(57)【要約】増大した血清半減期または血清安定性を有する、トランスフェリンおよび治療タンパク質または治療ペプチド（好ましくは抗体可変領域）の改変された融合タンパク質が開示されている。好ましい融合タンパク質には、トランスフェリン成分が、全くグリコシル化されないかグリコシル化が低下している、鉄に対して全く結合しないか結合が低下している、トランスフェリン受容体に対して全く結合しないか結合が低下している、の少なくともいずれかであるように改変された融合タンパク質が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの抗体可変領域に融合されたトランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質を含む融合タンパク質であって、上記Ｔｆタンパク質が野生型Ｔｆタンパク質に対して低下したグリコシル化を示す融合タンパク質。
【請求項２】
抗体可変領域が、ＶＨ領域、ＶＬ領域またはＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
少なくとも２つの抗体可変領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＶＨ領域およびＶＬ領域、ＶＨ領域およびＶＨ領域、またはＶＬ領域およびＶＬ領域を少なくとも含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
少なくとも２つの異なる抗体可変領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
異なる抗体可変領域が異なる抗原と特異的に結合する、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
抗体可変領域が接近して存在するように操作されている、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
抗体可変領域が、２つの隣接するＴｆループの中に挿入される、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
１つの抗体可変領域がＴｆのＣ末端に融合され、１つの抗体可変領域が隣接するＴｆループの中に挿入される、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
１つの抗体可変領域がＴｆのＮ末端に融合され、１つの抗体可変領域が隣接するＴｆループの中に挿入される、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＴｆのＣ末端プロリン残基が欠失されるか、別のアミノ酸で置換される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＴｆのＣ末端システインループが欠失される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
抗体可変領域がＴｆのＮ末端およびＣ末端に融合される、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
抗体可変領域が少なくとも１つのＣＤＲペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＣＤＲペプチドが抗原と特異的に結合する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ＣＤＲペプチドが抗体に由来する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ＣＤＲペプチドがペプチドライブラリーに由来する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
抗体可変領域が腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に特異的に結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
ＣＤＲがＴＮＦに特異的に結合する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
少なくとも１つの抗体可変領域が、抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域のアミノ末端ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
アミノ末端ドメインが少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
アミノ末端ドメインが３つのＣＤＲを含む、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
抗体可変領域がＴｆのＣ末端に融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
抗体可変領域がＴｆのＮ末端に融合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
抗体可変領域がＴｆの少なくとも１つのループの中に挿入される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
Ｔｆタンパク質がトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する低下した親和性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
Ｔｆタンパク質がラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
Ｔｆタンパク質がＴｆＲと結合しない、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
Ｔｆタンパク質が鉄イオンに対する低下した親和性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
Ｔｆタンパク質が鉄イオンと結合しない、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
Ｔｆタンパク質がグリコシル化を妨げる変異を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
Ｔｆタンパク質がラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）である、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
グリコシル化を阻害する化合物の存在下で発現させられる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
Ｔｆタンパク質が、Ｔｆタンパク質のＮドメインの一部、架橋ペプチド、およびＴｆタンパク質のＣドメインの一部を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
架橋ペプチドにより抗体可変領域がＴｆに連結される、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
抗体可変領域がＴｆタンパク質のＮドメインとＣドメインとの間に挿入される、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
Ｔｆタンパク質が、Ｔｆヒンジ領域において、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
ヒンジ領域が、配列番号３の残基９４付近〜残基９６付近、配列番号３の残基２４５付近〜残基２４７付近、配列番号３の残基３１６付近〜残基３１８付近、配列番号３の残基４２５付近〜残基４２７付近、配列番号３の残基５８１付近〜残基５８２付近、および配列番号３の残基６５２付近〜残基６５８付近からなる群から選択される、請求項３７に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
Ｔｆタンパク質が、Ａｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、Ｈｉｓ５８５、Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８およびＧｌｙ４５９からなる群から選択される配列番号３内の位置において、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
抗体可変領域によりＴｆの少なくとも１つのループが置換される、請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
グリコシル化部位がアミノ酸Ｎ４１３およびアミノ酸Ｎ６１１に対応するアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｔｆが、Ａｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、Ｈｉｓ５８５、Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８およびＧｌｙ４５９からなる群から選択される配列番号３のアミノ酸に対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を含む、請求項２６または２８に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
少なくとも１つの抗体可変領域に融合された、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対する低下した親和性を示すトランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項４４】
少なくとも２つの抗体可変領域を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
ＶＨ領域およびＶＬ領域、ＶＨ領域およびＶＨ領域、またはＶＬ領域およびＶＬ領域を少なくとも含む、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
少なくとも２つの異なる抗体可変領域を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
異なる抗体可変領域が異なる抗原と特異的に結合する、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
抗体可変領域が接近して存在するように操作される、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
抗体可変領域が２つの隣接するＴｆループの中に挿入される、請求項４８に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
１つの抗体可変領域がＴｆのＣ末端に融合され、１つの抗体可変領域が隣接するＴｆループの中に挿入される、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
１つの抗体可変領域がＴｆのＮ末端に融合され、１つの抗体可変領域が隣接するＴｆループの中に挿入される、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
ＴｆのＣ末端プロリン残基が欠失される、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
ＴｆのＣ末端システインループが欠失される、請求項５０に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
抗体可変領域がＴｆのＮ末端およびＣ末端に融合される、請求項４９に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
抗体可変領域が少なくとも１つのＣＤＲペプチドを含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
ＣＤＲペプチドが抗原と特異的に結合する、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
ＣＤＲペプチドが抗体に由来する、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
ＣＤＲペプチドがペプチドライブラリーに由来する、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
抗体可変領域が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に特異的に結合する、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
ＣＤＲがＴＮＦαに特異的に結合する、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
抗体可変領域が抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域のアミノ末端ドメインを含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
アミノ末端ドメインが少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
アミノ末端ドメインが３つのＣＤＲを含む、請求項６２に記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
抗体可変領域の血清半減期が非融合状態の抗体可変領域の血清半減期よりも増大している、請求項１または４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
治療タンパク質または治療ペプチドがＴｆのＣ末端に融合される、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
治療タンパク質または治療ペプチドがＴｆのＮ末端に融合される、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
治療タンパク質または治療ペプチドがＴｆの少なくとも１つのループの中に挿入される、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６８】
Ｔｆタンパク質がＴｆＲと結合しない、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項６９】
Ｔｆタンパク質が鉄に対する低下した親和性を有する、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項７０】
Ｔｆタンパク質が鉄と結合しない、請求項６９に記載の融合タンパク質。
【請求項７１】
Ｔｆタンパク質が、低下したグリコシル化を示すか、またはグリコシル化を示さない、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項７２】
グリコシル化を妨げる変異を少なくとも１つ含む、請求項７１に記載の融合タンパク質。
【請求項７３】
Ｔｆタンパク質が、Ｔｆタンパク質のＮドメインの一部、架橋ペプチド、およびＴｆタンパク質のＣドメインの一部を含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項７４】
架橋ペプチドにより治療タンパク質または治療ペプチドがＴｆに連結される、請求項７３に記載の融合タンパク質。
【請求項７５】
治療タンパク質、治療ペプチドまたは治療ポリペプチドが、Ｔｆタンパク質のＮドメインとＣドメインとの間に挿入される、請求項７３に記載の融合タンパク質。
【請求項７６】
Ｔｆタンパク質が、Ｔｆヒンジ領域において、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有する、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項７７】
ヒンジ領域が、残基９４付近〜残基９６付近、残基２４５付近〜残基２４７付近、残基３１６付近〜残基３１８付近、残基４２５付近〜残基４２７付近、残基５８１付近〜残基５８２付近、および残基６５２付近〜残基６５８付近からなる群から選択される、請求項７６に記載の融合タンパク質。
【請求項７８】
Ｔｆタンパク質が、Ａｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、Ｈｉｓ５８５、Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８およびＧｌｙ４５９からなる群から選択される位置において、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失または付加を有する、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項７９】
治療タンパク質または治療ペプチドにより少なくとも１つのループが置換される、請求項６７に記載の融合タンパク質。
【請求項８０】
グリコシル化部位が、アミノ酸Ｎ４１３およびアミノ酸Ｎ６１１に対応するアミノ酸残基からなる群から選択される、請求項７１に記載の融合タンパク質。
【請求項８１】
請求項１または４３のいずれかに記載される融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項８２】
請求項８１に記載される核酸分子を含むベクター。
【請求項８３】
請求項８２に記載されるベクターを含む宿主細胞。
【請求項８４】
請求項８１に記載される核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項８５】
コードされた融合タンパク質を発現させる条件のもとで請求項８３に記載の宿主を培養することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項８６】
コードされた融合タンパク質を発現させる条件のもとで請求項８４に記載の宿主を培養することを含む、Ｔｆ融合タンパク質を発現させる方法。
【請求項８７】
原核生物または真核生物である、請求項８３に記載の宿主細胞。
【請求項８８】
原核生物または真核生物である、請求項８４に記載の宿主細胞。
【請求項８９】
酵母細胞である、請求項８７に記載の宿主細胞。
【請求項９０】
酵母細胞である、請求項８８に記載の宿主細胞。
【請求項９１】
請求項８１に記載される核酸分子を含む遺伝子組換え動物。
【請求項９２】
請求項９１に記載される遺伝子組換え動物から融合タンパク質を単離することを含むＴｆ融合タンパク質の製造方法。
【請求項９３】
Ｔｆ融合タンパク質がラクトフェリンを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
融合タンパク質が遺伝子組換え動物から得られる生物学的液体から単離される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
液体が血清または乳汁である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
請求項１または請求項４３に記載される融合タンパク質を投与するステップを含む、患者の疾患または疾患症状を治療する方法。
【請求項９７】
Ｔｆタンパク質がタンパク質のそれぞれの端部にＮ末端ドメインを有する、請求項１または請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項９８】
抗体可変領域がＴｆタンパク質のそれぞれのＮ末端ドメインに融合される、請求項９７に記載の融合タンパク質。
【請求項９９】
抗体可変領域が毒素と特異的に結合する、請求項１または請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項１００】
抗体可変領域がＴＮＦに結合する、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
疾患が、敗血症ショック；エンドトキシンショック；細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、新生物疾患に関連する悪液質症候群；自己免疫疾患、炎症性疾患、関節炎、および移植片拒絶の予防のための治療に関連した有害作用からなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
Ｔｆタンパク質がＮドメインを１つだけ含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０３】
Ｔｆにおけるシステインが１つ以上置換されている、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１０４】
１つ以上のシステインがセリンで置換される、請求項１０３に記載の融合タンパク質。
【請求項１０５】
前記化合物がツニカマイシンである、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項１０６】
炭水化物の一部またはすべてを脱グリコシル化するために酵素で処理されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０７】
抗体可変領域により、Ｔｆループの一部およびそのＴｆループに隣接する一部が置換される、請求項２５に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]  本出願は、米国仮特許出願第６０／４０６，９７７号（２００２年８月３０日出願）および米国特許出願第１０／３８４，０６０号（２００３年３月１０日出願）（これらをともにその全体を参照として組み入れる）に対する優先権を主張する。
【発明の分野】
【０００２】
[0002]  本発明は、グリコシル化の低下または阻害を生じさせ、かつ／あるいは、鉄の結合および／またはトランスフェリン受容体の結合の低下または阻害を生じさせるために改変されたトランスフェリン分子に融合または挿入された、高まった血清安定性および／またはインビボ循環半減期を有する治療タンパク質または治療ペプチドに関する。具体的には、本発明は、トランスフェリン分子または改変されたトランスフェリン分子に融合または挿入された一本鎖抗体を含む。
【発明の背景】
【０００３】
[0003]  治療タンパク質または治療ペプチドは、その本来の状態において、または組換え産生されたとき、典型的には、短い期間の血清安定性または短いインビボ循環半減期を示す不安定な分子である。また、これらの分子は、多くの場合、配合されたとき、特に、診断目的および治療目的のために水溶液で配合されたときには、極めて不安定である。
【０００４】
[0004]  タンパク質性治療分子のインビボまたはインビトロでの安定性を高めるか、または促進するための、実用的な溶液は、ほとんど存在していない。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質に結合して、タンパク質のより長期に作用する持続した活性をもたらすことができる物質である。タンパク質の活性が、ＰＥＧへの結合によって長くなる場合、そのタンパク質を投与するために必要とされる頻度を少なくすることができる。しかしながら、ＰＥＧの結合は、多くの場合、タンパク質の治療活性を低下させ、または破壊する。場合により、ＰＥＧの結合は、タンパク質の免疫原性を低下させことができるが、他の場合には免疫原性を増大させことがある。
【０００５】
[0005]  治療タンパク質または治療ペプチドはまた、治療タンパク質のインビボ循環半減期を高めることができるタンパク質に融合することによって安定化されている。例えば、アルブミンまたは抗体フラグメントに融合された治療タンパク質は、非融合状態の治療タンパク質と比較したとき、高まったインビボ循環半減期を示す場合がある。米国特許第５，８７６，９６９号および同第５，７６６，８８３号を参照されたい。
【０００６】
[0006]  別の血清タンパク質であるグリコシル化ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）もまた、治療タンパク質との融合体を作製して、細胞の内部への送達を標的化するために、または、血液脳関門を越えて薬剤を運ぶために使用されている。グリコシル化ヒトＴｆを含むこれらの融合タンパク質は、全長Ｔｆを薬剤に融合することによって、神経成長因子（ＮＧＦ）または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を、血液脳関門を越えて標的化するために使用されている。米国特許第５，６７２，６８３号および同第５，９７７，３０７号を参照されたい。これらの融合タンパク質において、分子のＴｆ部分はグリコシル化され、２原子の鉄に結合する。これは、Ｔｆが細胞のＴｆ受容体に結合するために必要であり、また、これらの特許の発明者らによれば、血液脳関門を越えてＮＧＦ成分またはＣＮＴＦ成分の送達を標的化するために必要とされる。トランスフェリン融合タンパク質はまた、Ｔｆ受容体を介した細胞の内部への標的化された送達のために別の形態のＴｆ融合をもたらすことができることを調べるために、ＨＩＶ−１プロテアーゼ標的配列をグリコシル化トランスフェリンの表面露出ループの中に挿入することによって作製されている（Ａｌｉら（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３）。
【０００７】
[0007]  血清トランスフェリン（Ｔｆ）は、分子量が８０，０００ダルトンの単量体の糖タンパク質であり、循環において鉄と結合し、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介して様々な組織に鉄を輸送する（Ａｉｓｅｎら（１９８０）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：３５７〜３９３；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら（１９８１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：３５４３〜３５５３；米国特許第５，０２６，６５１号）。Ｔｆは最も一般的な血清分子の１つであり、総血清タンパク質の約５〜１０％までを構成している。糖欠損トランスフェリンが、アルコール中毒者の血液中に高レベルで存在し、これはグリコシル化トランスフェリンの半減期（約７〜１０日）よりも長い半減期（約１４〜１７日）を示している。ｖａｎ  Ｅｉｊｋら（１９８３）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１３２：１６７〜１７１；Ｓｔｉｂｌｅｒ（１９９１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、３７：２０２９〜２０３７（１９９１）；Ａｒｎｄｔ（２００１）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４７（１）：１３〜２７；Ｓｔｉｂｌｅｒら、「炭水化物不足の消費」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｏｒｄｍａｎｎら編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、１９８８年、第７１巻、３５３頁〜３５７頁を参照されたい。
【０００８】
[0008]  Ｔｆの構造は十分に特徴づけられており、受容体の結合、鉄の結合および放出、ならびに炭酸イオンの結合の機構が解明されている（米国特許第５，０２６，６５１号、同第５，９８６，０６７号、およびＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙら（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８（６）：３５４３〜３５４６）。
【０００９】
[0009]  トランスフェリン、およびトランスフェリン受容体と結合する抗体もまた、ガンの治療として毒性薬剤を腫瘍細胞に送達または運搬するために使用されており（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、１９９４）、また、トランスフェリンは、ＤＮＡを細胞に送達するために非ウイルス性遺伝子治療ベクターとして使用されている（Ｆｒａｎｋら、１９９４；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２）。トランスフェリン受容体を進入点として使用してタンパク質を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することができることが、ＣＤ４（Ｗａｌｕｓら、１９９６）、脳由来神経栄養因子（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９４）、グリア由来神経栄養因子（Ａｌｂｅｃｋら）、バソインテスティナルペプチドアナログ（Ｂｉｃｋｅｌら、１９９３）、β−アミロイドペプチド（Ｓａｉｔｏら、１９９５）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５）を含むいくつかのタンパク質およびペプチドを用いて明らかにされている。
【００１０】
[0010]  しかしながら、トランスフェリン融合タンパク質は、Ｔｆ成分のグリコシル化の低下または阻害をもたらすことによって治療タンパク質または治療ペプチドのインビボ循環半減期を延ばし、またはバイオアベイラビリティを増大させるために、あるいは、鉄および／またはＴｆ受容体の結合を低下させ、または妨げるためには改変または操作されていない。
【００１１】
抗体およびその構造
[0011]  血液および他の体液中を循環する抗体は体液性抗体と呼ばれ、抗体の親であるリンパ球に結合したままである「膜抗体」とは区別される。免疫グロブリンの用語は、すべての抗体を示すために総称的に使用される。ヒトにおいて、すべての免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥと名付けられた５つのクラスに分けられる。それぞれの免疫グロブリン分子は、一方が重鎖または軽鎖と名付けられた２対の同一ポリペプチド鎖からなる。「重鎖」は、ガンマ（γ）、アルファ（α）、ミュー（μ）、デルタ（δ）およびイプシロン（ε）と呼ばれる。「軽鎖」はラムダ（λ）またはカッパ（κ）と呼ばれる。
【００１２】
[0012]  天然に存在する抗体は、４つのポリペプチド鎖から、すなわち、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖からなる。各重鎖は約５０ｋＤａ〜７０ｋＤａであり、各軽鎖は約２５ｋＤａである。これらの鎖はジスルフィド結合によって連結される。抗体分子の基本構造は文字Ｙの形状を有する。Ｙの各枝（アーム）は１つの軽鎖および１つの重鎖の一部からなり、一方、Ｙの幹（ステム）は重鎖の残り部分からなる。Ｙのアームおよびステムはヒンジ領域によってつながれ、これにより、アームは動くことができる。
【００１３】
[0013]  抗体分子のステムと、ステムに連結されたアームの一部とにより、免疫グロブリンの定常ドメインが構成される。これらのドメインは、保存されたアミノ酸配列を有し、低い可変性を示す。アームの反対側の端部には、１００アミノ酸〜１１０アミノ酸からなる軽鎖および重鎖の可変領域が存在し、その内部には、非保存的アミノ酸配列または超可変領域の小さい領域が３つ存在する。これらの領域は抗原認識および抗原結合に関与している。
【００１４】
[0014]  すべての軽鎖のドメイン構造は、会合する重鎖クラスにかかわりなく同一である。各軽鎖は、１つのＶＬドメインと、constant, lightまたはＣＬと名付けられた比較的変化しないアミノ酸配列を有する１つのドメインとの２つのドメインを有する。これに対して、重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４と名付けられた定常ドメインまたはＣドメインの３つ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ）または４つ（ＩｇＭ、ＩｇＥ）と、ＶＨと名付けられた１つの可変ドメインとを有し得る。あるいは、Ｃドメインはその重鎖クラスにしたがって呼ばれることがある；例えば、Ｃε４はＩｇＥ（ε）重鎖のＣＨ４ドメインを示す。
【００１５】
[0015]  それぞれの可変軽鎖領域（ＶＬ）および可変重鎖領域（ＶＨ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる３つの超可変領域を含有する。ＣＤＲは一緒になり、抗原と結合するためのポケットを形成する。超可変領域におけるアミノ酸配列の可変性の結果として、結合部位の形状および性質が変化し、抗原に対する部位の特異性が変化する。
【００１６】
[0016]  通常、抗原が身体に進入したとき、その種々の部分が、さまざまなナイーブなＢ細胞によって認識される。各Ｂ細胞により、結合部位がわずかに異なる抗体が形成される。その結果、抗体分子の混合物が産生される。１９７７年に、Ｇｅｏｒｇｅ  ＫｏｈｌｅｒおよびＣｅｓａｒ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎは、同じ親和性を有する単一のタイプの抗体を多量に得る方法を発見した。モノクローナル抗体を作製するためにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより使用された方法は、免疫した動物から得られたＢ細胞を骨髄腫細胞と融合して、不死性ハイブリドーマの集団を作製すること、および、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択することを伴う。
【００１７】
[0017]  モノクローナル抗体は重要な研究ツールであり、また、治療剤として使用されている。しかしながら、モノクローナル抗体は、製造することが非常に高価かつ困難である。また、そのサイズが大きいことにより、多くの場合、モノクローナル抗体がその標的部位に到達することが阻害される。
【００１８】
一本鎖抗体
[0018]  一本鎖抗体（ＳＣＡ）はこれまで、診断および治療への応用においてモノクローナル抗体に取って代わるための手段として基礎研究および応用研究の対象となってきた。ＳＣＡは、モノクローナル抗体の結合特異性および結合親和性を有するが、サイズがそれよりも小さい遺伝子操作されたタンパク質であり、より迅速な毛細血管透過性を可能にする。モノクローナル抗体を上回るＳＣＡの利点には、診断的画像化および治療の両方のためのより優れた組織浸透性、免疫原性問題の低下、体内の標的部位へのより特異的な局在化、および、大量に作製することがより容易であり、かつ費用があまりかからないことが挙げられる。
【００１９】
[0019]  ＳＣＡは、通常、抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖の２つの可変領域をつなぐための短いペプチドリンカーを使用して形成される。これらの可変領域を連結するための適切なリンカーは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、完全な抗体の結合特異性を維持する三次元構造を有する単一ポリペプチド鎖に折り畳まれることを可能にするリンカーである。一本鎖の抗原結合タンパク質の理論および作製の説明が、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，２６０，２０３号、同第５，４５５，０３０号および同第５，５１８，８８９号、ならびに、Ｈｕｓｔｏｎらの米国特許第５，０９１，５１３号（「生合成的抗体結合部位」（ＢＡＢＳ））に見出される（それらの開示をすべて、参照として本明細書中に組み入れる）。上記特許に示された方法のもとで製造された一本鎖の抗原結合タンパク質は、対応するＦａｂフラグメントの結合特異性および結合親和性と実質的に類似する結合特異性および結合親和性を有する。
【００２０】
Ｆｃ領域
[0020]  抗体がパパインまたはペプシンなどのタンパク質分解酵素にさらされたとき、数個の主要なフラグメントが生じる。抗原結合能を保持しているこれらのフラグメントは抗体のＹ形態の２つの「アーム」からなり、Ｆａｂ（フラグメント−抗原結合性）、または、ジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂアーム部を表すＦａｂ’２と呼ばれている。生じたそれ他の主要なフラグメントはＹの１つだけの「テール」または中心軸を構成し、溶液から結晶化するその傾向のためにＦｃ（フラグメント−結晶性）と呼ばれている。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＤのＦｃフラグメントは、それぞれの抗体の２つのカルボキシ末端ドメイン（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤにおけるＣＨ２およびＣＨ３、ＩｇＭにおけるＣＨ３およびＣＨ４）の二量体からなる。これに対して、ＩｇＥのＦｃフラグメントはその３つのカルボキシ末端重鎖ドメイン（Ｃε２、Ｃε３およびＣε４）の二量体からなる。
【００２１】
[0021]  Ｆｃフラグメントには、抗体が免疫系の他の分子または細胞と「連絡する」ことを可能にし、それにより免疫系の防御機能を活性化および調節する、抗体の生物学的「活性部位」が含有される。このような連絡は、抗体領域内の活性部位が、Ｆｃ受容体と呼ばれる分子に結合したときに生じる。
【００２２】
[0022]  Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンのＦｃ領域に関して分子的活性部位に高い親和性および特異性で結合する分子である。Ｆｃ受容体は、細胞の外側の形質膜における内在性膜タンパク質として存在し得るか、あるいは、血漿または他の体液中を自由に循環する遊離型の「可溶性」分子として存在し得る。
【００２３】
[0023]  ５つの抗体クラスはそれぞれが、特定のクラスのＦｃ領域に特異的に結合し、異なる機能を発揮する数タイプのＦｃ受容体を有する。したがって、ＩｇＥのＦｃ受容体は、高い親和性で、ＩｇＥのＦｃ領域だけに、またはＩｇＥの単離されたＦｃフラグメントに結合する。Ｆｃ領域内の異なる場所を認識し、その場所に結合する種々のタイプのクラス特異的なＦｃ受容体が存在することが知られている。例えば、ＩｇＧのあるＦｃ受容体はＩｇＧの２番目の定常ドメイン（ＣＨ２）に専ら結合し、その一方で、他の免疫機能を媒介するＦｃ受容体はＩｇＧの３番目の定常ドメイン（ＣＨ３）に専ら結合する。ＩｇＧの他のＦｃ受容体は、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの両方に存在する活性部位に結合するが、１つだけの孤立したドメインには結合することができない。
【００２４】
[0024]  抗体のＦｃ領域の活性部位により活性化されると、Ｆｃ受容体は様々な重要な免疫殺傷機能および免疫調節機能を媒介する。例えば、ＩｇＧのいくつかのＦｃ受容体は、抗体がそのＦａｂアーム部を介して結合した細胞の直接的な殺傷を媒介する（抗体依存性細胞性細胞障害作用（ＡＤＣＣ））。ＩｇＧの他のＦｃ受容体は、ＩｇＧによって占有されたとき、いくつかの白血球を刺激して、食作用として知られるプロセスによって、細菌、ウイルス、ガン細胞または他の物質を飲み込み、破壊する。Ｂリンパ球として知られる白血球のいくつかのタイプにおけるＦｃ受容体はＢリンパ球の成長および抗体分泌形質細胞への発達を調節する。好塩基球およびマスト細胞として知られるいくつかの白血球に存在する、ＩｇＥに対するＦｃ受容体は、抗原により架橋されたＩｇＥによって占有されたとき、花粉症および喘息に特徴的なアレルギー反応を開始させる。
【００２５】
[0025]  血液補体系の一部であるいくつかの可溶性Ｆｃ受容体は、細菌、ウイルスおよびガン細胞を殺すことができる炎症応答を開始させる。他のＦｃ受容体はいくつかの白血球を刺激して、免疫防御を助けるリンホカインとして総称的に知られる強力な調節分子または細胞障害性分子を分泌させる。これらは、抗体のＦｃ受容体によって媒介される免疫活性のほんの少数の代表的な例にすぎない。
【００２６】
[0026]  抗体の機能を決めるアミノ酸のほとんどは、抗体の構造（非常に規則的な三次元形状）を決定する分子的「足場」である。数個のアミノ酸クラスターからなる抗体活性部位を正しく露出させ、空間的に配置するという非常に重要な機能を果たすのはこの足場である。特定の活性部位は、その機能に依存するが、すでに露出している場合があり、したがって、細胞受容体に結合することができる。あるいは、特定の活性部位は、抗体が抗原に結合するまでは隠されている場合があり、この場合、抗体が抗原に結合したとき、足場が配向を変化させ、続いて抗体の活性部位を露出させる。露出した活性部位は、その後、細胞の表面に存在するか、または可溶性分子（例えば、補体）の一部として存在するその特異的なＦｃ受容体に結合し、続いて特異的な免疫活性を開始させる。
【００２７】
[0027]  抗体の足場の機能は、細胞または可溶性分子に結合するためにその活性部位を保持し、配置することであるので、抗体の活性部位は、ペプチドとして単離および合成されたとき、完全な抗体分子の免疫調節機能を果たすことができる。
【００２８】
[0028]  活性部位ペプチドが結合する特定のタイプのＦｃ受容体に依存して、ペプチドは免疫機能の刺激または阻害のいずれかをもたらすことができる。刺激は、Ｆｃ受容体が、Ｆｃ領域に結合するという作用によって活性化されるタイプである場合に、あるいは、Ｆｃの活性部位ペプチドが受容体を刺激する場合に生じ得る。もたらされる刺激のタイプには、限定されないが、抗体Ｆｃ領域−Ｆｃ受容体の結合により直接的または間接的に媒介される様々な機能が含まれる。このような機能の例には、いくつかのクラスの白血球（多形核好中球、単球およびマクロファージ）による食作用の刺激、マクロファージ活性化、抗体依存性細胞性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の成長および発達、ならびにリンパ球によるリンホカイン（殺傷活性または免疫調節活性を有する分子）の分泌が含まれるが、これらに限定されない。
【発明の概要】
【００２９】
[0029]  以下においてより詳しく記載するように、本発明は、少なくとも１つの抗体フラグメントまたはＣＤＲフラグメント（好ましくは抗体可変領域）を含む改変Ｔｆ融合タンパク質を含む。ここで、Ｔｆタンパク質は、分子のインビボ循環半減期またはバイオアベイラビリティを高めるために操作されている。本発明はまた、このような融合タンパク質を含む医薬製剤および医薬組成物、ならびに、改変されたトランスフェリンに融合することによって抗体フラグメントまたはＣＤＲフラグメントの血清安定性、インビボ循環半減期およびバイオアベイラビリティを高める方法、改変Ｔｆ融合タンパク質をコードする核酸分子などを含む。本発明の別の態様は、患者を改変Ｔｆ融合タンパク質で治療する方法に関する。
【００３０】
[0030]  好ましくは、改変Ｔｆ融合タンパク質は、グリコシル化、鉄の結合および／または受容体の結合を低下または防止するために改変されているヒトＴｆ成分を含む。
【００３１】
[0031]  一態様において、本発明は、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに連結されたＳＣＡまたはＣＤＲ領域を含む「トランスボディー」を提供する。トランスボディーは、様々な薬理学的適用および診断的適用のために、種々の抗体可変領域を使用して構築することができる。
【００３２】
[0032]  別の態様において、本発明は、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに融合された１つ以上の抗原性ペプチドおよび抗体可変領域を含むトランスボディーを提供する。このようなトランスボディーは、抗原に結合する能力だけでなく、宿主において免疫応答を誘導する能力をも有する。本発明はまた、１つ以上の抗原結合ペプチドを含むトランスボディーを提供する。
【００３３】
[0033]  そのうえ、本発明のトランスボディーは、トランスフェリン分子または改変されたトランスフェリン分子に融合された毒素に対する抗体を含む。更に、本発明のトランスボディーは、トランスフェリン分子または改変されたトランスフェリン分子に融合された毒素に対するＣＤＲを含む。毒素の例には、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）および炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）が含まれるが、これに限定されない。
【詳細な説明】
【００３４】
一般的記載
[0039]  本発明は、トランスフェリン、改変されたトランスフェリン、または、インビボにおける分子の半減期を延ばすために十分なトランスフェリンもしくは改変されたトランスフェリンの一部にＳＣＡを遺伝子融合することによって、抗体、抗体フラグメント、ＣＤＲ領域およびＳＣＡが安定化されて、インビボにおけるそれらの血清半減期および／または活性を延ばすことができるという本発明者らによる発見に部分的に基づいている。改変トランスフェリン融合タンパク質は、ＳＣＡ抗体または抗体フラグメントに共有結合的に連結されたトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンドメインを含み、この場合、トランスフェリン部分は、野生型トランスフェリン配列と比較したとき、１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を含有するために改変されている。一実施形態において、Ｔｆ融合タンパク質は、Ｔｆ内またはＴｆドメイン内のグリコシル化を低下させるか、または妨げるために操作される。他の実施形態において、Ｔｆタンパク質またはＴｆドメインは、鉄イオンもしくは炭酸イオンへの低下した結合を示すか、または鉄イオンもしくは炭酸イオンへの結合を示さないように、あるいはＴｆ受容体（ＴｆＲ）に対する低下した親和性を有するか、またはＴｆ受容体（ＴｆＲ）に結合しないように改変される。
【００３５】
[0040]  一実施形態において、本発明は、トランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に融合または挿入された抗体の可変領域を含む融合タンパク質を提供する。具体的には、本発明は、部分的には、抗体の少なくとも２つの可変領域をつなげて、改変形態のＳＣＡを形成するためのトランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンの使用に基づいている。この様式で形成されるＳＣＡ融合タンパク質は、目的とする抗原と結合する能力を有し、かつ、トランスフェリンの長い循環半減期を有する。
【００３６】
[0041]  通常、ＳＣＡは、短いペプチドを用いて２つの可変領域をつなぐことによって作製される。このペプチドは任意の配列を有することができ、多くの場合、ほとんどが、その配列相同性または生物学的機能のためではなく、その三次元構造のために選ばれる。しかしながら、このペプチドは非天然産物であるので、免疫反応を誘導する。この短いペプチドとは異なり、トランスフェリンは、天然に存在するタンパク質であり、抗原性を有しない。トランスフェリンをリンカーとして使用することによって形成されるＳＣＡは１種のトランスボディー（すなわち、抗体活性を有するトランスフェリン）である。トランスボディーは医薬的に有用であり、また、酵母などの微生物システムにおいて作製することが容易である。また、大きく、かつ可溶性のトランスフェリン骨格は、トランスフェリンに結合された可変ドメインの可溶化および安定化を助ける。トランスボディーは、様々な可変領域を使用して構築することができ、また、様々な薬理学的適用および診断適用のために使用することができる。
【００３７】
[0042]  したがって、本発明は、トランスボディー、トランスボディーを含む治療組成物、および、トランスボディーを投与することによって疾患または障害を治療、予防または改善する方法を含む。本発明のトランスボディーは、少なくとも抗体可変ドメインと、少なくとも改変トランスフェリンのフラグメントまたは変異体とを含み、この場合、それらは、好ましくは遺伝子融合によって互いに結合している（すなわち、トランスボディーは、抗体可変ドメインの全体または一部をコードするポリヌクレオチドが、改変トランスフェリンの全体または一部をコードするポリヌクレオチドとｉｎ−ｆｒａｍｅで連結されている核酸の翻訳によって生じる）。好ましい実施形態において、本発明は、ＶＨ領域、ＶＬ領域、または１つ以上のＣＤＲ領域からなる群から選択される抗体可変領域を含むトランスボディーを提供する。抗体可変領域およびトランスフェリンタンパク質は、トランスフェリン融合タンパク質の一部となったとき、トランスフェリン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」（例えば、「ＳＣＡ部分または抗体可変領域部分」あるいは「トランスフェリンタンパク質部分」）ということがある。
【００３８】
[0043]  一実施形態において、本発明は、抗体可変領域およびトランスフェリンタンパク質または改変トランスフェリン分子を含むトランスボディー、あるいは、抗体可変領域およびトランスフェリンタンパク質または改変トランスフェリン分子からなるトランスボディーを提供する。他の実施形態において、本発明は、生物学的に活性な抗体可変領域と、トランスフェリンタンパク質または改変トランスフェリン分子とを含むトランスボディー、あるいは、生物学的に活性な抗体可変領域と、トランスフェリンタンパク質または改変トランスフェリン分子とからなるトランスボディーを提供する。他の実施形態において、本発明は、抗体可変領域（例えば、ヒト化抗体可変領域）の生物学的に活性で、かつ／または治療的に活性な変異体と、トランスフェリンタンパク質または改変トランスフェリン分子とを含むトランスボディー、あるいは、抗体可変領域（例えば、ヒト化抗体可変領域）の生物学的に活性で、かつ／または治療的に活性な変異体と、トランスフェリンタンパク質または改変トランスフェリン分子とからなるトランスボディーを提供する。更なる実施形態において、本発明は、抗体可変領域と、改変されたトランスフェリンの生物学的に活性で、かつ／または治療的に活性なフラグメントとを含むトランスボディーを提供する。
【００３９】
[0044]  また、本発明は、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたは免疫調節ペプチドを含むトランスボディーを開示する。このようなトランスボディーは、その抗原と結合することができるだけでなく、宿主において免疫応答を誘導することもできる。
【００４０】
[0045]  別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似または同等な方法および材料はどれも、本発明を実施または試験することにおいて使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。
【００４１】
定義
[0046]  本明細書中で使用される用語「抗体可変領域」は１つ以上のＶＨ領域、ＶＬ領域またはＣＤＲ領域を含む。
【００４２】
[0047]  本明細書中で使用される用語「トランスボディー」は、抗体活性を有するトランスフェリンを示す。好ましくは、トランスボディーは、少なくとも１つの抗体可変領域と、トランスフェリン分子、改変されたトランスフェリン分子、またはそのフラグメントとを含む。トランスボディーは、宿主において免疫応答を誘導することができる１つ以上の抗原性ペプチドを更に含むことができる。
【００４３】
[0048]  本明細書中で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を示す。認められている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子、ならびに、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それらにより、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンクラスがそれぞれ定義される。
【００４４】
[0049]  抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、あるいは、例えば、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のみを含有するＦｖフラグメント、可変領域と定常領域の一部とを含有するＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）’２フラグメント、一本鎖抗体（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２４〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；これらをともに参照として本明細書中に組み入れる）などを含む様々な形態における改変体として存在し得る。抗体は動物（特にマウスもしくはラット）起源またはヒト起源であり得るか、あるいはキメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、６８５１〜６８５５（１９８４）；これを参照として本明細書中に組み入れる）であり得るか、またはヒト化され得る（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５（１９８６）；公開された英国特許出願第８７０７２５２号；これらをともに参照として本明細書中に組み入れる）。本明細書中で使用される用語「抗体」には、これらの様々な形態が含まれる。
【００４５】
[0050]  本明細書中で使用される用語「抗体の一本鎖可変フラグメント」（ｓｃＦｖ）または用語「一本鎖抗体」（ＳＣＡ）は、ペプチドリンカー（Ｌ）によってＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを含有し、ＶＬ−Ｌ−ＶＨによって表されるポリペプチドを意味する。ＶＬドメインおよびＶＨドメインの順序は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬとして表されるポリペプチドを得るために逆にすることができる。「ドメイン」または「領域」は、抗原結合または抗原認識などの別個の機能を引き受けるタンパク質のセグメントである。
【００４６】
[0051]  本明細書中で使用される用語「多価一本鎖抗体」は、ペプチドリンカーによって共有結合的に連結された２つ以上の一本鎖抗体フラグメントを意味する。抗体フラグメントは、下記のようなＶＬドメインおよびＶＨドメインの順序を有する二価一本鎖抗体を形成させるために結合することができる：ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−ＶＨ；ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｌ−ＶＨ−Ｌ−ＶＬ；ＶＨ−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−ＶＨ−Ｌ−ＶＬ；またはＶＨ−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−ＶＬ−Ｌ−ＶＨ。三価以上である単鎖多価抗体は、１つ以上の抗体フラグメントが更なるペプチド間リンカーによって二価一本鎖抗体に結合されている。好ましい実施形態において、ＶＬドメインおよびＶＨドメインの数は等しい。
【００４７】
[0052]  本明細書中で使用される「Ｆｖ」領域は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）を含有する一本鎖抗体Ｆｖ領域を示す。重鎖および軽鎖は同じ抗体に由来し得るか、または、異なる抗体に由来してもよく、それによりキメラＦｖ領域がもたらされる。
【００４８】
[0053]  本明細書中で使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を示す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜残基３４付近（Ｌ１）、残基５０〜残基５６付近（Ｌ２）および残基８９〜残基９７付近（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１〜残基３５付近（Ｈ１）、残基５０〜残基６５付近（Ｈ２）および残基９５〜残基１０２付近（Ｈ３）（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））、および／または、「超可変ループ」に由来するこのような残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜残基３２付近（Ｌ１）、残基５０〜残基５２付近（Ｌ２）および残基９１〜残基９６付近（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける残基２６〜残基３２付近（Ｈ１）、残基５３〜残基５５付近（Ｈ２）および残基９６〜残基１０１付近（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」残基または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４９】
[0054]  当分野では周知であるように、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体特異性に主として関わる抗体の一部である。ＣＤＲは抗原のエピトープと直接的に相互作用する（一般的には、Ｃｌａｒｋ、１９８６；Ｒｏｉｔｔ、１９９１を参照されたい）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両方の可変領域には、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によってそれぞれ隔てられて存在する。フレームワーク領域（ＦＲ）は、抗原との相互作用に関与する抗体の一部であるパラトープの三次構造を維持する。ＣＤＲ、具体的にはＣＤＲ３領域、より具体的には重鎖ＣＤＲ３、は抗体特異性に寄与している。これらのＣＤＲ領域、具体的にはＣＤＲ３領域、は抗原特異性を抗体に付与するので、これらの領域をトランスボディーに取り込み、同一の抗原特異性をこの物質に付与することができる。
【００５０】
[0055]  本発明のトランスボディーを合成する際に使用されるＣＤＲ領域の配列は、当分野では既知の様々な方法によって決定することができる。重鎖可変領域は、長さが一般には１００アミノ酸から１５０アミノ酸に及ぶペプチドである。軽鎖可変領域は、長さが一般には８０アミノ酸から１３０アミノ酸に及ぶペプチドである。およそ３アミノ酸〜２５アミノ酸の配列のみを含む重鎖可変領域内および軽鎖可変領域内のＣＤＲ配列は、当業者によって容易に配列決定することができる。ペプチドは、市販品の製造元によって、例えば、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｃｏｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）などによって合成することさえできる。
【００５１】
[0056]  他の実施形態において、ＣＤＲ領域またはＣＤＲ配列は、ペプチド配列のライブラリーとしてランダムに作製し、所望の結合特性または機能的特性について標準的なアレイを使用してスクリーニングすることができる。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内では比較的保存されている。本明細書中で使用される「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に対して実質的に同一（約８５％以上、通常は約９０％〜９５％またはそれ以上）であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成要素の軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、ＣＤＲの配置および整列のために役立つ。
【００５２】
[0057]  本明細書中で使用される用語「結合ドメイン」は下記の１つまたは組合せを示す：（ａ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたは他の免疫グロブリン）のＶＬ領域＋ＶＨ領域；（ｂ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたは他の免疫グロブリン）のＶＬ領域＋ＶＬ領域；（ｃ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたは他の免疫グロブリン）のＶＨ領域＋ＶＨ領域；（ｄ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたは他の免疫グロブリン）の１つだけのＶＬ領域；（ｅ）免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭまたは他の免疫グロブリン）の１つだけのＶＨ領域、または１つ以上のＣＤＲペプチド配列；あるいは（ｆ）ＣＤＲペプチドと類似する抗原結合活性を有するペプチド。
【００５３】
[0058]  本明細書中で使用される用語「ヒト化（された）」は、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合性の部分配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を示す。多くは、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）で、レシピエント抗体の超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって置換されているものである。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能を更に精緻化および最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含み、この場合、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、かつ、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のそれらである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリンの定常領域または定常ドメイン（Ｆｃ）の一部を少なくとも含み、典型的には、ヒト免疫グロブリンのこのような一部を少なくとも含む。
【００５４】
[0059]  本明細書中で使用される用語「生物学的活性」は、生物学的環境において（すなわち、生物またはそのインビトロ複製環境において）治療用の分子、タンパク質またはペプチド（好ましくは、抗体可変フラグメントまたはＣＤＲ領域）によって発揮される１つの機能または一組の活性を示す。生物学的活性には、特許請求の範囲に記載される融合タンパク質の抗体部分の様々な機能を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明の融合タンパク質または融合ペプチドは、抗体対応体の１種以上の生物学的活性を示すか、あるいは、試験中のトランスボディーに関係したインビボアッセイまたはインビトロアッセイにおいて識別可能な応答を発揮するならば、生物学的に活性であると見なされる。
【００５５】
[0060]  本明細書中で使用される場合、配列「に対応するアミノ酸」またはある配列における「等価なアミノ酸」は、第１の配列と少なくとも第２の配列との間における同一性または類似性を最大にするためのアラインメント（配列比較）によって同定される。第２の配列における等価なアミノ酸を同定するために使用される数は、第１の配列における対応するアミノ酸を同定するために使用される数に基づく。場合により、これらの表現は、ウサギの血清トランスフェリンまたは別の種に由来するトランスフェリンにおける特定の残基と比較して、ヒトのトランスフェリンにおけるアミノ酸残基を記載するために使用されることがある。
【００５６】
[0061]  本明細書中で使用される用語「Ｔｆタンパク質のフラグメント」または用語「Ｔｆタンパク質」または用語「Ｔｆタンパク質の部分」は、天然に存在するＴｆタンパク質またはその変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むアミノ酸配列を示す。
【００５７】
[0062]  本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連する任意のＤＮＡセグメントを示す。したがって、遺伝子には、コード配列、および／またはその発現のために要求される調節配列が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含むことができる。遺伝子は、目的とする供給源からクローン化すること、または既知の配列情報もしくは予測された配列情報から合成することを含めて、様々な供給源から得ることができ、そして所望のパラメーターを有するように設計された配列を含むことがある。
【００５８】
[0063]  本明細書中で使用される「異種のポリヌクレオチド」または「異種の核酸」または「異種の遺伝子」または「異種の配列」または「外因性のＤＮＡセグメント」は、特定の宿主細胞に対して外来である供給源に由来するポリヌクレオチドまたは核酸またはＤＮＡセグメントを示し、あるいは、同じ供給源に由来する場合、その元の形態から改変されている。宿主細胞における異種の遺伝子には、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、改変されている遺伝子が含まれる。したがって、これらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるＤＮＡセグメントを示すか、または、細胞に対して相同的であるが、その要素が通常の場合には見出されない宿主細胞の核酸の内部の位置にあるＤＮＡセグメントを示す。一例を挙げるならば、酵母細胞に対して生来的シグナル配列がヒトＴｆ配列に結合すると、それは異種である。
【００５９】
[0064]  本明細書中で使用される「単離された」核酸配列は、他の核酸配列を本質的には含まない核酸配列を示し、例えば、アガロースゲル電気泳動によって測定されたとき、少なくとも約２０％純粋（好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは約６０％純粋、更により好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、更に最も好ましくは約９５％純粋）である核酸配列を示す。例えば、単離された核酸配列は、核酸配列を、その天然の存在位置から、その核酸配列が再生産される異なる部位に再配置するための遺伝子工学において使用される標準的なクローニング手法によって得ることができる。このようなクローニング手法では、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望する核酸フラグメントの切り出しおよび単離、ベクター分子へのフラグメントの挿入、ならびに核酸配列の多数のコピーまたはクローンが複製される宿主細胞内への組換えベクターの取り込みが伴い得る。核酸配列は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ＲＮＡ起源、半合成起源、合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであってもい。
【００６０】
[0065]  本明細書中で使用される場合、２つ以上のＤＮＡコード配列は、それらのＤＮＡコード配列の間におけるインフレーム融合の結果として、ＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳されるとき、「連結」または「融合」されていると言われる。
【００６１】
[0066]  本明細書中で使用される場合、Ｔｆ融合体に関する用語「融合」には、少なくとも１つの治療用のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド（好ましくは、抗体可変領域）をＴｆのＮ末端に結合すること、ＴｆのＣ末端に結合すること、Ｔｆ内において任意の２つのアミノ酸の間に挿入すること、および／または、ＴｆループなどのＴｆ配列の一部を置換することが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
[0067]  本明細書中で使用される場合、本明細書中で使用される用語「改変（された）トランスフェリン」は、野生型トランスフェリンと比較して、そのアミノ酸配列の少なくとも１つの改変を示すトランスフェリン分子を示す。好ましい実施形態において、「改変（された）トランスフェリン」は、低下したグリコシル化を示すか、またはグリコシル化を全く示さず、かつ、低下した鉄または炭酸イオンの結合を示すか、または鉄または炭酸イオンの結合を全く示さず、かつ、低下したトランスフェリン受容体の結合を示すか、またはトランスフェリン受容体の結合を全く示さないように改変されたトランスフェリンを示す。
【００６３】
[0068]  本明細書中で使用される場合、本明細書中で使用される用語「改変トランスフェリン融合タンパク質」は、少なくとも１分子の改変されたトランスフェリン（またはそのフラグメントもしくは変異体）を、少なくとも１分子の治療タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）に、好ましくは、少なくとも１分子の抗体可変フラグメントまたはＣＤＲに融合することによって形成されるタンパク質を示す。
【００６４】
[0069]  本明細書中で使用される用語「核酸」または用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかでのデキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを示す。具体的に限定されない限り、これらの用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドのアナログを含有する核酸を包む。別途示されない限り、ある特定の核酸配列ではまた、言うまでもなく、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドンの置換）、および相補的な配列が、明示的に示される配列と同様に含まれる。具体的には、縮重コドンの置換は、１つ以上の選択されたコドン（またはすべてのコドン）の３番目の位置が混合塩基残基および／またはデオキシイノシン残基で置換される配列を作製することによって達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら（１９８５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌら（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら（１９９４）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１〜９８）。核酸の用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によりコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。
【００６５】
[0070]  本明細書中で使用されるＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的な関係に置かれているとき、「機能的に連結されている」という。例えば、シグナル配列のＤＮＡは、融合タンパク質の分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに機能的に連結されている。一方、プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターまたはエンハンサーにより配列の転写が刺激される場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されているＤＮＡ配列は連続しており、シグナル配列または融合タンパク質の場合には、両者は連続し、かつ読み取り相が一致している。しかしながら、エンハンサーは、その転写がエンハンサーによって制御されるコード配列と連続している必要はない。これに関連して、連結は、都合のよい制限部位における連結によって、またはその代わりに挿入されているアダプターもしくはリンカーにおける連結によって達成される。
【００６６】
[0071]  本明細書中で使用される用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼと結合して、転写を開始させることに関与するＤＮＡ領域を示す。
【００６７】
[0072]  本明細書中で使用される用語「組換え」は、遺伝子またはＤＮＡの新しい組合せによる形質転換を受けている細胞、組織または生物を示す。
【００６８】
[0073]  本明細書中で使用される場合、標的物、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、特定の細胞タイプ［正常（例えば、リンパ球）または異常（例えば、ガン細胞）］に特異的に結合する分子を示し、したがって、トランスボディーまたは化合物（薬物または細胞障害性薬剤）をその細胞タイプに特異的に標的化するために使用することができる。
【００６９】
[0074]  本明細書中で使用される「治療（用の）タンパク質」には、１以上の治療活性および／または生物学的活性を有するタンパク質、ポリペプチド、ＳＣＡ、抗体可変フラグメント、ＣＤＲもしくはペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体が含まれる。ペプチド、タンパク質およびポリペプチドのこれらの用語は本明細書中では交換可能に使用される。また、用語「治療（用の）タンパク質」は、治療タンパク質の内因性相関体または天然に存在する相関体を示す場合がある。「治療活性」を示すポリペプチド、または「治療上活性な」タンパク質により、本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ当分野では既知の治療タンパク質の１以上などの治療タンパク質に関連する１以上の既知の生物学的活性および／または治療活性を有するポリペプチドが意味される。非限定的な一例として、「治療タンパク質」は、疾患、状態または障害を治療、予防または改善するために有用であるタンパク質である。このような疾患、状態または障害はヒトに存在し得るか、または非ヒト動物に存在し得る（例えば、獣医学的使用）。
【００７０】
[0075]  本明細書中で使用される用語「形質転換」は、細胞内への核酸（すなわち、ヌクレオチドポリマー）の移行を示す。本明細書中で使用される用語「遺伝的形質転換」は、細胞内へのＤＮＡ（特に、組換えＤＮＡ）の移行および取り込みを示す。
【００７１】
[0076]  本明細書中で使用される用語「形質転換体」は、形質転換を受けた細胞、組織または生物を示す。
【００７２】
[0077]  本明細書中で使用される用語「導入遺伝子」は、その機能を保証する様式で生物、宿主細胞またはベクターに挿入される核酸を示す。
【００７３】
[0078]  本明細書中で使用される用語「遺伝子組換えの」は、形質転換の様々な方法のいずれかによって、外来遺伝子または改変された遺伝子、具体的には、改変Ｔｆ融合タンパク質をコードする遺伝子を受け取っている細胞、細胞培養物、生物、細菌、菌類、動物、植物および上記のいずれかの子孫を示す。この場合、外来遺伝子または改変された遺伝子は、外来遺伝子または改変された遺伝子を受け取っている生物の種と同じ種または異なる種に由来する。
【００７４】
[0079]  「変異体」は、参照核酸または参照ポリペプチドとは異なるが、その本質的な性質を保持しているポリヌクレオチドまたは核酸を示す。一般に、変異体は、全体的に非常に類似しており、多くの領域において参照核酸または参照ポリペプチドと同一である。本明細書中で使用される「変異体」は、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療タンパク質部分であって、本来の治療タンパク質とは配列が異なるが、本明細書中に別記されるか、またはそうでない場合には当分野で既知である少なくとも１つのその機能的性質および／または治療的性質を保持している部分を言う。
【００７５】
[0080]  本明細書中で使用される用語「ベクター」は、広義には、外因性の核酸をコードする任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスを示す。この用語はまた、ビリオン内または細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド化合物、非ファージミド化合物および非ウイルス化合物、例えば、ポリリシン化合物などを含むように解釈される。ベクターは、核酸またはその変異体を細胞に送達するための運搬体として適切であるウイルスベクターであり得るか、あるいは、ベクターは、同じ目的のために適切である非ウイルスベクターであり得る。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの様々な例が、当分野では十分に知られており、例えば、Ｍａら（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２７４４〜１２７４６）に記載される。ウイルスベクターの例には、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルス（これらに限定されない）などが含まれる（Ｃｒａｎａｇｅら、１９８６、ＥＭＢＯ  Ｊ．、５：３０５７〜３０６３；国際公開公報第９４／１７８１０号（１９９４年８月１８日公開）；国際公開公報第９４／２３７４４号（１９９４年１０月２７日公開））。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
[0081]  本明細書中で使用される用語「野生型」は、天然に存在するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を示す。
【００７７】
[0082]  本明細書中で使用される用語「毒素」は生物学的起源の有毒物質である。
【００７８】
[0083]  本明細書中で使用される用語「免疫調節（の）」は、Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれかのレベルで抗原特異的な免疫応答を増大または低下させる能力を示す。免疫調節活性は、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、抗体産生、リンホカイン産生またはＴ細胞応答性を測定することによって検出することができる。特に、Ｔ細胞応答に対する影響に加えて、本発明の免疫調節ポリペプチドは、Ｂ細胞の表面で免疫グロブリン（すなわち、抗体）分子に結合し、同様にＢ細胞応答に影響を及ぼすことができる。
【００７９】
[0084]  本明細書中で使用される用語「免疫調節ペプチド」は、免疫応答に影響を及ぼすペプチドである。
【００８０】
[0085]  本明細書中で使用される用語「Ｆｃ領域」は、定常領域から構成される抗体分子の茎部を示す。Ｆｃ領域はまた、エフェクター領域とも呼ばれている。Ｆｃ領域は免疫系の他の構成成分と相互作用し、これにより、細菌が存在するというシグナルを細胞応答に変換する。抗体のＦｃ領域は、免疫応答の経過を通して異なる読み出し情報をもたらす際の重要な領域である。この領域は重鎖から構成され、読み出し情報が免疫応答の経過を通して変化する様式は、抗体のＦｃ領域の構造を変化させるためである。定常領域を変化させることによって、抗体のクラスが変化する。このプロセスはクラススイッチングと呼ばれており、Ｂリンパ球において行われている。
【００８１】
一本鎖抗体およびトランスボディー
[0086]  従来の抗体と比較した場合、一本鎖抗体は、サイズがより小さく、著しく低いコストで製造することができる。一本鎖抗体のサイズがより小さいことは、身体の免疫学的反応を低下させることができ、したがって、治療的適用の安全性および効能を増大させることができる。逆に、一本鎖抗体を、非常に抗原性であるように操作することができる。
【００８２】
[0087]  様々な一本鎖抗体（ＳＣＡ）が、元来は、抗体の選択および製造を単純化するために発明された。しかしながら、それらは、その小さいサイズ、自己凝集、および短いインビボ半減期のために、治療的価値が限られているか、または全くないことが判明した。トランスフェリンをＳＣＡに付加することにより、インビボ半減期、安定性、およびＳＣＡ製造の容易さが著しく増大する。
【００８３】
[0088]  したがって、ＳＣＡ由来の構成成分（ＶＬ領域、ＶＨ領域、および／または１つ以上のＣＤＲ領域）を、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端に融合することができる。これらの融合はまた、トランスフェリンの異なる部分またはドメイン（例えば、ＮドメインまたはＣドメインなど）を使用して行うことができる。タンパク質を、直接的に、または、様々な長さのリンカーペプチドを使用して融合することができる。活性なＳＣＡのすべてまたは一部分をトランスフェリンの足場の中に融合することもまた可能である。このような場合、融合タンパク質は、タンパク質を細胞内で産生させるために、ＳＣＡのｃＤＮＡをトランスフェリンのｃＤＮＡの中に挿入することによって作製される。
【００８４】
[0089]  一実施形態において、２つのＶＨ領域または２つのＶＬ領域をトランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンのその２つの末端に結合することができ、あるいはトランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンの中に挿入することができる。別の実施形態において、１つのＶＨおよび１つのＶＬをトランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに融合または挿入することができる。可変領域を、リンカー（Ｌ）を介して相互につなぎ、その後、トランスフェリンに融合または挿入することができる。リンカーは、Ｔｆへの結合またはＴｆ内への挿入を容易にするために可変ドメインに共有結合的に連結される分子である。まとめると、リンカーおよびＴｆは、指向しているエピトープと特異的に結合することができる立体配座を達成することができるように、十分な間隔および柔軟性を２つのドメインの間に提供する。また、トランスフェリンは、その２つの末端に結合した可変領域がともに接近することができるように改変することができる。このような改変の例には、より高い柔軟性を与えるために、Ｃ末端プロリンの除去および／またはＴｆのＣ末端に近いシステインループの除去が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
[0090]  本発明ではまた、多価トランスボディーが意図される。ＶＨ−Ｌ−ＶＨの順序を有する抗体可変領域をトランスフェリンの一方の端部に融合することができ、ＶＬ−Ｌ−ＶＬの順序を有する可変領域を反対側の末端において同じトランスフェリンに融合することができる。多価ＳＣＡを形成する可変領域の他の配列もまた本発明により検討される。例には、ＶＨ−Ｌ−ＶＬおよびＶＬ−Ｌ−ＶＨ、ならびに、より多くの可変領域が連結されているものが含まれるが、これらに限定されない。可変領域およびリンカーもまたトランスフェリン分子に挿入することができる。
【００８６】
[0091]  あるいは、非天然ペプチドリンカーを使用することなく可変ドメインをトランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に挿入することによって、多価の抗体の可変領域を形成させることができる。このようにして、トランスフェリン分子の様々な部分が、ドメイン間の空間および柔軟性を提供するためのリンカーとして作用する。
【００８７】
[0092]  本発明の一態様において、同じ抗原と結合する可変領域を同じトランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子の異なる末端に融合することができる。本発明の別の態様において、異なる抗原と結合する可変領域を同じトランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子の異なる末端に融合することができる。このようなトランスボディーは２つの異なる抗原を架橋することができ、あるいは、２つの異なる細胞と結合し、かつ／または２つの異なる細胞を活性化することができる。したがって、本発明は、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンに融合されたキメラ抗体可変領域を提供する。そのうえ、このような可変領域はトランスフェリン分子または改変トランスフェリン分子に挿入することができる。
【００８８】
[0093]  本発明では、所望のポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに特異的に結合するトランスボディーが意図される。トランスボディーは、１）結合活性の閾値レベルを示す場合、および／または、２）関連性のないポリペプチド分子と著しく交差反応しない場合、結合特異的であると決定される。場合により、トランスボディーは、コントロールポリペプチドに対する結合親和性よりも少なくとも１０倍高い親和性で所望のポリペプチド、ペプチドまたはエピトープに結合する場合、特異的に結合する。トランスボディーが１０６Ｍ−１以上（好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上）の結合親和性（Ｋａ）を示すことが好ましい。本発明のトランスボディーの結合親和性は、標準的な抗体親和性アッセイを使用して、例えば、スキャッチャード分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５１：６６０〜６７２、１９４９）によって当業者が容易に決定することができる。
【００８９】
[0094]  他の実施形態において、トランスボディーは、関連性のないポリペプチド分子と著しく交差反応しない場合、特異的に結合すると決定される。トランスボディーは、例えば、標準的なウエスタンブロット分析を使用して、関連性のないポリペプチド、ペプチドまたはエピトープではなく、所望のポリペプチド、ペプチドまたはエピトープを検出する場合、関連性のないポリペプチド分子と著しく交差反応しない。場合により、関連性のないポリペプチドはオルソログ（すなわち、タンパク質ファミリーのメンバーである同じ種に由来するタンパク質）である。
【００９０】
トランスボディーを作製するための抗体可変領域
[0095]  多数の抗体に由来する可変領域を、トランスボディーを製造するためにトランスフェリンに取り込むために適切な形態に変換することができる。これらには、抗ｅｒｂＢ２、Ｂ３、ＢＲ９６、ＯＶＢ３、抗トランスフェリン、Ｍｉｋ−β１およびＰＲ１が含まれる（それぞれ、Ｂａｔｒａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：２２００〜２２０５（１９９１）；Ｂａｔｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５８６７〜５８７１（１９９２）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８６１６〜８６２０（１９９１）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５４７〜５５１（１９９３）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１０６６〜１０７０（１９９０）；Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３：３３４〜３３９（１９９３）；Ｋｒｅｉｔｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：２８１０〜２８１５（１９９２）；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：５３０２〜５３０８（１９９３）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５２：６３１０〜６３１７（１９９２）を参照されたい）。
【００９１】
[0096]  典型的には、Ｆｖドメインは、文献ではそれらの略号によって知られる下記のモノクローナル抗体からなる群から選択されている：２６−１０、ＭＯＰＣ３１５、７４１Ｆ８、５２０Ｃ９、ＭｃＰＣ６０３、Ｄ１．３、マウスｐｈＯｘ、ヒトｐｈＯｘ、ＲＦＬ３．８ｓＴＣＲ、１Ａ６、Ｓｅ１５５−４、１８−２−３、４−４−２０、７Ａ４−１、Ｂ６．２、ＣＣ４９、３Ｃ２、２ｃ、ＭＡ−１５Ｃ５／Ｋ１２Ｇ０、Ｏｘなど（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、ＳＩＭ  Ｎｅｗｓ、３８（４）（Ｓｕｐｐ．）：１１（１９８８）；ＭｃＣａｒｔｎｅｙ，Ｊ．ら、ＩＣＳＵ  Ｓｈｏｒｔ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１０：１１４（１９９０）；Ｎｅｄｅｌｍａｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．、３２（Ｓｕｐｐ．）：１００５（１９９１）；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、分子設計およびモデル構築：概念および応用、パートＢ、Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６〜８８（１９９１）；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｅｐｅｎｅｔｏｓ，Ａ．Ａ．（編）、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ（１９９３）；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｂｅｄｚｙｋ，Ｗ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１８６１５〜１８６２０（１９９０）；Ｃｏｌｃｈｅｒ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８２：１１９１〜１１９７（１９９０）；Ｇｉｂｂｓ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：４００１〜４００４（１９９１）；Ｍｉｌｅｎｉｃ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１２：６３６３〜６３７１（１９９１）；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ、Ｍ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０１１７〜１０１２５（１９９１）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：３９４〜３９７（１９８９）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１０６６〜１０７０（１９９０）；Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１７１：１〜６（１９９０）；Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５１９８〜１５２０２（１９９０）；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：９４９１〜９４９４（１９９０）；Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１：２２００〜２２０５（１９９１）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８６１６〜８６２０（１９９１）；Ｓｅｅｔｈａｒａｍ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１７３７６〜１７３８１（１９９１）；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３０７５〜３０７９（１９９２）；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ，Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：１３６２〜１３６７（１９９０）；Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、９：２７３〜２７８（１９９１）；Ｐａｃｋ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：１５７９〜１５３４（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）；Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：６５９〜６６２（１９９０）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｖ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６６５４〜６６５８（１９９０）；Ｃｏｎｄｒａ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：２２９２〜２２９５（１９９０）；Ｌａｒｏｃｈｅ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１６３４３〜１６３４９（１９９１）；Ｈｏｌｖｏｅｔ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１９７１７〜１９７２４（１９９１）；Ａｎａｎｄ，Ｎ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：２１８７４〜２１８７９（１９９１）；Ｆｕｃｈｓ，Ｐ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、９：１３６９〜１３７２（１９９１）；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ，Ｆ．ら、Ｇｅｎｅ、１０４：１０４〜１５３（１９９１）；Ｓｅｅｈａｕｓ，Ｔ．ら、Ｇｅｎｅ、１１４：２３５〜２３７（１９９２）；Ｔａｋｋｉｎｅｎ，Ｋ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．、４：８３７〜８４１（１９９１）；Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３９：１９７〜２０５（１９９１）；Ｍｏｔｔｅｚ，Ｅ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：４６７〜４７１（１９９１）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８６４６〜８６５０（１９９１）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９（１９９１）；Ｈｏｏ，Ｗ．Ｆ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４７５９〜４７６３（１９９３）を参照されたい）。
【００９２】
[0097]  表１には、その可変領域およびＣＤＲが、トランスボディーを作製するために使用され得る様々なモノクローナル抗体が示される。
【００９３】
【表１−１】
2006506053.tif 000002
【００９４】
【表１−２】
2006506053.tif 000003
【００９５】
【表１−３】
2006506053.tif 000004
【００９６】
【表１−４】
2006506053.tif 000005
【００９７】
【表１−５】
2006506053.tif 000006
【００９８】
【表１−６】
2006506053.tif 000007
【００９９】
【表１−７】
2006506053.tif 000008
【０１００】
【表１−８】
2006506053.tif 000009
【０１０１】
【表１−９】
2006506053.tif 000010
【０１０２】
ヒト化抗体可変領域
[0098]  本発明ではまた、トランスボディーを作製するためのヒト化可変ドメインの製造および使用が意図される。ヒト抗体は、アミノ酸残基の一部またはすべてが類似のヒト抗体に見出される対応するアミノ酸残基で置換されている非ヒト抗体である。例えば、ヒト抗体から出発する場合、超可変領域における残基、および、可能であれば、ＦＲにおける残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。ヒト化は抗体の抗原性潜在的能力を低下させる。
【０１０３】
[0099]  抗体可変ドメインが、様々な方法によって、例えば、ＣＤＲグラフト化（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８））、露出した残基の置換（Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２８：４８９〜４９８（１９９１））、および可変ドメインを新たに表面に露出させること（Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９６９〜９７３（１９９４））などによってヒト化されている。表面に露出させる最小限の方法は、最大限の抗原結合親和性を維持するためにマウスまたは他の種のいくつかのフレームワーク残基を保存することを要求する抗体可変ドメインのためには特に適切である。しかしながら、ＣＤＲグラフト化法もまた、マウスのフレームワーク残基のいずれかを保存することなく（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８））、または、ちょうど１つもしくは２つのマウス残基の保存を伴って（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９〜１００３３（１９８９））、いくつかの抗体をヒト化するために使用することに成功している。
【０１０４】
[00100]  ヒト化はまた、重鎖および軽鎖の可変ドメインを、標準的な配列比較ソフトウエアを使用して配列データベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫまたはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴなど）において同定される最も良いヒトホモログと配列比較することによって行うことができる。モノクローナル抗体ＭｃＰＣ６０３の可変ドメインの結晶構造に基づく構造モデルに対する配列分析および配列比較（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９〜１００３３（１９８９）、Ｓａｔｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９０：５９３〜６０４（１９８６））；プロテインデータバンクエントリーＩＭＣＰ）により、マウス抗体とそのヒト対応体との間で異なるフレームワーク残基を同定することができる。
【０１０５】
[00101]  ヒト化抗体を作製する際に使用されるヒト可変ドメインの選択（軽鎖および重鎖の両方）は、抗原性を低下させるために重要である。いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。その場合、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１（１９８７））。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３））。
【０１０６】
抗原結合フラグメントおよびＣＤＲの製造
[00102]  トランスフェリンに融合または結合され得る抗原性結合フラグメントおよびＣＤＲを、ファージライブラリーからの選択、または、特定の抗体の可変領域を、その抗体のｃＤＮＡをクローン化し、可変領域をクローン化するためのプライマーとして隣接の定常領域を使用することによってクローン化すること、または、任意の特定の抗体の可変領域に対応するオリゴヌクレオチドを合成すること（これらに限定されない）を含むいくつかの方法によって製造することができる。ｃＤＮＡは、トランスフェリンに対するｃＤＮＡを含有するベクターにｃＤＮＡをクローン化するために、オリゴヌクレオチドリンカーが使用され得るように制限部位を作製するために５’末端および３’末端において調整することができる。これは、スペーサー配列を使用して、またはスペーサー配列を使用することなく、Ｎ末端において、またはＣ末端において、またはＮ末端およびＣ末端において行うことができる。融合分子のｃＤＮＡはベクターにクローン化することができ、その後、そのベクターから、完全な発現カセットが切り出され、酵母における融合タンパク質の発現を可能にするための発現ベクターに挿入される。その場合、酵母から分泌された融合タンパク質を培地から回収し、精製して、その活性について試験することができる。哺乳動物細胞株における発現の場合、使用された発現カセットにおいて、哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターが用いられることを除いて、類似する手順が採用される。この発現カセットは、その後、切り出され、哺乳動物細胞株のトランスフェクションのために適切なプラスミドに挿入される。この様式で製造されるトランスボディーは培地から精製され、標準的な免疫化学的方法を使用してその抗原に対するその結合について試験することができる。
【０１０７】
[00103]  具体的には、ファージディスプレー技術を、生物学的に機能的なタンパク質分子をその表面に発現および提示させるためにバクテリオファージの能力を利用することによって、抗原結合ペプチドの大きなライブラリーを作製するために使用することができる。他の実施形態において、抗原結合ペプチドのライブラリーを直接、改変されたＴｆにおいて調製して、トランスボディーのライブラリーを作製することができる。抗原結合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーが、バクテリオファージのプラークとして、または溶原菌のコロニーとしてスクリーニングされ得るバクテリオファージλの発現システムにおいて作製されている（Ｈｕｓｅら（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５；ＣａｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８７：６４５０；Ｍｕｌｌｉｎａｘら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８７：８０９５；Ｐｅｒｓｓｏｎら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８８：２４３２）。バクテリオファージの抗原結合ペプチドディスプレーライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの様々な実施形態が記載されている（Ｋａｎｇら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２；Ｂｕｒｔｏｎら（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：４１３３；Ｃｈａｎｇら（１９９１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ（１９９１）、Ｇｅｎｅ、１０４：１４７；Ｍａｒｋｓら（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）、８９：４４５７；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：８６７；Ｍａｒｋｓら（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９；Ｍａｒｋｓら（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１６００７；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２；Ｌｅｒｎｅｒら（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８：１３１３）。また、Ｒａｄｅｒ，Ｃ．およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．（１９９７）、「コンビナトリアル抗体ライブラリーのファージディスプレー」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８：５０３〜５０８による総説もまた参照のこと。バクテリオファージのコートタンパク質に呈示された様々なｓｃＦｖライブラリーが記載されている（Ｍａｒｋｓら（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９；Ｗｉｎｔｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９９１）、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）、前掲；Ｍａｒｋｓら（１９９１）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８７：１０６６；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら（１９９２）、ＴＩＢＴＥＣＨ、１０：８０；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８５：５８７９）。
【０１０８】
[00104]  一般に、ファージライブラリーは、抗体フラグメントまたは抗体ペプチド（例えば、ＶＬおよびＶＨなど）をコードするランダムなオリゴヌクレオチドのライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをＭ１３ファージまたはｆｄファージの遺伝子３に挿入することによって作製される。それぞれの挿入された遺伝子が遺伝子３産物（ファージの副コートタンパク質）のＮ末端において発現される。結果として、多様なペプチドを含有するペプチドライブラリーを構築することができる。ファージライブラリーは、その後、抗原などの目的とする固定化された標的分子に対してアフィニティースクリーニングされ、特異的に結合したファージが回収され、大腸菌宿主細胞の感染により増幅される。典型的には、受容体などの目的とする標的分子（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸）が、アフィニティークロマトグラフィーにより反応性ファージについて濃縮するためにクロマトグラフィー樹脂に対する共有結合的連結によって固定化され、かつ／あるいは、プラークまたはコロニー盛り上がりをスクリーニングするために標識される。最後に、増幅されたファージは、特定のペプチド配列を推定するために配列決定され得る。ファージディスプレーの固有的性質のために、ファージの表面に呈示された抗体またはペプチドは、哺乳動物システムでのようなインビトロ選択条件のもとではその本来の立体配座を取ることができない場合がある。また、細菌では、機能的な抗体が容易にプロセシングされ、組み立てられ、または発現／分泌されない。
【０１０９】
[00105]  本発明の一部として、ランダムなペプチドを含有するトランスフェリンまたはトランスフェリンの一部分を、ＶＬフラグメントまたはＶＨフラグメントの代わりにファージの遺伝子３の中に挿入することができる。この様式では、ライブラリーは、抗原性ペプチドを含有するトランスフェリンタンパク質についてスクリーニングすることができる。
【０１１０】
[00106]  遺伝子組換え動物（例えば、マウスなど）が、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ａｎｎａｎｄａｌｅ、Ｎ．Ｊ．）などの企業により開発されたＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を使用することによって完全なヒト抗体を作製するために使用されている。様々なマウス系統が、マウスの抗体遺伝子発現を抑制し、それをヒトの抗体遺伝子発現で機能的に置き換えることによって操作されている。この技術では、監視および親和性成熟におけるマウスの免疫系の自然の能力が、高親和性抗体の幅広いレパートリーを産生させるために利用される。
【０１１１】
[00107]  本発明の更に別の態様において、一本鎖抗体のライブラリーを製造するための方法は、酵母細胞において酵母発現ベクターのライブラリーを発現させることを含む。酵母発現ベクターはそれぞれが、抗体の重鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列と、抗体の軽鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列と、抗体の重鎖可変領域および抗体の軽鎖可変領域を連結するトランスフェリン配列とを含む。抗体の重鎖可変領域、抗体の軽鎖可変領域、およびトランスフェリンリンカーは単一のトランスボディー融合タンパク質として発現される。また、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、少なくとも約１０６の多様性を有するトランスボディーのライブラリーを生じさせるために、それぞれが独立して発現ベクターのライブラリーにおいて変化する。
【０１１２】
[00108]  類似する様式において、ライブラリーは、抗体フラグメントの代わりに様々な挿入ペプチドを含有するトランスフェリンを発現させることができる。このライブラリーは、その後、特定の抗原に対する最も良い結合活性を有するトランスボディーについてスクリーニングされる。
【０１１３】
[00109]  この実施形態によれば、トランスボディーのライブラリーの多様性は好ましくは約１０６〜１０１６であり、より好ましくは１０８〜１０１６であり、最も好ましくは１０１０〜１０１６である。
【０１１４】
治療用トランスボディー
[00110]  本発明ではまた、１つ以上の異なる抗原に対する抗体に由来する抗体可変領域を含むトランスボディーを疾患の治療または予防のために作製および使用することが伴う。好ましくは、抗原の少なくとも１つ（好ましくは、抗原のすべて）が生物学的に重要な分子であり、抗原に対するトランスボディーを、疾患または障害に罹患している哺乳動物に投与することにより、治療的利益がその哺乳動物においてもたらされ得る。本発明の好ましい実施形態において、抗原はタンパク質である。しかしながら、ポリペプチド以外の他の抗原（例えば、腫瘍に関連する糖タンパク質；米国特許第５，０９１，１７８号を参照されたい）を使用することができる。
【０１１５】
[00111]  例示的なタンパク質抗原には、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子およびフォンビルブランド因子など；抗凝固因子、例えば、プロテインＣなど；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくはヒト組織型のプラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）など；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミンなど；ミュラー管抑制物質；レラキシンＡ鎖；レラキシンＢ鎖；プロレラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、β−ラクタマーゼなど；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４など；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；プロテインＡまたはプロテインＤ；リウマチ様因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン−４、ニュートロフィン−５またはニュートロフィン−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）など、あるいは神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−βなど；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；繊維芽細胞増殖因子、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなど；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む）など；インスリン様成長因子−Ｉおよびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０など；エリスロポイエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドディスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；ＲＳＶエンベロープタンパク質；ＨＳＶのエンベロープタンパク質およびコートタンパク質；インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ��ど；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体またはＨＥＲ４受容体など；細菌およびその毒素、例えば、ボツリヌス毒素、コレラ毒素および炭疽毒素など；菌類、具体的には、病原性菌類；ならびに、上記ポリペプチドのいずれかの変異体および／またはフラグメントなどの分子が含まれる。本発明のトランスボディーが結合し得る更なる分子が国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／２７６３７（その全体を参照として組み入れる）に列挙される。
【０１１６】
トランスフェリンおよびトランスフェリン改変体
[00112]  本発明は、１つ以上の抗体可変領域と、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンとを含むトランスボディーを提供する。任意のトランスフェリンを、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を作製するために使用することができる。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、約７５ｋＤａ（グリコシル化を含まない）である６７９アミノ酸のタンパク質であり、遺伝子重複に由来すると考えられる２つの主要なドメイン、すなわち、Ｎドメイン（約３３０アミノ酸）およびＣドメイン（約３４０アミノ酸）を有する。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ００１０６３、同ＸＭ００２７９３、同Ｍ１２５３０、同ＸＭ０３９８４５、同ＸＭ０３９８４７および同Ｓ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）（これらはすべて、その全体を参照として本明細書中に組み入れる）、ならびに、配列番号１、配列番号２および配列番号３を参照されたい。これらの２つのドメインは、時間の経過とともに異なってきているが、高い程度の同一性／類似性を保持している（図１）。
【０１１７】
[00113]  ＮドメインおよびＣドメインはそれぞれが、更に２つのサブドメインに、すなわち、Ｎ１およびＮ２に、そしてＣ１およびＣ２に分けられる。Ｔｆの機能は、鉄を身体の細胞に輸送することである。このプロセスは、すべての細胞（特に、活発に成長している細胞）で発現するＴｆ受容体（ＴｆＲ）によって媒介される。ＴｆＲはＴｆの鉄結合型形態（１つの受容体あたり、その２分子が結合する）を認識し、その後、エンドサイトーシスが起こり、それにより、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームに輸送され、エンドソームにおいて、ｐＨの局所的な低下により、結合している鉄の放出がもたらされ、そして細胞表面へのＴｆＲ／Ｔｆ複合体の再循環、および（その鉄非結合型形態でのアポＴｆとして知られる）Ｔｆの放出がもたらされる。受容体の結合はＴｆのＣドメインを介して生じる。グリコシル化されていない鉄結合型Ｔｆは受容体と結合するので、Ｃドメインにおける２つのグリコシル化部位は、受容体の結合には関与していないようである。
【０１１８】
[00114]  各Ｔｆ分子は２つの鉄イオン（Ｆｅ３＋）を運搬することができる。これらは、Ｎ１およびＮ２のサブドメインの間の空間ならびにＣ１およびＣ２のサブドメインの間の空間において複合体化され、分子の立体配座的変化をもたらしている。Ｔｆは、Ｔｆ受容体を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を越える。
【０１１９】
[00115]  ヒトトランスフェリンにおいて、鉄結合部位が、少なくとも、配列番号３のＡｓｐ６３（生来的なＴｆシグナル配列を含む配列番号２のＡｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４またはＴｙｒ５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）のアミノ酸から構成される。ヒンジ領域が、少なくとも、配列番号３のＮドメインのアミノ酸残基９４〜９６、アミノ酸残基２４５〜２４７および／またはアミノ酸残基３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、アミノ酸残基５８１〜５８２および／またはアミノ酸残基６５２〜６５８から構成される。炭酸イオン結合部位が、少なくとも、配列番号３のＴｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧｌｙ４７８）のアミノ酸から構成される。
【０１２０】
[00116]  本発明の一実施形態において、トランスボディーは、改変されたヒトトランスフェリンを含む。任意の動物のＴｆ分子を、本発明のトランスボディーを製造するために使用することができるが、これには、ヒトＴｆ変異体、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、ならびに、ウシ、イヌおよびトリの他の種が含まれる（代表的な１組のＴｆ配列については図２を参照されたい）。これらのＴｆ配列はすべてが、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の公開されているデータベースにおいて容易に得ることができる。ヒトＴｆヌクレオチド配列を得ることができ（配列番号１、配列番号２および配列番号３、ならびに、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて利用することができる上記のアクセション番号を参照されたい）、これを使用して、ＴｆまたはＴｆのドメインと選ばれた治療分子との間での遺伝子融合体を作製することができる。融合体はまた、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ：ＮＭ＿００２３４３）などの関連した分子からも作製することができる。
【０１２１】
[00117]  ラクトフェリン（Ｌｆ）は、天然の鉄結合性防御タンパク質であり、抗菌活性、抗真菌活性、抗ウイルス活性、抗新生物活性および抗炎症活性を有することが見出されている。このタンパク質は、正常なフローラに一般に曝される外分泌性分泌物、すなわち、乳汁、涙、鼻腔浸出液、唾液、気管支粘液、胃腸液、頸膣粘液および精液に存在する。また、Ｌｆは、循環している多形核好中球（ＰＭＮ）の二次的な特異的顆粒の主要な構成成分である。アポタンパク質が、敗血領域におけるＰＭＮの脱顆粒のときに放出される。Ｌｆの主要な機能は、体液および炎症領域における遊離の鉄を除去し、その結果、フリーラジカルにより媒介される損傷を抑制し、侵入中の微生物細胞および新生物細胞に対する金属の利用性を低下させるという機能である。成体における１２５Ｉ−Ｌｆの代謝回転速度を調べた研究において、Ｌｆが肝臓および脾臓によって迅速に取り込まれ、放射能が肝臓および脾臓に数週間にわたって持続したことが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９７９）、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）、５７：４５３〜４６０）。
【０１２２】
[00118]  一実施形態において、本発明のトランスボディーのトランスフェリン部分はトランスフェリンのスプライスバリアントを含む。一例において、トランスフェリンのスプライスバリアントはヒトトランスフェリンのスプライスバリアントであり得る。具体的な一実施形態において、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアントはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ６１１４０のスプライス変異体であり得る。
【０１２３】
[00119]  別の実施形態において、本発明のトランスボディーのトランスフェリン部分はラクトフェリンのスプライスバリアントを含む。一例において、ヒト血清ラクトフェリンのスプライスバリアントは好中球ラクトフェリンの新規なスプライスバリアントであり得る。具体的な一実施形態において、好中球ラクトフェリンのスプライスバリアントはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＡ５９４７９のスプライスバリアントであり得る。別の具体的な実施形態において、好中球ラクトフェリンのスプライスバリアントは、新規なスプライス−バリアンス領域を含む下記のアミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号４）を含むことができる。
【０１２４】
[00120]  融合はまた、メラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．ＮＭ＿０１３９００、マウスメラノトランスフェリン）を用いて作製することができる。メラノトランスフェリンは、悪性メラノーマ細胞において高レベルで見出されるグリコシル化されたタンパク質であり、最初はヒトメラノーマ抗原ｐ９７と名付けられていた（Ｂｒｏｗｎら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３）。メラノトランスフェリンは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリンおよびトリトランスフェリンとの高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：１７１〜１７３；Ｒｏｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８６、８３：１２６１〜１２６５）。しかしながら、これらの受容体とは異なり、細胞受容体はメラノトランスフェリンについては同定されていない。メラノトランスフェリンは鉄と可逆的に結合し、また、２つの形態で存在し、その一方がグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞膜に結合し、もう一方の形態は可溶性であり、かつ活発に分泌される（Ｂａｋｅｒら、１９９２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、２９８：２１５〜２１８；Ａｌｅｍａｎｙら、１９９３、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１０４：１１５５〜１１６２；Ｆｏｏｄら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：７０１１〜７０１７）。
【０１２５】
[00121]  改変Ｔｆ融合体は、任意のＴｆタンパク質、フラグメント、ドメインまたは操作されたドメインを用いて作製することができる。例えば、融合タンパク質を、全長のＴｆ配列を使用して製造することができ、これは本来のＴｆシグナル配列を有しても有しなくてもよい。トランスボディーはまた、Ｔｆドメインを１つだけ使用して、例えば、個々のＮドメインまたはＣドメインなどを使用して作製することができる。トランスボディーはまた、２つのＴｆドメインを用いて、例えば、２つのＮドメインまたは２つのＣドメインなどを用いて作製することができる。いくつかの実施形態では、１つだけのＣドメインに対する治療タンパク質の融合体を製造することができ、この場合、Ｃドメインは、グリコシル化、鉄の結合、および／またはＴｆ受容体の結合を低下、阻害または防止するために変化している。他の実施形態では、Ｔｆのグリコシル化部位が、単独では鉄またはＴｆ受容体と結合しないＣドメインおよびＮドメインに存在するので、１つだけのＮドメインの使用が好都合である。好ましい実施形態は、高レベルで発現する、Ｎドメインを１つだけ有するＴｆ融合タンパク質である。
【０１２６】
[00122]  本発明において使用されるように、Ｎ様ドメインとして機能するように改変されたＣ末端ドメインまたは葉部（ｌｏｂｅ）は、天然型または野生型のＮドメインまたは葉部のグリコシル化パターンまたは鉄結合特性と実質的に類似するグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変される。好ましい実施形態において、Ｃドメインまたは葉部は、関係するＣドメインの領域またはアミノ酸を、天然型または野生型のＮドメインの対応する領域または部位に存在する領域またはアミノ酸に置換することによってグリコシル化および鉄との結合が生じないように改変される。
【０１２７】
[00123]  本発明において使用されるように、「２つのＮドメインまたは葉部」を含むＴｆ成分には、生来的なＣドメインまたは葉部を別の天然型もしくは野生型のＮドメインもしくは葉部または改変されたＮドメインもしくは葉部で置き換えるために改変されるＴｆ分子、あるいは、野生型Ｎドメインまたは改変されているＮドメインと実質的に類似するように機能するために改変されているＣドメインを含有するＴｆ分子が含まれる。米国仮特許出願第６０／４０６，９７７号（これはその全体を参照として本明細書中に組み入れる）を参照されたい。
【０１２８】
[00124]  ２つのドメインの三次元構造を重ねること（Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ３．７ｂ２、Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ）および直接的なアミノ酸アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ多重アラインメント）による２つのドメインの分析により、これらの２つのドメインが時間とともに分岐してきたことが明らかにされる。アミノ酸アラインメントでは、４２％の同一性および５９％の類似性が２つのドメインの間に示される。しかしながら、Ｎドメインの約８０％が構造的等価性のためにＣドメインと一致する。Ｃドメインはまた、Ｎドメインと比較して、更に数個のジスルフィド結合を有する。
【０１２９】
[00125]  ＮドメインおよびＣドメインに対する分子モデルのアラインメントにより、下記の構造的等価が明らかにされる：
【０１３０】
【表２】
2006506053.tif 000011
【０１３１】
２つのドメインに対するジスルフィド結合が下記のようにアラインメントされる：
【０１３２】
【表３】
2006506053.tif 000012
【０１３３】
[00126]  一実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分はトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を含む。更なる実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンに由来する少なくとも２つのＮ末端葉部を含む。
【０１３４】
[00127]  他の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８およびＨｉｓ２４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基における変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を含むか、または、このような変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部を備えるか、または、このような変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端葉部からなる。
【０１３５】
[00128]  別の実施形態において、改変されたトランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６およびＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリンＮ末端葉部変異体を含む。
【０１３６】
[00129]  別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含むか、または、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を備えるか、または、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部からなる。更なる実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンに由来するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含む。
【０１３７】
[00130]  更なる実施形態において、Ｃ末端葉部変異体は更に、グリコシル化されない、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１の少なくとも１つの変異を含む。
【０１３８】
[00131]  別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含み、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持している。代替の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含み、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力が低下している。別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端葉部を含み、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持しておらず、Ｎドメインと実質的に類似する機能を有する。
【０１３９】
[00132]  いくつかの実施形態において、ＴｆまたはＴｆ部分は、非融合状態の抗体可変領域のインビボ循環半減期、血清安定性（半減期）、インビトロ安定性またはバイオアベイラビリティと比較して、抗体可変領域のインビボ循環半減期、血清安定性、インビトロ溶液安定性またはバイオアベイラビリティを増大させるために十分な長さである。安定性またはインビボ循環半減期またはバイオアベイラビリティのこのような増大は、融合されていない抗体可変領域を上回る、約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の増大であり得る。場合により、改変されたトランスフェリンを含むトランスボディーは、約１０〜２０日もしくはそれ以上、約１２〜１８日または約１４〜１７日の血清半減期を示す。
【０１４０】
[00133]  ＴｆのＣドメインがトランスボディーの一部であるとき、２つのＮ結合型グリコシル化部位（配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に対応するアミノ酸残基）を、グリコシル化または過マンノシル化を妨げ、融合タンパク質および／または抗体可変領域の血清半減期を延ばすために、酵母システムにおける発現のために変異させることができ（これにより、アシアロ−Ｔｆ、または場合によりモノシアロ−Ｔｆもしくはジシアロ−Ｔｆを製造することができ）る。Ｎ４１３およびＮ６１１に対応するＴｆのアミノ酸に加えて、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の残基に対する変異は、グリコシル化を妨げるか、または実質的に低下させる。米国特許第５，９８６，０６７号（Ｆｕｎｋら）を参照されたい。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させたＴｆのＮドメインは、Ｓ３２において１つだけのヘキソースによるＯ結合型グリコシル化を受けることもまた報告されており、この部位もまた、このようなグリコシル化を妨げるために変異または改変することができる。そのうえ、Ｏ結合型グリコシル化は、ＰＭＴ遺伝子に変異を有する酵母宿主細胞において低下させることができ、または除去することができる。
【０１４１】
[00134]  したがって、本発明の一実施形態において、トランスボディーは、トランスフェリンが、低下したグリコシル化を示す改変されたトランスフェリン分子を含み、このような分子には、限定されないが、Ｔｆのアシアロ形態、モノシアロ形態およびジシアロ形態が含まれる。別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、グリコシル化を妨げるために変異させられている組換えトランスフェリン変異体を含む。別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化されている組換えトランスフェリン変異体を含む。更なる実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、グリコシル化を妨げるために変異させられている組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１の少なくとも１つが、グリコシル化されないアミノ酸に変異している。別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、グリコシル化を妨げるか、または実質的に低下させるために変異させられている組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異がＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の残基に対して行われ得る。そのうえ、グリコシル化は、そのセリン残基またはトレオニン残基を変異させることによって低下または防止することができる。更に、グリコシル化を阻害するために、Ｘをプロリンに変化させることが知られている。
【０１４２】
[00135]  以下でさらに詳しく論じるように、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質（好ましくは、改変Ｔｆを含むトランスボディー）はまた、鉄と結合しないように、かつ／またはＴｆ受容体と結合しないように操作することができる。本発明の他の実施形態において、鉄の結合は保持されており、Ｔｆの鉄結合能を２つの様式で使用することができる。１つは、治療タンパク質または治療ペプチドを、細胞の内部に、かつ／またはＢＢＢを越えて送達するためにである。鉄および／またはＴｆ受容体と結合するこれらの実施形態では、多くの場合、グリコシル化を低下させ、またはグリコシル化を妨げて、治療タンパク質の血清半減期を延ばすために操作される。Ｎドメインは単独では、鉄が負荷されたとき、ＴｆＲに結合せず、鉄と結合したＣドメインはＴｆＲと結合するが、その親和性は完全な分子と同じではない。
【０１４３】
[00136]  別の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持していない。代替の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。代替の実施形態において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する。
【０１４４】
[00137]  別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持していない。代替の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、トランスフェリン受容体に対して、野生型血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。代替の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、トランスフェリン受容体に対して、野生型血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する。
【０１４５】
[00138]  別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、炭酸イオンに結合する能力を保持していない。代替の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、炭酸イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。代替の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、変異を有する組換えトランスフェリン変異体を含むが、この場合、変異体は、炭酸イオンに対して、野生型血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する。
【０１４６】
[00139]  別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持している。代替の実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基において変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体であり、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力が低下している。別の実施形態では、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体であり、この場合、変異体は、金属イオンと結合する能力を保持していない。
【０１４７】
[00140]  別の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも強い結合力を有する（米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい。これはその全体を参照として本明細書中に組み入れる）。代替の実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は、金属イオンに対して、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも弱い結合力を有する。更なる実施形態において、トランスボディーのトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７における変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン変異体を含み、この場合、変異体は金属イオンと結合しない。
【０１４８】
[00141]  利用可能な技術はどれも、本発明のトランスボディーを作製するために使用することができ、これには限定されないが、一般に利用可能な様々な分子技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）に開示される技術が含まれる。当分野で周知の、部位特異的変異誘発を達成するための技術を使用してヌクレオチド置換を行うとき、コードされるアミノ酸の変化は、好ましくは、影響が大きくないものであり、すなわち、保存的アミノ酸置換である。しかし、非保存的な他の置換もまた、トランスボディーの改変されたトランスフェリン部分を製造するときには特に、例えば、低下したグリコシル化、低下した鉄の結合などを示す改変Ｔｆトランスボディーを製造するときには考えられる。特に考えられるのは、典型的には、１アミノ酸〜約３０アミノ酸のアミノ酸置換、小さい欠失または挿入；トランスフェリンドメイン間での挿入；小さいアミノ末端伸長またはカルボキシル末端伸長、例えば、アミノ末端のメチオニン残基、あるいは、トランスフェリンドメイン間に存在するか、またはトランスフェリンタンパク質および治療タンパク質もしくは治療ペプチド（好ましくは、抗体可変領域）を連結する、５０残基未満、４０残基未満、３０残基未満、２０残基未満または１０残基未満の小さいリンカーペプチドなど、あるいは、精製を容易にする小さい伸長（例えば、ポリヒスチジン部分、抗原性エピトープまたは結合性ドメインなど）である。
【０１４９】
[00142]  保存的アミノ酸置換の例は、同じグループの中で行われる置換であり、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジンなど）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸など）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギンなど）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンなど）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど）、および小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニンなど）のグループ内で行われる置換である。
【０１５０】
[00143]  非保存的な置換には、１つのグループにおけるアミノ酸を別のグループにおけるアミノ酸によって置換することが含まれる。例えば、非保存的な置換には、疎水性アミノ酸を極性アミノ酸に置換することが含まれる。ヌクレオチド置換の一般的な記載については、例えば、Ｆｏｒｄら（１９９１）、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．、２：９５〜１０７を参照されたい。非保存的な置換、欠失および挿入は、鉄の結合を全く示さないか、もしくは低下した鉄の結合を示し、かつ／またはＴｆ受容体に対する融合タンパク質の結合を全く示さないか、もしくはＴｆ受容体に対する融合タンパク質の低下した結合を示す本発明のＴｆ融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）を製造するために特に有用である。
【０１５１】
[00144]  本発明のポリペプチドおよびタンパク質では、下記の慣例的なリストにしたがってアミノ酸を示すことに関して、下記の系に従う：
【０１５２】
【表４】
2006506053.tif 000013
【０１５３】
[00145]  鉄の結合および／または受容体の結合を、ＴｆのＮドメインの残基（配列番号３のＡｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９）および／またはＣドメインの残基（配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４および／またはＨｉｓ５８５）の１つ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる。鉄の結合はまた、配列番号３のＬｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７またはＡｒｇ６３２のアミノ酸に対する変異によって影響を受けることがある。炭酸イオンの結合は、ＴｆのＮドメインの残基（配列番号３のＴｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７）および／またはＣドメインの残基（配列番号３のＴｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８および／またはＧｌｙ４５９）の１つ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる。炭酸イオンの結合の低下または破壊は鉄および／または受容体の結合に悪影響を及ぼし得る。
【０１５４】
[00146]  Ｔｆ受容体に対する結合を、鉄の結合について上述されたＴｆのＮドメインの残基の１つ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる。
【０１５５】
[00147]  先に論じたように、グルコシル化を、Ｃドメインの残基（Ｎ４１３および／またはＮ６１１）に対応するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位内のＴｆのＣドメイン残基の１つ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換、または挿入を含む変異によって低下または破壊することができる（米国特許第５，９８６，０６７号を参照されたい）。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１を、隣接アミノ酸が変異させら得るように、Ｇｌｕ残基に変異させることができる。
【０１５６】
[00148]  本発明のＴｆ融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）が、グリコシル化、鉄の結合、炭酸イオンの結合および／または受容体の結合を妨げるために改変されていない場合、グリコシル化、鉄イオンおよび／または炭酸イオンを融合タンパク質から取り去ることができ、または融合タンパク質から取り除くことができる。例えば、入手可能なデグリコシラーゼを、融合タンパク質からグリコシル化残基（特に、Ｔｆ部分に結合している糖残基）を切断するために使用することができ、かつ／またはグリコシル化酵素欠損酵母を、グリコシル化を妨げるために使用することができ、かつ／または組換え細胞を、グリコシル化を妨げる薬剤（例えば、ツニカマイシン）の存在下で増殖させることができる。
【０１５７】
[00149]  融合タンパク質における炭水化物もまた、融合タンパク質をデグリコシラーゼで処理することによって酵素的に低下または完全に除去することができる。様々なデグリコシラーゼが当分野では周知である。デグリコシラーゼの例には、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧアーゼＡ、ＰＮＧアーゼＦ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼおよびＥｎｄｏＨデグリコシラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５８】
[00150]  更なる変異を、Ｔｆの三次元構造を変化させるためにＴｆに関して行うことができ、例えば、鉄の結合およびＴｆ受容体の認識のために必要とされる立体配座変化を妨げるためのヒンジ領域に対する改変などを行うことができる。例えば、変異を、Ｎドメインのアミノ酸残基９４〜９６、アミノ酸残基２４５〜２４７および／またはアミノ酸残基３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、アミノ酸残基５８１〜５８２および／またはアミノ酸残基６５２〜６５８において、あるいはそれらの近くにおいて行うことができる。また、変異を、Ｔｆの構造および機能を変化させるためにこれらの部位の隣接領域またはその近くにおいて行うことができる。
【０１５９】
[00151]  本発明の一態様において、トランスボディーは、抗体可変領域の半減期またはバイオアベイラビリティを延ばすためのキャリアタンパク質として、ならびに、場合により、抗体可変領域を細胞の内部に送達するキャリアタンパク質として機能し得るし、また、血液脳関門を越える能力を保持する。代替の実施形態において、トランスボディーは、血液脳関門を越える能力をトランスフェリンが保持していない改変されたトランスフェリン分子を含む。
【０１６０】
[00152]  別の実施形態において、トランスボディーは、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合して抗体可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持している。代替の実施形態において、トランスボディーは、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合して抗体可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持していない。
【０１６１】
[00153]  更なる実施形態において、トランスボディーは、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合して抗体可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持するが、血液脳関門を越える能力を保持していない。代替の実施形態において、トランスボディーは、改変されたトランスフェリン分子を含むが、この場合、トランスフェリン分子は、血液脳関門を越える能力を保持するが、トランスフェリン受容体に結合して抗体可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持していない。
【０１６２】
改変トランスフェリンに基づくトランスボディー
[00154]  本発明のトランスボディー融合タンパク質は、Ｔｆタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に結合した１コピー以上の抗体可変領域を含有することができる。いくつかの実施形態において、抗体可変領域はＴｆタンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に結合させられ、融合タンパク質は抗体可変領域の１つ以上の等価体をＴｆのいずれかの末端または両末端に含有することができる。他の実施形態において、抗体可変領域は、Ｔｆタンパク質の既知のドメインの中に、例えば、Ｔｆのループの１つ以上の中に挿入される（Ａｌｉら（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３を参照されたい）。他の実施形態において、抗体可変領域はＴｆのＮドメインとＣドメインとの間に挿入される。
【０１６３】
[00155]  一般に、本発明のトランスフェリン融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）は、１つの改変トランスフェリン由来領域と、１つの抗体可変領域とを有し得る。しかしながら、それぞれのタンパク質の多数の領域を、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができる。同様に、２つ以上の抗体可変領域を、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製するために使用することができ、それにより、多機能性の改変Ｔｆ融合タンパク質が製造される。
【０１６４】
[00156]  一実施形態において、本発明のトランスボディーは、トランスフェリン分子またはその一部に融合された抗体可変領域またはその一部を含有する。別の実施形態において、本発明のトランスボディーは、トランスフェリン分子のＮ末端に融合された抗体可変領域を含有する。代替の実施形態において、本発明のトランスボディーは、トランスフェリン分子のＣ末端に融合された抗体可変領域を含有する。更なる実施形態において、本発明のトランスボディーは、抗体可変領域のＮ末端に融合されたトランスフェリン分子を含有する。代替の実施形態において、本発明のトランスボディーは、抗体可変領域のＣ末端に融合されたトランスフェリン分子を含有する。
【０１６５】
[00157]  本発明はまた、改変されたトランスフェリン分子またはその一部に融合された抗体可変領域またはその一部を含有するトランスボディーを提供する。
【０１６６】
[00158]  別の実施形態において、本発明のトランスボディーは、改変されたトランスフェリンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合された抗体可変領域を含有する。別の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端において融合された抗体可変領域は同じ抗原と結合する。また、同じ抗原と結合する抗体可変領域は、異なる抗体に由来してもよく、したがって、同じ標的における異なるエピトープと結合する。代替の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端において融合された抗体可変領域は、異なる抗原と結合する。別の代替の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端に融合された抗体可変領域は、疾患、障害または状態の治療または予防のために２つの異なる細胞を活性化するために有用であり得る異なる抗原と結合する。別の実施形態において、Ｎ末端およびＣ末端において融合された抗体可変領域は、患者において同時によく生じることが当分野で既知の疾患または障害を治療または予防するために２つの異なる抗原を架橋するために有用であり得る異なる抗原と結合する。
【０１６７】
[00159]  また、本発明のトランスフェリン融合タンパク質はまた、目的とする抗体可変領域（例えば、治療タンパク質またはそのフラグメントもしくは変異体と結合する一本鎖抗体）を改変されたトランスフェリンの内部領域に挿入することによって製造することができる。改変されたトランスフェリンの内部領域には、ループ領域、鉄結合部位、ヒンジ領域、重炭酸イオン結合部位または受容体結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
[00160]  改変トランスフェリン分子のタンパク質配列の内部には、ジスルフィド結合によって安定化される多数のループまたはターンが存在する。これらのループは、特異的な生物学的活性を有する改変トランスフェリン分子を作製するための、治療上活性なペプチド（好ましくは抗体可変領域、特に、機能的であるために二次構造を要求する抗体可変領域）または治療タンパク質（好ましくは抗体可変領域）の挿入または内部融合のために有用である。
【０１６９】
[00161]  抗体可変領域（好ましくはＣＤＲ）がＴｆ分子の少なくとも１つのループに挿入されるか、または、抗体可変領域（好ましくはＣＤＲ）により、Ｔｆ分子の少なくとも１つのループが置き換えられるとき、挿入は、Ｔｆの他の領域に加えて、表面に露出したループ領域のいずれかにおいて行うことができる。例えば、挿入を、Ｔｆのアミノ酸３２〜３３、アミノ酸７４〜７５、アミノ酸２５６〜２５７、アミノ酸２７９〜２８０およびアミノ酸２８８〜２８９を含む各ループにおいて行うことができる（Ａｌｉら、上掲）（図３参照）。上述したように、挿入はまた、以下でより詳しく述べるように、鉄および重炭酸イオンが結合するための部位、ヒンジ領域、ならびに受容体結合ドメインなどのＴｆの他の領域において行うことができる。タンパク質またはペプチドを挿入するために改変／置換が容易であるＴｆタンパク質配列内のループもまた、ランダムペプチド挿入体のスクリーニング可能なライブラリーを開発するために使用することができる。任意の手法を使用して、利用可能なファージディスプレーシステムおよび細菌ディスプレーシステムを含むペプチドライブラリーを作製するための核酸挿入体を製造することができ、その後、Ｔｆドメインへのクローニングおよび／またはＴｆの両端への融合を行うことができる。
【０１７０】
[00162]  ＴｆのＮ末端は分子の本体に拘束されておらず、分子の本体から離れるように向いている。したがって、Ｎ末端におけるタンパク質またはペプチドの融合は好ましい実施形態であり得る。このような融合体は、抗体可変領域をＴｆから隔てるために、ポリグリシンストレッチ（これに限定されない）などのリンカー領域を含むことができる。リーダー配列との間の接合、リーダー配列の選択、およびコドン操作／最適化によるｍＲＮＡの構造（リボソームの進行を阻害する大きなステムループが存在しないこと）に対する注意は、分泌を増大させ、そして標準的な組換えタンパク質技術を使用して容易に達成することができる。
【０１７１】
[00163]  ＴｆのＣ末端は、より多くが埋没し、また、ジスルフィド結合の６アミノ酸によりＣ末端から固定されているようである。ヒトＴｆにおいて、Ｃ末端アミノ酸はプロリンであり、このプロリンは、ヒトＴｆが配向する経路に依存して、融合体を分子の本体から離れるように向かわせるか、または分子の本体の中に向かわせるかのいずれかである。Ｃ末端におけるリンカー成分またはスペーサー成分を本発明のいくつかの実施形態において使用することができる。Ｎ末端の近くにもまたプロリンが存在する。本発明の一態様において、Ｎ末端および／またはＣ末端におけるプロリンは変化させられ、除くことができる。本発明の別の態様において、Ｃ末端のジスルフィド結合は、Ｃ末端を自由にするために除去することができる。
【０１７２】
[00164]  本発明の一実施形態において、抗原結合特性を有するペプチドを、トランスボディーを形成させるためにトランスフェリンに挿入することができる。本発明の別の実施形態において、トランスボディーはどれも、トランスボディーを免疫応答の標的にする免疫原性ペプチドを含有することができる。これらのトランスボディーは、抗原に結合した後、免疫応答を動員することができる通常の抗体と同様に挙動する。
【０１７３】
[00165]  更に別の実施形態において、小分子の治療剤を、細胞の内部への送達およびＢＢＢを越える送達のために、鉄と複合体化させて、改変トランスボディーに負荷することができる。標的化ペプチド、または例えば、ＳＣＡの付加を使用して、負荷物を特定の細胞タイプ（例えば、ガン細胞）に対して標的化することができる。
【０１７４】
核酸
[00166]  本発明はまた、治療タンパク質（好ましくは、抗体可変領域）に共有結合的に連結または結合されたトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部を含むトランスボディーをコードする核酸分子を提供する。先により詳細に論じたように、任意の抗体可変領域を使用することができる。融合タンパク質は、リンカー領域、例えば、約５０アミノ酸残基未満、４０アミノ酸残基未満、３０アミノ酸残基未満、２０アミノ酸残基未満または１０アミノ酸残基未満のリンカーを更に含むことができる。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部および治療タンパク質（好ましくは抗体可変領域）に対して、また、トランスフェリンタンパク質またはその一部および治療タンパク質（好ましくは、抗体可変領域）の間で共有結合的に連結することができる。本発明の核酸分子は精製されてもよく、または未精製であってもよい。
【０１７５】
[00167]  核酸分子を複製するための宿主細胞およびベクター、ならびに、コードされたトランスボディーを発現させるための宿主細胞およびベクターもまた提供される。任意のベクターまたは宿主細胞を、それらが原核生物由来または真核生物由来であっても使用することができるが、真核生物発現システム（特に、酵母発現システム）が好ましい場合がある。このような目的のために多くのベクターおよび宿主細胞が、当分野で知られている。所望の適用のために適切な組合せを選択することは十分に当分野の技術の範囲内である。
【０１７６】
[00168]  トランスフェリン、トランスフェリンの一部、および目的とする抗体可変領域をコードするＤＮＡ配列を、当分野で既知の様々なゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。プローブに基づく方法を使用してこのようなＤＮＡ配列を単離するための技術は、通常的な技術であり、当業者には周知である。このようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、発表されたＤＮＡ配列またはタンパク質配列に基づくことができる（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）、種々の種に由来するトランスフェリン配列の比較、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１０６Ｂ／１：２０３〜２１８、およびそれに引用されるすべての参考文献を参照されたい；これらをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）。あるいは、Ｍｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）（これらを参照として本明細書中に組み入れる）によって開示されているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することができる。このようなＤＮＡ配列を単離するためのライブラリーの選択およびプローブの選択は当分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１７７】
[00169]  当分野で知られるように、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間における「類似性」が、１つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列およびその保存されたヌクレオチド置換またはアミノ酸置換を別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定される。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列の間における配列関連性の程度を意味する「同一性」もまた当分野では知られており、これは、このような配列の２つの鎖の間における一致の同一性によって決定される。同一性および類似性はともに容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１７８】
[00170]  多数の方法が、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の間における同一性および類似性を測定するために存在するが、用語「同一性」および用語「類似性」は当業者には周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８））。２つの配列の間における同一性または類似性を決定するために一般に用いられる方法には、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ（Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９４）；Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に開示されている方法が含まれるが、それらに限定されない。
【０１７９】
[00171]  同一性を決定するための好ましい方法は、調べられている２つの配列の間において最大の一致をもたらすように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法はコンピュータープログラムに記述されている。２つの配列の間における同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ編、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３（１９９０））が含まれるが、これらに限定されない。上述の類似性または同一性の程度は２つの配列の間における同一性の程度として決定され、これにより、第１の配列が第２の配列に由来することが示される。２つの核酸配列の間における同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３〜４５３）などの当分野で既知のコンピュータープログラムによって決定することができる。本発明のために２つの核酸配列の間における同一性の程度を決定する目的のためには、ＧＡＰは下記の設定で使用される：ＧＡＰ生成ペナルティー：５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー：０．３。
【０１８０】
コドンの最適化
[00172]  遺伝暗号の縮重性は、トランスフェリンタンパク質および／または目的とする治療タンパク質（好ましくは抗体可変領域）のヌクレオチド配列の様々な変化を可能にし、その一方で、生来的なＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを依然としてもたらす。「コドンの最適化」として知られる手法（これは米国特許第５，５４７，８７１号（これはその全体を参照として本明細書中に組み入れる）に記載されている）により、このような変化したＤＮＡ配列を設計する手段が提供される。コドンが最適化された遺伝子の設計では、生物におけるコドン使用の頻度、隣接頻度、ＲＮＡ安定性、二次構造形成に対する可能性、合成経路、およびその遺伝子の意図された将来のＤＮＡ操作を含む様々な要因を考慮に入れなければならない。具体的には、利用可能な方法を使用して、酵母発現システムが使用されるときの酵母によって最も容易に認識されるコドンを用いて、所与の融合タンパク質をコードするコドンを変化させることができる。
【０１８１】
[00173]  遺伝暗号の縮重性は、同じアミノ酸配列を多くの異なる様式でコードおよび翻訳させることができる。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンはそれぞれが、６個の異なるコドンによってコードされ、一方、バリン、プロリン、トレオニン、アラニンおよびグリシンはそれぞれが、４つの異なるコドンによってコードされる。しかしながら、このような同義的コドンの使用頻度は真核生物および原核生物の間でゲノム毎に異なる。例えば、哺乳動物の間における同義的コドンの選択パターンは非常に類似しており、その一方で、進化的に離れている生物、例えば、酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、細菌（例えば、大腸菌など）および昆虫（例えば、キイロショウジョウバエなど）などでは、ゲノムでのコドン使用頻度の明らかに異なるパターンが明らかにされている（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、８、４９〜６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、９、４３〜７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１４、１５１〜１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１６、３１５〜４０２（１９８８）；Ｗａｄａ，Ｋ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９増刊、１９８１〜１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９（１９９１））。コドン選択パターンにおけるこれらの違いは、ペプチド伸長速度を調節することによって個々の遺伝子の全体的な発現レベルに寄与するようである（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２８５、１６５〜１６９（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３、２８９５〜２８９８（１９８４）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０７、３６５〜３７７（１９８９）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７、３７５〜３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．およびＹａｒｕｓ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２０９、６５〜７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６（１９８４）、Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８０、５４９〜５７６（１９８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、４３、２１１〜２２５（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１４６、１〜２１（１９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５１、３８９〜４０９（１９８１））。
【０１８２】
[00174]  合成遺伝子に対する好ましいコドン使用頻度は、組換えタンパク質発現のために使用されることが意図される細胞／生物の正確なゲノム（またはできる限り近い関係にあるゲノム）、特に、酵母種のゲノムに由来する核遺伝子のコドン使用を反映させなければならない。先に論じたように、好ましい一実施形態において、ヒトＴｆ配列は、抗体可変領域のヌクレオチド配列がコドン最適化され得るように、酵母発現のために本明細書中に記載されるような改変の前またはその後で、コドン最適化が行われる。
【０１８３】
ベクター
[00175]  本発明において使用される発現ユニットは、一般に、下記のエレメントを５’から３’の向きで機能的に連結されて含む：転写プロモーター、分泌シグナル配列、目的とする治療タンパク質または治療ペプチド（好ましくは抗体可変領域）をコードするＤＮＡ配列に結合された、トランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の一部を含む改変Ｔｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーター。先に論じたように、Ｔｆタンパク質またはＴｆタンパク質内に融合された治療タンパク質または治療ペプチドの任意の配置を本発明のベクターにおいて使用することができる。適切なプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの選択は、選択された宿主細胞によって決定され、当業者には明らかであり、そして、より具体的には以下に論じる。
【０１８４】
[00176]  本発明において使用される適切な酵母ベクターが米国特許第６，２９１，２１２号に記載されており、これには、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：１０３５〜１０３９、１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ、８：１２１〜１３３、１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ、２７５：１０４〜１０８、１９７８）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４およびそれらの誘導体が含まれる。有用な酵母プラスミドベクターにはまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、９２０３７、米国）から入手可能なｐＲＳ４０３〜４０６、ｐＲＳ４１３〜４１６およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）ベクターが含まれる。ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６のプラスミドは、酵母組込型プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカー（ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３）を含む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
【０１８５】
[00177]  このようなベクターは一般には選択マーカーを含み、このような選択マーカーは、形質転換体が選択されることを可能にするために、それに対する表現型アッセイが存在する優勢な表現型を示す多数の遺伝子の１つであり得る。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補するマーカー、抗生物質抵抗性をもたらすマーカー、または細胞が特定の炭素源を利用することを可能にするマーカーであり、これらには、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈら、同上）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ、８：１７、１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌら、同上）、またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ、欧州特許第１７１，１４２号）が含まれる。他の適切な選択マーカーには、クロラムフェニコール抵抗性を酵母細胞に付与するＣＡＴ遺伝子が含まれる。酵母において使用される好ましいプロモーターには、酵母の解糖系遺伝子に由来するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２５：１２０７３〜１２０８０、１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１：４１９〜４３４、１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来するプロモーター（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら（編）、３５５頁、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎ．Ｙ．、１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０１：１９２〜２０１、１９８３）が含まれる。これに関連して、特に好ましいプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号）およびＡＤＨ２−４Ｃ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３０４：６５２〜６５４、１９８３）である。発現ユニットはまた転写ターミネーターを含むことができる。好ましい転写ターミネーターはＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、同上）である。酵母発現システムの他の好ましいベクターおよび好ましい成分（例えば、プロモーターおよターミネーターなど）が欧州特許第０２５８０６７号、同第０２８６４２４号、同第０３１７２５４号、同第０３８７３１９号、同第０３８６２２２号、同第０４２４１１７号、同第０４３１８８０号および同第１００２０９５号；欧州特許公開第０８２８７５９号、同第０７６４２０９号、同第０７４９４７８号および同第０８８９９４９号；ＰＣＴ国際公開公報第００／４４７７２号および同第９４／０４６８７号；ならびに米国特許第５，７３９，００７号、同第５，６３７，５０４号、同第５，３０２，６９７号、同第５，２６０，２０２号、同第５，６６７，９８６号、同第５，７２８，５５３号、同第５，７８３，４２３号、同第５，９６５，３８６号、同第６，１５０，１３３号、同第６，３７９，９２４号および同第５，７１４，３７７号（これらをその全体を参照として本明細書中に組み入れる）に開示される。
【０１８６】
[00178]  酵母に加えて、本発明の改変融合タンパク質は、糸状菌類において、例えば、アスペルギルス属菌類の菌株において発現させることができる。有用なプロモーターの例には、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）の解糖遺伝子に由来するプロモーター、例えば、ａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：２０９３〜２０９９、１９８５）およびｔｐｉＡプロモーターが含まれる。適切なターミネーターの例には、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、同上）がある。このような構成成分を利用する発現ユニットを、例えば、アスペルギルス属の染色体ＤＮＡの中への挿入を可能にするベクターにクローン化することができる。
【０１８７】
[00179]  本発明を実施する際に使用される哺乳動物発現ベクターは、改変Ｔｆ融合タンパク質（好ましくは、改変されたＴｆを含むトランスボディー）の転写を行わせることができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターには、ウイルスプロモーターおよび細胞プロモーターが含まれる。好ましいウイルスプロモーターには、アデノウイルス２に由来する主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２：１３０４〜１３１９９、１９８２）、およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１：８５４〜８６４、１９８１）が含まれる。好ましい細胞プロモーターには、マウスメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２２：８０９〜８１４、１９８３）およびマウスＶκ（米国特許第６，２９１、２１２号を参照されたい）プロモーター（Ｇｒａｎｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１５：５４９６、１９８７）が含まれる。特に好ましいプロモーターはマウスＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）プロモーターである。このような発現ベクターはまた、プロモーターの下流で、かつ、トランスフェリン融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置する一組のＲＮＡスプライス部位を含有することができる。好ましいＲＮＡスプライス部位をアデノウイルス遺伝子および／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
【０１８８】
[00180]  発現ベクターにはまた、目的とするコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルが含有される。ポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来する初期ポリアデニル化シグナルまたは後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、同上）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域に由来するポリアデニル化シグナル、ならびにヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、９：３７１９〜３７３０、１９８１）が含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルはＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）遺伝子のターミネーターである。発現ベクターは、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する非コード性のウイルスリーダー配列（例えば、アデノウイルス２の三成分リーダーなど）を含むことができる。好ましいベクターはまた、エンハンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサーおよびマウスのμ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｃｅｌｌ、３３：７１７〜７２８、１９８３）などを含むことができる。発現ベクターはまた、アデノウイルスＶＡのＲＮＡをコードする配列を含むことができる。
【０１８９】
形質転換
[00181]  菌類を形質転換するための様々な技術が文献では広く知られており、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同上）、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９〜１９３３、１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：１７４０〜１７４７、１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ、３０１：１６７〜１６９、１９８３）に記載される。クローン化されたＤＮＡ配列を菌類細胞に導入するための他の技術、例えば、エレクトポレーション（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９４：１８２〜１８７、１９９１）などを使用することができる。宿主細胞の遺伝子型は、一般には、発現ベクターに存在する選択マーカーによって相補される遺伝的欠陥を含有する。特定の宿主および選択マーカーの選択は十分に当分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１９０】
[00181]  本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を含むクローン化されたＤＮＡ配列は、培養された哺乳動物細胞に、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６、１９７３）によって導入することができる。クローン化されたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞に導入するための他の技術、例えば、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１：８４１〜８４５、１９８２）またはリポフェクションなどもまた使用することができる。クローン化されたＤＮＡが組込まれている細胞を同定するために、選択マーカーが、一般には、目的とする遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に細胞に導入される。培養された哺乳動物細胞において使用される好ましい選択マーカーには、ネオマイシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲ遺伝子である。特に好ましい増幅可能なマーカーはＤＨＦＲｒ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照されたい）のｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｄａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２４９５〜２４９９、１９８３）である。様々な選択マーカーがＴｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓ．）によって総説されており、選択マーカーの選択は十分に当分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１９１】
宿主細胞
[00183]  本発明はまた、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質を発現させるために形質転換されている細胞、好ましくは酵母細胞を含む。形質転換された宿主細胞そのものに加えて、本発明はまた、栄養培地におけるこのような細胞の培養物、好ましくは、モノクローナル（クローン的に均一な）培養物、またはモノクローナル培養物に由来する培養物を含む。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、ポリペプチドを細胞とともに、または、細胞がろ過もしくは遠心分離によって除かれた場合には細胞を伴うことなく含有する。
【０１９２】
[00184]  本発明を実施する際に使用される宿主細胞には、外因性ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションされ、培養で増殖させることができる真核生物細胞および場合により原核生物細胞、例えば、培養された哺乳動物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、植物細胞および細菌細胞などが含まれる。
【０１９３】
[00185]  酵母の様々な種（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）を含む菌類細胞を本発明において宿主細胞として使用することができる。本発明のトランスフェリン融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）を発現させるための宿主として本発明の実施において有用であると考えられる酵母を含む菌類の例には、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（この一部は以前にはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属として分類されていた）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ザイゴサエカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｅｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、メツチュニコウイア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）属、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、およびエンドミコピシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｙｉｓ）属などがある。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．の例には、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓおよびＳ．ｒｏｕｘｉｉがある。ＫＩｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．の例には、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓがある。適切なトルラスポラ属種はＴ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．の例には、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（以前にはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ（以前にはＨ．ａｎｏｍａｌａ）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓがある。
【０１９４】
[00186]  本発明のＴｆ融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）を製造するための特に有用な宿主細胞はメタノール資化性ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｒｉｓ）である（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎら（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．、６：６１９〜６２４）。ピキア・パストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離およびクローン化されていたので、外来タンパク質を製造するための優れた宿主にするために開発されてきた；その形質転換が１９８５年に初めて報告された。Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓは、グルコースが存在しないとき、メタノールを炭素源として利用することができる。Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ発現システムでは、アルコールオキシダーゼ（メタノール代謝における最初の段階を触媒する酵素）の発現のためにコードする遺伝子を制御する、メタノールにより誘導されるアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用することができる。このプロモーターは特徴づけられており、一連のＰ．ｐａｓｔｒｉｓ発現ベクターに取り込まれている。Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓで産生されるタンパク質は、典型的には、正しく折り畳まれ、培地に分泌されるので、遺伝子操作されたＰ．ｐａｓｔｒｉｓの発酵により、大腸菌発現システムに代わる優れた方法が提供される。破傷風毒素フラグメント、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）パータクチン、ヒト血清アルブミン、リゾチーム、インターフェロンα、ならびにグリコシル化トランスフェリンおよび非グリコシル化トランスフェリンを始めとする多数のタンパク質が、このシステムを使用して製造されている。
【０１９５】
[00187]  酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株は別の好ましい宿主である。好ましい実施形態において、酵母細胞、または、より具体的には、糖タンパク質のアスパラギン結合型グリコシル化のために要求される遺伝子に遺伝的欠陥を含有するサッカロミセス・セレビシエ宿主細胞が使用される。このような欠陥を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞は、変異および選択の標準的な技術を使用して調製することができる。しかし、多くの利用可能な酵母菌株が、グリコシル化または過マンノシル化を妨げ、または低下させるために改変されている。Ｂａｌｌｏｕら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：５９８６〜５９９１、１９８０）は、アスパラギン結合型グリコシル化に影響を及ぼす遺伝子が不完全であるマンノプロテイン生合成変異体の単離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、７：４８１〜４８１、１９９７）は、酵母においてタンパク質のＯ−グリコシル化における最初の段階を担う酵素をコードする少なくとも６つの遺伝子（ＰＭＴ１〜６）からなるファミリーを記載している。これらの遺伝子の１つ以上が欠損している変異体は、低下したＯ結合型グリコシル化および／またはＯ−グリコシル化の変化した特異性を示す。
【０１９６】
[00188]  異種タンパク質の製造を最適化するために、宿主菌株が、低下したタンパク質分解活性をもたらす変異、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｐｅｐ４変異（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５：２３〜３３、１９７７）を有することもまた好ましい。他のプロテアーゼコード領域に変異を含有する宿主菌株は、本発明のＴｆ融合タンパク質を大量に製造するために特に有用である。
【０１９７】
[00189]  本発明のＤＮＡ構築物を含有する宿主細胞は適切な増殖培地において増殖させられる。本明細書中で使用される用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖のために要求される栄養分を含有する培地を意味する。細胞増殖のために要求される栄養分には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子が含まれ得る。増殖培地は一般には、ＤＮＡ構築物を含有する細胞について、例えば、薬物選択によって、または、ＤＮＡ構築物に存在する選択マーカー、もしくはＤＮＡ構築物と同時にトランスフェクションされる選択マーカーにより補完される必須栄養分における欠乏によって選択される。例えば、酵母細胞は好ましくは、炭素源（例えば、スクロース）、非アミノ酸窒素源、無機塩、ビタミンおよび必須アミノ酸補充物を含む化学的に規定された培地において増殖させられる。培地のｐＨは、好ましくは、２よりも大きく、かつ８未満のｐＨで維持され、好ましくはｐＨ５．５〜６．５で維持される。安定したｐＨを維持するための方法には、緩衝化および一定したｐＨ制御が含まれる。好ましい緩衝化剤には、クエン酸塩−リン酸塩またはコハク酸およびＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）が含まれ得る。アスパラギン結合型グリコシル化のために要求される遺伝子に欠陥を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定化剤を含有する培地において増殖させられる。好ましい浸透圧安定化剤は、０．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度で、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍで培地に補充されるソルビトールである。
【０１９８】
[00190]  培養されている哺乳動物細胞は、通常、市販の血清含有培地または無血清培地において増殖させられる。使用される特定の細胞株に対して適切な培地の選択は当分野における通常の技術レベルの範囲内である。トランスフェクションされた哺乳動物細胞は、目的とするＤＮＡ配列の発現を開始させるために、一定の期間にわたって、典型的には１日〜２日の期間にわたって増殖させることができる。その後、薬物選択が、選択マーカーを安定した様式で発現している細胞の増殖について選択するために加えられる。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクションされている細胞の場合、薬物の濃度を、増大したコピー数のクローン化された配列について選択するために段階的な様式で増大させることができ、それにより発現レベルを増大させることができる。
【０１９９】
[00191]  バキュロウイルス／昆虫細胞の発現システムもまた、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質を製造するために使用することができる。ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）は組換えタンパク質を昆虫宿主細胞において高レベルで発現させる。標的遺伝子が伝達ベクターに挿入され、その後、伝達ベクターが、線状化されたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡとともに昆虫宿主細胞にコトランスフェクションされる。ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡはバキュロウイルスゲノムの必須部分を有していない。ＤＮＡがベクターとの組換えを起こしたとき、必須エレメントが元に戻り、標的遺伝子がバキュロウイルスのゲノムに移される。組換え後、少数のウイルスプラークが選択され、精製され、そして組換え表現型が確認される。新しく単離された組換えウイルスは、その後、増幅され、そして、昆虫細胞培養物に感染させて、大量の所望のタンパク質を製造するために使用することができる。
【０２００】
[00192]  本発明のＴｆ融合タンパク質はまた、遺伝子組換え植物および遺伝子組換え動物を使用して製造することができる。例えば、ヒツジおよびヤギは治療タンパク質をその乳汁に作製することができる。あるいは、タバコ植物はタンパク質をその葉に含むことができる。遺伝子組換え植物および遺伝子組換え動物によるタンパク質製造ではともに、融合タンパク質をコードする新しい遺伝子を生物のゲノムに加えることが含まれる。遺伝子組換え生物は、新しいタンパク質を産生することができるだけでなく、この能力をその子孫に伝えることもできる。
【０２０１】
分泌シグナル配列
[00193]  用語「分泌シグナル配列」または用語「シグナル配列」または用語「分泌リーダー配列」は交換可能に使用され、例えば、米国特許第６，２９１，２１２号および米国特許第５，５４７，８７１号（これらはともにその全体を参照として本明細書中に組み入れる）に記載されている。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列により、分泌ペプチドがコードされる。分泌ペプチドは、成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質の細胞からの分泌を行わせるために作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、疎水性アミノ酸のコアによって一般には特徴づけられ、典型的には（しかし、絶対的ではないが）、新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見出される。非常に多くの場合、分泌ペプチドは分泌途中で成熟タンパク質から切断される。分泌ペプチドは、分泌経路を通過しているときに成熟タンパク質からのシグナルペプチドの切断を可能にするプロセシング部位を含有する場合がある。プロセシング部位はシグナルペプチド内にコードされ得るか、または、例えば、インビトロ変異誘発法によってシグナルペプチドに付加され得る。
【０２０２】
[00194]  分泌ペプチドは、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質の分泌を行わせるために使用することができる。他の分泌ペプチドとの組合せで使用され得る１つのこのような分泌ペプチドとして、α接合因子のリーダー配列がある。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌を生じさせる複雑な一連の翻訳後プロセシング工程のために要求される。完全なシグナル配列が存在する場合、発現途中のタンパク質は粗面小胞体の内腔に進入し、その後、ゴルジ装置を通って分泌小胞に輸送され、最終的には細胞外に輸送される。一般に、シグナル配列は、そのすぐ後には開始コドンが続き、分泌されるタンパク質のアミノ末端端部においてシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切断される。好ましいシグナル配列は、ウイルス発現ベクター、哺乳動物発現ベクターまたは酵母発現ベクターを使用する組換えタンパク質発現のプロセシング効率および細胞外輸送効率を改善する。場合により、生来的なＴｆシグナル配列を、本発明の融合タンパク質を発現および分泌させるために使用することができる。
【０２０３】
リンカー
[00195]  本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質のＴｆ成分および抗体可変領域は直接的に融合させることができ、または、より大きい物理的分離を融合されたタンパク質の間にもたらし、かつより高い空間移動性を融合されたタンパク質の間で可能にし、したがって、例えば、その同系受容体に対する結合のために抗体可変領域の接近性を最大にするために、様々な長さのリンカーペプチドを使用して融合させることができる。リンカーペプチドは、柔軟であるアミノ酸、または、より剛直であるアミノ酸から構成され得る。例えば、ポリグリシンストレッチ（これに限定されない）などのリンカーである。リンカーは、約５０アミノ酸残基未満、４０アミノ酸残基未満、３０アミノ酸残基未満、２０アミノ酸残基未満または１０アミノ酸残基未満であり得る。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその一部および抗体可変領域に対して、また、トランスフェリンタンパク質またはその一部と抗体可変領域との間に共有結合的に連結することができる。
【０２０４】
[00196]  リンカーはまた、抗体可変領域を結合させるために使用される。抗体可変領域を結合させるための適切なリンカーは、抗体可変領域が、完全な抗体の結合特異性を維持する三次元構造に折り畳まれることを可能にするリンカーである。
【０２０５】
トランスボディーの検出
[00197]  生物学的に活性な改変トランスフェリン−トランスボディーを検出するためのアッセイには、ウエスタントランスファーフィルター、タンパク質ブロットフィルターまたはコロニーフィルター、ならびに、トランスフェリンおよび抗体可変領域を含む融合タンパク質を検出する活性に基づくアッセイを挙げることができる。ウエスタントランスファーフィルターは、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：４３５０〜４３５４、１９７９）によって記載されている方法を使用して調製することができる。簡単に記載すると、サンプルがドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動される。ゲル中のタンパク質がニトロセルロースペーパーに電気泳動的に転写される。タンパク質ブロットフィルターは、例えば、マニホールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、Ｎ．Ｈ．）を使用してニトロセルロースフィルターで上清サンプルまたは濃縮物をろ過することによって調製することができる。コロニーフィルターは、適切な増殖培地を覆って置かれているニトロセルロースフィルターの上でコロニーを増殖させることによって調製することができる。この方法では、固体培地が好ましい。細胞は、少なくとも１２時間、フィルター上で増殖させられる。細胞が、フィルターに結合したタンパク質を除かない適切な緩衝液で洗浄することによってフィルターから除かれる。好ましい緩衝液は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１９ｍＭグリシン（ｐＨ８．３）、２０％メタノールを含む。
【０２０６】
[00198]  本発明のトランスフェリン融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）は、放射性同位体または他のイメージング剤で標識し、インビボ診断の目的のために使用することができる。好ましい放射性同位体画像化剤には、ヨウ素−１２５およびテクネチウム−９９が含まれ、テクネチウム−９９が特に好ましい。タンパク質−同位体のコンジュゲートを製造するための様々な方法が当分野では周知であり、例えば、Ｅｃｋｅｌｍａｎら（米国特許第４，６５２，４４０号）、Ｐａｒｋｅｒら（国際公開公報第８７／０５０３０号）およびＷｉｌｂｅｒら（欧州特許第２０３，７６４号）によって記載されている。あるいは、トランスボディーはスピン標識増強剤に結合することができ、また、磁気共鳴（ＭＲ）画像法のために使用することができる。適切なスピン標識増強剤には、安定な立体障害型フリーラジカル化合物（例えば、ニトロキシドなど）が含まれる。リガンドをＭＲ画像法のために標識するための方法が、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎら（米国特許第４，６５６，０２６号）よって開示されている。投与される場合、標識されたトランスボディーは、医薬的に許容され得るキャリアまたは希釈剤（例えば、滅菌された生理的食塩水または滅菌水）と一緒にされる。投与は、好ましくはボーラス注射により、好ましくは静脈内投与による。
【０２０７】
[00199]  本発明のトランスボディーの検出は、検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが含まれる。発光物質の例には、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが含まれる。適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【０２０８】
[00200]  一実施形態において、本発明のトランスボディーが、抗原に結合させるための抗原と結合または競合する能力についてアッセイされている場合、当分野で既知の様々な免疫測定法を使用することができ、これらには、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、サンドイッチ免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュー免疫アッセイ（例えば、金コロイドまたは酵素または放射性同位体の標識が使用される）、ウエスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなどの技術を使用する競合的アッセイシステムおよび非競合的アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、トランスボディーの結合が、トランスボディー上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、トランスボディーは、トランスボディーと相互作用する二次抗体または二次的な試薬の結合を検出することによって検出される。更なる実施形態において、二次抗体は標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおいて結合を検出することについて当分野で既知であり、このような手段は本発明の範囲内である。
【０２０９】
トランスボディーの製造
[00201]  本発明は更に、本明細書中に記載される核酸分子を使用して本発明の改変融合タンパク質（好ましくは、改変されたＴｆを含むトランスボディー）を製造するための方法を提供する。一般的に言えば、タンパク質の組換え形態の製造は、典型的には下記の工程を伴う：
【０２１０】
[00202]  本発明のトランスボディーをコードする核酸分子が最初に得られる。その後、核酸分子は、好ましくは、タンパク質のオープンリーディングフレームを含有する発現ユニットを形成するために、上述されたように、適切な制御配列との機能的な連結状態に置かれる。発現ユニットは、適切な宿主を形質転換するために使用され、形質転換された宿主は、組換えタンパク質の産生を可能にする条件のもとで培養される。必要に応じて、組換えタンパク質が培地または細胞から単離される。タンパク質の回収および精製は、いくつかの不純物が許容され得る場合には必ずしも必要とされ得ない。
【０２１１】
[00203]  上記工程のそれぞれを様々な方法で行うことができる。例えば、様々な宿主において作動可能な発現ベクターの構築が、上述されたように、適切なレプリコンおよび制御配列を使用して行われる。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子を発現させるために使用される宿主細胞のタイプに依存し、以前に詳しく論じられており、また、そうでない場合には、当業者には既知である。適切な制限部位を、通常の場合に利用できないならば、これらのベクターに挿入するための切り出し可能な遺伝子が得られるようにコード配列の端部に加えることができる。当業者は、本発明の核酸分子とともに使用される当分野では既知の任意の宿主／発現システムを、所望の組換えタンパク質を産生させるために容易に適合させることができる。
【０２１２】
[00204]  先に論じたように、任意の発現システムを使用することができ、それらには、酵母、細菌、動物、植物、真核生物および原核生物でのシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、酵母システム、哺乳動物細胞培養システム、および遺伝子組換え動物または遺伝子組換え植物での製造システムが好ましい。他の実施形態では、酵母の生来的なグリコシル化活性、過グリコシル化活性またはタンパク質分解活性を低下させるために改変されている酵母システムを使用することができる。
【０２１３】
トランスボディーの単離／精製
[00205]  分泌された生物学的に活性な改変トランスフェリン融合タンパク質（好ましくは、改変されたトランスフェリンを含むトランスボディー）を、生物学的に活性な融合タンパク質の分泌を可能にする条件のもとで増殖させた宿主細胞の培地から単離することができる。細胞物質が培養培地から除かれ、生物学的に活性な融合タンパク質が、当分野では既知の様々な単離技術を使用して単離される。適切な単離技術には、沈殿化、ならびに、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフェニティークロマトグラフィーを含む様々なクロマトグラフィー的方法による分画化が含まれる。
【０２１４】
[00206]  特に好ましい精製方法は、鉄結合カラムまたは金属キレート化カラムでのアフィニティークロマトグラフィー、あるいは、ポリペプチド融合体の抗体可変領域に向けられた同系の抗原を使用する免疫アフィニティークロマトグラフィーである。抗原は、好ましくは、固体の担体または基体に固定化または結合される。特に好ましい基体はＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）である。この方法によって、培地は、結合を生じさせることができる条件のもとで抗原／基体と一緒にされる。複合体は、非結合物を除くために洗浄することができ、そしてトランスボディーが、複合体形成に好ましくない条件の使用によって放出または溶出される。特に有用な溶出方法には、ｐＨの変化、この場合、固定化されている抗原は、第１のｐＨにおいてトランスボディーに対して高い親和性を有し、第２のｐＨ（より高いｐＨまたはより低いｐＨ）において低下した親和性を有する；ある種のカオトロピック剤の濃度の変化；または界面活性剤の使用によることが含まれる。
【０２１５】
細胞の内部へのトランスボディーの送達および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を越えたトランスボディーの送達
[00207]  本発明の範囲内において、改変トランスボディーは、トランスフェリンの三価鉄イオンに対して複合体化された分子または小分子治療剤を細胞の内部に送達するためのキャリアとして、または血液脳関門を超えて送達するためのキャリアとして使用することができる。これらの実施形態において、トランスフェリンは、典型的には、トランスボディーおよび／または抗体可変領域の血清半減期を延ばすためにグリコシル化を阻害または防止または除去するために操作または改変される。標的化ペプチドの付加、例えば、一本鎖抗体の付加は、トランスボディーを特定の細胞タイプ（例えば、ガン細胞）に対して更に標的化するために特に意図される。
【０２１６】
[00208]  一実施形態において、鉄を含有する抗貧血薬である三価鉄−ソルビトール−クエン酸塩複合体が本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質に負荷される。三価鉄−ソルビトール−クエン酸塩（ＦＳＣ）は、マウスの様々なガン細胞の増殖をインビトロで阻害し、また、腫瘍の退行をインビボで生じさせ、その一方で、非悪性細胞の増殖に対する作用を何ら有しないことが示されている（Ｐｏｌｊａｋ−Ｂｌａｚｉら（２０００年６月）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（合衆国）、１５／３：２８５〜２９３）。
【０２１７】
[00209]  別の実施形態において、抗悪性腫瘍薬アドリアマイシン（登録商標）（ドキソルビシン）および／または化学療法薬ブレオマイシン（これらはともに、三価鉄イオンとの複合体を形成することが既知である）が本発明のトランスボディーに負荷される。他の実施形態において、薬物の塩（例えば、クエン酸塩または炭酸塩）を調製して、Ｔｆにその後で結合させられる３価の鉄と複合体化することができる。腫瘍細胞は、多くの場合、鉄についてより高い代謝回転速度を示すので、少なくとも１つの抗腫瘍剤を運搬するように改変されたトランスフェリンは、腫瘍細胞に対する薬剤の暴露または負荷を増大させる手段を提供し得る（Ｄｅｍａｎｔ，Ｅ．Ｊ．、（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３７：１１３〜１１８；Ｐａｄｂｕｒｙら（１９８５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：７８２０〜７８２３）。
【０２１８】
医薬製剤および治療方法
[00210]  本発明の改変融合タンパク質、好ましくは、改変されたトランスフェリンを含む本発明のトランスボディーは、標準的な投与プロトコルを使用してその必要性のある患者に投与することができる。例えば、本発明の改変Ｔｆ融合タンパク質は、単独で、または組合せで、または、特定の病理学的プロセスを調節する他の薬剤との連続した組合せで与えることができる。本明細書中で使用されるように、２種類の薬剤が同時に投与されるとき、または、２種類の薬剤が同時もしくはほぼ同時に作用するような様式で独立して投与されるとき、２種類の薬剤は組合せで投与されると言われる。
【０２１９】
[00211]  本発明の薬剤は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路および頬側経路によって投与することができる。例えば、薬剤をマイクロ注入によって傷害部位に局所的に投与することができる。あるいは、同時に、投与は、経口経路、吸入経路、鼻腔経路または肺経路のいずれかによって非侵襲的であり得る。投与される投薬量は、被投与者の年齢、健康状態および体重、同時に行われる処置の種類（行われる場合）、処置頻度、ならびに所望される効果の性質に依存する。
【０２２０】
[00212]  本発明は更に、本発明の１つ以上のトランスボディーを含有する組成物を提供する。個々の必要性は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲を決定することは当分野の技術の範囲内である。典型的な投薬量は約１ｐｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。全身投与のための好ましい投薬量は約１００ｎｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。マイクロ注入による標的部位への直接的な投与のための好ましい投薬量は約１ｎｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重を含む。直接的な注射またはマイクロ注入によって投与されるとき、本発明の改変された融合タンパク質は、部分的には限局的な鉄毒性を防止するために、鉄の低下した結合を示すか、または鉄の結合を全く示さないように操作することができる。
【０２２１】
[00213]  薬理学的に活性なトランスボディーに加えて、本発明の組成物は、活性な化合物を作用部位への送達のために薬学的に使用され得る製剤に加工することを容易にする賦形剤および補助剤を含む適切な医薬的に許容され得るキャリアを含有することができる。非経口投与される適切な製剤には、水溶性形態（例えば、水溶性塩）にある活性な化合物の水溶液が含まれる。また、活性な化合物の懸濁物を適切な油状の注射懸濁物として投与することができる。適切な親油性の溶媒またはビークルには、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が含まれる。水性の注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質を含有することができ、これには、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよびデキストランが含まれる。必要に応じて、懸濁物はまた安定化剤を含有することができる。リポソームもまた、細胞内への送達のために薬剤をカプセル化するために使用することができる。
【０２２２】
[00214]  本発明による全身投与用の医薬製剤は、経腸投与、非経口投与または局所投与のために製剤化され得る。実際、３タイプの製剤のすべてが、有効成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。経口投与される適切な製剤には、ハードゼラチンカプセルまたはソフトゼラチンカプセル、ピル、錠剤（コーティング錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁物、シロップまたは吸入物およびその制御放出形態物が含まれる。
【０２２３】
[00215]  本発明の方法を実施する際、本発明のトランスボディーは、単独で、または組合せで、または他の治療剤もしくは診断剤との組合せで使用することができる。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のトランスボディーは、一般に容認されている医療行為にしたがってこれらの状態について典型的に処方される他の化合物と一緒に同時に投与することができる。本発明のトランスボディーは、インビボで、通常的には、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスなどの哺乳動物において、またはエキソビボで、またはインビトロで使用することができる。
【０２２４】
遺伝子組換え動物
[00216]  増大した血清半減期、増大した血清安定性、または増大したバイオアベイラビリティを有する本発明の改変トランスフェリン融合構築物（好ましくはトランスボディー）を含有する遺伝子組換え非ヒト動物の作製が本発明の一実施形態において意図される。いくつかの実施形態において、ラクトフェリンを融合タンパク質のＴｆ部分として使用することができ、その結果、融合タンパク質が乳汁中に産生および分泌される。他の実施形態において、本発明は、Ｔｆ融合タンパク質を乳汁に産生させることを含む。
【０２２５】
[00217]  遺伝子組換え非ヒト動物の成功した作製が多数の特許および刊行物に記載されている（例えば、米国特許第６，２９１，７４０号（２００１年９月１８日発行）；米国特許第６，２８１，４０８号（２００１年８月２８日発行）；および米国特許第６，２７１，４３６号（２００１年８月７日発行）など。これらの内容を、その全体を参照として本明細書中に組み入れる）。
【０２２６】
[00218]  動物、例えば、乳牛、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシおよびヒツジを含む家畜化された哺乳動物などの遺伝子構成を変化させることができることにより、多くの商業的適用が可能である。これらの適用には、容易に採集される形態（例えば、乳汁中または血液中への発現）で多量の外因性タンパク質を発現する動物の作製、増大した体重増加、給餌効率、肉組成、乳汁生産または乳汁含有量、疾患抵抗性および特定の微生物による感染に対する抵抗性を有する動物の作製、そして成長速度または繁殖成績が高められた動物の作製が含まれる。外因性ＤＮＡ配列をそのゲノムに含有する動物を遺伝子組換え動物という。
【０２２７】
[00219]  遺伝子組換え動物を作製するための最も広範に使用されている方法は、ＤＮＡを受精胚の前核に顕微注入することである（Ｗａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４９：１１３［１９９２］）。遺伝子組換え動物を作製するための他の方法には、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターによる胚の感染が含まれる。野生型レトロウイルスまたは組換えレトロウイルスのいずれかによる着床前および着床後の両方のマウス胚の感染が報告されている（Ｊａｎｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３：１２６０［１９７６］；Ｊａｎｅｎｉｃｈら、Ｃｅｌｌ、２４：５１９［１９８１］；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１５１［１９８４］；Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６９２７［１９８５］；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６１４８〜６１５２［１９８５］；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３８３〜３８８［１９８７］）。
【０２２８】
[00220]  レトロウイルスを胚に感染させるための代わりの手段は、マウス胚の胞胚腔の中にウイルスまたはウイルス産生細胞を注入することである（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２９８：６２３［１９８２］）。マウスの生殖系列への導入遺伝子の導入が、妊娠中期のマウス胚の子宮内でのレトロウイルス感染を使用して報告されている（Ｊａｈｎｅｒら、上掲［１９８２］）。遺伝子組換え動物を作製するためのレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターによるウシ胚およびヒツジ胚の感染が報告されている。これらのプロトコルでは、レトロウイルス粒子、またはレトロウイルス粒子を放つ成長停止させた（すなわち、マイトマイシンＣ処理された）細胞を受精卵または初期胚の卵黄周囲隙に顕微注入することが包含される（ＰＣＴ国際特許出願第９０／０８８３２号［１９９０］；ＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．、４０：３８６［１９９５］）。ＰＣＴ国際特許出願第９０／０８８３２号には、２細胞期〜８細胞期のヒツジ胚の卵黄周囲隙への野生型ネコ白血病ウイルスＢの注入が記載されている。注入された胚に由来する胎児は、多数の組込み部位を含有することが示された。
【０２２９】
[00221]  米国特許第６，２９１，７４０号（２００１年９月１８日発行）には、分裂中の細胞に形質導入するレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス［ＭＬＶ］に由来するベクター）を使用して、外因性ＤＮＡを未成熟な卵母細胞および成熟した未受精の卵母細胞（すなわち、受精前の卵母細胞）に導入することによる遺伝子組換え動物の作製が記載される。この特許にはまた、様々な組換えタンパク質のサイトメガロウイルスプロモーターにより駆動される発現ならびにマウス乳腫瘍ＬＴＲによる発現のための方法および組成物が記載されている。
【０２３０】
[00222]  米国特許第６，２８１，４０８号（２００１年８月２８日発行）には、胚性幹細胞を使用して遺伝子組換え動物を作製するための方法が記載される。簡単に記載すると、胚性幹細胞が、遺伝子組換え動物を作製するために、桑実胚との混合細胞同時培養において使用される。外来遺伝物質が、例えば、エレクトロポレーション、顕微注入またはレトロウイルス送達によって、同時培養の前に胚性幹細胞に導入される。この様式でトランスフェクションされたＥＳ細胞が、ネオマイシンなどの選択マーカーによって遺伝子の組込みについて選択される。
【０２３１】
[00223]  米国特許第６，２７１，４３６号（２００１年８月７日発行）には、始原生殖細胞の単離、これらの細胞を培養して始原生殖細胞由来の細胞株を作製すること、始原生殖細胞および培養された細胞株の両方を形質転換すること、そして、これらの形質転換された細胞および細胞株を使用して遺伝子組換え動物を作製することを含む方法を使用した遺伝子組換え動物の作製が記載されている。遺伝子組換え動物が作製される効率が大きく増大するので、齧歯類以外の遺伝子組換え動物種を作製することにおける相同的組換えの使用が可能になる。
【０２３２】
遺伝子治療
[00224]  改変されたトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンドメインが抗体可変ドメインに連結されている遺伝子治療用の改変トランスフェリン融合構築物の使用が、本発明の一実施形態において意図される。増大した血清半減期または血清安定性を有する本発明の改変トランスフェリン融合構築物は、遺伝子治療による治療に理想的に適している。
【０２３３】
[00225]  可溶性の融合タンパク質を発現させるための遺伝子治療の成功した使用が記載されている。簡単に記載すると、細胞障害性リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）およびヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ部分からなる可溶性の融合タンパク質をコードする遺伝子を含有するアデノウイルスベクターを注入することによる遺伝子治療が、最近、Ｉｊｉｍａら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（合衆国）、１２／９：１０６３〜７７、２００１）において示された。遺伝子治療のこの適用において、ＩＩ型コラーゲンで誘導された関節炎のマウスモデルにより、ベクターの関節内注入による処置が成功した。
【０２３４】
[00226]  遺伝子治療はまた、米国特許第６，２２５，２９０号（２００１年５月１日発行）、米国特許第６，１８７，３０５号（２００１年２月１３日発行）および米国特許第６，１４０，１１１号（２０００年１０月３１日発行）を含む多数の米国特許に記載されている。
【０２３５】
[00227]  米国特許第６，２２５，２９０号では、所望される治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を機能的に組み込むために哺乳動物の被験者の腸上皮細胞を遺伝的に変化させる方法および構築物が提供される。腸細胞の形質転換は、主として裸のＤＮＡ（ネーキッドＤＮＡ）から構成される製剤の投与によって達成され、ＤＮＡは経口投与することができる。経口投与経路または他の消化管内投与経路は簡単な投与方法をもたらし、その一方で、裸の核酸の使用により、遺伝子治療を達成するためのウイルスベクターの使用に関連する面倒な事態が回避される。発現したタンパク質は、直接、消化管および／または血流に分泌されて、タンパク質の治療的血中レベルをもたらし、それにより、そのタンパク質を必要としている患者が治療される。形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠損に関連する疾患、またはタンパク質の過剰発現による治療に従う疾患に対する短期または長期の治療法をもたらす。
【０２３６】
[00228]  米国特許第６，１８７，３０５号では、脊椎動物起源の細胞（特に、哺乳動物起源の細胞）における遺伝子標的化方法またはＤＮＡ標的化方法が提供される。簡単に記載すると、ＤＮＡが、ＤＮＡの相同的組換えまたは標的化を介して脊椎動物起源の初代細胞または二次細胞に導入され、これにより、ＤＮＡが、事前に選択された部位において初代細胞または二次細胞のゲノムＤＮＡに導入される。
【０２３７】
[00229]  米国特許第６，１４０，１１１号（２０００年１０月３１日発行）には、レトロウイルス遺伝子治療ベクターが記載される。開示されたレトロウイルスベクターは、目的とする遺伝子に対する挿入部位を含み、そして広範囲の様々なトランスフェクションされた細胞タイプにおいて、目的とする遺伝子に由来するタンパク質を高レベルに発現させることができる。選択マーカーを有しないレトロウイルスベクターもまた開示され、したがって、このことは、このようなレトロウイルスベクターを、抗生物質などのマーカー産物の同時発現を伴わない様々な疾患状態の治療におけるヒトの遺伝子治療のために適切にする。これらのレトロウイルスベクターは、ある種のパッケージング細胞株における使用に対して特に適している。哺乳動物細胞のゲノムに挿入するレトロウイルスベクターの能力により、レトロウイルスベクターは、ヒトおよび動物における遺伝的疾患の遺伝子治療において使用される特に有望な候補になっている。遺伝子治療では、典型的には、（１）インビボで患者の細胞に新しい遺伝物質を加えること、または（２）患者の細胞を身体から取り出し、新しい遺伝物質をその細胞に加えて、その細胞を体内に再導入すること（すなわち、インビトロ遺伝子治療）が伴う。レトロウイルスベクターを使用して様々な細胞において遺伝子治療を行なう方法に関する議論を、例えば、米国特許第４，８６８，１１６号（１９８９年９月１９日発行）および同第４，９８０，２８６号（１９９０年１２月２５日発行）（上皮細胞）、国際公開公報第８９／０７１３６号（１９８９年８月１０日公開）（肝細胞）、欧州特許第３７８，５７６号（１９９０年７月２５日公開）（繊維芽細胞）、ならびに国際公開公報第８９／０５３４５号（１９８９年６月１５日公開）および同第９０／０６９９７号（１９９０年６月２８日公開）（内皮細胞）において見出すことができる（それらの開示を参照として本明細書中に組み入れる）。
【０２３８】
毒素に対する抗体可変領域を含有するトランスボディー
[00230]  本発明は、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンと、毒素に対する抗体可変領域とを含むトランスボディーを提供する。本明細書中で使用される用語「毒素」は、生物学的起源の毒性物質を示す。所望される毒素抗体の１つ以上の抗体可変領域と、トランスフェリンとを含むトランスボディーは、先に論じたようにして得ることができる。毒素に対する抗体可変領域を含むトランスボディーは、毒素に関連する疾患に罹患している患者を治療するために使用することができる。毒素に対する抗体可変領域と、トランスフェリン分子または改変されたトランスフェリン分子とを含むトランスボディーはまた、診断目的のために使用することができる。
【０２３９】
[00231]  毒素は様々な微生物および植物によって産生される。このような微生物の例には、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ブドウ球菌属細菌、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、赤痢菌属細菌、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｗｅｌｃｈｉｉ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、大腸菌および炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの微生物および植物により産生される毒素の例には、シュードモナスの外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、リシン毒素、アブリン毒素、炭疽毒素、志賀毒素、ボツリヌス毒素、破傷風毒素、コレラ毒素、マイトトキシン、パリトキシン、シガトキシン、テクスチロトキシン、バトラコトキシン、αコノトキシン、タイポキシン、テトロドトキシン、αチツストキシン、サキシトキシン、アノトキシン、ミクロシスチン、アコニチン、エクスホリアチン毒素Ａ、エクスホリアチン毒素Ｂ、エンテロトキシン、毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、ペスト菌毒素およびガス壊疽毒素などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
[00232]  毒素は、様々なグループに、例えば、ＡＤＰリボシル化毒素、エクスホリアチン毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンおよびメタロプロテアーゼなどに類別することができるが、これらには限定されない。ＡＤＰリボシル化毒素の例には、シュードモナス毒素Ａ、ジフテリア毒素、破傷風毒素およびコレラ毒素が含まれる。
【０２４１】
[00233]  エクスホリアチン毒素Ａ、エクスホリアチン毒素Ｂ、ブドウ球菌エンテロトキシンならびに毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）は、微生物スーパー抗原の増大しつつあるファミリーに属し、これらは、形成された毒素の量、宿主の免疫状態、および循環に対する毒素の進入に依存して局所的または全身的な作用を媒介するサイトカインの産生をもたらすＴ細胞および単球／マクロファージを活性化する。エクスホリアチン毒素はブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群および水疱症の皮膚科学的症状発現を媒介する。これらの毒素により皮膚の上皮内裂開が表皮顆粒層において引き起こされ、水疱形成および表皮剥脱がもたらされる。７種の異なるエンテロトキシン（Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、ＤおよびＥ）が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる食中毒に関係している。これらの毒素は、中枢神経系に対する直接的な作用によって、腸の蠕動を高め、そして嘔吐を誘導するようである。毒性ショック症候群（ＴＳＳ）は、最も一般的には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの臨床単離体の５パーセント〜２５パーセントに存在するＴＳＳＴ−１によって媒介される。ＴＳＳはまた、より低い頻度ではあるが、エンテロトキシンＢによって媒介され、また、希ではあるが、エンテロトキシンＣ１によって媒介される。
【０２４２】
[00234]  メタロプロテアーゼの例には、クロストリジウム属の種（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍおよびＣ．ｔｅｔａｎｉ）および炭疽菌に由来する生物学的毒素が含まれる（Ｈｅｒｒｅｒｏｓら、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ、Ｊ．Ｅ．ＡｌｏｕｆおよびＪ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ編、第２版、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；２０２頁〜２２８頁）。これらの細菌は、真核生物細胞に進入し、別個の標的タンパク質を特異的に切断する亜鉛メタロプロテアーゼを発現および分泌する。
【０２４３】
[00235]  クロストリジウムは、グラム陽性の、嫌気性の胞子形成桿菌から構成される。これらの生物の天然の生息地は、環境、ならびに、ヒトおよび他の動物の腸管である。実際、クロストリジウムは至る所に存在する；クロストリジウムは、一般には、土壌、塵、下水、海洋沈降物、腐敗中の植物、および泥に見出される（例えば、Ｓｎｅａｔｈら、「クロストリジウム」、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（ＲＴＭ）  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第２巻、１１４１頁〜１２００頁、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ［１９８６］を参照されたい）。クロストリジウムを構成する約１００種が同定されているにもかかわらず、ほんの少数だけが、医学的および獣医学的に重要な病因因子として認識されている。それにもかかわらず、これらの種は、ボツリヌス中毒、破傷風、嫌気性蜂巣炎、ガス壊疽、菌血症、偽膜性大腸炎およびクロストリジウム胃腸炎を含む非常に重症な疾患に関連している。表２には、医学的および獣医学的に重要な種の一部、ならびに、それらが関連する疾患が列挙される。
【０２４４】
[00236]  表５に示されるように、これらの生物の大部分が重症および／または衰弱性の疾患に関連し得る。ほとんどの場合、これらの生物の病原性は、強力なエキソトキシンまたは非常に破壊的な酵素の放出に関係づけられる。実際、クロストリジウム属のいくつかの種が、医学的および獣医学的に非常に重要な毒素および他の酵素を産生している（Ｃ．Ｌ．Ｈａｔｈｅｗａｙ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、３：６６〜９８（１９９０））。
【０２４５】
【表５−１】
2006506053.tif 000014
【０２４６】
【表５−２】
2006506053.tif 000015
【０２４７】
[00237]  ヒト医療および動物医療に対するそれらの重要性のために、多くの研究が、これらの毒素に関して、特に、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉおよびＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素に関して行われている。
【０２４８】
[00238]  クロストリジウム神経毒は、神経細胞におけるカルシウム依存性神経伝達物質の分泌の強力な阻害剤である。クロストリジウム神経毒は、現在、神経伝達物質分泌の小胞結合（ｄｏｃｋｉｎｇ）事象および膜融合事象にとって重要である、３種の小胞膜会合タンパク質またはシナプス前膜会合タンパク質の少なくとも１つ（ＶＡＭＰ、シンタキシンまたはＳＮＡＰ−２５）の特異的なエンドプロテオリティク（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）切断を介してこの活性を媒介すると考えられている。破傷風神経毒およびボツリヌス神経毒の神経細胞標的化は、毒素が内在化され、続いて、そのエンドペプチダーゼ活性を発揮する適切な細胞内区画に輸送される受容体媒介事象であると考えられている。
【０２４９】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素
[00239]  嫌気性グラム陽性細菌のボツリヌス菌は、ヒト致死量がナノグラム範囲にある既知の最も有毒な生物学的神経毒を産生する。毒素の作用は、大腸の破壊を生じさせ得る下痢性の疾患から、死を生じさせ得る麻痺性の作用にまで及ぶ。ボツリヌス菌の胞子は土壌中に見出されており、また、多くのボツリヌス中毒事例の原因である、自家製缶詰の不適切に滅菌および密封された食品容器において増殖し得る。ボツリヌス中毒の症状は、典型的には、ボツリヌス菌の培養物または胞子が感染した食物を食べた後１８時間〜３６時間で現れる。ボツリヌス毒素は、明らかに、腸の内張層を弱毒化されずに通過し、末梢運動神経細胞を攻撃し得る。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、燕下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死にまで進行し得る。
【０２５０】
[00240]  ボツリヌス中毒疾患は、毒素の血流内への移入方法に基づいて４つのタイプに類別することができる。食品媒介のボツリヌス中毒が、ボツリヌス毒素を含有する不適切に保存され、不十分に加熱された食品を摂取することから生じている（すなわち、毒素が摂取前に既に形成されている）。創傷により誘導されるボツリヌス中毒が、ボツリヌス菌が外傷を受けた組織に侵入し、血流に吸収される毒素を産生することから生じている。１９５０年以降、３０例の創傷ボツリヌス中毒が報告されている（Ｓｗａｒｔｚ、「嫌気性の胞子形成桿菌：クロストリジウム属細菌」、６３３頁〜６４６頁［Ｄａｖｉｓら（編）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第４版）、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．（１９９０）］）。吸入ボツリヌス中毒が、毒素を吸入したときに生じている。吸入ボツリヌス中毒が、実験室での事故による暴露の結果として報告されており（Ｈｏｌｚｅｒ、Ｍｅｄ．Ｋｌｉｎ．、４１：１７３５［１９６２］）、これは、毒素が細菌戦争の作用因として使用された場合には潜在的に危険である（Ｆｒａｎｚら、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ａｎｄ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ、ＤａｓＧｕｐｔａ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９３］、４７３頁〜４７６頁）。感染性の幼児ボツリヌス中毒が、ボツリヌス菌が幼児の腸に定着し、毒素の産生および血流内へのその吸収が生じることから生じている。
【０２５１】
[00241]  ボツリヌス菌の異なる菌株がそれぞれ、Ａ〜Ｇの文字によって示される抗原的に異なる毒素を産生する。血清型Ａの毒素が食品ボツリヌス中毒事例の２６％に関係している；Ｂ型、Ｅ型およびＦ型もまた、食品ボツリヌス中毒事例のより小さい割合に関係している（Ｓｕｇｉｙａｍａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、４４：４１９（１９８０））。創傷ボツリヌス中毒は、報告によれば、Ａ型毒素またはＢ型毒素だけによって引き起こされている（Ｓｕｇｉｙａｍａ、上掲）。幼児ボツリヌス中毒のほぼすべての事例が、Ａ型毒素またはＢ型毒素のいずれかを産生する細菌によって引き起こされている（例外的に、１つのニューメキシコ事例が、Ｆ型毒素を産生するボツリヌス菌によって引き起こされ、別の１例が、Ｂ型Ｆ型のハイブリッドを産生するボツリヌス菌によって引き起こされた）（Ａｒｎｏｎ、Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｒｅｖ．、３：４５（１９８１））。Ｃ型毒素は、水鳥、ウシ、ウマおよびミンクを冒す。Ｄ型毒素はウシを冒し、Ｅ型毒素はヒトおよび鳥類の両方を冒す。
【０２５２】
[00242]  ボツリヌス菌毒素に対する様々な抗毒素が使用されている。ウマ血清から得られる三価抗毒素が、Ａ型、Ｂ型およびＥ型の毒素型に対する治療用に、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．から市販されている。抗体分子のＦ（ａｂ’）２部分のみを使用する七価のウマのボツリヌス抗毒素が米国陸軍によって試験された（Ｂａｌａｄｙ、ＵＳＡＭＲＤＣ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、６頁（１９９１））。これは、このような大型動物において不純物含有トキソイドに対して惹起されたが、高力価の製剤ではない。五価のヒト抗毒素が、幼児ボツリヌス中毒に対する治療としての使用のために、免疫化されたヒト被験者から集められている。毒素製剤を用いた被験者の免疫化が、ボツリヌス毒素に対する免疫性を誘導させるための試みにおいて行われている。化学的に不活性化された（すなわち、ホルムアルデヒド処理された）Ａ型毒素、Ｂ型毒素、Ｃ型毒素、Ｄ型毒素およびＥ型毒素を含むボツリヌス菌ワクチンが、ヒトでの使用のために市販されている。しかしながら、これらの抗毒素は、ボツリヌス中毒疾患の治療については安全でもなく、また、効果的でもない。
【０２５３】
破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）毒素
[00243]  破傷風は古代から認識されている（例えば、この疾患がヒポクラテスによって記述されている）が、１８６７年までは、その原因として感染性因子を有することは仮定されていなかった（例えば、Ｈａｔｈｅｗａｙ、上掲、７５頁を参照されたい）。破傷風菌により引き起こされるこの厳しい毒素産生性疾患は、重大であるとは考えられない刺創と関連していることが多い。この生物は、土壌および多くの動物種（例えば、ヒト、ウマなど）の腸内容物を含む様々なものから容易に単離される。
【０２５４】
[00244]  疾患が、外傷部位において生物により毒素が産生されたときに生じる。毒素は神経組織に素早く結合し、破傷風に特徴的な麻痺および痙攣を生じさせる。主として、効果的なトキソイドが利用できるために、破傷風は、現在では主として、ヒトを含めて、免疫化されていない動物の疾患である。例えば、臍帯断端の汚染による新生児破傷風が、世界の一部の地域では非常に蔓延している。新生児破傷風は大抵常に重症であり、非常に致死性が高い。世界中で報告された症例の約半数が新生児破傷風である。
【０２５５】
[00245]  破傷風は、強力な神経毒（テタノスパスミン）の作用から生じる極めて劇的な疾患である。この毒素は中枢神経系においてガングリオシドに結合し、運動神経細胞に対する抑制インパルスを遮断し、屈筋および伸筋の両方の長期にわたる筋肉痙攣を生じさせる。破傷風菌はまた、「テタノリシン」、ストレプトリシンＯに機能的および血清学的に関係づけられる酸素感受性溶血、および、少なくとも６種のクロストリジウム属種を含む様々な他の生物の酸素感受性溶血をもたらす（例えば、Ｈａｔｈｅｗａｙ、７６頁を参照されたい）。この毒素は、赤血球、多形核白血球、マクロファージ、繊維芽細胞、腹水腫瘍細胞、ＨｅＬａ細胞および血小板を含む様々な細胞を溶解する。この毒素は、コレステロールおよび関連したステロールに対する親和性を有する。実験的研究では、この毒素が、マウスにおいて肺水腫および死を引き起こし、ウサギおよびサルにおいて血管内溶血を引き起こし、サルにおいて心臓毒性作用を引き起こすことが示されているが、破傷風菌感染におけるその役割は依然として謎である（例えば、Ｈａｔｈｅｗａｙ、７７頁を参照されたい）。
【０２５６】
[00246]  破傷風の診断は、進行した場合には比較的容易であるが、治療の成功は、致死量の毒素が神経組織に固定され得る前の早期診断に依存する。したがって、患者は、通常、研究室のデータを受け取らないうちに経験的に治療される。破傷風トキソイドが、疾患を防止するために予防的に使用されている。トキソイドの予防注射に応答しないことがある免疫抑制患者の場合、筋肉内投与されたヒト破傷風免疫グロブリンが使用され得る。
【０２５７】
[00247]  診断された破傷風の治療は、創傷部位から生物を除くための創傷部の創傷清拭を伴う。この創傷清拭は、患者の痙攣がベンゾジアゼピン類で抑制された後に行われる。ペニシリンまたはメトロニダゾールが、多くの場合、患者を治療するために使用される。ヒト破傷風免疫グロブリンもまた筋肉内投与される。支持治療（例えば、呼吸補助、栄養支援および静脈内流体）が、多くの場合、患者生存において極めて重要である。清浄な軽傷の場合、患者が過去１０年間に追加免疫服薬を受けていないならば、破傷風トキソイドが投与され、しかし、重傷の場合には、患者が過去５年間に追加免疫を受けていない場合、トキソイドが投与される。
【０２５８】
クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素
[00248]  Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、最も広く存在する病原性細菌であると報告されている（Ｈａｔｈｅｗａｙ、上掲、７７頁を参照されたい）。この生物は、最初はＷｅｌｃｈおよびＮｕｔｔａｌｌにより１８９２年に記載され、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓと名付けられたが、今では一般にＣ．ｗｅｌｃｈｉｉとも言われる。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、一般には、土壌サンプル、ならびにヒトおよび他の動物の腸内容物から単離される。他のクロストリジウム属種（例えば、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｒｔｉｕｍ、Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓおよびＣ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）もまたガス壊疽に関連するが、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、最も一般的に関与している種である。これらの生物は、健康な組織に導入されたときには高い病原性を有さず、しかし、組織傷害（例えば、損傷を受けた筋肉）の存在下で導入されたときにはガスの蓄積ならびに筋肉および組織の広範囲にわたる壊死によって特徴づけられる急速に進行する破壊的な感染症に関連する。活発に増殖しているとき、クロストリジウム細菌の侵襲性株が、壊死（すなわち、細胞溶解）性、溶血性および／または致死性の性質を有するエキソトキシンを産生する。また、生物によって産生されるコラゲナーゼ、プロテイナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼおよびヒアルロニダーゼなどの酵素は、組織における毒性分解産物の蓄積をもたらす。
【０２５９】
[00249]  Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、種の毒素型が基づく４種の主要な致死性毒素（α、β、εおよびι）、ならびに、生物に関連する病原性に関与し得るか、または関与しないことがある９種の微量毒素（または可溶性抗原）を産生する（Ｈａｔｈｅｗａｙ、上掲、７７頁を参照されたい）。これらの微量毒素は、δ、θ、κ、λ、μ、ν、γ、ηおよびノイラミニダーゼである。また、一部の菌株は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの食物媒介疾患の原因であるエンテロトキシンを産生する。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、産生された毒素に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥと名付けられた「毒性型」に分けることができる。例えば、毒素型Ａのほとんどの菌株はα毒素を産生するが、それ以外の主要な致死性毒素（すなわち、β、εおよびι）を産生しない；毒素型Ｂの生物は、ι毒素を除く主要な致死性毒素のすべてを産生する；毒素型Ｃの生物は、αおよびβの主要な致死性毒素を産生するが、εまたはιの毒素を産生しない；毒素型Ｄの生物は、αおよびεの主要な致死性毒素を産生するが、βまたはιの毒素を産生しない；毒素型Ｅの生物は、αおよびιの主要な致死性毒素を産生するが、βまたはεの毒素を産生しない。
【０２６０】
[00250]  α毒素はレシチナーゼ（ホスホリパーゼＣ）であり、一方、β毒素はトリプシンに不安定な壊死性毒素である；ε毒素はパーミアーゼ型のトリプシン活性化型毒素である；ι毒素は、皮膚壊死性の、二成分型の、ＡＤＰリボシル化の、トリプシン活性化型毒素である。δ毒素は溶血素である；θ毒素は、酸素に不安定な溶血素であり、細胞溶解素である；κ毒素はコラゲナーゼであり、かつゼラチナーゼである；λ毒素はプロテアーゼである；μ毒素はヒアルロニダーゼである；ν毒素はＤＮａｓｅである。γ毒素およびη毒素は十分に特徴づけられておらず、それらの存在は疑問である（Ｈａｔｈｅｗａｙ、上掲、７７頁を参照されたい）。ノイラミニダーゼはＮ−アセチルノイラミン酸グリコヒドロラーゼであり、このエンテロトキシンは腸毒性および細胞障害性である。
【０２６１】
[00251]  これらの様々な毒素が、一般には、特定の疾患に関連している。例えば、毒素型Ａの生物が、ヒトにおける筋壊死（ガス壊疽）、食物媒介の病気、および感染性下痢；子ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマ、イヌ、アルパカおよび他の動物の腸毒血症；家禽における壊死性腸炎；ウシの腸クロストリジウム症（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｓｉｓ）；非ヒト霊長類および様々な他の動物種（ヒトを含む）における急性胃拡張に関連する。毒素型Ｂの生物が、子ヒツジの赤痢、ヒツジおよびヤギの腸毒血症（特に欧州および中東において）、ならびにモルモットの腸毒血症に関連する。毒素型Ｃの生物が、ダルムブランド（Ｄａｒｍｂｒｎａｄ）（ドイツ）、およびピッグ・ベル（ｐｉｇ−ｂｅｌ）（ニューギニア）、ヒツジにおける腸毒血症、子ヒツジおよびブタの腸毒血症、ならびに家禽における壊死性腸炎に関連する。毒素型Ｄの生物が、ヒツジの腸毒血症、および子ヒツジにおける髄質様腎臓病に関連する。毒素型Ｅの生物が、子ウシの腸毒血症、子ヒツジの赤痢、モルモットの腸毒血症、およびウサギの「ι」腸毒血症に関連する。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのＡ型株は土壌サンプルから一般に単離され、また、疾患の非存在下での腸内容物からも容易に見出される一方で、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型の菌株は、明らかに土壌中には生存していない（すなわち、これらの菌株は偏性寄生性である）。
【０２６２】
[00252]  現在、汚染された創傷の治療では、嫌気性蜂巣炎を予防するために、汚染創傷部の即刻の外科的創傷清拭が伴う。ガス壊疽は、単独での抗菌剤治療としては不十分である。クロストリジウム創傷感染が明らかになると、即刻の外科的創傷清拭が必要である。嫌気性蜂巣炎の場合には、患部領域の広範囲の切開、および創傷清拭が要求され、一方、ガス壊疽では、通常、関与する筋肉の完全な摘出が要求される（すなわち、通常、手足の切断が必要である）。
【０２６３】
[00235]  高用量のペニシリンが通常の場合には投与される。しかし、ペニシリン耐性株の出現により、クリンダマイシン、クロラムフェニコールおよびメトロニダゾールの使用が生じている。しかしながら、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシンおよびクリンダマイシンに対して耐性な菌株が観測されている。４つの種（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍおよびＣ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）の毒性ろ液に対して調製された多価のウマ抗毒素が、ガス壊疽の予防および治療において使用されている。しかしながら、その効力は明らかにされておらず、これは臨床的使用のためにもはや利用されていない（Ｓｗａｒｔｚ、６４５頁、Ｄａｖｉｓら（編）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．（１９９０））。
【０２６４】
クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素
[00254]  クロストリジウム・ディフィシレは、その単離が困難であるためにその名を得た生物であり、最近では、下痢性疾患の病因因子であることが判明している（Ｓｎｅａｔｈら、１１６５頁）。クロストリジウム・ディフィシレはヒトおよび動物における偽膜性大腸炎の病因因子である。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、患部領域において偽膜を形成する、下痢単独から、炎症性細胞およびフィブリンの蓄積を伴う際だった下痢および胃腸粘膜の壊死にまで及ぶ様々な下痢性の病気に関連する。
【０２６５】
[00255]  Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの腸毒性は主に、ＡおよびＢと呼ばれる、分子量がそれぞれ約３００，０００である２種の毒素の作用によるものである。両者は強力な細胞毒であり、毒素Ａが直接的な腸細胞毒活性を有している（Ｌｙｅｒｌｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４６３３（１９９２））。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（抗菌剤関連の下痢に希に関連する生物）の毒素Ａとは異なり、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素は胞子の外殻構成成分ではなく、そのため、胞子形成時に産生されない（Ｓｗａｒｔｚ、６４４頁）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素Ａは、ウサギの回腸ループにおける出血、体液蓄積および粘膜損傷を引き起こし、腸粘膜による毒素Ｂの取り込みを増大させるようである。毒素Ｂは腸の体液蓄積を引き起こさず、しかし、組織培養細胞に対しては毒素Ａよりも１０００倍高い毒性を有し、膜損傷を引き起こす。両毒素は、アクチン解離などの類似する細胞作用を誘導するが、細胞特異性の違いが存在する。
【０２６６】
[00256]  両毒素は疾患において重要である（Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１２（ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ１８５（１９９０）；Ｌｙｅｒｌｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、４７：３４９（１９８５）；Ｒｏｌｆｅ、Ｉｎｆｅｃｙ．Ｉｍｍｕｎ．、５９：１２２３（１９９０））。毒素Ａは、刷子縁受容体に結合することによって最初に作用し、外側の粘膜層を破壊し、その後、毒素Ｂがその下の組織に進入することを可能にすると考えられている。病理発生におけるこれらの段階は、毒素Ａに対する中和抗体の産生がＣＤＡＤの予防的治療において十分であり得ることを示している。しかしながら、毒素Ｂに対する抗体は、より後期段階の大腸疾患に対する効果的な治療のための必要な更なる構成要素であり得る。実際、動物は、疾患から完全に保護されるために、毒素Ａおよび毒素Ｂの両方に対する抗体を要求することが報告されている（ＫｉｍおよびＲｏｌｆｅ、Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６９：６２（１９８７））。米国特許第５，０７１，７５９号には、クロストリジウム・ディフィシレの毒素Ａおよび毒素Ｂの両方と免疫学的に結合するモノクローナル抗体が開示されている。米国特許第６，３６５，１５８号には、クロストリジウム・ディフィシレの毒素Ｂに対する中和抗毒素を産生させるための方法が開示されている。具体的には、これらの毒素に対する抗毒素が、可溶性の組換えクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂを使用して鳥類種において作製される。この鳥類抗毒素は、治療量で経口投与可能であるように設計されており、また、任意の形態（すなわち、固形物としてまたは水溶液として）にすることができる。
【０２６７】
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素
[00257]  炭疽毒素は、炭疽菌に由来する生物兵器のよく知られている作用因である。炭疽菌は、適切に組み合わせられたときに２つの強力な毒素（まとめて炭疽毒素と呼ばれる）を形成する３つのタンパク質を産生する。保護抗原（ＰＡ、８２，６８４Ｄａ（ダルトン））および浮腫因子（ＥＦ、８９，８４０Ｄａ）が一緒になって浮腫毒素（ＥＴ）を形成し、一方で、ＰＡおよび致死因子（ＬＦ、９０，２３７Ｄａ）が一緒になって致死毒素（ＬＴ）を形成する（Ｌｅｐｐｌａ，Ｓ．Ｈ．、Ａｌｏｕｆ，Ｊ．Ｅ．およびＦｒｅｅｒ，Ｊ．Ｈ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２７７〜３０２、１９９１）。ＥＴおよびＬＴはそれぞれがＡＢ毒素モデルと一致しており、この場合、ＰＡが標的細胞結合（Ｂ）機能を提供し、ＥＦまたはＬＦがエフェクター成分または触媒作用成分（Ａ）として作用する。これらの毒素の特異な特徴は、ＬＦおよびＥＦは、明らかに真核生物細胞の細胞質ゾルに進入することができないので、ＰＡの非存在下では毒性を有しないということである。
【０２６８】
[00258]  ＰＡは多くのタイプの細胞の表面に結合することができる。ＰＡが感受性細胞の表面の特定の受容体（Ｌｅｐｐｌａ、上掲、１９９１）に結合した後、ＰＡは細胞表面のプロテアーゼ（恐らくはフリン）によって一カ所だけが切断されて、受容体／ＰＡ複合体から放出されるアミノ末端の１９ｋＤａフラグメントをもたらす（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１９１０３〜１９１０７、１９８９）。このフラグメントがＰＡから除去されることにより、受容体に結合した６３ｋＤａのカルボキシル末端フラグメント（ＰＡ６３）におけるＬＦおよびＥＦに対する高親和性の結合部位が露出する。ＰＡ６３およびＬＦまたはＥＦの複合体が細胞の中に進入し、恐らくは、酸性化されたエンドソームを通過して細胞質ゾルに到達する。
【０２６９】
[00259]  最近、致死因子（ＬＦ）の標的の２つが細胞において同定された。ＬＦは、Ｍｅｋ１タンパク質およびＭｅｋ２タンパク質（すなわち、ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路の一部であるキナーゼ）を特異的に切断するメタロプロテアーゼである。ＬＦのタンパク質分解活性は、有糸分裂促進因子により活性化されるプロテインキナーゼのキナーゼ１またはキナーゼ２（ＭＥＫ１またはＭＥＫ２）の切断によってＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路を不活性化する（Ｌｅｐｐｌａ，Ｓ．Ａ．、Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｏｘｉｎｓ（Ｊ．Ｅ．ＡｌｏｕｆおよびＪ．Ｈ．Ｆｒｅｅｒ編、第２版）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；２４３頁〜２６３頁）。
【０２７０】
[00260]  ＰＡ（毒素の、非毒性の細胞結合性成分）は、現在利用可能なヒトワクチンの必須成分である。ワクチンは通常、炭疽菌のＳｔｅｒｎｅ株（これは無毒性であるが、クラスＩＩＩの病原体として取り扱われることが依然として要求される）のバッチ培養から製造されている。ＰＡに加えて、ワクチンは、少量の炭疽毒素成分（浮腫因子および致死因子）、ならびに様々な培養由来のタンパク質を含有する。これらの因子はすべてが、一部の個体におけるワクチンの記録された反応原性の一因である。ワクチンは高価であり、４回のワクチン接種からなる６ヶ月の経過期間を必要とする。更に、現在の明白な事実により、このワクチンは、特定の菌株を用いた吸入による抗原刺激に対して効果的でないことがあることが示唆されている（Ｍ．Ｇ．Ｂｒｏｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ａｎｔｈｒａｘ、１９８９年４月１１日〜１３日、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ｍｅｄ  Ｂｕｌｌ  Ｓｕｐｐｌ、第６８号（１９９０）、９１〜９２）。
【０２７１】
[00261]  米国特許第６，２６７，９６６号では、哺乳動物において免疫応答を生じさせることができる炭疽菌保護抗原またはその変異体もしくはフラグメントを発現することができる組換え微生物で、ＰＡまたはその上記変異体もしくはフラグメントをコードする配列を含む組換え微生物が提供され、この場合、上記微生物は、（ｉ）異化抑制因子タンパク質および／またはＡｂｒＢをコードする上記微生物の遺伝子が不活性化され、かつ／または、（ｉｉ）異化抑制因子結合部位として作用し得る上記ＰＡ配列の一部の領域が不活性化され、かつ／または、（ｉｉｉ）ＡｂｒＢ結合部位として作用し得る上記ＰＡ配列の一部の領域が不活性化されている。
【０２７２】
様々な毒素に対する抗体
[00262]  米国特許第６，４４０，４０８号では、その生物に特異的な中和抗体と複合体化されている生きた生物（細菌または原生動物）を含むワクチン製剤が提供される。複合体化されている中和抗体の量は、生物が活性な免疫応答を誘導することができ、一方で同時に、病原体の有害な作用からのある程度の保護を提供することができるような量である。
【０２７３】
[00263]  細菌中和抗体または原生動物中和抗体は、細菌または原生動物および抗体が十分な時間にわたって一緒に反応させられる場合、細菌または原生動物の感染性にインビボで対抗する抗体である。細菌中和抗体または原生動物中和抗体の供給源は重要ではない。細菌中和抗体または原生動物中和抗体は、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ）および哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ）を含む任意の動物に由来し得る。細菌中和抗体または原生動物中和抗体は起源がポリクローナルまたはモノクローナルであってもよい。例えば、Ｄ．ＹｅｌｔｏｎおよびＭ．Ｓｃｈａｒｆｆ、６８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、５１０（１９８０）を参照されたい。抗体はキメラであってもよい。例えば、Ｍ．Ｗａｌｋｅｒら、２６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０３（１９８９）を参照されたい。
【０２７４】
[00264]  抗体を作製する際に使用され得る細菌には、下記の細菌が含まれるが、それらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ  ｌｉｇｎｉｅｒｅｓｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｖｉｓ、Ａｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｎｓｅｒｉｎａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｈａｕｖｏｅｉ、Ｃ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｎｏｖｙｉ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｑｕｉ、Ｃ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃ．ｒｅｎａｌｅ、Ｃｏｗｄｒｉａ  ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｉｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｉｎｓｉｄｉｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｓ、Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｈ．ｓｕｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓ  ｓａｌｍｉｎｃｏｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ、Ｐ．ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ−ｏｖｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｅｑｕｉｒｕｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｙｏｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉｄａｅ、Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓ．ｅｑｕｉ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓおよびＶｉｂｒｉｏ  ｆｅｔｕｓ（対応する疾患については、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第５版、７４６頁、表５０．２（Ｎ．ＢｏｏｔｈおよびＬ．ＭｃＤｏｎａｌｄ編、１９８２）（Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）；ならびに、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｒｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｉｓｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｏｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｅｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｉｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｍｏｏｓｅｒｉａ、Ｒ．ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒ．ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（対応する疾患については、Ｒ．Ｓｔａｎｉｅｒら、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｗｏｒｌｄ、６３７〜３８頁、表３２．３（第５版、１９８６）を参照されたい）。
【０２７５】
[00265]  米国特許第４，６８９，２９９号には、免疫化後のヒト末梢血リンパ球を非分泌体のマウス骨髄腫細胞と融合することにより、細菌毒素に対するヒトモノクローナル抗体を分泌する安定なハイブリッド細胞株を作製することが教示される。この特許は、破傷風毒素およびジフテリア毒素とインビトロでそれぞれ結合し、かつ、破傷風およびジフテリアをインビボで動物においてそれぞれ予防する、破傷風毒素およびジフテリア毒素に対する保護モノクローナル抗体を生じさせる方法を開示する。本発明の抗破傷風毒素ヒトモノクローナル抗体および抗ジフテリア毒素ヒトモノクローナル抗体は破傷風毒素およびジフテリア毒素をそれぞれ中和することができる。それらは破傷風およびジフテリアの疾患を予防することができ、したがって、毒素誘導疾患の予防および／または治療のための新しい化学療法剤である。
【０２７６】
[00266]  本発明は、ＴｆまたはｍＴｆに融合された抗毒素を含むトランスボディーを提供する。好ましくは、トランスボディーは、ＴｆまたはｍＴｆに融合されたボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）に対する抗毒素を含む。トランスボディーは、軍対応者または救急対応者だけでなく、潜在的なバイオテロ攻撃に先だって一般住民にも送達することができ、また、必要になるまで、容易に投与される形態で保存することができる。バイオテロ行為の後の集団暴露の危険性からの軍関係者および多くの市民住民の保護では、極端な環境条件のもとで安定である抗毒素が要求され、また、このような保護は、１回の投与あたり少なくとも２週間の保護を有し、低い単位コストであり、すべての血清型に対して幅広く作用することを有する（この場合、Ａ、ＢおよびＥ（可能であれば、ＣおよびＤ）が、ボツリヌス中毒の疫学に基づいて優先度が最も高い）（Ａ、ＢおよびＥは、食中毒因子としてボツリヌス中毒を引き起こす原因であり得る最も優勢な血清型である）。
【０２７７】
[00267]  本発明では、ＢｏＮＴ  Ａの重鎖に対する結合親和性を有するペプチドをファージディスプレーによって同定することができ、候補ペプチドが非グリコシル化形態のトランスフェリン（ｍＴｆ）に操作されて入れられるか、または融合される。得られるトランスボディーは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現および分泌される。その目的は、ペプチドの毒素結合特性を保持し、ｍＴｆの長い循環半減期を呈することである。それぞれのトランスボディーは、神経毒Ａ、神経毒Ｂおよび神経毒Ｅの非毒性重鎖部分に対する結合親和性について評価され得る。
【０２７８】
[00268]  本発明は、キャリアタンパク質ｍＴｆによりもたらされる高いバイオアベイラビリティ、高い生体分布、および循環での長い半減期により作用が迅速に開始される、すべての血清型に対する幅広く作用する抗ＢｏＮＴを提供する。トランスボディーは、酵母発酵（業界における最も安価な製造システムの１つ）を使用して製造することができる。酵母は、数グラム／リットルの生成物を製造する潜在的能力を有し、この場合、生成物は、大部分が水、塩および炭素源（典型的にはスクロース）からなる完全に規定された発酵培地に分泌される。トランスボディーは培地から高純度に容易に精製される。酵母細胞培養物は、ヒトに対して非病原性であると考えられ、また、哺乳動物細胞での製造システムとは異なり、ウイルス不活性化は必要なく、これにより、妥当性確認要件の削減とともに、精製プロセスが非常に簡略化され、開発時間が短縮される。トランスボディーは、毒素そのものではないので、安全に製造することができる。毒素活性を中和することに対するこの代わりの方法は、毒素が標的受容体に結合し、神経毒性を生じさせ得る前に毒素を捕捉する循環する毒素結合物質を提供する。
【０２７９】
[00269]  一実施形態において、トランスボディーは、操作された形態のｍＴｆであり、この場合、毒素の重鎖と結合するペプチド配列がｍＴｆの表面ループの中に操作されて入れられている。この様式では、多数のペプチドを、血清型Ａ〜血清型Ｇのすべてに結合することができる多価構造を作製するために挿入することができる。別の実施形態において、親和性成熟化を、ファージディスプレーにより作製されたランダムペプチド配列の特異的な結合親和性を増大させるために用いることができる。
【０２８０】
抗原性の免疫調節領域を含むトランスボディー
[00270]  本発明の一実施形態において、トランスボディーは更に、少なくとも１つの抗原性ペプチドまたは免疫調節ペプチドを含むように改変される。これらのペプチドの１つ以上をトランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンの中に取り込むことができる。１つ以上の抗原性領域を含有するトランスボディーは、それらの抗原と結合することができるだけでなく、宿主において免疫応答を誘導することもできる。これらのトランスボディーにより誘導される細胞応答および体液性応答は、標準的な抗体よりも強い。これは、ほとんどの宿主は、トランスボディーに取り込まれている抗原性決定基で既に免疫化され、それに対する記憶を有しているからである。
【０２８１】
[00271]  抗原性ペプチドは、最も少なくは６アミノ酸の鎖長、（その片側での３アミノ酸を考慮して）好ましくは１２アミノ酸の鎖長を有し、同じ抗原もしくはアレルゲンまたは異なる抗原もしくはアレルゲンの他のエピトープが存在することによって特徴づけられ得る無限に長いアミノ酸鎖またはその成分を含有することができる。このような更なるエピトープを有するこのような更なる鎖、またはこのような更なるエピトープを有しないこのような更なる鎖が存在しない場合、抗原性ペプチドは一般には、５０アミノ酸を超えるアミノ酸鎖を有しない。所望されるエピトープを含有する短い鎖が所望される場合、抗原性ペプチドは、好ましくは、４０アミノ酸を超えるアミノ酸鎖長を有さず、より具体的には、３０アミノ酸を超えるアミノ酸鎖長を有さず、より具体的には、２０アミノ酸を超えるアミノ酸鎖長を有さない。最も好ましくは、トランスボディーは１５アミノ酸〜３０アミノ酸のペプチドを有する。
【０２８２】
[00272]  好ましくは、トランスボディーには、免疫応答を誘導する抗原性ペプチドが取り込まれる。より好ましくは、抗原性領域は、ワクチンのために使用されているタンパク質から選択される抗原性領域を含めて、非常に抗原性であることが知られているペプチドである。他の実施形態において、トランスボディー上にまたはトランスボディー内に挿入されるペプチドは免疫系を調節することができる。例えば、抗体のＦｃ領域を本発明のトランスボディーに含めることができる。
【０２８３】
[00273]  ポリペプチドの免疫原性は、ポリペプチド分子上の少数の場所に限定される限られた数の免疫原性決定基に向けられた免疫応答として定義することができる（Ｃｒｕｍｐｔｏｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（Ｓｅｌａ、Ｍ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７４）；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｅ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５８、８５〜１３５（１９７２）；Ａｔａｓｓｉ，Ｍ．Ｚ．、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１２、４２３〜４３８（１９７５）を参照されたい）。ポリペプチド配列の短い線状ストレッチに対応する化学合成されたペプチドに対して調製された抗血清が、ポリペプチド全体と十分に反応することが示されている（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．ら、Ｃｅｌｌ、２８、４７７〜４８７（１９８２）；Ｂｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、２９８、３０〜３３（１９８２）；Ｄｒｅｅｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２９５、１５８〜１６０（１９８２）；Ｐｒｉｎｃｅ，Ａ．Ｍ．、Ｉｋｒａｍ，Ｈ．、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、５７９〜５８２（１９８２）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、３４０３〜３４０７（１９８１）；Ｎｅｕｒａｔｈ，Ａ．Ｒ．、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．、Ｓｔｒｉｃｋ，Ｎ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、７８７１〜７８７５（１９８２）を参照されたい）。しかしながら、様々な相互作用が、相互作用部位が本来のタンパク質の免疫原性決定基と相関しないときでさえも生じることが見出されている（Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．ら（上掲）を参照されたい）。逆に、本来のタンパク質に対して産生された抗体は、免疫原性決定基に対するものであるので、当然のこととして、これらの抗体と相互作用するペプチドは免疫原性決定基の一部を少なくとも含有しなければならない。
【０２８４】
[00274]  免疫原性決定基が正確に位置づけされている少数のタンパク質の研究から、決定基が、（連続した）単一の配列から、または、その本来の状態で存在するとき、その鎖の折り畳みによりポリペプチド鎖の直線的に離れた領域から一緒になる（不連続な）数個の配列から構成され得ることが明らかである（Ａｔａｓｓｉ，Ｍ．Ｚ．、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５、９０９〜９３６（１９７８）を参照されたい）。リゾチームの場合、数個のエレメントが１つだけのアミノ酸のみからなるので、寄与するエレメントのサイズは、１アミノ酸と、抗体組合せ部位の大きさと一致する最大数のアミノ酸（５〜６の程度であることが考えられる）との間で変化し得る（Ａｔａｓｓｉ，Ｍ．Ｚ．（上掲）を参照されたい）。
【０２８５】
[00275]  少数のタンパク質のアミノ酸配列の内部における免疫原性決定基の正確な位置決定は、下記の方法の１つ以上によって行われている：（１）特定の残基における化学修飾の前およびその後での、ポリペプチド全体またはそれから単離されたペプチドフラグメントの抗原性測定；（２）モノクローナル抗体の存在下でタンパク質を発現するウイルスを成長させることによって選択される、置換のポリペプチドアミノ酸配列内の位置を決定すること；および（３）免疫原活性が疑われる領域のアミノ酸配列と相同的なペプチドを合成し、試験すること。
【０２８６】
[00276]  米国特許第４，５５４，１０１号には、タンパク質抗原またはアレルゲンの抗原性決定基またはアレルゲン決定基を、このようなタンパク質抗原またはアレルゲンの局所的平均疎水性が最も高い地点を明らかにすることに基づいて明らかにする方法が開示されている。更に、この特許では、局所的平均疎水性が最も高い地点に対応する６つ以上のアミノ酸からなる設計された配列を含有する合成ペプチドを作製することが教示される。
【０２８７】
[00277]  米国特許第４，５５４，１０１号に記載されている方法などの当業者には既知の方法を使用して、様々なタンパク質抗原またはアレルゲンに対する抗原性ペプチドを得ることができ、かつ、トランスボディーに取り込むことができる。例えば、抗原性ペプチドを、Ｂ型肝炎表面抗原、組織適合性抗原、インフルエンザ赤血球凝集素、家禽ペストウイルス赤血球凝集素、ブタクサアレルゲンＲａ３、ブタクサアレルゲンＲａ５、ならびに下記ウイルスの抗原から得ることができる：ワクシニアウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、サイトメガロウイルス、天然痘ウイルス、ヘルペスウイルス（Ｉ型単純ヘルペスおよびＩＩ型単純ヘルペス）、および黄熱病ウイルスなど。
【０２８８】
[00278]  また、抗原性ペプチドは下記の寄生虫から得ることができる：マラリアを媒介する生物（Ｐ．Ｆａｌｃｉｐｏｒｕｍ、Ｐ．Ｏｖａｃｅなど）。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  Ｖｏｌｖｕｌｕｓ、および他の糸状虫寄生虫、Ｔｙｒｐａｎｏｓｏｍｅｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、シャガス病、アメーバ症および鉤虫など。また、抗原性ペプチドは下記の細菌から得ることができる：ハンセン病、結核、梅毒および淋病など。
【０２８９】
[00279]  更に、既知の方法を使用して、抗原性ペプチドを下記のウイルスから得ることができる：感染性エクトロメリアウイルス、牛痘ウイルス、単純ヘルペスウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ウマ鼻肺炎（ウマ流産）ウイルス、家畜の悪性カタルウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、イヌヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス（感染性単核球増加症およびバーキットリンパ腫に関連する）、マレック病ウイルス、ヒツジ肺腺腫症（Ｊａａｇｚｉｅｋｌｅ）ウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス群、ヒトパピローマウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ミンク腸炎ウイルス、アフリカ馬疫ウイルス（９つの血清型）、ブルータングウイルス（１２の血清型）、マスの感染性膵臓壊死ウイルス、家禽肉腫ウイルス（様々な系統）、トリ白血病ウイルス（内臓性）、トリ白血病ウイルス（赤芽球性）、トリ白血病ウイルス（骨髄芽球性）、大理石骨病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、ムンプスウイルス、シチメンチョウウイルス、ＣＡＮＡＤＡ／５８、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ミクソウイルス、ヒトインフルエンザウイルスなどのＡ型ウイルス（例えば、Ａｏ／ＰＲ８／３４、Ａ１／ＣＡＭ／４６およびＡ２／シンガポール／１／５７）；家禽ペストウイルス；Ｂ型ウイルス（例えば、Ｂ／Ｌｅｅ／４０）；狂犬病ウイルス；東部ウマ脳炎ウイルス；ベネズエラウマ脳炎ウイルス；西部ウマ脳炎ウイルス；黄熱病ウイルス；１型デングウイルス（タイプ６）、２型デングウイルス（タイプ５）；３型デングウイルス；４型デングウイルス；日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス；跳躍病ウイルス；マレー峡谷脳炎ウイルス；オムスク出血熱ウイルス（１型および１１型）；セントルイス脳炎ウイルス；ヒトライノウイルス、口蹄疫ウイルス；１型ポリオウイルス；エンテロウイルスポリオ２；エンテロウイルスポリオ３；トリ感染性気管支炎ウイルス；ヒト呼吸器ウイルス；ブタの伝染性胃腸炎ウイルス；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサウイルス；マチュボウイルス；ピチンデウイルス；タカリベウイルス；パピローマウイルス。
【０２９０】
[00280]  一態様において、本発明のトランスボディーは、ワクチンのために既に使用されているタンパク質（例えば、ポリオおよび風疹に由来するタンパク質など）から選択される抗原性ペプチドを含む。別の態様において、本発明のトランスボディーは、ワクチン接種のために適切であることが既知の抗原性ペプチドを含む。
【０２９１】
[00281]  米国特許第４，６９４，０７１号および同第４，８５７，６３４号には、エンテロウイルスにより引き起こされる疾患に対するワクチン接種のために適切な様々な合成ペプチドが記載されている。これらのペプチドは、３型ポリオウイルスのＳａｂｉｎ株に対する構造的カプシドタンパク質ＶＰ１に由来する。
【０２９２】
[00282]  米国特許第４，７０８，８７１号には、口蹄疫ウイルスのＶＰ１タンパク質の抗原性を示す合成ペプチドで、ペプチドの少なくとも一部が、ＶＰ１タンパク質の５つ、６つまたは７つのアミノ酸の抗原活性な配列からなる群から選択されることによって特徴づけられる合成ペプチドが開示されている。
【０２９３】
[00283]  米国特許第４，７６９．２３７号では、動物宿主をピコルナウイルスから保護する抗体を作製するために有用な合成ペプチドが提供される。具体的には、この特許は、ピコルナウイルスの抗原性カプシドタンパク質（例えば、口蹄疫ウイルスおよび灰白髄炎ウイルスのＶＰカプシドなど）の特定の領域に対応する約２０アミノ酸残基の配列を含有する抗原性ペプチドを教示する。
【０２９４】
[00284]  米国特許第４，４７４，７５７号では、様々なインフルエンザ株に対するワクチンを作製するための合成ペプチドが教示される。抗原性フラグメントは、いくつかのインフルエンザ株の特異的な決定基に由来し、いくつかのインフルエンザ株の赤血球凝集素に存在する。
【０２９５】
[00285]  米国特許第５，４２７，７９２号には、風疹ウイルスのＥ１糖タンパク質およびＥ２糖タンパク質の線状ペプチドおよび環状ペプチドが開示されている。米国特許第５，１６４，４８１号には、風疹ウイルスのＥ１タンパク質およびＣタンパク質の線状ペプチドおよび環状ペプチドが開示されている。これらのペプチドもまた、風疹ウイルス感染に対するワクチンを製造するために有用である。米国特許第６，１８０，７５８号および同第６，０３７，４４号には、風疹ウイルス（ＲＶ）の構造タンパク質（特に、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質またはＣタンパク質）の少なくとも１つの抗原性決定基に対応するアミノ酸配列を有する、風疹に対するワクチンにおいて使用される合成ペプチドが開示されている。
【０２９６】
[00286]  米国特許第５，８６６，６９４号では、遺伝子的に多様なＨＩＶ−１単離体を中和する抗体を誘導する様々なペプチドが提供される。これらのペプチドは、長さが６アミノ酸であり、ｇｐ１６０に由来する。
【０２９７】
[00287]  米国特許第４，７７７，２３９号には、特定の所望されるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）について特異的な抗体を惹起させることができる１７の合成ペプチドが開示されている。これらのペプチドは、選択されたオープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質またはペプチドから、予測された二次構造および疎水性に基づいて選択される。二次構造および疎水性は、Ｈｏｐｐ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）（１９８１）、７８：３８２４；Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９７６）、１０４：５９；Ｃｈｏｕ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７４）、１３：２１１によって開示されている方法にしたがって、これらのタンパク質のアミノ酸配列から推定される。これらの推定の結果から、完全なタンパク質との反応性を有する抗体を誘発するペプチドの構築が可能になる。このような抗原性ペプチドの２つの一般的なタイプが調製される。他のＨＰＶ型との相同性がないことによりＨＰＶ−１６または他のＨＰＶ型に特異的な決定基に対して特異的であるとして同定されたペプチド領域は、ＨＰＶ−１６または他のウイルス型それ自体に対する診断目的、保護目的および治療目的のための抗体を惹起させるために有用であるペプチドをもたらす。目的とする様々なタイプのＨＰＶの間で相同的であるペプチド領域は、広範囲のスペクトルを有する診断剤およびワクチンとして有用であり、また、広範囲のスペクトルを有する診断剤である抗体を誘発させる。
【０２９８】
[00288]  米国特許第６，４１０，７２０号には、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）を含むマイコバクテリウムの感染症を治療するために有用であるマイコバクテリウム・バカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）由来のペプチド抗原が開示されている。可溶性抗原により、免疫応答が、マイコバクテリウムに以前にさらされた患者において誘導される。
【０２９９】
[00289]  米国特許第６，４８８，９３１号では、卵巣ガン腫タンパク質、および、卵巣ガン腫タンパク質特異的抗血清と反応する変異体の能力が実質的に損なわれていないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において異なるそのペプチド変異体の免疫原性部分を含有するポリペプチドを含むワクチンが提供される。
【０３００】
[00290]  米国特許第６，４８９，１０１号には、乳ガンを治療および予防するために有用なワクチンを作製するために免疫原性である、乳ガンタンパク質またはその変異体の少なくとも一部を含むポリペプチドが開示されている。
【０３０１】
[00291]  米国特許第６，４４７，７７８号では、細胞障害性リンパ球の産生および増殖を刺激することにより細胞媒介免疫応答を誘導するワクチンを作製するためのペプチドコンジュゲート体が教示される。ペプチドコンジュゲート体は、ＨＩＶのｇｐ１２０主要中和ドメイン（ＰＮＤ）、ｇｐ４１、およびＨＩＶのＮｅｆ（ｐ２７）に類似するアミノ酸配列と、免疫原性を高めるキャリアとを含む。
【０３０２】
[00292]  米国特許第６，４１９，９３１号では、哺乳動物において目的とする抗原に対する細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導するためのペプチドが提供される。典型的には、ＣＴＬ誘導ペプチドは７残基〜１５残基であり、より通常的には、９残基〜１１残基である。本発明の組成物および方法において有用であるＣＴＬ誘導ペプチドは、当然のことではあるが、目的とする標的化された抗原に依存して、様々な供給源から選択することができる。ＣＴＬ誘導ペプチドは、典型的には、目的とする疾患に対する効果的なＣＴＬ応答に関連する標的抗原の選択されたエピトープ領域に由来する小さいペプチドである。
【０３０３】
[00293]  米国特許第６，４１９，９３１号はまた、ＣＴＬ誘導ペプチドと、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答を誘発することができるペプチドとを含む組成物に関する。ＨＴＬ誘導エピトープは、ＣＴＬ誘導ペプチドにより標的化される抗原に実質的に対応するペプチドによって提供され得るか、または、より広く認識される抗原に対するペプチドであり、特定の組織適合性抗原制限について特異的でない。そのＭＨＣクラスＩＩ表現型にもかかわらず、ほとんどの個体によって認識される（「無差別的な」）ペプチドは特に好都合であり得る。ＨＴＬペプチドは、典型的には、６アミノ酸〜３０アミノ酸を含み、ＨＴＬ誘導エピトープを含有する。
【０３０４】
[00294]  ＣＴＬ応答は、広範囲の様々なウイルスに対する、ほとんどの哺乳動物の免疫応答の重要な構成要素の１つである。米国特許第６，４１９，９３１号では、ウイルス感染細胞に対するＣＴＬ応答を効果的に刺激し、宿主哺乳動物におけるこのような感染を治療または予防するための手段が提供される。例えば、この特許の組成物および方法は、タンパク質抗原および／またはペプチド抗原を提示する任意のウイルスに対して適用可能である。このようなウイルスには、下記のウイルスが含まれるが、それらに限定されない：病原性ウイルス、例えば、Ａ型およびＢ型のインフルエンザウイルス（ＦＬＵ−Ａ、ＦＬＵ−Ｂ）、Ｉ型およびＩＩ型のヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩ）、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）、Ｉ型およびＩＩ型のヒトＴリンパ親和性ウイルス（またはＴ細胞白血病ウイルス）（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ）、１型〜１８型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ−１〜ＨＰＶ−１８）、風疹ウイルス（ＲＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＶ）など。また、この特許は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、狂犬病ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルスおよび麻疹ウイルスのペプチド抗原に対して適用可能である。
【０３０５】
[00295]  類似する様式で、米国特許第６，４１９，９３１号の組成物および方法は、ＣＴＬエピトープに対する供給源であり得る腫瘍関連タンパク質に対して適用可能である。このような腫瘍タンパク質および／またはペプチドには、ＭＡＧＥ−１遺伝子、ＭＡＧＥ−２遺伝子およびＭＡＧＥ−３遺伝子の産物、ｃ−ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）プロトオンコジーンの産物、変異または過剰発現のいずれかを受け得る腫瘍抑制因子遺伝子および腫瘍調節遺伝子（例えば、ｐ５３、ｒａｓ、ｍｙｃおよびＲＢ１など）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＴＬ応答を腫瘍に対して標的化するための組織特異的タンパク質、例えば、前立腺ガンに対する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）および前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ならびに、骨髄腫に対するチロシナーゼなど。また、腫瘍細胞への細胞形質転換に関連するウイルス関係タンパク質（例えば、ＥＢＮＡ−１、ＨＰＶのＥ６およびＥ７など）も同様に適用可能である。上記タンパク質のいくつかに由来する非常に多数のペプチドが、ＭＨＣ結合モチーフの存在について、また、精製されたＭＨＣ分子に対して高い効率で結合するその能力について確認されている。
【０３０６】
[00296]  米国特許第６，４０７，０６３号には、疾患を治療するために免疫応答を誘発させるためのワクチンを作製するために使用され得るＭＡＧＥ−１およびＭＡＧＥ−４の特異的な抗原性ペプチドが開示されている。
【０３０７】
[00297]  米国特許第５，４６２，８７１号、同第５，５５８，９９５号、同第５，５５４，７２４号、同第５，５８５，４６１号、同第５，５９１，４３０号、同第５，５５４，５０６号、同第５，４８７，９７４号、同第５，５３０，０９６号および同第５，５１９，１１７号には、腫瘍関連の抗原性ペプチド（ＴＡＡ、これはＴＲＡＳ（腫瘍拒絶抗原）としても知られる）などの、特異的なＴ細胞応答（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかのＴ細胞）を誘発させるペプチドが開示されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ（１９９７）；Ｓｈａｗｌｅｒら（１９９７）による総説もまた参照のこと。
【０３０８】
[00298]  米国特許第６，３６８，８５２号には、ヒト胃細胞に対するＣＴＬ（細胞障害性Ｔリンパ球）をインビボまたはインビトロで誘導することができるペプチドが開示されている。より具体的には、このペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３１抗原（ヒト白血球抗原）に結合させられることによってＣＴＬをヒト細胞に提示することができる。このペプチドは、胃ガンを治療および予防するためのワクチンを製造するために使用することができる。
【０３０９】
Ｆｃ領域に由来するペプチド
[00299]  免疫グロブリン（Ｉｇ）はＢリンパ球によって産生され、血漿中に分泌される。単量体形態にあるＩｇ分子は、分子量が約１５０ｋＤａの糖タンパク質であり、おおよそＹのような形状を有する。すでに述べたように、このＹ形状は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される。重鎖は、カルボキシル末端（Ｙの基部）に存在するＦｃ部分と、アミノ末端（Ｙのアーム部）に存在するＦａｂ部分とに分けられる。糖鎖が分子のＦｃ部分に結合している。Ｉｇ分子のＦｃ部分は重鎖のみから構成される。ＩｇＧおよびＩｇＭのＦｃ部分は、マクロファージなどの免疫調節細胞の表面の受容体に結合し、免疫応答を調節するサイトカインの放出を刺激することができる。Ｆｃ部分は、個々のクラスに特有の決定基だけでなく、すべてのＩｇに共通するタンパク質配列を含有する。これらの領域は、同じクラス内の異なるＩｇ分子の間で大きく変化しないので、定常領域と呼ばれる。Ｆｃフラグメントの定常領域は、分子の様々な生物学的性質、例えば、受容体への結合および補体の活性化をもたらす。
【０３１０】
[00300]  Ｆｃ受容体は、Ｆｃ領域内の活性部位の結合によって活性化される。したがって、Ｆｃ受容体は、抗体と免疫系の残り部分との間の重要な連結である。したがって、抗体のＦｃ領域の活性部位に対するＦｃ受容体の結合は、抗体機能が媒介される「最後の共通する経路」として特徴づけることができる。抗原と結合した抗体がＦｃ受容体に結合しないならば、抗体は、免疫系のそれ以外の部分を活性化することができず、したがって、機能的に不活性にされる。
【０３１１】
[00301]  免疫グロブリンＦｃ受容体に結合する能力を有するペプチドはどれも、受容体に対する結合を調節するペプチドの能力によって免疫調節因子としての治療的有用性を有する。このようなＦｃ受容体「遮断剤」はＦｃ受容体の免疫グロブリン結合部位を占め、したがって、免疫グロブリン活性化能を「短絡」させる。
【０３１２】
[00302]  本発明は、免疫応答を調節するために、免疫グロブリンのＦｃ領域に由来するペプチドを含むトランスボディーを提供する。本発明では、免疫応答を調節することに関連する治療目的および診断目的の両方のために、このようなトランスボディーの使用が意図される。トランスボディーに挿入されたペプチドは、Ｆｃ受容体に結合することによって免疫応答を刺激することができ、または、Ｆｃ受容体に対する結合を阻止することによって免疫応答を阻害することができる。
【０３１３】
[00303]  米国特許第４，８１６，４４９号には、自己免疫疾患、アレルギー、および、哺乳動物免疫系により媒介される状態などの他の炎症状態に関連する炎症応答を減少させることができる新しい有用なペプチドの配列が開示されている。特に、特許請求の範囲に記載されるペンタペプチドは、アラキドン酸／ロイコトリエン−プロスグランジン経路により媒介される炎症を阻止することにおいて有用である。したがって、このようなペプチドは、ステロイド類（その多くが有害な副作用または毒性の副作用を示す）などの既知の抗炎症剤の代わりに効果的に使用することができる。これらのペプチドはヒトＩｇＥのＣε３のアミノ酸３２０〜３２４部分（この部分はＩｇＥのＦｃ受容体結合に関連すると考えられる）に対する構造的類似性を有するが、抗炎症活性の本発明の機構は、驚くべきことに、Ｆｃ受容体結合を阻止することを必ずしも伴わないと考えられる。むしろ、本発明のペプチドは、アラキドン酸媒介の炎症経路において直接的に相互作用し、それによりこのような炎症を軽減させることが示されている。しかしながら、本発明のペプチドとＩｇＥ分子との間での形態学的類似性は、特許請求の範囲に記載されるペプチドを、例えば、Ｆｃ受容体部位遮断剤として作用することによるように免疫系媒介の応答を調節することにおいて有用にし得ると考えられる。特許請求の範囲に記載されるペプチドは、下記のように定義されるアミノ酸配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ（配列番号５）を有する：
【０３１４】
[00304]  ＡはＡｓｐまたはＧｌｕであり；
【０３１５】
[00305]  Ｂは、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙまたはサルコシンであり；
【０３１６】
[00306]  Ｃは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり；
【０３１７】
[00307]  Ｄは、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；かつ
【０３１８】
[00308]  Ｅは、Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＯｒｎである。
【０３１９】
[00309]  米国特許第４，７５３，９２７号には、ヒト多形核好中球（ＰＭＮ）上のＩｇＧ  Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ免疫複合体の結合、単球およびマクロファージ（ＭＭ）および他の白血球上のＩｇＧ  Ｆｃ受容体およびＩｇＥ  Ｆｃ受容体に対するＩｇＧ免疫複合体およびＩｇＥ免疫複合体の結合を阻止することができる新しい有用なペプチドの配列が記載されている。この特許は、免疫グロブリンＦｃ受容体に対する免疫複合体の結合を阻止することによって哺乳動物における免疫応答を調節する方法で、アミノ酸配列−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（配列番号６）から選択される部分を含むペプチドを投与することを含む方法を提供する。この特許はまた、免疫複合体により媒介される炎症および組織破壊を低下させるためにヒトアレルギー反応を減少させるためのこのようなペプチドの使用を教示する。
【０３２０】
[00310]  活性部位ペプチドが結合するＦｃ受容体の特定タイプに依存して、ペプチドは免疫機能の刺激または阻害のいずれかをもたらし得る。Ｆｃ受容体が、Ｆｃ領域に結合するという作用によって活性化されるタイプである場合に、あるいは、Ｆｃ活性部位ペプチドが受容体を刺激する場合に、刺激は生じ得る。もたらされる刺激のタイプには、抗体Ｆｃ領域−Ｆｃ受容体の結合によって直接的または間接的に媒介される様々な機能が含まれ得るが、それらに限定されない。このような機能の例には、白血球の特定クラス（多形核好中球、単球およびマクロファージ）による食作用の刺激；マクロファージ活性化、抗体依存性細胞性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の成長および発達、ならびに、リンパ球によるリンホカイン（殺傷活性または免疫調節活性を有する分子）の分泌が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２１】
[00311]  本発明では、Ｆｃ受容体と相互作用し、上述された機能を含む免疫系機能を刺激するペプチドを含むトランスボディーの使用が意図される。このようなトランスボディーは、細菌、ウイルスまたは菌類により引き起こされる感染性疾患などの疾患、免疫系が先天的状態または後天的状態のいずれかにより不完全である状態、ヒトまたは動物のガンおよび多くの他の苦痛を治療することにおいて治療的に有用である。このような免疫刺激はまた、ワクチンとして投与されるいくつかの注射された物質または経口投与された物質に対する身体の保護的な細胞応答および抗体応答を高めるために有用である。この列挙は、免疫刺激が、明らかにされた治療的有用性を有する疾患または状態の代表的な例を単に示しているにすぎない。
【０３２２】
[00312]  活性部位ペプチドが、Ｆｃ領域に結合するという単なる作用によって活性化されない特定のＦｃ受容体に結合する場合に、免疫系機能の阻害は生じ得る。このようなＦｃ受容体は、通常、抗原−抗体凝集物または免疫複合体におけるいくつかのＦｃ領域がいくつかのＦｃ受容体に同時に結合し、それらを「架橋」させたときにだけ「活性化」される。いくつかのＦｃ領域によるこのようなＦｃ受容体架橋は、特定タイプのＦｃ受容体を活性化するために要求される重要なシグナルであるようである。このようなＦｃ受容体と結合し、それを阻止することにより、活性部位ペプチドは、免疫複合体または抗原−抗体凝集物におけるＦｃ領域が受容体に結合することを妨げ、したがって、Ｆｃ受容体の活性化を阻止する。
【０３２３】
[00313]  本発明では、Ｆｃ受容体と相互作用して、免疫系機能を刺激するペプチドを含むトランスボディーの使用が意図される。このようなトランスボディーは、アレルギー、自己免疫疾患（関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスを含む）、特定タイプの腎臓疾患、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎および局所的腸炎（クローン病）など）、特定タイプの炎症性肺疾患（例えば、特発性肺線維症および過敏性肺炎など）、特定タイプの脱髄性神経学的疾患（例えば、多発性硬化症など）、自己免疫性溶血性貧血、特発性（自己免疫性）血小板減少性紫斑症、特定タイプの内分泌腺疾患（例えば、グレーヴス病または橋本甲状腺炎など）、ならびに特定タイプの心臓疾患（例えば、リウマチ熱など）などの疾患を治療することにおいて治療的に有用である。免疫抑制はまた、臓器移植とともに生じるか、あるいは、ある種の白血病または再生不良性貧血を治療するために使用される骨髄細胞の移植において生じる有害な免疫「拒絶」応答を防止することにおいて治療的に有用である。この列挙は、免疫抑制が治療的に有用であることが知られている疾患または状態の代表的な例を単に示しているにすぎない。
【０３２４】
[00314]  ＪｏｈｎｓｏｎおよびＴｈａｍｅｓ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７、１４９１（１９７５））、ならびに、Ｂｏａｃｋｌｅ、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣａｕｇｈｍａｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２８２、７４２（１９７９））は、ａａ（アミノ酸）２７４〜２８１（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、配列番号７）においてヒトＩｇＧ１のＣＨ２に由来する配列を有するペプチドが、赤血球に吸着されたとき、実質的な補体活性化能を有することを見出した。具体的には、ａａ（アミノ酸）配列（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、配列番号８）を有する１つのペプチドが、Ｃ１ｑ媒介の細胞溶解を活性化することにおいて、熱凝集したＩｇＧにより形成される免疫複合体とほぼ同じくらい効果的であった。上記の研究者らは、この活性を、Ｃ１ｑ  Ｆｃ受容体に対する活性な結合部位として作用するこのペプチドの能力に起因すると考えた。他の合成ペプチドは、ＩｇＧのこの領域に由来する配列、または、ＩｇＭのＣＨ４のａａ４８７〜４９１（Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、配列番号９）に由来する配列を有した。
【０３２５】
[00315]  続いて、Ｐｒｙｓｔｏｗｓｋｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０、６３４９（１９８１））およびＬｕｋａｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２７、２５５５（１９８１））は、ａａ２８１〜２９２におけるすぐ隣接するＣＨ２領域に由来するペプチドがＣ１媒介溶血の阻害剤であることを明らかにした。具体的には、ＩｇＧと同一なペプチド、すなわち、ＣＨ２残基２８１〜２９０（Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、配列番号１０）およびａａ２８２〜２９２（Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ、配列番号１１）は、完全な単量体ＩｇＧとほぼ同じくらい活性な阻害剤であった。他のペプチド、例えば、ａａ２７５〜２９０（Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、配列番号１２）およびａａ２７５〜２７９（Ａｃ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、配列番号１３）、ａａ２８９〜２９２（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、配列番号１４）などは活性がより低かった。
【０３２６】
[00316]  タフトシンは、配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号１４）を有するテトラペプチドであり、すべてのヒトＩｇＧサブクラスの２番目の定常ドメインに存在し、モルモットＩｇＧではａａ２８９〜２９２に存在する。米国特許第３，７７８，４２６号では、タフトシンが、顆粒球、単球およびマクロファージによる食作用をインビトロで刺激することが示され、記載されている。また、タフトシンは、ＡＤＣＣ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性、マクロファージ依存性Ｔ細胞教育、ならびに、インビトロおよびインビボにおけるＴ細胞依存性抗原およびＴ細胞非依存性抗原に対する抗体合成を刺激することが示されている。ＲａｔｃｌｉｆｆｅおよびＳｔａｎｗｏｒｔｈによる研究（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、４、２１５（１９８２））では、タフトシンがヒト単球ＩｇＧ  Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧの結合を競合的に阻害するので、タフトシンがＩｇＧ  Ｆｃ受容体にまさに結合することが明らかにされる。
【０３２７】
[00317]  Ｍｏｒｇａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、５３８８（１９８２））は、リンパ球を非特異的に活性化する能力を有する、ＩｇＧのａａ３３５〜３５８と同一な２４残基ペプチドの配列を開示する。このペプチドは、ポリクローナルＢ細胞増殖、抗原特異的な抗体応答、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞媒介の溶解を誘導することが示された。このペプチド（Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、配列番号１５）、および、カルボキシ末端のメチオニンを有しない２３残基ペプチドは、恐らくは、ＩｇＧに関するリンパ球Ｆｃ受容体に結合することによって作用する。
【０３２８】
[00318]  Ｃｉｃｃｉｍａｒｒａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７２、２０８１（１９７５））は、ヒト単球ＩｇＧ  Ｆｃ受容体に対するＩｇＧの結合を阻止することができるヒトＩｇＧ由来のデカペプチドの配列を報告している。このペプチドはＩｇＧのａａ４０７〜４１６（Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、配列番号１６）と同一である。
【０３２９】
[00319]  ＲａｔｃｌｉｆｆｅおよびＳｔａｎｗｏｒｔｈ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、４、２１５（１９８２））は、ＩｇＧのａａ２９５〜３０１（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ、配列番号１７）と同一なペプチドがヒト単球ＩｇＧ  Ｆｃ受容体に対するＩｇＧの結合をわずかに阻止し得ることを示している。これに反して、ａａ２８９〜３０１におけるＩｇＧのＣＨ２残基と同一な関連ペプチドは単球ＩｇＧ阻止活性を全く有しなかった。
【０３３０】
[00320]  Ｈａｍｂｕｒｇｅｒは、ａａ３２０〜３２４（Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ、配列番号１８）におけるヒトＩｇＥのＣε３由来の配列を有するペンタペプチドが局所的皮膚アレルギー反応（プラウスニッツ・キュストナー）を約９０％阻害し得ることを記載している（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１８９、３８９（１９７５）；米国特許第４，１７１，２９９号および同第４，１６１，３２２号）。このペプチドは、その後、皮下経路による注射の後、ヒトにおける全身性アレルギー疾患を阻害することが示されている。様々な研究により、このペプチドは、ヒト好塩基球のＩｇＥ  Ｆｃ受容体に対して著しい親和性を有し、また、好塩基球ＩｇＥ  Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＥ結合を７０％まで阻止できることが明らかにされている（Ｐｌｕｍｍｅｒら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．、４２、７１３（１９８３））。ヒトにおける全身性アレルギー疾患を阻止するこのペプチドの観測された能力は、細胞ＩｇＥ  Ｆｃ受容体に結合するペプチドの能力に起因する（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ、Ａｄｖ．Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）、５９１頁〜５９３頁）。
【０３３１】
[00321]  Ｈａｍｂｕｒｇｅｒは、ａａ４７６〜４８１（Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ、配列番号１９）におけるＣε４由来のヘキサペプチドが、ヒトリンパ芽球様細胞株（ｗｉｌ−２ｗｔ）におけるＩｇＥ  Ｆｃ受容体に対するＩｇＥの結合を阻止し得ることを報告している（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３８、７８１（１９７９））。このペプチドは、以前には、ヒト好塩基球ＩｇＥ  Ｆｃ受容体に対するＩｇＥの結合を阻止することにおいて有用な因子として関係していた（米国特許第４，１６１，５２２号）。
【０３３２】
[00322]  Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９、１２４５（１９８２））は、ａａ５０５〜５１５（Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、配列番号２０）におけるヒトＩｇＥのＣε４の一部と同一な配列を有するデカペプチドがマウスマクロファージに対する１２５Ｉ−ヒトＩｇＧの結合の際だった増強を引き起こしたことを記載している。
【０３３３】
[00323]  Ｓｔａｎｗｏｒｔｈらは、ヒトＩｇＥのＣε４の一部、すなわち、ａａ４９５〜５０６（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、配列番号２１）と同一な配列を有するいくつかのペプチド、およびそのより小さい誘導体が、ヒトおよび齧歯類のマスト細胞の脱顆粒を生じさせることができ、したがって、アレルギー脱感作治療において有用であり得ることを明らかにした（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８０、６６５（１９７９）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８１、６２３（１９７９）；欧州特許公開第００００２５２号）。
【０３３４】
[00324]  Ｓａｒｍａｙら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８８、２５（１１）：１１８３〜８）は、ヒトＢリンパ球活性化サイクルの異なる段階におけるＣγ２ドメインまたはＣγ３ドメインの表面露出残基から構成される合成ペプチドの作用を示す結果をまとめている。ＣＨ２（２８９Ｔｈｒ〜３０１Ａｒｇ）ペプチドおよびＣＨ３（４０７Ｔｙｒ〜４１６Ａｒｇ）ペプチドの両方、ならびに完全なＦｃフラグメントは、ＰＷＭまたはＰＭＡ＋ＣａＩにより活性化されたリンパ球のＩｇＭ合成を増強した。この作用はＢ細胞活性化の初期段階で発揮された。分離された休止Ｂ細胞をＦｃフラグメントまたはＣＨ２ペプチドとインキュベーションすることにより、細胞体積の増大およびＨＬＡ−ＤＲ抗原の発現がもたらされた。他方で、ＬＩＦ産生がＣＨ２ペプチドおよびＣＨ３ペプチドの両方によって誘導された。Ｆｃペプチドが単球からのＩＬ−１放出を誘導することもまた示された。これらの結果から、ＣＨ２ドメインペプチドおよびＣＨ３ドメインペプチドは、休止Ｂ細胞を活性化し、休止Ｂ細胞を他の刺激に対してより感受性にすることによって部分的には直接的に、そして、そのうえ、ＩＬ−１の放出を開始させることにより体液性応答を増強することによってそれらの作用を発揮することが示唆される。
【０３３５】
[00325]  Ｓｈｅｒｉｄａｎら（Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ、１９９９、５（１２）：５５５〜６２）は、ＩｇＧのＦｃに由来する大きい分枝したジスルフィドペプチドであるＡｃ−Ｆ−Ｃ＊−Ａ−Ｋ−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｋ−Ｄ−Ｌ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｉ−Ｅ−Ｋ（Ａｃ−Ｅ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｇ−Ｐ−Ｓ−Ｖ−Ｆ）−Ｃ＊−Ｉ−ＮＨ２の固相合成を教示する。このペプチドはＩｇＧの下部側のヒンジ領域および近位側のβ−ヘアピンループ（これらはともに、ＦｃγＲＩに対する結合に関係する）を併せ持つ。環状のヒンジ−ループペプチドは、ＩＣ５０が４０μＭで、単球細胞株で発現したＦｃγＲＩからＩｇＧ２ａを追い出すことにおいて活性であり、これに対して、このペプチドの線状形態は不活性であった。このＦｃヒンジ−ループペプチドでは、ＦｃγＲＩに対する非ｍＡｂ高親和性免疫調節リガンドの潜在的可能性が明らかにされている。
【０３３６】
トランスフェリン／ＴＮＦ−ＳＣＡトランスボディーを使用する方法
[00326]  一態様において、本発明は、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）抗体の１つ以上の抗体可変領域またはＣＤＲと、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンとを含むトランスボディーを提供する。本発明では、治療目的および診断目的のためのこのようなトランスボディーの使用が意図される。ＴＮＦ−αの産生に関係づけられる重大な疾患状態の例には、敗血症ショック；エンドトキシンショック；細菌感染（例えば、結核、髄膜炎）、ウイルス感染（例えば、ＡＩＤＳ）、寄生虫感染（例えば、マラリア）および新生物疾患に関連する悪液質症候群；自己免疫疾患、これには関節炎のいくつかの形態（特に、リウマチ様形態および変性形態）が含まれる；移植片拒絶を防止するための治療に関連する有害作用が含まれるが、これらに限定されない。以下に論じるように、ＴＮＦ−αは様々な疾患状態または状況に関連する。本発明では、様々な疾患を治療および診断するための抗ＴＮＦトランスボディーの使用が意図される。
【０３３７】
ＴＮＦ−α
[00327]  ＴＮＦ−αは多面発現性の炎症性サイトカインである。身体のほとんどの器官がＴＮＦ−αによって影響を受けるようである。このサイトカインは成長刺激ならびに成長阻害の両方の性質を有する。ＴＮＦ−αはまた自己調節的性質を有するようである。例えば、ＴＮＦ−αは、好中球の増殖を炎症時に誘導し、しかし、ＴＮＦ−Ｒ５５受容体に結合したときには好中球のアポトーシスをも誘導する（Ｍｕｒｒａｙら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ、９０（７）：２７７２〜２７８３）。このサイトカインは、数タイプの細胞によって、しかし、特にはマクロファージによって産生される。病態生理学的状態におけるサイトカインの役割は完全には解明されていないが、ＴＮＦ−αは、傷害および病的状態のカスケードにおける主要な媒介因子であるようである。
【０３３８】
[00328]  多くの因子が炎症応答に寄与しているが、ＴＮＦ−αは、このプロセスの調節において主要な役割を果たしている。ＴＮＦ−αの細胞作用には、生理学的プロセス、細胞障害性プロセスおよび炎症プロセスが含まれる。恒常性において、ＴＮＦ−αは、有糸分裂誘発、分化および免疫調節に影響を及ぼし、一方で、アポトーシスによる細胞死を新生物細胞系統において生じさせる。ＴＮＦ−αによる細胞障害性は、デノボ転写および翻訳に関わりなく生じ、ユビセミキノン部位において主に生じる酸素ラジカルのミトコンドリアでの産生を伴う。
【０３３９】
[00329]  ＴＮＦ−αの生物学的作用はその濃度および産生部位に依存する。すなわち、低濃度では、ＴＮＦ−αは、所望の恒常性機能および防御機能をもたらし得るが、高濃度では、全身的または特定の組織において、ＴＮＦ−αは他のサイトカイン、特に、インターロイキン−１（ＩＬ−１）と相乗作用して、多くの炎症応答を悪化させ得る。
【０３４０】
[00330]  下記の活性は、（ＩＬ−１とともに）ＴＮＦ−αによって誘導されることが示されている；発熱、徐波睡眠、血行力学的ショック、急性期タンパク質の産生増大、アルブミンの産生低下、血管内皮細胞の活性化、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の発現増大、リポタンパク質リパーゼの低下、チトクロームＰ４５０の低下、血漿中の亜鉛および鉄の低下、繊維芽細胞の増殖、滑液細胞コラゲナーゼの増大、シクロオキシゲナーゼ活性の増大、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化、ならびに、サイトカイン（ＴＮＦ−α自身、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８）の分泌誘導。実際、様々な研究では、これらのサイトカインの生理学的作用が相互に関係していることが示されている（Ｐｈｉｌｉｐら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）、３２３（６０８３）：８６〜８９；Ｗａｌｌａｃｈ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）、１４０（９）：２９９４〜２９９９）。ＴＮＦ−αがその作用をいかにして発揮するかに関する詳細は不明であるが、その作用の多くは、細胞を刺激して、種々のプロスタグランジンおよびロイコトリエンを細胞膜のアラキドン酸から産生するＴＮＦ−αの能力に関係づけられると考えられている。
【０３４１】
[00331]  ＴＮＦ−αは、その多面発現効果の結果として、身体の多くの異なる器官における様々な病理学的状態に関係している。血管では、ＴＮＦ−αは出血性ショックを促進させ、内皮細胞のトロンボモジュリンをダウンレギュレーションし、凝固促進活性を高める。ＴＮＦ−αは、白血球および恐らくは血小板の血管壁への接着を生じさせ、その結果、血管炎だけでなく、アテローム性動脈硬化に至るプロセスを促進させ得る。
【０３４２】
[00332]  ＴＮＦ−αは血液細胞を活性化し、好中球、好酸球、単球／マクロファージ、ならびにＴリンパ球およびＢリンパ球の接着を生じさせる。ＩＬ−６およびＩＬ−８を誘導することによって、ＴＮＦ−αは炎症細胞の走化性および組織内へのその浸透を増強する。したがって、ＴＮＦ−αは、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶の組織損傷において役割を有している。
【０３４３】
[00333]  ＴＮＦ−αはまた、脂肪細胞の代謝活性を調節し、ガン、慢性感染症、慢性心不全および慢性炎症に付随する消耗および悪液質の一因となっているので、カケクチンと呼ばれている。悪液質は、ガンおよび他の疾患に関連する広範囲に及ぶ消耗である（Ｋｅｒｎら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｅｎｔｅｒ．Ｎｕｔｒ．、１２：２８６〜２９８（１９８８））。悪液質には、進行性の体重減少、食欲不振、および、悪性増殖に応答した身体の持続した浸食が含まれる。根本的な生理学的擾乱が、エネルギー消費に対する食物摂取の減少に関係づけられ得る。悪液質状態は、ガンによるほとんどの病的状態および死亡を生じさせる。ＴＮＦ−αは、ガン、感染性病理および他の代謝状態における悪液質を媒介し得る。ＴＮＦ−αはまた、食欲を阻害し、その一方で、脂肪組織の消耗を高めることによって拒食症における役割を有し得る。
【０３４４】
[00334]  ＴＮＦ−αは骨格筋および心筋に対する代謝作用を有する。ＴＮＦ−αはまた、肝臓に対する際だった作用を有する。ＴＮＦ−αはアルブミンおよびチトクロームＰ４５０の代謝を抑制し、フィブリノーゲン、１−酸性糖タンパク質および他の急性期タンパク質の産生を増大させる。ＴＮＦ−αはまた腸の壊死を生じさせ得る。
【０３４５】
[00335]  中枢神経系において、ＴＮＦ−αは血液脳関門を超え、発熱、増大した睡眠および食欲不振を誘導する。増大したＴＮＦ−α濃度が多発性硬化症に関連する。ＴＮＦ−αは更に、副腎の出血を生じさせ、ステロイドホルモンの産生に影響を及ぼし、皮膚におけるコラゲナーゼおよびＰＧＥ−２を高め、また、破骨細胞を活性化することにより骨および軟骨の破壊を生じさせる。
【０３４６】
[00336]  ＴＮＦ−αは、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）の複製をインビトロで促進および増強することが示され（Ｍａｔｓｕｙａｍａ、Ｔ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）、６３（６）：２５０４〜２５０９；Ｍｉｃｈｉｈｉｋｏ，Ｓ．ら、Ｌａｎｃｅｔ（１９８９）、１（８６４８）：１２０６〜１２０７）、また、ＨＩＶ−１遺伝子の発現を刺激し、したがって、ＨＩＶ−１潜伏感染者における臨床的ＡＩＤＳの発症を開始させることが示されている（Ｏｋａｍｏｔｏ、Ｔ．ら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８９）、５（２）：１３１〜１３８）。
【０３４７】
[00337]  ＴＮＦ−αはまた、様々な寄生虫の成長および分化の制御に関与することが示されている。宿主に感染したとき、寄生虫は、疾患の経過に影響を及ぼし得るＴＮＦなどの種々のサイトカインの分泌を誘導することができる。例えば、マラリアの場合、ＴＮＦ−αは、齧歯類マラリアでは寄生虫の生存を阻害するなど、特定の状況において保護的であり得る（Ｃｌａｒｋら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３４９３〜３４９６；Ｔａｖｅｒｎｅら、１９８７、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、６７：１〜４）。
【０３４８】
ＴＮＦ−α抗体
[00338]  ＴＮＦに結合する抗体に由来する任意のＣＤＲ領域、ＶＨ領域またはＶＬ領域を使用して、本発明のトランスボディーを作製することができる。ＴＮＦに対するポリクローナルマウス抗体がＣｅｒａｍｉら（欧州特許庁特許公開０２１２４８９、１９８７年３月４日）によって開示されている。このような抗体は、診断的免疫アッセイにおいて、また、細菌感染におけるショックの治療において有用であると言われていた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許庁特許公開０２１８８６８、１９８７年４月２２日）は、ヒトＴＮＦに対するマウスモノクローナル抗体、このような抗体を分泌するハイブリドーマ、このようなマウス抗体を製造する方法、および、ＴＮＦの免疫アッセイにおけるこのようなマウス抗体の使用を開示する。
【０３４９】
[00339]  Ｙｏｎｅら（欧州特許庁特許公開０２８８０８８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦマウス抗体（ｍＡｂを含む）、および、様々な病理（特に、川崎病および細菌感染）の免疫アッセイ診断におけるその有用性を開示する。川崎病（乳児急性熱性皮膚粘膜リンパ節症候群：Ｋａｗａｓａｋｉ、Ａｌｌｅｒｇｙ、１６：１７８（１９６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ、小児科、２６：９３５（１９８５））の患者の体液は、病理の進行に関係づけられた上昇したＴＮＦレベルを含有すると言われていた（Ｙｏｎｅら、下記参照）。
【０３５０】
[00340]  他の研究者らにより、中和活性をインビトロで有する、組換えヒトＴＮＦに対して特異的な齧歯類ｍＡｂまたはマウスｍＡｂが記載された（Ｌｉａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１３７：８４７〜８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒら、Ｈｙｄｒｉｄｏｍａ、６：３０５〜３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、６：３５９〜３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎら、Ｈｙｄｒｉｄｏｍａ、６：４８９〜５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、９６：５７〜６２（１９８７）；Ｍｏｌｌｅｒら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、２：１６２〜１６９（１９９０））。これらのｍＡｂのいくつかを使用して、ヒトＴＮＦのエピトープがマッピングされ、酵素免疫アッセイが開発され（Ｆｅｎｄｌｙら、下記参照；Ｍｏｌｌｅｒら、下記参照）、また、組換えＴＮＦの精製が助けられた（Ｂｒｉｎｇｍａｎら、下記参照）。
【０３５１】
[00341]  ＴＮＦに対する中和抗血清または中和ｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有害な生理学的変化を阻止し、また、実験的な内毒素血症および菌血症における致死的な抗原投与の後での死を防止することが示されている。この作用は、例えば、齧歯類致死性アッセイおよび霊長類病理学モデル系において明らかにされている（Ｍａｔｈｉｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１９２５〜１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８６９〜８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：６６２〜６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１７：３１１〜３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６２：４２１〜４２７（１９９０）；Ｏｐａｌら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６１：１１４８〜１１５２（１９９０）；Ｈｉｎｓｈａｗら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ、３０：２７９〜２９２（１９９０））。
【０３５２】
[00342]  ｈＴＮＦの推定される受容体結合位置がＥｃｋおよびＳｐｒａｎｇ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４（２９）、１７５９５〜１７６０５（１９８９））によって開示され、彼らは、ＴＮＦ−αの受容体結合位置を、アミノ酸１１〜１３、アミノ酸３７〜４２、アミノ酸４９〜５７およびアミノ酸１５５〜１５７からなるとして同定した。
【０３５３】
[00343]  重篤な移植片対宿主病に罹患している患者にマウスＴＮＦｍＡｂを投与することもまた報告されている（Ｈｅｒｖｅら、Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｒｅｓ．、９：５９１（１９９０））。
【０３５４】
[00344]  米国特許第５，６５６，２７２号には、ヒトＴＮＦ−αに対して特異的で、数多くのＴＮＦ−α媒介の病理および状態（例えば、クローン病など）の診断および治療のためにインビボで有用である抗ＴＮＦ抗体、そのフラグメントおよび領域が開示されている。
【０３５５】
[00345]  米国特許第６，４２０，３４６号には、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの免疫原性部分をコードし、プロモーターに機能的に連結された外因性ポリヌクレオチドを筋肉内投与することを含む、個体の関節リウマチを治療するための方法が開示されている。この場合、上記免疫原性部分の発現により、上記免疫原性部分に対する抗体の形成が誘導され、上記抗体により、上記サイトカインの内因性サイトカインのインビボ活性が低下させられ、それにより、慢性関節リウマチが治療される。
【０３５６】
[00346]  Ｍａｉｎｉらは、関節リウマチ患者を治療するためのインフリキシマブ（キメラＴＮＦ−αモノクローナル抗体）の使用を記載する（Ｌａｎｃｅｔ、３５４（９１９４）：１９３２〜９（１９９９））。
【０３５７】
トランスボディーを含有するキット
[00347]  更なる実施形態において、本発明は、例えば、治療用途または非治療用途または診断用途のために使用され得る、トランスフェリン融合タンパク質（好ましくは、免疫調節ペプチドを含むトランスボディーおよび改変されたトランスボディー）を含有するキットを提供する。キットは、ラベル付きの容器を含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、上述した用途などの治療用途または非治療用途のために有効なトランスフェリン融合タンパク質（好ましくはトランスボディー）を含む組成物を収容する。組成物における活性な薬剤は抗体である。容器上のラベルにより、組成物が特定の治療用途または非治療用途のために使用されることが示され、また、上述した指示などの、インビボまたはインビトのいずれかでの使用についての指示が示されることがある。
【０３５８】
[00348]  本発明のキットは、典型的には、上述した容器と、商業的な観点および使用者の観点から望ましい物質（例えば、緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および、使用に関する指示を伴う添付文書）を含む１つ以上の他の容器とを含む。
【０３５９】
[00349]  更なる記載を要することなく、当業者は、上述の説明および下記の例示的な実施例を使用して、本発明を行ない、かつ利用することができ、そして特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。例えば、当業者は、生物学的活性を、本発明の融合タンパク質構築物についてインビトロおよびインビボの両方で、その非融合状態での治療的成分の比較可能な活性と比較して容易に決定することができる。同様に、当業者は、本発明による構築物の血清半減期および血清安定性を容易に決定することができる。したがって、下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示しており、いかなる点においても開示の残り部分を限定するものとして解釈してはならない。
【実施例】
【０３６０】
[00350]  下記の実施例には、標的タンパク質と結合するペプチドと、トランスフェリンまたは改変されたトランスフェリン（ｍＴｆ）とを含むトランスボディーを作製するための方法が記載されている。トランスフェリンのＮ末端またはＣ末端における一本鎖抗体または抗原結合ペプチドなどの治療ペプチド（ＸまたはＹ）の融合（Ｘ−Ｔｆ−Ｘ）は、１つ以上のリンカー（Ｌ）の使用を伴う融合（Ｘ−Ｔｆ−Ｌ−Ｘ、Ｘ−Ｌ−Ｔｆ−Ｘ、Ｘ−Ｌ−Ｔｆ−Ｌ−Ｘ）、またはリンカーの使用を伴わない融合であるが、二価薬物の開発を可能にする。あるいは、トランスフェリンのＮ末端またはＣ末端におけるペプチドは異なる場合がある（Ｘ−Ｔｆ−Ｌ−Ｙ、Ｘ−Ｌ−Ｔｆ−Ｙ、Ｘ−Ｌ−Ｔｆ−Ｌ−Ｙ）。
【０３６１】
[00351]  このことは、標的化された分子の構築、例えば、トランスフェリン分子の両端における一本鎖抗体および毒性ペプチドの融合を容易にする。典型的な適用は、ガン細胞の標的化された殺傷である。また、Ｎ末端およびＣ末端の両方におけるＳＣＡは、トランスフェリンがＦｃヒンジとして作用する二機能性の抗体をもたらし得る。これは、（ヒト化）モノクローナル抗体技術に取って代わるための費用効果的な技術を提供する。
【０３６２】
[00352]  先に論じたように、トランスフェリン分子構造には、タンパク質またはペプチドを挿入するための、また、ランダムペプチド挿入体のスクリーニング可能なライブラリーを開発するための改変／置換が容易であり得る多数のループが存在する。
【０３６３】
実施例１
[00353]  トランスフェリン分子および一本鎖抗体を含むトランスボディーを製造することができる。トランスフェリンに融合され得るＳＣＡの具体的な例には、抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）がある。抗ＴＮＦは、様々な炎症性疾患および自己免疫疾患（例えば、関節リウマチなど）を治療するために使用されている。ＴＮＦ−ＳＣＡは、ＴＮＦ−ＳＣＡのコードＮ末端がトランスフェリンのＣ末端アミノ酸に直接結合されるような様式、または、ＴＮＦ−ＳＣＡのＣ末端アミノ酸がトランスフェリンのＮ末端アミノ酸に直接結合されるような様式で、改変トランスフェリンのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。あるいは、ペプチドリンカーを、トランスフェリンとＴＮＦ−ＳＣＡとの間のより大きな分離をもたらし、かつ、２種の融合されたタンパク質に対してより大きな空間的可動性を可能にするために挿入することができる。ＴＮＦ−ＳＣＡのいくつかの例が図４Ａ〜図４Ｂに示される。
【０３６４】
[00354]  改変Ｔｆ（ｍＴｆ）およびＴＮＦ−ＳＣＡの間での融合タンパク質が、ＳＣＡをコードするヌクレオチド配列の１コピーまたは数コピーをＴｆのヌクレオチド配列に融合して、ＳＣＡがＴｆのＮ末端またはＣ末端に融合された融合タンパク質を生じさせることによって作製することができる。ｍＴｆをコードする核酸を含有するベクター（例えば、ｐＲＥＸ００５２など）が、ＶＨ、ＶＬまたはＣＤＲとのｍＴｆ融合タンパク質を作製するために特別に設計される。リンカーおよびプライマーが、ＶＨ、ＶＬまたはＣＤＲをコードする配列をｍＴｆ含有ベクターに連結するために特別に設計される。
【０３６５】
抗ＴＮＦ−αＳＣＡのｍＴｆのＮ末端融合体およびＣ末端融合体の構築
[00355]  本プロセスにおける最初の工程では、リンカーが、ｍＴｆの５’末端（すなわち、Ｎ末端）におけるＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位の間でｐＲＥＸ００５２に挿入され、続いて、ｍＴｆにＶＨおよびＶＬをクローン化して、ｐＲＥＸ００６６を作製することができる。このリンカーは、本実施例ではＳ（ＳＧＧＧ）３Ｓ（配列番号３２）リンカーペプチドをコードするＤＮＡリンカーのいずれかの端部にＶＨおよびＶＬを挿入するための部位を含有する。
【０３６６】
【化１】
2006506053.tif 000016
【０３６７】
[00356]  次いで、ＶＨおよびＶＬに対するＤＮＡを、一連の重なる合成オリゴヌクレオチドを使用して別々に作製した。ＶＨは、５’のＸｂａＩ部位および３’のＳａｃＩ部位を伴って設計され、ＸｂａＩ／ＳａｃＩで切断されたｐＲＥＸ００６６に挿入された。挿入体の正しい配向およびＤＮＡ配列を確認し、得られたプラスミドをｐＲＥＸ００６７と名付けた。ＶＬは、５’のＥｃｏＲＶ部位および３’のＫｐｎＩ部位を伴って設計され、ＥｃｏＲＶ／ＫｐｎＩで切断されたｐＲＥＸ００６７に挿入された。挿入体の正しい配向およびＤＮＡ配列を確認し、得られたプラスミドをｐＲＥＸ００６８と名付けた。
【０３６８】
[00357]  １対の変異誘発ＰＣＲプライマーを使用して、ｐＲＥＸ００６７における完成したＳＣＡの５’末端および３’末端を、その後、得られるＰＣＲ産物がｍＴｆ（ｐＲＥＸ００５２）のＣ末端にＳａｌＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介して挿入され得るように改変した。挿入体の正しい配向およびＤＮＡ配列を確認し、得られたプラスミドをｐＲＥＸ００６９と名付けた。
フォワード： AGCCTGCACTTTCCGTCGACCTGAAGTGAAACTGGAAG (5'から3')
リバース： CAGTCATGTCTAAGCTTATTACTTCACTTCCAGGTTGG   (5'から3')
配列番号： 25
配列番号： 26
【０３６９】
[00358]  ｐＲＥＸ００６８およびｐＲＥＸ００６９に由来する発現カセットをＮｏｔＩ消化によって回収し、ＮｏｔＩ切断の酵母ベクターｐＳＡＣ３５に挿入して、ｐＲＥＸ００７０およびｐＲＥＸ００７１を作製した。これらは、酵母における形質転換および発現のために使用された。
【０３７０】
[00359]  ＶＨ−ｍＴｆ−ＶＬ融合構築物を作製するために、ｐＲＥＸ００６７内のＶＨを３’末端において改変して、ＫｐｎＩ部位を挿入した。ｐＲＥＸ００６８内のＶＬを５’末端において改変して、ＳａｌＩ部位を導入した。その後、改変されたＶＨおよびＶＬをｍＴｆ（ｐＲＥＸ００５２）の５’末端および３’末端に逐次挿入した：ＶＨがＸｂａＩ部位およびＫｐｎＩ部位を介してＮ末端において挿入され（ｐＲＥＸ００７２）、ＶＬがＳａｌＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してＣ末端において挿入された（ｐＲＥＸ００７４）。このベクターに由来する発現カセットを、その後、ＮｏｔＩ部位を介して酵母ベクター（例えば、ｐＳＡＣ３５など）にサブクローン化して、ｐＲＥＸ００７７を作製した。
【０３７１】
[00360]  あるいは、ＶＬをＮ末端に存在させることができ、かつ、ＶＨをＣ末端に存在させることができる。また、ＶＨまたはＶＬを単独でＮ末端に存在させることができ、あるいは、ＶＨまたはＶＬを単独でＣ末端に存在させることができる。この主題に関する様々な変化にはまた、ＶＨまたはＶＬと、Ｎ末端またはＣ末端との間でのＳ（ＳＧＧＧ）３Ｓ（配列番号２４）リンカーペプチドの使用が含まれる。また、ＶＨ／ＶＬをＮ末端およびＣ末端の両方に有する構築物を構築することができ、この場合、ＶＨ／ＶＬは同一または異なる標的に対するものである。同様に、Ｎ末端およびＣ末端における１つだけのＶＨまたはＶＬを、異なる標的に対するものにすることができる。
抗ＴＮＦαＶＨ
翻訳産物        ２４０アミノ酸
分子量          ２５９６４．１
等電点（ｐＩ）  ５．７７
【０３７２】
【化２】
2006506053.tif 000017
【０３７３】
【化３】
2006506053.tif 000018
【０３７４】
【化４】
2006506053.tif 000019
【０３７５】
実施例２
[00361]  トランスフェリンおよびＣＤＲを含むトランスボディーを作製することができる。ＣＤＲは、通常、ペプチドの比較的短い領域からなる。抗体は、通常、３つのＣＤＲをその重鎖に有し、３つのＣＤＲをその軽鎖に有する。抗原と相互作用することができる抗体の１つ以上のＣＤＲを改変トランスフェリンに融合して、抗原結合活性をトランスフェリン分子に付与することができる。ＣＤＲは、Ｎ末端、Ｃ末端、ならびにＮ末端およびＣ末端に融合することができ、または、トランスフェリンの内部足場の中に操作して入れることができる。抗ＴＮＦ抗体に由来するＣＤＲ配列の例がＴＮＦ−ＳＣＡの図４Ａ〜図４Ｂに示される。１つ以上のＣＤＲに対応するｃＤＮＡを改変トランスフェリンと融合して、ＴＮＦ結合活性をトランスフェリンに付与することができる。
【０３７６】
ＣＤＲの挿入
[00362]  ヒトＴｆ（ＰＤＢ識別子１Ａ８Ｅ）のＮドメインおよび完全なＴｆモデルＡＡＡａｏＴｆｗｏ（これは、ウサギモデル１ＪＮＦをテンプレートとして用いてＥｘＰａｓｙ  Ｓｗｉｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｅｒｖｅｒを使用して作製された）を調べることにより、直接的、または多数の残基の置換のいずれかによってペプチドを挿入するための多数の潜在的な部位が明らかにされる。これらの部位は、Ｃドメインにおけるそれらの等価な部位によって重複する。
【０３７７】
【表６】
2006506053.tif 000020
【０３７８】
[00363]  これらのループの２つが、ＣＤＲペプチド（特にＣＤＲ、Ｈ３）が挿入された部位である：Ｎ１のＨｉｓ２８９（２８６〜２９２）またはＮ２のＡｓｐ１６６（１６２〜１７０）。ＮドメインおよびＣドメインの間における構造的類似性のために、Ｃドメイン上の等価な挿入部位（Ｃ１４８９〜４９５、Ｃ２６２３〜６２８）もまた、分子多価体を作製するために使用することができる。これは、まさにＮドメインもしくはＣドメインにおいて、または、両ドメインにおける部位の組合せによって、上で示した様々な潜在的挿入部位を使用して行われる。
【０３７９】
【化５】
2006506053.tif 000021
【０３８０】
[00364]  Ｇｅｎｂａｎｋから得ることができる抗原ＴＮＦαに対する数個のＳＣＡに対する配列を調べることにより、下記のＣＤＲ（表７）が得られた。これらのペプチドのいずれか１つが結合ペプチドとして有用であり得る（例えば、Ｍｉｓａｗａら、２００２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、５２５：７１；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｓら、１９９６、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、７（３）：１０６；Ｊａｒｒｉｎら、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５４：１６９を参照されたい）。しかしながら、線状ペプチドとして、結合親和性は一般に、それらが由来した抗体の結合親和性よりも低い。ペプチドを別のタンパク質の足場の中に挿入することにより、この親和性の一部またはすべてが回復され得る。ｍＴｆを足場として用いた場合、恐らくは、同じ起源または異なる起源に由来する他のＣＤＲとの組合せで、多数の部位における挿入の可能性が存在する。
【０３８１】
[00365]  生殖細胞系列の配列からの相違の程度についてＣＤＲを調べることは、何らかの他のデータがない場合、結合に対する個々のＣＤＲのそれぞれの相対的な重要性または寄与についての指標として作用し得る。
【０３８２】
【表７】
2006506053.tif 000022
【０３８３】
[00366]  一例として、上記のＰ  ＶＨに由来するＣＤＲ３を、ｍＴｆのＮドメインに、Ｔｈｒ１６５とＡｓｐ１６６との間で挿入した。この配列を、酵母発現のために最適化されたコドンを使用してＤＮＡに逆翻訳した。
aat tat tat ggt tct act tat gat tat    (配列番号 80)
N   Y   Y   G   S   T   Y   D   Y    (配列番号 44)
【０３８４】
[00367]  テンプレートとしてｐＲＥＸ００５６、そして、プライマーＰ００２５と一緒に変異誘発プライマーＰ０１０９、および、プライマーＰ００１２と一緒に変異誘発プライマーＰ０１１０を使用して、２種のＰＣＲ産物を得た。続いて、これらを、外部プライマー（Ｐ００２５およびＰ００１２）を使用して連結した。これにより、ＣＤＲ  Ｈ３がＴｈｒ１６５とＡｓｐ１６６との間に挿入された。この連結反応に由来するＰＣＲ産物を、その後、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで同様に消化されたｐＲＥＸ００５６に再び挿入した。得られたプラスミドｐＲＥＸ００７９に由来する発現カセットを、その後、ＮｏｔＩ消化によって回収して、ＮｏｔＩ切断の酵母ベクター（例えば、ｐＳＣＡ３５など）に挿入して、ｐＲＥＸ００８０を作製し、タンパク質発現のために酵母に形質転換した。
【０３８５】
【化６】
2006506053.tif 000023
【０３８６】
P0109  (配列番号 78)
ATAATCATAAGTAGAACCATAATAATTCGTCCCATCCGCACAAGGGGCACAGCTGC
P0110  (配列番号 79)
GAATTATTATGGTTCTACTTATGATTATGACTTCCCCCAGCTGTGTCAACTG
【０３８７】
ＣＤＲ  Ｈ３を有する全長ｍＴｆを作製するために、ｐＲＥＸ００７９に由来するＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＲＥＸ００５２に挿入した。得られたプラスミドｐＲＥＸ０２６３に由来する発現カセットを、その後、ＮｏｔＩ消化によって回収して、ＮｏｔＩで切断した酵母ベクターｐＳＣＡ３５に挿入して、ｐＲＥＸ０２６８を作製し、タンパク質発現のために酵母に形質転換した。
【０３８８】
実施例３
[00368]  実施例１および実施例２におけるトランスボディーは、抗原性ペプチドまたは免疫調節ペプチドを含ませるために更に改変することができる。所望のペプチドをトランスボディーのトランスフェリン部分に挿入することができる。このようにして、改変されたトランスボディーは、その抗原と結合することができるだけでなく、宿主において免疫応答を誘導することもできる。
【０３８９】
実施例４
[00369]  本発明のトランスボディー技術は、従来のモノクローナル抗体法に代わる魅力的な方法を提供する。本実施例では、Ｔｆと、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体に由来する９アミノ酸のＣＤＲペプチド（配列番号４４）とを含むトランスボディーが作製された。このＣＤＲペプチドは、ＴＮＦαの細胞障害活性を阻止する能力をＴｆに与えることができた。
aat tat tat ggt tct act tat gat tat    (配列番号 80)
N   Y   Y   G   S   T   Y   D   Y    (配列番号 44)
【０３９０】
材料および方法
[00370]  細胞：９６ウエル組織培養プレートに、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ培地において、治療の１日前に、ＷＥＨＩ−１６４細胞を３ｘ１０４細胞／ウエルの密度で播種した。翌日、細胞は、７０パーセント〜８０パーセントのおおよそのコンフルエンシーで一様に分布して現れた。
【０３９１】
サンプル：
[00371]  Ｎドメイン（ＴＮＦ−ＣＤＲ３）：
・ｐＲＥＸ００８０構築物−ＴｆのＮドメインのＤ１６６において挿入されたＴＮＦ  ＣＤＲ３。
・ＢＸＰ１０株（ＹＯ１５０）で成長させる。
・サンプルをＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地で１／１０希釈して、３５０μｇ／ｍｌの最終濃度にする。０．２２μｍでろ過滅菌する。
【０３９２】
[00372]  ＴｆのＮドメイン：
・ｐＲＥＸ０１２８構築物
・ＢＸＰ１０株（ＹＯ０５１）で成長させる。
・サンプルをＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ培地で１／１０希釈して、３５０μｇ／ｍｌの最終濃度にする。０．２２μｍでろ過滅菌する。
【０３９３】
[00373]  ＴＮＦαストック：
・組換えヒトＴＮＦα（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃ＣＲＴ１００、ロット１２１ＣＹ２５）。２５，０００ユニット／ｍｌ（ｄＨ２Ｏ）、０．２２μｍでろ過滅菌する。
【０３９４】
[00374]  希釈プレートを、各サンプルの力価測定が一定量のＴＮＦαにおいて行われ得るように調製した。各条件が三通りのウエルで調製された。すべての希釈はＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳで行った。
【０３９５】
[00375]  種培養培地を、接着細胞層を乱さないように注意深く各ウエルから除き、１００μＬの試験条件を各ウエルに移した。すべての条件は三通り行った。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で２４時間〜４８時間インキュベーションした。
【０３９６】
[00376]  インキュベーション期間後、各ウエルにおける細胞の代謝活性を１０μＬのＭＴＳ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｇ３５８２）の添加によって測定した。このテトラゾリウム化合物は、代謝的に活性な細胞におけるデヒドロゲナーゼによって、分光光度測定法により定量され得る有色の水溶性ホルマザン生成物に還元される。３７℃で１時間〜４時間のインキュベーションの後、色変化の量を４９０ｎｍで測定した。
【０３９７】
[00377]  トランスボディーの調製：治療用ＴＮＦαのＣＤＲ３と等価な９アミノ酸の配列（配列番号４４）を操作して、トランスフェリンのＮドメインの中に入れ、サッカロミセス発現システムで産生させて、５Ｌの発酵から精製した。コントロールとして使用するために、トランスフェリンのＮドメインもまた、酵母で産生させ、精製した。
【０３９８】
[00378]  アッセイ方法：簡単に記載すると、使用されたアッセイにおいて、ＴＮＦα（５０ＩＵ／ｍｌ）および精製されたＮドメインの滴定（ＴＮＦ−ＣＤＲ３）（２５〜１．６μｇ／ｍｌ）の混合物による処理の後で、細胞の代謝活性を測定する。機能的なＴＮＦ  ＣＤＲトランスボディーは、溶液中の遊離ＴＮＦαに結合して、ＷＥＨＩ−１６４細胞（接着性のマウス線維肉腫細胞株）におけるＴＮＦ媒介の細胞障害性を防止するはずである。Ｎドメイン（ＴＮＦ−ＣＤＲ３）による細胞保護の特異性が、トランスフェリン（Ｔｆ）のＮドメインを使用する平行した処理を行うことによって管理される（上記の材料および方法を参照されたい）。
【０３９９】
結果
[00379]  図５は、２つの独立した実験から得られた結果を示し、ＷＥＨＩ−１６４細胞におけるＴＮＦ媒介の細胞障害性が２５μｇ／ｍｌの用量のＮドメイン（ＴＮＦ−ＣＤＲ３）によって防止されたことを示している。同じ用量のＴｆのＮドメインは保護をもたらさなかった。このことは、この活性が抗ＴＮＦ  ＣＤＲ３により媒介されることを示している。
【０４００】
[00380]  Ｎドメイン（ＴＮＦ−ＣＤＲ３）を２５μｇ／ｍＬの用量で使用したとき、ＷＥＨＩ−１６４細胞には、ＴＮＦαにより媒介される細胞障害性に対する保護がもたらされた。等しい濃度のＮドメインは単独では、いずれの実験でも保護作用を何ら示さなかったので、この活性は分子のＴＮＦ  ＣＤＲ部分に対して特異的であるようであった。
【０４０１】
[00381]  細胞生存性を測定する手段としてニュートラルレッド色素の取り込みを使用する別のアッセイでもまた、ＴＮＦαにより媒介される細胞障害性に対するＮドメイン（ＴＮＦ−ＣＤＲ３）の保護作用が１２．５μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬの両方で示された（データは示さず）。再び、保護作用はＮドメイン単独では示されなかった。
【０４０２】
[00382]  本発明は、上記の実施例を参照して詳細に記載されているが、様々な改変が、本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるだけである。本明細書中において参照される引用された特許および特許出願および刊行物はすべて、その全体を参照として本明細書中に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０４０３】
【図１】ヒト（Ｈｕ）トランスフェリン（Ｔｆ）のＮドメインおよびＣドメイン（それぞれ、配列番号３のアミノ酸１〜３３１およびアミノ酸３３２〜６７９）のアラインメントを示す。類似部分および同一部分が強調される。
【図２Ａ】種々の種から得られるトランスフェリン配列（配列番号８１〜８７）のアラインメントを示す。明るい陰影：類似部分；暗い陰影：同一部分。
【図２Ｂ】種々の種から得られるトランスフェリン配列（配列番号８１〜８７）のアラインメントを示す。明るい陰影：類似部分；暗い陰影：同一部分。
【図３】治療用のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドのための、Ｔｆ表面に露出した多数の挿入部位の位置を示す。
【図４Ａ】改変Ｔｆ融合タンパク質を製造するために使用された多数の好ましい抗ＴＮＦα抗体についてのＶＨ領域（配列番号８８〜９３）を示す。
【図４Ｂ】改変Ｔｆ融合タンパク質を製造するために使用された多数の好ましい抗ＴＮＦα抗体についてのＶＬ領域（配列番号９４〜９９）を示す。
【図５】５０Ｕ／ｍｌのＴＮＦαの存在下でのＷＥＨＩ−１６４細胞の、Ｎドメイン／ＴＮＦ  ＣＤＲ処置対Ｎドメイン単独処置の吸光度値を示す。それぞれの棒は各条件について３つの反復ウエルの平均値を表す。吸光度が大きいほど、代謝活性が大きいことを示す。
【図１】
2006506053.tif 000024
【図２Ａ】
2006506053.tif 000025
【図２Ｂ】
2006506053.tif 000026
【図３】
2006506053.tif 000027
【図４Ａ】
2006506053.tif 000028
【図４Ｂ】
2006506053.tif 000029
【図５】
2006506053.tif 000030
【配列表】
2006506053000001.app
【国際調査報告】
2006506053.tif 000031
2006506053.tif 000032