(57)【要約】本発明は、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の同定、示差定量のための、並びに、翻訳後修飾及び架橋状態の分析のための、方法、試薬及びキットを提供する。該方法は、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を誘導体化して、そのＣ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含む１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を形成させる段階、該固定電荷を含むように誘導体化したアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を質量分析装置に導入する段階、該固定電荷を含むように誘導体化したアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を第１の質量分解分析装置に通して、第１質量対電荷比を有するタンパク質又はペプチドプリカーサーイオンを選択する段階、上記の第１質量対電荷比を有するプリカーサーイオンを解離させて、固定電荷の近傍の部位において起こるフラグメント化の特性である第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを生成させる段階、及び第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを検出する段階、、を含んでなる。第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンは、プリカーサーイオンからの固定電荷の中性脱離によって形成されるプロダクトイオンであっても、又はプリカーサーイオンからの固定電荷の荷電脱離によって形成されるプロダクトイオンであってもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析方法であって、
（１）アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を誘導体化して、そのＣ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含むように誘導体化した１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を形成させる段階、
（２）Ｃ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含むように誘導体化した１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を質量分析装置に導入する段階、
（３）Ｃ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含むように誘導体化した１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を第１の質量分解分析装置に通して、第１質量対電荷比を有するタンパク質又はペプチドプリカーサーイオンを選択する段階、
（４）上記の第１質量対電荷比を有するプリカーサーイオンを解離させて、固定電荷の近傍の部位において起こるフラグメント化の特性である第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを生成させる段階、及び
（５）第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを検出する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンが、プリカーサーイオンからの固定電荷の中性脱離によって形成されるプロダクトイオンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンが、プリカーサーイオンからの固定電荷の荷電脱離によって形成されるプロダクトイオンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
（６）誘導体化したペプチド又はタンパク質の同一性を判定する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
誘導体化したペプチド又はタンパク質の同一性を判定する段階が、最初の繰返し段階（１）、（２）、（３）及び（４）と、次いでペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を決定するため、第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを解離させて所定範囲の質量対電荷比を有する一連のプロダクトイオンを形成させることによって実施される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンがプリカーサーイオンからの中性脱離によって形成される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンがプリカーサーイオンの荷電脱離によって形成される、請求項５記載の方法。
【請求項８】
誘導体化したペプチド又はタンパク質の同定の判定段階を高分解能質量分析装置の使用によって実施する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
高分解能質量分析装置の使用によって、段階（５）で検出されるプロダクトイオン又はその相補的プロダクトイオンに関して約１〜５ｐｐｍの質量精度を与える、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
誘導体化ペプチド又はタンパク質の同一性を判定する段階が、固定電荷誘導体を含むことが判明しているペプチドを同定するためのデータベース検索を含む、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
解離させる段階が、（ｉ）不活性ガスとの衝突（衝突誘起解離（ＣＩＤ））又は衝突活性化解離（ＣＡＤ））、（ii）表面との衝突（表面誘起解離（ＳＩＤ））、（iii）適宜レーザーを使用しての、光粒子との相互作用による光解離、（iv）熱／黒体赤外線放射解離（ＢＩＲＤ）、及び（ｖ）電子ビームとの相互作用による、１価のカチオンに対する電子誘起解離（ＥＩＤ）、多価のカチオンに対する電子捕捉解離（ＥＣＤ）、又はこれらの組合せからなる群から選択される方法を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
当該方法が、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の同定に使用される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
当該方法が、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の定量に使用される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
当該方法が、固定電荷への適切な同位体標識又は構造的標識の取り込みに基づくアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の示差定量に使用される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
同位体標識が１個以上の１３Ｃ、１５Ｎ、及び２Ｈである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
当該方法が、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾状態の分析に使用される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾状態の分析に、質量分析で安定な誘導体であるＯ−リン酸化及びＯ−グリコシル化セリン又はＯ−リン酸化及びＯ−グリコシル化スレオニンを形成させるためのβ−除去／Ｍｉｃｈａｅｌ付加法を介した固定電荷誘導体の取り込みを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
当該方法が、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の架橋状態の分析に使用される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
当該方法が、タンパク質の相互作用の分析に使用される、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
固定電荷誘導体が、選択されたアミノ酸残基の側鎖、又はタンパク質もしくはペプチドに含まれる選択されたアミノ酸残基の側鎖に含まれる、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記選択されたアミノ酸残基が希少アミノ酸のものである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記選択されたアミノ酸残基がその側鎖にＳ原子を含むものである、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸残基が、メチオニン、システイン、ホモシステイン又はセレノシステインである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記アミノ酸残基がメチオニンであり、当該方法がスキーム１、３及び４のいずれかによって実施される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸残基がシステインであり、当該方法がスキーム２、５、６、７及び８のいずれかによって実施される、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記選択されるアミノ酸残基がトリプトファン又はチロシンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸残基がチロシン又はトリプトファンであり、当該方法がスキーム５又は６のいずれかによって実施される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記側鎖がＳ−アルキル基を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸残基が、メチオニン、Ｓ−アルキルシステイン、Ｓ−アルキルホモシステイン、Ｓ−アルキルトリプトファン又はＳ−アルキルチロシンである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
固定電荷誘導体が翻訳後修飾アミノ酸残基の側鎖に含まれる、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
固定電荷誘導体がＯ−結合翻訳後修飾アミノ酸残基に含まれる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｏ−結合翻訳後修飾アミノ酸残基が、Ｏ−結合翻訳後修飾セリンアミノ酸残基からのβ−除去によって形成されるデヒドロアラニン残基である（スキーム９）、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
Ｏ−結合翻訳後修飾アミノ酸残基が、Ｏ−結合翻訳後修飾スレオニンアミノ酸残基からのβ−除去によって形成されるデヒドロアミノ−２−酪酸残基である、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
固定電荷誘導体が、２つのアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の間の架橋結合に含まれる（スキーム１０）、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
固定電荷誘導体が架橋試薬内に含まれている、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
ビーズ又は不溶性ポリマーと共有結合させた固定電荷試薬を使用する固相捕獲法によって固定電荷誘導体が選択的に予め富化されている（スキーム１１）、請求項１乃至請求項３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
固定電荷イオンが、スルホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン又は４級アルキルホスホニウムイオンである、請求項１乃至請求項３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
アミノ酸、ペプチド又はタンパク質イオンの分析をタンデム質量分析によって実施する、請求項１乃至請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
タンデム質量分析装置が、タンパク質又はペプチドイオンを気相に転換させるためのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェース又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）インターフェースを備えている、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
タンデム質量分析装置が、タンデム・イン・スペース型質量分析装置、タンデム・イン・タイム型質量分析装置、又はその組合せである、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
タンデム・イン・スペース型質量分析装置が、セクター型質量分析装置、飛行時間型質量分析装置、三連四重極質量分析装置、又は飛行時間型装置と四重極型装置を組合せたハイブリッド型質量分析装置である、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
セクター型質量分析装置が、二重収束セクター型質量分析装置又はセクター型装置と四重極型装置を組合せたハイブリッド型質量分析装置である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
タンデム・イン・タイム型質量分析装置が、２次元四重極イオントラップ質量分析装置、３次元四重極イオントラップ質量分析装置又はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析装置である、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
１以上のタンパク質抽出段階、タンパク質分離段階、システインジスルフィドの還元及びアルキル化段階、及び／又は消化段階をさらに含む、請求項１乃至請求項４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
アミノ酸、ペプチド又はタンパク質が、次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を用いて誘導体化される、請求項１乃至請求項４４のいずれか１項記載の方法。
【化１】
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【請求項４６】
Ｘが、ハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記置換アセトフェノンが、同位体標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物である、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
Ｘが、ハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上が水素又は炭素以外の原子を含む官能基である、請求項４５乃至請求項５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
置換アセトフェノンが水溶性である、請求項４５乃至請求項５２のいずれか１項記載の方法。
【請求項５４】
Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、或いは
Ｒ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである
請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又は
Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである；
請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物。
【化２】
2006506647.tif 000024
式中、Ｘはスルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである。
【請求項５７】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項５６記載の置換アセトフェノン。
【請求項５８】
置換アセトフェノンが、同位体的標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物である、請求項５６記載の置換アセトフェノン。
【請求項５９】
Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項５８記載の置換アセトフェノン。
【請求項６０】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである、請求項５８記載の置換アセトフェノン。
【請求項６１】
次式の水溶性置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物。
【化３】
2006506647.tif 000025
【請求項６２】
Ｘがハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである、請求項６１記載の水溶性置換アセトフェノン。
【請求項６３】
ＸがＢｒ又はＩである、請求項６２記載の水溶性置換アセトフェノン。
【請求項６４】
Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又は
Ｒ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項６３記載の水溶性置換アセトフェノン誘導体。
【請求項６５】
同位体標識された形態の請求項６１記載の水溶性置換アセトフェノン。
【請求項６６】
Ｘが、ハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである、請求項６４記載の同位体標識された水溶性置換アセトフェノン。
【請求項６７】
Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、
Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、
Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又は
Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである；
請求項６６記載の同位体標識された水溶性置換アセトフェノン。
【請求項６８】
請求項５６乃至請求項６７のいずれか１項記載の置換アセトフェノンを含む容器を含んでなる質量分析装置によるアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析のための試薬キット。
【請求項６９】
次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を含む容器を含んでなる、質量分析によるアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析用試薬キット。
【化４】
2006506647.tif 000026
式中、Ｘはハロゲン化物である。
【請求項７０】
ＸがＢｒ又はＩである、請求項６９記載の試薬キット。
【請求項７１】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項６９又は７０記載の試薬キット。
【請求項７２】
置換アセトフェノンが、同位体標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物である、請求項６９記載の試薬キット。
【請求項７３】
Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項７２記載の試薬キット。
【請求項７４】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである、請求項７２記載の試薬キット。
【請求項７５】
システインジスルフィド還元剤、システインアルキル化試薬、プロテアーゼ又は化学的切断剤、及び溶媒を含む１以上の容器をさらに含んでなる、請求項６８乃至請求項７４のいずれか１項記載の試薬キット。
【請求項７６】
システインジスルフィド還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、トリス−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、及び／又はトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）である、請求項７５記載の試薬キット。
【請求項７７】
システインアルキル化試薬が、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド）、ビニルピリジン又はアクリルアミドである、請求項７５記載の試薬キット。
【請求項７８】
プロテアーゼ又は化学的切断剤が、トリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、ペプシン、パパイン、サーモリシン、臭化シアン、ヒドロキシルアミン塩酸塩、２−［２′−ニトロフェニルスルフェニル］−３−メチル−３′−ブロモインドール（ＢＮＰＳ−スカトール）、ヨードソ安息香酸、ペンタフルオロプロピオン酸、及び／又は希塩酸である、請求項７５記載の試薬キット。
【請求項７９】
溶媒が、尿素、塩酸グアニジン、アセトニトリル、メタノール及び／又は水である、請求項７５記載の試薬キット。
【請求項８０】
側鎖固定電荷スルホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン又は４級アルキルホスホニウムイオンを含むように誘導体化されるアミノ酸又はかかるアミノ酸を含むペプチド。
【請求項８１】
アミノ酸が、請求項５５〜６６のいずれか１項記載の置換アセトフェノンを用いて誘導体化される、請求項８０記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８２】
アミノ酸が、次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を用いて誘導体化されている、請求項８０記載のアミノ酸又はペプチド。
【化５】
2006506647.tif 000027
式中、Ｘはハロゲン化物である。
【請求項８３】
ＸがＢｒ又はＩである、請求項８２記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８４】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項８２又は８３記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８５】
置換アセトフェノンが、同位体標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物である、請求項８２記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８６】
Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、請求項８５記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８７】
Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである、請求項８５記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８８】
アミノ酸誘導体が同位体標識されている、請求項８０乃至請求項８７のいずれか１項記載のアミノ酸又はペプチド。
【請求項８９】
固定電荷で誘導体化させた請求項８０乃至請求項８８のいずれか１項記載のアミノ酸又はペプチドをサンプルに所定量添加することを含んでなる、質量分析法における内部標準を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム配列の最初のドラフト完了に伴い、現在研究者が直面し挑戦しているのは遺伝子の機能を理解することである。しかし、遺伝子の生物学的機能は、そのＤＮＡ配列の単純な調査からは判断することができない。したがって、ゲノムにより発現されるタンパク質の総合的な分析が、遺伝子とその生物学的機能との間を埋めるであろう。プロテオミクスという用語は、（ｉ）任意の所定の時間における特定の細胞型又は組織によって合成される全タンパク質の同定及び特性決定、及び、２つの異なる細胞状態間において観察されるタンパク質発現レベルの全体的変化の定量（総して発現プロテオミクスとして知られる）と、（ii）機能性活性タンパク質複合体の構成成分の同定及び細胞間タンパク質トラフィッキング及びシグナル伝達経路に関与する固有のタンパク質−タンパク質相互作用の特性決定（総して細胞マッピングプロテオミクスとして知られる）と同義となっている。総合すると、これらの方法は、ある状態から別な状態への細胞の形質転換に次いで生じる複雑な細胞の変化をタンパク質レベルでの総合的な調査を可能なものにする［Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ，Ｗ．Ｐ．及びＷｅｉｒ，Ｍ．Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，１２１−１２７．；Ｐａｎｄｅｙ，Ａ．及びＭａｎｎ，Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０５，８３７−８４６］。
【０００３】
質量分析（ＭＳ）の最近の進歩は、ＭＳ由来データのデータベース呼び出しのための高度なバイオインフォマティクスツールの進歩とともに、プロテオミクスを実現する大きな要因となっている［Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．及びＰａｎｄｅｙ，Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１，７０，４３７−４７３］。特に、これら質量分析の迅速性、特異性及び感受性は、迅速なタンパク質の同定及び特性決定を必要とする方法における使用に対して特に魅力的なものとなっている。プロテオミクスに対する従来のＭＳ法は、通常、タンパク質混合物の一次元又は二次元電気泳動（２ＤＥ）による分離を伴い、次いで、タンパク質のスポット又はゲルスライスを切り出し、トリプシンを用いてｉｎ  ｓｉｔｕタンパク質分解に供する。次いで、ペプチドを抽出し質量分光分析に供する。これらのペプチドの質量は該タンパク質の特性であり、ペプチドに対してタンパク質を同定するためのデータベース検索において使用しうる「質量フィンガープリント」を提供する［Ｈｅｎｚｅｌ，Ｗ．Ｊ．Ｂｉｌｌｅｃｉ  Ｔ．Ｍ．，Ｓｔｕｌｔｓ  Ｊ．Ｔ．，Ｗｏｎｇ  Ｓ．Ｃ．，Ｇｒｉｍｌｅｙ  Ｃ．及びＷａｔａｎａｂｅ  Ｃ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９３，９０，５０１１−５０１５］。より総合的な方法、特に、複雑なタンパク質混合物中に存在する個々の成分の同定及び定量のためのより総合的な方法は、タンパク分解ペプチドの各々をタンデム質量分析にかけることである。続く各ペプチドの同定は、部分誘導体化アミノ酸「配列タグ」のデータベース検索［Ｍａｎｎ，Ｍ．及びＷｉｌｍ，Ｍ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４，６６，４３９０−４３９９］を介した未解釈プロダクトイオンスペクトルのデータベース分析［Ｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．及びＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９４，５，９７６−９８９］、又は「ｄｅ−ｎｏｖｏ」配列分析［Ｈｕｎｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ  Ｊ．，Ｗｉｎｓｔｏｎ  Ｓ．及びＨａｕｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８６，８３，６２３３−６２３７］のいずれかによって実施しうる。
【０００４】
しかし、この一般的分析方法は幾つかの制約により複雑である。
【０００５】
第１に、２Ｄ−ゲルは約１５００〜２０００のタンパク質を分離できるにすぎず、細胞では通常８０００を超えるタンパク質が発現して存在する。したがって、最も多く存在するタンパク質のみが観察され、２−ＤＥ分離ゲルスポットの主要部分は、共電気泳動（ｃｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）及び／又は異なる修飾（もしくはプロセシング）を受けた形態の同一タンパク質による１以上のタンパク質を含む。さらに、幾つかの分類のタンパク質は、特に、疎水性タンパク質、存在量の少ないタンパク質、及び極端なｐＩや分子量を有するタンパク質は、２Ｄ−ゲルに基づく分離においてはあまりあらわれない［Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｃｏｒｔｈａｌｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｒｏｃｈｏｎ，Ｙ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００，９７，９３９０−９３９５］。また、２−ＤＥは大きな労力を要し、速度も遅く、技術を要し、再現性が低いことも多いことから、ハイスループット又はオートメーションには容易に適応し得ない。
【０００６】
第２に、ＭＳ／ＭＳによるタンパク質消化物からの唯一のペプチドの同定は、該ペプチドが単一のタンパク質に独自のものであることという条件のもとでそのタンパク質の明確な同定のために必要とされる一方、実際、同じペプチドイオン（例えば、複雑なペプチド混合物のクロマトグラフィー的分離の間における連続的スキャンにおいて）、又は同じタンパク質の異なるペプチドのいずれかを分析する時に、複雑なペプチド混合物の分析の間に非常に長い時間が費やされる。そこで通常は、サンプルとするには高い相対量で存在するペプチドが好ましく、複雑な混合物中に存在するタンパク質の同定に関する情報は、量の少ないぺプチドに関しては一般に得られない。また、ペプチドＭＳに基づいてぺプチド配列解析の過程で得られるＭＳ／ＭＳスペクトルの１／４までが解析不能である（すなわちプロダクトイオンスペクトルがあまりに複雑であり、あまりに量が少なく、又はこれらの解釈を可能にするのに十分なイオンを欠いている）［Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｌ．Ｍ．，Ｅｄｄｅｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．及びＲｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２０００，２１，１７０７−１７３２］。
【０００７】
これらの制約を部分的に克服するためにＭＳ／ＭＳデータ取得時にｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎを使用することにより、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ実験工程を通じてより多くの数の個々のペプチドイオンが選択される［Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｔ．；Ｓｐａｈｒ，Ｃ．Ｓ．；ＭｃＧｉｎｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．；Ｂｕｒｅｓ，Ｅ．Ｊ．；Ｂｅｉｅｒｌｅ，Ｊ．；Ｍｏｒｔ，Ｊ．；Ｙｕ，Ｗ．；Ｌｕｅｔｈｙ，Ｒ．；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００１，１，１０８−１１７］。多次元クロマトグラフィー法［Ｗａｓｈｂｕｒｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｗｏｌｔｅｒｓ，Ｄ．及びＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１９，２４２−２４７］、又はアフィニティー選択により特定のアミノ酸を含有するペプチドのみを溶液中で選択的に濃縮する方法［Ｓｐａｈｒ，Ｃ．Ｓ．Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂｕｒｅｓ，Ｅ．Ｊ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｔ．，ＭｃＧｉｎｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．及びＳｃｏｔｔ  Ｄ．Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２０００，２１，１６３５−１６５０］、又は示差クロマトグラフィー［Ｇｅｖａｅｒｔ，Ｋ．，Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅ，Ｊ．，Ｇｏｅｔｈａｌｓ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｒ．，Ｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂ．，Ｄｅｍｏｌ，Ｈ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｌ．，Ｐｕｙｐｅ，Ｍ．，Ｓｔａｅｓ，Ａ．及びＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００２，１，８９６−９０３］のいずれかによる、質量分光分析の前にペプチド混合物を単純化する幾つかの方法も記載されている。ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎと上記概説した多次元クロマトグラフィー法を組合せることにより、これらの方法は、質量分光分析によって同定しうるタンパク質の数をさらに増加させうる。しかし、これらの複雑な混合物中で存在量が低い（個々のタンパク質の発現が細胞あたり１０〜１０６コピーの範囲でありうる）タンパク質の同定は、翻訳後修飾の構造及び位置等の重要な情報を潜在的に含みうることから、依然として重要な試みであり続ける。
【０００８】
プロテオミクス研究の基本的態様は、例えば、正常及び疾病細胞又は組織間で見られるような、生物系の２つの異なる状態間でのタンパク質発現レベルを判定（すなわち、タンパク質レベルの相対的定量）することである。ｍＲＮＡ発現レベル（トランスクリプトミクス）と対応するタンパク質（プロテオミクス）との間には著しい不一致が存在することから、アレイに基づく遺伝子発現モニタリング法又はｍＲＮＡ存在量を測定するためのその他の遺伝子発現法単独では、細胞のタンパク質相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を分析するためには不十分であることは明らかである［Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｏｃｈｏｎ，Ｙ．，Ｆｒａｎｚａ，Ｂ．Ｒ．及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９，１９，１７２０−１７３０］。
【０００９】
細胞周期調節、病状又は薬物曝露などの影響としてのタンパク質発現プロファイル変化の定性的及び定量的分析は、従来、直交型等電点分子量分離モードにより得られる高い次元性から、個々の染色タンパク質スポットのイメージ解析を介する２次元電気泳動によって行われてきた［Ｐａｔｔｏｎ  ＆  Ｂｅｅｃｈｅｍ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００２，６，６３−６９．；Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｌｉ，Ｈ．，ＤｅＣａｍｐ，Ｄ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｓｈｕ，Ｈ．，Ｇｏｎｇ，Ｙ．，Ｆｌａｉｇ，Ｍ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｈｕ，Ｎ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｒ．，Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．，Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ，Ｅ．Ｆ．及びＺｈａｏ，Ｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００２，１，１１７−１２３］。しかし、これら２ＤＥゲルに基づく定量法は、２ＤＥゲルに基づくタンパク質同定について上述したのと同じ制約を受け、それにより、定量分析対象は、ゲル上に比較的存在量が多く純度の高いスポットが存在するタンパク質、又は使用する染色法により適切に可視化しうるタンパク質に対するものに限られる［Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｃｏｒｔｈａｌｓ，Ｇ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｒｏｃｈｏｎ，Ｙ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００，９７，９３９０−９３９５］。これらの欠点のうちの幾つかは、ＳＹＰＲＯルビー蛍光タンパク質染色法［Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｋ．，Ｃｈｅｒｎｏｋａｌｓｋａｙａ，Ｅ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ｈ．，Ｋｅｍｐｅｒ，Ｃ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｆ．，Ｄｉｗｕ，Ｚ．，Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．及びＰａｔｔｏｎ，Ｗ．Ｆ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０００，２１，２５０９−２５２１］及び２−Ｄ示差ゲル電気泳動（ＤＩＧＥ）［Ｕｎｌｕ，Ｍ．，Ｍｏｒｇａｍｎ，Ｍ．Ｅ．及びＭｉｎｄｅｎ，Ｊ．Ｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９７，１８，２０７１−２０７７］等のより感度の高い検出法を使用することにより克服されてきた。しかし、これらの方法は基本的にスポット検出、ゲルマッチング、及びスポット定量のための適切なソフトウェアパッケージの使用に依存するものであり［Ｒａｍａｎ，Ｂ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ａ．及びＭａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２００２，２３，２１９４−２２０２］、重なり合うタンパク質スポットが存在する状況は説明し得ない。
【００１０】
２つの異なる細胞／組織状態間における示差タンパク質発現レベルを、同位体標識を利用して、ＭＳに基づいて定量するための２つの一般的方法が開発されている。
【００１１】
第１に、Ｓｍｉｔｈのグループ［Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｋ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．；Ｌｉｐｔｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｐｅｄｅｎ，Ｋ．Ｋ．；Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ，Ｓ；Ｔｏｌｉｃ，Ｎ；Ｂｒｕｃｅ，Ｊ．Ｅ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，７９４９−７９５０．；Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎｏｖｉｃ，Ｓ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，１１，７８−８２．；Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．ら  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，２１３２−２１３９；Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．；Ｌｉｐｔｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ．；Ｓｈｅｎ，Ｙ．；Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．；Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．；Ｕｄｓｅｔｈ，Ｈ．Ｒ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００２，２，５１３−５２３］、Ｃｈａｉｔのグループ［Ｏｄａ，Ｙ．；Ｈｕａｎｇ，Ｋ．；Ｃｒｏｓｓ，Ｆ．Ｒ．；Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｄ．；Ｃｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９９，９６，６５９１−６５９６］、及びその他［Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．，Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｅ．Ｍ．．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７２，１１３４−１１４３；Ｏｎｇ，Ｓｈａｏ−Ｅｎ．，Ｂｌａｇｏｅｖ，Ｂ．，Ｋｒａｔｃｈｍａｒｏｖａ，Ｉ．，Ｂａｃｈ−Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｄ．，Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．，Ｐａｎｄｅｙ，Ａ．及びＭａｎｎ，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００２，１，３７６−３８６；Ｊｉａｎｇ，Ｈ．及びＥｎｇｌｉｓｈ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｒｅｓ．２００２，１，３４５−３５０；Ｚｈｕ，Ｈ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｐａｎ，Ｓ．，Ｙａｕ，Ｐ．Ｍ．，Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｅ．Ｍ．及びＣｈｅｎ，Ｘ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２．７４，１６８７−１６９４］による方法であり、これらはすべて、同位体を枯渇させた（例えば１３Ｃ−、１５Ｎ−、及び２Ｈ−を枯渇させた）又は富化させたアミノ酸（１５Ｎ−を用いた均一的標識によるか、もしくは、重同位体（例：１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ）を含有する選択されたアミノ酸の取り込みのいずれかによる）の細胞タンパク質集団中への代謝的取り込みを伴う結果についてそれぞれ表している。細胞基質からタンパク質を単離した後、サンプルを天然の同位体を取り込ませたサンプルと混合し、次に、個々のタンパク質を電気泳動法又はクロマトグラフィー法によって分離し、消化し、ＭＳによってペプチドの質量を測定する。部位特異的標識は、未標識形態のものと比較することにより、アミノ酸質量「タグ」を豊富に含むペプチドの効率的同定を可能にする。さらに、同位体富化サンプルからのペプチドの相対量と、天然の存在量の同位体を用いて調製したサンプルからの相対量を比較することにより、２サンプル間のタンパク質発現レベルの変化を定量しうる。しかし、このインビボ標識法は、同位体標識の取り込みに適した条件下で細胞を培養しうる系に限定される。
【００１２】
第２の方法は、細胞基質からタンパク質を単離した後、同位体富化標識を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化学的誘導体化を伴う。今日までに大きな注目を浴びている１つの方法が、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄとその同僚らにより開発された同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）法である［Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．；Ｒｉｓｔ，Ｂ；Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓ．Ａ．；Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｆ；Ｇｅｌｂ，Ｍ．Ｈ．；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，９９４−９９９．；Ｓｍｏｌｋａ，Ｍ；Ｚｈｏｕ，Ｈ；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００２，１，１９−２９．；Ｓｈｉｉｏ，Ｙ；Ｄｏｎｏｈｏｅ，Ｓ；Ｙｉ，Ｅ．Ｃ．；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｄ．Ｒ．；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ；Ｅｉｓｅｎｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ＥＭＢＯ  ２００２，２１，５０８８−５０９６．；Ｈａｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｅｎｇ，Ｊ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１９，９４６−９５１．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｈａｎ，Ｄ．Ｋ．Ｍ．，Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｈ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．及びＰａｒｋｅｒ，Ｋ．Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１２，１２３８−１２４６．；Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｉｓｔ，Ｂ．及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１１，３９６−４０１］。２つの異なる細胞／組織状態から取得したタンパク質を還元し、天然存在量（軽）又は同位体富化（重）ＩＣＡＴ試薬のいずれかを用いてそれぞれＳ−アルキル化する。この各々はストレプトアビジンアフィニティー精製によるシステイン含有ペプチドの、続くアフィニティー選択のためのビオチン部分を含み、ＭＳ分析前の混合物の単純化をもたらす。代謝標識サンプルについて上記したのと同様に、これらの方法それぞれに対して、軽同位体「正常」サンプル由来のものと重同位体「疾病状態」サンプルを含むタンパク質分解誘導体化ペプチドとを（又は構造的標識を含むもの同士で）比較した存在比率は、２つのサンプル間におけるタンパク質発現レベルの変化の指標となり、それによりそれらの示差定量が可能となる。
【００１３】
選択的ペプチド同定及び示差定量のための多数の同様な方法がこれまでに記載されている［Ｓｐａｈｒ，Ｃ．Ｓ．Ｓｕｓｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｂｕｒｅｓ，Ｅ．Ｊ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｔ．，ＭｃＧｉｎｌｅｙ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．及びＰａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｄ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２０００，２１，１６３５−１６５０．；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．及びＧｅｂｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．；Ｗｕ，Ｊ．Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９９，１３，１８１３−１８１７．；Ｓｅｃｈｉ，Ｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，７０，５７５０−５１５８．；Ｓｅｃｈｉ，Ｓａｌｖａｔｏｒｅ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１６，１４１６−１４２４．；Ｇｅｈａｎｎｅ，Ｓ．，Ｃｅｃｃｏｎｉ，Ｄ．，Ｃａｒｂｏｎｉ，Ｌ．，Ｇｉｏｒｇｉｏ  Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．，Ｄｏｍｅｎｉｃｉ，Ｅ．及びＨａｎｄａｍ，Ｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１６，１６９２−１６９８．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ  ２００１，９２４（１−２），３４５−３５７．；Ａｍｉｎｉ，Ａ；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆｒｅｄ  Ｅ．．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ．２００２，７７２，３５−４４．；Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．及びＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．２００２，９４９，１５３−１６２．；Ｍｉｒｇｏｒｏｄｓｋａｙａ，Ｏ．Ａ．Ｋｏｚｍｉｎ，Ｙ．Ｐ．，Ｔｉｔｏｖ，Ｍ．Ｉ．，Ｋｏｒｎｅｒ，Ｒ．，Ｓｏｎｋｓｅｎ，Ｃ．Ｐ．及びＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｔｒｏｍ．２０００，１４，１２２６−１２３２．；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｉ．Ｉ．；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｔ；Ｆｉｇｅｙｓ，Ｄ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１５，２４５６−２４６５．；Ｙａｏ，Ｘ．；Ｆｒｅａｓ，Ａ；Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｊ．；Ｄｅｍｉｒｅｖ，Ｐ．Ａ．；Ｆｅｎｓｅｌａｕ，Ｃ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，２８３６−２８４２．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ｅ．Ｃ．，Ｈｏｒｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｔｕｌｌｙ，Ｄ．Ｃ．及びＢｒｏｃｋ，Ａ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１５，２３８７−２３９２．；Ｍｕｅｎｃｈｂａｃｈ，Ｍ．，Ｑｕａｄｒｏｎｉ，Ｍ．，Ｍｉｏｔｔｏ，Ｇ．及びＪａｍｅｓ，Ｐ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，４０４７−４０５７；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ  ２００２，９４９，１７３−１８４．；Ｇｅｎｇ，Ｍ．；Ｊｉ，Ｊ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ  ２０００，８７０，２９５−３１３．；Ｊｉ，Ｊ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ．；Ｇｅｎｇ，Ｍ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ａｍｉｎｉ，Ａ．；Ｂｉｎａ，Ｍ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ  ２０００，７４５，１９７−２１０．；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ａ．，Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｎｅｗｉｔｔ，Ｒ．，Ｙｉ，Ｅ．Ｃ．，Ｐｕｒｖｉｎｅ，Ｓ．，Ｅｎｇ，Ｊ．，ｖｏｎ  Ｈａｌｌｅｒ，Ｐ．���Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．及びＫｏｌｋｅｒ，Ｅ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１５，１２１４−１２２１．；Ｌｉｕ，Ｐ；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００２，１，４４３−４５０］。より最近では、２つのグループが混合物単純化のための共有結合固相システイン捕捉法について記載している［Ｚｈｏｕ，Ｈ．；Ｒａｎｉｓｈ，Ｊ．Ａ．；Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｄ．；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，５１２−５１５．；Ｑｉｕ，Ｙ；Ｓｏｕｓａ，Ｅ．Ａ．；Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，４９６９−４９７９］。構造標識を使用する幾つかの非同位体標識方法［Ｃａｇｎｅｙ，Ｇ．，Ｅｍｉｌｉ，Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，１６３−１７０．；Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ，Ｒ．Ｌ．，及びＲｅｉｌｌｙ，Ｊ．Ｐ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｒｅｓ．２００３，２，１５−２１］、並びに、対象のサンプルと対照との間でのクロマトグラフィーにより分離したＭＳイオン存在量を比較することによる示差定量を行うための方法も記載されている［Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｐ．Ｖ．，Ｃｈｅｌｉｕｓ，Ｄ．及びＳｈａｌｅｒ，Ｔ．Ａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，４７４１−４７４９．；Ｃｈｅｌｉｕｓ，Ｄ．Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ．Ｐ．Ｖ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００２，１，３１７−３２３］。多数の概説がこれら幾つかの方法の相対的利点及び制約について比較している［Ｍｏｓｅｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１９，Ｓ１０−Ｓ１６．；Ｐａｔｔｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｈｕｌｅｎｂｅｒｇ，Ｂ．及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔ．Ｈ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，１３，３２１−３２８．；Ｔｕｒｅｃｅｋ，Ｆ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，３７，１−１４．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．；Ｒｉｇｇｓ，Ｌ．；Ｚｈａｎｇ，Ｒ．；Ｘｉｏｎｇ，Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｐ．；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ，Ａ．；Ｓｅｅｌｅｙ，Ｅ．；Ｓｉｏｍａ，Ｃ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，３７，１３３−１４５］。
【００１４】
タンパク質の２つの主要な翻訳後修飾（ＰＴＭ′ｓ）はリン酸化とグリコシル化である。これらのうちで、タンパク質の可逆的リン酸化反応は、細胞の中で起こる最も重要なＰＴＭと位置づけられる。通常、リン酸化タンパク質／リン酸化ペプチドを富化するために、それらの検出及び続く詳細な特性決定に先立ち、２つの方法が用いられる。（ｉ）免疫沈降法；［Ｇｒｏｎｂｏｒｇ，Ｍ．，Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｚ．，Ｓｔｅｎｓｂａｌｌｅ，Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｏｈａｒａ，Ｏ．，Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｎ．及びＰａｎｄｅｙ，Ａ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００２，１，５１７−５２７］及び（ii）固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）；［Ｐｏｓｅｗｉｔｚ，Ｍ．Ｃ．及びＴｅｍｐｓｔ，Ｐ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９，７１，２８８３−２８９２，Ｆｉｃａｒｒｏ，Ｓｃｏｔｔ  Ｂ．；ＭｃＣｌｅｌａｎｄ，Ｍａｒｋ  Ｌ．；Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｔｏｄｄ；Ｂｕｒｋｅ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｊ．；Ｒｏｓｓ，Ｍａｒｋ  Ｍ．；Ｓｈａｂａｎｏｗｉｔｚ，Ｊｅｆｆｒｅｙ；Ｈｕｎｔ，Ｄｏｎａｌｄ  Ｆ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｆｏｒｅｓｔ  Ｍ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，３０１−３０５］が存在する。
【００１５】
２Ｄゲル又は１Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されるタンパク質は、インビボもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて３２Ｐ標識を利用するオートラジオグラフィー又は保存ホスホイメージングによって［Ｊｉ  Ｈ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ＧＳ，Ｂｕｒｇｅｓｓ  ＡＷ，Ｍｏｒｉｔｚ  ＲＬ，Ｗａｒｄ  ＬＤ及びＳｉｍｐｓｏｎ  ＲＪ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９３，２６８，１３３９６−１３４０５．；Ｂｏｙｌｅ  Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｅｒ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐ．及びＨｕｎｔｅｒ  Ｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９１，２０１，１１０−１４９．；Ｙａｎ  Ｊ．Ｘ．，Ｐａｃｋｅｒ  Ｎ．Ｈ．，Ｇｏｏｌｅｙ  Ａ．Ａ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．Ｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９８，８０８，２３−４１］、又はリン酸化されているタンパク質を検出するための抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出する段階、ができる。歴史的には、３２Ｐ標識されたペプチドの配列解析はエドマン分解によって実施される［Ｗｅｔｔｅｎｈａｌｌ，Ｒ．Ｅ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｈ．，及びＨｏｏｄ，Ｌ．Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９１，２０１，１８６−９９］。しかし、この方法は、通常、リン酸化部位の指標となる放射活性の喪失とペプチドのアミノ酸配列とを相関させるために、該タンパク質配列に関する事前の知識が必要であり、また、所定の部位におけるリン酸化が化学量論的に低い場合［Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．，Ｋｗｉｅｃｉｓｚｅｗｓｋｉ，Ｂ．，Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｃ．Ｍ．，Ｎｅｄｄｅｒｍａｎ，Ｐ．，Ｔａｎ，Ｓ−Ｌ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０００，２７８，５０１−５１３］、又は同一のタンパク質に複数の異なるリン酸化形態が存在する場合［Ｓｔｏｒｍ，Ｓ．Ｍ．，及びＫｈａｗａｊａ，Ｘ．Ｚ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．１９９９，７１，５０−６０］、それらにより妨害され得る。
【００１６】
より最近では、タンパク質リン酸化の分析のために質量分析が特に有用であることが示されている［Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｇ．及びＭａｎｎ，Ｍ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  １９９９，７１，２３５−２４２］。しかし、リン酸化ペプチドの質量分光分析は、陽イオンＭＳ分析モードにおけるイオン化効率の低さ［Ｌｉａｏ  Ｐ．Ｃ．，Ｌｅｙｋａｍ  Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｐ．Ｃ．，Ｃａｇｅ  Ｄ．Ａ．及びＡｌｌｉｓｏｎ  Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，２１９，９−２０］と、１回の実験工程の間に同定（ネガティブモード）及び特性決定（ポジティブモード）の両方を可能にするためイオン化極性を迅速に変換する際に直面する困難さ［Ｊａｎｅｋ  Ｋ．，Ｗｅｎｓｃｈｕｈ  Ｈ．，Ｂｉｅｎｅｒｔ  Ｍ．，及びＫｒａｕｓｅ  Ｅ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１５，１５９３−１５９９．；Ｍａ  Ｙ．，Ｌｕ  Ｙ．，Ｍｏ  Ｗ．，及びＮｅｕｂｅｒｔ  Ｔ．Ａ．．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１５，１６９３−１７００］から、未修飾ペプチドに対する分析と比較してより複雑である。また、ホスホセリン−及びホスホスレオニン−含有ペプチドは、ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩイオン化の際、並びに、低エネルギーＣＩＤの際に、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）の脱離が起こりやすい。
【００１７】
陽イオンモードにおけるリン酸化ペプチドのイオン化抑制に伴う困難性を回避するために幾つかの方法が存在する。イオン化を抑制する過剰量の未修飾ペプチドを減少させるために、サンプルを、上記のように、リン酸化ペプチドについて富化することができる。しかし、リン酸化ペプチドの分析におけるシグナルの低下を克服するためになされる試みにもかかわらず、タンデム質量分析によるリン酸化部位の同定を試みる際に、リン酸側鎖の不安定性から依然として制約が存在する。単純な解決法は、リン酸化ペプチドの分析を、アルカリホスファターゼを用いて処理したサンプルと用いなかったサンプルの並行分析により、リン酸化ペプチドの分析を行うことである［Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｌ．，Ｆｅｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．及びＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００１，１，２２３−２３８］。また、リン酸化ペプチドの同定は、ｍ／ｚ  ７９（ＰＯ３−）及びｍ／ｚ  ８９（Ｈ２ＰＯ４−）において特徴的なリン酸特異的プロダクトイオンをモニタリングする、プリカーサーイオンスキャンモード、続く陰イオンモードにおけるリン酸化ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）によるか、又は陽イオン中性脱離スキャンモードにおけるＨ３ＰＯ４（９８Ｄａ）又はＨＰＯ３（８０Ｄａ）の脱離をモニタリングすることによっても行うことができる［Ｃａｒｒ  Ｓ．Ａ．，Ｈｕｄｄｌｅｓｔｏｎ  Ｍ．Ｊ．及びＡｎｎａｎ  Ｒ．Ｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６，２３９，１８０−１９２．；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ  Ａ．，Ｐｉｐｋｏｒｎ  Ｒ．，Ｂｏｓｓｅｍｅｙｅｒ  Ｄ．及びＬｅｈｍａｎｎ  Ｗ．Ｄ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，１７０−１７６］。
【００１８】
無傷のリン酸化ペプチドについてのプロダクトイオンスキャンモードＭＳ／ＭＳは、ペプチド骨格の切断により形成されるｂ−及びｙ−型フラグメントが、リン酸化されているアミノ酸残基の特異的位置に関する情報を含み得るので、ペプチド内のリン酸の正確な位置を特性決定するために用いることができる場合がある。しかし、上記した通り、この方法は、長時間の気相における脱リン酸、並びにホスホセリン及びホスホスレオニンからのリン酸（Ｈ３ＰＯ４、９８Ｄａ）の除去により妨害されることが多く、これにより、修飾位置の正確な把握が困難となる。しかし、リン酸化チロシン側鎖は、アリールリン酸修飾による相対的に高い安定性を有することから、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ条件下において比較的安定であり、したがって、リン酸化チロシン残基の位置は、２４３Ｄａの２連続フラグメントイオン間の質量の差により、容易に判定することができる。実際、２１６．０４３Ｄａにおいて特徴的なリン酸化チロシンの「レポーター」インモニウムイオンが、リン酸化チロシンを含有するペプチドの選択的同定のための陽イオンモードＭＳ／ＭＳのプリカーサーイオン実験において使用されている［Ｓｔｅｅｎ  Ｈ．，Ｋｕｓｔｅｒ  Ｂ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｍ．，Ｐａｎｄｅｙ  Ａ．，及びＭａｎｎ  Ｍ．２００１．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１４４０−１４４８］。
【００１９】
ＭＳ／ＭＳ中のホスホセリン及びホスホスレオニン側鎖の不安定性を克服するための一般的方法は、リン酸基と、より安定な、酸性度の低い側鎖官能基を置換することである。このことは、デヒドロアラニン又はデヒドロアミノ酪酸基がそれぞれ得られるような強アルカリ条件下における、ホスホセリン及びホスホスレオニン残基のβ−除去により達成し得る。それに続く求核試薬のＭｉｃｈａｅｌ付加によって、質量分光分析の前に予めリン酸化されているセリン又はスレオニン残基を誘導体化するための単純な方法が可能となる［Ｗｅｃｋｗｅｒｔｈ，Ｗ．，Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ，Ｌ．及びＦｉｅｈｎ，Ｏ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，１４，１６７７−１６８１．；Ｍｏｌｌｏｙ，Ｍ．Ｐ．及びＡｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｃ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，５３８７−５３９４．；Ｌｉ，Ｗ．，Ｂｏｙｋｉｎｓ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｃｋｌｕｎｄ，Ｐ．Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．及びＣｈｅｎ，Ｈ−Ｃ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２  ７４，５７０１−５７１０．；Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．及びＭａｎｎ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１３，９９６−１００３］。この方法はまた、アフィニティー「タグ」の取り込みに使用することができ、これにより誘導体化ペプチドをそれらの分析前に富化させることを可能にし［Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｇｅｂｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．及びＷｕ，Ｊ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１５，１４８１−１４８８．；Ｏｄａ，Ｙ．，Ｎａｇａｓｕ，Ｔ．及びＣｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１，１９，３７９−３８２］、さらに、同位体標識と組合せた時に、２つの異なるサンプルのセットの間に観察されるリン酸化反応の度合を定量するために使用することができる［Ｇｏｓｈｅ  Ｍ．Ｂ．，Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．，Ｐａｎｉｓｋｏ，Ｅ．Ａ．，Ａｎｇｅｌｌ，Ｎ．Ｈ．，Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００１，７３，２５７８−２５８６．；Ｇｏｓｈｅ，Ｍ．Ｂ．，Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．，Ｐａｎｉｓｋｏ，Ｅ．Ａ．，Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．，Ａｎｇｅｌｌ，Ｎ．Ｈ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，２００２，７４，６０７−６１６．；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ；Ｇｅｂｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．及びＷｕ，Ｊ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１６，９９９−１００１］。
【００２０】
β−除去はＯ−ホスホ結合及びＯ−グリコシド結合の双方に対し同程度の影響を与えることに留意されたい。したがって、β−除去法は、セリン及びスレオニン残基のＯ−結合翻訳後修飾を識別し得ない。
【００２１】
ホスホプロテオーム解析のための他の化学的方法（ホスホチロシン含有ペプチド並びにホスホセリン残基及びホスホスレオニン残基を含有するペプチドに対しても適用可能）については最近の記載がある［Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｄ．及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１，１９，３７５−３７８］。定量的ホスホプロテオーム解析の最近の概説については以下を参照されたい［Ｍａｎｎ，Ｍ．，Ｏｎｇ，Ｓ−Ｅ．，Ｇｒｏｎｂｏｒｇ，Ｍ．，Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｎ．及びＰａｎｄｅｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，２６１−２６８］。
【００２２】
タンパク質−タンパク質相互作用の測定は、細胞シグナル伝達及びタンパク質トラフィッキングに関わる複雑な経路を理解することを目的とする集積的生物学研究における重要な態様である。すでに、酵母中の公知のタンパク質−タンパク質相互作用の大部分［Ｂａｄｅｒ，Ｇ．Ｄ．及びＨｏｇｕｅ，Ｃ．Ｗ．Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，９９１−９９７］は、ゲノムスケールの酵母ツーハイブリッドアッセイによって同定されており［Ｕｅｔｚ，Ｐ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０３，６２３−６２７．；Ｉｔｏ，Ｔ．，Ｃｈｉｂａ，Ｔ．，Ｏｚａｗａ，Ｒ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．及びＳａｋａｋｉ，Ｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００１，９８，４５６９−４５７４．；Ｌｅｇｒａｉｎ，Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，１２８−１２９］、また、（ｉ）アフィニティータグを付けた組換えタンパク質を用いた共沈殿［Ｇａｖｉｎ，Ａ−Ｃ．ら  Ｎａｔｕｒｅ  ２００２，４１５，１４１−１４７．；Ｈｏ，Ｙ．ら  Ｎａｔｕｒｅ．２００２，４１５，１８０−１８３］、（ii）構成要素タンパク質中のひとつに対する抗体を用いた「プルダウン」技法、（iii）タンパク質−アフニティー−相互作用（例えば、組換えグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質及びグルタチオン−アフィニティークロトグラフィーの使用）、又は（iv）無傷の複数タンパク質複合体の単離（例えば、核膜孔複合体、リボソーム複合体、及びスプライセオソーム）等の直接的アフィニティー捕捉法により同定されている。これらの後者の方法は、タンパク質同定のための質量分析と組合せて、細胞マッピングプロテオミクスのための主要な方法を構成し、この細胞マッピングプロテオミクスは、所定の細胞内におけるすべてのタンパク質−タンパク質相互作用（空間的及び時間的相互作用）を説明することを目的とする［Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ，Ｗ．Ｐ．及びＷｅｉｒ，Ｍ．Ｐ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９，１７，１２１−１２７］。しかし、これらの物理学的方法によって検出される相互作用は、生物学的意義を有しない多数の非特異的相互作用を含み得る［Ｂａｄｅｒ，Ｇ．Ｄ．及びＨｏｇｕｅ，Ｃ．Ｗ．Ｖ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，９９１−９９７］。
【００２３】
架橋形成を組合せた質量分析［Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒ，Ｊ．，Ｓｉｎｉｏｓｓｏｇｌｏｕ，Ｓ．，Ｈｕｒｔ，Ｅ．Ｃ．，及びＭａｎｎ，Ｍ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，２６７−２７５］、又は水素／重水素交換を組合せた質量分析［Ｙａｍａｄａ，Ｎ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｅ．，及びＨｉｒａｙａｍａ，Ｋ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１６，２９３−２９９］は、タンパク質及びタンパク質複合体の三次元構造についての迅速な低解像評価に使用することができる。架橋形成には、通常、単離されたタンパク質複合体の化学的架橋形成［Ｕｙ，Ｒ．及びＷｏｌｄ，Ｆ．，１９７７，Ｉｎ：”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ”（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｍ．編），Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．；Ｆａｎｃｙ，Ｄ．Ａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０００，４，２８−３３］又は光化学的架橋形成［Ｃｈｏｗｄｈｒｙ，Ｖ．及びＷｅｓｔｈｅｉｍｅｒ，Ｆ．Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７９，４８，２９３−３２５．；Ｆａｎｃｙ，Ｄ．Ａ．及びＫｏｄａｄｅｋ，Ｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９，９６，６０２０−６０２４］、次いで、結果として、隣接する領域の調べるタンパク質同士が近くに位置するための得られたペプチド混合物のタンパク質分解消化並びにＭＳ及び／又はＭＳ／ＭＳ分析が含まれる。しかし、架橋タンパク質の消化に次いで生じるペプチド種の数の多さが、架橋ペプチドの迅速かつ明確な同定を行うことを困難にしていることが多い。多くの異なるグループが、この制約を部分的に克服するための方法を開発してきた。該方法は、チオールを切断し得る架橋剤による予めの還元［Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｕｓｓｍａｎｎ，Ｍ．，Ｂｊｏｒｋ，Ｐ．，Ｇｏｄｚｗｏｎ，Ｍ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｐ．及びＲｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．Ｐｒｏｒｅｉｎ  Ｓｃｉ．２０００，９，１５０３−１５１８］、同位体標識手法の利用［Ｃｈｅｎ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｈ．，及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖ．Ｅ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９９，２７３，１９２−２０３．；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｐａｎｅｌｌ，Ｌ．Ｋ．及びＦａｌｅｓ，Ｈ．Ｍ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１６，１４９−１５９．；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｐ．，Ｔｏｗｂｉｎ，Ｈ．，Ｗｉｒｔｈ，Ｕ．，Ｖｏｓｈｏｌ，Ｈ．，Ｈｏｖｉｎｇ，Ｓ．，及びＳｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｍ．Ｏ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，１９２７−１９３４．；Ｂａｃｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｎｏｔｅｎｂｏｏｍ，Ｖ．，ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ，Ｌ．Ｊ．，Ｍｕｉｊｓｅｒｓ，Ａ．Ｏ．，Ｓｉｘｍａ，Ｔ．Ｋ．，ｄｅ  Ｋｏｓｔｅｒ，Ｃ．Ｇ．，及びｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，４４１７−４４２２．；Ｔａｖｅｒｎｅｒ，Ｔ．，Ｈａｌｌ，Ｎ．Ｅ．，Ｏ‘Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．及びＳｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，４６４８７−４６４９２］、又は架橋剤自体への不安定なＭＳ／ＭＳ「タグ」の取り込み［Ｂａｃｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｒｔｏｇ，Ａ���Ｆ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｍｕｉｊｓｅｒｓ，Ａ．Ｏ．，ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ，Ｌ．Ｊ．及びｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１２，２２２−２２７］、等による。
【００２４】
示差同位体「サイン」の取り込みに基づく選択的同定及び示差定量のための上記方法の全てがペプチド同定のための一般的な方法に依存していることを認識することは重要である。すなわち、対象であるペプチドイオンの同位体サインは、その無傷のプリカーサーイオンの質量分析により検出される。したがって、この方法の限界は以下の時に生じる。（ｉ）対象のイオンの存在量が少ない時（すなわち、そのスペクトルにおいて存在する化学的ノイズのレベルに近い、もしくはそれ以下である時）［Ｋｒｕｔｃｈｉｎｓｋｙ，Ａ．Ｎ．及びＣｈａｉｔ，Ｂ．Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１３，１２９−１３４］、（ii）異なる標識をした存在量の少ないペプチドの質量が、混合物中の、存在量のより多い他のペプチドの質量と重なり合う時、（iii）異なる標識をした「重」及び「軽」ペプチドの分離がペプチド混合物のクロマトグラフィー画分において生じる時［Ｚｈａｎｇ，Ｒ．；Ｓｉｏｍａ，Ｃ．Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，５１４２−５１４９，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｓｉｏｍａ，Ｃ．Ｓ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．；Ｘｉｏｎｇ，Ｌ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，４，３６６２−３６６９．；Ｚｈａｎｇ，Ｒ．及びＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００２，１，１３９−１４７］、又は（iv）質量分析装置が、２種類に標識した成分を適当に分離するのに充分な解像度を有しておらず、それにより、それらの検出ができない時。
【００２５】
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）解離法［ＭｃＬｕｃｋｅｙ，Ｓ．Ａ．及びＧｏｅｒｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９７，３２，４６１−４７４］（それによって、対象となるプリカーサーイオンの質量が選択され、衝突誘起解離（ＣＩＤ）を介するフラグメント化に供し、次に、得られたプロダクトイオンの質量を、ペプチドのアミノ酸配列に関する構造的情報を導き出すために、又は翻訳後修飾の存在及び位置を示すために分析される）を使用することにより、上記した限界の少なくとも幾つかを対処することができる。選択したプリカーサーイオンに対するものと異なるｍ／Ｚ値におけるプロダクトイオンの形成に伴う化学的ノイズの減少によって、さもなければマススペクトル中で明らかでない存在量の少ないイオンがＭＳ／ＭＳ法により首尾よく検出及び分析され得る。実際、プリカーサーイオンＭＳ／ＭＳスキャンモード［Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｃ．；Ｗａｄｅ，Ａ．Ｐ．；Ｅｎｋｅ，Ｃ．Ｇ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，６２，１８０９−１８１８．；Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ  Ａ．，Ｐｉｐｋｏｒｎ  Ｒ．，Ｂｏｓｓｅｍｅｙｅｒ  Ｄ．，及びＬｅｈｍａｎｎ  Ｗ．Ｄ．２００１．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：１７０−１７６．；ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｅ．；Ｑｕａｒｍｂｙ，Ｓ．Ｔ．；Ｙｏｓｔ，Ｒ．Ａ．；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，５７９９−５８０６］におけるタンデム質量分析の操作、又は中性脱離（ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｏｓｓ）ＭＳ／ＭＳスキャンモード［Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｃ．；Ｗａｄｅ，Ａ．Ｐ．；Ｅｎｋｅ，Ｃ．Ｇ．；Ｃｏｏｋｓ，Ｒ．Ｇ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０，６２，１８０９−１８１８．；Ｗｉｌｍ  Ｍ；Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｇ；Ｍａｎｎ  Ｍ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６８，５２７−３３．；ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｅ．；Ｑｕａｒｍｂｙ，Ｓ．Ｔ．；Ｙｏｓｔ，Ｒ．Ａ．；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，５７９９−５８０６］におけるタンデム質量分析の操作は、それにより診断用の低質量プロダクトイオン、又はプリカーサーイオンから質量を与えられることにより補正されるプロダクトイオンを検出するように質量分析装置がセットされるが、それぞれが、従来のＭＳに基づく検出方法の感度の高さを１〜２桁向上させることが示されている［Ｗｉｌｍ  Ｍ；Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｇ；Ｍａｎｎ  Ｍ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６８，５２７−５３３］。これらのプリカーサーイオン又は中性脱離スキャンモードを用いることにより、ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳの際に形成される診断用「サインイオン」の形成を介して、特定の構造的特徴を含むペプチドの存在を示すことができる。これによって、該スキャンモードは、ＭＳ系の方法と比較してより大きな特異性をもたらし、混合物中に存在する他のより存在量の多いペプチドと重なり合う存在量の少ないペプチドの問題を克服し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
しかし、ＭＳ／ＭＳに基づく方法の限界の一つは、対象のプロダクトイオン又は中性脱離を生じさせるフラグメント化が、通常、多くの解離チャンネルの一つに過ぎず、それによってスペクトルは「希釈」され、感度を限定し、続くスペクトルの解釈を複雑にし得ることである。さらに、示差タンパク質発現の定量のためのＭＳ／ＭＳ法については記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
本発明者らは特定の構造的特徴（例えば、選択されたアミノ酸の側鎖、もしくは翻訳後修飾や架橋剤を含むそれらの側鎖）を有する選択されたアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の固定電荷誘導体化を含んでなる、タンパク質の同定、示差定量、及び翻訳後修飾状態と架橋の分析のための新規な方法を開発した。その方法は、好ましい実施形態では、上記されたＭＳ及びＭＳ／ＭＳの全ての制約を解決することが可能であり、ＭＳに基づく既存の各種の方法に関する重要な複数の要求である、選択性及び感度の向上が期待される。
【００２８】
質量分析のための誘導体化の方法は一般的であり、これまでに概説されている［Ｋｎａｐｐ，Ｄ．Ｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９０，１９３、３１４−３２９．；Ａｎｄｅｒｅｇｇ，Ｒ．Ｊ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．１９８８，７，３９５−４２４．；Ｒｏｔｈ，Ｋ．Ｄ．Ｗ．，Ｈｕａｎｇ，Ｚ−Ｈ．，Ｓａｄａｇｏｐａｎ  Ｎ，及びＷａｔｓｏｎ  Ｊ．Ｔ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．１９９８，１７，２５５−２７４．；Ｓａｄａｇｏｐａｎ，Ｎ．及びＷａｔｓｏｎ  Ｊ．Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１２，３９９−４０９．；Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｂ．，Ｊｅｆｆｒｅｙ，Ｗ．Ａ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．，Ｐａｐｐｉｎ，Ｄ．Ｊ．Ｃ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９４，８，７３７−４２．；Ｓｐｅｎｇｌｅｒ，Ｂ．，Ｌｕｅｔｚｅｎｋｉｒｃｈｅｎ，Ｆ．，Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｓ．，Ｃｈａｕｒａｎｄ，Ｐ．，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｒ．，Ｊｅｆｆｅｒｙ，Ｗ．，Ｂａｒｔｌｅｔ−Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．及びＰａｐｐｉｎ，Ｄ．Ｊ．Ｃ．Ｉｎｔ．Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ  Ｐｒｏｃ．１９９７，１６９／１７０，１２７−１４０；Ｋｅｏｇｈ，Ｔ．，Ｌａｃｅｙ，Ｍ．Ｐ．，及びＹｏｕｎｇｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｓ．Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｍ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，１４，２３４８］。
【００２９】
ペプチドの固定電荷誘導体化はタンデム質量分析と連続的に使用され、配列解析への応用のために用いられるが、過去の研究は全て、配列イオンに由来する特定の一連の基本骨格開裂を生成するためのフラグメント化（すなわち配列開裂を最大にすること）に向けて集中してなされていた。そしてＮ−末端及びＣ−末端、並びにリジン及びアルギニン側鎖の誘導体化に限定されていた。
【００３０】
一方、本発明は固定電荷誘導体化の方法に基づき、単一の予測可能なフラグメント化経路に向けた解離を行わせるようにデザインされ、単一の生成物を生成し、その結果、プリカーサーイオンもしくは中性脱離をスキャンする方法によるＭＳ／ＭＳによって、複雑な混合物からそれを選択的に同定することを可能にし、次いでそれをさらなるＭＳ／ＭＳ、又は多段階ＭＳ／ＭＳ（ＭＳｎ）を用いて、又は上記プリカーサーイオン又はプロダクトイオンの「正確な質量タグ」を調べることによるさらなる構造的調査に供して、その特性決定を可能にする［Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，３３４９−３３５４．；Ｇｏｏｄｌｅｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｂｒｕｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ．，Ｆｉｅｈｎ，Ｏ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，１１１２−１１１８．；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｅ．Ｆ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｐ．Ｌ．，Ｔａｎｇ，Ｋ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３，１４，９８０−９９１］。
【００３１】
ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳフラグメント化を行わせるために固定電荷ペプチドイオン誘導体化法を使用する背景にある一般的原理は、メチオニンを含むペプチドの側鎖固定電荷スルホニウムイオン誘導体の選択的同定及び示差定量に関して本明細書中に明示されている（アミノ酸のメチオニン及びシステインの固定電荷スルホニウムイオン誘導体は、側鎖ＣＨ３ＳＲ（Ｒは置換アルキル基である）の中性脱離を介して限定的にフラグメント化することが観察され［Ｒｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．及びＯ′Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，１１，１０４７−１０６０．；Ｏ′Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．及びＲｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．Ｅｕｒ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９９，５，３２５−３３４］、アミノ酸の側鎖フラグメント化反応に含まれる潜在的プロダクトイオンを独立に気相で合成する目的で過去に採用されている）。その他のアミノ酸を含むペプチドの選択的解析のための同様の方法、翻訳後修飾アミノ酸を含む方法並びに、架橋したペプチドの特性決定の方法も記述されている。
【００３２】
本発明はアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析方法であって、
（１）アミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を誘導体化して、そのＣ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含むように誘導体化した１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を形成させる段階、
（２）Ｃ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含むように誘導体化した１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を質量分析装置に導入する段階、
（３）Ｃ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷イオンを含むように誘導体化した１以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の混合物を第１の質量分解分析装置に通して、第１質量対電荷比を有するタンパク質又はペプチドプリカーサーイオンを選択する段階、
（４）上記の第１質量対電荷比を有するプリカーサーイオンを解離させて、固定電荷の近傍の部位において起こるフラグメント化の特性である第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを生成させる段階、及び
（５）第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンを検出する段階、、からなる分析方法を提供する。
【００３３】
特徴的な第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンとは、荷電アミノ酸、ペプチド又はタンパク質、プリカーサーイオンからの固定電荷の中性脱離によって形成されるプロダクトイオン、もしくはプリカーサーイオンからの固定電荷の荷電脱離（ｃｈａｒｇｅｄ  ｌｏｓｓ）により形成される生成物プロダクトイオンのいずれかである。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法は（６）誘導体化したペプチド又はタンパク質の同一性を判定する段階をさらに含む。
【００３５】
段階（６）は、最初の繰返し段階（１）、（２）、（３）及び（４）によって実施され、さらにその後（ｉ）プリカーサーが有する荷電状態と同じ荷電状態を有するであろうプリカーサーからの中性脱離によって、又は（ii）プリカーサーイオンからの荷電脱離によって生成し、プリカーサーより低い荷電状態を有するプロダクトイオンを含むタンパク質又はペプチドに相当する、荷電生成物に対し相補的なプロダクトイオンによって形成される、特徴的な第２質量対電荷比を有するプロダクトイオンをさらなる解離段階に供することによって実施され、その目的はペプチドのアミノ酸配列を調べ、その後その起源となるタンパクを同定するために所定範囲の質量対電荷比を有する一連のプロダクトイオンを形成させることである。
【００３６】
あるいはまた段階（６）は、段階（５）で検出されるプロダクトイオン又はその相補的プロダクトイオン（すなわち、「正確なプロダクトイオン質量タグ」を得るための）に関して、約１〜５ｐｐｍの質量精度を与える高分解能質量分析装置を使用することによって実施される。この段階はデータベース検索と共に行われ、固定電荷誘導体を含むことが見出されているペプチドのその後に続く同定用手段となり得る。これまでに、プリカーサーイオンに対する「正確なプロダクトイオン質量タグ」が得られていた場合において、及び特定のアミノ酸の存在（例えばシステイン残基の存在）が知られていた場合において、データベース検索のアルゴリズムの特異性は向上し、この情報のみからペプチドが由来するタンパク質を明確に同定することが可能となる。
【００３７】
アミノ酸、ペプチド又はタンパク質は任意の好適な解離方法によって解離させてもよく、以下の方法に限定されるものではないが（ｉ）不活性ガスとの衝突（衝突誘起解離（ＣＩＤ）又は衝突活性化解離（ＣＡＤ）として知られる）、（ii）表面との衝突（表面誘起解離もしくはＳＩＤとして知られる）、（iii）光粒子との相互作用（例えばレーザーを介して）による光解離、（iv）熱／黒体赤外線放射解離（ＢＩＲＤ）、及び（ｖ）電子ビームとの相互作用による、１価のカチオンに対する電子誘起解離（ＥＩＤ）、多価のカチオンに対する電子捕捉解離（ＥＣＤ）もしくはそれらの組合せを含む。
【００３８】
本発明の分析方法はアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の同定、示差定量、翻訳後修飾状態の分析、架橋状態やタンパク質の相互作用の分析に使用し得る。
【００３９】
本発明はそのＣ末端又はＮ末端以外の部位に固定電荷を含むアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析方法を提供する。
【００４０】
固定電荷誘導体は、選択されたアミノ酸残基の側鎖、又はタンパク質もしくはペプチドに含まれる選択されたアミノ酸残基の側鎖に含まれる。好ましくは、選択されるアミノ酸残基は、以下に詳述するような「希少」アミノ酸である。固定電荷誘導体は、以下に詳述するように、翻訳後修飾アミノ酸残基の側鎖に含まれ得る。固定電荷誘導体は、以下に詳述するように、２つのタンパク質又はペプチドの間の架橋結合に含まれ得る。
【００４１】
選択されたアミノ酸残基は、その側鎖にＳ原子を含むものであり得る。好適なアミノ酸残基は、メチオニン、システイン、ホモシステイン又はセレノシステインである。選択されるアミノ酸残基はまた、トリプトファン又はチロシンであり得る。また側鎖はＳ−アルキル基を含んでもよい。好ましいアミノ酸残基は、メチオニン、Ｓ−アルキルシステイン、Ｓ−アルキルホモシステイン、Ｓ−アルキルトリプトファン又はＳ−アルキルチロシンである。荷電を導入するために選択されるアミノ酸残基の側鎖の誘導体化は、当業者に知られた各種の方法を用いて達成することができる。
【００４２】
固定電荷は、ペプチド又はタンパク質中のＯ−結合した翻訳後修飾アミノ酸残基（例えば、Ｏ−結合した翻訳後修飾セリンアミノ酸残基からのβ−除去によって形成されるデヒドロアラニン残基、又はＯ−結合した翻訳後修飾スレオニンアミノ酸残基からのβ−除去によって形成されるデヒドロアミノ−２−酪酸残基）上に含まれ得る。電荷を導入するための、先に翻訳後修飾されたアミノ酸残基の誘導体化は、当業者に知られた各種の方法を用いて達成することができる。
【００４３】
また、固定電荷は、架橋試薬内に、あるいは２つのアミノ酸、ペプチド又はタンパク質間の架橋内に含まれ得る。電荷を導入するための、架橋試薬又は２つのアミノ酸、ペプチド又はタンパク質間の架橋の誘導体化は、当業者に知られた各種方法を用いて達成することができる。
【００４４】
固定電荷の非限定的な例には、スルホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン又は４級アルキルホスホニウムイオンが含まれる。
【００４５】
アミノ酸、ペプチド又はタンパク質イオンの分析は、タンデム質量分析によって実施することができる。タンデム質量分析装置は、タンパク質又はペプチドイオンを液相から気相に転換させるためのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェース、又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）インターフェースを備えることができる。タンデム質量分析に適用可能な質量分析装置は２つの基本的カテゴリーに分類される：それはタンデム・イン・スペース型質量分析装置、及びタンデム・イン・タイム型質量分析装置である。これらのタイプの組合せも使用可能である。タンデム・イン・スペース型質量分析装置は、質量分析の各段階に対し個別の質量分析装置を有する；かかる例としてはセクター型質量分析装置（通常、二重収束セクター型質及びセクター型装置と四重極型装置を組合せたハイブリッド型である）、飛行時間型質量分析装置及び三連四重極質量分析装置、並びに飛行時間型装置と四重極型装置を組合せたハイブリッド型質量分析装置が含まれる。タンデム・イン・タイム型質量分析装置は１台のみの質量分析装置を有し、質量分析の各段階は同じ場所で起こるが、それらは処理工程の連続を介して時間的に分離されている。タンデム・イン・タイム型質量分析装置には、２次元及び３次元の四重極イオントラップ質量分析装置、及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析装置が含まれる。
【００４６】
特定の実施形態における本発明の方法は、１以上のタンパク質抽出段階、タンパク質分離段階、システインジスルフィドの還元及びアルキル化段階、及び／又は消化段階を含む。
【００４７】
本発明の方法における固定電荷の誘導体化の方法は、固定電荷への適切な同位体標識（例えば１３Ｃ、１５Ｎ、及び２Ｈ）の取り込み、又は構造的標識に基づく示差的なタンパク質発現の定量に応用することができる。本発明の方法における固定電荷の誘導体化の方法はまた、タンパク質の翻訳後修飾状態の同定及び定量に応用することができ、それは質量分析で安定な誘導体であるＯ−リン酸化及びＯ−グリコシル化セリン、又はＯ−リン酸化及びＯ−グリコシル化スレオニンを形成させるためのβ−除去／Ｍｉｃｈａｅｌ付加法を介した固定電荷誘導体の取り込みによって実施され、このことは、例えばＭｅｙｅｒ，Ｈ．，Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｐｏｓｏｒｓｋｅ，Ｅ．，Ｋｏｒｔｅ，Ｈ．及びＨｅｉｌｍｅｙｅｒ，Ｌ．Ｊ．ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．１９８６，２０４，６１−６６．，において記載され、この開示内容は参照により本明細書中に組み入れるものとする。本発明の方法における固定電荷の誘導体化の方法はまた、適切な架橋試薬への固定電荷誘導体の取り込みを介したタンパク質−タンパク質の相互作用を同定し、特徴づけるために応用することができる。
【００４８】
すでに上記されているように、固定電荷誘導体化ペプチドのタンデム質量分析は、解離において固定電荷サイトでのフラグメント化に特徴的な、解離時におけるプロダクトイオンの限定的生成を引き起こし、それにより、複雑な混合物を分析前に予め分離もしくは濃縮する必要なく、誘導体化を含むペプチドのみの特異的な同定を可能にする。
【００４９】
本発明の方法は、ある特定の実施形態では、異なる比率で存在するペプチドの選択的同定及び示差定量について下記に参照と共に記載され、また固定電荷誘導体を同位体標識したものを取り込ませることによって「軽」型（天然の同位体のみを含む）及び「重」型（置換基に同位体もしくは構造的な標識を含む）が得られるとともに、中性脱離モードのタンデム質量分析によってペプチドレベルの選択的同定及び示差定量がなされる。翻訳後修飾の状態並びに架橋分析によるタンパク質−タンパク質相互作用の選択的同定の一般的な方法の応用も開示される。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、上述の方法はアミノ酸、ペプチド又はタンパク質を、次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を用いて誘導体化したものを用いて実施される。
【００５１】
【化１】
2006506647.tif 000003
【００５２】
式中、Ｘは好ましくはハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである。特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである。その他の実施形態では、置換アセトフェノンが、同位体標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物であり、Ｒ１〜Ｒ５のうち好ましくは１以上、さらに好ましくは２以上、さらに一段と好ましくは３以上が２Ｈであり、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであり、又はＲ１〜Ｒ５がＨであり、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは２つ以上、さらに好ましくは３以上が１３Ｃである。
【００５３】
特定の実施形態では、Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上が水素又は炭素以外の原子を含む官能基である。
【００５４】
好ましくは、置換アセトフェノンは水溶性である。特定の水溶性分子にはＲ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又はＲ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである、上述のこれらの分子を含む。
【００５５】
同位体標識された水溶性置換アセトフェノン分子には、Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又はＲ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである、上述のものを含む。
【００５６】
これらの分子においては、列挙された置換のその他の組合せやその他の量が可能であることが理解され、本発明はそのような組合せを包含する。
【００５７】
本発明のその他の態様によれば、置換アセトフェノン（又はその塩、又はその溶媒和物）は、次式で表される。
【００５８】
【化２】
2006506647.tif 000004
【００５９】
式中、Ｘはスルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである。好ましい置換アセトフェノンはＲ１〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである。
【００６０】
本発明はまた、同位体的標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物である置換アセトフェノンを含む。特定の好ましい置換同位体標識アセトフェノンは、Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又はＲ１〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ５′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである。
【００６１】
本発明はさらに、次式の水溶性置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を包含する。
【００６２】
【化３】
2006506647.tif 000005
【００６３】
特定の実施形態では、Ｘはハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである。好ましい実施形態では、ＸはＢｒ又はＩである。
【００６４】
その他の実施形態では、水溶性置換アセトフェノンは、Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＨで、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又はＲ１−２がＨで、Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである。
【００６５】
水溶性置換アセトフェノンはまた、本明細書中に記載する同位体標識された形態のものであることができ、好ましくは、Ｘがハロゲン、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである。特に、同位体標識された水溶性置換アセトフェノンは、Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ２Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ２Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ５′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ３がＳＯ２Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ１がＳＯ３Ｈで、Ｒ２〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、Ｒ２がＳＯ３Ｈで、Ｒ１及びＲ３〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるか、Ｒ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５の１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又はＲ３がＳＯ３Ｈで、Ｒ１〜Ｒ２及びＲ４〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるものである。
【００６６】
これらの分子においては、列挙された置換のその他の組合せやその他の量が可能であることが理解され、本発明はそのような組合せを包含する。
【００６７】
その他の態様における本発明は、質量分析によるアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析のための試薬キットを含む。このキットには本明細書中に記載の置換アセトフェノンを含む１以上の容器を含む。
【００６８】
本発明の質量分析によるアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析のための特定の試薬キットは、次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を含む容器を含む。
【００６９】
【化４】
2006506647.tif 000006
【００７０】
式中、Ｘはハロゲン化物であり、好ましくは、ＸはＢｒ又はＩである。上記キットにおける特定の好ましい置換アセトフェノンは、Ｒ１〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである。その他のキット中において好ましい置換アセトフェノンは、同位体標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物であり、好ましくは、Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるもの、又はＲ１〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃであるものである。上記に列挙された置換アセトフェノンの水溶性誘導体も上記キット中に含むことができる。質量分析によるアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析における上記置換アセトフェノンの使用説明書も含むことができる。
【００７１】
上記のキットはさらに、システインジスルフィド還元剤、システインアルキル化試薬、プロテアーゼ又は化学的切断剤、及び／又は溶媒を含む１以上の容器を含むことができる。システインジスルフィド還元剤は、好ましくはジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、トリス−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、及び／又はトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）を含む。システインアルキル化試薬は、好ましくはハロゲン化アルキル（例えば、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド）、ビニルピリジン及び／又はアクリルアミドを含む。プロテアーゼ又は化学的切断剤は、好ましくはトリプシン、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、ペプシン、パパイン、サーモリシン、臭化シアン、ヒドロキシルアミン塩酸塩、２−［２′−ニトロフェニルスルフェニル］−３−メチル−３′−ブロモインドール（ＢＮＰＳ−スカトール）、ヨードソ安息香酸、ペンタフルオロプロピオン酸、及び／又は希塩酸を含む。溶媒は、好ましくは尿素、塩酸グアニジン、アセトニトリル、メタノール及び／又は水を含む。
【００７２】
本発明はまた、側鎖固定電荷スルホニウムイオン、４級アルキルアンモニウムイオン又は４級アルキルホスホニウムイオンを含むように誘導体化されるアミノ酸、又はかかるアミノ酸を含むペプチドを含む。好ましくは、アミノ酸は、本明細書中に記載の置換アセトフェノンを用いて誘導体化される。特に好ましい実施形態では、該アミノ酸は、次式の置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物を用いて誘導体化される。
【００７３】
【化５】
2006506647.tif 000007
【００７４】
式中、Ｘはハロゲン化物であり、好ましくは、ＸはＢｒ又はＩである。アミノ酸又はペプチドを誘導体化するために使用される特定の好ましい置換アセトフェノンは、Ｒ１〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃである。アミノ酸又はペプチドを誘導体化するために使用されるその他の好ましい置換アセトフェノンは、同位体標識された置換アセトフェノン又はその塩又はその溶媒和物であり、好ましくは、Ｒ１〜Ｒ５の１以上、好ましくは３以上が２Ｈで、Ｒ１′〜Ｒ６′が１２Ｃであるか、又はＲ１〜Ｒ５がＨで、Ｒ１′〜Ｒ６′のいずれか１以上、好ましくは３以上が１３Ｃである。上記に列挙された置換アセトフェノンの水溶性誘導体はアミノ酸又はペプチドを誘導体化するために使用することができる。好ましい実施形態では、このアミノ酸誘導体は同位体標識される。
【００７５】
その他の態様における本発明は、上述の固定電荷で誘導体化させたアミノ酸又はペプチドをサンプルに対し所定量添加することを含んでなる、質量分析法における内部標準を提供する方法を提供する。
【００７６】
ここに本発明を、特定の実施形態を参照して記載するが、本発明の方法はこれらの特定の実施形態に限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
定義
特記しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、通常、本発明が属する技術分野において通常理解されるものと同一の意味を有する。
【００７８】
「固定電荷」とは、本明細書中で使用される場合、任意の成分の付加により、タンパク質又はペプチドに含まれる特定のヘテロ原子に、又は（例えば、溶液中もしくは気相中の）誘導体化試薬内に含まれる特定のヘテロ原子に、局在化された任意の電荷を含む。
【００７９】
「固定電荷誘導化」とは、本明細書中で使用される場合、上記定義した固定電荷の導入を意味する。例えば、中性の試薬を導入し、次いで、タンパク質又はペプチド内の特定の部位に固定電荷を形成させることにより、又は固定電荷を含む試薬をタンパク質又はペプチド内の特定の部位に導入することにより、固定電荷を導入することができる。
【００８０】
このようにして形成される固定電荷誘導体は、該固定電荷誘導体に特徴的である脱離時に、プロダクトイオンの独占的形成を可能とする構造を有していることが好ましい。
【００８１】
「タンパク質」とは、本明細書中で使用される場合、限定するものではないが、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、増殖因子等を含むいずれかのタンパク質を意味する。タンパク質は、内因性であっても、又は他のタンパク質から化学的もしくはタンパク分解的切断により産生されてもよい。好ましいタンパク質は、少なくとも１５〜２０アミノ酸残基からなるタンパク質である。この用語には、架橋タンパク質も含まれる。
【００８２】
「ペプチド」とは、本明細書中で使用される場合、２以上のアミノ酸からなる任意の物質を含み、また、アミド結合によって結合するアミノ酸の数にしたがって、ジ−、トリ−、オリゴ及びポリペプチド等を含む。ペプチドは、内因性であっても、又は他のペプチドもしくはタンパク質から化学的もしくはタンパク分解的切断により産生されてもよい。好ましいペプチドは、１５〜２０までのアミノ酸残基からなるペプチドである。この用語には、架橋ペプチドも含まれる。
【００８３】
アミノ酸がα−アミノ酸の場合、Ｌ−光学異性体又はＤ−光学異性体のいずれかを使用することができる。Ｌ−異性体が通常好ましい。一般的概説としては以下を参照されたい［Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９８３，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７］。
【００８４】
「アルキル」とは、本明細書中で使用される場合、分岐鎖又は非分岐鎖、飽和又は不飽和の１価炭化水素を意味する。好適なアルキル基は、例えば、１以上のメチレン、メチン及び／又はメシン基を含む構造を含む。分岐鎖構造は、ｉ−プロピル、ｔ−ブチル、ｉ−ブチル、２−エチルプロピル等と類似の分岐モチーフを有する。本明細書中で使用する場合、この用語には、「置換アルキル」及び「環状アルキル」が含まれる。
【００８５】
「置換アルキル」とは、１以上の置換基、例えば、アルキル、アリール、アシル、ハロゲン（すなわちアルキルハロゲン、例えば、ＣＦ３）、ヒドロキシ、アミノ、アミド、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、チオアミド、アシルオキシ、アリールオキシ、アリールオキシアルキル、エーテル、エステル、ジスルフィド、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和及び不飽和環状炭化水素、複素環などを含む上記アルキルを意味する。これらの基は、いずれかの炭素原子又は該アルキル部分の置換基に結合していてもよい。さらに、これらの基は、アルキル鎖から張り出していてもよく、又は組み込まれていてもよい。固定電荷誘導体を共有結合させた固相において予め富化させておくためには、置換アルキル基は、不溶性のビーズ又はポリマーに共有結合させて、不溶性ビーズ又はポリマーと該アルキル基との間に化学的又は光化学的切断部位を含ませることができる。
【００８６】
「アリール」という用語は、本明細書中において、芳香族置換基を意味するものとして使用し、該芳香族置換基は単一の芳香族環であっても、又は共有結合で連結して互いに縮合しているか、もしくは、メチレンもしくはエチレン部分などの一般的な基と結合している複数芳香族環であってもよい。また、一般的連結基は、アセトフェノンの場合におけるカルボニルであってもよい。芳香族環は、その他のものの中では、例えば、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルメチル及び及びベンゾフェノンを挙げることができる。用語「アリール」には、「アリールアルキル」及び「置換アリール」が含まれる。
【００８７】
「置換アリール」とは、１以上の官能基、例えば、低級アルキル、アシル、ハロゲン、アルキルハロ（例：ＣＦ３）、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、フェノキシ、メルカプトを含む上記アリール、並びに、共有結合により連結しているかもしくはメチレンもしくはエチレン部分などの一般的な基と連結している芳香族環と縮合している飽和及び不飽和環状炭化水素を意味する。また、一般的連結基は、シクロヘキシルフェニルケトンの場合におけるカルボニルでありうる。用語「置換アリール」には「置換アリールアルキル」が含まれる。
【００８８】
「アリールアルキル」という用語は、本明細書中において、アリール基が本明細書中に定義されるアルキル基により別の基に結合していることを特徴とする、該「アリール」のサブセットを意味するものとして使用する。
【００８９】
「置換アリールアルキル」とは、置換アリール基が本明細書中に定義されるアルキル基により別の基に結合していることを特徴とする、該「置換アリール」のサブセットと定義する。
【００９０】
「アシル」という用語は、式中Ｒが、本明細書中に定義されるアルキル又は置換アルキル、アリール又は置換アリールであるケトン置換基−−（Ｏ）Ｒを表すものとして使用する。
【００９１】
略語
ＣＩＤ  衝突誘起解離
ＥＳＩ  エレクトロスプレーイオン化
ＭＡＬＤＩ  マトリックス支援レーザー脱離イオン化
ＭＳ  質量分析
ＭＳ／ＭＳ  タンデム質量分析
ＭＳｎ  マルチステージタンデム質量分析（ｎ  ＞  ２）。
【実施例】
【００９２】
材料及び方法
材料
モデル合成ペプチド（ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＡ（配列番号１）、ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）、ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）、ＧＡＩＬＡＧＡＩＬＡ（配列番号４）、ＧＡＩＬＡＧＡＩＬＫ（配列番号５）及びＧＡＩＬＡＧＡＩＬＲ（配列番号６））はＡｕｓｐｅｐ社（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から取得し、さらなる精製を行うことなく直接使用した。ヨードメタン、ヨードエタン、ヨードベンゼン、ヨードメチルベンゼン、ｄ５−アセトフェノン及びブロモアセトフェノンはＡｌｄｒｉｃｈ社（Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ，ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入した。ポリマー担持ピリジルブロミドパーブロミド、ヨード酢酸及びヨードアセトアミドはＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）から取得した。メタノール及びアセトニトリル（Ｃｈｒｏｍａｒ  グレード）はＭａｌｌｉｎｋｒｏｄｔ社（Ｐａｒｉｓ，ＫＹ，ＵＳＡ）から購入した。ギ酸及び酢酸はＢＤＨラボラトリー（Ｐｏｏｌｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）から取得した。全ての溶液は、タンデムＭｉｌｌｉ−Ｑ  ／  Ｍｉｌｌｉ−ＲＯ  システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって精製した脱イオン水を用いて調製した。
【００９３】
ｄ５−ブロモアセトフェノンの合成
ｄ５−ブロモアセトフェノンはＦｒｅｃｈｅｔらの方法［Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．，Ｆａｒｒａｌｌ，Ｍ．Ｊ．及びＮｕｙｅｎｓ，Ｌ．Ｊ．Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．−Ｃｈｅｍ．１９７７，Ａ１１，５０７−５１４］にしたがって合成した。簡潔に述べると、１．２５ｍＬのｄ５−アセトフェノンを、４．８ｇポリマー担持ピリジルブロミドパーブロミド（約３ｍｅｑ  Ｂｒ３−／樹脂１ｇ）を含む３０ｍＬメタノールに添加し、次いで、室温で４時間攪拌しながら反応させた。得られたα−ブロモケトンは、反応混合物をろ過し、溶媒を蒸発させることにより純粋な形態で取得し、次いで、使用前に再結晶化させた。
【００９４】
メチオニン含有ペプチドの側鎖固定電荷誘導体化
メチオニン含有ペプチドの側鎖固定電荷スルホニウムイオン誘導体は、１Ｍ溶液のアルキル化剤１０μＬを、１００μｇのペプチドを含有させた３０％  ＣＨ３ＣＮ含有２０％  酢酸水溶液１００μＬに添加することにより調製した。反応は室温で１６時間進行させ、その後、サンプルを希釈し、次いで、さらなる精製を行うことなく質量分析装置に導入した。
【００９５】
質量分析
質量分析は、（ｉ）四重極イオントラップ型（Ｆｉｎｎｉｇａｎ−ＭＡＴ  モデル  ＬＣＱ−ＤＥＣＡ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、（ii）四重極飛行時間型（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  モデル  Ｑ−ＴＯＦ２，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）、又は（ii）三連四重極型（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  モデル  ＴＳＱ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）質量分析装置のいずれかによって行った。全ての装置に、エレクトロスプレーイオン化インターフェースが装備されている。
【００９６】
四重極イオントラップ質量分析
サンプル（１０ｐｍｏｌ／μＬ、５０：５０：１  Ｈ２０：ＣＨ３ＣＮ：酢酸中）は流速２μＬ／分で質量分析装置に導入した。ＥＳＩの条件は対象イオンの強度が最大となるように最適化した。標準的条件は、スプレー電圧−５ｋＶ、窒素シースガス（ｓｈｅａｔｈ  ｇａｓ）３０ｐｓｉ、加熱キャピラリー温度１５０℃であった。ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３実験は、標準的な単離及び励起手順を用いて、選択したイオンの質量に対して行った。取得した全スペクトルは１０スキャンの平均である。
【００９７】
四重極飛行時間型質量分析
流速１μＬ／分でサンプル（イオントラップ型実験のための溶液組成と同一濃度）を注入した後、飛行時間型質量分析装置のＶ−オプティクスモードを使用してスペクトルを取得した。エレクトロスプレーインターフェース条件は対象イオンの強度が最大となるように最適化した。標準的条件は、スプレー電圧−４．５ｋＶ；窒素源ガス１  ｐｓｉ；コーンガス１００（任意単位）；ｓｏｕｒｃｅ温度５０℃；ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ温度１５０℃；コーン電圧５０Ｖ（１価イオンの場合）、３０Ｖ（２価イオンの場合）及び２０Ｖ（３価イオンの場合）であった。プロダクトイオンの電荷状態の測定を可能にするために、不活性衝突ガスとしてアルゴンを１０ｐｓｉの圧力で使用することによる、エネルギー分解ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ実験が、分離された同位体エンベローププリカーサーイオン群について自動的に必要とされた。衝突エネルギーは、１価イオンに対して１Ｖ増加させる場合には４Ｖから５８Ｖまで、２価及び３価イオンに対して１Ｖ増加させる場合には４Ｖから２０Ｖまで、２Ｖ増加させる場合には２０Ｖから４６Ｖまで増加させた。各衝突エネルギー値について取得したスペクトルは１０スキャンの平均である。
【００９８】
三連四重極質量分析
サンプル（１  ｐｍｏｌ／μＬ、５０：５０：１  Ｈ２０：ＣＨ３ＣＮ：酢酸中）は、流速２００ｎＬ／分で手製のナノエレクトロスプレーイオン化源による質量分析装置に導入した。スプレー電圧は−１．８ｋＶに維持した。加熱したキャピラリーの温度は１５０℃であった。アルゴン衝突ガス圧力は１．５ｍｔｏｒｒに維持した。質量分析装置はユニット分離条件下で操作した。中性脱離モードＭＳ／ＭＳスキャン（ｄ０−及びｄ５−を含有する２価のイオンに対しては８３及び８５．５Ｄａ、ｄ０−及びｄ５−を含有する３価のイオンに対しては５３．３及び５７Ｄａの中性脱離）は、それぞれ１８Ｖ及び１３Ｖの衝突エネルギーにて行った。次いで、中性脱離スキャンにより選択的に同定されるペプチドイオンのプロダクトイオン  ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ  スペクトルを、２価及び３価の電荷イオンそれぞれに対して１８Ｖと３１Ｖ、及び１３Ｖと１８Ｖにおいて取得した。示された全スペクトルは２０スキャンの平均である。
【００９９】
キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣは、以下の（ｉ）：Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ＲＰ−３００、７μｍ  ジメチルオクチルシリカを充填し、溶媒Ｂ  ０〜１００％の直線性６０分グラジエントを利用して、流速３．６μＬ／分で展開させるカラム（２００μｍ  Ｉ．Ｄ．ｘ  １５０ｍｍ  Ｏ．Ｄ  石英ガラス）（この場合、溶媒Ａは０．１Ｍ  酢酸水溶液であり、溶媒Ｂは６０％アセトニトリルを含有する０．１Ｍ  酢酸水溶液である）、又は（ii）：Ｖｙｄａｃ  Ｃ４を充填し、溶媒Ｂ  ０〜１００％の直線性６０分グラジエントを利用して、流速２００ｎＬ／分で展開させるカラム（７５μｍ  Ｉ．Ｄ．ｘ  １５０ｍｍ  Ｏ．Ｄ石英ガラス）（この場合、溶媒Ａは０．１Ｍ  酢酸水溶液であり、溶媒Ｂは６０％アセトニトリルを含有する０．１Ｍ  酢酸水溶液である）を使用して行った。
【０１００】
結果及び検討
固定電荷誘導体を含有するペプチドのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の同定
選択的なＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ分離による、ペプチドの選択的同定及び定量のための一般的方法を示すために、本発明においては、メチオニンを含有するペプチドの側鎖固定電荷誘導体化を行った。メチオニン含有ペプチドの固定電荷誘導体化を利用する根拠は、選択的同定及び示差タンパク質発現の定量のための方法は、希少なアミノ酸を含むペプチドの検出に対して特異的であり、それにより、分析に必要なペプチドの数を限定し、さらに、配列データベース内においてタンパク質を総合的にカバーするべきである、という考えに基づく。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースのリリース４０．０には合計１０１，６０２のタンパク質エントリーが含まれる。このデータベース中のメチオニン発現率は２．３７％である。対照的に、周知の方法であるＩＣＡＴ並びに選択的マススペクトル検出及び定量のための関連する方法において標的とするアミノ酸であるシステインの発現率は１．６３％である。個々のデータベースエントリーの中で、８５．３３％がシステインを含むのに対して、９６．９％がメチオニンを含む。メチオニン又はシステインのいずれかを含まないものはわずか１．６５％のエントリーに過ぎないのに対して、両方のアミノ酸を含むタンパク質を標的とした場合には９８．３５％のカバー率が達成される。したがって、メチオニン（又はメチオニン及びシステインの両方）を含有するタンパク質の同定に対して行う方法は、システインのみを標的とする方法よりも、データベース内に示されるタンパク質のより大部分を有意に広くカバーする必要がある。
【０１０１】
固定電荷スルホニウムイオン誘導体（すなわち、メチオニン又はＳ−アルキルシステイン側鎖がアルキル化されている誘導体）による、メチオニン含有ペプチド及びＳ−アルキルシステインの選択的同定及び続く示差定量のために本発明において考案した主な方法並びにタンデム質量分析について、以下に概要を示す。スルホニウム又は４級アルキル固定電荷誘導体を介した、システイン含有ペプチドの選択的同定及び示差定量のための同様の方法、並びにトリプトファン（発現率１．２１％）含有ペプチドの選択的同定及び示差定量のための同様の方法についても記載されている。
【０１０２】
メチオニン含有ペプチドの固定電荷スルホニウムイオン誘導体化
スルホニウムイオン固定電荷誘導体のＣＩＤを介したメチオニン含有ペプチドの同定は、幾つかの理由から魅力的である。メチオニンは希少なアミノ酸である（上記参照）。スルホニウムイオンの化学的及び生物学的適用についてはこれまでにも多く報告されており、特定のペプチド誘導体を含む適用において、これらのイオンを形成させる試薬を開発するための前例となっている［Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．及びＰａｔａｉ，Ｓ．Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｌｆｏｎｉｕｍ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１．；Ｌｕｎｄｂｌａｄ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８“Ｔｈｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ”  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９５．；Ｌｉｕ  Ｔ．−Ｈ．“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｕｌｆｕｒ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩＩ，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈｉｌｌ及びＢｏｅｄｅｒ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＮＹ，１９７７，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐｐ２３９−４０２．；Ｇｕｎｄｌａｃｈ，Ｈ．Ｇ．Ｍｏｏｒｅ，Ｓ，及びＳｔｅｉｎ，Ｗ．Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５９，２３４，１７６１−１７６４．；Ｌａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｃ．Ｍ．及びＷｉｔｋｏｐ，Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６１，８３，１５０９−１５１０．；Ｌａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｃ．Ｍ．及びＷｉｔｋｏｐ，Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６２，８４，１７１５−１７１８．；Ｇｒｏｓｓ  Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９６７，１１，２３８−２５５．；Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．及びＫｙｔｅ，Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８，８９，５２９−５３９．；Ｋｙｔｅ，Ｊ．，Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．及びＨａｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８３，９１，３６７−３７７］。タンパク質及びペプチドのメチオニン残基のアルキル化は、使用するアルキル化剤にかかわらず、低ｐＨにおいて特異的である［Ｌｕｎｄｂｌａｄ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  “Ｔｈｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ”  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９５．；Ｌｉｕ  Ｔ．−Ｈ．“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｕｌｆｕｒ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩＩ，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈｉｌｌ及びＢｏｅｄｅｒ．編  ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＮＹ，１９７７，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐｐ２３９−４０２］。この選択性の理由は、メチオニン側鎖におけるチオエーテル硫黄原子のアルキル化の速度が実際にｐＨ依存性（ｐＨ１まで低い場合でも）であるのに対し、すべてのその他の求核官能基（例えば、システイン、リジン及びヒスチジン残基）は低ｐＨにおいて減少する（脱プロトン化による）ためである。これまでに、スルホニウムイオンは、（ａ）ペプチド及びタンパク質のメチオニン部位にタグをつけるために［Ｌｕｎｄｂｌａｄ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍ���ｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  “Ｔｈｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ”  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９５．；Ｌｉｕ  Ｔ．−Ｈ．“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｕｌｆｕｒ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”  Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩＩ，Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈｉｌｌ及びＢｏｅｄｅｒ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＮＹ，１９７７，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，ｐｐ２３９−４０２．；Ｇｕｎｄｌａｃｈ，Ｈ．Ｇ．Ｍｏｏｒｅ，Ｓ，及びＳｔｅｉｎ，Ｗ．Ｈ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５９，２３４，１７６１−１７６４．；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｇ．Ａ．Ｓｈａｌｔｉｅｌ，Ｎ，及びＢｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，２５１，５７１１−５７１７．；Ｔｏｅｎｎｉｅｓ，Ｇ．及びＫｏｌｂ，Ｊ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４５，６７，８４９−８５１．；Ｌａｖｉｎｅ，Ｔ．Ｆ．Ｆｌｏｙｄ，Ｎ．Ｆ，及びＣａｍｍａｒｏｔｉ，Ｍ．Ｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４５，６７，８４９−８５１．；Ｌａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．及びＳｃｈｒａｍｍ，Ｈ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６２，８４，２０１７−２０１８］、（ｂ）液相におけるスルホニウムイオンのフラグメント化を介してメチオニン残基に隣接するペプチド結合の切断を誘導するために［Ｌａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｃ．Ｍ．及びＷｉｔｋｏｐ，Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６１，８３，１５０９−１５１０．；Ｌａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．，Ｆｏｌｔｚ，Ｃ．Ｍ．及びＷｉｔｋｏｐ，Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９６２，８４，１７１５−１７１８．；Ｊｅｎｄｒｅｋ，Ｊ．Ｐ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｈ．及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ａ．Ｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１９６７，１３６，４０９−４１１．；Ｇｒｏｓｓ  Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９６７，１１，２３８−２５５］、使用されてきた。その他のアルキル化剤も同様の効果のために使用されているが［Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｒ．及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９６７，１０２，５９３．；Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｒ．及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７０，１１８，６１１］、最も有名で広く研究されている系は臭化シアン反応である［Ｇｒｏｓｓ  Ｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９６７，１１，２３８−２５５］。ペプチドの精製［Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｒ．及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９６７，１０２，５９３．；Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．及びＫｙｔｅ，Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８，８９，５２９−５３９．；Ｋｙｔｅ，Ｊ．，Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．及びＨａｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８３，９１，３６７−３７７．；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｖｉｎｅｒ，Ｒ．Ｉ．及びＨｏ，Ｐ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００２，２３，３１８２−３１９２］並びにメチオニン残基のホモシステイン残基への変換［Ｃｈａｓｓａｉｎｇ，Ｇ；Ｌａｖｉｅｌｌｅ，Ｓ；Ｍａｒｑｕｅｔ，Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８３，４８，１７５７��６０］においてみられる、自己分解タンパク質切断反応［Ｔａｙｌｏｒ，ＫＬ．；Ｐｏｈｌ，Ｊ；Ｋｉｎｋａｄｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２，２６７，２５２８２−２５２８８］のように、関連する反応がペプチド合成において観察されたことに留意されたい［Ｇａｉｒｉ，Ｍ．，Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．，Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．及びＧｉｒａｌｔ，Ｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，１７５−１７８］。メチオニンのスルホニウムイオン誘導体を含む予備実験を、置換アルキルハロゲン化物  Ｒ１Ｘ（式中、Ｘはハロゲン、Ｒは置換アルキル基である）を用いて行った［Ｏ′Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．及びＲｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．Ｅｕｒ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９９，５，３２５―３３４］。これらの予備研究において使用する試薬は、酸性ｐＨ条件下、液体中でメチオニン側鎖と特異的に反応し、安定な側鎖スルホニウムイオン誘導体（−ＣＨ（ＣＨ２）２Ｓ（ＣＨ３）Ｒ１＋）を形成する（スキーム１の段階（ｉ））。これらの条件下で、前記試薬は、システイン含有ペプチドの遊離型チオールとは反応しない。しかし、前記試薬は、塩基性ｐＨ条件下でシステインチオール側鎖の最初のＳ−アルキル化後に、システイン含有ペプチドの誘導体化に使用され、誘導体（−ＣＨＣＨ２ＳＲ２）を得ることができる（スキーム２の段階（ｉ））。次に、メチオニンのアルキル化のために用いたのと同一の条件下でこれらのＳ−アルキルシステイン含有ペプチドをさらにアルキル化することにより、システインの安定なスルホニウムイオン誘導体（−ＣＨＣＨ２ＳＲ１Ｒ２＋）が形成される［Ｆｏｔｉ，Ｓ．，Ｓａｌｅｔｔｉ，Ｒ．及びＭａｒｌｅｔｔａ，Ｄ．Ｏｒｇ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９１，２６，９０３−９０７．；Ｌａｐｋｏ，Ｖ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．及びＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｂ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，３５，５７２−５７５］（ただし、最初のシステインアルキル化に使用される置換基Ｒ２はスルホニウムイオンの安定性を高める（すなわち、電荷が安定である）ものである）（スキーム２の段階（ii））。重要なことは、最初のＳ−アルキルシステイン誘導体がスルホニウムイオン形成に対して安定でないような条件を選ぶことができ、それにより、システインが予め還元され、Ｓ−アルキル化されている場合において、サンプル調製の間に効率的なタンパク分解を行うために、メチオニン含有ペプチドの特異的誘導体化が可能となることである。中性脱離モードスキャンモードＣＩＤタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）スキャン又は通常のＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ後のポストデータ取得用中性脱離プロダクトイオン検出ソフトウェアを使用して、特徴的であるメチオニンからのＣＨ３ＳＲ１の脱離、及びシステインからのＲ１ＳＲ２の脱離を介することにより、それぞれのプロダクトイオン［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３ＳＲ１］（ｎ＋１）＋及び［Ｍ＋ｎＨ−Ｒ１ＳＲ２］（ｎ＋ｌ）＋の形成を伴い、メチオニン含有ペプチド及びシステイン含有ペプチドを選択的に同定することができる。したがって、メチオニン含有ペプチド及びシステイン含有ペプチドは、−ＣＨ３に相当しないＲ２基（すなわち、メチオニンの側鎖アル���ル基）の使用によって、又は同時に、Ｒ２基が−ＣＨ３に相当する場合のシステインの最初に行われるアルキル化により、個別に同定することができる。
【０１０３】
【化６】
2006506647.tif 000008
【０１０４】
【化７】
2006506647.tif 000009
【０１０５】
この誘導体方法を成功させるためには、得られるスルホニウムイオンの液相及び気相における化学反応を検討する必要がある。これらの液相及び気相化学並びにメチオニン含有ペプチドの固定電荷スルホニウムイオン誘導体についてのフラグメント化挙動の特性決定を、トリプシン処理によって得られるものと類似するよう設計された一連のモデルペプチド（すなわち、タンデム質量分析によるタンパク質同定のために最も一般的に使用されるペプチド類）を用いて調べた。モデルペプチド（ＧＡＩＬＸ１ＧＡＩＬＸ２（配列番号７）、配列中Ｘ１はアラニン又はメチオニンであり、Ｘ２はアラニン、リジン又はアルギニンのいずれかである）のアミノ酸配列は、観察するフラグメント化挙動における電荷の状態、及びアミノ酸組成の効果について総合的な調査が可能となるように選択した。
【０１０６】
スルホニウムイオン形成のための液相の条件
反応は容易に入手可能な試薬を用いて簡便に行える必要がある。多くの潜在的に有用な試薬が市販されている。その他の潜在的に有用な試薬は、文献に記載されている単純な方法により合成することができる。重要なのは、選択した誘導体に好適な同位体標識を取り込めるか否かが、同一の方法を用いた示差タンパク質発現につづく定量の実現を考えた場合における重要な検討項目であるということである。したがって、これらの試薬の同位体標識誘導体は、市販されているか、又は容易に合成される必要がある。例えば、本発明において、臭素化剤  ポリ（４−ビニルピリジニウムトリブロマイド）を用いて、ワン段階工程でｄ５−アセトフェノンから同位体標識ｄ５−ブロモアセトフェノンを容易に調製した（材料及び方法のセクション参照）。反応は、迅速かつ完了するまで進行する必要があり、得られたスルホニウムイオンは溶液中で化学的及び熱的に安定である必要がある［Ｓｔｉｒｌｉｎｇ，Ｍ．Ｊ．及びＰａｔａｉ，Ｓ．Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｌｆｏｎｉｕｍ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１．；Ｓｔｉｒｌｉｎｇ  Ｃ．Ｊ．Ｍ．Ｓｕｌｆｏｎｉｕｍ  Ｓａｌｔｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｕｌｆｕｒ  Ｏａｅ，Ｓ．編  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ  １９７７，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，ｐｐ４７３−５２５．；Ｃａｐｏｚｚｉ，Ｇ，及びＭｏｄｅｎａ，Ｇ．Ｓｔｕｄ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８５，１９，２４６−２９８］。モデルペプチド  ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）を用いて、メチオニン側鎖固定電荷スルホニウムイオン形成のための一連の潜在的アルキル化剤、ヨードメタン、ヨードエタン、ヨードベンゼン、ヨードメチルベンゼン、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド及びブロモアセトフェノンについて評価した。ペプチドは、１００倍モル量過剰の各アルキル化剤とともに４、８、１６及び３２時間反応させ、次いで、反応の度合を判定するために質量分析法によって分析した。１６時間後、アセトフェノンスルホニウムイオン誘導体のみが反応完了まで反応した［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版  ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３４３．；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍ，１９７８，３２７．；Ｙｏｈ，Ｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，１９８８，２９，４４３１］。エチル誘導体は溶液中で最も低い反応性及び安定性を有することが判明した（１６時間後にわずか１％の反応）。全てのその他の試薬は、反応性の点においてこれら両極の間に位置した。ペプチドのアセトフェノン誘導体化スルホニウムイオンは、著しい分解が起こることなく数週間溶液中で安定であることが判明した。システイン残基の遊離型ＳＨ基は、メチオニン残基のアルキル化の逆反応へ効果を及ぼすことが示されており［Ｓｃｈｅｉｔｊｔｅｒ，Ａ．及びＡｖｉｒａｍ，Ｉ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９７２，２１，２９３−２９６］、また、スルホニウムイオン塩からの遊離型スルフヒドリル受容体へのメチル基の転移は周知の可能な副反応であり［Ｔｏｅｎｎｉｅｓ，Ｇ．及びＫｏｌｂ，Ｊ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４５，６７，１１４１−１１４４．；Ｎａｉｄｅｒ，Ｆ．及びＢｏｈａｋ，Ｚ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７２，１１，３２０８−３２１１．；Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｇ．Ｌ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６０，１，１８１］、タンパク質分解の前にシステインのＳ−アルキル化を伴う通常行われる段階が有用であり、必要な反応であり得る。
【０１０７】
スルホニウムイオンフラグメント化のための気相の条件
試験した全てのスルホニウムイオン（溶液中における反応性の低いものを含む）は気相において安定であることが判明したので、それらをＭＳ／ＭＳ実験用の質量として選択し、操作することができた。ＣＨ３ＳＲ１の中性脱離を介してフラグメント化させることにより、全てのイオンについて固有のフィンガープリントが得られることが判明した（スキーム１参照）。固定電荷誘導体からのＣＨ３ＳＲ１の脱離は、小モデル系［Ｒｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．及びＯ′Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，１１，１０４７−１０６０．；Ｏ′Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．及びＲｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．Ｅｕｒ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９９，５，３２５−３３４］、ペプチド［Ｆｏｔｉ，Ｓ．，Ｓａｌｅｔｔｉ，Ｒ．及びＭａｒ１ｅｔｔａ，Ｄ．Ｏｒｇ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９１，２６，９０３−９０７］並びにタンパク質［Ｌａｐｋｏ，Ｖ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．及びＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｂ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，３５，５７２−５７５］において今までに観察されている。これらの気相の反応は上記した液相の反応と類似することに留意されたい。安定したアルキルカチオン又はアルケンを得るために、分子内プロトン移動を介した電荷移動、アルキル基転移、並びに、結合の切断などの副反応は回避する必要がある［Ｏ‘Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．，Ｆｒｅｉｔａｓ，Ｍ．Ａ．，Ｇｒｏｎｅｒｔ，Ｓ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ａ．Ｒ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｔ．Ｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，１９９０−１９９８．；Ｍｕｄｄ，Ｓ．Ｈ．ら  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９６６，５，１６５３．；Ｄｅａｋｙｎｅ，Ｃ．Ａ．ら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．１９９９，４８５／４８６，３３−４１．；Ｍａｒｋｈａｍ，Ｇ．Ｄ．及びＢｏｃｋ，Ｃ．Ｗ．Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ，１９９３，９７，５５６２−５５６９．；Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ，Ａ．Ｒ．ら  Ｉｎｔ  Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１９９７，１６５／１６６，５７７−５８３．；Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｎ．ら  Ｊ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，２７５３−６２．；Ｍｅｓｔｄａｇｈ，Ｈ．ら  Ｏｒｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９８６，２１，３２１−３２７．；Ｍｅｓｔｄａｇｈ，Ｈ．ら  Ｏｒｇ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９８８，２３，２４６−２５１］。プロトン移動（スキーム３、経路１）は硫黄イリドを生じ得る。（ＣＨ３）３Ｓ＋イオンの酸性度（又は共役塩基（ＣＨ３）２Ｓ（ＣＨ２）のプロトン親和性）は不明だが、水酸化物イオン（ＨＯ−）又はアルキルリチウム試薬などの塩基を用いてスルホニウムイオンを脱プロトン化することにより、溶液中に硫黄イリドが形成され得る［Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．及びＭｅｌｖｉｎ，Ｌ．Ｓ．“Ｓｕｌｆｕｒ  Ｙｌｉｄｅｓ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ”．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：ＮＹ  １９７５］。高エネルギー転移状態（共直線性幾何）のため分子内ＳＮ２はまれにしか生じないことから、アルキル転移（スキーム３、経路２）が直ちに問題となることはない［Ｏ′Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．，Ｆｒｅｉｔａｓ，Ｍ．Ａ．，Ｇｒｏｎｅｒｔ，Ｓ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ａ．Ｒ．及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｔ．Ｄ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，６０，１９９０−１９９８］。幾つかの生物学的硫黄系の液相メチルカチオンアフィニティー（ＭＣＡｓ）ついて研究がなされている［Ｍｕｄｄ，Ｗ．Ａ．，Ｋｌｅｅ  Ｐ．Ｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９６６，５，１６５３］。残念なことに、気相  ＭＣＡｓは、ジメチルスルフィドの実験的及び理論的推定［Ｄｅａｋｙｎｅ，Ｃ．Ａ．；Ｋｎｕｔｈ，Ｄ．Ｍ．；Ｍｅｏｔ−Ｎｅｒ，Ｍ．；Ｂｒｅｎｅｍａｎ，Ｃ．Ｍ．；Ｌｉｅｂｍａｎ，Ｊ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．１９９９，４８５／４８６，３３−４１］並びに、幾つかのその他スルフィドの理論的推定［Ｍａｒｋｈａｍ，Ｇ．Ｄ．及びＢｏｃｋ，Ｃ．Ｗ．Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ，１９９３，９７，５５６２−５５６９］に限られる。その他の切断されるアルキル基の結合力は、濃縮相及び気相の両方において知られていないと思われる。しかし、質量分析によって分析されるスルホニウムイオンのフラグメント化反応については、幾つかの研究が存在している［Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ，ＡＲ  Ｓｈｉｐｋｏｖａ，ＰＡ  Ｗａｔｓｏｎ，ＣＨ  Ｅｙｌｅｒ，ＪＲ．及びＫｅｖｉｌｌ  ＤＮ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ，１９９７，１６５／１６６，５７７−５８３．；Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｎ；Ｍａｌｔｂｙ，Ｄ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ａ  Ｌ．；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ，ＮＪ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，２７５３−６２、（ｄ）Ｍｅｓｔｄａｇｈ，Ｈ；Ｍｏｒｉｎ，Ｎ；Ｒｏｌａｎｄｏ，Ｃ．Ｏｒｇ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９８６，２１，３２１−３２７．；Ｍｅｓｔｄａｇｈ，Ｈ；Ｍｏｒｉｎ，Ｎ；Ｒｏｌａｎｄｏ，Ｃ．Ｏｒｇ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９８８，２３，２４６−５１］。スキーム３（経路３）は、最も安定性の低いカルボカチオン（ＣＨ３＋）を非常に形成しにくい。スキーム３（経路４及び５）に関する問題点は、それぞれ、安定なイオンを生じないＲ１基を選択すること（例えば、ベンジル基などを避ける）、及びアルケンを形成しないＲ１基を選択すること（例えば、エチル又は置換エチル基並びに、より高次の同族体を避ける）ことにより回避することができる。メチオニン及びＳ−アルキルシステイン残基のスルホニウムイオンにおけるフラグメント化反応間の差異（すなわち、システインからのＲ１ＳＲ２の脱離（スキーム２）と対比したメチオニンからのＣＨ３ＳＲ１の脱離（スキーム１））は明瞭である。このことは、メチル基ではないアルキル基Ｒ２（すなわち、Ｒ２≠ＣＨ３）を用いることにより達成し得る。
【０１０８】
【化８】
2006506647.tif 000010
【０１０９】
本明細書に記載の作業に好適なスルホニウムイオン試薬の一般的構造
これまでに本発明において調べられた試薬の中で、α−カルボニル含有アルキル化剤、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド及びブロモアセトフェノンは、好ましい上記液相及び気相反応特性を示すものである。これらのうちで、アセトフェノンは、（例えば、ｄ５−ブロモアセトフェノン又は１３Ｃ６−ブロモアセトフェノンの合成を介して）好適な同位体標識の取り込みを容易にして、続く定量を可能にすることから、これ以降に使用される試薬となっている。しかし、一般構造ＸＲを有する任意の試薬（式中Ｘは、例えば、ハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルからなる任意の好適な脱離基であり［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ  ３５２−３５７］、またＲは脱離基に隣接した炭素を伴う任意の基質、例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基であり、上記に示唆される例外を伴って、示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができる）が重要であろう。
【０１１０】
メチオニン固定電荷スルホニウムイオン誘導体のフラグメント化挙動試験
四重極イオントラップ型質量分析装置におけるＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３試験
未修飾及びアセトフェノン側鎖が誘導体化したスルホニウムイオンメチオニンを含有するペプチドであるＧＡＩＬＭＧＡＩＬＸ（配列番号８）（Ｘはアラニン、リジン又はアルギニン、及びアセトフェノン側鎖が誘導体化したスルホニウムイオンメチオニンを含有するペプチドの、四重極イオントラップ型質量分析におけるイオンを含む３価に荷電したリジン及びアルギニンである）の、１価及び２価に荷電したイオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳにより得られるプロダクトイオンスペクトルを、図１から図８に示す。プロトンのみの付加によりイオン化される未修飾ぺプチドの１価及び２価に荷電した型は、全てペプチド基本骨格に従う解離から最初にイオン化され、ｂ−及びｙ−型のイオンを優勢とする。
【０１１１】
対照的に、アセトフェノン側鎖スルホニウムメチオニンを含むペプチドイオン誘導体は、各々がスルホニウムイオンに由来する単一の固定電荷を有し、０、１、２個のプロトンを伴い、それぞれ１価、２価もしくは３価に荷電したイオンに対する平衡を作り上げる。これらのイオンについての、それぞれの場合における、単離されたプリカーサーイオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳに続く圧倒的に優勢なフラグメント化経路は、メチオニン側鎖上の固定電荷の部位でのα−ＣＨ２−Ｓ結合の選択的開裂に相当し、Ｓ−メチルアセトフェノン（ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５）（−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）と記載する）の中性側鎖の脱離をもたらす。したがって、側鎖から中性脱離によって形成されるプロダクトイオンは、プリカーサーイオンが有するのと同じ荷電状態（イオン化されたプロトン数）を有することに留意することが重要である。３価に荷電したイオンの例は唯一の部分的例外であり、図５Ａ及び８Ａにおいては、プロトン化されたＳ−メチルアセトフェノン（ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５＋Ｈ＋）（（−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）＋Ｈ＋と記載する）の幾つかの荷電側鎖の脱離が（相当するプロトン化されたＳ−メチルアセトフェノン（ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）＋Ｈ＋と記載）イオンを伴って）観察された。３価に荷電したプリカーサーイオンからの荷電側鎖の脱離は、プリカーサーイオンのα−ＣＨ２−Ｓ共有結合の解離に続く中性脱離に由来するプロトン移動によって起こるが、その結果得られるイオン分子複合体が個々の生成物に解離するよりも前に起きると予測され、その理由はニオブの反発によると予測される。
【０１１２】
固定電荷誘導体からのＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５の中性脱離に関する、２つの可能性ある経路による潜在的メカニズムをスキーム４に示す。
【０１１３】
【化９】
2006506647.tif 000011
【０１１４】
スキーム４の経路１は、アルギニンやリジンの塩基性側鎖やＮ−末端アミノ基、又は基本骨格アミドカルボニル基などの分子内求核試薬（Ｎｕ）による直接的プロトン移動を含み、中性の脱離を伴って、８３Ｄａの質量を有する新規のアミノ酸誘導体である３−アミノ−１−ブテン酸（ビニルグリシン）を生じる。あるいは、フラグメント化が求核試薬の攻撃メカニズムにより引き起こされ、それによって隣接するアミドカルボニルが側鎖を攻撃して、環状生成物を生じながら中性脱離を引き起こす（修飾メチオニン残基のＮ−末端側における、アミドカルボニルによる求核攻撃によって形成される６員環生成物としてスキーム４の経路２に示す）。このメカニズムは、求核攻撃過程がプロトン化ペプチドイオンのフラグメント化に含まれる主要な過程である［Ｏ‘Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｊ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，３５，１３７７−１３８１．Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ，Ａ．及びＬｅｈｍａｎｎ，Ｗ．Ｄ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，３５，１３８２−１３９０］という認識が高まりつつあることと一致する。プリカーサーイオン（経路１）又はメチオニン側鎖の切断に次いで形成されるプロダクトイオン（経路２Ａもしくは２Ｂ）のいずれかの中に存在する酸性プロトンの分子内移動は、このプロトンの「可動化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」をもたらし、これにより、続くフラグメント化反応（プロトン化ペプチドイオンのフラグメント化を理論的に説明するために構築された移動プロトンモデルに従う）に関与できるようになる［Ｗｙｓｏｃｋｉ，Ｖ．Ｈ．，Ｔｓａｐｒａｉｌｉｓ，Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｌ．及びＢｒｅｃｉ，Ｌ．Ａ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，３５，１３９９−１４０６］。もしこの反応過程がスキーム４の経路２を介して起こるのであれば、環状生成物中に取り込まれるアミド結合は続く開裂には適用されにくいであろう。しかし、分子内移動（経路２Ａ）を介した環状生成物の開環は非環式アミノ酸誘導体を生じ、それにより、続くプロダクトイオンのフラグメント化を行わせ、Ｎ−末端及びＣ−末端側におけるアミノ酸誘導体の新たな形成を起こさせる。
【０１１５】
スルホニウムイオン誘導体化したペプチドが、ほぼ限定的にＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５の中性脱離を経由してフラグメント化し、荷電プロダクトイオンを生じるという前提のもと、各ペプチドイオンに対する中性脱離プロダクトイオンは質量で選択され、次いで、好ましいフラグメント化経路に対する証拠を得るため、及び配列解析によるその同定をも行うための付加的な構造情報をもたらすために、さらなるタンデム質量分析（ＭＳ３）段階に供される。上記に論考された中性脱離プロダクトイオンの各々の、ＣＩＤ  ＭＳ３に次いで得られるスペクトルを、図１Ｂから図４Ｂの挿入図、図５Ａの挿入図、図６Ｂ及び図７Ｂの挿入図、及び図８Ａの挿入図に示す。１価及び２価にプロトン化された非修飾ペプチドイオンの場合に類似して、固定電荷誘導体からの中性脱離によって生成する［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５］（ｎ＋１）＋プロダクトイオンのＭＳ３は、ｂ−型及びｙ−型のイオンを優勢とするペプチド基本骨格に従う解離から最初に生じる生成物の形成をもたらす。非修飾ペプチドのＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル、及び［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５］（ｎ＋１）＋プロダクトイオンのＭＳ３スペクトルの直接的比較は、幾つかの興味深い点を明らかにする。
【０１１６】
（ｉ）ほとんどの場合において、スルホニウムイオン側鎖の脱離によって形成される修飾ビニルグリシン残基のいずれかの側鎖上のアミド結合の開裂がＭＳ３に続いて観察され、このことは、フラグメント化する種がスキーム４の経路１、もしくはスキーム４の経路２により形成される環状生成物の開環のいずれかによって生成する非環式ビニルグリシン残基を含むことを示唆する。
【０１１７】
（ii）１価に荷電したメチオニン側鎖固定電荷ペプチドイオンのＭＳ３（図１Ｂ、３Ｂ及び６Ｂの挿入図）に対して、［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３ＳＣＨ２Ｃ６Ｈ５］（ｎ＋１）＋プロダクトイオンのＭＳ３に続く、より多くの「系列」イオンのフラグメント化が観察され、非修飾メチオニン含有ペプチドのＭＳ／ＭＳにより得られる結果と比較して、水やアンモニアの脱離及びａ−型プロダクトイオンの生成などの「非系列」イオンの開裂が少ない。この知見は、ペプチドのフラグメント化に対する移動プロトンモデルにより容易に説明しうる［Ｗｙｓｏｃｋｉ，Ｖ．Ｈ．，Ｔｓａｐｒａｉｌｉｓ，Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｌ．及びＢｒｅｃｉ，Ｌ．Ａ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，３５，１３９９−１４０６］。１価に荷電したスルホニウムイオンペプチド誘導体の場合、側鎖の脱離において生成する酸性プロトンは、スキーム４の経路１における開裂のための直接的プロトン移動メカニズムによって、もしくはスキーム４の経路２Ａにより示される環状生成物の開環によって、ペプチド基本骨格上へと迅速に移動され、続くフラグメント化が基本骨格にしたがって起こり得るようにする。一方で、エレクトロスプレーにより直接的に生成する１価プロトン化イオンの場合には、イオン化するプロトンは最初にアルギニンやリジン等の塩基性側鎖上に位置し、次なる基本骨格のフラグメント化を起こさせるためには、プロトン移動に対する障壁を克服するための多大なエネルギーが最初に供給されなければならない。そのようなものとして、プリカーサーイオン及びプロダクトイオンからの水やアンモニア等の低分子の脱離、及びａ−型プロダクトイオンの生成を含むその他の工程が、ゆえに、基本骨格開裂とうまく競合する。その他のペプチドに対して、２価プロトン化リジン及びアルギニンを含有するメチオニン側鎖固定電荷［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５］（ｎ＋１）＋ＭＳ／ＭＳプロダクトイオンからＭＳ３により生成するプロダクトイオン（図４Ｂ及び図７Ｂの挿入図）は、非修飾２価プロトン化ペプチドイオンのＭＳ／ＭＳから得られるものと類似であった。しかし、アセトフェノン修飾されたＧＡＩＬＭＧＡＩＬＡ（配列番号１）ペプチドの解離から生成する２価プロトン化プロダクトイオンのＭＳ３（図２Ｂの挿入図）は、ｂ９及びｂ９２＋イオンを優勢として、非修飾ペプチドのＭＳ／ＭＳにより得られる結果よりも少ない生成物を生じる。このことは、この場合において、プリカーサー中に最初に存在するプロトン及び、２価に荷電したスルホニウムイオン誘導体からの側鎖脱離によって生成する酸性プロトンが、１つのプロトンがアミノ末端上に存在し、かつもう一つのプロトンが基本骨格上に存在するような位置で２価にプロトン化されているペプチドの場合ほどには「可動性」でないことを示唆する；これも再び、固定電荷誘導体から形成される最初の環状生成物と一致する。３価にプロトン化したリジン及びアルギニンを含有するメチオニン側鎖固定電荷［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５］（ｎ＋１）＋ＭＳ３プロダクトイオン（図５Ａ及び図８Ａの挿入図）は、主にｙ８２＋プロダクトイオンを生じ、その他のｙ−型イオンも少量明らかに生じることがわかった。
【０１１８】
（iii）［Ｍ＋ｎＨ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］（ｎ＋１）＋プロダクトイオンのＭＳ３に対し必要な衝突エネルギーは、それぞれの荷電状態に対する非修飾ペプチド［Ｍ＋ｎＨ］ｎ＋プリカーサーイオンのＭＳ／ＭＳに対し必要とされるものよりも一貫して高い。このことは、中性脱離によって生じるプリカーサーイオンのフラグメント化が、エレクトロスプレーイオン化により直接的に生じるプリカーサーと比較してより高い活性化障壁を有していることを示唆し、また、続く解離の前に開環を必要として、再び、スキーム４の経路２における固定電荷誘導体からの環状プロダクトイオンの最初の生成が示唆される。
【０１１９】
四重極飛行時間型質量分析装置におけるエネルギー分解ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３
非修飾メチオニン含有ペプチド、並びにメチオニンに相当する位置にアラニン残基を含むもの（アラニンは、固定電荷誘導体からの中性脱離によって形成されるビニルグリシン残基に対する共通の酸という最も近い構造を有し、したがって、フラグメント化に必要とされる相対的エネルギーの直接比較のためにはメチオニンよりもすぐれた誘導体であると考えられる）と比較した、固定電荷誘導体由来の観察されるフラグメント化過程に対する相対的エネルギー論を調べるために、及び結果として得られるプロダクトイオンの構造に関する証拠を得るために、上記されたスルホニウムイオン含有ペプチドのフラグメント化反応を四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析装置におけるエネルギー分解ＣＩＤにより調べた。
【０１２０】
ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）の２価スルホニウムイオン誘導体に対する、エネルギー分解ＣＩＤの減少曲線及び出現曲線を図９Ａに示す。プリカーサー［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンの減少曲線、最初の中性脱離プロダクトイオン（−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ））の出現／減少曲線、並びに、個々のプロダクトイオン及び合計したプロダクトイオン量（プロダクトイオンの合計）の出現カーブを示す。［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンの減少と個々のプロダクトイオンの出現との間には、原則的に重なりがないように見受けられ、このことは、これらのイオンが最初のプリカーサーから直接的に形成されるのではないことを示唆する。むしろこれらのイオンは、プロダクトイオン（−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ））の最初の中性脱離  から生成する。プリカーサーイオン量の７０〜９０％の減少を得るのに十分な衝突エネルギー（１２ｅＶ）、及び最初の中性脱離（−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ））プロダクトイオン量の７０〜９０％の減少を得るのに十分な衝突エネルギー（２２ｅＶ）の条件下で得た、典型的なプロダクトイオンのスペクトルを図９Ｂ及びＣにそれぞれ示す。これらの「低」及び「高」エネルギー四重極ＣＩＤ条件下で観察されたプロダクトイオンスペクトルは、それぞれ、四重極イオントラップ型質量分析ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３実験において観察されたものと、原則的に同一であった。このことは、時間フレーム（イオントラップ及び四重極実験に対してそれぞれ、ミリ秒対マイクロ秒のスケールである）及びイオン活性化モードによるフラグメント化過程における向上効果がみられないことを示唆する。実際、これらの「低」及び「高」エネルギー四重極ＣＩＤ条件下で試験された全てのペプチドは、ＭＳ／ＭＳ及びＭＳ３スペクトル由来の相当するイオントラップと比較して、非常に似通ったプロダクトイオンスペクトルを示した（データ未掲載）。すなわち、方向づけされた固定電荷誘導体のフラグメント化は、最初の中性脱離プロダクトイオンの形成に対して低エネルギーのＣＩＤ条件を使用可能にし、さらにその後さらなる構造情報を得るための「高」エネルギーＣＩＤ条件の下で「擬似ＭＳ３」スペクトルが得られるようにする。比較のため、２価プロトン化された非修飾メチオニン及びアラニン含有ペプチドから生成するプロダクトイオンの合計に対する出現曲線を図１０に示す。
【０１２１】
プロトン化された非修飾ペプチドの各々から、及び、固定電荷誘導体由来の最初の中性脱離プロダクトイオンから生じるプロダクトイオンの形成を５０％達成するために必要とされる衝突エネルギーの合計を表１に示す。これらのデータは、スルホニウムイオン誘導体中性脱離プロダクトイオンの、非修飾型に対する安定性を測定するために使用できる。このデータは、スルホニウムイオン誘導体に由来する最初の中性脱離プロダクトイオンの解離に必要とされる衝突エネルギーが、アラニン及び非修飾メチオニン含有ペプチドの場合に比べ原則的に高いことを示唆し、続く解離に先立つ開環への障壁を克服するために必要とされる最初の環状プロダクトイオンの形成をさらに支持する（スキーム４、経路２Ａ）。
【０１２２】
【表１】
2006506647.tif 000012
【０１２３】
Ｑ−ＴＯＦ質量分析装置において、非修飾プリカーサーイオン量、又は固定電荷スルホニウムイオン誘導体からの最初の中性脱離プロダクトイオン量の５０％減少を達成するために必要な衝突エネルギー。
【０１２４】
固定電荷誘導体を含むことがわかっているこれらのペプチドの同定を行うために、付加的にＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ段階が行われることへの代替手段としては、データベース検索を組合せた高分解能の質量精度（正確な質量タグ）の使用があり得ることに留意されたい。
【０１２５】
従来、１ｐｐｍに近い「正確な質量タグ」が得られている場合で、かつ特定のアミノ酸の存在が知られている（例えばシステイン残基の存在）場合、データベース検索アルゴリズムの特性は向上し、この情報単独から、ペプチドが由来する起源のタンパク質の明確な同定が達成されてきた［Ｃｏｎｒａｄｓ，Ｔ．Ｐ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｖｅｅｎｓｔｒａ，Ｔ．Ｄ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，３３４９−３３５４．；Ｇｏｏｄｌｅｔ，Ｄ．Ｒ．，Ｂｒｕｃｅ，Ｊ．Ｅ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｒｉｓｔ，Ｂ．，Ｐａｓａ−Ｔｏｌｉｃ，Ｌ．，Ｆｉｅｈｎ，Ｏ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．及びＡｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，７２，１１１２−１１１８．；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｅ．Ｆ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｐ．Ｌ．，Ｔａｎｇ，Ｋ．及びＳｍｉｔｈ，Ｒ．Ｄ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３，１４，９８０−９９１］。
【０１２６】
三連四重極質量分析装置を用いた、スルホニウムイオン固定電荷誘導体の中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳによるメチオニン含有ペプチドの同定
中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳを用いて、比較的複雑な混合物中の特定のアミノ酸残基を含むペプチドを選択的に同定するための固定電荷誘導体の有用性を検証するために、還元されＳ−カルボキシアミドメチル化され、ブロモアセトフェノンを用いて誘導体化したウシ血清アルブミンのトリプシン消化物１０ｐｍｏｌをキャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳに供した（図１１）。そして、２連の実験において、ｍ／ｚ  ８３の中性脱離（すなわち、２価に荷電したプリカーサーイオンからのＣＨ３ＳＣＨ２ＣＯＣ６Ｈ５の脱離）を与えるこれらのペプチドが、中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳにおいて同定された。この結果得られた、この実験に関する全イオン流トレースを図１２Ａに示す。４つのメインピークが観察され、それらのうち２つから得られたマススペクトルを図１２Ｂ及び１２Ｃに示す。これらのピークの質量は、ウシ血清アルブミンの４つのメチオニン含有トリプシン消化ペプチドに相当することがわかった。図１１Ｂ及びＣ（ＭＳ実験から得られた全イオン流のクロマトグラムの２領域でのマススペクトルを矢印で示す）、並びに図１２Ｂ及びＣにおけるデータの比較によって、中性脱離スキャンモード実験で検出されるイオンが比較的少量（図１２Ｂにおけるｍ／ｚ  ７９９．４のイオンは図１１Ｃにおいて８番目に量の多いイオンにすぎず、図１２Ｃにおけるｍ／ｚ  ７５９．８のイオンは図１１Ｃにおいて３番目に量の多いイオンにすぎない）存在することが観察され得る。したがって、これらのデータは、固定電荷誘導体の中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳを用いて、特定のアミノ酸残基を含むペプチドを選択的に同定するための固定電荷誘導体の有用性を示す（ウシ血清アルブミンの４つのメチオニン含有トリプシン消化ペプチドは、この消化物中に存在する全体で約１００種のペプチド群から選択的に同定される）。
【０１２７】
その他のアミノ酸固定電荷誘導体を含むペプチドの中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定の方法
トリプトファン及びシステイン
固定電荷スルホニウムイオン誘導体を得るための、求電子性の芳香族化合物置換によるトリプトファンの修飾は、トリプトファン含有ペプチドをハロゲン化スルフェン（Ｒ１ＳＸ）と最初に反応させることにより達成でき、インドール側鎖の２位にチオエーテル官能基を有する誘導体が得られ（スキーム５Ａ）［Ｓｃｏｆｆｏｎｅ，Ｅ．，Ｆｏｎｔａｎａ，Ａ．及びＲｏｃｈｈｉ，Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９６８，７，９７１］、次いでメチオニン及びＳ−アルキルシステインスルホニウムイオン誘導体に対して上記したものと同様の条件下で、トリプトファンのスルホニウムイオン誘導体が生成する。ハロゲン化スルフェンはシステイン含有ペプチドとも反応して非対称ジスルフィドを生じる（スキーム５Ｂ）ことには留意すべきであるが、しかし、この反応のトリプトファンに対する特異性は、システインの最初のＳ−アルキル化によって、又はスルホニウムイオン形成前の非対称ジスルフィドの還元により与えられる。２−インドール  Ｓ−アルキルトリプトファン修飾された残基からのスルホニウムイオン生成に関する液相及び気相の条件は、メチオニン及びＳ−アルキルシステインスルホニウムイオン生成に対して上述されたものと同様である。トリプトファンの２−インドール  Ｓ−アルキル誘導体は、メチオニン及びＳ−アルキルシステインに対して上述されたものと同一の条件下で生成し、両方の残基はこの方法で修飾される。しかし、メチオニン及びＳ−アルキルシステインスルホニウムイオンに対して上述された方法に関し、−ＣＨ３基に相当しないＲ１基（例えばメチオニンの側鎖アルキル基）の使用を介して、もしくは同時に、Ｒ１基が−ＣＨ３基に相当する部位でのトリプトファンの最初のアルキル化を経由して、メチオニン及びトリプトファン含有ペプチドは個別に同定される。同様に、２−インドール  Ｓ−アルキルトリプトファン及びＳ−アルキルシステイン含有ペプチドは、システインの最初のアルキル化に使用されるＲ１基としては適合しないＳ−アルキルトリプトファン誘導体へのＲ１基の導入を介して、又は同時に、最初のシステインのアルキル化に使用するものと同じＲ１基を使用したトリプトファンの最初のアルキル化を経由して、個別に同定することができる。適切な条件下で、同様の求電子性の芳香族化合物置換反応が、チロシン残基側鎖へのＳ−アルキル基導入、それに次ぐスルホニウムイオン誘導体の形成にも使用できることに留意されたい。
【０１２８】
【化１０】
2006506647.tif 000013
【０１２９】
本明細書に記載の作業に好適な固定電荷イオン試薬の一般的構造
一般構造Ｒ１ＳＸｌを有する任意の試薬（Ｘｌは任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステル［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］からなり、かつＲ１は脱離基に隣接した炭素を伴う任意の基質、例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基であり、上記に示唆される例外を伴って、示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができる）、及び一般構造Ｒ２Ｘ２を有する任意の試薬（Ｘ２は任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステル［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］であり、かつＲ２は脱離基（例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基）に隣接した炭素を伴う任意の基質であり、上記に示唆される例外を伴って、示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができる）。
【０１３０】
トリプトファン及びシステイン含有ペプチドのスルホニウムイオンは、適切な脱離基Ｘ２を含有するハロゲン化スルフェン（Ｘ２ＲＳＸ１）との最初の反応により、直接的に形成させることもでき、結果としてトリプトファン（スキーム６Ａ）及びシステイン（スキーム６Ｂ）の環状スルホニウム誘導体が得られる。
【０１３１】
【化１１】
2006506647.tif 000014
【０１３２】
本明細書に記載の作業に好適な固定電荷イオン試薬の一般的構造
一般構造Ｘ２ＲＳＸｌを有する任意の試薬（Ｘｌは任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステル［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］からなり、かつＲは遊離基（例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基）に隣接した炭素を伴う任意の基質であり、上記に示唆される例外を伴って示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができ、さらにＸ２は任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルである［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］）。
【０１３３】
システイン
環状スルホニウムイオンは、試薬（Ｘ２ＲＸｌ）の最初のアルキル化によって（スキーム７）、又は試薬（Ｘ２ＲＳＳＸｌ）の最初のジスルフィド交換によって（スキーム７Ｂ）、システイン含有ペプチドから特異的に生成させることができ、それぞれは適切な脱離基Ｘ２を含み、結果として環状スルホニウムイオン誘導体を生成する。
【０１３４】
【化１２】
2006506647.tif 000015
【０１３５】
本明細書に記載の作業に好適な固定電荷イオン試薬の一般的構造
一般構造（ｉ）Ｘ２ＲＸｌを有する任意の試薬（Ｘｌは任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステル［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］からなり、かつＲは脱離基（例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基）に隣接した炭素を伴う任意の基質であり、上記に示唆される例外を伴って、示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができ、さらにＸ２は、任意の好適な脱離基、例えば、中性もしくは塩基性のｐＨ条件下ではハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルであり、あるいは酸性ｐＨ条件下ではプロトン化アミンやアルコールである［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］）、又は（ii）Ｘ２ＲＳＳＸ１を有する任意の試薬（Ｘ１は例えばニトロ安息香酸であり、Ｒは脱離基に隣接した炭素を伴う任意の基質、例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基であり、上記に示唆される例外を伴って、示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができ、さらにＸ２は、任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステルからなる［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］）。
【０１３６】
その他のアミノ酸固定電荷誘導体を含むペプチドのプリカーサーイオンスキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定の方法
上記に論考したフラグメント化反応と対照的に、中性脱離が観察されるところでは（これらの誘導体における固定電荷の部位が、結合開裂部位に直接隣接していることに留意されたい）、固定電荷が結合開裂部位の部位から離れた位置にある側鎖上において誘導体化したペプチドは、荷電生成物の脱離をもたらし、それはプリカーサーイオンスキャンモードＭＳ／ＭＳ実験を用いて選択的に検出する段階、ができる（スキーム８）。例えば、固定電荷スルホニウム、４級アルキルアンモニウム又は４級アルキルホスホニウムイオン試薬はｃｉｓ  １，２脱離を介した側鎖の荷電脱離をもたらし、相補的な中性ペプチド種（もしプリカーサーの初発の荷電状態が１であった場合）又はプリカーサーより荷電状態が１低い荷電ペプチドイオン種（もしプリカーサーの初発の荷電状態が１より大きかった場合）の生成を伴って、優勢な低分子生成物を生成する。これらの特徴的な低分子プロダクトイオンは、親イオンスキャンモードＭＳ／ＭＳ実験を用いて選択的に検出する段階、ができる。この側鎖の開裂はチオエーテルの酸化によりさらに促進することができる［Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．及びＭａｎｎ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１３，９９６−１００３］。基本的な機能性を有する試薬（例えばヨードアセトアミド、アクリルアミド及びビニルピリジン）でアルキル化されたシステイン含有ペプチドのフラグメント化は、側鎖での何らかのフラグメント化が起こる前に観察されるということに留意されたい［Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．Ｅｄｄｅｓ，Ｊ．Ｓ．，Ｒｅｉｄ，Ｇ．Ｅ．及びＳｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．１９９５，１７，９０７−９１７］。
【０１３７】
４級アルキルアンモニウム又は４級アルキルホスホニウムイオン生成、及びフラグメント化のための液相及び気相の必要条件は、上記に論考したスルホニウムイオンの生成及びフラグメント化のためのものと同様である。カルボキシペプチダーゼＣ−末端ペプチド配列解析が可能になる前に、システインの固定電荷誘導体（システイン残基の側鎖チオールへの荷電導入のために２−ブロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミド（ＢｒＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）３ＮＢｒ）を使用）が反応生成物検出のために質量分析と共に使用されてきたことに留意されたい［Ｂｏｎｅｔｔｏ，Ｖ．，Ｂｅｒｇｍａｎ，Ａ−Ｃ．，Ｊｏｒｎｖａｌｌ，Ｈ．及びＳｉｌｌａｒｄ，Ｒ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６９，１３１５−１３１９］。
【０１３８】
【化１３】
2006506647.tif 000016
【０１３９】
一般構造Ｒ＋Ｘを有する任意の試薬（Ｘは任意の好適な脱離基、例えばハロゲン化物、スルホン酸エステル、過塩素酸エステル又はクロロスルホン酸エステル［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］からなり、かつＲ＋は脱離基（例えばアルキル、アリール、又はα−カルボニル基）に隣接した炭素を伴う任意の基質、及び末端スルホニウム、４級アルキルアンモニウム又は４級アルキルホスホニウムイオンを伴い、示差定量に使用できるように、そこに同位体的もしくは構造的な標識を取り込むことができる）。
【０１４０】
その他の質量分析装置及びイオン源に関する検討
側鎖の中性脱離を伴う固定電荷誘導体の解離が、プリカーサーイオンと同一の荷電状態（及びイオン化プロトン数）を有するペプチドプロダクトイオンを生じることを認識することは重要である。したがって、これらの誘導体は、「高」エネルギーＭＳ／ＭＳもしくはＭＳ３によってペプチドの配列同定を達成しようとする場合に、ＥＳＩ（複数の荷電イオンが通常観察される）及びＭＡＬＤＩ（主要な単一の荷電イオンが観察される）の両方に使用可能である。一方、側鎖の荷電脱離を伴う固定電荷誘導体の解離（すなわち、低分子プロダクトイオンの生成）は、プリカーサーイオンの値より１少ない電荷を有するペプチド生成物を生じる。したがって、もしこのペプチド配列の同定がさらなる解離によって達成されるのであれば、この方法はＥＳＩ法を使用する場合にのみ適用可能であり、そこでは側鎖開裂低分子プロダクトイオンに加えて、ぺプチドを含む荷電プロダクトイオンが生成するであろう。
【０１４１】
固定電荷誘導体含有ペプチドのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳによる、タンパク質の示差定量
三連四重極質量分析装置における中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ
本明細書中に記載の固定電荷誘導体化法を用いたタンパク質発現の示差定量の一般的方法において、サンプルを質量分析装置に導入する前に、天然の（軽）同位体を含むスルホニウムもしくは３級アルキル固定電荷試薬を用いて第１のサンプルを誘導体化し、次いで、同位体的に富化させた（重）同位体を含む同様の試薬で誘導体化した第２のサンプルと混合する。そして、中性脱離もしくは親イオンスキャンモードＭＳ／ＭＳのいずれかを用いて、重同位体タグを含むものと比較した、軽同位体を含むペプチドイオンの中性脱離もしくは親イオンスキャンモードＭＳ／ＭＳによって形成されるプロダクトイオンの存在比率を調べることができる。その比は２サンプル間のタンパク質の存在量レベルにおける差異を示す。ペプチド生成物を表すこのプロダクトイオンは、次いで「高」エネルギーＭＳ／ＭＳ又はＭＳ３による、さらなる構造調査のために自動的に選択される。本明細書中に記載の方法は、「全体的」な標識（すなわち、Ｎ−もしくはＣ−末端標識）の方法と容易に組合せることもでき、これによって同位体標識が固定電荷部位から離れた部位に導入され、共通的な中性脱離が軽及び重同位体を含む誘導体の同定に使用可能となる。
【０１４２】
ｄ０−もしくはｄ５−アセトフェノンのいずれかを用いて誘導体化し、エレクトロスプレーイオン化法により三連四重極質量分析装置に導入したＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）ペプチドの名目上１．０ｐｍｏｌ／μＬ：１．０ｐｍｏｌ／μＬ混合物のＥＳＩマススペクトルを図１３Ａに示す。このマススペクトルから、ペプチドが２価に（ｍ／ｚ  ５６７．２及び５６９．７）荷電したものに対して１．０４：１の比が得られ、また３価に（ｍ／ｚ  ３７８．４及び３８０．１）荷電した状態に対して１．０６：１の比が得られる。ｍ／ｚ  ７００−８００周辺のスペクトルの１０倍拡大領域は、マススペクトルに伴う化学的ノイズのレベルを示す。比較して、同様の混合物の中性脱離モードＭＳ／ＭＳスペクトル（２価に荷電したプリカーサーの各々に対する８３Ｄａ及び８５．５Ｄａの中性脱離、及び３価に荷電したプリカーサーの各々に対する５５．３Ｄａ及び５７Ｄａの中性脱離）を図１３Ｂに示す。再び、各スペクトルのｍ／ｚ  ７００−８００の領域を１０倍拡大し、化学的ノイズレベルを表示した。図１３ＢにおけるＭＳ／ＭＳ中性脱離スキャンモードのイオンの増加に関し観察された割合は、基本的に図１３ＡにおけるＭＳイオンの増加に関し観察されたものと同一であり（ペプチドの２価及び３価の荷電状態に対し１．０２：１の比率が得られた）、化学的ノイズは図１３Ａにおけるマススペクトル中に観察されるものと比較して、その大きさが少なくとも２桁減少している。実際、単一データポイントのノイズである「スパイク」により特徴付けられる電気的ノイズの例外を除いて、中性脱離ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ベースライン上の非特異的化学的ノイズを全く示さなかった。
【０１４３】
ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）のｄ０−及びｄ５−含有メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウムイオン誘導体の１．０ｐｍｏｌ／μＬ：０．１ｐｍｏｌ／μＬの混合物のマススペクトルを図１４に示す。２価及び３価の荷電イオンはそれぞれ１０．１２：１及び９．７２：１であることがわかった。中性脱離スキャンモードＭＳ／ＭＳ実験（図１５）により観察されたイオンの比率は９．４５：１及び１０．８３：１であった。再び、ＭＳ／ＭＳ中性脱離スキャンモード実験における化学的ノイズレベルは、マススペクトル中に観察されるものと比較して、その大きさが少なくとも２桁減少した。全ての中性脱離スキャンモードＭＳ／ＭＳ実験について（０．１：１，０．２：１．０，０．５：１．０，１．０：１．０，１．０：０．５，１．０：０．２及び１．０：０．１の比率）、誤差は全て期待値の１０％以内であった。
【０１４４】
スルホニウムイオン誘導体ペプチドプリカーサーから形成される中性脱離プロダクトイオンに対して、共通の生成物が「重」及び「軽」イオンの両方から形成され、したがっていずれかの生成物が「高」エネルギーＣＩＤもしくはＭＳ３によるさらなる構造解析のために選択されることに留意されたい。
【０１４５】
単独のＭＳピークの増大によりこれらの同定を行うことを含む本明細書中に記載のＭＳ／ＭＳ法の付加的な優位点の一つは、イオン対の一つを検出可能にするために両方のイオン（すなわち、軽いイオン及び重いイオン）の存在を必要としないことである。また、これらの例においては、親イオンからの中性脱離の質量はその起源を（すなわち「軽い」又は「重い」サンプルに由来することを）示す。
【０１４６】
特定のアミノ酸残基を含むペプチドの示差定量のために中性脱離スキャンモードＭＳ／ＭＳを用いることと組合せた同位体標識固定電荷誘導体化の手法の有用性を検証するために、ｄ０−及びｄ５−アセトフェノンにより誘導体化したＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）ペプチド１ｐｍｏｌをキャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ及び中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳに供した（それぞれ図１６Ａ、及び１６Ｃ）。その結果、ＭＳにより得られた質量（２価及び３価の荷電イオンについて１．０６：１、及び１．０４：１の比率）及び中性脱離ＭＳ／ＭＳスキャン（２価及び３価の荷電イオンについて１．０２：１、及び０．９９：１の比率）を図１６Ｂ及び１６Ｃに示す。２価に荷電したｄ０−及びｄ５−標識プリカーサーに対する、８３Ｄａ及び８５．５Ｄａの中性脱離、及び３価に荷電したｄ０−及びｄ５−標識プリカーサーに対する、５５．３Ｄａ及び５７Ｄａの中性脱離スキャンを全て合計した。１０％以内の分解能で固定電荷誘導体のｄ０−及びｄ５−型が観察され、これらの固定電荷誘導体に対するクロマトグラフィー的な分離において強力な重水素同位体が存在しないことが示唆された。このことはクロマトグラフィーにおける重水素同位体の効果を制御する因子に関する最近の報告と一致する［Ｚｈａｎｇ，Ｒ．；Ｓｉｏｍａ，Ｃ．Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，７３，５１４２−５１４９．；Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｓｉｏｍａ，Ｃ．Ｓ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ａ．；Ｘｉｏｎｇ，Ｌ．；Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，３６６２−３６６９．；Ｚｈａｎｇ，Ｒ．及びＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００２，１，１３９−１４７］。
【０１４７】
固定電荷誘導体を含むペプチドのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳもしくはイオン−イオン反応ＭＳ／ＭＳによる、Ｏ−連結された翻訳後修飾タンパク質同定及び示差定量
質量分析に対し安定な誘導体である、セリン及びスレオニンのＯ−連結された翻訳後修飾アミノ酸を含むペプチドを形成するためのβ−除去／Ｍｉｃｈａｅｌ付加化学反応と組合せた場合には、固定電荷誘導体化の手法はタンパク質中におけるＯ−連結された翻訳後修飾の状態の同定及び定量へと拡張し得る。Ｏ−連結されたセリン又はスレオニンの翻訳後修飾のβ−除去に続いて、１又は２段階のＭｉｃｈａｅｌ付加反応工程が固定電荷導入に使用可能である。スキーム９に固定電荷誘導体（例えば、４級アンモニウム又はホスホニウムイオン誘導体）を直接的に導入するワン段階工程を図示する。また別の方法では、２段階の工程において、中性の側鎖誘導体を導入し（例えばアルキルチオール）、続いて固定電荷スルホニウムイオンを形成させるために誘導体化することができる。したがって、上記のスルホニウム、４級アルキルアンモニウム又は４級アルキルホスホニウムイオン化学反応は、修飾アミノ酸残基を含むペプチドの選択的検出に使用することができる。類似の方法は、β−除去されたホスホ−セリン及びホスホ−スレオニン残基へのジメチルアミン含有スルフェン酸誘導体の導入についてＳｔｅｅｎ及びＭａｎｎにより記載されており、これによって、プロトン化された低質量フラグメントが、低エネルギーＣＩＤにおけるプリカーサーイオンスキャンモードＭＳ／ＭＳによりｍ／ｚ１２２．０６において検出できる［Ｓｔｅｅｎ，Ｈ．及びＭａｎｎ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００２，１３，９９６−１００３］。しかし、このイオンは必ずしも常に主要生成物として観察されるわけではない。なぜなら、このイオンの生成は、基本骨格のフラグメント化プロセスと競合的だからである。したがって、修飾された側鎖を伴わないプロダクトイオン、及び修飾された側鎖を伴うプロダクトイオンの混合物が存在し得ることになり、同時に、複雑なプロダクトイオンスペクトルをもたらし、このことが、予測されるペプチド配列の知識がない場合の解釈を潜在的に難しくしている。しかし、本明細書中に記載の固定電荷誘導体化法は、修飾された側鎖の限定的な脱離をもたらし、そのことがペプチドの検出をより高レベルの感度へと向上させると共に、続く構造解析のための次なる解離工程をよりよく制御可能にし得る。上記に概説した異なる同位体標識方法と組合せた時には、本発明の固定電荷誘導体化法はＯ−連結された翻訳後修飾状態の示差定量をも可能にし得る。
【０１４８】
【化１４】
2006506647.tif 000017
【０１４９】
固定電荷誘導体を含む架橋されたペプチドのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳもしくはイオン−イオン反応ＭＳ／ＭＳによる、タンパク質−タンパク質相互作用の特性決定
固定電荷誘導体化の手法はタンパク質−タンパク質相互作用の特性決定にも拡張することができ、それは架橋反応前に適切な架橋試薬中に固定電荷誘導体をとりこませること、又は架橋反応後に２つのタンパク質又はペプチド間に含まれる架橋を誘導体化すること（ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳにおける、架橋からの特異的な中性脱離もしくは荷電実体の脱離を介してフラグメント化する）によって行われる。架橋剤上の不安定なＭＳ／ＭＳ「タグ」の取り込みは、低エネルギーＣＩＤにおいて生成する特徴的な低質量プロダクトイオンの検出を介して架橋されたペプチドを同定するために、Ｂａｃｋらにより使用されてきた［Ｂａｃｋ，Ｊ．Ｗ．，Ｈａｒｔｏｇ，Ａ．Ｆ．，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｍｕｉｊｓｅｒｓ，Ａ．Ｏ．，ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ，Ｌ．Ｊ．及びｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００１，１２，２２２−２２７］。一方で、このように生成したプロダクトイオンは比較的増加量の少ないプロダクトイオンのみであると見られた。逆に、上記に概説した固定電荷誘導体を使用してペプチドの同定及び定量を行うために採用される同様の方法において、固定電荷の限定的な開裂に向けた架橋ペプチドのフラグメント化を行わせて、特徴的な中性脱離又は低質量イオンを得るために（スキーム１０）、本発明の方法を採用し得る。架橋ぺプチドを含む上記プロダクトイオンは、次いでより高エネルギーのＭＳ／ＭＳ又はＭＳ３によるさらなる構造調査を行うため自動的に選択される。２種の異種サンプル間の架橋の定量的比較を必要とする場合には、同位体標識を架橋中に取り込ませることもできる。
【０１５０】
【化１５】
2006506647.tif 000018
【０１５１】
所望であれば、固定電荷誘導体を含む上述の任意のサンプルを、公知のクロマトグラフィー的手段により質量分析前に予め濃縮してもよい［Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｒ．及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９６７，１０２，５９３．；Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．及びＫｙｔｅ，Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８，８９，５２９−５３９．；Ｋｙｔｅ，Ｊ．，Ｄｅｇｅｎ，Ｊ．及びＨａｒｋｉｎｓ，Ｒ．Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８３，９１，３６７−３７７．；Ｇｅｖａｅｒｔ，Ｋ．，Ｖａｎ  Ｄａｍｒｎｅ，Ｊ．，Ｇｏｅｔｈａｌｓ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｇ．Ｒ．，Ｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ，Ｂ．，Ｄｅｍｏｌ，Ｈ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｌ．，Ｐｕｙｐｅ，Ｍ．，Ｓｔａｅｓ，Ａ．及びＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００２，１，８９６−９０３］。
【０１５２】
別の方法においては、ビーズ又は不溶性のポリマーに共有結合させた固定電荷試薬を用いた固相の捕捉方法により、固定電荷誘導体を選択的に予め濃縮することができる［Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｒ．；Ｖｉｎｅｒ，Ｒ．Ｉ．及びＨｏ，Ｐ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００２，２３，３１８２−３１９２．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．；Ｒａｎｉｓｈ，Ｊ．Ａ．；Ｗａｔｔｓ，Ｊ．Ｄ．；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２，２０，５１２−５１５．；Ｑｉｕ，Ｙ；Ｓｏｕｓａ，Ｅ．Ａ．；Ｈｅｗｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，７４，４９６９−４９７９．；Ｑｉａｎ，Ｗ−Ｊ，Ｇｏｓｈｅ，Ｍ．Ｂ．，Ｃａｍｐ  Ｄ．Ｇ．，Ｙｕ，Ｌ−Ｒ，Ｔａｎｇ，Ｋ．及びＳｍｉｔｈ．Ｒ．Ｄ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，５４４１−５４５０］。その後、ペプチドの固定電荷誘導体を遊離させ、それにより、分析すべき混合物サンプルの複雑性を質量分析装置への導入前に減少させるために、化学的もしくは光分解的な開裂が用いられる（スルホニウムイオン固定電荷誘導体についてスキーム１１に示す）。
【０１５３】
【化１６】
2006506647.tif 000019
【０１５４】
メチオニン固定電荷誘導体化試薬の好適な実施形態
以下に示す２つの構造式は、本明細書中に記載の研究において今日まで使用されてきたものである。これらはブロモアセトフェノン及び、それが同位体的に重水素（ｄ５）によりコード化標識されたものである。
【０１５５】
【化１７】
2006506647.tif 000020
【０１５６】
この型の好ましい同位体的コード化試薬には１３Ｃ６で標識されたものもあり、その構造を以下に示す。非標識の試薬に対する同位体標識されたものの任意のクロマトグラフィー分離を最小化する目的で、重水素標識よりも１３Ｃ標識が好ましい。この試薬が非標識の試薬が有する性質と同様の性質をもつことは当業者により予測されるであろう。
【０１５７】
【化１８】
2006506647.tif 000021
【０１５８】
さらに好ましい試薬は、上述の試薬の水溶性型である。この付加された特性が、より能率的なサンプル調製手順の流れを可能にするという利便を与えたからである。この試薬の水溶性型、並びにその１３Ｃ６標識型の例を下記に示す。スルフィン酸又はスルホン酸官能基の付加は、アセチル基に関連したオルト−、メタ−、もしくはパラ−位において達成されることに留意されたい。合成のための方法は、これらの位置で任意の１か所に向けた合成を行わせるために選択される；パラの置換位置を下図に示す。
【０１５９】
【化１９】
2006506647.tif 000022
【０１６０】
これらの誘導体の合成についての非限定的な方法は、（ｉ）ベンゼンを２，４−ジニトロフェニルスルフェニルクロリドと反応させてフェニル２，４−ジニトロフェニルスルフィドを得る工程、（ii）さらにこれを無水酢酸と反応させてｐ−アセチルベンゼン２，４−ジニトロフェニルスルフィドを得る工程（iii）ｐ−アセチルベンゼン２，４−ジニトロフェニルスルホンを得るための酸化（iv）メタノール性アルカリを用いて開裂させｐ−アセチルベンゼン２，４−ジニトロフェニルスルフィン酸を得る工程、次いで（ｖ）スルホン酸を得るためのさらなる酸化とそれに次ぐ臭素化工程、もしくは（ｖ）直接的な臭素化工程、を介して行われる方法であり、当業者に知られた方法を用いることができる［Ｂｕｅｓｓ，Ｃ．Ｍ．及びＫｈａｒａｓｃｈ，Ｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５０，７２，３５２９−３５３２．；Ｋｈａｒａｓｃｈ，Ｎ．及びＳｗｉｄｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５４，１９，１７０４−１７０７．；Ｖｏｇｅｌｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．第４版  １９７８．ｐ７７３−７７８．；Ｓｚｍａｎｔ，Ｈ．Ｈ．及びＩｒｗｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５６，７８，４３８６−４３８９］。
【０１６１】
別の方法では、段階（ｉ）及び（ii）に続いて、誘導体は（iii）チオ開裂によって開裂し、ｐ−アセチルチオベンゼン誘導体を得て（iv）スルフィン酸もしくはスルホン酸へと酸化され、次いで（ｖ）臭素化され得る。
【０１６２】
臭素原子は上述の構造における脱離基（すなわち、ＲＸのＸ部分）として示され、ヨウ素もまた好ましい。その他の使用可能な脱離基には：塩素原子のようなハロゲン化物、並びにスルホン酸エステル、過塩素酸エステル、塩化スルホン酸エステル、又はプロトン化アミン又はアルコールを含む［Ｍａｒｃｈ  Ｊ．“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，第４版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ３５２−３５７］。
【０１６３】
上記に示す遊離の酸に加えて、これらの化合物はその塩の形で調製されることができ（例えばナトリウム塩又は塩酸塩）、溶媒和物として調製することができる。
【０１６４】
本発明はまた、質量分析によるアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の分析用試薬キットをも含む。この試薬キットは１以上の上述の化合物、及びタンパク質のジスルフィド還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、トリス−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ））、システインのアルキル化試薬（例えば、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド）並びにビニルピリジンもしくはアクリルアミド）、プロテアーゼもしくは化学的開裂剤（例えば、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ，ペプシン、サーモリシン、臭化シアン、希酸）などのその他の試薬を含む。この試薬はまた、溶媒を含む。使用される典型的な溶媒には尿素、塩酸グアニジン、アセトニトリル、メタノール、水を含む。
【０１６５】
これらの各種試薬を、上述の方法の段階を液相で、もしくは固相で（例えば、この試薬をカラム上に固定化することにより）行うために使用することができる。
【０１６６】
本発明の方法を用いて標識されたアミノ酸又はペプチドは、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の分析に加えて、内部標準としても使用することができる。例えば、対象とする選択されたペプチドの絶対量を定量するための内部標準としてサンプル中に打ち込まれる、同位体的にコード化した既知量のペプチド誘導体を用いる最近の幾つかの報告とある程度類似的に、本明細書中に記載の誘導体化ペプチドを使用することができる［Ｇｙｇｉ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｐ．；Ｐｅｎｇ，Ｊｕｎｍｉｎ．ＰＣＴ  Ｉｎｔ．Ａｐｐｌ．（２００３）ＷＯ  ２００３０７８９６２；Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓｃｏｔｔ  Ａ．；Ｒｕｓｈ，Ｊｏｈｎ；Ｓｔｅｍｍａｎ，Ｏｌａｆ；Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｍａｒｃ  Ｗ．；Ｇｙｇｉ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３），１００，６９４０−６９４５］。これらの報告は、本明細書中に記載のタンデム質量分析検出に適用しやすい固定電荷誘導体の使用を取り入れてはいないことに留意されたい。
【０１６７】
実施例に示されたような本発明に対し、広範に記載された本発明の精神又は適用範囲を逸脱しない多数の変更及び／又は改良がなされ得ることは当業者に理解されるであろう。本発明の実施形態は、したがって、全て説明のためであり、限定的なものではないと考えられるべきである。
【０１６８】
本明細書中に引用した参考文献の開示内容は、参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【０１６９】
本実施例を通じて、「含んでなる、含む」の語は、規定された要素、数、段階もしくは要素群、数の群もしくは段階群の包含を意味するものと理解されるが、その他のいかなる要素、数、もしくは段階、要素群、数の群もしくは段階群を排除するものではない。
【０１７０】
本実施例に含まれる本明細書中のいかなる考察、行為、素材、デバイス、論文又はそれらに類するものは本発明の説明を提供する意図でのみ記載されている。これらの任意の事項、もしくは全ての事項が、本出願の各請求項の優先日以前に存在する公知技術の一部を形成する、もしくは本発明に関連する分野での共通の一般的知識であったと自認すると受け取られるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】１価ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＡ（配列番号１）及びそのメチオニン側鎖固定電荷誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ＋Ｈ］＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）］＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）図１Ｂにおけるプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図２】２価ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＡ（配列番号１）及びそのメチオニン側鎖固定電荷誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）図２Ｂにおけるプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］２＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図３】１価ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）及びそのメチオニン側鎖固定電荷誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ＋Ｈ］＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）］＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）図３Ｂにおけるプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図４】２価ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）及びそのメチオニン側鎖固定電荷誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）図４Ｂにおけるプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］２＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図５】ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）の３価アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ（ＡＰ）＋２Ｈ］３＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）プロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］３＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図６】１価ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）及びそのメチオニン側鎖固定電荷誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ＋Ｈ］＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）］＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）図６Ｂにおけるプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図７】２価ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）及びそのメチオニン側鎖固定電荷誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）図７Ｂにおけるプロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］２＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図８】ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）の３価アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム誘導体の四重極イオントラップタンデム質量分析。（Ａ）［Ｍ（ＡＰ）＋２Ｈ］３＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（挿入図）プロダクトイオン［Ｍ−ＣＨ３Ｓ（ＡＰ）］３＋のＣＩＤ  ＭＳ３。
【図９】（Ａ）ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）の２価メチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウム［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンのエネルギー分解ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。（Ｂ）１２Ｖの衝突エネルギー（ラボラトリーフレーム）で得られた［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル。（Ｃ）２２Ｖの衝突エネルギー（ラボラトリーフレーム）で得られた［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンのＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳプロダクトイオンスペクトル。
【図１０】ＧＡＩＬＡＧＡＩＬＫ（配列番号５）及びＧＡＩＬＭＧＡＩＬＫ（配列番号２）の２価［Ｍ＋２Ｈ］２＋イオンのエネルギー分解ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ。
【図１１】（Ａ）ウシ血清アルブミンの還元及びＳ−カルボキシアミドメチル化したトリプシン消化物を次いでブロモアセトフェノンを用いて誘導体化した該消化物１０ｐｍｏｌの２００μｍ  Ｉ．Ｄ．キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ  ＭＳ分析による全イオン流トレース。全イオン流クロマトグラムの２つの領域における個別のマススペクトルを矢印で示し、図１１Ｂ及び図１１Ｃに表す。
【図１２】（Ａ）ウシ血清アルブミンの還元及びＳ−カルボキシアミドメチル化したトリプシン消化物を次いでブロモアセトフェノンを用いて誘導体化した該消化物１０ｐｍｏｌの２００μｍ  Ｉ．Ｄ．キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ−中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ分析による全イオン流トレース。ペプチドは、ＩＥＴＭＲ（配列番号９）、ＥＴＹＧＤＭＡＤＣＣＥＫ（配列番号１０）、ＴＶＭＥＮＦＶＡＦＶＤＫ（配列番号１１）、及びＭＰＣＴＥＤＹＬＳＬＩＬＮＲ（配列番号１２）である。全イオン流クロマトグラムの２つの領域における個別の中性脱離スキャンモードマススペクトルを矢印で示し、図１２Ｂ及び図１２Ｃに表す。
【図１３】ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）のメチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウムイオン誘導体を含有するｄ０及びｄ５の１．０：１．０ｐｍｏｌ／μＬ混合物の（Ａ）マススペクトル及び（Ｂ）中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトル（［Ｍ（ＡＰ）＋Ｈ］２＋イオンを含有する２価ｄ０−及びｄ５−に対する８３．０  Ｄａ及び８５．５  Ｄａの中性脱離、並びに［Ｍ（ＡＰ）＋２Ｈ］３＋イオンを含有する３価ｄ０−及びｄ５−に対する５５．３  Ｄａ及び５７．０  Ｄａの中性脱離）。
【図１４】（Ａ）ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）のメチオニン側鎖固定電荷アセトフェノンスルホニウムイオン誘導体を含有するｄ０及びｄ５の１．０：０．１ｐｍｏｌ／μＬ混合物のマススペクトル。３価及び２価のプリカーサーに対するｍ／ｚレンジの領域を拡大させたものをそれぞれパネル（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【図１５】（Ａ）ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）のメチオニン側鎖固定電荷アセトフェノンスルホニウムイオン誘導体を含有するｄ０及びｄ５の１．０：０．１ｐｍｏｌ／μＬ混合物の合計された中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳスペクトル。３価及び２価のプリカーサーに対する個々の中性脱離マススペクトルをそれぞれパネル（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
【図１６】（Ａ）ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）のメチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウムイオン誘導体を含有するｄ０及びｄ５の１．０：１．０ｐｍｏｌ混合物の７５μｍ  Ｉ．Ｄ．キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ  ＭＳ分析による全イオン流トレース。（Ｂ）パネル（Ａ）で示された領域から合計したマススペクトル。（Ｃ）ＧＡＩＬＭＧＡＩＬＲ（配列番号３）のメチオニン側鎖固定電荷アセトフェノン（ＡＰ）スルホニウムイオン誘導体を含有するｄ０及びｄ５の１．０：１．０ｐｍｏｌ混合物の７５μｍ  Ｉ．Ｄ．キャピラリーＲＰ−ＨＰＬＣ−中性脱離スキャンモードＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳ分析による全イオン流トレース。（Ｄ）パネル（Ｃ）で示された領域から合計したマススペクトル。
【図１】
2006506647.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2006506647.tif 000042
【図１６】
2006506647.tif 000043
【配列表】
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【国際調査報告】
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