(57)【要約】本出願において、被験体において腫瘍を退縮または抑制するための方法が、開示される。この方法は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤を、腫瘍を退縮または抑制する必要がある被験体に投与し、その結果、その腫瘍が退縮または阻害されるようにする工程による。本発明の方法は、腫瘍の大きさの減少、および腫瘍転移の阻害をもたらす。この方法は、嵩高い転移性癌に罹患している患者にとって特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍退縮の処置のための医薬の調製における、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤の使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記腫瘍退縮の処置は、腫瘍の大きさの減少をもたらす、使用。
【請求項３】
請求項１〜２のうちのいずれか１項に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤は、ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ発現を阻害することが可能な分子である、使用。
【請求項４】
請求項３に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦ発現を阻害することが可能な分子は、抗体、核酸、ＶＥＧＦトラップ、低分子、脂質、および糖質からなる群より選択されるＶＥＧＦアンタゴニストである、使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦトラップは、アセチル化された、Ｆｌｔ−１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３Ｒ→Ｎ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ−１Ｄ２−Ｆｌｋ−１Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）からなる群より選択される、使用。
【請求項６】
請求項４に記載の使用であって、前記発現を阻害することが可能な薬剤は、アンチセンス分子である、使用。
【請求項７】
請求項１に記載の使用であって、前記医薬は、皮下経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、静脈内経路、鼻腔内経路、または経口経路を介する投与のための医薬である、使用。
【請求項８】
腫瘍転移に罹患しているヒト被験体において腫瘍転移を退縮させるための医薬の調製における、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤の使用。
【請求項９】
請求項８に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤は、ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ発現を阻害することが可能な分子である、使用。
【請求項１０】
請求項９に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦ発現を阻害することが可能な分子は、抗体、核酸、ＶＥＧＦトラップ、低分子、脂質、および糖質からなる群より選択されるＶＥＧＦアンタゴニストである、使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦトラップは、アセチル化された、Ｆｌｔ−１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３Ｒ→Ｎ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ−１Ｄ２−Ｆｌｋ−１Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）からなる群より選択される、使用。
【請求項１２】
請求項８に記載の使用であって、前記医薬は、皮下経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、静脈内経路、鼻腔内経路、または経口経路を介する投与のための医薬である、使用。
【請求項１３】
転移性癌に罹患しているヒト被験体において転移性癌を処置するための医薬の調製における、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤の使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤は、ＶＥＧＦ活性またはＶＥＧＦ発現を阻害することが可能な分子である、使用。
【請求項１５】
請求項１４に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦ発現を阻害することが可能な分子は、抗体、核酸、ＶＥＧＦトラップ、低分子、脂質、および糖質からなる群より選択されるＶＥＧＦアンタゴニストである、使用。
【請求項１６】
請求項１５に記載の使用であって、前記ＶＥＧＦトラップは、アセチル化された、Ｆｌｔ−１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３Ｒ→Ｎ）−ＦＣ、Ｆｌｔ−１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ−１Ｄ２−Ｆｌｋ−１Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）からなる群より選択される、使用。
【請求項１７】
請求項１３に記載の使用であって、前記医薬は、皮下経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、静脈内経路、鼻腔内経路、または経口経路を介する投与のための医薬である、使用。
【請求項１８】
製品であって、
（ａ）包装材料と；
（ｂ）該包装材料内に収容された薬剤と；
を備え、該薬剤は、本発明の少なくとも１種のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質を含み、該包装材料は、該ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質が腫瘍退縮のために使用され得ることを示す標識または包装挿入物を備える、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）活性を阻害することにより腫瘍および転移の退縮を促進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現は、ヒトの癌においてほぼ遍在的であり、これは、腫瘍の新脈管形成の重要な媒介因子としてのＶＥＧＦの役割と一致する。ＶＥＧＦまたはそのＶＥＧＦＲ−２レセプターに結合することによりＶＥＧＦの機能を遮断すると、複数の種々の異種移植片モデルにおいて移植された腫瘍細胞の増殖が阻害される（例えば、Ｇｅｒｂｅｒら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６２５３〜６２５８参照）。可溶性ＶＥＧＦアンタゴニスト（「ＶＥＧＦトラップ（Ｔｒａｐ）」と呼ばれる）が、記載されている（Ｋｉｍら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１３９９〜４０４；Ｈｏｌａｓｈら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１３９３〜８）。これらは、その全体が参考として具体的に援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の簡単な要旨）
第一の局面において、本発明は、腫瘍を退縮することまたは腫瘍の大きさを減少することが必要な被験体において、腫瘍を退縮するためまたは腫瘍の大きさを減少するための方法を特徴とし、この方法は、その被験体に、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な治療上有効な量の薬剤を投与する工程を包含し、その腫瘍は、退縮する。用語「退縮」とは、腫瘍の大きさを低減または減少すること（例えば、腫瘍を縮小すること）を意味する。
【０００４】
具体的な実施形態においてＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。より具体的には、このＶＥＧＦアンタゴニストとしては、アセチル化された、Ｆｌｔ−１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３Ｒ→Ｎ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ−１Ｄ２−Ｆｌｋ−１Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）からなる群より選択される、ＶＥＧＦトラップ（ｔｒａｐ）が挙げられる。具体的な好ましい実施形態において、上記ＶＥＧＦトラップは、配列番号１において示されるヌクレオチド配列と配列番号２において示されるアミノ酸配列とを有する、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（ＶＥＧＦトラップＲ１Ｒ２とも呼ばれる）である。本発明は、配列番号１において示されるヌクレオチド配列および／または配列番号２において示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９８％、または少なくとも９９％相同であるＶＥＧＦトラップの使用を包含する。他の具体的な実施形態において、上記薬剤は、抗体、脂質、核酸、低分子、アプタマー、アンチセンス分子、糖質、ペプチド模倣物、またはハプテンである。
【０００５】
本発明の方法により処置されるべき被験体は、好ましくは、１種以上の腫瘍を有するヒト被験体（例えば、嵩高い疾患（同所腫瘍、自然転移病変、および自然発生腫瘍が挙げられる）を伴う癌に罹患しているヒト被験体）であるが、本発明の方法は、処置を必要とする任意の哺乳動物（家畜種を含む）にとって有用である。さらなる実施形態において、本発明の方法は、他の治療方法（癌の処置において使用される他の薬剤を含む）と組み合わせて使用され得る。
【０００６】
上記薬剤の投与は、当該分野で公知の任意の方法（皮下投与経路、筋肉内投与経路、皮内投与経路、腹腔内投与経路、静脈内投与経路、鼻腔内投与経路、または経口投与経路を含む）により得る。
【０００７】
第二の局面において、本発明は、転移（例えば、肺転移）を退縮する必要がある被験体において転移を退縮する方法を特徴とし、この方法は、その被験体に、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な治療上有効な量の薬剤を投与する工程を包含する。
【０００８】
第三の局面において、本発明は、腫瘍の大きさが減少するように腫瘍を処置する方法を特徴とし、この方法は、その被験体に、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤を投与する工程を包含し、その腫瘍は大きさが減少する。
【０００９】
第四の局面において、本発明は、転移性癌に罹患している被験体において転移性癌を処置する方法を特徴として、この方法は、その被験体に、ＶＥＧＦ媒介性活性を遮断、阻害、または回復することが可能な薬剤を投与する工程を包含し、その腫瘍は大きさが減少する。
【００１０】
他の目的および利点は、続く詳細な説明を概観することにより明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本方法を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、そのような方法および条件は、変化し得るからである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載するためだけのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
【００１２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかに他のように示さない限りは、複数の言及物を包含する。従って、例えば、「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する言及は、本明細書中に記載されそして／または本開示などを読むと当業者にとって明らかになる型の１つ以上の方法および／もしくは工程を包含する。
【００１３】
他のように定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと類似するかまたは等しい任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここに記載される。本明細書中で言及されるすべての刊行物は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【００１４】
（一般的説明）
以前の研究は、最少残留疾患のモデルにおけるＶＥＧＦの役割に焦点を当てていた。この研究において、インヒビターが使用され、定着された脈管構造を有する大きな病変および遠位転移を処置することではなく、腫瘍増殖を防止することが目的であった。このアプローチを支持するのは、正常組織において定着した脈管ネットワーク（動員された平滑筋様脈管周囲細胞が内皮に接着する）は、ＶＥＧＦが除去または拮抗された場合に不安定にはならないようであるという知見（Ｂｅｎｊａｍｉｎら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５９〜１６５）である。脈管ネットワークの増殖および発達後のＶＥＧＦ生成を停止するように操作された腫瘍は、主に、脈管壁細胞を欠く脈管の退縮を示す（Ｂｅｎｊａｍｉｎら（１９９９）（上記））。
【００１５】
本明細書中に開示される本発明は、ＶＥＧＦ除去に対して内皮のみの腫瘍脈管の見かけ上の感受性が、絶対的ではなく相対的であり得るか否か、そしてこの病理学的脈管構造が、全体的にＶＥＧＦ依存性のままであり得るかを決定するための実験から生じる。腫瘍由来のＶＥＧＦの除去は、なお、関連する間質細胞により提供される低レベルのＶＥＧＦしかその内皮には必要ではない脈管の生存を可能にし得る。そのような腫瘍脈管は、正常組織の脈管構造と比較した場合に、なお、比較的未熟でありかつ病理学的であり得、従って、ＶＥＧＦの遮断に対して影響を受け得る。従って、腫瘍ＶＥＧＦおよび間質ＶＥＧＦの両方の遮断は、少なくともいくつかの腫瘍における内皮−脈管周囲細胞のシグナル伝達を潜在的に妨害し得、脈管構造の不安定化および明らかな腫瘍退縮をもたらすと、仮定された。
【００１６】
下記の実験は、最近記載された可溶性デコイレセプターである、Ｈｏｌａｓｈら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ  ９９：１１３９３〜１１３９８において記載されたＶＥＧＦトラップを用いて、実行された。この構築物は、ＶＥＧＦＲ−１のドメインおよびＶＥＧＦＲ−２のドメインの両方を組み込み、以前に報告されたＶＥＧＦアンタゴニストよりも有意に高い親和性でＶＥＧＦに結合する。腫瘍脈管微小環境におけるさらなるＶＥＧＦを遮断すると、既存の脈管構造の破壊が生じるか否かを調査するために、ＶＥＧＦトラップであるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１が、定着した異種移植片を有する動物および転移を有する動物に投与された。
【００１７】
（定義）
用語「治療有効用量」により、望ましい効果（そのために、この用量が投与される）を生じる用量が意味される。正確な用量は、処置の目的に依存し、公知の技術（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ参照）を使用して、当業者により確認可能である。
【００１８】
用語「ブロッカー」、「インヒビター」、または「アンタゴニスト」によって、化学反応もしくは化学的応答、または生理反応もしくは生理的応答を、遅延または防止する物質が意味される。一般的なブロッカーまたはインヒビターとしては、アンチセンス分子、抗体、アンタゴニスト、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、ＶＥＧＦブロッカーまたはＶＥＧＦインヒビターの例は、ＶＥＧＦレセプターベースのアンタゴニストであり、これには、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号１〜２）が挙げられる。ＶＥＧＦレセプターベースのアンタゴニスト（ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を含む）の完全な説明については、ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ００／７５３１９（この内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照されたい。
【００１９】
「低分子」とは、約５００ダルトン未満の分子量を有すると本明細書中で定義され、化学物質およびペプチド分子を包含し得る。
【００２０】
（核酸構築物）
本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質の個々の成分は、本明細書により提供される指示を伴って、当該分野で公知の分子生物学的方法により構築され得る。これらの成分は、第一細胞レセプタータンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ１）；第二細胞レセプタータンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ２）；多量体化成分（例えば、Ｆｃ）から選択される。
【００２１】
本発明の方法において有用なＶＥＧＦ特異的融合タンパク質の具体的実施形態は、その融合タンパク質が（例えば、多量体（好ましくは、二量体）として）会合するのを可能にする、多量体化成分を含む。好ましくは、上記多量体化成分は、免疫グロブリン由来のドメインを含む。適切な多量体化成分は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域をコードする配列（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８２  Ｃｅｌｌ  ２９：６７１〜６７９）、免疫グロブリン遺伝子配列、およびそれらの部分である。
【００２２】
本発明の方法において有用な融合タンパク質をコードする核酸構築物は、当該分野で公知の方法により発現ベクター中に挿入され、この核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結されている。タンパク質の生成用の宿主−ベクター系（そのタンパク質の発現のために適切な宿主細胞中に導入される発現ベクターを含む）は、当該分野で公知である。その適切な宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞、もしくはＮＳ０細胞）であり得る。
【００２３】
（アンチセンス核酸）
本発明の一局面において、ＶＥＧＦ媒介性活性が、ＶＥＧＦアンチセンス核酸の使用によって遮断または阻害される。本発明は、ＶＥＧＦをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡまたはその一部に対して、アンチセンスである少なくとも６ヌクレオチドを含む核酸の治療的使用または予防的使用を提供する。本明細書中で使用される場合、ＶＥＧＦ「アンチセンス」核酸とは、ＶＥＧＦをコードするＲＮＡ（好ましくは、ｍＲＮＡ）の一部に対して相補的ないくらかの配列によってハイブリダイズすることが可能な、核酸を指す。上記アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域に対して相補的であり得る。そのようなアンチセンス核酸は、ＶＥＧＦ発現を防止する化合物として有用性を有し、そして腫瘍縮退のために使用され得る。本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖のオリゴヌクレオチド、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、あるいはそれらの改変形または誘導体であり、そのアンチセンス核酸は、細胞に直接投与されても、または導入された外因性配列の転写により細胞内で生成されてもよい。
【００２４】
上記ＶＥＧＦアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドであり、好ましくは、６オリゴヌクレオチド〜約５０オリゴヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。具体的局面において、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチドである。上記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは改変形態であり得、そして一本鎖であっても二本鎖であってもよい。さらに、上記アンチセンス分子は、核酸模倣物であるポリマー（例えば、ＰＮＡ、モルホリノオリゴ、およびＬＮＡ）であり得る。他の型のアンチセンス分子としては、短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとして公知である）および短いヘアピンＲＮＡ、ならびに長いｄｓＲＮＡ（＞５０ｂｐであるが通常は≧５００ｂｐである）が挙げられる。
【００２５】
（阻害リボザイム）
本発明の局面において、腫瘍は、癌を罹患している被験体において、ＶＥＧＦをコードする遺伝子ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を使用し、標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳（従って、その遺伝子産物の発現）を防止することによって、ＶＥＧＦ活性レベルを減少することによって、退縮され得る。
【００２６】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡに対するそのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断事象を含む。リボザイム分子の組成は、その標的遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な１つ以上の配列を含まなければならず、そしてｍＲＡＮ切断を担う周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については、例えば、米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムが、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が、好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、その標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域により指示される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、その標的ｍＲＮＡが、２塩基の配列（５’−ＵＧ−３’）を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生成は、当該分野で周知である。本発明のリボザイムはまた、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（本明細書中で以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）（例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中に天然に存在するＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（ＩＶＳまたはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして公知である））を含む。このＣｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対活性部位を有し、この部位の後で、その標的ＲＮＡの切断が生じる。本発明は、ＶＥＧＦをコードする遺伝子中に存在する８塩基対活性配列を標的とする、Ｃｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【００２７】
（ＶＥＧＦタンパク質に対する抗体の生成）
本発明の別の局面において、本発明は、ＶＥＧＦ活性を結合および遮断することが可能な、抗ＶＥＧＦ抗体または抗体フラグメントを用いて実施され得る。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、米国特許第６，１２１，２３０号（本明細書中に参考として具体的に援用される）において開示される。用語「抗体」とは、本明細書中で使用される場合、抗原に特異的に結合してその抗原を認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ定常領域、λ定常領域、α定常領域、γ定常領域、δ定常領域、ε定常領域、およびμ定常領域、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これはさらに、それぞれ免疫グロブリンクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。各ＩｇＧクラス中には、種々のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）が存在する。代表的には、抗体の抗原結合領域は、結合特異性および結合親和性を決定する際に最も重要である。
【００２８】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用いた消化により生成される充分に特徴付けられた多数のフラグメントとして、存在する。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合の下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（Ｆａｂのダイマー）を生成する。これ自体は、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖である。このＦ（ａｂ）’２は、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を破壊するように穏やかな条件下で還元され得、それによりこのＦ（ａｂ）’２ダイマーは、Ｆａｂ’モノマーへと変換される。このＦａｂ’モノマーは、本質的にはＦａｂであり、ヒンジ領域部分を備える。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化に関して定義されるが、当業者は、そのようなフラグメントが、化学的に、または組換えＤＮＡ方法論を使用することにより、新規に合成され得ることを認識する。従って、用語「抗体」とはまた、本明細書中で使用される場合は、抗体全体の改変により生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成される抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ））、またはファージディスプレイライブラリーを使用して同定される抗体フラグメント（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４参照）のいずれかを含む。
【００２９】
抗体を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照のこと。目的とする抗体の重鎖をコードする遺伝子および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングされ得る。例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローニングされ得、そして組換えモノクローナル抗体を生成するために使用され得る。モノクローナル抗体の重鎖をコードする遺伝子ライブラリーおよび軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーはまた、ハイブリドーマまたは形質細胞から生成され得る。重鎖遺伝子産物および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせにより、種々の抗原特異性を有する抗体の大きなプールが生成される。単鎖抗体または組換え抗体を生成するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号；米国特許第４，８１６，５６７号）が、本発明の融合タンパク質および方法において使用される抗体を生成するために適合され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物（例えば、他の哺乳動物）が、ヒト抗体またはヒト化抗体を発現するために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイ技術が、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定するために使用され得る。
【００３０】
（抗体のスクリーニングおよび選択）
好ましい抗体のスクリーニングおよび選択は、当該分野で公知である種々の方法により実施され得る。標的抗原に対して特異的なモノクローナル抗体の存在についての初期スクリーニングが、例えば、ＥＬＩＳＡベースの方法の使用を介して実施され得る。二次スクリーニングは、好ましくは、本発明の多重特異的融合タンパク質の構築において使用するために望ましいモノクローナル抗体を同定および選択するために実施される。二次スクリーニングは、当該分野で公知の適切な任意の方法を用いて実施され得る。ある好ましい方法（「バイオセンサー修飾補助プロファイリング（「ＢｉａＭＡＰ」）と呼ばれる）が、同時係属中の米国特許出願番号６０／４２３，０１７（２００２年１１月０１日出願）（本明細書中にその全体が参考として具体的に援用される）に記載される。ＢｉａＭＡＰは、望ましい特徴を有するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマクローンの迅速な同定を可能にする。より具体的には、モノクローナル抗体は、抗体：抗原相互作用の評価に基づいて、別個のエピトープ関連グループへと選別される。
【００３１】
（処置集団）
嵩高い疾患（同所性腫瘍、自然発生転移性病変、および／または自然発生腫瘍を含む）を伴う癌に罹患しているヒト患者は、本発明の方法による処置のための候補である。種々の抗血管新生因子が、移植された異種移植片の増殖を防止する。これは、ヒト癌患者における最小残留疾患の状態を模倣する状態である。しかし、抵抗性癌を有する多くの患者は、嵩高い原発性病変または転移を有する。この集団は、それらの疾患が原因で死ぬ危険が高く、既存の腫瘍および転移を退縮することが可能な抗新脈管形成薬物から大いに恩恵を受ける。
【００３２】
（投与方法）
本発明は、有効量の本発明の薬剤を被験体に投与する工程を包含する、処置方法を提供する。好ましい局面において、その薬剤は、実質的に精製されている（例えば、その効果を制限する物質も、望ましくない副作用を生じる物質も、実質的には含まない）。その被験体は、好ましくは動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなど）であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００３３】
種々の送達系が、公知であり、本発明の薬剤を投与するために使用され得る（例えば、リポソーム中へのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、その化合物を発現可能な組換え細胞、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２参照）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など）。導入方法は、経腸的または非経口的であり、これには、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻内経路、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。上記化合物は、任意の従来経路によって（例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮内層または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜など）を通る吸収によって）、投与され得、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与され得る。投与は、全身投与であっても、局所投与であってもよい。投与は、急性であっても、慢性（例えば、毎日、毎週、毎月など）であっても、他の薬剤と組み合わせてもよい。
【００３４】
別の実施形態において、上記活性な薬剤は、小胞（特に、リポソーム）（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３）中で送達され得る。なお別の実施形態において、上記活性な薬剤は、制御放出系において送達され得る。一実施形態において、ポンプが使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）（前出）参照）。別の実施形態において、ポリマー物質が、使用され得る（Ｈｏｗａｒｄら（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５参照）。本発明の活性な薬剤が、タンパク質をコードする核酸である別の実施形態において、その核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部としてその核酸を構築し、その核酸が細胞内核酸になるように投与することによって（例えば、レトロウイルスベクターを使用して（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または直接注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）を使用して、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に侵入することが公知であるホメオボックス様ペプチド（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４〜１８６８参照）に連結されているその核酸を投与することなどによって）、その核酸によりコードされるタンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして例えば、相同組換えによって、発現のための宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。
【００３５】
（細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビトロおよびインビボにおける細胞のトランスフェクションのための、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質をコードする核酸の使用を包含する。これらの核酸は、標的細胞および生物のトランスフェクションのための周知の多数のベクターのうちのいずれかに挿入され得る。上記核酸は、そのベクターと標的細胞との相互作用を介して、エキソビボおよびインビボで細胞中にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞の再導入は、当該分野で公知の任意の方法（カプセル化した細胞の再移植を含む）によって達成され得る。上記組成物は、治療応答を惹起するために充分な量で被験体に（例えば、筋肉中への注射によって）投与される。これを達成するために充分な量は、「治療上有効な用量または量」として定義される。
【００３６】
別の局面において、本発明は、ヒトにおいて腫瘍を退縮する方法を提供し、この方法は、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程を包含し、この核酸は、上記ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む。ヒト疾患の処置または予防における遺伝子治療手順について、例えば、Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１４９〜１１５４参照。
【００３７】
（併用療法）
多数の実施形態において、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質は、１種以上のさらなる化合物または治療と組み合わせて、投与され得る。併用療法は、ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質と１種以上のさらなる薬剤とを含む単一の薬学的投与処方物の投与；ならびにＶＥＧＦ特異的融合タンパク質と、１種以上のさらなる薬剤とを、それ自体が別個の薬学的投与処方物中で投与することを包含する。例えば、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質および血糖降下剤は、単一の経口投与組成物（例えば、錠剤もしくはカプセル）にて一緒に患者に投与されても、または各々の薬剤が別個の経口投与処方物中で投与されてもよい。別個の投与処方物が使用される場合、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質と１種以上のさらなる薬剤とが、同時に、または別々に時差のある時間に（すなわち、連続的に）投与され得る。
【００３８】
（薬学的組成物）
本発明の方法の実施において有用な薬学的組成物は、治療上有効な量の活性薬剤と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む。用語「薬学的に受容可能な」とは、動物（より詳しくはヒト）における使用について、米国連邦政府の規制当局もしくは州政府により承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」とは、治療剤がともに投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的キャリアは、滅菌した液体（例えば、水および油（石油起源の油、動物起源の油、植物起源の油、または合成起源の油（例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）が挙げられる）であり得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが、挙げられる、上記組成物はまた、望ましい場合には、少量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、散剤、徐放処方物などの形態を採り得る。上記組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）を用いて、坐剤として処方され得る。経口処方物は、標準的キャリア（例えば、薬剤グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。
【００３９】
好ましい実施形態において、上記組成物は、ヒトへの静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与のために適合された薬学的組成物として、慣用的手順に従って処方される。必要な場合、上記組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を緩和するための局所麻酔剤（例えば、リドカイン）を含み得る。上記組成物が注入によって投与される場合、その組成物は、滅菌した薬剤グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルで分散され得る。その組成物が注射により投与される場合、滅菌した注射用水または生理食塩水のアンプルが、上記成分を投与前に混合し得るように提供され得る。
【００４０】
本発明の活性薬剤は、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離アミノ基と形成される塩（例えば、塩酸由来の塩、リン酸由来の塩、酢酸由来の塩、シュウ酸由来の塩、酒石酸由来の塩など）、および遊離カルボキシル基と形成される塩（例えば、ナトリウム由来の塩、カリウム由来の塩、アンモニウム由来の塩、カルシウム由来の塩、水酸化第二鉄由来の塩、イソプロピルアミン由来の塩、トリエチルアミン由来の塩、２−エチルアミノエタノール由来の塩、ヒスチジン由来の塩、プロカイン由来の塩など）が挙げられる。
【００４１】
本発明の処置方法において有効な本発明の活性薬剤の量は、本記載に基づいて標準的臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイが、最適な投与量範囲を同定するのを補助するために必要に応じて使用され得る。上記処方物において使用されるべき正確な用量はまた、投与経路、および状態の重篤度に依存し、実施者の判断および各被験体の事情に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与のために適切な投与範囲は、一般的には、体重１ｋｇ当たり約５０〜５０００μｇの活性化合物である。鼻内投与のために適切な投与量範囲は、一般的には、約０．０１ｐｇ／体重ｋｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇである。有効用量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から外挿され得る。
【００４２】
全身投与のために、治療上有効な用量は、まずインビトロアッセイから推定され得る。例えば、細胞培養物中で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するための用量が、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために、使用され得る。初期投与量はまた、インビボデータ（例えば、動物モデル）から、当該分野で周知の技術を使用して推定され得る。当業者は、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化し得る。
【００４３】
投与量および投与間隔は、治療効果を維持するために充分な上記化合物の血漿レベルを提供するために、個別の調整され得る。当業者は、過度な実験を伴わずに、治療上有効な局所投与量を最適化することが可能である。
【００４４】
投与される化合物量は、当然、処置される被験体、被験体の体重、疾患の重篤度、投与様式、および主治医の判断に依存する。上記治療は、症状が検出可能である間、または症状が検出可能ではない場合でさえ、断続的に反復され得る。上記治療は、単独でかまたは他の薬物と組み合わせて、提供され得る。
【００４５】
（キット）
本発明はまた、包装材料と、その包装材料内に収容された薬剤とを備える、製品を提供し、この薬剤は、本発明の少なくとも１種のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質を含み、この包装材料は、上記ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質が腫瘍退縮のために使用され得ることを示す標識または包装挿入物を備える。
【００４６】
（具体的実施形態）
以前の研究者は、一層の脈管壁細胞が内皮に近接して存在する腫瘍脈管は、腫瘍由来ＶＥＧＦの除去の影響から保護されると報告している（例えば、Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５０１２〜５０１６参照）。本発明者らは、内皮細胞または間質細胞により局所生成されるＶＥＧＦの効果は、腫瘍のＶＥＧＦ生成を停止することによって変化される必要はないことを理由付けた。さらに、低レベルのＶＥＧＦは、研究された可溶性レセプターＶＥＧＦトラップ構築物（Ｋｉｍら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１３９９〜１１４０４；Ｈｏｌａｓｈら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１３９３〜１１３９８（これらは、本明細書中にその全体が参考として具体的に援用される））よりもこの因子について親和性が低い薬剤によっては捕捉されないかもしれない。内皮−脈管壁細胞輸送におけるＶＥＧＦの役割が、腫瘍脈管の完全性にとって重要である場合、成熟腫瘍の脈管構造さえ、そのような高親和性抗ＶＥＧＦ薬剤による破壊に対して感受性であり得る。本明細書中に提供される結果は、使用したＶＥＧＦインヒビターが、既存の腫瘍における内皮細胞および動員された脈管周囲細胞の両方の同時アポトーシスを、脈管壁細胞層の見掛けの防御効果を伴わずに引き起こしたことを示す。
【００４７】
下記の実験において示されるように、ＶＥＧＦトラップは、定着した腫瘍を有する実験動物における腫瘍脈管構造をほぼ完全に消滅させ、内皮成分および脈管壁成分の両方の迅速に進行する消失を引き起こした。脈管の退縮の後には、既存の大きな異種移植片の有意な退縮が続いた。さらに、既存の肺微小転移は、大きさおよび細胞数の両方を顕著に減少し、１回以上のＶＥＧＦトラップの投与後にアポトーシスを提示した。このことは、これらの病変におけるＶＥＧＦ依存性ホメオスタシスについての役割もまた示唆した。微小転移に近接する肺微小脈管のパターンは、ＶＥＧＦトラップに対する暴露によって変化しないようであったので、退縮は、他のＶＥＧＦ機能（例えば、透過性）の破壊に関連し得る。そのような微小転移は、腫瘍細胞の低酸素が新脈管形成を刺激する大きさに達する前に、拡散によって供給され得る。提供される結果は、癌治療における標的としてのＶＥＧＦの重要性について証拠を提供し、そして抗ＶＥＧＦ戦略が、腫瘍増殖を停止し得るだけではなく実際の退縮も生じ得る証拠を提供する。これらの結果は、転移性の嵩高い癌を有する患者、ならびに最小残留疾患を有する患者の処置における、ＶＥＧＦインヒビターの使用を支持する。
【００４８】
本発明の他の特徴は、本発明の例示のために提供されるが、本発明の限定であることは意図されない、例示的実施形態についての以下の説明の過程で明らかになる。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の生成方法および使用方法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、そして以下の実施例は、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することは意図されない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して精度を確保するための努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差が、計上されるべきである。他のように示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、℃であり、および圧力は、大気圧または大気圧付近である。
【００５０】
（実施例１：ＶＥＧＦトラップ注射の間の定着した腫瘍の退縮）
（異種移植片モデル）
ＳＫ−ＮＥＰ−１ウィルムス腫瘍細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、またはＨＵＨ肝芽細胞腫細胞（ＨｕＨ−６、日本国茨城県理研バイオリソースセンター）を、１５％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を補充したＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を含む培養中で維持した。細胞を、３７℃にて５％ＣＯ２中でコンフルエントになるまで増殖させ、採集し、トリパンブルー染色により計数し、そして滅菌したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、１ｍｌ当たり濃度１０７細胞にて再懸濁した。異種移植片を、４〜６週齢の雌ＮＣＲヌードマウス（ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）中に、ヒト細胞株ＳＫ−ＮＥＰ−１細胞、ＳＹ５Ｙ細胞、または肝芽細胞腫細胞のうちの１つ由来の１０６細胞の腎臓内注射によって定着させ、そして特定の時間、増殖させた。
【００５１】
各細胞株を利用する実験のために、５〜６週間後に、大きな腫瘍がすべてのマウスにおいて触知可能であった。コホートをランダムに選択して（ｎ＝１０）、０日目コントロールを提供した。残りのマウスを２つのグループに分割し、それらに、毎週２回、ＶＥＧＦトラップ（５００ｍｇ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）または等量のヒトＦｃタンパク質を、同容量のビヒクル中で注射した。ウィルムス腫瘍を用いる実験のために、マウス（各時点で、コントロール動物および処理動物、ｎ＝５）を、注射開始後１日目、５日目、８日目、１５日目、および２７日目にて安楽死させ、腫瘍を切除して秤量した。処理したマウスのみが、３６日目まで生存した（ｎ＝１０）。同様に、肝芽細胞腫細胞株および神経芽細胞腫細胞株を使用する研究のために、マウスを腫瘍退縮および腫瘍増殖についてカリパスでモニターし、間隔を空けて安楽死させた。
【００５２】
（結果）
（ウィルムス腫瘍）
５週間増殖させた同所移植したＳＫ−ＮＥＰ−１ヒトウィルムス腫瘍細胞は、大きな腹膜後腫瘍（平均重量５．８ｇ＋１．１ｇ）を形成した。その後、ＶＥＧＦトラップ（５００ｍｇ）またはＦｃコントロールタンパク質の注射を、二週間毎に腹腔内投与した。処理マウスおよびコントロールマウスのサブセットを、間隔を空けて安楽死させた。３６日目までに、平均腫瘍体重は、７９．３％減少した（３６日目、１．２ｇ±０．３ｇ、ｐ＜０．０００２）（図１）。肉眼検査の際に、ＶＥＧＦトラップ処理した腫瘍は、コントロール腫瘍と比較して顕著に青白く、１５日目までに脈管構造が顕著に減少し、３６日目までに脈管が事実上なかった。腎臓（腫瘍組織により大いに置換された）は、その腫瘍組織が引っ込むと再出現し、３６日目までに顕著に通常の外観に戻った。
【００５３】
（肝芽細胞腫）
５週間増殖させた直腸内移植したＨＵＨ−６ヒト肝芽細胞腫細胞は、大きな腹腔後腫瘍（平均重量３．０±０．５ｇ）を形成した。ＶＥＧＦトラップ（５００ｍｇ）またはＦｃコントロールタンパク質の注射を、二週間毎に腹腔内投与した。処理マウスおよびコントロールマウスのサブセットを、間隔を空けて安楽死させた。ＶＥＧＦトラップの開始後、腫瘍増殖は完全に停止し、１５日目までに見掛け上のプラトーに達し、このプラトーは、４４日目にこの実験が終了するまで維持された（平均腫瘍重量２．１±０．１９ｇ、１５日目；２．２＋０．４ｇ、２９日目；２．０＋０．３ｇ、４４日目、０日目コントロールに対してｐ＝０．０５８）（図２）。対照的に、コントロール腫瘍は、増殖し続け、４４日目に、同じ時点でのＶＥＧＦトラップ処理腫瘍よりも有意に大きかった（それぞれ、６．９＋１．０ｇ  対  ２．０＋０．３ｇ；Ｐ＝０．０１１２）。
【００５４】
（神経芽細胞腫）
他の細胞株と同様に、ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞は、大きな腹腔後腫瘍を形成した。腫瘍移植の５週間後、未処理マウスにおける腫瘍は、大きさ６．６５±０．８４ｇに達し、１週間以内（Ｄ６）にて、大きさ７．２８±１．１６ｇ（ｎ＝１０）に達した。この時点で、コントロールコホート中のすべてのマウスを、屠殺しなければならなかった。この時点で、ＶＥＧＦトラップで処理したマウスは、３．３１±０．９６ｇの腫瘍を有した（ｎ＝５、ｐ＜０．０２７８）。このことは、退縮が生じたことを示唆した。
【００５５】
（実施例２：ＶＥＧＦトラップ注射の間のウィルムス腫瘍における既存の脈管構造の退縮）
（レクチン灌流）
安楽死の前に、各時点で選択したマウスに、フルオレセイン標識したＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン（１００μｌの生理食塩水中１００μｇ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を左心室に脈管内注射した。その脈管構造を、Ｔｈｕｒｓｔｏｎら（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｈ２５４７〜２５６２に記載されるように、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）の注入によって固定し、その後、ＰＢＳの灌流によって洗浄した。
【００５６】
（デジタル画像分析）
フルオレセイン標識レクチン研究からのデジタル画像を、Ｓｐｏｔ  ＲＴ  Ｓｌｉｄｅｒデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡（１０×対物レンズ）から獲得し、ＴＩＦＦファイルとして保存した。新脈管形成および腫瘍脈管構造の定量的評価を、Ｗｉｌｄら（２０００）Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５９：３６８〜３７６によって記載されたようなコンピューター支援式デジタル画像分析によって実施したが、但し、フルオレセイン標識レクチン（ＦＬ）を、ＣＤ−３１に対するフィコエリトリン（ＰＥ）結合体化モノクローナル抗体の代わりに用いた。全視野当たりのＦＬ陽性ピクセルの画分を、記載された（Ｗｉｌｄら（２０００）前出）ようなコンピューター支援式方法によって定量した。脈管構造の変化を、分岐点（節）、終点、および全脈管長を定量することによって評価した。画像を、一般的な閾値の適用、その画像の反転、形態学的衰退、およびスケルトン化の後に、記載された（Ｗｉｌｄら（２０００）（前出））ように、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）とＩｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌ  Ｋｉｔ（Ｒｅｉｎｄｅｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）との組み合わせを使用して分析した。
【００５７】
（ＰＥＣＡＭ−１免疫染色）
コントロール腫瘍およびＶＥＧＦトラップ処理腫瘍を、ラット抗マウス血小板内皮細胞接着分子１（ＰＥＣＡＭ−１）モノクローナル抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）およびウサギ抗ラットビオチン化二次抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で免疫染色した。増強型西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジンおよび基質である色素原のＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）を使用して、シグナル（ＨｉｓｔｏＳｔａｉｎ−Ｐｌｕｓキット、Ｚｙｍｅｄ）を可視化し、スライドを、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ６００顕微鏡を使用して試験した。
【００５８】
（ａＳＭＡ免疫染色）
モノクローナル抗ａ−平滑筋アクチン（ａＳＭＡ）抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、室温で３０分間インキュベートした。その後、標本を、１：４００のウサギ抗マウスビオチン化二次抗体とともにインキュベートした。フルオレセイン標識アビジンを使用して、緑色蛍光シグナルを発色させた。標本を分析し、蛍光顕微鏡によって写真を撮影した。
【００５９】
（共焦点顕微鏡）
レクチンを灌流した腫瘍の連続光学切片を、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ４１０）を使用して獲得した。コンピューター化したアルゴリズムを使用して、被写界深度によって、色コードをフルオレセイン標識脈管に割り当てた。
【００６０】
（結果）
ＶＥＧＦトラップ処理により引き起こされた脈管の変化を、以下のようにして試験した。脈管管腔の輪郭を得るために、フルオレセイン標識Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチンを、腫瘍を保有する動物中に脈管内注射した。最初のＶＥＧＦトラップ注射の一日後（１日目）、レクチンで輪郭付けた脈管の顕著な減少が、観察された。別の実験において、定量的画像分析を使用して、ＶＥＧＦトラップ注射した１日後の腫瘍において、微小脈管密度（ＭＶＤ）、レクチンを灌流した脈管の全長、脈管端部、および分岐点／節を比較した。腫瘍重量は、同じ時点のコントロールと比較して不変であった。ＶＥＧＦトラップで処理した腫瘍脈管構造は、未処理コントロールと比較すると、測定したすべてのパラメーターにおいて有意な減少を示した：ＭＶＤは５４％減少（３７，５９９±２３，４２８対８１，１６７±３９，３６３；平均白色ピクセル数±標準偏差（ＳＤ），ｐ＝０．０３７）、全脈管長は４２％減少（３，３４０±１，２４４対５，７２５±１，４３８，ｐ＝０．０１）、脈管端部は６３％減少（１２７±２２対３４７±１７８，ｐ＜０．００４）、および分岐点／節は８０％減少（１７±６対８５±４０，ｐ＜０．００４）。脈管構造は、進行的に消失し、１５日目までに脈管がほぼ完全に存在しなかった。脈管構造の変化がないことが、ＶＥＧＦトラップで処理した動物中の正常組織において観察された（データは、示さず）。
【００６１】
これらの灌流研究を、同じサンプル中のこれらの集団についての特異的免疫染色を実施することによって、腫瘍中の内皮細胞および動員された脈管周囲細胞の状態と比較した。これらの結果は、内皮細胞中の同様の時点での減少を示した。ＰＥＣＡＭ−１免疫陽性脈管構造は、ＶＥＧＦトラップを１回注射した後（１日目）に減少し、１５日目までに内皮が消滅した。腫瘍細胞の壊死が、５日目までに明らかであった。
【００６２】
脈管壁細胞の動員は、ＶＥＧＦの除去の間に腫瘍内皮をアポトーシスから防御することが提唱されている。この場合、ａＳＭＡ免疫陽性脈管構造（Ｍｏｒｉｋａｗａら（２００２）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：９８５〜１０００）は、ＶＥＧＦ遮断の間に退縮しないか、または内皮細胞単独よりもゆっくり退縮することが予測され得る。しかし、ａＳＭＡについての免疫染色は、この細胞集団が、１回のＶＥＧＦトラップ注射後に減少し、内皮と並行して１５日目までに存在しなかったことを示した。
【００６３】
この迅速な内皮細胞および脈管周囲細胞の退縮から生じる脈管の解剖学的変化を詳細に試験するために、共焦点顕微鏡分析を、初回ＶＥＧＦトラップ注射の１日後にレクチンを灌流した腫瘍の切片を介する擬似深度着色（ｐｓｅｕｄｏ−ｄｅｐｔｈ  ｃｏｌｏｒｉｎｇ）を用いて実施した。これらの研究は、ＶＥＧＦトラップが、脈管分布の迅速な減少を引き起こすのみならず、突然の脈管短縮もまた引き起こし、これは管腔崩壊と一致することを示す。
【００６４】
（実施例３．内皮細胞および脈管壁細胞におけるアポトーシス）
（ＰＥＣＡＭ−１、ａＳＭＡ、およびＴＵＮＥＬ二重染色）
アポトーシスを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性デオキシウリジン三リン酸ニック端部標識（ＴＵＮＥＬ）染色によって決定した。ＰＥＣＡＭ−１／アポトーシスおよびａＳＭＡ／アポトーシスについての免疫蛍光二重染色を、ＡｐｏｐＴａｇ  Ｒｅｄ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，ＮＹ）と、ラット抗マウスＰＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体または抗ａＳＭＡモノクローナル抗体のいずれかとを使用して、凍結切片に対して実施した。ビオチン化二次抗体を、フルオレセイン標識アビジンと組み合わせて使用して、内皮細胞および脈管壁細胞をそれぞれ可視化した。スライドを、蛍光顕微鏡によって試験して写真撮影した。
【００６５】
ＶＥＧＦ媒介性シグナル伝達が、成熟腫瘍脈管の内皮細胞および脈管壁細胞の両方の生存にとって重要である場合、アポトーシスが、両方の細胞集団において同時に検出可能であるはずである。ＰＥＣＡＭ−１およびａＳＭＡ免疫染色と組み合わせた上記ＴＵＮＥＬアッセイを使用する二重標識は、初回ＶＥＧＦトラップ注射の一日後の異種移植片脈管の両方の構成成分におけるアポトーシスを示した。より広範なアポトーシスが、５日目に、内皮細胞および動員された脈管周囲細胞において観察された（データは示さず）。これらの知見は、ＶＥＧＦの強力な遮断が、腫瘍脈管の両方の構成成分をアポトーシスから防御する内皮−脈管壁細胞シグナル伝達を、迅速に妨害することを示唆する。従って、特定のＶＥＧＦレベルは、「成熟」脈管構造においてさえ、安定性にとって重要であり得る。
【００６６】
（実施例４．腫瘍における脈管形成因子の発現の変化）
ＶＥＧＦの発現は、低酸素により精巧に調節され（例えば、Ｌｅｖｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３３３３〜１３４０）、一方、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）は、ＶＥＧＦおよび低酸素の両方により調節される（Ｏｈら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１５７３２〜１５７３９）。従って、ＶＥＧＦとＡｎｇ−２との同時発現は、低酸素に対する腫瘍細胞の生理的応答の指標として役立ち得、この応答は、通常は、脈管形成再構築および新規毛細管出芽を促進する（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：５５〜６０）。さらに、Ａｎｇ−２は、ＶＥＧＦが欠損している場合に脈管退縮を引き起こし得る（Ｈｏｌａｓｈら（１９９９）（前出））。脈管退縮の結果としてのみ退縮している腫瘍は、これらの因子の全体的アップレギュレーションを示すが、ＶＥＧＦＲ−２（増殖中の脈管構造についてのマーカーである）の発現の減少を示すと理由付けられた。従って、ＶＥＧＦ、Ａｎｇ−２、およびＶＥＧＦＲ−２の発現を、インサイチュハイブリダイゼーションにより調査した。
【００６７】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
組織を、まず、４％パラホルムアルデヒド中に一晩保存し、１７％スクロースに移し、そしてＯＣＴ化合物中に包埋し、そして凍結した。その後、組織切片を、以前に記載された（Ｈｏｌａｓｈら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１９９４〜１９９８（本明細書中にその全体が参考として援用される）ようにヒトＶＥＧＦ、Ａｎｇ−２、またはマウスＶＥＧＦＲ−２にハイブリダイズするプローブを含む３５Ｓ標識ｃＲＮＡでプロービングした。
【００６８】
（結果）
ＶＥＧＦおよびＡｎｇ−２の発現は、０日目と３６日目との間で顕著に増加した。逆に、腫瘍におけるＶＥＧＦＲ−２の発現は、同じ期間にわたって減少した。これは、このレセプターを発現する内皮細胞の消滅と一致した。
【００６９】
（実施例５．ＶＥＧＦトラップ投与の間の定着した肺転移の退縮）
ＶＥＧＦの遮断は、使用したモデルにおいて、肺微小転移のその後の形成を減少することが、以前に示された（Ｒｏｗｅら（２０００）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．３５：３０〜３３）。しかし、肺転移の維持におけるＶＥＧＦの役割は、未知である。
【００７０】
（転移の分析）
各々の腫瘍保有する動物の肺全体にわたるヘマトキシリンおよびエオシンで染色した切片の３つの異なるレベルを、転移について試験した。転移１つ当たりの細胞を計数し、転移の直径を、２人の観察者によって独立して測定し、それらの数を平均した。体積を、標準式：（長さ）×（幅）２×（０．５）により計算した。
【００７１】
（統計分析）
画像分析測定値、腫瘍重量および転移測定値（細胞数、最大直径、および体積）の比較を、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析を使用して実施した。
【００７２】
（結果）
上記の結果から、０日目のマウスの６０％および３６日目のＶＥＧＦトラップ処理マウスの５０％が肺転移を有したこと、および定着した転移の数は有意に変化しなかったことが、見出された。しかし、肺腫瘍沈着は、コントロールと比較して、ＶＥＧＦトラップで処理した肺において顕著に小さかった。その肺病変の大きさを、０日目および３６日目に、直径（図３Ａ）、体積（図３Ｂ）、および個々の細胞数（図３Ｃ）によって定量した。３つすべての測定によって、肺転移の大きさの有意な減少が存在した。転移の平均直径は、８０％減少し（２２５．２±３５．４ｍ対８９．２±８．４ｍ、Ｐ＝０．０００５）、平均体積は、７８％減少し（０．００２３±０．０００９ｍｍ３→０．０００１８±０．０００１ｍｍ３、Ｐ＝０．０００４）、そして転移１つ当たりの平均細胞数は、８３％減少した（１１５．３±１６．９→２０．１±７．２、Ｐ＝０．０００２）。ＴＵＮＥＬアッセイは、１回のＶＥＧＦトラップ投与の後に肺転移におけるアポトーシスを示し（データは、示さず）、一方、アポトーシス細胞は、０日目のコントロール転移において稀であった。０日目の転移は、周囲の新規脈管にではなく肺毛細管に近接していた。これは、３６日目の転移においても変化しなかったパターンであった。
【００７３】
本発明は、本発明の趣旨からも必須の特性からも逸脱することなく、他の具体的な形態で具体化され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、異種移植片脈管の退縮および腫瘍の退縮を示す。マウスを、ＶＥＧＦトラップ（５００ｍｇ）または等量のヒトＦｃタンパク質で処理した。マウスを、注射開始後１日目、５日目、８日目、１５日目、および２７日目に安楽死させた（平均腫瘍重量±平均標準誤差：それぞれ、５．５±１．０２ｇ、４．２±０．６６ｇ、３．９±０．８７ｇ、３．５±０．９１ｇ、２．７±０．８ｇ）。処理したマウスだけが、３６日目まで生存した（平均腫瘍重量±平均標準誤差：１．２ｇ±０．３ｇ、０日目のコントロールに対してＰ＜０．０００２）。誤差バーは、平均の標準誤差を示す。
【図２】図２は、ＶＥＧＦトラップ処理した脈管構造の内皮および脈管の壁区画における、腔灌流の進行的減少を示す。
【図３】図３は、肺転移に対するＶＥＧＦトラップの影響を示す。腫瘍を保有する動物における肺転移の発生率および近接する肺微小脈管のパターンは、ＶＥＧＦトラップ投与の間に有意には変化しなかったが、直径（Ａ）、体積（Ｂ）、および細胞数（Ｃ）は、有意に減少した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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