(57)【要約】【課題】  非経口的投与のための、相乗性又は相加性を示す患者特異的割合でカプセル化された２又は３以上の治療剤を含有する患者特異的送達媒体組成物及びその製造方法。【解決手段】  ２又は３以上の治療剤の患者特異的非拮抗的割合を決定するための方法において、i）患者から得た疾患細胞を供給すること、ii）前記疾患細胞の分子表現型を特徴付けること、iii）前記疾患細胞の分子表現型と培養細胞株の分子表現型とのマッチングを実行すること、iv）少なくとも第１及び第２治療剤を供給すること、及びv）前記第１治療剤と前記第２治療剤との種々の割合でのコンビネーションを前記培養細胞株に関してインビトロでアッセイし、前記培養細胞株に対する非拮抗的生物学的効果を示す前記第１及び第２治療剤の１つの割合を決定することを含むと共に、前記１つの割合は患者特異的非拮抗的割合として同定される。
2006523457.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２又は３以上の治療剤の患者特異的非拮抗的割合を決定するための方法において、
i）    患者から得た疾患細胞を用意すること、
ii）   前記疾患細胞の分子表現型を特徴付けること、
iii）  前記疾患細胞の分子表現型と培養細胞株の分子表現型とをマッチングさせること、
iv）   少なくとも第１及び第２治療剤を供給すること、及び
v）    前記第１治療剤と前記第２治療剤との種々の割合でのコンビネーションを前記培養細胞株に関してインビトロでアッセイし、前記培養細胞株に対する非拮抗的生物学的効果を示す前記第１及び第２治療剤の１つの割合を決定すること
を含むと共に、
前記１つの割合は患者特異的非拮抗的割合として同定されること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記患者特異的割合は、生物学的効果に関する前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の＞１％（１％超）が影響を受ける（ｆａ＞０．０１）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって前記培養細胞株に対する前記非拮抗的生物学的効果を示すこと
を特徴とする請求項１の方法。
【請求項３】
前記非拮抗的生物学的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受ける（ｆａ＝０．２〜０．８）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されること
を特徴とする請求項２の方法。
【請求項４】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受けるような濃度範囲の少なくとも２０％にわたって示されること
を特徴とする請求項３の方法。
【請求項５】
患者特異的医薬調製物の調製方法であって、
i）    第１治療剤と安定的に結合している第１送達媒体を含む第１組成物を供給すること、
ii）   第２治療剤と安定的に結合している第２送達媒体を含む第２組成物を供給すること、及び
iii）  患者の疾患組織又は血液から採取した細胞と類似又は同一の分子表現型を有する培養細胞に対し非拮抗的効果を示す前記第１治療剤対前記第２治療剤割合で前記第１組成物と前記第２組成物とを組み合わせること
を含む方法。
【請求項６】
前記第１及び第２組成物の組合せは、使用の直前に行われること
を特徴とする請求項５の方法。
【請求項７】
前記割合は、生物学的効果に関するインビトロアッセイにおいて前記培養細胞の＞１％（１％超）が影響を受ける（ｆａ＞０．０１）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって前記培養細胞に対する前記非拮抗的生物学的効果を示すこと
を特徴とする請求項５の方法。
【請求項８】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受ける（ｆａ＝０．２〜０．８）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されること
を特徴とする請求項７の方法。
【請求項９】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受けるような濃度範囲の少なくとも２０％にわたって示されること
を特徴とする請求項８の方法。
【請求項１０】
患者特異的医薬調製物の調製方法であって、
送達媒体と少なくとも１つの第１及び第２治療剤とを、患者の疾患組織又は血液から採取した細胞と類似又は同一の分子表現型を有する培養細胞に対し非拮抗的効果を示す該第１治療剤対該第２治療剤割合で、安定的に結合すること
を含む方法。
【請求項１１】
前記第１治療剤は第１送達媒体と安定的に結合され、かつ前記第２治療剤は第２送達媒体と安定的に結合されること
を特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記割合は、生物学的効果に関するインビトロアッセイにおいて前記培養細胞の＞１％（１％超）が影響を受ける（ｆａ＞０．０１）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって前記培養細胞に対する前記非拮抗的生物学的効果を示すこと
を特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受ける（ｆａ＝０．２〜０．８）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されること
を特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受けるような濃度範囲の少なくとも２０％にわたって示されること
を特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記第１及び第２治療剤は同一の送達媒体に共通カプセル化されること
を特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１６】
前記第１及び第２治療剤は第１及び第２送達媒体に別々にカプセル化されること
を特徴とする請求項１０の方法。
【請求項１７】
請求項５の方法によって調製された組成物。
【請求項１８】
請求項１０の方法によって調製された組成物。
【請求項１９】
患者に対し請求項１７の組成物を投与することを含む、患者に個別化治療を施す方法。
【請求項２０】
患者に対し請求項１８の組成物を投与することを含む、患者に個別化治療を施す方法。
【請求項２１】
患者に個別化治療を施す方法において、
第１治療剤と結合された第１送達媒体を含む第１組成物と、第２治療剤と安定的に結合された第２送達媒体を含む第２組成物とを、患者から得た細胞と類似又は同一の分子表現型を有する培養細胞に対し非拮抗的生物学的効果を示す割合で、当該患者に投与することを含むと共に、
前記第１及び第２送達媒体の薬剤動態は協調的であること
を特徴とする方法。
【請求項２２】
特定の患者に対し個別化された医薬調製物を供給する方法であって、
ａ）  前記患者から疾患細胞を得ること、
ｂ）  前記患者の疾患細胞の分子表現型を特徴付けること、
ｃ）  前記患者の疾患細胞の分子表現型と培養細胞の分子表現型とをマッチングさせること、
ｄ）  少なくとも第１及び第２治療剤を供給すること、
ｅ）  前記培養細胞に関しインビトロでアッセイを実行し、前記培養細胞に対し非拮抗的生物学的効果を示す少なくとも１つの第１及び第２治療剤の割合を決定すること；但し該割合は個別化治療のための患者特異的割合として決定されること、及び
ｆ）  前記第１治療剤と結合された第１送達媒体を含む第１組成物と、前記第２治療剤と安定的に結合された第２送達媒体を含む第２組成物とを、前記ｅ）で決定された患者特異的割合で混合すること；但し前記第１及び第２組成物中の第１及び第２送達媒体の薬物動態は協調的であること
を含む方法。
【請求項２３】
前記割合は、生物学的効果に関する前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の＞１％（１％超）が影響を受ける（ｆａ＞０．０１）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって前記培養細胞に対する前記非拮抗的生物学的効果を示すこと
を特徴とする請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受ける（ｆａ＝０．２〜０．８）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって示されること
を特徴とする請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記非拮抗的効果は、前記インビトロアッセイにおいて前記培養細胞の２０〜８０％が影響を受けるような濃度範囲の少なくとも２０％にわたって示されること
を特徴とする請求項２４の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００３年４月２日に出願された米国特許第６０／４６０，２２３号、２００３年８月１５日に出願された米国特許第６０／４９５，３９４号及び２００３年８月１８日に出願された米国特許第６０／４９６，１８０号の米国特許法１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。なお、これらの出願の内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、複数の治療剤のコンビネーションを用いる改善された治療法を施すための組成物及び方法に関する。更に、本発明は、個々の患者に最適化されたコンビネーション治療の同定及び創出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
医薬に対する人間の代謝反応は画一的であるとは到底いえないことはよく理解されている。単なる（種々の抗生物質に対するアレルギーのような）副作用と考えられるものに加え、関節炎、癌、炎症等のような比較的慢性的な状態を治療するために設計された薬剤は、全ての個人において同じ反応は示さない。患者群において認識されるこの不均質性は、個人のゲノムフィンガープリントが適切な治療法を構築するためにある種の履歴データとのコンビネーションで使用される薬理ゲノミクスのコンセプトを示唆している。個々の患者のためのテイラーメード治療に対するより直接的なアプローチの１つは、乳癌の治療においてハーセプチン（登録商標）（Herceptin）の投与を含む実務によって示されている。即ち、ハーセプチン（登録商標）と相互作用するＨＥＲ２レセプターを提示する腫瘍を有する患者に対してのみこの治療法が施される。
【０００４】
残念ながら、癌、ＡＩＤＳ、感染症、免疫不全及び循環器疾患のような生命に脅威を及ぼす多くの疾患の進行は複数の分子的機構によって影響を受ける。この複雑性のため、単一の（１種類の）剤を用いて有効な治療を達成しようとする試みは限定的な成果しか得られていない。そのため、疾患と戦うために、とりわけ癌の治療に複数の剤のコンビネーションがしばしば用いられてきた。投与される剤の数と急性リンパ性白血病及び細網肉腫のような癌の治癒率との間には大きな相関があるように思われる（Frei, et al., Clin. Cancer Res. (1998) 4:2027-2037; Todd, et al., J. Clin. 0ncol. (1984) 2:986-993）。
【０００５】
とりわけ腫瘍の治療においてコンビネーション治療は広く実施されているが、完全な成功例はごく稀にしか見られない。この成功例の欠如の原因の１つは、本出願の観点からすると、治療されるべき個人の特定の特徴に応じた、治療法の個別化の失敗である。
【０００６】
癌は原始的な正常細胞の挙動を調節する一連の遺伝子変化の結果であることを示唆する指標ないし証拠は増加の一途を辿っている。更に、このような細胞による悪性表現型の発症は種々の遺伝子の発現における変化によって引き起こされるように思われる。従って、癌は遺伝（学）的不均質性疾患として理解される必要があり、より特異的かつ個別化された治療法を開発するためには、個々の腫瘍における重要な変化に関するより精密な知識が必要とされる。上述のように、乳癌患者は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子の最初の発見及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍におけるハーセプチン（登録商標）による標的治療の概念研究の特徴証明（Hallmark proof）に引き続く、合理的に基礎付けられた分子標的治療の使用から既に便益を受けている。
【０００７】
人間の癌の未だよく理解されていない不均質性は、個々の乳癌患者から得た乳癌生検に関する最近の２つの報告において光が当てられている。独創性に富んだ研究において、Perou, et al.は、ｃＤＮＡマイクロアレイデータを用いて、ヒト乳癌は、それらの遺伝子発現特性に応じて幾つかの生物学的に互いに識別されるサブタイプ（生物学的識別サブタイプ）に分類することができること、即ち、基底上皮様（basal epithelia-like）；ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現性；及び正常乳房様群に分類できること、これらは何れも同様に特有のサブグループに分類できることを示した（Nature(2000) Aug. 17, 406(6797):747-752）。更に、最近では、van‘t Veer, et al.は、複数の患者の乳癌の遺伝子発現「サイン」の評価はアジュバント化学療法から利益を受け得るリンパ節転移陰性疾患患者を予言することを示した（Nature (2002) Jan.31, 415(6871):530-536）。これらの知見は、現在の病理学的評価基準と組み合わせた（ある人ないし患者の分子表現型を決定するための）バイオマーカーアッセイの使用には現実性及び価値があり、現行の治療モダリティを著しく改善することを示している。これらの研究は、次の１０年後には現在の病理学的アプローチに大幅に取って代わり得る癌の強力な分子論的分類（学）の発達を世界的に促進するであろう。
【０００８】
上記の例で示唆されたように、腫瘍不均質性は類似の細胞タイプから生じた癌を有する患者において観察することができる。従って、特定の癌と戦うために設計された化学療法剤は、当該癌を有する患者（複数）に対し別異に影響を及ぼす。このため、広範な患者集団に治療を行うために設計された単一薬剤コンビネーション産物を発見したとしても、現実的には、患者の限定的なサブセットにおいてのみ有効であるに過ぎないであろう。この問題は、複数の薬剤が異なる速度で分布・代謝されるという事実、従って所定の設定割合を有する複数の遊離薬剤のコンビネーションを投与すると多分に薬剤／薬剤割合が急速かつ非制御的に変化するという事実によって混乱される。治療されるべき個々人が投与された薬剤を異なる速度で分布・代謝するため、従って個々の薬剤（及び従ってそれらの割合）の薬剤動態の制御は患者毎の案件になるため、問題は一層困難になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
複数の薬剤のコンビネーションの効果はそれら薬剤が供給される割合が相加的（additive）又は相乗的（synergistic）である場合増強され得るので、薬剤割合の制御は重要である。薬剤の相乗的コンビネーションは、癌治癒速度を増加するために必要な容量がより少ないため毒性が低下されること（Barriere, et al., Pharmacotherapy (1992) 12:397-402; Schimpff, Support Care Cancer (1993) 1:5-18）、及び微生物の多耐性株の蔓延が低下されること（Shlaes, et al., Clin. Infect. Dis. (1993) 17:S527-S536）も示されている。異なる作用機構を有する複数の剤を選択することにより、生化学経路中の複数の部位が攻撃され相乗性が生じ得る（Shah and Schwartz, Clin. Cancer Res. (2001) 7:2168-2181）。Ｌ−カナバニンと５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のコンビネーションは、何れか一方の薬剤単独の効果を組み合わせた場合よりもラット大腸腫瘍モデルにおいて抗悪性腫瘍活性がより大きいことが報告されている（Swaffar, et al., Anti-Cancer Drugs (1995) 6:586-593）。シスプラチンとエトポシドは、ヒト小細胞肺癌細胞株ＳＢＣ−３の増殖との戦いにおいて相乗性を示す（Kanzawa, et al., Int. J. Cancer (1997) 71(3):311-319）。
【００１０】
先行する種々の研究において、相乗性を示すための各成分の割合の重要性は認識されている。例えば、５−フルオロウラシルとＬ−カナバニンは、１：１のモル比の場合相乗的であるが、５：１のモル比の場合拮抗的であることが見出されている。シスプラチンとカルボプラチンは、１３：１の曲線下面積（ＡＵＣ）比の場合相乗的効果を示したが、１９：５の場合拮抗的効果を示した。
【００１１】
その他の薬剤コンビネーションも相乗的相互作用を示すことが明らかにされているが、そのような相互作用のコンビネーション割合に対する依存性については記載されていない。このリストは極めて膨大であり、インビボ研究も僅かに含まれているが、主として、インビトロ培養物についての報告から構成されている。報告が多数であることに加え、多数のコンビネーションが臨床的に有効であることが示されている。
【００１２】
しかしながら、相乗的薬剤コンビネーションの使用に関連する種々の利点があるにも関わらず、それらの治療的使用を制限する欠点もまた種々存在する。例えば、相乗性は、薬剤の曝露時間や投与シークエンスのような種々のファクタに依存することが多い（Bonner and Kozelsky, Cancer Chemother. Pharmacol. (1990) 39:109-112）。エチルデスヒドロキシ（deshydroxy）−スパルソマイシンとシスプラチンとのコンビネーションを用いた研究は、相乗性はコンビネーション割合、治療期間及び治療シークエンスによって影響を受けることを示している（Hofs, et al., Anticancer Drugs (1994) 5:35-42）。
【００１３】
剤のコンビネーションによって相乗性が示されるようにするためにはそのような剤は限定された（範囲の）割合で存在する必要があることが知られている。薬剤の同じコンビネーションが、ある割合では拮抗的であり、別の割合では相乗的であり、更に別の割合では相加的であるというようなこともあり得る。更に、特定の割合が相乗的であるか相加的であるか拮抗的であるかは濃度にも依存する。ある（同一の）割合の場合でも、特定の薬剤濃度では拮抗的であり、他の薬剤濃度では非拮抗的である。従って、ターゲットに到達する薬剤の濃度は投与されたときの濃度とは異なるので、非拮抗的結果が広い濃度範囲で得られるような割合が選択されることが望ましい。
【００１４】
後述するとおり、所望の割合（即ち非拮抗性）を維持するという問題は、治療剤（複数）がリポソームのような送達媒体（複数）にカプセル化される場合、送達媒体が薬剤動態を決定し従ってカプセル化された剤が全ての患者においてより類似的な体内分布を示すという認識によって解決される。従って、治療に対する反応は（相乗的薬剤効果の最適化のために）個人の反応によって判断される場合恐らく改善されるであろうが、著しくより多くの患者は（送達システム内部での関連相乗性薬剤（複数）の薬剤動態に対するより良好な制御のために）当該治療に対する反応を示すべきである。
【００１５】
人間間に見られる不均質性は、個々の患者のための非拮抗的薬剤割合を同定し、個々の患者に対して最適化された用量を創出することによって吸収することができる。これが必要なのは、個々の患者は異なる薬剤コンビネーションに対し別異に応答し得、従って個々の患者に対して特異的なコンビネーションを同定する必要があるからである。薬剤の非拮抗的割合は通常インビトロ培養細胞のみを用いて同定されるのであるが、このような割合は、全ての被検体に投与された場合治療的活性が等しくないこともあり得る。このような問題を回避するために、本発明は、薬剤コンビネーション及び分子的に規定される癌の治療に有効な非拮抗的割合を選択しもって患者特異的割合を得るための方法を詳細に示す。癌の分子的分類（学）は、より明確な患者集団を同定し、もって個々の患者に対しより良好に適合された割合の選択を可能にするであろう。従って、本発明は、個々の患者に合せられた特異的薬剤治療法を構築する前に個々の患者に対し最適な非拮抗的効果を提供する薬剤コンビネーションを同定するために、薬剤スクリーニングを既に受けたかこれから受ける培養細胞の分子表現型（ＨＥＲ２レセプターのような多疾患関連生物学的マーカーの発現プロファイリング）と、（患者生検試料又は血液から得た細胞を用いた）特定の疾患患者の分子表現型とのマッチング（照合）を実行する方法を詳細に示す。患者の腫瘍からの情報が評価され（コンビネーション）割合が選択された後は、投与のための患者特異的医薬調製物の作成は、適切な量のカプセル化薬剤（複数）を所望の患者特異的割合で組み合わせることにより実験室又は病院の何れにおいても容易に行うことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、２又は３以上の治療剤をカプセル化する送達媒体組成物を用いてコンビネーション薬剤治療を当該薬剤ないし治療を必要とする患者に個別化する医薬組成物又は調製物の調製方法に関する。本発明の方法は、有効な治療剤（複数）の最適な患者特異的割合を同定するだけではなく、更に、治療剤コンビネーションが所望の割合でターゲット部位に送達されることを保証する。一般的には、治療剤の所望の割合は、投与により、個々の薬剤を単独で投与した場合と比べて、相乗的（synergistic）又は相加的（additive）効果を示す。好ましい一実施形態では、治療剤は抗腫瘍剤であるが、その他の種類の種々の剤も本発明の方法において使用することが意図されている。
【００１７】
癌は、遺伝（学）的不均質性疾患（genetically heterogeneous disease）である。特定の患者の癌に個別化された医薬調製物を調製するために、分子特性決定（キャラクタリゼーション：characterization）又は分子表現型決定（フェノタイピング：phenotyping）のため患者から疾患組織又は細胞を得る。「患者の細胞」とは、単一の（ひとりの）患者の疾患組織又は血液から、必要であれば、機械的及び化学的手段によって採取された細胞をいうものとする。患者の細胞の分子的キャラクタリゼーションは、サンプルの同定・分類に使用される種々の生物マーカーの発現パターンを決定することを含む。例えば生検又は血液／組織サンプリングによって、疾患患者からサンプルを得た後、疾患細胞を分子表現型決定にかけて、癌を幾つかの生物学的識別サブタイプに分類するために設計されたゲノム／プロテオムフィンガープリントを得る。
【００１８】
患者の癌は、１つの生物学的に特徴的なサブタイプに分類された後、種々の培養細胞株からの分子表現型に対してマッチングをさせる（照合ないし整合される）ことができる。対比のために容易に評価され得る培養細胞株からの生物マーカーに関する歴史的データのライブラリーないしデータベースは多数存在する。ライブラリーの一例として、ＮＣＩ６０細胞株ライブラリーがある。培養細胞の分子表現型は、患者の細胞の対比の時点又はそれに近接する時点において決定することもできる。次いで、培養細胞株は、実験代用物として使用され、また、特定の患者の癌に個別化された医薬組成物の調製を可能にする。
【００１９】
個別化された医薬組成物は、種々の治療試薬に対する培養細胞株の反応性に基づいて調製される。治療剤の複数のコンビネーションが、複数の割合で培養細胞株に供給され、培養細胞株に対して相乗的に作用する（割合を有する）治療剤のコンビネーションが同定される。このようにして、治療剤の最適な非拮抗的割合を同定することができる。例えば、治療剤Ａ及びＢの割合１：５が、特定の培養細胞株に対して相乗的効果を示すものとして同定されたとする。腫瘍を有するひとりの患者が１つのサンプルを提出したとして、当該患者の腫瘍が、培養細胞株の生物マーカーに類似する生物マーカーを呈することが決定される。この類似性のため、当該患者の腫瘍と当該培養細胞株とを同一の生物学的識別サブタイプに分類することが可能になる。治療剤Ａ及びＢの割合１：５が、当該患者の疾患細胞の分子表現型にマッチした分子表現型を有する培養細胞に対し最適に作用したのであるから、治療剤のこの割合が当該個人（患者）への投与のために調製される。従って、治療剤のこの患者特異的割合の詳細が、問題の患者のために個別化された医薬調製物の調製のために使用される。（図４参照。）
【００２０】
投与のために、同一の送達媒体において調製されるか別個の送達媒体において調製されるかに関わらず、最終結果は個別化された医薬調製物の調製である。個別化された医薬調製物は、個々の患者に特有の特異的割合で処方された１つの治療剤コンビネーションを含有する。治療剤（複数）をパッケージ化するために使用される送達媒体は、インビボ投与後の協調的薬物動態を利用して患者特異的割合を維持するために選択される。「協調的薬物動態」とは、送達媒体が投与された治療剤の割合の維持を保証することを意味するものとする。割合の維持は、複数の治療剤が同一の送達媒体に供給されるか別個の送達媒体に供給されるかに関わらず生じる。ひとたび生成された後は、医薬調製物は、患者に投与されたり、後の投与のために保存されたり、複数回投与のために複製物を作成することができる。
【００２１】
要約すると、複数の治療剤が個々の患者において相乗的又は相加的（即ち非拮抗的）結果を生じる割合で放出されるように、該複数の治療剤が１又は２以上の送達媒体を介してひとりの患者に供給される。治療剤の患者特異的割合は、培養細胞に対し相乗的又は相加的効果を示すコンビネーションの能力に基づいて選択される。治療剤コンビネーションのアッセイに使用される培養細胞は、一般的には、問題の患者からの疾患細胞の分子表現型に類似又は同一の分子表現型を示す。
【００２２】
従って、１つの視点において、本発明は、非経口的投与のための患者特異的送達媒体組成物であって、相乗性又は相加性を示す患者特異的割合で当該送達媒体組成物にカプセル化された２又は３以上の治療剤を含有する送達媒体組成物を提供する。
【００２３】
他の一視点において、本発明は、剤（複数）の患者特異的非拮抗的割合の同定方法を提供する。患者特異的非拮抗的割合は、疾患患者から細胞又は血液を採取して、その分子表現型を特徴付け、次いで、問題の患者から採取した細胞に類似又は同一の分子表現型を発現する培養細胞に対し（好ましくはコンビネーションインデックス（ＣＩ）を用いて）相乗的又は相加的効果を示す治療剤のコンビネーションを同定することによって決定される。ＣＩは広範な濃度範囲にわたって相乗的であることが好ましい。好適な剤は抗癌剤である。細胞に対し非拮抗的効果を維持する剤の割合を決定できる方法であれば任意のものが使用できる。培養又は採取細胞の分子表現型を決定できる方法であれば任意のものが使用できる。
【００２４】
より好ましくは、本発明は、複数の送達媒体を含有する患者特異的組成物の同定方法であって、少なくとも第１及び第２治療剤が、（疾患患者から採取された細胞に類似又は同一の分子表現型を示す）培養細胞の１％超が影響を受ける（影響フラクション（ｆａ）＞０．０１）ような濃度範囲の少なくとも５％にわたって当該培養細胞に対し非拮抗的生物学的効果を示す第１治療剤対第２治療剤モル比で該送達媒体にカプセル化されている方法、又は複数の送達媒体を含有する組成物であって、少なくとも第１及び第２治療剤が、（疾患患者から採取された細胞に類似又は同一の分子表現型を示す）培養細胞に対し非拮抗的細胞傷害性効果又は細胞分裂停止効果を示す第１治療剤対第２治療剤モル比で該送達媒体にカプセル化されていると共に、該治療剤は抗悪性腫瘍剤である組成物に関する。「培養細胞」とは、所望の生物学的効果の検査に適合的な少なくとも１つの細胞培養物又は細胞株をいうものとする。例えば、治療剤が抗悪性腫瘍剤である場合、「関連」細胞は、抗癌剤発見プログラムにおいて有用なものとして国立癌研究所（ＮＣＩ）／国立保健研究所（ＮＩＨ）の開発途上治療プログラム（ＤＴＰ）によって同定される細胞株であり得る。現在、ＤＴＰスクリーニングは、６０種類のヒト腫瘍細胞株を使用する。そのような細胞株の少なくとも１つに対する所望の活性は実証される必要があるであろう。
【００２５】
「患者の細胞」又は「疾患患者から採取した細胞」とは、ひとりの患者から疾患組織又は血液を取り出した後の当該患者から得た疾患組織又は血液のサンプルから、必要に応じ既知の機械的又は化学的方法によって、インビトロで採取された細胞の収集物をいうものとする。例えば、治療されるべき疾患が癌の場合、「患者の細胞」又は「単一の（ひとりの）患者の疾患組織又は血液から採取した細胞」は、資格のある個人によって患者から全腫瘍、腫瘍生検又は血液サンプルを取り出した後患者の癌組織又は血液から実験室で採取された細胞の収集物であり得る。上述したとおり、「患者特異的」相乗的、相加的又は非拮抗的割合とは、ひとりの患者に関し、該患者の分子表現型と少なくとも１つの培養細胞株の分子表現型とのマッチングを実行し（照合し）、次いで、該患者に関し、インビトロスクリーニング分析においてマッチング（照合）された培養細胞に至適に影響を及ぼす治療剤の割合を選択することによって同定された割合をいうものとする。
【００２６】
患者の細胞又は培養細胞の分子又は細胞表現型のキャラクタリゼーションは、Liu, et al.（Amer. J. of Pathology (2002) 161(5):1557-1565）によって記載されたような組織マイクロアレイを用いた診断免疫組織化学等の当業者に既知の方法によって実行することができる。スクリーニングされ得る典型的な癌特異的マーカーは、 上皮マーカー（例えば上皮膜抗原）；ケラチン、サイトケラチンサブセットマーカー（例えばcam5.2(サイトケラチン8/18),サイトケラチン(ck)5-6, ck7, ck19, ck20, 及びck22）；アデノカルシノーママーカー（例えば癌胚抗原、ＣＥＡポリクローナル−癌胚抗原及びB72-3）；カルシノーマサブセットマーカー（例えば甲状腺転写因子１、シナプトフィジン、胎盤アルカリホスファターゼ及びエストロゲンレセプター）； メラノーママーカー（例えばS-100 (ポリクローナル)及び melan-a）；サルコーママーカー（例えばビメンチン及びkp 1 (with CD68)）； サルコーマサブセットマーカー（例えばol3及びc-kit）；及び 癌遺伝子マーカー（例えばbcl-2及びp53）である。
【００２７】
更に後述するように、好ましい一実施形態では、上述の方法に応じた適切なコンビネーションの設計において、非拮抗的患者特異的割合が、関連するインビトロスクリーニング分析によって規定されるような、マッチングされた培養細胞が≦１．１のコンビネーションインデックス（ＣＩ）を示すものとして選択される。
【００２８】
他の一視点において、本発明は、（患者の分子表現型にマッチングする分子表現型を有する）培養細胞に対し非拮抗的である割合の少なくとも２つの治療剤を含む複数の送達媒体を含有する患者特異的治療組成物の調製方法であって、少なくとも２つの治療剤のパネルを供給し、但し該パネルは該治療剤の少なくとも１つの好ましくは複数の割合を有し、培養細胞に対し生物学的効果を引き起こすパネルのメンバーの能力を検査し、前記細胞に対し相乗的又は相加的効果を与える割合を有するパネルのメンバーを選択すること；及び１）パネルの成功した（選択された）メンバーによって表される割合の治療剤を薬剤送達媒体にカプセル化する（即ち安定的に結合する）か又は２）適切な量の予備処方（pre-formulated）送達媒体カプセル化治療剤をパネルの成功したメンバーによって表される治療剤の割合で組合せて、培養細胞の細胞／分子表現型に対しマッチングされた細胞／分子表現型を有する患者に投与するために適切な医薬調製物にするかの何れか一方を行うこと、を含む方法に関する。例えば、（単一の患者の表現型にマッチングする表現型を有する）培養細胞に関するインビトロスクリーニングが、１：５の割合の薬剤Ａ対Ｂが当該培養細胞に対する最適な非拮抗的効果を与えたことを示した場合、実験室技術者、製薬者、医師及びその他の資格を有する個人は、（薬剤送達媒体に安定的に結合されるために予備処方された）薬剤Ａの医薬調製物の１部と（薬剤送達媒体に安定的に結合されるために予備処方された）薬剤Ｂの医薬調製物の５部とを組み合わせ、次いで標準的な方法で当該患者に対し適用され得る患者特異的コンビネーション治療を実行することができる。また、医薬調製物が、薬剤送達媒体中に１：５の割合で共通カプセル化された薬剤Ａ及びＢから既に作成されている場合は、患者に投与するために、必要な用量の当該医薬調製物を直ちに使用することができる。
【００２９】
他の一視点では、本発明は、本発明の組成物を投与することにより、患者特異的相乗的又は相加的割合の２又は３以上の治療剤を当該患者に送達する方法に関する。
【００３０】
更なる一視点では、本発明は、少なくとも２つの医薬調製物を含むキットであって、第１の調製物は送達媒体と安定的に結合された少なくとも第１の治療剤を含有しかつ第２の調製物は送達媒体と安定的に結合された少なくとも第２の治療剤を含有すると共に、これら送達媒体が、患者の疾患状態を治療するために非拮抗的患者特異的割合で組み合わせることが可能な第１及び第２医薬調製物の初期割合を維持するようにマッチングされた薬物動態を有するようなキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、コンビネーション療法で使用される治療剤の非拮抗的割合を決定すること、及び協調的薬物動態を有するそのコンビネーションを送達することを含む。従って、治療剤の割合は、相乗的又は相加的である。治療剤のコンビネーションは、培養細胞に対し、種々の治療剤を種々のコンビネーション及び種々の濃度で検査することによって選択される。治療剤の検査に使用される培養細胞は、疾患患者の細胞に対する近接分子マッチング（close molecular match）に基づいて選択される。（１つの）個別化された治療組成物は、治療剤をスクリーニングするために使用される検査細胞を患者の疾患細胞の分子表現型にマッチングさせることによって生成される。選択後、治療剤（複数）は、所望の割合で、個々の患者のターゲット組織への当該割合の送達が保証されるような態様で処方される。
注：略語
ＭＴＴ：3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2Hテトラゾリウムブロマイド;
ＣＩ：コンビネーションインデックス；
ｆａ：影響フラクション（fraction affected）
【００３２】
疾患細胞の分子表現型の決定は、患者から生検サンプル又は血液を取得することから開始する。次に、生検サンプル又は血液中の細胞の分子表現型（又はゲノムフィンガープリント）を同定する一連の検査にかける。同定後、患者サンプルの分子表現型は、種々の培養細胞株の表現型と対比され、少なくとも１つの培養細胞株が患者サンプルとの類似性に基づいて選択される。この培養細胞株は、種々の割合の治療剤に対しインビトロでスクリーニングされ、当該細胞株従って当該個体患者のために使用されるべき剤の適切な非拮抗的割合が決定される。この割合（の剤）が、送達媒体が最初に投与された当該割合の維持が保証される適合的薬物動態を有するように、送達媒体の組成物に処方される。
【００３３】
好ましい一実施形態では、（複数の）治療剤コンビネーションを評価及び処方するために及び患者の細胞及び培養細胞の両者の分子表現型決定のために使用される方法を実行するために、単一の部位が組織化される。治療剤コンビネーション又は医薬調製物は、好ましくは、協調的（coordinated）薬物動態を有する送達媒体に予備処方された（pre-formulated）個々の治療剤から調製される。従って、一実施形態では、上記部位は、単一の患者からの細胞を受容し、当該細胞の分子表現型を同定する。患者の細胞の表現型は、培養細胞の分子表現型に対しマッチングされる。患者の細胞に対し類似の分子表現型を示す培養細胞は、後述の方法（複数）に応じ種々の割合の種々の候補治療剤コンビネーションによって評価される。これらの方法を用いて、培養細胞に対し有効な治療剤の最も好ましい割合が同定される。培養細胞に対する割合検査は、患者の組織又は細胞サンプルを取得する前後の何れでも実行することができる。
【００３４】
治療剤の好ましいコンビネーションが同定されかつ剤の好ましい割合が決定された後、当該治療剤及び１又は複数の送達媒体を含有する医薬調製物が生成される。また、個別的に処方された治療剤と、その患者に与えられるべき割合に関する情報とを、後の使用のためにケア担当者に提供してもよい。
【００３５】
本発明の方法は、典型的には、患者の分子表現型に類似又は同一の分子表現型を有する培養細胞に対し非拮抗的である治療剤の患者特異的割合をインビトロで同定することを含む。究極的には、この非拮抗的割合は、当該割合が所望の活性の部位において維持されることが保証される態様で、患者に供給される。治療剤の相乗的又は相加的割合は、２又は３以上の治療剤の少なくとも１つ割合が培養細胞に対し所定の濃度範囲にわたってインビトロで検査された際に得られた結果に一般的な分析手法を適用することによって決定される。一例として、個々の治療剤及びそれらの種々のコンビネーションは、培養細胞に対するそれらの生物学的効果（例えば細胞死の惹起又は細胞成長の阻害）が種々の濃度レベルで検査される。
【００３６】
好ましい実施形態では、患者特異的割合を含む治療剤の濃度レベルをパーセント細胞生存（度）に対してプロットして、「コンビネーションインデックス」（ＣＩ）を得る。使用される数学（的処理）は、１（例えば凡そ０．９〜凡そ１．１）の範囲）のＣＩが培養細胞株に対する活性剤の相加的効果を記述するようなものである。ＣＩ＞１（例えばほぼ１．１より大きい値）は、培養細胞株に対する活性剤の拮抗的効果を表す。ＣＩ＜１（即ち、例えば、ほぼ０．９より小さい値）は、培養細胞株に対する活性剤の相乗的効果を示す。（例１及び２参照。）２又は３以上の治療剤の（１つの）コンビネーションの非拮抗的割合のインビトロ決定は、上述の方法を用いて実行することができる。
【００３７】
このようにして得られた治療剤の患者特異的割合は、剤（複数）が予め決定された割合でリポソーム又はその他の粒状構造体にカプセル化された医薬組成物によって患者に供給される。非拮抗的割合の維持を保証する送達媒体が選択される。従って、医薬調製物は、好ましくは粒状構造の送達媒体を含有し、かつ個々の患者に対して同定された所望の割合の治療剤を含有する。
【００３８】
治療剤（複数）は、同一の送達媒体に含有されるために、共通カプセル化（co-encapsulated）することができる。或いは、治療剤（複数）は、別々の送達媒体にカプセル化することもできる。本発明で使用される送達媒体は、所望の割合の治療成分の安定的（consistent）かつ協調的（coordinated）送達が達成されるようなものである。従って、患者特異的割合の治療剤の送達は、治療剤が予め選択された（pre-selected）非拮抗的割合で患者に送達されるように治療剤送達の薬剤動態を制御する送達媒体によって維持される。
【００３９】
用語「カプセル化」とは、治療剤と送達媒体の安定的結合をいうものとする。尤も、送達媒体が１又は複数の治療剤を包み込むことまでは必要とされない。治療剤が、インビボで投与される際、送達媒体と安定的に結合されており、予め決定されている患者特異的治療剤割合が達成されるように放出されるだけでよい。従って、「〜と安定的に結合」及び「〜（内）にカプセル化」又は「〜によってカプセル化」又は「〜（内）に又は〜によって共通カプセル化」は、同義語であることが意図されている。従って、これらの用語は、本書では、区別なく同じように用いられている。
【００４０】
好適な送達媒体としては、例えば、脂質担体（lipid carriers）、リポソーム、脂質ミセル、リポタンパク質ミセル、脂質安定化（lipid-stabilized）エマルジョン、シクロデキストリン、重合体ナノパーティクル、重合体マイクロパーティクル、ブロック共重合体ミセル、重合体−脂質ハイブリッドシステム、誘導体化単鎖重合体等がある。送達媒体の選択は、投与されるべき個々の治療剤の所望の薬剤動態を伴う１又は２以上の治療剤の放出を実行しかつ所望の割合の治療剤をターゲット部位に送達する能力に基づいて行われる。  
【００４１】
本発明は、更に、選択された培養細胞に対し非拮抗的効果をインビトロで引き起こす所望の割合の治療剤を含有する患者特異的医薬調製物を生成することを含む。治療剤に関する患者特異的割合を決定するために使用される好適な培養細胞は、患者の疾患細胞と培養細胞との間の分子表現型の類似度を決定することにより選択される。医薬調製物は、１又は複数の同じ人物に対し分子表現型決定及び／又はインビトロ薬剤スクリーニング等を実行することにより調製することができる。医薬調製物は、所望の割合での（予備処方又は細胞のインビトロ分析後に処方された）複数の送達媒体カプセル化治療剤の適正量を組み合わせるか、又は所望の割合で所望の治療剤（複数）を共カプセル化した送達媒体を調製若しくは選択することによって調製することもできる。
【００４２】
患者特異的非拮抗的割合のインビトロ決定
【００４３】
本書に記載される医薬調製物を調製するために、送達媒体に含有される治療剤の所望の割合が、個々の患者に関して決定される。この決定は、通常、２ステップで実行される。一方のステップは、患者の分子表現型の決定に関する。患者の疾患細胞の分子表現型は、少なくとも１つのタイプの培養細胞の分子表現型とのマッチングが実行される。他方のステップは、複数の割合の治療剤の多数のコンビネーションに対する上記培養細胞のスクリーニングの実行に関する。このスクリーニングプログラムは、培養細胞に対する最適な生物学的効果を示す治療剤の割合を同定するのに役立つ。治療剤の送達割合は、相乗的又は相加的であるのが好ましい。そのような割合は、種々の数学モデルを用い、培養細胞においてインビトロで決定することができる。
【００４４】
治療剤の非拮抗的割合を同定するためにインビトロで細胞をスクリーニングするための一般的アプローチの１つを図１に示す。図示のとおり、治療剤Ａ及びＢは、細胞死又は細胞分裂停止を引き起こす能力に関し、個別的に及び２つの異なる割合で一緒に検査される。これらの実験では、細胞死又は細胞分裂停止は、後述するＭＴＴ（3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウム）アッセイを用いて評価した。簡潔にいえば、色素ＭＴＴは、生細胞によって減少され、細胞生存度に関連する光学密度に測定可能な変化を生じる。
【００４５】
治療剤Ａ及びＢの濃度と、２つの異なるコンビネーション割合（Ｙ：Ｚ及びＸ：Ｙ）との間の相関を細胞傷害性に対してプロットする。細胞傷害性は、未処置対照細胞の生存を基礎とした生存細胞のパーセントとして計算される。個別の治療剤及びコンビネーションの両方に関し細胞生存に対する用量依存効果が、予期したとおり、観察された。この相関の確立後、細胞生存又は影響フラクション（ｆａ）は、ＣＩの計算における濃度の代用として使用される。
【００４６】
ＣＩ計算の結果も図１に示す。このＣＩインデックスは、Chou及びTalalay（Advance Enz. Regul. (1985) 22:27-55）の方法に応じ、影響を受けた細胞のフラクションの関数として計算される。この仮説的状態において、薬剤Ａ＋Ｂの第１の割合（Ｘ：Ｙ）は、全ての濃度において非拮抗的であった。これに対し、第２の割合（Ｙ：Ｚ）での治療剤のコンビネーションは、拮抗的であった。従って、広い濃度範囲にわたって非拮抗的である治療剤Ａ＋Ｂの割合（割合１）を提供することができる。この割合が、本発明の組成物に含まれるべき望ましい割合である。
【００４７】
治療剤の種々の割合に対し「ＣＩ最大値」を計算することによる相乗性に対する割合及び濃度の効果の他の一例を以下に述べる。「ＣＩ最大値」は、種々異なる割合の治療剤のＣＩ値における最も大きな相違が観察されたところの（０．２〜０．８の間の）１つのｆａ値とみなされるＣＩ値として定義される。これは図２Ａ及び図２Ｂに示されている。図示のとおり、イリノテカン／シスプラチン割合が１：１０の場合、そのＣＩは、影響フラクション値が０．２のところで、その他の割合のＣＩと大きく異なる。ｆａ０．２におけるこの割合に対するＣＩ値は、図示のとおり、凡そ２．０である。
【００４８】
図１及び図２は、ただ２つの治療剤のコンビネーションに関する非拮抗的割合のインビトロ決定を例示している。ここに記載されたものと同じ手法を３又は４以上の治療剤のコンビネーションに適用することにより、類似の態様で所定の濃度範囲にわたるＣＩ値が得られる。２治療剤コンビネーションは、更に、第３の剤との相乗的又は相加的相互作用を決定するための、単一医薬単位（single pharmaceutical unit）として使用することができる。更に、３剤コンビネーションは、第４の剤との非拮抗的相互作用を決定するための、単位として使用することができる。以下同様。
【００４９】
相乗的又は相加的効果を示す治療剤の割合の決定は、後述する実験データのタイプに基づき、種々のアルゴリズムを用いて実行することができる。これらの方法としては、例えば、アイソボログラム法（Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3:285-290；Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5:27-55）、フラクショナルプロダクト（fractional product）法（Webb, Enzyme and Metabolic Inhibitors (1963) Vol.1, pp.1-5. New York: Academic Press）、モンテカルロシミュレーション法、CombiTool、ComboStat、及びChou, J Theor. Biol. (1976) 39:253-76及びChou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247に記載された１つの方程式に基づくChou-Talalay median-effect法がある。その他の方法としては、例えば、生存フラクション（surviving fraction）（Zoli, et al., Int. J. Cancer (1999) 80:413-416）、対照と比較された顆粒球／マクロファージコロニー形成単位に対するパーセント応答（Pannacciulli, et al., Anticancer Res. (1999) 19:409-412）等（Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41:93-141；Greco, et al., Pharmacol Rev. (1995) 47:331-385）がある。
【００５０】
中でも好ましいのは、Chou-Talalay median-effect法である。この分析法は、１つの方程式を使用する。この方程式では、特定の効果を引き起こす用量ｆａは以下のように表される：
Ｄ＝Ｄｍ［ｆａ／（１−ｆａ）］１／ｍ
ここに、Ｄは使用される薬剤の用量、ｆａは当該用量によって影響を受ける細胞のフラクション、Ｄｍは有効性を示す中央値効果（median effect）のための用量、ｍは用量効果曲線の形状を示す係数（一次反応に対してはｍは１）である。
【００５１】
この方程式は、更に、 Chou and Talalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22:27-55及びChou, et al., in: Synergism and Antagonism in Chemotherapy, Chou and Rideout, eds., Academic Press: New York 1991:223-244に記載されたような多薬剤効果（multiple drug-effect）方程式を基礎として、コンビネーションインデックス（ＣＩ）を計算するために操作することができる。この計算のためのコンピュータプログラム（CalcuSyn）は Chou and Chou（"Dose-effect analysis with microcomputers: quantitation of ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics": CalcuSyn Manual and Software; Cambridge: Biosoft 1987）に見出される。
【００５２】
コンビネーションインデックス方程式は、酵素動態学モデルに由来するChou-Talalayの多薬剤効果方程式に基づいている。（１つの）方程式は、相乗性及び拮抗性よりも寧ろ相加性のみを決定する。しかしながら、CalcuSynプログラムに応じて、相乗性は、期待相加的効果より大きいものとして定義され、拮抗性は期待相加的効果よりも小さいものとして定義される。ChouとTalalayは、１９８３年に、ＣＩ＝１を相加的効果として命名すること提案した。従って、２つの薬剤の多薬剤効果方程式から次式が得られる：
同一又は類似の作用モードを有する相互排除的な薬剤に対しては、
ＣＩ＝（Ｄ）１/（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２/（Ｄｘ）２      ［式１］
更に、完全に相互に独立した作用モードを有する相互非排除的薬剤に対しては次式が提案される：
ＣＩ＝（Ｄ）１/（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２/（Ｄｘ）２＋（Ｄ１）（Ｄ２）/（Ｄｘ）１（Ｄｘ）２    ［式２］
ＣＩ＜１、＝１及び＞１は、それぞれ、相乗性、相加的効果及び拮抗性を示す。式１又は式２は、（分子の）薬剤１、（Ｄ）１、と薬剤２、（Ｄ）２が、コンビネーションで、現実の実験においてｘ％を阻害することを規定する。従って、実験的に観察されるｘ％阻害は、端数のない数字（整数）ではなく、小数を有することが極めて多いであろう。式１及び２の（分母の）（Ｄｘ）１及び（Ｄｘ）２は、それぞれ、ｘ％を阻害する薬剤１単独及び薬剤２単独の用量である。単純には、２より多い薬剤がコンビネーションに関与する場合、通常、相互排除性であると想定されるが、必ずしもそのように想定されるわけではない（CalcuSyn Manual and Software ; Cambridge: Biosoft 1987）。
【００５３】
培養細胞を用いインビトロで基礎実験データを決定した後、コンビネーションインデックス（ＣＩ）を、濃度範囲の代用パラメータであるところの図１に示したような影響を受けた細胞のフラクション（ｆａ）の関数としてプロットするのが好ましい。治療剤の好ましいコンビネーションは、ｆａ値の相当の範囲にわたって相乗性又は相加性を示すものである。細胞の１％超が影響を受けるような即ちｆａ範囲が０．０１より大きいような濃度範囲の少なくとも５％にわたって相乗性を示す剤のコンビネーションが選択される。濃度（範囲）全体のより大きな部分、例えば０．２〜０．８のｆａ範囲の５％が、好ましいＣＩを示すことが好ましい；当該範囲の１０％が好ましいＣＩを示すとより好ましい。本発明の組成物に使用されるのが、該ｆａ範囲の２０％であると一層好ましく、０．２〜０．８のｆａ値の５０％にわたるのが好ましく、少なくとも７０％にわたるのが最も好ましい。ｆａ値の相当の範囲にわたって相乗性を示すコンビネーションを種々の剤割合に関して再評価し、非拮抗的相互作用の強度を増強しかつ相乗性が観察されるｆａ範囲を増大する最適割合を定義することもできる。
【００５４】
細胞が影響を受ける濃度範囲全体にわたって相乗性を有することが望ましいであろうが、多くの事例では、０．２〜０．８のｆａ範囲において結果の信頼性が極めて大きいことが観察されている。従って、本発明のコンビネーションによって示される相乗性は０．０１又はそれ以上の広い範囲内で存在することが明らかにされるが、相乗性は０．２〜０．８のｆａ範囲で確立されることが好ましい。
【００５５】
好ましい一実施形態では、所与の効果（ｆａ）は、培養細胞に細胞傷害剤を投与した後の細胞死又は細胞分裂停止に関連する。細胞死又は細胞生存能力は、一般に容認された任意の細胞傷害アッセイを用いて測定することができる。好適なアッセイのリストには、以下の方法が含まれる。
細胞傷害アッセイ                        参照文献
ＭＴＴアッセイ                          Mosmann, J. Immunol. Methods(1983)
65 (1-2):55-63
トリパンブルー色素排除試験              Bhuyan, et al., Experimental Cell
Research (1976) 97:275-280
放射性トリチウム（３Ｈ）−チミジン      Senik, et al., Int. A. Cancer
導入又はＤＮＡインターカレーション      (1975) 16 (6):946-959
アッセイ                                
放射性クロム−５１放出アッセイ          Brunner, et al., Immunology
(1968) 14:181-196
グルタミン酸ピルビン酸トランス          Mitchell, et al., J. of Tissue Culture
アミナーゼ、ケラチンホスホキナーゼ      Methods (1980) 6(3 & 4):113-116
及び乳酸脱水素酵素酵素漏出              
ニュートラルレッド取り込み              Borenfreund and Puerner, Toxicol. Lett.
(1985) 39:119-124
アルカリホスファターゼ活性              Kyle, et al., J. Toxicol. Environ.
Health (1983) 12:99-117
ヨウ化プロピジウム染色法                Nieminen, et al., Toxicol. Appl.
Pharmacol. (1992) 115:147-155
ビス−カルボキシエチレン−カルボキシ    Kolber, et al., J. Immunol. Methods
フルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）貯留        (1988) 108:255-264
ミトコンドリア膜電位                    Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1980) 77:990-994
クローン原性アッセイ                    Puck, et al., J of Experimental Medicine
(1956) 103:273-283
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存力／細胞傷害      Morris, Biotechniques (1990) 8:296-308
アッセイ                                
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ    Rubinstein, et al., J. Natl. Cancer
Instit. (1990) 82:1113-1118
【００５６】
上に定義したとおり、「培養細胞」に関するインビトロ相乗性試験は、個別の患者の細胞の分子表現型と当該培養細胞の分子表現型とのマッチングを行うことにより、当該患者に対して使用されるべき治療剤の割合を同定するために使用される。培養細胞及び／又は患者の細胞の分子表現型（の決定）は、当業者に周知の多くの方法を用いて実行することができる。例えば、通常採用されている方法の一例は、既知の生物学的マーカーの有無を同定するためにひとりの患者から採取した細胞又は組織がそのＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質発現パターンに対してスクリーニングされるような組織マイクロアレイを用いた免疫組織化学的診断である。このような方法は、Liu, et al., Amer. J. of Path. (2002) 161(5):1557-1565; Wick and Mills, Amer. J. Surg. Path. (2001) 25(9):1208-1210及びGolub, et al., Science (1999) 286:531-536において概説されている。これら文献の記載内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【００５７】
好ましい剤コンビネーション
【００５８】
上述の非拮抗的効果に関する基準を充足することが見出された治療剤の種々のコンビネーションは、次いで、薬剤送達媒体の処方物の形態で提供される。「治療剤」とは、単独で、又は他の化合物とのコンビネーションで、不所望の状態又は疾患によって影響を受けた被検体に対し所望の効果を有する化合物をいうものとする。
【００５９】
ある種の治療剤は、ターゲット状態又は疾患が癌の場合、コンビネーションで使用されると有利である。単なる例示であるが、以下のものが挙げられる：
「シグナル伝達阻害剤」：癌細胞の成長又は分裂を引き起こすシグナルに干渉又は阻止するもの；
「細胞傷害剤」；
「細胞周期阻害剤」又は「細胞周期制御阻害剤」：１つの細胞を誕生させる有糸分裂から当該細胞を複数の娘細胞に分裂させる有糸分裂に続く事象に至るまでの正常な細胞周期を通じた１つの細胞の進展即ち１つの細胞の寿命に干渉するもの；
「チェックポイント阻害剤」：細胞周期チェックポイント、例えばＳ／Ｇ２チェックポイント、Ｇ２／Ｍチェックポイント及びＧ１／Ｓチェックポイントの正常な機能に干渉するもの；
「トポイソメラーゼ阻害剤」（カンプトテシン等）：ＤＮＡ複製及び転写に必要な酵素であるトポイソメラーゼＩ又はＩＩ活性に干渉するもの；
「レセプターチロシンキナーゼ阻害剤」：チロシンキナーゼ活性を有する成長因子レセプターの活性に干渉するもの；
「アポトーシス誘導剤」：プログラム細胞死を促進するもの；
「代謝拮抗剤」（ゲムシタビン又はヒドロキシ尿素等）：必須代謝物に酷似するため必須代謝物が関与する生理的反応に干渉するもの；
「テロメラーゼ阻害剤」：テロメアの長さを伸長し、及び細胞の寿命及びその複製能を増強する酵素であるテロメラーゼの活性に干渉するもの；
「サイクリン依存性キナーゼ阻害剤」：ヒストンのような細胞タンパク質、細胞骨格タンパク質、転写因子、腫瘍抑制因子遺伝子等のリン酸化によって細胞周期の異なるフェーズ間の主要なステップを制御するサイクリン依存性キナーゼに干渉するもの；
「ＤＮＡ損傷剤」；
「ＤＮＡ修復阻害剤」；
「抗血管新生剤」：腫瘍増殖中に生じる新たな血管の生成又は既存の血管の成長に干渉するもの；及び
「ミトコンドリア毒」：ミトコンドリア呼吸鎖機能を直接的又は間接的に破壊するもの；
「放射性ヌクレオチド」：放射線を放出するもの；
「放射線増感剤」；及び
「薬剤耐性モジュレータ」：それ単独で活性又は不活性であり得るが、１又は２以上の治療剤の作用効果に対する薬剤耐性ターゲットの感受性を増強するもの。
【００６０】
上記の臨床的に是認されたコンビネーションは、腫瘍の治療のためにとりわけ好ましいコンビネーションである。これらのコンビネーションは人間に対する使用について既に認可されているので、適切な送達を保証するための再処方はとりわけ重要である。
【００６１】
コンビネーションで使用できる好ましい剤としては、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロンのようなＤＮＡ傷害剤；5-フルオロウラシル（5-FU）又はＦＵＤＲ、ゲムシタビン及びメトトレキサートのようなＤＮＡ修復阻害剤；カンプトテシン、イリノテカン及びトポテカンのようなトポイソメラーゼＩ阻害剤；ブレオマイシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及び ビノレルビンのようなＳ／Ｇ２又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤；Ｇ１／初期Ｓチェックポイント阻害剤；Ｇ２／Ｍチェックポイント阻害剤；ゲニステイン、トラスツズマブ、ＺＤ１８３９のようなレセプターチロシンキナーゼ阻害剤；細胞傷害剤；アポトーシス誘導剤；細胞周期制御阻害剤；及びカルシウムチャンネルブロッカーベラパミル及び免疫抑制剤シクロスポリンＡのような薬剤耐性モジュレータ等がある。
【００６２】
種々の抗ウイルス性化学治療剤も本発明によって使用することができる。例えば、サイトカイン、アシクロビル、アマンチジン、リバビリン、ジドブジン、プロテアーゼ阻害剤等のコンビネーションを非拮抗的コンビネーションに処方して、本発明の医薬調製物を調製することができる。同様に、抗菌化合物のコンビネーションも、本発明の医薬調製物に処方することができる。
【００６３】
１又は２以上の剤の作用機構は既知である必要はなく或いは正確に同定することはできないが、本書に開示されている方法の使用においては機能する。剤の患者特異的相乗的又は相加的コンビネーションは全て本発明の範囲内に含まれる。腫瘍の治療に対しては、非制御的細胞増殖を引き起こす２以上の機構を阻害するコンビネーションが、本発明に応じたそれらの患者特異的使用に関して検査されるのが好ましい。
【００６４】
患者の疾患組織又は血液からの細胞の分子表現型にマッチングされ得る培養細胞に対して検査されるべきとりわけ好ましいコンビネーションは、ＤＮＡ傷害剤とＤＮＡ修復阻害剤のコンビネーション、ＤＮＡ傷害剤とトポイソメラーゼＩ又はトポイソメラーゼＩＩ阻害剤とのコンビネーション、トポイソメラーゼＩ阻害剤とＳ／Ｇ２又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤とのコンビネーション、Ｇｌ／Ｓチェックポイント阻害剤又はＣＤＫ阻害剤とＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤とのコンビネーション、レセプターチロシンキナーゼ阻害剤と細胞傷害剤とのコンビネーション、アポトーシス誘導剤と細胞傷害剤とのコンビネーション、アポトーシス誘導剤と細胞周期制御阻害剤とのコンビネーション、Ｇ１／Ｓ又はＧ２／Ｍチェックポイント阻害剤と細胞傷害剤とのコンビネーション、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤とＤＮＡ修復阻害剤のコンビネーション、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤又はテロメラーゼ阻害剤と細胞周期制御阻害剤のコンビネーション、トポイソメラーゼＩ阻害剤とトポイソメラーゼＩＩ阻害剤とのコンビネーション、及び２つの細胞傷害剤のコンビネーションである。
【００６５】
好ましい候補コンビネーションは、一般に、ＦＤＡによって認められた臨床的に有効であることが既に示されているような上記のコンビネーション及び文献の報告に基づいて更に示唆されるコンビネーションが含まれる。本発明の方法で使用するための候補剤はこのような特定のコンビネーションに限定されないが、上述のコンビネーションは、好適なコンビネーション療法として発表されており、従って本発明の方法及び組成物への使用に好ましい。
【００６６】
脂質の中には、アポトーシスの誘導のような治療効果を発揮することができる「治療脂質」であるものもある。この定義に含まれるものとして、例えば、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホネート、セラミド及びセラミドアナログ、ジヒドロキシセラミド、フィトセラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシンアナログ、スフィンゴミエリン、セリン含有脂質及びスフィンガニンのような脂質がある。本書において定義される用語「セリン含有リン脂質」又は「セリン含有脂質」とは、極性頭部が一方の端部ではセリンと、他方の端部ではエーテル、エステル又はアミド結合により疎水性部分と結合した３員炭素骨格と共有結合したリン酸基を含むリン脂質をいうものとする。このクラスに含まれるものとしては、例えば、疎水性部分に５〜２３炭素原子長の２つの炭化水素鎖を有しかつ種々変化する飽和度を有するホスファチジルセリン（ＰＳ）のようなリン脂質がある。セリン含有リン脂質又はセリン含有脂質に関する用語疎水性部分とは、任意的に１又は２以上の芳香族、脂環式又は複素環式の基によって置換された、長い飽和又は不飽和脂肪族炭化水素鎖のような無極性基をいうものとする。治療脂質とその他の剤とのコンビネーションもまた、相乗的又は相加的効果を達成するために使用することができる。剤の非拮抗的コンビネーションは、上記したものと同様の方法によって、細菌又はウイルス並びに炎症性障害に対するその活性に対して同定することもできる。
【００６７】
カプセル化薬剤含有送達媒体の調製
【００６８】
上述の方法を用いて治療剤の適切な割合が決定された後、当該適切な割合の治療剤は、送達媒体組成物に配されるが、この組成物においては、１又は２以上の送達媒体が１又は２以上の治療剤をカプセル化している。医薬調製物に使用される送達媒体（複数）は同一である必要はないが、カプセル化された治療剤（複数）に関し協調的薬剤動態を生じるべきである。医薬調製物に使用される送達媒体（複数）は、典型的には、その投与経路に応じ、水性又はその他の種類の溶媒に懸濁し得るサイズのパーティクルである。そのような送達媒体としては、例えば、脂質担体、リポソーム、シクロデキストリン、ナノカプセル及びナノスフェアを含む重合体ナノパーティクル及び重合体マイクロパーティクル、ブロック共重合体ミセル、脂質安定化エマルジョン、誘導体化単鎖重合体、重合体−脂質ハイブリッドシステム、脂質ミセル、リポタンパク質ミセル等がある。
【００６９】
上述したように、治療剤は、患者特異的医薬調製物中において送達媒体と安定的に結合される。治療剤（複数）は、同じ医薬調製物中において、一緒にカプセル化ないし同じ送達媒体と安定的に結合されても、別々の送達媒体に（安定的に）結合されてもよい。
【００７０】
リポソームは、Liposomes: Rational Design（A. S. Janoff ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y.）に記載されたように調製することも、当業者に既知のその他の方法で調製することもできる。本発明で使用するためのリポソームは、「低コレステロール」（３０ｍｏｌ％未満）であるように調製してもよい。本発明のリポソームは、エーテル脂質、ホスファチジン酸、ホスホネート、セラミド及びセラミドアナログ、スフィンゴシン及びスフィンゴシンアナログ、及びセリン含有脂質等の治療脂質を含有してもよい。リポソームは、循環寿命を長くするために、ポリエチレングリセロール−ＤＳＰＥのような表面安定化親水性重合体−脂質コンジュゲートを用いて調製してもよい。担体の循環寿命を長くするために、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のような負荷電脂質の導入をリポソーム処方物に加えてもよい。これらの脂質は、表面安定化剤としての親水性重合体−脂質コンジュゲートを置換するために採用してもよい。本発明の実施形態では、凝集を阻止することにより担体の血中残留時間を増大するためにＰＧ又はＰＩを含有するコレステロールフリーリポソームを使用してもよい。
【００７１】
ミセルは、疎水性コア内に存在する低溶解性剤の送達のために使用される両親媒性脂質又は重合体成分から構成される自己集合パーティクルである。ミセル送達媒体の調製のための手段は多々存在し、当業者であれば容易に実行することができる。例えば、脂質ミセルは、Perkins, et al., Int. J. Pharm. (2000) 200(1):27-39（この文献の記載内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されたものとみなす。）に記載されたようにして調製することができる。リポタンパク質ミセルは、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質及びカイロミクロンを含む天然又は合成リポタンパク質から調製することができる。脂質安定化エマルジョンは、脂質単分子膜又は脂質二分子膜のような乳化成分によって安定化されたオイル充填コアを含むように調製されたエマルジョンである。このコアは、トリアシルグリセロール（コーン油）のような脂肪酸エステルを含んでもよい。単分子膜又は二分子膜は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧのような親水性重合体脂質コンジュゲートを含んでもよい。このような送達媒体は、該重合体脂質コンジュゲートの存在下でオイルを均質化することによって調製しても良い。脂質安定化エマルジョンに導入される治療剤は、通常、低水溶性である。ステアリン酸エステル又はポリ（エチレンオキシド）ブロック−ポリ（ヒドロキシエチル-L-アスパルタミド）及びポリ（エチレンオキシド）-ブロック-ポリ（ヒドロキシヘキシル-L-アスパルタミド）のミセルのようなリポタンパク質に類似する性質を呈する合成重合体アナログもまた、本発明のパーティクルに使用することができる（Lavasanifar, et al., J. Biomed. Mater. Res. (2000) 52:831-835）。
【００７２】
シクロデキストリンは、水に不溶性の薬剤をそのポケット内に収容することができるポケット形成性水溶性オリゴ糖から構成される。治療剤は、当業者に既知の方法を用いて、シクロデキストリンにカプセル化することができる。例えば、Atwood, et al., Eds. ,"Inclusion Compounds, "Vols. 2 & 3, Academic Press, NY (1984); Bender, et al., "Cyclodextrin Chemistry," Springer-Verlag, Berlin(1978); Szeitli, et al., "Cyclodextrins and Their Inclusion Complexes," Akademiai Kiado, Budapest, Hungary (1982) 及びWO 00/40962参照。
【００７３】
ナノパーティクル及びマイクロパーティクルは、重合体シェル（ナノカプセル）によって包囲された、又は重合体マトリックス（ナノスフェア）全体に分散された固体若しくは液体としての、薬剤の濃縮コアを含み得る。ナノパーティクル及びマイクロパーティクルを調製するための一般的方法は、Soppimath, et al. (J. Control Release (2001) 70(1-2):1-20)によって記載されている。この文献の開示内容全体は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。使用可能なその他の重合体送達媒体としては、例えば、親水性シェルによって包囲された疎水性コアを有する薬剤を含むブロック共重合体ミセルがある。これは、通常、疎水性薬剤の担体として使用され、Allen, et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces (1999) Nov 16(1-4):3-27によって発見されたように調製することができる。重合体−脂質ハイブリッドシステムは、脂質単分子膜によって包囲された重合体ナノパーティクルから構成される。重合体パーティクルは、疎水性薬剤の導入のためのカーゴスペースとして役立つのに対し、脂質単分子膜は疎水性コアと外部水性環境との間の安定化干渉作用を行う。ポリカプロラクトン及びポリ（d, l-ラクチド）のような重合体を使用することができるが、脂質単分子膜は典型的には脂質の混合物から構成される。好適な調製方法は、重合体ナノパーティクルについて上述した方法と同様である。誘導体化単鎖重合体は、重合体−薬剤コンジュゲートを生成するために、生理活性剤の共有結合に適合的な重合体である。 Numerous polymers have been proposed for synthesis of polymer-drug conjugates includingポリアミノ酸、デキストリン又はデキストランのような多糖及びN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）共重合体のような合成重合体を含む重合体−薬剤コンジュゲートの合成のために多くの重合体が提案されている。好適な調製方法の詳細はVeronese and Morpurgo, IL Farmaco (1999) 54(8):497-516に記載されている。この文献の記載内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【００７４】
静脈内投与に対しては、送達媒体の直径は、通常、凡そ４〜６，０００ｎｍである。好ましい直径は凡そ５〜５００ｎｍであり、より好ましい直径は５〜２００ｎｍである。吸入、くも膜下腔内投与、関節内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与に対しては、送達媒体は、通常、４μｍ〜５０μｍ超である。眼内投与のために設計された送達媒体組成物は、通常、より小さい。
【００７５】
治療剤は、送達媒体に「カプセル化」される。「カプセル化」は、１つの剤と送達媒体との共有結合又は非供給結合的結合を含む。これは、送達媒体の１又は複数の外層と剤との相互作用又は送達媒体内部の剤の封入によって可能であるが、平衡は送達媒体の異なる部位間で達成される。例えば、リポソームに関していえば、（１つの）剤のカプセル化は、脂質成分との共有結合的又は非共有結合的相互作用によるリポソームの二分子膜との相互作用による当該剤の結合によって又はリポソームの水性内部での封入によって可能であり、又は内部水性相と二分子膜との間の平衡において可能である。重合体系送達媒体に関しては、カプセル化は、直線状又は非直線状重合体と剤との共有結合に関し得る。更に、単なる例示に過ぎないが、重合体マトリックス全体にわたる剤の分散、又はナノカプセル、ブロック共重合体ミセル又は重合体脂質ハイブリッドシステムのコア内での薬剤の濃縮等も可能である。
【００７６】
所望のコンビネーションのカプセル化は、別々の送達媒体にカプセル化することによっても、同一の送達媒体にカプセル化することによっても達成することができる。送達媒体（複数）へのカプセル化は、その好適な非拮抗的割合に関する患者のスクリーニングに先立って行われるのが好ましい。リポソームのような別々の送達媒体へのカプセル化が望まれる場合は、個々のリポソームの脂質組成（物）は、個々の薬剤の類似の薬物動態を考慮するために全く異なったものであってもよい。送達媒体組成（物）を変化することにより、カプセル化された薬剤（複数）の放出速度は、腫瘍部位に送達されるべき薬剤の非拮抗的割合を可能とするために、調和（マッチング）され得る。放出速度の変化方法は、薬剤貯留を改善するための小胞形成脂質のアシル鎖の長さを増大すること、リポソーム膜からのＰＥＧのような表面移植親水性重合体の交換を制御すること及びステロール又はスフィンゴミエリンのような膜強化剤を膜内に導入することを含む。第１の薬剤と第２の薬剤が特異的薬剤割合で投与されることが望まれかつ第１の薬剤のリポソーム組成物（例えばＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）の内部における第２の薬剤の保持が乏しい場合、改善された薬剤動態は、アシル鎖の長さが伸長された脂質を有するリポソーム組成物（例えばＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ）内に第２の薬剤をカプセル化することによって達成され得ることは、当業者には明らかであろう。また、２又は３以上の剤を同じ送達媒体の内部にカプセル化してもよい。
【００７７】
カプセル化方法は、送達媒体の性質に依存する。例えば、治療剤は、受動的及び能動的導入（passive and active loading）法の両方を用いてリポソームに導入することができる。
【００７８】
リポソームへの剤のカプセル化の受動的方法は、リポソームの調製中に剤をカプセル化することを含む。この方法では、薬剤は、封入された水性空間内部に結合又はカプセル化された膜であり得る。これは、Bangham, et al., J. Mol. Biol. (1965) 12:238によって記載された受動的封入法を含む。この方法では、目的の剤を含む水性相が反応容器の壁に堆積された乾燥した小胞形成性脂質のフィルムと接触させられる。機械的手段による撹拌時に、脂質の膨潤が生じ、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）が生成する。押し出し（extrusion）法を用いることにより、ＭＬＶは、大単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）又は小単一ラメラ小胞（ＳＵＶ）に変換することができる。使用可能な受動的導入の他の方法には、Deamer and Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976)443:629によって記載された方法が含まれる。この方法は、小胞形成性脂質をエーテルに溶解することを含み、及び、最初にエーテルを蒸発して表面に薄膜を形成する代わりに（この薄膜は、後に、カプセル化するために水性相と接触させられる）、エーテル溶液が水性相に直接注入され、その後エーテルが蒸発されることにより、カプセル化された剤を含むリポソームが得られることを含む。使用可能な更なる方法の１つは、Szoka and Papahadjopoulos, P.N.A.S. (1978) 75:4194によって記載された逆相蒸発（ＲＥＶ）法である。この方法では、水に不溶性の有機溶媒中の脂質の溶液が、水性担体相において乳化され、次いで、有機溶媒が減圧下で除去される。
【００７９】
使用可能なその他の受動的封入法には、リポソームを連続的脱水及び再水和処理すること、又は凍結及び解凍することが含まれる。脱水は、蒸発又は凍結乾燥によって実行される。この方法は、Kirby, et al., Biotechnology (1984) 979-984によって発表されている。更に、Shew and Deamer (Biochim. et Biophys. Acta (1985) 816:1-8)は、超音波処理によって調製されたリポソームがカプセル化されるべき溶質と共に水溶液中で混合され、この混合物が回転フラスコ内で窒素雰囲気下で乾燥される方法を記載している。再水和時には、溶質の有意なフラクションがカプセル化されている大きなリポソームが生成される。
【００８０】
２又は３以上の剤の受動的カプセル化は、多くの薬剤組成物に対して実行可能である。この方法は、水性緩衝溶液中の薬剤の溶解度と送達システム内部に封入されない薬剤の大きなパーセントとによって制限される。導入は、薬剤と脂質サンプルとの共凍結乾燥及び薬剤の可溶化を可能にする最小体積における再水和によって改善されるであろう。溶解度は、バッファのｐＨを変化すること、温度を上昇すること及びバッファからの塩の除去又は添加によって改善されるであろう。
【００８１】
カプセル化の能動的方法も使用することができる。例えば、リポソームは、金属錯体形成又はｐＨ勾配導入法により導入することができる。ｐＨ勾配導入法によって、選択されたｐＨの水性相をカプセル化するリポソームが生成される。水和されたリポソームは、選択された異なるｐＨの水性環境に置かれ、カプセル化されるべき薬剤その他の剤の電荷が除去ないし最小化される。ひとたび薬剤がリポソームの内部に移動すれば、その内部のｐＨによって薬剤は荷電された状態になるため、薬剤の脂質二分子膜の透過が阻止され、薬剤がリポソーム内に封入されることとなる。
【００８２】
ｐＨ勾配を形成するために、元の外部媒質は、異なるプロトン濃度を有する新たな外部媒質で置換することができる。外部媒質の置換は、種々の方法によって、例えば、脂質媒体調製物を、（後述する実施例において示すような）新たな媒質で平衡されているゲルろ過カラム（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム）に通すことによって、又は遠心分離、透析、又はその他の関連技術によって達成することができる。内部媒質は、外部媒質に対し酸性・塩基性の何れであってもよい。
【００８３】
ｐＨ勾配を確立した後、ｐＨ勾配導入可能剤を混合物に添加すると、リポソームによる該剤のカプセル化が上述のように起こる。
【００８４】
ｐＨ勾配を用いた導入は、米国特許第5,616,341号、同第5,736,155号及び同第5,785,987号に記載された方法に応じて実行することもできる。これらの記載内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。ｐＨ勾配導入の好ましい方法の１つは、ｐＨ２〜６の開始バッファとしてのクエン酸と中性外部バッファとを使用するクエン酸系導入法である。
【００８５】
リポソームにわたるｐＨ勾配の確立・維持のために採用できる方法は多々ある。これら方法はすべてここに記載されているものとみなす。これは、リポソーム膜内に侵入可能でありかつプロトンとの交換により膜を介してイオンを輸送することができるイオノフォアの使用を含み得る（米国特許第5,837,282号参照）。リポソーム膜を介してプロトンを（往復）輸送すること従ってｐＨ勾配を形成することが可能な、リポソームの内部にカプセル化された化合物（米国特許第5,837,282号参照）を使用してもよい。このような化合物は、脱プロトン化されたとき中性を示しかつプロトン化されたとき荷電されるイオン化可能成分を含む。（プロトン化形態と平衡状態にある）中性の脱プロトン化形態は、リポソーム膜を横断することができるため、プロトンをリポソームの内部に留め置き、もって内部のｐＨの減少を引き起こすことができる。そのような化合物としては、例えば、メチルアンモニウムクロライド、メチルアンモニウムサルフェート、エチレンジアンモニウムサルフェート（米国特許第5,785,987号参照）及び硫酸アンモニウム等がある。塩基性内部ｐＨを確立することができる内部導入バッファも使用することができる。この場合、塩基性内部（環境）を確立するためにプロトンがリポソーム内部から外部に輸送されるようにして、中性形態はプロトン化される。そのような化合物の一例は、酢酸カルシウムである（米国特許第5,939,096号参照）。
【００８６】
２又は３以上の剤は、上記のものと同じ能動的導入法を用いてリポソームに導入することも可能であり、又はそれらとは異なる能動的導入法を使用することもできる。例えば、金属錯体形成導入は、複数の剤を能動的に導入するために使用することが可能であり、又はｐＨ勾配導入のような他の能動的導入法と組み合わせて使用することも可能である。金属系能動的導入は、典型的には、受動的にカプセル化された金属イオンを有する（受動的に導入される治療剤は有する場合も有しない場合もある）リポソームを使用する。金属イオンの種々の塩が使用されるが、塩は医薬的に許容可能でかつ水性溶液に可溶であることが前提とされる。能動的に導入される剤は、金属イオンとの錯体形成が可能であること、従ってリポソームの内部でそのように錯体を形成された場合保持されること、更に金属イオンに錯体形成されない場合リポソーム内に導入可能であることに基づいて選択される。金属に配位可能な剤は、通常、アミン、カルボニル基、エーテル、ケトン、アシル基、アセチレン、オレフィン、チオール、水酸基又はハライド基又は電子を金属イオンに供与することにより金属イオンとの錯体形成が可能なその他の好適な基のような配位部位を有する。金属に結合する活性剤としては、例えば、フルオロキノロンのようなキノロン；ナリジクス酸のようなキノロン；ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシンのようなアントラサイクリン；カナマイシンのようなアミノグリコシド；及びブレオマイシン、マイトマイシンＣ及びテトラサイクリンのようなその他の抗生物質；及びシクロホスファミド、チオセミカルバゾン、インドメタシン及びニトロプルシドのようなナイトロジェンマスタード；トポテカン、イリノテカン、ルルトテカン（lurtotecan）、9-アミノカンプトテシン、9-ニトロカンプトテシン及び10-ヒドロキシカンプトテシンのようなカンプトテシン；及びエトポシドのようなポドフィロトキシン等がある。剤の取り込みは、剤を外部媒質に添加した後、好適な温度で混合物をインキュベーションすることによって確立される。リポソームの組成、内部媒質の温度及びｐＨ、及び剤の化学的性質に依存して、剤の取り込みは、数分ないし数時間の期間にわたって実行することができる。リポソームの内部で剤と金属との間に配位が生じたか否かを決定する方法には、例えば、分光光度的分析その他の当業者に周知の伝統的方法が含まれる。
【００８７】
更に、リポソーム内のイオノフォアの不存在下で実行される金属系方法を用いたリポソーム導入効率及び貯留特性は、使用される金属及びリポソームの脂質組成に依存する。脂質組成及び金属を選択することにより、導入又は貯留特性は、所望の導入又はリポソームからの選択された剤の放出の達成に適応されることができる。
【００８８】
受動的及び能動的導入法は、複数の剤を１つの送達媒体に導入するために逐次的に組み合わせることができる。例えば、ＭｎＣｌ２の存在下でシスプラチンのような受動的に封入されたプラチナ剤を含有するリポソームは、その後、ドキソルビシンのようなアントラサイクリンのリポソームの内部への能動的カプセル化に使用することができる。この方法は、受動的カプセル化によりリポソーム内にカプセル化された薬剤の多くに対して適用可能であろう。
【００８９】
患者特異的医薬調製物の調製
【００９０】
少なくとも２つの治療剤の患者特異的割合が同定されれば、当該患者に投与するために設計された医薬調製物を調製することが可能な方法は多々存在する。第１に、治療剤は、上述の方法を用いて患者特異的割合のインビトロ同定を行う前に、送達媒体に予備処方されてもよく、或いはインビトロ分析後に送達媒体にカプセル化してもよい。複数の治療剤は、同一の送達媒体に共通カプセル化してもよく、又は別々にカプセル化してもよい。治療剤が別々の送達媒体にカプセル化される場合は、送達媒体の組成は投与されるべき個々の治療剤の類似の薬剤動態を考慮する必要がある。このような医薬調製物を調製するための資格を有する者、例えば実験室技術者、薬剤師、看護師、医師等は、インビトロスクリーニング及び分子表現型決定の現場で又は薬局若しくは病院等の遠隔地で患者特異的医薬調製物を調製してもよい。
【００９１】
調製物は、所望の患者特異的割合の（予備処方された、又は培養細胞のインビトロスクリーニングを行いかつ培養細胞と患者細胞との分子表現型決定を行った後に処方された）個別にカプセル化した複数の治療剤の適正な量を組み合わせ、当該患者のためにラベルを付したバイアルに入れることによって調製することができ、又は送達媒体が（予備処方された、又は培養細胞のインビトロスクリーニングを行いかつ培養細胞と患者細胞との分子表現型決定を行った後に処方された）所望の割合で共通カプセル化された複数の治療剤によって調製される場合は、この調製物の必要用量をバイアルに入れて保存し当該患者のためのラベルを付してもよい。
【００９２】
図４に、概要を示したように、患者特異的割合は、個々の患者の分子／細胞表現型にマッチングする培養細胞のインビトロスクリーニングを用いて同定した。この例では、患者特異的割合として、治療剤Ａ及びＢの割合１：５が決定された。この割合の詳細が、問題の患者のための医薬調製物を作成するための有資格者に引き渡される。この有資格者は、（治療剤Ａに好適な送達媒体に予備処方又はインビトロスクリーニング後及び／又は分子表現型決定後に処方された）治療剤Ａの１部と、（治療剤Ｂに好適な送達媒体に予備処方又は後に処方された）治療剤Ｂの５部とを組み合わせ、そのコンビネーションを当該患者のためにラベルが付されたバイアルに入れて保存してもよい。或いは、（この場合も、予備処方又は分子表現型決定及びスクリーニング後に処方された）共通カプセル化治療剤Ａ及びＢの１：５の割合で既に送達媒体が調製されている場合、この調製物の必要用量をバイアルに入れて保存し、患者のためのラベルを付してもよい。予備処方された送達媒体カプセル化薬剤を使用するのが好ましい。個々の患者に特異的なバイアルは、患者特異的治療を当該患者に施す前に滅菌すべきであろう。また、個々の薬剤調製物を滅菌すべきであるが、滅菌技術は患者特異的医薬調製物を作成するプロセス全体にわたって適用すべきであろう。
【００９３】
「患者特異的医薬」調製物又は組成物とは、従って、送達媒体に共通カプセル化されるか別々にカプセル化されるかに関わらず、当該患者の疾患組織又は血液から採取した細胞の分子表現型に類似又は同一の分子表現型を有する培養細胞に対する非拮抗的効果に関し最適化された割合（即ち「患者特異的割合」）で組み合わされた少なくとも２つの治療剤のコンビネーションを含有する処方物をいう。カプセル化された治療剤を患者特異的割合で組み合わせ患者特異的医薬調製物を作成した後は、該医薬調製物は、当該患者に直接投与しても、当該患者の部位に移しても、及び／又は当該患者に対する将来の投与のために貯蔵してもよい。更に、コンビネーション治療の多くは、同一の医薬調製物の複数の投与形態を必要とする。従って、上記医薬調製物はそのような場合のために複製（及び必要に応じ貯蔵）してもよい。
【００９４】
複数の剤をカプセル化した送達媒体組成物の治療的使用
【００９５】
本書に記載した割合−特異的送達媒体は、種々の被検体の種々の疾患の治療に使用することができる。本書に記載した方法及び組成物による治療に対し好適な被検体としては、例えば、人間、家畜又は家庭飼育動物（ペット）等の哺乳動物一般、ニワトリ及びアヒル等の家禽類、及び研究用の実験動物等が該当する。本発明の組成物の医学的使用としては、例えば、癌の治療、高血圧症、心不整脈及び再狭窄のような循環器疾患の治療、細菌、ウイルス、真菌又は寄生虫感染の治療、ワクチンのような本発明の組成物の使用による疾患の治療及び／又は阻止、炎症の治療又は自己免疫疾患の治療がある。
【００９６】
１つの実施形態では、本発明の送達媒体組成物は、腫瘍の治療に使用するのが好ましい。処方された薬剤の腫瘍部位への送達は、リポソーム又はその他の粒状送達システムの投与によって達成される。リポソームは直径２００ｎｍ未満であるのが好ましい。腫瘍脈管構造は、一般に、内皮の開窓又はギャップのため正常な脈管構造よりも漏出性が大きい。このため、直径２００ｎｍ以下の送達媒体は不連続部分のある内皮細胞膜及び血液を腫瘍に供給する欠陥を包囲する深層の基底膜に侵入することができる。血管外遊出に続き送達媒体が腫瘍部位に選択的に蓄積することにより、薬剤の送達及び治療の有効性は高まる。担体は血管外遊出をするので、血液中において決定される担体薬剤対薬剤割合は血管外空間における担体薬剤対薬剤割合と同等であろう。
【００９７】
本発明の組成物のインビトロ投与
【００９８】
上述のように、本発明の割合−特異的送達媒体組成物は、人間等の温血動物及び家禽類に投与してもよい。人間の疾患を治療するために、いやしくも資格を有する医師であれば、確立されたプロトコールを用いた投与の用量、スケジュール及びルートに関してどのように本発明の患者特異的組成物を使用すべきかについて決定することができる。本発明の送達媒体組成物にカプセル化された剤が被検体の健康な組織に対して示す毒性が低減されるべき場合は、そのような投与は用量エスカレーションを使用することができる。
【００９９】
本発明の患者特異的医薬組成物は、非経口的投与即ち動脈内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又は筋肉内投与をするのが好ましい。医薬組成物は、大量瞬時投与による静脈内又は腹腔内投与されるのがより好ましい。例えば、Rahman, et al.の米国特許第3,993,754号；Searsの米国特許第4,145,410号；Papahadjopoulos, et al.の米国特許第4,235,871号；Schneiderの米国特許第4,224,179号；Lenk, et al.の米国特許第4,522,803号及びFountain, et al.の米国特許第4,588,578号参照。これらすべての文献の開示内容は引用をもって本書に繰り込みここに記載されているものとみなす。
【０１００】
その他の方法では、本発明の患者特異的医薬又は美容調製物は、組織に調製物を直接投与することによってターゲット組織と接触させることができる。投与は、局所的、「開放型」又は「閉鎖型」方法によって行ってもよい。「局所的」とは、皮膚、中咽頭、外耳道（external auditory canal）等のような、環境に曝された組織に対する多剤調製物の直接的投与をいうものとする。「開放型」方法とは、患者の皮膚を切開すること及び医薬調製物が投与される深層の組織を直接露出することを含むような方法をいう。これは、通常、肺にアクセスするための開胸術、腹部の臓器にアクセスするための開腹術、又はその他ターゲット組織に対する直接的外科的アプローチのような外科的方法によって達成される。「閉鎖型」方法とは、内部のターゲット組織の直接的露出はされないが、皮膚の小さな傷を通した挿入装置によってアクセスされるような侵襲的方法をいう。例えば、調製物は、ニードル洗浄によって腹膜に投与することができる。或いは、調製物は内視鏡装置によって投与することもできる。
【０１０１】
本発明において概要を示したような患者特異的割合の薬剤をカプセル化した送達媒体を含む医薬組成物は、標準的な方法に従って調製されるが、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、５％デキストロース等を含有してもよく、更に、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等のような安定性増大のための糖タンパク質を含有してもよい。これらの組成物は、伝統的な周知の滅菌方法で滅菌してもよい。生成した水性溶液は、使用のために包装してもよく、無菌条件下で濾過し及び凍結乾燥してもよい。凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌水性溶液と混合される。組成物は、生理的条件に近づける必要がある場合、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等のようなｐＨ調節及び緩衝剤、張性調節剤等のような医薬的に許容可能な補助物質を含有してもよい。更に、送達媒体懸濁物は、保存中のフリーラジカル及び脂質過酸化損壊に対し脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。α−トコフェロールのような親油性フリーラジカル失活剤及びフェリオキサミンのような水溶性イオン特異的キレートは好適である。また、投与されたフルオロピリミジンの寿命を長くするために、標準的な方法によって本発明の組成物と共にロイコボリンを投与してもよい。
【０１０２】
患者特異的医薬処方物中の送達媒体の濃度は、凡そ０．０５重量％から、通常は２〜５重量％又は少なくとも２〜５重量％、１０〜３０重量％までのように広範に変更することができ、また選択された投与の特定のモードに応じて、液量、粘性等によって一次的に選択される。例えば、治療に関連する液体負荷を低下するために濃度を大きくしてもよい。或いは、刺激性脂質から構成される送達媒体は、投与部位における炎症を減少するために、希釈して濃度を小さくしてもよい。診断に対しては、送達媒体の投与量は、使用される特定のラベル、診断される疾患状態及び医師の判断に依存するであろう。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、静脈内投与されるのが好ましい。送達媒体処方物の用量は、薬剤対脂質の割合及び患者の年齢、体重及び状態に関し投与を行う医師の判断に依存するであろう。
【０１０４】
医薬組成物のほかにも、獣医学的使用のために好適な処方物を調製し、被検体に対し好適な方法で投与してもよい。好ましい獣医学的被検体は、例えば非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の哺乳類及び家禽等である。被検体としては、例えばとりわけラット、マウス及びモルモット等の実験動物も該当し得る。
【０１０５】
以下の実施例は、単なる説明のためのものに過ぎず、本発明を限定するものではない。本書に記載した好ましい実施例は、網羅的であること及び本発明の範囲を開示のものと全く同一のものに限定することは意図されておらず、本発明の本質及び当業者が本発明の教示を理解できるような応用的・実際的使用を最もよく説明するために選択・記載されたものである。
【実施例】
【０１０６】
［例１］
用量効果分析の複数の表示
【０１０７】
本発明の重要な部分は、疾患患者から採取された細胞の分子表現型に類似又は同一の分子表現型を薬剤スクリーニングの前後いずれかにおいて示すことが明らかにされた培養細胞に対する非拮抗的効果を示す薬剤のコンビネーションを同定することである。当該培養細胞に対する薬剤コンビネーションのインビトロクリーニングに関与するステップを実行するために、Ａ５４９培養細胞に対する効果を見るため、イリノテカンとカルボプラチンとのコンビネーションを種々の割合で検査した。本発明の好ましい一実施例では、方法は、患者別の特定の薬剤コンビネーションをより良好に同定するために、個々の患者の疾患組織又は血液から採取した細胞の分子表現型に類似又は同一の分子表現型を示す培養細胞に対する以下のインビトロスクリーニング分析を使用することを含む。
【０１０８】
薬剤の量（用量又は濃度）とその生物学的効果及び薬剤コンビネーションの複合的効果との間の関係の定量分析は、多くの方法で測定することができかつ報告されている。図２は、一例として、イリノテカンとカルボプラチンとを用いた、そのような５つの方法の説明である。用量効果分析に関するChou及びTalalayの理論に基づき、当業界で頻繁に使用されている多くの生化学的方程式を計算するために、「median-effect方程式」を用いた。この方程式を操作することにより、コンビネーションインデックス（ＣＩ）を計算するために使用される方程式のようなより高次の方程式が得られる。既に述べたとおり、ＣＩは、２以上の薬剤の複数のコンビネーション及び個々のコンビネーションの種々の割合が拮抗的、相加的又は相乗的であるかを決定するために利用することができる。ＣＩプロットは、通常、ｙ軸を示すＣＩ対ｘ軸の影響細胞（培養又は患者細胞）の個体群ないし影響フラクション（ｆａ）で記述される。図２Ａは、イリノテカン／カルボプラチンの１：１０のモル割合が拮抗的（ＣＩ＞１．１）であるのに対し、１：１及び１０：１では相乗的効果（ＣＩ＜０．９）を有することを示している。
【０１０９】
更に、本出願人は、使用される薬剤割合に対するＣＩの依存性を示す他の方法も明らかにした。図２Ｂに示したように特定のコンビネーションに対する割合特異的効果における傾向をより良好に説明するために、最大ＣＩ値を個々の割合に対してプロットする。ＣＩ最大値は、種々異なる割合における薬剤のＣＩ値の最も大きな相違が観察された（０．２〜０．８の間の）１つのｆａ値において得られるＣＩ値である。
【０１１０】
個々の割合に対して使用される薬剤の濃度（複数）は効果（即ち相乗性又は拮抗性）の決定において重要な役割を有するので、種々の濃度におけるＣＩを測定することも重要であり得る。Chou-Talalayによって「有効用量」（ＥＤ）とも称されたこのような濃度は、インビトロアッセイにおいて細胞の指定されたパーセントに影響を与えるのに必要な薬剤の濃度である。即ち、ＥＤ５０は、対照ないし未処理細胞個体群を基準として細胞の５０％に影響を与えるのに必要な薬剤の濃度である。図２Ｃに示したように、濃度効果における傾向は、種々の割合間で容易に区別される。図示のエラーバーは、平均値の前後のひとつの標準偏差を表すが、CalcuSynプログラムによって直接求められる。
【０１１１】
２又は３以上の薬剤の間の相乗的相互作用は、「用量縮小」としても知られる、肯定的効果を達成するために必要とされる個々の薬剤の量を減少することができるという利点を有する。Chou及びTalalayの「用量縮小インデックス」（ＤＲＩ）は、相乗的コンビネーション中の個々の薬剤の用量が、所与の効果レベルにおいて、個々の薬剤を単独で用いた場合に必要な用量に比べてどの程度減少され得るかを示す尺度である。ＤＲＩは、用量縮小によって治療有効性を維持しつつも被投与体に対する毒性の減少が達成される臨床的局面においては重要であった。図２Ｄのプロットは、単独で９０％細胞死滅を達成するために必要とされるイリノテカン及びカルボプラチンの濃度は、イリノテカン及びカルボプラチンが非拮抗的割合で組み合わされた場合に必要とされる個々の濃度と比べると著しく大きいことを示している。
【０１１２】
更に、上述のデータは、伝統的なアイソボログラムで表すことができる（図２Ｅ）。アイソボログラムは、異なるＥＤ値で作成することができるという利点を有するが、より多くの効果レベルが解釈のために選択されるため読み難くなる。このため、図２Ａ及び図２Ｂに示したタイプのプロットに応じてデータを示すのが好ましい。
【０１１３】
［例２］
治療効果の濃度依存性
【０１１４】
上述したとおり、本発明の研究者は、特定の薬剤割合がどのように処置細胞に影響を与えるかを決定する上で薬剤濃度が重要な役割を有することを認識している。このコンセプトを実証するために、１：１と１：１０のモル割合のイリノテカン及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の薬剤コンビネーションに対し、標準的なテトラゾリウム系比色分析ＭＴＴ細胞傷害アッセイ及びmedian-effect分析を用いて、培養細胞に対する相加的、相乗的又は拮抗的効果を検査した。本発明の好ましい実施例では、そのような治療剤のコンビネーションの非拮抗的又は拮抗的割合の検査を、薬剤スクリーニングの前後に関わらず患者の疾患組織又は血液から採取した細胞の分子表現型に類似又は同一の分子表現型を示すことが明らかにされた培養細胞に対して実行する。例証のために、培養細胞ＨＴ２９又はＭＣＦ−７を、薬剤割合及び濃度の特性を明らかにするために、個別の剤及び所定の割合の剤コンビネーションに曝した。ＭＴＴアッセイから光学濃度値を得て、対照のパーセントに変換し、平均した後、影響フラクション値に変換した。用量及び影響フラクション値をCalcuSynに入力し、図３に示したＣＩ対ｆａのグラフを得た。
【０１１５】
図３Ａは、１：１のモル割合のイリノテカン及び５−ＦＵが、影響フラクション量によって測定されるような濃度範囲全体にわたって非拮抗的（ＣＩ＜０．９）であったことを示す。これに対し、１：１０のモル割合では、イリノテカン及び５−ＦＵは、低濃度（小Ｆａ値）では非拮抗的であったが、より大きい濃度（大Ｆａ値）では拮抗的（ＣＩ＞１．１）であった。図３Ｂに示したように、エトポシド及びカルボプラチンは、１０：１のモル割合では濃度範囲全体にわたって拮抗的であった。これに対し、１：１０のモル割合では、エトポシド及びカルボプラチンは、低濃度では拮抗的であったが、高濃度では非拮抗的であった。
【０１１６】
したがって、これらの結果は、相乗性は剤相互の割合だけにではなくそれらの濃度にも大きく依存することを示している。
【０１１７】
［例３］
治療割合の患者特異的生成及び投与
【０１１８】
本発明の方法は、更に、個々の患者への投与に適し当該個々の患者に特異的な医薬調製物を生成することを含む。ひとりの患者の疾患組織又は血液を採取し、分子表現型決定によって特徴付け、類似又は同一の分子表現型を有する培養細胞とマッチングする前後に関わらず、治療剤の最適な非拮抗的割合を同定するために、培養細胞は上記［例１］及び［例２］に記載したようにスクリーニングされる。培養細胞について同定された最適割合は、これは患者の分子表現型とマッチングするのであるが、次いで、当該患者への投与のために使用されるべき「患者特異的割合」として選択される。患者に投与するための調製は、種々の方法で実行することができる。例えば、類似の癌を有する２人の患者の場合、以下のとおりに実行される。
【０１１９】
患者１は、腫瘍生検を受け、これを上述のように、分子表現型決定及び培養細胞に対する薬剤スクリーニングを用いて、インビトロで分析し、薬剤Ａ対Ｂの割合１：５が患者１の癌細胞に対する最適な非拮抗的効果を示すことを求めた（図４参照）。患者２は、腫瘍生検を受け、これも上述のように、分子表現型決定及び培養細胞に対する薬剤スクリーニングを用いて、インビトロで分析したが、この場合は、治療剤Ａ及びＢの割合１：２が、患者２の癌細胞に対する最適な非拮抗的割合であることが同定された。次に、患者１に投与されるべき医薬調製物の作成のために資格を有する者であれば、（予備処方又は患者特異的割合の同定後処方された）治療剤Ａの処方物の１部と、（予備処方又は患者特異的割合の同定後処方された）治療剤Ｂの処方物の５部とを組み合わせ（これは治療剤処方物の用量と質（即ち滅菌）が人間に対する使用に容認されているものであることを前提としている）、及び（資格があれば）調製物を患者１に投与するか又はコンビネーション調製物を患者１のためにラベルが付されたバイアルに入れて保存することができる（図４に概要が示されている）。
【０１２０】
或いは、上記の（有資格）者は、（予備処方又は患者１の特異的割合の同定後処方された）１：５の割合で共通カプセル化された治療剤Ａ及びＢを含有する適切な量の送達媒体処方物を患者１のためにラベルが付されたバイアルに入れて保存することができる（この場合も、バイアルに収容される処方物の量及び質は人間に対する使用に容認されているものであることが前提とされている）。同様に、同じ又は異なる者は、（この場合も予備処方又は新たに処方された）治療剤Ａの調製物の１部と、（予備処方又は新たに処方された）治療剤Ｂの調製物の２部とを組み合わせ（これは薬剤処方物の用量と質が人間に対する使用に容認されているものであることを前提としている）、及び（資格があれば）調製物を患者２に投与するか又はコンビネーション調製物を患者２のためにラベルが付されたバイアルに入れて保存することができる。或いは、上記の者は、（予備処方又は患者２の特異的割合の同定後処方された）１：２の割合で共通カプセル化された治療剤Ａ及びＢを含有する適切な量の送達媒体処方物を患者２のためにラベルが付されたバイアルに入れて保存することができる（この場合も、バイアルに収容される処方物の量及び質は人間に対する使用に容認されているものであることが前提とされている）。ラベルが付されたバイアルは、保存、（同じ患者に複数回投与するための）複製、及び／又は患者に投与する前に適切な条件下での移送をされてもよい。ラベルが付されるバイアルは、資格を有する実験室、病院、薬局等で作成されてもよい。
【０１２１】
本発明の他の実施例では、少なくとも１つの治療剤を含む少なくとも１つの医薬調製物と、少なくとも１つの第２の治療剤を含む第２の医薬調製物とを含むキットが提供される。上記の実施例を用いることにより、薬剤Ａの少なくとも１つの医薬調製物と、薬剤Ｂの医薬調製物とを有するキットも提供することができる。いやしくも有資格者であれば、資格を有する個人によって患者に投与される前にキットに含まれる個々の薬剤処方物の適切量（即ち患者１に対しては薬剤Ａ：Ｂの１：５の割合、患者２に対しては薬剤Ａ：Ｂの１：２の割合）を混合することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】培養細胞に対して検査される治療剤の適切な割合を決定するための本発明の方法の概要を示す概略図。
【図２Ａ】Ａ５４９細胞における影響フラクションに対するコンビネーションインデックス（ＣＩ）をプロットしたグラフ。
【図２Ｂ】イリノテカン：カルボプラチンモル割合に対するコンビネーションインデックス（ＣＩ）をプロットしたグラフ。
【図２Ｃ】イリノテカン：カルボプラチンモル割合に対するコンビネーションインデックス（ＣＩ）をプロットしたグラフ。
【図２Ｄ】イリノテカン及びカルボプラチンの単独薬剤投与又はコンビネーション投与によるＡ４５９細胞の９０％死滅に必要な薬剤濃度の棒グラフ。
【図２Ｅ】イリノテカン濃度対カルボプラチン濃度をプロットしたグラフ。
【図３Ａ】培養細胞ＨＴ２９の影響フラクション（ｆａ）の関数としての、イリノテカン：５−ＦＵのモル割合１：１０（黒四角）及び１：１（黒丸）のコンビネーションインデックス（ＣＩ）のグラフ。
【図３Ｂ】培養細胞ＭＣＦ−７の影響フラクション（ｆａ）の関数としての、エトポシド：カルボプラチンのモル割合１：１０（黒菱形）及び１０：１（黒四角）のＣＩのグラフ。
【図４】本発明の実施において使用される方法の概略図。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2006523457.tif 000013
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