(57)【要約】本発明の方法は，サンプル中の標的ポリヌクレオチドの特定の特性を同定するために用いられ，以下の工程：（ｉ）  サンプル中の各標的ポリヌクレオチドの一方の末端に，調べている特性に特異的なポリヌクレオチドシグナル配列を結合させ，（ｉｉ）  その特性が存在する場合には標的ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと相互作用する分子と接触させ；（ｉｉｉ）  工程（ｉｉ）の分子と相互作用する標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドアダプター配列を結合させ，アダプターは，標的ポリヌクレオチドのシグナル配列が結合している末端と反対側の末端に結合しており；（ｉｖ）  シグナル配列とアダプターの両方を含む標的ポリヌクレオチドについてポリヌクレオチド増幅反応を行い，任意に，他の特性について工程（ｉ）−（ｉｖ）を繰り返し；そして（ｖ）  増幅された産物にいずれのシグナル配列が存在するか，およびどの順番で存在するかを同定して，このことにより各標的ポリヌクレオチドの特性を決定する，を含む。
2006523451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチドの特定の特性を同定する方法であって，
（ｉ）  サンプル中の各標的ポリヌクレオチドの一方の末端に，調べている特性に特異的なポリヌクレオチドシグナル配列を結合させ，
（ｉｉ）  その特性が存在する場合には標的ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと相互作用する分子と接触させ；
（ｉｉｉ）  相互作用した標的ポリヌクレオチドを相互作用していない標的ポリヌクレオチドから分離し；
（ｉｖ）  任意に，工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返し；そして
（ｖ）  分離された標的ポリヌクレオチド上にいずれのシグナル配列が存在するか，およびどの順番で存在するかを同定し，このことにより各標的ポリヌクレオチドの特性を決定する，
の各工程を含む方法。
【請求項２】
工程（ｉｉｉ）が，
（ａ）分子と相互作用した標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドアダプター配列を結合させ；そして
（ｂ）シグナル配列とアダプターの両方を含む標的ポリヌクレオチドについてポリヌクレオチド増幅反応を行う，
ことにより行われる，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法が，標的ポリヌクレオチドの核酸配列を決定するために行われる，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
アダプターポリヌクレオチドが，増幅工程の後の切断を可能とする制限酵素認識配列を含む，請求項２記載の方法。
【請求項５】
増幅がポリメラーゼ反応を用いて行われる，請求項２記載の方法。
【請求項６】
アダプターおよびシグナル配列が，ポリメラーゼ反応において用いられるオリゴヌクレオチドプライマー用の認識部位を含む，請求項５記載の方法。
【請求項７】
サンプルがｎ個の反応コンパートメントに分離され，ここで，ｎは，調べている異なる特性の数であり，かつ各コンパートメントについてのシグナル配列はそのコンパートメントに特異的である，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
制限酵素認識配列がクラスＩＩｓ酵素に特異的である，請求項４記載の方法。
【請求項９】
酵素がＳｆａＮＩまたはＥａｒＩである，請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ポリメラーゼ反応が，ｄＣＴＰの代わりにメチル−ｄＣＴＰを用いて行われる，請求項５記載の方法。
【請求項１１】
アダプターが支持材料上に固定化されている，請求項２記載の方法。
【請求項１２】
連続したシグナル配列および任意に連続したアダプターが，異なるオリゴヌクレオチドプライマーの認識部位を含む，請求項６記載の方法。
【請求項１３】
標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって，
（ｉ）  二本鎖標的ポリヌクレオチドのサンプルを処理してそれぞれの末端にオーバーハングを形成し，その一方は配列決定すべきものであり，各オーバーハングは規定された数の塩基を有しており；
（ｉｉ）  サンプルを分割し，それぞれのサンプルを二本鎖ポリヌクレオチドシグナル配列および二本鎖アダプターポリヌクレオチドと接触させ，各シグナル配列は配列決定すべきオーバーハングの長さと同じ長さの特定のポリヌクレオチド配列を表し，かつ，標的ポリヌクレオチドの配列決定つつある側と反対側の末端へのハイブリダイゼーションおよびライゲーションを可能とするオーバーハングを含み，各アダプターは，配列決定されつつあるオーバーハング配列に相補的な配列のオーバーハングを含み；
（ｉｉｉ）  シグナル配列およびアダプター配列の末端にハイブリダイズするプライマーを用いてサンプルについてポリメラーゼ反応を行い，ここで，ポリメラーゼ反応の生成物は，アダプターを切断して配列決定すべき新たなオーバーハングを形成することを可能とする制限部位を含み，
制限酵素を用いて任意に工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返してオーバーハングを生成し；そして
（ｉｖ）  増幅された産物上にいずれのシグナル配列が存在するか，およびどの順番で存在するかを同定し，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定する，
の各工程を含む方法。
【請求項１４】
シグナル配列にライゲーションされるオーバーハングが少なくとも３塩基である，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
配列決定すべきオーバーハングが４塩基である，請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，後に標的ポリヌクレオチドの配列を決定するために，標的ポリヌクレオチドを読み出し可能な情報の鎖に変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子の研究における進歩は，部分的には，分子またはその生物学的反応を特性決定するために用いられる技術の改良により進められてきた。特に，核酸ＤＮＡおよびＲＮＡの研究は，配列分析およびハイブリダイゼーション事象の研究に用いられる技術の開発から利益を受けてきた。
【０００３】
大規模ＤＮＡ配列決定のために一般的に使用される主な方法は連鎖停止法である。この方法は，最初にＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎにより開発され（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７７；７４：５４６３−５４６７），４つのヌクレオチドのジデオキシ誘導体を使用して，ポリメラーゼ反応において生成しつつあるポリヌクレオチド鎖中にこれを取り込ませる。ジデオキシ誘導体が取り込まれるとポリメラーゼ反応が停止し，次に生成物をゲル電気泳動により分離し，分析して，特定のジデオキシ誘導体が鎖中に取り込まれた位置を明らかにする。
【０００４】
この方法は広く用いられており，信頼性のある結果を生ずるが，遅く，労力を要し，高価であることが認識されている。
【０００５】
ＵＳ−Ａ−５３０２５０９は，固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドを配列決定する方法を開示する。この方法は，異なる蛍光標識を有する，３’側がブロックされた塩基Ａ，Ｇ，ＣおよびＴを，ＤＮＡポリメラーゼの存在下で固定化されたポリヌクレオチドに取り込ませることに基づく。ポリメラーゼは標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を取り込むが，３’−ブロッキング基のため，さらなる付加が妨げられる。次に取り込まれた塩基上の標識を判定し，化学的切断によりブロッキング基を除去して，さらに重合反応が起こるようにする。しかし，このような様式でブロッキング基を除去する必要があるため，時間がかかり，高い効率で実施しなければならない。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−００／３９３３３は，標的ポリヌクレオチドの配列を，規定された配列およびそこに含まれる位置情報を有する第２のポリヌクレオチドに変換することにより，ポリヌクレオチドを配列決定する方法を記載する。標的の配列情報は，第２のポリヌクレオチド中で"拡大される"と言われ，標的分子上の個々の塩基を区別することがはるかに容易になる。これは，予め決定された核酸配列である"拡大タグ"を用いることにより行う。標的分子上の塩基，アデニン，シトシン，グアニンおよびチミンのそれぞれは，別々の拡大タグにより表され，元の標的配列は拡大された配列に変換される。次に，慣用の手法を用いて，拡大タグの順番を決定し，このことにより標的ポリヌクレオチド上の特定の配列を決定する。
【０００７】
好ましい配列決定方法においては，それぞれの拡大タグは標識，例えば，蛍光標識を含み，次にこれを同定し，これを用いて拡大タグの特性決定をすることができる。
【０００８】
この公開公報に開示された方法は多くの利点を有するが，標的ポリヌクレオチドを配列決定するための改良された方法がなお求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の観点にしたがえば，サンプル中に存在する標的ポリヌクレオチドの特定の特性を同定する方法は以下の各工程を含む：
（ｉ）  サンプル中の各標的ポリヌクレオチドの一方の末端に，調べている特性に特異的なポリヌクレオチドシグナル配列を結合させ，
（ｉｉ）  その特性が存在する場合には標的ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドと相互作用する分子と接触させ；
（ｉｉｉ）  相互作用した標的ポリヌクレオチドを相互作用していない標的ポリヌクレオチドから分離し；
（ｉｖ）  任意に，工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返し；そして
（ｖ）  分離された標的ポリヌクレオチド上にいずれのシグナル配列が存在するか，およびどの順番で存在するかを同定し，このことにより各標的ポリヌクレオチドの特性を決定する。
【００１０】
本発明の方法は，標的ポリヌクレオチドの多数の特性を容易に自動化可能な簡単な様式で決定することを可能とする。好ましい態様においては，本発明の方法は，特定の特性を有する標的上に２つのポリヌクレオチド分子を取り込ませ，増幅反応を進行させて，このことにより，所望の特性を有する標的ポリヌクレオチドの数を選択的に増加させ，この特性を有しない標的を効率的に除去する。この方法は，標的ポリヌクレオチドの配列を決定するのに特に適している。
【００１１】
本発明の第２の観点にしたがえば，標的ポリヌクレオチドの配列を決定する方法は以下の工程を含む：
ｉ）  二本鎖標的ポリヌクレオチドのサンプルを処理して，５’末端および３’末端にそれぞれ異なる数の塩基を含むオーバーハングを作成し；
ｉｉ）  サンプルを分割し，それぞれ個々のサンプルを二本鎖ポリヌクレオチドシグナル配列および二本鎖アダプターポリヌクレオチドと接触させ，各シグナル配列は，５’−オーバーハングにおいて特定のポリヌクレオチド配列を表し，かつ標的ポリヌクレオチドの３’末端とのハイブリダイゼーションおよびライゲーションを可能とするオーバーハングを含み，各アダプターは，シグナル配列により表される配列に相補的な配列であるオーバーハングを含み；
ｉｉｉ）  シグナル配列およびアダプター配列にハイブリダイズするプライマーを用いてサンプルについてポリメラーゼ反応を行い，ここで，ポリメラーゼ反応の生成物は，アダプターおよび標的ポリヌクレオチドの５’−オーバーハングを形成した部分を切断して新たな５’−オーバーハングを形成することができる制限部位を含み，制限酵素を用いて任意に工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返してオーバーハングを形成し；そして
ｉｖ）  増幅産物にいずれのシグナル配列がどの順番で存在するかを同定して，このことにより標的ポリヌクレオチドの配列を決定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の方法は，ＷＯ−Ａ−００／３９３３３に開示される変換方法の適用である。概要として，本発明は，特定のシグナル配列の組み込みに基づいて，同定すべき標的ポリヌクレオチドを特異的に特徴決定することを可能とする。シグナル配列はサンプル中に存在するすべての標的ポリヌクレオチド上に組み込まれるが，特定の特性を含むもののみが分離され特性決定される。
【００１３】
本発明の方法は，標的ポリヌクレオチドの配列を決定するのに特に適している。本発明の方法を用いて，標的ポリヌクレオチドの一方の末端における規定された数の配列を，標的ポリヌクレオチドの他方の末端における規定されたシグナル配列に変換することができる。一連の工程により，標的の"配列決定された"末端が切断され，一方，シグナル配列末端が構築されて，規定された一連のシグナル配列が生成し，続く同定工程においてこれを決定することができる。
【００１４】
"ポリヌクレオチド"との用語は当該技術分野においてよく知られており，一連の連結された核酸分子，例えばＤＮＡまたはＲＮＡを表すものとして用いられる。核酸模倣体，例えば，ＰＮＡ，ＬＮＡ（ロック核酸）および２’−Ｏ−ｍｅｔｈＲＮＡもまた本発明の範囲内である。
【００１５】
本明細書における塩基の表示Ａ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣは，当該技術分野において理解されるように，ヌクレオチド塩基，アデニン，チミン（ウラシル），グアニンおよびシトシンを表す。ウラシルは，ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にはチミンに置き換えられるか，またはｄＵＴＰを用いてＤＮＡ中に導入することができ，これも当該技術分野においてよく知られている。
【００１６】
ここで，標的ポリヌクレオチドの５’および３’末端について説明する。ある態様においては，標的ポリヌクレオチドは二本鎖であり，したがって各末端は５’末端および３’末端の両方を含む。しかし，５’末端および３’末端とは，調べているまたは配列決定されつつある標的の鎖に関して記述する。また，明細書で５’末端を配列決定されつつある末端と称する場合には，これが配列決定されている３’末端であるように改変することも可能であろう。すなわち，シグナル配列およびアダプターは本明細書に記載されているものと反対側の末端にライゲーションしてもよい。
【００１７】
本発明は，その最も広い観点においては，標的ポリヌクレオチドの特定の特性の同定を可能とする。特性はポリヌクレオチドの配列であってもよい。あるいは，標的ポリヌクレオチドが他の分子，例えばＤＮＡ結合蛋白質に結合するか，または相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力であってもよい。本発明の方法はまた，標的ポリヌクレオチド配列中に存在する制限酵素部位を同定し特性決定するためにも用いることができる。
【００１８】
各特性は，その特性を有する標的ポリヌクレオチドと相互作用し，かつその特性を有しないものから区別する分子を用いて反応を実施することにより同定する。分子と相互作用する標的ポリヌクレオチドは，その特性に特異的であり後の読み出し工程においてその特性を決定することを可能とするシグナル配列で標識される。
【００１９】
本発明は，サンプル中のすべての標的ポリヌクレオチドにシグナル配列を取り込ませることに基づいており，このシグナル配列は調べている特定の特性を表す。次に，標的ポリヌクレオチドを分子と接触させ，相互作用するものを分離する。このようにして，シグナル配列の識別により特性を同定することが可能である。
【００２０】
分子と相互作用する標的分子の分離は，種々の方法により行うことができる。例えば，分子は，標的ポリヌクレオチド／分子複合体の分離を可能とする結合成分を含んでいてもよい。適当な結合成分には，抗体およびビオチン／ストレプトアビジンが含まれる。あるいは，標的／分子複合体を複合体を形成していない成分から区別することが可能であるため，サイズ分画を行ってもよい。
【００２１】
本発明の好ましい態様は，ポリヌクレオチドシグナル配列およびポリヌクレオチドアダプター配列を標的ポリヌクレオチドに取り込ませることに基づいており，このことにより，増幅反応を行って，特定の分子と反応した標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。ポリメラーゼ反応の結果得られる産物は，標的を分子と反応させ，調べている特性を表すさらなるシグナル配列を取り込ませる工程を繰り返すことにより，さらに特性決定することができる。
【００２２】
本発明の方法は，好ましくは，調べているそれぞれの推定特性について１つずつの多数の反応コンパートメントを用いて行う。各反応コンパートメントには，そのコンパートメントに特異的なシグナル配列が附随する。標的ポリヌクレオチドを含有するサンプルを分割して反応コンパートメントに入れ，各標的ポリヌクレオチドの一方の末端にシグナル配列を付加する（例えばライゲーションにより）。標的が特定の特性を有するか否かにかかわらず，コンパートメント中の標的ポリヌクレオチドのすべてにシグナル配列を結合させる。次の工程は，各標的を，特性を含む標的と特異的に相互作用する分子と反応させることにより，特性を調べることである。したがって，分子は，ポリヌクレオチド結合蛋白質，酵素または他のポリヌクレオチドでありうる。次に，分子と相互作用する標的を分離する。好ましい態様においては，分子はアダプター配列を含む。したがって，標的と分子が相互作用すると，分子（アダプターを含む）は標的に結合するかライゲートする。次に，シグナル配列とアダプターとの両方を含む標的を増幅する。
【００２３】
増幅反応は，任意の適当な方法を用いて行うことができる。好ましい方法は，当該技術分野において知られる条件を用いて慣用のポリメラーゼ反応を用いることである。等温ｐｃｒおよび細菌中での増幅等の他の増幅反応も実施することができることが理解されるであろう。
【００２４】
好ましい態様は，この方法を用いて標的ポリヌクレオチドを配列決定することである。これは，標的ポリヌクレオチドの一方の末端で規定された数の塩基（例えば，３または４塩基）を同定し，次にこの情報を他方の末端上のシグナル配列に変換し，このことにより，前のサイクルで組み込まれたシグナル配列を除去することなく，追加の変換サイクルが生ずるようにすることにより行うことができる。
【００２５】
配列決定方法は，標的ポリヌクレオチドを取得し，これを一連の制限酵素で処理して，標的ポリヌクレオチドの各末端に規定されたオーバーハング領域を形成することにより行うことができる。オーバーハング領域は，各変換工程の間にシグナル配列およびアダプターを取り込ませることを可能とする。
【００２６】
"シグナル配列"とは，核酸配列の別々の"ユニット"を含む一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである。標的上のそれぞれの特性，例えば，塩基Ａ，Ｔ（Ｕ），ＧおよびＣは，別々の予め定義されたユニット，またはユニットの組み合わせにより表される。各ユニットは，好ましくは，２またはそれ以上のヌクレオチド塩基，好ましくは２−５０塩基，より好ましくは２−２０塩基，最も好ましくは４−１０塩基，例えば６塩基を含む。各ユニットには少なくとも２つの異なる塩基が存在する。好ましい態様においては，各ユニットには３つの異なる塩基が存在する。ユニットは，"読み出し"工程，例えば，重合反応において検出可能なように標識したヌクレオチドを取り込ませるか，または相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含む工程の間に，異なるユニットを区別することが可能であるように設計する。例えば，調べている特性が標的の配列である場合，標的上の各塩基は，ユニット中の特定の一連の塩基により表される。
【００２７】
好ましい態様においては，各シグナル配列は，２ユニットの，標的上の４つの塩基のすべてを表す別々の配列を含む。この態様にしたがえば，２つのユニットを，一方のユニットが"０"を表し，他方が"１"を表すバイナリ系として用いることができる。標的上の各塩基は，２つのユニットの組み合わせとして特性づけることができる。例えば，図１に示されるように，アデニンは"０"＋"０"，シトシンは"０"＋"１"，グアニンは"１"＋"０"，チミンは"１"＋"１"で表すことができる。ユニット間を区別することが必要であり，したがって，"ストップ"シグナルを各ユニット中に組み込むことができる。標的（テンプレート）ポリヌクレオチド上の塩基が奇数位置か偶数位置かによって"１"および"０"を表す異なるユニットを用いることも好ましい。
【００２８】
これは以下のように表される。
奇数のテンプレート配列：
"０"：ＡＴＴＴＴＴＡＴ（ＣＣ）  （配列番号１）
"１"：ＧＴＴＴＴＴＧＴ（ＣＣ）  （配列番号２）
偶数のテンプレート配列：
"０"：ＡＣＣＣＣＣＡＣ（ＴＴ）  （配列番号３）
"１"：ＧＣＣＣＣＣＧＣ（ＴＴ）  （配列番号４）
適当なシグナル配列はＷＯ−Ａ−００／３９３３３にも記載されている。
【００２９】
"アダプター"とは，一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである。アダプターの目的は，増幅が生ずることを可能とするのに必要な配列を提供することである。好ましい態様においては，アダプターは，標的ポリヌクレオチドの相補領域とハイブリダイズしこれにライゲーションすることができる規定されたオーバーハングを含む二本鎖ポリヌクレオチドである。相補領域は，通常は標的の，シグナル配列を組み込む末端とは反対側の末端である。アダプターは，増幅反応において必要なプライマー結合部位を提供する。好ましい態様においては，アダプターは，配列決定されつつある標的ポリヌクレオチドの一部，すなわち標的ポリヌクレオチドの５’−オーバーハング部分にハイブリダイズするよう設計する。標的上の５’−オーバーハングが４塩基であれば，アダプター上の相補的オーバーハングも４塩基である。このことにより，ライゲーションが生じて，二本鎖ポリヌクレオチドが形成される。標的の５’−オーバーハングが未知の配列である場合，通常は，（例えば）４塩基配列のすべての順列を有するアダプターの組を用いることが必要である。以下に説明するように，別々の反応において異なる配列のアダプターを用いる。
【００３０】
通常は各アダプターに制限酵素認識部位が組み込まれており，後の工程の間にこれを切断することが可能である。これを用いて新たな５’−オーバーハングを作成することができる。
【００３１】
好ましい態様の配列決定方法は，以下の一般的工程を含む：
消化
まず標的ポリヌクレオチドのサンプルを１またはそれ以上の制限酵素で処理し，標的中に規定された数の塩基，例えば３塩基を有するオーバーハングを生成し，これを後の手順においてシグナル配列のライゲーションに用いる（オーバーハング）。オーバーハングは標的ポリヌクレオチドの反対側の末端にも作成する（５’−オーバーハング）。このオーバーハングが，変換プロセスの間にシグナル配列により同定され（表され），アダプターにライゲーションされる。
【００３２】
ライゲーション
標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを，配列決定すべきオーバーハングのすべての順列を表す反応コンパートメント中に等分する。例えば，配列決定すべきオーバーハングが４塩基である場合，２５６個の反応コンパートメントを用いる。最初のコンパートメントにおいては，標的ポリヌクレオチドを例えばＡＡＡＡ（配列決定すべきオーバーハングが４塩基である場合）を表すシグナル配列と接触させ，このシグナル配列をすべての標的ポリヌクレオチド上の３’−オーバーハングにライゲーションさせる。さらにオーバーハングＴＴＴＴを有するアダプターポリヌクレオチドを加えるが，これは，ＡＡＡＡオーバーハングを含む標的ポリヌクレオチドにのみ特異的にライゲートし，異なるオーバーハング配列を有するポリヌクレオチドは，ライゲーションされていないオーバーハングとして残る。同じ手順を，それぞれ可能性のある４塩基配列の異なる組み合わせを表す他のコンパートメントにおいても行う。それぞれの場合において，アダプターはシグナル配列により表される配列の相補物である。
【００３３】
シグナル配列がオーバーハングの塩基のすべてを表すことが好ましいが，，オーバーハング中に存在する塩基より少ない塩基を配列決定することも可能である。例えば，オーバーハングが４塩基を含む場合，シグナル配列を用いてこれらのうちの３つを表すことができる。これは以下の実施例において説明される。
【００３４】
増幅
ライゲーション工程を実施した後，サンプルをプールし，ポリメラーゼ反応を実施することができる。ポリメラーゼ反応はシグナル配列およびアダプターの末端を標的とするプライマーを用いて行い，したがって，シグナル配列とアダプター配列との両方に首尾良くライゲーションした分子のみが指数的に増幅され，シグナル配列のみを含む分子は直線的増幅の結果として除去されるであろう。その結果得られるものは，標的ポリヌクレオチドの一方の末端で最初に生成した４塩基オーバーハングが標的ポリヌクレオチドの他方の末端で４塩基を表すシグナル配列で置き換えられている，変換されたポリヌクレオチドフラグメントの集団である。
【００３５】
好ましい態様においては，ポリメラーゼ反応は，メチル−ｄＣＴＰを用いて行い，このことにより，天然の制限酵素部位を不活性のまま残すことを確実とすることができる。追加の制限酵素部位がアダプター分子により組み込まれ，このことにより，さらなる変換サイクルを生じさせることが可能である。ポリメラーゼ反応において用いられるプライマーは，シグナル配列およびアダプター中に見いだされる配列に特異的であり，このことにより，シグナル配列とアダプターとの両方が標的ポリヌクレオチドにライゲーションされたときにのみ増幅工程が生ずることを確実とすることができる。
【００３６】
シグナル配列およびアダプターの異なる組においてプライマー結合部位が異なることも好ましい。すなわち，１つの変換サイクルで用いるシグナル配列およびアダプターは，先のサイクルにおいて用いたものと異なるプライマー結合部位を含む。このことにより，正しい配列が増幅されることを確実とすることができる。
【００３７】
オーバーハングは種々の方法により生成することができるが，好ましい態様においては，制限酵素，例えば，クラスＩＩｓの制限酵素を用いる。これらの酵素は，切断される配列に対する特異性を示さず，したがって，すべてのタイプの塩基組成に対してオーバーハングを生成することができる。制限酵素の結合部位は，実際の標的ポリヌクレオチドの内側にオーバーハングが形成されるような位置とすることができる。実用的には，３−４塩基対のオーバーハングを生成する酵素を選択することが好ましい。
【００３８】
クラスＩＩｓの制限エンドヌクレアーゼは知られており，ＷＯ−Ａ−００／３９３３３に示されている。
【００３９】
１つの態様においては，まず標的ポリヌクレオチドを，制限酵素ＢｂｖＩ用の認識配列を取り込むアダプターポリヌクレオチドで処理し，次に，ポリヌクレオチドを制限酵素で処理して，５’末端に特異的オーバーハングを生成する。ＢｂｖＩの天然の認識部位は，最初に標的ポリヌクレオチドをメチル化により処理することにより不活性化する。最初のオーバーハングを作成した後，次の５’末端のオーバーハングは好ましくは制限酵素ＳｆａＮＩを用いて作製する。これは，ＳｆａＮＩの認識配列を組み込む特異的アダプター配列を５’末端にライゲーションすることにより行う。
【００４０】
３’末端における最初のオーバーハングは，好ましくは，規定されたオーバーハングを組み込んだポリヌクレオチドをライゲーションすることにより作成する。規定されたオーバーハングは，最初のシグナル配列が３’末端でハイブリダイズしライゲーションすることを可能とする。別の態様においては，最初に標的ポリヌクレオチドを制限酵素ＭｍｅＩおよびＥａｒＩ（またはそのアイソシゾマーであるＥａｍ１１０４Ｉ）の認識配列を組み込んだアダプターポリヌクレオチドで処理する。次に，ポリヌクレオチドを制限酵素ＭｍｅＩで処理して，標的分子から２０塩基対を切り出し，これをアダプターポリヌクレオチドに結合させる。次に，制限酵素ＳｆａＮＩの認識配列を含む第２のアダプターポリヌクレオチドを，Ｍｍｅｌにより生成したオーバーハングにより，アダプター結合標的ポリヌクレオチドにライゲーションさせる。ＰＣＲ増幅を行って，２つのアダプターポリヌクレオチドにより挟まれている２０ｂｐの標的ポリヌクレオチドを含むフラグメントを増幅させる。続くＥａｒＩおよびＳｆａＮＩ消化から内部部位を保護するために，ｄＮＴＰミックス中の通常のｄＣＴＰをメチル化ｄＣＴＰで置き換えてＰＣＲを行う。オーバーハングにより生成したＭｍｅＩにより挟まれた標的ポリヌクレオチド（すなわち，消化からの副生成物）の増幅は，リン酸化されていない第２のアダプターを用いることにより排除することができる。５’末端の特異的オーバーハングは，ＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆａＮＩ（またはその同等物）で消化することにより生成する。３’末端における規定されたオーバーハングは，ＰＣＲ産物を制限酵素ＥａｒＩ（またはＥａｍ１１０４Ｉ）で消化することにより生成する。シグナル配列は制限酵素部位を組み込んでおり，これは好ましくは制限酵素ＥａｒＩ用の部位である。図２に示されるように，次の切断および取り込みサイクルは，制限酵素ＥａｒＩおよびＳｆａＮＩを用いて行う。
【００４１】
変換サイクルを図３にさらに概説する。図３は，この手順に用いた２５６個のコンパートメントから任意に取り出した３つの反応コンパートメント中の５つの異なるフラグメントの運命を示す。フラグメントは最初に２５６個のコンパートメントに均等に分布している。オーバーハング"ＴＣＴＡ"を同定するためのコンパートメント５６においては，この塩基組成物を表すシグナル配列を導入し，標的ポリヌクレオチドの左末端の３塩基の３’−オーバーハングとライゲーションさせる。このライゲーションは，ポリヌクレオチドの右側の４塩基の５’−オーバーハングとは関係なく生ずる。次に，３’ＴＣＴＡ−５’オーバーハングを有するフラグメントとのみライゲーションする特異的アダプターを導入し，ライゲーションを行う。アダプターのミスマッチライゲーションは，ライゲーションを"ブロッキング"アダプターの存在下で実施することにより減少させることができる。ブロッキングアダプターは，特異的アダプターとは異なるオーバーハング配列を有しており，したがって，特異的アダプターに非相補的なオーバーハングを有する標的ポリヌクレオチドにライゲーションする。次に，最終の増幅反応は，特異的アダプターとライゲーションしたフラグメントを選択的に増幅し，したがって，正しくないシグナル配列と結合している他のフラグメントを排除する。コンパートメント１４１および１９４においても同じ手順を実施するが，ただし，シグナル配列およびアダプターの組成は，ウエル中で同定すべきオーバーハング（３’−ＡＴＡＧ−５’および３’−ＣＡＡＴ−５’）にしたがって調節する。
【００４２】
２５６個のコンパートメントからの標的ポリヌクレオチドは，好ましくは，増幅反応を行う前に１つの共通の反応チューブにプールし，このことにより，２５６個の別々の増幅反応を実施する不便さを回避する。
【００４３】
続く変換サイクルを行った後，標的ポリヌクレオチドの５’末端の配列は減少し，標的ポリヌクレオチドの３’末端に導入されたシグナル配列は，今回"配列決定された"標的ポリヌクレオチドに対応する規定された方法で増加する。シグナル配列の種類および順番の決定はＷＯ−Ａ−００／３９３３３，またはＬｉｎｇＶｉｔａｅの名義で出願され，ＧＢ０３０８８５２．３に基づく優先権を主張する出願中の国際出願に開示された方法を用いて行うことができる。
【００４４】
増幅反応は望まれないアルチファクトを生ずるかもしれず，種々の工程を行ってこれらを減少または除去することができる。例えば，異なるシグナル配列上のプライマー認識部位（および任意に異なるアダプターも）が異なる場合には，プライマーが内部シグナル配列に結合しより大きな変換された標的のフラグメントを増幅する確率を低下させることが好ましい。
【００４５】
連続するまたは次のシグナル配列が異なる塩基配列を含むようにシグナル配列を設計することも好ましい。このことにより，末端シグナル配列にハイブリダイズするよう導入されたプライマーが，内部シグナル配列にハイブリダイズしないことが確実となり，増幅工程の間にフラグメントが生成する。
【００４６】
制限酵素の１またはそれ以上による不完全な消化もアルチファクトの原因となりうる。高い特異性および活性を有する制限酵素を用いることにより，この問題は低減するであろう。
【００４７】
アルチファクトはまた，ゲル精製により，または制限酵素で消化する前に生成物を固定化することにより，除去することができる。完全に消化されていない生成物は固定化されたまま残り，完全に消化された生成物から分離することができる。
【００４８】
増幅の前に過剰のアダプターおよび標的を除去することによっても，アルチファクトの生成が減少するであろう。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は本発明を例示する。
実施例１
ＢｂｖＩを用いたサイズ制限なしでの最初の製造
ＮＡのフラグメント化の前（または後）に標的ポリヌクレオチドをメチル化して，天然の認識部位を不活性化する。ＢｂｖＩを制限酵素として用いて，Ｍ．Ｂｂｖ（Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてその天然の部位を不活性化する。ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）を用いて標的ポリヌクレオチドを機械的剪断によりランダムにフラグメント化して，５００−１０００塩基対の断片とする。超音波処理と組み合わせて，さらに短いフラグメントを生成することができる。続く平滑末端アダプターライゲーションの工程の効率を高めるために，剪断されたポリヌクレオチドを任意にＤＮＡポリメラーゼで処理して，そのエキソヌクレアーゼ機能を用いてオーバーハングをフィルインまたは除去してもよい。この目的には，一般に，Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびクレノーラージフラグメントを単独で，またはこれらを組み合わせて用いる。
【００５０】
２つのポリヌクレオチドアダプターを平滑末端ライゲーションにより標的ポリヌクレオチドフラグメントに結合する。一方にはＢｂｖＩ部位が組み込まれており，他方には続くシグナル配列へのライゲーション用にオーバーハングが組み込まれている。各アダプターは１０−２０塩基対の長さであり，これを１０倍モル過剰で標的ポリヌクレオチドに加える。アダプターは，ＢｂｖＩアダプターの一方の鎖を除き，リン酸化されている。さらに，このアダプターの反対側の鎖はライゲーションの間のコンカテマー化を防ぐために，３’デオキシ基を有する。ライゲーションは，製造元の推奨にしたがって平滑末端ライゲーションについて最適化された条件下で行う。
【００５１】
ライゲーションしたポリヌクレオチドフラグメントをＢｂｖＩで消化する。消化の後，サイズ選択（例えば，ゲル分離またはカラム分画）を行って，過剰のアダプター，切断された末端フラグメントおよびある閾値の下および上のポリヌクレオチドフラグメントを除去する（例えば２倍のサイズ分布）。
【００５２】
実施例２
ＭｍｅＩおよびサイズ制限を用いた最初の製造
標的ポリヌクレオチドを，ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ装置（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）を用いて機械的剪断によりランダムに５００−１０００塩基対の断片に分解する。超音波処理を組み合わせることにより，より短いフラグメントを生成することができる。続く平滑末端アダプターライゲーションの工程の効率を高めるために，実施例１で記載したように，剪断したポリヌクレオチドを任意にＤＮＡポリメラーゼで処理して，オーバーハングをフィルインするかまたは除去してもよい。
【００５３】
１０倍モル過剰の２０−４０ｂｐ平滑末端アダプターを，フラグメント化された標的ポリヌクレオチドにライゲーションする。ライゲーションは，製造元の推奨にしたがって平滑末端ライゲーションについて最適化された条件下で行う。アダプターのアンチセンス鎖のみをリン酸化して，単一方向のライゲーションを確実にする（さらにアンチセンス鎖にａ３’ジデオキシ基またはブロッキング基を組み込んで，コンカテマー化を防止する）。アダプターはその最も３’末端にＭｍｅＩの制限部位を，さらに上流にＥａｒＩ（またはＥａｍ１１０４Ｉ）の制限部位を有する。サイズ排除カラムまたはアフィニティースピンカラム（例えば，ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて過剰なアダプターを除去するとともに，バッファを交換すると便利である。
【００５４】
最適条件下でＭｍｅＩ消化を行って標的分子から２０塩基対を除去し，アダプターポリヌクレオチドを結合させる。スピンカラムを用いてバッファを交換する（例えば，ＢｉｏＳｐｉｎ−６，ＢｉｏＲａｄ）。次に，制限酵素ＳｆａＮＩの認識配列を含む第２のアダプターポリヌクレオチドを，ＭｍｅＩにより生成したオーバーハングによりアダプター結合標的ポリヌクレオチドにライゲーションさせる（ＭｍｅＩは２塩基の３’オーバーハングを生成するため，第２のアダプターは３’オーバーハングに２塩基の１６すべての順列を有するアダプターのプールである）。ＳｆａＮＩ部位は，切断して標的配列の末端の４塩基を生ずるように配置されている。ＭｍｅＩにより生成した２つのオーバーハングを含む標的ポリヌクレオチド（標的ポリヌクレオチド消化からの副生成物）が後に増幅しないように，アダプターはリン酸化しないままにする。ＰＣＲ増幅を行って，２つのアダプターポリヌクレオチドに挟まれた２０ｂｐ標的ポリヌクレオチドを含むフラグメントを増幅する。続くＥａｒＩおよびＳｆａＮＩ消化から内部の部位を保護するために，ｄＮＴＰ中の通常のｄＣＴＰをメチル化ｄＣＴＰに置き換えてＰＣＲを行う。
【００５５】
ＰＣＲ  ｃｌｅａｎ−ｕｐスピンカラムを用いて過剰のプライマー，ＤＮＡポリメラーゼを除去し，バッファを交換する。
【００５６】
ＰＣＲ増幅した産物をＥａｒＩ（またはＥａｍ１１０４Ｉ）およびＳｆａＮＩで消化して，シグナル配列のライゲーションおよび生化学的変換に必要なオーバーハングを生成する。ＰＣＲにおいてビオチン化プライマーを用いることにより，消化された末端フラグメントをアフィニティー（例えば，ストレプトアビジン被覆ビーズ）により除去することができる。
【００５７】
実施例３
１回のサイクルにつき４つのヌクレオチドが変換されるサイクル変換の原理
標的ＤＮＡ中の１２塩基の配列をその対応するシグナル鎖に変換することにより，核酸塩基から読み出し可能なシグナル配列へのサイクル変換の原理を示す。変換は，サイクル方法を用いて，各サイクルで４塩基が変換され，合計で３サイクルを行う複数の工程により行った。末端生成物は，標的ＤＮＡ中の関連性のある塩基配列を表す１２のシグナル成分から構成されるシグナル鎖であった。この実験は図２に図解される。
【００５８】
ＳｆａＮＩおよびＥａｍ１１０４Ｉ用の内部部位を含む２４０ｂｐの標的ＤＮＡフラグメントを，バクテリオファージラムダゲノム（１５０７−１７０３）からそれぞれＥａｍ１１０４ＩおよびＳｆａＮＩの制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅した（図２の上のフラグメント）。後に内部部位から切断されることを回避するために，ＰＣＲ反応は，通常のデオキシシトシン（ｄＣＴＰ）の代わりにメチル化デオキシシトシンヌクレオチド（ｍ５−ｄＣＴＰ）を用いて行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりである：（５０μｌ）：１０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，ｐＨ８．８（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ＮｅｗＥ  ｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），２ｍＭ  Ｍｇ2+，２００μＭ  ｄＮＴＰ（−ｄＣＴＰ）および２００μＭ  ｍ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ），２０ｐｍｏｌのラムダプライマー＃３２８（５’−ａｇａｃｔｇｇｃｇａｔｃｃｃｔｇｇｃａｔｃａｃｃｃｃｔｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｔｔａｔ−３’；配列番号５）および２０ｍｐｏｌのラムダプライマー＃３２９（５’−ｇｃａｃｔｇａｔａｇｇｃｇｔｃａｃｔｃｔｔｃｇｃｔｇｔａｃｇｃｔｇｌｃｃａｇａｔｇｔ−３’；配列番号６）（ＭＷＧｂｉｏｔｅｃｈ），１０ｎｇのラムダゲノム，１ＵのＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。ＰＣＲサイクルはＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ）により行った。ホットスタート：９５℃，５分間，以下を３５サイクル：９５℃，１５秒間，５８℃，２０秒間，７２℃，３０秒間。完全伸長工程：７２℃，５分間。
【００５９】
サイクル１
フラグメントは配列決定サイクルに入り（図２，Ａ），Ｅａｍ１１０４ＩおよびＳｆａＮＩ（内部部位はメチル化されて切断から保護されているため，切断はプライマー領域からのみ生ずる）で切断する。消化条件：１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．９（ＮＥＢ３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），１μｇのメチル化ＰＣＲフラグメント，２０ＵのＥａｍ１１０４Ｉ，３ＵのＳｆａＮＩ，および３７℃で１時間のインキュベーション。酵素は６５℃で２０分間熱不活性化した。切断したフラグメントはＧｉｂｃｏＢＲＬ  ＰＣＲ精製システム（Ｇｉｂｃｏ）を用いて精製し，次に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで溶出した。切断したフラグメントは，シグナル連鎖ライゲーション用の３塩基のオーバーハングおよび特異的右手アダプターへのライゲーション用の４塩基のオーバーハングを有する点において，最初の調製または１サイクルの変換（実施例１に記載）の後に得られたフラグメントの性質に対応する。
【００６０】
選択マーカーを結合させる変換工程（図２，Ｂ）は，フラグメントを特異的アダプターおよびその附随するシグナル配列とライゲーションさせることにより行った：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＡＴＰ，ｐＨ７．８（リガーゼバッファ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ），１．６ｐｍｏｌのアダプター１（５’−ビオチン−ｇｇｃｔａｇｇｔｇｃｔｇａｔｇａａｃｇｃａｔｃｇ−３’；配列番号７；５’−ｔｇｇａｃｇａｔｇｃｇｔｔｃａｔｃａｇｃａｃｃｔａｇｃｃ−３’；配列番号８（ＭＷＧ−ｂｉｏｔｅｃｈ）とアニーリング，１．９ｐｍｏｌシグナル配列１（１），７．５Ｗｅｉｓｓ−ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。インキュベーションは室温（２２℃）で２．５時間行った。リガーゼは６５℃で１０分間熱不活性化した。
【００６１】
実験で用いたシグナル配列は，以下のようにして作成した：シグナル成分（それぞれ１塩基を表す）は，オリゴヌクレオチド（約４５塩基）をアニーリングさせ，一緒にライゲーションして所望のシグナル配列を生成することにより作成した（シグナル成分は，ライゲーションの配列を区別する異なるオーバーハングを用いて構築する）。シグナル配列をＰＣＲにより増幅し，シグナル配列を標的ＤＮＡにライゲーションするために必要な相補的オーバーハングを生成するために，ＳａｐＩで切断した。すべての標的ＤＮＡフラグメントがシグナル配列のライゲーション用に同じオーバーハングを有するため，所定の反応におけるすべてのフラグメントは，ＳｆａＮＩにより生成したオーバーハングの配列にかかわらず，同じシグナル配列にライゲーションされる。したがって，特異性および選択はアダプター中に存在する。これは標的ＤＮＡのＳｆａＮＩで切断した末端にライゲーションするため，アダプターに相補的なオーバーハングを有するフラグメントのみがライゲーションされる。したがって，変換は，標的ＤＮＡがシグナル配列にライゲーションされるとともに，アダプターへのライゲーションが生ずるためにアダプターに相補的なオーバーハングを有していることが前提となる。つまり，アダプターは，ライゲーションしたシグナル配列に対応するオーバーハング配列を有するフラグメントの特異的選択を確実にする。
【００６２】
塩基変換の選択工程は，フラグメントにライゲーションしたシグナル配列および特異的アダプターの両方を有するフラグメントの選択および増幅からなる（図２，Ｃ）。これはＰＣＲを用いて以下の条件で行った（５０μｌ）：１０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，ｐＨ８．８（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  ｂｕｆｆｅｒ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），２ｍＭ  Ｍｇ2+，２００μＭ  ｄＮＴＰ（−ｄＣＴＰ）および２００μＭ  ｍ５−ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ），２０ｐｍｏｌのアダプター１−プライマー＃３３２（５’−ビオチン−ｇｇｃｔａｇｇｔｇｃｔｇａｔｇａａｃｇｃａｔｃｇ−３’；配列番号９）および２０ｐｍｏｌのシグナル配列１−プライマー＃３４０（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｃａｔｇａｃｔｃｇａｇｃｃｔｃｔｔｃｇｃｇａ−３’；配列番号１０）（ＭＷＧ−ｂｉｏｔｅｃｈ），約３．５ｆｍｏｌのライゲーションした標的ＤＮＡおよび１ＵのＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。ＰＣＲサイクルはＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ）で行った。ホットスタート：９５℃，２分間，以下を２０サイクル：９５℃，１５秒間，６６℃，２０秒間，７２℃，３０秒間。完全伸長工程：７２℃，５分間。図２のウエル２は，配列決定方法の最初のサイクルの結果を示す。３８０ｂｐの正しいフラグメントが生成した。
【００６３】
サイクル２
次の４塩基を変換するために，ＰＣＲ産物をＧｉｂｃｏＢＲＬ精製システム（Ｇｉｂｃｏ）を用いて精製し，次にＳｆａＮＩおよびＥａｍ１１０４Ｉで切断した。この切断が生ずることが可能なのは，最初のサイクルからのシグナル配列およびアダプターがそれぞれＥａｍ１１０４ＩおよびＳｆａＮＩの部位を含むためである。この部位はプライマー領域中に存在するため，これらはＰＣＲの間にメチル化によりブロックされない。切断反応の効率を高めるために，切断は最適切断条件下で連続的に行った。ＳｆａＮＩ切断：１００ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．９（ＮＥＢ３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），１μｇのメチル化ＰＣＲフラグメント，４ＵのＳｆａＮＩ。インキュベーションは３７℃で１時間行った。酵素の熱不活性化は６５℃で１０分間行った。Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６カラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いてフラグメントを精製した。Ｅａｍ１１０４Ｉ切断：３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，ｐＨ７．９（ＴａｎｇｏＹ+，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ），ＳｆａＮＩ消化ＰＣＲフラグメント，１０ＵのＥａｍ１１０４Ｉ．３７℃で１時間インキュベートし，次に６５℃で２０分間熱不活性化した。消化した生成物をＧｉｂｃｏＢＲＬ精製システム（Ｇｉｂｃｏ）を用いて精製した。変換の最初の工程は，最初のサイクルに対応するよう行ったが，ただし，新たなシグナル配列およびこれに結合した特定のアダプター（配列の次の４塩基に対応）を加えた。可能性のある繰り越し問題を低減させるために，シグナル配列２はシグナル配列１とは異なるオーバーハングを有するように設計した。ライゲーション条件：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．５ｍＭ  ＡＴＰ，ｐＨ７．８（リガーゼバッファ，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ），０．５ｐｍｏｌのアダプター２（５’−ビオチン−ｃｇａｃａｇｔａｃｇａｃｇｇａｃｃａｇｃａｔｃｃ−３’；配列番号１１，５’−ａｃｇｃｇｇａｔｇｃｔｇｇｔｃｃｇｔｃｇｔａｃｔｇｔｃｇ−３’；配列番号１２にアニーリング）（ＭＷＧ−ｂｉｏｔｅｃｈ），１ｐｍｏｌのシグナル配列２（２），１Ｗｅｉｓｓ−ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。インキュベーションは室温（２２℃）で１．５時間行った。リガーゼは６５℃で１０分間熱不活性化した。ＰＣＲ増幅は最初のサイクルと同じ条件下で行ったが，ただし以下の新たなプライマーセットを用いた（アダプター２−プライマー＃３４７，５’−Ｂｉｏｔｉｎ−ｃｇａｃａｇｔａｃｇａｃｇｇａｃｃａｇｃａｔｃｃ−３’；配列番号１１，およびシグナル配列２−プライマー＃３４３，５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｃａｔｃｇａａｔｇａｃｃｇｃｃｔｃｔｔｃｃａｃｔ−３’；配列番号１３）。前の配列決定サイクルからの残留物を増幅する危険性を最小限にするために，各配列決定サイクルについて異なるプライマーセットを用いることが好ましい。第２サイクルにおけるＰＣＲ増幅の結果を図４のウエル３に示す。５２３ｂｐの正しいフラグメントが生成した。
【００６４】
サイクル３
次の４塩基の変換およびＰＣＲ増幅は，サイクル２について記載したものと同じパターンにしたがった：ＳｆａＮＩおよびＥａｍ１１０４Ｉで続けて切断した後，フラグメントをシグナル配列３（３）およびアダプター３（５’−ビオチン−ａｔｃｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔａｇｃａｇｃａｔｃａ−３’；配列番号１４，５’−ａａａｃｔｇａｔｇｃｔａｔｇｃｃａｇｇｃｔｃｇａｔ−３’；配列番号１５にアニーリング）（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）とライゲーションした。ＰＣＲ増幅は以下のプライマーセットを用いて行った：アダプター３−プライマー＃３５３（５＝−ａｔｃｇａｇｃｃｔｇｇｃａｔａｇｃａｇｃａｔｃａ−３＝；配列番号１４）およびシグナル配列３−プライマー＃３４５（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｃａｃｃｇｇｇｃａｇｇａｔａｇａｃｔｃｔｔｃａｇｇｔ−３’；配列番号１６）。サイクル３における増幅の結果は，図４のウエル４に示される。ウエル４は，２つの弱いバンドおよび１つの比較的強いバンドが形成されることを示す。強いバンドは，予測された長さである６６６ｂｐに近いところに来る。ウエル４（サイクル３）およびウエル３（サイクル２）に見られる間違ったサイズの弱いバンドは，おそらくは，繰り越し問題およびミスプライミングの結果であろう。ウエル３の弱いバンドおよびウエル４のさらに下の弱いバンドは，前のサイクルのＰＣＲフラグメントのサイズに相当する。可能な説明としては，１つのサイクルにおけるフラグメントの不完全な切断が次のＰＣＲサイクルにおいてテンプレートとして機能するのかもしれない。各サイクルにおける新たなプライマーセットはこの問題をある程度軽減させるが，プライマーが共通して有する酵素部位のため，ミスプライミングの危険性はなお存在する。しかし，このタイプのミスプライミングは，ＰＣＲの間によりストリンジェントなアニーリング条件（例えば，Ｍｇ2+，温度），より区別しうるポリメラーゼを使用すること，Ｅａｍ１１０４Ｉ部位を配列鎖プライマーの３’から離すこと，新たな配列の選択，または切断前にフラグメントを固定化して（例えば，マイクロビーズ上のビオチン−ストレプトアビジン系），次のサイクルに入るフラグメントが切断されることを補償することにより排除することができる。他のタイプのミスプライミングに対する最も良い解決法は，新規なプライマー配列を選択するか，および／またはＰＣＲ条件を最適化することであろう。余分のＤＮＡ材料（例えば，過剰なアダプターまたはライゲーションしていないＤＮＡ）の存在に起因するミスプライミング事象は，アダプターの凹型鎖をチオ保護する戦略を用いることにより除去することができる。ＰＣＲ前に５’−３’エキソヌクレアーゼ（例えば，Ｔ７エキソヌクレアーゼまたはラムダエキソヌクレアーゼ）により消化すると，アダプターにライゲーションしたＤＮＡの一方の鎖のみが無傷で残る。すべての標的配列が同じ長さである態様においては，生化学的変換のプロセスの間に，サイズ選択を用いて正しくない長さのフラグメントを除去することができる。
【００６５】
実施例４
１回のサイクルあたり３つのヌクレオチドが変換されるサイクル変換の原理
標的ＤＮＡ中の１２塩基の配列をその対応するシグナル配列に変換することにより，核酸塩基の読み出し可能なシグナル配列へのサイクル変換の原理を示す。変換は，サイクル方法による工程で，各サイクルで３塩基が変換される合計４サイクルで行う。最終生成物は，標的ＤＮＡ中の関連性のある塩基配列である１２シグナル成分からなるシグナル配列であった。図５に実験を図解する。
【００６６】
以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより６６ｂｐの合成標的ＤＮＡフラグメントを生成した：＃００３（５’−ＰＨＯ−ＧＡＴＣＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＧＴＣＴＧＡＴＴＧＴＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴ−３’；配列番号１７）および＃００４（５’−［ＰＨＯ−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＴＣＣＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＣＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＣＡＡＧ−３’；配列番号１８）。配列から明らかなように，標的分子はその３’末端に４つの連続するＡＴＧトリプレットを含む。アニーリングした分子は，最初の調製（実施例２に記載）の後に得られるフラグメントの性質に対応しており，シグナル配列ライゲーション用に３塩基のオーバーハングを，特異的アダプターへのライゲーション用に４塩基のオーバーハングを有する。
【００６７】
選択マーカーを結合させる変換工程（図５，Ｂ）は１ｐｍｏｌのフラグメントを特異的アダプターおよび附随するシグナル配列とライゲーションさせることにより行った：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２５μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，ｐＨ７．５（リガーゼバッファ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），１ｐｍｏｌのアダプター＃００５（５’−ＧＡＴＧＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＣ−３’；配列番号１９，＃００６５’−ＧＡＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡ−３’；配列番号２０）（ＭＷＧ−ｂｉｏｔｅｃｈ）にアニーリングさせる，１ｐｍｏｌのシグナル配列＃００１（５’−ＴＧＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴＡＴＴＣＧＴＣＴ−３’；配列番号２１，＃００２にアニーリングさせる５’−ＰＨＯ−ＡＴＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＧＣＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＣＡＣＡ−３’；配列番号２２）（ＭＷＧ−ｂｉｏｔｅｃｈ），１００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。インキュベーションはＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ）で２２℃で１時間行った。アダプターおよびシグナル配列アダプターの両方に首尾よくライゲーションした分子の選択および増幅は，ＰＣＲを用いて以下の条件で行った（５０μｌ）：１０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ4）ＳＯ4，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，ｐＨ８．８（Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  ｂｕｆｆｅｒ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），２ｍＭ  Ｍｇ2+，２００μＭ  ｄＮＴＰｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ），１０ｐｍｏｌのアダプタープライマー＃００６（５’−ＧＡＧＧＴＣＣＧＧＧＡＧＴＧＣＡＴＣＴＡ−３’；配列番号２３）（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）および１０ｐｍｏｌのシグナル鎖プライマー＃００７（５’−ＴＧＴＧＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴ−３’；配列番号２４）（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ），約１ｐｍｏｌのライゲーションした標的ＤＮＡおよび０．２ＵのＶｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。ＰＣＲサイクルはＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅａｓｅａｒｃｈ）で行った。ホットスタート：９５℃，２分間，９５℃，１５秒間，５９．３℃，２０秒間，７２℃，２０秒間からなる２５サイクル，完全伸長工程：７２℃，６０秒間。図６のウエル２は，配列決定方法の最初のサイクルの結果を示す。１４２ｂｐの正しいフラグメントが生成した。
【００６８】
サイクル２
次の３塩基を変換するため，ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し，次にＥａｍ１１０４ＩおよびＳｆａＮＩで切断した。切断反応の効率を高めるために，切断は最適切断条件下で連続的に（ｓｅｒｉａｌｌｙ）実施した。
【００６９】
Ｅａｍ１１０４Ｉ切断：２５μｌの反応中，３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸，１０ｍＭ酢酸マグネシウム，６６ｍＭ酢酸カリウム，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，ｐＨ７．９（ＴａｎｇｏＹ+，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ），０．５μｇのＰＣＲフラグメント，２０ユニットのＥａｍ１１０４Ｉ。３７℃で１時間インキュベートした。ＭｉｃｒｏＢｉｏ−Ｓｐｉｎ６カラム（ＢｉｏＲａｄ）を用いてフラグメントを精製した。ＳｆａＮＩ切断：１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．９（ＮＥＢ３，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），０．５μｇのＰＣＲフラグメント，２．５ユニットのＳｆａＮＩ。５０μｌの反応中で３７℃で１５分間インキュベートした。
【００７０】
消化した生成物はＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により精製し，破砕浸漬法を用いてゲルから精製した。ＭｉｃｒｏＢｉｏ−Ｓｐｉｎ６カラムを用いてゲル粒子を除去し，ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎクリーンアップカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製した。
【００７１】
変換工程は，同じシグナル配列およびこれに結合した特異的アダプターを用いて，最初のサイクルと対応するように行った。残りの工程は，サイクル１について記載したものと同じパターンにしたがったが，ただし，消化後，アガロースゲルおよびゲル精製キット（ＱｉａｅｘＩＩ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いてサンプルを精製した。第２サイクルにおけるＰＣＲ増幅の結果を図６のウエル３に示す。１７２ｂｐの正しいフラグメントが生成した。
【００７２】
サイクル３および４は，サイクル２について記載したものと同じパターンにしたがう。ＰＣＲ増幅の結果はウエル４および５に示されており，２０２ｂｐおよび２３２ｂｐの正しいフラグメントが生成した。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は，シグナル配列の概略図であり，標的ポリヌクレオチドの一部の規定されたシグナル配列への変換を示す。
【図２】図２は，本発明を用いて行ったポリヌクレオチド配列決定実験の概略図である。
【図３】図３は，変換プロセスにおける特定のシグナル配列を伴う種々のコンパートメントの使用の概略図である。
【図４】図４は，変換の結果を示し，３サイクルを行って標的ポリヌクレオチド上に一連のシグナル配列の塩基配列を形成することを示す。
【図５】図５は，１回のサイクルあたり３塩基配列を決定するよう実施されたポリヌクレオチド配列決定実験の概略図である。
【図６】図６は，変換の結果を示し，特定のシグナル配列が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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