(57)【要約】本発明は、腸細胞系の培養のための特殊培地を提供する。この培地は、細胞培養支持体の助け無しでも、現在可能なものより遥かに短い時間で高度に分化された腸上皮細胞単層の成立を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した、細胞培養増殖培地を含有する、腸上皮細胞系を培養するための組成物。
【請求項２】
細胞増殖培地が、約１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン及びＥＧＦの各々の濃度が、約０．０１〜約２００μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々の濃度が、約０．０１〜約１０μＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
酪酸ナトリウムの濃度が、約０．０５〜５ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
細胞培養培地が、約５〜約２０％のウシ胎児血清で補充されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
約１０％のウシ胎児血清、約２μＭのＬ−グルタミン、約１％の非必須アミノ酸、約１００μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、約３０μｇ／ｍｌのウシインシュリン、約５０ｎｇ／ｍＬのヒト上皮増殖因子、約２ｍＭの酪酸ナトリウム、並びに、約５μＭのヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々を補充した、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した細胞培養増殖培地を含有する組成物中で、細胞を再懸濁すること；乾燥細胞培養インサート上へ細胞を播種すること；及び、細胞を３７℃にて５％ＣＯ２中でインキュベートすること、を包含するインビトロで腸細胞系を培養するための方法。
【請求項９】
細胞がコンフルエントであり且つ約４日で分化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞増殖培地が、約１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン及びＥＧＦの各々の濃度が、約０．０１〜約２００μｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々の濃度が、約０．０１〜約１０μＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
酪酸ナトリウムの濃度が、約０．０５〜５ｍＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養培地が、約５〜約２０％のウシ胎児血清を補充されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
腸細胞系がＣａｃｏ−２細胞系である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した細胞培養増殖培地を滅菌条件下で混合することを包含する、細胞培養培地の組成物を調製するための方法。
【請求項１７】
細胞増殖培地が、約１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン及びＥＧＦの各々の濃度が、約０．０１〜約２００μｇ／ｍｌである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンの各々の濃度が、約０．０１〜約１０μＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
酪酸ナトリウムの濃度が、約０．０５〜５ｍＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
細胞培養培地が、約５〜約２０％のウシ胎児血清を補充されている、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞培養基質の助けを借りない現在可能なものよりも遥かに短い時間で高度に分化した腸上皮細胞単層の発生を可能にする培地処方物に関する。本発明は、また、特殊培地（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）を調製するための方法に加えて、細胞を培養する方法にも関する。これは、腸管の研究においてこのような細胞系に頼る研究者にとって、とりわけ腸における薬物吸収のためのモデルとしてこれらの細胞系を使用する製薬産業にとって、有益である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腸上皮は、腸から物質を吸収し且つそれらを最終的に血流に輸送する機能を有する形態学的に極性な（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）細胞の単層から構成される。腸の内側を覆う細胞を真似た、幾らかの上皮インビトロ細胞培養系が過去数十年間で確立されてきた。その細胞系の幾つかが、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ−２９、ＳＷ  １１１６、Ｔ８４、ＩＥＣ−１８、及びＩＥＣ−６である。Ｃａｃｏ−２及びＨＴ−２９腸細胞系は、最も広く使用され且つ最もよく特徴付けられた系である。研究されてきた他の実験モデルとしては、これらの系の種々のクローンが含まれる（例えば、Ｃａｃｏ−２／ＴＣ−７（Ｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．，  １９９５，  １１６）、Ｃａｃｏ−２ＢＢｅ（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｏｓｅｋｅｒ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １９９２  １０２  （３））、ＨＴ２９−ＭＴＸ  （Ｐｏｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２００１，  ９０（１０））、共培養系（例えば、Ｃａｃｏ−２／ＨＴ２９−ＭＴＸ（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  １９９６，  ８５  （１０））、及び、初代細胞培養（Ｆｕｋａｍａｃｈｉ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １９９２，  １０３））。
【０００３】
これらの細胞系は、薬物輸送、細菌感染、及び酵素誘導／調節の研究において多大な助けとなっている。大部分は、Ｃａｃｏ−２細胞が、薬物輸送の研究及び分析に一般的に好まれる細胞である。これらの細胞は、コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達してしばらくしてから培養物中で自然に分化する。Ｃａｃｏ−２細胞は、通常、完全に分化する（即ち、それらが、正常なヒト腸細胞の形態学的、酵素的、及び最も重要な栄養輸送の特性の多くを示す点まで分化する）のに、コンフルエンスに達した後、約１４〜３０日（コンフルエンス後、平均２１日）を必要とする。これは、細胞が実験を行うための準備に比較的長い時間待つことになり、また、この系を用いて研究を行うための綿密な長期計画を必要とする。
【０００４】
他の分化した上皮細胞培養物に加えて、Ｃａｃｏ−２細胞単層の発生及び分化に必要な時間を減らすための試みがなされてきた。そのアプローチの多くは、培養培地への種々の分化及び増殖因子の添加、細胞接着のためのコラーゲン支持体の使用、培地における血清要求の低減に関与する。現在、３−ｄａｙ  ＢＩＯＣＯＡＴ（登録商標）ＨＴＳ  Ｃａｃｏ−２  ａｓｓａｙ  ｍｏｄｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が、唯一の市販されている系であり、細胞基質として線維性コラーゲン及び血清フリー培地を使用している。Ｂｉｏｃｏａｔ（登録商標）系は、血清フリーな環境において３日以内に、分化した腸細胞単層の成立を可能にする。この系において、細胞は、Ｂｉｏｃｏａｔ（登録商標）Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に播種され、次いで、酪酸、ホルモン、増殖因子及び他の規定される代謝産物を補充した特殊培地中で培養される。Ｂｉｏｃｏａｔ（登録商標）及び他の促進された系（Ｌｅｎｔｚらによって開発されたもののような（Ｌｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，  １９９８，１  ：  Ｓ４５６））の評価により、これらの迅速なモデルが、化合物の透過性の順位を決定し且つ伝統的な２１日培養系（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０００，  ８９（３））におけるものと等しい結果を与えることを可能にすることが明らかになった。しかしながら、以前に開発された促進されたＣａｃｏ−２系のいくつかは、低いＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）レベルを発現し且つ漏れやすい接着結合を示した（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０００，８９（３））。ＢＩＯＣＯＡＴ（登録商標）系はこのような問題を示さないが、この市販モデルの使用は、促進されたＣａｃｏ−２系の成功した高スループットな培養が特殊培地及び線維性コラーゲン細胞培養インサート（Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃａｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ）の頻繁な購入を必要とするため、ルーチンな実験作業にとって実に高価である。さらに、コラーゲンコーティングが薬物輸送を妨げているか否か知られていないため、薬物吸収の本当の状況（ｔｒｕｅ  ｐｉｃｔｕｒｅ）を提供せず、また、伝統的なモデルに対する比較が問題となり得る。従って、潜在的な薬物の高スループットなスクリーニングのためにルーチンに使用され得る、安価で、非−コラーゲン依存性で、迅速なＣａｃｏ−２モデルを開発することが必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
伝統的な２１日培養と比べて約４日以内に高度に分化されたＣａｃｏ−２細胞単層の発生を可能にする新規な培地処方物を用いて、促進されたＣａｃｏ−２モデルが開発された。本発明の培地処方物は、共に用いられたときに驚くべきことに分化を誘導する環境をもたらす特定のサプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）を含有する。細胞培養培地に添加されるサプリメントは、ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、トランスフェリン（好ましくはヒト）、インシュリン（好ましくはウシ）、上皮増殖因子（好ましくはヒト又はマウス）、酪酸ナトリウム又は酪酸、及び、ホルモンであるヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンである。
【０００６】
本発明は、また、この培地を調製するための方法、並びに、この培地を用いて腸細胞系の促進された増殖を得るための方法にも関する。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ヒトトランスフェリン、ウシインシュリン、ヒト上皮増殖因子、酪酸又はその塩、ヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補充した細胞培養増殖培地を含有する、腸上皮細胞系を培養するための組成物を提供することである。
【０００８】
迅速なＣａｃｏ−２モデルの以前の研究によって、培養培地中に含まれる栄養分及び増殖因子の共力作用によって、腸上皮細胞の促進された分化が引き起こされる（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）ことが明らかになった。インシュリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフェリン及び種々のホルモンが、タンパク質及びアミノ酸合成、ホスフェート輸送、脂質生成及び細胞増殖を促進する培地サプリメントとしてルーチンに使用される。これら及び他のサプリメントの細胞培養培地への添加は、特に、低血清及び血清フリーな条件において細胞が増殖するときに重要である。血清の正確な組成は特に規定されないが、細胞増殖及び分化に必要な種々の成分を含有することが知られている。例えば、インシュリンは、細胞増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）のためのシグナルを提供し、一方、トランスフェリン、ＥＧＦ及びホルモンは、細胞分化を促進する（Ｃｈｏｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  ９２，  Ｓｏｕｌｅｉｍａｎｉ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｌｉｎ，  １９９３，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ３２６）。
【０００９】
上皮細胞培地のためのサプリメントとして文献に言及された他のコファクター及び栄養としては、コレラ毒素（Ｆｕｋａｍａｃｈｉ，  １９９２）、セレン、酪酸及びその塩（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９  ；  Ｓｉａｖｏｓｈｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、ヌクレオシド（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、及びアスコルビン酸（Ｌｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）が挙げられる。以前のモデルの多くは、低血清又は血清フリーな条件において開発された。
【００１０】
種々のサプリメントが細胞増殖及び／又は分化を促進することが知られているが、本発明の組成物の成分の特別な組み合わせは、以前に文献に記載されていない。
【００１１】
腸上皮細胞のための培地におけるサプリメントの濃度は幾分か変更され得、特定の腸細胞系について若干量の最適化が予想される。しかしながら、一般に、インシュリン、ＥＧＦ、及びトランスフェリンの培地濃度は、０．０１〜２００μｇ／ｍＬの範囲であり、一方、プロゲステロン、テストステロン及びヒドロコルチゾンのようなホルモンの含量は、０．０１〜１０μＭの範囲内である。酪酸及びその塩（酪酸ナトリウムのような）（既知の分化剤）は、０．５〜５ｍＭの範囲の濃度で有効であるだろう（Ｓｉａｖｏｓｈｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。薬物輸送研究のため、培地組成物は、約２００  Ｏｈｍ×ｃｍ２のＴＥＥＲ（経上皮電気抵抗）値を生成するとき、及び、コラーゲン支持体を含まないレギュラーポリカーボネートフィルター（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ−  Ｃｏｓｔａｒ）上に播種された４日目のＣａｃｏ−２単層の上で、最適であると考えられる。
【００１２】
特殊培地の処方は、幾つかの既知の細胞培養培地のいずれかに基づき、使用するものの選択は、特定の細胞系が増殖される推奨増殖培地を反映するはずである。例えば、本発明の促進されたＣａｃｏ−２細胞モデルの開発のために使用される培地は、ウシ胎児血清及び約１％の非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地をベースとする。他の培地は、例えば、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ  （ＨＴ−２９のための）、Ｅａｇｌｅ’ｓ最小必須培地（幾つかのＣａｃｏ−２系のための）又はＲＰＭＩであり得る。培地は、また、ｌ−グルタミン（代表的に、約２〜約４ｍＭ）のソースを含有する。ウシ胎児血清の濃度は、培地処方物の約５〜約２０％である。
【００１３】
トランスフェリン（例えば、ＶＷＲから入手可能な）に関して、これは、ヒト、ウシ又はマウス型であり、好ましくはヒトであり得る。上皮増殖因子については、ヒトが好ましいが、相互交換可能に、ヒト及びマウスのいずれかが使用され得る。
【００１４】
好ましい特殊な促進された増殖培地（「ＨＴＢ−１０」と称される）は、Ｃａｃｏ−２細胞のため、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に、１０％ウシ胎児血清、１％非必須アミノ酸、１００μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、３０μｇ／ｍｌウシインシュリン、５０ｎｇ／ｍＬヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）、２ｍＭ酪酸ナトリウム及び各々５μＭのヒドロコルチゾン、プロゲステロン及びテストステロンを補うことによって調製された。この培地は、必要に応じて（しかし、好ましくは）、１又はそれ以上の抗生物質（例えばペニシリン（約１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（約１００μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（約０．２５μｇ／ｍｌ）を含有する。
【００１５】
この培地を用いる方法もまた、本発明の一部である。以下の記載は、これがどのように行われるかの代表例である。Ｃａｃｏ−２細胞（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡより入手可能）を、ＨＴＢ−１０培地中に再懸濁し、３μｍ  ポリカーボネート６−ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）細胞培養インサート（直径２４．５ｍｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）上に、約０．２×１０６細胞／ｃｍ２の密度で播種する。細胞の播種は、乾燥フィルター上で、先ず腸側（ａｐｉｃａｌ  ｓｉｄｅ）に１．５ｍＬの細胞懸濁液を入れ、次いで血漿側（ｂａｓｏ−ｌａｔｅｒａｌ  ｓｉｄｅ）に２．５ｍＬのＨＴＢ−１０培地を添加することによって行われた。細胞は、約５％ＣＯ２を含む約９５％の相対湿度にて、３７℃インキュベーター中で増殖される。
【００１６】
異なる播種及び培養アプローチの実験比較により、乾燥フィルター上の細胞の播種が、高いＴＥＥＲ値を有する接着単層（ｔｉｇｈｔ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ）を得るのに非常に重要であることが明らかになった。この現象の理由は明らかではないが、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）フィルターのポリカーボネート表面の静電気的特性に関係しているかも知れない。細胞極性を誘導するため、播種後４８時間、腸側の培地の体積を１．５ｍｌから０．５ｍＬまで減らし、そして細胞に主として血漿側から栄養を与えた。この切り替えの後、４日間の全インキュベーション時間の間、２４ｈｒごとに培地を交換した。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の利点としては、（１）透過性アッセイのための分化されたＣａｃｏ−２単層を得るための時間の短縮；及び（２）コラーゲン支持体を用いない通常のＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）プレートの使用による且つ培養におけるインキュベーション時間の短縮による、細胞培養及び維持（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）のコスト及び時間の削減が挙げられる。本発明の新規な培地は、伝統的な２１日Ｃａｃｏ−２細胞モデルと矛盾しない特徴をもつ代替的な実験系の開発を可能にした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
【実施例１】
【００１９】
特殊な促進された増殖培地ＨＴＢ−１０の使用により、我々は、４日間で分化されたＣａｃｏ−２単層を得ることが可能になった。分化状態及び単層の完全さ（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定によって及びマンニトールの透過性の測定によって、モニターされた。ＨＴＢ−１０における４日間の培養後に発生した平均ＴＥＥＲは、４２０〜１０９０  Ｏｈｍ×ｃｍ２の範囲であった。マンニトールの透過性は、０．７×１０−６〜６．３×１０−６ｃｍ／ｓｅｃの範囲であった。促進されたＣａｃｏ−２系は、また、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＣＳ）のためのＦＤＡガイドラインに基づいた検証方法を通じて評価された。この方法において、Ｃａｃｏ−２細胞透過係数は、ヒトにおいて吸収される画分に従って順序づけられた２６の構造上異なる化合物について決定された。輸送研究は、以下の通り行われた。薬物溶液は、第１表に示される最終濃度にてＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）中で調製された。薬物のドナー溶液をサンプルフィルターの腸側に置き（１．５ｍＬ）、緩衝溶液（ＨＢＳＳ，ｐＨ７．４）を血漿側上に置いた（２．５ｍＬ）。プレートを、１〜３ｈｒ、シェイカー上で３７℃にてインキュベートした。指定された時点でサンプルを回収し、そして、ＨＰＬＣ（ｕｖ）又はラジオメトリー（放射性化合物のため）のいずれかによって分析した。促進されたＣａｃｏ−２系の適性は、メトトレキサート、プロプラノロール、及びテストステロンを含む幾つかのマーカー化合物の透過性の測定によって、検証された。
第１表：促進されたＣａｃｏ−２系の検証に使用されたモデル化合物の透過性
【００２０】
【表１】
2006520598.tif 000002
＊文献において報告された
＊＊能動輸送された化合物
【実施例２】
【００２１】
第２表（下記）は、３種の比較系（Ｂｉｏｃｏａｔ，  Ｌｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ及び本発明のもの）の培地組成物を要約する。また、図１は、異なるタイプの培地の比較研究から得られたグラフである。培地に依存して、我々の手順（ＨＴＢ−１０、ＨＴＢ−０について）において記載されるように、又は、Ｂｉｏｃｏａｔの指示書に従って、又は、Ｌｅｎｔｚ’ｓの論文（ＨＴＢ−３７について）に記載される手順に従って、播種が行われた。ＴＥＥＲは、播種後４日目に測定された。図１から分かるように、本発明の培地（ＨＴＢ−１０の場合）は、非−コラーゲン支持された細胞分化における他の全てのものより、性能が優れていた。
第２表
【００２２】
【表２】
2006520598.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、異なるタイプの培地の比較研究から得られたグラフである。図１に示されるように、本発明の培地（ＨＴＢ−１０の場合）は、非−コラーゲン支持体細胞分化において、他の全てのものより性能が優れていた。
【図１】
2006520598.tif 000004
【国際調査報告】
2006520598.tif 000005
2006520598.tif 000006