(57)【要約】本発明は、ヒアルロン酸またはそのカチオン性塩と、アミノ基含有糖質化合物のアミド化することによって得られ、良好な粘弾性特性を有するヒアルロン酸誘導体ゲル、およびその調製方法に関する。特に、本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、熱に対して特有の応答を示し、熱処理により種々の特性を持たせることができる。本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは種々の目的、例えば手術後の癒着防止用ゲル、しわ治療用材料、形成外科用補助材料、関節炎治療用材料、薬物送達システム用媒体等に利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒアルロン酸またはそのカチオン性塩と、アミノ基を含む糖質化合物を混合し、攪拌する工程：
（ｂ）前記ヒアルロン酸またはそのカチオン性塩のカルボキシル基を活性化する工程：および
（ｃ）前記ヒアルロン酸またはそのカチオン性塩の活性化された前記カルボキシル基を、前記糖質化合物のアミノ基と反応させる工程
を含むことを特徴とするヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸のカチオン性塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウムおよびヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムよりなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸またはそのカチオン性塩の最終反応濃度は、０．０５〜５０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項４】
前記ヒアルロン酸またはそのカチオン性塩の平均分子量は、５００，０００〜５，０００，０００であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項５】
前記アミノ基を含む糖質化合物は、キトサン、キトサン誘導体、脱アセチル化ヒアルロン酸および脱アセチル化ヒアルロン酸誘導体よりなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項６】
前記アミノ基を含む糖質化合物の添加量は、アミノ基と、前記ヒアルロン酸のカルボキシル基の比が０．０１：１〜１００：１となる量であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項７】
１種以上のカルボキシル基活性化剤を添加することにより、前記カルボキシル基の活性化を達成することを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項８】
主剤として１−アルキル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ここで、アルキルとは炭素数１〜１０のアルキル基をいう）、１−エチル−３−（３−（トリメチルアンモニオ）プロピル）カルボジイミド（ＥＴＣ）および１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）よりなる群から選択される１種以上の化合物を、また補助剤として１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびスルホＮＨＳよりなる群から選択される１種以上の化合物を添加することにより、前記カルボキシル基の活性化を達成することを特徴とする請求項７に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項９】
主活性化剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であり、補助活性化剤は、ＮＨＳであることを特徴とする請求項８に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項１０】
最終反応濃度が０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＥＤＣを添加することを特徴とする請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項１１】
最終反応濃度が０．１〜２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＮＨＳを添加することを特徴とする請求項９に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項１２】
前記工程（ｃ）で製造された前記ヒアルロン酸誘導体ゲルを、２５〜１３０℃で０．５〜１４４時間熱処理する工程を更に含むことを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸誘導体ゲルの製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法で製造されたヒアルロン酸誘導体ゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体ゲルに関する。より詳細には、本発明は、種々の分子量を有するアミノ基含有糖質化合物を、種々の分子量を有するヒアルロン酸またはそのカチオン性塩と、アミド化反応によりカップリングさせることによって形成されるヒアルロン酸誘導体ゲル、およびそれを調製する方法に関する。本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、アミド化反応の条件および付加的な熱処理に依存して、熱に対する種々の異なる特性を有する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、直鎖状の生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）高分子であり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸が結合した繰り返し単位を含み、眼の硝子体、関節の滑液、雄鶏のとさか等に高濃度で存在する。本明細書において用いる用語「ヒアルロン酸」は、時としてヒアルロン酸およびその任意のカチオン性塩の両者を指す。本明細書において用いるヒアルロン酸のカチオン性塩には、ヒアルロン酸ナトリウムおよびヒアルロン酸カリウムのような無機塩と、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムのような有機塩が含まれ、これらに限定されない。
【０００３】
手術後の癒着防止用フィルムまたはゲル、しわ治療用材料、形成外科用材料、関節炎治療用材料、薬物送達システム用媒体等として用いることを目的としたヒアルロン酸誘導体の開発が、広範囲にわたって行われている。特に、その固有の特性のため、多くの応用分野においてヒアルロン酸誘導体ゲルに対する注目が高まっている。例えば、特許文献１は、種々のカルボジイミドを用いてヒアルロン酸またはその塩のカルボキシル基を修飾し、Ｏ−アシルまたはＮ−アシル尿素としたヒアルロン酸誘導体ゲルを開示している。特許文献２は、２段階からなる架橋反応により得られる架橋多糖ゲルを開示している。特許文献３は、種々の特性を有するゲルの調製方法を開示している。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第５，３５６，８８３号
【特許文献２】米国特許第５，８２７，９３７号
【特許文献３】米国特許第５，３９９，３５１号
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの目的は、アミド化によりヒアルロン酸にアミノ基含有糖質化合物が結合したヒアルロン酸誘導体ゲルを提供することにある。
【０００６】
本発明の他の１つの目的は、反応条件に依存して、熱に対して種々異なる特性を有するヒアルロン酸誘導体ゲルを提供することにある。
【０００７】
本発明の更に他の１つの目的は、熱処理により種々異なる特性を有するヒアルロン酸誘導体ゲルの調製方法を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、種々の分子量を有するヒアルロン酸に、種々の分子量を有するアミノ基含有糖質化合物をアミド化により結合させることにより調製される。これらのヒアルロン酸誘導体ゲルは、優れた粘弾性特性を有するので、多くの用途に適用することができる。特に、本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、熱特異的な応答を示し、熱処理によって種々異なる特性を有するゲルとすることができる。更に本発明は、アミド化反応の条件に依存して調製しうる、熱に対する種々の特性を有する種々のヒアルロン酸誘導体を提供する
【０００９】
加えて、本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、ヒアルロン酸とアミノ基含有糖質化合物の間に共有結合（即ちアミド結合）を有しているので、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるいくつかの条件に抵抗する。これらのゲルは、カルボジイミド化合物を用いて合成される既存のヒアルロン酸誘導体とは大きく異なる特性を有する、新規な生体適合性材料である。
【００１０】
本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルの調製方法は、ヒアルロン酸の溶液と、アミノ基含有糖質化合物の溶液を混合して、両者の間にイオン結合を形成する工程；次いで、前記ヒアルロン酸のカルボキシル基と、前記アミノ基含有糖質化合物のカチオン性アミノ基を、カルボキシル基活性化剤を用いて反応させる工程；および反応物を水または酸溶液で洗浄して、精製物を生じさせ、その後これを分離・乾燥する工程を含む。換言すれば、前記ヒアルロン酸誘導体ゲルは、ヒアルロン酸とアミノ基含有糖質化合物を混合／攪拌する工程；前記ヒアルロン酸のカルボキシル基を活性化する工程；および前記ヒアルロン酸の活性化された前記カルボキシル基を、前記糖質化合物のアミノ基と反応させる工程を含む手順により調製することができる。上記の手順は、反応の進行が容易であり、分離工程が簡単であり、また有害な有機溶媒を用いない点において有利である。
【００１１】
好ましくは、本発明において用いられるヒアルロン酸またはそのカチオン性塩は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウムおよびヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムよりなる群から選択される１種以上である。
【００１２】
好ましくは、ヒアルロン酸の最終反応濃度は、０．０５〜５０ｍｇ／ｍｌである。ある化合物（Ａ）の「最終反応濃度」とは、本明細書において用いられる用語としては、化合物（Ａ）に加え、その他の成分（Ｂ、Ｃ…）をも含有する反応溶液全体における、化合物（Ａ）の濃度を意味する。
【００１３】
好ましくは、前記ヒアルロン酸の平均分子量は、５００，０００〜５，０００，０００である。
【００１４】
前記アミノ基含有糖質化合物は、キトサン、キトサン誘導体、脱アセチル化ヒアルロン酸および脱アセチル化ヒアルロン酸誘導体よりなる群から選択される１種以上である。
【００１５】
前記アミノ基含有糖質化合物の添加量は、好ましくは、アミノ基と、ヒアルロン酸のカルボキシル基の比が０．０１：１〜１００：１（カルボキシル基１モル当量に対するアミノ基のモル当量数）となる量である。
【００１６】
上記したように、活性化剤を用いてカルボキシル基の活性化を誘起することができる。活性化剤は、ヒアルロン酸のカルボキシル基を活性化することができ、且つ水溶性である限り特に限定されないが、好ましくは、主剤としての、１−アルキル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ここで、アルキルとは炭素数１〜１０のアルキル基をいう）、１−エチル−３−（３−（トリメチルアンモニオ）プロピル）カルボジイミド（ＥＴＣ）および１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）よりなる群から選択される１種以上の化合物と、補助剤としての、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）およびスルホＮＨＳよりなる群から選択される１種以上の化合物の混合物である。より好ましくは、活性化剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とＮＨＳの混合物である。
【００１７】
好ましくは、最終反応濃度が０．０１〜２０ｍｇ／ｍｌとなるように主活性化剤を添加する。また好ましくは、最終反応濃度が０．１〜２０ｍｇ／ｍｌとなるように補助活性化剤を添加する。
【００１８】
本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、熱特異的な応答を示す材料であり、従って熱処理により種々の特性を持たせることができる。前記熱処理の温度は、好ましくは２５〜１３０℃、より好ましくは４０〜８０℃である。前記熱処理の継続時間は、好ましくは０．５〜１４４時間である。前記熱処理は、例えば、ゲルを徐々に加熱する、ゲルをある温度まで加熱し、その後特定の時間、その温度に保持する、ゲルを加熱して、その温度を即座に変化させるなど、種々の方法で行うことができる。
【００１９】
本発明に従い、アミド化反応によって得られる生成物は、本発明の属する分野においてよく知られる方法により分離／精製することができる。これらの分離・精製方法には、蒸留（大気圧下または減圧下）、再結晶、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、相分離、溶媒抽出、透析、洗浄等が含まれる。各精製は、各反応の後で行ってもよく、一連の反応の後で行ってもよい。
【００２０】
以降、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はそれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２１】
実施例１：キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルの調製
キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルを調製すべく、ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量５００，０００〜２，５００，０００、ＬＧＣＩ社製）２００ｍｇを含む原料溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）３４ｍｌに、キトサン（平均分子量３００〜１６００、ＥｕｇｅｎＢｉｏ社製）４０ｍｇを含む原料溶液１ｍｌを添加して、キトサンの最終反応濃度が１．０ｍｇ／ｍｌ、ヒアルロン酸ナトリウムの最終反応濃度が５．０ｍｇ／ｍｌである最終溶液を形成し、攪拌した。この混合物に、ＥＤＣ１２５ｍｇを含む原料溶液２．５ｍｌと、ＮＨＳ１５０ｍｇを含む原料溶液２．５ｍｌを添加して、最終反応濃度が各々３．１２５ｍｇ／ｍｌおよび３．７５０ｍｇ／ｍｌとなるようにし、攪拌した。ＥＤＣおよびＮＨＳの添加後、２５℃で３時間反応を行い、高粘弾性のゲルを得た。上記のものとの比較のため、キトサンを添加しないこと以外は上記と同様の方法でもう１種の溶液を調製したが、ゲルは形成されなかった。
【００２２】
実施例２〜５：キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルの調製と、膨潤比の測定
説明の便宜のため、以降、成分の量を最終反応濃度のみで示す。
キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルを提供すべく、ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量２，５００，０００〜５，０００，０００、ＬＧＣＩ社製）（最終反応濃度５．０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液に、キトサン（平均分子量３００〜１６００、ＥｕｇｅｎＢｉｏ社製）を含む溶液を、下記表１に示すいくつかの最終反応濃度となるように添加し、次いで混合物を攪拌した。この混合物に、ＥＤＣ（最終反応濃度０．６２５ｍｇ／ｍｌ）およびＮＨＳ（最終反応濃度０．７５０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、攪拌した。ＥＤＣおよびＮＨＳの添加後、２５℃で１７時間反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度を１Ｍに調整した。反応溶液と同体積のエタノールを添加して、ヒアルロン酸誘導体を沈殿させた。反応溶液から沈殿物を分離し、洗浄・乾燥した。乾燥したヒアルロン酸誘導体に水を添加して、その濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整し、ゲルからなる分散溶液を得た。分散溶液からゲル相の生成物のみを分離し、次いでゲル表面の水をある程度除去して、ゲルの重量（Ｗｗｅｔ）を測定した。重量測定の後、ゲルを１２０℃で４５分加熱して乾燥させ、乾燥ヒアルロン酸誘導体の重量（Ｗｄｒｙ）を測定した。
ヒアルロン酸誘導体ゲルの膨潤比を、下記の式：
膨潤比＝Ｗｗｅｔ／Ｗｄｒｙ
に基づいて計算し、結果を下記表１に示した。
【００２３】
【表１】
2006505633.tif 000002
【００２４】
実施例６〜９：キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルの調製と、複素粘性率の測定
キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルを調製すべく、ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量５００，０００〜２，５００，０００、ＬＧＣＩ社製）（最終反応濃度５．０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液に、キトサン（平均分子量３００〜１６００、ＥｕｇｅｎＢｉｏ社製）（最終反応濃度１．０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液を添加し、次いで混合物を攪拌した。この混合物に、ＥＤＣとＮＨＳを各々下記表２に示すいくつかの最終反応濃度となるように添加した。ＥＤＣおよびＮＨＳの添加後、２５℃で１７時間反応を行った。その後、塩化ナトリウム濃度を１Ｍに調整した。反応溶液と同体積のエタノールを添加して、キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体を沈殿させた。反応溶液から沈殿物を分離し、洗浄・乾燥した。沈殿物に水を添加して、ヒアルロン酸誘導体の濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整した。その結果、下記表２に示す種々の相を有する生成物を得た。
【００２５】
反応終了時における反応混合物の複素粘性率（０．１Ｈｚ、２５℃）を、レオメータ（ＰＡＡＲ  ＰＨＹＳＩＣＡ社製）を用いて測定した。そのようにして得られた値を下記表２に示す。
【００２６】
【表２】
2006505633.tif 000003
【００２７】
実施例１０：脱アセチル化ヒアルロン酸誘導体ゲルの調製
ヒアルロン酸を低または高ｐＨで加熱すると、脱アセチル化が起こり、反応性の高いアミノ基が形成される。脱アセチル化のため、ヒアルロン酸を、０．２Ｎ〜１０ＮのＮａＯＨと２５〜５０℃で１〜３０時間反応させた。その結果、脱アセチル化度１〜４０％の脱アセチル化ヒアルロン酸を得た。脱アセチル化ヒアルロン酸の溶液（最終反応濃度１０ｍｇ／ｍｌ）に、ＥＤＣの溶液（最終反応濃度２．４ｍｇ／ｍｌ）およびＮＨＳの溶液（最終反応濃度２．９ｍｇ／ｍｌ）を添加し、２５℃で３時間反応を行った。生成物を精製してゲルを得た。
【００２８】
実施例１１：脱アセチル化ヒアルロン酸がカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルの調製
脱アセチル化ヒアルロン酸（脱アセチル化度１〜４０％）の溶液と、ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量２，５００，０００〜５，０００，０００）の溶液（各々最終反応濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）を混合し、混合溶液を製造した。この混合溶液に、ＥＤＣ（最終反応濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）およびＮＨＳ（最終反応濃度０．２４ｍｇ／ｍｌ）を添加し、２５℃で３時間反応を行った。反応終了後、反応物を精製・乾燥して脱アセチル化ヒアルロン酸がカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルを得た。
【００２９】
実験例１：キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルの熱的特性の測定（１）
キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲル（実施例５、７および８で得られたもの）の熱的特性を測定すべく、各ゲルのレオロジー測定を、レオメータを用い、温度を２５℃から７５℃まで上昇させて、０．１Ｈｚで行った。結果を下記表３〜５に記載する。
【００３０】
実施例５で得られたヒアルロン酸誘導体ゲルは、約６０℃から始まる急速な粘弾性の上昇を示し、また一般に極めて高い弾性を示した。実施例７で得られたヒアルロン酸誘導体ゲルは、温度が上昇するにつれて粘弾性の低下を示し、また弾性に比して高い粘性を示した。一方、実施例８で得られたヒアルロン酸誘導体ゲルは、２５〜７５℃の範囲においてほとんど粘弾性の変動を示さず、このことは、温度の変化に依存する物理的な構造変化が起こらないことを確証するものである。
【００３１】
【表３】
2006505633.tif 000004
【００３２】
【表４】
2006505633.tif 000005
【００３３】
【表５】
2006505633.tif 000006
【００３４】
実験例２：キトサンがカップリングしたヒアルロン酸誘導体ゲルの熱的特性の測定（２）
実施例２、３および４で得られたヒアルロン酸誘導体分散液を６０℃に３６時間保持して、高粘弾性のゲルを得た。各ゲルの複素粘性率（２５℃、０．０２Ｈｚ）を、レオメータを用いて測定した。結果を下記表６に示す。
【００３５】
【表６】
2006505633.tif 000007
【００３６】
実験例３：種々の熱処理によるヒアルロン酸誘導体ゲルの形成
実施例１〜５および７〜９において製造したヒアルロン酸誘導体を、２５〜１３０℃で０．１〜７２時間熱処理して、以下のレオロジーを有するゲル、ゲル分散液または溶液を得た。
複素粘性率（０．０１〜０．１Ｈｚ）：１００〜２０，０００，０００ｃＰ
貯蔵粘性率（０．０１〜０．１Ｈｚ）：０〜２０，０００Ｐａ
損失粘性率（０．０１〜０．１Ｈｚ）：０〜５０００  Ｐａ
【００３７】
本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなくいくつかの形態をとり得るので、上記の実施例は、特に断らない限り、先行するいかなる記述にも限定されるものではなく、むしろ、添付の特許請求の範囲に定義されたその精神および範囲内において広く解釈されるべきであると理解されるべきものであり、従って、特許請求の範囲内の全ての変更および修飾、またはそのような範囲内の等価物は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
上記したように、ヒアルロン酸と、アミノ基を含む糖質化合物の反応により生じる本発明のヒアルロン酸誘導体ゲルは、その共有結合のため、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における種々の条件に抵抗しうる生体適合性材料である。更に、このヒアルロン酸誘導体ゲルは、簡単な反応と単純な分離工程により、有害な有機溶媒を用いずに製造することができ、また極めて良好な粘弾性特性を有するので、種々の目的、例えば手術後の癒着防止用ゲル、しわ治療用材料、形成外科用材料、関節炎治療用材料、薬物送達システム用媒体等に利用することができる。特に、種々の反応条件を用いて、このヒアルロン酸誘導体ゲルに、熱に対する種々異なる特性を持たせることができる。その上、これらのヒアルロン酸誘導体ゲルは、種々の熱処理により、熱に対する種々の特有の特性を示すゲルの体裁を取らせることができる。
【国際調査報告】
2006505633.tif 000008
2006505633.tif 000009