(57)【要約】本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する方法及び組成物であって、ラミニン５分泌腫瘍を有する対象に、ラミニン５γ２鎖の１以上のエピトープに結合する抗体の腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量を投与することを含む方法及び組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者において腫瘍成長を抑制する医薬の製造のための、ラミニン５γ２鎖の１以上のエピトープに結合する抗体の使用。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍が癌である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬が、１以上のさらなる抗腫瘍薬剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記さらなる抗腫瘍薬剤が、化学療法薬剤である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ラミニン５γ２鎖のドメインＩＩＩの１又は１以上のエピトープに結合するが、配列番号９及び１０のアミノ酸配列内のエピトープに結合しない単離された抗体。
【請求項７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項５に記載の単離された抗体。
【請求項８】
請求項５に記載の単離された抗体及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項６に記載のモノクローナル抗体を発現する単離されたハイブリドーマ細胞。
【請求項１０】
腫瘍を有する患者において腫瘍成長抑制、腫瘍転移抑制、浸潤細胞の検出のうちの１以上を行う医薬の製造のための、請求項６〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１１】
ラミニン５γ２鎖のドメインIII内の１以上のエピトープに結合する抗体及びさらなる抗腫瘍薬剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記さらなる抗腫瘍薬剤が化学療法薬剤である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
組織において浸潤細胞の存在を検出するための方法であって、
組織サンプルを請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体と接触させて、免疫複合体を形成し、そして
該免疫複合体の形成を検出することを含み、ここで該免疫複合体の形成が、上記組織における浸潤細胞の存在と相関する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する抗体、組成物、及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ラミニンは、細胞接着、増殖、遊走、及び分化を含む多様な生物学的機能を有する基底膜糖タンパク質である。これまで、少なくとも１２個のラミニン・アイソフォーム形成する１１の遺伝的に異なる鎖が特定されてきた。この成長タンパク質ファミリーの全メンバーは、細胞内自己組織化メカニズムを通して形成されるα、β、及びγ鎖のヘテロ三量体連鎖結合を有する。
【０００３】
ラミニン５は、上皮基底膜の特異的構成要素であり、α３β２γ２の連鎖結合を有する(Kallunki, et al., J. Cell Biol.119 : 679-93,1992)。γ２鎖は、約１３０ｋｄの分子量を有し、約２００ｋｄの「古典的」ラミニン１のβ１及びγ１軽鎖より小さい。ラミニン５鎖の発現は、扁平細胞癌及び胃癌などの上皮癌において上方制御されることが多いが、間葉系由来の癌では上方制御されない(Larjava, et al., J. Clin. Invest. 92:1425-35,1993) (Pyke, et al., Am., J. Pathol.145 : 782-91, 1994) (Pyke, etal., Cancer Res. 55:4132-9, 1995) (Tani, et al., Am. J. Pathol. 145: 782-91) (Orian-Rousseau, et al., J. Cell. Sci. 111: 19932004, 1998) (Sordat, et al., J. Pathol. 185: 44-52, 1998)。しかしながら、上皮性前立腺癌及び乳房癌において下方制御されることが報告された(Hao, J., Yang, 25 Am.J. Pathol. 149: 1341-9, 1996)(Martin, et al., Mol. Med. 4: 602-613, 1998)。大腸腺癌において、γ２鎖の遺伝子発現及びタンパク質発現の両方が、簇出(budding)表現型を有する癌細胞の特徴であるようだ (Larjava, et al., J. Clin. Invest. 92: 1425-35, 1 993) (Pyke, et al., Am. J. Pathol. 145: 782-91, 1994) (Pyke, et al., Cancer Res. 55: 4132-9, 1995)。結腸直腸癌における腫瘍細胞の簇出は、細胞内ラミニン-５の存在に関連した。(Sordat, et al., J. Pathol. 185: 44-52, 1998)。
【０００４】
in situハイブリダイゼーション及び免疫組織化学的染色により測定するとき、ラミニン-５のγ２鎖は、いくつかのヒトの癌の浸潤の最前線に位置する悪性細胞において強く発現されることが示された(Pyke, C., Romer, J., Kallunki, P., Lund, L.R., Ralfkiaer, E., Dano, K.&Tryggvason, K.(1994) Am. J. Pathol. 145: 782-791 ; Pyke, C., Salo, S., Ralfkiaer, E., Romer, J., Dano, K. & Tryggvason, K. (1995) Cancer Res. 55: 43 32-4139)。しかしながら、ラミニン５のγ２鎖に対する抗体が、腫瘍細胞増殖を抑制するために使用されうるということを示す研究はない。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約
本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する抗体、組成物、及び方法を提供する。一の態様では、本発明は、ヒトのラミニン５γ２鎖の第IIIドメインの１以上のエピトープに結合する抗体を提供する(配列番号２及び４)。
別の態様では、本発明は、腫瘍成長及び転移の抑制方法であって、ラミニン５を分泌する腫瘍を有する患者に、ラミニン５γ２鎖の１以上のエピトープに結合する抗体の腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量を投与することを含む。１の実施態様では、抗体は、ラミニン５γ２鎖のドメインＩＩＩの１以上のエピトープに結合する。
さらなる態様では、本発明は、ラミニン５γ２鎖に結合する抗体及び１以上のさらなる抗腫瘍薬剤を含む医薬組成物を提供する。本態様の様々な実施態様において、抗体は、ラミニン５γ２鎖のドメインIIIにおける１以上のエピトープに選択的であり、及び/又はさらなる抗腫瘍薬剤は化学療法薬である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
一の態様では、本発明は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制する方法であって、ラミニン５-分泌腫瘍を有する対象に、腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために有効な量のラミニン５γ２鎖の１以上のエピトープに結合する抗体を投与することを含む方法を提供する。好ましい実施態様において、対象は哺乳動物であり；さらに好ましい実施態様において対象はヒトである。
【０００７】
本明細書中に使用されるとき、「腫瘍成長の抑制」という用語は、治療されない場合に生じる腫瘍成長量を低減することを意味し、腫瘍サイズの減少及び/又は腫瘍成長割合を低減することを含む。
【０００８】
本明細書中に使用されるとき、「腫瘍転移の抑制」という用語は、治療されない場合に生じる腫瘍転移量を低減することを意味し、転移の数及び/又はサイズを低減することを含む。
【０００９】
本明細書中に使用されるとき、「ラミニン５分泌腫瘍」という用語は、検出できる量のラミニン５を発現する腫瘍を意味する。そうした腫瘍は、非限定的に癌を含む。そうした癌は、非限定的に扁平細胞癌(非限定的に皮膚、子宮頚部、及び外陰部の扁平上皮細胞癌)、胃癌、大腸腺癌、結腸直腸癌、及び子宮頚癌を含む。
【００１０】
本明細書中に使用されるとき、「ラミニン５γ２鎖」という用語は、好ましくは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含むタンパク質配列を有するヒト・ラミニン５γ２鎖、及びその誘導体を指す。
【００１１】
本明細書中に使用されるとき、「エピトープ」という用語は、抗体が結合するタンパク質中の特定部位を指し、この特定部位は、直鎖及び非直鎖のエピトープの両方を含む。
【００１２】
好ましい実施態様において、抗体は、ラミニン５γ２鎖のドメインIIIの１以上のエピトープに結合する。本明細書中に使用されるとき、「ラミニン５γ２鎖のドメインIII」という用語は、配列番号２の３９１〜５６７残基の１７７個のアミノ酸領域を指し(Kallunki et al., J. Cell. Biol. 119: 679-693(1992))、この領域は、本明細書中で配列番号８として提示される。さらに好ましい実施態様では、この抗体は、配列番号６のアミノ酸配列中に含まれるドメインIII中の１以上のエピトープに結合し、そして配列番号９及び１０のアミノ酸配列中に存在するドメインIII中のエピトープには結合しない。
【００１３】
抗体はポリクローナル抗体でありうるし又はモノクローナル抗体でありうる。しかし、好ましくはモノクローナル抗体である。ヒトに使用する際には、ヒト化モノクローナル抗体が特に好ましい。
【００１４】
さらなる実施態様では、本発明の方法はさらに、対象を化学療法及び/又は放射線治療で治療することを含み、それにより抗体の使用は、腫瘍成長及び/又は転移を抑制するために必要な化学療法薬剤及び/又は放射線の投与量の低減を許容する。化学療法薬剤又は放射線投与量を低減することは、標準の化学療法及び/又は放射線治療に比較して副作用を低減することにより、患者の利得となる。
【００１５】
この実施態様では、抗体は、化学療法及び/又は放射線治療での所定の回の治療前に、治療と同時に、又は治療後すぐに投与されうる。好ましい実施態様において、抗体は、化学療法及び/又は放射線治療の所定の回の前又は同時に投与される。最も好ましい態様では、抗体は、化学療法及び/又は放射線治療の各回の前に、又は同時に投与される。抗体投与の正確なタイミングは、幾つかの因子に基いて主治医により決定されるだろうが、抗体は、一般的に化学療法及び/又は放射線治療の所定の回の２４時間前から化学療法及び/又は放射線治療の所定の回の時までの間で一般的に投与される。
【００１６】
本発明の方法は、１以上の細胞毒性薬剤(つまり、化学療法薬)、例えば非限定的に、シクロホスファミド、タキソール、５-フルオロウラシル、アドリアマイシン、シスプラチン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、マイトマイシンＣ、プレドニゾン、ビンデシン、カーバプラチナ(carbaplatinum)、及びビンクリスチンを使用する化学療法と合わせた使用に適している。細胞障害性薬剤は、増殖細胞を破壊することができる抗ウイルス化合物でありうる。化学療法において使用される細胞障害性薬剤の一般的な議論については、Sathe, M. et al., Cancer Chemotherapeutic Agents: Handbook of Clinical Data(1978)を参照のこと。該文献は、本明細書中に援用される。
【００１７】
本発明の方法はまた、化学療法及び/又は放射線治療を繰り返すことを必要とする患者又は高濃度の化学療法及び/又は放射線治療を必要とする患者に特に適している。
【００１８】
本発明を行う際に、使用される抗体の量又は投与量範囲は、腫瘍成長及び/又は転移を効果的に抑制する範囲である。実際の投与量範囲は、様々な因子、例えば年齢、体重、性別、個人の病状、病気の重篤度、及び投与の経路などに基く。使用されうる抗体の抑制量は、０.０１μｇ/体重ｋｇ〜１５ｍｇ/体重ｋｇ、好ましくは０.０５μg/体重ｋｇ〜１０ｍg/体重ｋｇ、より好ましくは１μg／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１０μg/体重ｋｇ〜５ｍｇ/体重ｋｇの範囲である。
【００１９】
抗体は、いずれかの適切な経路により投与されうるが、好ましくは慣用の医薬として許容される担体、補助剤、及び溶媒を含む投与単位製剤で非経口的に投与される。「非経口」という用語は、本明細書中で使用されるとき、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、輸液技術、又は腹腔内を含む。好ましい実施態様では、抗体は静脈内又は皮下経路で投与される。
【００２０】
抗体は、固体形態(例えば顆粒、粉末、又は坐薬)又は液体形態(例えば、溶液、懸濁液、又は乳濁液)に作られうる。抗体は、様々な溶液中に適用されうる。本発明に従った使用に適した溶液は、滅菌され、十分な量の抗体を溶解し、そして適用形態に害を及ぼさない。
【００２１】
抗体は、滅菌などの慣用の医薬操作を受け、及び/又は１以上の保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳濁剤、緩衝剤などの慣用の補助剤を含みうる。
【００２２】
投与のために、抗体は通常、投与の指示された経路に適した１以上の補助剤と混合される。化合物は、ラクト-ス、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロース・エステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸ナトリウム、及びリン酸及び硫酸カルシウム、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び/又はポリビニルアルコールと混合され、そして慣用される投与のために、錠剤化又はカプセル化される。或いは、抗体は、生理食塩水、水、ポリエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、カルボキシメチル・セルロースコロイド溶液、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカント・ゴム、及び/又は多様な緩衝液中に溶解されうる。別の補助剤及び投与形態は、医薬技術分野において周知である。担体又は希釈剤は、時間遅延物質、例えば単独の又はワックスを伴うモノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン、或いは当該技術分野に周知である別の物質を含みうる。
【００２３】
別の態様では、本発明は、ラミニン５γ２鎖のドメインIIIの１以上のエピトープに結合する単離された抗体、単離されたモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞、及びそうしたモノクローナル抗体を含む医薬組成物を提供する。さらなる好ましい実施態様では、単離された抗体は、配列番号６のアミノ酸配列中の１以上のエピトープに結合し、かつ配列番号９と１０のアミノ酸配列中のエピトープには結合しない。単離された抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうるが、好ましくはモノクローナル抗体である。さらなる実施態様では、単離された抗体はヒト化される。さらなる実施態様では、単離された抗体は、１以上の上記適切な医薬担体と混合されて医薬組成物として調製される。
【００２４】
単離された抗体は、本発明の全ての方法において、並びに組織サンプル中に浸潤細胞が存在するかを検出する診断使用において有用である。好ましい実施態様では、本発明の単離された抗体の診断使用は、腫瘍組織を１以上の単離された抗体と接触して免疫複合体を形成し、そして免疫複合体の形成を検出することを含む。ここで該免疫複合体の形成は、組織における浸潤細胞の存在と相関する。上記接触は、標識された単離抗体及び標準のイメージング技術を使用してin vivoにおいて行われうるし、又は組織サンプル上でin vitroで行われうる。
【００２５】
好ましい実施態様において、組織は腫瘍組織である。さらに好ましい実施態様では、腫瘍組織はラミニン５を分泌する腫瘍組織である。より好ましくは、腫瘍組織は、癌であり、非限定的に扁平細胞癌(例えば、非限定的に皮膚、子宮頚部、及び外陰部の扁平上皮癌)、胃癌、大腸腺癌、結腸直腸癌、及び子宮頚癌を含む。
【００２６】
本発明のこの態様のさらに好ましい実施態様では、単離されたモノクローナル抗体は、ＩｇＧアイソタイプの抗体である。さらに好ましい実施態様では、単離されたモノクローナル抗体は、本明細書中に４Ｇ１、５Ｄ５、及び６Ｃ１２と名付けられる抗体、並びにハイブリドーマが発現するモノクローナル抗体からなる群から選ばれる。ここで該ハイブリドーマは、American Type Tissue Collectionに、ATCC受入番号----、----、----で寄託された。これらの特定のハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の作製のより詳細な記載は、以下に与えられる。
【００２７】
１以上の単離された抗体を含む医薬組成物のさらなる構成要素は、上部に記載される。
【００２８】
抗体は、周知の方法、例えば、Harlow and lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1998)に記載される方法により作られる。一の例では、免疫化前の血清を初回免疫する前に集めた。ラミニン５γ２鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のペプチド部位は、適切な補助剤を伴い、免疫応答を誘発すために十分な量及び期間で動物に注射される。一定のインターバルで、好ましくは週毎に動物から採血して抗体タイターを測定した。動物は、初回免疫化に続いて、追加免疫注射を受けることもあるし、受けないこともある。各追加免疫の約７日後、又は初回免疫化の約１週後に、動物から採血し、血清を集め、そして一定量に分割して-２０℃で貯蔵した。ラミニン５γ２鎖に対するポリクローナル抗体は、動物から集められた血清をカラムに通すことにより直接精製されうる。ここで、このカラムには、同じ発現系から精製されるラミニン５γ２鎖ポリペプチド以外の非抗原関連タンパク質が結合する。
【００２９】
モノクローナル抗体は、動物から脾細胞を取得することにより産生されうる(Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)を参照のこと)。一の例では、関心のモノクローナル抗体(ｍＡｂ)は、近交系のマウスを、ラミニン５γ２鎖ポリペプチド又はその一部で免疫化することにより調製される。このマウスを、免疫応答を誘発するために十分な量及び間隔で、ＩＰ又はＳＣ経路により免疫化する。このマウスは、初回免疫を０日に受け、そして約３〜３０週休養された。免疫化マウスに静脈内(ＩＶ)経路により１回以上の追加免疫を与えた。当該技術分野に周知である標準方法に従い免疫化マウスから脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウスからのリンパ球を取得した。安定なハイブリドーマを形成することを許容する条件下で、脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと混合することにより、ハイブリドーマ細胞を産生した。抗体産生細胞と融合パートナー細胞を、約３０％〜５０％の濃度のポリエチレン・グリコール中で融合した。当該技術分野に周知である方法により、融合ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えたダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)中での成長度により選択した。細胞の成長が見られるウェルから上清を集め、そして固層イムノラジオアッセイなどの免疫アッセイにより抗体の産生を選別した。MacPHersonの軟寒天技術(Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse and Paterson, Eds., Academic Press, 1973)などの技術により抗体陽性のウェルにおけるハイブリドーマ細胞をクローン化した。
【００３０】
そうした抗体応答を作り出すために、ラミニン５γ２鎖ポリペプチド又はその一部は、典型的に、医薬として許容される非経口投与用担体とともに剤形される。そうした、許容される補助剤は、非限定的に、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿、コリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)を含むオイル乳濁液中の水、ｔＲＮＡを含む。ポリペプチドの濃度及び溶媒及び他の要素の選択を含むそうした組成物の製剤は、当業者の知識の範囲内である。
【００３１】
本明細書中で使用される抗体という用語は、ラミニン５γ２鎖のポリペプチドと選択的に作用する抗体断片を含むように意図される。抗体は、慣用の技術を使い断片化されることもあり、そして断片は、全抗体について上で記載されるのと同じ様式で有用性を選別された。例えば、Ｆ(ａｂ')2断片は、抗体をペプシンで処理することにより作り出される。得られたＦ(ａｂ’)2断片は、ジスルフィド架橋を還元するように処理されて、Ｆａｂ’断片を作り出す。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ラミニン５γ２鎖に結合する抗体及び一以上のさらなる抗腫瘍剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の態様の好ましい実施態様において、抗体は、上で記載されるように、ラミニン５γ２鎖のドメインIII中の１以上のエピトープに結合する。さらに好ましい実施態様では、単離された抗体は、配列番号６のアミノ酸配列中の１以上のエピトープに結合し、そして配列番号９及び１０のアミノ酸配列中のエピトープには結合しない。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうるが、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明の態様のさらに好ましい実施態様では、さらなる抗腫瘍薬剤は、化学療法薬剤、例えば上記における１以上の薬剤である。医薬組成物の構成要素は、一緒に前以って混合されていることもあり、又は医薬組成物を必要とする患者への投与前に混合されることもある。
【００３３】
以下の実施例は、例示の方法により表され、そして開示の範囲を制限することを意味しない。
【実施例１】
【００３４】
以下の実施例は、ラミニン-５のγ２鎖を含むラミニン-５の、細胞接着及び細胞遊走についての効果を示す。
【００３５】
材料と方法
細胞と細胞培養
マウス扁平上皮癌株化細胞、ＫＬＮ２０５(カタログ番号：ＡＴＣＣ・ＣＲＬ-１４５４)を、American Type Culture Collection(ロックビル、MD)から取得した。この細胞を非必須アミノ酸を含むイーグル最小必須培地(MEM)及び１０％ウシ胎児血清(FCS)を加えたアールのＢＢＳ中で単層培養として維持した。ＨａＣａｔヒト・ケラチノサイト細胞系列は、Ｄｒ. Ｆｕｚｅｎｉｇ(Heidelberg、ドイツ)から頂いた。ＨａＣａｔ細胞を、１０％ＦＣＳを加えたダルベッコＭＥＭ中で培養した。しかしながら、ラミニン-５を産生するためにこれらの細胞を培養するとき、培地を無血清培地で置換した。
【００３６】
タンパク質の調製
マウスＥＨＳラミニン(ラミニン１)を、ＧＩＢＣＯ・ＢＲＬから取得した。Vuento, M. & Vaheri, A.(1979) Biochem.J.183:331-337.34 及びGillies, R. J., Didier, N.& Denton, M.(1986) Anal. Biochem. 159: 109-113に記載されるように、ゼラチン-セファロース４Ｂカラム(Sigma)を使用して、フィブロネクチンをＦＣＳから精製した。ヒト・ラミニン５を、無血清中で３日間培養したＨａＣａｔ細胞の培地から、イムノアフィニティー精製をした。簡潔に記載すると、先ず培地を５ｍｌゼラチン-セファロース・カラム(Sigma、Ｓｔ.ルイス,ＭＯ)に通して、タンパク質調製からフィブロネクチンを完全に取り除いたことを確実にした。その後に、ラミニン-５分子を結合するために、培地を１０ｍｌ抗ラミニンγ２-セファロース・アフィニティーカラムに通した。両方のカラムをリン酸緩衝生理食塩水中で平行化した。タンパク質Ａ-精製された抗γ２ＩｇＧ(８ｍｇ/ｍｌ)を１０ｍｌのＣＮＢｒ-活性化セファロース(Pharmacia、Uppsala、Sweden)にカップリングすることにより、抗-ラミニンγ２-セファロースアフィニティカラムを調製した。γ２鎖のドメインIIIを含むＧＳＴ-融合タンパク質に対して調製されたウサギ・ポリクローナル抗血清から、抗-γ２ ＩｇＧを精製した(Pyke, C., Salo, S., Ralfkiaer. E.., Romer, J., Dano, K. & Tryggvason, K. (1995) Cancer Res. 55: 4132-4139)。５０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ１１.２５、０.１％トライトンＸ-１００を使用して、ラミニン−５をイムノアフィニティー・カラムから溶出し、１Ｍ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ７.０で直接中和した。アフィニティー・カラムの製造に使用したのと同じポリクローナル抗体を使用して、収集した分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより分析した。ラミニン-５を含む分画を、貯蔵し、そして５０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ、０.１Ｍ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.４に対して透析した。ラミニン-５の幾つかのバッチを、５Ｍ尿素で変性し、再構成して、接着及び遊走性質についてその処理の効果を試験した。
【００３７】
組換えバキュロウイルスの生成と組換えラミニン２鎖の発現
バキュロウイルス・システムを使用して、ラミニン-５のγ２鎖を組換えタンパク質として発現し、そして、その機能性質に基いて試験用に精製した。５’ＵＴＲの６ｂｐ及び３’ＵＴＲの８２２ｂｐを含む全長ヒト・ラミニンγ２鎖ｃＤＮＡを、四つの重複するｃＤＮＡクローン、Ｌ５２、ＨＴ２-７、Ｌ１５、及びＬ６１(Kallunki, P., Sainio, K., Eddy, R., Byers, M., Kallunki, T., Sariola, H., Beck, K., Hirvonen, H., Shows, T.B. & Tryggvason, K.(1992) J. Cell Biol. 119:679-693)から構築した。得られた４４０２ｂｐのｃＤＮＡを制限酵素マッピング及び一部をシーケンスすることにより分析し、そしてｐＶＬ１３９３組換えトランスファー・プラスミドへとクローン化し、その後にMax Summers(Texas A & M University)から頂いたＡｃＮＰＶ-γ２バキュロウイルス・ベクター中に導入した。ポリへドリン・プロモーターの転写制御下にヒト・ラミニンγ２鎖ｃＤＮＡを含むバキュロウイルスベクターを作り、そして以下の標準方法に従って精製した。ただし、このバキュロウイルスベクターは、Pen, et al.,(Pen, J., Welling, G.W. & Welling- Wester, S. (1989), Nucl. Acid. Res. 17: 451)の方法に従って、野生型ウイルス(ＡｃＮＰＶ)ＤＮＡと組換えトランスファー・ベクターｐＶＬ１３９３-γ２とをＳＦ９細胞に同時形質導入することにより得られたウイルスを含む培地から濃縮された。組換えタンパク質の発現のために、標準方法を使用して、細胞あたり５〜１０ｐｆuの感染効率(MOI)で組換えウイルスでハイファイブ(Ｈ５)細胞に感染させた。
【００３８】
組換えγ２鎖は、最初に細胞を１０体積分の５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.４、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、２.５ｍＭ・ＥＤＴＡ、１％トライトンＸ-１００、１ｍＭ・ＰＭＳＦ、及び１ｍＭ・ＮＥＭで懸濁し、続いてダウンス型(Dounce)のホモジェナイザーでホモジェナイズすることにより精製した。タンパク質を６０分間氷上で抽出し、そして可溶化したタンパク質を４℃で１０分間１５００×ｇで遠心することにより取り除いた。ペレットを再び１〜３Ｍ尿素を含む緩衝液で抽出した。組換えγ２鎖を５Ｍ尿素を含む緩衝液で抽出し、そして５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７,４、１００ｍＭ・ＮａＣｌに対して透析することにより再生した。
【００３９】
抗体の調製
ラミニンγ２鎖のドメインIIIに対するポリクローナル抗血清を調製し、そして以前に記載されるように特性を明らかにした。簡潔に記載すると、γ２-ＧＳＴ融合タンパク質を抗原として使用して、ウサギをｓ.c.で４回免疫化した。抗原は、γ２のドメインＩＩＩ(配列番号８)由来の１７７個のアミノ酸残基(ｒｅｓ.番号３９１-５６７)を含んだ(Kallunki, P., Sainio, K., Eddy, R., Bayers, M., Kallunki, T., Sariola, H., Beck, K., Hirvonen, H., Shows, T.B. & Tryggvason, K.(1992) J. Cell Biol. 119: 679-693)。Ｅ.ｃｏｌｉ発現ＧＳＴタンパク質をＣＮＢｒ-活性化セファロースにカップリングすることにより作られたＧＳＴ-セファロースでネガティブ免疫吸着を行うことにより、ＧＳＴ-エピトープに対する抗体を抗血清から取り除いた。ＧＳＴ特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、抗ＧＳＴ・ＩｇＧを取り除いたことを確認した。ラミニンγ２鎖に対する抗体の特異性を、ウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡにより試験した。
【００４０】
γ２-ＧＳＴ融合タンパク質を抗原として使用して、ラミニンγ２鎖のＣ末端に対するポリクローナル抗体を、上で記載したドメインＩＩＩに対する抗体と実質的に同様に産生した。抗原は、γ２鎖のドメインＩ/ＩＩ由来の１６１個のアミノ酸(ｒｅｓ.番号１０１７-１１７８)を含み、そしてＧＳＴ-エピトープに対する抗体を、ＧＳＴ-セファロースを用いてネガティブ免疫吸着を行うことにより、抗血清から取り除いた。抗体の特異性をウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡにより試験した。
【００４１】
ラミニン-１に対するポリクローナル抗血清は、Dr. Foidart(リージュ大学、Belgium)から頂いた。免疫化に使用するウサギから免疫化する前に、通常のウサギ血清を取得した。ラミニン-１及びラミニンγ２-鎖抗血清からのＩｇＧ、並びに通常のウサギ血清からのＩｇＧを、タンパク質Ａセファロース(Pharmacia, Uppsala, Sweden)を使用して精製した。
【００４２】
細胞接着アッセイ
マイクロタイター・プレート(９６ウェル：Nunc, Copehagen, Denmark)を一晩４℃でインキュベーションすることにより、１ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ又は５０Ｍ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.４中のラミニン-１(１０μｇ/ｍｌ)、ラミニン-５(１０μｇ/ｍｌ)、又は組換えラミニンγ２鎖(１０μg/ｍｌ)でコートした。コントロール・ウェルを等量のＢＳＡでコートするか、又はコートしなかった。幾つかの実験では、タンパク質を最初に５Ｍ尿素、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.５に対して一晩透析することにより変性し、続いて５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.５に対して透析することにより再生した。プレート上の残存している潜在的な活性部位を、室温で２時間、ＰＢＳ中の１０ｍｇ/ｍｌ・ＢＳＡ１５０μＬでブロッキングした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして５ｍｇ/ｍｌＢＳＡを含む１００ｍｌのイーグルのＭＥＭを加えた。接着アッセイのために、ＫＬＮ２０５細胞を、トリプシン-ＥＤＴＡ(０.２５％-０.０３％)で、サブコンフルエントの細胞培養ディッシュから引き離し、そしてイーグルＭＥＭ/ＢＳＡ(５ｍｇ/ｍｌ)中に２×１０5細胞/ｍｌで再懸濁し、そして３７℃で２０分間正常な状態に戻した。全体で２００００個の細胞を各ウェルに加えて、そしてさら９０分間３７℃で接着させた。６００ｎｍで生成する色を計測し、続いて３％パラホルムアルデヒドで固定し、そして０.１％クリスタルバイオレットで染色することにより、細胞接着の程度を測定した。抗γ２-抗体を用いる抑制アッセイのために、基質でコートされたウェルを、細胞とインキュベーションする前に、ＰＢＳ中の抗-γ２鎖ＩｇＧ(２０μｇ/ｍｌ)で６０分間インキュベーションした。
【００４３】
遊走アッセイ
Hujanen 及び Terranova(Hujanen, E. & Terranova, V.P.(1985) Cancer Res. 45: 3517-3521)により記載されるように、改変されたＢｏｙｄｅｎチャンバー・アッセイを使用することにより、ＫＬＮ２０５細胞の遊走に関する内在性ラミニン-５の効果を測定した。そして、Pelletier, et al., (Pelletier, A.J., Kunicki, T. 及びQuaranta, V.(1996), J. Biol. Chem. 271-364)により記載される改変されたトランスウェル・アッセイを使用して外来性ラミニン-５の効果を測定した。
【００４４】
Boydenチャンバーアッセイは、以下の様に行われた。ポリカーボネート・フィルター(孔サイズ、１０μＭ、直径１２ｍｍ、Costar, Cambridge, MA)を２.５μｇのＥＨＳＩＶ型コラーゲンでコートし、そして５０μｌのチャンバーの上部と下部を分離するために使用した。０.１％ＢＳＡを含むイーグルＭＥＭ中の１×１０5細胞を上部に配置し、そして下部を化学遊走物質(５０μｇ/ｍｌのラミニン-１又はフィブロネクチン)を伴うか又は伴わない培地で満たした。ラミニンγ２鎖抗体の細胞遊走についての効果を試験するために、抗-γ２(ＩＩＩ)ＩｇＧ又は抗γ２(Ｃ末端)ＩｇＧを２０μｇ/ｍｌの濃度で細胞と共に上部へと加えた。通常のウサギＩｇＧをネガティブ・コントロールとして使用した。３７℃加湿状態で８時間インキュベーションした後に、フィルターを取り除き、固定しそして染色した(Diff-Quick, Baxter Diagnostics, Tubingen, Germany)。遊走しない細胞を、綿で拭き取ることによりフィルターの上部表面から取り除いた。各フィルターの下部表面上の細胞を、ランダムに１０回選んだ高倍率視野(×４００)で細胞数をカウントすることにより、細胞の遊走を定量した。全てのアッセイを三回行った。
【００４５】
「トランスウェル」プレート・アッセイ(１２μｍの孔サイズ、直径１２ｍｍを有するトランスウェル・プレート；Costar,Cambridge,MA)を使用して、外来性ラミニン-５の細胞遊走についての効果を測定した。膜の下部を２.５μｇのＥＨＳ・ＩＶ型コラーゲンで３時間室温でコートした。両側を、１％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングした。上部に、１ウェルあたり１０％ＦＣＳを含むイーグルＭＥＭ中の１×１０5細胞を加え、そして下部を２.５μｇ/ｍｌラミニン-５を化学遊走物質として満たした。γ２鎖のＣ末端及びドメインＩＩＩに対する抗体又は非免疫化ＩｇＧを２０μｇ/ｍｌの濃度で、細胞とともに加えた。３７℃で１６時間インキュベーションした後に、細胞を固定し、そして染色した。膜の上面上の細胞を、綿で拭き取ることにより取り除いて、そして膜の下部に遊走した細胞を計測した(１２の領域±Ｓ.Ｄ.)。
【００４６】
免疫組織化学的染色
５μｍの厚いパラフィン切片をラミニン-１又はラミニン-５γ２鎖に対するポリクローナル抗体で染色した。簡潔に記載すると、パラフィン切片を最初に０.１Ｍ・ＨＣｌ中の０.４％ペプシンで３７℃で２０分間インキュベーションし、５％新生児ウサギ血清、０.１％ＢＳＡで非特異的結合をブロッキングし、そして次にＴＢＳ中に５〜１０μｇ/ｍｌに希釈したポリクローナルＩｇＧで３７℃一時間インキュベーションした。続いて、ビオチン化ブタ抗ウサギ抗体を適用し、続いて１：４００希釈の西洋わさび-ペルオキシダーゼ-アビジン-ビオチン-複合体(ＤＡＫＯ、Copenhagen, Denmark)とインキュベーションした。ジアミノベンツアミジン(diaminobentsamidine)(DAB)中で発色させて、続いてヘマトキシリンでスライドを対比染色した。
【００４７】
結果
タンパク質及び上皮由来細胞の特性
ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析するとき、ＨａＣａｔ細胞の培養液から単離した免疫精製された三量体のラミニンー５は、２個の主要バンドを含んだ。このバンドは、以前に報告されたように、各々１６５ｋＤａのγ２鎖、及び一つのバンドとして移動する１５５ｋＤａ及び１４０ｋＤａのγ２及びβ３鎖に対応する。さらに、処理されたγ２鎖に対応する約１０５ｋＤａの弱いバンドが見られた。
【００４８】
バキュロウイルスシステムを使用して、全長ヒト組換えラミニンγ２鎖をスポドプテラ フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)昆虫細胞ハイ・ファイブ中に産生させた。γ２鎖は、細胞内で通常のヘテロ三量体に組み立てられないため培地中に分泌されないので、材料と方法で記載したように、細胞画分から単離した。タンパク質を５Ｍ尿素を使用する変性条件下で抽出し、５０ｍM・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.４に対してよく透析することにより再生して、そして精製した。精製された組換えγ２鎖は、全長であり(約１５５ｋＤａ)、そしてＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により測定すると、純度が高かった。
【００４９】
ＨａＣａｔヒト・ケラチノサイト及びマウスＫＬＮ２０５扁平上皮癌細胞は、γ２鎖に特異的なポリクローナル抗体及び/又はｃＤＮＡプローブを使用することにより、免疫染色及びノーザン・ブロッティング分析に基いて、ラミニン-５を発現すると示された。さらにＫＬＮ２０５細胞は、マウスin vivoにおいて、γ２鎖陽性の原発腫瘍及び転移を発生させた(データー未掲載)。筋肉内又は皮下接種の後に、大きな原発腫瘍が４週間のうちに発生し、そして４〜６週間後に多数の肺転移を伴った。尻尾の静脈に注射されたＫＬＮ２０５細胞は、４週間のうちに複数の肺腫瘍(実験的転移)を作り出した。結果としてこの両方の細胞型は、本研究において行われた細胞付着及び遊走実験に適していると考えらる。
【００５０】
ラミニン５分子は細胞接着を促進したが、組換えラミニンγ２鎖は促進しなかった
本研究において調製されたラミニン５及び組換えγ２鎖、並びに市販のラミニン１を、共にラミニン５を発現する二つの上皮由来細胞系列ＨａＣａｔ及びＫＬＮ２０５についての付着アッセイにおける基層として使用した。両方の細胞系列は、約２.５時間でプラスチックよりはラミニン１によく付着した。細胞のラミニン５への付着は、ラミニン１への付着よりわずかに多いが、差異は統計的に有意ではなかった。上の組換えγ２鎖についての記載と同じ様に５Ｍ尿素中で変性され、次に５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.４に対して透析することにより再生したラミニン５標本に対しても細胞は同等に良く付着した。これにより、この処理が三量体分子の結合性質に影響しないということが示された。ラミニン５に対する付着は、γ２鎖の短腕又は長腕に対して作られた２つの異なるポリクローナル抗体或いは免疫化前のＩｇＧの存在下において有意に減少しなかった。γ２鎖の短腕に対する抗体の異なる量(５０μｇ/ｍｌまで)も試験したが、細胞付着についての影響が見られなかった。組換えγ２鎖のみの上に細胞を蒔いたとき、付着は、プラスチックに対する付着より有意に多くなることはなく、この付着は、γ２鎖に対するポリクローナル抗体により影響されない。以前の結果により三量対のラミニン５が上皮細胞の付着を促進するということが示されるが、今回の結果によりこの付着がγ２鎖により調節されないということが強く示唆されるということをこのデーターは確かにした。
【００５１】
ラミニンγ２ドメインIIIに対する抗体は、細胞遊走を抑制するが、ドメインI／IIに対する抗体は抑制しない
細胞遊走におけるラミニン５のγ２鎖の潜在的な役割を、in vitroで、材料と方法で記載されるように、Boyden及びトランスウェルチャンバーアッセイを使用して、ＫＬＮ２０５細胞について試験した。
【００５２】
ラミニン１及びフィブロネクチンを下部チャンバーに化学遊走剤として使用して、Boydenチャンバーアッセイにおいて遊走を最初に試験した(図２A参照のこと)。走化性Bydenチャンバーの二つのコンパートメントは、IV型コラーゲンでコートされた孔フィルターにより分離される(孔サイズ８μｍ)。０．１％ＢＳＡを含むＭＥＭ中の細胞(１×１０5)は、上部コンパートメントに配置され、そして０．１％ＢＳＡを含むＭＥＭ中のラミニン１(＋／−)又はフィブロネクチン(−／＋)を化学遊走剤として、下部コンパートメントに加えた。γ２鎖ドメインＩＩＩ、Ｉ／ＩＩに対するＩｇＧ、又は免疫前ＩｇＧを上部コンパートメントに、濃度２０μｇ／ｍｌの濃度で細胞と共に加えた。３７℃で８時間インキュベーション後、フィルターを取り、そしてフィルターの下部表面に遊走する細胞定量化した。データーは、高倍率視野あたりの遊走した細胞を、免疫化前のＩｇＧにおいて存在する遊走細胞の割合を１００％にして、割合(±ＳＤ(バー))で示した。ランダムに１０回選んだ高倍率視野において細胞を計測して、実験を三回行った。γ２鎖の短腕に対するポリクローナルＩｇＧを、細胞を含む上部コンパートメントに加え、フィルターを通した細胞の遊走は、免疫化する前の血清において観測される遊走に対し約３５〜４５％へと減少した。対照的に、Ｃ末端ドメインＩ／ＩＩに対するポリクローナル・ＩｇＧは、細胞の遊走に影響を与えなかった。
【００５３】
未変性のラミニン５を化学遊走剤として下部コンパートメントに使用するトランスウェルアッセイにおいて、二つの抗体の効果を同様に使用した(図２Ｂ)。膜の下部をＥＨＳＩＶ型コラーゲンでコートし、そして下部コンパートメントを２．５μｇ／ｍｌのラミニン５を化学遊走剤として満たした。免疫化前のＩｇＧ、γ２鎖ドメインＩＩＩ又はＩ／ＩＩに対するＩｇＧを、細胞を含む上層へ加えた。１６時間のインキュベーションの後、細胞を固定し、そして膜の下層にある細胞を計測した(１２領域±ＳＤ)。
【００５４】
結果は、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイの結果と実質的に同じであった。こうしてγ２鎖のドメインＩＩＩに対して作られたＩｇＧを加えることにより、免疫前ＩｇＧと比較して遊走を約５０％抑制する。一方、ドメインＩ/ＩＩに対するポリクローナルＩｇＧは、細胞遊走に影響しなかった。
【００５５】
これらのｉｎ ｖｉｔｒｏの結果により、ラミニン５が上皮由来細胞の移動運動に役割を果たし、そしてこの機能が、γ２鎖のドメインIIIに対する抗体により抑制されうるということが示された。
【００５６】
こうして、ラミニンλ２鎖の短腕に対する抗体は、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイにおいて測定すると、ＫＬＮ２０５扁平上皮癌細胞の遊走を約５５〜６５％抑制した。興味深いことに、ここで使用される抗体は、突然変異により欠失させると致死性表皮水疱症を引き起こすドメインIII(配列番号８)の１７７個のアミノ酸残基に対するものである。したがって、ラミニンλ２鎖の短腕は、このラミニン・アイソフォームが他の細胞外マトリックスタンパク質へと相互作用するために重要であり、そしてこの相互作用は、細胞遊走過程にも関与する。
【００５７】
実施例２
以下の例は、本発明に従ったモノクローナル抗体を調製すること並びにラミニン５を分泌する腫瘍における腫瘍細胞の成長抑制に使用することを詳細に記載する。
【００５８】
１００μｇのＧＳＴ-ラミニン-γ２-III融合タンパク質を抗原としてBalb/ｃマウスに免疫化することにより、ラミニン５のγ２鎖に対するモノクローナル抗体を産生した。ＧＳＴ-ラミニン-γ２-III融合タンパク質は、ヒト・ラミニン-γ２-鎖アミノ酸残基３９１〜５６７位(配列番号８)を含む。免疫化に続いて、免疫化マウス由来の脾臓細胞を細胞系列Ｐ３Ｘ６３Ａｇ.８.６５３(ＡＴＣＣ・＃ＣＲＬ-１５８０)から得たマウス・ミエローマ細胞と融合した。次に凍結パラフィン切片(ヒト子宮頚部癌、通常の子宮頚部、及び通常の皮膚)を免疫組織染色して、抗-ラミニン-γ２抗体を産生するハイブリドーマ・クローンを選別した。染色結果をネガティブコントロール、マウス通常血清及びＩｇＧの結果、並びに特性がよく明らかになっている抗-ラミニン-５、γ２鎖ポリクローナル抗体(Pyke, et al.,1995において記載される)で得られた陽性の結果と比較した。また、このハイブリドーマ・クローンをＥＬＩＳＡで選別した。最良のハイブリドーマ・クローンを拾い、そして(単一細胞クローニング)で二回クローニングして、得られたハイブリドーマ細胞系列が、単クローン性であることを確かにした。
【００５９】
３種の特定のハイブリドーマ・クローンと、それらから産生される対応したモノクローナル抗体の産出の詳細を以下に記載する。４Ｇ１、５Ｄ５、及び６Ｃ１２モノクローナル抗体に対して性質決定試験を行った。ウエスタンブロッティング分析及びＥＬＩＳＡを行なって、ラミニン５のγ２鎖に対する抗体の特異性を確かめた。ウエスタンブロッティング分析は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル中で組換えラミニン５γ２鎖を泳動し、ゲルをナイロン膜に転写し、そして膜を抗体でインキュベーションすることを含む。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ用に、０.１Ｍ炭酸/炭酸水素緩衝液(ｐＨ９)中の２.５ｕｇ/ｍｌの濃度のＧＳＴ-γ２-III融合タンパク質(抗原)１００μｌ(０.２５μｌ/ウェル)で、プレートを一晩４℃でコートした(Salo et al., Matrix Biology 18: 197-210(1999))。ＥＬＩＳＡプレートを次に３回ＰＢＳＴ溶液(２００μＬ)(１０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.５、及び０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０)で洗浄した。ＢＳＡ-ＰＢＳ(ＰＢＳ緩衝液(１０ｍＭ・Ｋ3ＰＯ4、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、ｐＨ７.５)中の１％ウシ血清)を１ウェルあたり２００μｌ、９０分間加えることにより非特異的吸着を抑制した。このプレートに対し、ネガティブコントロール(通常のマウス血清)の希釈液及びＢＳＡ-ＰＢＳ中の希釈されたサンプル(Ｍａｂ・４Ｇ１、５Ｄ５、又は６Ｃ１２)を加え、そして次にＥＬＩＳＡプレートを１時間室温でインキュベーションした。インキュベーションの後に、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで三回洗浄した。次に、ＨＲＰ-結合抗-マウスＩｇＧ二次抗体(ペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合ウサギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)、Jackson Laboratories、＃３１５-０３５-０４５)を加え、そしてプレートを室温で３０分間インキュベーションした。ＥＬＩＳＡプレートを次に再びＰＢＳＴ溶液(２００ｍｌ)で３回洗浄した。ＡＢＴＳ-過酸化物基質(０.１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５中に希釈されたＡＢＴＳは、アッセイに使用する直前に、クエン酸ナトリウム緩衝液+２μｌ３０％過酸化水素の溶液で１ｍｌから１０ｍｌに希釈された)を次にウェルに加え、そしてプレートを暗室中で３０分間インキュベーションした。マイクロプレート・リーダーを用いて４０５ｎｍで、３０分及び６０分で吸光度を測定した。
【００６１】
これらの分析により、ラミニン５γ２鎖のドメインIIIに対するモノクローナル抗体の特異性が明らかにされた。Ｍａｂ・４Ｇ１、５Ｄ５、又は６Ｃ１２により認識されるエピトープのエピトープマッピングにより、これらの抗体が、配列番号６(配列番号６は、ドメインIIIのアミノ末端及びカルボキシ末端の部分を欠如するγ２鎖のドメインIIIの一部である)のアミノ酸配列内のエピトープに結合し、そして配列番号９及び１０(それぞれ、ドメインIIIの９アミノ末端、及び４１のカルボキシ末端である)のアミノ酸配列内のエピトープには結合しないということが示された。
【００６２】
ラミニン５のγ２鎖に対するモノクローナル抗体を、ラミニン５分泌腫瘍における腫瘍細胞成長の抑制効率について試験した。
【００６３】
試験１：免疫抑制マウスにおける腫瘍成長
以下の試験により、ヒト・ラミニン５、γ２-III-ドメインに対するＩｇＧ免疫グロブリン(Ｍａｂ・５Ｄ５)が免疫不全マウスにおける転移の数及びサイズに影響を与える能力が示された。
【００６４】
腫瘍を移植させるために、１０6個のヒト扁平上皮癌細胞を免疫抑制マウスの尻尾静脈に注射した。使用された細胞系列は、ヒトの扁平上皮癌細胞、細胞系列Ａ４３１とＨＳＣ-３であった。この細胞は、ＤＭＥＭ-グルタマックス(glutamax)、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、５％ＦＣＳを含む培地中の懸濁液で提供された。接種するために、この細胞をＣａ及びＭｇを含まない滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。対照細胞の計測を、細胞懸濁液について行ない、そして細胞濃度及び注射量を記録した。細胞の起源はＨＳＣ-３：日本厚生労働省研究資源バンク、ＪＣＲＢ０６２３ Ａ４３１：ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ-１５５５であった。当該技術分野に周知であるように、ヒト起源の細胞を成長させることができる免疫抑制マウスを選択した。腫瘍転移させるために、群３と群６の腫瘍細胞は、試験物質(試験物質は５０μｇ/ｍｌである)と共にマウスへと注射された。腫瘍細胞を１週間成長させて、その後４週間のあいだ週２回、試験物質を静脈内注射した。
【００６５】
【表１】
2006511493.tif 000002
【００６６】
処置期間の後に、動物を屠殺し、そして組織サンプルを集めた。異なる組織における腫瘍の数及び大きさを計測しそして比較した。
【００６７】
試験物質と投与溶液
試験物質は、ヒト・ラミニン５、γ２-III-ドメイン(Ｍａｂ５Ｄ５)に対するＩｇＧ免疫グロブリンである。この試験物質は、上で記載されるようにｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてモノクローナル・ハイブリドーマ法で産生された。試験物質(Ｍａｂ  ５Ｄ５)を１ｍｇ/ｍｌの濃度で滅菌リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に懸濁した。溶媒を０.２μｍフィルターを使用して滅菌した。運搬された試験物質を、滅菌ＰＢＳで５０：５０に希釈して、５００μｇ/ｍｌの投与濃度を与えた。
【００６８】
試験物質を０.１ｍｌ/動物の体積で、免疫抑制マウスの外側尻尾静脈中に投与した。投与を週あたり２回、月曜日と木曜日に行った。試験物質の初回投与量を実験的転移誘導の一週間後に投与した。
【００６９】
四週間の処置(試験物質の８回投与)の後、動物をＣＯ2麻酔中に、心臓穿刺で全採血することにより屠殺した。血液を集め、血清を分離して、そして-２０℃で凍結した。肉眼による検死を行ない、そして肉癌による腫瘍の塊に特に注意して、肉眼でわかる兆候を記録した。可能ならば腫瘍の塊を数えそして計測した。以下の器官/組織を集めそして重量を測った：肺、リンパ節(頚部及び腸管部)、肝臓、及び脾臓。器官/組織をＰＢＳで洗浄し、そして４％リン酸緩衝ホルマリン中で固定した。
【００７０】
臨床的兆候
動物番号６は、５日目から試験が終わるまで尻尾の肥厚を有した。腫瘍細胞の接種後に、動物番号１１の尻尾は黒/茶色になり、最終的には壊死した。７日目以降では、尻尾の半分が失われた。他に処置に関連する臨床的兆候は記録されなかった。腫瘍細胞接種の次の日の朝において、１匹の動物(動物番号８、群２)が死んでいた。肉眼による検死では、肉眼でわかる変化はなかった。残りの動物は全て、試験の間良好な状態で生存した。
【００７１】
検死
注射された腫瘍細胞は、肺においてのみ腫瘍成長を誘導した。肉眼でわかる転移を有する別の組織は、脾臓、肝臓、小腸、及び包皮腺を含んだ。ＳＣＩＤマウスは、肝臓における変化を有した。この変化は細菌が原因であると思われる。肺では、転移は、とても多くかつ小さいので、個々の転移を数え又は測定することは実用的ではない。以下の表２は、表１の処置を受けたマウスの結果の要約を表す。
【００７２】
【表２】
2006511493.tif 000003
【００７３】
上記表２からわかるように、試験化合物を処置されたＢａｌｂ/ｃ-ｎｕｄｅマウスでは、５匹のマウスのうち１匹が肉眼で観察される肺転移を有し、一方試験化合物を処置されないコントロールであるBalb/ｃ-nudeマウスでは４匹中４匹が、肉眼でわかる肺転移を有した。
【００７４】
実施例３
腫瘍成長抑制アッセイにおいて、ＨＴ２９癌細胞に対してモノクローナル抗体５Ｄ５を試験した。このアッセイは、５Ｄ５・７５及び２５μｇ/マウス、ｑｏｄ×１５での免疫治療を、１００ｍｇ/ｋｇのＣＰＴ-１１(イリノテカン/カンプト(Camptosar))、ｑｗｋ×３と比較した。
【００７５】
材料と方法
メスの胸腺欠損ヌードマウス(Harlan)は、実験の１日目において１３週齢であった。動物は水(逆浸透水、１ｐｐｍ  Ｃｌ)及びＮＩＨ ３１が改変しかつ放射線を受けたＬａｂ Ｄｉｅｔ(商標)を自由に与えられた。ＬａｂＤｉｅｔ(商標)は、１８．０％タンパク質、５．０％脂肪、及び５％繊維からなる。マウスを静かなマイクロ隔離飼育器中に、１２時間の光サイクル、２１〜２２℃(７０〜７２°Ｆ)、及び４０％〜６０％の湿度で飼育した。
【００７６】
腫瘍接種
ＨＴ２９癌断片(１ｍｍ3)を、各マウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍が６２.５〜１２６ｍｇの大きさに達したら、群の平均腫瘍体重が８４.２〜８５.５ｍｇとなるようにマウスを５個の処置群に分けた。見積もりの腫瘍重量を、以下の式：
【数１】
2006511493.tif 000004
[式中、ｗ＝ＨＴ２９腫瘍の幅(ｍｍ)、及びｌ＝ＨＴ２９腫瘍の長さ(ｍｍ)]
を使用して計算した。
【００７７】
５Ｄ５及びコントロールであるＩｇＧの投与溶液を、リン酸緩衝生理食塩水で希釈することにより毎日新しく調製した。ＣＰＴ-１１(Pharmacia；２０ｍｇ/ｍｌ)を投与する日に生理食塩水で希釈した。
１日目において、マウスを５の動物群へと分け(ｎ＝１０/群)、そして以下の表３に記載されるプロトコルに従って投与を開始した。
【００７８】
【表３】
2006511493.tif 000005
【００７９】
陽性の対照薬剤として、ＣＰＴ１１を週に１度、１００ｍｇ/ｋｇの投与量で３週間投与した。ＣＰＴ-１１を０.２ｍｌ/体重２０ｇの体積でｉ.ｐ.でデリバリーし、ここでこの体積は体重により調整された。５Ｄ５又はコントロールのマウスＩｇＧの投与量を、０.２ｍｌ/マウスの体積で静脈投与によりデリバリーした。抗体投与量は、体重により調整されなかった。未処置群Ｉのマウスは、ＣＰＴ-１１治療に対するコントロールとして役に立つ。群３のマウスは、１５μｇ/マウスのコントロールＩｇＧ投与量を一日おきに１日１回受けた(ｑｏｄ×１５)。群４及び群５のマウスは、７５及び２５ｕｇ/マウスの５Ｄ５の投与量×１５をそれぞれ受けた。
【００８０】
評価項目
腫瘍成長抑制アッセイにおいて効力を評価した。３１日目に試験を終わらせるまでに、週二回腫瘍を計測した。各動物を次に安楽死し、そしてそのＨＴ２９の腫瘍を切り離し、そして重量を測定した。処置により、動物において完全な腫瘍退行(ＣＲ)又は部分的な腫瘍退行(ＰＲ)が起こった。ＣＲ応答では、試験の終了時において、計測できる腫瘍体積が存在しない。ＰＲ応答では、腫瘍体重は開始日の重量より少ないが、０ｍｇより重い重量であった。退行しない腫瘍を全て、腫瘍成長抑制の計算に含めた。
【００８１】
各動物の腫瘍重量の増加は、試験終了時の実際の腫瘍重量と一日目における計算された腫瘍重量との間の差として計算した。これらの値を群平均腫瘍重量増加を計算するために使用した。腫瘍成長抑制を以下の式：
【数２】
2006511493.tif 000006
により、処置及びコントロールマウスにおける群平均腫瘍重量の増加から計算した。
【００８２】
毒性
試験終了まで、週二回マウスの重量を計測した。薬剤に関連する有害副作用の臨床兆候についてマウスを頻繁に試験した。マウスの抗癌剤についての許容される毒性は、ＮＩにより、試験の期間中において群平均体重減少が２０％未満であり、かつ毒性死が１０の処置動物において１以下であると定義される。
【００８３】
統計分析及び図解法分析
(平均値及び中央値、それぞれの分析に対し)対応のないｔ検定及びマン-ウィットニーＵ検定を使用して、処置群のマウスとコントロール群のマウスにおける平均腫瘍重量の差の統計的有意性を測定した。両側検定された統計分析をＰ＝０.０５で行った。
【００８４】
結果
効力：コントロール・マウスにおけるＨＴ２９大腸癌の成長
処置プロトコルを表３に記載した。群Ｉのマウスは、処置を受けず、そしてＣＰＴ-１１及び５Ｄ５治療のコントロールとして役に立った。群３のマウスは、一日おきに７５μｇ/マウスの投与量の無関係なマウスＩｇＧを１５回受けた(qod×１５)。表４は、試験における全ての群の結果を要約する。３１日目における腫瘍重量の平均値は、未処置マウス及びＩｇＧ処置マウスにおいて、それぞれ６４０.０と６９６.２ｍｇであった。
【００８５】
【表４】
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【００８６】
腹腔内ＣＰＴ-１１治療に対するＨＴ２９異種移植片の応答
群２のマウスは、１００ｍｇ/ｋｇのＣＰＴ-１１を腹腔内注射で、週一回、３週間処置した(ｑｗｋ×３)(表３)。ＣＰＴ-１１に応答して腫瘍は退行しなかった。群３のマウスにおける最終平均腫瘍重量は、４４７.９ｍｇであった(表４)。群２のマウスは、未処置マウスに比較して３４.７％の腫瘍成長抑制を示した。図３において棒グラフで図示されるこの結果は、統計的に有意ではなかった(Ｐ＝０．２３.１１、両側検定された対応のないｔ検定)。図４Ａ〜Ｅは、キャリパー計測から計算された全ての処置群における各腫瘍の成長を示した。ＣＰＴ-１１処置により、腫瘍成長の勾配の減少した。
【００８７】
静脈内５Ｄ５免疫治療に対するＨＴ２９異種移植片の応答
５Ｄ５を群４及び群５のマウスに、ｑｏｄ×１５の投与計画で、それぞれ７５及び２５ｕｇ/マウスで静脈内投与した(表３)。腫瘍の退行は観測されなかった。７５及び２５μｇ/ｍｇのマウス５Ｄ５処置は、それぞれ５４３.５及び７００.７の最終平均腫瘍重量をもたらした(表４)。５Ｄ５の高投与量は、未処置マウスの腫瘍成長に対し、ＨＴ２９腫瘍成長を１７.８％抑制した。群４マウスにおける腫瘍成長抑制は、未処置及びＩｇＧ処置マウスに対し統計的に有意ではなかった(Ｐ＝０.６２４１及び０.４５３；ｔ検定)。群５のマウスは、腫瘍成長の抑制を示さなかった。図３は、有意な腫瘍成長抑制の欠如を示し、大きなエラーバー(ＳＥＭ)を与えた。図４Ａ〜Ｅにより、７５ｕｇ/マウスの５Ｄ５で処置される動物において腫瘍成長曲線の勾配が緩やかに減少することが示される。
【００８８】
副作用
全ての治療は、良好な耐容性を示した。最も高い群平均体重減少 (許容範囲である５.８％)は、ＣＰＴ-１１で処置されたマウスにおいて記録された。抗体処置されたマウスの体重減少は、３.６％又はそれ未満であった。
【００８９】
考察
ＨＴ２９大腸腫瘍異種移植モデルは、ＨＴ２９細胞がラミニンを産生するため、５Ｄ５の評価に適していた。原発腫瘍の成長は、抗増殖剤、例えばＣＰＴ１１により、並びに基層の浸潤を妨げる薬剤により抑制される。ラミニン５のγ２鎖に対するモノクローナル抗体、例えば５Ｄ５を、抗増殖剤、例えばＣＰＴ-１１などと合わせて使用する組み合わせ治療は、本発明の一部として考えられる。治療効率は、腫瘍成長抑制、つまり３１日間の試験におけるコントロールと処置動物群との間の平均腫瘍サイズ増加の差に基いている。２５μｇ/マウスの投与量では、５Ｄ５に対する応答がなかったが、７５μｇ/マウスの投与量で腫瘍成長を１７.８％抑制した(表４及び図３)。こうして、５Ｄ５の７５μｇ/マウスの投与量は、ＨＴ２９大腸癌に対していくつかの治療効果をもたらす。一般的に、ＣＰＴ-１１及び５Ｄ５で治療されるマウスにおいて腫瘍成長曲線の勾配が減少する(図４Ａ-Ｅ)。従って、これらの結果により、抗-ラミニン免疫治療が、ラミニン５分泌腫瘍のガン治療において適用性有するということが示された。
【００９０】
要約すると、定着したＨＴ２９大腸腫瘍は、５Ｄ５の７５μｇ/マウスの投与量による治療に応答した。高投与量５Ｄ５の免疫治療は、ＣＰＴ-１１化学治療によりもたらされる５０％の腫瘍成長抑制を達成した。図４Ａ〜Ｅに示される腫瘍成長曲線により、５Ｄ５の免疫治療が、７５μｇ/マウス又はそれ以上の投与量で大腸腫瘍成長を障害することができることを示した。
【００９１】
当業者は、さらにルーチンな実験を行なって、本明細書中に記載される発明の特定の態様に同等である実施態様を理解するだろうし、また確実にすることができるだろう。これら及び他の全ての同等である実施態様は、添付の特許請求の範囲により包含されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、in vitroにおける扁平上皮癌細胞KLN２０５及びケラチン生成細胞HaCatのヒト・ラミニン-５及び組換えヒト・ラミニンγ２鎖に対する付着効率を示す。付着効率は、ラミニン-１に結合する細胞の効率と比較される。ラミニン-１及びラミニン-５に対する最大付着を提供する基質濃度(１０μｇ/ｍｌ)を使用した。結果を、少なくとも４回の実験から計算される平均値±ＳＤとして示し、ラミニン-１に対する値を１００％とした。
【図２】図２Ａ-Ｂは、Boyden及びトランスウェル・チャンバーの遊走アッセイにおける扁平上皮癌細胞KLN２０５の遊走に対するポリクローナルγ２鎖抗体の効果を示した。
【図３】図３は、Ｍａｂ５Ｄ５及びＣＰＴ-１１を使用するＨＴ２９-ｅ２８細胞系列における３１日目における腫瘍成長抑制を示す。
【図４Ａ】図４Ａ-Ｅは、ＨＴ２９-ｅ２８試験における、各マウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ-Ｅは、ＨＴ２９-ｅ２８試験における、各マウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ-Ｅは、ＨＴ２９-ｅ２８試験における、各マウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ-Ｅは、ＨＴ２９-ｅ２８試験における、各マウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ-Ｅは、ＨＴ２９-ｅ２８試験における、各マウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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