(57)【要約】プレキャストスラブゲルカセットにおいて、ゲルが形成されるモノマー溶液に非イオン性両親媒性ポリマーを含め、ポリマーが含まれる状態でゲルを成型することによって、タンパク質がゲルとカセット壁との間に移動して、不鮮明なバンドを形成し得る通路の形成が避けられる。非イオン性両親媒性ポリマーはまた、結果として得られたゲルが電気泳動後にカセットから取り出される場合に壁に貼り付くのを防ぐ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラブ電気泳動において使用するためのプレキャストポリアクリルアミドスラブゲルを製造する方法であって、
(a)一定の距離で互いに隔てられた一対の化学的に不活性の透明な板によって定められるゲル封入物の中にゲル形成液体混合物を入れる段階であり、該ゲル形成混合物が、水溶液中で、アクリルアミドモノマー、架橋剤、緩衝剤、および約100,000またはそれ未満の分子量を有する非イオン性両親媒性ポリマーを含む段階;ならびに
(b)該ゲル形成混合物を重合してゲルにする段階
を含む方法。
【請求項２】
非イオン性両親媒性ポリマーが約20,000またはそれ未満の分子量を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
非イオン性両親媒性ポリマーが、ポリビニルアルコール、アガロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール/ポリエチレングリコールコポリマー、および直鎖状ポリアクリルアミドからなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
非イオン性両親媒性ポリマーがポリビニルアルコールである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリビニルアルコールが約200〜約20,000の分子量を有する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ポリビニルアルコールが水溶液の約0.5重量％〜約5重量％含まれる、請求項4記載の方法。
【請求項７】
非イオン性両親媒性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ポリエチレングリコールが約200〜約20,000の分子量を有する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
ポリエチレングリコールが水溶液の約0.01重量％〜約0.3重量％含まれる、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
板がガラスである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
板がプラスチックである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
プラスチックが、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー、アクリロニトリルポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンテレフタラートグリコラート、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)からなる群より選択されるメンバーである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
プラスチックがポリスチレン-アクリロニトリル混合物である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
スラブ電気泳動において使用するためのプレキャストポリアクリルアミドスラブゲルであり、
一対の化学的に不活性の透明な板、ならびに
該板の間のポリアクリルアミドゲルキャストであって、該ポリアクリルアミドゲルが、アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の重合によって形成され、該重合が、該アクリルアミドモノマー、該架橋剤、緩衝剤、および約100,000またはそれ未満の分子量を有する非イオン性両親媒性ポリマーを含む水溶液において行われる、ポリアクリルアミドゲルキャスト
を含む、プレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１５】
非イオン性両親媒性ポリマーが約20,000またはそれ未満の分子量を有する、請求項14記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１６】
非イオン性両親媒性ポリマーが、ポリビニルアルコール、アガロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール/ポリエチレングリコールコポリマー、および直鎖状ポリアクリルアミドからなる群より選択されるメンバーである、請求項14記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１７】
非イオン性両親媒性ポリマーがポリビニルアルコールである、請求項14記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１８】
ポリビニルアルコールが約200〜約20,000の分子量を有する、請求項17記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１９】
ポリビニルアルコールが水溶液の約0.5重量％〜約5重量％含まれる、請求項17記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２０】
非イオン性両親媒性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項14記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２１】
ポリエチレングリコールが約200〜約20,000の分子量を有する、請求項20記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２２】
ポリエチレングリコールが水溶液の約0.01重量％〜約0.3重量％含まれる、請求項20記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２３】
板がガラスである、請求項14記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２４】
板がプラスチックである、請求項14記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２５】
プラスチックが、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー、アクリロニトリルポリマー、ポリエチレンテレフタラート、ポリエチレンテレフタラートグリコラート、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)からなる群より選択されるメンバーである、請求項24記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項２６】
プラスチックがポリスチレン-アクリロニトリル混合物である、請求項24記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スラブゲル電気泳動において用いられるポリアクリルアミドゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動をスラブゲルで行うと、数個の試料を同じゲルで同時に分析することができ、結果として得られた電気泳動図は、個々の成分に対応するゲル上のバンドの位置を特定することによって視覚的に観察し、読み取ることができる。ポリアクリルアミドはスラブゲルに広く用いられるゲル材料である。
【０００３】
2枚の透明な平板を典型的に備えたカセットにおいて、スラブゲルは、2枚の平板の間に保持された状態で予め成型された形で供給されることが多い。板はガラスでもプラスチックでもよく、一般的に用いられる1つのプラスチックはポリスチレン-アクリロニトリル混合物である。ある特定のプレキャストポリアクリルアミドゲルの問題点は、貯蔵中に、ゲルがカセットの板から分離するように見られることである。これによって、ゲルと板の一方または両方との間に、試料が電気泳動中に移動できる通路が生じる。この移動によって、親バンド(すなわち、電気泳動分離の直接の結果として形成されるバンド)の鮮明さおよび特定をあいまいにする不鮮明なバンドが電気泳動図に生じる。不鮮明なバンドは、冷却せずに貯蔵されたプレキャストゲルにおいて最もよく生じる。
【０００４】
ポリアクリルアミドスラブゲルにおいて生じる別の問題は、ゲルが板に貼り付こうとする、または付着しようとする傾向である。これは、分離が完了し、染色、撮影または他の観察、検出または記録のためにゲルを板から取り出さなければならない場合に問題となる。板の一方または両方に貼り付いているゲルを取り出そうとすると、ゲルが傷つき、実験が失敗する可能性がある。この問題は、低濃度のゲルおよび等電点電気泳動に用いられるゲルにとって特に深刻である。
【０００５】
溶解酸素がゲル形成液体中に、またはゲル板の近くに存在する場合に、ポリアクリルアミドを形成する重合反応は阻害される。これは、ゲル板がプラスチック(例えば、ポリスチレン-アクリロニトリル)である場合に特に当てはまる。この阻害が起こらないようにするために、板とポリアクリルアミドゲル材料を接触させる前に、ポリ塩化ビニリデンまたはポリ二塩化ビニル(PVDC)のコーティングが板に塗布されることが多い。残念なことに、これらのコーティングは電気泳動像に影響を及ぼし、この影響はゲルと板が分離した結果であるように思われる。これらのコーティングもまた、ゲルが等電点電気泳動ゲル(例えば、pHが5〜8に及ぶ等電点電気泳動ゲル)である場合に貼り付きの問題を悪化させる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ポリアクリルアミドゲルとゲルカセット板との間の明らかな通路による不鮮明なバンドの出現および板へのゲルの付着の両方が、モノマーの他に非イオン性両親媒性ポリマーを含むモノマー溶液からゲルを形成することによって妨げることができるという発見にある。ポリマーは、ゲルが成型される前に溶液に添加され、次いで、依然としてポリマーが存在する状態で成型が行われる。
【０００７】
発明の詳細な説明および好ましい態様
本発明の実施において使用することができる非イオン性両親媒性ポリマーの例は、ポリビニルアルコール、アガロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール/ポリエチレングリコールコポリマー、および直鎖状ポリアクリルアミドである。これらのポリマーは、ゲル形成溶液に添加される前に完全に形成され、ゲル形成溶液に可溶性であり、架橋反応可能な部位を有さない。好ましいポリマーは、約100,000またはそれ未満の分子量を有するポリマーであり、より好ましくは約20,000またはそれ未満の分子量を有するポリマーであり、さらにより好ましくは約200〜約20,000の範囲内の分子量を有するポリマーであり、さらにより好ましくは約200〜約5,000の範囲内の分子量を有するポリマーである。モノマー溶液中のポリマーの重量パーセントは広範囲にわたってもよいが、分子量を小さくすると、より高い重量パーセントのポリマーと等価なまたは同様の結果が得られる傾向がある。例えば、ポリビニルアルコールの場合、好ましい濃度範囲はモノマー溶液の約0.5重量％〜約5重量％である。ポリエチレングリコールが用いられる場合、好ましい濃度は約0.01重量％〜約0.3重量％である。他の非イオン性両親媒性ポリマーの濃度および分子量は日常的な実験によって容易に決定され、多くの場合、当業者に容易に明らかであると思われる。
【０００８】
ゲル形成溶液は、重合して(一般的に、フリーラジカル反応によって重合して)ポリアクリルアミドを形成するモノマー混合物の水溶液である。使用されている、またはポリアクリルアミドゲルの形成に有用であると文献に記載されている任意のモノマー混合物を、本発明の実施において使用することができる。モノマー混合物は、一般的に、アクリルアミド、架橋剤、およびフリーラジカル開始剤を含む。好ましい架橋剤はビスアクリルアミドであり、特に便利な架橋剤は、N,N'-メチレン-ビスアクリルアミドである。
【０００９】
ゲル形成溶液はまた、一般的に、フリーラジカル開始剤系も含む。使用される最も一般的な系は、N,N,N',N'-テトラメチレンジアミン(TEMED)と過硫酸アンモニウムの組み合わせである。他の系は当業者に明らかであると思われる。ゲル形成溶液はまた、既知の、または様々な理由で電気泳動ゲルに用いられている追加成分を含んでもよい。一般的に、電気泳動分離は指定されたpH値で行われるので、緩衝剤が通常含まれる。グリセロールなどの密度調整剤も多くの系において(特に、分離ゲルがスタッキングゲルの下に形成される場合に)有用である。
【００１０】
電気泳動の使用および電気泳動ゲルの調製に熟練した人の中で、ポリアクリルアミドゲルは、パーセントとして表され、以下のように定義されるパラメータTおよびCによって特徴付けられる(式中、「ビス」はビスアクリルアミド架橋剤を指す)：
2006516732.tif 000002
【００１１】
TおよびCの値は、ポリアクリルアミドゲルの使用において一般的に変化するように本発明において変化してもよい。本発明の目的のために、好ましいT値の範囲は約3％〜約30％であり、最も好ましくは約5％〜約20％である。好ましいC値の範囲は約1％〜約10％(約10:1〜約100:1のアクリルアミド:ビスアクリルアミド重量比の範囲に相当する)であり、最も好ましくは約2％〜約4％(約25:1〜約50:1のアクリルアミド:ビスアクリルアミド重量比の範囲に相当する)である。
【００１２】
本発明は、均一濃度のゲルならびに勾配ゲルに適用することができる。均一ゲルを形成する方法および勾配ゲルを形成する方法は両方とも当技術分野において周知である。
【００１３】
ゲルカセットを形成する板は、化学的に不活性の透明な材料(ガラスもしくはプラスチックまたはその両方)である。多種多様なプラスチックを使用することができる。プラスチックは一般的に射出成形可能なプラスチックであり、その選択は、プラスチックが、ゲル形成溶液、ゲルそのもの、カセットにおいて分析しようとする試料中の溶質(典型的にタンパク質)、緩衝剤、および試料に一般的に存在する他の任意の成分に対して不活性であるという必要性によってのみ制限される。これらのプラスチックの例は、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー(SAN, NAS)、バレックス(BAREX)(登録商標)アクリロニトリルポリマー(Barex Resins, Naperville, Illinois, USA)、ポリエチレンテレフタラート(PET)、ポリエチレンテレフタラートグリコラート(PETG)、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)(PEN)である。
【００１４】
以下の実施例は例示のために示され、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００１５】
実施例
勾配ゲルの形成に用いられる3種類のゲル形成水溶液を以下のように調製した(全て重量パーセント)。
溶液A:
アクリルアミド/N,N'-メチレン-ビスアクリルアミド(T=21％、C=2.6％)
10％グリセロール
0.1％TEMED
0.0375％ポリエチレングリコール、重量平均分子量200〜1,000
溶液B:
アクリルアミド/N,N'-メチレン-ビスアクリルアミド(T=6％、C=2.6％)
0.2％TEMED
0.0375％ポリエチレングリコール、重量平均分子量200〜1,000
溶液C:
1.125Mトリス-HCl(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩)、pH8.6
0.15％過硫酸アンモニウム
【００１６】
2枚のスチレン-アクリロニトリルプラスチック板から形成されたスラブゲルカセットを使用した。ゲルの空間は13.4cm×8.4cm×1mmであった。まず最初に、スタッキングゲル溶液がT=4％、PEG濃度が0.025重量％となるように、溶液Bおよび溶液Cの混合物を体積比2/3 B:1/3 Cでカセットの底から注入することによって、ゲルをカセットの内部に形成した。次いで、溶液A、溶液B、および溶液Cの混合物を様々なA量およびB量でカセットの4％ゲル溶液の下に注入することによって、スタッキングゲルの下に勾配ゲルを形成した。T勾配が10.5％〜14％にわたるようにAとBの体積比を変更したが、2体積部のA+Bと1体積部のCの比は維持した。
【００１７】
前述の説明は主に例示を目的としている。さらなる変更、代用、および変化は当業者に明らかであり、本発明の範囲に含まれると考えられる。
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月6日(2005.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スラブ電気泳動において使用するためのプレキャストポリアクリルアミドスラブゲルを製造する方法であって、
(a)一定の距離で互いに隔てられた一対の化学的に不活性の透明な板によって定められるゲル封入物の中にゲル形成液体混合物を入れる段階であり、該ゲル形成混合物が、水溶液中で、アクリルアミドモノマー、架橋剤、緩衝剤、および非イオン性両親媒性ポリマーを含む段階;ならびに
(b)該ゲル形成混合物を重合してゲルにする段階
を含み、
該非イオン性両親媒性ポリマーが、約0.01重量％〜約0.3重量％の濃度のポリエチレンオキシドおよびポリエチレングリコールから選択される、方法。
【請求項２】
非イオン性両親媒性ポリマーが約100,000またはそれ未満の分子量を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
非イオン性両親媒性ポリマーが約20,000またはそれ未満の分子量を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
板がガラスである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
板がプラスチックである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
プラスチックが、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー、アクリロニトリルポリマー、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリ(エチレンテレフタラートグリコラート)、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)からなる群より選択されるメンバーである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
プラスチックがポリスチレン-アクリロニトリル混合物である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
スラブ電気泳動において使用するためのプレキャストポリアクリルアミドスラブゲルであり、
一対の化学的に不活性の透明な板、ならびに
該板の間のポリアクリルアミドゲルキャストであって、該ポリアクリルアミドゲルが、アクリルアミドモノマーおよび架橋剤の重合によって形成され、該重合が、該アクリルアミドモノマー、該架橋剤、緩衝剤、および非イオン性両親媒性ポリマーを含む水溶液において行われる、ポリアクリルアミドゲルキャスト
を含み、
該非イオン性両親媒性ポリマーが、約0.01重量％〜約0.3重量％の濃度のポリエチレンオキシドおよびポリエチレングリコールから選択される、プレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項９】
非イオン性両親媒性ポリマーが約100,000またはそれ未満の分子量を有する、請求項8記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１０】
非イオン性両親媒性ポリマーが約20,000またはそれ未満の分子量を有する、請求項8記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１１】
板がガラスである、請求項8記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１２】
板がプラスチックである、請求項8記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１３】
プラスチックが、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル系ポリマー、スチレン-アクリロニトリルコポリマー、アクリロニトリルポリマー、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリ(エチレンテレフタラートグリコラート)、およびポリ(エチレンナフタレンジカルボキシラート)からなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【請求項１４】
プラスチックがポリスチレン-アクリロニトリル混合物である、請求項12記載のプレキャストポリアクリルアミドスラブゲル。
【国際調査報告】
2006516732.tif 000003