(57)【要約】本発明は、ヒト被験者における血管新生または血管形成を伴う疾患状態の進行をモニタリングする方法を提供し、前記方法では、前記疾患の部位から得られた細胞を含む試料において、表1（表1とは、表1a〜1fのいずれかの1以上を意味する）に示す少なくとも1種の遺伝子の転写産物レベルの定量的測定を行って、対照の細胞試料から得られた少なくとも1種の遺伝子の転写産物レベルと比較する。表1の転写産物は、血清の除去後を含めた、さまざまな異なる条件下で、統計的有意性でもってVEGFに応答することが見出される。本発明はまた、前記方法に使用することができる、適切な対照と共に転写産物の全部または一部から構成される遺伝子チップアレイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者における血管新生または血管形成を伴う疾患状態の進行をモニタリングする方法であって、
前記疾患の部位から得られた細胞を含む試料において、表1に示す少なくとも1個の遺伝子の転写産物レベルの定量的測定を行うこと、および
そのように測定した転写産物レベルを、対照の細胞試料から得られた少なくとも1個の遺伝子の転写産物レベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記対照試料が、より早期の時点で前記患者の疾患部位から得られたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記対照試料が、前記患者の非疾患組織中の内皮細胞から得られたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記測定を前記患者の一続きの治療後に行う、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
転写産物レベルを、少なくとも1種の転写制御物質、少なくとも1種のアポトーシス制御物質、少なくとも1種の増殖因子または増殖因子受容体、および少なくとも1種の接着/基質タンパク質に関して測定する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも5個の遺伝子の転写産物レベルを測定する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも10個の遺伝子の転写産物レベルを測定する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
表1aの少なくとも1個の遺伝子に関する転写産物レベルを測定する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子チップ・アレイとのハイブリダイゼーションによって転写産物レベルを測定する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
定量PCRによって転写産物レベルを測定する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患状態が、固形腫瘍を含めて、望ましくない細胞増殖を伴う疾患である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患状態が血管構造の欠如と関係がある、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法で使用するための遺伝子チップ・アレイであって、表1に示す少なくとも1個の遺伝子を検出するための少なくとも1つの核酸、場合によっては前記少なくとも1個の遺伝子に特異的な対照、および場合によっては前記遺伝子チップ用の少なくとも1つの対照を含む、遺伝子チップ・アレイ。
【請求項１４】
血管新生または血管形成の調節物質に関するアッセイ方法であって、
(a)表1から選択したタンパク質を用意すること、
(b)前記タンパク質をその活性の候補調節物質と接触させること、および
(c)前記候補調節物質が前記タンパク質の活性を調節できるかどうかを決定すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項１５】
前記候補調節物質が、前記タンパク質と結合する抗体またはその結合性フラグメントである、請求項14に記載のアッセイ方法。
【請求項１６】
前記候補調節物質が、前記タンパク質の断片またはその擬似体である、請求項14に記載のアッセイ方法。
【請求項１７】
血管新生または血管形成の調節物質に関するアッセイ方法であって、
(a)培養中の内皮細胞を用意すること、
(b)前記細胞を血管新生の候補調節物質と接触させること、および
(c)前記候補調節物質が、表1の遺伝子から選択した少なくとも1個の遺伝子の転写を調節できるかどうかを決定すること、
を含むアッセイ方法。
【請求項１８】
前記候補調節物質がアンチセンス・オリゴヌクレオチドである、請求項17に記載のアッセイ方法。
【請求項１９】
ヒト患者の血管新生または血管形成の調節方法における、請求項14〜18のいずれか一項に記載のアッセイ方法から得られた調節物質の使用。
【請求項２０】
EST配列の転写用のプロモーターと作動可能に連結された、表1からの前記EST配列を含むベクター。
【請求項２１】
前記EST配列が、前記配列の翻訳のための翻訳開始領域とインフレームで連結している、請求項20に記載のベクター。
【請求項２２】
前記EST配列がアンチセンス配向をとる、請求項20に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、VEGFに応答する内皮細胞の遺伝子発現プロファイル、ならびに診断および治療におけるそのプロファイルの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
新しい毛細管が既存の血管から発生するプロセスである血管新生(angiogenesis)は、生理的および病的状態において主たる役割を果たしている。新しい毛細管網状構造の発生は、基底膜の分解および細胞外マトリックスのタンパク質分解と、それに付随して内皮細胞の増殖および移動、痕跡の血管構造の形成、および細胞外マトリックスの改造を伴う複雑なプロセスである。血管新生の制御は、血管新生誘導物質と阻害剤の間のバランスによって起こると考えられており、これらの多くは標的細胞上の特異的な受容体と相互作用する。ペプチド性および非ペプチド性のいくつかの因子が、in vivoで血管新生を誘導することが示されている。すなわち、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子α(TGFα)およびトランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)、腫瘍壊死因子α(TNFα、in vivo)、アンギオゲニン、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子(aFGF/bFGF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、PGE2およびモノブチリンである。血管新生の阻害剤は、複合ステロイドから、トロンボスポンジン、血小板因子IV、TNF-α(in vitro)、TGF-β、インターフェロン、アンギオスタチン、インテグリン阻害剤、16-kDプロラクチンを含めたポリペプチドまでの範囲で同定されている。
【０００３】
内皮は一般に、健康な成人の組織中では静止状態である。顕著な例外は女性の生殖管であり、この場合、追加的な血管構造の必要性が、一過性の構造の定期的な進化と、損傷した組織の周期的な回復により絶えず課される。雌性マウスの生殖経路の広範囲かつ全面的な破壊が、血管新生阻害剤AGM-1470で処置したマウスにおいて、近年記載された(Klauber N他、1997 Nature Medicine No.4 443〜446)。これらによって、卵巣および子宮内膜の周期が無くなり、動物が不妊症になる可能性があり、脱落膜および胎盤形成も全身の血管新生の阻害により害されたことも示された。雌性生殖系の周期的な血管新生事象はホルモンによって調整されている可能性が最も高く、その作用は、直接的あるいは間接的にホルモン誘導性である血管新生因子によって媒介されている可能性がある。卵巣、子宮、および胎盤組織は、血管新生因子および抗血管新生因子を含み、かつこれらの因子を産生することが示されている。これらのさまざまな血管新生因子の中で、VEGFは、それがこれらの組織中で重要な役割を果たすことを示唆する、いくつかの特異な性質を有する。具体的にはVEGFは、血管内皮細胞の有糸分裂誘発、血管透過性を促進し、また、新血管形成のプロセスに関与するいくつかのタンパク質分解酵素の産生も調節する。したがってVEGFは、新血管形成のすべてのステップを制御することができ、雌性生殖管および他の組織の生理的および病的血管新生において、重要である可能性がある。VEGF結合部位は多くの成体組織中で検出されており、このことは、VEGFが血管新生においてだけでなく、既存の血管の維持においても重要でありうることを示している。
【０００４】
血管系の発生におけるVEGFの中枢的役割は、近年のデータによってさらに強調されている(Risau (1997、Nature 386 671〜674)によって近年検討された)。単一のVEGF対立遺伝子の損失によって胚の致死がもたらされ、これは、VEGFレベルの比較的穏やかな低下でさえも、重大な影響を及ぼし得ることを示す。遺伝子ノックアウトの研究によって、Flt-1およびKDR (VEGFの受容体)が、胚の血管構造の発生および分化に必須であることも実証されている。Flt-1遺伝子がないマウスは、血管形成および血島形成を欠き、8.5日目と9.5日目の間に子宮内で死亡した。Flt-1遺伝子座の標的突然変異について同型であるマウス胚は、中期原節ステージで子宮内にて死亡した。
【０００５】
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は、ヘパリン結合性で、30〜46kDaの分泌型ホモ二量体糖タンパク質であり、血管透過性因子としても知られている。VEGFは血管内皮の強力なマイトジェンであり、強力な血管透過性促進活性を有し、血管新生に関与するいくつかのタンパク質分解酵素の発現を調節し、さらに、新しく形成された毛細血管の維持における役割も有する。
【０００６】
VEGF遺伝子の分析によって、タンパク質コード領域が8個のエキソン中に配置されていることが明らかになっている。エキソンの選択的スプライシングによって、VEGFの5個の異なるmRNAが生じ、これらはそれぞれ121、145、165、189および206個のアミノ酸を有する(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206)。大部分の組織では、121および165アミノ酸の形態が優位を占め、145アミノ酸の形態が一般的に最も珍しい。ヒト子宮内膜および胎盤組織におけるこの形態が最初に記載され(CharnockJones DS他、1993 Biology of Reproduction 48:1120〜1128)、他の形態のVEGFが共有していない特異な特徴を有することが最近示されている(Poltorak Z他、1997 Journal of Biological Chemistry USA、7151〜7158)。げっ歯類およびウシのVEGFは、１アミノ酸短いと推定されるが、一般的には高度に保存されている。近年、VEGFと相当な相同性を示すいくつかの他のタンパク質が同定されている。これらは胎盤増殖因子(PLGF)(Maglione D他、1993 Oncogene 8 925〜931)、VEGFB(Olofsson B他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:2576〜2581)、VEGFC(Joukov V他、1996 EMBO Journal15:290〜298)およびVEGFD(Yamada Y他、1997 Genomics 42 483〜488)と名付けられている。胎盤増殖因子はVEGFとヘテロ二量体を形成することができ、これらのヘテロ二量体はVEGF受容体の1つと結合できることが示されている。しかしながら、これらはVEGF165ホモ二量体より20〜50倍低い分裂促進性を有する。
【０００７】
VEGFは2つのチロシンキナーゼファミリー受容体を介して作用し、これらはc-fms様チロシンキナーゼ(f1t-1)およびキナーゼドメインインサート含有受容体(KDR)である。flt-1とKDRの両方は、それらの細胞外ドメインに7個の免疫グロブリン(IG)様ループを有し、これらは5個を有する以前に記載されたクラスIII受容体チロシンキナーゼとは異なっている。これらはまた、1つの膜貫通領域と、キナーゼインサート領域が介在する共通のチロシンキナーゼ配列とを含んでいる。Flt-1の第二のIG様細胞外ドメインは、リガンド結合および特異性に必要不可欠である。両方の受容体とも、VEGFと高い親和性で結合することが示されている。Flt-1は10〜20pMのKdでVEGFに対して最高の親和性を有し、KDRはより低い100〜125pMのKdを有する。KDRのマウス相同体である胎児肝キナーゼ-1(Flk-1)も同定されており、ヒトKDRと85%の配列同一性を共有している。Flt-1およびKDR/Flk-1のいずれのmRNAも、胎児および成体組織の血管内皮細胞中で主に発現される。これらはまた、末梢血単球、悪性メラノーマ細胞系、栄養芽細胞様絨毛癌細胞系BeWo、および腹水マクロファージを含めた、非内皮細胞上でも見られる。Flt-4チロシンキナーゼ受容体は、VEGF受容体であるflt-1およびKDRと関係があるが、VEGFとは結合せず、その発現は主に発生中のリンパ内皮に限られる。flt-1、KDR/Flk-1およびflt-4のmRNAは異なる発現パターンを有し、いくつかの内皮はこれら3つの受容体mRNAのうち1つまたは2つを欠いている。このことは、この遺伝子ファミリーによってコードされる受容体チロシンキナーゼが、血管の成長/分化の制御において、異なる機能を有する可能性があることを示唆している。
【０００８】
大部分の成体組織を供給する血管は安定しており、それらの内皮細胞は静止状態であり、アポトーシスに耐性がある。しかしながら、組織再構築の間、血管は形成的になり、それらが供給する組織の変化要件を満たすように、それら自体が再構築される。このことは、腫瘍の退行および女性の生殖器官内で起こる毎月の萎縮において最も明白である。この血管再構築の1つの重要な要素は、内皮細胞のアポトーシスである。
【０００９】
生存シグナルの除去によって、血管再構築中に内皮細胞のアポトーシスが増大する可能性がある。in vitroでは、内皮細胞のアポトーシスは、線維芽細胞増殖因子(FGF)-I、FGF-II、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)-Aまたはアンギオポイエチン(Ang)-1の除去によって誘導される。in vivoでは、アンドロゲン除去療法によるヒト前立腺腫瘍の治療によって、前立腺上皮のVEGF-Aの生産低下がもたらされ、次いでこれが、新しく形成された腫瘍血管中の内皮細胞の選択的アポトーシスを引き起こす。重要なことに、これらの腫瘍においては、生存因子の除去により仲介される内皮細胞のアポトーシスは、腫瘍細胞自体のアポトーシスに先行し、腫瘍血管の消失は腫瘍サイズの縮小に先行する。生存シグナルの除去が血管再構築中に内皮細胞のアポトーシスを誘導する可能性がある他のプロセスには、乳腺の退縮、胎盤の形成、および卵巣における黄体の周期的な退行がある。
【００１０】
転写産物の存在量を制御することは、十分に特徴づけられた翻訳後経路を補充して、生存因子の除去に続く内皮細胞のアポトーシスプログラムを調整することができる。例えば、転写因子p53の活性はいくつかのプロ-アポトーシス刺激によって誘導され、アポトーシスの最も重要な制御物質の多くは、p53標的遺伝子、例えばp21/WAF-1、14-3-3、Bax、Fas、DR5、PIG3およびTsp1などである。ディファレンシャル・ディスプレイおよび遺伝子アレイ実験によって、アポトーシス制御物質をコードする転写産物、およびp53によって誘導される機構が同定されている。アポトーシス中の内皮遺伝子発現を制御することが知られているもう一つの転写因子はNFkBである。健康な内皮細胞では、TRAF-1、TRAF-2、IAP-1およびIAP-2などの、抗アポトーシス遺伝子のNFkB活性化転写が、細胞の生存に不可欠である。内皮NFkB活性は、アポトーシスがリポ多糖、腫瘍壊死因子(TNF)-αおよびエトポシドにより誘導されると増大する。しかしながら、内皮細胞のアポトーシス中にNFkBが果たす役割は複雑でありうる。なぜなら、アポトーシス中のカスパーゼ仲介型のxIAPの切断はNFkB活性を低下させる可能性があり、また、NFkBは内皮細胞における保護遺伝子と前炎症遺伝子の双方の発現を促進しうるからである。他の転写因子、例えばE2FおよびMycファミリーなども、生存因子の除去により誘導される内皮細胞アポトーシスにおいて、何らかの役割を果たすと考えられる。
【発明の開示】
【００１１】
内皮細胞の専門化された性質およびVEGF-Aによるそれらの制御は、生命にとって不可欠である。一部には、それらの専門化は、先に記載した翻訳後のシグナル伝達カスケードの内皮特異的な組合せに依存している。しかしながら、これは最終的には、個別のRNA転写産物集団、すなわち内皮細胞のトランスクリプトームおよびその制御に依存している。
【００１２】
このことを検証するために、我々は、いくつかの異なる状況で遺伝子発現を分析した。最初に我々は、Affymetrix遺伝子アレイの発現データとSAGEデータを組み合わせて、どの転写産物がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において最も豊富であるかを決定した。第二に我々は、HUVECおよび他の細胞/組織型中に存在する相対的な転写産物の量を比較して、どの転写産物が内皮特異的であるかを決定した。
【００１３】
2つのさらなる実験において、我々はAffymetrixアレイのハイブリダイゼーションを使用して、HUVECがVEGF-Aにより誘導されて血清除去後に生存および増殖するとき、あるいは通常の培地中のHUVECがVEGFの添加によって刺激されるとき、のいずれかに生じる転写産物量の変化を同定した。この研究中に、我々は、異なる個体に由来する初代内皮細胞培養物が相当なトランスクリプトームの異質性を示すことも見出した。この知見に基づいて、我々は、単一の特異質(idiosyncratic)でありうる初代細胞培養物を使用するゲノム研究は、誤らせる可能性があることを提起する。
【００１４】
要するに、本発明において、我々は、内皮細胞における転写産物レベルがVEGF-Aに応答して改変される遺伝子を同定するために新規な方法を採用した。
【００１５】
従来技術では他の研究者たちは、遺伝子の活性がこの因子に応答して変わると考えられる各種遺伝子を同定しているが、本発明者らが採用した方法はいくつかの重要な点で相違している。これらは、初代細胞培養物の使用、5つの独立した試料の使用、およびVEGF-Aを加える前の血清飢餓の使用を含んでいた。特にこの後者のステップは、ある割合の細胞にアポトーシスを開始させるために採用したものであり、例えば腫瘍の治療が腫瘍の退行を招く状況において予想されるであろうことを模倣している。VEGF-Aを加えることにより、細胞の転写産物レベルが調節される。厳密な統計学的規準を使用して、我々は、VEGF-Aを加えた4時間後および24時間後に転写産物レベルが顕著に調節される遺伝子を同定した。驚いたことに、我々は、これら2つの時点において、4時間で同定した転写産物と24時間で同定した転写産物が、わずか2つの転写産物を同様に有していることを見出した。
【００１６】
我々はまた、細胞にストレスを与えるために、UVECに対して48時間の血清除去を使用した。我々は、確固たる再現性のある変化を同定したが、これらの変化は内皮細胞の運命が混乱するときに起こる全体的かつ特異的な変化の優れた指針となる。
【００１７】
したがって、本発明は、有用かつ新しい手法でいくつかの疾患状態のモニタリングを可能にする方法により、内皮細胞の運命を分析するための手段を提供する。いくつかの転写産物（自体公知の遺伝子とESTから公知の遺伝子の両方）の情報は、新規なアッセイ標的を提供し、疾患の新しい治療法の開発を可能にする。
【００１８】
いかなる理論によっても拘束されるものではないが、治療後4時間で顕著な調節を示す転写産物は、VEGFに対して直接的な応答を示す遺伝子であるが、24時間での転写産物プロファイルは、VEGF-Aの直接的な影響を反映する遺伝子のほかに、生存または恒常性維持機能を反映する遺伝子を含む可能性がある、と考えられる。
【００１９】
転写産物の異なる時間的プロファイルに加えて、個体の異質性が非常に重要であることが分かった。したがって、ある個体ではVEGFに応答して上方制御または下方制御されていると思われるいくつかの遺伝子が、他の個体で同様に制御されていないことが分かった。このようなばらつきを排除することによって、ヒト被験者におけるVEGFに対する真の応答を調べる際に、特に互いと共同して、使用しうると考えられる遺伝子のパネルを提供することが可能となった。
【００２０】
さらに、血清飢餓状態の細胞および非血清飢餓状態の細胞で見られるVEGF誘導発現の異なるプロファイルから、ヒト生体中の細胞がそれらの位置および性質に応じてVEGFに応答して経験する異なる応答が示される。例えば、女性の生殖管の細胞、または固形腫瘍の放射線療法もしくは他の治療を受けている細胞は、VEGFに対して、血清飢餓状態の細胞と類似した応答プロファイルを有するが、生体の他の位置にある細胞は非血清飢餓状態の細胞の応答プロファイルに類似した様式で応答すると考えられる。
【００２１】
多くの臨床状況において、血管新生は、望ましいものであれ望ましくないものであれ、臨床的結果の重要なマーカーである。アポトーシスが病因の顕著なまたは主要な特徴となる状態には、神経膠腫などの固形腫瘍、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病、SLE、脳卒中、アルツハイマー病、痴呆、高血圧、子宮内膜炎、異常子宮出血、卵巣過剰刺激症候群、肺炎、網膜症、黄斑変性症、不妊症、排卵、末梢血管疾患、末梢神経障害、アテローム性動脈硬化症、血管炎、糸球体腎炎、敗血症、敗血症性ショック、子かん前症、および子宮内生育遅滞がある。
【００２２】
したがって、先に挙げたまたは本明細書中の他の箇所で挙げた状態を含めて、VEGF-A（特に血管新生または血管形成）と関係がある状態を伴うヒトの医学的状態を診断および予後判定するための、信頼性のある確固たる方法の開発が引き続き必要とされている。
【００２３】
また、このような疾患の治療的介入のための新しい標的を同定する必要性も、当分野では引き続き存在する。加えて、このような標的に対して活性を有する治療薬を同定する必要性が存在する。さらに、これらの標的に対する前記薬剤の使用は、これらの疾患の治療および診断に有用でありうる。
【００２４】
第一の態様では本発明は、ヒト被験者における血管新生または血管形成を伴う疾患状態の進行をモニタリングする方法を提供し、前記方法は
前記疾患の部位から得られた細胞を含む試料において、表1に示す少なくとも1個の遺伝子の転写産物レベルの定量的測定を行うこと、および
そのように測定した転写産物レベルを、細胞の対照試料から得られた前記少なくとも1個の遺伝子の転写産物レベルと比較すること、
を含んでなる。
【００２５】
細胞の試料は内皮細胞であることが好ましい。
【００２６】
他の態様では本発明は、本発明の上記方法で使用するのに適した遺伝子チップ・アレイを提供し、前記アレイは、表1に示す少なくとも1個の遺伝子を検出するのに適した少なくとも1つの核酸、場合によっては前記少なくとも1個の遺伝子に特異的な対照、および場合によっては前記遺伝子チップ用の少なくとも1つの対照を含んでなる。
【００２７】
他の態様では本発明は、血管新生または血管形成の調節物質に関するアッセイ方法を提供し、前記方法は、
(a)表1から選択した遺伝子によってコードされるタンパク質を用意すること、
(b)前記タンパク質をその活性の候補調節物質と接触させること、および
(c)前記候補調節物質が前記タンパク質の活性を調節できるかどうかを決定すること、を含んでなり、
または、前記方法は、
(a)培養中の内皮細胞を用意すること、
(b)前記細胞を血管新生の候補調節物質と接触させること、および
(c)前記候補調節物質が表1の遺伝子から選択した少なくとも1個の遺伝子の転写産物レベルを調節できるかどうかを決定すること、
を含んでなる。
【００２８】
このような方法によって得られた調節物質は、ヒト患者の血管新生または血管形成を調節する方法において使用することができる。
【００２９】
他の態様では、ESTの同定により、治療的介入のために使用しうる新しい標的を開発することができた。したがって本発明は、EST配列の転写用のプロモーターと作動可能に連結された(operably linked)、表1からのEST配列を含むベクターを提供する。このようなベクターは、血管新生または血管形成における遺伝子の分析において、ESTによってコードされるタンパク質の発現に有用であり、例えば組換えタンパク質として、あるいは遺伝子治療用途において、ベクター自体が直接的な治療用途を有する可能性がある。
【００３０】
他の態様では本発明は、血管新生または血管形成を伴う状態を治療するために、患者の応答性をモニタリングする方法を提供し、前記方法は、前記患者由来の組織の試料を用意すること、前記試料をin vitroでVEGFと接触させること、および表1の1以上の転写産物の発現を調べる、ことを含んでなる。前記発現を、VEGF処理前の試料中の転写産物の発現と比較することが好ましい。一態様では、表1a、1bまたは1fに示す1以上の転写産物の発現を調べる。本発明のこの態様において、その発現が最も変化する転写産物は表1aまたは1bの転写産物であると見出される場合、これは、細胞が血清飢餓と類似した状態であったことを示す。これは疾患状態を示したり、または、例えば腫瘍の治療の場合には、抗血管新生治療処置に対する応答を示すことができる。表1fの転写産物の発現が最も変化していると見出される場合、これは、ストレスを受けておらず、したがって腫瘍の場合には治療に対して応答しない細胞、または場合によっては健康な組織の細胞を示すことができる。
【００３１】
表
表1aには、VEGF-Aを用いて処理した内皮細胞において、処理の4時間後にそのレベルが制御される転写産物を列挙する。
【００３２】
表1bには、VEGF-Aを用いて処理した内皮細胞において、処理の24時間後にそのレベルが制御される転写産物を列挙する。
【００３３】
表1cには、内皮細胞において、血清除去処理の48時間後にそのレベルが制御されるEST転写産物を列挙する。
【００３４】
表1dには、内皮細胞において、血清除去処理の48時間後にそのレベルが制御される、以前に特性決定された転写産物を列挙する。
【００３５】
表1eには、内皮細胞において、血清除去処理の48時間後にそのレベルが制御される、他の転写産物を列挙する。
【００３６】
表1fには、血清を補った培地で培養した細胞において、そのレベルがVEGFにより制御される転写産物を示す。
【００３７】
表2には、内皮細胞に豊富に存在する転写産物を列挙する。
【００３８】
表3には、子宮内膜組織またはBリンパ球細胞系Raji中よりも、HUVEC内皮細胞中において高レベルで発現される転写産物を列挙する。
【００３９】
発明の詳細な説明
表1
本明細書での表1への言及は、表1a、1b、1c、1d、1eおよび1fのいずれか1つを意味するものとして解釈すべきであるが、文脈が明らかに表1のこれらの構成部分のただ1つ(または、場合によっては2つまたは3つ)に関するものである場合は、この限りでない。
【００４０】
疾患の進行をモニタリングする方法
本発明では、患者の疾患の「部位から得られた」細胞の測定は、身体から取り出した後の試料に対して実施されるin vitro法を指すことが理解されるであろう。例えば生検におけるような、生体試料の取り出しは、そのままでは本発明の一部ではない。
【００４１】
先に説明したように、表1の遺伝子を同定するために使用する独特な方法は、血管新生または血管形成を伴う疾患状態の進行をモニタリングするための有用な手段である。我々が得たデータは、いくつかの遺伝子はVEGF-Aに応答して上方制御されるようであり、一方他の遺伝子は内皮細胞のアポトーシスをもたらす状態で上方制御されることを示している。したがって、望ましくない血管新生を伴う疾患の治療では、医師は、前者のカテゴリーの遺伝子が転写産物レベルの低下を示し、一方後者が転写産物レベルの増加を示す応答を探すであろう。
【００４２】
我々が同定した遺伝子の上方または下方制御は、患者の一続きの治療中に行うことができ、したがって、治療の有効性を評価することができる。例えば、多くの癌治療は種々の抗癌剤のカクテルを当てにしたものである。いずれか1つの特定のカクテルの有効性は、患者ごとに相違したり、あるいは、細胞が1種以上の薬物に対して耐性になる患者の治療過程で相違することがある。
【００４３】
本発明のこの態様では、初期の時点で、例えば治療前または一続きの治療と治療の間で、患者の疾患部位から得られた転写産物レベルに関して、比較を行うことができる。あるいはまた、前記患者の非疾患組織中の細胞の転写産物レベルとの比較を行ってもよい。もうひとつの選択肢は、対照のベースライン試料、または他の患者、より好ましくは患者集団からの病歴記録を提供することである。対照細胞は内皮細胞とすることが好ましい。
【００４４】
好ましい態様では、複数の遺伝子の転写産物パターンを調べることによって、本発明を実施する。その理由は、被験者ごとに個々の遺伝子の転写産物レベルが変わりうることが見出されたからである。例えば、表1aでは、被験者2〜5においてサイクリンD1の転写産物レベルが約1.5〜2倍上昇するが、被験者1ではほとんど増大しなかったことが観察されるであろう。したがって、いくつかの遺伝子に関して、転写産物レベルを評価することが望ましい。例えば、評価される遺伝子には、少なくとも1種の転写制御物質、少なくとも1種のアポトーシス制御物質、少なくとも1種の増殖因子または増殖因子受容体、および少なくとも1種の接着/基質タンパク質が含まれるであろう。
【００４５】
一般に、少なくとも5個、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個の遺伝子の転写産物レベルを測定する。
【００４６】
また、表1aまたは表1の他の構成部分の1以上の転写産物レベルを測定することが好適である。
【００４７】
1個以上の遺伝子の転写産物レベルは、どのような適切な手段によって測定してもよい。多くの異なる遺伝子の転写産物を調べる場合、好都合な方法は、遺伝子チップ・アレイに(直接、またはcRNAもしくはcDNAの作製後に)サンプルをハイブリダイゼーションさせることによるものである。
【００４８】
遺伝子チップ技術を使用する場合、遺伝子(本明細書で使用するこの語は、表1のESTを含む)はいずれもAffymetrixからの市販のチップ上に存在し、これらのチップを製造業者からのプロトコルに従い使用することができる。一般に、マイクロアレイを用意する方法、およびその使用は、例えばWO84/01031、WO88/1058、WO89/01157、WO93/8472、WO95/18376/、WO95/18377、WO95/24649、およびEP-A-0373203にも見出すことができ、これらの文献および当分野の他の文献も参照することができる。
【００４９】
表1は遺伝子の名称を提供し、これらを使用して、GenbankなどのデータベースからそれらのDNA配列を得ることができる。さらに、我々が使用したAffymetrixチップ上で用いられる個々の配列は、表中に与えるAffymetrix参照番号により決定することができ、これらは公に利用可能であり、Genbank参照番号と直接関連付けることができる。EST遺伝子配列も、Genbank参照番号により与えられる。当業者は、本発明を実施する際に、Affymetrix参照番号またはGenbank参照番号のいずれかを参照することができる。
【００５０】
これとは別に、または、それに加えて、例えば当分野で広く使用されているABI TaqMan(商標)技術に基づいて、定量PCR法を使用することができる。それは、いくつかの先行技術の刊行物に記載されており、例えばWO00/05409を参照することができる。PCR法は、適切な距離で離れている(典型的には50〜300塩基)、標的遺伝子の反対の鎖を標的とするプライマー対を必要とする。プライマーとして適切な標的配列は、前述のようにGenbank配列を参照することによって、決定することができる。
【００５１】
本発明の特定の用途は、望ましくない細胞増殖を伴う疾患（特に神経膠腫および肉腫を含めた固形腫瘍）の治療および予後判定に関するものである。このような疾患状態は、疾患の進行のために血管新生を当てにしており、したがって血管新生を阻止するか、あるいは血管の維持を妨げる治療が望ましい。
【００５２】
さらに、いくつかの疾患状態は血管構造の欠如と関係があり、例えば心血管病または本明細書で上述した他の状態などである。本発明によってこのような状態をモニタリングして、治療計画の有効性を検討することができる。
【００５３】
遺伝子チップ
従来技術は、非常に大きなアレイの一部として、表1a、1b、1c、1d、1eおよび1fの1個以上の遺伝子を含む遺伝子チップを提供するが、本発明において診断および予後判定に使用する比較的小さな遺伝子のセットの同定により、本発明で適切に使用するために特別に設計された小さなチップを提供することが可能となる。
【００５４】
したがって、本発明は、表1に示す少なくとも1個の遺伝子を検出するのに適した少なくとも1つの核酸、場合によっては前記少なくとも1個の遺伝子に特異的な対照、および場合によっては前記遺伝子チップ用の少なくとも1つの対照を含む、遺伝子チップ・アレイを提供する。望ましくは、アレイ中の配列の数は以下のようにする。すなわち、表1の転写産物を検出するのに適した核酸の数がnであり、個々の転写産物に特異的な対照核酸の数がn'（ここで、n'は0〜2n）であり、そして、前記遺伝子チップ上の対照核酸［例えば、「ハウスキーピング」転写産物、豊富な内皮細胞転写産物(表2の転写産物など)、内皮細胞中での発現レベルがより高い転写産物(表3の転写産物など)などを検出するためのもの］の数がm（ここで、mは0〜100、好ましくは1〜30）である場合、n+n'+mは、前記チップ上の核酸の少なくとも50%、好ましくは75%、さらに好ましくは少なくとも90%に相当する。
【００５５】
アッセイ方法
本発明のアッセイ方法は、さまざまなフォーマットで、例えばタンパク質または核酸成分に対して、あるいは培養中の全細胞において実施することができる。
【００５６】
1つのアッセイは、以下のことを含む:
(a)表1の転写産物によってコードされるタンパク質を提供すること、
(b)前記タンパク質をその活性の候補調節物質と接触させること、および
(c)前記候補調節物質が前記タンパク質の活性を調節できるかどうかを決定すること。
【００５７】
このアッセイ方法では、活性を調節できるかどうかの決定は、アッセイされるタンパク質の性質に依存するであろう。例えば、酵素機能を有するタンパク質は、酵素の基質の存在下で、活性を調節することができる調節物質の存在が基質のより速いまたはより遅い代謝回転をもたらすように、アッセイすることができる。基質は酵素の天然の基質であっても、合成の類似体であってもよい。いずれの場合も、基質は、その最終産物への変換をモニタリングするために、検出可能な標識で標識しうる。
【００５８】
受容体のようなリガンド結合機能を有するタンパク質に関しては、リガンド結合特性のアンタゴニズムまたはアゴニズムをもたらすような方法で、候補調節物質をリガンド結合機能について調べることができる。
【００５９】
転写制御物質のようなDNA結合活性を有するタンパク質に関しては、DNA結合または転写活性化活性を測定することができ、この場合、調節物質はこのような活性を高めるか、あるいは低下させるかのいずれかでありうる。例えば、DNA結合は移動度シフト・アッセイで測定することができる。
【００６０】
あるいは、タンパク質と結合するDNA領域は、レポーター遺伝子(および追加的に、必要ならば、前記DNA領域とレポーター遺伝子の間のプロモーター領域および/または転写開始領域)と作動可能に連結することができ、これにより遺伝子の転写を測定して、この転写の調節が起こる場合には、それを見ることができる。適切なレポーター遺伝子には、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはより好ましくは、緑色蛍光タンパク質などの蛍光レポーター遺伝子がある。
【００６１】
候補調節物質は、薬剤のスクリーニングプログラムで使用される天然または合成の化合物であってよい。特性決定がなされたまたはなされていない数種の成分を含む植物、微生物または他の生物の抽出物も使用することができる。コンビナトリアル・ライブラリー技術(固相合成法および並列合成法を含む)によって、膨大な数の異なる物質を、相互作用を調節する能力について試験する効率的な方法が提供される。このようなライブラリーおよびそれらの使用は、とりわけ、あらゆる種類の天然物、小分子およびペプチドなどに関して、当分野で知られている。本発明により現在想定されるタイプの薬剤スクリーニング・プログラム用には、多くのこのようなライブラリーが商業的に入手可能で、販売されている。
【００６２】
他のクラスの候補調節物質は抗体、またはタンパク質標的と結合するその結合フラグメントである。
【００６３】
抗原または他の結合相手と結合することができる抗体フラグメントの例は、VL、VH、ClおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント;VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;VHドメインからなるdAbフラグメント;単離したCDR領域およびF(ab')2フラグメント（ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された2つのFabフラグメントを含む二価フラグメント）である。一本鎖Fvフラグメントも含まれる。タンパク質に特異的な抗体は、例えば表面上に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを展示するλバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え的に作製したライブラリーから得ることができる。例えばWO92/01047を参照のこと。このような技法によって抗原に対する抗体を迅速に作製することが可能となり、したがってこれらの抗体を本発明に従いスクリーニングすることができる。
【００６４】
他のクラスの候補分子は、阻害されるタンパク質配列の断片に基づいたペプチドである。特に、他のタンパク質またはDNAと相互作用するタンパク質の部分に対応する該タンパク質の断片は、タンパク質機能の競合阻害剤として作用する小ペプチドの標的となりうる。このようなペプチドは、例えば5〜20アミノ酸長であってよい。
【００６５】
ペプチドはまた、擬似体（mimetics）を設計するための土台を提供することもできる。このような擬似体はペプチドの分析に基づいており、生物学的活性に必要かつ重要であるアミノ酸残基またはそれらの側鎖の部分を決定してファーマコフォアを規定し、続いてファーマコフォアをモデルにして必要な残基またはその一部分を適切な三次元関係で保持する擬似体を設計する。このような擬似体の設計を容易にするための、さまざまなコンピュータ支援の技法が当分野には存在する。
【００６６】
転写レベルまたは翻訳レベルでの遺伝子の発現を測定するために、細胞に基づいたアッセイ法を設計することができる。転写産物を測定する場合は、先に記載した本発明の第1の態様の方法を用いて、例えば遺伝子チップ上で、多重PCRまたは同様の方法により測定することができる。
【００６７】
細胞に基づいたアッセイ法を使用して、先に記載した候補調節物質をスクリーニングすることができる。さらに、細胞に基づいたアッセイ法を使用して、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを含めた、他のクラスの候補調節物質をスクリーニングすることもできる。このようなオリゴヌクレオチドは典型的には、12〜25ヌクレオチド、例えば約15〜20ヌクレオチド長であり、オリゴヌクレオチドの安定化を助けるために、改変された骨格構造、例えばメチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格を含めたり、これらから構成してもよい。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のコード領域から、あるいは5'または3'非翻訳領域から誘導することができる。候補分子は、RNAi、すなわち遺伝子転写産物に関して配列特異的である短い二本鎖RNA分子をさらに含んでいてもよい。
【００６８】
本発明に従って得られる調節物質は、ヒト患者の血管新生または血管形成を調節する方法において使用することができる。一般に調節物質は、被験者への選択した投与経路に適した、1種以上の製薬上許容される担体を用いて製剤化される。固体組成物の場合は、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含めた、慣用の非毒性固形担体を使用することができる。医薬として投与可能な液体組成物は、例えば、調節物質および任意の医薬用アジュバントを、担体（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に溶解、分散などさせて、それにより溶液または懸濁液を形成することによって、調製することができる。望むならば、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤など（例：酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど）も含むことができる。このような投与剤形を調製する実際の方法は、当業者に知られているか、または明白である。例えば、RemingtonのPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15版, 1975を参照のこと。投与される組成物または製剤は、いかなる場合でも、治療すべき被験者の症状を軽減するのに有効な量の活性化合物を含有する。
【００６９】
投与経路は治療しようとする状態により決まるが、内皮細胞は血管構造の内層を形成するので、(例えば静脈内注射による)血流中への投与が1つの可能な経路となる。
【００７０】
ベクター
VEGFによる内皮細胞の制御と関連があるいくつかのESTの同定は、先に記載した本発明の態様および本明細書で以下に記載する他の態様において有用な、新規ベクター系の基礎を提供する。したがって、ESTによってコードされるタンパク質を発現させるための発現ベクターは、本発明のさらなる態様を構成する。
【００７１】
好ましくは、ベクター中の本発明のESTは、宿主細胞によるコード配列の発現を与えることができる制御配列と作動可能に連結されており、すなわち、ベクターは発現ベクターである。
【００７２】
用語「作動可能に連結されている」とは、記載する構成成分がそれらの意図した様式で機能することを可能にする関係にある並置(juxtaposition)状態を指す。コード配列と「作動可能に連結されている」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合しうる条件下で達成されるように連結されている。
【００７３】
適切な宿主細胞には細菌、真核細胞（哺乳動物および酵母など）、およびバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドの発現に当分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビー・ハムスター腎細胞、COS細胞、およびその他多数がある。
【００７４】
ベクターは、挿入核酸の発現を駆動するためのプロモーターもしくはエンハンサー、ポリペプチドを融合体として産生させるような核酸配列、および/または宿主細胞内で産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるように分泌シグナルをコードする核酸など、他の配列を含んでいてもよい。
【００７５】
ベクターは、1以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、哺乳動物ベクターの場合はネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。
【００７６】
ベクターはさらに、エンハンサー配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、適宜に、他の配列を含むことができる。
【００７７】
ベクターは、例えばRNA作製用にin vitroで使用してもよいし、あるいは宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用してもよい。ベクターはまた、in vivoで、例えば遺伝子治療法において、使用するように適合させることもできる。各種の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング系および発現系は周知である。ベクターとしては、遺伝子治療ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス(HIVまたはMLVなど)に基づくベクター、またはαウイルスベクターが含まれる。
【００７８】
プロモーターおよび他の発現制御シグナルは、宿主細胞（そのための発現ベクターが設計されている）と適合しうるように選択することができる。例えば、酵母プロモーターには、S. cerevisiaeのGAL4およびADHプロモーター、S. pombeのnmt1およびadhプロモーターがある。哺乳動物プロモーターにはメタロチオネインプロモーターがあり、これはカドミウムなどの重金属に応答して含まれ得る。SV40ラージT抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターも使用することができる。これらのプロモーターはすべて、当分野では容易に入手可能である。
【００７９】
遺伝子治療に使用するための、本発明のESTによってコードされるポリペプチドの産生用のベクターには、ミニ遺伝子配列を担うベクターが含まれる。
【００８０】
先に記載した適切な宿主細胞をベクターで形質転換して、本発明のポリペプチドの発現をもたらすことができる。したがって、本発明の他の態様では、本発明のESTによってコードされるポリペプチドを調製する方法が提供され、この方法は、先に記載した発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現をもたらす条件下で培養すること、および発現されたポリペプチドを回収することを含んでなる。ポリペプチドは、網状赤血球溶解液のようなin vitro系を使用して、発現させることもできる。
【００８１】
本発明のESTによってコードされる、実質的に単離された形態のポリペプチドまたはその断片は、本発明のさらなる態様を構成する。ポリペプチドの断片は、少なくとも20アミノ酸の大きさであることが好ましく、25アミノ酸からポリペプチドの完全長までの大きさが好ましいであろう。
【００８２】
本発明の他の態様は、前記ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列である。このような核酸配列は、先に記載したようなベクター中に含まれていてもよい。
【００８３】
さらなる詳細に関しては、例えばMolecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition, Sambrook他、1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、DNAの細胞中への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸を操作するための多くの公知の技法およびプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編、John Wiley & Sons, 1992に詳細に記載されている。
【００８４】
本発明のEST配列がベクター中に存在する場合、そのEST配列は該配列の翻訳のための翻訳開始領域とインフレームで連結されていてもよく、あるいはまた、アンチセンスRNAの転写のためにアンチセンス配向であってもよい。
【００８５】
本発明を以下の実施例により例示する。
【実施例】
【００８６】
内皮に偏った豊富な転写産物
最も豊富な内皮の転写産物を決定するために、5つの異なる個体から単離したHUVECをそれらの最適培地で培養して、5回継代した。これらの培養物から抽出したRNAを使用して、複合cRNAプローブを作製し、これらを12,600素子のAffymetrix遺伝子アレイ・チップ(U95-A)とハイブリダイズさせた。5つのハイブリダイズしたチップからの転写産物特異的シグナルデータを正規化して(方法を参照)、直接的なチップ間比較を可能にし、5つの培養物のそれぞれの転写産物の中央値量を計算した。上部0.5% HUVEC転写産物を機能によりクラスター化して、表2に列挙する。この実験によって、5つの初代内皮細胞培養物(異なる個体に由来する)が、相当なトランスクリプトームの異質性を示すことが明らかになった。12,600の転写産物の6%〜8%は、5つのHUVEC培養物のトランスクリプトームを互いに比較すると、存在量が1.5倍を超えて異なっていた。
【００８７】
内皮細胞のトランスクリプトームを定義するため、また、それが他の細胞型のトランスクリプトームとどのように異なるかを調べるために、我々は、HUVECのトランスクリプトームを、Bリンパ球細胞系(Raji)およびヒト子宮内膜のトランスクリプトームと比較した。先に記載した単離物間の異質性の影響を最小限にするために、それぞれの細胞/組織型のいくつかの試料における正規化した転写産物の中央値量を決定した−HUVEC、5つのチップの中央値；Raji、2つのチップの中央値；子宮内膜、2つのチップの中央値(5患者から集めた組織をそれぞれ表す)。子宮内膜またはBリンパ球におけるより、HUVECにおいて10倍大きなシグナルを示す転写産物を機能によりクラスター化して、表3に列挙する。PAI-1、PECAM-1、コラゲナーゼおよびTSG-14を含めて、いくつかの場合には、シグナルがBリンパ球または子宮内膜におけるよりも、内皮細胞において50倍を超えて高かった。
【００８８】
VEGF-Aは内皮細胞の運命および転写産物の量を制御する
我々は、内皮細胞の生物学に対するVEGF-Aの影響と、転写産物の存在量とを相関させた。in vivoでは、VEGF-Aは、前生存(pro-survival)および有糸分裂促進の両機能を果たす。in vitroでの両機能の研究を可能にするために、5つの独立した初代HUVEC分離株を、最適な増殖に必要な濃度より低い増殖因子と血清の濃度で24時間培養した。これは増殖率を低下させ、約10〜16%という低いアポトーシス発生率を誘導した。VEGF-Aが増殖を回復させ、さらなるアポトーシスを妨げる能力を調べるために、次いでHUVECを、同じ培地でさらに4時間または24時間、10ng/mLのVEGF-A165の存在下または不在下で培養した。これらの実験の最後に、アポトーシスの発生率および総細胞数を計算し、全RNAを調製した。VEGF-Aとの4時間のインキュベーションは、アポトーシス発生率または細胞数に対して有意な影響を及ぼさなかった(図1aおよびb)。しかしながら、VEGF-Aとの24時間のインキュベーションによって、5つのHUVEC培養物すべてにおいてアポトーシス発生率が顕著に低下し(対応のあるT検定 P<0.05)、5つのHUVEC培養物のうち3つで総付着細胞数が増大した(対応のあるT検定 P<0.05; 図1c & d)。
【００８９】
これらの培養物から抽出したRNAを使用して、複合cRNAプローブを作製し、これを前述のAffymetrix遺伝子アレイとハイブリダイズさせた。VEGF-A処理によって、HUVECの転写産物量の全体的なパターンが変わったかどうかを調べるために、変量模型(random effects-model)分散分析法(ANOVA)を使用した。これにより、24時間のVEGF-Aとのインキュベーションは転写産物量の全体的なパターンを顕著に変化させたが(F=4.8; F>3.9はP<0.05を意味する)、4時間のVEGF-Aとのインキュベーションはそうでなかった(F=1.3)ことが示された。以前に示した初代培養物間の異質性もこの実験で証明された。転写産物量のパターンは、4時間のVEGF-A処理実験で使用した5つの対照培養物間(F=7.1; F>2.4はP<0.05を意味する)で、また、24時間のVEGF-A処理実験で使用した5つの対照培養物間(F=9.2; F>2.4はP<0.05を意味する)で、顕著に異なっていた。興味深いことに、ANOVAに基づく分散成分の計算は、24時間のVEGF-A処理に起因する転写産物量のパターンの変化が、顕著ではあったが、5つの初代培養物間のトランスクリプトーム差異に起因するそれの、わずか5分の1であることを示した。
【００９０】
VEGF-Aに対する異質の応答
ANOVAによって、5つの初代培養物は、VEGF-Aに対する精確な応答パターンが互いに異なっていることが明らかになった。なぜなら、VEGF-A処理と培養物源の間の統計的相互作用が有意であったからである(24時間の実験では、F=4.4; F>2.4はP<0.05を意味する)。
【００９１】
VEGF-Aに対する異質の応答は、HUVECのドナー間の遺伝的および歴史的な差異、さらには実験「誤差」(それぞれの培養の精確な条件間のわずかな違いなど)によるものである可能性がある。任意の2つの培養物間で、VEGF-Aに対する応答が1.5倍を超えて異なっていた転写産物のパーセントを決定した。次いで、ある個体（個体3）からのHUVECの2通りのバイアルを解凍し、同一の反復実験で培養した。2つの姉妹培養物のVEGF-Aに対する応答のパターンは、無関係な培養物のVEGF-Aに対する応答のパターンほどには変化しないことを、我々は見出した。
【００９２】
VEGF-Aによって制御される転写産物
VEGF-Aとの4時間または24時間のインキュベーションによって制御される特定の転写産物を同定するために、我々は以下の3つの規準に見合う転写産物を選択した；(i)5つの対照および処理済み培養物における転写産物の量を比較する、ベイズT検定の結果(CyberTアルゴリズム;方法参照)がP<0.05を示した。(ii)5つの培養物のうち少なくとも4つで、転写産物量がVEGF-Aにより一致して制御された。(iii) Affymetrixソフトウエアによって、比較される培養物の少なくとも1つのトランスクリプトーム中に転写産物が「存在する」と合図された。
【００９３】
これらの規準を使用して、我々は、VEGF-Aとの4時間のインキュベーションによって制御される可能性がある、20の既知の転写産物および5つのESTを同定した(図2aおよび表1a)。我々は、VEGF-Aとの24時間のインキュベーションによって制御される可能性がある、55の既知の転写産物および9つのESTを同定した(図2bおよび表1b)。これらの転写産物の完全な正規化した量データを、表1aおよび1bに示す。VEGF-Aによって制御される可能性がある転写産物は、内皮細胞の運命を制御することが知られている多様なタンパク質ファミリーのメンバー、および特性決定されていないタンパク質をコードしていた。ストロメライシン-2および転写因子「tubby」は、4時間と24時間の両方の時点で、VEGF-Aによって制御されるように思える。いくつかの他の転写産物は、4時間または24時間のいずれか一方の時点で、先に挙げた規準を満たしたが、他方の時点ではわずかに規準に合格しなかった。
【００９４】
AffymetrixアレイがVEGF-Aによって制御される転写産物を正確に同定したことを確認するために、我々は、Affymetrixハイブリダイゼーションにより分析されたRNAを鋳型として使用して、定量リアルタイムPCR(TaqMan)を行った。分析した3つの遺伝子(tubby、プロテインチロシンホスファターゼ-1B、およびGタンパク質シグナリング-3の制御物質)に関するAffymetrixおよびリアルタイムPCRの結果は一致した。TaqManにより決定された転写産物量のVEGF誘導変化は、大抵の場合、Affymetrixアレイ分析を使用して決定された変化を超えていた(図3)。
【００９５】
SAGE分析
最も豊富な内皮細胞の転写産物を決定し、それらがVEGF-Aによって制御されていたかどうかを決定するために、我々はAffymetrix遺伝子アレイ実験にSAGEを補足した。他のHUVEC分離株を、VEGF-Aの存在下および不在下で4時間、前に記載したのとまったく同様に培養した。メッセンジャーRNAを単離し、SAGEを行った。合計5380のジタグ(di-tag)をVEGF処理細胞から配列決定し、6698のジタグを未処理対照細胞から配列決定した。SAGEおよびAffymetrix分析により検出された最も豊富な転写産物のリストは、大部分が一致していた。SAGEにより同定された、最も豊富な0.5%の転写産物の5つを除いた全部が、対応するAffymetrix研究により同定された、最も豊富な1%の転写産物中に存在していた(図4)。この比較的小規模なSAGE研究において計数されたジタグの数は、最も豊富なHUVEC転写産物の発現を確実に評価するには充分であった。しかしながら、Affymetrix分析と一致して、最も豊富なHUVEC転写産物は、あるにしても少数しか、VEGF-Aとの4時間のインキュベーションによって制御されなかった。SAGE研究において計数されたジタグの数は、適度に豊富な転写産物の発現のVEGF媒介変化（例えば、より高感度のAffymetrix分析により検出された変化など）を検出するには、充分でなかった。
【００９６】
要約
内皮細胞は特殊化されたトランスクリプトームを有する。最も豊富なHUVEC転写産物には、細胞骨格要素およびそれらの制御物質、リボソーム・タンパク質、炭水化物代謝に関与する酵素、ユビキチン系のメンバー、およびさまざまな形のシグナル伝達に関わるタンパク質が含まれていた(表2)。これらの豊富なタンパク質は多様な細胞系統において必須の機能を果たし、至る所で発現される。興味深いことに、このリストは、非インテグリン・ラミニン受容体およびリンフォカイン(マクロファージ遊走阻害因子、MIF)も含んでいた。
【００９７】
他系統の細胞よりも内皮細胞中で豊富に発現された転写産物は、内皮の特殊な性質の基礎をなす可能性がある。このような転写産物は培養内皮細胞では高レベルで発現され、子宮内膜では中等レベルで発現され(この組織の血管成分のため)、培養Bリンパ球では低レベルで発現されると、我々は予想した。この分析によって、内皮細胞の特殊な構造および機能に寄与することが以前に知られていたいくつかの転写産物は、このパターンに従って発現されることが明らかになった(表2)。これらには、セルピンPAI-1(血管治癒および動脈の新内膜形成を仲介する;[15])、マトリックス・メタロプロテイナーゼ-1(血管新生中に間質コラーゲンを分解する;[16])、およびフォン・ビルブラント因子(凝固因子VIIICのキャリアーとして作用し、血小板と血管壁の相互作用を仲介する)が含まれていた。その他には、ERG(ETSファミリーのメンバー)およびHHEX(ホメオボックス・ファミリーのメンバー)が含まれており、これらは転写因子として、それら自体が内皮トランスクリプトームの特定の性質に寄与しうる。内皮に偏ったパターンに従って発現される他の転写産物は、細胞接着分子、例えばインテグリンα5およびα6B、VE-カドヘリン[7]およびCD31をコードしていた。これらは、毛細血管の形態形成および経内皮白血球移動に伴って起こる、特殊な接着の基礎をなす可能性がある。VEGF-C、アンギオポイエチン-2およびPlGFなどの、内皮細胞が特異的に応答する増殖因子の相対量は、それらの自己分泌シグナル伝達および内皮細胞生存に対するそれらの相乗作用の重要性を反映している[17]。この分析により同定されたESTによってコードされるタンパク質は、内皮細胞生物学において重要であるがまだ未確定の機能を同様に果たす可能性がある。
【００９８】
VEGF-Aに対する応答
VEGF-Aは内皮細胞には必須の増殖因子である。なぜなら、VEGF-Aは、内皮細胞の生存、増殖、移動、血管への形態形成、および血管透過性を助長するからである。VEGF-Aに対する内皮細胞の応答は、翻訳後のシグナル伝達カスケードに依存することが知られているが、下流のトランスクリプトーム変化（これらは現在ほとんど特徴づけられていない）は必須の役割を果たす可能性がある。これらの変化を定義するために、HUVEC細胞を、VEGF-Aと共に4時間および24時間インキュベートした。VEGF-Aと共に4時間インキュベートした後、増殖およびアポトーシスは、あるにしても少ししか変化しなかった。このことは、この時点で明らかな転写産物量の変化が、VEGF-Aそのものに対する直接的な応答であることを意味している。VEGF-Aと共に24時間インキュベートした後、細胞の生存および増殖が増大した。したがって、この時点でのトランスクリプトーム変化は、VEGF-Aの直接的な影響に加えて、これらのプロセスを反映しうる。ANOVAは、VEGF-Aとの4時間のインキュベーションが、転写産物量の全体的なパターンに有意な影響を及ぼさなかったことを示した。それにもかかわらず、4時間のVEGF-Aインキュベーションにより制御された可能性がある、少数の個々の転写産物が同定された。VEGF-Aに24時間曝すことは、転写産物量の全体的なパターンに顕著な影響を与えた。しかしながら、24時間のVEGF-A処理により媒介された全体的なトランスクリプトームに対する変化は、依然として比較的小さく、異なる個体に由来する内皮細胞のトランスクリプトーム間の差異ほどには顕著でなかった。この実験は、1つの因子が1つの細胞型に及ぼす急性の効果を調べるために設計されたので、ほんの小さな精選されたグループの転写産物の量が、VEGF-Aにより特異的に制御されているようであるという知見は、驚くべきことではないかもしれない。これらのいくつかを以下で述べることにする。
【００９９】
細胞周期制御物質をコードする転写産物のVEGF媒介制御は、図1に示すHUVEC増殖を開始させることができる。例えば、サイクリンD1(G1/S期の移行を開始させる)が上方制御される。E2F-4(RB、p107およびp130と結合して、増殖関連遺伝子の発現を抑制する)が下方制御される。
【０１００】
図1に示すHUVECのVEGF媒介生存は、プロアポトーシス・タンパク質をコードする転写産物の量の減少により、開始される可能性がある。トレイル(trail)(TNF様細胞死リガンド[18])の量は、4時間のVEGF-Aインキュベーションの後に減少する。この研究で分析したHUVECでは、DR-5トレイル受容体が非常に豊富であり(97パーセンタイル)、トレイルの2つの阻害性デコイ(decoy)受容体Dcr-1およびDcr-2は、VEGF-A処理とは無関係に、低レベルでしか発現されない。したがって、トレイルはおそらく自己分泌様式で作用して、内皮アポトーシスの可能性を増大させ、トレイル転写産物量のVEGF媒介減少は、血管平滑筋細胞および白血球などの他の局所細胞の生存を助長することに加えて、内皮細胞の生存を助長する可能性がある。2つの他のプロアポトーシス・タンパク質をコードする転写産物のVEGF媒介下方制御も生物学的に重要である可能性がある；p75（TNF-RI媒介アポトーシスを増大させる;[19])、およびDAXX（Fasと会合してJNK経路を活性化するプロアポトーシス・アダプタータンパク質;[20])。
【０１０１】
ここに記載する転写産物量の変化は、in vivoでVEGF-Aにより助長される血管の形態形成に寄与する可能性がある。例えば、プロテオグリカンおよびフィブロネクチンを分解することにより血管新生を助長しうるストロメライシン-2は、VEGF-Aにより上方制御される。血管平滑筋細胞のマイトジェンとして作用することにより動脈新生を促進しうるPDGFIIも上方制御される。インテグリンβ1およびα2をコードする転写産物の上方制御も、このプロセスを促進することができる。VEGF-AによるVEGF受容体Flt-1の下方制御は、最初は意外なことである。しかしながら、これは、負のフィードバックによりVEGF刺激血管新生の持続期間および程度を制限するように作用する可能性がある。VEGF-Aにより制御されると思われる多数の転写因子は、VEGF媒介変化をトランスクリプトームに特定して、それゆえ最終的に内皮特異的プロテオームを制御する可能性がある。特に興味深いのは、いくつかのエストロゲン核受容体ファミリーhERR1のVEGF媒介下方制御である[21]。VEGF-Aは、子宮内膜のストロマ細胞により周期的に産生されている。
【０１０２】
したがって、VEGF-Aによるエストロゲン受容体転写因子の下方制御によって、VEGF-Aと生殖ステロイドの間の「クロストーク」が可能となり、生殖組織における血管新生を巧妙に制御できると考えられる。
【０１０３】
ここで同定した3組の転写産物の制御は、以前の研究とは一致しないが、これに関する理由が存在するようである。(i)抗アポトーシス分子Bcl-2およびA1は、VEGF制御型として以前に同定された[22]。しかしながら、これらは我々の分析において重要な位置を占めなかった。なぜなら、それらの存在量は、Affymetrix比較に確実に含めるには不充分だったからである。(ii)以前の研究では、50ng/mLのVEGF-Aとの連続インキュベーションは、ヒト微小血管内皮細胞(HMEC)中の588の転写産物の量に対してほとんど影響を及ぼさなかった[23]。しかしながら、この研究の設計(連続的なVEGF-A刺激の長期作用を調べる)および使用した細胞型(HMEC)は、差異を説明することができる。(iii)VEGF-Aは、HUVEC細胞におけるFlt-1の発現を上方制御することが以前に示された[13]。我々の研究では、Flt-1の発現が、4時間または24時間のVEGF-A処理によって変わることはなかったが、flt-1の可溶形態をコードするスプライス変異体は、24時間後に下方制御された。VEGF-A刺激とFlt-1発現は、我々の実験系では結びついていなかった。VEGF媒介Flt-1発現を駆動する[16]、Ets-1転写因子は、我々のHUVEC培養物がVEGF-Aとのインキュベーション前に受けた血清除去ステップにより下方制御された(データは示さず)。
【０１０４】
ここで同定された内皮特異的でVEGF制御型の転写産物のいくつかは、培養系に特異的であるだろうが、この研究により同定された転写産物量パターンの多くは、in vivoでも起こり、すべての内皮細胞において機能的に重要であるだろう。このことは、血管形成した胚様体において、この研究により同定されたいくつかの内皮特異的でVEGF制御型のESTを発現させかつ「ノックアウト」して、複合組織中の内皮細胞においてそれらが果たす役割を評価することなどの、さまざまな研究によって確認することができる。
【０１０５】
血清除去に対する応答
SFDにより制御される転写産物のごくわずかしか、ストレス誘導保護応答と関連していなかったことは意外であった。制御された転写産物には、熱ショックタンパク質27(↑2.3x)、グルタチオンSトランスフェラーゼM4(↑9.5x)およびA20(↑1.8x)をコードする転写産物が含まれていた。転写因子NFκB、p53およびHIF-1α、ならびに熱ショック因子により上方制御される転写産物を含めた、内皮細胞ストレス応答と従来関連していた大部分の転写産物は、我々の研究では上方制御されず、実際、いくつかのものは下方制御された。これは、アポトーシスに関連した転写変化の蓄積を最大にするために、我々の研究において選択した長期のSFDによるものである可能性がある。これにより、一過性のストレス応答の検出が妨げられた可能性がある。
【０１０６】
我々が驚いたことに、圧倒的多数のSFD依存性トランスクリプトーム変化は、直接的にプロアポトーシス的であるか、あるいは将来のアポトーシスのために細胞を間接的に刺激するか、のいずれかであるようであった。我々は、これらの変化がアポトーシス・プログラムの不可欠な部分に相当しうると考える。これらの変化がアポトーシスを支持すると思われるいくつかの作用機構を以下に記載する。
【０１０７】
生存因子の除去によって誘導されるトランスクリプトーム変化は、細胞死を促進する可能性がある
細胞死受容体のシグナル伝達はSFD細胞において増大する可能性がある。なぜなら、細胞死受容体LARD(DR3)が上方制御(↑2x)され、腫瘍壊死因子相同体トレイル(Trail)が上方制御(↑2.8x)されたからである。カスパーゼ10(↑1.8x)およびカスパーゼ4(↑1.7x)を含めた、アポトーシス「機構」の成分はSFD細胞中で上方制御された。SFD細胞中では、カスパーゼ阻害剤cIAP1(MIHB;↓1.9x)およびDISC関連タンパク質TRAF-2(↓6.1)を含めた、抗アポトーシス・タンパク質をコードするいくつかの転写産物が下方制御された。
【０１０８】
生存シグナルの下方制御
いくつかのトランスクリプトーム変化は、SFD ECが細胞外の生存シグナルに応答する能力を低下させ、これによって細胞死を促進するように相乗作用するようである；(i)VEGF-A(↓4.5x)、VEGF-C(↓4.2x)、結合組織増殖因子(↓1.8)および上皮増殖因子(EGF;↓5.1x)を含めた、いくつかの自己分泌/パラ分泌EC増殖および生存因子をコードする転写産物が、SFD細胞中で下方制御された。(ii)生存因子受容体も下方制御された。例としては、流体誘導内皮Gタンパク質共役受容体(↓4.9x)、GP130(↓5.8x)およびIL1受容体成分-L1(↓6.6x)が挙げられる。(iii)正常ではECに接着依存性の生存シグナルを与えると思われる、ECMの成分をコードする転写産物も下方制御された。例としては、コラーゲンα2タイプVI(↓3.4x)およびコラーゲンα1タイプVII(↓4.3x)が挙げられる。(iv)Nr-CAM(↓5.3)を含めた、増殖/生存シグナルを伝達する接着分子受容体が下方制御された。興味深いことに、Nr-CAMは、in vitroでの血管新生中に上方制御される少数の転写産物の1つである。インテグリン-α2も顕著に下方制御された(↓4.1x)が、他のインテグリンは上方制御された(例えばインテグリン-α3 ↑2.9x)ので、SFD細胞中で制御されたインテグリン発現の重要性は、明らかではない。(v)EC中で生存シグナルを伝達する細胞内シグナル伝達分子をコードするいくつかの転写産物が下方制御された。例としては、STAT2(↓3.6x)、およびインテグリン関連キナーゼICAP-1a(↓3.3x)が挙げられる。Gタンパク質シグナル伝達と関係がある多数の転写産物も制御された;これらは特に重要でありうる。なぜなら、Rho/RasおよびGタンパク質シグナル伝達は、ECの運命を決定するのに不可欠な役割を果たすからである。
【０１０９】
転写因子はアポトーシス培養物中で制御される
転写因子は、アポトーシス過程を調節する際に、重要な役割を果たす。例えば、NF-κBファミリーのメンバーは、抗アポトーシス性内皮転写産物の発現を上方制御することによって、アポトーシスを阻害しうる。SFDの後に、NF-κBサブユニットp65はわずかに上方制御された(↑1.5x)が、このことは、ストレスに対するECの応答における以前に記載されたその役割を考慮すると、驚くべきことではない。しかしながら、NF-κB核局在化の阻害剤であるI-kBαおよびI-kBε(MAD3)は、顕著に上方制御され(それぞれ2.8xおよび2.7x)、これによりSFD細胞中でのNF-κBの前生存作用が相殺される可能性がある。Rel-Bをコードする転写産物も上方制御された(↑3.5x)。Rel-Bは、I-Relとしても知られるものであるが、NF-κB媒介転写活性化の直接的な阻害剤である。さらに、NF-κB p100サブユニットが上方制御された(↑4.8x)。p100はI-kB様活性を有し、細胞死ドメインを含む。これは、細胞死受容体媒介アポトーシスに対して細胞を敏感にしかつカスパーゼ8を活性化させる複合体の一成分として、近年同定されたものである。NF-κB活性がSFD細胞中で阻害されるという概念は、cIAP1およびTRAF-2のようなNF-κB依存性転写産物のSFD後の下方制御により支持される。転写因子JunDも、SFDにより上方制御される(↑2.1x)。そのプロアポトーシス相同体c-Junから類推して、JunDの上方制御がSFD ECのアポトーシスを促進する可能性がある。転写因子およびスプライシング因子をコードする他の26のRNAの量は、SFD細胞中では2倍以上制御されたので、これらは、ここで報告するトランスクリプトーム変化の一部に寄与している可能性がある。
【０１１０】
転写の変化はアポトーシス体の食作用を促進しうる
アポトーシス・プログラムの最終段階は、食細胞によるアポトーシス体の飲み込みである。ケモカイン単球走化性タンパク質-1(MCP-1)のRNAおよびタンパク質はどちらも、健康なEC中では検出不能であったが、それらはSFD後に大幅に上方制御された。この新たなMCP-1の発現により、EC死の領域へのマクロファージの動員が増大される可能性がある。アポトーシス細胞の食作用は、SFDにより媒介されるクラステリンの上方制御(↑3.7x)によっても促進され得る。クラステリン(アポリポタンパク質J)は、近隣の細胞が死んだときに生じる、アポトーシス残骸およびホスファチジルセリン含有脂質小胞により、生きている細胞において誘導され、非専門的な食細胞によるアポトーシス体の取込みを促進すると考えられている。
【０１１１】
有糸分裂に必要なシグナルが生存因子の欠乏により下方制御される
細胞周期および有糸分裂の制御物質をコードする転写産物の発現の変化は、血清を欠乏させた細胞の有糸分裂停止の原因となりうる。なぜなら、24の細胞周期関連の転写産物が、SFD後に2倍以上、下方制御されたからである。細胞周期関連の転写産物で、上方制御されたものは皆無であった。下方制御された転写産物には、G1/SおよびG2/M期の移行に必要なCDC2(↓3.8x)、サイクリンA(↓2.9x)、サイクリンH(↓2.4x)およびサイクリンE2(↓3.4x)、増殖性細胞核抗原(PCNA;↓3.4x)、DNAポリメラーゼのプロセッシビティー因子(↓3.4x)、およびDNAポリメラーゼ-αをクロマチンにロードする際にある役割を果たしうるCDC45(↓3.5x)が含まれていた。
【０１１２】
SFD中に誘導された転写産物量に対するいくつかの他の変化の、細胞死との関連性は、評価するのがさらに困難であった。これらには、アンギオポイエチン-2(血管再構築の促進物質; ↓5.3x)、コネキシン43(ギャップ結合成分;↓6.0x)、ストロメライシンII(メタロプロテイナーゼ;↓9.1x)、およびバイグリカン(コラーゲンおよびTGFβ結合糖タンパク質;↑3.4x)が含まれていた。
【０１１３】
ここに示したデータに基づいて、我々は以下のことを提案する。すなわち、トランスクリプトームおよびグリコームの変化は、最終的にストレスを受けた細胞を、生存シグナルに対して不応性にし、細胞死シグナルおよびカスパーゼ発現を直接増大させ、細胞周期の停止を促進し、食細胞を内皮損傷領域に動員し、食作用のプロセスを促進する可能性がある。
【０１１４】
EST
本発明と関連があるとして同定されたいくつかのESTは、本発明のモニタリング方法のマーカーとして、アッセイの標的として、また、治療に使用しうる治療薬として非常に興味深いものである。関心のあるESTは伸長されており、添付の配列表に示してある。ESTのオープンリーディングフレームを決定することができ、これらおよびそのESTまたは断片を本発明で使用することができる。関心のある他のESTには、以下のものがある:
AI223047は、NADHデヒドロゲナーゼ(ユビキノン)1α部分複合体と相同性があり、その配列の383bpに対して良好な相同性を有する、1.1kbの転写産物である。
【０１１５】
AI813532は、TNF-R2のA鎖およびR鎖と相同性があり(その長さの1.3kbに対して非常に良好な相同性を有する)、TNF-Rスーパーファミリーと相同性がある、3.7kbの転写産物である。
【０１１６】
AL050021は、sco-スポンジン-ムチン様タンパク質と相同性を有し、(M. musculusの)潜在的TGF結合タンパク質と若干の相同性を有する、3.1kbの転写産物である。
【０１１７】
AB020649は、PHドメイン相同性があり（その配列の305bpに対して）、その配列の305bpとの相同性よりも良好なRUNドメイン相同性がある、3.9kbの転写産物である。
【０１１８】
AL049701は、クローンMGC:20057とも関連がある仮想タンパク質をコードする、648bpの転写産物である。
【０１１９】
AI885381(710bp)は、クローンMGC2650と関連がある別の仮想タンパク質である。
【０１２０】
AI214965(4.4kb)は、C-末端Wd40の結晶構造、A鎖とのタンパク質相同性、およびKIAA1006のmRNAとの相同性を有する。
【０１２１】
AA492299(5.6kb)は、RAP1との類似性を有し、GTPアーゼ活性化タンパク質1は、その長さの638bpとの非常に良好な相同性を有する。
【０１２２】
AA631972(896bp)は、ナチュラルキラー転写産物4、A鎖と相同であり、その長さの558bpとの非常に良好な相同性を有する。
【０１２３】
D13633(2.6kb)は、KIAA0008遺伝子産物と関連がある。
【０１２４】
AI720438(925bp)は、小さな誘導性サイトカイン・サブファミリーAと類似しており、ヒト・ケモカインHcc-2の解明構造およびヒトMip-1αのNmr構造、A鎖とのタンパク質ドメイン相同性を有する。
【０１２５】
M20812(770bp)は、Igκ鎖との相同性、およびL鎖、アフィニティー成熟抗体と複合したVEGF、およびJ鎖、中和抗体と複合したVEGFとのタンパク質ドメイン相同性、およびヒトκ-免疫グロブリン生殖細胞系偽遺伝子との単一遺伝子相同性を有する。
【０１２６】
AI985964(487bp)は、トレフォイル(trefoil)因子3(腸)との相同性、鎖Aとのタンパク質ドメイン相同性を有する。
【０１２７】
S73591(2.7kb)は、1,25-ジヒドロキシビタミンD-3により上方制御されるタンパク質と相同である。
【０１２８】
AI912041(723bp)は、熱ショック10KDタンパク質1と類似しており、熱ショックタンパク質1のA鎖とのタンパク質ドメイン相同性を有する。
【０１２９】
U41635(2.7kb)は骨肉腫において増幅されたタンパク質であり、ヒト・グアニル酸結合タンパク質-1のA鎖とのタンパク質ドメイン相同性を有する。さらに、ヒトOS-9前駆体mRNAとの単一遺伝子相同性。
【０１３０】
U79259(1.7kb)は、アトロフィン-1-ヒトタンパク質と類似している。
【０１３１】
AI760932(805bp)は、プロスタグランジンD2シンターゼとの類似性、およびヒト好中球の結晶構造、B鎖とのタンパク質ドメイン相同性を有する。
【０１３２】
X66436(1.9kb)は、機能が不明なヒトGTP結合タンパク質様GTPアーゼとの相同性を有する。
【０１３３】
AB014538(5.1kb)は、ヘビーメロミオシンのcryo-Em構造、S鎖との相同性を有する。
【０１３４】
AF052106(4.2kb)は、仮想タンパク質MGC4614と相同である。
【０１３５】
Y09022(1.4kb)は、not様タンパク質との相同性、およびメラニンタンパク質のA鎖とのタンパク質ドメイン相同性を有する。
【０１３６】
D80008(3.3kb)は、KIAA0186と相同である。
【０１３７】
AI743606(1.9KB)は、ras-関連タンパク質との相同性、およびsec4-グアノシン-5'のA鎖/結晶構造とのタンパク質ドメイン相同性を有する。
【０１３８】
AA663800(1.4kb)は、仮想タンパク質である。
【０１３９】
初代培養物間の異質性
この研究での重大な知見は、異なる個体に由来する初代内皮細胞培養物が、相当なトランスクリプトームの異質性を示したことであった。この異質性の成分は、培養物の起源である個体間の遺伝的および歴史的な差異に起因する可能性がある。このことは、同一個体の細胞のまったく同じ2つの培養物が、異なる個体に由来する培養物ほどには、VEGF-Aに対するその応答に差異を示さなかった事実により支持された。VEGF-Aへの応答における同様の差異が、冠状動脈疾患[26]および末梢血管疾患[27]のためのVEGF-Aに基づいた治療法で処置した、個々の患者においても生じうると考えられる。同一個体の細胞のまったく同じ2つの培養物は、若干のトランスクリプトームの差異を依然として有しているので、培養条件のわずかな違いなどの、トランスクリプトーム異質性の他の成分も存在するに違いない。したがって、我々は、1つの特異質でありうる初代細胞培養物を使用するゲノム研究から結論を引き出すことは、非常に浅はかであることを提起する。
【０１４０】
転写産物量データの解釈
Affymetrix発現データは現在、代替的な技法によるさらなる確認をせずに、容認されることがある[28]。しかしながら、我々のデータが確固たるものであったことを保証するために、我々はSAGEを使用して、高度に発現された転写産物の大きなセットの相対量を確認し、また、定量リアルタイムPCRを使用して、VEGF-Aによる3つの転写産物の制御を確認した。Affymetrix発現データの信頼性は、「方法」に記載されるように、厳格な品質管理、および生データの慎重な全体的および部分的な正規化に決定的に依存すると、我々は考える。Affymetrixアレイで問い合わせた転写産物が多数であったために、VEGF処理培養物の5つすべてに一致する、いくつかの「偽陽性」の転写産物量の変化は、偶然に予想された。これは、すべての大規模なゲノム研究に共通する問題である。ボンフェローニ(Bonferroni)補正などの技法を使用して、観察される遺伝子の数に従う有意性に必要なP値を評価することができ、「マイクロアレイの有意性分析」[29]などの技法を使用して、偽陽性発見率を評価することができる。しかしながら、「偽陽性」の転写産物量の変化を減らすための最も確固たる方法は、我々がここで行っているように、多数の独立した試料を使用することである。
【０１４１】
要約
VEGF-Aにより制御される転写産物量の特殊化された内皮細胞特異的なパターン(トランスクリプトーム)を、我々は同定した。この独特のトランスクリプトームは、これらの細胞の専門化した構造およびそれらが健康状態および疾患状態の双方においてin vivoで果たす特異な役割の基礎をなす可能性がある。この研究により同定された内皮細胞特異的かつVEGF制御型の転写産物は、VEGFにより制御される複雑なプロセス(内皮細胞の生存、組織侵襲、および他の細胞型との相互作用を含む)へと至る翻訳前事象への洞察を提供する。この研究はまた、癌、子宮内膜症、および動脈硬化症などの血管新生依存性疾患の治療のための新しい標的を提供する。さらに、この研究は警告も与える。異なる患者から単離した初代内皮細胞のトランスクリプトームは、驚くことに異質であることを我々は示してきた。これは、他の細胞型の場合も同様である可能性がある。したがって我々は、1つの(おそらく特異質である)初代細胞培養物に対して実施した実験は、誤っている可能性があることを提起する。
【０１４２】
材料および方法
遺伝子アレイ研究用の細胞培養およびRNA単離
HUVECを、記載したように[30]、コラゲナーゼ消化により臍帯から分離した。継代2まで培養した後、それぞれのHUVEC分離株のいくつかのバイアルを、今後使用するために凍結させた。解凍した後、HUVECを、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、EGF、FGF、2%ウシ胎児血清、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンの専売混合物を補った専売培地(大血管内皮細胞培地;TCS、Botolph、UK)を使用して、5%CO2の湿潤雰囲気中で継代5まで培養した。継代5になったら、HUVECを、10ng/mLのヒトVEGF165(R & D systems Abingdon UK)の存在下または不在下において、わずか2%のチャコール処理FCS(Gibco/BRLUK)を補った基本培地中で培養することにより、増殖因子を部分的に除去した。それぞれのHUVEC培養物に対して、同一の集密状態（コンフルエンス）、ならびに同一バッチの培地、血清およびVEGF-Aを使用した。全RNAは、Trizol(Gibco/BRL UK)を使用して調製した後、RNeasyカラム(Qiagen,UK)を通過させ、エタノール沈殿を行った。RNAの完全性および濃度を、Agilent 2100バイオアナライザを使用して評価した。
【０１４３】
アポトーシスおよび細胞数の評価
遺伝子アレイ分析に使用したHUVEC分離株は、先に記載した条件を使用して、48ウェルプレート中で同時に培養した。すべてのおよびアポトーシスの接着細胞を、エピ蛍光緩衝位相差顕微鏡(Olympus, UK)を使用して8個の重複ウエル中で数えた。アポトーシス細胞は、トリパンブルー(0.2%; Sigma UK)およびヨウ化プロピジウム(20μg/mL; Sigma)を排除したが、AnnexinV(製造業者の使用説明書に従って使用されるAnnexin V-Fluos染色キット; Roche UK)で標識され、さらにアポトーシスの形態的特徴を示した細胞として定義した。
【０１４４】
Affymetrixオリゴヌクレオチド遺伝子アレイ
ビオチン標識したcRNA複合体プローブを作製し、Affymetrixのプロトコル(Affymetrix,High Wycombe, UK)に従って、Affymetrixヒト「U95A」遺伝子チップとハイブリダイズさせた。すべてのチップからの発現データの品質を、Affymetrix Microarray Suite(バージョン4.0)およびdChip[31]ソフトウェアを使用して評価した。これらの品質管理試験に合格しなかったチップからのデータは廃棄した。転写産物量のデータ(「平均差」)は、各チップの中央値の遺伝子発現(対照遺伝子を除く)を1とするように全体的にスケーリングした。その後、すべてのチップ上のあらゆる発現レベルの転写産物の発現が比較可能であることを保証するために、マイナーな程度のローカルスケーリングが必要であった。これを行うために、「R」統計ソフトウエア・システム(http://www.r-project.org/)の「loess」機能を、「NOMAD」プロトコル(http://pevsnerlab.kennedykrieger.org/)で使用した方法に基づいて、使用した。次に、VEGF処理および未処理培養物から得られた、正規化した転写産物量のデータを、CyberTアルゴリズム(バージョン7.03; スライディング・ウィンドウ=301、ベイズ(Bayes)の信頼推定値=15)を使用して比較した。このアルゴリズムは対応のない(unpaired)T検定であり、データセット中の他の転写産物の分散に基づくBayesian事前確率を包含させることにより改変されたものである[32]。選択した遺伝子に関する、詳細なAffymetrixプローブセットのハイブリダイゼーションデータは、Filemaker Proのデータベース・システムを使用して調べた。このシステムは、Affymetrixチップからのデータ(報告された転写産物量、個々のプローブセットマトリックスなど)と、既知の機能の両方に基づいて、クラスターの形成を可能にした。その後、このシステムは、これらのクラスターを、より小さなデータセットをもたらす多重比較ステートメント(AND/OR/NOT)において組み合わせ、次いでこれらを、配列および機能情報を集めるために、ウエブのデータベース(例えば、Swiss Prot, BLASTなど)と関連付けることを可能にした。さらなる統計分析のために、「R」統計ソフトウエア・システムおよびMicrosoft Excel 2001をMacintosh G4コンピュータで使用した。
【０１４５】
SAGE法および計算法
HUVECの他の分離株はTCS(Botolph Claydon, UK)から購入し、10ng/mLのVEGF-A165の存在下および不在下で上記のように4時間培養した。以前に記載されたSAGEプロトコル[33]に多少の変更を加えて、5μgのポリA+RNAからSAGEライブラリーを作製した。捕獲したcDNAを、タギング酵素BsmF1(New England Biolabs)の認識部位を含むリンカーと連結させた。次いでSAGEタグをBsmF1で放出させ、平滑末端とし、ヘッドとヘッドを連結させてジタグを形成させた。これらをNla III消化によりリンカーから切り離し、コンカテマー化し、脱リン酸化したSphI切断pGEM-3Zf+ (Promega Life Sciences)にクローニングし、Applied Biosystems Prism Dye Terminator反応キットを使用して配列決定し、これはABI373自動配列決定装置(Applied Biosystems Warrington UK)で行った。
【０１４６】
リアルタイムPCR
ABI PRISM 7700配列検出システム(TaqMan)を使用して、リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応を、製造業者のプロトコルに従い行った。Affymetrixの研究で使用した全てのRNAに関して、3つの転写産物のCT値を、シクロフィリンのものと比較した。使用したプライマーおよびプローブは以下のものであった;
(i)Tubby;
フォワード    5'-CCCCCCAGGGTATCACCA-3'  (配列番号4)
リバース      5'-CCCCGGTCCATCCCTTT-3'  (配列番号5)
プローブ      FAM-5'-AAATGCCGCATCACTCGGGACAAT-3'-TAMRA  (配列番号6)
(ii)PTP-1B;
フォワード    5'-TGATCCAGACAGCCGACCA-3'  (配列番号7)
リバース      5'-CCCATGATGAATTTGGCACC-3'  (配列番号8)
プローブ      FAM-5'-AAATGCCGCATCACTCGGGACAAT-3'-TAMRA  (配列番号9)
(iii)RGS-3
フォワード    5'-GGCTGCTTCGACCTGGC-3'  (配列番号10)
リバース      5'-AAGCGAGGGTACGAGTCCTTT-3'  (配列番号11)
プローブ      FAM-5'-AGAAGCGCATCTTCGGGCTCATGGT-3'-TAMRA  (配列番号12)
【０１４７】
図面および表の詳細な説明
表1aおよびb.  本文中に記載される統計学的検定に合格する候補のVEGF制御型転写産物を機能クラスターとして列挙する。いくつかの場合、量の変化の方向を示す。By-Pは、5対の対照培養物およびVEGF処理培養物の転写産物量を比較するために使用したベイズのT検定からのP値を示す。プローブ・セットは、それぞれの転写産物に対応するAffymetrixコードを示す。概してVEGF-Aにより顕著には制御されないシクロフィリンを対照として示す。
【０１４８】
表1a.  最も豊富な0.5%のHUVEC転写産物を列挙する。量は、異なる個体からの5つのHUVEC培養物における中央値正規化転写産物量を指す(この場合、中央値量の転写産物は1までの値を指定された)。プローブ・セットは、それぞれの転写産物に対応するAffymetrixプローブ・セットを示す。
【０１４９】
表1b.  本文中に記載される統計的基準を満たす候補VEGF制御型HUVEC転写産物の正規化転写産物量のデータを示す(各チップにつき、中央値量の転写産物は1までの値を指定された)。1〜5は、VEGF-Aの存在下(VEGF)および不在下(CON)で培養した5つの個体からのHUVECを示す。By-Pは、5対の対照培養物およびVEGF処理培養物の転写産物量を比較するために使用したベイズのT検定からのP値を示す。プローブ・セットは、それぞれの転写産物に対応するAffymetrixコードを示す。
【０１５０】
表1cおよびd.  表1cは、転写産物レベルが48時間の血清除去後に調節されることが判明した本発明のESTを提供する。したがって、これらのESTは、アポトーシス状態を示すものである。表1dは、やはり転写産物レベルが顕著に調節される、既知の機能を有する遺伝子を示す。
【０１５１】
表1e.  表1eは、48時間の血清除去後に調節されることが判明した、さらなる転写産物を提供する。これらは、表1cに関して本明細書で記載したとおりに決定された。
【０１５２】
表1f.  表1fは、初代HUVECのVEGF処理によって制御されることが判明した転写産物を提供する。前記HUVECはコラゲナーゼ消化によって3つの個体の臍帯から分離し、十分に湿潤な5%CO2雰囲気中で、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、2%ウシ胎児血清(FCS)、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンの専売混合物を補った基本培地(大血管内皮細胞培地; TCS、Botolph、UK)にて継代5まで培養した。細胞は、10ng/mlのVEGF165で24時間処理した。3つの試料からのデータを分析し、発現の平均倍率変化を表の最終欄に示す。
【０１５３】
表2.  先に記載した豊富な転写産物。
【０１５４】
表3.  Bリンパ球と子宮内膜の両方よりもHUVECにおいて少なくとも10倍豊富であった転写産物を列挙する。Et/BLは、HUVECにおける正規化転写産物量(5つのチップの中央値)と、ヒトBリンパ球細胞系Rajiにおける正規化量(2つのチップの中央値)との比を示す。Et/Emは、HUVECにおける正規化量と、ヒト子宮内膜の試料における正規化量(それぞれ5つの個体からのプールした組織を表す2つのチップの中央値)との比を示す。
【０１５５】
図1.  VEGF-Aはアポトーシスを阻害し、初代内皮細胞の増殖を誘導する。(aおよびb)HUVECをVEGF-Aの存在下(黒棒)またはVEGF-Aの不在下(白棒)で4時間培養した。(cおよびd)HUVECをVEGF-Aの存在下または不在下で24時間培養した。(aおよびc)アポトーシスの平均発生率。(bおよびd)平均細胞数。5つの別個の内皮細胞分離株についての結果を示し、誤差棒は2つのSDを示す。
【０１５６】
図2.  VEGFにより制御された転写産物。ドット-プロットを使用して、10ng/mLのVEGF-Aの存在下(Y軸)または不在下(X軸)で培養したHUVECにおけるloge(正規化した転写産物の量)を比較した。(a)4時間のVEGF-A。(b)24時間のVEGF-A。小文字は、表3に列挙した転写産物を指す。スケールの下側部分を広げるために、最も豊富な転写産物を示していないことに留意されたい。
【０１５７】
図3.  定量PCRによって、Affymetrix遺伝子アレイ分析からの一組の結果を確認した。対照およびVEGF処理したHUVECの間の、転写産物量の倍率差を示す。図は5つの培養物における中央値量を表すものであり、シクロフィリン (プローブセット33667_at; VEGF-Aによって実質的に制御されない) の量に対するものである。PCRおよびAffymetrix分析用に同一のRNAを使用した。誤差棒は、平均値の標準誤差を示す。分析した転写産物は、tubby(34600_s_at; VEGF-Aによる4時間および24時間処理後に評価した量)、プロテインチロシンホスファターゼ-1B(40137_at; 4時間VEGF-A)、およびGタンパク質シグナリング-3の調節物質(36737_at; 4時間VEGF-A)であった。
【０１５８】
図4.  SAGEによって、Affymetrix分析と同量の、内皮細胞の転写産物が同定される。ドット-プロットは、10ng/mLのVEGF-Aの存在下(Y軸)または不在下(X軸)で4時間培養したHUVECにおけるloge(正規化した転写産物の量)を示す。かぶせられた白丸は、SAGEにより検出された転写産物の最も豊富な0.5%の、Affymetrixデータセット中の位置を示す。直線はAffymetrixデータの99パーセンタイルを示す。
【０１５９】
略語
遺伝子発現の連続分析;SAGE
血管内皮細胞増殖因子;VEGF
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ;MAPK
ストレス活性化プロテインキナーゼ;SAPK
c-jun-NH2-キナーゼ;JNK
フォーカルアドヒージョン(focal adhesion)キナーゼ;FAK
ヒト臍帯静脈内皮細胞;HUVEC
分散分析;ANOVA
ヒト微小血管内皮細胞;HMEC
【０１６０】
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【表１ａ】
2006504395.tif 000002
【表１ｂ】
2006504395.tif 000003
2006504395.tif 000004
2006504395.tif 000005
【表１ｃ】
2006504395.tif 000006
2006504395.tif 000007
2006504395.tif 000008
【表１ｄ】
2006504395.tif 000009
2006504395.tif 000010
2006504395.tif 000011
2006504395.tif 000012
【表１ｅ】
2006504395.tif 000013
【表１ｆ】
2006504395.tif 000014
2006504395.tif 000015
2006504395.tif 000016
2006504395.tif 000017
【表２】
2006504395.tif 000018
2006504395.tif 000019
【表３】
2006504395.tif 000020
2006504395.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図1a〜1dは、血清除去後にVEGF-Aで処理した細胞におけるアポトーシスおよび細胞数を示す図である。
【図２】図2aおよび2bは、4時間および24時間での細胞における遺伝子の転写産物レベルを示す図である。
【図３】3種の遺伝子の転写産物レベルの変化を示す図である。
【図４】遺伝子チップ上で同定された豊富な転写産物がSAGEによっても同定されることを示す図である。
【配列表】
2006504395.tif 000022
2006504395.tif 000023
2006504395.tif 000024
2006504395.tif 000025
2006504395.tif 000026
2006504395.tif 000027
【図１】
2006504395.tif 000028
【図２】
2006504395.tif 000029
【図３】
2006504395.tif 000030
【図４】
2006504395.tif 000031
【国際調査報告】
2006504395.tif 000032
2006504395.tif 000033
2006504395.tif 000034
2006504395.tif 000035
2006504395.tif 000036