(57)【要約】哺乳類における腸の炎症性疾患の治療の有効性を決定する新規方法が提供される。この方法は、腸の炎症性疾患の治療の有効性をスクリーニング及び決定することにおいて使用され、そして所定の療法での腸の炎症性疾患の個人の罹患者の有効性反応を決定するために使用される。この方法を実施するキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において腸の炎症性疾患の治療の有効性をインビボで決定する方法であって、
ａ）哺乳類の被験者の生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｂ）少なくとも１つの抗炎症サイトカインの少なくとも１つの炎症促進サイトカインに対する比率を決定する工程；
ｃ）前記治療を施す工程；
ｄ）前記治療を施した後の時点で前記哺乳類の被験者の生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｅ）前記治療を施した後で少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの比率を決定する工程；を含み、
前記治療を施した後での抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の上昇が、腸の炎症性疾患の阻害物質を示し、前記治療を施した後での抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の変わらないこと又は減少が、前記治療は、腸の炎症性疾患の阻害物質ではないことを示す方法。
【請求項２】
抗炎症サイトカインが、インターロイキン−１０、トランスホーミング増殖因子−β、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１３、及びこれらの混合物を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗炎症サイトカインが、インターロイキン−１０、トランスホーミング増殖因子−β、及びこれらの混合物を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
炎症促進サイトカインが、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、及びこれらの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
炎症促進サイトカインが、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、及びこれらの混合物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの前記比率が、インターロイキン−１０／インターロイキン−１２の比率である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの前記比率が、トランスホーミング増殖因子−β／インターロイキン−１２の比率である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの前記比率が、インターロイキン−１０／インターフェロン−γの比率である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルが、尿、血漿、血清、唾液、生検組織、脳脊髄液、インビトロ刺激を有する末梢血単核球、インビトロ刺激のない末梢血単核球、インビトロ刺激を有する消化管リンパ様組織、インビトロ刺激のない消化管リンパ様組織、消化管洗浄液、及びこれらの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体サンプルが、血清、インビトロ刺激を有する末梢血単核球、インビトロ刺激のない末梢血単核球、及びこれらの混合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体サンプルが、インビトロ刺激を有する末梢血単核球、インビトロ刺激のない末梢血単核球、及びこれらの混合物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記インビトロ刺激が、マイトジェン、プロバイオティクス、抗−ＣＤ３分子、及びこれらの混合物を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記インビトロ刺激がマイトジェンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイトジェンが、リポ多糖体、レクチン、スーパー抗原、及びこれらの混合物を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記レクチンが、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン、ポークウィードマイトジェン、及びこれらの混合物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの抗炎症サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、マイクロアレープラットホームによるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタンブロット、クロマトグラフ系分離システム、ＲＴ−ＰＣＲ、競合逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、遺伝子アレイ、ｍ−ＲＮＡの直接測定、及びこれらの混合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体サンプルにおいて抗炎症サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、及びこれらの混合を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの抗炎症サイトカインの濃度を測定する手段が、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、マイクロアレープラットホームによるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタンブロット、クロマトグラフ系分離システム、ＲＴ−ＰＣＲ、競合逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、遺伝子アレイ、ｍ−ＲＮＡの直接測定、及びこれらの混合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、及びこれらの混合を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する手段が、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療前、及び治療後又はその間の少なくとも一時点で哺乳類の被験者からの生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインを測定する第１測定要素又は系、治療前、及び治療後又はその間の少なくとも一時点で前記哺乳類の被験者からの生体サンプルにおいて少なくとも１つの炎症促進サイトカインを測定する第２測定要素又は系を含むキットであって、治療を施した後で抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の変化を測定することができ、使用指示書がユーザーに治療の前及び後の両方で抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの比率の決定を指示し、抗炎症サイトカインの前記炎症促進サイトカインに対する前記比率の上昇が、腸の炎症性疾患の阻害物質を示すキット。
【請求項２３】
前記キットが、治療の前及び後で前記生体サンプルを得る手段を更に含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
腸の炎症性疾患の治療における組成物の有効性をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ｅ）少なくとも１つの消化管由来細胞の種類を含む生体サンプルを準備する工程；
ｆ）前記生体サンプルを前記組成物によりインビトロで処置する工程；
ｇ）前記組成物による処置の後の時点で生体サンプル中の少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｄ）組成物による処置の後の時点で生体サンプル中の少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの比率を決定する工程；を含み、
処置された生体サンプルからの工程（ｄ）で決定された比率が、同時に試験された未処理対照生体サンプルで決定された同様の比率よりも大きいと、組成物は、腸の炎症性疾患の阻害物質であることを示し、（ｄ）で決定された比率が未処理対照生体サンプルの比率と同じであるか、又はそれより低いと、組成物は、腸の炎症性疾患の阻害物質ではないことが示されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
生体サンプルが、消化管関連リンパ様組織を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
消化管関連リンパ様組織が、腸間膜リンパ節細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）の前にインビトロで生体サンプルを刺激する追加の工程を含む。請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
抗炎症サイトカインが、インターロイキン−１０、トランスホーミング増殖因子−β、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１３、及びこれらの混合物から成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
抗炎症サイトカインが、インターロイキン−１０、トランスホーミング増殖因子−β、及びこれらの混合物から成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
炎症促進サイトカインが、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、及びこれらの混合物を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
炎症促進サイトカインが、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−α、インターフェロン−γ、及びこれらの混合物を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの前記比率が、インターロイキン−１０／インターロイキン−１２の比率である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの前記比率が、トランスホーミング増殖因子−β／インターロイキン−１２の比率である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの前記比率が、インターロイキン−１０／インターフェロン−γの比率である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記インビトロ刺激が、マイトジェン、プロバイオティクス、抗−ＣＤ３分子、及びこれらの混合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記インビトロ刺激がマイトジェンを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記マイトジェンが、リポ多糖体、レクチン、スーパー抗原、及びこれらの混合物を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記レクチンが、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン、ポークウィードマイトジェン、及びこれらの混合物を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの抗炎症サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、マイクロアレープラットホームによるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタンブロット、クロマトグラフ系分離システム、ＲＴ−ＰＣＲ、競合逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、遺伝子アレイ、ｍ−ＲＮＡの直接測定、及びこれらの混合を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体サンプルにおいて抗炎症サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、及びこれらの混合を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの抗炎症サイトカインの濃度を測定する手段が、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、マイクロアレープラットホームによるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタンブロット、クロマトグラフ系分離システム、ＲＴ−ＰＣＲ、競合逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、遺伝子アレイ、ｍ−ＲＮＡの直接測定、及びこれらの混合を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する手段が、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、及びこれらの混合を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生体サンプルにおいて前記少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する手段が、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
消化管由来細胞の種類を含む生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインを測定する第１測定要素又は系、消化管由来細胞の種類を含む生体サンプルにおいて少なくとも１つの炎症促進サイトカインを測定する第２測定要素又は系を含む、腸の炎症性疾患の治療における組成物の有効性をスクリーニングするキットであって、対照サンプルと、組成物で刺激された処置サンプルとの間の、抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの比率の差を決定することができ、使用指示書がユーザーに抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの比率の決定を指示し、抗炎症サイトカインの前記炎症促進サイトカインに対する前記比率が対照よりも大きいと、腸の炎症性疾患の阻害物質を示すキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸の炎症性疾患の分野、特にこれらの疾患の治療の有効性をスクリーニングし、決定するための方法に関する。更に、本発明の方法を実施するキットも提供される。
【背景技術】
【０００２】
腸の炎症性疾患は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）のような腸の炎症及び胃腸（ＧＩ）管の慢性炎症性疾患である潰瘍性大腸炎及びクローン病のような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を起こす疾患の一般的な呼び方である。例えば、潰瘍性大腸炎は、大腸内層粘膜の炎症を起こし、通常、直腸及び結腸下部に発生するが、結腸全体に影響を及ぼすこともあるＩＢＤである。クローン病は、ＧＩ管のあらゆる部位（すなわち、口、食道、胃、小腸、大腸、直腸及び肛門）に影響を及ぼすことがあり、腸壁のすべての層に関わることがある。これらの疾患の多くは原因が不明である。
【０００３】
ＩＢＳは、腹部不快感又は疼痛が、排便又は便通習慣に伴い、排便障害の特徴と関連している機能性胃腸疾患である。これらの症状は、消化官の運動及び／又は知覚機能の障害が、社会心理学的異常と関連していることがあり、その相互作用が胃腸管にさまざまな水準の症状を引き起こす状態を表す。
【０００４】
ＩＢＳは、現在では、最もよく見られる胃腸疾患である。西洋社会での罹患率は、未成年及び成人人口で１５〜２０％であると推定され、疾患は、胃腸科クリニックへの照会の２０〜５０％を占める。
【０００５】
ＩＢＳ管理の現行の取り組みは、症候群と一致する症状を同定し、同様の症状の器質性疾患を除外し、続いて適切であれば非薬理学的及び薬理学的治療をすることから成る。現行の薬理学的治療オプションは限定されており、その多くの有効性は低いことが実証されている。現行の薬理学的治療は症状を治療することを目的とし、腸の運動性を調節すること、内臓の感受性を減退させること、又は関連する疾患、特に不安若しくはうつを治療することのいずれかが理にかなったことである。
【０００６】
ＩＢＤの最もよく見られる症状は、腹部疼痛、しぶり腹、便意ひっ迫、及び血性下痢が挙げられる。また罹患者は、疲労、体重喪失、食欲不振、直腸出血、並びに体液及び電解質の喪失を経験することもある。疾患の症状は、通常、進行性であり、罹患者は、典型的には、寛解の期間の後で突然の重篤な再発を経験する。
【０００７】
ＩＢＤの流行にもかかわらず（米国単独で約２百万人が罹患している）、治療法がなく、疾患の正確な原因は、未だに解っていない。ＩＢＤの従来の治療は、抗炎症剤、免疫抑制剤及び手術である。しかし、この疾患の治療に使用される薬剤の多くは、悪心、めまい、貧血、白血球減少、皮膚発疹及び薬物依存のような否定的な副作用を有し、外科的処置は、多くの場合、腸切除術及び結腸切除術のような過激な手法である。
【０００８】
このことは、幾人かの研究者たちが、腸の炎症性疾患の治療における新たな且つ新規の薬剤の同定を試みる原因となった、残念ながら、疾患の性質そのものが、ヒト被験者における潜在的治療の有効性をスクリーニングし、測定することが極めて困難であることを意味している。多くの場合、臨床試験の結果は、試験志願者自身の主観的な証言に依存し、その主張を実証する生化学的又は生理学的データが、ほとんどか又はまったくない。動物モデルを使用して、罹患器官から組織切片を取ることも可能であるかもしれないが、動物モデルにおける薬剤の有効性は、必ずしもヒトにおいて同じ有効性を有するとは限らない。
【０００９】
炎症性疾患の制御は、数多くの段階で行われている。制御要因には、ホルモン、プロスタグランジン、活性酸素及び窒素中間体類、ロイコトリエン及びサイトカインが挙げられる。サイトカインは、免疫及び炎症反応の発生及び制御に関わる低分子量で生物学的に活性なタンパク質である。数多くの細胞の種類がこれらのサイトカインを産生し、損傷部位において数が多いので、好中球、単球及びリンパ球が炎症反応の主要な源である。
【００１０】
複数の機構が存在し、それにより炎症部位で発生したサイトカインが炎症反応に影響を与える。走化性が、炎症細胞を損傷部位へホーミングするように刺激するが、特定のサイトカインは、組織内への細胞の浸潤を促進する。損傷組織内に放出されたサイトカインは、結果的に炎症性浸潤を活性化することになる。ほとんどのサイトカインは、多面発現性であり、生物学的に重複する複数の活性を発現する。特定のサイトカインの、特定の細胞の種類に対する活性ではなく、むしろサイトカインのカスケード及び網状組織が炎症反応を制御する。非制御炎症反応は、腸の炎症性疾患のような疾患を招く結果となる可能性があり、サイトカイン産生が、これらの疾患に罹患した個人において方向を誤ると予想することは妥当である。しかし、多くのサイトカインが炎症促進及び抗炎症活性の両方を有することがあり、疾患の症状又はそれから回復が特定の個別のサイトカインに起因すると考えることは極めて困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
前述に基づき、生物学的又は生理学的データを発生する、ヒト又は他の哺乳類における腸の炎症性疾患の潜在的治療の有効性をスクリーニング及び測定する方法を提供することが望ましい。このデータは、治療の有効性を評価するために使用できる。腸の炎症性疾患をもつ被験者の予後及び疾患の進行がモニターできるように、腸の炎症性疾患の発生病理に潜在的に関わる特定のサイトカインの濃度の変化を測定する方法を提供することが、更に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、哺乳動物において腸の炎症性疾患の治療の有効性をインビボで決定する新規方法であって、
ａ）哺乳類の被験者の生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｂ）少なくとも１つの抗炎症サイトカインの少なくとも１つの炎症促進サイトカインに対する比率を決定する工程；
ｃ）前記治療を施す工程；
ｄ）前記治療を施した後の時点で前記哺乳類の被験者の生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｅ）前記治療を施した後で少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの比率を決定する工程；を含み、
前記治療を施した後での抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の上昇が、腸の炎症性疾患の阻害物質を示し、前記治療を施した後での抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の変わらないこと又は減少が、前記治療は、腸の炎症性疾患の阻害物質ではないことを示す方法を提供する。
【００１３】
加えて、本発明は、腸の炎症性疾患の治療における組成物の有効性をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ｅ）少なくとも１つの消化管由来細胞の種類を含む生体サンプルを準備する工程；
ｆ）前記生体サンプルを組成物によりインビトロで処置する工程；
ｇ）組成物による処置の後の時点で生体サンプル中の少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｄ）組成物による処置の後の時点で生体サンプル中の少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの対する比率を決定する工程；を含み、
処置された生体サンプルからの工程（ｄ）で決定された比率が、同時に試験された未処理対照生体サンプルで決定された同様の比率よりも大きいと、組成物は、腸の炎症性疾患の阻害物質であることを示し、（ｄ）で決定された比率が未処理対照生体サンプルの比率と同じであるか、又はそれより低いと、組成物は、腸の炎症性疾患の阻害物質ではないことが示されることを特徴とする方法を提供する。
【００１４】
本発明は、また、本明細書の方法の更なる使用、及び本明細書の方法を実施するキットを提供することを対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書のすべての重量、測定値及び濃度は、指示がない限り組成物の全体に対して２５℃で測定される。
【００１６】
指示がない限り、本明細書で参照される組成物のすべてのパーセントは、重量パーセントであり、すべての比率は重量比である。
【００１７】
指示がない限り、すべての分子量は、重量平均分子量である。
【００１８】
指示がない限り、本文書中で参照されたすべての文献出典の内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれる。
【００１９】
実際に測定した値の特定の例を提示する場合を除いて、本明細書で言及される数値は、「約」という言葉により制限されていると考えるべきである。
【００２０】
本明細書で使用する時、「腸の炎症性疾患」には、「過敏性腸症候群−ＩＢＳ」及び「炎症性腸疾患−ＩＢＤ」が挙げられる。
【００２１】
本明細書で使用する時、「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」には、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような腸の炎症を起こす疾患が挙げられる。
【００２２】
（方法及び使用）
本発明は、哺乳動物における腸の炎症性疾患の治療の有効性をインビボで決定する方法であって、
ａ）哺乳類の被験者の生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｂ）少なくとも１つの抗炎症サイトカインの少なくとも１つの炎症促進サイトカインに対する比率を決定する工程；
ｃ）前記治療を施す工程；
ｄ）前記治療を施した後の時点で前記哺乳類の被験者の生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｅ）前記治療を施した後で少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの比率を決定する工程；を含み、
前記治療を施した後での抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の上昇が、腸の炎症性疾患の阻害物質を示し、前記治療を施した後での抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の変わらないこと又は減少が、前記治療は、腸の炎症性疾患の阻害物質ではないことを示す方法を提供することを対象とする。本発明の方法は、治療が施される前に、少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの比率を測定し決定することを含む。これは、治療が始まる前、理想的には治療が始まる直前の０日目に少なくとも１回、本明細書の濃度及び比率を測定／決定することが包含されてよい。あるいは、前記サイトカインの濃度及び比率は、当業者に既知のベースライン測定値を提供するために、治療の始まる前に所定の時間にわたって繰り返し測定／決定してもよい。本発明の方法は、前記治療を施した後の同様の時点で、工程（ｄ）及び（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことを更に含んでよい。更に、本発明の方法は、前記哺乳類の被験者が前記治療をまだ施されている間の同様の時点で、工程（ｄ）及び（ｅ）を少なくとも１回繰り返すことを含んでよい。本発明の方法は、腸の炎症性疾患の治療における未知若しくは新しい治療又は組成物の有効性を、検査するためと、臨床評価するための両方に使用してもよい。更に、本発明の方法は、また、腸の炎症性疾患をもつ個別の患者における既知の治療の有効性をモニターするために使用してもよい。なお更に本明細書の方法は、疾患の診断に役立つ、腸の炎症性疾患の予測バイオマークを提供するために使用してもよい。
【００２３】
加えて、本発明は、腸の炎症性疾患の治療における組成物の有効性をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ｅ）少なくとも１つの消化管由来細胞の種類を含む生体サンプルを準備する工程；
ｆ）前記生体サンプルを組成物によりインビトロで処置する工程；
ｇ）組成物による処置の後の時点で生体サンプル中の少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を測定する工程；
ｄ）組成物による処置の後の時点で生体サンプル中の少なくとも１つの抗炎症サイトカインと少なくとも１つの炎症促進サイトカインとの比率を決定する工程；を含み、
処置された生体サンプルからの工程（ｄ）で決定された比率が、同時に試験された未処理対照生体サンプルで決定された同様の比率よりも大きいと、組成物は、腸の炎症性疾患の阻害物質であることを示し、（ｄ）で決定された比率が未処理対照生体サンプルの比率と同じであるか、又はそれより低いと、組成物は、腸の炎症性疾患の阻害物質ではないことが示されることを特徴とする方法を提供する。
【００２４】
本明細書の方法は、腸の炎症性疾患の治療における治療及び組成物の臨床的有効性を、スクリーニング及び決定するための使用に好適である。これらの疾患には炎症性胃腸疾患が挙げられ、その非限定例の幾つかには、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）及び潰瘍性大腸炎及びクローン病のようなＩＢＤが挙げられる。好ましくは、本明細書の方法は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の治療の有効性を測定するために使用される。
【００２５】
本明細書の治療には、腸の炎症性疾患の治療に使用されるあらゆる治療及び／又は組成物が挙げられる。組成物は、腸の炎症性疾患、好ましくはＩＢＳの治療における、潜在的有効性を決定されるべき１つ以上の成分を含んでよい。そのような組成物の非限定例には、抗炎症性薬剤、プロバイオティクス組成物、腸の炎症性疾患の治療に有効性を有することが知られていない新たな組成物及び化合物、腸の炎症性疾患の治療に有用な既知の薬剤の新たな送達形態を含む、腸の炎症性疾患の症状を緩和することが知られている組成物及び化合物、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００２６】
本発明のインビボでの方法は、また、腸の炎症性疾患を罹患している個人の、腸の炎症性疾患の治療に有用な組成物に対する反応を測定するのに使用される。これは、腸の炎症性疾患に罹患している個人における所定の治療の有効性を決定することができ、医師が、患者の進行をモニターすることでき、患者の治療を最適化するために薬剤の種類か又は送達形態のいずれかを変えることを決定することができる。これは、結果として患者が疾患に対してより良い治療を受けることになり、腸の炎症性疾患に罹患している人々における効果のない治療に浪費されている薬剤の量及び金額を削減することになる。
【００２７】
（インビボでの方法における生体サンプル）
本発明の方法は、前記治療を施される前及び施されている間の両方、又は施された後で、哺乳類の被験者から得た生体サンプルにおけるサイトカインの濃度を測定することを含む。本明細書に用いるのに好適な哺乳類の被験者の非限定例には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ及びラット種を含むげっ歯類被験者、ウサギ又はウマ被験者が挙げられ、好ましくはヒト被験者である。本明細書で有用な生体サンプルは、当業者に周知である。本明細書で使用する時、「生体サンプル」には、尿、血漿、血清、唾液、生検組織、脳脊髄液、インビトロ刺激を有する末梢血単核球、インビトロ刺激のない末梢血単核球、インビトロ刺激を有する消化管リンパ様組織、インビトロ刺激のない消化管リンパ様組織、消化管洗浄液、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましくは本発明のインビボでの方法に使用される生体サンプルは、血清、生検組織、インビトロ刺激を有する末梢血単核球、インビトロ刺激のない末梢血単核球、及びこれらの混合物、より好ましくは、インビトロ刺激を有する末梢血単核球、インビトロ刺激のない末梢血単核球、及びこれらの混合物を含む。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、フィコール・ハイパーク密度遠心分離のような当業者に既知の方法を使用して、ＥＤＴＡ処置非凝固静脈血から採取されてよい。さらにより好ましくは、本発明のインビボでの方法は、インビトロ刺激を有する末梢血単核球を含む生体サンプルを使用する。本明細書で使用する時、インビトロ刺激を有するか、又はそれがない「末梢血単核球」には、新たに採取されたＰＢＭＣ、新たに採取されたＰＢＭＣの全細胞ホモジネート、新たに採取されたＰＢＭＣの抽出タンパク質分留、新たに採取されたＰＢＭＣのｍＲＮＡ転写物、新たに採取されたＰＢＭＣの組織培地上清、冷凍ＰＢＭＣ、冷凍ＰＢＭＣの全細胞ホモジネート、冷凍ＰＢＭＣの抽出タンパク質分留、冷凍ＰＢＭＣのｍＲＮＡ転写物、冷凍ＰＢＭＣの組織培地上清、採取されたＰＢＭＣのインビトロ培養物、採取されたＰＢＭＣのインビトロ培養物全細胞ホモジネート、採取されたＰＢＭＣのインビトロ培養物の抽出タンパク質分留、採取されたＰＢＭＣのインビトロ培養物のｍＲＮＡ転写物、採取されたＰＢＭＣのインビトロ培養物の組織培地上清、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２８】
本明細書で使用する時「インビトロ刺激」には、ドナーの身体以外、典型的には実験室での組織培養設定で生体サンプルを刺激することが挙げられる。好ましくは刺激は、当業者に既知のマイトジェン、プロバイオティクス、抗−ＣＤ３分子、及びこれらの混合物を含む。より好ましくは、刺激は、マイトジェン、プロバイオティクス、及びこれらの混合物を含む。
【００２９】
本明細書で使用する時、「マイトジェン」には、Ｔ又はＢ細胞に高い割合で細胞分裂を誘発することができる物質が挙げられる。本明細書で有用なマイトジェンの好適な例には、レクチン、細菌性リポ多糖体、スーパー抗原及びこれらの混合物が挙げられる。本明細書で使用する時、「スーパー抗原」には、Ｔ細胞受容体がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合している抗原ペプチドを認識しない場合でさえも、Ｔ細胞受容体のＶ（可変）ドメインにおける残基及び抗原結合間隙の外側のＭＨＣクラスＩＩ分子における残基に結合することができる物質が挙げられる。本明細書で有用なスーパー抗原の好適な例には、ブドウ球菌外毒素、中毒性ショック症候群毒素１、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましくは、マイトジェンは、レクチン、細菌性リポ多糖体、及びこれらの混合物を含む。本明細書で有用なレクチンの好適な例には、コンカナバリンＡ（タチナタマメから単離）、フィトヘマグルチニン（インゲンマメから単離）、ポークウィードマイトジェン（アメリカヤマゴボウから単離）及びこれらの混合物、好ましくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）が挙げられる。本明細書で有用な細菌性リポ多糖体の好適な例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０５５：Ｂ５、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−２３５（すべてシグマ（Sigma）（ミズーリ州、セントルイス）より入手可能）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella Minnesota）、サルモネラ・ティフィムリウム、フレクスナー赤痢菌、肺炎悍菌（Klebisella pneumonia）、緑膿菌、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３０】
プロバイオティクス菌は、宿主に有益な効果を与える微生物又は微生物の加工組成物である。プロバイオティクス菌がどのように宿主に有益な効果を与えるかは不明である。本発明の目的においては、「プロバイオティクス菌」は、別個に示されていない場合には、発酵プロセスの際に微生物により生み出される代謝産物を包含することが更に意図される。これらの代謝産物は、発酵の媒質から放出されることがあるか、又は微生物の体内に保存されることがある。本明細書で使用する時、「プロバイオティクス」は、また、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌性抽出物、細菌性上清、及びこれらの混合物も包含し、これらは、治療用量で与えられると宿主に対して有益な働きをする。従って、イースト菌、糸状菌及び細菌も包含されてよい。ＥＰ０８６２８６３は、現在知られているプロバイオティクス菌の幾つかの例を示している。本明細書で有用なプロバイオティクス菌の好適な例は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・インファンティス（Bifidiobacterium longum infantis）（ＮＣＩＭＢ３５６２４）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭＩー１２２５）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）（ＤＳＭ２０２１５）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）（ＣＮＣＭＩ−２２１６）の菌株、及びこれらの混合物を含む。本明細書で有用なプロバイオティクス菌の更なる非限定例は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０３／１０２９７Ａ１、同ＷＯ０３／０１０２９８Ａ１、同ＷＯ０３／０１０２９９Ａ１（すべて２００３年２月６日発行、アリメンタリ・へスル社（Alimentary Health Ltd）に譲渡）で記載されている。
【００３１】
（インビトロでの方法における生体サンプル）
本発明のインビトロでの方法は、少なくとも１つの消化管由来細胞の種類を含む生体サンプルを使用する。インビトロでの方法における消化管由来細胞の種類の使用は、例えば、末梢血単核細胞（mononucleocyte）のような他の組織に関わる従来技術のインビトロでの方法よりも有利であることが分かった。理論に束縛されることなく、これは、スクリーニングを受ける、腸の炎症性疾患を治療している組成物と、消化管との間の相互作用が、インビボで何が起きているかをより良く示しているからと考えられる。本明細書のインビトロスクリーニングの方法は、腸の炎症性疾患の潜在的治療をより容易に同定し、臨床有効性との相関関係が改善されることが分かった。理論に束縛されることなく、腸の炎症性疾患において、炎症反応を媒介するのに中心的な役割を果たすのは消化管組織であり、従って、インビトロで消化管由来細胞の種類のサイトカインの比率を有利に変えるこれらの組成物は、インビボにおいても効果を有する可能性が高いという事実によると考えられる。
【００３２】
本明細書で使用する時、「消化管由来細胞の種類」には、哺乳類の消化管又は消化管関連組織に由来する細胞の種類及び細胞株が挙げられ、前記組織には、胃、十二指腸、空腸、回腸、リンパ様、腸間膜、腋窩、鼠経、膝窩、骨髄、盲腸、結腸、虫垂及び直腸が挙げられる。更にそのような細胞の種類には、また、前記組織から新たに単離された細胞、及びインビトロで日常的に培養され、続いて上記組織から単離される、非永久増殖細胞株、発癌性そうでなければ永久増殖細胞株を包含する細胞の種類も挙げられる。好ましくは、インビトロでの方法は、新たに単離されたか、又はそのインビトロ細胞培養物であるかのいずれかの、消化管関連リンパ様組織を含む生体サンプルを使用する。より好ましくは、生体サンプルは、新たに単離されたか、又はそのインビトロ細胞培養物であるかのいずれかの、腸間膜リンパ節細胞を含む。
【００３３】
更に本発明のインビトロでの方法は、上記工程（ｃ）の前に生体サンプルを刺激する更なる工程を追加的に含んでよい。本明細書で使用する時、「インビトロ刺激」には、ドナーの身体の外側、典型的には実験室の組織培養設定で生体サンプルを刺激することが挙げられる。好ましくは刺激は、当業者に既知のマイトジェン、プロバイオティクス、抗−ＣＤ３分子、及びこれらの混合物を含む。より好ましくは、刺激は、マイトジェン、プロバイオティクス、及びこれらの混合物を含む。
【００３４】
本明細書で使用する時、「マイトジェン」には、Ｔ又はＢ細胞に高い割合で細胞分裂を誘発することができる物質が挙げられる。本明細書で有用なマイトジェンの好適な例には、レクチン、細菌性リポ多糖体、スーパー抗原及びこれらの混合物が挙げられる。本明細書で使用する時、「スーパー抗原」には、Ｔ細胞受容体がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合している抗原ペプチドを認識しない場合でさえも、Ｔ細胞受容体のＶ（可変）ドメインにおける残基及び抗原結合間隙の外側のＭＨＣクラスＩＩ分子における残基に結合することができる物質が挙げられる。本明細書で有用なスーパー抗原の好適な例には、ブドウ球菌外毒素、中毒性ショック症候群毒素１、及びこれらの混合物が挙げられる。好ましくは、マイトジェンは、レクチン、細菌性リポ多糖体、及びこれらの混合物を含む。本明細書で有用なレクチンの好適な例には、コンカナバリンＡ（タチナタマメから単離）、フィトヘマグルチニン（インゲンマメから単離）、ポークウィードマイトジェン（アメリカヤマゴボウから単離）及びこれらの混合物、好ましくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）が挙げられる。本明細書で有用な細菌性リポ多糖体の好適な例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４、Ｅ．ｃｏｌｉ  ０５５：Ｂ５、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−２３５（すべてシグマ（Sigma）（ミズーリ州、セントルイス）より入手可能）、サルモネラ・ミネソタ（Salmonella Minnesota）、サルモネラ・ティフィムリウム、フレクスナー赤痢菌、肺炎悍菌（Klebisella pneumonia）、緑膿菌、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３５】
プロバイオティクス菌は、宿主に有益な効果を与える微生物又は微生物の加工組成物である。プロバイオティクス菌がどのように宿主に有益な効果を与えるかは不明である。本発明の目的においては、「プロバイオティクス菌」は、別個に示されていない場合には、発酵プロセスの際に微生物により生み出される代謝産物を包含することが更に意図される。これらの代謝産物は、発酵の媒質から放出されることがあるか、又は微生物の体内に保存されることがある。本明細書で使用する時、「プロバイオティクス」は、また、細菌、細菌性ホモジネート、細菌性タンパク質、細菌性抽出物、細菌性上清、及びこれらの混合物も包含し、これらは、治療用量で与えられると宿主に対して有益な働きをする。従って、イースト菌、糸状菌及び細菌も包含されてよい。ＥＰ０８６２８６３は、現在知られているプロバイオティクス菌の幾つかの例を示している。本明細書で有用なプロバイオティクス菌の好適な例は、ビフィドバクテリウム・ロンガム・インファンティス（Bifidiobacterium longum infantis）（ＮＣＩＭＢ３５６２４）、ラクトバシラス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭＩー１２２５）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）（ＤＳＭ２０２１５）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）（ＣＮＣＭＩ−２２１６）の菌株、及びこれらの混合物を含む。本明細書で有用なプロバイオティクス菌の更なる非限定例は、ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ０３／１０２９７Ａ１、同ＷＯ０３／０１０２９８Ａ１、同ＷＯ０３／０１０２９９Ａ１（すべて２００３年２月６日発行、アリメンタリ・へスル社（Alimentary Health Ltd）に譲渡）で記載されている。
【００３６】
（サイトカイン）
本発明の方法は、少なくとも１つの抗炎症及び少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を、哺乳類被験者から得た生体サンプルにおいて測定する工程を含む。インビボでの方法では、前記サンプルは、関心のある組成物による処置の前と後の両方で回収される。サイトカインは多面発現性があり、生物学的に重複する複数の活性を発現することが当業者に知られている。それ故に、本明細書で有用なサイトカインは、本発明の系ではその炎症活性により分類されるが、そのような成分のあるものは、場合によっては１つを超える免疫反応を提供できることが理解されるべきである。従って、本明細書の分類は、便宜上なされている。
【００３７】
本発明に有用な抗炎症サイトカインは、当該技術分野において既知のものを含む。本明細書で有用な抗炎症サイトカインの非限定例には、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−１３、インターロイキン−１０、トランスホーミング増殖因子−β、及びこれらの混合物が挙げられる。本発明での使用に好ましい抗炎症サイトカインには、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０：目録番号：ＣＡＡ５５２０１；ＧＩ目録ＩＤ：１４６２５９４０）、トランスホーミング増殖因子−βイソ型１、２、３及び４、並びにこれらの混合物が挙げられる。本発明で有用な炎症促進サイトカインは、当該技術分野において既知のものを含む。本明細書で有用な炎症促進サイトカインの非限定例には、インターロイキン−２、ヘテロ二量体インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、インターフェロン−γ、及びこれらの混合物が挙げられる。本明細書で有用な好ましい炎症促進サイトカインには、ヘテロ二量体インターロイキン−１２、（ＩＬ−１２：目録番号：鎖Ａ；１Ｆ４５Ａ、鎖Ｂ；１Ｆ４５Ｂ；ＧＩ目録ＩＤ：鎖Ａ；１４７９６４０；鎖Ｂ；１４７９６４１）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ：目録番号：ＡＡＣ０３５４２；ＧＩ目録ＩＤ：２９０５６３４）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ：目録番号：ＮＰ＿００６１０；ＧＩ目録ＩＤ：１０８３５１７１）、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００３８】
（濃度の測定手段）
本発明の方法によると、少なくとも１つの抗炎症サイトカイン及び少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度が生体サンプルにおいて測定される。抗炎症サイトカイン若しくは炎症促進サイトカイン、又はその両方の濃度を測定する手段は、当業者に既知の方法を含む。前記抗炎症サイトカイン及び前記炎症促進サイトカインの濃度は、当業者に既知である、ｍＲＮＡ発現又はタンパク質発現を測定することにより測定されてよい。そのような方法の非限定例には、免疫吸着アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、マイクロアレープラットホームによるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタンブロット、クロマトグラフ系分離システム、ＲＴ−ＰＣＲ、競合逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、遺伝子アレイ、ｍ−ＲＮＡの直接測定、及びこれらの混合、好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、クロマトグラフ系分離システム、ウェスタンブロット、及びこれらの混合が挙げられる。より好ましくは、手段は、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡを含む。本発明の方法での使用に好適なＥＬＩＳＡは当業者に既知のものを含み、その非限定例には、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、直接サンドイッチＥＬＩＳＡ、間接サンドイッチＥＬＩＳＡ、及びこれらの混合が挙げられる。本明細書に用いるのに好適な、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いる市販のマルチプレックスＥＬＩＳＡの非限定例は、バイオ・ラド社（Bio Rad GmbH）製のバイオプレックス・ビーズ・フロー・サイトメーター（商標）（BIOPLEX BEAD FLOW CYTOMETER（Trademark））と連結している、米国ミズーリ州のリンコ・リサーチ社（Linco Research Inc.）から入手可能なリンコプレックス（LINCOplex）キットアッセイである。
【００３９】
（比率）
本発明の方法は、少なくとも１つの抗炎症サイトカインの少なくとも１つの炎症促進サイトカインに対する比率を決定する工程を含む。インビボでの方法によると、これらの濃度は、処置を施す前と、処置の間か又は処置が完了した後のいずれかで同様の比率を決定することの両方により測定される。インビトロでの方法において少なくとも１つの抗炎症サイトカインと、少なくとも１つの炎症促進サイトカインの濃度を処置サンプルで測定し、非処置対照生体サンプルが同時に試験される。対照生体サンプルは、処置群で使用される生体サンプルと同じものに由来しなければならず、当業者に既知の方法及び原則を使用して未処置対照として実施されなければならない。本明細書で使用する時、抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率は、炎症促進サイトカインの濃度で割った抗炎症サイトカインの濃度を意味する。そのような比率は、下記式により記載されることができる
比率＝抗炎症サイトカインの濃度／炎症促進サイトカインの濃度
理論に束縛されるものではないが、本発明によると、本明細書で決定される比率が、処置が始まる前又は未処置対照生体サンプルで決定された比率と比較して、処置の後又はその間で上昇すると、処置は、腸の炎症性疾患の阻害物質であると見なされると考えられる。本明細書の比率は、本明細書におけるあらゆる抗炎症サイトカイン及びあらゆる炎症促進サイトカインを使用して決定することができる。好ましくは、本明細書で有用な比率は、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率、ＩＬ−１０／ＩＦＮ−γの比率、ＩＬ−１０／ＴＮＦ−αの比率、及びこれらの混合である。理論に束縛されるものではないが、本明細書で記載される特定の比率は腸の炎症性疾患の進行又は寛解に対して重要であり、従って、本明細書の比率の変化は、調査されている処置により影響を受ける疾患の阻害又は促進を示すと考えられる。腸の炎症性疾患をもつ個人は、炎症性の状態を示す歪曲されたサイトカインの特徴を有する。同様に、腸の炎症性疾患の阻害物質による治療の後で最大の変化を示す、本明細書で使用されるサイトカインは、これらの疾患を罹患している人がＴｈ−１活性に偏っているＰＢＭＣを有し、正常なＴｈ−１／Ｔｈ−２サイトカイン平衡を変えることを示す。驚くべきことに、本明細書で記載される比率が上昇することにより、腸の炎症性疾患の症状が緩和されうることが分かった。理論に束縛されるものではないが、これは、腸の炎症性疾患に罹患している人においてこれらの比率が上昇することにより、処置が比率を健康な被験者に見られるレベルに戻すか、又はそれに近づける事実によると考えられる。
【００４０】
（キット）
本発明によると、本発明の方法を実施するためにキットが提供される。好ましくはキットは、処置の前及び処置の後又はその間の少なくとも１時点で、哺乳類被験者からの生体サンプルにおいて少なくとも１つの抗炎症サイトカインを測定する第１測定要素又は系、及び処置の前及び処置の後又はその間の少なくとも１時点で、前記哺乳類被験者からの生体サンプルにおいて少なくとも１つの炎症促進サイトカインを測定する第２測定要素又は系を含み、処置を施した後、抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率の変化を決定することができる。そのような測定要素又は系には、当業者に既知のものを挙げてもよく、その非限定例には、免疫吸着アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、マイクロアレープラットホームによるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ、ウェスタンブロット、クロマトグラフ系分離システム、ＲＴ−ＰＣＲ、競合逆転写ＰＣＲ、ノーザンブロット、遺伝子アレイ、ｍ−ＲＮＡの直接測定、及びこれらの混合、好ましくは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡ、クロマトグラフ系分離システム、ウェスタンブロット、及びこれらの混合、より好ましくは、フロー・サイトメーター検知システムと連結し、コードされたミクロスフェアを用いるマルチプレックスＥＬＩＳＡが挙げられる。本発明のキットは、被験者から生体サンプルを得る手段を更に含んでよい。そのような手段は、静脈血を収集する静脈血収集管及び装置、尿又は唾液用の試料管、静脈血からＰＢＭＣを分離する手段、及びこれらの混合物を含んでよい。
【００４１】
更に本発明のキットは、使用指示書を含んでよい。使用指示書は、本発明の比率をどのようにして決定するかを示す言葉、及び／又は行った方法による結果の意味を示す言葉を含む。そのような指示書の非限定例は、抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインの濃度に対する比率の上昇が、腸の炎症性疾患の阻害物質を示すことを指示する言葉を包含する。
【実施例】
【００４２】
（インビボ方法論）
健康な成人１０人及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を自己報告した１３人の患者は、１０8コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌのビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４を含有するミルク１００ｍｌのプロバイオティクス調製物を毎日３週間摂取した（ＩＢＳの潜在的治療）。プロバイオティクス調製物の経口摂取の前と後で各被験者から静脈血が取られた。静脈血は、血液収集管（ナトリウムヘパリンを含有するＣＰＴ（商標）バクテイナー（VACUTAINER）細胞分離管、ニュージャージー州、フランクリン・レークス、ベクトン・ディキンソン（Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ））に収集された。ＰＢＭＣが、遠心分離４００ｘｇを使用して血液から単離され、続いて当業者に既知の適切な細胞培養条件でインビトロで培養された。１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、２．５μｇ／ｍｌフンギソン（ギブコ）、２９２μｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン（ギブコ）及び１０％ウシ胎児血清（＃１１０３１５５、ギブコ）により補充されたダルベッコ最小必須培地（Dulbecco's Minimum Essential Media）（ＤＭＥＭ）が、ウシ胎児血清が除かれたＴＦＧ−βの測定以外は、すべての細胞培養物において本明細書で使用された。単離されたＰＢＭＣ懸濁液は、生存細胞カウントの１．３×１０6／ｍｌに調整され、培地中に単独（刺激なし）で又は０．１μｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１１１Ｂ４リポ多糖体（シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）、１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−シグマ（Sigma）、ミズーリ州セントルイス）若しくは１０7ＣＦＵ／ｍｌ全ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４と共に、３日間培養された。続いて、細胞懸濁液がマイクロチューブに収集され、ＭＲＸ−１５２微量遠心管（トミー・テック（Tomy Tech）、カリフォルニア州パウロ・アルト）で１０４７Ｒａｄ／ｓ（１００００ｒｐｍ）、４℃で３分間遠心分離し、上清が分析のために収集された。
【００４３】
上清中のサイトカインの量が、市販のバイオプレックス・ビーズ・フロー・サイトメーター（商標）（BIOPLEX BEAD FLOW CYTOMETER（バイオ・ラド（Bio Rad）、カリフォルニア州ハーキュレス））中のリンコプレックス（LINCOplex）キットアッセイ（リンコ・リサーチ社製（Linco Research Inc.）、米国ミズーリ州）を使用して分析された。培養上清２５μｌは、サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ）、及びトランスホーミング増殖因子−β（ＴＧＦ）に特異的な抗体で被覆された微小球ビーズのパネルと共にインキュベートされた（米国ミズーリ州リンコ・リサーチ社製のリンコプレックスキットアッセイ（LINCOplex kit assay from Linco Research Inc.,Missouri,US））。ビーズ混合物は洗浄され、ストレプトアビジン−フィコエリトリンと共に室温で３０分間更にインキュベートされた。同時に、連続希釈で調製された対照と標準も上記手順でインキュベートされた。ビーズ懸濁液が洗浄され、バイオプレックス（BBIOPLEX）システムによる読み取りのため緩衝剤に再懸濁された。サイトカイン濃度はｐｇ／ｍｌの単位で定量化された。サイトカイン濃度は個体群及び摂取効果の両方において、スチューデントの対ｔ検定により統計的に分析された。
【００４４】
プロバイオティクスのビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４の３週間にわたる毎日の経口摂取は、ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４によるインビトロ刺激により、ＩＢＳ患者のＰＢＭＣにおけるＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率を１１．２±３．９（平均±標準誤差）から４０９．５±９５．２に上昇させた。同様に、ＩＢＳ群のＰＢＭＣが、乳酸菌２９９Ｖ及び乳酸菌ＧＧを含む他のプロバイオティクス菌によりインビトロで刺激されたとき、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２の比率に同様の上昇が観察された（図１を参照）。
【００４５】
加えて、摂取後のＩＢＳ患者のＰＢＭＣへのプロバイオティクスの刺激（ビフィドバクテリウム）が、ＩＬ−１０／ＴＮＦ−αの比率を０．１±０．０から２．０±０．５に上昇させることを示し、また同様の結果が、乳酸菌４３３１及び乳酸菌２９９Ｖを含む他のプロバイオティクス菌による刺激の後で見られた（図２を参照）。また、プロバイオティクスのビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４での刺激により、処置の後、IL−１０／IFN−γの比率が０．７±０．１から１４．１±２．３に上昇する結果となった（図３を参照）。
【００４６】
更に、平均腹部疼痛／不快感が減少し、ＩＬ−１０のＬＩ−１２に対する平均比率が、ビフィドバクテリウム・インファンティスで治療されたＩＢＳ患者で上昇したことが観察された。腹部疼痛／不快感の変化と、ＩＬ−１０のＩＬ−１２に対する比率の変化の間の負の相関関係は、ＩＬ−１０のＩＬ−１２に対する比率の上昇が、ＩＢＳ症状の腹部疼痛／不快感の軽減と関連があることを示した（図１を参照）。
【００４７】
（インビトロ方法論）
この試験は、コーク大学付属病院の倫理委員会（the Ethics Committee of Cork University Hospital）により承認された。腸間膜リンパ節は、活性ＩＢＤをもつ患者１０人（ｎ＝１０：年齢範囲１９〜４１歳（平均３２．２歳）、女性３人、男性７人：ＣＤの患者が５人；ＵＣの患者が５人）から得た。すべての患者に対して処方箋が作られ、患者は５’−アミノサリチル酸を摂取した。疾患の進行のため、及びステロイドに反応しなかったために、全ての患者に外科的切開が必要であった。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、活発な炎症性腸疾患を有する患者（ｎ＝１２）から得た。年齢は２０〜５１歳の範囲（平均２８歳）であった。女性５人及び男性７人が試験され、ＣＤの患者が５人であり、ＵＣの患者が７人であった。
【００４８】
（腸間膜リンパ節細胞（ＭＬＮＣ）単離）
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）が、腸の炎症領域に対する解剖学的部位を注意深く考慮しながらこの試験のために選択された。選択されたＭＬＮを、腸の炎症領域から直接排出した。この試験群内の３人の患者から、炎症を起こしている腸及び炎症を起こしていない腸のＭＬＮ排出セグメントを得ることができた。単一細胞懸濁液は、組織を、１８０μメッシュワイヤスクリーンを通して穏やかに押出することによりＭＬＮから産出された。細胞は洗浄され、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ変性ワシ培地（Dulbecco's modified eagle medium）（インビロゲン（Invitrogen）、英国ペイズリー）に再懸濁された。単核球がフィコール・ハイパーク密度遠心分離で単離され、完全培地−２５ｍＭグルコース、１０％ＦＣＳ、１％非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（インビトロゲン（Invitrogen）、英国ペイズリー）に１×１０6細胞／ｍｌで再懸濁された。これらの単核球は、腸間膜リンパ節細胞（ＭＬＮＣ）と呼ばれる。
【００４９】
（樹状細胞の単離）
ＭＬＮからのＤＣ及び末梢血は、同様の手順を使用して単離された。細胞は、４％ＦＣＳを有するＰＢＳ（Ｃａ2+又はＭｇ2+無含有）中に５×１０7細胞／ｍｌで再懸濁された。ＤＣの最適な回収のために、１ｍＭ  ＥＤＴＡがすべての培地に添加され、細胞懸濁液が抗−ＣＤ３２抗体（ステムセル（StemCell）、フランス、メイラン）でブロックされた。ＤＣは、ＤＣネガティブ単離（negative isolation）キット（ステムセプ（StemSep）（商標）枯渇カクテル（depletion cocktail）、ステムセル、フランス、メイラン）を使用して、製造会社のプロトコールに従って、この細胞懸濁液から単離された。ＤＣは、ステムスパン（Stemspan）血清無含有培地（ステムセル、フランス国メイラン）中に１×１０6細胞／ｍｌで再懸濁された。トリパンブルー排除により決定される生存能力は、一貫して≧９８％であった。ＤＣ調製物の純度は、フローサイトメトリーを使用して査定した。ＨＬＡ−ＤＲ陽性であり、且つＣＤ３／ＣＤ１４／ＣＤ１６／ＣＤ１９／ＣＤ２０／ＣＤ５６陰性である細胞は、ＤＣと呼ばれる。すべての抗体は、ＢＤバイオサンエンス（Biosciences）（英国オックスフォード）から得た。
【００５０】
（細菌株）
乳酸菌サリバリウス（salivarius）ＵＣＣ１１８（Ｌ．サリバリウス）及びビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４（Ｂ．インファンティス）の単離の選択基準について以前に報告した。Ｌ．サリバリウス及びＢ．インファンティスは、日常的に、それぞれデマン（deMann）、ロゴサ（Rogosa）及びシャープ（Sharpe）培地、ＭＲＳ（オキソイド、英国バシングストーク）と、０．０５％システイン（シグマ、アイルランド、ダブリン）で補充されているＭＲＳに嫌気的に２４〜４８時間培養された。サルモネラ・ティフィムリウムＵＫ１（Ｓ．ティフィムリウム）は、トリプシンダイズブイヨン（オキソイド、英国バシングストーク）に嫌気的に１８〜２４時間培養された。細菌培養物は遠心分離（３，０００ｇ×１５分）で採取され、ＰＢＳで洗浄され、続いて希釈されて、ＤＭＥＭ中に最終細胞密度１×１０7、１×１０5及び１×１０3コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌを含む組成物が形成された。
【００５１】
（生体サンプルのインビトロでの処置）
すべての細胞が２４ウエル組織培養プレート（コスター、オランダ、スキポール−レイケ）に１×１０6細胞／ｍｌで接種された。ＭＬＮＣは、３つの異なる細菌濃度１×１０7ＣＦＵ、１×１０5ＣＦＵ及び１×１０3ＣＦＵでＬ．サリバリウス、Ｂ．インファンティス又はＳ．ティフィムリウムを含む組成物により７２時間刺激を受けた。１×１０7細菌での処置により、サイトカイン産生が有意に刺激されたので、この細菌濃縮は次の実験に使用された。炎症を起こしていない腸からのＭＬＮＣは、これらの細菌により１×１０7ｃｆｕで７２時間刺激を受けた。ＭＬＮ由来ＤＣは、Ｌ．サリバリウス、Ｂ．インファンティス又はＳ．ティフィムリウムにより２４時間刺激を受けた。未処理対照生体サンプルは、サイトカイン分泌の自然濃度を査定するために提示された。プレートは、５％ＣＯ2及び３７℃加湿環境でインキュベートされ、その後、上清がサイトカイン分析のために採取された。サイトカイン産生は、市販のエリサ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄシステム（R&D Systems）、英国アビントン）を使用して、製造会社の指示書に従って測定された。測定されたサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βを包含した。
【００５２】
（統計分析）
結果は、ＡＮＯＶＡ分析を使用して分析された。値は、平均±標準誤差として示される。刺激を受けていない細胞（対照）と細菌で刺激された細胞との間のサイトカイン産生における統計的に有意な差は、ｐ＜０．０５で認められた。
【００５３】
（結果）
図４、５及び６から分かるように、消化管由来細胞の種類によりインビトロで産生され、続いてプロバイオティクス細菌（Ｂｉｆ．３５６２４及びＬｂ．１１８）で刺激を受けた、抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率は、刺激を受けていない対照サンプルにより生じた同様の比率よりも大きい。この傾向は、必ずしも統計的に有意には成らないが、プロバイオティクス組成物及び腸の炎症性疾患の治療に有益であるかもしれない組成物一般が、病原菌と比較してインビボで消化管に対して異なる相互作用を有することを示す。これは、組成物が腸の炎症性疾患の阻害物質であることを示していると考えられる。図４、５及び６から分かるように、病原菌（サルモネラ菌）による刺激は、刺激を受けていない対照サンプルと比較すると、抗炎症サイトカインの炎症促進サイトカインに対する比率に差を生じないか、又はより典型的には前記比率に減少を生じる。この場合も、この差は必ずしも統計的に有意には成らないが、これは、腸の炎症性疾患の阻害物質ではない、組成物を示す。
【００５４】
【表１】
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ビフィドバクテリウム・インファンティスを摂取したＩＢＳ患者におけるＩＬ−１０のＩＬ−１２に対する比率の変化と、腹部疼痛／不快感スコアの変化との間の負の関連の統計的優位性を試験する、ピアソン相関係数及びｐ値を示す表。ビフィドバクテリウム・インファンティスの摂取前から摂取後で、ＩＬ−１０とＩＬ−１２との平均比率が上昇し、腹部疼痛／不快感平均スコアが減少したことに留意すること。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】ビフィドバクテリア属インファンティス（Bifidobacteria infantis）により摂取前及び後の両方で刺激をインビトロで受けたＩＢＳ患者のＰＢＭＣから発生したＩＬ−１０とＩＬ−１２との平均比率を示す棒グラフ。
【図２】ビフィドバクテリア属インファンティス（Bifidobacteria infantis）により摂取前及び後の両方で刺激をインビトロで受けたＩＢＳ患者のＰＢＭＣから発生したＩＬ−１０とＴＮＦ−αとの平均比率を示す棒グラフ。
【図３】ビフィドバクテリア属インファンティス（Bifidobacteria infantis）により摂取前及び後の両方で刺激をインビトロで受けたＩＢＳ患者のＰＢＭＣから発生したＩＬ−１０とＩＦＮ−γとの平均比率を示す棒グラフ。
【図４】インビトロで刺激を受けた腸間膜リンパ節細胞（ＭＬＮＣ）により産生された、抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの比率を示す棒グラフ。
【図５】インビトロで刺激を受けたパイエル板細胞（ＰＰ）により産生された、抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの比率を示す棒グラフ。
【図６】インビトロで刺激を受けた腸間膜リンパ節細胞由来樹状細胞（ＭＬＮＣ  ＤＣ）により産生された、抗炎症サイトカインと炎症促進サイトカインとの比率を示す棒グラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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