(57)【要約】膀胱癌の治療方法であって、（ａ）膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、１以上の治療薬に結合されたキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる多重特異性抗体を、尿道を介して投与し、該多重特異性抗体を膀胱癌の部位に局在させて、遊離の多重特異性抗体を患者から実質的にクリアリングさせ、かつ、（ｂ）１以上の治療薬に結合された治療上有効な量のキャリヤーを投与することによる、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者において膀胱癌を治療する方法であって、
（ａ）膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、１以上の治療薬に結合されたキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体の治療上有効な量を、尿道を介して投与し、該多重特異性抗体を膀胱癌の部位に局在させて、遊離の多重特異性抗体を患者から実質的にクリアリングさせ、かつ
（ｂ）１以上の治療薬に結合された治療上有効な量のキャリヤーを投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項２】
投与が尿道を介する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１以上の治療剤に結合された該キャリヤーを投与する前に、膀胱に局在した多重特異性抗体の量を決定することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
膀胱に局在した多重特異性抗体の量を、排泄物から回収される多重特異性抗体の量を定量することにより決定する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
膀胱に局在した多重特異性抗体の量を、患者をイメージングすることにより決定し、かつ、多重特異性抗体がトレーサー核種をさらに含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
多重特異性抗体が１以上の抗体フラグメントまたはサブフラグメントを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
多重特異性抗体が、ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ＩｇＧ×ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×ｓＦｖ、（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２、ｓＦｖ×ｓＦｖ、二重特異性抗体（diabodies）、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、および、五重特異性抗体(quintabodies)からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
多重特異性抗体が１を超えるターゲッティングアームを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該１を超えるターゲッティングアームがＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
膀胱癌抗原が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４４、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４；Ｌｅ−ｙ、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６、上皮細胞糖タンパク質（ＥＧＰ）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、腫瘍壊死物質、およびヒト乳汁脂肪グロブリン抗原（ＨＭＦＧ１およびＨＭＦＧ２）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
トレーサー核種が、Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３およびＩ−１３１、またはガドリニウムからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
治療薬が、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３、Ａｃ−２２５、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２またはＲａ−２２３からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
キャリヤー分子が、構造［ＨＳＧ］ｍ−ポリマー主鎖−［ＤＯＴＡ−治療薬］ｎ（ここで、ＨＳＧは認識ハプテンを含んでなり、ｍ≧１かつｎ≧１である）のポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｍ＝１または２である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｎが１〜約１００である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
キャリヤー分子が生体適合性ポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
キャリヤー分子がポリアミノ酸またはポリペプチドであり、ここでアミノ酸は、Ｄ型、Ｌ型、または双方である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
キャリヤー分子が、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）コポリマー、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ）コポリマー、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１）コポリマーまたは２〜５０の残渣長のポリペプチドからなる群から選択されるポリアミノ酸またはポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
キャリヤー分子が、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸／無水物（ＳＭＡ）、ポリ（ジビニルエーテルマレイン酸無水物）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトキシル化ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）ε−［ヒスタミニル−スクシニル−グリシル］−リジンアミド、および、ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−ＤＴＰＡに結合されたアポ−メタロチオネインからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
キャリヤー分子が、それに対して二次認識抗体が惹起され得る免疫剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
治療を必要とする患者において膀胱癌を治療する方法であって、
（ｉ）治療薬に結合したキャリヤーを含んでなる、複合体、および
（ii）膀胱癌抗原と結合するターゲッティングアームと、治療薬のキャリヤーと結合する捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体
を患者に投与することを含んでなる、方法。
【請求項２２】
多重特異性抗体および複合体が、投与前に混合される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
多重特異性抗体および複合体が、実質的にキャリヤーを含まない形態で調製される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗体および複合体を、およそ等モル比で混合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
結合しなかった組成物を、患者から実質的にクリアリングさせることをさらに含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
多重特異性抗体の投与が患者の膀胱の尿道を介する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
多重特異性抗体を、排泄によって患者の尿道からクリアリングさせる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
多重特異性抗体が、カテーテルからクリアリングされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
治療薬が、静脈投与されるか、または患者の膀胱の尿道を介して投与されるか、あるいは両方法により投与される、請求項１または２１に記載の方法。
【請求項３０】
治療薬が患者の膀胱の尿道を介して投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
治療薬が種々の間隔で患者の膀胱の尿道を介して投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
治療を必要とする患者において膀胱癌を治療する方法であって、
（ａ）膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、治療薬のキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体の治療上有効な量を投与し、該多重特異性抗体を膀胱癌の部位に局在させて、非ターゲッティング多重特異性抗体を患者から実質的にクリアリングさせ、かつ
（ｂ）治療上有効な量の該治療薬を投与する
ことを含んでなる、方法。
【請求項３３】
（ａ）の前に、治療薬キャリヤーと治療薬の複合体を実質的にキャリヤーを含まない形態で調製することをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
多重特異性抗体または治療薬または両者が、尿道を介して投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
治療薬が該キャリヤーに実質的に等モル比で結合される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
（ｂ）の前に、膀胱に局在した多重特異性抗体の量を決定することをさらに含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
膀胱に局在した多重特異性抗体の量を、排泄物から回収される多重特異性抗体の量を定量することにより決定する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
膀胱に局在した多重特異性抗体の量を、患者をイメージングすることにより決定し、かつ、多重特異性抗体がトレーサー核種をさらに含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
多重特異性抗体が１以上のフラグメントまたはサブフラグメントである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
多重特異性抗体が、ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ＩｇＧ×ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×ｓＦｖ、（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２、ｓＦｖ×ｓＦｖ、二重特異性抗体（diabodies）、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、および、五重特異性抗体(quintabodies)からなる群から選択されるフラグメントまたはサブフラグメントである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
多重特異性抗体が１を超えるターゲッティングアームを有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
該１を超えるターゲッティングアームがＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
該膀胱癌抗原が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４４、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４；Ｌｅ−ｙ、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６、上皮細胞糖タンパク質（ＥＧＰ）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、腫瘍壊死物質、およびヒト乳汁脂肪グロブリン抗原（ＨＭＦＧ１およびＨＭＦＧ２）からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
トレーサー核種が、Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３およびＩ−１３１、またはガドリニウムからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
治療薬が、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３、Ａｃ−２２５、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２またはＲａ−２２３からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
キャリヤー分子が、構造［ＨＳＧ］ｍ−ポリマー主鎖−［ＤＯＴＡ−治療薬］ｎ（ここで、ＨＳＧは認識ハプテンを含んでなり、ｍ≧１かつｎ≧１である）のポリマーである、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
ｍ＝１または２である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ｎが１〜約１００である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
キャリヤー分子が生体適合性ポリマーである、請求項３２に記載の方法。
【請求項５０】
キャリヤー分子がポリアミノ酸またはポリペプチドであり、ここでアミノ酸はＤ型、Ｌ型、または双方である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
キャリヤー分子が、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）コポリマー、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ）コポリマー、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１）コポリマーまたは２〜５０の残渣長のポリペプチドからなる群から選択されるポリアミノ酸またはポリペプチドである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
キャリヤー分子が、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸／無水物（ＳＭＡ）、ポリ（ジビニルエーテルマレイン酸無水物）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトキシル化ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）ε−［ヒスタミニル−スクシニル−グリシル］−リジンアミド、および、ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−ＤＴＰＡに結合されたアポ−メタロチオネインからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
キャリヤー分子が、それに対して二次認識抗体が惹起され得る免疫剤である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
治療薬が、毒素、化学療法薬、または１以上のハプテンに結合された化学療法薬である、請求項１、２１または３２に記載の方法。
【請求項５５】
薬剤として用いるための、膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、１以上の治療薬に結合されたキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体の治療上有効な量を含んでなる、組成物。
【請求項５６】
膀胱癌の治療に向けた薬剤の製造において用いるための、膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、１以上の治療薬に結合されたキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体の治療上有効な量を含んでなる組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
膀胱癌は、比較的よく見られる癌であり、特に、男性に多く見られ、その発生率は徐々に増加している。表在癌は、一般に、内視鏡切除によって処置されるが、ほとんど全ての患者は膀胱内で新しい腫瘍を発達させ、その多くがより高い病期に達している。長期間かけてのさらなる治療としては、さらなる切除、照射、および化学療法薬およびカルメット・ゲラン菌(bacillus Calmette-Guerin)を使用する方法をはじめとする種々の膀胱内治療が挙げられる。全ての治療法には副作用がある。最終的には、疾患が広がり、膀胱切除（全膀胱と多様な周囲組織の除去）を余儀なくさせる場合がある。膀胱癌は早期に診断されることが多いため、膀胱内投与による特定の治療の影響を受けやすく、それが奏功することが多い。残念なことに、治癒的であるものはなく、事実上、有意義な時間の症候の緩解をもたらす治療は少ない。さらに、膀胱癌がこの器官を超えて広がれば、ほとんど全ての患者はこの転移性疾患に屈する。膀胱癌が膀胱内にとどまる場合でさえ、表面の上皮を超えて筋層に深く浸潤し、その後に患者の腸管から集尿袋(urinary pouch)を作製する必要があり、患者に多大な困難をもたらし、患者の生活の質に大きな影響を与える膀胱全摘出でしか治癒の可能性はない。
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた放射免疫治療（ＲＡＩＴ）は、種々の癌の特異的標的化治療の非常に将来有望な様式であり、癌治療への標準的な放射線治療法および化学療法アプローチに比べて実質的に向上した治療成績が見込める。しかしながら、この治療は放射性標識したｍＡｂを癌患者に注入する場合、放射性免疫複合体が腫瘍標的組織で最大となり、背景組織および循環からクリアリングされる時間を制限する必要があるという欠点がある。無傷の放射性標識免疫グロブリンＩｇＧに対してはかなり長く、放射性標識ＩｇＧフラグメントおよびサブ−Ｆａｂ’フラグメントに対しては幾分短いこの時間の間、患者は非疾患標的照射(non-disease-targeted radiation)に曝される。主として、ｍＡｂ局在化段階の間受けるこの非標的照射は、放射能毒性に直接変わる。このことから、投与できる放射性標識ｍＡｂの全量が制限され、 ほとんどの固形腫瘍（癌腫）が造血系新生物と比べて比較的放射線抵抗性であるために５０〜８０Ｇｙの範囲の腫瘍線量を必要とする最適なＲＡＩＴを実現するための投与量の増加が抑えられる。
【０００３】
この問題を克服するため、放射性核種の送達を、一般にプレターゲッティングと呼ばれる方法での最初のターゲッティング工程から切り離した。この系では、局在部分、通常、腫瘍抗原と結合する少なくとも１つのアームと、低分子量ハプテンと結合する少なくとも１つの別のアームを有する多重特異性抗体（ｍｓＡｂ）（例：二重特異性抗体（ｂｓＡｂ））を患者に施与し、腫瘍組織にて最大とし、その一方で、正常組織からクリアリングされる。しばらくして、低分子量ハプテンを放射性標識した形態で施与する。後者のものは腫瘍にプレターゲッティングした多重特異性抗体に局在するが、それ以外は急速に循環および正常組織からクリアリングされる。ほぼ投与直後に多重特異性抗体を介して放射性種を腫瘍標的に局在させ得ることで治療可能比を劇的にプラスにシフトする一方で、結合しなかった放射活性が腎臓および尿を介して排出される。放射活性の増加分は腫瘍標的に向けられ、正常組織はそれを逃れ、その結果、全毒性が低下する。
【０００４】
膀胱内ＲＡＩＴは、これまで、膀胱癌の治療に向けて提案され、研究されてきた。Murray et al., J Nucl Med 2001; 42: 726-732, 2001; Hughes, et al., J. Clin. Oncol., 18: 363-370, 2000、および Syrigos, et al., Acta Oncol., 38: 379-382, 1999を参照。従来のＲＡＩＴと同様に、放射性核種とモノクローナル抗体の複合体を使用して、尿道を介して直接膀胱に送達させる。他の主要な内臓（例えば、骨髄、肝臓、脾臓および肺）には放射性免疫複合体への曝露がないことから、毒性の大幅な低下が予想される。そのため、膀胱癌を表示させるための放射性核種とモノクローナル抗体との直接複合体の使用には、他の癌を対象とする標準的なＲＡＩＴに対して大きな可能性ある利点がある。しかしながら、このアプローチへのこれまでの試みでは（上記参照）、放射性標識された抗体の腫瘍での高い取込みは短時間でしか達成されず、２４時間までに消失する(Hughes 2000)。さらに、Murray 2001では、使用された放射性免疫複合体が不安定であることが判明し、抗腫瘍活性の証拠がないことが報告された。このように、放射活性の膀胱癌への局在化は膀胱内投与によって達成され得たが、現在までに抗腫瘍活性の証拠が得られておらず、観察された標的化は、表在性膀胱癌、および放射性核種から放出された放射線を用いて成功した治療には不適当である期間に限定されていた。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の１つの態様は、治療を必要とする患者において膀胱癌を治療する方法であって、
（ａ）膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、１以上の治療薬に結合されたキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体の治療上有効な量を、尿道を介して投与し、該多重特異性抗体を膀胱癌の部位に局在させて、遊離の多重特異性抗体を患者から実質的にクリアリングさせ、かつ
（ｂ）１以上の治療薬に結合された治療上有効な量のキャリヤーを投与する
ことを含んでなる、方法である。
【０００６】
本発明のもう１つの態様は、治療を必要とする患者において膀胱癌を治療する方法であって、
（ｉ）治療薬に結合したキャリヤーを含んでなる複合体、および
（ii）膀胱癌抗原と結合するターゲッティングアームと、治療薬のキャリヤーと結合する捕捉アームとを含んでなる多重特異性抗体
を患者に投与することを含んでなる、方法である。
【０００７】
本発明のさらにもう１つの態様は、治療を必要とする患者において膀胱癌を治療する方法であって、
（ａ）膀胱癌抗原と結合する少なくとも１つのターゲッティングアームと、１治療薬のキャリヤーと結合する少なくとも１つの捕捉アームとを含んでなる、多重特異性抗体の治療上有効な量を投与し、該多重特異性抗体を膀胱癌の部位に局在させて、非ターゲッティング多重特異性抗体を患者から実質的にクリアリングさせ、かつ
（ｂ）治療上有効な量の該治療薬を投与する
ことを含んでなる方法である。
【発明の具体的説明】
【０００８】
全てのＲＡＩＴプロトコールに関して存在し、上記の膀胱内ＲＡＩＴに関してなお残り、本発明が対象とする大きな問題は、依然として取り組まれていない。この問題は、以下で詳細に記述するように、多重特異性抗体技術、ターゲッティング試薬および治療用試薬の膀胱内投与アプローチ、第二の治療用キャリヤーの任意的な全身送達、および有用なＲＡＩＴ核種に対するキャリヤーの賢明な選択を新規に組み合わせることによって取り組まれている。本発明により送達させる治療薬としては、限定されるものではないが、放射性核種が挙げられる。
【０００９】
この大きな問題は、施与した投与量に対するｍＡｂの腫瘍の絶対的取込みが、ほとんどの場合、臨床条件で非常に低いこと（組織１ｇ当たり０．０１〜０．００００１％注入量であることが多い）および腫瘍における放射活性の滞留時間が必要な放射線量を実現するには十分でないことが多いことである。そのため、注入した放射性標識ｍｓＡｂのごく一部だけが標的組織に実際に比較的短期間局在するが、かなり大きく過剰なものが正常組織全体に分布し、毒性をもたらす。局在化はそれによって抗体をそれらの標的組織と結合させるプロセスであり、一般に、１〜１０時間内に起こる。膀胱内ＲＡＩＴを採用することで、同等の腫瘍の取込みが得られる上に全身毒性を回避することができ、それゆえ、治療可能比を所望の方向にシフトする。しかしながら、その腫瘍の絶対的取込みは、依然として非常に低いままであり、ターゲッティング抗体によってターゲッティングすることができる抗原部位の数によって制限された範囲に抑えられる。また、腫瘍の膀胱内ＲＡＩＴによって送達された放射能への曝露時間は２４時間内であり、そのため、癌の有効放射には不十分であることが分かっている(Hughes 2000)。上記のように(Murray 2001)、膀胱癌治療に向けた膀胱内ＲＡＩＴのこのアプローチを試みて、安定な放射性複合体を使用し得た者はおらず、その結果、腫瘍に適切かつ特異的に照射することはできなかった。よって、これらの問題を解決するためには他の方法が必要とされる。これらの問題に加えて、全ての抗体分子が放射性核種分子と関連するというわけではないことからの欠乏もある。これは放射能ペイロードを保有していないｍＡｂ分子が利用可能な抗原性部位の大部分を標的化することを意味する。内在化および／または再循環がない場合、１０に１つのｍＡｂ分子が放射性核種原子を保有するならば、１０に１つの抗原部位だけが放射性核種により標的化され得る。実際の問題として、１０に１つの放射性核種保有ｍＡｂ分子が、事実上、非常に有益なｍＡｂ対放射性核種比であり、その比が１００に１つか、またはそれよりも低くてよいことも多い。例えば、治療用放射性核種レニウム−１８８で、タンパク質１ｍｇ当たり１ｍＣｉにて標識したｍＡｂのサンプルを考えた場合、およそ２００に１つのｍＡｂ分子が放射性Ｒｅ−１８８原子と実際に結合する。より多くの放射性核種が、それらの腫瘍の限られた数の抗原部位を不所望に遮断することなく、それを必要とする抗原部位に向けられ、より長時間の膀胱癌細胞の放射線治療薬への曝露を達成するるならば、膀胱内ＲＡＩＴの改善があることは明らかであろう。
【００１０】
プレターゲッティングを利用することにより、ターゲッティングｍＡｂが放射能ペイロードを保有する必要性がなくなる。化学または放射線分解事象に関連した厳しい状況の負担が重いか、またはそれを受ける状態にある場合には、ｍＡｂは、それらの抗原性標的との結合能が容易に低下するデリケートな生体分子であるために、多重特異性抗体（ｍｓＡｂ）を使用することで、直接複合体を用いる膀胱内ＲＡＩＴで明らかな送達受容能力の実際問題を克服するまれな機会が与えられる。認識ハプテンが多重特異性抗体と結合すると複合体が形成される。
【００１１】
ｍＡｂターゲッティング工程を放射性核種ターゲッティング工程と分ける場合、ターゲッティングベクターとしてｍｓＡｂを使用することにより、放射性核種結合部分の設計がかなり自由なものとなる。これらの態様については以下で詳細に記述する。さらに、放射性核種結合部分が血液系を通じてよりも尿道を介して膀胱に直接貯留される特に好ましい態様は、血液および組織での放射性核種複合体の安定性、全身薬物動態、および非ターゲッティング組織での不所望の代謝に対して存在するいくつかの制約を取り除いている。放射性核種がキレートと結合すると複合体が形成される。さらに、ｍｓＡｂを腫瘍に局在させた後に放射性核種保有部分を投与すると、腫瘍のより長時間の照射がもたらされる（好適な放射性核種および放出する放射線の路程が選択される場合にはより深部の腫瘍を含む）。膀胱外での腫瘍播種が疑われるか、またはこのような拡散の予防が望まれる場合には、所望により、次いで、第二の放射性核種結合部分を全身に施与してもよい。
【００１２】
優れたＲＡＩＴは、次の方法を用いて行われる：ｍｓＡｂを、好ましくは、膀胱癌患者の尿道を通じて投与し、腫瘍組織に局在させ、短時間に最大とする。結合しなかったｍｓＡｂの排出後に、放射性標識された部分を静脈内および／または膀胱内施与し、短時間、プレターゲッティングｍｓＡｂと結合させる。過剰の放射性標識部分を排出させ、腫瘍と結合した放射活性だけを残し、それが崩壊する。このプロセスを、腫瘍に送達する照射線量を高めるために繰り返すことができる。別の態様では、ｍｓＡｂを放射性標識された認識部分と前もって混合し、膀胱内注入する。結合しなかったｍｓＡｂの排出後、残留する放射活性が腫瘍貯留物の部位にて崩壊する。これらのアプローチでは、電離放射線を選択的に癌細胞に２４時間を超える時間（４８時間を超える場合もある）送達する。これは、一つには、使用する放射性免疫複合体が他の正常組織よりも腫瘍に多くの放射活性を送達するよう十分に安定であることが理由である。
【００１３】
さらに、本発明のいかなる態様も以下のことをさらに含んでなることができる：  １以上の治療剤に結合された該キャリヤーを投与する前に膀胱に局在した多重特異性抗体の量を決定すること。また、膀胱に局在した多重特異性抗体の量が排泄物から回収される多重特異性抗体の量を定量することにより決定される本発明のいかなる方法も実施することができる。膀胱に局在した多重特異性抗体の量が患者をイメージングすることにより決定され、該多重特異性抗体がトレーサー核種をさらに含んでなる本発明のいかなる方法も実施することができる。トレーサー核種は、Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉ−１２３およびＩ−１３１、またはガドリニウムからなる群から選択され得る。
【００１４】
特異的ターゲッティング
具体的に、標的化薬剤が身体の中枢循環系および異化系を通過することなくターゲッティング可能な、膀胱癌における処置可能な腫瘍部位が存在することが、患者の膀胱に投与されるｍｓＡｂの相当量（ほとんど全てである場合もある）を腫瘍組織に局在させ得ることを意味する。よって、全身的ｍｓＡｂアプローチに見られる特異的な標的の少量取込み／非標的の多量分布（特異的な標的組織対非標的組織における注入量の残留、０．０１−０．０００１％ＩＤ／ｇ）は不適切とされる。種々の標準的な方法を使用した患者の経験的試験を利用して、膀胱に局在する疾患の範囲を決定し、それにより、施与するターゲッティング抗体の好適な量を決定することができる。生検またはイメージングによるなどの当技術分野では公知の方法を使用した膀胱に局在した抗体の量の決定を利用することができる。これが標準的な全身的ＲＡＩＴである場合には、患者は、実際には１０〜１０００ごとに１つのｍＡｂ分子が破壊性崩壊し得る放射性核種原子を保有する核種−ｍｓＡｂ複合体を受ける。
【００１５】
本発明では、上記のターゲッティング工程を膀胱癌で発現された腫瘍抗原と反応する１つのアームを有するｍｓＡｂを用いて実施する。一度、過剰なｍｓＡｂを実質的にクリアリングさせたら、多数の利用可能な抗原腫瘍部位は投与したｍｓＡｂで飽和され、そこにｍｓＡｂによって認識される放射性標識されたハプテンを施与する。投与した抗体の約９０％以上が患者の体内から出れば、抗体は実質的にクリアリングされたと考えられる。放射性標識ハプテンの投与量は、前もって膀胱に局在したｍｓＡｂの量から決定することができる。そして、後者は放射性標識ハプテンの投与に先立ち、投与したｍｓＡｂの量と排出段階で回収された量から容易に決定することができる。１つの好ましい態様では、膀胱に滞留するｍｓＡｂの量は、少量のトレーサー放射性核種で放射性標識したｍｓＡｂを使用し、所望により、放射性標識ハプテンの投与の前に患者をイメージングすることにより決定することができる。当然のことながら、疾患ターゲッティングｍＡｂからの放射性核種のデカップリング行為によって、直接ｍＡｂ放射性標識の最大達成可能比放射能によるターゲッティングに課された制限も外される。言い換えれば、放射性標識ハプテンを、核種対認識ハプテン比  １：１にて調製することができれば、腫瘍組織の各ｍｓＡｂが１つの放射性核種原子を局在させることができる。本発明の前混合方法およびプレターゲッティング方法の両方を使用することにより、およそ等モル比の抗体と活性剤を送達することができる。およそ等モル比は、約１：１〜約１：１０、１：１０までのあらゆる比、例えば、１：２、１：３などであることができる。モル比が１：１０未満である場合、それらはより好ましくは、１：６未満、より好ましくは、１：３未満である。さらに、１を超える放射性核種原子を各認識ハプテンと結合させる場合には、局在するｍｓＡｂ当たりに局在する放射性核種の量がこの１：１比を超えることもある。後者は１または２認識ユニットしか有していない部分に放射性核種を多重置換することにより容易に達成することができる。
【００１６】
ｍｓＡｂは、抗原腫瘍組織および放射性標識認識ハプテンの両方に対して十分な親和性を有していることが好ましい。一般に、各標的特異性は長期にわたりその認識部分と結合することができる（一般に、Ｋａ  １０−７Ｍ以上を示す）べきである。しかしながら、この適応に関しては、少し低いＫａもまた有効であり、大きな親和性を有するターゲッティングＡｂほど組織とあまり結合しない傾向にあることが周知であることから、特定の状況（例えば、組織のより深部まで浸透させる必要がある場合）下では、好ましい場合さえあり得る。これに関して、当然のことながら、ｍｓＡｂフラグメントおよびサブフラグメントは本質的にＩｇＧサイズのものなどの大きな分子よりも高い組織浸透性を有するため、それらもまた本発明の実施において特に有用である。標準的な全身投与によるＲＡＩＴおよびｍｓＡｂ  ＲＡＩＴでは、サイズのより小さなターゲッティングベクターを投与するほど、必然的に、より急速な血液クリアランス特性が生じ、標的組織の取込みがより少なくなり、標的の絶対的取込みを、放射性標識ＩｇＧまたはＩｇＧ×ＩｇＧに基づくｍｓＡｂで達成可能なすでに低い絶対レベルからさらに低下させることは周知である。本発明のｍｓＡｂは膀胱内施与されるため、血液クリアランス特性は重要でなく、フラグメントおよびサブフラグメントがより有用なものとされる。
【００１７】
多重特異性抗体
ｍｓＡｂとしては、抗体フラグメント、サブフラグメントおよびその組合せが挙げられる。抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどである。抗体フラグメントは無傷の抗体により認識される抗原と同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体フラグメントはＣＤ２２のエピトープと結合する。また、本発明のｍｓＡｂとしては、限定されるものではないが、ＩｇＧ×ＩｇＧ、ＩｇＧ×Ｆ（ａｂ’）２、ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ＩｇＧ×ｓｃＦｖ、ＩｇＧ×ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’×Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’×ｓＦｖ、（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２、ｓＦｖ×ｓＦｖ、およびｓｃＦｖ×ｓｃＦｖ二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉｓｍＡｂ）も挙げられる。また、ｓｃＦｖ×ＩｇＧ×ｓｃＦｖおよびＦａｂ’×ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ×Ｆ（ａｂ’）２×ｓｃＦｖおよびＦａｂ’×Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’などの種も含まれる。最も好ましくは、ＩｇＧの部位特異的付着部位または一方または両方のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＦ（ａｂ’）２、例えば、操作した炭水化物または操作したまたは解放された遊離チオール基を利用することができる。これらのｍＡｂは二量体であることから、それらは別の２モルのｍＡｂと結合することができる。例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するｍＡｂ、操作された軽鎖炭水化物を有する抗ＣＥＡ  Ｆ（ａｂ’）２を酸化し、ヒドラジド−マレイミド架橋剤を使用して、各軽鎖に少なくとも１つのペンダントマレイミド基を有する抗ＣＥＡ  Ｆ（ａｂ’）２誘導体へと変換することができる。この種は、少なくとも抗キレート−Ｆａｂ’×抗ＣＥＡ−Ｆ（ａｂ’）２−抗キレートＦａｂ’複合体が生成するように、抗キレートＦａｂ’−ＳＨと１：２モル比にて結合させる。得られたｍｓＡｂは標的組織および高分子複合体に対して二価である。それらの最も小さい状態で、ｍｓＡｂは各特異性に対して向けられたペプチド分子認識ユニットを用いて構築され、二重特異性抗体（diabodies）、三重特異性抗体（triabodies）、四重特異性抗体（tetrabodies）、五重特異性抗体(quintabodies)などが挙げられる。さらに、本開示において「ｍｓＡｂ」とは、多重特異性抗体および多重特異性抗体フラグメントを包含するものと理解される。
【００１８】
また、「抗体フラグメント」とは、特異的な抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する合成タンパク質または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基または関連ペプチドからなる最小認識ユニットが挙げられる。
【００１９】
本発明のｍｓＡｂは、本質的にモノクローナルであってもポリクローナルであってもよいが、好ましくは、モノクローナルである。さらに、ｍｓＡｂのターゲッティングアームおよび捕捉アームは、本質的にモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。好ましくは、ターゲッティングアームまたは捕捉アームのいずれかがモノクローナルである。最も好ましくは、ターゲッティングアームおよび捕捉アームのいずれもがモノクローナルである。
【００２０】
本発明のｍｓＡｂは、標識を保有するように操作してもよい。ｍｓＡｂが保有し得る標識の例としては、限定されるものではないが、ビオチン−ストレプトアビジン複合体および放射性同位元素などの標識リガンドが挙げられる。局在化およびクリアランスの追跡を容易にするために、本発明のｍｓＡｂを放射性標識することが有利である。
【００２１】
本発明のいずれの態様でも、多重特異性抗体は１以上の抗体フラグメントまたはサブフラグメントを含み得る。多重特異性抗体は、ＩｇＧ×Ｆａｂ’、ＩｇＧ×ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’、Ｆａｂ’×ｓＦｖ、（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２、ｓＦｖ×ｓＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および、五重特異性抗体からなる群から選択することができる。多重特異性抗体はまた、１を超えるターゲッティングアームを有することができる。１を超えるターゲッティングアームはＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’であってよい。
【００２２】
また、本発明において有用なｍｓＡｂは、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’フラグメントなどの１を超えるターゲッティングアームを有するｍｓＡｂを包含するとも考えられる。従って、１つのアームを認識ハプテンにターゲッティングし、２つのアームを腫瘍関連抗原に向けることができ、またはその逆も可能である。さらに、Ｆ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’フラグメントのＦ（ａｂ’）２部分（Ｆａｂ’部分が放射性標識ハプテンに向けられると仮定すると）は、同一抗原の２つの異なるエピトープ（例えば、ＣＥＡ）または２つの異なる抗原（例えば、ＣＥＡおよびＭＵＣ１）に対して向けることができる。よって、それ自体は、１つのＦａｂ’またはｓＦｖアームが１つの腫瘍抗原に対して向けられ、１つが標的組織の別の腫瘍抗原に対して向けられるというターゲッティング能力の点から見て多重特異性であり得る。さらに、このＦ（ａｂ’）２または（ｓＦｖ×ｓＦｖ）２亜種の１つのターゲッティングアームは腫瘍抗原に対して向けることができるが、別のターゲッティングアームは別のタイプの抗原、例えば、膀胱腫瘍に存在する血管抗原エピトープに対して向けられる。
【００２３】
全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年７月２５日出願の米国出願番号０９／９１１，６１０、１９９５年６月２２日出願の同０９／３３７，７５６、および２００１年４月３日出願の同０９／８２３，７４６で記載されている二重特異性融合タンパク質もまた、本発明で有用である。他の抗体ならびに本発明で有用な組成物および方法としては、１つのＩｇＧ成分と２つのｓｃＦｖ成分を含む変異型二重特異性抗体（ここで、ＩｇＧのＦｃ−ヒンジフラグメントはＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェース領域に１以上のアミノ酸突然変異を含む）、変異体融合ｂｓＡｂ、ｈＭＮ１４ＩｇＧ（Ｉ２５３Ａ）−（７３４ｓｃＦｖ）２、および引用することにより明確に本明細書の一部とされる、２００２年３月１日出願の米国仮出願番号６０／３６１，０３７で開示されている対象物が挙げられる。
【００２４】
標的抗原
本発明の下で有用な標的抗原は、正常な膀胱組織よりも膀胱腫瘍組織により広い範囲で存在するか、または正常な膀胱組織と比べて膀胱腫瘍内の脈管組織により広い範囲で存在するいかなるエピトープも包含する。典型的な  上皮細胞抗原が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４４、ＭＵＣ−１、上皮細胞糖タンパク質（ＥＧＰ）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ヒト乳汁脂肪グロブリン抗原（ＨＭＦＧ１およびＨＭＦＧ２）、および腫瘍壊死物質（例えば、ヒストン）である。また、特に膀胱癌と関連した抗原としては、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４；Ｌｅ−ｙ、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６、およびＶＥＧＦが挙げられる。これらの受容体（またはリガンド）に加えて、対応するリガンド（または受容体）、もしくはリガンド−受容体複合体は、抗体の有効な標的としての役割も果たし得る。例えば、ＶＥＧＦ受容体の他、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲ：ＶＥＧＦ複合体も抗体の有効な標的であり得る。これらの抗原中の多くのものに対する抗体については、科学文献(Goldenberg, J Nucl Med 2002; 43: 693-713)で記述されている。さらなる抗体としては、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、Epstein et al.による特許（米国特許第６，０７１，４９１号、第６，０１７，５１４号、第５，０１９，３６８号および第５，８８２，６２６号）で記載されているように、癌遺伝子産物、および腫瘍壊死物質に対する抗体が挙げられる。また、癌遺伝子のマーカーもしくは産物に対する抗体、またはＶＥＧＦなどの血管新生因子に対する抗体も有用である。ＶＥＧＦ抗体については、Thorpe et al., 米国特許第６，３４２，２２１号、同第５，９６５，１３２号および同第６，００４，５５４号で記述されており、これらは全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる。本発明のいずれの態様においても、膀胱癌抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ４４、ＭＵＣ−１、上皮細胞糖タンパク質（ＥＧＰ）、上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、腫瘍壊死物質、およびヒト乳汁脂肪グロブリン抗原（ＨＭＦＧ１およびＨＭＦＧ２）からなる群から選択され得る。
【００２５】
治療薬
本発明のいずれの態様においても、治療薬としては、放射性核種が挙げられる。典型的な放射性核種としては、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３、Ａｃ−２２５、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２またはＲａ−２２３が挙げられる。
【００２６】
他の治療薬としては、毒素または化学療法薬、特に、癌治療において有用であるものが挙げられる。毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、またはシュードモナス内毒素が挙げられる。
【００２７】
本開示の目的では、化学療法薬としては、あらゆる公知の化学療法薬が挙げられる。公知の化学療法薬としては、少なくとも、タキサン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン；葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカ・アルカロイド、抗生物質、酵素、白金配位錯体、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質からの抑制剤、またはアンタゴニストが挙げられる。さらに具体的には、化学療法薬は、ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、またはアンドロゲンであってよい。なおさらに具体的には、化学療法薬は、アザリビン、ブレオマイシン、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＰＴ−１１、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドキソルビシン、エチニルエストラジオール、エトポシド、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、ゲムシタビン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、酢酸メドロプロゲステロン、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、酪酸フェニル、プレドニゾン、プロカルバジン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキサン、タキソール、プロピオン酸テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビンブラスチン、またはビンクリスチン、およびＢＣＧであってよい。
【００２８】
化学療法薬は、個々の薬物の構造、ならびにそれを結合するペプチドまたはポリマーの構造に基づいて選択される標準的な化学修飾を利用して、１以上のハプテンとの複合体とすることができる。このような標準的な方法は、当業者ならば容易に入手することができる有機合成に関する標準的な書籍(例えば、R. C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, NY, 1989、またはJ. March, Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience, NY, 1985を参照)から容易に得ることができる。一例を挙げれば、標準的な化学療法薬、ドキソルビシンの構造が実例となる。例えば、アントラサイクリン類似体ドキソルビシンは、その１３位に遊離のケト基、そのグリカンの環に遊離のアミノ基および側鎖Ｃ−１４にアルキルヒドロキシル基を有する。これらのうちのいずれを用いてもドキソルビシンをハプテン保有部分の主鎖に結合させ得る。さらに具体的には、グリカンの遊離のアミノ基は、アミドを形成するハプテンのカルボキシル部分、例えば、複数のアスパルチル残基またはグルタミル残基を有するカルボキシル含有ポリマーと結合する可能性がある。ケトンは、ヒドラゾン結合を形成する遊離のヒドラジニル部分も含有するハプテン−ペプチド、例えば、Ｎ末端ヒドラジンを有するテトラペプチドと結合する可能性がある。ヒドロキシル基は、エステル結合を形成するカルボキシル含有ハプテン−ペプチド、例えば、グルタミル残基またはアスパルチル残基を有する短いペプチドと結合する可能性がある。さらに、ドキソルビシンのこれらの基のいずれもを、Pierce Chemical Company (Chicago, IL)から入手可能なものなどの標準的な架橋剤を使用して活性化することができる。例えば、ヒドラジンおよびマレイミドを含むヘテロ二官能性架橋剤をドキソルビシンの１３−ケト基と反応させて、（ヒドラゾン結合した）マレイミド基を保有する中間体ドキソルビシン−リンカー付加生成物を形成することができる。周知のように、マレイミド基は容易な条件下、中性ｐＨにて遊離のチオール基と反応するため、ドキソルビシン−リンカー−マレイミド付加生成物を、チオール含有ハプテン、ハプテン、ペプチドまたはハプテン−ポリマーと反応させて、好適な複合体を生成させることができる。薬物と標的化薬剤を連結するためのこの戦略および類似の戦略については、当技術分野では周知である(例えば、Willner et al. Bioconjug. Chem., 4: 521-527, 1993)。
【００２９】
抗体の調製
二次認識ハプテンに対する抗体を、免疫プライミングの後に目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを作製するという標準的な方法を使用して調製することができる。このようにして、種々の特異的抗体が作製され、大量生産されるが、これらのものとしては、金属−キレート複合体インジウム−ジエチレントリアミン五酢酸（Ｉｎ−ＤＴＰＡ）、およびイットリウム−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（Ｙ−ＤＯＴＡ）に対する抗体、ならびにヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、ビオチンおよびフルオレセインなどの他の多様な種に対する抗体が挙げられる。本発明は、その範囲に、高分子などの大きな構造体のエピトープと結合することができる多重特異性抗体をはじめとする二次認識ハプテンに対する抗体も包含する。腫瘍ターゲッティングｍＡｂおよび二次認識ｍＡｂの特異性および親和性を標準的なファージディスプレイ法を使用して前もって選択することができ、これにより、所望の特性のヒトｍｓＡｂを得ることができる。特異的な抗体は、親和性ならびに結合および解離速度を高めるために当技術分野で公知の技術により熟慮された親和性であり得る。
【００３０】
本発明のＭｓＡｂは、化学結合を使用する周知の方法、体細胞法、または好適な宿主生物でタンパク質を産生させる分子生物学に基づく発現系により製造される。ｍｓＡｂの起源または生産様式は本発明の中心ではないと考えられる。よって、本明細書においてｍｓＡｂとは、多価多重特異性ターゲッティング抗体またはフラグメント／サブフラグメントを包含するものであり、具体的には、二価×二価および三価×一価および三価×二価種、多重特異性ミニ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、五重特異性抗体、およびｓｃＦｖ×ｓｃＦｖタンデムが挙げられる。
【００３１】
好ましい態様では、腫瘍組織で取り込まれた量を容易に定量するために、ターゲッティングｍｓＡｂを放射性標識することができる。これは簡単な減算により行うことができるし、または、いずれにしても、結合していない放射性標識ｍｓＡｂを除去した後に、周知の画像化技術を使用して行ってもよい。放射性核種認識ハプテン複合体の投与の前に、透過性放射性核種を使用して、コンピュータ断層（ＣＴ）もしくは単光子放出コンピュータ断層（ＳＰＥＣＴ）、または陽電子放射断層（ＰＥＴ）撮影を実施することができる。いずれにしても、この定量の目的は、特定の患者に好適である放射性標識認識ハプテンの量をより適切に判定することである。本態様下で画像化するのに有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｇａ−６７、Ｇａ−６８、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、１−１２３またはＩ−１３１が挙げられる。
【００３２】
本発明の認識ハプテンは、プレターゲッティングｍｓＡｂの少なくとも１つのアームによって認識される少なくとも１つのエピトープを有することだけが必要である。これは二価ハプテンの結合が極めて重要となる標準的なｍｓＡｂ  ＲＡＩＴプロトコールとは全く違っている。膀胱内アプローチにおいては、膀胱内容物には多くの血清成分が存在しないので、ｍｓＡｂ認識ハプテン複合体の競合的分解は実質的に低い。さらに、膀胱癌の場合には、代謝的クリアランスプロセスも考慮することができる。ｍｓＡｂ  ＲＡＩＴ治療を全身的に行う場合、本質的に、認識には二価である必要があることが分かっている。それが一価であると、腫瘍標的において長時間保持されるのに十分、プレターゲッティングｍｓＡｂと結合しない。それが三価以上であると、血清中で高分子量複合体が形成することによって、放射性標識認識ハプテンの、主として患者の肝臓および脾臓への早期クリアランスが起こるという危険性があり、腫瘍の取込みが不十分となり、非特異的な放射能毒性が生ずる。そのため、本発明は、不十分な保持および早期クリアランスという二重の問題との関係は最小限に、あるいは無関係に、ｍｓＡｂに対して一価から上のあらゆる価数の認識ハプテンを包含する。
【００３３】
先ほど述べた問題を理由に、ｍｓＡｂプレターゲッティングＲＡＩＴで用いる認識ハプテンの設計には大幅な自由を適用することができる。単純な形では、一価結合が本発明の範囲内で有用であることから、認識ハプテンおよび放射性核種の複合体を使用することができる。この例は、ＤＴＰＡまたはＤＯＴＡを伴う金属イオンキレート、ビオチン−キレート複合体で使用する抗ビオチンｍＡｂ、およびＨＳＧ−キレート複合体で使用する抗ＨＳＧ  ｍＡｂとの反応性を有するアームを有するｍｓＡｂである。これらの例では、金属は放射性のものであり、キレート剤によって強力に結合する。低分子量キレート剤の金属複合体が、金属が適切に精製され、キレート剤が適切に選択されるならば、金属対キレートおよそ１：１比にて作製できることが知られている。本発明で有用な放射性金属としては、粒子放射、例えば、αおよびβ放射体、ならびに／または低エネルギーγ線放射（オージェ放射体）により崩壊するものが挙げられる。それらとしては、網羅するものではないが、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３およびＡｃ−２２５内のものが挙げられる。放射性標識では、これらの金属のうちいずれかのものを最初に過剰のキレート剤により複合体化し、その後、余剰キレート剤を金属キレートから除去することも留意すべきである。この分離は、金属カチオンとの結合後にキレート剤の複数の負電荷を中和することから、通常、イオン交換手順に基づく。このような精製を実施する方法については、科学文献で記載されている。
【００３４】
チオールまたはチオール−アミノ含有リガンドと結合する別の放射性金属も本発明の範囲内で使用できる。これらの放射性金属としては、限定されるものではないが、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３およびＰｂ−２１２が挙げられる。
【００３５】
ハプテン
非金属治療用放射性核種を保有するハプテンも本方法に使用することができる。例えば、認識ユニット、ε−ＨＳＧ−リシル−チロシンおよびＨＳＧ−チロシンをＩ−１２５またはＩ−１３１放射性核種で放射性標識することができ、放射性標識した認識ユニットをｍｓＡｂプレターゲッティング後に使用することができる。治療用α粒子放出核種が望まれる場合には、放射性アスタチンを使用して同様の薬剤を調製することができる。細胞内プロセシング後に細胞内に保持される非代謝形態の放射性ヨウ素を生成する新しい放射性ヨウ素化剤が設計されている。種々のこのような薬剤が科学文献で記載されており、それらを使用して認識ハプテンの残留放射性ハロゲンサブユニットとの複合体を形成させることができる。認識ハプテンと実際に放射性核種を保有する部分との複合体の形成には標準的な有機化学技術および方法を使用する。好適ないずれの化学結合も使用することができ、それらとしては、限定されるものではないが、アミド結合を形成するカルボキシルとアミノ、チオエーテル結合を形成するチオールとハロカーボン、イミン結合を形成し、所望により、第二級アミノ結合に還元可能であるアミノとアルデヒドなどが挙げられる。必要に応じて、短いリンカー（例えば、カルボキシル含有核種キャリヤー（例えば、金属−ＤＴＰＡ）およびカルボキシル含有認識ユニット（例えば、ヒスタミン−スクシニル−グリシン）の連結に使用されるジアミン）を使用することができる。これらの一般的原理は本発明での使用に向けて作製され得る全ての複合体に適用可能であると考えられる。
【００３６】
全身ｍｓＡｂ治療に使用される二価認識ハプテンはこの膀胱内アプローチでも有用である。基本的には、好適ないずれの化学結合によって２つの認識ハプテンを互いに結合させてもよい。例えば、２つの認識ハプテンは、下記に例示したような短い直鎖または環状ペプチドにより連結される：
【化１】
2006501157.tif 000002
【００３７】
これらの例では、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡユニットは、上記の、同じ治療上有用な放射性金属の放射性核種で放射性標識することができる（酸素−窒素リガンドが好ましい）。同様に、キレートＴｓｃｇ−Ｃｙｓ−（チオセミカルバゾニルグリオキシル−システイン−）は、治療用放射性金属（チオール−窒素リガンドが好ましい）で放射性標識されるよう設計されている。ペプチドがＩ−１２５またはＩ−１３１により容易にヨウ素化され得るように、チロシル残基をすでに組み込んでそれらを設計することができる。放射性核種を受け入れ得る１を超えるキャリヤー部位を有するペプチドは、例えば、放射性ヨウ素および放射性金属で二重標識することができる。ペプチドがＤ−アミノ酸を含有し、Ｎ末端がアシル化され、Ｃ末端がアミド化されているように、それらを、酵素に耐性であるように選択することができる。上記の種は、必要に応じて、抗ＤＴＰＡ、抗ＤＯＴＡまたは抗ＨＳＧ二次認識アームを有するｍｓＡｂとともに使用することができる。同じ認識ユニットは、本質的に、ペプチドではない鋳型と容易に結合することもできる。例えば、単純なジアミンは、ＤＴＰＡまたはＤＯＴＡ部分で二重置換することができる。同様に、適切に置換されたジアミノ糖鋳型をＤＯＴＡまたはＤＴＰＡで二重置換することもできる。
【００３８】
また、２を超える認識ユニットを本発明の実施において使用することもできる。最も好ましくは、認識ユニットが放射治療薬、例えば、イットリウム−９０−ＤＯＴＡキレート複合体の不可欠な部分でもある場合にこのように実施される。このような複合体は高分子キャリヤーへと多重置換することができる。イットリウム−９０−ＤＯＴＡなどの薬剤を保有し、本発明で使用される高分子キャリヤーは、非特異的組織の取込み、ならびに大量の放射性核種の肝臓および腎臓などの組織への代謝クリアランスについての懸念がずっと少なくてすむことから、好ましくは、膀胱内投与される。好ましい態様では、高分子タイプ［ＨＳＧ］ｍ−高分子主鎖−［ＤＯＴＡ−イットリウム−９０］ｎ（この場合、ＨＳＧが認識ハプテンを含む）が生成されるように、認識ユニットと放射性核種キャリヤーとが分離される。好ましくは、ｍ＝１、一方、ｎ＝１０〜１００。いずれにしても、認識ハプテンの置換レベルは、高分子ユニット当たり１〜２に維持され、一方、ＤＯＴＡの置換レベルは高分子ユニット当たり最大である。全身的な薬物動態学的問題が除かれたこのタイプの複合体には、Ｙ−９０を容易に過負荷することができる。腫瘍との結合および認識はＨＳＧ含有ｍｓＡｂを介するため、治療崩壊では腫瘍をプレターゲッティングする全てのｍｓＡｂが少なくとも１つのイットリウム−９０原子を送達することが確実になり得る。
【００３９】
本発明のいずれの態様も、キャリヤー分子が構造［ＨＳＧ］ｍ−ポリマー主鎖−［ＤＯＴＡ−治療薬］ｎ（ここで、ＨＳＧは認識ハプテンを含んでなり、ｍ≧１かつｎ≧１である）のポリマーであり得る。（Ｍは１または２であってよく、ｎは１〜約１００であり得る。）請求項１の方法はキャリヤー分子が生体適合性ポリマーであり得る。キャリヤー分子はポリアミノ酸またはポリペプチド（ここで、アミノ酸酸はＤ型、Ｌ型、または双方である）であり得る。キャリヤー分子はポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）コポリマー、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｓｐ）コポリマー、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１）コポリマーまたは２〜５０の残渣長のポリペプチドからなる群から選択されるポリアミノ酸またはポリペプチドであり得る。キャリヤー分子はポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸／無水物（ＳＭＡ）、ポリ（ジビニルエーテルマレイン酸無水物）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトキシル化ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）ε−［ヒスタミニル−スクシニル−グリシル］−リジンアミド、およびｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−ＤＴＰＡに結合されたアポ−メタロチオネインからなる群から選択される。キャリヤー分子は、それに対して二次認識抗体が惹起され得る免疫剤であり得る。
【００４０】
本発明に有用な複合体および二機能性リガンドとしては、その開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる米国特許第５，６１２，０１６号に開示されているものを含む。また、米国特許第６，１２６，９１６号に開示されている結合リガンドおよび２００１年４月４日出願の米国出願０９／８２３，７４６に開示されているキレート剤も本発明において有用である。
【００４１】
ポリマーキャリヤー
本発明の典型的なポリマーキャリヤーはポリアミノ酸（ポリペプチド）であり、例えば、ポリリジン、ポリグルタミン酸（Ｅ；１文字表記）およびアスパラギン酸（Ｄ）（そのＤ−アミノ酸類似体を含む）である。互いに所望の比率のビルディングブロックを有するコポリマーが選択される場合には、ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）｛ポリ［ＫＥ］｝などのコポリマーが特に有利である。これらの比率は、ポリ［ＫＥ］またはポリ［ＫＤ］の場合、１：１０〜１０：１であることが有利と考えられる。ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１）などのアミノ酸ビルディングブロックに基づくより複雑なコポリマーもまた使用し得る。ポリマーの有効な分子量は、一般に、１，０００〜１００，０００ダルトンの範囲内である。アミノ酸ビルディングブロックは、認識ハプテンと治療薬のキャリヤーとして作用するそれらの能力に関してだけでなく、個々の構成ブロックがポリマー複合体全体を構成することができる物理的および生物学的特性に関して選択される。例えば、好ましいポリマー複合体は多重置換されても十分な溶解性を保持するものである。ポリペプチドにおいては、これは多数の荷電残基が存在していることを意味する場合が多い。正味の正電荷を有する薬剤が非特異的に細胞および組織と結合することが時に起こり得るため、もう１つの好ましい特性は生理学的ｐＨにて正味の負電荷を保有する最終的なポリマー複合体にある。ポリペプチドの場合、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの圧倒的多数の酸性残基が最も簡単にこの基準を満たす。第３の好ましい特性は、ポリマー主鎖が膀胱組織に存在する酵素に対して安定であることである。この優先傾向のため、ポリペプチドはＤ−アミノ酸を含み得、アシル化Ｎ末端がアシル化され、Ｃ末端がアミド化される。好ましい分子量範囲に関しては、５，０００〜２５，０００間のベースポリマー重量が特に好ましい。
【００４２】
本発明の範囲内では、完全に定義された分子量のより低分子のポリマーキャリヤーもまた好ましい。これらは固相ペプチド合成技術により化学的に定義された実体として合成することができ、容易に２〜５０の残基鎖長のポリペプチドを作製することができる。このタイプの試薬の第２の利点は、厳密な構造定義以外に、鎖の特定位置に１つまたは所望の数の化学結合手を置く能力である。これらは後に認識ハプテンと治療用放射性核種との、各部分選択された濃度にての結合に使用することができる。
【００４３】
ポリペプチド以外のポリマーを本発明の範囲内で使用することができる。ポリ（エチレン）グリコール［ＰＥＧ］は、多重特異性抗体プロドラッグアプローチに望ましいin vivo特性を有しており、ポリマーの末端に異なる化学的機能性を有する種々の形態で得ることができる。ほとんどのＰＥＧ誘導体はポリマー鎖の一末端にたった２つの機能的反応性部位しか有していないが、分枝鎖単位もまた構成されている。認識ハプテンと治療用放射性核種の運搬に使用することができる他の合成ポリマーとしては、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸／無水物（ＳＭＡ）、ポリ（ジビニルエーテルマレイン酸無水物）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトキシル化ポリエチレンイミン、スターバーストデンドリマーおよびポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）が挙げられる。一例として、複数の無水物単位からなるＤＩＶＥＭＡポリマーを限られた量のアミノ−ベンジル−ＤＴＰＡと反応させて、ポリマー主鎖で所望の置換比率のＤＴＰＡキレートを作製する。次いで、残存する無水物基を水性条件下で開裂して遊離のカルボン酸基を得る。限定数の遊離のカルボン酸基を、標準的な水溶性ペプチドカップリング剤（例えば、ＥＤＡＣ）を用いて活性化し、遊離のアミノ基を保有する認識部分と結合させる。抗体が化合物のＨＳＧ部分に対してすでに惹起されていることから、後者の例はε−［ヒスタミニル−スクシニル−グリシル］−リジンアミド（ＨＳＧＫ−ＮＨ２）である。遊離のα−リジン残基は、後に認識ハプテンのポリマー主鎖との結合点となる。最終的に、場合によっては、使用するポリマーが天然ポリマーであってよい。この例が７つの遊離チオール基を有する低ＭＷタンパク質であるアポ−メタロチオネインの使用である。このタンパク質をｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−ＤＴＰＡと結合させて、チオエーテル結合によりＤＴＰＡ単位を連結することができる。その結果、タンパク質は限定数の、ＨＳＧなどの認識ハプテンを保有するよう改変されたεリシル残基を有することができる。
【００４４】
ポリマー主鎖自体は、免疫剤として使用することができ、それに対して二次認識ｍＡｂを惹起し得る。ポリマーは免疫原性を高めるために巨大分子と結合させることができ、その複合体が免疫原として使用され、抗体発現についてのスクリーニングが標準的な方法を使用して行われる。ポリマー主鎖に対する抗体の生産には、「ユニバーサル」認識ｍＡｂが得られるという利点があり得る。したがって、ＤＴＰＡ、ＨＳＧまたはＤＯＴＡなどの異なる認識ユニットを使用する場合のように、二次抗体認識は特定の薬物には拘束されず、同じｍｓＡｂが同じポリマー主鎖に結合された種々の放射性治療薬に対して使用され得る。２つの異なるポリマー−放射性核種複合体が組み合わせて使用されるならばこの態様は有用であると思われる（併用化学療法を平行させる状況において異なるエネルギーの核種数種類を使用することが有利となる）。本発明において有用なさらなるポリマーについては、全開示内容が引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年７月３１日出願の米国仮出願番号６０／３０８，６０５で記載されている。
【００４５】
投与
患者への投与に関し、ｍｓＡｂプレターゲッティング工程を膀胱内に施すことが好ましい。放射性標識認識ハプテンを膀胱内または全身に、好ましくは、静脈内に、または両経路を組み合わせて施与することができる。放射性標識認識ハプテンを施与する最適な時期は、ｍｓＡｂの膀胱および膀胱壁などの周囲組織からの完全またはほぼ完全なクリアランス後である。しかしながら、もう１つの態様では、両方の薬剤を同時に膀胱内施与することができる。この方法では、患者への投与に先立ち、ｍｓＡｂと放射性標識認識ハプテンが前もって混合される。このアプローチの利点は、該投与の前に、各ｍｓＡｂが放射性標識認識ハプテンと結合することが保証されることである。最後に、当然のことながら、膀胱の内容物排出を促進するために、一般に施与されるまたは実施される他の薬剤または手順を上記の薬剤のクリアランスを速めるためにも実施してもよい。本発明により投与されるいかなる組成物も尿道を介する投与であり得る。
【００４６】
本発明のいずれの態様においても、多重特異性抗体および複合体は投与前に混合され得る。多重特異性抗体および複合体は実質的にキャリヤーを含まない形態で調製され得る。抗体および複合体を、およそ等モル比で混合することができる。また、さらなる態様は、結合しなかった組成物を、患者から実質的にクリアリングさせることである。多重特異性抗体の投与は患者の膀胱の尿道を介するものであり得る。多重特異性抗体は排泄によって患者の尿道からクリアリングさせ得る。多重特異性抗体はカテーテルからクリアリングされ得る。治療薬は静脈投与され得るか、または患者の膀胱の尿道を介して投与され得るか、あるいは両方法により投与され得る。治療薬は患者の膀胱の尿道を介して投与され得る。治療薬は種々の間隔で患者の膀胱の尿道を介して投与され得る。投与の前に、治療薬キャリヤーと治療薬の複合体を実質的にキャリヤーを含まない形態で調製し得る。多重特異性抗体または治療薬または両者が尿道を介して投与され得る。治療薬が該キャリヤーに実質的に等モル比で結合され得る。
【００４７】
本発明はまた、膀胱に局在した多重特異性抗体の量を決定することも含み得る。これは、膀胱に局在した多重特異性抗体の量が排泄物から回収される多重特異性抗体の量を定量することにより決定されることである。また、これは、膀胱に局在した多重特異性抗体の量が患者をイメージングすることにより決定され、該多重特異性抗体がトレーサー核種をさらに含んでなることでもある。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例では、多重特異性抗体（ｍｓＡｂ）複合体の一種である二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）について言及する。また実施例では、放射性核種の送達に用いられるものとして二価ハプテンを挙げる。これらの実施例は単に例示のために示すものであり、本発明の範囲は本明細書に記載されている広範な種の試薬の二重特異性または二価変異体だけに限定されるものではない。
【００４９】
例１：二重特異性抗体の調製
ａ）相補性決定領域をグラフトしたモノクローナル抗体ｈＭＮ−１４（ヒト化；抗癌胎児性抗原［ＣＥＡ］および６７９と呼ばれる抗ハプテン抗体（ネズミ；抗ヒスタミニル−グリシル−スクシンイミジル−（ＨＳＧ−）部分）を個々に、酢酸バッファー中２００μｇ／ｍＬのペプシン（ｐＨ３．７）で１時間インキュベートすることにより消化してＦ（ａｂ’）２フラグメントとする。各場合において、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィーにより、このＦ（ａｂ’）２フラグメントを試薬および副生成物から精製し、実質的に純粋な１００，０００ｋＤフラグメントの生成物を得る。
【００５０】
ｂ）上記ペプシン消化から得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを個々に、０．１Ｍリン酸緩衝０．９％塩化ナトリウム（ＰＢＳ）バッファー（ｐＨ７．５）中、３７℃にて１時間、１０ｍＭの新しく調製したＬ−システインとともにインキュベートする。還元されたＦａｂ’−ＳＨフラグメントを個々に、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＧ−５０−８０  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）を含むスピンカラム上での遠心分離により精製する。生成物であるＦａｂ’フラグメント抗体は、架橋反応まで４℃で維持する。
【００５１】
ｃ）上記ｂ）から得られた６７９−Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、活性化反応物中のジメチルスルホキシドの最終濃度が１５％となるようにジメチルスルホキシドに溶解した２０倍過剰のチオール架橋剤オルト−フェニルジマレイミド（ＯＰＤ）と４℃で３０分間反応させる。生成物６７９−Ｆａｂ’−Ｓ−リンカー−マレイミドを、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で平衡化したＧ−５０−８０ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）を含むスピンカラム上での遠心分離により精製する。６７９−Ｆ（ａｂ’）２−Ｓ−リンカー−マレイミドを１モル当量のｈＭＮ−１４−Ｆａｂ’−ＳＨと混合し、４℃で３０分間反応させる。目的生成物であるｈＭＮ−１４−Ｆａｂ’−リンカー−Ｆａｂ’−６７９［Ｆａｂ’１×Ｆａｂ’２二重特異性抗体］が、ＴＳＫ−３０００(Tosohaas, Montgomeryville, PA)上の分取サイズ排除高速液体クロマトグラフィーにより低分子量の夾雑物および未反応のＦａｂ’種を除去すれば純粋な形で得られる。
【００５２】
例２：イットリウム−９０放射性標識二価ハプテンの調製
図１に示されるＩＭＰ２４１（ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２と呼ばれるモノ−ＤＯＴＡ、ジ−ＨＳＧ二価ハプテンペプチドを、〜６ｎｍｏｌのペプチドおよび〜１ｍＣｉの乾燥Ｙ−９０クロリドを用い、Ｙ−９０で放射性標識する。６μｌの０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）、次いで２．７μＬ（５．９４ｎｍｏｌ）を０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）中、２．２ｍＭのＩＭＰ−２４１溶液へ加える。この溶液をアルミニウムブロックヒーターを用い、５５℃で３０〜４０分間加熱した後、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ（終濃度）でクエンチし、同じ温度でさらに１０分間加熱し、冷却する。
【化２】
2006501157.tif 000003
【００５３】
この溶液を４０μｌの水で希釈し、４．５μＬの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液と混合し、最終のｐＨを〜７．５まで引き上げる。酢酸イットリウム−９０の代わりに酢酸Ｉｎ−１１１で同様の標識を行う。
【００５４】
例３：キャリヤーフリーイットリウム−９０放射性標識二価ハプテンの調製
上記の例２で得られたＹ−９０−ＩＭＰ  ２４１を、下記のように、重力流を用いたＤｏｗｅｘ  ＡＧ１−Ｘ２陰イオン交換樹脂にて、非Ｙ−９０含有ＩＭＰ  ２４１から精製する。この放射性標識溶液を、二方向ストップコックを取り付けた（流れを止める）１ｍｌシリンジ中、０．５ｍｌの樹脂ベッド上に乗せる。１分後、この溶液を樹脂ベッドのちょうど最上部付近まで濾過する。樹脂が接触するまで何分か流れを止めた後、１０×０．１２５ｍｌの水画分を続ける。適用した放射活性の大部分は画分４〜１１に回収される。このアプローチを用いれば、最終生成物において非Ｙ−９０含有ペプチドのレベルに１００倍の減少が達成され、その結果、ペプチド１ｍｍｏｌ当たり２７，８８８ｃｉ  Ｙ−９０の比活性が得られる。Ｙ−９０自体の比活性は〜５００ｃｉ／ｍｇ（４５，０００ｃｉ／ｍｍｏｌ）であることから、ペプチド各１ｍｍｏｌに０．６ｍｍｏｌのＹ−９０が会合ていること、すなわち、Ｙ−９０放射性核種１分子につきペプチド２分子未満に相当する。所望により、二回目にＡＧ１−Ｘ２樹脂を通すと、ペプチド：イットリウム−９０比は１：１に接近するまで低下する。次に、Ｙ−９０−ＩＭＰ  ２４１をそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００５５】
例４：レニウム−１８８放射性標識二価ハプテンの調製
ａ）次に続くレニウム−１８８標識のために下記のように好適な二価ペプチドを調製する：図２に示されるペプチドＩＭＰ  １９２［Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２］がレニウム−１８８標識に用いられる。調製としては、９０ｍＬ部のグルコヘプトン酸溶液につき５４０ｍｇ（５１４μＬ）の氷酢酸を加えることで、グルコヘプトン酸ナトリウム中８００ｍＭ（１７．８５ｇ，１９８ｍｇ／ｍＬ）および１００ｍＭ酢酸ナトリウム溶液９０ｍＬを調製する。次に、バッファー９０ｍＬにつき、抗酸化剤として１８０ｍｇのアスコルビン酸を加える。この混合物３０ｍＬに、１ｍｇ（６．３×１０−７モル）のＩＭＰ−１９２ペプチド、次いで６倍モル過剰の塩化インジウム（１．６ｍＬの２．３×１０−３モルのインジウム原液）を加える。このペプチドのターゲッティングに用いる二重特異性抗体はインジウム−ＤＴＰＡ複合体を認識するので、インジウムを加えて２つのＤＴＰＡ認識部分に結合させる。次に、この溶液に９０ｍｇの塩化スズ二水和物を加え、この混合物を０．２２ミクロンフィルターで迅速に濾過し、この混合物０．３ｍＬを２ｍＬ凍結乾燥バイアルに分注する。これらのバイアルおよび内容（各５０μｇのＩＭＰ  １９２ペプチドを含む）をドライアイス浴を用いて凍結させ、真空下で凍結乾燥する。
【化３】
2006501157.tif 000004
【００５６】
ｂ）タングステン−１８８／レニウム−１８８放射性核種ジェネレーターから好ましくは直接採取した濃縮Ｒｅ−１８８溶出液（１ｍＬ，５０ｍＣｉ）を、１ｍＬのシールドシリンジを用い、パート４ａ）のＩＭＰ−１９２の凍結乾燥バイアルの１つに加える。このバイアルを軽く振盪して内容物を溶かし、バイアルを９０℃で１時間加熱する。冷却後、ＨＰＬＣおよびＩＴＬＣ（即時薄層クロマトグラフィー放射分析）では９０％を超えるＲｅ−１８８がＩＭＰ  １９２に、以下に示される還元型レニウム−ＴｓｃＣＧ複合体としてこれに結合して組み込まれていることを示す。
【００５７】
例５：キャリヤーフリーレニウム−１８８放射性標識二価ハプテンの調製
上記４ｂ）から得られたＲｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２を、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２ｍＬの脱気２００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）で１：１希釈する。希釈したＲｅ−１８８−ＩＭＰ１９２を、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む脱気２００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）で予め平衡化したＳＵＬＦＯＬＩＮＫ（商標）カップリングゲルカラム(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)上部に加える。Ｒｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２をこのカラムのゲルに流し、３０分間、ゲルと接触させておく。その後、Ｒｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２を含むバッファーをカラムから排出し、このカラムを、５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むさらに２ｍＬの脱気２００ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）で洗浄する。次に、Ｒｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２をそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００５８】
例６：アクチニウム−２２５放射性標識二価ハプテンの調製
上記で示したＩＭＰ  ２４１（ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２［図１］と呼ばれるモノ−ＤＯＴＡ、ジ−ＨＳＧ二価ハプテンペプチドを、〜６ｎｍｏｌのペプチドおよび〜１ｍＣｉの乾燥Ａｃ−２２５を用い、Ａｃ−２２５で放射性標識する。好適な塩の例としてはＡｃＣｌ３がある。０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）中、ＩＭＰ−２４１の２．２ｍＭ溶液に、６μＬの０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．４）、次いで２．７μＬ（５．９４ｎｍｏｌ）を加える。この溶液をアルミニウムブロックヒーターを用い、６０℃で１時間加熱した後、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ（終濃度）でクエンチし、同じ温度でさらに１０分間加熱し、冷却する。この溶液を４０μＬの水で希釈し、４．５μＬの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液で最終ｐＨを〜７．５まで引き上げる。
【００５９】
例７：キャリヤーフリーアクチニウム−２２５放射性標識二価ハプテンの調製
上記例６で得られたＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１を、上記例３）に記載のものと同様の手順を用い、重量流を用いるＤｏｗｅｘ  ＡＧ  １−Ｘ２陰イオン交換樹脂にて、非アクチニウム−２２５含有ＩＭＰ  ２４１から精製する。このアプローチを用いれば、最終生成物において非アクチニウム２２５含有ペプチドのレベルに１００倍の減少が達成され、その結果、ペプチド：アクチニウム−２５５比は３：１未満となる。所望により、二回目にＡＧ  １−Ｘ２樹脂を通すと、ペプチド：イットリウム−９０比は１：１に接近するまで低下する。次に、Ａｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１をそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００６０】
例８：高比活性放射性標識ポリマーの調製
ａ）２ｍＬのホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中、ポリ（Ｌ−リジン）１０ｍｇ（約５×１０−８モル；平均分子量約２００，０００と推定））攪拌溶液を、約１００倍モル過剰（〜１．８ｍｇ）のジエチレントリアミン五酢酸ジアンヒドリド（ＤＴＰＡＡ；Sigma Chem. Co., St Louis, MO）で処理する。さらに１５分間攪拌した後、２Ｎの臭化水素酸の滴下を用いてｐＨを４に調整する。室温でさらに１時間後、混合物を分子量カットオフ１０，０００ダルトンの膜中で水に対して透析して副生成物を除去する（なお、３〜１６時間の５回の透析の間で、４回透析物液を交換する）。この生成物の溶液を凍結乾燥により蒸発乾燥させて標題の化合物を回収し、次にこれをアミノ基置換レベルに関して標準的なＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）アッセイにより分析する。生成物をさらに、Ｉｎ−１１／非放射性インジウム標準液を過剰量で加えたサンプルを正確に秤量したものを放射性標識し、標識混合物中の非結合インジウムに対するインジウム取り込み量を求めることにより、ＤＴＰＡキレート含量に関して分析する。
【００６１】
ｂ）上記８ａ）で調製したＤＴＰＡ−ポリ−（Ｌ−リジン）を、１：５の比のＹ−９０：利用可能なＤＴＰＡ残基を用い（これらはインジウム結合アッセイから求める）、Ｙ−９０で放射性標識する。標識は、０．２５Ｍ酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．４）中、室温で１５分間行う。次にこの標識混合物を１当量のインジウムクロリドで処理し、室温でさらに１５分間放置する。Ｙ−９０（インジウム−ＤＴＰＡ）−ポリ−（Ｌ−リジン）はサイズ排除クロマトグラフィーにより精製して過剰量のインジウム金属を除去してもよいし、あるいはさらなる精製を行わずに用いてもよい。このＹ−９０−（インジウム−ＤＴＰＡ）−ポリ−（Ｌ−リジン）はそのまま注射するか、あるいは注射または注入用にさらに希釈する。
【００６２】
例９：β放出放射性核種を用いたプレミックス二重特異性抗体媒介放射免疫治療による膀胱癌患者の治療
表在性の膀胱癌を有する６８歳の男性患者を、例１の二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×６７９−Ｆ（ａｂ’）２［抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ］と例３のキャリアーフリーＹ−９−ＩＭＰ  ２４１二価ハプテンの１：１モル混合物で処置した。予め混合物した放射免疫治療薬を局所麻酔下で挿入した尿道カテーテルを介して膀胱へ導入した。注射に先立ち、膀胱を完全に排出させ、０．９％ＮａＣｌ７０ｍＬ中、７０ｍＬの複合体（２０ｍｇの二重特異性抗体と二価ハプテンに結合された１０ｍＣｉのＹ−９０を含む）を点滴し、９０分間、腫瘍組織と結合させて局在させた。次に、結合しなかった放射性標識二重特異性抗体混合物を、５０ｍＬの０．９％ＮａＣｌを用いて膀胱を洗浄することで、膀胱から尿道を経て排泄させ、投与した放射活性のうち実質的に腫瘍細胞に結合したものだけが留まるようにした。７２時間後、患者を手術室に移し、顕微鏡的に正常な尿路系上皮と膀胱腫瘍の生検を採取した。尿路系上皮は下層にある筋層から分離し、腫瘍および正常組織の放射活性の測定が可能なβシンチレーションカウンターにてアッセイした後、これらの調製物を組織病理学的評価のためにホルマリン中で固定した。腫瘍：正常組織の放射活性に関しては計数値６：１比が認められ、組織学的標本は、比較的無傷な正常尿路系上皮に対し、腫瘍部位では著しい崩壊および壊死領域を示し、選択的な腫瘍溶解の誘導が示唆された。その後３ヶ月にわたる患者の膀胱鏡検査では、明確な癌部位がおよそ５０％を超えて減少および吸収されたことを示した。患者には最初の処置後６ヶ月でこの処置を繰り返し、さらに約３０％の疾病改善を示した。最初の処置から１年の時点で膀胱鏡検査を行ったところ、数個の小さな、明らかな癌病巣が存在することが分かったが、これらは観察期間中、大きくなったようには見えず、患者は膀胱の不快感を感じたり、または尿に血液の痕跡があったりする徴候も最小となったものと思われた。
【００６３】
例１０：β放出放射性核種を用いたプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による膀胱癌患者の治療
再発性膀胱癌を有する別の患者を、抗ｈＭＮ−１４×抗インジウム−ＤＴＰＡ二重特異性抗体からなる二重特異性抗体で、前記例と同様に薬剤を尿道から膀胱へ直接導入することにより処置した。その後２時間の間、定期的に患者に排尿させ、抗原に結合しなかった二重特異性抗体を器官からクリアリングした。特異的ターゲッティングとクリアランスを見込んだ２時間後、上記例５のＲｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２を４０ｍＣｉの用量で患者に静脈注入した。Ｒｅ−１８８放射性標識ペプチドは腎臓を経て膀胱から迅速にクリアリングし、そこに保持されているプレターゲッティング二重特異性抗体と結合するが、一方、捕捉されていない余分なＲｅ−１８８ＩＭＰ  １９２は患者から排泄される。患者はこの手順を十分許容し、６週間後、膀胱鏡検査とともに生検を採取したところ、癌部位の大きさおよび数の減少の形跡が見られ、採取した生検では選択的腫瘍細胞壊死が確認された。
【００６４】
例１１：α放出放射性核種を用いたプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による膀胱癌患者の治療
浸潤性膀胱癌を示す患者を、抗ＥＧＦＲ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体からなる二重特異性抗体で、例９で示すように薬剤を尿道から膀胱へ直接導入することにより処置した。６時間、二重特異性抗体を局在させ、尿としてクリアリングさせた後、上記例６のＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１組成物もまた尿道から膀胱へ導入した。１時間内に、予め導入された抗ＨＳＧ抗体アームの総ての利用可能な部位は導入されたＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１を捕捉した。残留Ａｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１は、クリアランス過程を加速するための液体を付加的に投与することで尿道から排泄された。
【００６５】
例１２：α放出放射性核種を用いたプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による膀胱癌患者の治療
浸潤性膀胱癌を示す患者を、抗ｈＭＮ−１４×抗ＨＳＧＥ二重特異性抗体からなる二重特異性抗体で、薬剤を尿道から膀胱へ直接導入することにより処置した。６時間、二重特異性抗体を局在させ、尿としてクリアリングさせた後、上記例７のＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１組成物もまた尿道から膀胱へ導入した。１時間内に、予め導入された抗ＨＳＧ抗体アームの総ての利用可能な部位は導入されたＡｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１を捕捉した。残留Ａｃ−２２５−ＩＭＰ  ２４１は、クリアランス過程を加速するための０．９％ＮａＣｌ５０ｍＬを投与することで尿道から排泄された。
【００６６】
例１３：放射免疫検出による局在の定量後のプレターゲッティング二重特異性抗体媒介放射免疫治療による膀胱癌患者の治療
再発性膀胱癌を有する患者を、抗ＭＵＣ−１×抗インジウム−ＤＴＰＡアームを有するＩ−１３１放射性ヨウ素化二重特異性抗体で、薬剤を尿道から膀胱へ直接導入することにより処置した。その後２時間の間、定期的に患者に排尿させ、抗原に結合しなかった二重特異性抗体を器官からクリアリングした。特異的ターゲッティングとクリアランスを見込んだ２時間後、平板または単光子放出コンピュータ断層（ＳＰＥＣＴ）技術を用いた放射免疫検出により患者をイメージングし、罹患膀胱組織に保持されるＩ−１３１の範囲およびを投与量に対して見られた数値比から割り出した。次に上記例４のＲｅ−１８８−ＩＭＰ  １９２を、事前の定量的放射免疫イメージングの結果から予め算出した投与量で、尿道から患者に投与した。わずかに余分なＲｅ−１８８ＩＭＰ  １９２を通常の経路で患者からクリアリングさせた。スキャンの結果、４８時間の時点でのイメージングで、既知の病巣がある膀胱の領域に近似して放射性同位元素が特異的に局在することを示し、このスキャンから、腫瘍：非腫瘍比が４：１〜８：１の範囲にあることが割り出された。
【００６７】
本発明の組成物および方法を好ましい態様について記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱せずに、本明細書に記載の組成物、および方法の工程または工程の順序に変更をなし得ることは明らかである。もっと具体的には、化学的および生理学的の両面で関連のある特定の薬剤は、同じまたは類似の結果が達成される限り、本明細書に記載の薬剤の代わりとすることができるのは明らかである。このような類似の置換および改変は総て、付属の特許請求の範囲で定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。本願に挙げられた総ての参照文献は総てのテキスト、例示および図面を含め、引用することにより本明細書の一部とされる。
【国際調査報告】
2006501157.tif 000005
2006501157.tif 000006
2006501157.tif 000007
2006501157.tif 000008
2006501157.tif 000009
2006501157.tif 000010
2006501157.tif 000011