(57)【要約】本発明はプロテアーゼ活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸並びに前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを製造および使用する方法を目的とする。本発明のポリペプチドは種々の診断薬、治療薬および工業関係で用いることができる。本発明のポリペプチドは、例えば洗剤、食品加工および逆反応を利用する化学合成のための添加物として用いることができる。さらにまた、本発明のポリペプチドは食品加工、醸造浴添加物、アルコール製造、ペプチド合成、鏡像選択性、皮革工業における皮革製造、廃棄物処理および動物の分解、写真工業における銀の回収、医療、絹の脱ガム、バイオフィルムの分解、バイオマスのアルコールへの変換、生体防御、抗菌剤および消毒剤、身だしなみおよび化粧品、バイオテク試薬、トウモロコシの湿潤混練りの澱粉収量の増加、並びに医薬品（例えば消化促進剤および抗炎症（抗燃素）剤）で用いることができる。
2006516889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:158、配列番号:164、配列番号:171、配列番号:179、配列番号:187、配列番号:193、配列番号:199、配列番号:204、配列番号:210、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:229、配列番号:234、配列番号:241、配列番号:248または配列番号:254と、少なくとも約100残基の領域にわたって少なくとも約50％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離または組換え核酸であって、プロテアーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードし、さらに前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される前記核酸。
【請求項２】
配列同一性が少なくとも約51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％または64％である、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項３】
配列同一性が、少なくとも約65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％若しくはそれより高い、または100％である、請求項２記載の単離または組換え核酸。
【請求項４】
配列同一性が、少なくとも約50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150残基若しくはそれより多い残基、または遺伝子若しくは転写物の全長にわたる配列同一性である、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項５】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:158、配列番号:164、配列番号:171、配列番号:179、配列番号:187、配列番号:193、配列番号:199、配列番号:204、配列番号:210、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:229、配列番号:234、配列番号:241、配列番号:248または配列番号:254に示される配列を含む、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項６】
配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24、配列番号:26、配列番号:28、配列番号:30、配列番号:32、配列番号:34、配列番号:36、配列番号:38、配列番号:40、配列番号:42、配列番号:44、配列番号:46、配列番号:48、配列番号:50、配列番号:52、配列番号:54、配列番号:56、配列番号:58、配列番号:60、配列番号:62、配列番号:64、配列番号:68、配列番号:70、配列番号:72、配列番号:74、配列番号:78、配列番号:80、配列番号:82、配列番号:84、配列番号:86、配列番号:88、配列番号:90、配列番号:92、配列番号:94、配列番号:96、配列番号:98、配列番号:100、配列番号:102、配列番号:104、配列番号:106、配列番号:108、配列番号:110、配列番号:112、配列番号:114、配列番号:116、配列番号:118、配列番号:120、配列番号:122、配列番号:124、配列番号:126、配列番号:128、配列番号:130、配列番号:132、配列番号:134、配列番号:136、配列番号:138、配列番号:140、配列番号:142、配列番号:144、配列番号:147、配列番号:151、配列番号:159、配列番号:165、配列番号:172、配列番号:180、配列番号:188、配列番号:194、配列番号:200、配列番号:205、配列番号:211、配列番号:219、配列番号:223、配列番号:230、配列番号:235、配列番号:242、配列番号:249または配列番号:255に示される配列を有するポリペプチド、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドをコードする、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項７】
配列比較アルゴリズムがBLAST Ver.2.2.2アルゴリズムであって、フィルタリング設定がblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他のオプションが規定値に設定されている、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項８】
プロテアーゼ活性がペプチド結合の加水分解を触媒する活性を含む、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項９】
プロテアーゼ活性がエンドプロテアーゼ活性またはエキソプロテアーゼ活性を含む、請求項８記載の単離または組換え核酸。
【請求項１０】
プロテアーゼ活性がプロテイナーゼ活性またはペプチダーゼ活性を含む、請求項８記載の単離または組換え核酸。
【請求項１１】
ペプチダーゼ活性がカルボキシペプチダーゼ活性を含む、請求項10記載の単離または組換え核酸。
【請求項１２】
ペプチダーゼ活性がアミノペプチダーゼ活性を含む、請求項10記載の単離または組換え核酸。
【請求項１３】
プロテアーゼ活性がセリンプロテアーゼ活性を含む、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項１４】
プロテアーゼ活性がメタロプロテアーゼ活性、マトリックスプロテアーゼ活性またはコラゲナーゼ活性を含む、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項１５】
プロテアーゼ活性がシステインプロテアーゼ活性を含む、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項１６】
プロテアーゼ活性がアスパラギンプロテアーゼ活性を含む、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項１７】
プロテアーゼ活性がキモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインまたはスブチリシン活性を含む、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項１８】
プロテアーゼ活性がペプチダーゼ活性を含む、請求項1記載の単離または組換え核酸。
【請求項１９】
プロテアーゼ活性がジペプチジルペプチダーゼ活性を含む、請求項18記載の単離または組換え核酸。
【請求項２０】
プロテアーゼ活性が熱安定性である、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項２１】
ポリペプチドが約37℃〜約95℃、約55℃〜約85℃、約70℃〜約75℃、約70℃〜約95℃または約90℃〜約95℃の温度範囲を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持する、請求項20記載の単離または組換え核酸。
【請求項２２】
プロテアーゼ活性が耐熱性である、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項２３】
ポリペプチドが、約37℃より高い温度から約95℃、約55℃より高い温度から約85℃、または約70℃から75℃、または約90℃よりも高い温度から約95℃の範囲の温度に曝露した後にプロテアーゼ活性を維持する、請求項22記載の単離または組換え核酸。
【請求項２４】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:158、配列番号:164、配列番号:171、配列番号:179、配列番号:187、配列番号:193、配列番号:199、配列番号:204、配列番号:210、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:229、配列番号:234、配列番号:241、配列番号:248または配列番号:254を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離または組換え核酸。
【請求項２５】
核酸が少なくとも長さ約50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000残基若しくはそれより多い残基、または遺伝子若しくは転写物の完全長である、請求項24記載の単離または組換え核酸。
【請求項２６】
ストリンジェントな条件が、0.2 x SSC中で約65℃にて約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む、請求項24記載の単離または組換え核酸。
【請求項２７】
配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:158、配列番号:164、配列番号:171、配列番号:179、配列番号:187、配列番号:193、配列番号:199、配列番号:204、配列番号:210、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:229、配列番号:234、配列番号:241、配列番号:248または配列番号:254を含む配列の少なくとも10の連続する塩基を含み、結合またはハイブリダイゼーションによってプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブ。
【請求項２８】
少なくとも約10〜50、約20〜60、約30~70、約40〜80、約60〜100または約50〜150の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項27記載の核酸プローブ。
【請求項２９】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブであって、前記プローブが、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:158、配列番号:164、配列番号:171、配列番号:179、配列番号:187、配列番号:193、配列番号:199、配列番号:204、配列番号:210、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:229、配列番号:234、配列番号:241、配列番号:248または配列番号:254の少なくとも約10の連続する塩基を含む核酸を含み、前記配列同一性が配列比較アルゴリズムによる分析または目視精査によって決定される前記核酸プローブ。
【請求項３０】
少なくとも約10〜50、約20〜60、約30〜70、約40〜80、約60〜100または約50〜150の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項29記載の核酸プローブ。
【請求項３１】
請求項１または24記載の配列を含む核酸またはその部分配列を増幅することのできる、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー対。
【請求項３２】
増幅プライマー配列対の構成プライマーが、前記配列の約10〜50の連続する塩基、または、約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30若しくはそれより多くの連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項31記載の増幅プライマー対。
【請求項３３】
増幅プライマー対であって、前記プライマー対が、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:25、配列番号:27、配列番号:29、配列番号:31、配列番号:33、配列番号:35、配列番号:37、配列番号:39、配列番号:41、配列番号:43、配列番号:45、配列番号:47、配列番号:49、配列番号:51、配列番号:53、配列番号:55、配列番号:57、配列番号:59、配列番号:61、配列番号:63、配列番号:65、配列番号:67、配列番号:69、配列番号:71、配列番号:73、配列番号:75、配列番号:77、配列番号:79、配列番号:81、配列番号:83、配列番号:85、配列番号:87、配列番号:89、配列番号:91、配列番号:93、配列番号:95、配列番号:97、配列番号:99、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:105、配列番号:107、配列番号:109、配列番号:111、配列番号:113、配列番号:115、配列番号:117、配列番号:119、配列番号:121、配列番号:123、配列番号:125、配列番号:127、配列番号:129、配列番号:131、配列番号:133、配列番号:135、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:141、配列番号:143、配列番号:145、配列番号:146、配列番号:150、配列番号:158、配列番号:164、配列番号:171、配列番号:179、配列番号:187、配列番号:193、配列番号:199、配列番号:204、配列番号:210、配列番号:218、配列番号:222、配列番号:229、配列番号:234、配列番号:241、配列番号:248または配列番号:254の最初（5'側）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上の残基によって示される配列を有する第一のメンバー、および前記第一のメンバーの相補鎖の最初（5'側）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上の残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む前記増幅プライマー対。
【請求項３４】
請求項３３記載の増幅プライマー対を用いたポリヌクレオチドの増幅によって生成される、プロテアーゼをコードする核酸。
【請求項３５】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による、請求項３４記載のプロテアーゼをコードする核酸。
【請求項３６】
核酸が遺伝子ライブラリーの増幅によって生成される、請求項３４記載のプロテアーゼをコードする核酸。
【請求項３７】
遺伝子ライブラリーが環境ライブラリーである、請求項３４記載のプロテアーゼをコードする核酸。
【請求項３８】
請求項３４記載のプロテアーゼをコードする核酸によってコードされる、単離または組換えプロテアーゼ。
【請求項３９】
請求項１若しくは請求項２４記載の核酸配列またはその部分配列を増幅することのできる増幅プライマー配列対で鋳型核酸を増幅することを含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法。
【請求項４０】
請求項１または請求項２４記載の配列を含む核酸を含む発現カセット。
【請求項４１】
請求項１または請求項２４記載の配列を含む核酸を含むベクター。
【請求項４２】
ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含む、請求項１または請求項２４記載の配列を含む核酸を含むクローニングビヒクル。
【請求項４３】
ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含む、請求項４２記載のクローニングビヒクル。
【請求項４４】
細菌人工染色体（BAC）、プラスミド、バクテリオファージP1-誘導体ベクター(PAC)、酵母人工染色体(YAC)、哺乳動物人工染色体(MAC)を含む、請求項４２記載のクローニングビヒクル。
【請求項４５】
請求項１または請求項２４記載の配列を含む核酸を含む形質転換細胞。
【請求項４６】
請求項４０記載の発現カセットを含む形質転換細胞。
【請求項４７】
バクテリア細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または植物細胞である、請求項４０記載の形質転換細胞。
【請求項４８】
請求項１または請求項２４記載の配列を含む非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４９】
マウスである、請求項４８記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５０】
請求項１または請求項２４記載の配列を含むトランスジェニック植物。
【請求項５１】
トウモロコシ、ソルガム、ポテト、トマト、小麦、脂肪種子植物、ナタネ、ダイズ、コメ、オオムギ、草本、またはタバコである、請求項５０記載のトランスジェニック植物。
【請求項５２】
請求項１または請求項２４記載の配列を含むトランスジェニック種子。
【請求項５３】
種子が、トウモロコシ種子、小麦核、脂肪種子、ナタネ種子、ヤシ核、ヒマワリ種子、ゴマ種子、コメ、オオムギ、ラッカセイ、タバコ種子である、請求項５２記載のトランスジェニック種子。
【請求項５４】
請求項１若しくは請求項２４記載の配列またはその部分配列に相補的またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
約10〜50、約20〜60、約30〜70、約40〜80または約60〜100塩基長である、請求項４９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
請求項１若しくは請求項２４記載の配列に相補的またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入するまたは細胞中で発現させることを含む、細胞中のプロテアーゼメッセンジャーの翻訳を阻害する方法。
【請求項５７】
請求項１または請求項２４記載の配列の部分配列を含む二本鎖阻害性RNA(RNAi)分子。
【請求項５８】
約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチド長またはそれより長い、請求項５２記載の二本鎖阻害性RNA(RNAi)分子。
【請求項５９】
請求項１または請求項２４記載の配列の部分配列を含む二本鎖阻害性RNA(RNAi)分子を細胞に投与するまたは細胞内で発現させることを含む、細胞におけるプロテアーゼの発現を阻害する方法。
【請求項６０】
（i）配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドと少なくとも約100残基の領域にわたって少なくとも50％の配列同一性を有する単離または組換えポリペプチド（前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される）；または、
（ii）配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248または配列番号:254に示される配列と少なくとも約100残基の領域にわたって少なくとも50％の配列同一性を有する核酸によってコードされるか（前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される）、または配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248または配列番号:254に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸によってコードされる、単離または組換えポリペプチド。
【請求項６１】
配列同一性が、少なくとも約51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または100％の配列同一性である請求項60に記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項６２】
配列同一性が、少なくとも酵素の約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050残基またはそれより多い残基領域、または酵素の全長にわたる、請求項６０記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項６３】
配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255記載に示される配列、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドに示される配列を有する、請求項６０記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項６４】
プロテアーゼ活性を有する、請求項６０記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項６５】
プロテアーゼ活性がペプチド結合の加水分解を触媒する活性を含む、請求項１記載の単離または組換え核酸。
【請求項６６】
プロテアーゼ活性がエンドプロテアーゼ活性またはエキソプロテアーゼ活性を含む、請求項６５記載の単離または組換え核酸。
【請求項６７】
プロテアーゼ活性がプロテイナーゼ活性またはペプチダーゼ活性を含む、請求項６５記載の単離または組換え核酸。
【請求項６８】
ペプチダーゼ活性がカルボキシペプチダーゼ活性を含む、請求項６７記載の単離または組換え核酸。
【請求項６９】
ペプチダーゼ活性がアミノペプチダーゼ活性を含む、請求項６７記載の単離または組換え核酸。
【請求項７０】
プロテアーゼ活性がセリンプロテアーゼ活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７１】
プロテアーゼ活性がメタロプロテイナーゼ活性、マトリックスプロテイナーゼ活性またはコラゲナーゼ活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７２】
プロテアーゼ活性がシステインプロテアーゼ活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７３】
プロテアーゼ活性がアスパラギンプロテアーゼ活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７４】
プロテアーゼ活性がキモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインまたはスブチリシン活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７５】
プロテアーゼ活性がペプチダーゼ活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７６】
プロテアーゼ活性がジペプチジルペプチダーゼ活性を含む、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７７】
プロテアーゼ活性が熱安定性である、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項７８】
ポリペプチドが約1℃〜約5℃、約5℃〜約15℃、約15℃〜約25℃、約25℃〜約37℃、約37℃〜約95℃、約55℃〜約85℃、約70℃〜約95℃、約70℃〜約75℃または約90℃〜約95℃の温度範囲を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持する、請求項77記載の単離または組換え核酸。
【請求項７９】
プロテアーゼ活性が耐熱性である、請求項６４記載の単離または組換え核酸。
【請求項８０】
ポリペプチドが、1℃〜約5℃、約5℃〜約15℃、約15℃〜約25℃、約25℃〜約37℃、約37℃〜約95℃、約55℃〜約85℃、約70℃〜約75℃、または約90℃〜約95℃またはそれよりも高い範囲の温度に曝露した後にプロテアーゼ活性を維持する、請求項79記載の単離または組換え核酸。
【請求項８１】
請求項６０記載のポリペプチドを含み、シグナル配列またはプレプロ配列を欠く単離または組換えポリペプチド。
【請求項８２】
請求項６０記載のポリペプチドを含み、異種シグナル配列または異種プレプロ配列を含む単離または組換えポリペプチド。
【請求項８３】
プロテアーゼ活性が約37℃にて、タンパク質１mgあたり約100〜約1000ユニット、タンパク質１mgあたり約500〜約750ユニット、タンパク質１mgあたり約500〜1200ユニット、またはタンパク質１mgあたり約750〜1000ユニットの比活性を含む請求項６４記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項８４】
耐熱性が、上昇した温度まで加熱後に37℃におけるプロテアーゼの比活性の少なくとも半分の活性を維持することを含む、請求項７９記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項８５】
耐熱性が、上昇した温度まで加熱後に37℃においてタンパク質１mgあたり約500〜1200ユニットの比活性を維持することを含む、請求項７９記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項８６】
少なくとも一つのグリコシル化部位を含む、請求項６０記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項８７】
グリコシル化がN-結合グリコシル化である、請求項８６記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項８８】
P.パストリスまたはS.ポンベで発現させるとグリコシル化される、請求項８７記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項８９】
約pH6.5、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5またはpH4.0を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持する、請求項６４記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項９０】
約pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10またはpH10.5を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持する、請求項６４記載の単離または組換えポリペプチド。
【請求項９１】
液体、固体、またはゲルを含む、請求項６０記載のポリペプチドを含むタンパク質調製物。
【請求項９２】
請求項６０記載のポリペプチドおよび第２のドメインを含むヘテロ二量体。
【請求項９３】
第２のドメインがポリペプチドであり、ヘテロ二量体が融合タンパク質である、請求項９２記載のヘテロ二量体。
【請求項９４】
第２のドメインがエピトープまたはタグである、請求項９２記載のヘテロ二量体。
【請求項９５】
請求項６０記載のポリペプチドを含むホモ二量体。
【請求項９６】
前記ポリペプチドペプチドが請求項６０記載の配列またはその部分配列を含む固定化ポリペプチド。
【請求項９７】
ポリペプチドが細胞上、金属上、樹脂上、ポリマー上、セラミック上、ガラス上、微小電極上、グラファイト粒子上、ビーズ上、ゲル上、プレート上、アレイ上、またはキャピラリー管上に固定化されている、請求項９６記載の固定化ポリペプチド。
【請求項９８】
固定化された請求項６０記載のポリペプチドを含むアレイ。
【請求項９９】
固定化された請求項１または請求項２４記載の核酸を含むアレイ。
【請求項１００】
請求項６０記載のポリペプチドに特異的に結合する単離または組換え抗体。
【請求項１０１】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１００記載の単離または組換え抗体。
【請求項１０２】
請求項６０記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマ。
【請求項１０３】
以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを単離または同定する方法：
（ａ）請求項１０２記載の抗体を提供する工程；
（ｂ）ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）のサンプルを工程（ａ）の抗体と、前記抗体が前記ポリペプチドへ特異的に結合することのできる条件下で接触させ、それによりプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを単離または同定する工程。
【請求項１０４】
請求項１または請求項２４記載の核酸またはその部分配列を液性免疫応答を生じさせるに充分な量で非ヒト動物に投与し、それによって抗プロテアーゼ抗体を生じさせることを含む、抗プロテアーゼ抗体の作製方法。
【請求項１０５】
請求項６０記載のポリペプチドまたはその部分配列を液性免疫応答を生じさせるに充分な量で非ヒト動物に投与し、それによって抗プロテアーゼ抗体を生じさせることを含む、抗プロテアーゼ抗体の作製方法。
【請求項１０６】
以下の工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法：
（ａ）プロモーターに機能可能に連結した核酸を提供する工程であって、前記核酸が請求項１または２４記載の配列を含む核酸である、前記工程；および、
（ｂ）工程（ａ）の核酸を、ポリペプチドの発現が可能な条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを生成させる工程。
【請求項１０７】
更に、工程（ａ）の核酸で宿主細胞を形質転換し、続いて工程（ａ）の核酸を発現させ、それにより形質転換細胞において組換えポリペプチドを生成させることを含む、請求項１０６記載の方法。
【請求項１０８】
（ａ）請求項６４記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）プロテアーゼ基質を提供する工程；および
（ｃ）前記ポリペプチドを工程（ｂ）の基質と接触させ、前記基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出する工程、
を含み、基質の量の減少または反応生成物の量の増加によりプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを検出することを含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法。
【請求項１０９】
（ａ）請求項６４記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）試験基質を提供する工程；および
（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験基質と接触させ、前記基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出する工程、
を含み、前記基質の量が減少または前記反応生成物が増加すれば前記試験基質をプロテアーゼ基質として同定することを含む、プロテアーゼ基質を同定する方法。
【請求項１１０】
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を有する核酸または前記核酸を含むベクターを、前記核酸がポリペプチドに翻訳され得る条件下で発現させる工程；
（ｂ）試験化合物を提供する工程；
（ｃ）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；および、
（ｄ）工程（ｂ）の試験化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するかどうかを測定する工程、
を含む、試験化合物がポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定する方法。
【請求項１１１】
（ａ）請求項６０記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）試験化合物を提供する工程；
（ｃ）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；および、
（ｄ）工程（ｂ）の試験化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するかどうかを測定する工程、
を含む、試験化合物がポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定する方法。
【請求項１１２】
（ａ）請求項６４記載のポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）試験化合物を提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）のポリペプチドを工程（ｂ）の試験化合物に接触させ、プロテアーゼ活性を測定する工程、
を含み、前記試験化合物の非存在下で測定されるプロテアーゼ活性に比較して前記試験化合物の存在下で測定されるプロテアーゼ活性が変化すれば、前記試験化合物がプロテアーゼ活性を調節すると決定する、プロテアーゼ活性の調節因子を同定する方法。
【請求項１１３】
プロテアーゼ活性が、プロテアーゼ基質を提供すること、および基質の量の減少若しくは反応生成物の量の増加を検出する、または、基質の量の増加若しくは反応生成物の量の減少を検出すること、によって測定される、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
試験化合物非存在下における基質の量若しくは反応生成物の量に比較して、前記試験化合物存在下における基質の量が減少若しくは反応生成物の量が増加すれば、前記試験化合物をプロテアーゼ活性の活性化因子であると同定する、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１５】
試験化合物非存在下における基質の量若しくは反応生成物の量に比較して、前記試験化合物存在下における基質の量が増加若しくは反応生成物の量が減少すれば、前記試験化合物をプロテアーゼ活性の阻害因子であると同定する、請求項１１３記載の方法。
【請求項１１６】
プロセッサおよびデータ保存装置を含むコンピュータシステムであって、前記データ保存装置にはポリペプチド配列または核酸配列が保存され、前記ポリペプチド配列は請求項６０記載の配列または請求項１若しくは請求項２４記載の核酸配列によってコードされるポリペプチドを含む。
【請求項１１７】
更に、配列比較アルゴリズムおよび少なくとも一つの参照配列が保存されたデータ保存装置を含む、請求項１１５記載のコンピュータシステム。
【請求項１１８】
配列比較アルゴリズムが多型性を表示するコンピュータプログラムを含む、請求項１１７記載のコンピュータシステム。
【請求項１１９】
配列の１以上の特徴を同定するアイデンティファイアーを更に含む請求項１１７記載のコンピュータシステム。
【請求項１２０】
ポリペプチド配列または核酸配列が保存されたコンピュータ読取り可能媒体であって、前記ポリペプチド配列が請求項６０記載のポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記コンピュータ読取り可能媒体。
【請求項１２１】
以下の工程を含む、配列中の特徴を同定する方法：
（ａ）配列中の１以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを用いて配列を読む工程であって、前記配列はポリペプチド配列または核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列は請求項６０記載のポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；および、
（ｂ）前記コンピュータプログラムにより前記配列中の１以上の特徴を同定する工程。
【請求項１２２】
以下の工程を含む、第１の配列と第２の配列とを比較する方法；
（ａ）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第１の配列及び第２の配列を読む工程であって、前記第１の配列はポリペプチド配列または核酸配列を含み、前記ポリペプチド配列は請求項６０記載のポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、前記工程；および、
（ｂ）前記第１の配列と前記第２の配列間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程。
【請求項１２３】
第１の配列と第２の配列間の相違を決定する工程が、更に多型性を同定する工程を含む、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２４】
配列中の１以上の特徴を同定するアイデンティファイアーを更に含む、請求項１２３記載の方法。
【請求項１２５】
コンピュータプログラムを用いて第１の配列を読み、前記配列中の１以上の特徴を同定することを含む、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
以下の工程を含む、環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法：
（ａ）請求項３１または33記載の増幅プライマー配列対を提供する工程；
（ｂ）環境サンプルから核酸を単離する、または環境サンプルを前記サンプル中の核酸が前記増幅プライマー対へハイブリダーゼションのために接近可能となるように処理する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の核酸を工程（ａ）の増幅プライマー対と合わせ、前記環境サンプルからの核酸を増幅し、それによって前記環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。
【請求項１２７】
増幅プライマー配列対の各構成プライマーが、配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248または配列番号:254に示される配列またはその部分配列の少なくとも約10〜50の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２６記載の方法。
【請求項１２８】
以下の工程を含む、環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法：
（ａ）請求項１または請求項２４、またはその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；
（ｂ）環境サンプルから核酸を単離する、または、環境サンプルを前記サンプル中の核酸が工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブにハイブリダイゼーションのために接近可能であるように処理する工程；および、
（ｃ）工程（ｂ）の単離された核酸または処理された環境サンプルを工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；
（ｄ）工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによって、環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。
【請求項１２９】
環境サンプルが水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、大気サンプルまたは生物学的サンプルを含む、請求項１２７または１２８記載の方法。
【請求項１３０】
生物学的サンプルが細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、または哺乳動物細胞に由来する請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】
以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を作製する方法：
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を含む鋳型核酸を提供する工程；および、
（ｂ）前記鋳型配列における１以上のヌクレオチドを改変、欠失または付加、またはそれらの組合せにより、前記鋳型核酸の変種を作製する工程。
【請求項１３２】
変種核酸を発現させて変種プロテアーゼポリペプチドを生成させることを更に含む、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３３】
改変、付加または欠失が、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結アッセンブリ(SLR)およびそれらの組合せを含む方法により導入される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３４】
改変、付加、欠失が、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ付加二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成、およびそれらの組合せによって導入される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３５】
鋳型核酸によってコードされるポリペプチドの活性または安定性に対して変異した若しくは異なる活性を有する、または、変異した若しくは異なる安定性を有するプロテアーゼが生成されるまで反復される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１３６】
変種プロテアーゼポリペプチドが耐熱性であって、上昇した温度に曝露した後にある程度の活性を維持する、請求項１３５記載の方法。
【請求項１３７】
変種プロテアーゼポリペプチドが鋳型核酸によってコードされるポリペプチドに比較してグリコシル化が増加する、請求項１３５記載の方法。
【請求項１３８】
変種プロテアーゼポリペプチドが高温下でプロテアーゼ活性を有し、鋳型核酸によってコードされるプロテアーゼが高温下で活性を有しない、請求項１３５記載の方法。
【請求項１３９】
鋳型核酸のコドン使用とは異なるコドン使用を有するプロテアーゼコード配列が生成されるまで反復される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１４０】
鋳型核酸のメッセンジャー発現または安定性よりも高いまたは低いメッセンジャー発現レベルまたは安定性を有するプロテアーゼ遺伝子が生成されるまで反復される、請求項１３１記載の方法。
【請求項１４１】
以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における前記核酸の発現を増加させる方法：
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する工程；および、
（ｂ）工程（ａ）の核酸中の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中性的に使用されるコドンに置換し、それによって核酸を改変して発現を増加させる工程であって、前記優先コドンとは宿主中の遺伝子内のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先コドンまたは低優先コドンとは前記宿主中の遺伝子内のコード配列において低頻度に提示されるコドンである、前記工程。
【請求項１４２】
以下の工程を含む、プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変する方法：
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する工程；および、
（ｂ）工程（ａ）の核酸中のコドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同一のアミノ酸をコードする異なるコドンに置換し、それによってプロテアーゼをコードする核酸中のコドンを改変する工程。
【請求項１４３】
以下の工程を含む、プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主における前記核酸の発現を増加させる方法：
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を含む、プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸を提供する工程；および、
（ｂ）工程（ａ）の核酸中の非優先コドンまたは低優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中性的に使用されるコドンに置換し、それによって核酸を改変して発現を増加させる工程であって、前記優先コドンとは宿主細胞中の遺伝子内のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先コドンまたは低優先コドンとは前記宿主細胞中の遺伝子内のコード配列において低頻度に提示されるコドンである、前記工程。
【請求項１４４】
以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸のコドンを改変して宿主細胞における前記核酸の発現を減少させる方法：
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を含む、プロテアーゼポリペプチドをコードする核酸を提供する工程；および、
（ｂ）工程（ａ）の核酸中の少なくとも一つの優先コドンを同定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドンまたは低優先コドンに置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞でのその発現を減少させる工程であって、前記優先コドンとは宿主細胞中の遺伝子内のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先コドンまたは低優先コドンとは前記宿主細胞中の遺伝子内のコード配列において低頻度に提示されるコドンである、前記工程。
【請求項１４５】
宿主細胞が細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である、請求項１４４記載の方法。
【請求項１４６】
以下の工程を含む、複数の改変プロテアーゼ活性部位または基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する方法であって、前記改変プロテアーゼ活性部位または基質結合部位が第１の活性部位または第１の基質結合部位をコードする配列を含む第１の核酸に由来する前記方法：
（ａ）第１の活性部位または第１の基質結合部位をコードする第１の核酸を提供する工程であって、前記第１の核酸の配列が、配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248または配列番号:254に示される配列またはその部分配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記核酸がプロテアーゼ活性部位またはプロテアーゼ基質結合部位をコードする、前記工程；
（ｂ）前記第１の核酸中の複数の標的コドンにおいて天然のアミノ酸変種をコードする、変異性オリゴヌクレオチドの組を提供する工程；および、
（ｃ）前記変異性オリゴヌクレオチドの組を用いて、変異させた各アミノ酸コドンにおいて一群のアミノ酸変種をコードする、一組の活性部位コード変種核酸または結合部位コード変種核酸を生成する工程。
【請求項１４７】
工程（ａ）の第１の核酸を、最適化定方向進化システム、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、または合成連結再アッセンブリ(SLR)を含む方法によって変異させることを含む、請求項１４５記載の方法。
【請求項１４８】
変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指向変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成連結再アッセンブリ(SLR)またはそれらの組合せを含む方法によって、工程（ａ）の第１の核酸または変種に変異導入することを含む請求項１４５記載の方法。
【請求項１４９】
組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ付加二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成、またはそれらの組合せを含む方法によって工程（ａ）の第１の核酸または変種に変異導入することを含む請求項１４５記載の方法。
【請求項１５０】
以下の工程を含む、小分子を作製する方法：
（ａ）小分子を合成または改変できる複数の生合成酵素を提供する工程であって、前記酵素の一つが請求項１または請求項２４記載の配列を含む核酸によってコードされるプロテアーゼ酵素を含む、前記工程；
（ｂ）工程（ａ）の酵素の少なくとも一つに対する基質を提供する工程；および
（ｃ）複数の生体触媒反応を容易にする条件下で工程（ｂ）の基質を前記酵素と反応させ、一連の生体触媒反応によって小分子を生成させる工程。
【請求項１５１】
以下の工程を含む小分子を改変する方法：
（ａ）プロテアーゼ酵素を提供する工程であって、前記酵素は請求項６４記載のポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸配列を含む核酸によってコードされるポリペプチドを含む酵素である、前記工程；
（ｂ）小分子を提供する工程；
（ｃ）工程（ａ）の酵素を、前記プロテアーゼ酵素によって触媒される酵素反応を容易にする条件下で、工程（ｂ）の小分子と反応させる工程。
【請求項１５２】
工程（ａ）の酵素に対する複数の小分子基質を含み、それによって前記プロテアーゼ酵素によって触媒される少なくとも一つの酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作製することを含む、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５３】
酵素による複数の生体触媒反応を容易にして前記複数の酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを生成させる条件下で複数の追加の酵素を含む、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５４】
ライブラリーを試験して、前記ライブラリー中に所望の活性を示す特定の改変小分子が存在するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１５３記載の方法。
【請求項１５５】
ライブラリーを試験する工程が、更に、改変小分子の一部を所望の活性を有する特定の改変小分子の存在または非存在について試験し、前記所望の活性を有する特定の改変小分子を生成する少なくとも一つの特異的な生体触媒反応を同定することによって、ライブラリー中の複数の改変小分子の一部を生成するために使用された生体触媒反応の一つを除く全てを系統的に除去する工程を含む、請求項１５４記載の方法。
【請求項１５６】
以下の工程を含む、プロテアーゼ酵素の機能的断片を決定する方法：
（ａ）プロテアーゼ酵素を提供する工程であって、前記酵素は請求項６４記載のポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む酵素である、前記工程；
（ｂ）工程（ａ）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、残存する部分配列についてプロテアーゼ活性を試験し、それによってプロテアーゼ酵素の機能的断片を決定する工程。
【請求項１５７】
プロテアーゼ活性が、プロテアーゼ基質を提供すること、および、基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出すること、によって測定される、請求項１５６記載の方法。
【請求項１５８】
以下の工程を含む、リアルタイム代謝フラックス分析を用いた、新規な、または、改変された表現型について全細胞を操作する方法：
（ａ）細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作製する工程であって、前記遺伝的構成が細胞に請求項１または請求項２４記載の配列を含む核酸を導入することによって改変される、前記工程；
（ｂ）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生成させる工程；
（ｃ）リアルタイムで工程（ｂ）の細胞培養物を監視することにより、前記細胞の少なくとも一つの代謝パラメーターを測定する工程；および、
（ｄ）工程（ｃ）のデータを解析して、測定されたパラメーターが同様な条件下における未改変細胞の対応する測定値と異なるかどうかを決定し、それによってリアルタイム代謝フラックスを用いて細胞の操作された表現型を同定する工程。
【請求項１５９】
細胞の遺伝的構成が細胞中の配列の欠失または配列の改変、もしくは遺伝子の発現をノックアウトすることによって改変される、請求項１５８記載の方法。
【請求項１６０】
新規に操作された表現型を含む細胞を選抜することを更に含む、請求項１５８記載の方法。
【請求項１６１】
さらに、選抜した細胞を培養し、新規に操作された表現型を含む新規な細胞株を生成させることを含む、請求項１６０記載の方法。
【請求項１６２】
（i）配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドの残基１〜17、１〜18、１〜19、１〜20、１〜21、１〜22、１〜23、１〜24、１〜25、１〜26、１〜27、１〜28、１〜28、１〜30、１〜31、１〜32、１〜33、1〜34、１〜35、1〜36、1〜37、1〜38または、1〜39に示される配列、または（ii）表4に示される配列からなる単離または組換えシグナル配列。
【請求項１６３】
請求項１６２記載の配列を有するシグナルペプチド(SP)を含む少なくとも第１のドメイン、および、異種ポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも第２のドメインを含み、前記異種ポリペプチドまたはペプチドが前記シグナルペプチド(SP)と天然では連結していない、キメラポリペプチド。
【請求項１６４】
異種ポリペプチドまたはペプチドがプロテアーゼではない、請求項１６３記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６５】
異種ポリペプチドまたはペプチドがシグナルペプチド(SP)またはプロテアーゼ触媒ドメイン(CD)のアミノ末端、カルボキシル末端、または両方の末端である、請求項１６３記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６６】
キメラポリペプチドをコードする単離または組換え核酸であって、前記キメラポリペプチドは請求項１６２記載の配列を有するシグナルペプチド(SP)を含む少なくとも第１のドメイン、および、異種ポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも第２のドメインを含み、前記異種ポリペプチドまたはペプチドが前記シグナルペプチド(SP)と天然では連結していない、前記単離または組換え核酸。
【請求項１６７】
プロテアーゼのグリコシル化を含む、プロテアーゼポリペプチドの耐熱性または熱安定性を増大させる方法であって、前記ポリペプチドが請求項６０記載のポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも30個の連続するアミノ酸を含む、前記方法。
【請求項１６８】
請求項１または請求項２４記載の核酸を含むベクターを発現させることを含む、細胞で組換えプロテアーゼを過剰発現させる方法であって、過剰発現が高活性プロモーター、二シストロン性ベクター、またはベクターの遺伝子増幅によって行われる、前記方法。
【請求項１６９】
以下の工程を含むトランスジェニック植物の作製方法：
（ａ）請求項１または請求項２４記載の配列を含む異種核酸配列を細胞に導入し、それにより形質転換植物細胞を生成する工程；
（ｂ）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を生成する工程。
【請求項１７０】
工程（ａ）が更に、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションによって異種核酸を導入することを含む、請求項１６９記載の方法。
【請求項１７１】
工程（ａ）が更に、DNA粒子ボンバードメントまたはアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主によって異種核酸を植物組織に直接導入することを含む、請求項１６９記載の方法。
【請求項１７２】
以下の工程を含む、植物細胞中で異種核酸配列を発現させる方法：
（ａ）プロモーターに機能可能に結合した異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程であって、前記異種核酸配列が請求項１または請求項２４記載の配列を含む、前記工程；
（ｂ）前記植物細胞中で前記異種核酸配列が発現する条件下で植物を生育させる工程。
【請求項１７３】
以下の工程を含む、タンパク質含有組成物を加水分解、細分または破壊する方法：
（a）請求項６４記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１若しくは請求項２４記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）タンパク質を含む組成物を提供する工程；および
（c）前記プロテアーゼが前記タンパク質含有組成物を加水分解、細分または破壊する条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程。
【請求項１７４】
前記組成物が、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞を含む請求項173記載の方法。
【請求項１７５】
以下の工程を含む、組成物からタンパク質を液化または除去する方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）タンパク質を含む組成物を提供する工程；
（c）前記プロテアーゼが前記タンパク質を除去または液化する条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程。
【請求項１７６】
請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む洗剤組成物であって、前記ポリペプチドがプロテアーゼ活性を有する、前記洗剤組成物。
【請求項１７７】
プロテアーゼが、非界面活性プロテアーゼまたは界面活性プロテアーゼである、請求項176記載の洗剤組成物。
【請求項１７８】
プロテアーゼが、非水性液状組成物、鋳造固形物、顆粒形態、粒状形態、打錠剤、ゲル状形態、ペーストまたはスラリー状形態として製剤化される請求項176の洗剤組成物。
【請求項１７９】
以下の工程を含む物体の洗浄方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；
（b）物体を提供する工程；および
（c）前記組成物が前記物体を洗浄することができる条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の物体と接触させる工程。
【請求項１８０】
請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む布地または繊維製品。
【請求項１８１】
布地または繊維製品がセルロース含有繊維を含む請求項180記載の方法。
【請求項１８２】
以下の工程を含む、組成物からタンパク質の汚れを除去する方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；
（b）タンパク質の汚れを有する組成物を提供する工程；および
（c）前記プロテアーゼが前記汚れを除去することができる条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程。
【請求項１８３】
以下の工程を含む、繊維製品の仕上がりを改善する方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；
（b）繊維製品を提供する工程；および
（c）前記ポリペプチドが前記繊維製品を処理することができる条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の繊維製品と接触させ、それによって前記繊維製品の仕上がりを改善する工程。
【請求項１８４】
繊維製品が毛織物または絹織物である請求項183記載の方法。
【請求項１８５】
請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飼料または食物。
【請求項１８６】
以下の工程を含む、動物によって消費されるに先立って、飼料または食物中のタンパク質を加水分解する方法：
（a）請求項64記載の配列を有するか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む飼料材料を入手する工程；および、
（b）前記タンパク質が加水分解され処理済食物または飼料が生成されるために十分な量で十分な時間、工程（a）のポリペプチドを前記飼料または食物材料に加え、それによって動物が消費する前に前記食物または飼料中のタンパク質を加水分解する工程。
【請求項１８７】
食物または飼料がトウモロコシである請求項186記載の方法。
【請求項１８８】
以下の工程を含む、乳製品の質感および風味を改善する方法：
（a）プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程であって、前記プロテアーゼが請求項64記載の配列を有するか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記工程； 
（b）乳製品を提供する工程；および
（c）前記プロテアーゼが前記乳製品の質感または風味を改善することができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の乳製品を接触させる工程。
【請求項１８９】
乳製品がチーズまたはヨーグルトを含む請求項188記載の方法。
【請求項１９０】
請求項64記載の配列を有するか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む乳製品。
【請求項１９１】
以下の工程を含む、肉または魚をやわらかくする方法：
（a）プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを提供する工程であって、前記プロテアーゼが請求項64記載の配列を有するか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、；
（b）肉または魚を含む組成物を提供する工程；および
（c）前記ポリペプチドが前記肉または魚をやわらかくすることができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の組成物を接触させる工程。
【請求項１９２】
以下の工程を含む、油に富む植物材料から油の抽出を促進する方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）油に富む植物材料を提供する工程；および
（c）プロテアーゼ活性を有する前記ポリペプチドがペプチド結合の加水分解を触媒することができる条件下で、工程（a）のポリペプチドおよび前記油に富む植物材料を接触させる工程。
【請求項１９３】
油に富む植物材料が油に富む種子を含む、請求項220記載の方法。
【請求項１９４】
前記油がダイズ油、オリーブ油、ナタネ（キャノーラ）油、またはヒマワリ油である請求項193記載の方法。
【請求項１９５】
以下の工程を含む、果実もしくは野菜ジュース、シロップ、ピューレまたは抽出物の調製方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）果実または野菜材料を含む組成物または液体を提供する工程；および
（c）工程（a）のポリペプチドおよび前記組成物を接触させ、それによって前記果実もしくは野菜ジュース、シロップ、ピューレまたは抽出物を調製する工程。
【請求項１９６】
請求項64記載のプロテアーゼまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む紙もしくは紙製品または紙パルプ。
【請求項１９７】
以下の工程を含む、紙または紙もしくは木材パルプを処理する方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）紙または紙もしくは木材パルプを含む組成物を提供する工程；および
（c）前記プロテアーゼが紙または紙もしくは木材パルプを処理することができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の組成物を接触させる工程。
【請求項１９８】
請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１９９】
消化補助または局所皮膚保護として機能する、請求項198記載の医薬組成物。
【請求項２００】
請求項199記載の組成物を局所適用することを含む表皮剥離の不均衡を治療する方法。
【請求項２０１】
治療が予防的である請求項199記載の方法。
【請求項２０２】
請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む口腔ケア製品。
【請求項２０３】
前記製品が練り歯磨き、歯磨きクリーム、ゲルもしくは歯磨き粉、オドンティック、口腔洗浄液、歯磨き前後のリンス剤、チューインガム、ロゼンジまたはキャンディーを含む、請求項202記載の口腔ケア製品。
【請求項２０４】
請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含むコンタクトレンズ洗浄組成物。
【請求項２０５】
以下の工程を含む、動物の固体廃棄物または液体廃棄物を処理する方法：
（a）請求項64記載のポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；
（b）動物の固体廃棄物または液体廃棄物を提供する工程；および
（c）前記プロテアーゼが前記廃棄物を処理できる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の固体廃棄物または液体廃棄物を接触させる工程。
【請求項２０６】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む廃棄物の加工生成物であって、前記ポリペプチドが請求項64記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記廃棄物の加工生成物。
【請求項２０７】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む毛球治療薬であって、前記ポリペプチドが請求項64記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記毛球治療薬。
【請求項２０８】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む毛球予防組成物であって、前記ポリペプチドが請求項59記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記毛球予防組成物。
【請求項２０９】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む血液または有機的シミ除去剤であって、前記ポリペプチドが請求項64記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記血液または有機性シミ除去剤。
【請求項２１０】
以下の工程を含む、固体または液体の消毒方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；
（b）消毒されるべき固体または液体を提供する工程；および
（c）前記プロテアーゼが前記固体または液体を消毒することができる条件下で工程（a）の組成物および工程（b）の固体または液体を接触させる工程。
【請求項２１１】
工程（a）の組成物がスプレーまたは液体として製剤化される請求項210記載の方法。
【請求項２１２】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む抗菌、抗ウイルスまたは抗芽胞剤であって、前記ポリペプチドが請求項64記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記抗菌、抗ウイルスまたは抗芽胞剤。
【請求項２１３】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む消毒剤であって、前記ポリペプチドが請求項64記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記消毒剤。
【請求項２１４】
以下の工程を含む、組織を解離させる方法：
（a）請求項64記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドまたは請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；
（b）工程（a）の組成物を解離されるべき組織と接触させる工程。
【請求項２１５】
組織が創傷である、請求項214記載の方法。
【請求項２１６】
工程（b）の接触が、圧迫潰瘍、脚部潰瘍、火傷、足の糖尿病性潰瘍、瘢痕、IV固定、手術創または小さな傷の治療のための創傷洗浄、創傷床調製に使用される請求項214記載の方法。
【請求項２１７】
プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを含む医療用包帯であって、前記ポリペプチドが請求項64記載の配列を含むか、または請求項１もしくは請求項24記載の核酸によってコードされる、前記医療用包帯。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子および細胞生物学並びに生化学に関する。特に、本発明はプロテアーゼ酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを製造および使用する方法に関する。本発明のポリペプチドは、種々の診断、治療および工業関係で使用することができる。本発明のポリペプチドは、例えば洗剤用、食品の加工用および逆反応を利用する化学合成用添加剤として用いることができる。さらにまた、本発明のポリペプチドは、食品の加工、醸造、浴添加剤、アルコール製造、ペプチド合成、鏡像選択性、皮革工業における皮革の製造、廃棄物処理および動物の分解、写真工業における銀の回収、医療、絹の脱ガム、バイオフィルムの減成、バイオマスのエタノールへの変換、生体防御、抗菌剤および消毒剤、身だしなみ用品および化粧品、バイオテク試薬、トウモロコシ湿潤混練りのでん粉収量の増加、並びに医薬（例えば消化促進剤および抗炎症（抗催炎）剤）で用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、工業、研究および医薬品において広い範囲で利用される。酵素の利用により、工業的プロセスは低温および低圧で実施することができ、さらに腐食性または有毒な物質を使用する必要性を減少させることができる。したがって酵素の使用は、非酵素生成物およびプロセスと比較して製造コスト、エネルギー消費および汚染を減少させることができる。重要な酵素群はプロテアーゼである。プロテアーゼはカルボニルヒドラーゼで、前記は一般的にはタンパク質またはペプチドのペプチド結合の切断で機能する。タンパク分解酵素はいたるところに存在し、全ての生物で見出され、細胞増殖および分化に必須である。細胞外プロテアーゼは商品価値を有し、種々の工業分野で多くの用途を有する。プロテアーゼの工業的用途には、食品加工、醸造、アルコール製造、ペプチド合成、鏡像選択性、皮革工業における皮革製造、廃棄物処理および動物の分解、写真工業における銀回収、医療、絹の脱ガム、バイオフィルムの減成、バイオマスのエタノールへの変換、生体防御、抗菌剤および消毒剤、身だしなみ用品および化粧品、バイオテク試薬、およびトウモロコシ湿潤混練りのでん粉収量の増加が含まれる。さらにまた、プロテアーゼは洗濯洗剤および他の製品の重要な成分である。生物学的研究では、プロテアーゼは所望されないタンパク質の分解のために精製プロセスで用いられる。特異性の少ないプロテアーゼまたはより特異性の高いプロテアーゼの混合物を用いることが、必要な分解度を得るためにしばしば所望される。
【０００３】
プロテアーゼはそれらの触媒メカニズムにしたがって分類される。IUBMB（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）は以下の４クラスのメカニズムを認定している：（1）セリンプロテアーゼ；（2）システインプロテアーゼ；（3）アスパラギンプロテアーゼ；および（4）メタロプロテアーゼ。さらにまた、IUBMBは、未知の触媒メカニズムをもつエンドペプチダーゼ（オリゴペプチダーゼ）クラスも認定している。触媒タイプによる分類は、プロテアーゼの進化的関係に基づくファミリーによる分類によって拡張すべきであると提唱されている（例えば以下を参照されたい：N.D. Rawlings & A.J. Barett, (1993) Biochem. J. 290:205-218）。セリンプロテアーゼはアルカリ性の最適pHを有し、メタロプロテアーゼは中性付近で最適活性を有し、さらにシステインおよびアスパラギン酵素は酸性の最適pHを有する（Biotechnology Handbooks. Bacilluis. vol. 2. ed. Harwood, 1989 Plenum Press, New York）。アスパラギンプロテアーゼは細菌では稀で、今日まで病原菌では全く報告されていない。他方、メタロプロテアーゼはほとんどの病原菌で共通の特徴であるようにみえる。したがって、基本的な2種類の細菌プロテアーゼはセリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼである。
【０００４】
セリンプロテアーゼは、セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸の三残基触媒を特徴とする。前記プロテアーゼには広範囲の特異性および生物学的機能を有する多様な酵素クラスが含まれる。セリンプロテアーゼクラスは2つの別個のファミリー、キモトリプシンファミリーおよびスブチリシンファミリーを含む。前者には哺乳動物の酵素（例えばキモトリプシン、トリプシン、エラスターゼまたはカリクレイン）が含まれ、スブチリシンファミリーには細菌酵素（例えばスブチリシン）が含まれる。一般的な3D構造は2つのファミリーで異なるが、それらは活性部位で同じ幾何学的構造を有し、同じメカニズムにより触媒反応が進行する。例えば、セリンプロテアーゼスブチリシンは洗濯洗剤として使用され、タンパク質性の汚れの除去を促進する（例えば以下を参照されたい：Crabb, ACS Symposium Series 460:82-94, 1991）。食品加工工業では、セリンプロテアーゼは魚および家畜由来のタンパク質富裕濃縮物の製造および乳製品の調製に用いられる（Kida et al., Jounal of Fermentation and Bioengineering 80:478-484, 1995; Haard & Simpson, in A.M. Martin, ed., Fisheries Procesing: Biotechnological Aplications, Chapman and Hall, London, 1994, 132-154; Bos et al., European Patent Office Publication 494,149A1）。
【０００５】
メタロプロテアーゼ（MP）およびセリンプロテアーゼはもっとも多様なプロテアーゼ触媒タイプを構成する。前記は細菌、真菌の他に高等生物でも見出される。前記は配列および構造が大きく異なるが、大半の酵素は触媒活性を有する亜鉛原子を含んでいる。いくつかの事例では、活性の低下を生じさせずに亜鉛を別の原子（例えばコバルトまたはニッケル）に置き換えることができる。前記の触媒メカニズムによって、切れやすい構造をもつカルボニル基上の亜鉛結合水分子の攻撃後に非共有結合性正四面体構造が形成される。この中間体はさらにグルタミン酸部分の脱離基への移転によって分解される。
一般的には、酵素（プロテアーゼを含む）は狭い範囲の環境条件（温度、pHなど）下で活性を有し、さらに多くは特定の基質に対し高度に特異的である。ある酵素の活性の範囲が狭いことによって、その応用性が限定され、（a）類似の活性をもつが別個の条件下で活性を示す酵素、または（ｂ）異なる基質を有する酵素を選択する必要性が生じる。例えば、50℃で反応を触媒することができる酵素は35℃では効率が悪く低温での使用は適切ではないであろう。前記の理由から、洗濯洗剤は、広範囲の洗浄温度およびpHで使用できるように一般的にはタンパク質分解酵素の選別を含む。タンパク質分解酵素の特異性および工業、研究および医薬におけるプロテアーゼの使用の増大という観点から、当業界には新規な酵素および新規な酵素阻害剤に対する要望が存在する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、本発明の例示的な核酸、例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254と少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500またはそれ以上の残基にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有し、プロテアーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離または組換え核酸であって、前記配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される前記単離または組換え核酸を提供する。
【０００７】
本発明の例示的な核酸にはまた、配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249；配列番号:255に示される配列を有するポリペプチド、または配列番号:145によってコードされるポリペプチド、並びにその部分配列およびその変種をコードする単離または組換え核酸が含まれる。ある特徴では、前記ポリペプチドはプロテアーゼ活性を有する。
【０００８】
以下のリストは、本発明の例示的な配列のポリペプチド配列と核酸コード配列との関係のまとめである（例えば、配列番号:2は配列番号:1によってコードされ、配列番号:255は配列番号:254によってコードされる、etc）。
2006516889.tif 000003
【０００９】
ある特徴では、本発明はまた、初めて混合培養から単離された／由来するという点で共通の新規性を有するプロテアーゼおよびプロテアーゼコード核酸を提供する。本発明は、本発明の例示的な核酸、例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254と少なくとも約50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150またはそれより多くの残基にわたって、少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有する核酸配列を含む、混合培養から単離されたプロテアーゼコード核酸を提供する。
【００１０】
ある特徴では、本発明はまた、下記に示されるように、初めて共通の源、例えばアルケア（古細菌）源、細菌源、真菌源（例えば糸状子嚢菌類、例えばコクリオボルス・ヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus）、例えばC. heterostrophus C4株、ATCCアクセッション番号48331）または環境源（例えば混合環境源）から由来するという点で共通の新規性を有するプロテアーゼおよびプロテアーゼコード核酸を提供する。
配列番号        由来源
1, 2            アルケア
17, 18          アルケア
63, 64          アルケア
15, 16          細菌
13, 14          細菌
5, 6            細菌
3, 4            細菌
57, 58          細菌
7, 8            細菌
187, 188        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
210, 211        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
234, 235        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
164, 165        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
199, 200        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
229, 230        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
158, 159        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
193, 194        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
222, 223        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
179, 180        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
218, 219        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
150, 151        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
171, 172        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
204, 205        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
254, 255        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
248, 249        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
241, 242        コクリオボルス・ヘテロストロフスC4株（ATCC483331）
85, 86          環境源
11, 12          環境源
121, 122        環境源
117, 118        環境源
119, 120        環境源
83, 84          環境源
9, 10           環境源
93, 94          環境源
101, 102        環境源
127, 128        環境源
129, 130        環境源
139, 140        環境源
146, 147        環境源
33, 34          環境源
113, 114        環境源
39, 40          環境源
71, 72          環境源
133, 134        環境源
45, 46          環境源
77, 78          環境源
19, 20          環境源
59, 60          環境源
41, 42          環境源
111, 112        環境源
123, 124        環境源
125, 126        環境源
107, 108        環境源
109, 110        環境源
79, 80          環境源
23, 24          環境源
27, 28          環境源
143, 144        環境源
69, 70          環境源
141, 142        環境源
55, 56          環境源
61, 62          環境源
73, 74          環境源
87, 88          環境源
37, 38          環境源
47, 48          環境源
51, 52          環境源
65, 66          環境源
29, 30          環境源
67, 68          環境源
25, 26          環境源
75, 76          環境源
81, 82          環境源
31, 32          環境源
35, 36          環境源
43, 44          環境源
49, 50          環境源
137, 138        環境源
131, 132        環境源
95, 96          環境源
103, 104        環境源
135, 136        環境源
145             環境源
105, 106        環境源
99, 100         環境源
97, 98          環境源
89, 90          環境源
91, 92          環境源
21, 22          環境源
115, 116        環境源
53, 54          環境源
【００１１】
例えば（上記リストを参照して）、配列番号:2（配列番号:1によってコードされる）、配列番号:18（配列番号:17によってコードされる）、配列番号:64（配列番号:63によってコードされる）および配列番号:16（配列番号:15によってコードされる）に示されるプロテアーゼ、およびプロテアーゼコード核酸は、それらがアルケア源などから得られたという点で共通の新規性を有する（ポリペプチドおよび核酸はまず初めに細菌、真菌（コクリオボルス・ヘテロストロフス）または環境源から得られた）。
ある特徴では、本発明は、初めて環境源（例えば混合環境源）から単離／誘導されたプロテアーゼおよびプロテアーゼコード核酸を提供し、前記核酸は、本発明の核酸と少なくとも約50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200またはそれより多くの残基領域にわたって少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有する核酸を含み、前記核酸はプロテアーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードし、さらに前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される。
【００１２】
糸状子嚢菌類コクリオボルス・ヘテロストロフスから初めて由来するという共通の新規性をもつ本発明のプロテアーゼおよびプロテアーゼコード核酸に関しては、ある特徴では、これらポリペプチドおよび核酸は、まず初めにニワトリの飼料またはトウモロコシ繊維（前記は唯一の窒素源であった）でコクリオボルスを増殖させることによって単離された。培養液の上清を濃縮し、ゲル上で泳動した。ゲルバンドから単離して得られたタンパク質を質量分析によって分析した。これらのタンパク質の配列を決定し、コクリオボルスのゲノム配列と比較した。コクリオボルス・ヘテロストロフスから初めて単離された本発明のプロテアーゼおよびプロテアーゼコード核酸は下記にまとめられている：
2006516889.tif 000004
【００１３】
ある特徴では、配列比較アルゴリズムはBLASTバージョン2.2.2アルゴリズムであり、フィルタリング設定はblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、他の全てのオプションは規定値である。
本発明のまた別の特徴は、本発明の核酸配列、前記と実質的に同一の配列および前記と相補的な配列の少なくとも10の連続する塩基を含む単離または組換え核酸である。
ある特徴では、本発明のプロテアーゼ活性はペプチド結合の加水分解の触媒を含む。“プロテアーゼ活性”という用語は任意のペプチド結合の加水分解を含み、プロテアーゼ活性、ペプチダーゼ活性および／またはプロテイナーゼ活性が含まれる。プロテアーゼ活性はエンドプロテアーゼ活性および／またはエキソプロテアーゼ活性を含む得る。プロテアーゼ活性はカルボキシペプチダーゼ活性、アミノペプチダーゼ活性、セリンプロテアーゼ活性、メタロプロテアーゼ活性（例えばマトリックスメタロプロテアーゼまたはコラゲナーゼ活性）、システインプロテアーゼ活性および／またはアスパラギンプロテアーゼ活性を含むことができる。ある特徴では、プロテアーゼ活性は、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインおよび／またはスブチリシン活性と同じまたは類似の活性を含み得る。プロテアーゼ活性はペプチダーゼ活性、例えばジペプチジルペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性を含み得る。また別の特徴では、プロテアーゼ活性は、アクロシルインドロペプシン活性、アクロシン活性、アクチニデイン活性、アシルアミノアシルペプチダーゼ活性、ADAM17エンドペプチダーゼ活性、ADAM10エンドペプチダーゼ活性、アダマリシン活性、ADAMTS-4エンドペプチダーゼ活性、アデネイン活性、エーロモノリシン活性、アラニンカルボキシペプチダーゼ活性、アルファ-溶解エンドペプチダーゼ活性、代替補体経路C3/C5コンバターゼ活性、アミノペプチダーゼB活性、アミノペプチダーゼEy活性、アミノペプチダーゼI活性、アナネイン活性、アントラックス致死因子エンドペプチダーゼ活性、アスクレパイン活性、アスパルチルアミノペプチダーゼ活性、アスペルギロペプシンI活性、アスペルギロペプシンII活性、アッセンブリン活性、アスタシン活性、アトロリシンA活性、アトロリシンB活性、アトロリシンC活性、アトロリシンE活性、アトロリシンF活性、アトロキサーゼ活性、オーレオリシン活性、バシロリシン活性、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ活性、バリヤーペプシン活性、β-Ala-Hisジペプチダーゼ活性、β-アスパルチルペプチダーゼ活性、ベータ溶解性メタロエンドペプチダーゼ活性、ブレオマイシンヒドラーゼ活性、ボントキシリシン活性、ボンスロリシン活性、ボンスロパシン活性、ブラキウリン活性、カルパイン-1活性、カルパイン-2活性、癌プロコアグラント活性、カンジダペプシン活性、カルボキシペプチダーゼA活性、カルボキシペプチダーゼA2活性、カルボキシペプチダーゼB活性、カルボキシペプチダーゼC活性、カルボキシペプチダーゼD活性、カルボキシペプチダーゼH活性、カルボキシペプチダーゼM活性、カルボキシペプチダーゼT活性、カルボキシペプチダーゼU活性、カリカイン活性、カスパーゼ-1活性、カテプシンB活性、カテプシンD活性、カテプシンE活性、カテプシンF活性、カテプシンG活性、カテプシンH活性、カテプシンK活性、カテプシンL活性、カテプシンO活性、カテプシンS活性、カテプシンT活性、カテプシンV活性、セレビシン活性、コリオリシンH活性、コリオリシンL活性、キマーゼ活性、キモパパイン活性、キモシン活性、キモトリプシン活性（例えばキモトリプシンC活性）、古典的補体経路C3/C5コンバターゼ活性、クロストリジウムアミノペプチダーゼ活性、クロストリパイン活性、凝固第IXa因子活性、凝固第VIIa因子活性、凝固第Xa因子活性、凝固第XIa因子活性、凝固第XIIa因子活性、コッコリシン活性、補体成分C1r活性、補体成分C1s活性、補体因子D活性、補体因子I活性、クルジパイン活性、ククミシン活性、システイン型カルボキシペプチダーゼ活性、シスチニルアミノペプチダーゼ活性、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、サイトゾル非特異的ジペプチダーゼ活性、ダクチリシン活性、デューテロリシン活性、ジペプチダーゼE活性、ジペプチジル-ジペプチダーゼ活性、ジペプチジル-ジペプチダーゼI活性、ジペプチジル-ジペプチダーゼII活性、ジペプチジル-ジペプチダーゼIII活性、ジペプチジル-ジペプチダーゼIV活性、D-立体特異的アミノペプチダーゼ活性、エンドペプチダーゼC1p活性、エンドペプチダーゼLa活性、エンドペプチダーゼSo活性、エンドテリン-変換酵素1活性、エンドチアペプシン活性、エンテロペプチダーゼ活性、エンベリシン活性、フィブロラーゼ活性、フィカイン活性、フラバスタシン活性、フラビリン活性、フラジリシン活性、果実ブロメライン活性、フリン活性、ガメトリシン活性、ガンマ-D-グルタミル-メゾ-ジアミノピメレートペプチダーゼI活性、ガンマ-グルタミルヒドロラーゼ活性、ガンマ-レニン活性、ガストリシン活性、ゼラチナーゼA活性、ゼラチナーゼB活性、ジンジパインK活性、ジンジパインR活性、Glu-Gluジペプチダーゼ活性、グルタメートカルボキシペプチダーゼII活性、グルタメートカルボキシペプチダーゼ活性、グルタミルアミノペプチダーゼ活性、グルタミルエンドペプチダーゼII活性、グルタミルエンドペプチダーゼ活性、グリシルエンドペプチダーゼ活性、Gly-Xカルボキシペプチダーゼ活性、GPRエンドペプチダーゼ活性、グランザイムA活性、グランザイムB活性、ヘルパー成分プロテイナーゼ活性、ヘパシビリン活性、ヒストリサイン活性、HIV-1レトロペプシン活性、HIV-2レトロペプシン活性、ホーリリシン活性、ヒポデルミンC活性、IgA-特異的メタロエンドペプチダーゼ活性、IgA-特異的セリンエンドペプチダーゼ活性、インスリシン活性、間質コラゲナーゼ活性、ジャララジン活性、ケクシン活性、ラクトセピン活性、レグマイン活性、リーシュマノリシン活性、ロイコリシン活性、ロイシルアミノペプチダーゼ活性、ロイシルエンドペプチダーゼ活性、白血球エラスターゼ活性、リムルス凝血酵素活性、リムルス凝血因子B活性、リムルス凝血因子C活性、L-ペプチダーゼ活性、リジン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ活性、リソゾームPro-Xカルボキシペプチダーゼ活性、リソスタフィン活性、リシルアミノペプチダーゼ活性、リシルエンドペプチダーゼ活性、マクロファージエラスターゼ活性、マグノリシン活性、マトリリシン活性、メマプシン1、メマプシン2、膜アラニンアミノペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ、膜Pro-Xカルボキシダーゼ、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ-1、メプリンA、メプリンB、メタロカルボキシペプチダーゼ活性D、メチオニルアミノペプチダーゼ、メトリジン、Met-Xaaジペプチダーゼ、細菌コラゲナーゼ、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、ミトコンドリアプロセッシングペプチダーゼ、ムコロペプシン、ムクロリシン、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、ムコリシン、ミエロブラスチン、ナルジリシン、ネオペンテシン、ネプリリシン、ノイロリシン、好中球コラゲナーゼ、N-ホルミルメチオニル-ペプチダーゼ、ノダウイルスエンドペプチダーゼ、非立体特異的ジペプチダーゼ、核-封入-エンドペプチダーゼ、オリゴペプチダーゼA、オリゴペプチダーゼB、オムプチン、オフィオリシン、オリジン、O-シアログリコプロテインエンドペプチダーゼ、膵エラスターゼII、膵エラスターゼ、膵エンドペプチダーゼE、パパイン、パッパリシン-1、ペニシロペプシン、PepBアミノペプチダーゼ、ペプシンA、ペプシンB、ペプチジル-Aspメタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル-ジペプチダーゼA、ペプチジル-ジペプチダーゼB、ペプチジル-ジペプチダーゼDcp、ペプチジル-グリシンアミダーゼ、ペプチジル-Lysメタロエンドペプチダーゼ、フィテプシン、ピコルナイン2A、ピコルナイン3C、ピトリリシン、血漿カリクレイン、プラズメプシンI、プラズメプシンII、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーターPla、ポリプロペプシン、プレピリンペプチダーゼ、プロコラーゲンC-エンドペプチダーゼ、プロコラーゲンN-エンドペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、プロリルオリゴペプチダーゼ、プロ-オピオメラノコルチン変換酵素、プロプロテインコンバーターゼ1、プロプロテインコンバターゼ2、プロテアソームエンドペプチダーゼ複合体、プロテインC（活性化）、プロテイナーゼK、シュードリシン、ピクノポロペプシン、ピログルタミル-ペプチダーゼI、ピログルタミル-ペプチダーゼII、レニン、リプレッサlexA、リゾプスペプシン、ロドトルラペプシン、ルベルリシン、ラッセルリシン、S2Pエンドペプチダーゼ、サッカロリシン、サッカロペプシン、ステラリン、シタリドペプシンA活性、シタリドペプシンB、セメノゲラーゼ、セパラーゼ、セリン型D-Ala-D-Alaカルボキシペプチダーゼ、セラリシン、シグナルペプチダーゼI、シグナルペプチダーゼII、蛇毒因子Vアクチベーター、スナパリシン、スパーモシン、スタフォパイン、Ste24エンドペプチダーゼ、ステムブロメライン、ストレプトグリシンA、ストレプトグリシンB、ストレプトパイン、ストロメリシン1、ストロメリシン2、スブチリシン、テントキシリシン、テルミターゼ、テルモリシン、テルモミコリン、テルモプシン、耐熱性カルボキシダーゼ1、シメット（Thimet）オリゴペプチダーゼ、トロンビン活性、組織カリクレイン活性、トガヴィリン活性、T-プラスミノーゲンアクチベーター活性、トリミアリシンI活性、トリミアリシンII活性、トリペプチドアミノペプチダーゼ活性、トリペプチジル-ペプチダーゼI活性、トリペプチジル-ペプチダーゼII活性、トリプシン活性、トリプターゼ活性、トリプトファニルアミノペプチダーゼ活性、ツブリニル-Tyrカルボキシペプチダーゼ活性、ユビキチニルヒドロラーゼ1活性、U-プラスミノーゲンアクチベーター活性、V-cathエンドペプチダーゼ活性、ヴェノンビンA活性、ヴェノンビンAB活性、Xaa-Argジペプチダーゼ活性、Xaa-Hisジペプチダーゼ活性、Xaa-メチル-Hisジペプチダーゼ活性、Xaa-Proアミノペプチダーゼ活性、Xaa-Proジペプチダーゼ活性、Xaa-Proジペチジル-ペプチダーゼ活性、Xaa-Trpアミノペプチダーゼ活性、ヤプシン1活性、亜鉛D-Ala-D-Alaカルボキシペプチダーゼ活性��たはその組合せを含むことができる。
【００１４】
本発明の例示的なポリペプチド（例えば上記リスト）のいくつかのまた別の活性は、実験的データによって、他の配列との相同性（配列比較）によって、または配列比較と実験結果の両方によって決定された。しかしながら本発明の典型的な種または典型的な配列によるポリペプチドの属はいずれの特定のプロテアーゼ活性にも限定されない。したがって、また別には（ただしそれらに限定されないが）、配列番号:2に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:1によってコードされる）はアルカリプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:4に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:3によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:6に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:5によってコードされる）はペプチダーゼ活性を有することができ；配列番号:22に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:21によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:26に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:25によってコードされる）はスブチリシン様分泌プロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:28に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:27によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えばアルカリセリンプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:36に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:35によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えばアルカリセリンプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:38に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:37によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:42に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:41によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えば細胞外アルカリセリンプロテアーゼ2活性）を有することができ；配列番号:50に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:49によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えばアルカリセリンプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:58に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:57によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:68に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:67によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えばアルカリセリンプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:74に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:73によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えばアルカリセリンプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:76に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:75によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えば低温活性セリンアルカリプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:82に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:81によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:86に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:85によってコードされる）はプロテアーゼII活性を有することができ；配列番号:90に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:89によってコードされる）はセリンメタロプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:92に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:91によってコードされる）はメタロプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:96に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:95によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性（例えば低温活性セリンアルカリプロテアーゼ活性）を有することができ；配列番号:98に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:97によってコードされる）はペプチダーゼ活性を有することができ；配列番号:100に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:99によってコードされる）はプロホルモンコンバターゼ活性を有することができ；配列番号:106に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:105によってコードされる）はコラゲナーゼ活性を有することができ；配列番号:112に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:111によってコードされる）はアルカリセリンプロテアーゼII活性を有することができ；配列番号:114に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:113によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:120に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:119によってコードされる）はスブチリシン様プロテイナーゼ活性を有することができ；配列番号:128に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:127によってコードされる）はセリンプロテイナーゼ活性（例えばセリンプロテアーゼA活性）を有することができ；配列番号:134に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:133によってコードされる）はロイシンアミノペプチダーゼ活性を有することができ；配列番号:136に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:135によってコードされる）はコラゲナーゼ活性を有することができ；配列番号:142に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:141によってコードされる）は中性プロテイナーゼ活性を有することができ；配列番号:146に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:147によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:151示される配列を有するポリペプチド（配列番号:150によってコードされる）はメタロプロテイナーゼ活性またはアスパルチルプロテイナーゼ（アスパルチルプロテアーゼ）を有することができ；配列番号:159に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:158によってコードされる）はメタロプロテイナーゼ活性またはカルボキシペプチダーゼ活性（例えばセリン型カルボキシペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:165に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:164によってコードされる）はペプチダーゼ活性、例えばアミノペプチダーゼ活性（例えばロイシンアミノペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:172に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:171によってコードされる）はペプチダーゼまたはCaaXプレニルプロテアーゼ活性（例えばCaaXプロセッシング活性）を有することができ；配列番号:180に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:179によってコードされる）はカルボキシペプチダーゼ活性（例えば亜鉛カルボキシペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:188に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:187によってコードされる）はセリンプロテアーゼ活性またはスブチラーゼ様活性を有することができ；配列番号:194に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:193によってコードされる）はメタロプロテイナーゼ活性またはペプチダーゼ活性（例えばアミノペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:200に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:199によってコードされる）はカルボキシペプチダーゼ活性（例えばカルボキシペプチダーゼA活性または亜鉛カルボキシペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:205に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:204によってコードされる）はカルボキシペプチダーゼ活性（例えば亜鉛カルボキシペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:211に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:210によってコードされる）はカルボキシペプチダーゼ活性（例えばカルボキシペプチダーゼS1活性またはセリンカルボキシペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:218に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:219によってコードされる）は亜鉛カルボキシペプチダーゼ活性を有することができ；配列番号:223に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:222によってコードされる）はペプチダーゼ活性を有することができ；配列番号:230に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:229によってコードされる）はアルカリ性もしくはセリンプロテイナーゼ活性またはスブチラーゼ活性を有することができ；配列番号:235に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:234によってコードされる）はメタロプロテイナーゼ活性またはアシルアミノアシルペプチダーゼ活性（例えばカルボキシペプチダーゼS1活性）を有することができ；配列番号:242に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:241によってコードされる）はカルボキシペプチダーゼ活性（例えば亜鉛カルボキシペプチダーゼ活性）を有することができ；配列番号:248に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:249によってコードされる）はアスパルチルプロテアーゼ活性を有することができ；配列番号:255に示される配列を有するポリペプチド（配列番号:254によってコードされる）はメタロプロテイナーゼ活性またはカルボキシペプチダーゼ活性（例えばセリン型カルボキシペプチダーゼ活性）を有することができる。本発明のいずれのポリペプチドも（上記に挙げた典型的な活性を有するポリペプチドを含む）、前記酵素の酵素として活性な形態を生じるためにプロセッシングを必要とすることができる（例えばプレプロ形のプロセッシング、リン酸化、プレニル化、二量体化など）。
【００１５】
ある特徴では、本単離または組換え核酸は、熱安定性のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、約37℃から約95℃；約55℃から約85℃；約70℃から約95℃；または約90℃から約95℃の温度範囲を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持することができる。
別の特徴では、本単離または組換え核酸は、耐熱性のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは、37℃以上から約95℃の範囲の温度または55℃以上から約85℃の範囲のいずれかの温度に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。前記ポリペプチドは、約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約75℃；または約90℃から約95℃またはそれを超える範囲の温度に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、pH4.5で90℃以上から約95℃の範囲の温度に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。
【００１６】
本発明は、配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254、またはその断片もしくは部分配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離または組換え核酸を提供する。ある特徴では、前記核酸はプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする。前記核酸は、長さが少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200またはそれ以上の残基であるか、または完全長の遺伝子もしくは転写物である。ある特徴では、前記ストリンジェントな条件には、0.2ＸのSSC中で約65℃で約15分の洗浄を含む洗浄工程が含まれる。
【００１７】
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブを提供する。前記プローブは、本発明の配列またはその断片もしくは部分配列を含む配列の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000またはそれ以上の連続する塩基を含み、前記プローブは結合またはハイブリダイゼーションによって前記核酸を同定する。前記プローブは、本発明の配列またはその断片もしくは部分配列を含む配列の少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、または約60から100の連続する塩基を含む。
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブを提供する。前記プローブは、本発明の核酸と少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有する、少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000またはそれより多い残基の配列を含む核酸を含み、前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される。
前記プローブは、本発明の核酸配列またはその部分配列の少なくとも約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、または約60から100の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００１８】
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅させる増幅プライマー対を提供する。前記プライマー対は、本発明の配列またはその断片もしくは部分配列を含む核酸を増幅させることができる。前記増幅プライマー配列対の１つまたは各メンバーは、前記配列の少なくとも約10から50の連続する塩基、または前記配列の12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれより多くの連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。
本発明は増幅プライマー対を提供する。前記プライマー対は、本発明の核酸の最初の（5'側の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれより多い残基によって示される配列を有する第一のメンバー、および前記第一のメンバーの相補鎖の最初の（5'側の）約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれより多い残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む。
本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いて増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR））によって生成されるプロテアーゼコード核酸を提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いて増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR））によって生成されるプロテアーゼを提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いて増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR））によってプロテアーゼを生成する方法を提供する。ある特徴では、前記増幅プライマー対は、ライブラリー、例えば遺伝子ライブラリー（例えば環境ライブラリー）から核酸を増幅させる。
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸配列またはその断片もしくは部分配列を増幅させることができる増幅プライマー配列対による鋳型核酸の増幅を含む。
【００１９】
本発明は、本発明の核酸配列またはその部分配列を含む発現カセットを提供する。ある特徴では、前記発現カセットは、プロモーターに機能的に連結された前記核酸を含むことができる。前記プロモーターはウイルスプロモーター、細菌プロモーター、哺乳動物プロモーターまたは植物プロモーターであろう。ある特徴では、前記植物プロモーターは、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、コムギ、タバコまたはオオムギのプロモーターであり得る。前記プロモーターは構成的プロモーターであろう。前記構成的プロモーターはCaMV35Sを含むことができる。別の特徴では、前記プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。ある特徴では、前記プロモーターは組織特異的プロモーターまたは環境によって調節されるプロモーターまたは発生に応じて調節されるプロモーターであり得る。したがって、前記プロモーターは例えば種子特異的、葉特異的、根特異的、茎特異的または離脱-誘導プロモーターであり得る。ある特徴では、前記発現カセットはさらに植物または植物ウイルス発現ベクターを含むことができる。
本発明は、本発明の発現カセット(例えばベクター)または本発明の核酸を含むクローニングビヒクルを提供する。前記クローニングビヒクルはウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体であろう。前記ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ付随ウイルスベクターを含むことができる。前記クローニングビヒクルは細菌の人工染色体（BAC）、プラスミド、バクテリオファージP1-由来ベクター（PAC)、酵母人工染色体（YAC）または哺乳動物人工染色体（MAC）を含むことができる。
本発明は、本発明の核酸または本発明の発現カセット（例えばベクター）または本発明のクローニングビヒクルを含む形質転換細胞を提供する。ある特徴では、前記形質転換細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞であり得る。ある特徴では、前記植物細胞はジャガイモ、コムギ、イネ、トウモロコシ、タバコまたはオオムギ細胞であり得る。
【００２０】
本発明は、本発明の核酸または本発明の発現カセット(例えばベクター)を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
本発明は、本発明の核酸または本発明の発現カセット(例えばベクター)を含むトランスジェニック植物を提供する。前記トランスジェニック植物はトウモロコシ、ジャガイモ、トマト、コムギ、ナタネ、アブラナ、ダイズ、イネ、オオムギまたはタバコであり得る。本発明は、本発明の核酸または本発明の発現カセット(例えばベクター)を含むトランスジェニック種子を提供する。前記トランスジェニック種子はトウモロコシ、コムギ、ナタネ、アブラナ（キャノーラ）、ダイズ、ヤシ、ヒマワリ、ゴマ、落花生またはタバコの種子であり得る。
本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の核酸に相補的な核酸配列、または本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含む。本発明は、細胞内のプロテアーゼメッセージの翻訳を阻害する方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸に相補的な核酸配列または本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に投与するか、または前記細胞で発現させることを含む。ある特徴では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約10から50、約20から60、約30から70、約40から80または約60から100塩基である。
本発明は、細胞内のプロテアーゼメッセージの翻訳を阻害する方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸に相補的な核酸配列または本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを前記細胞に投与するか、または前記細胞で発現させることを含む。本発明は、本発明の配列の部分配列を含む二本鎖の阻害性RNA（RNAi）分子を提供する。ある特徴では、前記RNAiは長さが約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25またはそれ以上の二重鎖ヌクレオチドである。本発明は、細胞内のプロテアーゼの発現を阻害する方法を提供する。前記方法は、二本鎖の阻害性RNA（RNAi）を前記細胞に投与するか、または前記細胞で発現させることを含み、前記RNAは本発明の配列の部分配列を含む。
【００２１】
本発明は、本発明の例示的なポリペプチドまたはペプチドと少なくとも約25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350またはそれ多くの残基にわたって、または前記ポリペプチドの完全長にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離または組換えポリペプチドを提供し、前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される。本発明の例示的なポリペプチドまたはペプチド配列には、配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255、または配列番号:145によってコードされるプロテアーゼ、並びにその部分配列および変種が含まれる。例示的なポリペプチドはまた、長さが少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600またはそれより多い残基の断片、または完全長の酵素を含む。本発明の例示的なポリペプチドまたはペプチド配列には本発明の核酸によってコードされる配列が含まれる。本発明の例示的なポリペプチドまたはペプチド配列には、本発明の抗体が特異的に結合するポリペプチドまたはペプチドが含まれる。ある特徴では、本発明のポリペプチドは少なくとも1つのプロテアーゼ活性を有するであってよい。
【００２２】
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドまたはペプチド配列、前記と実質的に同一の配列、および前記と相補的な配列の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100またはそれ以上の連続する塩基を含む単離または組換えポリペプチドまたはペプチドを提供する。前記ペプチドは例えば免疫原性断片、モチーフ（例えば結合部位）、シグナル配列（例えば表4に示されるもの）、プレプロ配列または活性部位であり得る。
ある特徴では、プロテアーゼ活性はペプチド結合の加水分解の触媒を含む。前記プロテアーゼ活性はエンドプロテアーゼ活性および／またはエキソプロテアーゼ活性を含むことができる。前記プロテアーゼ活性は、カルボキシペプチダーゼ活性、アミノペプチダーゼ活性、セリンプロテアーゼ活性、メタロプロテアーゼ活性、システインプロテアーゼ活性および／またはアスパラギンプロテアーゼ活性を含むことができる。ある特徴では、プロテアーゼ活性は、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインおよび／またはスブチリシン活性と同じまたは類似の活性を含むことができる。前記プロテアーゼ活性はペプチダーゼ活性、例えばジペプチジルペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性を含むことができる。
ある特徴では、前記プロテアーゼ活性は熱安定性である。前記ポリペプチドは、約1℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約95℃、約55℃から約85℃、約70℃から約95℃、または約90℃から約95℃またはそれ以上の温度範囲を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持することができる。また別の特徴では、前記プロテアーゼ活性は耐熱性であってよい。前記ポリペプチドは、約37℃以上から約95℃の範囲の温度、または55℃以上から約85℃の範囲の温度に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、pH4.5で約90℃以上から約95℃の範囲の温度に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。
【００２３】
ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドの残基1〜12、1〜13、1〜14、1〜15、1〜16、1〜17、1〜18、1〜19、1〜20、1〜21、1〜22、1〜23、1〜24、1〜25、1〜26、1〜27、1〜28、1〜29、1〜30、1〜31、1〜32、1〜33、1〜34、1〜35、1〜36、1〜37、1〜38、1〜39、1〜40、1〜41、1〜42、1〜43、1〜44に示される配列を含む／から成るペプチド（またはそれより長いペプチド）を含むシグナル配列を提供する。ある特徴では、表4に示される配列を含む／から成るペプチドを含むシグナル配列を提供する。
本発明は、配列番号:2の残基1から37と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有する、配列番号:4の残基1から36と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有する、配列番号:6の残基1から32と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有する、配列番号:10の残基1から28と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有する、配列番号:14の残基1から33と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有する、さらに配列番号表に示される他のシグナル配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離または組換えペプチドを提供し、前記配列同一性は配列比較アルゴリズムを用いる分析によって、または目視精査によって決定される。これらのペプチドは、その内因性プロテアーゼに対し、または別のプロテアーゼに対し、または異種のタンパク質（非プロテアーゼ酵素または他のタンパク質）に対しシグナル配列として機能することができる。
ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列（例えば表4参照）を含む第一のドメインおよび少なくとも1つの第二のドメインを含むキメラタンパク質を提供する。前記タンパク質は融合タンパク質であり得る。前記第二のドメインは酵素を含むことができる。前記酵素はプロテアーゼであり得る。
本発明はキメラポリペプチドを提供する。前記は、本発明のシグナルペプチド（SP）、プレプロ配列および／または触媒ドメイン（CD）を含む少なくとも1つの第一のドメインおよび異種ポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも1つの第二のドメインを含み、前記異種ポリペプチドまたはペプチドは、天然の状態では前記シグナルペプチド（SP）、プレプロ配列および／または触媒ドメイン（CD）と結合していない。ある特徴では、前記異種ポリペプチドまたはペプチドはプロテアーゼではない。前記異種ポリペプチドまたはペプチドは、シグナルペプチド（SP）、プレプロ配列および／または触媒ドメイン（CD）のアミノ末端、カルボキシ末端またはその両末端に存在することができる。
本発明はキメラポリペプチドをコードする単離または組換え核酸を提供し、前記キメラポリペプチドは、本発明のシグナルペプチド（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）を含む少なくとも1つの第一のドメインおよび異種ポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも1つの第二のドメインを含み、前記異種ポリペプチドまたはペプチドは、天然の状態では前記シグナルペプチド（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）と結合していない。ある特徴では、前記異種ポリペプチドまたはペプチドはプロテアーゼではない。
【００２４】
ある特徴では、プロテアーゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約1200ユニット、またはタンパク質1ミリグラムにつき約100から約1000ユニットの範囲の比活性を含む。別の特徴では、前記プロテアーゼ活性は、タンパク質1ミリグラムにつき約100から約1000ユニット、またはタンパク質1ミリグラムにつき約500から約750ユニットの比活性を含む。また別には、前記プロテアーゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約750 ユニット、またはタンパク質1ミリグラムにつき約500から約1200ユニットの範囲の比活性を含む。ある特徴では、前記プロテアーゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約500 ユニット、またはタンパク質1ミリグラムにつき約750から約1000ユニットの範囲の比活性を含む。別の特徴では、前記プロテアーゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約250 ユニットの範囲の比活性を含む。また別には、前記プロテアーゼ活性は、37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約100ユニットの範囲の比活性を含む。また別の特徴では、前記耐熱性は、上昇温度に加熱した後37℃で前記プロテアーゼ比活性の少なくとも半分が維持されることを含む。また別には、前記耐熱性は、上昇温度に加熱した後、37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約1200ユニット、またはタンパク質1ミリグラムにつき約500から約1000ユニットの範囲の比活性が維持されることを含む。また別の特徴では、前記耐熱性は、上昇温度に加熱した後37℃でタンパク質1ミリグラムにつき約1から約500 ユニットの範囲の比活性が維持されることを含む。
【００２５】
本発明は、少なくとも1つのグリコシル化部位を含む本発明の単離または組換えポリペプチドを提供する。ある特徴では、グリコシル化はN-結合グリコシル化であり得る。ある特徴では、前記ポリペプチドは、P. パストリス（pastoris）またはS. ポンベ（pombe）で発現した後でグリコシル化され得る。
ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5またはpH4を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持することができる。別の特徴では、前記ポリペプチドは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5またはpH11を含む条件下でプロテアーゼ活性を維持することができる。ある特徴では、前記ポリペプチドは、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5またはpH4を含む条件下に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。別の特徴では、前記ポリペプチドは、約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5またはpH11を含む条件下に暴露した後プロテアーゼ活性を維持することができる。
本発明は本発明のポリペプチドを含むタンパク質調製物を提供する。前記タンパク質調製物は液体、固体またはゲルを含む。
本発明は、本発明のポリペプチドおよび第二のタンパク質またはドメインを含むヘテロ二量体を提供する。前記へテロ二量体の第二のメンバーは別のプロテアーゼ、別の酵素または別のタンパク質であり得る。ある特徴では、前記第二のドメインはポリペプチドで、前記へテロ二量体は融合タンパク質であり得る。ある特徴では、前記第二のドメインはエピトープまたはタグであり得る。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドを含むホモ二量体を提供する。
【００２６】
本発明はプロテアーゼ活性を有する固定ポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、本発明のポリペプチド、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、または本発明のポリペプチドおよび第二のドメインを含むポリペプチドを含む。ある特徴では、前記ポリペプチドは細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、グラファイト粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイまたはキャピラリー管に固定することができる。
本発明は、固定された本発明の核酸を含むアレイを提供する。本発明は本発明の抗体を含むアレイを提供する。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する単離または組換え抗体を提供する。前記抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもあり得る。本発明は、本発明の抗体、例えば本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）を含む動物用食品補助物を提供する。ある特徴では、前記食品補助物中の前記ポリペプチドはグリコシル化することができる。本発明は、本発明のポリペプチド（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）を含む食用酵素デリバリーマトリックスを提供する。ある特徴では、前記デリバリーマトリックスはペレットを含む。ある特徴では前記ポリペプチドはグリコシル化することができる。ある特徴では前記プロテアーゼ活性は耐熱性である。別の特徴では、前記プロテアーゼ活性は熱安定性である。
【００２７】
本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを単離または同定する方法を提供する：（a）本発明の抗体を提供する工程；（b）ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程；（c）前記抗体が前記ポリペプチドと特異的に結合する条件下で工程（a）の抗体と工程（b）のサンプルを接触させ、それによってプロテアーゼを単離または同定する工程。
本発明は、以下の工程を含む抗プロテアーゼ抗体を製造する方法を提供する：非ヒト動物に液性免疫応答を生じさせるために十分な量で本発明の核酸または本発明のポリペプチドまたはその部分配列を投与し、それによって抗プロテアーゼ抗体を製造する。本発明は、非ヒト動物に免疫応答を生じさせるために十分な量で本発明の核酸または本発明のポリペプチドまたはその部分配列を投与することを含む抗プロテアーゼ免疫を生じさせる方法を提供する。
本発明は以下の工程を含む組換えポリペプチドを製造する方法を提供する：（a）プロモーターに機能的に連結された本発明の核酸を提供する工程；（b）前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で工程（a）の核酸を発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程。ある特徴では、前記方法はさらに、宿主細胞を工程（a）の核酸で形質転換し、続いて工程（a）の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞で組換えポリペプチドを製造することを含むことができる。
本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）プロテアーゼ基質を提供する工程；および、（c）工程（a）のポリペプチドまたはその断片または変種を工程（b）の基質と接触させ、基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出し、基質量の減少または反応生成物量の増加によってプロテアーゼ活性を有するポリペプチドを検出する工程。
本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ基質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）試験基質を提供する工程；および、（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験基質と接触させ、基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出し、基質量の減少または反応生成物量の増加によって前記試験基質をプロテアーゼ基質と同定する工程。
【００２８】
本発明は、試験化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）核酸または核酸を含むベクターを前記核酸のポリペプチドへの翻訳を許容する条件下で発現させるか（前記核酸は本発明の核酸を含む）、または本発明のポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；（c）前記ポリペプチドを前記試験化合物と接触させる工程；および、（d）工程（b）の試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ活性の調節物質を同定する方法を提供する：（a）本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）試験化合物を提供する工程；（c）工程（a）のポリペプチドを工程（b）の試験化合物と接触させてプロテアーゼの活性を測定し、試験化合物の非存在下のプロテアーゼ活性と比較して試験化合物の存在下で測定されるプロテアーゼ活性が変化した場合に、前記試験化合物がプロテアーゼ活性を調節すると決定する工程。ある特徴では、前記プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ基質を提供すること、および、基質量の減少もしくは反応生成物量の増加、または基質量の増加若しくは反応生成物量の減少、を検出することによって測定することができる。試験化合物非存在下での基質量または反応生成物量と比較して試験化合物存在下で基質量が減少または反応生成物量が増加すれば、試験化合物をプロテアーゼの活性化物質と同定する。試験化合物非存在下での基質または反応生成物量と比較して試験化合物存在下で基質量が増加または反応生成物量が減少すれば、試験化合物をプロテアーゼの阻害物質と同定する。
【００２９】
本発明は、プロセッサおよびデータ保存装置を含むコンピュータシステムを提供し、前記データ保存装置には本発明のポリペプチド配列（例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド）または本発明の核酸配列が保存されている。
ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに配列比較アルゴリズムおよび少なくとも1つの参照配列が保存された保存装置を含むことができる。別の特徴では、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含む。ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに、前記配列における1つまたは2つ以上の特徴を同定するアイデンティファイアーを含むことができる。本発明はコンピュータ読み出し可能媒体を提供し、前記媒体には、本発明のポリペプチド配列または本発明の核酸配列が保存されている。本発明は、以下の工程を含む配列の特徴を同定する方法を提供する：（a）配列内の1つまたは2つ以上の特徴を同定するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程（前記配列は本発明のポリペプチド配列または本発明の核酸配列を含む）；および、（b）前記コンピュータプログラムにより前記配列の1つまたは2つ以上の特徴を同定する工程。本発明は、以下の工程を含む第一の配列と第二の配列を比較する方法を提供する：（a）配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列および第二の配列を読み取る工程（前記第一の配列は本発明のポリペプチド配列または本発明の核酸配列を含む）；および、（b）第一の配列と第二の配列間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程。第一の配列と第二の配列間の相違を決定する工程はさらに多型性を同定する工程を含むことができる。ある特徴では、前記方法はさらに、配列内の1つまたは2つ以上の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含むことができる。別の特徴では、前記方法は、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、さらに前記配列内の1つまたは2つ以上の特徴を同定することを含むことができる。
【００３０】
本発明は、以下の工程を含む、環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するために増幅プライマー配列を提供する工程（前記プライマー対は本発明の核酸を増幅することができる）；（b）前記環境サンプルから核酸を単離するか、または前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために前記増幅プライマー対に接近できるように前記環境サンプルを処理する工程；および、（c）工程（b）の核酸を工程（a）の増幅プライマー対と一緒にして前記環境サンプルの核酸を増幅し、それによって環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。前記増幅プライマー配列対の一方または各メンバーは、本発明の配列の少なくとも約10から50の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。ある特徴では、前記増幅プライマー配列対は本発明の増幅対である。
本発明は、以下の工程を含む環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法を提供する：（a）本発明の核酸配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程；（b）前記環境サンプルから核酸を単離するか、または前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために工程（ａ）のポリヌクレオチドに接近できるように前記環境サンプルを処理する工程；（c）工程（b）の単離された核酸または処理された環境サンプルを工程（ａ）のポリヌクレオチドプローブと一緒にする工程；および、（d）工程（a）のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによって環境サンプルからプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。前記環境サンプルは水サンプル、液体サンプル、土壌サンプル、大気サンプルまたは生物学的サンプルを含むことができる。また別の特徴では、前記生物学的サンプルは、細菌細胞、原虫細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞に由来することができる。
【００３１】
本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を作製する方法を提供する：（a）本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供する工程；（b）前記鋳型配列内の1つまたは2つ以上のヌクレオチドの改変、欠失もしくは付加、またはそれらの組合せを実施して前記鋳型核酸の変種を作製する工程。
ある特徴では、前記方法はさらに、変種核酸を発現させて変種プロテアーゼポリペプチドを生成することを含む。前記改変、付加または欠失は、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ(SLR)またはそれらの組合せを含む方法により導入することができる。また別の特徴では、前記改変、付加または欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ付加二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成、またはそれらの組合せによって導入することができる。
【００３２】
ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドの活性または安定性とは変異したもしくは異なる活性または変異したもしくは異なる安定性を有するプロテアーゼが得られるまで反復することができる。ある特徴では、前記変種プロテアーゼ変種は耐熱性であり、上昇温度に暴露された後ある程度の活性を維持する。また別の特徴では、前記変種プロテアーゼポリペプチドは、鋳型核酸によってコードされるプロテアーゼと比較して高いグリコシル化を有する。また別には、前記変種プロテアーゼポリペプチドは高温化でプロテアーゼ活性を有するが、鋳型核酸によってコードされるプロテアーゼは高温下では活性をもたない。ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸のコドン使用とは変異したコドン使用を示すプロテアーゼコード配列が得られるまで反復することができる。前記方法は、別の特徴では、鋳型核酸のメッセージ発現レベルまたは安定性レベルより高いまたは低いレベルのそれを有するプロテアーゼ遺伝子が得られるまで前記方法を反復することができる。
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞でのその発現を高める方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；および、（b）工程（a）の核酸の非優先コドンまたは低優先コドンを特定し、前記コドンを同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中性的に使用されるコドンに置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞内での前記の発現を増加させる工程（前記優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先コドンまたは低優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）。
本発明は、以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変する方法を提供する：（a）本発明の核酸を提供する工程；および、（b）工程（a）の核酸のコドンを特定し、前記コドンを同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによってプロテアーゼをコードする核酸内のコドンを改変する工程。
【００３３】
本発明は、以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞でその発現を高める方法を提供する：（a）プロテアーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程；および、（b）工程（a）の核酸内の非優先コドンまたは低優先コドンを特定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中性的に使用されるコドンで置換する工程であって（優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである）、それによって前記核酸を改変して宿主細胞でのその発現を高める工程。
本発明は、以下の工程を含む、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞でその発現を低下させる方法を提供する：（a）本発明の核酸を提供する工程；および、（b）工程（a）の核酸内の少なくとも1つの好ましいコドンを特定し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドンまたは低優先コドンで置換する工程であって（優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度提示されるコドンであり、非優先または低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度提示されるコドンである）、それによって前記核酸を改変して宿主細胞でのその発現を低下させる工程。ある特徴では、前記宿主細胞は細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞である。
【００３４】
本発明は、複数の改変プロテアーゼ活性部位または基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する方法を提供する（前記改変活性部位または基質結合部位は、第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸に由来する）。前記方法は以下の工程を含む：（a）第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする第一の核酸を提供する工程（前記第一の核酸配列は本発明の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記核酸はプロテアーゼ活性部位またはプロテアーゼ基質結合部位をコードする）；（b）第一の核酸内の複数の標的コドンで天然に存在するアミノ酸変種をコードする一組の変異導入オリゴヌクレオチドを提供する工程；（c）前記一組の変異導入オリゴヌクレオチドを用いて、変異導入アミノ酸コドンの各々一連のアミノ酸変種をコードする一組の活性部位コード変種または基質結合部位コード変種核酸を生成し、それによって複数の改変プロテアーゼ活性部位または基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する工程。ある特徴では、前記方法は、最適化定方向進化システム、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、または合成連結再アッセンブリ(SLR)、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド指向変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成連結再アッセンブリ(SLR)またはそれらの組合せを含む方法によって、工程（ａ）の第一の核酸に変異導入することを含む。別の特徴では、前記方法は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ付加二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成およびそれらの組合せを含む方法によって、工程（a）の第一の核酸または変種に変異導入することを含む。
【００３５】
本発明は、以下の工程を含む小分子の製造方法を提供する：（a）小分子を合成または改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程（前記酵素の1つは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼ酵素を含む）；（b）工程（a）の酵素の少なくとも１つのための基質を提供する工程；および、（c）複数の生物触媒反応を促進する条件下で工程（b）の基質を前記酵素と反応させて一連の生物触媒反応により小分子を生成する工程。本発明は、以下の工程を含む小分子の改変方法を提供する：（a）プロテアーゼ酵素を提供する工程（前記酵素は本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む）；（b）小分子を提供する工程；および、（c）前記プロテアーゼ酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で工程（a）の酵素を工程（b）の小分子と反応させ、それによってプロテアーゼ酵素反応により小分子を改変する工程。ある特徴では、前記方法は、工程（a）の酵素のための複数の小分子基質を提供し、それによってプロテアーゼ酵素により触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作製することを含むことができる。ある特徴では、前記方法は、前記酵素による複数の生物触媒反応を促進する条件下で複数の酵素を追加して、複数の酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作製することを含むことができる。別の特徴では、前記方法はさらに、所望の活性を示す特定の小分子がライブラリー内に存在するか否かを決定するために前記ライブラリーを試験する工程を含むことができる。前記ライブラリーの試験工程はさらに、所望の活性をもつ特定の改変小分子の有無について改変小分子の一部分を試験することによって、ライブラリー内の複数の改変小分子の前記一部分を生成するために用いられた生物触媒反応の1つ以外の全てを系統的に排除し、所望の活性をもつ特定の改変小分子を生成する少なくとも1つの特異的な生物触媒反応を同定する工程を含むことができる。
【００３６】
本発明は、以下の工程を含むプロテアーゼ酵素の機能的断片を決定する方法を提供する：（a）プロテアーゼ酵素を提供する工程（前記酵素は本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む）；および、（b）工程（a）の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、プロテアーゼ活性について残余の配列を試験し、それによってプロテアーゼ酵素の機能的断片を決定する工程。
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析によって新規または改変表現型の全細胞操作のための方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作製する工程（前記遺伝的構成は本発明の核酸を細胞に導入することによって改変される）；（b）前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生成する工程；（c）工程（b）の細胞培養をリアルタイムでモニターすることによって前記細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを測定する工程；さらに（d）工程（c）のデータを分析して、前記測定パラメーターが類似の条件下で未改変細胞の対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって細胞の操作された表現型をリアルタイム代謝フラックス分析により同定する工程。ある特徴では、細胞の遺伝的構成は、細胞内の配列の欠失もしくは改変または遺伝子発現のノックアウトを含む方法によって改変することができる。ある特徴では、前記方法はさらに、新規に操作された表現型を含む細胞の選別を含むことができる。別の特徴では、前記方法は、選別細胞を培養し、それによって新規に操作された表現型を含む新規な細胞株を作製することを含むことができる。
本発明は、プロテアーゼポリペプチドの耐熱性または熱安定性を高める方法を提供する。前記方法は、プロテアーゼポリペプチドをグリコシル化し（前記ポリペプチドは本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも30の連続するアミノ酸を含む）、それによってプロテアーゼポリペプチドの耐熱性または熱安定性を高める。ある特徴では、本プロテアーゼ比活性は約37℃以上から約95℃の範囲の温度で熱安定性または耐熱性であり得る。
【００３７】
本発明は、細胞で組換えプロテアーゼポリペプチドを過剰発現させる方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸または本発明の核酸配列（前記配列の同一性は配列比較アルゴリズムによる分析または目視精査によって決定される）を含むベクターを発現させることを含み、前記過剰発現は、高活性プロモーターの使用、二シストロン性ベクターの使用によって、または前記ベクターの遺伝子増幅によって達成される。
本発明は、以下の工程を含むトランスジェニック植物の製造方法を提供する：（a）異種核酸配列を細胞に導入し（前記異種核酸配列は本発明の核酸配列を含む）、それによって形質転換植物細胞を作製する工程；および、（b）前記形質転換細胞からトランスジェニック植物を作出する工程。ある特徴では、工程（a）はさらに、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションにより前記異種核酸配列を導入することを含むことができる。別の特徴では、工程（a）はさらに、DNA粒子ボンバードメントによって植物組織に直接前記異種核酸配列を導入することを含むことができる。また別には、工程（a）はさらに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主を用いて植物細胞DNAに前記異種核酸配列を導入することを含むことができる。ある特徴では、前記植物細胞はジャガイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、タバコまたはオオムギ細胞であり得る。
本発明は、以下の工程を含む植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する：（a）プロモーターに機能的に連結された異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程（前記異種核酸配列は本発明の核酸を含む）；（b）前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現する条件下で前記植物を生長させる工程。本発明は、以下の工程を含む植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する：（a）プロモーターに機能的に連結された異種核酸配列で前記植物細胞を形質転換する工程（前記異種核酸配列は本発明の核酸を含む）；（b）前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現する条件下で前記植物を生長させる工程。
【００３８】
本発明は、以下の工程を含むタンパク質含有組成物を加水分解、細分または破壊する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）タンパク質を含む組成物を提供する工程；（c）前記プロテアーゼが前記タンパク質含有組成物を加水分解、細分または破壊する条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程。ある特徴では、前記組成物は植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞を含む。したがって、前記組成物は任意の植物もしくは植物部分、任意のタンパク質含有食物もしくは飼料、廃棄物などであろう。本発明は、以下の工程を含む組成物からタンパク質を液化または除去する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）タンパク質を含む組成物を提供する工程；（c）前記プロテアーゼが前記タンパク質を除去または液化する条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む洗剤組成物を提供する。前記ポリペプチドはプロテアーゼ活性を有する。前記プロテアーゼは非界面活性プロテアーゼまたは界面活性プロテアーゼであろう。前記プロテアーゼは、非水性液体組成物、鋳造固形物、顆粒形、粒状形、打錠剤、ゲル状形、ペーストまたはスラリー形として製剤化することができる。本発明は以下の工程を含む物体の洗浄方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；（b）物体を提供する工程；および、（c）前記組成物が前記物体を洗浄することができる条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の物体と接触させる工程。
【００３９】
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む布または繊維製品（例えば糸を含む）を提供する。ある特徴では、前記布または繊維製品はセルロース含有繊維を含む。本発明は、以下の工程を含む、組成物からタンパク質の汚れを除去する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；（b）タンパク質の汚れを有する組成物を提供する工程；さらに（c）前記プロテアーゼが前記汚れを除去することができる条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の組成物と接触させる工程。本発明は、以下の工程を含む、繊維製品の仕上がりを改善する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程；（b）繊維製品を提供する工程；および、（c）前記ポリペプチドが前記繊維製品を処理することができる条件下で工程（a）のポリペプチドを工程（b）の繊維製品と接触させ、それによって前記繊維製品の仕上がりを改善する工程。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む食物または飼料を提供する。本発明は、動物によって消費される前に飼料または食物中のタンパク質を加水分解する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）本発明のプロテアーゼまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飼料材料を入手する工程；さらに（b）前記タンパク質が加水分解されるため、および処理食物または飼料が生成されるために十分な量で十分な時間、前記ポリペプチドを前記飼料または食物材料に加え、それによって動物が消費する前に前記食物または飼料中のタンパク質を加水分解する工程。ある特徴では、本発明は、動物が消費した後で、飼料または食物中のタンパク質を加水分解する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）本発明のプロテアーゼまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む飼料材料を入手する工程；（b）工程（a）のポリペプチドを前記飼料または食物材料に添加する工程；および、（c）前記飼料または食物材料を動物に与える工程であって、消費後に前記プロテアーゼが前記動物の消化管の中で前記飼料または食物中のタンパク質の加水分解を惹起する、前記工程。前記食物または飼料は例えばトウモロコシであり得る。
【００４０】
本発明は、以下の工程を含む、乳製品の質感および風味を改善する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程；（b）乳製品を提供する工程；および、（c）前記プロテアーゼが前記乳製品の質感または風味を改善することができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の乳製品を接触させる工程。ある特徴では、前記乳製品はチーズまたはヨーグルトを含む。本発明は、本発明のプロテアーゼまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む乳製品を提供する。本発明の、以下の工程を含む肉または魚をやわらかくする方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを提供する工程；（b）肉または魚を含む組成物を提供する工程；および、（c）前記ポリペプチドが前記肉または魚をやわらかくすることができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の組成物を接触させる工程。本発明は、以下の工程を含むグルテン非含有製品を製造する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを提供する工程；（b）グルテンを含む製品を提供する工程；さらに（c）前記ポリペプチドがグルテンを加水分解することができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の製品を接触させ、それによってグルテン非含有製品を製造する工程。ある特徴では、前記グルテン非含有製品は穀類、パンまたはビールである。本発明は、本発明のポリペプチド（プロテアーゼ活性を含む）または本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含むグルテン非含有食物組成物を提供する。
【００４１】
本発明は、油に富む植物材料から油の抽出を改善する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを提供する工程；（b）油に富む植物材料を提供する工程；（c）工程（a）のポリペプチドおよび前記油に富む植物材料を接触させる工程。
本発明は、以下の工程を含む、果実もしくは野菜ジュース、シロップ、ピューレまたは抽出物の調製方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを提供する工程；（b）果実または野菜材料を含む組成物または液体を提供する工程；および、（c）工程（a）のポリペプチドおよび前記組成物を接触させ、それによって前記果実もしくは野菜ジュース、シロップ、ピューレまたは抽出物を調製する工程。
本発明は、本発明のプロテアーゼまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む紙もしくは紙製品または紙パルプを提供する。本発明は、以下の工程を含む、紙または紙もしくは木材パルプを処理する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを提供する工程；（b）紙または紙もしくは木材パルプを含む組成物を提供する工程；さらに（c）前記プロテアーゼが紙または紙もしくは木材パルプを処理することができる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の組成物を接触させる工程。
【００４２】
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。ある特徴では、前記医薬組成物は、消化補助または局所皮膚保護として機能する。本発明は、本発明の医薬組成物を局所適用することを含む表皮剥離の不均衡を治療する方法を提供する。ある特徴では、前記治療は予防的である。本発明は口腔ケア製品を提供する。前記製品は、プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む。前記口腔ケア製品は練り歯磨き、歯磨きクリーム、ゲル、歯磨き粉、オドンティック、口腔洗浄液、歯磨き前後の洗浄剤、チューインガム、ロゼンジまたはキャンディーを含むことができる。本発明はコンタクトレンズ洗浄組成物を提供する。前記組成物はプロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む。
本発明は、以下の工程を含む、動物の固体または液体廃棄物を処理する方法を提供する：（a）プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを提供する工程；（b）動物の固体または液体廃棄物を提供する工程；および、（c）前記プロテアーゼが前記廃棄物を処理できる条件下で工程（a）のポリペプチドおよび工程（b）の固体または液体廃棄物を接触させる工程。
本発明は、プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む毛球予防薬および／または治療薬を提供する。本発明は、プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるプロテアーゼを含む、血液または有機性シミの除去剤を提供する。
本発明の1つまたは2つ以上の実施態様の詳細は添付の図面および下記の説明で示される。本発明のその他の特徴、目的および利点はこれらの記載および図面から、さらに特許請求の範囲から明らかになろう。
本明細書に引用した全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC寄託物は参照により本明細書に含まれる。
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこれらポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造および使用方法を提供する。ある特徴では、本発明のプロテアーゼは、ペプチド結合の加水分解を触媒するために用いられる。本発明のプロテアーゼは、食品または飼料、織物地、洗剤などの製造および／または加工に用いることができる。本発明のプロテアーゼは医薬組成物および食品補強物で用いることができる。
本発明のプロテアーゼ調製物（飼料もしくは食品の処理または加工用、繊維および織物地の処理用、廃棄物処理、植物処理のための調製物を含む）は、さらに1つまたは2つ以上の酵素、例えばペクテートリアーゼ、セルラーゼ（エンド-ベータ-1,4-グルカナーゼ）、ベータ-グルカナーゼ（エンド-ベータ-1,3-(4)-グルカナーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、または前記の混合物を含むことができる。
【００４４】
定義
“プロテアーゼ”という用語は、プロテアーゼ活性(ペプチダーゼおよび／またはプロテイナーゼ活性を含む)を有する全てのポリペプチドを含む。本発明のプロテアーゼ活性は、ペプチド結合の加水分解の触媒を含むことができる。本発明のプロテアーゼは、両方向のペプチド加水分解反応を触媒することができる。前記反応の方向は、例えば基質および／または生成物の濃度、温度、プロテアーゼの選択などを操作することによって定めることができる。前記プロテアーゼ活性はエンドプロテアーゼ活性および／またはエキソプロテアーゼ活性を含むことができる。前記プロテアーゼ活性は、プロテアーゼ活性、例えばカルボキシペプチダーゼ活性、ジペプチジルペプチダーゼもしくはアミノペプチダーゼ活性、セリンプロテアーゼ活性、メタロプロテイナーゼ活性、システインプロテアーゼ活性および／またはアスパラギンプロテアーゼ活性を含むことができる。ある特徴では、プロテアーゼ活性は、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインおよび／またはスブチリシン活性と同じまたは類似の活性を含むことができる。
【００４５】
プロテアーゼ活性を有する本発明のポリペプチドをいう場合、例えば配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249；配列番号:255に示される配列を有する例示的なポリペプチド、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドの記載で、前記ポリペプチドがシグナル配列および／またはプレプロ配列（例えば“プレプロ”ドメイン）を含むならば、前記ポリペプチドはシグナル配列の存在下および／または非存在下またはプレプロ配列（例えば“プレプロ”ドメイン）の存在下および／または非存在下でプロテアーゼ活性を有することを意味する。したがって、本発明は、プロテアーゼの全ての活性型およびその活性な部分配列の他にも、不活性型のポリペプチド（例えば“成熟”前、またはそのプレプロ配列をプロセッシングして（例えば前駆タンパク質プロセッシング酵素、例えばプロプロテインコンバターゼによる） “活性な”成熟タンパク質を生じる前、または翻訳後プロセッシング事象（例えばエンド-もしくはエキソ-ペプチダーゼまたはプロテイナーゼ作用、リン酸化事象、アミド化、グリコシル化または硫酸化、ダイマー化事象など）による“活性化”前の前駆タンパク質のようなポリペプチド）を含む。
ポリペプチドは、プロテアーゼ活性について任意の方法によって日常的にアッセイすることができる（例えば前記タンパク質が本発明に包含されるものであるか否かを調べるために試験することができる）。例えば、プロテアーゼ活性は、ザイモグラムを用いたカゼインの加水分解、ゼラチンから蛍光の遊離、または種々の小型ペプチド基質からp-ニトロアナリドの遊離によってアッセイすることができる（前記および他の典型的なプロテアーゼアッセイは下記の実施例に示されている）。
【００４６】
“抗体”という用語は、１つの免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子またはその断片から誘導されたか、その後設計されたか、または実質的にコードされたペプチドまたはポリペプチドであって、抗原またはエピトープに特異的に結合することができるものを含む。例えば以下を参照されたい：Fundamental Immunology, Third Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)；Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273；Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97。抗体という用語は、抗原に結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち“抗原結合部位”（例えば断片、部分配列、相補性決定領域（CDR））を含み、（i）Fab断片（VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片）；（ii）F(ab')2断片（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された2つのFab断片を含む二価断片）；（iii）VHおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の1つの腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片；（v）dAb断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）（VHドメインからなる）；および（vi）単離された相補性決定領域（CDR）が含まれる。単鎖抗体もまた言及により“抗体”という用語に含まれる。
本明細書で用いられる“アレイ”または“マイクロアレイ”または“バイオチップ”または“チップ”という用語は複数の標的成分であって、各標的成分は、基質表面の一定面積上に固定された一定量の1つまたは2つ以上のポリペプチドもしくは核酸を含む（更なる詳細は下記に記載される）。
【００４７】
本明細書で用いられるように、“コンピュータ”、“コンピュータプログラム”および“プロセッサ”は前記のもっとも広い一般的な意味で用いられ、下記で詳細に述べるような装置の全てが含まれる。具体的なポリペプチドまたはタンパク質の“コード配列”または前記を“コードする配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチドまたはタンパク質に転写および翻訳される核酸配列である。
本明細書で用いられる“発現カセット”という用語は、前記のような配列と適合する宿主で構造遺伝子（タンパク質コード配列、例えば本発明のプロテアーゼ）の発現を達成することができるヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、前記ポリペプチドコード配列（および場合によって他の配列、例えば転写終了シグナル）と機能可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。発現の実施に必要なまたは有用なさらに別の因子（例えばエンハンサー）もまた用いることができる。したがって、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え“裸のDNA”ベクターなどを含む。
本明細書で用いられる“機能可能に連結される”とは、2つまたは3つ以上の核酸（例えばDNA）セグメント間における機能的関係を指す。典型的には、前記用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモーターが適切な宿主細胞または他の発現系でコード配列（例えば本発明の核酸）の転写を刺激または調節する場合、前記プロモーターは前記コード配列と機能可能に連結されている。一般的には、転写される配列と機能可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、前記転写される配列と物理的に連続している。すなわち、それらはcis-作用性である。しかしながら、いくつかの転写調節配列、例えばエンハンサーは、それらが転写を増強しようとするコード配列と物理的に連続していること、または前記と接近して配置されることを必ずしも必要としない。
【００４８】
“ベクター”は、細胞に感染、トランスフェクション、一過性もしくは永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合体を形成した核酸でもよいことは理解されよう。ベクターは場合によってウイルスまたは細菌の核酸および／またはタンパク質および／または膜（例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど）を含む。ベクターには、DNA断片が結合し複製できるようになったレプリコン（例えばRNAレプリコン、バクテリオファージ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。したがって、ベクターには、自律的自己複製性環状もしくは直鎖状DNAまたはRNA（例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば米国特許出願第5,217,879号参照）が含まれ（ただし前記に限定されない）、さらに発現および非発現プラスミドが含まれる。組換え微生物または細胞培養が“発現ベクター”の宿主として記載されている場合は、染色体外環状および直鎖状DNA並びに宿主染色体に取り込まれたDNAの両方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持される場合は、前記ベクターは自律性構造物として有糸分裂時に細胞によって安定的に複製されるか、または宿主のゲノム内に取り込まれるであろう。
【００４９】
本明細書で用いられる“プロモーター”という用語には、細胞（例えば植物細胞）内でコード配列の転写を駆動させることができる全ての配列が含まれる。したがって、本発明の構築物で用いられるプロモーターには、遺伝子の転写のタイミングおよび／または速度の調節または調整に必要とされるcis-作用性転写制御エレメントおよび調節配列が含まれる。例えば、プロモーターは、cis-作用性転写制御エレメント（エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組み込み配列、5'および3'非翻訳領域またはイントロン配列が含まれ、前記は転写調節に必要である）であろう。前記のcis-作用性配列は、典型的にはタンパク質または他の生物学的分子と相互作用して転写を実行する（転写のON、OFFの切り替え、調節または調整など）。“構成的”プロモーターは、大部分の環境条件下および発育または細胞分化の状態で持続的に発現を駆動するプロモーターである。“誘導性”または“調節性”プロモーターは環境条件または発育条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導する。例えば誘導性プロモーターによって転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気的条件、上昇温度、乾燥または光の存在が含まれる。
“組織特異的”プロモーターは、例えば植物または動物の特定の細胞または組織または器官でのみ活性を有する転写制御エレメントである。組織特異的調節は、ある組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子の発現を担保するある種の固有の因子によって達成できる。そのような因子は哺乳動物および植物に存在し、特定の組織を発達させることが知られている。
【００５０】
“植物”という用語には完全な植物、植物の部分（例えば葉、茎、花、根など）、植物のプロトプラスト、種子および植物細胞並びにその子孫が含まれる。本発明の方法で用いることができる植物クラスは、一般的には、形質転換技術を施しやすい高等植物クラスと同様の幅があり、裸子植物と同様に被子植物（単子葉および双子葉植物）が含まれる。これらには多様な倍数性レベルを有する植物（倍数体、二倍体、半数体および半接合状態を含む）が含まれる。本明細書で用いられる“トランスジェニック植物”には、異種核酸配列（例えば本発明の核酸および種々の組換え構築物、例えば発現カセット）が挿入された植物または植物細胞が含まれる。
“プラスミド”は、市販もしくは制約なく公開されているか、または公表された方法にしたがって入手可能なプラスミドから構築することができる。本明細書に記載されているプラスミドと同等なプラスミドは当技術分野で公知であり、当業者には明らかであろう。
“遺伝子”という用語には、転写生成物（前記は順次翻訳されたポリペプチド鎖を生じるか、または遺伝子の転写、再生または安定性を調節する）の生成に必要なDNAのセグメントを含む核酸配列が含まれる。遺伝子はコード領域に先行または後続する領域、例えばリーダーおよびトレイラー、プロモーターおよびエンハンサー並びに（適用がある場合には）個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含むことができる。
【００５１】
“核酸”または“核酸配列”という語句にはオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドが含まれ、それらのいずれかの断片、ゲノム由来もしくは合成起源のDNAまたはRNA（例えばmRNA、rRNA、tRNA、iRNA）（前記は一本鎖でも二本鎖でもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表すことができる）、ペプチド核酸（PNA）または任意のDNA様もしくはRNA様物質、天然もしくは合成起源のリボヌクレオプロテイン（iRNAを含む）（例えば二本鎖iRNA、例えばiRNP）を指す。前記用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸（すなわちオリゴヌクレオチド）を包含する。前記用語はまた合成骨格をもつ核酸様構造物を包含する（例えば以下を参照されたい：Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156）。
“アミノ酸”または“アミノ酸配列”にはオリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列、または前記のいずれかの断片、部分またはサブユニット、並びに天然に存在する分子および合成分子が含まれる。“ポリペプチド”および“タンパク質”という用語には、ペプチド結合または改変ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸、すなわちペプチドイソステアーが含まれ、20個の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外の改変アミノ酸を含むことができる。“ポリペプチド”という用語にはまたペプチドおよびポリペプチド断片、モチーフなども含まれる。前記用語はまたグリコシル化ポリペプチドを含む。本発明のペプチドおよびポリペプチドにはまた、下記でさらに詳細に記載されるように全ての“模倣体”および“ペプチド模倣体”が含まれる。
【００５２】
“単離”という用語は、その本来の環境（物質が天然に存在する場合はその天然の環境）から移された物質を含む。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に一緒に存在する物質のいくつかまたは全てから分離されている前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよいし、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおそのようなベクターまたは組成物は前記の天然の環境の一部分ではないという点で、単離されたものである。本明細書において、単離物質または組成物はまた“精製”された組成物であってもよく、すなわち、完全な純粋性は要求されず、むしろ相対的な定義が意図される。ライブラリーから得られる個々の核酸は電気泳動による均質度まで通常的に精製される。また別の特徴では、本発明は、ライブラリーまたは他の環境中のゲノムDNAもしくは他の配列から少なくとも10、102、103、104、105またはそれ以上に精製された核酸を提供する。
本明細書で用いられるように、“組換え体”という用語は、天然の環境では隣接していない“骨格”核酸に隣接する核酸を含むことができる。ある特徴では、核酸は、“骨格分子”核酸集団で5％またはそれ以上の数の核酸挿入物を表す。本発明の“骨格分子”には、問題の核酸挿入物を維持または操作するために用いられる核酸、例えば発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組み込み核酸、および他のベクターまたは核酸が含まれる。ある特徴では、組換え骨格分子集団で濃縮された核酸は、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％またはそれ以上の数の核酸挿入物を表す。“組換え”ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えDNA技術によって製造されたポリペプチドまたはタンパク質、例えば所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性DNA構築物によって形質転換された細胞から製造されたものを指す。“合成”ポリペプチドまたはタンパク質は、下記でさらに詳細に記載されるように化学的合成によって調製されたものである。
【００５３】
プロモーター配列は、下記でさらに考察されるように、前記プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼがコード配列のmRNAへの転写を開始する場合には“機能可能に連結”されているであろう。
“オリゴヌクレオチド”には、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2本の相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖が含まれ、前記は化学的に合成することができる。そのような合成オリゴヌクレオチドは5'リン酸をもたず、したがってキナーゼの存在下でATPによりリン酸を付加されなければ別のオリゴヌクレオチドに連結されないであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片に連結することができる。
2つの核酸またはポリペプチドの関係で“実質的に同一”という語句は、公知のいずれかの配列比較アルゴリズム（下記で詳細に考察される）を用いるかまたは目視精査により最大一致のための比較およびアラインメントを実施したとき、例えば少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基（配列）同一性を有する2つまたは3つ以上の配列を指すことができる。また別の特徴では、本発明は、本発明の典型的な配列、例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254（核酸）、配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番��:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドと、少なくとも約10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000もしくはそれ以上の残基にわたって、または前記核酸もしくはポリペプチドの約50残基からその完全長の範囲の領域にわたって実質的な配列同一性を有する核酸およびポリペプチド配列を提供する。本発明の核酸配列は、ポリペプチドコード領域の全長にわたって実質的に同一であろう。
【００５４】
“実質的に同一”のアミノ酸配列にはまた、1つまたは2つ以上の保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入（特にそのような置換が分子の活性をもたない部位で生じている場合であって、前記ポリペプチドがその機能的特性を本質的に維持していることを条件として）によって参照配列と異なる配列が含まれるであろう。保存的アミノ酸置換は、例えばあるアミノ酸を同じクラスの別のアミノ酸で置換する（例えば疎水性アミノ酸（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）で別の疎水性アミノ酸を置換、または極性アミノ酸で別のアミノ酸を置換、例えばアルギニンでリジンを置換、グルタミン酸でアスパラギン酸を置換、またはグルタミンでアスパラギンを置換）。1つまたは2つ以上のアミノ酸を例えばプロテアーゼから欠失させて、その生物学的活性を顕著に変更することなく、前記ポリペプチドの構造を改変させることができる。例えば、プロテアーゼ活性に要求されないアミノ末端またはカルボキシル末端アミノ酸を除去することができる。
“ハイブリダイゼーション”は、核酸の鎖が相補的な鎖と塩基対形成によって結合するプロセスを含む。ハイブリダイゼーション反応は鋭敏で選択性があり、前記が低い濃度でしか存在しないサンプルにおいてさえ問題の固有配列を同定することができる。ストリンジェントな条件は、例えば前ハイブリダイゼーション溶液またはハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって限定することができ、当業界でよく知られている。例えば、ストリンジェンシーは、下記で詳細に記載されるように、塩濃度の減少、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリダイゼーション温度の上昇、ハイブリダイゼーション時間の変更によって高めることができる。また別の特徴では、本発明の核酸は、本明細書に示す種々の（例えば高度、中程度および低）ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
【００５５】
“変種”には、1つまたは2つ以上の塩基対、コドン、イントロン、エクソンまたはアミノ酸残基で改変され、しかもなお本発明のプロテアーゼの生物学的活性を維持する本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが含まれる（前記活性は、例えばザイモグラムによるカゼインの加水分解、ゼラチンから蛍光の遊離または種々の小ペプチド基質からp-ニトロアナリドの遊離によってアッセイすることができる）。変種は、例えば変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリーPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、GSSMおよびそれらの任意の組合せを含む手段のいずれかにより作製することができる。例えば、野生型プロテアーゼとは異なるpHまたは温度で活性を有する変種プロテアーゼを作製する技術は本明細書に含まれている。
“飽和変異導入”または“GSSM”という用語には、下記に詳細に記載されているように、縮退オリゴヌクレオチドプライマーを用いて点変異をポリヌクレオチドに導入する方法が含まれる。
“最適化定方向進化システム”または“最適化定方向進化”という用語には、関連する核酸配列（例えば関連する遺伝子）の断片を再アッセンブリングする方法が含まれ、下記で詳細に説明される。
“合成連結再アッセンブリ”または“SLR”という用語には、非確率的態様でオリゴヌクレオチド断片を連結する方法が含まれ、下記で詳細に説明される。
【００５６】
核酸の作製および操作
本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254、配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255に示されるポリペプチド、または配列番号:145によってコードされるポリペプチドをコードする核酸（発現カセット、例えば発現ベクターを含む）を提供する。本発明はまた、本発明の核酸を用いて新規なプロテアーゼ配列を見つけるための方法を含む。本発明はまた、本発明の核酸を用いてプロテアーゼ遺伝子、転写物およびポリペプチドの発現を阻害する方法を含む。さらにまた、本発明の核酸を例えば合成連結再アッセンブリ、最適化定方向進化系および／または飽和変異導入によって���変する方法が提供される。
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローニングおよび発現、メッセージまたはゲノムDNAのPCRによる増幅などによって作製、単離および／または操作することができる。本発明の方法の実施では、相同な遺伝子は、本明細書に記載されるように鋳型核酸の操作によって改変することができる。本発明は、当業界で公知の任意の方法または手順または装置（前記は学術文献および特許文献に詳しく記載されている）と併用して実施することができる。
【００５７】
一般技術：本発明の実施に用いられる核酸は、RNAであれ、iRNAであれ、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルスまたは前記のハイブリッドであれ、種々の供給源から単離することも、遺伝的に操作、増幅することも、および／または組換えにより発現／作製することもできる。これらの核酸から作製された組換えポリペプチド（例えばプロテアーゼ）は個々の単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系（細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む）を用いることができる。
また別には、これら核酸は既知の化学的合成技術によってin vitroで合成することができる。前記技術は例えば以下に記載されている：Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (9179) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US Patent No. 4,458,066。
核酸操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブの標識（例えばクレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは学術文献および特許文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)。
【００５８】
本発明の方法の実施に用いられる核酸を入手および操作するために有用なまた別の手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、および所望の場合には、例えばゲノムクローンもしくはcDNAクローンから単離または増幅した挿入物のスクリーニングおよび再クローニングである。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、哺乳動物人工染色体（MAC）（例えば米国特許5,721,118号、同6,025,155号を参照されたい）、ヒト人工染色体（Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、P1人工染色体（Woon (1998) Genomics 50:306-316）、P1由来ベクター（PAC）（Kern (1997) Biotechniques 23:120-124）、コスミド、組換えウイルス、ファージまたはプラスミドに含まれるゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーが含まれる。
ある特徴では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはその断片の分泌を誘導することができるリーダー配列とともに適切な局面でアッセンブリングされる。
本発明は融合タンパク質およびそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドは異種ペプチドまたはポリペプチド、例えば所望の特性（例えば安定性増強または精製の簡便化）を付与するN-末端識別ペプチドと融合させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、より強い免疫原性をもつペプチドを製造するために、組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するために、抗体および抗体発現B細胞を特定および単離するために、その他の同様な目的のために、前記に結合した1つまたは2つ以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成および発現させることができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば金属キレートペプチド（例えばポリヒスチジン鎖およびヒスチジン-トリプトファンモジュール（前記は固定金属上での精製を可能にする）、プロテインAドメイン（前記は固定免疫グロブリン上での精製を可能にする）、およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系（Immune Corp, Seatle WA）で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインおよびモチーフ構成ペプチドまたはポリペプチド間の切断可能リンカー配列（例えばXa因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego CA））の挿入は精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、6つのヒスチジン残基とそれに続くチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位に連結されたエピトープコード核酸配列を含むことができる（例えば以下を参照されたい：Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414）。前記ヒスチジン残基は検出および精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の利用に関する技術は学術文献および特許文献に詳しく記載されている（例えば以下を参照されたい：Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53）。
【００５９】
転写および翻訳制御配列：本発明は、RNA合成／発現を誘導または調節するために発現（例えば転写または翻訳）制御配列（例えばプロモーターまたはエンハンサー）に機能的に連結された本発明の核酸（例えばDNA）配列を提供する。前記発現制御配列は発現ベクター内に存在するであろう。典型的な細菌プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。典型的な真核細胞プロモーターにはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIが含まれる。
細菌でのポリペプチド発現に適したプロモーターには、大腸菌のlacまたはtrpプロモーター、lacIプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPRプロモーター、ラムダPLプロモーター、糖分解酵素（例えば3-ホスホグセレートキナーゼ（PGK））をコードするオペロン由来のプロモーターおよび酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真核細胞プロモーターには、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期および後期SV40プロモーター、、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモーターが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターもまた用いることができる。
【００６０】
組織特異的植物プロモーター：本発明は、組織特異的態様で発現させることができる、例えば組織特異的態様で本発明のプロテアーゼを発現させることができる発現カセットを提供する。本発明はまた、本発明のプロテアーゼを組織特異的態様で発現することができる植物または種子を提供する。組織特異性は、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的などであり得る。
ある特徴では、構成的プロモーター（例えばCaMV35Sプロモーター）は、植物もしくは種子の特定の部分または植物全体での発現に用いることができる。例えば、過剰発現のためには、植物のいくつかの組織または全ての組織（例えば再生植物）で核酸の発現を誘導する植物プロモーター断片を用いることができる。そのようなプロモーターは、本明細書では“構成的”プロモーターと称され、ほとんどの環境条件下および発育または細胞分化状態で活性を示す。構成的プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S転写開始領域、アグロバクテリア・ツメファシエンス（Agrobacteria tumefaciens）のT−DNA由来1'-または2'-プロモーター、および当業者に公知の種々の植物遺伝子のその他の転写開始領域が含まれる。そのような遺伝子には、例えばアラビドプシス（Arabidopsis）のACT11（Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139）；アラビドプシスのCat3（GenBank No. U43147、Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251：196-203）；ブラシーカ=ナプス（Brassica napus）のステアロイル-アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（GenBank No. X74782、Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176）；トウモロコシのGPc1（GenBank No. X15596、Martinez (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565）；トウモロコシのGpc2（GenBank No. U45855、Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112）；米国特許4,962,028号、同5,633,440号に記載された植物プロモーターが含まれる。
本発明は、ウイルス由来の組織特異的または構成的プロモーターを用いる。前記には、例えばトバモウイルスのサブゲノムプロモーター（Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683）；イネのツングロ杆状ウイルス（RTBV）（前記は、強力な師部特異的レポータ遺伝子発現を駆動するそのプロモーターにより感染したイネの師部細胞でのみ複製する）；キャッサバ葉脈モザイクウイルス（CVMV）プロモーター（前記は、管状エレメント、葉の葉肉細胞および根の先端でもっとも強い活性を有する）（Verdaguer（1996） Plant Mol. Biol. 31:1129-1139）。
あるいは、植物プロモーターは、特定の組織、器官または細胞タイプでプロテアーゼ発現核酸の発現を誘導するか（すなわち組織特異的プロモーター）、またはそれとは別により厳密な環境もしくは生育制御下に置くか、または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気性条件、上昇温度、光の存在、化学物質／ホルモンの噴霧が含まれる。例えば、本発明は、トウモロコシの乾燥誘導性プロモーター（Busk (1997) 上掲書）；ジャガイモの低温、乾燥および高塩誘導性プロモーター（Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909）を取り込んでいる。
【００６１】
組織特異的プロモーターは、組織内の一定の時間枠内の生育段階内でのみ転写を促進することができる。例えば以下を参照されたい：Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800（前記はアラビドプシスのLEAFY遺伝子のプロモーターの性状を明らかにする）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Cardon (1997) Plant J 12:367-377（前記は、A.タリアーナ（thaliana）の花の分裂組織の実体遺伝子AP1のプロモーター領域中の保存配列モチーフを認識する転写因子SPL3について記載している）；およびMandel (1995) Plant Molecular Biology, vol 29, pp995-1004（前記は分裂組織プロモーターeIF4について記載している）。特定の組織のライフサイクルの全体を通して活性を有する組織特異的プロモーターを用いることができる。ある特徴では、本発明の核酸は、主としてワタの繊維細胞でのみ活性を示すプロモーターに機能的に連結される。ある特徴では、本発明の核酸は、例えば上掲書（Rinehart （1996））に記載されたように、主としてワタの繊維細胞の伸張期間に活性を示すプロモーターに機能的に連結される。核酸は、ワタの繊維細胞で優先的に発現されるようにFbl2A遺伝子プロモーターに機能的に連結することができる（上掲書）。さらに以下を参照されたい：John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773；John et al., US Patent No. 5,608,148, 5,602,321（前記にはワタの繊維特異的プロモーターおよびトランスジェニックな綿の木を構築する方法が記載されている）。根特異的プロモーターもまた本発明の核酸の発現に用いられる。根特異的プロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーターが含まれる（DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60）。本発明の核酸の発現に用いることができる他のプロモーターには、例えば胚珠特異的、胚特異的、内胚葉特異的、珠皮特異的、種子外皮特異的プロモーター、または前記のいくつかの組合せ；葉特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Busk (1997) Plant J. 11:1285-1295、前記にはトウモロコシの葉特異的プロモーターが記載されている）；アグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）由来のORF13プロモーター（前記は根で高い活性を示す（上掲書（Hansen, 1997）を参照されたい））；トウモロコシの花粉特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Guerrero (1990) Mol. Gen. Gnet. 224:161-168）；果実成熟時、葉の老化および離脱時に活性を示すトマトのプロモーター（前記より低頻度で花のプロモーターも用いることができる）（例えば以下を参照されたい：Blume (1997) Plant J. 12:731-746）；ジャガイモのSK2遺伝子由来のめしべ特異的プロモーター（例えば以下を参照されたい：Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425-431）；エンドウマメのBlec4遺伝子（前記はトランスジェニックアルファルファの栄養および生殖茎頂の表皮組織で活性を示し、活発に生長しているシュートまたは繊維の表皮層で外来遺伝子を発現するために有用である）；珠皮特異的BEL1遺伝子（例えば以下を参照されたい：Reiser (1995) Cell 83:735-742, GenBank No. U39944）；および／または米国特許第5,589,583号（Klee）（分裂組織および／または急速に分裂している細胞で高レベルの転写を付与することができる植物プロモーターについて記載）のプロモーターが含まれる。
【００６２】
また別には、植物ホルモン（例えばオーキシン）の暴露に際して誘導することができる植物プロモーターを用いて本発明の核酸を発現させる。例えば、本発明は以下を用いることができる：ダイズ（Glycine max L.）のオーキシン応答エレメントE1プロモーター断片（AuxRE）（Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407）；オーキシン応答アラビドプシスGST6プロモーター（サリチル酸および過酸化水素にも反応性である）（Chen (1996) Plant J. 10:955-966）；タバコのオーキシン誘導parCプロモーター（Sakai (1996) 37:906-913）；植物ビオチン応答エレメント（Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937）；およびストレスホルモンアブシジン酸に応答するプロモーター（Sheen (1996) 274:1900-1902）。
本発明の核酸はまた、植物に適用可能な化学的試薬（例えば農薬または抗生物質）の暴露に際して誘導することができる植物プロモーターに機能的に連結することもできる。例えば、トウモロコシのIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド農薬の毒性緩和剤によって活性化される）を用いることができる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）。種々の農薬の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、茎頂分裂組織での発現を含む別個の遺伝子発現パターンが誘導される。コード配列は、例えばテトラサイクリン誘導プロモーター（例えばアヴェナ・サティヴァL.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）を含むタバコのトランスジェニック植物で開示されたとおり）、またはサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下に置くことができる。化学的に（例えばホルモンまたは殺虫剤によって）誘導されるプロモーター（すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に対し応答するプロモーター）を用いて、本発明のポリペプチドの発現を植物の発育の特定の段階で誘導することができる。したがって、本発明はまた、その宿主域が標的植物種に限定される、作物の任意の発育段階で誘導可能な本発明のポリペプチドをコードする誘導性遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供する。
【００６３】
当業者には、組織特異的植物プロモーターは標的組織以外の組織で機能可能に連結された配列の発現を駆動することができることは理解されよう。したがって、組織特異的プロモーターは、標的組織または細胞タイプで優先的に発現を駆動させることができるが、他の組織でもまた同様にある程度の発現を誘導することができるプロモーターである。
本発明の核酸はまた、化学的試薬に暴露されたときに誘導される植物プロモーターに機能できるように連結することができる。前記の試薬には、例えば農薬、合成オーキシンまたは抗生物質が含まれる。前記はトランスジェニック植物に適用、例えば噴霧することができる。本発明のプロテアーゼ生成核酸の誘導性発現によって、栽培者は最適プロテアーゼ発現および／または活性を有する植物を選別することができる。植物の部分の発現はしたがって制御可能である。このようにして、本発明は、植物および植物の部分の収穫を促進する手段を提供する。例えば、種々の実施態様では、トウモロコシのIn2-2プロモーター（ベンゼンスルホンアミド農薬の毒性緩和剤によって活性化される）が用いられる（De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577）。種々の農薬の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、茎頂分裂組織での発現を含む別個の遺伝子発現パターンが誘導される。本発明のコード配列は、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えばアヴェーナ=サティヴァL.（エンバク）のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子（Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473）を含むタバコのトランスジェニック植物で開示されたとおり）、またはサリチル酸応答エレメント（Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324）の制御下に置くことができる。
いくつかの特徴では、適切なポリペプチド発現にはコード領域の3'末端にポリアデニル化領域が必要とされるであろう。ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物（または動物またはその他の）遺伝子、またはアグロバクテリウムのT-DNAの遺伝子に由来することができる。
【００６４】
発現ベクターおよびクローニングビヒクル：本発明は、本発明の核酸、例えば本発明のプロテアーゼをコードする配列を含む発現ベクターおよびクローニングビヒクルを提供する。本発明の発現ベクターおよびクローニングビヒクルは、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびSV40の誘導体）、P1系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および問題の特定宿主（例えばバチルス、アスペルギルスおよび酵母）に特異的な他の任意のベクターが含まれる。本発明のベクターには染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列が含まれる。多くの適切なベクターが当業者に知られており、市場で入手できる。典型的なベクターには以下が含まれる：細菌系：pＱＥベクター（Qiagen）、pBluescriptプラスミド、pＮＨベクター、ラムダ-ZAPベクター（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核細胞系：pXT1、pSG5（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかしながら、他の任意のプラスミドまたは他のベクターもまた、それらが宿主内で複製可能で、さらに生存可能である限り用いることができる。低コピー数または高コピー数ベクターを本発明に関して用いることができる。
発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終了因子を含むことができる。発現を増幅させるために、ベクターはまた適切な配列を含むことができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、必要な任意のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5'フランキング非翻訳配列を含むことができる。いくつかの特徴では、SV40スプライシングおよびポリアデニル化部位に由来するDNA配列を用いて、必要な非転写遺伝子エレメントを提供することができる。ある特徴では、発現ベクターは1つまたは2つ以上の選別可能なマーカー遺伝子を含み、前記ベクターを含む宿主細胞の選別を可能にする。そのような選別可能マーカーには、真核細胞培養に対してはジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子またはネオマイシン耐性を付与する遺伝子、大腸菌ではテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を付与する遺伝子、およびビール酵母菌（S. cerevisiae）TRP1遺伝子が含まれる。プロモーター領域は、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（CAT）ベクターまたは選別可能なマーカーを有する他のベクターを用いて、所望される任意の遺伝子から選択できる。
【００６５】
真核細胞でポリペプチドまたはその断片を発現させるためのベクターはまた発現レベルを高めるためにエンハンサーを含むことができる。エンハンサーはDNAのcis-作用性エレメントであり、通常は長さが約10から約300bpであってプロモーターに作用してその転写を高める。例には、複製起点の後期側100bpから270bpにあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
核酸配列は多様な方法によってベクターに挿入することができる。一般的には、前記配列は、適切な制限エンドヌクレアーゼによる挿入物およびベクターの消化に続いてベクター内の所望の位置に連結される。また別には、挿入物とベクターの両方の平滑端を連結することもできる。多様なクローニング技術が当業界で公知であり、例えばAusubel and Sambrookに記載されている。そのような技術および他の技術は当業者の技術範囲内であろう。
ベクターはプラスミド、ウイルス粒子またはファージの形態を有し得る。他のベクターには染色体配列、非染色体配列および合成DNA配列、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージDNAの組合せに由来するベクター、ウイルスDNA、例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスが含まれる。原核細胞および真核細胞宿主で使用できる多様なクローニングベクターおよび発現ベクターは例えばSambrookによって記載されている。
使用できる具体的な細菌ベクターには、以下の既知のクローニングベクターの遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドが含まれる：pBR322（ATCC37017）、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、GEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）、pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pD10、psiX174Bluescript IIKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）、pKK232-8およびpCM7。具体的な真核細胞ベクターには、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（Pharmacia）が含まれる。しかしながら他のベクターのいずれも前記が宿主細胞内で複製可能で生存可能である限り使用することができる。
【００６６】
本発明の核酸は、発現カセット、ベクターまたはウイルスで発現させることができ、さらに一過性または安定的に植物細胞および種子で発現させることができる。ある典型的な一過性発現系はエピソーム発現系、例えばカリフラワーモザイクウイルス（CaMV）のウイルスRNA（スーパーコイルDNAを含むエピソームミニ染色体の転写によって核内で生成される）を用いる（例えば以下を参照されたい：Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637）。また別には、コード配列（すなわち本発明の完全な配列または部分配列）を植物宿主細胞ゲノムに挿入して宿主染色体DNAの一体化部分を形成することができる。センスまたはアンチセンス転写物を前記のようにして発現させることができる。本発明の核酸由来の配列（例えばプロモータまたはコード配列）を含むベクターは植物細胞または種子に選別可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むことができる。例えば、殺菌物質耐性、特に抗生物質耐性（例えばカナマイシン、G418、ブレオマイシン、ヒグロマイシンに対する耐性）、または農薬耐性（例えばクロロスルフロンまたはバスタに対する耐性）をコードすることができる。
植物で核酸およびタンパク質を発現することができる発現ベクターは当業界で既知で、例えばアグロバクテリウム亜種、ジャガイモのウイルスX（例えば以下を参照されたい：Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3648）、タバコモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Casper (1996) Gene 173:69-73）、トマトのブッシースタントウイルス（例えば以下を参照されたい：Hillman (1989) Virology 169:42-50）、タバコのエッチウイルス（例えば以下を参照されたい：Dolja (1997) Microbiol. Immunol. 37:471-476）、カリフラワーモザイクウイルス（例えば以下を参照されたい：Cecchini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101）、トウモロコシAc/Ds転移因子（例えば以下を参照されたい：Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194）、およびトウモロコシサプレッサー-ミューテータ（Spm）転移因子（例えば以下を参照されたい：Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717-725）、並びに前記の誘導体が含まれよう。
ある特徴では、発現ベクターは、2つの生物で（例えば、発現のために哺乳動物細胞または昆虫細胞で、クローニングおよび増幅のために原核細胞で）維持され得るように2つの複製系を含むことができる。さらにまた、組込み発現ベクターについては、発現ベクターは宿主細胞ゲノムと相同な少なくとも1つの配列を含むことができる。発現ベクターは、前記発現構築物にフランキングする2つの相同な配列を含むことができる。組み込みベクターは、ベクター内に含まれる適切な相同配列を選択することによって固有の遺伝子座に誘導することができる。組込みベクターのための構築物は当業界でよく知られている。
本発明の発現ベクターはまた選別可能なマーカー遺伝子を含み、形質転換された細菌株の選別を可能にすることができる。前記遺伝子は、例えば細菌を薬剤（例えばアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリン）に耐性にする遺伝子である。選別可能マーカーにはまた、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路の遺伝子が含まれる。
【００６７】
宿主細胞および形質転換細胞：本発明はまた、本発明の核酸配列、例えば本発明のプロテアーゼをコードする配列、または本発明のベクターを含む形質転換細胞を提供する。前記宿主細胞は、当業者に既知の任意の宿主細胞であって、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞が含まれるであろう。典型的な細菌細胞には、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）並びにシュードモナス、ストレプトミセスおよびスタフィロコッカス属の種々の種が含まれる。典型的な昆虫細胞には、ドロソフィラS2およびスポドプテラSf9が含まれる。典型的な動物細胞にはCHO、COSまたはボウズ=メラノーマまたは任意のマウスおよびヒト細胞株が含まれる。適切な宿主を選択することは当業者の技術範囲内である。多様な高等植物種を形質転換する技術はよく知られており、技術文献および学術文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477；米国特許5,750,870号。
ベクターは、多様な任意の技術を用いて前記宿主細胞に導入することができる。前記技術には、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはTi媒介遺伝子伝達が含まれる。具体的な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる（L. Davis, M. Dibner, I. Battey, Basic Methods in Molecular Biology, (1986)）。
【００６８】
ある特徴では、本発明の核酸またはベクターはスクリーニングのために細胞に導入される。したがって前記核酸はその後の核酸の発現に適した態様で細胞に導入される。導入方法は、主として標的細胞タイプによって決定される。典型的な方法にはCaPO4沈殿、リポソーム融合、リポフェクション（例えばLIPOFECTIN（登録商標））、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。候補核酸は宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれるか（例えばレトロウイルス導入による）、または細胞質に一過性もしくは安定的に存在することができる（すなわち慣例的なプラスミドを使用し、標準的な調節配列、選別マーカーなどを利用する）。多くの医薬的に重要なスクリーニングではヒトまたはモデル動物細胞の標的が要求されるので、そのような標的にトランスフェクションすることができるレトロウイルスが好ましい。
適切な場合には、操作によって作出した宿主細胞は、プロモーターの活性化に適切なように改変した通常の栄養培地で培養し、形質転換体を選別するか、または本発明の遺伝子を増幅することができる。適切な宿主株を形質転換し、さらに適切な細胞密度に前記宿主株を増殖させた後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって誘導し、さらに追加の期間培養して所望のポリペプチドまたはその断片を産生させることができる。
細胞を遠心分離によって採集し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために維持することができる。タンパク質の発現に用いた微生物細胞は任意の一般的な方法によって破壊することができる。前記方法には、凍結融解の繰り返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。前記のような方法は当業者にはよく知られている。発現ポリペプチドまたはその断片は、組換え細胞培養から以下を含む方法によって回収および精製することができる：硫安またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性反応によるクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー。タンパク質の再折りたたみ工程は、ポリペプチドの構造の完成に際して必要に応じて用いることができる。所望の場合には、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
【００６９】
種々の哺乳動物細胞培養系もまた組換えタンパク質の発現に用いることができる。哺乳動物発現系の例には、サル腎線維芽細胞のCOS-7株および、コンパチブルベクターからタンパク質を発現させることができる他の細胞株、例えばC127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞株が含まれる。
宿主細胞内の構築物を通常の態様で用い、前記組換え配列によってコードされる遺伝子生成物を産生させることができる。組換え体の作製方法で用いる宿主細胞に依存して、前記ベクターを含む宿主細胞により産生されるポリペプチドはグリコシル化されることも、グリコシル化されないこともある。本発明のポリペプチドはまた最初のメチオニン残基を含んでいることも含まないこともある。
無細胞翻訳系もまた本発明のポリペプチドの製造に利用することができる。無細胞翻訳系は、前記ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含むDNA構築物から転写されたmRNAを用いることができる。いくつかの特徴では、前記DNA構築物は、in vitro転写反応実施前に直鎖化することができる。続いて適切な無細胞翻訳抽出物（例えばウサギ網状赤血球抽出物）とともに前記転写mRNAをインキュベートし、所望のポリペプチドまたはその断片を生成する。
発現ベクターは1つまたは2つ以上の選別可能な遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞の選別用表現型特質（真核細胞の場合にはジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、大腸菌では例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供することができる。
【００７０】
核酸の増幅：本発明の実施では、本発明の核酸および本発明のポリペプチドをコードする核酸または本発明の改変核酸は増幅によって再生させることができる。増幅はまた本発明の核酸のクローニングまたは改変にも用いることができる。したがって、本発明は、本発明の核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供する。当業者は、これら配列の任意の部分またはその完全長のための増幅プライマー配列対を設計することができる。
ある特徴では、本発明は、本発明のプライマー対によって増幅される核酸を提供する。前記プライマー対は、本発明の核酸の最初（5'側）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30またはそれ以上の残基、または（例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254の）相補鎖の最初（5'側）の約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25残基によって示されるプライマー対である。
【００７１】
本発明は、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供し、前記プライマー対は、本発明の配列を含む核酸またはその断片もしくは部分配列を増幅させることができる。前記増幅プライマー配列対の一方またはその各々は、前記配列の少なくとも約10から50の連続する塩基、または前記配列の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。本発明は、第一のメンバーおよび第二のメンバーを含む増幅プライマー対を提供し、前記第一のメンバーは、本発明の核酸の最初（5'側）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25残基によって示される配列を有し、さらに第二のメンバーは、前記第一のメンバーの相補鎖の最初（5'側）の約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25残基によって示される配列を有する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いる増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成されるプロテアーゼを提供する。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いる増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってプロテアーゼを製造する方法を提供する。ある特徴では、前記増幅プライマー対は、ライブラリー（例えば遺伝子ライブラリー、例えば環境ライブラリー）の核酸を増幅させる。
増幅反応はまたサンプル中の核酸の量（例えば細胞サンプル中のメッセージの量）の定量、核酸の標識（例えば前記核酸をアレイまたはブロットに適用する）、前記核酸の検出、またはサンプル中の特定の核酸量の定量に用いることができる。本発明のある特徴では、細胞またはcDNAライブラリーから単離したメッセージが増幅される。当業者は適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計することができる。増幅方法はまた当業界でよく知られており、例えば以下が含まれる：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば以下を参照されたい：PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, ed. Innis, Academic Press, NY (1990); PCR Strategies (1995) ed. Innis, Academic Press, Inc., NY）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（例えば以下を参照されたい：Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117）、転写増幅（例えば以下を参照されたい：Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173）、およびセルフサステイン配列複製（例えば以下を参照されたい：Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874）、Qベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）、自動Q-ベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば以下を参照されたい：Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271）および他のRNAポリメラーゼ媒介技術（例えば以下を参照されたい：NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）。さらにまた以下を参照されたい：Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; US Patent Nos. 4,683,195および4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564。
【００７２】
配列同一性の程度の決定
本発明は、本発明の例示的な核酸（例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254、並びに配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144および／または配列番号:147をコードする核酸）と少なくとも約50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550またはそれより多い残基領域にわたって少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有する配列を含む核酸を提供する。本発明は、本発明の例示的なポリペプチドと少なくとも約50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％���59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い、または完全な（100％）配列同一性を有する配列を含むポリペプチドを提供する。配列同一性（相同性）の程度は、任意のコンピュータプログラムおよび付属のパラメーター（本明細書に記載されたもの、例えばBLAST2.2.2またはFASTA ver. 3.0t78を含む）を初期設定パラメーターとともに用いて決定することができる。
【００７３】
相同な配列にはまたRNA配列が含まれる（RNA配列では前記核酸配列のチミンはウリジンに置換されている）。相同な配列は本明細書に記載されている方法のいずれかを用いて入手できるが、またシークェンシングエラーの修正から得ることができる。本明細書に示される核酸配列は、伝統的な一文字様式（例えば以下を参照されたい：Lubert Stryer, Biochemistry, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York）または配列内のヌクレオチドの実体を記録する他の任意の様式で表現することができることは理解されよう。
本発明のこの特徴では本明細書で特定した種々の配列比較アルゴリズムが用いられる。タンパク質および／または核酸配列の同一性（相同性）は、当業界で公知の多様な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTAおよびCLUSTALWが含まれるが、ただしこれらに限定されない（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448, 1988; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680, 1994; Higgins et al., Methods Enzymol. 266:383-402, 1996; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990; Altschul et al., Nature Genetics 3:266-272, 1993）。
【００７４】
相同性または同一性は配列分析ソフト（例えばジネティクスコンピュータグループ（Universty of Wisconsin Bitechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）の配列分析ソフトウェアパッケージ）を用いて測定できる。そのようなソフトは、種々の欠失、置換および他の改変に対して相同性の程度を決めることによって類似の配列を見つける。2つまたは3つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して“相同性”および“同一性”という用語は、比較ウィンドウまたは指定の領域上で、任意の数の配列比較アルゴリズムを使用するかまたは手動アラインメントおよび目視精査による測定にしたがって最大一致を求めて比較およびアラインメントを実施したとき、同じであるかまたは特定のパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じである2つまたは3つ以上の配列を指す。配列比較の場合、一方の配列は参照配列（例えば本発明の配列）として機能し、前記に対してテスト配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いるとき、テスト配列および参照配列はコンピュータに入力され、サブ配列同等物が必要な場合に指定され、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。規定値プログラムパラメーターを用いることができるが、また別のパラメーターを指定することもできる。続いて配列比較アルゴリズムは、前記のプログラムパラメーターを基に参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００７５】
本明細書で用いられる“比較ウィンドウ”は、任意数の連続残基セグメントに対する参照を含む。例えば本発明の別の特徴では、本発明の例示的なポリペプチドまたは核酸配列の20から完全長の間のいずれかの範囲の連続残基が、同じ数の連続した箇所の参照配列と前記2つの配列を最適にアラインメントした後で比較される。参照配列が本発明の例示的なポリペプチドまたは拡散配列と必要な配列同一性を有するならば、例えば50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い配列同一性を本発明の配列に対して有するならば、前記配列は本発明の範囲に包含される。また別の実施態様では、約20から600、約50から200、および約100から150の範囲の部分配列が、同じ数の連続した箇所の参照配列と前記2つの配列を最適にアラインメントした後で比較される。配列比較のアラインメントを実施する方法は当業界では既知である。配列比較の最適アラインメントは、例えばSmith & Watermanの局所相同性アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)）によって、Needleman & Wunschの相同性アラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443 (1970)）によって、Pearson & Lipmanの類似性検索方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)）によって、前記アルゴリズムのコンピュータによる実施によって（GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または手動アラインメントと目視精査によって実施できる。相同性または同一性決定のための他のアルゴリズムには、BLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）の他に、ALIGN、AMAS（Analysis of Multiply Aligned Sequences）、AMPS（Protein Multiple Sequence Alignment）、ASSET（Aligned Segment Statistical Evaluation Tool）、BANDS、BESTSCOR、BIOSCAN（Biological Sequence Comparative Analysis Node）、BLIMPS（BLocks IMProved Searcher）、FASTA、Intervals & Points、BMB、CLUSTALV、CLUSTALW、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Watermanアルゴリズム、DARWIN、ラスベガスアルゴリズム、FNAT（Forced Nucleotide Alignment Tool）、フレームアライン、フレームサーチ、DYNAMIC、FILTER、FSAP（Fristensky Sequence Analysis Package）、GAP（Global Alignment Program）、GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC（Sensitive Sequence Comparison）、LALIGN（Local Sequence Alignment）、LCP（Local Content Program）、MACAW（Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench）、MAP（Multiple Alignment Program）、MBLKP、MBLKN、PIMA（Pattern-Induced Multi-Sequence Alignment）、SAGA（Sequence Alignment by Genetic Algorithm）およびWHAT-IFが含まれる。前記のようなアラインメントプログラムはまたゲノムデータベースのスクリーニングに用いられ、実質的に同一の配列をもつポリヌクレオチド配列を同定することができる。多数のゲノムデータベースが利用可能で、例えばヒトゲノムの実質的部分がヒトゲノム配列決定プロジェクト（Gibbs, 1995）の一部分として利用可能である。いくつかのゲノムの配列、例えばM. ジェニタリウム（genitalium）（Fraser et al., 1995）、M. ジャナスキイー（jannaschii）（Bult et al., 1996）、H. インフルエンザ（Fleischmann et al. 1995）、大腸菌（Blattner et al. 1997）、酵母（S. cerevisiae）（Mewes et al. 1997）およびD.メラノガスター（melanogaster）（Adams et al., 2000）の配列が決定された。顕著な進展がモデル生物（例えばマウス、C. エレガンスおよびアラビドプシス種（Arabidopsis sp））のゲノム配列決定で達成された。いくつかの機能的情報の注釈をもつゲノム情報を含むデータベースが種々の機関で維持されており、インターネットでアクセスすることができる。
【００７６】
BLAST、BLAST2.0およびBLAST2.2.2アルゴリズムもまた本発明の実施に用いることができる。前記アルゴリズムは例えば以下に記載されている：Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410。BLAST分析を実施するソフトは、National Center for Biotechnology Informationから公開されている。このアルゴリズムは、審査配列内の長さがWの短いワードを同定することによって高スコアをもつ配列対（HSP）をまず初めに同定することを必要とする。前記は、データベース配列中の同じ長さを持つワードとアラインメントを実施したとき、一致するかまたはいくらかの正の値をもつ閾値スコアTの条件を満たす。Tは近傍ワードスコア閾値と称される（Altschul (1990)上掲書）。これらの最初の近傍ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるための検索開始のシードとして機能する。前記ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り各配列の両方向に沿って伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（一致残基対のための褒賞スコア、常に＞0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ下降したとき；累積スコアが、1つまたは2つ以上の負のスコアを与える残基アラインメントの累積のために0またはそれ以下になったとき；またはどちらかの配列の末端に達したとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは前記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、規定値として11のワード長、10の期待値（E）、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、3のワード長および10の期待値（E）、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖の比較を用いる。BLASTアルゴリズムはまた2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば以下を参照されたい：Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性測定の1つは最小合計確率（P(N)）であり、前記は2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率を示す。例えば、テスト核酸と参照核酸の比較で最小合計確率が約0.2未満、好ましくは約0.01未満、もっとも好ましくは約0.001未満であるならば、前記核酸は参照配列と類似であると考えられる。ある特徴では、タンパク質および核酸配列相同性はベーシック=ローカル=アラインメント=サーチ=ツール（Basic Local Alignment Search Tool, “BLAST”）を用いて評価される。例えば、5つの特別なBLASTプログラムを用いて以下のタスクを実施することができる：（1）BLASTPおよびBLAST3はアミノ酸の審査配列をタンパク質配列データベースと比較する；（2）BLASTNはヌクレオチドの審査配列をヌクレオチド配列データベースと比較する；（3）BLASTXは審査ヌクレオチド配列（その両方の鎖）の概念的6フレーム翻訳生成物をタンパク質配列データベースと比較する；（4）TBLASTNは審査タンパク質配列（両方の鎖）を全ての6つの読み枠で翻訳されるヌクレオチド配列データベースと比較する；さらに（5���TBLASTXはヌクレオチド審査配列の6枠翻訳をヌクレオチド配列データベースの6枠翻訳と比較する。BLASTプログラムは類似のセグメントを同定することによって相同な配列を同定する。前記セグメントは本明細書では審査アミノ酸または核酸配列とテスト配列間の“高スコアセグメントペア”と称され、好ましくはタンパク質または核酸配列データベースから得られる。高スコアセグメントペアは好ましくは、スコアリングマトリックス（その多くは当業界で公知である）によって特定される（すなわちアラインメントが実施される）。好ましくは、使用されるスコアリングマトリックスはBLOSUM62マトリックスである（Gonnet et al., Science 256:1443-1445 (1992); Henikoff and Henikoff, Proteins 17:49-61 (1993)）。好ましさは劣るが、PAMまたはPAM250もまた用いることができる（例えば以下を参照されたい：Schwartz and Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation）。
【００７７】
本発明のある特徴では、核酸が本発明の範囲内のものであるために必要な配列同一性を有するか否かを決定するためにNCBI BLAST 2.2.2プログラムが用いられる。規定値オプションはblastpである。BLAST 2.2.2プログラムには約38の設定オプションがある。
本発明のこの典型的な特徴では、全ての規定値がフィルタリング設定規定値を除いて用いられる（すなわち全てのパラメーターはフィルタリング（前記はOFFに設定される）を除いて規定値に設定される）。フィルタリングは規定値の代わりに“-FF”設定が用いられ、前記はフィルタリングを無効にする。規定値のフィルタリングはしばしば、配列の長さが短いためにKarlin-Altschulバイオレーションを生じる。
本発明のこの典型的な特徴で用いられる規定値には以下が含まれる：
“低複雑度用フィルター：ON
＞ワードサイズ：3
＞マトリックス：Blosum62
＞ギャップコスト：存在する場合：11
＞ギャップが伸長する場合：1”
他の規定値は以下のとおりである：低複雑度用フィルターはOFF、タンパク質のためのワードサイズは3、BLOSUM62マトリックス、ギャップ存在のペナルティーは-11、およびギャップ伸長のペナルティーは-1。
典型的なNCBI BLAST2.2.2プログラム設定は下記の実施例１に示されている。“-W”オプションの規定値は0であることに留意されたい。これは、設定されなければワードサイズの規定値はタンパク質で3、ヌクレオチドで11であることを意味する。
【００７８】
コンピュータシステムおよびコンピュータプログラム製品
配列同一性、構造的相同性、モチーフなどをコンピュータシステムで決定および同定するために、コンピュータによって読み取りさらにアクセスすることができる任意の媒体上に本発明の配列を保存、記録し、さらに操作することができる。したがって、本発明は、本発明の核酸およびポリペプチド配列を記録または保存させたコンピュータ、コンピュータシステム、コンピュータ読み出し可能媒体、コンピュータプログラム製品などを提供する。本明細書で用いられる“記録”および“保存”という用語はコンピュータ媒体に情報を保存するプロセスを指す。当業者は、コンピュータ読み出し可能媒体に情報を記録するための任意の公知の方法を容易に利用して、本発明の1つまたは2つ以上の核酸および／またはポリペプチド配列を含む製品を製造することができる。
本発明のまた別の特徴は、本発明の少なくとも1つの核酸および／またはポリペプチド配列が記録されているコンピュータ読み出し可能媒体である。コンピュータ読み出し可能媒体には、磁気により読み出し可能な媒体、光学的に読み出し可能な媒体、電子的に読み出し可能な媒体および磁気/光学媒体が含まれる。例えば前記コンピュータ読み出し可能媒体はハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、CD-ROM、デジタル多用途ディスク（DVD）、ランダムアクセスメモリー（RAM）、または読み出し専用メモリー（ROM）の他、当業者に公知の他のタイプの媒体であろう。
本発明の特徴には、システム（例えばインターネット使用システム）、特にコンピュータシステムが含まれる。前記は本明細書に記載されている配列および配列情報を保存し、これを操作する。コンピュータシステム（100）の一例が図1の組み立て分解図に示されている。本明細書で用いられる“コンピュータシステム”は、本発明のヌクレオチドまたはポリペプチド配列の分析に用いられるハードウェア構成部分、ソフトウェア構成部分およびデータ保存構成部分を指す。コンピュータシステム（100）は、配列データを処理し、これにアクセスし、さらに前記を操作するプロセッサーを含むことができる。プロセッサ（105）は既知のタイプの中央演算ユニットのいずれか、例えばインテル社（Intel Corporation）のペンチアムIIIまたはサン（Sun）、モトローラ（Motorola）、コンパック（Compaq）、AMDまたはインターナショナル・ビジネス・マシーン（IBM）の類似のプロセッサーであろう。コンピュータシステム（100）は汎用システムであり、前記はプロセッサー（105）および1つまたは2つ以上のデータ保存のための内部データ保存成分（110）、および前記データ保存成分に保存されたデータを検索するための1つまたは2つ以上のデータ検索装置を含む。従来の利用可能なコンピュータシステムのいずれも適切であることは当業者には理解されよう。
【００７９】
ある特徴では、コンピュータシステム（100）は、バス（メインメモリー（115）（好ましくはRAMとして提供されている）に連結されている）に連結されたプロセッサー（105）、および1つまたは2つ以上の内部データ保存装置（110）（例えばハードドライブおよび／またはそれにデータが記録される他のコンピュータ読み出し可能媒体）を含む。コンピュータシステム（100）はさらに、内部データ保存装置（110）のデータを読み取るための1つまたは2つ以上のデータ検索装置（118）を含む。データ検索装置（118）は、例えばフロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、または遠隔データ保存システムに連結することができる（例えばインターネットを介して）モデムであろう。いくつかの実施態様では、内部データ保存装置（110）は取り外し可能なコンピュータ読み出し可能媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどで、制御ロジックおよび／またはそれに記録されたデータを含んでいる。コンピュータシステム（100）は便利には、データ検索装置にいったん挿入されたデータ保存成分から前記制御ロジックおよび／またはデータを読み出すための適切なソフトを含むか、または前記ソフトによってプログラムされる。コンピュータシステム（100）は、コンピュータのユーザーに出力結果を表示するために用いられるディスプレー（120）を含む。コンピュータシステム（100）は他のコンピュータシステム（125a−c）とネットワークまたは広域ネットワークで連結され、コンピュータシステム（100）への中央アクセスを提供することができることは留意されるべきであろう。本発明のヌクレオチドまたはアミノ酸配列にアクセスし前記を処理するためのソフトは実行時にはメインメモリー（115）に存在するであろう。いくつかの特徴では、コンピュータシステム（100）はさらに本発明の核酸配列を比較するための配列比較アルゴリズムを含むことができる。前記アルゴリズムおよび配列はコンピュータ読み出し可能媒体に保存することができる。“配列比較アルゴリズム”は、データ保存手段内に保存されている他のヌクレオチド配列および／または化合物とヌクレオチド配列を比較するためにコンピュータシステム（100）に（端末または遠隔端末から）提供される1つまたは2つ以上のプログラムを指す。例えば、配列比較アルゴリズムは、コンピュータ読み出し可能媒体に保存されている本発明のヌクレオチド配列をコンピュータ読み出し可能媒体に保存されている参照配列と比較し、相同性または構造モチーフを決定することができる。
【００８０】
上記のアルゴリズムとともに用いられるパラメーターは、配列の長さおよび調べられる相同性の程度に応じて適用することができる。いくつかの特徴では、前記パラメーターは、ユーザーの指示がない場合に前記アルゴリズムによって用いられる規定値パラメーターであろう。図2は、新規なヌクレオチドまたはタンパク質配列を配列データベースと比較して、新規な配列とデータベースの配列との間の相同性レベルを決定するためのプロセス（200）の1つの特徴を示すフローチャートである。前記データベースの配列は、コンピュータシステム（100）内に保存された個人的データベースでも、公的データベース（例えばインターネットを介して利用可能なGENBANK）でもよい。プロセス（200）は開始状態（201）で始まり、続いて、比較されるべき新規な配列がコンピュータシステム（100）内のメモリーに保存される状態（202）に移行する。上記で考察したように、前記メモリーは任意のタイプのメモリー（RAMまたは内部保存装置を含む）であろう。続いてプロセス（200）は状態（204）に移行し、ここで配列データベースが分析および比較のために開かれる。続いてプロセス（200）は、データベースに保存されている第一の配列がコンピュータのメモリーに読み出される状態（206）に移行する。続いて比較が状態（210）で実施され、第一の配列が第二の配列と同じであるか否かが決定される。この工程は、新規な配列とデータベースの第一の配列との間の正確な比較の実施に限定されないことに留意することが重要である。2つのヌクレオチド配列またはタンパク質配列を（たとえそれらが同一ではなくても）比較するよく知られた方法を当業者は心得ている。例えばギャップを1つの配列に導入してこれら2つのテスト配列間の相同性レベルを高めることができる。比較時にギャップまたは他の特徴を配列に導入するか否かを制御するパラメーターは通常はコンピュータシステムのユーザーによって入力される。いったん2つの配列の比較が状態（210）で実施されたら、決定の状態（210）で前記2つの配列が同じか否かの決定が下される。もちろんのこと、“同じ”という用語は完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーター内にある配列は、プロセス（200）で“同じ”と示され、プロセス（200）は状態（214）に移行する（前記状態でデータベース由来の配列の名称がユーザーに表示される）。前記状態はディスプレーされた名称の配列が入力した相同性の特徴を満たすことをユーザーに知らせる。保存配列の名称がユーザーに表示されたら、プロセス（200）は、それ以上の配列がデータベースに存在するか否かの決定が下される決定状態（218）に移行する。それ以上データベースに配列が存在しない場合には、プロセス（200）は終了状態（220）で終了する。しかしながらデータベースにさらに配列が存在する場合は、プロセス（200）は状態（224）に移行し、前記状態でポインターは、データベースの次の配列に移行し前記新たな配列と比較することができる。このようにして、新たな配列はアラインメントを実施されデータベースの各配列と比較される。配列が相同でないという決定が決定状態（212）で下された場合、プロセス（200）は直ちに決定状態（218）に移行し、データベース内に比較されるべ���他の配列が存在するか否かが決定されることは留意されよう。したがって、本発明のある特徴は、プロセッサー、本発明の核酸配列および比較を実施するための配列コンペアラーが保存されているデータ保存装置を含むコンピュータシステムである。前記配列コンペアラーは、比較される配列間の相同性レベルを示すかまたは構造モチーフを同定することができる。前記はまたこれらの核酸コードまたはポリペプチドコードと比較される配列内の構造モチーフを同定することができる。図3は、2つの配列が相同であるか否かを決定するコンピュータシステムのプロセス（250）のある実施態様を示すフローチャートである。プロセス（250）は開始状態（252）で開始し、続いて比較されるべき第一の配列がメモリーに保存される状態（254）に移行する。続いて比較されるべき第二の配列が状態（256）でメモリーに保存される。続いてプロセス（250）は状態（260）に移行し、前記状態（260）で第一の配列中の第一の記号が読み取られ、続いて状態（262）に移行し、前記状態（262）で第二の配列の第一の記号が読み取られる。前記配列がヌクレオチド配列の場合、前記記号は通常はA、T、C、GまたはUのいずれかであることは理解されよう。前記配列がタンパク質配列の場合は、前記記号は一文字のアミノ酸コードであり、それによって第一および第二の配列は容易に比較することができる、続いて2つの記号が同じものであるか否かの決定が決定状態（264）で下される。それらが同じものである場合、プロセス（250）は状態（268）に移行し、前記状態（268）で第一および第二の配列の次の記号が読み取られる。続いて、前記次の記号が同じものであるか否かの決定が下される。それらが同じものである場合には、プロセス（250）は2つの記号が同じでなくなるまでこのループを繰り返す。次の2つの記号が同じでないという決定が下された場合、プロセス（250）は決定状態（274）に移行して、いずれかの配列に読み取られるべき記号がそれ以上存在するか否かが決定される。読み取られるべき記号がそれ以上存在しない場合は、プロセス（250）は状態（276）に移行し、第一および第二の配列間の相同性レベルがユーザーに表示される。相同性レベルは、第一の配列内の記号の総数のうち同じであった配列間の記号の割合を計算することによって決定される。したがって、第二の配列の各全ての記号と最初の100ヌクレオチド配列内の全ての記号のアラインメントが達成された場合、前記相同性レベルは100％であろう。
【００８１】
また別には、前記コンピュータプログラムは本発明の配列と参照配列とを比較して、前記配列が1つまたは2つ以上の位置で異なるか否かを決定することができる。前記プログラムは、リファレンス配列または本発明の配列にいずれかの配列に対して、挿入、欠失または置換されたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さまたはそれらが何であるかを記録することができる。前記コンピュータプログラムは、本発明の配列に対して参照配列が一ヌクレオチド多型性（SNP）を含むか否か、または本発明の配列が公知の配列のSNPを含むか否かを決定するプログラムであってよい。したがって、いくつかの特徴では、前記コンピュータプログラムはSNPを同定するプログラムである。前記方法は上記に述べたコンピュータシステムによって実施することができ、前記方法は図3に示されている。前記方法は、前記コンピュータプログラムを使用することにより本発明の配列およびリファレンス配列を読み取り、前記コンピュータプログラムにより相違を同定することによって実施することができる。
他の特徴では、前記コンピュータ使用システムは、本発明の核酸またはポリペプチド内の特徴を同定するアイデンティファイヤーを含む。“アイデンティファイヤー”は、核酸配列内のある種の特徴を同定する1つまたは2つ以上のプログラムを指す。例えば、アイデンティファイヤーは核酸配列内の開放読み枠（ORF）を同定するプログラムを含むことができる。図4は、配列内の1つの特徴の存在を検出するためのアイデンティファイヤープロセス（300）のある特徴を示す流れ作業図である。プロセス（300）は開始状態（302）で開始し、続いて状態（304）に移行し、前記状態（304）で特徴についてチェックされるべき第一の配列がコンピュータシステム（100）のメモリー（115）に保存される。プロセス（300）は続いて状態（306）に移行し、前記状態（306）で配列の特徴のデータベースが開かれる。そのようなデータベースは各特徴の属性リストを前記特徴の名称とともに含むであろう。例えば、特徴の名称は“開始コドン”であり、その属性は“ATG”であろう。別の例では、特徴の名称は“TAATAAボックス”であり、特徴の属性は“TAATAA”であろう。そのようなデータベースの例は、ウィスコンシン大学のGenetics Computer Groupによって作製されている。また別には、前記特徴は構造的なポリペプチドモチーフ例えばアルファへリックス、ベータシートまたは機能的ポリペプチドモチーフ、例えば酵素活性部位、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフまたは当業者に公知の他のモチーフであろう。特徴のデータベースが状態（306）で開かれると直ちにプロセス（300）は状態（308）に移行し、前記状態（308）で第一の特徴がデータベースから読み取られる。続いて第一の特徴の属性と第一の配列との比較が状態（310）で実施される。続いて、前記特徴の属性が第一の配列内で見出されるか否かの決定が決定状態（316）で下される。前記属性が見出された場合、プロセス（300）は状態（318）に移行し、前記状態（318）で見出された特徴の名称がユーザーに表示される。続いてプロセス（300）は決定状態（320）に移行し、前記状態（320）でそれ以上の特徴がデータベースに存在するか否かの決定が下される。特徴がそれ以上存在しない場合は、プロセス（300）は終了状態（324）で終了する。しかしながら、それ以上の特徴がデータベースに存在する場合、プロセス（300）は状態（326）で次の配列特徴を読み取り、状態（310）に戻り、前記状態で次の特徴の属性が第一の配列に対して比較される。第一の配列で前記特徴の属性が決定状態（316）で見出されない場合、プロセス（300）は直接決定状態（320）に移行し、特徴がそれ以上データベースに存在するか否かを決定する。したがって、ある特徴では、本発明は開放読み枠（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）を同定するコンピュータプログラムを提供する。
【００８２】
本発明のポリペプチドまたは核酸配列を、種々のデータプロセッサプログラムで多様な様式で保存し操作することができる。例えば配列は、当業者に知られた多様なデータベースプログラム（例えばDB2、SYBASEまたはORACLE）でワードプロセッシングファイル（例えばマイクロソフトワードまたはワードパーフェクト）のテキストとしてまたはアスキーファイルとして保存することができる。さらに、多くのコンピュータプログラムおよびデータベースを配列比較アルゴリズム、アイデンティファイヤー、または本発明の核酸配列と比較するべきリファレンスヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の供給源として用いることができる。本発明の実施に用いられるプログラムおよびデータベースには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：MacPattern（EMBL）、DiscoveryBase（Molecular Applications Group）、GeneMine （Molecular Applications Group）、Look（Molecular Applications Group）、MacLook（Molecular Applications Group）、BLASTおよびBLAST2（NCBI）、BLASTNおよびBLASTX（Alyschul et al. J. Mol. Biol. 215:403, 1990）、FASTA（Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444,1988）、FASTDB (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990)、Catalyst（Molecular Simulations Inc.）、Catalyst/SHAPE（Molecular Simulations Inc.）、Cerius2.DBAccess（Molecular Simulations Inc.）、HypoGen（Molecular Simulations Inc.）、Insight II（Molecular Simulations Inc.）、Discover（Molecular Simulations Inc.）、CHARMｍ（Molecular Simulations Inc.）、Felix（Molecular Simulations Inc.）、DelPhi（Molecular Simulations Inc.）、QuanteMN（Molecular Simulations Inc.）、Homology（Molecular Simulations Inc.）、Modeler（Molecular Simulations Inc.）、ISIS（Molecular Simulations Inc.）、Quanta/Protein Design（Molecular Simulations Inc.）、WebLab（Molecular Simulations Inc.）、WebLab Diversity Explorer（Molecular Simulations Inc.）、Gene Explorer（Molecular Simulations Inc.）、SeqFold（Molecular Simulations Inc.）、MDL Available Chemicals Directoryデータベース、MDL Drug Data Reportデータベース、Comprehensive Medical Chemistryデータベース、Derwent's World Drug Indexデータベース、BioByteMasterFileデータベース、Genbankデータベース。本発明の開示により他の多くのプログラムおよびデータベースも当業者には明白であろう。
上記のプログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、普遍化部位、アルファヘリックス、ベータシートをコードする配列、コードされたタンパク質の分泌を誘導するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関与する配列（例えばホメオボックス）、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位および酵素切断部位が含まれる。
【００８３】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、本発明の典型的な配列（例えば配列番号:1；配列番号:3；配列番号:5；配列番号:7；配列番号:9；配列番号:11；配列番号:13；配列番号:15；配列番号:17；配列番号:19；配列番号:21；配列番号:23；配列番号:25；配列番号:27；配列番号:29；配列番号:31；配列番号:33；配列番号:35；配列番号:37；配列番号:39；配列番号:41；配列番号:43；配列番号:45；配列番号:47；配列番号:49；配列番号:51；配列番号:53；配列番号:55；配列番号:57；配列番号:59；配列番号:61；配列番号:63；配列番号:65；配列番号:67；配列番号:69；配列番号:71；配列番号:73；配列番号:75；配列番号:77；配列番号:79；配列番号:81；配列番号:83；配列番号:85；配列番号:87；配列番号:89；配列番号:91；配列番号:93；配列番号:95；配列番号:97；配列番号:99；配列番号:101；配列番号:103；配列番号:105；配列番号:107；配列番号:109；配列番号:111；配列番号:113；配列番号:115；配列番号:117；配列番号:119；配列番号:121；配列番号:123；配列番号:125；配列番号:127；配列番号:129；配列番号:131；配列番号:133；配列番号:135；配列番号:137；配列番号:139；配列番号:141；配列番号:143；配列番号:145；配列番号:146；配列番号:150；配列番号:158；配列番号:164；配列番号:171；配列番号:179；配列番号:187；配列番号:193；配列番号:199；配列番号:204；配列番号:210；配列番号:218；配列番号:222；配列番号:229；配列番号:234；配列番号:241；配列番号:248および／または配列番号:254）、または本発明のポリペプチド（たとえば配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144および／または配列番号:147）をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離または組換え核酸を提供する。前記ストリンジェントな条件は、高度にストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、低ストリンジェント条件であってよく、本明細書に記載されている高ストリンジェンシー条件および低ストリンジェンシー条件を含む。ある特徴では、下記に考察されるように、ある核酸が本発明の範囲内のものであるか否かを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。
【００８４】
また別の実施態様では、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるその能力によって定義される本発明の核酸は、本発明の核酸の約5残基から完全長の間であろう。例えばそれらは、長さが少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000またはそれ以上の残基であろう。完全長より短い核酸もまた含まれる。これらの核酸は、例えばハイブリダイゼーションプローブ、標識プローブ、PCRオリゴヌクレオチドプローブ、iRNA、（一本鎖または二本鎖）、アンチセンス、または抗体結合ペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードする配列として有用である。
ある特徴では、本発明の核酸は、約37℃から42℃で約50％のホルムアミドの条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる能力によって定義される。ある特徴では、本発明の核酸は、約30℃から35℃で約35％から25％のホルムアミドの条件を含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる能力によって定義される。
また別には、本発明の核酸は、42℃の約50％ホルムアミド、5XのSSPE、0.3％SDSおよび反復配列ブロック核酸（例えばcot-1またはサケ精子DNA（例えば200n/mＬのせん断変性サケ精子DNA））の条件を含む高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる能力によって定義される。ある特徴では、本発明の核酸は、35℃の低温で約35％のホルムアミドを含む低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる能力によって定義される。
ハイブリダイゼーションの後、フィルターは6XのSSC、0.5％SDSにより50℃で洗浄することができる。この条件は、25％を超えるホルムアミドで“中程度”の条件、25％より低いホルムアミドで“低い”条件と考えられる。“中程度にストリンジェントな”ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェント”ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
ストリンジェンシーの個々のレベルに対応する温度範囲は問題の核酸のプリン対ピリミジンの比を計算し、したがって温度を調節することによってさらに狭めることができる。本発明の核酸はまた文献（AusubelおよびSambrook）に示される高度、中程度および低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によっても定義される。上記の範囲および条件のヴァリエーションは当業界でよく知られている。ハイブリダイゼーション条件は下記でさらに考察される。
【００８５】
上記の方法は、プローブ配列に対して相同性が低い核酸を同定するために改変することができる。例えば、検出可能なプローブに対して相同性が低い核酸を得るために、ストリンジェンシーが低い条件を用いることができる。例えば、約1MのNa+濃度を有する緩衝液中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2XのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。前記の条件は、50℃以上で“中程度”の条件、50℃未満で“低”条件と考えられる。“中程度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが55℃で実施される場合である。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施される場合である。
また別には、ハイブリダイゼーションはホルムアミドを含む緩衝液（例えば6XのSSC）で42℃の温度で実施することができる。この事例では、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミドの濃度は50％から0％まで5％ずつ減少させて、プローブとの相同性が低いクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーション後に、フィルターを6XのSSC、0.5％SDSで50℃で洗浄することができる。この条件は、25％を超えるホルムアミドで“中程度”の条件、25％未満のホルムアミドで“低”条件と考えられる。“中程度”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施される場合である。“低ストリンジェンシー”のハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記のハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施される場合である。
しかしながら、ハイブリダイゼーションの様式の選択は決定的なものではなく、ある核酸が本発明の範囲内に包含されるか否かを決定する条件を示すのは洗浄条件のストリンジェンシーである。本発明に包含される核酸を同定するために用いられる洗浄条件には例えば以下が含まれる：約0.02Mの塩濃度でpH７、少なくとも約50℃または約55℃から約60℃；または約0.15Mの塩濃度のNaClで72℃で約15分；または約0.2XのSSCの塩濃度で少なくとも約50℃または約55℃から約60℃の温度で約15から20分；またはハイブリダイゼーション複合体が、0.1％のSDSを含む約2XのSSCの塩濃度を有する溶液で室温で15分2回室温で洗浄し、続いて0.1％のSDSを含む約0.1XのSSCで68℃で15分2回室温で洗浄する；または前記と同等な条件。SSC緩衝液および同等な条件に関してはSambrook, TijssenおよびAusubelの著書を参照されたい。
前記方法は本発明の核酸の単離に用いることができる。
【００８６】
オリゴヌクレオチドプローブおよびその使用方法
本発明はまた、例えばプロテアーゼ活性をもつポリペプチドをコードする核酸もしくはその断片を同定するか、またはプロテアーゼ遺伝子を同定するために用いることができる核酸プローブを提供する。ある特徴では、前記プローブは、本発明の核酸の少なくとも10の連続する塩基を含む。また別には、本発明のプローブは、本発明の核酸で示される配列の少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150または約10から50、約20から60、約30から70の連続する塩基であり得る。前記プローブは、結合および／またはハイブリダイゼーションによって核酸を同定する。前記プローブは、例えばキャピラリーアレイを含む本発明のアレイ（下記の考察を参照されたい）で用いることができる。本発明のプローブはまた他の核酸またはポリペプチドの単離に用いることができる。
本発明のプローブを用いて、生物学的サンプル（例えば土壌サンプル）が、本発明の核酸を有する生物または前記核酸が得られた生物を含むか否かを決定することができる。そのような方法では、前記核酸が単離された生物を潜在的に保有する生物学的サンプルを入手し、前記サンプルから核酸を得る。前記プローブがサンプル中に存在する相補的配列のいずれかと特異的にハイブリダイズすることができる条件下で、前記核酸を前記プローブと接触させる。必要な場合には、相補性配列を含まない対照配列とともに相補性配列を含むことが判明しているサンプルの相補性配列と前記プローブを接触させることによって、前記プローブが特異的にハイブリダイズすることができる条件を決定することができる。ハイブリダイゼーション条件（例えばハイブリダイゼーション緩衝液の塩濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド濃度またはハイブリダイゼーションの温度）を変化させて、前記プローブが相補性核酸と特異的にハイブリダイズすることができる条件を同定することができる（個々のハイブリダイゼーション条件に関しては考察を参照されたい）。
【００８７】
前記核酸が単離された生物をサンプルが含む場合、プローブの特異的なハイブリダイゼーションが検出される。ハイブリダイゼーションは、プローブを検出可能な薬剤（例えば放射性同位元素、蛍光染料、または検出可能な生成物の形成を触媒することができる酵素）で標識することによって検出できる。標識プローブを用いてサンプル中の相補性核酸の存在を検出する多くの方法が当業者にはよく知られている。前記方法にはサザンブロット、ノザンブロット、コロニーハイブリダイゼーション法およびドットブロットが含まれる。前記方法の各々のプロトコルは文献（AusubelおよびSambrook）に示されている。
また別には、2つ以上のプローブ（そのうちの少なくとも1つは核酸サンプルに存在する任意の相補性配列と特異的にハイブリダイズすることができる）を増幅反応で用いて、サンプルが本発明の核酸配列を含む生物（例えば前記核酸が単離された生物）を含むか否かを決定することができる。ある特徴では、前記プローブはオリゴヌクレオチドを含む。ある特徴では、前記増幅反応はPCR反応を含むことができる。PCRプロトコルは文献（AusubelおよびSambrook）に記載されている（増幅反応に関しては考察を参照されたい）。そのような方法では、サンプル中の核酸をプローブと接触させ、増幅反応を実施し、さらに生成された増幅生成物のいずれかを検出する。増幅生成物は、反応生成物のゲル電気泳動を実施し、前記ゲルをインターカレーション試薬（例えば臭化エチジウム）で染色することによって検出することができる。また別には1つまたは2つ以上のプローブを放射性同位元素で標識し、ゲル電気泳動の後で放射性増幅生成物の存在を検出してもよい。
【００８８】
本発明の核酸配列の3'または5'末端近くの配列に由来するプローブもまた染色体ウォーキング法に用いて、さらに別の、例えばゲノム配列を含むクローンを同定することができる。そのような方法は、問題のさらに別のタンパク質をコードする遺伝子の宿主生物からの単離を可能にする。
ある特徴では、本発明の核酸配列をプローブとして用いて関連核酸が特定および単離される。いくつかの特徴では、そのようにして特定された関連核酸は、本発明の核酸が最初に単離された生物以外の生物に由来するcDNAまたはゲノムDNAであろう。そのような方法では、核酸サンプルを、プローブが特異的に関連配列とハイブリダイズすることができる条件下で前記プローブと接触させる。続いて、関連生物に由来する核酸とプローブのハイブリダイゼーションが上記に記載した方法のいずれかを用いて検出される。
核酸ハイブリダイゼーション反応では、具体的なストリンジェンシーレベルを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質にしたがって変動するであろう。例えば、核酸のハイブリダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含有量）および核酸タイプ（例えばRNA対DNA）は、ハイブリダイゼーション条件の選択に考慮することができる。さらに考慮されることは、核酸の1つが例えばフィルターに固定されているか否かである。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中程度ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーの条件下で実施することができる。核酸のハイブリダイゼーションの例として、固定変性核酸を含むポリマーメンブレンを最初に45℃で30分、以下から成る溶液（0.9MのNaCl、50mMのNaH2PO4（pH7.0）、5.0mMのNa2EDTA、0.5％SDS、10Xのデンハルト溶液および0.5mg/mLのポリリボアデニル酸）中でプレハイブリダイズさせる。約2x107cpm（比活性4−9x108cpm/μg）の32P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを続いて溶液に添加する。12−16時間インキュベーションした後で、前記メンブレンを0.5％のSDSを含む１XのSET（150mMのNaCl、20mＭトリス塩酸塩（pH7.8）、1mMのNa2EDTA）中で30分室温（RT）で洗浄し、続いて新しい１XのSET中で30分、オリゴヌクレオチドプローブのためのTm-10℃で洗浄する。続いて、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するためにメンブレンでオートラジオグラフフィルムを感光させる。
【００８９】
核酸、例えばcDNAまたはゲノムDNA（前記は検出プローブとハイブリダイズする）の特定に用いられるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変動させることによって、プローブと相同性レベルが異なる核酸を特定し、これを単離することができる。ストリンジェンシーは、プローブの融解温度より低い種々の温度でハイブリダイゼーションを実施することによって変動させることができる。融解温度（Tm）は、（限定されたイオン強度およびpHの下で）標的配列の50％が完全に相補性のプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、個々のプローブのTmに等しいかまたはそれより約5℃低くなるように選択される。プローブの融解温度は以下の式を用いて計算できる。長さが14から70ヌクレオチドのプローブの場合、融解温度（Tm）は下記の式を用いて計算される：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。ハイブリダイゼーションがホルムアミド含有溶液中で実施される場合、融解温度は以下の式を用いて計算できる：Tm＝81.5＋16.6（log[Na＋]）＋0.41（G+Cの割合）−（0.63％ホルムアミド）−（600/N）、式中Nはプローブの長さである。プレハイブリダイゼーションは、6XのSSC、5Xのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性断片化サケ精子DNA、または6XのSSC、5Xのデンハルト試薬、0.5％SDS、100μgの変性断片化サケ精子DNA、50％ホルムアミド中で実施することができる。SSCおよびデンハルト試薬ならびに他の溶液のための組成は例えば上掲書（Sambrook）に挙げられている。
【００９０】
ハイブリダイゼーションは、検出プローブを上記に挙げたプレハイブリダイゼーション溶液に添加することによって実施される。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に変性させる。プローブが、それと相補的または相同な配列を含むcDNAまたはゲノムDNAとハイブリダイズできるように十分な時間ハイブリダイゼーション溶液とフィルターを接触させる。長さが200ヌクレオチドを超えるプローブの場合、ハイブリダイゼーションはTmより15-25℃下で実施できる。より短いプローブの場合（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）、ハイブリダイゼーションはTmより5−10℃下で実施できる。ある特徴では、6XのSSC中でのハイブリダイゼーションが約68℃で実施される。ある特徴では、50％ホルムアミド含有溶液中でハイブリダイゼーションが約42℃で実施される。前述のハイブリダイゼーションの全ては高ストリンジェンシー条件下であると考えられよう。
ハイブリダイゼーションの後で、フィルターを洗浄して非特異的に結合した一切の検出プローブを除去する。フィルターの洗浄に用いられるストリンジェンシーは、ハイブリダイズされる核酸の性質、ハイブリダイズされる核酸の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えばGC対AT含量）および核酸のタイプ（例えばRNAであるかDNAであるか）にしたがって変動させ得る。だんだんと高くなるストリンジェンシー洗浄条件の例は以下のとおりである：2XのSSC、0.1％SDS、室温で15分（低ストリンジェンシー）；0.1XのSSC、0.5％SDS、室温で30分（中程度ストリンジェンシー）；0.1XのSSC、0.5％SDS、ハイブリダイゼーションの温度から68℃の間で15から30分（高ストリンジェンシー）；0.15MのNaCl、72℃で15分（非常に高いストリンジェンシー）。最後の低ストリンジェンシー洗浄は、0.1XのSSCで室温で実施することができる。上記の例は、フィルター洗浄に用いることができる条件セットの単なる例示である。当業者には種々のストリンジェンシーのために多くの洗浄レシピが存在することは理解されよう。
【００９１】
プローブにハイブリダイズした核酸はオートラジオグラフィーまたは他の一般的な技術によって特定できる。上記の方法は、プローブ配列と相同性レベルが低い核酸を同定するために改変することができる。例えば、検出プローブと相同性が低い核酸を得るためには、より低いストリンジェンシー条件を用いることができる。例えばハイブリダイゼーション温度は、Na+濃度が約1Mのハイブリダイゼーション緩衝液で６８℃から42℃まで5℃ずつ下げることができる。ハイブリダイゼーションの後で、フィルターはハイブリダイゼーション温度で2XのSSC、0.5％SDSで洗浄することができる。これらの条件は、50℃より上で“中程度”の条件、50℃より下で“低ストリンジェンシー”条件と考えられる。“中程度”ハイブリダイゼーション条件の例は、上記ハイブリダイゼーションが55℃で実施されるときである。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーション条件の例は、上記のハイブリダイゼーションが45℃で実施されるときである。
また別には、ハイブリダイゼーションは、緩衝液（例えばホルムアミド含有6XのSSC）中で42℃の温度で実施できる。この事例では、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの濃度は、プローブと相同性レベルの低いクローンを同定するために50％から0％まで5％ずつ減少させることができる。ハイブリダイゼーションの後で、フィルターを6XのSSC、0.5％のSDSで50℃で洗浄することができる。これらの条件は、25％より高いホルムアミドで“中程度”の条件、25％より低いホルムアミドホルムアミドで“低”ストリンジェンシー条件と考えられる。“中程度”ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記ハイブリダイゼーションが30％のホルムアミドで実施されるときである。“低ストリンジェンシー”ハイブリダイゼーション条件の具体的な例は、上記ハイブリダイゼーションが10％のホルムアミドで実施されるときである。
【００９２】
本発明のこれらプローブおよび方法を用いて、本発明の核酸の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000またはそれ以上の連続する塩基を含む本発明の核酸配列と少なくとも約99％、98％、97％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％または少なくとも50％の相同性を有する配列をもつ核酸を単離することができる。相同性は、本明細書で考察したようなアラインメントアルゴリズムを用いて測定できる。例えば、相同なポリヌクレオチドは、本明細書に記載されたコード配列の1つの天然に存在する対立遺伝子座変種のコード配列を有するであろう。そのような対立遺伝子座変種は、本発明の核酸と比較したとき1つまたは2つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有するであろう。
さらにまた、本発明のプローブおよび方法を用いて、本発明のポリペプチドの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150の連続するアミノ酸を含む前記ポリペプチドと、配列アラインメントアルゴリズムを用いて決定したとき少なくとも約99％、少なくとも95％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少なくとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％または少なくとも50％の配列同一性（相同性）を有するポリペプチドペプチドをコードする核酸を単離することができる（前記配列アラインメントアルゴリズムは、例えばFASTAバージョン3.0t78アルゴリズム（規定値を用いる）またはBLAST2.2.2プログラム（本明細書に示される典型的な設定を用いる）である）。
【００９３】
プロテアーゼの発現阻害
本発明は、本発明の核酸（例えばプロテアーゼコード核酸）と相補的な核酸（例えばアンチセンス配列）を提供する。アンチセンス配列は、プロテアーゼコード遺伝子の輸送、スプライシングまたは転写を阻害することができる。前記阻害は、ゲノムDNAまたはメッセンジャーRNAのターゲッティングにより達成することができる。標的とされた核酸の転写または機能は、例えばハイブリダイゼーションおよび／または切断によって阻害することができる。本発明によって提供される特に有用な阻害物質セットには、プロテアーゼ遺伝子またはメッセンジャーに結合し、いずれの事例でもプロテアーゼの生成もしくは機能を防止または抑制することができるオリゴヌクレオチドが含まれる。前記の結合は配列特異的ハイブリダイゼーションによるであろう。別の有用な阻害物質の種類にはプロテアーゼメッセージの不活化または切断をもたらすオリゴヌクレオチドが含まれる。前記オリゴヌクレオチドはそのような切断を惹起する酵素活性を有することができる（例えばリボザイム）。オリゴヌクレオチドは化学的に改変するか、または相補性核酸を切断することができる酵素もしくは組成物と結合させることができる。種々の前記のようなオリゴヌクレオチドの多数を含むプールを所望の活性を有するものについてスクリーニングすることができる。したがって、本発明は、核酸および／またはタンパク質レベルで（例えばアンチセンス、本発明のプロテアーゼ配列を含むiRNAおよびリボザイム、並びに本発明の抗プロテアーゼ抗体）プロテアーゼの発現を阻害する種々の組成物を提供する。
プロテアーゼ発現の阻害は種々の工業的用途を有するであろう。例えば、プロテアーゼ発現の阻害は腐敗を遅らせ、またはこれを防止することができる。腐敗は、ポリペプチド（例えば構造ポリペプチド）が酵素により分解するときに生じるであろう。これは果実または野菜の変質または腐敗をもたらすであろう。ある特徴では、プロテアーゼの発現および／または活性を阻害する本発明の組成物（例えば抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびRNAi）を用いて腐敗を遅らせるかまたは防止する。したがって、ある特徴では、本発明は、植物または植物生成物（例えば果実、種子、根、葉など）に、本発明の抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびRNAiを適用することを含む、腐敗を遅らせまたは防止する方法および組成物を提供する。前記の組成物はまた、植物（例えばトランスジェニック植物）または別の生物（例えば細菌または本発明のプロテアーゼ遺伝子で形質転換された他の微生物）によって発現させることができる。
プロテアーゼ発現阻害のための本発明の組成物（例えばアンチセンス、iRNA、リボザイム、抗体）を、医薬組成物として、例えば抗病原体薬剤として、または他の治療（例えば抗炎症もしくは皮膚もしくは消化促進治療）で用いることができる。例えば、プロテアーゼは、寄生虫感染および進行における（特に宿主の赤血球の断裂、侵襲およびヘモグロビン分解過程における）その不可欠の役割のために重要な抗マラリア標的である（例えば以下を参照されたい：Wu (2003) Genome Res. 13:601-616）。産卵活性を調節するペプチドの活性/不活化に必要な蚊のアンギオテンシン変換酵素（ACE）（ジペプチジルカルボキシペプチダーゼ）の選択的阻害は蚊に対抗する有効な方法であろう（例えば以下を参照されたい：Ekbote (2003) Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 134:593-598）。マトリックスメタロペロテアーゼ（例えばメタロプロテイナーゼ）およびコラゲナーゼの阻害（前記は細胞外マトリックスを分解し、癌細胞の遊走および転移を促進する）は、これらの症状の治療および緩和に用いることができる（例えば以下を参照されたい：Elnemr (2003) Gastric Cancer 6:30-38）。
【００９４】
アンチセンスオリゴヌクレオチド：本発明は、プロテアーゼメッセージと結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。前記はmRNAを標的とすることによってタンパク分解活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなプロテアーゼオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするためのジーンウォーキング／RNAマッピングプロトコルは当業界でよく知られている。例えば以下を参照されたい：Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183。前記はRNAマッピングアッセイを記載し、前記アッセイは標準的な分子技術を基にし、強力なアンチセンス配列選別のための簡単で信頼できる方法を提供する。さらにまた以下を参照されたい：Smith (2000) Eur. J. Phar. Sci. 11:191-198。
天然に存在する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の長さであろう。また別の特徴では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは約5から100、約10から80、約15から60、約18から40である。最適な長さは日常的なスクリーニングによって決定できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは任意の濃度で提供できる。最適濃度は日常的なスクリーニングによって決定できる。この潜在的課題に用いることができる広範囲の合成された天然に存在しないヌクレオチドおよび核酸類似体が知られている。例えば、非イオン性骨格（例えばN-（2-アミノエチル）グリシンユニット）を含むペプチド核酸（PNA）を用いることができる。ホスホロチオエート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる（前記は以下に記載されている：WO97/03211; WO96/39154; Mata (1997) Toxicol. App. Pharmacol. 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996)）。本発明によって提供される合成DNA骨格類似体をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドにはまた、上記で述べたようにホスホロ-ジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、3'-N-カルバメートおよびモルホリノカルバメート核酸が含まれる。
コンビナトリアルケミストリー的方法を用いて膨大な数のオリゴヌクレオチドを作出することができる。前記オリゴヌクレオチドは、任意の標的（例えば本発明のセンスおよびアンチセンスプロテアーゼ配列）に対し適切な結合親和性および特異性を有する特定のオリゴヌクレオチドについて迅速にスクリーニングすることができる（例えば以下を参照されたい：Gold (1995) J. Biol. Chem. 270:13581-13584）。
【００９５】
阻害性リボザイム：本発明は、プロテアーゼメッセージと結合することができるリボザイムを提供する。これらのリボザイムは、例えばmRNAを標的にすることによりプロテアーゼ活性を阻害することができる。リボザイムを設計し、ターゲッティングのためにプロテアーゼ特異的アンチセンス配列を選別する方法は学術文献および特許文献に詳しく記載されており、当業者は本発明の新規な試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。リボザイムは、標的RNAを切断するRNAの酵素部分に接近して保持されているリボザイムの標的RNA結合部分を介して標的RNAと結合することによって機能する。したがって、リボザイムは、相補性塩基対形成により標的RNAを認識し、これと結合する。正確な部位にいったん結合したら、前記は酵素として機能し標的RNAを切断し、これを不活化する。切断がコード配列内で発生すれば、そのような態様での標的RNAの切断は、コードされるタンパク質の合成を指令するその能力を破壊するであろう。リボザイムがそのRNA標的と結合し、これを切断した後、リボザイムは典型的にはRNAから遊離し、したがって繰り返し新たな標的と結合しこれを切断することができる。
いくつかの環境下では、リボザイムの酵素的性質は他の技術、例えばアンチセンス技術（アンチセンス技術では、核酸分子は核酸標的に単に結合してその転写、翻訳または別の分子との結合を妨げるだけである）に比べて有利であろう。なぜならば、治療達成に必要なリボザイムの有効濃度はアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれよりも低いからである。この潜在的な利点はリボザイムの酵素として機能する能力の結果である。したがって、ただ1つのリボザイム分子が多くの標的RNA分子を切断することができる。さらにまた、リボザイムは典型的には特異性が高い阻害剤であり、阻害の特異性は塩基対形成による結合メカニズムだけでなく、リボザイムが結合するRNAの発現を前記リボザイム分子が阻害するメカニズムにも依存している。すなわち、前記阻害はRNA標的の切断によって生じ、したがって特異性は非標的RNAの切断速度に対する標的RNAの切断速度の比と定義される。この切断メカニズムは塩基対形成に必要とされる要因にさらに付け加えられる要因に依存する。したがって、リボザイム作用の特異性は、同じRNA部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド結合の特異性よりも高いであろう。
本発明のリボザイム、例えば酵素リボザイムRNA分子は、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、肝炎デルタウイルスモチーフ、グループIイントロンモチーフおよび／またはRNAガイド配列と結合したRNaseP様RNAモチーフとして生成することができる。ハンマーヘッドモチーフの例はRossi（Aids Research and Human Retroviruses 8:183 (1992)）によって、ヘアピンモチーフの例はHampel（Biochmistry 28:4929 (1989)およびNuc. Acids Res. 18:299 (1992)）によって、肝炎デルタウイルスモチーフの例はPerrotta（Biochemistry 31:16 (1992)）によって、RNasePモチーフの例はGuerrier-Takada（Cell 35:849 (1983)）によって、さらにグループIイントロンの例はCech（US Pat. No. 4,987,071）によって記載されている。前記の特定のモチーフの記載は前記に限定することを意図したものではない。当業者は、本発明のリボザイム、たとえば酵素RNA分子は、標的遺伝子のRNA領域の1つまたは2つ以上と相補的な固有の基質結合部位を有することができることを理解していよう。本発明のリボザイムは、基質結合部位内またはその周辺に前記リボザイム分子にRNA切断活性を付与するヌクレオチド配列を有し得る。
【００９６】
RNA干渉（RNAi）：ある特徴では本発明は、本発明のプロテアーゼ配列を含むRNA阻害分子、いわゆる“RNAi”分子を提供する。RNAi分子は二本鎖RNA（dsRNA）分子を含む。RNAiはプロテアーゼ遺伝子の発現を阻害することができる。ある特徴では、RNAiは、長さが約15、16、17、18、19、20、21、2、23、24、25またはそれ以上の二重鎖ヌクレオチドである。本発明はいずれの特定の作用メカニズムにも限定されないが、RNAiは細胞内に入り、類似または同一の配列を有する一本鎖RNA（ssRNA）（内因性mRNAを含む）の分解を引き起こす。細胞が二本鎖RNA（dsRNA）に暴露されるとき、相同な遺伝子に由来するmRNAは、RNA干渉（RNAi）と称されるプロセスによって選択的に分解される。RNAiの背後にある可能な基本的メカニズムは、特定の遺伝子配列と一致する二本鎖RNA（dsRNA）の短い破片（短小干渉性RNAと称される）への分解である。前記短小干渉性RNAは、その配列と一致するmRNAの分解の引き金となる。ある特徴では、本発明の前記RNAiは遺伝子サイレンシング療法で用いられる（例えば以下を参照されたい：Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046）。ある特徴では、本発明は、本発明のRNAiを用いて選択的にRNAを分解する方法を提供する。前記方法はin vitro、ex vivoまたはin vivoで実施することができる。ある特徴では、本発明のRNAi分子を用いて細胞、器官または動物の機能消失変異を作出することができる。選択的にRNAを分解するためにRNAi分子を製造および使用する方法は当業界ではよく知られている。例えば以下を参照されたい：米国特許第6,506,559号、第6,511,824号、第6,515,109号および第6,489,127号。
【００９７】
核酸の改変
本発明は、本発明の核酸（例えばプロテアーゼ酵素をコードする核酸）の変種を作出する方法を提供する。前記方法は反復するか、または多様な組合せで使用して、鋳型核酸によってコードされたプロテアーゼのそれとは変異したもしくは異なる活性または変異したもしくは異なる安定性をもつプロテアーゼ酵素を作出することができる。前記方法はまた反復するか、または多様な組合せで用いて、例えば遺伝子／メッセージ発現、メッセージ翻訳またはメッセージ安定性における変種を作出することができる。別の特徴では、細胞の遺伝的構成は、例えば相同遺伝子のex vivo改変とそれに続く前記遺伝子の細胞への再挿入により改変される。
本発明の核酸は任意の手段、例えばランダムもしくは確率的な方法、または非確率的方法、または“定方向進化”方法によって改変できる（例えば米国特許6,361,974号を参照されたい）。遺伝子のランダム変異導入の方法は当業界でよく知られている（例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,830,696）。例えば変異原を用いて遺伝子をランダムに変異させることができる。変異原には、例えば紫外線またはガンマ線照射、または化学的変異原、例えばマイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレンが含まれ、単独または併用して組換えによって修復されやすいDNA破壊を誘導する。他の化学的変異原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸が含まれる。その他の変異原は、ヌクレオチド前駆体の類似物質、例えばニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリンまたはアクリジンである。これらの薬剤はPCR反応にヌクレオチド前駆体の代わりに添加され、それによって前記配列を変異させることができる。インターカレーション薬剤（例えばプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）もまた用いることができる。
【００９８】
分子生物学の任意の技術、例えばランダムPCR変異導入（例えば以下を参照されたい：Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471）またはコンビナトリアルマルチカセット変異導入（combinatorial multiple cassette mutagenesis）（例えば以下を参照されたい：Crameri (1995) Biotechniques 18:194-196）を用いることができる。また別には、核酸（例えば遺伝子）をランダムにまたは“確率的に”断片化した後で再アッセンブリングすることもできる（例えば以下を参照されたい：米国特許第6,291,242号; 同6,287,862号; 同6,287,861号; 同5,955,358号; 同5,830,721号; 同5,824,514号; 同5,811,238号; 同5,605,793号）。また別の特徴では、改変、付加または欠失が、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、位置特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ、遺伝子部位飽和変異導入（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）、組換え、反復配列組換え、ホスホチオエート改変DNAによる変異導入、ウラシル含有鋳型による変異導入、ギャップ含有デュープレックスによる変異導入、点ミスマッチ修復による変異導入、修復欠損宿主株による変異導入、化学的変異導入、放射源による変異導入、欠失による変異導入、制限-選別変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマーの生成および／またはそれらの組合せ並びに他の方法によって導入される。
【００９９】
以下の文献は、本発明の方法に取り入れることができる多様な反復組換え手順および／または方法を記載している：Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties", Tiumor Tageting 4:1-4; Ness (1999) NatureBiotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding", Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling", Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution", Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate dtoxification pathway by DNA shuffling", Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screenig", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten et al. (1997) "Applications of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines”, Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri et al. (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling", Nature Medicine 2:100-103; Crameri et al. (1996) "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling”, Nature Biotechnology 14:315-319; Gates et al. (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor `headpiece dimer`" Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer et al. (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; およびStemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。
【０１００】
多様性を作出する変異導入方法には例えば以下が含まれる：位置特異的変異導入(Ling et al. (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale et al. (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; および Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin))；ウラシル含有鋳型を用いる変異導入 (Kunkel (1985) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367-382;およびBass et al. (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245)；オリゴヌクレオチド誘導変異導入（Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; および Zoller & Smith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350)；ホスホロチオエート改変DNA変異導入(Taylor et al. (1985) "The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor et al. (1985) "The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698; Sayers et al. (1988) "Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791-802;およびSayers et al. (1988) "Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814)；ギャップをもつ二重鎖DNAを用いる変異導入(Kramer et al. (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367; Kramer et al. (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; およびFritz et al. (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999)。
【０１０１】
本発明の方法で用いられるさらに別のプロトコルには以下が含まれる：点ミスマッチ修復(Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887)、修復欠損宿主株を用いる変異導入(Carter et al. (1985) "Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; and Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403)、欠失変異導入(Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells et al. (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423)、全遺伝子合成による変異導入(Nambiar et al. (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar and Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells et al. (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323;およびGrundstrom et al. (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale `shot-gun` gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316)、二本鎖開裂修復(Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. "Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181)。上記の方法の更なる詳細は” Enzymology”（Volume 154）で見出すことができる。前記はまた種々の変異導入方法に関する問題を解決するための有用な管理について記載されている。
【０１０２】
本発明の実施に用いることができるプロトコルは例えば以下に記載されている：U.S. Pat. No. 5,605,793（Stemmer, Feb. 25, 1997, "Methods for In Vitro Recombination）；U.S. Pat. No. 5,811,238 (Stemmer et al.,Sep. 22, 1998, "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination")；U.S. Pat. No. 5,830,721（Stemmer et al., Nov. 3, 1998, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"）；U.S. Pat. No. 5,834,252（Stemmer, et al., Nov. 10, 1998, "End-Complementary Polymerase Reaction"）；U.S. Pat. No. 5,837,458（Minshull, et al., Nov. 17, 1998, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"）；WO 95/22625（Stemmer and Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"）；WO 96/33207（Stemmer and Lipschutz, "End Complementary Polymerase Chain Reaction"）；WO 97/20078（Stemmer and Crameri, "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination"）；WO 97/35966（Minshull and Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering"）；WO 99/41402（Punnonen et al. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors"）；WO 99/41383（Punnonen et al. "Antigen Library Immunization"）；WO 99/41369（Punnonen et al. "Genetic Vaccine Vector Engineering"）； WO 99/41368（Punnonen et al. "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines"）；EP 752008（Stemmer and Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly"）；EP 0932670（Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination"）；WO 99/23107（Stemmer et al., "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling"）；WO 99/21979（Apt et al., "Human Papillomavirus Vectors"）；WO 98/31837（del Cardayre et al. "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination"）；WO 98/27230（Patten and Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering"）；WO 98/27230（Stemmer et al., "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection"）；WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries"；WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences"；WO 98/42832（Arnold et al., "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers"）；WO 99/29902（Arnold et al., "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences"）；WO 98/41653（Vind, "An in Vitro Method for Construction of a DNA Library"）；WO 98/41622（Borchert et al., "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling"）；およびWO 98/42727（Pati and Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination"）
【０１０３】
本発明の実施に用いることができるプロトコル（種々の多様性を作出する方法に関する詳細を提供する）は例えば以下に記載されている："SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES"（Patten et al.,1999年9月28日出願、U.S. Ser. No. 09/407,800)；"EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION"（del Cardayre et al., 米国特許6,379,964号)；"OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION"（Crameri et al., 米国特許6,319,714号; 6,368,861号; 6,376,246号; 6,423,542号; 6,426,224号およびPCT/US00/01203；"USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING"（Welch et al., 米国特許6,436,675号）；"METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS"（Selifonov et al., 2000年1月18日出願、PCT/US00/01202) および、例えば "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS"（Selifonov et al., 2000年7月18日出願、U.S. Ser. No. 09/618,579)；"METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS"（Selifonov and Stemmer, 2000年1月18日出願PCT/US00/01138)；および "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION"（Affholter, 2000年9月6日出願、U.S. Ser. No. 09/656,549)；および米国特許6,177,263号；同6,153,410号。 
非確率的、または“定方向進化”方法（例えば“飽和変異導入”（GSSM）、合成連結再アッセンブリ（SLR）またはそれらの組合せを含む）を用いて本発明の核酸を改変し、新規なまたは変異した特性（例えば強酸または強アルカリ条件下、高温または低温条件下などでの活性）を有するプロテアーゼが作出される。改変された核酸によってコードされるポリペプチドは、タンパク分解活性または他の活性について試験する前に活性についてスクリーニングすることができる。任意の試験様式またはプロトコルを用いることができる。例えばキャピラリーアレイ台を用いることができる。例えば米国特許第6,361,974号、同6,280,926号、同5,939,250号を参照されたい。
【０１０４】
飽和変異導入（またはGSSM）：ある特徴では、縮退N,N,G/T配列を含むコドンプライマーを用いてポリヌクレオチド（例えば本発明のプロテアーゼまたは抗体）に点変異が導入され、子孫ポリペプチドセットが作出される。子孫ポリペプチドセットでは、例えば改変の標的となる酵素活性部位またはリガンド結合部位の各アミノ酸の位置で単一のアミノ酸置換の全てが出現する。これらのオリゴヌクレオチドは、連続する第一の相同配列、縮退N,N,G/T配列および場合によって第二の相同な配列を含むことができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用することによって得られる下流の子孫翻訳生成物には、N,N,G/T配列の縮退は20の全てのアミノ酸のためのコドンを含むので前記ポリペプチドに沿って各アミノ酸の位置で可能な全てのアミノ酸変化が含まれる。ある特徴では、１つのそのような縮退オリゴヌクレオチド（例えば１つに縮退N,N,G/Tカセットを含む）が、親のポリヌクレオチド鋳型中の本来のコドンの各々を全範囲のコドン置換に付すために用いられる。また別の特徴では、親のポリヌクレオチド鋳型中の少なくとも2つの本来のコドンを全範囲のコドン置換に付すために少なくとも2つの縮退カセットが（同じヌクレオチドまたは別個のヌクレオチドで）用いられる。例えば2つ以上のN,N,G/T配列を1つのオリゴヌクレオチド内に含ませ、2つ以上の部位でアミノ酸置換を導入することができる。この複数のN,N,G/T配列は連続していてもよいし、または1つもしくは2つ以上のさらに別のヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。別の特徴では、付加および欠失の導入に役立つオリゴヌクレオチドは単独またはN,N,G/T配列を含むコドンとともに用いて、アミノ酸付加、欠失および／または置換の任意の組合せまたは並べ換えが導入される。
【０１０５】
ある特徴では、2つまたは3つ以上の連続するアミノ酸位置の同時変異は、連続するN,N,G/Tトリプレット（すなわち縮退(N,N,G/T)n配列）を含むオリゴヌクレオチドを用いて実施される。別の特徴では、N,N,G/T配列よりも縮退性の小さい縮退カセットが用いられる。例えば、いくつかの事例では、ただ1つのＮ（Ｎは前記トリプレットの第一、第二または第三番目の位置に存在できる）を含む縮退トリプレット配列を（オリゴヌクレオチドで）用いることができる。任意の組合せおよび並べ換えを含む他のいずれの塩基もトリプレットの残りの2つの位置で用いることができる。また別にはいくつかの事例で縮退N,Ｎ,Ｎ,トリプレット配列を（例えばオリゴヌクレオチドで）用いることができる。
ある特徴では、縮退トリプレット（例えばN,N,G/Tトリプレット）の使用によって、ポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸の位置について天然アミノ酸の全範囲の（合計20アミノ酸）系統的で容易な作出が可能になる（別の特徴では、前記方法はまた、各アミノ酸残基、コドン、位置の可能な全ての置換よりも少ない置換の作出も含む）。例えば、100アミノ酸のポリペプチドの場合、2000個の別個の種（すなわち各位置につき20個の可能なアミノ酸x100個のアミノ酸位置）が作出される。縮退N,N,G/Tトリプレットを含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットを使用することによって、32個の個々の配列が20個の可能な天然のアミノ酸を全てコードすることができる。したがって、親のポリヌクレオチド配列が少なくとも1つの前記のようなオリゴヌクレオチドを用いて飽和変異導入に付される反応容器では、20個の別個のポリペプチドをコードする32個のそれぞれ別個の子孫ポリヌクレオチドが生成される。対照的に、位置特異的変異導入では非縮退オリゴヌクレオチドを使用したとき、各反応容器につきただ1つの子孫ポリペプチド生成物が生じるだけである。非縮退オリゴヌクレオチドは場合によって開示の縮退プライマーとともに用いることができる。例えば、非縮退オリゴヌクレオチドを用いて対象のポリヌクレオチドで特定の点変異を作出することができる。前記は、特定のサイレント点変異、対応するアミノ酸変化をもたらす点変異、並びに終止コドンおよびポリペプチド断片の対応する発現を生じさせる点変異を作出する1つの手段を提供する。
【０１０６】
ある特徴では、各飽和変異導入反応容器は、親のポリヌクレオチドで変異を導入されたコドンの位置に一致する個々のアミノ酸位置において20個全ての天然アミノ酸が出現することができるように、少なくとも20の子孫ポリペプチド（例えばプロテアーゼ）分子をコードするポリヌクレオチドを含む（他の特徴では20個未満の天然の組合せが用いられる）。各飽和変異導入反応容器から作出される32倍の縮退子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば適切な宿主（例えば大腸菌宿主）に例えば発現ベクターを用いてクローニングする）、さらに発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより好ましい特性の変化を提示させることによって個々の子孫ポリペプチドが特定されたならば（例えば親のポリペプチドと比較したときアルカリ性または酸性条件下でタンパク分解活性が増加する）、子孫ポリペプチドを配列決定し、その中に含まれる対応する好ましいアミノ酸置換を同定することができる。
ある特徴では、本明細書に開示したように、親のポリペプチドのそれぞれ全てのアミノ酸位置を飽和変異導入を用いて変異を導入するとき、好ましいアミノ酸変化が2つ以上のアミノ酸位置で特定されることがある。これら好ましいアミノ酸置換の全てまたは一部分の組合せを含む1つまたは2つ以上の新規な子孫分子を作出することができる。例えば、2つの具体的な好ましいアミノ酸変化が、ポリペプチドの3つのアミノ酸位置の各々で特定されるならば、前記の変更は各位置および3つの位置で3つの可能性を含む（最初のアミノ酸から変化のないものおよび2つの好ましい変化をもつそれぞれのもの）。したがって、3ｘ3ｘ3、または合計27の可能性が存在し、前記は以前に調べられた7つ− 6つの単一点変異（すなわち3つの位置の各々で2つ）およびいずれの位置においても変化のないもの −を含む。
別の特徴では、位置飽和変異導入をまた別の確率的または非確率的手段と一緒に用いて配列を変化させることができる。前記別の手段は、例えば合成連結再アッセンブリ（下記参照）、シャッフリング、キメラ化、組換えおよび他の変異導入プロセスおよび変異導入剤である。本発明は任意の変異導入プロセスの使用を提供する。前記には反復態様で用いられる飽和変異導入が含まれる。
【０１０７】
合成連結再アッセンブリ（SLR）：本発明は、“合成連結再アッセンブリ”、または簡潔に“SLR”、“定方向進化プロセス”と称される、新規なまたは変異した特性を有するポリペプチド（例えば本発明のプロテアーゼまたは抗体）を作出する非確率的遺伝子改変系を提供する。SLRは、オリゴヌクレオチド断片を非確率的に一緒に連結する方法である。この方法は、核酸構築ブロックがランダムにシャッフルされず、連結されず、またはキメラ化されず、むしろ非確率的にアッセンブリングされるという点で確率的オリゴヌクレオチドシャッフリングとは異なる。例えば以下を参照されたい：米国特許出願（USSN）09/332,835（”Synthetic Ligation Reassembly in Directed Evolution”）（1999年6月14日出願）。ある特徴では、SLRは以下の工程を含む：（a）鋳型ポリヌクレオチドを提供する工程（前記鋳型ポリヌクレオチドは相同な遺伝子をコードする配列を含む）；（b）複数の構築ブロックポリヌクレオチドを提供する工程（前記構築ブロックポリヌクレオチドは鋳型ポリヌクレオチドとあらかじめ定められた配列で交差再アッセンブリングを生じるように考案され、構築ブロックポリヌクレオチドは前記相同な遺伝子の変種である配列および前記変種配列とフランキングする前記鋳型ポリヌクレオチドと相同な配列を含む）；（c）前記構築ブロックポリヌクレオチドが前記鋳型ポリヌクレオチドと交差再アッセンブリングして相同な遺伝子配列変種を含むポリヌクレオチドを作出できるように、構築ブロックポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドと一緒にする工程。
SLRは、再アレンジメントを実施されるポリヌクレオチド間に高レベルの相同性が存在することを必要としない。したがって、本方法は、10100を超える種々のキメラを含む子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率的に作製するために用いることができる。SLRを用いて101000を超える種々の子孫キメラを含むライブラリーの作製に用いることができる。したがって、本発明の特徴は、設計により選択された全体的なアッセンブリの順番にしたがって完成されたキメラ核酸分子セットを製造する非確率的方法を提供する。前記方法は以下を含む：互いに適合する連結可能な有用な末端を有する複数の特別な核酸構築ブロックを設計により作製し、考案した全体的なアッセンブリの順番が達成されるように前記核酸構築ブロックをアッセンブリングすること。
【０１０８】
アッセンブリングされる互いに適合する核酸構築ブロックの末端は、これらが前記構築ブロックをあらかじめ定めた順序で結合させることができるならば、このタイプの指定されたアッセンブリに対して“有用”であると考えられる。したがって、前記核酸構築ブロックが結合される全体的なアッセンブリの順番は、連結させることができる末端の設計によって特定される。2つ以上のアッセンブリ工程が用いられる場合、核酸構築ブロックが結合される全体的アッセンブリの順番は、前記アッセンブリ工程の一連の順番によって特定される。ある特徴では、アニールされた構築片が酵素（例えばリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼ））で処理され、前記構築片の共有結合が達成される。
ある特徴では、オリゴヌクレオチド構築ブロックの設計は、祖先核酸配列鋳型セットを分析することによって得られる（祖先核酸配列は完成したキメラポリヌクレオチドの子孫セットを製造する基礎として機能する）。したがって、これら親のオリゴヌクレオチド鋳型は、変異（例えばシャッフリングまたはキメラ化）を導入しようとする核酸構築ブロックの設計に役立つ配列情報源として機能する。この方法のある特徴では、複数の親核酸鋳型の配列でアラインメントを実施して1つまたは2つ以上の境界点が選択される。境界点は相同領域に位置し、1つまたは2つ以上のヌクレオチドを含むことができる。これらの境界点は好ましくは少なくとも2つの祖先鋳型によって共有される。それによって前記境界点は、親ポリヌクレオチドの再編成のために作製されるオリゴヌクレオチド構築ブロックの境界線を引くために用いることができる。祖先分子で特定され選別される境界点は、完成キメラ子孫分子のアッセンブリにおける潜在的キメラ形成点として機能する。境界点は、少なくとも2つの親ポリヌクレオチド配列によって共有される相同領域（少なくとも1つの相同なヌクレオチド塩基を含む）であろう。また別には、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも半分によって共有される相同領域であるか、または親ポリヌクレオチド配列の少なくとも2/3によって共有される相同領域であろう。さらに好ましくは、有用な境界点は、親ポリヌクレオチド配列の少なくとも3/4によって共有される相同領域であるか、または前記は親ポリヌクレオチド配列のほぼ全てによって共有されるであろう。ある特徴では、境界点は、親ポリヌクレオチド配列の全部によって共有される相同領域である。
ある特徴では、連結再アッセンブリプロセスは、子孫キメラポリヌクレオチドの網羅的ライブラリーを作製するために網羅的に実施される。換言すれば、全ての可能な順番で組み合わされた核酸構築ブロックが、完成キメラ核酸分子セットに提示される。同時に、別の実施態様では、各組合せにおけるアッセンブリの順番（すなわち完成したキメラ核酸の各々の配列の5'から3'方向における各構築ブロックのアッセンブリの順番）は上記に記載したように、設計によるもの（すなわち非確率的）である。本発明の非確率的な性質のために、望ましくない副生成物の可能性が極めて低下している。
【０１０９】
別の特徴では、前記連結再アッセンブリ方法は系統的に実施される。例えば、前記方法は、系統的に区分化された子孫分子のライブラリーを作製するために実施され、前記区分化ライブラリーは、系統的に（例えば1つずつ）スクリーニングすることができる。換言すれば、本発明は、連続工程によるアッセンブリング反応の選択的および慎重な使用と併せて特定の核酸構築ブロックを選択的および慎重に使用することによって、特定の子孫生成物セットがいくつかの反応容器の各々で生成される設計ができるということを提供する。これによって系統的な調査およびスクリーニング方法の実施が可能になる。したがって、これらの方法は、潜在的に膨大な数の子孫分子をより小さなグループで系統的に調査することを可能にする。特に祖先分子間で低レベルの相同性しか存在しないときに、高度に柔軟性を有し、しかも網羅的で系統的な態様でのキメラ化の実施を可能にするその能力のために、これらの方法は膨大な数の子孫分子を含むライブラリー（またはセット）の作出を提供する。本発明の連結再アッセンブリの非確率的性質のために、作出される子孫分子は好ましくは、設計により選択された全体的なアッセンブリの順番を有する完成されたキメラ核酸分子のライブラリーを含む。飽和変異導入および最適化された定方向進化方法もまた種々の子孫分子種の作出に用いることができる。本発明は、境界点、核酸構築ブロックのサイズおよび数並びに結合の設計の選択に関して選択と制御の自由を提供することは理解されよう。さらにまた、分子間相同性の要求は、本発明を実施し易くするために大きく緩和されることもまた理解されよう。実際、境界点はほとんどまたはまったく分子間相同性がない領域でも選択できる。例えば、コドンの揺らぎのために（すなわちコドンの縮退性のために）、ヌクレオチド置換は、対応する祖先鋳型で本来コードされるアミノ酸を変更することなく核酸中に導入することができる。また別には、コドンを変更して本来のアミノ酸のコードを変更してもよい。本発明は、分子間相同性を有する境界点の出現傾向を高めるために、したがって構築ブロック間で達成される結合数を高めるために（前記はそれぞれ生成される子孫キメラ分子数の増加を可能にする）、前記のような置換の核酸構築ブロックへの導入を提供する。
また別の特徴では、構築ブロックが作製される工程の合成的な性質によって、in vitroプロセス（例えば変異導入により）またはin vivoプロセス（例えば宿主生物の遺伝子スプライシング能を利用することにより）で場合によって後で除去することが可能なヌクレオチド（例えば1つまたは2つ以上のヌクレオチドで、例えばコドンまたはイントロンまたは調節配列であろう）を設計または導入することが可能になる。多くの事例で、有用な境界点を創出できるという潜在的な利点の他に多くの他の理由からこれらヌクレオチドの導入はまた所望されるであろうということは理解されよう。
ある特徴では、核酸構築ブロックを用いてイントロンを導入することができる。したがって、機能的なイントロンが本明細書に記載された方法にしたがって製造された人工遺伝子に導入される。前記人工的に導入されたイントロンは、天然に存在するイントロンが遺伝子スプライシングで機能を発揮する態様とほぼ同じように遺伝子スプライシングのために宿主細胞で機能することができる。
【０１１０】
最適化定方向進化系：本発明は、新規なまたは変異した特性をもつポリペプチド、例えば本発明のプロテアーゼまたは抗体を作出するために、“最適化定方向進化系”と称される非確率的遺伝子改変系を提供する。最適化定方向進化は、組換えによる核酸の定方向分子進化を可能にする、還元的再組合せ（reductive reassotment）、組換えおよび選別の反復サイクルを用いることを意図する。最適化定方向進化は進化したキメラ配列の大集団の作出を可能にし、前記作出集団には予め定められた数の交差事象を含む配列がきわめて豊富に存在する。
交差事象はキメラ配列内の点であり、前記点で一方の親の変種から別の親の変種へ配列のシフトが生じる。そのような点は通常は2つの親に由来するオリゴヌクレオチドが一緒に連結され、単一の配列を形成する結合部に存在する。本方法は、最終的なキメラ配列集団が選択した数の交差事象を豊富に含むことができるようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、予め定められた数の交差事象を含むキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
さらにまた、本方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種スペースの探索のための簡便な手段を提供する。以前には、反応中に例えば1013個のキメラ分子が作出された場合、そのような膨大な数の変種の特定の活性についてテストすることは極めて困難だったであろう。さらにまた、子孫集団の顕著な部分が、特定の活性のレベルが増加している可能性が少ないタンパク質を生じる非常に大きな数の交差事象を含むであろう。前記の方法を用いることによって、キメラ分子集団は特定の数の交差事象を含む変種を豊富に含むことができる。したがって、反応中になお1013個のキメラ分子しか作出できなくても、更なる分析のために選別される分子の各々は、例えば3つの交差事象だけを含む可能性が高くなる。生成された子孫集団が予め定めた数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界線が減少する。これによって、最初の親のポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を及ぼすために必要かを計算するときにより操作しやすい数の変数が提供される。
【０１１１】
キメラ子孫ポリヌクレオチドを作製する１つの方法は、それぞれの親の配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドを作製することである。各オリゴヌクレオチドは好ましくは固有のオーバーラップ領域を含み、その結果、前記オリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって、各オリゴヌクレオチド断片が正しい順番でアッセンブリングされた新規な変種が生成される。更なる情報は、例えばUSSN09/332,835；米国特許6,361,974号で見出すことができよう。
各親変種ために作出されるオリゴヌクレオチドの数は、最終的に作製されるキメラ分子で生じる交差の総数と関係がある。例えば、3つの親のヌクレオチド配列変種が提供され、連結反応を経て高温でより高い活性をもつキメラ変種を見つけることができるであろう。1つの例として、50個のオリゴヌクレオチド配列を含むセットを各親変種のそれぞれの部分に対応して作製することができる。
したがって、連結アッセンブリプロセスの間に、キメラ配列の各々の中に50個までの交差事象が存在することができよう。作出されたキメラポリヌクレオチドの各々が交互に各親変種由来のオリゴヌクレオチドを含む確率は非常に低い。各オリゴヌクレオチド断片が連結反応で同じモル濃度で存在するならば、いくつかの位置で同じ親に由来するオリゴヌクレオチドが互いに並んで連結され、したがって交差事象を生じない可能性がある。各親に由来する各オリゴヌクレオチドの濃度がこの例のいずれの連結工程でも一定に保たれるならば、同じ親変種に由来するオリゴヌクレオチドがキメラ配列内で連結され、交差を生じないチャンスは1/3（3つの親と仮定した）である。
【０１１２】
したがって、親変種セットの数、各変種に対応するオリゴヌクレオチドの数、および連結反応の各工程における各変種の濃度が与えられたならば、確率濃度関数（probability density function (PDF)）を決定して連結反応の各工程で生じる可能性がある交差事象をもつ集団を予測することができる。PDFの決定の根拠となる統計学および数学は以下に記載される。これらの方法を用いることによって、前記の確率濃度関数を決定することができ、したがって個々の連結反応から生じる予め定めた数の交差事象のためにキメラ子孫集団の濃度を高めることができる。さらにまた、交差事象の標的数は予め定めることができ、続いて、予め定めた交差事象数に集中する確率濃度関数をもたらす連結反応の各工程における各親オリゴヌクレオチドの出発量を算出するために前記系をプログラミングすることができる。これらの方法は、組換えによりポリペプチドをコードする核酸の誘導分子進化を可能にする還元的再組合せ、組換えおよび選別の反復サイクルを用いることを意図する。前記の系は進化したキメラ配列の大集団の作製を可能にし、前記作製された集団は、予め定めた数の交差事象を含む配列が顕著に濃縮されている。交差事象は、一方の親変種からもう一方の親変種へ配列のシフトが生じるキメラ配列中の点である。そのような点は通常は2つの親に由来するオリゴヌクレオチドが一緒に連結され、単一の配列を形成する結合部に存在する。前記方法は、最終的なキメラ配列集団が選択した数の交差事象に富むことができるようにオリゴヌクレオチド配列の正確な濃度の計算を可能にする。これによって、予め定めた数の交差事象を含むキメラ変種の選択に対してより大きな制御が提供される。
さらにまた、これらの方法は、他の系と比較して膨大な量の可能なタンパク質変種空間の探索のための簡便な手段を提供する。本明細書に記載した方法を用いることによって、特定の数の交差事象を含む変種についてキメラ分子集団を濃縮することができる。したがって、反応中になお1013個のキメラ分子しか作出できなくても、更なる分析のために選別される分子の各々は、例えば3つの交差事象だけを含む可能性が高くなる。生成された子孫集団が予め定めた数の交差事象を持つように偏らせることができるので、キメラ分子間の機能的変種に対する境界点が減少する。これによって、最初の親のポリヌクレオチドに由来するどのオリゴヌクレオチドが特定の属性に影響を及ぼすために必要かを計算するときにより操作しやすい数の変数が提供される。
ある特徴では、前記方法は、それぞれの親の配列の断片または部分に対応するオリゴヌクレオチドを作製することによってキメラ子孫ポリヌクレオチド配列を作出する。各オリゴヌクレオチドを一緒に混合することによって各オリゴヌクレオチド断片が正しい順番でアッセンブリングされた新規な変種が生じるように、各オリゴヌクレオチドは好ましくは固有のオーバーラップ領域を含む。USSN09/332,835を参照されたい。
【０１１３】
交差事象の決定：本発明の特徴は、所望の交差事象の確立濃度関数（PDF）、再アッセンブリングされる親遺伝子の数および再アッセンブリでの断片数を入力として受け取るシステムおよびソフトを含む。このプログラムの出力は、再アッセンブリングされた遺伝子を製造するためのレシピを決定するために用いることができる“断片PDF”およびこれら遺伝子の概算交差PDFである。本明細書に記載されるプロセッシングは好ましくは、MATLAB（登録商標）（The Mathworks, Natick, Massachusetts）、プログラミング言語およびテクニカルコンピューティングのための発展環境で実施される。
【０１１４】
反復プロセス：本発明の実施に際して、これらのプロセスは何度も繰り返すことができる。例えば、変異したまたは新規なプロテアーゼ表現型をもたらすある核酸（または所定の核酸）は特定、再単離、再改変され、さらに活性について再試験される。このプロセスは、所望の表現型が作出されるまで何度も繰り返すことができる。例えば、完全な生化学的同化作用または異化作用経路（例えばエポキシド加水分解活性を含む）を細胞内に高度な操作により作出することができる。
同様に、特定のオリゴヌクレオチドが所望の属性（例えば新規なプロテアーゼ表現型）について全く影響を与えないと決定されたならば、前記オリゴヌクレオチドは可変物として除去することができ、それは除去される配列を含むより大きな親オリゴヌクレオチドを合成することによって達成される。配列をより大きな配列内に取り込むことによって一切の交差事象が防止されるので、子孫ポリヌクレオチド中にはこの配列の変型はもはや全く存在しないであろう。どのオリゴヌクレオチドが所望の属性と最も関係があり、どのオリゴヌクレオチドが無関係であるかを決定するこの反復実施は、特定の属性または活性を提供する可能性があるタンパク質の全てについてより効率的な探索を可能にする。
【０１１５】
in vivoシャッフリング：分子のin vivoシャッフリングは、本発明のポリペプチド（例えば抗体、プロテアーゼなど）の変種を提供する本発明の方法で使用される。in vivoシャッフリングは、マルチマーを再結合させる細胞の天然の特性を利用して実施することができる。in vivo組換えは分子の多様性をもたらす主要な天然の経路を提供してきたが、一方遺伝子組み換えは以下を含む比較的複雑なプロセスのままである：1）相同性の認識；2）鎖の切断、鎖の侵襲、および組換え交差の生成をもたらす代謝過程；および最後に3）別個の再結合分子へのキアズマの分離。キアズマの形成は相同配列の認識を必要とする。
ある特徴では、本発明は、少なくとも第一のポリヌクレオチド（本発明のプロテアーゼ）および第二のポリヌクレオチド（例えば酵素、例えば本発明のプロテアーゼもしくは任意の他のプロテアーゼ、またはタグもしくはエピトープ）からハイブリッドポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。本発明を用いてハイブリッドポリヌクレオチドを製造することができる。前記は、部分的な配列相同性を少なくとも1つの領域で共有する少なくとも第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入することによって達成される。部分的な配列相同性領域は、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成する配列認識を生じるプロセスを促進する。本明細書で用いられる“ハイブリッドポリヌクレオチド”という用語は、本発明の方法によりもたらされ、少なくとも2つの原型ポリヌクレオチド配列由来の配列を含む任意のヌクレオチド配列である。そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、DNA分子間の配列統合を促進する分子間組換え事象により生じる。さらにまた、そのようなハイブリッドポリヌクレオチドは、連続工程の繰り返しによりDNA分子内のヌクレオチド配列を改変させる分子内還元的再組合せプロセスにより生成することができる。
【０１１６】
配列変種の生成：本発明はまた、本発明の核酸（例えばプロテアーゼ）配列の変種を作製する方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸およびポリペプチドを用いてプロテアーゼを単離するさらに別の方法を提供する。ある特徴では、本発明は本発明のプロテアーゼコード配列（例えば遺伝子、cDNAまたはメッセージ）の変種を提供する。前記変種は、任意の手段（例えばランダムもしくは確率的方法、または非確率的もしくは上記に記載した“定方向進化”方法を含む）によって変異させることができる。
前記単離変種は天然に存在するものでもよい。変種はまたin vitroで作出することもできる。変種は遺伝子工学技術、例えば位置特異的変異導入、化学的ランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIII欠失方法および標準的クローニング技術を用いて作出することができる。また別には、そのような変種、断片、類似体または誘導体は化学的合成または改変方法を用いて作出することができる。変種を作製する他の方法もまた当業者にはよく知られていよう。前記には、天然の単離体から得られた核酸配列を改変して、それらの工業的価値または実験室利用を高める性状をもつポリペプチドをコードする核酸を生成する方法が含まれる。そのような方法では、天然の単離体から得られた配列に対して1つまたは2つ以上のヌクレオチドの相違を有する多数の変種配列が作出され、性状が決定される。これらのヌクレオチド相違は、天然の単離体の核酸によってコードされるポリペプチドに対してアミノ酸変化をもたらすことができる。
【０１１７】
例えば、変種は変異性PCRを用いて作製することができる。変異性PCRでは、PCRは、DNAポリメラーゼの複写信頼性が低く、高率の点変異がPCR全長にわたって得られるような条件下で実施される。変異性PCRは例えば以下に記載されている：D.W. Leung et al., Technique, 1:11-15 (1989); R.C. Caldwell & G.F. Joyce, PCR Methods Applic. 2:28-33 (1992)。簡単に記せば、この方法では、変異を導入される核酸は、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼおよび適切な濃度のdNTPと混合され、PCR生成物の全長にわたって高率の点変異が達成される。例えば、この反応は、20fmoleの変異を導入されるべき核酸、30pmoleの各PCRプライマー、反応緩衝液（50mMのKCL、10mMのトリス（pH8.3）および0.01％のゼラチンを含む）、7mMのMgCl2、0.5mMのMnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mMのdGTP、0.2mMのdATP、1mMのdCTPおよび1mMのdTTPを用いて実施される。PCRでは、94℃1分、45℃1分および72℃1分の30サイクルが実施される。しかしながら、これらのパラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。変異核酸は適切なベクターでクローニングされ、前記変異核酸によってコードされたポリペプチドの活性が評価される。
変種はまた、任意のクローニングされた問題のDNAで位置特異的変異を生じるオリゴヌクレオチド特異的変異導入を用いて作出することができる。オリゴヌクレオチド変異導入は例えば以下に記載されている：Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57。簡単に記せば、前記の方法では、クローン化DNAに導入されるべき1つまたは2つ以上の変異をもつ複数の二本鎖オリゴヌクレオチドが合成され、変異を導入されるクローン化DNAに挿入される。変異を導入されたDNAを含むクローンを回収し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１１８】
変種を作出するまた別の方法はアッセンブリPCRである。アッセンブリPCRでは、小さなDNA断片混合物からPCR生成物をアッセンブリングすることが必要である。多数の様々なPCR反応が同じバイアル中で生じ、1つの反応の生成物が別の反応の生成物をプライミングする。アッセンブリPCRは例えば米国特許第5,965,408号に記載されている。
変種を作出するまた別の方法はセクシュアルPCR変異導入である。セクシュアルPCR変異導入では、配列相同性によるDNA分子のランダムな断片化とそれに続くPCR反応におけるプライマーの伸長による交差の固定の結果として、強制された相同組換えが、別個であるが相関性を有するDNA配列をもつDNA分子間でin vitroで生じる。セクシュアルPCR変異導入は例えば以下に記載されている：Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751。簡単に記せば、前記の方法では、組換えられるべき複数の核酸をDNaseで消化して平均サイズが50−200ヌクレオチドの断片を生成する。所望の平均サイズをもつ断片を精製し、PCR混合物に再懸濁する。PCRは、核酸断片間の組換えが促進される条件下で実施される。PCRは、例えば以下によって実施できる:精製断片を10−30ng/μＬの濃度で溶液（0.2Mの各dNTP、2.2mMのMgCl2、50mMのKCl、10mMのトリス塩酸（pH9.0）および0.1％トリトンX-100）に再懸濁する。100μＬの反応混合物につき2.5単位のTaqポリメラーゼを添加し、PCRを以下の方式を用いて実施する：94℃60秒、94℃30秒、50−55℃30秒、72℃30秒（30−45回）および72℃で5分。しかしながらこれらのパラメーターは適宜変動させることができることは理解されよう。いくつかの特徴では、オリゴヌクレオチドをPCR反応に含ませることができる。他の特徴では、DNAポリメラーゼIのクレノー断片をPCR反応の最初のセットで用い、Taqポリメラーゼをその後のPCR反応セットで用いることができる。組換え配列を単離し、それらがコードするポリペプチドの活性を評価する。
【０１１９】
変種はまたin vivo変異導入によって作出することができる。いくつかの特徴では、細菌株（例えば大腸菌株）で問題の配列を増殖させることによって、問題の配列でランダム変異が作出される。前記大腸菌株はDNA修復経路の1つまたは2つ以上に変異を含む。そのような“ミューテーター”株は野生型の親よりも高いランダム変異率を有する。これらの株の1つでDNAを増殖させることによって、最終的にはDNA内部にランダム変異が作出されるであろう。in vivo変異導入に使用するために適したミューテーター株は例えばPCT公開広報WO91/16427に記載されている。
変種はまたカセット変異導入を用いて作出される。カセット変異導入では、二本鎖DNA分子の小さな領域が、天然の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチド“カセット”で置き換えられる。前記オリゴヌクレオチドはしばしば完全におよび／または部分的に任意抽出された天然の配列を含む。
再帰的アンサンブル変異導入もまた変種の作出に用いることができる。再帰的アンサンブル変異導入は、表現型が関連性をもつ変異体の多様化集団（そのメンバーはアミノ酸配列が異なる）を作出するために開発されたタンパク質工学（タンパク質変異導入）のためのアルゴリズムである。前記方法はフィードバックメカニズムを用いて、コンビナトリアルカセット変異導入（combinatorial cassette mutagenesis）の連続一巡工程を制御する。再帰的アンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815。
【０１２０】
いくつかの特徴では、変種はエクスポネンンシャルアンサンブル変異導入を用いて作出される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は、高い割合の固有で機能的な変異体を含むコンビナトリアルライブラリーを作出するプロセスである。前記変異導入では、残基の小グループが並行して任意抽出され、機能的タンパク質を生じるアミノ酸がそれぞれ変更された位置で特定される。エクスポネンンシャルアンサンブル変異導入は例えば以下に記載されている：Delagrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552。ランダムな変異導入および位置特異的変異導入は例えば以下に記載されている：Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455。
いくつかの特徴では変種はシャッフリング方法によって作出される。前記では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分が融合され、例えば米国特許第5,965,408号、同第5,939,250号に記載されたようなキメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列が作出される（上記の考察もまた参照されたい）。
本発明はまた本発明のポリペプチド（例えばプロテアーゼ）の変種を提供する。前記変種では、（例えば本発明の例示的なポリペプチドの）1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（例えば保存アミノ酸残基）で置換されている配列を含み、さらにそのような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされるものでも、そうでないものでもよい。保存置換は、ポリペプチド内のあるアミノ酸が同様な特徴を持つ別のアミノ酸によって置換されるものである。したがって、本発明のポリペプチドは本発明の配列（例えば本発明の例示的なポリペプチド）の保存的置換を有するポリペプチドを含む。前記置換は以下の置換を含む（ただしこれらに限定されない）：脂肪族アミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の別の脂肪族アミノ酸による置換；セリンのスレオニンによる置換またはその逆；酸性残基（例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸）の別の酸性残基による置換；アミド基をもつ残基（例えばアスパラギンおよびグルタミン）の別のアミド基をもつ残基による置換；塩基性残基（例えばリジンおよびアルギニン）の別の塩基性残基による交換；および芳香族残基（例えばフェニルアラニン、チロシン）の別の芳香族残基による置換。他の変種は、本発明のポリペプチドの1つまたは2つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む変種である。
【０１２１】
本発明に包含される他の変種は、前記ポリペプチドが別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と結合しているものである。
本発明に包含されるさらに別の変種は、例えばリーダー配列、分泌配列、プロプロテイン配列または前記ポリペプチドの精製、濃縮または安定化を促進する配列のような、さらなる別のアミノ酸が前記ポリペプチドに融合されているものである。
いくつかの特徴では、本発明のポリペプチドの変種、断片、誘導体および類似体は、例示的なポリペプチドと同じ生物学的機能または活性、例えば本明細書に記載されたようなプロテアーゼ活性を保持している。他の特徴では、前記変種、断片、誘導体または類似体は、そのプロプロテイン部分の切断によって前記変種、断片、誘導体または類似体が活性化されて活性なポリペプチド生成することができるようにプロプロテインを含む。
【０１２２】
宿主細胞における高レベルのタンパク質発現を達成するためのコドンの最適化
本発明は、コドン使用頻度を改変するためにプロテアーゼコード核酸を改変する方法を提供する。ある特徴では、本発明は、プロテアーゼをコードする核酸のコドンを改変して宿主でのその発現を増加または減少させる方法を提供する。本発明はまた、宿主細胞でのその発現を高めるために改変されたプロテアーゼをコードする核酸、そのように改変されたプロテアーゼおよび前記改変プロテアーゼ酵素を製造する方法を提供する。本方法は、”非優先”または“低優先”コドンをプロテアーゼコード核酸中で特定し、さらにこれら非優先もしくは低優先コドンの1つまたは2つ以上を、前記コドンと同じアミノ酸をコードする“優先コドン”で置き換え、核酸内の少なくとも1つの非優先または低優先コドンを同じアミノ酸をコードする好ましいコドンによって置き換えることを含む。優先コドンとは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度に提示されるコドンであり、非優先または低優先コドンとは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである。
【０１２３】
本発明の核酸、発現カセットおよびベクターの発現のための宿主細胞には細菌、酵母、真菌、植物細胞および哺乳動物細胞が含まれる。したがって、本発明はこれら全ての細胞でコドン使用頻度を最適化する方法、コドン改変核酸およびコドン改変核酸によって生成されるポリペプチドを提供する。典型的な宿主細胞には、グラム陰性細菌（例えば大腸菌、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas flluorescens））；グラム陽性細菌（例えばストレプトミセス・ディベルサ（Streptomyces diversa）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトコッカス=ラクチス（Lactococcus lactis）,ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、枯草菌）が含まれる。典型的な宿主細胞はまた真核生物、例えば種々の酵母、例えばサッカロミケス種（ビール酵母菌、シゾサッカロミケス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびクリベロミケス=ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、アスペルギルス・ニゲルを含む）並びに哺乳動物細胞および細胞株、並びに昆虫細胞および細胞株を含む。したがって、本発明はまた前記生物および種での発現のために最適化された核酸およびポリペプチドを含む。
【０１２４】
例えば、細菌細胞から単離されたプロテアーゼをコードする核酸のコドンは、前記プロテアーゼが由来した細菌とは異なる細菌細胞、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞で前記核酸が最適に発現できるように改変される。コドンを最適化する方法は当業界においてよく知られており、例えば以下を参照されたい：US Pat. No. 5,795,737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253。さらにまた以下を参照されたい：Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253（マウス系でのコドンの最適化を記載）；Outchkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24（酵母でのコドンの最適化を記載）；Feng (2000) Biochemistry 39:15339-15409（大腸菌でのコドンの最適化を記載）；Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264（大腸菌での分泌に影響するコドン使用の最適化を記載）。
【０１２５】
非ヒトトランスジェニック動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（例えばプロテアーゼ）、発現カセットもしくはベクター、またはトランスフェクションされたもしくは形質転換された細胞を含むヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。本発明はまた、非ヒトトランスジェニック動物の作製方法および使用方法を提供する。
前記トランスジェニック動物は、例えばヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、乳牛、ラットおよびマウスで、本発明の核酸を含む。これらの動物は、例えばプロテアーゼ活性を調べるin vivoモデルとして、またはin vivoでのプロテアーゼ活性の調節物質をスクリーニングするモデルとして用いることができる。ヒト以外のトランスジェニック動物で発現されるべきポリペプチドのコード配列は、構成的であるように、または組織特異的、発育特異的もしくは誘導性調節因子の制御下にあるように設計することができる。ヒト以外のトランスジェニック動物は当業界で公知の任意の方法を用いて設計および作出することができる。例えば以下を参照されたい：US Patent No. 6,211,428; 6,187,992; 6,156,952; 6,118,044; 6,111,166; 6,107,541; 5,959,171; 5,922,854; 5,892,070; 5,880,327; 5,891,698; 5,639,940; 5,573,933; 5,387,742; 5,087,571（前記は形質転換細胞および卵並びにトランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタおよびウシの製造および使用について記載されている）。さらにまた例えば以下を参照されたい：Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157（トランスジェニック乳牛のミルクの組換えタンパク質の製造について記載）；Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461（トランスジェニックヤギの作製を示す）。米国特許第6,211,428号は、DNA配列を含む核酸構築物をその脳で発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物の製造および使用について記載している。米国特許第5,387,742号は、クローン化組換えまたは合成DNA配列の受精マウス卵への注入、前記注入卵の偽妊娠雌への移植および、アルツハイマー病関連タンパク質をその細胞が発現するトランスジェニックマウスの妊娠期間満了までの発育について記載している。米国特許第6,187,992号は、そのゲノムがアミロイド前駆体（APP）をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスの製造および使用を記載している。
“ノックアウト動物”もまた本発明の方法の実施に用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明のトランスジェニックまたは改変動物は“ノックアウト動物”、例えば内因性遺伝子を発現しないように操作された“ノックアウトマウス”を含む（前記内因性遺伝子は、本発明のプロテアーゼまたは本発明のプロテアーゼを含む融合タンパク質を発現する遺伝子で置き換えられている）。
【０１２６】
トランスジェニック植物および種子
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド（たとえばプロテアーゼ）、発現カセットもしくはベクター、またはトランスフェクションもしくは形質転換された細胞を含むトランスジェニック植物および種子を提供する。本発明はまた、本発明の核酸および／またはポリペプチド（例えばプロテアーゼ）を含む植物生成物、例えば種子、葉、抽出物などを提供する。トランスジェニック植物は双子葉植物または単子葉植物であり得る。本発明はまたトランスジェニック植物および種子の製造方法および使用方法を提供する。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞は当業界で公知の任意の方法にしたがって構築できる。例えば米国特許第6,309,872号を参照されたい。
本発明の核酸および発現構築物は任意の手段によって植物細胞に導入できる。例えば、核酸または発現構築物は所望の植物宿主のゲノムに導入することができるが、核酸または発現構築物はエピソームであってもよい。所望の植物のゲノム中への導入は、宿主のプロテアーゼの産生が内因性の転写または翻訳制御エレメントによって調節できるようなものであろう。本発明はまた、相同組換えによる遺伝子配列の挿入によって内因性遺伝子の発現が破壊された“ノックアウト植物”を提供する。“ノックアウト”植物を作製する手段は当業界でよく知られており、例えば以下を参照されたい：Strepp (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4368-4373; Miao (1995) Plant J. 7:359-365。下記のトランスジェニック植物についての考察を参照されたい。
【０１２７】
本発明の核酸を用いて、所望の属性を本質的に任意の植物（例えば澱粉生成植物、例えばジャガイモ、コムギ、イネ、オオムギなど）に付与することができる。本発明の核酸を用いて植物の代謝経路を操作し、宿主のプロテアーゼ発現を最適化または変化させることができる。本発明の核酸は植物のプロテアーゼ活性を変化させることができる。また別に、本発明のプロテアーゼをトランスジェニック植物の製造に用いて、天然には産生されない化合物を前記植物によって製造することができる。これによって製造コストを下げるか、または新規な生成物を作出することができる。
ある特徴では、トランスジェニック植物製造の第一の工程は、植物細胞での発現のための発現構築物を作製することを含む。この技術は当業界では公知である。これにはプロモーターの選別およびクローニング、リボソームのmRNAへの効率的な結合を促進するためのコード配列および適切な遺伝子ターミネーター配列の選別が含まれる。例示的な構成的プロモーターの1つはカリフラワーモザイクウイルスに由来するCaMV35Sであり、これは一般的な植物で高度な発現をもたらす。他のプロモーターはより特異的であり、植物の内部環境または外部環境の合図に反応する。例示的な光誘導プロモーターは、主要な葉緑素a/b結合タンパク質をコードするcab遺伝子に由来するプロモーターである。
ある特徴では、核酸は改変されて植物細胞でのより強い発現が達成される。例えば、本発明の配列は植物で認められるA-Tヌクレオチド対の割合と比較して高いA-Tヌクレオチド対をもつ可能性が高い（植物のいくつかはG-Cヌクレオチド対を好む）。コード配列内のA-Tヌクレオチドは、アミノ酸配列を顕著に変化させることなくG-Cヌクレオチドに置換して、植物細胞での遺伝子生成物の産生を高めることができる。
【０１２８】
選別可能なマーカー遺伝子を遺伝子構築物に付加し、トランスジーンを組み込むことに成功した植物細胞または組織を同定することができる。前記は、植物細胞での遺伝子の取り込みおよび発現の達成が稀な事象であり、標的組織または細胞のわずかな割合で生じるだけであるので必要であろう。選別可能なマーカー遺伝子は、通常は植物にとって有毒である物質（例えば抗生物質または除草剤）に対して耐性を提供するタンパク質をコードする。前記適切な抗生物質または除草剤を含む培地で増殖させたとき、前記選別可能なマーカー遺伝子を組み込んだ植物細胞だけが生存するであろう。他の挿入遺伝子の場合のように、マーカー遺伝子もまた適切な機能のためにプロモーターおよびターミネーター配列を要求する。
ある特徴では、トランスジェニック植物または種子の作製は、本発明の配列および場合によってマーカー遺伝子の標的発現構築物（例えばプラスミド）への取り込みを前記プロモーターおよびターミネーター配列の適切な配置とともに含む。これは、適切な方法により改変遺伝子を前記植物に移すことを必要とするであろう。例えば、構築物は植物細胞のゲノムDNAに、例えば植物細胞のプロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を用いて直接導入することができる。または、構築物は投射的方法（例えばDNA粒子ボンバードメント）を用いて植物組織に直接導入することもできる。例えば以下を参照されたい：Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35:197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6:17-30; Klein (1987) Nature 327:70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72:63-69（前記はトランスジーンのコムギへの導入のための粒子ボンバードメントの使用を考察する）；およびAdam (1997)上掲書（YACの植物細胞への導入のための粒子ボンバードメントの使用について記載）。例えばRinehart (1997)（上掲書）は粒子ボンバードメントを用いてトランスジェニック綿の木を作出した。粒子を加速する装置は米国特許第5,015,580号に記載されており、さらにBioRad（Biolistics）PDS-2000粒子加速装置が市販されている。さらに以下もまた参照されたい：米国特許第5,608,148号（John）；および米国特許第5,681,730号（Ellis）（前記は裸子植物の粒子媒介形質転換を記載している）。
【０１２９】
ある特徴では、プロトプラストを固定化し、核酸（例えば発現構築物）を注入することができる。プロトプラストから植物を再生させることは穀類では容易ではないが、マメ類では体細胞の胚形成を用いてプロトプラスト由来カルスから植物の再生が可能である。器官を形成した組織を遺伝子銃技術を用いて裸のDNAで形質転換することができる。この場合はDNAはタングステンの微小発射体上に被覆され、細胞のサイズの1/100に発射される。前記発射体はDNAを細胞および細胞内小器官の奥深くに運ぶ。続いて形質転換組織を再生のために誘導する（通常は体細胞胚形成による）。前記技術はいくつかの穀類種（トウモロコシおよびイネを含む）で成功した。
核酸、例えば発現構築物もまた組換えウイルスを用いて植物細胞に導入することができる。植物細胞はウイルスベクター、例えばタバコモザイクウイルス由来ベクターを用いて形質転換することができる（Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989-999）。以下を参照されたい：”Use of viral replicons for the expression of genes in plants”, Mol. Biotechnol. 5:209-221。
【０１３０】
また別には、核酸（例えば発現構築物）を適切なT-DNAフランキング領域と結合させて、一般的なアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）宿主ベクターに導入することができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのビルレンス機能は、細胞が前記細菌に感染したとき植物細胞DNAに前記構築物および隣接するマーカーの挿入を誘導するであろう。アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換技術（バイナリーベクターの毒性解除および使用を含む）は学術文献に詳しく記載されている。例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496-498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803;Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995)。アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞中のDNAは細菌の染色体に、Ti（腫瘍誘発；tumor-inducing）プラスミドとして知られている別の構造物と同様に収納される。Tiプラスミドは、T-DNA（約20kbの長さ）と称される一続きのDNA（感染プロセスで植物細胞に移される）および一連のvir（virulence、ビルレンス）遺伝子（関連プロセスを誘導する）を含む。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは傷からのみ植物に感染する。植物の根または茎が傷を受けたとき、植物はある種の化学的シグナルを発し、それに対してアグロバクテリウム・ツメファシエンスのvir遺伝子は活性化され、TiプラスミドのT-DNAの植物染色体への移転に必要な一連の事象を誘導する。続いてT-DNAは創傷から植物細胞に進入する。１つの推測は、T-DNAは、植物DNAが複製または転写されるまで待機し、続いて露出された植物DNAに挿入するということである。アグロバクテリウム・ツメファシエンスをトランスジーンベクターとして使用するために、T-DNAの腫瘍誘発部分を除去し、一方T-DNAボーダー領域およびvir遺伝子は維持する必要がある。続いてトランスジーンをT-DNAボーダー領域間に挿入する（この場合、トランスジーンは植物細胞に移され、植物染色体に組み込まれる）。
【０１３１】
本発明は、本発明の核酸を用いて単子葉植物（重要な穀類を含む）の形質転換を提供する（Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218）。さらにまた、例えば以下を参照されたい：Horsch (1984) Science 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803; Thykjaer (1997) 上掲書; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135-1148（ゲノムDNAへのT-DNAの組み込みについて考察する）。さらにまた以下を参照されたい：米国特許第5,712,135号（D'Halluin）（穀類または他の単子葉植物の細胞内で機能を有する遺伝子を含むDNAの安定な組み込みのための方法を開示する）。
ある特徴では、第三の工程は、取り込まれた標的遺伝子を次の世代に伝達することができる完全な植物の選別および再生を含むことができる。そのような再生技術は、組織培養の増触培地での一定の表現型のマニピュレーションに依存し、典型的には所望のヌクレオチド配列と一緒に導入された有毒物質および／または除草剤マーカーに依存する。培養プロトプラストから植物を再生することについては以下に記載されている：Evans et al., Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp.124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; Binding, Regenration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985。再生はまた植物カルス、外植片、器官またはその部分からも得ることができる。そのような再生技術は一般的には以下に記載されている：Klee (1987) Ann. Rev. of Phys. 38:467-486。トランスジェニック組織（例えば未熟胚）から完全な植物を得るために、前記胚を栄養およびホルモンを含む一連の培養液中で環境制御条件下（組織培養として公知の方法）で増殖させることができる。いったん植物体全体が生成され種子が生じたら、子孫の評価が開始される。
【０１３２】
発現カセットがトランスジェニック植物に安定的に取り込まれた後、前記カセットは有性交配によって他の植物に導入することができる。交配される種に応じて、多くの標準的育種技術のいずれも用いることができる。本発明の核酸のトランスジーン発現は表現型の変化を生じるので、本発明の組換え核酸を含む植物を第二の植物と有性交配して最終生成物を得ることができる。したがって、本発明の種子は、本発明の2つのトランスジェニック植物間の交配、または本発明の植物と他の植物間の交配から誘導することができる。所望の効果（例えば開花の態様が変化した植物を作製するために本発明のポリペプチドを発現させる）は、両方の親植物が本発明のポリペプチド（例えばプロテアーゼ）を発現するときに強化される。所望の効果は将来の植物世代に標準的な繁殖手段によって伝えることができる。
本発明の核酸およびポリペプチドは任意の植物または種子で発現されまたは挿入される。本発明のトランスジェニック植物は双子葉植物でも単子葉植物でもよい。本発明のトランスジェニック単子葉植物の例は、牧草、例えばメドーグラス（meadow grass（ブルーグラス、Poa））、飼い葉用草類、例えばフェスチュカ（festuca）、ロリウム（lolium）、テンペレートグラス、例えばアグロスチス（Agrostis）および穀類、例えばコムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、コメ、モロコシおよびトウモロコシ（コーン）である。本発明のトランスジェニック双子葉植物の例は、タバコ、豆類（例えばルピン）、ジャガイモ、サトウダイコン、エンドウマメ、インゲンマメおよびダイズ、並びに十字架植物（Brassicaceae科）、例えばカリフラワー、ナタネ、および近縁のモデル植物のアラビドプシス=タリアーナ（Arabidopsis thaliana）である。したがって、本発明のトランスジェニック植物および種子には以下を含む広範囲の植物が含まれる（ただしこれらに限定されない）：アナカルジウム（Anacardium）、アラキス（Arachis）、アスパラガス、アトロパ（Atropa）、アベナ（Avena）、ブラシッカ（Brassica）、シトラス、シトラルス（Citrullus）、カプシクム（Capsicum）、カルサムス（Carthamus）、ココス（Cocos）、コフェア（Coffea）、ククミス（Cucumis）、ククルビタ（Cuurbita）、ダウクス（Daucus）、エレイス（Elaris）、フラガリア（Fragaria）、グリシン（Glycine）、ゴッシピウム（Gossypium）、ヘリアンサス（Helianthus）、ヘテロカリス（Heterocallis）、ホルデウム（Hordeum）、ヒオシアムス（Hyoscyamus）、ラクツカ（Lactuca）、リヌム（Linum）、ロリウム（Lolium）、ルピナス、リポペルシコン（Lycopersicon）、マルス（Malus）、マニホット（Manihot）、マジョラナ（Majorana）、メディカゴ（Medicago）、ニコチアナ、オレア（Olea）、オリザ（Oryza）、パニエウム（Panieum）、パニセツム（Panisetum）、ペルシア（Persea）、ファセオルス（Phaseolus）、ピスタキア（Pistachia）、ピスム（Pisum）、ピルス（Pyrus）、プルヌス（Prunus）、ラファヌス（Raphanus）、リシヌス（Ricinus）、セカレ（Secale）、セネシオ（Senecio）、シナピス（Sinapis）、ソラナム（Solanum）、ソルグム（Sorghum）、テオブロムス（Theobromus）、トリゴネラ（Trigonella）、トリチクム（Trigonella）、ビシア（Vicia）、ビチス（Vitis）、ビグナ（Vigna）、およびゼア（Zea）。
【０１３３】
また別の実施態様では、本発明の核酸は、繊維細胞を含む植物（綿、シルクコットンツリー（Kapok、Ceiba pentandra）、ヤナギ（desert willow）、クレオソートブッシュ、ウィンターファット、バルサ、カラムシ、ケナフ、アサ、ロゼレ（roselle）、ジュート、サイザル（sisal abaca）およびアマを含む）で発現される。また別の実施態様では、本発明のトランスジェニック植物はゴシピウム（Gossypium）属のメンバー（一切のワタの種のメンバー、例えばG.アルボレウム（arboreum）; G. ヘルバセウム（herbaceum）; G. バルバデンス（barbadense）; G. ヒルスタム（hirsutum）を含む）であろう。
本発明はまた、大量の本発明のポリペプチド（例えばプロテアーゼまたは抗体）を製造するために用いることができるトランスジェニック植物を提供する。例えば以下を参照されたい：Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289-296（オーキシン誘導性二方向性マンノピンシンターゼ（mas1',2'）プロモーターを用い、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介リーフディスク形質転換法により母乳タンパク質のベータカゼインのトランスジェニックジャガイモによる生産を記載）。
公知の方法を用いて、当業者は、形質導入植物でトランスジーンのmRNAまたはタンパク質の増減を検出することによって本発明の植物をスクリーニングすることができる。mRNAの検出および定量手段は当業界でよく知られている。
【０１３４】
ポリペプチドおよびペプチド
ある特徴では、本発明は、本発明の例示的なポリペプチド（アミノ酸）配列（例えば配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249；配列番号:255に示される配列を有するタンパク質、または配列番号:145によってコードされるポリペプチド）に対して配列同一性（例えば少なくとも50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77%、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはより高い、または完全な（100％）配列同一性）を有する単離または組換えポリペプチドを提供する。ある特徴では、前記ポリペプチドは、プロテアーゼ活性（プロテイナーゼおよび／またはペプチダーゼ活性（例えばぺプチド結合を加水分解する能力）を含む）を有する。前記プロテアーゼ活性は、ペプチダーゼ活性（例えばカルボキシペプチダーゼ活性、ジペプチジルペプチダーゼもしくはオリゴペプチダーゼ活性、またはアミノペプチダーゼ活性を含むことができる。前記ペプチダーゼ活性は、セリンプロテイナーゼ活性、メタロプロテイナーゼ活性、システインプロテアーゼ活性および／またはアスパラギンプロテアーゼ活性、またはキモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインおよび／またはスブチリシンと同じもしくは類似の活性を含むことができる。
【０１３５】
典型的なプロテアーゼ活性は、表１、表２および表３に示されている。アッセイは下記の実施例に詳細に記載されている。アッセイは、タンパク質基質（例えばカゼイン、ゼラチン、トウモロコシのゼイン、ダイズのトリプシンインヒビター、ダイズレクチンおよびコムギ胚芽レクチン）の他に、小分子に結合させた種々のPNA（パラ-ニトロアナリド）に対するプロテアーゼ活性を測定するために開発された。小ペプチド基質のアッセイでは、末端ペプチド結合の加水分解によってpNA基が遊離され、410nmでの吸収の増加がもたらされる。タンパク質基質に対する活性のモニターでは、37℃でのプロテアーゼと基質のインキュベーションに続いて、分子内消光基質に由来する蛍光の増加がO-フタルジアルデヒド（OPA）分析によってモニターされる。OPA分析では、BMEの存在下でOPAは遊離アミノ末端と反応して蛍光性イミダゾールを生成し、前記は標準的な蛍光プレート読み取り装置を用いて、またはSDS-PAGE分析（プロテアーゼ活性は基質バンドの減少または消失によって表示される）によって検出できる。
カゼイン、ゼラチンまたはダイズゼインに対するプロテイナーゼ活性はまたザイモグラムによって決定される。ザイモグラムゲルはゲルマトリックスに包埋された酵素の基質（例えばアルファ-ゼイン）を含む。プロテアーゼがゲル中のゼインに対して活性を有する場合、電気泳動、再生、現像および染色工程に続いて背景内に透明なゾーンが生じるであろう。透明ゾーンはゲル中のプロテアーゼの位置に一致する。
下記の表１はプロテアーゼ活性を有する例示的なポリペプチドを示している。
【０１３６】
表１．
2006516889.tif 000005
＋は、活性がこの基質で検出されたことを示し、−はこの基質について試験条件で活性が検出されなかったことを示し、空欄は対応する基質に対する活性はまだ測定されていないことを示している。（AAPF=N-Suc-アラニン-プロリン-フェニルアラニン-pNA、AAA=N-Suc-アラニン-アラニン-アラニン-pNA、BAPNA=N-BZ=D,L-アルギニン-pNA、GGF=N-Suc-グリシン-グリシン-フェニルアラニン-pNA、IEGR=N-Suc-イソロイシン-グルタメート-グリシン-アルギニン-pNA、PFR=N-Suc-プロリン-フェニルアラニン-アルギニン-pNA）。
下記の表２および３は、ペプチダーゼ活性を有する例示的なポリペプチドを示し、それらのプロテアーゼ活性のまとめを示す。
【０１３７】
表２：
2006516889.tif 000006
【０１３８】
表３：活性のまとめ
2006516889.tif 000007
ND=試験条件下で検出可能な活性無し；M=Maybe（試験条件下でわずかな活性）；
*-48時間の時点でのデータ。
対応する陰性対照は分析により、検出可能な活性をもたないことが示された。
OPAデータは、酵素および基質の反応の蛍光を対応する酵素のみおよび基質のみの対照の総計で割った比として表されている。
活性比＝    FL  基質および酵素調製物の反応
（FL 基質のみ）＋（FL 酵素調製物のみ）
【０１３９】
蛍光比が１というのは、バックグラウンドより高い活性がないことを示す。１より高い蛍光比はプロテアーゼによる基質のタンパク分解によって生成された遊離アミノ末端が存在することを示す。１より低いFL比は、酵素調製物中のバックグラウンドタンパク質の加水分解が、基質が存在する場合よりも基質の非存在下でより強く生じて前記プロテアーゼが基質によって阻害されたことを示しているかもしれない。この事例では、酵素のみの対照におけるFLバックグラウンド蛍光は、酵素プラス基質サンプルのバックグラウンド成分に対して不当に大きいであろう。
本発明のポリペプチドには活性型および不活性型のプロテアーゼが含まれる。例えば、本発明のポリペプチドには、例えば“活性な”成熟タンパク質を生成する前駆タンパク質プロセッシング酵素（例えば前駆タンパク質コンバターゼ）による “成熟前”またはプレプロ配列のプロセッシング前の前駆タンパク質が含まれる。本発明のポリペプチドには、その他の理由（例えば翻訳後プロセッシング事象、例えばエンド-もしくはエキソ-ペプチダーゼまたはプロテイナーゼ作用、リン酸化事象、アミド化、グリコシル化もしくは硫酸化、ダイマー化など）で不活性なプロテアーゼが含まれる。
本発明のポリペプチドには全ての活性型（前記プロテアーゼの活性な部分配列、例えば触媒ドメインまたは活性部位を含む）が含まれる。ある特徴では、本発明は下記に示される触媒ドメインまたは活性部位を提供する。ある特徴では、本発明は、下記に示される活性部位ドメインを含むか、または前記から成るペプチドまたはポリペプチドを提供する。前記ドメインは、データベース（Pfam）を使用することにより予想された。前記データベースは、多くの一般的なタンパク質ファミリーに及ぶ多数の配列アラインメントおよび隠蔽されたマルコフ（Markov）モデルの大きな集合物、Pfamタンパク質ファミリーデータベースである（A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, L. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, and E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30(1):276-280, 2002）。
【０１４０】
配列番号      ドメイン（AA=アミノ酸）
248, 249 AA(104)...(500)
真核細胞アスパルチルプロテアーゼ
AA(112)...(317)
218, 219 亜鉛カルボキシペプチダーゼ
AA(116)...(325)
179, 180亜鉛カルボキシペプチダーゼ
AA(117)...(321)
241, 242亜鉛カルボキシペプチダーゼ
AA(121)...(228)
PA(プロテアーゼ付随)ドメイン；
AA(234)...(468)
193, 194ペプチダーゼファミリーM28
AA(124)...(340)
204, 205亜鉛カルボキシペプチダーゼ
AA(124)...(344)
199, 200亜鉛カルボキシペプチダーゼ
AA(128)...(378)
164, 165ペプチダーゼファミリーM28
AA(156)...(426)
スブチラーゼファミリー；
AA(74)...(142)
187, 188スブチリシンN-末端領域
AA(234)...(471)
ペプチダーゼファミリーM28；
AA(115)...(224)
222, 223(プロテアーゼ付随)ドメイン
AA(239)...(439)
171, 172ペプチダーゼファミリーM48
AA(35)...(120)
スブチリシンN-末端領域；AA(134)...(397)
229, 230スブチラーゼファミリー
AA(5)...(389)
150, 151真核細胞アスパルチルプロテアーゼ
AA(52)...(494)
210, 211セリンカルボキシペプチダーゼ
AA(74)...(522)
254, 255セリンカルボキシペプチダーゼ
AA(96)...(532)
158, 159セリンカルボキシペプチダーゼ
【０１４１】
例えば、本発明は、配列番号:249（配列番号:248によってコードされる）の残基104から500に示される活性部位ドメインを含むかまたは前記から成るペプチドまたはポリペプチドを提供する（前記活性部位はアスパルチルプロテアーゼ活性を有する）。別の特徴では、本発明は、配列番号:219（配列番号:218によってコードされる）の残基112から317に示される活性部位ドメインを含むまたは前記から成るペプチドまたはポリペプチドを提供する（前記活性部位は亜鉛カルボキシペプチダーゼ活性を有する）、など等である。
“プレプロ”領域配列およびシグナル配列を同定する方法は当業界ではよく知られている。例えば以下を参照されたい：Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2):115-136。例えば、プレポ配列を同定するために、前記タンパク質を細胞外間隙から精製し、N-末端タンパク質配列を決定し、プロセッシングを受けていない形態と比較する。
本発明には、シグナル配列および／またはプレプロ配列を有するポリペプチドまたは前記を有しないポリペプチドが含まれる。本発明には、異種シグナル配列および／またはプレプロ配列を有するポリペプチドが含まれる。プレプロ配列（異種プレプロドメインとして用いられる本発明の配列を含む）は前記タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端配置することができる。本発明にはまた、本発明の配列を含む、単離または組換えシグナル配列（例えば表４参照）、プレプロ配列および触媒ドメイン（例えば“活性部位”）が含まれる。
パーセント配列同一性は前記ポリペプチドの全長にわたり得る。または前記同一性は少なくとも約50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700またはそれより多くの残基領域にわたることができる。本発明のポリペプチドはまた、例示的なポリペプチドの完全長より短くてもよい。また別の特徴では、本発明は、あるポリペプチド（例えば酵素、例えばプロテアーゼ）の約5から完全長のサイズ範囲のポリペプチド（ペプチド、断片）を提供する。典型的なサイズは、本発明の例示的なプロテアーゼの約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700またはそれより多い、例えば本発明の例示的プロテアーゼの連続残基である。
【０１４２】
本発明のペプチド（例えば本発明の例示的なポリペプチドの部分配列）は、例えば標識プローブ、抗原、トレラジェン、モチーフ、プロテアーゼ活性部位（例えば“触媒ドメイン”）、シグナル配列および／またはプレプロドメインとして役立つことができる。
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、天然の供給源から単離するか、合成または組換えによって生成されるポリペプチドである。ペプチドおよびタンパク質は組換えによってin vivoまたはin vitroで発現させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当業界で公知の任意の方法を用いて製造および単離できる。本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、当業界で知られた化学的方法を用いてその全体または部分を合成してもよい。例えば以下を参照されたい：Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; A.K. Banga, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を用いて実施してもよい（例えば以下を参照されたい：Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3_13）。さらに前記は、例えばABI431Aペプチド合成装置（Perkin Elmer）を用い製造元の提供する指示にしたがって自動合成することもできる。
【０１４３】
本発明のペプチドおよびポリペプチドはまたグリコシル化することもできる。前記グリコシル化は翻訳後に化学的にまたは細胞の生合成メカニズムによって行われ得る。後者の場合、公知のグリコシル化モチーフの使用が含まれる（前記モチーフは配列にとって天然のものでもよく、またペプチドとして付加するか配列をコードする核酸に付加することもできる）。前記グリコシル化はO-結合またはN-結合であり得る。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは（上記で定義されたように）、全ての“模倣体”および“ペプチド模倣体”形を含む。“模倣体”および“ペプチド模倣体”という用語は、実質的に本発明のポリペプチドと同じ構造および／または機能的特徴を有する合成化学物質を指す。前記模倣体は完全に合成された非天然アミノ酸類似体で構成されているか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に非天然のアミノ酸類似体のキメラ分子であり得る。前記模倣体はまた任意の量の天然アミノ酸保存置換を含むことができるが、ただしそのような置換が前記模倣体の構造および／または活性を実質的に変化させない場合に限られる。保存的変種である本発明のポリペプチドに関しては、日常的な実験によって模倣体が本発明の範囲内に包含されるものであるか否か、すなわちその構造および／または機能が実質的に改変されていないかどうかが決定されるであろう。したがって、ある特徴では、模倣体組成物がプロテアーゼ活性をもつならば前記は本発明の範囲内に包含される。
【０１４４】
本発明のポリペプチド模倣体組成物は任意の組合せの非天然成分を含むことができる。また別の特徴では、本発明の模倣体組成物は以下の3つの構造基の1つまたは全てを含む：a）天然のアミド結合（“ペプチド結合”）以外の残基結合基；b）天然に存在するアミノ酸残基の代わりに非天然残基；c）二次構造模倣を誘導する（すなわち二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファヘリックス構造を誘導または安定化させる）残基。例えば本発明のポリペプチドは、その残基の全てまたはいくつかが天然のペプチド結合以外の化学的手段によって結合されるとき模倣体と特徴付けることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合、他の化学的結合、またはカップリング手段、例えばグルタールアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能基性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）またはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）によって結合される。通常のアミド結合（“ペプチド結合”）の代用となることができる結合基には例えば以下が含まれる：ケトメチレン（例えば-C(=O)-NH-の代わりに-C(O=)-CH2-）、アミノメチレン（CH2-NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH2-O）、チオエーテル（CH2-S）、テトラゾール（CN4）、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステル（例えば以下を参照されたい：Spatola (1983) Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp267-357, “Peptide Backbone Modifications”, Marcell Dekker, NY）。
本発明のポリペプチドはまた、天然に存在するアミノ酸残基の代わりに全てまたはいくつかの非天然の残基が含まれることによって模倣体として特徴付けることもできる。非天然残基は学術文献および特許文献に詳しく記載されている。天然のアミノ酸残基の模倣体として有用な典型的な非天然組成物のいくつかおよび基準は以下で述べる。芳香族アミノ酸の模倣体は、例えば以下によって置き換えることによって生成することができる：D-またはL-ナフチルアラニン；D-またはL-フェニルグリシン；D-またはL-2チエネイルアラニン；D-またはL-１、-2,3-、または4-ピレネイルアラニン；D-またはL-3チエネイルアラニン；D-またはL-(2-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(3-ピリジニル)-アラニン；D-またはL-(2-ピラジニル)-アラニン；D-またはL-(4-イソプロピル)-フェニルグリシン；D-(リフルオロメチル)-フェニルグリシン；D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン；D-p-フルオロ-フェニルアラニン；D-またはL-p-ビフェニルフェニルアラニン；K-またはL-p-メトキシ-ビフェニルフェニルアラニン；D-またはL-2-インドール(アルキル)アラニン；およびD-またはL-アルキルアラニン（前記アルキルはメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、iso-ブチル、sec-イソチル、iso-ペンチルまたは非酸性アミノ酸で置換できるがまた置換されてなくてもよい）。非天然アミノ酸の芳香環には、例えばチアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
【０１４５】
酸性アミノ酸の模倣体は、例えば陰性荷電を維持している非カルボキシレートアミノ酸、（ホスホノ）アラニン、硫酸スレオニンによって置換することにより生成できる。カルボキシル側鎖基（例えばスパルチルまたはグルタミル）はまた、カルボジイミド（R'-N-C-N-R'）、例えば1-シクロヘキシル-3(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3(4-アゾニア-4,4-ジメソールペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に改変することができる。アスパルチルまたはグルタミルもまた、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。塩基性アミノ酸の模倣体は、（リジンおよびアルギニンの他に）アミノ酸オルニチン、シトルリンまた
は(グアニジノ)-酢酸または(グアニジノ)アルキル-酢酸（アルキルは上記で定義されたとおり）による置換によって生成することができる。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）でアスパラギンまたはグルタミンを置換することができる。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、対応するアスパルチルまたはグルタミル残基に脱アミノ化することができる。アルギニン残基模倣体は、アルギニルを例えば1つまたは2つ以上の通常の試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロ-ヘキサンジオンまたはニンヒドリンを含む）と、好ましくはアルカリ性条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基模倣体はチロシルを例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによって生成することができる。N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いてO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体をそれぞれ形成することができる。システイン残基模倣体は、システイニル残基を例えばアルファ-ハロアセテート（例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）および対応するアミンと反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成することによって達成できる。システイン残基模倣体はまた、システイン残基を例えばブロモ-トリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-ベータ-(5-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド；メチル2-ピリジルジスルフィド；p-クロロ水銀ベンゾエート；2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール；またはクロロ-7-ニトロベンゾ-オキサ-1,3-ジアゾールと反応させることによって生成することができる。リジン模倣体は、リジニルをコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることによって（さらにアミノ末端残基を変化させることによって）生成することができる。リジンおよび他のアルファ-アミノ含有残基模倣体はまた、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロ-ベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオンとの反応、およびグキオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応によって生成することができる。メチオニンの模倣体は、例えばメチオニンスルホキシドとの反応によって生成することができる。プロリンの模倣体には、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、3-または4-ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリン、3-または4-メチルプロリンまたは3,3-ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基模倣体はヒスチジルを例えばジエチルプロカルボネートまたはパラ-ブロモフェナシルブロミドと反応させることによって生成することができる。他の模倣体には、例えばプロリンおよびリジンのヒドロキシル化；セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのアルファ-アミノ基のメチル化；N-末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはN-メチルアミノ酸による置換；またはC-末端カルボキシル基のアミド化によって生成することができるものが含まれる。
【０１４６】
本発明のポリペプチドの残基、例えばアミノ酸はまた反対のキラリティーをもつアミノ酸(またはペプチド模倣体残基)によって置換することができる。したがって、L型構造で天然に存在するいずれのアミノ酸（前記化学物質の構造に応じてRまたはSとも呼ぶことができる）も、同じ化学構造型であるが反対のキラリティーのアミノ酸またはペプチド模倣体（D-アミノ酸と称されるが、またR-またはS-型とも称される）で置換することができる。
本発明はまた本発明のポリペプチドを、天然のプロセス(例えば翻訳後プロセッシング、例えばリン酸化、アセチル化など)または化学的改変技術のどちらかによって改変する方法、および生成された改変ポリペプチドを提供する。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド内のいずれの場所でも生じることができる。あるポリペプチドで同じタイプの改変が同じ程度または種々の程度でいくつかの部位で存在することができることは理解されよう。さらにまた与えられたポリペプチドが多くのタイプの改変を含むこともできる。改変には以下が含まれる：アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム成分の共有結合による付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質または脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合による付加、架橋環形成、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストリエーション、酸化、PEG化、タンパク分解プロセッシング、リン酸化、プレニレーション、ラセミ化、セレノイレーション、硫酸化、およびタンパク質へのトランスファーRNA媒介アミノ酸付加、例えばアルギニル化。例えば以下を参照されたい：T.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C.  Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 (1983)。
【０１４７】
固相ペプチド化学合成法もまた本発明のポリペプチドまたは断片の合成に用いることができる。前記の方法は1960年代初頭より当業界で公知であり（R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963；さらにまた以下を参照されたい：J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Snthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., pp.11-12）、さらに最近は市販の実験室ペプチド設計および合成キット（Canbridge Research Biochemicals）として用いられている。そのような市販の実験室キットは一般的にはH.M. Geysenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998 (1984)）の教示を利用し、多数の“ロッド”または“ピン”（前記は全て一枚のプレートにつながっている）の先端でペプチドを合成させる。このような系を利用するときは、ロッドまたはピンを含むプレートはさかさまにされ、対応するウェルまたはレザバーの第二のプレートに挿入される。前記ウェルまたはレザバーは適切なアミノ酸をピンまたはロッドの先端に結合または固着させるために溶液を含んでいる。そのような工程（すなわちロッドまたはピンの先端をさかさまにして適切な溶液に挿入する工程）を繰り返すことによって、アミノ酸は所望のペプチドに構築される。さらにまた、多数のFMOCペプチド合成系が利用可能である。例えば、ポリペプチドまたは断片のアッセンブリーはアプライドバイオシステムズ社のモデル431A（登録商標）自動ペプチド合成装置を用いて固相上で実施できる。前記のような装置は、直接合成または一連の断片（前記断片は他の公知の技術を用いて結合させることができる）の合成によって本発明のペプチドの容易な入手を提供する。
本発明には、シグナルを含むまたはシグナルを含まない本発明のプロテアーゼが含まれる。本発明のシグナル配列を含むポリペプチド（例えば表4参照）は、本発明のプロテアーゼ、または別のプロテアーゼ、または別の酵素または他のポリペプチドであろう。
【０１４８】
本発明には固定化されたプロテアーゼ、抗プロテアーゼ抗体およびその断片が含まれる。本発明は、例えば本発明の優性ネガティブ変異体または抗プロテアーゼ抗体を用いてプロテアーゼ活性を阻害する方法を提供する。本発明には、本発明のプロテアーゼを含むヘテロ複合体（例えば融合タンパク質、へテロ二量体など）が含まれる。
本発明のポリペプチドは、種々の条件（極端なpHおよび／または温度、酸化剤など）の下でプロテアーゼ活性を有することができる。本発明は、（例えば温度、酸化剤および洗浄条件の変化に対し）種々の触媒性能および安定性を有するまた別のプロテアーゼ調製物をもたらす方法を提供する。ある特徴では、プロテアーゼ変種は、位置特異的変異導入および／またはランダム変異導入の技術を用いて作製することができる。ある特徴では、定方向進化を用いてまた別の特異性および安定性を有する極めて多様なプロテアーゼ変種を作製することができる。
本発明のタンパク質はまた、プロテアーゼ調節物質（例えばプロテアーゼ活性の活性化物質または阻害物質）を同定するための研究試薬として有用である。簡単に記せば、試験サンプル（化合物、ブロス、抽出物など）をプロテアーゼアッセイに加え、前記の基質切断能力を決定する。このようにして特定された阻害物質は、工業および研究で用いて、望ましくないタンパク質分解を減少または防止することができる。プロテアーゼに関しては、阻害物質を一緒にして活性スペクトルを広げることができる。
本発明の酵素はまた、タンパク質消化またはタンパク質の配列決定のための研究試薬として有用である。例えば、プロテアーゼを用いてポリペプチドを、例えば自動シークェンサーによる配列決定のためにより小さな断片に分解することができる。
【０１４９】
本発明はまた、本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体を用いて新規なプロテアーゼを発見する方法を提供する。ある特徴では、発現されるか否かによってプロテアーゼを発見するためにファージミドライブラリーがスクリーニングされる。また別の特徴では、発現されるか否かによってプロテアーゼを発見するためにラムダファージライブラリーがスクリーニングされる。ファージまたはファージミドライブラリーのスクリーニングによって、有毒クローンの検出、基質への接近性の改善、ライブラリーの大量切り出しによる一切の偏りの可能性を回避することによって宿主操作の必要性を減らすことが可能になり、さらに低クローン密度でのより速い増殖が可能になる。ファージまたはファージミドライブラリーは液相または固相でスクリーニングすることができる。ある特徴では、本発明は液相でのスクリーニングを提供する。これは、アッセイ条件のより大きな融通性、更なる基質融通性、弱いクローンに対するより高い感度、および固相スクリーニングを超える自動化の容易さを提供する。
本発明は、本発明のタンパク質および核酸並びにロボットによる自動化を用い、何千もの生物触媒反応およびスクリーニングアッセイを短時間（例えば毎日）実施しながら、なお高レベルの正確性および再現性を担保できるスクリーニング方法を提供する（下記のアレイの考察を参照されたい）。結果として誘導化合物ライブラリーを1週間程度で作製することができる。分子（小分子を含む）の改変についての更なる教示についてはPCT/US94/09174を参照されたい。
本発明には、天然には存在しないカルボニルヒドロラーゼ（例えばプロテアーゼ変種）変種であるプロテアーゼ酵素が含まれる。前記変種は、そのアミノ酸配列が誘導された前駆体のカルボニルヒドロラーゼと比較して異なるタンパク分解活性、安定性、基質特異性pHプロフィルおよび／または性能特性を有する。特に、そのようなプロテアーゼ変種は天然には見出されないアミノ酸配列を有し、前記は前駆体プロテアーゼの複数のアミノ酸残基の別個のアミノ酸による置換によって誘導される。前記前駆体プロテアーゼは天然に存在するプロテアーゼまたは組換えプロテアーゼであろう。有用なプロテアーゼ変種は、指定のアミノ酸残基の位置において天然に存在するL-アミノ酸のいずれかの置換を含む。
【０１５０】
プロテアーゼシグナル配列、プレプロおよび触媒ドメイン：本発明は、プロテアーゼシグナル配列（例えばシグナルペプチド（SP））、プレプロドメインおよび触媒ドメイン（CD）を提供する。本発明のSP、プレプロドメインおよび／またはCDは単離または組換えペプチドであるか、または融合タンパク質の一部分、例えばキメラタンパク質の異種ドメインとして存在することができる。本発明は、これら触媒ドメイン（CD）、プレプロドメインおよびシグナル配列（SP、例えば本発明のポリペプチドのアミノ末端残基を含む配列および／または前記から成る配列有するペプチド）をコードする核酸を提供する。
ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドの残基1から12、1から13、1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から29、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から39、1から40、1から41、1から42、1から43、1から44（またはそれより大きいペプチド）に示される配列を含むペプチドおよび／または前記から成るペプチドを含むシグナル配列を提供する。
【０１５１】
また別の特徴では、本発明は下記の表４に示す配列を含むペプチド／前記から成るペプチドを含むシグナル配列を提供する：
配列番号      シグナル（AA）
1, 2          1-37
101, 102      1-22
111, 112      1-36
113, 114      1-32
115, 116      1-33
121, 122      1-25
123, 124      1-56
127, 128      1-27
13, 14        1-33
131, 132      1-21
133, 134      1-27
139, 140      1-38
141, 142      1-25
143, 144      1-35
15, 16        1-31
164, 165      1-17
179, 190      1-21
19, 20        1-39
193, 194      1-19
199, 200      1-18
21, 22        1-22
210, 211      1-19
222, 223      1-15
229, 230      1-21
23, 24        1-23
241, 242      1-20
254, 255      1-18
27, 28        1-27
29, 30        1-24
3, 4          1-36
31, 32        1-26
35, 36        1-27
37, 38        1-37
41, 42        1-22
43, 44        1-25
45, 46        1-26
47, 48        1-24
49, 50        1-30
5, 6          1-32
51, 52        1-27
53, 54        1-32
55, 56        1-27
57, 58        1-31
61, 62        1-40
67, 68        1-27
69, 70        1-32
71, 72        1-25
73, 74        1-28
75, 76        1-25
81, 82        1-20
83, 84        1-22
85, 86        1-20
87, 88        1-35
89, 90        1-32
9, 10         1-28
93, 94        1-36
95, 96        1-24
【０１５２】
本発明のプロテアーゼシグナル配列（SP）および／またはプレプロ配列は、単離ペプチドであるか、または別のプロテアーゼもしくは非プロテアーゼポリペプチドと結合した配列（例えば融合（キメラ）タンパク質のようなもの）であり得る。ある特徴では、本発明は、本発明のプロテアーゼシグナル配列を含むポリペプチドを提供する。ある特徴では、本発明のプロテアーゼシグナル配列SPおよび／またはプレプロを含むポリペプチドは、本発明のプロテアーゼにとって異種の配列を含む（例えば本発明のSPおよび／またはプレプロおよび別のプロテアーゼまたは非プロテアーゼタンパク質に由来する配列を含む融合タンパク質）。ある特徴では、本発明は、異種SPおよび／またはプレプロ配列（例えば酵母のシグナル配列）を有する本発明のプロテアーゼを提供する。本発明のプロテアーゼは、異種SPおよび／またはプレプロをベクター（例えばpPICシリーズベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA））中に含むことができる。
ある特徴では、本発明のSPおよび／またはプレプロ配列は新規なプロテアーゼポリペプチドを特定した後で特定される。タンパク質が選別され、それらの適切な細胞内の分布場所に輸送される経路はしばしばタンパク質ターゲティング経路と称される。これら全てのターゲティング系のもっとも重要な成分の1つは、新規に合成されたポリペプチドのアミノ末端の短いアミノ酸配列（シグナル配列と称される）である。このシグナル配列はタンパク質をその適切な細胞内の分布場所に誘導し、前記は輸送中またはタンパク質がその最終的な目的地に到達したときに除去される。ほとんどのリソゾームタンパク質、膜タンパク質または分泌タンパク質は、小胞体の管腔内への輸送のための前記タンパク質の印となるアミノ末端シグナル配列を有する。このグループのタンパク質の100を超えるシグナル配列が決定されている。前記シグナル配列の長さは13から36アミノ酸残基と変動する。シグナル配列を認識する種々の方法が当業者には知られている。例えば、ある特徴では、新規なプロテアーゼシグナルペプチドはSignalPと称される方法によって特定される。SignalPは神経結合ネットワークを使用する。前記はシグナルペプチドおよびそれらの切断部位の両方を認識する（Nielsen et al., "Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites”. Protein Engineering, 10(1):1-6 (1997)）。
【０１５３】
いくつかの特徴では、本発明のプロテアーゼはSPおよび／またはプレプロ配列または“ドメイン”を持たないことがあることは理解されよう。ある特徴では、本発明は、シグナル配列の全てまたは一部分を欠く本発明のプロテアーゼを提供する。ある特徴では、本発明は、SPおよび／またはプレプロドメインの全てまたは部分を欠く本発明のプロテアーゼを提供する。ある特徴では、本発明は、あるプロテアーゼに由来するシグナル配列（SP）および／またはプレプロをコードする核酸が別のプロテアーゼの核酸配列に機能的に連結されたものを提供し、また場合によって非プロテアーゼタンパク質のシグナル配列（SP）および／またはプレプロドメインを所望することもできる。
本発明はまた、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）および異種の配列を含む単離または組換えポリペプチドを提供する。前記異種配列は、SP、プレプロドメインおよび／またはCDとは（例えばプロテアーゼと）天然には結合していない配列である。SP、プレプロドメインおよび／またはCDが天然には結合していない配列は、SP、プレプロドメインおよび／またはCDのアミノ末端、カルボキシ末端および／またはそれらの両末端に存在し得る。ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）を含むポリペプチドを含む（または前記から成る）単離または組換えポリペプチドを提供するが、ただし前記ポリペプチドはそれが天然に結合しているいずれの配列（例えばプロテアーゼ配列）とも結合していないことを条件とする。同様にある特徴では、本発明は、これらのポリペプチドをコードする単離または組換え核酸を提供する。したがって、ある特徴では、本発明の単離または組換え核酸は、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）および異種配列（すなわち本発明のシグナル配列（SP）、プレプロドメインおよび／または触媒ドメイン（CD）と天然には結合していない配列）のコード配列を含む。前記異種配列は、SP、プレプロドメインおよび／またはCDコード配列の3'末端、5'末端および／またはその両末端に存在することができる。
【０１５４】
ハイブリッド（キメラ）プロテアーゼおよびペプチドライブラリー
ある特徴では、本発明は、本発明の配列を含むハイブリッドプロテアーゼおよび融合タンパク質（ペプチドライブラリーを含む）を提供する。本発明のペプチドライブラリーを用いて、標的（例えばプロテアーゼ基質、レセプター、酵素）のペプチド調節物質（例えば活性化物質または阻害物質）を単離することができる。本発明のペプチドライブラリーを用いて、標的に正式な結合パートナー、例えばリガンド、例えばサイトカイン、ホルモンなどを同定することができる。ある特徴では、本発明は、本発明のシグナル配列（SP）、プレプロ配列（PPS）および／または触媒ドメインおよび異種の配列（上記を参照されたい）を含むキメラタンパク質を提供する。
ある特徴では、本発明の融合タンパク質（例えばペプチド成分）は構造的に安定化され（直鎖状ペプチドと比較して）、標的に対してより高い結合親和性を可能にする。本発明は、本発明のプロテアーゼと他のペプチド（公知であって任意のペプチドを含む）の融合を提供する。それらは、プロテアーゼの構造が顕著には乱されない態様で、さらに前記ペプチドが代謝的にまたは構造的構成的に安定化されるような態様で融合させることができる。これによって、細胞内のその存在および量を容易にモニターできるペプチドライブラリーの作製が可能になる。
【０１５５】
本発明のアミノ酸配列変種は、天然に存在する形態（例えば対立遺伝子変種または種間変種）とそれらとを区別する特徴、予め定めた性質による特徴を有する。ある特徴では、本発明の変種は、天然に存在する類似体と同じ定性的生物学的活性を示す。また別には、前記変種は改変された性状を有するものについて選別することができる。ある特徴では、アミノ酸配列変種を導入する部位または領域は予め決定されるが、変異それ自体を予め決定する必要はない。例えば、ある部位における変種の成果を最適にするために、ランダム変異導入を標的コドンまたは領域で実施し、所望の活性の最適な組合せについて発現されたプロテアーゼ変種をスクリーニングすることができる。既知の配列を有するDNAの予め定めた部位に置換変異を導入する技術は既知であり、本明細書ではM13プライマー変異導入およびPCR変異導入が考察されている。変異体のスクリーニングはタンパク分解活性のアッセイを用いて実施できる。また別の特徴では、アミノ酸置換は単一残基であろう。挿入は約1から20アミノ酸の規模であろう。ただしはるかに大きな挿入も実施することができる。欠失は約1から約20、30、40、50、60、70残基またはそれを超える範囲でもよい。最適な特性を有する最終的な誘導体を得るために、置換、欠失、挿入または前記の任意の組合せを用いることができる。一般的には、これらの変更は数アミノ酸で実施し、分子の改変を最小限に止める。しかしながら、ある種の環境ではもっと大きな変更も容認される。
本発明は、そのポリペプチド骨格構造、二次または三次構造（例えばアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造）が改変されたプロテアーゼを提供する。ある特徴では、電荷または疎水性が改変されている。ある特徴では、側鎖の体積が改変されている。保存性が低い置換を選択することによって、機能または免疫学的同一性に実質的な変更がもたらされる。例えば、以下に対してより顕著な影響を与える置換を実施することができる：改変領域のポリペプチド骨格構造（例えばアルファ-ヘリックスまたはベータ-シート構造）；分子の荷電または疎水性部分（前記は活性部位に存在していてもよい）；または側鎖。本発明は、本発明のポリペプチドに以下のような置換を提供する：（ａ）疎水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）で親水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、バリルまたはアラニル）を置換する（または前者を後者で置換する）；（ｂ）システインまたはプロリンで他の任意の残基を置換する（または前者を後者で置換する）；（ｃ）陽性荷電側鎖をもつ残基（例えばリシル、アルギニルまたはヒスチジル）で陰性荷電残基（例えばグルタミルまたはアスパルチル）を置換する（または前者を後者で置換する）；または（ｄ）体積の大きな側鎖（例えばフェニルアラニン）で側鎖をもたない残基（例えばグリシン）を置換する（または前者を後者で置換する）。前記変種は同じ定性的生物学的活性（例えばプロテアーゼ活性）を示すことができるが、ただし変種を選別してプロテアーゼの性状を必要とされるように改変することができる。
【０１５６】
ある特徴では、本発明のプロテアーゼは、エピトープもしくは精製タグ、シグナル配列または他の融合配列などを含む。ある特徴では、本発明のプロテアーゼは任意のペプチドと融合させて、融合ポリペプチドを形成させることができる。本明細書では“融合”または“機能可能に連結”とは、任意のペプチドおよびプロテアーゼが、前記プロテアーゼ構造の安定性の破壊を最小限に止める（例えば前記がプロテアーゼ活性を維持する）ことができる態様で一緒に結合されることを意味する。融合ポリペプチド（または融合ポリペプチドをコードする核酸）はさらに別の成分（複数のループに存在する複数のペプチドを含む）も同様に含むことができる。
ある特徴では、前記ペプチドおよびそれらをコードする核酸はランダム化される。前記ランダム化は完全なランダム化であっても、またはランダム化が、例えばヌクレオチド／残基頻度において全体的にもしくは位置毎に偏っていてもよい。“ランダム化された”とは各核酸およびペプチドがそれぞれ本質的に任意のヌクレオチドおよびアミノ酸から成ることを意味する。ある特徴では、前記ペプチドを生じる核酸は化学的に合成することができ、したがって、任意の位置に任意のヌクレオチドを取り込むことができる。したがって、核酸が発現されペプチドを生成するとき、任意の位置に任意のアミノ酸残基が取り込まれ得る。合成プロセスは、ランダム化された核酸が生成されるように設計して、核酸の全長にわたって可能な全てのまたは大半の組合せを形成し、したがってランダム化された核酸ライブラリーの形成を可能にすることができる。前記ライブラリーは、構造的に十分に多様なランダム化された発現生成物集団を提供し、所望の反応を示す1つまたは2つ以上の細胞の提供のために確率的に十分な範囲の細胞反応に影響を与えることができる。したがって、本発明は、ライブラリーメンバーの少なくとも1つがいくつかの分子、タンパク質または他の因子に対する親和性を与える構造を有することができるように十分に大きな相互作用ライブラリーを提供する。
【０１５７】
スクリーニング方法論および“オンライン”モニター装置
本発明の方法の実施に際して、多様な装置および方法論を本発明のポリペプチドおよび核酸と併せて用いることができる。例えば、前記多様な装置および方法論は、プロテアーゼ活性についてポリペプチドをスクリーニングするため（例えばザイモグラムでのカゼインの加水分解、ゼラチンの蛍光遊離、または種々の小ペプチド基質のp-ニトロアナリド遊離のようなアッセイ）、プロテアーゼ活性の潜在的調節物質（例えば活性化物質または阻害物質）としての化合物をスクリーニングするため、または本発明のポリペプチドと結合する抗体について、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸についてスクリーニングするため、本発明のポリペプチドを発現する細胞をスクリーニングするためなどに用いることができる。サンプルのスクリーニングのためには下記で詳細に述べるアレイ様式の他に、また別の様式も本発明の方法の実施に用いることができる。そのような様式には、例えば、分光光度法、クロマトグラフィー（例えば、高速HPLCおよび他の液体クロマトグラフィー様式）およびより小型の様式（例えば1536ウェルプレート、384ウェルプレート）などが含まれる。高処理スクリーニング装置を応用し本発明の方法の実施に用いてもよい。例えば米国特許出願第20020001809号を参照されたい。
【０１５８】
キャピラリーアレイ：本発明の核酸およびポリペプチドはアレイに固定または適用することができる。アレイを用いて、（例えば小分子、抗体、核酸の）組成物ライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドに結合するその能力または前記の活性を調節するその能力についてスクリーニングまたはモニターすることができる。キャピラリーアレイ、例えばGIGAMATRIX（登録商標）（Diversa Corporation, San Diego, CA）および例えば米国特許出願20020080350A1、WO0231203A、WO0244336Aに記載されたアレイはサンプル保持およびスクリーニングのための代替装置を提供する。ある特徴では、前記キャピラリーアレイは、複数のキャピラリーが隣接キャピラリーのアレイを形成するものを含み、各キャピラリーはサンプル保持のために管腔を仕切る少なくとも1つの壁を含む。前記管腔は円筒形、四角形、六角形または、前記壁が液体またはサンプルの保持用管腔を形成する限り他の任意の幾何学形であろう。前記キャピラリーアレイのキャピラリーは接近して一緒に保持され平面構造を形成することができる。キャピラリーは、溶融によって（その場合キャピラリーは例えばガラスで製造される）一緒に束ねるか、接着剤で接着するか、縛るかまたは隣同士を留め金で固定することができる。さらにまた、前記キャピラリーアレイは、アレイ中の隣接キャピラリーの間に注入された間隙剤を含み、それによって複数の貫通孔を含む固形平面装置を形成することができる。
キャピラリーアレイは任意の数の個々のキャピラリー、例えば100から4,000,000本の範囲のキャピラリーで形成できる。さらにまた、標準的な実験室装置に適合させるために、約100,000本またはそれ以上の個々のキャピラリーを有するキャピラリーアレイをマイクロタイター（登録商標）プレートの標準サイズおよび形状に成形してもよい。前記管腔は、毛細管作用または細い注射針を用いて手動または自動的に満たされる。対象のサンプルは更なる分析または性状決定のためにその後個々の管腔から取り出すことができる。例えば、管腔に物質を添加または管腔から物質を引き出すために、細い注射針様プローブが選択されたキャピラリーとの液路に配置される。
【０１５９】
一段スクリーニングアッセイでは、キャピラリーアレイへの注入前にアッセイ成分は混合されて対象の溶液が生成される。アレイの少なくとも一部分が対象の溶液に浸漬されるとき管腔は毛細管作用で満たされる。各キャピラリーの化学的または生物学的反応および／または活性は検出可能な事象についてモニターされる。検出可能な事象はしばしば“ヒット”と称され、前記は通常は光学的検出によって“ノンヒット”を示すキャピラリーと区別することができる。したがって、キャピラリーアレイは“ヒット”の大量並行検出を可能にする。
多段スクリーニングアッセイでは、ポリペプチドまたは核酸(例えばリガンド)は第一の成分に導入され、前記はキャピラリーアレイのキャピラリーの少なくとも一部に導入される。続いて気泡を第一の成分の後ろのキャピラリーに導入することができる。第二の成分が続いてキャピラリーに導入され、そこで第二の成分は前記気泡によって第一の成分と分離される。続いて前記第一および第二の成分は、キャピラリーアレイの両側への流体静力学的圧力を適用して気泡を破壊することによって混合することができる。続いて前記キャピラリーアレイを、前記2つの成分の反応また無反応から生じる検出可能な事象についてモニターする。
結合スクリーニングアッセイでは、対象のサンプルは、検出可能粒子で標識された第一の液体としてキャピラリーアレイのキャピラリーに導入される。前記キャピラリーの管腔は、前記結合可能粒子を前記管腔と結合させるために結合物質で被覆される。続いて第一の液体はキャピラリーから取り出され、管腔に結合した検出可能粒子はキャピラリー内に残留し、さらに第二の液体がキャピラリーに導入されれる。続いて前記粒子と第二の液体との反応または無反応から生じる検出可能事象についてキャピラリーをモニターする。
【０１６０】
アレイまたは“バイオチップ”：本発明の核酸またはポリペプチドはアレイに固定化するかまたは適用される。アレイを用いて、（例えば小分子、抗体、核酸などの）組成物ライブラリーを、本発明の核酸またはポリペプチドに結合するその能力または前記の活性を調節するその能力についてスクリーニングまたはモニターすることができる。例えば本発明のある特徴では、モニターされるパラメーターはプロテアーゼ遺伝子転写物の発現である。細胞の1つもしくは2つ以上または全てを細胞の転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって測定することができ、また細胞の核酸相当物もしくは細胞の転写物と相補的な核酸をアレイもしくは“バイオチップ”上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。マイクロチップ上の核酸の“アレイ”を用いることによって、細胞の転写物のいくつかまたは全てを同時に定量することができる。また別には、ゲノム核酸を含むアレイはまた、本発明の方法によって新規に作出された株の遺伝子型の決定に用いることができる。“ポリペプチドアレイ”はまた、複数のタンパク質の同時定量に用いることができる。
本発明は公知の任意の“アレイ”（“マイクロアレイ”または“核酸アレイ”または“ポリペプチドアレイ”または“抗体アレイ”または“バイオチップ”またはその変型とも称される）を用いて実施することができる。アレイは一般的には複数の“スポット”または“標的エレメント”である。各標的エレメントは一定量の1つまたは2つ以上の生物学的分子、例えばオリゴヌクレオチドを含み、それらはサンプル分子（例えばmRNA）と特異的に結合する基質表面の一定領域に固定されている。
本発明の方法の実施に際して、任意の公知のアレイおよび／またはアレイの製造および使用方法の全体もしくは部分またはその変型を取り入れることができる。前記は例えば以下に記載されているようなものである：米国特許第6,277,628号；第6,277,489号；第6,261,776号；第6,258,606号；第6,054,270号；第6.048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,965,452号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,830,645号；第5,770,456号；第5,632,957号；第5,556,752号；第5,143,854号；第5,807,522号；第5,800,992号；第5,744,305号；第5,700,637号；第5,556,752号；第5,434,049号。さらにまた例えば以下を参照されたい：WO99/5173；WO99/09217；WO97/46313；WO96/17958。さらにまた例えば以下を参照されたい：Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174；Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092；Kern (1997) Biotechniques 23:120-124；Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes＆ Cancer 20:399-407；Bowtell (1999) Nature Genetis Supp. 21:25-32。さらにまた以下を参照されたい：米国特許出願公開広報第20010018642号；同第20010019827号；同第20010016322号；同第20010014449号；同第20010014448号；同第20010012537号；同第20010008765号。
【０１６１】
抗体および抗体使用スクリーニング方法
本発明は、本発明のプロテアーゼと特異的に結合する単離または組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本発明のプロテアーゼまたは関連するポリペプチドを単離、特定または定量することができる。前記の抗体を用いて本発明の範囲内に包含される他のポリペプチドまたは他の関連するプロテアーゼを単離することができる。
前記抗体は、プロテアーゼの活性部位と結合するように設計することができる。したがって、本発明は、本発明の抗体を用いてプロテアーゼを阻害する方法を提供する（本発明の抗プロテアーゼ組成物の適用に関する上記の考察を参照されたい）。
本発明は本発明の酵素の断片を提供する。前記断片は、本発明のポリペプチド（例えば配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255、または配列番号:145によってコードされるポリペプチド）の免疫原性断片を含む。本発明の免疫原性ペプチド（例えば配列番号:2；配列番号:4；配列番号:6；配列番号:8；配列番号:10；配列番号:12；配列番号:14；配列番号:16；配列番号:18；配列番号:20；配列番号:22；配列番号:24；配列番号:26；配列番号:28；配列番号:30；配列番号:32；配列番号:34；配列番号:36；配列番号:38；配列番号:40；配列番号:42；配列番号:44；配列番号:46；配列番号:48；配列番号:50；配列番号:52；配列番号:54；配列番号:56；配列番号:58；配列番号:60；配列番号:62；配列番号:64；配列番号:66；配列番号:68；配列番号:70；配列番号:72；配列番号:74；配列番号:76；配列番号:78；配列番号:80；配列番号:82；配列番号:84；配列番号:86；配列番号:88；配列番号:90；配列番号:92；配列番号:94；配列番号:96；配列番号:98；配列番号:100；配列番号:102；配列番号:104；配列番号:106；配列番号:108；配列番号:110；配列番号:112；配列番号:114；配列番号:116；配列番号:118；配列番号:120；配列番号:122；配列番号:124；配列番号:126；配列番号:128；配列番号:130；配列番号:132；配列番号:134；配列番号:136；配列番号:138；配列番号:140；配列番号:142；配列番号:144；配列番号:147；配列番号:151；配列番号:159；配列番号:165；配列番号:172；配列番号:180；配列番号:188；配列番号:194；配列番号:200；配列番号:205；配列番号:211；配列番号:219；配列番号:223；配列番号:230；配列番号:235；配列番号:242；配列番号:249または配列番号:255、または配列番号:145によってコードされるポリペプチド）は、アジュバント、担体などを含むことができる。
【０１６２】
前記抗体は、免疫沈澱、染色、イムノアフィニティーカラムなどで用いることができる。所望の場合は、特異的な抗原をコードする核酸配列を、免疫とそれに続くポリペプチドまたは核酸の単離、増幅またはクローニングおよびポリペプチドの本発明のアレイ上への固定によって作製することができる。また別には、本発明の方法を用いて、改変されるべき細胞により産生される抗体の構造を改変することができる。例えば抗体の親和性を強化または低下させることができる。さらにまた、抗体を製造または改変する能力は本発明の方法により細胞を操作して付与した表現型であり得る。
免疫、抗体（ポリクローナルおよびモノクローナル）の製造および単離の方法は当業者には公知で、さらに学術文献および特許文献に記載されている。例えば以下を参照されたい：Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) Basic and Clinical Immunology (7th ed.) Lang Medical Publications, Los Altos, CA ("Stites"); Goding, Monoclonal Antibodies: Priciples and Practice (2nd ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York。抗体はまた、動物を用いる従来のin vivo方法以外でも、in vitroで例えば組換え抗体結合部位発現ファージディスプレーライブラリーを用いて作製することができる。例えば以下を参照されたい：Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45。
ポリペプチドまたはペプチドを用いて、前記ポリペプチド（例えば本発明のプロテアーゼ）と特異的に結合する抗体を作製することができる。生成された抗体はイムノアフィニティークロマトグラフィー方法で用いて、前記ポリペプチドを単離または精製するか、または前記ポリペプチドが生物学的サンプルに存在するか否かを決定することができる。そのような方法では、タンパク質調製物（例えば抽出物）または生物学的サンプルを本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合することができる抗体と接触させる。
イムノアフィニティー方法では、前記抗体を固相（例えばビーズまたは他のカラムマトリックス）に付着させる。抗体が本発明のポリペプチドの1つと特異的に結合する条件下で、前記タンパク質調製物を前記抗体と接触させる。洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出させる。
【０１６３】
生物学的サンプル中のタンパク質の前記抗体と結合する能力は、当業者に知られた多様な方法を用いて決定できる。例えば、結合は前記抗体を検出可能な標識（例えば蛍光物質、酵素標識または放射性同位元素）で標識することによって決定できる。また別には、抗体とサンプルとの結合は、前記のような検出可能な標識をその上に保持する二次抗体を用いて検出してもよい。具体的なアッセイにはELISAアッセイ、サンドイッチアッセイ、放射能免疫アッセイおよびウェスタンブロットが含まれる。
本発明のポリペプチドに対して作製されるポリクローナル抗体は、動物に前記ポリペプチドを直接注射することによって、または非ヒト動物に前記ポリペプチドを投与することによって得ることができる。そのようにして得られた抗体は前記ポリペプチド自体と結合するであろう。このようにして、ポリペプチドの断片のみをコードする配列でさえも完全な天然のポリペプチドと結合することができる抗体の作製に用いることができる。続いて前記のような抗体を用いて、前記ポリペプチドを発現している細胞から前記ポリペプチドを単離することができる。
モノクローナル抗体の調製の場合、持続的細胞株の培養によって生成される抗体を提供するいずれの技術も用いることができる。その例にはハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術およびEBV-ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば以下を参照されたい：Cole (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）。
単鎖抗体の生成のために記載された技術（例えば米国特許第4,946,778号を参照されたい）を利用して、本発明のポリペプチドに対する単鎖抗体を生成することができる。また別には、遺伝子導入マウスを用いて、これらポリペプチドまたはその断片に対するヒト化抗体を発現させることができる。
本発明のポリペプチドに対して作製された抗体を他の生物およびサンプル由来の類似のポリペプチド（例えばプロテアーゼ）のスクリーニングに用いることができる。そのような技術では、前記生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、さらに前記抗体と特異的に結合するポリペプチドが検出される。上記に記載したいずれの方法も抗体結合の検出に用いることができる。
【０１６４】
キット
本発明は、前記組成物（例えば本発明の核酸、発現カセット、ベクター、細胞、トランスジェニック種子または植物もしくは植物部分、ポリペプチド（例えばプロテアーゼ）および／または抗体）を含むキットを提供する。前記キットはまた、本明細書に記載されたような本発明の方法論および工業的使用を教示する指示物を含むことができる。
【０１６５】
全細胞操作および代謝パラメーターの測定
本発明の方法は、細胞の遺伝的構成を改変することによって、新規な表現型（例えば新規なまたは改変されたプロテアーゼ活性）を持つ新規な細胞株を開発するために、全細胞進化または全細胞操作を提供する。遺伝的構成は、本発明の酵素のコード配列を細胞に導入することによって改変することができる。例えばWO0220032、WO0196551を参照されたい。
新規な表現型を検出するために、改変細胞の少なくとも1つの代謝パラメータを“リアルタイム”または“オンライン”でモニターする。ある特徴では、複数の細胞（例えば細胞培養）が“リアルタイム”または“オンライン”でモニターされる。ある特徴では、複数の代謝パラメータが“リアルタイム”または“オンライン”でモニターされる。代謝パラメータは本発明のプロテアーゼを用いてモニターできる。
代謝フラックス分析（MFA）は公知の生化学的フレームワークを基にしている。線形独立な代謝行列を、細胞内代謝物に対する質量保存の法則および擬似定常状態仮説（pseudo-steady state hypothesis, PSSH）に基づいて構築する。本発明の方法の実施に際して、以下を含む代謝ネットワークが確立される：
−全ての経路の基質、生成物および中間代謝物の実体；
−前記経路の代謝物を変換する全ての化学反応の実体、前記経路の反応の化学量論；
−前記反応を触媒する全ての酵素の実体、前記酵素反応のカイネティクス；
−経路の構成成分間の調節的相互作用、例えばアロステリック相互作用、酵素-酵素相互作用など；
−酵素の細胞内区画局在性または前記酵素の他の超分子的構成；および
−代謝物、酵素またはエフェクター分子の濃度勾配、またはそれらの移動に対する拡散障壁の存在。
ある株について前記代謝ネットワークがいったん確立されたら、行列表記による数学的表現を導入し、オンライン代謝物データが利用可能ならば細胞内代謝フラックスを概算することができる。代謝表現型は細胞内の完全な代謝ネットワークの変化に依存する。代謝表現型は、環境条件、遺伝的調節、発育状態および遺伝子型などに対応する経路の利用変化に左右される。本発明の方法のある特徴では、オンラインMFA計算の後で、細胞の動的態様、細胞の表現型および他の特性が前記経路の利用を精査することによって分析される。例えば、酵母の発酵時にグルコースの供給が増加し、酸素が減少する場合、呼吸経路の利用は低下および／または停止し、発酵経路の利用が優先的になるであろう。細胞培養の生理的状態の制御は前記経路分析の後で可能になるであろう。本発明の方法は、基質供給、温度、誘発物質などをどのように変化させるか、細胞の生理的条件を制御して所望の方向にどのように誘導するかを決定することによって発酵の操作方法の決定に役立つことができる。本発明の方法の実施に際して、MFAの結果はまた、代謝の操作または遺伝子シャッフリングなどのために実験およびプロトコル設計のためにトランスクリプトームデータおよびプロテオームデータと比較することができる。
本発明の実施では、任意の改変表現型または新規な表現型（細胞の新規なまたは改善された性状を含む）を付与しこれを検出することができる。代謝または増殖のいずれの特徴もモニターすることができる。
【０１６６】
mRNA転写物発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作された表現型は、細胞内でのmRNA転写物（例えばプロテアーゼメッセージ）の発現の増加もしくは減少、または新規転写物（例えばプロテアーゼ）の生成を含む。この発現増加または低下は、本発明のプロテアーゼの存在について試験するか、またはプロテアーゼ活性のアッセイによって追跡することができる。mRNA転写物（またはメッセージ）はまた、当業界で公知の任意の方法（ノザンブロット、定量的増幅反応、アレイへのハイブリダイゼーションなどなどを含む）によって検出および定量することができる。定量的増幅反応は、例えば定量的PCR（例えば定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（またはRT-PCR）を含む）；定量的リアルタイムRT-PCR（または“リアルタイムキネティックRT-PCR”）を含む（例えば以下を参照されたい：Kreuzer (2000) Br. J. Haematol. 114:313-318; Xia (2001) Transplantation 72:907-914）。
本発明のある特徴では、操作される表現型は同種遺伝子の発現をノックアウトすることによって作出される。遺伝子のコード配列または1つもしくは2つ以上の転写制御エレメント（例えばプロモーターまたはエンハンサー）をノックアウトすることができる。したがって転写物の発現は完全に除去されるか、または単に減少させることができる。
本発明のある特徴では、操作される表現型は同種遺伝子の発現の増加を含む。これは、負の制御エレメント（cis-またはtrans-で作用する転写調節エレメントを含む）のノックアウト、または正の制御エレメントの変異導入によって実施できる。細胞の1つもしくは2つ以上または全てを、細胞の転写物を含むサンプルのハイブリダイゼーションによって測定することができ、また細胞の核酸相当物もしくは細胞の転写物と相補的な核酸をアレイ上に固定された核酸とのハイブリダイゼーションによって測定することができる。
【０１６７】
ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸の発現のモニタリング：本発明のある特徴では、操作される表現型は、細胞内でのポリペプチド（例えばプロテアーゼ）の発現の増加もしくは低下、または新規なポリペプチドの生成を含む。前記の発現増加または低下は、存在するプロテアーゼ量の決定またはプロテアーゼ活性のアッセイによって追跡することができる。ポリペプチド、ペプチドおよびアミノ酸はまた、当業界で公知の任意の方法（例えば核磁気共鳴（NMR）、分光光度法、ラジオグラフィー（タンパク質放射能標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高拡散クロマトグラフィー、多様な免疫学的方法、例えば免疫沈澱、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えばSDS-PAGE）、抗体による染色、蛍光活性化細胞分類装置（FACS）、熱分解質量分析法、フーリエ変換赤外線分光分析、ラマン分光分析、並びにLC-エレクトロスプレーおよびcap-LC-タンデム-エレクトロスプレー質量分析などを含む）によって検出および定量することができる。新規な生物活性はまた、米国特許第6,057,103号に記載された方法またはその変法を用いてスクリーニングできる。さらにまた以下で詳細に考察されるように、細胞のポリペプチドの1つまたは2つ以上、またはその全てはタンパク質アレイを用いて測定することができる。
【０１６８】
工業的応用
洗剤組成物：本発明は、1つまたは2つ以上の本発明のポリペプチド（例えばプロテアーゼ）を含む組成物、並びに前記組成物の製造および使用方法を提供する。本発明は、洗剤組成物を製造および使用する方法の全てを取り込んでいる。例えば、米国特許6,413,928号、同6,399,561号、同6,365,561号、同6,380,147号を参照されたい。前記洗剤組成物は、1つおよび2つの部分の水溶液組成物、非水溶液組成物、鋳造固形物、顆粒形、粒状形、圧縮錠剤、ゲルおよび／またはペーストおよびスラリー形であろう。本発明のプロテアーゼはまた、固形または液体形の洗剤添加生成物としてもまた用いることができる。そのような添加生成物は通常の洗剤組成物の性能の補充または補強を目的とし、洗浄プロセスの任意の段階で添加できる。
本発明はまた、甚だしい食べ物の汚れ、食べ物の残渣および他のわずかな食物組成物の薄層を前記洗剤組成物を用いて除去することができる方法を提供する。本発明のプロテアーゼは、タンパク質の触媒的加水分解により汚れの除去を促進することができる。本発明のプロテアーゼは、皿洗浄洗剤、洗濯洗剤として用いることができる。
実際の活性酵素含有量は、前記洗剤溶液が所望の酵素活性を有すると仮定して、洗剤組成物の製造方法によって左右され重要ではない。ある特徴では、最終溶液に存在するプロテアーゼの量は、製剤組成物1mgにつき約0.001mgから0.5mgの範囲である。本発明の方法および組成物で使用するために選択される具体的な酵素は、最終的な利用条件（製品の物理的形態、使用pH、使用温度、並びに分解および改変されるべき汚れのタイプを含む）によって左右される。酵素は、与えられた使用条件のいずれに対しても最適の活性および安定性を提供するように選択することができる。ある特徴では、本発明のプロテアーゼは、約4から約12の範囲のpH、約20℃から約95℃の範囲の温度で活性を有する。本発明の洗剤は、陽イオン性、半極性非イオン性または双性イオン性界面活性剤または前記の混合物を含むことができる。
【０１６９】
本発明のプロテアーゼは粉末または液体洗剤に製剤化できる（約0.01から約5質量％（好ましくは0.1から0.5質量％）の濃度で4.0から12.0のpHを有する）。前記洗剤組成物はまた他の酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、またはエンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-グルカナーゼ、ベータ-グルカナーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-グルカナーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドラーゼおよび／またはトランスグルタミナーゼを含むことができる。前記洗剤組成物はまたビルダーおよび安定化剤を含むことができる。
通常の洗浄組成物への本発明のプロテアーゼの添加は特別な使用制限をもたらさない。換言すれば、酵素が目的の使用pHおよび／または温度で活性を示すか、そのpHおよび／または温度で許容される限り、その洗剤に適した任意の温度およびpHがまた本発明の組成物に適切である。さらにまた、本発明のプロテアーゼは洗剤を含まない洗浄組成物で、単独またはビルダーおよび安定化剤と一緒に用いることができる。
本発明は、硬質表面を洗浄する洗剤組成物、布地を洗浄する洗剤組成物、皿洗浄組成物、口内洗浄組成物、歯磨き組成物、およびコンタクトレンズ洗浄溶液を含む洗浄組成物を提供する。
【０１７０】
ある特徴では、本発明は、洗浄のために十分な条件下で対象物を本発明のポリペプチドと接触させることを含む対象物の洗浄方法を提供する。本発明のプロテアーゼは洗剤添加物として含有させることができる。本発明の洗剤組成物は、本発明のポリペプチドを含む例えば手洗いまたは機械による洗濯洗剤組成物として製剤化することができる。汚れの付着した布地の予備処理に適した洗濯添加物は本発明のポリペプチドを含むことができる。布地の柔軟化組成物は本発明のポリペプチドを含むことができる。また別には、本発明のプロテアーゼは、一般的な家庭用硬質表面洗浄作業に使用される洗剤組成物として製剤化することができる。また別の特徴では、本発明の洗剤添加物および洗剤組成物は、1つまたは2つ以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、別のプロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、たとえばラクターゼおよび／またはペルオキシダーゼを含むことができる（上記もまた参照されたい）。本発明の酵素の特性は、選択した洗剤に適合するように選択され（すなわち、最適pH、他の酵素および非酵素成分に対する適合性など）、酵素は有効量で存在する。ある特徴では、本発明のプロテアーゼ酵素を用いて布地から悪臭を有する物質が除去される。本発明の実施で用いることができる種々の洗剤組成物および前記を製造する方法は、例えば米国特許6,333,301号、同6,329,333号、同6,326,341号、同6,297,038号、同6,309,871号、同6,204,232号、同6,197,070号、同5,856,164号に記載されている。
洗濯機洗浄方法で使用するために適した組成物として製剤化される場合は、本発明のプロテアーゼは界面活性剤およびビルダーの両方を含むことができる。前記はさらに1つまたは2つ以上の洗剤成分、例えば有機ポリマー化合物、漂白剤、追加の酵素、石鹸泡抑制剤、分散剤、ライムソープ分散剤、汚れ遊離および再沈着防止剤、および腐食防止剤を含むことができる。さらに別の洗剤成分として、本発明の洗濯組成物はまた柔軟化剤を含むことができる。カーボヒドラーゼを含むそのような組成物は、洗濯洗剤組成物として製剤化された場合、布地の洗浄、シミの除去、白さの維持、柔軟化、カラーアピアランス、染色移りの防止および殺菌を提供する。
本発明の選択洗剤組成物の濃度は、組成物の約200から1500g/L、または約400から1200 g/L、または約500から950 g/L、または600から800 g/Lの範囲であろう。前記は約20℃で測定できる。
【０１７１】
本発明の選択洗剤組成物の“圧縮”型は、密度によって、さらに組成に関しては無機充填塩の量によってもっともよく示される。無機充填塩は、粉末型の洗剤組成物の一般的な成分である。一般的な洗剤組成物では、前記充填塩はかなりの量、典型的には全組成物の17から35質量％で存在する。圧縮組成物のある特徴では、前記充填塩は、全組成物の15質量％を超えない、または10質量％を超えない、または5質量％を超えない量で存在する。無機充填塩は、硫酸塩および塩化物のアルカリおよびアルカリ土類金属塩、例えば硫酸ナトリウムから選択することができる。
本発明の液体洗剤組成物はまた“濃縮型”であってもよい。ある特徴では、液体洗剤組成物は、一般的な液体洗剤と比較して少ない量の水を含むことができる。また別の特徴では、濃縮液体洗剤の水の含有量は、洗剤組成物の40質量％未満、または30質量％未満、または20質量％未満である。本発明の洗剤化合物は、WO97/01629に記載の成分組成を含むことができる。
本発明のプロテアーゼ、例えばメタロプロテアーゼ（MP）およびセリンプロテアーゼは、種々の洗浄組成物の配合物に有用であろう。界面活性剤として適切な多数の公知の化合物（非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または双性イオン性洗剤を含む）を、例えば米国特許4,404,128号、同4,261,868号、5,204,015号に開示されたように使用することができる。さらにまた、プロテアーゼは、例えば棒状石鹸もしくは液体石鹸として、皿洗浄洗剤、コンタクトレンズ洗浄溶液もしくは製品、ペプチド加水分解、水処理、布地処理、タンパク質製造での融合-切断酵素として用いることができる。プロテアーゼは、別の洗剤プロテアーゼと比較して洗剤組成物の性能の強化を生じさせる。すなわち、標準的洗浄サイクル後の通常の評価による測定によれば、本酵素群は、ある種の酵素感受性汚れ（例えば草または血液）の洗浄を高めることができる。メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ（または本発明の他のプロテアーゼ）は、公知の粉末洗剤または液体洗剤（約0.01から約5質量％（例えば約0.1から0.5質量％）のレベルで6.5から12.0のpHを有する）に製剤化することができる。前記の洗剤洗浄組成物はまた他の酵素、例えば公知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼまたはエンドグリコシダーゼをビルダーおよび安定化剤と同様に含むことができる。
【０１７２】
繊維および布地の処理：本発明は、本発明の1つまたは2つ以上のプロテアーゼを用いて繊維および繊維製品を処理する方法を提供する。前記プロテアーゼは任意の繊維処理方法または繊維製品処理方法で用いることができる。前記方法は当業界では知られており、例えば米国特許6,261,828号、同6,077,316号、同6,024,766号、同6,021,536号、同6,017,751号、5,980,581号、米国特許公開広報20020142438A1を参照されたい。例えば、本発明のプロテアーゼは、繊維および／または繊維製品の脱サイズ(desizing)に用いることができる。ある特徴では、繊維の感触および外観は、繊維を本発明の溶液中のプロテアーゼと接触することを含む方法によって改善される。ある特徴では、繊維は加圧下で前記溶液で処理される。例えば、本発明のプロテアーゼは汚れの除去で用いることができる。
ある特徴では、本発明のプロテアーゼは、布地を織っている間もしくは織った後で、または脱サイズ工程中に、または1つもしくは2つ以上の追加の繊維繊維製品加工工程中に適用される。布地が織られている間、糸は強い機械的緊張に暴露される。織機で布を織る前に、縦糸はしばしばサイズ用澱粉または澱粉誘導体で被覆され、その引張り強度が高められ破損が防止される。本発明のプロテアーゼは前記のサイズ用澱粉または澱粉誘導体の除去に用いることができる。布地を織り上げた後、繊維を脱サイズ工程処理することができる。前記工程の後に1つまたは2つ以上の追加の繊維製品加工工程が続き得る。脱サイズは“サイズ”を布地から除去する作業である。機織り後に、前記サイズコーティングは更なる繊維加工の前に除去され、均質で耐洗浄性が得られたことを担保しなければならない。本発明は、本発明のプロテアーゼの作用による“サイズ”の酵素処理を含む脱サイズ方法を提供する。
【０１７３】
本発明の酵素を洗剤添加物として（例えば水性組成物として）用いて、綿含有繊維製品を含む繊維製品を脱サイズすることができる。本発明はインジゴ染色デニム織物および衣料にストーンウォッシュした外観を生じる方法を提供する。衣服の製造のために、布地を切断して衣服または衣料に縫製することができる。これら衣類は前記処理の前または後で完成される。特にデニムのジーンズ製造の場合、種々の酵素仕上げ方法が開発されている。デニムの衣料の仕上げは酵素による脱サイズ工程で開始し、その間衣料はアミロース分解酵素作用に付されて、柔軟さが織物に提供され、さらに綿をその後の酵素仕上げ工程に馴染みやすくさせる。本発明は、本発明のプロテアーゼを用いてデニムの衣料を仕上げる方法（例えば“バイオストーン処理”）、酵素による脱サイズおよび布地に柔軟さを提供する方法を提供する。本発明は、脱サイズおよび／または仕上げ処理においてデニム衣料を迅速に柔軟化する方法を提供する。
これらの脱サイズ処理において他の酵素もまた用いることができる。例えば、アルカリおよび熱耐性アミラーゼおよびプロテアーゼを脱サイズおよびバイオスカーリングのために１つの浴で一緒にすることができる。脱サイズおよびスカーリングを一工程にまとめる利点はとりわけ、省エネルギーおよび水使用削減および廃棄生成物の減少によるコスト削減および環境への影響の減少である。脱サイズおよびバイオスカーリングのための典型的な適用条件は、pH約8.5から10.0および温度約40℃以上である。本発明のプロテアーゼを用いる場合、より低い酵素使用量、例えば約100g/トン綿、および短い反応時間、例えば約15分を用いて、有効な脱サイズおよびスカーリングがカルシウムを添加することなく得られる。
ある特徴では、アルカリおよび熱耐性アミラーゼおよびプロテアーゼが脱サイズおよびバイオスカーリングのために1つの浴で一緒にされる。一工程で脱サイズおよびスカーリングをまとめる利点はとりわけ、省エネルギーおよび水の使用削減および廃棄生成物の減少によるコスト削減および環境への影響の減少である。脱サイズおよびバイオスカーリングのための典型的な適用条件は、pH約8.5から10.0および温度約40℃以上である。低い酵素使用量、例えば約100g/トン綿、および短い反応時間、例えば約15分を用いて、有効な脱サイズおよびスカーリングがカルシウムを添加することなく得られる。
【０１７４】
本発明のプロテアーゼは、繊維の調製または繊維の洗浄のために他の炭水化物分解酵素（例えばセルラーゼ、アラビナナーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチナーゼなど）と一緒に用いることができる。前記プロテアーゼは洗剤と一緒に用いることができる。ある特徴では、本発明のプロテアーゼは布地の老化防止処理に用いることができる。
本発明のプロテアーゼを用いて、綿、混紡綿または天然もしくは人工セルロース類（例えばキシラン含有セルロース繊維（例えば木材パルプ））から製造された任意のセルロース素材（繊維（例えば綿、麻、亜麻またはリネン）を含む）、縫製および未縫製織物（例えばニット、織物、デニム、織物糸およびタオル地）を処理することができる。混紡の例は、綿またはレーヨン／ビスコースと1つまたは2つ以上のコンパニオンメンバー（例えばウール、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、塩化ポリペプチドビニル繊維、塩化ポリビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）およびセルロース含有繊維（例えばレーヨン／ビスコース、カラムシ、麻、亜麻／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）との混紡である。
【０１７５】
本発明の織物処理方法（本発明のプロテアーゼを使用する）は、他の織物処理、例えばスカーリングおよび漂白と一緒に用いることができる。スカーリングは、綿繊維から非セルロース性物質（例えばキューティクル（主としてワックスから成る）および一次細胞壁（主としてペクチン、タンパク質およびキシログルカンから成る））を除去することである。適切なワックスの除去は高い吸湿性を得るために必要である。これは染色のために必要である。本発明の方法による一次細胞壁の除去はワックスの除去を改善し、より均質な染色を担保する。本発明の方法による布地の処理は、漂白工程で白さを改善する。スカーリングで用いられる主要な化学物質は、高濃度の水酸化ナトリウムおよび高温である。漂白は布地を酸化することを含む。漂白は、完全に漂白された（白色）布地を得るか、または染料の完全な濃淡の度合いを担保するために、典型的には酸化剤として過酸化水素の使用を必要とする。
本発明はまたアルカリプロテアーゼ（アルカリ条件下で活性を有するプロテアーゼ）を提供する。前記は、織物加工、植物繊維（例えば植物靭皮繊維）の脱ガム、ペクチン廃液処理、製紙、コーヒーおよび紅茶発酵で広い適用範囲を有する（例えば以下を参照されたい：Hoondal (2002) Applied Microbiology and Biotechnology 59:409-418）。
【０１７６】
食物処理および食品加工：本発明のプロテアーゼは食品加工工業に多数の用途を有する。例えば、ある特徴では、本発明のプロテアーゼを用いて、油に富む植物材料（例えば油に富む種子）の油の抽出、例えばダイズから大豆油の抽出、オリーブからオリーブ油の抽出、ナタネからナタネ油の抽出および／またはヒマワリの種子からヒマワリ油の抽出が改善される。
本発明のプロテアーゼは植物細胞材料の成分の分離に用いることができる。例えば、本発明のプロテアーゼは、タンパク質に富む材料（例えば植物細胞）の成分への分離（例えばテンサイから砂糖の分離、またはジャガイモから澱粉もしくは砂糖の分離）、髄または外皮部分の分離に用いることができる。ある特徴では、本発明のプロテアーゼを用いて、タンパク質に富む、または油に富む作物を有益なタンパク質および油並びに外皮部分に分離することができる。前記分離プロセスは当業界で公知の方法を使用して実施できる。
本発明のプロテアーゼを果実ジュース、野菜ジュース、シロップ、抽出物などの製造に用いて収量を高めることができる。本発明のプロテアーゼは、種々の植物細胞壁由来材料または廃棄物質（例えばワインまたはジュース製造に由来する）、または農作物残渣（例えば野菜の外皮、豆類外皮、テンサイの茎髄、オリーブの茎髄、ジャガイモの茎髄など）の酵素処理に用いることができる。本発明のプロテアーゼは、加工果実または野菜の濃度および外観の改変に用いることができる。本発明のプロテアーゼを用いて植物材料を処理し、植物材料（食物を含む）の加工を促進、植物成分の精製もしくは抽出を促進することができる。本発明のプロテアーゼを用いて、飼料価値を高め、水との結合能力を低下させ、排水プラントでの分解能を改善し、および／または植物材料のエンシレージ（サイロ貯蔵物）への変換を改善することなどが可能である。
【０１７７】
動物の飼料および食品または飼料添加物：本発明は、本発明のプロテアーゼを用いて動物の飼料および食物並びに食品および飼料添加物を処理する方法を提供する。動物には哺乳動物（例えばヒト）、鳥類、魚などが含まれる。本発明は、本発明のプロテアーゼを含む動物の飼料、食物および添加物を提供する。ある特徴では、本発明のプロテアーゼを用いて動物の飼料、食物および添加物を処理することによって、動物の飼料または添加物中の栄養物（例えば澱粉）の利用性を高めることができる。消化が困難なタンパク質を分解することによって、または澱粉（または他の栄養物）を脱マスキングすることによって、プロテアーゼは他の内在性または外来性酵素が栄養物に接近しやすくする。前記プロテアーゼはまた、消化および吸収が容易な栄養物および糖類を簡単に遊離させることができる。
動物の飼料または食物の改変で、本発明のプロテアーゼは、in vitro（飼料または食物の成分を改変することによって）またはin vivoで前記飼料または食物を加工することができる。プロテアーゼは、大量のアラビノガラクタンまたはガラクタンを含む動物の飼料または食物組成物（例えばダイズ、ナタネ、ルピンなどに由来する植物材料を含む飼料または食物）に添加することができる。飼料または食物に添加したとき、前記プロテアーゼは、植物細胞壁物質のin vivoでの分解を顕著に改善し、それによって動物（例えばヒト）による植物栄養物のより良好な利用が達成される。ある特徴では、動物の成長速度および／または飼料変換率（すなわち体重増加に対する摂取飼料の重量）が改善される。例えば、部分的にまたは消化不能のガラクタンを含むタンパク質は、本発明のプロテアーゼによって（例えば別の酵素、例えばベータ-ガラクトシダーゼと併用して）ペプチドおよびガラクトースおよび／またはガラクトオリゴマーに完全にまたは部分的に分解される。酵素消化生成物は動物がより消化しやすい。したがって、本発明のプロテアーゼは飼料または食物の利用可能なエネルギーに寄与することができる。さらにまた、ガラクタン含有タンパク質の消化に寄与することによって、本発明のプロテアーゼは、炭水化物および非炭水化物飼料または食物構成物（例えばタンパク質、脂肪およびミネラル）の消化性および取り込みを改善することができる。
別の特徴では、本発明のプロテアーゼはトランスジェニック飼料作物（例えばトランスジェニック植物、種子など）、例えばトウモロコシ、ダイズ、ナタネ、ルピンなどで前記酵素を直接発現させることによって供給することができる。上記で考察されたように、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジェニック植物、植物部分および植物細胞を提供する。ある特徴では、前記核酸は、本発明のプロテアーゼが回収可能な量で産生されるように発現される。前記プロテアーゼはいずれの植物または植物部分からも回収することができる。また別には、前記組換えポリペプチドを含む植物または植物部分は、食物または飼料の質を改善するために、例えば栄養価、美味および流動特性を改善するために、または栄養阻害因子を破壊するために用いることができる。
【０１７８】
紙およびパルプ処理：本発明のプロテアーゼは紙またはパルプの処理、または紙の脱インクで用いることができる。例えばある特徴では、本発明は本発明のプロテアーゼを用いる紙の処理プロセスを提供する。別の特徴では、コピー用紙の紙成分が、化学的酵素的脱インク処理時にリサイクルされる。ある特徴では、本発明のプロテアーゼはセルラーゼ、ペクチンリアーゼまたは他の酵素と併用して用いることができる。紙は以下の3つの工程によって処理することができる：１）本発明のプロテアーゼの存在下での分解；２）脱インク物質および本発明のプロテアーゼによる分解；および／または３）本発明のプロテアーゼとともに浸漬した後での分解。プロテアーゼで処理したリサイクル紙は、セルラーゼだけで処理された紙と比較してトナー粒子が除去されているために白さが増し得る。本発明はいずれの特定の理論にも拘束されないが、本発明のプロテアーゼの効果は、パルプ懸濁液中の界面活性剤としてのその働きによるものかもしれない。
本発明は、本発明の1つまたは2つ以上のプロテアーゼを用いる紙および紙パルプの処理方法を提供する。本発明のプロテアーゼは任意の紙処理またはパルプ処理方法で用いることができる。前記方法は当業界で既知であり、例えば米国特許6,241,849号、同6,066,233号、同5,582,681号を参照されたい。例えばある特徴では、本発明は、染料を含む印刷された紙の脱インクおよび脱色のための方法を提供する。前記方法は、印刷された紙をどろどろにしてパルプスラリーを得て、本発明のプロテアーゼの存在下でインクを前記パルプスラリーから除去することを含む（他の酵素もまた添加することができる）。別の特徴では、本発明は、本発明のプロテアーゼを含む酵素混合物（他の酵素、例えばペクチンリアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼまたはグルコアミラーゼ）もまた含むことができる）をパルプ（例えば二次繊維から製造されたパルプ）に添加し、酵素処理パルプを生成する反応を惹起させることによって、前記パルプのろ水度(freeness)を増進する方法を提供する。酵素処理パルプのろ水度は、白さを失わせることなく最初の二次繊維のろ水度から増強される。
【０１７９】
廃棄物処理：本発明のプロテアーゼは多様な他の工業的用途、例えば廃棄物処理で用いることができる。例えば、ある特徴では、本発明は、本発明のプロテアーゼを用いる固形廃棄物消化プロセスを提供する。前記方法は、実質的に未処理の固形廃棄物の大きさおよび体積を減少させることを含むことができる。固形廃棄物は、制御温度において酵素溶液（本発明のプロテアーゼを含む）の存在下で酵素消化プロセスにより処理することができる。これにより添加微生物によって生じる相当な細菌の発酵無しに反応がもたらされる。固形廃棄物は液化廃棄物およびなんらかの残留固形廃棄物に変換される。生じた液化廃棄物は前述の残留固形廃棄物から分離することができる。例えば米国特許5,709,796号を参照されたい。
さらに、本発明のプロテアーゼは、動物分解工業で用いて、例えば羽毛を除去することができる。前記は例えばYamamura（Biochem. Biophys. Res. Com. 294:1138-1143 (2002)）によって記載されている。アルカリプロテアーゼもまた、廃棄羽毛またはケラチン含有材料からタンパク質性飼料を製造する場合に用いることができる。前記は例えばGupta（Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:15-32 (2002)）によって記載されている。
口内手入れ製品：本発明は、本発明のプロテアーゼを含む口内手入れ製品を提供する。典型的な口内手入れ製品には、練り歯磨き、歯磨きクリーム、ゲルまたは歯磨き粉、オドンティクス、口内洗浄液、歯磨き前または歯磨き後の洗浄剤、チューインガム、ロゼンジまたはキャンディーが含まれる。例えば米国特許6,264,925号を参照されたい。
【０１８０】
醸造および発酵：本発明は、本発明のプロテアーゼを含むビール醸造（例えば発酵）方法を提供する。ある典型的なプロセスでは、澱粉含有原料を分解し処理してモルトを形成する。本発明のプロテアーゼは発酵プロセスの任意の時点で用いられる。例えば、本発明のプロテアーゼはオオムギモルトの加工時に用いることができる。ビール醸造の主要な原料はオオムギモルトである。これは三段階プロセスで行い得る。第一に、オオムギの穀粒を浸漬して水分含有量を、例えば約40％程度に増加させることができる。第二に、前記穀粒を酵素合成がジベレリンの制御下で刺激される3から6日間15から25℃でインキュベートすることによって発芽させることができる。ある特徴では、本発明のプロテアーゼは工程のこの段階（または他の任意の段階）で添加される。プロテアーゼの作用は発酵可能な還元糖の増加をもたらす。これはジアスターゼ能力（DP）として表すことができ、DPは12℃5日間でおよそ80から190に上昇することができる。本発明のプロテアーゼを任意のビール製造またはアルコール飲料製造プロセスで用いることができる。これは例えば米国特許5,762,991号、同5,536,650号、同5,405,624号、同5,021,246号、同4,788,066号に記載されているとおりである。
【０１８１】
医学および研究用途：本発明のプロテアーゼは、コラゲナーゼと同じ態様で細胞治療のために、組織からの細胞を単離するために用いることができる。例えば、本発明のメタロエンドプロテイナーゼおよび他の酵素（コラーゲンをより小さなペプチド断片に切断できる）を組織分離のための“リベラーゼ酵素”として用い、単離細胞の健康性を改善することができる。“リベラーゼ酵素”を慣行的コラゲナーゼに置き換えることができる。コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、クロストリペインおよび／または中性プロテアーゼ活性を有する本発明のプロテアーゼを組織分離に用いることができる。ある特徴では、組織分離のために、本発明のコラゲナーゼアイソフォームが互いに混ぜ合わされ、場合によって中性プロテアーゼが混合される。ある特徴では、前記中性プロテアーゼは中性プロテアーゼディスパーゼおよび／または中性プロテアーゼテルモリシンである。
さらにまた、本発明のプロテアーゼは、その細菌溶解特性のために抗菌剤として用いることができる。前記は例えば以下に記載されている：S. Li et al. Bacteriolytic Activity and Specificity of Achromobacter b-Lytic Protease, J. Biochem. 124, 332-339 (1998)。
本発明のプロテアーゼはまた治療に用いて、特定のタンパク質を切断および破壊することができる。潜在的標的には毒素タンパク質（例えばアントラックス、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、リシン）およびウイルスまたはがん細胞タンパク質が含まれる。
本発明のプロテアーゼはまた、例えば以下に記載されたように消毒剤として用いることができる：J. Gen. Microbiol. (1991) 137(5):1145-1153; Science (2001) 249:2170-2172。
本発明のプロテアーゼのさらに別の医学的使用には、脂肪腫の除去、創傷の創縁切除および瘢痕形成防止（コラゲナーゼ）、慢性皮膚潰瘍および重篤な火傷領域の創縁切除が含まれる。
本発明のプロテアーゼは、創傷清浄酵素組成物（例えば軟膏）を殺菌するために用いることができ、ある特徴では、前記軟膏は1グラム当たり約250コラゲナーゼ単位を含む。担体は白色ワセリンUSPであろう。ある特徴では、本発明のプロテアーゼは、サンチル（Santyl（登録商標））軟膏（BTC, Lynbrook, NY）と類似の指示の下で用いることができる。本発明のプロテアーゼはまた、アルギン酸包帯、抗菌バリヤー包帯、火傷包帯、圧迫包帯、診断用ツール、ゲル包帯、水分選択性包帯、ヒドロセル（泡沫）包帯、親水コロイド包帯、I.V.包帯、切開ドレープ、低粘着性包帯、臭い吸収包帯、軟膏包帯、術後包帯、瘢痕手当て、皮膚保護、透明フィルム包帯および／または創傷閉鎖に用いることができる。本発明のプロテアーゼは、創傷洗浄、創傷床調製物で用いて、圧迫潰瘍、脚部潰瘍、火傷、糖尿病性の足の潰瘍、瘢痕、IV固定、手術創および微小な傷を治療することができる。
さらにまた、本発明のプロテアーゼは一般的にプロテオミクスおよび実験室作業で用いることができる。例えば、プロテアーゼはDNA制限酵素と同じ態様で用いることができる。
【０１８２】
その他の工業的用途：本発明はまた、完成した井孔周辺の地層内で見出される、生産活動中に生じる粘稠でタンパク質を含有する有害な液を除去することによって地層から生じる産出液流を増加させる方法を含む。前記方法は、井孔から産出液を流出させ、前記地層から生じる産出液流を予想された流速未満に低下させ、水性液および本発明のポリペプチドを一緒に混合することによって酵素処理物を調合し、前記酵素処理物を前記井孔内の所望の場所にポンプで送り込み、前記酵素処理物に粘稠なタンパク質を含有する有害な液を分解させ、それによって前記液体を地層から井戸の表面に移すことができる。この場合前記酵素処理物は細胞壁中のタンパク質の攻撃に有効である。
本発明のプロテアーゼは、ペプチド合成、皮革工業（例えば皮革加工、例えば毛の除去および／または皮のあく抜き）、廃棄物処理（例えばドレーンから毛を除去する）、写真工業で（例えばフィルムから銀の回収で）、医療工業（例えば上記に考察したように、例えば火傷、創傷、カルブンケル、ねぶとおよび深部膿瘍の治療のため、またはフィブリンを溶解することによって凝血を溶解させるため）、絹の脱ガムにおいて用いることができる。
他の特徴では、本発明のプロテアーゼは、例えばチーズ、ペットフードにおける風味の増強に、例えばPommerが記載したように用いることができる（K. Pommer, Investigating the impact of enzymes on pet food palatability, Petfood Industry, May 2002, 10-11）。
本発明のさらにまた別の実施態様では、本発明のプロテアーゼを用いて、トウモロコシの湿潤混練りから澱粉の収量を高めることができる。前記は例えば以下に記載されている：D.B. Johnston and V. Singh, Use of proteases to Reduce Steep Time and SO2 requirements in a corn wet-milling process, Cereal Chem. 78(4):405-411。
他の特徴では、本発明のプロテアーゼは生体防御（例えば胞子または細菌の破壊）に用いることができる。生体防御における応用でのプロテアーゼの使用は、これまでのところ未知のいずれの生物学的兵器に対してもそれらを非常に迅速に開発することができるという点で顕著な利点を提供する。さらにまた、本発明のプロテアーゼは影響を受けた環境の汚染除去のために用いることができる。
さらにまた、本発明のプロテアーゼは、バイオフィルム分解、バイオマスのエタノールへの変換、および／または身だしなみおよび化粧品工業で用いることができる。
本発明のプロテアーゼはまた鏡像選択性の強化に用いることができる。前記は例えば以下に記載されている：A. Arisawa et al. Streptomyces Serine Protease (DHP-A) as a New Biocatalyst Capable of Forming Chiral Intermediates of 1,4-Diohydropyridine Calcium Antagonists. Appl. Environ Microbiol. 2002 Jun; 68(6):2716-2725; D. Haring et al. Semisynthetic Enzymes in Asymmetric Synthesis: Enantioselective Reduction of Racemic Hydroperoxides Catalyzed by Seleno-Subtilisin. J. Org. Chem. 1999, 64:832-835。
本発明は以下の実施例を参照しながらさらに詳細に記載されるであろう。しかしながら本発明はそのような実施例に限定されないことは理解されよう。
【０１８３】
実施例１．プロテアーゼ活性アッセイ
以下の実施例では、プロテアーゼの触媒活性を決定するための典型的なプロテアーゼ活性アッセイについて述べる。これらの典型的なアッセイを用いて、あるポリペプチドが本発明の範囲内に包含されるか否かを決定できる。
プロテイナーゼ（タンパク質に対して活性を有する）のために用いられる活性アッセイには、ザイモグラムおよび液体基質酵素アッセイが含まれる。３つの異なるタイプのザイモグラム、カゼイン、ゼラチンおよびゼインを用いて活性を測定した。液体基質酵素アッセイのためには、3つの主要なタイプ、ゲル電気泳動、O-フタールジアルデヒド（OPA）および蛍光終末点アッセイを用いた。ゲル電気泳動およびOPAアッセイの両者については、4つの異なる基質、ゼイン、ダイズトリプシンインヒビター（SBTI、SIGMA-Aldrich, T6522）、コムギ胚芽レクチンおよびダイズレクチンを用いた。蛍光終末点アッセイのための基質はゼラチンとした。
プロテイナーゼおよびペプチダーゼ（ペプチドに対して活性を有する）について用いたアッセイでは、pNA結合小ペプチド基質を用いた。前記アッセイは特異性終末点アッセイ、単位規定カイネティックアッセイおよびpHアッセイを含んでいた。
以下の実施例では、上記の典型的な活性アッセイについて述べる。これらの典型的なアッセイを用いて、あるポリペプチドが本発明の範囲内に包含されるか否かを決定できる。
【０１８４】
タンパク質（プロテイナーゼ活性）
カゼインザイモグラムゲルアッセイ：カゼインザイモグラムゲルを用いてプロテイナーゼ活性を評価した（表1および2を参照）。プロテアーゼ活性アッセイは、ゲルマトリックスに埋め込まれた青色染料結合カゼインを含む4−16％グラディエントゲル（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）を用いて調べた。全てのザイモグラムゲルは製造元の指示にしたがって処理した。簡単に記せば、各サンプルを等体積の2Xのローディング色素と混合し、ローディング前に加熱することなく10分間インキュベートした。電気泳動後に、ゲルを復元バッファー中でインキュベートしてSDSを除去し、タンパク質にそれらの本来の形態を回復させた。続いてゲルを現像溶液に移し、4から24時間37℃でインキュベートした。プロテアーゼがカゼインをゲル内で消化すると、分解がなければ青色である背景に対して透明なゾーンが生じる。前記ゾーンはゲル内のプロテアーゼの位置と一致する。陰性対照（ゲル図ではNCで示されている）は、各実験の実験サンプルと一緒に処理し、それらの対応するプロテアーゼの隣のカゼインザイモグラム上で電気泳動した。
慣行的SDS-PAGEとは異なり、サンプルはカゼインザイモグラムの電気泳動前に熱変性しない。結果として、プロテアーゼの分子量を正確に評価することは時に困難である。例えば、スブチリシンA（Sigma, P5380；ゲル図ではSubt.Aで示されている）（前記はこれらの実験では陽性対照としても用いられた）は、サイズが約27kDaであると予測される。しかしながら、記載の条件を用いてカゼインザイモグラムで電気泳動したとき、スブチリシンAはゲル内へほとんど移動せず、183kDaより上でのみ見ることができる。したがって、ザイモグラムは表示のプロテアーゼのMWを特定せず、むしろ活性の指標として用いられる。
ゼラチンザイモグラムアッセイ：ゼラチンザイモグラム（Novex（登録商標）Zymogram Gels）は製造元（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）の指示にしたがって実施した。カゼインザイモグラムとは異なり、ゼラチンザイモグラムは、現像に続いてコロイドブルー染色キットまたはSIMPLYBLUE（登録商標）セイフステイン（Safestain）（両方ともInvitrogen）のどちらかを用いて後染色した。プロテアーゼ活性の領域は暗色の背景に対して透明なバンドとして出現した。
【０１８５】
トウモロコシゼインアッセイ：トウモロコシゼインをプロテアーゼ活性アッセイの基質として用いた。粉末のZ-3625（Sigma Chemical Co. St. Louis, MO）、およびアクァゼイン（Aquazein）10％溶液（Freeman Industries, Tuckahoe, NY）を用いた。SDS-PAGEで分画したとき、両供給源由来のゼインは24および22kDaのバンドを生じた。前記2つのゼインバンドは以前にアルファ-ゼインについて記載されたものと分子量が一致する（アルファ-ゼインはゼインのもっとも豊富なサブクラスであり、トウモロコシの全ゼインの71−84％を構成すると概算されている（例えば以下を参照されたい：Consoil (2001) Electrophoresis 22:2983-2989）。結果は上記の表3に示されている。
活性なプロテアーゼを含む凍結乾燥培養上清を再懸濁し、透析し、50mMのKPO4（pH7.5）中でゼインとともにインキュベートした。反応を96ウェルのマイクロタイター様式で実施した。“基質のみ”および“酵素調製物のみ”の対照を実験サンプルと同様に処理した。30℃で24時間後に、アリコットを取り出しOPA、SDS-PAGEまたはザイモグラム分析に付した。いくつかの事例では、新鮮な少量を取り出し、30℃で48または72時間後に分析した。
ゼインザイモグラム：アクァゼインを10％のポリペプチドアクリルアミドゲルに最終濃度0.075％で添加した。透析したプロテアーゼサンプルのアリコットを標準的な条件を用いてゼインザイモグラムで電気泳動した。電気泳動後、ザイモグラムゲルを洗浄し、復元バッファー中でインキュベートし、プロテアーゼ活性に最適な現像緩衝液（トリス緩衝液（pH8）中にNaCl、CaCl2およびBrij35を含む）で一晩インキュベートし、クマシーブルーで染色した。
SDA-PAGE：等体積のアリコットを各サンプルから取り出し、SDS-PAGE分析に付した。電気泳動後、ゲル中のタンパク質をSYPROオレンジ（Molecular Probes）で染色し、UV透過光を用いて可視化した。
OPA：ベータ-メルカプトエタノール（BME）の存在下で、OPAを遊離アミノ末端と反応させ、蛍光イミダゾールを生成し、前記は標準的な蛍光プレート読取装置を用いて検出することができる。このアッセイでは、等体積のアリコットを各サンプルから取り出し、黒色の蛍光プレートに入れた。続いてサンプルをOPA試薬中で1：10に希釈した。5分インキュベートした後で蛍光（Ex=340nm、Em=450nm）を測定した。全ての基質に対するOPAデータのまとめは上記の表3に含まれている。
【０１８６】
ダイズトリプシンインヒビターアッセイ：ダイズトリプシンインヒビター（SBTI, SIGMA-Aldorich, T6522）をプロテアーゼ活性の基質として用いた。活性なプロテアーゼを含む凍結乾燥培養上清を再懸濁し、透析し、SBTI（最終濃度1mg）とともに50mMのKPO4（pH7.5）中で37℃でインキュベートした。基質単独および酵素調製物単独の対照を実験サンプルと一緒に処理した。24時間後に、少量を取り出しOPAおよびSDS-PAGE分析に付した。結果は上記の表3に示されている。SDS-PAGE：SBTIの場合、電気泳動に続いて、ゲル中のタンパク質はクマシーブルーで染色した。
コムギ胚芽レクチンアッセイ：コムギ胚芽レクチン（WGA, EY Laboratories, L-2101, Pure）をプロテアーゼ活性の基質として用いた。活性なプロテアーゼを含む凍結乾燥培養上清を再懸濁し、透析し、WGA（最終濃度1mg）とともに50mMのKPO4（pH7.5）中で37℃でインキュベートした。基質単独および酵素調製物単独の対照を実験サンプルと一緒に処理した。24時間後に、少量を取り出しOPAおよびSDS-PAGE分析に付した。結果は上記の表3に示されている。SDS-PAGE：WGAの場合、電気泳動に続いて、ゲル中のタンパク質はクマシーブルーで染色した。
ダイズレクチンアッセイ：ダイズレクチン（SBA, EY Laboratories, L-1300, Crude）をプロテアーゼ活性の基質として用いた。活性なプロテアーゼを含む凍結乾燥培養上清を再懸濁し、透析し、SBA（最終濃度1mg）とともに50mMのKPO4（pH7.5）中で37℃でインキュベートした。基質単独および酵素調製物単独の対照を実験サンプルと一緒に処理した。24時間後に、少量を取り出しOPAおよびSDS-PAGE分析に付した。結果は上記の表3に示されている。SDS-PAGE：SBAの場合、電気泳動に続いて、ゲル中のタンパク質はクマシーブルーで染色した。
【０１８７】
蛍光液ゼラチン終末点アッセイ：DQゼラチン（Molecular Probes, fuleorescein conjugate, D-12054）を用いて本発明のプロテアーゼのタンパク分解活性を調べた。DQゼラチンは、分子が完全であるときにその蛍光が消光されるように蛍光発光団で強く標識されたタンパク質である。基質を切断するプロテアーゼは内部消光から蛍光を遊離させ、蛍光はプロテアーゼ活性に比例して増加するであろう。DQゼラチンを最終濃度25μg/mLに100μＬの反応物で希釈した。前記反応物は、適切な緩衝液（例えばザイモグラム現像緩衝液（Invitrogen））および種々の濃度のプロテアーゼ調製物を含む。反応物を384ウェルの透明な平底マイクロタイタープレートで37℃で1時間から一晩の間の種々の時間インキュベートした。蛍光は、37℃で種々の時間インキュベートした後、蛍光プレート読取装置を用いてモニターした。
蛍光液終末点アッセイから得られる結果の例として、表5および図5を参照されたい。前記は配列番号:144（配列番号:143によってコードされる）の活性を示している。サンプルはデュープリケートでアッセイし、未加工データは下記の表4に示されている。デュープリケートの結果を平均し陰性対照から得たバックグラウンドを差し引いて、配列番号:144の活性によって1時間に生じた蛍光の増加を棒グラフを用いて表した（図5）。
【０１８８】
表５．
2006516889.tif 000008
【０１８９】
ペプチド（プロテイナーゼおよびペプチダーゼ活性）
特異性終末点アッセイ：プロテアーゼの特異性決定および生化学的性状決定の促進のためにしばしば発色団に結合させた合成小ペプチド基質が用いられる。本発明のプロテアーゼの基質特異性を測定するために、合成ペプチドと結合させたいくつかのパラ-ニトロアナリドをシグマから入手した。これらには以下が含まれる：Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(AAPF)、Ala-Ala-Ala-ｐNA(AAA)、N-Bz-D,L-Arg-pNa(BAPNA)、Gly-Gly-Phe-pNA、Ile-Glu-Gly-Arg-pNAおよびPro-Phe-Arg-pNA。P1基質の位置でpNA基とアミノ酸との間のペプチド結合が切断されたとき黄色が生じ、その吸収を410nmで測定することができる。小ペプチド基質の25mMストックをDMSO中で調製した。基質は100μＬの反応物体積（種々の濃度のプロテアーゼ調製物を含む）中で最終濃度250μMで用いた。反応は適切な緩衝液（例えば1Xのザイモグラム現像緩衝液（Invitrogen））中で実施し、384ウェルの透明な平底マイクロタイタープレートで37℃で1時間から一晩の間の種々の時間インキュベートした。この“終末点”アッセイは、定量的ではなく基質の特異性を評価する定性的な方法を提供するが、この方法は、種々の小分子ペプチド基質のための初速を決定することによって定性的データを提供するように調整することができる。
【０１９０】
単位定義カイネティックアッセイ：以下のアッセイは、プロテアーゼ活性単位を決定するためにpNA結合小ペプチド基質を用いて開発された。このアッセイは、それぞれの単位を基準として本発明の酵素をスブチリシンと直接比較することを可能にする。遊離pNAを用いて標準曲線を作成し、pNA吸収のpNAモル濃度への変換を可能にしてプロテアーゼによって遊離されるpNAの量の直接定量を可能にした（図6）。
AAPF-pNAに対するスブチリシンA活性（初速）は100倍の酵素濃度範囲にわたって測定した（シグマが提供した活性を基にしてアッセイでは0.1から10U/mLの範囲）。スブチリシンAの活性は、この範囲の酵素濃度では直線的であり、広い活性範囲にわたって本発明の酵素の等価の単位の決定を可能にした。スブチリシンA標準曲線は図7に示されている。
【０１９１】
pHアッセイ：以下のアッセイは、種々のpHでのプロテアーゼの相対活性を決定するためにスブチリシンを用いて開発された。種々の範囲のpHの試験を可能にする4つの異なる緩衝液を特定した。プロテアーゼ活性は、小ペプチド基質p-ニトロアナリド結合Ala-Ala-Pro-Phe（AAPF-pNA, Sigma, S-7388）を用いて以下のようにアッセイした：前記アッセイ条件を用いて初速を得るために必要なスブチリシンAの量を所望のpHで決定した（5mMのAAPF-pNA、37℃）。反応はトリプリケートで実施した。初速を決定し平均を求めた。種々のpHのパーセント活性を最高の活性を有するサンプルについて決定し、続いてパーセント相対活性をpHに対してプロットした。試験したpHにおける基質安定性は活性の非存在下で確認した。結果は表6および図8に示されている。
【０１９２】
表６：速度（A405nm X 103/分）
2006516889.tif 000009
【０１９３】
本発明の多数の実施態様を記載したが、本発明の範囲を外れることなく種々の改変が可能なことは理解されよう。
したがって、他の実施態様も本発明の範囲内に包含される。
本特許または特許出願明細書は少なくとも1枚の着色図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願明細書の写しは、申請と必要な手数料の支払いに応じて特許庁から提供される。
種々の図面中の同じ参照記号は同じ成分を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】コンピュータシステムの概略図である。
【図２】新規なヌクレオチドまたはタンパク質配列を配列データベースと比較し、新規な配列とデータベースの配列との間の相同性を決定するためのプロセスのある特徴を示す工程図である。
【図３】2つの配列が相同であるか否かを決定するためのコンピュータプロセスのある特徴を示す工程図である。
【図４】配列内の特徴の存在を検出するためのアイデンティファイヤープロセスのある特徴を示す工程図である。
【図５】実施例１で詳細に記載したゼラチン蛍光液終末点アッセイにおける配列番号:144（配列番号:143によってコードされる）の試験結果を示す。
【図６】実施例１に詳細に記載した、pNA吸収（A405nm）をpNAモル濃度へ変換できるように作成した（pNA）（パラ-ニトロアナリド）の標準曲線を示す。
【図７】実施例１に詳細に記載した、スブチリシンAプロテアーゼの標準曲線を示す。
【図８】実  施例１に詳細に記載した、小ペプチド基質p-ニトロアナリド結合Ala-Ala-Pro-Pheを用いたプロテアーゼ活性の試験結果を示す。
【図１】
2006516889.tif 000010
【図２】
2006516889.tif 000011
【図３】
2006516889.tif 000012
【図４】
2006516889.tif 000013
【図５】
2006516889.tif 000014
【図６】
2006516889.tif 000015
【図７】
2006516889.tif 000016
【図８】
2006516889.tif 000017
【配列表】
2006516889000001.app