(57)【要約】アデノウイルス血清型はその天然向性に差異がある。アデノウイルスの各種血清型は少なくともそのキャプシド蛋白質（例えばペントン塩基及びヘキソン蛋白質）、細胞結合に関与する蛋白質（例えばファイバー蛋白質）、及びアデノウイルス複製に関与する蛋白質に差異があることが分かっている。血清型間の向性及びキャプシド蛋白質のこの差異に基づき、キャプシド蛋白質の改変によりアデノウイルス向性を再指揮する目的で多くの研究努力が為されている。本発明は希少アデノウイルス血清型である血清型３４の組換え複製欠損アデノウイルスとこの代替的組換えアデノウイルスの作製方法を提供し、このようなキャプシド蛋白質改変の必要を回避する。更に、外来遺伝子の送達及び発現のために前記組換えアデノウイルスを利用する手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも部分的にＥ１を欠失し、Ｅ１活性を欠損する、血清型３４の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクターを含む細胞集団。
【請求項３】
（ａ）請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞集団にトランスフェクトする段階と；
（ｂ）得られた組換え複製欠損アデノウイルスを回収する段階
を含む、組換え複製欠損アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法に従って回収された、精製組換え複製欠損アデノウイルス粒子。
【請求項５】
請求項４に記載の精製組換えアデノウイルス粒子を含む組成物。
【請求項６】
生理学的に許容可能なキャリヤーを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも部分的にＥ１を欠失し、Ｅ１活性を欠損しており、異種核酸を含む、血清型３４の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えアデノウイルスベクターを含む細胞集団。
【請求項９】
（ａ）請求項７に記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞集団にトランスフェクトする段階と；
（ｂ）得られた組換え複製欠損アデノウイルスを回収する段階
を含む、組換え複製欠損アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項１０】
ベクターが、
（ａ）蛋白質をコードする核酸と；
（ｂ）蛋白質をコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターと；
（ｃ）転写終結配列
を含む、遺伝子発現カセットを含む、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
遺伝子発現カセットがＥ１領域に挿入されている、請求項１０に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
異種核酸がヒト宿主での発現に最適化されたコドンを含む、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
Ｅ１欠失部に異種核酸を含む、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１４】
少なくとも部分的にＥ３を欠失している、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項１５】
請求項９に記載の方法により回収された、精製組換え複製欠損アデノウイルス粒子。
【請求項１６】
請求項９に記載の精製組換えアデノウイルス粒子を含む組成物。
【請求項１７】
生理学的に許容可能なキャリヤーを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
同一又は異なるベクターによる異種核酸の投与前又は投与後に請求項１６に記載の組成物を投与することを含む、異種核酸を送達及び発現する方法。
【請求項１９】
異なる血清型のアデノウイルスによる異種核酸の投与が組成物の前又は後に行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
異種核酸がＨＩＶ抗原をコードする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物を個体に投与することを含む、個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の発生方法。
【請求項２２】
ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ｇａｇ又は免疫学的に関連するその改変物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ｎｅｆ又は免疫学的に関連するその改変物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ｐｏｌ又は免疫学的に関連するその改変物である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
少なくとも部分的にＥ１を欠失し、Ｅ１活性を欠損しており、ＨＩＶ−１遺伝子を含む、血清型３４の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組換えアデノウイルスベクターを含む細胞集団。
【請求項２７】
（ａ）請求項２５に記載の組換えアデノウイルスベクターを細胞集団にトランスフェクトする段階と；
（ｂ）得られた組換え複製欠損アデノウイルスを回収する段階
を含む、組換え複製欠損アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法により回収された、精製組換え複製欠損アデノウイルス粒子。
【請求項２９】
請求項２８に記載の精製組換えアデノウイルス粒子を含む組成物。
【請求項３０】
生理学的に許容可能なキャリヤーを含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
同一又は異なるベクターによるＨＩＶ−１遺伝子の投与前又は投与後に請求項３０に記載の組成物を投与することを含む、ＨＩＶ−１遺伝子を送達及び発現する方法。
【請求項３２】
異なる血清型のアデノウイルスによるＨＩＶ−１遺伝子の投与が組成物の前又は後に行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の組成物を個体に投与することを含む、個体におけるＨＩＶに対する細胞性免疫応答の発生方法。
【請求項３４】
ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ｇａｇ又は免疫学的に関連するその改変物である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３５】
ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ｎｅｆ又は免疫学的に関連するその改変物である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３６】
ＨＩＶ抗原がＨＩＶ−１ｐｏｌ又は免疫学的に関連するその改変物である、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願のクロスリファレンス）
本願は２００３年３月２８日に出願した米国仮出願第６０／４５８，８２５号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスはエンベロープをもたない二十面体ウイルスであり、数種の鳥類及び哺乳動物宿主で同定されている；Ｈｏｒｎｅら，１９５９  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：８４−８６；Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９０  Ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｐｐｓ．１６７９−１７２１。最初のヒトアデノウイルス（Ａｄ）が単離されたのは４０年以上前であった。それ以来、種々の哺乳動物種に感染する１００種を越える異なるアデノウイルス血清型が単離されており、そのうち５１種がヒトに由来する；Ｓｔｒａｕｓ，１９８４，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｅｄ．Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｐｐｓ．４５１−４９８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９８８  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５８：８０４−８１３；Ｓｃｈｎｕｒｒ  ａｎｄ  Ｄｏｎｄｅｒｏ，１９９３，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ；３６：７９−８３；Ｊｏｎｇら，１９９９  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−５。ヒト血清型はラット及びアカゲザル赤血球の凝集特性、ＤＮＡホモロジー、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量百分率及び発癌性等の多数の生物学、化学、免疫学及び構造基準に基づいて６種の亜属（Ａ〜Ｆ）に分類されている；Ｓｔｒａｕｓ，前出；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前出。
【０００３】
アデノウイルスゲノムは非常に詳細に特性決定されている。約３６，０００塩基対の線状２本鎖ＤＮＡ分子から構成され、数種の異なる血清型が存在するが、アデノウイルスゲノムの全体的な体制（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）はある程度保存されており、特定機能が同様に配置されている。
【０００４】
アデノウイルスは外来遺伝子の送達に非常に魅力的なターゲットとなっている。アデノウイルスの生態は非常によく解明されている。アデノウイルスは免疫応答性の個体では重症ヒト疾患と結び付けられていない。このウイルスはそのＤＮＡを宿主細胞に導入するのに極めて有効であり、多様な細胞に感染させることができる。更に、このウイルスは高ウイルス力価で大量に生産することができる。更に、このウイルスはウイルスゲノムの必須初期領域１（Ｅ１）の欠失により複製欠損性にすることができる；Ｂｒｏｄｙら，１９９４  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，７１６：９０−１０１。
【０００５】
複製欠損アデノウイルスベクターはワクチン及び遺伝子治療目的で、遺伝子導入ベクターとして広く使用されている。これらのベクターはＥ１遺伝子産物をｉｎ  ｔｒａｎｓで提供する細胞系で増殖する。必須Ｅ１遺伝子産物のｉｎ  ｔｒａｎｓ補完はベクターが同一又は非常に近縁の血清型に由来する場合に非常に有効である。Ｅ１を欠失させたＣ群血清型（Ａｄ１，Ａｄ２，Ａｄ５及びＡｄ６）は例えばＡｄ５Ｅ１領域を含有及び発現する２９３又はＰＥＲ．Ｃ６細胞で良好に増殖する。しかし、２９３又はＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＡｄ５Ｅ１配列はＣ群以外の全血清型の複製を完全に補完するわけではない。これは恐らくＡｄ５（Ｃ群）Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子産物が非Ｃ群血清型のＥ４遺伝子産物と機能的に相互作用することができないためであると考えられる。相互作用は同一亜群のメンバー内で保存されているが、亜群間で十分に保存されていることは認められていない。代替非Ｃ群血清型の組換えアデノウイルスを有効に成功裏にレスキューするためには、興味ある血清型のＥ１領域を発現する細胞系を作製する必要がある。あるいは、Ａｄ５Ｅ１に加えてＡｄ５Ｅ４（又はＯｒｆ６）も発現するように利用可能なＡｄ５Ｅ１発現細胞系を改変する必要がある。これらの単調で困難な付加作業は、組換え非Ｃ群アデノウイルスベクター生産の障害となっている。
【０００６】
Ａｄ５ＥＩ発現細胞系（例えばＰＥＲ．Ｃ６又は２９３）における代替血清型の増殖とレスキューに有効な手段の１例は係属中の米国仮出願（第６０／４０５，１８２号，出願日２００２年８月２２日）に開示されている。この方法は増殖させようとするアデノウイルスに必須Ｅ４領域の組込みを含む。必須Ｅ４領域は相補細胞系のＥ１遺伝子産物、特にＥ１Ｂ５５Ｋ領域と同一であるか又は非常に近縁の血清型のウイルスに生得であり、少なくともＥ４  Ｏｒｆ６をコードする核酸を含む。
【０００７】
現在、Ｃ亜群に由来する２種の詳細に特性決定されているアデノウイルス血清型であるＡｄ５及びＡｄ２は最も広く使用されている遺伝子送達ベクターである。一般集団における中和抗体は、同一血清型の初期投与又は再投与を制限する可能性があるので、遺伝子導入ベクターとして代替Ａｄ血清型を開発する必要がある。中和抗体のプレバレンスは血清型により変異し得る。Ａｄ５等の所定の血清型に対する中和抗体は多く見られるが、他の血清型に対する抗体は比較的少ない。代替血清型は更に、ワクチン又は遺伝子治療目的で使用した場合に優れた免疫応答を誘発するような代替向性を有する。
【０００８】
Ｂ亜群アデノウイルスであるアデノウイルス血清型３４は１９７２年に最初に単離され、１９７５年に公認参照株として樹立された（Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９７５  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：３６６−３７６）。４６種の他のヒトアデノウイルスに対するその抗原関係が参照ウマ抗血清で決定され、考察された；Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９９１  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒａｌ．１２１：１７９−１９７。Ａｄ３４の部分配列情報は入手可能である。Ａｄ３４ヘキソン配列に関して数件の開示がある。所定の５’及び３’フランキング配列を有するＡｄ３４ヘキソンの完全配列（３３５８ｂｐ）はＭｕｋｏｕｙａｍａによりＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＢ０５２９１１）に寄託されている。Ａｄ３４ヘキソンの部分配列（１４４９ｂｐ）はＴａｋｅｕｃｈｉら，１９９９  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３３９２−３３９４とＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＢ０１８４２６）に開示されている。Ａｄ３４ヘキソンの部分配列（２５３ｂｐ）はＡｌｌａｒｄら，２００１  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：４９８−５０５に開示され、ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＦ１６１５７３）に寄託されている。ＰｅｒｅｒａとＣａｒｄｏｓａはＡｄ３４ヘキソンの２つの部分配列（５７１ｂｐ及び３０１ｂｐ）をＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＪ２７２６１０及びＡＪ２５０７８６）に寄託されている。Ａｄ３４ファイバー遺伝子の配列はＡｒｕｎ，Ｍｕｋｏｕｙａｍａ及びＩｎａｄａによりＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＢ０７３１６８）に寄託されている。Ａｄ３４のウイルス関連ＲＮＡ領域（ＶＡ  ＲＮＡ１及び２）の配列（１６２ｂｐ）はＫｉｄｄら，１９９５  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０７：３２−４５とＧｅｎＢａｎｋ（受入番号Ｕ１０６７７）に開示されている。更に、Ａｄ３４のウイルス関連ＲＮＡ領域と前末端蛋白質及び５２／５５Ｋ蛋白質の部分配列の配列（３５４ｂｐ）はＭａ  ＆  Ｍａｔｔｈｅｗｓ，１９９６  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８３−９９とＧｅｎＢａｎｋ（受入番号Ｕ５２５７１）に開示されている。Ａｄｈｉｋａｒｙ，Ｍｕｋｏｕｙａｍａ及びＩｎａｄａはＬ４  １００ｋＤａ、Ｌ４ｐＶＩＩＩ、Ｅ３  １２．３ｋＤａ、Ｅ３  １４．９ｋＤａ、Ｅ３ｇｐ  １８．５ｋＤａ、Ｅ３  ２０．３ｋＤａ、Ｅ３  ２０．５ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａ１、Ｅ３  １５．２ｋＤａ２、及び部分ファイバー配列のＡｄ３４遺伝子の配列（４８２８ｂｐ）を開示し、ＧｅｎＢａｎｋ（受入番号ＡＢ０７９７２４）に寄託されている。ウイルスゲノムの右末端の配列（１０３８ｂｐ）はＣｈｅｎ  ＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９０  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７９：５６７−７５とＧｅｎＢａｎｋ（受入番号Ｍ６２７１２）に開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ワクチン及び遺伝子治療の分野は、代替アデノウイルス血清型、特にヒト集団で充分に特性決定されていないＡｄ３４等の血清型に関する知見から多大な恩恵を得るであろう。代替アデノウイルス血清型に基づく組換えアデノウイルスベクターと、このような組換えアデノウイルスベクターの獲得手段は特に関心がある。本分野におけるこの必要性は、アデノウイルス血清型３４に基づく組換えアデノウイルスベクターに関する本願の開示により充足される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は希少アデノウイルス血清型である血清型３４の組換え複製欠損アデノウイルスベクターと、この代替血清型に基づく組換えアデノウイルスの作製方法に関する。更に、外来遺伝子の送達及び発現のために前記組換えアデノウイルスを使用する手段を提供する。従って、本発明は夫々のトランスジーンの有効な発現を促進する調節配列に作動可能に連結された１個以上のトランスジーンを含む血清型３４の組換え複製欠損アデノウイルスベクターに関する。このような組換えアデノウイルス血清型３４ベクターを宿主に投与すると、単独で投与するかあるいは併用法及び／又はプライムブーストレジメで投与するかに関係なく、組込んだトランスジーンを有効に発現させ、投与した特定抗原（例えばＨＩＶ）を特異的に認識し得る免疫応答を有効に誘導することができる。更に、このような組換えウイルスはヒト集団において一般に遭遇するアデノウイルス血清型（例えばＡｄ５及びＡｄ２）に対する既存免疫を回避すると考えられる。従って、本明細書に開示する方法は興味ある特定抗原（例えばＨＩＶ）に対する免疫応答を誘導するための強力な手段を提供する。従って、得られる免疫応答は未感染個体に予防的利点を提供し、及び／又は感染個体内のウイルス負荷レベルを低下させて無症状感染期を延長することにより、治療的効果を提供すると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
希少アデノウイルス血清型は、そのターゲット部位への外来遺伝子の効率的送達及び発現を既存免疫により制限されないと思われるので、より一般的に利用されているアデノウイルス血清型（例えばアデノウイルス血清型２及び５）にまさる固有の利点がある。各種アデノウイルス血清型は更にキャプシド構造の相違により異なる向性を示し、従って、各種組織を標的化する能力を示し、ワクチン又は遺伝子治療目的に使用した場合には優れた免疫応答を誘発すると予想される。しかし、これらの希少アデノウイルス血清型は複製欠損型にした場合には、現在入手可能なアデノウイルス増殖細胞系で増殖及びレスキューすることが困難であると思われる。
【００１２】
本出願人は最近、このような希少複製欠損代替血清型であるＢ亜群アデノウイルスのアデノウイルス血清型３４をレスキュー及び増殖させるのに成功し、本明細書では外来トランスジーンの送達及び発現におけるアデノウイルスの有効な機能を立証する。
【００１３】
即ち、本発明は遺伝子治療又はワクチン接種プロトコールで使用するのに適した血清型３４の組換えアデノウイルスベクターに関する。野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を図３Ａ−１〜３Ａ−９に示すが、当業者に自明の通り、アデノウイルス血清型３４の任意機能的ホモログ又は別の株を本発明の方法により利用することができる。Ａｄ３４配列は数ヶ所の領域に差異が認められた。以下の部位は、Ａｄ３４に認められる配列変異の単なるサンプリングである：（１）配列番号１の塩基対１０６４０付近の配列ｇｔｇａｇｔｃｃｔａ（配列番号８）に続く「Ｔ」が１２個ではなく１３個である；（２）配列番号１の塩基対１５３７２付近の配列ｃｃｇｃａｃｔｔｔｃｔ（配列番号９）に続く「Ａ」が１６個ではなく１５個又は１７個である；（３）配列番号１の塩基対１７３２５付近の配列ａｔｔｇａｃａｔｔｇｇ（配列番号１０）に続く「Ａ」が１２個ではなく１３個である；（４）配列番号１の塩基対２５７１７付近の配列ｇｇａｇｇａ（配列番号１２）に続く配列ｃａｇｔｃｔｇｇａｇｇａ（配列番号１１）が欠失している。アデノウイルス血清型はラット及びアカゲザル赤血球の凝集特性、ＤＮＡホモロジー、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量百分率及び発癌性等の当分野で周知の多数の生物学、化学、免疫学及び構造基準により区別されている；Ｓｔｒａｕｓ，前出；Ｈｏｒｗｉｔｚ，前出。所与血清型はウイルスＤＮＡの制限マッピング；ウイルスＤＮＡの移動度の分析；電気泳動後のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上のビリオンポリペプチドの移動度の分析；特に血清型を規定する配列を含むキャプシド遺伝子（例えばヘキソン）に由来する既知配列との配列情報の比較；及びＡＴＣＣから入手可能な特定血清型に関する参照血清との配列比較等の多数の方法により同定することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるアデノウイルス血清型の分類はＷａｄｅｌｌら，１９８０  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３５４：１６−４２に記載されている。制限マッピングによるアデノウイルス血清型の分類はＷａｄｅｌｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０：１９１−２２０に記載されている。Ｂ亜群アデノウイルスであるアデノウイルス血清型３４は１９７２年に最初に単離され、１９７５年に公認参照株として樹立された（Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９７５  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １：３６６−３７６）。参照ウマ抗血清で決定された４６種の他のヒトアデノウイルスに対するその抗原関連性が、文献中で考察されている；Ｊ．Ｃ．Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら，１９９１  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１２１：１７９−１９７。
【００１４】
本発明のアデノウイルス血清型３４ベクターは少なくとも部分的にＥ１を欠失し、Ｅ１活性を欠損（又は本質的に欠損）しており、ベクターは所期宿主で複製することができない。Ｅ１領域が完全に欠失又は不活化していることが好ましい。アデノウイルスはＥ３と他の初期領域にも更なる欠失を含むことができるが、Ｅ２及び／又はＥ４が欠失している場合、組換え複製欠損アデノウイルスベクターを作製するにはＥ２及び／又はＥ４相補細胞系が必要であり得る。
【００１５】
本発明の方法で使用するアデノウイルスベクターは参考として本明細書に援用されているＨｉｔｔら，１９９７”Ｈｕｍａｎ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０：１３７−２０６に記載される技術等の周知技術を使用して構築することができる。多くの場合、特定の興味あるアデノウイルスに相同である配列を含む興味ある異種核酸を含むプラスミド又はシャトルベクターを作製する。シャトルベクターとウイルスＤＮＡ又はクローニングしたウイルスＤＮＡを含む第２のプラスミドを次に宿主細胞にコトランスフェクトして相同組換えを生じさせ、異種核酸をウイルス核酸に組込む。好適シャトルベクター及びクローン化ウイルスゲノムはアデノウイルス部分とプラスミド部分を含む。複製欠損ベクターの構築に使用するシャトルベクターでは、アデノウイルス部分は一般に非機能的又は欠失Ｅ１及びＥ３領域と、適切な制限部位に挟まれた遺伝子発現カセットを含む。シャトルベクターのプラスミド部分は一般に原核プロモーターの転写制御下に抗生物質耐性マーカーを含む。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子及び他の医薬的に許容可能な抗生物質耐性マーカーを使用することができる。原核生物での発酵により核酸の高レベル生産を助長するためには、シャトルベクターに原核複製起点を含ませて、高コピー数にすると有利である。これらの利点は多数の市販されている原核クローニングベクターにより提供される。非必須ＤＮＡ配列を除去することが好ましい。ベクターが真核細胞で複製できないようにすることも好ましい。こうして、核酸ワクチン配列がレシピエントのゲノムに組込まれる危険を最小限にする。核酸発現を特定組織型に制限することが望ましい場合には組織特異的プロモーター又はエンハンサーを使用することができる。
【００１６】
シャトルベクターと野生型アデノウイルス３４ウイルスＤＮＡ（Ａｄ３４バックボーンベクター）の相同組換えにより、アデノウイルスプレプラスミドが作製される（ｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６，ｐＭＲＫＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６，ｐＡｄ３４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６，及びｐＡｄ３４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６参照）。線状化すると、プレプラスミドはＰＥＲ．Ｃ６（寄託商標）細胞又は他のＥ１相補細胞系で複製できる。その後、ウイルス複製が完了したら感染細胞と培地を回収することができる。
【００１７】
十分な量のアデノウイルスを生産するには一般にパッケージング細胞が必要になる。パッケージング細胞は特定の興味あるアデノウイルスの生産に必要なエレメントを含むべきである。パッケージング細胞とベクターは組換えにより複製コンピテントなウイルスとなるようなオーバーラップするエレメントを含まないことが好ましい。組換えＡｄ３４Ｅ１欠失ベクターの増殖に適した細胞の特定例はアデノウイルス３４又は別のＢ群血清型の初期領域１（Ｅ１）を発現する。あるいは、同一血清型ではあるが、Ａｄ３４以外の亜群（例えば，Ａｄ５Ｅ１及びＥ４）に由来するアデノウイルスＥ１及びＥ４領域（特に、Ｅ４オープンリーディングフレーム６（「ＯＲＦ６」））を発現する増殖細胞系を使用することができる；例えばＡｂｒａｈａｍｓｅｎら，１９９７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９４６−８９５１，及び米国特許第５，８４９，５６１号参照。更に、（１）Ｅ１Ａ又は（２）Ｅ１Ａと別の亜群の血清型に由来するＥ１Ｂに加えて、Ａｄ３４に由来するＥ１Ｂを発現する細胞系を使用することもできる。同時係属中の米国仮出願第６０／４０５，１８２号（出願日２００２年８月２２日）には、代替アデノウイルス血清型の効率的な増殖とレスキューのためのストラテジーが開示されている。この方法は相補細胞系で発現されるＥ１遺伝子産物、特にＥ１Ｂと同一又は非常に近縁の血清型のＥ４領域（又はＥ４ＯＲＦ６を含むその一部）をアデノウイルスベクターのゲノムに組込むことに基づく。実施例１〜４はＡｄ５Ｅ４領域の組込みとＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ａｄ５Ｅ１を発現する細胞）におけるその増殖により、このような方法の実行可能性を立証している。野生型アデノウイルス血清型５の配列は当分野で公知であり、文献に記載されている；参考として本明細書に援用されているＣｈｒｏｂｏｏｚｅｋら，１９９２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１８６：２８０参照。Ｅ４領域又はＯＲＦ６含有部分を配置することは必須ではない。必須段階はプロモーターを供給するか、又はベクターに天然のプロモーター（例えばＥ４プロモーター）をランオフするように遺伝子を戦略的に配置することである。ベクターの天然Ｅ４領域を置換、欠失又は無傷にすることができる。従って、この方法は本発明のアデノウイルスベクターの増殖及びレスキューに使用するのに適している。
【００１８】
一般に、増殖細胞は網膜又は腎臓に由来するヒト細胞であるが、適切なＥ１及び／又はＥ４領域を発現可能な任意細胞系を本発明では利用することができる。羊膜細胞等の胚細胞はＥ１相補細胞系の作製に特に適していることが示されている。数種の細胞系が入手可能である。これらの例としては限定されないが、公知細胞系ＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、９１１，２９３、及びＥ１Ａ５４９が挙げられる。
【００１９】
本発明はアデノウイルスＥ１相補細胞系で血清型３４の組換え複製欠損アデノウイルスを生産するための方法に関し、アデノウイルスＥ１相補細胞に血清型３４の組換え複製欠損アデノウイルスベクターをトランスフェクトする段階と、ウイルス粒子を生産させる段階を含む。こうして生産されたウイルス粒子は本発明の別の側面を形成する。本発明の組換え複製欠損アデノウイルス血清型３４ベクターを含む宿主細胞は、本発明の更に別の側面を形成し、宿主細胞はトランスジェニックヒトを含まない細胞集団として定義される。本発明の方法により回収された組換え複製欠損アデノウイルスも本発明に含まれる。この回収された材料を宿主に投与する前に、精製、製剤化及び保存することができる。
【００２０】
本発明のアデノウイルスベクターは特に、個体の免疫応答が、より一般に利用されているアデノウイルス血清型による投与又は再投与を有効に阻止する場合に、所望蛋白質の発現を行なわせるのに非常に好適である。従って、本発明の特定態様は興味ある異種核酸を含む血清型３４の組換え複製欠損アデノウイルスベクターである。興味ある核酸は遺伝子、又は遺伝子の機能的部分とすることができる。核酸はＤＮＡ及び／又はＲＮＡとすることができ、２本鎖でも１本鎖でもよく、発現カセットの形態でもよい。核酸はＥ１パラレル（５’→３’転写）又はアンチパラレル（ベクターバックボーンに対して３’→５’方向転写）方向に挿入することができる。核酸は所望の宿主（例えば哺乳動物宿主）で発現するようにコドン最適化することができる。異種核酸は発現カセットの形態とすることができる。遺伝子発現カセットは一般に、（ａ）興味ある蛋白質又は抗原をコードする核酸と；（ｂ）蛋白質をコードする核酸に作動可能に連結された異種プロモーターと；（ｃ）転写終結シグナルを含む。
【００２１】
特定態様では、異種プロモーターは真核ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。本発明で使用するのに適したプロモーターの１例は、即時型ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである（Ｃｈａｐｍａｎら，１９９１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６）。本発明で使用することができるプロモーターの別の例は、強力イムノグロブリンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーター及びβアクチンプロモーターであるが、当業者に自明の通り、所期宿主で発現を行うことが可能な任意プロモーターを本発明の方法により使用することができる。プロモーターはＴｅｔオペレーター配列等の調節配列を含むことができる。転写及び発現の調節能力を提供するこれらの配列等の配列は、遺伝子転写の抑圧が所望される場合に有用である。アデノウイルス遺伝子発現カセットは転写終結配列を含むことができ、その特定態様はウシ成長ホルモン終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）又は以下の配列：
【００２２】
【化１】
2006521089.tif 000002
として定義される５０ヌクレオチド長の短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）である。リーダー又はシグナルペプチドもトランスジーンに組込むことができる。特定態様では、リーダーは組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質ｔＰＡに由来する。
【００２３】
興味ある異種核酸は免疫原性及び／又は治療性蛋白質をコードする遺伝子（又はその機能的部分）である。好適な治療性蛋白質は投与すると、個体宿主に所定の測定可能な治療効果を誘発するものである。好適免疫原性蛋白質は個体に免疫応答を誘発することが可能な任意蛋白質である。本発明者らは非ヒト霊長類（アカゲザル）で本明細書中の代表的免疫原性蛋白質（ＨＩＶｇａｇ）の送達を例示したが、治療性又は免疫原性蛋白質をコードする任意遺伝子を本明細書に開示する方法に従って使用することができる。アデノウイルス血清型３４ベクターは有意レベルのｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘導することが判明した；図５。更に、開示するベクターで免疫すると、ＨＩＶ特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞を誘発できることも判明した；図６。
【００２４】
従って、本発明の１側面は、ＨＩＶトランスジーンを含むアデノウイルス血清型３４系ベクターに関する。これらの態様では、任意ＨＩＶ抗原をコードする核酸を利用することができる（その具体例としてはｇａｇ，ｐｏｌ，ｎｅｆ，ｇｐ１６０，ｇｐ４１，ｇｐ１２０，ｔａｔ，及びｒｅｖとこれらの遺伝子の誘導体が挙げられる）。本明細書に例示する態様はコドン最適化ｐ５５ｇａｇ抗原をコードする核酸を利用する；図７（配列番号３）参照。コドン最適化ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子はＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４及びＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７（夫々公開日１９９７年８月２８日（ＷＯ９７／３１１１５）及び１９９７年１２月２４日）に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子は米国出願第０９／７４５，２２１号（出願日２０００年１２月２１日）及びＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４（同じく出願日２０００年１２月２１日）に開示されている。コドン最適化ＨＩＶ−１ｎｅｆ遺伝子は米国出願第０９／７３８，７８２号（出願日２０００年１２月１５日）及びＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２（同じく出願日１２月１５日）に開示されている。
【００２５】
ＨＩＶ−１遺伝子を含む組換え複製欠損Ａｄ３４ベクターのこの特定態様では、遺伝子はＨＩＶ−１株ＣＡＭ−１に由来することができる；参考として本明細書に援用されているＭｙｅｒｓら，ｅｄｓ．”Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ：１９９５，ＩＩＡ３−ＩＩＡ１９。この遺伝子はクレードＢ（北米／ヨーロッパ）配列のコンセンサスアミノ酸配列に近似する。ＨＩＶ遺伝子配列は各種クレードのＨＩＶ−１に基づくことができ、具体例としてクレードＢ及びＣが挙げられる。多数のＨＩＶ株の遺伝子の配列がＧｅｎＢａｎｋから公けに入手可能であり、ＨＩＶのフィールド単離株はこれらの株を入手できるようにＱｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）と契約している米国国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。株はスイス、ジュネーブに所在の世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ＷＨＯ）からも入手可能である。当業者はＨＩＶ抗原又は免疫学的に関連するその部分又は改変物をコードする適切なヌクレオチド配列を容易に選択することができる。本明細書に定義する「免疫学的に関連」とは（１）ウイルス抗原については、蛋白質を投与した場合にウイルスの増殖及び／又は繁殖を遅らせるため及び／又は個体内に存在するウイルス負荷を低下させるために十分な測定可能な免疫応答を個体内に誘発することができるか；又は（２）ヌクレオチド配列については、配列が上記のことが可能な蛋白質をコードできることを意味する。
【００２６】
本発明は（１）個体で治療応答を達成するため及び（２）免疫応答（細胞性免疫応答を含む）を発生するための方法として、本発明の組換えアデノウイルス血清型３４ベクターを個体に投与することを含む方法に関する。本発明の１側面は１種以上の抗原（細菌、ウイルス（例えばＨＩＶ）、又はその他（例えば癌））に対する強化免疫応答を発生するための方法として、興味ある抗原を発現する組換えアデノウイルス血清型３４ビヒクルを投与することを含む方法である。こうして組換えＡｄ３４ベクターを投与すると、特により詳細に特性決定されているアデノウイルス血清型（例えばＡｄ２及びＡｄ５）に対する既存免疫が所与宿主に存在する場合に、改善された細胞性免疫応答を提供することができる。改善されたワクチン投与方法の１つの効果は未感染個体に対する感染率（又は発生率）の低下（即ち予防的適用）及び／又は感染個体内のウイルス／細菌／外来物質レベルの低減（即ち治療的適用）であると考えられる。ＨＩＶ適応については、改善ワクチン投与方法の１つの効果は未感染個体に対する感染率の低下（即ち予防的適用）及び／又はＨＩＶ感染の無症状期を延長するような感染個体内のウイルス負荷レベルの低下（即ち治療的適用）であると考えられる。組換えＡｄ３４ベクターの投与、細胞内送達及び発現は、宿主ＣＴＬ及びＴｈ応答を誘発する。
【００２７】
従って、本発明は有効な免疫予防を提供するため、ウイルス（例えばＨＩＶ）、細菌もしくは他の物質に暴露後の感染の確立を防止するため、又は感染を緩和してウイルス／細菌／他の負荷の低下と有益な長期予後を得るための感染後治療用ワクチンとしての組換えＡｄ３４ウイルスベクター（又はその免疫原組成物、本明細書ではワクチンと言う）の投与に関する方法に関する。
【００２８】
本発明の組換えアデノウイルス血清型３４ベクターは単独で投与してもよいし、プライム／ブースト投与レジメの一部として投与してもよい。プライミング用量の少なくとも１種の抗原（例えばＨＩＶ抗原）をまず組換えアデノウイルスベクターで送達する。この用量は免疫応答を有効にプライムし、その後、抗原が循環免疫系で識別されるとすぐに免疫応答は宿主内で抗原を認識し、これに応答することができる。プライミング用量の投与後に、抗原をコードする少なくとも１種の遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターを含むブースト用量を投与する。混合様式のプライム及びブースト接種スキームの結果、特に既存抗ベクター免疫が存在する場合に免疫応答が強化される。プライム−ブースト投与は一般に、対象を（ウイルスベクター、プラスミド、蛋白質等により）少なくとも１回プライミングし、所定時間経過させた後に（ウイルスベクター、プラスミド、蛋白質等により）ブーストする。多重プライミング、一般には１〜４回を通常使用するが、５回以上でもよい。プライミングとブーストの間の時間は一般に約４カ月〜１年間とすることができるが、当業者に自明の通り、他の時間を使用してもよい。
【００２９】
本発明の組換え複製欠損アデノウイルス血清型３４ベクターにより送達される単一の興味ある蛋白質又は抗原に加え、２種以上の蛋白質又は抗原を別のビヒクル又は同一ビヒクルにより送達することができる。多重オープンリーディングフレームを含むプレアデノウイルスプラスミドを作製するには、適切なシャトルプラスミドに多重遺伝子／機能的等価物を連結反応させることができる。多重遺伝子／機能的等価物のオープンリーディングフレームを別個のプロモーター及び転写終結配列に作動可能に連結することができる。他の態様では、オープンリーディングフレームを単一プロモーターに作動可能に連結することができ、オープンリーディングフレームを内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ；ＷＯ９５／２４４８５に開示）、又は単一プロモーターをランオフするように多重オープンリーディングフレームの転写を可能にする適切な代替物に作動可能に連結することができる。所定態様では、段階的ＰＣＲ又は２個のオープンリーディングフレームを相互に融合するのに適した代替方法により、オープンリーディングフレームを相互に融合することができる。但し、ウイルスビヒクルの有効なパッケージング限度について十分に考慮する必要がある。例えば、５型アデノウイルスは野生型Ａｄ５配列の約１０５％のクローニング能力上限を示すことが分かっている。
【００３０】
プライム−ブーストレジメは種々のアデノウイルス血清型を利用することができる。このようなプロトコールの１例は第１の血清型の組換えアデノウイルスベクターを含むプライミング用量の後に第２の異なる血清型の組換えアデノウイルスベクターを含むブースト用量を投与する；例えば実施例６と図１２及び１３参照。この場合には、サルのコホートにＡｄ３４系ＨＩＶｇａｇベクターを０週と４週に２回投与し、２４週にＡｄ３５系ＨＩＶｇａｇベクターをブースト投与した。Ａｄ３５系ベクターの投与の結果、Ｔ細胞応答はブースター時のレベルに比較して約３倍に増加した。代替態様では、プライミング用量は異なる蛋白質／抗原をコードする遺伝子を各々含む別個のアデノウイルスビヒクルの混合物を含むことができる。このような場合には、ブースト用量がプライミング用量で送達されたと同一又は同様の抗原セットをコードする遺伝子材料を含む組換えウイルスベクターを投与するのであれば、ブースト用量も別個の蛋白質／抗原をコードする遺伝子を各々含むベクターの混合物を含むであろう。これらの多重遺伝子／ベクター投与法を更に併用することができる。更に、特定抗原とは異なる多重成分を含む併用法を実施することも本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
本発明のアデノウイルスベクターを含む組成物（ワクチン組成物を含む）は本発明の重要な側面である。これらの組成物は哺乳動物宿主、好ましくはヒト宿主に予防又は治療適用で投与することができる。可能な宿主／ワクチンとしては限定されないが、霊長類、特にヒト及び非ヒト霊長類が挙げられ、商業又は家畜用として重要な任意の非ヒト哺乳動物が挙げられる。組換えアデノウイルス血清型３４ベクターを含む組成物は単独投与してもよいし、他のウイルス又は非ウイルス系ＤＮＡ／蛋白質ワクチンと併用投与してもよい。これらの組成物はより広い治療レジメの一部として投与してもよい。本発明は、開示する組換えアデノウイルス血清型３４ベクターを他の療法、例えばＨＡＡＲＴ療法（組換えＨＩＶベクターの場合）と併用投与する場合も含む。
【００３２】
組換えウイルスベクターを含む組成物は緩衝液、正常食塩水又はリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩類及びポリソルベート等の生理学的に許容可能な成分を添加することができる。所定態様では、製剤は２．５〜１０ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液、好ましくは約５ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液；２５〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ  ＮａＣｌ；２．５〜１０％スクロース、好ましくは約５％スクロース；０．０１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；及び０．００１％〜０．０１％ポリソルベート８０（植物由来）を含有する。ｐＨは約７．０〜９．０、好ましくは約８．０とすべきである。当業者に自明の通り、他の慣用ワクチン賦形剤も製剤に使用してもよい。特定態様では、製剤は５ｍＭ  ＴＲＩＳ，７５ｍＭ  ＮａＣｌ，５％スクロース，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．００５％ポリソルベート８０を含有し、ｐＨ８．０である。これはＡｄ５及びＡｄ６安定性にほぼ最適なｐＨと２価カチオンの組成であり、ガラス表面へのウイルス吸着の可能性を最小限にする。筋肉内注射しても組織刺激を生じない。使用時まで凍結することが好ましい。
【００３３】
ワクチンレシピエントに導入されるべきワクチン組成物中のウイルス粒子の量は、使用する転写及び翻訳プロモーターの強度と発現される遺伝子産物の免疫原性により異なる。一般に、粒子１×１０７〜１×１０１２個、好ましくは粒子約１×１０１０〜１×１０１１個の免疫的又は予防的有効量を筋肉組織に直接投与する。皮下注射、皮内導入、経皮圧入及び他の投与方法（例えば腹腔内、静脈内又は吸入送達）も考えられる。本発明のワクチン組成物の非経口導入と同時又は導入後に、インターロイキン−１２蛋白質を静脈内、筋肉内、皮下、又は他の投与手段等により非経口投与しても有利である。
【００３４】
以下、非限定的な実施例により本発明の実施を更に例証する。
【実施例１】
【００３５】
ｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の構築
既存Ｃ群／Ａｄ５Ｅ１相補細胞系（２９３，ＰＥＲ．Ｃ６）で増殖することができるＥ１−Ａｄ３４系ベクターを作製するために、Ａｄ５Ｏｒｆ６を天然Ｅ４領域の代わりに挿入した。Ａｄ３４プレアデノウイルスプラスミドを構築するために、Ａｄ３４とＡｄ３５の配列相同性を利用した。ＢＪ５１８３細菌を、精製した野生型Ａｄ３４ウイルスＤＮＡと適切に構築したＡｄ３５ＩＴＲカセットで同時形質転換し、相同組換えによりウイルスゲノムを環状化した。Ａｄ３４系プレＡｄプラスミドの構築を以下に要約する。
【００３６】
ｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６（Ｅ１欠失部とＡｄ５Ｏｒｆ６で置換されたＥ４欠失部を含むＡｄ３４プレＡｄプラスミド）を構築するために、Ａｄ３５ＩＴＲカセットを使用した。Ａｄ３４とＡｄ３５の配列相同性により相同組換えが生じるであろうと予想した。Ａｄ３５ゲノム（図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０参照）の右末端（ｂｐ３１５９９〜３１９１３及びｂｐ３４４１９〜３４７９３）と左末端（ｂｐ４〜４５６及びｂｐ３４０３〜３８８６）に由来する配列の間を、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列で隔てたＡｄ３５ＩＴＲカセットを構築した。４セグメントをＰＣＲにより作製してｐＮＥＢ１９３に順次クローニングし、ｐＮＥＢＡｄ３５−４を作製した。次に、Ａｄ５Ｏｒｆ６オープンリーディングフレームをＰＣＲにより作製し、Ａｄ３５ｂｐ３１９１３〜３４４１９間にクローニングし、ｐＮＥＢＡｄ３５−４Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＩＴＲカセット）を作製した。ＰＣＲ産物を導入したプラスミドｐＮＥＢ１９３は通常使用されている市販クローニングプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｎ３０５１Ｓ）であり、細菌複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子と、多重クローニング部位を含む。ＩＴＲカセットはＡｄ３５ｂｐ４５７〜３４０２に由来するＥ１配列の欠失部に配置したユニークなＳｗａＩ制限部位と、Ａｄ３５ｂｐ３１９１４〜３４４１８に由来するＥ４欠失部にＥ４パラレル方向で導入したＡｄ５Ｏｒｆ６を含む。この構築物では、Ａｄ３５Ｅ４プロモーターによりＡｄ５Ｏｒｆ６発現が駆動される。ＩＴＲカセットのＡｄ３５配列（ｂｐ３１５９９〜３１９１３及びｂｐ３４０３〜３８８６）は精製Ａｄ３４ウイルスＤＮＡとの相同領域を提供し、ＢＪ５１８３細菌への同時形質転換後に細菌組換えが生じた（図１）。ＩＴＲカセットは更に、消化により組換えＡｄ３４ゲノムをプラスミド配列から遊離するように、ウイルスＩＴＲの末端に配置されたユニークな制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含むように設計した。可能性のあるクローンを制限分析によりスクリーニングし、１個のクローンをｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。
【実施例２】
【００３７】
ウイルスへのｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のレスキュー
プレアデノウイルスプラスミドｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６をウイルスにレスキューし、Ｃ群Ｅ１相補細胞系で増殖できるか否かを調べるために、このプラスミドをＰｍｅＩで消化し、リン酸カルシウム沈殿法（Ｃｅｌｌ  Ｐｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）を使用してＰＥＲ．Ｃ６細胞のＴ−２５フラスコにトランスフェクトした。ＰｍｅＩ消化によりプラスミド配列からウイルスゲノムが遊離され、細胞侵入後にウイルス複製を生じさせた。ウイルス複製及び増幅が生じていたことを示すウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が、トランスフェクション後に観察された。トランスフェクションから約７〜１０日後にＣＰＥが完了したら感染細胞と培地を回収し、３回凍結／解凍し、細胞破片を遠心によりペレット化した。細胞溶解液約１ｍｌを使用してＰＥＲ．Ｃ６細胞のＴ−２２５フラスコに８０〜９０％コンフルエンスで感染させた。ＣＰＥに達したら感染細胞と培地を回収し、３回凍結／解凍し、細胞破片を遠心によりペレット化した。次に、清澄化細胞溶解液を使用してＰＥＲ．Ｃ６細胞の２層ＮＵＮＣセルファクトリーに感染させた。ＣＰＥの完了後、ウイルスをＣｓＣｌ密度勾配で超遠心により精製した。レスキューされたウイルスの遺伝子構造を確認するために、プロナーゼ処理後にフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿を使用してウイルスＤＮＡを抽出した。次にウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで処理して制限フラグメントをＰ３３−ｄＡＴＰで末端標識した。末端標識した制限フラグメントを、次にゲル電気泳動によりサイズ分画し、オートラジオグラフィーにより可視化した。消化産物を元の（標識前にＰｍｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいた）対応するプレアデノウイルスプラスミドの消化産物と比較した。予想サイズが観察され、ウイルスレスキューに成功したことが確認された。
【実施例３】
【００３８】
ｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６への発現カセットの挿入
ｇａｇ又はＳＥＡＰ発現カセット（夫々図８及び９参照）をｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６のＥ１領域に導入するために、再び細菌組換えを使用した。１）ヒトサイトメガロウイルスに由来する即時型遺伝子プロモーターと、２）ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ｇａｇ（ＣＡＭ−１株；１５２６ｂｐ）遺伝子のコーディング配列と、３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列から構成されるｇａｇ発現カセットを、Ａｄ３５シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ３５−２（上記Ａｄ３５ＩＴＲカセットの前駆体）のＥ１欠失部にクローニングし、ｐＮＥＢＡｄ３５ＣＭＶｇａｇＢＧＨｐＡを作製した。ｐＮＥＢＡｄ３５−２はゲノムの左末端（ｂｐ４〜４５６及びｂｐ３４０３〜３８８６）に由来するＡｄ３５配列と、欠失部のｂｐ４５６〜３４０３に挿入したユニークなＳｗａＩ部位を含む。ｇａｇ発現カセットは予め構築したシャトルプラスミドからＥｃｏＲＩ消化により得た。消化後、所望フラグメントをゲル精製し、Ｋｌｅｎｏｗ処理して平滑末端化し、ｐＮＥＢＡｄ３５−２のＳｗａＩ部位にクローニングした。このクローニング段階の結果、ｇａｇ発現カセットはｂｐ４５６〜３４０３間のＥ１欠失部にＥ１パラレル方向で挿入された。ｇａｇトランスジーンを含むシャトルベクターを消化し、Ａｄ３５ｂｐ４〜４５６とｂｐ３４０３〜３８８６に挟まれたｇａｇ発現カセットから構成されるＤＮＡフラグメントを作製し、フラグメントをアガロースゲル電気泳動後に精製した。ＢＪ５１８３細菌を、シャトルベクターフラグメントと、ＳｗａＩ消化によりＥ１領域で線状化したｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６で同時形質転換し、相同組換えによりＡｄ３４ｇａｇを含むプレアデノウイルスプラスミドｐＡｄ３４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を作製した。可能性のあるクローンを制限分析によりスクリーニングした。
【００３９】
同様のストラテジーを使用してＳＥＡＰ発現カセットを含むＡｄ３４プレＡｄプラスミドを作製した。この場合には、１）ヒトサイトメガロウイルスに由来する即時型遺伝子プロモーターと、２）ヒト胎盤ＳＥＡＰ遺伝子のコーディング配列と、３）ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列から構成されるＳＥＡＰ発現カセットを、Ａｄ３５シャトルプラスミドｐＮＥＢＡｄ３５−２のＥ１欠失部にクローニングし、ｐＮＥＢＡｄ３５ＣＭＶＳＥＡＰＢＧＨｐＡを作製した。ＳＥＡＰ発現カセットは、予め構築したシャトルプラスミドからＥｃｏＲＩ消化により得た。消化後、所望フラグメントをゲル精製し、Ｋｌｅｎｏｗ処理して平滑末端化し、ｐＮＥＢＡｄ３５−２のＳｗａＩ部位にクローニングした。次にトランスジーンをｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６に組換え、ｇａｇトランスジーンについて上述したようにｐＡｄ３４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を作製した。
【００４０】
全プレＡｄプラスミドを上記のようにウイルスにレスキュー及び増殖させ、ＣｓＣｌ精製ストックを作製した。
【実施例４】
【００４１】
ｐＭＲＫＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の構築
Ａｄ３４配列全体から構成されるＡｄ３４プレＡｄプラスミドを構築するために、Ａｄ３４ＩＴＲカセットを作製した。Ａｄ３４ゲノム（図３Ａ−１〜３Ａ−９参照）の右末端（ｂｐ３１５８４〜３１８９５及びｂｐ３４４０９〜３４７７２）と左末端（ｂｐ４〜４５６及びｂｐ３４０２〜３８８５）に由来する配列の間を、細菌複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列で隔てたＡｄ３４ＩＴＲカセットを構築した。これらの４セグメントをＰＣＲにより作製してｐＮＥＢ１９３に順次クローニングし、ｐＮＥＢＡｄ３４−４を作製した。次に、Ａｄ５Ｏｒｆ６オープンリーディングフレームをＰＣＲにより作製し、Ａｄ３４ｂｐ３１８９５〜３４４０９間にクローニングし、ｐＮＥＢＡｄ３４−４Ａｄ５Ｏｒｆ６（ＩＴＲカセット）を作製した。ＰＣＲ産物を導入したプラスミドＰＮＥＢ１９３は通常使用されている市販クローニングプラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｎ３０５１Ｓ）であり、細菌複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子と、多重クローニング部位を含む。ＩＴＲカセットはＡｄ３４ｂｐ４５７〜３４０１に由来するＥ１配列の欠失部に配置したユニークなＳｗａＩ制限部位と、Ａｄ３４ｂｐ３１８９６〜３４４０８に由来するＥ４欠失部にＥ４パラレル方向で導入したＡｄ５Ｏｒｆ６を含む。この構築物ではＡｄ３４Ｅ４プロモーターによりＡｄ５Ｏｒｆ６発現が駆動される。ＩＴＲカセットのＡｄ３４配列（ｂｐ３１５８４〜３１８９５及びｂｐ３４０２〜３８８５）は精製Ａｄ３４ウイルスＤＮＡとの相同領域を提供し、ＢＪ５１８３細菌に同時形質転換後に細菌組換えを生じさせた（図２）。ＩＴＲカセットは更に、消化により組換えＡｄ３４ゲノムをプラスミド配列から遊離するようにウイルスＩＴＲの末端に配置されたユニークな制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含むように設計した。可能性のあるクローンを制限分析によりスクリーニングし、１個のクローンをｐＭＲＫＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６として選択した。
【実施例５】
【００４２】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ試験
Ａ．免疫
アカゲザル３頭からなる各コホートに（１）（２００２年３月２１日公開ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８８６１に開示されている図１０Ａ−１〜１０Ａ−４５のＭＲＫＡｄベクターバックボーン中の）１０１１ｖｐ  ＭＲＫＡｄ５−ＳＥＡＰと；（２）１０１１ｖｐ  Ａｄ３４ΔＥ１ＳＥＡＰΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６の２種のベクターの一方を１回、筋肉内注射した。アカゲザルは体重３〜１０ｋｇのものを使用した。いずれの場合も、各ワクチンの総用量を緩衝液１ｍＬに懸濁した。アカゲザルを麻酔（ケタミン／キシラジン）し、ツベルクリン注射器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して０．５ｍＬアリコートを両側三角筋に筋肉内送達した。免疫レジメ中の数時点で採取した血液サンプルから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。全動物飼育及び処置は全米研究協議会、実験動物資源協会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）の「実験動物の管理と使用に関する指針」（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に記載の原則に従って所内動物実験委員会により承認された標準に基づいて実施した。
【００４３】
Ｂ．ＳＥＡＰアッセイ
ＴＲＯＰＩＸ  ｐｈｏｓｐｈａ−ｌｉｇｈｔ化学発光キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ）を使用して血清サンプルの循環ヒト分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）値を分析した。９６ウェル白色ＤＹＮＥＸプレートで各血清の２×５μＬアリコートをキットに添付された希釈用緩衝液４５μＬと混合した。１０％ナイーブサル血清中のヒト胎盤アルカリホスファターゼ（カタログ番号Ｍ５９０５，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の連続希釈溶液を使用して標準曲線を作成した。ウェルを３０分間６５℃で加熱することによりサンプル中の内在ＳＥＡＰ活性を不活化した。サンプル中の酵素ＳＥＡＰ活性をキットに記載されている手順に従って測定した。ＤＹＮＥＸルミノメーターを使用して化学発光読み取り値（相対光単位で表す）を記録した。対数−対数回帰分析を使用してＲＬＵ読み取り値をｎｇ／ｍＬ  ＳＥＡＰに変換した。
【００４４】
Ｃ．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
従来記載されているプロトコール（Ａｌｌｅｎら，２００１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）を多少変更して、アカゲザルでＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。抗原特異的刺激のために、１０ａａオーバーラップを有する完全ＨＩＶ−１ｇａｇ配列を含む２０ａａペプチド（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）から、ペプチドプールを調製した。各ウェルに末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）２〜４×１０５個５０μＬを加え、下限値カットオフを８０フェムトリットル（「ｆＬ」）に設定したＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを使用して細胞をカウントした。培地５０μＬ又はペプチド当たり８μｇ／ｍＬ濃度のｇａｇペプチドプールをＰＢＭＣに加えた。サンプルを３７℃，５％ＣＯ２で２０〜２４時間インキュベートした。こうしてスポットを展開し、ＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）に基づく特注イメージャー及び自動計数サブルーチンを使用してプレートを処理し、カウントを細胞入力１０６に標準化した。
【００４５】
Ｄ．細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
（１７×１００ｍｍ丸底ポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ）に加えた）完全ＲＰＭＩ培地中２×１０６個／ｍＬのＰＢＭＣ１ｍｌに、抗ｈＣＤ２８（クローンＬ２９３，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及び抗ｈＣＤ４９ｄ（クローンＬ２５，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）モノクローナル抗体を終濃度１μｇ／ｍＬまで加えた。ｇａｇ特異的刺激のために、ペプチドプール１０μＬ（ペプチド当たり０．４ｍｇ／ｍＬ）を加えた。チューブを３７℃で１時間インキュベートした後、５ｍｇ／ｍＬブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）２０μＬを加えた。細胞を１６時間３７℃、５％ＣＯ２，９０％湿度でインキュベートした。冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳ４ｍＬを各チューブに加え、細胞を１０分間１２００ｒｐｍでペレット化した。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁し、数種の蛍光標識ｍＡｂ即ち抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ，クローンＦＮ−１８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）２０μＬ／チューブ；抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ，クローンＳＫＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２０μＬ；及び抗ｈＣＤ４−ＰＥ，クローンＳＫ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２０μＬを使用して表面マーカーとして染色した（３０分間，４℃）。この段階からのサンプル処理は暗所で実施した。細胞を洗浄し、１×ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）７５０μＬ中で１０分間室温にてインキュベートした。細胞をペレット化し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁し、ＦＩＴＣ−抗ｈＩＦＮ−γ，クローンＭＤ−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）０．１μｇを加えた。３０分間インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置の全４個のカラーチャネルを使用してサンプルを分析した。データを分析するために、側方及び前方の低散乱リンパ球集団をまずゲートし、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団の両者で、サンプルのモック及びｇａｇ−ペプチド反応チューブの両者に対して、サイトカイン陽性イベントの共通蛍光カットオフを使用した。
【００４６】
Ｅ．結果
発現：注射前後の血清サンプルの循環ＳＥＡＰ活性を分析し、結果を図４に示す。その結果、代替アデノウイルス血清型により生産されたＳＥＡＰ蛋白質のピーク値は１０１１ｖｐの同一高用量レベルのＭＲＫＡｄ５のピーク値よりも低いが、その３倍以内であった（図４）。１０日後に血清中のＳＥＡＰ値は劇的に減少し、僅か１５日でバックグラウンドに近づいた。これらの観察は、Ａｄ３４系ベクターが霊長類に筋肉内投与後にトランスジーンを発現するのに有効であることを強く示唆するものである。
【００４７】
免疫原性：完全蛋白質配列を含む２０ａａペプチドのプールに対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ワクチンにより誘導されたＨＩＶ−１ｇａｇに対するＴ細胞応答を定量した。結果を図５に示し、ペプチドプール又はモック（ペプチド不含有）対照に応答した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数として表す。
【００４８】
ｇａｇ発現Ａｄ３４ベクターで免疫すると、ベクターの単回投与直後に検出可能なレベルの循環ｇａｇ特異的Ｔ細胞が誘導された。４週目に２回目の投与をした後、応答は改善された。全般にＡｄ３４系ベクターに対する応答は同一用量のＭＲＫＡｄ５−ｇａｇにより誘導される応答よりも僅かに低かった。この結果は、Ａｄ３４系ベクターがＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答を有効にプライムできることを強く示唆している。
【００４９】
Ａｄ３４を免疫した動物に由来するＰＢＭＣのＩＦＮ−γＩＣＳ分析の結果、ベクターは検出可能なレベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を誘導できることが判明した（図６）。
【実施例６】
【００５０】
異種免疫
サル３３頭からなる各コホートに（０、４週に）１０１１ｖｐ  Ａｄ３４ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を免疫した後に、２４週目に１０１０ｖｐ  Ａｄ３５ΔＥ１ｇａｇΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６をブースター免疫した。完全蛋白質配列を含む２０ａａペプチドのプールに対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ワクチンにより誘導されたＨＩＶ−１ｇａｇに対するＴ細胞応答を定量した。結果を図１２に示し、ペプチドプール又はモック（ペプチド不含有）対照に応答した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）１０６個当たりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数として表す。
【００５１】
ｇａｇ発現Ａｄ３４ベクターで免疫すると、検出可能なレベルの循環ｇａｇ特異的Ｔ細胞が誘導され、ブースト時に９４〜１３９ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣまで減少した。Ａｄ３５系ＨＩＶベクターによる異種免疫の結果、Ｔ細胞応答は３倍にまで増加した。
【００５２】
Ａｄ３４プライム／Ａｄ３５ブースト動物に由来するＰＢＭＣを、２８週目にＩＦＮ−γＩＣＳ分析した結果、ベクターは検出可能なレベルのＣＤ４＋及びＣＤ８＋ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を誘導できることが判明した（図１３）。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ｐＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を回収するために利用した相同組換えスキームを示す。
【図２】ｐＭＲＫＡｄ３４ΔＥ１ΔＥ４Ａｄ５Ｏｒｆ６を回収するために利用した相同組換えスキームを示す。
【図３Ａ−１】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−２】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−３】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−４】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−５】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−６】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−７】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−８】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図３Ａ−９】図３Ａ−１〜３Ａ−９は野生型アデノウイルス血清型３４の核酸配列（配列番号１）を示す。Ａｄ３４のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１６である。
【図４】アカゲザルでＭＲＫＡｄ５及びＡｄ３４ベクターを使用したＳＥＡＰ発現の時間経過を示す。データはコホート幾何平均を示す。
【図５】ＨＩＶ−１ｇａｇを発現するＭＲＫＡｄ５及びＡｄ３４ベクターを使用して誘導されたＴ細胞応答を表形式で示す。データはＰＢＭＣ１０６個当たりのスポット形成細胞数（ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣ）で表す。「ａ」は１０ａａオーバーラップを有する完全ＨＩＶ−１ＣＡＭ１ｇａｇを含む２０量体ペプチドプールを表す。
【図６】Ａｄ３４を免疫したアカゲザルにおける１２週目のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｇａｇ特異的Ｔ細胞レベルを表形式で示す。「ａ」は１０ａａオーバーラップを有する完全ＨＩＶ−１ＣＡＭ１ｇａｇを含む２０量体ペプチドプールを表す。
【図７】最適化ヒトＨＩＶ−１ｇａｇオープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号３）を示す。
【図８】ｇａｇ発現カセットをコードする核酸配列（配列番号４）を示す。図の各種領域は以下の通りである：（１）第１の下線セグメントはヒトサイトメガロウイルスに由来する即時型遺伝子プロモーター領域をコードする核酸配列である；（２）下線なしの小文字で示した第１のＤＮＡセグメントは適切な制限酵素部位を含む；（３）大文字領域はＨＩＶ−１ｇａｇのコーディング配列を含む；（４）下線なしの小文字で示した第２のＤＮＡセグメントは適切な制限酵素部位を含む；（５）第２の下線セグメントはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列をコードする核酸配列を含む。
【図９】ＳＥＡＰ発現カセットをコードする核酸配列（配列番号５）を示す。図の各種領域は以下の通りである：（１）第１の下線セグメントはヒトサイトメガロウイルスに由来する即時型遺伝子プロモーター領域をコードする核酸配列である；（２）下線なしの小文字で示した第１のＤＮＡセグメントは適切な制限酵素部位を含む；（３）大文字領域はヒト胎盤ＳＥＡＰ遺伝子のコーディング配列を含む；（４）下線なしの小文字で示した第２のＤＮＡセグメントは適切な制限酵素部位を含む；（５）第２の下線セグメントはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列をコードする核酸配列を含む。
【図１０Ａ−１】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−５】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−６】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−７】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−８】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−９】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１０】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１１】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１２】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１３】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１４】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１５】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１６】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１７】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１８】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−１９】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２０】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２１】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２２】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２３】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２４】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２５】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２６】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２７】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２８】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−２９】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３０】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３１】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３２】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３３】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３４】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３５】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３６】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３７】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３８】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−３９】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４０】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４１】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４２】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４３】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４４】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４５】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４６】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１０Ａ−４７】図１０Ａ−１〜１０Ａ−４７はｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクターのヌクレオチド配列（配列番号６［コーディング］及び配列番号７［非コーディング］）を示す。
【図１１Ａ−１】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−２】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−３】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−４】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−５】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−６】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−７】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−８】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−９】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１１Ａ−１０】図１１Ａ−１〜１１Ａ−１０は野生型アデノウイルス血清型３５のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。Ａｄ３５のＡＴＣＣ品番はＶＲ−７１８である。
【図１２】アカゲザルで異種Ａｄ３４プライム／Ａｄ３５ブーストレジメを使用して誘導されたＴ細胞応答を表形式で示す。「ａ」は１０ａａオーバーラップを有する完全ＨＩＶ−１ＣＡＭ１ｇａｇを含む２０量体ペプチドプールを表す。
【図１３】Ａｄ３４プライム／Ａｄ３５ブーストしたアカゲザルにおける２８週目のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｇａｇ特異的Ｔ細胞レベルを表形式で示す。「ａ」は１０ａａオーバーラップを有する完全ＨＩＶ−１ＣＡＭ１ｇａｇを含む２０量体ペプチドプールを表す。
【図１】
2006521089.tif 000003
【図２】
2006521089.tif 000004
【図３Ａ−１】
2006521089.tif 000005
【図３Ａ−２】
2006521089.tif 000006
【図３Ａ−３】
2006521089.tif 000007
【図３Ａ−４】
2006521089.tif 000008
【図３Ａ−５】
2006521089.tif 000009
【図３Ａ−６】
2006521089.tif 000010
【図３Ａ−７】
2006521089.tif 000011
【図３Ａ−８】
2006521089.tif 000012
【図３Ａ−９】
2006521089.tif 000013
【図４】
2006521089.tif 000014
【図５】
2006521089.tif 000015
【図６】
2006521089.tif 000016
【図７】
2006521089.tif 000017
【図８】
2006521089.tif 000018
【図９】
2006521089.tif 000019
【図１０Ａ−１】
2006521089.tif 000020
【図１０Ａ−２】
2006521089.tif 000021
【図１０Ａ−３】
2006521089.tif 000022
【図１０Ａ−４】
2006521089.tif 000023
【図１０Ａ−５】
2006521089.tif 000024
【図１０Ａ−６】
2006521089.tif 000025
【図１０Ａ−７】
2006521089.tif 000026
【図１０Ａ−８】
2006521089.tif 000027
【図１０Ａ−９】
2006521089.tif 000028
【図１０Ａ−１０】
2006521089.tif 000029
【図１０Ａ−１１】
2006521089.tif 000030
【図１０Ａ−１２】
2006521089.tif 000031
【図１０Ａ−１３】
2006521089.tif 000032
【図１０Ａ−１４】
2006521089.tif 000033
【図１０Ａ−１５】
2006521089.tif 000034
【図１０Ａ−１６】
2006521089.tif 000035
【図１０Ａ−１７】
2006521089.tif 000036
【図１０Ａ−１８】
2006521089.tif 000037
【図１０Ａ−１９】
2006521089.tif 000038
【図１０Ａ−２０】
2006521089.tif 000039
【図１０Ａ−２１】
2006521089.tif 000040
【図１０Ａ−２２】
2006521089.tif 000041
【図１０Ａ−２３】
2006521089.tif 000042
【図１０Ａ−２４】
2006521089.tif 000043
【図１０Ａ−２５】
2006521089.tif 000044
【図１０Ａ−２６】
2006521089.tif 000045
【図１０Ａ−２７】
2006521089.tif 000046
【図１０Ａ−２８】
2006521089.tif 000047
【図１０Ａ−２９】
2006521089.tif 000048
【図１０Ａ−３０】
2006521089.tif 000049
【図１０Ａ−３１】
2006521089.tif 000050
【図１０Ａ−３２】
2006521089.tif 000051
【図１０Ａ−３３】
2006521089.tif 000052
【図１０Ａ−３４】
2006521089.tif 000053
【図１０Ａ−３５】
2006521089.tif 000054
【図１０Ａ−３６】
2006521089.tif 000055
【図１０Ａ−３７】
2006521089.tif 000056
【図１０Ａ−３８】
2006521089.tif 000057
【図１０Ａ−３９】
2006521089.tif 000058
【図１０Ａ−４０】
2006521089.tif 000059
【図１０Ａ−４１】
2006521089.tif 000060
【図１０Ａ−４２】
2006521089.tif 000061
【図１０Ａ−４３】
2006521089.tif 000062
【図１０Ａ−４４】
2006521089.tif 000063
【図１０Ａ−４５】
2006521089.tif 000064
【図１０Ａ−４６】
2006521089.tif 000065
【図１０Ａ−４７】
2006521089.tif 000066
【図１１Ａ−１】
2006521089.tif 000067
【図１１Ａ−２】
2006521089.tif 000068
【図１１Ａ−３】
2006521089.tif 000069
【図１１Ａ−４】
2006521089.tif 000070
【図１１Ａ−５】
2006521089.tif 000071
【図１１Ａ−６】
2006521089.tif 000072
【図１１Ａ−７】
2006521089.tif 000073
【図１１Ａ−８】
2006521089.tif 000074
【図１１Ａ−９】
2006521089.tif 000075
【図１１Ａ−１０】
2006521089.tif 000076
【図１２】
2006521089.tif 000077
【図１３】
2006521089.tif 000078
【国際調査報告】
2006521089.tif 000079
2006521089.tif 000080