(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩及びその中間体を調製する方法に関し、該方法は、（ａ）式（II）で表される化合物をハロゲン化して、式（IIａ）で表される化合物を得るステップ、（ｂ）式（IIａ）の化合物の１４位を、場合により適切なリンカーの存在下で、式（III）で表されるペプチドのチオール部分と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップを含み、その際、上記式中、Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し；Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表し；Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＯＣＦ３を表し；Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し；Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３又はＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２を表し；Ｒ８は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ９は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ１０は、ハロゲンを表し；及び、Ｌは、場合により存在する適切なリンカーアームを表す。
2006504657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2006504657.tif 000029
で表される化合物又はその薬学的に許容される塩及びその中間体を調製する方法であって、
（ａ）  式（II）で表される化合物をハロゲン化して、式（IIａ）で表される化合物を得るステップ：
【化２】
2006504657.tif 000030
（ｂ）  式（IIａ）の化合物の１４位を、場合により適切なリンカーの存在下で、式（III）で表されるペプチドのチオール部分と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップ：
【化３】
2006504657.tif 000031
［上記式中、Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し；Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表し；Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＯＣＦ３を表し；Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し；Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３又はＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２を表し；Ｒ８は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ９は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ１０は、ハロゲンを表し；及び、Ｌは、場合により存在する適切なリンカーアームを表す］
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ａ）  式（II）の化合物をハロゲン化 して、式（IIａ）の化合物を得るステップ：
【化４】
2006504657.tif 000032
（ｂ）  式（IIａ）の化合物の１４位を、式（IV）で表されるリンカーと反応させて、式（Ｖ）で表される化合物を得るステップ：
【化５】
2006504657.tif 000033
［上記式中、Ｚは、チオールと反応することが可能な官能基であり、Ｘは、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を含む群から選択される二価の基を表す］
（ｃ）  式（Ｖ）の化合物を、式（III）のペプチドのチオール部分とカップリングさせて、式（Ｉ）の化合物を得るステップ：
【化６】
2006504657.tif 000034
［上記式中、Ｌは、式：Ｒ−Ｘ−Ｙ−で表されるリンカーアームを表し、ここで、Ｒは、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｙは、Ｚが式（III）の化合物のチオール部分と反応したときの生成物であり、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、上記で定義された意味と同じ意味を有する］
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）  式（II）の化合物をハロゲン化 して、式（IIａ）の化合物を得るステップ：
【化７】
2006504657.tif 000035
（ｂ）  式（IIａ）の化合物の１４位を、式（III）のペプチドのチオール部分と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップ：
【化８】
2006504657.tif 000036
［Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０は、上記で定義された意味と同じ意味を有し、−Ｌ−は、式（Ｉａ）で表されるように、存在しない］
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１０がＢｒである、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ハロゲン化するステップを、適切なアルコールの存在下で、式（II）の化合物の１３−ケトンをケタール化するステップと同時に行う、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記ケタール化するステップを、適切なオルトエステルの存在で行う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記官能基Ｚが、α，β−不飽和カルボニル、カルボキシ、カルバモイル及びイミジル基を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記官能基Ｚが、マレイミジル基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
式（IV）のリンカーが、マレイミド酪酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
式（II）の化合物が、ダウノルビシン、カルミノマイシン又はイダルビシンである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
式（II）の化合物が、ダウノルビシンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
式（III）のペプチドが、１〜１００個のアミノ酸を含んでいる、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
式（III）のペプチドが、１０〜３０個のアミノ酸を含んでいる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
式（Ｉ）の化合物が、式（Ｉｄ）：
【化９】
2006504657.tif 000037
［式中、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義されている意味と同じ意味を有し、ｎは、２〜１０の範囲の数字である］
で表される化合物である、請求項１、２及び４〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
式（Ｉｄ）の化合物が、式（Ｉｃ）：
【化１０】
2006504657.tif 000038
［式中、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義されている意味と同じ意味を有する］
で表される化合物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により得られる中間体。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法により得られる化合物。
【請求項１８】
式（Ｉａ）：
【化１１】
2006504657.tif 000039
［式中、Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ４は、Ｈ又はＣＯＣＦ３を表し、Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し、Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ８は、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ９は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し、及び、Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表す］
を有する化合物。
【請求項１９】
Ｒ３が、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ４がＨを表し、Ｒ５が、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し、Ｒ６が、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ８がＨであり、Ｒ９がＨであり；Ｒ１が、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し、及び、Ｒ２が、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表す、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ３が、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＨであり、Ｒ６がＨであり、Ｒ８がＨであり、Ｒ９がＨであり；Ｒ１が、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し、及び、Ｒ２が、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表す、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
式（Ｉｂ）：
【化１２】
2006504657.tif 000040
［式中、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義されている意味と同じ意味を有する］
を有する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
１〜１００個のアミノ酸を含む、請求項１７〜２１のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２３】
１０〜３０個のアミノ酸を含む、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
医薬用担体及び治療有効量の請求項１７〜２３のいずれか一項記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項２５】
医薬として使用するための、請求項１７〜２３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項２６】
抗腫瘍剤としての、請求項１７〜２３のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項２７】
抗腫瘍剤の調製における前駆物質としての、請求項１６に記載の化合物の使用。
【請求項２８】
癌を処置するための医薬を調製するための、請求項１７〜２３のいずれか一項記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートの合成方法に関する。より詳細には、本発明は、ドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートの合成方法に関する。本発明は、さらに、該方法により得られるアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩にも関する。本発明は、さらに、癌を処置するための医薬としての該アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートの使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
アンスラサイクリン系化合物は、最も効果的で、最も広く使用されている抗腫瘍剤の一種である。この種類の化合物の中で最もよく知られているのは、ドキソルビシン及びダウノルビシンである。ダウノルビシンは、急性白血病の処置において有効である。ドキソルビシンは、これまで確認されている最も活性が高い抗新生物薬の一つである。それは、急性白血病、ホジキン病及び非ホジキンリンパ腫、小細胞肺癌及び非小細胞性肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、甲状腺癌及び膀胱癌、骨原性肉種及び軟部組織肉腫、並びに、悪性黒色腫に対して治療効果を有していることが知られている。上記化合物は、腫瘍、及び、選択された細胞集団を除去することが求められる別の疾患状態の処置において有用であり得るが、それらの治療効力は、多くの場合、それらの投与に関連した用量依存性毒性によって制限される。さらに、腫瘍には薬剤耐性が存在することにより、上記化合物の細胞毒性が低減される。
【０００３】
アンスラサイクリン系化合物のペプチドコンジュゲートは知られており、それらを合成するためのさまざまな方法が記述されている。ＷＯ００／７８３５９号は、アンスラサイクリンをペプチドにコンジュゲートさせるか、又は、アンスラサイクリンをペプチドと同時に投与することを含む、癌及び化学療法耐性癌を治療するための方法及び組成物に関する。その点に関し、該ペプチドは、ドキソルビシンのアミノ末端とペプチドのカルボキシ末端の間のアミド結合、又は、ドキソルビシンの第一級ヒドロキシルとペプチドのカルボキシ末端の間のエステル結合のいずれかを介して、アンスラサイクリンに結合している。米国特許第５，９９８，３６２号は、オリゴペプチドと公知細胞毒性薬（例えば、アンスラサイクリン系薬物）を含んでいる化学的コンジュゲート（chemical conjugate）に関する。該オリゴペプチドは、アンスラサイクリンのアミノ末端又は１４−ヒドロキシルのいずれかに共有結合により結合している。これまでに、数種類の有用な新規誘導体が合成されたが、いまだ、容易に且つ多量に調製することが可能な類似体を見いだすことが強く求められている。
【０００４】
本発明の目的は、アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを合成するための新規方法を提供することである。本発明の別の目的は、該コンジュゲートを合成するための容易に実施可能な方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、限定された数のステップを含む、該コンジュゲートの合成方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、該コンジュゲートを容易に入手可能な出発物質及び試薬から安価に調製することが可能な方法を提供することである。さらに別の目的は、該コンジュゲートを良好な収率で生成させる該コンジュゲートの合成方法を提供することである。本発明の別の目的は、強力な抗腫瘍剤である新規アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを提供することである。本発明のさらに別の目的は、多剤耐性腫瘍の処置において有用な新規アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを提供することである。
【０００５】
発明の要約
第一の態様によれば、本発明は、式（Ｉ）：
【０００６】
【化１３】
2006504657.tif 000003
【０００７】
で表されるアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩及びその中間体を合成する方法に関し、ここで、該方法は、式（II）で表される化合物の１４位を、場合により適切なリンカーの存在下で、式（III）で表されるペプチドのチオール部分と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップを含み、その際、式中、Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＯＣＦ３を表し；Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し；Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３又はＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２を表し；Ｒ８は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ９は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し；Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表し；及び、Ｌは、場合により存在する適切なリンカーアーム（linker arm）を表す。
【０００８】
【化１４】
2006504657.tif 000004
【０００９】
より詳細には、本発明は、式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容される塩及びその中間体を調製する方法に関し、ここで、該方法は、第一に、式（II）で表される化合物をハロゲン化して、式（IIａ）で表される化合物を得るステップ：
【００１０】
【化１５】
2006504657.tif 000005
【００１１】
第二に、式（IIａ）の化合物の１４位を、場合により適切なリンカーの存在下で、式（III）で表されるペプチドのチオール部分と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得るステップを含む：
【００１２】
【化１６】
2006504657.tif 000006
【００１３】
上記式中、Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し；Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表し；Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ４は、Ｈ又はＣＯＣＦ３を表し；Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し；Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３又はＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２を表し；Ｒ８は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ９は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ１０は、ハロゲンを表し；及び、Ｌは、場合により存在する適切なリンカーアームを表す。
【００１４】
一実施形態によれば、本発明は、式（IIａ）の化合物を、１４位で式（IV）で表されるリンカーと反応させて、式（Ｖ）で表される化合物を得た後［ここで、式中、Ｚは、チオールと反応することが可能な官能基であり、Ｘは、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を含む群から選択される二価の基を表す］：
【００１５】
【化１７】
2006504657.tif 000007
【００１６】
得られた式（Ｖ）の化合物を、式（III）のペプチドのチオール部分とカップリングさせて、式（Ｉ）の化合物を得る方法に関する：
【００１７】
【化１８】
2006504657.tif 000008
【００１８】
上記式中、Ｌは、式：Ｒ−Ｘ−Ｙ−のリンカーアームを表し、ここで、Ｒは、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｙは、Ｚが式（III）の化合物のチオール部分と反応したときの生成物であり、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は、上記で定義された意味と同じ意味を有する。
【００１９】
別の実施形態によれば、本発明は、式（IIａ）の化合物を、１４位で、式（III）のペプチドのチオール部分と直接反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る方法に関する［ここで、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は、上記で定義された意味と同じ意味を有し、Ｌは、式（Ｉａ）で表されるように、存在しない］：
【００２０】
【化１９】
2006504657.tif 000009
【００２１】
本発明は、さらに、第二の態様において、上記方法により得られたアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲート及び中間体に関する。式（Ｉ）で表される該アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートは、少なくとも１つのシステインを含んでいるペプチドを含有しており、ここで、該ペプチドは、該システイン残基の側鎖を介して、場合により適切なリンカーを通して、該アンスラサイクリンの１４−炭素基に共有結合している。
【００２２】
さらに、本発明は、癌の処置における医薬としての上記で記載した新規アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートの使用に関する。
【００２３】
以下において、本発明に関してさらに詳細に開示する。実施例を記載し、それにより、該記述をさらに支持する。
【００２４】
詳細な説明
本発明は、式（Ｉ）で表されるアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の合成方法に関し、ここで、該ペプチドは、システイン残基の側鎖を介して、場合により適切な二官能性リンカーＬを通して、該アンスラサイクリンの１４−炭素基に共有結合している。
【００２５】
【化２０】
2006504657.tif 000010
【００２６】
式（Ｉ）の化合物におけるリンカーアームＬは、式（Ｉ）の化合物内のメチル基（Ｃ１４）とチオエーテル基の間に存在する任意の二価基を表し得る。Ｌは、好ましくは、式：Ｒ−Ｘ−Ｙ−［式中、Ｒはエステル結合を表し、Ｘは、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を含む群から選択される二価基を表し、Ｙは、カルボニル基、カルボキシ基、カルバモイル基及びイミジル基を含む群から選択される官能基である］で表される二価基であるか、又は、Ｌは、式（Ｉａ）により示されているように、式（Ｉ）の化合物内に存在していなくてもよい。
【００２７】
【化２１】
2006504657.tif 000011
【００２８】
本明細書において使用される場合、用語「アルキル」及び「アラルキル」のアルキル部分及び類似した用語は、直鎖、分枝鎖若しくは環状部分又はそれらの組合せを有し、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜１０個の炭素原子、さらに好ましくは１〜８個の炭素原子、さらに好ましくは１〜６個の炭素原子、さらに好ましくは１〜４個の炭素原子を含む、飽和二価炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル及びシクロヘキシルなどである。本明細書において使用される場合、用語「アリール」は、２つの水素を除去することにより芳香族炭化水素から誘導される二価有機基を包含し、各環に７以下の環員を有していて少なくとも１つの環が芳香族である任意の単環式炭素環又は二環式炭素環が含まれる。その様なアリール成分の例としては、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントリル又はアセナフチルなどを挙げることができる。本明細書において使用される場合、用語「アラルキル」は、式：アルキル−アリール（ここで、アルキルは上記で定義されているとおりである）で表される基に関する。アラルキル基の例としては、ベンジル及びフェネチルなどを挙げることができる。本明細書において使用される場合、用語「シクロアルキル」は、二価の非芳香族環状炭化水素基を包含するものである。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシルなどを挙げることができる。本明細書において使用される場合、用語「アルケニル」は、１つ又は数個の二重結合を有し、直鎖、分枝鎖若しくは環状部分又はそれらの組合せを有し、２〜２０個の炭素原子、好ましくは２〜１０個の炭素原子、さらに好ましくは２〜８個の炭素原子、さらに好ましくは２〜６個の炭素原子、さらに好ましくは２〜４個の炭素原子を含んでいる、二価炭化水素基を包含する。アルケニル基の例としては、ビニル、アリル、イソプロペニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、１−プロペニル、２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、イソプレニル、ファルネシル、ゲラニル及びゲラニルゲラニルなどを挙げることができる。
【００２９】
本明細書において使用される場合、用語「カルボニル」は、式：−Ｃ（＝Ｏ）アルキル−で表される二価基を意味し、直鎖基、分枝鎖基若しくは環状基又はそれらの組合せである。本明細書において使用される場合、用語「カルボキシ」は、式：−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキルで表される二価基を意味し、直鎖基、分枝鎖基若しくは環状基又はそれらの組合せである。本明細書において使用される場合、用語「カルバモイル」は、式：−Ｎ（アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル−で表される二価基を意味し、直鎖基、分枝鎖基若しくは環状基又はそれらの組合せである。本明細書において使用される場合、用語「イミジル」は、式：−Ｎ（Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）２−で表される二価基を意味し、直鎖基、分枝鎖基若しくは環状基又はそれらの組合せ、例えば、スクシンイミドなどである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「化合物」は、その範囲内に、記載されているか又は列挙されている特定の化合物のみではなく、該化合物の別の形態も包含する。該化合物は不斉中心を有してもよく、ラセミ化合物、ラセミ混合物、及び、個々のジアステレオ異性体として存在し得る。光学異性体を包含する全ての可能な立体化学的異性体は本発明に包含される。
【００３１】
上記方法における出発物質は、アンスラサイクリンであり、さらに好ましくは、式（II）［式中、Ｒ７は、Ｈ、ＯＨ、−ＯＣＯ（ＣＨ２）３ＣＨ３又は−ＯＣＯＣＨ（ＯＣ２Ｈ５）２を表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は上記で定義されている意味と同じ意味を有する］で表されるアンスラサイクリンである。
【００３２】
【化２２】
2006504657.tif 000012
【００３３】
好ましい実施形態では、式（II）で表される該アンスラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、カルミノマイシン、イダルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、ピラルビシン（ＴＨＰ）及びＡＤ−３２を含む群から選択される。より好ましくは、該アンスラサイクリンは、ダウノルビシン、イダルビシン又はカルミノマイシンである。さらに好ましくは、式（II）で表される該化合物は、ダウノルビシンである。
【００３４】
式（Ｉ）のアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを調製するための上記方法の第一のステップは、式（II）で表されるアンスラサイクリンの１４位をハロゲン化することからなる。該ハロゲン化ステップにより、式（IIａ）で表される化合物が得られる［ここで、式中、Ｒ１０はハロゲンを表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は上記で定義されている意味と同じ意味を有する］。本発明の一実施形態では、Ｒ１０はＢｒである。本発明の別の実施形態では、Ｒ１０はＣｌである。本発明のさらに別の実施形態では、式（IIａ）の化合物は、Ｒ１０＝ＣｌとＲ１０＝Ｂｒの１／１の比における混合物からなる。
【００３５】
【化２３】
2006504657.tif 000013
【００３６】
該ハロゲン化剤は、好ましくは、分子状ハロゲン又は原子状ハロゲンである。用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含する。好ましい実施形態では、該ハロゲン化は、臭素を用いて行う。一般に、このハロゲン化ステップは、０〜１００℃の温度、例えば、０〜５０℃、好ましくは、０〜２０℃ぐらいの温度で行う。一般に、このハロゲン化反応は、適切な溶媒中で、例えば、ジオキサン又は塩素化極性溶媒又は単なる極性溶媒又はそのような溶媒の混合物中で行うことができる。例えば、該ハロゲン化は、ジオキサンとメタノールの混合物中で行うことができる。
【００３７】
該ハロゲン化は、好ましくは、ケトン官能基を保護するために、式（II）のアンスラサイクリンの１３−ケトンをケタール化するステップと同時に行う。該ケタール化ステップは、任意の適切な方法で行うことができるが、好ましくは、式（II）のアンスラサイクリンをアルコールと反応させることにより行う。
【００３８】
この反応には、任意の適切なアルコールを使用することができる。そのようなアルコールは、例えばケタールの形成を容易にするために、ケタール化するカルボニル基に対して過剰に供給すべきである。この反応についての好ましいアルコールは、メタノールである。種々のオルトエステルが上記反応において使用するのに適している。オルトエステルは、反応から水を化学的に除去して、反応を完結させる作用を有している。オルトギ酸エステルを使用すると高い収率が得られるので、有利には、オルトギ酸エステルを使用する。好ましいオルトギ酸エステルとしては、オルトギ酸トリイソブチル、オルトギ酸トリイソプロピル及びオルトギ酸トリエチルなどを挙げることができる。オルトギ酸トリメチルが最も好ましい。
【００３９】
ケタールをケトンに戻す変換は、水性酸で処理することにより達成される。好ましい実施形態において、該水性酸は臭化水素酸である。
【００４０】
上記方法の次のステップは、式（IIａ）で表される該ハロゲン化アンスラサイクリンを、以下の２種類の代替的な経路に従って、式（III）で表されるペプチドのチオール部分と縮合させることからなる。第一の経路は、式（IIａ）の化合物を式（IV）で表される適切なリンカーと反応させた後、式（III）のペプチドと反応させることからなり；第二の経路は、式（IIａ）の化合物を式（III）のペプチドと直接反応させることからなり、それにより、式中にＬが存在しない式（Ｉ）の化合物（これは、本明細書においては、式（Ｉａ）により表される）を得る。
【００４１】
第一の経路は、式（IIａ）のハロゲン化アンスラサイクリンを式（IV）のリンカーと反応させることからなり、それにより、式（Ｖ）で表される化合物を生成させる。
【００４２】
【化２４】
2006504657.tif 000014
【００４３】
〔上記式中、Ｘは、アルキル基、アラルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基及びアリール基を含む群から選択される二価の基を表し、Ｚは、チオールと反応することが可能な官能基を表し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は上記で定義されている意味と同じ意味を有する〕。
【００４４】
好ましい実施形態において、式（IV）のリンカーは、α，β−不飽和カルボニル、カルボキシ、カルバモイル及びイミジル基を含む群から選択される官能基Ｚを有する。さらに好ましくは、 該官能基Ｚは、マレイミジル基である。一実施形態において、Ｘは、Ｃ１−８アルキル基である。好ましい実施形態において、Ｘは、Ｃ１−４アルキル基である。さらに好ましい実施形態では、Ｘは、メチル、エチル、プロピル及びブチルを含む群から選択される。さらに好ましくは、Ｘはプロピルである。
【００４５】
一実施形態において、式（IV）のリンカーは、２−クロロ−５−マレイミド安息香酸、３−マレイミド安息香酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミドサリチル酸、６−マレイミドヘキサン酸、β−マレイミドプロピオン酸、ε−マレイミドカプロン酸及びγ−マレイミド酪酸をふくむ群又はそれらの塩から選択される。好ましい実施形態では、式（IV）の該リンカーは、マレイミド酪酸、例えば、γ−マレイミド酪酸、又は、それらの塩である。本発明の一実施形態において、式（IV）の該リンカーは、マレイミド酪酸ナトリウム及びマレイミド酪酸カリウムを含む群から選択される。
【００４６】
上記調製方法の次のステップは、式（Ｖ）の化合物を式（III）のペプチドのチオール部分とカップリングさせることからなり、それにより、式（Ｉ）［式中、Ｌは、式：Ｒ−Ｘ−Ｙ−のリンカーアームを表し、ここで、Ｒは、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−であり、Ｙは、Ｚが式（III）の化合物のチオール部分と反応したときの生成物であり、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は、上記で定義された意味と同じ意味を有する］の化合物を得る。一実施形態では、該ペプチドは、酸化されていない。
【００４７】
上記カップリング反応は、適切な溶媒中で行うことができる。そのような溶媒の非限定的な例には、酸素を含んでいない水及びＤＭＦなどがある。
【００４８】
式（III）の該ペプチドは、１つ又は数個のシステイン残基を含んでいてもよい。システイン残基は、リンカーのペプチドへの結合を提供する。該カップリングにシステインを用いることにより、カップリングの選択性が高まる。システイン残基は、該ペプチドの末端に位置し得るか、又は、該ペプチド鎖の内部に位置し得るが、但し、その位置は、該位置における結合によりペプチドの構造及び特性を干渉しない。システインの総数とは関係なく、１つのシステイン残基がＮ−末端又はＣ−末端に位置しているのが好ましい。適切なペプチドの例は、システイン残基を該ペプチドのＣ−末端に有する。
【００４９】
式（III）の該ペプチドは、化学的に合成し得るか、又は、組換え手段により生成させ得る。いずれの方法も適宜実施することが可能である。該ペプチドには、人工的な（unnatural）アミノ酸又は非アミノ酸を有するものも包含される。そのようなペプチドは化学的合成によって調製されるであろう。そのようなペプチドには、修飾されたアミノ酸を有するか又はアミノ酸の代わりに別の部分構造を有するペプチドが包含される。そのような別の部分構造には、フッ素、塩素、有機化合物、例えば、アルコール類、有機環構造、及び、ヒドロキシ酸などがあるが、それらに限定されない。Ｌ−配置にあるペプチドを使用することができるように、Ｄ−配置にあるアミノ酸又はペプチドも使用することができる。ペプチド模倣体及びペプトイドも、本発明に包含される。ここで、「ペプチド模倣体（peptidomimetic）」は、本明細書において使用される場合、ペプチドの薬理学的に関連する部分を実質的に複製することによりペプチドの生物学的活性を模倣するが、ペプチドではない分子を表す。用語「ペプトイド（peptoid）」は、本明細書において使用される場合、ペプチド結合の１つ以上が、同一であるか又は異なっている疑似ペプチド結合（pseudopeptide bond）により置き換えられているペプチドの類似体を表す。そのような疑似ペプチド結合は、カルバΨ（ＣＨ２−ＣＨ２）；デプシΨ（Ｃ（＝Ｏ）Ｏ）；ヒドロキシエチレンΨ（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）；ケトメチレンΨ（ＣＯ−ＣＨ２）；メチレン−オキシ ＣＨ２−Ｏ−；還元されたもの ＣＨ２−ＮＨ；チオメチレン ＣＨ２−Ｓ−；チオペプチド ＣＳ−ＮＨ；Ｎが修飾されたもの −ＮＲＣＯ−；又は、レトロインベルソ −ＣＯ−ＮＨ−であり得る。１つのペプチド分子は、１種以上の疑似ペプチド結合を含み得る。それは、通常のペプチド結合も含み得る。
【００５０】
好ましい実施形態では、式（III）の該ペプチドは、１〜１００個のアミノ酸、好ましくは、１０〜５０個のアミノ酸、より好ましくは、１０〜４０個のアミノ酸、さらに好ましくは、１０〜３０個のアミノ酸を含んでいる。
【００５１】
式（III）で表される適切なペプチドの例には、非極性アミノ酸、正電荷アミノ酸、極性非電荷アミノ酸及び負電荷アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸を含んでいるペプチドなどがあるが、それらに限定されない。例えば、式（III）の該ペプチドは、少なくとも３の正電荷アミノ酸を含み得る。
【００５２】
式（III）で表されるペプチドの別の適する例には、４５〜９０%の正電荷アミノ酸、好ましくは、４５〜８０%の正電荷アミノ酸、さらに好ましくは、４５〜７０%の正電荷アミノ酸、最も好ましくは、４５〜６０%の正電荷アミノ酸を含んでいるペプチドなどがあるが、それらに限定されない。 
【００５３】
例えば、式（III）で表される該ペプチドは、以下のアミノ酸配列からなり得る：ＣｙｓＮＮＰＮＰＢＰＰＮＰＰＰＰＰＡＰＮＢＰＢＮＰＢＰＢＰＰＢＢＮ。ここで、「Ｎ」は非極性アミノ酸であり、「Ｂ」は正電荷アミノ酸であり、「Ｐ」は極性非電荷アミノ酸であり、「Ａ」は負電荷アミノ酸である。
【００５４】
本明細書において使用される場合、非極性アミノ酸は、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ及びＶである。極性非電荷アミノ酸は、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｔ及びＹである。正電荷アミノ酸は、Ｒ、Ｈ及びＫである。負電荷アミノ酸は、Ｄ及びＥである。
【００５５】
本発明の一実施形態において、該ペプチドは、本発明のアンスラサイクリンコンジュゲートを細胞の内部に運ぶことができるペプチドであり得る。これにより、抗癌薬耐性の問題を克服することが可能となる。該ペプチドは、細胞膜との相互作用を通して、アンスラサイクリンコンジュゲートの細胞質内への内部移行を促進し得る。
【００５６】
本発明の方法により調製される化合物の例には、式（Ｉｄ）［式中、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義されている意味と同じ意味を有し、ｎは、２〜１０の範囲の数である］で表される化合物（例えば、式（Ｉｃ）の化合物）などがあるが、それらに限定されない。
【００５７】
【化２５】
2006504657.tif 000015
【００５８】
上記第二の経路は、上記のように、式（IIａ）のハロゲン化アンスラサイクリンを式（III）のペプチドのチオール部分と反応させることからなり、それにより、式（Ｉａ）で表されるように、式中にＬが存在しない式（Ｉ）の化合物が得られる。
【００５９】
上記反応は、メタノールのような適切な溶媒の存在下で行うことができる。該反応は、適切には、塩基性条件下で、例えば、ｐＨ１０以上で行う。該反応条件は、炭酸カリウムのような適切な塩基を添加することにより塩基性にすることができる。
【００６０】
当業者は、本発明の化合物の合成において、出発物質及び中間体の種々の反応性官能基を保護することが必要な場合があり、その際、所望の反応は、該分子の別の部分で実施するということを理解する。所望の反応が完了した後、又は、任意の望ましいときに、通常、そのような保護基を、例えば加水分解的手段又は水素化分解的手段により、除去する。そのような保護ステップ及び脱保護ステップは、有機化学において慣習的である（Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie, ed., Plenum Press, NY, N.Y.(1973)；及び, Protective Groups in Organic Synthesis, Greene, ed., John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1981)）。
【００６１】
本明細書中に記述されている方法において、該化合物及び中間体は、例えば抽出、結晶化、摩砕及びクロマトグラフィーのような、当技術分野において一般に知られている方法に従って、さらに精製することができる。
【００６２】
本発明の別の態様は、上記方法により得られた中間体及び化合物に関する。
【００６３】
より詳細には、本発明は、式（Ｉａ）［式中、Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ４は、Ｈ又はＣＯＣＦ３を表し、Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し、Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ８は、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ９は、ＯＨ又はＨを表し；Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し、及び、Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表す］で表される化合物に関する。
【００６４】
【化２６】
2006504657.tif 000016
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｉａ）［式中、Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ４はＨであり、Ｒ５は、ＯＨ、Ｏ−テトラヒドロピラニル又はＨを表し、Ｒ６は、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ８はＨであり、Ｒ９はＨであり；Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し、及び、Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表す］で表される化合物に関する。
【００６６】
さらに別の実施形態では、本発明は、式（Ｉａ）［式中、Ｒ３は、ＯＣＨ３、ＯＨ又はＨを表し、Ｒ４はＨであり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ６はＨであり、Ｒ８はＨであり、Ｒ９はＨを表し；Ｒ１は、ＯＨ、ＮＨ２又はＮＨ−ペプチドを表し、及び、Ｒ２は、Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドを表す］で表される化合物に関する。
【００６７】
さらに別の実施形態では、本発明は、式（Ｉｂ）［式中、Ｒ１及びＲ２は、上記で定義されている意味と同じ意味を有する］で表される化合物に関する。
【００６８】
【化２７】
2006504657.tif 000017
【００６９】
本発明の上記新規化合物は、１〜１００のアミノ酸、好ましくは、１０〜５０のアミノ酸、さらに好ましくは、１０〜３０のアミノ酸を含み得る。一実施形態において、該化合物は、少なくとも３個の正電荷アミノ酸を含み得る。
【００７０】
本発明の化合物は、非極性アミノ酸、極性非電荷アミノ酸、及び、正電荷又は負電荷アミノ酸を含む群から選択されるアミノ酸を含み得る。
【００７１】
例えば、該新規化合物は、４５〜９０%の正電荷アミノ酸、好ましくは、４５〜８０%の正電荷アミノ酸、さらに好ましくは、４５〜７０%の正電荷アミノ酸、最も好ましくは、４５〜６０%の正電荷アミノ酸を含み得る。
【００７２】
本発明化合物は、以下のアミノ酸配列を含み得る：ＣｙｓＮＮＰＮＰＢＰＰＮＰＰＰＰＰＡＰＮＢＰＢＮＰＢＰＢＰＰＢＢＮ。ここで、「Ｎ」は非極性アミノ酸であり、「Ｂ」は正電荷アミノ酸であり、「Ｐ」は極性非電荷アミノ酸であり、「Ａ」は負電荷アミノ酸である。
【００７３】
本発明は、さらにまた、該化合物の代替的な形態、例えば、薬学的に許容される塩、溶媒和物及び水和物なども包含する。本発明化合物の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性の無機酸又は有機酸から形成されるような、本発明化合物の慣習的な非毒性の塩などがある。例えば、そのような、慣習的な非毒性の塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸及び硝酸などのような無機酸から誘導される塩：及び、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸及びトリフルオロ酢酸などのような有機酸から調製される塩などを挙げることができる。
【００７４】
本発明の新規化合物又はその医薬組成物は、医薬として有用であり、より詳細には、癌及び薬物耐性癌を治療するための医薬として有用である。さらにまた、本発明の中間体も、抗腫瘍剤の調製における前駆物質として有用である。
【００７５】
本発明の新規化合物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩は、医薬用担体及び治療有効量の上記化合物を含有する医薬組成物の形態で患者に投与することができる。該組成物には、さらに、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、リポソーム又は脂質配合物なども含有させることができる。さらにまた、該医薬組成物には、１種以上の追加の活性成分、例えば、別の化学療法薬、抗菌薬、抗炎症薬及び麻酔薬なども含有させることができる。
【００７６】
該医薬組成物は、局所療法又は全身療法のいずれが望ましいかに応じて、また、治療する範囲に応じて、多くの方法で投与することができる。投与は、皮膚に局所的に、眼内に、膣内に、直腸内に、鼻腔内に、経口的に、吸入により、又は、非経口的に、例えば、点滴静注、皮下注射、腫瘍内注射、腹腔内注射、リンパ管内注射若しくは筋肉内注射により行うことができる。好ましい投与方法は、非経口投与である。
【００７７】
局所投与用の製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤及び散剤などを挙げることができる。慣習的な医薬用担体、水性、粉末状又は油性の基剤、及び、増粘剤などが、必要であるか又は望ましい場合がある。経口投与用の組成物としては、散剤若しくは顆粒剤、水若しくは非水性媒体中の懸濁液剤若しくは溶液剤、カプセル剤又は錠剤などを挙げることができる。増粘剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。非経口投与用の製剤としては、無菌水溶液などを挙げることができ、これは、場合により、緩衝剤、リポソーム、希釈剤及び別の適する添加剤を含有し得る。
【００７８】
上記新規化合物の「治療有効量」は、必要とされる治療反応又は望ましい治療反応を惹起するのに十分な本発明化合物の量に関係する。換言すれば、患者に投与されたときに、はっきりと感知し得る生物学的な応答を惹起するのに十分な量に関係する。投与量は、治療しようとする疾患の重症度及び応答性に依存し、治療過程は、数日間から数ヶ月間、又は、治癒するまで、又は、疾患状態が軽減されるまで、継続する。最適の投与スケジュール及び投与量は、単独の化学療法薬に基づいて計算することが可能である。コンジュゲート化合物又は同時に投与される化合物を単独の化学療法薬と比較することが可能であり、それによって投与量を調節することが可能である。例えば、最適の投与量は、一般に、致死量より１０倍低い量である。最適の投与スケジュールも、薬物の体内への蓄積を測定することにより計算することが可能である。当業者は、最適の投与量及び投与方法について、容易に決定することができる。
【００７９】
本発明の新規化合物又はその医薬組成物は、薬物として有用であり、より詳細には、癌及び薬物耐性癌を処置するための医薬として有用である。従って、当該新規化合物は、抗腫瘍剤として有用であり、また、癌を処置するための医薬を調製するために使用することができる。
【００８０】
本発明は、さらに、癌を患っている患者を治療する方法にも関し、該方法では、上記アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを該患者に投与する。
【００８１】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものである。以下の実施例は、本発明を例証するために示されているものであって、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００８２】
実施例１．
スキーム１に示されている、ダウノルビシンから出発する式（Ｉｃ）のアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートの合成
【００８３】
【化２８】
2006504657.tif 000018
【００８４】
１４−ブロモ−１３−ジメチルケタール−ダウノルビシンを経由する１４−ブロモ−ダウノルビシン
ダウノルビシン．ＨＣｌ（１．０６５mmol）を乾燥メタノール（６mL）と乾燥ジオキサン（６mL）の混合物に溶解させた。次いで、オルトギ酸トリメチル（４．８９６mmol，４．６当量）を添加した後、臭素（１．４０４mmol，１．３１当量）を添加した。この混合物を、アルゴン下、１５℃で、１時間撹拌した。次いで、プロピレンオキシド（２．７４８mmol，２．５７当量）を添加し、４℃で３０分間経過した後、イソプロピルエーテル（６５mL）を添加した。直ちに、１４−ブロモ−１３−ジメチルケタール−ダウノルビシンの沈澱が生じた。この沈澱を遠心（５分間，１０００ｇ）により回収し、別のイソプロピルエーテル（８．４mL）でさらに洗浄し、アルゴン下で乾燥させた。１４−ブロモ−１３−ジメチルケタール−ダウノルビシンをアセトン（２２．８mL）に懸濁させ、０．２５MのＨＢｒ水溶液（２２mL）を添加した。この溶液を、アルゴン下、室温で４５分間撹拌した後、水（２７mL）で希釈し、クロロホルム（２×６５mL）で抽出した。水層に飽和ＮａＣｌ（６mL）を添加し、次いで、この水層を、無色になるまでｎ−ブタノール（各抽出ステップ毎に２４mL）で抽出した。有機層を合し、１４−ブロモ−ダウノルビシンが沈澱するまで、溶媒を蒸発させた（高真空ポンプ，３０〜３５℃）。ｎ−ヘキサン（５０mL）を添加し、濾過により沈澱を回収し、ｎ−ヘキサンで洗浄し、乾燥させた（収率８０%）。
【００８５】
ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレート
１４−ブロモ−ダウノルビシン（０．８５１mmol）をアセトン（８０mL）に懸濁させ、マレイミド酪酸ナトリウム（４．９１mmol，５．７７当量）を添加した。この混合物を２時間還流し、室温まで冷却し、定量濾紙で濾過した。得られた沈澱物をアセトンで洗浄し、濾液を合して蒸発させた（浴：３０℃）。残渣を水に溶解させ、余分なマレイミドブチレートを除去するために、陰イオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４０２Ｃｌ）と一緒にインキュベーションした。あるいは、ＹＭＣシリカゲルを使用してもよい。凍結乾燥後、ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレートを７９%の収率で得た。
【００８６】
ドキソルビシン−ペプチドコンジュゲート
ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレート（０．０７６mmol）をＤＭＦ（５mL）に溶解させ、予めジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，５mL）に溶解させておいた非酸化ペプチド（０．７当量，実際のペプチド含有量を考慮に入れて０．０５３mmol）を添加した。アルゴン下、室温で、３〜２４時間（ペプチドに応じて）撹拌した後、水（１０mL）を添加し、得られた溶液をジクロロメタン（ＤＣＭ，６×２０mL）で抽出した。水層を凍結乾燥して、ドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートを得た。該反応は、水（９mL）の中で行うこともできる。撹拌後、混合物をＤＣＭ／ＤＭＦ：９／１（２５×９mL）で抽出し、次いで、ＤＣＭ（６×９mL）で抽出した。ドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートは、逆相高速液体クロマトグラフィーで精製することができた。例えば、溶媒として水中の０．１%トリフルオロ酢酸とアセトニトリル中の０．１%トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、２５０×２１．２mm，１０μ  Ｌｕｎａ  カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用することができた。７０分間での２０−４０%のアセトニトリルの勾配（流速  ６mL／分）を用いることにより、適切に分離することができた。窒素又はアルゴンを通気することにより、該コンジュゲートを含んでいるフラクションからそこに含まれている最大限のアセトニトリルとトリフルオロ酢酸を除去した後、凍結乾燥した。
【００８７】
【化２９】
2006504657.tif 000019
【００８８】
スキーム１．ダウノルビシンから出発するドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートの合成（上記式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２又は−ＮＨ−ペプチドであり；Ｒ２は、−Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドである）。
【００８９】
実施例２．
スキーム２に示されている、式（Ｉｂ）のアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートの合成
【００９０】
【化３０】
2006504657.tif 000020
【００９１】
１４−ブロモ−ダウノルビシン（０．３５０mmol）を丸底フラスコ内の乾燥メタノール（１２mL）に溶解させた。ペプチド（０．８５当量，ペプチド含有量を考慮に入れる）を添加した後、Ｋ２ＣＯ３（１．３当量）（ｐＨが１０に達するはずであり、もし、１０に達しない場合は、炭酸カリウムを添加する）を添加した。反応混合物を、アルゴン下、光から保護しながら、３０〜９０分間（ペプチドに応じて）撹拌した。０．５M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９（メタノール容積の１／１０）を添加し、有機層が無色になるまでクロロホルム（６×１容積）で抽出することにより、後処理を開始した。次いで、水層を、ガラス製フリット内のメタノール及び水で予め調整しておいたＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ  固相抽出樹脂（未精製化合物１００mg当たり５g）にローディングした。水中の０．１%ＴＦＡで洗浄した後、メタノールで溶離させることにより、該コンジュゲートを回収した。メタノールを蒸発させ、残渣を水に溶解させ、次いで、得られた溶液を凍結乾燥して、未精製のチオエーテルコンジュゲートを得た。
【００９２】
【化３１】
2006504657.tif 000021
【００９３】
スキーム２．ダウノルビシンから出発するダウノルビシン−ペプチドコンジュゲートの合成（上記式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２又は−ＮＨ−ペプチドであり；Ｒ２は、−Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドである）。
【００９４】
実施例３．
式（Ｉｃ）のアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートのマルチグラムスケール合成（スケールアップ因子＝３０，スキーム３）。
【００９５】
【化３２】
2006504657.tif 000022
【００９６】
スキーム３．ダウノルビシンから出発するドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートの合成（上記式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２又は−ＮＨ−ペプチドであり；Ｒ２は、−Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドである）。
【００９７】
ダウノルビシンから出発する式（Ｉｃ）のアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートの合成における種々のステップ（スキーム１〜スキーム３）を改善し、マルチグラムスケールに適合させた（出発ダウノルビシン３０mmol；以前は１mmol）。
【００９８】
１４−ブロモ−１３−ジメチルケタール−ダウノルビシンを経由する１４−ブロモ−ダウノルビシンの合成
ダウノルビシン．ＨＣｌ（３０．０mmol）を乾燥メタノール（２０７mL）と乾燥ジオキサン（２０７mL）の混合物に溶解させた。次いで、オルトギ酸トリメチル（１３８．５mmol，４．６当量）を添加し、得られた混合物を室温で５分間撹拌した。得られた溶液を１２℃に冷却し、臭素（５１．５mmol，１．３１当量）を２分間かけて添加した。この混合物を、アルゴン下、１２℃で２時間撹拌し、次いで、２℃まで冷却した後、プロピレンオキシド（７８mmol，２．５７当量）を添加した。２℃で７５分間経過した後、イソプロピルエーテル（１７４０mL）を添加した。直ちに、１４−ブロモ−１３−ジメチルケタール−ダウノルビシンの沈澱が生じた。この沈澱を、定量濾紙で濾過することにより回収し、別のイソプロピルエーテル（５４０mL）でさらに洗浄した。
【００９９】
次いで、１４−ブロモ−１３−ジメチルケタール−ダウノルビシンを、アセトン（６９０mL）と０．２５Mの水性ＨＢｒ（６００mL）の混合物に溶解させた。この溶液を、アルゴン下、室温で６６時間撹拌した後、水（７５０mL）で希釈し、クロロホルム（３×７５０mL）で抽出した。水層に飽和ＮａＣｌ（１５０mL）を添加し、次いで、この水層を、無色になるまでｎ−ブタノール（２×１．５L，２×０．７５L）で抽出した。有機層を合し、容積が約３００mLになるまで、溶媒を蒸発させた（高真空ポンプ，３０〜３５℃）。ｎ−ヘキサン（２L）を添加し、濾過により沈澱を回収し、ｎ−ヘキサンで洗浄し、乾燥させた（収率７１%）。得られた赤色の固体は、ＬＣ−ＭＳ分析及びプロトンＮＭＲ分光測定により、１４−ブロモ−ダウノルビシンと１４−クロロ−ダウノルビシンの混合物（約１／１）であることが確認された。
【０１００】
抽出ステップに際して、塩化ナトリウムの代わりに飽和臭化ナトリウムを使用することにより、ハロゲン交換を防止することができた。表１は、種々の合成法において見いだされたハロ−ダウノルビシン種のＨＰＬＣピーク面積を示している。
【０１０１】
【表１】
2006504657.tif 000023
【０１０２】
上記アセタール中間体の分析により、１４−クロロ−ダウノルビシンが存在することが示されたが、これは、おそらく、出発物質が塩酸塩であったことによるものと思われる。続いて塩化ナトリウム溶液を添加したことにより、多量のハロゲン交換が起こった。塩化物イオンを存在させなくすることにより、１４−ブロモ−ダウノルビシンのみを生成させることが可能である。
【０１０３】
Ｂｒ／Ｃｌ−ダウノルビシンの種々の調製物を用いたドキソルビシン−１４−マレイミドブチレートの調製
エステル化反応を行うのに最も良好な収率及び純度の両方を達成するために、１４−Ｃｌ−ダウノルビシン化合物と１４−Ｂｒ−ダウノルビシン化合物を種々の割合で含んでいるハロ−ダウノルビシン種を用いて一連の反応を行った。これら種々のハロ−ダウノルビシン調製物の各々を、下記のようにして得たマレイミド酪酸ナトリウムと反応させた。結果については、表２に要約する。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
これらの研究から、上記カップリング反応が、かなり多くの１４−Ｃｌ−ダウノルビシン種の存在下において最もよく進行することが明らかである。しかしながら、本質的に純粋な１４−クロロ化合物を用いることは理想的ではない。それは、１４−クロロ化合物種は反応性が低く、かなりな量の未反応出発物質をもたらすからである。総体的に最もよい結果は、１４−ブロモ−ダウノルビシンに対する１４−クロロ−ダウノルビシンの比率が約１／１のときに得られた。
【０１０６】
マレイミド酪酸ナトリウムの合成
１Lのメスフラスコ内の水に炭酸水素ナトリウム（１００mmol）を溶解させて、０．１M溶液とする。４−マレイミド酪酸（８．０１４g，４３．７５mmol）を水（８０mL）に懸濁させた懸濁液を撹拌しながら、それに、前記溶液の一部（４３５mL，４３．５mmol）を滴下漏斗によってゆっくりと添加した。得られた溶液を２０分間撹拌し、減圧下に３０℃（水浴の温度）で水を蒸発させた後、凍結乾燥ユニットで最終的に乾燥させた。生成物を、僅かにピンクがかったオフホワイトの固体として得た（９．０６g，１００%）。
【０１０７】
ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレートの合成
約１／１の１４−ブロモ−ダウノルビシン／１４−クロロ−ダウノルビシン（１２．６mmol）をアセトン（１．２L）に懸濁させ、マレイミド酪酸ナトリウム（６５．８mmol，５．７７当量）を添加した。この混合物を、アルゴン下で３時間還流し、室温まで冷却し、定量濾紙で濾過する。沈澱物をアセトンで洗浄し、濾液を合して蒸発させた（浴：３０℃）。残渣を水に溶解させ、余分なマレイミドブチレートを除去するために、陰イオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４０２Ｃｌ）と一緒にインキュベーションした。ＹＭＣ逆相ゲルに通すことも可能であった。凍結乾燥後、ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレートを６９%の収率で得るが、これは、エステル化反応に続いて形成された１種類の主要な不純物を含んでいた。この不純物は、質量分析法により、ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレートのアセトン付加体であることが確認された。
【０１０８】
【化３３】
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【０１０９】
エステル化について代替溶媒の使用
マレイミド酪酸ナトリウムとハロ−ダウノルビシンのカップリングに際して、副産物としてアセトン付加体が生成するということは、高価なダウノルビシン出発物質の浪費である。アセトン付加体が生成されない代替的なカップリング媒体を見いだすために、数種類の別の溶媒を評価した。理想的な溶媒は、出発物質である１４−ハロ−ダウノルビシンとエステル生成物のいずれも溶解することが可能であることが求められ、また、同時に、マレイミド酪酸ナトリウム及び該カップリング反応の無機副産物に対しては溶解性に乏しいことが求められる。表２に示されているように、数種類の溶媒について試験したが、いずれも、アセトンに比較して劣っていることが分かった。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
今までのところ、依然として、アセトンは該カップリング反応にとって最も優れた溶媒である。溶媒としてアセトンを使用することにより不純な生成物が単離されることになるが、得られた副産物は次のステップでは反応性を有さず、抽出ステップにより除去することが可能である。
【０１１２】
１４−Ｂｒ−ダウノルビシンと１４−Ｃｌ−ダウノルビシンの約１／１の混合物を調製することは、概して、確固とした調製方法であると思われる。該調製方法は、小さなスケール（３００mg）及び中間スケール（１６g）の両方で等しく機能した。
【０１１３】
ドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートの合成
ドキソルビシン−１４−マレイミドブチレート（３．９１mmol）を水（１６０mL，酸素非含有）に溶解させ、予め酸素を含まない水（１６０mL）に溶解させておいた非酸化ペプチド（０．７当量，実際のペプチド含有量を考慮に入れて３．２７mmol）を添加した。追加の８０mLの水を添加してフラスコをすすぎ洗いした。アルゴン下、室温で４８時間撹拌した後、得られた溶液を、ＤＣＭ／ＤＭＦ：９／１（３０×１００mL）で抽出し、次いで、ＤＣＭ（３×１００mL）で抽出した。このコンジュゲートは、溶媒Ａとして水中の０．１%ＴＦＡ、溶媒Ｂとしてとアセトニトリル中の０．１%ＴＦＡ（勾配：１０分間５−３０%Ｂ，３分間３０%Ｂ，１分間３０−９０%Ｂ，６分間９０%Ｂ；  流速：２０mL/分；  ローディング：１回の実施当たり１mL中２００mg）を用いて、Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２），１０μm，２５０×２１．２mm，セミ分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ｒｅｆ．００Ｇ−４２５３−Ｐ０）とＭｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＭＤ  装置を使用して、分取ＨＰＬＣ分離により精製した。
【０１１４】
ドキソルビシン−ペプチドＴＦＡ塩の大規模塩交換
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の毒性プロフィールについては十分なキャラクタリゼーションが成されていないので、ＴＦＡ塩を開発することはできないし、薬物として使用することはできない。このような理由により、ＴＦＡ塩をＨＣｌ塩に変換するために、塩交換方法が必要とされる。
【０１１５】
イオン交換法：  ビーカー内で、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−４１０（Ｃｌ）イオン交換樹脂（２６０g）を２M塩酸（４００mL）と混合し、３０分間撹拌した。次いで、得られた樹脂のスラリーを、直径６．５cmのガラス製クロマトグラフィーカラム（樹脂カラムの高さ＝１１cm）にローディングし、僅かに正圧をかけた窒素で該液体を吹き飛ばした。充填した樹脂を、溶出液のｐＨが中性になるまで水で溶離させる（１．２Lの水が必要である）。ドキソルビシン−ペプチドＴＦＡ塩（２．５ g）を水（２５mL）に溶解させて、イオン交換カラムにローディングした。次いで、該カラムを水で溶離させ、暗赤色の生成物の群が採集されるまで、約３５mLのフラクションを採集した。次いで、このプロセスを、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＪＲＡ−４１０（Ｃｌ）樹脂の第二のカラムを用いて、上記方法で繰り返した。両方のカラムから得た赤い色の当該生成物を含有している全てのフラクションを合し、凍結乾燥して、最終的なＨＣｌ塩生成物を赤色の固体として得た（３．７２g，９０%）。残留ＴＦＡ分析：＜０．１%。
【０１１６】
実施例４．
アセタールの単離を行わない、１４−ブロモ−ダウノルビシン及びそのマレイミド誘導体の合成（スキーム４）
【０１１７】
ダウノルビシン．ＨＣｌ（７．９mmol）を乾燥メタノール（３５．１g）と乾燥ジオキサン（３８g）の混合物に溶解させた。次いで、オルトギ酸トリメチル（３６．７mmol，４．６当量）を添加し、得られた混合物を室温で１０分間撹拌した。得られた溶液を１２℃に冷却し、臭素（１３．７mmol，１．３１当量）を５分間かけて添加した。この混合物を、２０℃で２時間撹拌した。プロピレンオキシド（２０．５mmol，２．５７当量）を２℃で１０分間かけて添加した。２℃で７５分間経過した後、この混合物を２０℃に昇温させた。アセトン（１００g）と７%(w/w)ＨＢｒ水溶液（６．４gのＨＢｒ４８%及び３７．６gの水）を添加した。得られた溶液を、２０℃で３５時間撹拌した後、水（１２０g）で希釈し、クロロホルム（２×１５０g）で抽出した。水層にＮａＣｌ溶液（１３３．２gの水中の４６．８g）を添加し、次いで、この水層を、無色になるまでｎ−ブタノール（２×１００g）で抽出した。有機層を合し、量が約１０２gになるまで、溶媒を蒸発させた（高真空ポンプ，３０〜３５℃）。ｎ−ヘキサン（８０g）を添加し、濾過により沈澱を回収し、ｎ−ヘキサン（１００g）で洗浄し、乾燥させた（収率９８%）。得られた化合物は、Ｃｌ−ダウノルビシンとＢｒ−ダウノルビシンの約１／１の比率の混合物である。
【０１１８】
ｔＢｕＯＫを用いたマレイミド酪酸カリウムの合成
４−マレイミド酪酸（５g，０．０２７３mmol）をＴＨＦ（６５．２g）に溶解させた溶液を撹拌しながら、それに、ＴＨＦ中のｔＢｕＯＫの溶液（２３．５g，０．９５当量）を、室温で、１５分間かけて添加した。得られた懸濁液を４℃に維持した後、さらに処理することなく使用し、単離した（収率１００%）。
【０１１９】
【化３４】
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【０１２０】
スキーム４．ダウノルビシンから出発するドキソルビシン−ペプチドコンジュゲートの合成（上記式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２又は−ＮＨ−ペプチドであり；Ｒ２は、−Ｈ又は−ＣＯ−ペプチドである）。
【０１２１】
ＧＭＰに従い、該調製方法及びその規模拡大性を改善すべく行った一連の研究の結果、以下に示すさらなる改善が達成された［マルチグラムスケール（いずれの場合も、８mmolのダウノルビシン）で得られた結果］。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
要約すれば、ステップの数を減らした容易に実施可能な方法により、本発明のアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを調製することが可能であることが、これらの実施例により示された。さらに、容易に入手可能な出発物質及び試薬から、該コンジュゲートを安価に調製することが可能である。
【０１２４】
本発明による上記合成方法は、種々の理由により、該化合物の最も興味深い合成経路であるという利点を有している。第一に、これらの化合物の合成において、保護／脱保護ステップが含まれていない。第二に、中間体を多量に調製することが可能であり、また、該中間体は数週間安定である（乾燥器内で室温におけるブロモダウノルビシン，−２０℃におけるドキソルビシン−１４−マレイミドブチレート）。乾燥器内で室温におけるブロモダウノルビシンの安定性は予想外のことであるということを留意すべきである。実際は、この化合物は、殆どの条件下で特に不安定であるとして知られている（ＥＰ０２９５１１９Ｂ１を参照されたい）。本発明の方法により調製した中間体化合物は、良好な安定性を有しているので、アンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを調製するための有用な中間体である。
【０１２５】
さらに、式（Ｉａ）及び式（Ｉｂ）で表されるアンスラサイクリン−ペプチドコンジュゲートを調製する場合、本発明の方法において用いられる、ハロアンスラサイクリンと該ペプチドのチオール部分との反応は、ペプチドのサイズ（ＭＷ＞２５００）が大きいのにもかかわらず極めて良好に進行することが分かった。
【国際調査報告】
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