配列同一性、より好ましくは約９５％の配列同一性、より好ましくは約９６％の配列同一性、より好ましくは約９７％の配列同一性、より好ましくは約９８％の配列同一性、より好ましくは約９９％の配列同一性を互いに有することを示している。あるいは、実質的な相同性は、選択的なハイブリダイゼーション条件下でストランドの相補鎖にセグメントがハイブリダイズする場合に存在する。二つの配列を整列させ、％同一性を同定する方法は当業者に知られている。％同一性を決定するための幾つかのコンピュータプログラムが利用可能である。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ-２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR）ソフトウェアのような公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技量の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００１５】
「転写制御配列」は、それらが作用可能に結合しているタンパク質コード配列の転写を誘導又は制御する、開始シグナル、エンハンサー、及びプロモーターのようなポリヌクレオチド配列を意味する。好適な実施態様では、組換え導入遺伝子の転写は、発現が意図されている細胞型における組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（又は他の転写制御配列）の制御下にある。組換え遺伝子が、同じであるか又はその配列とは異なっており、ＣＤ２０又はＣＤ１６の天然に生じる形態の転写を制御する転写制御配列の制御下にありうることがまた理解される。
ここで使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、例えばここに開示された方法によってヒトの介入によって細胞中に導入された核酸配列（例えばＣＤ２０又はＣＤ１６をコードする）を意味する。導入遺伝子は、それが導入されるトランスジェニック動物又は細胞に対して部分的に又は完全に異種性、つまり外来性でありうる。導入遺伝子は一又は複数の転写制御配列と、選択された核酸の最適な発現に必要でありうるイントロンのような任意の他の核酸を含みうる。
【００１６】
「トランスジェニック動物」又は「Ｔｇ＋」は同義に使用され、動物の細胞の一又は複数が、当該分野でよく知られているトランスジェニック技術によるようなヒトの介入によって導入されているヒトＣＤ２０及び／又は好ましくはヒトＣＤ１６をコードする異種性核酸を含む任意の非天然に生じる非ヒト動物を含むことを意図している。核酸は、細胞の前駆体中への導入、故意の遺伝子操作、例えばマイクロインジェクション又は組換えウイルスでの感染によって、直接的に又は間接的に細胞中に導入される。遺伝子操作という用語は古典的な交雑育種を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入に関している。この分子は染色体内に組込まれうるか、又はそれは染色体外に複製するＤＮＡでありうる。「Ｔｇ＋」という用語には、ヒトＣＤ２０及び／又はヒトＣＤ１６の何れかにヘテロ接合性及び／又はホモ接合性である動物が含まれる。
【００１７】
「ＣＤ２０関連疾患」は、細胞上のＣＤ２０の発現、Ｂ細胞の異常増殖又は活性化を伴っているか、又は抗ＣＤ２０抗体で治療されている疾患又は障害を意味する。例えば、キメラ抗ＣＤ２０抗体がリンパ腫の患者を治療するために使用されている。抗ＣＤ２０療法で治療されている他の疾患又は症状には自己免疫症状又は疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス及び強直性脊椎炎が含まれる。他の症状には、血液又は骨髄移植後のエプスタインバーウイルス関連疾患、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス関連多中心性キャッスルメン(Castlemen)病、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症血管炎、自己免疫溶血性貧血を伴うリンパ球増殖疾患、及びＡＮＣＡ関連血管炎が含まれる。
【００１８】
Ａ．発明の形態
本発明は異種性ＣＤ２０マーカー、異種性ＣＤ１６マーカー又は双方を発現するトランスジェニック動物を提供する。一実施態様では、本発明のヒトＣＤ２０トランスジェニック動物はＢ細胞の同じ型にＣＤ２０を発現する。現在記載されているトランスジェニック動物への抗ヒトＣＤ２０抗体の投与により、ヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球の枯渇が生じる。ヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニック動物を調製する過去の試みでは、導入遺伝子中への効果的な転写制御領域の取り込みができなかったために適切なＢ細胞区画におけるヒトＣＤ２０の発現を達成できなかった。他の実施態様では、本発明のトランスジェニックマウスはヒトＣＤ２０及びヒトＣＤ１６を発現する。
本発明は、ヒト患者と同様な形で反応する細胞を有するトランスジェニック動物を提供する。現在記載されているトランスジェニック動物への抗ヒトＣＤ２０抗体の投与により、ヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球の枯渇が生じる。一実施態様では、ヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスは、発現細胞に結合した抗ヒトＣＤ２０抗体が細胞の死滅化に影響を及ぼすのに十分なレベルでの細胞上でのヒトＣＤ２０の発現により特徴付けられ、少なくとも約７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、更には１００％の末梢及び／又は循環Ｂ細胞のＢ細胞枯渇を生じる。同様な応答がヒトにおいて観察される。これらの動物モデルは、限定されるものではないがＣＤ２０マーカーに対するモノクローナル抗体を含む薬剤のスクリーニングに使用することができる。また、ヒトＣＤ１６を発現するトランスジェニックマウスは、エフェクター細胞応答（例えばＮＫ細胞媒介応答）を誘導する薬剤の能力又は（腫瘍Ｂ細胞を含む）ＣＤ２０を発現するＢリンパ球を更に枯渇させる薬剤の能力を決定するためのモデルを提供する。また、トランスジェニック動物は抗ＣＤ２０に向けられた治療法の効果と毒性を試験するために使用することができる。
【００１９】
Ｂ．ＤＮＡコンストラクト
典型的には、本発明の異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子は、適切な宿主細胞中でポリヌクレオチド分子を複製するためにベクター、好ましくはＤＮＡベクター中に挿入される。ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６導入遺伝子は別個に産生され挿入されるか、又は挿入のための単一のコンストラクトに一緒に産生されてもよいことが理解される。ＤＮＡコンストラクトはまたノックアウト動物のためのターゲティングベクターを調製するのにも有用でありうる。
ＣＤ１６及び／又はＣＤ２０遺伝子座を単離し、クローニングし、移すために、酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いることができる。全遺伝子座をクローニングし、一又は数個のＹＡＣクローン内に含めることができる。複数のＹＡＣクローンが用いられ重複する相同性領域を含む場合、それらを酵母宿主菌内で組換えて全遺伝子座を提示する単一のコンストラクトをつくることができる。ＹＡＣアームは、過去に概説された方法によって胚性幹細胞又は胚中へのコンストラクトの導入の補助を改善することによって哺乳動物選択カセットで更に改変することができる。
高安定性及び比較的大きな挿入断片、操作及びショットガンシークエンシングの容易性のため、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーは対象遺伝子のヒト配列を提供し得る。ＢＡＣライブラリーは１００−１５０ｋｂの平均挿入サイズを含む。ＢＡＣクローンは３０００００塩基対もの多くの挿入断片を有することが可能である。Shizuya等, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Kim等, (1996) Genomics 34 213-218; Swiatek, 等, (1993) Genes and Development 7:2071-2084。ヒト及びマウスのゲノムＢＡＣライブラリーが構築され、商業的に入手可能である（インビトロゲン, Carlsbad CA）。ゲノムＢＡＣライブラリーはまたヒト及びマウスＣＤ２０及び／又はＣＤ１６遺伝子配列並びに転写制御領域の供給源となり得る。
【００２０】
ヒトＣＤ２０をコードする核酸は当業者には知られている。ヒト及びマウスＣＤ２０の代表的なｃＤＮＡ（配列番号：５）、ゲノム（配列番号：６）及びアミノ酸配列（配列番号：４）は図２３に示す。他の配列もまた受託番号ＡＨ００３３５３のようにジェンバンクに見出すことができる。
ヒトＣＤ１６のα鎖のアイソタイプをコードする核酸は当業者には知られている。ヒトα鎖サブタイプＡの代表的なｃＤＮＡ（配列番号：２）、ゲノム（配列番号：３）及びアミノ酸配列（配列番号：１）は図２２Ａ、Ｂ及びＣに示す（ジェンバンク受託番号ＮＭ０００５６９及びＺ４６２２２）。ヒトＣＤ１６α鎖サブタイプＢの代表的なアミノ酸配列（配列番号：１０）及びｃＤＮＡ配列（配列番号：１１）は図２２Ｅに示す（ジェンバンク受託番号ＮＭ０００５７０）。ヒトＣＤ１６α鎖サブタイプＢをコードするゲノム配列は図２２Ｆ（ジェンバンク受託番号Ｚ４６２２３）に示す。ヒトＦｃレセプターγ鎖をコードする核酸配列もまた当業者に知られている。代表的なアミノ酸配列（配列番号：７）（ジェンバンク受託番号Ｐ３０２７３）及びｃＤＮＡ配列（ジェンバンク受託番号Ｍ３３１９５）（配列番号：８）は図２５に示す。
異種導入遺伝子は好ましくはトランスジェニック非ヒト動物中で発現されることとなる対象遺伝子に作用可能に結合した生殖系列制御ＤＮＡ配列を含む。「作用可能に結合」という用語は核酸セグメント、又は与えられたセグメント又は配列の上流（５'）又は下流（３'）の配列に作用的に（つまり機能的に）結合した遺伝子配列を意味する。それらの近傍の配列はしばしば所望細胞型中での核酸セグメント又は配列のプロセシング及び／又は発現に影響を及ぼす。
【００２１】
好ましくは、これらの制御配列は由来がゲノムであり、一又は複数のイントロンを含む。例えば、トランスジェニックコンストラクトは宿主細胞中で遺伝子を複製及び発現可能な形でコード化配列に作用可能に結合して、ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６をコードする遺伝子の５'-フランキング領域に位置した制御領域を含み得る。一実施態様では、制御配列はＣＤ２０及び／又はＣＤ１６の何れかに天然に付随する内因性プロモーター配列を含む。幾つかの実施態様では、プロモーターは配列が由来する動物中での発現レベルに類似のレベルの組織特異的発現をもたらす。更なるフランキング配列が発現の最適化に有用であり、かかる配列は既存の配列をプローブとして使用してクローニングできる。導入遺伝子のプロセシング又は発現を最大にするのに必要な更なる配列はゲノム配列から誘導することができる。
あるいは、プロモーターは、トランスジェニック宿主動物中の対応する内因性遺伝子に付随したプロモーターでありうる。例えば、マウス遺伝子ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６遺伝子が対応するヒト遺伝子との統合によって破壊される場合、対応するヒト遺伝子は、好ましくは、内因性マウスＣＤ２０及び／又はＣＤ１６のそれぞれのマウス転写制御領域に作用可能に結合するように組み込まれる。
好ましくは、制御配列は、例えば抗体での検出のような標準的な方法を使用して発現を検出することができるように適切な細胞中での所定のレベルでの導入遺伝子の発現をもたらす。一実施態様では、制御配列はヒト細胞上でのＣＤ２０の発現の少なくとも４０％のレベルのヒトＣＤ２０導入遺伝子の発現をもたらす。
【００２２】
導入遺伝子をコードする発現系又はコンストラクトはＣＤ２０マーカー及び／又はＣＤ１６レセプターに特異的な転写制御配列、例えばヒト内因性プロモーターを含むコンストラクトから発現させることができる（例えば、出典明示によりここに取り込む米国特許第５８７７３９６号を参照のこと）。
ここに記載された導入遺伝子をコードする発現系又はコンストラクトはまたＤＮＡ配列の下流の３'未翻訳領域を含みうる。そのような領域は発現系のＲＮＡ転写物を安定化させることができ、よって発現系から所望のタンパク質の収率を増大させる。この発明のコンストラクトに有用な３'未翻訳領域にはポリＡシグナルをもたらす配列がある。そのような配列は、例えば当該分野でよく知られたＳＶ４０スモールｔ抗原、ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６未翻訳領域又は他の３'未翻訳配列から誘導することができる。
場合によっては、発現系又はコンストラクトはシグナル配列をコードするＤＮＡ配列とプロモーターの間に５'未翻訳領域を有する。そのような未翻訳領域は、プロモーターが取り出されるものと同じ制御領域から由来するか又は異なった遺伝子から由来し得、例えばそれらは他の合成、半合成又は天然源から誘導されうる。
【００２３】
また、導入遺伝子には天然には付随しない他のプロモーター又は他の転写制御配列を利用することができる。例えば異種プロモーターは発現又は組織特異的発現のレベルの向上をもたらしうる。異なった強さを有する様々なプロモーターを、非ヒト動物又は所望の組織型においてそのプロモーターが機能する限り利用することができる。多くのプロモーターが当業者に知られている。
発現系は当該分野で公知の方法を使用して調製することができる。例えば、発現系は、より大きなプラスミドの一部として調製することができる。そのような調製は当該分野で知られているような効率的な形での正しいコンストラクトのクローニングと選択を可能にする。発現系は、それらが所望の哺乳動物中への組み込みのため残りのプラスミド配列から容易に単離することができるように、プラスミド上の簡便な制限部位間に位置し得る。好ましくは、ヒトＣＤ２０及び／又はＣＤ１６をコードするＤＮＡコンストラクトは、組織特異的発現をもたらすために天然に付随する転写制御配列を含む細菌人工染色体を含む。
プラスミドの調製及び宿主生物の形質転換に使用される様々な方法が当該分野で知られている。原核生物細胞と真核生物細胞の双方に対して好適な他の発現系、並びに一般的な組換え手順については、Sambrook, Fritsch及びManiatisによって編集されたMolecular Cloning A Laboratory Manual, 第２版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) の第１６及び１７章を参照のこと。
【００２４】
Ｃ．トランスジェニック動物の産生
ノックアウトとノックインを含む本発明のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野でよく知られている（一般には、Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner編, Oxford University Press, Inc. (2000)を参照のこと）。トランスジェニックマウスの産生は、マウスマーカーの遺伝子座の破壊とヒトマーカーをコードする遺伝子のマウスゲノム中の、好ましくは内因性遺伝子と同じ位置への導入を場合によっては含みうる。
本発明によれば、ヒトＣＤ２０がマウスゲノム中に導入されたトランスジェニックマウスモデルが産生される（ｈｕＣＤ２０＋；あるいはｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋と記載する）。内因性マウスＣＤ２０ポリペプチドはマウスリンパ球上に存在するが、既知の抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体はマウスＢ細胞に結合しない。従って、内因性マウスＣＤ２０遺伝子は、破壊されないが、望まれるならば破壊することができる。内因性マウスＣＤ２０が破壊されない場合、ヒトＣＤ２０をコードする遺伝子は、好ましくはマウスＣＤ２０をコードする遺伝子の位置以外の位置に挿入される。
好適な実施態様では、トランスジェニック動物のゲノムは、ヒトＣＤ１６、好ましくはα鎖、より好ましくはサブタイプＡα鎖をコードする配列を更に含む。マウスが使用される場合、マウスＣＤ１６遺伝子、好ましくはα鎖が破壊されたノックアウト系統が産生される（ｍＣＤ１６−／−）。別に、ヒトＣＤ１６α鎖がゲノム中に導入されたトランスジェニックマウス系統が産生される（ｈｕＣＤ１６＋；あるいはｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋と記載する）。ｍＣＤ１６−／−及びｈｕＣＤ１６＋マウス系統はついで交雑育種されヒトＣＤ１６α鎖を発現するが内因性ＣＤ１６を発現しないマウス（ｈｕＣＤ１６＋ｍＣＤ１６−／−）が産生される。あるいは、ヒト遺伝子はｍＣＤ１６−／−由来のＥＳ細胞中に導入することができ、又はマウスＣＤ１６遺伝子を破壊するために使用することができる。
【００２５】
内因性遺伝子座の不活化
好適な実施態様では、内因性遺伝子座の不活化は、胚性幹細胞における相同組換えによる標的化破壊によって達成される。一実施態様では、ＤＮＡが宿主細胞中に導入され、内因性遺伝子座において組換えられて内因性ＣＤ１６の産生を破壊する。同様に、他の実施態様では、ＤＮＡが宿主細胞中に導入され、内因性ＣＤ２０遺伝子座において組換えられて内因性ＣＤ２０の産生を破壊する。
ターゲティングコンストラクトは、当該分野で公知の標準的方法を使用して産生することができる（Sambrook等, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；E.N. Glover編, 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, 第I及びII巻；M.J. Gait編, 1984, Oligonucleotide Synthesis；B. D. Hames及びS.J. Higgins編, 1985, Nucleic Acid Hybridization；B.D. Hames及び S. J. Higgins 編, 1984, Transcription and Translation；R.I. Freshney編, 1986, Animal Cell Culture；Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, 1986；B. Perbel, 1984, A Practical Guide To Molecular Cloning；F.M. Ausubel等編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.を参照のこと）。例えば、ターゲティングコンストラクトは、配列が合成され、天然源から単離され、操作され、クローン化され、ライゲーションされ、インビトロ突然変異誘発を受け、プライマー修復等を受ける一般的な方法に従って調製することができる。様々な段階で、結合された配列がクローン化され、制限分析によって分析され、配列決定等がなされうる。
【００２６】
ターゲティングＤＮＡは当該分野でよく知られている技法を用いて得ることができる。例えば、ターゲティングＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの化学合成、二本鎖ＤＮＡ鋳型のニックトランスレーション、配列のポリメラーゼ連鎖反応増幅（又はリガーゼ連鎖反応増幅）、対象配列（例えばクローン化ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は上記の組み合わせの何れか）を含む原核細胞又は標的クローニングベクターの精製、例えばプラスミド、ファージミド、ＹＡＣ、コスミド、ＢＡＣ、バクテリオファージＤＮＡ、他のウイルスＤＮＡ又は複製中間体、又はその精製制限断片、並びに所望のヌクレオチド配列を有する一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの他の供給源の精製によって産生することができる。更に、相同の長さは当該分野で既知の方法を使用して選択することができる。例えば、選択は予め決められた内因性標的ＤＮＡ又は複製中間体配列の配列組成と複雑性に基づいている場合がある。
一実施態様では、本発明のターゲティングコンストラクトは、破壊されることになるＣＤ１６遺伝子及び／又はＣＤ２０の一部又は領域に相同の第一配列（又はアーム）とその遺伝子の第二部分又は領域に相同な第二配列を含むターゲティング領域を含む。ターゲティングコンストラクトは、第一及び第二ＤＮＡ配列間に好ましくは位置するポジティブ選択マーカーを更に含みうる。ポジティブ選択マーカーはプロモーター及びポリアデニル化シグナルに作用可能に結合していてもよい。
【００２７】
他の実施態様では、ターゲティングコンストラクトは、ターゲティングコンストラクトの相同アームの一方又は双方の外側に好ましくは位置している、単純ヘルペスウイルスｔｋ（ＨＳＶ-ｔｋ）遺伝子のようなネガティブ選択マーカーを含む一を越える選択マーカー遺伝子を含みうる。ネガティブ選択マーカーはプロモータ及びポリアデニル化シグナルに作用可能に結合しうる（例えば米国特許第５４６４７６４号；第５４８７９９２号；第５６２７０５９号及び第５６３１１５３号を参照）。
適切なターゲティングコンストラクトがひとたび調製されれば、ターゲティングコンストラクトは当該分野で知られている任意の方法を使用して適切な宿主細胞中に導入することができる。例えば、前核マイクロインジェクション；生殖系列中へのレトルウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞での標的遺伝子組換え；胚のエレクトロポレーション；精子媒介遺伝子移入；及びリン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、核中へのＤＮＡのマイクロインジェクション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、形質移入、ポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンなど等々を含む様々な方法を本発明において用いることができる（例えば米国特許第４８７３１９１号; Van der Putten等, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152; Thompson等, 1989, Cell 56:313-321; Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814; Lavitrano等, 1989, Cell, 57:717-723を参照のこと）。哺乳動物細胞を形質転換する様々な技法が当該分野で知られている（例えばGordon, 1989, Intl. Rev. Cytol., 115:171-229; Keown等, 1989, Methods in Enzymology; Keown等, 1990, Methods and Enzymology, Vol. 185, pp. 527-537; Mansour等, 1988, Nature, 336:348-352を参照のこと）。
【００２８】
相同組換えが可能な任意の細胞型を本発明の実施に使用することができる。そのような標的細胞の例には、ヒト、ウシ種、ヒツジ種、マウス種、サル種のようなほ乳類を含む脊椎動物、及び糸状真菌のような他の真核生物、及び植物のような高等多細胞生物から誘導された細胞が含まれる。
好適な細胞型には、典型的にはインビトロで培養された移植前胚から得られる胚性幹（ＥＳ）細胞が含まれる（例えば、Evans, M. J.等, 1981, Nature 292:154-156; Bradley, M. O.等, 1984, Nature 309:255-258; Gossler等, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069; 及びRobertson等, 1986, Nature 322:445-448を参照のこと）。当業者によく知られた方法を使用してＥＳ細胞を培養し、ターゲティングコンストラクト導入の準備をする（例えば、Robertson, E. J.編 "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, a Practical Approach", IRL Press, Washington D.C., 1987; Bradley等, 1986, Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371; Hogan等,"Manipulating the Mouse Embryo": A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., 1986; Thomas等, 1987, Cell 51:503; Koller等, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10730; Dorin等, 1992, Transgenic Res. 1:101;及びVeis等, 1993, Cell 75:229を参照のこと）。ターゲティングコンストラクトと共に挿入されるＥＳ細胞は、それらが導入されることになる発生胚と同じ種の胚又は胚盤胞から由来する。ＥＳ細胞は典型的には内部細胞塊に組み込まれ、発生の胚盤胞段階で胚の哺乳動物中に導入される場合に個体の生殖系列に寄与するその能力について選択される。よって、この能力を有する任意のＥＳ細胞株が本発明を実施するための使用に適している。
【００２９】
ターゲティングコンストラクトが細胞中に導入された後、標的遺伝子の組み込みが成功した細胞が同定される。標的遺伝子中へのターゲティングコンストラクトの挿入は、典型的にはマーカー遺伝子の発現によって細胞を同定することによって検出される。好適な実施態様では、本発明のターゲティングコンストラクトで形質転換された細胞を、選択マーカーを発現しない細胞に対して選択する適切な薬剤で処置する。選択マーカー遺伝子を発現する細胞だけが、ある条件下で生存し及び／又は成長する。例えば、導入されたネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は化合物Ｇ４１８に耐性がある一方、ネオ遺伝子マーカーを発現しない細胞はＧ４１８によって殺される。ターゲティングコンストラクトがまたＧＦＰのようなスクリーニングマーカーを含む場合、蛍光光の下にスクリーニング細胞コロニーを通して相同組換えを同定することができる。相同組換えを受けた細胞はＧＦＰ遺伝子を欠失しており、蛍光を発しない。
あるいは、ポジティブ-ネガティブ選択技術を用いて相同組換え体を選択することができる。この技法は、第一薬剤を細胞集団に加える、例えばネオマイシン様薬剤を形質移入細胞の成長を選択するために、つまりポジティブな選択のために加える。例えばＦＩＡＵのような第二薬剤を、つづいてネガティブ選択マーカーを発現する細胞を死滅させるために、つまりネガティブ選択のために加える。ネガティブ選択マーカーを含み発現する細胞は選択薬剤によって死滅される一方、ネガティブ選択マーカーを含まず発現しない細胞は生存する。例えば、コンストラクトの非相同的挿入を伴う細胞はＨＳＶチミジンキナーゼを発現し、よってガンシクロビル（ＧＡＮＣ）又はＦＩＡＵ（１-(２-デオキシ２-フルオロ-Ｂ-Ｄ-アラビノフルラノシル)-５-ヨードウラシル）のようなヘルペス薬に感受性がある。（例えば、Mansour等, Nature 336:348-352: (1988); Capecchi, Science 244:1288-1292, (1989); Capecchi, Trends in Genet. 5:7076 (1989)を参照のこと）。他の方法には、制御ポジティブ選択法が含まれ（米国特許出願公開第２００３００３２１７５Ａ１を参照）、これは単一の選択薬剤の添加を必要とする。
【００３０】
成功裏の組換えは、選択された細胞のＤＮＡを分析して相同組換えを確認することによって同定することができる。当該分野で既知の様々な方法、例えばＰＣＲ及び／又はサザン分析法を用いて相同組換え事象を確認することができる。
ついで、選択された細胞は動物（例えばマウス）の胚盤胞（又は例えば桑実胚のような生存可能な動物を作り出す目的に適した発達の他の段階）に注入してキメラを形成する（例えば、Bradley, A. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson編, IRL, Oxford, pp.113-152 (1987)を参照のこと）。あるいは、選択されたＥＳ細胞を分離したマウス胚細胞と凝集させて凝集キメラを形成する。ついで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌育成動物中に移植し、胚を出産させることができる。その生殖細胞に相同組換えＤＮＡを有するキメラ子孫を用いて、動物の全細胞が相同組換えされたＤＮＡを含む動物を育種することができる。一実施態様では、キメラ子孫マウスを用いてＣＤ１６又はＣＤ２０遺伝子にヘテロ接合性破壊を持つマウスを産生する。ヘテロ接合性トランスジェニックマウスをついで交配させることができる。典型的にはそのような交配の子孫の１／４がＣＤ１６又はＣＤ２０にホモ接合性破壊を有することは当該分野においてよく知られている。
上述の内因性遺伝子座の不活化方法に加えて、更なる好適な不活化方法が利用でき、例えば、対象の特異的遺伝子の時間的な制御を移用するｔｅｔ転写系の使用（Proc. Natl. Acad. Sci. 91:9302-9306 (1994))又は組織特異的制御のためのデオキシサイクリン転写調節制御の導入(Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10933-10938 (1996))が含まれうる。
更なる好適な機能的不活化方法には、遺伝子座の標的ノックアウトのためのcre-lox欠失、部位特異的組換え系の利用が含まれ、そこでは、loxP部位が対象の隣接遺伝子に挿入され、creリコンビナーゼが活性化されて遺伝子を欠失させる(Curr. Opin. Biotechnol., 5:521-527 (1994))。
【００３１】
あるいは、所望の遺伝子座の転写を阻害し、よって内因性遺伝子座の機能的破壊を生じさせるためにアンチセンス又はＲＮＡｉ法を利用することができる（ノックダウン法）。そのような状況で、対象の指定遺伝子座の特異的配列を標的とするオリゴヌクレオチドが産生され、成功裏のターゲティングにより機能性タンパク質の産生が阻害される。
マウスＦｃγＲＩＩＩレセプターを欠くノックアウトマウスの系統はTaconicから商業的に入手できる。これらのマウスはマウスＦｃγＲＩＩＩガンマ鎖を欠き、これがまたＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩの発現の喪失を生じる。また、機能的マウスγ鎖を欠き、従ってマウスＦｃγＲＩＩＩレセプターを欠くノックアウトマウスを、出典明示によりここに取り込む米国特許第５８７７３９６号に記載されたようにして調製することができる。
機能性マウスＦｃγＲＩＩＩα鎖を欠くマウスは同様の方法を使用して産生することができる。簡単に述べると、一実施態様では、ターゲティングベクターは、図２２Ｇに示されるようにマウスＣＤ１６α鎖のｃＤＮＡ配列を使用して調製することができる（ジェンバンク受託番号第ＮＭ０１０１８８号）。ターゲティングベクターは好ましくはコード化配列から上流の５'配列並びにコード化配列の少なくとも３００ヌクレオチドを含む。このコンストラクトはｐＭＣ１ネオ（ストラタジーン）のようなネオマイシン耐性遺伝子をコードするベクター中にクローニングすることができる。ついで、得られたベクターは、エレクトロポレーションを用いてＥＳ細胞中に導入することができる。ＥＳ細胞はネオ耐性胚性線維芽細胞支持細胞層に蒔いた後、Ｇ４１８の存在下で選択する。選択されたＥＳ細胞は胚盤胞中に注入される。マウスＣＤ１６α鎖の適切なターゲティングはＲＴ-ＰＣＲを使用して又は細胞上のマウスＣＤ１６α鎖の発現の喪失によって決定することができる。ＰＣＲプライマーはマウスＣＤ１６α鎖のｃＤＮＡ配列を使用して設計することができる。
【００３２】
内因性ＣＤ２０の喪失に対してホモ接合性のノックアウトマウスは国際公開第０２／０６２９４６号に記載されたようにして調製することができる。簡単に述べると、一実施態様では、ＣＤ２０欠損マウスを、相同組換えを使用して胚性幹（ＥＳ）細胞中におけるマウスＣＤ２０遺伝子を標的破壊することによって産生することができる。ネオマイシン耐性遺伝子を持つマウスＣＤ２０の大きなカルボキシル末端細胞質ドメイン、第四膜貫通ドメイン、第二の細胞外ループの一部をコードするエキソンを置き換えるターゲティングベクターを産生することができる。マウスＣＤ２０のヌクレオチド配列は当業者に知られている。（ジェンバンク受託番号第Ｍ６２５４１号）。一実施態様では、適切な遺伝子ターゲティングはアミノ酸位置１５７が切断され、ネオ遺伝子配列によってコードされる８８アミノ酸タンパク質と融合された異常ＣＤ２０タンパク質を産生する。
ＤＮＡ形質移入後、標的の対立遺伝子を担持するネオ耐性ＥＳ細胞クローンをサザンブロット分析法によって決定することができる。一つのＥＳ細胞クローンの細胞は育成母中に移され得る胚盤胞中に注入することができる。高度にキメラな雄の子孫（外被色によると８０−１００％）は、その変異を子孫に伝えるために、Ｃ５７ＢＬ／６(Ｂ６)雌と共に飼育することができる。ＣＤ２０遺伝子の破壊に対してホモ接合性のマウスを、ヘテロ接合性子孫を交雑することによって期待されたメネデリアン頻度で得ることができる。
ＣＤ２０の適切なターゲティングはホモ接合性子孫からのゲノムＤＮＡをＰＣＲ分析することによって更に証明することができる。ＣＤ２０−／−マウス中の野生型ＣＤ２０ｍＲＮＡの存在又は不存在はＣＤ２０−／−マウスの脾細胞から産生されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認することができる。ＣＤ２０−／−マウス中の細胞表面ＣＤ２０タンパク質の発現の欠如は、マウス抗ＣＤ２０モノクローナル抗体でＢ２２０＋脾細胞を染色することによって更に証明することができる。ＣＤ２０遺伝子の標的変異は細胞表面ＣＤ２０タンパク質の発現を抑制する。
【００３３】
非ヒト動物中への導入遺伝子の導入
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は好ましくは動物の生殖系列中に導入遺伝子を導入することにより産生される。様々な発達段階の胚性標的細胞を用いて導入遺伝子を導入することができる。胚性標的細胞の発達段階に応じて異なった方法が使用される。この発明を実施するために使用される任意の動物の特異的系統は全体的に良好な健康、良好な胚収量、胚における良好な前核可視性、及び良好な生殖適合性について選択される。トランスジェニックマウスが産生されることになる場合、Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２Ｆ１のような株、又はＦＶＢ系統がしばしば使用される（Charles River Labs, Boston, Mass., The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 又はTaconic Labsから商業的に取得した）。好適な系統は、Ｈ-２ｂ、Ｈ-２ｄ又はＨ-２ｑハプロタイプのもの、例えばＣ５７ＢＬ／６又はＤＢＡ／１である。ヒト腫瘍細胞の導入を可能にするためにヌードマウスを利用してもよい。ヌードマウスの飼育と維持はそれが感染や疾患に罹りやすいために更に難しい。この発明を実施するために使用される系統自体がトランスジェニック体であってもよく、及び／又はノックアウト体であってもよい。好ましくは、最初のノックアウト哺乳動物とトランスジェニック哺乳動物の双方の調製には同じ系統を使用する。これにより、続く飼育と戻し交雑をより効率的なものとできる。
【００３４】
胚中への導入遺伝子の導入は当該分野で知られた任意の手段、例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション又はリポフェクションによって達成することができる。例えば、導入遺伝子は、受精哺乳動物卵の前核中にコンストラクトをマイクロインジェクションすることによって発達中の哺乳動物の細胞にコンストラクトの一又は複数のコピーを保持させることができる。受精卵中への導入遺伝子コンストラクトの導入後に、変動時間量の間、卵をインビトロでインキュベートするか、又は代理宿主中に再移植するか、又は双方を実施することができる。成熟するまでのインビトロでのインキュベーションはこの発明の範囲内である。一つの一般的な方法は、種に応じて約１−７日インビトロで胚をインキュベートし、ついでそれを代理宿主中に再移植することである。
再移植は標準的な方法を使用して達成される。通常、代理宿主を麻酔し、胚を卵管中に挿入する。特定の宿主中に移植される胚の数は種によって変化するが、通常は、その種が天然に産生する子孫の数に匹敵する。
【００３５】
レトロウイルス感染もまた非ヒト動物中に導入遺伝子を導入するために使用することができる。発達中の非ヒト胚を胚盤胞期までインビトロで培養することができる。この期間中、割球がレトロウイルス感染の標的でありうる（Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264）。割球の効果的な感染は透明帯を取り除く酵素処理によって得られる（Manipulating the Mouse Embryo, Hogan編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986）。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は典型的には導入遺伝子を担持する複製欠陥性レトロウイルスである（Jahner等 (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten等 (1985) PNAS 82:6148-6152）。形質移入は、ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって簡単かつ効果的に得られる（上掲のVan der Putten; Stewart等 (1987) EMBO J. 6:383-388）。あるいは、感染は後の段階で実施することができる。ウイルス又はウイルス産生細胞を割腔中に注入することができる（Jahner等 (1982) Nature 298:623-628）。殆どのファウンダー（起源物）は、トランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにのみ取り込みが生じるので、導入遺伝子に対してモザイクである。更に、ファウンダーは子孫で一般に分離するゲノム中の異なった位置に導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入を含みうる。また、中期妊娠期間胚の子宮内レトロウイルス感染によって生殖系列中に導入遺伝子を導入することもできる（上掲のJahner等 (1982)）。
【００３６】
導入遺伝子導入のための標的細胞の第三のタイプは胚性幹細胞である。導入遺伝子はＤＮＡ形質移入によるか又はレトロウイルス媒介形質導入によってＥＳ細胞中に効率的に導入することができる。そのような形質転換ＥＳ細胞をついで非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わせることができる。その後、ＥＳ細胞は胚とコロニー形成し、得られるキメラ動物の生殖系列に寄与する。
一実施態様では、図２３に示すようにヒトＣＤ２０をコードするｃＤＮＡ又はゲノムクローンを、マイクロインジェクション又は形質移入を使用してＦＶＢマウス受精卵又はＥＳ細胞中に導入することができる。胚をインビトロで約１−７日間インキュベートした後、代理宿主に移植する。ＥＳ細胞を自然に交配した宿主動物からの胚盤胞と組み合わせ、胚盤胞を代理母中に再移植する。
他の実施態様では、図２２に示すようにヒトＣＤ１６α鎖サブタイプＡをコードするｃＤＮＡ又はゲノムクローンを、形質移入又はマイクロインジェクションを使用してＥＳ細胞又は受精胚中に導入することができる。他の実施態様では、ヒトＦｃレセプターγ鎖をコードするｃＤＮＡ又はゲノムクローンを、ヒトＣＤ１６α鎖と共にＥＳ又は受精胚中に導入することもできる。受精卵をインビトロで１−７日間インキュベートした後、代理宿主に再移植する。ＥＳ細胞を自然に交配した宿主動物からの胚盤胞と組み合わせ、胚盤胞を代理母中に再移植する。マウス細胞中でのヒトＣＤ１６α鎖（ＦｃγＦＩＩＩα鎖）の発現は、マウス及びヒトγ鎖の配列は類似しているので、マウスγ鎖の存在下で生じる。
【００３７】
本発明の一実施態様では、非ヒト宿主の内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子は、異種ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子が内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子をそれぞれ実質的に置換し、好ましくは内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子のコード化配列を完全に置換するように、異種ＣＤ２０又はＣＤ１６α鎖遺伝子の相同組込みによって機能的に破壊される。好ましくは、異種ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子は、相同組込みの結果として、異種遺伝子が内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子座から調節エレメントの転写制御下で発現されるように、内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子のそれぞれの制御配列（例えばエンハンサープロモーター）に結合する。そのような置換対立遺伝子体に対してホモ接合性である非ヒト宿主はここに記載の方法によって生産することができる。そのようなホモ接合性非ヒト宿主は一般に異種ＣＤ２０又はＣＤ１６又は双方を発現するが、内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６タンパク質を発現しない。通常、異種ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子の発現パターンは、天然に生じる（非トランスジェニック）非ヒト宿主における内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子のそれぞれの発現パターンを実質的に模倣する。
【００３８】
例えば、内因性マウスＣＤ２０遺伝子配列の代わりにヒトＣＤ２０遺伝子配列を有し、内因性マウス制御配列によって転写制御されるトランスジェニックマウスを産生させることができる。一般にヒトＣＤ２０は、天然に生じる非トランスジェニックマウスにおけるマウスＣＤ２０と同様にして発現される。
例えば、ヒトＣＤ１６α鎖配列を有し、内因性マウス制御配列によって転写制御されるトランスジェニックマウスを産生させることができる。あるいは、ヒトＣＤ１６α鎖をマウスに導入することができ、ついでマウスＣＤ１６α鎖の発現を欠くマウスと交雑させることができる。ヒトＣＤ１６α鎖の発現はマウスγ鎖の存在下で生じることが予想される。
一般に、置換タイプのターゲティングコンストラクトが相同遺伝子置換に用いられる。ターゲティングコンストラクトの内因性ＣＤ２０又はＣＤ１６α遺伝子配列間の二重クロスオーバー相同組換えにより、異種ＣＤ２０又はＣＤ１６遺伝子セグメントの標的組込みが生じる。通常、導入遺伝子の相同性標的領域は内因性ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６α遺伝子セグメントに隣接する配列を含むので、相同組換えは、それぞれ内因性ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６遺伝子セグメントの同時の欠失と異種遺伝子セグメントの相同組込みを生じせしめる。実質的に、内因性ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６遺伝子の全体を、単一ターゲティング事象によるか又は複数ターゲティング事象によって（例えば、個々のエキソンの逐次の置換）異種ＣＤ２０及び／又はＣＤ１６遺伝子で置き換えることができる。通常はポジティブ又はネガティブ選択発現カセットの形態の、一又は複数の選択マーカーをターゲティングコンストラクトに位置させることができる。通常は、選択マーカーは異種置換領域のイントロン領域に位置しているのが好ましい。
【００３９】
トランスジェニックマウスの交雑
導入遺伝子ヒトＣＤ２０を有するトランスジェニックマウスは、導入遺伝子ＣＤ１６を有しマウスＣＤ１６を欠くトランスジェニックマウスと交雑させることができる。好ましくは、トランスジェニックマウスはヒトＣＤ１６α鎖を含み、マウスＣＤ１６α鎖を欠く。調製方法は、所望のノックアウトコンストラクト又は導入遺伝子の一つをそれぞれが含む一連の哺乳動物を産生することである。そのような哺乳動物を、一連の交雑、戻し交雑及び選択を通して互いに育種し、最終的には、あらゆる所望のノックアウトコンストラクト及び／又は導入遺伝子を含む単一の哺乳動物が生産されるが、その哺乳動物はノックアウトコンストラクト及び／又は導入遺伝子が存在することを除くと野生型とその他の点でコンジェニック（遺伝的に同一）である。
典型的には、交雑及び戻し交雑は、飼育過程の各特定の工程の目標に応じて、同胞又は親系統を子孫と交配させることによって達成される。ある場合には、適切な染色体位置にノックアウトコンストラクト及び／又は導入遺伝子のそれぞれを含む単一の子孫を産生するためには、多数の子孫を産生することが必要である場合がある。また、所望の遺伝子型を最終的に得るには数世代にわたって交雑又は戻し交雑を行う必要がある場合がある。
【００４０】
相同組換えかランダム組込みによってひとたびヒト遺伝子座が宿主ゲノム中に導入され、様々なトランスジェニック又は変異動物の適切な育種によって不活化された内因性ＣＤ１６遺伝子座を持つ宿主動物が産生されたならば、内因性ＣＤ１６α鎖を産生する本来の能力を欠くがヒトＣＤ１６α鎖及び／又はＣＤ２０をつくる能力を有している宿主をつくることができる。
一実施態様では、ＣＤ１６α鎖を発現するトランスジェニックマウスをマウスＣＤ１６α鎖欠損マウスと交配させ、それによって、そのＣＤ１６ポリペプチドの欠損したマウスにおいてその特異的ヒトＣＤ１６の発現を再構成する。他の実施態様では、ついで、これらのトランスジェニックマウスを、ヒトＣＤ２０を発現するマウスと共に育種して、ヒトＣＤ１６とヒトＣＤ２０の双方を発現するが内因性ＣＤ１６はしないマウス系統をつくりだすことができる。
【００４１】
Ｄ．導入遺伝子の存在の検証
代理宿主のトランスジェニック子孫を、所望の組織、細胞又は動物中での導入遺伝子の存在及び／又は発現について任意の好適な方法によってスクリーニングすることができる。スクリーニングは、しばしばサザンブロット又はノーザンブロットによって、少なくとも導入遺伝子の一部に相補的であるプローブを用いて達成される。導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析法は、導入遺伝子産物の存在をスクリーニングする代替の又は更なる方法として用いることができる。典型的には、ＤＮＡを尾の組織から準備し、導入遺伝子についてサザン分析法又はＰＣＲによって分析する。あるいは、最も高いレベルで導入遺伝子を発現すると思われている組織又は細胞が、サザン分析法又はＰＣＲを用いて導入遺伝子の存在及び発現について試験されるが、任意の組織又は細胞型をこの分析に使用することができる。
導入遺伝子の存在を評価するための別の又は更なる方法は、限定するものではないが、好適な生化学アッセイ、例えば酵素及び／又は免疫学的アッセイ、特定のマーカー又は酵素活性に対する組織学的染色、フローサイトメトリー分析等々を含む。血液の分析はまた血液中の導入遺伝子産物の存在を検出し、また様々なタイプの血液細胞及び他の血液成分のレベルに対する導入遺伝子の効果を評価するのに有用でありうる。一実施態様では、ヒトＣＤ２０又はＣＤ１６又はその双方の発現は、ヒトＣＤ２０又はＣＤ１６又は双方に対する検出可能に標識された抗体を使用し、ＦＡＣＳを用いて標識細胞を分析することにより、脾臓、骨髄、末梢血、リンパ節、及びパイエル板からの免疫細胞において検出することができる。
本発明のトランスジェニックマウスにおける発現パターンの検査により、ヒトＢ系統細胞に見出される正常なヒトＣＤ２０発現のミラーリングが明らかになる。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び好中球のものを含む細胞割合及び表現型特性について検査した他の免疫学的パラメータは、トランスジェニックネガティブ及びポジティブ同腹仔間の類似性を明らかにした。ＣＤ２０Ｔｇ＋／ＣＤ１６Ｔｇ＋における発現パターンの検査はヒトＣＤ２０及びＣＤ１６マーカー双方の発現を示す。
【００４２】
Ｅ．トランスジェニック動物の用途
本発明のトランスジェニック動物は、ヒトにおけるＣＤ１６及び／又はＣＤ２０の発現及び機能のモデルを表す。従って、これらの動物はその機能と関連する事象の背後にある機構を研究し、癌や自己免疫症状を含むＣＤ２０関連ヒト疾患を治療し診断するのに有用な生成物（例えば抗体、二重特異性体、多重特異性体等々）を産生し試験するのに有用である。
好適な実施態様では、遺伝子組換え的に発現されるヒトＣＤ２０及び／又はＣＤ１６はヒト細胞において示されるものと同様の機能特性を保持している。例えば、ヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球は、抗ヒトＣＤ２０抗体によって、またヒトにおけるようにして認識され、ヒトＣＤ２０抗体の投与に応答してトランスジェニック動物から同様にして枯渇される。実施例において更に詳細に記載されるように、本発明のトランスジェニックマウスのＢリンパ球はリツキサンのような抗ヒトＣＤ２０抗体での治療に応答して枯渇される。一実施態様では、ヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスは、抗ヒトＣＤ２０抗体が発現細胞に結合して細胞の死滅に影響を及ぼすのに十分なレベルでの細胞上でのヒトＣＤ２０の発現によって特徴付けられ、少なくとも約７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、更には１００％の末梢及び／又は循環Ｂ細胞のＢ細胞枯渇を生じる。また、ヒトＣＤ２０はヒトＣＤ２０のものと同じタイプのＢ細胞に見出される。ヒトＣＤ１６を発現する細胞はまた抗ヒトＣＤ１６抗体によっても認識される。
【００４３】
トランスジェニックＣＤ１６動物は好ましくは少なくとも一のＦｃレセプター媒介エフェクター細胞機能又は応答を媒介可能である。「Ｆｃレセプター媒介エフェクター細胞機能」という用語はエフェクター細胞上のＦｃレセプターへの例えばＩｇＧのような免疫グロブリンの結合によって惹起されるあらゆるエフェクター機能を含むことが意図される。例えば、遺伝子組換え的に発現されるヒトＣＤ１６を担持する細胞への例えばＩｇＧのような免疫グロブリンの結合は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、ＮＫ細胞媒介応答及びリゾチーム産生のような様々なエフェクター機能を誘導し得る。
従って、一実施態様では、本発明のトランスジェニック動物は、例えばヒトＣＤ２０、ＣＤ１６又は双方の領域のような標的エピトープへの結合について、例えば抗体、多重又は二重特異的分子、イムノアドヘシンのような薬剤を（例えばヒトの安全性と効果について）試験するために使用される。他の薬剤は、Ｆｃ領域を伴うか伴わない抗体の抗原結合断片、単鎖抗体、ミニボディ(minibodies)(重鎖のみの抗体)、多量体抗ヒトＣＤ２０及び／又は抗ヒトＣＤ１６抗原結合領域の一つを伴うヘテロ多量体イムノアドヘシンを含み得る。他の薬剤は、ＣＤ２０に結合するがＣＤ２０を活性化しないＣＤ２０のリガンド変異体を含みうるＣＤ２０-Ｂ細胞枯渇を阻害するかこれを生じる小分子を含みうる。例えば、悪性Ｂ細胞のようなＣＤ２０発現細胞を枯渇させるそのような薬剤の効果は、試験薬剤の投与の前後でのトランスジェニック動物中のＢリンパ球レベルを測定することによって決定することができる。
【００４４】
従って、本発明は、ヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニック動物に薬剤を投与し、Ｂリンパ球の数の減少があるかどうかを決定することにより、Ｂ細胞リンパ腫を治療可能な薬剤、並びにヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球を枯渇又は死滅させることができる薬剤を同定する方法を提供する。ここで使用する場合、「Ｂ細胞枯渇」とは、薬剤又は抗体での治療後のかかる治療前のレベルと比較した動物又はヒトにおけるＢ細胞レベルの減少を意味する。Ｂ細胞レベルはここに記載されるよく知られたアッセイ法を使用して測定することができる。Ｂ細胞枯渇は部分的か又は完全でありうる。好ましくは、薬剤によって誘導されるＢ細胞枯渇のレベルは、疾患又は障害の徴候の低減又は軽減と相関する量である。推定薬剤の効果（つまり、ＣＤ２０を発現するＢリンパ球を枯渇させるその能力）は、ＣＤ２０を発現するトランスジェニック動物における循環Ｂリンパ球のベースラインレベルを測定し、同動物における投与後のレベルと比較することによって評価することができる。Ｂ細胞枯渇の効果の比較を、抗ヒトＣＤ２０抗体（例えばリツキサン）のような既知の治療剤に対して行って、ＣＤ２０関連症状の治療のための推定薬剤の効果を測定することができる。あるいは、Ｂリンパ球のベースラインレベルを、ヒトＣＤ２０を発現する第一のトランスジェニック動物の様々な組織（例えば、脾臓、骨髄、末梢血、リンパ節、パイエル板）において測定することができる。ついで、推定薬剤を、ヒトＣＤ２０を発現する第二のトランスジェニック動物に投与することができる。ついで、その動物を屠殺し、Ｂリンパ球のレベルを分析する。ヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニック動物におけるＢリンパ球数の減少が、Ｂ細胞リンパ腫に関連する癌細胞を減少させ、及び／又はヒト患者におけるＢ細胞リンパ腫を治療する点における薬剤の効果の指標である。併用療法もまた所望の細胞型を枯渇させる効果を決定するために試験することができる。例えば、抗ヒトＣＤ２０抗体をＢｒ３-Ｆｃのような他の薬剤と組み合わせて、抗ヒトＣＤ２０による死滅に耐性があるかも知れない任意のＣＤ２０担持Ｂ細胞の枯渇を生じさせることができる。
【００４５】
Ｂリンパ球の回復は、一連のトランスジェニック動物において経時的に細胞レベルを測定することによってまた評価することができる。ヒトＣＤ２０に対する薬剤の特異性は、野生型マウス（ＣＤ２０マーカーを発現しない）に対する効果とヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニックマウスに対する薬剤の効果を比較することによって評価することができる。薬剤の効果はまた非特定的Ａｂ又は他のコントロール剤のようなプラシーボ又はコントロール物質の効果と比較することもできる。好ましくは、薬剤は、ヒトＣＤ２０を有する細胞の殆ど又は全てを標的とするが、Ｔ非依存性免疫反応を刺激する抗原に対して免疫応答性をもたらす細胞に影響を及ぼさない。
また、上記動物は、そのような薬剤の投与時におけるトランスジェニック動物においての免疫反応の開始が、薬剤がヒトにおいても同じ効果を示すことの指標であるので、ヒトにおいて潜在的な免疫反応を評価するための有用なモデルである。そのようなトランスジェニック動物における免疫反応に対する効果は例えばサイトカインレベルの変化、抗体の産生又はＴ細胞応答によって検出することができる。また、トランスジェニック動物は多重又は二重特異的分子の投与の前に標的細胞（例えば腫瘍、ウイルス）を含むように操作することができる。
【００４６】
よって、本発明は、ＡＤＣＣ又はＮＫ細胞媒介免疫反応のようなエフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤を同定する方法を提供する。特に、本発明は、Ｆｃ媒介エフェクター細胞応答、特にＦｃγＩＩＩ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤を同定する方法を提供する。そのような応答を誘導可能な推定薬剤は、例えばサイトカインレベルを分析することによって評価することができる。例えば、推定薬剤の効果は、ヒトＣＤ１６を発現する第一のトランスジェニック動物においてＦｃγＩＩＩ媒介エフェクター細胞応答に関連した一又は複数のサイトカインのベースラインレベルを測定し、動物における投与後のレベルと比較することによって評価することができる。あるいは、比較は、薬剤が投与されたヒトＣＤ１６を発現する第一のトランスジェニック動物と何れの薬剤も投与されていないか又はプラシーボ又はコントロール物質が投与された第二のトランスジェニック動物との間でなされる。薬剤の特異性は、ヒトＣＤ１６を発現するトランスジェニック動物に対する薬剤の効果は、内因性ＣＤ１６遺伝子を破壊した（つまり、ＣＤ１６ノックアウト）トランスジェニック動物に対する効果及び／又は野生型動物（つまり、機能的内因性ＣＤ１６を有する）と比較することによって評価することができる。ヒトＣＤ１６を発現するトランスジェニック動物におけるヒトＦｃγＩＩＩ媒介エフェクター細胞応答に関連するサイトカインレベルの増加は、ヒトの患者においてそのような応答を誘導する薬剤の効果を示している。
【００４７】
本発明の一側面は、ヒトＣＤ２０及びヒトＣＤ２０／ＣＤ１６トランスジェニック動物のそれぞれに推定薬剤を投与し、例えばヒトＣＤ２０のＢ細胞の死滅又は枯渇についての薬剤の効果を比較することを含む。一実施態様は、ヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球に対してＦｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能な薬剤を同定する方法であって、ＣＤ２０トランスジェニック動物に薬剤を投与し；ＣＤ２０トランスジェニック動物におけるヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し；Ｂリンパ球のレベルの減少割合（パーセント）を定量し；ＣＤ２０＋／ＣＤ１６＋トランスジェニック動物に薬剤を投与し；ＣＤ２０＋／ＣＤ１６＋トランスジェニック動物におけるヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球のレベルを測定し；ＣＤ２０＋／ＣＤ１６＋トランスジェニック動物におけるＢリンパ球のレベルの減少割合（パーセント）を定量することを含み、ＣＤ２０＋／ＣＤ１６＋トランスジェニック動物におけるＢリンパ球のレベルの減少割合がＣＤ２０動物において定量した減少割合より多いならば、その薬剤はヒトＣＤ２０を発現するＢリンパ球に対してＦｃ媒介エフェクター細胞応答を誘導可能であるものとして同定される方法である。
トランスジェニック動物への抗ＣＤ１６及び／又は抗ＣＤ２０抗体又は二重又は多重特異的分子の投与後に抗体結合を検出するために、任意の好適なアッセイを使用することができる。例えば、動物の血液の試料を採取して、当該分野で既知のスクリーニング方法、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はウェスタンブロットアッセイを使用して抗ＣＤ抗体-ＣＤ複合体の存在をアッセイすることができる。これらのアッセイの各々は一般に対象の複合体に特異的な標識試薬（例えば抗体）を用いることによって特定の対象のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。従って、本発明では、これらのアッセイを用いて、動物の血清中に含まれる免疫グロブリン（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ等）と動物の特定の細胞の表面に含まれるヒトＣＤマーカーの間で形成されるＣＤ-抗体複合体を検出する。
【００４８】
ＣＤマーカー-抗体複合体は、例えば抗体-ＣＤマーカー複合体を認識しそれに特異的に結合する酵素結合抗体又は抗体断片を使用して検出することができる。あるいは、複合体は、様々な他の免疫アッセイ法の任意のものを使用して検出することができる。例えば、抗体は放射標識することができ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に使用することができる。放射性同位元素はガンマカウンター又はシンチレーションカウンターの使用のような手段又はオートラジオグラフィーによって検出することができる。
トランスジェニック動物への抗体又は二重又は多重特異的分子又は他の薬剤の投与後に免疫反応を検出するために、動物の血漿又は血清中の例えばサイトカイン、抗体又はＴ細胞集団の濃度変化を測定する任意の好適な手順を使用することができる。例えば、インビボでのサイトカイン濃度の変化は様々なイムノアッセイ法、例えば酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイを経由して検出することができる。アッセイすることができる例示的なサイトカインには、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）、インターロイキン１−１２（ＩＬ-１からＩＬ-１２）が含まれる。
【００４９】
例えば、血漿を、抗体、二重特異的又は多重特異的分子又は他の薬剤が投与されたトランスジェニック動物から得ることができる。サイトカインの濃度は、抗体とのサイトカインの相互作用を検出することによってＥＩＡを使用して測定することができ、その抗体が続いて酵素に結合される。酵素の活性は、例えば分光光度定量、蛍光定量又は可視手段によって検出することができる化学部分をつくり出すような、適切な基質、好ましくは色素生産性基質との反応によって検出される（Voller, "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller等, J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio編 Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa等編 Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981）。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、限定するものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-５-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ-グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンステアラーゼが含まれる。検出は酵素の色素生産性基質を用いる比色分析法によって達成することができる。検出はまたＲＩＡを使用して又は同様にして調製した標準と比較した基質の酵素反応の度合いの可視による比較によっても達成することができる。
【００５０】
抗サイトカイン抗体又は抗ＣＤ２０剤を蛍光化合物で標識することもまたできる。蛍光的に標識された抗体が適切な波長の光に暴露されると、その存在を検出することができる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物としてはフルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ-フタルアルデヒド及びフルオレサミンがある。抗体はまた１５２Ｅｕのような蛍光発光金属、又はランタニド系の他のものを使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して抗体に結合させることができる。抗体はまた化学発光化合物にそれを結合させることにより検出可能に標識することができる。ついで、化学発光タグ抗体の存在は化学反応の過程中に生じる発光を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、サーロマティック(theromatic)アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。同様に、生物発光化合物は抗体を標識するために使用することができる。生物発光は生物学的系に見出される化学発光の一タイプであり、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することによって決定される。標識のために重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【００５１】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は更にヒトに投与される特定の薬剤の安全性の指標を提供し得る。例えば、ヒト化抗体又は他の薬剤をトランスジェニック動物に投与することができ、動物への薬剤の投与の結果としてのあらゆる毒性又は有害作用を、インビボでのヒトへの使用のための薬剤又はヒト化抗体の安全性と耐容性の指標としてモニターすることができる。短期間ベースで生じうる有害事象には、頭痛、感染、発熱、悪寒、痛み、吐き気、無気力、咽頭炎、下痢、鼻炎、注入反応、及び筋肉痛が含まれる。短期の有害事象は治療後何日間かしばらく測定される。長期の有害事象には、ある細胞型の細胞傷害性、血小板減少による出血事象、免疫及び／又はアレルギー反応によるメディエータの放出、免疫系の阻害及び／又は抗治療剤抗体の発生、終末器官毒性、及び感染又は悪性腫瘍の発生増加が含まれる。長期の有害事象は治療後何ヶ月間も測定される。
本発明の他の側面は、抗ＣＤ２０薬剤の効果を決定する方法を含む。効果は、ある範囲の用量の薬剤を、ヒトＣＤ２０及び／又はヒトＣＤ１６α鎖を有するトランスジェニック動物群に投与し、ヒトＣＤ２０を有する細胞の減少を生じせしめる薬剤の少なくとも一の用量を決定することによって、決定することができる。
【００５２】
細胞、組織又はそれらから誘導される他の材料を含む本発明のトランスジェニック動物は疾患、特にＣＤ２０担持細胞に関連し又はそれに媒介される疾患のモデルとして利用することができる。限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ミニブタ、ヤギ及び非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サル及びチンパンジーを含む任意の種の動物を用いて疾患動物モデルを産生することができる。これらの系は様々な用途に使用することができる。そのようなアッセイは、例えば疾患の徴候を軽減することができる化合物のような薬剤を同定するために設計されるスクリーニング方策の一部として利用することができる。よって、動物及び細胞ベースのモデルを用いて、薬剤、医薬、疾患の治療に効果的でありうる治療法及び介入を同定することができる。
細胞ベース系は疾患の徴候を軽減するように作用する可能性のある化合物を同定するために使用することができる。例えば、そのような細胞系は疾患の徴候を軽減する能力を示すと思われる化合物に、暴露された細胞に疾患徴候のそのような軽減を誘発するのに十分な濃度で十分な時間の間、暴露することができる。暴露後に、細胞を検査して、疾患細胞表現型の一又は複数が改変されて、より正常な又はより野生型の非疾患表現型に似ているかどうかを決定する。
他の用途は当業者には直ぐに明らかであろう。
以下の非限定的実施例は本発明を例示するものである。ここで引用した全ての文献を出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【００５３】
実施例１
この実施例はヒトＣＤ２０ＢＡＣトランスジェニック（Ｔｇ＋）マウスの産生とｈＣＤ２０＋マウスにおける抗ヒトＣＤ２０抗体処置の効果の研究を記載する。
ヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスを、インビトロゲンのヒトＣＤ２０ＣＩＴＢヒトＢＡＣ-Ｄ-クローン番号１１７Ｈ１９（Invitrogen, Carlsbad, CA）を使用して産生した。ヒトＣＤ２０をコードするＤＮＡをヒトリンパ球から単離し、インビトロゲンに送った。インビトロゲンは、ヒトＢＡＣライブラリーからのクローンを用いてフィルターに対してＤＮＡを試験し、クローン１１７Ｈ１９を同定した。ヒトＣＤ２０を発現するトランスジェニックマウスを産生する過去の試みは、おそらくは部分的には導入遺伝子コンストラクト中に十分な転写制御領域を含ませるのに失敗したために成功しなかった。トランスジェニックマウスは、クローン１１７Ｈ１９で調製したヒトＣＤ２０ＢＡＣコンストラクトをマウスのＦＶＢ近交系の受精卵中に微量注入することにより産生した。受精卵は１−７日間インキュベートした後、代理マウス中に移植した。マウスをヒトＣＤ２０発現のＦＡＣＳ分析に基づいてスクリーニングした。図１のＦＡＣＳプロットから分かるように、導入遺伝子に対してヘテロ接合性（Ｔｇ＋／−）及びホモ接合性（Ｔｇ＋／＋）のマウスがそのＢ２２０＋Ｂ細胞上にヒトＣＤ２０を発現する。マウスＣＤ２０遺伝子は意図的に破壊しなかった。
図２はＢ細胞分化及び成熟化の間における様々な細胞表面マーカー（ＣＤ４３、ＩｇＭ、ＩｇＤ）の発現の概略図を提供する。Ｔｇ＋マウスでは、ｈＣＤ２０はプレＢ、未熟Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞に発現される。ヒトＣＤ２０はヒトのものと同じ細胞型に見出され、ヒトＢ細胞上のように僅かに低いレベルに匹敵するレベルでこれらの細胞型に発現される。
【００５４】
Ｔｇ＋マウスを、ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）に結合した抗ヒトＣＤ２０抗体を使用して骨髄、脾臓、腸間膜ＬＮ及びパイエル板のＢ細胞におけるヒトＣＤ２０発現についてスクリーニングした（結果は図３−６に示す）。Ｂ２２０及びＣＤ４３、ＣＤ２１又はＣＤ３８について細胞をゲーティングすることにより、異なった組織由来のＢ細胞の様々な集団中への描写が可能になる。ゲーティングでは、ＰｅｒＣＰ（BD Biosciences）に結合した抗Ｂ２２０Ａｂ及び抗ＣＤ４３Ａｂ、抗ＣＤ２１Ａｂ又はＰＥ（蛍光, Becton Dickinson）に結合した抗ＣＤ３８Ａｂで細胞を染色した。
トランスジェニックマウスの末梢血細胞上でのヒトＣＤ２０の発現レベルを、ＦＡＣＳ分析を使用し平均蛍光強度を計算してヒト末梢血細胞上のヒトＣＤ２０のものと比較した。末梢血細胞をヒトドナー及びｈＣＤ２０Ｔｇ＋マウスから得て、標識抗ヒトＣＤ２０抗体（ｍＨ２７）で染色した。細胞をＦＡＣＳによって分析し、ヒトＣＤ１９＋及びＢ２２０＋集団についてゲーティングした。図２８は、ヒト末梢血細胞上でのＣＤ２０の発現と比較した場合のヒトＣＤ２０トランスジェニックマウス由来の末梢血細胞上のヒトＣＤ２０発現の発現レベルの代表的な比較を示す。グラフ上の数は平均蛍光強度を表す。結果は、トランスジェニック細胞上のヒトＣＤ２０はヒト細胞上にヒトＣＤ２０の約４０％のレベルで発現されたことを示している。
これらの結果は、トランスジェニックマウスの多くの異なった組織から得たＢ細胞がヒトＣＤ２０マーカーを発現することを示している。ヒトＣＤ２０マーカーは成熟Ｂ細胞に優勢に見出されるが、ヒトに観察されるプロファイルと同様にプレＢ及び未熟Ｂ細胞にもまた見出すことができる。
【００５５】
ついで、トランスジェニックマウスを、抗体処置がＢ細胞枯渇を生じるかどうかを決定するために抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂ ｍ２Ｈ７で処置した。抗体ｍ２Ｈ７はＢＤ PharMingen（San Diego, CA）、eBioscience、又はCalbiochemから得ることができる。ｍ２Ｈ７の抗ヒトＣＤ２０活性を、インビトロアッセイでリツキサンの活性と比較したが、匹敵する活性を有していた。リツキサンのようなヒト化抗体は、ヒト化抗体への免疫反応が問題とはならない十分に短い時間にわたってインビボでの細胞死滅が生じるので細胞死滅研究においても利用することができる。
抗体ｍ２Ｈ７を、図７に概略図によって概説しているように、７０ｋｇのヒトの場合の３．５ｍｇに等価な全１ｍｇの用量でトランスジェニックマウスに投与した。ＦＡＣＳ分析を、矢印で示した日に、末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄及びパイエル板について実施した。抗ＣＤ２０ｍＡｂの血清レベルをモニターした。
抗ＣＤ２０ｍＡｂ（ｍ２Ｈ７）だけでＴｇ＋マウスを処置した場合、末梢血、成熟末梢リンパ節Ｂ細胞、脾臓中のＴ２及び卵胞Ｂ細胞の枯渇を生じた（図８−１１を参照）。しかしながら、ある種のＢ細胞サブセットは、細胞表面上での抗体の非常に高いおそらくは飽和レベルにも拘わらず、抗ＣＤ２０抗体による死滅に耐性があることもまた観察された。これらの耐性Ｂ細胞は脾臓中の周辺帯Ｂ細胞（図１０）、及びパイエル板（図１２）及び脾臓（図１４）の双方の胚中心Ｂ細胞である。図１４では、マウスに、１日目に１００ｕｇの抗ＣＤ２０ｍＡｂの第一の用量と、続く３日目の第二の１００ｕｇ用量を注射した（５０ｕｇの単一用量がＢ細胞を飽和させるのに十分であったようである）。Ｔ２／卵胞Ｂ細胞は枯渇したが、パイエル板からの胚中心Ｂ細胞は抗ＣＤ２０ｍＡｂに結合することが示されたが死滅化に耐性があった。
【００５６】
抗ヒトＣＤ２０抗体での処置に続くＢ細胞の回復を研究した。抗体を１日目にマウスに投与した。図１３は、抗体処置の６日後に、末梢血中のＢ細胞は検出できなかったことを示している。６週目には、抗体の除去時に、ｈＣＤ２０＋細胞が検出され始め、１４週には、Ｂ細胞は正常なレベルまで回復したように見えた。回復はＣＤ２０を発現しないプレカーサーＢ細胞から生じ、それはついでヒトＣＤ２０＋の成熟Ｂ細胞になる。
図１４は脾臓胚中心Ｂ細胞の短期（単一注射）抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置に対する耐性を証明するＦＡＣＳプロットを示す。マウスは免疫しないか、又は脾臓に胚中心を誘導するために１日目に腹腔内注射によってヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を用いて免疫した。胚中心は７日で現れる。８日には、一群のマウスをｍ２Ｈ７で処置した。マウスのコントロール群はｍＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体で処置した。マウスの脾臓細胞を１２日目に分析した。胚中心を染色するＰＮＡ（ピーナッツアグルチニン）を利用した。ＳＲＢＣで免疫しなかったマウスの脾臓には検出可能な胚中心細胞は見られなかったが、免疫したマウスの脾臓は０．３％ＰＮＡ染色細胞を示す。Ｔ２／卵胞Ｂ細胞は抗ＣＤ２０抗体処置で枯渇するが、脾臓中の周辺帯Ｂ細胞は抗体に耐性がある。
ついで、Ｂ細胞枯渇時にマウスがＴ非依存性免疫反応を生じ得るかどうかを決定した。マウスを、０日目にｍ２Ｈ７又はアイソタイプコントロール抗体ｍＩｇＧ２ａで処置した。３−７日目に、Ｂ細胞枯渇が生じた。７日目に、マウスに肺炎連鎖球菌ＩＶを静脈内注射して多糖に対する応答を誘導した。Ｔ細胞非依存性応答に１１日目に達した。図１５に示す結果は、抗ヒトＣＤ２０での処置は周辺帯及びＢ１細胞からのＢ細胞応答に影響を及ぼさないこと、すなわち非枯渇ＭＺ及びＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性抗原に対する保護を付与することを実証している。このデータは、体液性免疫の幾つかの観点、特にＴ非依存性Ｂ細胞応答（この場合）が抗ＣＤ２０ｍＡｂでの処置にも拘わらず保存されることを実証している。
【００５７】
まとめると、ヒトＣＤ２０トランスジェニック動物は血液、骨髄、脾臓、リンパ節及びパイエル板の成熟、プレＢ及び未熟Ｂ細胞上にヒトＣＤ２０を発現した。ヒトＣＤ２０はヒト細胞上に発現されるＣＤ２０のものの約４０％のレベルでトランスジェニック細胞上に発現した。抗ヒトＣＤ２０抗体でのマウスの処置により、脾臓中の周辺帯Ｂ細胞（図１０）及びパイエル板（図１２）及び脾臓（図１４）の双方の胚中心Ｂ細胞を除いて、処置から３−４日以内にＢ細胞の有意な枯渇が生じた。如何なる理論に縛られるものではないが、Ｂ細胞死はＡＤＣＣ、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）又はアポトーシス又はこれら３種の組み合わせによって媒介されるように思われる。Ｔ非依存性抗原に対する応答は、ヒト抗ヒトＣＤ２０抗体による枯渇に対する脾臓周辺帯Ｂ細胞の耐性に一致している抗ヒトＣＤ２０処置マウスに観察された。抗ヒトＣＤ２０抗体での死滅化に耐性のあるＢ細胞はＴ非依存性免疫応答の保持及び／又は併用療法が所望される場合Ｂ細胞の全てを枯渇させるのに必要とされるうるという証拠を提供する。ヒトＣＤ２０を発現するＢ細胞の回復は、最もありそうなことにはプレカーサーＢ細胞の成熟化により、抗ヒトＣＤ２０抗体での処置後１４週までに観察された。これらの結果はリツキサンで処置されたヒトに見られるものと同様である。
【００５８】
実施例２
この実施例はＢ細胞調節／枯渇のための抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置とＢＲ３アンタゴニスト処置の相乗効果を実証する。ＢＲ３-Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１、この場合は免疫グロブリン配列の定常ドメインに融合したヒトＢＲ３の細胞外ドメインを有するイムノアドヘシンである。
発現するヒトＣＤ２０トランスジェニックマウス（ｈＣＤ２０＋マウスと命名）を、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（９日目に１００マイクログラムの単一注射）、ＢＲ３-Ｆｃ（１日目から１２日目まで一日おきに１００マイクログラム）、又は抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＢＲ３-Ｆｃの組み合わせの腹腔内投与注射で処置した。各群は４匹のマウスからなる。最後の注射の２日後に、マウスを屠殺し、ｈＣＤ２０＋Ｂ細胞について分析した。脾臓、血液、リンパ節及びパイエル板のＦＡＣＳ分析をＢ細胞マーカーについて分析した（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）。
結果は、抗ＣＤ２０ｍＡｂ療法が血液及びリンパ節中の成熟循環Ｂ細胞の＞９９％を枯渇させ、ＢＲ３-Ｆｃ処置が血液及びリンパ節中の成熟循環Ｂ細胞を減少させた（図１６）ことを示している。抗ＣＤ２０ｍＡｂ療法はＴ２及び卵胞Ｂ細胞を枯渇させたが、脾臓中の周辺帯Ｂ細胞は枯渇させず、またＢＲ３-Ｆｃ処置は脾臓中のＴ２／卵胞及び周辺帯Ｂ細胞を減少させた。
【００５９】
抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３-Ｆｃの組み合わせは相乗的に脾臓中のＢ細胞の全集団を枯渇させた。抗ＣＤ２０ｍＡｂの枯渇は殆どの周辺帯及び幾らかの卵胞／Ｔ２脾臓Ｂ細胞を残し、またＢＲ３-Ｆｃ枯渇は主として周辺帯及び幾らかの卵胞／Ｔ２Ｂ細胞で生じた（図１６）。よって、両方の試薬の併用は脾臓中のＢ系統細胞を完全に枯渇させる。ＢＲ３-Ｆｃも２Ｈ７もその２つの組み合わせも何れもパイエル板中の胚中心Ｂ細胞には効果がなかった（図１７）。形質細胞は抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置によって有意な影響を受けなかったが（図１８）、これは、免疫応答性のある種の側面が抗ＣＤ２０抗体で処置したマウスで維持されたことを示している。
これらの結果は、殆どのＢ細胞を枯渇させるために併用療法が有効であることを示している。ヒトと同様に、トランスジェニックマウスの幾らかのＢ細胞は抗ＣＤ２０抗体での死滅化に耐性がある。併用療法は抗ＣＤ２０抗体に耐性のある脾臓中のＢ細胞の枯渇をもたらす。これは、トランスジェニックマウスが、抗ＣＤ２０耐性細胞又は非常に攻撃的な腫瘍を有する状況下で更に有効でありうる薬剤の組み合わせを同定するのにもまた有用であることを示している。
【００６０】
実施例３
この実験では、ナチュラルキラー細胞が抗ＣＤ２０ｍＡｂ媒介Ｂ細胞枯渇に所定の役割を果たすことが証明された。
ＰＫ-１３６ｍＡｂ（マウスＮＫ１.１に対して特異的）を作るハイブリドーマクローンをＡＴＣＣから得た。４群のヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスに、コントロールｍＡｂ、ＰＫ-１３６、抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＰＫ-１３６／抗ＣＤ２０の組み合わせをそれぞれ腹腔内(ｉｐ)注射した。腹腔内投与の用量は次の通りであった：
コントロールｍＡｂ：  ２００ｕｇ／ｉｐ、３ｉｐ／週、１週間
ＰＫ-１３６：         ２００ｕｇ／ｉｐ、３ｉｐ／週、１週間
抗ＣＤ２０ｍＡｂ：    １０ｕｇ／ｉｐ、単一用量
末梢血、リンパ節及び脾臓からのリンパ球を、抗ＣＤ２０ｍＡｂ腹腔内投与３日後に分析した。データはｎ＝８で平均＋／−標準誤差として表される。
結果は、ＰＫ-１３６での処置により、検査された組織（肝臓、脾臓及び血液）の中でＮＫ細胞集団のおよそ８０％から９０％の減少が生じたことを示している（図１９）。ＮＫ細胞の大部分がない場合、２Ｈ７媒介Ｂ細胞の枯渇は効果が低かった（図２０）。よって、ＮＫ細胞は抗ＣＤ２０ｍＡｂ媒介Ｂ細胞枯渇に所定の役割を担っている。
【００６１】
実施例４
ヒトＣＤ２０／ＣＤ１６を発現するトランスジェニック動物を産生させ、ヒトマーカーの発現について評価した。
ヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスは実施例１に記載しているようにヒトＣＤ２０ＢＡＣ ＤＮＡ（Invitrogen, Carlsbad, CA）から産生させた。マウスはヒトＣＤ２０の発現のＦＡＣＳ分析に基づいてスクリーニングした。ヒトＣＤ１６α鎖サブタイプＡのヒト導入遺伝子を持ちマウスＣＤ１６α鎖を欠くヌードマウスをＲａｖｅｔｃｈ博士（ロックフェラー大学）から得た。ついで、これらのマウスを、Ｃ５７Ｂ１６、ＦＶＢ、及び１２９マウスと引き続いて交配して、ＣＤ１６α鎖をコードするヒト導入遺伝子に対してポジティブで、１２９／ヌード／ＦＶＢ／Ｂ６バックグラウンドにマウスＣＤ１６α鎖を欠いたマウスを得た。ついで、ヒトＣＤ２０を有するＦＶＢマウスを、ヒトＣＤ１６α鎖を有しマウスＣＤ１６α鎖を欠く１２９／ヌード／ＦＶＢ／Ｂ６マウスと交配した。
ｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−マウスにおけるヒトマーカーの発現を、末梢血細胞から白血球を単離し、それを標識抗ヒトＣＤ２０抗体（ｍ２Ｈ７）、抗Ｂ２２０抗体（BD PharMingenから取得）、及び抗ヒトＣＤ１６抗体（BD PharMingenから取得）で染色することによって評価した。染色された細胞集団の分析をＦＡＣＳを使用して実施した。ｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−を、ＣＤ２０Ｔｇ−／Ｃｄ１６Ｔｇ−（コントロールマウス）、ＣＤ２０Ｔｇ＋／ＣＤ１６Ｔｇ−、ＣＤ２０Ｔｇ−／ＣＤ１６Ｔｇ＋マウスと比較した。結果を図２１に示す。
【００６２】
この結果は、ＣＤ２０Ｔｇ＋／ＣＤ１６Ｔｇ−マウスがヒトＣＤ２０を発現する細胞を有しており、これらの細胞は抗Ｂ２２０抗体とのその反応性に基づいてＢ細胞であったことを示している。ＣＤ２０Ｔｇ−／ＣＤ１６Ｔｇ＋マウスは、抗ヒトＣＤ１６での染色に基づいてヒトＣＤ１６を発現したが、これらの細胞は抗Ｂ２２０抗体と反応性ではなかったためにＢ細胞ではなかった細胞を有していた。ｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−は、異なった細胞集団であると思われたＣＤ２０及びＣＤ１６双方にポジティブな細胞を有していた。この結果は、ＣＤ２０Ｔｇ＋／ＣＤ１６Ｔｇ＋マウスが成功裏に産生されたことを裏付けている。これらの結果は、また、ヒトＣＤ２０がＢ細胞に見出され、ヒトＣＤ１６が主にナチュラルキラー細胞、マクロファージ及び顆粒球に発現されるという知見と一致している。
ヒトＣＤ１６導入遺伝子を発現する細胞を分析してどの細胞型が導入遺伝子を発現したかを決定した。末梢血細胞をｈｕＣＤ２０Ｔｇ＋ｈｕＣＤ１６Ｔｇ＋ｍＣＤ１６−／−トランスジェニックマウスから得て、ＰＥ（BD Pharmingen）で標識した抗ヒトＣＤ１６抗体で染色し、マクロファージを検出するためにＡＰＣに結合した抗Ｆ４／８０抗体で、又はナチュラルキラー細胞を検出するために抗ＤＸ５＋抗体でゲーティングした。結果を図２４に示す。この結果は、ｈｕＣＤ１６＋導入遺伝子を発現する細胞がナチュラルキラー細胞及びマクロファージであることを示している。
【００６３】
マウスＣＤ１６α鎖を欠くマウスの細胞を分析して、マウスＣＤ１６α鎖が細胞上に存在しないかどうかを決定した。マウスＣＤ１６α鎖を欠くマウス及び野生型マウスからの末梢血細胞を抗マウスＣＤ１６抗体で染色してＦＡＣＳによって分析した。血液細胞を抗ｍａｃ-１での染色によってマクロファージについてゲーティングした。結果を図２６に示す。この結果は、ＣＤ１６α鎖を欠くマウスからの細胞上にその遺伝子のノックアウトのために検出可能なマウスＣＤ１６α鎖はなかったことを示している。
マウスＣＤ１６α鎖を欠くマウスからの細胞を分析して、他のＦｃレセプターが発現されたかどうかを決定した。その細胞についてマウスＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の有無を分析した。マウスＣＤ１６α鎖を欠くマウス及び野生型マウスからの末梢血細胞を抗マウスＣＤ６４モノクローナル抗体（ジェネンテックにより調製）で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。血液細胞を抗ｍａｃ-１での染色によってマクロファージについてゲーティングした。結果を図２７に示す。影を付けた部分はアイソタイプコントロールである。この結果は、ＣＤ１６α鎖を欠くマウスからのマクロファージ上にその遺伝子のノックアウトのためにＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）の発現があったことを示している。染色における弱いシフトは抗体の低親和性のためでありうる。これらの結果は、マウスＣＤ１６α鎖−／−ノックアウトマウスが他のマウスＦｃレセプターとマウスγ鎖ホモ二量体を発現したことを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、導入遺伝子のないマウス（Ｔｇ−）、導入遺伝子についてヘテロ接合マウス（Ｔｇ＋／−）及びホモ接合性マウス（Ｔｇ＋／＋）から由来するマウスＢ２２０＋細胞中でのヒトＣＤ２０の発現を示す。
【図２】図２はＢ細胞分化及び成熟化の間の様々な細胞表面マーカー（ＣＤ４３、ＩｇＭ、ＩｇＤ）の発現の模式図を提供する。Ｔｇ＋マウスでは、ｈＣＤ２０はプレＢ、未熟Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞に発現する。
【図３】図３は骨髄のＢ細胞中でのヒトＣＤ２０を発現するＴｇ＋マウスのスクリーニングの結果を示す。細胞はＦＩＴＣ（BD Phramingen）に結合した抗ヒトＣＤ２０で染色した。Ｂ２２０及びＣＤ４３の存在について細胞をゲーティングすることによってＢ細胞の様々な集団を描写することが可能になる。ゲーティングには、細胞を、ＰｅｒＣＰ（BD Phramingen）に結合した抗Ｂ２２０Ａｂ及びＰＥ（蛍光、BD Phramingen）に結合した抗ＣＤ４３Ａｂで染色した。
【図４】図４は脾臓のＢ細胞中でのヒトＣＤ２０を発現するＴｇ＋マウスのスクリーニングの結果を示す。細胞はＦＩＴＣ（BD Phramingen）に結合した抗ヒトＣＤ２０で染色した。Ｂ２２０及びＣＤ２１について細胞をゲーティングすることによってＢ細胞の様々な集団を描写することが可能になる。ゲーティングには、細胞を、ＰｅｒＣＰ（BD Phramingen）に結合した抗Ｂ２２０Ａｂ及びＰＥ（蛍光、BD Phramingen）に結合した抗ＣＤ４３Ａｂで染色した。ヒトＣＤ２０を有するＢ細胞はＴ１帯、周辺帯及びＴ２／卵胞帯に見出される。
【図５】図５は腸間膜リンパ節のＢ細胞中でのヒトＣＤ２０を発現するＴｇ＋マウスのスクリーニングの結果を示す。細胞はＦＩＴＣ（BD Phramingen）に結合した抗ヒトＣＤ２０で染色した。Ｂ２２０及びＣＤ２１について細胞をゲーティングすることによってＢ細胞の様々な集団を描写することが可能になる。ゲーティングには、細胞を、ＰｅｒＣＰ（BD Phramingen）に結合した抗Ｂ２２０Ａｂ及びＰＥ（蛍光、BD Phramingen）に結合した抗ＣＤ２１Ａｂで染色した。
【図６】図６はパイエル板のＢ細胞中でのヒトＣＤ２０を発現するＴｇ＋マウスのスクリーニングの結果を示す。細胞はＦＩＴＣ（BD Phramingen）に結合した抗ヒトＣＤ２０で染色した。Ｂ２２０及びＣＤ３８について細胞をゲーティングすることによってＢ細胞の様々な集団を描写することが可能になる。ゲーティングには、細胞を、ＰｅｒＣＰ（BD Phramingen）に結合した抗Ｂ２２０Ａｂ及びＰＥ（蛍光、BD Phramingen）に結合した抗ＣＤ２１Ａｂで染色した。ヒトＣＤ２０を有するＢ細胞は成熟Ｂ細胞及び胚中心の細胞に見出される。
【図７】図７はＴｇ＋マウス中への抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂの投与とヒトＣＤ２０を有する細胞の有無の分析の模式図である。抗ヒトＣＤ２０モノクローナル抗体１ｇの単一用量を０日に投与した。−１日、１、２、３、４、７、１４及び２１日に様々な組織から試料を取った。末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄、及びパイエル板のような異なった組織からの試料を、過去に記載されているようにして、ＦＡＣｓによって分析した。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の血清レベルもまたモニターした。
【図８】図８は抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂｍ２Ｈ７（BD Pharmingen）で処置したトランスジェニックマウスにおける末梢Ｂ細胞の枯渇を示す。抗体を、１ｍｇの全用量で図７の概略図に概要が示されているようにトランスジェニックマウスに投与した。ＦＡＣＳ分析を、過去に記載されたようなゲーティングによって末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄、及びパイエル板について実施した。
【図９】図９は抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂｍ２Ｈ７で処置したトランスジェニックマウスにおける成熟末梢リンパ節Ｂ細胞の枯渇を示す。抗体を、１ｍｇの全用量で図７の概略図に概要が示されているようにトランスジェニックマウスに投与した。ＦＡＣＳ分析を、過去に記載されたようなゲーティングによって末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄、及びパイエル板について実施した。
【図１０】図１０は抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂｍ２Ｈ７で処置したトランスジェニックマウスにおける脾臓Ｔ２及び卵胞Ｂ細胞の枯渇を示す。抗体を、１ｍｇの全用量で図７の概略図に概要が示されているようにトランスジェニックマウスに投与した。ＦＡＣＳ分析を、過去に記載されたようなゲーティングによって末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄、及びパイエル板について実施した。
【図１１】図１１は抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂｍ２Ｈ７で処置したトランスジェニックマウスにおける再循環成熟Ｂ細胞の枯渇を示す。抗体を、１ｍｇの全用量で図７の概略図に概要が示されているようにトランスジェニックマウスに投与した。ＦＡＣＳ分析を、過去に記載されたようなゲーティングによって末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄、及びパイエル板について実施した。
【図１２】図１２は抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂｍ２Ｈ７で処置したトランスジェニックマウスにおける成熟Ｂ細胞の枯渇とパイエル板胚中心Ｂ細胞の枯渇に対する耐性を示す。抗体を、１ｍｇの全用量で図７の概略図に概要が示されているようにトランスジェニックマウスに投与した。ＦＡＣＳ分析を、過去に記載されたようなゲーティングによって末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄、及びパイエル板について実施した。
【図１３】図１３は抗ＣＤ２０ｍＡｂの投与後のＢ細胞の枯渇と回復を示す。抗体処置後６日目には、末梢血中にヒトＣＤ２０発現Ｂ細胞を検出できなかった。６週目では、抗体の排除時に、ｈＣＤ２０＋細胞が検出され始める。１４週目までには、Ｂ細胞は正常なレベルに回復したようであった。回復は、ＣＤ２０を発現せず、ついでヒトＣＤ２０＋を持つ成熟Ｂ細胞に発達するプレカーサーＢ細胞から生じる。
【図１４】図１４は短期抗ＣＤ２０ｍＡｂ療法に対する脾臓胚中心Ｂ細胞の耐性を示すＦＡＣＳプロットを示す。マウスは未免疫か又は１日目に腹腔内注入によってヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）で免疫化して脾臓に胚中心を誘導した。胚中心は７日目に現れる。８日目に、マウスの一群を抗ＣＤ２０抗体ｍ２Ｈ７で処置した。マウスのコントロール群はｍＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体で処置した。マウスの脾臓細胞を１２日目に分析した。検出可能な胚中心細胞はＳＲＢＣで免疫しなかったマウスの脾臓では見られなかったが、免疫したマウスの脾臓は０．３％のＰＮＡ染色細胞を示す。Ｔ２／卵胞Ｂ細胞は抗ＣＤ２０抗体処置で枯渇するが、脾臓中の周辺中心Ｂ細胞は抗体に耐性がある。
【図１５】図１５は抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置マウス及びコントロールにおけるＴ細胞非依存性応答を示す。マウスを、０日目にｍ２Ｈ７又はアイソタイプコントロール抗体ｍＩｇＧ２ａで処置した。３−７日目に、Ｂ細胞枯渇が生じた。７日目に、マウスに肺炎連鎖球菌ＩＶを静脈内注射して、多糖に対する応答を誘導した。Ｔ細胞非依存性応答は１１日に達した。該結果は、抗ヒトＣＤ２０ｍ２Ｈ７での処置は周辺帯及びＢ１細胞からのＢ細胞応答に影響を及ぼさない、つまり非枯渇ＭＺ及びＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性抗原に対する保護をもたらすことを実証している。
【図１６】図１６はＴｇ＋マウスにおけるＢＲ３及び２Ｈ７抗体処置の効果の比較を示す。ヒトＣＤ２０をコードする細菌人工染色体を発現するヒトＣＤ２０トランスジェニックマウス（ｈＣＤ２０＋マウスと称す）を、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（９日目に１００マイクログラムの一回の注射）、ＢＲ３-Ｆｃ（１日目から１２日目まで一日おきに１００マイクログラム）、又は抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３-Ｆｃの組み合わせの腹腔内注射で処置した。各群は４匹のマウスから構成されていた。最後の注射の２日後に、マウスを屠殺し、ｈＣＤ２０＋Ｂ細胞について分析した。脾臓、血液、リンパ節及びパイエル板のＦＡＣＳ分析をＢ細胞マーカー（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）について分析した。抗ＣＤ２０ｍＡｂ療法はＴ２及び卵胞Ｂ細胞を枯渇させたが脾臓中の周辺帯Ｂ細胞は枯渇させず、またＢＲ３-Ｆｃ処置は脾臓中のＴ２／卵胞及び周辺帯Ｂ細胞を減少させた。
【図１７】図１７はパイエル板に対する抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置の効果の欠如を示す。ヒトＣＤ２０をコードする細菌人工染色体を発現するヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスを、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（９日目に１００マイクログラムの一回の注射）、ＢＲ３-Ｆｃ（１日目から１２日目まで一日おきに１００マイクログラム）、又は抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３-Ｆｃの組み合わせの腹腔内注射で処置した。各群は４匹のマウスから構成されていた。最後の注射の２日後に、マウスを屠殺し、ｈＣＤ２０＋Ｂ細胞について分析した。脾臓、血液、リンパ節及びパイエル板のＦＡＣＳ分析をＢ細胞マーカー（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）について分析した。ＢＲ３-Ｆｃも２Ｈ７もその二つの組み合わせの何れもパイエル板中の胚中心Ｂ細胞に対して効果がなかった。
【図１８】図１８は長期の抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置後に形質細胞が枯渇しないことを示す。ヒトＣＤ２０に対して陽性のトランスジェニックＴｇ＋マウスを、過去に記載されているようにして抗ヒトＣＤ２０ｍＨ２７抗体で処置した。シンジカン(syndican)（ＣＤ-１３８形質細胞マーカー）に対して陽性であった骨髄及び脾臓中の細胞を検出することによって形質細胞の有無についてマウスを分析した。ＩｇＡ又はＩｇＭ陽性形質細胞の数をまた抗ヒトＣＤ２０処置後にモニターした。結果は、Ｔｇ＋マウス中の形質細胞は抗ヒトＣＤ２０抗体処置には影響を受けないことを示し、これはＴｇ＋マウスが抗体を産生する能力を尚有していることを示している。
【図１９】図１９はＴｇ＋マウス中でのＰＫ-１３６ｍＡｂによるＮＫ細胞の枯渇を示す。（マウスＮＫ１.１に対して特異的な）ＰＫ-１３６ｍＡｂを産生するハイブリドーマクローンをＡＴＣＣから取得した。４群のヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスに、コントロールｍＡｂ、ＰＫ-１３６、抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＰＫ-１３６／抗ＣＤ２０の組み合わせをそれぞれ腹腔内(ｉｐ)注射した。腹腔内投与された用量は次の通りであった：      コントロールＡｂ：２００ｕｇ／ｉｐ、３ｉｐ／週、１週間      ＰＫ-１３６：２００ｕｇ／ｉｐ、３ｉｐ／週、１週間      抗ＣＤ２０ｍＡｂ：１０ｕｇ／ｉｐ、単一用量      末梢血、肝臓及び脾臓からのＮＫ細胞を、抗体処置後に分析した。データは、ｎ＝８で、平均＋／−標準誤差として表す。
【図２０】図２０は、ＮＫ細胞がＴｇ＋マウス中において２Ｈ７媒介Ｂ細胞枯渇に所定の役割を果たしていることを示す。（マウスＮＫ１.１に対して特異的な）ＰＫ-１３６ｍＡｂを産生するハイブリドーマクローンをＡＴＣＣから取得した。４群のヒトＣＤ２０トランスジェニックマウスに、コントロールｍＡｂ、ＰＫ-１３６、抗ＣＤ２０ｍＡｂ及びＰＫ-１３６／抗ＣＤ２０の組み合わせをそれぞれ腹腔内(ｉｐ)注射した。腹腔内投与された用量は次の通りであった：      コントロールＡｂ：２００ｕｇ／ｉｐ、３ｉｐ／週、１週間      ＰＫ-１３６： ２００ｕｇ／ｉｐ、３ｉｐ／週、１週間      抗ＣＤ２０ｍＡｂ：  １０ｕｇ／ｉｐ、単一用量      末梢血、リンパ節及び脾臓からのリンパ球を、抗ＣＤ２０ｍＡｂの腹腔内投与３日後に分析した。データは、ｎ＝８で、平均＋／−標準誤差として表す。
【図２１】図２１はトランスジェニックマウスの異なった細胞集団上でのヒトＣＤ２０及びヒトＣＤ１６の発現を示す。ＣＤ２０Ｔｇ−／Ｃｄ１６Ｔｇ−（コントロールマウス）、ＣＤ２０Ｔｇ＋／Ｃｄ１６Ｔｇ−、ＣＤ２０Ｔｇ−／Ｃｄ１６Ｔｇ＋、及びＣＤ２０Ｔｇ＋／Ｃｄ１６Ｔｇ＋マウスからの血液細胞を、ＦＩＴＣで標識した標識抗ヒトＣＤ２０抗体、ＰｅｒＣＰに結合した抗Ｂ２２０抗体及びＰＥ（BD Pharmingen）で標識した抗ヒトＣＤ１６抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。結果は、ヒトＣＤ２０がＢ細胞上に見出され、ヒトＣＤ１６がＢ２２０マーカーを欠く細胞上に見出され、よってＢ細胞にはないことを示している。双方のマーカーに対して陽性のトランスジェニックマウスは双方の細胞集団を示している。
【図２２Ａ】図２２Ａは代表的なアミノ酸配列（配列番号：１）（ジェンバンク受託番号ＮＭ０００５６９）を示す。
【図２２Ｂ】ヒトＣＤ１６α鎖アイソタイプＡのｃＤＮＡ（ジェンバンク受託番号ＮＭ０００５６９）を示す。
【図２２Ｃ】ヒトＣＤ１６α鎖アイソタイプＡのゲノムＤＮＡ配列（配列番号：３）（ジェンバンク受託番号Ｚ４６２２２）を示す。
【図２２Ｄ】マウスＣＤ１６α鎖の代表的なｃＤＮＡ配列（ジェンバンク受託番号ＮＭ０１０１８８）（配列番号：９）を示す。
【図２２Ｅ】図２２Ｅは代表的なアミノ酸配列（配列番号：１０）及びヒトＣＤ１６α鎖アイソタイプＢのｃＤＮＡ配列（ジェンバンク受託番号ＮＭ０００５７０）を示す。
【図２２Ｆ】ヒトＣＤ１６α鎖アイソタイプＢをコードする代表的ゲノム配列（配列番号：１２）（ジェンバンク受託番号Ｚ４６２２３）を示す。
【図２２Ｇ】マウスＣＤ１６α鎖をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１３）（ジェンバンク受託番号ＮＭ０１０１８８）を示す。
【図２３Ａ】図２３ＡはヒトＣＤ２０のアミノ酸配列（配列番号：４）（ジェンバンク受託番号ＢＣ００２８０７）を示す。
【図２３Ｂ】ヒトＣＤ２０のｃＤＮＡ配列（配列番号：５）（ジェンバンク受託番号ＢＣ００２８０７）を示す。
【図２３Ｃ−１】ヒトＣＤ２０のゲノム配列（配列番号：６）（ジェンバンク受託番号ＡＨ００５３５３）を示す。
【図２３Ｃ−２】ヒトＣＤ２０のゲノム配列（配列番号：６）（ジェンバンク受託番号ＡＨ００５３５３）を示す。
【図２３Ｃ−３】ヒトＣＤ２０のゲノム配列（配列番号：６）（ジェンバンク受託番号ＡＨ００５３５３）を示す。
【図２３Ｄ】マウスの代表的なｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）（ジェンバンク受託番号Ｍ６２５４１）を示す。
【図２４】図２４はヒトＣＤ１６Ｔｇ＋マウスとのヒトＣＤ１６Ｔｇ−マウスにおけるヒトＣＤ１６の発現の比較を示す。細胞はＰＥ（BD Pharmingen）に結合した抗ヒトＣＤ１６で染色し、またＮＫ細胞を同定するために抗ＤＸ５-ＦＩＴＣ（BD Pharmingen）で、あるいはマクロファージを同定するためにＡＰＣ（Allophycocyanin）に結合した抗Ｆ４／８０で染色した。結果は、ＮＫとマクロファージの双方がヒトＣＤ１６Ｔｇ＋マウスにおいてヒトＣＤ１６導入遺伝子を発現することを示している。
【図２５】図２５はヒトＦｃレセプターγ鎖のアミノ酸（ジェンバンク受託番号Ｐ３０２７３）（配列番号：７）及びｃＤＮＡ配列（ジェンバンク受託番号Ｍ３３９１５）（配列番号：８）を示す。
【図２６】図２６はマクロファージ上のマウスＣＤ１６の発現の有無のＦＡＣＳ分析を示す。マウスＣＤ１６を欠くマウス由来（ＣＤ１６−／−）及びマウスＣＤ１６を有するコントロールマウス由来（ＣＤ１６＋／−）の末梢血細胞を抗マウスＣＤ１６抗体で染色した。抗ｍａｃ１抗体を使用してマクロファージマーカーｍａｃ-１の発現について細胞をゲーティングした。
【図２７】図２７はＣＤ１６−／−マウス由来の末梢血細胞上のマウスＣＤ６４の発現の有無のＦＡＣＳ分析を示す。ＣＤ６４はＦｃγＲＩであり、マウス細胞上でのこのレセプターの発現は、他のＦｃレセプターの発現がＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）α鎖をノックアウトすることによって影響を受けなかったことを示している。マウスＣＤ１６を欠くマウス由来（ＣＤ１６−／−）及びアイソタイプコントロールマウス由来の末梢血細胞を抗マウスＣＤ６４抗体で染色した。抗ｍａｃ１抗体を使用してマクロファージマーカーｍａｃ１の発現について細胞をゲーティングした。
【図２８】図２８はヒト末梢血細胞上のＣＤ２０の発現と比較したヒトＣＤ２０トランスジェニックマウス由来の末梢血細胞上のヒトＣＤ２０発現の発現レベルの代表的な比較を示す。末梢血細胞はヒトドナー及びｈＣＤ２０Ｔｇ＋マウスから取得し、標識抗ヒトＣＤ２０抗体（ｍＨ２７）で染色した。細胞をＦＡＣＳによって分析し、ヒトＣＤ１９＋及びＢ２２０＋集団についてゲーティングした。グラフ上の数値は平均蛍光強度を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ−１】
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【図２３Ｃ−２】
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【図２３Ｃ−３】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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