(57)【要約】本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。
2006504394.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最終生成物を生成する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて中間体を生成する工程；及び
ｂ）前記中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、前記中間体は前記中間体酵素により実質的に全て最終生成物に変換される。
【請求項２】
前記中間体変換酵素が微生物酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中間体変換微生物酵素が前記中間体と接触して微生物により分泌される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質変換酵素が微生物酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基質変換微生物酵素が前記基質と接触して微生物により分泌される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が同じ種の微生物により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が異なる種の微生物により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記中間体の濃度レベルが前記中間体から前記最終生成物への変換において異化代謝産物抑制を引き起こすレベル以下で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記中間体の濃度レベルが前記中間体から前記最終生成物への変換において酵素抑制を引き起こすレベル以下で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記中間体が濃度を０．２５％以下に維持するために十分な速度で前記最終生成物に変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質がバイオマス及びでんぷんからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記中間体がヘキソース及びペントースからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘキソースがグルコースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記最終生成物が１，３−プロパンジオール、グルコン酸、グリセロール、琥珀酸、乳酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、グルコン酸塩、グルコース、アルコール及びアスコルビン酸中間体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質及び基質変換酵素との接触工程がさらに前記基質を生物変換して前記中間体を生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
最終生成物を生成する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて、中間体を生成する工程；及び
ｂ）前記中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、ここで前記中間体は前記中間体酵素により実質的に全て最終生成物に変換され、前記最終生成物の存在が前記最終生成物のさらなる生成を阻害しない。
【請求項１７】
前記中間体変換酵素が微生物酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記中間体変換微生物酵素が前記中間体と接触して微生物により分泌される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質変換酵素が微生物酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質変換微生物酵素が前記基質と接触して微生物により分泌される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が同じ種の微生物により生成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が異なる種の微生物により生成される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
最終生成物を生成する方法であって、以下の工程を含む：
ａ）炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて、中間体を生成する工程；及び
ｂ）前記中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、ここで前記中間体は前記中間体酵素により実質的に全て最終生成物に変換され、前記基質の存在が前記最終生成物のさらなる生成を阻害しない。
【請求項２４】
前記中間体変換酵素が微生物酵素である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記中間体変換微生物酵素が前記中間体と接触して微生物により分泌される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記基質変換酵素が微生物酵素である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記基質変換微生物酵素が前記基質と接触して微生物により分泌される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が同じ種の微生物により生成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記中間体変換酵素及び前記基質変換酵素が異なる種の微生物により生成される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。
【０００２】
発明の背景
工業的発酵はタンパク質、酵素及び化学物質の生成のための供給原料としてグルコースを主に用いる。これらの発酵は通常、バッチ、フェッドバッチまたは連続式であり、基質限定及び最小副生成物形成条件下で操作する。これらは発酵時間、収率及び効果を最適化するために発酵中制御しなければならない重要な操作条件である。現在使用されている方法及び供給原料は発酵プロセスの効率を減少させる欠点を有する。
【０００３】
グルコースは開始基質として多数の化学的及び生物学的合成用途に有用な天然で、炭素ベースの化合物である。しかしながら、純度レベル９０％以上のグルコースを含むシロップは比較的高価である。さらに、グルコースが高濃度で存在すると発酵系が微生物汚染を受けやすくなり、それにより生成効率に悪影響を与える。他の欠点としては、低レベルから中レベルのグルコースが発酵樽中に存在している場合であっても、例えば、酵素阻害及び／または異化代謝産物抑制、及び／または微生物の成長により、グルコースから所望の最終生成物への転換に悪影響を与える。結果として、工業的発酵のコストを下げるため、特にグルコースより費用の安い基質の利用において種々の試みがなされてきた。しかしながら、多数の手段が開発されたにもかかわらず、当業界において、経済的で、効果的に活用できる発酵用の基質の必要性が依然としてある。実際に、より効率的に所望の最終生成物を生成するために、グルコースよりも費用のかからない開始物質を利用する方法が当業界において大いに必要とされている。
【０００４】
発明の概要
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。
【０００５】
いくつかの好ましい実施態様において、異化代謝産物抑制を避けることによる該方法の効率及び／または基質から最終生成物への酵素的変換における中間体の酵素的抑制効果を高めるために、本発明は低濃度で、好ましくは異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制を引き起こす閾値以下で変換の中間体濃度を維持することを特徴とする最終生成物を生成する方法を提供するものである。
【０００６】
特に好ましい実施態様において、本発明は最終生成物を生成する方法を提供し、該最終生成物は有機酸を含み、限定されないが、グルコン酸、アスコルビン酸中間体、琥珀酸、クエン酸、酢酸、乳酸、アミノ酸及び抗菌剤が挙げられ、並びに酵素及び有機溶媒を含み、限定されないが、１，３−プロパンジオール、ブタノール、アセトン、グリセロール及びエタノールが挙げられる。いくつかの実施態様において、本方法は中間体を生成するために炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させる工程を含み、続いて中間体と少なくとも１の中間体生成酵素を接触させ、ここで該中間体は最終生成物生産微生物により実質的に完全に生物変換される。追加の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。
【０００７】
好ましい実施態様において、最終生成物の生成は変換媒体中で中間体を低濃度に維持することにより効率的に達成され、中間体生成物形成に関連した異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制効果が減少するようにする。本発明は種々の中間体濃度レベルでの方法を提供し、基質、中間体及び中間体からエタノールへ変換する工程を提供する。
【０００８】
本発明は以下の工程を含む最終生成物を生成する方法を提供する：炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させ、中間体を生成する工程；及び該中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程あって、ここで該中間体は中間体酵素により実質的に全部が最終生成物に変換される。好ましい実施態様において、中間体変換酵素は微生物酵素である。別の実施態様において、微生物酵素は中間体と接触して微生物により生成される。別の実施態様において、基質変換酵素は微生物酵素である。さらに別の実施態様において、微生物酵素は基質と接触して微生物により生成される。さらに別の実施態様において、基質変換酵素及び中間体変換酵素の両方は中間体及び／または基質接触して微生物により生成される。いくつかの実施態様において、両酵素は同じ種類の微生物により提供され、一方他の実施態様においては、該酵素は異なる種の微生物により生成される。特に好ましい実施態様において、中間体の濃度レベルは、中間体から最終生成物への変換において異化代謝産物抑制効果が引き起こされるレベル以下で維持する。さらに好ましい実施態様において、中間体の濃度レベルは中間体から最終生成物への変換において酵素抑制効果が引き起こされるレベル以下で維持する。さらに別の実施態様において、中間体は混合物の濃度を０．２５％以下に維持するために十分な速度で最終生成物に変換される。特に好ましい実施態様において、基質はバイオマス及びでんぷんからなる群より選択される。さらに別の実施態様において、中間体はヘキソース及びペントースからなる群より選択される。好ましい実施態様において、ヘキソースはグルコースである。種々の好ましい実施態様において、最終生成物は１，３−プロパンジオール、グルコン酸、グリセロール、琥珀酸、乳酸、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、グルコン酸塩、グルコース、アルコール及びアスコルビン酸中間体からなる群より選択される。他の実施態様において、１以上の最終生成物が生成される。さらに別の実施態様において、基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触する工程はさらに、基質を生物変換して中間体を生成する工程を含む。いくつかの実施態様において、１以上の中間体が生成される。この場合、いくつかの実施態様において、中間体変換酵素は全ての中間体上で作用し、一方、他の実施態様において、中間体変換酵素は中間体の一部の集団上で作用し、さらに別の実施態様において、中間体変換酵素は１つの中間体上でのみ作用して、少なくとも１の最終生成物を生成する。さらに別の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。
【０００９】
本発明はまた、最終生成物を生成する方法を提供し、該方法は炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触して中間体を生成する工程、及び中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程を含み、ここで中間体は中間体酵素により実質的に全部が最終生成物に変換され、最終生成物の存在はさらなる最終生成物の生成を阻害しない。いくつかの実施態様において、１以上の中間体が生成される。この場合、いくつかの実施態様において、中間体変換酵素は全ての中間体上で作用し、一方、他の実施態様において、中間体変換酵素は中間体の一部の集団上で作用し、さらに別の実施態様において、中間体変換酵素は１つの中間体上でのみ作用して、少なくとも１の最終生成物を生成する。いくつかの実施態様において、中間体変換酵素は微生物酵素であり、一方、他の実施態様において、基質変換酵素は微生物酵素である。好ましい実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は中間体及び／または基質と接触した微生物により生成される。いくつかの実施態様において、両酵素は同じ種の微生物により提供され、一方、他の実施態様において、該酵素は異なる種の微生物により生成される。別の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。
【００１０】
また、本発明は最終生成物を生成する方法を提供し、該方法を以下の工程を含む：炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させ、中間体を生成する工程；及び該中間体と少なくとも１の中間体変換酵素を接触させる工程であって、ここで、該中間体は中間体酵素により実質的に全部が最終生成物に変換され、かつ基質の存在はさらなる最終生成物の生成を阻害しない。いくつかの実施態様において、中間体変換酵素は微生物酵素であり、一方、他の実施態様において、基質変換酵素は微生物酵素である。いくつかの好ましい実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は中間体及び／または基質と接触した微生物により生成される。いくつかの実施態様において、両酵素は同じ種の微生物により提供され、一方、他の実施態様において、該酵素は異なる種の微生物により生成される。いくつかの実施態様において、１以上の中間体が生成される。この場合、いくつかの実施態様において、中間体変換酵素は全ての中間体上で作用し、一方、他の実施態様において、中間体変換酵素は中間体の一部の集団上で作用し、さらに別の実施態様において、中間体変換酵素は１つの中間体上でのみ作用して、少なくとも１の最終生成物を生成する。別の実施態様において、基質変換及び／または中間体変換酵素は無細胞抽出物として提供される。
【００１１】
いくつかの好ましい実施態様において、接触工程は反応容器内で行い、限定されないが、タンク、ボトル、フラスコ、袋、生物反応器、及び本発明の方法を行うのに適した任意のその他の容器が挙げられる。
【００１２】
発明の簡単な説明
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。
【００１３】
本発明はでんぷんまたはバイオマス及び加水分解酵素をでんぷんまたはセルロースをグルコースに変換するために用いる方法を提供する。さらに、本発明はでんぷんからグルコースへの変換と各発酵生成物形成に必要なグルコース供給速度が一致するような速度でこれらの基質が提供される方法を提供する。従って、本発明は重要なグルコース限定発酵条件及び多くの代謝調節及び抑制を回避する方法を提供する。
【００１４】
いくつかの好ましい実施態様において、本発明は所望の最終生成物を生成する手段を提供し、グルコースの連続供給が制御速度条件下でなされ、原材料コストの低下、低粘度、代謝効率の改善された酸素移動、改善された生物変換効率、高収率、異化代謝産物抑制及び酵素抑制レベルの改変、及び全体的な製造原価の低減などの利点を提供する。
【００１５】
上述の通り、グルコースよりも安価な開始物質を使用して効率的に所望の最終生成物を生成する方法への大きな必要性が当業界に存在している。ここに詳細に記載するように、本発明はでんぷん（例えば、コーンスターチ及び小麦でんぷん）及びバイオマスなどの基質を含む方法を提供する。
【００１６】
でんぷん（スターチ）は植物ベースの発酵炭素源である。コーンスターチ及び小麦でんぷんは発酵用のグルコース炭素供給原料よりもかなり安価な炭素源である。液化でんぷんからグルコースへの変換は当業界に公知であり、通常、α−アミラーゼ、プルラナーゼ及びグルコアミラーゼなどの酵素を用いて行う。多数の方法が液化でんぷんから単糖類、グルコースへの変換に関して記載されている。グルコースはそれ自体価値があり、フルクトースなどその他の糖類の前駆体としても価値がある。さらに、グルコースはエタノールまたはその他の発酵生成物に発酵されることもできる。しかしながら、第１の炭素源から中間体、特にグルコースへの酵素的変換能力は中間体の存在により損なわれる。
【００１７】
例えば、日本の酒造及びアルコール生成に用いられる一般的な方法は加熱処理なしででんぷんを用いる。しかしながら、これらの技術は、有害微生物の汚染を防止する、麦芽汁の酸性化（ｐＨ３．５）などの特別な処理を必要とする。さらに、これらの方法は本発明よりも、糖化及び発酵に長期間の時間を要する。さらに、これらの方法は発酵培養液の透析など複雑なプロセス工程を必要とし、発酵生成物の一般的な生成に利用するには面倒すぎる。
【００１８】
発酵の際の供給原料としての溶性デキストリン及びグルコースの使用は種々の欠点を有し、例えば、高い加工費及び粘度及び酸素移動に関する問題がある。さらに、本発明と比較して、これらの方法は所望の生成物の収率が低く、副生成物の形成に関する問題をより多く生じる。実際に、でんぷんまたはバイオマスをデキストリンに変換する費用は多大であり、高いエネルギー導入量、別個の反応槽、多くの時間、細かいバイオプロセス操作、不完全な糖化、逆反応、及び一般的な発酵前糖化工程に関する酵素を伴う。これらの問題により１つの反応容器またはコンテナー内で、低温で、直接でんぷんを変換する方法を提供する試みが多数なされた。混合培養物中での炭水化物源から１，３−プロパンジオールのバイオ変換は米国特許第５，５９９，６８９号（Ｈａｙｎｉｅ，ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｈａｙｎｉｅ，ｅｔ  ａｌ．に記載された方法はグリセロール（すなわち、中間体）生成生物とジオール生成生物（すなわち、最終生成物）を混合し、該混合培養基と炭素基質を接触し、該混合培養基を培養して所望の最終生成物、１，３−プロパンジオールを生成することを含む。米国特許第４，５１４，４９６号において、Ｙｏｓｈｉｚｕｍａは、加熱処理なしで（すなわち、糖化前の高温液化なしで）発酵によりアルコールを生成するため、麦芽汁に関するスラリー中の原材料の濃度を維持することを含む方法について記載している。それでもなお、これらの方法は本発明により提供される効率及び経済的利点を欠いたものである。
【００１９】
本発明は、有機酸（例えば、グルコン酸、アスコルビン酸中間体、琥珀酸、クエン酸、酢酸、グルコン酸、及び乳酸）、アミノ酸、抗生物質、酵素及び有機溶媒（例えば、１，３−プロパンジオール、ブタノール及びアセトン）、グリセロール及びエタノールなど、最終生成物を生成する方法を提供する。好ましい実施態様において、本方法は少なくとも１の炭素基質と少なくとも１の基質変換酵素を接触させて、少なくとも１の中間体を生成する工程、及び少なくとも１の中間体と中間体生成酵素を（通常、任意の適切な種類の反応容器内で）接触させる工程であって、ここで少なくとも１の中間体が実質的に完全に最終生成物に生物変換される工程を含む。好ましい実施態様において、この生物変換は微生物により達成される。変換培地内で低濃度の中間体を維持することにより、中間体の異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制効果が変化する（例えば、減少する）。本発明は種々の中間体濃度レベル、基質、中間体及び中間体を所望の最終生成物に変換する工程も提供する。
【００２０】
定義
ここで別に定めない限り、ここで用いる全ての技術及び科学用語は本発明が属する当業者に通常理解される意味と同じ意味を有するものとする。種々の参考文献（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）；及びＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１））はここで用いる多くの言葉の一般的な定義を提供する。さらに、ここで引用する全ての特許及び文献、当該特許及び文献に開示される全ての配列は明示的に引用するものとする。
【００２１】
ここに記載される方法及び物質に類似または同等のものは本発明の実施に有用であるが、好ましい方法及び物質をここに記載する。数値範囲は範囲を定める数を含む。別段の定めがない限り、それぞれ、核酸は５’から３’方向で左から右に記載し、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ方向で左から右に記載する。本発明は記載した特定の方法論、手順及び試薬に限定されず、これらは変形できることは当然に理解されることである。
【００２２】
ここに提供する表題は、明細書全体を参照することにより得られる種々の本発明の側面または実施態様を限定するものではない。さらに、この後に定義する言葉は明細書全体を参照することでより十分に定義される。
【００２３】
ここで使用する、“炭素基質”の語は、中間体に酵素的に変換でき、続いて所望の炭素最終生成物中に変換できる、少なくとも１の炭素原子を含んだ物質をいう。典型的な炭素基質は、限定されないが、バイオマス、でんぷん、デキストリン及び糖が挙げられる。
【００２４】
ここで用いる“バイオマス”とはセルロース及び／またはでんぷん含有原料をいい、限定されないが、木材チップ、コーンストーバー、米、草、飼い葉、ペリエグラス（ｐｅｒｒｉｅ−ｇｒａｓｓ）、ジャガイモ、塊茎、根、ひきトウモロコシ（ｗｈｏｌｅ  ｇｒｏｕｎｄ  ｃｏｒｎ）、トウモロコシの穂軸、穀物、小麦、大麦、ライ麦、ミロ、ブラン、シリアル、糖含有原料（例えば、糖蜜、果物原料、サトウキビまたは甜菜）、木及び枯れ植物が挙げられる。実際に、本発明はバイオマスとして用いるいかなる特定物質にも限定する趣旨ではない。本発明の好ましい実施態様において、原材料はでんぷん含有原料（例えば、トウモロコシの穂軸、ひきトウモロコシ、トウモロコシ、穀物、ミロ及び／またはシリアル及びこれらの混合物）である。特に好ましい実施態様において、該語は任意の植物源を原料に得られるでんぷん含有物質をいう。
【００２５】
ここで用いる、“でんぷん”は任意のでんぷん含有物質をいう。特に、該語は種々の植物ベースの物質をいい、限定されないが、小麦、大麦、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、トウモロコシ（ｃｏｒｎ、ｍａｉｚｅ）、カサバ、ミロ、ライ麦及びブランが挙げられる。実際、本発明はでんぷんの特定の種類及び／または原料に限定するものではない。一般に、該語は植物の複合多糖炭水化物を含み、アミロース及びアミロペクチンを含む任意の物質をいい、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘであり、“ｘ”は任意の数字である。
【００２６】
ここで、“セルロース”の語はセルロース含有物質をいう。特に、該語はグルコース（または“セロビオース”）のポリマーをいい、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘを有し、“ｘ”は任意の数字である。セルロースは植物細胞壁が主成分であり、自然界で最も豊富な有機物質である。セルロース中にはβ−グルコシド結合があるが、でんぷんにはα−グルコシド結合がある。リグニンと組み合わせて、セルロースは“リグノセルロース”を形成する。
【００２７】
ここで用いる“中間体”の語は、炭素基質が酵素的に変換された少なくとも１の炭素原子を含む化合物をいう。典型的な中間体としてが、限定されないが、ペントース（例えば、キシロース、アラビノース、リキソース、リボース、リブロース、キシルロース）；ヘキソース（例えば、グルコース、アロース、アルトロース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース及びタガトース）；及びそれらの有機酸が挙げられる。
【００２８】
ここで用いる、“酵素変換”の語は、基質または中間体と酵素を接触させることによる、炭素基質から中間体への変形または中間体から最終生成物への変形をいう。いくつかの実施態様において、接触は基質または中間体を適当な酵素に直接さらすことにより行う。他の実施態様において、接触は基質または中間体を酵素を発現または分泌する生物、及び／または所望の基質及び／または中間体をそれぞれ所望の中間体及び／または最終生成物に代謝する生物にさらすことを含む。
【００２９】
ここで用いる“でんぷん加水分解酵素”の語は、でんぷんを中間体糖（例えば、ヘキソースまたはペントース）に変換できる任意の酵素をいう。
【００３０】
ここで用いる、“単糖類”は実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎを有する任意の化合物をいい、ここでｎは３〜７であり、好ましくは５〜７である。いくつかの実施態様において、該語は単一のポリヒドロキシアルデヒドまたはケトン単位からなる“単糖”をいう。該語は、限定されないが、グルコース、ガラクトース及びフルクトースを含む。
【００３１】
ここで用いる“二糖類”は２つの共有結合単糖単位を含む任意の化合物をいう。該語は、限定されないが、スクロース、ラクトース及びマルトースなどの化合物を含む。
【００３２】
ここで用いる、“オリゴ糖”はグルコシド結合で結合した２〜１０の単糖単位を有する任意の化合物をいう。いくつかの実施態様において、該語は共有結合により共に結合した単糖単位の短鎖をいう。
【００３３】
ここで用いる、“多糖類”は直鎖または分岐鎖で結合した複数の単糖単位を有する任意の化合物である。いくつかの好ましい実施態様において、該語は１００または１，０００の単糖単位を含む長鎖をいう。セルロースなどいくつかの多糖類は直鎖を有し、一方別の多糖類（例えば、グリコーゲン）は分岐鎖を有する。最も豊富な多糖類はでんぷん及びセルロースであり、繰り返しグルコース単位からなる（これらの化合物はグルコース単位の結合の仕方が異なる）。
【００３４】
ここで用いる“培養”は炭素基質から所望の最終生成物への発酵生物変換をいう（通常、反応容器内）。特に好ましい実施態様において、培養は所望の最終生成物の生成のために適当な条件下で微生物の成長を伴う。
【００３５】
ここで用いる、“糖化”の語は、生物変換または発酵生物変換のために使用に適さない多糖類を有用な糖供給原料に直接変換することをいう。
【００３６】
ここで用いる、“発酵”の語は、微生物による有機基質の酵素的及び嫌気性崩壊をいい、単純な有機生成物を生成する。好ましい実施態様において、発酵は微生物（例えば細菌）による炭水化物の利用をいい、嫌気性条件下で起こる酸化還元代謝プロセスを伴い、有機基質は最終的な（酸素というよりも）水素受容体として働く。発酵は嫌気性条件下で起こるが、該語は、発酵は酸素の存在下でも起こるので、厳密な嫌気性条件に単に限定する趣旨のものではない。
【００３７】
ここで使用する、“実質的に全て消費される”及び“実質的に全て生物変換される”とは、中間体変換酵素が中間体を最終生成物またはその他の中間体に変換する能力及び／または基質変換酵素が基質を中間体に変換する能力において、中間体（例えば、ヘキソース）の酵素抑制、酸素移動、収率、副生成物最小化及び／または異化代謝産物抑制効果に悪影響を及ぼす、変換培地中で中間体を低レベルに維持することをいう。
【００３８】
ここで使用する、“生物変換”及び“生物変換された”の語は、炭素基質または中間体がそれぞれ中間体または最終生成物に変換されるような条件下で微生物と炭素基質または中間体を接触させることをいう。いくつかの実施態様において、これらの語は生体触媒のみを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で別の仲介中間体の生成について記載するために用いる。好ましい実施態様において、該語は微生物による代謝及び／または所望の変換を達成する酵素の発現または分泌を含む。
【００３９】
ここで用いる、“変換媒体”及び“変換培地”は、酵素及び炭素基質、中間体及び最終生成物がお互い接触する媒体／培地をいう。これらの言葉は、限定されないが、酵素及び炭素基質、中間体及び最終生成物を溶解または懸濁する発酵媒体、有機及び／または嫌気性媒体を含む。いくつかの実施態様において、媒体は複合体であり、他の実施態様において媒体は合成である。
【００４０】
ここで用いる“最終生成物”は中間体から酵素的に変換された炭素源由来分子生成物をいう。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は“所望の最終生成物” （すなわち、これらの方法を使用して生成することを目的とした生成物）を生成するために用いる。
【００４１】
ここで用いる、“低濃度”とは、化合物の存在により有害な影響を生じる場合よりも少ない化合物の濃度レベルをいう。特に好ましい実施態様において、該語は異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制の有害な影響が観察される場合より少ない特定の中間体濃度関して用いる。いくつかの実施態様において、該語は基質及び／または生成物により異化代謝産物抑制及び／または酵素抑制を引き起こす以上の特定の中間体の濃度レベルをいう。
【００４２】
ここで用いる“異化代謝産物抑制効果を引き起こす以下のレベルで維持する”とは、中間体濃度を異化代謝産物抑制を引き起こすレベル以下に維持することをいう。
【００４３】
ここで用いる、“異化代謝産物抑制の減少”とは、異化代謝産物抑制の効果が生じる状態を意味する。好ましい実施態様において、該語は中間体濃度が異化代謝産物抑制効果を引き起こす閾値よりも低い状態をいう。
【００４４】
ここで用いる、“酵素抑制の減少”とは、酵素抑制が通常、標準状態での酵素抑制と比較して減少している状態を意味する。本発明の好ましい実施態様において、該語は中間体、基質及び／または酵素反応の生成物の濃度が酵素抑制を引き起こす閾値よりも低い状態をいう。
【００４５】
ここで用いる“基質変換酵素”は基質（例えば、顆粒でんぷん）を中間体（例えば、グルコース）に変換する酵素をいう。基質変換酵素は限定されないが、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、でんぷん加水分解酵素及びこれらの種々の組み合わせを含む。
【００４６】
ここで用いる、“中間体変換酵素”の語は中間体（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース等）を所望の最終生成物に変換する酵素をいう。好ましい実施態様において、この変換は加水分解により達成され、他の実施態様において、該変換は中間体から最終生成物への微生物による代謝に関する。しかしながら、本発明は特定の変換酵素または手段に限定されない。実際、任意の適当な酵素が本発明の種々の実施態様において活用できる。
【００４７】
ここで用いる、“収量”は本発明の方法を用いて生成した最終生成物または中間体の量をいう。好ましい実施態様において、本発明の方法を用いて得られた収量は当業界で公知の方法を用いて得られた収量よりも大きい。いくつかの実施態様において、収量は最終生成物または中間体の量をいうが、他の実施態様において、該語は組成物中の最終生成物または中間体の濃度に関して用いる。
【００４８】
ここで用いる“酸素移動”とは、律速段階にならないように気体相から液体培地に移動した生物変換及び／または発酵生物変換培地において溶解した酸素を十分に有することをいう。
【００４９】
ここで用いる“副生成物形成”は望ましくない生成物の生成をいう。好ましい実施態様において、本発明は当業界に公知の方法と比較して、副生成の生成を回避または減少させる方法を提供する。
【００５０】
ここで用いる、“酵素的抑制”の語は酵素上の物理的または生化学的効果による酵素活性の損失をいう。いくつかの実施態様において、抑制は酵素活性により生成される生成物の効果から生じ、一方、他の実施態様において、抑制は酵素上の基質または中間体の作用から生じる。
【００５１】
ここで用いる、“酵素活性”はその基質上での酵素の働きをいう。いくつかの実施態様において、酵素活性は基質から中間体への変換を決定するための手段を用いて定量され、一方、他の実施態様において、基質から最終生成物への変換を決定する手段を用い、さらに別の実施態様において、中間体から最終生成物への変換を決定する手段を用いる。
【００５２】
ここで用いる、“酵素単位”の語は（特に示さない限り）最適分析条件で１分当たり１ミクロモルの基質を基質生成物に変換する酵素量をいう。いくつかの実施態様において、市販の酵素は本発明の方法において使用できる（例えば、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＤＩＳＴＡＬＬＡＳＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）、ジェネンコー・インターナショナル）。
【００５３】
ここで用いる“グルコアミラーゼ単位”（ＧＡＵ）は、４０℃、ｐＨ５．０の分析条件下で１分当たり１ミクロモルのグルコースを生成するために必要な酵素量として定義される。
【００５４】
ここで用いる“グルコースオキシダーゼ単位”（ＧＯＵ）は２５℃、ｐＨ７．０の分析条件下で１分当たり１ミクロモルのＤ−グルコースをグルコン酸に酸化するために必要な酵素量として定義される。
【００５５】
ここで用いる“カタラーゼ単位”（ＣＵ）は４０℃、ｐＨ５．０の分析条件下で１分当たり１ミクロモルの過酸化水素を分解するために必要な酵素量として定義される。
【００５６】
ここで用いる１のＡＧ単位（ＧＡＵ）は２５℃、ｐＨ４．３で１分当たり１ミクロモルのマルトースを分割する酵素量である。本発明のいくつかの実施態様において、ｍｌ当たり４００ＧＡＵ活性の市販の液状グルコアミラーゼ（ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）Ｌ−４００、ジェネンコー・インターナショナル）を使用する。
【００５７】
ここで用いる、“炭素最終生成物”とは炭素中間体から生成される任意の炭素生成物を意味し、当該基質は少なくとも１の炭素原子を含む（すなわち炭素基質）。
【００５８】
ここで用いる“炭素中間体”は炭素含有基質から炭素最終生成物への変換時に生成される炭素含有化合物をいう。
【００５９】
ここで用いる“酵素的制御”とは反応において使用される酵素の量または活性を変化させることにより炭素基質から生成される炭素中間体の量を調節することを意味する。
【００６０】
ここで用いる、“微生物”は一般的に顕微鏡でしか見えないと考えられる細胞を含む生物をいい、当該有機体として細菌、真菌（酵母及びかび）、リケッチア及び原生動物が挙げられる。本発明は特定の微生物または微生物種に限定するものではなく、種々の微生物及び細菌性酵素は本発明での使用に適している。本発明はまた、野生型微生物に限定するものでもなく、組換えＤＮＡ技術を用いて生成した微生物及び細菌性酵素も本発明で使用される。
【００６１】
ここで用いる、“微生物酵素”は微生物により生成される酵素をいう。ここで用いる“微生物中間体変換酵素”は中間体を最終生成物に変換する酵素であり、“微生物基質変換酵素”は基質を中間体に変換、または基質を最終生成物に直接変換する（すなわち中間体化合物が存在しない）酵素である。
【００６２】
ここで用いる、“グルコン酸”はグルコースの酸化生成物をいい、グルコースのＣ６ヒドロジル（ｈｙｄｒｏｚｙｌ）基はカルボン酸基に酸化される。
【００６３】
ここで用いる“グルコン酸生成体”及び“グルコン酸生成生物”とはヘキソースまたはペントースの使用を通じてグルコン酸を生成することができる生物または細胞をいう。いくつかの実施態様において、グルコン酸生成細胞は基質変換酵素としてセルラーゼを含み、及び中間体からグルコン酸への変換のためにグルコースオキシダーゼ及びカタラーゼを含む。
【００６４】
ここで用いる、“グリセロール生成体”及び“グリセロール生成生物”とはグリセロールを生成できる生物または細胞をいう。いくつかの実施態様において、グリセロール生成生物は好気性細菌であるが、他の実施態様においては嫌気性細菌である。さらに別の実施態様において、グリセロール生成生物は真菌（すなわち酵母及びかび）、藻類及びその他の適当な生物などの微生物を含む。
【００６５】
ここで用いる“ジオール生成体”、“プロパンジオール生成体”、“ジオール生成生物”及び“プロパンジオール生成生物”とは１，３−プロパンジオール活用グリセロールを生成することができる生物をいう。一般に、ジオール生成細胞はジオール・デヒドラターゼ（脱水酵素）酵素、またはグリセロール・デヒドラターゼ酵素を含む。
【００６６】
ここで用いる、“乳酸生成体”及び“乳酸生成生物”及び“乳酸生成微生物”の語はヘキソースまたはペントースを利用することにより乳酸を生成できる生物または細胞をいう。いくつかの実施態様において、乳酸生成体は乳酸菌またはザイモモナス属の種類であり、一方他の実施態様において、それらの生物は真菌類である。
【００６７】
ここで用いる、“エタノール生成体”及び“エタノール生成生物”とはヘキソースまたはペントースからエタノールを生成できる生物または細胞をいう。一般に、エタノール生成細胞はアルコール・デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。
【００６８】
ここで用いる、“アスコルビン酸中間体生成体”及び“アスコルビン酸中間体生成生物”の語はヘキソースまたはペントースからアスコルビン酸中間体を生成できる生物または細胞をいう。通常、エタノール生成細胞は、所望の特定アスコルビン酸中間体に応じて、グルコース・デヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩レダクターゼ、２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩レダクターゼ、２−ケト−レダクターゼ、５−ケト−レダクターゼ、グルコキナーゼ、グルコノキナーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、ヘキソキナーゼ、２，５−ＤＫＧレダクターゼ、及び／またはイドン酸塩デヒドロゲナーゼを含む。
【００６９】
ここで用いる、“アスコルビン酸中間体”は以下の成分のいずれかをいう：Ｄ−グルコン酸塩、２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩（２ＫＤＧ）、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩（２，５−ＤＫＧまたは５ＤＫＧ）、２−ケト−Ｌ−グルコン酸（２ＫＬＧまたはＫＬＧ）、Ｌ−イドン酸（ＩＡ）、エリスロビン酸（ＥＡ）及びアスコルビン酸（ＡＳＡ）。
【００７０】
ここで用いる“クエン酸”とは式Ｃ６Ｈ８Ｏ７を有するものをいい、柑橘系果物、ビート、クランベリー及びその他の酸性果物に一般的に見られる。該語は天然または合成いずれであっても、任意の供給源由来のクエン酸をいい、並びに該酸の塩及びその他の形態もいう。
【００７１】
ここで用いる、“琥珀酸”とは式Ｃ４Ｈ６Ｏ４を有する酸をいい、琥珀、藻、苔癬、サトウキビ、ビート及びその他の植物に通常見られる。また、この酸は種々のかび、酵母及び細菌により糖、酒石酸塩及びその他の物質の発酵時にも形成される。該語は天然または合成いずれであっても、任意の供給源由来の琥珀酸をいい、並びに該酸の酸、及び天然塩及びエステル及びその他の形態もいう。
【００７２】
ここで用いる“アミノ酸”とは天然アミノ酸、合成アミノ酸のいずれかであり、アミノ酸誘導体を含む。
【００７３】
ここで用いる“抗菌剤”とは微生物を殺すまたは抑制する任意の化合物をいう（限定されないが、抗細菌化合物など）。
【００７４】
ここで用いる、“連結培養（ｌｉｎｋｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）”とは、少なくとも２つの細胞培養物を使用する発酵システムをいい、培養物を連続して加える。連結システムの実施態様のほとんどにおいて、初代培養または一連の初代培養は所望の中間体の生成に最適な発酵条件下で成長する（すなわち、中間体は培養基中に解放され、“ならし培地”を生成する）。初代培養の発酵に続いて、ならし培地をそれから二次培養にさらす。二次培養はそれからならし培地中で中間体を所望の最終生成物に変換する。本発明のいくつかの実施態様において、初代培養は通常、グリセロール生成体であり、二次培養は１，３−プロパンジオール生成体である。
【００７５】
ここで用いる、“混合培養”とは、培地中に微生物種の組み合わせが存在することをいう。いくつかの好ましい実施態様において、混合培養は、混合生物の個々の代謝過程の相互作用によりいずれの生物も個々で生成できないような生成物を生じるように反応容器中で成長する。本発明は特定の数の微生物種を含む混合培養に限定するものではない。
【００７６】
ここで用いる、“ならし培地”とは、微生物増殖の有機副生成物により補完された、微生物の成長に適した発酵培地をいう。本発明の好ましい実施態様において、ならし培地は連結培養の発酵時に生成され、グリセロール生成細胞がグリセロールを発酵培地中に分泌し、続いて１，３−プロパンジオールに変換する。
【００７７】
ここで用いる、“酸素摂取速度”（“ＯＵＲ”）とは、反応容器内の酸素の個別の消費量の決定をいう。酸素消費量は当業界に公知の種々のオンライン測定を用いて決定できる。１の実施態様において、ＯＵＲ（ｍｍｏｌ／（リットル＊時間）は以下の式により決定する：（気流（固定リットル／分）／発酵重量（発酵培養液の重量、キログラム）×供給Ｏ２×培養液密度×（標準２０．０℃の代わりに２１．１℃での気流較正のための定数）−（［気流／発酵重量］×［オフガスＯ２／オフガスＮ２］×供給Ｎ２×培養液密度×定数）。
【００７８】
ここで用いる、“炭素放出率”（“ＣＥＲ”）とは、発酵時に反応容器内でどれくらい多くのＣＯ２が生成されるかの決定をいう。通常、ＣＯ２は最初またはその後に反応容器に供給されないので、ＣＯ２は反応容器内で起こる発酵過程で生成されると考えられる。“オフガスＣＯ２”とは反応容器内で測定されたＣＯ２の量をいい、通常は当業界で公知の質量分光法により測定する。
【００７９】
ここで用いる、“高められた”の語は、目的のタンパク質の生成が向上したことをいう。好ましい実施態様において、本発明は目的のタンパク質の高められた（すなわち、向上した）生成及び分泌を提供する。これらの実施態様において、“高められた”生成は宿主（例えば野生型細胞）による生成の通常レベルと比較して向上している。従って、異種タンパク質については、基本的に任意の発現は高められ、該細胞は通常は該タンパク質を生成しない。
【００８０】
ここで用いる“単離した”及び“精製した”とは、それがもともと含まれている少なくとも１の成分から取り出した核酸またはアミノ酸をいう。
【００８１】
ここで用いる、“異種タンパク質”とは天然には宿主細胞中に生じないタンパク質またはポリペプチドをいう。別の実施態様において、該タンパク質は商業的に重要な工業用タンパク質またはペプチドである。該語は天然遺伝子、変異遺伝子、及び／または合成遺伝子によりエンコードされるタンパク質を包含するものとする。
【００８２】
発明の詳細な説明
本発明はバイオマスベースの供給原料基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ生物変換の所望の最終生成物を生成するための方法を提供し、限定されないが、そのような物質としてでんぷん及びセルロースがある。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は基質のゲル化及び／または液化を必要としない。
【００８３】
本発明の方法はバイオマス及び／またはでんぷんなどの市販の炭素基質を中間体、特に一次性代謝産物（例えばアスコルビン酸中間体、乳酸、琥珀酸またはアミノ酸）、アルコール（例えばエタノール、プロパノール、及び／または１，３−プロパンジオール）及び酵素または抗菌剤などの二次性代謝産物など多数の所望の最終生成物に容易に変換できる中間体に直接変換する方法を劇的に向上させる手段を提供する。
【００８４】
いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明は顆粒でんぷんをグルコースに直接変換する方法を劇的に向上させる手段を提供し、グルコースは一次性代謝産物（例えば、アスコルビン酸中間体、乳酸、琥珀酸またはアミノ酸）、アルコール（例えば、エタノール、プロパノール及び／または１，３−プロパンジオール）及び酵素または抗菌剤などの二次性代謝産物など多数の所望の最終生成物に容易に変換できる中間体である。
【００８５】
別の実施態様において、本発明はでんぷんまたはセルロースをグルコースに変換する方法を劇的に向上させる手段を提供し、同様に所望の最終生成物に変換する。変換培地内で中間体を低濃度で維持することにより、生成の全体的な効率が向上する。いくつかの実施態様において、酵素的抑制及び／または異化代謝産物抑制、必要酸素摂取量及び／または副生成物形成が減少する。
【００８６】
いくつかの好ましい実施態様において、最小中間体濃度の維持は中間体濃度を低濃度で維持することにより達成される。１の実施態様において、中間体の濃度は培地重量の０．２５重量％以下である（例えば、０．２５重量％〜０．００００１重量％）。その他の実施態様において、中間体の濃度は０．２０重量％、０．１０重量％、０．０５重量％または０．０１重量％以下である（例えば、それぞれ０．２０重量％〜０．００００１重量％、０．１０重量％〜０．００００１重量％、０．０５重量％〜０．００００１重量％、０．０１重量％〜０．００００１重量％）。もしくは、中間体濃度は変換培地中で２．０μモル以下の濃度に維持する。他の実施態様において、濃度は１．０μモル以下に維持する。さらに別の実施態様において、中間体の濃度は０．７５μモル以下の濃度で維持する。いずれにしても、低濃度での維持は酵素抑制（すなわち、酵素抑制効果）、異化代謝産物抑制（すなわち異化代謝産物抑制効果）を生じる閾値以下で中間体濃度を維持することを意味する。
【００８７】
別の実施態様において、最小濃度の維持は基質から中間体への変換率を中間体から最終生成物への変換率以下で維持することにより達成される。基質から中間体への変換は必ずしも中間体から最終生成物への変換の律速である必要はないことが認識されるが、炭素基質から最初の酵素変換により実質的に全ての中間体が生成される変換のために十分な中間体変換酵素を供給することにより、実質的に全ての中間体が開始基質から変換されて変換培地中の中間体の存在を最小にする速さで最終生成物に変換される。そのような過剰な中間体変換を提供する典型的な方法は過剰な中間体変換酵素を提供することを含み、中間体変換酵素の酵素活性を増加させ、及び／または基質変換酵素の活性を低下させて基質から変換されるとできるだけ早く中間体を最終生成物に変換する。変換の実際の速度は生成される特定の最終生成物により様々であると考えられ、様々な量及び量を決定する実験がいくつか考えられる。しかしながらこれらの決定を行う指針をここに提供する。
【００８８】
本発明のいくつかの実施態様において、中間体の変換または消費速度は、混合培地のその他の物理的パラメーター及びを考慮に入れて混合培地中に存在する生物の量を計算することにより決定し、一般的に公知の変換率をその量に掛けた。これにより中間体（例えば、グルコース）から最終生成物への変換率が得られる。いくつかの実施態様において、中間体から所望の最終生成物へのこの変換は天然生物による中間体から最終生成物への変換または生物変換による、またはそのような生物変換を提供するための変異によるものである。中間体から最終生成物への変換の他の実施態様は公知の酵素による酵素変換の使用を含み、公知の酵素変換方法を用いて所望の最終生成物に変換する。例えば、いくつかの実施態様において、グルコースから所望の最終生成物（例えば、プロパンジオール、琥珀酸、グルコン酸、乳酸、アミノ酸、抗菌剤、エタノール、アスコルビン酸中間体及び／またはアスコルビン酸）への変換はグルコースを所望の特定最終生成物へ変換することが知られる一定の酵素を添加することにより達成される。
【００８９】
中間体から所望の最終生成物への変換率が決定されると、炭素基質から中間体への変換の限界が同じように決定できる。中間体から最終生成物変換の上限を計算することにより、炭素基質から中間体への変換速度が決定でき、変換培地中の中間体濃度レベルが通常の中間体の異化代謝産物抑制／酵素抑制効果に逆の影響を与えるのに十分に低レベルで維持されると主として考えられる。１の実施態様において、これは中間体から最終生成物への過剰な変換率または炭素基質から中間体への変換率と等しい変換率を維持することにより達成される。従って、本発明は最終生成物への変換率を増加させる手段を提供し、及び炭素基質から中間体への変換を制限する手段を提供する。
【００９０】
中間体から最終生成物への変換率が炭素基質からの中間体生成以上であるかを決定する他の方法は反応容器内の中間体の重量％を測定することである。反応容器中に存在する中間体の量は種々の公知の方法により測定でき、限定されないが、反応容器中に存在する中間体の量を直接または間接的に測定することを含む。直接測定は反応容器内の中間体及び／または最終生成物の量を同定するための公知の分析法を用いて、該容器内の内容物を周期的に分析することによりできる。さらに、反応容器内の中間体量の直接測定はオンライン気体、液体及び／または当業界に公知の高性能液体クロマトグラフィー法を含む。
【００９１】
生成される中間体または最終生成物のレベルの間接測定は当業界に公知の方法を用いて酸素摂取量または二酸化炭素生成の測定により評価できる（例えば、酸素摂取量率及び／または炭素放出率を測定する）。
【００９２】
基質
本発明の基質は酵素的に中間体化合物に変換できる炭素ベース化合物である。適当な基質は、限定されないが、糖に変換できる成分を含む被加工原料である（例えば、セルロース誘導体バイオマス、グリコーゲン、でんぷん及びそれらの種々の形態、例えばコーンスターチ、小麦でんぷん、固形コーン及び固形小麦）。本発明の研究において、コーンスターチ及び小麦でんぷんを用いて優れた結果が得られたが、その他の供給源、穀物及びイモ類（ｔｕｂｅｒｓ）（例えば、サツマイモ、ジャガイモ、米及びキャッサバでんぷん）由来のでんぷんなども本発明で用いられる。種々のでんぷんが市販されている。例えば、コーンスターチはＣｅｒｅｓｔａｒ、Ｓｉｇｍａ及びＫａｔａｙａｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（日本）から市販されており、小麦でんぷんはＳｉｇｍａから市販、サツマイモでんぷんはＷａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．（日本）から、及びジャガイモでんぷんはＮａｋａｒｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｖｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．（日本）から市販されている。特に有用な炭素基質はコーンスターチである。本発明のいくつかの実施態様において、顆粒でんぷんはでんぷん比率が約２０％〜約３５％のスラリー中で用いる。好ましくは、でんぷんは約１０％〜約３５％の濃度である。特に好ましい実施態様において、でんぷんの比率範囲は３０％〜３２％である。原料の顆粒でんぷんに加えて、その他の炭素基質原料は本発明で使用でき、限定されないが、バイオマス、多糖類、及び酵素的に中間体に変換できるその他の炭素ベース材料が挙げられる。
【００９３】
発酵性糖は幅広い種類の原料から得られ、リグノセルロース物質などがある。リグノセルロース物質はリグノセルロース廃棄物（例えば、枯れ植物及び古紙）から得られる。適当な枯れ植物の例としては、限定されないが、幹、葉、穀粒や種子の外皮、トウモロコシの皮、トウモロコシの軸穂等、及び伐採残、ｂｅｇａｓｓｅｓ、木材、木くず、木材パルプ、及びおがくずが挙げられる。古紙の例としては、限定されないが、任意の種類の廃棄紙（例えば、コピー紙、コンピューター印刷紙、ノート紙、メモ用紙、タイプライター紙等）、及び新聞、雑誌、ボール紙、及び紙ベースの包装材料が挙げられる。糖をエタノールに変換する条件は当業界に公知である。一般に、温度は約２５℃〜３５℃である（例えば、２５℃〜３５℃、及び特に３０℃）。変換培地に有用なｐＨ範囲は約４．０〜６．０。４．５〜６．０、及びｐＨ５．５〜５．８である。しかしながら、本発明はこれらの条件として特定の温度及び／またはｐＨに限定するものではなく、関連する基質、酵素、中間体、及び／または最終生成物により左右される。
【００９４】
酵素
本発明の好ましい実施態様において、基質変換酵素である酵素（すなわち最初に炭素基質を炭素中間体に変換できる酵素）及び中間体変換酵素である酵素（すなわち最終的な中間体を仲介中間体及び／または所望の最終生成物に変換することができる酵素）の両方は本発明で使用できる。炭素基質を中間体に変換するために本発明の実施態様において使用できる酵素は、限定されないが、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、でんぷん加水分解グルコアミラーゼ、及びプルラナーゼが挙げられる。中間体から最終生成物への変換に使用できる酵素は主として実際の所望の最終生成物による。例えば、糖を１，３−プロパンジオールに変換するために有用な酵素は限定されないが、大腸菌及びその他の微生物により生成された酵素が挙げられる。例えば、糖を乳酸に変換するために有用な酵素は限定されないが、乳酸菌及びザイモモナスにより生成された酵素が挙げられる。糖をエタノールに変換するために有用な酵素は限定されないが、アルコール・デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが挙げられる。糖をアスコルビン酸中間体に変換するために有用な酵素は限定されないが、グルコース・デヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩レダクターゼ及び種々のその他の酵素が挙げられる。糖をグルコン酸に変換するために有用な酵素は限定されないが、グルコースオキシダーゼ及びカタラーゼが挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施態様において、本発明の方法で用いられるα−アミラーゼは通常、でんぷんのα−（１，４）グルコシド結合をランダムに切断する酵素である。ほとんどの実施態様において、α−アミラーゼはＥ．Ｃ．番号Ｅ．Ｃ．３．２．１．１、特にＥ．Ｃ．３．２．１．１−３を有する微生物酵素の中から選択される。好ましい実施態様において、α−アミラーゼは熱安定性細菌性α−アミラーゼである。最も好ましい実施態様において、α−アミラーゼはバチルス種由来である。実際に、本発明の開発時に、バチルス・リケニホルミスから得られたＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）α−アミラーゼ（ジェネンコー）を用いて良い結果が得られた。他の実施態様において、加熱処理（ｐｒｅｃｏｏｋｉｎｇ）なしでトウモロコシ及びキャッサバなどのでんぷんからアルコール性発酵する方法において記載されている黒麹アミラーゼ（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５０：２３７−２４２［１９８０］；及びＵｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５８；２３７−２４２［１９８０］）は本発明で使用できる。
【００９６】
当業者に理解されるように、本発明の方法で使用されるα−アミラーゼの量はα−アミラーゼの酵素活性及び最終生成物変換体による生成グルコースの変換率に依存する。例えば、通常は０．０１〜１．０ｋｇの量のＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ（ジェネンコー）を１メートルトンのでんぷんに加える。いくつかの実施態様において、酵素は０．４〜０．６ｋｇの量で加え、一方、他の実施態様において、０．５〜０．６ｋｇの量のＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤを１メートルトンのでんぷん毎に加える。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様において、グルコアミラーゼはでんぷんの非還元末端から連続グルコース単位を取り除く酵素である。該酵素はでんぷん、アミロース及びアミロペクチンの直鎖及び分岐グルコシド結合の両方を加水分解できる。ほとんどの実施態様において、本発明の方法で用いられるグルコアミラーゼは微生物酵素である。好ましい実施態様において、グルコアミラーゼは、アスペルギルス・グルコアミラーゼなどの熱安定性真菌グルコアミラーゼである。実際に、本発明の開発中、アスペルギルス・ニガー由来のＤＩＳＴＡＬＬＡＳＥ（登録商標）グルコアミラーゼ（ジェネンコー）を用いて良い結果が得られた。また、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ調製物は前もって加熱処理（ｐｒｅｃｏｏｋｉｎｇ）なしで用いた（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２３：２９１［１９８１］を参照）。３つのグリコアミラーゼはでんぷんの加水分解に使用するためにアスペルギルス・アワモリ  ｖａｒ．カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．ｋａｗａｃｈｉ）から選択的に分離されている（Ｈａｙａｓｈｉｄａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３９：２０９３−２０９９［１９７３］）。加熱しないＥｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｏｅｕグルコアミラーゼによるサツマイモのアルコール性発酵についても記載されている（Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２５：１１８１−１１８６［１９８３］）。本発明で使用できる他の酵素は、非還元末端から徐々にα−１，４−グルコシド鎖を加水分解する酵素である、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）である。この酵素はα−１，６−グルコシド鎖も加水分解する。グルコアミラーゼは本発明の方法で使用できるアスペルギルス、リゾプス及びムコール属の菌類からも分泌される。これらの酵素はグルコース生成及びグリコーゲン及びでんぷんの定量にも使用できる。Ｅ．フィブリゲラから得られるグルコアミラーゼ調製物（ＩＦＯ０１１１）はアルコール発酵のために生サツマイモでんぷんと接触するために使用されてきた（Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２５：１１８１−１１８６［１９８３］を参照）。この酵素の主な用途の一つはでんぷん材料由来エチルアルコールの生成において糖化剤としてである。しかしながら、ここに記載するその他のグルコアミラーゼと同様に、この酵素も本発明の方法において使用できる。
【００９８】
本発明の方法で使用できる別のグルコアミラーゼはリゾプス及びフミコーラ属から得られるものがあり、特に高い生産性及び酵素的活性を有することを特徴とする。さらに、その他の生物から得たグルコアミラーゼと比較して、リゾプス由来グルコアミラーゼはでんぷん上で強い作用を示し、最適ｐＨなどその酵素学的及び化学的性質は特に穀類でんぷんの糖化に適している。これらの特徴のため、リゾプス由来グルコアミラーゼは非加熱または低温加熱でんぷんを用いたアルコール生成に最も適していると考えられる（米国特許第４，５１４，４９６号及び４，０９２，４３４号を参照）。リゾプスグルコアミラーゼを含む生コーンスターチはリゾプスα−アミラーゼとともに使用して培養し、グルコアミラーゼによるでんぷん分解を加速させることに留意した。本発明を特定のメカニズムまたは理論に限定することを意図するものではないが、リゾプスグルコアミラーゼはやはりα−アミラーゼを含むアスペルギルス・ニガーグルコアミラーゼ調製物よりも強い分解活性を有するものと考えられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｎｐｕｎ  Ｋａｇａｋｕ、３７：１２９−１３６［１９９０］を参照）。本発明で使用できる１の市販調製物はＳｈｉｎ  Ｎｉｐｐｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から市販のリゾプスｎｉｖｅｕｓ株の麹培養から得られるグルコアミラーゼ調製物である。他の本発明で使用できる１の市販調製物はＢｉｏｃｏｎ  Ｉｎｄｉａ（バンガロール、インド）から市販の市販でんぷん加水分解組成物Ｍ１である。
【００９９】
当業者に理解されるように、本発明の方法で使用されるグルコアミラーゼの量はグルコアミラーゼ（例えば、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）Ｌ−４００）の酵素活性に依存する。通常、０．００１〜２．０ｍｌの量のグルコアミラーゼ溶液を２０〜３５％乾燥固体に調節した４５０ｇｍのスラリーに加え、該スラリーは糖化時に液化する麦芽汁であり、及び／または発酵時に加水分解されたでんぷん及び糖中にある。いくつかの実施態様において、グルコアミラーゼは０．００５〜１．５ｍｌの当該溶液に加える。好ましい実施態様において、酵素は０．０１〜１．０ｍｌの当該溶液に加える。
【０１００】
上述の通り、プルラナーゼも本発明の方法で使用できる。これらの酵素はα−１，６−グルコシド結合を加水分解する。従って、液化でんぷんの糖化時に、プルラナーゼはでんぷんの非還元末端から連続グルコース単位を取り除く。この酵素はでんぷん、アミロース及びアミロペクチンの直鎖及び分岐グルコシド結合の両方を加水分解することができる。
【０１０１】
本発明の方法で使用できる別の酵素はフミコーラＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物などでんぷん加水分解（ＲＳＨ）酵素が挙げられる（米国特許第４，６１８，５７９号）。このフミコーラＲＳＨ酵素調製物はｐＨ５．０〜７．０の範囲内、特に５．５〜６．０の範囲内で最大活性を示す。さらに、当該酵素調製物は５０℃〜６０℃の温度範囲内で最大活性を示す。従って、当該酵素を用いる本発明の各工程において、でんぷんの酵素溶解は好ましくはこれらのｐＨ及び温度範囲内で行う。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、真菌生物株フミコーラ・グリセアｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａから得られるフミコーラＲＳＨ酵素調製物は本発明の方法で使用できる。特に好ましい実施態様において、これらのフミコーラＲＳＨ酵素はＡＴＣＣ（米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）１６４５３、ＮＲＲＬ（ＵＳＤＡ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１５２１９、ＮＲＲＬ  １５２２０、ＮＲＲＬ  １５２２１、ＮＲＲＬ  １５２２２、ＮＲＲＬ  １５２２３  ＮＲＲＬ  １５２２４、及びＮＲＲＬ  １５２２５及びこれらの酵素由来の遺伝子組換え株からなる群より選択される。
【０１０３】
本発明の方法で使用できる別のＲＳＨグルコアミラーゼはリゾプスＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物を含む。いくつかの実施態様において、Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（日本）から商標名“ＣＵ  ＣＯＮＣ”で市販のリゾプスｎｉｖｅｕｓの麹株から得られる酵素が使用できる。他の有用な酵素調製物はＡｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌから商標名“ＧＬＵＣＺＹＭＥ”で市販のリゾプス由来の市販の消化剤である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，９８：６６３−６７１［１９８５］を参照）。別の酵素はリゾプス種の３つの形態のグルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）を含み、すなわち、“Ｇｌｕｃ１”（ＭＷ７４，０００）、“Ｇｌｕｃ２”（ＭＷ５８，６００）及び“Ｇｌｕｃ３”（ＭＷ６１，４００）である。Ｇｌｕｃ１はＧｌｕｃ２またはＧｌｕｃ３より２２〜２５倍効果的であることがわかった。従って、Ｇｌｕｃ２及びＧｌｕｃ３は本発明では有用だが、Ｇｌｕｃ１はでんぷんに固く結合し、最適ｐＨが４．５なので、Ｇｌｕｃ１が本発明での使用に特に適している。本発明に使用される別のＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物はＢｉｏｃｏｎ  Ｉｎｄｉａ，Ｌｔｄ．，（バンガロール、インド）から記号表示“Ｍ１”で市販の酵素調製物を含む（Ｍ１は多面的（ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ）酵素組成物または混合物）。
【０１０４】
上述の通り、ほとんどの実施態様において、フミコーラＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物はグルコアミラーゼ活性及びでんぷんを溶解する促進因子を含む。促進因子及びその他のＲＳＨ酵素調製物におけるグルコアミラーゼ活性の相対的比率は若干変化し得る。しかしながら、本発明で使用できるＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物を用いて、グルコアミラーゼフラクションと一緒に生成される促進因子は通常は十分にある。従って、ＲＳＨグルコアミラーゼ酵素調製物の活性はそれらのグルコアミラーゼ活性に関して決められる。
【０１０５】
上述の加水分解酵素を含む酵素組成物の使用に加えて、本発明は微生物が基質に曝露され、所望の最終生成物を生成するために微生物が基質を使用する方法を提供する。従って、いくつかの実施態様において、基質または中間体を含む所望の最終生成物を生成する真菌、細菌またはその他の微生物を基質または中間体を所望の中間体または最終生成物に変換するために使用する。例えば、乳酸菌アミロボラス（ａｍｙｌｏｖｏｒｏｕｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６２１）は、家畜肥料トウモロコシ濃縮から単離された乳酸生成細菌である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，３１：５６−６３［１９８１］）。  この株は、液化（溶解）でんぷんをグルコースに加水分解することを可能にし、乳酸に発酵できる細胞外アミラーゼを生成する。（Ｘｉａｏｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９：８４１−８４３［１９９７］）。大腸菌は１，３−プロパンジオール及びグリセロール及び琥珀酸を生成し、グリセロール及び１，３−プロパンジオールを生成するためにグルコースと接触させることができる。
【０１０６】
実際、市販のα−アミラーゼ及びグルコアミラーゼは、経済的に現実的な酵素濃度で本発明の方法で使用できる。一般的な発酵条件は最適温度を利用しないが、発酵のｐＨ条件は市販の糖化酵素（すなわち、グルコアミラーゼ）に最適なｐＨに近いところで実に一致する。本発明のいくつかの実施態様において、グルコースへの完全な糖化は顆粒でんぷんを徐々に溶解することにより有利となる。おそらく、酵素は常に低濃度のデキストリンに曝露されている。さらに、発酵の間中グルコースを除去することで発酵培地中の低グルコース含量を維持する。従って、グルコアミラーゼは低濃度のグルコースに曝露される。結果として、グルコアミラーゼが非常に効率的に用いられるので、経済的に実行できる投与レベルのグルコアミラーゼ（ＧＡＵ）は本発明の方法での使用に適したものとなる（すなわち、０．０５〜１０．０ＧＡＵ／（でんぷん）ｇのグルコアミラーゼ投与；及び好ましくは０．２〜２．０ＧＡＵ／（でんぷん）ｇ。
【０１０７】
グルコアミラーゼの上述の用量は発酵培養液中の酵素的糖化活性の効果的な濃度のおおよそを述べただけであり、糖化活性の別の割合としてα−アミラーゼが寄与する。本発明を特定のメカニズムまたは理論で限定する意図のものではないが、α−アミラーゼはでんぷん顆粒上のグルコアミラーゼによりあけられた穴をさらに広げるものと考えられる（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、ｓｕｐｒａを参照）。通常、市販のα−アミラーゼの使用によりかなりの量のグルコース及びマルトースなどの糖の生成を生じる。
【０１０８】
アスペルギルス・オリゼー（例えば、ＣＬＡＲＡＳＥ（登録商標）Ｌ（ジェネンコー・インターナショナル））由来のα−アミラーゼの麦芽汁への添加は醸造業での使用が考えられる。この特別な酵素はデキストリンをマルトトリオース及びマルトースへ糖化する。従って、α−アミラーゼの目的はでんぷんを液化することだが、その糖化傾向はα−アミラーゼを糖化酵素含量の一部にもできる。
【０１０９】
さらに、いくつかの市販グルコアミラーゼはα−アミラーゼ活性を含む。従って、グルコアミラーゼのみの存在下で（通常は実用的ではないが）粒状でんぷんを発酵することが可能である。しかしながら、当該実施態様を本発明から除外する意図のものではない。
【０１１０】
本発明の方法のほとんどの実施態様において、α−アミラーゼを効果的な量で粒状でんぷんのスラリーに加える。グルコアミラーゼが寄与するα−アミラーゼ活性の不明確な量に加えて、α−アミラーゼの効果的活性は供給業者から与えられる単位活性値とは全く違い得ることは当業者が当然に理解することである。α−アミラーゼの活性はｐＨ依存性であり、発酵のために選択されるｐＨ範囲で異なり得る（すなわち、供給業者により用いられるそれらの報告単位活性値に関する試験条件と比較して）。従って、α−アミラーゼの最も効果的用量を確立するために、ここに明示的に記載していないが、本発明の方法に使用できる、いくつかの予備的実験が時には必要であると考えられる。
【０１１１】
いくつかの最も好ましい実施態様において、真菌α−アミラーゼのα−アミラーゼ用量範囲は０．０２ＳＫＢＵ／ｇ（真菌α−アミラーゼ単位）〜２．０ＳＫＢＵ／（でんぷん）ｇであるが、いくつかの特に好ましい実施態様においては、当該範囲は０．０５〜０．６ＳＫＢＵ／ｇである。“ＳＫＢＵ”は当業界に公知である（Ｃｅｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ．，１６：７１２−７２３［１９３９］を参照）。バチルスα−アミラーゼを利用するほとんどの実施態様において、該範囲は０．０１ＬＵ／ｇ〜０．６ＬＵ／ｇであり、好ましくは０．０５〜０．１５ＬＵ／ｇである。発酵スラリー内のグルコアミラーゼ及びα−アミラーゼの両方の実際の活性が不明確であると、いくつかの実施態様を実施する予備的な調査が必要であると考えられる。最適化の考慮として、一定グルコアミラーゼ含量を含むα−アミラーゼ用量を増加させることにより、発酵速度を増加させるという事実がある。さらに、一定α−アミラーゼ含量を含むグルコアミラーゼ用量を増加させることにより発酵速度を増加させる。酵素用量を一定に維持すること及び／またはスラリー中のでんぷん含量を増加させることでも発酵速度が増加する。実際に、いくつかの実施態様において、最適α−アミラーゼ用量はこれまで液化でんぷんに関して推奨されてきた用量をかなり上回り、最適グルコアミラーゼは糖化シロップに関して推奨された用量をかなり上回ることが考えられる。しかしながら、酵素用量レベルは酵素使用法と混同するべきではない。でんぷんスラリー中に投与される酵素の実質的な割合は、新たに顆粒でんぷんを発酵での使用のための発酵培養液から回収するために利用可能である。
【０１１２】
発酵温度で酵素を使用することから生じる問題をさらに検討すると、酵素は低相対活性を示すが（例えば、発酵温度でのＢ．リケニフォルミス由来α−アミラーゼの活性は最高活性の多くて約２５％である）、低相対活性は発酵継続期間を４８〜１２０時間延長することにより、及び高温にさらされなかった酵素の半減期を延長することにより埋め合わせされる。実際に、酵素活性の９０％以上は発酵７２時間後に維持されていることが測定された。
【０１１３】
Ｂ．リケニフォルミスのα−アミラーゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＡＡ及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ酵素；ジェネンコー・インターナショナルＩｎｃ．）は蒸留器温度への短い曝露に耐えられる程度に十分安定している。従って、蒸留廃液（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の再利用はα−アミラーゼを再利用する方法として使用できる。しかしながら、再利用蒸留廃液中の酵素の回収は、酵素を不活性化させるエタノール回収温度に発酵培養液がさらされることを避ける注意が必要である。例えば、アルコールは発酵培養液から真空回収でき、そのような蒸留廃液は次の反応での使用に適した酵素を回収するために再利用する。
【０１１４】
しかしながら、前述の通り、いくつかのＲＳＨグルコアミラーゼ（例えば、リゾプスから得られる酵素）は非加熱温度ででんぷんをグルコースに変換するのに利用でき、酵素組成物を蒸留器温度に曝露する必要性を減少させる。これは炭素基質を所望の最終生成物に変換するエネルギー費用を減少させ、それにより製造の全体的なコストを減少させる。従って、これらの酵素は本発明の方法で特に使用できる。
【０１１５】
本発明の好ましい実施態様において、いったん炭素基質を酵素的に中間体に変換すると、適当な方法で所望の最終生成物に変換する。変換は任意の適当な方法により達成される（例えば、酵素的または化学的）。好ましい実施態様において、変換は中間体を微生物と接触させることにより中間体の生物変換により達成する。別の好ましい実施態様において、それぞれ基質変換酵素及び中間体変換酵素は基質及び／または中間体と直接接触させる。いくつかの実施態様において、酵素は単離、精製または濃縮製剤として提供される。
【０１１６】
別の実施態様において、基質及び／または中間体は、それぞれ基質または中間体を分泌または代謝する微生物（例えば、細菌または真菌）と直接接触させる。従って、本発明は基質から最終生成物へ生物変換する方法を提供する。いくつかの実施態様において、少なくとも１の中間体化合物はこの変換工程時に生成される。
【０１１７】
いくつかの実施態様において、野生型生物により通常は生成されない酵素を発現するように遺伝子組換えされた微生物が利用される。いくつかの特に好ましい実施態様において、微生物は野生型生物により通常生成される酵素を過剰発現するように改変される。
【０１１８】
所望の最終生成物は基質から最終生成物へ酵素的に変換することにより生成される任意の生成物であってよい。いくつかの好ましい実施態様において、基質は最初は少なくとも１の中間体に変換され、それから中間体から最終生成物に変換される。例えば、ヘキソースは多数の生成物に生物変換でき、例えば、アスコルビン酸中間体、エタノール、１，３−プロパンジオール、及びグルコン酸である。アスコルビン酸中間体は、限定されないが、２，５−ジケトグルコン酸塩、２ＫＬＧ（２−ケト−Ｌ−グルコン酸塩）、及び５ＫＤＧ（５−ケト−Ｄ−グルコン酸塩）が挙げられる。グルコン酸塩はグルコースとグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を接触させることによりグルコースから変換できる。さらに、グルコン酸塩自体はグルコン酸塩とＧＤＨを接触させることにより２−ＫＤＧ（２−ケト−Ｄ−グルコン酸塩）に変換できる。さらに、２−ＫＤＧは２−ＫＤＧと２−ＫＤＧＨを接触させることにより２，５−ＤＫＧに変換できる。グルコン酸塩は、グルコン酸塩と２ＫＲを接触させることにより２−ＫＤＧにも変換できる。グルコースはグルコースと大腸菌を接触させることにより１，３−プロパンジオールにも変換できる。さらに、グルコースはグルコースと大腸菌を接触させることにより琥珀酸に変換できる。別の実施態様も、ここに記載するように、本発明により提供される。
【０１１９】
グルコースが中間体の実施態様において、グルコースとエタノール生成（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎｉｃ）微生物を接触させることによりエタノールに変換される。中間体と中間体変換酵素の接触において、単離及び／精製酵素は中間体と接触すると考えられる。他の実施態様において、中間体は、中間体を取り込み、所望の最終生成物を生成する細菌、真菌またはその他の生物などの生物変換剤と接触させる。いくつかの実施態様において生物は野生型であり、一方、他の実施態様において変異体である。
【０１２０】
エタノール生成微生物の好ましい例として、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを発現するエタノール生成細菌があり、例えばザイモモナス・モビリスから得られる（例えば、米国特許第５，０２８，５３９号、第５，０００，０００号、第５，４２４，２０２号、第５，４８７，９８９号、第５，４８２，８４６号、第５，５５４，５２０号、第５，５１４，５８３号、及び同時継続中の米国出願番号第０８／３６３，８６８号（１９９４年１２月２７日出願）、米国出願番号第０８／４７５，９２５号（１９９５年６月７日）及び米国出願番号第０８／２１８，９１４号（１９９４年３月２８日）を参照）。
【０１２１】
別の実施態様において、エタノール生成微生物は、キシロースをキシルロースに変換する酵素である、キシロースレダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを発現する。さらに別の実施態様において、キシロースイソメラーゼはキシロースをキシルロースに変換するために使用される。別の実施態様において、エタノール生成微生物は、キシルロースからキシルロース−５−リン酸への変換を触媒するキシルロキナーゼも発現する。別の酵素はトランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼを含む経路の完成に関与する。これらの酵素は大腸菌、クレブシエラ・オキトカ及びエルウィニア種から得られる（例えば、米国特許第５，５１４，５８３号を参照）。
【０１２２】
特に好ましい実施態様において、ペントース及びヘキソースの両方をエタノールに発酵できる微生物を利用する。例えばいくつかの実施態様において、１セットの酵素を本来有する組換え生物及び酵素の相補セットを含むように遺伝子組換えされた組換え生物を使用する（例えば、米国特許第５，０００，０００号、第５，０２８，５３９号、第５，４２４，２０２号、第５，４８２，８４６号、第５，５１４，５８３号及びＷＯ９５／１３３６２を参照）。いくつかの実施態様において、特に好ましい微生物はクレブシエラ・オキトカＰ２及び大腸菌ＫＯ１１である。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、補助剤を栄養培地（すなわち、培養基）に加え、限定されないが、ビタミン、主要栄養素及び微量栄養素を加える。ビタミンは、限定されないが、塩化コリン、ニコチン酸、チアミンＨＣｌ、シアノコバラミン、ｐ−アミノ安息香酸、ビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、ピリドキシン．ＨＣｌ及びリボフラビンが挙げられる。主要栄養素は、限定されないが、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏが挙げられる。微量栄養素は、限定されないが、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、モリブデン酸（ｔｅｃｈ）、ＣｕＣｌ３・２Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、及びＨ３ＢＯ３が挙げられる。
【０１２４】
培地及び炭素基質
本発明の変換培地は適当な炭素基質を含んでいなければならない。適当な炭素基質は、限定されないが、バイオマス、単糖類（例えば、グルコース及びフルクトース）、二糖類（例えば、ラクトース及びスクロース）、オリゴ糖、多糖類（例えば、でんぷん及びセルロース）、及びこれらの混合物が挙げられ、及び例えば、乳清浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、甜菜糖液及び大麦モルトなど再生可能な供給原料由来の非精製混合物が挙げられる。別の実施態様において、炭素基質は二酸化炭素などの１炭素基質または重要な生化学中間体への代謝変換を示すためのメタノールを含む。
【０１２５】
単一の炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒドまたはギ酸塩）からのグリセロール生成はメチロトローフ酵母（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３：５４１−５４３［１９８９］）及び細菌（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４：４１４８−４１５５［１９５８］）中において報告されている。これらの生物は、酸化状態でメタノールからギ酸塩に及んで単一炭素化合物を取り入れることができ、グリセロールを生成する。いくつかの実施態様において、炭素取り込み経路はリブロースモノリン酸、セリンまたはキシルロースモノリン酸を通る（例えば、Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９８６］を参照）。リブロースモノリン酸経路はギ酸塩とリブロース−５−リン酸塩の縮合に関連し、フルクトースになる６炭糖を形成し、最終的に３炭素生成物グリセルアルデヒド−３−リン酸を形成する。同様に、セリン経路は、メチレンテトラハイドロ葉酸により１炭素化合物を解糖経路に取り込む。
【０１２６】
１及び２の炭素基質の利用に加え、メチロトローフ生物は多数のその他の炭素含有化合物、例えば、メチルアミン、グルコサミン及び代謝活性のための種々のアミノ酸も利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを形成することが公知である（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集）、第７版、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．，４１５−３２、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ、ＵＫ［１９９３］）。同様に、種々のカンジダ菌種はアラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５３：４８５−９［１９９０］）。従って、本発明で利用される炭素源は様々な炭素含有基質を包含し、宿主生物の要求によってのみ限定される。
【０１２７】
上述の全ての炭素基質及びそれらの混合物は本発明の方法で使用できると考えられるが、好ましい炭素基質は単糖類、二糖類、オリゴ糖、多糖類及び１炭素基質である。特に好ましい実施態様において、炭素基質はグルコース、フルクトース、スクロース及び単一炭素基質、例えば、メタノール及び二酸化炭素からなる群より選択される。最も特に好ましい実施態様において、基質はグルコースである。
【０１２８】
当業界に公知であるように、適当な炭素源に加えて、発酵培地適当な窒素源、ミネラル、塩、共同因子、バッファー、及び培養物の成長及び所望の最終生成物（例えば、グリセロール）の生成に必要な酵素経路の促進に適したその他の成分を含まなければならない。いくつかの実施態様において、（ＩＩ）塩及び／またはビタミンＢ１２またはこれらの前駆体は本発明で使用できる。
【０１２９】
培養条件
通常、細胞は適当な培地中で約３０℃で成長する。本発明で利用する好ましい成長培地は一般に市販の調製培地を含み、例えば、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）培地、サブローデキストロース（ＳＤ）培地またはＹＭ（Ｙｅａｓｔ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ）培地である。しかしながら、必要に応じてその他の規定のまたは合成成長培地も使用できる。適当な培養条件は当業界に公知である。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、異化代謝産物抑制を直接または間接的に調節することが知られる薬剤は（例えば、環状アデノシン２’：３’−モノリン酸または環状アデノシン２’：５’−モノリン酸）は反応培地中に組込まれる。同様に、グリセロール生成を高める酵素活性を調節することが知られる薬剤の使用（例えば、亜硫酸塩剤、重亜硫酸及びアルカリ）も遺伝子操作と併せてまたは代わりとして使用できる。
【０１３１】
発酵に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲が反応系の初期条件に特に好ましい。さらに、反応は利用する生物に合わせて好気性、微好気性、または嫌気性条件下で行うことができる。
【０１３２】
バッチ及び連続発酵
いくつかの好ましい実施態様において、本方法はバッチ発酵方法を用いる。古典的バッチ発酵は閉鎖系であり、培地組成物は発酵の最初に用意し、発酵中は人為的な変更を加えない。従って、発酵の開始時に培地に所望の生物を植菌する。この方法では、当該系にいかなる成分も加えることなく発酵が起こる。通常、バッチ発酵は炭素源の追加に関して“バッチ”とし、ｐＨや酸素濃度などの制御因子で行われることが多い。バッチシステムの代謝産物及びバイオマス組成は発酵が止まる時間まで常に変化する。バッチ培養物内で、細胞は静電遅滞期から高成長ログ期及び最終的に成長率が減少または止まる静止期を通して穏やかである。未処理の場合、静止期の細胞は最終的に死ぬ。通常、遅滞期の細胞は最終生成物または中間体の生成の大半に関与している。
【０１３３】
標準的なバッチシステムの変化形は“フェッドバッチ発酵”システムであり、本発明で使用できる。この一般的なバッチシステムの変化形において、基質は発酵が進行する毎に追加する。フェッドバッチシステムは異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェッドバッチシステム中の実際の基質濃度の測定は困難であり、従って、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ２など排ガスの分圧などの測定可能因子の変化に基づき評価する。バッチ及びフェッドバッチ発酵は一般的であり、当業界に公知である。
【０１３４】
本発明の方法は連続発酵法にも適合可能であることが当然に理解される。連続発酵は、規定の発酵培地を連続的に生物反応器に加え、等量の調整培地を処理用に同時に取り除く開放系である。連続発酵は通常、細胞が主としてログ期成長となる一定の高密度で培養物を維持する。
【０１３５】
連続発酵は、細胞成長及び／または最終生成物濃度に影響を与える１の因子または多数の因子の調節を可能とする。例えば、１の実施態様において、炭素源、または窒素レベルなどの限定栄養素は定率でその他全てのパラメーターを抑えることができるように維持される。他のシステムにおいて、成長に影響を与える多数の因子は、培地濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちながら連続的に変化させることができる。連続システムは成長条件を定常状態に維持しようとするものである。従って、取り除かれた培地による細胞消失は発酵中の細胞成長率に対して平衡が保たれなければならない。連続発酵方法の栄養素と成長因子を調節する方法及び生成物形成率を最大化させる技術は工業微生物学の当業界で公知である。
【０１３６】
いくつかの実施態様において、本発明はバッチプロセスを用いて実行され、一方、他の実施態様において、フェッドバッチまたは連続プロセス及びその他の発酵に適した方法が使用される。さらに、いくつかの実施態様において、細胞は全細胞触媒として基質上に固定化され、適当な最終生成物の生成のための発酵条件に供する。
【０１３７】
酵素経路の変更
種々の変更した酵素経路が本発明の方法に使用できると考えられる。１の代表的な酵素経路はグルコースから１，３−プロパンジオールの生成に関する。いくつかの実施態様において、これは当業界に公知の多数の経路を代表する以下の一連の工程により達成される。この代表的な経路において、グルコースは解糖経路の酵素により一連の工程を通ってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）及びホスホグリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に変換される。グリセロールそれからＤＨＡＰの加水分解によりジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）になり、続いて還元により形成され、またはＤＨＡＰの還元によりグリセロール３−リン酸（Ｇ３Ｐ）になり、続いて加水分解により形成される。加水分解工程は、それらの基質に関して特異的または非特異的であることが知られる任意の数の細胞ホスファターゼにより触媒でき、または該活性を組換えにより宿主に導入できる。いくつかの実施態様において還元工程はＮＡＤ＋（またはＮＡＤＰ＋）結合宿主酵素により触媒され、または該活性は組換えにより宿主中に導入される。ｄｈａレギュロンは、式３の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含むことに留意する。
【０１３８】
グリセロール  →  ３−ＨＰ＋Ｈ２Ｏ  （式１）
３−ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋  →  １，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ＋  （式２）
グリセロール＋ＮＡＤ＋  →  ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋  （式３）
グリセロールは、既に詳しく述べたように中間体３−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）を経て１，３−プロパンジオールに変換される。中間体３−ＨＰは、宿主によりエンコードされる、または組換えにより宿主中に導入された脱水酵素によりグリセロールから（式１）生成される。この脱水酵素はグリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）またはこの変換を触媒できるその他の酵素である。グリセロールデヒドラターゼはｄｈａレギュロンによりエンコードされるが、ジオールデヒドラターゼはエンコードされない。いくつかの実施態様において、１，３−プロパンジオールはＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋結合宿主酵素により３−ＨＰから（式２）生成され、一方、他の実施態様において、活性は組換えにより宿主中に導入される。いくつかの実施態様において、１，３−プロパンジオールの生成におけるこの最終的な反応は１，３−プロパンジールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）またはアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒される。いくつかの実施態様において、変異及び形質転換は炭素チャネリングに影響することに留意する。１，３−プロパンジール生成経路に変形を含む多数の変異生物は本発明で使用できる。トリオースリン酸イソメラーゼ変異（ｔｐｉ−）の微生物への導入は変異使用の例であり、炭素チャネリングの性能を向上させる。もしくは、エタノール（ａｄｈ）または乳酸塩（ｌｄｈ）生成を減少させる変異は１，３−プロパンジオールの生成のためのＮＡＤＨの有用性を増加させる。グリセルアルデヒド−３−リン酸後の解糖工程における別の変異は１，３−プロパンジオール生成経路を含む。ＰＥＰ損失を防止するＰＴＳなどグルコース輸送を生じる変異も本発明で使用できる。グリセロール異化経路（ｇｌｐ）など１，３−プロパンジオール生成経路の中間体のための別の経路をブロックする変異も本発明で使用できる。いくつかの実施態様において、変異は構造遺伝子を目的とし、酵素活性の活性を弱めるまたは高めるようにし、または調節遺伝子を目的とし、酵素活性の発現レベルを調節できるようにする。
【０１３９】
別の実施態様において、形質転換及び変異は１，３−プロパンジオール生成を高めるための特定の酵素活性を制御するために組込む。従って、１，３−プロパンジオールの生成を増加させるような全細胞触媒の変異を提供することは本発明の範囲内である。
【０１４０】
最終生成物の同定及び精製
発酵培地から最終生成物を精製する方法は当業界に公知である。例えば、プロパンジオールは反応混合物を有機溶媒、蒸留及びカラムクロマトグラフィーを用いた抽出に供することにより細胞培地から得られる（例えば、米国特許第５，３５６，８１２号を参照）。この方法の特に優れた有機溶媒はシクロヘキサンである（例えば、米国特許第５，００８，４７３号を参照）。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、最終生成物は培地を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に供することにより直接同定する。本発明の１の方法は、定組成で０．０１Ｎ  硫酸の移動相を用いた分析イオン交換カラムにおける発酵培地の分析を含む。
【０１４２】
酵素の同定及び精製
培地中の酵素レベルは酵素分析により測定できる。例えば、１，３−プロパンジオールの製造において、タンパク質Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼの発現レベルは酵素分析により測定する。Ｇ３ＰＤＨ活性分析はＤＨＡＰのＧ３Ｐへの変換における補基質、ＮＡＤＨのスペクトル特性に依存する。ＮＡＤＨは固有ＵＶ／ｖｉｓ吸収を有し、その消費量は分光光度法で３４０ｎｍで観測できる。Ｇ３Ｐホスファターゼ活性は反応において解放された無機リン酸を測定する任意の方法により測定できる。最も一般的に使用される検出方法は、青色リンモリブデン酸アンモニウム錯体の可視分光測定を用いる。
【０１４３】
従って、当業界に公知の方法及び本発明の方法間で種々の表面的な類似性があるが、本発明は本発明、特に酵素再利用、バイオマス及びでんぷん再利用などの実施を独特のものとする多くの詳細な特徴を反映するより総合的な目的を提供する。
【０１４４】
回収
概して、再利用蒸留廃液における酵素の回収は、変換培地が酵素を不活性化させる温度に曝されるのを避けるために注意が必要である。１の例において、エタノールの変換のため、アルコールは発酵培養液から真空除去され、蒸留廃液は酵素を回収するために再利用する。いくつかの実施態様において酵素は限外ろ過または電気透析の使用により回収し、再利用する。
【０１４５】
プロセス検討事項
上述の通り、顆粒でんぷんスラリーの発酵はシロップの発酵と比べて全く異なる特徴を有する。通常、溶液中約２０％の固体濃度は発酵培地中の最大糖含量と考えられ、より高い濃度では発酵の開始及び最後に問題を生じる。しかしながら、でんぷんスラリーの発酵において同様の制限は存在しない。スラリー中のでんぷん濃度は１０〜３５％で様々であり、発酵の開始で認識できる影響はない。でんぷん濃度を増加すると（例えば、一定酵素量で）生物変換率の速度が上がり、または反対に、所定の生物変換率を達成するために必要な酵素量の低下を可能にする。過剰（すなわち余剰の）顆粒でんぷんは、実質的な酵素量と一緒に回収でき、再び発酵に供することができる。従って、でんぷん濃度の制御は本発明の実施の主なプロセスパラメーターである。
【０１４６】
１の好ましい実施態様において、１０〜３５重量％でんぷんを有する顆粒でんぷんスラリーの生物変換及び発酵の手段を提供する。いくつかの好ましい実施態様において、大腸菌を含む１０〜３５％でんぷんスラリーの発酵は、発酵が目的の有機酸または１，３−プロパンジオール含量レベルに進行した場合、余剰でんぷんの生成を生じる。しかしながら、この反応は微生物及び使用するバイオプロセス条件に依存し、従って、でんぷん粒子上の酵素の再利用は余剰でんぷんが再度発酵されたときに起こる。しかしながら、たとえ２５〜３５％のでんぷんスラリーが発酵された場合でも、好ましい実施態様において、発酵は、新しい発酵のために、顆粒でんぷんが完全に消失する前に止まる。従って、でんぷんの再利用は再利用のための酵素を回収する容易な方法である。
【０１４７】
本発明の好ましい実施態様において、（顆粒）でんぷん及び微生物は一緒に取り除かれる（例えば、遠心分離またはろ過により）。この除去でんぷん及び微生物は新しい顆粒でんぷん及び必要な酵素の追加アリコートと混合し、別の発酵操作のための発酵分量を生じる。
【０１４８】
他の好ましい実施態様において、１０〜２５重量％セルロース誘導体を有するコーンストーバー（トウモロコシ伐採残）スラリーの生物変換及び発酵が提供される。１の実施態様において、大腸菌を含む１０〜２５％のセルロース誘導体スラリーの発酵は、発酵が目的の有機酸または１，３−プロパンジオール含量レベルに進行した場合、余剰セルロース誘導体を生じる。この反応は使用する微生物及びバイオプロセス条件に依存する。上述の通り、セルロース誘導体において酵素の再利用は余剰コーンストーバーが再度発酵された場合に起こる。しかしながら、２５〜３５％のセルロース誘導体スラリーが発酵された場合でも、好ましい実施態様において、発酵は、新しい発酵のために、ストーバーが完全に消失する前に止まる。従って、ストーバーの再利用は再利用のために酵素を回収する容易な方法である。
【０１４９】
他の好ましい実施態様において、コーンストーバー及び微生物は一緒に取り除かれる（例えば、遠心分離またはろ過により）。この除去されたコーンストーバー及び微生物は新しいコーンストーバー及び必要な酵素の追加アリコートと一緒に混合し、他の発酵操作のための発酵分量を生じる。
【０１５０】
当業者に理解されるように、最適方法の詳細への到達に工学技術の交互使用が考慮され、これらの交互使用は様々であり、各特定の状況に依存する。それにもかかわらず、ここで提供される方法は最適方法を得るための当該交互使用を生じるために必要な技術を提供する。例えば、妥当な最も速い発酵を達成するために、高でんぷんまたはセルロース含量及び高酵素量が示される。しかし、結果的に速い発酵は発酵培養液中の栄養素レベルの生成に徐々に収まり、それから栄養素の回収に影響し、または発酵は比較的低最終生成物（例えば、アルコール）含量で止まる。しかしながら、比較的低発酵率が許容可能であれば、それから、酵素量は比較的低く、及び栄養素損失は従来発酵分野で受け入れられていたレベルに保たれる。最終生成物（例えば、アルコール）の最高収率が主な目的である場合、α−アミラーゼ量を抑える低でんぷん含量スラリー及び高グルコアミラーゼ量は本発明で使用できる。しかしながら、本発明を特定の方法設計に限定するものではない。
【０１５１】
ここに示すように、本発明はかなりの量の熱エネルギーを節約する。しかしながら、開始基質（例えば、でんぷん）が液化のために用いられる熱条件に供されることがないので、基質は熱殺菌されない。従って、いくつかの実施態様において、開始基質（例えば、顆粒でんぷん）は汚染微生物を発酵培地に添加することが考えられる。従って、いくつかの実施態様において、発酵培地に、再利用基質（例えば、でんぷん）に関連する多数の生成物生成微生物を蒔くことが有利である。汚染物質を大きく数で上回ることにより、再利用微生物は汚染微生物を圧倒し、それにより発酵で優勢となり、所望の最終生成物の生成を生じる。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、最初に発酵槽または生物反応器中に充填される微生物及び／または酵素の量は種々の生成物の発酵及び／または生物変換に実施される従来技術に従う。これらの量は様々であり、発酵の過程において微生物細胞が増加し、一方生物変換に使用される酵素は有限半減期を有する。いくつかの実施態様において、微生物の再利用が活用されるが、多くの実施態様において、本発明の実施に必須ではない。それに対して、特に好ましい実施態様において、酵素を再利用するのが望ましい（しかし、酵素の再利用を必須とする方法に本発明を限定する趣旨ではない）。
【０１５３】
従って、いくつかの実施態様において、余剰でんぷんまたはバイオマスの再利用前に余剰でんぷんまたはバイオマス粒子から微生物を除去することを考慮する。しかしながら、本発明の実施は開始基質（例えば、でんぷん）の熱処理を必ずしも必要とするものではないことに再度留意されたい。従って、いくつかの実施態様において、開始基質は熱殺菌されるが、他の実施態様においてはされない。従って、いくつかの実施態様において、発酵／生物変換は、汚染の影響を克服するために、比較的大部分の微生物の存在下で行われる。別の実施態様において、抗菌剤を発酵培地に加えて汚染微生物の成長を抑圧する。さらに別の実施態様において、冷滅菌技術、紫外線放射、６５℃低温殺菌を用いて開始（例えば、基質）物質を殺菌する。しかしながら、バイオマスは発酵槽または生物反応器の殺菌に関して問題を生じない。
【０１５４】
ここで記載するように、本発明は代謝糖を制御速度で微生物またはその後の酵素に放出することにより発酵速度を制御する手段を提供する。本発明の方法はこれまで行われてきとものとは非常に異なった方法である。先行技術は発酵前の固形でんぷんと酵素の処理及び／またはエネルギーを保存するため及び／または発酵効率を向上させるために発酵培地に酵素を含めることについて教示する。しかしながら本発明とは対照的に、先行技術には直線状に近い発酵速度を達成するために発酵の特徴を変えることについては教示していない。本発明は、特に高温でんぷん液化と比較して、効果的にエネルギーを保存する手段を提供する。実際、好ましい実施態様において、より熱的エネルギーが保存される。本発明の方法は高発酵効率で作用し、いくぶんでんぷん後退に起因する生成物損失、不完全糖化及び発酵性物の不完全発酵が減少する。さらに、でんぷんまたはバイオマス濃度の制御により発酵率を調整する能力、及び酵素含量及び比率の制御は、本発明が提供するように、最小の炭水化物含量で所望の最終生成物の生成を促進する。
【０１５５】
以下の実施例にさらに示すように、本発明はでんぷんの酵素変換を用いたグルコン酸の生成の新規な方法を提供する。ここで示すように、でんぷんからグルコン酸への酵素変換の使用は、酵素を用いたグルコースからのグルコン酸生成時に目下直面する２つの重要なバリアの除去を助ける。現行のグルコン酸生成方法を達成するために、グルコースを３０〜６０重量％溶液で用いる必要があり、それは部分的にその高さの濃度でグルコースオキシダーゼ／カタラーゼ酵素系を阻害する。現在使用する方法において、この高さのグルコース濃度はこれらの酵素を非常に高い用量で生じ、従って、該方法は経済的に非常に高くなる。現在使用される方法の別の問題としては６０％糖溶液基質を用いると、高粘度レベルとなり、反応混合物中の酸素溶解性にマイナスの影響を与えることである。酸素は第２の基質であり、この酸化のために等モルであることが必要である。溶液における酸素の利用可能性が低いと、グルコースからグルコン酸への酸化率が低くなり、従ってよりよいＫｌａ（酸素移動定数）輸送反応器が必要である。
【０１５６】
開始物質としてでんぷんを使用することより、上述の現在使用されている方法の短所に対処するだけでなく、コーンスターチとＤ−グルコースの原材料費用、基質の還元及び／または生物変換に使用される酵素の生成物ベースの阻害に関する少なくとも３つのさらなる著しい利点を有し、及び同時にグルコン酸の生成のための高酵素量の必要性が著しく減少する。
【０１５７】
要するに、本発明は原料コーンスターチからグルコン酸を生成する新規な方法を提供する。実際に、本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物反応器及び酵素生物変換を用いたでんぷんからグルコン酸への変換をまず実証する。本発明の方法はさらに、主要な消耗品、すなわち産業化学的グルコン酸の形成のための低コストの再生可能な供給原料を用いる手段を提供する。
【０１５８】
さらに、以下の実施例は、ジェネンコーのＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素を用いてマルトデキストリンを効果的にグルコン酸に変換できることを示す。また、最適な酵素比を用いることにより、反応時に生成される過酸化水素の悪影響を回避できることも示す。さらに、以下の実施例は、３つ全部の酵素の酵素量を設定することにより、マルトデキストリンから生成されるグルコースの酸化のために反応器中の必要な溶解酸素要求を維持できることも示す。また、ＯＰＴＩＭＡＸ（αアミラーゼ；ジェネンコー）の用量を最適化することにより、反応混合物中のグルコースの放出が制御できることも示す。
【０１５９】
さらに、以下の実施例は、別のより安いでんぷん様炭素供給原料による発酵制御、及び酵素ベース変換を用いたバイオマスはより経済的で効率的で、持続性の発酵方法を提供し、工業的薬品、酵素及び治療剤を生成することを示す。以下の実施例に示すように、グルコース放出率は酵素付加の量により制御できる。実際に、グルコアミラーゼを用いるでんぷん変換率は最初の予測より１００倍早いことが観測された。しかしながら、生成物へのグルコース変換率は培地中で利用可能なグルコース濃度に依存し、従って、最終生成物形成に影響する。従って、グルコアミラーゼ量を添加することで変換に利用可能なグルコースの放出を制御することにより、生成物形成のために達成可能な最も速い変換速度を提供するための反応を操作する手段を提供する。
【０１６０】
さらに、変換の選択性は使用するグルコアミラーゼの用量に基づき制御可能である。以下の実施例に示すように、生成物形成の最適速度は３単位の酵素を用いて生じた。しかしながら、本発明の実施者は特定の目的に合わせて正確な反応条件を修正することが考えられる。実際、各プロセスの詳細は様々であることを考慮し、使用する加水分解酵素の動態、生成物変換のためのグルコースの動態に依存する。さらに、外部の反応条件、例えば、ｐＨ、温度及び培養基組成は同様に重要な検討材料である。それにもかかわらず、本発明は種々の条件下で本発明の実施に必要な内容を提供する。
【０１６１】
また、炭素供給原料の効率的な変換のための本発明の方法はその他の種々の発酵への使用も考えられ、限定されないが、セルロース及び／またはヘミセルロースからの効率的なバイオ生成物の生成がある。また、ここで提供する開始物質は種々の発酵方法において乳糖の代わりに使用できる。従って、本発明は工業的発酵産業において広く使用できる。
【０１６２】
本記載及び実施例の種々のその他の例及び変更は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく当該開示の内容を読んだ当業者に明らかであり、そのような例または変更のすべては請求の範囲内に含まれる。ここに記載されたすべての文献及び特許はその内容の全体をここに引用するものとする。
【０１６３】
実験
以下の実施例は特定の好ましい本発明の実施態様及び側面を示し、さらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定すると解釈されるものではない。実際、これらの技術はさらにここに記載された方法システムを最適化するために使用できる。
【０１６４】
以下の実験的記載において、以下の省略形は、ｗｔ％（重量％）、℃（摂氏温度）、ｒｐｍ（１分当たりの回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｎｇ（ナノグラム）、μｌ（マイクロリットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、ｍｍ（ミリメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、μｍ（マイクロメートル）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（単位（ユニット））、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｐｓｉ（ポンド／平方インチ絶対圧力）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）（時間）、Ｑ．Ｓ．及びｑ．ｓ．（十分量（ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ））、ＯＤ（光学密度）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍの光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍの光学密度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＤＯ（溶存酸素）、Ｄｉ（脱イオン化した）、フタル酸緩衝液（フタル酸ナトリウム溶液、２０ｍＭ、ｐＨ５．０）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２］、Ｃｅｒｅｓｔａｒ顆粒でんぷん（Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｆｏｏｄｓ  ＰＦＰ２２００顆粒でんぷん）、Ｃｅｒｅｓｔａｒ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｉｎｃ．，カンパニー、ミネアポリス、ミネソタ州）、ＡＶＩＣＥＬＬ（登録商標）（ＦＭＣコーポレーション）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ｗ／ｖ（重量対体積）、ｖ／ｖ（体積対体積）、ｓｌｐｍ（標準化リットル／分）、ＡＴＣＣ（米国菌培養収集所、ロックビル、メリーランド州）、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ミシガン州）、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬまたはＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（ライフ・テクノロジーズ，Ｉｎｃ．，ゲイサーズバーグ、メリーランド州）、ジェネンコー（ジェネンコー・インターナショナル，Ｉｎｃ．，パロアルト、カリフォルニア州）、Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ（新日本、日本）である。
【０１６５】
以下の実施例において、当業者に公知の追加の種々の培地及びバッファーを用い、以下を含む。
【０１６６】
乳酸菌ＭＲＳ培地（接種材料）：Ｄｉｆｃｏ（参照番号２８８１３０）：
０．５×変異乳酸菌ＭＲＳ培地ｗ／ｏグルコース＋８％顆粒でんぷん処方：
酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）                      １５．０ｇ／Ｌ
顆粒でんぷん（Ｃｅｒｅｓｔａｒ）              ８０．０ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ                            ０．３ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                                    ０．５ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４                                    ０．５ｇ／Ｌ
酢酸ナトリウム                                ０．５ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ                            ０．０３ｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４＊１Ｈ２Ｏ                            ０．０３ｇ／Ｌ
Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４（消泡剤）                １ｍＬ
１０００×Ｔｉｇｅｒ微量金属                  ０．２ｍｌｓ原液
ＴＭ２処方（発酵培地リットル当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４  １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物  ２ｇ、クエン酸第２鉄アンモニウム  ３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．２ｇ、酵母抽出物  ５ｇ、１０００×修飾Ｔｉｇｅｒ微量金属溶液  １ｍｌ。当該成分すべてをｄｉＨ２Ｏ中に一緒に加え、溶解させる。ｐHは水酸化カリウム（ＫＯＨ）を用いて６．８に調節し、体積ｑ．ｓ．とする。最終生成物は（オートクレーブだけでなく）０．２２ｕ（ミクロン）フィルターを用いてろ過殺菌する。
【０１６７】
マーフィー  ＩＩＩ培地（ｇ／ｌ）
ＫＨ２ＰＯ４（１２ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（４ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、ＤＩＦＣＯ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（２ｇ）、クエン酸ナトリウム（０．１ｇ）、フルクトース（５ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（１ｇ）、ニコチン酸（０．０２ｇ）、０．４ｇ／ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（５ｍｌ）、及びＰｈｏ塩（５ｍｌ）。
【０１６８】
１０００×修飾Ｔｉｇｅｒ微量金属溶液：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊１Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分をＤｉＨ２Ｏ中で同時に溶解し、ＨＣｌ／ＮａＯＨを用いてｐＨを３．０にし、それから体積をｑ．ｓ．し、０．２２ミクロンフィルターを用いてろ過殺菌する。
【０１６９】
実施例１
グルコースからグルコン酸への変換
この実施例では、グルコースからグルコン酸への変換のために行う実験を説明する。まず、３０ｗｔ％グルコース溶液を生成した（脱イオン水中、２７５ｍｌの５０ｍＭフタル酸ｐＨ５．１２、１１５ｇのグルコースを含む）。この溶液を３５℃、背圧０．３ｂａｒに保った。それから、２７００Ｕのグルコースオキシダーゼ及び２７０単位のカタラーゼを１１００ｒｐｍで溶液及び１２０％ＤＯ（標準温度及び圧力、ＮＴＰまたはＡＴＰ下で）溶存酸素水溶液（“ＤＯ”）中で混合した。酵素を混合する際、３０％グルコース、酸素の使用が必要な操作条件下で１５％以下飽和反応培地中で浸したＤＯは律速基質となり得る。実際に、酵素は、３０％以下の糖溶液中で試験した場合、部分的に抑制されたようであり、グルコースの変換が促進し、２０％以下濃度になった。従って、６０％糖溶液（すなわち、当業界で使用される最も一般的な糖供給物の一つ）の使用は抑制を生じ、及び酸素輸送のきっかけを生じる。これらの実験の結果は図１に示す。
【０１７０】
実施例２
でんぷんからグルコースへの変換
この実施例では、でんぷんをグルコースに変換するための行う実験を説明する。まず、３０％コーンスターチスラリーを作り（１００ｇのでんぷん（Ｃｅｒｅｓｔａｒ）を２７０ｍｌの５０ｍＭフタル酸バッファー、ｐＨ５．０中で混合した）、４５℃で維持した。そして、当該混合物を１１００ｒｐｍ、１５０％ＤＯで混合した。それから、２５０ｍｇのＲＳＨ酵素（ＣＵＣＯＮＣ（登録商標）、日本、１８７グルコアミラーゼ単位／ｇの粉末）を溶液中に混合した。この組合せにより、ｐＨ５．０、４５℃ででんぷんからグルコースへの変換が１６ｇ／ｌ／ｈｒ初速度で生じた。これらの結果はＲＳＨグルコアミラーゼ酵素がでんぷんから糖への変換に優れた動態を有することを示す（図２を参照）。しかしながら、低分量のＲＳＨグルコアミラーゼが本発明の方法において使用でき、でんぷんをグルコースに変換すると考えられる。実際に、いくつかの実施態様において、当業界で一般的に行われる２ｇ／ｌ／ｈｒ生成が用いられ、３０％でんぷん原液の１００ｍｇのＲＳＨグルコアミラーゼ粉末（活性／単位）／リットルは効果的にでんぷんをグルコースに変換するのに十分な量である。
【０１７１】
顆粒でんぷんからグルコースへの変換を評価するための別の実験において、ｐＨ６．７及び温度３４℃、所望の発酵でグルコアミラーゼ活性を有する酵素を用いて顆粒でんぷんからグルコース形成を観測するために１Ｌのオレンジキャップボトル中で実験を行った。
【０１７２】
この実験で、スラリー中の顆粒でんぷん形態を、最高最終濃度８０ｇ／Ｌグルコースとするために、１Ｌのボトル（例えば、１６％グルコース同等でんぷんを含む３００ｍＬスラリーを６００ｍＬスラリーに加えた）に加えた。スラリー／培養液のｐＨをＮＨ４ＯＨを用いて６．７に調節した。混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃で３０分間保ち、それか６５℃、１４時間で低温殺菌した。それから、試験酵素（フミコーラｇｒｉｓｅａの発酵槽上澄み液の３０ｍｌ  ＵｌｔｒａＦｉｌｔｅｒ濃縮物）を用いてでんぷん加水分解活性（すなわち、ＲＳＨ活性）を示し、及び０．４ｍｌのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤαアミラーゼ液濃縮物（ジェネンコー）及び３０ｍｇスペクチノマイシン及び１ｍｇビタミンＢ１２（スペクチノマイシン及びＢ１２をＤＩ水中に０．２ミクロンろ過物として加えた）。反応中、サンプルを容器から取り出し、遠心分離し、上澄みを冷蔵し、酵素作用を終わらせた。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験ではグルコース形成を測定することにより顆粒でんぷんの糖化を観測した。当該結果は３２．０９ｇ／Ｌグルコースが３時間で蓄積したことを示した。従って、１０ｇ／Ｌ−時間速度での顆粒でんぷんからグルコースへの変換は、３４℃、ｐＨ６．７での顆粒でんぷんから１，３−プロパンジオールへの同時糖化発酵（ＳＳＦ）に関して優れている。
【０１７３】
実施例３
でんぷんからグルコン酸への変換
この実施例では、でんぷんをグルコン酸へ変換するために行う実験について説明する。まず、３０％コーンスターチスラリーを作り（ｐＨ５．１、５０ｍＭフタル酸バッファー２７０ｍｌ中でんぷん１００ｇ）、４０℃に保った。そして、１１００ｒｐｍ及び１３０ＤＯの条件下、２５０ｍｇのＲＳＨ酵素（ＣＵＣＯＮＣ（登録商標）、日本、１８７グルコアミラーゼ単位／ｇの粉末）、８８０μｌのＯＸＹＧＯ（登録商標）（グルコースオキシダーゼ、ジェネンコー）及び８８０μｌのＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）（カタラーゼ、ジェネンコー）（１５００Ｕ／ｍｌ及び１０００ｕ／ｍｌ）を溶液中に混合した。これによりｐＨ５．１〜５．２、４０℃ででんぷんからグルコースへの１７ｇ／ｌ／ｈｒ初速度での変換を生じた。この結果はＲＳＨグルコアミラーゼ酵素がこれらの生物変換条件下で生物反応器中、でんぷんから糖への変換に関して優れた動態を有することを示す（図３を参照）。
【０１７４】
しかしながら、別の実施態様において、条件を最適化することは当該系の長期間の安定性の最大化に役立つ。グルコースをグルコン酸に変換するために必要な別の酵素は、グルコース蓄積が起こらないように、これらの実験で使用される間にわたってこの系と一致してうまく作用するようにするためにも決定した。従って、これらの結果は、１０ｇ／ｌ／ｈｒの容量生産性の工程を実施するために必要なＲＳＨ酵素の分量が現在使用されている方法に必要な量よりもかなり少ないということを示す。
【０１７５】
実施例４
ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）を加えたでんぷんからグルコン酸への変換
この実施例では、酵素混合物中、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）を用いてでんぷんをグルコン酸に変換するために行う実験について説明する。まず、３０％コーンスターチ（Ｃｅｒｅｓｔａｒ）スラリーをｐＨ５．０、１０ｍＭ酢酸バッファー中で調製し（１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液）、４０℃にした。それから、１１００ｒｐｍ及び１１８ＤＯ条件下、２５０ｍｇのＣＵ  ＣＯＮＣ（登録商標）ＲＳＨグルコアミラーゼ、１５０μｌのＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）−Ｌ−４００（３５０ＧＡＵ／ｇ；ｓｐ１．１５）、１２５０μｌのＯＸＹＧＯ（登録商標）及び１５００μｌのＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）を当該溶液に加えた。これにより２５ｇ／ｌ／ｈｒの初速度でグルコン酸生成をもたらした。従って、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）Ｌ−４００グルコアミラーゼ酵素を反応混合物に添加することはグルコン酸生成の初速度を高めるだけでなく、図４に示すように生コーンスターチからグルコン酸への変換を全体的に改善して導くことが明らかである。
【０１７６】
実施例５
マルトデキストリンからグルコースへの変換
本発明の方法の有用性をさらに示すために、別の基質を用いた。当該基質は、マルトデキストリンであり、やはり重要な糖供給源となる。図５に示すように、マルトデキストリンからグルコースへの定量変換はＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素を用いて実行可能であった。
【０１７７】
実施例６
マルトデキストリンからグルコン酸への変換
さらに、マルトデキストリンからグルコン酸への変換を低酵素量条件で試みた。特に、低分量のカタラーゼを試験した。この結果により、マルトデキストリンは３つの酵素を用いてシングルポット反応でグルコン酸に変換できることが明らかになった（データは示していない）。さらにＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）（αアミラーゼ及びプルラナーゼブレンド；ジェネンコー）酵素調製物は、ここに記載する他の実施例において試験したＣＵ  ＣＯＮＣ（登録商標）ＲＳＨグルコアミラーゼと比較して過酸化水素に対して感度が低いことが測定された。
【０１７８】
実施例７
ＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＮＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素の比
さらなる実験で、最高生産性及びＯＸＹＧＯ（登録商標）酵素の安定性のために活性ベースの最小で１：１比が望ましいことが測定された。図６に示すように、グルコースからグルコン酸への完全な変換はこれらの条件下で示された。
【０１７９】
実施例８
再構築した酵素量を用いるマルトデキストリンからグルコン酸への変換
この実験では、マルトデキストリンからグルコン酸への生成を７ｇ／ｌ／ｈｒの速度で５０％以上の収率で達成した。変換初速度は２５ｇ／ｌ／ｈｒ以上に接近した。この実施例で使用した分量レベルは１０００単位のＯＸＹＧＯ（登録商標）酵素及び２００単位のＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）酵素を含むＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素である。この実施例は生物変換を達成するために正確な酵素タイプを利用する必要性について説明する。
【０１８０】
実施例９
全体的な変換効率を向上させるための酵素量の最適化
これらの実験では、ＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）酵素の分量をさらに最適化することにより、マルトデキストリンからグルコン酸の生成収率及び容量生産性が８０％以上及び８ｇ／ｌ／ｈｒに達した（図８参照）。この実施例で用いた分量レベルは１２５０単位のＯＸＹＧＯ（登録商標）及び２００単位のＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）を含む１０００単位のＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）である。この実施例は所望の生物変換を達成するために正確な酵素タイプ及び分量レベル最適化を含む必要性について説明する。
【０１８１】
実施例１０
生コーンスターチと生小麦でんぷんの比較
本発明の有用性をさらに示すために、別のでんぷん源を試験した。この基質は、生小麦でんぷんであり、やはり重要な糖供給源である。図９に示すように、小麦でんぷんもＯＸＹＧＯ（登録商標）、ＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）及びＣＵ  ＣＯＮＣ  ＲＳＨグルコアミラーゼ酵素を用いてグルコン酸に効果的に変換できる。実際に、当該結果は小麦でんぷんが同様の生物変換時間で比較した場合、コーンスターチよりも生物変換に敏感に反応することを示す。
【０１８２】
実施例１１
でんぷんから乳酸への変換
この実験は１Ｌ生物反応器中で行い、グルコアミラーゼ活性を有する酵素を用いて所望の発酵、ｐＨ６．４及び温度３４℃での顆粒でんぷんからの乳酸形成を観測した。この実験では、０．５×修飾乳酸菌培養発酵培地中のスラリー形態中の顆粒でんぷん（最高最終濃度が８０）を低温殺菌した（すなわち、混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃、３０分間で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した）。これを前もって殺菌しておいた１Ｌ生物反応器に加えた。スラリー／培養液のｐＨを６．４に調節し、２８％のＮＨ４ＯＨを使って６．４で制御した。それから、所望の酵素（０．４ｇのｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＣＵ  ＣＯＮＣ（登録商標）、Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）を０．２ミクロンのろ過溶液（２０ｍｌ）としてＤＩ水に加えた。そして、乳酸生成株乳酸菌ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ３９３）の接種材料で、凍結ガラス瓶から採取したものを乳酸菌ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で調製した。接種材料が、０．６ｓｌｐｍ（（標準化リットル／分）流速）で窒素分離して３４℃、１Ｌ生物反応器中、５５０ｎｍで測定してＯＤ２．４に成長した後、反応器（６００ｍｌ）の内容物を遠心分離し、４５ｍｌ上澄み中で再懸濁し、生物反応器中の発酵性生物変換の接種材料として細胞ペレット（４２ｍｌのＯＤ２２物質）を移動させた。発酵性生物変換の操作時間中、窒素を０．６ｓｌｐｍで分離し、背圧を５ｐｓｉに保ち、温度を３４℃に保ち、２８％  ＮＨ４ＯＨの塩基滴定によりｐＨを６．４に保った。反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及び乳酸への変換を測定することにより顆粒でんぷんの生物変換を観測した。１６．３時間で、乳酸の蓄積量は６１．７５ｇ／Ｌに達した（図１０）。
【０１８３】
さらに、顆粒でんぷんから乳酸への生物変換は温度３４℃、ｐＨ６．４で、３．７９ｇ／Ｌ時間速度レベルを示した。
【０１８４】
実施例１２
でんぷんから琥珀酸への変換
この実験は、ｐＨ６．７及び温度３４℃の望ましい発酵条件でグルコアミラーゼ活性を有する酵素を使った顆粒でんぷんからの琥珀酸形成を観測するために１Ｌ生物反応器中で行った。
【０１８５】
この実験で、０．５×ＴＭ２発酵培地中のスラリー形態中の生顆粒でんぷん（最高最終濃度が８０ｇ／Ｌグルコース）を低温殺菌した（すなわち、混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃、３０分で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した）。これを前もって殺菌した１Ｌ生物反応器に加えた。スラリー／培養液のｐＨは６．７に調節し、ＮＨ４ＯＨで６．６５に制御した。そして、所望の酵素（０．６ｇのｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＣＵ  ＣＯＮＣ；Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）を０．２ミクロンろ過溶液（２０ｍｌ）としてＤＩ水に加えた。琥珀酸生成株３６  １．６ｐｐｃ大腸菌の接種材料で、凍結ガラス瓶から採取したものをＴＭ２＋１０ｇ／Ｌグルコース培地中で調製した。接種材料が、５５０ｎｍで測定してＯＤ０．６に成長した後、６００ｍｌフラスコを遠心分離し、８０ｍｌ上澄み中で再懸濁し、細胞ペレット（８０ｍｌのＯＤ１４．３物質）を生物反応器に移動した。操作までの３．７時間で、０．６ｓｌｐｍで分離される空気を窒素に交換し、それも０．６ｓｌｐｍで分離した。
【０１８６】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及び琥珀酸への変換を測定することにより顆粒でんぷんの生物変換を観測した。４３時間で、琥珀酸の蓄積量は１．４６ｇ／Ｌに達した（図１１）。０．０３４ｇ／Ｌ時間速度での顆粒でんぷんから琥珀酸への変換が３４℃、ｐＨ６．７での顆粒でんぷんから琥珀酸への発酵生物変換に関して示された。
【０１８７】
実施例１３
でんぷんから１，３−プロパンジオールへの変換
この実験は、ｐＨ６．７及び温度３４℃の望ましい発酵条件でグルコアミラーゼ活性を有する酵素を使った顆粒でんぷんからの１，３−プロパンジオール形成を観測するために１Ｌ生物反応器中で行った。
【０１８８】
この実験で、０．５×ＴＭ２発酵培地中のスラリー形態中の顆粒でんぷん（最高最終濃度が８０ｇ／Ｌグルコース）を上述の通り低温殺菌した（すなわち、混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃、３０分で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した）。これを前もって殺菌した１Ｌ生物反応器に加えた。スラリー／培養液のｐＨは６．７に調節し、ＮＨ４ＯＨで６．６５に制御した。そして、所望の酵素（でんぷん加水分解活性［すなわち、ＲＳＨグルコアミラーゼ活性］を有するフミコーラｇｒｉｓｅａの発酵槽上澄みの３０ｍｌのＵｌｔｒａＦｉｌｔｅｒ濃縮体、及びαアミラーゼ活性を有する０．４ｍｌのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ液濃縮体［ジェネンコー］）及び１，３−プロパンジオール生成に特定の必要条件（３０ｍｇスペクチノマイシン及び２ｍｇビタミンＢ１２）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。１，３−プロパンジオール生成大腸菌株ＴＴａｌｄＡＢｍｌ／ｐ１０９Ｆ１の接種材料で、凍結ガラス瓶から採取したものをｓｏｙｔｏｎｅ酵母抽出物グルコース培地中で調製した。接種材料が、５５０ｎｍで測定してＯＤ０．６に成長した後、２つの６００ｍｌフラスコを遠心分離し、その内容物を７０ｍｌ上澄み中で再懸濁し、細胞ペレット（７０ｍｌのＯＤ３．１物質）を生物反応器に移動した。
【０１８９】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及びグリセロール（１，３−プロパンジオール経路中間体）及び続いて１，３−プロパンジオールへの変換を測定することにより顆粒でんぷんの発酵生物変換を観測した。２３．５時間で、グリセロール及び１，３−プロパンジオールの蓄積量はそれぞれ７．２７及び４１．９３ｇ／Ｌに達した（図１２）。
【０１９０】
１．７５ｇ／Ｌ時間速度での顆粒でんぷんからグリセロール及び１，３−プロパンジオールへの変換が３４℃、ｐＨ６．７での顆粒でんぷんから１，３−プロパンジオールへの発酵生物変換に関して示された。
【０１９１】
別の類似の実験において、顆粒でんぷんからグリセロールへの発酵性物変換を３４℃及びｐＨ６．７で測定した。これらの実験において、グルコース形成及びグリセロールへのその変換を測定した。９時間で、グリセロールの蓄積が１４．９３ｇ／Ｌだった。顆粒でんぷんからグリセロールへの変換速度は１．６０ｇ／Ｌ−時間であり、顆粒でんぷんの発酵性物変換に良い速度であった。同様に、上述の１．７５ｇ／Ｌ−時間速度は顆粒でんぷんから１，３−プロパンジオールへの発酵性物変換に関して優れた速度であった。
【０１９２】
実施例１４
ＣＵ  ＣＯＮＣ  ＲＳＨ  グルコアミラーゼによるでんぷんから１，３−プロパンジールの発酵性物変換
最初の実験は、所望の発酵条件、ｐＨ６．７及び温度３４℃でグルコアミラーゼ活性を有する酵素を用いて顆粒でんぷんからのグルコース形成を観測するために１Ｌオレンジキャップボトル中で行った。
【０１９３】
この実験で、スラリー形態中の顆粒でんぷん（最高最終濃度が４０ｇ／Ｌグルコース）をＩＬボトルに加え（例えば、８％グルコース同等でんぷんを含む３００ｍＬスラリー）及び３００ｍＬのＴＭ２培地と混合した。スラリー／培養液のｐＨはＮＨ４ＯＨを用いて６．７に調節した。混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４〜３５℃、３０分で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した。それから所望の酵素（０．６ｇ  Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＣＵ；Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）及び１，３−プロパンジオール生成に特定の必要条件（３０ｍｇスペクチノマイシン及び１ｍｇビタミンＢ１２）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成を測定することにより、顆粒でんぷんの生物変換を観測した。この実験で、６時間で、１２．８６ｇ／Ｌのグルコースが蓄積した。２ｇ／Ｌ時間速度での顆粒でんぷんからグルコースへの変換が３５℃、ｐＨ６．７での顆粒でんぷんから１，３−プロパンジオールへの生物変換に関して示された（データは示していない）。
【０１９４】
第２の実験で、所望の発酵条件、ｐＨ６．７及び温度３４℃でＲＳＨグルコアミラーゼ活性を有する酵素を用いて顆粒でんぷんからの１，３−プロパンジオール形成を観測するために１Ｌ生物反応器を用いた。この実験で、ＴＭ２発酵培地中のスラリー形態中の顆粒でんぷん（最高最終濃度が４０ｇ／Ｌグルコース）を上述のように殺菌及び低温殺菌した。この混合物を前もって殺菌したＩＬ生物反応器に加えた。スラリー／培養液のｐＨを６．７に調節し、ＮＨ４ＯＨを用いて６．６５に制御した。混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃、３０分で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した。それから所望の酵素（０．６ｇ  Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＣＵ；Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）及び１，３−プロパンジオール生成に特定の必要条件（３０ｍｇスペクチノマイシン及び１ｍｇビタミンＢ１２）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。凍結ガラス瓶から採取した１，３−プロパンジオール生成大腸菌株ＦＭＰ’ｍｌ（１．５ｇａｐ）／ｐＳＹＣＯ１０６の接種材料をｓｏｙｔｏｎｅ−酵母抽出物グルコース培地中で調製した。接種材料が、５５０ｎｍで測定してＯＤ１．１に成長した後、細胞を遠心分離し、細胞ペレットを生物反応器に移した。
【０１９５】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及びグリセロール（１，３−プロパンジオール経路中間体）及び続いて１，３−プロパンジオールへの変換を測定することにより顆粒でんぷんの発酵生物変換を観測した。５時間で、グリセロール及び１，３−プロパンジオールの蓄積量はそれぞれ２．５７及び０．５９ｇ／Ｌに達した（図１３）。
【０１９６】
これらの実験は、３４℃及びｐＨ６．７で顆粒でんぷんから１，３−プロパンジオールへの発酵生物変換に関して、０．６３ｇ／Ｌ−時間速度で顆粒でんぷんからグリセロール及び１，３−プロパンジオールへの優れた変換を示した。
【０１９７】
実施例１５
でんぷんからグリセロールへの発酵生物変換
この実験は、ｐＨ６．７及び温度３４℃の望ましい発酵条件でグルコアミラーゼ活性を有する酵素を使った顆粒でんぷんからの１，３−プロパンジオール形成を観測するために１Ｌ生物反応器中で行った。
【０１９８】
この実験で、０．５×ＴＭ２発酵培地中のスラリー形態中（最高最終濃度が８０ｇ／Ｌグルコース）の顆粒でんぷん（Ｃｅｒｅｓｔａｒ）を上述の通り低温殺菌した（すなわち、混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃、３０分で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した）。この混合物を前もって殺菌した１Ｌ生物反応器に加えた。スラリー／培養液のｐＨは６．７に調節し、ＮＨ４ＯＨで６．６５に制御した。そして、所望の酵素（でんぷん加水分解活性［すなわち、ＲＳＨ活性］を示すフミコーラｇｒｉｓｅａの培養物から得られた発酵槽上澄みの３０ｍｌのＵｌｔｒａＦｉｌｔｅｒ濃縮体、及びαアミラーゼ活性を有する０．４ｍｌのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ液濃縮体［ジェネンコー］）及び３０ｍｇスペクチノマイシンを０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。グリセロール生成大腸菌株ＴＴａｌｄＡＢｍｌ／ｐ１０９Ｆ１の接種材料をｓｏｙｔｏｎｅ酵母抽出グルコース培地（Ｄｉｆｃｏ）中で調製した。接種材料が、５５０ｎｍで測定してＯＤ０．６に成長した後、２つの６００ｍｌフラスコを遠心分離し、７０ｍｌ上澄み中で再懸濁し、細胞ペレット（７０ｍｌのＯＤ３．１物質）を生物反応器に移した。
【０１９９】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及びグリセロールへの変換を測定することにより顆粒でんぷんの発酵生物変換を観測した。９時間で、グリセロールの蓄積量は１４．９３ｇ／Ｌに達した（図１４）。１．６０ｇ／Ｌ−時間速度で顆粒でんぷんからグリセロールへの変換は３４℃及びｐＨ６．７で顆粒でんぷんからグリセロールへの発酵生物変換に関して示された。
【０２００】
実施例１６
でんぷんから２，５−ＤＫＧへの変換
この実験は、コーンスターチ及びＲＳＨグルコアミラーゼを用いる発酵生物プロセスを示し、パントエアｃｉｔｒｅａとして知られる微生物を用いて、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸、ビタミンＣの前駆体分子などの最高生成速度を満足させるグルコース放出速度を維持するためのものである。
【０２０１】
Ｃｅｒｅｓｔａｒ生コーンスターチ及びＭ１Ｂｉｏｃｏｎ（インド）グルコアミラーゼ（１７８６Ｇａｕ／ｇ）をこの研究で用いた。パントエアｃｉｔｒｅａ（グルコース由来の２，５−ジケト  Ｌ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）及び２−ケト  Ｌ−グルコン酸２−ＫＬＧなどの酸化糖ケト酸生成物の生成に必要なペリプラスム酸化デヒドロゲナーゼを含むグラム陰性細菌種）をこの実施例で用いた。
【０２０２】
マーフィーＩＩＩ培地を細胞を成長させるために一晩中用いた。修飾マーフィーＩＩＩ培地（以下の式を参照）をでんぷんからグルコース、２，５−ＤＫＧへの変換のために用いた。振とうフラスコ及び回転式振とう培養器をこれらの実験で用いた。生成物分析をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒ’ｓ）を用いて行い、グルコースをＭｏｎａｒｃｈロボットシステム（すなわち、自動化分析作業で当業界に公知の機器）を用いて酵素的に分析した。
【０２０３】
パントエアｃｉｔｒｅａを一晩中、１００ｍｌのマーフィーＩＩＩ培地中［２８℃及び２５０ｒｐｍ］で接種した。４０ｍｌの脱イオン水（ＤＩ）及び１ｇの生コーンスターチ（２０ｇ／ｌ最終濃度）を含む５つのフラスコを上述の通り低温殺菌した（すなわち、混合物をでんぷんスラリー中に存在する汚染物質の発芽のために３４℃、３０分で保ち、それから６５℃、１４時間で低温殺菌した）。
【０２０４】
修飾マーフィーＩＩＩ培地はさらに細胞成長及び生成物生成を調製するための培地を提供するために使用した。ろ過殺菌した１０×培地は、（リットル当たり）ＫＨ２ＰＯ４  ２４ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４  ８ｇ；ＭｇＳＯ４  ０．１６ｇ；ＭＳＧ  １．５ｇ；（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ；ニコチン酸；Ｐｈｏ塩（ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＮａＣｌ）；ＦｅＣｌ３；パントテン酸塩及びテトラサイクリン  ２０ｍｇ／ｌからなる。培地のｐＨはリン酸カリウムを用いて５．８に調節した。それから、５ｍｌのこの培地を無菌ででんぷん及び水の混合物を含む振とうフラスコに加えた。別のフラスコには、１ｇのグルコース及び５ｍｌの修飾マーフィーＩＩＩ培地を含む４０ｍｌの水を無菌で加えた。それから、一晩中で５５０ｎｍでＯＤが２１．５まで成長した５ｍｌの細胞培養物を５つのフラスコに加えた。フラスコ−１（ＧＣＭＫ１）は従って、修飾マーフィーＩＩＩ培地中に２０ｇ／ｌグルコース及び５ｍｌのパントエアｃｉｔｒｅａ細胞培養物を含んだ。フラスコ−２（ＧＣＭＫ２）は１ｇのでんぷん、５ｍｌの細胞培養物及を含み、反応は１０単位のＢｉｏｃｏｎグルコアミラーゼを添加して開始させた。フラスコ−３（ＧＣＭＫ３）は、３単位のグルコアミラーゼも含む以外はフラスコ−２と同じである。フラスコ−４（ＧＣＭＫ４）は１単位のグルコアミラーゼを添加した。フラスコ−５（ＧＣＭＫ５）は対照であり、グルコアミラーゼを含まない。フラスコ−６（ＧＣＭＫ６）はもう一つの対照であり、１単位のグルコアミラーゼを含むが、細胞を含まない。培養中、３つの時点において（０．３時間、３時間及び７時間）、１．５ｍｌサンプルを各フラスコから回収し、遠心分離した。上澄みをそれからろ過し、生成物分析、ｐＨ及びグルコース測定に関して処理した。結果を図１５に示す。
【０２０５】
結果はコーンスターチが、パントエアｃｉｔｒｅａ細胞及びグルコアミラーゼを用いた２，５−ＤＫＧの発酵制御及び生成において適した炭素源であることを示した。１単位のグルコアミラーゼを含むフラスコ４及び６は５．６ｇ／ｌの類似のグルコースレベルを有した。このグルコースレベルは２０ｇ／ｌ／ｈｒ変換速度に変わる。従って、１０単位のグルコアミラーゼを含むフラスコ−２は１５ｇ／ｌのグルコースを０．３時間内に有した。（グルコースを加えた）フラスコ−１の結果はフラスコ−２で得られたものと似ていた。フラスコ−３中のグルコース生成速度はフラスコ２及び４と非常に相関していた。予想通り、フラスコ−５はグルコースを含まなかった。
【０２０６】
３時間の時点で、フラスコ１〜４のグルコースレベルは１ｇ／ｌ以下に落ち込み、酸化生成物であるグルコン酸、２ＫＤＧ及び２，５−ＤＫＧに変換された。興味深いことに、フラスコ２、３及び４はグルコースの放出が制御され、より優れた最終生成物形成を示し、一方、フラスコ１は過剰グルコース生成し、低レベルの最終生成物形成を示したが依然として高い生成物中間体濃度を有していた。対照フラスコ５及び６は予想通りの挙動を示した。
【０２０７】
７時間のサンプル点では、各フラスコ１〜４は予想された生成物レベルを生じた。さらに、フラスコ１〜４のｐＨは落ち込み、当該傾向は生成物（糖酸）形成に基づき予想された通りであった。
【０２０８】
実施例１７
セルロース誘導体バイオマスからグルコン酸への生物変換
この実施例で示すように、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）（ＦＭＣコーポレーション）及びコーンストーバーなどのバイオマス由来セルロースは生物触媒系を用いて所望の最終生成物に変換できる。バイオマスを変換するこの方法は、バイオマスからグルコースへの変換時にセルロース分解性酵素の生成物抑制を克服するものである。この方法はセルロース分解性最終生成物を同時に所望の最終生成物に変換し、セルロース分解性酵素の抑制が最小限になるようにする。グルコース、キシロース及びセロビオースなどのセルロース誘導体最終生成物が生成されるが、同時に同じ速度で最終生成物に変換され、それによりこれらのセルロース分解性酵素に対して抑制性もある最終生成物の蓄積を最小限にすることを可能にする。従って、本方法は所望の最終生成物の改善された生産性及び収率を提供する。
【０２０９】
これらの実験では、セルロース（ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）；３０ｇ１０ｗｔ％）及びコーンストーバー（３０ｇ、１０ｗｔ％）を、４５℃で、ｐＨ、攪拌、温度、泡及び酸素制御を備えた１リットルの生物反応器中の２７０ｇの５０ｍＭクエン酸バッファー中で別々の実験で試験した。セルロースからグルコースへの変換は１０ｍｌのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ（ジェネンコー）を添加することにより（セルロース１ｇ当たり３０ｍｇｓの全タンパク質で投与）開始させ、加水分解の程度を反応の経過時間にわたって測定した。次の実験では、１．５ｍｌのＯＸＹＧＯ（登録商標）グルコースオキシダーゼ（ジェネンコー）及び２ｍｌＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）カタラーゼ（ジェネンコー）を１０ｍｌのＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ（ジェネンコー）と一緒に混合し、セルロース及びコーンストーバーに加えた。これらの酵素は、対照実験でのセルロースからのグルコース生成速度と比較して、改善速度でセルロース及びコーンストーバーをグルコン酸に変換した。これにより、基本的に非現存レベルを維持するために反応中の一定状態のグルコース濃度を可能にした。グルコン酸濃度はＨＰＬＣを用いて測定し、加水分解の程度は背景を計算した。３０ｇ／ｌグルコースがＡＶＩＣＥＬ（登録商標）から作られた同じ時間帯で、対照実験において（図１６Ａ及び図１６Ｂを参照）、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）由来の５０ｇ／ｌ以上のグルコン酸がＯＸＹＧＯ（登録商標）、ＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）の酵素ブレンドを用いて作られるという結果が達成された。４８時間の時間枠で、６０ｗｔ％技術グレードＡＶＩＣＥＬ（登録商標）（Ｌａｔｔｉｃｅ  ２０）はグルコン酸に変換された（図１６Ｂ）。セルロース誘導体最終生成物濃度を最小で維持することにより、反応経過時間中セルロース加水分解酵素を安定に維持することが可能であることが観測された。
【０２１０】
実施例１８
バイオマスから１，３−プロパンジオールへの発酵生物変換
この実験はバイオマスから１，３−プロパンジオールを生成するために生物変換を使用する適性を決定するためのものである。これらの実験は、ｐＨ６．７、３４℃の望ましい発酵条件でセルラーゼ活性を有する酵素を用いてセルロース（技術グレード、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｌａｔｔｉｃｅ２０）からのグルコースの形成を観測するために、２Ｌトリバッフル（ｔｒｉ−ｂａｆｆｌｅｄ）エレンマイヤーフラスコ中で行った。
【０２１１】
この実験は、スラリー形態中のセルロース（最高最終濃度１００ｇ／Ｌグルコース）を２Ｌフラスコに加え（例えば、２０％セルロースを含む２００ｍＬスラリー）、２００ｍＬのＴＭ２培地と混合した（１００ｇ／Ｌグルコース同等物を得た）。スラリー／培養液のｐＨはＮＨ４ＯＨを用いて６．７に調節した。混合物を１２１℃、３０分で殺菌した。それから、所望の酵素（１３ｍｌ  ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ；ジェネンコー）及び１，３−プロパンジオール生成に特異な必要条件（２０ｍｇスペクチノマイシン及び１ｍｇビタミンＢ１２）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成を測定することにより、バイオマス（セルロース）の分解を観測した。９８．７時間で、１２．１９ｇ／Ｌのグルコースの蓄積が測定された。０．１２ｇ／Ｌ−時間速度でバイオマスからグルコースへの変換は３４℃及びｐＨ６．７でバイオマスから１，３−プロパンジオールへの生物変換に関して示された（データは示していない）。
【０２１２】
続いて、実験はｐＨ６．７及び温度３４℃の望ましい発酵条件でセルラーゼ活性を有する酵素を用いてセルロース（技術グレード、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標））からのグルコースの形成を観測するために、１Ｌ生物反応器中で行った。この実験で、ＴＭ２発酵培地中のスラリー形態中のバイオマス（セルロース）（最高最終濃度１００ｇ／Ｌグルコース）を１Ｌ生物反応器中で殺菌した。スラリー／培養液のｐＨは６．７に調節し、ＮＨ４ＯＨを用いて６．６５に調節した。混合物を１２１℃、３０分で殺菌した。それから、所望の酵素（２２ｍｌ  ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ；ジェネンコー）及び１，３−プロパンジオール生成に特異な必要条件（３０ｍｇスペクチノマイシン及び１ｍｇビタミンＢ１２）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。凍結ガラス瓶から採取した１，３−プロパンジール生成大腸菌株ＴＴａｌｄＡＢｍｌ／ｐ１０９ｆ１  ＷＳ＃２の接種材料をｓｏｙｔｏｎｅ−酵母抽出グルコース培地（Ｄｉｆｃｏ）中で調製した。接種材料が５５０ｎｍで測定してＯＤ１．２まで成長した後、６０ｍｌの培養液を生物反応液に移した。
【０２１３】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及びグリセロール（１，３−プロパンジオール経路中間体）及びそれから１，３−プロパンジオールへの変換を測定することにより、バイオマスから１，３−プロパンジオールへの発酵生物変換を観測した。２４．４時間で、グリセロール及び１，３−プロパンジオールがそれぞれ１．０２及び４．７３ｇ／Ｌ蓄積した（図１７を参照）。
【０２１４】
０．２４ｇ／Ｌ−時間速度でバイオマスからグリセロール及び１，３−プロパンジオールへの変換は、３４℃及びｐＨ６．７でバイオマスから１，３−プロパンジオールへの発酵生物変換に関して示された。
【０２１５】
実施例１９
バイオマスから乳酸への発酵生物変換
この実験は、ｐＨ６．４及び温度３４℃の望ましい発酵条件でセルラーゼ活性を有する酵素を用いてセルロース（技術グレード、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｌａｔｔｉｃｅ２０）からのグルコースの形成、及び続いての乳酸生成株乳酸菌ｃａｓｅｉを用いた乳酸への変換を観測するために、１Ｌ生物反応器中で行った。
【０２１６】
この実験は、修飾乳酸菌ＭＲＳ培地中のスラリー形態中のバイオマス（セルロース）（最高最終濃度１００ｇ／Ｌグルコース）を１Ｌ生物反応器中で殺菌した。スラリー／培養液のｐＨは６．４に調節し、及び２８％のＮＨ４ＯＨを用いて６．４に制御した。混合物を１２１℃、３０分で殺菌した。操作温度である３４℃に冷却した後、所望の酵素（２２ｍｌ  ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ；ジェネンコー）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。凍結ガラス瓶から採取した乳酸生成株乳酸菌ｃａｓｅｉ（ＡＴＣＣ３９３）の接種材料を乳酸菌ＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ）中で調製した。接種材料が５５０ｎｍで測定してＯＤ２．７まで成長した後、０．６ｓｌｐｍで窒素を散布しながら３４℃、１Ｌの生物反応器中で、反応器（６００ｍｌ）の内容物を遠心分離し、ＳＤＣ生物反応器の接種材料として細胞ペレット（４６ｍｌのＯＤ２４．２物質）を移すために５０ｍｌの上澄み中で再懸濁させた。
【０２１７】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及び乳酸への変換を測定することにより、バイオマスから乳酸への発酵生物変換を観測した。４８時間で、３．９３ｇ／Ｌの乳酸が蓄積した（図１８）。
【０２１８】
実施例２０
バイオマスから琥珀酸への発酵生物変換
この実験はｐＨ６．７及び温度３４℃の望ましい発酵条件でセルラーゼ活性を有する酵素を用いてセルロース（技術グレード、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｌａｔｔｉｃｅ２０）からのグルコースの形成、及び続いての琥珀酸生成株、３６  １．６ｐｐｃ（大腸菌）を用いた琥珀酸への変換を観測するために、１Ｌ生物反応器中で行った。
【０２１９】
この実験は、ＴＭ２発酵培地中のスラリー形態中のバイオマス（セルロース）（最高最終濃度１００ｇ／Ｌグルコース）を１Ｌ生物反応器中で殺菌した。スラリー／培養液のｐＨは６．７に調節し、及びＮＨ４ＯＨを用いて６．６５に制御した。混合物を１２１℃、３０分で殺菌した。操作温度の３４℃に冷却した後、所望の酵素（２２ｍｌ  ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ；ジェネンコー）を０．２ミクロンろ過溶液としてＤＩ水に加えた。凍結ガラス瓶から採取した琥珀酸生成株３６  １．６ｐｐｃ大腸菌の接種材料をＴＭ２＋１０ｇ／Ｌグルコース培地中で調製した。接種材料が５５０ｎｍで測定してＯＤ０．８５まで成長した後、６００ｍｌフラスコの内容物を遠心分離し、細胞ペレット（６０ｍｌのＯＤ９．３物質）を生物反応器に移すために６０ｍｌの上澄み中で再懸濁させた。操作の継続時間中、窒素を０．６ｓｌｐｍで窒素を散布した。
【０２２０】
反応中、サンプルを容器から採取し、遠心分離し、上澄みは酵素作用を停止させるために冷蔵した。上澄みをそれからＨＰＬＣ分析にかけた。この実験はグルコース形成及び琥珀酸への変換を測定することにより、バイオマスから琥珀酸への発酵生物変換を観測した（図１９を参照）。４８時間で、琥珀酸は２．７３ｇ／Ｌ蓄積した。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】バッチ生物反応器中の酵素ＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）によるグルコースからグルコン酸への生物変換を示すグラフである。
【図２】バッチ生物反応器中のＣＵ  ＣＯＮＣ  ＲＳＨグルコアミラーゼ（Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｊａｐａｎ）による生コーンスターチからＤ−グルコースへの生物変換を示すグラフである。
【図３】バッチ生物反応器中のＣＵ  ＣＯＮＣ、ＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素の存在下、生コーンスターチからＤ−グルコン酸への生物変換を示すグラフである。
【図４】バッチ生物反応器中の修正条件下、ＣＵ  ＣＯＮＣ、ＯＸＹＧＯ（登録商標）、ＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）酵素の存在下、でんぷんからグルコン酸への生物変換を示すグラフである。
【図５】バッチ生物反応器中のＯＰＴＩＭＡＸ（登録商標）４０６０によるマルトデキストリンからグルコースへの生物変換を示すグラフである。
【図６】グルコースからグルコン酸への最も効果的な生物変換のための適当な酵素濃度を決定するための酵素量分析の結果を示すグラフである。
【図７】修正酵素量下でのマルトデキストリンからグルコン酸への生物変換を示すグラフである。
【図８】マルトデキストリンからグルコン酸への全体的な変換を改善するための酵素量の最適化を示すグラフである。
【図９】でんぷんから２，５−ジケトグルコン酸（ＤＫＧ）の生物変換を示すグラフである。
【図１０】顆粒でんぷんからグルコース及び乳酸への生物変換を示すグラフである。
【図１１】顆粒でんぷんからグルコースの生物触媒変換及びその琥珀酸への変換を示すグラフである。
【図１２】顆粒でんぷんからグルコースの生物変換及びそのグリセロールへの変換及びその後の１，３−プロパンジオールへの変換を示すグラフである。
【図１３】顆粒でんぷんからグルコース構造への生物変換及びそのグリセロールへの変換及びその後の１，３−プロパンジオールへの変換を示すグラフである。
【図１４】顆粒でんぷんからグリセロールへの生物変換を示すグラフである。
【図１５】コーンスターチからグルコースへの生物変換、及びその２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸への変換を示すグラフである。
【図１６Ａ】ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）酵素によりセルロース（ＡＶＩＣＥＬ（登録商標））からグルコースの生物変換を示すグラフである。
【図１６Ｂ】ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）（“ＳＰＥ”）、ＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素によりセルロース（ＡＶＩＣＥＬ（登録商標））からグルコン酸への生物触媒変換を示すグラフである。
【図１６Ｃ】ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）（“ＳＰＥ”）、ＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素によりコーンストーバー（トウモロコシ伐採残）からグルコン酸への生物触媒変換を示すグラフである。
【図１６Ｄ】ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）（“ＳＰＥ”）、ＯＸＹＧＯ（登録商標）及びＦＥＲＭＣＯＬＡＳＥ（登録商標）酵素によりセルロースからグルコン酸への生物触媒変換を示すグラフである。
【図１７】セルロースからグリセロール及び１，３−プロパンジオールへの生物変換を示すグラフである。
【図１８】セルロースから乳酸への生物変換を示すグラフである。
【図１９】セルロースから琥珀酸への生物変換を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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