(57)【要約】【課題】スラウストチトリッドプロチスト類中の上記多不飽和脂肪酸類（ＰＵＦＡｓ）量を高めること。【解決手段】スラウストチトリッドプロチスト類（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ  ｐｒｏｔｉｓｔｓ）中の多不飽和脂肪酸類のレベルを高める方法、さらに詳細には、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２１、ＭＴＣＣ５１２２およびＭＴＣＣ５１２３としてそれぞれ寄託した属シゾチトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびアプラノチトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するスラウストチトリッドプロチストの細胞中において、粘度を高めた培地中でそれらを増殖させることによってドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸のレベルを高め、それによって上記多不飽和脂肪酸類（ＰＵＦＡｓ）を高含量にした細胞をその後、多不飽和脂肪酸類を必要とする動物飼料、ヒト栄養物および栄養強化のためのＰＵＦＡｓ抽出のようなさまざまな有益な適用において良好に利用できるようにする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階：
（ａ）ザ・マイクロバイアルタイプカルチャーコレクション［Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）］、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２１として寄託したシゾチトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属，
またはＴｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２２として寄託したスラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、
またはＴｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２３として寄託したアプラノチトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属
に属するスラウストチトリッドプロチスト（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ  ｐｒｏｔｉｓｔ）を培地中に接種し、それを２５℃〜３０℃で約２日間増殖させること；
（ｂ）このようにして増殖させた培養物を接種物として使用するために得て、それを用いて粘度を高めた培地に接種すること；
（ｃ）２５℃〜３０℃で２〜５日間、段階（ｂ）のスラウストチトリッドプロチスト培養物を増殖させること、および
（ｄ）遠心分離により前記細胞を採取し、この細胞から増大した量のドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸を抽出すること、
を含む、スラウストチトリッドプロチスト（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ  ｐｒｏｔｉｓｔ）中においてドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸レベルを高める方法。
【請求項２】
段階（ａ）において、使用した培地が、０．５重量％〜１．５重量％範囲のペプトン；０．０１重量％〜０．１重量％範囲の酵母抽出物；０．０１重量％〜１．０重量％範囲のグルコース；および約１００ｍｌの海水を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）において、使用した培地が、０．５重量％〜１．５重量％範囲のペプトン；０．０１重量％〜０．１重量％範囲の酵母抽出物；０．０１重量％〜１．０重量％範囲のグルコース；０．５重量％〜１．５重量％範囲のポリビニルピロリドン；および約１００ｍｌの海水を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記培地が、１．５％のペプトン；０．１％の酵母抽出物；１．０％のグルコース；１．０％のポリビニルピロリドンおよび１００ｍｌの海水を含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、１．５％のペプトンを含む請求項２または３記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、０．１％の酵母抽出物を含む請求項２または３記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、１．０％のグルコースを含む請求項２または３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スラウストチトリッドプロチスト類中の多不飽和脂肪酸類レベルを高める方法に関する。さらに詳細には、本発明は、多不飽和脂肪酸類であるドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸を、属スラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ），シゾチトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）およびアプラノチトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属するスラウストチトリッドプロチスト細胞中において、粘度を高めた培地中でそれを増殖させることによって高める方法に関する。したがって、前記多不飽和脂肪酸類（ＰＵＦＡｓ）高含量の細胞類をその後、多不飽和脂肪酸類を必要とする動物飼料、ヒト栄養および栄養強化用ＰＵＦＡｓ抽出のようなさまざまな有益な用途において、ＰＵＦＡｓを高含量としていない細胞よりもより良好に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術および関連技術参考文献類
脂肪酸類は脂質の構成成分であり、全ての生物が生長、生存および繁殖のために必要としている。脂肪酸類の中でも、飽和脂肪酸類は、炭素原子が互いに単結合のみで結合し二重結合を全く含まない化学構造を有するものである。不飽和脂肪酸類は、１個以上の炭素原子が互いに二重結合で結合しているものである。多不飽和脂肪酸類は以下でＰＵＦＡｓと称されており、１個を超える二重結合が見られるものである。
【０００３】
ＰＵＦＡｓの中でも、２種が、動物およびヒトの健康に非常に必要であると考えられている。これらは、ドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸であり、以下ではＤＨＡおよびＥＰＡと称する。ＤＨＡおよびＥＰＡ両者の分子構造は、最初の二重結合が脂肪酸構造メチル末端の第３炭素原子の後に続くようなものである。したがって、これらはまた、オメガ−３ＰＵＦＡｓとも称されている。ＤＨＡは炭素原子２２個を含んでおり、その間に６個の二重結合がある。ＥＰＡは炭素原子２０個を含んでおり、その間に５個の二重結合がある。ＤＨＡおよびＥＰＡ両者ともに、ヒトの健康および動物栄養において重要であることが明らかになっている。ヒトの健康において、ＤＨＡとＥＰＡは、小児の脳発達、動脈硬化予防、神経疾患である夜間視力喪失の予防および癌の予防可能性においてさえも重要であると示されてきた（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これら２種のオメガ−３  ＰＵＦＡｓは、テナガエビ類のような甲殻類において成長と繁殖を高めることが明らかとなっており、それらは、ヒト消費のための海洋養殖動物として非常に重要となっている（非特許文献４）。したがって、ＤＨＡおよびＥＰＡをヒトおよび動物飼料に取り入れることが重要と考えられている。スラウストチトリッドプロチスト類のＤＨＡおよびＥＰＡレベルは、本発明に詳細に述べたように粘度を高めた培地中でその細胞を増殖させることによってその天然レベル以上に増強でき、それらの細胞は、現在公知の製法に比べてヒト栄養サプリメントとしておよび動物飼料としてはるかに優れた用途となることができる。スラウストチトリッド類は、充分に確立された発酵技術を用いて大量に培養することができる。スプレイ−ドライおよび凍結によってのようにそれら細胞を適切に処理し保存することによって、このようにして得た細胞を動物飼料として使用できる。また、オメガ−３脂肪酸類を増強した細胞バイオマスも得ることができ、ＤＨＡとＥＰＡを純粋な形態で抽出できる。これらは、これらの必須オメガ−３ＰＵＦＡｓが少ないヒト食品を強化するために使用できる。
【０００４】
ヒト消費のためのＥＰＡとＤＨＡの主要起源は、魚油の形状である。しかし、魚油は臭いという欠点を有しており、多くのヒト消費者には受け入れられない。また、ＤＨＡとＥＰＡを含む魚は極めて季節性が高く、そのオメガ−３ＰＵＦＡ含量も変動している。その他に、魚油のほとんどは水素添加されており、オメガ−３ＰＵＦＡｓは破壊されている。こうした理由から、ＥＰＡとＤＨＡを含み大量に培養できる微生物類が、ヒトの栄養と動物飼料として適切と考えられている（非特許文献５）。数種の単細胞植物類海藻類は高レベルのＥＰＡとＤＨＡを含み、前記目的用に検討されてきた。Ａ．Ｓｉｎｇｈ（非特許文献６）を参照。
【０００５】
微生物は、安価な栄養物を用いて容易に大量に培養できる。数群の微生物類は、多量のＥＰＡとＤＨＡを含有している。このような微生物類は、直接、飼料として使用でき、または、前記ＰＵＦＡｓをそれらから抽出して使用することもできる。多量のＤＨＡおよびＥＰＡを含む微生物の探索により、スラウストチトリッドプロチスト類が最大量のＤＨＡおよびＥＰＡを含むことが明らかになった。スラウストチトリッド類は既に、商業上重要であると考えられている。それらの細胞は、動物飼料中で使用されたりまたは商業的用途用ＰＵＦＡｓ抽出のために使用されている（非特許文献７；特許文献１）。
【０００６】
日本国特許９６３３２６３（１９９６）（特許文献２）は、食品添加物、乳児用ミルク添加物としての栄養サプリメント類、食品および薬剤添加物のような食品業界における適用のためスラウストチトリッド株を記載している。前記株は、乾燥重量で少なくとも２％のＤＨＡを含んでいる。日本国特許９８０  ３６７１（１９９８）（特許文献３）は、スラウストチトリッドプロチスト類脂質からのＤＨＡとＰＵＦＡであるドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の発酵による生産を記載している。スラウストチトリッドプロチスト類の細胞は、水中培養において飼料として直接使用することもできる（特許文献４）。これとは別に、ＤＨＡおよびＥＰＡは、スラウストチトリッド（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）細胞から抽出することもできる（特許文献５および特許文献６）。米国特許５，３４０、５９４（特許文献７）は、高濃度のオメガ−３ＰＵＦＡｓを有するスラウストチトリッドプロチスト類を用いて全細胞または抽出した微生物産物の製造方法を記載している。ヒト栄養剤としてスラウストチトリッドプロチスト類を使用できる可能性がある（特許文献８）。
【０００７】
ＤＨＡおよびＥＰＡのスラウストチトリッドプロチスト類からの製造には、それらを発酵器中適切な条件で増殖させ商業的に有用な量のＰＵＦＡｓを得ることが必要である。いくつかの研究論文および特許で、スラウストチトリッド類中でのＤＨＡおよびＥＰＡ生産および製造に適した条件を提供する問題について述べている。米国特許５，３４０、７４２（特許文献９）は、スラウストチトリッドプロチスト類の増殖のために規定した適切な培地中でそれらを増殖させる方法を開示している。２００２年１０月８日付けの米国特許６，４６１、８３９（特許文献１０）は、Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ（ラビリンスラ）種において炭素源としてオイルまたは脂肪酸を含む培地を用いてＰＵＦＡｓを製造する方法を提供している。Ｙｏｋｏｃｈｉら（非特許文献８）は、多量のＤＧＡをスラウストチトリッド  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ（シゾチトリウムリマシナム）中で生産するための塩分、温度、炭素源、オイルおよび窒素源を述べている。最適ｐＨと培地成分類もスラウストチトリッドオーレウム（ａｕｒｅｕｍ）について述べられてきた（非特許文献９）。
【０００８】
上述の特許類全ては、多数のスラウストチトリッド培養物のスクリーニング、ＤＨＡおよびＥＰＡ最大含量の株を選択すること、これらの変異株を作製することおよびこの株を商業的生産のための最適培養条件下で培養することに関する。その他に、上述の関連特許は、中等度のＤＨＡおよびＥＰＡ濃度しか有していないであろう多数の株を排除している。
【０００９】
本発明者らが先に出願しＣｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに譲渡された米国特許６，４１０、２８２（特許文献１１）は、スラウストチトリッドＵｌｋｅｎｉａ  ｒａｄｉａｔａ  Ｇａｅｒｔｎｅｒ（ウルケニアラジアタガエルトナー）中において多不飽和脂肪酸類を増強する方法を提供しており、培地成分を変える必要はないが培地粘度をポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）添加により高めている。この特許は、スラウストチトリッド類の唯一の属と種に限定されている。当業者には公知であるように、微生物の特定属および種に適用可能な製法を別の微生物属および種に適用できるとは想定できない。さらに、本発明者らは、ここで、米国特許６，４１０、２８２（特許文献１１）に記載された製法がＵｌｋｅｎｉａ  ｒａｄｉａｔａ（ウルケニアラジアタ）という唯一の属と種を常に考慮して具体化されており他の種は含まれていないことに特に注目したい。上記の米国特許は、また、記載の製法が他のスラウストチトリッド種にも採用できると示唆していない。上記を鑑みれば、本発明の製法が自明であるとか上記米国特許に記載の製法を凌ぐ新規性を有していないとは考えられない。
【００１０】
本発明は、ウルケニアラジアタについての上記米国特許６，４１０、２８２を拡大してスラウストチトリッド類の他の属も含めること、およびこれらの種におけるＤＨＡおよびＥＰＡレベルを栄養物や培養条件とは独立して高めることを目的としており、その結果それらは、前記ＰＵＦＡｓをはるかに高い商業的収率で提供するであろう。本発明において、中等度量のＤＨＡおよびＥＰＡを有する株類でさえも、粘度を高めた培地中でそれらを増殖させることによってこれらＰＵＦＡｓをより多量に生産するようにさせることができる。
【００１１】
【特許文献１】２００２年９月１７日付け米国特許６，４５１、５６７
【特許文献２】日本国特許９６３３２６３（１９６６）
【特許文献３】日本国特許９８０  ３６７１（１９９８）
【特許文献４】１９９９年６月１日付け米国特許５，９０８、６２２
【特許文献５】１９９８年１１月２４日付け日本国特許ＪＰ１０３１０５５５５
【特許文献６】１９９７年５月１２日付けＪＰ１０３１０５５６
【特許文献７】米国特許５，３４０、５９４
【特許文献８】Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＡＮＺＦＡ）、２００１年１２月１２日の出願Ａ４２８
【特許文献９】米国特許５，３４０、７４２
【特許文献１０】２００２年１０月８日付けの米国特許６，４６１、８３９
【特許文献１１】米国特許６，４１０、２８２
【非特許文献１】Ｂａｊｐａｉ，Ｐ．およびＰ．Ｋ．Ｂａｊｐａｉ．１９９３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：１６１−１８３
【非特許文献２】Ｂａｒｃｌａｙ，Ｗ．Ｒ．ら．１９９４．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ  ６：１２３−１２９
【非特許文献３】Ｓｉｎｇｈ  Ａ．およびＯ．Ｐ．Ｗａｒｄ．１９９７  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、４５：２７１−３１２
【非特許文献４】Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｋ．Ｅ．１９９０．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：１−２８
【非特許文献５】Ｂａｊｐａｉ，Ｐ．およびＰ．Ｋ．Ｂａｊｐａｉ  １９９３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０：１６１−１８３
【非特許文献６】Ｓｉｎｇｈ，Ａ．およびＯ．Ｐ．Ｗａｒｄ，１９９７．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４５：２７２−３１２
【非特許文献７】Ｌｅｗｉｓ，Ｔ．Ｅ．ら、１９９９、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ．Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：５８０−５８７
【非特許文献８】１９９９；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４９、７２−７６
【非特許文献９】Ｉｉｄａ  Ｔ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｇｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８１：７６−７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の主要目的は、スラウストチトリッドプロチスト類中のＰＵＦＡｓ量を高めることであり、上記に詳細に述べた欠点を回避することである。
さらに本発明の目的は、スラウストチトリッド株類に対して、最適栄養条件を用いて通常それらが生産するよりも多量のＤＨＡおよびＥＰＡを生産させることである。
さらに本発明の目的は、粘度を高めた培地中でスラウストチトリッドプロチスト類培養物を増殖させ、これらの脂肪酸類レベルを高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、スラウストチトリッドプロチスト類中の多不飽和脂肪酸類のレベルを高める方法、さらに詳細には、ザ・マイクロバイアルタイプカルチャーコレクション［Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）］、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２１、ＭＴＣＣ５１２２およびＭＴＣＣ５１２３としてそれぞれ寄託したシゾチトリウム、スラウストチトリウム，およびアプラノチトリウム属に属するスラウストチトリッドプロチストの細胞中において、粘度を高めた培地中でそれらを増殖させることによってドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸のレベルを高め、それによって上記多不飽和脂肪酸類（ＰＵＦＡｓ）を高含量にした細胞をその後、多不飽和脂肪酸類を必要とする動物飼料、ヒト栄養物および栄養強化のためのＰＵＦＡｓ抽出のようなさまざまなの有益な適用において良好に利用できるようにする方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の主な利点は、下記のようである。
１．培養物中に通常存在するスラウストチトリッド類のＤＨＡおよびＥＰＡレベルを、さらに高めることができる。
２．中程度のＤＨＡおよびＥＰＡしか有していない株類でさえも、これらの脂肪酸類を多く含ませることができる。
３．前記培地の粘度は、容易に入手できる化学物質であるポリビニルピロリドンを添加することによって高める。
４．ポリビニルピロリドンは前記培養物によって栄養として用いられるわけではなく、従って、それらの正常代謝に干渉しない。
５．ポリビニルピロリドンは前記培養物にとって有毒ではなく、それらの正常な代謝を傷害しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
したがって、本発明は、スラウストチトリッドプロチスト類中においてドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸レベルを高める方法で、下記：
（ａ）Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２１として寄託したシゾチトリウム属，またはＴｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，ＩｎｄｉａにＭＴＣＣ５１２２として寄託したスラウストチトリウム属、またはＴｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，ＩｎｄｉａにＭＴＣＣ５１２３として寄託したアプラノチトリウム属に属するスラウストチトリッドプロチストを培地中に接種し、それを２５℃〜３０℃で約２日間増殖させること；
（ｂ）このようにして増殖させた培養物を接種物として使用するために得て、それを用いて粘度を高めた培地に接種すること；
（ｃ）段階（ｂ）の粘度を高めた培地中で２５℃〜３０℃で２〜５日間、スラウストチトリッドプロチスト培養物を増殖させること、および
（ｄ）遠心分離により前記細胞を採取し、この細胞から増大した量のドコサヘキサエン酸およびエイコサペンタエン酸を抽出すること、
の段階を含む。
【００１６】
本発明の態様において、段階（ａ）において、使用した培地は、０．５重量％〜１．５重量％範囲のペプトン；０．０１重量％〜０．１重量％範囲の酵母抽出物；０．０１重量％〜１．０重量％範囲のグルコース；および約１００ｍｌの海水を含む。
【００１７】
本発明の別の態様において、段階（ｂ）において、使用した培地は、０．５重量％〜１．５重量％範囲のペプトン；０．０１重量％〜０．１重量％範囲の酵母抽出物；０．０１重量％〜１．０重量％範囲のグルコース；０．５重量％〜１．５重量％範囲のポリビニルピロリドン；および約１００ｍｌの海水を含む。
【００１８】
さらに本発明の態様において、前記培地は、１．５％のペプトン；０．１％の酵母抽出物；１．０％のグルコース；１．０％のポリビニルピロリドンおよび１００ｍｌの海水を含む。
【００１９】
さらに本発明の態様において、前記培地が、１．５％のペプトンを含む。
さらに本発明の態様において、前記培地が、０．１％の酵母抽出物を含む。
さらに本発明の別の態様において、前記培地が、１．０％のグルコースを含む。
【００２０】
本発明によれば、オメガ−３ＰＵＦＡｓ  ＤＨＡおよびＥＰＡを含む候補種スラウストチトリッド真菌培養物を、最初に液体栄養培地に接種する。アメリカンタイプカルチャーコレクションによるＡＴＣＣ番号１８９０６、１８９０７、２０８９０、２０８９１、２０８９２、２６１８５を有するもののようなスラウストチトリッド真菌のスラウストチトリウム種、または寄託番号２８２１０を有するスラウストチトリウムロセウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）または寄託番号３４３０４を有するスラウストチトリウムオーレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）に属する真菌株も、使用できる。
【００２１】
例えば適切な培地は、ペプトン、酵母抽出物、グルコースおよび海水を含むものである。前記真菌の増殖を支持する他のいかなる培地もまた、使用できる。前記培養物を２５〜３０℃の範囲の室温で２日間増殖させる。この培養物を接種物として使用し、粘度を高めた培地に接種するために使用する。粘度を高めるために添加する化合物は、デキストランまたはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような前記微生物が栄養物として利用せず培地粘度の増加に寄与するだけの通常のポリマー類のひとつである。例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は塩基性の水溶性ポリマーである（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０巻、１９８２）。ＰＶＰは、液体粘度を高めるためによく使用され、この目的のために適した物質である（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｒ．Ｄ．およびＲ．Ｂ．Ｅｍｌｅｔ、１９９３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １７６：２０７−２２１）。
【００２２】
本実施例において、０．１〜１．０％濃度のＰＶＰを培地に添加する。培養物は、実験室フラスコまたは回転シェーカーで増殖させるか、あるいは、大量培養が必要な時には発酵器中で増殖させることができる。前記培養物を２５〜３０℃の室温かまたは特定の株が最もよく増殖するいかなる温度でも増殖させる。適切な期間の後、例えば、２〜７日間増殖させた後、培養物から細胞を採取する。このことは、遠心分離、連続フロー遠心分離、ろ過等のようないかなる適当な方法によっても行なうことができる。このようにして得られた細胞を、スラウストチトリッド細胞を必要とするいかなる適用にも使用することができる。このような用途には、動物飼料、ヒト食品強化物または純粋なＤＨＡおよびＥＰＡ抽出のための細胞バイオマスを含むことができる。
【００２３】
したがって、本発明は、粘度を高めるためにポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加した培地を用いてスラウストチトリッド真菌における多不飽和脂肪酸レベルを高める方法を提供し、段階ａ：属スラウストチトリウム，シゾチトリウムまたはアプラノチトリウム［以前は、Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ（ラビリンスロイデス）と称されていた］に属するスラウストチトリッドプロチストを提供すること；段階ｂ：前記株を培地に接種すること；段階ｃ：前記培養物を２５〜３０℃の温度で２日間増殖させること；段階ｄ：接種物として使用するため上記培地を用いて前記培養物を得て、異なる濃度のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を入れた培地に接種すること；段階ｅ：前記培養物を２５〜３０℃範囲の温度で２〜５日間別々に増殖させること；段階ｆ：前記細胞を前記培養物から遠心分離により採取することおよび増量させたドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を抽出すること、を含む。
【００２４】
本発明の態様において、前記培地粘度は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を濃度０．５〜１．０％で取り込ませることによって高めることができる。
本発明の別の態様において、スラウストチトリッドプロチスト類細胞中においてＰＵＦＡｓレベルを高めるための方法が提供される。
【００２５】
さらに本発明の別の態様において、増量させたＰＵＦＡｓがＤＨＡおよびＥＰＡである。
さらに本発明の別の態様において、ＤＨＡおよびＥＰＡは、粘度を高めた培地中で前記培養物を増殖させることによって、スラウストチトリッド真菌細胞中で高められる。
【００２６】
さらに本発明のもうひとつの態様において、粘度増加は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような栄養物として利用されない物質を濃度１．０％で取り込ませることによって得られる。
【００２７】
本発明は従って、前記オメガ−３  ＰＵＦＡｓであるＤＨＡおよびＥＰＡレベルを高める方法に関する。この方法によって、スラウストチトリッド類培養株を調製し、他の条件下におけるよりも高いレベルでこれらのＰＵＦＡｓを産生させることができる。さらに、中程度量のこれらＰＵＦＡｓしか含まない株類も調製し、多量をそれらの細胞内部に産生させることができる。
【００２８】
本発明を付属図面を参照し詳細に記載するが、本発明を例示するためにのみ示している。
【実施例】
【００２９】
下記の実施例は、本発明を例示するためにのみ示しており、従って、いかなる意味でも本発明の範囲を限定しない。
【００３０】
実施例１
＃ＮＩＯＳ−１に属するスラウストチトリッド培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で、細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。ＰＶＰ添加で粘度を高めた培地に増殖した培養物は、ＰＶＰ増加させていない培地で増殖させたものに比べて約０．５倍多いＤＨＡを含んでいた（図１）。
【００３１】
実施例２
＃ＮＩＯＳ−１に属するスラウストチトリッド培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で、細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。ＰＶＰ添加で粘度を高めた培地に増殖した培養物は、ＰＶＰ増加させていない培地で増殖させたものに比べて約０．５倍多いＥＰＡを含んでいた（図２）。
【００３２】
実施例３
＃ＮＩＯＳ−２に属するスラウストチトリッド培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で、細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。ＰＶＰ添加で粘度を高めた培地に増殖した培養物は、ＰＶＰ増加させていない培地で増殖させたものに比べて約０．５倍多いＤＨＡを含んでいた（図３）。
【００３３】
実施例４
＃ＮＩＯＳ−２に属するスラウストチトリッド培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で、細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。粘度を高めていないものによる培養物はＥＰＡを全く示していなかったが、ＰＶＰ添加により粘度を高めたものによる培養物は、ＥＰＡを含んでいた（図４）。
【００３４】
実施例５
＃ＮＩＯＳ−３に属するスラウストチトリッド（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で、細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。ＰＶＰ増量させていない培地の培養物に比較して、ＰＶＰ添加により粘度を高めた培地での培養物は、ＤＨＡをほとんど３倍多く含んでいた（図５）。
【００３５】
実施例６
＃ＮＩＯＳ−３に属するスラウストチトリッド培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。ＰＶＰ添加により粘度を高めた培地で増殖させた培養物は、冷蔵庫保存しなかったものに比べて２倍多くＥＰＡを含んでいた（図６）。
【００３６】
実施例７
＃ＮＩＯＳ−４に属するスラウストチトリッド培養物を、ゼラチン−ペプトン１．５重量％；酵母抽出物０．１重量％；グルコース１．０重量％および海水１００ｍｌを含む培地１００ｍｌに接種した。前記培養物を２日間、シャーカーで２５〜３０℃の室温で増殖させた。これらの培養物を実験に接種物として用いた。上記と同一組成の培地であるが１．０％ポリビニルピロリドンを添加したものを含む培地を用いて培養セットを設定した。実験は、接種物１０ｍｌを前記実験セットの培地１００ｍｌに添加して行なった。培養物は、シェーカーで２５〜３０℃の室温で３日間増殖させた。この期間の終点で、細胞を遠心分離で採取し、脂肪酸類を抽出、ガスクロマトグラフィで分析した。ＰＶＰ添加により粘度を高めた培地で増殖した培養物は、ＰＶＰ増加のない培地で増殖させたものに比べてほとんど３倍多くＤＨＡを含んでいた（図７）。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２１として寄託されたシゾチトリウム属ゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）およびベルスキー（Ｂｅｌｓｋｙ）に形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＤＨＡ含量を示した。
【図２】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２１として寄託されたシゾチトリウム属ゴールドスタインおよびベルスキーに形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＥＰＡ含量を示した。
【図３】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２２として寄託されたスラウストチトリウム種スパロウ（Ｓｐａｒｒｏｗ）に形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＤＨＡ含量を示した。
【図４】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２２として寄託されたスラウストチトリウム種スパロウに形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＥＰＡ含量を示した。
【図５】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊａｐａｎに寄託番号ＡＢ２２１１５として寄託されたウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）種に形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＤＨＡ含量を示した。
【図６】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊａｐａｎに寄託番号ＡＢ２２１１５として寄託されたウルケニア種に形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＥＰＡ含量を示した。
【図７】液体栄養培地で増殖させた際、Ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ，Ｉｎｄｉａに寄託番号ＭＴＣＣ５１２３として寄託されたアプラノチトリウム種に形態およびライフサイクルで対応しているスラウストチトリッド株のＤＨＡ含量を示した。
【図１】
2006521814.tif 000002
【図２】
2006521814.tif 000003
【図３】
2006521814.tif 000004
【図４】
2006521814.tif 000005
【図５】
2006521814.tif 000006
【図６】
2006521814.tif 000007
【図７】
2006521814.tif 000008
【国際調査報告】
2006521814.tif 000009
2006521814.tif 000010
2006521814.tif 000011
2006521814.tif 000012
2006521814.tif 000013