(57)【要約】ある種の腫瘍において示差発現した核酸が提供される。これらの示差発現核酸に基づいて種々の分類方法、スクリーニング方法、診断方法および治療方法が提供される。かかる方法を行うための装置およびキットも開示する。
2006521794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）腫瘍細胞に由来する試験試料を準備すること（ここで、該腫瘍細胞は表１および表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーを発現する能力を有する）；
（ｂ）該試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定すること；
（ｃ）該試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルと腫瘍状態がわかっている対照試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルとを比較すること；および
（ｄ）工程（ｃ）の比較に基づいて腫瘍細胞を分類すること
を含む、腫瘍を分類する方法。
【請求項２】
対照試料が既知の腫瘍を表す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が癌である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも５個の核酸マーカーの発現レベルが測定される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１０個の核酸マーカーの発現レベルが測定される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２５個の核酸マーカーの発現レベルが測定される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
核酸マーカーのリストが表３または表４に記載されているものからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
腫瘍細胞が乳房、卵巣または肺組織からのものである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
１個またはそれ以上の核酸の発現レベルが複数の既知の腫瘍を表す対照試料からの同核酸マーカーの発現レベルと比較される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
発現レベルの測定が１個またはそれ以上の核酸マーカーについての転写物レベルを測定することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
発現レベルの測定が１個またはそれ以上の核酸マーカーについてのタンパク質レベルを測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
測定がプローブアレイ分析によって行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
測定が定量的ＰＣＲ法により行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍細胞が哺乳動物から得られるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍細胞がヒトから得られるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
試験試料がインビトロで準備される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
試験試料がエキソビボで準備される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
試験試料がインビボで準備される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
１個またはそれ以上の核酸が表１および表２からのそれぞれ少なくとも１個の核酸を含み、
表１からの１個またはそれ以上の核酸の発現レベルが対照試料における対応する発現レベルと比べて増加し、表２からの１個またはそれ以上の核酸の発現レベルが対照試料における対応する発現レベルと比べて減少する場合、試験試料は高い分裂指数を持つものであると分類され、
表１からの１個またはそれ以上の核酸の発現レベルが対照試料における対応する発現レベルと比べて減少し、表２からの１個またはそれ以上の核酸の発現レベルが対照試料における対応する発現レベルと比べて増加する場合、試験試料は低い分裂指数を持つものであると分類される、
請求項１記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）対象体からの癌組織に由来する試験試料を準備すること；
（ｂ）癌組織における表１または表２からの１個またはそれ以上のマーカーの発現レベルを測定すること（ここで、表１に記載されているものからの１個またはそれ以上のマーカーの発現が同タイプの組織の正常な試料におけるこれらのマーカーのレベルと比べて増加していることおよび表２に記載されているものからの１個またはそれ以上のマーカーの発現が同タイプの組織の正常な試料におけるこれらのマーカーのレベルと比べて減少していることは、癌組織がＫＳＰの阻害物質によって処置可能であることを示している）
を含む、癌組織がＫＳＰの阻害物質で処置可能であるかどうかを判定する方法。
【請求項２１】
阻害物質がキナゾリノン誘導体である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
表Ｉおよび表ＩＩからのそれぞれ少なくとも５個のマーカーの発現レベルが測定される、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
表Ｉおよび表ＩＩからのそれぞれ少なくとも１０個のマーカーの発現レベルが測定される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
表Ｉおよび表ＩＩからのそれぞれ少なくとも２５個のマーカーの発現レベルが測定される、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
癌組織が乳房、卵巣または肺組織から得られるものである、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
発現レベルの測定が１個またはそれ以上の核酸マーカーについての転写物レベルを測定することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
発現レベルの測定が１個またはそれ以上の核酸マーカーについてのタンパク質レベルを測定することを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２８】
対象体が哺乳動物である、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
対象体がヒトである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）対象体から得た試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定すること（ここで、１個またはそれ以上の核酸マーカーは表１および表２に記載されているものからなる群から選択される）；
（ｂ）該試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルと腫瘍状態がわかっている対照試料におけるこれらの同核酸マーカーの発現レベルとを比較すること；および
（ｃ）工程（ｂ）の比較に基づいて、対象体における腫瘍の存在もしくは非存在、または対象体による腫瘍に対する素因を診断すること
を含む、対象体における腫瘍の存在または腫瘍に対する素因を診断する方法。
【請求項３１】
少なくとも５個の核酸マーカーの発現レベルが測定される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１０個の核酸マーカーの発現レベルが測定される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも２５個の核酸マーカーの発現レベルが測定される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
核酸マーカーのリストが表３および表４に記載されているものの群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
既知の癌または腫瘍が乳癌、卵巣癌または肺癌である、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
対照試料が癌または腫瘍にかかっていない個体または集団を表し；
診断工程が、１個またはそれ以上の核酸の発現レベルが対照試料における対応する発現レベルと異なる場合に腫瘍の存在を診断することを含む、
請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
発現レベルの測定が１個またはそれ以上の核酸マーカーについての転写物レベルを測定することを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
発現レベルの測定が１個またはそれ以上の核酸マーカーによってコードされるこれらのタンパク質についてのタンパク質レベルを測定することを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
対象体が哺乳動物である、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
対象体がヒトである、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）表１または表２に記載されているものを含む群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーを発現する能力を有する試験細胞を試験薬剤と接触させること；
（ｂ）表１および表２に記載されているものを含む１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定すること；
（ｃ）この１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルと、腫瘍状態がわかっていて試験薬剤と接触させていない対照細胞集団についての同マーカーの発現レベルとを比較すること；および
（ｄ）比較工程（ｃ）に基づいて試験薬剤を腫瘍の阻害物質として同定すること
を含む、腫瘍の阻害物質を同定するためのスクリーニング法。
【請求項４２】
（ａ）表１または表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーを発現する能力を有する試験細胞と試験薬剤とを接触させること；
（ｂ）表１および表２に記載されているものの群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定すること；
（ｃ）この１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルと、癌にかかっている組織および／または癌にかかっていない組織からの細胞を表す対照細胞集団についての同マーカーの発現レベルと比較すること；および
（ｄ）比較工程（ｃ）に基づいて試験薬剤を潜在的発癌物質であるかまたはそうではないと同定すること
を含む、試験薬剤が潜在的発癌物質であるかどうかを評価する方法。
【請求項４３】
腫瘍にかかっているかまたは腫瘍を発病する恐れのある対象体に、表１に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現または活性を阻害する、および／または表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸の発現または活性を活性化する薬剤を投与すること
を含む、高い分裂指数をもつ腫瘍の治療方法。
【請求項４４】
腫瘍が対象体の乳房、卵巣または肺に存在する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
薬剤がＫＳＰ阻害物質である、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍にかかっているかまたは腫瘍を発病する恐れのある対象体に、表１に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現または活性を活性化する、および／または表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸の発現または活性を阻害する薬剤を投与すること
を含む、低い分裂指数をもつ腫瘍の治療方法。
【請求項４７】
腫瘍が対象体の乳房、卵巣または肺に存在する、請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００３年２月１４日に出願された米国仮出願第60/447,842号の利益を主張し、出典明示によりその全体として本明細書の記載とする。
【０００２】
（背景）
紡錘体は、長い間、癌化学療法における重要な機能的標的であった。これは、細胞分裂により生じる２個の娘細胞のそれぞれへのゲノムの複製コピーの分配が主に微小管によって構成される紡錘体によるものだからである。それは癌細胞分裂の阻害を引き起こす化学療法剤による紡錘体の破壊であると推定される。これは、次に、結果としてガン細胞死を生じる。標的としての紡錘体の重要さは抗チューブリン剤であるビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン（ビンカアルカロイド類）ならびにタキサン、パクリタキセルおよびドセタキセルの臨床的および商業的成功により証明される。これらの治療薬は全て、微小管の構成単位であるチューブリンを標的とする。
【０００３】
しかしながら、紡錘体を標的とすることについての問題は、紡錘体を構成する微小管が、細胞周期の間期の間のそれらの役割に加えて、非増殖性最終分化細胞において重要な役割を果たすことである。微小管は、例えば、ニューロナルトランスポートにおいて必須の役割を果たす。神経毒性はいくつかのチューブリン結合性薬物の開発を止めさせた。また、神経毒性はパシリタキセル、ドテキセルおよびビンクリスチンの重大な副作用でもある。そのようにチューブリンを標的とする治療薬はそれらの有用性を制限する副作用をもっていることがある。
【０００４】
これらの困難が別の抗有糸分裂メカニズムをもつ化学療法剤を同定しようとする努力を促してきた。一のアプローチはキネシン運動タンパク質を阻害することであった。かかるアプローチの利点はこれらのタンパク質が有糸分裂以外の役割をもっていないということである。かくして、キネシンの阻害物質はチューブリン結合性化合物に付随する望ましくない副作用を引き起こすとは考えられない。
【０００５】
有糸分裂キネシンは紡錘体の構築および機能のために必須の酵素であるが、一般的には、神経プロセスにおけるような他の微小管構造の一部ではない。有糸分裂キネシンは、有糸分裂の全ての期の間、必須の役割を果たす。これらの酵素はＡＴＰの加水分解により放出されるエネルギーを、微小管に沿った細胞カーゴの定方向運動を駆動する力学的な力に変換する「分子モーター」である。この課題に対して十分な触媒ドメインは、約３５０アミノ酸のコンパクトな構造である。有糸分裂の間、キネシンは微小管を紡錘体である双極構造に構築し、互いに関連がある微小管を滑走し、かくして、強いて２つの紡錘体極を離れさせる。キネシンはまた、紡錘体微小管に沿った染色体の運動および有糸分裂の特定の期に付随した紡錘体の構造的変化を媒介する。有糸分裂キネシン機能の実験的摂動は紡錘体の形成異常または機能不全を引き起こし、しばしば、結果として細胞周期停止および細胞死を引き起こす。
【０００６】
同定された有糸分裂キネシンの１つはＫＳＰ（キネシン様１、ＨｓＥｇＳとも称される）である。ＫＳＰは、反平行ホモダイマーからなる双極性ホモテトラマーを構築するプラスエンドに向けられた微小管モーターの進化的に保存されたキネシンサブファミリーに属する。有糸分裂の間、ＫＳＰは紡錘体の微小管に付随する。ＫＳＰに対して向けられた抗体のヒト細胞へのマイクロインジェクションは、前中期の間、紡錘体極分離を防止し、単極性紡錘体を生じ、有糸分裂停止およびプログラム細胞死の誘導を引き起こす。
【０００７】
ヒトＫＳＰは、Blangy, et al., Cell, 83: 1159-69 (1995)；Whitehead, et al., Arthritis Rheum., 39: 1635-42 (1996)；Galgio et al., J. Cell Biol., 135: 339-414 (1996)；Blangy, et al., J. Biol. Chem., 272: 19418-24 (1997)；Blangy, et al., Cell Motil Cytoskeleton, 40: 174-82 (1998)；Whitehead and Rattner, J. Cell Sci. 111: 2551-61 (1998)；Kaiser, et al., J. Biol. Chem. 274: 18925-31 (1999)；GenBank accession numbers: X85137, NM004523 および U37426に記載されている。米国特許第6,437,115号および第6,414,121号もまた参照（どちらも全ての目的のために出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。ＫＳＰ遺伝子のフラグメント（ＴＲＩＰＳ）はまた、Lee, et al., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995)；およびGenBank accession number L40372に記載されている。
【０００８】
多くのＫＳＰ阻害物質が同定されている。これらは、ＰＣＴ国際公開WO 01/30768およびWO 01/98278（どちらも全ての目的のために出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）に記載されているキナゾリノン誘導体の大きなファミリーを包含する。これらの阻害物質は有糸分裂キネシンを阻害または調節することができるが、他のタイプのキネシン（例えば、トランスポートキネシン）を阻害または調節することはできず、それにより、細胞増殖の選択的阻害を達成することができる。かかる阻害物質は、結果として紡錘体の形成異常または機能不全を引き起こす有糸分裂キネシン機能を摂動することにより作用すると考えられる。これは、次に、しばしば、結果として細胞周期停止および細胞死を引き起こす。
【０００９】
標的としてのそれらの魅力のために、一般的にキネシン、特にＫＳＰに関するさらなる情報は化学療法剤のさらなる開発において有用である。
【００１０】
（概要）
ある種の腫瘍または癌において示差発現される多くの核酸が提供される。これらの核酸、またはそれらによりコードされるタンパク質は、腫瘍の種々の分類方法、診断方法および治療方法、ならびにかかる方法を行うためのキットおよび装置に利用され得る。
【００１１】
ある種の分類方法は、例えば、まず、腫瘍細胞に由来する試験試料を準備することを含む。ここで、該腫瘍細胞は、表１および表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーを発現する能力を有する。次いで、試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定する。これらの発現レベルを、腫瘍状態がわかっている対照試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルと比較する。次いで、工程の比較に基づいて腫瘍細胞を分類する。
【００１２】
他の方法は、癌組織がＫＳＰの阻害物質で治療可能であるかどうかを判定することを含む。かかる腫瘍の同定は、化学療法剤としてのＫＳＰ阻害物質の魅力のために治療戦略を開発するのに非常に有用であり得る。これらの方法は、一般に、対象体からの癌組織に由来する試験試料を準備することを含む。次いで、癌組織における表１および表２からの１個またはそれ以上のマーカーの発現レベルを測定する。表１に記載されているものからの１個またはそれ以上のマーカーの発現が同タイプの組織の正常な試料におけるこれらのマーカーのレベルと比べて増加していることおよび表２に記載されているものからの１個またはそれ以上のマーカーの発現が同タイプの組織の正常な試料におけるこれらのマーカーのレベルと比べて減少していることは、癌組織がＫＳＰの阻害物質によって治療可能であることを示している。
【００１３】
本明細書で同定される示差発現遺伝子に基づいて種々の診断薬を用いることができる。これらの方法のいくつかは対象体における腫瘍の存在または腫瘍に対する素因を診断することを含む。これらの方法は、通常、対象体から得た試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定することを含む。ここで、１個またはそれ以上の核酸マーカーは表１および表２に記載されているものからなる群から選択される。次いで、この試験試料における１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを腫瘍状態がわかっている対照試料におけるこれらの同核酸マーカーの発現レベルと比較する。次いで、工程の比較に基づいて、対象体における腫瘍の存在もしくは非存在、または対象体による腫瘍に対する素因を診断する。
【００１４】
多くの異なるスクリーニング方法もまた提供される。これらの方法のいくつかは腫瘍の阻害物質を同定するように設計される。かかる方法は、一般に、表１または表２に記載されているものを含む群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーを発現する能力を有する試験細胞を試験薬剤と接触させることを含む。次いで、表１および表２に記載されているものを含む１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定する。この１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを、腫瘍状態がわかっていて試験薬剤と接触させていない対照細胞集団についての同マーカーの発現レベルと比較する。最後に、比較工程に基づいて試験薬剤を腫瘍の阻害物質として同定する。
【００１５】
別のスクリーニング方法は、試験薬剤が潜在的発癌物質であるかどうかを評価することを含む。このタイプの方法は、典型的には、表１または表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーを発現する能力を有する試験細胞と試験薬剤とを接触させることを含む。次いで、表１および表２に記載されているものの群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを測定する。これらの発現レベルを、癌にかかっている組織および／または癌にかかっていない組織からの細胞を表す対照細胞集団についての同マーカーの発現レベルと比較する。比較工程に基づいて試験薬剤を発癌物質であると同定する。
【００１６】
治療方法もまた提供される。これらは、ある種の腫瘍における示差発現される遺伝子のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションに対抗するように設計される。いくつかの方法は高い分裂指数をもつ腫瘍を治療するように設計される。これらの方法は、腫瘍にかかっているかまたは腫瘍を発病する恐れのある対象体に、表１に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現または活性を阻害する、および／または表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸の発現または活性を活性化する薬剤を投与することを含む。
【００１７】
他の治療方法は、低い分裂指数をもつ腫瘍の治療に関する。このタイプの方法は、一般的には、腫瘍にかかっているかまたは腫瘍を発病する恐れのある対象体に、表１に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現または活性を活性化する、および／または表２に記載されているものからなる群から選択される１個またはそれ以上の核酸の発現または活性を阻害する薬剤を投与することを含む。
【００１８】
（図面の簡単な説明）
図１は正常な組織におけるＫＳＰの発現を示すチャートであり、胸腺および骨髄において高い発現を示しており、回腸、食道、直腸、胃および小腸のような消化管の器官において少しの発現を示している。
図２は悪性乳房腫瘍（乳房浸潤導管癌）におけるＫＳＰの発現が正常な乳房組織と比べてＫＳＰ発現における広がりを示すことを例示するプロットである。ＫＳＰレベルは一般的にこの群において増加するが、腫瘍患者には「正常な」発現と重複するＫＳＰレベルをもつものがいる。
図３はクラスター分析の結果を示す。この分析は、乳房腫瘍試料の、細胞周期に付随する遺伝子の比較的高い発現を示すものおよびシグナル伝達の比較的高い発現を示すものへの分離を示している。組織試料２００個のそれぞれについての結果がｘ軸に沿って示されている；個体２００個のそれぞれの異なる遺伝子についての結果がｙ軸に沿って示されている。ｘ軸上に示されるように、正常なＫＳＰレベルもつ腫瘍患者はこの軸の左手側に表されており、一方、高いＫＳＰレベルをもつ腫瘍患者は、この軸の右手側に表されている。結果は、一般的に、６つの領域に分けることができる。領域Ａ、ＢおよびＣは主にシグナル伝達遺伝子（表２を参照）である遺伝子を含む。領域Ｄ、ＥおよびＦは、一般的に、細胞周期遺伝子（表１を参照）のクラスに分類される遺伝子と一致する。
【００１９】
（説明）
Ｉ．定義
「腫瘍」とは、当該技術分野における通常の意味をもち、生理学的機能を伴わない組織の異常な増殖をいう。腫瘍は癌性または良性であり得る；かくして、腫瘍は癌を含む。
【００２０】
「分裂指数」とは、細胞周期遺伝子である細胞において発現される遺伝子、すなわち、細胞増殖、特に、有糸分裂に関与するこれらの遺伝子の数を示す。かかる遺伝子の例としては、表１に記載されているものが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００２１】
「正常な細胞」とは、目的の特定の癌または腫瘍にかかっていないものである。しばしば、このような細胞はどのようなタイプの癌または腫瘍にもかかっていない。正常な細胞における発現レベルを試験細胞（例えば、腫瘍にかかっているかまたは腫瘍にかかっているのではないかと疑われる細胞）におけるものと比較しようとする場合、正常な細胞は典型的には、目的の癌または腫瘍の状態に関することを除いて、できる限り試験細胞に類似するものであるように選択される。
【００２２】
「核酸」なる用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいい、他に限定されない限り、自然発生のヌクレオチドと類似の方法で核酸とハイブリダイズする天然ヌクレオチドの既知のアナログを包含する。他に特記しない限り、特定の核酸配列はその相補配列を含む。「サブシーケンス（subsequence）」または「セグメント」とは、それぞれ長い配列のヌクレオチドまたはアミノ酸（例えば、ポリペプチド）の一部を含むヌクレオチドまたはアミノ酸の配列をいう。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーをいう。
【００２４】
「標的核酸」なる用語は、ポリヌクレオチドプローブが特異的にハイブリダイズするように設計される、核酸（しばしば生物学的試料に由来する）をいう。それは検出されるべき標的核酸の存在もしくは非存在、または、定量されるべき標的核酸の量である。標的核酸は標的に向けられる対応するプローブの核酸配列と相補的である配列をもつ。標的核酸なる用語は、プローブが向けられる大きな核酸の特異的サブシーケンスまたは発現レベルの検出が望まれる全配列（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）をいうことがある。
【００２５】
「プローブ」または「ポリヌクレオチドプローブ」とは、１種類またはそれ以上のタイプの化学結合を介して、通常、相補塩基対形成を介して、通常、水素結合形成を介して、相補配列の標的核酸と結合する、かくして二本鎖構造を形成する能力を有する核酸である。該プローブは「プローブ結合部位」と結合するかまたはハイブリダイズする。プローブは、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含むことができる。プローブは、一本鎖ＤＮＡであるオリゴヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドプローブは合成され得るか、または自然発生のポリヌクレオチドから生成され得る。さらに、プローブにおける塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により連結され得る。かくして、プローブは、例えば、構成要素である塩基がホスホジエステル結合というよりもむしろペプチド結合によって連結されているペプチド核酸を含むことができる（例えば、Nielsen et al., Science 254, 1497-1500 (1991)を参照）。相補性をもつ領域と隣接する非相補性をもつリーディングおよび／またはトレイリング（trailing）配列を持つことができるプローブもある。
【００２６】
「完全マッチドプローブ」は特定の標的配列と完全に相補的な配列をもつ。該プローブは典型的には標的配列の一部（サブシーケンス）と完全に相補的である。「ミスマッチプローブ」とは、配列が特定の標的配列と完全には相補的でないように意図的に選択されるプローブをいう。
【００２７】
「プライマー」は、適当な緩衝剤中、適当な温度で、適当な条件下で（すなわち、４種類のヌクレオチド三リン酸、およびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素のような重合のための薬剤の存在下で）鋳型依存性ＤＮＡ合成の開始点として作用する能力を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマーの適当な長さは、プライマーの意図した使用に依存し、典型的には１５〜３０ヌクレオチドの範囲であるが、より短いまたはより長いプライマーも同様に使用することができる。短いプライマー分子は、一般的に、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにはより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。「プライマー部位」なる用語は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域をいう。「プライマー対」なる用語は、増幅されるべきＤＮＡ配列の５'末端とハイブリダイズする５'「上流プライマー」および増幅されるべき配列の３'末端の補体とハイブリダイズする３'「下流プライマー」を含む一組のプライマーを意味する。
【００２８】
「相補的な」なる用語は、一の核酸がもう１つの核酸分子と同一であるか、または選択的にハイブリダイズすることを意味する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の欠落が全体的ではなくより選択的であるハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、ひと続きの少なくとも１４〜２５ヌクレオチドにわたって少なくとも約５５％の同一性、好ましくは、少なくとも６５％、より好ましくは、少なくとも７５％、最も好ましくは、少なくとも９０％の同一性がある場合に生じる。好ましくは、一の核酸は他の核酸と特異的にハイブリダイズする。M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984)を参照。
【００２９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」なる用語はアミノ酸残基のポリマーをいうために互換性をもって用いられる。該用語はまた、１個またはそれ以上のアミノ酸が対応する自然発生アミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３０】
「作動可能に連結した」なる用語は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイ）と別のポリヌクレオチドとの間の機能的結合をいい、ここで、発現調節配列はこの別のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００３１】
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドに関連する「同一」またはパーセント「同一性」なる用語は、例えば以下に記載するもののような配列比較アルゴリズムを用いて測定して、または目視検査により、比較して最大一致のために整列させた場合、同一であるか、または同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージをもつ、２つまたはそれ以上の配列またはサブシーケンスをいう。
【００３２】
２つの核酸またはポリペプチドに関連する「実質的に同一の」なるフレーズは、例えば以下に記載するもののような配列比較アルゴリズムを用いて測定して、または目視検査により、比較して最大一致のために整列させた場合、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％またはそれよりも高いヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性をもつ２つまたはそれ以上の配列またはサブシーケンスをいう。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約３０残基の長さの配列の領域にわたって、好ましくは、５０残基よりも長い領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約７０残基にわたって存在し、もっと好ましくは、該配列は、例えば、ヌクレオチドのコーディング領域のような比較されている配列の全長にわたって実質的に同一である。配列比較に関して、典型的には、一の配列は参照配列として作用し、それと試験配列とを比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要であればサブシーケンス座標を設計し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを設計する。そこで、配列比較アルゴリズムは、設計されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列同一性を算出する。
【００３３】
比較のための最適な配列アラインメントは、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性の検索方法により、これらのアルゴリズム（ウィスコンシン州マジソン、サイエンス・ドライブ５７５番のGenetics Computer GroupのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実行により、または、目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1995 supplement)を参照）により行うことができる。
【００３４】
配列比較を行うための一の有用なアルゴリズムはＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)のプログレッシブアラインメント法の単純化を使用する。使用した方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)により記載された方法に類似する。ＰＩＬＥＵＰを用いて、参照配列を他の試験配列と比較して以下のパラメーターを用いてパーセント配列同一性関係を決定する：デフォルトギャップ重量（３.００）、デフォルトギャップ長さ重量（０.１０）、および加重したエンドギャップ。ＰＩＬＥＵＰはＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７.０（Devereaux et al., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984)）から得ることができる。
【００３５】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの別の例は、Altshul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２.０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公然と入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同一の長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の値のスレッシュホールドスコアＴに匹敵するかまたはそれを満足するクエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコアスレッシュホールド値と呼ばれる（上掲のAltshul et al.）。これらの初期隣接ワードヒットはそれらを含む長いＨＳＰを見出すためのサーチを開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができるかぎり、各配列に沿って両方向に伸びる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一対のマッチング残基についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸びは、累積アラインメントスコアがその最大達成値から定量Ｘ低下するか；累積スコアは１個またはそれ以上の負のスコアリング残基アラインメントの累積のために０またはそれ以下となるか；またはどちらかの配列の末端に達しない場合に停止させられる。
【００３６】
核酸またはポリペプチドが本発明の範囲内のものであるかどうかを同定するために、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトパラメーターは適当である。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）はデフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとしてワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ ６２スコアリングマトリックスを用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列についてはタンパク質配列を用いる）はデフォルトとしてワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ ６２スコアリングマトリックスを用いる。（例えば、Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照）。
【００３７】
２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェント条件下にて互いにハイブリダイズし合うことである。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸との間での相補的ハイブリダイゼーションをいい、標的ポリヌクレオチド配列の所望の検出を達成するようにハイブリダイゼーション培地のストリンジェンシーを低下させることにより行うことができるマイナーミスマッチを含む。「特異的にハイブリダイズすること」なるフレーズは、配列が複合混合物（例えば、全細胞の）ＤＮＡまたはＲＮＡに存在する場合、分子がストリンジェント条件下にて特定のヌクレオチド配列だけと結合、二本鎖形成またはハイブリダイズすることをいう。
【００３８】
「ストリンジェント条件」なる用語は、プローブがその標的サブシーケンスとハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、種々の環境において異なるであろう。長い配列は高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特異的配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下での）温度である。（標的配列が一般的に過剰に存在する場合、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度がｐＨ７.０〜８.３で約１.０Ｍ Ｎａイオンよりも低い、典型的には、約０.０１〜１.０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であるものであろうし、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを超える）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加と共に達成され得る。
【００３９】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、以下に記載するように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。抗体について言及する場合、「タンパク質と特異的に結合する」または「と特異的に免疫反応性である」なるフレーズは、タンパク質および他の生物学的薬剤の異種集団の存在下でのタンパク質の存在の決定力のある結合反応をいう。かくして、指摘されたイムノアッセイ条件下にて、特定された抗体は特定のタンパク質と優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質と有意な量では結合しない。かかる条件下でのタンパク質との特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を必要とする。特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために種々のイムノアッセイフォーマットを用いてもよい。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために慣用的に固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが用いられる。特異的免疫反応性を測定するために用いることができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の記載については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照。
【００４０】
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に修飾された変異」とは、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードするこれらのポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合には実質的に同一の配列をいう。遺伝暗号の縮重のために、多くの機能的に同一の核酸はいずれもの所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡおよびＡＧＧは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。かくして、アルギニンがコドンによって特定される全ての位置で、コードされたポリペプチドを変えずに、該コドンを記載した対応するコドンのいずれかに変えることができる。かかる核酸変異は、「保存的に修飾された変異」の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載したすべてのポリヌクレオチド配列はまた、他に特記する場合を除き、すべての可能なサイレント変異を記載する。当業者は、核酸における各コドン（通常はメチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を、標準技術により機能的に同一の分子を得るように修飾することができるということを認識するであろう。したがって、記載した各配列にはポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント変異」が含まれている。
【００４１】
ポリペプチドと別のポリペプチドは、典型的には、例えば、この２つのペプチドが保存的置換基によってのみ異なる場合には実質的に同一である。タンパク質について記載する場合、「保存的置換基」とは、タンパク質の活性を実質的に変えないタンパク質のアミノ酸組成の変化をいう。かくして、特定のアミノ酸配列の「保存的に修飾された変異」とは、タンパク質活性に対して重要ではないこれらのアミノ酸のアミノ酸置換、またはアミノ酸の、重要なアミノ酸の場合でさえ置換が活性を実質的に変えないようなアミノ酸の類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正または負に荷電された、極性または無極性など）をもつ他のアミノ酸との置換をいう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換テーブルは当該技術分野において周知である。例えば、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Companyを参照。加えて、コード化配列における単一のアミノ酸または低いパーセンテージのアミノ酸を変えるか、加えるか、または欠失させる個々の置換、欠失または付加もまた、「保存的に修飾された変異」である。
【００４２】
物体に適用される場合、「自然発生」なる用語は、物体を天然において見出すことができることをいう。例えば、天然において供給源から単離することができ、研究室においてヒトによって意図的に修飾されていない、生物中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は自然発生のものである。
【００４３】
「抗体」なる用語は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１個またはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常部遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変部遺伝子を包含する。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。
【００４４】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の２組の同一の対からなり、各対は一が軽鎖（約２５ｋＤ）であり、一が重鎖（約５０〜７０ｋＤ）をもつ。各鎖のＮ末端は抗原認識の主な原因である約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変部を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖をいう。
【００４５】
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生成される多くの十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。かくして、例えば、ペプシンはヒンジ部においてジスルフィド結合の下で抗体を消化して、自体がジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と連結した軽鎖であるＦａｂの二量体であるＦ(ａｂ)'2を生成する。Ｆ(ａｂ)'2を穏やかな条件下で還元して、ヒンジ部においてジスルフィド結合を破壊し、それにより(Ｆａｂ')2二量体をＦａｂ'単量体に転換することができる。Ｆａｂ'単量体は実質的にヒンジ部の部分をもつＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記載については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照）。種々の抗体フラグメントは無傷の抗体の消化により定義されるが、当業者は、かかるＦａｂ'フラグメントは化学的に、または、組換えＤＮＡ法を用いることによって、新たに合成され得ると理解するであろう。かくして、本明細書で用いる場合、抗体なる用語はまた、完全抗体の修飾によって生成されるかまたは組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成される抗体フラグメントを包含する。好ましい抗体としては、一本鎖抗体、より好ましくは、可変重鎖および可変軽鎖が（直接またはペプチドリンカーを介して）一緒に連結されていて連続するポリペプチドを形成する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体が挙げられる。
【００４６】
一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、直接連結したかまたはペプチドコード化リンカーにより連結したＶＨ−およびＶＬ−コード配列を含む核酸から発現され得る共有結合したＶＨ::ＶＬヘテロ二量体である。Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)。自然に凝集するが化学的に分離されるポリペプチド軽鎖および重鎖を抗体Ｖ領域からｓｃＦｖ分子に転換するための多くの構造は抗原結合部位の構造に実質的に類似する三次元構造に折り畳まれるであろう。例えば、米国特許第5,091,513号および第5,132,405号および第4,956,778号を参照。
【００４７】
「抗原結合部位」または「結合部分」とは、免疫グロブリン分子の、抗原結合に関係する部分をいう。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内にある３つの高度に異なるストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られているより保存されたフランキングストレッチの間にある「超可変部」をいう。かくして、「ＦＲ」なる用語は、免疫グロブリンにおける超可変部間でそれらと隣接して自然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変部および重鎖の３つの超可変部は抗原結合「表面」を形成するように三次元空間において互いに対して配置されている。この表面は標的抗原の認識および結合を媒介する。重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変部は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれ、例えば、Kabat et al. Sequences of proteins of immunological interest, 4th ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987)により特徴付けられる。
【００４８】
「抗原決定基」なる用語は、抗原特異性を与える分子の特定の化学基をいう。
【００４９】
「エピトープ」なる用語は、一般に、抗原の、抗体と相互作用する部分をいう。より詳しくは、エピトープなる用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合する能力を有するいずれものタンパク質決定基を包含する。特異的結合は、抗原と結合している抗体についての解離定数が≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１ｎＭである場合に存在する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸のような分子の化学的に活性な表面原子団からなり、典型的には、特異的な三次元構造特性および特異的な荷電特性をもつ。
【００５０】
「特異的結合」なる用語（および等価なフレーズ）は、タンパク質および他の生物学的薬剤の異種性集団の存在下における結合部位（例えば、受容体、抗体、リガンドまたはアンチリガンド）の、特定の標的分子（例えば、リガンドまたは抗原）と優先的に（すなわち、試験試料中に存在する他の成分との有意な結合を伴わずに）結合する能力をいう。典型的には、リガンドおよび受容体のような２つのエンティティー間の特異的結合は少なくとも約１０6Ｍ-1、好ましくは、少なくとも約１０7、１０8、１０9または１０10Ｍ-1の結合親和性を意味する。
【００５１】
「対象体」とは、一般的に、腫瘍にかかっている生物をいう。通常、該対象体は哺乳動物（例えば、サル、類人猿（ape）またはチンパンジーのような霊長類）であり、しばしばヒトである。
【００５２】
II．概要
癌または腫瘍の種々の分類法、診断法および治療法、ならびにかかる方法を行うために有用な核酸、タンパク質および抗体を含むキットおよび装置が提供される。記載されている該方法、キットおよび装置は、一部は、腫瘍細胞と正常細胞との間または異なるタイプの腫瘍間で異なる発現レベルを示す「示差発現核酸」または「示差発現遺伝子」の比較的小さな群の同定に基づいている。ある種の腫瘍におけるこれらの発現レベルはまた、キネシンモータータンパク質ＫＳＰと正または負の相関関係にある（表１および２を参照）。これらの示差発現核酸およびそれらによりコードされるタンパク質は種々のタイプの腫瘍を分類および診断するための「マーカー」として用いることができる。
【００５３】
種々の腫瘍タイプにおける示差遺伝子発現を分析するための技術の組み合わせを用いて、ある種の腫瘍が３つグループに分けられることが見出された。第１のグループでは、ＫＳＰおよび細胞周期遺伝子（例えば、表１を参照）の発現レベルが増加し、その結果、該グループは高い分裂指数によって特徴付けられるが、シグナル伝達遺伝子発現は減少した。第２のグループは、シグナル伝達遺伝子の発現レベルが上昇するが（例えば、表２を参照）、ＫＳＰレベルは正常であり、細胞周期遺伝子の発現は減少することによって特徴付けられる。第３のグループは、ＫＳＰおよび細胞周期遺伝子発現の増加を示すが、シグナル伝達遺伝子の発現もまた増加した。この分析はまた、表１に記載する細胞周期遺伝子はＫＳＰ発現と正の相関関係にあるが、表２に記載するシグナル伝達遺伝子はＫＳＰ発現と負の相関関係にあることも示した。
【００５４】
これらの異なる腫瘍タイプについての示差遺伝子発現プロフィールの同定は、種々の分類方法、診断方法および治療方法の基礎を提供する。例えば、１個またはそれ以上の示差発現遺伝子の相対的な発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルが３つのグループにおける遺伝子についての発現レベルと一致するかどうかを評価することにより、腫瘍を上記の３つのグループの１つに分類することができる。治療方法は、本明細書において示差発現されると同定される１個またはそれ以上の遺伝子についての発現レベルの減少または増加を妨害する治療薬を投与することにより特定のタイプの腫瘍に依存して合わせることができる。
【００５５】
そこで、例えば、分類方法および治療方法は、１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現レベルが高レベルのＫＳＰを発現する腫瘍と一致するかを判定するのに用いることができる（例えば、ＫＳＰと正の相関関係にある１個またはそれ以上のマーカーの発現レベルが対照よりも増加するか、および／またはＫＳＰと負の相関関係にある１個またはそれ以上のマーカーの発現が対照よりも減少するかを判定する）。このカテゴリーに分類される腫瘍はＫＳＰ阻害物質による有効な治療の候補である。本明細書で同定したマーカーを用いてかかる腫瘍を同定する能力は重要である。というのは、上記したように、ＫＳＰ阻害物質による治療は他の化学療法よりも有利な点をいくつかもたらすからである。そこで、提供されるマーカーの一の重要な態様はそれらがＫＳＰの代用として役割を果たすことができることである。
【００５６】
示差発現核酸はまた、ある種の腫瘍の阻害物質を同定するためのスクリーニング方法において用いることもできる。一般的な戦略は、発現レベルが腫瘍において上昇するこれらの示差発現核酸の発現を阻害するかおよび／または発現レベルが腫瘍において減少するこれらの核酸の発現を活性化する候補薬剤を同定することである。
【００５７】
他の方法は、薬剤をスクリーニングしてそれらが潜在的な発癌物質であるかを評価するために１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現レベルを測定する。これらの方法では、試験薬剤を非癌性細胞と接触させ、１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現レベルを測定する。特定の腫瘍におい上昇するこれらの核酸の発現レベルの増加および／またはダウンレギュレートされるこれらの核酸の発現レベルの減少は試験薬剤が潜在的発癌物質であることの指標である。
【００５８】
記載した方法を行うのに用いるためのカスタマイズされたアレイのようなキットおよび装置もまた提供される。ある種のキットおよび装置は、１個またはそれ以上の示差発現核酸と特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブを含む。他のキットおよび装置は１個またはそれ以上の示差発現核酸によってコードされるタンパク質と特異的に結合する抗体または他の受容体を含む。このタイプのキットおよび装置は提供されるスクリーニング方法および診断方法を行うのに有用である。
【００５９】
III．示差発現核酸および発現プロフィール
化学療法標的としてのＫＳＰの重要さのために、本発明者らは、異なる細胞タイプにおける、特に、正常細胞と比べた種々の癌および腫瘍におけるＫＳＰ発現の範囲を理解するために一連の研究を行った。２つの一般的な技術を用いてこれらの分析を行った：定量ＲＴ−ＰＣＲ（特に、ＴＡＱＭＡＮ法）および核酸マイクロアレイ分析法。これらの方法はどちらも以下にさらに詳細に記載する。
【００６０】
これらの２つの技術は、まず、種々のタイプの組織におけるＫＳＰ発現レベルを研究して、ＫＳＰが広範に発現されるかまたは選ばれた組織においてのみ発現されるかを判定した。遺伝子発現データのデータベースを用いて、ＫＳＰが、骨組織（特に、骨髄造血細胞）、胸腺、ならびに程度は若干低いが回腸、食道、直腸、胃および小腸を含むある種の細胞においてのみ比較的高いレベルで発現されることを測定した（図１を参照）。かくして、これらの結果は、ＫＳＰが広範に発現されないことを示した。代わりに、細胞が急速にターンオーバーされる組織において、すなわち、高い増殖能をもつ組織において発現されると考えられる。このことは細胞増殖におけるＫＳＰの役割と一致する。
【００６１】
次に、ＫＳＰ発現が高い細胞増殖を含む疾患（例えば、腫瘍および癌）において増加するかを判定する研究を行った。１組の実験は、５０の異なる個体からの正常な乳房組織、および乳房浸潤導管癌（例えば、腺癌または扁平上皮癌）にかかっている２００の個体におけるＫＳＰ発現レベルの測定を含んだ。これらの研究から、ＫＳＰ発現レベルが一般に正常試料と比べて腫瘍試料において増加したことが見出された。しかしながら、腫瘍試料についての結果は、全ての腫瘍が高レベルのＫＳＰを発現するわけではないことを示した。むしろ、腫瘍にかかっているいくつかの個体についてのＫＳＰレベルは正常組織についての予想される範囲内となった。そこで、この結果は、少なくともある種の腫瘍タイプをもつ個体を２つのグループに分けることができることを示した：１つのグループはＫＳＰレベルが正常組織についてのものと一致しており、もう１つのグループはＫＳＰレベルが上昇する（図２を参照）。しかしながら、他の悪性の組織において、ＫＳＰ発現は増加しなかった。前立腺腫瘍は、例えば、検出不可能なレベルのＫＳＰ転写物を発現する。ＫＳＰ発現はある種の悪性腫瘍（例えば、乳房、卵巣および肺）において増加するが、良性の組織では増加しないことも見出された。上皮マーカーであるサイトケラチン１８のような細胞型特異的遺伝子と比べたＫＳＰ発現を評価するために他の実験を行った。
【００６２】
浸潤性乳癌にかかっているある種の個体は正常なＫＳＰレベルを有するが、残りは高いレベルを有するという観察結果は、発明者らを、これらの２つのグループの個体の間に生物学的差異があったかどうかを次に評価することにかりたてた。これは、２つの腫瘍グループにおける試料についての遺伝子発現に差異があったかを判定するためにクラスター分析を行うことによって行われた。問題となっている遺伝子はこれらの２つの集団のそれぞれにおいて高度に発現されたものであった。上記したように、腫瘍を３つのグループに分類することができるという知見が得られた：１）ＫＳＰの増加した発現（例えば、正常細胞と比べてＫＳＰ発現は１.５〜２倍以上増加した）および高い分裂指数（すなわち、細胞周期遺伝子の増加した発現）、ならびにシグナル伝達遺伝子の減少したレベルによって特徴付けられるこれらの腫瘍、２）シグナル伝達関連遺伝子の増加した発現および細胞周期遺伝子の減少したレベルを示しているこれらの腫瘍、および３）他の２つのクラスの特徴、すなわち、高い分裂指数およびシグナル伝達関連遺伝子の増加した発現をもつこれらの腫瘍（図３を参照）。容易に言い表すために、本明細書では、これらの腫瘍のクラスを、時折、それぞれカテゴリー１、２および３腫瘍と簡単に表す。
【００６３】
そこで、この研究の一結果は、ＫＳＰ発現と正または負の相関関係にある核酸のパネルの同定であった。正の相関関係にある核酸は、その発現がＫＳＰの発現をたどるものである（すなわち、発現は、ＫＳＰ発現が増加する場合に増加し、ＫＳＰ発現が減少する場合に減少する）。負の相関関係にある核酸は発現レベルがＫＳＰレベルと反対に動くものである（すなわち、遺伝子発現のレベルは、正常細胞に対してＫＳＰ発現レベルが上昇すると減少し、ＫＳＰ発現レベルが減少すると増加する）。かくして、これらの核酸はＫＳＰ発現についてのマーカーとして役立つことができる。
【００６４】
乳房腫瘍におけるＫＳＰ発現レベルと正の相関関係にある示差発現核酸を表１に示す。これらの遺伝子は「細胞周期」遺伝子、すなわち、細胞増殖、特に、有糸分裂に関与する遺伝子である傾向にある（例えば、Ｋｉ６７およびＣｙｃｌｉｎ Ｂ１）。ＫＳＰ発現レベルと負の相関関係にあるこれらの遺伝子を表２に示す。これらの遺伝子の多くはシグナル伝達遺伝子であるが、種々の他の細胞プロセスに関与する遺伝子も含まれる（例えば、表４に記載した種々の機能を参照）。表１の左から右へと説明すると、第１欄は各示差発現核酸の番号（すなわち、示差遺伝子番号）である；第２欄はクローンＩＤ番号であり、同定された各示差発現核酸に付された内部の参照番号である；第３欄はGenBank受入番号である；第４欄にはＬｏｃｕｓリンクＩＤを記載する；第５欄には科学文献で一般的に用いられている遺伝子の名称を記載する。表２は遺伝子についての別の一般名称を記載する「ＡＬＩＡＳ」と標記したさらなる欄を含む。総括的に、表１および２に記載した遺伝子は本発明の示差発現核酸または遺伝子である。
【００６５】
乳房浸潤導管癌試料でおこなった研究に類似する研究を卵巣および肺の腫瘍からの試料についても行った。遺伝子発現プロフィールに基づいて、これらの腫瘍もまた同じ３つのカテゴリーに分類されることが見出された。最も高い相関関係を示すこれらの遺伝子を同定するためにさらなる分析を行って、乳房腫瘍、卵巣腫瘍および肺腫瘍において一貫してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされたこれらの遺伝子を同定した。これらの３組の腫瘍においてＫＳＰ発現と最も高い正および負の相関関係にあることが判明したこれらの遺伝子をそれぞれ表３および４に記載する。これらの表は表１および２について記載したように構成されている。
【００６６】
以下にさらに詳細に考察するように、種々の腫瘍タイプにおいてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる核酸についての知識は多くの異なるスクリーニング方法、治療方法および診断方法を行うための装置に加えてこれらの方法の基礎を提供する。例えば、示差発現核酸は、「フィンガープリント遺伝子」および「標的遺伝子」のどちらも包含する。「フィンガープリント遺伝子」は特定の腫瘍タイプまたは特定の細胞状態（例えば、悪性または良性）と相関関係にあるこれらの核酸である。以下にさらに詳しく記載するように、フィンガープリント遺伝子は、腫瘍を分類するためおよび／または特定の病状の存在または非存在を同定するための種々の異なるスクリーニング方法および診断方法の開発において使用することができる。「標的遺伝子」は腫瘍の形成を引き起こすかまたは阻害するタンパク質をコードする核酸である。標的遺伝子が原因因子であるタンパク質をコードする場合、標的遺伝子産物のダウンレギュレーションは保護機能をもつ。他方、標的遺伝子が阻害タンパク質をコードする場合、標的遺伝子のアップレギュレーションは保護機能をもつ。癌または腫瘍形成におけるそれらの役割のために、標的遺伝子は以下に記載するような化合物発見プログラムの開発および創薬のために有用な標的である。場合によっては、フィンガープリント遺伝子が標的遺伝子であり得、逆もまた同じである。
【００６７】
示差発現遺伝子、特に、フィンガープリント遺伝子の組み合わせの発現レベルを用いて特定の癌、腫瘍または細胞状態の特徴である「発現プロフィール」を開発することができる。本明細書で用いられる発現プロフィールは少なくとも２つの示差発現遺伝子に相当する遺伝子発現のパターンをいう。典型的には、発現プロフィールは、少なくとも１、２、３、４または５個の示差発現遺伝子を含むが、他の場合、少なくとも６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはそれ以上の示差発現遺伝子を含むことができる。場合によっては、発現プロフィールは、特定の腫瘍、癌または細胞状態について知られている示差発現遺伝子の全てを含む。そこで、例えば、ある種の発現プロフィールは表１および２、または表３および４における示差発現遺伝子のそれぞれについての発現レベルの程度（定量的または定性的）を含む。
【００６８】
遺伝子発現プロフィールに関連する発現パターンは、いくつかの方法で定義することができる。例えば、遺伝子発現プロフィールはたくさんの特定の示差発現遺伝子の絶対的な転写物レベル（例えば、測定値）または相対的な転写物レベルであり得る。他の場合、遺伝子発現プロフィールは一の状態における種々の遺伝子の発現のレベルと別の状態における同遺伝子の発現のレベルを比較すること（例えば、悪性対良性）により、または一の細胞型と別の細胞型との間で比較すること（例えば、癌性細胞対正常細胞）により定義することができる。
【００６９】
本明細書で用いる場合、「示差発現核酸」なる用語は、表１〜４に示されるような特定のGenBankおよびＬｏｃｕｓリンクＩＤエントリーにおいて記載したような特異的な配列をいう。しかしながら、この用語はまた、より幅広く自然発生する配列（GenBankエントリーについて記載したものの対立遺伝子変種を含む）、ならびに合成配列および意図的に操作された配列（例えば、部位特異的突然変異誘発に供した核酸）を包含することも意図される。示差発現核酸はまた、記載された配列と相補的な配列、および遺伝暗号の縮重により引き起こされる変性配列を包含する。かくして、示差発現核酸は、（ａ）記載したGenBank受入番号にて提供される配列に相当する配列を有する核酸；（ｂ）（ａ）の核酸によりコードされるアミノ酸をコードする核酸；（ｃ）（ａ）の核酸の補体とストリンジェント条件下にてハイブリダイズする核酸；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）において記載されている核酸とストリンジェント条件下にてハイブリダイズする、したがってその核酸の補体である核酸を包含する。本発明の示差発現核酸はまた、（ａ）記載したGenBank受入番号に相当する全長ヌクレオチド配列と相補的なデオキシリボヌクレオチド配列；（ｂ）記載したGenBank受入番号に相当する全長配列と相補的なリボヌクレオチド配列；および（ｃ）（ａ）のデオキシリボヌクレオチド配列および（ｂ）のリボヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を包含する。該示差発現核酸はさらに上記配列のフラグメントを包含する。例えば、示差発現核酸からの１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００個の連続するヌクレオチド（またはそれらの間の多数のヌクレオチド）を包含する核酸を包含する。かかるフラグメントは、例えば、（例えば、かかる配列の検出および増幅において）全長示差発現核酸をハイブリダイズするためのプライマーおよびプローブとして有用である。
【００７０】
場合によっては、示差発現核酸は保存的に修飾された変異を含む。かくして、例えば、場合によっては、示差発現核酸は修飾される。当業者は、所定の核酸構築物における変化を生じる多くの方法を認識するであろう。かかる周知の方法としては、部位特異的突然変異誘発、変性ポリヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅、核酸を含む細胞の変異誘発剤または照射への暴露、および（例えば、大きい核酸を生じるためのライゲーションおよび／またはクローニングと組み合わせる）所望のポリヌクレオチドの化学合成が挙げられる。例えば、Giliman and Smith (1979) Gene 8:81-97、Roberts et al. (1987) Nature 328: 731-734を参照。示差発現核酸がベクター中に取り込まれると、該核酸は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位および多重クローニング部位を包含するがそれらに限定されるものではない他の配列と組み合わせることができる。かくして、核酸の全長は相当に変わり得る。
【００７１】
本発明のある種の示差発現核酸は配列番号１に記載したポリヌクレオチド配列と実質的に同一のポリヌクレオチドを包含する。かかる核酸はある種の腫瘍についての新しいマーカーとして機能することができる。例えば、本発明は、表１〜４に記載したGenBankエントリーにて提供されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または１００％同一であるポリヌクレオチド配列を包含する。同一性は典型的には、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個の連続するヌクレオチドにわたって測定される。他の場合、同一性は、長さが少なくとも１５０、２００または２５０ヌクレオチドの領域にわたって測定される。また、他の場合、類似性の領域は長さ２５０ヌクレオチドを超え、長さ少なくとも３００、３５０、４００、４５０もしくは５００ヌクレオチドについて、または、該配列の全長にわたって伸長する。
【００７２】
上記したように、配列同一性比較は、当業者に知られているもののようなヌクレオチド配列比較アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いることができる。ＢＬＡＳＴＮにおいて用いるための適当なパラメーターはワードレングス（Ｗ）１１、Ｍ＝５およびＮ＝４、ならびに記載された同一性値および領域サイズである。
【００７３】
Ｂ．示差発現遺伝子の調製
示差発現核酸は、例えば、（１）ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーの、相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとのハイブリダイゼーション；（２）共有された構造特徴をもつクローンＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング；（３）目的の核酸とアニール化する能力を有するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような種々の増幅法；および（４）直接化学合成法を包含する当該技術分野で知られているいずれもの適当な方法によって得ることができる。
【００７４】
所望の核酸はまた周知の増幅技術を用いてクローン化することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術を包含するインビトロ増幅方法により当業者を導くのに十分プロトコールの例は、Berger, Sambrook, and Ausubel, as well as Mullis et al. (1987)米国特許4,683,202号；PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al, eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis)；Arnheim & Levinson (October 1, 1990) C&EN 36-47；The Journal Of NIH Research (1991) 3: 81-94；(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173；Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874；Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826；Landegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080；Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294；Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560；およびBarringer et al. (1990) Gene 89: 117に見られる。インビトロ増幅した核酸をクローニングする改良方法は、Wallace at al., 米国特許第5,426,039号に記載されている。
【００７５】
核酸をクローニングする代わりに、適当な核酸を化学的に合成することができる。直接化学合成法としては、例えば、Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 90-99のホスホトリエステル法；Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68: 109-151のホスホジエステル法；Beaucage et al. (1981) Tetra. Lett., 22: 1859-1862のジエチルホスホアミダイト法；および米国特許第4,458,066号に記載の固体支持法が挙げられる。化学合成法は、一本鎖ポリヌクレオチドを生成する。これは、相補配列とのハイブリダイゼーションにより、または、鋳型として一本鎖を用いるＤＮＡポリメラーゼとの重合により二本鎖ＤＮＡに転換することができる。ＤＮＡの化学合成はしばしば約１００塩基の配列に制限されるが、短い配列のライゲーションにより長い配列を得ることができる。別法としては、サブシーケンスをクローン化することができ、適当な制限酵素を用いて適当なサブシーケンスを切断することができる。次いで、該フラグメントを連結して、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【００７６】
Ｃ．示差発現核酸および発現プロフィールの有用性
上記したように、また、以下にさらに詳しく記載するように、提供される示差発現核酸および発現プロフィールは種々のスクリーニング方法および診断方法においてマーカーとして使用することができる。例えば、示差発現核酸はハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとしての有用性を見出す。場合によっては、これらのプローブおよびプライマーはこのセクションの初めの方に記載した長さの示差発現核酸のフラグメントである。かかるフラグメントは、一般に、対象体から得た試料におけるＲＮＡまたはＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものである。該核酸は、典型的には、長さ１０〜３０ヌクレオチドであるが、それらは、上記のように、より長いものであり得る。該プローブは、ノーザンブロットおよびサザンブロットを包含するがこれらに限定されるものではない種々の異なるタイプのハイブリダイゼーション実験において、また、カスタムアレイ（上記を参照）の調製において使用することができる。示差発現核酸はまた、示差発現核酸を増幅するためのプライマーの設計において、また、定量的ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーおよびプローブの設計おいて使用することもできる。該プライマーは、ほとんど、所望のレベルの安定性およびかくして増幅における選択性を得るために示差発現核酸の約２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含むが、上記したような長い配列を用いることもできる。
【００７７】
ハイブリダイゼーション条件は特定の用途に従って様々である。高い選択性を必要とする用途（例えば、特定の配列の増幅）については、約５０℃〜約７０℃の温度で０.０２Ｍ〜約０.１０Ｍ ＮａＣｌのような比較的ストリンジェントな条件が用いられる。これらのような高いストリンジェンシー条件は、プローブと示差発現核酸の鋳型または標的鎖との間のもしあったとすれば小さいミスマッチは許容する。かかる条件は例えば、特異的な遺伝子を単離するのに、または特定のｍＲＮＡ転写物を検出するのに有用である。
【００７８】
部位特異的突然変異誘発によるアミノ酸の置換のような他の用途はより低いストリジェンシーを必要とする。これらの条件下では、プローブおよび標的核酸の配列が完全には相補的ではなく、１個またはそれ以上のミスマッチを含む場合でさえハイブリダイゼーションを引き起こすことができる。塩濃度を増加させることおよび温度を低下させることにより、条件をより低いストリンジェントにすることができる。例えば、中程度のストリンジェント条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で約０.１〜０.２５Ｍ ＮａＣｌを含む。低いストリンジェンシー条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で約０.１５Ｍ〜約０.９Ｍ塩を含む。
【００７９】
Ｖ．タンパク質
Ａ．一般的
同定された示差発現核酸を多くの既知の発現系のいずれかに挿入して遺伝子または遺伝子フラグメントによってコードされるタンパク質を多量に生じることができる。次いで、かかるタンパク質を抗体の調製に用いることができる。標的遺伝子によりコードされるタンパク質は以下に記載する化合物開発プログラムにおいて、および種々の診断薬（例えば、抗体アレイ）の調製において用いることができる。
【００８０】
該ポリペプチドは、天然源から単離することができるか、および／または組換え法に従って調製することができるか、および／または化学合成によって調製することができるか、および／または組換え法および化学合成を併用して調製することができる。実質的に全長のポリペプチドのほかに、該ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントもまた提供される。生物学的活性は、例えば、抗体結合（例えば、該フラグメントは全長ポリペプチドと競合する）および免疫原性（すなわち、該フラグメントに対するＢ細胞またはＴ細胞応答を刺激するエピトープの所有）を包含することができる。かかるフラグメントは、一般に、少なくとも５個の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも６または７個の連続するアミノ酸、他の場合では８または９個の連続するアミノ酸、通常、少なくとも１０、１１または１２個の連続するアミノ酸、さらに他の場合では少なくとも１３または１４個の連続するアミノ酸、さらに他の場合では少なくとも１６個の連続するアミノ酸、場合によっては、少なくとも２０、４０、６０または８０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８１】
しばしば、該ポリペプチドは、全長ポリペプチドのアミノ酸配列と同様に少なくとも１つの抗原決定因子を有するであろう。かかる共通の決定因子の存在は、変種タンパク質と全長ポリペプチドに対して調製された抗体との交差反応性によって立証される。交差反応性は全長ポリペプチドに対するポリクローナル血清を用いて試験することができるが、全長ポリペプチドに対する１個またはそれ以上のモノクローナル抗体を用いて試験することもできる。
【００８２】
該ポリペプチドは、自然発生ポリペプチドの保存的変異を含む。かかる変異は集団内で天然の変異によって生じるポリペプチドのマイナーな配列変異（例えば、単一ヌクレオチド多形性）であるか、またはそれらは他の種において見られるホモログであり得る。それらはまた、天然には生じないが、それらが同様に機能するかおよび／または天然形態のポリペプチドと交差反応する免疫応答を誘発するように十分に類似する配列であり得る。配列変種は、標準的な部位特異的突然変異誘発技術によって調製することができる。該ポリペプチド変種は、置換変種、挿入変種または欠失変種であり得る。欠失変種は機能または免疫原活性に必須ではない天然タンパク質の１個またはそれ以上の残基を欠いている（例えば、トランスメンブランまたは分泌シグナル配列を欠いているポリペプチド）。置換変種はタンパク質内の１個またはそれ以上の部位で一のアミノ酸残基を他のものと保存的置換することを含んでおり、タンパク質分解性切断に対する安定性のようなポリペプチドの１個またはそれ以上の性質を調節するように設計することができる。挿入変種は、例えば、ポリペプチドの迅速な精製を可能にするために使用されるもののような融合タンパク質を包含し、また、該ポリペプチドの相同体である他のポリペプチドからの配列を含有するハイブリッドタンパク質を包含することもできる。上記の変異を用いて、等価な、または改良された第二世代ポリペプチドでさえつくり出すことができる。変種の調製は当該技術分野において周知である（例えば、Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company（全ての目的のために出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を参照）。
【００８３】
提供されるポリペプチドはまた、ポリペプチドが修飾ポリペプチド主鎖をもつものを包含する。かかる修飾の例としては、アセチル化およびカルボキシル化のようなポリペプチドの化学的誘導体化が挙げられる。修飾はまた、グリコシル化修飾および典型的なポリペプチドの変種のプロセシングも含む。かかるプロセシング工程は、特に、ユビキチン化およびリン酸化のような酵素的修飾を包含する。例えば、Hershko & Ciechanover, Ann. Rev. Biochem. 51: 335-364 (1982)を参照。タンパク質二次元構造の要素を模倣するペプチド含有分子である模倣物もまた包含される（例えば、Johnson, et al., "Peptide Turn Mimetics" in Biotechnology and Pharmacy, (Pezzuto et al., Eds.), Chapman and Hall, New York (1993)を参照）。ペプチド模倣物は、典型的には、模倣物の側鎖が天然タンパク質における側鎖の相互作用と類似の分子相互作用に関与することができるように主鎖から延びている側鎖基が配向されるように設計される。
【００８４】
Ｂ．ポリペプチドの生成
１．組換え技術
示差発現核酸によりコードされるポリペプチドは、コード配列が発現ベクター中の発現調節配列と作動可能に結合した後に宿主において発現され得る。発現ベクターは、典型的には、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの内在性部分として宿主生物において複製可能である。発現ベクターは、一般に、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有していて、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の検出および／または選択を可能する（例えば、米国特許第4,704,362号を参照）。
【００８５】
示差発現遺伝子は、典型的には、比較的多量の本発明のポリペプチドを生成するために、所望の宿主細胞において機能的なプロモーターの調節下におかれる。非常に広範囲に及ぶ様々なプロモーターは当業者に周知であり、特定の用途に依存して、発現ベクターにおいて使用することができる。通常、選択されたプロモーターは、該プロモーターが活性であるべきである細胞に依存する。リボソーム結合部位および転写終結部位などのような他の発現調節配列もまた任意に含んでもよい。１個またはそれ以上のかかる調節配列を含む構築物は「発現カセット」と称される。したがって、示差発現核酸が所望の宿主細胞における対応するタンパク質の高レベルの発現のために取り込まれる発現カセットが提供される。
【００８６】
ある場合には、該発現カセットは原核生物宿主細胞におけるポリペプチドの発現のために有用である。一般的に用いられる原核生物調節配列（本明細書において、リボソーム結合部位配列に加えて転写開始のためのプロモーターを任意にはオペレーターと一緒に含むように定義される）としては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Change et al. (1977) Nature 198: 1056）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057）、ｔａｃプロモーター（DeBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）；およびλ由来ＰLプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128）のような一般的に使用されるプロモーターが挙げられる。しかしながら、一般に、原核生物において機能するいずれもの入手可能なプロモーターを用いることができる。
【００８７】
イー・コリ（E. coli）以外の原核生物細胞におけるポリペプチドの発現に関しては、特定の原核生物種において機能するプロモーターが必要とされる。かかるプロモーターは、該種からクローン化された遺伝子から得ることができるか、または、異種プロモーターを用いることができる。例えば、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターはイー・コリに加えてバシラス（Bacillus）において機能する。
【００８８】
酵母におけるポリペプチドの発現に関しては、好都合のプロモーターとしては、ＧＡＬ１−１０（Johnson and Davies (1984) Mol. Cell. Biol. 4:1440-1448）、ＡＤＨ２（Russell et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:2674-2682）、ＰＨＯ５（EMBO J. (1982) 6:675-680）およびＭＦα（Herskowitz and Oshima (1982) in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (eds. Strathern, Jones, and Broach) Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 181-209）が挙げられる。酵母において用いるための別の適当なプロモーターはCousens et al., Gene 61:265-275 (1987)に記載されているＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターである。真核生物宿主細胞において用いるのに適当な他のプロモーターは当業者に周知である。
【００８９】
哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現に関しては、好都合のプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター（Miller, et al., BioTechniques 7:980）、ＳＶ４０プロモーター（de la Luma, et al., (1998) Gene 62:121）、ＲＳＶプロモーター（Yates, et al, (1985) Nature 313:812）、ＭＭＴＶプロモーター（Lee, et al., (1981) Nature 294:228）が挙げられる。
【００９０】
昆虫細胞におけるポリペプチドの発現に関しては、好都合のプロモーターはバキュロウイルス、アウトグラファ・カリフォルニカ（Autographa Californica）核多角体病ウイルス（ＮｃＭＮＰＶ）からのものである（Kitts, et al., (1993) Nucleic Acids Research 18:5667）。
【００９１】
発現系において構成または調節プロモーターのいずれかを使用することができる。ポリペプチドの発現が誘発される前に宿主細胞は高密度に増殖し得るので、調節プロモーターが有利であり得る。異種タンパク質の高レベルの発現は状況によっては細胞増殖を遅らせる。イー・コリおよび他の細菌宿主細胞に関しては、誘導プロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーター、バクテリオファージλＰLプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Amann et al. (1983) Gene 25: 167；de Boer et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:21）、およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Studier et al. (1986) J. Mol. Biol.；Tabor et al. (1985) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82: 1074-8）が挙げられる。これらのプロモーターおよびそれらの使用はSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (1989)において議論されている。他の生物についての誘導プロモーターもまた当業者に周知である。これらのプロモーターとしては、例えば、アラビノースプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、メタロチオネインプロモーター、および熱ショックプロモーター、ならびにその他多くのものが挙げられる。
【００９２】
上記した要素の１個またはそれ以上を含有する適当なベクターの構築は標準的なライゲーションを用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを切断し、処理し、必要とされるプラスミドを作成するのに望まれる形態で再連結する。構築されたプラスミドにおける正しい配列を確認するために、制限エンドヌクレアーゼ消化および／または公知の方法に従って配列決定することなどの標準的な技術により該プラスミドを分析することができる。組換え核酸の構築に適当な広範囲に及ぶ種々のクローニングおよびインビトロ増幅法は、例えば、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)；および"Current Protocols in Molecular Biology," F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture bwtween Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1998 Supplement) (Ausubel)に記載されている。
【００９３】
本発明の示差発現核酸を含有する発現ベクターを構築するための出発物質として使用するのに適当な種々のベクターがある。細菌におけるクローニングに関しては、一般的なベクターとしては、ｐＢＲ３２２由来ベクター、例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴTM、ｐＵＣ１８／１９、およびλ−ファージ由来ベクターが挙げられる。酵母において、適当なベクターとしては、Ｙｅａｓｔ Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｉｎｇプラスミド（例えば、ＹＩｐ５）およびＹｅａｓｔ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇプラスミド（ＹＲｐ系プラスミド）ｐＹＥＳ系および例えばｐＧＰＤ−２が挙げられる。哺乳動物細胞における発現は、例えば、ｐＳＶ２、ｐＢＣ１２ＢＩ、およびｐ９１０２３、ｐＣＤＮＡ系、ｐＣＭＶ１、ｐＭＡＭｎｅｏ、ならびに溶解性ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス）、エピソームウイルスベクター（例えば、ウシパピローマウイルス）およびレトロウイルスベクター（例えば、ネズミレトロウイルス）を包含する種々の一般的に入手可能なプラスミドを用いて達成され得る。昆虫細胞における発現は、例えば、ｐＦａｓｔＢａｃ１、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ系、ｐＢｌｕｅｓＢａｃ４.５、ｐＢｌｕｅｓＢａｃＨｉｓ系、ｐＭｅｌＢａｃ系、およびｐＶＬ１３９２／１３９３を包含する種々のバキュロウイルスベクターを用いて行われ得る。
【００９４】
全長遺伝子またはそのフラグメントによりコードされるポリペプチドは、イー・コリ、他の細菌宿主、酵母、ならびにＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびミエローマ細胞系のような種々の高等真核生物細胞を包含する種々の宿主細胞において発現され得る。宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、または例えば酵母細胞、細菌細胞または真菌細胞のような微生物であり得る。有用な細菌の例としては、エシェリキア（Escherichia）、エンテロバクター（Enterobactor）、アゾトバクター（Azotobacter）、エルウィニア（Erwinia）、クレブシエラ（Klebsiella）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００９５】
該発現ベクターは、イー・コリに関する塩化カルシウム形質転換および哺乳動物細胞に関するリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションのような周知の方法により、選択された宿主細胞に転移され得る。該プラスミドにより形質転換された細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子のようなプラスミド上に含有される遺伝子により与えられる抗体に対する抵抗性により選択され得る。
【００９６】
いったん発現されると、組換えポリペプチドは、硫安沈殿、アフィニティーカラム、イオン交換および／またはサイズ排除クロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などを包含する当該技術分野の標準的な方法に従って精製され得る（一般に、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)を参照）。該ポリペプチドは通常、少なくとも約９０〜９５％の均一性の実質的に純粋な組成物を得るために精製される；他の用途においては、該ポリペプチドはさらに、少なくとも９８〜９９％またはそれ以上の均一性に精製される。
【００９７】
２．自然発生ポリペプチド
示差発現核酸によりコードされる自然発生ポリペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィーのような慣用技術を用いて単離することもできる。例えば、目的のポリペプチドに対してポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が引き起こされ、それを周知技術により適当なアフィニティーカラムに付着させることができる。例えば、Hudson & Hay, Practical Immunology (Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK, 1980), Chapter 8を参照（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。当業者に知られている化学的または酵素的切断法により無傷ポリペプチドからペプチドフラグメントを作成することができる。
【００９８】
３．他の方法
別法として、示差発現遺伝子または遺伝子フラグメントによりコードされるポリペプチドは、化学的な方法により合成され得るか、または翻訳を導くためにポリヌクレオチド鋳型を用いるインビトロ翻訳系により生成され得る。ポリペプチドの化学合成およびインビトロ翻訳のための方法は当該技術分野において周知であり、また、Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）により記載されている。
【００９９】
Ｃ．利用性
該ポリペプチドを用いて、該ポリペブチドまたはそのフラグメントに関連するエピトープと特異的に結合する抗体を作成することができる。商業的に入手可能なコンピューター配列分析法を用いて該ポリペプチドの推定される主要な抗原決定エピトープの位置を決定することができる（例えば、コネティカット州ニューヘヴンのIBIからのＭａｃＶｅｃｔｏｒ）。このような分析がいったん行われると、抗原決定基の少なくとも必須の構造特徴を含有するポリペプチドを調製することができ、それを該ポリペプチドに対する抗血清の生成に利用することができる。これらの決定基をコードするミニ遺伝子または遺伝子融合体を構築し、標準的な技術を用いて上記したような発現ベクターに挿入することができる。主要な抗原決定基はまた経験的に決定され得、該ポリペプチドをコードする遺伝子のその部分が組換え宿主において発現され、得られたタンパク質はそれらの免疫応答を誘発する能力について試験される。例えば、ＰＣＲを用いて、ポリペプチドのＣ末端の連続的に長いフラグメントを欠いているポリペプチドをコードする一連のｃＤＮＡを調製することができる。次いで、これらのポリペプチドのそれぞれの免疫保護活性は、この活性に必須の該ポリペプチドのこれらのフラグメントまたはドメインを同定する。ほんの少数のアミノ酸が各反復で除去されるさらなる実験は該ポリペプチドの抗原決定基の位置決定を可能にする。
【０１００】
標的遺伝子によりコードされるポリペプチドは、例えば癌性細胞に関連する遺伝子産物を調節するような医薬組成物の開発において利用され得る。さらに、かかるポリペプチドの同定、その後の化合物の開発のための方法を以下に記載する。
【０１０１】
VI．例示的なスクリーニング方法、分類方法および診断方法
Ａ．一般的な考察
提供される多くの方法は、試験細胞集団における１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現レベルを、対照細胞集団における同核酸の発現レベルを用いて測定することを含む。該示差発現核酸の発現のレベルは、該核酸レベルまたはタンパク質レベルのいずれかで測定することができる。かくして、示差発現核酸に関して用いる場合、「発現レベルを測定する」なるフレーズおよび他の同様のフレーズは、転写物レベルおよび／または示差コード核酸によりコードされるタンパク質のレベルを検出することを意味する。発現のレベルを測定する場合、該レベルは定性的に測定され得るが、一般的には定量的に測定される。
【０１０２】
本明細書に記載の配列情報に基づいて、本明細書に記載されており、当該技術分野において知られている核酸およびタンパク質検出方法と結び付けて考えると、これらの遺伝子の発現レベルは容易に測定することができる。転写物レベルを測定する場合、それらは慣用の方法を用いて測定することができる。例えば、本明細書にて提供される配列情報（例えば、GenBank配列エントリー）を用いて、種々のハイブリダイゼーション検出法（例えば、ノーザンブロット）のような慣用方法を用いて核酸プローブを構築することができる。別法として、提供された配列情報を用いてプライマーを作成し、次いで、それを用いて、試料中に存在する示差発現核酸を増幅し、検出することができる（例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法）。代わりに発現をタンパク質レベルで検出する場合、多くの確立された技術のどれを用いても、コードされたタンパク質を検出し、所望により、定量することができる。一の一般的なアプローチは、イムノアッセイ法において該タンパク質生成物に特異的に結合する抗体を用いることである。示差遺伝子発現を行う方法に関して、以下にさらに詳細に記載する。
【０１０３】
表１〜４に記載する示差発現核酸の１つ、いくつかまたは全てについて発現レベルを検出することができる。いくつかの方法については、１、２、３、４または５個の示差発現核酸についての発現レベルが測定される。他の方法では、少なくとも６、７、８、９または１０個の示差発現核酸についての発現レベルが測定される。さらに他の方法では、少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０個の示差発現核酸についての発現レベルが測定される。さらに他の方法では、表１および２における示差発現遺伝子の全てが測定されるか、または、別法として、表３および４に記載されているもの全てが測定される。いくつかの方法ではまた、ＫＳＰおよび／またはチューブリンについての発現レベルの測定を含む。
【０１０４】
発現レベルの測定は、典型的には、試験細胞集団から採取した試験試料について行われる。本明細書において記載する場合、細胞について用いる場合、「集団」なる用語は、単一の細胞を意味することができるが、典型的には、複数の細胞（例えば、組織試料）をいう。試験細胞集団は、複数の異なる細胞型を含み得るが、典型的には、単一の細胞型を含む。ある種の方法（例えば、分類方法または診断方法）では、試験試料は、通常、腫瘍または癌組織から、または、腫瘍を含むかまたは癌性であると考えられる組織から得られる。
【０１０５】
ある種のスクリーニング法（例えば、試験薬剤が発癌物質であるかどうかを評価するためのスクリーニング）は、典型的には、腫瘍由来ではなく、かつ、癌性ではない試験細胞を用いる。このタイプの方法は、１個またはそれ以上の示差発現核酸を「発現する能力を有する」試験細胞について行われる。これに関連して用いる場合、「発現する能力を有する」なるフレーズは、目的の核酸が無傷形態であり、細胞内で発現され得ることを意味する。
【０１０６】
本質的には、提供されるスクリーニング方法において、１個またはそれ以上の示差発現核酸を発現する能力を有する限りいずれものタイプの細胞を用いることができる。かかる細胞の例は、肝臓、乳房、皮膚、腎臓、胃および膵臓を包含するがこれらに限定されるものではない種々の異なるヒト組織から得られるものである。適当な細胞系としては、例えば、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＬ６０およびＭＣＦ７細胞が挙げられる。
【０１０７】
提供される多くの方法は、「試験細胞」におけるある種の示差発現核酸についての発現レベルと、「対照細胞」（「対照試料」、「参照細胞」、「基準値」または単に「対照」というときもある）における同核酸についての発現レベルとの比較を含む。対照細胞の発現レベルは、本質的には、実験値を比較するベースラインを確立する。発現レベルの比較は、１）「細胞」なる用語により意味されるものに関して、２）試験細胞および対照細胞についての発現レベルを測定する時間に関して、および３）発現レベルの程度に関して、幅広く解釈されることを意味する。
【０１０８】
そこで、例えば、「試験細胞」および「対照細胞」なる用語が便宜上用いられるが、「細胞」なる用語は幅広く解釈されることを意味する。細胞は、例えば、まさに細胞の集団が単一のメンバーをもち得るような細胞の集団（例えば、組織試料）をも表す。該細胞は、場合によっては、細胞に由来する試料（例えば、細胞可溶化物、ホモジェネート、細胞フラクションまたは細胞小器官）であり得る。ヒト対象体から得られる試料は、示差発現核酸またはそれらのタンパク質生成物を得ることができる実質的にいずれもの供給源から得ることができる。該方法が、試料が腫瘍または癌組織からのものであるかどうかを判定することを必要とする場合、該試料は、疑わしい組織から得られるべきである。しかしながら、一般に、試料は、例えば、痰、組織、血液、組織または穿刺生検試料、尿、腹腔内液、および胸腔内液、またはそれらからの細胞から得ることができる。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取される凍結切片のような組織の切片を含むことができる。
【０１０９】
対照細胞が実際の細胞である場合、試験細胞および対照細胞は一般にできる限り互いに類似する組織に由来するものである。場合によっては、これは、対照細胞が試験細胞と同一の対象体から得られることを意味する。そこで、場合によっては、対照細胞は試験細胞が採取される領域と近位の部位から採取される。例えば、対照細胞は腫瘍組織または癌性であると疑われる組織に隣接する正常組織から採取され得る。別法として、細胞集団は、試験および対照亜集団に分けられる。亜集団は、オリジナル試料をできる限りほぼ同一のグループに分けることにより得られる。これは、例えば、インビトロまたはエキソビボスクリーニング方法における場合であり得る。
【０１１０】
タイミングに関しては、発現レベルの比較は、同時に行うことができる（例えば、試験細胞および対照細胞を平行反応においてそれぞれ試験薬剤と接触させる）。別法として、比較は、時間的に異なる時点で測定された発現レベルを用いて行うことができる。一例としては、対照細胞についての発現レベルは、試験細胞についての発現レベルの前に集めることができ、さらなる使用のために記憶され得る（例えば、発現レベルは、コンピューターコンパチブル記憶媒体に記憶される）。
【０１１１】
対照細胞についての発現レベル（例えば、ベースライン）は、単一細胞についての値であり得、または、複数の細胞について測定された平均（average）値、平均（mean）値または他の統計学的値であり得る。一例として、対照細胞についての発現レベルは、一集団の対象体（例えば、疾患にかかっていない対象体）について発現レベルの平均値であり得る。他の場合、対照細胞についての各発現レベルについての値は、特定の集団について観察された範囲を表す一連の値である。発現レベル値はまた、定性的または定量的のいずれであってもよい。発現レベルについての値はまた、所望により、分析下のマーカーの１つではない核酸の発現レベルに関して規準化することもできる。
【０１１２】
いくつかの方法において必要とされる比較分析は、発現レベル値が互いに「似ている」（または「類似している」）かまたは「異なっている」か判定することを含む。場合によっては、試験細胞および対照細胞における特定のマーカーについての発現レベルは、それらが互いに実験誤差のレベル以下異なる場合に類似すると考えられる。しかしながら、しばしば、発現レベルは、試験細胞におけるレベルが対照細胞に対して５％、１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％または２００％未満異なる場合に類似すると考えられる。かくして、場合によっては、試験細胞における特定のマーカーについての発現レベルは、差異が実験誤差のレベルよりも大きい場合、または、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％または２００％よりも大きい場合、対照細胞における同マーカーについての発現レベルとは異なると考えられるということによる。いくつかの方法では、比較は、試験細胞および対照細胞におけるマーカーについての発現レベルに「統計学的に有意な差異」があるかどうかの判定を含む。差異は、一般に、偶然に生じる観察された差異の確率（ｐ値）が予め決定されたレベルよりも低い場合に「統計学的に有意」であると考えられる。本明細書において用いられる場合、「統計学的に有意な差異」とは、＜０.０５、好ましくは、＜０.０１、最も好ましくは、＜０.００１であるｐ値をいう。遺伝子発現が対照細胞またはベースラインと比べて（まさに定義したように）異なるように十分に増加する場合、この遺伝子の発現は「アップレギュレート」または「増加」したと考えられる。遺伝子発現が対照細胞またはベースラインとは異なるように減少する場合、この遺伝子の発現は「ダウンレギュレート」または「減少」したと考えられる。
【０１１３】
試験細胞と対照細胞との間の発現レベルの比較は、上記したような単一のマーカーまたは複数のマーカーについてのレベルを比較することを含み得る。単一のマーカーについての発現レベルが測定される場合、試験細胞と対照細胞との間の発現レベルが類似するか異なるかは、単一のマーカーの発現レベルの比較を含む。しかしながら、複数のマーカーについての発現レベルを比較する場合、比較分析はしばしば２つの分析を含む：１）発現レベルが試験細胞と対照細胞との間で類似するかを試験する各マーカーについての判定、および２）試験されるマーカーのグループからのどのくらい多くのマーカーが類似または異なる発現レベルを示すかの判定。第一の判定は記載したように行われる。第二の判定は、典型的には、試験されるマーカーの少なくとも５０％が発現レベルにおいて類似性を示すかどうかを判定することを含む。しかしながら、よりストリンジェントな相関関係が必要とされる方法においては、マーカーの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％が、試験細胞と対照細胞との間で類似であると考えられる試験されるマーカーのグループの発現レベルについての類似の発現レベルを示さなければならない。
【０１１４】
Ｂ．腫瘍の分類
当該示差発現核酸またはマーカーはいずれもＫＳＰ発現レベルと正の相関関係（表１および３）または負の相関関係（表２および４）にある。ＫＳＰ発現はある種の腫瘍タイプにおいて増加し、他の腫瘍タイプにおいては増加しないので、これらの表に記載されたマーカーをＫＳＰの代理として（または、別法として、ＫＳＰと組み合わせて）用いて腫瘍を種々の一般的なクラスまたはタイプに分類することができる。一例としては、本明細書で提供される結果は、腫瘍を３つの異なるカテゴリーに分類するために、この同定されたマーカーを利用することができるということを示している。異なる腫瘍タイプは異なる治療法に潜在的に応答するので、この方法での腫瘍の分類は重要である。そこで、分類は、適当な治療オプションについてのガイダンスを医療専門家に提供することができる。
【０１１５】
これらの分類方法は、一般に、対象体からの腫瘍細胞（例えば、癌細胞）からの試料を得ることを含む。次いで、１個またはそれ以上の示差発現核酸についての発現レベルを測定する。次に、これらの発現レベルを、腫瘍状態（すなわち、存在または非存在）がわかっている対照細胞における発現のレベル（ベースライン）と比較する。対照に対する発現レベルの類似性または差異を用いて、試験試料を、特定のクラスの腫瘍に属するかまたは一のクラスから排除されるか分類することができる。そこで、例えば、いくつかの方法では、発現レベルは、既知の癌または腫瘍を表す対照細胞またはベースラインに対して比較される。試験細胞と対照細胞との間の発現レベルまたは発現プロフィールの類似性は、試験細胞が対照と同一のクラスまたはタイプ内の腫瘍または癌からのものであることを示している。しかしながら、発現レベルまたはプロフィールの差異は、試験細胞が対照とは異なるタイプの腫瘍または癌からのものであることを示している。
【０１１６】
この一般的な方法の利用性の一の特定の例は、腫瘍または癌組織がＫＳＰ阻害物質による治療に反応性であると考えられるかどうかを判定することを含む。上記したように、ＫＳＰ阻害物質は望ましくない副作用に対してより感受性が低いので、それらは興味のある化学療法剤である。本明細書において同定されるマーカーはＫＳＰと正または負の相関関係にあるので、それらを用いて、特定の腫瘍または癌組織が高レベルのＫＳＰを発現するものであるかどうかを判定することができ、かくして、それがＫＳＰ阻害物質による治療のための良好な候補であるかどうかを判定することができる。該方法は、分類方法に類似している。１個またはそれ以上の示差発現核酸についての発現レベルを腫瘍または癌組織から採取された組織について測定する。次いで、これらの発現レベルを、ＫＳＰレベルが増加する腫瘍または癌組織について同核酸についての発現レベルと比較するか、および／または正常な組織からの発現レベルに対して比較する。上記したように、「正常な組織」は、通常、試験試料を採取するものと同一のタイプの組織からの組織である。典型的には、腫瘍を含まない組織（例えば、非癌組織）からのものでもある。該比較が、ＫＳＰ発現が増加する癌組織における発現レベルに対して行われる場合、発現レベルの類似性は、試験組織がＫＳＰ阻害物質に対して応答性であると予想されることを示している。代わりに発現レベルを正常な組織と比較すると、試験組織は、１）ＫＳＰ発現と正の相関関係にある１個またはそれ以上のこれらの核酸（例えば、表１および３を参照）の発現レベルが増加する場合、および／または２）ＫＳＰ発現と負の相関関係にある１個またはそれ以上のこれらの核酸（例えば、表２および４を参照）の発現レベルが減少する場合、ＫＳＰ治療に対して応答すると考えられる。
【０１１７】
他の関連する分類方法は、表１または３に記載されている１個またはそれ以上の細胞周期遺伝子の発現レベルが増加するか、および／または表２または４からの１個またはそれ以上のシグナル伝達遺伝子の発現レベルを減少させるかを腫瘍試料について判定することを含む。そのような場合、腫瘍試料は、１個またはそれ以上の細胞周期遺伝子の阻害および／または１個またはそれ以上のシグナル伝達遺伝子の活性化を引き起こす治療計画に反応性であると考えられるものとして分類される。
【０１１８】
Ｃ．診断方法
対象体の組織におけるある種の腫瘍または癌の存在または非存在を判定する方法もまた提供される。かかる方法は、まず腫瘍にかかっているかまたは腫瘍が発病し易い対象体からの試験試料を得ることを含む。次いで、１個またはそれ以上の核酸マーカーの発現レベルを該試料について測定する。試験細胞の集団は、主要な腫瘍を含むことができる（例えば、該試料は腫瘍を含む組織である）か、または主要な腫瘍が広まった細胞（例えば、血液またはリンパ液）を含むことができる。
【０１１９】
次いで、発現レベルを、対照細胞集団における同マーカーの発現レベルと比較する。癌の存在または非存在に関する対照細胞集団の状態はわかっている（例えば、対照細胞集団は正常な組織、癌性の組織またはかかる組織の組み合わせからのものである）。そこで、例えば、対照細胞集団が正常組織を表す場合、試験細胞集団と対照細胞集団との間の発現レベルまたは発現プロフィールの類似性は、試験細胞集団が腫瘍または癌性細胞を含まないことを示している。対照的に、発現レベルまたは発現プロフィールの差異は、試験細胞が腫瘍を含むかまたは癌性であることを示している。
【０１２０】
代わりに対照細胞集団が腫瘍または癌をもつ組織を表す場合、発現レベルまたは発現プロフィールの類似性は、試験細胞集団が腫瘍を含むかまたは癌性であることを意味する。別法として、発現レベルまたは発現プロフィールの差異は、試験細胞集団が癌性ではないかまたは腫瘍を含まないことを示している。
【０１２１】
Ｄ．候補化学療法剤についてのスクリーニング
提供される示差発現核酸は、ある種の腫瘍または癌の治療に有用な候補薬剤を同定するためのスクリーニング方法に用いることができる。これらの方法は、一般に、候補薬剤が非癌性状態と一致する方向に１個またはそれ以上のマーカーについての発現レベルを変更するかを判定することを含む。かくして、いくつかの方法は、試験薬剤が癌性状態を表す発現プロフィールを、非癌性状態を表す発現プロフィールに変えるかを判定することを含む。
【０１２２】
該方法は、まず１種類またはそれ以上の薬剤を試験細胞集団と接触させることを含む。次いで、試験細胞集団における１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現レベルを測定する。次に、試験細胞における発現レベルを、治療剤と接触していない対照細胞集団における同核酸についての発現レベルと比較する。試験細胞集団および対照細胞集団のどちらの細胞も典型的には、できる限り互いにほぼ同一であるように選択される。このように、試験集団と対照集団との間の発現レベルの差異は、主に、試験集団は候補薬剤と接触したが、対照集団は接触しなかったということを反映している。
【０１２３】
対照細胞集団が正常細胞または癌性細胞だけまたはその混合物を含むかに関係なく、比較における主な研究は、１）腫瘍細胞においてアップレギュレートされる１個またはそれ以上の核酸についての発現レベルの減少があるかどうか、および２）腫瘍細胞においてダウンレギュレートされる１個またはそれ以上の核酸についての発現レベルの増加があるかどうかである。潜在的な化学療法価を有する候補薬剤は、癌性細胞においてアップレギュレートされる１個またはそれ以上の核酸の発現を減少させるか、および／または癌性細胞においてダウンレギュレートされる１個またはそれ以上の核酸の発現を増加させるものである。
【０１２４】
いくつかの方法は、任意に、試験細胞集団および対照細胞集団と癌性状態を誘発する発癌物質とを接触させることを含む。
【０１２５】
候補薬剤はいずれもの多くの様々なタイプであり得る。候補薬剤の例としては、天然物ライブリーからのもの、合成ライブラリーからのものおよびランダムなライブラリーからのものが挙げられる。しばしば、候補薬剤は小分子化合物（例えば、＜１０００ダルトン、または＜５００ダルトンの分子量を有する化合物）である。例えば、複素環式化合物、尿素に基づく誘導体、β−ラクタム類、オリゴ−Ｎ−置換グリシン類、およびポリカルバメート類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の候補薬剤は、アンチセンス核酸、リボザイム、または二本鎖ＲＮＡ（上記を参照）である。いったん候補薬剤が化学療法剤としての潜在的な有効性を示したら、腫瘍増殖の予防におけるその効力を評価するためにさらに試験することができる。かかる分析は、化学療法剤の毒性および臨床有効性を評価するための慣用方法を利用して行うことができる。
【０１２６】
Ｅ．潜在的な発癌物質の同定方法およびリスク評価方法
提供される示差発現核酸はまた、潜在的な発癌物質を同定するよう設計されたスクリーニング方法において有用である。一般的に、これらの方法は、試験薬剤が癌性状態について観察される発現レベルと一致するように１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現（またはこれらの核酸の発現プロフィール）を変えるかどうかを判定することを含む。
【０１２７】
試験薬剤をまず試験細胞集団（典型的には、正常細胞の集団）と接触させる。試験薬剤が癌性状態を誘発する活性を有する場合に該癌性状態を誘発することができるように十分に長い時間、該試験薬剤を試験細胞集団と接触させたままにすることができる。該試験細胞集団は、示差発現核酸を発現する能力を有するように選択される。次いで、示差発現核酸の発現レベルを測定し、典型的には試験薬剤と接触していない対照細胞集団における同核酸の発現レベルと比較する。試験細胞集団および対照細胞集団のどちらの細胞も通常できる限り互いにほぼ同一である。このように、試験集団と対照集団との間の発現レベルの差異は、主に、試験集団は試験薬剤と接触したが、対照集団は接触しなかったということを反映している。
【０１２８】
比較は、癌組織においてアップレギュレートされるこれらの示差発現核酸についての発現の増加があるか、および／または癌性遺伝子においてダウンレギュレートされるこれらの示差発現遺伝子についての発現の減少があるかを判定することを含む。潜在的に発癌性である試験薬剤は、癌組織においてアップレギュレートされる１個またはそれ以上の核酸の試験細胞における発現の増加を引き起こすか、および／または癌組織においてダウンレギュレートされる１個またはそれ以上の核酸の試験細胞における発現の減少をもたらす。
【０１２９】
試験薬剤が長い暴露の後または暴露の後のどこかの時点で腫瘍または癌の形成を誘発するかを評価するために、上記方法を、試料が様々な時点で試験細胞集団から採取されるように任意に拡大することができる。かくして、ある種の方法は、試験薬剤と接触する前、接触している間、または接触した後の試験集団からの複数の試料採取を含む。採取された各試料について、参照細胞集団との比較を一般に上記したように行う。
【０１３０】
これらのスクリーニング方法は、潜在的に発癌性であると考えられる本質的にいずれもの化合物についても行うことができる。そこで、例えば、該方法を用いて、潜在的な医薬、ならびに溶媒、食品添加物、化粧成分、クレンザー、保存剤、家庭用製品、染料、個人用衛生製品、農薬（pesticides）、除草剤および殺虫剤（insecticides）などを包含するがこれらに限定されるものではない種々の非医薬的化合物を評価することができる。
【０１３１】
Ｆ．標的核酸と相互作用する化合物についてのスクリーニングアッセイ
癌性細胞において調節される核酸は、例えば、以下のものを含むいくつかのカテゴリーの１つに分類され得る：１）調節が腫瘍または癌形成を導く遺伝子；２）調節が腫瘍または癌形成に対して保護効果を引き起こす遺伝子；または３）癌または腫瘍を示しているものであるが、原因因子または細胞の保護応答として直接関与するものではない遺伝子。
【０１３２】
標的核酸または遺伝子およびそれらのそれぞれの標的遺伝子産物は、癌または腫瘍形成に影響を及ぼすことが示されるこれらの遺伝子および産物であり、かくして、単に腫瘍または癌性状態のマーカーではない。種々のアッセイは、標的遺伝子産物と結合するか、標的遺伝子産物と相互作用する他の細胞タンパク質または細胞外タンパク質と結合するか、または標的遺伝子産物と他の細胞タンパク質または細胞外タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するように設計することができる。例えば、場合によっては標的遺伝子産物の発現レベルを低下させ、標的遺伝子発現および／または標的遺伝子産物のこの全体的にみて低いレベルは腫瘍または癌形成を引き起こす。このような場合、スクリーンは、標的遺伝子または標的遺伝子産物と相互作用して標的遺伝子の発現または標的遺伝子産物の活性を増大させる化合物を同定するように開発することができる。そのようにすることにおいて、かかる化合物は、標的遺伝子産物活性のレベルを有効に増大させ、それにより、癌または腫瘍形成の可能性を低下させる。
【０１３３】
他の場合、標的遺伝子のアップレギュレーションは、後に腫瘍または癌形成を引き起こす標的遺伝子産物の増加を引き起こす。この場合、スクリーンは、標的遺伝子または遺伝子産物と相互作用して標的遺伝子または遺伝子産物の活性を低下させる化合物を同定するように設計される。かかる化合物は、腫瘍または癌が形成されるリスクを改善するための治療に利用することができる。標的遺伝子のアップレギュレーションが保護効果を発揮する標的遺伝子産物を生じるという反対の状況もまた存在する。このような場合のスクリーンの目的は、このようにアップレギュレートした遺伝子の発現またはそれらの遺伝子産物の活性を増強して腫瘍または癌形成の機会を減少させる化合物を同定することである。
【０１３４】
標的遺伝子の発現が組織を癌性にするかもしれない暴露とは関係なく人工的に調節される適当な実験によって標的遺伝子自体を同定することができる。例えば、アップレギュレーションが保護効果を発揮する遺伝子は、クローン化され、試験細胞にトランスフェクトされ、高レベルで発現されると、細胞が発癌物質で攻撃される場合の腫瘍形成の可能性を低下させる。同様に、ダウンレギュレーションがポジティブな効果を発揮するこれらの標的遺伝子について、該遺伝子の欠失は、腫瘍または癌形成についてのリスクを減少させることができる。このようにして、発現が腫瘍または癌形成を引き起こす標的遺伝子の過剰発現は組織が腫瘍を形成するかまたは癌性になる可能性を悪化させることができ、一方、かかる遺伝子の欠失はかかる反応についての可能性を低下させることができる。
【０１３５】
１．標的遺伝子産物と結合する能力を有する化合物についてのアッセイ
標的遺伝子または遺伝子産物と結合する化合物を同定するための種々の方法を開発することができる。ある種のアッセイでは、標的遺伝子によってコードされるタンパク質と試験化合物とを、この２つの成分を相互作用させて反応混合物において単離および／または検出することができる複合体を形成するのに十分な時間、適当な条件下にて接触させる。かかる結合アッセイを行うために当業者に知られている種々の異なるフォーマットを利用することができる。
【０１３６】
例えば、標的遺伝子タンパク質または試験化合物を固相に付着させ、次いで、他の成分を加えて試験化合物／標的遺伝子タンパク質複合体を形成させる。複合体を固体支持体に固定化させたままの条件下で、典型的には洗浄により、未結合成分を除去する。複合体の検出は、様々な方法で行うことができる。非固定化成分を標識する場合、複合体は、該支持体上にて固定化された標識を同定することによって簡単に検出することができる。非固定化成分が複合体形成前に標識されなかった場合、複合体は間接法を用いて検出することができる。例えば、最初に固定化されなかった成分に対して結合特異性をもつ標識抗体を加えて、最初に固定化されなかった成分との複合体を形成することができる（別法として、非標識抗体を加え、非標識抗体に対して結合特異性を有する標識抗体を加えて標識複合体を形成することができる）。
【０１３７】
結合アッセイはまた溶液中にて行うことができ、ここで、試験化合物および標識遺伝子タンパク質が複合体を形成し、次いで、該複合体を非複合化成分から分離することができる。一のかかるアプローチは、標的遺伝子産物（または頻繁ではないが試験化合物）に対して特異的な抗体を固定化すること、次に、複合体を支持体に固定化することを含む。固定化された成分の１つを標識することにより複合体を検出することができる。
【０１３８】
２．標的遺伝子産物と他の成分との間の相互作用を妨害する化合物についてのアッセイ
それらのインビボ効果を発揮するにおいて、標的タンパク質は、１つまたはそれ以上の細胞タンパク質または細胞外タンパク質と相互作用して複合体を形成することができる。かかる複合体におけるタンパク質を結合パートナーという。かかるパートナー間の相互作用を中断させる能力を有する化合物は、標的遺伝子タンパク質の活性を調節するのに有用であり得る。
【０１３９】
多くのアッセイは、結合パートナー間の相互作用を中断するために行うことができる。一のアプローチは、試験化合物の存在下および非存在下のどちらでも標的遺伝子産物とその結合パートナーとを接触させることを含む。該試験化合物は、結合パートナーと接触する時点で含むことができるか、または、結合パートナーを一緒に混合した後のどこかの時点で加えることができる。平行な対照実験は、試験化合物が対照混合物に含まれないか、またはパートナーの結合に影響を及ぼさないことが知られている対照化合物が混合物に含まれることを除いて同一条件下にて行われる。次いで、パートナー間の複合体の形成が検出される。試験混合物中ではなく対照反応混合物中の複合体の形成は、試験化合物が結合パートナー間の相互作用を妨害することを示している。かかるアッセイは、結合メンバーの一を固体支持体に固定化する不均一アッセイにおいて、または上記セクションにおいて記載した方法と同様の方法を用いて液相中にて全ての成分を互いに接触させる均一アッセイにおいて行うことができる。
【０１４０】
VII．治療的処置方法
腫瘍および癌を治療するための様々な方法も提供される。これらの方法は、一般に、腫瘍にかかっている対象体または腫瘍を発病し易い対象体に、適当な方法で１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現を調節する治療剤を投与することを含む。治療的方法および予防的方法のどちらも提供される。治療的方法では、医薬組成物は、腫瘍または癌の１つまたはそれ以上の症状を軽減するのに十分な量で腫瘍または癌にかかっているかまたはかかっていると思われる対象体に投与される。場合によっては、該組成物は、腫瘍を取り除くかまたは癌を寛解に向かわせるのに十分な量で投与される。予防的方法では、医薬組成物は、腫瘍または癌の発病を軽減するかまたは抑えるのに十分な量で腫瘍または癌を発病し易いかまたは発病する恐れのある対象体に投与される。該処置は単一用量で投与することができるが、より一般的には、何回か投与される。
【０１４１】
表１および３に記載されている核酸は、発現がある種の腫瘍においてアップレギュレートされるものであるので、いくつかの方法は、一般に、１個またはそれ以上のこれらの核酸の発現のレベルを低下させる薬剤を対象体に投与すること、および／またはそれらがコードするタンパク質の活性を阻害することを含む。この目的を達成するために、当該技術分野で知られている多くの公知方法を利用することができる。一のアプローチは、転写または翻訳のいずれかのレベルでアップレギュレートされた遺伝子の発現を阻害する薬剤（例えば、核酸）を投与することである。かかる薬剤の例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、三本鎖ヘリックス構造および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、特に低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）が挙げられる。これらの薬剤は、以下にさらに詳細に記載する。別法として、アップレギュレートされる遺伝子によりコードされるタンパク質の活性をアンタゴナイズする化合物もまた利用することができる。例としては、コードされたタンパク質と特異的に結合する抗体が挙げられる。他のアンタゴニストは小分子である。
【０１４２】
他の処置方法は、ある種の腫瘍または癌組織においてダウンレギュレートされる表２または４に記載されている１個またはそれ以上の核酸の発現を活性化する薬剤を投与することを含む。このアプローチに関して、該薬剤は、ダウンレギュレートされた核酸の発現のレベルを増加させるのに十分な量でそれに十分な時間投与される。種々の薬剤をこの目的のために用いることができる。一のオプションは、ダウンレギュレートされた遺伝子産物をコードする核酸を投与することである。この核酸は、腫瘍または癌組織におけるその発現を容易にするための適当な発現対照要素と作動可能に結合される。別のオプションは、ダウンレギュレートされた核酸またはその活性フラグメントによりコードされるタンパク質を直接投与することである。さらに別のオプションは、ダウンレギュレートされた遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を増加させるアゴニストを投与することである。
【０１４３】
他の処置プログラムは、２つの上記アプローチの組み合わせを含む。かくして、かかる方法は、１個またはそれ以上のアップレギュレートされた遺伝子の発現を阻害する１個またはそれ以上の薬剤および１個またはそれ以上のダウンレギュレートされた遺伝子発現を促進する薬剤を対象体に投与することを含む。
【０１４４】
アプローチに関係なく、投与は、全身または局所（例えば、腫瘍または癌組織に近位）であり得る。また、医薬組成物の投与に関しては以下に記載する。
【０１４５】
かかる方法の一例として、表１または３に記載されている１個またはそれ以上の遺伝子がアップレギュレートされるか、および／または表２または４からの１個またはそれ以上の遺伝子がダウンレギュレートされる腫瘍にかかっている対象体に、背景のセクションに記載したようなＫＳＰ阻害物質を投与することができる。というのは、これらの遺伝子はそれぞれＫＳＰ発現と正または負の相関関係にあるからである。
【０１４６】
同様に、分析が、腫瘍を上記したカテゴリー１（すなわち、高い分裂指数をもつもの）に分類することを示す場合、細胞周期遺伝子（例えば、表１を参照）の発現またはそれがコードするタンパク質の活性を阻害する化合物を投与することができる。別法として、または、合わせて、シグナル伝達遺伝子（例えば、表２を参照）の発現を活性化する化合物を投与することができる。
【０１４７】
代わりに分析が、対象体がカテゴリー２に分類される腫瘍にかかっていることを示す場合、場合によっては、細胞周期遺伝子（例えば、表１を参照）の発現を活性化するか、および／またはシグナル伝達遺伝子（例えば、表２を参照）の発現を阻害する治療剤の投与を含む。
【０１４８】
カテゴリー３の腫瘍は、場合によっては、１個またはそれ以上の細胞周期遺伝子およびシグナル伝達遺伝子を阻害する治療剤（複数も可）を投与することにより治療することができる。
【０１４９】
本明細書で提供される方法および組成物は、多くの様々な腫瘍および癌を治療するために利用することができる。治療され得る癌の例としては、心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原生癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポージ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖管：腎臓（腺癌、ヴィルムス腫瘍（腎芽腫）、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、睾丸（セミノーム、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、乾湿細胞癌、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：ヘパトーム（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺癌、血管腫；骨：骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外骨腫症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫類骨骨腫、および巨細胞腫瘍；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状腫、髄芽腫、グリオーム、上衣細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュヴァン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、グリオーム、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌）、頸（子宮頸癌、前腫瘍性子宮頸部形成異常）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、ムチン性嚢胞腺癌、未分類の癌］、顆粒膜−卵胞膜腫、セルトーリ−ライディヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（横紋筋肉腫］、ファローピウス管（癌）；血液：血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、脊髄形成異常症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；皮膚：悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポージ肉腫、色素性母斑異形成性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および副腎：神経芽腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１５０】
肺、卵巣および乳房のようなＫＳＰレベルが増大する腫瘍の治療に特に有用なある種の方法
【０１５１】
VIII．標的遺伝子の合成または活性を阻害または増強するための化合物
Ａ．活性または合成阻害
上記したように、ある種の標的遺伝子は、腫瘍または癌形成を引き起こすことができるかまたはかかる腫瘍または癌に伴う結果をいっそう悪くする。かかる標的遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成または活性を阻害するための種々の方法を用いて、かかる標的遺伝子およびそれらの産物の発現または活性の増大に抗することができる。
【０１５２】
例えば、アンチセンス、リボザイム、三本鎖ヘリックス分子および抗体を用いてかかる標的遺伝子および遺伝子産物のネガティブな効果を改善することができる。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡとハイブリダイズしてタンパク質翻訳を遮断することによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように直接作用する。故に、アンチセンス分子に対して有用な標的は翻訳開始領域である。
【０１５３】
リボザイムは、特異的配列とハイブリダイズし、次いで、特異的なヌクレオチド鎖切断反応を行う酵素的ＲＮＡ分子である。かくして、有効な使用のためには、リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的である配列、および切断反応を行うために必要な配列を含む（例えば、米国特許第5,093,246号を参照）。
【０１５４】
三本鎖ヘリックス形成を促進して転写を阻害するために用いられる核酸は、一本鎖であり、ジデオキシリボヌクレオチドからなる。かかるポリヌクレオチドの基本組成は、Hoogsteen塩基対則を介して三本鎖ヘリックス形成を促進するように設計され、典型的には、二本鎖の片方の鎖にてピリミジンまたはプリンのいずれかの有意なひと続きの配列を必要とする。
【０１５５】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）阻害方法はまた、１個またはそれ以上の示差発現核酸の発現を阻害するために用いることができる。かかる方法で用いられるＲＮＡは、少なくともｄｓＲＮＡの領域が示差発現核酸（例えば、標的遺伝子）の領域と実質的に同一であるように設計される；場合によっては、該領域は、標的と１００％同一である。哺乳動物において用いるためには、ｄｓＲＮＡは、典型的には約１９〜３０ヌクレオチド長である（すなわち、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が用いられる）。ｄｓＲＮＡｉおよびｓｉＲＮＡを行うために有用な方法および組成は、例えば、ＰＣＴ国際公開WO 98/53083；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/44914；WO 01/36646；WO 01/75164；WO 02/44321；および公開された米国特許出願01/195,034に記載されている（それぞれ、全ての目的のために出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。
【０１５６】
遺伝子タンパク質の活性を妨害する標的遺伝子タンパク質に対する結合特異性を有する抗体もまた遺伝子タンパク質活性を阻害するために用いることができる。かかる抗体は、以下に記載する方法に従って全長タンパク質またはそのフラグメントから作成することができる。
【０１５７】
Ｂ．活性増強
腫瘍または癌形成は、ある種の標的遺伝子の過小発現によって、および／または標的遺伝子産物の活性の低下によって悪化させることができる。別法として、ある種の標的遺伝子産物のアップレギュレーションは有益な効果を生じることができる。これらのシナリオのいずれにおいても、かかる標的遺伝子およびタンパク質の発現、合成または活性を増大させることが有用である。
【０１５８】
これらの目的は、例えば、標的遺伝子産物のレベルまたは活性な遺伝子産物の濃度を増加させることによって達成することができる。一のアプローチにおいて、以下に記載するような医薬組成物の形態の標的遺伝子タンパク質を腫瘍または癌にかかっている対象体に投与する。別法として、標的遺伝子タンパク質をコードするＤＮＡ配列を腫瘍または癌を治療するかまたは腫瘍形成のリスクを減少させるのに十分な濃度で患者に投与することができる。遺伝子療法は、別のオプションであり、種々のベクターを用いて、正常な標的遺伝子の１つまたはそれ以上のコピー、または機能的標的タンパク質を生産する能力を有するそのフラグメントを細胞に挿入することを含む。適当なベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターが挙げられる。場合によっては、リポソームおよびＤＮＡを細胞に導入する能力を有する他の粒子を用いることもできる。次いで、正常な標的遺伝子を発現する細胞、典型的には自家細胞を患者に導入または再導入して腫瘍または癌を治療することができる。
【０１５９】
Ｘ．抗体
示差発現核酸またはそのフラグメントから発現されたポリペプチドと免疫反応性がある抗体もまた提供される。該抗体は、異なるエピトープ特異性を有するポリクローナル抗体、別個のモノクローナル抗体またはプールされたモノクローナル抗体であり得る。
【０１６０】
Ａ．抗体の生産
該抗体は、免疫性抗原として示差発現遺伝子または標的遺伝子によりコードされるタンパク質からの抗原決定基を含有する無傷のポリペプチドまたはフラグメントを用いて調製することができる。動物を免疫化するために使用されるポリペプチドは、天然源からのものであるか、または、翻訳されたｃＤＮＡに由来するか、または、化学合成により調製され得る。場合によっては、該ポリペプチドは担体タンパク質と結合する。一般的に用いられる担体としては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および破傷風毒素が挙げられる。次いで、結合したペプチドを用いて動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫化する。宿主の種に依存して種々のアジュバントを用いて免疫応答を増強することができ、該アジュバントとしては、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールおよび担体タンパク質のような界面活性剤、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）のようなヒトアジュバントが挙げられる。
【０１６１】
モノクローナル抗体は、例えば、KohlerおよびMilstein（Nature, 256:495-497, (1975)）；および米国特許第4,376,110号（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）のハイブリドーマ技術によりタンパク質の抗原含有フラグメントから調製することができる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988)（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）も参照。該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそのいずれものサブクラスを包含するいずれものイムノグロブリンクラスのものであり得る。
【０１６２】
例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983)）（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を含むヒトモノクローナル抗体の作成のための技術はまた記載されている；レビューのためには、Larrick et al., 
米国特許第5,001,065号（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）もまた参照。別のアプローチは、組換えＤＮＡ技術により非ヒト抗体の相補性決定領域またはＣＤＲ領域（例えば、Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S.Dept. of Health and Human Services, (1987)；およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）をヒト定常部と結合することによるヒト化抗体の作成である。Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)およびWO 90/07861（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を参照。別法として、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)により記載されている一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、次いで、所望の特異性をもつ抗体（または結合フラグメント）をコードする配列をクローニングおよび増幅させることによりヒトモノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。Huseにより記載されているプロトコールは、ファージディスプレイ技術と合わせてより有効にされる。例えば、Dower et al., WO 91/17271およびMcCafferty et al., WO 92/01047（出典明示により本明細書の記載とする）を参照。ファージディスプレイ技術はまた、本発明のペプチドに対して親和性を有することが予め示される抗体のＣＤＲ領域を変異誘発するために用いることができる。改良された結合親和性をもつ抗体が選択される。
【０１６３】
適当な抗原特異性をもつマウス抗体分子から遺伝子を適当な抗原特異性をもつヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産のために開発された技術を使用することができる。キメラ抗体は、ネズミモノクローナル抗体に由来する可変部およびヒトイムノグロブリン定常部を有するもののような、様々な部分が種々の種に由来する分子である。本発明の示差発現遺伝子産物に対して特異的な一本鎖抗体は確立された方法に従って生産することができる（例えば、米国特許第4,946,778号；Bird, Science 242:423-426 (1988)；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)；およびWard et al., Nature 334:544-546 (1989)（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を参照）。一本鎖抗体は、アミノ酸橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを結合して、一本鎖ポリペプチドを生じることにより形成される。
【０１６４】
抗体は、さらに、抗体を産生させるポリペプチドまたはペプチドと結合する支持体と結合し、該支持体から溶離することにより精製することができる。当該技術分野で知られている種々の他の技術もまた、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を精製するために用いることができる（例えば、Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, (1994)（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を参照）。
【０１６５】
エピトープを模倣するモノクローナル抗体を生産するために抗イディオタイプ技術を用いることができる場合もある。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して作成された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体により結合されるエピトープの「イメージ」である超可変部における結合ドメインを有するであろう。
【０１６６】
Ｂ．抗体の使用
提供される抗体は、例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするのに、および構造的に関連する免疫交差反応性タンパク質をコードするｃＤＮＡインサートを含有するクローンを同定するために有用である。例えば、Aruffo & Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1977)（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を参照。抗体はまた、抗体を作成するために用いられた天然ポリペプチドまたはそのフラグメントと構造的に関連する免疫交差反応性タンパク質を同定および／または精製するのにも有用である。また、該抗体を用いて抗体アレイを形成し、示差発現核酸により発現されるタンパク質を検出することができる。
【０１６７】
該抗体はまた、標的およびフィンガープリント遺伝子産物のような示差発現遺伝子の検出において使用することもできる。かくして、該抗体を使用して、例えば、特異的細胞、組織または血清におけるかかる遺伝子産物を検出することができ、該抗体は診断アッセイにおける利用性を有する。競合結合アッセイ、直接または間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイを包含するがこれらに限定されるものではない種々の診断アッセイを用いることができる（例えば、Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp.147-158を参照）。診断アッセイにおいて用いる場合、該抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。該標識は、検出可能なシグナルを直接または間接的に生産する能力を有するいずれもの分子であり得る。適当な標識としては、例えば、放射性同位体（例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセインおよびローダミン染料およびその誘導体）、クロモフォア、化学発光分子、酵素基質（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素を包含する）が挙げられる。抗体はまた抗体アレイの開発に使用することもできる。
【０１６８】
上記のとおり、抗体は、示差発現核酸の発現産物を阻害するのに有用であり、ある種の標的遺伝子産物（例えば、腫瘍または癌形成を引き起こすかまたは悪化させるとして同定された標的遺伝子産物）の作用を阻害するのに役立つ。故に、該抗体はまた、種々の治療用途における利用性を見出す。
【０１６９】
XI．医薬組成物
標的遺伝子産物のような示差発現遺伝子産物の活性を阻害するかまたは増強する種々のスクリーニング法の間に同定される化合物は、治療に用いるための医薬組成物に製剤化することができる。例えば、腫瘍形成に関連する標的遺伝子産物（例えば、抗体、アンチセンス配列、リボザイム、三本鎖ヘリックス分子）を阻害する化合物を医薬組成物の調製に用いることができる。別法として、ポジティブな効果を発揮する標的遺伝子産物の濃度または活性を増強するスクリーニングの間に同定される化合物を医薬組成物に配合することができる。
Ａ．組成物
癌および腫瘍の治療に用いられる医薬組成物は、本明細書に記載したような阻害または活性増強化合物のような活性成分、および任意には、種々の他の成分を含む。
【０１７０】
かくして、例えば、該組成物はまた、所望の製剤に依存して、動物またはヒト投与のための医薬組成物を処方するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される医薬上許容される非毒性担体または希釈剤を含むことができる。該希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。かかる希釈剤の例は、蒸留水、緩衝化水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。加えて、該医薬組成物または製剤は、他の担体、補助剤、または非毒性、非治療性、非免疫原性の安定化剤および賦形剤などを含むことができる。該組成物はまた、ｐＨ調製および緩衝化剤、毒性調節剤、湿潤剤および界面活性剤などのようなおおよその生理学的条件に追加される物質を含むこともできる。
【０１７１】
該組成物はまた、例えば、抗酸化剤のような種々の安定化剤のいずれも含むことができる。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、該ポリペプチドは、該ポリペプチドのインビボ安定性を増強するか、または、その薬理学的性質を増強する（例えば、該ポリペプチドの半減期を増大させる、その毒性を減少させる、溶解性または取り込みを増強する）種々の周知の化合物と複合体を形成することができる。かかる変更または複合体形成剤の例としては、スルフェート、グルコナート、シトラートおよびホスファートなどの生成が挙げられる。該組成物のポリペプチドはまた、それらのインビボ特性を増強する分子と複合体を形成することもできる。かかる分子としては、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質が挙げられる。
【０１７２】
また、種々のタイプの投与に適当な製剤に関するガイダンスは、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)において見出すことができる。薬物送達のための方法の簡単なレビューについては、Langer, Science 249:1527-1533 (1990)を参照。
【０１７３】
Ｂ．用量
医薬組成物は、予防的処置および／または治療的処置のために投与することができる。該医薬組成物における活性成分は、典型的には、腫瘍形成を遅らせるかまたは逆転するのに、腫瘍を除くのに、または腫瘍もしくは癌に関連する症状を取り除くのに十分な量である治療量で存在する。活性成分の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ50（集団の５０％における治療上有効な用量）を測定することを含む、細胞培養および／または実験動物において標準的な製薬手順に従って測定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療係数であり、比ＬＤ50／ＥＤ50と表すことができる。大きい治療係数を示す化合物が好ましい。
【０１７４】
細胞培養および／または動物実験から得られるデータは、ヒトに対する一連の投薬を処方するのに使用することができる。活性成分の用量は、典型的には、ほとんど毒性をもたないＥＤ50を含む一連の循環濃度の範囲内である。該用量は、用いられる投与剤形および用いられる投与経路に依存してこの範囲内で変化することができる。
【０１７５】
予防的用途において、提供される化合物を含む組成物は、腫瘍形成し易いまたは腫瘍形成の恐れのある患者に投与される。かかる量は、「予防的に有効な」量または投与量であると定義される。この使用において、正確な量は、患者の健康状態および体重に依存する。典型的には、該投与量は、体重１ｋｇにつき精製タンパク質約１〜５００ｍｇの範囲であり、より一般的には約５〜１００ｍｇ／ｋｇの用量が用いられる。
【０１７６】
Ｃ．投与
該活性成分は、単独でまたは他の適当な成分と組み合わせて、吸入により投与するためのエアゾール製剤（すなわち、それらは「噴霧」することができる）に調製することができる。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素のような加圧された許容される噴射剤中におくことができる。
【０１７７】
直腸投与のための適当な製剤としては、例えば、包装された活性成分および坐剤基剤からなる坐剤が挙げられる。適当な坐剤基剤としては、天然または合成トリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が挙げられる。加えて、包装された核酸、および、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコールおよびパラフィン炭化水素を含む基剤の組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを用いることもできる。
【０１７８】
例えば、関節内経路（関節における）、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路および皮下経路によるような非経口投与に適当な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性および非水性の等張性滅菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含むことができる水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈注射による投与、経口投与、局所投与、腹腔内投与、膀胱内投与またはクモ膜下腔内投与することができる。注射用製剤は、保存剤を添加した、単位投与剤形で、例えば、アンプルにて、または反復投与容器にて提供され得る。該組成物は、無菌の実質的に等張性のものとして、米国食品医薬品局の優良医薬品製造基準（ＧＭＰ）規制を完全に遵守して処方することができる。
【０１７９】
XII．遺伝子発現変化を同定するための方法
Ａ．核酸検出
遺伝子発現変化は、例えば、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ、プローブアレイ法、定量逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、ノーザン分析、消去式ハイブリダイゼーション（subtractive hybridization）、ＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮＧTM、ＲＮａｓｅ保護、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、およびインサイツアッセイを包含する当該技術分野で知られている種々の方法により核酸レベルでモニターすることができる。ほとんどの方法は、試料からのＲＮＡ（典型的には、ｍＲＮＡ）の単離、次いで、目的遺伝子の発現のレベルの測定を用いて始まる。
【０１８０】
１．ｍＲＮＡ単離
遺伝子の転写物レベルの測定（またはそれによる発現レベルの測定）を行うために、遺伝子または遺伝子フラグメントのｍＲＮＡ転写物を含む核酸試料、またはｍＲＮＡ転写物に由来する核酸が得られる。ｍＲＮＡ転写物に由来する核酸は、ｍＲＮＡ転写物またはその結果物が最終的に合成のための鋳型として役立った核酸をいう。かくして、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅したＤＮＡから転写されるＲＮＡは、全て、該ｍＲＮＡ転写物に由来し、このように誘導された生産物の検出は、試料におけるオリジナル転写物の存在および／または存在量を示している。かくして、適当な試料としては、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、該ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、該ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、該遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅したＤＮＡから転写されるＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１８１】
いくつかの方法では、核酸試料は、生物学的試料から単離される全ｍＲＮＡである；他の場合には、核酸試料は、生物学的試料からの全ＲＮＡである。本明細書で用いる場合、「生物学的試料」または単なる「試料」なる用語は、細胞、生物学的組織および液体のような、生物から、または生物の成分から得られる試料をいう。いくつかの方法においては、該試料はヒト患者からのものである。かかる試料としては、痰、血液、血球（例えば、白血球）、組織または穿刺生検試料、尿、腹腔内液、および胸腔内液、またはそれらからの細胞が挙げられる。生物学的試料はまた、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を包含することもできる。しばしば、比較のために２つの試料が準備される。該試料は、例えば、異なる細胞または組織タイブからのもの、異なる固体からのもの、または２つの異なる処置をした同一のオリジナル試料からのもの（例えば、薬物処置および対照）であり得る。
【０１８２】
ｍＲＮＡの単離に対して選択されないいずれものＲＮＡ単離技術は、かかるＲＮＡ試料の精製のために用いることができる。例えば、核酸の単離および精製の方法は、WO 97/10365、WO 97/17317、Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P. Tijssen, ed.) Elsevier, N.Y. (1993)；Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part 1. Theory and Nucleic Acid Preparation, (P. Tijssen, ed.) Elsevier, N.Y. (1993)；およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (1989)；Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel, F.M. et al., eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York (1987-1993)に詳細に記載されている。例えば、米国特許第4,843,155号に記載されているChomczynski, P.の一段ＲＮＡ単離法を含む当該技術分野で知られている技術を用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１８３】
２．ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ
ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（ＤＤ ＰＣＲ）は、異なるセットの条件下で示差発現された遺伝子を同定するために有用な一の方法である。ＤＤ ＰＣＲは、ｍＲＮＡのポリＡテールとハイブリダイズするプライマーおよび任意のプライマーからなるプライマー対を用いて試料内に含まれるｍＲＮＡの種々のセグメントを増幅する十分に確立されたＰＣＲ技術の変形法を用いる（例えば、米国特許第4,683,202号および第4,683,195号を参照）。得られた増幅産物を配列決定ゲル上で分離する。試験試料および対照試料についての得られた分離ゲル上のバンドの比較は、示差発現遺伝子の同定を可能にする。示差発現されるバンドを切り取り、示差発現遺伝子の同一性を判定するために分析することができる。
【０１８４】
ＤＤ−ＰＣＲは、遺伝子配列の前知識を必要としない点で示差遺伝子発現検出のある種の他の方法よりも利点がある。また、該ＰＣＲ条件は相対的に低いストリンジェンシー条件下にて行われて、各プライマーの３'末端の５〜６塩基が潜在的な鋳型と適合する必要があるだけであるので、十分な数のプライマーを用いてほとんどの発現遺伝子を検出することができる。
【０１８５】
ＤＤ ＰＣＲの使用に関するさらなるガイダンスは、例えば、米国特許第5,262,311号；第5,599,672号；およびLiang, P. and Pardee, A.B., Science 257:967-971 (1992)；Liang, P., et al., Methods of Enzymol. 254:304-321 (1995)；Liang, P. et al., Nucl. Acids Res. 22:5763-5764 (1994)；Liang, P. and Pardee, A.B., Curr. Opin. in Immunology 7:274-280 (1995)；およびReeves, S.A., et al., BioTechniques 18:18-20 (1995)（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）を含む多くの情報源において見出すことができる。
【０１８６】
３．プローブアレイ
アレイに基づく発現モニターリングは、示差遺伝子発現を検出するための別の有用なアプローチである。このアプローチを用いて高処理分析を行うことができる。示差遺伝子発現分析において用いられる該アレイは、検出しようとする遺伝子および／または遺伝子フラグメントが実験に先だって知られているかどうかに部分的に依存して種々の異なるタイプのものであり得る。例えば、いくつかのアレイは、短いポリヌクレオチドプローブを含み、一方、他のアレイは、全長ｃＤＮＡを含む。該プローブの性質に関係なく、該プローブは典型的にはあるタイプの支持体と結合する。
【０１８７】
プローブアレイ法において、いったん試験試料から核酸が得られると、それらは典型的には標識ｃＤＮＡに逆転写されるが、標識ｍＲＮＡは直接使用することができる。次いで、標識核酸を含む試験試料を該アレイのプローブと接触させる。標的が該プローブとハイブリダイズする期間の後、該アレイを典型的には１回またはそれ以上の高ストリンジェンシー洗浄に付して未結合標的を除去し、該アレイの核酸プローブとの非特異的結合を最少にする。標的核酸の結合、かくして、試料における発現遺伝子の検出は、種々の商業的に入手可能なスキャナーおよび付属のソフトウェアプログラムを用いて検出される。
【０１８８】
発現アレイを用いるための一般的な方法はWO 97/10365、PCR/US96/143839およびWO 97/27317（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）に記載されている。発現分析におけるマイクロアレイの使用に関するさらなる考察は、例えば、Duggan, et al., Nature Genetics Supplement 21:10-14 (1999)；Bowtell, Nature Genetics Supplement 21:25-32 (1999)；Brown and Botstein, Nature Genetics Supplement 21:33-37 (1999)；Cole et al., Nature Genetics Supplement 21:38-41 (1999)；Debouck and Goodfellow, Nature Genetics Supplement 21:48-50 (1999)；Bassett, Jr., et al., Nature Genetics Supplement 21:51-55 (1999)；およびChakravarti, Nature Genetics Supplement 21:56-60 (1999)（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）において見出すことができる。
【０１８９】
本発明のアレイにおいて用いられる該プローブとしては、例えば、比較的短い長さ（例えば、２０量体または２５量体）の合成プローブ、ｃＤＮＡ（遺伝子の全長またはそのフラグメント）、増幅ＤＮＡ、ＤＮＡのフラグメント（例えば、制限酵素により作成される）および逆転写ＤＮＡを挙げることができる。異なるタイプのマイクロアレイについてのレビューについては、例えば、Southern et al., Nature Genetics Supplement 21:5-9 (1999)（出典明示により本明細書の記載とする）を参照。
【０１９０】
対照試料および標的試料を上記した１つまたはそれ以上のプローブセットを含むアレイとハイブリダイズし、任意に洗浄して未結合および非特異的結合プローブを除去した後、各試料についてのハイブリダイゼーション強度を該アレイにおける各プローブについて測定する。蛍光標識について、ハイブリダイゼーション強度は、例えば、光子計数モードでの走査型共焦点顕微鏡により測定することができる。適当な走査型装置は、例えば、Trulson et al.の米国特許第5,578,832号、およびStern et al.の米国特許第5,631,734号（どちらも出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）により記載されており、Affymetrix, Inc.からＧｅｎｅＣｈｉｐTM標識の下に入手可能である。いくつかのタイプの標識は、酵素法（Broude, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 3072-3076 (1994)を参照）により増幅され得るシグナルを提供する。例えば、放射性同位体、クロモフォア、磁気粒子および高電子密度粒子を含む種々の他の標識もまた適当である。
【０１９１】
標識の位置は、米国特許第5,143,854号、WO 90/15070、およびTrulson et al.の米国特許第5,578,832号（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）により記載されているようなリーダーを用いてアレイにおける各プローブについて検出することができる。次いで、カスタマイズされたアレイに関してハイブリダイゼーションパターンを分析して、例えば、WO 97/10365に記載されているように分析される試料における公知のｍＲＮＡ種の存在および／または相対的な量または絶対的な量を測定することができる。２つの試料の発現パターンの比較は２つの試料の間で示差発現されるｍＲＮＡおよびそれらの対応する遺伝子を同定するために有用である。
【０１９２】
多数の遺伝子についての発現レベルの定量モニタリングは、遺伝子機能を解明すること、腫瘍に関連するメカニズムを探究することにおいて、ならびに潜在的な治療的および診断的標的および方法の発見のために役立つことができる。
【０１９３】
４．定量ＲＴ−ＰＣＲ
種々の、いわゆる「リアルタイム増幅」法または「リアルタイム定量ＰＣＲ」法を用いて、増幅工程の間に形成される増幅産物の量を測定することにより試料中に存在するｍＲＮＡの量を測定することもできる。フルオロジェニックヌクレアーゼアッセイは、本発明の方法と一緒に成功裏に用いることができるリアルタイム定量法の一の特定の例である（実施例２を参照）。増幅産物の形成をモニターするこの方法の基礎は、二重標識フルオロジェニックオリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することである。該アプローチはしばしば文献において簡単に「ＴａｑＭａｎ」法と記される。
【０１９４】
かかるアッセイにおいて用いられるプローブは、典型的には、２つの異なる蛍光染料で標識される短い（約２０〜２５塩基）ポリヌクレオチドである。該プローブの５'末端は、典型的には、リポーター染料と結合しており、３'末端はクエンチング染料と結合しているが、該染料は、同様にプローブ上の他の位置で結合することができる。該プローブは、プローブ結合部位との少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計される。この座のフランキング領域と結合する上流および下流ＰＣＲプライマーを該反応混合物に加えることもできる。
【０１９５】
該プローブが無傷である場合、２つのフルオロフォアの間のエネルギー伝達が生じ、クエンチャーは該リポーターからの発光をクエンチする。ＰＣＲの伸長期の間、該プローブをＴａｑポリメラーゼのような核酸ポリメラーゼの５'ヌクレアーゼ活性により切断し、それにより、ポリヌクレオチド−クエンチャーから該リポーターを放出し、適当な検出器により測定することができるリポーター発光強度の増強を引き起こす。
【０１９６】
フルオロジェニックアッセイの間に生じるもののような蛍光発光を測定するのに特に適している一の検出器は、カリフォルニア州フォスターシティのApplied Biosystems, Inc.により製造されたＡＢＩ ７７００である。該装置と共に提供されるコンピューターソフトウェアは、増幅の過程にわたってリポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録することができる。次いで、これらの記録された値を用いて、連続的に規準化リポーター発光強度の増加を算出し、最終的に増幅されているｍＲＮＡの量を定量することができる。
【０１９７】
増幅産物の濃度のリアルタイム測定を行うためのフルオロジェニック方法の理論および操作に関するさらなる詳細は、例えば、Gelfandの米国特許第5,210,015号、Livakの米国特許第5,538,848号、およびHaalandの米国特許第5,863,736号、ならびにHeid, C.A., et al., Genome Ressearch, 6:986-994 (1996)；Gibson, U.E.M, et al., Genome Research 6:995-1001 (1996)；Holland, P.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, (1991)；およびLivak, K.J., et al., PCR Methods and Applications 357-362 (1995)（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）に記載されている。
【０１９８】
５．ドットブロットアッセイ
示差遺伝子発現を検出するための別のオプションは、支持体上で示差発現されることが知られている核酸を含む溶液のスポッティングを含む。スポッティングは、例えば、Cartesian Technologies, Inc.により製造されるＢＩＯＤＯＴ装置のような装置を用いて再現性を増加させるためにロボットにより行うことができる。該核酸は典型的には当該技術分野で知られているＵＶ架橋結合法を用いて支持体と結合する。目的のｍＲＮＡ試料から調製した標識ｃＤＮＡクローンを処理して、自己アニール化または異なるクローン間でのアニール化を取り除き、次いで、支持体と結合した核酸と接触させ、十分な時間、支持体上で核酸とハイブリダイズさせる。支持体を洗浄してハイブリダイズしていないクローンを除去する。ハイブリダイズ複合体の形成は、例えば、燐光物質スクリーンを暴露すること、および、次にホスホイメージャー（例えば、Molecular Dynamicsから入手可能であるもの）を用いて走査することを含む種々の公知の技術を用いて検出することができる。腫瘍からの試験細胞および正常な組織からの対照細胞から得られたｍＲＮＡを用いてこの方法を繰り返して、示差発現される遺伝子を同定することができる。実施例１にさらに記載するように、かかる方法を本発明に用いて、ＤＤ ＰＣＲにより得られた結果を確認した。かかる方法についてのさらなるガイダンスについては、例えば、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)を参照。
【０１９９】
６．サブトラクティブハイブリダイゼーション
このアプローチは、典型的には、２つの異なる供給源（例えば、腫瘍からの試験細胞および正常な組織からの対照細胞）からのｍＲＮＡを単離することを含む。該供給源の１つからの単離したｍＲＮＡを典型的には逆転写して標識ｃＤＮＡを形成する。得られた一本鎖を、第２の密接に関連している細胞からの大過剰のｍＲＮＡとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、標準的な技術を用いてｃＤＮＡ：ｍＲＮＡハイブリッドを除去する。次いで、残存する「サブトラクトされた」標識ｃＤＮＡを用いて同細胞集団のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーンし、潜在的に示差発現されるこれらの遺伝子を同定することができる。例えば、Sargent, T.D., Meth. Enzymol. 152-423-432 (1987)；およびLee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2825-2830 (1991)を参照。
【０２００】
７．インサイツハイブリダイゼーション
このアプローチは、標識プローブと１個またはそれ以上の目的の示差発現遺伝子とのインサイツハイブリダイゼーションを含む。該方法はインサイツで行われるので、細胞からＲＮＡを調製する必要がないという利点を有する。該方法は、初めに試験細胞を支持体（例えば、マイクロタイターウェルの壁）に固定すること、次いで、該細胞を適当な透過処理溶液で透過処理することを含む。次いで、該標識プローブを含む溶液を細胞と接触させ、該プローブを相補的示差発現遺伝子とハイブリダイズさせる。過剰なプローブを消化し、洗浄し、ハイブリダイズしたプローブの量を測定する。例えば、Harris, D.W., Anal. Biochem. 243:249-256 (1996)；Singer et al., Biotechniques 4:230-250 (1986)；Haase et al., Methods in Virology, vol. VII, pp. 189-226 (1984)；およびNucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (Hames, et al., Eds.), (1987) を参照（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。
【０２０１】
８．ディファレンシャルスクリーニング
この技法は、ライブラリーの１つのコピーを１つの細胞タイプのｍＲＮＡ集団に相当する全細胞ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーンするｃＤＮＡライブラリーの二重スクリーニングを含む。このｃＤＮＡライブラリーの複製コピーを、第２の細胞タイプのｍＲＮＡ集団に相当する全ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングする。例えば、１つのｃＤＮＡプローブは対照対象体から得た細胞の全細胞ｃＤＮＡプローブに相当する。第２のｃＤＮＡプローブは腫瘍にかかっている対象体から得られた同細胞タイプの全細胞ｃＤＮＡプローブに相当する。１つのプローブとハイブリダイズするが他のプローブとはハイブリダイズしないクローンは示差発現遺伝子に由来するクローンを潜在的に表す。かかる方法は、例えば、Tedder, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:208-212 (1988)により記載されている。
【０２０２】
９．他の種々の方法
いくつかの最近開発された方法を用いて示差発現遺伝子を検出することもできる。これらの方法としては、ＧＥＮＥＣＡＬＬＩＮＧTM法（例えば、米国特許第5,871,697号；およびShimikets et al., Nature Biotechnology 17:798-803 (1999)を参照、それぞれ出典明示により本明細書の記載とする）および遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）法（例えば、米国特許第5,866,330号；Velculescu et al. (1995) Science 270:484-487；およびZhang et al. (1997) Science 276:1268-1272、それぞれ出典明示により本明細書の記載とする）が挙げられる。
【０２０３】
Ｂ．タンパク質検出
示差発現核酸によりコードされるタンパク質が試料中に存在するレベルを検出することにより発現レベルを測定することができる。試料中のタンパク質を検出するための多くの方法が当該技術分野において知られており、例えば、ウェスタンブロットおよび免疫組織化学的染色が挙げられる。免疫組織化学的染色法は、典型的には、まず、組織試料を脱水することおよび固定することを含む。次いで、該試料を、示差発現核酸によりコードされるタンパク質と特異的に結合する標識抗体で標識する。定義のセクションに記載したいずれものタイプの抗体を用いることができる。適当な抗体を調製するための方法は上記にて記載されている。該標識は、直接、抗体、または第１の抗体と結合する第２の抗体に付着させることができる。該タンパク質の発現のレベルは、例えば、染色強度を対照と比較することまたは標識された細胞を計数することによるものである。
【０２０４】
XIII．示差発現核酸検出装置
Ａ．カスタマイズされたプローブアレイ
１．標的核酸に関するプローブ
提供される示差発現核酸を用いて、スクリーニングおよび診断用途において使用するためのカスタムプローブアレイを調製することができる。一般に、かかるアレイは、示差発現核酸についてのセクションにおいて上記したもののようなプローブを含み、かくして、全長示差発現核酸と相補的なプローブ（例えば、ｃＤＮＡアレイ）および典型的には１０〜３０ヌクレオチド長の短いプローブ（例えば、合成アレイ）を含む。典型的には、該アレイは、複数の本発明の示差発現核酸を検出する能力を有するプローブを含む。例えば、かかるアレイは、一般に、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の示差発現核酸を検出するためのプローブを含む。より完全な分析のためには、該アレイは、少なくとも１２、１４、１６、１８または２０個の示差発現核酸を検出するためのプローブを含むことができる。他の場合、該アレイは、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５個または全ての、本明細書にて同定される示差発現核酸を検出するためのプローブを含む。
【０２０５】
２．対照プローブ
（ａ）規準化対照
規準化対照プローブは、典型的には、核酸試料に添加される１個またはそれ以上の標識参照ポリヌクレオチドと完全に相補的である。ハイブリダイゼーション後に該規準化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件、標識強度、読み取りおよび分析効率、ならびに完全なハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変えさせることができる他の因子のバリエーションについての対照を提供する。全ての他のプローブから読み取られるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば、蛍光強度）により分割することができ、それにより、測定値を規準化することができる。
【０２０６】
実質的には、いずれものプローブは規準化対照として役立つことができる。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成およびプローブ長を用いて変えることができる。規準化プローブは、アレイ中に存在する他のプローブの平均長さを反映するように選択することができるが、しかしながら、それらはまた一連の長さをカバーするように選択することもできる。規準化対照はまた、アレイにおける他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選択することもできる。規準化プローブは、アレイにおけるいずれもの位置に、またはアレイの全体にわたる複数の位置に局在化することができて、ハイブリダイゼーションにおいて空間的バリエーションについて効率的に調節することができる。
【０２０７】
（ｂ）ミスマッチ対照
ミスマッチ対照プローブもまた提供することができる；かかるプローブは発現レベル対照または規準化についての対照として機能する。ミスマッチ対照プローブは典型的には、公知のｍＲＮＡ種とマッチするプローブを含有するカスタマイズされたアレイにおいて用いられる。例えば、ある種のアレイは、各マッチプローブに対応するミスマッチプローブを含む。該ミスマッチプローブは、少なくとも１カ所のミスマッチを除いてその対応するマッチプローブと同一である。ミスマッチ塩基は、該プローブが特異的にハイブリダイズすることができる標的配列における対応する塩基に対して相補的ではないように選択される塩基である。適当なハイブリダイゼーション条件（例えば、ストリンジェント条件）下にて試験プローブまたは対照プローブがその標的配列とハイブリダイズすると予想できるが、該ミスマッチプローブがハイブリダイズすることができない（または有意に低い程度にしかハイブリダイズすることができない）ように１つまたはそれ以上のミスマッチが選択される。ミスマッチプローブはある種のミスマッチを含むことができる。かくして、例えば、プローブが２０量体である場合、対応するミスマッチプローブは、６から１４までのいずれかの位置での単一の塩基ミスマッチ（例えば、Ａの代わりにＧ、ＣまたはＴを用いる）（中央ミスマッチ）を除いて同一の配列をもつことができる。
【０２０８】
（ｃ）試料調製、増幅、および定量対照
アレイはまた試料調製／増幅対照プローブを含むこともできる。かかるプローブは、通常、アッセイされる特定の生物学的試料の核酸において生じないので、選択される対照遺伝子のサブシーケンスに対して相補的であり得る。適当な試料調製／増幅対照プローブは、例えば、問題の試料が真核生物からの生物学的試料である場合に細菌遺伝子（例えば、Ｂｉｏ Ｂ）に対するプローブを含むことができる。
【０２０９】
次いで、該ＲＮＡ試料は、プロセシング前に試料調製／増幅対照プローブが相補的である既知の量の核酸を用いてスパイクすることができる。試料調製／増幅対照プローブのハイブリダイゼーションの定量化はプロセシング工程により引き起こされる数多くの核酸の変化の尺度を提供する。定量化対照も同様である。典型的には、かかる対照は、ハイブリダイゼーション前に対照核酸を既知の量で同核酸と組み合わせることを含む。それらは、定量参照を提供するのに有用であり、ハイブリダイゼーション量（濃度）を定量化するための標準曲線の判定を可能にする。
【０２１０】
３．アレイ合成
本発明において用いるための核酸アレイは２つの一般的な方法で調製することができる。一のアプローチは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーからのＤＮＡを例えばガラスのようなあるタイプの固体支持体と結合させることを含む。（例えば、Meier-Ewart, et al., Nature 361:375-376 (1993)；Nguyen, C. et al., Genomics 29:207-216 (1995)；Zhao, N. et al., Gene, 158:207-213 (1995)；Takahashi, N. et al., Gene 164:219-227 (1995)；Schena, et al., Science 270:467-470 (1995)；Southern et al., Nature Genetics Supplement 21:5-9 (1999)；およびCheung, et al., Nature Genetics Supplement 21:15-19 (1999)を参照（それぞれ全ての目的のために出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。
【０２１１】
第二の一般的なアプローチは核酸プローブの合成を含む。一の方法は、標準的な自動技術に従う該プローブの合成、次いで、該プローブの支持体への合成後結合を含む。例えば、Beaucage, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 (1981)およびNeedham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)を参照（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。第二の幅広いカテゴリーは、いわゆる「空間特異的（spatially directed）」ポリヌクレオチド合成アプローチである。このカテゴリーに分類される方法はまた、光特異的ポリヌクレオチド合成、マイクロ印刷技術、インクジェットによる適用、特異的な位置へのマイクロチャネルデポジションおよび物理的バリヤーによる隔離現象を含むが、これらは例示的であり、限定されるものではない。
【０２１２】
核酸プローブを調製するための光特異的コンビナトリアル法は、米国特許第5,143,854号、第5,424,186号および第5,744,305号；国際公開番号WO 90/15070および92/10092；EP 476,014；Fodor et al., Science 251:767-777 (1991)；Fodor, et al., Nature 364:555-556 (1993)；およびLipshutz, et al., Nature Genetics Supplement 21:20-24 (1999)（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）に記載されている。これらの方法は、高密度のポリヌクレオチドプローブである小型化アレイの合成に向ける光の使用を必要とする。合成サイクルの数を減少させるためのマスクの設計についてのアルゴリズムは、Hubbel et al.の米国特許第5,571,639号および米国特許第5,593,839号によって、ならびにFodor et al., Science 251:767-777 (1991)に記載されている（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。
【０２１３】
本発明に用いるためのアレイを調製するために用いることができる他のコンビナトリアル法は、インクジェットプリンターを用いて支持体上に試薬をスポットすることを含む。Pease et al.のEP 728,520、およびBlanchard, et al. Biosensors and Bioelectronics II:687-690 (1996)を参照（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。アレイはまた、機械的に拘束されている流路またはマイクロチャネルを用いて支持体のセルにモノマーを送達することによりコンビナトリアル・ケミストリーを用いて合成することもできる。Winkler et al.のEP 624,059；WO 93/09668；および米国特許第5,885,837号を参照（それぞれ出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。
【０２１４】
４．アレイ支持体
支持体は、複数のプローブを支持する能力を有しており、ストリンジェンシー洗浄溶液と適合する多くの物質のいずれかから製造することができる。適当な物質の例としては、例えば、ガラス、シリカ、プラスチック、ナイロンまたはニトロセルロースが挙げられる。支持体は、一般に硬く、平面を有する。支持体は、典型的には、１〜１０,０００,０００個の別々の空間的にアドレスできる領域またはセルを有する。１０〜１,０００,０００個または１００〜１００,０００個または１０００〜１００,０００個の領域を有する支持体が一般的である。セルの密度は典型的には１ｃｍ2内に少なくとも１０００個、１０,０００個、１００,０００個または１,０００,０００個の領域である。各セルは少なくとも１個のプローブを含んでおり、しばしば、種々のセルが複数のプローブを含む。一般的には、各セルは単一のタイプのプローブを少なくとも合成方法により得ることができる純度に含有するが、他の場合、いくつかのまたは全てのセルが異なるタイプのプローブを含む。アレイ設計の記載は、WO 95/11995、EP 717,113およびWO 97/29212に記載されている（出典明示によりその全体として本明細書の記載とする）。
【０２１５】
XIII．キット
本発明のスクリーニングおよび診断方法を行うことが必要とされるキットもまた提供される。いくつかのキットは、典型的には、提供される種々の示差発現核酸とストリンジェント条件下でハイブリダイズする複数のプローブを含む。他のキットは、複数の異なるプライマー対を含み、各対は、異なる示差発現核酸の増幅を有効に刺激するように選択される。キットが定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて用いるためのプローブを含む場合、該プローブは必要なドナーおよびアクセプター染料で標識することができるか、またはこれらは、標識プローブを調製するのに用いるための別々の成分としてキット中に含むことができる。
【０２１６】
該キットはまた、種々のポリメラーゼ（例えば、ＲＴおよびＴａｑ）のような増幅反応を行うための酵素、ならびにデオキシヌクレオチドおよびバッファーを含むことができる。１個またはそれ以上の本発明の示差発現核酸を発現する能力を有する細胞もまたある種のキットに含むことができる。
【０２１７】
典型的には、キットの異なる成分は別々の容器中にて貯蔵される。分析を行うための成分の使用説明書もまた一般的に含まれる。
【０２１８】
以下の実施例は提供される方法および装置のある種の態様を例示するためのものである；これらの実施例は本発明を制限しようとするものではない。
【０２１９】
実施例１
示差発現遺伝子の同定
Ａ．種々の組織におけるＫＳＰ発現の分析
病理学的に「正常な」ヒト組織および病気にかかっているヒト組織の遺伝子発現プロフィールのコレクションを含むＧｅｎｅ Ｌｏｇｉｃデータベースを用いて、比較的高いレベルのＫＳＰを発現する正常な器官を同定した。データベース内の組織の大部分は悪性腫瘍および周囲の正常組織（正常なプロフィールとして用いた）に由来しており、各組織についての詳細な臨床歴も含んでいる。
【０２２０】
図１は、「正常な」組織のパネル全体のＫＳＰの発現を示す。これらの結果は、ＫＳＰ発現が遍在性ではないことを示す。胸腺および骨髄のような増殖性組織において最も高いレベルのＫＳＰ発現が見られ、結腸、十二指腸、食道、胃および小腸のような消化管の器官中において中程度の発現が見られる。比較的高いレベルの細胞増殖を受ける組織においてＫＳＰが比較的高いレベルで発現されるという発見は、有糸分裂におけるＫＳＰの役割と一致する。
【０２２１】
Ｂ．腫瘍および正常な組織におけるＫＳＰ発現
次に、該データベースに問い合わせて、周囲の「正常な」組織に関して過剰にＫＳＰを発現する腫瘍を同定した。ＫＳＰを過剰発現する腫瘍を評価した後、正常な組織発現に関してＫＳＰの増加した発現を示すのは一の特定の腫瘍タイプではないことが観察された。図２に示すように、腫瘍におけるＫＳＰ発現の傾向は一般に正常な組織よりも高いが、ＫＳＰの「正常な」発現を示すいくつかの腫瘍がある。故に、腫瘍は、本質的に、ＫＳＰ発現に基づいて２つのカテゴリーに分けることができる：ＫＳＰの「正常な」発現を示すものおよび正常な組織発現に関してＫＳＰの「高い」発現を示すもの（すなわち、ＫＳＰ発現がヌップレギュレートされる腫瘍）。
【０２２２】
Ｃ．ＫＳＰ発現と正および負の相関関係にある遺伝子の同定
遺伝子発現の差異がこれらの２つのクラスの腫瘍の間で生物学的差異の説明となり得るかどうかを判定するために、主成分分析法（ＰＣＡ）および階層的なクラスタリングのような無監督の学習技術、ならびに部分最小二乗法−判別分析法（ＰＬＳ−ＤＡ）のような監督された学習技術を用いて遺伝子発現データの多変量解析を行った。
【０２２３】
１．核酸プローブアレイ
AffymetrixからのヒトＵ１３３チップセット（チップＡおよびＢ）は、既知の遺伝子の全てを構築する約４４０００遺伝子プローブおよび未知の機能の多数のＥＳＴ（発現配列Ｔａｇ）配列を表す。これらは、所定の試料内の多数の転写体を表すｃＲＮＡプローブと結合するインサイツ合成オリゴヌクレオチドアレイである。ＭＡＳ５.０ソフトウェアを用いて規準化し、複数のチップ全体のデータを分析する。Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉｃデータベースは、各チップについての予め規準化された強度を含む。
【０２２４】
２．データセットフィルターリング
分析前に、乳房の悪性組織および乳房の正常組織内の全ての試料を、３'：５'比を評価することによりＲＮＡ質についてチェックした。３の比率の推奨カットオフを用いて、低いＲＮＡ質をもった試料を除去した。病理学的に「正常な」試料は悪性腫瘍の周囲の「正常な」組織から単離されるので、第二の品質管理工程を実行して悪性組織とクラスター形成すると考えられる「正常な」試料の遺伝子発現プロフィールを除去した。これは、正常というよりも悪性組織のように思われるように遺伝子発現データを変更する汚染悪性組織に起因する。主成分分析法（ＰＣＡ）は７４個の「正常な」乳房組織および４００個の悪性乳房組織全体の４４,０００個の遺伝子全てからｌｏｇ(１０)形質転換強度に適用して、悪性組織とクラスター形成する異常値を同定した。主成分分析法は、遺伝子発現データにおける可変性を用いて、データセット内の発現の最も有意なテーマまたはパターンを同定する分解技術である。最も豊富な可変性は、データの一次変換により誘導される固有ベクトルである第一および第二主成分として表示される。最も大きい固有値の固有ベクトルが第一の主成分において表される。ＰＣＡおよびデータの図による可視化は、ＳＩＭＣＡ−Ｐ ９.０（Umetrix、スウェーデン）を用いて行った。ＰＣＡを用いて、合計５１個の「正常な」組織を「正常」な遺伝子発現を表すものとして選択した。
【０２２５】
３．データ解析
７０の強度カットオフを用いて（図２を参照）、浸潤性乳癌を、ＫＳＰの「正常な」発現を示した腫瘍の発現プロフィールを含んでいたクラス１およびＫＳＰの「高い」発現を示した腫瘍の発現プロフィールを含んでいたクラス２の２つのクラスに分けた。
【０２２６】
４４,０００個のプローブ全てを用いるこれらの腫瘍試料のＰＣＡは、これらの腫瘍が３つのクラスに分かれることを示しており、これらの腫瘍を進行させてしまう明瞭に異なる基本的な生物学的プロセスがあることを示唆している。監督された学習アルゴリズムである部分最小二乗法−判別分析法（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いてこの分類に最も有意に関与する遺伝子を同定した。ＰＬＳ−ＤＡは、この場合、定性的変数が作られ（２つのクラス）、アルゴリズムが定量的変数（遺伝子発現データ）を用いてどのような主要な変数が主観的なクラスの間にあるかを判定するように要求されるので監督された学習法と呼ばれる。これは、事前の知識を用いずに分類してしまうＰＣＡとは異なる。ＳＩＭＣＡ−Ｐ ９.０を用いてＰＬＳ−ＤＡを行い、結果を可視化した。データを対数変換し、ユニット・バリアンス（Unit Variance）（標準偏差分の１として計算した重み）にスケーリングした。ＰＬＳ−ＤＡを用いて、分類への寄与の重要さに基づいて４４,０００の各遺伝子に重要度スコアの変数（ＶＩＰ）を与えた。次いで、１６９個の最も有意な遺伝子について階層的なクラスター形成を使用して、２つのクラスの癌の間で異なる別個の遺伝子発現パターンを同定した。
【０２２７】
図３は、２００種類の異なる組織試料についてのこの分析の結果を示す。この図では、２００種類の異なる腫瘍組織試料（個体）がｘ軸に沿って表される。示されているように、該図の左側は、組織試料が正常なレベルのＫＳＰを有した個体についての結果を表しており；右側は、高いＫＳＰレベルをもつ個体についての結果である。示されているように、クラスター分析図は、６つの領域に分けることができる。領域Ａ、ＢおよびＣは、主にシグナル伝達遺伝子である遺伝子（表２を参照）を含むが、表４に挙げられているような他のファミリーからの遺伝子も含んでいる。領域Ｄ、ＥおよびＦは、一般に、細胞周期遺伝子のクラス内に分類される遺伝子（表１を参照）に相当している。アップレギュレートされている遺伝子は黒い点として示されており；一方、ダウンレギュレートされている遺伝子は淡色の点として示されている。
【０２２８】
分かるように、腫瘍は３つの一般的なクラスに分類される。正常なＫＳＰレベルをもつ腫瘍は、シグナル伝達遺伝子の有意なアップレギュレーションを示す（領域Ａ）が、細胞周期遺伝子の有意なダウンレギュレーションを示す（領域Ｄ）。反対に、高いレベルのＫＳＰをもつほとんどの腫瘍は、シグナル伝達遺伝子のダウンレギュレーション（領域Ｂ）および細胞周期遺伝子のアップレギュレーション（領域Ｅ）を示した。しかし、高いＫＳＰレベルを有するものからの第３のグループの腫瘍は、シグナル伝達遺伝子（領域Ｃ）および細胞周期遺伝子（領域Ｆ）の両方のアップレギュレーションを示した。発現がＫＳＰ発現と正の相関関係にあるこれらの遺伝子を表１に記載する；負の相関関係にあるこれらの遺伝子を表２に記載する。
【０２２９】
本明細書に記載した実施例および実施態様は単なる例示目的であり、それを考慮に入れて様々な改変または変更は当業者に示唆されるであろうし、本願の趣旨および範囲ならびに特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであると解される。
【０２３０】
【表１−１】
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【０２３１】
【表１−２】
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【０２３２】
【表１−３】
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【０２３３】
【表１−４】
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【０２３４】
【表２−１】
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【０２３５】
【表２−２】
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【０２３６】
【表２−３】
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【０２３７】
【表３−１】
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【０２３８】
【表３−２】
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【０２３９】
【表４−１】
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【０２４０】
【表４−２】
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【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】図１は正常な組織におけるＫＳＰの発現を示すチャートであり、胸腺および骨髄において高い発現を示しており、回腸、食道、直腸、胃および小腸のような消化管の器官において少しの発現を示している。
【図２】図２は悪性乳房腫瘍（乳房浸潤導管癌）におけるＫＳＰの発現が正常な乳房組織と比べてＫＳＰ発現における広がりを示すことを例示するプロットである。
【図３】図３はクラスター分析の結果を示す。この分析は、乳房腫瘍試料の、細胞周期に付随する遺伝子の比較的高い発現を示すものおよびシグナル伝達の比較的高い発現を示すものへの分離を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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