(57)【要約】ラクトバシラス−カゼイＡＴＣＣ番号ＰＴＡ３９４５から誘導されるプロバイオティック組成物が開示されている。より具体的には、食用油を含んでいるプレバイオティック組成物を含有しているプロバイオティック組成物が提供される。本明細書に開示されているプロバイオティック／プレバイオティック組成物は、長期間にわたる高い生存率を維持するため、窒素パージ即時結合嫌気的カプセル封入プロセスを使用してパッケージされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用油に懸濁された乳酸菌（ＬＡＢ）を含み、前記食用油がプレバイオティック特性を有しているプロバイオティック組成物。
【請求項２】
該ＬＡＢがラクトバシラス−アシドフィルス、Ｌ．アミロヴォルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブルガリカス、Ｌ．カゼイ亜種カゼイ、Ｌ．カゼイ亜種ラムノーサス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．デルブリッキー亜種ラクティス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ヘルヴェティクス、Ｌ．ジョンソニー、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．ペントーサス、Ｌ．プランタルム、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．サケ、ビフィドバクテリウム−アニマリス、Ｂ．ビフィドゥム、Ｂ．ブレヴェ、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ロングム、ペディオコッカス−アシディーラクティー、プロピオニバクテリウム−アシディープロピオニー、Ｐ．フロイデンライシイ、Ｐ．イエンセニー、Ｐ．テオニ、ストレプトコッカス−クレモリス、Ｓ．ラクティス、Ｓ．サーモフィルスおよびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項３】
該プレバイオティック食用油が、魚油、オリーブ油、米糠油、大豆油およびそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項４】
該ＬＡＢが、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ３９４５を有しているＬ．カゼイＫＥ０１株である、請求項１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項５】
さらに、硬質、二片カプセルを含んでおり、ここにおいて該ゼラチン／植物性カプセルが窒素パージされそして即時結合されている（ＮＰＩＢ）、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項６】
食用油中に懸濁されているＡＴＣＣ番号ＰＴＡ３９４５を有するラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を含むプロバイオティック組成物であって、前記食用油はプレバイオティック特性を有し、かつ魚油、オリーブ油、米糠油、大豆油およびそれらの組み合わせから成る群より選択されるプロバイオティック組成物。
【請求項７】
さらに、硬質、ゼラチン／植物性カプセルを含んでおり、ここにおいて該ゼラチン／植物性カプセルが窒素パージされそして即時結合されている（ＮＰＩＢ）、請求項６に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項８】
食用油中に懸濁されているＡＴＣＣ番号ＰＴＡ３９４５を有するラクトバシラス  カゼイＫＥ０１株を含むプロバイオティック組成物であって、前記食用油はプレバイオティック特性を有し、かつ魚油、オリーブ油、米糠油、大豆油およびそれらの組み合わせから成る群より選択されるプロバイオティック組成物。
【請求項９】
該食用油が魚油である、請求項８に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１０】
該食用油がオリーブ油である、請求項８に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１１】
該食用油が米糠油である、請求項８に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１２】
該食用油が大豆油である、請求項８に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１３】
さらに、大豆オリゴ糖類、フルクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、ガラクトシル  ラクトースおよびパラチノース、ラクツロース、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、牛乳、粉乳、乳清、乳清タンパク質濃縮物、カゼイン、カゼイン加水分解物、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、ラクトグロブリン、グリコマクロペプチド、ラクト糖類、ラクト脂質から成る群より選択される安定化剤成分を含んでいる、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１４】
さらに、硬質、二片カプセルを含んでおり、ここにおいて該ゼラチン／植物性カプセルは窒素パージされそして即時結合されている（ＮＰＩＢ）、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１５】
プレバイオティックオリーブ油中に懸濁されているＡＴＣＣ番号ＰＴＡ３９４５を有するラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株を含むプロバイオティック組成物であって、前記プロバイオティック組成物は硬質二片カプセルに封入されており、該硬質二片カプセルは窒素パージおよび即時結合（ＮＰＩＢ）されているプロバイオティック組成物。
【請求項１６】
プロバイオティック組成物を作製するための方法であって：
乳酸菌（ＬＡＢ）を、プレバイオティック特性を有する食用油中に乳化させて、乳化プロバイオティックを形成すること；
硬質カプセル本体を前記乳化プロバイオティックで充填し、ここで前記カプセルは垂直に配向していること；
前記乳化プロバイオティックを含んでいる前記の垂直整列化硬質カプセル本体の上にキャップを付けて、充填されたカプセルを形成すること；
前記充填されたカプセルを希ガスでパージすること；および
前記カプセル本体を前記カプセルキャップに対し密閉し、その間、前記カプセル本体および前記カプセルキャップは前記の垂直整列化配向であること；
を含む方法。
【請求項１７】
乳化工程がさらに、魚油、オリーブ油、米糠油、大豆油およびそれらの組み合わせから成る群より選択される食用油を含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
乳化工程がさらに、ラクトバシラス−アシドフィルス、Ｌ．アミロヴォルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブルガリカス、Ｌ．カゼイ亜種カゼイ、Ｌ．カゼイ亜種ラムノーサス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．デルブリッキー亜種ラクティス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ヘルヴェティクス、Ｌ．ジョンソニー、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．ペントーサス、Ｌ．プランタルム、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．サケ、ビフィドバクテリウム  アニマリス、Ｂ．ビフィドゥム、Ｂ．ブレヴェ、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ロングム、ペディオコッカス−アシディーラクティー、プロピオニバクテリウム−アシディープロピオニー、Ｐ．フロイデンライシイ、Ｐ．イエンセニー、Ｐ．テオニ、ストレプトコッカス−クレモリス、Ｓ．ラクティス、Ｓ．サーモフィルスおよびそれらの組み合わせから成る群より選択されるＬＡＢを含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＬＡＢがＡＴＣＣ番号ＰＴＡ３９４５を有しているＬ．カゼイＫＥ０１株である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
充填する工程がさらに、植物性、動物性ゼラチン、合成ポリマーまたは天然ポリマーから誘導される硬質カプセルを含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
パージする工程がさらに、窒素、アルゴンおよび二酸化炭素から成る群より選択されるガスを含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
密閉工程がさらに、イソプロピルアルコールおよびエタノールから成る群より選択される有機溶剤を含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ＫＥ０１特異的プライマーの対であって、該ＫＥ０１特異的プライマーが、ポジティブ鎖から成り、該ポジティブプライマーが配列番号１であり、該ネガティブ鎖が配列番号２であるプライマー対。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｏｃ）組成物およびそれを作製するための方法に関している。より具体的には、本発明はプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）食用油に乳化され、および嫌気的カプセル封入システムでパッケージされている乳酸菌に由来するプロバイオティック組成物に関している。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティックは微生物に基づいた食物補助剤であり、粘膜性および全身性免疫を調節することにより、ならびに消化管中の栄養および微生物平衡を改良することにより、宿主生理機能に有益に影響している［Ｎａｉｄｕ  ＡＳ，Ｂｉｄｌａｃｋ  ＷＲ，Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＲＡ（１９９９）乳酸菌（ＬＡＢ）のプロバイオティックスペクトル．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．３９：３−１２６］。乳酸菌（ＬＡＢ）は、宿主のミクロ生態学において重要な役割を果たす哺乳動物の消化管に固有のマイクロフローラ（ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ）であり、治療および予防特性の印象的なリストをもって信用されてきた。［Ｎａｉｄｕ  ＡＳ，Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＲＡ（２０００）プロバイオティック，ｐ．４３１−４６２．Ａ．Ｓ．Ｎａｉｄｕ（編），Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ中．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ］。これら治療および予防特性としては、これらに限定されるわけではないが、腸の微生物生態学の維持、生理学的効果、免疫変調効果および抗菌効果が挙げられる。［Ｇｉｂｓｏｎ  ＧＲ，Ｓａａｖｅｄｒａ  ＪＭ，Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  Ｓ，Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ  ＧＴ（１９９７）プロバイオティックおよび腸感染，ｐ．１０−３９．Ｒ．Ｆｕｌｌｅｒ（編），Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ２：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ中．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ］。他のＬＡＢ関連性状としては、腸管腔への酵素放出が挙げられ、これはＬＡＢ付着と相乗的に作用し、腸の吸収不良の症状を緩和することができる。その上、ＬＡＢ放出酵素は腸のｐＨ調節を助け、それにより芳香族アミノ酸分解を増すことができる。［Ｍｉｔｓｕｏｋａ  Ｔ（１９８４）ビフィズス菌の分類学および生態学．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ３：１１］。また、ＬＡＢは、動物の糞廃棄物中の硫化物およびアンモニア含有化合物を顕著に減少させることにより、動物の排泄物による匂いと毒性とを減少させる能力を示した。［Ｎａｉｄｕ  ＡＳ，Ｘｉｅ  Ｘ，Ｌｅｕｍｅｒ  ＤＡ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｓ，Ｂｕｒｒｉｌｌ  ＭＪ，Ｆｏｎｄａ  ＥＡ（２００２）硫化物およびアンモニア化合物の減少、およびインビトロでのラクトバシラス−カゼイ株ＫＥ９９の接着特性．Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：１９６−２０５］。
【０００３】
しかしながら、ＬＡＢがヒトおよび家畜の生命の質を向上させる最も高い可能性は、それらのインビボでのプロバイオティック応用にある。ＬＡＢがインビボでの有益なプロバイオティック効果を示すためには、生物体は腸で長い時間生存しなければならない。それゆえに、腸の収縮による迅速な除去を防ぐような特質を所有するプロバイオティックＬＡＢ株を選択することが重要である［Ｈａｖｅｎａａｒ  Ｒ，Ｂｒｉｎｋ  Ｂ，Ｈｕｉｓ  ｉｎ'ｔ  Ｖｅｌｄ  ＪＨＪ（１９９２）プロバイオティック使用のための株の選択，ｐ．２０９−２２４．Ｒ．Ｆｕｌｌｅｒ（編），Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ，ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｂａｓｉｓ中．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ］。有効なプロバイオティック細菌は、胃の環境での生存が可能であり、腸上皮に付着することによって少なくとも一時的に腸で定着することが可能でなければならない［Ｃｏｎｗａｙ  Ｐ（１９９６）プロバイオティック微生物のための選択基準．Ａｓｉａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ  ５：１０−１４］。
【０００４】
さらに、インビボ生存率および消化管寿命を増加させることに加え、室温での延長された有効期間が商業的挑戦として残っている。乳酸桿菌は一般に、それらの再生後に生菌機能活性（即ち、腸接着／保持、バクテリオシン／酵素産生）を保持する有効な送達システムを必要とする［Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ，Ｉｓｏｌａｕｒｉ  Ｅ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｅ（１９９６）腸粘膜障壁を安定化するためのプロバイオティックの臨床使用：成功株および将来の挑戦．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７０：３４７−３５８１］。凍結乾燥は、プロバイオティックの保存および送達に有効なプロセスではあるけれども、湿度、通気（酸素利用能）および温度のごときいくつかの物理−化学的因子が細胞生存率、それにより有効期間、を損なうことがある。
【０００５】
インビボ寿命および保存有効期間の両方を増すことができる、一つの可能性のある追加のクラスは、プレバイオティックである。プレバイオティックは、一つまたは制限された数の細菌種の増殖および／または活性を選択的に刺激することにより宿主に有益に影響し、そしてそれにより宿主の健康を結果において改良する、非−消化可能な、または部分的に消化可能な食物成分である。［Ｇｉｂｓｏｎ  ＧＲ，Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ  ＭＢ（１９９５）ヒト結腸微生物叢の食餌性変調：プレバイオティック概念の導入．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：１４０１−１４１２］。プレバイオティックの取り入れは、プロバイオティックＬＡＢを有益に変調することが可能である。一般に食物繊維、および特にフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）のごとき、非−消化可能オリゴ糖類はよく知られたプレバイオティックである［Ｒｏｂｅｒｆｒｏｉｄ  ＭＢ（１９９７）非−消化可能オリゴ糖類の健康利益．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４２７：２１１−２１９］。プロバイオティックそしてプレバイオティックの理論的根拠を組み合わせることにより、「シンバイオティック（ｓｎｂｉｏｔｉｃｓ）」の概念が、健康促進機能性食品成分と組み合わされた、興味深い栄養特性を有するいくつかの結腸食品を特徴付けるために提案された［Ｆｕｌｌｅｒ  Ｒ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＧＲ（１９９７）プロバイオティックおよびプレバイオティックを使用する腸マイクロフローラの修飾．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．２２２：２８−３１］。
【０００６】
精油は、その低い水活性および制限された空気拡散のため、生物学的保存剤として知られている。いくつかの精油はまた、抗酸化、抗菌、抗腫瘍および免疫変調活性を含む、多様な栄養補助的利点を提供することも知られている。しかしながら、プロバイオティックＬＡＢに対する精油のプレバイオティック効果はこれまで知られていない。それ故、ＬＡＢを含むプロバイオティック組成物のプロバイオティック活性、インビボ生存率および有効期間を促進させる必要性が残っている。一つの可能な解答は、高度なパッケージ法と組み合わされたプレバイオティックの応用である。
【発明の概要】
【０００７】
増加した生存率、インビボ寿命および増加した有効期間を有している、強化されたプロバイオティック組成物を提供するのが本発明の一つの目的である。
増加した生存率、インビボ寿命および増加した有効期間を有している、ラクトバシラスの新規の株を組み合わせたプレバイオティック組成物を提供するのが本発明の別の目的である。
【０００８】
新規窒素パージ、即時結合（ｉｎｓｔａｎｔ−ｂｏｎｄｉｎｇ）（ＮＰＩＢ）システムを使用するカプセル封入プロセスと組み合わせた本発明のプレバイオティック油組成物の使用を含んでいる、ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１のプロバイオティック特質を保存するのが、しかし限定されるわけではない、本発明のさらに別の目的である。
【０００９】
本発明は、示されたインビボ抗腸病原体活性を含む、科学的に証明されたプロバイオティック特性を所有する、ＫＥ０１と名付けられたラクトバシラス−カゼイの新規株を提供することにより、これらおよびその他の目的を実現する。その上、本発明は、生物体に対する長期間の保護を提供し、そしてその証明されたプロバイオティック特性および増加したインビボ寿命および有効期間を維持するのを助けている、食用油プレバイオティック組成物に処方されている、Ｌ．カゼイＫＥ０１株から構成された栄養補助食品および医薬製剤を提供する。
【００１０】
腸管病原体感染を治療および予防し、ヒトおよび家畜の健康および生命力の維持を補助するのに用いることが出来る新規のプロバイオティック配合物が必要とされている。近年、米国食品薬品管理局（ＦＤＡ）は、抗生物質の過剰な処方および臨床上の乱用に対する運動を強めてきた。過剰な抗生物質使用は、第一選択抗生物質に耐性のあるヒトおよび動物病原体の数に応じて増加し、それにより従来の抗菌療法に反応しない感染症が増加してしまう。その上、動物飼料における予防的な抗生物質使用により家畜の腸の感染が驚くほど増加し、栄養素の吸収不良により群れの大きさや動物の体重が減少してしまう。その結果として、ヒトが摂取するのに適した健康な動物の数は減少し、市場に出すのに十分な程長く生存した動物は顕著に体重が減少し、結果的に肉の品質が低下する。
【００１１】
ヒトおよび家畜における薬剤耐性の腸管病原体の急速な蔓延を防ぐ一つの手段は、抗生物質の使用を著しく減らすことである。しかしながら、飼育場および都市が過剰に込み合っているために、腸の感染を含む伝染病の蔓延は不可避である。その結果として、予防的な抗生物質使用を完全に中断する前に、適切な抗菌の代案が利用可能でなければならない。近年の研究によれば、プロバイオティック微生物の特定の株を含んでいる食料品および栄養補助食品を使用することにより、腸管病原体による病気の予防を補助し、多くの場合、実際に治癒するということが示されている。しかしながら、現在市販されている多くのプロバイオティック処方は、ラクトバシラス種およびビフィドバクテリア種（および他の属）を含む生物に依拠し、これらは、プロバイオティック効能を評価する承認された方法を用いた科学的な調査が行われていない。その結果として、現在利用可能な「プロバイオティック」処方のあまりにも多くが、インビボでの抗腸管病原体の活性が証明されていない。その上、市販の臨床上有効なプロバイオティック配合物の多くは貯蔵に適しておらず、それゆえに、有効量の生存性プロバイオティック細菌が使用者に送達されない。本発明者は、多くの市販の調製物を試験し、微生物の生存率が表示されていた濃度よりかなり低いことを見つけ、多くの場合において、本発明者は、これら市販の調製物が生存性細菌を少しも含まないことを発見している。
【００１２】
本発明者は、ＫＥ０１と名付けられたラクトバシラス−カゼイの新菌株を調製およびパッケージするための方法を開発した。本発明者は、もともとは、このラクトバシラス−カゼイの新菌株を伝統的な発酵したヨーグルト様のアジアの乳製品から得た。その後、本発明者は、単離物を特徴づけ、その株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，ＭＤ，ＵＳＡ）に寄託した。ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ  ３９４５を与えられた。その上、本発明者は、生存性プロバイオティック微生物の臨床的に有効な量が宿主に達するようなＬ．カゼイＫＥ０１の生存率を維持する調製物およびパーケージングシステムを開発した。
【００１３】
本発明は、腸管病原体の細菌付着を阻止する（微生物の妨害）Ｌ．カゼイ株（ＫＥ０１）を提供し、当該腸管病原体としては、例えば、これらに限定されるわけではないが、多様な哺乳動物細胞タイプに対する、腸管病原性および腸管毒素原性大腸菌、ヘリコバクター−ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター−ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、サルモネラ−チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびサルモネラ−エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｔｉｄｉｓ）が挙げられる。その上、本発明のラクトバシラス菌はまた、これら細菌性病原体および他の細菌性病原体を、多くの哺乳動物細胞に競合的に結合させないようにする（競合的な排除）。本発明の新規ラクトバシラス株に関する有益な特性により、全般的なヒトおよび動物の健康を支持する改善されたプロバイオティック栄養補助食品が得られた。その上、本発明は、例えば、これらに限定されるわけではないが、旅行者下痢症、胃腸感染症、溶血尿毒症症候群、および胃潰瘍などの状態に対する、予防薬、治療薬および苦痛緩和薬（本明細書においては、まとめて「プロバイオティック」と称する）を提供するために使用することが可能である。
【００１４】
この新規Ｌ．カゼイＫＥ０１株の追加的な新しい特徴および特質としては、これらに限定されるわけではないが、約２０００ｐｐｍの硫化物を含む増殖培地に晒した場合、４８時間以内に、３００ｐｐｍを超える係数で硫化物濃度を減少させるＬ．カゼイＫＥ０１の能力、そして、バイオコート（登録商標）（コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＶ型、ラミニン、およびフィブロネクチン）、マトリゲル（登録商標）およびＣａｃｏ−２細胞の単層を含む上皮下部のマトリックスへ強い結合を示すこと、が挙げられる。最も重要なことには、本発明のＬ．カゼイの再生した凍結乾燥調製物は、コラーゲンに付着した大腸菌を効果的に引き離すことが示された。
【００１５】
本発明のＬ．カゼイの生存率およびプロバイオティック特質を維持するために使用された本方法には、これらに限定されるわけではないが、新規窒素パージ、即時結合（ＮＰＩＢ）システムを使用する嫌気的カプセル封入プロセスと組み合わせた本発明のプレバイオティック油組成物の使用を含んでいる。
【００１６】
ラクトバシラス種の新菌株の、これらの、および他の有益なプロバイオティック特性は、以下の、非限定的な本発明の詳細な説明によりさらに明らかになるであろう。
【発明の詳細な記載】
【００１７】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、宿主のミクロ生態学において重要な役割を果たす哺乳動物の消化管に固有のマイクロフローラであり、治療および予防特性の印象的なリストをもって信用されてきた。これら治療および予防特性としては、これらに限定されるわけではないが、腸の微生物生態学の維持、生理学的効果、免疫変調効果および抗菌効果が挙げられる。他のＬＡＢ関連性状としては、腸管腔への酵素放出が挙げられ、これはＬＡＢ付着と相乗的に作用し、腸の吸収不良の症状を緩和することができる。その上、ＬＡＢ酵素は腸のｐＨ調節を助け、それにより芳香族アミノ酸分解を増すことができる。［Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．プロバイオティック食品−現在の使用および将来の発展．ＩＦＩ  ＮＲ  ３：２３−２６（１９９３）；Ｍｉｔｓｕｏｋａ  Ｔ，ビフィズス菌の分類学および生態学．Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ３：１１（１９８４）；Ｇｉｂｓｏｎ  Ｇ．Ｒら，プロバイオティックおよび腸感染，ｐ．１０−３９．Ｒ．Ｆｕｌｌｅｒ（編），Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ  ２：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ中．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（１９９７）；Ｎａｉｄｕ  ＡＳら，乳酸菌（ＬＡＢ）のプロバイオティックスペクトル．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒ．３９：３−１２６（１９９９）；Ｎａｉｄｕ  Ａ．Ｓ，Ｃｌｅｍｅｎｓ  Ｒ．Ａ，プロバイオティック，ｐ．４３１−４６２．Ａ．Ｓ．Ｎａｉｄｕ（編），Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ中．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（２０００）］
ＬＡＢはまた、動物の糞廃棄物中の硫化物およびアンモニア含有化合物を顕著に減少させることにより、動物の排泄物による匂いと毒性とを減少させる能力を示した。農業ビジネスが発展し、地域社会が見た限り際限無く未使用の農業地域への進出が続くにつれ、このエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でのＬＡＢの用途はますますより重要になりつつある。例えば、雄鶏の雛鳥や貝の廃棄物と、１５％の炭水化物およびＬＡＢを含む混合物とを混合すれば、ＬＡＢは、不快な匂いを除去し、孵化場の廃棄物に関する硫化水素生成物を減少させることが示されている。その上、ＬＡＢ組成物は、孵化場の廃棄物中の大腸菌およびサルモネラ菌含量を無視できるレベルに減少させる効能が示されている。
【００１８】
加えて、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が媒介する乳酸発酵により、ブロイラー処理廃棄物のような家禽廃物の匂いや粘度が顕著に減少する。その上、ＬＡＢ含有調製物は、分解困難な炭水化物の破壊を促進し、ブタの盲腸の細菌によるアンモニア生成物を減少させることが報告されている。最後に、エキソビボでのＬ．カゼイＦＧ１およびＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の貯蔵生牧草の発酵は、尿素分解生物を抑制することによって顕著にアンモニア量を減少させる。［Ｄｅｓｈｍｕｋｈ，Ａ．Ｃ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｈ．，乳酸発酵による孵化場廃棄物の保存１．実験室規模での発酵，Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ７６：１２１２−１２１９（１９９７）；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．ら，ブロイラー処理廃棄物の乳酸発酵：物理的特性および化学分析，Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  ７１：７６５−７７０（１９９２）；Ｔｉｂｂｅｔｔｓ，Ｇ．Ｗ．ら，ブタを成長させるおよび仕上げる食餌のためラクトバシラス−アシドフィルスとともにサイロに貯蔵した家禽廃物．Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ６４：１８２−１９０（１９８７）；Ｓａｋａｔａ，  Ｔ．ら，プロバイオティック製剤はバッチ培養において用量依存的に有機酸の総産生速度を増加させ、ブタ盲腸細菌によるアンモニアのその速度を減少させる，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  ４４：１４８５−１４９３（１９９９）；Ｃａｉ，Ｙ．ら，貯蔵生牧草の発酵特性、好気的変質に対する、飼い葉穀物から単離された乳酸菌応用の効果．Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ８２：５２０−５２６（１９９９）；Ｍｏｄｌｅｒ，Ｈ．Ｗ．ら，ビフィズス菌およびビフィズス菌発生因子．Ｃａｎ  Ｉｎｓｔ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈ  ２３：２９−４１（１９９０）］。
【００１９】
しかしながら、ＬＡＢがヒトおよび家畜の生命の質を向上させる最も高い可能性は、ＬＡＢのインビボでのプロバイオティック応用にある。ＬＡＢがインビボでの有益なプロバイオティック効果を示すためには、生物体は消化管で長い期間生存しなければならない。それゆえに、腸の収縮による迅速な除去を防ぐような特質を所有するプロバイオティックＬＡＢ株を選択することが重要である。有効なプロバイオティック細菌は、胃の環境での生存が可能であり、腸上皮に付着することによって少なくとも一時的に腸で定着することが可能でなければならない。その結果として、粘膜表面に付着するための高められた能力を示し、それゆえに改善された細菌の維持、および、持続的な消化管での滞留時間を示すＬＡＢは、それらを示さないＬＡＢに対して競争力のある利点を有する。［Ｓａｌｍｉｎｅｎ，Ｓ．ら，腸粘膜障壁を安定化するためのプロバイオティックの臨床使用：成功株および将来の挑戦．Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７０：３４７−３５８（１９９６）；Ｃｏｎｗａｙ  Ｐ．，プロバイオティック微生物のための選択基準．Ａｓｉａ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ  ５：１０−１４（１９９６）；Ｈａｖｅｎａａｒ  Ｒ．ら，プロバイオティック使用のための株の選択，ｐ．２０９−２２４．Ｒ．Ｆｕｌｌｅｒ（編），Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ，ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｂａｓｉｓ中．Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（１９９２）］。
【００２０】
ラクトバシラス種は、多数の異なるメカニズムを介して哺乳動物の消化管にうまく定着することができる。例えば、いくつかの細菌種は、様々な上皮下部の（ｓｕｂ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）マトリックスタンパク質、および腸粘膜上の特定の受容体に結合する。他の種は、細菌および宿主の真核細胞表面上で、炭水化物とタンパク質因子との異なる組み合わせを必要とするメカニズムを介して、哺乳動物の腸の細胞に付着することができる。しかしながら、付着のメカニズムに関係なく、ヒト消化管にうまく定着するのはＬＡＢの能力であり、それはＬＡＢにプロバイオティック特性を与えている。［Ｇｒｅｅｎｅ．Ｊ．Ｄ．．Ｋｌａｅｎｈａｍｍｅｒ，Ｔ．Ｒ．ヒトＣａｃｏ−２細胞へのラクトバシラス種の付着を介する因子，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６０：４４８７−４４９４（１９９４）；Ｓａｒｅｍ，Ｆ．ら，Ｃａｃｏ−２およびＩｎｔ−４０７ヒト腸細胞株への３つのラクトバシラス株の付着の比較，Ｌｅｔｔ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２２：４３９−４４２（１９９６）；Ｎａｉｄｕ，Ａ．Ｓ．ら，スタフィロコッカス−アウレウス上のフィブロネクチン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンレセプターの迅速検出のための粒子凝集アッセイ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２６：１５４９−１５５４（１９８８）；Ｗａｄｓｔｒｏｍ，Ｔ．ら，ブタの小腸から単離されたラクトバシラス種の表面特性，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ６２：５１３−５２０（１９８７）；Ｂｅｒｎｅｔ，Ｍ．Ｆ．ら，ラクトバシラス−アシドフィルスＬＡ  １は培養ヒト腸細胞株へ結合し、そして腸毒性細菌の細胞接着、侵襲を阻害する，Ｇｕｔ  ３５：４８３−４８９（１９９４）；Ｊｉｎ，Ｌ．Ｚ．ら，ニワトリの腸上皮細胞へのサルモネラ菌のインビトロ付着に対する付着ラクトバシラス種の効果，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ８１：２０１−２０６（１９９６）；Ｒｅｉｄ，Ｇ．ら，線維および上皮細胞へのスタフィロコッカス−アウレウスおよびカンジダ−アルビカンスの付着に対するラクトバシラス種の影響，Ｊ  Ｉｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５：２４８−２５３（１９９５）］。
【００２１】
一般的に言えば、競合的な結合プロセスで侵襲性または毒素産生の病原性の腸細菌（腸管病原体）を腸の粘膜から退去させることにより、プロバイオティック細菌は自身の有益な効果を働かせる。腸管病原体、例えば、これらに限定されるわけではないが、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ−エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、エルシナ−シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｎｉａ  ｐｓｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、および、リステリア−モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、病気を引き起こすために動物の腸管にうまく定着することができなければならない。
【００２２】
プロバイオティック組成物は、生存性プロバイオティック細菌のパーセンテージが高い場合に、最適の有益な特質を働かせる。しかしながら、細菌生存性を維持することは、プロバイオティック産業にとっては、重要な挑戦となっている。その結果として、ほとんどのプロバイオティック組成物は比較的短い有効期間を有しており、そして最適状態には及んでいないパーセント生存率で使用されている。多くのプロバイオティック組成物（本発明のものを含んで）は、ラクトバシラス−アシドフィルス、Ｌ．アミロヴォルス（ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、Ｌ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブルガリカス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．カゼイ亜種カゼイ、Ｌ．カゼイ亜種ラムノーサス（ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．クリスパタス（ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．デルブリッキー（ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ヘルヴェティクス（ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．ジョンソニー（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．パラカゼイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．ペントーサス（ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）およびＬ．サケ（ｓａｋｅ）：Ｂ．アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ビフィドゥム（ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ブレヴェ（ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）およびＢ．ロングム（ｌｏｎｇｕｍ）を含むビフィドバクテリウム属：Ｐ．アシディーラクティー（ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）を含む４連球菌属：Ｐ．アシディープロピオニー（ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、Ｐ．フロイデンライシイ（ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、Ｐ．イエンセニー（ｊｅｎｓｅｎｉｉ）およびＰ．テオニ（ｔｈｅｏｎｉｉ）を含むプロピオン酸菌属：およびＳ．クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｓ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）およびＳ．サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含むストレプトコッカス属、を含んだ細菌（本明細書において集合的に乳酸菌またはＬＡＢと称される）の選択された株（またはその組み合わせ）を使用して作製される。
【００２３】
現在、プロバイオティック組成物は、培養され、濃縮されたＬＡＢを使用して産生され、それは乾燥または凍結乾燥され、そして次ぎに、限定されるわけではないが、ラフィノース、大豆オリゴ糖類、フルクトオリゴ糖類、ガラクトオリゴ糖類、ガラクトシル  ラクトースおよびパラチノース、ラクツロース、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、牛乳、粉乳、乳清、乳清タンパク質濃縮物、カゼイン、カゼイン加水分解物、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ、ラクトグロブリン、グリコマクロペプチド、ラクト糖類、およびラクト脂質、を含むタンパク質および糖のごとき安定化成分と混合する。これらのプロバイオティック混合物は小さな顆粒または微粉末へ粉砕し、次ぎに多様な医薬として受容可能な形にシールし、そしてパッケージする。もしくは、冷蔵庫温度で保存しなければならない、液体製剤が提供される。しかしながら、形にかかわらず、乾燥されていようが液体であろうが、小売店および最終使用者へ出荷された後は速やかにＬＡＢ生存率は劇的に低下し始める。
【００２４】
本発明者は、驚くことに、特定の食用油が、こうしたタンパク質および糖のような成分で安定化させている従来の技術よりも良好にＬＡＢ生存率を保護するのみでなく、実際に生存率を増加させてプレバイオティック効果を生じていることを発見した。上に議論したように、プレバイオティックとは、結腸中の一つまたは制限された数の細菌種の増殖および／または活性を選択的に刺激することにより宿主に有益に影響し、そしてそれにより宿主の健康を結果において改良する、非−消化可能な、または部分的に消化可能な食物成分である。本発明の一つの態様は、プレバイオティック食用油のｍＬ当たり約１０５から１０１１コロニー形成単位の生存性ＬＡＢを含んでいる、栄養補助食品である。しかしながら、本発明のプロバイオティック組成物はこの範囲に限定されるわけではないこと、そしてプレバイオティック食用油のｍＬ当たり約１から＞１０１２コロニー形成単位の生存性ラクトバシラスを含むことができることが理解される。
【００２５】
本発明の一つの態様において、ＬＡＢはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−３９４５を有しているラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株である。本発明の一つの態様において、プレバイオティック／プロバイオティック組成物は、少なくとも一つの食用油に懸濁されているラクトバシラス種組成物で満たされた、硬質二片のカプセルを含んでいる。この態様において、硬質二片のカプセルは、以下により完全に説明されるように、充填時に不活性ガスでパージされ、無酸素環境を確実にするためにシールされている。硬質二片のカプセルは、植物性、動物性ゼラチンかまたは合成および天然ポリマーから誘導することが可能である。
【００２６】
本明細書を通して、本発明は、プロバイオティック組成物、ラクトバシラス種含有組成物、栄養補助食品、または、プロバイオティック／プレバイオティック組成物と称することができる。これら全ての上述の用語は、形態または他の成分の存在もしくは非存在に関係なく、生存性および／または非生存性ＬＢＡおよび少なくとも一つのプレバイオティック食用油を含む組成物を意味している。一つの態様において、ＬＡＢはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３９４５を有しているラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株、または本明細書で詳述される方法を用いて決定されるようなその遺伝的均等物である。
【００２７】
本発明の一つの態様において、動物には、プロバイオティック組成物の１グラム当たり約１０５から１０１１個のラクトバシラスを含んでいる単一用量が与えられる。総摂取量は、動物の個々の必要性、ならびに、動物の体重および大きさに依存する。任意の既定の応用のための好ましい投与量は、滴定で簡単に決定することができる。滴定は、一連の標準重量用量（それぞれ１グラム当たり約１０５から１０１１個のラクトバシラスを含む）を調製することによって達成される。一連の用量を投与し、０．５グラムから始めて動物のサイズおよび用量形態により決定される理論的な終了点に達するまで上げ続ける。適切な用量は、所望の結果が得られるラクトバシラス組成物の最小限の量が投与される場合に達成される。また、適切な用量は、本発明のプロバイオティック組成物の「有効量」として当業者にも知られている。
【００２８】
例えば、動物における過敏性腸症候群に関する症状を軽減することが望ましい場合、上述の１つの測定用量を、症状が静まるまで用量をそれぞれ連続的に１日０．５グラムずつ増加させて段階的に上げながら毎日投与する。本発明の一実施形態において、好ましい用量は、体重（動物レシピエントの重量）１キログラム当たり、１日当たり、約１０３から１０８個の生存性ラクトバシラスの範囲である。これは、平均的な健康な成人に関して、１日当たり約１００億個の生存性ＬＡＢと同等である。全ての体重の全ての動物に適したおよその用量を外挿法により計算することは、簡単である。これは、上述の滴定方法により、プロバイオティック組成物を処方する当業者により適切に変えることができる非限定的な例である、と認識される。
【００２９】
本発明のプロバイオティック組成物は、それを必要とする全ての動物に投与することができる、当該動物としては、これらに限定されるわけではないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、および、魚類が挙げられる。典型的な用途としては、本発明のプロバイオティック  組成物を、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ、インコ、オウム、ならびに、他の野生動物および家畜動物に投与することが挙げられる。
【００３０】
特に、本発明のプロバイオティック組成物は、本明細書に記載の方法を用いてそれを必要とする動物に投与する場合、腸管病原体関連病を阻害または治療するために用いることができる。腸管病原体による病気としては、例えば下痢、過敏性腸症候群および腸の出血などの病原体により発症する病気が挙げられる。これら病気に関する腸管病原体の例としては、これらに限定されるわけではないが、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、サルモネラ−エンテリティディス、エルシナ−シュードツベルクローシス、および、リステリア−モノサイトゲネスが挙げられる。競合的な結合プロセスを介して腸管病原体による病気の阻害および治療が本発明のプロバイオティック組成物により達成されることが、本発明者により理論化されるが、限定として提供されることではない。すなわち、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスは、腸の粘膜上の結合部位で腸管病原体と競合する。本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスがこれら結合部位に対して腸管病原体よりも高い親和性および結合活性を有するために、本発明のプロバイオティック性ラクトバシラスは、正常な代謝プロセスにより無害に腸から流出して、腸内環境に腸管病原体を置換する。
【００３１】
本発明の一つの態様において、伝統的な発酵ヨーグルト様のアジアの乳製品から本発明のプロバイオティック生物を単離した。スクリーニング方法は，安全なヒトの消費の少なくとも１０年の歴史を有する伝統的な発酵ヨーグルト様のアジアの乳製品に限定された。プロバイオティック細菌の単離は、３種の選択的な微生物用培地を用いて、微生物学の当業者には既知の方法を用いて行われた。ラクトバシラス選択的培地としては０．０５％システインを添加したＳＬ培地が挙げられ、ビフィドバクテリウム属は抗生物質を含むトリプチケースペプトン酵母抽出培地を用いて選択され、ストレプトコッカス属に関してはトリプチケース酵母抽出システイン培地を用いて単離された。
【００３２】
候補のプロバイオティック  ラクトバシラス種杆菌は、カタラーゼ陰性の、グルコースホモ発酵型の、グラム陽性の非胞子形成杆菌であり、これは、低いｐＨ、胃酸および胆汁耐性を示した。ラクトバシラス単離物が酢酸塩含有培地で成長する能力に加えて、ラクトバシラス単離物がｐＨ９．０で成長できないことは、それらをカルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種から区別するのに役立った。総計で８１個の単離物が、これらの基準に基づき候補のプロバイオティック性ラクトバシラスとして分類され、さらに以下の基準、すなわち：ｉ）低い膵液への耐性；ｉｉ）上皮下部のマトリックス、例えばバイオコート（商標）、マトリゲル（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）への付着能力、および、培養した腸上皮細胞（Ｃａｃｏ−２細胞系）への付着能力；ｉｉｉ）コラーゲンマトリックスに付着する腸管出血性大腸菌血清型Ｏ１５７：Ｈ７を競合的に排除するそれらの能力；および、ｉｖ）アンモニアおよび硫化物含有化合物を減少させるそれらの能力に関して特徴付けられた。
【００３３】
８１個の全ての候補のプロバイオティック性ラクトバシラスを分析した後、全ての上述した特徴を有する２つの株を同定した。これらの株は、ＫＥ９７株およびＫＥ９９株（ＫＥ０１と再命名された）と名付けられた。最後に、成長増殖速度（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ（商標）Ｂａｃｔｏｍｅｔｅｒシステムを用いたインピーダンス検出によって決定された世代時間）、連続培養における株の安定性、凍結乾燥および再生の特徴、および芳香／フレーバー特性を各株で確認した。
【００３４】
単離されたラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株生物は本発明のプロバイオティック組成物の調製に用いるための実質的に純粋な培養物中で維持する。本明細書で用いられるように、「実質的に純粋な培養物」とは、固体または半固体の微生物用培地上で培養された場合、識別可能な一つの生物のみが生じる細菌学上の培養物を意味する。他の細菌種の細胞が極めて低い量で存在してもよいが、しかしながら、これらの細胞は、生存不可能、培養不可能であるか、または、典型的なゲノムに基づかない微生物学的技術を用いた検出の限界値より低いか、のいずれかである、ということが理解される。「ゲノムに基づかない」という用語は、微生物のＤＮＡまたはＲＮＡを検出するのに用いられるＰＣＲ検出または類似方法のような方法が排除されていることを意図する。
質（純度）および量（総細菌数）についてのＫＥ０１株の具体的な測定のためのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＭＲＳ寒天上の標準プレートカウントによりＣＦＵカウントを見積もることに加え、油基剤処方中のＫＥ０１株の生存および再生速度の定性的／定量的測定のために、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用した。ＫＥ０１株に特異的なプライマーを開発し、そして以下に記載するようにＲＴ−ＰＣＲを実施した：
プライマー設計
種特異的ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１（ＡＴＣＣ−ＰＴＡ３９４５）の増幅のためのプライマーのセットを合成した（表１）。すべてのプライマーは標準脱塩プロセス（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を使用して合成した。ＫＥ０１株のためのプライマーセットは、ラクトバシラス種の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅により設計し、配列決定し（Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡ）、そしてＬａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ソフトウェアーを使用して公開遺伝子バンクに対する塩基付加、欠失、置換などを比較した。リアルタイムＰＣＲのためのプライマーセットは次ぎに、ＫＥ０１株特異的であるように開発した。このプライマーセットは１５４ｂｐ断片を作り出した。全てのプライマーセットは、モレキュラーグレードの水（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で１００ｍＭまで再水和し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００３５】
【表１】
2006501281.tif 000002
【００３６】
リアルタイムＰＣＲ
ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱでの定量的リアルタイムＰＣＲを、２５μｌ反応液当たり７μｌの鋳型ＤＮＡで二重に実施した。ｉＱ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ反応液は、１ｘの最終濃度でのｉＱ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、１０ｎＭのフルオレセイン、ｓｕｐｅｒｍｉｘ主混合液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２５単位／ｍｌ  ｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含むＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉから成っていた。
【００３７】
反応液は９６ウェル薄壁ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中、以下のパラメーターを使用して増幅した：９５℃で３分間、続いて９５℃で１０秒間の変性、６６℃で１５秒間のアニーリングを４０サイクル。融解曲線分析は、増幅後直ちに、５５℃から９５℃へ温度を傾斜させることにより実施した。単一ＰＣＲ生成物の存在は、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ分析ソフトウェアーを使用した、特定の生成物を表している単一融解温度ピークの存在（非特異的プライマー−二量体ピークに対して）により、および１２．５％  ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル上に予想されるサイズの単一バンドの検出により、両方で確認した。
【００３８】
検量線を作製し、そして試料の濃度を決定するために使用した。濃度値は０．１６ｎｇ、０．０１６ｎｇ、０．００１６ｎｇおよび０．０００１６ｎｇであり、保存既知細菌（ＫＥ０１株）を使用した。標準濃度は保存大腸菌（ＡＴＣＣ４３８９５）およびＫＥ０１株を使用した。総ラクトバシラス推定のためには、株の混合物、即ち、Ｌ．カゼイ（ＡＴＣＣ３９３）、Ｌ．ペントーサス（ＡＴＣＣ８０４１）、Ｌ．プランタルム（ＡＴＣＣ１４９１７）、Ｌ．パラカゼイ亜種パラカゼイ（ＡＴＣＣ２５３０２）およびＫＥ０１株を使用した。全ての保存細菌のＤＮＡを抽出し、そしてＤＮＡ濃度をＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）定量キットにより決定し、そしてＲＴ−ＰＣＲ分析に適した適切な濃度へ１Ｘ  ＴＥ緩衝液でしかるべく希釈した。図３は、ＫＥ０１株のためのリアルタイムＰＣＲ標準物質の結果を描いている。各々の標準物質濃度（０．１６、０．０１６、０．００１６、０．０００１６および０ｎｇ）は二重に実行した（標準物質当たり二つの線）。
ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析によるＤＮＡフィンガープリンティング
ＲＡＰＤプロトコールにおいて、細菌の同定のための独特なフィンガープリントを作製するためにＰＣＲが用いられる。ＰＣＲによる分析は、迅速かつ信頼できる方法で行うことができる。従って、ＲＡＰＤ分析が、ＫＥ０１株の分子同定およびフィンガープリンティングに用いられた。ＡＴＣＣコレクションからの全ての１２種のラクトバシラス種型の株をフィンガープリンティングし、ＫＥ０１と比較した。ＤＮＡフィンガープリンティングのために、全てのラクトバシラス種株をＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ）で一晩培養した。ＤＮＡフィンガープリントに関して分析されたラクトバシラス種株を表２に列挙する。
【００３９】
【表２】
2006501281.tif 000003
【００４０】
ＤＮＡ抽出方法
ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてラクトバシラスからＤＮＡを抽出した。簡単に言えば、１ｍＬの２４時間成長させたＭＲＳブロスの各ラクトバシラス種の培養物を遠心分離により回収し、細胞を５０ｍＭのＥＤＴＡ中で再懸濁し、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用い、３７℃で６０分間処理した。ラクトバシラス種杆菌細胞を遠心分離でペレット化し、上清を除去した。細菌のペレットを核溶解溶液中で再懸濁し、８０℃で５分間インキュベートした。細胞懸濁液を室温に冷却し、ＲＮＡ分解酵素をその溶液に混合した。その懸濁液を３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、タンパク質沈殿溶液をその混合物に加えた。溶液をボルテックスで混合し、氷上で５分間インキュベートした。その混合物を３分間１５Ｋ×ｇで遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、ＤＮＡをイソプロピルアルコールで沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離し、イソプロピルアルコールを吸引した。ＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離で回収した。エタノールを除去し、ペレットを乾燥させた。ＤＮＡをトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中で再懸濁した。
抽出されたＤＮＡのＰＣＲ増幅
Ｃｏｃｃｏｎｃｅｌｌｉら（１９９５）に従い、１マイクロリッターの抽出されたＤＮＡを使用し、単一の任意のヌクレオチド配列を用いてｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＰＣＲ反応を行った。２×ＰＣＲ溶液−Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を各反応に用いた。各反応は、総量５０μＬ、１．２５単位のＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、１×緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ）を含んでいた。プライマーの最終濃度を４μＭとし、増幅に用いられたプライマーは、５’−ＡｇＣＡｇＣｇＴｇｇ−３’であり（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）、鋳型ＤＮＡを含む反応混合物を、以下の温度プロフィールでサイクル反応させた：９４℃で５分間を１サイクル；９４℃で１分間、２９℃で１分間、１．５分間で７２℃まで上昇させ、７２℃で１．５分間維持を４０サイクル；７２℃で２分間を１サイクル；そして、４℃で維持。［Ｃｏｃｃｏｎｃｅｌｌｉ，ＰＳら，乳酸菌および腸球菌の株の型分類のためのＲＡＰＤプロトコールの開発，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２１：３７６−３７９（１９９５）］。
ゲル電気泳動
各ＲＡＰＤで増幅された反応物の一部（１０μＬ）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に従って、トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中の１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のアガロースゲル電気泳動により分析した。ゲルを冷却しないで１２０Ｖで２時間泳動させた。標準としてＤＮＡ分子量マーカーのＨｙｐｅｒｌａｄｄｅｒ  Ｉ（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｒａｎｄｏｌｐｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた。電気泳動した後、ゲルをエチジウムブロマイド（５μｇ／ｍＬ）で１０分間染色し、５分間洗浄し、可視化し、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）で分析した。［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］。
【００４１】
単一の１０−ｍｅｒプライマーを用いたＲＡＰＤアッセイにより、様々なラクトバシラス種参照株およびＫＥ０１株のＤＮＡサンプルを含む１％アガロースゲル上で、変化する強度の、多数の増幅産物のはっきりとした固定パターンが得られた。ゲル上での、異なる種の断片と参照ラクトバシラス種との比較を示した。図１および表３で示された説明文付きの固定パターンは、ＫＥ０１株を一意的に同定し、ゲノムフィンガープリンティングライブラリーを提供するのに役立つ。ゲノムフィンガープリンティングに基づいて、図２で示されたようにデンドグラム（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）を推測した。系統発生分析のワード（Ｗａｒｄ）のクラスター方法を適用した。この方法は、各工程で形成され得る２種のクラスターのいずれかの平方和を最小化し、小さいサイズのダスター（ｄｕｓｔｅｒ）を作製した。系統発生分析に基づき、ＫＥ０１株は、ラクトバチルス−ヘルヴェティクスＡＴＣＣ１５００９と１３％相同性を示し、ラクトバシラス−カゼイ属の亜種ラムノーサスＡＴＣＣ７４６９と５５％相同性を示した。
【００４２】
【表３】
2006501281.tif 000004
【００４３】
ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の純粋な培養物をアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に寄託し、ＰＴＡ３９４５のＡＴＣＣ番号が付与された。
【００４４】
本発明者は、乳酸桿菌を食用油に懸濁させることにより、プロバイオティック／プレバイオティック組成物が、従来可能であったよりもより卓越した生存度を有する結果に帰することを示した。しかしながら、以下の実施例から明らかになるであろうごとく、単に、特定の油が食用に適し、そして実際にそれ自身が健康寄与特性を有することができるといって、必ずしも全ての食用油が満足すべきプレバイオティックであるわけではない。下記表４に見ることができるように、対照に対するパーセント回収は、４週間の保存の間に、約５９％から３７０％を超えて変動した。これらの観察に基づき、本発明者は、魚油、オリーブ油、米糠油および大豆油はプレバイオティック効果を示し、試験された他の油はプレバイオティックではなく、または実際抗菌的であったことを結論した。
【００４５】
上に議論したごとく、本発明者は、適切なプレバイオティック油を選択することが、生存度を保存および強化するための手段、そしてこの故に本発明のラクトバシラス製剤のプロバイオティック活性を提供することを発見した（注、非−生存性ラクトバシラス桿菌もまたプロバイオティック効果を所有することができる、しかしながら、非−生存性製剤は本発明のプレバイオティック処方から重要な利益を得ることができない）。しかしながら、最適プレバイオティック油が最適化された送達システムと組み合わされた場合、総プロバイオティック活性はより長い期間にわたって、増加および／または保存することが可能である。
【００４６】
プロバイオティックラクトバシラス桿菌は最適の生存度のために、嫌気的または微好気性条件を必要とする。油浸漬は低水活性および限定された酸素拡散を提供するけれども、微小環境からの酸素の排除はプロバイオティック保存を促進するであろう。従って、図５に描かれたような窒素−パージ−即時−結合（ＮＰＩＢ）を使用する、新規嫌気的カプセル封入システムを、本発明の油乳化プロバイオティック処方を保護するために開発した。このプロセスは、プロバイオティック細菌にとって理想的である、最適微小環境（嫌気的／微好気的）条件を提供する。本明細書において、用語「嫌気的」とは、低酸素圧環境を意味し、厳密な嫌気的環境および微好気的環境を含んでいる。本発明のＮＰＩＢシステムは、酸素置換と同時に硬質、二片カプセル中に油乳化ラクトバシラス桿菌を密封することを提供する。
【００４７】
さらに、本発明のＮＰＩＢシステムはまた、限定するわけではないが、粉体、油基剤液体、油基剤懸濁液、油基剤ペースト、蝋、低水含量乳剤を含む他の組成物、および限定するわけではないが、ラクトフェリンを含む多様な生物活性化合物とともに使用することができる。さらに、カプセル材料の選択は高度に融通性がある。例えば、本発明の一つの態様において、天然の二片硬質ゼラチン／植物カプセルが使用され、別の態様においては、軟質ゼラチン／植物カプセルが使用され、追加のカプセル組成物には多彩な合成および天然ポリマーが含まれる。本発明のＮＰＩＢシステムは、手動、半または完全自動化、ならびに連続的または間欠作動装置を含む、任意の型のカプセル充填装置に組み込むことが可能である。
【００４８】
図５は、本発明の嫌気的カプセル封入システムを行うためのプロセスが描かれている。キャップおよび本体（図５において、各々の５０４および５０６）の分離後、本発明の油基剤生物活性組成物をカプセル本体５０６へ加える。次ぎに、限定するわけではないが、窒素またはアルゴンのごとき嫌気性ガスをカプセルキャップ５０４内へ注入し、そして密閉溶液を、キャップの内部、下部区画（継ぎ目５０２）へ適用する。このことで、キャップ５０４および本体５０６が閉鎖工程の間に接合された時に、キャップおよび本体の即時結合を生じる。一つの態様において、密封溶液は、約５０％から９９％エタノール、９０％が好ましい（植物性カプセルに対して）、または１０％から７０％のイソプロピルアルコール（ＩＰＡ），６０％が好ましい（ゼラチンカプセルに対して），および植物基材カプセルに最適化されている１５％−３０％ＩＰＡを含んでいる水性アルコール溶液である。しかしながら、処方および充填技術の当業者は、他の有機溶剤が適しており、そして異なった溶剤の組み合わせが使用できることを認識している。例えば、限定として意図されていないが、植物由来セルロースを含んでいる植物性カプセルは、異なった程度でエタノール、イソプロピルアルコールまたは水に可溶である。密閉剤中の、これら三つの溶剤の特定の比は、（ｉ）密閉剤適用の速度、（ｉｉ）適用された密閉剤の容量、（ｉｉｉ）密閉剤適用の方法、（ｉｖ）密閉剤噴霧の程度、（ｖ）噴霧の方法、および（ｖｉ）滞留時間のごときいくつかの因子に依存している。これらの因子はまた厳密に、カプセル材料の水和性、溶解性および軟化特性にも依存している。従って、以下の条件を密閉プロセスの間に制御しなければならない：（ａ）軟化は、閉鎖工程の間に、キャップの構造的剛性を超えてはならない。ある限界を超えると、キャップが変形し、本体を保持できない；（ｂ）キャップの水和性および溶解特性は保持され、そして本体へ有効に移送されなければならない。このことは、閉鎖工程の間の、キャップの内部表面と本体の外部表面との適切な融合を可能にするであろう；（ｃ）エタノールおよびイソプロピルアルコールは急速に蒸発し、一方、水は数時間の期間にわたり徐々に蒸発するので、キャップおよび頭部は優れた閉鎖適合性を有していなければならない；（ｄ）「即時結合」プロセスの間、水和および溶解特性は高度に決定的である。
【００４９】
本発明の一つの態様において、窒素パージおよび密閉工程は、カプセルが図５の垂直位置にある間に行われる。このことは、垂直位置でカプセルを充填および閉鎖し、そして次ぎに直ちに充填されたカプセルを水平位置に射出する従来の技術での方法と異なっている。この変更された配向（垂直から水平へ）は、カプセルの液体内容物をカプセルの半分５０４および５０６間のカプセル継ぎ目５０２内へ移動させる。カプセル継ぎ目に一度液体が混入したら、密封工程はかなり効率が悪くなり、カプセルからの生成物の漏出、およびカプセル内容物への空気の混入を生じる。
【００５０】
本発明のＮＰＩＢシステムは、カプセル位置の変化が開始される前に、充填およびパージング後直ちにカプセルを密封することにより、この問題を解決した。その結果として、カプセル継ぎ目は汚染されずに残り、そして密閉完全性は危険にさらされない。
【００５１】
本発明の一つの態様において、食用油、プレバイオティック特性を有している食用油に乳酸菌（ＬＡＢ）を乳化させることを含んでいる、プロバイオティック組成物を作成するための方法が提供される。次ぎに、硬質カプセル本体５０６に乳化したプロバイオティックを充填するが、その間カプセルは垂直配向をとっている。充填されたカプセル本体５０６は垂直位置に残されている。次ぎに、キャップ５０４を、限定するわけではないが、窒素またはアルゴンのごとき希ガスでパージし、そして密封溶液をキャップ継ぎ目５０２へ適用する。キャップ継ぎ目５０２へ密封剤を適用した後、キャップ５０４およびカプセル本体５０６を一緒にし、そして即時に結合させる。いくつかの態様において、絶乾（ｂｏｎｅ−ｄｒｙ）二酸化炭素ガスを同様に使用することができる。最後に、充填し、パージされたカプセルを水性有機溶剤溶液で密封する。処方および充填の当業者には、パージングプロセスを充填プロセスと同時に行うことが可能であることが認識されている。
【００５２】
以下の実施例は、その範囲に限定されていないことを意味している。特定の範囲の程度まで、組成物、成分および条件が挙げられているが、これらは好ましい態様および／または最良の様式を教示する目的のための単なる例示と考えるべきである。
【実施例】
【００５３】
実施例１
プレバイオティック油の調製および試験
ラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株の純粋な培養物を、タンパク質、ビタミン、ミネラルおよび炭水化物源を含む発酵ブロス培地中で再生させた。発酵器に取り付けられた発酵槽で種培養を調製した。発酵プロセス中、微生物の純度を、所定の時間ポイントで（対数期と最終サイクルとを通して）モニターした。微生物の集団を殺菌した分離器で回収し、担体および凍結保護物質と混合した後、細胞濃縮物のスラリーを凍結乾燥した。凍結乾燥したラクトバシラス細胞濃縮物を、殺菌した製粉器具を用いて微粉末に粉砕した。使用前に、ＫＥ０１粉末の品質の純度および生存率を確かめた。生存率は、約１０１０ＣＦＵラクトバシラス桿菌／粉末ｇｍであった。
【００５４】
プロバイオティックラクトバシラス桿菌粉末は次ぎに、最終的に０．１％の乳濁液まで、表４に列挙した、異なった油と混合した（１０９ＣＦＵラクトバシラス桿菌を含んでいる約０．１ｇ粉末を１ｍＬの油に混合した）。本発明の一つの態様において、乳濁液は１０ｍＬの殺菌ガラスチューブ中で調製し、そしてボルテックスブレンダーでホモゲナイズした。混和した混合物は次ぎに、試験する前に気密キャップで密封した。各々の型の油乳濁液のために、多数のチューブを準備し、チューブは室温で保存した（２８℃）。１０９ＣＦＵラクトバシラス桿菌粉末を含んでいるが、どんな油も含んでいないチューブは増殖対照として働いた。
【００５５】
週間隔で４週間、以下のように、Ｌ．カゼイを含んでいる各々の油の１ｍＬ試料を試験した：９ｍＬのｄｅＭａｎｎ  Ｒｏｇｏｓａ  Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）ブロスを各々の試験液へ加え、そして内容物をボルテックスブレンダーでホモゲナイズした。ホモゲナイズした混合物の一連の１０倍希釈液をＭＲＳブロスチューブで調製した。全てのチューブを３７℃で１８時間インキュベートした。ラクトバシラス桿菌増殖は、最も低い希釈液で、６００ｎｍの光学密度の変化として測定した。同様の希釈液で６００ｎｍの光学密度として測定された、対照チューブの増殖を１００％と考えた。試験結果は、対照と比較したパーセント生存率として表現されている（表４）。
【００５６】
ラクトバシラス桿菌は、乳化後１週以内に油環境へ順応した。しかしながら、続いての週において、ラクトバシラス桿菌の生存率はある種の油、即ち、ハシバミの実、サクラソウ、カボチャおよびテリラにおいて徐々に減少し、低プロバイオティック回収を示唆している。対照的に、魚油（オメガ）、オリーブ油（エクストラバージン）、米糠油および大豆油は全て優秀なラクトバシラス桿菌の回収を提供した。さらに、下記表４に表現されている結果に基づくと、亜麻仁油およびビタミンＥ油もまた同様なプレバイオティック活性を示すことができることが推論された。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
実施例２
窒素パージ即時結合カプセル中のプロバイオティック試料の調製および試験
ＮＰＩＢシステムにより調製された各々のゼラチン／植物性カプセルは、１０９ＣＦＵのラクトバシラス桿菌および０．５ｍｌの魚（オメガ）、オリーブ、米糠または大豆油を含んでいる約５５０ｍｇの乳濁液を含んでいた。各々の油乳化ラクトバシラス桿菌の１０のカプセルを、気密性キャップを有するいくつかのガラス保存瓶に保ち、室温（２８℃）および冷蔵温度（４℃）で保存した。各々の油乳濁液型のボトルを両方の保存条件から、周期的に、毎月、取り出し、そしてラクトバシラス桿菌の生存率について（コロニー形成単位、ＣＦＵ）、カプセルの内容物を試験した。ＮＰＩＢシステムにより作製された、１０９ＣＦＵのラクトバシラス桿菌を含んでいるが、どんな油も含んでいないチューブは増殖対照として働いた。
【００５９】
各々のゼラチン／植物性カプセルを、１０ｍＬ  ＭＲＳブロスを含んでいる試験チューブ中、約３０分間、室温で溶解させた。カプセル内容物の放出後、チューブはボルテックスブレンダーを使用して十分にホモゲナイズした。ホモゲナイズした混合物の一連の１０倍希釈液をＭＲＳブロスチューブで調製した。全てのチューブを３７℃で１８時間インキュベートした。同様の希釈液で６００ｎｍの光学密度として測定された、対照チューブの増殖を１００％と考えた。リアルタイムＰＣＲもまた、カプセル封入された油混合物および総ラクトバシラス桿菌集団から再生したＫＥ０１株の純度を決定するために使用した。試験結果は、対照と比較した％生存率として表現されている（表５）。
【００６０】
４つ全ての型の油乳化プロバイオティックラクトバシラス桿菌は、室温で１２ヶ月の保存期間に渡って４００％から７６０％の範囲の著しい回復比を示した。対照ラクトバシラス桿菌の１００％再生比と比較したこれらのデータは、これらの油乳濁剤型の強力なプレバイオティック効果を示唆している。
【００６１】
【表５】
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【００６２】
さらに、カプセル封入された油混合物から再生されたＫＥ０１細胞を、それらの保存培養物と比較した純度およびプロバイオティック活性を試験した。油混合物から再生されたラクトバシラス桿菌は、高度の純度を示し、リアルタイムＰＣＲ分析によると、ＫＥ０１株と１００％の同一性で一致した。これらの再生されたラクトバシラス桿菌は、それらのＫＥ０１保存培養物と同様に、プロバイオティックプロフィール、即ち、インビトロでのアンモニア／硫化物減少、腸管Ｃａｃｏ−２細胞への付着、およびＣａｃｏ−２単層からの腸管病原体の競合的排除を示した。これらのデータは、ＮＰＩＢシステムでの、特定の油混合物中のＫＥ０１のカプセル封入は、長期間にわたり、このラクトバシラス桿菌のプロバイオティック活性に影響しない、または活性を変化させないことを示唆している。
【００６３】
室温での油乳化プロバイオティック処方の保存は、使いやすくそして商業的に好ましい。こうした保存条件は、プロバイオティック生成物を冷蔵しなくてよく、そしてプロバイオティックの生存率を落とすことがない。さらに、細胞再生のプレバイオティック促進は、油乳化プロバイオティックカプセル封入の強力な機能的活性を示唆した。
【００６４】
本発明の範囲内で考えられる追加の変形には、カプセル封入内容物への粘性促進剤の添加、およびカプセル外コーティングが含まれる。例えば、グリセロール（例えば、グリセリン）；グリコール（例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール）；植物由来の蝋（例えば、ブラジルロウヤシ、米、カンジリラ（ｃａｎｄｉｌｉｌｌａ））；非植物性の蝋（蜜蝋）、乳化剤（例えば、レシチン）；およびシリカ（例えば、二酸化シリコン）は、ＮＰＩＢ技術に適合性である。これらの粘性促進剤は、カプセル内容物の一様な分散を提供し、そしてまた、カプセル封入におけるプロバイオティック生物体の微好気性／嫌気性条件を改良できる。
【００６５】
カプセル外コーティングは、味覚マスキング、遅延された放出、蒸気／ガス遮断層、香味、着色、芳香、腸保護および漏れ安全性を含む多様な応用として働く。こうしたコーティングには、限定されるわけではないが、少し名前を挙げれば、セルロース（例えば、メチル−およびエチル−セルロース）；メタクリレート；およびシェラック（例えば、医薬上薬）が含まれる。
結果
最後に、本明細書で開示された本発明の態様は本発明の原理を例示していることを理解すべきである。用いることができる改変は、本発明の範囲内に含まれる。従って、一例として、これらに限定されるわけではないが、本発明の教示に従って、本発明のその他の形状を用いることができる。従って、本発明は、厳密に示されたもの、説明されたものに限定されない。
【００６６】
本発明を説明する文章中（特に以下の請求項の文章中）で用いられた用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ（該）」ならびに類似の指示語は、明細書中に特に他の規定がない限り、または、文章により明確に否定されない限り、単数および複数の両方を含むと解釈される。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に含まれるそれぞれ別々の値を個別に意味する簡略的な方法として提供されることを単に意図する。明細書中に特に他の規定がない限り、それぞれの個々の値は、本明細書で個々に列挙されたかのように、本明細書に含まれる。本明細書に記載の全ての方法は、明細書中に特に他の規定がない限り、あるいは、文章により明確に否定されない限り、適切な順番のいずれかで行うことができる。本明細書で示されるありとあらゆる実施例または典型的な言葉（例えば「ｓｕｃｈ  ａｓ」）の使用は、単に、本発明をより良く説明することを意図しており、本発明の範囲あるいは特許請求された範囲に限定を与えない。本明細書における言葉は、本発明の実施に必須な、特許請求されていない要素のいずれかを示すものと解釈されるべきでない。
【００６７】
本明細書で開示された本発明の代替の要素または態様の分類は、限定とは解釈されない。各群の要素は、個々に、または、本明細書で見出される群または他の要素の他の要素との組み合わせのいずれかにおいて、言及され、特許請求され得る。便宜上および／または特許性の理由で、群の１またはそれより多くの要素が含まれてもよいし、または、群から削除されてもよいと予想される。このような包含または削除のいずれかがなされる場合、明細書は、ここに改変された群を含むものとみなされ、従って、添付の請求項で用いられた全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たしている。
【００６８】
本発明を実施するために本発明者には既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい態様が本明細書に記載されている。もちろん、その好ましい態様の改良型は、上述の説明を読めば当業者に明白である。本発明者は、当業者がこのような改良型を適切なものとして用いることを考慮しており、本発明者等は、本発明が特に本明細書に記載されたものとは異なって実施されることを意図する。従って、本発明は、準拠法により認可された本明細書に添付された請求項に記載の主題の全ての改変および均等物を含む。その上、全ての可能なそれらの改変型における上述した要素の組み合わせのいずれかは、明細書中に特に他の規定がない限り、あるいは、文章により明確に否定されない限り、本発明に含まれる。
【００６９】
その上、本明細書を通して、特許および印刷された出版物に対して多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献および印刷された出版物の各々は、個々に本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析に基づいて、１２種の異なるラクトバシラス種タイプの株と比較した１％アガロースゲル上のラクトバシラス−カゼイＫＥ０１株のゲノムフィンガープリントを示している。
【図２】図２は、ゲノムフィンガープリンティングから推測された系統発生学的系統樹と、ラクトバシラス種ＫＥ０１株とラクトバシラス種タイプの株の他の種との関連を示している。
【図３】図３は、ＫＥ０１特異的プライマーを使用する、本発明のラクトバシラス含有量を定量するために使用された標準化リアルタイムＰＣＲを示している。
【図４】図４は、本発明のＫＥ０１プライマーを使用する、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示している。
【図５】図５は、本発明の技術に従ったＮＰＩＢを使用する、嫌気的カプセル封入システムを作製するためのプロセスを示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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