(57)【要約】本発明は、ＧＧＩＴＮＹＮＳＡＬＭ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＳＡＣＹ；ＹＣＩＴＮＹＮＳＣＹ：ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＨＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＣＹ；ＧＧＩＡＮＹＮＴＳ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＣＹ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＴＳＣＹ；及びＹＣＩＡＮＹＮＴＣＹなどのペプチドリガンドを含むガングリオシドＧＤ２のリガンドを提供している。本発明のＧＤ２リガンドは、例えば、神経芽細胞腫を含む細胞がＧＤ２を発現する癌などの疾患を治療又は診断するのに用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ｚ1−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｚ2  (I)で表される実質的に純粋なＧＤ２リガンド。
［式中、
Ｘ１  は存在せず、又はＹ、若しくはその類似体である。
Ｘ２  は存在せず、又はＣ、若しくはその類似体である。
Ｘ３  はＧ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ４  はＧ、Ｃ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ５  はＩ、若しくはＣ、又はそれらの類似体である。
Ｘ６  はＴ、又はＡ、又はそれらの類似体である。
Ｘ７  はＮ、又はその類似体である。
Ｘ８  はＹ、又はその類似体である。
Ｘ９  はＮ、若しくはＧ、又はそれらの類似体である。  
Ｘ１０はＳ、Ｃ、Ｖ、若しくはＴ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１１はＡ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、若しくはＳ、又はそれらの類似体である。    
Ｘ１２は存在せず、或いはＬ、Ｃ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。  
Ｘ１３は存在せず、或いはＭ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｚ１がＨ２Ｎ−、ＲＨＮ−、又はＲＲＮ−の式のＮ末端基である。      
Ｚ２が−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲの式のＣ末端基である。        
それぞれの場合におけるＲが、独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１
−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキ
ル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニルから選
択され；また、“−”は，共有結合性を示す。］
【請求項２】
式ＩＩ：
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−(II)で表されるドメインを有する実質的に純粋な合成ＧＤ２リガンド又は組換えＧＤ２リガンド。  
［式中、
Ｘ１は存在せず、又はＹ、若しくはその類似体である。
Ｘ２は存在せず、又はＣ、若しくはその類似体である。
Ｘ３はＧ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。  
Ｘ４はＧ、Ｃ、若しくはＹ、又はその類似体である。
Ｘ５はＩ、若しくはＣ、又はそれらの類似体である。
Ｘ６はＴ、又はＡ、又はそれらの類似体である。
Ｘ７はＮ、又はその類似体である。
Ｘ８はＹ、又はその類似体である。
Ｘ９はＮ、若しくはＧ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１０はＳ、Ｃ、Ｖ、若しくはＴ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１１はＡ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、若しくはＳ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１２は存在せず、或いはＬ、Ｃ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１３は存在せず、或いはＭ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である；
また、“−”は共有結合を示す。］
【請求項３】
リガンドがＸ1からＸ13までのいずれかの二つの間に更に環式結合を特徴とする請求項１又は２記載のＧＤ２リガンド。
【請求項４】
リガンドが、ＧＧＩＴＮＹＮＳＡＬＭ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＳＡＣＹ；ＹＣＩＴＮＹＮＳＣＹ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＨＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＣＹ；ＧＧＩＡＮＹＮＴＳ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＣＹ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＴＳＣＹ；及びＹＣＩＡＮＹＮＴＣＹから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１記載のＧＤ２リガンド。
【請求項５】
ドメインがＧＧＩＴＮＹＮＳＡＬＭ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＳＡＣＹ；ＹＣＩＴＮＹＮＳＣＹ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＨＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＣＹ；ＧＧＩＡＮＹＮＴＳ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＣＹ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＴＳＣＹ；及びＹＣＩＡＮＹＮＴＣＹから成るグループから選択されることを特徴とする請求項２記載のＧＤ２リガンド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか記載のＧＤ２リガンドを有効量投与することを含む、疾患細胞にＧＤ２を発現させることを特徴とする疾患に罹患した患者を治療する方法。
【請求項７】
患者から採取した細胞が請求項１〜５のいずれか記載のＧＤ２リガンドに結合するかどうかを決定することを含む、疾患細胞がＧＤ２を発現させることを特徴とする疾患の診断方法。  
【請求項８】
インビトロで実施されることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
インビボで実施されることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【請求項１０】
患者に顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の有効量を投与することを更に含む請求項６記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から５のいづれかのＧＤ２リガンドが、有効量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と共に含まれる医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいづれか記載のＧＤ２リガンドと、ＧＤ２活性の調節又はＧＤ２発現細胞の検出のためのＧＤ２リガンドの使用説明書とを含む商業用パッケージ。
【請求項１３】
ＧＤ２リガンドが、組換えＴ細胞受容体であることを特徴とする請求項２記載のＧＤ２リガンド。
【請求項１４】
組換えＴ細胞受容体が細胞障害性Ｔ細胞株において発現することを特徴とする請求項１３記載のＧＤ２リガンド。
【請求項１５】
実質的に上記において説明し、また、実施例に示される単離されたＧＤ２リガンド。
【請求項１６】
細胞株を形質転換してＧＤ２を発現する形質転換細胞を得、該形質転換細胞を有効量の請求項１又は２記載のＧＤ２リガンドで処理することを特徴とする細胞株のアブレーション（ablating）法。
【請求項１７】
疾患細胞にＧＤ２を発現させることを特徴とする疾患を治療する薬物を処方する請求項１から５のいづれかのＧＤ２リガンドの使用。
【請求項１８】
疾患が癌であることを特徴とする請求項１７記載のＧＤ２リガンドの使用。
【請求項１９】
癌が神経芽腫であることを特徴とする請求項１８記載のＧＤ２リガンドの使用。
【請求項２０】
推定上のＧＤ２リガンドを同定又は確認するためのスクリーニング方法は以下のステップから成る：
ａ）会合性に利用可能なＧＤ２成分及びｐ５６Lck成分を有するシステムに推定上のＧＤ２リガンドを投与し、
ｆ）システムにおけるＧＤ２とｐ５６Lck成分との会合性又は機能的関係を測定する。
【請求項２１】
推定上のＧＤ２リガンドが、ポリペプチド、又は同じ活性基若しくは類似の側鎖官能基を有するぺプチド模倣体等の非ペプチド性類似体を含むことを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
推定上のＧＤ２リガンドが、テネイシンＲに由来することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
システムが、ＧＤ２及びｐ５６Lckを発現する細胞であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
ＧＤ２成分が、未変性のＧＤ２であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
ｐ５６Lck成分が未変性のｐ５６Lckであることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
ＧＤ２及びｐ５６Lck成分との会合性がｐ５６Lck成分のキナ-ゼ活性を決定することによって、測定されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド癌化学療法薬などの治療組成物及び方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、一つ以上のシアル酸残基を含む細胞表面スフィンゴ糖脂質である。ガングリオシドは、「ラフト」と称する洗浄剤耐性細胞膜ミクロドメイン内で局在化させられ、遠位、又は、濃度が小さすぎたりして、複合体を形成したりシグナルカスケードを活性化することができないであろう接着分子、変更因子、基質、又は、補助因子を包括することによって、タンパク質が機能する環境を提供する。しかしながら、シグナル伝達におけるガングリオシドの作用機序に関しては、提案が十分に為されていない。
【０００３】
ガングリオシドＧＤ２は、報告によれば、一定の神経個体群において低次で発現しているが、多種の腫瘍（神経芽腫、黒色腫、肺の小さな癌細胞、神経膠腫、軟部組織肉腫、及び、Ｂ細胞リンパ腫）において大いに蔓延している。
【０００４】
細胞外マトリックス成分テネイシンＲ(Tenascin-R)は、ＧＤ２のための天然リガンドとして、最近説明された（Probstmeier et al., 1999）。しかしながら、ＧＤ２の生物学的機能やテネイシンＲなどのリガンドとの相互作用の機能的性質については相対的に知られていない。
【０００５】
ＧＤ２は、広範に腫瘍マーカーとして研究され、抗体性治療のための標的（例  抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８）（Cheung et al., 1985）として、臨床的に使用されている。しかしながら、治療上、患者に適用された抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８は、投与の直後に、急性かつ一過性の痛みを引き起こしている。抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８を基礎とした治療学は、神経芽腫や軟髄膜癌を含む広範囲の癌の治療学及び診断において、使用のために提案された。例えば、１３１Ｉ標識された抗ＧＤ２ ３Ｆ８モノクローナル抗体は、４００ｍｇ／ｍ２  非標識／無修飾３Ｆ８モノクローナル抗体と共に、標的放射免疫療法（２０ ｍＣｉ/ｋｇで投与）において、使用された。同様に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、神経芽腫の患者の治療において抗ＧＤ２モノクローナル抗体と共に用いられた。
【非特許文献１】Probstmeier, R., Michels, M., Franz, T., Chan, B. M., and Pesheva, P. (1999). Tenascin-R interferes with integrin-dependent oligodendrocyte precursor cell adhesion by a ganglioside-mediated signalling mechanism, European Journal ofNeuroscience 11, 2474-88.
【非特許文献２】Cheung, N. K., Saarinen, U. M., Neely, J. E., Landmeier, B., Donovan, D., and Coccia, P. F. (1985). Monoclonalantibodies to a glycolipid antigen on human neuroblastoma cells, Cancer Research 45, 2642-9.
【発明の開示】
【０００６】
ある面では、発明は式IのＧＤ２リガンドを提供している：
Ｚ1−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｚ2  (I)
［式中、
Ｘ１  は存在せず、又はＹ、若しくはその類似体である。
Ｘ２  は存在せず、又はＣ、若しくはその類似体である。
Ｘ３  はＧ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ４  はＧ、Ｃ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ５  はＩ、若しくはＣ、又はそれらの類似体である。
Ｘ６  はＴ、若しくはＡ、又はそれらの類似体である。
Ｘ７  はＮ、又はその類似体である。
Ｘ８  はＹ、又はその類似体である。
Ｘ９  はＮ、若しくはＧ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１０はＳ、Ｃ、Ｖ、若しくはＴ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１１はＡ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、若しくはＳ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１２は存在せず、或いはＬ、Ｃ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１３は存在せず、或いはＭ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｚ１がＨ２Ｎ−、ＲＨＮ−、又はＲＲＮ−の式のＮ末端基である。      
Ｚ２が−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲの式のＣ末端基である。        
それぞれの場合におけるＲが、独立して（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１
−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキ
ル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニルから選
択され；また、“−”は，共有結合を示す。］
別の態様では、発明は、標識IIの領域を持つ実質的に純合成リガンド又は組換えＧＤ２リガンドを提供する。
【０００７】
−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−
Ｘ１２−Ｘ１３−(II)
［式中、
Ｘ１は存在せず、又はＹ、若しくはその類似体である。
Ｘ２は存在せず、又はＣ、若しくはその類似体である。
Ｘ３はＧ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ４はＧ、Ｃ、若しくはＹ、又はその類似体である。
Ｘ５はＩ、若しくはＣ、又はそれらの類似体である。
Ｘ６はＴ、若しくはＡ、又はそれらの類似体である。
Ｘ７はＮ、又はその類似体である。
Ｘ８はＹ、又はその類似体である。
Ｘ９はＮ、若しくはＧ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１０はＳ、Ｃ、Ｖ、若しくはＴ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１１はＡ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、若しくはＳ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１２は存在せず、或いはＬ、Ｃ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である。
Ｘ１３は存在せず、或いはＭ、若しくはＹ、又はそれらの類似体である；
また、“−”は共有結合を示す。］
【０００８】
一つの態様では、本発明は、ドメインが組換えタンパク質の結合をＧＤ２に媒介することが出来る事を特徴とする組換えタンパク質を提供する。例えば、本発明のドメインを有する組換えＴ細胞受容体は、細胞障害性Ｔ細胞といった形質転換Ｔ細胞株において、提供されるであろう（「細胞障害性Ｔリンパ球」又は、「ＣＴＬ」は、ＴＣＲを介して、ＭＨＣクラスＩ分子によって、提示されたエピトープを認識する免疫組織細胞である）。本発明の形質転換Ｔ細胞株は、例えば、ＧＤ２の発現を特徴とする病理学組織を有する癌などの病気の治療に使用されている。（ここの引用文献に組み込まれている２００２年２月１４日、Sadelain, M. et. al.の名の元に出版された米国特許出願２００２００１８７８３Ａ１に説明されているアプローチに類似している）。
【０００９】
本発明のＧＤ２リガンドは、リガンドがＸ1からＸ13までのいずれかの二つの間に更に環式結合を有することから成る。別の態様では、発明のＧＤ２リガンド又は、発明のドメインは、ＧＧＩＴＮＹＮＳＡＬＭ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＳＡＣＹ；ＹＣＩＴＮＹＮＳＣＹ；ＹＣＧＧＩＴＮＹＮＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＨＣＹ；ＹＣＴＮＹＧＶＣＹ；ＧＧＩＡＮＹＮＴＳ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＣＹ；ＹＣＧＧＩＡＮＹＮＴＳＣＹ；及びＹＣＩＡＮＹＮＴＣＹから成るグループから選択される。いくつかの態様では、ｍＡｂ ３Ｆ８及びテネイシンＲなどの既知のＧＤ２リガンドは、本発明におけるクレームされたリガンドから、特異的に除外される。しかしながら、いくつかの態様では、小分子誘導体及び既知のリガンドの類似体（相補性決定領域ｍＡｂｓのペプチド又はペプチド模倣薬）は、除外されない。
【００１０】
また、本発明のＧＤ２リガンドを有効量投与することを含む、疾患細胞にＧＤ２を発現させることを特徴とする疾患に罹患した患者を治療する方法を本発明は提供している。また、被験者から採取した細胞が本発明のＧＤ２リガンドに結合するかどうかを決定することを含む、疾患細胞がＧＤ２を発現させることを特徴とする疾患の診断方法が提供される。本発明の診断及び治療方法は、インビトロ又はインビボで実施されるであろう。
【００１１】
別の態様では、本発明のＧＤ２リガンドは、有効な量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子といった他の治療化合物と共に用いられるだろう。本発明は、ＧＤ２活性の調節又はＧＤ２発現細胞の検出のためのＧＤ２リガンド使用説明書とを含む商業用パッケージを提供する。
【００１２】
表１は、多くの別のＧＤ２リガンドの配列、又は、本発明のＧＤ２結合性ドメインを並べている。構造活性相関（ＳＡＲ）及び遺伝子欠失分析は、いくつかの置換は許容されておりペプチド閉環は活性を促進させることを示している。（＊で示されているペプチドは、不活性）
【００１３】
【表１】
2006516241.tif 000002
【００１４】
発明は、例えば、同様の治療を要する患者にＧＤ２リガンドを投与することによって、ＧＤ２リガンドと、ＧＤ２リガンド使用説明書とを含む商業用パッケージを更に提供している。
【００１５】
別の態様では本発明はＧＤ２リガンドを同定するスクリーニング方法を提供している。例えば、このようなスクリーニング方法は、以下を含む：
ａ）会合性（ＧＤ２及びｐ５６Ｌｃｋを発現する細胞など）に利用可能なＧＤ２成分及びｐ５６Ｌｃｋ成分を有するシステムに、推定上のＧＤ２リガンド（テネイシンＲ由来のポリペプチドなど）を投与する；
ｂ）例えば、ｐ５６Ｌｃｋ部分のリン酸化酵素活性を決定することによってシステムにおけるＧＤ２成分とｐ５６Ｌｃｋ成分との会合を測定する。更に別の態様においては、本発明は以下を含む：  
ｃ）例えばＣＤ４５部分のリン酸化酵素活性を決定することによってシステムにおけるＧＤ２部分とＣＤ４５部分（moieties）との会合を測定する。
【００１６】
更に別の態様では、前記の方法は、更に以下を含む：
ｂ）ＧＤ２成分及び、ＣＤ４５などのリン酸化酵素を有するシステムに
推定上のＧＤ２リガンドを投与する；及び
ｃ）ＧＤ２とリン酸化酵素との会合性や機能的関係を測定する。
ｄ）試験化合物（例  コンビナトリアルライブラリー）が、ここに説明されているＧＤ２リガンドのいずれかを置換するために用いられている競合性のスクリーニング分析
ｅ）ここに説明されているＧＤ２リガンドのいずれかが、試験化合物を置換するために用いられている競合性のスクリーニング分析
いくつかの態様では、推定上のＧＤ２リガンドは、例えば、ポリペプチ
ド、又は、同じ活性基、若しくは、類似の側鎖官能基を有するペプチド模
倣体などの非ペプチド性類似体を構成するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＧＤ２結合性領域として発明の一態様と調和して同定されるボックス内において、はっきりと、確認される領域と共に、ジェンバンクアクセッションＸＰ−０４０５５０からのホモサピエンステネイシンＲの全長のタンパク質の配列を示す図である。発明の一側面は、ＧＤ２結合性領域が例えば、ＧＤ２とテネイシンＲタンパク質との間の相互作用の強度を調節するために変更されている別のテネイシンＲタンパク質を提供している。
【図２】図２はＧＤ２とｐ５６Ｌｃｋとの免疫共沈降に関するデータを示している。      （ａ）Ｒ１．１及びＥＬ４ ＧＤ２陽性細胞可溶化液は、抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８又はコントロールマウスＩｇＧ（ｍＩｇ）との免疫共沈降に従属している。免疫共沈降におけるｐ５６Ｌｃｋタンパク質の存在は、ウェスタンブロット法によって認められた。ｐ５６Ｌｃｋ  は、ＥＬ４ ＧＤ２陽性細胞にはある（７列目）が、Ｒ１．１細胞にはない（５列目）ｍＡｂ ３Ｆ８によって免疫共沈降する。全細胞可溶化液は、ｐ５６Ｌｃｋ検出（１及び２列目）のためのコントロールとして用いられた。      （ｂ）及び（ｃ）Ｒ１．１ ＥＬ４ ＧＤ２陰性及びＥＬ４ ＧＤ２陽性細胞可溶化液は抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８ ＧＭ１結合性コレラ毒素、抗ｐ５６Ｌｃｋ ｍＡｂ ３Ａ５及び抗Ｚａｐ−７０ ｍＡｂ ＬＲとの免疫共沈降を必要とした。免疫共沈降におけるリン酸化酵素活性ｐ５６Ｌｃｋの存在は、ｐ５６特異的基質Ｓａｍ６８及びＧａｐ ｐ６２と共にリン酸化酵素分析のインビトロによって、確認された。図２（ｂ）のデータは、ｐ５６Ｌｃｋリン酸化酵素活性は、ＥＬ４ ＧＤ２陽性  細胞にはある（１列目）が、ＥＬ４ ＧＤ２陰性  細胞にはない（４列目）ｍＡｂ ３Ｆ８によって、免疫共沈降されることが出来ることを示している。図２（ｃ）のデータは、ｐ５６Ｌｃｋリン酸化酵素活性は、ＥＬ４ ＧＤ２陽性細胞における(１列目)ｍＡｂ ３Ｆ８によってだけでなく、Ｒ１．１細胞におけるコレラ毒素Ｂ（４列目）によっても、免疫共沈降されることが出来る。      （ｄ）Ｒ１．１及びＥＬ４ＧＤ２陽性細胞可溶化液は、抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８、ＧＭ１結合性コレラ毒素Ｂ、及び、抗ｐ５６Ｌｃｋ ｍＡｂ ３Ａ５との免疫共沈降を必要とした。免疫共沈降におけるガングリオシドＧＤ２及びＧＭ１の存在は、ＥＬＩＳＡによって、認められた。抗ｐ５６LckｍＡｂ３Ａ５は、ＥＬ４ＧＤ２陽性細胞から、ＧＤ２を免疫共沈降することが出来るが、Ｒ１．１からＧＭ１を免疫共沈降することが出来ない。示されているのは代表的な実験、１実験に付き、ｎ=４の平均±ＳＥＭである。
【図３】図３は、ガングリオシドの精製されたｐ５６Lckのインビトロ、リン酸化酵素活性に対する影響を示す。ｐ５６Ｌckのリン酸化酵素活性は、ＧＤ２又はＧＭ１の有り無しで、ペプチドｐ５６Lck基質における３２ＰＯ４の組入れを測定することによって、認められた。ＧＭ１ではなくＧＤ２の存在は、ｐ５６Ｌckリン酸化酵素活性を積極的に変化させることができる。活性は、２０分の時点で、未治療のｐ５６Ｌckに評準化されている。示されているのは、平均３から５のアッセイ±ＳＥＭである。
【図４】図４は、以下を示す。    （ａ）ＧＤ２リガンドが、ｐ５６Ｌｃｋホスホチロシンに及ぼす影響。ＥＬ４ＧＤ２陽性休止細胞は、表示時間のためにｍＡｂ ３Ｆ８（１３ｎＭ）又はコントロールマウスＩｇＧ（ｍＩｇ）と共に治療された。溶解後、ｐ５６Ｌｃｋタンパク質は、抗ｐ５６Ｌｃｋ ｍＡｂ ３Ａ５と共に免疫共沈降させられ、ビチオン標識されたウェスタンブロット法によって  ホスホチロシン（ＰＹ）が検査された。抗５６Ｌｃｋは、５分以内にｐ５６のチロシンのリン酸化を誘発し(３列目)、少なくとも３０分間は維持する(４列目)。      （ｂ）ＧＤ２リガンドがＺａｐ−７０リン酸化に与える影響。ＥＬ４ＧＤ２陽性休止細胞は表示時間のためのｍＡｂ  ３Ｆ８（１３  ｎＭ）又は、コントロールマウスＩｇＧ（ｍＩｇ）と共に治療された。溶解後、Ｚａｐ−７０タンパク質は、抗Ｚａｐ−７０  ｍＡｂ  ＬＲと共に免疫共沈降させられ、ホスホチロシン（ＰＹ）のために、抗ホスホチロシンｍＡｂ４Ｇ１０を用いたウェスタンブロット法によって検査された。抗ＧＤ２  ｍＡｂ ３Ｆ８は、５分以内にＺａｐ−７０のチロシンホスホチロシンを誘発することが出来る。（３列目）ｃ）ＧＤ２リガンドが細胞内カルシウム濃度に与える影響。休止ＥＬ４  ＧＤ２陽性細胞は、ｍＡｂ  ３Ｆ８（１３ｎＭ）、コントロールマウスＩｇＧ（ｍＩｇ）、又は、カルシウムイオン透過孔Ａ２３１８７と共に治療された。細胞内カルシウム濃度はカルシウム感受性のフルオロフォアＲｈｏｄ−２ ＡＭを用いるフローサイトメトリーによって評価された。ｍＡｂ３Ｆ８は、５分以内に、強度の持続可能なカルシウムの変化を誘発することが出来るが、コントロールマウスＩｇＧは何も影響がない。ｐ５６Ｌｃｋ阻害剤ＰＰ１の付加は、ｍＡｂ ３Ｆ８の影響を部分的に無効にした。示されているのは、４つの独立した分析の平均±ＳＥＭである。
【図５】図５は、特に、ｐｐ６０ＳｃｒＣ末端リン酸化調節性の配列を気質として用いたときに、ＧＤ２がインビトロでＣＤ４５脱リン酸酵素活性に与える阻害的影響を示す。２０分間、共培養したときに、ＧＤ２（他のガングリオシドではない）は、遊離したリン酸塩の比色の数量化によって測定されているように、ＣＤ４５脱リン酸酵素活性を徹底的に、阻害することが出来る。
【図６】図６は、ｐ５６Ｌｃｋ上に、チロシン５０５の脱リン酸化によって測定されているエキスビボＣＤ４５脱リン酸酵素活性に対するＧＤ２の阻害効果を示す。ＥＬ４ ＧＤ２陽性及びＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞は２０分間３７℃でコントロールｍＩｇ、抗ＧＤ２抗体３Ｆ８、又は抗ＣＤ３抗体１４５−２Ｃ１１が、抗ハムスター抗体Ｇ９４−５６と架橋することで、治療された。溶解後、ｐ５６Ｌｃｋ  は、ｐ５６Ｌｃｋ３Ａ５被覆ビーズで免疫共沈降させられ、抗ＰＹ−５０５抗体でウェスタンブロット法によって、位置５０５にて、ホスホチロシンが精査された。抗ＣＤ３と治療したＥＬ４ ＧＤ２陽性細胞はチロシン５０５（３列目）において、ｐ５６Ｌｃｋの脱リン酸を誘発するのに失敗し、一方、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞は、同様の治療と共に著しい脱リン酸を示し、ＧＤ２の存在がチロシン５０５脱リン酸の原因であるＣＤ４５脱リン酸酵素を阻害していることを提示している。抗ＧＤ２抗体３Ｆ８などのＧＤ２リガンドは、ＧＤ２媒介阻害剤のＣＤ４５を軽減することが出来る（２列目）。
【図７】図７は、軟寒天クローン原生の分析からのデータを示す。ＥＬ４ ＧＤ２陽性及びＥＬ４ ＧＤ２陰性細胞は、抗ＧＤ２抗体存在下又は非存在下で、軟寒天において（１サンプルにつき、２プレート）培養された。  （ａ）可視コロニーの総数。ＥＬ４ＧＤ２陽性細胞は、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞に比べて還元型コロニー形成を示している。抗ＧＤ２抗体３Ｆ８は、ＥＬ４  ＧＤ２陽性細胞の増殖を無効にするが、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞には影響しない。  （ｂ）典型的なＥＬ４  ＧＤ２陽性及びＥＬ４  ＧＤ２陰性コロニー。ＥＬ４ ＧＤ２陰性コロニーは、ＥＬ４  ＧＤ２陽性コロニーよりも多くのコロニーを含む。Ｂａｒ＝１００ミクロメーター。
【図８】図８は、腫瘍化した分析からのデータを示す。ＥＬ４ＧＤ２陽性及びＥＬ４ＧＤ２陰性細胞はａ）ヌードＢａｌｂ／ｃ、及び、ｂ）同系のＣ５７ＢＬ／ｇマウス。ＥＬ４ ＧＤ２陰性が注入された動物（左）は重要な腹水の腫瘍を示している一方で、ＥＬ４ＧＤ２陽性が注入された動物（右）は、局在型の固形腫瘍（丸い部分）を示す。Ｂａｒ＝１ｍｍ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
一つの態様では、本発明は、ＧＤ２の人工リガンドの選択肢を提供している。いくつかの態様では、このようなリガンドは、特に腫瘍原生増殖又は侵害受容性レセプターにつながる経路において、正常に発現している血管内でガングリオシドＧＤ２シグナル伝達を選択的に調節するのに用いられる。発明の一態様においては、ＧＤ２結合のために決定的なテネイシンＲにおける主要且つ立体構造の同一性を含んでいる。別の態様では、発明は、抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８の領域を決定する相補性が、テネイシンＲの類似体であることを示している。テネイシンＲの小ペプチド擬態(mimics)及び抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８の擬態は、従って、ＧＤ２のリガンドの選択肢としてデザインされ合成された。別のリガンドは、発明のリガンドを基礎とし、タンパク質擬態及び抗体擬態技術（Saragovi et al., 1992）によって、提供されるだろう。
【００１９】
発明の別の態様においては、ＧＤ２（ＧＭ１ではない）は洗浄性溶解に対して安定性のある複合体においてインビボでｐ５６Ｌｃｋと共に物理的に結合することが示されている。ＧＤ２は、インビトロでｐ５６Ｌｃｋ酵素活性を増強したり、インビボでｐ５６Ｌｃｋのリン酸化及びｐ５６Ｌｃｋ基質Ｚａｐ７０を強化したりすることによって、シグナル形質導入を調節することが示されている。従って、発明のＧＤ２リガンドは、生細胞における細胞内カルシウムの中で、ｐ５６Ｌｃｋ依存性溶剤を引き起こす為に用いられ、それによって、多種の生理学的又は病理学的細胞機能を調節する。
【００２０】
発明の一方の態様では（他のガングリオシドではない）、インビトロ及びエキソビボで、表現型活性を阻害可能であることが示されている。従って、発明のＧＤ２リガンドは生細胞におけるＣＤ４５に対するＧＤ２の阻害活性を拮抗する為に用いられ、それによって、多種の生理学的、免疫学的、又は病理学的細胞機能を調節する。
【００２１】
発明の一態様では、ＧＤ２の発現は、インビトロ及びインビボにおいて腫瘍原性を変質させるために示されている。実施例に示されてるようにＧＤ２陽性細胞より表現型的に識別可能なＧＤ２陰性であるＥＬ４クローンは、等しい倍加時間を有するが、軟寒天コロニー増殖は、ＧＤ２陰性細胞において、有意により効率的である。更に、この分析におけるＧＤ２リガンドの付加はＧＤ２陽性細胞のアポトーシスの死を引き起こす。ＧＤ２陰性細胞は、又、インビボで、より腫瘍化する。同系のマウスの腹腔内又は皮下に注入されるＧＤ２陽性細胞は、小さな転移を伴って、第一部位において、固形腫瘍を形成する。対照的に、ＧＤ２陰性細胞は、腹膜の膜を温侵し、粘ちょう性のムチンのような腫瘍、小固形腫瘍結節を形成し、転移性は高い。従って、発明のある態様においては、細胞は癌化するので、それらはＧＤ２陽性であり、癌化したＧＤ２陽性細胞は、例えば、アポト−シス経路によって、細胞死を媒介する為に、発明のＧＤ２リガンド細胞に処置されるであろう。例えば、ＧＤ２陰性癌細胞は、標的遺伝子治療技術によって、形質変換するので、細胞はＧＤ２陽性となり、変質したＧＤ２陽性癌細胞は、発明のＧＤ２リガンドで治療される。
【００２２】
一方では、発明のＧＤ２リガンドは、癌などの病気の治療、及び、疼痛などの症状の対処におけるインビトロ及びインビボという生物学的に適切な方法において、シグナル形質導入に影響を与えたり、調節したりする為に用いられる。
【００２３】
一態様においては、発明は、精製・単離された、又は、実質的に純粋なＧＤ２リガンドなどの化合物を提供している。化合物は、元来付随している成分から単離された時に、「実質的に純粋」である。典型的に、化合物は、少なくとも６０％、通常、標本の全重量の７５％から９０％であるときに、実質的に純粋である。従って、例えば、組換えの技術によって化学的に合成されたり生産されたりするポリペプチドは、通常、自然に付随している成分を実質的に含まない。核酸分子は、発明のＤＮＡが由来する生物体の自然発生的ゲノムにおいて通常近接しているコード配列に接触していない（すなわち、共有結合的に連鎖している）ときに実質的に純粋である。実質的に純粋な化合物は、例えば、資源からの抽出；ポリペプチド化合物をコード化する組換えの核酸分子の発現；又は化合成分によって得られる。純度はカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの適切な方法を用いて測定することが出来る。
【００２４】
「アルキル」という表現は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及び、シクロアルキル置換アルキル基を含んだ飽和脂肪基のラジカルに言及している。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、Ｔブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシルなどを含むが、これらに限ったものではない。アルキル基は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル又は、（Ｃ１−Ｃ３）アルキルを指す。「置換アルキル」は、水素を炭化水素バックボーンの一つ以上の炭素に置き換える置換基を有する。このような置換基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル、（カルボキシル、ケトン、（アルキルカルボニル及びアリールカルボニル基を含む）及びエステル（アルキルカルボニル及びアルキロキシルカルボニル基を含む））、チオカルボニル、アシル、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アシルアミノ、アミド、アミジン、イミノ、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、流酸塩、スルホン酸塩、スルファモイル、スルホンアミド、ヘテロシクリル、アラルキル、又は、芳香族若しくは複素芳香族成分を含むことが出来る。炭化水素鎖に置換された成分は、適切であれば、それ自体置換されることが出来る。例えば、置換アルキルの置換基は、エーチル、アルキルチオ、カルボニル、（ケトン、アルデヒド、カルボキシル、及びエステルを含む）−ＣＦ３、−ＣＮなどのみならず、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートを含む）スルホニル（流酸塩、スルホンアミド、スルファモイル、及び、スルホン酸塩を含む）及び、シリル基の置換及び非置換型も含むことが出来る。典型的な置換アルキルは、以下に示されている。シクロアルキルは、更に、アルキル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＦ３、−ＣＮなどに置換されることが出来る。
【００２５】
「アルケノル」及び「アルキニル」という表現は、上記に説明されたアルキルに置換可能な長さが類似した不飽和の脂肪性の基に言及しているが、それは、少なくとも、それぞれ二重又は三重の結合を含んでいる。「アルケノル」は、少なくとも一炭素-炭素二重結合と共にラジカルである、不飽和な分枝直鎖、又は、環状炭化水素である。ラジカルは、二重結合のシス又はトランス構造のいずれかに存在し得る。典型的なアルキノル基は、エチニル、プロピニル、イソプロピニル、ブテニル、イソブテニル、tert―ブタノール、ペンチニル、ヘキシニルなどを含むが、これらに限ったものではない。「アルキノル」は、少なくとも一炭素―炭素三重結合と共にラジカルな不飽和な分枝直鎖、又は、環状炭化水素のことである。典型的なアルキノル基は、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブテニル、ペンチニル、ヘキシニルなどを含むが、これらに限ったものではない。
【００２６】
「実質的に同一」の配列は、ここに説明されている一つ以上の保存的置換、又は、試験化合物の生物学的機能を破壊しない配列位置に在る非保存的な置換、削除、又は、挿入を一つ以上含む基準配列とは異なるアミノ酸やヌクレオチド配列のことである。このような配列は、少なくとも、６０％又は７５％、通常は少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％、若しくは、比較に用いられる配列とアミノ酸やヌクレオチドが９９％同レベルとなる。配列同一は、公的に利用可能な配列分析ソフトウェア（すなわち、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 
University Avenue, Madison, Wis. 53705、又は、the National Library of Medicineより入手可能なBLAST software）によって、容易に測定することが出来る。有用なソフトウェアの実施例は、プログラム、パイルアップ（Pile-up）、及び、プリティボックス（Pretty Box）を含む。そのようなソフトウェアは、相同性の程度を多種の置換、削除、置換、及び、他の修飾に指定することで類似の配列に合致している。
【００２７】
一態様では、ＧＤ２リガンドは、(i)側鎖、(ii)バックボーン、又は(iii)ペプチド内のイオン性相互作用のいづれかの／又は  置換によって生産される。又、構造的又は機能的アナログは、１）ペプチド擬態
（peptidomimicry）によって発生するペプヂドＧＤ２リガンドのホモログ及び２）ＧＤ２リガンドの配列／構造が、ＧＤ２結合を更に大きなタンパク質に運搬するために導入されているアナログを含むことが出来る。
【００２８】
発明の一態様において、発明のペプチド化合物をコード化する核酸を提供している。そのような核酸は、発現を目的として、安定した又は一過性の発現のための標準的な組換え技術を用いて、細胞に導入されるであろう。発明の核酸分子は、自然発生又は非自然発生的ヌクレオチド、若しくはヌクレオチドアナログを含む二つ以上のヌクレオシド鎖を含有する。
【００２９】
発明の多様な遺伝子及び核酸配列は、組換え配列であろう。「組換え」という表現は、何かが再結合したことを意味するので、核酸合成に関するときには、その言葉は、分子量生物学的技術の方法によって結合したり生産したりする核酸配列から成る分子に言及している。「組換え」という言葉が、遺伝子組成に関するときには、親のゲノムには発生しなかった対立遺伝子の新たな組合せを伴う配偶子、子孫、細胞、又は、ゲノムに言及している。組換え核酸合成は、結合している、又は、結合するために操作されているヌクレオチド配列、自然に結合していない、又は、自然に異なる場所で結合されている核酸配列を含んでいる。従って、核酸組成物に「組換え」として言及する際、核酸分子量は、遺伝子工学、すなわち、人間の介入によって操作されていることを意味する。組換え核酸合成は例えば、形質転換によって宿主細胞に導入されるであろう。そのような核酸合成は、単離し宿主細胞に再導入された同類の宿主細胞類、又は、異なる宿主細胞類に由来する配列を含むであろう。組換え核酸合成配列は、宿主細胞の本来の形質変換の結果、又は、後の再結合、及び／又は、修復事象の結果として、宿主細胞ゲノムに、統合される。
【００３０】
発明の別の態様は、発明の化合物の抗体及び、そのような抗体を代わりに認識する抗イディオタイプ抗体を提供する。発明の化合物は、例えば、Harlow and Lane(Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring 
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)又は、技術の熟練者達に知られている標準の製法技術を用いるＧＤ２リガンドに対する抗体を調製するのに使用されることが出来る。抗体は、例えば、ある種族からの抗原結合ドメイン及び、別の種族からのＦc部分を含むキメラ、又は、適切な種族の雑種細胞腫から作られる抗体を用いることによって、害寄宿免疫応答を最小化するために仕立てられる。
【００３１】
発明の化合物は、例えば、ＧＤ２リガンドのアミノ酸残基、又は、発明のドメインを他の保存されたアミノ酸残基、すなわち、類似の物理的、生物的、又は化学的特質、及び、生物的機能のスクリーニングを置換、削除、挿入することによって調製されることが出来る。いくつかの一時変異及び変化は、生物学的に等しいポリペプチドを得るために、ペプチドの生物学的機能を実質的に変質することなしに、ポリペプチドの構造において作ることが出来る。又、本発明のペプチド、リガンド及びドメインは、保存アミノ酸置換による本発明の新規リガンド配列部分とは異なる生物学的に同等のペプチド、リガンド、及びドメインにまで及ぶ。ここに使用されているように、「保存アミノ酸置換」という言い回しは、置換が関連機能の実質的な喪失なしに置換可能なペプチド内の定めれた位置内における別のアミノ酸への置換に言及している。そのような変化においては、アミノ酸残基のような置換は、例えば、それらの大きさ、負荷、疎水性、親水性などの側鎖置換の関連した類似性を基本に作られる事が出来、そのような置換は、ルーティン試験法のペプチド機能に対する影響のために分析されるだろう。
【００３２】
いくつかの態様においては、保存されたアミノ酸置換は、類似の親水価値（例えば、±２．０の価値の範囲内）を有し、以下が、Ｔｙｒ（−１．３）又はＰｒｏ（−１．６）ｓが、アミノ酸残基に指定されるような約−１．６疎水性親水性指標を有するアミノ酸であろう。（詳細は、米国特許番号４，５５４，１０１にあり、ここに参考のために示されている。）：Ａｒｇ(＋３．０) ; Ｌｙｓ(＋３．０) ; Ａｓｐ(＋３．０) ; Ｇｌｕ(＋３．０) ; Ｓｅｒ(＋０．３) ; Ａｓｎ(＋０．２) ; Ｇｌｎ(＋０．２) ; Ｇｌｙ(０); Ｐｒｏ(−０．５) ; Ｔｈｒ(−０．４) ; Ａｌａ(−０．５) ; Ｈｉｓ(−０．５) ; Ｃｙｓ(−１．０) ; Ｍｅｔ(−１．３) ; Ｖａｌ(−１．５) ; Ｌｅｕ(−１．８) ; Ｉｌｅ(−１．８) ; Ｔｙｒ(−２．３) ; Ｐｈｅ(−２．５) ; 及びＴｒｐ(−３．４)。
【００３３】
別の態様においては、保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の疎水性親水性指標（例えば±２．０の価値の範囲内）を有する別のアミノ酸残基に置換するアミノ酸残基において作られるであろう。そのような態様においては、各アミノ酸残基は、以下のような疎水性及び負荷の特質を基礎とした疎水性親水性指標に指定されるであろう：Ｉｌｅ(＋４．５) ; Ｖａｌ(＋４．２) ; Ｌｅｕ(＋３．８) ; Ｐｈｅ(＋２．８) ; Ｃｙｓ(＋２．５) ; Ｍｅｔ （＋１．９）;  Ａｌａ(＋１．８) ; Ｇｌｙ(−０．４) ; Ｔｈｒ(−０．７) ;  Ｓｅｒ(−０．８) ; Ｔｒｐ(−０．９) ; Ｔｙｒ(−１．３) ; Ｐｒｏ(−１．６) ; Ｈｉｓ(−３．２) ; Ｇｌｕ(−３．５) ; Ｇｌｎ(−３．５) ; Ａｓｐ(−３．５) ; Ａｓｎ(−３．５) ; Ｌｙｓ(−３．９) ; 及びＡｒｇ(−４．５).
【００３４】
別の態様においては、保存アミノ酸置換は、アミノ酸が、以下の非極性、酸性、塩基性、中性に分けられるのと同じ分類において、もう一つのアミノ酸残基に置換されるアミノ酸残基において作られるであろう：非極性：Ａｌａ, Ｖａｌ, Ｌｅｕ, Ｉｌｅ, Ｐｈｅ, Ｔｒｐ, Ｐｒｏ, Ｍｅｔ;
酸性：Ａｓｐ, Ｇｌｕ;  塩基性: Ｌｙｓ, Ａｒｇ, Ｈｉｓ; 中性: Ｇｌｙ, Ｓｅｒ, Ｔｈｒ, Ｃｙｓ, Ａｓｎ, Ｇｌｎ, Ｔｙｒ。
【００３５】
保存アミノ酸の変質は、Ｄアミノ酸に一致して、保存Ｄアミノ酸、又は、自然発生的に非遺伝的にコード化されたアミノ酸形態によるＬアミノ酸の置換だけでなく、保存されたＬアミノ酸置換を含有する。 自然発生的に非遺伝子的コード化されたＬアミノ酸置換は、βアラニン、３−アミノ酪酸、２、３―ジアミノ酪酸、αアミノイソ酪酸、４-アミノ酪酸、Ｎ−トリシン（サルコシン）、ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ―ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ノルベリン、２−ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１、２、３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β―２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリシン、２−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、２、４−ジアミノ酪酸、ｐ―アミノフェニルアラニン、Ｎ―メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、システイン酸、イプシロン−アミノヘキサン酸、デルタ−アミノ吉草酸、又は、２、３−ジアミノ酪酸を含有する。
【００３６】
別の態様においては、保存アミノ酸変質は、親水性又は疎水性、大きさ、又は量、又は負荷を基礎とした変質を含む。アミノ酸は、アミノ酸側鎖の特質に本来依存している疎水性又は親水性を全般に特徴とすることが出来る。疎水性アミノ酸は、ゼロ以上の疎水性を提示し、親水性アミノ酸は、Eisenberg et al.（J. Mol. Bio. 179:125-142, 1984）の正規合意した疎水性尺度を基礎としたゼロ以下の親水性を提示した。遺伝的にコード化した疎水性のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ及びＴｒｐを含み、遺伝的にコード化した親水性のアミノ酸はＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ及びＬｙｓを含んでいる。非遺伝的にコード化した疎水性のアミノ酸はＴブチルアラニンを含む一方で、非遺伝的にコード化された親水性のアミノ酸はシトルリン及びホモシステインを含有している。
【００３７】
疎水性又は親水性のアミノ酸は、それらの側鎖の特質を基礎として、更に細分化されることが出来る。例えば芳香族のアミノ酸は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−ＣＩ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲのような置換基を一つ以上含む少なくとも一つの芳香族又は芳香族複素環を内包する側鎖を有する疎水性アミノ酸である。そこでは、Ｒは独立して、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ１ーＣ６）アルケニル、（Ｃ１ーＣ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５−Ｃ２０）アリール、（Ｃ６−Ｃ２６）アルキルアリール、置換（Ｃ６−Ｃ２６）アルキルアリール、５−２０員ヘテロアリール、置換５−２０員ヘテロアリール、６−２６員alkheteroaryl、又は、置換６−２６員alkheteroarylである。遺伝子的にコード化した芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｙｐを含む一方、非遺伝子的にコード化した芳香族アミノ酸はフェニルグリシン、２―ナフチルアラニン、β―２−チエニルアラニン、１、２、３、４テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、４−クロロフェニルアラニン、２−フォルオロフェニルアラニン−３−フォルオロフェニルアラニン及び、４−フォルオロフェニルアラニンを含む。
【００３８】
非極性のアミノ酸とは、生理学的ｐＨにて無電化である側鎖を有する疎水性のアミノ酸が二つの原子（すなわち、両側の鎖は、極性ではない）によって均等に保たれ共有の一対の電子の結合を有する疎水性アミノ酸のことである。遺伝子的にコード化された非極性のアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＭｅｔを含む一方で非遺伝子的にコード化された非極性のアミノ酸は、シクロヘキシルアラニンを含む。非極性アミノ酸は、脂肪性の炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸である脂肪性アミノ酸を含むために更に細分化されることが出来る。遺伝子的にコード化された脂肪性アミノ酸は、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ及びＩｌｅを含む一方で、非遺伝子的にコード化された脂肪性アミノ酸はノルロイシンを含有している。
【００３９】
極性アミノ酸は、生理学的ｐＨによって無電化である側鎖を備えた親水性アミノ酸であるが、一対の電子が原子の一つによってより近接に二つの原子によって維持されている一つの結合を有している。遺伝子的にコード化された極性のアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎを含む一方で、非遺伝子的にコード化された極のアミノ酸は、シトルリン、Ｎアセチルリシン、及びメチオニンスルホキシドを含んでいる。
【００４０】
酸性アミノ酸は、７以下の側鎖ｐＫａ価値を備える親水性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、炭素イオンの喪失のために、生理学的ｐＨにおいて、側鎖を典型的に陰性にチャージした。遺伝子的にコード化した酸性アミノ酸は、Ａｓｐ及びＧｌｕを含んでいる。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウムイオンとの会合性のために、生理学的ｐＨにおいて側鎖を典型的に陽性にチャージした。遺伝子的にコード化した塩基性アミノ酸は、Ａｒｇ,Ｌｙｓ及びＨｉｓを含む一方で、非遺伝子的にコード化された塩基性アミノ酸は、非環式アミノ酸オルニチン、２、３、−ジアミノプロピオン酸、２、４−ジアミノ酪酸、及びホモアルギニンを含んでいる。
【００４１】
上記の分類は、絶対的ではなく、アミノ酸は、一つ以上のカテゴリーに分類されるであろう。更に、アミノ酸は、既知の作用、及び又は、特定化した分析を基礎とする、又は前記に確認されたアミノ酸と比較した特徴的な化学的、物理的、又は生物学的性質を基礎として分類することが出来る。アミノ酸は、アミノ酸のような側鎖を有する二機能性の部分を含むことが出来る。
【００４２】
保存の変質は、例えば、アミノ酸の機能的側鎖の反応によって、非誘導体化の残基のための化学的に誘導体化した部分の置換をも含んでいる。従って、これらの置換は、遊離アミノ基が、アミン塩酸塩、ｐトルエンスルホニル基、カルボベンゾキン基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基に誘導体化している。同様に、遊離カルボキシル基は、塩、メチル、及びエチルエステル又は他のエステル又はヒドラジドを形成するために誘導体化されることが出来、側鎖は、ヒスチジンのイミダゾール窒素のための遊離ハイドロキシル基又はＮ−ｉｍベンジレヒスチジンのためのＯ−アシル又はＯ−アルキル誘導体を形成するために誘導体化されることが出来る。ペプチド類似体は、例えばエチルアミン、エタノールアミン、エチレン、ジアミン、アミノ酸側鎖（リシンのイプシロンアミノ基など）のアシル化又はメチル化などのアリルアミンによるＣ末端アミノ酸のメチル化、アミド化によって化学的に変質されたアミノ酸を含む。ペプチド類似体は、ペプチドにおける置換アミド（例えば、Ｒが（Ｃ１-Ｃ６）アルキル（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、又は置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキニルである式−Ｃ（Ｏ）−ＮＲの群）とのアミド結合の交替、又は、アミド結合の同配体（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、又は−ＣＨ２ＳＯ-）をも含む。
【００４３】
本発明のＧＤ２リガンド、ペプチド、ドメインは、同種重合体又はヘテロ多重体を形成するために、例えば、重合又は接合によって、共有結合的に結合するのであろう。生理学的状況のもとに無電荷されたアミノ酸などの小中性分子から典型的に構成されるスペーサー及びリンカーが用いられることが出来る。結合は、多くの方法において達成される。例えばシステイン残基はペプチド終端に加えられることが出来、多重ペプチドは規定の酸化によって共有結合的に結合されることが出来る。代わりに、薬剤を形成するジスルフィド／アミド又はチオエーテル／アミドなどのヘテロ二重機能性薬剤が用いられることが出来る。化合物は、Ｔ細胞反応を促進することの出来る脂質を含む分子やペプチドにも結合することが出来る。化合物は、例えば、環状部分を有することによって抑圧されることが出来る。
【００４４】
ペプチド又はペプチド類似体は、例えば、溶液又は固相合成方法論を用いて自動合成によって、標準の化学技術によって、合成されることが出来る。自動ペプチド合成機は、商業的に利用可能であり、その分野においてよく知られている技術を用いる。ペプチド又はペプチド類似体は、標準の方法を用いる組換えＤＮＡ技術を使用することによって精製されることも出来る。
【００４５】
本発明の化合物は、人間への投与に適切な形態で、リポソーム、アジュバント、又は薬学的に受け入れられるキャリアの存在下において、単独、又は、併用、又は、他の化合物（例えば、毒素、増殖因子、抗アポトーシス薬剤、小分子、ペプチド、又はペプチド類似体）との接合において、提供されることが出来る。従来の薬務は、癌などの疾患に苦しむ患者に投与する化合物に適切な形態又は構成に適用されるであろう。例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、眼窩内、眼科、脳室内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、又は経口投薬のような、いかなる適切な投薬経路が適用されるであろう。
【００４６】
非経口投薬の処方は、例えば、賦形剤、無菌水、サリン、ポリエチレングリコール、野菜の原油、又は、硬化ネプタリンなどのポリアルキレングリコールを含む。生体適合性の生物分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコールコポリマー、又はポリオキシチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーは、化合物の放出を制御するために用いられる。他の潜在的に有用な調節性の化合物は、非経口伝達システムは、エチレンビニールアセテートコポリマー分子、浸透性ポンプ、移植可能な注入システム、及び、リポソームを含む。吸引形態は、例えば、ラクトースのような賦形剤を含み、ポリオキシチレン−９−ラウリルエーテル、グリコール酸、及び、デオキシコール酸のような水溶液であり、点鼻薬の形、又は、ゲルとして投与される油剤であるだろう。
【００４７】
要求されるのであれば、本発明による化合物の治療は、例えば、手術や化学療法などの従来の疾患療法と組み合わされるであろう。
【００４８】
治療又は予防組成物のために、化合物は、細胞破壊の誘発（癌など）又は、細胞破壊の抑止や減速（神経保護の治療や痛みの治療など）に十分な量において、患者に投与されるであろう。十分だと思われる量は、使用された具体的な化合物、投与方法、疾患の段階及び重症度、年齢、性別、治療されている患者の健康、及び、同時進行の治療によって変容する。しかしながら、一般的なルールとして、投与量は、最初の投与量では、患者の体重１キログラムあたり、１ミクログラムから１００ｍｇまで及び、後の患者の反応によって調節される。
【００４９】
ワクチン処方の際には、本発明の化合物の有効量は、単独、又は、フロイントの不完全アジュバントやアルミニウム水酸化物といった他の化合物との組合せによって提供されることが出来る。化合物は、免疫原性を促進するためにウシ血清アルブミン又はＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）などのキャリア分子と結合されるであろう。
【００５０】
一般的に、本発明の化合物は、実質的な毒性を引き起こすことなしに、用いられるべきである。発明の化合物の毒性は、例えば、細胞培養、又は、実験動物の試験、及び、治療係数、すなわち、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）とＬＤ１００（個体群の１００％の致死量）との比率の決定という標準技術を用いることで決定されることが出来る。場合によっては、しかしながら、重症な疾患状態においては、化合物の実質的な過剰量を投与する必要があるであろう。
【００５１】
以下の実施例は、様々な態様及び本発明の側面を示し、どのような方法においても本発明を制限することはない。
【実施例】
【００５２】
方法
細胞：ＥＬ４マウスリンパ腫及びＲ１．１マウスリンパ腫は、５％の二酸化炭素の加湿空気の中、３７℃で、５％の致死ウシ血清、２ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ及びペニシリン／ストレプトマイシンと共に補充されたＲＰＭＩ１６４０培地溶液（Life Technologies）において増殖された。ＥＬ４のＧＤ２陰性変異体は、抗ＧＤ２  ｍＡＢ  ３Ｆ８及びウサギ補体との培養に耐性のＥＬ４細胞のサブクローニングの後、得られた。
【００５３】
流動細胞計測法（フローサイトメトリー）：５０mｌＦＡＣＳ緩衝液
（ＰＢＳリン酸緩衝食塩水０．５％、ＢＳＡウシ血清アルブミン０．０５％、ＮａＮ３アジ化ナトリウム）における１０５細胞は、以下のリガンドと共に３０分間、氷上で染色された：ＧＤ２には蛍光標識試薬複合化の抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８；ＧＭ１には、蛍光標識試薬複合化のコレラ毒素Ｂサブユニット（Sigma）；ＧＭ２には、ウサギ抗ＧＭ２ ｍＡｂ ＮＡＮＡ（Matreya）、次に、蛍光標識試薬複合化の抗ウサギ抗体（Sigma）；ＧＤ３には、抗ＧＤ３ ｍＡｂマウス（Pharmingen）、続いて、蛍光標識試薬複合の抗マウス抗体（Sigma）。細胞は、蛍光標識細胞分取器緩衝液で二度洗浄され、CellQuestソフトウェアを用いて、流動細胞計測法（Becton-Dickinson）で分析された。
【００５４】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＧＤ２又はＧＭ１の検出：ガングリオシドの１２．５ｎｇ／ｗｅｌｌ（ＧＤ２、高度免疫化学又はＧＭ１）は、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）９６ウェルプレート（Falcon）上で、乾燥させることによって、固定化され、その後、１時間、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にブロッキングされた。そして、１０分間、抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８又はビオチンＣＴＢが追加された。プレートはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に３回洗浄され、西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）複合の抗マウス抗体又はＨＲＰ複合アビジンと共に６０分間、培養された。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共に３回洗浄され、２回ＰＢＳで洗浄され、比色基質ＡＢＴＳが付加され、プレートは、バイオラド５５０プレートリーダー上、４１４ｎｍであった。
【００５５】
ＧＤ２及びｐ５６Ｌｃｋの免疫共沈降：細胞（一つのサンプルにつき５×１０６）ＰＢＳにおいて洗浄され、１ｍｌの溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭナトリウムリン酸ｐＨ７．２、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％ＣＨＡＰＳ、２００mＭナトリウムバナジン酸塩、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１００mＭロイペプチン、１ｍＭベンズアミド、３００ｎＭアプロチニン、５００ｎＭ大豆トリプシン阻害剤）において再縣濁され、
３０分間４℃で培養された。上清は、遠心沈降（４℃で１５分間１６０００ｇ）後、可溶化疫から収集された。免疫沈降は、４℃で一晩、５mｇの抗ＧＤ２ ｍＡｂ ３Ｆ８又は抗ｐ５６Ｌｃｋ ｍＡｂ ３Ａ５(Santa Cruz Biotechnology)又はコントロールＩｇＧ；又は５０m ｌのアビジンアガロース(Sigma)のいづれか、及び、ＧＭ１ガングリオシドに特異的な５mｇのビオチンＣＴＢと共に、タンパク質Ｇセファロースを用いて実施された。免疫沈降は、ＣＨＡＰＳ洗浄剤の減少性濃度を含む冷溶解緩衝液１ｍｌで５回洗浄され、サンプルは還元型Laemmli緩衝液と共に抽出された。サンプルは、そこで、ウェスタンブロット分析のために用いられ（上記参照）サンプルからのリピドはＥＬＩＳＡによってガングリオシド定量化のために単離された（上記参照）。
【００５６】
生化学的分析：ウェスタンブロッティング：免疫沈降したサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分割され、メンブランに伝達され、ｐ５６Ｌｃｋイムノブロットは、ウサギの抗ｐ５６Ｌｃｋ多クローン抗体を用いて行われた。ｐ５６Ｌｃｋ及びＺａｐ７０のチロシンリン酸化（一つのサンプルにつき、５×１０６）は、ＰＢＳと共に洗浄され、０．２％のＢＳＡを含む５ｍｌの無タンパク質のハイブリドーマ培地において再縣濁され、キナーゼ作用のベースラインを低下させるために、６０分間３７℃で安静にさせた。次に、１０mｇの抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８（１３ｎＭ濃度）又は非特異的マウスＩｇＧが、５時間２０分間、添加された。サンプルは、そこで、冷ＰＢＳ内で、洗浄され、洗浄剤は溶解緩衝疫内で、５mｇの抗５６Ｌｃｋ  ｍＡｂ  ３Ａ５（Santa Cruz Biotechnology）又は、抗Ｚａｐ７０ｍＡｂＬＲ(Santa Cruz Biotechnology)を用いて免疫沈降された。サンプルは、そこで、抗ホスホチロシンｍＡｂ  ４Ｇ１０を用いたウェスタンブロッティングによって分析された。インビトロによるｐ５６ＬｃＫキナ−ゼ作用：ｐ５６Ｌｃｋ免疫沈降は、キナ−ゼ反応緩衝液（１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２．５mＭ ＡＴＰ、２０mＣｉ［g−３２Ｐ］ＡＴＰ）において、ＧＡＰ  ｐ６２又はＳａｍ６８特異基質ｐ５６Ｌｃｋと共に２０分間３７℃で培養された。反応は還元型Laemmli緩衝液の追加及び沸騰によって停止された。ｐ５６Ｌｃｋ基質のリン酸化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって視覚化及び数量化され、ImageQuantソフトウェアでＳｔｏｒｍ８４０ホスフォイメージャー上で分析された。
【００５７】
外因性のＧＤ２がインビトロのキナ−ゼアッセイによってｐ５６Ｌｃｋに与える影響：
クロマトグラフ的に精製された  ｐ５６Ｌｃｋチロシンキナーゼ
（Upstate Biotechnology）は、氷上で、１０分間、キナ−ゼ緩衝液
（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、２ｍＭ ＥＧＴＡ，１５０mＭ  ＡＴＰ、０．２５  ｍＭナトリウムバナジン酸塩、２ｍＭ ＤＴＴ）において、２０倍までのガングリオシドのモル過剰、及び、１０mＣｉ［g−Ｐ］ＡＴＰの有り無しで培養された。次に、１０mｇのＳｒｃキナ−ゼ基質ペプチドｐ３４ｃｄｃ２（６−２０）（Upstate Biotechnology）が、反応が１００mＭヨードアセドアミドの付加、及び、最終１０％ＴＣＡのタンパク質の沈殿によって停止された後、混合物に付加され、指定時間内、室温で培養された。ＴＣＡによって沈澱化されていないリン酸化ペプチド基質を含む上清は、Ｐ８１紙（Whatman）に点在され、３回、０．７５％のリン酸で、及び、１回アセトンで洗浄された。［３２Ｐ］−ペプチド含量は、ImageQuantソフトウェアと共にＳｔｏｒｍ８４０ホスフォイメージャーを用いて数量化された。
【００５８】
ペプチドは、テネイシンＲ配列及びテネイシン属ホモログの多様性を基礎として、モデル化された。ペプチドは、固相Ｆｍｏｃ化合物を用いた高度化合自動シンセサイザー（Advanced Chemetech automatic synthesizer）と共に合成された。樹脂からの分割及び脱側鎖保護の後、末端システインを含むペプチドは、５０ｍＭアンモニウム炭酸水素塩ｐＨ８．５において、Ｏ２の元、４℃で、酸化によって、環化に従属された。ペプチドは、Ｃ−１８調整用カラム（Phenomenex）を用いたＨＰＬＣ（>９５％）によって精製され、質量分析によって実証された。
【００５９】
競合性ＥＬＩＳＡによるペプチドＧＤ２の相互作用の影響評価：ＥＬＩＳＡｓは、ペプチド（ＰＢＳにおいて、５０mｇ／ｗｅｌｌ）が抗ＧＤ２ｍＡｂ  ３Ｆ８又は抗ＧＭ１コレラ毒素Ｂの１時間前にウェルに付加されることを除いては、上記のように説明された通りである。阻害の選択性は、相互作用に与える影響の欠如にコントロールされている。
【００６０】
細胞内カルシウム研究：細胞（一つのサンプルに付き１×１０６）は、リンゲル溶液（１５５ｍＭ  ＮａＣｌ，４．５ｍＭ  ＫＣＩ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、５  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で洗浄され、１５分間、３７℃で、１０mＭ ｐ５６Ｌｃｋ阻害剤ＰＰ１（BioMol）又は溶媒を含む１ｍｌのリンゲルにおいて、再縣濁された。そこで、５mＭ Ｒｈｏｄ−２ＡＭ(Molecular Probes)が細胞に加えられ、３０分間、室内温度で、温和な攪拌と共に培養された。細胞は１回リンゲル内で洗浄され１ｍＭリンゲル内で再縣濁され、培養された後、細胞が表示されたガングリオシドリガンド（又はコントロールとしてのカルシウムイオン透過孔）に刺激され、３０分間流動血球計数器（Becton-
Dickinson）を用いて細胞内Ｃａ２＋が分析された。
【００６１】
軟寒天コロニー形成：ＥＬ４  ＧＤ２陰性及びＥＬ４  ＧＤ２陽性の単独細胞縣濁液は、ｍＡｂ  ３Ｆ８（５０mｇ／プレート）の有り無しで上層培養液（０．３５％の寒天を含むＲＰＭＩ１６４０、１５％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及びペニシリン／ストレプトマイシン）内で、事前形成された下層（０．５％寒天以外は上記と同じ）の表面上で、１００ｍｍポリスチレン皿（Falcon）に撒かれ（１５００細胞／プレート）、コロニーが眼で見えるようになるまで増殖された。
【００６２】
インビボ腫瘍研究：ハンクスの平衡塩におけるＥＬ４  ＧＤ２陰性及びＥＬ４  ＧＤ２陽性の単独細胞縣濁液はヌードＢａｌｂ／ｃマウス(Charles River)（動物一匹につき１×１０６細胞）腹腔内に注入された。動物は、細胞増殖によって、７日から１０日後、屠殺及び検死された。      
インビトロＣＤ４５脱リン酸酵素アッセイ：ヒト組換えＣＤ４５酵素（BioMol、７５ユニット／ｗｅｌｌ）は、ナトリウムハナジン酸塩（陽性コントロール）又は多様なガングリオシド（１６．７mＭ）の存在又は非存在下で２０分間、９６ウェルマイクロタイタープレートの半分の量において室温で前保温された。ＣＤ４５に特異的な基質（ｐｐ６０Ｓｒｃ  Ｃ末端リン酸調節性ペプチド、２００mＭ）が、そこで２０分間、３０℃で、付加され、その後、反応は停止しBioMol Green試薬で数量化された。プレートはバイオラド５５０プレートリーダーで６２０ｎｍを指した。
【００６３】
エキスビボＣＤ４５アッセイ：ＥＬ４  ＧＤ２陰性及びＥＬ４  ＧＤ２陽性の単独細胞縣濁液は、５mｇ／ｍｌのｍＩｇ(陰性コントロール)、抗ＧＤ２抗体３Ｆ８、又は抗ハムスターＧ９４−５６(Pharmingen)に架橋された抗ＣＤ３抗体１４５−２Ｃ１１（Pharmingen）の存在下で、５％の致死ウシ血清、２ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ及び、ペニシリン／ストレプトマイシンに補充された培養液ＲＰＭＩ１６４０において２０分間、３７℃で、培養された。細胞は、そこで洗浄され、洗浄剤は溶解した。ｐ５６Ｌｃｋは、次に、抗５６Ｌｃｋ抗体被覆ビーズによって免疫沈降され、抗ＰＹ５０５(Cell Signaling Technology)を用いたウェスタンブロッティングによって、ホスホチロシン５０５は探索された。
【００６４】
結果
ｐ５６Ｌｃｋとガングリオシドとの特異的物理的会合性を研究するために、流動細胞計測法によって査定されたように、ＧＤ２、ＧＭ１、ＧＭ２、及びＧＤ３の細胞表面の発現の変化に伴って、細胞のパネルが生成された。表示細胞（表２）は、ｐ５６Ｌｃｋの類似したレベルを発現している（データは示されていない）。
【００６５】
【表２】
2006516241.tif 000003
【００６６】
ｐ５６Ｌｃｋと−ＧＤ２との特異的かつ安定した会合性
我々は、ｍＡｂ  ３Ｆ８との抗ＧＤ２免疫沈降を行い、続いて、抗ｐ５６Ｌｃｋ抗体を用いたウェスタンブロティングを行った（図２Ａ）。ＥＬ４
ＧＤ２陽性細胞においては、ｐ５６Ｌｃｋは，ｍＡｂ  ３Ｆ８と共沈澱したが、コントロールマウスＩｇＧとはしなかった。ＧＤ２陰性であるコントロールＲ１．１細胞においてはｐ５６Ｌｃｋが高いレベルにおいて発現しているにもかかわらず、どの抗体もｐ５６Ｌｃｋと共沈澱しなかった。
【００６７】
抗ＧＤ２免疫沈降におけるｐ５６Ｌｃｋの存在及びキナ-ゼ活性は、実証かつ数量化された（図２Ｂ及び２Ｃ）。表示免疫沈降は、ＥＬ４  ＧＤ２陽性又はＥＬ４  ＧＤ２陰性上で行われ、ｐ５６Ｌｃｋに特異的な基質Ｓａｍ６８を用いてインビトロで行われた。ＥＬ４  ＧＤ２陽性において、ｐ５６Ｌｃｋ活性の約１５％が、抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８によって共沈澱（図２Ｂ、１列目）し、抗Ｌｃｋ  ｍＡｂ  ３Ａ５と比較された（図２Ｂ、２列目）。実際、ｐ５６Ｌｃｋ活性の抗ＧＤ２共沈澱は、Ｚａｐ７０に対する抗体による共沈澱と比較可能であった（図２Ｂ３列目）。これは、報告によれば、Ｚａｐ７０及びｐ５６Ｌｃｋが物理的かつ機能的にインビボで会合しているという事実と合致していた。
【００６８】
これらのアッセイの特異性は、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞を用いて、研究において実証され、抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８はｐ５６Ｌｃｋ活性と共沈澱しない（図２Ｂ、４列目）一方で、抗Ｌｃｋ及び、抗Ｚａｐ７０抗体は共沈澱した（図２Ｂ５、６列目）。抗Ｚａｐ７０抗体とのｐ５６Ｌｃｋ免疫共沈澱がＥＬ４  ＧＤ２陽性及びＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞株と比較可能であったため（図２Ｂ、３及び６列目）、データはＺａｐ７０とｐ５６Ｌｃｋとの会合性は、ＧＤ２非依存性であることを提案している。
【００６９】
類似の研究が、ＥＬ４  ＧＤ２陽性又はＲ１．１（ＧＤ２陰性）細胞を用いて、インビトロでｐ５６Ｌｃｋ活性が選択的基質におけるキナ-ゼ活性を含有することを示しながら行われた。再度、抗ＧＤ２は、抗Ｌｃｋ  ｍＡｂ  ３Ａ５と精製された１５％以下の活性と一致するＰ５６Ｌｃｋ活性を共精製した。対照的に、コレラ毒素Ｂサブユニット結合型ビーズによるＧＭ１のアフィニティー単離は、Ｒ１．１細胞が高レベルのＧＭ１及びｐ５６Ｌｃｋのを有する（表２Ｃ、４列目）にもかかわらず、ｐ５６Ｌｃｋ活性を共精製しなかった（表２Ｃ、３列目）。
【００７０】
ｐ５６Ｌｃｋが初めてｍＡｂ  ３Ａ５と免疫沈降した逆実験が行われ、ＧＤ２又はＧＭ１の存在がＥＬＩＳＡによって計られた（図２Ｄ）。ＥＬ４ＧＤ２陽性細胞からの抗ｐ５６Ｌｃｋ免疫沈降は抗ＧＤ２  ｍＡｂ  ３Ｆ８によって単離するこの出来る５５％以下のＧＤ２を含んでいた。特異コントロールにおいて、Ｒ１．１細胞からの抗ｐ５６Ｌｃｋ免疫沈降は、ガングリオシドＧＭ１を共沈澱しなかった。
【００７１】
ＧＤ２リガンド非存在下のｐ５６ＬｃｋとＧＤ２との会合性の機能的連関
次の実験（図３）はＧＤ２とｐ５６Ｌｃｋとの安定かつ選択的結合に機能的関連性があるかどうかインビトロで取り組まれた。精製ｐ５６Ｌｃｋへの外因性ＧＤ２の付加は、２０分時点で、キナ-ゼ作用において急激な７０％増加を伴って、２５分以下の半減期から１７分以下の半減期（from t1/2 of 〜25 minutes to a t1/2 of 〜17 minutes）における酵素活性の動態をインビトロで増加させた。しかしながら、Ｖmaxは、存在するＧＤ２の有る無しに、酵素活性が類似のプラトー（plateau）に到達するにつれて変化はなかった。コントロールアッセイにおいて、ｐ５６Ｌｃｋキナ-ゼ活性は外因性ＧＭ１の付加（図３）又は、ホスファチジルコリン又は他のリピドの付加（データに表示されていない）によって変更はなかった。
【００７２】
人工ＧＤ２リガンドの発生  
小ペプチド（長さ６−１３のアミノ酸）は、ＧＳ２リガンド、テネイシンＲの第一配列に及ぶために構成された。環化及び他の高次構造上の抑圧は、それらを構造上に抑圧するために、これらのペプチド内に導入された。
【００７３】
これらのペプチド（１００以下は合成された）は、ＧＤ２−ｍＡｂ３Ｆ８プレート（表３）における相互作用の阻害のために試験された。付加された競合ペプチド又はコントロールとは無関係のペプチドは、１００％結合として標準化された。簡素化のために、９０以下の少量の不活性ペプチドが示されている。
【００７４】
多種の態様において、ＧＤ２−ｍＡＢ  ３Ｆ８相互作用を活発に阻害するペプチド類似体は、ＮＨ２−ＩＩｅ−Ｔｈｒ（Ａｌａ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ配列に及んでいる。いくつかの態様では、本発明のペプチドは、Ｇｌｙ残基（下線）が配列に組み込まれているかどうかによって、Ｃα１からＣα４原子までの距離が４から７Ａの間で変動しながらＩＶ型（３：５又は３：３）正準β-ｔｕｒｎ構造に属するのであろう。
又、溶解に構成されていない（データに示されていない）１１アミノ酸の線状ペプチド（ｐｅｐ５１）は競合性阻害剤として作用する事も出来る。
【００７５】
【表３】
2006516241.tif 000004
【００７６】
ペプチドによって固定化されたＧＤ２に結合するｍＡｂ３Ｆ８の阻害は競合性  ＥＬＩＳＡによって測定される。いかなるペプチド又はコントロールペプチドの治療は、０％阻害として標準化されていない。いかなるｍＡｂ  ３Ｆ８治療も１００％阻害として標準化されていない。５つの独立した実験の平均は各実験においてｎ＝４である。平均値±平均値の標準誤差。
【００７７】
ｐ５６Ｌｃｋ活性におけるＧＤ２リガンドの機能的連関性
この実施例は、以下のことを示している（ｉ）細胞表面ＧＤ２とリガンドとの結合がｐ５６ＬｃｋのｐＴｙｒを引き起こすかどうか（図４Ａ）；（ｉｉ）細胞表面ＧＤ２とリガンドとの結合が下流エフェクターＺａｐ７０に通じるかどうか（図４Ｂ）（ｉｉｉ）細胞表面ＧＤ２の結合が細胞内カルシウム溶剤を誘発するかどうか（図４Ｃ）。
第一に、ＥＬ４  ＧＤ２陽性生細胞におけるＧＤ２細胞表面と人工ＧＤ２リガンドｍＡｂ  ３Ｆ８との結合は、５分以内に、インビボで（図４Ａ  ３・４列目）ｐ５６ＬｃｋのｐＴｙｒ引き起こした。コントロールマウスＩｇＧは、この影響を引き起こさなかった（図４Ａ  １・２列目）。
【００７８】
第二に、ｐ５６ＬｃｋのｐＴｙｒは、どのＴｙｒ残基がリン酸化されるかどうかで、このキナ―ゼの活性化又は不活性化に導くことが出来るので、活性ｐ５６Ｌｃｋのダウンストリームのアダプター分子かつ、活性ｐ５６Ｌｃｋによってリン酸化されているので、ｐＴｙｒの特性Ｚａｐ７０は、インビボで研究された。Ｚａｐ７０は、リガンド（図４Ｂ、３・４列目）として、細胞表面ＧＤ２とｍＡｂ  ３Ｆ８と結合する際、一時的にｐＴｙｒである。このＺａｐ７０  ｐＴｙｒは、おそらくｐ５６Ｌｃｋを経由して発生する。コントロールマウスＩｇＧは、ＥＬ４  ＧＤ２陽性細胞において、Ｚａｐ７０  ｐＴｙｒを引きおこさなかった（図４Ｂ、１・２列目）。他の特異コントロールにおいては、ＧＤ２リガンドとのＥＬ４ＧＤ２陰性細胞の治療は、細胞表面ＧＤ２発現は、いくつかの態様においては、ＧＤ２のリガンド結合及び続くダウンストリームの効果に必要とされることを示しながら、ｐ５６ＬｃｋのｐＴｙｒ又はＺａｐ７０を引き起こさなかった（データには示されていない）。
【００７９】
第三に、細胞内Ｃａ＋＋濃度は、細胞表面ＧＤ２がリガンドと結合した後にＥＬ４  ＧＤ２陽性生細胞において測定された（図４Ｃ）。Ｒｈｏｄ−２フルオロフォア感受性のカルシウムを用いた流動細胞数測定分析は、ｍＡｂ  ３Ｆ８結合後、迅速な（５分以下）細胞内カルシウムの１．６倍増殖を示したが、コントロールマウス抗体又はＣＴＢ（データは示されていない）による結合後には示さなかった。選択的ｐ５６Ｌｃｋキナ-ゼ阻害剤ＰＰ１（１０mＭ）は、カルシウム溶剤のｍＡｂ  ３Ｆ８―阻害を著しく減少させた。このコントロールは、活性ｐ５６Ｌｃｋは、いくつかの態様において細胞内カルシウム溶剤を導くシグナル伝達経路の側面の原因である。
【００８０】
ＣＤ４５活性におけるＧＤ２の存在の機能的連関性
ＣＤ４５ホスフォターゼは、ｐ５６Ｌｃｋの作用の原因であるため、ＣＤ４５活性に及ぼすＧＤ２の影響が分析された。第一に、ＧＤ２の影響が、ヒト組換えＣＤ４５酵素、及び、ｐｐ６０Ｓｒｃペプチドを基質として用いることでインビトロで試験された。表５に示されているようにＧＤ２は、ＣＤ４５ホスファターゼ作用（８５％阻害）を徹底的に阻害し、他方、他のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ３、及びＧＭ３）は、ＣＤ４５の酵素活性に少しの影響しか与えなかった。ＧＤ２以外は、ＧＤ１ａのみが、重要な阻害（５０％）を示した。
【００８１】
ＣＤ４５に対するＧＤ２の阻害効果は，図６に示されているように生細胞内でも見られる。ここでは、ＥＬ４  ＧＤ２陽性及びＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞は、十分実証されている細胞受容体クロスリンク方法論を用いて刺激されたが、その方法論はＣＤ４５によるチロシンにおける脱リン酸に続いてｐ５６Ｌｃｋの活性化に典型的に帰結する。興味深いことに、ＥＬ４ＧＤ２陽性細胞は活性化に耐性であり（図６、３列目）、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞（図７、６列目）は、Ｔ細胞受容体クロスリンクに直ちに活性化される。この矛盾はｐ５６ＬｃｋのＣＤ４５媒介活性化を遮断することが出来るＥＬ４  ＧＤ２陽性細胞におけるＧＤ２の存在に起因する。興味深いことの中には、ｍＡｂ  ３Ｆ８などのＧＤ２リガンドは、ＣＤ４５のＧＤ２抑制を緩和することが出来、ｐ５６Ｌｃｋに対するチロシン５０５の脱リン酸によって見られるように（図６、２列目）、Ｔ細胞受容体を活性化させるという事実である。
【００８２】
腫瘍遺伝的増殖におけるＧＤ２及びＧＤ２リガンドの機能的関連性
癌細胞の増殖及び生存におけるＧＤ２の細胞表面発現の効果を示すために、ＥＬ４  ＧＤ２陽性及びＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞は、クローン原生の軟寒天アッセイにおいて増殖（図７）、又は、腹腔内に、インビボで注入された（図８）。
軟寒天におけるコロニー形成アッセイは、ＥＬ４  ＧＤ２陽性及びＥＬ４ＧＤ２陰性細胞の増殖動態において著しい相違を示した。増殖の１０日目、各プレートにおけるＥＬ４  ＧＤ２陽性コロニーの総数は、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞と比較して、５０％低下した（図７ａ）。更に、ＥＬ４  ＧＤ２陰性コロニーは、より大きく、より多くの細胞を含んだ(図７ｂ)。これは、両細胞株が液体培養において同一の二倍を有していた点で際立っている。
【００８３】
寒天層におけるｍＡｂ  ３Ｆ８の付加（ＧＤ２媒介シグナルを推定的に、拡散、結合、及び、活性化する）は、ＥＬ４  ＧＤ２陰性コロニーの数及び大きさの結果を一つも有しないまま、ＥＬ４  ＧＤ２陽性コロニー形成を破壊した。これは、本発明のＧＤ２リガンドが例えば、このような細胞の増殖を阻害したり、細胞を殺したりするＧＤ２を発現する癌細胞を治療するために、増殖の調節を目的としたＧＤ２陽性細胞を治療するために用いられていることを示している。いくつかの態様において、ＧＤ２が結合する際（データに示されていない）、ＥＬ４  ＧＤ２陽性細胞はアポトーシスによって消滅し、本発明のＧＤ２リガンドがＧＤ２の存在がいくつかの態様においてはアポトーシスを誘発するために、用いられることを示している。
【００８４】
証拠の相違は、細胞がインビボで増殖する際にも観察される。腹腔内に注入される際、ＥＬ４  ＧＤ２陰性細胞は、主に攻撃的かつ転移性の腹水腫瘍を形成し、腹腔は、ムチンのようなペプチドグリカンを含んでいる。対照的に、ＥＬ４  ＧＤ２陽性細胞は、局在型で高度に血管新生化された腹膜メンブランに付属的な高度固形腫瘍を形成している（図８）。
【００８５】
結論
本発明の様々な態様が、ここに開示されているにもかかわらず、多くの適応や修正は、技術の熟練者達の共通した一般知識と一致しながら本発明の範囲内でなされるであろう。同様の修正は、実質的に同一の方法において同一の結果を得るために、発明のどの側面にも知られている等価物の置換を含む。数の範囲は、範囲を定義する数を包括している。明細書では、「comprising」という言葉は、幅拾い解釈の出来る言い回しとして用いられ、「including, but not limited to」というフレーズに実質的に等しく、「comprises」という言葉と一致した意味を持つ。ここでの引用文献は、本発明の先行技術であるような了承事項として解釈されるべきではない。本明細書に引用されている特許及び特許出願を含むが、これらに限ったものではない全ての刊行物は、各刊行物が、本明細書に具体的かつ個々に示されているかのように、且つ、ここに完全に前述しているかのように、参考のために示されている。発明は、以上の実施例及び図面への言及に説明されているように、全ての態様及び変形例を実質的に含んでいる。
【００８６】
References
以下の文書は、参考のために示されている：
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【図１】
2006516241.tif 000005
【図２ａ】
2006516241.tif 000006
【図２ｂ】
2006516241.tif 000007
【図２ｃ】
2006516241.tif 000008
【図２ｄ】
2006516241.tif 000009
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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