(57)【要約】本発明は、患者の生体液中のサバイビンの存在を検出することを含む、癌の診断および再発癌の予測のための方法を包含する。本発明は、またサバイビンポリペプチドまたはサバイビン核酸を検出する１つまたは複数の試薬と、検査のために生体液を採集するための容器とを備えるキットをも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サバイビンの有無について患者からの生体液試料をアッセイすることを含む、患者における癌の再発を予測する方法であって、前記患者が癌の治療によって寛解期にあって、前記試料中のサバイビンの存在が前記患者に癌が再発することを示す、方法。
【請求項２】
前記患者が１カ月未満前に前記癌の治療を完了した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌の治療が、化学療法、放射線療法、免疫療法、免疫毒素療法および外科療法からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌の治療が、ＢＣＧを膀胱内に投与することを含む免疫療法である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記癌の治療が、マイトマイシンＣを膀胱内に投与することを含む化学療法である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生体液が尿または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記癌が泌尿生殖器に浸潤する任意の癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記泌尿生殖器癌が膀胱癌または前立腺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記膀胱癌が移行上皮癌である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サバイビンが、サバイビンと結合する抗体、サバイビン結合パートナー、およびサバイビンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸からなる群から選択される試薬を用いて検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬が標識でタグ付けされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、または化学発光タグである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サバイビンがイムノアッセイにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記イムノアッセイが酵素免疫吸着測定法またはラジオイムノアッセイである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記イムノアッセイが、イムノブロット法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、または免疫沈降法を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
サバイビンがドットブロット法により検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ドットブロット法がＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦモジュールを使用することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
サバイビンが核酸ハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸ハイブリダイゼーションがＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者から生体液を採集するための容器と、前記生体液中のサバイビンの存在を検出する試薬とを備える、癌の再発を予測するためのキットであって、前記患者が癌の治療によって寛解期にある、キット。
【請求項２１】
前記試薬がサバイビンと結合する抗体、サバイビン結合パートナー、およびサバイビンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸からなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記試薬が標識でタグ付けされている、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記標識が、放射性標識、蛍光標識、酵素、または化学発光タグである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記試薬が水性媒体中に、または凍結乾燥の形態でパッケージされている、請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
サバイビンの存在を分析するための手段をさらに備える、請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
前記癌が膀胱癌または前立腺癌である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２７】
前記生体液が尿または血清である、請求項２０に記載のキット。
【請求項２８】
患者からの生体液試料中のサバイビンの量を定量することを含む、患者における再発癌のステージまたはグレードを決定する方法であって、前記患者が癌の治療によって寛解期にある、方法。
【請求項２９】
前記癌のグレードを決定するために前記試料中のサバイビンの量と対照試料中のサバイビンの量とを比較することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＩＳステージの癌を有する患者からの生体液試料中のサバイビンの量が、非浸潤癌ステージの癌を有する患者からの生体液試料中のサバイビンの量よりも多い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
癌のグレードを決定するために患者からの生体液試料中のサバイビンの量を定量することを含む、患者における再発癌をモニタリングする方法。
【請求項３２】
ＣＩＳステージの癌を有する患者からの生体液試料中のサバイビンの量が、非浸潤癌ステージの癌を有する患者からの生体液試料中のサバイビンの量よりも多い、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体液が前立腺液、精液、全血、血清、尿、乳房生検液、胃腸液および膣液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌がサバイビンを発現する任意の癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記癌が、神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、泌尿生殖器癌、前立腺癌、腎臓癌および膀胱癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が前記患者において１年以内に再発する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]本出願は、２００３年６月１８日に出願した米国出願第１０／４６３８６７号の優先権を主張する。本出願は、２００２年１月１１日に出願した米国出願第１０／０４２３０２号および２００１年１月１２日に出願した米国仮出願第６０／２６０８９８号に関連し、これら出願の両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
[0002]本出願は、またその全体が参照により本明細書に組み込まれている１９９７年１１月２０日に出願した米国出願第０８／９７５０８０号、現在の米国特許第６２４５５２３号にも関連する。
【技術分野】
【０００３】
[0003]本発明は、患者の生体液中のサバイビンの存在を検出することを含む、癌を診断およびモニタリングし、癌の再発を予測する方法に関する。特に、本方法は、患者の尿試料中のサバイビンの存在を検出することを含む、膀胱癌の診断に関する。さらに、本発明は、患者の生体液中のサバイビンを検出する試薬と生体液を採集するための容器とを含む、癌を診断するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]癌は、周囲の組織に浸潤する傾向があり新しい身体部位に転移する悪性新生物を指す。癌は、除去を試みた後も再発するおそれがあり、適切に治療を行った場合を除き、患者の死亡を引き起こすおそれがある。癌の正確な原因は未知であるが、喫煙または発癌物質への曝露のようなある種の行動とある種の癌および腫瘍の罹患率との関連が、多くの研究者によって明らかにされている。
【０００５】
[0005]原発部位から遠隔器官への癌の蔓延、すなわち転移は、依然として大部分の癌患者の主な死亡原因である。長年の研究にもかかわらず、その過程に関与する遺伝メカニズムの大部分は、依然と特定されていない。この疾患の進行が不確定であることを考慮すれば、そのような情報は癌の予後に特に重要である。現行の腫瘍グレーディング法を用いて癌の予後を常に正確に評価できるわけではないことから、癌患者の治療の成功を阻む最大の障害の１つは、相変わらず、信頼できる予後マーカーの欠如である。
【０００６】
（膀胱癌）
[0006]膀胱癌は、通常膀胱の内表面を覆う尿路上皮細胞（移行細胞）から生じる悪性腫瘍増殖である。米国において膀胱の尿路上皮癌、すなわち膀胱癌は、男性で４番目に多く、女性で８番目に多い癌であり、毎年５４０００例を超える新しい症例と１１２００例の死亡の原因となっている。膀胱癌の再発は最大８０％の患者で起こり、そのような再発は筋肉への浸潤および播種性疾患を伴うことが多く、寛解の長期継続への手強い障害となっている（Ｄａｗｓｏｎら、ＡＢＣ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ：Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ−ＩＩ：Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｔｕｍｏｒｓ．ＢＭＪ、１９９６、３１２：１０９０〜９４）。
【０００７】
[0007]膀胱癌の発現には多数のファクターが寄与している可能性がある。喫煙および芳香族アミン（β−ナフチルアミン、キセニルアミン、４−ニトロビフェニル、ベンジジン）と呼ばれるある種類の有機化学物質への職業曝露は、十分に確立したリスクファクターである。高用量の人工甘味料サッカリンと膀胱移行上皮癌との間に関連がありうることを示唆する研究もある。子宮頸癌の治療のために放射線療法を受けた女性では膀胱移行上皮癌を発生するリスクが増加していると示した研究もある。さらに、化学療法薬であるシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ）を投与された者は、高い膀胱癌発現リスクを示した。
【０００８】
[0008]膀胱癌で最もよくみられる臨床症状は、血尿である。しかし、血尿が間欠性であるためか、または尿路感染もしくは抗凝固剤の使用のような他の原因によるものとされるため、膀胱癌の診断が遅れることが多い。排尿中の移行細胞の細胞診が膀胱癌を診断するために従来から使用されている。尿細胞診が陽性であれば、尿路上皮の移行上皮癌がほぼ確実に存在する。しかし、移行細胞の細胞学的観察では、膀胱癌を有する患者の最大半数は陰性のおそれがある。したがって、細胞学的結果が陰性であっても膀胱癌の存在は排除されない（Ｂａｄａｌａｍｅｎｔら、Ｃａｎｃｅｒ、１９８７、５９（１２）：  ２０７８；Ｃｏｈｅｎら、Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、１９９２、１９（３）：４２１）。
【０００９】
[0009]さらなる診断の煩雑さとして、一旦膀胱癌の最初の診断がされれば移行上皮癌について尿路全体を評価しなければならない。それは、移行細胞が腎臓レベルに始まり、腎盂、尿管、膀胱および尿道の大部分を含む尿路の内表面を覆っているからである。腎臓の腎盂および尿管は経静脈性腎盂造影（ＩＶＰ）または逆行性腎盂造影で最もうまく評価される。ＩＶＰは、造影剤の静脈内注射を必要とし、その造影剤はその後腎臓によってろ過されて血液から尿に入る。この過程で撮影された単純Ｘ線像は尿路を示す。通常、逆行性腎盂造影は経静脈造影剤にアレルギーを有するか、またはＩＶＰでの造影が悪い患者のために確保されている。逆行性腎盂造影は膀胱鏡検査の時点で実施される。
【００１０】
[0010]膀胱内部を調べるためにライト付き器具の使用を必要とする膀胱鏡検査は、膀胱癌と確実に診断するために利用される苦痛のある処置である。膀胱鏡による逆行性腎盂造影の実施にあたっては、尿管に小さなプラスチック製チューブを挿入し、造影剤を尿管および腎臓に注入する。膀胱鏡検査は、超音波、コンピューター断層撮影法、または磁気共鳴画像法のような他の診断モダリティによって見落とされるおそれのある小さな微妙な異常を同定できる。このように、診察室で行う膀胱鏡検査は初期評価に欠かせない部分であり、この時点で他の検査に置き換えることはできない。今日、診療室で行う大部分の膀胱鏡検査は軟性鏡で実施される。硬性膀胱鏡検査に比べて、軟性内視鏡検査の方は苦痛が少なく、医師は肥大した前立腺の湾曲部周囲を観察することができる。
【００１１】
[0011]膀胱癌を診断するために生検も実施できる。生検は、診断を確認または確立するか、予後を予測するか、または疾患の経過を追うために、膀胱のような器官から生組織の小さな試料を切り取り、顕微鏡で観察するものである。しかし、生検は侵襲性の処置であるため望ましくなく、また時々人体に麻酔を施す必要がある。また、任意の侵襲性処置と同様に、生検を受ける個体は感染のリスクを冒す。さらに、膀胱癌が存在するかどうかを決定するために膀胱全体を生検することはできない。
【００１２】
（膀胱癌のステージング）
[0012]膀胱癌は、その侵攻性および周囲の膀胱組織とどの程度異なるか（分化）に基づいて分類される。医師は膀胱癌を診断するときに膀胱癌のステージングおよびグレーディングを行う。
【００１３】
[0013]腫瘍のステージングにはいくつかの異なる方法がある。膀胱癌のための最も一般に使用される２つのステージング方式は、ＡＢＣＤ方式（Ｊｅｗｅｔｔ−Ｓｔｒｏｎｇ−Ｍａｒｓｈａｌｌ方式）およびＴＮＭ方式である。ＡＢＣＤ方式は、より古く、膀胱癌の別個の相または期を分類するためにＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ分類を使用している。この方式は、以下の尺度を基本的に使用している。０：上皮内癌（腫瘍は膀胱粘膜（内表面）に限定される）、Ａ：腫瘍は粘膜を通過して伸展しているが粘膜下組織を超えては伸展していない、Ｂ：腫瘍は筋肉に浸潤している、Ｃ：腫瘍は脂肪内に浸潤している、Ｄ：癌は所属リンパ節または遠隔部位に蔓延している。各アルファベットの後に、例えばＡ１、Ｂ２などのように数字が続く。ＴＮＭ方式では、膀胱をＴ、リンパ節をＮ、遠隔への蔓延をＭで記述する。各アルファベットの後に記述数字、Ｔ２ａＮ０Ｍ０が続く。例えば、Ｔａは非浸潤性乳頭状癌を、Ｔｉｓは上皮内癌を、Ｔ１は上皮下結合組織に浸潤している腫瘍を表す。
【００１４】
[0014]膀胱癌は、前立腺、子宮、膣、尿管および直腸を含む近隣の器官に伸展することによって残りの身体に蔓延する。転移は骨盤リンパ節を介して起こり、次に腫瘍は肝臓、肺および骨に蔓延する。
【００１５】
（膀胱癌のグレーディング）
[0015]膀胱癌は、病理学者によって生検からグレーディングされる。癌のグレードは、癌がどれほど速く増殖し、どれほど侵攻性でありうるかに関する情報を提供する。高グレードの癌は、低グレードの癌よりも速く増殖し、早期に蔓延する。現行のグレーディング方式は、３つの異なるグレード、すなわち高分化型、中分化型および低分化型（またはグレードＩ、ＩＩ、もしくはＩＩＩ）のみを使用している。病理学者の中にはＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの４段階のグレーディング方式を使用する者もいる。どちらの方式も許容でき、病理学者はＩＩ／ＩＩＩまたはＩＩ／ＩＶと癌を表すことによって何段階を使用しているかを常に書き留めるものである。分母または２番目の数は、使用した方式を述べている。高分化型の腫瘍は、癌が正常な膀胱組織に類似しており、よって普通は迅速に増殖または蔓延しないことを意味する。低分化型腫瘍は、癌が正常な膀胱に類似しておらず、普通は迅速に増殖して他の組織に早期に蔓延することを意味する。中分化型腫瘍はこれらの中間である。
【００１６】
[0016]グレードは重要であるが、ステージよりも治療法の決定に関係しない。グレードおよびステージが分かった後で、今後の治療について任意の決定を下す前に他の要因も働き始める。
【００１７】
（前立腺癌）
[0017]前立腺癌は、前立腺内の悪性腫瘍増殖である。前立腺癌は、全ての年齢の男性で癌による死亡原因のうち３番目多い原因であり、７５歳を超える男性では癌による死亡の最大の原因である。前立腺癌は、年齢４０歳未満の男性にはまれにしかみられない。
【００１８】
[0018]原因は未知であるが、一部の研究は前立腺癌と食事からの高い脂肪摂取およびテストステロンレベルの増加との間の関係を示した。良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）との関連性は知られていない。
【００１９】
[0019]前立腺癌は、膀胱癌のようにその侵攻性および周囲の前立腺組織と異なる程度に基づいて分類またはステージングされる。大部分の前立腺癌は、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄステージング方式またはＴＮＭ方式を用いてステージングされる。前立腺癌についてＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄ方式は、以下の尺度を用いて腫瘍を基本的に類別する。Ａ：触知可能（感触可能）ではないが生検の顕微鏡観察で検出できる腫瘍、Ｂ：前立腺に限定して触知可能な腫瘍、Ｃ：遠隔転移を有さない、前立腺を超えた腫瘍の伸展、およびＤ：癌が所属リンパ節に蔓延。一方ＴＮＭ方式は、前立腺（Ｔ）、リンパ節（Ｎ）、および転移性疾患（遠隔蔓延）の証拠（Ｍ）を別々に記述する。前立腺癌は、精嚢、膀胱および腹腔に伸展することによって蔓延する。前立腺癌は、一般的にリンパ節、骨、肺、肝臓および腎臓に転移する。
【００２０】
[0020]今日、前立腺癌は、通常ミネソタ大学の病理学者に因んで命名されたグリーソングレード体系を用いて悪性分類される。この体系は、前立腺内での異なるパターンの侵攻性を探し、次に１〜５の２つのスコアを付けることを含む。これら２つのスコアを足して２〜１０の範囲となる総グリーソンスコアを得る。スコアが高いほど腫瘍の侵攻性は大きいであろう。例えば、典型的なグリーソングレーディングされた癌は、グリーソン４＋３＝７、またはグリーソン２＋２＝４のように記載されうる。
【００２１】
（サバイビン）
[0021]アポトーシス（プログラム細胞死）阻害因子の脱調節された発現は、細胞の生存を異常に伸ばし、突然変異の蓄積に有利に働き、治療に対する耐性を促進することによって癌に寄与すると考えられる（Ｒｅｅｄ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９９、１７：  ２９４１〜５３）。最近、サバイビンは癌における細胞の死／生存バランスの新規な調節因子として同定された（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３：  ９１７〜２１）。サバイビンは、アポトーシス阻害因子（ＩＡＰ）遺伝子ファミリーの一員である（Ｄｅｖｅｒａｕｘら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１９９９、１３：２３９〜５２）。
【００２２】
[0022]サバイビンは、１つの部分的に保存されたＢＩＲ（バキュロウイルスＩＡＰリピート）ドメインと、ＲＩＮＧフィンガーの代わりに高度に荷電したカルボキシ末端のコイルドコイル領域とを含む１６．５ｋＤａの細胞質タンパク質であり、Ｂ細胞前駆細胞に形質転換と、増殖因子（ＩＬ−３）の除去によって誘導されるアポトーシスを阻害する（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９７、３：９１７〜９２１）。配列が全般的に保存されていること、カルボキシ末端のＲＩＮＧフィンガーが存在しないこと、および１つの部分的に保存されたＢＩＲドメインが存在することに基づけば、サバイビンはＩＡＰファミリーの最も遠縁の一員であり、ＮＡＩＰ（神経細胞アポトーシス抑制タンパク；Ｒｏｙら、Ｃｅｌｌ，１９９５，８０：１６７〜１７８）と最大の類似性を共有している。さらに、他のＩＡＰタンパク質とは異なり、サバイビンは正常な成体組織で検出できないが、ｉｎ  ｖｉｖｏで肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌および前立腺癌のようなよくみられるヒトの癌（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３：９１７〜２１；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９、２３：３８７〜８８）、ならびに高悪性度非ホジキンリンパ腫の〜５０％において発現する上位から４番目の転写産物となる。尿路上皮癌におけるアポトーシスの脱調節という予想された役割（Ｇａｚｚａｎｉｇａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９６、６９：１００〜０４；Ｌａｒａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．、１９９９、４３：１０１５〜１９）に一致して、サバイビンは膀胱癌の７８％にみられるが、正常尿路上皮にはみられず、その発現は再発の促進と相関した（Ｓｗａｎａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９９、３４１：４５２〜５３）。サバイビンが正常組織ではなく癌に過剰発現すること（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３：９１７〜２１；Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ、１９９９、２３：３８７〜８８）、およびサバイビンが多様な悪性疾患において好ましくない予測／予後の意味をもつことから（Ａｄｉｄａら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８、３５１：８８２〜８３；Ｉｓｌａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００、１９：６１７〜２３；Ｔａｎａｋａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、６：１２７〜３４；Ｍｏｎｚｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９９、１７：２１００〜０４；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、５８：５０７１〜７４）、サバイビンは癌における有用な分子マーカーとなりうる。これは、治療に対する応答をモニタリングし追跡プロトコルを単純化するための簡単で非侵襲的な診断手段が必要に迫られている膀胱癌に特に該当する（Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、１９９８、１６０：６４５〜５９；Ｏｚｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９８、１０：２７３〜７８）。尿細胞診は「ゴールドスタンダード」（Ｂｒｏｗｎ  ＦＭ、Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．、２０００、２７：２５〜３７）とされているものの、膀胱癌では低い感度（３０〜４０％）しか有さず、表在性の低グレードの病変を検出でき���い。したがって、本出願の発明者らは、膀胱癌の診断および膀胱癌の再発の予測のための癌の検出、特に尿サバイビンの検出のための新しい分子マーカーとして体液中サバイビンの潜在的適切性について研究した。
【発明の開示】
【００２３】
[0023]本発明は、患者における癌を診断し癌の再発を予測する方法を提供し、その方法は、サバイビンの有無について患者からの生体液試料をアッセイすることを含む。ここで、試料中にサバイビンが存在することは患者が癌を有することを示す。好ましい実施形態において、生体液は前立腺液、精液、全血、血清、尿、乳房生検液、胃腸液および膣液からなる群から選択され、癌は肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、非ホジキンリンパ腫および神経芽細胞腫からなる群から選択される初発癌または再発癌である。より好ましくは、生体液は尿または血清であり、癌は膀胱癌または前立腺癌である。最も好ましくは、生体液は尿であり、癌は膀胱癌である。
【００２４】
[0024]本発明の一実施形態において、本発明は、癌の治療により寛解期にある患者における癌の再発を予測する方法を提供する。癌の治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、免疫毒素療法および外科療法を含むが、それらに限定されない。好ましくは、治療はＢＣＧを投与することを含む免疫療法またはマイトマイシンＣを投与することを含む化学療法である。より好ましくは、癌は膀胱癌である。
【００２５】
[0025]別の実施形態において、本発明は、１カ月未満前に癌の治療を完了した患者における癌の再発を予測する方法を提供する。さらに、その患者において癌は１年以内に再発するであろう。
【００２６】
[0026]一態様において、本発明は、患者の生体液中のサバイビン量を定量することによって癌のグレードを決定する方法を含み、ここで、高レベルのサバイビンは癌が高グレードであることを示す。さらに、本発明は癌のステージを決定するため本方法の使用を含み、ここで、ＣＩＳステージの癌は非浸潤性乳頭状癌ステージの癌よりも高レベルのサバイビンを有する。
【００２７】
[0027]別の態様において、本発明は、患者における癌をモニタリングする、好ましくは癌の再発をモニタリングする方法を含み、その方法は、患者の生体液中のサバイビン量を定量することを含む。さらに、本発明は、患者の生体液中のサバイビン量を検出または定量することによって患者の予後を決定することを意図している。場合によっては、サバイビンの存在は予後不良を示す。サバイビンの定量は、試料中のサバイビンの相対レベルを測定することを含む。それは、サバイビンの有無の検出をも含む。
【００２８】
[0028]好ましくは、サバイビンは、サバイビンに結合するかまたはサバイビンをコードする核酸にハイブリダイズする試薬を用いて検出される。最も好ましくは、試薬はサバイビンと結合する抗体、サバイビン結合断片、およびサバイビンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸からなる群から選択され、試薬は標識でタグ付けされている。標識は放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、または比色タグでありうる。
【００２９】
[0029]本発明の一態様において、サバイビンはイムノアッセイによって検出される。好ましくは、イムノアッセイは酵素免疫吸着測定法またはラジオイムノアッセイであり、イムノアッセイは免疫ブロット法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、または免役沈降法を含む。より好ましくは、サバイビンはドットブロット法により検出され、最も好ましくはＢｉｏ−Ｄｏｔ法およびＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦモジュールを使用することによって検出される。
【００３０】
[0030]本発明の別の態様において、サバイビンは核酸ハイブリダイゼーションによって検出される。
【００３１】
[0031]好ましい実施形態において、核酸ハイブリダイゼーションはＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット分析である。核酸ハイブリダイゼーションに使用される試薬は、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、または比色タグで標識されている。
【００３２】
[0032]本発明は、患者における癌もしくは再発癌を診断のための、予後のための、またはモニタリングするためのキットをも提供し、そのキットは、患者から生体液を採集するための容器と、生体液中のサバイビンの存在を検出する１つまたは複数の試薬とを備える。キット中の試薬は標識でタグ付けできる。あるいは、試薬をタグ付けするために他の構成要素をキットに含めることができる。本発明は、患者における癌を診断およびモニタリングし、癌の予後を決定するための他の構成要素を備えるキットをも意図している。一実施形態において、キットの構成要素は水性媒体中に、または凍結乾燥の形態でパッケージされる。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．概説
[0038]本発明は、癌、特に膀胱癌を検出するための、または癌の再発を予測するための安全で、信頼でき、非侵襲性のスクリーニング戦略を開発する必要性に基づく。疾患の単一の予測／予後マーカーが依然として同定しにくい（Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１９９８、１６０：６４５〜５９）。癌、特に膀胱移行上皮癌の診断およびスクリーニングのための、および癌の活性をモニタリングし膀胱癌を有する個体の予後を決定するためのマーカーの同定および方法の開発は、癌の治療に有用であろう。
【００３４】
[0039]本発明は、癌を有する患者の尿または他の体液中のアポトーシス阻害因子サバイビンを同定するための、抗体または他のプローブに基づく簡単な検査を提供する。
【００３５】
[0040]本発明は部分的に、新たに診断されたか、または再発性膀胱癌を有する全ての患者の尿中に尿サバイビンがみられるが、正常志願者または他の泌尿器癌を有する患者にはみられず、非腫瘍性泌尿生殖器障害を有する患者ではまれにしかみられないという発見に基づく。本発明はまた部分的に、尿サバイビンについて検査で陽性となった血尿を有する患者３人のうち１人は膀胱癌についての細胞診で陽性となり、もう１人はサバイビン検出から６カ月以内に膀胱癌と診断されたという発見に基づく。さらに本発明は、膀胱癌を治療され膀胱鏡検査上の寛解を達成している患者が尿サバイビン陰性であるという発見に基づく。
【００３６】
[0041]本発明はまた部分的に、膀胱癌および前立腺癌を有する患者の血清からサバイビンが検出されるという発見に基づく。
【００３７】
[0042]さらに本発明は部分的に、サバイビンに対するポリクローナル抗体を利用したドットブロット法を用いて、腫瘍のステージまたはグレードにかかわらず初発または再発の移行上皮癌（ＴＣＣ）を有する被験者の尿からサバイビンタンパク質が検出されたという発見に基づく。サバイビンの検出は、対照に比べて初発または再発ＴＣＣの診断を有する被験者に対して感度１００％および特異性９５％を有した。ＴＣＣを有する被験者からの尿中細胞は、サバイビンｍＲＮＡおよびサバイビンタンパク質を示した。カルメットゲラン菌（ＢＣＧ）またはマイトマイシンＣの膀胱内注入を受けたＴＣＣ被験者における尿サバイビンの存在は、再発と関連する。したがって、体液中のサバイビンの存在は癌の再発の予測に有用である。尿サバイビンの検出は、ＴＣＣの治療転帰を評価するための迅速で非侵襲性の検査を提供する。
【００３８】
ＩＩ．具体的な実施形態
１．移行上皮癌（ＴＣＣ）と治療
[0043]腎盂および尿管のＴＣＣは、尿を採集する腎臓における組織（腎盂）および／または腎臓と膀胱をつなぐ管（尿管）に悪性細胞がみられる疾患である。腎盂および尿管の内側を覆う細胞は移行細胞と呼ばれる。ＴＣＣで侵されるのはこれらの細胞である。
【００３９】
[0044]表在性膀胱癌は、膀胱内表面または粘膜に限られる。浸潤癌は粘膜を通過して筋肉に伸展する癌として定義される。表在性腫瘍は、最初の発現時に大部分のＴＣＣ症例に存在する。
【００４０】
[0045]ＴＣＣは、最も一般的な膀胱癌であり、西半球で診断される膀胱癌の９５％に相当する。膀胱癌の７０〜８０％は尿路上皮に限定される低グレードの非侵攻性腫瘍であるが、被験者の最大７０％に再発が起こる。この高い再発率は適切な追跡診断および治療に課題をつきつける。転移または再発性移行上皮癌を有するどの患者の予後も不良である。再発の妥当な管理は、再発部位、以前の治療の程度、および個別の患者の留意事項に依存する。
【００４１】
[0046]外科療法は腎盂および尿管のＴＣＣで最もよくみられる治療である。腎尿管切除術と呼ばれる手術で腎臓、尿管および膀胱上部が除去されうる。切除によって尿管および腎臓の一部が除去されうる。膀胱内療法が利用できるようになる前は、根治的膀胱全摘術（膀胱全体の摘出）が再発表在性膀胱癌、特に上皮内癌（ＣＩＳ）の治療に最も通常の治療であった。
【００４２】
[0047]腫瘍が腎盂または尿管の表面に存在するならば、電流を用いた電気外科療法で腫瘍を焼いて除去できるし、また強い光のナロービームを用いたレーザー療法でそれを除去できる。
【００４３】
[0048]化学療法を用いてもＴＣＣを治療できる。「化学療法」は、化学物質を用いた疾患の治療を指す。本明細書において使用するように、化学療法は癌を有する個体への抗腫瘍化学物質の適用を指す。薬物が血流に入り、体内を移動して体内くまなく癌細胞を殺滅するため、化学療法は全身治療である。化学療法を尿管または腎盂に直接投入することもできる（尿管内または腎盂内化学療法）。
【００４４】
[0049]膀胱の転移性移行上皮癌または再発性移行上皮癌を有する患者において、併用化学療法は、高い反応率、ときには完全な反応性を実現した（Ｓｔｅｍｂｅｒｇら、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ  ６４：２４４８〜２４５８；Ｈａｒｋｅｒら、１９８５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３：１４６３〜１４７０）。ランダム化治験で、進行膀胱癌の治療へのメトトレキサート、ビンブラスチン、ドキソルビシンおよびシスプラチンの組み合わせ（ＭＶＡＣ）をシスプラチンの単剤と比較した結果は、反応率および生存期間の中央値の両方でＭＶＡＣが有意な利点を示した。この組み合わせ群の治験におけるＭＶＡＣの全体反応率は３９％であった（Ｌｏｅｈｒｅｒら、１９９２、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１０：１０６６〜１０７３）。
【００４５】
[0050]転移性移行上皮癌に活性を示した他の化学療法剤には、パクリタキセル、イホスファミド、硝酸ガリウムおよびゲムシタビンがある（Ｒｏｔｈら、１９９５、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（３）Ｓｕｐｐｌ．６：１〜５；Ｗｉｔｔｅら、１９９７、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １５：５８９〜５９３；Ｅｉｎｈｏｒｎら、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２（１１）：２２７１〜２２７６；Ｐｏｌｌｅｒａら、１９９４、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５（２）：１８２〜１８４、１９９４）。マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））も膀胱癌を治療するために使用されている。他の組み合わせ剤には、パクリタキセルとシスプラチン、ゲムシタビンとシスプラチン、シスプラチンと組み合わせるか、または組み合わせないゲムシタビンとパクリタキセルがある（Ｈ．Ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｍａｓｓｅ、２００２、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２９（１、Ｓｕｐｐｌ．３）：３〜１４）。
【００４６】
[0051]放射線療法もＴＣＣを有する患者を治療するために使用される。放射線療法は、癌細胞を殺滅し腫瘍を萎縮させるために高エネルギーＸ線の使用を伴う。体外の機械（体外光線照射療法）、または癌細胞が見出された領域に細いプラスチックチューブによって放射線を発生する物質（放射性同位体）を置くこと（内部照射療法）によって放射線が発生しうる。体外光線照射療法は、任意の異常細胞を破壊し腫瘍の増殖または再増殖を防止するために、癌が見出された部位の端に高焦点放射線光線を照射するために使用される。近接照射療法は、腫瘍または腫瘍近辺のどちらかに放射線源を配置することを伴う放射線療法の１種である。近接照射療法では、放射線源から放射線が外部に放射され、短距離に限られる。このように、腫瘍に達するために放射線が正常組織を通過する必要のある体外光線照射療法とは異なり、近接照射療法はずっと局所的であるため、正常組織への被曝が少ない一方で、体外光線照射療法に比べて高い線量が可能である。
【００４７】
[0052]一般に、癌患者を放射線のみで治療しうる。例えば、前立腺癌はこのように治療されることが多い。しかし、上部尿路ＴＣＣを有する患者では、放射線療法は大抵患者の治療の単なる一部である。放射線療法および／または化学療法、ならびに外科療法でＴＣＣ患者を治療しうる。実際に、手術前に患者を放射線療法および／または化学療法で治療することが、そうでない場合に必要であろう手術よりも、過激でない手術を患者に施すことを可能にする。例えば膀胱癌患者の中には、単一の治療よりも、放射線療法、化学療法および外科療法で治療される場合、膀胱を保存することができる。
【００４８】
[0053]ＴＣＣの他の治療法には、免疫療法（生物学的療法）および免疫毒素療法がある。免疫療法は、癌と闘うために患者の免疫系を採用する。免疫療法は、疾患に対する患者の自然防御をブースト（ｂｏｏｓｔ）し、方向付けし（ｄｉｒｅｃｔ）、または回復させる（ｒｅｓｔｏｒｅ）ために、患者自身の体によって作られたか、または実験室で作られた物質を使用する。免疫療法に使用される薬物は、体を刺激して癌に生物学的または自然に応答させるため、ときに「生物応答調節剤」（ＢＲＭ）と呼ばれる。免疫療法は局所または全身性でありうるし、標的をもつか、または非特異性でありうる。
【００４９】
[0054]局所免疫療法は体の一部分を治療することを伴う。ＴＣＣを治療するための局所免疫療法の例は、カルメットゲラン菌（ＢＣＧ）の膀胱内注入である。
【００５０】
[0055]全身免疫療法は全身の治療を指す。全身免疫療法は局所免疫療法よりも一般的であり、蔓延した可能性のある癌を治療するために使用できる。非特異的免疫治療手段は、癌細胞と闘うのにより有効となるように一般的に免疫系をブーストするために与えられる治療を指す。標的免疫療法は、癌細胞に狙いを定め、可能ならば正常細胞をそのままに保つ免疫療法を指す。標的免疫療法の例には癌ワクチンおよびモノクローナル抗体があるが、それに限定されない。
【００５１】
[0056]癌ワクチンは研究室で抗体を作りそれを患者に与えるよりも、むしろ患者の体を刺激して患者自身の免疫応答を発生させることを伴う。体内のＴ細胞が癌細胞と反応し、癌細胞を殺滅することが発見された。Ｔ細胞ワクチンの接種は、進行癌の治療に有用でありうる。
【００５２】
[0057]モノクローナル抗体は、癌細胞が体の免疫防御によって殺滅されるように癌細胞をマークするために使われるか、または癌細胞を殺滅する抗癌薬または放射性物質を連結させるために使用される。例えば免疫毒素は、モノクローナル抗体に連結したタンパク質毒素を含むハイブリッド分子である。これを、化学カップリング剤または組換え手段を用いて実施できる。組換えＤＮＡ法の手法を用いて毒素の結合ドメインをモノクローナル抗体のＦｃ部分と交換することによって免疫毒素を製造できる。組換え免疫毒素は化学カップリングによって作製された免疫毒素よりも均質である。
【００５３】
[0058]上に解説したように、ＴＣＣおよび膀胱癌の再発率は高い。したがって、定期的に患者をモニタリングする必要がある。現行のモニタリングは侵襲的な方法である膀胱鏡検査および尿細胞診によって行われる。したがって、膀胱癌の再発を検出するための非侵襲性で高感度の方法を開発する関心が存在する。
【００５４】
[0059]本発明は、寛解期にあるまたは治療を完了した患者における腫瘍の再発を予測、検出およびモニタリングする簡単、非侵襲性および高感度の方法を提供する。好ましくは、本発明は膀胱癌または前立腺癌の再発を予測、検出および／またはモニタリングするために使用される。より好ましくは、本発明はＴＣＣの再発を検出するために使用される。
【００５５】
２．ＢＣＧおよびマイトマイシンを用いた膀胱内治療
[0060]ＢＣＧは、結核に対するワクチンとして使われてきたウシ型結核菌の弱毒株である。ＢＣＧは、１９７６年にはじめて膀胱癌を治療するために使用された。ＢＣＧは宿主防御メカニズムの強力な刺激因子であり、免疫適応能をもつ宿主に腫瘍の退縮を誘導できる。ＢＣＧの反復注入は、膀胱内で非特異的免疫反応を生じ、その反応は内表面の細胞、特に速やかに分裂中の癌細胞を剥落させることができる。ＢＣＧは、普通は手術において表在性膀胱腫瘍が除去された後で与えられる。ＢＣＧは膀胱に留置したカテーテルチューブを介して膀胱内に投与され、一定期間にわたり反復投与される。ＢＣＧは、表在性膀胱癌および上皮内癌（ＣＩＳ）の有効な膀胱内治療として浮上した（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｆｆら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９９、３５３：１６８９）。膀胱癌におけるＢＣＧの効果は単に局所性であり、ＢＣＧと接触しない領域の腫瘍の発現には防止効果がない。
【００５６】
[0061]マイトマイシンＣは、ストレプトミセスケスピトスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）から単離された抗腫瘍抗生物質である。マイトマイシンＣの臨床治験は１９６０年代後半に米国で始まる。Ｉｎ  ｖｉｖｏでマイトマイシンＣは活性化してＤＮＡに結合する二官能性および三官能性アルキル化剤になる。ＤＮＡとマイトマイシンＣとの結合によってＤＮＡが架橋し、ＤＮＡの合成および機能の阻害に至る。膀胱癌の治療に膀胱内投与した場合、マイトマイシンＣは膀胱癌の治療に、特に生存率に関してＢＣＧと同等である。
【００５７】
[0062]本研究において、治療前のサバイビンレベルは、寛解に達した被験者に比べ治療後にＴＣＣが再発した被験者の方が高い。サバイビンレベルは治療中に数倍に増加し、再発する被験者で最高のサバイビンレベルが測定される。治療後のサバイビンの中央値は寛解に達する被験者ではゼロであり、ＴＣＣが再発する被験者では尿１ｍｌ当たりサバイビン約１．０ｎｇである。
【００５８】
[0063]治療完了の１カ月後に尿サバイビンが存在することは、感度約１００％、特異性約７８％でＴＣＣの再発を予測する。１年後ではＴＣＣの再発を予測する特異性は約９２％に増加する。治療後のサバイビンレベルが尿１ｍｌ当たりサバイビン≦０．１ｎｇであった被験者１４人中１２人において約１年間にＴＣＣは再発しなかった。治療完了の１カ月後にサバイビン陽性であるが寛解期の患者４人中３人は、１年以内にＴＣＣが再発した。膀胱内注入の完了後に尿サバイビンを有する被験者は、ＴＣＣが再発する高い可能性を有する。
【００５９】
３．生体液
[0064]本明細書に使用する「患者の生体液」という用語は、生きた生物からの液体を指す。この用語は、生きた生物の体内にみられる「体液」を包含する。
【００６０】
[0065]本発明は、サバイビンの存在についての生体液のスクリーニングに試薬を使用することを含む。これによって患者から回収された生体液のｉｎ  ｖｉｔｒｏ血清学的評価は、癌の非侵襲的診断を可能にする。例えば、前立腺液、精液、全血、血清、尿、乳房生検液、胃腸液および膣液のようなヒト体液を患者から採取し、ラジオイムノアッセイもしくは酵素免疫吸着測定法、競合的酵素免疫吸着測定法、ドットブロット、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、ＰＣＲ、または当技術分野で公知の他のアッセイによってサバイビンを検出できる試薬を用いてサバイビンの存在についてアッセイできる。
【００６１】
[0066]一実施形態において、患者からの血清を採集して膀胱癌または前立腺癌の診断のためにサバイビンの存在を検出する。
【００６２】
[0067]別の実施形態において、患者からの尿試料を採集して膀胱癌の診断のためにサバイビンの存在を検出する。被験尿試料を検査のかなり前に採集して処理まで凍結してもよい。尿試料を分析まで凍結する予定であれば、試料を採集して氷冷することが好ましい。好ましくは、氷冷した試料を約２時間の時間以内に遠心分離して細胞の破片を沈殿させてからろ過し、次にろ液を−２０℃、より好ましくは−８０℃で急速凍結する。分析直前に３７℃の温水浴に入れて凍結試料を迅速に溶かすべきである。新鮮尿試料も、採集して最適な遠心分離およびろ過の直後に使用できる。より好ましくは、−８０℃で凍らせるまで全尿を氷冷する。４℃で解凍後、尿を４℃で遠心分離し、サバイビンについてアッセイする。
【００６３】
４．サバイビンを検出する試薬
[0068]患者の生体液中のサバイビンを検出できる試薬は、サバイビンと、またはサバイビンをコードする核酸と相互作用する試薬である。そのような試薬の例には、サバイビンと結合するサバイビン抗体またはその断片、ｐ３４ｃｄｃ２−サイクリンＢ１キナーゼのようなサバイビン結合パートナー、およびサバイビンをコードする核酸にハイブリダイズする核酸があるが、それに限定されない。
【００６４】
サバイビン抗体
[0069]サバイビン抗体は、当業者によって調製され使用されてきた。Ｌｕら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、５８（９）：１８０８〜１２）は、胃癌の免疫組織化学分析のために、組換え製造されたサバイビン／グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質からのマウスモノクローナルサバイビン抗体の調製について教示している。Ｇｒｏｓｓｍａｎら（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９９、１１３：１０７６〜８１）は、ヒト転移性悪性黒色腫細胞系におけるサバイビンを検出するためのウサギポリクローナル抗体の使用を開示している。（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ９８／２２５８９も参照のこと）。
【００６５】
[0070]当技術分野で周知であり記載されている標準的な免疫学的方法を用いて抗体を作製するために、サバイビンまたはサバイビンペプチドを使用できる（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔ編、Ｍａｒｃｈｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９８４）。簡潔には、例えば宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって生成された、単離したサバイビンまたはサバイビンペプチドが、異種宿主において抗体を作製するために使用される。好ましい抗体は、サバイビンタンパク質のエピトープに特異的に結合する抗体であり、好ましくはそのエピトープに対して約１０５Ｍ−１を超える結合親和性を有し、最も好ましくは約１０７Ｍ−１を超える親和性を有する。例えば、ヒトサバイビンタンパク質に対する抗体が望ましい場合、適当な抗体発生宿主は、マウス、ヤギ、ウサギ、モルモット、または抗体の発生に有用な他の哺乳動物である。サバイビンタンパク質またはペプチドを、宿主における抗体産生を増強できる適当なアジュバントと組み合わせ、例えば腹腔内投与により宿主に注射する。宿主の免疫応答の刺激に適した任意のアジュバントを使用できる。一般に好ましいアジュバントはフロイントの完全アジュバント（例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．、サンディエゴ、またはＧｉｂｃｏ、グランドアイランド、ニューヨーク州からの乾燥死菌細胞を含むエマルション）である。多数回の抗原注射が望ましい場合、その後の注射は不完全アジュバントと組み合わせた抗原（例えば無細胞エマルション）を含む。
【００６６】
[0071]好ましい実施形態において、生体液中のサバイビンの存在を検出する開示された方法は、サバイビンに特異的に結合する抗体を用いて実施される。当技術分野で公知の方法によってサバイビンに特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製できる。抗体には、Ｈｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４６：１２７５〜１２８１；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」Ｂｕｒｄｏｎ．ら編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８５、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダムも参照のこと）の方法により調製された組換えポリクローナルまたはモノクローナルＦａｂ断片がある。
【００６７】
[0072]上述のように、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業者に周知である。簡潔には、ウサギ、マウス、ラット、またはヤギのような宿主哺乳動物に、サバイビンタンパク質またはサバイビンペプチドもしくは断片を注射することによってポリクローナル抗体を製造できる。哺乳動物からの血清を抽出しスクリーニングして、ペプチドまたはペプチド断片に特異的なポリクローナル抗体を得る。
【００６８】
[0073]抗体を発生させるためのサバイビンのタンパク質、ペプチド、または断片は、天然供給源からのサバイビンの単離によって、組換え手段によって、または合成手段によって、得ることができる。
【００６９】
[0074]モノクローナル抗体を製造するために、宿主哺乳動物にサバイビンタンパク質またはペプチドを接種し、次にブーストする。接種を受けた哺乳動物から、最終ブーストの数日後に脾臓を採集する。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６：４９５〜４９７）によって記載された一般法に従って、脾臓の細胞懸濁液を腫瘍細胞と融合させる。有用であるためには、ペプチド断片は検出されるサバイビン分子のエピトープを規定するのに十分なアミノ酸残基を含まなければならない。
【００７０】
[0075]断片が免疫原性であるには短すぎる場合、断片を担体分子とコンジュゲートさせてもよい。適当な担体分子の中にはキーホールリンペットヘモシアニンおよびウシ血清アルブミンがある。当技術分野で公知である方法によってコンジュゲーションを実施できる。そのような１つの方法は、断片のシステイン残基を担体分子のシステイン残基と結合させることである。当技術分野で公知の方法によってペプチド断片を合成できる。適当な方法のいくつかはＳｔｕａｒｔおよびＹｏｕｎｇ「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８４）に記載されている。
【００７１】
[0076]抗体または断片の精製は、硫酸アンモニウムもしくは硫酸ナトリウムによる沈殿後に生理食塩水による透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティもしくはイムノアフィニティクロマトグラフィー、およびゲルろ過、ゾーン電気泳動法などを含む当業者に公知の多様な方法によって達成できる（Ｇｏｄｉｎｇ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」第２版、１０４〜１２６頁、オーランド、フロリダ州、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。癌患者の液体中、好ましくは膀胱癌患者の尿中のサバイビンの検出のために、精製された抗体、または抗体の、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ断片（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）を含むサバイビン結合領域の少なくとも一部を有する精製された断片を使用することが好ましい。
【００７２】
[0077]癌の検出および／またはモニタリングに使用するために、ならびに癌の再発を予測するために、精製抗体をレポーターグループとして働く化合物に直接またはリンカーを介して共有結合させ、サバイビンの存在を検出可能にできる。酵素、色素、放射性の金属および非金属同位体、蛍光発生化合物、蛍光化合物などを含むがそれに限定されない多様な異なる種類の物質がレポーターグループとして働くことができる。検出、モニタリングに有用な本発明の抗体（またはその断片）の抗体コンジュゲートを調製するための方法は、米国特許第４６７１９５８号、第４７４１９００号および第４８６７９７３号に記載されている。
【００７３】
[0078]本発明の一態様において、好ましい結合エピトープを公知のサバイビン遺伝子配列およびそれがコードするアミノ酸配列から同定して、高結合親和性を有するサバイビン抗体を発生させるのに使用できる。また、サバイビンの結合エピトープの同定を好ましい抗体の設計および構築に使用できる。例えば、サバイビンの好ましいエピトープをコードするＤＮＡを組換え発現させ、そのエピトープに選択的に結合する抗体を選択するのに使用できる。次に、サバイビンの特異的結合エピトープに対する抗体の特異的結合を可能にするのに十分な条件で、選択された抗体を試料に曝露し、形成した複合体の量を検出する。特異的抗体による方法論は十分に理解され、文献に記載されている。これら抗体の調製のさらに詳細な記載は、例えばＰｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔ  Ｗ．Ｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９８４から見出すことができる。
【００７４】
[0079]本発明は、サバイビン抗体の検出をも意図している。サバイビンは癌特異的マーカーである。このように、患者の生体液中のサバイビン抗体の検出は癌の診断を可能にしうる。
【００７５】
サバイビンの結合パートナー
[0080]生体液中のサバイビンの存在を検出するためにサバイビンと結合する他の分子も使用できる。サバイビン抗体以外のサバイビンの結合パートナーの例には、ｐ３４ｃｄｃ２−サイクリンＢ１キナーゼおよびカスパーゼ９があるが、それに限定されない。（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０１／６４７４１を参照のこと）。
【００７６】
核酸
[0081]サバイビンをコードする核酸にハイブリダイズする、天然核酸、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび合成オリゴヌクレオチドを含む核酸は、癌患者の生体液中の、好ましくは膀胱癌患者の尿中のサバイビンの存在を検出するための試薬として有用である。Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら（Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９７、３：９１７〜９２１）は、サバイビン遺伝子のクローニングについて開示している。本発明に有用な試薬である核酸およびオリゴヌクレオチドには、Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら（Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１９９７、３：９１７〜９２１）によって単離されたサバイビン遺伝子に対応するものがあるが、それに限定されない。本発明は、癌患者の生体液中の、好ましくは膀胱癌患者の尿中のサバイビン発現を検出するための試薬として使用するための、サバイビンのコード配列およびその相補的配列に対応する核酸配列と、コード配列からさらに上流または下流に存在するサバイビン転写配列（例えば５’および３’非翻訳領域に含まれるか、５’および３’非翻訳領域にまで延伸する配列）に相補的な配列との使用を含む。
【００７７】
[0082]生体液中のサバイビンの存在を検出するための好ましいオリゴヌクレオチドは、サバイビンをコードするｃＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的なオリゴヌクレオチドである。これらの相補的配列は、「アンチセンス」配列としても当技術分野で知られている。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドでありうる。さらに、オリゴヌクレオチドは生物学的に重要なヌクレオチド、すなわちＡ（アデニン）、ｄＡ（デオキシアデニン）、Ｇ（グアニン）、ｄＧ（デオキシグアニン）、Ｃ（シトシン）、ｄＣ（デオキシシトシン）、Ｔ（チミン）およびＵ（ウラシル）からなる天然オリゴマー、またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合におけるリン酸性酸素を例えばメチル基もしくは硫黄原子によって置換した修飾オリゴヌクレオチド種でありうる。さらに、これらのヌクレオチド自体および／またはリボース部分は修飾されうる。
【００７８】
[0083]当技術分野で十分に記載された任意の公知のオリゴヌクレオチド化学合成法を用いてオリゴヌクレオチドを化学合成できる。例えば、市販の任意の核酸自動合成装置を使用することによってオリゴヌクレオチドを調製する。あるいは、例えば非コード鎖の転写を誘導することのような標準的な組換えＤＮＡ法によってオリゴヌクレオチドを創作できる。サバイビンをコードするＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ系において逆方向となってもよく、例えば非コード鎖が転写されるように適当なプロモーター下流に逆方向に挿入できる。
【００７９】
[0084]サバイビンをコードする核酸にハイブリダイズさせるために、任意の長さのオリゴヌクレオチドを利用できるが、一般的に８〜１００ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドが好ましい。尿試料中のサバイビンの検出に使用するための好ましいオリゴヌクレオチドの大部分は、１５〜５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。
【００８０】
[0085]化学合成されたものであれ組換えＤＮＡ法によって合成されたものであれ、サバイビン核酸にハイブリダイズさせるために選択されたオリゴヌクレオチドを、次に標準法を用いて単離および精製し、それから好ましくは標準標識プロトコルを用いて（例えば３５Ｓまたは３２Ｐで）標識する。
【００８１】
[0086]本発明は、生体液中のサバイビンの発現を検出するための、定性、半定量または非定量的であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）へのオリゴヌクレオチド対の使用も含む。オリゴヌクレオチド対は、サバイビンプライマーおよびサバイビン逆プライマーからなる。好ましいオリゴヌクレオチド対は、配列番号１および配列番号２である。より好ましくは、オリゴヌクレオチド対は配列番号３および配列番号４である。
【００８２】
５．検出法
タンパク質結合アッセイ
[0087]当業者に認識されているであろうように、癌患者の生体液中のサバイビンタンパク質を特異的に同定および／または定量するための任意の手段が意図される。試料中のサバイビンタンパク質を検出するための現行の好ましい手段は、マーカータンパク質と特異的に相互作用できる結合タンパク質による。好ましくは、標識抗体、標識抗体の結合部分、または他のサバイビン結合パートナーを使用できる。抗体は、起源がモノクローナルまたはポリクローナルでありえ、また生物合成的に製造されうる。サバイビン結合パートナーも、天然分子または合成製造されたものでありうる。複合サバイビンタンパク質の量、例えば結合タンパク質と会合したサバイビンタンパク質の量を、当技術分野で記載された標準的なタンパク質検出法を用いて決定する。他のアッセイでは、量を定量することなくサバイビンの存在を検出する。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコルの詳細な総説を、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、１９８４を含む当技術分野の多数の出典から見出すことができる。
【００８３】
[0088]標識抗体でタンパク質を検出するために多様なアッセイを利用できる。一段階アッセイでは、サバイビン分子が（もしも存在するならば）、それを固定化し標識抗体と共にインキュベートする。標識抗体は固定化標的分子と結合する。洗浄して未結合の分子を除いた後で標識の存在について試料をアッセイする。
【００８４】
[0089]二段階アッセイでは、固定化サバイビン分子を未標識抗体と共にインキュベートする。サバイビン−未標識抗体複合体が（存在するならば）、次に未標識抗体に特異的な標識した二次抗体に結合させる。試料を洗浄して標識の存在についてアッセイする。
【００８５】
[0090]抗体の標識に使用するマーカーの選択は、アプリケーションにより様々であろう。しかし、マーカーの選択は当業者によって容易に決定できる。腫瘍の存在を検出するため、イムノアッセイおよび組織学的アプリケーションにこれらの標識抗体を使用できる。標識抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。好ましい実施形態において、抗体はウサギポリクローナル抗体である。
【００８６】
[0091]放射性原子、酵素、発色もしくは蛍光部分（ｍｏｉｅｔｙ）、または比色タグで抗体を標識できる。タグ付け用の標識の選択は、所望の検出限界にも依存するであろう。酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、一般的に酵素タグを付けた複合体と酵素基質との相互作用によって形成した呈色生成物の検出を可能にする。放射性原子のいくつかの例には３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｐがある。酵素のいくつかの例にはホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼがある。発色部分のいくつかの例には、フルオレセインおよびロダミンがある。当技術分野で公知の方法によって抗体をこれらの標識にコンジュゲートできる。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなどのようなカップリング剤によって酵素および発色分子を抗体にコンジュゲートできる。あるいは、コンジュゲーションはリガンド−受容体対を介して生じうる。適当なリガンド−受容体対の中には、例えばビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンおよび抗体−抗原がある。
【００８７】
[0092]今日知られている最も高感度の標識は、タグと反応物質との相互作用が光の発生を招く化学発光タグである。有用な標識には、アクリジニウムエステルのような化学発光分子または反応物質が酵素の基質である化学発光酵素がある。例えばアクリジウムエステル（Ａｃｒｉｄｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒ）がアルカリ性ペルオキシド溶液と反応すると、強い閃光が発生し、検出限界が他の標識によりもたらされる検出限界の１００から１００００倍に増加する。さらに、この反応は迅速である。化学発光およびイムノアッセイの詳細な総説をＷｅｅｋｓら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８３、１３３：３６６〜３８７）、Ｋａｗａｇｕｉｃｈｉら（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｈｅｎｙｌ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−−Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、第９回国際シンポジウム要旨集１９９６、Ｈａｓｔｉｎｇｓ、ＫｒｉｃｋａおよびＳｔａｎｌｅｙ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９７、４８０〜４８４頁）、および米国特許第５４６８６４６号から見出すことができる。液体アッセイのための他の選択肢には、マイクロタイターウェルまたはカラムイムノアッセイの使用がある。カラムアッセイは、化学発光標識のような迅速反応標識を使用する場合に特に有利でありうる。反応物質または酵素の基質も含有するポストカラム検出器までタグ付き複合体を溶出させて、その後形成した生成物を直ちに検出することができる。
【００８８】
[0093]一態様において、本発明は、血清および他の生体液中のサバイビンタンパク質を検出するためのサンドイッチ法の使用を意図している。１９９３年５月１３日に公開されたＰＣＴ公報ＷＯ９３／０９４３７に記載されているように、この方法は、対象タンパク質と結合できる２つの抗体、例えば１つは固体支持体に固定化され、もう１つは溶液中に遊離状態であるが容易に検出される化学化合物で標識された抗体を必要とする。二次抗体に使用できる化学標識の例には、放射性同位元素、蛍光化合物、および酵素、または反応物質もしくは酵素の基質に曝露された場合に、呈色した生成物もしくは電気化学的に活性な生成物を発生する他の分子があるが、それに限定されない。サバイビンタンパク質を含有する試料をこの系に置く場合、サバイビンタンパク質は固定化抗体および標識抗体の両方に結合する。その結果、支持体表面に「サンドイッチ」免疫複合体が生成される。結合していない試料構成要素および過剰の標識抗体を洗浄し、支持体表面のタンパク質と複合体を形成した標識抗体の量を測定することによって、複合体を形成したタンパク質を検出する。検出限界の良好な標識を使用するならば、サンドイッチイムノアッセイは特異性が高く非常に高感度である。
【００８９】
[0094]本発明は、多数の生体液試料を同時にスクリーニングすることをも意図している。これは、広く使用され容易に自動化できる通常の９６穴マイクロタイター形式を用いて実施できる。９６穴プレートを熱量分析するための市販のスペクトロメーター（プレートリーダー）もいくつかある。
【００９０】
[0095]好ましくは、ラジオイムノアッセイもしくは酵素免疫吸着測定法、競合的酵素免疫吸着測定法、ドットブロット、ウエスタンブロット、クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または当技術分野で公知の他のアッセイにより体液試料中のサバイビンの存在を検出する。
【００９１】
[0096]ドットブロット法は、プローブとして抗体を用いて所望のタンパク質を検出するために当業者によってルーチンで実施される（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｕｉｄｅ、第２版、１９９１、２６３頁、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ドットブロット装置を用いて膜に試料をアプライする。膜と共に標識プローブをインキュベートし、そのタンパク質の存在を検出する。
【００９２】
[0097]ウエスタンブロット分析は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８９、第３巻、１８章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。ウエスタンブロットでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を分離する。ゲルを膜に転写させる。所望のタンパク質を検出するために標識抗体と共に膜をインキュベートする。
【００９３】
[0098]上記のアッセイは、イムノブロット法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、または免疫沈降法のようなステップを伴うが、それに限定されない。
【００９４】
[0099]好ましくは、サバイビンはドットブロット法またはウエスタンブロット法により検出される。より好ましくは、癌患者の生体液中のサバイビンは、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ法およびＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦモジュールを用いたドットブロット法により検出される。
【００９５】
核酸の検出
[00100]患者の生体液試料中のサバイビンの存在は、ノーザンブロット分析、ドットブロット法、マイクロアレイハイブリダイゼーション、サザンブロット分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびＰＣＲを例とするがそれに限定されない核酸ハイブリダイゼーションによっても決定されうる。クロマトグラフィー、好ましくは、ＨＰＬＣおよび他の公知のアッセイも、試料中のサバイビンのメッセンジャーＲＮＡレベルを決定するために使用できる。
【００９６】
[00101]被検液体に流れ出しているまたは放出されているサバイビンＤＮＡは、多分、サバイビン陽性癌細胞内部の生体液から見出しうる。
【００９７】
[00102]一態様において、本発明は、患者の生体液中のサバイビンを検出するための試薬として核酸の使用を意図しており、その核酸は標識されている。放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色タグか、あるいは上記もしくは当技術分野で公知の他の標識またはタグで核試薬を標識できる。
【００９８】
[00103]別の態様において、本発明は体液試料中のサバイビンｍＲＮＡの存在を検出するためのノーザンブロット分析の使用を意図している。分析の第１段階は、ゲル電気泳動でサバイビン核酸含有試料を分離することを伴う。次に分散した核酸をニトロセルロースフィルターまたは別のフィルターに転写する。その後、適当なハイブリダイゼーション条件、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２、ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載しているように４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．１％ＳＤＳの条件で標識オリゴヌクレオチドをフィルターに曝露させる。当技術分野で公知である他の有用な方法には、溶液ハイブリダイゼーション、ドットおよびスロットＲＮＡハイブリダイゼーション、ならびにプローブに基づくマイクロアレイがある。当技術分野で公知の標準法を用いてハイブリダイゼーション後の断片の放射能を測定することは、患者の生体液中に存在するサバイビン核酸の量を定量する。
【００９９】
[00104]ドットブロット法は、対象核酸を含有する試料を膜にアプライすることを伴う。膜にアプライする前または後に核酸を変性できる。膜を標識プローブと共にインキュベートする。ドットブロット法は当業者に周知であり、米国特許第４５８２７８９号および第４６１７２６１号にさらに十分に記載されている。これらの特許の開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【０１００】
[00105]ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ポリマー化のためにプライマーおよび試薬を用いて核酸試料中に存在する１つまたは複数の特異的核酸配列を増幅させ、増幅した配列を次に検出するための方法である。あるプライマーがもう一方のプライマーにハイブリダイズした場合のそのプライマーの伸長産物は、所望の特異的核酸配列の産生のためのテンプレートおよびその逆となり、所望の量の配列を産生させるのに必要な回数だけこの方法を繰り返す。所望の配列の存在を検出する当業者（米国特許第４６８３１９５号）は、ルーチンでポリメラーゼ連鎖反応を使用する。
【０１０１】
[00106]所望の配列を検出する当業者によってルーチンで実施されるＰＣＲの具体的な例は、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２３０：１３５０；Ｓｃｈａｒｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３３：１０７６）である。ＲＴ−ＰＣＲは、生体液から全ＲＮＡを単離すること、所望の核酸配列を認識するプライマーの存在下でそのＲＮＡを変性させること、そのプライマーを用いて逆転写によりＲＮＡのｃＤＮＡコピーを発生させること、特異的プライマーを用いてＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅させること、および増幅したｃＤＮＡを電気泳動または当業者に公知である他の方法によって検出することを伴う。
【０１０２】
[00107]好ましい実施形態において、癌患者の生体液中の、好ましくは膀胱癌患者の尿中のサバイビン核酸を検出する方法には、ノーザンブロット分析、ドットブロット法、サザンブロット分析、ＦＩＳＨおよびＰＣＲがある。より好ましくは、検出方法は以下の２つのプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲである：配列番号１および２、ならびに配列番号３および４。
【０１０３】
６．癌を診断するためのキット
[00108]一態様において、本発明には癌を診断するために必要な要素を含むキットがある。好ましくはキットは、患者から生体液を採集するための容器と、その液中のサバイビンまたはそれをコードする核酸の存在を検出するための試薬とを備える。水性媒体中に、または凍結乾燥の形態でキットの構成要素をパッケージできる。
【０１０４】
[00109]サバイビン抗体、その断片、またはサバイビン結合パートナーを例とするがそれに限定されない、サバイビンタンパク質を検出する１つまたは複数の試薬を含有する、癌を診断もしくはモニタリングし、癌の再発を予測するためのキットを製造できる。患者から生体液を採集するための容器と共に試薬をパッケージできる。抗体または結合パートナーを、放射性金属イオンまたは部分（ｍｏｉｅｔｙ）のような標識が連結したコンジュゲートの形でキットに使用する場合に、完全にコンジュゲートした形態、中間体の形態、またはキットの使用者によりコンジュゲートされる別々の部分（ｍｏｉｅｔｙ）としてそのようなコンジュゲートの構成要素を供給できる。
【０１０５】
[00110]完全長サバイビン核酸、サバイビンオリゴヌクレオチド、およびサバイビンのプライマー対を例とするがそれに限定されない、サバイビン核酸を検出する１つまたは複数の試薬を含むキットをも製造できる。患者から生体液を採集するための容器と共に試薬をパッケージできる。核酸は標識された形態または後で標識される形態でありうる。
【０１０６】
[00111]キットの他の構成要素には、生体液を採集するための手段、試薬を標識するための手段、生体液中のサバイビンまたはサバイビン核酸を固定化するための膜、膜に生体液をアプライするための手段、患者の生体液中のサバイビンに試薬を結合させるための手段、二次抗体、患者の生体液から全ＲＮＡを単離するための手段、ゲル電気泳動を実施するための手段、単離された全ＲＮＡからｃＤＮＡを発生させるための手段、ハイブリダイゼーションアッセイを実施するための手段、およびＰＣＲを実施するための手段などがありうるが、それに限定されない。
【０１０７】
７．本発明のアッセイおよびキットの用途
[00112]本発明のアッセイまたは方法およびキットは、診断、予後、および／または患者における癌のモニタリング、ならびに患者における癌再発の予測に有用である。本発明の一態様において、患者の生体液中のサバイビンの存在は、患者が癌を有することを示す。癌は初発癌または再発癌でありうる。本明細書に使用する「再発癌」という用語は、癌が治療された後に復帰（再発）したことを意味する。本明細書に使用する「初発癌」という用語は、新たに発現した癌を指す。
【０１０８】
[00113]サバイビンが発現し、体液中に分泌、放出または発見される任意の癌からの生体液からサバイビンを検出できる。サバイビンは、肺癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３：９１７〜２１）、膀胱癌（Ｓｗａｎａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ：Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９９、３４１：４５２〜５３）、および非ホジキンリンパ腫に発現する。神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、膀胱癌および結腸直腸癌におけるサバイビンの発現は、予後不良の疾患および生存の短縮と相関した（Ａｄｉｄａら、Ｌａｎｃｅｔ、１９９８、３５１：８８２〜８３；Ｉｓｌａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００、１９：６１７〜２３；Ｔａｎａｋａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、６：１２７〜３４；Ｍｏｎｚｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９９、１７：２１００〜０４；Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、５８：５０７１〜７４；Ｓｗａｎａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１９９９、３４１：４５２〜５３）。
【０１０９】
[00114]サバイビンは、腫瘍の進行中に剥離した癌細胞によって細胞外環境に放出されうる。したがって、サバイビンの存在について患者からの任意の生体液をアッセイできる。好ましくは前立腺液、精液、全血、血清、尿、乳房生検液、胃腸液および膣液のようなヒト体液を患者から採取してサバイビンの存在についてスクリーニングできる。
【０１１０】
[00115]好ましい実施形態において、本発明の方法およびキットを使用して、患者の生体液中のサバイビンを検出することによって膀胱癌、前立腺癌および腎臓癌を含む初発泌尿生殖器癌を診断し、その癌の再発を予測する。より好ましくは、本発明の方法およびキットを使用して、患者の尿試料中のサバイビンの存在を検出することによって膀胱癌を診断する。患者の尿試料中のサバイビンの存在は、患者が膀胱癌を有することを示す。
【０１１１】
[00116]別の態様において、本発明の方法およびキットを使用して患者の生体液中のサバイビンの量を定量できる。患者の生体液中のサバイビンの量は、癌のグレーディングに有用でありうる。患者の生体液中に高レベルのサバイビンが存在することは、その癌が高グレードであることを示しうる。あるいは、本発明の方法およびキットを使用して患者における癌のステージを決定できる。ＣＩＳステージの癌は非浸潤性乳頭状癌ステージの癌よりも高レベルのサバイビンを有する。寛解期の患者の生体液中に、あるレベルのサバイビンが存在することは、癌の再発を予測しうる。
【０１１２】
[00117]本明細書に使用する「乳頭状癌」という用語は、腫瘍上皮細胞の表層で覆われた線維性ストロマの多数の、不規則な、指様の突起の形成を特徴とする悪性新生物を指す。
【０１１３】
[00118]本明細書に使用する「上皮内癌（ＣＩＳ）」という用語は、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と同義である。膀胱癌を指すのに使用する場合、この用語は膀胱内表面（移行細胞）における扁平腫瘍を意味する。
【０１１４】
[00119]さらに、患者における癌の進行をモニタリングするために、および癌患者の予後を決定するために、患者の生体液から定量されたサバイビンの量を使用できる。例えば、一定期間に渡って測定されたサバイビンの量は、癌がどの程度の速度で増殖しているかについての情報を提供する。
【０１１５】
[00120]患者をモニタリングするための、および寛解期の患者における癌の再発を予測するための迅速で安価な方法として尿サバイビンを使用できる。尿サバイビン検査を一連の尿マーカーに組み込んで再発を早期に検出する感度および特異性を改善できる。
【０１１６】
[00121]患者が検査で生体液中のサバイビンが陽性となった後で、膀胱鏡検査のような、より侵襲性で高価な取り組みを用いて患者をさらに検査することが意図している。
【０１１７】
[00122]上記の概説を考慮に入れると、以下に発表する具体的な実施例は単に例示であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。他の一般的および具体的形態は当業者に明白であろう。
【実施例】
【０１１８】
材料と方法
[00123]尿検体：エールニューヘブン病院および復員軍人局（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ウェストヘーブン、コネティカット部）の泌尿器科診療所で１５８個の尿検体を採集した。５つの異なる群に分類した個体からランダムに無菌採取または直線状のカテーテルで採取した尿試料を得た。第１群は、薬剤の投与を受けていない平均年齢４７．６±２０．８歳の健常志願者である（ｎ＝１７）。第２群は、非腫瘍性尿路疾患または血尿の診断を有する平均年齢６０．０±１８．１歳の患者である（ｎ＝３０）。第３群は、膀胱癌を除外した泌尿生殖器癌の診断を有する平均年齢７１．５±９．９歳の患者である（ｎ＝３０）。第４群は、初発または再発膀胱癌の診断を有する平均年齢６９．７±８．７歳の患者である（ｎ＝４６）。第５群は、膀胱癌のための治療を受けている途中か、すでに治療を受けた患者であって、採尿日に細胞診による評価で陰性であった平均年齢７６．１±８．９歳の患者である（ｎ＝３５）。第５群における治療手段には、膀胱内カルメットゲラン菌（ＢＣＧ）投与、チオテパ、経尿道的切除、部分膀胱切除および放射線照射がある。第４群は、採尿後に同様の治療手段および／またはサルベージ膀胱切除もしくは根治的膀胱全摘術を受けた患者を含む。
【０１１９】
[00124]統計解析：尿サバイビンと患者の診断との間の関係をカイ二乗検定で解析した。補正された（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）尿サバイビンスコアとエールニューヘブン病院で実施したグレーディング方式とを比較するためにノンパラメトリック統計解析を使用した。
【０１２０】
実施例１  Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦモジュールを用いた尿サバイビンの検出
[00125]４８穴スロット形式をもたらすモジュールにおける精密ろ過装置を用いてニトロセルロース膜上で尿検体をろ過した。ポリクローナル抗体を用いてサバイビンの存在についてブロットを分析した。プロトコルを以下のとおりとした。尿を採集し、分析まで−８０℃で保存した。分析を行う日に尿試料を２００００×ｇで２０分間遠心分離した。その間に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ精密ろ過装置を０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）と共に組み立て、２０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）に入れて湿らせた。次に、尿上清（３００μｌ）と同様に、大腸菌に発現させた段階濃度の組換えサバイビン（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９６：５８０〜８４）をＴＢＳ３００μｌに溶かしたものを標準（０．００１〜１．０μｇ／ｍｌ）としてこの膜上でろ過した。ろ過後に、膜を乾燥させＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶かした５％Ｂｌｏｔｔｏおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で４℃で１２時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．２５％）に入れて洗浄後に、サバイビンに対する２μｇ／ｍｌウサギ抗体（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９９、１１３：１０７６〜８１）と共に２２℃で３時間膜をインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎに入れて洗い、ホースラディッシュペルオキシダーゼがコンジュゲートしたロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を１：１０００に希釈したものと共に２２℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回、１０分間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで２回、５分間、ＰＢＳで２回、５分間洗った後で、電気化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびオートラジオグラフィーによって一次抗体の結合を検出した。デンシトメトリーによってバンドを定量し、以下のようにして段階濃度の組換えサバイビンとの抗体の反応性に基づいて補正されたサバイビンスコアを計算した：０＝検出不能、１＝０．００１〜０．２５μｇ／ｍｌ、２＝０．２５〜１μｇ／ｍｌ、および３＝＞１μｇ／ｍｌ。各尿検体を少なくとも２つの異なる状況において２回分析し、共通する結果を得た。
【０１２１】
実施例２  ウエスタンブロット法
[00126]尿検体（１００ｍｌ）を１２００×ｇで２２℃で１０分間遠心分離し、細胞のペレットをＴＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で４℃で３０分間０．５％トリトンＸ−１００に溶解させた。ＳＤＳゲル電気泳動で試料を分離し、ナイロン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．）に転写させ、さらにサバイビンに対する１μｇ／ｍｌの抗体（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、１９９９、１１３：１０７６〜８１）の後にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）がコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートし、化学発光を行った。
【０１２２】
実施例３  ＲＴ−ＰＣＲ
[00127]初発または再発尿路上皮癌を有する患者１５人、膀胱癌を治療された患者２人、前立腺癌患者１人、非腫瘍性尿路疾患の患者１人および健康志願者１人から無菌採取した尿５０ｍｌを得た。トリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）を用いて尿ペレットから全ＲＮＡを単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）１μｌを用いて４３℃で１時間、全ＲＮＡ１〜５μｇをランダムプライミングすることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。７０℃で１５分間加熱後、サバイビンプライマー５’−ＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＡ−３’（正方向；配列番号１）および５’ＡＡＴＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＣＡ−３’（逆方向；配列番号２）を用いて９４℃で１５秒間の変性、５３℃で１５秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を２０サイクル行い、その後７２℃で５分間インキュベートすることで初回増幅反応を実施した。サバイビン内側プライマー（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）５’−ＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣ−３’（正方向；配列番号３）および５’−ＣＴＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＣＣ−３’（逆方向；配列番号４）を用いて９４℃で３０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を３０サイクル行い、その後７２℃で５分間インキュベートすることでサバイビンｃＤＮＡの４６３塩基対（ｂｐ）断片を第２ラウンドの増幅にかけた。増幅した２７９ｂｐのサバイビンｃＤＮＡを２．０％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。β−アクチン特異的プライマー５’−ＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧ−３’（正方向；配列番号５）および５’−ＣＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’（逆方向；配列番号６）を用いて対照反応物を増幅させ、３０９ｂｐの断片が発生した。
【０１２３】
（結果）
[00128]Ｂｉｏ−Ｄｏｔ検査を用いて尿サバイビンを検出する代表的な実験を図１に示す。本研究のために採集した１５８検体のうち１３８検体についてＢｉｏ−Ｄｏｔ法による尿サバイビンの決定を行った（表１）。ＲＴ−ＰＣＲによってサバイビン発現について追加の尿試料２０個を分析し、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ法の特異性を独立して評価した。サバイビンは、正常志願者（０／１６）、ならびに良性前立腺肥大症（０／６）、間質性膀胱炎（０／２）、腎結石（０／３）、尿路感染症（０／６）、および他の非腫瘍性尿路疾患（０／６）を有する患者の尿からは検出されなかった（表１）。経尿道的前立腺切除術後に残尿および排尿困難の既往を有して来院し膀胱鏡検査で不規則に肥厚した肉柱膀胱が明らかとなった潜伏性血尿の患者５人中３人から尿サバイビンが検出された（補正されたサバイビンスコア２）。ＰＳＡレベルが増加しているが前立腺癌の診断を有さない患者１人は、尿サバイビンが陽性であった（表１）。膀胱鏡検査でこの患者も肥厚した肉柱膀胱が明らかとなった。サバイビンは前立腺癌（０／１９）、腎臓癌（０／８）、膣癌（０／１）、および子宮頸癌（０／１）を有する患者の尿検体からは検出されなかった（表１）。対照的に、尿サバイビンは初発または再発膀胱癌を有する全ての患者から検出された（３１／３１）（表１）。Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦにより尿サバイビンについて分析された第４群の患者３１人の組織病理学的グレーディング（グレードＩ〜ＩＶ）には、グレードＩＩ腫瘍を有する患者が１３人、グレードＩＩＩ腫瘍を有する患者が７人、およびグレードＩＶ腫瘍を有する患者が５人存在した。患者５人の乳頭状浸潤癌に付随して、および患者１人の尿管の高グレード尿路上皮癌に付随して上皮内癌（ＣＩＳ）が発見された。
【０１２４】
【表１】
2006527983.tif 000002
【０１２５】
[00129]Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦで分析された第５群の患者３３人中３０人は、検出できる尿サバイビンを有さなかった（表１）。これらの患者３０人中５人はＢＣＧ投与を受けている最中で、３〜５回の治療を完了していた。残りの２５人は膀胱鏡検査陰性の治療後状態であった。最初の診断がＧＩＩ非浸潤膀胱癌であった第５群の患者３人は、膀胱鏡検査を受けて結果が陰性であった後に尿サバイビンの検査結果が陽性であった。この患者３人のうち１人は膀胱癌についての尿細胞診が陽性であった。患者３人のうち２人は膀胱腫瘍の経尿道的切除で治療され、１人は高周波療法で治療された。
【０１２６】
[00130]補正されたサバイビンスコアについて基準化した場合、ＣＩＳを有する患者（２．５±０．５、ｎ＝６）は、グレードＩＩ膀胱癌を有する患者（１．３±０．６、ｎ＝１３）よりもかなり高いサバイビンスコアを有した。補正されたサバイビンスコアと多様な膀胱癌症例の組織病理学またはグレーディングとの間の相関をそれぞれ表２および表３に示す。
【０１２７】
【表２】
2006527983.tif 000003
【０１２８】
【表３】
2006527983.tif 000004
【０１２９】
[00131]ウエスタンブロット法により、膀胱癌を有する患者からの尿細胞ペレットから１６．５ｋＤａのサバイビンの単一バンドが検出されたが、健康志願者からは検出されなかった（図２）。
【０１３０】
[00132]Ｂｉｏ−Ｄｏｔ法で得られた結果を独立して評価するために、ＲＴ−ＰＣＲにより尿サバイビンについて初発または再発膀胱癌を有する追加的な患者１５人を分析した。膀胱癌を有する新しい患者１５人全ての尿細胞ペレットから２７９ｂｐのサバイビンｃＤＮＡを増幅した（１５／１５）（図３およびデータ示さず）。これに対して、尿路感染症を有する１人、膀胱癌の治療後で膀胱鏡検査陰性の２人、前立腺癌を有する１人、および正常志願者からの１人である追加の個体５人からの尿細胞ペレットは、サバイビンｃＤＮＡを有さなかった（図３）。対照実験において、対照および膀胱癌患者の尿から３０９ｂｐのβ−アクチンｃＤＮＡ断片を増幅したが、両者に区別はつかなかった（図３）。ＲＴ−ＰＣＲにより分析された膀胱癌の組織病理学例には、グレードＩＩ腫瘍を有する患者５人、グレードＩＩＩを有する患者１人、グレードＩＶを有する患者６人、およびＣＩＳを有する患者３人が含まれた。剥離した癌細胞は腫瘍が進行する間に細胞外環境すなわち尿に受動的にサバイビンを放出することを、これらの実験は示唆している。
【０１３１】
[00133]ここで実験した一連の患者において、初発または再発膀胱癌に対する尿サバイビン検査の感度は１００％であり、他の腫瘍性および非腫瘍性泌尿生殖器疾患に対する特異性は９５％（ｐ＜０．０２）であった。本検査が高特異性であることから、尿サバイビン検査は細胞診および／または他の診断マーカーを補完して（Ｒａｍａｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１９９９、１６１：３８８〜９４；Ｌｏｋｅｓｈｗａｒら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．、２０００、１６３：３４８〜５６）膀胱癌患者をよりよくモニタリングし、初期再発またはｄｅ  ｎｏｖｏ新生物を同定するために有用でありうる。尿サバイビン検査の他の潜在的な利点には、今や商業的に入手可能となったサバイビンに対する単一の抗体を用いたワンステップ検出を使用する簡易性、サービス時点管理（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｓｅｒｖｉｃｅ）法としての適合性、および費用対効果がある。
【０１３２】
実施例４  患者の血清中のサバイビンの検出
[00134]膀胱癌および前立腺癌患者から血液を採集した。血清を単離し、実施例１に記載したドットブロット法によりサバイビンの存在について検査した。膀胱癌および前立腺癌患者の血清からサバイビンを検出した。μｇ／ｍｌ単位で段階濃度の組換えサバイビン（左右の列）、尿試料または血清試料をスロットブロット装置にアプライした。サバイビンに対する抗体と共に膜をインキュベートした後で、ＨＲＰとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧと共にインキュベートした。化学発光によりバンドを可視化した。
【０１３３】
[00135]癌患者の血清中のサバイビンの検出は、サバイビンが他の癌を検出するためのマーカーとして有用であることを示す。サバイビンの存在について血清を検査することは、スクリーニングに、および癌の再発および回帰の検出に有用である。
【０１３４】
実施例５  尿サバイビンレベルおよび転帰に対するカルメットゲラン菌およびマイトマイシンＣを用いた移行上皮癌の膀胱内治療の効果
[00136]本発明において、ＴＣＣのために２７回のＢＣＧの膀胱内治療またはマイトマイシンＣを受けている被験者２５人からの尿を治療前、治療中および治療後に採集する。治療完了の１カ月後および１２カ月後に、尿サバイビンレベルと、細胞診および膀胱鏡検査（±生検）によって評価した転帰とを比較する。
【０１３５】
（材料と方法）
[00137]被験者：エールニューヘブン病院、復員軍人局（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ウェストヘーブン、コネティカット部）、およびニューヘーブンのいくつかの地域泌尿器科医の診療所から全ての採尿を得た。エール大学医学部ヒト治験委員会およびＶＡ研究委員会は試料の採集および実験計画を承認した。膀胱鏡検査および生検の後に、表在性ＴＣＣを有する被験者２５人（平均年齢７０歳、範囲４８〜８９歳、女性１２％）についてＢＣＧ（ｎ＝２３）で治療するかマイトマイシンＣ（ｎ＝４）で治療するかの決定を行った。被験者２人はそれぞれ２クールの治療を受け、合計２７回の治療となった。被験者２５人についての最初のグレードおよびステージは以下のとおりであった。グレードＩ：１．４％、グレードＩＩ：４８％およびグレードＩＩＩ、ＩＶ：４８％；Ｔａステージ：４８％、Ｔｉｓステージ：２０％、およびＴＩステージ：３２％）。被験者の２０パーセントは上皮内癌（ＣＩＳ）陽性の領域を有した。
【０１３６】
[00138]膀胱腫瘍の経尿道的切除（ＴＵＲＢＴ）後で最初の膀胱内注入直前（治療前）、残りのＢＣＧまたはマイトマイシンＣ治療それぞれの直前、および治療クールの完了の約１カ月後（治療後）に、無菌採取尿またはカテーテル尿を各患者から採集した。同じ患者から無菌採取尿またはカテーテル尿を採集した場合にサバイビンレベルの差はみられなかった。最も高い尿サバイビンは、膀胱内注入のクール中に測定された最高レベルのサバイビンであった。各被験者について２回目の注入前に得られた尿から最終の膀胱内注入前に得られた尿にわたる平均尿サバイビン値を計算する。尿試料を採集し、分析まで−８０℃で小分けして保存した。
【０１３７】
[00139]尿サバイビンの検出：一次抗体とのさらに長いインキュベーション時間を使用し、化学発光生成物の検出にさらに長時間かけ、かつ凍結全尿試料を使用することを除いて、方法は、Ｓｍｉｔｈら（ＪＡＭＡ、２００１、２８５：３２４）に記載されている。本明細書によってこの文献はその全体が参照により組み込まれている。凍結全尿試料は、遠心分離してから上清を凍結した尿試料よりも多量のサバイビンを含有することが多い。サバイビン分析を行う日に、尿試料を解凍し、２００００×ｇで２０分間遠心分離した。その間、２０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中で湿らせた０．２μニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州）と共にＢｉｏ−Ｄｏｔ精密ろ過装置を組み立てた。次に、尿上清（５００μｌ）と同様に大腸菌に発現させた段階濃度（０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ）の組換えサバイビン（Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９６：５８０）、サバイビン陰性タンパク質対照、ならびにサバイビン陽性対照尿試料およびサバイビン陰性対照尿試料を膜上でろ過した。ろ過後に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を溶媒とする５％脱脂粉乳および０．０１％アジ化ナトリウム中で膜をインキュベートした（４℃、２時間）。ＰＢＳ−トウィーン２０（０．５％）中で洗浄した後で、サバイビンに対する２μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル抗体（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９９、１１３：１０７６）と共にこの膜を４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ−トウィーン（０．０５％）で洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼがコンジュゲートしたロバ抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスタカウェイ、ニュージャージー州）を１：１０００に希釈したものと共にインキュベートした（２２℃、１時間）。ＰＢＳ、ＰＢＳ−トウィーン（０．０５％）および再度ＰＢＳでそれぞれ２回洗った後で、電気化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスタカウェイ、ニュージャージー州）で一次抗体の結合を検出した。Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １Ｄ画像解析システム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、ロチェスター、ニューヨーク州）を用いてブロットをスキャンし、サバイビン濃度を決定した。
【０１３８】
[00140]データ解析および統計：治療後膀胱鏡検査（±生検）および細胞診の結果により再発および寛解状態への帰属を決定する。分類不確定（ｎ＝３）への帰属は、膀胱鏡検査で疑いがある、生検がＴＣＣについて陰性であり、細細診で異型細胞を有する被験者からなる。Ｓｔａｔｖｉｅｗ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ケアリー、ノースカロライナ州）を用いて群間差を決定した。研究結果を平均±標準誤差および中央値として表現した。符号つきｔ検定およびＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を含むノンパラメトリック解析を用いて治療の転帰を解析した。アッセイの検出限界は、非特異的バックグラウンドを有さないサバイビン０．１ｎｇ／ｍｌであった。
【０１３９】
（結果）
[00141]膀胱内治療の転帰：細胞診および膀胱鏡検査±生検の所見により測定されたように膀胱内注入完了の１カ月後に１５／２７回の治療がＴＣＣの寛解を招き、９／２７回の治療がＴＣＣの再発を有した（表４）。３回の治療は不確定と分類された転帰を有した。これらは、１）最初の治療後生検が扁平上皮化生を示したが、１１カ月以内にグレード２／４  ＴＣＣの再発の診断があった例；２）マイトマイシンＣの膀胱内注入の１カ月後に治療後細胞診が異型性を示し膀胱鏡検査所見が目視的にＣＩＳを示唆したが、生検は腫瘍について陰性であった例（この被験者は１１カ月後にＣＩＳの領域を有するグレード３／４／４  ＴＣＣと診断された）；および３）治療後膀胱鏡検査で目視的に新生物の疑いがあったが、生検は陰性であった例からなる。直腸と膀胱両方の癌と診断されたこの被験者において４回の細胞診のうち１回は異型性を示し、両方の癌が１年後に寛解期にあった。
【０１４０】
【表４】
2006527983.tif 000005
【０１４１】
[00142]治療前のサバイビンレベル：ＴＵＲＢＴ後および膀胱内化学療法による治療前の全ての被験者について要約した尿サバイビンレベルの中央値は、サバイビン０．２ｎｇ／ｍｌ尿であった（表５）。治療が再発（中央値：サバイビン０．７ｎｇ／ｍｌ尿、ｎ＝９）よりも寛解（中央値：サバイビン０ｎｇ／ｍｌ尿、ｎ＝１５）を招いた場合の方が治療前サバイビンレベルは低かった（表５）。寛解に達した被験者のうち８人は、切除後およびＢＣＧまたはマイトマイシンＣによる治療前に測定可能なサバイビンを有さなかった（表４）。寛解に達した被験者および再発した被験者からの尿サバイビンレベルの代表的なブロットを図５に示す。不確定と分類された転帰を招いた治療は、寛解を招いた治療よりも高いサバイビンレベルを有した（中央値サバイビン１．４ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝３）。これら３例のうち２例は１年以内に膀胱腫瘍を有すると診断された。
【０１４２】
【表５】
2006527983.tif 000006
【０１４３】
[00143]治療中のサバイビンレベル：治療中に測定し全ての被験者について要約した最高サバイビンレベルは、治療前または治療後サバイビンレベルよりも高かった（表５、図５）。治療中の最高サバイビンレベルを転帰尺度と比較したとき、寛解を招いた治療中のレベル（中央値：サバイビン０．５ｎｇ／ｍｌ尿）は、再発が生じた治療中のレベル（中央値：サバイビン２．０ｎｇ／ｍｌ尿）よりも低かった（表５）。
【０１４４】
[00144]転帰尺度と比較した治療後サバイビンレベル：寛解を招いた治療に対するサバイビンの治療後レベルの中央値はゼロであった（ｎ＝１５）（表５）。治療１カ月後にサバイビン≦０．１ｎｇ／ｍｌ尿のサバイビンレベルを有する被験者１４人は全て寛解期にあった。これら１４人中１２人は１年後に腫瘍を有さなかったが、これら１２人のうち１人は治療の１４カ月後に再発した。この被験者（被験者１３）は、治療中に高い尿サバイビンを有したが、治療１カ月後にサバイビンゼロおよび寛解の両方を達成した。その後の尿２つはサバイビンレベルがゼロであったが、ＢＣＧ治療完了の８カ月後かつ再発の診断前に尿サバイビンは陽性であった。
【０１４５】
[00145]不確定な転帰を有すると分類された治療のうち、サバイビンに対する治療後レベルの中央値は、サバイビン０．８ｎｇ／ｍｌ尿（ｎ＝３）であった。再発を招いた治療のうち、サバイビンについての治療後レベルの中央値は、サバイビン１．０ｎｇ／ｍｌ尿（ｎ＝９）であった。治療直後に、サバイビンは再発した被験者全ての尿から検出された。治療後に最高のサバイビンレベルを有した被験者はＴＣＣに対する膀胱切除を受けていた。尿サバイビンが陽性であった被験者１人は、１カ月で再診を拒絶し、１年以内にＴＣＣの再発が検出された。
【０１４６】
[00146]治療後短期間でサバイビン陽性であったが、その時点で再発していなかった被験者４人中３は、１年以内にＴＣＣの再発を発現した。治療後サバイビンレベル１．０ｎｇ／ｍｌ尿を有し、治療後短期間のＴＣＣに関する膀胱鏡検査および細胞診が陰性であった被験者１人は、治療後６カ月以内にＴＣＣの再発を発現した。治療後サバイビンレベルがサバイビン２．２および０．８ｎｇ／ｍｌ尿であり疑いのある膀胱鏡検査所見±細胞診で異型細胞を有するが生検ではＴＣＣと診断できなかった他の被験者２人は、ＢＣＧ注入の完了後１年以内に再発性ＴＣＣを発現した。治療後サバイビンレベルがサバイビン０．４ｎｇ／ｍｌ尿である被験者１人は、直腸癌の既往を有した。この被験者は疑わしい膀胱鏡検査所見を有し続けているが、この被験者は臨床的に明らかな膀胱癌を発現していない。
【０１４７】
[00147]治療直後に測定した尿サバイビンレベルは、感度１００％および特異性７８％で治療の失敗（すなわち治療１カ月以内の再発）を予測する。１年後に、治療直後に測定した尿サバイビンレベルは、感度８３％および特異性９２％で依然としてＴＣＣの再発を予測する（表６）。
【０１４８】
【表６】
2006527983.tif 000007
【０１４９】
（考察）
[00148]ＴＣＣの治療後１カ月で寛解に達した被験者における治療後サバイビンレベルの中央値はゼロであるが、ＴＣＣが再発した被験者は、サバイビン１．０ｎｇ／ｍｌ尿という治療後中央値レベルを有する。膀胱内治療クールの完了の１カ月後に評価した場合、再発しなかった被験者４人は尿中にサバイビンを有した。もっとも、この４人中３人は不確定な分類となっていた。１２カ月以内にこれら被験者４人中３人がＴＣＣの再発を有した。４番目の被験者は、ＴＣＣに追加して第二の癌、すなわちリンパ浸潤を伴う直腸−Ｓ状結腸癌を診断され治療されていたが、いくつかの膀胱鏡検査で疑いがあったにもかかわらず、膀胱生検は陰性のままである。直腸−Ｓ状結腸癌は寛解を維持している。
【０１５０】
[00149]治療後のサバイビンレベルがゼロ（被験者１３人）またはサバイビン０．１ｎｇ／ｍｌ尿（被験者１人）である被験者１４人は、ＢＣＧまたはマイトマイシンＣ治療直後に陰性の膀胱鏡検査／細胞診結果を有した。これら被験者１４人中１２人は治療の完了１年後にＴＣＣの再発を有さなかった。いくつかの研究は、非浸潤性（ｐＴａステージ）腫瘍または粘膜固有層浸潤性（ｐＴ１ステージ）腫瘍を有し、膀胱腫瘍の初回経尿道的切除の３カ月後の膀胱鏡検査所見が陰性であった被験者が１２カ月間は追跡膀胱鏡検査の義務から解放されうることを示唆していた（Ｈｏｌｍａｎｇら、Ｊ  Ｕｒｏｌ、２００２、１６７：１６３４；Ｐａｒｍａｒら、Ｊ  Ｕｒｏｌ、１９８９、１４２：２８４；Ａｂｅｌ，Ｐ．Ｄ．、Ｂｒ  Ｊ  Ｕｒｏｌ、１９９３、７２：１３５）。ＴａまたはＴ１病変を有し治療後サバイビンがゼロであった被験者１２人中１人だけが１年以内に再発したことから、尿サバイビンの不在は、あまり厳しくない膀胱鏡検査方式ための追加的な基準を提供する。ＴａまたはＴ１病変を有し治療後尿サバイビンが陽性であった被験者８人中７人は１年以内に再発した。この研究において、当初ＴａまたはＴ１ステージＴＣＣを有すると診断された被験者の４０％（８／２０）が再発したが、これらの被験者の１人だけが治療後にサバイビン陰性であり、この再発はグレード１と分類された。最初の追跡膀胱鏡検査とサバイビン測定とを連関させることは、低ＴＣＣステージを有する被験者についての追跡間隔を決定するうえで有用でありうる。
【０１５１】
[00150]ＴＵＲＢＴ直後にサバイビンが不在であることは、必ずしもＴＵＲＢＴ後の寛解を示さない。ＴＵＲＢＴ後に尿中にサバイビンを有さなかった（サバイビン≦０．１ｎｇ／ｍｌ尿）被験者１０人中８人が寛解に達した。しかし、被験者１０人中８人は治療中にサバイビン陽性であった。
【０１５２】
[00151]まとめると、寛解に達する患者に比べて再発する患者の方が膀胱内治療前、治療中および治療後のサバイビンレベルが高い。ＢＣＧまたはマイトマイシンＣの膀胱内注入直後の測定で尿サバイビンが存在することは、感度１００％および特異性７８％でＴＣＣの再発を予測する。治療直後に測定した尿サバイビンレベルは１年後に依然として感度８３％および特異性９２％でＴＣＣの再発を予測する。この本研究は、膀胱内注入の完了後に尿サバイビンを有する被験者は予後不良であり、尿サバイビンを有さない被験者に比べて集中した追跡を必要としうることを示す。したがって、膀胱内注入の完了後の患者に尿サバイビンが存在することは患者の予後のインジケーターとして使用できる。
【０１５３】
[00152]前記の解説および実施例は単にある好ましい実施形態の詳細な説明を表すものである。したがって、種々の変更および等価物が本発明の精神および範囲から逸脱せずに製作されうることは当業者に明らかであろう。本特許出願において確認された全ての雑誌記事、他の参照、特許および特許出願はその全体が参照により組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦモジュールを用いた尿サバイビンの検出を示す図である。μｇ／ｍｌ単位で表した段階濃度の組換えサバイビン（左列）、または表示した患者群からの尿検体をスロットブロット装置にアプライした。サバイビンに対する抗体の後で、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧと共に膜をインキュベートした。化学発光によりバンドを可視化し、デンシトメトリーで定量した。ＴＣＣ：膀胱癌（第４群）、ＴＣＣ／Ｒ：寛解（第５群）、ＴＣＣ／Ｔ：治療中（第５群）、ＲＣＣ：腎細胞癌、ＰＣ：前立腺癌（第３群）、ＰＳＡ：前立腺癌の診断を有さないＰＳＡが上昇した患者（第２群）、ＢＰＨ：良性前立腺肥大症（第２群）、Ｃｔｒｌ：健康な志願者（第１群）。
【図２】尿サバイビンのウエスタンブロット分析を示す図である。健常志願者（正常）および膀胱癌（ＴＣＣ）を有する第４群の患者からの尿細胞ペレットを電気泳動させ、ナイロン膜に転写させ、サバイビンに対する抗体で免疫ブロットを行ってから化学発光を行った。相対的分子量マーカーを左に示す。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲによる尿中サバイビンｍＲＮＡの増幅を示す図である。尿細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライミングにより逆転写した。サバイビンに特異的な内側のプライマー（２７９ｂｐ）またはβ−アクチン特異的プライマー（３０９ｂｐ）を用いて増幅反応を実施した。分子量マーカーをｂｐで表したものを示す（Ｍ）。ＴＣＣ：初発または再発膀胱癌を有する代表的な患者５人の分析（第４群）。
【図４】Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦモジュールを用いた血清サバイビンの検出を示す図である。μｇ／ｍｌ単位で表した段階濃度の組換えサバイビン（左右の列）、尿試料、または血清試料をスロットブロット装置にアプライした。サバイビンに対する抗体の後で、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧと共に膜をインキュベートした。化学発光によりバンドを可視化した。数字が「血清（ｓｅｒｕｍ）Ｂｌ  ＣＡ」の前に来るときは、ＴＣＣを有する患者からの血清を示す。これらの試料の大部分を２回１組としてブロットにアプライした。膀胱癌を有する患者からの血清試料８個中７個が陽性であった。１つの試料（８−血清ＢｌＣＡ）は、検査した２つの試料の１つで陰性であった。患者２ＢｌＣＡからの尿および血清は陽性であった。「尿（ｕｒｉｎｅ）ＨｘＴＣＣ」は、以前にＴＣＣを有すると診断されたただ１人の患者からの尿を示す。この患者は、切除を受け、ＢＣＧ治療中である。「３−血清ＰＣＡ」は、前立腺癌を有する患者からのサバイビン陽性血清を示す。「６−血清ＢＰＨ」は、良性前立腺肥大症を有する患者からの血清である。この試料は、検査した２回中１回でサバイビン陽性であった。この患者について追加の情報は入手できない。「尿ＴＣＣ」は、膀胱癌を有する患者からの尿である。「Ｎｅｇ  ｃｏｎ」は、タンパク質対照である。「ブランク（ｂｌａｎｋ）」は、ＴＢＳ緩衝液のみである。
【図５】ＴＣＣ被験者の尿中の尿サバイビンレベルの代表的なブロットを示す図である。治療の結果が寛解期にある被験者および治療後にＴＣＣが再発する被験者について尿試料中のサバイビンの相対強度を示す。治療前、治療中および治療後のサバイビンレベルを示す。強度はブロットの曝露時間に対するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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