(57)【要約】本発明は、染色体内に存在するｔｄｃＢＣ、ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化され、結果的にＬ−トレオニンの生産性が画期的に向上した微生物を開示する。また、本発明は、前記微生物を用いてＬ−トレオニンを製造する方法を開示する。前記ｐｃｋＡ遺伝子の不活性化された微生物は、Ｌ−トレオニンを量産する母菌株、すなわちＬ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣが特異的に不活性化された菌株の染色体に存在するｐｃｋＡ遺伝子に抗生剤抵抗性遺伝子を組み換え方法によって導入させて製造する。前記微生物は、ｔｄｃＢＣ遺伝子が不活性化されてＬ−トレオニンの分解及び細胞内流入が防止され、且つＬ-トレオニンの合成に阻害されるｐｃｋＡ遺伝子が不活性化されてＬ−トレオニンの生合成経路がより活性化された。よって、高濃度のブドウ糖の存在下でもＬ−トレオニンを高濃度、高収率で生産することができるため、Ｌ−トレオニンの量産に有用に利用できる。
2006521789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｄｃＢＣ、ｐｃｋＡ遺伝子が同時に不活性化されたことを特徴とする大腸菌。
【請求項２】
Ｌ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣの不活性化された母菌株に、部位特異的組み換え酵素(site-specific recombinase)結合部位が両末端に存在する抗生剤抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片を導入させ、前記ｐｃｋＡ遺伝子切片と染色体内のｐｃｋＡ遺伝子との間に相同的組み換え(homologous recombination)が起こるようにすることにより、染色体内のｐｃｋＡ遺伝子が不活性化されたことを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌。
【請求項３】
部位特異的組み換え酵素の発現によって染色体のｐｃｋＡ遺伝子内の抗生剤抵抗性遺伝子が除去され、ｐｃｋＡ遺伝子内に部位特異的組み換え酵素結合部位が１コピー存在することにより、ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化されたことを特徴とする、請求項２に記載の大腸菌。
【請求項４】
前記部位特異的組み換え酵素は、ＦＬＰ、ＣｒｅまたはＸｅｒＣ／Ｄであることを特徴とする、請求項２に記載の大腸菌。
【請求項５】
前記大腸菌は、Ｌ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣの不活性化された母菌株に、ｌｏｘＰ部位が両末端に結合したクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片を導入させることにより、染色体内のｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された大腸菌ＦＴＲ２７１７（ＫＣＣＭ−１０４７５）であることを特徴とする、請求項２に記載の大腸菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の大腸菌を用いてＬ−トレオニンを製造する方法。
【請求項７】
ｐｃｋＡ遺伝子の一部分をｐＴ７Ｂｌｕｅクローニングベクターに導入してｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡを製造し、ｐｌｏｘｐｃａｔ２プラスミドからクロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びｌｏｘＰ部位を含む遺伝子切片ｌｏｘｐｃａｔ２を得た後、前記ｌｏｘｐｃａｔ２遺伝子切片とＮｒｕＩ制限酵素処理されたｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡとを連結して製造された、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びｌｏｘＰ部位を有するｐｃｋＡ遺伝子切片を含むことを特徴とする、組み換えプラスミドｐＴ７ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の背景〕
〔発明の技術分野〕
本発明は、Ｌ−トレオニンを生産する微生物及びこれを用いてＬ−トレオニンを製造する方法に係り、より詳しくは、染色体内に存在するｔｄｃＢＣ、ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化され、結果的にＬ−トレオニンの生産性が画期的に向上した微生物、及びこれを用いてＬ−トレオニンを製造する方法に関する。
【０００２】
〔関連技術の説明〕
Ｌ−トレオニン(L-threonine)は、必須アミノ酸の一種であって、飼料、食品添加剤及び動物成長促進剤として広く使用されており、医薬用水液剤、医薬品の合成原料としても使用されている。現在、Ｌ−トレオニンは、日本の味の素社を含んで先進国の５つの企業からのみ生産されており、国際価格がトン当たり５０００〜６０００ドルであって付加価値が高いものと知られているリジンの２〜３倍に達するために市長成長率が非常に高い製品である。
【０００３】
このようなＬ−トレオニンは、微生物発酵技術によってのみ生産することが可能なアミノ酸であるが、大腸菌(Escherichia coli)、コリネ型細菌(Corynebacterium)、ブレビ型細菌(Brevibacterium)、セラチア属(Serratia)細菌、プロビデンシア属(Providencia)菌株の野生株から誘導された突然変異株を主に用いて生産されている。現在、このような突然変異菌株は、アミノ酸類似体及び薬剤耐性株、またはこれらの耐性株にジアミノピメリン酸、メチオニン、リジン、イソロイシン栄養要求性を与えた突然変異株などが公知になっている（日本国特開平２−２１９５８２号、韓国特許出願第１９９８−３２９５１号、Appl. Microbiol. Biotechnol., 29:550-553, 1988）。ところが、このような突然変異株は、Ｌ−トレオニンの生産性があまり高くないうえ、ジアミノンピメリン酸要求性またはイソロイシン要求性の菌株なので、ジアミノピメリン酸またはイソロイシンのように高価の物質を添加しなければならないという欠点がある。すなわち、ジアミノピメリン酸要求性の菌株を使用する場合、ジアミノピメリン酸を追加発酵しなければならないので、コスト負担の要因が大きく、イソロイシン要求性の菌株を使用する場合にも、イソロイシンを発酵培地に添加しなければならないが、イソロイシンの価格が高いので、コストアップの原因となった。
【０００４】
したがって、かかる問題点を克服するために、倍地にイソロイシンを添加する必要がなく、従来の菌株よりＬ−トレオニンを高濃度で生産することが可能なイソロイシンリーキー(leaky)型突然変異菌株が製造されたことがある（韓国特許公告第９２−８３６５号）。ところが、このような古典的な突然変異方法は、新しいＬ−トレオニン高生産菌株の選別に多くの時間がかかり、非効率的であるうえ、何よりも生産性の向上に限界が伴うという欠点がある。
【０００５】
このため、最近は、このような栄養要求性突然変異株(auxotroph)の代わりに、Ｌ−トレオニンを生合成する代謝経路に関与する主要酵素の反応性を増加させる代謝工学的な方法によって組み換え菌株を製造し、これからＬ−トレオニンを量産することが可能な方法が開発されている。すなわち、遺伝子組み換え技術を用いて、Ｌ−トレオニンの代謝経路に関与する酵素の遺伝子を分離し、これらの遺伝子を適切な遺伝子運搬体にクローニングした後、突然変異菌株に逆導入することにより、Ｌ−トレオニンの生産性を向上させる方法が開発されている。
【０００６】
本発明者らは、このような代謝工学的な方法を用いたＬ−トレオニン製造方法を開発し、韓国特許出願第２００１−６９７６号で出願したことがある。すなわち、ホスホエノールピルビン酸塩（phosphoenol pyruvate、以下「ＰＥＰ」という）からＬ−トレオニン生合成の前駆体であるオキサロ酢酸（oxaloacetate、以下「ＯＡＡ」という）に転換する酵素のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenol pyruvate carboxylase、以下「ｐｐｃ」という）遺伝子、及びアスパラギン酸塩(aspartate)からＬ−トレオニンを生合成する経路に関与する遺伝子であるアスパルトキナーゼ１−ホモセリンデヒドロゲナーゼ（aspartokinase 1-homoserine dehydrogenase、ｔｈｒＡ）、ホモセリンキナーゼ（ｔｈｅｒＢ）、トレオニンシンターゼ（threonine synthase、ｔｈｒＣ）が含まれたオペロンをそれぞれ１コピー以上ずつ微生物の染色体内に挿入することにより、発現量を増加させてＬ−トレオニンの生産量を向上させた方法を開発したことがある。
【０００７】
Ｌ−トレオニンの生合成過程は、ピルビン酸塩から転換されたＰＥＰがＰＰＣによってＯＡＡに転換され、このＯＡＡがさらにアスパラギン酸塩に転換された後、多段階の中間過程を経てＬ−トレオニンが合成される。ところが、このような生合成過程で培地中のブドウ糖濃度が菌株の生長速度とＴＣＡ回路の速度に比べて過量で存在する場合、ｐｐｃ遺伝子の発現は抑制され、ＯＡＡをＰＥＰに転換させるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEP carboxykinase、以下「ｐｃｋＡ」という）遺伝子の発現が活性化される。これにより、ｐｃｋＡ酵素によってアスパラギン酸塩関連アミノ酸生合成の前駆体ＯＡＡがＰＥＰに転換され、このＰＥＰから他の副産物が合成されるものと知られている(Goldie H. Medina V., Mol. Gen. Genet., 220(2):191-196, 1990; Dang et al., E.coli and Salmonella, 1:191-102, 1996)。よって、Ｌ−トレオニンを合成する代謝経路の流れを増大させてＬ−トレオニンを量産するためには、このようなｐｃｋＡ遺伝子が必須的に不活性化されなければならない。
【０００８】
一方、Ｌ−トレオニンの分解と関連して幾つかの代謝経路が知られているが、例えば、トレオニンデヒドロゲナーゼ(threonine dehydrogenase)によってＬ−トレオニンがα−アミノ−β−ケトブチラート(a-amino-b-ketobutyrate)に分解され、これがアセチル−ＣｏＡ(acetyl-CoA)及びグリシン(glycine)に転換されるか、あるいは同時にアミノアセトンに分解されてピルビン酸塩に転換される経路や、トレオニンデヒドラターゼ(threonine dehydratase)によってα−ケトブチラートが生成されてプロピオニル−ＣｏＡ(propionyl-CoA)に代謝され、最終的にＴＣＡサイクルの中間体であるスクシニル−ＣｏＡ(succinyl-CoA)に転換される経路、トレオニンアルドラーゼ(threonine aldolase)を用いる分解経路などがある(Neidhardt F.C. et al. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2nd ed. ASM press. Washington DC, pp369-370)。この中でも、トレオニンデヒドラターゼは、低酸素条件及びトレオニン濃度が高いときに発現されるオペロンである。本発明者らは、このようなオペロン遺伝子（ｔｄｃＢＣ）を遺伝子組み換えによって特異的に不活性化させることにより、Ｌ−トレオニンの生産量を向上させた微生物を開発し、出願したことがある（韓国特許出願第２００２−０１５３８０号）。
【０００９】
一方、国際公開番号第ＷＯ０２／２９０８０Ａ２号には、ｐｃｋＡ遺伝子の一部配列を欠失(deletion)した後、ベクターに挿入し、前記ｐｃｋＡ遺伝子の一部配列が挿入された組み換えベクターを微生物に導入することにより、ｐｃｋＡ遺伝子の活性が抑制された微生物によってＬ−トレオニンを生産する方法が開示されているが、前記微生物は、合成されたトレオニンの分解及び再導入経路が活性化されているため、Ｌ−トレオニンの生産効率に問題点があった。
【００１０】
本発明者らは、従来のＬ−トレオニンを製造する方法において提起された問題点を解決し、高濃度のブドウ糖が含まれている培地でもＬ−トレオニンを量産することができると共に、生産されたＬ−トレオニンが分解されない微生物を製造することができる方法について研究を行い、この前、本発明者らによって開発されたｔｄｃＢＣオペロン遺伝子の不活性化された菌株を母菌株として組み換え方法でｐｃｋＡ遺伝子を不活性化させて製造した菌株が、従来のＬ−トレオニンを量産する菌株と比較してＬ−トレオニンの生産収率が向上したことを確認することにより、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明の目的は、より効率よくＬ−トレオニンを量産することが可能な微生物を提供することにある。
【００１２】
〔発明の概要〕
上記目的を達成するために、本発明は、ｔｄｃＢＣ、ｐｃｋＡ遺伝子が同時に不活性化されたことを特徴とする大腸菌を提供する。
【００１３】
前記ｔｄｃＢＣ、ｐｃｋＡ遺伝子が同時に不活性化された大腸菌は、Ｌ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣの不活性化された母菌株に、部位特異的組み換え酵素(site-specific recombinase)結合部位が両末端に存在する抗生剤抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片を導入させて、前記ｐｃｋＡ遺伝子切片と染色体内のｐｃｋＡ遺伝子との間に相同的組み換え(homologous recombination)が起こるようにすることにより、染色体内のｐｃｋＡ遺伝子が不活性化されたことを特徴とする。
【００１４】
また、本発明は、前記大腸菌を用いてＬ−トレオニンを製造する方法を提供する。
【００１５】
〔発明の詳細な説明〕
本発明では、Ｌ−トレオニンの分解過程に関与するオペロン遺伝子が遺伝子組み換えによって特異的に不活性化されてＬ−トレオニンの生産性が向上した大腸菌を母菌株として用いることができ、好ましくは、本発明者らが開発した菌株ＴＲＮ２１２（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０３５３、韓国特許出願第２００２−０１５３８０号）を母菌株として用いることができる。
【００１６】
本発明は、Ｌ−トレオニンの分解過程に関与するオペロン遺伝子（ｔｄｃＢＣ）の不活性化された菌株を母菌株として、Ｌ−トレオニンの生産を阻害するｐｃｋＡ遺伝子を組み換え方法で不活性化させることにより、ｔｄｃＢＣ遺伝子の活性によるＬ−トレオニンの分解及び細胞内流入が防止され且つｐｃｋＡ遺伝子の活性によるＬ−トレオニンの合成阻害が防止され、これによりＬ−トレオニンの生合成経路が活性化されることにより、結果的にＬ−トレオニンをより高濃度、高収率で生産する菌株を製造したことに特徴がある。
【００１７】
すなわち、本発明は、Ｌ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣの不活性化された母菌株に、部位特異的組み換え酵素(site-specific recombinase)の結合部位が両末端に存在する抗生剤抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片を導入させ、前記ｐｃｋＡ遺伝子切片と染色体内のｐｃｋＡ遺伝子との間に相同的組み換えが起こるようにすることにより、染色体内のｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された大腸菌を提供することを特徴とする。
【００１８】
具体的には、本発明は、部位特異的組み換え酵素の発現によって染色体のｐｃｋＡ遺伝子内の抗生剤抵抗性遺伝子が除去され、ｐｃｋＡ遺伝子内に部位特異的組み換え酵素結合部位が１コピー存在することにより、ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された大腸菌を提供することを特徴とする。
【００１９】
本発明では、相同的組み換え方法(homologous recombination)を用いて、微生物の染色体内にあるｐｃｋＡ遺伝子を不活性化させる。すなわち、抗生剤抵抗性遺伝子をｐｃｋＡの塩基配列を有する遺伝子切片中に挿入してｐｃｋＡ遺伝子切片の作用を不活性化させた後、この不活性化されたｐｃｋＡ遺伝子切片をさらに菌株内に導入させて染色体内のｐｃｋＡ遺伝子と前記不活性化されたｐｃｋＡ遺伝子切片との間に二重交差組み換え(double crossover recombination)が起こるようにすることにより、微生物の染色体内のｐｃｋＡ遺伝子を不活性化させる。この際、抗生剤抵抗性遺伝子によってｐｃｋＡ遺伝子切片が導入され、ｐｃｋＡ遺伝子の不活性化された菌株のみを容易に選別することができる。
【００２０】
前記において、ｐｃｋＡ遺伝子を不活性化させるために挿入される抗生剤抵抗性遺伝子は、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、ゲンタマイシン抵抗性遺伝子またはアンピシリン抵抗性遺伝子が例として挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００２１】
一方、本発明では、抗生剤抵抗性特性を用いて、ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された菌株のみを選別した後、部位特異的組み換え酵素を発現させて、菌株の染色体内に挿入した抗生剤抵抗性遺伝子を除去する。すなわち、抗生剤抵抗性遺伝子と共にｐｃｋＡ遺伝子内に部位特異的組み換え酵素が結合する部位を挿入し、ｐｃｋＡ遺伝子の不活性化された菌株内に部位特異的組み換え酵素を発現させて抗生剤抵抗性遺伝子を除去する。このために、部位特異的組み換え酵素ＦＬＰ、ＣｒｅまたはＸｅｒＣ／Ｄが結合する部位を使用することができるが、これに制限されるのではない。このように抗生剤抵抗性遺伝子が除去されることにより、同一の菌株内で相異なる種類の遺伝子を不活性化させようとするとき、前記抗生剤抵抗性遺伝子をさらに選別マーカーとして使用することができる。
【００２２】
具体的に、本発明では、染色体内のｐｃｋＡ遺伝子を不活性化させるために、両末端にｌｏｘＰ部位が結合したクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片を使用したが、前記ｌｏｘＰ部位は、部位特異的組み換え酵素Ｃｒｅが結合する部位であって、菌株内におけるＣｒｅ酵素の発現及び作用によって、ｌｏｘＰ部位の間にある抗生剤抵抗性遺伝子が染色体から除去される。
【００２３】
前記において、菌株内のＣｒｅ酵素の発現には当業界において公知の方法が利用でき、具体的に、本発明では、ｃｒｅ遺伝子を含んでいるプラスミッドｐＪＷ１６８を菌株に導入してＣｒｅ酵素が菌株内で発現されるようにした。
【００２４】
本発明の一実施例では、ｔｄｃＢＣオペロン遺伝子の不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株からＰＣＲ方法によってｐｃｋＡ遺伝子の一部分を増幅し、この遺伝子をｐＴ７Ｂｌｕｅクローニングベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏ．）に導入して、ｐｃｋＡ遺伝子の含まれた組み換えベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡを製造した。また、ｐｌｏｘｐｃａｔ２プラスミド(Beatriz Palmeros et al., Gene, 247:255-264, 2000)からクロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びｌｏｘＰ部位を含む遺伝子切片ｌｏｘｐｃａｔ２を得た後、前記ｌｏｘｐｃａｔ２遺伝子切片とＮｒｕＩ制限酵素処理されたｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡとを連結することにより、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びｌｏｘＰ部位を有するｐｃｋＡ遺伝子切片を含む組み換えプラスミドｐＴ７ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔを製造した。本発明は、前記のように製造された組み換えプラスミドｐＴ７ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔを提供することを特徴とする。
【００２５】
本発明の他の実施例では、ｌｏｘＰ部位が両末端に存在するカナマイシン抵抗性遺伝子を用いた相同的組み換えによってｔｄｃＢＣ遺伝子が不活性化された母菌株ＴＲＮ２１２に、ｌｏｘＰが両末端に結合したクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片を導入した後、大腸菌染色体内のｐｃｋＡ遺伝子と、前記クロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びｌｏｘＰ部位を含むｐｃｋＡ遺伝子切片との間に相同的組み換えが起こるようにすることにより、結果的に大腸菌染色体内のｔｄｃＢＣ遺伝子とｐｃｋＡ遺伝子の不活性化された組み換え大腸菌を製造し、これを大腸菌ＦＴＲ２７１７と命名し、韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms)に２００３年３月２０日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０４７５）。
【００２６】
前記大腸菌ＦＴＲ２７１７の特徴は、次のとおりである。
１）野生株と比較してトレオニン類似体、リジン類似体、イソロイシン類似体及びメチオニン類似体に対する耐性を有し、
２）元来のｐｐｃ遺伝子とトレオニンオペロンに含有された遺伝子（ｔｈｒＡ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ）の他に、さらに１コピー以上のｐｐｃ遺伝子とトレオニンオペロンに含有された遺伝子が染色体ＤＮＡに挿入されており、
３）Ｌ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣが不活性化された特性を有し、
４）Ｌ−トレオニンの生産反応を阻害する酵素ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化され、高濃度のブドウ糖が含有された培地でもＬ−トレオニンを量産することができるという特徴がある。
【００２７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００２８】
（実施例１：ｐｃｋＡ遺伝子のクローニング）
ｐｃｋＡ遺伝子を含む組み換えベクターを製作した（図１参照）。まず、キアゲンゲノミック−チップシステム（QIAGEN Genomic-tip system、ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏ．）を用いて、ｔｄｃＢＣオペロン遺伝子の不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株ＴＲＮ２１２（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０３５３）菌株からゲノムＤＮＡを分離した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、ｐｃｋＡ遺伝子の一部分が含まれるＤＮＡ切片約１．５ｋｂをＰＣＲ方法によって増幅した。ＰＣＲには配列番号１及び２の塩基配列で表示される正方向プライマーと逆方向プライマーが使用された。また、ＰＣＲ過程は、変性段階(denaturation)は９４℃で３０秒間、アニーリング段階(annealing)は５５℃で３０秒間、拡張段階(extension)は７２℃で１分３０秒間行い、全体３０サイクルとした。
【００２９】
前記ＰＣＲ方法で増幅されたＤＮＡ切片を０．８％アガロースゲル上で電気泳動した後、１．５ｋｂサイズのバンドのみを抽出した。抽出したバンドからＤＮＡゲル精製キット（DNA Gel purification kit、ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏ．）を用いて１．５ｋｂサイズのＤＮＡのみを精製した後、制限酵素ＥｃｏＲ Ｖで処理されたｐＴ７Ｂｌｕｅクローニングベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏ．）と１６℃で平滑末端ライゲーション(blunt end ligation)を行うことにより、ｐｃｋＡ遺伝子のクローニングされた組み換えベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡを製作した。前記製作されたｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡを大腸菌ＮＭ５２２に形質転換させ、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有の固体培地（ＬＢ：１％ＮａＣｌ、１％トリプトン、０．５％酵母エキス）に塗抹した後、３７℃で一晩中培養した。培養された固体培地上で成長したコロニーをアンピシリン含有の液体培地３ｍＬに接種して一晩中培養し、キアゲンミニプレップキット（QIAGEN mini prep kit、ＱＩＡＧＥＮ Ｃｏ．）を用いてプラスミドＤＮＡを分離して大きさを確認した。また、制限酵素ＮｒｕＩとＳｔｕＩで処理した後、ｐｃｋＡ遺伝子の方向を確認した。方向と大きさが確認されたプラスミドＤＮＡを再び制限酵素ＮｒｕＩで処理した後、０．７％アガロースゲル上で電気泳動し、約４．３ｋｂサイズのバンドを注入してＤＮＡのみを精製した。
【００３０】
（実施例２：不活性化されたｐｃｋＡ遺伝子を含む組み換えベクターの製作及びｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された菌株の製造）
２−１）不活性化されたｐｃｋＡ遺伝子を含む組み換えベクターの製作
プラスミドｐｌｏｘｐｃａｔ２（ｌｏｘＰ配列がクロラムフェニコール抵抗性遺伝子の両側に存在するＤＮＡ切片を含むプラスミド；Beatriz Palmeros et al., Gene, 247:255-264, 2000, Professor G. Gosset, University of Mexico）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理し、両末端にｌｏｘＰ部位を有するクロラムフェニコール抵抗性遺伝子切片ｌｏｘｐｃａｔ２（１．２ｋｂサイズ）を得た。前記遺伝子切片ｌｏｘｐｃａｔ２と実施例１で製作したＮｒｕＩ処理済みの組み換えベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ／ｐｃｋＡとを平滑末端ライゲーションさせ、不活性化されたｐｃｋＡ遺伝子を含む約５．７ｋｂサイズの組み換えベクターｐＴ７ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔ２を製作した（図２参照）。
【００３１】
２−２）ｐｃｋＡ遺伝子が不活性化された菌株の製造
前記実施例２−１）で製作した組み換えベクターｐＴ７ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔ２をＮＭ５２２菌株に形質転換させ、アンピシリンとクロラムフェニコールの含まれた固体培地に塗抹して３７℃で一晩中培養した。その後、培養されたコロニーを選択して、アンピシリンとクロラムフェニコールの含まれた液体培地３ｍＬに接種して一晩中培養させ、キアゲンミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを分離した。前記プラスミドＤＮＡの大きさと方向を確認し、制限酵素ＰｓｔＩとＫｐｎＩを同時に処理した後、０．７％アガロースゲル上で電気泳動して２．７ｋｂサイズのバンドを抽出し、純粋なＤＮＡ切片のみを精製した（ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔ２）。
【００３２】
両末端にｌｏｘＰ部位が結合したクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むｐｃｋＡ遺伝子切片ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔ２をＬ−トレオニン生産菌株ＴＲＮ２１２（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０３５３）にエレクトロポレーション(electroporation)で導入した。その後、前記菌株をクロラムフェニコール含有の固体培地に塗抹し、クロラムフェニコールに抵抗性を有する菌株のみを選別することにより、最終的に染色体上のｐｃｋＡ遺伝子がｐｃｋＡ遺伝子切片（ｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔ２）によって代替された菌株のみを選別した。次いで、前記選別された菌株の染色体内でｐｃｋＡ遺伝子が特定的にノックアウト(Knock-out)されたかを確認するために、下記実験例１と同様の方法でサザンブロット分析(Southern blot analysis)を行った。
【００３３】
ｐｃｋＡ遺伝子が特定的にノックアウトされたかサザンブロットによって確認された菌株のみを対象とし、ｌｏｘＰ部位に作用する部位特異的組み換え酵素をコードするｃｒｅ遺伝子を含んでいるプラスミドｐＪＷ１６８（メキシコ大学校、Ｇｕｕｉｌｅｒｍｏ Ｇｏｓｓｅｔ教授から購入して使用する）を導入した後、培地内に１ｍＭ Ｌ−アラビノースを仕込んで一晩中培養することにより、菌株の染色体からクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を除去した。培養液を１０７倍希釈してアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有のＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で一晩中静置培養した。成長したコロニー１００株をクロラムフェニコール含有のＬＢ培地とクロラムフェニコール非含有のＬＢ培地にそれぞれ接種した後、３７℃で一晩中培養した。クロラムフェニコール含有培地では成長せずにクロラムフェニコール非含有培地でのみ成長するコロニーを選別することにより、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子の除去された菌株のみを選別した。
【００３４】
（実験例１：サザンブロットを用いた染色体内ｐｃｋＡ遺伝子のノックアウトの確認）
母菌株ＴＲＮ２１２菌株と、前記実施例２−２）で選別されたクロラムフェニコールに抵抗性を有する菌株をクロラムフェニコール（１５ｍｇ／Ｌ）含有の液体培地３ｍＬで一晩中培養した後、キアゲンゲノミックキット２０を用いてゲノムＤＮＡを分離した。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶを用いて一晩中切断し、０．７％アガロースゲル上で電気泳動してＤＮＡ切片の大きさのまま分離した。電気泳動済みのゲルを毛細管転移方法(capillary transfer、Molecular Cloning, Vol 1., pp6.31-6.38)を用いて一晩中ＤＮＡをナイロンメンブレイン（Biodyne B membrane、Ｙｏｕｎｇ Ｓｃｉ）に付着させた。このメンブレインを乾燥させた後、ＵＶ（１２０ｍＪ／ｃｍ２、ＳｐｅｃｔｒｏＬｉｎｋｅｒＴＭ）を照射することにより、ＤＮＡをメンブレインに固定させた(Molecular Cloning, Vol 1., pp6.45)。このメンブレインを５５℃で２時間前混成化溶液Ｉ（prehybridization solution Ｉ、Ｒｏｃｈｅ＃１０９３６５７）を用いて前混成化させ、変性されたＤＮＡ探針を入れた後、５５℃に固定された混成化オーブン（hybridization oven、ＢＡＭＢＩＮＯ ２３０３００）内で一晩中混成化させた。
【００３５】
使用した探針は、次のように準備した。まず、キアゲンキットを用いて分離したプラスミドｐｌｏｘｐｃａｔ２を制限酵素ＨｉｎｃＩＩで処理し、ｌｏｘＰ部分がクロラムフェニコール抵抗性遺伝子の両末端に存在するＤＮＡ切片（１．２ｋｂ）を得た。このＤＮＡ切片を１００℃の沸かし湯で５分間加熱した後、直ちに氷でさらに５分間冷却して１本鎖ＤＮＡ(single stranded DNA)に作った。このＤＮＡをＤＩＧ標識キット（DIG Labeling and Detection Kit、Ｒｏｃｈｅ ＃１０９３６５７）を用いて３７℃で一晩中反応させ、ＤＩＧ−ＵＤＰの入り込んだＤＮＡ探針を製造した。
【００３６】
混成化完了の後、洗浄溶液Ｉ、ＩＩ（washing solutions Ｉ and ＩＩ、Ｒｏｃｈｅ ＃１０９３６５７）を用いて、メンブレインに非特異的に付着しているＤＮＡを除去した。前混成化溶液ＩＩ（prehybridization solution ＩＩ、Ｒｏｃｈｅ ＃１０９３６５７）を用いて常温で３０分間メンブレインをマスキングした後、ＤＩＧ−ＵＴＰに特異的に結合する抗体(anti-DIG antibody)を添加して常温で３０分間反応させた。洗浄溶液ＩＩＩ（washing solutions ＩＩＩ、Ｒｏｃｈｅ ＃１０９３６５７）を用いて非特異的にメンブレインに付着している抗体(anti-DiG antibody)のみを除去し、標識キット（Labeling and Detection Kit、Ｒｏｃｈｅ ＃１０９３６５７）を用いて、バンドが現れるまで常温で発色反応させた。
【００３７】
その結果、図３に示すように、母菌株ＴＲＮ２１２（レイン２）では、クロラムフェニコール遺伝子がないため、何のバンドも現れなかった。これに対し、本発明で選別された菌株（レイン１）では、約３．６ｋｂ程度のバンドが見られた。すなわち、前記選別された菌株の染色体内にクロラムフェニコール抵抗性遺伝子が導入されていることを確認することができた。
【００３８】
（実施例３：組み換えられた菌株に対する三角フラスコでのＬ−トレオニン生産量の比較実験）
前記実施例２−２）で選別された、最終的にクロラムフェニコール抵抗性遺伝子が除去された組み換え菌株の中からコロニー３０株を選別し、表１に示した培地を用いて三角フラスコに培養した後、生産されたＬ−トレオニンの量を測定した。すなわち、３２℃に保たれる培養器でＬＢ固体培地中に一晩中培養した単一コロニー２５ｍｌを、表１に示した培地に１ループずつ接種して３２℃で２５０ｒｐｍにて４８時間培養した。それぞれのコロニー培養液を遠心分離した後、上澄液のみを取って蒸留水で２５０倍希釈した。ＨＰＬＣによって前記希釈液のＬ−トレオニンの濃度を測定し、その結果を表２に示した。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
【表２】
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【００４１】
母菌株ＴＲＮ２１２菌株のＬ−トレオニン生産量は２３ｇ／Ｌであったが、前記表２に示すように、組み換えられた新菌株は、３０株中の２８株が母菌株に比べて優れたＬ−トレオニン生産性を示し、特に９株は２６ｇ／Ｌ以上の生産量を示した。よって、Ｌ−トレオニン生産量が母菌株と比較して約１３．０４％程度向上したことを確認することができた。この３０株の菌株の中で、Ｌ−トレオニン生産量が最も高かった１株（約２６ｇ／Ｌ）を選択してＦＴＲ２７１７（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０４７５）と命名した。
【００４２】
〔産業上の利用可能性〕
以上述べたように、本発明では、Ｌ−トレオニンを量産する母菌株、すなわちＬ−トレオニンの分解に関与するオペロン遺伝子ｔｄｃＢＣが特異的に不活性化された菌株の染色体ＤＮＡに存在するｐｃｋＡ遺伝子に抗生剤抵抗性遺伝子を組み換え(recombination)方法によって導入させ、ｐｃｋＡ遺伝子の不活性された微生物を製造した。本発明に係る微生物は、ｔｄｃＢＣ遺伝子が不活性化されてＬ−トレオニンの分解及び細胞内流入が防止され、且つＬ-トレオニン合成を阻害するｐｃｋＡ遺伝子が不活性化されてＬ−トレオニンの生合成経路がより活性化された。よって、高濃度のブドウ糖の存在下でもＬ−トレオニンを高濃度、高収率で生産することができるため、Ｌ−トレオニンの量産に有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ｐｃｋＡ遺伝子のクローニング過程を示す概略図である。
【図２】図２は、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子とｌｏｘＰ部位を含むｐｃｋＡ遺伝子切片ΔｐｃｋＡ：：ｌｏｘｐｃａｔが導入された組み換え菌株を製造する過程を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明のＬ−トレオニンを生産する大腸菌染色体のｐｃｋＡ遺伝子内にクロラムフェニコール遺伝子が挿入されたことを確認するためのサザンブロットの結果を示す写真である（レイン１：本発明のＬ−トレオニンを生産する大腸菌染色体のｐｃｋＡ遺伝子、レイン２：母菌株染色体のｐｃｋＡ遺伝子、レイン３：マーカー）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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