(57)【要約】本発明は、被検体の選別、検出および同定に有用なオリゴヌクレオチド利用アッセイシステムおよびキットである。本システムは、それぞれの対の一方のオリゴヌクレオチドが固体支持体に固定化され、他方のオリゴヌクレオチドは被検体結合剤が付着した、相補的なオリゴヌクレオチドの対を利用する。異なるオリゴヌクレオチドの対が、実質的に同一の速度でハイブリダイゼーションを起こし、実質的に同一のＴｍを有し、異なる対の間でのクロス・ハイブリダイゼーションを最小限にするように設計されたヌクレオチド配列を有し、検出可能なクロス・ハイブリダイゼーションを起こすことなく、周囲温度で比較的迅速にハイブリダイゼーションを起こす。
2006523462.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体と、１０対または１１対以上のオリゴヌクレオチドとを含む被検体用アッセイシステムであって、
前記対をなすそれぞれのオリゴヌクレオチドは、前記対の他方のオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的であり、それぞれの対は、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを含み、第１オリゴヌクレオチドは被検体結合剤を含み、該被検体結合剤は第１オリゴヌクレオチドに付着し、第２オリゴヌクレオチドは前記固体支持体に固定化され、第１および第２オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを含む、被検体用アッセイシステム。
【請求項２】
前記第１および第２オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する２０個または２１個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項３】
前記第１および第２オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する２４個または２５個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項４】
前記第１および第２オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する２８個または２９個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項５】
前記１０対または１１対以上のオリゴヌクレオチドは配列番号１−１８８の配列からなるグループから選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項６】
配列番号１−１８８の配列からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する１２対または１３対以上のオリゴヌクレオチドがある、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項７】
配列番号１−１８８の配列からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する１４対または１５対以上のオリゴヌクレオチドがある、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項８】
配列番号１−１８８の配列からなるグループから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する１５対のオリゴヌクレオチドがある、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７５、配列番号７７、配列番号９３、配列番号９５、配列番号１１７、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１６３、配列番号１８７およびこれらの相補体からなるグループから選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１０】
それぞれの対の第１オリゴヌクレオチドに連結した異なる被検体結合剤があり、異なる被検体結合剤のそれぞれは１個または２個以上のサンプル中の異なる被検体に対する特異性を有する、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
１対または２対以上のオリゴヌクレオチドに由来する一方または両方のオリゴヌクレオチドはリンカー分子またはリンカー核酸配列を含み、該リンカー分子またはリンカー核酸配列は前記一方または両方のオリゴヌクレオチドに付着している、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
前記リンカー核酸配列は１対または２対以上のオリゴヌクレオチドの対に由来する一方のオリゴヌクレオチドと共有結合で結合し、前記リンカー核酸は、前記固体支持体と共有結合で結合し、前記リンカー核酸は前記オリゴヌクレオチドを前記固体支持体に付着させる、請求項１１に記載のアッセイシステム。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドの対は、０．１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションを起こすことなく、周囲温度で互いにハイブリダイゼーションを起こす、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１４】
前記第１オリゴヌクレオチドの被検体結合剤は、抗体および該抗体の抗原結合断片からなるグループから選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１５】
前記異なるオリゴヌクレオチドのそれぞれは、予め定められた異なる領域で前記固体支持体の表面に付着する、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１６】
前記固体支持体はビーズ玉である、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１７】
前記被検体は、ポリペプチドまたはタンパク質、炭水化物、リガンド、核酸、脂質、ステロイド類、代謝物、乱用薬物、ウイルス抗原および細菌抗原からなるグループから選択される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項１８】
前記被検体は、抗体および該抗体の結合断片、ホルモン、レクチン、レセプター、ステロイド類、細胞表面抗原、サイトカイン、成長因子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、疾患マーカーおよび発がんマーカーからなるグループから選択される、請求項１４に記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
１種類または２種類以上の特異的な被検体を検出するためのキットの形状で提供される、請求項１に記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
１対または２対以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含む被検体アッセイシステムであって、相補的なオリゴヌクレオチドのそれぞれの対は第１および第２オリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは被検体が付着し、第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定化され、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７５、配列番号７７、配列番号９３、配列番号９５、配列番号１１７、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１６３、配列番号１８７およびこれらの相補体とからなるグループに由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する配列からなるグループから選択される、被検体アッセイシステム。
【請求項２１】
少なくとも１０対の相補的なオリゴヌクレオチドを含む被検体用アッセイシステムであって、相補的なオリゴヌクレオチドのそれぞれの対は第１および第２オリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは被検体が付着し、第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定化され、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７５、配列番号７７、配列番号９３、配列番号９５、配列番号１１７、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１６３、配列番号１８７およびこれらの相補体とからなるグループに由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する配列からなるグループから選択される、被検体用アッセイシステム。
【請求項２２】
配列番号１−１８８に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する配列からなるグループから選択される核酸配列を有するオリゴヌクレオチドの組。
【請求項２３】
配列番号１−１８８に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する配列からなるグループから選択される１個または２個以上のオリゴヌクレオチドからなる核酸配列を有する、１対または２対以上の相補的なオリゴヌクレオチド対の組。
【請求項２４】
サンプル中の被検体を検出する方法であって、
（ａ）１対または２対以上のオリゴヌクレオチド対を選択するステップであって、それぞれの対は第１および第２オリゴヌクレオチドを有し、第１オリゴヌクレオチドは被検体結合剤を含み、該被検体結合剤は第１オリゴヌクレオチドに付着し、第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定化され、対をなす第１または第２オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号６３、配列番号７３、配列番号７５、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７およびこれらの１個または２個以上のそれぞれについての相補的なオリゴヌクレオチドに由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する、１対または２対以上のオリゴヌクレオチド対を選択するステップと、
（ｂ）１種類または２種類以上の被検体を含むサンプルを用意するステップと、
（ｃ）前記被検体結合剤がそれぞれの被検体に結合できる条件下で第１オリゴヌクレオチドに１種類または２種類以上の被検体を混合し、被検体が結合してハイブリダイゼーションを起こしたオリゴヌクレオチドを形成するために、相補的なオリゴヌクレオチドの選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件下で前記１対または２対以上のオリゴヌクレオチド対を混合するステップと、
（ｄ）１種類または２種類以上の結合した被検体を検出するステップとを含む、サンプル中の被検体を検出する方法。
【請求項２５】
核酸配列のコレクションを生成する方法であって、
（ａ）選択された長さおよびＧＣ含量の第１の核酸配列を選択するステップと、
（ｂ）第１の核酸配列とほぼ同じ長さおよびほぼ同じＧＣ含量を有する核酸配列のライブラリを生成するステップと、
（ｃ）前記コレクションに追加するために、前記ライブラリから第２の配列を選択するステップと、
（ｄ）前記選択された第２のオリゴヌクレオチド配列が４個を超える連続する同一の塩基を含むかどうか判断して、含む場合には前記選択された第２の配列を捨てるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前または後に、前記選択された第２のオリゴヌクレオチド配列が、第１の核酸配列とのアライメントでいずれか８個の塩基のウィンドウにおいて５箇所を超える一致を有するかどうかを判断して、有する場合には前記選択された第２の配列を捨てるステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）および（ｅ）で捨てられない場合には、前記第２の配列を前記コレクションに追加するステップとを含む、核酸配列のコレクションを生成する方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を少なくともさらに１回繰り返すことを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロス・ハイブリダイゼーションについて前記コレクション中の配列をテストして、前記コレクション中の他のいずれかの配列と０．１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションを起こす配列を前記コレクションから捨てるステップを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記生成するステップは、５個を超えない長さのヌクレオチドしか違わないヌクレオチド配列のライブラリを生成することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記生成するステップは、実質的に同一の長さを有するヌクレオチド配列のライブラリを生成することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記生成するステップは、１個を超えない長さのヌクレオチドしか違わないヌクレオチド配列のライブラリを生成することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記生成するステップは、３０％を超えないＧＣ含量の違いしかないヌクレオチド配列のライブラリを生成することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記生成するステップは、実質的に同一のＧＣ含量を有するヌクレオチド配列のライブラリを生成することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記生成するステップは、１０％を超えないＧＣ含量の違いしかないヌクレオチド配列のライブラリを生成することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
固体支持体と、１０対または１１対以上のオリゴヌクレオチド対とを含む被検体用のアッセイシステムであって、
前記対をなすオリゴヌクレオチドのそれぞれは前記対の他方のオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的であり、それぞれの対は第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを含み、第１オリゴヌクレオチドは被検体結合剤を含み、該被検体結合剤は第１オリゴヌクレオチドに付着し、第２オリゴヌクレオチドは前記固体支持体に固定化され、第１および第２オリゴヌクレオチドは、請求項２６に記載の方法によって生成されるコレクションから選択されるオリゴヌクレオチドの組に由来する１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを含む、被検体用のアッセイシステム。
【請求項３５】
請求項２６に記載の方法によって生成される少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体の選別、検出および同定に有用なアッセイシステム、キットおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、本発明に関する情報の概要を提供するものであって、本明細書に提供された情報または引用された刊行物が本明細書の特許請求の範囲に記載の発明の先行技術であることを示すものではない。
【０００３】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、被検体の選別、検出および同定を含む、非常に広範な分析および診断アッセイに有用である。かかるアッセイでは、非相補的なオリゴヌクレオチドがクロス・ハイブリダイゼーションを起こさないことが重要である。オリゴヌクレオチドのクロス・ハイブリダイゼーションは、部分的には、異なるヌクレオチド間の塩基スタッキング・エネルギーのばらつきと、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド配列変異とが原因である。オリゴヌクレオチドのクロス・ハイブリダイゼーションに影響を与えるパラメータの別の組み合わせはハイブリダイゼーション反応条件である。残念ながら、かかる非特異的なクロス・ハイブリダイゼーションはありふれた問題であって、オリゴヌクレオチドを利用するアッセイ、特に、複数のオリゴヌクレオチド対が用いられる場合の偽陽性または偽陰性信号の主要な原因である。
【０００４】
複数のオリゴヌクレオチドを利用するアッセイシステムの設計および実施に問題となる他の要因は、実質的に全ての対になるオリゴヌクレオチドが実質的に同一のＴｍを有することが望ましいこと、全ての対になるオリゴヌクレオチドが実質的に同一の速度および同一の時間フレームでハイブリダイゼーションすること、および、前記オリゴヌクレオチドが有意なクロス・ハイブリダイゼーションを起こすことなく、周囲温度（ａｍｂｉｅｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で比較的迅速にハイブリダイゼーションをすることが望ましいことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
必要なのは、異なるオリゴヌクレオチド対の間で有意なクロス・ハイブリダイゼーションを起こさず、その結果、偽陽性または偽陰性を起こさないで、オリゴヌクレオチド対の組み合わせを利用して、複数の被検体を検出するためのオリゴヌクレオチド利用アッセイシステムである。対をなす全てのオリゴヌクレオチドが実質的に同一の速度でハイブリダイゼーションを起こし、実質的に同一のＴｍを有し、相補的なオリゴヌクレオチドの対が、有意なクロス・ハイブリダイゼーションを起こすことなく周囲温度で比較的迅速にハイブリダイゼーションをすることができる、オリゴヌクレオチド利用アッセイシステムの必要性も存在する。残念ながら、いまのところ、かかるアッセイシステムは入手不可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は上記の必要を満たす。本発明は、被検体の選別、検出および同定に有用なアッセイシステム、キットおよび方法である。前記アッセイシステムは１対または２対以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含み、対をなすオリゴヌクレオチドのそれぞれは、対の相手のオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性があり、前記オリゴヌクレオチドは異なる対の間でのクロス・ハイブリダイゼーションを最小限にとどめるように設計された配列を有する。好ましくは、前記異なるオリゴヌクレオチドの対は、実質的に同一の速度でハイブリダイゼーションを起こし、実質的に同一のＴｍを有し、検出可能なクロス・ハイブリダイゼーションを起こすことなく、周囲温度で比較的迅速にハイブリダイゼーションを起こす。各オリゴヌクレオチド対は、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを含む。ある対の第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定化される。好ましい実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８からの１２個または１３個以上の連続したヌクレオチドを有する配列からなるグループから選択される。本発明は、アッセイシステム、キットおよび方法に使用するための相補的なオリゴヌクレオチド対の核酸配列を生成する方法も含む。
【０００７】
発明の詳細な説明
以下では、本発明の実施態様と、これらの実施態様の複数の変更とを説明する。しかし、この説明は、これらの特定の実施態様に本発明を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、同様に、多数の他の実施態様を認識するであろう。好ましい、あるいは、特に好ましいものとして言及される本明細書に説明される実施態様の全てにおいて、これらの実施態様は好ましい場合があっても、必須ではない。
【０００８】
定義
本明細書で用いられるところの用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、天然または合成の２本鎖デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」という。）、１本鎖ＤＮＡまたはリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」という。）を含むように本明細書では取り替え可能に使われる。
【０００９】
本明細書で用いられるところの用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらのアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）等を含む、天然または修飾モノマー、修飾された骨格または修飾された連結部の直鎖状オリゴマーを含む核酸であって、ワトソン−クリック型の塩基対合等のような規則的なパターンのモノマーとモノマーとの相互作用によって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの標的と特異的に結合できる核酸をいう。モノマーは、数個、例えば３ないし４個のモノマー単位から数十個のモノマー単位までの範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成するために、リン酸ジエステル結合またはその類似体によって連結されるのが通常である。リン酸ジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホアニリダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）等を含む。非天然骨格を形成する、ホスホロチオエート、ホスホアミダートおよび類似のかかる官能基のような代替的な化学物質も、生成されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率に悪影響を生じないことを条件として、使用される場合がある。前記オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｏｚａｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：５２０５−５２１４  （１９９２）、Ａｇｒａｗａｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：５４１９−５４２３  （１９９０）等のような多数のアプローチによって合成可能である。
【００１０】
「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合によるポリヌクレオチドの自然な結合を指す。例えば、５’−ＡＧＴ−３’という配列は、３’−ＴＣＡ−５’という相補的な配列に結合する。２本の１本鎖分子の間の相補性は、核酸の一部だけが結合して２重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成するという、「部分的な」場合があり、あるいは、相補性は、１本鎖分子間に完全な相補性が存在するという、「完全な」場合がある。核酸のストランドの間の相補性の程度は、該核酸のストランドの間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい影響がある。
【００１１】
核酸の「２重鎖」は、一方のストランドの３’末端が反対ストランドの５’末端に配向されて結合される、逆平行複合体を形成するＤＮＡまたはＲＮＡの相補的なストランドの塩基対合によって形成される。この塩基対合は、デオキシイノシン、２−アミノプリン基を有するヌクレオシド等のような「ヌクレオシド類似体」の対合をも含み、これらが使用される場合がある。本明細書で用いられるところの用語「ヌクレオシド」は、例えばＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＤＮＡ複製）、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、１９９２年）に説明されるような、２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシ型を含む天然ヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関して「類似体（ａｎａｌｏｇｓ）」は、特異的ハイブリダイゼーションが可能な、修飾塩基原子団および／または修飾糖原子団を有する合成ヌクレオシドを含み、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（ヌクレオチド類似体）（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９８０年）、ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０）等に説明される。かかる類似体は、結合特性を向上させ、縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を減少させ、特異性を増大させる等のために設計された合成ヌクレオシドを含む。「雑種形成させる」または「ハイブリダイゼーション」という用語には、少なくとも２個の相補的な核酸配列が存在するとき、該配列が塩基対合によって２本鎖構造を形成するような条件下で少なくとも２個の核酸配列を混合することを含む意図がある。
【００１２】
本発明は、被検体についてのアッセイシステムに向けられる。前記アッセイシステムは、１対または２対以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含む。相補的なオリゴヌクレオチドのそれぞれの対は、第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを含む。被検体結合剤が、オリゴヌクレオチド対の第１オリゴヌクレオチドに付着している。好ましい実施態様では、それぞれの対の第１オリゴヌクレオチドに連結された異なる被検体結合剤が存在し、異なる被検体結合剤のそれぞれは１個または２個以上の試料中の異なる被検体について特異性を有する。オリゴヌクレオチド対の第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定化される。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、異なるオリゴヌクレオチド対に由来するオリゴヌクレオチドとのクロス・ハイブリダイゼーションを最小限にする配列を有するように選択される。それぞれの対の相補的なオリゴヌクレオチドは、典型的には、同じ合計個数のヌクレオチドか、あるいは、ヌクレオチドの合計個数が２ないし５個未満の違いしかないオリゴヌクレオチドを含み、より典型的には、ヌクレオチドの合計個数が３個以下の違いしかないオリゴヌクレオチドを含む。典型的には、各オリゴヌクレオチドのグアニンおよびシトシンの含量の和である「ＧＣ含量」は約３５％ないし約６５％であり、より典型的には、各オリゴヌクレオチドのＧＣ含量は約５０％ないし約６０％である。好ましくは、それぞれの対の相補的なオリゴヌクレオチドは、予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で実質的に同一のＴｍ（溶融温度）を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１−配列番号１８８と、これらの変異体（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）および部分配列（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎｓ）と含み、ここで、配列番号１は配列番号２に相補的であり、配列番号３は配列番号４に相補的であり、配列番号５は配列番号６に相補的であり、以下同様である。配列番号１−１８８で表されるオリゴヌクレオチドは表１に示される。
【００１４】
上記配列の部分配列を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８に由来する１２個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する１４個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する１６個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する１８個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する２０個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する２２個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する２４個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する２６個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８に由来する２８個以上の連続するヌクレオチドを有する配列か、配列番号１−１８８の配列からなるグループから選択されるのが典型的である。連続するヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドの鎖またはストランドにおいてリン酸ジエステル結合で直接連結されるのが典型的なものをいう。代替的には、オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８の配列のいずれかのヌクレオチドにおける１個のヌクレオチドの変異を有する配列と、配列番号１−１８８の配列のいずれか２個または１個のヌクレオチドにおける２個または１個のヌクレオチドの変異を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１−１８８の配列のいずれか３個または２個以下のヌクレオチドにおける３個または２個以下のヌクレオチドの変異を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１−１８８の配列のいずれか４個または３個以下のヌクレオチドにおける４個または３個以下のヌクレオチドの変異を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１−１８８の配列のいずれか５個または４個以下のヌクレオチドにおける５個または４個以下のヌクレオチドの変異を有するオリゴヌクレオチドとからなるグループから選択される。前記アッセイシステムは、代替的には、配列番号１−１８８の１対または２対以上のオリゴヌクレオチドまたは本明細書に説明されるこれらの変異体と、配列番号１−１８８の１０対のオリゴヌクレオチドまたは本明細書に説明されるこれらの変異体と、配列番号１−１８８の１０対または１１対以上のオリゴヌクレオチドまたは本明細書に説明されるこれらの変異体と、配列番号１−１８８の１４対または１５対以上のオリゴヌクレオチドまたは本明細書に説明されるこれらの変異体と、配列番号１−１８８の全ての対のオリゴヌクレオチドまたは本明細書に説明されるこれらの変異体とを使用する。
【００１５】
特定の実施態様では、本発明は、１０対および１４対の相補的なオリゴヌクレオチドを含む、被検体のアッセイシステムである。それぞれの対の相補的なオリゴヌクレオチドは第１オリゴヌクレオチドと第２オリゴヌクレオチドとを含み、第１オリゴヌクレオチドは被検体結合剤が付着し、第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定化される。前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１１、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７５、配列番号７７、配列番号９３、配列番号９５、配列番号１１７、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１６３および配列番号１８７と、これらのそれぞれに相補的なオリゴヌクレオチドである、配列番号１２、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７６、配列番号７８、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１１８、配列番号１２４、配列番号１３０、配列番号１６４および配列番号１８８とからなるグループから選択される１２個または１３個以上の連続するヌクレオチドを有する配列からなるグループから選択される。
【００１６】
一部の実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１−１８８の配列か、これらの部分配列かを有するオリゴヌクレオチドに共有結合で連結された、１個または２個以上のリンカー分子またはリンカー核酸配列を含む。前記リンカー分子またはリンカー核酸配列は、前記オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端にあるのが典型的で、前記対の他のオリゴヌクレオチドと塩基対合する前記オリゴヌクレオチドの領域を超えて伸びる。前記リンカー分子またはリンカー核酸配列が存在するときには、該リンカー分子またはリンカー核酸配列は、ある対の第１オリゴヌクレオチドを被検体結合剤に連結および付着するか、あるいは、ある対の第２オリゴヌクレオチドを固体支持体に連結するのが典型的である。オリゴヌクレオチドをさまざまな固体支持体に付着させる技術は、その内容全体が引用文献によって取り込まれる、Ｍａｔｓｏｎ、Ｒ．ら、「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ：  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ（ポリプロピレン支持体上での生体高分子合成：オリゴヌクレオチドアレイ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２４：１１０−１１６（１９９５）と、Ｍｉｌｔｏｎ、Ｒ．、米国特許第６，１４６，８３３号明細書と、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（固定化アフィニティリガンド技術）」、６４−６７頁（１９９２年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）とに説明されるように、当業者に周知である。オリゴヌクレオチドをタンパク質および抗体に付着する技術は、Ｒｅｄｄｙら、米国特許第５，６４８，２１３号明細書に説明されるように、当業者に周知である。
【００１７】
ハイブリダイゼーションの反応条件は、アッセイシステムに由来するオリゴヌクレオチドの混合物中で各オリゴヌクレオチドがその対となるオリゴヌクレオチドだけとハイブリダイゼーションを起こすように、予め選択されることが好ましい。ここで言及される、相補的な対となるオリゴヌクレオチドだけとハイブリダイゼーションをするとは、０．１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションがないこと、好ましくは、０．０１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションがないことを意味する。穏和な反応条件下では、異なる対に由来するオリゴヌクレオチドは、０．１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションを示さないことが好ましく、０．０１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションを示さないのが好ましい。例えば、かかる穏和な条件は、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中の５０−１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む反応混合液中で周囲室温（ａｍｂｉｅｎｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１時間インキュベーションすることを含む。これらの条件下で、本発明のオリゴヌクレオチド対は、０．１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションなしで、好ましくは、０．０１％を超えるクロス・ハイブリダイゼーションなしで、互いにハイブリダイゼーションをする。周囲室温とは、約５０°Ｆ（１０°Ｃ）から約１００°Ｆ（３７．８°Ｃ）までの範囲に該当するのが一般的で、約６５°Ｆ（１８．３°Ｃ）から約８５°Ｆ（２９．４°Ｃ）までの範囲に該当するのがより好ましく、約６８°Ｆ（２０°Ｃ）ないし約８０°Ｆ（２６．７°Ｃ）の範囲に該当するのが最も典型的である。
【００１８】
オリゴヌクレオチド対の間のクロス・ハイブリダイゼーションは、異なる対に由来するオリゴヌクレオチドの相補性の程度が非常に低いヌクレオチド配列を選択することによって部分的に最小限にされる。さらに、対をなすオリゴヌクレオチドと塩基対合しない、少なくとも数個のヌクレオチドを含むギャップの導入またはループの形成を含むように前記オリゴヌクレオチドの一方のアライメントが他方に対してシフトするとき、異なる対に由来するオリゴヌクレオチドは相補性が非常に低いことが好ましい。
【００１９】
クロス・ハイブリダイゼーションは、配列番号１−１８８の第２オリゴヌクレオチドの組と、被検体結合剤に付着した単一の第１オリゴヌクレオチドとを用いるアッセイシステムでテストされる。比較的高濃度（当該アッセイシステムにとって最大測定可能値に近い濃度）の単一被検体を使って実行され、クロス・ハイブリダイゼーションは前記アッセイにおけるいずれかの探および第２オリゴヌクレオチドの位置からの信号として検出される。クロス・ハイブリダイゼーションは、（並行してアッセイされた被検体の較正曲線から求められる）クロス・ハイブリダイゼーションを起こした信号に対応する被検体量を推定し、試料中の被検体量の百分率として表すことによって提供される。例えば、１０，０００ｐｇ／ｍＬの単一被検体を含む試料のアッセイであって、（第１オリゴヌクレオチドが非相補的な第２オリゴヌクレオチドとクロス・ハイブリダイゼーションを起こすため）異なるオリゴヌクレオチドの位置で１ｐｇ／ｍＬの被検体に対応する偽陽性信号を発生するアッセイは、０．０１％（１ｐｇ／ｍＬの１０，０００ｐｇ／ｍＬによる商に１００％を掛けた積）のクロス・ハイブリダイゼーションを表す。
【００２０】
第２オリゴヌクレオチドと、被検体結合分子に付着した相補的な第１オリゴヌクレオチドとを含むアレイであって、被検体結合分子のアレイが予め選択されたハイブリダイゼーション条件下で第１および第２オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの際に「自己集合（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅ）」するアレイが提供される。「自己集合」という用語は、ハイブリダイゼーションが特異的なオリゴヌクレオチドにタグ付けされた結合分子をアレイの特定の位置に局在化して、溶液から結合分子のアレイを形成または集合させることを意味する。
【００２１】
本発明は、前記アッセイシステムで使用するのに適当な相補的オリゴヌクレオチド対の核酸配列を生成する方法を含む。前記方法は、（ａ）米国特許第５，６４８，２１３号明細書に示される配列のような予め選択された長さおよびＧＣ含量で、好ましくは少なくとも３５％のＧＣ含量の１種類または２種類以上の第１配列を選択するステップと、（ｂ）前記１種類または２種類以上の第１配列とほぼ同じ長さで、好ましくは実質的に同一の長さを有し、ほぼ同じＧＣ含量で、好ましくは実質的に同一のＧＣ含量を有する、ランダム配列のライブラリを生成するステップと、（ｃ）前記ランダム配列のライブラリから第２配列を選択するステップと、（ｄ）第２オリゴヌクレオチド配列を捨てるステップであって、捨てるべき第２配列の選択は、第２配列を第１配列と比較して、（ｉ）これら２つの配列のいずれかのアライメントにおいていずれか８個の塩基のウィンドウで５箇所を超える一致（ｍａｔｃｈ）があるか、（ｉｉ）第２配列が４個を超える連続する同一の塩基を含むかのいずれかの場合に拒絶され、捨てるステップと、（ｅ）捨てられなかった第２配列を第１配列に追加するステップと、（ｆ）任意的に、配列のコレクションを形成するために、ステップ（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返すステップとを含む。前記方法は、可能な２次構造または自己相補性についてそれぞれの保持された配列を分析するために、カリフォルニア州９４３０３−４５０４、パロアルト、３７８６  Ｃｏｒｉｎａ  ＷａｙのＰｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から入手可能なＮｅｔＰｒｉｍｅｒ２．０のようなコンピュータアルゴリズムを使うステップであって、有意な予測２次構造または自己相補的な構造を有する配列は拒絶される、ステップを任意的に含む。保持される配列は、相補的な対のハイブリダイゼーションと、非相補的な対のハイブリダイゼーションとを弁別でき、０．１％以下のクロス・ハイブリダイゼーションを検出できる敏感なアッセイを用いて、例えば、周囲温度で生理学的な塩濃度条件下のような比較的穏和な条件下でクロス・ハイブリダイゼーションについてテストされるのが典型的である。前記保持される組の他のいずれかの配列とのクロス・ハイブリダイゼーションが０．１％を超える配列は拒絶される。長さがヌクレオチド５個または４個以下しか違わない場合には、２個の配列はほぼ同じ長さである。長さがヌクレオチド１個または０個の違いしかない場合には、２個の配列は実質的に同一の長さであるとされる。２個の配列は、ＧＣ含量の差が３０％を超えない場合にほぼ同じＧＣ含量を有し、差が１０％を超えない場合に実質的に同一のＧＣ含量を有する。
【００２２】
前記被検体結合剤は、関心のある被検体と特異的に結合できるタンパク質またはポリペプチドを含むのが典型的である。前記被検体結合剤は、前記被検体に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体か、あるいは、これらの抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）かであることが好ましい。抗体またはこれらの抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト型抗体、組換え抗体その他の形状の抗体を含むものと理解される。前記被検体結合剤は、標的被検体と特異的に結合する、さまざまな免疫反応物質（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔａｎｔｓ）の類似体および変異体（例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて作成されるもの）を含む。抗体および抗原の結合と比較できる特異的な結合対の形成であって、例えば、レセプタータンパク質またはこれらの断片および被検体リガンド、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド結合対、ポリヌクレオチドおよびタンパク質結合対、脂質およびタンパク質結合対、酵素および酵素結合対、酵素および基質結合対、酵素および阻害剤結合対、酵素および代謝物結合対、炭水化物およびタンパク質結合対、炭水化物およびレクチン結合対、タンパク質および薬物結合対等のような、タンパク質を利用するか、ペプチドを利用するか、核酸を利用するか、炭水化物を利用するか、脂質を利用する他の特異的なシステムを使うことを通じて実施できる、特異的な結合対の形成も本発明の範囲内に含むものとして意図される。関心のある被検体と選択的に結合する化学的な分子レセプターシステムも本発明の範囲内のものとして意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
図１に示される実施態様では、アッセイシステムはサンドイッチアッセイを利用する。第１オリゴヌクレオチドに付着する被検体結合剤は、前記被検体に特異的な捕捉抗体である。それぞれの対のオリゴヌクレオチドについて、第１オリゴヌクレオチドは第２オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションをし、第２オリゴヌクレオチドは固体支持体に直接付着する。前記対の第１オリゴヌクレオチドは、第２オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを通じて前記固体支持体に固定化される。前記捕捉抗体は特定の被検体に特異的で、この被検体は前記捕捉抗体との結合を通じて固体支持体に付着するようになる。前記捕捉抗体は異なる被検体に特異的であるのが典型的で、前記捕捉抗体の前記固体支持体上での空間的な位置は、前記固体支持体上でのそれぞれの対の第２オリゴヌクレオチドの場所によって決定される。前記被検体は、検出抗体とよばれる２次抗体を通じて検出されるが、該検出抗体には検出原子団が付着している。図１に示される実施態様では、検出原子団は蛍光標識ＰＢＸＬ−１（メリーランド州２１０４５、６４８０  Ｄｏｂｂｉｎ  Ｒｏａｄ，  ＣｏｌｕｍｂｉａのＭａｒｔｅｋから入手可能）である。検出原子団として使用可能な蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）および蛍光色素は当業者に周知である。他の適当な検出原子団は、例えば、控訴利用検出用基質、放射性標識等を含む。例えば、競合アッセイおよびプライマー伸長アッセイのような、結合した被検体の代替的な検出方法は本発明の範囲内にあると予想される。
【００２４】
一部の実施態様では、固体支持体は平らな面を含み、それぞれの異なるオリゴヌクレオチドが実質的に平らな面の予め定められた異なる領域に付着する。固体支持体は、平らな顕微鏡スライドと、ニトロセルロース、ナイロンおよびＰＶＤＦでできた可撓性の膜と、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネートでできたマイクロウェルプレートとを含むがこれらに限定されない、マイクロアレイの基質を含むのが典型的である。
【００２５】
代替的な実施態様では、固体支持体は、ビーズ玉（ｂｅａｄ）、粒子、微粒子等であるが、本明細書では、ビーズ玉、粒子および微粒子という用語は互いに取り替え可能なように使用される。前記ビーズ玉は、約０．０４から５０マイクロメートルまでの範囲の直径を有するのが典型的である。本発明の１つの実施態様では、前記ビーズ玉は約０．１から約２０マイクロメートルまでの範囲内のサイズである。前記ビーズ玉は、密度が約０．５ないし約２．０ｇ／ｍＬの範囲内であるように、液体に懸濁されるのが典型的である。ビーズ玉懸濁液のサイズおよび密度は、ピペット、ポンプおよびある種のバルブのような大抵の液体輸送装置によってビーズ玉を単純な液体として取り扱うことを可能にする。前記ビーズ玉を調整するために用いられる材料および方法は当業者に周知である。
【００２６】
典型的には、本アッセイシステムで検出される被検体は、抗体およびその結合断片を含むがこれらに限定されないポリペプチドまたはタンパク質、炭水化物、リガンド、核酸、脂質、ホルモン、レクチン、レセプター、ステロイド類、細胞表面抗原、サイトカイン、ウイルス抗原、細菌抗原、ｃＤＮＡおよび乱用薬物からなるグループから選択される。好ましい実施態様では、前記アッセイシステムは、１種類または２種類以上の特異的な被検体の検出用のキットの形態で提供される。
【００２７】
表１
配列番号 1:    5'-ATACTGACTGGCGATGCTGTCGAAGTAGCG-3'
配列番号 2:    5'-CGCTACTTCGACAGCATCGCCAGTCAGTAT-3'
配列番号 3:    5'-AGTTAAATAGCTTGCAAAATACGTGGCCTT-3'
配列番号 4:    5'-AAGGCCACGTATTTTGCAAGCTATTTAACT-3'
配列番号 5:    5'-GAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC-3'
配列番号 6:    5'-GGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTC-3'
配列番号 7:    5'-GCTTACCGAATACGGCTTGGAGAACCTATC-3'
配列番号 8:    5'-GATAGGTTCTCCAAGCCGTATTCGGTAAGC-3'
配列番号 9:    5'-GCGTGGTCCGCGATCTTCCTACGATTGATG-3'
配列番号 10:    5'-CATCAATCGTAGGAAGATCGCGGACCACGC-3'
配列番号 11:    5'-TTTGAGGTTTCGGAGCGTTCCGTGCATCGC-3'
配列番号 12:    5'-GCGATGCACGGAACGCTCCGAAACCTCAAA-3'
配列番号 13:    5'-AATCCTGTTGTGAGCCGACCAAGTGCCTCC-3'
配列番号 14:    5'-GGAGGCACTTGGTCGGCTCACAACAGGATT-3'
配列番号 15:    5'-GTATCTGACGCGTATGCCCAGGTTAGTGGC-3'
配列番号 16:    5'-GCCACTAACCTGGGCATACGCGTCAGATAC-3'
配列番号 17:    5'-CGGAGTCGTCCTCTGTAGGGATTTGCCCTT-3'
配列番号 18:    5'-AAGGGCAAATCCCTACAGAGGACGACTCCG-3'
配列番号 19:    5'-CAGGCTGTGGAGTGCTATTGTCATATGGGC-3'
配列番号 20:    5'-GCCCATATGACAATAGCACTCCACAGCCTG-3'
配列番号 21:    5'-TCTTCTCTCTGGTCTAAGGCATCGAGCGGA-3'
配列番号 22:    5'-TCCGCTCGATGCCTTAGACCAGAGAGAAGA-3'
配列番号 23:    5'-TGGCGTACTAGTGCTTAGGCGTACTGAAGC-3'
配列番号 24:    5'-GCTTCAGTACGCCTAAGCACTAGTACGCCA-3'
配列番号 25:    5'-TGCTGGCTTTACTGCGACGGTGACTCTCCT-3'
配列番号 26:    5'-AGGAGAGTCACCGTCGCAGTAAAGCCAGCA-3'
配列番号 27:    5'-CTATCAAAGCTGGTTCCAGGCGCTCCTGGA-3'
配列番号 28:    5'-TCCAGGAGCGCCTGGAACCAGCTTTGATAG-3'
配列番号 29:    5'-TGAGGCAAGTACATTAGTTCTCAGCCGGCG-3'
配列番号 30:    5'-CGCCGGCTGAGAACTAATGTACTTGCCTCA-3'
配列番号 31:    5'-GCTTGGGTTAGATTGTGTTTGCCGAGCCAA-3'
配列番号 32:    5'-TTGGCTCGGCAAACACAATCTAACCCAAGC-3'
配列番号 33:    5'-CGTCCATTCCTATCGGGAGGTAACAGACTT-3'
配列番号 34:    5'-AAGTCTGTTACCTCCCGATAGGAATGGACG-3'
配列番号 35:    5'-CTAAGGAGTCCGAAGATGTACAATGGGTCG-3'
配列番号 36:    5'-CGACCCATTGTACATCTTCGGACTCCTTAG-3'
配列番号 37:    5'-AACTAGCCGCCTCCTGTCCCATGAATTCTA-3'
配列番号 38:    5'-TAGAATTCATGGGACAGGAGGCGGCTAGTT-3'
配列番号 39:    5'-AGCTTCTTGTAACGTTGAGTTGCAGGTCCG-3'
配列番号 40:    5'-CGGACCTGCAACTCAACGTTACAAGAAGCT-3'
配列番号 41:    5'-CACTGGATAATTGCGCCTTCCGTGCATGAA-3'
配列番号 42:    5'-TTCATGCACGGAAGGCGCAATTATCCAGTG-3'
配列番号 43:    5'-CCCGCGCAGAGCGTAGTTGTAATTTAGATC-3'
配列番号 44:    5'-GATCTAAATTACAACTACGCTCTGCGCGGG-3'
配列番号 45:    5'-CCTGGAAATAAGCAGCAGCACCAACTCTCA-3'
配列番号 46:    5'-TGAGAGTTGGTGCTGCTGCTTATTTCCAGG-3'
配列番号 47:    5'-GGCTCATGGTTCTTTGCTCAACCATAAGCC-3'
配列番号 48:    5'-GGCTTATGGTTGAGCAAAGAACCATGAGCC-3'
配列番号 49:    5'-CTTGCTCCTCACATGATGCGGAAACGCTAA-3'
配列番号 50:    5'-TTAGCGTTTCCGCATCATGTGAGGAGCAAG-3'
配列番号 51:    5'-ATCCTTCTGCACTTTCGCGTAGACATAGCC-3'
配列番号 52:    5'-GGCTATGTCTACGCGAAAGTGCAGAAGGAT-3'
配列番号 53:    5'-ATCGAACCCAAACTGAGGTTAAGAGCCGCT-3'
配列番号 54:    5'-AGCGGCTCTTAACCTCAGTTTGGGTTCGAT-3'
配列番号 55:    5'-AAGGACTGGACGTTGCATTCACAGTGGGTT-3'
配列番号 56:    5'-AACCCACTGTGAATGCAACGTCCAGTCCTT-3'
配列番号 57:    5'-CTCATGAAGGCCGTCGGGAAATTCCAAGTT-3'
配列番号 58:    5'-AACTTGGAATTTCCCGACGGCCTTCATGAG-3'
配列番号 59:    5'-TGGATTCCGTTATCACCATTTGGACCCTGC-3'
配列番号 60:    5'-GCAGGGTCCAAATGGTGATAACGGAATCCA-3'
配列番号 61:    5'-TAAGGGCTCTATCTACCACCTCCGACTTTC-3'
配列番号 62:    5'-GAAAGTCGGAGGTGGTAGATAGAGCCCTTA-3'
配列番号 63:    5'-TACGCTCCCAGTGTGATCACCAAAGCTTAC-3'
配列番号 64:    5'-GTAAGCTTTGGTGATCACACTGGGAGCGTA-3'
配列番号 65:    5'-AGACTGAACTACCGGCGGTTGCACTACTAA-3'
配列番号 66:    5'-TTAGTAGTGCAACCGCCGGTAGTTCAGTCT-3'
配列番号 67:    5'-GCCAAACACGCCCAATCACTGTTACATGTC-3'
配列番号 68:    5'-GACATGTAACAGTGATTGGGCGTGTTTGGC-3'
配列番号 69:    5'-GCTTGACGTCTACCACCGTGAACATAAGGA-3'
配列番号 70:    5'-TCCTTATGTTCACGGTGGTAGACGTCAAGC-3'
配列番号 71:    5'-AAGAACCGTAATAGGCCCGGTTGGGAATTC-3'
配列番号 72:    5'-GAATTCCCAACCGGGCCTATTACGGTTCTT-3'
配列番号 73:    5'-CGGACTAACAAGACTCTTATAGCGTCTCGC-3'
配列番号 74:    5'-GCGAGACGCTATAAGAGTCTTGTTAGTCCG-3'
配列番号 75:    5'-TCGCCAACGTAGCTGTGCTACAGTTGATTC-3'
配列番号 76:    5'-GAATCAACTGTAGCACAGCTACGTTGGCGA-3'
配列番号 77:    5'-GCAGCGGCTAAACCTTGAGATCGAATGGAA-3'
配列番号 78:    5'-TTCCATTCGATCTCAAGGTTTAGCCGCTGC-3'
配列番号 79:    5'-GCAACCGTCAACGGTCTTAATGACACATCG-3'
配列番号 80:    5'-CGATGTGTCATTAAGACCGTTGACGGTTGC-3'
配列番号 81:    5'-GGGTAGAAACGGACGTTACCCATGATCTTG-3'
配列番号 82:    5'-CAAGATCATGGGTAACGTCCGTTTCTACCC-3'
配列番号 83:    5'-GGCGGCAACACCTACCTTCTAGATTGAAAC-3'
配列番号 84:    5'-GTTTCAATCTAGAAGGTAGGTGTTGCCGCC-3'
配列番号 85:    5'-CGCTAATAGTGGACCCTCTCATAGCTATGG-3'
配列番号 86:    5'-CCATAGCTATGAGAGGGTCCACTATTAGCG-3'
配列番号 87:    5'-CTGATGGAATCTACCACTGCTAAACGCAGC-3'
配列番号 88:    5'-GCTGCGTTTAGCAGTGGTAGATTCCATCAG-3'
配列番号 89:    5'-GCCTAGTCGGATGCTCGGATATCATACTAC-3'
配列番号 90:    5'-GTAGTATGATATCCGAGCATCCGACTAGGC-3'
配列番号 91:    5'-CTTTGAACGACATCTTAGTCTCGAACGCCG-3'
配列番号 92:    5'-CGGCGTTCGAGACTAAGATGTCGTTCAAAG-3'
配列番号 93:    5'-TCGACATGCGCGTCATCTGATACTGCGGTC-3'
配列番号 94:    5'-GACCGCAGTATCAGATGACGCGCATGTCGA-3'
配列番号 95:    5'-GGTGGCCTCGTAAGGCGAGAATTAGGGTTG-3'
配列番号 96:    5'-CAACCCTAATTCTCGCCTTACGAGGCCACC-3'
配列番号 97:    5'-GGCTAGATAGGCGATTAGTCAGAGTGGACA-3'
配列番号 98:    5'-TGTCCACTCTGACTAATCGCCTATCTAGCC-3'
配列番号 99:    5'-CCTGGATAAGACGTTAACGTTACGGAGCCA-3'
配列番号 100:    5'-TGGCTCCGTAACGTTAACGTCTTATCCAGG-3'
配列番号 101:    5'-CAAACTGAGCTAGGCCTAACTGTGATGCAG-3'
配列番号 102:    5'-CTGCATCACAGTTAGGCCTAGCTCAGTTTG-3'
配列番号 103:    5'-CGCCTCGTGTGTTATAACGATGGGACTTTG-3'
配列番号 104:    5'-CAAAGTCCCATCGTTATAACACACGAGGCG-3'
配列番号 105:    5'-TGGTTTAGCCTTTCCGGCATCTGCTGTACA-3'
配列番号 106:    5'-TGTACAGCAGATGCCGGAAAGGCTAAACCA-3'
配列番号 107:    5'-CAACCTCTACCCAGAAACTCAAGTTTCGGC-3'
配列番号 108:    5'-GCCGAAACTTGAGTTTCTGGGTAGAGGTTG-3'
配列番号 109:    5'-CTCGTTTCTAGGTCACTGCGCAAAACGCTT-3'
配列番号 110:    5'-AAGCGTTTTGCGCAGTGACCTAGAAACGAG-3'
配列番号 111:    5'-TGCTCTTCTCGTGCCCGTTAAAGGATCGAT-3'
配列番号 112:    5'-ATCGATCCTTTAACGGGCACGAGAAGAGCA-3'
配列番号 113:    5'-CCCGGCAGGTATACAAAGCACTTCGTATAC-3'
配列番号 114:    5'-GTATACGAAGTGCTTTGTATACCTGCCGGG-3'
配列番号 115:    5'-GTAGAAGCCTGTGGTTAAAACTATGGCCCG-3'
配列番号 116:    5'-CGGGCCATAGTTTTAACCACAGGCTTCTAC-3'
配列番号 117:    5'-CATCGGTCGAACCCGTGTCAACAAGATTCT-3'
配列番号 118:    5'-AGAATCTTGTTGACACGGGTTCGACCGATG-3'
配列番号 119:    5'-TGGAGGAGACTTGTCAGGATTTGCTCTGAG-3'
配列番号 120:    5'-CTCAGAGCAAATCCTGACAAGTCTCCTCCA-3'
配列番号 121:    5'-AGCCCAAGGAATAGTCAATACTTCCTCAGC-3'
配列番号 122:    5'-GCTGAGGAAGTATTGACTATTCCTTGGGCT-3'
配列番号 123:    5'-CAAAGGAAATGTTCGAGCCGCCAGACTAGA-3'
配列番号 124:    5'-TCTAGTCTGGCGGCTCGAACATTTCCTTTG-3'
配列番号 125:    5'-TCCTATTATGCCTGAATTCAGGCAGCCGAC-3'
配列番号 126:    5'-GTCGGCTGCCTGAATTCAGGCATAATAGGA-3'
配列番号 127:    5'-GCATGTGTAGATGGCCAGCCACTTATTAGG-3'
配列番号 128:    5'-CCTAATAAGTGGCTGGCCATCTACACATGC-3'
配列番号 129:    5'-CCTTTGGGTATTGCTCTGACCTGGTTATGC-3'
配列番号 130:    5'-GCATAACCAGGTCAGAGCAATACCCAAAGG-3'
配列番号 131:    5'-AGGCAGGTCCCTAGTCACAACTTAATCTGC-3'
配列番号 132:    5'-GCAGATTAAGTTGTGACTAGGGACCTGCCT-3'
配列番号 133:    5'-CCGACAGTACTTTACTCATTGTGGCGCAGT-3'
配列番号 134:    5'-ACTGCGCCACAATGAGTAAAGTACTGTCGG-3'
配列番号 135:    5'-AAGTGAAAGCATCTCCGCATGCATTGGCCA-3'
配列番号 136:    5'-TGGCCAATGCATGCGGAGATGCTTTCACTT-3'
配列番号 137:    5'-GCACGTACACGAGAAACGGGTATCTAAGCT-3'
配列番号 138:    5'-AGCTTAGATACCCGTTTCTCGTGTACGTGC-3'
配列番号 139:    5'-TCCAGCTGCAGACAAAGACCTATGCGTTAC-3'
配列番号 140:    5'-GTAACGCATAGGTCTTTGTCTGCAGCTGGA-3'
配列番号 141:    5'-ATCCGACTCATCTAGGTGCACCTCTATGTG-3'
配列番号 142:    5'-CACATAGAGGTGCACCTAGATGAGTCGGAT-3'
配列番号 143:    5'-CTGGACGACTTTCTAGATGCCCTGAGTTAC-3'
配列番号 144:    5'-GTAACTCAGGGCATCTAGAAAGTCGTCCAG-3'
配列番号 145:    5'-CTAAGACACATCCTATTATCCTGCCCGAGC-3'
配列番号 146:    5'-GCTCGGGCAGGATAATAGGATGTGTCTTAG-3'
配列番号 147:    5'-AGAATTGCGCACAAGAAGTCTCTGCGGCAA-3'
配列番号 148:    5'-TTGCCGCAGAGACTTCTTGTGCGCAATTCT-3'
配列番号 149:    5'-CCGAGCACTATAGGAGTTATAATCGAGGGG-3'
配列番号 150:    5'-CCCCTCGATTATAACTCCTATAGTGCTCGG-3'
配列番号 151:    5'-CTAGTTACCCACACTTAGTCACTTGCAGCG-3'
配列番号 152:    5'-CGCTGCAAGTGACTAAGTGTGGGTAACTAG-3'
配列番号 153:    5'-GCAAATCAGTAAAGATGGACAGGCCTACCC-3'
配列番号 154:    5'-GGGTAGGCCTGTCCATCTTTACTGATTTGC-3'
配列番号 155:    5'-ATGGTCGCATGATTTAGTACGGATGGCGTG-3'
配列番号 156:    5'-CACGCCATCCGTACTAAATCATGCGACCAT-3'
配列番号 157:    5'-AACATTCTTCTCGGGTTACAAACCGCGCGA-3'
配列番号 158:    5'-TCGCGCGGTTTGTAACCCGAGAAGAATGTT-3'
配列番号 159:    5'-GGCAAGACTCGTTCTGGGCTGCTTATTAGA-3'
配列番号 160:    5'-TCTAATAAGCAGCCCAGAACGAGTCTTGCC-3'
配列番号 161:    5'-CCATATCACGTGATGCCGGAATTGTCACGT-3'
配列番号 162:    5'-ACGTGACAATTCCGGCATCACGTGATATGG-3'
配列番号 163:    5'-TGCGATATACTCCATGCCTCTCTTGGCGGA-3'
配列番号 164:    5'-TCCGCCAAGAGAGGCATGGAGTATATCGCA-3'
配列番号 165:    5'-GTGTGCGCGCCTTCTAGAATACTCATAAGC-3'
配列番号 166:    5'-GCTTATGAGTATTCTAGAAGGCGCGCACAC-3'
配列番号 167:    5'-CCAGCACAAACGCTGATCGTTGAAACGGAT-3'
配列番号 168:    5'-ATCCGTTTCAACGATCAGCGTTTGTGCTGG-3'
配列番号 169:    5'-AAGTGTGAGGTCGTTCACTTTCACACTGCC-3'
配列番号 170:    5'-GGCAGTGTGAAAGTGAACGACCTCACACTT-3'
配列番号 171:    5'-TAAATCAACGGCATTGGCGTCCGTTATCGC-3'
配列番号 172:    5'-GCGATAACGGACGCCAATGCCGTTGATTTA-3'
配列番号 173:    5'-TGCGCCCACACGTTACGATCTGTATAAAGC-3'
配列番号 174:    5'-GCTTTATACAGATCGTAACGTGTGGGCGCA-3'
配列番号 175:    5'-ATAATGCGTTTCCGGCCACCGCGTTATTAC-3'
配列番号 176:    5'-GTAATAACGCGGTGGCCGGAAACGCATTAT-3'
配列番号 177:    5'-TCAACGCGCGGTTTCTTGAGTAATTCAGCC-3'
配列番号 178:    5'-GGCTGAATTACTCAAGAAACCGCGCGTTGA-3'
配列番号 179:    5'-GCACCGGAGGTTTACATCATGCAGAAGTGT-3'
配列番号 180:    5'-ACACTTCTGCATGATGTAAACCTCCGGTGC-3'
配列番号 181:    5'-TGTCTCACTAGAGCTTCACCCATGCATGTG-3'
配列番号 182:    5'-CACATGCATGGGTGAAGCTCTAGTGAGACA-3'
配列番号 183:    5'-GCCAAACATAGTTGGAATCCTCGGGAGGAA-3'
配列番号 184:    5'-TTCCTCCCGAGGATTCCAACTATGTTTGGC-3'
配列番号 185:    5'-GCACTATAAACTTCCTAGCCTTCTCGTCGC-3'
配列番号 186:    5'-GCGACGAGAAGGCTAGGAAGTTTATAGTGC-3'
配列番号 187:    5'-GGTTTGCAAGAAGCAGAAGCCATTCCGACA-3'
配列番号 188:    5'-TGTCGGAATGGCTTCTGCTTCTTGCAAACC-3'
【００２８】
以上のとおり本発明を説明してきたが、上記に示され、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲と正当な意味から逸脱することなく、多数の変更および改良が加えられる場合があることは明らかである。
【００２９】
本発明は特定の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に説明されたが、他の実施態様も可能である。したがって、特許請求の範囲の精神および範囲は本明細書に説明された好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。
【００３０】
特許請求の範囲、要約および図面を含む本明細書に開示された全ての特徴と、開示されたいずれかの方法またはプロセスの全てのステップとは、かかる特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排除的であるような組み合わせを除いて、いかなる組み合わせで組み合わされてもかまわない。特許請求の範囲、要約および図面を含む本明細書に開示されたそれぞれの特徴は、特記されない限り、同一、均等または類似の目的に役立つ代替的な特徴によって置換される場合がある。したがって、特記されない限り、開示されたそれぞれの特徴は、均等または類似の特徴の一連の上位概念の１つの実施例にすぎない。
【００３１】
特定の機能を実行するための「手段」か、特定の機能を実行するための「ステップ」かであることを明示して表明しない特許請求の範囲に記載のいかなる要素も、米国特許法第１１２条に定められる「手段」または「ステップ」の規定のとおりに解釈されるべきではない。
【００３２】
本発明の特徴、局面および利点は本明細書の説明、添付される特許請求の範囲および図面を参照するとよりよく理解されるであろう。
【配列表フリーテキスト】
【００３３】
配列番号１―１８８の全てについて、フリーテキストの記載事項は「人工配列の説明：合成オリゴヌクレオチド」である。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の特徴を有するサンドイッチアッセイの概念図。
【図１】
2006523462.tif 000003
【配列表】
2006523462000001.app
【国際調査報告】
2006523462.tif 000004
2006523462.tif 000005
2006523462.tif 000006
2006523462.tif 000007
2006523462.tif 000008
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