(57)【要約】炎症抑制の標的としての新規のタンパク質が記載される。該タンパク質の製造方法及び抗炎症剤の同定のためのアッセイにおける該タンパク質の使用が記載される。該タンパク質をコードする遺伝子についてのノックアウトマウスの作成方法も記載される。
2006504398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
P-Rex1、又はP-Rex1活性を保持するその誘導体のアミノ酸配列を含む、実質的に単離された形態のタンパク質。
【請求項２】
Rac-GEF活性を保持するP-Rex1誘導体のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ヒトP-Rex1のアミノ酸配列（配列番号：１）を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号：２〜８のうちの１以上のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする配列を含む、実質的に単離された形態の核酸。
【請求項６】
ストリンジェントな条件下で、請求項５に記載の核酸、又は請求項５に記載の核酸に相補的な核酸にハイブリダイズすることのできる、実質的に単離された形態の核酸。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸に相補的な、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
好ましくは、発現ベクターである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、又は昆虫細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法であって、上記タンパク質の発現のための条件下で、上記タンパク質の発現を導くことのできるベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項１２】
P-Rex1を発現させる方法であって、それによってP-Rex1の発現が挿入されたプロモーターの制御下にあるように、P-Rex1をコードする染色体DNAの上流に挿入することのできるプロモーターを含むベクターで、P-Rex1をコードする染色体DNAを含む宿主細胞を形質転換することを含む、前記方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質に結合することのできる抗体。
【請求項１４】
上記タンパク質に特異的なエピトープを認識する、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を増幅するための、オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１６】
P-Rex1活性に拮抗することのできるP-Rex1の断片又は誘導体。
【請求項１７】
P-Rex1の発現を阻害することのできる、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
P-Rex1活性、P-Rex1の結合パートナーとの結合、又はP-Rex1発現の阻害物質。
【請求項１９】
それによってP-Rex1遺伝子からのP-Rex1の発現を阻害するために、上記遺伝子との相同性組み換えを行うことのできる核酸を含む、ベクター。
【請求項２０】
分裂させられたP-Rex1遺伝子に対しヘテロ接合性又はホモ接合性である、非ヒト組み換え動物。
【請求項２１】
P-Rex1遺伝子ノックアウトマウス、又はP-Rex1遺伝子ノックインマウス。
【請求項２２】
上記タンパク質のアフィニティー精製を可能とする精製タグをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
上記タンパク質の検出を可能とする標識を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項２４】
上記標識が蛍光物質又は放射性標識である、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項２６】
緑色蛍光タンパク質（GFP）、或いは蛍光活性を有するGFPの異形又は誘導体を含む、請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
上記融合タンパク質のアフィニティー精製を可能とする精製タグをさらに含む、請求項２５又は２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
薬物発見の標的としての、請求項１〜４、又は２２〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２９】
炎症、転移、敗血症ショック、神経変性、又はアテローム性動脈硬化を減少又は阻害することのできる薬物の発見のための、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質、P-Rex1活性の調節物質、又はP-Rex1発現の調節物質を同定するためのスクリーニングアッセイにおける、請求項１〜４、２２〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質、又は請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項３１】
P-Rex1活性の調節物質を同定する方法であって、請求項１〜４又は２２−２７のいずれか１項に記載のタンパク質と、調節物質候補を接触させること、及び上記タンパク質の活性が上記調節物質候補によって調節されるか否かを決定することを含む、前記方法。
【請求項３２】
上記調節物質候補によって上記タンパク質の活性が調節されることが見出された場合、上記調節物質候補を同定することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質を同定するための方法であって、以下のステップ：
調節物質候補の存在下及び非存在下で、請求項１〜４、又は２２〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質を、結合パートナーと接触させること；及び
上記タンパク質と上記結合パートナーとの結合が、上記調節物質候補によって調節されるか否かを決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項３４】
上記結合パートナーが、PIP3、Gβγ−サブユニット、Rac、PIP3含有固定化膜、蛍光標識されたGroP-Ins(3,4,5)P4又はPIP3、蛍光標識されたGβγ−サブユニット、蛍光標識されたRac,或いは上記タンパク質に結合可能なそれらの誘導体のうちの１以上である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
上記タンパク質が結合パートナーとしてのRac-GDP、及びGTP又は加水分解不可能なGTPのアナログと接触させられる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
上記タンパク質の結合パートナーへの結合が、調節物質候補によって調節されることが見出された場合に、調節物質候補を同定することをさらに含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質、P-Rex1活性の調節物質、又はP-Rex1発現の調節物質を同定するための、細胞に基づくアッセイの使用。
【請求項３８】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質、又はP-Rex1活性の調節物質を同定するための、細胞に基づくアッセイであって、以下のステップ：
調節物質候補の存在下及び非存在下において、P-Rex1と結合パートナーとの結合のための刺激物質又はP-Rex1の活性化のための刺激物質で細胞を刺激すること；及び
上記調節物質候補がP-Rex1と上記結合パートナーとの結合又はP-Rex1の活性を調節するか否かを決定すること；
を含む、前記アッセイ。
【請求項３９】
上記細胞が、野生型の細胞、又は上記細胞中でP-Rex1の発現を導く外因性の核酸を含む細胞である、請求項３８に記載のアッセイ。
【請求項４０】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質又はP-Rex1活性の調節物質を同定するための、細胞に基づくアッセイであって、以下のステップ：
請求項２３、２４又は２６のいずれか1項に記載のタンパク質、又は内因性のP-Rex1から識別可能な、P-Rex1活性を有するP-Rex1の異形を提供すること；
調節物質候補の存在下及び非存在下で、P-Rex1と結合パートナーとの結合のための刺激物質又はP-Rex1の活性化のための刺激物質で上記細胞を刺激すること；及び
上記調節物質候補が、P-Rex1と結合パートナーとの結合又はP-Rex1の活性を調節するか否かを決定すること；
を含む、前記アッセイ。
【請求項４１】
上記調節物質候補が上記結合又はP-Rex1の活性を調節することが見出された場合に、上記調節物質候補を同定することをさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項４２】
P-Rex1の上記結合又は活性が、スーパーオキサイド形成、化学走性によって、又はリポーター遺伝子の発現、蛍光の使用、１の細胞内位置若しくはコンパートメントから他へのタンパク質の移動の測定によって、或いはラメリポディア形成を調べることによって、決定される、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項４３】
上記刺激物質がスーパーオキサイド形成、化学走性、又はラメリポディア形成を刺激する、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項４４】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質又はP-Rex1の活性の調節物質を同定するための、細胞に基づくアッセイであって、以下のステップ：
調節物質候補の存在下及び非存在下において、細胞中でP-Rex1を過剰発現させること；及び
ラメリポディア形成が、上記調節物質候補によって変化させられたか否かを決定すること；
を含む、前記アッセイ。
【請求項４５】
請求項３１〜４４のいずれか１項に記載の方法又はアッセイにおける、請求項１〜４、又は２２〜２７のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項４６】
P-Rex1の不活性突然変異体。
【請求項４７】
請求項４６に記載の突然変異体をコードする核酸。
【請求項４８】
野生型P-Rex１よりも高い親和性をもって、請求項４６に記載の突然変異体を結合することのできる抗体。
【請求項４９】
組み換えP-Rex1陰性細胞。
【請求項５０】
細胞であって、該細胞中でP-Rex1の発現を阻害する阻害物質を含む、前記細胞。
【請求項５１】
上記阻害物質がP-Rex1アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５０に記載の細胞。
【請求項５２】
請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の細胞からの抽出物。
【請求項５３】
請求項４６〜５２のいずれか１項に記載の突然変異体、核酸、抗体、細胞、又は抽出物の、スクリーニングアッセイにおける使用。
【請求項５４】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質、又はP-Rex1活性の調節物質を同定するためのスクリーニングアッセイにおける、対照としての、請求項４６、４９〜５２のいずれか１項に記載の突然変異体、細胞、又は抽出物の使用。
【請求項５３】
エピトープタグを付与された、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５４】
P-Rex1の結合パートナーへの結合の調節物質の同定のための酵母２−ハイブリッド（又は３−ハイブリッド）システムの使用。
【請求項５５】
P-Rex1依存性の情報伝達経路の調節物質を同定するための、インビトロの、又は細胞に基づくアッセイの使用。
【請求項５６】
P-Rex1トランスジェニックマウス。
【請求項５７】
炎症、転移、敗血症ショック、神経変性、又はアテローム性動脈硬化を減少又は阻害する薬物候補の活性をテストするための、請求項２０に記載の非ヒト動物、或いは請求項２１に記載のP-Rex1遺伝子ノックアウト又はノックインマウス、又は請求項５６に記載のP-Rex1トランスジェニックマウスの使用。
【請求項５８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞。
【請求項５９】
PtdIns(3,4,5)P3感受性及び／又はGβγサブユニット感受性Rac-GEF活性を有するタンパク質。
【請求項６０】
P-Rex1のスプライスバリアント。
【請求項６１】
請求項６０に記載のスプライスバリアントをコードする核酸。
【請求項６２】
ストリンジェントな条件下で、P-Rex1遺伝子のゲノム配列鎖のいずれかにハイブリダイズすることのできる、実質的に単離された形態の核酸。
【請求項６３】
P-Rex1の発現を阻害することのできる干渉RNA（dsRNAi）。
【請求項６４】
ターゲティングベクターであって、該ターゲティングベクターがゲノムDNAと相同性組み換えを行う場合に、選択マーカーをコードする核酸が上記ゲノムDNAに取り込まれ、そしてP-Rex1遺伝子の発現が妨害又は減少されるように、上記P-Rex1遺伝子をコードする上記ゲノムDNAと相同性組み換えを行うことのできる核酸、及び上記選択マーカーを含む、前記ターゲティングベクター。
【請求項６５】
請求項６４に記載のターゲティングベクターを含むマウスES細胞。
【請求項６６】
その中で、P-Rex1遺伝子の発現が妨害又は減少された、組み換えマウスES細胞。
【請求項６７】
その中で、染色体対のうちの１におけるP-Rex1遺伝子の発現が妨害又は減少された、組み換えヘテロ接合性マウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症抑制の標的として有用な新規タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、及び抗炎症剤の同定のためのアッセイにおける該タンパク質の使用に関する。
【０００２】
GTPase（GTP加水分解酵素）単量体は、細胞内情報伝達の主要制御因子である（Bourne et al. 1990）。Racタンパク質（Rac1,２及び３）は、転写活性化、ラメリポディア形成及び活性酸素種（ROS）産生の刺激のような応答の受容体制御に関与するRho−ファミリーGTPase単量体のサブファミリーである（Tapon and Hall 1997）。Rho‐ファミリーGTPase単量体は、GTPに結合すると「オン」となってエフェクタータンパク質を活性化することができ、GDPに結合すると「オフ」となる、分子スイッチである。GTPaseは、GDP結合形態GTPaseの結合部位を特異的にこじあけることによって、ヌクレオチド交換を促進するように作用するグアニンヌクレオチド交換因子（GEFs）によって活性化されることができる(Worthylake et al. 2000)。
【０００３】
（いくつかは他のGTPase単量体のためにGEFとして作用することもできるにもかかわらず、）Rac-GEFの大きなファミリーがある。これらは、Vav（１，２，３）、Tiam（１，２）、PIX（α、β）、Ras-GRF（１，２）、及びSosを含む（Manser et al. 1998, Scita et al. 1999, Stam and Collard 1999）。プロテインキナーゼは近年、Rac-GEF活性の主要な直接的制御因子であると考えられている。例えば、Vav1は、Lckによってチロシン１７４上でリン酸化され、活性化されることができる（Crespo et al. 1997, Han et al. 1997）。同様に、Ras-GRF1は、Rac-GEF活性を表すためにチロシンリン酸化されなければならず（Kiyono et al. 1999）、Tiam１は、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIによっておそらくリン酸化され、制御されている（Fleming et al. 2000）。ホスホイノシチド３−キナーゼ（PI3Ks）及びGβγs、などの他のRac-GEFの制御因子は、これらのリン酸化に影響を与えることによって主に働く（Han et al. 1998, Kiyono et al. 1999）。
【０００４】
PI3Kタイプ１は、細胞表面受容体によって活性化されて、細胞内メッセンジャー、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）P3（PtdIns(３，４，５)P3）を合成する。PtdIns(３，４，５)P3の情報伝達ターゲットは、典型的には、脂質を結合し、形質膜におけるPtdIns(３，４，５)P3の蓄積部位へのホストタンパク質の転位を推進することのできる、PHドメインを有する（すべてのPHドメインがPtdIns(３，４，５)P3を結合するわけではない）（Lemmon and Ferguson 2000）。多くの細胞において、PI3Kタイプ１が受容体によって推進されるRacの刺激に必要であり、活性化PI3Kタイプ１がRacの活性化に充分であることがしめされた（Hawkins et al. 1995, Reif et al. 1996）。これらの経路は、広く重要であり、ラメリポディア形成のような応答を支持し、膜のラッフリングそしておそらくROS形成と関連する。これにもかかわらず、PI3Kタイプ１及び／又はPtdIns（３，４，５）P3がRacを活性化するメカニズムは、多くの細胞成分において不明である。これは、部分的には、Rac−GEFがPI3K依存性のRac活性化を示す細胞成分から精製され、それらの活性に基づいて、そしてこれに関連して同定されていないということの結果である。最初のそれらの発見及び特徴づけに続く研究に基づいて、最近知られたRac-GEFの４の亜群、すなわちTiam、Vav、Sos、及びPIXが、PI3K依存性の様式で制御されていると主張されている。しかしながら、PI3K及び／又はPtdIns(３，４，５）P3のこれらの効果は、直接的である場合には小さく、或いは間接的である場合には未知の又はリン酸化に基づくメカニズムの調節を介しており（Han et al. 1998, Rameh et al. 1997, Fleming et al. 2000, Buchanan et al. 2000, Yoshii et al. 1999, Scita et al. 1999, Das et al. 2000, Nimnual et al. 1998）、PI3Kがこの複合体を制御するメカニズムは不明である。
【０００５】
好中球様の細胞においては、Racは、多様な情報伝達経路、特別にはPAKキナーゼ及びホスホリパーゼDの活性化並びに走化作用、貪食作用及びROS形成のようなさらに下流の応答、において重要な役割を果たす（Roberts et al. 1999, Dorseuil et al. 1992）。受容体刺激によるROS形成の調整におけるその役割は、おそらく最も理解されているであろう。（ほとんどの種においてRac２である）Racは、p47phox、p67phox、gp91phox及びgp22phoxとともに、適切な刺激を受けた細胞のファゴソームの／エンドソームの膜システム上に集合した触媒活性を有するオキシダーゼ複合体の構成成分である（Babior 1999）。この過程は、Rac活性化と関連付けられた（Akasaki et al. 1999, Benard et al. 1999）。それは、Rac-GTPase活性化タンパク質（GAPs）によってインビトロで阻害され（Geiszt et al. 2001）、Rac-GAPノックアウト（Bcr）において増強され（Roberts et al. 1999）、Rac2に主要な突然変異を有する何人かの免疫不全症患者において阻害され（Ambruso et al. 2000）、そしてGTPに結合するが、GDPに結合しないRacはp67phox及びgp91phoxの両方に結合することができ、p47及びp67phoxをリン酸化すると主張されるPAKキナーゼを活性化することができる（Babior 1999）、ということが実証された。しかしながら、いくつかの研究は、受容体刺激によるROS形成が、Racの活性化なしに起こり得ることを示唆し（Geijsen et al. 1999）、GTP-Racの基底レベルがいくつかの制御メカニズムにとって十分であるか、又は単に必要でないということを暗示している。
【０００６】
PI3KがGタンパク質に連結した受容体の活性化及びROS形成の間の情報伝達の仲介において、好中球中で主要な役割を果たすという証拠がある。炎症性メディエーターに応答したROS形成を、BPI3Kタイプ１ヌリザイゴート（nullizygote）は起こさず、PI3K阻害物質はブロックする（Condliffe and Hawkins 2000）。しかしながら、PI3KがROS形成の推進に寄与するメカニズムは不明である。我々は、PtdIns3P（潜在的なPtdIns(3,4,5）P3の分解産物）がp40phoxのPXドメインを介してROS形成を制御し、これがGTPγS-Racの存在下で検出されることのできる効果であり、したがって、Racの活性化を含むことができないということを示した（Ellson et al. 2001）。いくつかのデータは、好中球においては、PI3Kタイプ１がRacの活性化の上流にあることができる、という考えを支持しない。PI3K阻害物質であるLY294002及びワートマニン（wortmannin）は、炎症性メディエーターに応答して顕著にRacの活性化を低下させたことが示された（Akasaki et al. 1999, Benard et al. 1999）。しかしながら、上記の研究(Hart et al.1998)に明らかに矛盾して、１の論文は、fMLP刺激によるRac活性化がPI3K阻害物質に対して抵抗性のあることを示す確信的なデータを示し（たが、ディスカッションを参照のこと。）（Geijsen et al. 1999）、そして代わりに、Gα13によって活性化されるp115Rho-GEFによる先の組とともに、Gαサブユニットが１以上の好中球Rac-GEF活性を亢進することができるという示唆に到達した（Geijsen et al. 1999）。
【０００７】
好中球における受容体刺激によるRac活性化及び／又はROS形成に関与するRac-GEFが何であるかは未知のままである。知られたRac-GEFの分布及び性質並びにROS形成を推進することのできる受容体のタイプの関係において、Vav及び／又はSOSタンパク質がタンパク質−チロシンに結合した受容体の下流にあることができ、その一方、G−タンパク質結合受容体の下流には類似の役割を有する明らかな候補がない、ということは理解できると思われる。
【発明の開示】
【０００８】
我々は、好中球サイトゾルから、PtdIns(3,4,5）P3感受性Racアクチベーターを精製した。これは、豊富な、新規の１８５kDグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）であり、われわれはこれをクローン化し、P-Rex-1と名づけた。組み換え酵素は、インビトロ及びインビボの両方において、PtdIns(3,4,5)P3及びGβγによって、直接的、実質的、且つ相乗的に活性化されるRac-GEF活性を有する。P-Rexアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好中球様細胞株において、内因性のP-Rex１発現及びC5a刺激による活性酸素種の形成を減少させた。P-Rex1は、特に好中球におけるヘテロ三量体Gタンパク質の下流において機能するのに適した、PtdIns(3,4,5)P3及びGβγ情報伝達経路における新規な同時検出器であることがわかった。
【０００９】
本発明によれば、P-Rex1又はP-Rex1活性を有するその誘導体のアミノ酸配列を含む、実質的に単離された形態のタンパク質が提供される。
【００１０】
ヒトP-Rex１の非ヒト等価物も本発明の範囲内にあるが、好ましくは、該タンパク質はヒトP-Rex-1（図３A中に示された配列番号：１）のアミノ酸配列を含む。P-Rex1の非ヒト等価物は、データベース配列情報の検索又はストリンジェントな条件下でヒトP-Rex１をコードする核酸にハイブリダイズ可能な核酸プローブの使用などの、当業者に知られた技術を使用して同定されることができる。BLAST相同性検索を用いて、非ヒトP-Rex１は、少なくとも９５％の相同性をヒトP-Rex１に対して有することが予想される。
【００１１】
P-Rex1の誘導体は、１以上のアミノ酸の変更（置換、付加、欠失又は翻訳後修飾を含む修飾）によって、野生型P-Rex１と異なるが、野生型P-Rex１の少なくとも１の活性を保持するタンパク質であることができる。これらの活性は、Rac-GEF活性、PtdIns(3,4,5)P3と結合すること、及びGβγサブユニットと結合することを含む。好ましくは、P-Rex-1の誘導体は、配列番号：１のアミノ酸残基１００個のそれぞれについて、好ましくは約４０以下、より好ましくは約２０以下のアミノ酸の変更を含む。
【００１２】
P-Rex1誘導体は、当業者に知られた標準的な突然変異誘発技術によって作製されることができ、そして標準的な技術を用いて、P-Rex１のいずれかの活性について試験されることができる。
【００１３】
本発明によって、ヒトP-Rex１（配列番号：２〜８）の１以上の異なるドメインのアミノ酸配列を含むタンパク質も提供される。これらは、以下の図３の説明及び図３によって同定される。配列番号：２〜８のアミノ酸配列のいずれかにおいて１以上のアミノ酸の変更を含む、これらのタンパク質の誘導体もまた、本発明の範囲内にある。好ましくは、そのような誘導体は、アミノ酸残基１００個あたり、約４０以下、より好ましくは約２０、のアミノ酸の変更を含む。
【００１４】
本発明によれば、PtdIns(3,4,5)P3感受性及び／又はGβγサブユニット感受性のRac-GEF活性を有するタンパク質もまた、提供される。
【００１５】
本発明によれば、さらに、P-Rex1のスプライスバリアント、及び該スプライスバリアントをコードする核酸が提供される。スプライスバリアントは、当業者に知られた標準的な技術によって同定されることができる。
【００１６】
本発明によれば、さらに、本発明のタンパク質をコードする配列を含む、実質的な単離形態の核酸が提供される。本発明によれば、また、ストリンジェントな条件下で本発明のタンパク質をコードする核酸、又は本発明のタンパク質をコードする核酸に相補的な核酸にハイブリダイズすることのできる実質的な単離形態の核酸も提供される。
【００１７】
本明細書中で使用される「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションのための広く認識されたプロトコールにおいて特定されたストリンジェントな条件に相当する、と当業者に一般的に理解されるハイブリダイゼーション条件を意味する。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual(2nd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), pp.1.101-1.104; 9.47-9.58及び11.45-11.57を参照のこと。典型的には、これらの条件は、ハイブリダイゼーション膜の６５Cにおける、０．１％のSDSを含む０．０５×〜０．５×SSCによる少なくとも１回の洗浄、又は同等にストリンジェントな洗浄条件を含む。
【００１８】
本発明によれば、また、ストリンジェントな条件下でヒトP-Rex１をコードする核酸にハイブリダイズすることのできるP-Rex1プローブも提供される。該プローブは、他の動物においてP-Rex1遺伝子を同定するために使用されることができる。
【００１９】
本発明によれば、また、例えばPCRによって本発明の核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーも提供される。
【００２０】
本発明によれば、また、本発明の核酸を含むベクターも提供される。該ベクターは、本発明のタンパク質の発現のための発現ベクターであることができる。
【００２１】
本発明によれば、また、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供される。該宿主細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、又は昆虫細胞であることができる。
【００２２】
本発明の核酸で安定にトランスフェクトされた細胞も提供される。
【００２３】
本発明によれば、また、本発明のタンパク質の発現のための条件下で該タンパク質の発現を導くことのできるベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、本発明のタンパク質の製造方法も提供される。
【００２４】
いくつかの環境において、細胞内での内因性のP-Rex1発現をアップレギュレートすることが望ましいかもしれない。これは、P-Rex1の発現が、挿入されたプロモーターの制御下にあるように、P-Rex1をコードする内因性の核酸の上流に（例えば、相同組み換えによって）挿入することのできるプロモーターを含むベクターで宿主細胞を形質転換することによって達成されることができる。
【００２５】
本発明によれば、また、それによって細胞内P-Rex1及び／又は組み換えP-Rex1の検出を可能とする、本発明のタンパク質、好ましくは該タンパク質に特異的なエピトープに結合することのできる抗体（又は抗体断片）も提供される。そのような抗体は、当業者に知られた技術によって作製されることができる。抗P-Rex１ヤギポリクローナル抗体は、以下の実験手順セクションにおいて記載される。これらは、ヒトP-Rex1に対する、抗ペプチドヤギポリクローナル抗体である。組み換えヒト野生型P-Rex1を用いて一緒にアフィニティー精製された２の血清のプールがアフィニティー精製に使用されることができる。これらの抗体は、ウエスタンブロット及び過剰発現されたP-Rex1を用いた免疫蛍光実験のために使用されることができる。これらの抗体とともに使用されるサンプルの調製方法及びウエスタンブロットのための抗体の使用のプロトコールは以下に記載される。
【００２６】
P-Rex1は、白血球中の炎症性経路に関与するタンパク質として同定され、スーパーオキサイド形成及び化学走性に関連している。P-Rex1が転移、敗血症ショック、炎症又はフリーラジカルメカニズムを含む神経変性、及びアテローム性動脈硬化において役割を果たすかも知れないという可能性もある。したがって、P-Rex1活性、又はP-Rex1の結合パートナーとの結合、又はP-Rex1発現の阻害物質は、以下の：炎症、転移、敗血症ショック、神経変性、及びアテローム性動脈硬化のいずれをも減少させ、又は阻害することができる。また、P-Rex1活性の刺激も急性の細菌感染において価値がある可能性がある。
【００２７】
本発明によれば、さらに、P-Rex1活性に拮抗することのできるP-Rex1の断片又は誘導体が提供される。P-Rex1の断片又は誘導体は、当業者によって容易に作製され、それらがP-Rex1活性又はP-Rex1と結合パートナーとの結合を阻害するかについてテストされることができる。
【００２８】
本発明によれば、P-Rex1の発現を阻害することのできるアンチセンスオリゴヌクレオチドも提供される。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、P-Rex1遺伝子のDNA、又はP-Rex1遺伝子から発現されたRNAに結合することのできるDNA又はRNAオリゴヌクレオチドであることができる。したがって、DNA-DNA、RNA-RNA、又はDNA-RNAハイブリッドが形成されることができる。P-Rex1の発現を阻害することのできる干渉RNA（dsRNAi）もまた、提供される。
【００２９】
本発明によれば、それによってP-Rex1遺伝子からのP-Rex1発現を阻害するために、該遺伝子の核酸との相同性組み換えを行うことのできる核酸を含むベクターも提供される。
【００３０】
本発明によれば、また、破壊P-Rex1遺伝子に対してヘテロ接合性又はホモ接合性である、非ヒト動物も提供される。好ましくは、該動物はP-Rex1遺伝子ノックアウトマウスである。P-Rex1トランス遺伝子を有する非ヒト動物、好ましくはマウス、も提供される。P-Rex1遺伝子ノックインマウスも提供される。そのような動物は、炎症、転移、敗血症ショック、神経変性、アテローム性動脈硬化、又は細菌感染の研究におけるインビボモデルとして使用されることができる。
【００３１】
本発明によれば、また、ターゲティングベクターがゲノムDNAと相同性組み換えを行う場合に、選択マーカーをコードする核酸がゲノムDNAに組み込まれ、P-Rex1遺伝子の発現が阻害又は減少されるように、P-Rex1遺伝子をコードするゲノムDNAと相同性組み換えを行うことのできる核酸、及び選択マーカーを含むターゲティングベクターも提供される。
【００３２】
好ましくは、ターゲティングベクターは、P-Rex1遺伝子の核酸配列を含み、ここで該遺伝子のエキソンの核酸配列が、選択マーカーをコードする核酸配列によって置換されているものを含む。
【００３３】
好ましくは、ターゲティングベクターは、少なくとも８〜１０kbのP-Rex1遺伝子の核酸配列を含む。
【００３４】
好ましくは、P-Rex1遺伝子の核酸配列は、ベクターの５’及び３’アームの間で２０／８０％〜５０／５０％に分断される。好ましくは、P-Rex1遺伝子の核酸配列の２０％〜８０％が選択マーカーをコードする核酸配列の５’であり、残りが選択マーカーをコードする核酸の３’である。
【００３５】
好ましくは、P-Rex1核酸配列のエキソン５が、選択マーカーをコードする核酸配列によって置換される。P-Rex1遺伝子のエキソン１〜８は、すべてフレーム内にある。結論として、これらのエキソンのいずれかが選択マーカーをコードする核酸配列と置換された場合、理論的には、残りのエキソンが一緒に再度スプライシングされて、僅かのアミノ酸を欠く、ほとんど完全な長さのタンパク質が産生されることが可能であった。エキソン５は、P-Rex1タンパク質の触媒部位をコードするため、エキソン４〜エキソン６のスプライシングが起こったとしても、生じたいずれのタンパク質も不活性である。
【００３６】
好ましくは、選択マーカーをコードする核酸は、抗生物質耐性を指定する。好ましくは、抗生物質耐性は、ネオマイシン、ゲントマイシン、ヒグロマイシン、又はピューロマイシン耐性である。
【００３７】
本発明によれば、さらに、本発明のターゲティングベクターを含むマウスES細胞が提供される。本発明によれば、また、P-Rex1遺伝子の発現が阻害又は減少された組み換えマウスES細胞も提供される。マウスES細胞は、E14、CCB、R1、又はR3ES細胞株であることができる。
【００３８】
本発明によれば、また、P-Rex1遺伝子の発現が阻害又は減少された組み換えマウスES細胞を移植された、偽妊娠マウスも提供される。
【００３９】
本発明によれば、さらに、染色体対の１においてP-Rex１遺伝子の発現が阻害又は減少された組み換えヘテロ接合性マウスが提供される。
【００４０】
本発明によれば、また、本発明のタンパク質のアフィニティー精製を可能とする精製タグをさらに含む該タンパク質も提供される。また、抗エピトープ抗体によるタンパク質の検出を可能とするエピトープタグをさらに含む、本発明のタンパク質も提供される。
【００４１】
本発明のタンパク質の検出を可能とする標識を含む、該タンパク質も提供される。好ましくは、標識は蛍光物質又は放射性標識である。
【００４２】
本発明によれば、また、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質も提供される。該融合タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）又は融合タンパク質の検出を可能とする蛍光活性を有するGFPの異形又は誘導体を含むことができる。融合タンパク質は、該融合タンパク質のアフィニティー精製を可能とする精製タグを含むことができる。
【００４３】
本発明によれば、また、薬物発見のための標的としての、本発明のタンパク質、タグを付加された又は標識された本発明のタンパク質、或いは本発明の融合タンパク質の使用も提供される。そのような使用は、抗炎症活性を有する薬物の同定を可能とすると期待される。また、転移、敗血症ショック、神経変性、又はアテローム性動脈硬化を減少又は阻害する薬物が同定されることも可能である。
【００４４】
本発明はまた、P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質、P-Rex1活性の調節物質、又はP-Rex1発現の調節物質を同定するためのスクリーニングアッセイにおける本発明のタンパク質又は本発明の核酸の使用も提供する。インビトロの又は細胞に基づくアッセイも使用されることができる。一般的に、そのようなアッセイは、P-Rex1の結合、又はP-Rex1の活性又は発現の阻害物質を同定するために使用されるであろう。なぜなら、そのような化合物は、炎症、転移、敗血症ショック、神経変性又はアテローム性動脈硬化を減少又は阻害する能力を有し、或いは、そのような活性を有する薬物の設計又は同定において役立つであろうからである。
【００４５】
本発明によれば、本発明のタンパク質をP-Rex1活性の調節物質候補と接触させ、そして該タンパク質の活性が調節物質候補によって調節されるか否かを決定することを含む、P-Rex1活性の調節物質の同定方法が提供される。そのような方法においては、例えば、Rac-GEF活性についてアッセイする場合、P-Rex1のRac-GEF活性を亢進することのできる、PIP3及び／又はGβγサブユニット或いはそれらの誘導体の存在下で、該方法を実施することが望ましい。
【００４６】
本発明によれば、また、調節物質候補の存在下又は非存在下において、本発明のタンパク質を結合パートナーと接触させること、及び該タンパク質の結合パートナーへの結合が該調節物質候補によって調節されるか否かを決定することを含む、P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質を同定するための方法も提供される。
【００４７】
典型的には、調節物質のアッセイは、P-Rex1とPIP3又はP-Rex1が相互作用する１以上のタンパク質のいずれかとの相互作用を阻害する化合物を見出すために設計されるだろう。インビトロのアッセイは、好ましくは、そのすべてが適切な精製タグを有し、バキュロウイルス又はＥ．コリのようなインビトロの発現系中で発現され、そして好適な精製タグを用いて精製される、完全長のP-Rex1、切断された配列、又は緑色蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質の使用を含む。蛍光タンパク質との融合タンパク質として産生されない場合、精製されたタンパク質は、標準的なタンパク質標識方法論を使用して、（典型的には、フルオレッセイン、ローダミン又は最大励起波長が４５０nmを超える他の蛍光色素である）蛍光物質で化学的標識されるか、又は放射性標識で標識される。タンパク質は、個々の調節物質候補及び残りのアッセイ試薬とともにインキュベートされることができ、そして相互作用は、直接的分光光度法による測定、又は続く結合した又は遊離したP-Rex1構成物の分離のいずれかによって測定されることができる。
【００４８】
好ましいアッセイ方法を以下に列挙する。これらの方法のすべてが、商業的に入手可能な設備を用いて、１日あたり１０，０００を越える化合物のハイスループットスクリーニングに容易に適用されることができる。
【００４９】
１．蛍光消光法又は蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）によって結合を測定する、PIP3含有合成膜（リポソーム）への、ドナー蛍光標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の結合の阻害。典型的には、オキサノールのような脂溶性蛍光アクセプターが膜に取り込まれる。
【００５０】
２．蛍光消光法又は蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）によって結合を測定する、ビーズ上のPIP3含有固定化膜（例えば、Kingman et al, (2002) Molecular Cell 9, 95-108）へのドナー蛍光標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の結合の阻害。典型的には、オキサノールのような脂溶性蛍光アクセプターが膜に取り込まれる。
【００５１】
３．濾過によって遊離の溶液からビーズを分離し、そしてビーズ上に残った蛍光を測定することによって、P-Rex1の結合をアッセイする、ビーズ上のPIP3含有固定化膜（例えば、Kingman et al, (2002) Molecular Cell 9, 95-108）への蛍光標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の結合の阻害。
【００５２】
４．蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）によって結合を測定する、ビーズ上のPIP3含有固定化膜（例えば、Kingman et al, (2002) Molecular Cell 9, 95-108）への放射能標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の結合の阻害。
【００５３】
５．シンチレーションプロキシミティ（scintillation proximity）によって、P-Rex1の結合をアッセイする、SPAマルチウエルプレートのウエル上に固定化されたPIP3への放射能標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の結合の阻害。
【００５４】
６．蛍光偏光の変化を測定することによってリガンド結合をアッセイする、溶液中の蛍光標識GroP-Ins(3,4,5)P4又はPIP3へのP-Rex1完全タンパク質（又は[質量増加のために]例えばGSTに融合させた切断構築物）の結合の阻害。
【００５５】
７．（FITCなどの）ドナー蛍光物質で標識されたP-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）及び（ローダミン又はテキサスレッドなどの）アクセプター蛍光物質で標識されたGroP-Ins(3,4,5)P4又はPIP3の溶液中での阻害。結合は、ドナー消光又はFERTの変化によって、或いは蛍光寿命の変化によって測定されることができた。
【００５６】
８．上記のすべての方法は、追加の脂質、タンパク質又はP-Rex1、特別にはGβγ及び／又はRacと相互作用することが知られている他のリガンドを含ませることによって改変されることができる。
【００５７】
９．蛍光消光法、蛍光共鳴エネルギー移動法（FRET）又は蛍光寿命によって結合を測定する、アクセプター又はドナー蛍光標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の、アクセプター又はドナー蛍光標識βγサブユニットへの結合の阻害。
【００５８】
１０．濾過によって遊離の溶液からビーズを分離し、そしてビーズ上に残った蛍光を測定することによって、P-Rex1の結合をアッセイする、蛍光標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の、ビーズ上に固定化されたβγサブユニットへの結合の阻害。
【００５９】
１１．濾過によって遊離の溶液からビーズを分離し、そしてビーズ上に残った放射活性を測定することによって、P-Rex1の結合をアッセイする、放射能標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の、ビーズ上に固定化されたβγサブユニット（例えば、Kingman et al, (2002) Molecular Cell 9, 95-108）への結合の阻害。
【００６０】
１２．シンチレーションプロキシミティ（scintillation proximity）によって、P-Rex1の結合をアッセイする、SPAマルチウエルプレートのウエル底上に固定化されたβγサブユニットへの放射能標識P-Rex1完全タンパク質（又は切断構築物）の結合の阻害。
【００６１】
１３．βγサブユニットがRacのようなP-Rex1の他の結合パートナーによって置換される、上記のパラグラフ９〜１２において特定されたアッセイ。
【００６２】
１４．GDPを先に負荷したRac上でのGDPのGTPへの交換のP-Rex1による刺激の阻害。アッセイ混合物は、Rac-GDP及びP-Rex1（又は切断構築物）を含み、アッセイはGTPγS35の添加によって開始する。所定の時間の終わりにRacに結合しているGTPγS35量を、アッセイ混合物からのRacの分離に続いて測定する。結合した及び遊離のGTPγS35の分離は濾過によって実施されることができ、或いは、Racはビオチンで標識され、そしてストレプトアビジンコーティングしたビーズ又はプレートを使用して分離されることができる。試験化合物は、GTPγS35添加の前に混合物に添加される。
【００６３】
上記の方法（８）の適用として、SPAプレートは、GDP-Racでコーティングされることができ、これをP-Rex1及び放射性同位体標識GTPγSとともにインキュベートした。放射標識GTPと固定化Racとの結合は、シンチレーションプロキシミティの決定によって連続的に測定される。
【００６４】
本発明によればまた、P-Rex１と結合パートナーとの結合の調節物質、P-Rex1活性の調節物質、又はP-Rex1発現の調節物質を同定するための、細胞に基づくアッセイの使用も提供される。
【００６５】
P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質、又はP-Rex1活性の調節物質を同定するための細胞に基づく本発明の方法は、以下のステップ：
調節物質候補の存在下又は非存在下で、細胞を、P-Rex1と結合パートナーとの結合、又はP-Rex１の活性化のための刺激物質によって刺激すること；
該調節物質候補が、P-Rex1と結合パートナーとの結合又はP-Rex1活性を調節するか否かを決定すること；
を含む。
【００６６】
細胞は、P-Rex1を発現する野生型細胞、又は細胞中でP-Rex1の直接的な発現を導く外因性の核酸を含む野生型細胞であることができる。
【００６７】
本発明によればまた、P-Rex1と結合パートナーとの結合の調節物質又はP-Rex１活性の調節物質を同定するための、細胞に基づくアッセイであって、以下のステップ：
標識を含む、本発明のタンパク質、又は（緑色蛍光タンパク質のような）標識を含む、本発明の融合タンパク質、或いは、内因性のP-Rex1から識別可能な、P-Rex1活性を有するP-Rex１の異形を提供すること；
調節物質候補の存在下及び非存在下で、P-Rex1と結合パートナーとの結合のための、又はP-Rex1の活性化のための刺激物質で、該細胞を刺激すること；及び
調節物質候補が、P-Rex1と結合パートナーとの結合、又はP-Rex1活性を調節するか否かを決定すること；
を含む上記アッセイも提供される。
【００６８】
P-Rex1の結合又は活性は、スーパーオキサイド形成、化学走性、ラメリポディア形成によって、又はリポーター遺伝子の発現、蛍光の使用、１の細胞内位置若しくはコンパートメントから他へのタンパク質の移動の測定によって、或いはラメリポディア形成を調べることによって、決定されることができる。刺激は、好ましくは、例えばスーパーオキサイド形成、化学走性、又はラメリポディア形成を刺激する、炎症性メディエーターである。
【００６９】
細胞に基づくさらなるアッセイは、調節物質候補の存在下及び非存在下において、細胞中でP-Rex1を過剰発現させること、及び該調節物質候補によってラメリポディア形成が変化したか否かを決定することを含む。
【００７０】
同定されたいずれかの調節物質がP-Rex1活性又はP-Rex1と結合パートナーとの結合を調節していることを確認するために、適切な対照が必要であることは、理解されるであろう。
【００７１】
細胞に基づく好ましいアッセイが以下に列挙される。これらのアッセイにおいて、細胞透過を可能とするために、刺激物質の添加前に細胞は調節物質候補を含む培地中で３０分間インキュベートされる。
【００７２】
１．ミエロイド由来細胞を用い、ルミネッセント試薬としてルミノールを用いて、スーパーオキサイド形成の産生を測定する。細胞は、ホルボールエステル、リポポリサッカライド、ケモカイン、C5、又はオプソニン処理粒子のような適切な刺激物質で刺激される。P-Rex1刺激によるスーパーオキサイド形成を選択的に阻害する化合物を識別するために、アッセイ中で使用される細胞は、野生型細胞又はP-Rex1でトランスフェクトされた細胞或いはP-Rex1の不活性突然変異体を含むことができる。
【００７３】
２．ミエロイド由来細胞を用い、例えばボイデンチャンバー中で、細胞の化学走性刺激物質への遊走を測定する。適切な刺激物質は、ホルボールエステル、リポポリサッカライド、又はケモカイン刺激物質を含む。P-Rex1刺激によるスーパーオキサイド産生を選択的に阻害する化合物を識別するために、アッセイ中で使用される細胞は、野生型細胞又はP-Rex1でトランスフェクトされた細胞或いはP-Rex1の不活性突然変異体を含むことができる。
【００７４】
３．PC12又は他の好適な細胞タイプが、P-Rex1のPHドメインをGFPとともに含む構築物及び標準的な方法論を用いて得られた安定なプールでトランスフェクトされる。或いは、GFP融合タンパク質は、本分野で知られたプラスミド又はウイルス（例えば、レトロウイルス）に基づく方法を用いて安定に又は一過性に細胞中で発現されることができた。細胞はその後、底面からの蛍光測定に好適なマイクロタイタープレートに播かれ、付着させられた。細胞中でPIP3産生を刺激するために、調節物質候補が添加され、続いて、例えば、PC１２細胞の場合にはEGF、或いは他の細胞タイプにおいては他の適切な刺激物質が添加される。アッセイは、Cellomics ArrayScan（登録商標）IIのような適切なソフトウエアと画像処理装置を使用して、細胞質から細胞膜へのP-Rex1-GFP融合構築物の転位を測定する。阻害化合物は該構築物の細胞膜への転位をブロックするであろう。
【００７５】
４．上記の方法（３）の代わりに、GFPと原形質膜片中へ導入されたアクセプター又はドナー（例えば、オキサノール）の間のFRETを測定することによって、P-Rex1-GFP融合物の転位がモニターされることができる。
【００７６】
５．少なくともPDGF受容体を過剰発現しているPAE細胞においては、基底状態において、P-Rex1タンパク質の比率は原形質膜に局在している。この会合の性質は未知であるが（これが脂質又はタンパク質の相互作用であるか否かはわからない）、この基底状態の会合をブロックする化合物のスクリーニングは、GFP-完全長P-Rex1を使用して可能であった。そのような阻害物質は、P-Rex1とその基質であるRacとの会合をブロックすることができた。細胞をP-Rex1-GFP融合物でトランスフェクトし、Cellomics ArrayScan（登録商標）IIのような適切なソフトウエアと画像処理装置を使用して、P-Rex1の膜における局在を測定する。
【００７７】
６．P-Rex1とGβγサブユニットの会合をブロックする化合物の細胞に基づくスクリーニングは、予想可能であった。細胞を（プレニル化によって、おそらく一緒に原形質膜に局在する）Gβγサブユニットをコードする遺伝子で安定的にトランスフェクトする。同時発現されたP-Rex1のGβγサブユニットへの親和性が充分に高い場合、GFP-P-Rex1は、内因性レベルのGβγサブユニットを発現している細胞中よりも、よりはっきりしたPMの局在を示すことができた。Cellomics ArrayScan（登録商標）IIのような適切なソフトウエアと画像処理装置を使用して、P-Rex1の膜における局在を測定する。このアプローチは、発見された他のいずれかのタイプのP-Rex１：タンパク質相互作用をモニターするために使用されることができた。
７．細胞は、ドナー蛍光（例えば、CFP）で標識されたGβ又はGγサブユニット、及びアクセプター蛍光（例えば、YEP）で標識されたP-Rex1（又はその断片）で同時にトランスフェクトされる。GサブユニットとP-Rex1の間のFRETは、FLIPR又は他の好適な装置を使用して測定されることができた。
【００７８】
８．P-Rex1の過剰発現は、ラメリポディア形成の結果として「フライドエッグ」表現型の形成を誘導する。P-Rex1でトランスフェクトされた（PDGF受容体を過剰発現するミエロイド由来細胞又はPAE細胞などの）細胞が固定化され、そして透過化処理され、その後ラメリポディア形成を調べるためにローダミン−ファロイディン染色される。（細胞の形状、高さ−幅特性、縁の滑らかさなどの）細胞の形態計測学的分析又は可視的な膜のラッフリングは、Cellomics ArrayScan （登録商標）IIのような適切なソフトウエアと好適な画像処理装置又はAcumen Explorer(TTP, Cambridge)の使用によって評価されることができた。
【００７９】
９．P-Rex1でトランスフェクトされた細胞は、基底状態のレポーター遺伝子発現及び（C5などの）アゴニスト刺激されたレポーター遺伝子発現について試験されることができ、ここで、（ルシフェラーゼなどの）レポーター遺伝子は血清応答因子（Rac-応答性）含有プロモーターの制御下に置かれる。ルシフェラーゼ発現の検出は、FLIPRシステム又は同等のルミネッセンス検出装置による。
【００８０】
１０．細胞は、PAKからのRac-相互作用ドメインとのGFP融合物でトランスフェクトされることができた。GFP−融合タンパク質の原形質膜への転位は、Rac活性化の指標とすることができる。細胞は、GFP-融合タンパク質でトランスフェクトされることができ、原形質膜におけるこの融合物の局在化は、Cellomics ArrayScan （登録商標）IIのような適切なソフトウエアと画像処理装置を使用して測定されることができる。
【００８１】
１１．（１０）の代わりに、細胞は、PAKからのCFP標識Rac相互作用ドメイン及びYFP標識Racでトランスフェクトされることができた。（C5などの）アゴニストで刺激された細胞は、Rac活性化の結果としてFRETの増加を示す。
【００８２】
１２．（１０）及び（１１）の代わりに、細胞は、そのN及びC末端でBFP及びGFPに結合した、PAKからのRac結合ドメインを含む組み換えRacレポーターでトランスフェクトされる。Racの活性化の結果、RacとPAKからのRac結合ドメインとの相互作用及びBFPとGFPの間のFRETの変化が生じた（Graham DL, Lowe PN, Chalk PA. (2001) Anal Biochem 296, 208-17 A method to measure the interaction of Rac/Cdc42 with their binding partners using fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent potein）。
【００８３】
１３．或いは、Rac活性化は、安定してRac-GFPを発現している細胞中で測定されることもできた。これらの細胞は、好適な蛍光ドナー又はアクセプターで標識されたPAKのRac結合ドメイン由来のタンパク質を負荷される。該タンパク質は、例えば、Active Motif(http://www.activemotif.com/)からのChariot（登録商標）タンパク質トランスフェクション試薬を使用して細胞中へ負荷されることができた。Racの活性化は、Rac-GFP及びRac結合ドメインの間のFRETの増加として可視化される。この方法は、Kraynov VS, Chamberlain C, Bokoch GM, Schwartz MA, Slabaugh S, Hahn KM. (2000) Science, 290, 333-337 Localized Rac activation dynamics visualized in living cells中においてより詳細に記載される。
【００８４】
酵母２−ハイブリッド（又は３−ハイブリッド）システムが、P-Rex１の結合パートナーへの結合の調節物質の同定に使用されることができる。
【００８５】
本発明によれば、また、P-Rex1の不活性突然変異体、該突然変異体をコードする核酸、及び野生型P-Rex1に対してよりも高い親和性をもって該突然変異体と結合可能な抗体であって、それによって該突然変異体の特異的検出を可能とする上記抗体も提供される。さらに、スクリーニングアッセイにおける該突然変異体、核酸又は抗体の使用も提供される。
【００８６】
本発明によれば、また、P-Rex1−陰性細胞、細胞におけるP-Rex1の発現を阻害する阻害物質を含む細胞、及びそのような細胞からの抽出物も提供される。また、スクリーニングアッセイにおけるそのような細胞又は抽出物の使用も提供される。
【００８７】
そのような突然変異体、細胞及び抽出物は、P-Rex１と結合パートナーとの結合の調節物質、又はP-Rex1活性の調節物質を同定するためのスクリーニングアッセイにおける対照として使用されることができる。
【００８８】
P-Rex1遺伝子中の突然変異、又はP-Rex1遺伝子の発現産物、又はP-Rex1の発現レベル若しくはP-Rex１遺伝子の発現パターンの相違は、病気又は障害に関連しているかもしれない。そのような突然変異、又は発現における相違は、当業者に知られた標準的な技術であって、そこで（組織、細胞又は抽出物のような）病気の及び正常の生物学的材料が、病気の組織と関連するが正常の組織とは関連しない、発現におけるいずれかの突然変異又は相違があるか否かを判断するために比較されるところの上記技術によって同定されることができる。そして、同定されたいかなる相違の検出も、該病気又は障害を有する又はその疑いのある個体を同定するための診断テストの基礎として使用されることができた。
【００８９】
本発明によれば、また、P-Rex1の調節物質に依存した情報伝達経路を同定するための、インビトロの又は細胞に基づくアッセイの使用が提供される。そのような使用は、好ましくは、本発明のタンパク質、核酸、ベクター、抗体、細胞、又は抽出物の使用も必要とするであろう。
【００９０】
本発明の実施態様は、添付の図面を参照することによってさらに説明される：
【００９１】
図１：PI３K及びGβγはRac活性化及びROS形成を制御する。
A)PI3K及びGβγは、相乗的にROS形成を刺激する。好中球のサイトゾル及び低密度膜を、ワートマニンとともに（２００nM、灰色のバー）又はワートマニンなし（黒いバー）のいずれか、或いはドミナントネガティブなN17-Rac（２００nM、斜線のバー）とともに、４５nMの組み換えp101/p110PI3K及び／又は５４nMのウシ脳Gβγをインキュベートし、そしてROS形成（SPC、０．１分間の単一光子計数）を測定した。データは、２の実験からの平均（n＝４）±SDである。
B)PtdIns(3,4,5)P3は、ROS形成を刺激する。好中球のサイトゾル及び低密度膜をPtdIns(3,4,5)P3、PtdIns(3,4)P2、又はPtdIns(4,5)P2、（S/A、ステアロイル−アラキドニル、P/P、ジパルミトイル）のアイソマーとインキュベートし、ROS形成を測定した。データは、平均（n＝２〜６）±分布幅（range）である。
C)PI3K及びGβγは、相乗的にRacを刺激する。好中球のサイトゾル及び低密度膜を、ワートマニン（２００nM）とともに（灰色のバー）、又はワートマニンなしで（黒いバー）のいずれかでPI3K（５０nM）、PtdIns(3,4,5)P3（３０nM）及び／又はGβγ（左パネルでは４０nM、右パネルでは２００nM）とともにインキュベートし、EE-Rac1（３０nM）への[α32P]-GTPの取り込みを定量した（４の実験からの平均（n=４〜８）±SD）。
D)活性Racは、ROS形成を誘導する。好中球のサイトゾル及び低密度膜を、Wt-Rac（黒いバー）又はドミナントネガティブなN１7-Rac（２００nM、白いバー）のいずれかとともにインキュベートし、示したグアニンヌクレオチドを前負荷して、ともにインキュベートし、Wt-Racについてはワートマニン（２００nM、灰色のバー）とともにインキュベートし、ROS形成を測定した。データは、３の実験からの平均（n=２〜６）±分布幅である。
【００９２】
図２：ブタ白血球サイトゾルからのPtdIns(3,4,5)P3依存性Rac-GEF活性の精製
A)クロマトグラフィープロフィール。PtdIns(3,4,5)P3依存性Rac-GEF活性を、９０ｌのブタ血液からこの連続カラムを使用して精製した。点線は、２８０nmにおける吸収を表し、破線は塩濃度を示す。カラム分画を、PtdIns(3,4,5)P3とともに（太い黒線）又はPtdIns(3,4,5)P3なし（斜線であらわした線）のいずれかのリポソームを使用して、Rac-GEF活性についてアッセイした。灰色のバーは、以下の精製ステップのために選ばれた分画を表す。
【００９３】
B) PtdIns(3,4,5)P3依存性Rac-GEF活性のピークを含む銀染色したSDS-pageの分画、ゲル濾過（１％分画容量）及びMono S（１．６７％分画容量）精製ステップにおいてカラムから回収した。
【００９４】
C)精製の概要。出発物質（１００％）の絶対活性を、方法において記載した条件下、PtdIns(3,4,5)P3の存在下で、１．４ピコモルのGTPγSのRac（上記のRacのみ）上への負荷の刺激／分／mgタンパク質と計算した。
【００９５】
図３：ヒトP-Rex1の構造
A)ヒトP-Rex1（配列番号：１）のアミノ酸配列。精製P-Rex1から得られたトリプシンペプチドは、残基182（K)-198(R)、913（T)-920（R)、1463（L)-1470（K)、1501（V)-1506(R)、及び1590（S)-1604（R)である。タンパク質の相同ドメインに下線を付した。これらは以下の通りである。
【００９６】
【表１】
2006504398.tif 000003
【００９７】
B)P-Rex1のドメイン構造の模式的表示
【００９８】
図４．ヒトP-Rex1の発現及び基質特異性
A)ノーザンブロット。Clontechからの複数の組織のノーザンブロットを、P-Rex1mRNA発現について調べた。
【００９９】
B)ウエスタンブロット。EE-エピトープタグを付与したP-Rex1を一過性にCOS-7細胞中で発現させ、その後、１％Triton-X100含有緩衝液で抽出し、１０，０００ｇの上清のアリコート（５×１０3、５×１０4、５×１０5細胞／レーン）を抗EE抗体でイムノブロッティングした。
【０１００】
C)組み換えヒトP-Rex1のGEF活性を、PtdIns(3,4,5)P3（１０μM）とともに（黒いバー）又はなしで（斜線のバー）、リポソーム（各２００μMのPtdCho、PtdS、PtdIns）及び示した精製GTPase（１００mM）を用いて測定した。データは、３の実験の１からの、二連の平均±分布範囲である。
【０１０１】
図５：PtdIns(3,4,5)P3及びＧβγによる、インビトロでの組み換えヒトP-Rex1Rac-GEF活性の制御
A)PtdIns(3,4,5)P3の用量応答。P-Rex1依存性のEE-Rac１活性化を、２００μMのPtdCho、PtdS、PtdChoのそれぞれ及び示した濃度のPtdIns(3,4,5)P3（P-Rex1の最終濃度は１００nMであった）を含むリポソームの存在下でアッセイした。データは、２の実験のプールからの平均（n=２-４）±分布範囲である。
【０１０２】
B) P-Rex1依存性のRac活性化の脂質特異性を、示したホスホイノシチド（S/A、ステアロイル-アラキドニル、P/P、ジパルミトイル）の１０μM（黒いバー）又は０．３μMのいずれかとリポソーム（Aのとおり）の存在下で測定した。データは、別個の２の実験の１から得られた二連の平均±分布範囲である。
【０１０３】
C) PtdE、PtdS、PtdCho（各３３０μM）及び示したホスホイノシチド（６モル-％）を含むリポソームへのホスホイノシチド依存性のP-Rex1（１００nM）の結合を、Biacoreによって測定した。データは、プールした４の実験からの平均±SDである。
【０１０４】
D)Gβγの用量応答。P-Rex1依存性のRac活性化を、示した濃度の精製ウシ脳Gβγを使用してアッセイした。１μMのGβγサンプル（0.0104％）以外についての最終的なコール酸濃度は、0.0072％であった。データは、３の実験の１からの２連の平均±分布範囲である。
【０１０５】
E)Gβγ効果のための対照。P-Rex1依存性のRac活性化を、示したところでは、Gβγ（０．３μM、プレニル化又は非プレニル化と示されたSf9細胞以外は、ウシ脳由来）、混合Gαサブユニット（０．２３μM）、A1F（１０μM）、煮沸ウシ脳Gβγ（０．５μM）、組み換えプレニル化Gβγ（０．５μM）、又は組み換え非プレニル化Gβγ（０．５μM）を使用してアッセイした。Gβγ及びGαの組み合わせについては、これら（又は対照緩衝液）を。氷上で３０分間プレインキュベートした。最終的なコール酸濃度は、0.012％であった。データは、１の実験からの２連の平均±分布範囲である。
【０１０６】
F)P-Rex1のRac-GEF活性の制御におけるPtdIns(3,4,5)P3（０．２μM）及びウシ脳Gβγ（０．３μM）。最終的なコール酸濃度は、0.0048％であった。データは、３の実験の１からの二連の平均±分布範囲である。
【０１０７】
図６：ヒト組み換えP-Rex1のインビボにおけるRac-GEF活性
A)インビボにおけるP-Rex1によるRac活性化のウエスタンブロット。６cm皿中の５×１０6Sf9細胞のアリコートに、示したP-Rex1、Gβ1、Gγ2、ｐ101、ｐ110γをコードするウイルスの組み合わせまたは対照ウイルスを感染させた。培地中で４２．５時間、その後血清なしで４時間培養後、細胞をPAK-Cribプルダウンアッセイにかけた。イムノブロットは、抗Rac（１番上及び２番目のパネル）抗体又は抗CDC４２（３番目のパネル）抗体でプローブした。皿の０．１８倍と等量の細胞を、PAK-Cribプルダウンから負荷し、総ライセートについては、皿の０．０５倍を負荷した。一番下のパネルは、クマシー染色後の２番目のパネルフィルターを表す。
【０１０８】
B)インビボにおける、P-Rex1による相乗的なPI3K及びGβγ依存性のRac活性化。Sf9細胞に上記のウイルスを示したとおりに感染させ、そしてA)の通りに処理した。ECLに露出したフィルムを計数化し、そして示したデータは、２のプールした実験からの平均±分布範囲（n=４）である。
【０１０９】
C)Gβγ及び／又はPI3Kにより誘導されたSf9細胞内のPtdIns(3,4,5)P3形成を測定し（データは、平均（n=５）±分布範囲）、P-Rex1依存性のGβγ及び／又はPI3Kにより誘導されたRac活性化に対してプロットした（Bからのデータ）。
【０１１０】
図７：P-Rex1は、PAE細胞において、活性化Rac様の表現型を誘導する。
A)１０ng/mlのPDGFで５分間刺激後（２番目のパネル）又は刺激しない（最初及び３番目のパネル）、血清飢餓状態の正常PAE細胞（最初及び２番目のパネル）又は安定にV12-RacでトランスフェクトしたPAE細胞（３番目のパネル）の免疫蛍光顕微鏡写真。固定化した細胞を、繊維状アクチンを染色するために、FITC−ファロイジンで標識した。
B)及びC)PAE細胞中におけるP-Rex1の発現。mycのタグを付与したP-Rex1又はDAPP1を一過性にPAE細胞中で発現させ、これらを培養し（１０時間）、血清飢餓状態とし（８時間）、ワートマニン（１００nM、１０分）処理し、又はせず、そして示したとおりの範囲のPDGF濃度で５分間刺激した。細胞を固定化し、抗-myc抗体、続いて、P-Rex1又はDAPP1を標識するためのFITC２次抗体及び繊維状アクチンを標識するためのTRITC-ファロイジンで染色した。
【０１１１】
B)免疫蛍光顕微鏡写真。
【０１１２】
C)免疫蛍光顕微鏡写真データの定量。結果は、カバーガラスあたり、１００のP-Rex1陽性細胞（黒いバー）又はDAPP１陽性細胞（斜線のバー）を計数することによって得た。P-Rex1データは、２の独立した実験の１からの二連のカバーガラス（平均±分布範囲）からのものである。DAPP1データは、１の実験からの条件あたりの１のカバーガラスからのものである。
【０１１３】
図８：P-Rex1は、ROS形成に必要である。
ヒト前骨髄球NB4細胞を、２日間、１μMのすべてトランスのレチノイン酸で分化させ、１０μMのP-Rex1アンチセンスオリゴヌクレオチド又は無作為化対照オリゴヌクレオチドのいずれかで処理し、そして以下の実験にかけた。
【０１１４】
A)オリゴヌクレオチド処理したNB4細胞を０．１５nMのC5aで刺激し、ROS形成（SPC、単一光子計数）を測定した。データは、３の実験の１からの平均±標準偏差（ｎ＝４）である。
【０１１５】
Ｂ）P-Rex１でトランスフェクトされたCos７細胞又は対照Cos7細胞、ヒト好中球、或いはオリゴヌクレオチド処理したNB4細胞の総ライセートを、P-Rex1発現レベルについて、ポリクローナル抗P-Rex1抗体を用いたウエスタンブロッティングによって分析した。
【０１１６】
C)オリゴヌクレオチド処理したNB4細胞を血清飢餓状態とし、その後、室温において３分間、示したとおりにC5aで刺激した。MapK活性化を、ホスホーMapK抗体を用いたウエスタンブロット及びブロットのデンシトメトリーのスキャンによって測定した。データは、２の実験からの平均±分布範囲（n=２）である。
【０１１７】
図９−１：ヒトP-Rex1のｃDNA配列（配列番号：１３）
【０１１８】
図９−２：ヒトP-Rex1のｃDNA配列（配列番号：１３）
【０１１９】
図１０：A)P-Rex１のDH/PHドメインのモデル。DHドメインは濃い灰色、PHドメインは薄い灰色である。（DHドメインの触媒活性について重要であると予想される残基を含む）エキソン５によってコードされるペプチド配列は黒く表す。
【０１２０】
B)マウスP-Rex1遺伝子のエキソン／イントロン配置。P-Rex1のための遺伝子は、マウス染色体２、セクションH3上にあり、およそ８０kbにわたる。それは、４０のエキソン（グラフ中の番号１~４０）から成る。
【０１２１】
図１１：標準的な相同組み換えによるP-Rex1-/-マウス作成のための一般的プロトコール。
【０１２２】
図１２：マウスP-Rex1ゲノム配列中の標的エリア
【０１２３】
図１３：A)正しい部位におけるターゲティングベクター挿入を試験するためのスクリーニングストラテジー。このスクリーンは、サザンブロッティングによって、３’外部プローブ及びXmnI消化ES細胞ゲノムDNAを使用し、オリジナルの配列について１８．９kbのバンド、及び標的配列について１２．７kbのバンドを得た。
【０１２４】
B)P-Rex1標的ES細胞からのXmn1消化DNAについてのサザンブロット。３’外部プローブでブロッティングを行った。矢印は、陽性クローンを示す。
【０１２５】
ヒトP-Rex1のためのゲノム配列（配列番号：１４）を配列リストで示す。
【０１２６】
PI3K、Gβγ及びPtdIns(3,4,5)P3によるRac活性化及びROS形成の制御
好中球からのサイトゾル及び低密度膜の混合物は、SDS及びアラキドン酸のような両親媒性物質の添加によって刺激され、ROSを産生することができる。我々は、MgATP及びGTPの存在下で、精製された組み換えp101／p110γ-PI3K及び精製されたGβγ（組み換えSF9由来Gβ1γ2又はウシ脳Gβγのいずれかであって、その両方が実質的にp101／p110γ-PI3Kを活性化することができる）の組み合わせを添加することによって、タイプ１PI3KがROS形成の上流を操作することができるという概念をテストした。先に我々は、類似の状況において、PtdIns(3,4,5)P3、PtdIns(3,4)P2及びPtdIns3Pがこれらのアッセイにおいて合成されることを示した（Pacold et al. 2000）。上記のアッセイが、内因性のPI3K及びGβγを含むにもかかわらず、添加された組み換えタンパク質は、独立してROS形成を刺激したが、一緒に添加された場合には、相乗的に作用した（図１A）。これらの効果は、すべて強力なPI3K阻害物質であるワートマニンによって阻害され、それは、Gβγ単独の効果がよりワートマニン感受性でないということにわれわれが注目したにもかかわらず、おどろくべきことにそれらがPI3K活性の結果であることを示唆している。化学合成されたリポソームの形態のホスホイノシチドの添加は、PtdIns(3,4,5)P3の生物学的ジアステレオマーが強力にROS形成を活性化することができたことを示した（図1B）。これらの結果の立体選択性は、これらの効果が、添加されたPtdIns(3,4,5)P3の生理化学的性質の結果ではないことを示唆し、PI3Kが膜脂質をリン酸化し、したがって膜に局在する脂質産物を生成するという、上で得られた結果を支持するものである。
【０１２７】
Racの活性におけるPI3Kの重要な役割及びオキシダーゼ複合体の構築においてRacが行う重要な部分を定める文献の関係において、我々は、これらの効果はRacの活性化に依存するのか？という質問をした。少量の純粋な組み換えの翻訳後脂質修飾されたEE-Rac1及び[α32P]-GTPをこれらのアッセイに添加することによって、我々はp101/p110γ-PI3K及びGβγが独立して、そして組み合わせると相乗的にRacを活性化することを示すことができた（図１C）。ｐ101/ｐ110γ-PI3Kは単独で、そして非常に低濃度のGβγとの相乗的組み合わせにおいて、顕著にワートマニン感受性の様式でRac１活性化を刺激した。対照的に、より高濃度のGβγは、ワートマニン耐性の様式でRac１活性化を刺激した。PtdIns(3,4,5)P3は、単独でもRac１の活性化を刺激した。これらの結果は、Racがこのシステムにおいて、p101/p110γ-PI3Kの下流に作用することを示唆した。我々は、純粋な脂質修飾されたドミナントネガティブなN17-Rac１と、我々のサイトゾル及び膜の分画とのプレインキュベーションによる、Rac活性化を阻害する試みによって、これをテストしようと考えた。この処理は、顕著にp101/p110γ-PI3Kを介するROS形成の活性化及びGβγを介するROS形成の活性化を阻害した（図１A）。さらに、N17-Rac1濃度の増加は、いかなるより大きな阻害も生じなかった（示さない）。PtdIns(3,4,5)P3刺激によるROS形成は、PI3K刺激によるROS形成よりは有効性が低いにもかかわらず、N17-Rac1によっても阻害された（３５％の平均、データは示さない）。
【０１２８】
上記のデータは、これらのアッセイ中で、ROS形成の刺激において、Racがp101/p110γ-PI3K、Gβγ及びPtdIns(3,4,5)P3の上流に作用することができることを示唆する。我々は、純粋な組み換えの脂質修飾されたRacがROS形成を刺激することができたか否かをテストした。GTPγS-Rac1は、実質的にGDP-Rac1又はGTPγS処理されたN17-Rac1よりもより効果的にROS形成を刺激した（図１D）。この結果の意味するところは、ROS形成の刺激にはRacの活性化で充分であるということである。しかしながら、これは、好中球サイトゾル及び膜分画の複合体混合物という状況にあり、その結果これらの効果は実際に他の情報に依存するかも知れない。我々がこのシステムにおいて観察したPtdIns(3,4,5)P3依存性のRac1活性化は、この効果が、好中球サイトゾル中又は膜分画中のいずれかに存在するPtdIns(3,4,5)P3-感受性Rac-GEFによって仲介されるということを示唆した。
【０１２９】
PtdIns(3,4,5)刺激によるRac-GEF活性が、サイトゾル分画において回収されたことを見出し、この供給源からこれを担う酵素を精製しようと試みた（図２）。精製中に使用されたアッセイは、上記で使用したアッセイの変法であり、PtdIns(3,4,5)P3（最終的に１０μM）を伴なうか又は伴なわない、リン脂質混合物のリポソーム（PtdCho、PtdS、PtdIns）の存在下における、純粋な組み換えの脂質修飾されたEE-Rac1への亢進された[35S]-GTPγSの結合に関するRac-GEF活性を定量した。高速Qセファロース上でのサイトゾルの分取は、PtdIns(3,4,5)P3感受性Rac-GEF活性の主要ピークを分離した。活性のこのピークは、SP-セファロース、ヘパリンセファロース、ゲル濾過およびMono Sを介してさらに精製されて（図２Ａ）、その両方が最後の２のカラムの間にRac-GEF活性の溶出プロフィールで完全に較正された、１９６ｋDの主要バンド及び１４２ｋDの小さなバンドである、２の検出可能なタンパク質のみを含む調製物を得た（図２B）。どちらのタンパク質もニトロセルロースへ移され、トリプシン消化され、得られたペプチドはMALDI-TOF及びN-末端配列決定によって分析された。これは、１４２ｋDの小さなバンドがほとんど確実に主要なバンドのタンパク分解断片であり、該タンパク質が新規であるということを確立した。我々は、該タンパク質をPtdIns(3,4,5)P3依存性Racエクスチェンジャーからとって、P-Rex1と名づけた。
【０１３０】
ヒトP-Rex1のクローン化及び発現
我々は、ランダムプライム法によるヒトU937細胞及び脾臓cDNAライブラリーからのライブラリースクリーニングとヒト白血球マラソンレディ（marathon-ready）cDNAライブラリーからのＰＣＲの組み合わせを用いて関連するヒト遺伝子をクローニングした。これらのアプローチによって、通過可能なKozak配列及びN末端におけるCGに富む領域がこれに先立つ、開始ATGを有するが、上流の停止コドンを有さず、我々が真の開始ATGを同定していないというわずかな可能性を残す、4980bpの新規な完全長のORF（受け入れ番号AJ320261）が得られた。基礎となるゲノム配列は、P-Rex1のコード配列が４１のエキソン中に配置され、ｑ13.13.における２０番染色体の３００kb超にわたる（AL131078、AL049541、AL445192、AL035106、AL133342）。また、スプライスバリアント及び８番染色体上の潜在的な相同体が存在する可能性も明らかとなった（データベースエントリーESTBAB14375を参照のこと）。
【０１３１】
P-Rex1タンパク質の配列は、1659アミノ酸の長さであり、185kDのタンパク質であることが予想され、精製ブタ酵素から得られた５のトリプシンペプチドすべてを含む（図３A）。該タンパク質は、RhoファミリーのGEFに典型的なタンデムＤＨ/ＰＨドメイン、２のDEF及び２のPDZドメインを有し、並びにそのC末端側半分にわたって、イノシトールポリホスフェート４−ホスファターゼに対する顕著な類似性を有する（図３Ｂ）。
【０１３２】
我々は、P-Rex1をコードする配列の６７３塩基対から作製したプローブで、Clontechからのヒト複数組織のノーザンブロットを調べることによって、P-Rex1mRNAの発現について研究した。ノーザンブロットは、完全長のP-Rex1mRNAの予想サイズと一致する、およそ６kbの主要バンド及びそのすぐ下の小さなバンドを明らかにした。それらは、P-Rex1が主に末梢血白血球及び脳において発現され、脾臓及びリンパ節ではより少なく、そして他のほとんどの組織では非常に弱く発現されることを示す（図４A）。
【０１３３】
我々は、N-末端EEエピトープを有するP-Rex1をCOS-7細胞中で一過性に発現させ、そして抗EEウエスタンブロットは、見かけの分子量１９７kDのタンパク質を細胞ライセート中において明らかにした（図４B）。
【０１３４】
インビトロにおける、P-Rex-1によるPtdIns(3,4,5)P3-及びGβγ-依存性のRac活性化
我々は、SF9細胞においてN-末端EEタグを有するP-Rex1を発現させた。タンパク質は良好に発現し、プロテインG−セファロースにクロスリンクした抗-EEモノクローナル抗体を使用する１のステップにおいて９５％を超える純度に精製されることができた。
【０１３５】
組み換えP-Rex1は、精製タンパク質に非常に類似したPtdIns(3,4,5)P3-感受性Rac-GEF活性を表した。我々は、多様なRho-ファミリーGTPase及び翻訳後脂質修飾をされたか又はされないRacタンパク質或いは異なるエピトープタグを有するRacタンパク質についてのP-Rex1の特異性をテストした。P-Rex1はRac1、Rac2及びCDC42に対して類似したPtdIns(3,4,5)P3-感受性の活性、並びにRhoAに対して低い活性を表した（図４C）。興味深いことに、Rac１タンパク質は、これらのアッセイにおいて基質として働くために、脂質修飾される必要はなかった（図４Ｃ）。
【０１３６】
P-Rex1のRac-GEF活性のさらなる分析は、PtdIns(3,4,5)P3が、０．３μMにおいて最大効果の５０％を有し（図５A）、該濃度においてP-Rex1は、その他のジアステレオマーに比べてPtdIns(3,4,5)P3の生物学的なD-ジアステレオマーに対して顕著に選択性であったということを示した（図５B）。１０μMにおいて異なるホスホイノシチドが比較された場合、P-Rex1はなおPtdIns(3,4,5)P3に対して選択的であり、PtdIns(3,4)P2の生物学的なジアステレオマーによって弱く活性化されたが、他のホスホイノシチドでは活性化されなかった（図５B）。我々は、P-Rex1がステアロイル−アラキドニル脂質によるよりも、ジパルミトイルPtdIns(3,4,5)P3によって明らかにより立体選択的な様式で活性化されたことを観察した。我々は、ARAP３による類似の効果を観察したが（Krugmann et al. 2002）、これらの脂質調製物は、PKBを完全に立体特異的に活性化し、PDK-1を同一の部分的選択性をもって活性化した（Stephens et al. 1997）。我々は、これがホスホイノシチドとそれらに結合するタンパク質の間の脂肪酸感受性の相互作用を反映していると推測する。
【０１３７】
我々は、可溶性P-Rex1及びデキストランコーティングしたL1金チップ上に固定化されたPtdIns(3,4,5)P3-又はPtdIns(3,4)P2含有リン脂質ビヒクルの間の相互作用を、表面プラズモンエネルギー移動技術（BiaCore）を利用して分析した。リン脂質ビヒクルへのP-Rex1の結合は、PtdIns(3,4,5)P3を含ませることによって実質的に増強され、PtdIns(3,4)P2によってより少なく増強された（図５C）。リン脂質ビヒクル中のPtdIns(3,5)P2、 PtdIns(4,5)P2、PtdIns3P、PtdIns4P、又はPtdIns5Pの存在は、P-Rex1の結合を弱く増加させたのみであった。これらの結果は、我々のアッセイにおいて、PtdIns(3,4,5)P3が、P-Rex1と相互作用するためにRacの分布又はRacの能力に影響する等の間接的な効果よりも、むしろ直接的な効果をP-Rex1に対して及ぼすという考えに一致する。
【０１３８】
GβγがP-Rex1を直接的に活性化できるという可能性を支持する直接的なアッセイデータを我々が有さなかったにもかかわらず、Gタンパク質へテロ三量体と相互作用するタンパク質中に共通して発生するDEFドメインの存在及び好中球サイトゾル／膜混合物についての我々の先の結果は、我々がGβγのP-Rex1 Rac-GEF活性に対する効果をテストすることを後押しした。ウシ脳からの純粋なGβγ又は同時感染したSF9細胞からの組み換えG-EE-β1γ2として調製されたGβγは、どちらもインビトロでP-Rex1 Rac-GEF活性を増強させた（図５D）。Gβγの効果は、先に加熱すること（９５℃で３０分）によって消滅させられ、精製されたGDP‐結合Gαと先に結合させることによって実質的に阻害され、組み換えGβγの場合には、それらの翻訳後脂質修飾に依存して阻害される（図５E）。Gαは、単独又はA1Fの存在下では、P-Rex1 Rac-GEF活性を増強しなかった。（我々がGβγ及びGαタンパク質の調製物のための貯蔵緩衝液中で使用する界面活性剤である）コール酸塩は、P-Rex1 Rac-GEF活性を強力に阻害し、結果的に、実験中のGβγの効果のスケールは、Gβγ及び総コール酸塩濃度を併せた関数である。我々は、Gβγ及びPtdIns(3,4,5)P3の併用効果を試験した（図５F）。P-Rex1は、Gβγ及びPtd(3,4,5)P3によって相乗的に活性化され、これは、それらの効果が異なるメカニズムを介していることを示唆する。
【０１３９】
インビボにおける、P-Rex1によるPtdIns(3,4,5)P3-及びGβγ-依存性のRac活性化
細胞中でのRac対CDC42についてのP-Rex1の選択性、及びGβγ及びPtdIns(3,4,5)P3の効果の生理学的な重要性に関する疑問に答えるために、我々は、SE9細胞中での内因性のRac及びCDC42の活性化の研究を可能とする、関連するバキュロウイルスを調製した。我々は、P-Rex1、ｐ101/ｐ110γ-PI３K及びGβ1γ2の産生を推進するバキュロウイルスに感染したSF９細胞が、内因性のGTP-Racのレベルを増加させるが、内因性のGTP-CDC42のレベルは変化させないことを見出し、これはインビボにおいてP-Rac1がRac-GEFとして作用することを示唆する（図６A）。さらに、ｐ101/ｐ110γ-PI３K及びGβ1γ2によるRac活性化のパターンは、インビトロにおける我々の結果と一致し、P-Rex1 Rac-GEF活性の相乗的な増強を示した（図６A及びB）。PI3K及びGβγの同時発現が、PI3Kのみの発現に比べて顕著に高いPtdIns（3,4,5)P3の産生を導いたにもかかわらず、PtdIns(3,4,5)P3及びGTP-Racの増加を直接比較すると、Gβγ及びPI3Kの存在下におけるRac活性化が、PtdIns(3,4,5)P3の増加のみによって説明されるよりも実質的に大きいということを明らかに示した（図６C）。
【０１４０】
P-Rex1は、PDGF刺激されたPAE細胞中で構成的活性型Racのような表現型を誘導する
我々は、P-Rex1が哺乳動物細胞において、細胞表面受容体の下流の情報伝達経路によって制御され、そしてRac-GEFとして作用することができるという証拠を探した。我々は、安定的にPDGFβ受容体を過剰発現するブタ大動脈内皮（PAE）細胞株を使用した。これらの細胞においては、PDGFはPtdIns(3,4,5)P3の蓄積、Racのワートマニン感受性の活性化、及びRac依存性の膜のラッフリング及びラメリポディア形成を刺激し、構成的活性型V12-Racの安定的な過剰発現が非常に誇張されたラメリポディア（「フライドエッグ」）の形成を引き起こす（図７A、及びHawkins et al. 1995, Welch et al. 1998）。
【０１４１】
PAE細胞は、一過性にN-末端mycタグを付与されたP-Rex1でトランスフェクトされ、血清飢餓状態とされ、細胞の形状及びmyc-P-Rex1の分布に対するPDGF刺激の効果が間接的免疫蛍光顕微鏡法によって分析された（図７B）。血清飢餓状態の非刺激myc-陽性細胞の大半において、いくらかのP-Rex1が原形質膜に局在するように見えるにもかかわらず、P-Rex1は主にサイトゾルに局在しており、細胞は典型的な基底状態の形状を有した。しかしながら、非刺激myc-陽性細胞の約３０％において、P-Rex1の発現は、構成的活性型V12-Racによって誘導されたものと同一の非常に誇張されたラメリポディア（「フライドエッグ」）の形成を引き起こした。V12様の表現型を示す細胞の比率は、ワートマニン処理された細胞において半分に減少し（図7B及びC）、それが基底状態のPI3K活性によって誘導されたことを示唆していた。PAE細胞のPDGF刺激は、V12-Rac様の表現型を表すP-Rex1陽性細胞を８０％まで増加させ、この増加は、ワートマニン感受性でもあった。V12-Rac様の表現型の誘導は、P-Rex1陽性細胞に特異的であり、平行した試験におけるDAPP1によって誘導されなかった。V12-Rac様の表現型を示す細胞において、P-Rex1はなお、主にサイトゾルに局在していたが、ラメリポディアの縁における皮質下のアクチンリングの顕著な同時ステイニング及び原形質膜中のP-Rex1のわずかな可変の蓄積が起こった。しかしながら、原形質膜の転位は、平行した実験におけるDAPP１についてよりもより弱く且つより明確でなかった。我々がGFPタグを付与されたP-Rex1の分布を対照及びPDGF刺激されたPAE細胞において共焦点走査顕微鏡によるライブ画像処理によって調べた類似の実験は、同じ結果となった（示さない）。したがって、PI3Kの活性化は、P-Rex1の原形質膜への大規模な転位を起こさず、P-Rex1を介するラメリポディアの強い形成を誘導するのに充分であった。これらの結果は、P-Rex1がRac-GEFとして作用可能で、哺乳動物細胞中の細胞表面受容体の下流の情報伝達経路によって制御されることを示唆する。
【０１４２】
好中球様の細胞株におけるアゴニスト刺激によるROS形成は、P-Rex1に依存する
我々は、レチノイン酸及びP-Rex1を標的とするホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド又は無作為化対照オリゴヌクレオチドのいずれかで、前骨髄球細胞株（NB4）を処理した。２日後、両方の細胞母集団は正常に分化し、C5aに応答して識別不能なMAPK活性化（図８C）、及びβ-COPの発現を示した（示さない）。対照的に、アンチセンス処理した培養においては、特に、P-Rex1のレベルは８０〜８５％低下し（図８B）、そしてC5a刺激によるROS形成は、約４０〜４５％低下した（図８A）。
【０１４３】
最後に、P-Rex1のC末端側半分は、イノシトールポリホスフェート４−ホスファターゼと実質的に相同であるため、我々は、32P-PtdIns(3,4,5)P3及び32P-PtdIns(3,4)P2を基質として、そしてイノシトールポリホスフェート４−ホスファターゼ及びSHIP-1を対照として用いて、該タンパク質がイノシトールポリホスフェート４−ホスファターゼ活性を有するか否かを決定することを試みた。我々はまた、プロテインホスファターゼアッセイにおいて、スペクトルの広い基質としてパラ−ニトロフェノールホスフェートを使用し、ウシ小腸アルカリホスファターゼ及びMEG-2チロシンホスファターゼを対照として使用した。これらのアッセイ中の１．４５μM以下及び１９２nM以下のそれぞれのP-Rex1濃度において、酵素は、脂質ホスファターゼ活性又はプロテインホスファターゼ活性のいずれも示さなかった。
【０１４４】
我々の知識によれば、いかなるRhoファミリー又はRasファミリーGEFもうまく精製されず、それらのGEF活性に基づいて同定されていない。Rac-GEFの場合、これは、ライセート中の活性又は特異的情報伝達に含まれる活性は、稀に特別なGEFによるのみであり、さらに、いかなるGEFによる総細胞内GEF活性への貢献も不明であるということを意味する。我々は、Q−セファロース上のクロマトグラフィーによって好中球サイトゾルを分離し、PtdIns(3,4,5)P3感受性Rac-GEF活性の主要ピーク（PtdIns(3,4,5)P3の存在下においては、総Rac-GEF活性の約６５％を示した）を見出し、これを精製し、クローン化してP-Rex1と名づけた。P-Rex1は、サイトゾルタンパク質の約０．１％の、驚くほど豊富なタンパク質である（これに比べて、類似の分画から精製されたPI3Kタイプ１Bについては、０．００１％である）。
【０１４５】
我々の結果は、PtdIns(3,4,5)P3がインビトロにおいて実質的にP-Rex1 Rac-GEF活性を増強することができること、及び細胞表面受容体がインビボにおいて、PI3K依存性の様式でP-Rex1を活性化することができることを示す。さらに、我々は、P-Rex1が選択的にPtdInx(3,4,5)P3含有リン脂質ビヒクルを結合することができることを実証する。しかしながら、インビボにおいて、P-Rex1は実質的にサイトゾルからPtdIns(3,4,5)P3の蓄積部位へ転位せず、むしろ、該酵素は血清飢餓細胞中の膜に部分的に局在化している。これらの結果の意味するものは、PtdIns(3,4,5)P3が、P-Rex1を膜にターゲティングさせることよりもむしろ、触媒的に重要なコンフォメーションシフトを誘導すること、又はP-Rex1を膜表面に再配向させることによって該酵素を活性化することができるということである。これは、DHドメインGEF活性のホスホイノシチド阻害されたリプレッサーとしてのRhoファミリーGEFのタンデムDH／PHドメイン中のPHドメインの役割についての新たな見解に、全体として適合する（Worthylake et al. 2000の導入部を参照のこと）。これは、脂質の結合が純粋に膜ターゲティングデバイスとして作用する、PLCδのようなタンパク質中のＰＨドメインの役割についての一般的に受け入れられた見解とは全く異なる。
【０１４６】
いくつかのデータが、好中球様の細胞中のヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化が、Rac-GEF活性を刺激することができること（Geijsen et al. 1999）、そしてさらに、好中球ライセート中におけるGβγのRac-GEF活性に対する（対照よりも約４０％高い）小さな効果が報告されている（Arcaro 1998）。P-Rex1は、Gβγによって直接的に活性化されることのできるRac-GEFの最初の例である。相乗的にP-Rex1を活性化するというGβγ及びPtdIns(3,4,5)P3の能力は、これらの制御物質が同時に、独立した部位、われわれはこれらの部位を同定していないが、に結合可能であることを示唆する。したがって、P-Rex1は、その数が増加している、ｐ101/110γ-PI3K及びPLCを含む好中球中でGβγサブユニットによって制御されるエフェクタータンパク質リストの一つとなる（Sternweis and Smrcka 1992）（上記を参照のこと）。
【０１４７】
Gタンパク質を介する好中球中での情報伝達経路は迅速に応答し、例えば、Racの最大活性化は１０秒以内で起こり得る。血清飢餓細胞において、ｐ101/ｐ110γ-PI3K及びP-Rex1の両方が部分的に膜に局在し、サイトゾルからのいかなる転位をも必要とせずに膜のレベルで活性化される（Krugmann et al. 2002）という事実は、おそらくこの迅速性に寄与する。
【０１４８】
我々のデータは、Gタンパク質に結合した受容体からの、そしてGβγ、PI3Kタイプ１B及びPtdIns(3,4,5)P3、並びにROS形成を促進するためのRac活性化を介する好中球中における情報伝達経路の存在と一致する。これらの結合を示唆する顕著な研究があるが、これは、適切なRac-GEFがない場合には弱くなった。該文献はまた、このモデルと明らかに一致しない質の高い研究をも含み：fMLPのようなリガンドによるRacの活性化がPI3K阻害物質に対して耐性であることが示された（Geijsen et al. 1999、導入部を参照のこと）。我々の結果は、可能性のある説明を提供し、それは、fMLPのようなリガンドによる刺激の早期に、GβγによるP-Rex1の活性化がPtdIns(3,4,5)P3を介する活性化よりも重要であるかも知れず、それはなぜなら、Gβγによるp101/p110γ-PI3Kの刺激によってPtdIns(3,4,5)P3レベルの上昇するからである、ということを彼らは示唆している、というものである。さらに、この現象は、fMLPに応答して２０倍低いPtdIns(3,4,5)P3を産生する、初回刺激されない好中球において誇張されるであろう（Condliffe and Hawkins, 2000）。これは、文献中に見られたものと全く同じであり、実際的に初回刺激されない好中球を用い、また、最短時間（１０秒）での刺激も行った研究者らは、fMLPによるRac活性化がPI3K阻害物質に対して大きな耐性を有することを見出した（Geijsen et al. 1999）。刺激のより後の時点で（１分）PI3K阻害物質をテストした研究者らは、PI3K阻害物質が実質的に、しかし完全にではなく、Rac活性化を阻害することを見出した（Akasaki et al. 1999, Benard et al. 1999）。
【０１４９】
P-Rex1は、おそらく同じ膜内にある、併合されたPtdIns(3,4,5)P3及びGβγ対単離されたPtdIns(3,4,5)P3及びGβγの出現率に対応するように設計されたことが明らかな同時発生的検出物質である。好中球において、情報のこの組は、原形質膜中の大きなGiタンパク質母集団及び実際にGβγを含む膜中のPtdIns(3,4,5)P3の蓄積を推進する（特に造血系細胞において濃縮された）Gβγ感受性ｐ101/ｐ110γ-PI3Kとの関係においてGタンパク質に結合した受容体の活性化によって自然にデリバリーされる（Stephens et al. 1997）。この共同作用の重要性は、主にタンパク質チロシンキナーゼに基づくメカニズムを介してPI3Kタイプ１Aを活性化するGM-CSFのようなリガンドが顕著なPtdIns(3,4,5)P3の蓄積を起こさないにもかかわらず（Corey et al. 1993）、検出可能なRacの活性化を起こさない（Geijsen et al. 1999）という事実に反映されているのであろう。他の細胞成分においては、おそらく脳においては、P-Rex1が、PI3Kタイプ１A及びGi/Goタンパク質の同時発生的活性化をデリバリーする特別な情報伝達パターンの検出に関連することができると容易に想像される。このタイプの制御は、Racが例えば神経突起の伸長において主要な役割を演じるという観点から、特別な細胞接触の形成又は強化において特別に重要であることができた（Luo et al. 1997）。
【０１５０】
実験手順
材料
GTPase単量体（EE-Rac-1、GST-Rac-1、EE-N17 Rac1、EE-Rac2、GST-CDC42、GST-RhoA）を、GDPに結合した状態で９５％を超える純度でSf9細胞から精製し、１％（w/v）コール酸塩、５μMGDP、５ｍM MgCl2、１ｍM EGTA、１ｍM DDT、０．１５M NaCl、４０ｍM Hepes/NaOH pH7.4(４℃)中に保存した。非脂質修飾GST-Racは細菌に由来する。Gβγは、ウシ脳（Sternweis and Robishaw 1984)又はSf9細胞（そのどちらも野生型EE-β１、γ２及び非プレニル化突然変異体EE-β１、C186S-γ２）から精製し、１％コール酸塩、１ｍM DDT、２０ｍM Hepes/NaOH pH８．０（４℃）５μM GDP（ウシ脳Gβγのために）、及び１ｍM EDTA中に保存した。（αi1、αi2及びαoの混合物である）Gαサブユニットをウシ脳から精製し（Sternweis and Pang 1990）、５０ｍM Hepes/NaOH pH８．０（４℃）、１ｍM EDTA、１ｍM DTT、１００ｍM NaCl、１％コール酸塩及び１０μM GDP中に保存した。P-Rex1に対するホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド及び対照を設計し、BIOGNOSTIK, Gottingen, Germanyにより製造した（アンチセンス：TCA TTG ATG GAG TAG ATC(配列番号：９)、無作為化対照：ACT ACT ACA CTA GAC TAC (配列番号：１０)）。
【０１５１】
組み換えＥＥ-p101/ヘキサ-His-ｐ110 PI3KをＳｆ９細胞から作製した（Stephens et al. 1997）。無作為化アミノ末端ＥＥ−タグ付与P-Rex1を、EE-タグを利用してSf9細胞から精製し、PBS、１ｍM EGTA、１ｍM DTT、０．０１％アジ化ナトリウム中に保存した。
【０１５２】
ステアリル−アラキドニル（S/A）-PtdIns(3,4,5)P3立体異性体を、P. Gaffneyが合成した（Gaffney and Reese 1997）。すべてのジパルミトイル（P/P）-ホスホイノシチドを、G. Painterが作製した（Painter et al. 1999）。この原稿において、別記されない限り、PtdIns(3,4,5)P3という用語はD/D-(S/A)-PtdIns(3,4,5)P3を指す。
【０１５３】
２の独立したアフィニティー精製された（以下のP-Rex1配列：CLHPEPQSQHE（配列番号：１１）及びCAAARESERQLRLR（配列番号：１２）に基づく結合ペプチドに対する）ヒツジ抗P-Rex1ポリクローナル抗体をプールし、イムノブロッティングによって内因性及び異種性P-Rex1を検出するために使用した。
【０１５４】
好中球サイトゾル及び膜分画とのROS形成アッセイ
好中球に富む白血球をブタ血液から単離し、０．２５Mショ糖、０．１M KCｌ、５０ｍM Hepes/MaOH pH ７．２（４℃）、１ｍM DTT、２ｍM EGTA、０．１ｍM PMSF及び１Xアンチプロテアーゼ（それぞれ２０μg/mlのアンチパイン、アプロチニン、ペプスタチン及びロイペプチン）中で超音波処理し、遠心分離して（１００，０００×ｇ、1時間、４℃）サイトゾル及び軽量の膜分画（０．６０及び１．３５Mの間のショ糖で集め、超音波処理緩衝液で洗浄した、４．５mg/mlのタンパク質）を得た。軽量の膜（３μl）を、５ｍM ATP、８ｍM MgCl2、２０ｍM Hepes/NaOH pH7.5（4℃）、２mM EGTA、１０mMβ-グリセロホスフェート、０．１mMオルトバナデート、０．１M KCl、１mM DTT、０．０１％（w/v）アジ化ナトリウムを含む６μl中で、Gβγサブユニット、p101/p110γ-PI3K及び／又はN17-Rac（又は煮沸した対照）と先に混合した。氷上に２５分間置いた後、１５μlサイトゾル及び1mM MgGTP、２０μM FAD、４００μM NADPH及び２００μMルミノールを含む２０μlを添加した。室温で８分後、０．１分あたりの単一光子計数（SPC）を、シンチレーションカウンター中、２０分まで３〜５分の間隔で定量した（サイトゾルを含まないブランクを差し引いた）。脂質を添加した場合、それらを膜とプレインキュベートし、１０μM GTPγSでMgGTPを置換した。ワートマニンを添加した場合、それを、サイトゾル及び膜分画の両方と氷上で１５分間プレインキュベートした。EE-Rac１を添加した場合、それに異なるグアニンヌクレオチドを結合GDPの５倍過剰で先に負荷した。
【０１５５】
好中球サイトゾル及び膜分画とのRac-GEFアッセイ
このアッセイは、（最終濃度３０〜５０nMの）純粋な脂質修飾EE-Rac-1がサイトゾルに添加され、GTP、GTPγS、NADPH、FAD及びルミノールが除かれる以外は、基本的にはROS産生についてと同様である。膜及びサイトゾル分画の混合の３分後、[α32P]-GTP（サンプルあたり２０μCi）を添加した。４分後、反応を停止し、Gタンパク質セファロースに結合した抗-EE抗体を使用してEE-Racをプルダウンした。EE-Rac1上の総dpmをシンチレーション計数によって定量した（EE-Rac1を含まないブランクを差し引いた）。
【０１５６】
P-Rex1の精製及び組み換えP-Rex1のためのアッセイ
（ホスファチジルコリン（PtdCho）、ホスファチジルセリン（PtdS）、ホスファチジルイノシトール（PtdIns）がそれぞれ最終アッセイ濃度で２００μMの）リポソームを、PtdIns(3,4,5)P3を含むか又は含まない脂質緩衝液（２０mM Hepes/NaOH pH7.5（４℃）、１００mM NaCl、１mM EGTA）中で超音波処理し、氷上で５mM MgCl2、５０mg/ml BSA、５mM DTT、２０mM Hepes/NaOH pH7.5(４℃)、１００mM NaCl、１ｍM EGTA（１００nM EE-Rac1、０．００２４％コール酸塩の最終アッセイ濃度の）中、精製したGDP負荷組み換え脂質修飾EE-Rac-１の２μlとともにインキュベートした。そして、Rac-GEF活性を有する４μl（サイトゾル、カラム分画又は組み換えP-Rex1）を添加し、続いて２μlの（脂質緩衝液中、１μCi[35S]-GTPγSを含む、最終アッセイ濃度５μMの）GTPγSを添加した。３０℃で１０分おいた後、反応を停止し、Gタンパク質セファロースに結合した抗-EE抗体を使用してEE-Racをプルダウンし、Racの[35S]-GTPγS負荷をシンチレーションβ計数によって定量した。組み換えP-Rex1を「緩衝液A」（２０mM Hepes/NaOH pH7.5（４℃）、１％ベタイン、０．０１％アジ化ナトリウム、０．５ｍM EGTA、２００mM KCl、１０％エチレングリコール）で希釈し、最終アッセイ濃度５０nMとした。Gβγとのアッセイにおいては、氷上での１０分間の前に、２μlの緩衝液A中Gβγをリポソーム／Rac混合物に添加し、P-Rex1を５倍で添加した。
【０１５７】
PtdIns(3,4,5)P3依存性のRac-GEFの精製
９０ｌのブタ血液から調製した好中球に富む白血球を３０mMトリス／HCl pH７．８（４℃）、０．１M NaCl、４ｍM EGTA、１mM DTT、０．１mM PMSF及び０．５Xアンチプロテアーゼ中で超音波処理した。サイトゾル（１００，０００×ｇの上清）を、１０mMトリス／HCl pH7.8（４℃）を含む「緩衝液B」（０．５mM EGTA、１０％エチレングリコール、１％ベタイン、０．０１％アジ化ナトリウム、１mM DTT、５０μM PMSF、及び０．１Xアンチプロテアーゼ）で、１６．７mM NaClに希釈し、３０mMトリス／HCl pH7.8（4℃）及び０．１mM EDTAを含む「緩衝液B」で平衡化した４００mlのQ-セファロース高速カラムに適用し、３lの０．１〜０．６MのNaClグラジエントで溶出した。０．４３及び０．５２Mの間のNaClで溶出したPtdIns(3,4,5)P3依存性Rac-GEF活性のピークを、２０mMHepes/NaOH pH6.8（4℃）を含む「緩衝液B」で平衡化した１．４ｌのG２５‐ファインカラム上で脱塩し、その後、同じ緩衝液で平衡化した５０mlのSP-セファロース-HPカラムに適用し、５００mlの０．２５〜０．７５MのKCｌグラジエントで溶出した。活性を０．３１及び０．３７５Mの間のKCｌで回収し、２０mM Hepes/NaOH pH7.2（4℃）を含む「緩衝液B」で平衡化した３００mlのG２５−ファインカラム上で脱塩し、同じ緩衝液で平衡化した１２mlのヘパリンセファロースカラム上へ適用し、１５０mlの０．１〜０．７MのKClグラジエントで溶出した。活性を、０．５５及び０．６９Mの間のKCｌで回収した。良好な精製倍率のために選択した０．６０〜０．６５Mの塩にあたる分画を濃縮し、pH調整し、そして２０mMHepes/NaOH pH6.9（４℃）及び１２０mM NaClを含む「緩衝液B」で平衡化した２００ｍlのHPLCサイズ排除カラムに適用した。見かけの大きさである２０３kDに相当する１０４mlの後、活性を回収し、２０mM Hepes/NaOH pH7.0（4℃）を含む「緩衝液B」で平衡化した１mlのMono S FPLCカラムに負荷し、５４mlの０．１〜０．７M KClグラジエントで溶出した。純粋なPtdIns(3,4,5)P3依存性のRac-GEF活性を、０．３７５及び０．４２５M KClの間で溶出した。
【０１５８】
ヒトP-Rex1のクローン化
精製ブタPtdIns(3,4,5)P3依存性Rac-GEFのトリプシン消化物は、MALDI-TOF及びN末端配列決定によって分析されたT14、T３０、T４４、T６９、T７２の５のペプチドであった。T７２は、（Tiamと相同な）マウスEstAA796530と同一であった。T１４及びT６９は、（イノシトールポリホスフェート４−ホスファターゼと相同な）マウスEstA1466041とほぼ同一であった。T３０及びT４４は、新規であった。基礎をなすヒトゲノム配列では、T44はイノシトールポリホスフェート４−ホスファターゼ相同領域に、T７２は予想されたタンパク質のN-末端近くにある。これらの領域を含む予想された部分配列は、公開されている（Nagase et al. 2000）。EstAA796530をBgl2で切断し、プライム−エー−ジーンシステム（prime-a-gene system）(Promega)を使用して[α32P]‐ｄCTPで標識して、ヒトU937細胞ランダムプライムλ−Zap2 cDNAライブラリー及びヒト脾臓ランダムプライムλGT11cDNAライブラリーのスクリーニングのための673塩基対のプライマーを作製し、それぞれ２４及び３６の多様な長さのクローンを得た。平行して、基礎となるゲノム配列に基づくPCRプライマーを、マラソン−レディヒト白血球cDNAライブラリー（Clontech）のスクリーニングのために使用した。
【０１５９】
３の断片から完全長の配列を得て、以下のようにｐBluescript（Stratgene）中にクローン化した：クローン１を最初のSph1切断部位までのP-Rex1のN末端のｐBluesdriptを得るために、Sa11/Sph1で切断した。P-Rex1の真中を得るために、クローン２をSph1/Bc11で切断し、PCR由来のC末端であるクローン３をTテールベクターからBc11/Sa11で切断した。断片を３通りにライゲーションした。得られたｐBluescriptのポリリンカーは、さらに、Sa11の５’側にSpe1、Not1及びPst1切断部位を有した。５’オーバーハングをPCRによって置換し、インフレームEcoRI/開始ATGを作り出した。６０塩基対の３’オーバーハングは保存した。EcoR1/Spe1切断ｐBluescript-P-Rex1からのP-Rex1をEcoR1/Xba1切断ベクター中へライゲーションすることによって、完全長P-Rex1をmyc-又はEE-エピトープタグを有するpCMV3哺乳動物発現ベクター（Welch et al. 1998）又はN末端EE-タグを有するpAc0G1 Sf9細胞発現ベクター中へ、サブクローニングした。
【０１６０】
ノーザンブロット
ライブラリースクリーニングのための上記のプローブと同じプローブを、製造者の指定したとおりに、Clontechマルティプルティシューノーザンブロット（multiple tissue northern blot）をハイブリダイズするために使用した。
【０１６１】
表面プラスモン共鳴
１００nMの精製組み換えSf9細胞由来のP-Rex1の注射の前に、L1ビヒクル捕捉チップ（Biacore）を負荷するためのさらなるホスホイノシチド（6モル％の最終濃度）を含むか又は含まない混合リン脂質ビヒクルを用いて（それぞれ３３０μMの最終濃度のPtdCho、PtdS、ホスファチジルエタノラミン（PtdE））、記載の通りに（Ellson et al, 2000）、アッセイを行った。
【０１６２】
Rac及びCDC42-GEFアッセイ並びにSf9細胞におけるPtdIns(3,4,5)P3形成の測定
インビボにおける、Rac及びCDC４２−GEFのアッセイを、内因性のRac及びP-Rex1、Gβγ及びPI3Kの組み合わせを産生するように感染させたSf9細胞からのCDC42とともに、（GDPに結合したRacではなく、活性化GTPに結合したRac及びCDC42のみがPAKのCribドメインに結合するという事実に基づく）PAK-Cribプルダウンアッセイとして、記載のとおりに（Sander et al. 1998）実施した。Sf9細胞中でのPtdIns(3,4,5)P3形成の測定を、基本的に記載の通りに（Van der Kaay et al. 1996）放射性リガンド置換アッセイ（radioligand displacement assay）によって実施した。
【０１６３】
免疫蛍光顕微鏡観察
ブタ大動脈内皮細胞（PAE）をエレクトロポーレーションによって、一過性にpCMV３−myc-P-Rex1又はpCMV3-myc-DAPP1でトランスフェクトし、カバーグラス上で１０時間培養し、続いて８時間飢餓状態にした。その後、それらを、１００nMのワートマニンで１０分間処理し、又はせずに続いて多様な用量のPDGFで５分間刺激した。細胞を固定し、抗-myc-エピトープタグ付与した一次抗体及びFITC−ヤギ抗マウス二次抗体でP-Rex1及びDAPP1を染色し、並びに先に記載したように（Welch et al. 1998）繊維状アクチンをTRITC-ファロイジンで染色することによる免疫蛍光顕微鏡観察のために調製した。
【０１６４】
NB4細胞の培養並びにMAPK及びROS形成アッセイ
（M. Lanotte, Parisからの）NB4細胞を培養し、１μMのすべてトランスのレチノイン酸の存在下で記載の通りに（Lanotte et al., 1991）、対照又はP-Rex1アンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかの存在下で２〜３日分化させた。C5aに応答するMAPKの活性化を、（推奨された通りに使用したCell Signalling Technologyからの）抗-ホスホ-MAPK抗体（サンプルあたり５×１０4細胞）によるイムノブロッティングによってモニターした。ROS形成を、単一光子計数モードのシンチレーションカウンターにおけるルミノールに基づく検出を用いてモニターした（サンプルあたり３×１０4細胞）。
【０１６５】
P-Rex1ノックアウトマウス（P-Rex1-/-マウス）の作製
１）予想された表現型：
P-Rex1の制限された組織分布、その好中球中での豊富さ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドについての我々の研究（Welch et al, 2002）に基づいて、我々は、好中球機能に対するP-Rex1の顕著な影響を予想する。P-Rex1情報伝達に含まれる他の２の酵素であるRac2及びPI3Kクラス１B（触媒的及び制御的サブユニット）、のためのマウスモデルは、これらの酵素が好中球機能に必須であることを示している（Roberts et al; Hirsch et al; Li et al; Sasaki et al; 及び我々の未公開の結果）。Rac２-/-マウスは、好中球増多、炎症性の腹腔浸出液形成の減少及びアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）感染による死亡率の増加を特徴とする（Roberts et al）。これらのマウスからの白血球は、そのアクチン細胞骨格構造、ROS形成及び化学走性の欠損を示す（Roberts et al）。D57N点突然変異により引き起こされた先天的なRac2欠損を有するヒト患者は、再発性の生命を脅かす感染症にかかり、そして彼らの好中球はRac２-/-マウスに類似した欠陥を示す（Williams et al; Ambruso et al）。PI3Kクラス１Bを欠くマウスは、細胞及び生物のレベルの両方で類似した表現型を有する（Hirsch et al; Li et al; Sasaki et al; 及び我々の未公開の結果）。我々はまた、P-Rex1-/-１マウスにおける類似の表現型を予想する。しかしながら、P-Rex1が２の異なるPI3K及びGβγからの情報を潜在的に組み込むことができるため、そしてP-Rex1が基質としてRac2のみだけでなく、他のRacイソフォーム（Rac1及びRac3）をも使用するため、我々は、P-Rex1-/-マウスがいくつかの特有のそして明白な形質をあらわすことを期待する。したがって、我々は、P-Rex1-/-マウスの特徴づけにおいて分子レベル及び細胞レベルの両方における好中球機能の欠陥、並びに好中球の補充の欠陥、そしてマウスの感染除去能力に焦点を当てる。
【０１６６】
２）P-Rex1-/-マウスの作製
これは、ネオマイシン耐性遺伝子カセットによってエキソン５（触媒DHドメインの重要な残基をコードしている（図１０Aを参照のこと））を置換する、標準的な相同性組み換えによる完全ノックアウトとして行われる。P-Rex1の欠失は、ノーザン及びウエスタンブロッティングによって確認されることができ、後者は我々がすでに作り出したポリクローナルP-Rex1抗体を使用する（Welch et al, 2002）。
【０１６７】
２ａ）ターゲティングベクター：標的領域をコードするゲノムＤＮＡを、ヒトP-Rex1のエキソン２〜７に対応するプローブによるマウスＰＡＫライブラリーRPCI21（UK HGMP Resource Centre）のスクリーニングによって得た。得られたクローンは、ヒトP-Rex1のエキソン４及び５に対応するプローブによるサザンブロッティングによってチェックし、６の同一の陽性クローンを得た。エキソン５の５’側８kb〜エキソン５の３’側３kb（図１２中の白い部分）にわたる領域を、マウスゲノムデータベース及びテンプレートとして陽性のマウスPAKクローンから単離されたDNAに基づいて設計されたプライマーを使用したPCRによって、３の断片でクローン化した。断片をpBluescriptII KSクローニングベクター中で構築した。その後、エキソン５を含む２kbの領域を切除し、ネオマイシン耐性遺伝子カセットを含む２kbの配列で置換した。ネオ−カセットは、ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター、細菌ネオマイシン耐性遺伝子、それに続く停止コドン及びホスホグリセレートキナーゼポリAシグナルからなる。最終的な標的ベクターは１６．５kbであった。
【０１６８】
２ｂ）P-Rex1標的ES細胞の作製：精製され、直線化されたターゲティングベクターを、２の異なるES細胞株、E１４及びCCB、中にエレクトロ-ポーレーションした。ネオマイシンを選択培地として使用して、ES細胞クローンを培養した。
【０１６９】
２ｃ）サザンブロットスクリーニング：３’外部プローブ（図１３A）を用いたサザンブロッティングによって、P-Rex1ターゲティングベクターの正しい挿入に関してネオマイシン耐性ES細胞をスクリーニングした。ネオマイシン耐性遺伝子カセットを有する新たなXmnI部位の挿入によって、非標的配列は、１８．９kbの標識断片、そして標的配列は、１２．７kbの断片を得た。
【０１７０】
３’プローブ／XmnIスクリーンからの陽性のクローン（E１４細胞から６、そしてCCB細胞から１）を、その後、ゲノムDNAのPsiI/SpeIの二重消化物と組み合わせた５’外部プローブを用い、そしてWbaI消化DNAとともに内部プローブをも用いてサザンブロッティングによってさらに検証した。３’プローブ／WmnIスクリーンにおいて陽性だったすべてのクローンは、他のスクリーンのどちらにおいても陽性であった。
【０１７１】
２ｄ）マウスの作製：（２はE１４細胞株由来、そして１はCCB細胞株由来の）３の陽性のES細胞クローンを独立に単離されたBlack６マウスの胚盤胞に注射し、これらを偽妊娠雌性Black6マウス（C５７BI/6 J）に移植した。これから、５０を超えるキメラ仔マウスが生まれた。これらを、標的ES細胞由来の体の部分（主に被毛の色）の程度によって評価し、ヘテロ接合性の子孫の繁殖のために、最も有望な雄性キメラマウスを雌性Black６（C５７BI/6 J）と交配させた。生殖系列の伝達が達成されれば、（CCB細胞株由来のマウスの）アグーティの被毛の色及び（E14細胞株由来のマウスの）クリーム色の被毛が予想される。潜在的にヘテロ接合性の子孫は、その後、「尾を切断」されることができ、尾のDNAは、上記の３’プローブ／XmnIストラテジーを用いたサザンブロットによって、P-Rex1ターゲティングについてスクリーニングされることができる。陽性のヘテロ接合性マウスを一緒に繁殖させると、P-Rex1-/-マウスが得られると予想される。
【０１７２】
サンプル調製、抗−P-Rex1ウエスタンブロットのためのヒト好中球総ライセート
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、８×１０6細胞の１０mlの、新たに精製された静止状態の（初回刺激しない）ヒト好中球。
１０μlの７Mジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）を添加する（注意！適切な指示に必ず従うこと）。
室温で１０分間インキュベートする。
室温で３５０×ｇで４分間回転させる。
（NaOH中へ）上清を捨てる
ペレットを４×１０7細胞／mlで沸騰した１×Laemmliサンプル緩衝液中に再懸濁する。
（激しく！）５分間煮沸し、この間、すべてを迅速に細いゲージの針／シリンジを通し、ボルテックスにかけることによって急速に再懸濁することを助ける。
−２０℃で貯蔵する（凍結／融解が繰り返し可能である）。
ゲルへの負荷のために：さらに１×Laemmliサンプル緩衝液中、1〜３×１０5細胞／５０μlに等しくなるように希釈する。すべてを負荷する前に煮沸＋遠心による沈殿形成を再び行う（標準的なBioRadサイズ、２０ウエルのコーム、１ｍM SDS PAGEの１ウエルに対して可能）。（比較のために、等量の２〜６×１０4HL60細胞又は０．３〜１×１０5NB4細胞、１×１０4のトランスフェクトされたCOS細胞（陽性対照）、１〜３×１０5のトランスフェクトされたCOS細胞（陰性対照）を負荷する。）
【０１７３】
抗−P-Rex1のウエスタンブロット
Immobilon−P（millipore, PVDF膜）上へ湿潤の状態で移行させる（ポンソー染色しないこと、決して膜を乾燥させないこと）。
TBS-Tween（２０mM トリス pH8.0 室温（！）、１５０mM NaCl, 0.1% Tween 20）中で膜をすすぐ。
ブロック＃１：TBS-Tween+５％乾燥脱脂乳中、室温、１時間振とうする（pHを再調製しないこと）。
ブロック＃２：ブロック＃１と同様、しかし、１％の正常ウサギ血清を加える。
第1AB：１：１５００にアフィニティー精製したヒツジ抗−ヒトP-Rex1ポリクローナル抗体、室温、ブロッキング溶液＃２中で振とうする。（ABをブロック溶液に加える前に、TBS-Tween中で１：１０に先に希釈し、凝集物を除去するために、4℃で、微量遠心管中、最大速度で４５分間遠心分離する。）
洗浄（激しく！）：３回すすぎ+６×１０分間、室温、ブロック溶液＃１中で振とう。
第２AB：ブロック溶液＃２中、１：５０００のウサギ抗−ヒツジHRP抗体（Santa Cruz）、１時間、室温、振とう
洗浄：ブロック溶液＃１中、３回すすぎ＋６×５分、室温、振とう。続いて、TBS-Tween中、２×５分
ECL-PLUS（Amersham）
【０１７４】
アフィニティー精製したヒツジ抗−ヒトP-Rex1ポリクローナル抗体：
−２０℃において！（５０％グリセロール含む、したがって、凍結しない。）、アザイドを含む、−８０℃で凍結しないこと。
【０１７５】
陽性ウエスタンブロット対照：P-Rex1でトランスフェクトしたCOS7細胞のライセート。レーンあたり、１及び１０μlの間で使用する。
【０１７６】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【図面の簡単な説明】
【０１７７】
（原文記載なし）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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