(57)【要約】  高い接着強度を与える直接的かつ広範囲にわたる無機物-基質接触を有する三次元骨様複合体を製造するための、鋳型駆動性の生体無機化プロセスを提供する。pHの増大による十分量の表面及び内部のカルボキシレートのインサイチュー生成が、基質-無機物界面における高親和性の二次元無機物成長を促進するための無機物イオンの核結合部位として作用する。骨様複合体の基質とは、コモノマー及び架橋剤と架橋された加水分解可能なエステル側鎖を有する、重合ベースモノマーからなるヒドロゲル足場である。エステル含有側鎖の加水分解は、尿素の熱分解によって媒介されることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む骨様複合体：
a. ポリマーが重合化合物-(CH2-CR2-COOR1)n-（式中、R1はH又は低級アルキルであり、R2はH又は1〜20個の炭素原子を有する低級アルキルであり、nは10〜100,000である）を含む、ヒドロゲルポリマー足場；
b. 前記ヒドロゲルポリマーの表面及び内部の無機物沈着物であって、カルシウムイオン及び、R1の加水分解開裂後に残っているポリマー基の間のイオン電荷によって結合され、無機物層はナノ結晶質層を形成している、無機物沈着物。
【請求項２】
ヒドロゲルポリマー足場の水含量が20%〜100%である、請求項1記載の複合体。
【請求項３】
重合化合物がpHEMAである、請求項2記載の複合体。
【請求項４】
ポリマー足場が0.1%〜50%の架橋剤をさらに含有する、請求項2記載の複合体。
【請求項５】
架橋剤がR3C(CH2)-C(O)-X-R4-X-C(O)-C(CH2)R3'（式中、R3及びR3'は同じか異なってよく、Hまたは低級アルキルであってよく、ここでアルキル基の数は10個未満であり；R4はアルキル鎖[-(CH2)n-Y-(CH2)n'-]m（式中、n及びn'は独立して1〜10であり、m=1〜500,000である）であり、XはO、S又はNであり、Yは存在しないかO、S、又はNHである）の化合物である、請求項4記載の複合体。
【請求項６】
架橋剤が、ジアクリレート、ジアクリルアミド、ジメタクリレート、又はジメタクリルアミドからなる群より選択される、請求項5記載の複合体。
【請求項７】
架橋剤が、繰り返し単位1〜500,000個の異なる長さを有する、請求項6記載の複合体。
【請求項８】
架橋剤が、アニオン基、ヘテロ原子、極性リガンド、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、核酸、アミノ酸、修飾アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖、コラーゲン、ラミニン、細胞外マトリクス成分、生分解性モチーフ、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される官能基を有する、請求項7記載の複合体。
【請求項９】
架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジメタクリルアミド、又はCH3C(CH2)-CO-O-CH2CH3-O-CO-(CH2)CCH3若しくはCH3C(CH2)-CO-N-CH2CH3-N-CO-(CH2)CCH3の化合物である、請求項8記載の複合体。
【請求項１０】
ポリマー足場が0.1%〜50%のコモノマーをさらに含有する、請求項1記載の複合体。
【請求項１１】
コモノマーがメタクリレート又はメタクリルアミドである、請求項10記載の複合体。
【請求項１２】
コモノマーが、アニオン基、極性リガンド、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、核酸、アミノ酸、修飾アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、コラーゲン、ラミニン、細胞外マトリクス成分、生分解性モチーフ、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される官能基を有する、請求項11記載の複合体。
【請求項１３】
無機化混合物が、Ca2+、PO43-、OH-、CO32-、Cl-、及び他の微量無機元素からなる群より選択される無機成分からなる、請求項1記載の複合体。
【請求項１４】
PO43-イオンに対するCa2+イオンの比が0.5〜4である、請求項13記載の複合体。
【請求項１５】
PO43-イオンに対するCa2+イオンの比が1〜2である、請求項14記載の複合体。
【請求項１６】
無機化混合物が、結晶質、ナノ結晶質、又は非晶質ヒドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、CaO-2P2O5から4CaO-P2O5までの範囲の化学量論を有し、かつ、酸性及び塩基性の条件下で、ヒドロキシアパタイトのものと同様の溶解度挙動を有するリン酸カルシウムからなる群より選択される、請求項15記載の複合体。
【請求項１７】
前記無機化混合物及びpHの緩やかな上昇を調節することができる弱塩基を含有する溶液とヒドロゲルポリマーを接触させることによってR1の加水分解が媒介される、請求項13記載の複合体。
【請求項１８】
初期無機物沈着物がナノ結晶質又は非晶質の無機物の沈着物である、請求項17記載の複合体。
【請求項１９】
伸長した前記無機物層の厚さが約1μm〜7μmである、請求項18記載の複合体。
【請求項２０】
脊椎動物対象内で骨に付着するか、またはインプラント上に沈着するか、有機-無機ハイブリッド材料上に沈着する、請求項19記載の複合体。
【請求項２１】
以下から調製される、複合体構造：
ベースモノマー-(CH2-CR2-COOR1)n-（式中、R1はH又は低級アルキルからなる群より選択され；R2はH又は低級アルキルからなる群より選択され；nは10〜100,000である）；
ジアクリレート、ジアクリルアミド、メタクリレート、及びタクリルアミドからなる群より選択される架橋剤；並びに
カルシウム及びリン酸塩の無機化混合物（前記カルシウムとリン酸塩の比は1Ca対2Pである）。
【請求項２２】
以下の工程を含む、骨様複合体の調製方法：
a. エステル含有側鎖を有する重合ベースモノマーからなる、表面及び内部を有する架橋ヒドロゲルポリマーを形成する工程；
b. ある割合の前記エステル側鎖を加水分解して、ヒドロゲルの表面上および内部に反応性酸性基を形成する工程；及び
c. 前記反応性酸性基を無機物と接触させて、前記ヒドロゲルの酸性表面上および内部にナノ結晶質又は非晶質の無機物沈着物を形成する工程。
【請求項２３】
ベースモノマーが、-(CH2-CR2-COOR1)n-（式中、R1は低級アルキル基であり、R2はH又は任意の低級アルキル基であることができ、nは10〜100,000である）の構造を有する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
ベースモノマーが2-ヒドロキシエチルメタクリレートである、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
架橋が0.1%〜50%である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
架橋剤が、R3C(CH2)-C(O)-X-R4-X-C(O)-(CH2)CR3'（式中、R3及びR3'はHまたは低級アルキルであってよく、ここでアルキル基の数は10個未満であり；R4は[-(CH2)n-Y-(CH2)n'-]m（式中、n及びn'は独立して1〜10であり、m=1〜500,000である）であり、ここで各R4アルキル基は独立して同じか異なってよく；XはO、S、又はNであり、Yは存在しないかO、S、又はNHである）の構造を有する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
架橋剤がジメタクリレート、ジメタクリルアミド、ジアクリレート、又はジアクリルアミドからなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
架橋剤がエチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジメタクリルアミド、又はR3C(CH2)-C(O)-X-R4-X-C(O)-(CH2)CR3'（式中、R3及びR3'はどちらもCH3であり、R4はCH2CH3である）であり、XはOである）の化合物である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
ポリマーが0.1%〜50%のコモノマーをさらに含有する、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
コモノマーがメタクリレート又はメタクリルアミドである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
コモノマーがアニオン基、極性リガンド、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、核酸、アミノ酸、修飾アミノ酸、リン酸化アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、硫酸化アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖、コラーゲン、ラミニン、細胞外マトリクス成分、生分解性モチーフ、及びポリエチレングリコールからなる群より選択される官能基を有する、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
R1基の加水分解が、熱分解又は水性分解して前記ヒドロゲルの内部及び表面に酸又は塩基を穏やかに放出する酸、塩基、又はエステラーゼ酵素の漸進的添加又はインサイチュー生成によって触媒される、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
塩基がアンモニア、水酸化アンモニウム、尿素、ピペリジン、イミダゾール、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム、及びピリジンからなる群より選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
酸が塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、カルボン酸、及び水混和性である（miscible with water）有機酸からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
R1基の加水分解が尿素水溶液の徐熱によって引き起こされる、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
尿素の徐熱が、0.1℃/分〜1℃/分の加熱速度で室温から95℃までである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
加熱速度が0.2℃/分〜0.5℃/分の一定加熱速度である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
尿素の加熱がかき混ぜ又は撹拌を伴わない、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
ヒドロゲル中及び表面上に沈着される前記無機物がリン酸カルシウムである、請求項22記載の方法。
【請求項４０】
無機物中のホスフェートに対するカルシウムの比が0.5〜4である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
無機物がナノ結晶質又は非晶質のヒドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
以下を含む、骨様複合体の調製方法：
a. ヒドロゲル足場を尿素及び無機物からなる溶液と接触させる工程であって、前記ヒドロゲル足場は架橋剤及びモノマーから成り、前記モノマーはエステル含有側鎖を有する置換又は無置換ポリアクリレート誘導体であり、前記架橋剤はジメタクリレート、ジメタクリルアミド、ジアクリレート、又はジアクリルアミドからなる群より選択される工程；
b. 前記溶液を加熱して、尿素を分解しpHを増大させて、前記エステル含有側鎖を加水分解し、前記ヒドロゲル足場の表面上および内部に反応性酸性基を形成する工程；ならびに
c. 前記ヒドロゲルの表面上および内部に無機物沈着物を形成する工程であって前記無機物沈着物が、前記ヒドロゲルの表面及び内部での前記酸性基における核形成の結果として起こる工程。
【請求項４３】
無機物がヒドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、及びリン酸八カルシウムからなる群より選択される、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
無機物沈着物中のホスフェートに対するカルシウムの比が0.5〜4、好ましくは1〜2であり、前記リン酸カルシウム化学量論がCaO-2P2O5〜4CaO-P2O5の範囲でありうる、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
ヒドロゲルが、HEMAモノマー、及び、エチレングリコールジメタクリレート又はエチレングリコールジメタクリルアミドからなる群より選択される架橋剤から形成される、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
pHが約1〜3から約7〜9まで増大する、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
溶液の徐熱が、0.1℃/分〜1℃/分の加熱速度で室温から95℃までである、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
加熱速度が0.2℃/分〜0.5℃/分の一定加熱速度である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
溶液の加熱がかき混ぜ又は撹拌を伴わない、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
溶液の加熱を約10時間〜12時間までに延長して、前記無機物沈着物上に、伸長した無機物層を形成する、請求項49記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体適合性ヒドロゲル足場の使用及び生体無機化により得られる三次元骨様バルク複合体材料の分野に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2002年12月18日に出願された米国特許仮出願第60/434,596号（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）の優先権を主張する。
【０００３】
政府の援助の表明
本発明は、米国エネルギー省により契約第DE-AC03-76SF00098号の下で援助を受けた研究においてなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術
骨は、体内で多くの本質的な機能を果たす複合組織である。骨は、器官を保護し、筋肉付着の支持及び部位を提供し、血液細胞を生成し、本質的なイオンレベルの維持に役立つ。構造的に、天然の骨は、コラーゲン、タンパク質をベースとしたヒドロゲル鋳型、及び無機ダヒライト（dahilite）（炭酸塩化アパタイト）結晶の複合体である。硬い無機材料および基礎となる弾性ヒドロゲルネットワークとの異例な組み合わせにより、天然骨に、低い剛性、引張り力及び圧縮力への耐性、並びに高い破壊靭性などの特有の力学的特性が与えられる。骨の空洞全体に、骨細胞並びに、骨の形成及び再形成のプロセスに絶えず関与する無数の可溶性因子及び細胞外マトリクス成分が存在する。骨に特有の生物機能及び力学的特性は、材料科学者、技術者、及び臨床医にとって種々の用途に関して魅力的であるが、骨の構造の複雑な性質により、骨欠損治療を含む広範な用途のための人工骨様材料の実際の生体模倣的設計が妨げられてきた。
【０００５】
天然の骨の形成は、コラーゲン足場に付着した強酸性のリンタンパク質によるカルシウムアパタイト無機化の誘導によって起こると考えられている（Robey, P. G., Connective Tissue Research, 35 (1-4): p.131-6, 1996; Boskey, A. L., Connective Tissue Research, 35 (1-4): p.357-63, 1996）。おそらく、酸性基がカルシウムイオンの結合部位として働き、有機マトリクスと無機物相との間の界面エネルギーを低下させる（Weiner, S. and Addadi, L., Design strategies in mineralized biological materials. Journal of Materials Chemistry, 1997, 7(5): p.689-702）。
【０００６】
最近、自己集合薄膜（self-assembling thin-film）をベースとした鋳型により誘導される生体無機化について大きな進展があったが
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、そのような戦略の適用は、既存の金属又はアロイ骨置換物の表面被覆に限定される。骨に特有の力学的特性及び生物学的特性（動的吸収及び組織再生）を模擬するためには、被覆上ではなくバルク材料中で骨の複雑な組成及び微小構造を模倣しなければならない。これまで、これらの要求をすべて満たす高機能バルク骨様複合材料はなかった。ほとんどの試みは、生体無機物及びポリペプチドの共沈殿によって調製される、ポリペプチド又は高分子電解質をベースとした有機アパタイトに向けられてきた
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。これらの有機アパタイトは、従来の骨インプラントに対していくつかの力学的改良点を示したが、製造コストが比較的高く、構造的特性に乏しく、かつ、さらなる官能化が困難である。
【０００７】
天然の骨の主な無機成分であるヒドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）によるポリマーフィルムの無機化によって骨を模倣するために、多大な努力がなされてきた。しかし、概して、有機足場およびヒドロキシアパタイトが統合され（integrated）、かつ天然の骨の統合レベルを示す複合材料は、未だ達成されていない。
【０００８】
ヒドロゲルポリマーは、高機能組織操作足場の設計に対して、特に魅力ある候補である。合成ヒドロゲル固有の弾性及び水保持能力は、骨を含む種々の結合組織における構造的足場として広く普及しているコラーゲンマトリクスなどの天然ヒドロゲルと似ている。
【０００９】
ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、すなわちpHEMAは、最も研究されている合成ヒドロゲルポリマーの１つである。高い生体適合性を有するので、pHEMA及びその官能化コポリマーは、組織操作で最も広範に用いられている合成ヒドロゲルの一部となっている。用途には、眼科用器具（例えば、コンタクトレンズ）（Kidane, A.ら、Biomaterials 1998, 19, 2051-2055）、軟骨置換物（Oxley, H. R.ら、Biomaterials 1993, 14, 1064-1072）、歯科用樹脂及び骨セメント中の結合剤（Yang, J. M.ら、Biomed. Mater. Res. 1996, 33, 83-88; Prati, C.ら、Clin. Mater. 1991, 8, 137-143）並びに種々の薬物送達ビヒクル（Lu, S.; Anseth, K. S. J. Controlled Release 1999, 57, 291-300; Sefton, M. V.ら、J. Controlled Release 2000, 65, 173-186）が含まれる。本発明は、例示的なHEMA及び、当前記技術分野で既知でありかつ、本明細書で開示されるHEMAの変化によるHEMA誘導体の、構造上の改変を意図している。
【００１０】
カルシウムアパタイトは、骨付着（apposition）及び、骨芽細胞への間葉細胞の分化を促進することが知られている（Darimont, G. L.ら、Biomaterials 2002, 23, 2569-2575）。ヒドロキシアパタイトは、中性及び塩基性のpHでは水への溶解度が限られるが、酸性pHでは高い可溶性を有する。この特性に基づき、複合セラミック粉末の調製においては尿素媒介性溶液沈殿技術が用いられてきた
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。Wangらは、Biomaterials 23: 4787-4791 (2002)において、ヒドロキシアパタイトを沈殿させてポリアミドマトリクス中に均一に分散させるために、リン酸アンモニウム溶液をpH10〜pH12に保持しながら70℃まで加熱攪拌することによる、ポリアミド（ポリヘキサメチレンアジパミド）を有する生体模倣型複合体の製造方法を記載している。
【００１１】
骨様複合材料の製造において天然の骨の合成を模倣するために、非常に規則正しい分子鋳型を用いて開始し、結晶質アパタイトの鋳型駆動性の無機化を促進することができる（Kim, H. M.ら、Calcif. Tissue Int. 1996, 59, 58-63）。実際には、この手法はナノチューブ複合体に関して続行されてきており、生体模倣的に設計された無機物核形成リガンドを有するペプチド両親媒性物質の超分子凝集物を用いる。あるいは、適切に接着された非晶質又はナノ結晶質の骨親和性無機物組成物との複合材料で出発し、生来の再形成経路を進めて、最終的に引き継ぎ、かつ初期の無機物相を操作することができる。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、エステル含有側鎖を有するヒドロゲルポリマー足場；エステル側鎖の部分加水分解後の無機化混合物との接触によるヒドロゲルポリマー足場の表面及び内部への初期無機物沈着物；並びに初期無機物沈着物から成長した伸長無機物層を含む、骨様複合体を提供する。
【００１３】
本発明の一局面では、ヒドロゲルポリマー足場の水含量は、20%〜100%、好ましくは約40%である。
【００１４】
ヒドロゲルポリマー足場は、以下の構造1に示される構造を有するポリマーを含む：-(CH2-CR2-COOR1)n-（式中、R1はH又は低級アルキルであり、R2はH又は低級アルキルであり、nは好ましくは10〜100,000である）。好ましい態様では、ポリマーはpHEMAである。好ましい態様では、R1はエチルであり、R2はHであり、nは10〜100,000である。
【００１５】
ポリマー足場は、0.1%〜50%の、より好ましくは2%〜10%の架橋剤をさらに含有することができる。架橋剤は、以下の構造2の化合物であることが好ましい：R3-C(CH2)-CO-X-R4-X-C(O)-C(CH2)-R3'（式中、R3及びR3'は、Hまたは低級アルキルであってよく、炭素原子の数は好ましくは10個未満であり；R4は[-(CH2)n-Y[-(CH2)n'-]m（式中、n及びn'は独立して1〜10個の炭素原子）であることができ、m=1〜500,000である）。Yは存在しないか、O、S、又はNHであることができ、XはO、S、又はNのヘテロ原子である。
【００１６】
さらに、架橋剤は、ジアクリレート、ジアクリルアミド、ジメタクリレート、又はジメタクリルアミドからなる群より選択されることが好ましい。好ましい態様では、架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジメタクリルアミド、又は構造IIの化合物（R3がCH3であり、R4がCH2CH3であり、XがO又はNである）である。
【００１７】
ポリマー足場は、0.0%〜50%の、好ましくは0%〜25%のメタクリレートコモノマー又はメタクリルアミドコモノマーをさらに含有することができる。コモノマーは、アニオン基、極性リガンド、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、核酸、アミノ酸、修飾アミノ酸若しくはリン酸化アミノ酸若しくはグリコシル化アミノ酸若しくは硫酸アミノ酸、ペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、コラーゲン及びラミニンなどの細胞外マトリクス成分、生分解性モチーフ、及びポリエチレングリコールを含むがこれらに限定されない官能基を有することができる。
【００１８】
別の局面では、初期無機物沈着物は、ナノ結晶質又は非晶質の無機物沈着物である。初期無機物沈着物は、Ca2+、PO43-、OH-、CO32-、Cl-、及び他の無機元素などの無機成分からなる無機化混合物からなる。PO43-イオンに対するCa2+イオンの比は、0.5〜4であることが好ましく、1〜2であることがより好ましい。無機化混合物は、ヒドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、CaO-2P2O5〜4CaO-P2O5の範囲の化学量論を有しかつ、酸性及び塩基性の条件下でヒドロキシアパタイトと同様の溶解度挙動を有するリン酸カルシウムなどの、無機物混合物でありうる。
【００１９】
本発明の別の局面において、複合体の伸長した無機物層は約1μm〜7μmの厚さである。無機化時間及び条件を延長することによって、伸長した無機物層を成長させることができる。次いで、本発明の複合体を、脊椎動物対象内で骨に付着させるか、あるいはインプラント又は有機-無機ハイブリッド材料に付着させることが好ましい。
【００２０】
本発明はさらに、(a) エステル含有側鎖を有する架橋ポリマーからなる、ヒドロゲル足場を形成する工程、(b) 何パーセントかのエステル側鎖を加水分解して、ヒドロゲルの表面上及び内部に反応性酸性基を形成する工程；ならびに (c) 反応性酸性基を無機物と接触させて、ヒドロゲルの酸性表面上および内部にナノ結晶質又は非晶質の無機物沈着物を形成する工程を含む、骨様複合体の調製方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法において、熱分解又は水性分解して酸又は塩基をヒドロゲルの内部及び表面に穏やかに放出する組成物の漸進的添加又はインサイチュー生成によって、エステル側鎖の加水分解が触媒される。加水分解に用いられる酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、カルボン酸、水混和性である（miscible with water）他の有機酸又は無機酸、及び、これらの酸の生成を導きうるいずれかからなる群より選択されることが好ましい。塩基は、アンモニア、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム又は炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム又は重炭酸ナトリウム、ピペリジン、イミダゾール、ピリジン、他の無機塩基又は有機塩基、尿素、及びこれらの塩基の生成を導きうるいずれかであることが好ましい。この機能、すなわちR1エステルの開裂を行うために、エステラーゼを用いることもできる。
【００２２】
本発明の方法において、加水分解は、尿素の徐熱による尿素の熱分解により生成されうるアンモニアの添加又はインサイチュー生成により、ヒドロゲル足場全体にわたってpHを漸進的に増大させることにより行うことが好ましい。
【００２３】
pHを約1〜3から約7〜9まで増大させ、溶液を、好ましくは、0.1℃/分〜1℃/分の加熱速度、より好ましくは0.2℃/分〜0.5℃/分の間の一定の加熱速度で室温から95℃まで加熱することが好ましい。尿素の熱分解では、かき混ぜ又は撹拌を伴わないことが好ましい。本発明の方法では、溶液の加熱を約10時間〜12時間まで延長して、無機物沈着上に伸長した無機物層を形成することが更に意図される。
【００２４】
好ましい態様の詳細な説明
定義
本明細書中で用いられる「ヒドロゲル」という用語は、水中で膨張し、かつ、架橋剤で重合された1つまたは複数のモノマーからなる、多孔性三次元巨大分子ネットワークを指す。
【００２５】
本明細書中で用いられる「架橋剤」という用語は、その一般的な意味である、すなわち、適切なベースモノマーと反応したときに三次元ネットワークを形成することができる分子である。
【００２６】
本明細書中で用いられる「架橋された」という用語は、架橋剤がベースモノマー分子と反応して三次元ネットワークを形成する場合を指す。
【００２７】
本明細書中で用いられる「無機物」という用語は、Ca2+、PO43-、OH-、CO32-、Cl-、及び他の微量無機元素を含むがこれらに限定されない無機元素からなる、任意の無機化合物を指す。無機化合物は、酸性及び塩基性の条件においてヒドロキシアパタイトと同様の溶解度挙動を有する、結晶質、ナノ結晶質、もしくは非晶質のヒドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）、炭酸カルシウム、及びリン酸カルシウムであって、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、もしくは限定的な組成及び限定的な結晶質、ナノ結晶質、又は非晶質の構造を有する、CaO-2P2O5〜4CaO-P2O5の範囲の化学量論を有するリン酸カルシウムを含むがこれらに限定されない、リン酸カルシウムの化合物を含むことができるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で用いられる「無機化」という用語は、ヒドロゲル足場表面上への又は内部への無機成分の統合を指す。
【００２９】
「足場」という用語は、無機物又はその他の骨無機物の付着のためのポリマーに沿ってイオン部位又は被覆イオン部位を有するか有さない三次元多孔性ポリマー構造を指す。
【００３０】
本明細書中で用いられる「ナノ結晶質」という用語は、肉眼スケールでは結晶質ではなく、非晶質であってもよい無機物形成を指す。それは、図4〜図6及び図8に図示されている。
【００３１】
本明細書中で用いられる「核形成」という用語は、無機カチオンがヒドロゲル中のアニオン部位に集められる無機化の最初の工程を指す。
【００３２】
「低級アルキル」という用語は、置換アルキル残基を含む、1個〜20個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素残基を意味する。置換アルキル残基とは、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アシルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アルキル、アリール又はヘテロアリール基で一置換又は二置換されていてもよいアミノ、アミジノ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、又はヘテロシクリル基で置換されていてもよい尿素、アルキル、アリール、又はヘテロアリール基でN-一置換又はN,N-二置換されていてもよいアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノなどの1〜3個の基又は置換基で独立して置換されている、先に定義された直鎖状アルキル、分枝状アルキル、又はシクロアルキル基である。
【００３３】
本明細書中で用いられる「pHEMA」という用語は、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)を指す。本明細書中で用いられる「pHEMAm」という用語は、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド)を指す。
【００３４】
本明細書中で用いられる「CP」という用語は、リン酸カルシウムを指す。
【００３５】
本明細書中で用いられる「HA」という用語は、ヒドロキシアパタイトを指す。
【００３６】
本明細書中で用いられる「EDS」という用語は、関連するエネルギー分散分光法を指す。
【００３７】
本明細書中で用いられる「XRD」という用語は、X線回折を指す。
【００３８】
本明細書中で用いられる「SEM」という用語は、走査型電子顕微鏡検査を指す。
【００３９】
好ましい態様の説明
無機相と有機相との高親和性統合、動的吸収、及び組織再生などの、骨に特有の力学的特性及び生物学的特性を模擬するため、一般的態様により、多くの特性を有するバルクポリマー足場の設計及び構成を必要とする、被覆上ではなくバルク材料中での骨様複合体及び微小構造が提供される。一般的な態様では、これらバルクポリマー足場は、強固であり、かつ、複合材料の全体的形状を定義するものでなければならず、また、無機物がポリマーネットワーク全体に十分に浸透するのを保証することができるように足場の内部及び表面上のどちらでも効果的な無機物結合部位（すなわち「核形成部位」）を担持しなければならない。細胞の付着及び広がりを促す生物学的リガンドの付着は、対象脊椎動物への複合体の移植により組織の統合が促進されるように、簡便に導入されることが好ましい。最後に、ポリマー足場は、長期間移植用途のために安定的かつ長く持続するか、あるいは短期間用途のために所望の生分解性を達成するように、操作されなければならない。
【００４０】
複合体は、酸性及び塩基性の水性媒体中での無機物の溶解度が劇的に異なること、及び加水分解して対応するカルボン酸にすることができるエステル含有側鎖の化学的に不安定な性質であることを利用する、無機化方法によって形成される。エステル含有側鎖を有するヒドロゲル足場の表面及び内部でのエステルの部分加水分解は、核形成部位として作用する反応性酸性（カルボキシレート）基を形成する。ここで図1を参照すると、図1Aは、ヒドロゲルの内部及び表面上の双方に多数のペンダント（pendant）側鎖3を伴った骨格2を有するヒドロゲル1を図示している。示されたポリマーは、pHEMAである。側鎖3は、4で図示されるエステル結合を含有する。図1Bに示す通り、酸、塩基、又は酵素のいずれかによるエステル結合の加水分解により、反応性酸性基が露出する。次いで、これらの反応性酸性基は、Ca2+イオン、PO43-イオン、及びOH-イオンを有するとして図示される無機物又は無機物含有溶液と接触して、ヒドロゲルの酸性表面及びヒドロゲル中の酸性内部に無機物沈着物を形成することができる（図1B）。したがって、図1Cに示す通り、核形成部位（酸性基）からの不均一な核形成及び、カルシウムアパタイトなどの無機物の高親和性の二次元の外向き成長がゲル表面で起こり、これは、ゲル内部での広範囲にわたるカルシウム沈着を伴う。長期の無機化によって、ヒドロゲル表面全体を覆う厚さ1nm〜7nmの無機物層の成長が可能となる（図1D）。
【００４１】
概して、本方法は、無機物とポリマー基質間の質の高い界面統合を伴う生体適合性複合材料の強固な無機化を生じるための迅速かつ簡便な手法を提供する。界面統合を以下に詳細に記載する。無機物沈着物は好ましくは、ヒドロゲルから容易に剥離できる大きな結晶質無機物の形成をもたらす三次元成長ではなく、最初はゲル-無機物界面で二次元的に成長して、ヒドロゲルに強固に接着した非晶質又はナノ結晶質の層を形成する。さらにこの手法は、三次元ヒドロゲル足場の多用途特性を有する高親和性の鋳型駆動性の生体無機化を統合するための基礎を提供し、かつ改良型の官能化骨複合体及び置換物の基礎を提供する。
【００４２】
A. ヒドロゲルポリマー足場
典型的なヒドロゲルの調製では、ヒドロゲルベースモノマーをコモノマー架橋剤及び水と合わせる。重合をラジカル開始によって開始することができる。次いで、十分混合した粘稠溶液をガラスチャンバーに注ぎ込んで凝固させる。その後、毎日水を交換しながら、ゲルを水に2〜3日間浸して、無機化及びさらなる物理的特徴決定に用いる前に未反応のモノマーの完全除去を確実にする。
【００４３】
ヒドロゲルは実質的にベースポリマーからならなり、ここでモノマーは、以下の構造1に示される一般式を有する、エステル側鎖を含む置換アクリレートである：
2006513745.tif 000005
ここで、R1はHまたは低級アルキルであってよく、R2はHまたは低級アルキルであってよく、塩基性の繰り返し単位の数（n）は異なってもよいが、10〜100,000であることが好ましい。
【００４４】
例示的な好ましい態様では、ベースポリマーは、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)（pHEMA）であり、ここで、R1は-CH2CH3であり、R2はHであり、nは10〜100,000である。
【００４５】
他の態様では、ベースモノマーは、生体模倣的特性及び生体適合性を与えるコモノマーと共重合することができる。これらのコモノマーは、重合可能な基を含有しなければならず、好ましくはメタクリレート又はメタクリルアミドである。これらのコモノマーは、アニオン基を有することができ、または、極性リガンド、核酸、アミノ酸、修飾又はグリコシル化されたアミノ酸、リン酸化又はスルホン化されたアミノ酸、ペプチド、タンパク質、並びに、ポリエチレングリコール（PEG）、アルデヒド、ケトン、炭水化物、コラーゲンなどの細胞外マトリクス成分、ラミニン、ホスフェートなどの生分解性モチーフ、及び他の生物学的分子を含むがこれらに限定されない他の官能基などの、他の種類の官能基を有することができる。好ましい態様では、コモノマー架橋剤は、カルシウムイオン、親水性及び非付着性の残基、並びにRGD、GRGDS、及びGRGDなどのペプチドを含むがこれらに限定されない細胞接着ペプチド模倣官能基に結合する傾向にある、アニオン部位を有する。ヒドロゲル足場へのこれらのコモノマーの添加、特に、骨細胞外マトリクスの物理的特性の一因となることが知られている配列を含有するものの添加は、複合体表面全体にわたる骨細胞接着及び増殖を促進する。例えば、米国特許第6,479,460号においてBabらは、および米国特許第5,461,034号においてRodanらは、官能基としてコモノマーに付着して好ましい態様の生体模倣的複合体を作製できる、骨形成活性を有する合成ペプチド、偽ペプチド、及び薬学的組成物を記載しており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。空隙率、核形成部位の濃度、及び他の特性を制御するため、異なるコモノマーを用いてもよい。
【００４６】
好ましい態様におけるヒドロゲルは、0.1%〜100%、好ましくは約30%〜50%の平衡水含量（EWC）を有することができる。室温でのEWCは、十分水和したヒドロゲルの重量に対する乾燥ヒドロゲルによって吸収される水の比として定義される。ヒドロゲルによって吸収される水の量は、凍結乾燥したゲルの重量（Wd）及び対応する水和したゲルの重量（Wh）から、等式：EWC(%)=[(Wh-Wd)/Wh]×100に従って決定される。所望のEWCは、乾燥ヒドロゲルを所望の量の水で水和することによって得られる。
【００４７】
架橋剤は足場を支持する。好ましい態様では、架橋剤は、以下の一般的構造である構造IIを有する、任意のジアクリレート又はジアクリルアミドである：
2006513745.tif 000006
式中、R3及びR3'は同一または異なり、Hまたは低級アルキルであってよく、ここで、炭素原子の数は1〜10であり；R4は[-(CH2)n-Y-(CH2)n'-]mであることができ、ここでmは1〜500,000であり、YはO、S、又はNHであるか存在しない。n及びn'は独立して、1〜10個の炭素原子であり；より好ましくは1〜4個の炭素原子である。Xは、O、S、又はNである。架橋剤の長さmは、空隙率、弾性、及び無機化を制御する方法に応じてヒドロゲル範囲内で変化させてよい。
【００４８】
ベースポリマーに添加される架橋剤の量は、様々な架橋度を有するヒドロゲルを与えるため、0.1重量%〜50重量%であることが好ましく、2重量%〜10重量%であることがより好ましい。架橋の量により、ヒドロゲルの全体的な空隙率及び強度が決定される。好ましい架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート、又は構造IIであり、ここでR3及びR3'はどちらもCH3であり、R4はCH2CH2であり、XはOである。
【００４９】
生体模倣的特性及び生体適合性を付与するために、上記の論述に従って種々の架橋剤を用いてもよい。コモノマーにおける使用に関して先に論じた種々のリガンド、核酸、ペプチド、及び他の機能性リガンドを、構造IIのR4と置き換えることができる。
【００５０】
B. 初期の及び伸長した無機物層
ベースモノマーのエステルの加水分解後、ヒドロゲルの酸性表面及び内部を無機化溶液と接触させて、不均一な核形成により初期無機物沈着物を形成する。エステルの部分加水分解によりカルボキシレート基が露出し、これにより、無機化溶液からの初期無機物沈着のための核形成部位が提供される。この加水分解工程は、C項に関連して以下で論じる。
【００５１】
初期無機化沈着物は、ナノ結晶質又は非晶質のいずれかである。初期無機化沈着物中の結晶はナノサイズであり、X線回折（XRD）によって検出可能なシグナルを生じない。したがって、初期無機物沈着がナノ結晶質であるか非晶質であるかを区別することはできない。初期無機物沈着物に関する結晶HAに対応した典型的な反射を観察することはできないであろう。無機化前のヒドロゲルにおいて観察されるのと類似した広い反射が、ほんのいくつか見られる。これにより、カルシウムイオンとインサイチューで生じた表面カルボキシレートとの間は高親和性結合しているが、これらの表面アニオンリガンドの間隔、順序、及び/又はアラインメントは、XRD分析で結晶HAの典型的な反射を生じるのに十分に大きないずれの特定の配向に沿った微結晶（crystallite）のエピタキシャル成長も、促進しないことが示唆される。しかし、無機物イオンとヒドロゲルカルボキシレートとの間の強力な親和性は、個々の核形成部位からの初期無機物沈着層の二次元の外向き結晶成長を生じる。
【００５２】
好ましくは、無機化溶液は、Ca2+、PO43-、OH-、CO32-、Cl-などの元素、並びに、結晶、ナノ結晶質、又は非晶質のヒドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）、炭酸カルシウム、及び、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、又はCaO-2P2O5〜4CaO-P2O5の範囲の化学量論を有するリン酸カルシウムを含むがこれらに限定されない、ヒドロキシアパタイトのものと同様の酸性及び塩基性の条件下での溶解度挙動を有するリン酸カルシウムなどの他の微量無機元素からなる、無機化混合物である。
【００５３】
ヒドロゲルと接触した無機化溶液中及びその後の無機物沈着物中のホスフェートに対するカルシウムの比は0.5〜4であり、好ましくは1〜2である。例えば、無機化溶液及び初期沈着物中のCa/P比は、リン酸二カルシウムを用いた場合は1であり、リン酸八カルシウムについては1.33であり、リン酸三カルシウムでは1.5であり、ヒドロキシアパタイトを用いた場合は1.67となりうる。
【００５４】
鋳型表面を初期ナノ結晶質又は非晶質の無機化沈着で飽和すると、XRDによって容易に検出可能な大きな小板状結晶物からなる伸長結晶無機化層の成長がエネルギー的に好都合になる。好ましい態様では、伸長無機物層が約1μm〜7μmの好ましい厚さとなるまで無機物混合物とヒドロゲルとの接触を延長することにより、初期無機物層から伸長無機物層が成長する。
【００５５】
C. 無機化方法
図1に示され、かつ、先に論じた通り、ヒドロゲルの加水分解表面上での強固な無機化層の形成は、カルボキシレートに富むゲル表面と無機物との間の低い界面エネルギーによって駆動される。pHの増大によりヒドロゲル中のエステル側鎖が加水分解されてカルボキシレート基となる。ヒドロゲル表面上及びヒドロゲル内部で露出した酸性カルボキシレート基は核形成部位として作用し、Ca2+イオンを集める。多くの無機物が核形成され、成長し、統合されるにつれて、これら核形成部位からの二次元の外向き成長により、ヒドロゲルの表面上及び内部に初期無機化層が作製される。pH及び温度が平衡に達したとき、ゲル鋳型表面は初期のナノ結晶質又は非晶質の無機化層で十分に覆われる。カルシウムも、ヒドロゲル内部に内在化すると考えられる。カルシウムイオンは、PO43-、HPO42-、H2PO4-、又はOH-などの無機物アニオンを集める。結合したイオンにより、ヒドロゲル足場の表面上及びその内部に無機物沈着物が形成される。リン酸カルシウムが無機物沈着物の主成分と考えられるが、他の無機物を添加してもよい。
【００５６】
乾燥状態では、アルキル基（構造IのR2）が空中に向かって外向きに露出されることが好ましいが、R1エステル（アルキル基R2よりも疎水性が低い）はヒドロゲル中に伸長する傾向がある。しかし、エステルが加水分解されてカルボキシレートになれば、アニオン性カルボキシレートは露出されて水環境と相互作用することを好む。水に浸した場合、ヒドロゲルの内部及び外部の双方に水があるために、ベースポリマーエステル側鎖上のエステルはヒドロゲルの内部または外部に伸長し、かつ、炭素主鎖の周りに任意の方向で配向することができる。しかし、立体障害、静電反発力、及び水との更に十分な水和により、ヒドロゲル内部から離れて表面カルボキシレートの優先的露出がもたらされる可能性が高い。無機化露出が増大することにより、カルボキシレート基に加水分解されるエステルの割合が増す。好ましい態様では、ヒドロゲルポリマー足場中のすべてのR1エステルの部分加水分解だけが必要となる。加水分解されるエステルの割合は、ヒドロゲル足場中の全エステル側鎖の1%〜100%の間のいずれでもよいが、好ましくは約10%〜50%であり、これにより、後述の押込み試験によって測定されるような層間剥離を起こすことなく無機物-ゲル界面が少なくとも5Nの荷重に耐えうるような強力な無機物-ゲル界面を作出するために、十分な数の核形成部位が生成される。
【００５７】
エステル含有側鎖の加水分解は、熱分解又は水性分解して酸又は塩基を穏やかに放出する酸触媒加水分解、塩基触媒加水分解、又はヒドロゲル足場を組成物又はエステラーゼと接触させることによる酵素加水分解によって、行うことができる。例えば、NH3などのバブリングガスをゆっくりと無機化媒体に入れることを考慮してもよい。水酸化アンモニウム、炭酸カリウム若しくは炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ピペラジン、イミダゾール、ピリジン、又はこれらの塩基の生成につながりうる任意のものを含むがこれらに限定されない弱塩基の使用を、本発明のプロセスにおける使用に適合化することができる。温和な酸の使用も有用でありうり、一部の態様では、一般的には塩基触媒加水分解の方が酸触媒加水分解より効果的であるにも関わらず、好ましい。本プロセスに有用である適切な温和な酸には、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、蟻酸、クエン酸、カルボン酸、水混和性である他の有機酸、及びこれらの酸の生成につながりうる任意の物質又は化合物が含まれてもよいが、これらに限定されない。
【００５８】
pHの増大及びエステル含有側鎖の加水分解は、インサイチューでゆっくりと生じる弱塩基性組成物（pH8〜pH10）によって媒介されることが好ましい。pHの増大方法は溶液全体にわたってpHを均一に変化させなければならず、これにより強塩基誘導性の均一沈殿物中で一般に観察される、任意の急激な局所的pH変化が回避され、したがって、ヒドロゲルの内部全体及び表面上でのエステル側鎖の加水分解が確実になる。また無機化溶液の最終pHを約pH8で維持することによっても、媒体由来の均一な沈殿物の競合が妨げられる。
【００５９】
エステル含有側鎖の加水分解が、尿素の熱分解によって媒介されることが、現在好ましい。尿素の熱分解によって、溶液全体にわたるpHの均一な変化が可能になり、これにより任意の急激な局所的pH変化が回避され、ヒドロゲルの内部全体及び表面上でのエステル側鎖の加水分解が確実になる。
【００６０】
水中で尿素を熱分解することにより、弱塩基であるアンモニアが生じるが、これは、ヒドロゲルと接触すると、ヒドロゲルの表面上および内部に反応性酸性基（カルボキシレート）を露出させる。ヒドロゲルの内部の酸性基は、カルシウムイオンに対する親和性の高い、部分的にまたは実質的に酸性の内部を作出し、したがってヒドロゲル内部での広範囲にわたる無機化を促進する。
【００６１】
表面エステルの加水分解及び水溶液からのHAの沈殿を生じるようなpHの増大をもたらす、水中での尿素の熱分解は、以下の化学式によって表される。
2006513745.tif 000007
【００６２】
現在好ましいpH依存性無機物複合体形成の機構を、図2にさらに図示する。点曲線は、ヒドロゲルから高度に統合された複合体へと化学的及び物理的に変換されるのに伴う、ヒドロゲル足場の尿素媒介性かつpH依存性の核形成及び成長挙動の定性的な図を示している。Ca2+の溶解度は、pHの関数として曲線1に示されている。pHが増大することによりCa2+の溶解度が低下することが分かる。曲線2及び曲線3は、基本的な核形成理論から得られるリン酸カルシウムの典型的な核形成挙動の定性的な図を表す（Blendell, J. E., Bowen, H. K. & Coble, R. L., High Purity Alumina by Controlled Precipitation from Aluminum Sulfate Solutions. Am. Ceram. Soc. Bull., 1984, 63, 797-801; De Jonghe, L. C. & He, Y., Composite Powder Synthesis. In: Ceramic Microstructures: Control at the Atomic Level, ed. Tomsia, A. P. & Glaeser, A. Plenum Press, New York, 1998, pp.559-565を参照されたい）。
【００６３】
「不均一な核形成」という用語は、無機物イオンがインサイチューで生成されたカルボキシレート基又は他の表面アニオン基上に核を生成して無機化層が界面で形成されるのにつれてpHが増大する際の、ゲル-無機物溶液界面で起こる核形成を指す。「均一な核形成」は、無機物が溶液から沈殿するにつれて増大したpHにおいて、無機物溶液全体にわたって起こり始める。本発明の方法は、均一な核形成領域に入るのを回避する。約pH7〜pH8では、尿素の熱分解が起こるにつれて、Ca2+の溶解度が低下し、それによりヒドロゲルの内部及び表面上で核形成及びカルシウム沈着が引き起こされる。
【００６４】
したがって現在は、無機化溶液は尿素を含有することが好ましい。次いで、尿素-無機化溶液をヒドロゲルと接触させて、尿素の熱分解のために加熱することができる。尿素-無機化溶液を攪拌することなく2時間以内で室温から90℃〜95℃まで0.1℃/分〜1.0℃/分の漸進的加熱速度で徐熱したとき、尿素が分解し始め、pHがゆっくり増大して約pH8となると考えられる。加熱速度をより遅くし無機化の合計時間をより長くすることにより、ゲル表面上でより密接に同化したCP層の形成が促進される。尿素媒介プロセスに任意の所与pHへのヒドロゲルの露出がより長くなるほど、エチルエステル側鎖のより十分な加水分解がもたらされうり、これによって、堅いカルシウムイオン結合剤及び初期核形成部位として作用しうる表面カルボキシレートの数が増加する。
【００６５】
無機化溶液の持続的な攪拌により、pHが漸進的に増大しながら無機物が無機物溶液から均一に沈殿される。ヒドロゲル表面上でのカルシウムアパタイトの核形成及び高親和性の成長は、持続的なかき混ぜの下でのいずれの試験加熱速度でも観察されなかった。このことは、尿素-無機化溶液を直接攪拌することにより、インサイチューで生成された酸性ゲル表面及び内部での、所望の不均一な核形成及び無機化成長が妨げられることを示唆している。これは溶液全体にわたる無機物の望ましくない均一な沈殿を促進し、それにより多量の無機物沈殿物が形成される。
【００６６】
ヒドロゲルの表面に薄いナノ結晶質又は非晶質の無機物沈着物を形成させる尿素媒介性無機化プロセスの好ましい時間は、室温から95℃までの温度上昇において、1時間〜12時間であり、好ましくは2時間〜6時間である。加熱速度は、0.1℃/分〜1℃/分の間のいずれかの直線的な加熱速度であることができ、好ましくは0.2℃/分〜0.5℃/分の間の一定の加熱速度でありうる。
【００６７】
あるいは、酵素消化（例えば、プロテアーゼ）を用いて核形成部位を作製する特定の態様では、アミド結合などの他の側鎖が好適でありうることが意図される。広い意味で言えば、インサイチューにおいて核形成部位での不均一な核形成が促進される限り、側鎖がエステル結合している必要はない。
【００６８】
ヒドロゲルの鋳型表面が初期ナノ結晶質又は非晶質の無機化沈着物で飽和されたら、X線回折（XRD）によって容易に検出可能な大きな小板状結晶物からなる伸長結晶無機化層の成長は、エネルギー的に好都合になる。95℃に達した後に無機化をより長時間進行させることにより、無機物-ゲル界面での良好な統合を有する厚さが最大数マイクロメートルの無機物被覆を得ることができる。ヒドロゲルの表面に厚さ約1〜7μmのより厚い無機化層の形成を生じさせるための尿素媒介性無機化プロセスの好ましい時間は、無機化溶液が95℃に達した後、その温度で保ちつつ、少なくともさらに約4時間足したものであり、好ましくはさらに約12時間を足したものである。
【００６９】
延長された無機化時間の際に、初期核形成部位の最上部に三次元凝集物を形成する無機化結晶の成長が観察されうる。凝集物は、中心が核形成部位である球状であることができ、あるいは任意の他の形状でありうる。いったん複合体が埋め込まれたら破骨細胞及び骨芽細胞によって前記形状は再形成される可能性があるので、三次元結晶成長の形状は、本発明にとって重要性がより低い。
【００７０】
このプロセスによって作製される複合体の1つの特徴は、ゲル-無機物界面における強力な接着である。ゲル表面への初期ナノ結晶質又は非晶質の層の接着強度は、無機物-ヒドロゲル複合体の表面について行われる微小押込み分析（Gomez-Vega, J. M.ら、J. Biomed. Mater. Res., 1999, 46, 549-559）によって研究することができる。無機物層の層間剥離は、最大15Nの荷重によるビッカース（Vickers）押込み後でさえ、SEMによって観察されない。実施例3において、荷重5N及び10Nでの圧子マーカーの中心だけではなく先端でも、pHEMAヒドロゲル上でのCP層の層間剥離のいかなる徴候も示されず、これは、無機物-ゲル界面における良好な接着の指標となる。これにより、生物活性ガラス、ポリマー足場、又はコラーゲンフィルム上でのSBF中の無機化によって得られる薄片様の結晶アパタイト被覆のほとんどが強固ではなく、かつ、乾燥時に容易に層間剥離する傾向がある、現在広く用いられている模擬体液（SBF）の無機化方法の主な改良点が示される。
【００７１】
D. ヒドロゲルの空隙率及び官能化
ヒドロゲル足場の空隙率は、溶液流延（solvent casting）、粒子の浸出（particultate leaching）、発泡、及び凍結乾燥（Misra, D. N. J. Dent. Res. 1985, 12, 1405-1408; Bradt, J.-H.ら、Chem. Mater. 1999, 11, 2694-2701; Liu, Q.ら、J. Biomed. Mater. Res. 1998, 40, 257-263; MurpHy, W. L.ら、J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1910-1917）を含む多くの利用可能な技術によって調節することができ、本試験に適用することができる。ヒドロゲル足場内部での無機物結晶の成長は、空間及び、既に部分的にアニオン性であるヒドロゲルの内部で達成された遊離アニオンの濃度によって制限される。したがって、ヒドロゲルの空隙率の増加は、ヒドロゲル内部でのより大きなカルシウム沈着及びホスフェート組み込みを容易にしうる。そのような修飾は複合材料の内部での無機化の程度をさらに高め、より深い組織の内部成長を可能にしうる。
【００７２】
ヒドロゲル足場の空隙率を制御する1つの方法とは、架橋剤の長さ及び架橋剤の導入割合の変更であり、これは平均の孔サイズ及び架橋度の双方に直接に影響を及ぼす。ヒドロゲル足場中の空隙率を増加する別の方法とは、種々の割合のイオン性コモノマーの導入である。おそらく、荷電コモノマー側鎖の間の静電反発により、孔サイズが増加するのであろう。導入されるイオン性コモノマーの割合が高くなるほど、そのような反発的相互作用はより強くなり、ヒドロゲルの空隙率はより大きくなる。しかし、高割合の高イオン性モノマーは、架橋度及びモノマー鎖の長さを減少させうる。生体模倣的ポリアクリレートをベースとしたヒドロゲルコポリマーの合成の一般的ストラテジーを図3に示すが、ここでベースモノマーは、図3Aの左側の架橋剤及び種々の非付着残基及び機能性リガンドを有するコモノマーと架橋されて、図3Bの右側のヒドロゲル足場を生じる、。ヒドロゲルの空隙率は、材料の弾性に対してだけではなく、誘導された無機物成長及び細胞透過の程度に対しても有意な影響を与えると考えられる。しかし、高い空隙率はまた、得られるヒドロゲル足場の力学的な完全性が低いことの一因であることもできる。
【００７３】
ここで図3を参照すると、種々の側鎖（構造1のR1）を有するコモノマーの混合物が左側に図示されている。エステル側鎖（ES）は、カルボキシル無機化部位を生じるための単純かつ開裂可能な側鎖である。側鎖NRは、非付着残基である。側鎖FLは、機能性リガンドである。構造2に基づく代表的な架橋剤も図示されている。側鎖が加水分解に耐えうるコモノマー（例えば、GluMAm、SerMAmなどの機能性リガンドを有するモノマーなど）については、モノマー及びコモノマーがモノマーと共重合されて加水分解を受けた場合にそれらのアミド結合側鎖が加水分解されずに耐えることができるように、意図的にアミド結合が設計される。
【００７４】
コモノマーと架橋剤のこの混合物を、標準の遊離ラジカル重合開始剤を有する水性媒体に添加して、無機化及び官能化ドメインを有するヒドロゲルネットワークである構造30を生じさせる。ネットワーク30は32において図示され、用いられる各成分の割合に応じて種々の側鎖がランダムに組み込まれていることが示されている。主成分はESであり、NRが次に最も一般的であり、次いでFLである。好ましい用途（以下に論じる）では、ネットワーク30をインプラント又は骨34に付着させる。
【００７５】
E. 用途
ゲル-無機物界面における強力な接着に加えて、本方法によって作製された複合体は、骨インプラント用途に理想的な構造及び厚さを有するナノ結晶質又は非晶質の無機化層を有する。チタンインプラント上のリン酸カルシウム被覆の分析により、被覆の吸収はあまり組織化されていないアパタイト領域で大部分が起こり、被覆の結晶化度が高い場所では停止することが示された（Ratner, B. D. J. Mol. Recognit. 1996, 9, 617-625）。したがって、本方法によって達成される非晶質又はナノ結晶質の層は、吸収、骨の統合、細胞付着及び増殖を促進しうる。さらに、先行する研究では、厚さ1μm〜7μmのオーダーのHAの薄層は、インプラント基質との進行性の骨接触を可能にするのに十分な吸収時間枠を与えること、およびしたがって、天然の骨への材料の統合を誘導するのに理想的であることが示唆されている（Ratner, B. D. J. Mol. Recognit. 1996, 9, 617-625）。対照的に、金属インプラントに適用される古典的なプラズマスプレー技術（Lu, S.; Anseth, K. S. J. Controlled Release 1999, 57, 291-300）では、厚さ50μmを上回るHA被覆が生じる。本明細書中に記載した手法を用いて得られるヒドロゲル-カルシウムアパタイト複合体の好ましい特性は、インビボでの再形成カスケードの開始及び続く積極的な組織-インプラントの統合の機会を最大にしうる。
【００７６】
したがって、実際上は、修復又は再構築対象の骨構造の特定領域にうまく合うように適合されたヒドロゲルに従って、移植可能な構造がインビトロで形成されることが意図される。複合体は、脊椎動物対象内で骨に付着させるか、インプラントに付着したヒドロゲルに沈着させるか、または別の種類の生理学的インプラントに付着したヒドロゲルに沈着させる。本手順に従った無機化の後、無機化された構造を、受容部位において対象に移植する。次いで、破骨細胞及び骨芽細胞の修飾又は媒介など、生理条件下でインプラントを骨構造に付着させる。本方法のそのような用途及び拡張は関連技術分野の当業者に既知であるか、理解されるであろう。
【００７７】
実施例1：出発材料の調製 - ベースモノマーである2-ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）及び架橋剤の調製
架橋剤であるエチレングリコールジメタクリレート（EGDMA）を2重量%、5重量%、及び10重量%で用いて、多様な架橋度を有するpHEMAゲルを生成した。EGDMA中、R3=CH3、X=O、R4=CH2CH2である。これらのゲルは、同じ（40%）平衡水含量（EWC）を有していることが見出された。その後の実験はすべて、2% EGDMAで架橋されたゲルを用いて行った。
【００７８】
2-ヒドロキシエチルメタクリレート（HEMA）をアルドリッチ社（Aldrich）から購入し、使用前に減圧下での蒸留によって精製した。Chilkoti, A.らによって開示された標準ラジカル重合プロトコル（Analysis of polymer surfaces by SIMS. 16. Investigation of surface cross-linking in polymer gels of 2-hydroxyethyl methacrylate. Macromolecules, 1993, 26, 4825-4832）をEGDMAで架橋されたpHEMAヒドロゲルの調製に適用した。
【００７９】
典型的な手順では、ヒドロゲルの調製及び重合は以下の通りである。ヒドロゲルモノマー 500 mgをエチレングリコールジメタクリレート10μL、ミリ-Q 水 100μL、及びエチレングリコール150μLと混合した。この混合物に、それぞれ50μLのメタ重亜硫酸ナトリウム（150 mg/mL）及び過硫酸アンモニウム（400 mg/mL）の水溶液を添加した。好ましいラジカル開始剤は、過硫酸ナトリウム及び過硫酸アンモニウムである。また、溶媒は、使用するモノマー及び架橋剤を可溶化する能力に基づいて選択すべきである。
【００８０】
次いで、十分混合された粘稠溶液を顕微鏡スライドガラスで作製されたガラスチャンバーに注ぎ込み、室温で一晩放置した。その後、ゲル（5.5cm×1.5cm×1mm）を毎日新しい水に交換しながらミリ-Q水に2〜3日浸し、無機化及びさらなる物理的特徴決定に用いる前に、未反応のモノマー及びラジカル開始剤を確実に完全に除去した。形成されたヒドロゲルからのこれらモノマー及び開始剤の完全な除去は、それらが生物学的環境中で毒性効果又は副作用を示しうることから、生物学的用途のためにも重要である。
【００８１】
実施例2：ヒドロゲルの特徴決定に用いる方法及び測定
平衡水含量（EWC）測定
室温でのEWCは、十分に水和したヒドロゲルの重量に対する乾燥ヒドロゲルによって吸収される水の重量の比として定義される。ヒドロゲルによって吸収される水の量は、凍結乾燥したゲルの重量（Wd）及び対応する水和ゲルの重量（Wh）から、以下の式：EWC(%)=[(Wh-Wd)/Wh]×100に従って決定する。
【００８２】
接触角測定
液滴法を用いて、ヒドロゲル上での水に対するジヨードメタン液滴の接触角を測定した。ジヨードメタン液滴3μL〜5μLを水に沈めたヒドロゲルのセグメントの表面上に置いた。滴を沈着した後10秒以内に液滴の両側から角度計により静止接触角を測定し、値を平均化した。接触角は、加水分解前のpHEMA及び加水分解後のpHEMAでそれぞれ129°及び142°であることが見出された。
【００８３】
尿素熱分解の際の2-ヒドロキシエチルエステルの加水分解は表面親水性を増加させることが予測され、これを接触角及びEWC測定によって確認した。偽実験では、同じ濃度の尿素を含有する溶液中かつHA非存在下で、pHEMAゲルのセグメントを上記の通りに熱処理した。際立った透過及び接触角履歴現象なしに親水性材料上で安定な液滴を形成することが知られている疎水性溶媒であるジヨードメタンを、処理済み及び未処理のpHEMAゲル上での水に対する接触角の測定に用いた。ゲル表面上でのジヨードメタン液滴の接触角は、尿素媒介熱処理を2時間行ったときに129°から142°に増加することが見出された。疎水性溶媒による表面湿潤性の低下が観察されたことは、尿素媒介性無機化の際に極性表面カルボキシレートがインサイチューで生成されるという仮定と一致する。加水分解によって、ゲルのEWCもわずかに（2%〜3%）増加した。
【００８４】
構造特徴決定
さらなる構造分析及び力学的特徴決定のために凍結乾燥させる前に、無機化されたヒドロゲル細片を水中で繰り返し洗浄し、緩やかに付着している無機物及び可溶性イオンを除去した。ヒドロゲルの表面上及び内部で成長した材料の表面微小構造及び結晶化度を、関連するエネルギー分散分光法（EDS）及びX線回折（XRD）とともに走査型電子顕微鏡（SEM）によって分析した。
【００８５】
SEM-EDS
凍結乾燥したヒドロゲル及びヒドロゲル-無機物複合体のSEM顕微鏡写真はすべて、関連するEDSとともにISI-DS 130Cデュアル・ステージ（dual stage）SEMにより得た。試料は、最適な画像化結果を得るためにBAL-TEC SCD 050スパッタ塗布機上でAu又はPtのいずれかで被覆するか、EDS分析のために炭素で被覆した。複合材料の画像化及び分析は15 kVで行い、ヒドロゲルの画像化及び分析は低い電圧下（8 kV〜12 kV）で行った。すべての複合材料のCa/P比の決定は、標準の合成HA試料を用いた較正に基づいた。
【００８６】
XRD
沈殿した無機物層中の結晶相の存在及び全配向を、Cu Kα照射を用いたSiemens D500機器によるXRDによって評価した。
【００８７】
無機物-ヒドロゲル界面接着性の評価
接着性の押込み試験
pHEMAヒドロゲルに付着した無機物層の接着性を評価するために、相対的な亀裂耐性を、押込みにより定性的に評価した。その表面間での角度136°のダイアモンド錐形先端を有するVickers圧子（Micromet、Buehler, Ltd.、米国）を用いて押込み試験を行った。各測定については、5〜15ニュートンの荷重を20秒間適用した。押込み後、層間剥離について点検するために、試料をSEMによって分析した。層間剥離が無いことは、無機物層とヒドロゲル基質との間の強力な接着の指標となる。
【００８８】
実施例3：尿素媒介プロセスによるヒドロゲルの無機化
pHEMAヒドロゲルのセグメントを実施例1に従って調製し、高濃度の尿素（2M）を含有するHAの酸性溶液（pH2.5〜3）に浸した。まずHA（2.95 g）を攪拌しながらミリ-Q 水 200 mLに懸濁し、すべてのHA懸濁物が2.5〜3の最終pHで溶解するまで2M HClを連続的に添加した。次いで、2Mの濃度に達するように尿素（24 g）を溶液に溶解した。その後、尿素を含有する酸性HA保存液50 mLに各ヒドロゲル細片を浸した。
【００８９】
1分あたり0.6℃の速度で室温から90℃〜95℃まで（2時間以内）徐熱すると（攪拌なし）、尿素は分解し始め、pHはゆっくり増加した（約pH8）。これらの条件下では、2-ヒドロキシエチルエステルの加水分解の一部がヒドロゲル表面で起こり、リン酸カルシウム（CP）の不均一な核形成及び二次元成長を促進した。二次元成長とは主に、ヒドロゲル表面に沿って広がる結晶成長を意味する。
【００９０】
pHEMAヒドロゲルのSEM画像は、2時間の加熱時間及び無機物成長後、実施例2のpHEMAヒドロゲルの酸性表面上の複数の核形成部位からカルシウムアパタイトの二次元の環状かつ外向きの成長を示した。環状無機物層の同化及びカルシウムアパタイトによるヒドロゲル表面の十分な被覆もSEMによって観察された。環状に成長した無機物層の同化により、個々のCP片をつなげる鋭い縁が生じた。
【００９１】
無機物層のSEM関連EDS面積分析により、HAに典型的な、化学組成及びCa/P比（1.6±0.1）が確認された。Ca/P比の測定を較正するために合成HAを用いた。pHEMA-無機物複合体及び無機化されていないpHEMAゲルのX線回折パターンは、結晶HAに対応する回折ピークを示さなかったが、これは非晶質又はナノ結晶質無機物層がpHEMA表面上に形成されたことを示唆している。
【００９２】
無機物-ヒドロゲル界面接着を、押込み分析によって試験した。凍結乾燥したヒドロゲル-CP複合体の表面について微小押込み分析を行った。SEMにより、5Nの荷重でVickers微小圧子を用いたところ、無機化pHEMAの表面上にくぼみが形成されたことが示された。しかし、リン酸カルシウム層では、最大15Nの荷重によるVickers押込み後でさえ層間剥離の兆候が示されなかった。5N又は10Nで荷重した圧子マーカーの中心及び先端のいずれにも、層間剥離の兆候は示されなかった。
【００９３】
実施例4：尿素媒介プロセスによるpHEMAの無機化の延長
無機化時間を10時間〜12時間に延長することにより、複合体の側面図の画像に示されるような（図4A）、無機物-ゲル界面での統合が良好な、厚さ最大数ミクロンの無機物被覆が得られた。図4Aは、その左側に伸長したカルシウム-リン酸層を有するpHEMAヒドロゲルの断面のSEM画像である。点線は、無機物-ゲル界面を示している。試料台を、45°に傾けた。無機物層のミクロンスケールの厚さ及び無機物-ゲル界面における非常に良好な統合に留意されたい。
【００９４】
表面が非晶質アパタイト層で十分に被覆されると、初期核形成部位の最上部（環状アパタイトの輪の中心）に球状凝集物を形成するHA結晶の成長が観察された（図4B）。これらの無機物球状物は、SBF無機化を用いて生物活性ガラスポリマー基質又はコラーゲンフィルム上で成長した結晶アパタイトで観察される典型的な形態である、平板様の結晶物からなる。
【００９５】
図4Cを参照して、球状アパタイト凝集物について行ったEDS分析の結果により、結晶HAの予想Ca/P比（1.6±0.1）が確認された。pHEMA-アパタイト複合体の断面のSEM関連EDS面積分析では、カルシウムに対応する大きな強いピークが示されたが、これはヒドロゲル内部全体にわたる有意なカルシウム沈着を示唆している。複合材料について行ったXRDでは、（その結果は図4Dに示されるが、）結晶HAに対応する典型的な反射ピークが（002）及び（112）で検出されたが、これは初期カルシウムアパタイトナノ結晶質又は非晶質の層の最上部で成長する球状HAの結晶特性を示唆している。XRDでは、c軸に沿った優先的アラインメントも検出された。しかし、二次的な沈殿によって形成されたHA結晶がしばしば同様の優先的配向を採ることは、注目に値する。これは、複合材料における優先的アラインメントのアパタイト結晶格子の観察が基礎となる基質との特定の相互作用を必ずしも反映しないことを示唆している。
【００９６】
複合材料の断面を調べることにより、ホスフェートの取り込みの程度は制限されるが、ヒドロゲル内部にも有意な程度のカルシウム沈着があったことが明らかになった。ヒドロゲル内部の広範囲にわたるカルシウム沈着は、pHEMAゲル内部での2-ヒドロキシエチルエステル側鎖の部分加水分解により促進することができる。pHEMA足場内部でのカルシウムアパタイトの成長は、既に部分的にアニオン性のヒドロゲルの内部に形成された、空間及び遊離アニオン濃度の双方によって制限される。図5Eの顕微鏡写真に示されるpHEMA-アパタイト複合体の断面のSEM関連EDS面積分析では、ヒドロゲル内部全体にわたる有意なカルシウム沈着が示唆された。これは約3.8 kVにおけるCaの強いピークによって示唆されている。
【００９７】
実施例5：尿素媒介プロセスによるpHEMAmゲルの望ましくない表面無機物パターン
基質の表面化学及び複合材料の無機化パターンの間の関係をより良く理解するために、実施例3で用いた同じ無機化技術を、無機化条件下で側鎖の加水分解が起こりにくいヒドロゲルであるポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド)（pHEMAm）に適用した。このポリマーでは、R1=CH2CH3、R2=Hであり、C(O)O結合はC(O)Nに置き換えられ、n=10〜100,000である（構造1）。
【００９８】
標準ラジカル重合プロトコルを、Chilkoti, A., Lopez, G. P. & Ratner, B. D., Analysis of polymer surfaces by SIMS. 16. Investigation of surface cross-linking in polymer gels of 2-hydroxyethyl methacrylate. Macromolecules, 1993, 26, 4825-4832に記載されるpHEMAmの調製に用いた。弱塩基性（pH8）条件下でエタノールアミンと塩化メタクリロイルとを直接共役させることによって、2-ヒドロキシエチルメタクリルアミド（HEMAm）を合成した。エタノールアミン（2 mL、33 mmol）の氷冷メタノール溶液20 mLに、塩化メタクリロイル（THF 20 mL中で希釈したもの）3.26 mL（34mmol）にゆっくりと添加した。水酸化カリウム（1M、水溶液）を添加して、反応全体を通して溶液のpHを8〜9に維持した。混合物を2時間かけて室温まで温め、塩酸を添加して最終pHを5とすることによりクエンチされるまで、さらに2時間攪拌した。生成物を濃縮し、冷エタノールに再溶解して、塩化カリウムの塩を沈殿させた。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー精製（クロロホルム:メタノール/9:1）後、生成物（Rf 0.5）を収率95%で単離した。
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【００９９】
架橋剤であるエチレングリコールジメタクリレート（EGDMA）を2重量%で用いてpHEMAmゲルを架橋した。
【０１００】
尿素媒介性無機化方法を適用したときのpHEMAmヒドロゲルで全く異なる表面無機物パターンが得られた。図6Aに示す通り、pHEMAmヒドロゲルは花様（flower-like）無機物パターンとなり、12時間の無機化後でさえも表面被覆の範囲ははるかに狭かった。複合材料の暗視野光学画像及びXRDの双方によって示唆された通り、pHEMAm上で成長したアパタイトは結晶質であり、主反射は結晶ヒドロキシアパタイト（HA）のものと一致していた。
【０１０１】
図6Aは、無機物パターンのXRD分析を示している。複合体のXRD分析の主反射及び相対強度は、c軸が基質に垂直な、（002）に沿った優先的アラインメントを示唆している。SEM顕微鏡写真により、無機物パターンのさらなる詳細が明らかとなり、ひげ結晶の束がゲル表面から離れて上向きに成長したことが示された（図6B）。これは、表面無機物被覆が比較的低いことに加えて、カルシウムアパタイトとpHEMAmの中性ヒドロゲル表面との間の親和性が減少したことと一致している。
【０１０２】
pHEMAmヒドロゲルの無機物の束について行ったEDS分析により、Ca/P比（1.6±0.1）がHAと一致することが再度明らかとなった。Ca及びPのX線元素マッピングにより、無機物パターンが均一なリン酸カルシウムアパタイトからなることが示された。花様無機物パターンを欠く暗いヒドロゲル表面位置は、pHEMAmの低いカルシウム結合性と一致した。表面化学は、無機化の程度及びパターンの双方を決定する役割を果たすと考えられる（二次元対三次元無機物成長）。pHEMAヒドロゲル上の堅固に結合したHAは表面上に広がることを好み、環状に成長する無機物層を形成し、これは最終的にはゲル表面全体を覆う。それに対し、pHEMAmの場合のように緩く結合したHAは、ヒドロゲルと統合されるのではなく、表面上で三次元的により容易に成長する。したがって、ヒドロゲルの内部でカルシウム沈着又はホスフェートの取り込みが検出されず、かつヒドロゲルによる無機化がより少ないので、ベースモノマーとしてpHEMAmを使用することは好ましくない。
【０１０３】
実施例6：尿素媒介プロセスにおける異なる速度の温度上昇の効果
非常に良好な温度制御を有する自家製の加熱システムを用い、同じ酸性HA-尿素保存液を用いて、室温から95℃までそれぞれ1.0、0.5、0.2、及び0.1℃/分の加熱速度で、実施例1のpHEMAヒドロゲルを無機化した。無機物保存液のかき混ぜは行わず、温度が95℃に達したら、実施例3の無機化プロセスを終了した。得られた複合体を、表面無機化パターンについてはSEMにより、元素組成についてはEDSにより、かつ無機物成分の結晶化度についてはXRDにより、検査された。
【０１０４】
ここで図7を参照すると、1.0℃/分などの比較的速い加熱速度では、SEM又は関連するEDS分析のいずれかによって検出可能なpHEMAゲルの無機化レベルにつながらなかった。複合体について行ったEDS分析では、標準のSEM操作条件（15kV）下で直ちに表面の損傷が生じることとなり、その結果は図7AのEDS分析において示される。電子ビームに対するそのような高い表面感度は、無機化されていないヒドロゲルに典型的である。ヒドロゲル表面上のランダムで特徴のない沈着は、リン酸カルシウムの特徴的な反射が欠如した図7Bの顕微鏡写真に示されるXRD分析によって立証される通り、結晶カルシウムアパタイトのいずれにも対応しなかった。概して、これらのデータは、1.0℃/分などの速い加熱速度及び不十分な無機化時間（室温から95℃まで、合計で70分間の線形加熱）では上記実施例3における尿素媒介プロトコルを用いたときにヒドロゲルの無機化が十分に達成されないことを示唆している。
【０１０５】
0.5℃/分の加熱速度を適用したとき、ヒドロゲル表面上での環状無機物層の形成が観察され、個々の核形成部位の周囲に同様の二次元の外向き成長パターンの形成が見られた。Ca及びPのX線元素マッピングにより、環状の無機物パターンは均一なリン酸カルシウムからなることが示された。複合体について行ったEDS分析では、Ca/P比がHAのものと一致することが明らかになった（図8A）。しかし、複合体のXRDにより結晶カルシウムアパタイトのものと一致する反射は示されず、これは、ヒドロゲル表面で成長した環状CP層が本質的にはナノ結晶質又は非晶質のいずれかであることを示唆している（図8B）。
【０１０６】
線形加熱速度（室温から95℃）を0.2℃/分に低下させたとき、ヒドロゲル-無機物複合体の表は密接に同化した（well merged）環状無機物層で十分に被覆された。剃刀の刃で表面無機物層に擦り傷をつけ（scratch）ても層間剥離は何ら生じず、これは、ゲル-無機物界面における良好な接着強度を示している。さらに、初期核形成部位の最上部に球状凝集物（環状無機物の輪の中心と見える）を形成するHA結晶の成長が観察された。これらの無機物球状物は、模擬体液（SBF）の無機化などの方法を用いて生物活性ガラス、ポリマー基質、又はコラーゲンフィルム上で成長した結晶アパタイトで観察される典型的な形態である平板様の微結晶からなる（Kokubo, T.ら、Acta Mater., 1998, 46, 2519-2527; Rhee, S.-H. & Tanaka, J., Biomaterials, 1999, 20, 2155-2160; Murphy, W. L. & Mooney, D. J., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 1910-1917; Saiz, E.ら、Biomaterials, 2002, 23, 3749-3756を参照されたい）。
【０１０７】
図9を参照して、球状アパタイト凝集物について行ったEDS分析（図9A）及び0.2℃/分の加熱速度で産生された複合材料について行ったXRD（図9B）により、結晶HAの予想Ca/P比並びに典型的な反射である（002）及び（112）が確認された（Saiz, E.ら、Biomaterials, 2002, 23, 3749-3756）。前述の結果は、より低い加熱速度及びより十分な完全無機化時間により、ゲル表面上の良好に同化したCP層の形成が促進されること、並びに、ゲル表面が初期のナノ結晶質又は非晶質のCP層で十分に被覆されたら、XRDにより容易に検出可能な大きな小板状結晶物からなるCPの成長がエネルギー的に好ましいものとなることを示唆している。
【０１０８】
今回の研究で試みた最も低い加熱速度は0.1℃/分であった（室温から95℃まで）。この無機化条件に由来する最も明白な特徴は、pHEMAヒドロゲル表面上で形成される核形成部位の数の劇的な増加であった。尿素媒介プロセスの際のpHEMAゲルの任意の所与pHへの露出をより長くすることにより、エチルエステル側鎖のより十分な加水分解をもたらす可能性が高く、これにより、堅固なカルシウムイオン結合剤及び初期核形成部位として作用できる表面カルボキシレートの数が増加する。圧倒的な量の核形成部位も、環状CP層の二次元の外向き成長の区別を難しくする。しかし、互いに同化する前の分離した核形成部位の高分解能画像のいくつかでは、これらの核形成中心の周囲での二次元の外向き成長パターンが明確に示された。Ca及びPのX線元素マッピングにより、観察された無機物パターンは均一なリン酸カルシウムからなることが、再び示された。無機物表面について行ったEDS面積分析では、HAのものと一致するCa/P比が示された。複合体のXRDでは、結晶カルシウムアパタイトのものと一致する典型的な反射が示された。これは、非晶質CP層で十分に覆われた領域内の一部の核形成部位に見られた平板様のHA結晶凝集物の形成からもたらされる可能性が高い。
【０１０９】
実施例7：尿素媒介プロセスにおける無機化溶液のかき混ぜの効果
無機物の核形成及び沈殿挙動に対するHA-尿素無機物保存液のかき混ぜの影響を、先の実施例6で記載したものと同じ範囲の加熱速度を用いて調べた。無機化溶液を持続的に攪拌したとき、pHを漸進的に増加させた無機物溶液からHAが均一に沈殿することが見出された。pHEMAゲル表面上でのカルシウムアパタイトの核形成及び高親和性成長は、持続的なかき混ぜ下での試験加熱速度のいずれでも観察されなかった。これは、HA-尿素無機物保存液を直接攪拌することにより、インサイチューで生成された酸性ゲル表面上でのCPの所望の不均一な核形成及び成長が妨げられることを示唆している。代わりに、これにより、溶液全体にわたってHAの均一な沈殿が促進され、多量のHA沈殿物が形成されることとなる。
【０１１０】
実施例8：種々のアニオン官能基を有するHEMAモノマー及びコモノマーで作られる複合体
3種のメタクリルアミド（MAm）モノマー（各々は、以下のアニオン基：グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、及びセリン（Ser）の1つを有する）のそれぞれ5%と共重合したHEMAから、ヒドロゲルを得た。ここで図10を参照すると、HEMAモノマー（101）及びHEMAmモノマー（102）、非付着残基を有するコモノマー（103）、グリシン-メタクリルアミドコモノマー（GlyMAm、104）、セリン-メタクリルアミドコモノマー（SerMAm、105）、並びにグルタミン酸-メタクリルアミドコモノマー（GluMAm、106）が示されている。コモノマー104、105、及び106はそれぞれ、グリシン、セリン、及びグルタミン酸と塩化メタクリロイルとの反応によって合成した。
【０１１１】
また、ヒドロゲルコポリマーの物性、化学的多用途性、及び生体適合性をさらに微調整するための他のメタクリルアミドモノマーも設計及び合成したが、本ヒドロゲルの作製には用いなかった。例えば、様々な数の非付着エチレングリコール単位を担持するHEMAm及び、103などのモノマーを合成した。ヒドロゲルをさらに綿密に仕上げるため、より伸長したエチレングリコールリンカー（nは1〜500,000でありうるが、1〜1000であることが好ましい）を末端ヒドラジン又はアミノオキシ基により官能化することができる。例えば、アルデヒド若しくはケトン含有ペプチド、炭水化物リガンド、又は代謝操作された細胞とこれらの末端官能基との化学選択的結合を行って、ヒドロゲルの生体適合性を高めることがことができる。
【０１１２】
尿素媒介性無機化技術を、実施例1のプロトコルに従って作られたpHEMA-co-5%-pGluMAm、pHEMA-co-5%-pGlyMAm、及びpHEMA-co-5%-pSerMAmゲルの無機化に適用すると、実施例3のものと同様の無機化パターンが観察された。二次元の環状リン酸カルシウムの外向きの成長が核形成部位から起こった。12時間の延長した無機化後、非晶質又はナノ結晶質リン酸カルシウム層がゲル表面を完全に覆い、実施例3におけるpHEMAの場合のように、その最上部に結晶アパタイト沈殿物の球状凝集物が形成された。複合体の意図的な破砕の際にはいずれの環状無機物ドメインの層間剥離も生じず、これにより優れたゲル-無機物界面接着強度が示唆される。
【０１１３】
尿素媒介手順を用いて無機化されたpHEMA-co-5%-pGluMAmゲルの表面上に形成された無機物層のEDS分析（図11）により、複合体の初期無機物層がリン酸カルシウム薄層であることを示す、Ca及びPと相関する２つの異なるピークが示された。無機化されたpHEMA-co-5%-pGlyMAm及びpHEMA-co-5%-PSerMAmゲルで同様の結果が観察された。
【０１１４】
本実施例、方法、手順、特定の化合物及び分子は、本発明を例証し証明するものであり、決して本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中で言及される特許又は刊行物はいずれも、本特許が属する当業者の水準を示すものであり、各々が具体的かつ個別的に参照として組み入れられるのと同程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】無機化プロセスにおけるヒドロゲル足場を定性的に表したものである。図1Aは、無機化溶液と接触したpHEMAヒドロゲル足場中のエステル含有側鎖の拡大図である。図1Bは、pHの増加によって核形成部位を生じさせるためのエステル含有側鎖の加水分解後のヒドロゲル足場の拡大図である。図1Cは、初期無機化層の核形成及び二次元の外向き成長並びに核形成部位からの内部無機化の際の、ヒドロゲル足場の図である。図1Dは、マイクロメートル厚さの伸長した無機化層及びヒドロゲル内の広範囲にわたる無機化を有するヒドロゲル足場の図である。
【図２】Ca2+の溶解度（曲線1）、不均一な核形成の限界（曲線2）、及び均一な核形成の限界（曲線3）と比較した、ヒドロゲルから高度に統合された複合体へと変換される際の、ヒドロゲル足場の尿素媒介性かつpH依存性の核形成及び成長挙動（点曲線）をpHの関数として定性的に表したグラフである。
【図３】エステル側鎖を有するモノマーを、架橋剤および非付着性かつ機能性のリガンドを有するコモノマーを用いて重合する工程による、潜在的な無機化部位及び官能基を有するヒドロゲルネットワークを作製するストラテジーの図である。
【図４】SEM顕微鏡写真並びに、pHEMA-無機物複合体における無機化の程度を特徴付けるEDS及びXRD分析を示している。図4Aは、伸長無機化後のpHEMA-無機物複合体の断面を示すSEM顕微鏡写真である。図4Bは、伸長無機化後のpHEMAの十分に無機化された表面を示すSEM顕微鏡写真であり、挿入図は、核形成部位におけるHA微結晶の球状塊の一つの拡大図を示している。図4Cは、図4Bの顕微鏡写真に示された表面無機物層の較正済みEDS面積分析である。図4Dは、得られたpHEMA-CP複合体のX線回折パターンである。
【図５】pHEMA-アパタイト複合体の断面のSEM関連EDS面積分析であり、ヒドロゲル内部全体にわたる有意なカルシウム沈着を示唆している。
【図６】pHEMAm-無機物複合体における表面無機物パターンのSEM顕微鏡写真を示している。図6Aは、尿素媒介性無機化条件下でpHEMAmヒドロゲルの表面上で成長した、花様無機物パターンのSEM顕微鏡写真である。図6Bは、pHEMAmヒドロゲルの表面上に沈着した無機物の束を示すSEM顕微鏡写真である。
【図７】加熱速度が1.0℃/分と比較的早い、無機化されたpHEMAヒドロゲルの特徴決定である。図7Aは、標準SEM操作条件下で表面が直ぐに損傷を受けることを示す複合体について行ったEDS分析であり、ヒドロゲル表面は無機物にほとんど被覆されていないことを示唆している。図7Bは、結晶質カルシウムアパタイトのいずれにも対応しなかったヒドロゲル表面上の散在性の無機物沈着を示すXRD分析である。
【図８】0.5℃/分と穏やかな加熱速度で無機化されたpHEMAヒドロゲルの特徴決定である。図8Aは、複合体について行ったEDS分析であり、Ca/P比がHAのものと一致することを明らかにしている。図8Bは、複合体のXRD分析であり、ナノ結晶質又は非晶質のCP層がヒドロゲル表面上で形成されていることを示唆している。
【図９】0.2℃/分と穏やかな加熱速度で無機化されたpHEMAヒドロゲルの特徴決定である。図9Aは、ヒドロゲル上に形成された球状アパタイト凝集物について行ったEDS分析であり、予想Ca/P比を確証するものである。図9Bは、複合材料について行ったXRD分析であり、結晶質HAの形成を確証するものである。
【図１０】モノマー（101、102）並びに、非付着残基を有するコモノマー（103）及び機能性リガンドを有するコモノマー（104、105、及び106）の構造を示す。
【図１１】無機化されたpHEMA-co-5%-pGluMAmヒドロゲルについてのEDS分析である。無機化されたpHEMA-co-5%-pGlyMAm及びpHEMA-co-5%-pSerMAmヒドロゲルにより、同様の結果が得られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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