(57)【要約】天然物（例えば、植物）原料を供給する工程と、極性溶媒を用いて前記原料の第１の試料を抽出し極性抽出物と非極性残渣とを生成する工程と、前記極性抽出物をイオン交換クロマトグラフィーにかけイオン性化合物の濃縮抽出物と非イオン性残渣とを生成する工程と、前記イオン性化合物の濃縮抽出物をクロマトグラフィーで分画して１つまたはそれ以上のイオン性（植物）化学物質を含んだ１つまたはそれ以上の極性画分を生成する工程とを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）天然物（例えば植物）原料を供給する工程と、
（ｂ）極性溶媒を用いて前記原料の第１の試料を抽出して、極性抽出物と非極性残渣とを生成する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の前記極性抽出物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて、イオン性化合物の濃縮抽出物と非イオン性残渣とを生成する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の前記濃縮抽出物をクロマトグラフィーによって分画して、１つまたはそれ以上のイオン性（植物）化学物質を含む１つまたはそれ以上の極性画分を生成する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記濃縮抽出物を、解析規模でクロマトグラフィーによって分画する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフィーによる前記分画が気−液クロマトグラフィーを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
気−液クロマトグラフィーにかけられる前に、前記濃縮抽出物を誘導体形成処理する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記濃縮抽出物を調製規模でクロマトグラフィーによって分画する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィーによる分画がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）前記原料の第２の試料を抽出し、または、非極性溶媒を用いて前記第１の試料の非極性残渣を引き続き抽出して、非極性抽出物を生成する工程と、（ｉｉ）前記非極性抽出物を疎水相互作用させ、または、逆相クロマトグラフィーにかけて、脂肪およびクロロフィル中の減損抽出物を生成する工程と、（ｉｉｉ）前記減損抽出物をクロマトグラフィーで分画して、１つまたはそれ以上の非極性植物化学物質を含む１つまたはそれ以上の非極性画分を生成する工程とをさらに含む、請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記減損抽出物を解析規模でクロマトグラフィーによって分画する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーによる前記分画が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および／または気−液クロマトグラフィーを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記減損抽出物を、調製規模でクロマトグラフィーによって分画する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
クロマトグラフィーによる前記分画が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、逆相ＨＰＬＣ）および（例えば、後にＨＰＬＣが続く）流出分画（例えば、順相シリカクロマトグラフィー）を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）工程（ｃ）の前記非イオン性残渣を疎水相互作用させ、または、逆相クロマトグラフィーにかけて、糖中のスカベンジングされた減損非イオン性抽出物を生じさせる工程と、（ｉｉ）スカベンジングされた前期抽出物をクロマトグラフィーで分画して、１つまたはそれ以上の非イオン性植物化学物質を含む１つまたはそれ以上のスカベンジングされた画分を生成する工程とによって、非イオン種のために、前記非イオン性残渣をスカベンジングすることをさらに含む、請求項１から１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
スカベンジングされた前記抽出物を、解析規模でクロマトグラフィーによって分画する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
クロマトグラフィーによる前記分画が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはＧＣ−ＭＳを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
スカベンジングされた前記抽出物を、調製規模でクロマトグラフィーによって分画する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
クロマトグラフィーによる前記分画が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、逆相ＨＰＬＣ）および（例えば、後にＨＰＬＣが続く）流出分画（例えば、順相シリカクロマトグラフィー）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
画分を収集し、そして、単離する工程と、単離された前記画分を順序だてて配列する工程とをさらに含む、植物化学物質のライブラリーを形成するための請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、一連の異なる植物源の原料に対して反復して適用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
画分を特徴づける工程をさらに含む、植物の植物化学プロファイルを形成するための、請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
画分を特徴づける工程と、定義済みの特徴に基づいて前記生薬原料に関する標準規格を定義する工程とを含む、生薬原料に関する標準規格を確立するための請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
分画工程が分取クロマトグラフィーを含む、植物抽出物を生成するための請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
画分を収集する工程と、前記画分から植物化学物質を単離する工程とを含む、単離植物化学物質を生成するための請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
画分を特徴づけして、生物活性指数を得るため工程をさらに含む、生物活性を有する植物化学物質の存在を捜して植物をスクリーニングするための請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
植物供給原料が単一の基準草種源から得られ、前記方法が、さらに
（ａ）画分を特徴づける工程と
（ｂ）特徴づけされた前記画分が問題の植物化学物質を含有するかどうかを決定し、それによってデータを得る工程と
（ｃ）（ｂ）において得られたデータを基準草種源と関連付けて、植物化学物質ディレクトリの構成要素を形成する工程との
反復サイクルをさらに含み、
（ａ）〜（ｃ）の工程を複数の異なる基準草種源について反復することにより、複数のディレクトリ構成要素を形成し、それによって植物化学ディレクトリを構成する、植物化学物ディレクトリを形成するための請求項１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
前記濃縮抽出物を分画することによって、定義された画分または単離された（例えば、実質的に純粋な）イオン性植物化学物質を得る、請求項１から２４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２６】
減損抽出物を分画することによって、定義された画分または単離された（例えば、実質的に純粋な）非極性植物化学物質を得る請求項７から２５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
スカベンジングされた抽出物を分画することによって、定義された画分または単離された（例えば、実質的に純粋な）非イオン性植物化学物質を得る、請求項１２から２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
植物化学物質が
（ａ）医薬品、
（ｂ）農薬、
（ｃ）殺虫剤、
（ｄ）毒物、
（ｅ）コンビナトリアルライブラリーの生成に使用されるテンプレート分子、および
（ｆ）食品、食品添加物または機能食品材料
から選択される、請求項１から２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
画分が特徴づけされる、請求項１から２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
画分が、
（ａ）機能的に、および／または
（ｂ）物理的に、および／または
（ｃ）化学的に
特徴づけされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記機能的な特徴づけ（ａ）が、例えば
（ａ）インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）もしくはインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイ、ならびに／または
（ｂ）酵素阻害アッセイ（例えば、グリコシダーゼおよび／もしくはリパーゼ阻害）、ならびに／または
（ｃ）受容体結合アッセイ、ならびに／または
（ｄ）細胞アッセイ（例えば、細胞複製、細胞−病原体および細胞−細胞相互作用、ならびに細胞分泌アッセイ）、ならびに／または
（ｅ）イムノアッセイ、ならびに／または
（ｆ）抗菌作用（例えば、細菌およびウイルスの細胞結合および／または複製）アッセイ、ならびに／または
（ｇ）毒性アッセイ（例えば、ＬＤ50アッセイ）
から選択されるバイオロジカルアッセイを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記物理的特徴づけ（ｂ）が、
（ａ）植物化学物質の定量、および／または
（ｂ）構成成分の純度の測定、および／または
（ｃ）分子量（もしくは分子量分布、もしくは複数の異なる植物化学物質構成成分を含む画分の場合、その様々な統計的相関関係）の決定、および／または
（ｄ）分子式の決定（例えば、核磁気共鳴による）、および／または
（ｅ）スペクトル解析
から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記スペクトル解析（ｅ）によって
（ａ）質量スペクトル（例えば、荷電数当たりの質量（ｍ／ｚ）対存在量）、および／または
（ｂ）クラマトグラフィーによるデータ（例えば、スペクトル、カラム保持時間、溶離液プロファイル等）、および／または
（ｃ）ホトダイオードアレイ（ＰＤＡ）スペクトル（例えば、ＵＶおよび可視両領域における）、および／または
（ｄ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（1Ｈおよび／または13ＣＮＭＲを介して得られるスペクトルデータセット）
が得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記スペクトルによる特徴づけを、例えばＧＣ−ＭＳおよび／またはＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを使用することによって、分画工程と合体させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記化学的特徴づけ（ｃ）が、
（ａ）植物化学成分の化学的反応性、ならびに／または
（ｂ）植物化学成分の溶解性、ならびに／または
（ｃ）植物化学成分の安定性および融点
の測定によって行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１７または１８に記載の方法によって得られる植物化学物質ライブラリー。
【請求項３７】
請求項３６のライブラリーを含む各部分から成るキット。
【請求項３８】
画分を特徴づける工程と、定義された特徴に基づいて前記製品がその標準規格を満たしているかどうかを決定する工程とを含む、生薬製品を製造するための請求項１から３５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３９】
請求項２０に記載の方法に従って生薬原料の標準規格を確立することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８または３９に記載の方法によって得られる生薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物（例えば、植物）原料の分画法に関する。本発明は、特に、植物のプロフィーリング法（例えば、品質管理を目的としたプロフィーリング法）および植物抽出物や単離された植物化学物質のライブラリーの形成法、植物化学物質ライブラリーの構築、ならびに植物抽出物および植物化学単離物の抽出、分離、単離、特徴づけおよびスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物の発見
新規な医薬品、農薬またはその他の生物活性化合物などの発見は、商業開発用の活性化学物質を迅速に同定しかつ特徴づける能力にかかっている。各種植物およびその他の天然物は、分子の多様性および機能性に非常に富んでおり、現在、医薬品および農薬市場における年間売り上げの数十億ポンドを植物由来の製品が占めている。
【０００３】
しかし、スクリーニング用の植物抽出物を形成するのは面倒であり困難を伴う。根本的な問題は、存在する植物化学物質の数の多さに起因する。例えば、ある典型的な植物の場合、優に５０００を超えるそれぞれ独自の植物化学化合物を広い濃度範囲で含有している。
【０００４】
前記問題に対する従来の対処法は、選択された、植物化学化合物の複合混合物を含有する粗抽出物としての植物資源をテストすることである。典型的な場合、１植物当たり１〜３個の抽出物がスクリーニング用に形成される。これら抽出物は、１抽出物当たり十〜２百の化合物を含有していることがある。次いで、各抽出物の所望の活性をテストし、活性が検出された場合には、その活性を利用して活性植物化学物質の精製法および同定法を導くことになる。
【０００５】
しかし、このような方法は面倒かつ非効率的である。その主たる理由は、スクリーニングに使用される抽出物中に、バイオアッセイを妨げ得る化合物が存在することである。このような化合物は生物学的特性を覆い隠すまたはバイオアッセイの機序を妨害する可能性がある。このように妨害することが知られている多くの植物化学物質の中には、脂肪酸、リン脂質ならびにトリ、ジおよびモノグリセリドが含まれるが、これら物質はすべて受容体−リガンド結合を阻害するまたは受容体の構造またはコンホメーションを修飾する傾向がある。これによって、バイオアッセイ時に偽陽性または偽陰性を生じることがある。
【０００６】
植物抽出物のスクリーニング時に生じるもう１つの問題は、抽出物中に存在する微量成分の活性が、大量成分の活性によって覆い隠されることから生じる。すなわち、一植物全体に存在する何千という植物化学物質のうち、粗抽出物中に検出される生物活性は１０〜１５種類の大量成分の活性を表しているにすぎない。さらに、リガンドおよびその受容体の衝突頻度および適正な配向が結合に役割を果たしているため、非常に多数の化合物を含有する植物抽出物をスクリーニングすることによってある種の生物学的効果が損なわれる。
【０００７】
したがって、植物抽出物を形成するための改良された方法が必要とされている。
【０００８】
薬剤の生産
植物は、医薬品および農薬の開発における新規リード化合物の重要な供給源となるばかりでなく、工業的に有用な植物化学物質の大規模生産における原料源としても使用することができ、合成による生産戦略に取って代わる便利でかつ経済的な手段としての役割を果たす。
【０００９】
例えば、植物から新規医薬品を商業的に生産することが実行可能な選択肢であることは、ブリストルマイヤースクイブがタキソール（商標）の事例で示しているが、タキソールはある種のイチイの木の樹皮に含まれる微量成分である。しかし、今では、ヨーロッパイチイの木の針葉に大量に見出される関連化合物を半合成的に修飾することによって生産されている。ラッパスイセンも、アルツハイマ−病治療用ガランタミンを抽出するために、イーストアングリアで栽培が始まっている。
【００１０】
このように、将来、伝統的な作物が新規製薬事業のベースとなるように思われる。
【００１１】
しかし、現在、工業用化学物質の生産において、大規模合成化学の代替手段として植物を栽培するという最大限の可能性は、知られている工業用化学物質（または構造的に非常に近いそれらの同類物）が植物中に天然にどの程度生じるものかについての情報が不十分であるために、限られている。知られている工業用化学物質（医薬品、農薬等を含めて）またはこれら工業用化学物質の半合成品において中間物質としての役割をすることができる関連植物化学物質が各種植物中に天然に分布していることに関する情報があれば、ある特定の作物を工業用化学物質の供給源として合理的に選択することが可能となろう。
【００１２】
このために、多数の異なる植物についてある種の植物化学物質の存在を検査するために使用することができ、それによって工業的に有用な、知られている化学物質およびそれらに対応する植物の源の索引を提供するような植物化学物質ライブラリーの構築が可能となる技術の開発および応用が必要とされている。
【００１３】
生薬製品の標準化および品質管理
現在、生薬の使用への多大な関心があり、また生薬製品の全体論的研究方法が重要であって、それによってすでに確立している治療法がより完全なものとなることについての医療関連会社および医療従事者等の支持は高まりつつある。生薬への問題の復活は、従来の医薬品ではほとんど治療を受ける利点がないことが分かっている慢性の病状が、標準化された生薬製品をうまく使用することによって治療できたことに特に刺激されてきた。例えば、Ｖａｌｅｒｉａｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの標準抽出物は、ベンゾジアゼピン薬の天然代替物としての役割をする鎮静薬としてヨーロッパで広く使用されており、また一方Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａの葉の標準抽出物は独国でしばしば処方され、脳虚血を緩和するのに服用されている。生薬のその他の例としては、朝鮮人参、Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ（ニンニク）、Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ、Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐｅｒｆｏｒａｔｕｍ（セイヨウオトギリ草）、Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａおよびＡｌｏｅ  ｖｅｒａなどが挙げられる。
【００１４】
医学界が「生薬」製品の長所を進んで受け入れる傾向は、結果として、それら製品が従来の医薬品と同レベルの規定下におかれることなり、消費者のためになろう。したがって、有効成分レベルでの有効性、安全性およびバッチごとの再現性に関する品質管理などの書類で立証された証拠が極めて重要となろう。
【００１５】
しかし、生薬の品質管理は、植物原料の複雑な性質および本来備わっている不均一性のために容易でない。生薬に使用される物質は、通常、各植物の全体または部分またはそれらの抽出物である。植物および菌類物質は多くの異なる化学成分を含有しているため、それら原料は複雑な混合物である。このことが、それら物質の品質の標準化および管理を難しくしている。さらに、多くの生薬は２つまたはそれ以上の生薬成分の混合物であり、したがって混合物同士の混合物ということになり、複雑さの度合いをさらに増すことになっている。
【００１６】
大多数の生薬製品の有効成分がいまだ議論のただ中にあり、しばしば不活性な「マーカー」が標準化に用いられている。このようなマーカーは不活性な製品に存在する可能性があり、またはこのようなマーカーが存在しない活性な製品もあり得る。
【００１７】
さらに、使用される配合表および製造法は一定の規則に従っていないことも多く、開示されぬままのこともある。本質的に異なるが外見上は同一の源から得られる所与の製品の２つの試料が、実際同じ成分混合物であることを保証することは、これらの要因によって難しくなる。この問題によって、前記した物質の品質管理が困難になるのだが、生薬を扱う専門家の間ですらある種の生薬の使用には限界があった。
【００１８】
その他の問題は、生薬の実践に使用される植物が地方によってはしばしば入手できず、したがって、最終的な使用者から遠く離れた植物源から得る必要があるという事実に由来する。しかし、遠隔地からのそのような植物の供給は、それらに関する同一性および品質の標準を含んだ詳細なモノグラフが存在しないからこそ、一定しないこともあれば不確かなこともある。生薬に見出される複合的な成分混合物は、その植物学上の源、その植物が育った地域、収穫の時期、その生薬物質が保管され加工される条件、および使用した抽出手順を含めた多くの要因によって、種類および濃度が大きく異なる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、生薬製品のプロファイルを描くことができ、それゆえに治療活動と関連づけることができるような生薬物質の標準規格を確立し、それゆえに生薬の生産において品質管理が可能となり、知られている成分または活性であろうと思われる成分を理想的に定量するような感度の良い方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明によれば、（ａ）天然物（例えば植物）原料を供給する工程と、（ｂ）極性溶媒を用いて前記原料の第１の試料を抽出し、極性抽出物と非極性残渣とを生成する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の前記極性抽出物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、イオン性化合物の濃縮抽出物と非イオン性残渣（本残渣は例えば糖、脂肪、フェノール化合物などを含む）とを生成する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の前記イオン性化合物の濃縮抽出物をクロマトグラフィーによって分画し、１つまたはそれ以上のイオン性植物化学物質（本植物化学物質は、例えば、アルカロイド（例えば、水溶性または極性アルカロイド）、アミノ酸および小アミンを含む）を含む１つまたはそれ以上の極性画分を生成する工程とを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明の方法の１つの変形態様においては、前記非イオン性残渣は非イオン種のためにスカベンジングされる。この任意のスカベンジングプロセスは、（ｉ）前記非イオン性残渣を疎水相互作用させるかまたは逆相クロマトグラフィーにかけるかして、スカベンジングされた糖中の減損非イオン性抽出物を生成する工程と、（ｉｉ）スカベンジングされた前記抽出物をクロマトグラフィーで分画して１つまたはそれ以上の非イオン性植物化学物質を含んだ１つまたはそれ以上のスカベンジングされた画分を生成する工程とを含んでいてもよい。
【００２２】
本発明の方法のもう１つの変形態様においては、前記方法はさらに（ｉ）前記原料の第２の試料を抽出し、または、非極性溶媒を用いて引き続き前記第１の試料の非極性残渣を抽出して、非極性抽出物を生成する工程と、（ｉｉ）前記非極性抽出物を疎水相互作用させるかまたは逆相クロマトグラフィーにかけるかして、脂肪およびクロロフィル中の減損抽出物を生成する工程と、（ｉｉｉ）前記減損抽出物をクロマトグラフィーで分画して１つまたはそれ以上の非極性植物化学物質を含んだ１つまたはそれ以上の非極性画分を生成する工程とを含む。
【００２３】
本発明の各方法（およびそれらの変形態様）は様々な用途において有用である。
【００２４】
第１の用途において、本発明の各方法は、前記画分を収集し単離する工程とその単離物を順序づけし配列する工程とをさらに含む方法において、植物化学物質のライブラリーの形成のために使用される。
【００２５】
第２の用途において、本発明の各方法は、画分を特徴づける工程をさらに含む方法において、ある植物の植物化学的プロファイルを形成するために使用される。本発明の各方法は、前記方法が画分を特徴づける工程と、定義された特徴に基づいて前記植物原料の標準規格を定義する工程とをさらに含むとき、生薬原料の標準規格を確立するために特に有用である。
【００２６】
第３の用途において、本発明の各方法は、クロマトグラフィーによる分画工程が分取クロマトグラフィーを含む方法において、定義された植物抽出物を形成するために使用される。
【００２７】
第４の用途において、本発明の各方法は、画分を収集する工程とそ（れら）の画分から植物化学物質を単離する工程とをさらに含む方法において、単離植物化学物質を生じさせるために使用される。
【００２８】
第５の用途において、本発明の各方法は、生物活性指数を割り出すために画分を特徴づける工程をさらに含む方法において、生物活性植物化学物質の有無について植物をスクリーニングするために使用される。
【００２９】
第６の用途において、本発明の各方法は、植物原料を単一の基準草種源から得る方法、かつ（ｉ）画分を特徴づける工程、（ｉｉ）特徴づけされた画分が問題の植物化学物質を１つまたはそれ以上含有するかどうかを決定し、それによってデータを得る工程、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）において得られたデータを基準草種源と関連付け、植物化学物質ライブラリーの構成要素を形成する工程の反復サイクルをさらに含む方法において、植物化学物質ライブラリーを形成するために使用される。これにより、複数の異なる基準草種源について工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を反復することで植物化学ライブラリーの構成要素が複数形成され、植物化学ライブラリーが構成される。
【００３０】
第７の用途において、本発明の各方法は、生薬製品を生産する方法であって、画分を特徴づけ、明らかにされた特徴に基づいて前記製品がその標準規格を満たしているかどうかを決定する工程をさらに含む方法において使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
定義
特にことわりのない限り、本明細書で使用される下記の用語は、それらが当業界において有する任意の広い（狭い）意味に加え、下記の意味を有するものとする。
【００３２】
「植物」は、本明細書では広義に使用され、厳密な意味での植物に限らず菌類および細菌も含む。
【００３３】
「植物化学物質」は、本明細書では広義に使用され、高分子および小分子を含めた植物を構成する任意の化学物質を含む。重要な例としては、アルカロイド（例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピロリジジン、インドリジジン、トロパンおよびノルトロパン）、炭水化物類似体、フェノール化合物、テルペノイド、酵素阻害物質、グリコシド、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質および糖が挙げられる。本発明の植物化学物質は、とりわけ医薬品、農薬、コンビナトリアルケミストリーのテンプレート、抗酸化剤、植物起源または品質のマーカー、動物毒、殺虫剤、化粧品および食品添加物としての働きをする可能性がある。
【００３４】
「単離された」は、本明細書においては、単離された物質（例えば、植物化学物質）が現実に生じる物理的環境とはまったく異なる物理的環境に存在していることを表すのに使用される。例えば、単離された物質は、特に本発明のライブラリーという状況においては、それが天然に生じる複雑な細胞環境に対して実質的に単離されている（例えば、精製されている）。
【００３５】
本明細書において本発明の「精製」物質と明記する場合、純度の絶対的レベルは重要でなく、当業者であれば、その物質が使用される用途によって適正なレベルを容易に決定することができよう。しかし、純度は９０％ｗ／ｗまたは９９％ｗ／ｗまたはそれ以上のレベルであることが好ましい。
【００３６】
ある状況では、単離された植物化学物質は、組成物（例えば、多くのその他物質を含有する幾分粗な抽出物）または緩衝系の一部を形成している。ここで緩衝系は例えば他の成分を含有することもある。別の状況では、単離された植物化学物質は、植物化学物質ライブラリーなどの一物品または材料一セットの一部を形成している。また別の状況では、単離された植物化学物質は、例えば分光測光法、ＮＭＲまたはカラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）によって測定されるような、本来の均質性にまで精製されていることがある。
【００３７】
本明細書において任意の対象試料（例えば、植物、および抽出物、画分または植物化学物質）に適用される「スクリーニング」とは、前記対象が１つまたはそれ以上の所定の規準を満たしているか否かを決定するために、その対象を解析することを意味するものである。生物活性について植物化学物質をスクリーニングする場合に適用されるように、仮想のスクリーニング（同スクリーニングは、対象がある機能上の規準を満たしているか否かを決定するためにコンピュータモデリングまたは類似予測法を使用する）をも含む。
【００３８】
本明細書において使用されるように、「生物活性指数」とは、生物活性と相互に関係している特徴または特性を定義しようとする用語である。例えば、植物化学物質上のある特定の群の反応性基を毒性のマーカーとして使用し、一方でｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の受容体と相互作用する能力を薬剤活性の指標とすることが可能である。
【００３９】
本明細書において任意の対象（例えば、植物または抽出物またはそれらの画分）に適用される「プロフィーリング」とは、併せて前記対象の特徴となるような一連の特性および／または特長を定義するためにその対象を解析することを意味するものである。このような一連の特性および／または特長は「ケミカルフィンガープリント」とも呼ばれている。前記特性は、本明細書（「画分の特徴づけ」の項）で論じる任意のまたはすべての特性を含むことが可能であり、典型的な場合、質量スペクトルおよび／またはＰＤＡスペクトルなどの分光特性を含む。
【００４０】
本明細書において使用されるように、「極性」および「非極性」とは、相対的用語として溶媒に対して適用され、それら溶媒が電気双極子モーメントを有する度合い、したがって親水性（極性）または疎水性（非極性）を示す度合いを示す用語である。極性および非極性溶媒は、極性および非極性植物化学物質を抽出するためにそれぞれ使用される。
【００４１】
「ライブラリー」とは、本明細書においては植物化学物質に適用され、単離された画分（同画分は複数の別個の植物化学物質を含んでいる）および／または単離された植物化学物質の順序だった配列を定義する用語である。単離された画分のライブラリーの場合、各画分は、好ましくは２〜５個、例えば５〜１０、より好ましくは最大５０個までの異なる植物化学物質を含む。
【００４２】
本明細書において使用されるように、「植物化学物質ライブラリー」とは、一群の異なる植物供給源における１つまたはそれ以上の問題の植物化学物質の分布に関する情報を含むデータベースを定義する用語である。例えば、本発明のライブラリーは、異なる植物の集合におけるある種の極性化学物質の分布に関する情報を含むことが可能である。
【００４３】
本明細書において使用されるように、「単一の基準草種源」とは、ある特定の植物タクソンを定義する用語である。多くの場合、単一の植物種（または系）を定義する用語である。本用語の定義を拡大して、ある特定の地方でまたはある特定の定義された条件下で生長したある特定の種とすることもできる。
【００４４】
「生物学的スクリーニング」とは、本明細書においては、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のテストおよびバイオアッセイを含め、一試料の生物活性を検出するために用いられる任意の方法を意味する。
【００４５】
「ハイスループットスクリーニング」とは、比較的短時間のうちに比較的多数の試料をテストすることが可能なスクリーニング法を意味する。一般に、ハイスループットシステムは自動化されており、ヒトの介入をほとんど必要としない。
【００４６】
植物原料
本発明の方法で用いられる植物原料は、生かつ未処理の原料でもよいし、または抽出および分画の前に種々ある方法のうちの任意の方法で前処理した原料でもよい。
【００４７】
前処理は、物理的または化学的前処理、例えば圧縮、粉末化、粉砕、凍結、乾燥または製粉などを伴ってよい。植物原料は、植物抽出物（例えば、煎じ液もしくはチンキ剤）または植物画分（例えば、製粉画分）を含むかまたはそれらから成るかまたはそれらから誘導してもよい。
【００４８】
好ましくは、植物原料は使用前に乾燥しておく。凍結乾燥、噴霧乾燥または風乾を含めて、任意の便利な乾燥形態を使用することができる。特に好ましい実施形態においては、本発明の方法において出発原料として使用される植物原料は、（好ましくは収穫したばかりの植物原料を）製粉および凍結乾燥によって前処理する。チンキ剤または処理済み抽出物を乾燥せずに直接使用してもよい。
【００４９】
植物原料は植物の全体または一部を含むかまたはそれらから成るかまたはそれらから誘導してもよい。本発明の方法において、植物の特定の部分を選択して出発原料として使用する場合、その部分は、例えば根、塊茎、茎、樹皮、葉、芽、花、果実、樹液、浸出物、胴枯病  ばい瘤、か皮、根瘤、果汁、種またはそれらの組合せまたは誘導体から選択することができる。
【００５０】
供給源の選択
本発明の方法においては、植物（例えば、温帯植物、熱帯植物、香草、生薬、真菌、陸生植物、水性植物、民族薬用植物および有毒植物）、微生物（例えば、培養細菌）または昆虫を含む（ただし、これらに限定されない）任意の天然供給源を使用することができる。ある場合には、供給源は哺乳類、例えばヒトである。後者の場合、供給源は組織（例えば、血液または脳）試料であって、このような供給源は薬物動力学および薬物毒物学の用途において特に重要である。
【００５１】
この２０年の間に、薬剤および農薬に使用し得る新規天然物の供給源として熱帯植物が注目されてきたが、確認されている商業上価値のある植物化合物の大部分は温帯植物から得られている。これら植物化合物にはＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｓｐｐ．から得られるエトポシド（抗がん剤）、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ（一年生ヨモギ）から得られるアルテミシニン（抗マラリア薬）およびＴａｘｕｓ  ｓｐｐ．（イチイの木）から得られるタキソール（商標）が含まれる。卵巣がんの治療薬としてのタキソール（商標）は、最も売れている医薬品３０品目に含まれている。
【００５２】
このように、本発明の方法において使用される好ましい植物源は、野生植物および栽培植物の両者を含めた温帯植物である。
【００５３】
熱帯植物同様、温帯植物は草食動物および病原体からの保護用として、また、風や温度による損傷に反応して多数の生物活性代謝物を産生する。特定の時期にあらわれる気圧変化および生長期間の短縮といった季節に特有の自然現象もまた、一年の間に化学的防御手段の産生に変化をもたらす。
【００５４】
したがって、好ましい１つの態様において、本発明は、本発明で使用する植物原料の供給源として、ストレスを受けている植物、好ましくはストレスを受けている温帯植物を使用する。この文脈において、「ストレスを受けている植物」とは、例えば、病原体の（昆虫、真菌、センチュウ、ウイルスもしくは微生物の）攻撃、物理的外傷（風による損傷、磨耗、切断もしくはつぶれなど）または環境による傷害（干ばつもしくは熱）の結果、収穫の前および本発明の方法で出発原料として使用する前にストレス下にあった植物を意味する。
【００５５】
溶媒抽出
本発明の方法で使用される好適な極性溶媒の例としては、有機アルコールなどの各種有機溶媒が挙げられるが、これに限定されるものではない。エタノールおよびメタノール、ならびにエタノール／水またはメタノール／水の混合物が好ましい。
【００５６】
好ましくは、極性溶媒は、５１〜８０％エタノール／水、３１〜５０％エタノール／水、および最大３０％のエタノール／水混合物の中から選択される。約５０％エタノール／水の極性溶媒は特に好ましい。
【００５７】
本発明の方法で使用される好ましい非極性溶媒の例としては、ヘキサンおよびジクロロメタン（ＤＣＭ）などの有機溶媒またはクロロホルムが挙げられるが、これに限定されるものではない。ジクロロメタンは特に好ましい。
【００５８】
抽出が実施される条件（時間、温度、攪拌程度等）は経験に基づいて容易に決定することができ、植物またはその部分の性質ならびに前処理および選択される溶媒系によって異なる。
【００５９】
濃縮抽出物のクロマトグラフィーによる分画
前記のように、本発明の方法は、イオン性化合物の濃縮抽出物を生成し、生成された抽出物をクロマトグラフィーによって分画し、１つまたはそれ以上のイオン性植物化学物質を含む１つまたはそれ以上の極性画分を生成する。
【００６０】
濃縮抽出物のクロマトグラフィーによる分画は、解析規模で実施することができる。解析規模の分画は、プロフィーリング、品質管理、スクリーニングおよび規格（品質管理）の各用途、ならびに比較的少量の物質しか必要とされないライブラリーおよびライブラリーの形成において有用である。
【００６１】
解析規模のクロマトグラフィーによる分画の例として、好ましくは気−液クロマトグラフィーが挙げられる。気−液クロマトグラフィーは、試料を、圧力下にある不活性ガスと加熱カラム内の不活性支持体上にコーティングされた不揮発性液体の薄層の２相間に分配することによって、揮発性物質の複合混合物をその構成成分に分離する方法である。混合物の状態にある特定の化合物を好適に分離するためには、適正な特徴を有するカラムを使用することが極めて重要である。固体支持体の性質、液相の種類および量、充填法、全長、ならびにカラム温度は重要なファクターである。
【００６２】
当業者であれば、日頃の試行錯誤および一般常識によって、環境に応じて、とりわけ調査対象である植物および抽出に使用する溶媒の性質を含めた環境に応じて適正なカラムの特徴を容易に決定することができよう。非極性液相でコーティングされたキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ内径×０．２５μｍＢＰＸ５固定相、ＳＧＥ社製、またはその等価物）は特に好ましく、多くの環境において有用である。
【００６３】
多くの化合物は、その極性の強さ、揮発性の低さまたは熱不安定性のために、ガスクロマトグラフに直接注入するには不適当である。高度にヒドロキシル化されている化合物は、分子間の水素結合によって蒸発しにくくなっている。しかし、ヒドロキシル基の水素原子を他の化学基で置換することによって、そのような化合物も十分揮発性となりＧＣ解析ができるようになる。
【００６４】
ヒドロキシル基の誘導体を形成する最も一般的な２つの手段は、アセチル化とシリル化であって、それぞれアセチレート［ＣＨ3ＣＯ−Ｏ−Ｒ］またはシリルエーテル、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテル［（ＣＨ3）3Ｓｉ−Ｏ−Ｒ］が形成される。
【００６５】
このように、濃縮抽出物をクロマトグラフィーによって解析規模で分画する実施形態においては、例えばアセチル化またはシリル化によって濃縮抽出物の植物化学成分の誘導体形成処理を行うことが好ましい。トリメチルシリル（ＴＭＳ）誘導体形成処理は特に好ましい。
【００６６】
濃縮抽出物のクロマトグラフィーによる分画を、生成規模で実施することも可能である。これは、本発明の方法を植物抽出物および単離植物化学物質の生成に適用する場合に有用である。
【００６７】
濃縮抽出物のクロマトグラフィーによる生成規模での分画には、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。イオン交換クロマトグラフィーは、一部イオン種を精製してそれらを濃縮し、かつ汚染物質を除去する。当業者であれば、日頃の試行錯誤および一般常識によって、とりわけ分画される量、調査対象である植物原料、および抽出に使用される溶媒の性質などに応じた、好適なカラム充填剤および移動相を容易に同定することができよう。
【００６８】
遊離酸もしくは水素（Ｈ+）の形態またはアンモニウム（ＮＨ4+）塩の形態のいずれかで使用し得る強酸性カチオン交換樹脂は、本発明の方法においては特に好ましい。このような形態の樹脂は溶液からのカチオンを吸着し、等数の対イオンを溶液中に放出する（Ｈ-またはＮＨ4+、使用した形態による）。
【００６９】
生成規模で使用する場合、アニオン交換クロマトグラフィーおよび／または吸着クロマトグラフィーも使用可能である。
【００７０】
スカベンジングされた抽出物のクロマトグラフィーによる分画
本発明の任意のスカベンジングプロセスは糖中の減損非極性抽出物をスカベンジングし、クロマトグラフィーによって分画し、１つまたはそれ以上の非イオン性植物化学物質を含む１つまたはそれ以上のスカベンジングされた画分を生成する。
【００７１】
スカベンジングされた抽出物のクロマトグラフィーによる分画は、解析規模で行うことが可能である。解析規模の分画は、プロフィーリング、スクリーニングおよび規格（品質管理）の各用途、ならびに比較的少量の物質しか必要とされないライブラリーおよびライブラリーの形成において有用である。
【００７２】
解析規模のクロマトグラフィーによる分画には、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。この手法を用いると、試料は好適な溶媒に溶解され、圧力下、カラムの中をポンプで送液される溶媒混合物を用いてカラム上で分離される。当業者であれば、日頃の試行錯誤および一般常識によって、とりわけ分画される量、調査対象である植物原料、および抽出に使用される溶媒の性質などに応じた、好適なカラム充填剤、ポンプによる送液圧力、流速および移動相を容易に同定することができよう。
【００７３】
生成規模でのクロマトグラフィーによる分画には、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、逆相ＨＰＬＣ）と共同して行う（後にＨＰＬＣを伴う）流出分画（順相流出分画）が含まれる。流出分画は、溶媒流出速度を速めるために圧力の印加を伴う、分取カラムクロマトグラフィーの一形態であって、種々の支持体を使って実施することができる。
【００７４】
この分画には、気−液クロマトグラフィー（濃縮抽出物の分画に関する項に記載したように）を含むことも可能である。
【００７５】
減損抽出物のクロマトグラフィーによる分画
本発明の任意の非極性分画プロセスは、非極性抽出物を疎水相互作用または逆相クロマトグラフィーにかけ、脂肪およびクロロフィル中の減損抽出物を生成し、減損抽出物をクロマトグラフィーによって分画して１つまたはそれ以上の非極性植物化学物質を含む１つまたはそれ以上の非極性画分を生成することを含む。
【００７６】
減損抽出物のクロマトグラフィーによる分画は解析規模で実施することが可能である。解析規模の分画は、プロフィーリング、スクリーニングおよび規格（品質管理）の各用途、ならびに比較的少量の物質しか必要とされないライブラリーおよびライブラリーの形成において有用である。
【００７７】
解析規模のクロマトグラフィーによる分画には、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が含まれる。ただし、代替手段として、気−液クロマトグラフィーを使用するかまたはＨＰＬＣと共同して気−液クロマトグラフィーを使用することも可能である。
【００７８】
生成規模での減損抽出物のクロマトグラフィーによる分画には、好ましくは、前記したように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、逆相ＨＰＬＣ）と共同して行う（後にＨＰＬＣを伴う）流出分画（順相流出分画）が含まれる。
【００７９】
極性化学物質の場合、分画に、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオンおよび／またはアニオン交換クロマトグラフィー）および／または吸着クロマトグラフィー（例えば、中性アルミナクロマトグラフィー）を含むことも可能である。
【００８０】
画分の収集および単離
本発明の方法が、とりわけ植物化学物質のライブラリーの形成または単離された植物化学物質の生産に適用される場合、画分の一部または全部を収集して単離する。
【００８１】
画分の収集は、自動検出システム、または手動もしくは自動式時間依存収集によって行うことが可能である。収集の規準は、所定量の溶離液の収集、特定溶媒の溶離液の収集、検出システム（例えば、ＭＳもしくは電気化学的検出）に基づいた特定画分の収集、またはその他任意の所定の規準によって決定される。自動システムは、その起源、使用される分離法および収集規準を含めて、個々の試料を追跡できることが好ましい。
【００８２】
画分の順序づけおよび配列
単離された画分は、各画分用に分離した場所を有する物理的支持体上に順序だった配列をなして分配される。物理的支持体は、例えばマイクロタイタープレートまたはカプセルである。単離された画分は乾燥（例えば、凍結乾燥）してもよい。
【００８３】
好ましくは、収集されかつ単離された各画分は、物理的支持体上の識別子と関連付けられる。識別子は、例えば、バーコードまたは行と列であらわされる位置である。配列における各画分の識別子は、関連のデータ配列に格納される。このデータ配列によって、各画分の源、ならびにその調製に使用した諸条件、例えば、妨害物の除去に使用したカラム、分離に使用したカラム、クロマトグラフィーの条件、収集規準、および支持体上の各試料の物理的位置などが確認される。データ配列を含みその結果画分の物理的配置を読み取るようなデータベースを作ると好都合である。
【００８４】
画分の物理的状態
画分の物理的状態は、画分の調製に用いられる分画手法に依存し、また、その用途および化学成分によって異なる。
【００８５】
いくつかの実施形態（例えば、本発明の植物化学物質ライブラリー）においては、所与の単離画分のいずれにおいても単離された植物化学物質は本質的に唯一の植物化学物質である。しかしある場合には、本発明のライブラリーは、複数の異なる植物化学物質、例えば約１００未満、好ましくは約１５未満、最も好ましくはわずか約５つ未満の異なる植物化学物質を含有する単離画分を含む。
【００８６】
単離されかつ精製された植物化学物質、例えば約９０％の純度まで（例えば、９０％を上回る純度までまたは９９％を上回る純度まで）精製された植物化学物質を含有する画分は特に好ましい。
【００８７】
画分の特徴づけ
本発明の方法の多くの用途において、画分は何らかの形の特徴づけをされる。特徴づけの形は、用途の性質および採用する特徴づけの手法によって決まる。
【００８８】
一般に、下記の方法のいずれかまたはすべてを用いることが可能である。
【００８９】
（ａ）機能による特徴づけ
この形の特徴づけは、生物活性を有する植物化学物質の存在を捜して植物をスクリーニングするのに本発明の方法を使用するような用途において、得に有用である。しかし、この特徴づけは、注文に応じて特別に植物化学物質ライブラリーを形成する場合、プロフィーリング、スクリーニング、規格（品質管理）などの用途、ならびに定義済み抽出物および単離された生物活性植物化学物質のライブラリーの形成においても使用可能である。
【００９０】
機能による特徴づけにはバイオロジカルアッセイを含めることができる。バイオロジカルアッセイはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われるが、酵素阻害アッセイ（例えば、グリコシダーゼおよび／またはリパーゼ阻害）を含んでよい。その他のバイオロジカルアッセイの例としては、受容体結合アッセイ、細胞アッセイ（細胞複製、細胞−病原体および細胞−細胞相互作用、ならびに細胞分泌アッセイを含む）、イムノアッセイ、抗菌作用（例えば、細菌およびウイルスの細胞結合および／または複製）アッセイ、ならびに毒性アッセイ（例えば、ＬＤ50アッセイ）が挙げられる。
【００９１】
（ｂ）物理的特徴づけ
この形の特徴づけは、あらゆる用途において本発明の方法の補足となり有用である。この特徴づけは、任意の所与の画分に存在するまたは本方法のその他の段階で存在する植物化学物質の定量、構成成分の純度の測定、分子量（もしくは分子量分布、もしくは複数の異なる植物化学物質構成成分を含む画分の場合、その様々な統計的相関関係）の決定、精製された単一化学物質の場合における分子式の決定（例えば、核磁気共鳴による）、ならびに種々のスペクトル解析などの形を取り得る。
【００９２】
特に有用なスペクトル特性には、
・質量スペクトル（例えば、荷電数当たりの質量（ｍ／ｚ）対存在量）および／または
・クラマトグラフィーによるデータ（例えば、スペクトル、カラム保持時間、溶離液プロファイル等）および／または
・ホトダイオードアレイ（ＰＤＡ）スペクトル（例えば、ＵＶおよび可視両領域において）および／または
・核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（1Ｈおよび／または13ＣＮＭＲを介して得られたスペクトルデータセットを含む）
が含まれる。
【００９３】
スペクトルによる特徴づけは、分画工程と合体させることができる。例えば、ＧＣ−ＭＳやＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳを使用して（本明細書に記載のように）、分画と質量スペクトル、ＵＶ−可視スペクトルおよびクロマトグラフィーによるデータを得ることを合体させることができる。
【００９４】
前記特性のいずれかまたはすべてを用いて、任意の所与の植物（任意の画分またはその植物化学成分）について「ケミカルフィンガープリント」を定義することができる。
【００９５】
（ｃ）化学的特徴づけ
この形の特徴づけは、あらゆる用途において本発明の方法の補足となり有用である。この特徴づけは、とりわけ植物化学成分の化学的反応性、溶解性、安定性および融点の測定という形を取り得る。
【００９６】
植物プロフィーリング
一般に、植物プロフィーリングは、単一の植物種を解析することによって、その植物化学成分に関係した多数の特性（一般に１０〜１００の間）を定義することを含む。例えば、典型的な植物プロファイルは、多数（典型的な場合で１０を上回り、好ましくは５０を上回り、しばしば１００を上回る）の分画抽出物の質量スペクトルおよびＰＤＡスペクトルを含むであろう。
【００９７】
また、植物プロフィーリングは、単一の植物種を解析することによって、一群の定義済み化学物質の存在を検出することも含む。このようなプロフィーリングの手法は、プロファイルが、収集された植物化学成分（典型的な場合で５を上回り、好ましくは１０を上回り、しばしば２０を上回る）に関係したスペクトルデータを含んでいるような植物抽出物（およびそれらの画分）に適用することも可能である。
【００９８】
このようにしてプロフィーリングされた植物抽出物および画分は、それぞれ「定義済み抽出物」および「定義済み画分」と呼ばれる。なぜならば、それらプロファイルによって、抽出物／画分に関する標準規格を確立することが可能になり、その結果、引き続き調製された抽出物／画分がその標準規格に応じたものかどうかをテストできるようになるからである。このことは、バッチごとの変化を最小に抑えなければならない、抽出物、画分または植物化学組成物のバルク生産に本発明の方法を適用する場合、特に有用である。
【００９９】
「標準規格」を確立するために、プロフィーリングの手法を、精製された植物化学物質を含む基準植物、基準抽出物、基準画分または基準組成物に適用することができる。「標準規格」とは、基準とする植物、抽出物、画分または組成物の一群の特性（またはプロファイル）である。各場合における基準は、機能、組成および／または純度に関して典型的であることに基づいて選択される。したがって、標準規格は、試験対象（例えば、植物、その抽出物もしくは画分、またはそれらから得られる植物化学組成物）が標準規格をどの程度満たしているかを決定するために、品質管理手続きのなかで使用することができる。
【０１００】
このような手法は、品質管理手続きにおいて、特に定義済みの抽出物、植物化学組成物および生薬製品の生産において極めて重要である。
【０１０１】
植物化学物質ライブラリー
本発明の植物化学物質ライブラリーは、広範囲にわたる植物化学物質の順序だてられた配列を、好ましくはスクリーニング（例えば、ハイスループットスクリーニング）に好適な形で含む。生物学的アッセイのスクリーニングに好適なライブラリーは特に好ましい。
【０１０２】
前記配列は、単離され収集された画分の試料がその上または中に配列された固体支持体の形をなしている。好適な固体支持体であればいずれの支持体も使用できる。容器（例えば、カプセル、チューブまたはガラス瓶）、各種膜またはプレート（例えば、マイクロタイタープレート）は特に好ましい。試料を乾燥するおよび／または固体支持体に吸着させてもよい。
【０１０３】
画分／植物化学単離物質の配列をデータと関連づけることが好ましい。データによって、例えば植物源、および画分または植物化学単離物質を得るために使用される処理条件が確認される。
【０１０４】
以下に、本発明を具体的な実施例に関して説明する。これら実施例は単に本発明を説明するためのものであって、本明細書に請求の独占の範囲または本明細書に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０５】
イオン種の結合
乾燥植物原料１０ｇを２５０ｍｌのコニカルフラスコに入れ、次いで、十分量の５０％エタノール水溶液を加えて植物原料を浸し、同水溶液が植物原料の上方２ｃｍ高さになるようにする。これを１５時間または一晩放置して抽出を行う。
【０１０６】
抽出物を、ブフナー漏斗を用いてろ過する。植物原料は、廃棄するかまたは引き続き行うジクロロメチル（ＤＣＭ）での抽出用に残しておく。ＤＣＭ抽出工程用には新たな乾燥原料を使用することが好ましいが、十分な原料が入手できない場合には、同原料を使って引き続く抽出を行うことができる。また同原料を使って成分の特徴づけまで行うこともある。
【０１０７】
Ｄｏｗｅｘ５０樹脂（５０〜１００メッシュ）に過剰の２ＮＨＣｌを加えて最低１５分間浸し、調製する。次いで、同樹脂を、過剰の脱イオン水で洗浄してｐＨ７とする。調製した樹脂を１０×１ｃｍのため付きカラムに注ぎ入れる。カラムを５０％エタノール水溶液２５ｍｌで洗浄し、植物試料の形成に用いたと同様の溶媒と平衡させる。
【０１０８】
各カラムのためを、樹脂をゆっくり通過することができる抽出物で満たす。
【０１０９】
未結合試料約３０ｍｌの画分を大ガラス瓶に収集し、ラベルをはり、ＨＰ−２０スカベンジング用に保存する。１または２付近とすべき溶離液のｐＨをモニターする。ｐＨが６または７まで上昇している場合は、樹脂が消耗している。このようなｐＨ上昇が発生したら、カラムの最上部に樹脂を少量加え、必要ならば試料全体を再度カラムに適用して全イオン性成分が結合していることを確認する。カラムに試料全体を適用した後、５０％エタノール水溶液７５ｍｌで洗浄し、次いで水７５ｍｌで洗浄する。これら洗浄液は廃棄する。水は、結合した成分を溶離する前にアルコールを除去するために使用する。
【０１１０】
カラムを２Ｎ水酸化アンモニウム１００ｍｌで溶離し、２５０ｍｌ丸底フラスコ内に収集する。溶離液を、４０℃未満の回転エバポレータで３〜５ｍｌになるまで蒸発させ、秤量済み７ｍｌガラス瓶に移す。乾燥は、窒素を使ったブローダウンおよび／または凍結乾燥によって完了する。各試料を同じ日に乾燥するよう、また、必要（一般に１５分未満）以上に長い時間試料をアンモニア溶液中に放置しないよう注意する。さもないと、化合物の分解が起こることがある。各乾燥試料１〜３ｍｇをＧＣガラス瓶に入れ、解析前に再度凍結乾燥する。
【０１１１】
非イオン種のスカベンジング
本プロセスは、前記したＤｏｗｅｘ５０カラムからの未結合抽出物を利用する。
【０１１２】
Ｄｏｗｅｘ５０カラムからの未結合抽出物３０ｍｌを大ガラス瓶に収集する。Ｓｅｐ−ｐａｋ真空マニホールドをＳｅｐ−ｐａｋカートリッジと共に（これらはＨＰ−２０樹脂を含有する）使用する。Ｓｅｐ−ｐａｋカートリッジを５ｍｌピペットの先端を使って修正すると大きなカラムになる。
【０１１３】
大きいガラス瓶または小さいビーカーをカートリッジの下に置き、廃棄物を収集する。試料５ｍｌをＳｅｐ−ｐａｋカートリッジに詰める。穏やかな真空を適用してカートリッジの中を通過するように試料を引き寄せ、一定の速さで滴下させる。試料がカートリッジ内のＨＰ−２０樹脂の上に積まれたら、２５％メタノール水溶液３ｍｌでカラムを洗浄する。この液を前記と同じビーカー／ガラス瓶に集め、内容物を廃棄する。この洗浄の目的は、溶離の前に樹脂から糖類の大部分を取り除くことである。糖類は、エタノール水溶液植物抽出物中に一般に大量に存在する、ありふれた無用の代謝産物であり、除去しないと、試料解析の妨げになる。
【０１１４】
１０％アセトンメタノール溶液５ｍｌでカラムを溶離し、この試料を秤量済み７ｍｌガラス瓶に集める。試料を真空下で乾燥し、必要であれば引き続き凍結乾燥する。ガラス瓶を再度秤量し、試料を１０ｍｇ／ｍｌメタノール溶液とする。試料１５０μｌを解析用としてラベルをはったＨＰＬＣおよびＧＣガラス瓶に移す。
【０１１５】
非極性成分の抽出
円筒ろ紙を作り、乾燥および粉砕した植物原料、またはイオン性化学物質を除去した後に乾燥した植物原料１０ｇを添加する。５００ｍｌ丸底フラスコ内にガラスビーズを２〜３個入れ、次いでフラスコを加熱マントルに入れて、ジクロロメタン（ＤＣＭ）２００ｍｌを添加する。試料の円筒ろ紙をソックスレーチューブに入れて、これを丸底フラスコに取り付ける。ＤＣＭ１５０ｍｌをソックスレーチューブ内の試料に添加する。ソックスレー装置の最上部に冷却器を載置し、冷却水を出す。一定の還流速度が確立された時点で過熱マントルのスイッチを入れる。抽出が終わったら、過熱マントルのスイッチを切る。水を止める前にシステムをさらに３０分間冷却する。
【０１１６】
抽出物を周囲温度にまで冷却後、ソックスレーチューブ内に残留するＤＣＭはすべてサイフォンを通ってフラスコに入るようにした状態で、ソックスレー装置を分解する。フラスコをマントルから取り外す。ＨＰ−２０樹脂１００ｍｌを、ラベルをはった１０００ｍｌ丸底フラスコ内に入れ、次いでＤＣＭ抽出物を添加する。ＨＰ−２０／抽出物を真空下、４０℃未満に設定した回転エバポレータで乾燥するまで蒸発させる。乾燥樹脂を２５０ｍｌコニカルフラスコに移し、１０％アセトンメタノール溶液３×１００ｍｌで溶離する。この溶液を、フィルターを通して予め秤量してある５００ｍｌ丸底フラスコに傾しゃし、回転エバポレータで乾燥するまで蒸発させる。丸底フラスコを再度秤量して抽出物の重量を決定し、次いで１０ｍｇ／ｍｌメタノール溶液とし、ラベルをはったガラス瓶に移す。抽出物は、ＨＰＬＣ−ＰＤＡ／ＭＳおよびＧＣ−ＭＳによる解析の前にろ過しておく。
【０１１７】
注釈
（ａ）ＨＰ−２０樹脂
Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（住友製）は、スチレンジビニルベンゼンポリマー樹脂である。同樹脂は疎水性であって、親油性化合物および弱酸を吸着する。合成吸着剤ＨＰおよびＳＰシリーズは、マクロポアを有する不溶性３次元架橋ポリマーである。それらはイオン交換基またはその他の官能基を有していないが、表面積が大きく、ファンデルワールス力によって種々の有機物質を吸収することができる。このポリマーマトリックスは、芳香族（スチレンジビニルベンゼン）型またはアクリル（メタクリル）型のいずれかに分類することができる。
【０１１８】
一旦吸着されたら、化合物は、好適な溶媒を適用することによって樹脂から洗い流すことができる。ＨＰ−２０は下記のように使用され、植物のジクロロメタン（ＤＣＭ）抽出物から過剰量の脂肪およびクロロフィルを除去する。
【０１１９】
可溶化した抽出物を、真空下、樹脂上で乾燥する。この樹脂を、含有アセトン量を増やした（アセトン３０％まで）メタノールで溶離する。このメタノール溶液は、脂肪およびクロロフィルをＨＰ−２０に吸着させたままの状態で、問題の全化合物を洗い落とすのに十分である。ＨＰ−２０樹脂は、再利用するために、アセトンおよびヘキサンで洗浄して清浄にする。こうすることで、無用の化合物はすべて洗い落とされ、メタノールでの最終洗浄後には、樹脂は再度利用できるようになる。
【０１２０】
非イオン性化合物のスカベンジングのために、この抽出物の構成成分は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）抽出物の構成成分より極性が強い（より水溶性である）。したがって、ＨＰ−２０樹脂はやや異なる方法で使用され、１０％アセトンメタノール溶液で残留結合物質を溶離する前に、先ず２５％メタノール水溶液で樹脂から糖を洗い落とすことによって糖を問題の化合物から分離する。ＨＰ−２０樹脂を異なる仕方で使用する鍵は、同樹脂に吸着された物質の溶離に使用する溶媒系の極性にある。
【０１２１】
（ｂ）イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換工程は、イオン種を濃縮し、かつイオン種の解析を妨害する恐れのある汚染物質を除去する。最初に、試料を、約５０％水性アルコールを用いた抽出によって処理する。約５０％水性アルコールによって、各植物の極性成分はより極性の低い成分から分離され、また、抽出物に存在する可能性のあるいずれのタンパク質も変性される。次いで、抽出物をイオン交換クロマトグラフィーによって処理する。イオン交換クロマトグラフィーによって、各抽出物中のイオン性化合物（大部分はアルカロイド、アミノ酸および小アミン）は、やはり抽出物中に存在する非イオン性化合物（主として糖、脂肪および大部分のフェノール化合物）から分離され濃縮される。次いで、試料を酵素アッセイにてＧＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣによって解析する。
【０１２２】
ろ過した抽出物を、ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹脂であるＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂に充填する。この樹脂は、遊離酸もしくは水素（Ｈ+）の形態または例えばアンモニウム（ＮＨ4+）塩などの塩の形態のいずれかで使用し得る強酸性カチオン交換体である。この樹脂は前記いずれの形態でも溶液からのカチオンを吸着し、等数の対イオンを溶液中に放出する（Ｈ+またはＮＨ4+イオン、使用した樹脂の形態による）。Ｈ+の形態では、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂は、溶液（極度の強酸を除き）からのすべてのイオン性化合物をその電荷に関係なく吸着する。したがってこの形態は好ましい。
【０１２３】
抽出物のカチオンが吸着すると、樹脂からはプロトンが追放され、その結果、試料の濃度にもよるが、溶離液のｐＨはｐＨ６．０（樹脂の使用前に樹脂の水洗に使用した蒸留水のｐＨ）からｐＨ２．０まで低下する。試料を希釈すれば、それだけｐＨの低下は小さくなる。しかし、一旦樹脂の容量を達成してしまうと、試料の充填を続けることによってｐＨは粗抽出物のｐＨにまで上昇する。
【０１２４】
Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂（５０〜１００メッシュサイズ）を２ＮＨＣｌで洗浄することによって調製し、Ｈ+の形態に変換されていることを確かめる。過剰な酸を、蒸留水でまんべんなくすすいで除去する。粗抽出物を樹脂に充填した後、溶離液のｐＨが上昇して蒸留水のｐＨになるまで、カラムを蒸留水で洗浄し、すべての未結合物質を除去する。結合した化合物は、水酸化アンモニウム（ＮＨ4+ＯＨ-）の２Ｎ溶液で溶出する。カラムを水で洗浄してｐＨ６．０とし、減圧下、４０℃にて回転エバポレータを使用した蒸発によって、試料からアンモニアを除去する。
【０１２５】
化学物質のＨＰ−２０によるスカベンジングに向けて、イオン交換樹脂に結合しなかった物質の体積を、減圧下の蒸発により低減しておく。
【０１２６】
（ｃ）ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）
この手法は、濃縮され、スカベンジングされかつ減損している抽出物の構成成分の検出および定量に使用される。
【０１２７】
気−液クロマトグラフィーは、揮発性物質の複合混合物を、圧力下にある不活性ガスと加熱カラム内の不活性支持体上にコーティングされた不揮発性液体の薄層の２相間に分配することによって、その構成成分に分離する方法である。混合物の状態にある特定の化合物を好適に分離するためには、適正な特徴を有するカラムを仕様することが極めて重要である。固体支持体の性質、液相の種類および量、充填法、全長、ならびにカラム温度は重要なファクターである。非極性液相でコーティングされたキャピラリーカラム（２５ｍ×０．２２ｍｍ内径×０．２５μｍＢＰＸ５固定相、ＳＧＥ社製）またはその等価物が好ましい。
【０１２８】
多くの化合物は、その極性の強さ、揮発性の低さまたは熱不安定性のために、ガスクロマトグラフに直接注入するには不適当である。高度にヒドロキシル化されている化合物は、分子間の水素結合によって蒸発しにくくなっている。しかし、ヒドロキシル基の水素原子を他の化学基で置換することによって、そのような化合物も十分揮発性となりＧＣ解析ができるようになる。ヒドロキシル基の誘導体を形成する最も一般的な２つの手段は、アセチル化とシリル化であって、それぞれアセチレート［ＣＨ3ＣＯ−Ｏ−Ｒ］またはシリルエーテル、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテル［（ＣＨ3）3Ｓｉ−Ｏ−Ｒ］が形成される。解析の前に、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、Ｓｉｇｍａ  Ｓｉｌ  Ａ（トリメチルクロロシランとヘキサメチルジシラザンとピリジンの１：３：９混合物）を用いて試料をシリル化しておくことが好ましい。誘導体形成処理は、密封ガラス瓶内で乾燥物質１ｍｇ当たりＳｉｇｍａ  Ｓｉｌ  Ａ１００μｌを添加することによって達成される（試薬は水の存在下で分解する）、また、反応は試料を６０℃で１５分間加熱することによって完了する。
【０１２９】
誘導体が形成された各試料内のトリメチルシリルエーテルを、温度プログラムを使ってカラム上で分離する。このように温度プログラムを使うことによって、沸点が広範にわたる各化合物の分離を迅速に行うことができる。
【０１３０】
電子衝撃質量分析においては、分離され気化された化合物を含んだガスクロマトグラフィーからの流出物を、高度に真空状態にある質量分析器のイオンチャンバー内を通過させる。分子をイオン化しフラグメント化するフィラメントからの加速された電子線によって、分子に衝撃を与える。最初に、各分子から一個の電子が取り除かれ、正に帯電した分子イオン（Ｍ+、すなわちラジカルカチオン）が形成される。分子イオンにおいては、結合強度に対して結合の破壊がただちに起こり、フラグメントイオンを生じる。分子フラグメントが極めて特徴的であるそのあり方を、「フィンガープリント」による識別の１つの形として利用することができる。様々なイオンが加速されて質量分析器の解析部分に入り、そこで、フラグメントの分子量に相当する荷電数当たりの質量（ｍ／ｚ値）によって振り分けられる。イオンのシグナルは電子増倍管によって増幅され、質量スペクトルが質量の小さいものから大きいものへとプロットされる。ｍ／ｚ値がイオンの相対的存在量に対してプロットされ、目に見える「フィンガープリント」が提供される。
【０１３１】
（ｄ）ＨＰＬＣ−ＰＤＡ／ＭＳ／ＥＬＳ（蒸発光散乱検出法）
この手法は、スカベンジングされた減損抽出物の構成成分を検出しかつ定量するために使用される。この手法を用いて、試料を好適な溶媒に溶解し、圧力下、カラムの中をポンプで送液される溶媒混合物を用いてカラム上で分離する。３つの検出器、すなわち前記したような質量分析器と、化合物がＵＶおよび可視両領域の波長において光を吸収するかどうかを測定するホトダイオードアレイシステムが使用される。
【０１３２】
前記各実施例においては、逆相Ｃ8ＨＰＬＣカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ内径×３．５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を取り付けたＷａｔｅｒｓ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ（商標）ＨＰＬＣ−ＰＤＡ／ＭＳシステムを使用した。カラムの中を流れる溶媒の流速は０．３５ｍｌ／分とし、水９０％およびアセトニトリル１０％（０．０１％トリフルオロ酢酸を含有）から始める直線グラジエントを使用した。６分かけてアセトニトリル１００％にし、さらに６．５分間その状態を維持した。
【０１３３】
吸収量（ホトダイオードアレイ−ＰＤＡ）のデータは２００〜６００ｎｍの範囲で集め、質量スペクトルのデータは７１〜６００ｍ／ｚの範囲で集めた。
【０１３４】
均等物
上述した内容は、現在好ましいとされる本発明の実施形態を詳述したものである。当業者であれば、これら記載内容を考慮して、前記実施形態には実際に多くの修正および変更を加えうることが予想されるであろう。そのような修正および変更も本明細書に添付の請求項の範囲内に含むものとする。
【国際調査報告】
2006505765.tif 000002
2006505765.tif 000003
2006505765.tif 000004