(57)【要約】遺伝分析を行うための、改善された系および方法が提供される。複数の個体に由来する遺伝子DNAに対して完全なゲノムDNAのスキャンが行われ、遺伝的変異体が同定される。それらの変異体について、完全な遺伝子DNAのスキャンに基づくのではなく、付加的な個体においては変異体のみがスキャンされ、共に遺伝する傾向がある変異体のブロックが同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、遺伝分析を行う方法：
a．少なくとも10,000個の塩基がスキャンされる、複数の個体に由来するゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体を遺伝的変異体についてスキャンする段階；
b．複数の個体において生じる、該ゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体における該遺伝的変異体を同定する段階；
c．少なくとも10,000個の該塩基の全てではないが、複数の個体において生じる少なくとも該ゲノム変異体について、付加的な個体に由来するゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体をスキャンし、付加的な該個体においては該遺伝的変異体のいずれが生じているかを同定する段階；ならびに
d．段階c）の結果に基づき、該変異体のブロックを同定する段階。
【請求項２】
関連研究においてブロック内の変異体を用いる段階をさらに含む、請求項1記載の方法であり、それにより、該ブロック内の該変異体が表現型形質と関連付けられる、方法。
【請求項３】
ブロック内にある1つまたはそれ以上の変異体を用いて、表現型形質を診断する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
表現型形質と関連する変異体を用い、潜在的な薬剤標的を同定する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項５】
小分子をスクリーニングする工程において潜在的な薬剤標的を用いる段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体をスキャンする段階が以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
a．a）該ゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体の第一の配列の部分に対して相補的な、およびb）該ゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体の変異体に対して相補的な、プローブのアレイを形成させる段階；
b．該ゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体を該アレイにハイブリダイズさせる段階；ならびに
c．該ゲノムDNAまたはそれ由来の誘導体が、該アレイのどこにハイブリダイズするかを同定する段階。
【請求項７】
ゲノムDNAをスキャンする段階が、ゲルに基づくシーケンサーを用いて該ゲノムDNAを配列決定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ゲノムDNAをスキャンする段階が、キャピラリーに基づくシーケンサーを用いて該ゲノムDNAを配列決定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
複数の個体の10％より多くにおいて生じる変異体のみが段階c）において使用される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
付加的な個体においては変異体のいずれが生じているかを同定する、ゲノムDNAをスキャンする段階が、以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
a．標識ゲノムDNAまたはその誘導体を、該変異体に対して相補的なプローブの高密度アレイに曝露する段階；および
b．該ゲノムDNAが、該高密度アレイにどこでハイブリダイズするかを決定する段階。
【請求項１１】
付加的な個体においては変異体のいずれが生じているかを同定する、遺伝子DNAをスキャンする段階が、インベーダーアッセイの使用を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
付加的な個体においては変異体のいずれが生じているかを同定する、遺伝子DNAをスキャンする段階が、タックマンアッセイの使用を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
1×106個より多くの塩基を変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
1×107個より多くの塩基を変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
1×108個より多くの塩基を変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
1×109個より多くの塩基を変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
イントロンを変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
イントロンおよびエキソンを変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
生物体に由来する全ての非反復ゲノムDNAの10％より多くを変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
生物体に由来する全ての非反復ゲノムDNAの25％より多くを変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
生物体に由来する全ての非反復ゲノムDNAの50％より多くを変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
生物体に由来する全ての非反復ゲノムDNAの75％より多くを変異体についてスキャンする、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
変異体が一塩基多型である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
関連研究の結果を使用して、臨床試験において患者集団を層別化する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項２５】
関連研究の結果を使用して、薬剤に応答する患者を、薬剤に応答しない患者から層別化する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項２６】
関連研究の結果を使用して、薬剤に対して毒性応答を示すと考えられる患者を、薬剤に対して毒性応答を示さないと考えられる患者から層別化する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項２７】
以下を含む、遺伝分析を行う方法：
（a）ある個体集団に由来するゲノムDNAまたはその誘導体を解析し、個体における遺伝的変異の部位のセットおよびその部位を占める変異形態を同定する段階であり、セットにおけるその部位がゲノムDNAにおいて少なくとも10,000塩基に渡る段階；
（b）部位のセットのサブセットを決定する段階であり、そのサブセットのそれぞれの部位が、集団中の少なくとも2個体においてそれぞれ存在する少なくとも2つの変異形態を有する段階；
（c）付加的な個体における、サブセット中のその部位を占める変異形態を決定する段階；ならびに
（d）ブロック内の部位を占める変異形態の組み合わせが連鎖不平衡にあるという基準に基づき、サブセットからブロックに部位を分類する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその全体を参照として組み入れられる、2002年1月7日に出願されたUSSN第10/042,819号の一部継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトの染色体を構成するDNAは、身体における全てのタンパク質の生産を行わせる指示を与える。これらのタンパク質は、生命にとって重要な機能を行う。DNAにおける変異はしばしば、タンパク質における変異をもたらし、それにより細胞の機能に影響が与えられる。環境はしばしば重要な役割を担うが、DNAにおける変異または突然変異は、感染症、癌、遺伝疾患、および自己免疫疾患を含む、ほとんど全てのヒトの疾患に直接関連する。さらに、ヒトの遺伝学の知見によって、多くの疾患が、幾つかの遺伝子の複雑な相互作用、または、1つの遺伝子内におけるあらゆる数の突然変異のいずれかから生じるという認識が導かれた。例えば、I型糖尿病およびII型糖尿病は、各々がその独自の突然変異パターンを有する複数の遺伝子と関連付けられた。対照的に、嚢胞性線維症は、単一の遺伝子における、300個を超える異なる突然変異のいずれか1つによって引き起こされる可能性がある。
【０００３】
加えて、薬剤応答−薬理遺伝学の分野−について言えば、ヒトの遺伝学の知識では、個体間の差異についての理解は限られている。半世紀以上も前に、2つの薬剤代謝酵素、血漿のコリンエステラーゼおよびグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼにおいて、薬剤の有害応答がアミノ酸の変異と初めて関連付けられて以来、慎重な遺伝分析によって、35個を超える薬剤代謝酵素、25個の薬剤標的、および5個の薬剤輸送体において、配列多型が許容レベルの薬剤の有効性または安全性と関連付けられてきた。診療所においては、そのような情報が、薬剤毒性を予防するために使用されつつある；例えば、患者はしばしば、6-メルカプトプリンまたはアザチオプリンの代謝の減少を引き起こすチオプリンメチルトランスフェラーゼ遺伝子における遺伝的差異についてスクリーニングされる。しかし、これまでには、認められた薬剤毒性のうち、ほんのわずかなパーセンテージのもののみが、確証された薬理遺伝学的マーカーの組によって適切に説明されているに過ぎない。さらに、以前に臨床試験において安全かつ有効であると示された薬剤が投与された場合に、「例外的な」個体において、不十分な治療的有効性または不測の副作用が認められることは、ヘルスケア従事者にとっては非常に大きな問題であり、製薬業界に対しては著しいジレンマを与えるものとなる。
【０００４】
疾患関連遺伝子および薬理遺伝学的遺伝子のバリデーションは、集団の要素および量的遺伝学および基盤のしっかりした統計的手法に依存する；しかし、第一段階は通常、候補標的遺伝子の同定に依存する。これまで、候補遺伝子を同定するためには、様々な生物工学的方法が使用されてきた。例えば、本質的に、罹患個体と非罹患個体との遺伝子発現における相違、または、治療個体と非治療個体との遺伝子発現における相違を探索する、示差的な遺伝子発現が使用されてきた。さらに、薬剤受容体およびその直接的なエフェクターを同定するために、タンパク質-タンパク質相互作用の地図が用いられてきた。その他のアプローチは、認容されている疾患関連制御因子または薬物動態学的制御因子または薬力学的制御因子と類似した配列についてのヒトの配列データベースの敷設（mine）に関与するものである。
【０００５】
ヒトのいかなる2個体も99.9％はその遺伝的構成が類似しているため、そのゲノムのDNA配列のほとんどは同一である。しかし、DNA配列には個体間での変異が存在する。例えば、DNAの多くの塩基の一続きの欠失、一連のDNAの挿入、非コード領域における反復DNA成分の数の変異、および、「一塩基多型」または「SNP」と呼ばれる、ゲノムにおける1つの窒素塩基の位置の変化がある。少なくとも10％の人間において生じる、300〜400万個の共通に認められるSNPが存在すると見積もられている。これらの共通に認められるSNPは、独立しては生じないが、複数のSNPからなる可変長のブロックとして世代から世代に伝達され、ゲノムに渡ってパターンを形成する。そのようなSNPのブロックは、本明細書においてはSNPハプロタイプブロックと呼ばれる。
【０００６】
SNPについて最も適切な候補遺伝子同定戦略は、様々な個体集団についての全ゲノムの関連付けである−即ち、個体集団の全ゲノムをスキャンし、SNPを疾患または薬剤応答と関連付けるものである。そのような全ゲノム解析では、高い精度の遺伝子マッピングおよび極めて正確な連鎖の特定の領域が提供されることになる。全ゲノム解析に関連しては、様々な方法が提案され、使用されている。例えば、（あらゆる目的のために参照として本明細書に組み入れられる）2002年3月26日に出願された米国特許出願第10/106,097号において説明される方法が、そのような適用における使用のために提案されている。あらゆる目的のために参照として本明細書に組み入れられる、2002年10月31日に出願された米国特許出願第10/284,444号は、1つの代表的な染色体、即ち染色体21に渡るSNPおよびSNPハプロタイプブロックの同定を与えている。
【０００７】
首尾よく行われる一方で、そのような解析を行うことができる速度および効率を上げることが望ましい、ならびに、そのような解析を行うコストを削減することが望ましい。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
遺伝分析を行うための改善された方法、装置、および系が提供される。本発明のある態様に従い、複数の個体に由来する遺伝子DNAまたはそれ由来の誘導体がスキャンされるようなある方法が提供される。スキャニングでは、例えば、ゲルに基づくシーケンサーまたは高密度アレイを使用し、複数の個体における遺伝的多型を同定する。スキャンされた塩基の全てではなく、複数の個体において生じる多型について、付加的な個体に由来する遺伝子DNAまたはそれ由来の誘導体を評価し、付加的な個体においては変異体のいずれが生じているかを同定する。付加的な個体のスキャニングの結果に基づき、本方法では、共に遺伝する傾向のある多型のブロックの同定が与えられる。その後、薬剤標的の同定、診断の同定、臨床試験の評価、ファーマコゲノミクスおよび他の適用のような広範な適用において、多型のブロックを使用することができる。
【０００９】
好ましい態様の詳細な説明
本開示を通して、様々な特許、特許出願および刊行物が参照される。他に指示されない限り、各々は、あらゆる目的のためにその全体を参照として組み入れられる。
【００１０】
一塩基多型を同定し、そのような多型を群に割当て、およびそのような群をドラッグディスカバリーの過程において使用するための方法は、例えば、あらゆる目的のために参照として本明細書に組み入れられる、USSN第10/106,097号において説明されている。図1は、そのような過程を説明する全般的な図を提供する。図1においては、ヒトゲノムのようなゲノムにおける変異位置が段階110において同定される。段階110において使用される過程は、例えば、（あらゆる目的のために参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,861,242号において一般に議論されているように、）アフメトリックス社から入手可能であるもののようなDNA/RNAアレイを用いて、変異体についてゲノム領域をスキャンする段階、アプライドバイオシステムズ社から入手可能なゲルシーケンサーに基づくもののような、従来的なゲル配列決定技術、キャピラリー配列決定技術、または他の技術の使用を含み得る。好ましくは、その各々が問題の集団の10％より多くにおいて生じる少なくとも2つの変異形態を有するもののような、共通に認められるSNPのみが解析において使用される。なぜなら、例えば、これらのSNPは進化の上でより古い変異体に相当するものと考えられるため、およびしたがって、集団のより大きな画分においてより一般的な疾患／状態と関連する傾向があるためである。
【００１１】
好ましい態様においては、高密度DNAアレイを用いて、ゲノムDNA（または、例えばPCR DNAもしくはRNAアンプリコンなどの、それ由来の誘導体）を変異体についてスキャンする。ある技術を用い、高密度アレイ上にプローブのアレイを形成させる。プローブのアレイは、a）（第一の配列決定を試みる段階から得られるもののような）遺伝子DNAのベースライン配列の部分に対して相補的なプローブ、および、b）遺伝子DNAのベースライン配列の変異体に対して相補的な、1つまたはそれ以上のプローブを含む。その後、遺伝子DNAまたはその変異体を標識し、アレイにハイブリダイズさせスキャンする。ハイブリダイゼーションが検出される位置に基づき、遺伝子DNA中の塩基が「野生型」かまたは変異体であるかを検出することが可能である。特定の塩基が参照配列と同じである場合は、標識された材料は、野生型プローブにより強固にハイブリダイズする。DNA配列が参照配列と異なる場合には、標識された材料は、変異型プローブの1つにより強固にハイブリダイズする。本情報に基づき、特定の塩基を、参照配列と同じである、または参照配列の変異型であると呼ぶことができる。
【００１２】
好ましい態様においては、10,000個より多くの塩基を変異体についてスキャンする。より好ましい態様においては、1×106個より多くの塩基を変異体についてスキャンし、より好ましくは2×106個より多くの塩基、より好ましくは1×107個、より好ましくは1×108個より多く、およびより好ましくは1×109個より多くの塩基を変異体についてスキャンする。選択的に、スキャニングによって同定される多型部位は、少なくとも10,000塩基の距離に渡る；即ち、同じ染色体上にある多型部位のあるセットの最も外側のものは、少なくとも10,000塩基離れている。選択的に、多型部位のセットの最も外側のものは、少なくとも2×106塩基または1×107塩基離れている。好ましい態様においては、少なくともイントロンを変異体についてスキャンし、より好ましい態様においては、イントロンおよびエキソンの双方を変異体についてスキャンする。好ましい態様においては、スキャンされる核酸はゲノムDNAである。最も好ましい態様においては、そのようなDNAはヒトのような哺乳動物の生物体に由来する。好ましい態様においては、生物体からのゲノムDNAの10％より多くをスキャンし、より好ましい態様においては、生物体からのゲノムDNAの25％より多くをスキャンし、より好ましい態様においては、生物体からのゲノムDNAの50％より多くをスキャンし、および最も好ましい態様においては、ゲノムDNAの75％より多くをスキャンする。
【００１３】
段階120においては、変異体が群に割当てられる。そのような変異体群は、共に遺伝する傾向がある変異体のブロック（ほとんどの場合においては、一塩基多型または「SNP」）である。そのような「ブロック」または「SNP変異ハプロタイプブロック」は、ブロックの端部はその種における昔の組み換えイベントの境界である傾向があると考えられるため、進化の視点から生じた可能性が高い。1つのブロック内における多型部位の変異形態の組み合わせまたはハプロタイプは、異なるブロックにおいて生じる多型部位の組み合わせまたはハプロタイプよりも高い頻度で、ある集団において共分離する。一般に、あるブロック内の多型部位は互いに連鎖不平衡にある一方、ブロック外の多型部位は、ブロック内のものと独立して組み換えを行う傾向がある、または、ブロック内の多型部位よりは少なくとも独立して組み換えを行う傾向がある。連鎖不平衡（LD）は、その集団におけるいかなる特定の対立遺伝子の頻度について偶然に起こると予測されるよりも高い頻度で生じる、特定の変異形態の、近傍の染色体位置にある別の変異形態との優先的な関連を意味する。例えば、遺伝子座Xが、等しい頻度で生じる対立遺伝子aおよびbを有し、連鎖した遺伝子座Yが、等しい頻度で生じる対立遺伝子cおよびdを有する場合、ハプロタイプacは個体集団において0.25の頻度で生じると予測される。acがより高い頻度で生じる場合、対立遺伝子aおよびcは連鎖不平衡にあると考えられる。選択的に、多型部位のブロックは、変異形態の8つまでの組み合わせまたはハプロタイプが各々、集団における個体の少なくとも10％において生じ、集団におけるこれらの変異形態の組み合わせまたはハプロタイプの少なくとも80％を集合的に占めるような、多型部位のセットであると定義付けられることが可能である。通常、1つのブロックは、集団におけるそのブロックの可能なハプロタイプの少なくとも80％に相当する2、3または4個のハプロタイプを有する。あるブロック内の多型部位の数は、ゲノムの異なる部分において様々である。全てではないが、幾つかのブロックは、1つの多型部位を含み得る。そのようなブロックは、アイソレート（isolate）と呼ばれる。幾つかのブロックは、少なくとも2、5、20、または100個の多型部位を含み得る。
【００１４】
段階130においては、そのようなブロックの表現型との関連を同定するための関連研究において、各ブロックからの代表的な変異体が使用される。そのような関連研究は、a）アフメトリックス遺伝子型同定アレイ、b）参照として本明細書に全て組み入れられる、Agarwal, P.ら「Comparison study for identifying promoter allelic polymorphism in interleukin 10 and tumor necrosis factor alpha genes」, Diagn Mol Pathol 9, 158〜64(2000)；Cooksey, R.C., Holloway, B.P., Oldenburg, M.C., Listenbee, S.およびMiller, C.W.「Evaluation of the Invader assay, a linear signal amplification method, for identification of mutations associated with resistance to rifampin and isoniazid in Mycobacterium tuberculosis」, Antimicrob Agents Chemother 44, 1296〜301(2000)；ならびに、Mein, C.A.ら「Evaluation of single nucleotide polymorphism typing with Invader on PCR amplicons and its automation」, Genome Res 10, 330〜43(2000)において説明されているような、Third Waveから入手可能な「インベーダー（Invader）」アッセイ、または、c）Arnold, B.A., Hepler,R.W.およびKeller,P.M.「One-Step Fluorescent Probe Product-Enhanced Reverse Transcriptase Assay」, BioTechniques 25(1):98〜106, 1998；Becker K., D.PanおよびC.B.Whitley, 1999, Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer, Hum.Gene Ther. 10:2559〜2566, 1999；Berg,T., Miller,A.R., Platz,K.P., Hohne, M., Bechstein,W.O.,Hopf,U., Wiedenmann,B., Neuhaus,P.,およびSchreier, E.「Dynamics of GB virus C viremia early after orthotopic liver transplantation indicates extrahepatic tissues as the predominant site of GB virus C replication」, Hepatology 29(1):245〜249, 1999において説明される「タックマン（Taqman）」アッセイのような、様々な技術、または様々な他の技術を用いて行われることが可能である。例として、アレイに基づく技術が使用される場合は、変異位置のみがアレイ上に「張りつけ」られることを除いては、上記に説明されるものと同様のアレイを作製する。
【００１５】
ハプロタイプのパターンおよびブロックを試験するのに特に適したあるアプローチは、二倍体状態から半数体状態に染色体を分離するために体細胞の遺伝学を使用するものである。ある態様においては、二倍体であるヒトのリンパ芽球様細胞系を、ヒトの染色体がハムスター細胞に導入されて細胞ハイブリッドが作製されるように、同様に二倍体であるハムスターの線維芽細胞系に融合することが可能である。結果として生じる細胞ハイブリッドは、どのヒト染色体が転移されたか、および、もし転移されたのであれば、転移されたどのヒト染色体が半数体状態にあるかを決定するために試験される（例えば、Pattersonら, Annal.N.Y.Acad.Of Sciences, 396:69〜81(1982)を参照のこと）。
【００１６】
例えば、ある疾患状態と、ゲノムのどの領域が関連しているかが一旦決定されれば、ドラッグスクリーニングアッセイが行われ、段階140において、ゲノムの関連部分を仲介する、1つまたはそれ以上の分子が同定され、治療薬150が同定される。加えて、段階160においては、遺伝的診断アッセイ、免疫アッセイまたは他の診断テストにおいて、関連自体を直接使用することが可能である。代替の態様においては、ファーマコゲノミクス研究のような薬剤応答を評価する研究において変異領域を使用する。その後、その結果を使用して、薬剤応答に従って患者を層別化する。幾つかの態様においては、層別化を、毒性応答を示し得る個体をそうでないものから層別化するために使用することが可能である。他の場合においては、層別化によって、無応答者となるものを応答者となるものから分けることが可能である。
【００１７】
図2は、変異体、通常SNPが、ゲノムにおける群またはブロックにおいてどのように生じるかを示す1つの実例を提供する。そのようなSNPハプロタイプブロックは、比較的少数の共通形態を有する、単位として遺伝される傾向のある染色体領域である。図2における各々の列は、異なる個体の半数体ゲノム配列の部分を示す。そこに示されるように、個体Wは位置241に「A」を、位置242に「G」を、および位置243に「A」を有する。個体Xは、位置241、242、および243に同じ塩基を有する。逆に、個体Yは、位置241および243にTを有するが、位置242にAを有する。個体Zは、位置241、242、および243に個体Yと同じ塩基を有する。変異体は、最も一般的に、二対立遺伝子となる、即ち、可能な変異形態の4つ全てではなく、2分の1のみの変異形態で生じる。ブロック261における変異体は、共に生じる傾向がある。同様に、ブロック262および263における変異体は、共に生じる傾向がある。当然のことながら、ゲノムにおけるほんのわずかな塩基のみが図2においては示されている。実際には、ほとんどの塩基は位置245および248におけるものと同様に、個体と個体の間で異ならないと考えられる。
【００１８】
SNPの、SNPハプロタイプブロックにおいて共に生じるこの傾向により、関連研究において、あるブロックにおけるSNPの全てを用いずに、そのブロックにおける単独または少数のSNPを使用することが可能になる。例えば、位置241におけるSNPのみを評価することにより、SNP242および243を同定するアッセイを行わずに、位置242および243におけるSNPを予測することが可能である。位置241がAを含む場合、位置242はGを含み、位置243はAを含むことになる。逆に、位置241がTを含む場合、位置242および243は各々、AおよびTを含むことになる。同様に、ブロック262におけるSNPを、ブロック262における他のSNPを予測するために使用することが可能である。例えば、SNP244がTである場合、位置246がCであり、位置247がGであるとわかることになる。逆に、位置244がCである場合、位置246はAであり、位置247はCである。
【００１９】
本明細書の発明に従い、第一の、限定されたサンプルのセットにおいて、ゲノム領域における塩基の全て、または実質的に全てが、共通に認められるSNPについてスキャンされる。その後、実質的に第一のスキャニング段階において同定されたSNP、特に、集団の少なくとも10％において生じる少なくとも2つの変異形態を有するSNPのみを用いて、関心対象のゲノム領域の完全なスキャンから同定されたSNP位置における、付加的な個体の遺伝子型同定が行われる。第一のサンプルのセットは、ゲノムDNAの完全なスキャンによって、十分に高いレベルの信頼度で十分な数のSNPが同定される程度に十分大きいが、特定の実験についてブロック境界の全てを必要なレベルの信頼度にまで必ず同定するほど十分大きくはない。第二のサンプルのセットは、その実験について十分なレベルの信頼度でブロック境界の定義付けを可能にする程度に十分なサイズのものである。
【００２０】
図3は、より詳細に工程を説明するものである。示されるように、段階310においては、「n」個のゲノムDNAのサブセットが、そのようなゲノムの全てまたは部分に渡って、塩基の位置毎に、共通に認められるSNPまたは変異体についてスキャンされる。その後、上記に説明されるもののような遺伝子型同定技術を用いて、段階310において同定された変異位置のみが、付加的な「m」個の個体を遺伝子型同定するために使用される。段階310および320から蓄積された遺伝子型を用い、変異ブロックが割当てられる。多型部位のブロックへの割当ては、段階310または320またはその両方において得られたデータに基づくことが可能である。解析される集団の画分については、変異体の各々のブロックへの割当てにおいて、関心対象のゲノムDNAの塩基のある画分のみの評価を行えばよいため、本明細書の発明を用いると、遺伝分析、特に全ゲノム解析を行うコストおよび負担が著しく減少する。
【００２１】
好ましい態様においては、段階310において、10個より多くの異なる単相体ゲノムDNAのコピーが変異体についてスキャンされ、さらなる遺伝子型同定解析において使用される（即ち、「n」は10またはそれ以上である）。より好ましい態様においては、15個より多くの異なるゲノムDNAのコピーが変異体についてスキャンされ、さらなる遺伝子型同定解析において使用される（即ち、「n」は15またはそれ以上である）。より好ましい態様においては、18個より多くのゲノムDNAのコピーが変異体についてスキャンされ、さらなる遺伝子型同定解析において使用される（即ち、「n」は18またはそれ以上である）。より好ましい態様においては、20個より多くのゲノムDNAが変異体についてスキャンされ、さらなる遺伝子型同定解析において使用される（即ち、「n」は20またはそれ以上である）。より好ましい態様においては、25個より多くのゲノムDNAのコピーが変異体についてスキャンされ、さらなる遺伝子型同定解析において使用される（即ち、「n」は25またはそれ以上である）。
【００２２】
好ましい態様においては、ゲノムDNAの完全なスキャニング後に、段階320において付加的なサンプルの遺伝子型同定を行い、完全なスキャンにおいて見出された代表的なSNPの評価を行う。好ましい態様においては、遺伝子型同定段階320によって、10個より多くの異なる単相体ゲノムDNAを解析する（即ち、「m」は10またはそれ以上である）。より好ましい態様においては、遺伝子型同定段階320によって、15個より多くの異なるゲノムDNAを解析する。より好ましい態様においては、遺伝子型同定段階320によって、20個より多くの異なるゲノムDNAを解析する。より好ましい態様においては、遺伝子型同定段階320によって、25個より多くの異なるゲノムDNAを解析する。より好ましい態様においては、遺伝子型同定段階320によって、30個より多くの異なるゲノムDNAを解析する。
【００２３】
図4は、仮定的な状況における、図3の工程の結果を説明するものである。図4の上の部分は、変異位置を示し、変異ブロック境界を引いた、仮定上の一連のDNA配列を説明する。当然のことながら、図4の上の部分は、この情報が最初から分かるわけではないが、突然変異を印付け、ブロック境界を引いた、一連のゲノムDNAを例として説明するものである。配列決定の結果410は、3個体の半数体DNAを配列決定した結果を示す。示されるように、一般に、比較的少数の個体を配列決定した後に、共通に認められるSNPの大きな画分を同定してしまうことが可能である。図4の場合においては、図4の上の部分に示される、各位置におけるSNPが同定されており、チェック印によって示される。しかし、さらなる個体が評価されない場合は、ブロック境界はこの段階においては正しく同定されない。例えば、この段階においてブロック420と430の間にブロック境界を引くことが可能である（第一のC→G変異体により、第一のG→A変異体が予測され、第一のC→T変異体により、第二のC→T変異体が予測されることに注意すること）一方、この段階においてブロック430と440の間を見分けることは可能ではない。本段階においては、第一のC→T変異体によって第一および第二のT→A変異体が予測されると考えられる。したがって、ブロック境界を引くためには、統計学的により有意なサンプルのセットが必要とされる。しかし、関連SNPが同定されたため、ここでは、一連のゲノムDNAの全てを配列決定せずに、ブロック境界を同定する工程を完了するために、変異位置のみを遺伝子型同定することが可能である。
【００２４】
別の仮定上のゲノムサンプルにおいてSNPのみについて遺伝子型同定工程を行った結果は、図4の450において示される。示されるように、この付加的な遺伝子型同定段階を行うことによって、ここでは、ブロック430と440が識別可能であることが分かり得る。特定的に、ここでは、第一のC→T変異体によって第一および第二のT→A変異体はつきとめられないが、代わりに、第一のC→T変異体を、第二のC→T変異体のみを予測するために用いることは可能であること、および、第一のT→A変異体を、第二のT→A変異体を予測するためだけに用いることは可能であることがわかる。
【００２５】
いかなる特定の操作の理論に縛られることも望ましくないが、このような仕方でアッセイを首尾良く利用し得るその基礎は、最も共通に認められるSNPを発見するためには少数の個体を使用すればよいという事実に見出されると考えられる。ほとんどの個体は、最も共通に認められるハプロタイプによって説明されるが、共通に認められる頻度の低いハプロタイプは、より大きなサンプルのセットが使用されなければ、その出現頻度によって誤って順位付けられる可能性がある。
【００２６】
実施例
Affymetrix whole wafersを用い、あらゆる目的のために参照として本明細書に組み入れられる、2002年3月26日に出願された米国特許出願第10/106,097号の方法を一般的に使用して、染色体21からのゲノムDNAのある領域を、多型領域についてスキャンした。その後、染色体21の19個の付加的なコピーを、同じ技術を用いて評価した。この特定の実施例においては10％を超える対立遺伝子頻度で生じるものを意味する、「共通に認められる」SNPを評価した。38個ではなく、19個のスキャンをSNP検出のために使用できるかどうかを評価するために、いくつのSNPが全38個のスキャンに渡って> 10％の対立遺伝子頻度を生み出し、しかしながら、19個のみのスキャンのセットにおいては共通に認められる多型とは考えられないかを決定した。一方の19個のスキャンにおいて全く多型が認められない場合、38個において> 10％の対立遺伝子頻度を有するためには、あるSNPは19個のスキャンにおいて> 20％の頻度を有することが必要となる。実施された解析においては、19個のみのスキャンを評価することによって、共通に認められるSNPの89％が同定された。上記の解析において同定されたSNPは、表1、2、および3において示される。表1は、38個のスキャンのセットのうち、最初および最後の19個のスキャンの双方において認められたと考えられるSNPを示す。表2は、染色体21の38個のスキャンのうち最初の19個を評価することによって同定されたと考えられるが、他方の19個のスキャンのみを評価することによっては同定されなかったと考えられるSNPを示す。表3は、染色体21の38個のスキャンのうち最後の19個を評価することによって同定されたと考えられるが、最初の19個のスキャンのみを評価することによっては同定されなかったと考えられるSNPを示す。最初および最後のどちらの19個のスキャンにおいても同定される、3,170個のSNPが存在する。最初の19個のスキャンにおいてのみ認められる361個のSNPが存在し、他方の19個のスキャンにおいてのみ認められる516個のSNPが存在する。したがって、染色体21におけるスキャン数の半分のみにおいては認められないようなSNPは、平均して、（(0.5)*(361+516) ）/(3170+361+516)または11％存在する。
【００２７】
上記の説明は例として役立つものであり、制限されるものではないと理解される。したがって、本発明の範囲は、上記の説明に関してではなく、代わりに、特許請求の範囲が与えられる同等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲に関して決定されるべきである。
【００２８】
【表１】
2006504392.tif 000002
2006504392.tif 000003
2006504392.tif 000004
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【表２】
2006504392.tif 000053
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【表３】
2006504392.tif 000060
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2006504392.tif 000062
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2006504392.tif 000068
【００２９】
以下の図および図面は、本特許の発明のある局面を示すために、本明細書の部分をなし、本明細書に含まれる。本発明は、本明細書において示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたはそれ以上を参照することによってより十分に理解されることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の局面を説明するフローチャートである。
【図２】SNPのブロックを説明する。
【図３】本発明のさらなる局面を説明するフローチャートである。
【図４】本発明のある局面に従ってブロックを同定する局面を説明する。
【図１】
2006504392.tif 000069
【図２】
2006504392.tif 000070
【図３】
2006504392.tif 000071
【図４】
2006504392.tif 000072
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月15日(2004.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
【図１】本発明の局面を説明するフローチャートである。
【図２】SNPのブロックを説明する。
【図３】本発明のさらなる局面を説明するフローチャートである。
【図４】本発明のある局面に従ってブロックを同定する局面を説明する。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  Perlegen Sciences, Inc.
<120>  GENETIC ANALYSIS  SYSTEMS AND METHODS
<130>  TO-A0431
<140>  JP 2003-558032
<141>  2003-01-07
<150>  US 10/042,819
<151>  2002-01-07
<160>  8     
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 2, illustration of haploid genome sequence
<400>  1
agattcgata acg                                                        13
<210>  2
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 2, illustration of haploid genome sequence
<400>  2
agactacata acg                                                        13
<210>  3
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 2, illustration of haploid genome sequence
<400>  3
tatttcgata acg                                                        13
<210>  4
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 2, illustration of haploid genome sequence
<400>  4
tatctacaat cac                                                        13
<210>  5
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 4 reference genomic DNA
<400>  5
actgacccct ttt                                                        13
<210>  6
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 4, illustration of haploid genome sequence
<400>  6
agtaacccct ttt                                                        13
<210>  7
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 4, illustration of haploid genome sequence
<400>  7
actgacccct ttt                                                        13
<210>  8
<211>  13
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Figure 4, illustration of haploid genome sequence
<400>  8
actgactctt taa  
【国際調査報告】
2006504392.tif 000073
2006504392.tif 000074