(57)【要約】【課題】動物の免疫応答を免疫学的に弱いかまたは稀な抗原に向けなおす方法の提供。【解決手段】（ａ）動物に、抗原の第一のセットを投与しそして第一および第二の免疫応答を可能にする工程、（ｂ）動物に、急速に増殖する免疫細胞の成長を阻害する免疫抑制剤を投与する工程、（ｃ）動物に、抗原の第一のセットに類似または関連しているがそれとは別個の抗原の第二のセットを投与する工程、そして（ｄ）抗原の第二のセットに対する抗体の力価を上昇させるのに十分なそして抗原の第二のセットに対する抗体を分泌する形質細胞の動物の脾臓への増大した移入を生じさせるのに十分な抗原の第二のセットのブースター注入を投与する工程からなる。
2006521095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）動物に、抗原の第一のセットを投与しそして第一および第二の免疫応答を可能にし、
（ｂ）動物に、急速に増殖する免疫細胞の成長を阻害する免疫抑制剤を投与し、
（ｃ）動物に、抗原の第一のセットに類似または関連しているがそれとは別個の抗原の第二のセットを投与し、そして
（ｄ）抗原の第二のセットに対する抗体の力価を上昇させるのに十分なそして抗原の第二のセットに対する抗体を分泌する形質細胞の動物の脾臓への増大した移入を生じさせるのに十分な抗原の第二のセットのブースター注入を投与する
ことからなることを特徴とする動物の免疫応答を免疫学的に弱いかまたは稀な抗原に向けなおす方法。
【請求項２】
（ａ）動物に、抗原の第一のセットを投与しそして第一および第二の免疫応答を可能にし、
（ｂ）動物に、急速に増殖する免疫細胞の成長を阻害する免疫抑制剤を投与し、
（ｃ）動物に、抗原の第一のセットに類似または関連しているがそれとは別個の抗原の第二のセットを投与し、
（ｄ）抗原の第二のセットに対する抗体の力価を上昇させるのに十分なそして抗原の第二のセットに対する抗体を分泌する形質細胞の動物の脾臓への増大した移入を生じさせるのに十分な抗原の第二のセットのブースター注入を投与し、
（ｅ）脾細胞を動物から単離し、そして
（ｆ）単離した脾細胞を培養で無期限に複製できる骨髄腫細胞または形質転換細胞と融合して、免疫学的に弱いかまたは稀な抗原と特異的に応答するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成する
ことを特徴とする免疫学的に弱いまたは稀な抗原と特異的に応答するモノクローナル抗原を生成する方法。
【請求項３】
免疫抑制剤がシクロホスファミドである請求項１または２の方法。
【請求項４】
抗原の第一のセットが、未形質転換細胞からなり、そして抗原の第二のセットが、腫瘍的に形質転換された該細胞から由来する細胞からなる請求項１または２の方法。
【請求項５】
抗原の第二のセットが、天然の形および変性された形の両方の抗原からなる請求項１または２の方法。
【請求項６】
抗原の第一のセットが、ＢＭＲＰＡ１（ＢＭＰＲＡ．４３０）細胞からなり、そして抗原の第二のセットが、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞からなる請求項４の方法。
【請求項７】
抗原の第一のセットが、ＢＭＲＰＡ１（ＢＭＰＲＡ．４３０）細胞からなり、そして抗原の第二のセットが、ＴＵＣ３（ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓｖａｌ１２）細胞である請求項４の方法。
【請求項８】
抗原の第二のセットが、腫瘍関連抗原または腫瘍特異抗原からなる請求項４の方法。
【請求項９】
がん関連抗原が膵臓がん関連抗原である請求項８の方法。
【請求項１０】
腫瘍関連抗原が膵臓腫瘍関連抗原である請求項８の方法。
【請求項１１】
培養培地が、約０．０２Ｍのグルタミン、約０．０１−約０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、培地１Ｌあたりの酢酸１ｍＬあたり約０．００１−約０．０１ｍｇの範囲の酢酸に溶解したウシインスリン、約１−約８×１０−７ＭのＺｎＳＯ４、約１−約８×１０−１０ＭのＮｉＳＯ４６Ｈ２Ｏ、５×１０−７−約５×１０−６ＭのＣｕＳＯ４、５×１０−７−約５×１０−６ＭのＦｅＳＯ４、約５×１０−７−約５×１０−６ＭのＭｎＳＯ４、約５×１０−７−約５×１０−６Ｍの（ＮＨ４）６Ｍｎ７Ｏ２４、培地１Ｌあたり約３−約０．７ｍｇのＮａ２ＳｅＯ３、約１×１０−１０−約８×１０−１０ＭのＳｎＣｌ２２Ｈ２Ｏおよび約５×１０−４−約５×１０−５Ｍのカルバミルコリンからなり、該培地が約６．８−７．４の範囲に調節されたｐＨを有することを特徴とする分化状態でＢＭＲＰＡ１細胞を維持できる培地。
【請求項１２】
請求項２の方法により生成されたモノクローナル抗体。
【請求項１３】
約１２−約２４時間１μｇのＮＮＫ／ｍＬ培地に曝された形質転換したＢＭＲＰＡ１（ＢＭＰＲＡ．４３０）細胞。
【請求項１４】
請求項１３の細胞から由来する細胞系ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ。
【請求項１５】
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を注入されたマウスの腫瘍から由来する細胞系ＴＵＮＮＫ。
【請求項１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されて約４１．２ｋＤの分子量、
約５．９−約６．９の等電点電気泳動のｐＩ、そして
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＮＮＫ細胞、ヒト膵臓ガン細胞系ＣＡＰＡＮ１、ＣＡＰＡＮ２、Ａ５４９ヒト肺ガン細胞およびＢ１６マウス黒色腫細胞で検出可能
を特徴とする実質的に純粋な形のガン関連抗原３Ｄ４−Ａｇ。
【請求項１７】
抗原が、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されて約４１．２ｋＤの分子量、
約５．９−約６．９の等電点電気泳動のｐＩ、そして
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＮＮＫ細胞、ヒト膵臓ガン細胞系ＣＡＰＡＮ１、ＣＡＰＡＮ２、Ａ５４９ヒト肺ガン細胞およびＢ１６マウス黒色腫細胞で検出可能である
ことを特徴とするガン関連抗原３Ｄ４−Ａｇへの特異的な結合特異性を有する抗体。
【請求項１８】
モノクロール抗体である請求項１７の抗体。
【請求項１９】
請求項１６の３Ｄ４−Ａｇと特異的に免疫応答可能なモノクロール抗体を生成するネズミ科のハイブリドーマ細胞。
【請求項２０】
請求項１９のハイブリドーマにより分泌されるモノクロール抗体ｍＡｂ３Ｄ４。
【請求項２１】
ハイブリドーマが、ＢＭＲＰＡ１およびＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の表面で抗原に結合する抗体を生成する請求項６の方法により生成したハイブリドーマ。
【請求項２２】
該抗体がｍＡｂ４ＡＢ１またはｍＡｂ２Ｂ５である請求項２１のハイブリドーマにより生成された抗体。
【請求項２３】
ハイブリドーマが、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の抗原に結合するが未形質変換ＢＭＲＰＡ１細胞とは結合しない抗体を生成する請求項６の方法により生成されたハイブリドーマ。
【請求項２４】
抗体がｍＡｂ３Ａ２である請求項２３のハイブリドーマにより生成される抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の免疫応答を向けなおす方法に関する。特に、本発明は、動物の免疫応答を免疫学的に弱いかまたは稀な抗原例えば腫瘍抗原に向けなおす方法に関する。方法は、消去式免疫と超免疫とを組み合わせたものであり、標的特異性抗体、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋−Ｔリンパ細胞）および細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋−Ｔリンパ細胞）のコントロールされたまたはそれらに向けられた生成物を生ずる。得られた抗体は、特に、診断および治療の応用に有用である。
【背景技術】
【０００２】
２０年を超える間、ｍＡｂは、哺乳動物、鳥類および両生類の組織から、植物、寄生虫、細菌およびウイルスからの種々の細胞に存在する抗原並びに合成の抗原の同定のための強力な手段として使用されてきている。前世紀の前半におけるＫ．Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒの先駆的研究から、抗体は、それらの能力によって２つの外見上ほとんど同じ蛋白の間を区別して蛋白の一次、二次および／または三次の構造における微細な相違を特異的に認識（反応）することが知られている（エピトープ）。従って、蛋白における唯一のアミノ酸の変化は、それが特定の蛋白について遺伝子コーディング中への単一の点突然変異の導入により生ずるとき、Ｂリンパ細胞の表面に存在する抗体により認識されて、形質細胞への免疫細胞の増殖そして抗原特異性抗体（エピトープ）の分泌が生ずる。その例として、抗体は、ブタインスリンを注入された糖尿病で生成し、ブタインスリンは、唯一のアミノ酸によりヒトインスリンとは別個のものである。
【０００３】
非特許文献１によるハイブリドーマ融合方法の開発は、これらの精製された認識特異性を有する抗体の同定、永久的な培養における生成した形質細胞の維持そして従って望ましい特異性を有するｍＡｂの工業的な方法の探究および同定を可能にした。その結果、診断薬そしてさらに最近では治療薬の伝達並びに治療薬としてのそれらの用途に使用される多数のｍＡｂが増加しつつある。
【０００４】
融合方法は、十分にコントロールされた日常的に行われる方法になっているが、未処置細胞のような抗原のコンプレックス混合物による免疫脾細胞の（動物）ドナーを免疫化する方法は、ほとんどの場合、純粋に実験的な方法（「標準的」免疫方法）のままであった。それゆえ、これらの動物の脾臓における（望ましい）抗原特異性抗体分泌形質細胞の存在および頻度についてほとんど予想されていない。「標準的」免疫化の使用は、しばしば、望ましい特異性を有するｍＡｂを分泌する唯一のまたはそのようなハイブリドーマの同定をもたらす。しばしば、問題のｍＡｂ分泌ハイブリドーマは、まったく同定されていない。たとえ見かけ上望ましい特異性のｍＡｂが見いだされたとしも、生成したｍＡｂの多くをテストすると、それぞれの１つ以上の抗原が、ほとんどの場合、標的とする器官のそれらよりも多くの細胞に存在し、そして免疫化方法において抗原として使用されることが立証される。明らかに、これらの結果は、生体外で器官特異性または細胞特異性の媒体としてのｍＡｂの有用性をかなり制限する。
【０００５】
標的特異性ｍＡｂの生成に現在使用される方法は、特異的な免疫学的寛容の導入を含む。この方法では、免疫優性の抗原に対する免疫応答は、（ａ）新生児寛容の導入、（ｂ）低投与量の抗原の投与の繰り返し、（ｃ）抗原の第一のセットの単一の注入中またはその直前直後の免疫抑制剤の投与および主な免疫応答の導入により抑制される（非特許文献２−９）。しかし、これらの方法は、問題により妨げられる。例えば、しばしば、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、未形質転換の母細胞に既に存在する分子の僅かな改変（上記参照）から由来し、そのため、存在する数限りない他の免疫優性の抗原内で認識できない。さらに、ＴＳＡ／ＴＡＡは、かなり数が少ないので、受動免疫応答は宿主で全くまたはほとんど発生しない。
【０００６】
診断または治療の目的で標的に向かう媒体としてｍＡｂの潜在的な識別特異性を完全に利用するには、免疫化動物の応答の操作が非常に望まれ、２つの主な目的が達成される。第一に、Ｂリンパ細胞の応答そしてその結果抗体の生成は、圧倒的に細胞および／または器官特異性の抗原の１つ以上に向かわなければならない。さらに、融合の時点で、所望の１つ以上の抗体を生成する最大の可能な数のこれらの形質細胞は、免疫化ドナー動物の脾臓に移動しそして存在しなければならない。第一の目的は、問題とする抗原に応答するＢリンパ細胞のみの増殖を生ずるだろうが、第二の目的は、脾臓における多数の非常に選択された（抗体特異性に関して）形質細胞のかなりな増加により、これらの（所望の）形質細胞の１つ以上と骨髄腫細胞の１つ以上との間の融合のかなり高い頻度をもたらす。本発明は、両方の目的を達成し、そして生体外で成長する非常に多数のハイブリドーマをもたらすばかりか、正確に所望の抗原特異性を有する予想できる高い頻度のハイブリドーマ分泌ｍＡｂをもたらす。
【０００７】
【非特許文献１】ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５−４９７
【非特許文献２】Ｍａｎｙら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７０、６：８７−９９
【非特許文献３】Ｈａｎａｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９８６、４６：４４３８−４４４３
【非特許文献４】Ｍｉｄｄｅｌｏｎら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．１９８４、３９：９２６
【非特許文献５】Ｇｏｌｕｍｂｉｓｋｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８６、１５４：３７３
【非特許文献６】Ｍａｔｔｈｅｗら、１９８７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１００：７３−８２
【非特許文献７】Ｐｙｔｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８８、１６７：４２１
【非特許文献８】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１９９２、１２：８４２−８４７
【非特許文献９】Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９３、１２２：１３５１−１３５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、両方の目的を達成し、そして生体外で成長する非常に多数のハイブリドーマをもたらすばかりか、正確に所望の抗原特異性を有する予想できる高い頻度のハイブリドーマ分泌ｍＡｂをもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、動物の免疫応答を免疫学的に弱いかまたは稀な抗原に向けなおす方法を提供する。その方法は、（ａ）動物に、抗原の第一のセットを投与しそして第一および第二の免疫応答を可能にする工程、（ｂ）動物に、急速に増殖する免疫細胞の成長を阻害する免疫抑制剤を投与する工程、（ｃ）動物に、抗原の第一のセットに類似または関連しているがそれとは別個の抗原の第二のセットを投与する工程、そして（ｄ）抗原の第二のセットに対する抗体の力価を上昇させるのに十分なそして抗原の第二のセットに対する抗体を分泌する形質細胞の動物の脾臓への増大した移入を生じさせるのに十分な抗原の第二のセットのブースター注入を投与する工程からなる。
【００１０】
本発明の他の構成では、免疫学的に弱いまたは稀な抗原と特異的に応答するモノクローナル抗原を生成する方法が提供される。その方法は、（ａ）動物に、抗原の第一のセットを投与しそして第一および第二の免疫応答を可能にする工程、（ｂ）動物に、急速に増殖する免疫細胞の成長を阻害する免疫抑制剤を投与する工程、（ｃ）動物に、抗原の第一のセットに類似または関連しているがそれとは別個の抗原の第二のセットを投与する工程、（ｄ）抗原の第二のセットに対する抗体の力価を上昇させるのに十分なそして抗原の第二のセットに対する抗体を分泌する形質細胞の動物の脾臓への増大した移入を生じさせるのに十分な抗原の第二のセットのブースター注入を投与する工程、（ｅ）脾細胞を動物から単離する工程、そして（ｆ）単離した脾細胞を培養で無期限に複製できる形質転換細胞または骨髄腫細胞と融合して、免疫学的に弱いかまたは稀な抗原と特異的に応答するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成する工程からなる。好ましくは、免疫抑制剤はシクロホスファミドである。好ましい態様では、抗原の第一のセットは未形質変換細胞からなるが、一方抗原の第二のセットは腫瘍的に形質転換された該細胞から由来する細胞からなる。例えば、抗原の第一のセットは、ＢＭＲＰＡ１（ＢＭＰＲＡ．４３０）細胞からなり、そして抗原の第二のセットは、ＢＭＲＰＡ．ＮＮＫ細胞からなる。本明細書で使用されるとき、「ＢＭＲＰＡ１」細胞および「ＢＭＲＰＡ．４３０」細胞は、同義的である。他の例では、抗原の第一のセットは、ＢＭＲＰＡ１（ＢＭＰＲＡ．４３０）細胞からなることができ、そして抗原の第二のセットは、ＴＵＣ３（ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２）細胞からなることができる。抗原の第二のセットの例は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原である。ガン関連抗原の例は、膵臓ガン関連抗原である。
【００１１】
本発明の他の構成では、上記の方法により生成されるモノクローナル抗体が提供される。
【００１２】
分化状態でＢＭＲＰＡ１細胞を維持できる培地も本発明により提供される。培地は、約０．０２Ｍのグルタミン、約０．０１−約０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、培地１Ｌあたりの酢酸１ｍＬあたり約０．００１−約０．０１ｍｇの範囲の酢酸に溶解したウシインスリン、約１−約８×１０−７ＭのＺｎＳＯ４、約１−約８×１０−１０ＭのＮｉＳＯ４６Ｈ２Ｏ、５×１０−７−約５×１０−６ＭのＣｕＳＯ４、５×１０−７−約５×１０−６ＭのＦｅＳＯ４、約５×１０−７−約５×１０−６ＭのＭｎＳＯ４、約５×１０−７−約５×１０−６Ｍの（ＮＨ４）６Ｍｎ７Ｏ２４、培地１Ｌあたり約３−約０．７ｍｇのＮａ２ＳｅＯ３、約１×１０−１０−約８×１０−１０ＭのＳｎＣｌ２２Ｈ２Ｏおよび約５×１０−４−約５×１０−５Ｍのカルバミルコリンからなり、該培地は約６．８−７．４の範囲に調節されたｐＨを有する。
【００１３】
好ましくは、培地は、約０．０２Ｍのグルタミン、約０．０２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸に溶解したウシインスリン（培地１Ｌあたりの酢酸１ｍＬあたり約０．００４ｍｇ）、約５×１０−７ＭのＺｎＳＯ４、約５×１０−１０ＭのＮｉＳＯ４６Ｈ２Ｏ、約５×１０−６ＭのＣｕＳＯ４、約５×１０−６ＭのＦｅＳＯ４、約５×１０−９ＭのＭｎＳＯ４、約５×１０−７Ｍの（ＮＨ４）６Ｍｎ７Ｏ２４、培地１Ｌあたり約０．５ｍｇのＮａ２ＳｅＯ３、約５×１０−１０ＭのＳｎＣｌ２２Ｈ２Ｏおよび約５×１０−５Ｍのカルバミルコリンからなり、該培地は約７．３の範囲に調節されたｐＨを有する。
【００１４】
本発明は、また約１６時間培地１ｍＬあたり１μｇのＮＮＫに曝された形質転換されたＢＭＲＰＡ１（ＢＭＰＲＡ．４３０）細胞を提供する。これらの細胞の例は、細胞系ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫである。ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫを注入されたマウスの腫瘍から由来する細胞系ＴＵＮＮＫも、また本発明により提供される。
【００１５】
本発明は、またＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されて約３９．０ｋＤまたは２Ｄゲル電気泳動により測定されて約４１．２ｋＤの分子量、約５．９−約６．９の等電点電気泳動のｐＩ、そしてＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＮＮＫ細胞、ヒト膵臓ガン細胞系ＣＡＰＡＮ１、ＣＡＰＡＮ２、Ａ５４９ヒト肺ガン細胞およびＢ１６マウス黒色腫細胞で検出可能を特徴とする実質的に純粋な形のガン関連抗原３Ｄ４−Ａｇを提供する。
【００１６】
ガン関連抗原３Ｄ４−Ａｇへの特異的な結合特異性を有する抗体も本発明により提供される。抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されて約４１．２ｋＤの分子量、約５．９−約６．９の等電点電気泳動のｐＩ、そしてＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＮＮＫ細胞、ヒト膵臓ガン細胞系ＣＡＰＡＮ１、ＣＡＰＡＮ２、Ａ５４９ヒト肺ガン細胞およびＢ１６マウス黒色腫細胞で検出可能であることを特徴とする。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルである。また提供されるのは、モノクローナル抗体ｍＡｂ３Ｄである。
【００１７】
本発明の他の構成では、抗原３Ｄ４−Ａｇと特異的に免疫応答可能なモノクロール抗体を生成するネズミ科のハイブリドーマ細胞系が提供される。
【００１８】
本発明は、また本明細書で記述された方法により生成されるハイブリドーマを提供し、そのハイブリドーマは、未形質転換細胞例えばＢＭＲＰＡ１そして形質転換細胞例えばＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の表面で抗原に結合する抗体を生成する。
【００１９】
これらの抗体が形質転換および未形質転換の細胞に結合するハイブリドーマにより生成される抗体例えばモノクローナル抗体ｍＡｂ４ＡＢ１およびｍＡｂ２Ｂ５も提供される。
【００２０】
ハイブリドーマがＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の抗原に結合するが未形質変換ＢＭＲＰＡ１細胞とは結合しない抗体を生成する、本発明の方法により生成されるハイブリドーマも提供される。
【００２１】
この抗体が形質転換細胞と結合するが未形質転換細胞と結合しないハイブリドーマにより生成される抗体例えばｍＡｂ３Ａ２も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、動物の免疫応答を免疫学的に弱いまたは稀な抗原に向けなおすことに関する。本発明によれば、（ｉ）例えば単一の点突然変異の結果として、２つのさもなければ相同の蛋白抗原が異なるかもしれないほとんどすべての抗原性エピトープの１つ以上に対して、または（ｉｉ）コンプレックス抗原の混合物内で低い頻度で存在するかまたは弱い免疫原性である任意の抗原に対して、多数の標的特異性ｍＡｂを生成する方法が提供される。得られる抗体は、動物特にヒトの種々の病状を診断および治療するのに使用できる。さらに、本発明は、標的特異性ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋−Ｔリンパ細胞）および細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋−Ｔリンパ細胞）を提供する。
【００２３】
本発明によれば、免疫抑制剤は、抗原の第一のセットによる宿主の完全な免疫化後すなわち一次および二次の免疫応答が完了した後に投与される。これは、以下のことを生ずる。（ｉ）初期（一次）応答Ｂ細胞クローン（免疫抑制剤を使用する他の方法におけるように）のみならず、最初のコンプレックス抗原混合物に存在する少ない免疫原、または二次免疫応答中のみすなわち第二および／または第三のブースト後のさらに低い頻度で存在する免疫原に応答するこれらのＢ細胞クローンの抑制／排除、（ｉｉ）クラススイッチをおこない、そして偶然の遭遇により新しい抗原（第二または第三のブースト）がコンプレックス抗原混合物に存在する免疫原の任意のものに対する高い親和性の抗体を生成しがちな記憶細胞を生成した応答／増殖Ｂ細胞クローンの排除、（ｉｉｉ）コンプレックス抗原混合物から処理された抗原のＡＰ（樹状細胞＞＞マクロファージ）によるプレゼンテーションに応答する増殖するヘルパーＣＤ４＋ＴＨリンパ細胞の排除。従って、関連するＢ細胞による混合物中の抗原のいくつかの最初の認識後のこれらのＴＨリンパ細胞の除去は、増殖するＢ細胞がクラススイッチ、より高い親和性および長期にわたって有効な抗体、そして特異的な記憶Ｂリンパ細胞の生成を必要とする助けを除くだろう。さらに、（ｉｖ）最初のコンプレックス抗原混合物に向かう長期にわたる（＞４月）免疫抑制の生成がある。
【００２４】
そのため、本発明の方法は、本発明が、さらに、天然および変性の形でそして抗原の１つ以上の第一のセットへの寛容化による免疫化後、所望の抗原の１つ以上の第二のセットによる免疫および超免疫の急速な連続を用いる点で、現在の方法とは異なる。これは、以下のことをもたらす。（ｉ）第一のコンプレックス抗原混合物に存在した抗原に対する動物の応答の連続する抑制の期間中抗原の第二のセットに対する抗体の力価の顕著な上昇、（ｉｉ）宿主動物の脾臓中への抗原の第二のセットに特異的な高い親和性の１つ以上の抗体を分泌する形質細胞の移動の増大。従って、宿主動物の脾臓中の形質細胞の比が、他の特異性に対して抗原の第二のセットに特異的なものを増加させる。その結果、ハイブリドーマ融合中、抗原の第二のセットに特異的な高い親和性の抗体を生成する形質細胞の数の脾細胞内の存在を増大させ、そしてそれは骨髄腫細胞と融合するだろう。これは、抗原の第二のセットに存在するユニークな抗原性決定因子に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを同定する機会を改善する。さらに、また（ｉｉｉ）抗原の第二のセットの分子の天然および変性の両方の形に対するモノクロール抗体（ｍＡｂ）の生成がある。二次後の免疫応答の免疫抑制剤による処理の繰り返しにより導入される、抗原の第一のセットに対する長期にわたる寛容の発生に加えて、関連するが別個の抗原の第二のセットによる選択的に免疫不全の宿主動物の次に急速な超免疫は、強いが制限されたすなわち標的に向かう免疫応答、並びに任意の新規な１つ以上の抗原および抗原性エピトープに対する抗体の生成を導く。超免疫された宿主動物中の抗原の高いレベルの第二のセットの連続する存在は、応答するＢ細胞に力を働かせて、多数に増殖させ、クラススイッチにより動かし、そして抗原の第二のセット内のユニークな抗原性決定因子の天然および／または変性した形と反応性の高い親和性の抗体を生成する形質細胞を選択する。次のハイブリドーマ融合のために選択される宿主動物の脾細胞内のこれら形質細胞の高頻度での存在は、望ましい１つ以上の特異性のｍＡｂを分泌するハイブリドーマの頻度を顕著に上げる。それゆえ、すべてを考えると、本発明の方法は、抗原のコンプレックス混合物内の抗原性決定因子を選択するｍＡｂを生成するのに、標準の免疫方法の使用よりも大きな利点をもたらす。
【００２５】
従って、本発明は、以下の工程からなる標的特異性モノクローナル抗体を生成する方法を提供する。始めに、動物は、抗原の第一のセットにより免疫化され、そして完全な免疫化に十分なようにブーストされて一次および二次の免疫応答が完了する。次に、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞のクローンを含む急速に増殖する免疫細胞（細胞毒性／サプレッサー細胞、ヘルパー細胞）の成長を阻害する免疫抑制剤が、免疫化動物に投与される。免疫抑制された動物は、次に抗原の第一のセットに関連するがそれとは別個の抗原（天然および変性された形）の第二のセットにより免疫化され、そしてその後十分にブーストされる。超免疫プロトコールは、抗原の第二のセットの追加のブースターを短時間内に受ける動物について続く。脾細胞は、動物から単離され、そしてハイブリドーマを生成する培養で無限に複製できる形質転換細胞または骨髄腫細胞と融合される。得られるハイブリドーマは、培養され、得られたコロニーは、所望のモノクローナル抗体の生成についてスクリーニングされる。抗体生成コロニーは、多量の所望の抗体を生成するために生体内または生体外で成長させる。
【００２６】
本発明の方法で使用される免疫抑制剤は、Ｂリンパ細胞およびＴリンパ細胞のクローンを含む急速に増殖する免疫細胞の成長を阻害するものでなければならない。特に有用な化合物は、アルキル化剤、代謝拮抗薬および天然物質のクラスのものを含む。これら化合物の例は、シクロスポリンＡ、ミコフェノレート、モフェチル、アザチオプリン、タクロリムス、レフルノミド、ミコフェノール酸、メルファラン、クロラムブシル、メトトレキサート、フルオルラシル、ビンクリスチン、ブスルファンおよびシクロホスファミドを含むがこれらに限定されない。好ましくは、シクロホスファミドが、本発明の方法の免疫抑制剤として使用される。
【００２７】
本発明の方法で使用される抗原は、脊椎生物の免疫応答を刺激するのに有効な任意の物質を含むことができる。従って、例えば、抗原は感染因子例えば細菌またはウイルスである。本発明で使用される抗原は、また単離された蛋白、ペプチドまたはこれらのフラグメントを含む。これらの蛋白、ペプチドまたはこれらのフラグメントは、感染因子または他の生体の源から単離されたものでも、化学的に合成されるかまたは組み換えにより生成されたものでもよい。さらに、小分子例えばハプテンは、本発明の方法において使用される抗原として機能できる。好ましくは、抗原は、感染因子または腫瘍細胞の表面蛋白である。さらに好ましくは、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）である。ＴＡＡは、黒色腫、乳腺ガン、前立腺腺ガン、食道ガン、リンパ腫および多くの他のものを含む多数の腫瘍について同定されてきている。Ｓｈａｗｌｅｒら（１９９７）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：３０９−３３７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照。
【００２８】
それゆえ、本発明の方法で使用される抗原は、（ｉ）それにより２つのさもなければ相同の１つ以上の蛋白抗原が例えば単一の点突然変異の結果として異なるほとんどすべての抗原性決定因子（エピトープ）、または（ｉｉ）コンプレックス抗原の混合物内で低頻度で存在するかまたは弱い免疫原性である任意の抗原からなる。２つの蛋白抗原は、もしそれらが付加、欠損または置換の任意の組み合わせによりアミノ酸配列に変異を有するが、それ以外では同じ官能性を有するか、または同じ官能性を共通にする蛋白から由来するフラグメントであるならば、相同である。それにより２つのさもなければ相同である１つ以上の蛋白抗原が異なる抗原性決定因子（エピトープ）の特異的なモノクローナル抗体、またはコンプレックス抗原の混合物内で低頻度で存在するかまたは弱い免疫原性である抗原に特異的であるモノクローナル抗体を生成するために、関連するが別個の抗原の２つのセットが使用される。
【００２９】
抗原の２つの関連するが別個のセットは、いくつかの手段により得ることができる。例えば、細胞は、第一の組織源から単離されそして抗原の第一のセットとして使用できるが、一方同じ生物からの第二の組織源からの細胞は、抗原の第二のセットとして使用できる。抗原の第一のセットおよび第二のセットの源として利用できる細胞の例は、異なる膵臓の組織からの細胞例えば管細胞、中心腺房細胞、腺房細胞および島細胞を含む。他の例では、多くのタイプの脳細胞が前駆細胞から由来するとき、脳組織の異なる層が使用できる。なお他の例では、甲状腺細胞および上皮小体細胞が抗原の第一および第二のセットとして利用できる。副腎の組織も、抗原の第一および第二のセットとして働くことのできる異なる細胞のタイプから作られる。また他の例では、卵巣ガン特異性抗原は、一次抗原として患者から病気にかかっていない卵巣から単離された細胞そして二次抗原として同じ患者から単離された細胞を使用して単離できる。
【００３０】
本発明の方法は、ＴＳＡおよびＴＡＡに対するｍＡｂを生成するのに特に有用であり、ＴＳＡおよびＴＡＡは、上記のように、しばしば、未形質変換母細胞に既に存在している分子の僅かな改変により由来する。これらＴＳＡおよびＴＡＡは、従って、多数の存在する他の免疫優性の抗原の中で認識できない。ＴＳＡおよびＴＡＡは、また、受動免疫応答のみが宿主に発生するかまたは全く免疫応答が発生しないような小さい数で存在する。そのため、例えば、ＴＳＡおよびＴＡＡについて、未形質転換細胞系および形質転換腫瘍細胞系は、類似の抗原または関連するが別個の抗原の第一および第二のセットとして使用できる。腫瘍形質変換は、Ｋ−ｒａｓガン突然変異およびｐ１６腫瘍サプレッサー遺伝子プロモーターを経て生じ、ｐ１６蛋白発現の損失を招くことが知られている（Ｂｅｌｉｎｓｋｙら、１９９８）。従って、細胞は、Ｋ−ｒａｓガン突然変異からなるプラスミドまたはヌクレオチド配列からなるプラスミドのようなベクター（ｐ１６腫瘍サプレッサー遺伝子を不活性化できる）により形質転換される。さらに、細胞を種々のニトロソアミン（４−（メチル−ニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１ブタノン（ＮＫＫ）を含む）に曝すことは、ＤＮＡおよび蛋白の付加物、ＤＮＡ鎖切断および遺伝子の突然変異の形成を生ずることが示されている（Ｃｕｒｐｈｅｙら、１９８７、Ｖａｎ  Ｂｅｎｔｈｅｍら、１９９４、Ｓｔａｒｅｔｚら、１９９５、Ｈｅｃｈｔ、１９９６）。ニコチン由来ＮＮＫおよびその代謝物４−（メチル−ニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノール（ＮＮＡＬ）は、実験室動物で膵臓腫瘍を生成するのに有用であり（Ｈｏｆｆｍａｎら、１９９４）、そして膵細胞の腫瘍形質転換を誘導するのに特に有用である。膵細胞をＮＮＫに曝す時間は、約６時間から約６０時間の任意の時間に及ぶ。暴露の好ましい範囲は、約１２−約２４時間である。約１６時間の暴露時間が特に好ましい。
【００３１】
正常の細胞を腫瘍細胞に形質転換することが知られている広範囲の発ガン性物資が存在する。本発明によれば、細胞は、腫瘍細胞を生成するために、種々の化合物に曝される。これら化合物の例は、ニトロソアミン例えばＮＮＫ並びに他の群例えばアルキル化剤、アルアルキル化剤、アリールアルキル化剤、アリールアミン化剤および多環芳香族炭化水素を含むが、これらに限定されない。これらの化合物および腫瘍細胞を生ずるためのこれらの化合物の使用は、種々の文献、例えばＤｅｖｉｔａ  Ｊｒ．Ｖ．Ｔ．ら編「Ｃａｎｃｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｅｎｓ，Ｐｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，６ｔｈ  ｅｄ．中のＹｕｓｐａ，Ｓ．Ｈ．ら、「Ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ；ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ」ｐｐ．１７９−１９３（この記述は、本明細書で参考として引用される）に記載されている。前記の発ガン性物質は、限定的なものではなく、ただの例示に過ぎない。多くの異なる発ガン性物質が使用されて、本発明の方法を実施するのに有用なＴＡＡまたはＴＳＡを発生するための腫瘍細胞を生成できる。
【００３２】
動物の源から直接採られた腫瘍性組織または細胞は、しばしば、正常細胞およびガン細胞の混合物並びに結合組織およびプロテアーゼを含む。そのため、形質転換された細胞系は、好ましくとは、本発明の方法では抗原または抗原の源として使用される。未形質転換の母細胞系は、抗原の第一のセットとして使用でき、一方腫瘍形質転換されたそれらから由来する細胞系は、関連（類似）しているが別個の抗原の第二のセットとして使用できる。
【００３３】
本発明の方法によれば、上記の消去式免疫（ｉｍｍｕｎｏｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）超免疫プロトコール（「ＩＳＨＩＰ」）が、標的に向かう抗体を生成するのに使用されてきている。一般的な方法は、「寛容導入の標的に向かう抗体の生成」ともよばれるが、さらに以下に詳述される。
【００３４】
プロトコールの開始（０日目）で、動物は、免疫前の血清を採血される。好ましくはマウスである動物は、コンプレックス抗原プロフィル「Ａ」とよばれる抗原の第一のセットにより免疫化される。好ましくは、抗原の第一のセットは、腹腔内（ｉｐ）または皮下（ｓｃ）の注入により投与される。さらに、生細胞および固定細胞の混合物は、好ましくは、抗原の第一のセットすなわちコンプレックス抗原プロフィル「Ａ」として使用される。例えば、ｉｎｆｒａと記載されるＢＭＰＲＡ．４３０細胞は、コンプレックス抗原プロフィル「Ａ」として使用できる。固定細胞に使用できる化合物およびこれら化合物の処方は、当業者に周知であり、そして例えばホルムアルデヒド、グルタールアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドを含む。パラホルムアルデヒドが、本発明の方法で細胞を固定するのに使用される。
【００３５】
動物は、次に生および固定のコンプレックス抗原プロフィル「Ａ」の混合物により２倍にブーストされる。１２−１５日目に、第一のブースター注入は、０日目の注入に使用された細胞数または蛋白濃度の５０％での例えば生／固定コンプレックス抗原プロフィル「Ａ」の腹腔内注入により、行われる。１８−２１日目で、第二のブースター注入がなされ、そして０日目と同じ濃度での生／固定コンプレックス抗原プロフィル「Ａ」からなる。好ましくは、第二のブースターは、皮下投与による。
【００３６】
動物は、次にベースラインの体重を求めるために体重を測られ、それは、以後免疫抑制剤の効果を決定するのに使用される（以下に詳細に述べられる）。第二のブースター注入約４−２４時間後に、動物は、免疫血清を得るために採血され、そして血清は抗原プロフィル「Ａ」に対する抗体についてテストされる。
【００３７】
次の５日間（２３−２６日目）、動物は、毎日秤量され、次に免疫抑制剤例えばシクロホスファミドを、滅菌生理学的食塩水で希釈された６０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。好ましくは、シクロホスファミドの投与は、腹腔内（ｉｐ）注入による。処置の代表的なスケジュールは、以下の通りである。第二のブースター注入２４時間後に、動物を秤量し、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内に投与する。第二のブースター注入４８時間後、動物を再び秤量し、そして、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内に投与する。第二のブースター注入７２時間後、動物を再び秤量し、そして、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内に投与する。第二のブースター注入９６時間後、動物を再び秤量し、そして、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内に投与する。最後に、第二のブースター注入１２０時間後、動物を再び秤量し、そして、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｋｇ体重で腹腔内に投与する。好ましくは、シクロホスファミドの投与は、ｉ．ｐ．による。
【００３８】
シクロホスファミド処置動物における２−１０％の観察された体重の損失は、この薬剤による処置が、動物の飼料および液体の摂取を低下させる効果を有するため、薬剤の作用の一般的な指標である。シクロホスファミドの最後の注入後、動物は、約１０−１２日間毎日秤量される。この期間の終わりに、動物は、処置前の体重を回復する。シクロホスファミド以外の免疫抑制剤の効果の指標は、適切な場合、もちろん使用できる。例えば、血液サンプルを採り、血小板および白血球細胞（ＷＢＣ）のレベルを測り、そのレベルは、免疫抑制剤の処置後低下することが予想されるだろう。血液を次に免疫化動物から集め（３３−３６日目）、そして免疫血清中の抗体の力価は、抗原プロフィルＡ（例えば、ＢＭＲＰＡ．４３０細胞）に対し、そして密接に関連するが別個の抗原の第二のセットに対して得られる。それに対して動物が免疫応答をするように向けられつつあるのは抗原のこのセットであり、すなわち改変抗原プロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」である。好ましくは、抗原の第二のセットは、形質変換した細胞、例えばＢＭＲＰＡ．４３０．ＮＮＫまたはＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ（ｉｎｆｒａと記載される）とよばれる形質転換した細胞系からなる。血液サンプルは、免疫前の血清並びに第二のブースト５時間後すなわち第一のシクロホスファミド注入直前に採られた血清によりテストされる。予想される結果は、以下の表１に示される。
表  １
テスト抗原
Ａｇプロフィル「Ａ」  Ａｇプロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」
免疫前血清                    ０                            ０
血清、１８−２１日目        ＋＋＋                      ＋＋／＋＋＋
血清、３３−３６日目          ０                            ０
免疫抑制されたマウスは、抗原プロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」細胞（例えば、生（５０％）およびパラホルムアルデヒド固定（５０％）細胞の混合物、ここではＢＭＲＰＡ．４３０．ＮＮＫ細胞）による３７日目の腹腔内または皮下注入により免疫化される。
【００３９】
抗原プロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」（すなわち、生／固定細胞混合物）の第一のブースターは、３７日目の注入の細胞数の５０％で４９−５２日目に腹腔内注入により投与される。抗原プロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」（すなわち、生／固定細胞混合物）の第二のブースターは、３７日目の注入の細胞数の７５％で５５−５８日目に腹腔内注入により投与される。
【００４０】
血清は、次にテストのために集められ、そして以下の超免疫プロトコールが行われる。６０−６３日目に、抗原プロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」のブースターが、３７日目に使用された投与レベルで投与される。６２−６５日目に、第四のブースター注入が、６０−６３日目の注入の繰り返しとして投与される。好ましくは、投与は、ｓ．ｃ．注入による。６４−６７日目に、第五のブースター注入が、３７日目に注入された抗原プロフィル「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」の１．５倍の量で投与される。６６−６９日目に、第六のブースター注入が投与され、それは６４−６７日目の注入の繰り返しである。これら最後の２つのブースターは、好ましくはｉ．ｐ．注入により投与される。
【００４１】
６８−７１日目に、第七のブースター注入が投与され、それは６４−６７日目の注入の繰り返しである。７０−７３日目（融合日−２日）に、第八のブースター注入が投与され、それは６４−６７日目の注入の繰り返しである。
【００４２】
７１−７４日目に、血清を免疫化した動物から採取し、そして個々に、抗原プロフィル「Ａ＋」および「Ａ＋ｎａ」並びに「Ａ」そしてそれに対して動物が曝されていない抗原すなわち無関係な抗原または細胞（Ｉｒ−Ａｇ）の群に対し抗体の存在についてテストした。予想された結果を以下の表２に示す。
表  ２
テストされたＡｇプロフィル
「Ａ」  「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」      「Ｉｒ−Ａｇ」
血清、３３−３６日目        ０                ０                      ０／＋
血清、５５−５８日目        ０                ＋＋                      ０
血清、７１−７４日目      ０／＋            ＋＋＋＋                  ０／＋
７２−７５日目に、脾細胞が、７１−７４日目のテストにおける血清抗体の力価により規定されるように、１匹以上のマウスから融合について単離され、そして血清を、抗原プロフィル「Ａ＋」および「Ａ＋ｎａ」並びに「Ａ」および「Ｉｒ−Ａｇ」に対する抗体の存在に関する追加のテストのために集める。
【００４３】
上記のように、免疫化動物から得られた脾細胞は、培養で無期限に複製可能な形質転換された細胞または骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成する。ハイブリドーマを生成する方法は、当業者に周知であり、そして例えばＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）およびＰｙｔｏｗｓｋｉ（１９８８）（これらの記述は本明細書で参考として引用される）に記載された方法を含む。個々のハイブリドーマ細胞はクローン化され、そしてクローンは、「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」に対する抗体の生成についてテストされる。例えば、ハイブリドーマの上澄み物は、抗原特異性抗体反応物についてスクリーニングされる。一度抗原「Ａ＋」または「Ａ＋ｎａ」と反応する抗体を生成するハイブリドーマ細胞系が同定されると、細胞は凍結保存されて、長期間の供給を確かめる。これらの細胞系は、次にさらなる抗体が必要なとき解凍されて、長期の供給を確実にする。
【００４４】
目的とする抗体は、診断薬および治療薬において異なる用途を見いだす。診断の用途では、本発明により生成した抗体は、抗原との交差反応性を免疫学的に決定する手段として使用できる。例えば、本発明により生成した抗体は、同じ抗原の異なる抗原性決定因子（エピトープ）と反応でき、そして診断薬またはコントロールとして有用である。さらに、腫瘍細胞のあるタイプに特異的な目的とする抗体は、そのような腫瘍細胞に生ずる変化を示すのに有用であり、そして患者の治療をモニターするのに有用である。例えば、腫瘍細胞が死ぬと、抗原は血液および血清中に流れ、そのため目的とする抗体は、腫瘍細胞に生ずるこのような変化を決定するのに有用である。さらに、本発明により生成した抗体は、特異的な抗原例えば腫瘍特異性抗原と反応し、単独で投与されるかまたは細胞毒性薬剤と一緒に投与されて、治療薬として有用である。
【００４５】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００４６】
膵細胞系ＢＭＲＰＡ．４３０の腫瘍形質転換による細胞系ＢＭＲＰＡ．４３０．ＮＮＫ（ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ）の生成
材料：１６４０ＲＰＭＩ培地、ペニシリン−ストレプトマイシン原料溶液（１００００Ｕ／１００００ｍｇ／ｍＬ）（Ｐ／Ｓ）、Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ´−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸を含む０．２％トリブシン（トリプシン−ＥＤＴＡ）並びにトリパンブルーは、すべてＧＩＢＣＯ（ニューヨーク）から得た。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（アトランタ、ＧＡ）から得た。ＤｕｌｂｅｃｃｏのＣａ２＋およびＭｇ２＋なしのＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）並びに完全な培地用のすべての微量元素は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（セント・ルイス、ＭＯ）から購入した。組織培養フラスコ（ＴＣＦ）は、Ｆａｌｃｏｎ−Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（マウンテン  ビュー、ＣＡ）から得られ、組織培養皿（ＴＣＤ）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（カミング、ＮＹ）から得られ、２４穴組織培養プレート（ＴＣＰ）および９６穴ＴＣＰは、Ｃｏｓｔａｒ（ケンブリッジ、ＭＡ）から得られた。フィルターはＮａｌｇｅｎｅ（ロチェスター、ＮＹ）から得られた。
【００４７】
コンプレックスＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）細胞培地の調製：ｃＲＰＭＩは、ＲＰＭＩ、グルタミン（０．０２Ｍ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．０２Ｍ）、酢酸に溶解したウシインスリン（０．０２ｍｇ／ｍＬ酢酸／Ｌ培地）、ヒドロコーチゾン（０．１μｇ／ｍＬ）、ＺｎＳＯ４（５×１０−７Ｍ）、ＮｉＳＯ４６Ｈ２Ｏ（５×１０−１０Ｍ）、ＣｕＳＯ４（１０−８Ｍ）、ＦｅＳＯ４（１０−６Ｍ）、ＭｎＳＯ４（１０−９Ｍ）、（ＮＨ４）６Ｍｎ７Ｏ２４（１０−７Ｍ）、Ｎａ２ＳｅＯ３（培地１Ｌあたり０．５ｍｇ）、ＳｎＣｌ２２Ｈ２Ｏ（５×１０−１０Ｍ）を含む微量元素およびカルバミルコリン（１０−５Ｍ）により調製され、そしてｐＨは７．３に調節された。培地は滅菌濾過された。
【００４８】
細胞および培養：ＢＭＲＰＡ．４３０（ＢＭＲＰＡ１）は、正常のラットの膵臓から確立された自発的に不死にされた細胞系である（Ｂａｏら、１９９４）。ＴＵＣ３（ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２）は、コドン１２（Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ）で発ガン性突然変異を有する活性化されたヒトＫ−ｒａｓを含むプラスミドによるトランスフェクションにより形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞である（Ｄｒ．Ｍ．Ｐｅｒｕｃｈｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）。すべての細胞系は、ｃＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）を用い９５％空気−５％ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃で日常的に維持される。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡにより継代される。細胞は、有効成分のない（ｓｐｅｎｔ）培地５０％、並びに１０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを有する新鮮なｃＲＰＭＩを含む凍結培地５０％からつくられた混合物中で凍結保存される。細胞の生存は、トリパンブルーの排除により評価された。
【００４９】
ＮＮＫ暴露：発ガン物質を含む培地のすべての調製物は、規定された保護的手段を使用してＮＣＩによりデザインされしかも証明された化学フード内で別の実験室内でつくられた。ＮＮＫ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＮＹ）は、ＰＢＳ中の１０ｍｇのＮＮＫの原料溶液として調製され、そしてＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩに添加して、１００、５０、１０、５および１μｇ／ｍＬの最終濃度にした。継代３６（ｐ３６）のＢＭＲＰＡ１細胞を１０５／６０ｍｍＴＣＤで接種し、そして６日間成長させた。次に、培地を取り出し、異なる濃度のＮＮＫを含むＦＢＳのないｃＲＰＭＩ（４ｍＬ／ＴＣＤ）により細胞を処理する前に、予め加温した（３７℃）ＦＢＳのないｃＲＰＭＩにより細胞を２回洗った。ＢＭＲＰＡ１細胞を含むＴＣＤの６番目のセットを、ＮＮＫなしのＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩでインキュベートし、そしてコントロールとして使用した。異なる培養条件の６つのセットのそれぞれについて使用される８つのＴＣＤは、３７℃かつ９５％空気−５％ＣＯ２のインキュベーターに戻した。１６時間後、ＮＮＫ含有培地をすべてのＴＣＤから取り出し、細胞をＰＢＳにより３回洗い、次に新鮮なｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ（４ｍＬ／ＴＣＤ）を添加し、そしてインキュベーションを続けた。ＮＮＫのないコントロール培地は、平行して処理された。有効成分のない培地の１／２を新鮮なｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳにより置換することにより２日置きに細胞に養分を与えた。十分に密集成長したとき、細胞をすべてのＴＣＤから集め、それぞれの群の細胞をプールし、そして新鮮なＴＣＤに２×１０４で継代した。
【００５０】
コロニーの単離：形質転換した細胞の個々のコロニーから細胞を取り出すことを助けるために、コロニーを含む細胞培養物を１０５細胞／１００ｍｍＴＣＤで再接種し、そして７日間成長させた。滅菌パスツールピペットの細い末端を火にあて、急に延ばし、そしてその最も細い点で壊して、細胞の多いコロニーの芯のみを拾い上げるのに十分なほど細かく延伸されたガラス針を作った。ＮＮＫ処理細胞のみが細胞の多いボール状のコロニーを含んだ。８つの顕著なコロニーの中心の芯を取り出し、〜８０−２００の緊密に詰まった細胞からなるそれぞれの芯を、２４穴の皿のそれぞれである別々の穴に入れた。このように移された４つのコロニーの細胞は、生存しそして増殖した。
【００５１】
細胞成長のアッセイ：１０％ＦＢＳでの細胞の成長を測るために、細胞を、４ｍＬのｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳを含むＴＣＤ６０ｍｍあたり５×１０４細胞で接種した。３日置きに、３つのＴＣＤを、検討中のそれぞれの細胞系について取り出し、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにより離し、そしてトリパンブルーの存在下カウントした。低下したＦＢＳ濃度を含むｃＲＰＭＩの細胞成長に対する効果を評価するために、同じ数（１．５×１０４細胞／ｍＬ／穴）のＮＮＫ処理および未処理のＢＭＲＰＡ１細胞を、２４穴ＴＣＤの３つの穴に接種した。細胞をｃＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳで１晩接着させ、ＰＢＳにより洗い、そして指示された％のＦＢＳを含むｃＲＰＭＩにより再インキュベートした。細胞の成長を、クリスタルバイオレット相対的増殖アッセイ（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９７）の改変により評価した。簡単にいえば、細胞をＰＢＳで洗い、１０％緩衝液含有ホルマリンで固定し、次に蒸留水で濯ぐ。細胞を次に０．１％クリスタルバイオレットにより３０分間室温（ＲＴ）で染色し、ｄＨ２Ｏにより洗い、そして乾燥した。細胞に結合した染料は、１ｍＬの１０％酢酸により抽出され、ｄＨ２Ｏにより１：２に希釈され、そしてＯＤ６００ｎｍ測定のために９６穴のマイクロタイタープレートに移された。細胞の成長は、２４時間でのＯＤ６００ｎｍ値の読みに対して計算された。
【００５２】
ＢｒｄＵの組み込み：細胞（５×１０４）を６０ｍｍのＴＣＤに置き、そしてｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳで成長させた。３日後、ＢｒｄＵ（１０ｕＭ）を含む新鮮な培地を３時間加え、細胞を洗い、トリプシン−ＥＤＴＡにより離し、そして組み込まれたＢｒｄＵを、製造者（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により示唆されたように、ＦＡＣＳ分析によりＦＩＴＣ共役抗ＢｒｄＵ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により検出した。簡単にいえば、１０６トリプシン−ＥＤＴＡ離脱細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡにより２回洗い、７０％エタノールで３０分間固定し、そしてＲＮＡアーゼ（０．１ｍｇ／ｍＬ）中に３０分間３７℃で再懸濁した。細胞を洗った後、それらのＤＮＡを２ＮのＨＣｌ／トリトンＸ−１００により３０分間変性し、そして０．１ＭのＮａ２Ｂ４Ｏ７１０Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．５により中和した。細胞を次に０．５％ツィーン２０を含むＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗い、そして２０μＬのＦＩＴＣ−抗ＢｒｄＵ抗体を含むＰＢＳ−１％ＢＳＡ溶液中の０．５％ツィーン５０μＬに再懸濁した。３７℃で４５分後、細胞を洗い、プロピジウムヨーダイド（０．００５ｍｇ／ｍＬ）およびＲＮＡアーゼＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含むクエン酸ナトリウム緩衝液１ｍＬに再懸濁した。組み込んだＢｒｄＵおよびＰＩ染色を検出するための蛍光活性化細胞選別またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析は、４８８ｎｍの励起波長を使用してアルゴンイオンレーザーを備えたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．からのＦＡＣＳｃａｎ分析器を使用することにより、行われた。データの分析は、ＬＹＳＹＳ  ＩＩプログラムを使用して行われた。
【００５３】
独立したサンプルテストは、ＢｒｄＵを組み込む未形質変換および形質転換の細胞の統計上有意差％（ｐ＜０．０５）を示すのに使用された。ＤＮＡ指標は、（未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞のＧ０／Ｇ１ピークに関するＰＩ染色測定）により（調べられた形質転換細胞のＧ０／Ｇ１ピークに関するＰＩ染色測定）を除した比として、ＤＮＡヒストグラムから既述（Ｂａｒｌｏｇｉｅら、１９８３、Ａｌａｎｅｎら、１９９０）されたように計算された。
【００５４】
足場非依存性成長：４ｍＬの０．５％寒天−培地混合物（寒天は６４ｍＬのＨ２Ｏ中でオートクレーブにかけられ、水浴中で５０℃に冷やされ、そして１５ｍＬの５×ｃＲＰＭＩ、１９ｍＬのＦＢＳおよび１ｍＬのＰ／Ｓに添加された）を、２５ｃｍ２のＴＣＦに注ぎ、そして１晩４℃で硬化した。細胞を植える前に、フラスコをＣＯ２−空気のインキュベーターに５時間まで３７℃で置き、ｐＨおよび温度の平衡を助けた。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで集め、０．１ｍＬの細胞懸濁物（ｃＲＰＭＩ中の４００００／ｍＬ細胞）をそれぞれのフラスコの寒天の表面上に注意深く分散させ、そして培養物を９５％Ｏ２−５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに戻した。２４時間後、寒天で被覆されたＴＣＦを逆さにして、過剰の培地を流した。培養物を、ツアイスの倒立顕微鏡を使用してコロニーの成長について９日後および１４日後に顕微鏡で調べた。
【００５５】
Ｎｕ／Ｎｕマウスの腫瘍発生性：Ｎｕ／Ｎｕマウス（７週令）をＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（インディアナポリス、ＩＮ）から得た。注入に使用される細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡにより離され、ｃＲＰＭＩで洗い、そして１０８細胞／ｍＬでＰＢＳに再懸濁された。テストされるそれぞれのマウスに、０．１ｍＬのこの細胞懸濁物を皮下（ｓ．ｃ．）注入した。動物について始めの４週間毎日腫瘍の進展を調べ、次に１週の間隔で調べた。小片の腫瘍（１−２ｍｍ３）を腫瘍の芯から切り取り、そして４％パラホルムアルデヒドに１晩４℃で置いた。組織を次にＰＢＳで洗い、そして３０％しょ糖にさらに２４時間置いた。ＬＩｐｓｈａｗ包埋マトリックス（ピッツバーグ、ＰＡ）で冷凍された腫瘍の組織の切片をＪｕｎｇクリオスタット（Ｌｅｉｃａ）で作り、ゼラチン被覆スライドに置き、そして−２０℃で貯蔵した。Ｈ＆Ｅ染色は、標準の方法により行われた。
【００５６】
切除したＮｕ／Ｎｕマウスの腫瘍からのＴＵＮＮＫ細胞系の確立：Ｎｕ／Ｎｕマウス中に皮下に移植されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞から成長した腫瘍から細胞を単離することは、いくつかの方法上の変化をともなうＡｍｓｔｅｒｄａｍ，Ａ．ら、１９７４，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６３：１０３７−１０５６により記載された方法に類似した方法でなされた。腫瘍を有するＮｕ／Ｎｕマウスを、ＣＯ２窒息により殺し、氷冷したベッドに置き、腫瘍を覆っている皮膚を開き、そして腫瘍を急速に外科的および滅菌的に取り出し、そして急速な処置のため氷上のＬ−１５培地（ＧＩＢＣＯ、グランドランド、ＮＹ）に入れた。氷冷のＬ−１５培地にある間、組織を小さい片に刻み、次に２サイクルの酵素的消化および機械的な破壊を行った。Ｌ−１５培地の消化混合物は、コラゲナーゼ（１．５ｍｇ／ｍＬ）（１３６Ｕ／ｍｇ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）、大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）（０．２ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）、並びにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；結晶化）（２ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）からなった。始めの消化サイクル（２５分、３７℃）後、細胞を組織のフラグメントを２５０×ｇでペレット化し、そしてＳＢＴＩ（０．２ｍｇ／ｍＬ）、ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬ）、ＥＤＴＡ（０．００２Ｍ）およびＨＥＰＥＳ（０．０２Ｍ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．インディアナポリス）を含む氷冷のＣａ＋＋およびＭｇ＋＋のないホスフェート緩衝塩水（ＰＤ）（Ｓ−Ｂｕｆｆｅｒ）で１回洗った。細胞を再びペレット化し、消化混合物に再懸濁し、そして第二の消化サイクル（５０分、３７℃）にかけた。まだ消化混合物にある間、残った細胞の塊を、サイズが小さくなる針を付けた注射器およびピペットを使用して細胞懸濁物をピペットで移すことを繰り返して破壊した。細胞懸濁物を次に滅菌２００μメッシュおよび２０μメッシュのナイロン製Ｎｙｔｅｘ格子（Ｔｅｔｋｏ  Ｉｎｃ．エルムスホード、ＮＹ）を通して逐次分け、Ｓ−Ｂｕｆｆｅｒで洗い、そして２−３ｍＬのＬ−１５培地に再懸濁し、５０×ｇで５分間４℃で遠心分離した。細胞のペレットを集め、ＰＢＳで洗い、そしてｃＲＰＭＩに再懸濁した。フラクションのサンプルを、トリパンブルー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．）排除（Ｍｉｃｈｌ  Ｊ．ら、１９７６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４４（６）、１４８４−９３）によるＪｏ生存細胞カウンティングについて、そして細胞化学的分析について処理した。細胞を、６穴ＴＣＤの３５ｍｍあたり１０５細胞でｃＲＰＭＩに接種し成長させた。
【００５７】
顕微鏡写真：細胞培養物のすべての観察および写真は、Ｌｅｉｔｚカメラおよび位相差光学装置を備えたＬｅｉｔｚの倒立顕微鏡でなされた。観察は、ＴＭＸ  ＡＳＡ１００モノクロームフィルムに記録された。
【実施例２】
【００５８】
ＮＮＫのＢＭＲＰＡ１形態に対する効果：ＮＮＫおよびニトロソアミンへの暴露の繰り返しは、膵臓ガンの種々のけっ歯動物およびヒトの生体外実験モデルにおいて細胞毒性およびガンの形態上の改変を誘導することが観察された（Ｊｏｎｅｓ、１９８１、Ｐａｒｓａ、１９８５、Ｃｕｒｐｈｅｙ、１９８７、Ｂａｓｋａｒａｎら、１９９４）。これらの変化がＮＮＫへの単一の暴露そして比較的低いＮＮＫ濃度で誘導されるかどうかを決定する目的で、細胞を、１６時間の１回の期間１００、５０、１０、５および１μｇＮＮＫ／ｍＬを含む無血清培地に曝した。膵細胞による従来の研究で観察されるように、高い濃度のＮＮＫは、弱く付着し退化した死んだ細胞からなる細胞毒性の変化を生じ、そして細胞の成長を遅くし、一方これらの変化は、５および１μｇＮＮＫ／ｍＬに曝された細胞においてかなり少ないことが観察された。１００、５０および１０μｇＮＮＫ／ｍＬによる処理の退化的変化は、１週以内に、紡錘体の形態および巣状過密のような腫瘍性の形質転換を示す表現型の変化を出現させた。１μｇ／ｍＬでＮＮＫにより処理されたＢＭＲＰＡ１細胞は、また腫瘍性の形質転換を特徴とする表現型の変化を示したが、遅い速度で数週間を要した。他の突然変異原について示唆されたように（Ｓｔｒｉｖａｓｔａｖａら、１９８８）、低い投与量で観察された変化は、ヒトの環境で遭遇するそれらに近い投与量で、ＮＮＫ誘導病変の特異的かつ選択的な分子部位をより反映していると思われる。その上、１μｇ／ｍＬにおけるこれらの変化の漸進的な速度は、ＮＫＫ誘導形質転換の過程における初期および後期の両者の事象の継代毎の研究を可能にする。従って、以下に示される結果は、１μｇ／ｍＬ無ＦＢＳ培地に１回１６時間曝されたＢＭＲＰＡ１細胞により得られた。
【００５９】
３５継代で培地で連続的に成長したＢＭＲＰＡ１細胞を、形質転換し接触阻害された上皮細胞の代表的な単層の丸石様のパターンに整えた（図１Ａ）。１μｇＮＮＫ／ｍＬへの暴露２週間後、ＢＭＲＰ１細胞は、細かい形態上の変化を示し、いくつかの分かれた領域における細胞は、それらの多角形の形状を失い始め、そして細胞の島は、細胞質の少ない紡錘形の細胞からなり、そしてより黒い核が形成し始めた（図１Ｂ、ｐ２）。継代６（ｐ６）から始まって、密に詰まった紡錘細胞の鎖の頂部およびその内部の円形細胞の数が増加することが観察可能であり（ｐ６−８）、接触阻害剤の損失を示唆した（図１Ｃ）。
【００６０】
密集細胞の島状領域（細胞増殖巣）は、ｐ７までに明らかになり（図１Ｄ、矢印の先端）、そして細胞のボール状凝集は、コロニーとしてこれらの細胞増殖巣の頂部に形成し始めた（ｐ７−１１）。第一の明らかに明確なコロニーが、ＮＮＫ暴露約３月後、ｐ８−９で見られた。最初に、コロニーは小さく（図１Ｄ、矢印）そして数は僅かに過ぎないが、それらは、ＮＮＫ処理ＢＭＲＰＡ１細胞が継代されたすべての６ＴＣＦで存在した。コロニーは、遙かに低下した付着性を有する密集した塊（図１Ｅ）として水平かつ垂直に成長し続け、例えば密集した細胞は、トリプシン処理および繰り返されたピペット処理により容易に分離可能であり、それは、これらの培養物は腫瘍細胞からなると思われることを示している。これらのコロニーのトリプシン処理による急速な破壊は、形質転換ＢＭＲＰ４３０（ＢＭＲＰＡ１）細胞とは直接的に反する。ＮＮＫなしの無ＦＢＳのｃＲＰＭＩへ１６時間暴露後に平行に連続的に培養されたコントロールＢＭＲＰＡ１細胞は、どんな変化も示さず、そしてＢＭＲＰＡ１細胞の最初の単層から区別できなかった。
【００６１】
コロニー形成細胞の表現型および分子の特徴の研究を助けるために、いくつかのコロニーの芯は、細かく延伸されたガラス針により単離され、そして８０−２００細胞の単離物は、「クローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ」とよばれる細胞系として別々に成長させた。単離された細胞は、紡錘形から三角形を示し、そしてしばしば、１つ以上の顕著な仁を含む異なるサイズの核を有する多核化された。新しいフラスコに再接種したとき、これらの細胞は、細胞増殖巣およびコロニーを形成する能力を維持した（図１Ｆ）。興味のあることに、ＮＮＫ形質転換ＢＭＲＰＡ１に見られるＮＮＫ誘導表現型の変化は、ヒトの発ガン性Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２によるＢＭＲＰＡ１の形質転換中観察されるものと同じであるかまたはそれよりも顕著ではない。Ｈ＆Ｅ染色後肉眼的（図２Ａ）および顕微鏡的（図２Ｃ）で容易に観察できるＮＮＫ誘導好塩基性細胞増殖巣は、また発ガン性のＫ−ｒａｓＶａｌ１２によるトランスフェクションにより形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞により形成されるものと類似している（図２Ａおよび２Ｄ）。対照的に、細胞増殖巣またはコロニーの何れも、未処理ＢＭＲＰＡ１細胞の成長中形成されなかった（図２ＡおよびＢ）。ＢＭＲＰＡ１細胞におけるＮＮＫにより誘導された形態上の変化は、また生体外で培養された他の形質転換した細胞の十分に確立された特徴、すなわち低細胞密度での紡錘形および三角形の細胞の形状、高細胞密度での輪状の外見を有する円形の細胞の形状並びに細胞増殖巣およびそれらの隣接する細胞の頂部の成長により示される接触阻害の損失に類似している（Ｃｈｕｎｇ、１９８６）。
【００６２】
ＮＮＫ誘導超増殖：ＢＭＲＰＡ１細胞の増殖に対するＮＮＫの長期の永久的な効果は、最初に、１０％ＦＢＳを補給されたコンプレックス培地（ｃＲＰＭＩ）で培養されたＮＮＫ処理および未処理の細胞の細胞成長を比較することにより評価された。ＢＭＲＰＡ１、未クローン化ＮＮＫ処理ＢＭＲＰＡ１細胞および「クローン化」ＢＭＲＰＡ１ＮＮＫ細胞すなわちこの実施例で上記で生成された単離された細胞を、ＴＣＤに等しい密度で接種された。予定された日で、ＴＣＤの細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡにより離され、集められ、そしてトリパンブルーの存在下カウントされた。図３に示されるように、継代４６（ｐ４６）での未処理ＢＭＲＰＡ１細胞は、約９日目でプラトーに達し、接触阻害された成長を示した。対照的に、ＮＮＫ処理１１継代後に関する平行に成長させたＮＮＫ処理細胞は、始めの９日間早い成長を示し（図３）、そしてその後成長は、恐らくＮＮＫにより影響をうけなかった未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞の連続した存在により、遅くなった。ＮＮＫ誘導コロニーの芯から単離したクローン化ＢＭＲＰＡ．１ＮＮＫ細胞は、未処理ＢＭＲＰＡ１細胞よりかなり早い速度で培養の１２日を通して妨げられることなく成長を続け、非常に密な密集過密を生じた。
【００６３】
細胞の成長曲線は、接触阻害された成長および細胞死が、観察された細胞の成長に顕著に寄与していると思われるもっぱら高い細胞密度のみでのＮＮＫ処理および未処理のＢＭＲＰＡ１細胞の間の顕著な成長を明らかにできたため、低細胞密度で増殖するＮＮＫ処理細胞の増加した内在する能力は、ＢｒｄＵを組み込むこれらの細胞の能力を測ることによりさらに評価された。ＲＮＡアーゼ処理細胞におけるＢｒｄＵ組み込みの測定は、増殖する細胞のＳ相中のＤＮＡ合成を評価するのに日常的に使用されている（Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ．ら、２００２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ、４ｔｈ  ｅｄ．ＮＹ）。未形質転換ＢＭＲＰＡ１．ｐ５８、形質転換されかつ未クローンのＢＭＲＰＡ．ＮＮＫ、ｐ１１および形質転換されかつクローン化ＢＭＲＰＡ．ＮＮＫ、ｐ２３におけるＢｒｄＵ組み込みのＦＡＣＳ分析により得られた結果は、ＮＮＫ処理がＢＭＲＰＡ１における永久的な超増殖性変化を生じたさらなる証拠となった（図４Ａ−４Ｅ）。これらの観察は、ＮＮＫが、接触阻害の損失および超増殖の両者を誘導することにより、ＢＭＲＰＡ１細胞を形質転換できるという実験的証拠をもたらす。
【００６４】
未形質転換およびＮＮＫ形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞に対する血清欠損の効果：形質転換細胞の１つのしばしば引用される特徴は、低濃度の成長因子および血清、一次および未形質転換細胞の成長をほとんど支持しない条件でのそれらの選択的な成長の有利さである（Ｃｈｕｎｇ、１９８６、Ｆｒｉｅｓｓら、１９９６、Ｋａｔｚら、１９９７）。未形質転換およびＮＮＫ形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞の血清依存性を確かめるために、細胞を１％、５％および１０％のＦＢＳを補給されたｃＲＰＭＩ培地に移し、等しい細胞数で２４穴ＴＣＰに接種し、そして１２日間成長させた。クリスタルバイオレットアッセイを使用して相対的な細胞の成長を評価した（Ｓｅｒｒａｎｏ、１９９７）。このアッセイは、トリプシン−ＥＤＴＡにより放出される細胞のカウンティングより顕著な利点をもたらす。それは、それが、低血清濃度でのＴＣＤへの強い細胞の接着により生ずる細胞の損失（不完全な放出および細胞死）を排除するからである。
【００６５】
図５でわかるように、形質転換したＢＭＲＰＡ１ＮＮＫ細胞は、調べられたすべてのＦＢＳ濃度で、未処理細胞より選択的な成長の利点を有する。たとえ１％ＦＢＳを含むｃＲＰＭＩ培地においてすら、ＮＮＫ形質転換細胞は、１０％ＦＢＳを含むｃＲＰＭＩで培養された未処理ｃＲＰＭＩ細胞より良好に成長した。極めて血清を除いた条件で細胞の成長を維持するＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の観察された能力は、ＮＮＫへの暴露によりＢＭＲＰＡ１細胞の形質転換をさらに支持する。
【００６６】
足場非依存性細胞の成長：多くの細胞の悪性の形質転換は、足場非依存性条件下で寒天に成長する新しく獲得した能力を生ずることが示されている（Ｃｈｕｎｇ、１９８６）。寒天上で成長するクローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＫＫおよび未処理ＢＭＲＰＡ１細胞の能力は、細胞を低密度でソフト寒天上に分散させることによって調べられた（実施例１参照）。これらの細胞が１４日間にわたってコロニーを形成する能力は、表３に示される。
表  ３
コントロールＢＭＲＰＡ１およびＮＮＫ処理ＢＭＲＰＡ１細胞による寒天上の足場非依存性コロニーの形成
細胞              接種後の日                形成されたコロニー＊の数
＜５０細胞    ＞５０細胞        合計      
ＢＭＲＰＡ１            ９              ０          ０                ０
１４            ０          ０                ０
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ    ９            １４      １５±２．５    １７．３±５．２
＊接眼レンズ計数格子を使用して、コロニーは、一連の３０の連続１ｍｍ２の視野でカウントされた。５ＴＣＦ＋／−ＳＥＭからのコロニーの平均カウントが示される。
【００６７】
従来の観察（Ｂａｏら、１９９４）と一致するように、ＢＭＲＰＡ１細胞は、寒天上に成長できず、そして死んでしまう。逆に、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞は、成長しコロニーを形成する強い能力を示した。事実、接種されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の４つに約１つは、５０細胞より大きなコロニーを形成した。寒天上の成長は、腫瘍形質転換を示す。
【００６８】
Ｎｕ／Ｎｕマウスにおける免疫原性：寒天上に成長した細胞は、Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍として成長する能力を有する（Ｓｈｉｎら、１９７５、Ｃｏｌｂｕｒｎら、１９７８）。腫瘍としてＮｕ／Ｎｕマウスにおいて成長する細胞の能力は、悪性形質転換の強い指標であると考えられている（Ｃｈｕｎｇ、１９８６）。その結果、１０７のクローン化生存ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を、Ｎｕ／Ｎｕマウスの後側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注入した。マウスの他の群には、未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞を同様な条件でｓ．ｃ．で注入した。Ｎｕ／Ｎｕマウスの第三の群には、正のコントロールの目的のために、ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞を注入した。それは、これらの細胞が、Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍を形成することが既に示されているからである。
表  ４
Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫの腫瘍原性
細胞                  腫瘍を有するマウスの数            転移を有するマウスの数
テストされたマウスの数            テストされたマウスの数
ＢＭＲＰＡ１                        ０／５                          ０／５
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ                ３／６                          １／６
ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２  ５／５                          １／５
ＢＭＲＰＡ１細胞は、注入された５Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍を形成できず、一方ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２は、接種４週以内に腫瘍（＞１ｃｍ）になった急速に成長する小結節（＜０．５ｃｍ）を形成した。明確に異なったことは、クローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を注入されたＮｕ／Ｎｕマウスにおける腫瘍の形成の推移であった。クローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を注入された後１週間内では、２−３ｍｍの小結節が、すべての６匹のマウスの注入部位に形成した。小結節は、２ヶ月以内に動物の３匹で消失した。それにもかかわらず、４ヶ月以内の休眠の期間後、残りの３匹の動物の小結節は、次の１２−１４週以内で、直径１ｃｍより大きい腫瘍に発展した。大きな腫瘍の塊を有するこれらのマウスの１匹は、さらに、腹水を生じ、転移腫瘍細胞の存在を示唆した。ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞によりそしてＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓ細胞により形成された腫瘍の病理学的所見は、図６Ａおよび６Ｂに示される。
【００６９】
ＴＵＮＮＫと命名された細胞系は、機械的な破壊およびコラゲナーゼ消化を組み合わせた方法により、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ注入Ｎｕ／Ｎｕマウスで成長する腫瘍の１つから確立された。ＴＵＮＮＫは、Ｎｕ／Ｎｕマウス中に注入されたクローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞に類似の形質転換した形態学的特徴を有する。今までのところ、これら２つの間の唯一の顕著な区別できる表現型の特徴は、細胞の凝集として生体外で浮遊するＴＵＮＮＫの傾向であり、細胞の接着性における顕著な変化が、生体内の選択的な成長過程中生じたことを示唆した。Ｎｕ／ＮｕマウスにおけるＮＮＫ形質転換細胞の選択的な成長が、最初のＮＮＫ誘導超増殖をさらに増加させたかどうかを確かめるために、ＴＵＮＮＫ細胞のＢｒｄＵ組み込みも、図４に示されたものと同じ条件下で決定された。ＴＵＮＮＫの増殖は、Ｎｕ／Ｎｕマウス中に皮下で最初に導入されたクローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫのそれより僅かに少なかった（図４）。それにもかかわらず、Ｎｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍を形成するＮＮＫ形質転換細胞の観察された能力は、１μｇＮＮＫ／ｍＬへの僅か１６時間の暴露でもＢＭＲＰＡ１細胞の悪性の形質転換における重要かつ速度を制限する段階に影響したことを示した
【実施例３】
【００７０】
腫瘍関連抗原を同定するための寛容誘導抗体の生成の使用
材料および方法
材料：ＲＰＭＩ  １６４０、５．５ｍＭのグルコース（ＤＭＥＭ−Ｇ＋）を含むＤＭＥＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２％トリプシン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヤギ血清およびトリプシンブルーは、ＧＩＢＣＯ（ニューヨーク）から得た。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（アトランタ、ＧＡ）。選択性ＨＡＴおよびＨＴの培地のためのヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、およびチミジン（Ｔ）並びにＰＥＧ１５００は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツ）から購入した。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、ＢｉｏＧｅｎｅｘ（ダブリン、ＣＡ）から得た。ＰＢＳおよび西洋ワサビペルオキシダーゼラベルヤギ抗マウスＩｇＧ［Ｆ（ａｂ´）２ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧ］は、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（コクランビル、ＰＡ）から得た。アプロチニン、ペプスタチン、ＰＭＳＦ、ナトリウムデオキシコレート、ヨードアセトアミド、パラホルムアルデヒド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｚｍａベース、ＯＰＤ、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧ、並びに完全な培地のためのすべての微量元素は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。過硫酸アンモニウム、ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、尿素、ＣＨＡＰＳ、低分子量マーカーおよび予め染めた（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）マーカーは、ＢＩＯＲＡＤ（リッチモンド、ＣＡ）から得た。増強した化学発光（ＥＣＬ）キットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（アーリントンハイツ、ＩＬ）から得た。メルカプトエタノール（２−ＭＥ）およびフィルムは、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（ロチェスター、ＮＹ）から得た。組織培養フラスコ（ＴＣＦ）は、Ｆａｌｃｏｎ（マウンテンビュー、ＣＡ）から得られ、組織培養皿（ＴＣＤ）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング、ＮＹ）から得られ、２４穴ＴＣプレート（ＴＣＰ）および９６穴ＴＣＰは、Ｃｏｓｔａｒ（ケンブリッジ、ＭＡ）から得た。組織培養チェンバー／スライド（それぞれ８室）は、Ｍｉｌｅｓ（ナッパービル、ＩＬ）から得た。
【００７１】
細胞および培養：すべてのラットの膵細胞系は、１０％ＦＢＳを含むｃＲＰＭＩで成長した。他の細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得たが、ただしラット脈管内皮細胞（Ｅ４９）は、Ｍ．ＤｅｌＰｉａｎｏ博士（Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ドルトムント、ドイツ）から得た。白血球は、健康なボランティアのドナーから得られ、そしてヒト膵臓組織（マッチングしていない形質転換組織）は、Ｄｏｗｎｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＯｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ＤｉｖｉｓｉｏｎからＳｏｍｍｅｒｓ博士から提供された。細胞の生存は、トリパンブルー排除により調べた。
【００７２】
消去式免疫超免疫プロトコール（ＩＳＨＩＰ）；生存（１０６）およびパラホルムアルデヒド固定および洗浄（１０６）細胞の混合物を、腹腔内（ｉｐ）でそれぞれの免疫化に使用した。６匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（〜１２週齢）（Ｂａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  Ｌａｂｓ、セントルイス）を使用し、２匹のマウスに、ＢＭＲＰＡ１細胞を標準の免疫化中４回注入した。他の４匹のマウスには、同様に３回ＢＭＲＰＡ１細胞を注入し、そして最後のブースター注入５時間後、それらに６０μｇのシクロホスファミド／日／ｇ体重を次の５日間ｉｐで注入した。これらの免疫抑制されたマウスの２匹に、最後のシクロホスファミド注入後ＢＭＲＰＡ１細胞を注入した。他の２匹の免疫抑制されたマウスに、１週１回でさらに３回形質転換ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を注入し、そして１週後にマウスを、融合前１０日間の形質転換ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の５回の追加の注入により超免疫化した（ＩＳＨＩＰマウス）。血清を、指示された数の免疫化後１週以内にすべてのマウスから得た。
【００７３】
ハイブリドーマおよびｍＡｂ増殖：ハイブリドーマは、ほとんど免疫抑制されたＩＳＨＩＰマウスからの脾細胞によるＰ３Ｕ１骨髄腫細胞の融合により、既述（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｐｙｔｏｗｓｋｉら、１９８８）通り得られた。ハイブリドーマ細胞を２４穴ＴＣＰの２８８穴で培養した。ハイブリドーマを、１０日間ＨＡＴ  ＤＭＥＭ−Ｇ＋（２０％ＦＢＳ）で最初に成長させ、次に８日間ＨＴ含有培地で成長させ、次いでＤＭＥＭ−Ｇ＋（２０％ＦＢＳ）で成長させた。ハイブリドーマの上澄みを、免疫蛍光顕微鏡法および免疫組織化学によるさらなる分析のための特異的ｍＡｂ含有上澄みの選択が行われる前で特異的反応性の存在のための融合３週間後に始まる細胞酵素免疫アッセイ（Ｃｅｌｌ−ＥＩＡ）により３回テストした。ｍＡｂ３Ｄ４は、ハイブリドーマ上澄みの５０％飽和硫酸アンモニウム中の沈殿により精製され、そしてその後沈殿物をＰＢＳに溶解し、そしてＰＢＳに対して透析した。ｍＡｂ３Ｄ４は、マウスＩｇＧ抗体として同定され、そして前記のように（Ｐｙｔｏｗｓｋｉら、１９８８）、セファロース−ブルークロマトグラフィーにより透析された物質から分離された。ＩｇＧフラクションは、Ｂｒａｄｆｏｒｄのアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）により測定して、〜１０．５ｍｇ蛋白／ｍＬを含んだ。
【００７４】
細胞−酵素免疫アッセイ（Ｃｅｌｌ−ＥＩＡ）：ＢＭＲＰＡ１およびＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を、０．１ｍＬのｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳにより３×１０４／穴でＴＣＰ（９６穴）に接種した。細胞を２４時間接着させ、風乾し、そして室温で真空下貯蔵した。細胞を次にＰＢＳ−１％ＢＳＡにより再水和し、次にハイブリドーマ上澄みまたはマウス血清の２倍の連続希釈の何れかを各穴へ４５分間室温で添加した。ＰＢＳ−ＢＳＡによる洗浄後、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧ（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中１：１００）を４５分間室温で各穴へ添加した。未結合抗体を次に洗って除き、そしてＯＰＤ基質を４５分間室温で添加した。基質の色の推移を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ３５５０）によりＯＤ４９０ｎｍで測定した。ハイブリドーマの上澄みについて、０．２０より大きいＯＤ４９０ｎｍの価（未反応血清により得られる負のコントロールＯＤの５倍）は、正と考えられた。
【００７５】
未処理細胞に対する間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）：細胞をＰＢＳ中の０．０２Ｍ  ＥＤＴＡによるインキュベーションにより解放し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡにより洗い、そして免疫蛍光分析のために氷冷温度で生存したまま処理した。細胞を１時間ハイブリドーマ上澄みまたは血清による懸濁中でインキュベートされ、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗い（３×）、そしてＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で１：４０に希釈されたＦＩＴＣ−ＧαＭＩｇＧに曝した。４５分後、未結合抗体を洗って除き、そして細胞をエピ蛍光顕微鏡法により調べた。
【００７６】
浸透可能化細胞および組織の切片の免疫ペルオキシダーゼ染色：細胞および組織の調製：形質転換および未形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞を、組織培養チェンバー中で１×１０４細胞／０．３ｍＬｃＲＰＭＩ／チェンバーで接種した。２日後、細胞をＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで１晩４℃で固定した。細胞を次にＰＢＳ−１％ＢＳＡにより２回洗い、そして免疫組織化学染色に使用した。免疫組織化学染色用の膵臓の組織は、０．１Ｍホスフェート緩衝液ｐＨ７．２中の４％パラホルムアルデヒドを濯流したラットの成獣から調製した。固定した膵臓を固定したラットから取り出し、そして１晩４％緩衝したパラホルムアルデヒド中に４℃で保存した。膵臓を次に洗いそして３０％しょ糖中に１晩置いた。凍結した組織の切片（１０μｍ）を、Ｊｕｎｇクリスタット（Ｌｅｉｃａ）により作成し、ゼラチン被覆ガラススライドに置き、そして−２０℃で保存した。細胞系または組織切片を次に１分間４％緩衝したパラホルムアルデヒドで後固定し、トリス緩衝液（ＴｒｉｓＢ）（０．１Ｍ、ｐＨ７．６）で洗い、そして１５分間室温でＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＴｒｉｓＢ中０．２５％）に置いた。次に、免疫組織化学を既述のように行った（Ｇｕｚら、１９９５）。
【００７７】
３Ｄ４−Ａｇのウエスタンブロット分析：３Ｄ４−Ａｇの存在に関してテストされた細胞系を、２５ｃｍ２ＴＣＤで密集成長させ、氷冷ＰＢＳで洗い、そして５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％ナトリウムデオキシコレート、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦおよび５ｍＭのヨードアセトアミドからなる０．５ｍＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液（ｐＨ８）により氷上でインキュベートした。３０分後、残った細胞の残存物を溶解溶液中にこすり落とし、細胞のライゼートを１１５００×ｇで１５分間遠心分離して不溶の残存物を除いた。膵臓組織からの細胞ライゼートを、ウエスタンブロット分析のために同様な方法で処理したが、異なる点は、組織タイプ１つあたり〜２ｍｍ３の２つの片を、氷温で１ｍＬのＲＩＰＡ溶解緩衝液中でＤｏｕｎｚｅホモゲナイザーでホモゲナイズした。各ライゼートの蛋白濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの分析（ＢｉｏＲａｄ）により決定した。細胞の抽出物を、等容量のサンプル緩衝液（１２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール、２％のＳＤＳ、０．１％のブロモフェノールブルー、２０％ｖ／ｖのグリセロール、ｐＨ６．８）と混合した。各サンプル（２０μｇ／穴）からの蛋白を、既述されたようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）、そしてニトロセルロース膜上に電気移動させた。膜をＴＢＳ−Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）ドライミルクと１時間インキュベートし、ｍＡｂ３Ｄ４（１：２００）およびＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを添加し、そして製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により示唆されたように、化学発光をＥＣＬキットを使用して増幅した。テストされたそれぞれの化学発光による関心のある蛋白の存在は、Ｘ−ＯＭＡＴフィルム（Ｋｏｄａｋ）に露出することにより検出された。
【００７８】
２Ｄ等電点電気泳動／ＳＤＳ−デュラアクリルゲル電気泳動ポリペプチド分離：未形質転換およびＮＮＫ形質転換の細胞を、１０５細胞／２５ｃｍ２ＴＣＦで接種し、３日置きに養分を与え、そして未形質転換細胞が密集に達するまで成長させた。フラスコ中の細胞は、次にＢｒａｄｆｏｒｄの蛋白測定のためにＲＩＰＡ緩衝液で、または０．１ｇのＤＴＴ、０．４ｇのＣＨＡＰＳ、５．４ｇの尿素、５００μＬのＢｉｏ−ｌｙｔｅ両性電解質、６ｍＬのｄｄＨ２Ｏ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦおよび５ｍＭのヨードアセトアミドから作成された溶解緩衝溶液の何れかで溶解された。細胞のライゼートを１１５００×ｇで１５分間遠心分離して、不溶性の残存物を除いた。Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＭＡ）からのプレキャストの一次元および二次元のゲルおよび装置を次に使用した。蛋白（１００μｇ）を一次元（ｐＩ３−１０）に入れ、それを３００Ｖで３時間次に１０００Ｖで１７時間作動した。それぞれの実験に関する二次元は、２０ｍＡ／ゲルでプレキャスト１０％ＳＤＳ−デュラアクリルゲル（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＭＡ）を使用して作動した。分離されたポリペプチドを、１．２５ｍＡ／ｃｍ２（４８４ｍＡ）で１時間半乾燥条件下ニトロセルロース膜上に急速に移すか、または製造者（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＭＡ）に従って銀染色するかの何れかを行った。ニトロセルロース膜を次にウエスタンブロット分析による３Ｄ４−Ａｇ検出に使用し、後でＲｅｖ  Ｐｒｏ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ＭＡ）またはＡｍｉｄｏ  Ｂｌａｃｋ（Ｓｉｇｍａ）の何れかで染色した。一次元のゲルからの０．５ｃｍ切片のｐＨ勾配は、前述（Ｏ´Ｆａｒｒｅｌｌ、１９７５）のように測定された。２Ｄ分離ポリペプチドの銀染色は、１００ＡＳＡモノクロ（Ｋｏｄａｋ）フィルムを使用して写真を作成した。
【００７９】
顕微鏡写真：染色された細胞培養または組織サンプルのすべての観察および写真は、１２５ＡＳＡモノクロ、４００ＡＳＡエクタクローム（Ｋｏｄａｋ）または１６００ＡＳＡ  ＰＲＯＶＡ（富士）フィルムを使用して、カメラおよび位相差光学装置を備えたＬｅｉｔｚの倒立顕微鏡により行われた。
【実施例４】
【００８０】
結果
消去式免疫超免疫プロトコール（ＩＳＨＩＰ）：２つの密接に関連するコンプレックス抗原間の相違を認識できる抗体を生成するように開発された消去式免疫法は、コンプレックスＡｇにより共有される免疫優性エピトープに主として応じて増殖するように刺激されたＢ細胞を選別的に殺す、うまく規定された量のシクロホスファミドの能力を利用する（Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９６７、Ａｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９６８、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９２、Ｍａｔｈｅｗら、１９８７、Ｐｙｔｏｗｓｋｉら、１９８８）。過去において、ヒツジ赤血球の形の多量のＡｇによる免疫後のシクロホスファミドの投与は、非常に有効なＡｇ特異性免疫学的寛容を生じたが、一方もし薬剤が少ない量のＡｇの後に投与されたならば、特異的な免疫学的寛容は有効ではなかった（Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９６７、Ａｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９６８、Ｐｌａｙｆａｉｒ、１９６９）。未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞に存在するＡｇ（「寛容原性抗原」）に応じて増殖する免疫細胞のクローンの排除におけるシクロホスファミドの有効性を改善するために、免疫化のプロトコールがデザインされ、それは、ＢＭＲＰＡ１細胞による３回の免疫化後にシクロホスファミドが投与された（図７）。シクロホスファミドによる免疫抑制の程度は、最初に、乾燥されたＢＭＲＰＡ１細胞に対する免疫化かつシクロホスファミド処理されたマウスからの血清によるＣｅｌｌ−ＥＩＡにより評価された。ＢＭＲＰＡ１細胞により４回ｉ．ｐ．で免疫化されたマウスから集められた血清は、これらの細胞についてかなりな抗体力価を含んだ（図７Ａ）。対照的に、ＢＭＲＰＡ１細胞の３つの注入後、５時間後で次の５日間シクロホスファミドをｉ．ｐ．注入したとき、強い免疫抑制が、調べられた４匹のマウスすべてに観察された。驚くべきことに、シクロホスファミド処理後のＢＭＲＰＡ１細胞によるブースター注入は、寛容原性抗原に対する抗体力価の回復を生じなかった（図７Ａ）。これらの結果は、ラットの膵臓組織の免疫組織化学により確認された（図７Ｂ）。ＢＭＲＰＡ１細胞により免疫化されたマウスからの血清の強い交差反応性は、ラット膵臓組織により観察されたが（図７Ｂ、左）、一方ＢＭＲＰＡ１により免疫化され次にシクロホスファミド処理マウスからの血清は、ラット膵臓組織の染色はほとんど示されなかった（図７Ｂ、右）。
【００８１】
この研究に使用された投与量でのシクロホスファミドは、Ａｇ特異性の増殖するＢ細胞およびＴ細胞を選択的に殺すことがマウスで示されたが、それはまた脾細胞に対する追加の非特異性の細胞毒性効果を有する（Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９６７、Ａｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９６８、Ｔｕｒｋら、１９２７、Ｌａｇｒａｎｇｅら、１９７４，Ｍａｒｉｎｏｖａ−Ｍｕｔａｆｃｈｉｅｖａら、１９９０、Ｐａｎｔｅｌら、１９９０）。これらの既に記載された非特異性の免疫抑制は、シクロホスファミド処理３−７週後消去式免疫プロトコールに存在することが報告され（Ａｉｓｅｎｂｅｒｇ、１９６７、１９６８）、それは、形質転換ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（新規なＡｇ）が未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞（寛容原性抗原）に寛容化された動物に導入される時間である。非特異性免疫抑制のこの不完全な状態は、融合に使用される動物の脾臓に存在する形質転換Ａｇに特異的なＢ細胞の数を低下させ、恐らく所望のｍＡｂの生成を減少させる。その上、たとえ古典的な免疫化において処理されていない免疫系を有する動物がガン細胞を注入されるとき、形質転換に関連するＡｇが、低い免疫原性を有することが観察された（Ｏｌｄ、１９８１、Ｓｈｅｎら、１９９４）。これらの潜在的な問題を極力解決しそして腫瘍抗原により増殖するように刺激されたＢ細胞の数を増やすために、シクロホスファミドによるＢＭＲＰＡ１細胞への二次免疫応答の免疫抑制は、１０日および１６日後の２回のブースター注入のＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞によるｉ．ｐ．免疫化を伴い、そしてハイブリドーマ融合に先立つ日に形質転換細胞の他の５つのブースター注入による急速な超免疫化を伴う。ハイブリドーマ融合に使用されるマウスからの超免疫前後に集められた血清で行われたＣｅｌｌ−ＥＩＡは、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の５回の注入による急速な超免疫がＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞に対する抗体力価を増大させたことを示した（図７Ｃ）。
【００８２】
ＮＮＫ形質転換および未形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞間の抗原の相違の検出：２８８穴から集めたハイブリドーマ上澄みは、乾燥したＮＮＫ形質転換および未形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞と反応性のＩｇＧ抗体の存在下でＣｅｌｌ−ＥＩＡによりテストされた。融合１８−２１日目の評価は、調べられた２８８穴の２６５（９２％）が１つ以上の成長するハイブリドーマを含んだことを確かめた。Ｃｅｌｌ−ＥＩＡにより、穴の７３（または２３．５％）からの上澄みは、形質転換ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞と反応した抗体を含んだ。逆に、僅か４７（または１６．３％）の上澄みはＢＭＲＰＡ１細胞と反応し、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞が、未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞により発現しない抗原を発現することを示す。その上、ＢＭＲＰＡ１細胞と反応性の４７ハイブリドーマ上澄みすべては、形質転換ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞との交差反応性を示した。
【００８３】
未処理かつ未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞および形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞との選択されたハイブリドーマ上澄みの免疫反応性：Ｃｅｌｌ−ＥＩＡテストが、乾燥かつ破壊された細胞で実施されたため、上澄み中の抗体は、細胞内および血漿膜の両者のＡｇに接近し結合できた。認識されたＡｇの細胞の位置に関する最初の情報を得るために、５ハイブリドーマ上澄みを最初に未処理の細胞のＩＦＡによるさらなるテストについて選択した。それは、Ｃｅｌｌ−ＥＩＡにより、これらの上澄みが、常にＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞のみ（上澄み３Ａ２、３Ｃ４、３Ｄ４）によるかまたはＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫおよびＢＭＲＰＡ１の両者の細胞（上澄み４ＡＢ１、２Ｂ５）によるかの何れかにより見込みのある強い反応性を示したからである。表５に要約されているように、上澄み３Ｃ４、４ＡＢ１および２Ｂ５は、Ｃｅｌｌ−ＥＩＡの結果と一致して未処理細胞の細胞表面を染色した。驚くべきことに、３Ｃ４は、輪状のパターンでＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ（図８Ｄ）およびＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞（図８Ｆ）を染めたが、未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞の細胞表面を染めず（図８Ｈ）、形質転換細胞のみの表面膜上の３Ｃ４−Ａｇの存在を示した。
表  ５
免疫蛍光による未処理細胞による選択された上澄みの免疫反応性
細胞                                                上澄み
３Ｄ４  ３Ａ２  ４ＡＢ１  ２Ｂ５    ３Ｃ４
ＢＭＲＰＡ１                        −      −      ３＋    ＋／２＋    −
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ                −      −      ３＋    ３＋        ３＋
ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２  −      −      ３＋    ＋／２＋    ３＋
＊間接免疫蛍光染色の強度は、超免疫マウス（正のコントロール、ＩＦＡ＝３＋）および未反応性の有効成分のないハイブリドーマ上澄み（負のコントロール、ＩＦＡ＝（−））からの血清により染められた細胞の平行する調製物に見られるそれと、各サンプルの蛍光強度を比較することによって決定された。
【００８４】
ＥＤＴＡにより放出された未処理の細胞の表面上のＡｇを認識する他のハイブリドーマ上澄み（２Ｂ５および４ＡＢ１）は、小斑点状のパターンで形質転換および未形質転換の細胞の血漿膜抗原と反応した（表５）。興味のあることに、ハイブリドーマ上澄み３Ｄ４および３Ａ２は、未処理でしかもＥＤＴＡにより放出された生きた未形質転換または形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞を染めなかった。ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ乾燥細胞によるＣｅｌｌ−ＥＩＡによる３Ｄ４および３Ａ２の強いしかも持続性の反応性から見て、間接免疫蛍光によるＥＤＴＡ放出の未処理の細胞との同様な反応性がないことは、３Ｄ４および３Ａ２のＡｇが、恐らく形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞において細胞内の配置を有することを示した。
【００８５】
浸透化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の３Ｄ４による免疫細胞化学染色：ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞における３Ｄ４−Ａｇの可能な細胞内の位置を確認するために、免疫細胞化学染色を、固定したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００浸透化された細胞について実施した。図９に示されるように、正のコントロールの血清は、全細胞体、並びに広がった浸透化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の拡大する血漿膜を含む細胞の成分のほとんどを染色した（図９Ｆ）。おもしろいことに、ｍＡｂ３Ｄ４による染色は、浸透化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（図９Ｅ）およびＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞の細胞質そして特に周辺核の領域に主として維持され、特に強い染色は、活発に分割している細胞であった。逆に、ｍＡｂ３Ｄは、浸透化されたが未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞と反応せず（図９Ｃ）、ガラススライド上のその単層の上皮の外見は、これらの細胞に対して明るくされた免疫マウス血清による染色後、正確に見ることができる（図９Ｄ）。最も重要なことは、ｍＡｂ３Ｄ４は、管、腺房および島細胞を含む正常のラットの膵臓組織に存在する異なる細胞タイプと反応せず（図９Ａ）、３Ｄ４−Ａｇが形質転換関連抗原であることを示唆している。
【００８６】
３Ｄ４Ａｇは、４１．２ｋＤのけっ歯動物およびヒトのガン関連抗原である。ｍＡｂ３Ｄ４によるウエスタンブロット染色は、Ｋ−ＲａｓおよびＮＫＫ形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞において〜４１．２ｋＤの唯一のバンドを示したが、未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞ではそうではなかった（図１０）。驚くべきことに、強い３Ｄ４−Ａｇ発現は、またＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞において観察されるものと同様な分子量のバンドとしてヒト膵臓ガン細胞ＣＡＰＡＮ１（図１１、レーン６）およびＣＡＰＡＮ２（図示せず）において見られた（図１１、レーン２）。３Ｄ４−Ａｇは、未形質転換ヒト腺房（図１１、レーン４）および管細胞（図１１、レーン５）から由来する細胞ライゼートに見いだせなかった。さらに、どんな３Ｄ４−Ａｇ発現も、外分泌ラット膵臓腫瘍の一次培養から由来した細胞系であるＡＲＩＰでは観察されなかった（図５、レーン３）。ラット膵臓腫瘍から由来するＡＲＩＰ細胞が、正常な細胞の行動を示しそして玉石の外観を有する単層として成長しそしてヌードマウスに腫瘍を生成しないことは、注目に値する。
【００８７】
ヒト肺ガン（Ａ５４９）、形質転換原発性胎生期腎ガン（２９３）、子宮頸類上皮（Ｈｅｌａ）、結腸腺ガン（ＣａＣｏ−２）、正常ヒト白血球（ＷＢＣ）、マウス線維芽細胞（Ｌ９２９）およびマウス黒色腫細胞（Ｂ１６）からの細胞における３Ｄ４−Ａｇの発現は、またウエスタンブロット分析により調べられた（図１２）。強い３Ｄ４−Ａｇの発現は、Ａ５４９ヒト肺ガンおよびＢ１６マウス黒色腫細胞においてのみ観察された（図１２、レーン１、７）。３Ｄ４のどんな発現も、ヒトガン細胞系の残り、Ｌ９２９マウス線維芽細胞（図１２）およびＥ４９ラット脳脈管内皮細胞（図示せず）ではなかった。３Ｄ４−Ａｇは、正常のヒト白血球細胞（図１２、レーン５）、および原発性ヒト臍帯内皮細胞ＨＵＶＥＣ（図示せず）では検出されなかった。これらの結果は、３Ｄ４−Ａｇが、そのエピトープおよび分子量がマウス、ラットおよびヒトにおいて数少ない選択されたガン細胞に保存されているガン関連抗原であることを示している。
【００８８】
２Ｄポリペプチド分離次いで銀染色およびウエスタンブロットによる３Ｄ４−Ａｇの特徴確認：２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動は、分子量および等電点に従って全細胞ライゼートからの多数のポリペプチドの分離を可能にしている（Ｏ´Ｆａｒｒｅｌｌ、１９７５）。技術的な進歩がなされて、多量の蛋白の分離を可能にし、結果をさらに再現可能にし、そして検出方法および２Ｄパターンの解釈の両者を改善することにより、２Ｄ分離技術の能力を増大させている（Ｂａｕｗら、１９８９、Ｋｏｖａｏｖａら、１９９４）。３Ｄ４−Ａｇの特徴をよりよく確認するために、１００μｇの全細胞ライゼート蛋白を、３−１０のｐＨ勾配で一次元でｐＩに従って分離し、次にデュラアクリル電気泳動により二次元で分子量によって分離した。ＮＮＫ形質転換および未形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞からの２Ｄ分離ポリペプチドを含むゲルの銀染色は、再現可能な２Ｄ分離およびポリペプチドプロフィルを示した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ＮＮＫ形質転換および未形質転換の細胞からの２Ｄ分離ポリペプチドの銀染色は、ほとんどのポリペプチドが、未形質転換細胞およびＮＮＫ形質転換細胞の何れも同様なレベルで発現することを明らかにした。それにもかかわらず、定量および定性の両方のポリペプチド発現の相違は、ＢＭＲＰＡ１細胞とＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞との間で明確に知ることができた。
【００８９】
未染色ゲルからニトロセルロース膜への分離されたポリペプチドの移動次にｍＡｂ３Ｄ４によるウエスタンブロット分析は、ラット（ｐＩ〜６．２４＋／−０．２５、６．３０＋／−０．２０、および６．４８＋／−０．２５）、およびヒト（ｐＩ〜６．６、６．７および６．９）の両者の膵臓ガン細胞系における３つの電荷変異型を有するポリペプチドとして３Ｄ４−Ａｇを同定した。Ｒｅｖ−ＰｒｏおよびＡｍｉｄｏ  Ｂｌａｃｋによる同じ膜のポリペプチド染色は、また、平行して行われるゲルからのポリペプチドの感度のさらに高い銀染色により検出され、全細胞ライゼートにおける他の蛋白に対する３Ｄ４−Ａｇの位置を確かめるのに助けとなった（図１３Ｄ、１３Ｃ）。容易に認識できる主な蛋白例えばアクチンの位置（４３ｋＤにおける）および使用される分子量の標準（ともに２Ｄおよび１Ｄ）は、ヒトおよびラットの両者の細胞における３Ｄ４−Ａｇに関する〜４１．２ｋＤの分子量を確かめるのに助けになった。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ＡからＤは、ＢＭＲＰＡ１細胞におけるＮＮＫにより誘導された形態学的変化を示す顕微鏡写真である。（図１Ａ）未処理ＢＭＲＰＡ１の代表的な上皮の玉石様単層。（図１Ｂ−１Ｆ）ＮＮＫ処理ＢＭＲＰＡ１細胞。１６時間無ＦＢＳｃＲＰＭＩ中の１μｇＮＮＫ／ｍＬへの暴露後の連続細胞継代（ｐ２−９）。（図１Ｂ）ｐ２、上皮単層中の紡錘体細胞の外観。（図１Ｃ）ｐ６、紡錘体細胞の鎖内および頂部の円形細胞。（図１Ｄ）ｐ７、ＴＣＤ全体の細胞増殖巣（矢印）およびコロニーの開始（矢印の先端）。（図１Ｅ）ｐ９、多くのコロニーから成長した、示されたもののような細胞の密な塊。（図１Ｆ）細いガラス針中への吸引によりコロニーの芯（「クローン化」）から単離されそして紡錘形で接種されさらに細胞の細胞増殖巣および密な塊を形成する能力を維持している細胞。
【図２】Ａは、ＢＭＲＰＡ１（ＢＭＲＰＡ．４３０）、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫおよびＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２（ＴＵＣ３）細胞の培養プレートを示す。細胞増殖巣は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により顕微鏡で観察された。ＢからＤは、Ｈ＆Ｅ染色による細胞増殖巣を示す顕微鏡写真である。好塩基性細胞増殖巣からのＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（図２Ｃ）は、形質転換ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２（ＴＵＣ）細胞の培養で観察されるものと同様である（図２Ｄ）。細胞増殖巣は、同じ条件下で成長し染色されたＢＭＲＰＡ１細胞では存在しない（図２Ｂ）。
【図３】１０％ＦＢＳでのＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫおよびＢＭＲＰＡ１細胞の細胞成長を示したグラフである。細胞（５×１０４）を６０ｍｍＴＣＤに接種し、そして１０％ＦＢＳを有するｃＲＰＭＩで成長させた。指示された時間の間隔で、３枚の皿の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡにより離し、そしてカウントした。図３では、黒い三角はＢＭＲＰＡ１、ｐ４８細胞を表し、黒い逆三角は、未クローンＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、ｐ１１細胞を表し、そして白い四角はクローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、ｐ２３を表す。それぞれの実験は、２回行われ、そして表示された結果は、両方の試験を表す。それぞれの時点について、３枚の細胞のカウント±ＳＤの平均が示される。
【図４】ＡからＤは、細胞の成長を立証するＦＡＣＳ分析の結果である。ＢｒｄＵは、ＢＭＲＰＡ１、ｐ５４（図４Ｂ）、未クローンＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、ｐ１３（図４Ｃ）およびクローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、ｐ２３（図４Ｄ）に添加された。細胞は同様に処理されたが、ＢｒｄＵ不存在は、負のコントロールとして使用された（図Ａ）。細胞（５×１０４）を、６０ｍｍＴＣＤに接種し、そして１０％ＦＢＳ添加ｃＲＰＭＩで成長させた。３日後、ＢｒｄＵを新鮮な培地に添加し、そして配合されたＢｒｄＵをＦＡＣＳ分析により検出した。それぞれの実験を２回行い、そして示された結果は、両方の実験を示す。Ｅは、ＡからＤのＦＡＣＳ分析からのデータからなる棒状グラフである。テストされた細胞系のそれぞれに関する配合されたＢｒｄＵ＋／−ＳＤの％は、結果のセクションに含まれている。
【図５】ＮＮＫ形質転換および未形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞における血清損失の効果を示すグラフである。ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫおよびＢＭＲＰＡ１の細胞は、１．５×１０４／穴で２４穴ＴＣＰ中に接種され、そして１、５および１０％ＦＢＳを含むｃＲＰＭＩで成長させた。指示された時間の間隔で、相対的な細胞の成長は、クリスタルバイオレット分析（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９７）により３つの穴で評価された。ＮＮＫ形質転換および未形質転換のＢＭＲＰＡ１細胞に関する１日目のＯＤ６００ｎｍ値は、ほとんど同じであった。わずか１％のＦＢＳでのＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の成長の利点は、ＢＭＲＰＡ１細胞の成長を比較するとき、非常に明らかである。それぞれの実験は、２回行われ、そして示された結果は、両方の実験を表す。それぞれの時点は、１日目に読み取られたＯＤ６００ｎｍに対する指示された時点における３つの穴からのＯＤ６００ｎｍ値の平均の比を示す。
【図６】ＡおよびＢは、（Ａ）ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、ｐ２３細胞および（Ｂ）ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓの皮下接種から由来するＮｕ／Ｎｕマウス腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色を示す顕微鏡写真である。
【図７−Ａ】Ｃｅｌｌ−ＥＩＡにより測定された、未形質転換細胞により発現された抗原に対する抗体の応答の有効なシクロホスファミド排除を示すグラフである。ＢＭＲＰＡ１抗原に対する強い免疫抑制はＢＭＲＰＡ細胞のみにより４回免疫化されたマウス（三角、４Ｉ（４３０））と比較して、それぞれ、ＢＭＲＰＡ１細胞（またはここではＢＭＲＰ．４３０細胞と呼ばれる）により３回免疫化され次にシクロホスファミド（丸、３免疫化（３Ｉ）ＢＭＰＲＡ．４３０細胞（４３０）＋Ｃｙ）を注入されそして同じ細胞（四角、３Ｉ（４３０＋Ｃｙ＋Ｉ（４３０））を１回再注入されたマウスについて観察された。相対的な抗体の力価は、連続的に希釈された血清およびＢＭＲＰＡ１（ＢＭＲＰ．４３０）細胞に対するＣｅｌｌ−ＥＩＡを使用して、２回測定された。
【図７−Ｂ】ラット膵臓の免疫組織化学を示す顕微鏡写真であり、シクロホスファミドによる免疫抑制を確認している。ＢＭＲＰＡ１細胞による４回の連続した免疫化後得られた血清は、その場でラットの膵細胞を強く染色した（左）。３回免疫化され次にＣｙ処理されそしてＢＭＲＰＡ１細胞により再免疫化されたマウスからの血清による染色の不存在は、ＢＭＲＰＡ１細胞に対する免疫応答のシクロホスファミド誘導抑制の有効性を確実にしている。
【図７−Ｃ】ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（またここではＢＭＲＰＡ．４３０．ＮＮＫ細胞と呼ばれる）による超免疫化が抗体の生成を増加することを示すグラフである。ハイブリドーマ融合前の日時におけるＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞による追加の５免疫化（５Ｉ）は、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫによる３Ｉ次にシクロホスファミド免疫抑制の標準のプロトコールにより得られたＡｂ力価をさらに増大した。ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞に関するＣｅｌｌ−ＥＩＡは、それぞれ３Ｉ（４３０）＋Ｃｙ＋３Ｉ（ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、四角）および３Ｉ（４３０）＋Ｃｙ＋８Ｉ（ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、丸）後の血清についてそして免疫前コントロール血清（三角）についてなされた。２つの穴の光学密度（ＯＤ４９０ｎｍ）の読み取りは、±ＳＤで平均されて、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の追加の５注入（シクロホスファミド処理後合計８注入）による急速な超免疫化後の抗体力価を測定した。
【図８】ＡからＪは、ハイブリドーマ上澄み３Ｃ４が、２つの独立した形質転換細胞系の細胞表面に位置するＡｇを認識することを示す顕微鏡写真である。細胞はＥＤＴＡにより離脱され、そして氷上の未処理かつ生きている細胞は３Ｃ４上澄みおよびＦＩＴＣ−ＧαＭＩｇＧと次々と反応した。細胞は、洗浄されそしてガラススライドに置かれ、そして可視（図８Ａ、８Ｃ、８Ｅ、８Ｇおよび８Ｉ）および紫外線（図８Ｂ、８Ｄ、８Ｆ、８Ｈおよび８Ｊ）の下で写真にとった。線状の輪のような染色パターンが、形質転換ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（図８Ｄ）およびＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞（図８Ｆ）で観察され、ＢＭＲＰＡ１細胞における染色が全くないこと（図８Ｈ）は、３Ｃ４が細胞表面形質転換関連抗原を認識していることを示す。図８Ｂは、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の強い染色が、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞により超免疫化されたマウスからの融合前の血清で観察されることを示している（正のコントロール）。図８Ｊは、形質転換ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２ＴＵＣ３の染色が、未反応の有効成分のないハイブリドーマ上澄みにより進み、そしてＦＩＴＣ−ＧαＭＩｇＧは観察されない（特異性コントロール）ことを示す。
【図９】ＡからＦは、３Ｄ４が、未形質転換ラット膵細胞から存在していないＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞中の細胞内抗原を認識することを示す顕微鏡写真である。ｍＡｂ３Ｄ４または免疫血清を使用し次にＨＲＰＧαＭＩｇＧおよびＨＲＰ反応基質ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）によって検出する免疫細胞化学染色は、固定したＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１％）浸透可能化細胞系（図９Ｃ−９Ｆ）およびラット膵臓の凍結切片（図９Ａおよび９Ｂ）について行われた。図９Ａ、９Ｃおよび９Ｅに使用されるサンプルは、ｍＡｂ３Ｄ４により処理され、図９Ｂ、９Ｄおよび９Ｆにおけるサンプルは、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞により直接免疫化されたマウスからの血清により処理された。染色は、浸透可能化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（図９Ｅ）で観察されたが、浸透可能化された未形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞（図９Ｃ）または浸透可能化正常ラット膵細胞（図９Ａ）ではそうではなかった。予想されたとおり、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞により直接免疫化されたマウスからの血清は、正常な膵臓組織（Ｂ）、ＢＭＲＰＡ１（Ｄ）およびＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞（図９Ｆ）と広範囲な交差反応性を示す。
【図１０】形質転換ＢＭＲＰＡ１細胞における約３９ｋＤ抗原として３Ｄ４抗原の同定を示すウエスタンブロットである。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離されたそれぞれの細胞ライゼート（３０μｇ）から等量の蛋白をニトロセルロースに移し、次にｍＡｂ３Ｄ４およびＨＲＰ−ＧａＭＩｇＧとの連続するインキュベーションを行った。Ａｇ−Ａｂコンプレックスの位置を次に増大したＥＣＬおよびＸｏｍａｔフィルムへの露出により可視化された。レーン１、ＢＭＲＰＡ１細胞、レーン２、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞、レーン３、ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞。レーン４では、有効成分のないＰ３Ｕ−１骨髄腫培地は、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞ライゼート（特異性コントロール）の免疫ブロティング中ｍＡｂ３Ｄ４を置換した。
【図１１】正常の管および腺房のヒト膵細胞においてではないＣＡＰＡＮ−１における３Ｄ４−Ａｇの存在の同定を示すウエスタンブロットである。ウエスタンブロット分析は、図１０で記載したように行ったが、ただしそれぞれ細胞ライゼートからの蛋白２０μｇが１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離された。レーン１、ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞（負のコントロール、ｍＡｂ３Ｄ４なし）、レーン２、ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞、レーン３、ＡＲＩＰ細胞、レーン４、ヒト膵臓腺房組織、レーン５、ヒト膵臓管組織、レーン６、ＣＡＰＡＮ−１細胞、レーン７、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞。
【図１２】ヒト肺ガンおよびマウス黒色腫から由来する細胞系における３Ｄ４−Ａｇの同定を示すウエスタンブロットである。ウエスタンブロット分析は、図１１に記載したように行われるが、ただしレーン１、ヒト肺ガンＡ５４９細胞、レーン２、ヒト結腸ガンＣａＣＯ−２細胞、レーン３、ヒト子宮頸ガンＨｅＬａ細胞、レーン４、ヒト胚腎臓２９３細胞、レーン５、ヒト白血球（ＷＢＣ）、レーン６、マウス線維芽細胞Ｌ９２９細胞、レーン７、マウス黒色腫Ｂ１６細胞、レーン８、有効成分のないＰ３Ｕ−１黒色腫培地に曝されたヒト肺ガンＡ５４９細胞（特異性コントロール）である。
【図１３】Ａ、ＢおよびＣは、２Ｄポリペプチド分離２Ｄ等電点電気泳動／全細胞ライゼートからのポリペプチド１００μｇのデュラアクリルゲル電気泳動分離次いでＢＭＲＰＡ１（図１３Ａ）およびＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ（図１３Ｂ）の銀染色によるラット３Ｄ４−Ａｇの特性測定を示す。銀染色したゲルと平行して行われた未染色ゲルからの分離されたポリペプチドは、ニトロセルロース膜に移された。膜のウエスタンブロット分析（図１３Ｄ）は、ラット３Ｄ４−Ａｇが、３つの電荷イソ型（６．２４＋／−０．２５、６．３＋／−０．２０、６．５＋／−０．２５のｐＩ）を有することが明らかにされ、そしてＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞における４１．２ｋＤの分子量を確認した。ニトロセルロース膜は、Ａｍｉｎｏ  ＢｌａｃｋまたはＲｅｖＰｒｏの何れかで染色されて、その発現パターンが銀染色ゲルで認識可能な主な蛋白に関連して３Ｄ４−Ａｇの位置を明らかにした。ラット３Ｄ４−Ａｇは、３つの別々の実験で同じ位置で見いだされた（図１１３Ｃ、矢印の先端）。
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【図３】
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【図５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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