(57)【要約】豚が腸毒素原性 E. Coli (ETEC)に対し耐性であるか非耐性であるかどうかの同定。特に、豚がETECに対し耐性である、または非耐性であると同定することを含む、方法、プローブおよびDNA分子を提供する。耐性/非耐性の情報を用いる豚を育種するための方法、雄豚の混合精液、およびETECに対する非耐性を補う薬物を開発する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸毒素原性E. coli(ETEC)に対する耐性と連鎖する、遺伝的多型の対立遺伝子を含む単離核酸(NA)分子、ここで、該遺伝的多型は、ブタ染色体SSC13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する。
【請求項２】
ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子により、対立遺伝子に関して同型接合性である豚がETECに対し耐性となる、請求項１の単離NA分子。.
【請求項３】
単離NA分子は、少なくとも3.0のlodスコアを有する、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子を含む、請求項１または２の単離NA分子。
【請求項４】
単離NA分子が、ブタMUC4遺伝子中に位置するNA配列を含む、請求項１または３の単離NA分子。
【請求項５】
単離NA分子が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号67、配列番号68、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196および配列番号197、それらの相補的配列およびそれら何れかのフラグメントからなる配列の群から選択される配列と、同一または少なくとも90 % 相同性を有するNA配列を含む、請求項１または４の単離NA分子。
【請求項６】
単離NA分子が、ETECに対し耐性である豚とETECに対し非耐性である豚とを識別するNA配列を含む、請求項１から５の何れかの単離NA分子。
【請求項７】
請求項１から６の何れかの単離NA分子のフラグメントに相同性であるNA配列を含む、NAプローブ。
【請求項８】
NAプローブが、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997A、配列番号83中のG3277Cおよびそれらの相補的配列からなるSNPの群から選択された少なくとも１つのSNPの対立遺伝子に特異的である、請求項７のNAプローブ。
【請求項９】
配列番号66のNA配列またはその相補的配列に相同的なNA配列を含む、請求項７のNAプローブ。
【請求項１０】
豚がETECに対し耐性であるかどうかを同定する方法であって、該方法は以下を含む
i)該豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含んでいる、
ii)該サンプルを使用することにより、豚がETECに対する耐性と連鎖する、遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるかどうかを決定すること、該遺伝的多型は、ブタ染色体SSC13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する、および
iii)豚が耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるならば、ETECに対して豚が耐性であると同定すること。
【請求項１１】
方法は、豚が、ETECに対し非耐性かどうか、耐性のキャリアーまたは非キャリアーであるかどうかを同定することを更に含み、更に、
iv)該サンプルを使用することにより、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と異型接合的であるかまたはその非キャリアーであるか決定すること、および
v)
a)豚が耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子の非キャリアーならば、ETECに対し非耐性であり、耐性の非キャリアーであるとして豚を、または
b)豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子に異型接合的であるならば、ETECに対し非耐性であるが耐性のキャリアーであるとして豚を
同定すること、
を含む、請求項１０の該方法。
【請求項１２】
ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型がマーカーSW207およびS0075に隣接する領域およびそれらを含む領域中に位置する、請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
遺伝的多型が少なくとも3.0のlodスコアでETECに対する耐性と連鎖する、請求項１０から１２の何れかの方法。
【請求項１４】
遺伝的多型がブタMUC4遺伝子中に位置する、請求項１０から１３の何れかの方法。
【請求項１５】
ETECに対する耐性が、ETECによる腸管癒着症に対する耐性、ETECによる腸コロニー形成に対する耐性、ETECが原因の下痢のような腸障害に対する耐性およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される耐性である、請求項１０から１４の何れかの方法。
【請求項１６】
豚が、サス・スクロファ(イノシシ科)、ヨークシャー、デンマーク系ヨークシャー、デンマーク系デュロック、ランドレース、デンマーク系ランドレース、ホワイト・デーニッシュ・ランドレース、黒いぶちのデンマーク系ランドレース、ハンプシャー、デンマーク系ハンプシャー、ポーランド・チャイナ、ヘレフォードおよびそれら任意の交雑育種からなる豚の群から選択される、請求項１０から１５の何れかの方法。
【請求項１７】
豚が、雄豚、雌豚、乳離れしていない子豚、乳離れした豚、育種した豚および成熟した豚からなる群から選択される、請求項１０から１６の何れかの方法。
【請求項１８】
遺伝的多型が、一塩基変異多型(SNP)、種々の数の縦列反復多型、分散化反復DNA、挿入、欠失、増幅、再配列、SNPの組合せ、短い縦列反復、ジヌクレオチド反復、分散化反復DNAおよびこれら何れかの組合せからなる群から選択される遺伝的多型である、請求項１０から１８の何れかの方法。
【請求項１９】
遺伝的多型がSNPであるかSNPの組合せである、請求項１９の方法。
【請求項２０】
SNPが一塩基G/C多型である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
SNPが、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997Aおよび配列番号83中のG3277Cからなる群から選択される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
更に、
請求項１０の工程ii)において、ETECに対する耐性と連鎖する第一の遺伝的多型の対立遺伝子に加えて豚が、ETECに対する耐性と連鎖する少なくとも第二の遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合的、異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかをサンプルにおいて決定すること、および
請求項１０の工程iii)において、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の第一の対立遺伝子および／またはETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の少なくとも第二の対立遺伝子と同型接合的であるならば、ETECに対して耐性であると豚を同定すること
を含む、請求項１０から２１の何れかの方法。
【請求項２３】
少なくとも第二の遺伝的多型が、少なくとも4、5、6、7、10、20、30または少なくとも50遺伝的多型のような少なくとも3遺伝的多型を含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
少なくとも第二の遺伝的多型が、一塩基変異多型(SNP)、種々の数の縦列反復多型、分散化反復DNA、挿入、欠失、増幅、再配列、SNPの組合せ、短い縦列反復、ジヌクレオチド反復、分散化反復DNAおよびこれら何れかの組合せからなる群から選択される遺伝的多型である、請求項２２または２３の方法。
【請求項２５】
少なくとも第二の多型が、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997Aおよび配列番号83中のG3277Cからなる群から選択されるSNPである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
少なくとも第二の遺伝的多型がブタFUT1遺伝子中に位置する、請求項２２から２４の方法。
【請求項２７】
サンプルが、DNA および／またはRNA、血液、唾液、組織、咽頭スワブ、精液、およびそれらの組合せを含む物質からなる群から選択される、請求項１０から２６の何れかの方法。
【請求項２８】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかの決定の工程が、対立遺伝子特異的PCR、ミニシーケンシング、プライマー伸張、パイロシーケンシング、PCR-RFLP、対立遺伝子-特異的ローリングサークル増幅、ARMS(Amplification Refracting Mutation System)、例えば、DNAアレイへのハイブリダイゼーション、DASH(Dynamic Allele-Specific Hybridisation)、融解曲線測定、プライマー伸張後のMALDI-TOFマススペクトロメトリーおよびそれら何れかの組合せからなる群から選択される技術を用い行われ得る、請求項１０から２７の何れかの方法。
【請求項２９】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかの決定の工程を含む、請求項１０から２８の何れかの方法であって、該方法は以下の工程の少なくとも１つを含む
i)豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含む;
ii)ゲノムDNAを該サンプルから抽出すること;
iii)ゲノムDNAの少なくともフラグメントを増幅し、増幅産物を得ること;
iv)増幅産物と制限酵素を摂食させること;
v)ゲル電気泳動により、得られたフラグメントを分離すること;
vi)フラグメントのそれぞれの数および長さを決定すること; および
vii)数および長さから多型の存在を決定すること。
【請求項３０】
制限酵素がXbaIである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
ETECが、E. coli F4ab/F4ac、E. coli O149、E. coli F4、E. coli F18、E. coli F5、E. coli F6、E. coli 987P、E. coli F41、E. coli F18ab、E. coli F107、E. coli F18ac、E. coli 2134PおよびE. coli Av24、およびこれらの生物の何れかの組合せからなる群から選択される、請求項１０から３０の何れかの方法。
【請求項３２】
請求項１から６の何れかの単離NA分子および／またはETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型のブタ対立遺伝子を検出するためのプローブとしての請求項７から９の何れかのNAプローブの使用。
【請求項３３】
PCRに基づく方法におけるプライマー用のNA分子対の使用、ここで、そのPCRに基づく方法は、豚がETECに対し耐性かまたは非耐性かを同定するための方法に使用し、該NA分子対は、配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択される。
【請求項３４】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかを決定するためのキット、ここで、該キットは、請求項７から９のNAプローブ、請求項１から６のNA分子、PCR-プライマー対、制限酵素およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される第一のコンポーネントを含む。
【請求項３５】
PCR-プライマー対が、配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択される、請求項３４のキット。
【請求項３６】
ETECに対し耐性である豚を育種するための方法であって、該方法は以下を含む
i)第一の豚を選択すること、該豚は、請求項１０から３１の何れかの方法を用いETECに対し耐性であると同定している; および
ii)該第一の豚を第二の豚と共に育種すること、
そして、ランダムに選択した親豚の子孫よりもETECに対し耐性である豚の子孫を得る。
【請求項３７】
第二の豚は、請求項１０から３１の何れかの方法を用いETECに対し耐性であると同定される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
アンチセンス-NA、iRNA、リボザイム、遺伝的医薬のためのETC、遺伝子治療またはシネトプラスティックDNA修復のような使用のための請求項１から６の何れかの単離NA分子。
【請求項３９】
豚肉を生産するための方法であって、以下の工程を含む該方法、
i)請求項３６または３７の豚の子孫を得ること、
ii)その豚の子孫から豚肉を得ること。
【請求項４０】
ETECに対する非耐性の治療のための可能性ある薬物候補をスクリーニングするための方法であって、以下の工程を含む該方法、
i)ETECに対し非耐性であると同定した豚の試験群を選択すること、該同定は請求項１０から３１の何れかの方法を用い行う; 
ii)該試験群に可能性ある薬物候補を投与すること; および
iii)試験群における可能性ある薬物候補の効力を評価する。
【請求項４１】
少なくとも２匹の雄豚由来の精液を含む、雄豚の混合精液、ここで、該雄豚は、請求項１０から３１の何れかの方法を用い、ETECに対し耐性であると同定する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、最も広い観点においては、腸毒素原性E. coli (ETEC)に耐性かまたは非耐性かについての豚の同定に関する。特に、ETECに耐性かまたは非耐性かについての豚の同定を含む方法、プローブおよびDNA分子を提供する。本発明は、更に、耐性/非耐性、雄豚の混合精液(mixed boar semen)の情報を用いる、豚を育種するための方法、およびETECに対する非耐性を補う薬物を開発する方法に関する。
【０００２】
技術分野および従来技術
豚の育種における主な問題は、新たに生まれた、特に、乳離れ後の若い豚が病気にかからないようにすることである。その点に関しては、腸障害が最も広まっており深刻な問題であり、世界中の豚(swine)の育種および生産農場では、毎年、これらの疾患の発生により相当な家畜を失っている。更なる喪失が、医薬のコスト、成長遅延およびその疾患の他の結果により生ずる(死に至る直接の損傷よりも実質的に多いかもしれない)。
【０００３】
若い豚において顕著に多くの下痢を引き起こす、原因の病原体はE. coliの腸毒素原性株、ETECであることが知られている。幾つかのETECが感染した動物から単離され、E. coli F18、およびE. coli F4(以前はK88として知られていた)のようなE. coli株の型は若い豚で見られる死に至る主要な株である。
【０００４】
F18およびF4という名は、ETECの線毛型を指し、種々の株を区別するのに使用する。粘着性の線毛は、腸における、E. coliのコロニー形成を仲介する。コロニー形成は、その細菌の、腸細胞に対する粘着性およびその後の増殖に依存し、ETECの毒素産生が下痢を生ずる。
【０００５】
その疾患は、ETECが子豚の腸管中に入ると生ずる。ETEC細菌は、表面タンパク質抗原(線毛)により小腸の壁に付着し、そこで、大量に繁殖し、腸上皮細胞に直接毒素を送り込む。毒素により生ずる作用により、腸上皮細胞の液体吸収活動は停止し、その細胞は、大量の液体を腸管腔中に分泌し、その結果、多かれ少なかれ重篤な下痢へ進行する。
【０００６】
当分野において、努力は、ETECにより生ずる、豚のような動物での下痢のコントロールのために為されている。US 4,443,549では、病原性細菌の付着部(その付着は皮膚と粘膜との組織(mucocutaneous tissue)に対する細菌の結合を仲介する)に対するモノクローナル抗体を産生する方法が記載されている。該抗体は、動物に対する経口投与に適する医薬組成物中で使用され得る。
【０００７】
US 4,761,372では、免疫原性、非毒性、熱不安定性腸毒素および／または非毒性、熱安定性腸毒素をコードする遺伝子を含むプラスミドおよび下痢性疾患の予防接種をヒトおよび動物に行う生ワクチンとして使用するための該プラスミドを含むE. coliを開示する。
【０００８】
更に、WO 00/58476は豚における乳離れ後の下痢を予防するための、経口的に適用可能なE. coli生ワクチンを産生する方法を記載する。２つの付着線毛(F4およびF18)を生ずるE. coliの腸毒素を出さない(free)株が、局所的保護を供するために若い豚に投与される。
【０００９】
しかし、すべての豚がE. coli感染で死ぬわけでない。付着に対する感受性、すなわち、特定の線毛の結合のための豚におけるレセプターの発現が、宿主により遺伝的にコントロールされることが判った。その耐性機構は、耐性動物における腸の境界(intestinal borders)ではE. coliはコロニー化しない、すなわち、該細菌は耐性動物の腸壁には付着しないことであると思われる。
【００１０】
E. coli耐性を検出する試みはWO 98/53101で報告されている。その出願は、F18 E. coliが関連する疾患に耐性かまたは感受性か何れかである豚を識別するするための方法に関係する。その識別は、ブタ染色体6のα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ 1(FUT1)遺伝子のDNA多型に関するDNA試験を用い行う。
【００１１】
F4abまたはF4ac線毛(従来、K88ab および K88acとして知られていた)を発現する腸毒素原性大腸菌細胞(ETEC)は、新生および若い豚における下痢および死の主な要因である(Wilson and Francis, 1986)。デンマークでは、報告された下痢のケースの約25%にETEC F4がある(Ojeniyi et al., 1994)。
【００１２】
1975年、Sellwoodらは、ETEC F4に関連する２つの豚表現型、すなわち、それぞれ耐性の豚および感受性の豚の存在について述べる論文を発表した。1977年、Gibbonsらは、ETEC F4ac 耐性は常染色体の劣性メンデル形質(Mendelian trait)として遺伝することを示し、トランスフェリン遺伝子座(TF)との連鎖を示唆し、後にそれを確認した(Guerin et al. 1993)。ETEC F4ac および F4abに対する感受性の要因となるブタ遺伝子座の連鎖マッピングにより、可能性ある候補の遺伝子は豚染色体13に位置するという仮説が得られた(Edfors-Lilja et al., 1995)。しかし、候補の遺伝子は発見されず、また示唆されなかった。これは、このタイプのETEC F4 耐性用の利用可能な唯一の診断検査は1975年にSellwoodらにより開発された付着検査であることを意味する。その付着検査は、大規模な腸外科手術か屠殺か何れかを必要とし、そしてその試験は非常に労力がかかるという事実から、育種計画に組み入れることは困難である。
【００１３】
育種計画に診断検査を組み込むために満たす必要のある前提条件は、迅速に、容易に使用される必要があり、そして生きた動物で正確に遺伝子型の決定が可能であることである; しかし、今のところ適当な方法でその必要性を満たすものはない。
【００１４】
発明の概要
本発明は、E. coliに対する耐性と連鎖し、ブタ染色体(SSC)13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域内に位置する、新規に発見した遺伝的多型の適用に関する。
【００１５】
本発明の幾つかの利点には、使用の容易さ、非侵入性の検査(non-invasive testing)および迅速な検査結果が含まれる。大局的見地から見ると、本発明の種々の態様の利点は、例えば、抗生物質の消費の低下による環境的により安全な肉生産、肉生産のよりより経済性および生産におけるより健康な動物である。
【００１６】
従って、第一の態様において、本発明は、単離核酸(NA)分子に関係する。その分子は、腸毒素原性E. coli(ETEC)に対する耐性と連鎖する、遺伝的多型の対立遺伝子を含み、該遺伝的多型は、ブタ染色体13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する。
【００１７】
本発明の他の態様は、上記NA分子のフラグメントに相同的なNA配列を含む、NAプローブを提供する。
【００１８】
また、本発明の他の態様は、豚がETECに対し耐性であるかどうかを同定する方法に関係し、該方法は以下を含む:
i)該豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含んでいる、
ii)該サンプルを使用することにより、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子に関し同型接合であるかどうかを決定すること、該遺伝的多型は、ブタ染色体13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する、および
iii)豚が、耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるならば、ETECに対して豚が耐性であると同定すること。
【００１９】
更に本発明の態様は、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型のブタ対立遺伝子を検出するためのプローブとしての、単離NA分子および／またはNAプローブの使用に関する。
【００２０】
また、本発明の他の態様は、PCRに基づく方法におけるプライマー用のNA分子対の使用に関し、そのPCRに基づく方法は、豚がETECに対し耐性かまたは非耐性かを同定するための方法に使用し、該NA分子対は、配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択される。
【００２１】
本発明他の態様は、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかを決定するためのキットを提供し、該キットは、NAプローブ、NA分子、PCR-プライマー対、制限酵素およびそれらの何れかの組合せからなる群から選択される第一のコンポーネントを含む。
【００２２】
また、本発明の他の態様は、ETECに対し耐性である豚を育種するための方法に関し、該方法は以下を含む
i)第一の豚を選択すること、該豚は、上記の方法を用いETECに対し耐性であると同定している;および
ii)該第一の豚を第二の豚と共に育種すること、
そして、ランダムに選択した親豚の子孫よりもETECに対し耐性である豚の子孫を得る。
【００２３】
また更なる態様では、本発明は、遺伝的医薬(genetic medicine)、遺伝子治療またはシネトプラスティック(cinetoplastic)DNA修復のためのアンチセンス-NA、iRNA、リボザイム(Ribosyme)、ETCとして使用するための単離NA分子を提供する。
【００２４】
本発明はまた、豚肉を生産するための方法に関係し、該方法は、i)本明細書に定義のような豚の子孫を得ること、およびii)その豚の子孫から豚肉を得ることを含む。
【００２５】
ある興味ある態様では、本発明は、ETECに対する非耐性の治療のための可能性ある薬物候補をスクリーニングするための方法に関係し、該方法は以下を含む
i)ETECに対し非耐性であると同定した豚の試験群を選択すること、該同定は本明細書に記載の方法を用い行う; 
ii)該試験群に可能性ある薬物候補を投与すること、および
iii)該試験群における可能性ある薬物候補の効力を評価すること。
【００２６】
更なる態様では、本発明は、少なくとも２匹の雄豚由来の精液を含む、雄豚の混合精液を提供し、ここで、該雄豚は、本明細書に記載の方法を用い、ETECに対し耐性であると同定している。
【００２７】
本発明の詳細な説明
定義:
用語「核酸分子」または「NA分子」とは、本文脈において、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはそれらの疑似物のオリゴマーまたはポリマーをいう。この用語には、天然に生じる核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間(バックボーン)連結からなる分子、および類似の機能を有する天然には生じない核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間(バックボーン)連結またはそれらの組合せを有する分子を含む。その修飾されるかまたは置換された核酸は、例えば、細胞取り込みの増大、核酸標的に対する親和性の増大ならびにヌクレアーゼおよび他の酵素の存在下での安定性の増大のような望ましい特性のため、時折、天然型よりも好ましく、本文脈においては、用語「核酸類似体」または「核酸疑似物」と記載する。核酸疑似物の好ましい例は、ペプチド核酸(PNA-)、ロックされた核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA-)、キシロ-LNA-、ホスホロチオエート(phosphorothioate)-、2'-メトキシ-、2'-メトキシエトキシ-、モルホリノ-およびホスホラミデート(phosphoramidate)-含有分子などである。
【００２８】
本明細書で使用するように、用語「ETEC」とは、腸毒素原性および／または腸病原性のE. coli(ETEC)細菌であるエシュリヒア属および大腸菌種由来の細菌をいう。ETECはその線毛型により区別され、ETEC群には、以下に限らないが、E. coli F4ab/F4acのようなE. coli F4(従来、K88として知られていた)、E. coli F4ab、E. coli F4ac、E. coli F4ad、E. coli O149、E. coli F5 (従来、K99として知られていた)、E. coli F6(従来、987Pとして知られていた)、E. coli F41、E. coli F18、E. coli F18ab、E. coli F107、F18ac、E. coli 2134P、E. coli Av24、およびそれら何れかの組合せが含まれる。
【００２９】
用語「ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子」は、ETECに対する耐性に関して観察されるNA配列と関係し、用語「ETECに対する非耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子」は、ETECに対する非耐性に関して観察されるヌクレオチド配列である。
【００３０】
用語「NA配列」は、核酸分子を指し示すのに用い得る。より正確には、表現「NA配列」は、核酸物質自体を含み、それ故、特定のDNAまたはRNA分子を生化学的に特徴付ける配列情報(すなわち、４塩基から選択される文字の連続)に制限されない。
【００３１】
用語「相同」は、同じ長さの２つのアミノ酸配列間、または同じ長さの２つのヌクレオチド配列間での相同の程度の定量的測定を示す。比較する２つの配列が同じ長さでないならば、それらは最良に適合するように並べなければならない。配列同一性は((Nref-Ndif)100)/(Nref)として算出し、ここで、Ndifは並べたときの２つの配列における非同一の残基の総数であり、Nrefは一方の配列の残基数である。これによると、DNA配列 AGTCAGTC は、配列 AATCAATCと75%の配列同一性を有する(Ndif=2 および Nref=8)。ギャップは、特定残基の非同一としてカウントし、すなわち、DNA配列 AGTGTC はDNA配列 AGTCAGTCと75%の配列同一性を有する(Ndif=2 および Nref=8)。配列同一性はまた、BLASTプログラム、例えば、BLASTPプログラム(Pearson & Lipman (1988)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST)によって算出され得る。本発明のある実施態様では、アライメントは、http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.htmlで利用可能な、Huang & Miller (1991)に記載のようなデフォルトのパラメーターによるグローバル・アライン・アルゴリズムで行う。
【００３２】
用語「相同的」は、一方の一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列とハイブリダイズし得ることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量および温度および塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む多くの要因に依存し得る。
【００３３】
用語「lodスコア」は以下の意味を有する: 遺伝的多型の対立遺伝子がETECに対する耐性と連鎖しているかどうか決定するために、lodスコアを適用し得る。時折、Zmaxとも呼ばれるlodスコアは、遺伝的マーカー遺伝子座および特定の遺伝子の遺伝子座が特定の距離で連鎖する可能性を示す(可能性の比の対数)。Lodスコアは、例えば、LINKAGEパッケージのMLINKプログラムのようなコンピュータープログラムを適用することにより算出し得る(Lathrop et al., 1985)。3.0を超えるlodスコアは、遺伝的多型とETECに対する耐性または遺伝子遺伝子座との間の連鎖に関する重要な証明となると考えられる。
【００３４】
用語「フラグメント」は、より大きなNA分子の部分に関係し、ここで、該部分は、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、1000、2000、5000のような少なくとも10ヌクレオチドを含み、例えば少なくとも10000ヌクレオチドである。NA分子のフラグメントをPCRに基づく方法のためのプライマーとして使用するとき、その部分は10-30ヌクレオチドおよび更により好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22または23ヌクレオチドのような15-23ヌクレオチドを含むことが好ましい。
【００３５】
用語「遺伝的多型」は、染色体におけるブタゲノムDNA中に存在し得る可変性のヌクレオチド配列(多型)に関係する。遺伝的多型には、一塩基多型(SNP)、種々の数の縦列反復多型、分散化反復(interspersed repetitive)DNA、挿入、複製、欠失、増幅、再配列、SNPの組合せ、短い縦列反復、ジヌクレオチド反復、分散化反復DNAおよびこれら何れかの組合せからなる群から選択される多型が含まれる。可変性のヌクレオチド配列は、核酸増幅によって識別し得、そして多型性によるヌクレオチドの大きさまたは配列の相違の観察によって識別し得る。
【００３６】
用語「豚」には、イノシシ科種ファミリーのサス・スクロファ(Sus scrofa)のメンバー全てが含まれる。今日、比較的十分に特徴付けられた豚の品種はたくさんあり、これらの品種の多くは、腸毒素原性または腸病原性のE. coli株に対し多かれ少なかれ感受的である。本発明による方法(ここで、豚は、サス・スクロファ(Sus scrofa)由来(descender)の豚の群から選択される)により、ETECに対し耐性である品種を生ずることが示される。現在、10品種の豚(swine)があり、それらは、米国では、純血と認識されており、登録され得る。これらは、バークシャー、チェスター・ホワイト、デュロック、ハンプシャー、ランドレース、ポーランド・チャイナ、スポット、ヨークシャー、ヘレフォードおよびタムワースである。
【００３７】
高度に産業化された今日の動物生産では、ランドレース、ヨークシャー、デュロックおよびハンプシャーの４品種が特に重要である。４品種はすべてETECに対し非耐性であり得、個体群すべてにおいて、本発明で開示の方法を含む育種計画で利点が得られ得る。
【００３８】
豚品種の他の例には、ランドレース、ハンプシャー、デュロック、ヨークシャー、デンマーク系ヨークシャー、デンマーク系デュロック、ランドレース、デンマーク系ランドレース、ホワイト・デーニッシュ・ランドレース、黒いぶち(Sortbroget)のデンマーク系ランドレース、ハンプシャー、デンマーク系ハンプシャー、ポーランド・チャイナ、ヘレフォード・アメリカン・ランドレース、米国系ヨークシャー、アラパワ・アイランド(Arapawa Island)、バスエン(Ba Xuyen)、バンツー(Bantu)、Bazna、北京黒ブタ(Beijing Black)、ベラルーシ・ブラック・パイド(Belarus Black Pied)、ベルジアン・ランドレース、バークシャー、英国系ランドレース、ブリティッシュ・ロップ(British Lop)、ブルガリアン・ホワイト、広東ブタ(Cantonese)、チェスター・ホワイト、チェコ改良種ホワイト(Czech Improved White)、Dermantsi Pied、オランダ系ランドレース、Fengjing、フィンランド系ランドレース、フランス系ランドレース、ドイツ系ランドレース、グロスターシア・オールド・スポット(Gloucestershire Old Spots)、ギニア・ホッグ(Guinea Hog)、Hezuo、イベリアン、イタリア系ランドレース、チンホフ(Jinhua)、Kele、Krskopolje、Kunekune、ラコーム、ラージブラック、ラージブラック-ホワイト、ラージホワイト、リトアニア天然種(Lithuanian Native)、メイシャン(Meishan)、ミドル・ホワイト(Middle White)、ミンズー(Minzhu)、モンカイ、Mukota、Mora Romagnola、モウラ、ミュールフット、ネイチアン(Neijiang)、ニンシアン(Ningxiang)、ノルウェー系ランドレース、Ossabaw Island、Oxford Sandy and Black、フィリピン天然種(Philippine Native)、ピエトレン(Pietrain)、レッド・ワットル(Red Wattle)、サドルバック(Saddleback)、スポット、スウェーデン系ランドレース、Swallow Belied Mangalitza、タムワース、Thuoc Nhieu、チベット(Tibetan)、Turopolje、ポットベリー(Vietnamese Potbelly)、ウェールズおよびウーチーシヤン(Wuzhishan)がある。
【００３９】
本発明の方法は、上記の豚ファミリーおよび品種の何れかの交雑育種由来の耐性動物を同定するのに使用し得ることに更に注目すべきである。
【００４０】
用語「遺伝物質」は、本文脈において、最も広い態様で解釈すべきであり、染色体のようなゲノムDNA、mRNA、およびフラグメントおよび／またはこれらの分子の消化物からなる群から選択される１以上の成分を含み得る。
【００４１】
用語「ゲノムDNA」は最も広い態様で解釈すべきであり、染色体のようなゲノムDNA、およびフラグメントおよび／またはこれらの分子の消化物からなる群から選択される１以上の成分を含み得る。
【００４２】
説明:
本明細書に記載の全ての用語、実施態様および特徴は、本明細書で述べる全ての態様に用いられ得ることを主張する。
【００４３】
本発明の第一の態様では、腸毒素原性E. coli(ETEC)に対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子を含む、単離核酸(NA)分子を提供し、該遺伝的多型はブタ染色体13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域に位置する。有用な実施態様では、遺伝的多型はマーカーSW207およびS0075に隣接する領域およびそれらを含む領域中に位置する。
【００４４】
本発明の１つの実施態様では、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子により、該対立遺伝子に関して同型接合的である豚はETECに対し耐性となる。
【００４５】
本発明の１つの実施態様では、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の該対立遺伝子に関して同型接合的である豚はETECに対し耐性である。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様では、ETECはE. coli F4および／またはE. coli F4 ab/acである。
【００４７】
好ましい実施態様では、単離NA分子は、少なくとも4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 または 9.0、10、少なくとも50などを含む少なくとも3.0のlodスコアで、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子を含み得る。
【００４８】
本発明の好ましい実施態様では、単離NA分子は、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子を含む。単離NA分子はまた、ブタMUC4遺伝子中に位置するNA配列を含み得る。
【００４９】
本発明の特定の好ましい実施態様では、単離NA分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号67、配列番号68、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、それらの相補的配列およびそれら何れかのフラグメントからなる配列の群から選択される配列と、同一または少なくとも95%または少なくとも99%相同性のような少なくとも90%相同性を有するNA配列を含む。
【００５０】
本発明の更なる好ましい実施態様では、単離NA分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号67、配列番号68、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、それらの相補的配列およびそれらのフラグメントからなる配列の群から選択される配列と、同一または少なくとも95%または99%相同性のような少なくとも90%相同性を有するNA配列を含む。
【００５１】
本発明の特に好ましい実施態様では、単離NA分子は、配列番号6、配列番号8、配列番号82、配列番号83、配列番号87および配列番号88、それらの相補的配列およびそれらのフラグメントからなる配列の群から選択される配列と、同一または少なくとも95%または99%相同性のような少なくとも90%相同性を有するNA配列を含む。
【００５２】
適当な実施態様では、単離NA分子は、ETECに対し耐性である豚とETECに対し非耐性である豚とを識別するNA配列を含む。
【００５３】
本発明の他の実施態様では、単離NA分子は、上記の何れかのNA分子と完全なまたはほぼ完全な連鎖不平衡のNA分子である。
【００５４】
２以上の隣接する遺伝子座にある対立遺伝子は、それらが、各対立遺伝子の頻度から予測される頻度とは顕著に異なる頻度で共に生ずるとき、連鎖不平衡となる。完全な連鎖不平衡は、２つのNA配列(例えば、遺伝的多型およびブタMUC4遺伝子)が染色体上で互いに物理的に非常に近いとき、および組み換えの機会が制限される場合に、一般的に生ずる。２つのNA配列が連鎖不平衡である場合、マーカーを目的の遺伝子の遺伝子型の予測に用い得る前に、各血統における連鎖相(linkage phase)(すなわち、対立遺伝子がどのように連鎖するか)を決定することが必要である。目的の遺伝子と完全ではないが部分的に連鎖不平衡な遺伝的多型は、予測試験で幾分有用であり得る。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様では、NA分子は、例えば、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997A、配列番号83中のG3277Cまたはそれらの相補的配列の何れかのような遺伝的多型の部位を含む。
【００５６】
NA分子は、配列番号83の1726位で見られる変異、ここで、ヌクレオチドAACGTGは耐性のある豚に存在し、6塩基対欠失がETEC感染の豚で観察される; 配列番号83の2009位で見られる変異、ここで、豚ではTが見られるかTの欠失が見られる; 配列番号87の332位で見られる変異、ここで、GとAとのSNPシフトが存在する; または配列番号88の3530位で見られる変異、ここで、GとAとのSNPシフトが存在する、のような遺伝的多型の部位を含むように選択され得る。理論にとらわれることなく、これら３つの遺伝的多型は、ETECに対する耐性と関係すると考えられる。
【００５７】
本発明は、第二の態様で、上記のような単離NA分子のフラグメントに対し相同的なNA配列を含むNAプローブを提供する。
【００５８】
NAプローブは、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997A、配列番号83中のG3277Cおよびそれらの相補的配列からなる、SNPの群から選択される少なくとも１つのSNPの対立遺伝子に対し特異的であり得る。
【００５９】
NAプローブは、配列番号83の1726位で見られる変異、ここで、ヌクレオチドAACGTGは耐性のある豚に存在し、6塩基対欠失がETEC感染の豚で観察される、を含む少なくとも１つの遺伝的多型の対立遺伝子に特異的であり得る。
【００６０】
NAプローブは、配列番号83の2009位で見られる変異、ここで、豚ではTが見られるかTの欠失が見られる; 配列番号87の332位で見られる変異、ここで、GとAとのSNPシフトが存在する; および配列番号88の3530位で見られる変異、ここで、GとAとのSNPシフトが存在するを含む少なくとも１つの遺伝的多型の対立遺伝子に特異的であり得る。理論にとらわれることなく、これら３つの遺伝的多型は、ETECに対する耐性と関係すると考えられる。
【００６１】
本発明の好ましい実施態様では、NAプローブは、遺伝的多型を含む対立遺伝子の部分または遺伝的多型を含む対立遺伝子の部分に相補的なNA配列とハイブリダイズすることができる。
【００６２】
NAプローブは、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子に特異的であり得、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の該対立遺伝子は、少なくとも4.0、5.0、6.0、7.0、8.0または9.0、10、少なくとも50などを含む少なくとも3.0のlodスコアでETECに対する耐性と連鎖する。
【００６３】
NAプローブはまた、目的の実施態様において、配列番号66のNA配列またはその相補的配列に相同的なNA配列を含み得る。
【００６４】
有用な実施態様では、NAプローブは、少なくとも11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400のような少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチドなどを含む。現在好ましいNAプローブは15から23までのヌクレオチドのような10から30までのヌクレオチドを含む。更なる有用な実施態様では、NAプローブは、16、17、18、19、20、21、22または23ヌクレオチドのような15ヌクレオチドを含む。
【００６５】
本発明の更なる態様では、豚がETECに対し耐性であるかどうかを同定する方法を提供し、該方法は以下を含む
i)該豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含んでいる、;
ii)該サンプルを使用することにより、豚がETECに対する耐性と連鎖する、遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるかどうかを決定すること、該遺伝的多型は、ブタ染色体13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する、および
iii)豚が耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるならば、ETECに対して豚が耐性であると同定すること。
【００６６】
本発明の１つの実施態様では、方法は、豚が、ETECに対し非耐性かどうか、耐性のキャリアーまたは非キャリアーであるかどうかを同定することを更に含み、該方法は更に以下を含む
iv)該サンプルを使用することにより、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と異型接合的であるかまたはその非キャリアーであるか決定すること; および
v)
a)豚が耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子の非キャリアーならば、ETECに対し非耐性であり、耐性の非キャリアーであるとして豚を; または
b)豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子に異型接合的であるならば、ETECに対し非耐性であるが耐性のキャリアーであるとして豚を
同定すること。
【００６７】
発明の他の実施態様では、遺伝的多型はブタ染色体6中に位置しない。更なる実施態様では、遺伝的多型はブタα-(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(FUT1遺伝子)中に位置しない。
【００６８】
好ましい実施態様では、遺伝的多型は、マーカーSW207およびS0075が隣接しそれらを含む領域のような、マーカーSW2196およびSW225が隣接しそれらを含む領域中に位置する。
【００６９】
豚の連鎖マッピングで最も一般に使われる遺伝マーカーはマイクロサテライト(例えば、SW2196、SW225、SW207およびS0075ならびに以下の表 1の他のマーカー)であり、ここで、マーカーのコアは、２(通常)または少数のヌクレオチドである縦裂に反復する配列であり、ここで、種々の対立遺伝子は種々の数の反復を有することにより識別する。マイクロサテライトの場合(および多くの他の可能なマーカー型の場合)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、少量のDNAサンプルを増幅するのに使用し、択一的に対立遺伝子を同定する(すなわち、遺伝子型決定(genotyping))第一の工程を提供する。特有のPCRプライマーを用い、目的の特定マーカーの対立遺伝子のみが各動物のDNAサンプルから増幅されるようにする。次いで、PCR産物は電気泳動で分離し、例えば、放射活性または蛍光標識を使用することにより視覚化し得る。DNAに基づくマーカーにおけるPCRの使用は、非常に少量のDNAサンプルで遺伝子型決定を行うことができ、それは、いつでも比較的簡単に収集することができることを意味する。これ故、動物は、血液、耳切りまたは他の物質から単離したDNAを用いれば、生まれて直ぐに遺伝子型決定することができる。
【００７０】
遺伝的多型は、ブタ染色体13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する任意の遺伝的多型であり得、ここで、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子は、少なくとも4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0または10.0、少なくとも50などを含む少なくとも3.0のlodスコアで、ETECに対する耐性と連鎖する。
【００７１】
他の実施態様では、遺伝的多型は、ブタMUC4遺伝子中、および／またはMUC4遺伝子の3'および／または5'末端の隣接ゲノム配列中に位置する。その隣接ゲノム配列は、300 kb未満または更に100kb未満のような、500 kb(キロベース)未満であり得る。
【００７２】
発明の現在好ましい実施態様では、遺伝的多型は、配列番号6および／または配列番号8に相当するゲノム配列中に位置する。これらの配列は、ブタMUC4遺伝子の一部であると考えられる。しかし、遺伝的多型はまた、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、それら何れかのフラグメントおよびそれら何れかの組合せの群から選択されるヌクレオチド配列に相当するゲノム配列中に位置し得る。
【００７３】
本発明の実施態様では、遺伝的多型はブタMUC4遺伝子中に位置する。
【００７４】
また、遺伝的多型は、上記の遺伝的多型と完全なまたはほぼ完全な連鎖不平衡である遺伝的多型を含む。本発明による遺伝的多型は、実施例、例えば、実施例 6に記載のように同定し得る。
【００７５】
用語「ETECに対し耐性である」または「ETECに対する耐性」は、本文脈において、豚が、１以上のレベルのE. coli感染に対し耐性であり、例えば、ETECによる腸管癒着症に耐性であり、ETECによる腸コロニー形成に耐性であり、ETECが原因の下痢のような腸障害に耐性であり、およびそれらの任意の組合せに耐性であることに関係する。耐性の豚および非耐性の豚の二匹の豚が同量のETECにさらされた場合、特定のETEC株に対し耐性の豚は、非耐性の豚よりも、ETECによる腸管癒着症および／またはETECによる腸コロニー形成および／またはETECが原因の腸障害に罹患しないだろう。本発明の有用な実施態様では、耐性のある豚はETECに全く感染しない。
【００７６】
腸管癒着症の場合では、耐性 対 非耐性は、Sellwood et al., 1975に記載のような付着検査を用い決定する。
【００７７】
端的に述べると、付着検査は以下の方法で行い得る: 小腸の上部分の上皮細胞を、豚の屠殺後回収した試料標本から得る。付着検査は、上皮細胞をそれぞれ例えば、E. coli F4ab および E. coli F4acと共にインキュベーションすることにより行う。例えば、10から20の上皮細胞を含むサンプルを、干渉顕微鏡によりE. coli F4ab および E. coli F4acの両方の付着に関し検査し得る。その結果は、1 から 4でスコアし得、ここで、1 = 腸細胞に付着する細菌なし および 4 = 該細胞全ての刷子縁全体に細菌が付着。そのスコアが1ならば、動物は各ETECによる腸管癒着症に対し耐性であるといえる(この場合、E. coli F4ab および E. coli F4acに対して)。あるいは、豚は、スコアが1または2の何れかであるならば、ETECによる腸管癒着症に対し耐性であるといえる。
【００７８】
ETECによる腸コロニー形成の場合では、耐性 対 非耐性は、例えば、豚の糞サンプル中のETEC細胞カウントを用い、または糞サンプル中のETECに関係のある線毛(ETEC related fimbrie)の濃度を測定することにより、決定し得る。耐性の、感染した豚では、糞サンプル中のETECの数またはETEC関係線毛の濃度が、非耐性の、感染した豚よりも顕著に低くなるだろう。
【００７９】
ETECによる腸疾患の場合では、耐性 対 非耐性は、例えば、豚にある量のETECを食べさせることにより決定し、ETECが原因の腸疾患が進行するかどうか観察し得る。豚の疾患が進行するならば、その豚は非耐性である。豚の疾患が進行しないならば、その豚は耐性であるか、またはその豚は非耐性であるが幾つかの理由のため腸疾患が進行していないか何れかを意味し得る。豚の非耐性を補う薬物または特定の食べ物を与えることにより、非耐性の豚はETECにさらされても腸疾患を進行しないこととなる。
【００８０】
豚は雄または雌の何れかであり得、耐性または非耐性の決定および／またはその同定の使用の何れにおいても何歳であってもよい。そのため、豚は、雄豚、雌豚、まだ乳離れしていない子豚、乳離れした豚、育種した(grower)豚および成熟した(finisher)豚からなる群から選択され得る。耐性または非耐性の決定および／またはその同定の使用の何れにおいても、豚はまだ生まれていないか、または1日から1月齢、1-2月齢、2-3月齢、3-4月齢、4-5月齢、5-6月齢、6-7月齢、7-8月齢、8-9月齢、9-10月齢、10-11月齢、11-12月齢、12-14月齢、14-16月齢、16-18月齢、18-20月齢、20-24月齢、2-3年齢、3-4年齢、3-4年齢、4-5年齢、5-6年齢、6-7年齢、7-8年齢または8-10年齢であり得る。
【００８１】
発明の実施態様では、豚は、例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、または15、少なくとも20世代前(generation back)などを含む、少なくとも2世代前のような少なくとも1世代前の祖先が判っている既知の血統である。豚は、高度に同系交配の動物であり得、血統証を有し得る。
【００８２】
本発明の現在の好ましい実施態様では、遺伝的多型はSNPであるかまたはSNPの組合せである。SNPは、例えば、一塩基G/Cの変異多型であり得る。
【００８３】
現在、好ましいSNPは、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997Aおよび配列番号83中のG3277Cからなる群から選択され得る。
【００８４】
SNPについて言及するとき、使用する構文は「配列番号ZZ中のX位置Y」であり、ここで、位置は配列番号ZZ中のSNPのヌクレオチドナンバーであり、そして、Xは非耐性ハプロタイプのヌクレオチドであり、Yは耐性ハプロタイプのヌクレオチドである。例えば、配列番号6中のA1059Gは、配列番号6のヌクレオチド配列のヌクレオチドナンバー1059にSNPが存在し、更に、豚が非耐性ならばヌクレオチドナンバー1059はアデノシンモノホスフェート基であり、豚が耐性ならばヌクレオチドナンバー1059はグアノシンモノホスフェート基であることを意味する。
【００８５】
SNPについてより一般的に言及するとき、構文「X/Y SNP」を用いる。これはSNPについて言及したものであるが、非耐性の豚がSNP位置でXヌクレオチドを有し、耐性の豚がSNP位置でYヌクレオチドを有することを意味する。このため、G/C SNPは、豚が耐性であればグアノシンモノホスフェート基を意味し、豚が非耐性であればシトシンモノホスフェート基を意味する。
【００８６】
本発明により、SNPは、G/C一塩基変異多型、G/A一塩基変異多型、T/C一塩基変異多型、G/T一塩基変異多型、A/T一塩基変異多型またはC/A一塩基変異多型のような任意の一塩基変異多型であり得る。
【００８７】
本発明の実施態様では、方法は更に以下を含む
工程ii)において、ETECに対する耐性と連鎖する第一の遺伝的多型の対立遺伝子に加えて豚が、ETECに対する耐性と連鎖する少なくとも第二の遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合的、異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかをサンプルにおいて決定すること、および
工程iii)において、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の第一の対立遺伝子および／またはETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の少なくとも第二の対立遺伝子と同型接合的であるならば、ETECに対して耐性であると豚を同定すること。
【００８８】
少なくとも第二の遺伝的多型は、少なくとも4、5、6、7、10、20、30または少なくとも50遺伝的多型のような少なくとも3遺伝的多型を含み得る。
【００８９】
好ましい実施態様では、少なくとも第二の遺伝的多型は、一塩基変異多型(SNP)、種々の数の縦列反復多型、分散化反復DNA、挿入、欠失、増幅、再配列、SNPの組合せ、短い縦列反復、ジヌクレオチド反復、分散化反復DNAおよびこれら何れかの組合せからなる群から選択される遺伝的多型である。
【００９０】
少なくとも第二の多型は、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997Aおよび配列番号83中のG3277Cからなる群から選択されるSNPであり得る。
【００９１】
発明の他の実施態様では、少なくとも第二の遺伝的多型はブタFUT1遺伝子内に位置する。
【００９２】
本発明の方法によると、豚から得られるサンプルは、DNAおよび／またはRNA、血液、唾液、組織、咽頭スワブ(throat swap)、精液、およびそれらの組合せを含む物質からなる群から選択され得る。
【００９３】
発明による方法には、遺伝物質を含むサンプルを提供することが含まれる。その物質には、任意の通常の方法または手段により提供され得るブタDNA物質が含まれる。ブタDNA物質は、例えば、血液(例えば、新しいものまたは凍結したもの)、組織サンプル(例えば、脾臓、頬塗抹標本)、小胞細胞を含む髪サンプルおよび精液から抽出、単離および精製され得る。サンプルには、血液、部分的または完全に加水分解された血液、唾液、組織、咽頭スワブ、精液またはそれらの組合せが含まれ得る。
【００９４】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかの決定は、対立遺伝子特異的PCR、ミニシーケンシング、プライマー伸張、パイロシーケンシング(pyrosequencing)、PCR-RFLP、対立遺伝子-特異的ローリングサークル増幅、ARMS(Amplification Refracting Mutation System)、例えば、DNAアレイへのハイブリダイゼーション、DASH(Dynamic Allele-Specific Hybridisation)、融解曲線測定、およびプライマー伸張後のMALDI-TOFマススペクトロメトリーおよびそれら何れかの組合せからなる群から選択される技術を用い行われ得る。
【００９５】
下記の実施例 4では、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合かまたは非キャリアーであるかどうかの決定のため、PCRおよびDASH、それぞれの使用を示す。
【００９６】
一塩基変異および他の型の多型の検出に用い得る多くの方法が存在する。有用な方法についての詳細な記載がAusubel et al. (2000)およびSambrook et al. (1989)で見られ得る。より重要な方法の中には:DNAシーケンシング; 一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)方法; 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)方法; ジデオキシフィンガープリント、制限エンドヌクレアーゼフィンガープリントおよび一定変性剤ゲル電気泳動(constant denaturing gel electrophoresis)(CDGE)がある。変異はまた、分析する核酸に対する、オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションにより検出され得る。
【００９７】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかの決定は、以下の工程の少なくとも１つを含む方法を用い行い得る
a)豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含む;
b)ゲノムDNAを該サンプルから抽出すること;
c)ゲノムDNAの少なくともフラグメントを増幅し、増幅産物を得ること;
d)増幅産物と制限酵素を接触させること;
e)ゲル電気泳動により、得られたフラグメントを分離すること;
f)フラグメントのそれぞれの数および長さを決定すること; および
g)数および長さから多型の存在を決定すること。
【００９８】
決定の方法は、a)、b)、c)、d)、e)、f)およびg)の順番で行い得る。
【００９９】
制限酵素は、Aat II、Bam HI、BgI II、Cla I (Bsu 151)、Dpn I、Eco RI、Eco RV、Esp I (Bpu 1102I)、Hind III、Nco I、Nde I、Not I、Pae I (Sph I)、Pau I、Pst I、Pvu I、Sac I、Sal I、Sma I、Xba IまたはXho Iのような酵素であり得る。
【０１００】
ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子がSNP C1849Gであるとき、制限酵素XbaIが好ましい。
【０１０１】
好ましい実施態様では、ETECは、E. coli F4ab/F4ac、E. coli O149、E. coli F4、E. coli F18、E. coli F5、E. coli F6、E. coli 987P、E. coli F41、E. coli F18ab、E. coli F107、E. coli F18ac、E. coli 2134PおよびE. coli Av24、およびこれらの生物の何れかの組合せからなる群から選択される。
【０１０２】
本発明は更に、本明細書に記載のような単離NA分子の使用および／またはETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子を検出するためのプローブのような、本明細書に記載のようなNAプローブに関係する。
【０１０３】
更に本発明の態様は、PCRに基づく方法におけるプライマー用のNA分子対の使用に関し、ここで、そのPCRに基づく方法は、豚がETECに対し耐性かまたは非耐性かを同定する方法において使用され、該NA分子対は配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択される。
【０１０４】
本発明は本明細書に記載の対の使用に限定されるものではない。それ故、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64および配列番号65中のNA配列は、PCRに基づくプロセスにおけるプライマーとして全て使用し得、そのPCRに基づくプロセスは、豚がETECに対し耐性かまたは非耐性かを同定する方法における工程である。
【０１０５】
また、PCRに基づく方法におけるプライマー用のNA分子対は、配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択されるNA分子を含み得る。
【０１０６】
本発明は本明細書に記載の対の使用に限定されるものではないと理解されるだろう。それ故、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64および配列番号65中のNA配列は、PCRに基づくプロセスにおけるプライマーとして全て使用し得、そのPCRに基づくプロセスは、豚がETECに対し耐性かまたは非耐性かを同定する方法における工程である。
【０１０７】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは、NA配列またはNA配列のフラグメントを含み得、該NA配列は配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64および配列番号65からなる群から選択される。
【０１０８】
有用なプライマーは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196、配列番号197、およびそれらの相補的配列からなる群から選択されるNA配列のフラグメントを含み得る。
【０１０９】
好ましいプライマーは、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101からなる群から選択されるNA配列のフラグメントを含み得る。
【０１１０】
有用なプライマー対は上記のような２つのプライマーを含み得る。好ましくは、これらのプライマーうちの１つは、既述の配列番号のNA配列に相補的である。
【０１１１】
好ましい実施態様では、プライマー対 配列番号62および配列番号63または配列番号64および配列番号65を、ブタMUC4遺伝子の増幅部分として用いる。
【０１１２】
本発明により、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかを決定するためのキットをも提供し、該キットは、本明細書に記載のようなNAプローブ、本明細書に記載のようなNA分子、本明細書に記載のようなPCR-プライマー対、制限酵素およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される第一のコンポーネントを含む。
【０１１３】
有用なプライマーは本明細書に記載のようなプライマーを含み得、そのようなPCR-プライマー対は配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択され得る。
【０１１４】
キットは、制限酵素、pH-緩衝液、ゲル、洗浄緩衝液およびインキュベーション緩衝液、またはそれら何れかの組合せからなる群から選択される少なくとも第二のコンポーネントを更に含み得る。
【０１１５】
キットはまた、制限酵素、pH-緩衝液、ゲル、洗浄緩衝液、インキュベーション緩衝液、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも第三のコンポーネントを更に含み得る。
【０１１６】
更なる態様では、本発明は、ETECに対し耐性である豚を育種するための方法に関係し、該方法は以下を含む
i)第一の豚を選択すること、該豚は、本明細書に記載の方法を用いてETECに対し耐性であると同定されている; および
ii)該第一の豚を第二の豚と共に育種すること、
そして、ランダムに選択した親豚の子孫よりもETECに対し耐性である可能性の高い豚の子孫を得る。
【０１１７】
また、その方法は、本明細書に記載の方法を用い、ETECに対し耐性であると同定した第一の豚を第二の豚と共に育種することにより行い得る。それにより得られた豚の子孫は、ランダムに選択した親豚の子孫よりもETECに対し耐性である可能性が高いであろう。第二の豚の耐性/非耐性について知る必要はない。
【０１１８】
しかし、好ましい実施態様では、第二の豚は、本明細書に記載のような同定方法を用いETECに対し耐性であると同定された豚から選択した豚である。
【０１１９】
本発明により、ETECに対し耐性または非耐性であるとして豚を同定するための豚の物理的マーキングを使用することが有用であり得る。物理的マーキングは、ヒトの目、バーコード、耐性/非耐性の情報を無線で受信装置に送ることができるマーキング装置により読み取ることができる標示を含み得る。
【０１２０】
また更なる態様では、本発明は、アンチセンス-NA、iRNA、リボザイム、遺伝的医薬のためのETC、遺伝子治療またはシネトプラスティックDNA修復のような使用のための本明細書に記載のような単離NA分子に関係する。
【０１２１】
本発明により、豚肉を生産するための方法をも提供し、該方法は、i)本明細書に記載のような、改善した耐性を有する豚の子孫を得ること、およびii)その豚の子孫から豚肉を得ること、の工程を含む。
【０１２２】
本発明により、ETECに対し耐性または非耐性であるとして豚を同定するための豚の物理的マーキングを使用することが有用であり得る。物理的マーキングは、ヒトの目、バーコード、耐性/非耐性の情報を無線で受信装置に送ることができるマーキング装置により読み取ることができる標示を含み得る。
【０１２３】
更なる態様では、発明は、ETECに対し非耐性である豚を治療するための遺伝的多型の使用に関係し、該遺伝的多型は、ブタ染色体13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する。有用な実施態様では、遺伝的多型はマーカーSW207およびS0075に隣接する領域およびそれらを含む領域中に位置する。
【０１２４】
また更なる態様では、本発明はETECに対する非耐性の治療のための可能性ある薬物候補をスクリーニングするための方法に関係し、該方法は以下の工程を含む
i)本明細書に記載のようにETECに対し非耐性であると決定された豚の試験群を選択すること; 
ii)該試験群に可能性ある薬物候補を投与すること; および
iii)試験群における可能性ある薬物候補の効力を評価する。
【０１２５】
本発明により、ブタMUC4タンパク質は薬物として用い、ETECに対し非耐性の豚を耐性とし得る。
【０１２６】
本発明はまた、少なくとも２匹の雄豚の精液を含む雄豚の混合精液を含み、該雄豚は、本明細書に定義のような方法を用いETECに対し耐性であると同定される。その混合に関与する雄豚の数は、少なくとも3、少なくとも4、5、6、7、8、10、12、15、20、25など、少なくとも100などの雄豚であり得る。
【０１２７】
豚における遺伝的多型の存在または非存在の情報は、通常、データ保存媒体に保存され得ると理解されるだろう。データプロセッシングシステムにおける耐性/非耐性の情報は、例えば、豚の飼養、薬物療法または育種を調節するのに使用し得る。
【０１２８】
また、本発明の他の態様は、豚が腸毒素原性または腸病原性E. coli (ETEC)に対し耐性か非耐性かを同定するための方法を提供し、その方法は以下を含む: 
i)該豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含んでいる、;
ii)ETECに対する耐性と連鎖するマーカーの存在または非存在を該サンプルにおいて決定すること、および
iii)ETECに対する耐性と連鎖するマーカーがサンプル中に存在するならば、豚はETECに対し耐性であると推測すること。
【０１２９】
本発明の有用な実施態様では、マーカーは、タンパク質、ホルモンおよび遺伝的多型からなる群から選択される１以上のコンポーネントを含む。コンポーネントがサンプル中に存在するならば、マーカーはサンプル中に存在すると考えられ得る。また、サンプル中のコンポーネントの濃度が、例えば、特定の限界値を超えるか、特定の限界値未満であるか、特定の濃度区間内であるかまたは特定の濃度区間外であるならば、マーカーはサンプル中に存在すると考えられ得る。
【０１３０】
マーカーがタンパク質を含むとき、このタンパク質はブタMUC4、またはブタ ムチン様タンパク質であり得る。タンパク質はまた、適当には、トランスフェリンレセプタータンパク質またはトランスフェリン-レセプター-様活性を有するタンパク質であり得る。
【０１３１】
本発明はまた、ETECに対する耐性と連鎖するマーカーに特異的なプローブを含む。
【０１３２】
プローブは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、レセプター、リガンドからなる群から選択される結合エレメントを含み得る。好ましい実施態様では、プローブは、MUC4タンパク質に特異的な抗体またはリガンドである。
【０１３３】
本発明は、以下の実施例(これらに限定されない)および図面で更に解説する。
【０１３４】
図1は、連鎖マップであり、F4ab/F4ac 遺伝子座の位置(太字)を示す。
図2は、BAC 配列を伴うブタ染色体13(SSC13)およびヒト染色体3(HSA3)の比較マッピングを示す。
図3は、この出願のマッピング結果を用いるSSC13とHSA3との比較マップを示す。
図4は、MUC4 pigEBACのコンティグ(contig)を示す。
図5は、スカホールドとしてヒトMucin4ゲノムを用いた、SNP情報を伴うシーケンシングの状態を示す。一列に並べたブタ配列はエキソンを実線で示し、縦棒はエキソンを示す。
図6は、XbaI多型近辺の配列(配列番号67)を示す。耐性対立遺伝子のSNPは太字およびアンダーラインで示す。
図7は、XbaI多型近辺の配列(配列番号68)を示す。感受性対立遺伝子のSNPは太字およびアンダーラインで示す。
【実施例】
【０１３５】
実施例
実施例1
E. coli ETEC F4ab/F4ac下痢に対する耐性に応答する遺伝子の同定
1.1. 序論
E. coli F4ab/F4ac下痢に対する耐性に応答する遺伝子を特性解析するため、いわゆる「位置的候補遺伝子クローニング(positional candidate gene cloning)」ストラテジー(Collins 1995)が信頼し得ると決定した。出発点は、1995年のEdfors-Lilja and co-workersにより述べられた成果であった。この研究は、Edfors-Lilja分析で使用した同一の交雑雑種血統における豚染色体13(SSC13)連鎖マップでのDNA-マーカー密度の増加により顕著に拡大した。更に、ETEC F4ab/F4acに対する耐性に応答する遺伝子が局在する染色体領域における遺伝子マッピングは顕著に改善された。
【０１３６】
以下において成果を述べる。それは、候補遺伝子の同定のために行い、豚におけるETEC F4ab/F4ac状態と相当に連鎖不平衡である候補遺伝子中の多型を同定をした。
【０１３７】
1.2 連鎖分析
動物
連鎖分析において、我々はEdfors-Lilja et al.(1995)により述べられた血統を用いた。親世代には、ヨーロピアンワイルド(European Wild)の雄豚が２匹含まれていた。それらはそれぞれ、４匹のスウェーデン系ヨークシャーの雌豚とかけ合わせた。F1世代を交雑させ(４匹の雄親および22匹の母親)、F2 子孫は２００匹生まれた。巨大で完全な兄弟姉妹(full-sib)ファミリーを得るために交配を繰り返し、その結果、子孫は２つの出産経歴(parities)において生まれた。
【０１３８】
付着検査
小腸の上部分由来の上皮細胞は、全動物の屠殺後、回収した試料標本から得た。付着検査は、上皮細胞をそれぞれE. coli F4abおよびE. coli F4acと共にインキュベーションすることにより行った。10から20細胞を含むサンプルを、干渉顕微鏡により、E. coli F4ab および E. coli F4acの両方の付着に関して試験した。その結果を１から４でスコアした。ここで、1 = 細菌なしおよび4 = 全ての細胞の刷子縁全体に細菌が付着(Edfors-Lilja et al., 1996)。
【０１３９】
遺伝子型決定
マイクロサテライトマーカー(すなわち、マーカーのコアが２(通常)または少数のヌクレオチドの縦裂に反復する配列であり、種々の対立遺伝子が種々の数の反復を有することにより識別される、マーカー)を連鎖マッピングの遺伝マーカーとして使用した。
【０１４０】
本成果において、ブタ染色体13(SSC13)由来の60のマイクロサテライトマーカーをUSDA 連鎖マップ(Rohrer et al. 1996; http://www.marc.usda.gov/)から選択した。
【０１４１】
60のマーカーのそれぞれから由来する１つのPCRプライマーは、6-FAM、HEXまたはTET(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)の何れかで蛍光的に標識し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、25 ngゲノムDNA、1×PCR緩衝液、1.5-2.0 mM MgCl2、200 μMの各dNTP、0.35 μMの各プライマー、および0.25ユニットAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を含む10 μl 反応体積を用いるPE9600サーモサイクラー(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)またはABI877(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で行った。サーモサイクリング条件は以下のとおりであった: 事前の変性、95℃10分、その後、低いアニーリング温度で10サイクル(95℃15秒、64℃-55℃30秒、72℃60秒)、固定したアニーリング温度で25サイクルの反応(89℃15秒、55℃30秒、72℃60秒)、および72℃で１時間の伸張。
【０１４２】
PCR産物は、4.25% ポリアクリルアミド変性シーケンシングゲルにロードし、ABI PRISM 377 DNAシーケンサーでランした。PCR産物はGeneScan 2 ソフトウェア(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用い分析した。十分に増幅させ、スコアが容易であり、血統のF1-世代において異型接合性が見られる、マーカーを、236匹全ての動物における連鎖マッピングのために選択した。アルファベットの順で、以下のマーカーを使用した:
CP、EST24F05、PR39、S0075、S0076、S0215、S0219、S0222、S0281、S0282、S0291、SW1030、SW1056、SW1864、SW1898、SW207、SW2196、SW225、SW2412、SW398、SW458、SW698、SW769、SW864、SW873、SW882、SW937、SW955、SWR1008、SWR428、SWR926、およびTF。
【０１４３】
遺伝マーカーの詳細な説明は、USDA Meat Animal Research Center(http://www.marc.usda.gov/)のウェブサイトおよび豚ゲノムデータベース(http://www.thearkdb.org/pig)で見ることができる。
【０１４４】
対立遺伝子を指定し、遺伝子型決定データはGEMMAソフトウェア(Iannuccelli, 1996)を用い管理した。遺伝子型決定データはSSC13連鎖マップの構成に使用した。連鎖分析はCRIMAPバージョン2.4(Green et al. 1990)を用い行った。最初に、オプションTWOPOINTを用い、３を超えるlodスコアを有するマーカー間の連鎖を発見した。その後、オプションBUILDを用い、フレームワークマップを構成し、残りのマーカーをオプションALLを用い、組み込んだ。最終的に、遺伝子型はオプションCHROMPICを用いチェックし、そのデータを任意の、あまりない二重組換え体について細かく調べた。
【０１４５】
連鎖分析マップの結果を表 1に示す。
【０１４６】
F4ab/F4ac遺伝子座のデータ(遺伝子の位置が、ETEC F4誘発性疾患に対する耐性/感受性を供与する)を加えると、この遺伝子座にとって最もあり得る位置はS0075の近くであり、これは、次に最善である並び(ETEC F4ab/F4ac遺伝子座はS0075とは離れて位置する)と比較するとlodスコア1.91であることにより支持される。そのため、連鎖分析の結論は、次に続くF4ab/F4acの位置はCEN-SW207-F4ab/F4ac-S0075-TELである。F4ab/F4ac遺伝子座の位置を示す連鎖マップを図 1に示す。
表1. 得られた連鎖マップ(性別で平均化)
【表１】
2006506991.tif 000002
【０１４７】
1.3 細胞遺伝学的マッピング
E. coli F4ab/F4ac下痢に対する耐性に応答する遺伝子を含む領域の物理的マップを得るために、F4ab/F4ac 遺伝子座周辺のマイクロサテライトマーカーを用い、豚 BAC ライブラリー(Anderson et al. 2000)をスクリーニングした。豚 BAC ライブラリーは、豚ゲノムDNAの巨大フラグメントの収集物(平均サイズ = 150,000 塩基対)であり、その各フラグメントはE. coli 細菌のクローン中で不死化した細菌性人工染色体(BAC)クローニングベクター中に保持する。 
【０１４８】
本発明の研究では、Roslin pigE BAC ライブラリー(96-ウェルおよび384-ウェルマイクロプレート中の各クローンとして保存されるおよそ100,000の独立のBACクローンからなる)を使用した。このライブラリーは豚ゲノムのおよそ５倍の範囲である。BACクローンは、BAC クローン由来のDNAプールにおいてマーカーSw207、S0283、S0075、Sw1876およびSw225由来のPCRプライマーを用い同定した。
【０１４９】
DNAは、Qiagen Plasmid Midiprep kit(Qiagen, Germany)を用いマーカー-陽性BACクローンから抽出し、BACはそれぞれビオチン-14-dATPまたはジゴキシゲニン-11-dUTP (Boehringer-Mannheim, Germany)で標識されており、それらは、ブタの中期および間期の染色体に対する単色および二色、両方の蛍光イン シトゥーハイブリダイゼーション(FISH)分析であった(Chowdhary et al., 1995で記載されるように)。
【０１５０】
身体的オーダー(physical order)のマーカー、すなわち、CEN-Sw207-S0283-S0075-Sw1876-Sw225-TELは連鎖データと一致した。マーカーSw207、S0283およびS0075を含むBACは全て豚染色体13のバンドq41にハイブリダイズし、これは候補領域であることを示す。本明細書に記載のマーカーを増幅するためのプライマーを表 2に列挙している。
【０１５１】
表 2 本発明に関連する配列
【表２】
2006506991.tif 000003
【表３】
2006506991.tif 000004
【表４】
2006506991.tif 000005
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１５２】
1.4 比較マッピング
E. coli F4ab/F4ac下痢に対する耐性に応答する遺伝子の調査を促進することが、ヒトゲノム全体の配列により示される莫大な量の配列情報の利点の獲得を決定づける。
【０１５３】
この情報を活用するために、ブタ染色体13(SSC13)およびヒト染色体3(HSA3)の関連部分における遺伝子の比較マッピングを行った。
【０１５４】
FISH検証(verified)BAC由来のDNAをSau3AIを用い消化し、フラグメントをpUC19のBamHI部位にライゲーションし、Epicurian Coli XL1-BLUE細胞(Stratagene)中に形質転換した。その形質転換体をLBアンピシリンプレートにプレートし、約100のサブクローンをランダムにピックした。プラスミドDNAを、Qiaprep spin miniprep kit(Qiagen, Germany)を用いサブクローンから単離した。プラスミドベクターにクローニングした挿入物を、T3およびT7プライマーならびにBigDye terminator sequencing(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用い配列決定し、ABI377(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で電気泳動した。得られた配列を、NCBIウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の豊富ではないヌクレオチドデータベースに対してBLAST化した。
【０１５５】
BACのショットガンシーケンシングで同定した遺伝子を表 3に列挙する。
【０１５６】
表 3. 単離BACクローンで同定された遺伝子
【表９】
2006506991.tif 000010
【０１５７】
ヒトデータはEntrez Genome view build 30(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/Entrez/map_search)から入手した。DNA配列データベースのこれらの調査で発見されたヒト遺伝子(例えば、TRAD)の詳細はLOCUSLINK(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)およびEnsembl(http://www.ensembl.org/)を含む幾つかのWebサイトで見つけ得る。SSC13はブタ染色体13であり、HSA3はヒト染色体3である点に注意。
【０１５８】
豚BACクローンから得られた配列とヒトゲノム配列とのマッチに基づき、SSC13とHSA3との比較マップを図示した。図2参照。
【０１５９】
1.5 比較的良好なマッピング
SSC13とHSA3との比較マップを更に改良するために、KIAA0804、TRADおよびSEC22Aに類似することが判ったショットガンシーケンシングにより得られた配列を選択した。加えて、遺伝子との配列類似性に基づくSSC13に対するマッピングを予測する発現配列タグ(ESTs)および相同的ヒト染色体(HSA3)に対しマッピングすることが既知であるESTsを、ブタ小腸ESTsの我々の源から選択した(Wintero et al., 1996; Wintero & Fredholm、未発行)。
【０１６０】
選択の基準は、各クローンの5' cDNA配列が、豊富ではないヌクレオチドデータベースに対するBLASTネットワークサービスを用い、ヒトオーソロガス遺伝子と顕著な配列同一性(期待値< e-6)を有することであった。
【０１６１】
プライマーは、豚特異性が増大するために選択クローン(表 4参照)の3' UTR領域で設計した。プライマー3ウェブサイト(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi(Rozen and Skaletsky, 2000))をプライマーの設計に使用した。豚体細胞ハイブリッドパネル(Yerle et al., 1996)および豚放線ハイブリッドパネル(IMpRH)(Yerle et al., 1998)を領域指定およびマッピングに使用した。PCR条件は、豚、マウスおよびハムスターゲノムDNAを用い最適化した。PCRは、体(somatic)および放線パネル、それぞれの各ハイブリッド系由来のDNA10 ngおよび25 ngで行った。PCR条件は: 0.35μMの各プライマー、2から4 mMのMg2+ および0.05ユニットのHotStartTaq(Qiagen, Germany)、反応体積10 μl、タッチダウン(TD) 60または64で35サイクルであった。PCRは、更なるサイクルにおいて95℃15分の初期変性、およびその後に95℃15秒により行った。伸張は、72℃1分で行った。タッチダウンは、最初の10サイクルの各サイクルの後にアニーリング温度を1℃下げ、TD64およびTD60でそれぞれ64℃または60℃で開始することにより行った。最後の25サイクルは、TD64およびTD60のそれぞれでアニーリング温度54℃または50℃で行った。
【０１６２】
増幅産物は2 %アガロースゲルで分離し、手動でスコアした。PCR結果は直接SCHおよびRHデータ分析プログラム(それぞれhttp://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/pcr/pcr.htm および http://imprh.toulouse.inra.fr/)に導入した。領域指定は、Chevalet et al. (1997)により開発されたコンピュータープログラムを用いることにより行った。 放線ハイブリッドPCR産物の結果は、Milan et al. (2000)により開発されたIMpRHマッピングツールで分析した。遺伝子およびその位置を表 4に示している。
【０１６３】
4のマッピング結果を用いるSSC13とHSA3との比較マップを図3に示す。
【０１６４】
先に報告された比較データをこの研究により得られるデータに加える(Sun et al. 1999; Van Poucke et al. 1999, Pinton et al. 2000, Van Poucke et al. 2001)と、SSC13とHSA3との総合的な比較マップがコンパイルされた。候補領域(SCC13q41)にクローズアップすると、HSA3における候補領域はq21およびq28-qtelであることが証明された。
【０１６５】
1.6 候補遺伝子
豚のETEC F4ab/F4ac状態に関する可能な候補遺伝子についての文献を調査すると、ETEC F4ab/F4acに対する感受性と関係するタンパク質について幾つか報告がある(Metcalfe et al., 1991; Grange and Mouricout, 1996; Francis et al., 1998; Grange et al., 1998)。ある報告では、それはトランスフェリンファミリーに属する74-kDaのグリコタンパク質であることを示し(Grange and Mouricout, 1996)、あるグループは、40 kDaのグリコタンパク質であることを示唆し(Metcalfe et al., 1991)、そしてより最近の研究ではムチン型シアロ糖タンパク質であることが指摘されている(Francis et al. 1998; Grange et al. 1998)。これらの報告を考慮すると、トランスフェリン-様-遺伝子または ムチン-様遺伝子の何れかに遺伝子の調査を集中すべきであることが明かである。連鎖および比較データを加えるならば、HSA3の候補領域由来のある遺伝子、すなわち、Hsa3q29のムチン4(MUC4)は、位置的な候補(positional candidate)となる。
【表１０】
2006506991.tif 000011
【０１６６】
実施例2
ブタMUC4遺伝子のクローニング
2.1 MUC4を含む豚BACのスクリーニング
MUC4遺伝子が本当にE. coli ETEC F4ab/F4ac下痢に対する耐性に応答する遺伝子であるかどうかを調査するために、遺伝子の大部分をクローン化し、配列決定した。
【０１６７】
ヒトMUC4 cDNAの3229 bp RACE PCR フラグメントを含むプラスミド S1325(Moniaux et al., 1999)はJ.P. Aubert教授から頂いた。そのフラグメントは、ヒト腸粘膜細胞由来のトータルRNAを用い合成した。Advantage(商標) RT-for-PCR kit(Clontech, Heidelberg, Germany)を用い、第一鎖cDNAをRNA 1μgから5'/3'-RACE kit(Boehringer Mannheim, Roche Diagnostics, Meylan, France)のオリゴ(dT)-アンカープライマーを使用して合成した。Expand long PCRを、Expand(商標) Long Template PCR System (Boehringer Mannheim)をセンスプライマーNAU 491(5'-AGCAGGCCGAGTCTTGGATTA-3'、配列番号50)と共に使用し行い、アンチセンスプライマーとして、5'/3'-RACE kitのPCRアンカープライマーを用いた。PCR増幅反応混合物(50 μl)には5 μlのcDNA、10 mM dNTPナトリウム、0.4 μMの各プライマー、5 μlの10×Expand(商標) Long Template PCR 緩衝液 3、0.75 mM MgCl2および2.5ユニットの酵素混合物が含まれていた。PCRはPerkin-Elmer Thermal Cycler Gene Amp(登録商標) PCR System 9700を用い行った。PCRパラメーターは、94℃2分、その後、94℃30秒、アニーリング60℃45秒そして伸張71℃4分を30サイクル行い、最後の20サイクルは各新規のサイクルのために伸張時間を40秒延ばし、その後、最終伸張を71℃15分とした。ネスト化PCRはNAU 483(5'-CTGTTTCTCTACCAGAGCGGT-3'、配列番号51)およびPCRアンカープライマーを用い行った。増幅産物は1% TBE(1×TBE = 45 mM Tris/ホウ酸/1 mM EDTA) アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロミドで染色した。バンドを切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用い精製し、Original TA Cloning(登録商標) Kit (Invitrogen, Leek, The Netherlands)にサブクローニングした。挿入物を精製し、32P-dCTPを用いランダムに標識した。
【０１６８】
UK HGMP Resource Centre (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/geneservice/reagents/products/ descriptions/pig_BAC.shtml)により提供される豚BACライブラリー(Anderson et al., 2000)の高密度グリッドフィルター(high density gridded filter)はヒト MUC4 プローブとハイブリダイズした。
【０１６９】
４つの陽性BACクローンを選択し、表 5に列挙する。
【０１７０】
表 5 ムチン4陽性豚EBACクローン
クローン名
PigEBAC53f14
PigEBAC104b01
PigEBAC222b07
PigEBAC250f16
【０１７１】
2.2 MUC4豚 E BAC クローンのコンティグ
４つのMUC4 豚 E BAC クローンのそれぞれから由来するサブクローンと共に４つのMUC4 豚 E BAC クローンの末端を、BigDyeターミネーター化学を用い配列決定し、配列タグ化部位(STSs)を得た。STSsを表 6に列挙する。
【０１７２】
表 6 BAC コンティグに使用するSTSs
【表１１】
2006506991.tif 000012
【０１７３】
これは、どのようにBAC クローンがオーバーラップするか部分的に決定し得る。コンティグを図. 4に示す。
【０１７４】
BAC 末端配列から、PigEBAC250f16はMUC4 遺伝子に5’-トランケーションがあることが判った。PigEBAC 53f14 および 222b07はMUC4の遺伝子上流、すなわち、ACK1が含まれており、それ故、これらのクローンは、全豚ゲノムMUC4配列を含む良好な候補であった。そのより小さなサイズにより、クローン222b07を更なるシーケンシング用に選択した。
【０１７５】
2.3 PigEBAC222b07のショットガンシーケンシング
BAC DNAは、Qiagen Large-construct kit(Qiagen, Germany)を用い調製し、BAC DNAは、TOPO shotgun subcloning kit(Invitrogen, CA, USA)を用いサブクローニングした。クローンをLBアンピシリンプレートにプレートし、1536 クローンを４つの384-ウェルプレートにピックした。プラスミド調製はQiaprep spin miniprep kit(Qiagen, Germany)を用い行った。挿入物は、T3 および T7プライマー ならびに BigDye ターミネーターシーケンシング(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用い配列決定し、ABI3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)で電気泳動した。
【０１７６】
作製したトレースファイル(tracefile)をベースコール(base call)し、クオリティーはPHRED (Ewing et al., 1998)を用いチェックし、ベクター配列を、CROSS MATCH(http://www.phrap.org/)を用いマスクアウト(mask out)し、配列はPHRAP(http://www.phrap.org/)を用いコンティグにアセンブルし、CONSED (Gordon et al. 1998)を用い見た。すべて配列を作製した(すなわち、コンティグおよびシングレット)。配列は、NCBIウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)の豊富ではないヌクレオチドデータベースに対しBLASTサーチした。加えて、ヒトMUC4ゲノム配列(GenBank accession AJ430032, AJ430033, AJ430034)を用いるFASTA33サーチを行った。
【０１７７】
約1200サブクローンを配列決定し、ブタMUC4の25のエキソン全ての配列を、豚配列とヒトMUC4遺伝子の配列との比較により同定した。我々は、エキソン1 および 25を除く全てのエキソンの全配列情報を有する。更に、我々は、全てのイントロンの配列情報を有し、我々は、イントロン 1、11、14、16、19 および 24を除く全ての情報を有する(表 2、「本発明に関連する配列」)。
【０１７８】
実施例3
E. coli ETEC F4ab/F4ac下痢に対する耐性と連鎖するMUC4 遺伝子における多型の同定
E. coli ETEC F4ab/F4ac下痢に対する耐性に連鎖するブタMUC4遺伝子における可能な遺伝的変異を同定するために、実施例 2で得た配列情報を既述のように活用した。
【０１７９】
エキソン4 および 8の配列を作製した後、以下のPCRプライマーを設計した:
SSMUC4_ex4U : 5'- GAC TTC ACC TCG CCA CTC TT (配列番号60)
SSMUC4_ex8L : 5'- CGA TAC TTC TCC CAC ACT GG (配列番号61)
【０１８０】
豚ゲノムDNAにこれらのプライマーを用い、およそ4 kb長の範囲のPCR産物を、Elongase(Invitrogen, CA, USA)を用い作製した。最初の変性は、94℃2分であり、94℃30秒、60℃1分、68℃10分の35サイクルであった。増幅後、種々の制限酵素を動物由来の増幅フラグメントで試験し、既知のF4ab/F4ac 遺伝子型およびXbaI多型を発見した。
【０１８１】
3.1 MUC4による連鎖分析
連鎖分析に使用した血統を、XbaI多型について遺伝子型決定し、F4ab/F4acによる完全な共分離を示した。複数の点分析(multi-point analysis)では、Sw207とS0075との間にMUC4が確実に位置し、F4ab/F4ac遺伝子座との組み換えは見られなかった。
【０１８２】
3.2 連鎖不平衡
連鎖マッピングした血統の10匹の親動物では、18 染色体は既知のF4ab/F4ac状態を有する(すなわち、染色体領域は感受性かまたは耐性の何れかであることが知られる)。F4ab/F4ac 遺伝子座近辺のハプロタイプではMUC4との連鎖不平衡は最大となる。フィッシャーの直接確率検定を使用した観察での確率はP=0.00005である。その領域における他のマーカーでは、同程度の連鎖不平衡は見られない。
【０１８３】
3.3 RT-PCR
相補的DNAは、空腸、回腸および結腸の粘膜組織から単離したRNAから合成した。SSMUC4_ex4U/SSMUC4_ex8Lプライマーを使用し、種々の組織由来のcDNA 5 ngのPCRにおいて、総体積20 μl中、1x PCR 緩衝液、200 μMの各dNTP、0.4 μMの各プライマー および 0.25ユニット HotStarTaq(Qiagen, USA)を用いた。
【０１８４】
サーマルサイクリングは、95℃15分の最初の変性、その後、更なるサイクルにおいて、95℃15秒を用い行った。伸張は72℃1分で行った。タッチダウンは、最初の10サイクルの各サイクル後にアニーリング温度を1℃下げることにより行い、60℃で開始した。最後の25サイクルはアニーリング温度50℃で行った。
【０１８５】
2% アガロースゲルでの電気泳動により、３つ全ての組織に約600bpのRT-PCR産物が見られた。
【０１８６】
この結果により、ムチン4は豚の空腸、回腸 および結腸で発現したことが明らかに判った。
【０１８７】
3.5 XbaI-多型の特性解析
PCR およびPCR産物のシーケンシングを用いることにより、ゲノム配列は、使用血統由来の既知のF4ab/F4ac遺伝子型を有する豚により得られた。MUC4-遺伝子のゲノム配列において17の多型が発見された。領域エキソン5 からエキソン8において、２つのMUC4-ハプロタイプ(少なくとも14の単一のヌクレオチド置換および6 bp欠失により異なっている)が述べられ得る。これらハプロタイプのうちの１つは、E. coli F4ab/F4ac 下痢に対する耐性対立遺伝子と一致しており、他方のハプロタイプは我々のファミリー材料(family material)におけるE. coli F4ab/F4ac 下痢に対する感受性と一致する。図5において、現在のシーケンシングの状態が、スカホールドのようなヒト MUC4のゲノム編成を用い示される。
【０１８８】
表7A-Dでは、２つのハプロタイプ間の相違を示す。
【０１８９】
表 7A. 多型の位置  その位置は、配列番号6および配列番号8の２つの配列に関連する。配列番号6の多型は、ヒトMUC4遺伝子のイントロン5の類似性を示す配列の一部を示す。配列番号8の多型は、ヒトMUC4遺伝子のイントロン7の類似性を示す配列の一部を示す。
【０１９０】
【表１２】
2006506991.tif 000013
【０１９１】
表 7B. 多型の位置  その位置は、配列番号82の配列に関連する。多型は、ヒト MUC4 遺伝子のイントロン5の類似性を示す配列番号82の一部を示す。
【表１３】
2006506991.tif 000014
【０１９２】
表 7C. 多型の位置  その位置は、配列番号83の配列に関連する。多型は、ヒト MUC4 遺伝子のイントロン6の類似性を示す配列番号83の一部を示す。
【表１４】
2006506991.tif 000015
【０１９３】
表 7D. 多型の位置  その位置は、配列番号83、87 および 88の配列に関連する。配列番号83の２つの多型は、ヒト MUC4 遺伝子のイントロン7の類似性を示す配列の一部を示す。従って、配列番号87 および 88の多型は、イントロン15 および エキソン18にそれぞれ関連する配列の一部を示す。
【表１５】
2006506991.tif 000016
【０１９４】
実施例4
MUC4-遺伝子における耐性および感受性対立遺伝子を識別するDNAに基づくアッセイ
MUC4 多型の確認の促進のために、MUC4-遺伝子における耐性および感受性対立遺伝子を識別する種々の試験を開発した。発見された最初のSNPは配列#8(イントロン 7)中の1849位にあった。このSNPは、耐性対立遺伝子中にXbaI制限部位を生ずる。そのSNPは長期間(long-range)PCR-RFLP(実施例 3参照)を用い発見され、更なる特性解析後、より迅速に遺伝子型決定し得る単純なPCRに基づく試験を開発した。更に、粗DNA調製物の遺伝子型決定をし得る動的な対立遺伝子-特異的ハイブリダイゼーションアッセイを開発した。1849位 SNPあたりの共通配列を図. 6 および 7に示す。
【０１９５】
4.1 PCR-RFLP
PCR-RFLPアッセイでは、豚由来の25 ngゲノムDNA におけるPCRを、総体積20 μlにおいて1x PCR緩衝液、200 μMの各dNTP、0.4 μMの各プライマー および 0.25ユニット HotStarTaq (Qiagen, USA)を用い行った。プライマー配列は以下の通りである:
Muc4_in7u: 5'-GTG CCT TGG GTG AGA GGT TA -3'  (配列番号62)
Muc4_in7l: 5'-CAC TCT GCC GTT CTC TTT CC -3'  (配列番号63)
【０１９６】
サーモサイクリングは開始変性95℃15分を用い、その後、更なるサイクルにおいて95℃15秒を行った。伸張は72℃1分行った。タッチダウンは、最初の10サイクルの各サイクル後にアニーリング温度を1℃下げることにより行い、60℃で開始した。最後の25サイクルはアニーリング温度50℃で行った。豚ゲノムDNAから得たPCR産物は367 bpであり、PCR産物10 μlを、供給業者(New England Biolabs, MA, USA)の推奨のようにXbaI消化に使用する。XbaIによる消化後、フラグメントは:
耐性対立遺伝子   : 367 bp
感受性対立遺伝子 : 151 bp、216 bp
である。
【０１９７】
以下のパターンが３種類の遺伝子型で観察される:
耐性              : 367 bp
感受性異型接合体  : 151 bp、216 bp、367 bp
感受性同型接合体  : 151 bp、216 bp
【０１９８】
4.2 動的対立遺伝子-特異的ハイブリダイゼーション(DASH)アッセイ
DASHは、Howell et al. (1999)に記載のように、そして1849位 SNPに隣接するプライマーの使用により行い、条件は以下の通りであった:
ビオチン標識化フォワードプライマー: 
5'-ビオチン-GGCAATGACTTATCTATTTGTACC-3'  (配列番号64)
リバースプライマー: 5'-GTATATTACAACAACCCCATGAAGG-3'  (配列番号65)
C 対立遺伝子に特異的なプローブ: 5'-CCATTCTAGAGATACAG-3'  (配列番号66)
【０１９９】
PCRは以下の試薬を用い20 μl中で行った:
水                                               13.52 μl
MgCl2 (25mM)                                      0.80 μl
10xPCR緩衝液                                      2.00 μl
ビオチン-標識化フォワードプライマー(2,5 pmol/μl)  0.80 μl
非標識化リバースプライマー (15 pmol/μl)           0.80 μl
Taq ポリメラーゼ (5 ユニット/μl)                  0.08 μl
DNA (10-25 ng/μl)                                 1.00 μl
dNTP混合物(それぞれ4 mM)                          1.00 μl
合計                                              20.00 μl
【０２００】
サーマルサイクリングは、95℃15分の最初の変性、その後、更なるサイクルにおいて、95℃15秒を用い行った。伸張は72℃1分で行った。タッチダウンは、最初の10サイクルの各サイクル後にアニーリング温度を1℃下げることにより行い、60℃で開始した。最後の25サイクルはアニーリング温度50℃で行った。
【０２０１】
PCR後、10 μlのHEN 緩衝液(0.1 M HEPES、50 mM NaCl、10 mM EDTA pH=8.0)および10 μlのPCR産物を、ストレプトアビジン被覆化マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、+4℃で16時間インキュベートした。PCR 混合物を取り除き、50 μlの0.1 M NaOHを加え、1-5分間インキュベーションし、取り除いた。次いで、そのプレートを50 μlのHEN 緩衝液で洗浄した。DASH 緩衝液 (10 ml HEN 緩衝液中、1 μl SybrGreen (Molecular Probes, OR, USA))(49 μl)および1 μlの対立遺伝子特異的プローブ(30 pmol/μl)を各ウェルに添加した。サンプルを85℃に加熱し、10分以内に、20℃と25℃との間に冷却させた。サンプルを50 μl HEN 緩衝液で洗浄し、50 μl DASH 緩衝液を添加した。DASHは熱速度設定(heat rate set)0.03および熱の範囲35℃から90℃で行った。
【０２０２】
4.3 確認
試験は、豚血統材料(pig pedigree material)において証明し、先に記載したように、F4ab/F4acとMUC4との間で連鎖不平衡は最大となった。更に、13匹の関連しない豚を付着検査で試験すると、スコア4 (すなわち、強力な付着)であり、それらは全て少なくとも１コピーの感受性ハプロタイプを有していた。E. coli O149、F4ac 下痢を伴う２０匹の子豚はまた、MUC4 遺伝子座において遺伝子型決定され、全て感受性ハプロタイプを有していた。９匹の耐性動物を試験し、全ての動物で全く付着なしか少しの付着が見られた。中国の豚品種Meishanは耐性であるという先の報告を試験するために、２匹の雌豚を試験し、その両方は耐性ハプロタイプについて同型接合であることが判った。
【０２０３】
実施例5
一群の研究
長期間PCR-RFLP試験には、デンマークの４つの主な商業用品種からの限定数の動物を用いた。E. coli F4ab/F4ac 感受性対立遺伝子の算出された頻度を表 8に示す。
【０２０４】
表 8. 1849位のC 対立遺伝子の頻度(ETEC F4ab/F4ac 感受性)
【表１６】
2006506991.tif 000017
【０２０５】
結論
F4ab/F4ac 遺伝子座は、連鎖分析により確実に位置づけ、ムチン 4は位置的に強力な候補遺伝子であった。RT-PCRの使用による発現分析により、明らかに、MUC4は豚の腸粘膜で発現することが判った。ムチン 4のイントロン5および7において多型が発見され、遺伝子の２つのハプロタイプが示された。その２つのハプロタイプ間の相違により、少なくとも14の置換が見られ、これは、異なる起源、すなわち、アジアンおよびヨーロピアンのハプロタイプであるこを示している。ファミリー材料中の２つの元(founder)の野生雄豚は、ETEC F4ab/F4acに対し同型接合性耐性であり、それらは、MUC4-遺伝子に関し同じハプロタイプを共有する。２匹のヨークシャー 雌豚は異型接合性ETEC F4ab/F4ac感受性であり、これら２匹の雌豚は何れも耐性であり感受性ハプロタイプであった。他のヨークシャー 雌豚は同型接合性であり、全てMUC4-遺伝子の同一ハプロタイプを有していた。関連性のない市場の豚の配列決定が他のハプロタイプに寄与することはなかった。Chinese Meishan 豚の遺伝子型決定は、E. coli F4ab/F4acに対し耐性であるこの品種と一致した。
【０２０６】
実施例6
新規遺伝的多型の同定
本発明により提供される技術的意味を供するため、新規遺伝的多型は以下の手順により容易に同定される。
【０２０７】
ショットガンシーケンシングを続け、PigEBAC222b07全体を１つのコンティグにアセンブルする。ブタのムチン 4のゲノム配列全体が示されるだろう、そして25のエキソンのそれぞれに隣接するPCRプライマーを設計する。25のエキソンを、異なるムチン 4遺伝子型を有する動物で配列決定する。エキソン配列の比較により、コーディングSNPが示されるだろう、そして連鎖マッピングに使用される血統においておよび更なる無関係の動物において試験する。
【０２０８】
ムチン 4 遺伝子に隣接する領域もまた配列決定されるだろう、そしてこれらの領域中のSNPを連鎖不平衡について試験する。
【０２０９】
最大の連鎖不平衡が見られる領域では、豚染色体13におけるムチン 4領域に隣接するSNPを用い特性解析がされるだろう。
【０２１０】
リアルタイムRT-PCRを用いると、３種類全てのムチン 4 ハプロタイプのMUC4発現プロファイルが評価されるだろう。
【０２１１】
トランスフェクション研究、および種々のブタのムチン 4 遺伝子変異体を用いるトランスジェニック動物を使用すると、ムチン 4変異体とETEC F4ab/F4ac状態との関係が証明されるだろう。
【０２１２】
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【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図1は、連鎖マップである。
【図２】図2は、ブタ染色体13(SSC13)およびヒト染色体3(HSA3)の比較マッピングである。
【図３】図3は、SSC13とHSA3との比較マップである。
【図４】図4は、MUC4 pigEBACのコンティグである。
【図５】図5は、SNP情報を伴うシーケンシングの状態である。
【図６】図6は、XbaI多型近辺の配列(配列番号67)である。
【図７】図7は、XbaI多型近辺の配列(配列番号68)である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月6日(2004.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸毒素原性E. coli(ETEC)に対する耐性と連鎖する、遺伝的多型の対立遺伝子を含む単離核酸(NA)分子、ここで、該遺伝的多型は、ブタ染色体SSC13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する。
【請求項２】
ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子により、対立遺伝子に関して同型接合性である豚がETECに対し耐性となる、請求項１の単離NA分子。
【請求項３】
単離NA分子は、少なくとも3.0のlodスコアを有する、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子を含む、請求項１または２の単離NA分子。
【請求項４】
単離NA分子が、ブタMUC4遺伝子中に位置するNA配列を含む、請求項１または３の単離NA分子。
【請求項５】
単離NA分子が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号67、配列番号68、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135、配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143、配列番号144、配列番号145、配列番号146、配列番号147、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153、配列番号154、配列番号155、配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159、配列番号160、配列番号161、配列番号162、配列番号163、配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167、配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171、配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175、配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179、配列番号180、配列番号181、配列番号182、配列番号183、配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187、配列番号188、配列番号189、配列番号190、配列番号191、配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195、配列番号196および配列番号197 、それらの相補的配列およびそれら何れかのフラグメントからなる配列の群から選択される配列と、同一または少なくとも90 % 相同性を有するNA配列を含む、請求項１または４の単離NA分子。
【請求項６】
単離NA分子が、ETECに対し耐性である豚とETECに対し非耐性である豚とを識別するNA配列を含む、請求項１から５の何れかの単離NA分子。
【請求項７】
請求項１から６の何れかの単離NA分子のフラグメントに相同的であるNA配列を含む、NAプローブ。
【請求項８】
NAプローブが、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997A、配列番号83中のG3277Cおよびそれらの相補的配列からなるSNPの群から選択された少なくとも１つのSNPの対立遺伝子に特異的である、請求項７のNAプローブ。
【請求項９】
配列番号66のNA配列またはその相補的配列に相同的なNA配列を含む、請求項７のNAプローブ。
【請求項１０】
豚がETECに対し耐性であるかどうかを同定する方法であって、該方法は以下を含む
i)該豚から得たサンプルにおいて、該サンプルは遺伝物質を含んでいる、
ii)該サンプルを使用することにより、豚がETECに対する耐性と連鎖する、遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるかどうかを決定すること、該遺伝的多型は、ブタ染色体SSC13におけるマーカーSW2196およびSW225の間の領域およびそれらを含む領域中に位置する、および
iii)豚が耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合であるならば、ETECに対して豚が耐性であると同定すること。
【請求項１１】
方法は、豚が、ETECに対し非耐性かどうか、耐性のキャリアーまたは非キャリアーであるかどうかを同定することを更に含み、更に、
iv)該サンプルを使用することにより、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子と異型接合的であるかまたはその非キャリアーであるか決定すること、および
v)
a)豚が耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子の非キャリアーならば、ETECに対し非耐性であり、耐性の非キャリアーであるとして豚を、または
b)豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子に異型接合的であるならば、ETECに対し非耐性であるが耐性のキャリアーであるとして豚を
同定すること、
を含む、請求項１０の該方法。
【請求項１２】
ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型がマーカーSW207およびS0075に隣接する領域およびそれらを含む領域中に位置する、請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
遺伝的多型が少なくとも3.0のlodスコアでETECに対する耐性と連鎖する、請求項１０から１２の何れかの方法。
【請求項１４】
遺伝的多型がブタMUC4遺伝子中に位置する、請求項１０から１３の何れかの方法。
【請求項１５】
ETECに対する耐性が、ETECによる腸管癒着症に対する耐性、ETECによる腸コロニー形成に対する耐性、ETECが原因の下痢のような腸障害に対する耐性およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される耐性である、請求項１０から１４の何れかの方法。
【請求項１６】
豚が、サス・スクロファ(イノシシ科)、ヨークシャー、デンマーク系ヨークシャー、デンマーク系デュロック、ランドレース、デンマーク系ランドレース、ホワイト・デーニッシュ・ランドレース、黒いぶちのデンマーク系ランドレース、ハンプシャー、デンマーク系ハンプシャー、ポーランド・チャイナ、ヘレフォードおよびそれら任意の交雑育種からなる豚の群から選択される、請求項１０から１５の何れかの方法。
【請求項１７】
豚が、雄豚、雌豚、乳離れしていない子豚、乳離れした豚、育種した豚および成熟した豚からなる群から選択される、請求項１０から１６の何れかの方法。
【請求項１８】
遺伝的多型が、一塩基変異多型(SNP)、種々の数の縦列反復多型、分散化反復DNA、挿入、欠失、増幅、再配列、SNPの組合せ、短い縦列反復、ジヌクレオチド反復、分散化反復DNAおよびこれら何れかの組合せからなる群から選択される遺伝的多型である、請求項１０から１８の何れかの方法。
【請求項１９】
遺伝的多型がSNPであるかSNPの組合せである、請求項１９の方法。
【請求項２０】
SNPが一塩基G/C多型である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
SNPが、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997Aおよび配列番号83中のG3277Cからなる群から選択される、請求項１９の方法。
【請求項２２】
更に、
請求項１０の工程ii)において、ETECに対する耐性と連鎖する第一の遺伝的多型の対立遺伝子に加えて豚が、ETECに対する耐性と連鎖する少なくとも第二の遺伝的多型の対立遺伝子と同型接合的、異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかをサンプルにおいて決定すること、および
請求項１０の工程iii)において、豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の第一の対立遺伝子および／またはETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の少なくとも第二の対立遺伝子と同型接合的であるならば、ETECに対して耐性であると豚を同定すること
を含む、請求項１０から２１の何れかの方法。
【請求項２３】
少なくとも第二の遺伝的多型が、少なくとも4、5、6、7、10、20、50または少なくとも50遺伝的多型のような少なくとも3遺伝的多型を含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
少なくとも第二の遺伝的多型が、一塩基変異多型(SNP)、種々の数の縦列反復多型、分散化反復DNA、挿入、欠失、増幅、再配列、SNPの組合せ、短い縦列反復、ジヌクレオチド反復、分散化反復DNAおよびこれら何れかの組合せからなる群から選択される遺伝的多型である、請求項２２または２３の方法。
【請求項２５】
少なくとも第二の多型が、配列番号6中のA1059G、配列番号6中のT1125G、配列番号6中のA1134G、配列番号6中のC1138G、配列番号8中のC1849G、配列番号8中のC2129T、配列番号82中のA4847G、配列番号82中のT4913G、配列番号82中のA4922G、配列番号82中のC4926G、配列番号83中のA1659T、配列番号83中のT1666G、配列番号83中のC1684A、配列番号83中のT1740A、配列番号83中のC1795T、配列番号83中のT1820G、配列番号83中のC1912T、配列番号83中のG2997Aおよび配列番号83中のG3277Cからなる群から選択されるSNPである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
少なくとも第二の遺伝的多型がブタFUT1遺伝子中に位置する、請求項２２から２４の方法。
【請求項２７】
サンプルが、DNAおよび／またはRNA、血液、唾液、組織、咽頭スワブ、精液、およびそれらの組合せを含む物質からなる群から選択される、請求項１０から２６の何れかの方法。
【請求項２８】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかの決定の工程が、対立遺伝子特異的PCR、ミニシーケンシング、プライマー伸張、パイロシーケンシング、PCR-RFLP、対立遺伝子-特異的ローリングサークル増幅、ARMS(Amplification Refracting Mutation System)、例えば、DNAアレイへのハイブリダイゼーション、DASH(Dynamic Allele-Specific Hybridisation)、融解曲線測定、プライマー伸張後のMALDI-TOFマススペクトロメトリーおよびそれら何れかの組合せからなる群から選択される技術を用い行われ得る、請求項１０から２７の何れかの方法。
【請求項２９】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかの決定の工程を含む、請求項１０から２８の何れかの方法であって、該方法は以下の工程の少なくとも１つを含む
i)豚からサンプルを得ること、該サンプルは遺伝物質を含む;
ii)ゲノムDNAを該サンプルから抽出すること;
iii)ゲノムDNAの少なくともフラグメントを増幅し、増幅産物を得ること;
iv)増幅産物と制限酵素を接触させること;
v)ゲル電気泳動により、得られたフラグメントを分離すること;
vi)フラグメントのそれぞれの数および長さを決定すること; および
vii)数および長さから多型の存在を決定すること.
【請求項３０】
制限酵素がXbaIである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
ETECが、E. coli F4ab/F4ac、E. coli O149、E. coli F4、E. coli F18、E. coli F5、E. coli F6、E. coli 987P、E. coli F41、E. coli F18ab、E. coli F107、E. coli F18ac、E. coli 2134PおよびE. coli Av24、およびこれらの生物の何れかの組合せからなる群から選択される、請求項１０から３０の何れかの方法。
【請求項３２】
ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型のブタ対立遺伝子を検出するためのプローブとしての請求項１から６の何れかの単離NA分子および／または請求項７から９の何れかのNAプローブの使用。
【請求項３３】
PCRに基づく方法におけるプライマー用のNA分子対の使用、ここで、そのPCRに基づく方法は、豚がETECに対し耐性かまたは非耐性かを同定するための方法に使用し、該NA分子対は、配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択される。
【請求項３４】
豚が、ETECに対する耐性と連鎖する遺伝的多型の対立遺伝子において同型接合的か異型接合的かまたは非キャリアーであるかどうかを決定するためのキット、ここで、該キットは、請求項７から９のNAプローブ、請求項１から６のNA分子、PCR-プライマー対、制限酵素およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される第一のコンポーネントを含む。
【請求項３５】
PCR-プライマー対が、配列番号18および配列番号19、配列番号20および配列番号21、配列番号22および配列番号23、配列番号24および配列番号25、配列番号26および配列番号27、配列番号28および配列番号29、配列番号30および配列番号31、配列番号32および配列番号33、配列番号34および配列番号35、配列番号36および配列番号37、配列番号38および配列番号39、配列番号40および配列番号41、配列番号42および配列番号43、配列番号44および配列番号45、配列番号46および配列番号47、配列番号48および配列番号49、配列番号50および配列番号51、配列番号52および配列番号53、配列番号54および配列番号55、配列番号56および配列番号57、配列番号58および配列番号59、配列番号60および配列番号61、配列番号62および配列番号63、配列番号64および配列番号65およびそれらの相補的配列からなる群から選択される、請求項３４のキット。
【請求項３６】
ETECに対し耐性である豚を育種するための方法であって、該方法は以下を含む
i)ETECに対して耐性であるとして第一の豚を、請求項１０から３１の何れかの方法を用い同定すること;
ii)該第一の豚を選択すること; および
iii)該第一の豚を第二の豚と共に育種すること、
そして、ランダムに選択した親豚の子孫よりもETECに対し耐性である豚の子孫を得る。
【請求項３７】
以下の工程を含む、請求項３６の方法、
i)ETECに対して耐性であるとして第一の豚を、請求項１０から３１の何れかの方法を用い同定すること;
ii)該第一の豚を選択すること;
iii)ETECに対する耐性について第二の豚を、請求項１０から３１の何れかの方法を用い同定すること; および
iv)該第一の豚を該第二の豚と共に育種すること
そして、ランダムに選択した親豚の子孫よりもETECに対し耐性である豚の子孫を得る。
【請求項３８】
アンチセンス-NA、iRNA、リボザイム、遺伝的医薬のためのETC、遺伝子治療またはシネトプラスティックDNA修復のような使用のための請求項１から６の何れかの単離NA分子。
【請求項３９】
豚肉を生産するための方法であって、以下の工程を含む該方法、
i)請求項３６または３７の豚の子孫を得ること、
ii)その豚の子孫から豚肉を得ること。
【請求項４０】
ETECに対する非耐性の治療のための可能性ある薬物候補をスクリーニングするための方法であって、以下の工程を含む該方法、
i)ETECに対し非耐性であると同定した豚の試験群を選択すること、該同定は請求項１０から３１の何れかの方法を用い行う; 
ii)該試験群に可能性ある薬物候補を投与すること; および
iii)試験群における可能性ある薬物候補の効力を評価する。
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月22日(2005.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006506991000001.app
【国際調査報告】
2006506991.tif 000124
2006506991.tif 000125
2006506991.tif 000126
2006506991.tif 000127