(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルス感染症の治療及び予防に有用な方法及び組成物に関する。特に本発明は、Ｅ１及び／又はＥ２をコードする核酸分子、ＤＮＡワクチン送達に好適なベクター、並びにこれらを含有する医薬組成物に関する。上記分子、ベクター及び組成物を製造する方法もまた包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なるＨＰＶ株に由来する少なくとも２つの初期抗原又はその断片からのエピトープを有するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つの抗原がＨＰＶ  Ｅ１に由来する又はその断片である、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
少なくとも１つの抗原がＨＰＶ  Ｅ２に由来する、請求項２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＤＮＡ配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
子宮頸癌、良性の皮膚いぼ又は生殖器いぼに関連するＨＰＶ型又はその亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
１〜４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６〜２９、３１、３３、３５、３９、４９、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型の１つのＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
子宮頸癌又は生殖器いぼに関連するＨＰＶ型又はその亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項６記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
６、１１、１６、１８、３３又は４５型の１つのＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項４又は５記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
ＨＰＶ１１、６ａ又は６ｂから選択されるＨＰＶ型又はその亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項５記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
生物学的機能が低減している変異型ＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
ポリペプチドの天然の生物学的機能の１以上が不活性化される１以上の点突然変異を含む変異型ＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ヒト遺伝子についてのコドン利用係数が０．４を超えるが１未満である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
ヒト遺伝子についてのコドン利用係数が０．５を超えるが１未満である、請求項１２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、それと機能的に連結された、宿主細胞による該ポリヌクレオチド配列の発現をもたらしうる制御配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
ｐ７３１３ＰＬｃである、請求項１４記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１８】
ＤＮＡをコーティングした複数の金粒子を含む、請求項１６又は１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
さらにアジュバントを含む、請求項１６、１７又は１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
アジュバントが、上記ポリヌクレオチドによりコードされるＨＰＶポリペプチドとの融合物としてコードされている、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＰＶ感染症の治療又は予防における請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
ＨＰＶ感染症の治療又は予防における請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項２３】
ＨＰＶ感染症の治療又は予防における請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
皮膚（表皮）いぼ、生殖器いぼ、意味未確定の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、子宮頸部形成異常、頸部上皮内癌（ＣＩＮ）又は子宮頸癌の治療又は予防における請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
ＨＰＶ感染症又はそれに関連するいずれかの症候若しくは疾患の治療又は予防方法であって、有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項２６】
ＨＰＶ感染症又はそれに関連するいずれかの症候若しくは疾患の治療又は予防方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター系又は非ウイルスに基づく系による初回免疫−追加免疫投与計画において、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス感染症の治療及び予防に有用な方法及び組成物に関する。特に本発明は、異なるＨＰＶ株由来の初期抗原に基づくポリ蛋白質をコードする核酸分子、ＤＮＡワクチン送達に好適なベクター、及びこれらを含有する医薬組成物に関する。上記分子、ベクター及び組成物を製造する方法、並びに医学におけるこれらの使用もまた包含する。
【背景技術】
【０００２】
パピローマウイルスは組織及び種に高度に特異的である。このウイルスは基底上皮細胞に感染し、複製し、細胞の核内で全生活環を完了する。ウイルス遺伝子の発現は上皮細胞の分化及びキャプシドの集合と密接に連鎖し、成熟は上皮細胞上層における完全に分化した上皮細胞においてのみ起こる。
【０００３】
生殖器いぼに存在する感染性ヒトパピローマウイルスの遺伝子型は遺伝子型６ｂ又は遺伝子型１１であることが知られている。生殖器いぼの大部分（約９０％）がＨＰＶ６ｂに感染しており、約１０％がＨＰＶ１１に感染している。子宮頸癌に関係した感染に存在する一次感染遺伝子型はＨＰＶ１６及び１８である。
【０００４】
ヒト生殖器いぼは感染部位に発生し、慢性になり長期間存続するおそれがあるが、代わりに自然に退縮して瘢痕を残さずに完全に消散する場合もある。この退縮を誘発する要因は未確定であるが、この疾患の消散過程に細胞性応答が関与しうると仮定されている。
【０００５】
パピローマウイルスは自然状態ではあまり免疫原性でなく、自然感染の過程では抗体は非常に遅れて（消散中又はその後に）少数の患者に生じるが、一部の患者では検出できる抗体を全く発生せずに疾患を消散する場合がある。
【０００６】
パピローマウイルスの初期抗原を用いたワクチン接種は、いくつかの異なる動物モデル系において広く研究されてきた。しかし、治療用免疫について研究している報告はごく少数である。例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）タンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４及びＥ７を含むタンパク質混合液で治療用免疫を受けたウシは、対照に比べて一部の動物でパピローマ疾患の負荷の減少を示した。
【０００７】
パピローマウイルス感染症は、ヒツジ、イヌ、ウサギ、サル、ウシ及びヒトを含めた多様な種で観察されている。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、ＤＮＡ配列相同性の程度に基づいて８０を超える型に分類され(Epidemiology and Biology of Cervical Cancer Seminars in Surgical Oncology 1999 16:203〜211。Wolfgang MJ、Schoell MD、Janicek MF及びMirhashemi R）、その一部はさらに亜型（例えば６ａ及び６ｂ型）に分類されている。パピローマウイルスは一般に上皮に感染するが、異なるＨＰＶ型が別個の疾患を引き起こす。例えば１〜４、７、１０、及び２６〜２９型は良性のいぼを引き起こし、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、及び６８型は子宮頸癌と関連し、６及び１１型は生殖器いぼ（生殖管の非悪性コンジローム）と関係している。
【０００８】
ＨＰＶは組織培養での増殖が困難であることが証明されたため、伝統的な生ワクチン又は弱毒ウイルスワクチンは存在しない。ヒトウイルスを研究できる好適な動物モデルが欠如していることからも、ＨＰＶワクチンの開発は遅延した。これは、これらのウイルスが高度に種特異的であるため、ワクチンを初めてヒトに試す前に安全に試験するために必要となるような異なる種の宿主からのパピローマウイルスを動物に感染させることが非常に困難であるからである。
【０００９】
パピローマウイルスはＥ１からＥ７と呼ばれる「初期」遺伝子、並びにＬ１及びＬ２と呼ばれる「後期」遺伝子をコードするＤＮＡゲノムを有する。初期遺伝子の配列は、ウイルスＤＮＡの複製及び転写、宿主免疫の回避、並びに正常な宿主細胞周期及び他の過程の変化に関係する機能を有することが示された。例えばＥ１タンパク質はＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼであり、ウイルスＤＮＡの複製過程の開始に関わるが、Ｅ２はウイルス遺伝子の発現及びＤＮＡ複製の両方を制御している調節タンパク質である。Ｅ１及びウイルスの複製起点の両方と結合する能力により、Ｅ２はその起点でＥ１の局所濃縮をもたらすことでウイルスＤＮＡの複製開始を刺激する。Ｅ４タンパク質はいくつかのあまり特定されていない機能を有すると思われるが、それらの中で宿主細胞の細胞骨格と結合する可能性があり、Ｅ５はエンドソームの酸性化を遅らせて細胞表面でのＥＧＦ受容体の発現の増加を招くと考えられ、Ｅ６及びＥ７の両方は細胞タンパク質ｐ５３及びｐＲＢとそれぞれ結合することが知られている。子宮頸癌に関連するＨＰＶ型からのＥ６及びＥ７タンパク質は既知の癌遺伝子である。Ｌ１及びＬ２は２つのウイルス性構造（キャプシド）タンパク質をコードしている。
【００１０】
ワクチンは、歴史的に病原体を認識する免疫系を初回刺激し、感染が起こったならばそれを中和する、病原体による感染を予防する一方法とみなされる。ワクチンは、病原体からの１つ又は複数の抗原を包含する。その抗原は、通例は死滅した形若しくは弱体化（弱毒化）形のどちらかである生物全体、又はその生物から選択された抗原性ペプチドである。免疫系に抗原を曝露すると、その個体が生きている期間に免疫「記憶」を保つ細胞が発生する。その後（例えば病原体の感染に際して）の同一の抗原に対する曝露は特異的免疫応答を刺激し、感染性因子の除去又は不活性化を招く。
【００１１】
免疫応答には体液性（抗体）応答と細胞性応答の２部門がある。細胞内で複製する病原体（ウイルス及び一部の細菌）から得られるタンパク質抗原は感染した宿主細胞内でプロセシングされ、短いペプチドを放出し、その後それらのペプチドはクラスＩ主要組織適合性（ＭＨＣＩ）分子と会合して感染細胞表面に表出される。ＭＨＣＩとペプチドとの、この会合複合体が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と接触すると、このＴ細胞は活性化し、細胞傷害性を獲得する。これらの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は感染した宿主細胞を溶解できることから、感染性病原体の複製と蔓延を制限している。免疫応答のもう１つの重要な部門はＣＤ４＋Ｔ細胞により制御される。病原体由来の抗原が細胞外環境に放出されると、それらの抗原は特殊化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り上げられ、ＭＨＣＩＩ分子と会合してこれらの細胞表面上に提示される。この複合体に存在する抗原が認識されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は刺激を受け、他のＴ細胞のエフェクターメカニズムを調節する可溶性因子（サイトカイン）を分泌する。抗体はＢ細胞により産生される。分泌された抗体に対する抗原の結合は病原体の感染性を中和する場合があり、Ｂ細胞表面上の膜結合性抗体への抗原の結合は、Ｂ細胞の分裂を刺激することによりＢ細胞応答を増幅させる。一般に、細菌感染を抑制するためには良好な抗体応答が必要で、ウイルスによる感染を抑制するためには抗体及び細胞性免疫応答（ＣＤ８＋及びＣＤ４＋）の両方が必要である。
【００１２】
病原体による感染後でさえ、ワクチン接種により免疫系を利用してその病原体を不活性化又は除去することにより感染を抑制又は消散することが可能でありうると考えられている。そのような「治療用」ワクチンが有効であるためには細胞性応答を必要とするであろうし、体液性及び細胞性免疫応答の両方を引き起こすことが理想的であろう。
【００１３】
リン酸カルシウムにより沈殿させたＤＮＡをマウスに接種すると、そのＤＮＡがコードするペプチドの発現を招くことが実証された(Benvenisty、N及びReshaf、L.PNAS 83 9551〜9555)。その後、沈殿していないプラスミドＤＮＡをマウスに筋肉内注射すると、筋肉細胞へのＤＮＡの取込み及びコードするタンパク質の発現を招くことが示された。ＤＮＡの発現が、コードする病原体タンパク質の宿主細胞内での産生を自然感染の場合と同様に招くことから、このメカニズムは治療用ワクチンに必要な細胞性免疫応答を刺激できる。ＤＮＡワクチンはＷＯ９０／１１０９２号（Vical,Inc.）に記載されている。
【００１４】
ＤＮＡワクチン接種を、筋肉内注射以外のメカニズムにより送達できる。例えば皮膚への送達は、皮膚及び粘膜のように感染に対する障壁である組織において免疫メカニズムが高度に活性であるという事実を利用している。皮膚への送達は注射、（加圧下で液体を皮膚に注入する）ジェット注射器、又は上皮を透過するために十分な密度で粒子にＤＮＡをコーティングしうる粒子ボンバードメント（米国特許第５，３７１，０１５号）を利用しうる。皮膚へのこれらの粒子の発射は、表皮細胞及び表皮ランゲルハンス細胞の両方の直接トランスフェクションを招く。ランゲルハンス細胞はＤＮＡを取り込み、コードするペプチドを発現し、細胞表面のＭＨＣタンパク質上に提示するためにこれらをプロセシングする抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。トランスフェクションされたランゲルハンス細胞はリンパ節に遊走し、提示されている抗原断片をそこでリンパ球に提示し、免疫応答を引き起こす。皮膚への粒子の送達を介した免疫応答を誘導するためには非常に少量のＤＮＡ（０．５〜１μｇ）しか必要でなく、これは直接の筋肉内注射の後に免疫応答を発生させるために必要であることが知られているミリグラム量のＤＮＡとは対照をなしている。
【００１５】
例えばＬ１及びＬ２キャプシドタンパク質から形成されたウイルス様粒子を用いた、又はこれらのタンパク質を単独で用いた研究（１）において、ＨＰＶは免疫原性に乏しいことが報告された。さらに、ＨＰＶ遺伝子はヒト又は他の哺乳動物細胞において発現することが困難であることが証明され、タンパク質サブユニットワクチンの開発に困難をもたらした。哺乳動物細胞において単一シストロンのＥ１は異種プロモータからの発現に特に抵抗性であることが証明された(J.Virology 1999 73、3062〜3070。Remm M、Remm A及びMart Ustav。ヒトパピローマウイルス１８Ｅ１型は不連続スキャンメカニズムにより多シストロン性ｍＲＮＡから翻訳される）。Ｅ１の発現は代替としてＨＰＶ起源を含有するプラスミドのインビトロのＤＮＡ複製を用いて検出されることが最も多い(Lu、JZJ、Sunら、J.Virol 1993 67、7131〜7139及びDel Vecchio AMら、J.Virol 1992 66、5949〜5958)。
【００１６】
国際特許出願ＷＯ０２／０８４３５号は、高度に発現したヒト遺伝子の利用パターンに似るように配列を最適化したＨＰＶのポリヌクレオチドを提供する。具体的には、コドンを最適化したＨＰＶ６ｂＥ１及びＨＰＶ１１Ｅ２が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、ヒトパピローマウイルスが誘導した生殖器いぼ又はＨＰＶが誘導した他の続発症の予防、及びさらに具体的には治療に有用である新規な核酸構築物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第一の態様によれば、少なくとも２つの異なる初期抗原由来のエピトープを含有するポリタンパク質をコードする核酸構築物を提供する。好ましくは本発明は、３つの異なる初期抗原由来のエピトープを含むポリタンパク質をコードする核酸構築物を提供する。そのような構築物は、動物モデルにおいて単一タンパク質を用いる手法よりも効果的であることが本発明者らによって示された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
好ましい構築物は、ＨＰＶ６ｂ及びＨＰＶ−１１由来のＥ２のように２つの異なるＨＰＶ遺伝子型からのＥ２をコードする核酸を包含する。さらに、Ｅ１をコードする配列が存在することが好ましい。好ましくはＥ１はＨＰＶ６又はＨＰＶ１１由来のものである。
【００２０】
好ましい構築物は以下の配置を有する核酸分子を包含する：
１）  ＨＰＶ６ｂＥ１−ＨＰＶ６ｂＥ２−ＨＰＶ１１Ｅ２
２）  ＨＰＶ６ｂＥ２−ＨＰＶ６ｂＥ１−ＨＰＶ１１Ｅ２
３）  ＨＰＶ６ｂＥ２−ＨＰＶ１１Ｅ２−ＨＰＶ６ｂＥ１
【００２１】
最も好ましくは上記ポリタンパク質の核酸配列の全ては、高度に発現されたヒト遺伝子のコドンの利用に似るように最適化したコドンである。好ましくはＥ１及びＥ２遺伝子は実質的な全長であり、さらに好ましくは全長である。実質的な全長は、Ｅ１及びＥ２ポリペプチドの少なくとも８５％、好ましくは９０％をコードすることを意味する。驚いたことに、そのような構築物はコドンを最適化した個々のタンパク質と同等の発現レベルで発現し、ポリタンパク質をコードする単一プラスミドは、３つの個々のプラスミドよりも製造が安価で容易であるという利点を有する。
【００２２】
これらの遺伝子は、そのコドン利用パターンが、高度に発現されるヒト遺伝子産物であるアクチンのコドン利用パターンと類似するようにコドンを最適化されていることが好ましい。
【００２３】
ポリヌクレオチドの配列はＤＮＡ配列、例えば二本鎖ＤＮＡ配列でありうる。ポリヌクレオチド配列は好ましくはＨＰＶ６、１１、１６、１８、３３又は４５型の、最も好ましくは１１型、６ａ亜型又は６ｂ亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする。ある実施形態においては、コードするアミノ酸配列は野生型ＨＰＶアミノ酸配列である。別の実施形態においては、コードするアミノ酸配列は、ポリペプチドの１つ又は複数の天然の生物学的機能を低下又は不活性化するのに十分なアミノ酸変化、例えばアミノ酸点突然変異を有する野生型配列を含む変異型ＨＰＶアミノ酸配列である。この変異型アミノ酸配列は、野生型ポリペプチドの免疫原性を望ましくは保持するであろう。本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質も本発明の一態様を形成する。
【００２４】
Ｅ１の場合、主たる生物学的役割は感染細胞におけるウイルス特異的ＤＮＡ複製を開始することである。Ｅ１は突然変異してその複製能を不活性化していることが好ましい。
【００２５】
好ましい突然変異は、Ｇ４８２Ｄ
Ｋ８３Ｇ
Ｒ８４Ｇ
である。
【００２６】
好ましくは２つ以上の突然変異が包含される。
【００２７】
最も好ましくは３つの突然変異が包含される。
【００２８】
Ｅ２の場合、これは一次複製起点認識タンパク質として機能する部位特異的結合性核タンパク質であり、開始前複製複合体の集合を援助する。Ｅ２タンパク質は不活性化していることが好ましい。この目的を達成するために好ましい突然変異はＫ１１１Ａである。
【００２９】
本発明の一態様によると、ポリヌクレオチドのコドン利用パターンでは、ヒトに高度に発現する遺伝子において０．２未満のＲＳＣＵ値を有するコドンを好ましくは除外する。相対的同時コドン利用（ＲＳＣＵ）値は、そのアミノ酸に対する全てのコドンが等頻度で使用された場合に期待される数で、観察されたコドンの数を割った数である。本発明のポリヌクレオチドは、高度に発現されたヒト遺伝子に対して０．３を超える、好ましくは０．４を超える、最も好ましくは０．５を超えるコドン利用係数を一般に有する。本発明の第二の態様によると、本発明によるポリヌクレオチド配列を含みその発現を指令できる発現ベクターが提供され、上記ポリヌクレオチドは２つ以上の初期抗原からのエピトープを有するポリペプチドをコードする。そのベクターは、細菌、昆虫又は哺乳動物細胞、具体的にはヒト細胞において異種ＤＮＡの発現を駆動するために好適でありうる。一実施形態では、発現ベクターはｐ７３１３ＰＬｃである。
【００３０】
さらなる態様において、本発明はタンパク質、ベクター、又は本発明のポリヌクレオチド配列を含むワクチン組成物を提供する。好ましくはワクチン組成物は、本発明によるＤＮＡベクターを含む。好ましい実施形態において、ワクチン組成物は、複数の粒子、好ましくは金粒子を含み、その粒子は２つ以上の初期抗原からのエピトープを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有するベクターを含むＤＮＡでコーティングされている。別の実施形態において、ワクチン組成物は、製薬上許容される賦形剤及び本発明の第二の態様によるＤＮＡベクターを含む。ワクチン組成物はアジュバントも包含しうる。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は２つ以上の初期抗原からのエピトープを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築すること、及び製薬上許容される賦形剤と共に製剤することを包含するワクチン組成物の製造法を提供する。
【００３２】
ＨＰＶ感染症、好ましくはＨＰＶ６、１１、１６又は１８型の感染症の治療又は予防における、本発明に係るポリヌクレオチド又はベクターの使用も提供する。本発明は、皮膚のいぼ（皮膚いぼ）、生殖器いぼ、意義未確定の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、子宮頸部形成異常、頸部上皮内癌（ＣＩＮ）若しくは子宮頸癌の治療又は予防における、本発明に係るポリヌクレオチド又はベクターの使用も提供する。したがって、本発明は、ＨＰＶ感染症又はそれに関連するいずれかの症候若しくは疾患の治療又は予防のためのワクチンの製造における、本発明に係るポリヌクレオチド又はベクターの使用も提供する。
【００３３】
本発明は、本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター又はワクチンの有効量を投与することを含む、ＨＰＶ感染症又はそれに関連するいずれかの症候若しくは疾患を治療又は予防する方法も提供する。ワクチンの投与は、例えば「初回免疫−追加免疫（prime-boost）」投与計画における、１つ又は複数の個別の用量の形式をとりうる。特定の事例において、「初回刺激」ワクチン接種はＤＮＡワクチン送達による場合があり、具体的には、好ましくはプラスミドから誘導されたベクター中に組み込まれた本発明のポリヌクレオチドの、粒子が媒介するＤＮＡ送達を利用する場合があり、「追加免疫」は同一のポリヌクレオチド配列を有する組換えウイルスベクターの投与による場合がある。あるいは、タンパク質アジュバントの取り組みが初回免疫又は追加免疫の手法の一部として実施される場合があり、このときＤＮＡは初回免疫−追加免疫計画のもう一方の部門として送達される（そのタンパク質はそのＤＮＡがコードするタンパク質と同一である）。
【００３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のような変形は、包括するように解釈されるべきである。すなわちこれらの語は、事情が許す場合に、具体的に述べられていない他の要素又は整数の、可能性のある包含を伝えることが意図されている。
【００３５】
「変異体」という用語は、本発明の別のポリヌクレオチドと同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝コードの縮重のために異なるヌクレオチド配列を有する一方で、同一のコドン利用パターンを維持する、例えばもう一方のポリヌクレオチドと同一のコドン利用係数、又はその０．１以内、好ましくは０．０５以内のコドン利用係数を有する、ポリヌクレオチドをいう。
【００３６】
「コドン利用パターン」という用語は、論じているヌクレオチド配列、遺伝子又は遺伝子クラス（例えば高度に発現された哺乳動物遺伝子）における全てのコドンに対する平均頻度をいう。ヒトを含めた哺乳動物に対するコドン利用パターンを文献中に見いだすことができる(例えばNakamuraら、Nucleic Acids Research 1996、24:214〜215参照)。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドにおいて、コドン利用パターンはヒトパピローマウイルスに典型的なパターンからヒトのコドンの偏りをよりよく表すものに変わっている。「コドン利用係数」は、与えられたポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のコドンパターンとどれほどよく類似しているかの尺度である。コドン頻度は多くの種の高度に発現された遺伝子についての文献の出典から得ることができる(例えばNakamuraら、Nucleic Acids Research 1996、24:214〜215参照)。６１個のコドンのそれぞれについての（選択された遺伝子クラスの１０００個のコドンあたりの出現数として表された）コドン頻度を２０個の天然アミノ酸のそれぞれについて標準化し、各アミノ酸について最も高頻度で利用されたコドンに対する値を１と定め、それよりも現れにくいコドンについての頻度が０と１の間になるような尺度にする。よって、標的種の高度に発現する遺伝子について６１個のコドンそれぞれに１以下の値が割り振られる。その種の高度に発現した遺伝子に関して、特定のポリヌクレオチドについてのコドン利用係数を計算するために、特定のポリヌクレオチドの各コドンについて尺度決定後の値に注目し、（これらの値の自然対数をコドンの総数で割り、逆対数を求めることにより）これら全ての値の幾何平均を求める。この係数は０と１の間の値を有し、その係数が大きいほどそのポリヌクレオチドにおいて頻繁に利用されるコドンが多くなる。ポリヌクレオチド配列がコドン利用係数１を有するならば、全てのコドンが標的種の高度に発現される遺伝子についての「最頻」コドンである。
【００３８】
比較的短鎖のポリヌクレオチド配列が本発明の範囲に入る。例えば、本発明のポリヌクレオチドはＨＰＶタンパク質の断片をコードしうる。少なくとも８個、例えば１〜１０個のアミノ酸長、又は２０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０若しくは２００個までのアミノ酸長の断片をコードするポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドがＨＰＶの抗原性を示すポリペプチドをコードする限り、本発明の範囲に入るとみなされる。具体的であるが排他的でなしに、本発明のこの態様は、ポリヌクレオチドが完全なＨＰＶタンパク質配列の断片をコードし、そのタンパク質の１つ又は複数の別個のエピトープを表現しうるような状況を包含する。
【００３９】
以上考察したように、本発明は本発明のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含む。このような発現ベクターは分子生物学の技術分野では慣用的に構築されていて、例えばプラスミドＤＮＡ及び適当なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び必要でありうる他のエレメント、例えばポリアデニル化シグナルの使用に関わるものであり、そしてこれらはタンパク質発現を可能にするために正しい方向に配置される。他の適当なベクターは当業者には明らかであろう。この点に関するさらなる例として、Sambrookら, 「分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）」 第２版 CSH Laboratory Press. (1989)が挙げられる。
【００４０】
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチド又は本発明に使用するポリヌクレオチドは宿主細胞によるコード配列の発現を可能にする制御配列と機能しうる形で連結されている、すなわち上記ベクターは発現ベクターである。用語「機能しうる形で連結された」は、記載された構成要素がそれらの意図する方法で機能することを可能にする関係にある近位を意味する。コード配列と機能しうる形で連結されたプロモーターなどの調節配列は、調節配列と適合しうる条件のもとでコード配列の発現が達成されるような方法で置かれる。
【００４１】
ベクターは、例えばプラスミド、人工染色体、ウイルス又はファージベクターであって、複製起点、場合によってはポリヌクレオチド発現のためのプロモーター、及び場合によってはプロモーターのレギュレーターを備えたものであってもよい。ベクターは、１以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン又はカナマイシン耐性遺伝子又は真菌ベクターに対する耐性遺伝子を含有してもよい。ベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡの産生のために使用してもよく、又は宿主細胞、例えば哺乳類動物宿主細胞をトランスフェクション又は形質転換するために使用してもよい。ベクターはまた、例えばＤＮＡワクチン接種又は遺伝子治療の方法で、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するように適合させてもよい。
【００４２】
プロモーター及び他の発現調節シグナルは、発現が設計される宿主細胞に合わせて選択することができる。例えば哺乳類動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属に応答して誘発させることができるメタロチオネインプロモーター、及びβ−アクチンプロモーターを含む。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターなどのウイルスプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期（ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスプロモーター、又はＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）も利用することができる。全てのこれらのプロモーターは当技術分野では容易に利用しうる。
【００４３】
適当なウイルスベクターの例は、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニア又はアルファ−ウイルスベクター及びレトロウイルスを含み、そしてレンチウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含む。これらのウイルスを用いる遺伝子導入技術は当業者に知られている。例えば、レトロウイルスベクターを用いて安定して本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノム中に組込むことはできるが、このような組換えは好ましいものではない。複製欠陥アデノウイルスベクターは対照的にエピソームに残り、従って一過性の発現が可能である。昆虫細胞（例えばバキュロウイルスベクター）、ヒト細胞又は細菌細胞において発現を駆動することができるベクターを、例えばサブユニットワクチンとして使用するために、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるＨＰＶタンパク質の一定量を生産するために採用してもよい。好ましいウイルスベクターは、非ヒト霊長類アデノウイルス、例えばＣ６８チンパンジーアデノウイルス（米国特許第６，０８３，７１６号）、またＰａｎ９として知られるもの等に由来する。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドが治療薬（例えばＤＮＡワクチン中）として用いられる場合には、核酸は、ワクチン接種対象の哺乳動物、例えばヒトに投与しうる。核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡなど、好ましくはＤＮＡ）は、上述したものなどのように、哺乳動物の細胞内で発現されうるベクターの形態で提供される。ポリヌクレオチドは、任意の利用可能な技術によって投与しうる。例えば、核酸は、針注射により、好ましくは皮内、皮下又は筋肉内経路で投与しうる。あるいは核酸は、核酸送達装置、粒子媒介ＤＮＡ送達（ＰＭＤＤ）などを用いて皮膚を通過して直接送達することも可能である。この方法では、不活性の粒子（金ビーズなど）を核酸でコーティングし、例えば発射装置からの高圧下で放電によって、レシピエントの表面（例えば皮膚）を貫通できるのに十分な速度にそれらを加速する（本発明の核酸分子でコーティングされた粒子は、そのような粒子を充填した装置とともに本発明の範囲内である）。
【００４５】
裸のポリヌクレオチド又はベクターを患者中に導入するための好適な技術は、適当なビヒクルを用いる局所の適用を含む。核酸を、局所的に皮膚又は粘膜表面、例えば鼻腔内、経口、膣内又は直腸内に投与することができる。裸のポリヌクレオチド又はベクターは製薬上許容される賦形剤、例えばリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）と一緒に存在してもよい。ＤＮＡ取込みは、促進薬、例えば製剤中に含まれたブピバカインの添加により、さらに促進させることができる。核酸をレシピエントに直接投与する他の方法としては、超音波、電気刺激、エレクトロポレーション及び米国特許第５，６９７，９０１号に記載のマイクロシーディング（microseeding）が挙げられる。
【００４６】
核酸構築物の取込みは、例えばトランスフェクション試薬の使用を含む複数の公知のトランスフェクション技術により促進することができる。これらの試薬の例は、カチオン試薬（例えばリン酸カルシウム）、ＤＥＡＥ−デキストラン並びにリポフェクタント（lipofectant）（例えばリポフェクタム（lipofectam）及びトランスフェクタム（transfectam））を含む。投与する核酸の用量は変えることができる。典型的には、核酸は、粒子媒介遺伝子の送達の場合は１ｐｇ〜１ｍｇ、好ましくは１ｐｇ〜１０μｇの核酸、他の経路の場合は１０μｇ〜１ｍｇの範囲の量で投与する。
【００４７】
本発明の核酸配列はまた、遺伝子治療において有用な特殊設計送達ベクターを用いて投与しうる。遺伝子治療手法は、例えばVerme et al, Nature 1997, 389:239-242において論じられている。ウイルス系及び非ウイルス系のいずれも用いることができる。ウイルスに基づく系には、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、カナリア痘ウイルス、及びワクシニア−ウイルスに基づく系などが含まれる。非ウイルスに基づく系には、核酸の直接投与及びリポソームに基づく系が含まれる。
【００４８】
本発明の核酸配列はまた、形質転換した細胞を用いて投与してもよい。このような細胞は被験者から採取した細胞を含む。本発明の裸のポリヌクレオチド又はベクターをこのような細胞中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入し、その後、形質転換した細胞を被験者に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドを細胞中に既に存在する核酸中に相同組換え事象により組込んでもよい。もし所望であれば、形質転換した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し、得られる１以上の細胞を本発明に利用してもよい。細胞を患者の適当な部位に公知の外科又はミクロ外科技術（例えば、移植術、ミクロ注入など）により提供することもできる。
【００４９】
本発明のワクチン組成物は、タンパク質自体により誘導される免疫応答を増大するために機能しうる、又はプラスミドＤＮＡによりコードされるアジュバント化合物を含んでもよい。ワクチン接種の種に適合するためのコドン偏向の改変は、発現を増大させ、それにより免疫応答を高めるものとして本明細書で提唱しているが、アジュバントはそれでもなお望ましい。なぜなら、ＤＮＡワクチンがマウスモデルにおいて良好に作用しても、大部分の種（ヒトと同様の効力を有すると推測されている非ヒト霊長類など）では何らかの弱い効力の証拠が存在するからである。
【００５０】
本発明のワクチン組成物はまた、アジュバント、例えば一実施形態においてはイミキモド（imiquimod）、ツカレゾール（tucaresol）又はミョウバンを含みうる。
【００５１】
好ましくは、アジュバントを本発明のものと同時に投与し、そして好ましい実施形態においては一緒に製剤化する。そのようなアジュバント製剤は本発明に包含され、またアジュバント製剤としては、（このリストは決して全てを網羅するものでなく、また他の薬剤を排除するものでもない）：合成イミダゾキノリン、例えばイミキモド［Ｓ−２６３０８、Ｒ−８３７］、（Harrisonら, 「イミキモド単独で又は糖タンパク質ワクチンと組合わせて使用する再発性HSVの低減（Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine）」, Vaccine 19:1820-1826,（2001））；及びレシキモド［Ｓ−２８４６３、Ｒ−８４８］（Vasilakosら, 「免疫応答修飾因子R-848のアジュバント活性：CpG ODNとの比較（Adjuvant activites of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN）」, Celllular Immunology 204:64-74（2000））、抗原提示細胞及びＴ細胞表面上に構成的に発現されるカルボニル及びアミンのシッフ塩基、例えばツカレゾール（tucaresol）（Rhodes, J.ら, 「同時刺激性シッフ塩基形成薬物による免疫系の治療効力の増強（Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming drugs）」, Nature 377:71-75 (1995)）、サイトカイン、ケモカイン及び同時刺激性分子、Ｔｈ１誘導因子、例えばインターフェロンγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８、Ｔｈ２誘導因子、例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３並びに他のケモカイン及び同時刺激性遺伝子、例えばＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＣＡ−３、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０Ｌ、他の免疫刺激性ターゲティングリガンド、例えばＣＴＬＡ−４及びＬ−セレクチン、アポトーシス刺激性タンパク質及びペプチド、例えばＦａｓ、（４９）、合成脂質に基づくアジュバント、例えばヴァクスフェクチン（vaxfectin）、（Reyesら,「ヴァクスフェクチンは抗原特異的抗体力価を増強しかつプラスミドDNA免疫感作に対するTh1型免疫応答を維持する（Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization）」, Vaccine 19:3778-3786）、スクアレン、α−トコフェロール、ポリソルベート８０、ＤＯＰＣ及びコレステロール、内毒素、［ＬＰＳ］（Beutler, B.,「内毒素、トル様受容体4、及び先天免疫の求心性肢（Endotoxin, Toll−like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity）」, Current Opinion in Microbiology 3:23-30 (2000)）；ＣｐＧオリゴ−及びジ-ヌクレオチド（Sato, Y.ら,「有効な皮内遺伝子免疫感作に必要な免疫刺激性ＤＮＡ配列（Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization）」, Science 273(5273):352-354 (1996)、Hemmi, H.ら,「トル様受容体は細菌DNAを認識する（A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA）」, Nature 408:740-745, (2000)）並びにトル（Ｔｏｌｌ）受容体をトリガーしてＴｈ１誘導サイトカインを産生する他の潜在的リガンド、例えば合成放線菌リポタンパク質、放線菌タンパク質ｐ１９、ペプチドグリカン、タイコ酸及びリピドＡが挙げられる。
【００５２】
優先的にＴｈ１型応答を誘発するある特定の好ましいアジュバントは、モノホスホリルリピドＡなどのリピドＡ誘導体、又は好ましくは３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａを含む。ＭＰＬ(登録商標)アジュバントはコリキサ社（Corixa Corporation、Seattle、WA；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号及び第４，９１２，０９４号を参照）から入手することができる。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここでＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もＴｈ１応答を優先的に誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知でありかつ例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８及び米国特許第６，００８，２００号及び第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列はまた、例えば、Satoら, Science 273:352, 1996にも記載されている。他の好ましいアジュバントは、サポニン、例えばＱｕｉｌＡ、又はＱＳ２１及びＱＳ７を含むその誘導体（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA）；エスシン（Escin）；ジギトニン；又はカスミソウ属（Gypsophila）若しくはアカザ科キノア（Chenopodium quinoa）サポニンを含む。
【００５３】
一実施形態において、アジュバントは、免疫刺激性ＣｐＧオリゴヌクレオチド、例えばＷＯ９６１０２５５５号に開示されているものなどを含む。典型的な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、８〜１００塩基長であり、一般式Ｘ１ＣｐＧＸ２（式中、Ｘ１及びＸ２はヌクレオチド塩基であり、Ｃ及びＧはメチル化されていない）を含む。
【００５４】
本発明のアジュバント又はワクチンに使用するのに好適なオリゴヌクレオチドは、２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含み、好ましくは少なくとも３ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも６又はそれ以上のヌクレオチドで分離されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間はホスホジチオエートであり、より好ましくはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステル及び他のヌクレオチド間結合は本発明の範囲内であり、例えば混合したヌクレオチド間結合（例：混合したホスホロチオエート／ホスホジエステル）が含まれる。オリゴヌクレオチドを安定化させるほかのヌクレオチド間結合も使用可能である。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド又はホルホロジチオエートの製造方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号、及びＷＯ９５／２６２０４号に記載されている。
【００５５】
好ましいオリゴヌクレオチドの例は以下の配列を有している。配列は、好ましくはホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間連結を含む。
【００５６】
オリゴ1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)（配列番号２４）
オリゴ2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)（配列番号２５）
オリゴ3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG（配列番号２６）
オリゴ4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)（配列番号２７）
オリゴ5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)（配列番号２８）
【００５７】
別のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、上記の好ましい配列において重要ではない欠失又は付加を有する配列を含みうる。
【００５８】
本発明において使用するＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法（例えばＥＰ４６８５２０）を用いて合成することができる。簡便には、かかるオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を用いて合成しうる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含むアジュバント製剤は「ImmunEasy」のトレードマークでQiagenより購入可能である。
【００５９】
以下の実施例は、添付の図面を参照しながら本発明をさらに理解するのに役立つものである。
【実施例１】
【００６０】
１．プラスミド：ｐＷＲＧ７０７７  ６ｂｅ２  ｃ／ｏ変異型
目的の遺伝子：
ＨＰＶ６ｂｅ２遺伝子はサイズが約１．１Ｋｂであり、コドン最適化配列（ヒト発現について）はＳｙｎｇｅｎｅと称するビジュアルベーシックプログラムを用いて作製した。この配列はアミノ酸位置１１１におけるコドン変更を含むほか、野生型におけるリジン残基（ＡＡＧ）がアラニン残基（ＧＣＡ）に変更し、突然変異遺伝子を作製した。この変化は、６ｂｅ２の転写活性を不活性化する。５’及び３’末端の両末端における選択した制限部位を有し全体遺伝子を含む重複するプライマーを設計した。
【００６１】
クローニング：
１．１ｋｂのＰＣＲ断片をゲル精製し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化してベクターｐＷＲＧ７０７７（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ）と連結した。遺伝子は、全長極初期ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、ウシ成長ホルモンポリＡテールを有する。
【００６２】
クローンを配列決定し、所定の数の塩基誤差が示された。好適なクローンのいくつかは、制限消化物を用いて正確な遺伝子配列を構築することができることがわかった。再度クローニングを行い、１つのクローン（Ｃ７）が４９７位に１つの塩基誤差（ＴからＣ）しか有しないことを確認した。他のクローンはこの領域でｏ．ｋ．であり、誤差を正確にするために単純な断片の交換が必要であった。最終的なクローンＣ７ａはコドン最適化し突然変異を有する６ｂｅ２であることを確認した（図２参照）。
【００６３】
ｐＷＲＧ７０７７における６ｂｅ２配列（配列番号１）
ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGA
GGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGT
CAGTGCTCCTGTACAAGGCCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTG
CCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAGGGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCT
GGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCCCTGGACTCTCCAGGAGACGTCCT
ACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAGCGCGGCAAGACAGTTGAG
GTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGATGTCTA
CGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGGCATCT
ATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAG
TATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGC
CTCCGTGTCGTCCACCACCCAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGG
CCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCC
CGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATGCCCTGTGCGTTGCTCACAT
CGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACGACCAGCACCAAA
GGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAAC
TGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGACTTGAT
CAGTTCCACGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGG
TGACCTACGACTCCGAGGAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCG
ACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGTGA
【００６４】
アミノ酸配列（配列番号２）
MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP
PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK
FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS
TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA
RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF
RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL
GFMSLHLL
【００６５】
２．プラスミド：ｐ７３１３ｐｌｃ  ６ｂｅ１  ｃ／ｏ  ｍｕｔ
目的の遺伝子：
ＨＰＶ６ｂｅ１遺伝子はサイズが約２Ｋｂであり、コドン最適化野生型（ｗｔ）配列（大腸菌及びヒト発現について）はＳｙｎｇｅｎｅと称する統計学的ビジュアルベーシックプログラムを用いて作製された。５’及び３’末端の両末端における選択した制限部位を有し全体遺伝子を含む重複するプライマーを設計した。制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化してベクターｐＣＩＮ４と連結した。いくつかの選択したクローンについての配列決定データから、多数の塩基誤差が発見された。正確なクローンは、クローン＃２４からの正確なＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片とクローン＃２１からのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ断片を組み合わせて作製し、ｐ７３１３−ｐｌｃに導入した。配列決定により正確なクローン（＃１）を確認した。突然変異誘発用プライマーは、以下のアミノ酸を変化するように設計した：８３位におけるリジン（ＡＡＡ）をグリシン（ＧＧＡ）へ、８４位におけるアルギニン（ＣＧＣ）をグリシン（ＧＧＣ）へ、及び４８２位におけるグリシン（ＧＧＣ）をアスパラギン（ＧＡＣ）へ。
【００６６】
６ｂｅ１コドン最適化変異配列（配列番号３）
ATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGGTTGGTTCATGGT
TGAAGCAATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGATCTCCGATGACGAAGACGAAGAAG
TTGAAGATTCTGGTTACGACATGGTTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAAC
TCTCTGGAAGCACAGGCTCTGTTTAACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGT
TCAGGACCTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGATCAACACTATCG
CAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTGGACGCTATCAAACTGACTCGTCAG
CCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTTCCAGACTCGTGAACTGACCGACTCCGGTTACGG
TTATAGCGAAGTTGAGGCTGGCACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACGGTGTACCGGAAA
ACGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGTGAGGAACACACC
GAAGCTGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACACGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGA
ACTGCTGAAATGCAAAGACCTGCGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCG
GCCTGTCTTTCATTGACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGAC
TGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTGAAGCATTCCAGAAACTGAT
CGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTGGCTGACTAACGCTTGGGGTATGGTTC
TGCTGGTACTGCTGCGCTTTAAAGTAAACAAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCTG
GCTACCCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAAATCCAGTC
TGGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAGCACTGTTATCG
GTGAAGCACCGGAATGGATCACTCGTCAGACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAGATTCT
CAGTTCAAACTGACTGAAATGGTTCAGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATC
TGAAATTGCGTTCGAATACGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCC
TGAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTACCATGTGCCGTCACTAC
AAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAACAGTGGATCAAGCACCGCGGTTCTAA
AATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAACCGATCGTTCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCG
AATTCATCCCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAAAAAC
TGCATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTATGTCCCTGAT
CTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGC
AGCCACTGGTAGACGCGAAAGTAGCTCTGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATC
TACATGGATACTTACATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGTAA
ACACAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGCCGCTGCTGGTAACTTCTAACATCGACA
TCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATACCCGTGTTACTACCTTTACTTTCCCG
AACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTAACGCTGTTTACGAACTGTCCAACACTAACTG
GAAATGCTTCTTCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAG
AAGATGGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGTACTCTG
TGA
【００６７】
アミノ酸配列（配列番号４）
MADDSGTENE GSGCTGWFMV EAIVQHPTGT QISDDEDEEV EDSGYDMVDF 
IDDSNITHNS LEAQALFNRQ EADTHYATVQ DLGGKYLGSP YVSPINTIAE 
AVESEISPRL DAIKLTRQPK KVKRRLFQTR ELTDSGYGYS EVEAGTGTQV 
EKHGVPENGG DGQEKDTGRD IEGEEHTEAE APTNSVREHA GTAGILELLK 
CKDLRAALLG KFKECFGLSF IDLIRPFKSD KTTCLDWVVA GFGIHHSISE 
AFQKLIEPLS LYAHIQWLTN AWGMVLLVLL RFKVNKSRST VARTLATLLN 
IPENQMLIEP PKIQSGVAAL YWFRTGISNA STVIGEAPEW ITRQTVIEHG 
LADSQFKLTE MVQWAYDNDI CEESEIAFEY AQRGDFDSNA RAFLNSNMQA 
KYVKDCATMC RHYKHAEMRK MSIKQWIKHR GSKIEGTGNW KPIVQFLRHQ 
NIEFIPFLTK FKLWLHGTPK KNCIAIVGPP DTDKSYFCMS LISFLGGTVI 
SHVNSSSHFW LQPLVDAKVA LLDDATQPCW IYMDTYMRNL LDGNPMSIDR 
KHKALTLIKC PPLLVTSNID ITKEDKYKYL HTRVTTFTFP NPFPFDRNGN 
AVYELSNTNW KCFFERLSSS LDIQDSEDEE DGSNSQAFRC VPGTVVRTL 
【００６８】
３．プラスミド：ＷＲＧ７０７７  １１ｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ
目的の遺伝子：
ＨＰＶ１１ｅ２遺伝子はサイズが約１．１Ｋｂであり、コドン最適化配列（ヒト発現について）はＳｙｎｇｅｎｅと称するビジュアルベーシックプログラムを用いて作製した。この配列はアミノ酸位置１１１におけるコドン変更を含むほか、野生型におけるリジン残基（ＡＡＧ）をアラニン残基（ＧＣＣ）に変更し、突然変異遺伝子を作製した。この変化は、Ｅ２タンパク質の転写活性を不活性化することが文献で示されている。５’及び３’末端の両末端における選択した制限部位を有し全体遺伝子を含む重複するプライマーを設計し、これを用いて合成コドン最適化変異体１１ｅ２を構築した。
【００６９】
クローニング：
１．２ｋｂのＰＣＲ断片をゲル精製し、制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで消化してベクターｐＷＲＧ７０７７（Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ）と連結した。遺伝子は、全長極初期ＣＭＶプロモーターの制御下にあり、ウシ成長ホルモンポリＡテールを有する。
【００７０】
クローンを配列決定し、所定の数の塩基誤差が示されたが、これらは後で修正した。最終的なクローンＦ１はコドン最適化し突然変異を有する１１Ｅ２であることを確認した。
【００７１】
ｐＷＲＧ７０７７における１１ｅ２配列（配列番号５）
ATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTACGA
GGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGA
GCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTC
CCCCCTCTGACCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCACCT
CGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACACCTCGT
ACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAG
GTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTA
TCTGCAGGACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCT
ACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAAAAG
TATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGC
CAGCGTGTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTG
CCCAGACGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCA
CCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCCTCTGTGTGGCGAACATTCG
CAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGGC
GTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGC
CTTAAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTC
GTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCA
CTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACG
ATCCGTCATAAGGTCGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGTGA
【００７２】
アミノ酸配列（配列番号６）
MEAIAKRLDA CQDQLLELYE ENSIDIHKHI MHWKCIRLES VLLHKAKQMG LSHIGLQVVP 
PLTVSETKGH NAIEMQMHLE SLAKTQYGVE PWTLQDTSYE MWLTPPKRCF AKQGNTVEVK 
FDGCEDNVME YVVWTHIYLQ DNDSWVKVTS SVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FNKEAQKYGS 
TNHWEVCYGS TVICSPASVS STVREVSIAE PTTYTPAQTT APTVSACTTE DGVSAPPRKR 
ARGPSTNNTL CVANIRSVDS TINNIVTDNY NKHQRRNNCH SAATPIVQLQ GDSNCLKCFR 
YRLNDKYKHL FELASSTWHW ASPEAPHKNA IVTLTYSSEE QRQQFLNSVK IPPTIRHKVG 
FMSLHLL
【００７３】
４．プラスミド：ＨＰＶ１０２（ｐ７３１３ｍｅ  １１ｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ）
目的の遺伝子：
コドン最適化した突然変異型１１ｅ２をｐＷＲＧ７０７７  １１ｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔから別の発現ベクターｐ７３１３ｍｅに移した。
【００７４】
クローニング：
１１ｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ断片をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素によりｐＷＲＧ７０７７  １１ｅ２ベクターから切り出した。続いてこの断片をこれらの部位を用いてｐ７３１３ｍｅベクターに連結した。
【００７５】
ＨＰＶ１０２における１１ｅ２配列（配列番号７）
ATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTACGA
GGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGA
GCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTC
CCCCCTCTGACCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCACCT
CGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACACCTCGT
ACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAG
GTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTA
TCTGCAGGACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCT
ACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAAAAG
TATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGC
CAGCGTGTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTG
CCCAGACGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCA
CCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCCTCTGTGTGGCGAACATTCG
CAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGGC
GTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGC
CTTAAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTC
GTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCA
CTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACG
ATCCGTCATAAGGTCGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGTGA
【００７６】
アミノ酸配列（配列番号８）
MEAIAKRLDA CQDQLLELYE ENSIDIHKHI MHWKCIRLES VLLHKAKQMG LSHIGLQVVP 
PLTVSETKGH NAIEMQMHLE SLAKTQYGVE PWTLQDTSYE MWLTPPKRCF AKQGNTVEVK 
FDGCEDNVME YVVWTHIYLQ DNDSWVKVTS SVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FNKEAQKYGS 
TNHWEVCYGS TVICSPASVS STVREVSIAE PTTYTPAQTT APTVSACTTE DGVSAPPRKR 
ARGPSTNNTL CVANIRSVDS TINNIVTDNY NKHQRRNNCH SAATPIVQLQ GDSNCLKCFR 
YRLNDKYKHL FELASSTWHW ASPEAPHKNA IVTLTYSSEE QRQQFLNSVK IPPTIRHKVG 
FMSLHLL
【００７７】
５．プラスミド：ＨＰＶ１０４（ｐ７３１３ｍｅ  ６ｂ／１１ｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ）
目的の遺伝子：
６ｂｅ２と１１ｅ２の融合タンパク質をＨＰＶ１０２及びＨＰＶ１１０を鋳型とし、また適当に設計したプライマーを用いてＰＣＲを２回を行って構築した。融合断片約２．２ｋｂは、融合タンパク質の開始部位において６ｂｅ２を有するｐ７３１３ｍｅ発現ベクターにクローニングした。
【００７８】
クローニング：
２．２ｋｂ融合物をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐ７３１３ｍｅ発現ベクターに連結した。単離したクローンを配列決定により調べ、誤差が挿入されていないことが示された。
【００７９】
ＨＰＶ１０４における６ｂ／１１ｅ２融合配列（配列番号９）
ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAAAACAG
CACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGG
CCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAG
GGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCC
CTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAGCGCG
GCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGAT
GTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGGCATCTATTA
CACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCA
AGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACCCAG
GAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCAC
CAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG
CCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACGAC
CAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAA
CTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGACTTGATCAGTTCCA
CGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAG
GAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCAT
GTCCCTGCACCTGCTGATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGC
TGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGC
GTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGAC
CGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCACCTCGAGTCGCTGGCGAAAACAC
AGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGA
TGCTTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTA
TGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGGACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACG
CGAAGGGCATCTACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAA
AAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGT
GTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTC
CGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCA
AGCACCAACAACACCCTCTGTGTGGCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGAC
GGATAACTATAACAAGCACCAGAGGCGTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCC
AGGGAGACAGCAATTGCCTTAAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAG
CTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCAC
TTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATA
AGGTCGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGA
【００８０】
アミノ酸配列（配列番号１０）
MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP
PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK
FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS
TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA
RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF
RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL
GFMSLHLLME AIAKRLDACQ DQLLELYEEN SIDIHKHIMH WKCIRLESVL LHKAKQMGLS
HIGLQVVPPL TVSETKGHNA IEMQMHLESL AKTQYGVEPW TLQDTSYEMW LTPPKRCFAK
QGNTVEVKFD GCEDNVMEYV VWTHIYLQDN DSWVKVTSSV DAKGIYYTCG QFKTYYVNFN
KEAQKYGSTN HWEVCYGSTV ICSPASVSST VREVSIAEPT TYTPAQTTAP TVSACTTEDG
VSAPPRKRAR GPSTNNTLCV ANIRSVDSTI NNIVTDNYNK HQRRNNCHSA ATPIVQLQGD
SNCLKCFRYR LNDKYKHLFE LASSTWHWAS PEAPHKNAIV TLTYSSEEQR QQFLNSVKIP
PTIRHKVGFM SLHLL
【００８１】
６．プラスミド：ＨＰＶ１０５（ｐ７３１３ｍｅ  １１／６ｂｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ）
目的の遺伝子：
６ｂｅ２と１１ｅ２の融合タンパク質をＨＰＶ１０２及びＨＰＶ１１０を鋳型とし、また適当に設計したプライマーを用いてＰＣＲを２回を行って構築した。融合断片約２．２ｋｂは、融合タンパク質の開始部位において１１ｅ２を有するｐ７３１３ｍｅ発現ベクターにクローニングした。
【００８２】
クローニング：
２．２ｋｂ融合物をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐ７３１３ｍｅ発現ベクターに連結した。単離したクローンを配列決定により調べ、誤差が挿入されていないことが示された。
【００８３】
ＨＰＶ１０５における１１／６ｂＥ２融合配列（配列番号１１）
ATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTACGAGGAGAACAG
CATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGG
CCAAGCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGACCGTGTCAGAGACAAAG
GGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCACCTCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCC
ATGGACCCTGCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAACAGG
GCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCAC
ATCTATCTGCAGGACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCTACTA
TACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCA
ACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTGCGC
GAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTG
TACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCC
TCTGTGTGGCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGATAACTATAACAAG
CACCAGAGGCGTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTG
CCTTAAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTCGTCGACGT
GGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAG
CAGAGACAGCAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGTCGGCTTCATGTC
ACTGCATCTCCTGATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGT
ACGAGGAAAACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTG
CTCCTGTACAAGGCCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGT
GAGCGAAGCCAAGGGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAAT
ACAGCATGGAGCCCTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGT
TTCGCAAAGCGCGGCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGT
GGTGTGGACCGATGTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCA
AGGGCATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAG
TATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTC
GTCCACCACCCAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCG
TCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAG
TCTCCCTGCAATGCCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCAC
GAACAACCACGACCAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCC
AGGGGGAGTCCAACTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGAC
TTGATCAGTTCCACGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGGTGAC
CTACGACTCCGAGGAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACA
AGCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGA
【００８４】
アミノ酸配列（配列番号１２）
MEAIAKRLDA CQDQLLELYE ENSIDIHKHI MHWKCIRLES VLLHKAKQMG LSHIGLQVVP
PLTVSETKGH NAIEMQMHLE SLAKTQYGVE PWTLQDTSYE MWLTPPKRCF AKQGNTVEVK
FDGCEDNVME YVVWTHIYLQ DNDSWVKVTS SVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FNKEAQKYGS
TNHWEVCYGS TVICSPASVS STVREVSIAE PTTYTPAQTT APTVSACTTE DGVSAPPRKR
ARGPSTNNTL CVANIRSVDS TINNIVTDNY NKHQRRNNCH SAATPIVQLQ GDSNCLKCFR
YRLNDKYKHL FELASSTWHW ASPEAPHKNA IVTLTYSSEE QRQQFLNSVK IPPTIRHKVG
FMSLHLLMEA IAKRLDACQE QLLELYEENS TDLHKHVLHW KCMRHESVLL YKAKQMGLSH
IGMQVVPPLK VSEAKGHNAI EMQMHLESLL RTEYSMEPWT LQETSYEMWQ TPPKRCFAKR
GKTVEVKFDG CANNTMDYVV WTDVYVQDND TWVKVHSMVD AKGIYYTCGQ FKTYYVNFVK
EAEKYGSTKH WEVCYGSTVI CSPASVSSTT QEVSIPESTT YTPAQTSTLV SSSTKEDAVQ
TPPRKRARGV QQSPCNALCV AHIGPVDSGN HNLITNNHDQ HQRRNNSNSS ATPIVQFQGE
SNCLKCFRYR LNDRHRHLFD LISSTWHWAS SKAPHKHAIV TVTYDSEEQR QQFLDVVKIP
PTISHKLGFM SLHLL
【００８５】
７．プラスミド：ＨＰＶ１０８（ｐ７３１３ｉｅ  ６ｂｅ１  ｃ／ｏ  ｍｕｔ）
目的の遺伝子：
コドン最適化した突然変異型６ｂｅ１をｐ７３１３ｐｌｃ  ６ｂｅ１  ｃ／ｏ  ｍｕｔクローンＮからベクターｐ７３１３ｉｅに移した。
【００８６】
クローニング：
６ｂｅ１  ｃ／ｏ  ｍｕｔ断片をＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ制限消化物によりｐ７３１３ｐｌｃ  ６ｂｅ２クローンから切り出した。続いてこの断片をこれらの部位を用いてｐ７３１３ｉｅベクターに連結した。この遺伝子はｉｅプロモーター（極初期ｃｍｖ＋エキソン１）の制御下にあり、その後にウサギβグロビンポリアデニル酸付加シグナルを有する。
【００８７】
ｐ７３１３ｉｅにおける６ｂｅ１配列（配列番号１３）
ATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGGTTGGTTCATGGTTGAAGCAAT
CGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGATCTCCGATGACGAAGACGAAGAAGTTGAAGATTCTGGTTACG
ACATGGTTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGCACAGGCTCTGTTTAAC
CGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTCAGGACCTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTCCGTA
CGTTTCCCCGATCAACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTGGACGCTATCA
AACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTTCCAGACTCGTGAACTGACCGACTCCGGT
TACGGTTATAGCGAAGTTGAGGCTGGCACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACGGTGTACCGGAAAACGG
CGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGTGAGGAACACACCGAAGCTGAAGCTC
CGACTAACTCTGTTCGTGAACACGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGAACTGCTGAAATGCAAAGACCTG
CGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCGGCCTGTCTTTCATTGACCTGATCCGTCCGTT
TAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGACTGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTG
AAGCATTCCAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTGGCTGACTAACGCTTGG
GGTATGGTTCTGCTGGTACTGCTGCGCTTTAAAGTAAACAAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCT
GGCTACCCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAAATCCAGTCTGGTGTAG
CTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAGCACTGTTATCGGTGAAGCACCGGAATGG
ATCACTCGTCAGACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAACTGACTGAAATGGTTCA
GTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGCGTTCGAATACGCTCAGCGTGGCGACT
TCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCCTGAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTACC
ATGTGCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAACAGTGGATCAAGCACCGCGG
TTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAACCGATCGTTCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCGAAT
TCATCCCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAAAAACTGCATCGCTATC
GTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTATGTCCCTGATCTCTTTCCTGGGCGGCACTGT
AATCTCTCACGTTAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACTGGTAGACGCGAAAGTAGCTCTGC
TGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATACTTACATGCGCAACCTGCTGGACGGTAAC
CCGATGTCTATCGACCGTAAACACAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGCCGCTGCTGGTAACTTC
TAACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATACCCGTGTTACTACCTTTACTTTCC
CGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTAACGCTGTTTACGAACTGTCCAACACTAACTGGAAATGC
TTCTTCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAGAAGATGGTTCTAACTC
TCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGTACTCTGTGA
【００８８】
アミノ酸配列（配列番号１４）
MADDSGTENE GSGCTGWFMV EAIVQHPTGT QISDDEDEEV EDSGYDMVDF IDDSNITHNS
LEAQALFNRQ EADTHYATVQ DLGGKYLGSP YVSPINTIAE AVESEISPRL DAIKLTRQPK
KVKRRLFQTR ELTDSGYGYS EVEAGTGTQV EKHGVPENGG DGQEKDTGRD IEGEEHTEAE
APTNSVREHA GTAGILELLK CKDLRAALLG KFKECFGLSF IDLIRPFKSD KTTCLDWVVA
GFGIHHSISE AFQKLIEPLS LYAHIQWLTN AWGMVLLVLL RFKVNKSRST VARTLATLLN
IPENQMLIEP PKIQSGVAAL YWFRTGISNA STVIGEAPEW ITRQTVIEHG LADSQFKLTE
MVQWAYDNDI CEESEIAFEY AQRGDFDSNA RAFLNSNMQA KYVKDCATMC RHYKHAEMRK
MSIKQWIKHR GSKIEGTGNW KPIVQFLRHQ NIEFIPFLTK FKLWLHGTPK KNCIAIVGPP
DTDKSYFCMS LISFLGGTVI SHVNSSSHFW LQPLVDAKVA LLDDATQPCW IYMDTYMRNL
LDGNPMSIDR KHKALTLIKC PPLLVTSNID ITKEDKYKYL HTRVTTFTFP NPFPFDRNGN
AVYELSNTNW KCFFERLSSS LDIQDSEDEE DGSNSQAFRC VPGTVVRTL
【００８９】
８．プラスミド：ＨＰＶ１１０（ｐ７３１３ｉｅ  ６ｂｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ）
目的の遺伝子：
コドン最適化した突然変異型６ｂｅ２をｐＷＲＧ７０７７  ６ｂｅ２からベクターｐ７３１３ｉｅに移した。
【００９０】
クローニング：
６ｂｅ２  ｃ／ｏ  ｍｕｔ断片をＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩ制限消化物によりｐＷＲＧ７０７７  ６ｂｅ２クローンから切り出した。続いてこの断片をこれらの部位を用いてｐ７３１３ｉｅベクターに連結した。この遺伝子はｉｅプロモーター（極初期ｃｍｖ＋エキソン１）の制御下にあり、その後にウサギβグロビンポリアデニル酸付加シグナルを有する。
【００９１】
ｐ７３１３ｉｅにおける６ｂｅ２配列（配列番号１５）
ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAAAACAG
CACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGG
CCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAG
GGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCC
CTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAGCGCG
GCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGAT
GTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGGCATCTATTA
CACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCA
AGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACCCAG
GAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCAC
CAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG
CCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACGAC
CAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAA
CTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGACTTGATCAGTTCCA
CGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAG
GAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCAT
GTCCCTGCACCTGCTGTGA
【００９２】
アミノ酸配列（配列番号１６）
MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP
PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK
FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS
TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA
RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF
RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL
GFMSLHLL
【００９３】
９．プラスミド：ＨＰＶ１１６（ｐ７３１３ｉｅ  ６ｂｅ１．６ｂｅ２．１１ｅ２）
目的の遺伝子：
構築物ＨＰＶ１１６におけるポリタンパク質の遺伝子は、コドン最適化し突然変異型の６ｂｅ１、６ｂｅ２、１１ｅ２の全てをこの順で含む三重融合タンパク質である。ポリタンパク質遺伝子は、２回の以前のＰＣＲ断片（６ｂｅ１及び６ｂ／１１ｅ２）を用いてＰＣＲにより構築した。遺伝子のサイズは約４．１ｋｂであり、ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより観察したところ約１７０ｋＤのポリタンパク質が生成された。
【００９４】
クローニング：
ポリタンパク質遺伝子はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐ７３１３ｉｅベクターに連結した。選択したクローンの配列決定分析は、所定の「普通ではない」塩基変化を示したが、これは種々の断片を交換することにより解消された。得られたクローンｈｐｖ１１６  ＃１は誤差がないことを確認した。
【００９５】
ＨＰＶ１１６におけるポリタンパク質配列（配列番号１７）
ATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGGTTGGTTCATGGTTGAAGCAA
TCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGATCTCCGATGACGAAGACGAAGAAGTTGAAGATTCTGGTTA
CGACATGGTTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGCACAGGCTCTGTTT
AACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTCAGGACCTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTC
CGTACGTTTCCCCGATCAACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCGCGCCTGGACGC
TATCAAACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTTCCAGACTCGTGAACTGACCGAC
TCCGGTTACGGTTATAGCGAAGTTGAGGCTGGCACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACGGTGTACCGG
AAAACGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGTGAGGAACACACCGAAGC
TGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACACGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGAACTGCTGAAATGC
AAAGACCTGCGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCGGCCTGTCTTTCATTGACCTGA
TCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGACTGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATCCACCA
CTCTATCTCTGAAGCATTCCAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTGGCTG
ACTAACGCTTGGGGTATGGTTCTGCTGGTACTGCTGCGCTTTAAAGTAAACAAATCTCGTTCCACTG
TTGCTCGTACTCTGGCTACCCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAAAT
CCAGTCTGGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAGCACTGTTATCGGT
GAAGCACCGGAATGGATCACTCGTCAGACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAAC
TGACTGAAATGGTTCAGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGCGTTCGAATA
CGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCCTGAACAGCAACATGCAGGCTAAATAC
GTAAAAGACTGCGCTACCATGTGCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAAC
AGTGGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAACCGATCGTTCAGTTCCT
GCGCCATCAGAACATCGAATTCATCCCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCG
AAAAAAAACTGCATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTATGTCCCTGA
TCTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACT
GGTAGACGCGAAAGTAGCTCTGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATACTTAC
ATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGTAAACACAAAGCGCTGACTCTGATCA
AGTGCCCGCCGCTGCTGGTAACTTCTAACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCA
TACCCGTGTTACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTAACGCTGTTTAC
GAACTGTCCAACACTAACTGGAAATGCTTCTTCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACT
CTGAAGATGAAGAAGATGGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGTAC
TCTGATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAA
AACAGCACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGT
ACAAGGCCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGA
AGCCAAGGGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGC
ATGGAGCCCTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCG
CAAAGCGCGGCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGT
GTGGACCGATGTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAG
GGCATCTATTACACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGT
ATGGTTCCACCAAGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTC
GTCCACCACCCAGGAAGTGAGCATTCCGGAGAGACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCG
TCAGCAGCAGCACCAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCA
GTCTCCCTGCAATGCCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATC
ACGAACAACCACGACCAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGT
TCCAGGGGGAGTCCAACTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTT
CGACTTGATCAGTTCCACGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACG
GTGACCTACGACTCCGAGGAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCA
GCCACAAGCTTGGCTTCATGTCCCTGCACCTGCTGATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTG
CCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGG
AAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCC
TTCAGGTGGTCCCCCCTCTGACCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCA
CCTCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACACCTCGTACGAA
ATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACG
GCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGGACAACGACAGTTG
GGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCTACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTAC
TATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGA
GCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGAC
CACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGC
GCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCCTCTGTGTGGCGAACATTCGCA
GCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGGCGTAACAACTG
TCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGCCTTAAGTGCTTCCGCTAT
CGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCG
AGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCT
GAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGTCGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGTGA
【００９６】
アミノ酸配列（配列番号１８）
MADDSGTENE GSGCTGWFMV EAIVQHPTGT QISDDEDEEV EDSGYDMVDF IDDSNITHNS 
LEAQALFNRQ EADTHYATVQ DLGGKYLGSP YVSPINTIAE AVESEISPRL DAIKLTRQPK 
KVKRRLFQTR ELTDSGYGYS EVEAGTGTQV EKHGVPENGG DGQEKDTGRD IEGEEHTEAE 
APTNSVREHA GTAGILELLK CKDLRAALLG KFKECFGLSF IDLIRPFKSD KTTCLDWVVA 
GFGIHHSISE AFQKLIEPLS LYAHIQWLTN AWGMVLLVLL RFKVNKSRST VARTLATLLN 
IPENQMLIEP PKIQSGVAAL YWFRTGISNA STVIGEAPEW ITRQTVIEHG LADSQFKLTE 
MVQWAYDNDI CEESEIAFEY AQRGDFDSNA RAFLNSNMQA KYVKDCATMC RHYKHAEMRK
MSIKQWIKHR GSKIEGTGNW KPIVQFLRHQ NIEFIPFLTK FKLWLHGTPK KNCIAIVGPP 
DTDKSYFCMS LISFLGGTVI SHVNSSSHFW LQPLVDAKVA LLDDATQPCW IYMDTYMRNL 
LDGNPMSIDR KHKALTLIKC PPLLVTSNID ITKEDKYKYL HTRVTTFTFP NPFPFDRNGN 
AVYELSNTNW KCFFERLSSS LDIQDSEDEE DGSNSQAFRC VPGTVVRTLM EAIAKRLDAC 
QEQLLELYEE NSTDLHKHVL HWKCMRHESV LLYKAKQMGL SHIGMQVVPP LKVSEAKGHN 
AIEMQMHLES LLRTEYSMEP WTLQETSYEM WQTPPKRCFA KRGKTVEVKF DGCANNTMDY 
VVWTDVYVQD NDTWVKVHSM VDAKGIYYTC GQFKTYYVNF VKEAEKYGST KHWEVCYGST
VICSPASVSS TTQEVSIPES TTYTPAQTST LVSSSTKEDA VQTPPRKRAR GVQQSPCNAL 
CVAHIGPVDS GNHNLITNNH DQHQRRNNSN SSATPIVQFQ GESNCLKCFR YRLNDRHRHL 
FDLISSTWHW ASSKAPHKHA IVTVTYDSEE QRQQFLDVVK IPPTISHKLG FMSLHLLMEA 
IAKRLDACQD QLLELYEENS IDIHKHIMHW KCIRLESVLL HKAKQMGLSH IGLQVVPPLT 
VSETKGHNAI EMQMHLESLA KTQYGVEPWT LQDTSYEMWL TPPKRCFAKQ GNTVEVKFDG 
CEDNVMEYVV WTHIYLQDND SWVKVTSSVD AKGIYYTCGQ FKTYYVNFNK EAQKYGSTNH 
WEVCYGSTVI CSPASVSSTV REVSIAEPTT YTPAQTTAPT VSACTTEDGV SAPPRKRARG
PSTNNTLCVA NIRSVDSTIN NIVTDNYNKH QRRNNCHSAA TPIVQLQGDS NCLKCFRYRL 
NDKYKHLFEL ASSTWHWASP EAPHKNAIVT LTYSSEEQRQ QFLNSVKIPP TIRHKVGFMS 
LHLL
【００９７】
１０．プラスミド：ＨＰＶ１１７（ｐ７３１３ｉｅ  ６ｂｅ２．６ｂｅ１．１１ｅ２）
目的の遺伝子：
構築物ＨＰＶ１１７におけるポリタンパク質の遺伝子は、コドン最適化し突然変異型の６ｂｅ２、６ｂｅ１、１１ｅ２の全てをこの順で含む三重融合タンパク質である。ポリタンパク質遺伝子は、３回の以前のＰＣＲ断片（６ｂｅ１及び６ｂｅ２及び１１ｅ２）を用いてＰＣＲにより構築した。遺伝子のサイズは約４．１ｋｂであり、ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより観察したところ約１７０ｋＤのポリタンパク質が生成された。
【００９８】
クローニング：
ポリタンパク質遺伝子はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐ７３１３ｉｅベクターに連結した。選択したクローンの配列決定分析は、所定の「普通ではない」塩基変化を示したが、これは種々の断片を交換することにより解消された。得られたクローンｈｐｖ１１７  ＃６は誤差がないことを確認した。
【００９９】
ＨＰＶ１１７におけるポリタンパク質配列（配列番号１９）
ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAAAACAG
CACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGG
CCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAG
GGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCC
CTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAGCGCG
GCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGAT
GTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGGCATCTATTA
CACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCA
AGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACCCAG
GAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCAC
CAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG
CCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACGAC
CAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAA
CTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGACTTGATCAGTTCCA
CGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAG
GAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCAT
GTCCCTGCACCTGCTGATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGTTGTACCGGTTGGT
TCATGGTTGAAGCAATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGATCTCCGATGACGAAGACGAAGAAGTT
GAAGATTCTGGTTACGACATGGTTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATAACTCTCTGGAAGC
ACAGGCTCTGTTTAACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTCAGGACCTGGGAGGCAAAT
ATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGATCAACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTCTGAAATCTCCCCG
CGCCTGGACGCTATCAAACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGTTCCAGACTCGTGA
ACTGACCGACTCCGGTTACGGTTATAGCGAAGTTGAGGCTGGCACCGGCACCCAGGTTGAAAAACACG
GTGTACCGGAAAACGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGAGGGTGAGGAACAC
ACCGAAGCTGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACACGCAGGTACTGCGGGTATCCTGGAACTGCT
GAAATGCAAAGACCTGCGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCGGCCTGTCTTTCATTG
ACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGACTGGGTTGTAGCAGGCTTCGGCATC
CACCACTCTATCTCTGAAGCATTCCAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACGCGCACATCCAGTG
GCTGACTAACGCTTGGGGTATGGTTCTGCTGGTACTGCTGCGCTTTAAAGTAAACAAATCTCGTTCCA
CTGTTGCTCGTACTCTGGCTACCCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGATCGAACCGCCGAAA
ATCCAGTCTGGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTAGCACTGTTATCGG
TGAAGCACCGGAATGGATCACTCGTCAGACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAGATTCTCAGTTCAAAC
TGACTGAAATGGTTCAGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAATTGCGTTCGAATAC
GCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCCTGAACAGCAACATGCAGGCTAAATACGT
AAAAGACTGCGCTACCATGTGCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATGTCTATCAAACAGT
GGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAACCGATCGTTCAGTTCCTGCGC
CATCAGAACATCGAATTCATCCCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACGGTACCCCGAAAAA
AAACTGCATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTATGTCCCTGATCTCTT
TCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGCAGCCACTGGTAGAC
GCGAAAGTAGCTCTGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATACTTACATGCGCAA
CCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGTAAACACAAAGCGCTGACTCTGATCAAGTGCCCGC
CGCTGCTGGTAACTTCTAACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCTGCATACCCGTGTT
ACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTAACGCTGTTTACGAACTGTCCAA
CACTAACTGGAAATGCTTCTTCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGACTCTGAAGATGAAG
AAGATGGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGTACTCTGATGGAAGCC
ATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGCTGTACGAGGAGAACAGCATTGACAT
CCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGCGTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGA
TGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGACCGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAAC
GCAATCGAGATGCAGATGCACCTCGAGTCGCTGGCGAAAACACAGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCT
GCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGATGCTTCGCCAAACAGGGCAACACAG
TGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTATGTCGTGTGGACGCACATCTATCTG
CAGGACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACGCGAAGGGCATCTACTATACCTGTGG
GCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAAAAGTATGGCTCCACCAACCACTGGG
AGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGTGTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGC
ATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTCCGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGA
GGACGGCGTGAGCGCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCAAGCACCAACAACACCCTCTGTGTGG
CGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGACGGATAACTATAACAAGCACCAGAGG
CGTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCCAGGGAGACAGCAATTGCCTTAAGTG
CTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAGCTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGG
CCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCACTTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAG
CAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATAAGGTCGGCTTCATGTCACTGCATCT
CCTGTGA
【０１００】
アミノ酸配列（配列番号２０）
MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP
PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK
FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS
TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA
RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF
RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL
GFMSLHLLMA DDSGTENEGS GCTGWFMVEA IVQHPTGTQI SDDEDEEVED SGYDMVDFID
DSNITHNSLE AQALFNRQEA DTHYATVQDL GGKYLGSPYV SPINTIAEAV ESEISPRLDA
IKLTRQPKKV KRRLFQTREL TDSGYGYSEV EAGTGTQVEK HGVPENGGDG QEKDTGRDIE
GEEHTEAEAP TNSVREHAGT AGILELLKCK DLRAALLGKF KECFGLSFID LIRPFKSDKT
TCLDWVVAGF GIHHSISEAF QKLIEPLSLY AHIQWLTNAW GMVLLVLLRF KVNKSRSTVA
RTLATLLNIP ENQMLIEPPK IQSGVAALYW FRTGISNAST VIGEAPEWIT RQTVIEHGLA
DSQFKLTEMV QWAYDNDICE ESEIAFEYAQ RGDFDSNARA FLNSNMQAKY VKDCATMCRH
YKHAEMRKMS IKQWIKHRGS KIEGTGNWKP IVQFLRHQNI EFIPFLTKFK LWLHGTPKKN
CIAIVGPPDT DKSYFCMSLI SFLGGTVISH VNSSSHFWLQ PLVDAKVALL DDATQPCWIY
MDTYMRNLLD GNPMSIDRKH KALTLIKCPP LLVTSNIDIT KEDKYKYLHT RVTTFTFPNP
FPFDRNGNAV YELSNTNWKC FFERLSSSLD IQDSEDEEDG SNSQAFRCVP GTVVRTLMEA
IAKRLDACQD QLLELYEENS IDIHKHIMHW KCIRLESVLL HKAKQMGLSH IGLQVVPPLT
VSETKGHNAI EMQMHLESLA KTQYGVEPWT LQDTSYEMWL TPPKRCFAKQ GNTVEVKFDG
CEDNVMEYVV WTHIYLQDND SWVKVTSSVD AKGIYYTCGQ FKTYYVNFNK EAQKYGSTNH
WEVCYGSTVI CSPASVSSTV REVSIAEPTT YTPAQTTAPT VSACTTEDGV SAPPRKRARG
PSTNNTLCVA NIRSVDSTIN NIVTDNYNKH QRRNNCHSAA TPIVQLQGDS NCLKCFRYRL
NDKYKHLFEL ASSTWHWASP EAPHKNAIVT LTYSSEEQRQ QFLNSVKIPP TIRHKVGFMS
LHLL
【０１０１】
１１．プラスミド：ＨＰＶ１１８（ｐ７３１３ｉｅ  ６ｂｅ２．１１ｅ２．６ｂｅ１）
目的の遺伝子：
構築物ＨＰＶ１１８におけるポリタンパク質の遺伝子は、コドン最適化し突然変異型の６ｂｅ２、１１ｅ２、６ｂｅ１の全てをこの順で含む三重融合タンパク質である。ポリタンパク質遺伝子は、２回の以前のＰＣＲ断片（６ｂｅ１及び１１／６ｂｅ２）を用いてＰＣＲにより構築した。遺伝子のサイズは約４．１ｋｂであり、ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットにより観察したところ約１７０ｋＤのポリタンパク質が生成された。
【０１０２】
クローニング：
ポリタンパク質遺伝子はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化し、ｐ７３１３ｉｅベクターに連結した。選択したクローンの配列決定分析は、所定の「普通ではない」塩基変化を示したが、これは種々の断片を交換することにより解消された。得られたクローンｈｐｖ１１８  ＃３は誤差がないことを確認した。
【０１０３】
ＨＰＶ１１８におけるポリタンパク質配列（配列番号２１）
ATGGAAGCTATTGCCAAGCGACTGGACGCCTGCCAGGAGCAGCTGCTGGAGCTGTACGAGGAAAACAG
CACAGACCTCCACAAGCACGTGCTGCACTGGAAGTGCATGCGCCACGAGTCAGTGCTCCTGTACAAGG
CCAAGCAGATGGGGCTGTCCCACATCGGGATGCAGGTCGTGCCCCCGCTGAAGGTGAGCGAAGCCAAG
GGCCACAACGCTATCGAGATGCAGATGCACCTGGAGAGCCTGCTGCGGACCGAATACAGCATGGAGCC
CTGGACTCTCCAGGAGACGTCCTACGAAATGTGGCAGACTCCTCCGAAGCGCTGTTTCGCAAAGCGCG
GCAAGACAGTTGAGGTGAAATTCGATGGGTGCGCAAACAACACGATGGACTACGTGGTGTGGACCGAT
GTCTACGTGCAGGACAATGACACCTGGGTGAAGGTACATAGTATGGTGGATGCCAAGGGCATCTATTA
CACCTGCGGGCAGTTCAAGACGTACTACGTCAACTTCGTCAAGGAAGCCGAAAAGTATGGTTCCACCA
AGCACTGGGAGGTGTGTTACGGGAGTACTGTGATCTGCAGCCCCGCCTCCGTGTCGTCCACCACCCAG
GAAGTGAGCATTCCGGAGAGCACCACATACACCCCGGCCCAAACGAGCACGCTCGTCAGCAGCAGCAC
CAAGGAGGACGCCGTCCAGACGCCCCCCCGGAAGAGGGCCCGGGGGGTCCAGCAGTCTCCCTGCAATG
CCCTGTGCGTTGCTCACATCGGCCCTGTCGATTCTGGGAACCACAATCTCATCACGAACAACCACGAC
CAGCACCAAAGGCGCAACAACTCTAACAGCTCCGCAACTCCAATAGTGCAGTTCCAGGGGGAGTCCAA
CTGCCTCAAGTGTTTCCGCTACCGCCTCAACGACCGCCACCGCCACCTGTTCGACTTGATCAGTTCCA
CGTGGCACTGGGCCAGCAGCAAGGCGCCCCACAAACACGCTATCGTGACGGTGACCTACGACTCCGAG
GAGCAGAGGCAGCAGTTCCTGGACGTCGTGAAGATTCCTCCGACAATCAGCCACAAGCTTGGCTTCAT
GTCCCTGCACCTGCTGATGGAAGCCATCGCGAAGAGGCTCGACGCCTGCCAGGACCAGCTGCTCGAGC
TGTACGAGGAGAACAGCATTGACATCCATAAGCACATCATGCACTGGAAGTGCATTCGCCTGGAGAGC
GTGCTGTTGCACAAGGCCAAGCAGATGGGCCTGTCCCACATAGGCCTTCAGGTGGTCCCCCCTCTGAC
CGTGTCAGAGACAAAGGGCCATAACGCAATCGAGATGCAGATGCACCTCGAGTCGCTGGCGAAAACAC
AGTACGGCGTGGAGCCATGGACCCTGCAGGACACCTCGTACGAAATGTGGCTGACCCCACCTAAGCGA
TGCTTCGCCAAACAGGGCAACACAGTGGAGGTGAAGTTCGACGGCTGTGAGGATAACGTTATGGAGTA
TGTCGTGTGGACGCACATCTATCTGCAGGACAACGACAGTTGGGTGAAGGTGACCAGCTCCGTGGACG
CGAAGGGCATCTACTATACCTGTGGGCAGTTTAAAACCTACTATGTGAACTTCAACAAAGAGGCCCAA
AAGTATGGCTCCACCAACCACTGGGAGGTCTGCTATGGGAGCACGGTGATTTGCTCTCCCGCCAGCGT
GTCTAGCACTGTGCGCGAGGTGAGCATTGCCGAGCCGACCACGTACACCCCTGCCCAGACGACCGCTC
CGACCGTGTCTGCTTGTACTACCGAGGACGGCGTGAGCGCTCCACCCAGGAAGCGTGCGAGGGGCCCA
AGCACCAACAACACCCTCTGTGTGGCGAACATTCGCAGCGTCGACAGTACCATCAATAACATCGTGAC
GGATAACTATAACAAGCACCAGAGGCGTAACAACTGTCACTCTGCCGCAACCCCCATCGTGCAGCTCC
AGGGAGACAGCAATTGCCTTAAGTGCTTCCGCTATCGCCTCAACGACAAGTACAAGCACCTCTTTGAG
CTCGCCTCGTCGACGTGGCACTGGGCCTCACCCGAGGCACCTCACAAGAACGCCATCGTCACTCTCAC
TTACTCCAGTGAGGAGCAGAGACAGCAGTTTCTGAACAGCGTGAAGATCCCACCGACGATCCGTCATA
AGGTCGGCTTCATGTCACTGCATCTCCTGATGGCAGACGATTCCGGTACTGAGAACGAAGGTTCTGGT
TGTACCGGTTGGTTCATGGTTGAAGCAATCGTTCAGCATCCGACTGGTACCCAGATCTCCGATGACGA
AGACGAAGAAGTTGAAGATTCTGGTTACGACATGGTTGACTTCATCGATGACTCCAACATCACTCATA
ACTCTCTGGAAGCACAGGCTCTGTTTAACCGCCAGGAAGCTGATACCCATTACGCTACTGTTCAGGAC
CTGGGAGGCAAATATCTGGGCTCTCCGTACGTTTCCCCGATCAACACTATCGCAGAAGCAGTTGAGTC
TGAAATCTCCCCGCGCCTGGACGCTATCAAACTGACTCGTCAGCCGAAGAAGGTTAAACGTCGTCTGT
TCCAGACTCGTGAACTGACCGACTCCGGTTACGGTTATAGCGAAGTTGAGGCTGGCACCGGCACCCAG
GTTGAAAAACACGGTGTACCGGAAAACGGCGGCGACGGTCAGGAAAAGGACACCGGCCGCGACATCGA
GGGTGAGGAACACACCGAAGCTGAAGCTCCGACTAACTCTGTTCGTGAACACGCAGGTACTGCGGGTA
TCCTGGAACTGCTGAAATGCAAAGACCTGCGCGCGGCTCTGCTGGGCAAATTCAAAGAATGCTTCGGC
CTGTCTTTCATTGACCTGATCCGTCCGTTTAAGTCTGACAAAACTACCTGTCTGGACTGGGTTGTAGC
AGGCTTCGGCATCCACCACTCTATCTCTGAAGCATTCCAGAAACTGATCGAGCCGCTGTCTCTGTACG
CGCACATCCAGTGGCTGACTAACGCTTGGGGTATGGTTCTGCTGGTACTGCTGCGCTTTAAAGTAAAC
AAATCTCGTTCCACTGTTGCTCGTACTCTGGCTACCCTGCTGAACATCCCGGAGAACCAGATGCTGAT
CGAACCGCCGAAAATCCAGTCTGGTGTAGCTGCACTGTACTGGTTTCGTACTGGCATCTCTAACGCTA
GCACTGTTATCGGTGAAGCACCGGAATGGATCACTCGTCAGACCGTTATCGAACACGGTCTGGCAGAT
TCTCAGTTCAAACTGACTGAAATGGTTCAGTGGGCATACGACAACGACATCTGCGAGGAATCTGAAAT
TGCGTTCGAATACGCTCAGCGTGGCGACTTCGACTCCAACGCTCGTGCTTTCCTGAACAGCAACATGC
AGGCTAAATACGTAAAAGACTGCGCTACCATGTGCCGTCACTACAAACACGCGGAAATGCGTAAAATG
TCTATCAAACAGTGGATCAAGCACCGCGGTTCTAAAATCGAAGGTACCGGTAACTGGAAACCGATCGT
TCAGTTCCTGCGCCATCAGAACATCGAATTCATCCCGTTCCTGACCAAATTCAAGCTGTGGCTGCACG
GTACCCCGAAAAAAAACTGCATCGCTATCGTAGGTCCACCGGACACTGACAAGTCTTACTTCTGTATG
TCCCTGATCTCTTTCCTGGGCGGCACTGTAATCTCTCACGTTAACTCTTCCTCCCATTTCTGGCTGCA
GCCACTGGTAGACGCGAAAGTAGCTCTGCTGGACGACGCGACCCAGCCGTGCTGGATCTACATGGATA
CTTACATGCGCAACCTGCTGGACGGTAACCCGATGTCTATCGACCGTAAACACAAAGCGCTGACTCTG
ATCAAGTGCCCGCCGCTGCTGGTAACTTCTAACATCGACATCACCAAGGAAGATAAATACAAGTACCT
GCATACCCGTGTTACTACCTTTACTTTCCCGAACCCGTTCCCGTTTGATCGTAACGGTAACGCTGTTT
ACGAACTGTCCAACACTAACTGGAAATGCTTCTTCGAGCGTCTGTCTTCCTCCCTGGACATCCAGGAC
TCTGAAGATGAAGAAGATGGTTCTAACTCTCAGGCTTTCCGTTGTGTTCCGGGTACTGTTGTTCGTAC
TCTGTGA
【０１０４】
アミノ酸配列（配列番号２２）
MEAIAKRLDA CQEQLLELYE ENSTDLHKHV LHWKCMRHES VLLYKAKQMG LSHIGMQVVP 
PLKVSEAKGH NAIEMQMHLE SLLRTEYSME PWTLQETSYE MWQTPPKRCF AKRGKTVEVK 
FDGCANNTMD YVVWTDVYVQ DNDTWVKVHS MVDAKGIYYT CGQFKTYYVN FVKEAEKYGS 
TKHWEVCYGS TVICSPASVS STTQEVSIPE STTYTPAQTS TLVSSSTKED AVQTPPRKRA 
RGVQQSPCNA LCVAHIGPVD SGNHNLITNN HDQHQRRNNS NSSATPIVQF QGESNCLKCF 
RYRLNDRHRH LFDLISSTWH WASSKAPHKH AIVTVTYDSE EQRQQFLDVV KIPPTISHKL 
GFMSLHLLME AIAKRLDACQ DQLLELYEEN SIDIHKHIMH WKCIRLESVL LHKAKQMGLS 
HIGLQVVPPL TVSETKGHNA IEMQMHLESL AKTQYGVEPW TLQDTSYEMW LTPPKRCFAK 
QGNTVEVKFD GCEDNVMEYV VWTHIYLQDN DSWVKVTSSV DAKGIYYTCG QFKTYYVNFN 
KEAQKYGSTN HWEVCYGSTV ICSPASVSST VREVSIAEPT TYTPAQTTAP TVSACTTEDG 
VSAPPRKRAR GPSTNNTLCV ANIRSVDSTI NNIVTDNYNK HQRRNNCHSA ATPIVQLQGD 
SNCLKCFRYR LNDKYKHLFE LASSTWHWAS PEAPHKNAIV TLTYSSEEQR QQFLNSVKIP 
PTIRHKVGFM SLHLLMADDS GTENEGSGCT GWFMVEAIVQ HPTGTQISDD EDEEVEDSGY 
DMVDFIDDSN ITHNSLEAQA LFNRQEADTH YATVQDLGGK YLGSPYVSPI NTIAEAVESE 
ISPRLDAIKL TRQPKKVKRR LFQTRELTDS GYGYSEVEAG TGTQVEKHGV PENGGDGQEK 
DTGRDIEGEE HTEAEAPTNS VREHAGTAGI LELLKCKDLR AALLGKFKEC FGLSFIDLIR 
PFKSDKTTCL DWVVAGFGIH HSISEAFQKL IEPLSLYAHI QWLTNAWGMV LLVLLRFKVN 
KSRSTVARTL ATLLNIPENQ MLIEPPKIQS GVAALYWFRT GISNASTVIG EAPEWITRQT 
VIEHGLADSQ FKLTEMVQWA YDNDICEESE IAFEYAQRGD FDSNARAFLN SNMQAKYVKD 
CATMCRHYKH AEMRKMSIKQ WIKHRGSKIE GTGNWKPIVQ FLRHQNIEFI PFLTKFKLWL 
HGTPKKNCIA IVGPPDTDKS YFCMSLISFL GGTVISHVNS SSHFWLQPLV DAKVALLDDA 
TQPCWIYMDT YMRNLLDGNP MSIDRKHKAL TLIKCPPLLV TSNIDITKED KYKYLHTRVT 
TFTFPNPFPF DRNGNAVYEL SNTNWKCFFE RLSSSLDIQD SEDEEDGSNS QAFRCVPGTV 
VRTL
【０１０５】
ＣｏｌＥ１  ｃｅｒ配列は、David Hodgeson（Warwick University）から得たプラスミドｐＤＡＨ２１２からのサブクローンより、ＥｃｏＲＩ制限部位を配列の末端に配置するためにプライマーを用いてＰＣＲにより増幅して得た。続いてｃｅｒ配列をｐ７３１３−ＰＬのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐ７３１３−ＰＬｃを生成した。増幅されたｃｅｒの配列を、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１４１１に対して確認した。
【実施例２】
【０１０６】
哺乳動物２９３Ｔ細胞における発現
哺乳動物２９３Ｔ細胞を、６ウエルのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１０  Ｔｈｅ  ＶａｌｌｅｙＣｅｎｔｒｅ、Ｇｏｒｄｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ、バッキンガムシア州、イギリス）組織培養用プレートで３７℃で５％ＣＯ２中で一晩、対数期の終濃度２×１０５細胞となるまで増殖させた。以下のトランスフェクション用混合物を調製し、２５分間かけて複合させた。
【０１０７】
目的ＤＮＡ                                                ２μｇ
２μｇ
滅菌再蒸留水で体積調整                                    １６μｌ
ＯＰＴＩ−ｍｅｍ（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ペーズリー、スコットランド）８μｌ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）    ６μｌ
ウエルにおける各細胞単層をＯＰＴＩ−ｍｅｍ（商標）で注意深く２回洗浄した。ＯＰＴＩ−ｍｅｍ（商標）８００μｌを各ウエルに加えた。ＯＰＴＩ−ｍｅｍ（商標）２００μｌを各トランスフェクション混合物に加え、混合し、細胞単層に静かに加えた。プレートを３７℃で５％ＣＯ２中で５時間培養し、その後トランスフェクション混合物及びＯＰＴＩ−ｍｅｍ（商標）を捨てた。細胞単層を細胞増殖培地で２回静かに洗い、最後に１０％ウシ胎仔血清及び２９．２ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で、トランスフェクトされた細胞を３７℃で５％ＣＯ２中で２４時間培養した。細胞を剥がしてマイクロ試験管に入れ、ＰＢＳで２回洗浄し、遠心分離で沈殿させ、細胞のペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）色素中に再懸濁した。細胞のペレットを沸騰させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに導入し、１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳ緩衝液で電気泳動させた。電気泳動後にゲルをニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写し、ウエスタンブロットを行った。ニトロセルロース膜を、ＰＢＳに溶かした５％Ｍａｒｖｅｌ（商標）（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｅｖｅｒａｇｅｓ、Ｋｎｉｇｈｔｏｎ、Ａｄｂａｓｔｏｎ  スタッフォード、イギリス）を用いて室温で３０分間ブロッキングし、ＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。ＨＰＶ６ｂＥ１のＣ末端タンパク質配列（タンパク質配列：ＣＳＳＳＬＤＩＱＤＳＥＤＥＥＤＧＳＮＳＱＡＦＲ、配列番号２３）に対してウサギで作製されたポリクローナル抗体を、ＰＢＳに溶かした５％Ｍａｒｖｅｌ（商標）で希釈し、ニトロセルロース膜に加えた。これを静かに振盪させながら室温で１時間インキュベートした。ＨＰＶ１１Ｅ１に対するポリクローナル抗体も交差反応性をチェックするために使用した。希釈した抗体を除去し、ＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で膜を３回洗浄した。二次結合体であるブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＤＡＫＯ）をＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１：２００００に希釈した。これを洗浄後の膜に加え、静かに振盪させながら室温で１時間インキュベートした。次に、その膜をＰＢＳ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で完全に洗浄した。化学発光ＨＲＰキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して膜上に移行したタンパク質を検出した。
【０１０８】
結果：
結果（図１３）は、コドンを最適化したＨＰＶポリタンパク質を含有するＨＰＶ１１６、１１７及び１１８のそれぞれが正確なサイズのタンパク質を発現したことを示す。
【０１０９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれの構築物のＤＮＡ約０．５ｕｇをトランスフェクトし、その２４時間後に細胞を回収した。これらの試料をまずポリアクリルアミド電気泳動により、次にウエスタンブロットにより分析した。ポリタンパク質の発現（約１８０ｋｄ）を検出するために２つのペプチド抗体である抗６ｂＥ１（ｎｏ．１０９７）及び抗６ｂＥ２（ｎｏ．１１０１）を使用した。
【実施例３】
【０１１０】
Ｅ１抗原の不活性化と実験による確認
ＨＰＶのＥ１タンパク質は、非特異的にＤＮＡと結合する、ＡＴＰアーゼ活性及びヘリカーゼ活性を有する保存性の高い核タンパク質である。Ｅ１は宿主の細胞性ＤＮＡポリメラーゼ−αプライマーゼ及びＨＰＶのＥ２タンパク質とも結合し、Ｅ２タンパク質は次に開始前ウイルスＤＮＡ複製複合体にＥ１を「動員」する。Ｅ１の主な役割は感染細胞におけるウイルス特異的ＤＮＡ複製を開始することである。
【０１１１】
Ｅ１（及びＥ２）のＤＮＡ複製機能は比較的に非特異的で、１つの遺伝子型からのＥ１及びＥ２タンパク質が、異なる遺伝子型からの複製起点配列を保持するプラスミドの起点特異的なＤＮＡ複製を駆動できることを多くの研究が今や示している。研究は、低コピー数のＨＰＶプラスミドをすでに保有している細胞に、高度に発現されるＥ１及びＥ２を導入すると、そのプラスミドの顕著な増幅を招きうることも示した。この無秩序は、小さな潜在的な安全性リスクを有しており、プロジェクトはそのリスクを排除することを探索した。その結果、Ｅ１（及びＥ２）の複製能を不活性化する突然変異が探索された。
【０１１２】
Ｅ１突然変異であるＧ４８２Ｄは高度に保存されたＡＴＰ結合コンセンサス配列に生じ、この突然変異を有しているＥ１タンパク質は多数の機能的欠損を有することが示された。このタンパク質のＮ末端への他の突然変異（Ｋ８３Ｇ、Ｒ８４Ｇ）はＥ１の核への局在を排除することが示された。核区画に局在しないことは、宿主の複製タンパク質及びウイルスＤＮＡからＥ１を分離するためにも役立ち、追加レベルの不能及び安全をもたらす。これらの突然変異（Ｇ４２８Ｄ、Ｋ８３Ｇ、Ｒ８４Ｇ）を選択し、ＨＰＶのＤＮＡ免疫治療用Ｅ１ベクターの一部としてＥ１に組み込んだ。
【０１１３】
Ｅ１のＤＮＡ複製機能が無能であることを確認するために、ＨＰＶのＤＮＡ複製のインビトロアッセイを使用した（付随して、突然変異によるＥ２の複製増強活性の不活性化もこの同一のアッセイで確認できた）。簡潔にはＥ１及びＥ２は協同してＨＰＶの複製起点を活性化し、ＨＰＶ６ｂ由来のＥ１及びＥ２タンパク質はＨＰＶ−１１の起源からの新規なＤＮＡ複製を活性化し駆動することが知られていた。本発明者のコドンを最適化したＥ１及びＥ２配列をコードするプラスミドを、ＨＰＶ−１１の複製起点（ｏｒｉプラスミド）を有するプラスミドと共に２９３細胞に共トランスフェクトした。共トランスフェクションの４８時間後に細胞からＤＮＡを回収することにより、Ｅ１及びＥ２に依存した投入ｏｒｉプラスミドの複製を測定する（ハート（Ｈｉｒｔ）溶解）。抽出されたＤＮＡをまずＨｉｎｄＩＩＩで、次に非メチル化非複製ＤＮＡを分解するＤｐｎＩで制限酵素分解する。次にＤＮＡにサザンブロットを行い、プローブとしてｏｒｉプラスミドＤＮＡでハイブリダイゼーションする。ＤｐｎＩによる分解後にｏｒｉプラスミドと等しいサイズを有するバンドは、新規にインビトロ複製されたプラスミドＤＮＡのマーカーである。
【０１１４】
野生型Ｅ１及びＥ２（ＨＰＶ１１９＋ＨＰＶ１２０）は複製された投入プラスミドＤＮＡを示す強いバンドを示す。３つの先導構築物（ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８）のそれぞれは、複製なしの結果を示す陰性である。
【０１１５】
結論：先導構築物ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８はＤＮＡ複製活性を有さない。
【実施例４】
【０１１６】
パピローマウイルスのＥ２タンパク質は、一次複製起点認識タンパク質として機能する部位特異的ＤＮＡ結合核タンパク質であり、開始前ＤＮＡ複製複合体の集合を援助する。全長Ｅ２タンパク質は（他の転写因子部位に関する）位置及びその同起源の結合部位に対するそのタンパク質の親和性に依存してウイルス転写のリプレッサー又はアクチベーターのいずれとしても働くことができる。Ｅ２はいくつかの宿主細胞プロモータの転写に影響することも知られている。突然変異によるＥ２の不活性化が広く研究され、具体的には１つの突然変異Ｌｙｓ１１１→Ａｌａ（Ｋ１１１Ａ）がＥ２の転写機能及び複製機能の両方を不活性化することが示された。この突然変異は、そのタンパク質の核への移行を阻害するという追加の利益も有しうる。ＨＰＶのＤＮＡによる免疫治療の一部として、この突然変異（Ｋ１１１Ａ）が各Ｅ２抗原に組み込まれた。
【０１１７】
本発明者は、インビトロＣＡＴ転写レポーターアッセイにおいてＫ１１１Ａ突然変異したＥ２及び各ポリタンパク質構築物の不能を確認することに着手した。本発明者は２つの陽性対照（活性Ｅ２タンパク質の起源）を使用した。これらはＨＰＶ−１１の非突然変異（活性）Ｅ２タンパク質を発現する構築物、及び強力な転写トランス作用因子であるＢＰＶのＥ２タンパク質を発現する第二のベクターであった。これらのデータを図１４に示す。
【０１１８】
結論：これらのデータは、天然（非突然変異）ＨＰＶ６ｂＥ２ベクターから発現されたタンパク質が転写活性を有するが、突然変異（Ｋ１１１Ａ）Ｅ２はポリタンパク質ベクターＨＰＶ１１６、１１７及び１１８のそれぞれと同様に不活性であることを示す。
【実施例５】
【０１１９】
個別の遺伝子構築物ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８の発現と比較
先導構築物ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８を比較する遺伝子発現研究は、インビトロの遺伝子発現に明らかな違いを何も確認できなかった。さらに、ポリタンパク質の発現は単一プラスミド（ＨＰＶ１１０）に個別の（未融合）抗原を発現させたときと同等であった。等しく重要なことには、点突然変異の導入は遺伝子発現に影響を及ぼさなかった（ＨＰＶ１０８及びＨＰＶ１１０）。
【実施例６】
【０１２０】
マウスにおけるインビボ免疫原性研究
３つの異なる構築物ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８のインビボ免疫原性を比較するためにＰＭＩＤを用いてマウスを免疫した。
【０１２１】
各免疫は、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２Ｋｄ）又はＣ５７ＢＬ６（Ｈ−２Ｋｂ）マウスの剃毛した腹部にＤＮＡ０．５μｇを２か所に発射することを含む。動物にＤＮＡ１μｇを初回免疫し、２１日後に同用量を追加免疫し、追加免疫の５〜７日後に選別した。ＰＭＩＤ後に発生した体液性及び細胞性免疫応答を分析するために血清及び脾臓を採取した。
【０１２２】
体液のアッセイ
標準ＥＬＩＳＡ法を用い捕獲抗原として組換えＥ１及びＥ２タンパク質を用いて、ＰＭＩＤ免疫したマウスに生じた抗体を評価した。長期の免疫スケジュールをこなした後を除き、Ｅ２免疫マウスにおいて信頼性のある抗体応答を検出できなかった。本発明者はマウスにおいてＥ１抗原に対する抗体の検出を確認しなかった。これらの弱い／検出不能の抗体応答は、公表された文献と一致する。
【０１２３】
細胞のアッセイ
マウスにおける細胞性免疫応答を研究するためにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した。この方法は、同系のＭＨＣ分子に関連して提示される抗原に特異的に応答してサイトカインを分泌できる、既知の密度の培養物内に存在する細胞数を評価するために適している。
【０１２４】
簡潔には、抗サイトカイン捕獲抗体をコーティングした特殊なマイクロタイタープレートに、免疫した動物から単離された脾臓の単細胞懸濁液を加え、好適な標的細胞により提示される抗原の存在下で一晩培養する。細胞のすぐ周囲の領域でプレートと結合した抗体によりサイトカインは捕獲され、細胞が溶解し洗浄除去された場合も、このサイトカインは結合を維持する。ビオチニル化二次抗サイトカイン抗体及びストレプトアビジンアルカリホスファターゼ複合体の使用により検出を達成する。発色団基質に及ぼすこの酵素の作用は、サイトカイン産生細胞数の視覚化を可能にする。
【０１２５】
ワクシニアＥＬＩＳＰＯＴアッセイとデータ
明確なマウスＴ細胞エピトープが存在しないことから、標的抗原を発現するように操作された組換えワクシニアウイルスの形で抗原が提供された。そのようなウイルスを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてエフェクター細胞に抗原を提示させるために適した標的細胞に感染させた。
【０１２６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対する３つの候補構築物のＰＭＩＤ後にＨＰＶ６ｂＥ１に対する応答が検出された。２つの別々の実験の結果を統計解析した。代表的な実験の結果を図１５及び１６に示す。
【０１２７】
マウスにおいて先導構築物及びＰＭＩＤを用いた代表的な免疫原性のデータ：
ＣＴＬアッセイとデータ
活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、同系のＭＨＣＩ分子に関連して提示された特異的ペプチドに応答して細胞を溶解できる。従来のクロム放出アッセイを非放射性に変更したＥｕ３＋放出バイオアッセイによりこの機能を決定できる。
【０１２８】
これらの目的にこのアッセイを使用するには、ＨＰＶ６ｂＥ１タンパク質の一次配列から得られるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの同定が必要であった。サイトカインＥＬＩＳＰＯＴを用いて、１１個だけ重複する１５量体から成るペプチドライブラリーをスクリーニングすることによりこれが達成された。標準的なフロー法により、応答する集団をＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞と同定した。
【０１２９】
この方法の基本は、同族ペプチドで刺激したＥｕ３＋標識標的細胞の溶解を必要とする。２時間の培養過程の間に、細胞傷害性Ｔ細胞による標的細胞の溶解に際してＥｕ３＋は培養上清に放出される。これは時間分解蛍光分析により検出される。比溶解は、標的細胞が化学的手段により溶解した場合に検出される溶解の総量の百分率として表される。
【０１３０】
細胞免疫学のデータの評価
ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８の免疫学的評価は、免疫学的アウトプットとしてワクシニアＥＬＩＳＰＯＴ及びＣＴＬアッセイ分析を用いたマウスにおける反復ＰＭＩＤ免疫研究を含んだ。全ての候補は各抗原に対して強力な免疫応答を生じた。
【０１３１】
まとめると、Ｅ１に対する応答が突然変異やＥ２抗原構成要素との融合により損なわれないことをワクシニアＥＬＩＳＰＯＴデータは示している。ＨＰＶ−１０８（単一６ｂＥ１構築物）、ＨＰＶ１１６、ＨＰＶ１１７及びＨＰＶ１１８の間のＥ１応答を比較するとき、それらの応答には統計的な差が存在しない。しかし、ワクシニアＥＬＩＳＰＯＴのデータはＨＰＶ−１１  Ｅ２抗原成分に対する応答には実際に差を示す。Ｅ２抗原特異的応答はＨＰＶ１１６又はＨＰＶ１１７で免疫されたマウスよりもＨＰＶ１１８で免疫されたマウスで有意に大きい。これのみに基づくと、ＨＰＶ１１８はＨＰＶ１１６又はＨＰＶ１１７よりも優れた免疫原であると思われる。
【０１３２】
Ｅ１抗原に特異的なＣＴＬの溶解の分析も効力に傾向があることを明らかにした。特異的溶解率は、ＨＰＶ１１６又はＨＰＶ１１７のどちらかで免疫されたマウスよりもＨＰＶ１１８で免疫されたマウスからのＴ細胞を用いた場合の方が高値であった。この観察には再現性がある。
【０１３３】
まとめると、さらにワクシニアＥＬＩＳＰＯＴ及びＣＴＬ溶解データの両方に基づくと、ＨＰＶ１１８はより強力な免疫原である。
【０１３４】
結論：純粋に免疫学的な基準では構築物ＨＰＶ１１８が最も免疫原性の高いポリタンパク質である。
【実施例７】
【０１３５】
コドンを最適化したＣＯＰＶＥ１／Ｅ２融合蛋白質のＰＭＩＤ送達は、コドンを最適化したＥ１又はコドンを最適化したＥ２のどちらか単独よりもイヌ口腔パピローマウイルス疾患に対する予防に有効である
序説
イヌ口腔パピローマウイルス（ＣＯＰＶ）動物モデルはヒト粘膜パピローマウイルス疾患をよく模倣している。イヌにおいてＣＯＰＶにより引き起こされた疾患の特徴は、ヒトにみられるものと非常に類似している（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００１、２８３（１）３１〜３９）。重要なのはこれが粘膜パピローマウイルス疾患モデルということである。ＣＯＰＶウイルスはイヌ粘膜上皮に感染し、２、３週間の遅滞期を経ていぼが出現し、そのいぼはさらに数週間後に自然に退縮する。ＣＯＰＶウイルスはヒトパピローマウイルス遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１及びＬ２）のそれぞれのホモログをコードする。
【０１３６】
イヌＣＯＰＶ粘膜疾患モデルはヒトのウイルス様粒子（ＶＬＰ）パピローマウイルスワクチンのための原理を開発する上で欠かせないモデルとして使用されてきた(Ghimら、Vaccines 1995 25、375〜379、Suzichら、PNAS 1995、92 11553〜11557)。ヒトパピローマウイルスのＶＬＰワクチンは現在開発中で、ヒトにおける初期段階の臨床試験が最近完了した。
【０１３７】
本発明者は、ＰＭＩＤにより投与した場合に、コドンを最適化したＥ１及びＥ２遺伝子の融合体をコードするプラスミドＤＮＡが、コドンを最適化したＥ１又はコドンを最適化したＥ２のどちらか単独よりも疾患の負荷を効果的に低下させることを示す。
【０１３８】
方法
コドンを最適化したＥ２／Ｅ１融合ベクターの構築
以前に記載された方法を用いて、コドンを最適化したＣＯＰＶ  Ｅ２配列をコードする合成遺伝子を作製した。クローンｐＣＯＰＶＥ１ｃ／ｏから回収した、コドンを最適化した合成ＣＯＰＶ  Ｅ１遺伝子とこれを融合し、ベクターＷＲＧ７０７７に挿入して新しいクローンを作製し、ｐＣＯＰＶＥ２／Ｅ１ｃ／ｏと名付けた。このクローンはＣＯＰＶ  Ｅ２（Ｎ末端）とＣＯＰＶ  Ｅ１（Ｃ末端）との融合体を含むポリタンパク質を発現する。ウエスタンブロットにより測定されたように、このポリタンパク質は予想されるサイズである。
【０１３９】
ビーグル犬におけるｐＣＯＰＶＥ１ｃ／ｏ、ｐＣＯＰＶＥ２ｃ／ｏ、及びｐＣＯＰＶＥ２／Ｅ１ｃ／ｏの免疫
３つの精製したプラスミドｐＣＯＰＶＥ１ｃ／ｏ、ｐＣＯＰＶＥ２ｃ／ｏ、及びｐＣＯＰＶＥ２／Ｅ１ｃ／ｏのそれぞれを、ＰＭＩＤによりビーグル犬に免疫した。腹部正中線の各側に、重ならないようにそれぞれ６か所、計１２か所の皮膚部位で動物を免疫した。全てのワクチン接種を全身麻酔下で行った。各群、動物５匹とした。第一ワクチン接種の６週間後に同じ手技を用いた同一の方法で追加ワクチン接種を行った。
【０１４０】
最終の追加免疫の２週間後に、免疫した動物に感染性ＣＯＰＶウイルスをチャレンジした。各動物の上唇を軽く乱刺した。精製ＣＯＰＶウイルス調製物１０μｌを１０か所の部位（上唇の各側にそれぞれ５か所）のそれぞれに適用し、２、３分間吸収させた。感染性ＣＯＰＶウイルスの単離と精製については記載されている(Virology 1999、265(2)365〜374)。
【０１４１】
ＣＯＰＶウイルスをチャレンジした後に、チャレンジした粘膜部位を毎週検査した。いぼ（パピローマ）の（チャレンジからの）出現時間及びいぼのサイズ（ｍｍ）を測定した。
【０１４２】
ｐＣＯＰＶＥ１ｃ／ｏを免疫された動物において、チャレンジの７週間後から粘膜チャレンジ部位にパピローマが発生した。パピローマは拡大を続け、第１１週までに平均サイズ＞３．５ｍｍに達した。ｐＣＯＰＶＥ２ｃ／ｏを免疫した動物においてパピローマは第８週に初めて出現し、パピローマの平均サイズは第１１週に１．５ｍｍに達した。ｐＣＯＰＶＥ２／Ｅ１ｃ／ｏを免疫した動物では疾患の第一の兆候は他の群と一致するが、全般的な疾患の負荷は有意に減少している。ｐＣＯＰＶＥ２／Ｅ１ｃ／ｏ群における（５匹のうち）１匹の動物は発症を完全に予防され、その群の残りの動物は全て非常に小さなパピローマしか発生せず、そのパピローマは短期間（１〜２週間）で退縮した。
【０１４３】
パピローマウイルス感染症のこの動物モデルにおいて、ＣＯＰＶＥ１及びＣＯＰＶＥ２の融合体をコードするプラスミドＤＮＡは、ＣＯＰＶＥ１又はＣＯＰＶＥ２の一方よりも疾患の発生の予防に有効である（図１８）。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】本発明のＨＰＶ免疫療法ワクチン構築物の概要図である。
【図２】コドン最適化し突然変異を有するＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ２をコードするＰ７０７７６ｂｅ２のプラスミドマップである。
【図３】コドン最適化し突然変異を有するＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ１をコードするｐ７３ｐ１ｃ６ｂｅ１のプラスミドマップである。
【図４】コドン最適化し突然変異を有するＨＰＶ  １１  Ｅ２をコードするｐ７０７７１１ｅ２のプラスミドマップである。
【図５】ｐ７３１３バックグラウンドにおけるＨＰＶ  １１  Ｅ２をコードするＨＰＶ１０２のプラスミドマップである。
【図６】ｐ７３１３バックグラウンドにおけるＨＰＶ  ６ｂ由来のＥ２とＨＰＶ  １１由来のＥ２との融合物であるＨＰＶ１０４のプラスミドマップである。
【図７】コドン最適化し突然変異を有するＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ２とＨＰＶ１１由来Ｅ２の融合物であるＨＰＶ１０５のプラスミドマップである。
【図８】ｐ７３１３バックグラウンドにおけるコドン最適化し突然変異を有するＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ１であるＨＰＶ１０８のプラスミドマップである。
【図９】ｐ７３１３バックグラウンドにおけるコドン最適化し突然変異を有するＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ２であるＨＰＶ  １１０のプラスミドマップである。
【図１０】ＨＰＶ１１６（ＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ１、ＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ２、ＨＰＶ  １１  Ｅ２）のプラスミドマップである。
【図１１】ＨＰＶ１１７（ＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ２、ＨＰＶ  １１  Ｅ２、ＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ１）のプラスミドマップである。
【図１２】ＨＰＶ１１８（ＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ２、ＨＰＶ  １１  Ｅ２、ＨＰＶ  ６ｂ  Ｅ１）のプラスミドマップである。
【図１３】２９３Ｔ細胞における本発明の３つのポリタンパク質構築物のウェスタンブロット分析である。
【図１４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＡＴ転写リポーターアッセイにおけるＫＩＩＩＡ変異型Ｅ２の不能を示す。
【図１５】Ｅ１に対するマウスの細胞性免疫応答を示す。
【図１６】Ｅ２に対する細胞性免疫応答を示す。
【図１７】ＰＭＩＤ後のＨＰＶ１１８によるＣＴＬアッセイデータである。
【図１８】ＣＯＰＶモデルにおけるＥ１／Ｅ２の投与後のいぼの低減を示す。
【配列表】
2006516386.tif 000002
2006516386.tif 000003
2006516386.tif 000004
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2006516386.tif 000028
【図１】
2006516386.tif 000029
【図２】
2006516386.tif 000030
【図３】
2006516386.tif 000031
【図４】
2006516386.tif 000032
【図５】
2006516386.tif 000033
【図６】
2006516386.tif 000034
【図７】
2006516386.tif 000035
【図８】
2006516386.tif 000036
【図９】
2006516386.tif 000037
【図１０】
2006516386.tif 000038
【図１１】
2006516386.tif 000039
【図１２】
2006516386.tif 000040
【図１３】
2006516386.tif 000041
【図１４】
2006516386.tif 000042
【図１５】
2006516386.tif 000043
【図１６】
2006516386.tif 000044
【図１７】
2006516386.tif 000045
【図１８】
2006516386.tif 000046
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月2日(2004.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの異なるＨＰＶ株に由来する少なくとも３つの初期抗原又はその断片からのエピトープを有するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ポリペプチドをコードし、ヒト遺伝子についてのコドン利用係数が０．４を超え１．０未満である、ポリヌクレオチド配列。
【請求項２】
少なくとも１つの抗原がＨＰＶ  Ｅ１に由来する又はその断片である、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
少なくとも１つの抗原がＨＰＶ  Ｅ２に由来する、請求項２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
ＤＮＡ配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
子宮頸癌、良性の皮膚いぼ又は生殖器いぼに関連するＨＰＶ型又はその亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
１〜４、６、７、１０、１１、１６、１８、２６〜２９、３１、３３、３５、３９、４９、５１、５２、５６、５８、５９及び６８型の１つのＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
子宮頸癌又は生殖器いぼに関連するＨＰＶ型又はその亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項６記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
６、１１、１６、１８、３３又は４５型の１つのＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項４又は５記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
ＨＰＶ１１、６ａ又は６ｂから選択されるＨＰＶ型又はその亜型のＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項５記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１０】
生物学的機能が低減している変異型ＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
ポリペプチドの天然の生物学的機能の１以上が不活性化される１以上の点突然変異を含む変異型ＨＰＶポリペプチドをコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
ＨＰＶ６ｂのＥ１抗原由来のエピトープ、ＨＰＶ６ｂ  Ｅ２由来のエピトープ、及びＨＰＶ１１  Ｅ２由来のエピトープを含む、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
ヒト遺伝子についてのコドン利用係数が０．５を超えるが１未満である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、それと機能的に連結された、宿主細胞による該ポリヌクレオチド配列の発現をもたらしうる制御配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
ｐ７３１３ＰＬｃである、請求項１４記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項１８】
ＤＮＡをコーティングした複数の金粒子を含む、請求項１６又は１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
さらにアジュバントを含む、請求項１６、１７又は１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
アジュバントが、上記ポリヌクレオチドによりコードされるＨＰＶポリペプチドとの融合物としてコードされている、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＨＰＶ感染症の治療又は予防における請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項２２】
ＨＰＶ感染症の治療又は予防における請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクターの使用。
【請求項２３】
ＨＰＶ感染症の治療又は予防における請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
皮膚（表皮）いぼ、生殖器いぼ、意味未確定の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、子宮頸部形成異常、頸部上皮内癌（ＣＩＮ）又は子宮頸癌の治療又は予防における請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
ＨＰＶ感染症又はそれに関連するいずれかの症候若しくは疾患の治療又は予防方法であって、有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項２６】
ＨＰＶ感染症又はそれに関連するいずれかの症候若しくは疾患の治療又は予防方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクター系又は非ウイルスに基づく系による初回免疫−追加免疫投与計画において、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、上記方法。
【国際調査報告】
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