(57)【要約】本発明は、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を過剰増殖性細胞、代表的には癌細胞に導入して、細胞プロセスに関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを切除することによる、過剰増殖性細胞、代表的には癌細胞の細胞分裂を阻害する方法を記載し、且つＲＮＡｉ分子及び上記ＲＮＡｉ分子をコードする転写カセットを含むベクターを含む。上記ＲＮＡｉ分子をｉｎ  ｖｉｖｏで癌に適用することにより、治療に効果を及ぼし、それにより癌細胞を殺傷するかいずれにしろ除去することが可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞の細胞分裂を阻害する方法であって、該癌細胞に少なくとも１つの抑制性ＲＮＡ分子を導入することを含み、前記抑制性ＲＮＡ分子は該細胞の少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する、癌細胞の細胞分裂を阻害する方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡｉ分子は、前記細胞の細胞分裂周期の少なくとも１つの工程を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、生殖細胞（germ cell）癌腫細胞、特に奇形癌腫細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡｉ分子は、図９〜図１６のいずれか１つに示される核酸配列を参照して設計される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの癌細胞の少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する少なくとも１つの遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、ＲＮＡｉ分子。
【請求項６】
前記ＲＮＡｉ分子は修飾リボヌクレオチド塩基を含む、請求項５に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項７】
前記ＲＮＡｉ分子は、図９〜図１６のいずれか１つに示される核酸配列の少なくとも１つ又はその一部分を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ分子。
【請求項８】
発現カセットを含む核酸分子であって、該カセットは、少なくとも１つの過剰増殖性細胞の少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する遺伝子の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含み、前記カセットは、センス核酸分子及びアンチセンス核酸分子の両方が該カセットから転写されるように、少なくとも１つのプロモーターの提供により適合される、発現カセットを含む核酸分子。
【請求項９】
前記カセットには、前記核酸分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を転写するのに適合した少なくとも２つのプロモーターが提供されている、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記カセットは、核酸分子を含み、該分子は第二の部分に結合した第一の部分を含み、該第一の部分と該第二の部分はそれらの配列の少なくとも一部分にわたって相補的であり、且つさらに前記核酸分子の転写は前記第一の部分と前記第二の部分の相補的塩基対形成により二本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を産生する、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記第一の部分と前記第二の部分は、少なくとも１つのヌクレオチド塩基により結合している、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記リンカーは少なくとも１０ヌクレオチド塩基である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記カセットは、図９〜図１６のいずれか１つに示されるとおりの核酸配列から成る、核酸分子又はその一部分を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載のカセットを含むベクター。
【請求項１５】
前記プロモーターは癌特異的プロモーターである、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子又はベクター。
【請求項１６】
前記プロモーターは、胚幹細胞、生殖細胞又は胚性癌腫細胞特異的プロモーターである、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の核酸分子又はベクター。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ分子、核酸分子又はベクターを投与することを含む、細胞分裂の阻害の恩恵を受けると思われる症状を治療する方法。
【請求項１８】
前記症状は癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌は胚細胞癌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌は奇形癌腫である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌は、精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢癌及び絨毛癌から成る群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌の治療に用いる医薬品を製造するための、請求項５〜１６のいずれか１項に記載のＲＮＡｉ分子、核酸分子又はベクターの使用。
【請求項２３】
前記癌は胚細胞癌である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記癌は奇形癌腫である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記奇形癌腫は、精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢癌及び絨毛癌から成る群より選択される、請求項２４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を細胞に導入して、細胞プロセスに関与するポリペプチドをコードするｍＲＮＡを切除することで、その細胞の表現型を変更する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子及び／又は遺伝子産物を特異的に切除することを目的とする多数の技術が開発された。例えば、標的ｍＲＮＡ分子に結合し、それによって標的ｍＲＮＡ分子をブロック又は不活化するためのアンチセンス核酸分子の使用は、遺伝子産物の産生を阻害する有効な手段である。これは、アンチセンス技術が、多数の顕著な表現型の特徴をもたらす植物で一般的には非常に有効である。しかし、組換えアンチセンス技術は変わりやすく、表現型が、アンチセンス導入遺伝子発現に実際に本当に関連していることを確認するために、アンチセンス導入遺伝子の一つ以上のコピーを担持するトランスジェニック生物を多数、時には数百、スクリーニングすることが必要になる。必ずしも安定なトランスフェクタントの産生を伴うとは限らないアンチセンス技術が、培養中の細胞に適用され、多様な結果を生んできた。
【０００３】
加えて、相同組換えによって遺伝子を破壊することができる能力は、生物学者に、高等生物における発生経路を明らかにする上で重要な道具を与えた。マウス遺伝子「ノックアウト」系を使用することにより、遺伝子機能及び欠失したマウス遺伝子に対するヒトホモログの推定される機能を詳細に分析することが可能になった（Jordan及びZant、１９９８年）。
【０００４】
遺伝子機能を特異的に切除するより最近の技術は、抑制性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）とも呼ばれる二本鎖ＲＮＡの細胞への導入によるもので、その結果としてＲＮＡｉ分子に含まれる配列に相補的なｍＲＮＡが破壊される。このＲＮＡｉ分子は、互いにアニーリングされて二本鎖ＲＮＡ分子を形成する２本のＲＮＡ相補鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）から成る。ＲＮＡｉ分子は、一般に、切除される遺伝子のエキソン配列に由来する。
【０００５】
最近の研究から、コード配列に由来する１００〜１，０００ｂｐの範囲のＲＮＡｉ分子が、遺伝子発現の有効なインヒビターであることが示唆される。意外なことに、遺伝子発現をブロックするために、僅か数分子のＲＮＡｉを必要とするにすぎず、このメカニズムが触媒的であることを意味する。ＲＮＡｉが細胞の細胞質で検出できるとしても僅かなため、この作用部位は核であると考えられ、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ合成又はプロセッシングの間にその作用を発揮することが示唆される。
【０００６】
ＲＮＡｉの正確な作用機序は不詳であるが、この現象を説明する理論がある。例えば、全ての生物は、外因性遺伝子発現の作用を制限する、保護機構を進化させてきた。例えば、ウイルスは、しばしば、ウイルスが感染した生物に有害な影響を引き起こす。従って、ウイルスの遺伝子発現及び／又は複製が抑制されることが必要である。加えて、遺伝子形質転換の急速な進歩及びトランスジェニック植物及び動物の提供により、導入遺伝子も外来核酸として認識され、様々に、鎮圧（quelling）（Singer及びSelker、１９９５年）、遺伝子サイレンシング（Matzke及びMatzke、１９９８年）及び同時抑制（Stam他、２０００年）と呼ばれる現象に付されることが認識されるに至った。
【０００７】
ＲＮＡｉを使用した初期の研究では、線虫（Caenorhabditis elegans）を使用した。ＲＮＡｉを虫に注入した結果として、ＲＮＡｉ分子を含む遺伝子配列に対応するポリペプチドが消失した（Montgomery他、１９９８年；Fire他、１９９８年）。近年では、植物、トリパノソーマ（Shi他、２０００年）、ショウジョウバエ（Kennerdell及びCarthew、２０００年）を含むが（限定するためではなく例として挙げるものである、）、多数の真核生物でＲＮＡｉ阻害の現象が明らかにされた。最近の実験で、ＲＮＡｉは、高等真核生物でも機能する可能性があることが明らかにされた。例えば、ＲＮＡｉは、マウス卵母細胞におけるｃ−ｍｏｓ及びマウス着床前胚におけるＥ−カドヘリンを切除できることが証明されている（Wianny及びZernicka-Goetz、２０００年）。
【０００８】
多くの疾患は、制御されていない細胞分裂、すなわち過剰増殖を特徴とし、これにより疾患がもたらされる。例として、乾癬、癌及び細胞形質転換をもたらすウイルス性疾患が挙げられる。
【０００９】
乾癬は、皮膚細胞の異常増殖を特徴とする広範囲の疾患を包含する一般用語である。この疾患は、以下のリストを包含するが、リストはすべてを網羅するものではなくほんの一例にすぎない：爪乾癬、頭皮乾癬、プラーク乾癬、膿疱性乾癬、滴状乾癬、逆位乾癬、紅皮性乾癬、乾癬性関節炎。乾癬は、世界中の白色人種人口の１〜３％が罹っている、最もよくある皮膚疾患のうちの１つである。この疾患は、多種多様な細胞型の変更を特徴とする。それらには、局所的不全角化、並びに過剰増殖付随ケラチン対６／１６、インボルクリン、フィラグリン（fillaglin）及びインテグリン接着分子（例えば、ＶＬＡ−３、５、６）をコードするケラチノサイト遺伝子の異常発現により示される、過剰増殖及び分化の変更を特徴とする上皮ケラチノサイトが含まれる。
【００１０】
乾癬症状を制御する最新の方法として、コールタールの局所的塗布の利用が挙げられ、これは皮膚のかゆみ及びかさぶた化を減少させる。しかし、コールタールは、皮膚を紫外線に対して敏感にし、それにより個体を日焼けしやすくする。コールタールでの治療はまた、光過敏性を引き起こすおそれもある。コールタールの使用に代わるものとして、局所的ステロイドがある。ステロイド治療は、効果はあるものの、皮膚菲薄化を引き起こすおそれがある。また、ステロイドが長期間使用されると、身体に耐性が付き、それにより治療が無効になるおそれがある。他の医薬的治療として、アントラリン、ビタミンＤ３及びレチノイド治療の局所的適用が挙げられる。局所的治療に十分に応答しない重症状態の疾患には、経口薬物療法もまた利用可能である。これらには、メトトレキセート、シクロスポリン、チガソン（Tegison）が挙げられる。これらの薬物療法のそれぞれが、肝臓及び肺の障害（メトトレキセート）、免疫抑制（シクロスポリン）並びに発疹、抜け毛及び肝炎（チガソン）を含む深刻な副作用を有する。また、これらの薬物の多くは、妊娠時に不適合であり、したがって妊娠可能な年齢の女性は避けるべきである。明らかに、これらの欠点を有さない代替治療が必要とされている。
【００１１】
正常なケラチノサイトを培養した場合、それらはｉｎ  ｖｉｖｏでの乾癬と同様な過剰増殖状態をとるので、偽乾癬性（pseudo-psoriatic）表現型と名付けられている。これは、動物モデル実験が行われる前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで各種治療処置を試験する優れたモデルを提供する。そのうえ、この症状の治療に関して各種療法の試験を可能にする乾癬の動物モデルが存在する（米国特許第５，９４５，５７６号を参照、これは参照されて本明細書の一部とする）。皮膚を構成する細胞の大部分（＞９５％）は、分化の様々な段階にあるケラチノサイトである。基底層のケラチノサイトは定常的に分裂し、続いて娘細胞が外側に向かって動き、この間、娘細胞は分化の周期を進行させて細胞分裂を停止させる。乾癬プラークの形成をもたらすのは、これらケラチノサイトの無制御分裂である。
【００１２】
癌は、無制御細胞分裂のさらなる例である。癌は多くの組織で発生する可能性があり、悪性細胞はこれらの組織の幹細胞から形成されるというひとつの考え方がある。幹細胞は、自己再生、又は幹細胞としてそれらが機能する組織の特徴的な細胞への分化、又は不適切な状況におけるアポトーシスによる細胞死の能力を有する細胞である。そのような幹細胞から生じる腫瘍細胞の悪性度は、増強された無制御細胞増殖及び自己再生の性向の両方並びに細胞死又は分化の性向の減少に関与する可能性がある。
【００１３】
奇形癌腫は、幹細胞を含有する癌の１例を提供する。これらの腫瘍は、広範囲の分化した組織を含む可能性があり、数百年前からヒトで既知であった。それらは、一般に、性腺腫瘍として、男性及び女性の両者で発生するが、性腺外でも発生し得る。こうした腫瘍の性腺での形は、一般に、生殖細胞に由来すると考えられ、一般に、同一範囲の組織を有する性腺外での形は、胚形成中に誤って移動した生殖細胞に起因すると考えられている。したがって、奇形癌腫は一般に、多数の異なる組織型を含む生殖細胞腫瘍として分類される。これらの中には、精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢癌及び絨毛癌が含まれる。多くの実験により、ＥＣ細胞はこうした腫瘍の幹細胞であること、及びこうしたＥＣ細胞は初期胚の内部細胞塊の細胞及びそのような初期胚に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞に密接に類似していることが示されている（Andrews、２００２年；Henderson他、２００２年、Draper他、２００２年）。
【００１４】
Ｏｃｔ４は、ＥＣ細胞により発現される制御タンパク質の例であり、これはＥＣ細胞の継続的な増殖及び自己再生に必要とされる。Ｏｃｔ４タンパク質発現の消失は、無能性（nullipotent）及び多能性ヒト胚性癌腫（ＥＣ）細胞（精巣生殖細胞腫瘍に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞の悪性対応物）並びにヒトＥＳ細胞自体の、増殖及び分化の減少をもたらす。このことは、悪性細胞を標的として、生殖細胞腫瘍を形成する悪性細胞の増殖減少と分化の両方を引き起こすことを可能にするはずである。奇形癌腫は、生殖細胞腫瘍の形であり、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）を含む。こうした細胞は、ＥＳ／ＥＧ細胞と共通した多くの特長を有する。こうした特長で最も重要なものは、多能性という特徴である。生殖細胞腫瘍でのＯｃｔｄ４タンパク質発現の消失は、Ｏｃｔ４に対するｄｓＲＮＡにより達成することができる。
【００１５】
さらに、胚幹細胞の分化培養では、ＥＳ細胞が未分化のまま混入細胞として残存する可能性がある。こうした細胞は、移植に用いられた場合に、それらの多能性及び分化した誘導体と比較して速い増殖速度のため、レシピエントで奇形癌腫形成をもたらすおそれがあり、後の段階で問題となる可能性がある。こうした培養でＲＮＡｉを用いてＯｃｔ４  ｍＲＮＡを標的とすることは、混入細胞の消失をもたらし、したがって医療としてのＥＳ細胞の安全性を改善するだろう。さらに、動物の生殖細胞が配偶子を産生することをできなくさせるためのＯｃｔ４に対するｄｓＲＮＡの使用は、動物を不妊にするだろう。
【００１６】
幹細胞、特に胚幹細胞が、宿主に許容されるように、それらの免疫応答を調節し得ることが望ましいだろう。これはｉｎ  ｖｉｖｏでｄｓＲＮＡを細胞に送達して免疫応答から保護することを含む。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ−２−ミクログロブリン又はＩ型ＨＬＡ複合体遺伝子に対するｄｓＲＮＡで処理された細胞は、免疫原性がより低くなるだろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一態様によれば、細胞分裂を阻害する方法であって、過剰増殖性細胞に少なくとも１つの抑制性ＲＮＡ分子を導入することを含み、該抑制性ＲＮＡ分子は該細胞の少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する、細胞分裂を阻害する方法が提供される。
【００１８】
本発明の好ましい方法では、上記ＲＮＡｉ分子は、上記細胞の細胞分裂周期の少なくとも１つの工程を阻害する。
【００１９】
「過剰増殖性」という用語は、疾患状態（例えば、乾癬又は癌）をもたらし得る無制御細胞分裂周期を示す細胞を示す。ＲＮＡｉ分子を組成物で細胞に付加すること、又はセンス及びアンチセンス核酸の両方を発現するように適合した遺伝子治療ベクターを提供して、ｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡｉ分子を産生することにより、ＲＮＡｉ分子の細胞への導入が可能であることが、当業者に明らかであるだろう。
【００２０】
「基幹的」という用語は、一般的には、ｉ）自己再生、ｉｉ）増殖ｉｉｉ）分化の阻害、ｉｖ）アポトーシスの阻害に必要である遺伝子を示す。これらのどれを阻害しても、例えば未分化（悪性）幹細胞の損失を導くことから価値があるだろう。
【００２１】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記過剰増殖性細胞は、ケラチノサイト、好ましくは乾癬性ケラチノサイトである。
【００２２】
本発明の好ましい方法では、上記過剰増殖性細胞は癌細胞であり、好ましくは胚細胞癌細胞である。
【００２３】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記過剰増殖性細胞は胚性癌腫細胞である。
【００２４】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記過剰増殖性細胞は胚幹細胞である。
【００２５】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記配列は、過剰増殖付随ケラチン対６／１６、インボルクリン、フィラグリン及びインテグリン接着分子（例えば、ＶＬＡ−３、５、６）から成る群より選択されるタンパク質をコードする配列の少なくとも１つ、又はその一部を含む。
【００２６】
本発明の好ましい方法では、上記ＲＮＡｉ分子は、図９〜図１５のいずれか１つに示される核酸配列又はその一部を参照して設計される。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つの抑制性ＲＮＡ分子（ＲＮＡｉ）を細胞に導入することを含む、免疫応答を阻害する方法が提供され、上記ＲＮＡｉ分子は、少なくとも１種の免疫原性応答を上記細胞に媒介する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する。
【００２８】
本発明の好ましい方法では、上記細胞は幹細胞であり、好ましくは上記幹細胞は胚性である。
【００２９】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記ＨＬＡ遺伝子は、β−２−ミクログロブリンであり、且つ図１７に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３０】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、I型ＨＬＡ複合体遺伝子であり、且つ図１８に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３１】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、Ｉ型ＨＬＡ複合遺伝子であり、且つ図１９に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３２】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、Ｉ型ＨＬＡ複合遺伝子であり、且つ図２０に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３３】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、Ｉ型ＨＬＡ複合遺伝子であり、且つ図２１に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３４】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、Ｉ型ＨＬＡ複合遺伝子であり、且つ図２２に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３５】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記遺伝子は、Ｉ型ＨＬＡ複合遺伝子であり、且つ図２３に示されるとおりの核酸配列から成る核酸分子を参照して設計される。
【００３６】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つの過剰増殖性細胞の少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する少なくとも１つの遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、ＲＮＡｉ分子が提供される。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、上記基幹的プロセスは上記細胞分裂周期の少なくとも１つの工程で起こる。
【００３８】
好ましい実施形態では、上記コード配列はエキソンである。
【００３９】
代替的には、上記ＲＮＡｉ分子は、イントロン配列、又は上記基幹的プロセスを媒介する遺伝子のコード配列／エキソン配列に隣接する（flank）５’及び／又は３’非コード配列に、由来する。
【００４０】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ分子の長さは１０ｂｐ〜１，０００ｂｐである。より好ましくは、ＲＮＡｉの長さが１００ｂｐ〜１，０００ｂｐの範囲にあるときは、長さは、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ又は１，０００ｂｐから選択される。より好ましくは、上記ＲＮＡｉは、少なくとも１，０００ｂｐである。より好ましくは、ＲＮＡｉの長さが１０ｂｐ〜１，０００ｂｐの範囲にあるときは、長さは好ましくは１０ｂｐ〜１００ｂｐであるか、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ又は１００ｂｐから選択されてもよい。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、上記ＲＮＡｉ分子は２１ｂｐである。
【００４２】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、上記ＲＮＡｉ分子は修飾リボヌクレオチド塩基を含む。
【００４３】
天然の塩基シトシン、ウラシル、アデノシン及びグアノシンのみならず修飾された塩基も包含することは、上記修飾された塩基を含有するＲＮＡｉ分子に有利な特性を与える可能性があることが、当業者に明白であるだろう。例えば、修飾された塩基は、ＲＮＡｉ分子の安定性を高め、それによって所望の作用をもたらすのに必要な量を減少させることが可能である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、上記ＲＮＡｉ分子は、図９〜図１６のいずれか１つに示される核酸配列の少なくとも１つを含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つの免疫応答性細胞で少なくとも１種の免疫原性応答を媒介する少なくとも１つの遺伝子のコード配列を含むことを特徴とする、ＲＮＡｉ分子が提供される。
【００４６】
過剰増殖性細胞での少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介するＲＮＡｉ分子に応用可能な好ましい実施形態は、上記に対する態様にも等しく応用可能である。
【００４７】
本発明のさらなる態様によれば、発現カセットを含む核酸分子であって、該カセットは、少なくとも１つの過剰増殖性細胞の少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する遺伝子の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含み、上記カセットは、センス核酸分子及びアンチセンス核酸分子の両方が上記カセットから転写されるように適合される、発現カセットを含む核酸分子が提供される。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、発現カセットを含む核酸分子であって、該カセットは、少なくとも１つの免疫応答細胞の少なくとも１つの免疫原性応答を媒介する遺伝子の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含み、上記カセットは、センス核酸分子及びアンチセンス核酸分子の両方が上記カセットから転写されるように適合される、発現カセットを含む核酸分子が提供される。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記カセットには、上記核酸分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖を転写するのに適合した少なくとも２つのプロモーターが提供されている。
【００５０】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記カセットは、核酸分子を含み、該分子は第二の部分に結合した第一の部分を含み、上記第一の部分と上記第二の部分はそれらの配列の少なくとも一部分にわたって相補的であり、且つさらに上記核酸分子の転写は上記第一の部分と上記第二の部分の相補的塩基対形成により二本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を産生する。
【００５１】
代替的実施形態には、ベクターが保有する発現カセットから合成されるいわゆる「ステムループＲＮＡｉ」分子の合成が含まれる。ステムループＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、２つの部分で構成されており、第一の部分は調節することが望ましい遺伝子に由来している。第二の部分は、第一の部分の配列と相補的なＤＮＡ配列で提供される。カセットは、一般的には、ＤＮＡをＲＮＡに転写するプロモーターの制御下にある。ＲＮＡ分子の第一部分と第二部分との相補性は、ＲＮＡ分子の長さの少なくとも一部分にわたって塩基対形成をもたらし、二本鎖ヘアピンＲＮＡ構造又はステムループを形成する。第一部分及び第二部分は、リンカー配列と共に提供され得る。ステムループＲＮＡｉは、植物で、特定のｍＲＮＡを切除して、それにより植物の表現型に影響を及ぼすのに用いられて成功している（Smith他、(2000) Nature 407, 319-320を参照）。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記第一の部分と上記第二の部分は少なくとも１つのヌクレオチド塩基により結合している。本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記第一の部分と上記第二の部分は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のヌクレオチド塩基により結合している。本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記リンカーは少なくとも１０ヌクレオチド塩基である。
【００５３】
ＲＮＡｉを形成するＲＮＡ分子の合成は、プロモーター配列に動作可能に連結された標的遺伝子又は標的遺伝子のフラグメントを含むベクターを提供することによって達成できることが、当業者には明白であるだろう。一般に、ＲＮＡｉ分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されるならば、プロモーター配列はファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６）である。有利なことに、ベクターは、遺伝子又は遺伝子フラグメントをサブクローニングすることができる多数のクローニング部位を備えている。一般に、ベクターは、ファージプロモーターが、当該遺伝子を含有する多数のクローニング部位に隣接するように設計される。ファージプロモーターは、一つのプロモーターが、センスＲＮＡ及び別のファージプロモーター、アンチセンスＲＮＡを合成するように配置されている。従って、ＲＮＡｉの合成が促進される。標的遺伝子又は標的遺伝子のフラグメントをファージプロモーターに直接融合させて、オリゴ合成技術によりキメラプロモーター／遺伝子融合体を作成することができる。このようにして作成された構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応で容易に増幅され、ＲＮＡ分子を製造するための鋳型を提供することができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、上記カセットは、図９〜図１６のいずれか１つに示されるとおりの核酸配列から成る、核酸分子又はその一部分を含む。
【００５５】
本発明の代替的な好ましい実施形態では、上記カセットは、図１７〜図２３のいずれか１つに示されるとおりの核酸配列から成る、核酸分子を含む。
【００５６】
本発明の一態様によれば、本発明によるカセットを含むベクターが提供される。
【００５７】
ｉｎ  ｓｉｔｕでＲＮＡｉ分子を形成することが望ましい場合、発現ベクターは、プロモーター配列の制御下にある核酸分子を含む発現カセットを提供するように適合して、センスＲＮＡ分子及びアンチセンスＲＮＡ分子の形成をもたらすことができる。これは、センス分子及びアンチセンス分子の両方がベクターから転写されるように、プロモーター配列を上記核酸分子の上流及び下流に配置することにより促進され得る。代替的には、別々の発現カセットを、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを産生するように適合させることができる。
【００５８】
好ましくは、上記さらなる核酸配列は、特定の細胞型で機能するプロモーター配列を含む。好ましくは、プロモーター配列は、ケラチノサイト、理想的には乾癬性細胞、すなわち乾癬性ケラチノサイトで機能性である。
【００５９】
本発明の代替的な好ましい実施形態では、上記プロモーター配列は癌特異的プロモーターである。
【００６０】
好ましくは、プロモーター配列は、免疫応答性細胞又は胚幹細胞若しくは胚性癌腫細胞で機能性である。胚幹細胞又は胚性癌腫細胞に特異的なプロモーターの例は、ＦＧＦ４プロモーターであり、国際公開第０３／０８０８１６号パンフレットに開示される（これは具体的に参照されて本明細書の一部とする）。要求性幹細胞特異的発現性（requisite stem cell specific expression）のプロモーターの他の例は当業者に既知であり、ＲＮＡｉ標的遺伝子として本明細書中開示される遺伝子を含む。
【００６１】
本発明の好ましい方法では、上記プロモーター配列は、以下から選択される。ケラチンプロモーターＫ１、Ｋ５、Ｋ６、Ｋ１０、Ｋ１４、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリン。
【００６２】
理想的には、上記プロモーター配列はケラチンＫ６である。Ｋ６プロモーターは、過剰増殖している上皮細胞で高レベルの発現を示すことが既知である（米国特許第５，９５８，７６４号明細書を参照）。
【００６３】
要求性発現パターンを示す遺伝子は容易に入手可能であることが、当業者に明白であるだろう。限定するわけではなく、例として、ケラチンＫ６、Ｋ５及びＫ１４が、Woodcock及びMitchell, J. Cell Biol. 95, p580-88 (1982)に記載されている。Ｋ１及びＫ１０が、Roop他、Proc Natl. Acad. Sci USA, 80, p716-720, (1983)及び Schweizer他、Cell 37, pl59-170, (1984)に記載されている。こうした遺伝子の多くは、クローニングされており、それらの配列は、例えば、Ｋ５、Lersch他、Mol Cell Biol. 8, p486-493, (1988)；Ｋ１４、Marchuk他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, P1609-1613, (1985)及びKnapp他、J. Biol Chem. 262, 938-945, (1987)；Ｋｌ、Steinert他、J. Biol. Chem. 260, p7142-7149, (1985)；Ｋ１０、Kreig他、J. Biol. Chem. 260, p5867-5870, (1985)；Ｋ６、Tyner他、Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82, 4683-4687, (1985)；ロリクリン、Yoneda他、J. Biol. Chem. 267 (25), 18060-18066に記載されている。
【００６４】
さらに、転写活性化に関与する５’領域を定義するプロモーター配列が既知である。例えば、Tomic他、Cell Reg. 1, p965-973（Ｋ５、Ｋ６、Ｋ１０、Ｋ１４）、Greenhalgh他、Mol. Carcinogenesis, 7, p99-110, (1993)を参照。上皮細胞に、上皮特異的プロモーターを含むベクターをトランスフェクトする方法もまた、上皮細胞でのポリペプチドの異種発現に関連する方法として既知である。Morgan他、Science, 237, pl476-1479, (1987)；Teumer他、FASEB, 4, p3245-3250, (1990)；Sellheyer他、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90, p5237- 5241, (1993)を参照。ケラチノサイトの細胞培養法もまた、既知である（米国特許第５，９６８，５４６号明細書を参照）。
【００６５】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）ベクター又はキメラプロモーター／遺伝子融合物を提供すること、
（ｉｉ）上記ＲＮＡｉ分子を含む各ＲＮＡ鎖の合成を可能にする試薬及び条件を提供すること、及び
（ｉｉｉ）各ＲＮＡ鎖の長さの少なくとも一部について、又は少なくとも、過剰増殖性細胞での少なくとも１つの基幹的プロセスを媒介する遺伝子をコードする核酸配列に対応する部分について、各ＲＮＡ鎖を会合させることができる条件を提供すること
を含む、ＲＮＡｉ分子を製造する方法が提供される。
【００６６】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）ベクター又はキメラプロモーター／遺伝子融合物を提供すること、
（ｉｉ）上記ＲＮＡｉ分子を含む各ＲＮＡ鎖の合成を可能にする試薬及び条件を提供すること、及び
（ｉｖ）各ＲＮＡ鎖の長さの少なくとも一部について、又は少なくとも、免疫応答細胞での少なくとも１つの免疫原性応答を媒介する遺伝子をコードする核酸配列に対応する部分について、各ＲＮＡ鎖を会合させることができる条件を提供すること
を含む、ＲＮＡｉ分子を製造する方法が提供される。
【００６７】
ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は確立された方法論である。ベクター、リボヌクレオチド三リン酸、緩衝液、ＲＮＡ分解酵素インヒビター、ＲＮＡの産生を促進するＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ファージＴ７、Ｔ３、ＳＰ６）を提供するキットが市販されている。
【００６８】
本発明のさらなる態様によれば、細胞増殖を阻害するのに十分な、本発明によるＲＮＡｉの有効量を動物に投与することを含む、過剰増殖性細胞での基幹的プロセスを阻害するｉｎ  ｖｉｖｏ方法が提供される。
【００６９】
本発明の好ましい方法では、上記阻害は癌細胞増殖の阻害である。好ましくは、上記癌細胞は奇形癌腫細胞である。
【００７０】
好ましくは、上記奇形癌腫細胞は、精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢癌及び絨毛癌から成る群より選択される癌に由来する。
【００７１】
ＲＮＡｉは、標的遺伝子ＲＮＡとＲＮＡｉ分子との間の相同性に頼ることが、当業者には明白であるだろう。このことは、過剰増殖性細胞を標的とする際に、かなりの程度の特異性をＲＮＡｉ分子に与える。
【００７２】
本発明のさらなる態様によれば、胚幹細胞を含む細胞の調製物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理法が提供され、この方法は上記調製物中で上記胚幹細胞の増殖を阻害するのに十分な、少なくとも１種の本発明によるＲＮＡｉ分子を上記調製物に添加することを含む。
【００７３】
本発明の好ましい方法では、上記細胞の調製物は、胚幹細胞と分化した細胞との混合集団である。
【００７４】
本発明のさらなる好ましい方法では、上記処理された細胞調製物は、組織補充（replacement)療法を必要としている動物、好ましくはヒトに投与される。
【００７５】
本発明のさらなる態様によれば、免疫応答を阻害するのに十分な、本発明によるＲＮＡｉの有効量を動物に投与することを含む、上記免疫応答細胞での免疫原性応答を阻害するｉｎ  ｖｉｖｏ方法が提供される。
【００７６】
本発明のさらなる態様によれば、免疫応答を阻害するのに十分な、本発明によるＲＮＡｉの有効量で免疫応答細胞を処理することを含む、上記免疫応答細胞での免疫原性応答を阻害するｉｎ  ｖｉｖｏ方法が提供される。
【００７７】
ＲＮＡｉ分子をリポソーム内に封入して、動物免疫系及び／又は動物血清中に存在するヌクレアーゼから保護することが可能である。
【００７８】
リポソームは、選択された治療薬を封入し、次いで患者に導入される、脂質を主成分とする（lipid based）小胞である。一般に、リポソームは、純粋なリン脂質か又はリン脂質とホスホグリセリドとの混合物のいずれかから製造される。一般に、２００ｎｍ未満の直径を有するリポソームを製造することができ、これよって静脈内に注射することが可能になり、また、肺毛細血管床を通過することができる。さらに、リポソームは、その生化学的性質により、血管膜を通って透過し、選択された組織に接近する。リポソームは比較的短い半減期を有する。ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）で被覆されたリポソームを含む、いわゆるＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームが開発された。このＰＥＧ処理リポソームは、患者に静脈内投与されたとき、有意に増加した半減期を有する。加えて、ＳＴＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソームは、細網内皮系における取り込み減少及び選択された組織における蓄積増加を示す。加えて、選択された細胞／組織へのＲＮＡｉ分子の送達の特異性を高めるために、脂質を主成分とする小胞と抗体（単数又は複数）とを組み合わせた、いわゆるイムノリポソームが開発されている。
【００７９】
送達手段としてのリポソームの使用は、米国特許第５，５８０，５７５号明細書及び米国特許第５，５４２，９３５号明細書に記載されている（これらは参照されて本明細書の一部とする）。市販されている送達手段は、当業者に容易に入手可能である（例えば、Ｅｘｇｅｎ（商標）又はＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（商標））。
【００８０】
ＲＮＡｉ分子を送達する他のビヒクルとして、ウイルスベクター及びプラスミドが挙げられる。
【００８１】
ウイルス又は「ウイルスベクター」の使用は、当該分野で既知である。多数のウイルスが、外来遺伝子を送達するベクターとして普通に用いられている。普通に用いられるベクターとして、組換えで修飾されたエンベロープ型又は非エンベロープ型のＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルス、好ましくはバキュロウイルス科（baculoviridiae）、パルボウイルス科（parvoviridiae）、ピコルノウイルス科（picornoviridiae）、ヘルペスウイルス科（herpesveridiae）、ポックスウイルス科、アデノウイルス科（adenoviridiae）又はピコルナウイルス科（picornnaviridiae）から選択されるものが挙げられる。キメラベクターもまた用いることができ、これは親ベクターの特性それぞれの有利な要素を活用する（例えば、Feng他、(1997) Nature Biotechnology 15: 866-870を参照）。そのようなウイルスベクターは、野生型であってもよく、又は組換えＤＮＡ技法により複製欠損性、条件複製性(conditionally replicating)又は複製適格性（replication competent）であるように修飾されたものでもよい。
【００８２】
好ましいベクターは、アデノウイルスゲノム、アデノ随伴ウイルスゲノム及びレトロウイルスゲノムに由来する。本発明の最も好ましい実施では、ベクターはヒトアデノウイルスゲノムに由来する。特に好ましいベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２又は血清型５に由来する。そのようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａ及び／又はＥ１ｂコード領域での修飾又は欠失により（「複製欠失性」と判断される点まで）減弱することができる。特定の発現特徴を達成する、又は繰り返し投与若しくは免疫応答低下を許容するための、ウイルスゲノムに対する他の修飾は好適である。最も好ましいのは、ヒトアデノウイルス５型ベクターである。
【００８３】
代替的は、ウイルスベクターは、条件複製性又は複製適格性であってもよい。条件複製性ウイルスベクターは、不都合な広範囲の感染を回避しつつ、特定の細胞型での選択的発現を達成するのに用いられる。条件複製性ベクターの例は、Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343、Russell及びS. J. (1994) Eur. J. of Cancer 30A (8): 1165-1171に記載される。選択的複製性ベクターのさらなる例として、ウイルス複製に必須の遺伝子が、特定の細胞型でのみ、又はそのような遺伝子の発現がない場合はウイルスが複製されないという細胞状態でのみ活性なプロモーターの制御下にあるベクターが挙げられる。そのようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日付けで発行されたHenderson他、米国特許第５，６９８，４４３号明細書及び１９９９年２月１６日付けで発行されたHenderson他、米国特許第５，８７１，７２６号明細書に記載される（これらの教示はすべて本明細書中で参照されて一部とする）。
【００８４】
さらに、ウイルスゲノムは、ある条件下でのみ複製又は発現を達成する誘導性プロモーターを含むように修飾されてもよい。誘導性プロモーターの例は、科学文献で既知である（例えば、Yoshida及びHamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430；Iida他、(1996) J. Virol. 70 (9): 6054-6059；Hwang他、(1997) J. Virol 71 (9): 7128-7131；Lee他、(1997) Mol. Cell. Biol. 17 (9): 5097-5105；及びDreher他、(1997) J. Biol. Chem 272 (46); 29364-29371を参照）。胚性幹細胞プロモーターが好ましい。
【００８５】
ウイルスはまた、ウイルスを選択的に複製するように設計されてもよい。特に好ましい選択的複製性ウイルスは、Ramachandra他、ＰＣＴ国際公開第００／２２１３７号パンフレット、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１４５２号（２０００年４月２０日公開）及びHowe, J.、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ＷＯ  ００２２１３６号、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１４５１号（２０００年４月２０日公開）に記載される。特に好ましい選択的複製性組換えアデノウイルスは、Howe, J.により詳しく記載されるとおりのウイルスｄ１０１／０７／３０９である。
【００８６】
ＲＮＡｉ分子は、経口用若しくは鼻用スプレー、エアゾール、懸濁液、乳濁液及び／又は点眼液の形で提供できることが、当業者に明白であるだろう。代替的には、ＲＮＡｉ分子は、錠剤の形で提供してもよい。代替の送達手段としては、吸入器又はネブライザーなどがある。
【００８７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による少なくとも一つのＲＮＡｉ分子を含む治療用組成物が提供される。好ましくは、上記ＲＮＡｉ分子は、過剰増殖性疾患の治療に用いるものである。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態では、上記過剰増殖性疾患は乾癬である。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、上記過剰増殖性疾患は癌である。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態では、上記癌は、胚細胞癌である疾患である。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、上記癌は、奇形癌腫である疾患である。
【００９２】
好ましくは、上記癌は、精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢癌及び絨毛癌から成る群より選択される。
【００９３】
好ましくは、上記ＲＮＡｉ分子は、免疫抑制の恩恵を受けると思われる症状の治療に用いるものである。より好ましくは、症状は移植片拒絶反応である。
【００９４】
本発明のさらに好適な実施形態において、上記治療用組成物はさらに、希釈剤、キャリア又は賦形剤を含む。
【００９５】
材料及び方法
細胞培養条件
皮膚をパンチ生検して正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）を単離し、次いでケラチノサイト−ＳＦＭ中に維持した。
【００９６】
ＮＴＥＲＡ２  ｃｌ．Ｄ１及び２１０２Ｅｐ  ｃｌ．２Ａ６ヒトＥＣ細胞を、先に記載されたとおりに、１０％熱不活性化ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中で培養した。ヒトＥＳ細胞株、Ｈ７（参照１）を、２０％のＳｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Invitrogen）及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Invitrogen）を添加した「ノックアウト」ＤＭＥＭ（Invitrogen）中、マイトマイシンＣ１．１６で有糸分裂を不活性化したマウス胚線維芽細胞の支持細胞層上で培養した。安定したトランスフェクションのため、細胞を１ｃｍ２あたり３×１０４個で蒔いて、１日後に製造者のプロトコルに従ってＥｘｇｅｎ５００（Fermentas）を用いてｐＣＡＧ−ＧＦＰでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を培養物に添加し、ピューロマイシン耐性の緑色蛍光コロニーを選択してさらなる実験用に拡大させた。
【００９７】
ＲＮＡｉ産生及びケラチノサイトの処理
特定の遺伝子配列に対応するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ（Mullis及びFaloona、１９８７年）で増幅して、ＲＮＡｉ産生用の特異的な鋳型を作成する。特定の反応で用いられる両方のプライマーは、遺伝子特異的配列に付加した５’Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ）を含んでいた。ＰＣＲ反応物を１％アガロース中で電気泳動させ、増幅に妥当な大きさの単独バンドを切り取って増幅させた。１００μｌのＰＣＲ反応物のうち５μｌを、ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ  Ｔ７転写反応（Ambion, USA）用鋳型として用いた。ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ反応の産物を、沈殿させ、水に再懸濁させた。ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ反応物を３０分間６５℃に加熱すること及び室温まで冷却してアニーリングさせることにより、ＲＮＡｉを作成した。全長ｄｓＲＮＡの産生を試験するため、６μｇを１％変性アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウムで染色した。３０２ｎｍのＵＶ光の透過光によりＲＮＡを観測した。
【００９８】
以下の方法は、６ウェルプレートで培養された細胞のＲＮＡｉを記載する。体積及び細胞数は、より大きい又はより小さい培養容器には適切に拡大縮小されるべきである。
【００９９】
細胞を、処理前日に、１ウェルあたり５００，０００個蒔いて、それらの正常培地中で増殖させた。処理されるウェルそれぞれについて、９．５μｇの当該二本鎖ＲＮＡを３００μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌに希釈した。２１μｌのＥｘＧｅｎ５００（MBI Fermentas）を希釈ＲＮＡ溶液に添加して、ボルテックスすることで混合した。ｄｓＲＮＡ／ＥｘＧｅｎ５００混合物を、室温で１０分間インキュベートした。次いで３ｍｌの新鮮な細胞増殖培地を添加し、ＲＮＡｉ処理培地を作成した。増殖培地を培養容器から吸引して、１ウェルあたり３ｍｌのＲＮＡｉ処理培地と交換した。次いで、培養容器を２８０ｇで５分間遠心分離して、インキュベーターに戻した。１２〜１８時間後、ＲＮＡｉ処理培地を正常増殖培地と交換して、細胞を必要に応じて維持した。
【０１００】
［オリゴフェクタミンについてのｓｉＲＮＡトランスフェクションプロトコル］
細胞をトリプシン処理して、６ウェルプレートに１ｃｍ２あたり約２×１０４個蒔いた（それらはトランスフェクションの時点で３０-５０％コンフルエントであるべきである）。翌日、製造者のプロトコルに従って、オリゴフェクタミントランスフェクション試薬（Invitrogen）を用いてｓｉＲＮＡを細胞に導入した。簡単には、１０μｌのｓｉＲＮＡ（２０μＭ溶液）を、１９０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Invitrogen）中４μｌのオリゴフェクタミンと共に２０分間インキュベートした；次いで、混合物を、１．２ｍｌの最終体積で細胞に添加した。トランスフェクトした細胞を培養し、アッセイするまで毎日新鮮な培地を与えた。
【０１０１】
ＲＮＡｉ産生並びにＥＣ細胞及びＥＳ細胞の処理
ｅＧＦＰ、β２Ｍ及びＯｃｔ４に対応するｓｉＲＮＡを、以下のセンス及びアンチセンス配列を用いて設計し、Xeragon Inc. (Huntsville, USA)で合成した。
【表１】
2006521109.tif 000002
【０１０２】
細胞をトリプシン処理して、６ウェルプレートに１ｃｍ２あたり２×１０４個蒔いた。翌日、製造者のプロトコルに従って、オリゴフェクタミントランスフェクション試薬（Invitrogen）を用いてｓｉＲＮＡを細胞に導入した。簡単には、１０μｌのｓｉＲＮＡ（２０μＭ溶液）を、１９０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Invitrogen）中４μｌのオリゴフェクタミンと共に２０分間インキュベートした；次いで、混合物を、１．２ｍｌの最終体積で細胞に添加した。トランスフェクトした細胞を培養し、アッセイするまで毎日新鮮な培地を与えた。
【０１０３】
ＲＮＡ抽出
増殖中の細胞培養物を吸引して、ＤＭＥ及びウシ胎児血清を除去した。極微量のウシ胎児血清は、リン酸緩衝食塩水で洗浄して除去した。新鮮なＰＢＳを細胞に加え、酸で洗浄したガラスビーズを使用して、細胞を培養容器から取り出した。得られた細胞懸濁液を、３００×ｇで遠心分離した。ペレットからＰＢＳを吸引した。Ｔｒｉ試薬（Sigma, USA）を、１０７細胞当たり１ｍｌ加え、室温で１０分間放置した。この反応からの溶解物を、４℃にて、１２，０００×ｇで１５分間遠心分離した。得られた水相を新しい容器に移し、０．５ｍｌのイソプロパノール／トリゾールｍｌを加えて、ＲＮＡを沈澱させた。４℃にて、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、ＲＮＡをペレット化した。上澄を除去し、ペレットを７０％のエタノールで洗浄した。洗浄したＲＮＡを、ＤＥＰＣ処理２回蒸留水に溶解した。
【０１０４】
抗体染色及びＦＡＣＳによるケラチノサイト形質移入体の分析
細胞をトリプシン（０．２５％ｖ／ｖ）で５分間処理して、細胞を分解し、洗浄し、２×１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。回転式シェーカー上の９６ウェルプレートで、この細胞懸濁液を一次抗体５０μｌと共に、４℃にて１時間インキュベートした。骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８からの上澄を陰性対照として使用した。９６ウェルプレートを、１００ｒｐｍで３分間、遠心分離した。このプレートを、５％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳで３回洗浄し、結合していない抗体を除去した。次いで、細胞を、適切なＦＩＴＣ複合二次抗体５０μｌと共に、４℃にて１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ＋５％のウシ胎仔血清で３回洗浄し、ＥＰＩＣＳエリートＥＳＰフローサイトメーター（Coulter eletronics,U.K）を使用して分析した（Andrews他、１９８２年）。
【０１０５】
免疫蛍光及びＦＡＣＳによるＥＣ細胞及びＥＳ細胞での抗原発現の分析
抗原発現を、以下のモノクローナル抗体：ＭＣ６３１、抗段階特異的胚抗原−３（ＳＳＥＡ３）、ＭＣ８１３−７０、抗段階特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ４）、ＭＣ４８０、抗段階特異的胚抗原−１（ＳＳＥＡｌ）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−２−５４、抗肝臓／腎臓／骨アルカリホスファターゼ、ＢＢＭ１及びＷ６／３２を用いて先に記載されるように、免疫蛍光及びフローサイトメトリーでアッセイした（Draper他、２００２年）。
【０１０６】
ケラチノサイトから抽出されたＲＮＡのノーザンブロット分析
ＲＮＡの分離は、一般に、標準ＤＮＡと同じ原理によるが、ＲＮＡは、それ自体又は他のＲＮＡ分子とハイブリダイズする傾向がある。ホルムアルデヒドをゲルマトリックスで使用して、ＲＮＡのアミン基と反応させ、シッフ塩基を形成する。標準アガロースゲル電気泳動法を使用して、精製したＲＮＡを泳動させる。大抵のＲＮＡの場合、１％のアガロースゲルで十分である。アガロースは、１×ＭＯＰＳ緩衝溶液で作製し、０．６６Ｍのホルムアルデヒドを加える。乾燥させたＲＮＡサンプルを再構成し、ＲＮＡローディング緩衝溶液で変性させ、ゲルにローディングする。ゲルを約３時間（染色の先端が、ゲルの下方の３／４になるまで）泳動させる。
【０１０７】
ＲＮＡを使用してきれいなブロッティングを得ることに関する主な問題は、ホルムアルデヒドの存在である。ホルムアルデヒドをマトリックスから除去するために、蒸留水を４回交換しながら、泳動ゲルを蒸留水に２０分間浸漬した。ＤＮＡ（サザン）ブロッティングの場合とまったく同じ様式で、トランスファーアセンブリを組立てた。しかし、使用したトランスファー緩衝溶液は、１０ＸＳＳＰＥであった。ゲルを一晩トランスファーさせた。膜を２ＸＳＳＰＥに浸漬してアガロースをトランスファーアセンブリから除去し、ＲＮＡを膜に固定した。固定は、短波長（２５４ｎＭ）ＵＶ光線を使用して実行した。固定した膜を１〜２時間ベークし、残留ホルムアルデヒドを除去した。
【０１０８】
所与のプローブに合わせてハイブリダイゼーション温度を下げるために、ホルムアミドを含む水性相でハイブリダイゼーションを実行した。ＲＮＡブロットを、ノーザンプレハイブリダイゼーション溶液中で２〜４時間プレハイブリダイズした。標識したＤＮＡプローブを、９５℃で５分間変性させ、ブロットに加えた。全てのハイブリダイゼーション工程を、インキュベーションオーブン内のローリングボトルで実行した。プローブを、プレハイブリダイゼーション溶液中で一晩、少なくとも１６時間、ハイブリダイズさせた。標準セットの洗浄液を使用した。
洗浄のストリンジェンシーは、低塩含有洗浄用緩衝液を使用することによって達成した。後続の洗浄手順は下記の通りである。
２×ＳＳＰＥ                    １５分      室温
２×ＳＳＰＥ                    １５分      室温
２×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ    ４５分      ６５℃
２×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ    ４５分      ６５℃
０．１×ＳＳＰＥ                １５分      室温
【０１０９】
放射標識ＤＮＡプローブの作製
Feinberg及びVogelsteinの方法（Feinberg及びVogelstein、１９８３年）を使用してＤＮＡを放射性標識した。簡単に記載すると、このプロトコルは、クレノウＤＮＡポリメラーゼＩフラグメントを使用した、変性したＤＮＡ鋳型上の多数の部位におけるＤＮＡ合成を誘発（prime）するために、ランダム配列ヘキサヌクレオチドを使用した。一貫性の助けとなるように、予備形成したキットを使用した。ＤＮＡフラグメント（ＰＣＲのゲル精製又は制限消化物から得られる）５〜１００ｎｇを水中で作製し、ランダムヘキサマーと共に９５℃で５分間変性させた。この混合物を氷で急冷し以下のものを加えた。
５μｌの［（α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ  ３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ
１μｌのクレノウ  ＤＮＡポリメラーゼ（４Ｕ）
【０１１０】
次いで、反応物を３７℃で１時間インキュベートした。取り込まれなかったヌクレオチドをスピンカラム（Nucleon Biosciences）で除去した。
【０１１１】
ケラチノサイトからｃＤＮＡの作製
オリゴ（ｄＴ）及び（ｄＮ）プライマーで誘発した組換えモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素の３’〜５’ポリメラーゼ活性を使用して、ＲＮＡの、１本鎖ｃＤＮＡへの酵素的転換を実行した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応に、１本鎖ｃＤＮＡを使用した。ｃＤＮＡを１μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成するか、又は全ＲＮＡを以下のものと共にインキュベートした。
１．０μＭ        全ＲＮＡ用オリゴ（ｄＴ）プライマー又はｍＲＮＡ用ランダムヘキサマー
０．５ｍＭ        １０ｍＭのｄＮＴＰ混合物
１Ｕ／μｌ        ＲＮＡ分解酵素インヒビター（Promega）
１．０Ｕ／μｌ        製造業者により供給された緩衝溶液中のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Promega）
反応物を、４２℃で２〜３時間インキュベートした。
【０１１２】
蛍光自動化配列決定
ＲＮＡｉ製造に使用する鋳型の作成に使用するＰＣＲプライマーの特性を確認するために、プリズム蛍光標識連鎖ターミネーター配列決定キット（Perkin-Elmer）（Prober他、１９８７年）を使用して、自動配列決定を行った。適量の鋳型（２００ｎｇのプラスミド、１００ｎｇのＰＣＲ産物）、１０μＭの配列決定用プライマー（一般に、５０％のＧ−Ｃ含量を有する２０量体）を、８μｌのプリズムプレミックス（prism pre-mix）に加え、総反応体積を２０μｌに調整した。２４サイクルのＰＣＲ（１０秒間９４℃、１０秒間５０℃、４分間６０℃）。熱サイクルの後、３Ｍの酢酸ナトリウム２μｌ及び１００％のエタノール５０μｌを加えることにより生成物を沈澱させた。ＤＮＡを、エッペンドルフ微量遠心分離機で、１３，０００ｒｐｍにてペレット化し、７０％のエタノールで１回洗浄し、且つ真空乾燥させた。サンプルを、Ｉｎ−ｈｏｕｓｅ配列決定サービス（Krebs Institute）で分析した。乾燥サンプルをホルムアミドローディング緩衝溶液４μｌ中に再懸濁し、変性させ、ＡＢＩ３７３自動シーケンサーにローディングした。生(raw)の配列を収集し、ＡＢＩプリズムソフトウェアを使用して分析し、分析したヒストグラムトレースの形態で結果を提供した。
【０１１３】
ＥＣ細胞及びＥＳ細胞での遺伝子発現を決定する逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応法
１．２５ｍ  ＭｄＮＴＰを含有する４０μｌ反応体積中、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Promega）と共に１μｇのオリゴ−ｄＴプライマーを用いて、３７℃で、全ＲＮＡ（２μｇ）を逆転写した。ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアパッケージ（DNASTAR-Inc., Madison, WI）中のＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔプログラムを用いて、ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。１５ｐｍｏｌの各プライマー、０．１ｍＭのｄＮＴＰ及び０．３単位のＴａｑポリメラーゼ（Promega）を含有するＰＣＲ２５μｌ中１μｌのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。用いたプライマー配列及びそれらの反応条件は以下のとおりであった。
【表２】
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【０１１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによるケラチノサイト上の特異的タンパク質標的の検出
細胞溶解物を得るために、細胞の単層を、２ｍＭのＣａＣｌ２を添加した氷冷ＰＢＳで３回すすいだ。細胞を、１ｍｌ／７５ｃｍ２フラスコ溶解用緩衝溶液（ＰＢＳ中、１％ｖ／ｖのＮＰ４０、１％ｖ／ｖのＤＯＣ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ）と共に、４℃で１５分間インキュベートした。細胞溶解物をエッペンドルフ管に移し、２１ゲージの針を通過させて、ＤＮＡを剪断した。続いてこれを凍結解凍し、次に遠心分離（３０分、４℃，１５，０００ｇ）して、不溶性物質を除去した。市販のタンパク質アッセイ（Biorad）を使用して上澄のタンパク質濃度を求め、１．３ｍｇ／ｍｌに調整した。４倍のLaemmli電気泳動サンプル緩衝液を加え、５分間煮沸することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルを調製した。１６μｇのタンパク質を、１０％のポリアクリルアミドゲル（Laemmli、１９７０年）上で電気泳動させた後、このタンパク質を０．４５μｍのポアサイズを有するニトロセルロース膜に移した。ブロットを、ＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した。ＰＢＳ−Ｔ中５％の粉乳で、ブロットをブロッキンングさせた（室温にて６０分）。ブロットを、適切な一次抗体と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して、ＥＣＬ（Amersham, Bucks., UK）により抗体結合を可視化した。特に記載がない限り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに使用した材料は、Biorad（California, USA）から入手した。
【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングによるＥＣ及びＥＳ上の特異的タンパク質標的の検出
トリプシンを用いて細胞を収穫し、ＲＩＰＡ緩衝液（１×ＰＢＳ、１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中１０７個／ｍｌで溶解させた。これらの溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に一晩ブロッティングした。膜をポンソー（Ponceau）−Ｓで染色してローディングを点検し、５％無脂乳溶液で１時間ブロッキングした。サンプルを、０．２５μｇ／ｍｌの濃度のＯｃｔ４に対するヤギポリクローナル抗体（Santa-Cruz Biotechnology）及び１：４０００希釈の抗ヤギＩｇＧ−ペルオキシダーゼ複合体（Sigma-Aldrich）でプローブした。染色物をＥＣＬキット（Amersham Biosciences）を用いて視覚化した。
【０１１６】
ここで、本発明の実施形態を、以下の図を参照しながら、例としてのみ説明する。
【実施例】
【０１１７】
Ｏｃｔ４タンパク質発現並びに細胞増殖及び分化のレベルにおけるＲＮＡｉの効果
無能性ＥＣ株である２１０２Ｅｐを、Ｏｃｔ４を標的とするｓｉＲＮＡで処理した。Ｏｃｔ４タンパク質のレベルは、ウエスタンブロッティング（図１ａ）で検出したところ、顕著に低下した。Ｏｃｔ４タンパク質レベルへの最大の影響は、ｓｉＲＮＡでの処理後３日目と５日目の間で見られ、且つこのレベルは８日目に再び上昇し始めた。対照として用いたβ２−ミクログロブリンｓｉＲＮＡは、Ｏｃｔ４  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルに影響を及ぼさなかった。
【０１１８】
Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡで処理した細胞は、明らかに増殖がより遅くなり（図３）、分化を示す巨大な平たい形態を獲得した（図１ｂ）。
【０１１９】
Ｏｃｔ４発現のＲＮＡｉ媒介ノックダウンの影響を試験するため、２１０２Ｅｐ及びＮＴＥＲＡ２ヒトＥＣ、並びにＨ７ヒトＥＳ細胞を、Ｏｃｔ４及びβ２Ｍを標的とするｓｉＲＮＡで３〜５日間処理した。各細胞株で、Ｏｃｔ４タンパク質レベルに、明らかな特異的減少が観測され（図２ａ）、且つＳＳＥＡ３陰性細胞及びＴＲＡ−１−６０陰性細胞の大きな集団が出現した（図２ｂ）。ヒトＥＣ細胞及びＥＳ細胞のこうした特徴的マーカーの欠失は、分化の初期の兆候である。こうした抗原陰性細胞の出現は、Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ処理したＥＣ株で最も観測された。なぜなら、それらの培養物は、最適条件下であってさえ、一般的に多数の自然に分化した細胞を含んでいた培養物であるＥＳ細胞と比較して、対照中自然に分化する傾向が少ないことを示したからである。しかし、Ｏｃｔ４  ＲＮＡｉは、ＥＣ細胞と同じようにＥＳ細胞に変化を誘導したことが明らかであった。同時に、同じく分化を示すＳＳＥＡｌ陽性細胞数が、Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡで処理した２１０２Ｅｐ  ＥＣ培養物及びＨ７  ＥＳ培養物で増加したが、ＮＴＥＲＡ２培養物ではＳＳＥＡｌ陽性細胞の限られた出現しか見られなかった。再び、予想どおり、β２Ｍ  ｓｉＲＮＡは、Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して、２１０２Ｅｐ細胞及びＨ７細胞でβ２Ｍ発現の明らかなダウンレギュレーションを引き起こした。この実験では、いずれの場合もわずかなβ２−ミクログロブリン発現がＮＴＥＲＡ２培養物でみられたが、このことは、ＮＴＥＲＡ２細胞はしばしば、非常に低レベル、かろうじて検出可能なレベルでのみβ２Ｍ及びＨＬＡを発現するが、一方両者の発現は２１０２Ｅｐ細胞及びＨ７細胞で恒常的に観測され得るという過去の実験と一致する。
【０１２０】
悪性ＥＣ細胞である２１０２、１７７７及びＴｅｒａ−１をＯｃｔ４  ＲＮＡｉに暴露させると、細胞増殖の明らかな減少を引き起こした（図３）。［多能性幹細胞マーカーＳｏｘ２に対する２種の異なるｓｉＲＮＡ（図１０ｂ）を、本発明者らは２１０２ＥｐＥＣ細胞に適用した。得られた細胞は、対照細胞と比較した場合に、増殖特徴に明らかな減少を示した。］
【０１２１】
Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ処理で、ｈＣＧ  ｍＲＮＡは、２１０２Ｅｐ細胞及びＨ７細胞で明らかにアップレギュレートされ（図４）、栄養外胚葉への分化が、ヒトＥＣ細胞及びＥＳ細胞においてＯｃｔ４レベルが低下した結果であることを示している。このことと一致して、マウスでこの分化系統に伴う転写因子Ｃｄｘ２（Rossant及びCroos、２００１年）もまた、２１０２Ｅｐ細胞でアップレギュレートされた（図４）。しかし、Ｃｄｘ２は、対照Ｈ７細胞ではかなりのレベルですでに発現しており、ｓｉＲＮＡ処理後にさらなる変化は見られなかった。このことは、おそらく、こうした多能性細胞の対照培養においてある程度まで自然に分化する傾向を反映している。対照的に、ＮＴＥＲＡ２細胞は異なる挙動を示した。実際、ｈＣＧに対応する、弱くかろうじて検出可能なバンドが、Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡで処理した細胞では出現したが、Ｃｄｘ２は対照細胞では発現したものの、Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡでの処理に続いてダウンレギュレートされた。しかし、ＮＴＥＲＡ２  ＥＣ細胞の増殖もまた、実質的に阻害された。一連のＥＣ細胞株を、上記に記載されるように、β−２−ミクログロブリン又はＯｃｔ４のいずれかに対するｓｉＲＮＡで処理した。Ｏｃｔ４に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞株はすべて、β−２−ミクログロブリンで処理した細胞と比較した場合、陽性細胞割合（図６Ａ）及び集団全体の平均蛍光（図６Ｂ）の両方のダウンレギュレーションを示した。このことは、ＥＣ細胞で細胞分化を誘導するＯｃｔ４  ｓｉＲＮＡと一致する。
【０１２２】
β２Ｍに対するｓｉＲＮＡでの細胞の処理
β２Ｍに対するｓｉＲＮＡでの細胞の処理は、フローサイトメトリーで分析したところ、抗体ＢＢＭ１のβ−２−ミクログロブリンへの結合及び細胞表面発現にβ−２−ミクログロブリンを必要とするＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ重鎖（Arce-Gomez他、１９７８年）の実質的な減少をもたらした。
【０１２３】
引用文献
Draper, J. S., Pigott, C., Thomson, J. A. & Andrews, P. W.「ヒト胚幹細胞の表面抗原：培養での分化における変化(Surface antigens of human embryonic stem cells: changes upon differentiation in culture)」. J Anat. 200, 249-58 (2002).
Rossant, J. & Cross, J. C.「胎盤発生：マウス突然変異体からの教訓(Placental development: lessons from mouse mutants)」. Nat. Genet. Rev. 2, 538-548 (2001).
Arce-Gomez, B., Jones, E. A., Barnstable, C. J., Solomon, E. & Bodmer, W. F.「体細胞ハイブリッドにおけるＨＬＡ−Ａ及びＢ抗原の遺伝子制御：β−２−ミクログロブリンの必要性（The genetic control of HLA-A and B antigens in somatic cell hybrids: requirement for beta2 microglobulin）」. Tissue Antigens 11,96-112 (1978).
Henderson, J., Draper, J. S., Baillie, H. S., Fishel, S., Thomson, J. A., Moore, H., Andrews, P. W. (2002)「着床前ヒト胚と胚幹細胞はステージ特異的胚抗原の同等の発現を示す(Pre-implantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage specific embryonic antigens)」. Stem Cells, 20: 329-337.
Andrews, P. W. (2002).「奇形癌腫から胚幹細胞へ(From teratocarcinomas to embryonic stem cells)」. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 357,405-417．
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】Ａ：β２Ｍ（レーン１、３、５）又はＯｃｔ４（レーン２、４、６）のいずれかを標的とするｄｓＲＮＡで処理して３日後（レーン１、２）、５日後（レーン３、４）又は７日後（レーン５、６）の細胞でのＯｃｔ４発現についてのウェスタンブロッティングを示す。              Ｂ：β２Ｍ（パネルＡ）及びＯｃｔ４（パネルＢ）を標的とするｓｉＲＮＡで処理して７日後の、２１０２Ｅｐ細胞の形態を示す。
【図２】ＮＴＥＲＡ２、２１０２Ｅｐ  ＥＣ細胞及びＨ７  ＥＳ細胞を、Ｏｃｔ４を標的とするｄｓＲＮＡ及びβ２Ｍを標的とするｄｓＲＮＡで処理して５日後に分析した。Ａ：ＮＴＥＲＡ２（レーン１、２）、２１０２Ｅｐ（レーン３、４）及びＨ７（レーン５、６）でのＯｃｔ４タンパク質について；Ｏｃｔ４に対するｓｉＲＮＡ（レーン１、３及び５）；２Ｍに対するｓｉＲＮＡ（レーン２、４、及び６）のウェスタンブロットを示す。Ｂ：Ｏｃｔ４（陰付きヒストグラム）及びβ２Ｍ（陰なしヒストグラム）を標的とするｓｉＲＮＡでの処理後の表面抗原発現を示す。
【図３】０日目のβ２Ｍ及びＯｃｔ４に対する、ｄｓＲＮＡでの処理の１日前にもともと２×１０５個の細胞を蒔いておいた３つ組のウェルから細胞を収穫して計数した結果を示す。
【図４】Ｏｃｔ４を標的とするｄｓＲＮＡ及びβ２Ｍを標的とするｄｓＲＮＡでの処理後、ｈＣＧ及びＣｄｘ２の発現をＲＴ−ＰＣＲで検査した結果を示す。β−アクチンＰＣＲを鋳型ローディング対照として用いた。Ｏｃｔ４  ＲＮＡｉに応答して、栄養芽細胞特異的ｍＲＮＡ、ｈＣＧは、２１０２Ｅｐ細胞及びＨ７細胞に誘導されたが、栄養外胚葉分化に伴う転写因子をコードするＣｄｘ２は、２１０２Ｅｐ細胞でアップレギュレートされたものの、ＮＴＥＲＡ２細胞ではダウンレギュレートされた。Ｃｄｘ２は、対照Ｈ７細胞でかなり発現し、Ｏｃｔ４に対するｓｉＲＮＡでの処理後に顕著な変化はみられなかった。
【図５】ｍｏｃｋ（ｓｉＲＮＡなし）処理した細胞と比較して、Ｓｏｘ２（ＳｏｘＢ及びＳｏｘＣ）に対する２種の異なるｓｉＲＮＡでの２１０２Ｅｐ細胞の処理に続く、細胞数減少を示す。
【図６Ａ】β−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）及びＯｃｔ４に対するｄｓＲＮＡでの処理後の、ヒトＥＣ細胞及びＥＳ細胞で発現した細胞表面抗原のフローサイトメトリー分析。パネルＡ：陽性細胞の割合。
【図６Ｂ】β−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）及びＯｃｔ４に対するｄｓＲＮＡでの処理後の、ヒトＥＣ細胞及びＥＳ細胞で発現した細胞表面抗原のフローサイトメトリー分析。パネルＢ：平均蛍光。
【図７Ａ】ｍｏｃｋ（ｄｓＲＮＡなし、ひし形）又はＯｃｔ４に対するｓｉＲＮＡ（四角）のいずれかで処理された、一連のヒト胚性癌腫細胞株での細胞増殖の減少。２１０２Ｅｐを示す。
【図７Ｂ】ｍｏｃｋ（ｄｓＲＮＡなし、ひし形）又はＯｃｔ４に対するｓｉＲＮＡ（四角）のいずれかで処理された、一連のヒト胚性癌腫細胞株での細胞増殖の減少。１７７７Ｎを示す。
【図７Ｃ】ｍｏｃｋ（ｄｓＲＮＡなし、ひし形）又はＯｃｔ４に対するｓｉＲＮＡ（四角）のいずれかで処理された、一連のヒト胚性癌腫細胞株での細胞増殖の減少。Ｔｅｒａ−１を示す。
【図７Ｄ】ｍｏｃｋ（ｄｓＲＮＡなし、ひし形）又はＯｃｔ４に対するｓｉＲＮＡ（四角）のいずれかで処理された、一連のヒト胚性癌腫細胞株での細胞増殖の減少。８３３ＫＥを示す。
【図７Ｅ】ｍｏｃｋ（ｄｓＲＮＡなし、ひし形）又はＯｃｔ４に対するｓｉＲＮＡ（四角）のいずれかで処理された、一連のヒト胚性癌腫細胞株での細胞増殖の減少。１１５６ＱＥを示す。
【図８】β−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）又はＯｃｔ４に対するｄｓＲＮＡでの処理後の、胚性癌腫細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。レーンは左から右の順に、１：２１０２Ｅｐ＋Ｂ２Ｍ  ｓｉＲＮＡ、２：２１０２Ｅｐ＋Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ、３：８３３ＫＥ＋Ｂ２Ｍ  ｓｉＲＮＡ、４：８３３ＫＥ＋Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ、５：１１５６ＱＥ＋Ｂ２Ｍ  ｓｉＲＮＡ、６：１１５６ＱＥ＋Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ、７：１７７７Ｎｒｐｍｅｔ＋Ｂ２Ｍ  ｓｉＲＮＡ、８：１７７７Ｎｒｐｍａｔ＋Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ、９：Ｔｅｒａ−１＋Ｂ２Ｍ  ｓｉＲＮＡ、１０：Ｔｅｒａ−１＋Ｏｃｔ４  ｓｉＲＮＡ。
【図９】Ｏｃｔ４の核酸配列を示す。
【図１０Ａ】Ｓｏｘ２の核酸配列を示す。
【図１０Ｂ】Ｓｏｘ由来の２１ｂｐのＲＮＡｉ分子を示す。
【図１１】ＦＧＦ４の核酸配列を示す。
【図１２】ＳＴＡＴ３の核酸配列を示す。
【図１３】ＮＡＮＯＧの核酸配列を示す。
【図１４】ＴＤＧＦの核酸配列を示す。
【図１５】ＧＤＦ３の核酸配列を示す。
【図１６】ＧＡＴＡ６の核酸配列を示す。
【図１７】β−２−ミクログロブリンの核酸配列を示す。
【図１８】ＨＬＡ−Ａの核酸配列を示す。
【図１９】ＨＬＡ−Ｂの核酸配列を示す。
【図２０】ＨＬＡ−Ｃの核酸配列を示す。
【図２１】ＨＬＡ−Ｅの核酸配列を示す。
【図２２】ＨＬＡ−Ｆの核酸配列を示す。
【図２３】ＨＬＡ−Ｇの核酸配列を示す。
【図２４Ａ】ｐＣＡＧ−ＧＦＰの核酸配列を示す。図２４Ｂに続く。
【図２４Ｂ】ｐＣＡＧ−ＧＦＰの核酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【国際調査報告】
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