(57)【要約】本発明は、発現プロファイルを用いて、２以上の医薬均等性薬物製剤のバイオ均等性を決定する方法を提供する。さらに、本発明は、臨床効力に変化なしに標準的薬物製剤に代わり得る薬物を選択する方法を提供する。 別の実施態様において、本発明は、本発明方法を実施するためのコンピューターシステム、キットおよびデータベースを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
類似の生物学的サンプルを接触せしめるときに、２医薬均等性薬物製剤のバイオ均等性の程度を決定する方法であって、下記： 
(a) 第１発現プロファイルを、第１薬物製剤または組成物と接触された生物学的サンプル中の第１の複数の細胞構成体の存在量を測定することにより得る；
(b) 第２発現プロファイルを、医薬均等性の第２薬物製剤または組成物と接触された類似の生物学的サンプル中の第２の複数の細胞構成体の存在量を測定することにより得る；
(c) 得られた発現プロファイルを比較する；および 
(d) ２薬物製剤または組成物間のバイオ均等性の程度を、発現プロファイル間の類似性の程度を比較することにより決定する；
ことを含む方法。
【請求項２】
該生物学的サンプルが哺乳動物である、請求項１の方法。
【請求項３】
該生物学的サンプルがヒトである、請求項１の方法。
【請求項４】
該生物学的サンプルが細胞培養物である、請求項１の方法。
【請求項５】
該生物学的サンプルが酵母である、請求項１の方法。
【請求項６】
該生物学的サンプルが非哺乳動物である、請求項１の方法。
【請求項７】
発現プロファイルを比較する工程を、発現プロファイルをベクトルに変換し、計量類似性の使用によりベクトルを比較することにより行う、請求項１−６のいずれかの方法。
【請求項８】
計量類似性が一般化されたコサイン角である、請求項７の方法。
【請求項９】
バイオ均等性の程度を決定する工程を、計量類似性から共効率相関を決定することにより行う、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
該第１の複数の細胞構成体および該第２の複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のＲＮＡ種の存在量を含む、請求項１−９のいずれかの方法。
【請求項１１】
該第１のＲＮＡの複数の存在量が、第１の既知の薬物製剤の投与に対する応答において細胞中で増加または減少されるのが知られている多数のＲＮＡ種の存在量を構成する、請求項１０の方法。 
【請求項１２】
該存在量を、遺伝子転写体アレイを該細胞からのＲＮＡまたはそれから誘導されたｃＤＮＡと接触させることを含む方法により測定する、なお、遺伝子転写体アレイは付着された核酸または核酸模擬体を有する表面を含み、該核酸または核酸模擬体は該複数のＲＮＡ種またはそれから誘導されたｃＤＮＡとハイブリドし得るものである、請求項１０または１１の方法。
【請求項１３】
該第１の複数の細胞構成体および該第２複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のタンパク質種の存在量を含む、請求項１−９のいずれかの方法。
【請求項１４】
該存在量を、該細胞からのタンパク質と抗体アレイを接触せしめることを含む方法により測定する、なお、抗体アレイは付着された抗体を有する表面を含み、該抗体は該複数のタンパク質種と結合し得るものである、請求項１３の方法。
【請求項１５】
該存在量を、該細胞からのタンパク質の２次元電気泳動を行うことを含む方法により測定する、請求項１３の方法。
【請求項１６】
該細胞構成体が該細胞型中に存在する複数のタンパク質種の活性を含む、請求項１−９のいずれかの方法。
【請求項１７】
第１薬物製剤が製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤である、請求項１−１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
第１発現プロファイルが、製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤の発現プロファイルであり、表１３に示される、請求項１−１６のいずれかの方法。
【請求項１９】
バイオ均等性置換薬物製剤を、該薬物処置の必要な患者の処置における使用のために選択する方法であって、下記： 
(a) 第１発現プロファイルを、第１の既知の薬物製剤を投与した対象からの細胞中の第１の複数の細胞構成体の存在量を測定することにより得る；
(b) 第２発現プロファイルを、該置換薬物製剤での医薬均等性の治療がなされた類似の対象の細胞中の第２の複数の細胞構成体の存在量を測定することにより得る；
(c) 得られた発現プロファイルを比較する；  
(d) ２薬物製剤間のバイオ均等性の程度を、発現プロファイル間の類似性の程度を比較することにより決定する；
(e) (d)で決定されたバイオ均等性の程度から、該置換薬物製剤が、第１の既知または標準的薬物製剤の臨床結果と十分類似である臨床結果を患者にもたらし、第１薬物製剤を第２薬物製剤で置換し得るかどうかを評価する；および
(f) 該薬物処置の必要な患者の処置における使用のために、(e) における評価が置換をなし得ることを示していると、該置換薬物製剤を選択する；
ことを含む方法。
【請求項２０】
該生物学的サンプルが哺乳動物である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該生物学的サンプルがヒトである、請求項１９の方法。
【請求項２２】
発現プロファイルを比較する工程を、発現プロファイルをベクトルに変換し、計量類似性の使用によりベクトルを比較することにより行う、請求項１９−２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
計量類似性が一般化されたコサイン角である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
バイオ均等性の程度を決定する工程を、計量類似性からの共効率相関を決定することにより行う、請求項２２または２３の方法。
【請求項２５】
該第１の複数の細胞構成体および該第２の複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のＲＮＡ種の存在量を含む、請求項１９−２４のいずれかの方法。
【請求項２６】
該第１のＲＮＡの複数の存在量が、第１の既知の薬物製剤の投与に対する応答において細胞中で増加または減少されるのが知られている多数のＲＮＡ種の存在量を構成する、請求項２５の方法。 
【請求項２７】
該存在量を、遺伝子転写体アレイを該細胞からのＲＮＡまたはそれから誘導されたｃＤＮＡと接触させることを含む方法により測定する、なお、遺伝子転写体アレイは付着された核酸または核酸模擬体を有する表面を含み、該核酸または核酸模擬体は該複数のＲＮＡ種またはそれから誘導されたｃＤＮＡとハイブリドし得るものである、請求項２５または２６の方法。
【請求項２８】
該第１の複数の細胞構成体および該第２複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のタンパク質種の存在量を含む、請求項１９−２４のいずれかの方法。
【請求項２９】
該存在量を、該細胞からのタンパク質と抗体アレイを接触せしめることを含む方法により測定する、なお、抗体アレイは付着された抗体を有する表面を含み、該抗体は該複数のタンパク質種と結合し得るものである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
該存在量を、該細胞からのタンパク質の２次元電気泳動を行うことを含む方法により測定する、請求項２８の方法。
【請求項３１】
該細胞構成体が該細胞型中に存在する複数のタンパク質種の活性を含む、請求項１９−２４のいずれかの方法。
【請求項３２】
第１薬物製剤が製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤である、請求項１９−３０のいずれかの方法。
【請求項３３】
第１発現プロファイルが、製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤の発現プロファイルであり、表１３に示される、請求項１９−３０のいずれかの方法。
【請求項３４】
第１の既知の薬物製剤での処置を必要とする患者を第２薬物製剤で処置する方法であって、下記：
(a) 第１の既知の薬物製剤または組成物と第２の異なるが医薬均等性である薬物製剤とのバイオ均等性の程度を決定する；
(b) (a)で決定されたバイオ均等性の程度から、第２薬物製剤が、第１薬物製剤の臨床結果と十分類似である臨床結果を患者にもたらし、第１薬物製剤または組成物を第２薬物製剤で置換し得るかどうかを評価する；および
(c) 第１の既知の薬物の処置を必要とする患者を、(b) における評価が置換をなし得ることを示していると、第２薬物製剤の投与により処置する；
ことを含む方法。
【請求項３５】
バイオ均等性の程度を決定する工程を、請求項１−１８のいずれかの方法により行う、請求項３４の方法。
【請求項３６】
評価の工程を、第１薬物製剤または組成物を第２薬物製剤または組成物で置換し得るのに十分類似であると知られている対の薬物製剤と決定された共効率相関とを比較して、行い、決定された共効率相関が既知の対の共効率相関より大きくないと、置換をなし得る、請求項３４の方法。
【請求項３７】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.90 より大きくなければならない、請求項３４−３６のいずれかの方法。
【請求項３８】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.95 より大きくなければならない、請求項３７の方法。
【請求項３９】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.98 より大きくなければならない、請求項３８の方法。
【請求項４０】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.99 より大きくなければならない、請求項３９の方法。
【請求項４１】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.995 より大きくなければならない、請求項４０の方法。
【請求項４２】
該第１既知薬物製剤が製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤である、請求項３４−４１のいずれかの方法。
【請求項４３】
第１発現プロファイルが、製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤の発現プロファイルであり、表１３に示される、請求項３４−４１のいずれかの方法。
【請求項４４】
類似の対象に投与された２以上の薬物製剤のバイオ均等性を決定するためのコンピューター・システムであり、プロセッサーおよび該プロセッサーに連結されたメモリーを含み、該メモリーが１以上のプログラムをコードし、１以上のプログラムが該プロセッサーを起動して、下記を含む方法：
(a) 使用者のインプットまたは内部データベースから来る１以上の発現プロファイルを受ける；
(b) 均等のベクトル表示を計算する；
(c) これらのベクトルを比較して、計量類似性により類似性の程度を決定する；
(d) 計量類似性から共効率相関を計算する；
(e) 共効率相関から２以上の薬物製剤のバイオ均等性の程度を決定する；
を行うコンピューター・システム。
【請求項４５】
ベクトルを比較して類似性の程度を決定する該工程を、比較すべき発現プロファイルの２ベクトル表示間の一般化されたコサイン角である計量類似性の手段により２以上の発現プロファイル・ベクトルを比較することを含む方法によって、達成する、請求項４４のコンピューター・システム。
【請求項４６】
比較すべき発現プロファイルのひとつがコンピューター・メモリー中に含有されている、請求項４４のコンピューター・システム。
【請求項４７】
メモリー中に保持される発現プロファイルが、製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤の発現プロファイルであり、表１３に示される、請求項４４−４６のいずれかのコンピューター・システム。
【請求項４８】
第１発現プロファイルおよび該第２発現プロファイルの両方がメモリー中で利用可能とされる、請求項４４−４７のいずれかのコンピューター・システム。
【請求項４９】
該プログラムが該プロセッサーを起動して、第１および第２の発現プロファイルを表すベクトルを計算および比較する工程を行う、請求項４４−４８のいずれかのコンピューター・システム。
【請求項５０】
対象において薬物製剤への暴露から得られる発現プロファイルを決定するためのキットであって、既知の異なる配列の複数の核酸を表面に含有する固体相を含み、各核酸は該固体相の既知の位置にあり、各核酸はＲＮＡ種またはそれから誘導されるｃＤＮＡ種とハイブリドでき、該ＲＮＡ種は該治療の該作用の異なるレベルで増加または減少されるのが知られており、該複数が増加または減少されないＲＮＡとハイブリドし得る核酸を実質的に除外しているキット。
【請求項５１】
対象において２以上の薬物製剤のバイオ均等性を決定するためのキットであって、下記：
(a) 既知の異なる配列の複数の核酸を表面に含有する固体相、各核酸は該固体相の既知の位置にあり、各核酸はＲＮＡ種またはそれから誘導されるｃＤＮＡ種とハイブリドでき、該ＲＮＡ種は薬物製剤に対する応答において増加または減少されるのが知られている； および
(b) 電子形態または記載形態にある既知または標準的な薬物製剤の発現プロファイル、なお、該発現プロファイルは、既知または標準的な薬物製剤が投与された１以上の対象の細胞中の複数の細胞構成体の測定された量を含む；
ことを含むキット。
【請求項５２】
該発現プロファイルが電子形態にあり、そして該キットはコンピューター読み取り媒体上に発現プロファイル解析ソフトウエアをさらに含み、該ソフトウエアはプロセッサーも有するコンピューターのメモリー中にコード可能であり、該コードされたソフトウエアが該プロセッサーを起動して、下記を含む方法：
(a) 該対象の細胞の発現プロファイルを受ける、該発現プロファイルはＲＮＡ種またはそれから誘導されたｃＤＮＡの測定された存在量を含む；
(b) 均等のベクトル表示を計算する；
(c) 計算されたベクトルを、コンピューター・メモリー中に保存された発現プロファイルから計算される１以上のベクトルと比較し、そしてその類似性の程度を、比較される発現プロファイルの２ベクトル表示間の一般化されたコサイン角である計量類似性の手段により決定する；
(d) 計量類似性から共効率相関に基づくバイオ均等性を決定する；および
(e) この計算されたバイオ均等性をアウトプットする；
を行う、請求項５１のキット。
【請求項５３】
コンピューター・メモリー中に保存される発現プロファイルが、製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤の発現プロファイルであり、表１３に示される、請求項５１または５２のキット。
【請求項５４】
コンピューター読み取り媒体上のデータベースであって、１以上の薬物製剤についての発現プロファイルを含み、該データベースは電子形態にあり、該発現プロファイルは、薬物製剤に対する１以上のレベルの暴露で１以上の対象の細胞中の複数の細胞構成体を測定することを含むデータベース。
【請求項５５】
該発現プロファイルが、製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤の発現プロファイルを含み、表１３に示される、請求項５４のデータベース。 
【請求項５６】
該複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のＲＮＡ種の存在量を含む、請求項５４のデータベース。
【請求項５７】
該複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のタンパク質種の存在量を含む、請求項５４のデータベース。
【請求項５８】
該複数の細胞構成体が、該細胞中に存在する複数のタンパク質種の活性の測定を含む、請求項５４のデータベース。
【請求項５９】
薬物製剤の１バッチを同じ薬物製剤の第２バッチと品質管理の目的で比較する方法であって、下記：
(a) 第１バッチの薬物製剤と第２バッチの薬物製剤とのバイオ均等性の程度を決定する；
(b) (a) で決定されたバイオ均等性の程度から、第２バッチの薬物製剤が、第１バッチの薬物製剤の臨床結果と十分類似である臨床結果を患者にもたらし、第１バッチの薬物製剤または組成物を第２バッチの薬物製剤または組成物で置換し得るかどうかを評価する；および
(c) (b) における評価が、２バッチが十分な程度のバイオ均等性を有することを示していると、バッチ１とバッチ２が、最終製品をつくる製造プロセスを続けるのに十分なバイオ均等性であることがわかる；
ことを含む方法。 
【請求項６０】
バイオ均等性の程度を決定する工程を請求項１−１８のいずれかの方法により行う、請求項５９の方法。 
【請求項６１】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.90 より大きくなければならない、請求項５９または６０の方法。
【請求項６２】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.95 より大きくなければならない、請求項６１の方法。
【請求項６３】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.98 より大きくなければならない、請求項６２の方法。
【請求項６４】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.99 より大きくなければならない、請求項６３の方法。
【請求項６５】
評価が置換をなし得ることを示すために、共効率相関が 0.995 より大きくなければならない、請求項６４の方法。
【請求項６６】
該第１バッチの薬物製剤が製剤Ａと呼ぶ ASM981 経口製剤である、請求項５９−６５のいずれかの方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、対象、特にヒト患者における２以上の医療領域のバイオ均等性に関するインビボ機能を基にする決定を行うための、発現プロファイリング・システムおよび発現プロファイリングの使用に関する。特に、本発明は、対象における種々の処置領域のバイオ均等性をモニターし、比較する方法、キット、データベースおよびコンピューターシステム、ならびに適当な医療的選択を決定するためにこの比較を使用することに関する。
【０００２】
関連技術についての記述
近年、いくつかの技術における進歩が、いずれの一時点における細胞内の多数の遺伝子転写体の発現レベルをモニターするのを可能にした。これを“遺伝子発現プロファイリング”という。完全なゲノムが知られている生物体において、細胞内のすべての遺伝子の転写体を解析することは可能である。ヒトなどの生物体において、ゲノムについての知識が増加している。現在、細胞内の多数の遺伝子(参照、例えば、 Schena et al., Science, Vol. 270, pp. 467−470 (1995); Lockhart et al., Nat. Biotech., Vol. 14, pp. 1675−1680 (1996); Blanchard et al., Nat. Biotech., Vol. 14, p. 1649 (1996); Ashby et al., 米国特許 5,569,588（1996.10.29)およびタンパク質(参照、例えば、McCormack et al., Anal. Chem., Vol. 69, pp. 767−776 (1997); Chait−BT, Nat. Biotech., Vol. 14, p. 1544 (1996))を同時にモニターできる。
【０００３】
この技術の採用は、例えば、種々の生理的状態、特に疾患状態において、上方調節または下方調節される遺伝子の同定を含む。転写体アレイおよび遺伝子プロファイルの比較についての追加的使用は、情報伝達系メンバーの解析、種々の薬剤のための標的の同定、特定の疾患の状態および重篤度についての評価、疾患状態の医療法の効果についてのモニターを含む (参照、例えば、米国特許 6,218,122; 5,965,352; 5,811,231; 6,190,857; 5,777,888; 6,190,857; 6,146,830; 5,800,992; 5,723,290; 5,695,937; 6,203,987; 5,741,666; 5,702,902; 5,695,937; 6,222,093; 5,769,074; 5,707,807; 5,741,666; 5,702,902; 5,935,060; 6,222,093; 5,569,588 および米国特許出願公開 2001/0018182；PCT 公開 WO 99/66024; WO 00/39338; WO 00/39337; WO 01/11082; WO 00/58520; WO 00/24936; WO 01/20043 A1; WO 00/58520, WO 99/57324; WO 01/34789; WO 99/58708；WO 00/39336, すべてを出典明示により本明細書の一部とする)。
【０００４】
このような適用は、メッセンジャーＲＮＡ(mRNA)種や細胞内にタンパク質等の分子種などの細胞構成体の存在量および／または活性レベルが、細胞の生物学的状態または環境に実質的な改変に応じて変わるという知見に基づいている。この“改変”は、限定でないが、具体的な薬剤処置または療法あるいは生物体の細胞の生物的または化学的な環境における微妙な変化を含み得る。この改変は、処方、賦形剤、組成、結晶形態、薬剤自体もしくは薬剤運搬システムの物理化学的性質の微細な変化による薬剤バイオアベイラビリティの変化から生じ得る。すなわち、このような複数の細胞構成体、本明細書では“発現プロファイル”または遺伝子発現プロファイルと言うが (mRNAの測定に言及するときに)、このものは改変の本質および作用について豊富な情報を含有している。さらに、この発現プロファイルは、改変の特性によって独自的に決定され、上記のなんらの因子の単離および比較を可能にする。
【０００５】
この生物学的プロファイルを測定し比較する能力は、大きい人的および商業的な利点の可能性を有する。例えば、薬剤の発見および医療法の設計の過程において大きい利点があり、既知または既存の薬剤の新規候補薬剤に対する応答プロファイルを提供し比較する。また、薬剤の処方または療法のバイオ均等性を決定する薬剤力学的因子の特異的かつ同定可能な観点に関する、機能を基にする遺伝子発現応答プロファイルを確立し得ることに大きい利点がある。このことは、既知の標準的薬剤のバイオ均等性と同様のバイオ均等性をもつ薬剤処方の同定を可能にし、既知の標準的薬剤と同一で特定の望ましい医療的効果をもつ薬剤候補の同定をもたらし得る。さらに、特定の個々の化合物、製剤、配合、組成物、賦形剤などがバイオ均等性をどうして変えるのか、また、これが臨床に関連する効率または毒性の性質に関係し得るのか、についての理論が発展するのを助ける。
【０００６】
薬力学
薬力学は、薬物動態と対照的に、薬物の生化学的および生理学的作用およびその作用メカニズムを研究する。この解析の焦点は、薬物と標的細胞との化学的および物理的相互作用を描写することにある。大部分の薬物の作用は薬物と生物体または細胞の微分子構成物質との相互作用から生じる。通常、この構成物質は受容体形態にある。用語 “受容体” は、薬物がその作用を開始するために結合するすべての細胞微分子を意味する。最も重要な受容体の多くは、その正常機能が、内因性調節リガンド、特にホルモン、成長因子、神経伝達体およびオータコイドについての受容体として働く細胞のタンパク質である。これらの受容体は非常に選択性である。これらの生理学的受容体は、特徴的に、大きい選択性をもつ個々の情報伝達分子を認識し、それに応答するからである。
【０００７】
受容体に結合し、内因性調節的化合物の作用に似ている薬物は“アゴニスト”と言い、アゴニストの作用を阻害する薬物は“アンタゴニスト”と言う。アゴニストとして部分的に作用する物質は“部分的アゴニスト”と言い、生産的アゴニスト依存的配座変化を受けることから受容体を安定にする物質を“陰性アンタゴニスト”または “逆アゴニスト”と言う。
【０００８】
受容体の調節作用は、その細胞標的、エフェクタータンパク質に直接的に発揮されるか、または介在性分子すなわちトランスデューサーにより細胞の標的に伝達され得る。このしばしば複雑である作用群は“受容体情報導入経路”と言う。
【０００９】
薬物受容体相互作用の究極の効果は、非常に多様なエフェクターのメカニズムにより仲介され得る。このメカニズムは、酵素、調節性タンパク質、構造性タンパク質などの標的タンパク質のリン酸化などの改変を含み得る。メカニズムは周期的ＡＭＰなどの細胞質第２メッセンジャーまたはカルシウムイオン濃度を含み得る。他のメカニズムは、細胞膜のポテンシャルの改変によりシグナルを送る血漿膜リガンド依存性チャネルでのイオン選択性チャネルの調節を含む。エフェクターメカニズムの１つの重要な型は、例えば、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、レチノイドなどについての受容体であり、転写因子として作用し、特異的遺伝子の転写を調節する溶性のＤＮＡ結合タンパク質がある(参照、Evans, Science, Vol. 240, pp. 889−895 (1988))。
【００１０】
いくつかの薬物は受容体との結合により作用しない。このような薬物の例には、種々の体液の容量オスモル濃度を制御するマンニトールの使用、または細胞構成成分中に取り込まれて、その機能を改変し得る正常の生物学的化学物の構造的類似物の使用がある。
【００１１】
薬物動態
用語 “薬物動態” は、本明細書において薬力学と区別して用い、薬物の吸収、体組織または液中の分布、メカニズムおよび／または消失についての動態に関するすべての因子を意味する。これは、膜を越えての薬物の移動を調節する生理化学的因子を含む。薬物の吸収、分布、生物的形質転換および排泄がすべて細胞膜を越えての薬物の通過を含むからである。
【００１２】
臨床家にとって大きい興味は薬物のバイオアベイラビリティである。この用語は、本明細書において、薬物がその作用部位に到達する範囲または薬物がその作用部位への通路を有する生物学的液を示す。バイオアベイラビリティに影響を与える因子は、対象からの薬物の吸収および代謝または排泄の速度を含む。多くの因子が吸収に影響を与え、それには、膜を通っての移動に影響を与える多数の生理化学的因子、薬物の溶解性や取り込みメカニズム、並びに投与の部位および薬物の処方や組成がある。薬物投与の種々の経路が非常に異なる吸収特性を有する。それらの経路には、経口摂取、肺吸収、非経口注入および粘膜や皮膚や目への適用がある。非経口注入は、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、鞘内注入を含む。
【００１３】
薬物は、血流に吸収または注入されると、間質液または細胞液中に分配され得る。特定の薬物の分配パターンは薬物の物理化学的性質と宿主のある種の生理的因子との両方の関数である。これらの因子は、血流、リピド溶解性、薬物のタンパク質結合性、ならびにｐＨおよび毛管内皮膜の透過性を含む。この最後の因子は、最も臨床的に関連する分配因子の決定的な１つである血液脳関門に関与する。脳毛細管の内皮細胞は、多くの他の内皮細胞と、細胞間小穴および細胞吸水小胞を欠くことで相違する。代わって、密着結合が支配して、水の大きい流れが非常に制限される。これは、多くの薬物、特に非脂質溶解性薬物の、ヒトを含む哺乳動物における中枢神経系（ＣＮＳ）への接近を制限する。
【００１４】
薬物の分配はまた、体内の特定の組織に薬物が蓄積または濃縮することにより影響を受ける。すなわち、いくつかの薬物は、細胞外液よりも細胞内に蓄積し、または上皮細胞を越えて細胞間移動液中に蓄積し、または脂質（脂肪）または骨中に優先的に蓄積することがある。薬物の作用は再分配によっても変えられることがある。例えば、高い脂質溶解性ＣＮＳ活性薬物を静注(i.v.)で投与すると、脂肪細胞に急速に取り込まれる。
【００１５】
薬物のバイオアベイラビリティはバイオ形質転換または代謝によっても決定される。バイオ形質転換をフェーズＩとフェーズIIに分けると便利である。フェーズＩ反応は、親化合物上の官能基に関する反応、例えば、酸化、水酸化、脱アミン化などである。フェーズＩ反応はしばしば、薬理学的活性の消失をもたらし、改変された薬物が尿中に急速に排泄されるか、ついで内因性化合物と反応して、尿中に排泄される水溶性のコンジュゲートを形成する。
【００１６】
フェーズIIコンジュゲーション反応は親化合物上の官能基と内因性のグルクロン酸、硫酸塩、グルタチオン、アミノ酸または酢酸塩との共有結合の形成を導く。得られる高度に極性のコンジュゲートは一般的に非活性であり、尿および糞便中にすぐに排泄される。
【００１７】
薬物の代謝性転換は本質的にほとんど酵素性であり、しばしば肝臓で起きる。しかし、腎臓、消化管、皮膚、肺などの他の器官も有意の代謝能力を有する。最も重要かつ複雑な酵素系のひとつはチトクローム P450 モノオキシゲナーゼ系である。この系は、多数の組織の平滑内質細網に存在するヘム含有膜タンパク質からなる。 他の重要な酵素系の例として、加水分解性コンジュゲーション反応を触媒するものがある。
【００１８】
多くの他の因子が薬物のバイオ形質転換に影響を与え得る。これらの因子には、酵素系の誘導または阻害、遺伝的多形性、疾患、年齢、性別、薬物−薬物相互作用がある。最後に、薬物のバイオアベイラビリティは、体から薬物の排泄または消失の経路および効率によって決定される。腎臓が薬物およびその代謝体の消失について最も重要な器官である。尿中での薬物およびその代謝体の排泄には３過程がある。すなわち、糸球体濾過、能動的細管分泌、受動的細管再吸収である。肝で形成された薬物代謝体の多くは、腸管中に胆汁で排泄され、糞便に排泄されるか、または血液に再吸収されて最終的に尿に排泄される。他の薬物は、汗、唾液、涙、皮膚、乳汁などに排泄されることがある(参照、Goodman and Gilman's “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 9th Ed., Hardman and Limbird, eds., McGraw−Hill, NY (1996), 参照、特に Chapters 1, 2, 3 and Appendix 1)。
【００１９】
バイオ均等性
バイオ均等性の現象および他の点では非常に類似の医薬品の間のバイオ均等性の正確な決定は、製薬業界での最も重要かつ困難な実際的な問題のひとつとなっている（参照、例えば、Welage, et al., J. Am. Pharm. Assoc., Vol. 41, No. 6, pp. 856−867 (2001); Senn, Stat. Med., Vol. 20, Nos. 17−18, pp. 2785−2799 (2001); Nerurkar et al., J. Clin. Pharmcol., Vol. 32, No. 10, pp. 935−943 (1992); Hendeles, Am. J. Hosp. Pharm., Vol. 50, No. 5, p. 913 (1993)）。医薬品は、同じ活性成分（化学的に同じ薬剤物質）を含有し、強度または濃度ならびに投与の用量形態および経路が同じであると、本明細書で用いる用語 “医薬均等性” であると考える。２つの医薬均等性医薬品は、２製品における活性成分のバイオアベイラビリティの速度および程度が適切な試験条件で有意に相違しないときに、本明細書で用いる用語“バイオ均等性”にあると考える。
【００２０】
かつて、異なる製造者の薬剤の用量形態および単一製造者の異なる製造ロットは、時にバイオアベイラビリティが相違していた。この相違は、主に低い溶解性で吸収の遅い薬剤の経口用量形態で見られた。このような変動は、製品の製剤および製造において、ある種の製造者が厳格に制御し得ない薬剤の結晶形態や粒子サイズなどの特性の相違から生じる。これらの因子は、例えば、用量形態の崩壊、薬物の不溶性、さらには薬物吸収の速度および程度に影響を与え得る。
【００２１】
異なる薬物製剤のバイオ均等性の変動可能性は、製薬業界、医師、とりわけ患者にとっての大きい懸念事項である。調節要件を強めることは、承認され表面上は同等の医薬品間のバイオ均等性の変動を低下せしめるのに必要である。しかし、薬物製剤の起こり得る非バイオ均等性の意義は、大きい公的健康上の関心事である。必要な医薬が妥当な価格で消費者に使用可能とすること、およびこれをブランド薬と市場で競争できるジェネリック薬の導入によりさらに進めることを、公的政策は模索している。
【００２２】
しかし、ジェネリック薬を著名のブランド薬とバイオ均等性であるときにのみ承認することを確保しようとする製薬業界および関連政府当局の努力にもかかわらず、実際には、必ずしもそうとなっていない。臨床に従事する多くの医師は、患者の著名なブランド薬を価格の安いジェネリック薬に変えると、バイオ均等性の予期できない変動のために、臨床的に有意の、時に重い危険な変化が薬理学的作用に起きることを経験している(参照、 Ronald et al., Neurology, Vol. 57, pp. 571−573 (2001); Keith, Int. J. Fertil. Womens. Med., Vol. 46, No. 6, pp. 286−295 (2001); Balter et al., Clin. Ther., Vol. 23, No. 10, pp. 1720−1731 (2001); Lam, J. Clin. Psychiatry, Vol. 62, Suppl. 5, pp. 18−22 (2001); Wagner et al., Pharmacotherapy, Vol. 20, No. 2, pp. 240−243 (2000); Welty, Ann. Pharmacother., Vol. 26, No. 6, pp. 775−777 (1992); Nerurkar et al., J. Clin. Pharmacol., Vol. 32, No. 10, pp. 935−943 (1992); Lesser et al., Neurology, Vol. 57, pp. 571−573 (2001); Lam et al., J. Clin. Psychiatry, Vol. 62, Suppl. 5, pp. 18−22 (2001); Kluznik et al., J. Clin. Psychiatry, Vol. 62, Suppl. 5, pp. 14−18 (2001); Olling et al., Biopharm. Drug Dispos., Vol. 20, pp. 19−28 (1999); Rosenbaum et al., Epilepsia, Vol. 35, pp. 656−660 (1994); Mikati et al., Epilepsia, Vol. 33, pp. 359−365 (1992); Ludden et al., Ther. Drug Monit., Vol. 13, pp. 120−125 (1991); Alvarez et al., Ann. Neurol., Vol. 9, pp. 309−310 (1981); Wilder et al., Neurology, Vol. 57, pp. 582−589 (2001); Epilepsy Foundation of America Statement on Substitution of Generic Anticonvulsant Drugs, J. Epilepsy, Vol. 1, p. 49 (1988); Nuwer et al., Neurology, Vol. 40, pp. 1647−1651 (1990); Neurology, Vol. 40, pp. 1647−1651 (1990); Cook et al., Neurology, Vol. 57, pp. 698−700 (2001); この問題について一般的な検討は、参照、Goodman and Gilman's“The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 9th Ed., Hardman and Limbird , Eds., McGraw−Hill, NY (1996), 参照、特に Appendix 1, pp. 1697−1698 and Chapters 1 and 3)。
【００２３】
もちろん、２薬物の薬理学的作用の相違は多くの因子から起こり得る。しかし、このことは、問題のジェネリック製剤が著名なブランド製品と医薬均等にあれば、すなわち、同じ活性成分（同じ化学的物質）を含有し、同じ強度および濃度にあり、投与について同じ用量形態と経路であれば、比較的容易に決定できる。しかも、この決定は、患者に薬剤を投与することなく、通常の試験室的分析手法により決定できる。他の点で医薬均等性の薬剤のバイオ均等性の変動は、臨床効果に顕著な変動をもたらすことがあり、その変動は、実際の患者における現実の最終効果の観察以外には、検出するのに複雑かつ困難である(参照、 Pollak, Can. J. Cardiol., Vol. 17, No. 11, pp. 1159−1163 (2001) and Goodman and Gilman, 前出)。このように、この問題は、患者の安全性および処置の経済性と相まって非常に重要であり、処方箋でブランド薬かジェネリック薬かを選択する医師にとって一義的な特別の関心事である。
【００２４】
このように、生物体に対する薬物または処置法の最終的効果を一緒に決定する因子は極めて複雑で、上記したすべての薬物動態的および薬力学的因子を含む。さらに、２つの医薬的に均等の医療方法の間においてもバイオ均等性の臨床的に問題の多い変動が生じ、上記したすべての薬物動態のいずれかから起こり得る。これらの因子は、数多く、予測困難であり、試行錯誤によってのみ決定できる。
【００２５】
上記理由により、バイオ均等性を変え得る因子に変化が起きたときに、決定し得ることは、非常に重要である。それは、限定でないが、異なる処方、組成、結晶形の性質、投与法または賦形剤の性質が患者での均等的最終結果を生じることを含む。従って、所望の処置療法の異なる処方または組成物のバイオ均等性を正確に再現可能に決定できるように、ヒトにおける種々の処置法の実際の機能的臨床効果を決定し比較する方法が必要である。
【００２６】
所望のすべての薬物の最終的機能的効果は、生物体の暴露細胞の遺伝子発現プロファイルにおける特異的および独特の改変がつくられることである。このことは、少なくとも部分的に、例えば、具体的な薬物治療の結果として起きる、タンパク質の機能や活性などの細胞の種々の構成体の改変が他の遺伝子の転写および活性に特徴的な変化を起こすことに基づいている。 このように生じた特徴的変化を、特定の薬物治療の機能的作用に相関する特定の改変の“記号”を明確にするために使用できる。これは、薬物効果に関連するタンパク質の機能または活性に実際の混乱がなくても、遺伝子調節の複雑な過程を支配する代償的かつフィードバックのメカニズムのゆえに、使用できる。従って、これらの記号またはプロファイルを、使用し、薬物作用のバイオ均等性を含む種々の事項を比較でき、同時的にいくつかの治療をモニターするのにも使用できる。
【００２７】
疾患状態、薬物の効果および毒性を決定する目的のための既知プロファイルについて、遺伝子発現プロファイルを含み発現プロファイルを一般化し比較する基本的な考えが提案されている (参照、特に、米国特許 5, 800,992 (Fodor); 5,777,888 (Rine and Ashby, 1998); 6,218,122 (Friend and Stoughton, 2001); および PCT 公開 WO 00/39336, WO 00/39338, WO 00/39337)。
【００２８】
米国特許 6,218,122 (Friend and Stoughton, 2001) (122) は、治療を行った対象からの診断的遺伝子発現プロファイルをその診断についての “内挿された変動応答プロファイル”と比較することにより、対象に対する薬物療法の効果を決定する方法を開示する。この内挿された変動応答プロファイルは、類似の対象における遺伝子発現プロファイルなどの応答プロファイルを種々の用量レベルまたは各療法の効果レベルで測定することにより、そして得られた応答プロファイルを内挿することにより得られる。診断的プロファイルに最も類似の内挿された変動応答プロファイルは、効果のレベルおよび特定の治療または薬物用量レベルを指し示す。
【００２９】
このように、122 特許の方法は、特定の処置療法を受けた対象の遺伝子発現プロファイルを、用量の関数で変化する内挿された変動応答プロファイルと比較することを可能にする。しかし、２つの他の点では同じである、すなわち医薬均等性の薬物製剤の間におけるバイオ均等性にのみに関する因子を具体的に単離し、機能的に比較するのに、発現プロファイルを使用することは開示されていない。
【００３０】
PCT 公開 WO 00/39336 A1 (Friend Stoughton and He, 国際公開、２０００年７月６日) は、薬物への暴露に対する応答で対象からの細胞中の多数の細胞構成体の測定により得られる応答プロファイルにおける共調節された細胞構成体のセット (いわゆる遺伝子セット) を明確にする方法を開示している。さらに、この開示された方法は、共通の応答モチーフ、いわゆる共通プロファイルを応答プロファイルにおいて同定し、元の応答プロファイルを遺伝子セット中に投影して、薬物の効果および毒性に関する簡単にされた規模減少の応答プロファイルを得ることを含む。
【００３１】
また、PCT 公開 WO 00/39336 A1 は、生物学的応答を共通プロファイルに、種々の型の計量類似性の使用により比較する方法を開示する。この方法は、既知の薬物の応答プロファイルを共通プロファイルに比較することにより薬物発見に使用される。しかし、開示された方法は、薬物の薬力学性に関する薬物作用のエレメント、例えば、薬物活性および薬物受容体相互作用の改変などの検定を目的とする。２以上の薬理学的に均等の薬物製剤間でのバイオ均等性の程度を、バイオ均等性を決定する因子以外のすべての因子が一定である状況で、単離し具体的に決定し、バイオ均等性の変動の効果の測定を可能にする発現プロファイル分析の使用は、考えられていない。
【００３２】
従って、類似または同一と考えられる薬物または医薬的に均等な薬物製剤または組成物の間におけるバイオ均等性の相違を単離し比較でき、もって得られたバイオ均等性の簡単で臨床的に意味のある比較を可能にする遺伝子発現プロファイルデータまたはタンパク質の存在量もしくは活性のデータなどの発現プロファイルデータを分析する方法が必要である。
なお、本明細書で引用文献についての説明等は、その引用文献が本発明の先行技術であると認めるものではない。
【００３３】
発明の要旨
本発明は、対象に対する２以上の薬物治療の機能的結果または応答をモニターし得られた発現プロファイルを比較して、２以上の薬物治療間におけるバイオ均等性の程度を決定する方法を提供する。この方法は、第１すなわち既知の標準的薬物製剤または組み合わせでの治療を受けた対象からの細胞における遺伝子発現産物 (mRNA) またはタンパク質の存在量を測定することにより得られる遺伝子またはタンパク質の発現プロファイルを、第２すなわち未知であるが、既知の標準と比較すべき薬物を含む他のすべての点で医薬均等性の薬物での治療を受けた類似の対象からの細胞におけるｍＲＮＡまたはタンパク質の存在量を測定することにより得られる遺伝子またはタンパク質の発現プロファイルと、比較することを含む。
【００３４】
本発明は、類似の対象に投与されたときに、２以上の薬物製剤または組成物のバイオ均等性を決定またはモニターおよび比較する方法を提供するものであって、下記を含む: (i) 第１薬物製剤または組成物における細胞構成体の存在量を測定して第１発現プロファイルを得る; (ii) 医薬均等性の第２薬物製剤または組成物で処置された類似の対象の細胞に生じる細胞構成体の存在量を測定し第２発現プロファイルを得る; (iii) ついで、得られた発現プロファイルを比較する;  (iv) いくつかの客観的かつ臨床上意味のある尺度に従い、発現プロファイル間の類似性の程度を比較して、２以上の薬物製剤または組成物間のバイオ均等性の程度を決定する。
【００３５】
さらなる実施態様において、本発明は、患者を処置する方法を提供するものであって下記を含む：(i) 第１の既知薬物製剤または組成物と第２の異なるが医薬均等性の薬物製剤または組成物とのバイオ均等性の程度を決定する; (ii) (i) で決定された類似性の程度から、第２薬物製剤または組成物が第１の既知薬物製剤または組成物の臨床結果と十分類似の臨床結果を患者に生じ、第１の薬物製剤または組成物を第２の薬物製剤または組成物で置き換え得るかどうかを決定する; (iii) その (ii) での評価が置換可能であれば、かかる処置の必要な患者を第２の薬物製剤または組成物で処置する。
【００３６】
他の実施態様において、未知の薬物製剤または組成物のバイオ均等性を決定するためのキットも提供する。このキットは種々の組合せの構成成分を含み得る。それには、限定でないが、具体的な薬物のバイオ均等性の決定に大きい所望のある特異的ハイブリダイゼーション標的を含有し、その決定ならびにペーパーまたはコンピューター読み取り可能媒体でのデータベースに有用でないオリゴヌクレオチド標的を含有しないアレイフォーマット中の特異的オリゴヌクレオチドアレイの組合せがあり、この特異的／独特のアレイからの発現プロファイルデータの分析を使用する。さらに、このキットは、分析および比較を行うためのソフトウエアーおよびコンピューターの種々の組合せを含み、データベースからのデータを読み処理し、有用で使用者フレンドリイのフォーマットに結果をアウトプットする。
【００３７】
さらなる実施態様において、本発明は、ペーパーまたはコンピューター読み取り可能媒体におけるデータベースを提供する。それは、本発明の上記の実施態様のいずれかで使用できる１以上の薬物治療のための発現プロファイルデータ (すなわち、遺伝子またはタンパク質発現プロファイルまたはタンパク質活性データ) を含む。
【００３８】
上記実施態様の種々の面において、遺伝子発現 (mRNA レベルまたは存在量)、タンパク質存在量、タンパク質の測定または測定の組合せにより発現プロファイルを決定できる。
【００３９】
種々の実施態様において、本発明方法はさらに、発現プロファイルのいくつかのフラクションにおける有意の応答を示す細胞構成体のみを選択する工程を含む。
【００４０】
上記実施態様の種々の面において、発現プロファイルは、特定の薬物治療に対する応答において生じるｍＲＮＡ存在量の同時的測定により得られ、特定の薬物への暴露の不存在で得られる類似の測定と比較される発現プロファイルである。
【００４１】
このような方法は、所望のバイオ均等性プロファイルに適合しまたは満たす薬物製剤または組成物を同定するために、ならびにかかる所望のプロファイルに達しない薬物製剤または組成物を同定するために、例えば、薬物の発見または設計の過程において有用である。
【００４２】
本発明の方法はまた、得られる製剤または組成物のバイオ均等性に影響を与え得る既知の製剤または組成物に対する修飾を分析するために、およびなぜある種の製剤または組成物が改変されたバイオ均等性を持つかという理論を進展するために有用である。
【００４３】
本発明の方法は患者を処置するのにも有用である。この実施態様において、本方法は、医薬均等性であることに加えて、既知または標準的薬物製剤に非常に類似または同一のバイオ均等性を有する薬物製剤または組成物を医師などが選択するのを可能にする。従って、本方法は、医師が、かかる薬物処置の必要な患者を、代替えの薬物製剤で、その代替え薬物製剤が有効性ならびに毒性または副作用を含む非常に類似または同一の効果を患者に与えるとの確信をもって、処置し得ることを可能にする。
【００４４】
さらに、特定の薬物製剤または組成物に対する生物学的応答が、その薬物製剤または組成物の異なるバッチ間で、製造過程での微少な変動により、しばしば変わることがあるので、本発明方法は、薬物自体の品質および同一性を保持し、バッチ対バッチの変動の程度を決定するのに、薬物製造の過程において有用である。このことは、変動を制御するのに多くの困難がバッチ対バッチの変動の決定に関与する自然界にある物質またはその物質の半合成から誘導される薬物の生産において特に価値あるものとなろう。
【００４５】
最後に、特定の薬物製剤または組成物に対する生物学的応答が個々の生物体でしばしば異なるので、本発明方法は、個体の処置、例えば、臨床において、所望の医療的効果を得るために最上の薬物製剤および組成物を決定するのに有用である。
【００４６】
種々の実施態様において、本発明方法は、比較しようとする２以上の薬物の製剤または組成物からの発現プロファイル応答を比較するのに計量類似性の使用を含む。計量類似性は、ベクトル (a) と (b) との間の一般化されたコサイン角であり得る。ベクトルは発現プロファイルを含む複数の細胞構成体を表す。
【００４７】
種々の実施態様において、本発明方法はさらに、２以上の発現プロファイルを比較し、両者の類似性を決定するためのクラスター・アルゴリズムなどのパターン認識法の実行を含み得る。
種々の実施態様において、本発明方法はさらに、類似性に従って発現プロファイルをグループ化するためのクラスター・アルゴリズムなどのパターン認識法の実行を含み得る。
【００４８】
ある実施態様において、類似性の視覚的同定を容易にするために、応答プロファイルを、例えば、仮の色プロットなどに表示する。
ある実施態様において、本発明方法は、既知の標準的薬物製剤または化合物と、標準的薬物製剤と比較される未知の程度のバイオ均等性の変動を持つ試験化合物とを、識別する遺伝子の “プレディクター・セット”を使用できる。
【００４９】
最後に、本発明方法は、上記方法を遂行し得るコンピューターシステムなどの自動システムで行うのが好ましい。従って、本発明はまた、さらなる実施態様において、本発明方法を実行するためのコンピューター読み取り可能プログラムコードを有するコンピューター使用媒体を提供する。 コンピューターシステムは、２以上の発現プロファイルを解析し比較して、両者の類似性の程度を決定し、試験薬物と標準的薬物とのバイオ均等性を、特徴的な発現プロファイルがコンピューターシステムのメモリー中にあるか、使用者によりインプットされ得るようなすべての標準的薬物について、指し示すアウトプットをつくることを含む。
【００５０】
コンピューターシステムは、プロセッサーおよび１以上のプログラムをコードする該プロセッサーに接続されたメモリーを含む。メモリー中にコードされたプログラムによって上記方法の工程をプロセッサーが実行する。そこでは、インプットとしてコンピューターシステムに第１または第２（またはそれ以上）の発現プロファイルが取り込まれている。さらに、コンピューターシステムのメモリーは、発現プロファイルデータ、すなわち、コンピューター読み取り媒体中の１以上の既知の標準的薬物のデータベースを含有する。
【００５１】
図面についての説明
図１は、本発明方法を実行するのに有用なコンピューターシステムの例示的実施態様を示す。
【００５２】
本発明についての詳細な説明
本項では、本発明およびその適用についての詳細な説明を記述する。この記述は、本発明の一般的な方法について、いくつかを例示的に明らかにする。例は、当業者に明らかなような非限定的かつ関連的なものであり、添付の請求項により包含されることを意図する。さらに、例は、一般的方法に伴うデータ収集工程の実施態様の説明である。
【００５３】
発現プロファイルの記述
本明細書において“発現プロファイル”、細胞の生物学的状態の態様を示す複数の細胞構成体の測定を含む。この測定は、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質の存在量あるいはタンパク質の活性レベルの測定を含む。
【００５４】
本発明方法は、発現プロファイルを測定することで好ましくは始まる。多くの場合、特定の薬物製剤または組成物での処置のために対象においてすでに測定されている。他の事例では、この応答データを次の工程の前に測定しなければならない。
【００５５】
これらの測定は類似の対象で行う。本明細書における用語“類似の対象”は、発現プロファイルが有用な発現プロファイルデータを提供するのに十分類似であると当業者が思えるように、医療効果および薬物製剤の効果が決定される対象と十分に類似である対象を意味する。好ましい実施態様において、類似の対象は、同種の対象であり、選択的に、同性
および／またはほぼ同じ年齢および細胞培養を適用するなら同じ細胞型である。ある実施態様において、発現プロファイルが得られる元の類似の対象は、効果がモニターされている対象として、同じ個体 (すなわち、同じ生物体または患者) であり得る。
【００５６】
上記のように、発現プロファイルは、細胞構成体の関連特性の変化についての測定を含む。より具体的には、変動の遺伝子発現レベル(すなわち、薬物暴露の存在)と元の遺伝子発現レベル(すなわち、薬物暴露の不存在)の比率（またはこの比率のロガリスム）を測定する。
【００５７】
既知または候補の薬物についての発現プロファイルデータを同様にして得る。もしまだ利用可能でなければ測定しなければならない。上記のように、データは、所望の細胞、すなわち対象からの細胞における細胞構成体のレベルを測定することで得る。医療の効果またはバイオ均等の類似性の実際のレベルは、このデータを得たときは通常未知である。上記のように、発現比率は、変動したシステムのレベルと元のシステムのレベルとの比率である。
【００５８】
本明細書における用語“薬物”は、既知または未知のメカニズムによって、および医療的に使用されていようが、なかろうが、生物学的システムを変動せしめるすべての程度の複雑性をもつすべての化合物を意味する。薬物は下記を含む：研究または医療上の興味ある典型的な小分子；自然界に存在する因子、例えば、すべての型の細胞受容体と相互作用するエンドクリン、パラクリン、オートクリンの因子；細胞内因子、例えば、細胞内情報伝達系エレメント；他の天然源から単離された因子、例えば、植物や菌類、およびこれらの単離因子の合成的修飾物、殺菌剤、殺草剤、殺虫剤など。
【００５９】
薬物の生物学的作用は、とりわけ、ＲＮＡの１以上の種の転写または分解の速度、１以上のポリペプチドの翻訳または翻訳後プロセシングの速度および程度、１以上のタンパク質の分解の速度および程度、１以上のタンパク質の作用または活性の速度および程度などにおける薬物仲介による変化の結果であり得る。事実、ほとんどの薬物がタンパク質との相互作用によりその作用を発揮する。タンパク質の活性またはレベルを速度増加または促進する薬物を本明細書において“活性薬物”と言い、タンパク質の活性またはレベルを速度減少または阻害する薬物を本明細書において“阻害薬物”と言う。
【００６０】
薬物の生物学的作用は、本発明では細胞の生物学的状態の変化の観測により測定する。細胞はすべての型、例えば、原核、真核、哺乳動物、植物または動物のものであり得る。本明細書における細胞の“生物学的状態”は、薬物の作用を特徴つけるなどの、意図する目的にとって細胞を特徴つけるのに十分である細胞構成体の集団の存在量および／または活性を意味する。これらの構成体の状態に対してなされた測定および／または観測はその存在量 (すなわち、細胞中の量または濃度)または活性ついてであり得、あるいは, 薬物作用の特性に関連する別の測定であり得る。
【００６１】
種々の実施態様において、本発明は、細胞構成体の異なる収集物に対する同様の測定および／または観測をなすことを含む。この細胞構成体の異なる収集物は、細胞の“生物学的状態”の態様とも本明細書で言い得る。本明細書において用語“細胞構成体”は、ミトコンドリアやリソソームなどの既知の準細胞的小器官を意味することを意図しない。
【００６２】
本発明の好ましい実施態様において、測定される細胞の生物学的状態は転写的状態である。細胞の転写的状態には、与えられた条件群での細胞中の構成ＲＮＡ種、特にｍＲＮＡの本質および存在量がある。好ましくは、細胞におけるすべての構成ＲＮＡ種の実質的フラクションを測定するが、少なくとも十分なフラクションを測定して、所望の薬物の特徴解明を行う。転写的状態は、本発明において測定された生物学的状態の現状で好ましい態様である。例えば、いくつかの存在する遺伝子発現法のいずれかによるｃＤＮＡ存在量の測定で便利に決定できる。
【００６３】
本発明で有用に測定される細胞の生物学的状態の他の態様は、その翻訳状態である。細胞の翻訳状態には、与えられた条件群での細胞における構成タンパク質種の本質および存在量がある。当業者に知られているように、転写的状態はしばしば翻訳状態の代表である。好ましくは、細胞中のすべての構成タンパク質種の実質的フラクションを測定するが、少なくとも、興味ある薬物の作用を特徴解明するのに十分なフラクションを測定する。
【００６４】
細胞の生物学的状態の他の態様も本発明において有用である。例えば、細胞の活性状態、本明細書でのこの使用では、与えられた条件群での細胞中の構成タンパク質種（または選択的な触媒活性核酸種）の活性を含む。当業者に知られているように、翻訳状態はしばしば活性状態の代表である。 
【００６５】
本発明は、生物学的状態の異なる態様についての測定が組み合わされた生物学的状態の“混合”態様にも適応でき関連する。例えば、ある混合態様において、あるＲＮＡ種およびあるタンパク質種の存在量を別のタンパク質種の測定と組み合わせる。さらに、本発明が測定可能な細胞の生物学的状態の別の態様にも適応できることで評価される。
【００６６】
薬物暴露は、発明の特定の実施態様において測定または観測される細胞の生物学的状態のいかなる態様についても、多くの構成体に典型的に影響を及ぼす。細胞中での存在が知られている調節的、ホメオスティックおよび代償的なネットワークおよびシステムの結果として、“理想の薬物”すら、すなわち、細胞中の単一の構成体にのみ直接的に影響し、いかなる他の構成体に直接的作用のない薬物でも複雑でしばしば予想できない間接的作用を有する。
【００６７】
単一の仮定的タンパク質、タンパク質Ｑの活性を有意および完全に阻害する薬物が一例である。薬物自体がタンパク質Ｑの活性を直接的にのみ変え得るが、タンパク質Ｑにより阻害または促進されるか、またはタンパク質Ｑ活性の喪失を代償するために上昇または低下される追加的な細胞構成体も影響を受ける。
【００６８】
さらに他の細胞構成体が第２段階の構成体などのレベルまたは活性の変化により影響を受ける。従って、その標的であるタンパク質Ｑに対する薬物の直接的作用は、タンパク質Ｑからの多くの間接的作用の下流に隠されている。このようなタンパク質Ｑの下流作用を、本明細書ではタンパク質Ｑに発する生物学的経路と言う。従って、１以上の主要な分子標的に直接的に影響を及ぼす“非理想的”薬物は、いっそうの複雑な下流作用を有することがある。
【００６９】
細胞の転写的状態の測定は本発明において好ましい。測定が比較的容易であるとの理由だけでなく、いかなる環境の特異的および独特のセットにおいて細胞への薬物の投与が転写的状態において、直接または間接の作用を通して測定可能で独特の変化をほとんど常にもたらすからである。このことは、タンパク質の活性の阻害などの翻訳後メカニズムを通して作用し、その分解の速度を変化せしめても、同じであり得る。
【００７０】
薬物暴露が細胞の転写的状態を変化せしめる理由は、上記したフィードバックのシステムまたはネットワークによる。これは、代償的に感染、遺伝子修飾、環境変化（薬物投与を含む）に反応し、遺伝子の発現または転写を変えることで主に進行する。内部的代償の結果として、生物学的システムについての多くの変動は、システムの外部的挙動に対する黙示の作用のみを有するが、細胞における個々のエレメント、例えば遺伝子発現の内部的応答に非常な影響を及ぼし得る。
【００７１】
ある実施態様において、細胞構成体は、連続的変数として測定する。例えば、転写速度を単位時間当たりに合成された分子の数として典型的に測定する。転写速度はまた、対照速度の百分率としても測定できる。さらに別の実施態様において、細胞構成体は絶対的変数として測定できる。例えば、転写速度を“オン”または“オフ”のいずれかで測定できる。“オン”は特定の使用者の決めた閾値以上の転写速度を示し、“オフ”は閾値を下回る転写速度を示す。
【００７２】
好ましい実施態様において、本発明方法により解析された応答プロファイルは、解析前に選択的にスクリーンして、プロファイルのいくつかのフラクションにおいて有意の応答を有する細胞構成体のみを選択する。ほとんどの薬物処置において、これらの構成体の大きい部分または過半数すら処置に対する応答に有意の変化を与えず、あるいは変化が小さくて実験誤差により支配されることがある。このことは、プロファイルが何百または何千の細胞構成体をカバーしていても、事実である。多くの実施態様において、本発明の解析方法におけるすべてのプロファイルからこれらの構成体を除くことは有用である。
【００７３】
ある実施態様においては、Ｎを越えるプロファイルにおける２つの標準誤差より大きいか等しい応答を有する細胞構成体のみを後の解析について選択する。Ｎは１以上であり得、好ましくは使用者により選択される。好ましくは、応答プロファイルが大きいほど大きくなる。例えば、ある好ましい実施態様において、解析しようとする応答プロファイルの平方根におよそ等しい。
【００７４】
いくつかの実施態様において、細胞構成体の活性レベルおよび／または存在量の増加および／または減少を示す仮の色プロットなどに、視覚的に表示できる。例えば、細胞構成体が遺伝子転写を含むいくつかの実施態様においては、かかる視覚的表示は個々の転写の上方調節および下方調節についての仮の色プロットを含むのが好ましい。
【００７５】
真核細胞中には、相互に連絡している何百から何千の情報伝達系が存在する。そのために、細胞内のタンパク質機能のいかなる変動も、タンパク質および一次的、二次的、時には三次的な経路で連結している他のタンパク質の機能に対して多くの作用を有する。この種々のタンパク質の間の拡大的な相互連絡は、ひとつのタンパク質の変動が多数の他のタンパク質において代償的変化をもたらすことを意味する。特に、特殊な環境における薬物への暴露によるなどの、細胞内でのタンパク質の部分的な崩壊は、タンパク質が単一であっても、十分な数の他の遺伝子の転写に特徴的で独特の代償的変化をもたらす。転写体におけるこの変化は、タンパク質活性における変化が検出不能な段階においても、特定の薬物暴露の独特の特性により起こされる機能の具体的な破壊に関連する特定の転写体改変の“記号”を明確にするのに使用できる。
【００７６】
事実、このような代償的変化は、タンパク質機能のモニターによる変化を検出し得る前から長くモニターできる。細胞の生物学的状態が破壊または部分的に破壊されたときに、細胞内での結果的な遺伝子の上方調節および下方調節は、ホメオスタシスを維持するために細胞が行う代償的変化を表す。転写におけるこの代償的変化は、細胞がなんらかの見分け得る生理的変化を示す前に、生じるので、これらの発現プロファイルは、細胞の生物学的状態についての非常に感度のよい指標である。この感度が薬物暴露の特異的で独特の作用を検出し比較するのに達し、薬物暴露の本質においてバイオ均等性の改変の微細な作用を他の改変の作用から単離せしめ得るときに、この感度は有意の値を有する。改変には、限定でないが、比較しようとする薬物の薬力学的性質の変動がある。
【００７７】
治療効果をモニターするための発現プロファイルは、同一の治療を行う類似の対象における細胞構成体を測定することで、つくり、測定できる。必要とする遺伝子発現プロファイルおよびタンパク質活性データを得るための受動的手法を、従ってこれらのシステムで採用する。遺伝子発現プロファイルおよびタンパク質活性データを得るための受動的手法は、限定でないが、固定または変動の薬物用量で、検査、治療または他の目的のために薬物処置を行う前および後に個体から組織または血液のサンプルを採取することを含む。
【００７８】
本発明についての説明の多くが、遺伝子発現データの測定および作成に費やされるが、本発明は、細胞の生物学的状態の他の態様、例えば、タンパク質の存在量や活性の測定に等しく適用可能である。タンパク質活性の直接的測定法は当業者に周知である。この方法は、例えば、Western blotting 法などの、タンパク質の抗体リガンドの保有に依存する方法を含む(参照、例えば、Burnette, Anal. Biochem., Vol. 112, pp. 195−203 (1981))。この方法はまた、酵素活性アッセイを含み、これは、よく研究された薬物標的について利用できる。それには、限定でないが、HMG CoA レダクターゼ (Thorsness et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 9, pp. 5702−5712 (1989)) およびカルシネウリン (Cyert et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 12, pp. 3460−3469 (1992)) がある。制御可能なプロモーターの停止による特異的な遺伝子機能を停止し、それをタンパク質消耗と Western blotting で相関さす例が、 Deshaies et al., Nature, Vol. 332, pp. 800−805 (1988)に挙げられている。
【００７９】
本発明の解析方法
方法１：ベクトル比較法
本発明の方法およびシステムの解析実施態様は、第１に、多数の細胞構成体の“ベクトル”の見地から、測定された生物学的発現プロファイル、特に、１以上の医薬均等性の薬物製剤への暴露に対する生物学的サンプルについて測定された遺伝子またはタンパク質の発現プロファイルを表示するための実施態様を含む。
【００８０】
本発明の解析実施態様の追加の態様は、測定された発現プロファイル“ベクトル”の類似性を決定するため (種々の測定により) ならびにこの類似性の客観的測定および従って比較された薬物製剤または組成物のバイオ均等性を決定するための実施態様を含む。すべての他の関連因子が、比較すべき２以上の医薬均等性の薬物製剤または化合物の投与法により一定に保持されているからである。
【００８１】
本発明はまた、バイオ均等性の決定のためのキットを含む。これは、コンピューターシステムと併せて使用されるコンピューター読み取り媒体中に具体的なヌクレオチドアレイおよびデータベースを含む。
【００８２】
本発明の解析方法の実施態様は、コンピューターシステムなどの自動システムを用いて行うのが好ましい。このシステムは、例えば、１以上の生物学的サンプルからの発現プロファイルデータを含む自動的に与えられる使用者インプットの本発明の種々の実施態様の１以上を実行する。
【００８３】
ベクトルとしての生物学的応答の表示
生物学的サンプル (例えば、細胞、細胞培養物または生物体) の薬物適用に対する応答は、サンプルの生物学的状態の変化を観測することで測定できる。例えば、応答データを、１以上の生物学的サンプル (例えば、細胞または生物体) を２以上の相違するが医薬的に均等な薬物製剤で処置し、細胞構成体のよく解明されたセットを含む特徴的な薬物応答発現プロファイルをつくることを含む方法により得る。本明細書における用語“生物学的サンプル”は、細胞、細胞培養物などの細胞群または無傷の生物体を意味する。２以上の薬物製剤の生物学的サンプルへの適用は、２薬物処置間の唯一の相違が薬物製剤間のバイオ均等性の変動に起因するような方法、すなわち薬物製剤および投与方法が“医薬均等性”の処置を構成する方法で行う。実際において、偽りの結果を減じるために、いくつかの実施態様では、ある種の因子よりも大きい応答をもつこれらのｍＲＮＡ転写体のみを含む。好ましい実施態様において、これは１または２の因子である。 
【００８４】
この発現プロファイルデータは、細胞構成体の複数 k について測定された変化の収集を含む。発現プロファイルは、ベクトル v の見地から定量分析について記載できる。特に、変動 n に対する生物学的サンプルの発現プロファイルは、ベクトル v(n)として本明細書で定義する。
【数１】
2006506046.tif 000002
式中、vi(n) は、変動すなわち薬物暴露 n 下での細胞構成体 i の応答の増幅である。いくつかの実施態様において、vi(n) は、単に、変動 n が生物学的サンプルに適用される前および後における、細胞構成体の存在量および／または活性レベル間の相違、または変動 n の対象となる生物学的サンプルと変動 n の対象とならない生物学的サンプルとの細胞構成体の存在量および／または活性レベルとの相違であり得る。
【００８５】
他の実施態様において、vi(n) は、変動 n が生物学的サンプルに適用される前および後における、細胞構成体の存在量および／または活性レベル間の比率、または変動 n の対象となる生物学的サンプルと変動 n の対象とならない生物学的サンプルとの細胞構成体の存在量および／または活性レベルとの比率である。
【００８６】
好ましい実施態様において、vi(n) は、測定誤差の動態についての知識などから決定され得る閾値増幅または信頼限界を下回る応答をもつすべての細胞構成体 i についてゼロに等しくセットする。例えば、いくつかの実施態様において、n を越えるプロファイルにおける２以上の標準誤差の応答を有する細胞構成体のみを、次の解析のために選択し得る。次の解析では、プロファイル数 n を本発明の使用者が選択するのが好ましい。
【００８７】
決められた閾値増幅を越える応答をもつ細胞構成体については、vi(n)は単に測定された値でよい。例えば、変動 n が具体的な薬物に対する暴露を含む実施態様において、応答 vi(n) は、活性が薬物投与により閾値増幅以上に改変されている i 番の細胞構成体の発現および／または活性に単に等しくする。
【００８８】
別の実施態様において、応答プロファイルデータは絶対的であり得る。例えば、２元近似において、応答増幅 vi(n) は、細胞構成体 i が変動 n に有意の応答を有していると、単位に等しくし、そして有意の応答がないと、ゼロに等しくする。あるいは、３元近似において、細胞構成体 i が変動 n に対する発現および／または活性の有意の増加を有すると、応答増幅を ＋1 に等しくし、有意の応答がないと、ゼロに等しくし、発現および／または活性の有意の減少があると、−1 に等しくする。このような実施態様は、ベクトル v(n) が比較されるべきベクトル応答の個々の構成成分が、v(n) におけるのと同じ相対的増幅を有さないが、同じ細胞構成体を含むことが知られているか、予想されるときに、特に好ましい。
【００８９】
さらに他の実施態様において、例えば、Brunel, Neural Computation, Vol. 10, No. 7, pp. 1731−1757 (1998)) に記載のような“Mutual Information”を使用するのが望ましいことがある。
【００９０】
上記の実施態様において、ベクトル長  ｜v(n) ｜ を単一とするように、同じ定数で ベクトル v(n) のすべてのエレメントを等級化することにより応答発現プロファイルを標準に一致させるのが好ましい。一般的に、ベクトル長は下記のように定義し得る。
【数２】
2006506046.tif 000003
【００９１】
発現プロファイル・ベクトルを比較しバイオ均等性を決定する方法 
計量類似性としての一般化されたコサイン角の使用
標準的薬物製剤についての特徴的発現プロファイルが一旦同定されると、２以上の発現プロファイル間の類似および相違は、異なるが医薬均等の薬物製剤または組成物の投与の作用を表すものであり、容易に評価し比較して、２以上の薬物製剤間の類似性および従ってバイオ均等性の程度を決定できる。ここでは次のように用いる。P(a) は、既知の 標準的薬物製剤、すなわち“製剤 a”の発現プロファイルのベクトル表示であり、P(b) は、未知および／または候補または代替えの薬物製剤、すなわち“製剤 b”の発現プロファイルのベクトル表示である。
【００９２】
当業者は、２以上のベクトルを比較し、類似性の決定をなし得る数学的方法を知っているであろう。好ましい実施態様において、２以上の発現プロファイル・ベクトルを客観的定量的計量 S で比較する。特に好ましい実施態様において、計量類似性 S は、比較すべき２以上の発現プロファイル・ベクトルの間、この例では P(a) と P(b) の間の一般化されたコサイン角である。
【００９３】
一般化されたコサイン角は当業者に周知の計量あり、下記の数式で定義される。
【数３】
2006506046.tif 000004
式中、ドット産物 P(a)・P(b) は下記で定義される。
【数４】
2006506046.tif 000005
および
【数５】
2006506046.tif 000006
【００９４】
この実施態様において、発現プロファイル・ベクトル P(a) は、Sa,b が最大であると、発現プロファイル・ベクトル P(b) に最も類似する。この実施態様において、Sa,b は “共効率的相互関係”を構成し、−1 〜 ＋1 のいかなる値もとり得る。値 Sa,b = ＋1 は、２プロファイルが基本的に同一であること：l; P(a) において作用されるのと同じ細胞構成体が P(b) において比較的に作用されることを示す。ただし、２応答の大きさ（すなわち強さ）は異なることがある。値 Sa,b = −1 は、２プロファイルが反対にあることを示す。このように、P(a) における同じ細胞構成体セットが P(b) 中で比較的に作用されるが、P(a) 中で増加する (例えば、上方調節される) このセットは P(b) 中で減少する (例えば、下方調節される)。またその逆である。このプロファイルを“反相関された” と言う。最後に、値 Sa,b = 0 は、２応答間の最大の非類似性を示す; P(a) 中で作用されるこの細胞構成体セットは P(b) 中で作用されない。またその逆である。
【００９５】
ベクトル類似性の比較からのバイオ類似性の決定
一般的に、本発明方法によりつくられた発現プロファイルは、薬物などの影響を与えるものとの接触に対する応答においてつくられる種々の細胞構成体の存在量または活性、あるいは存在量または活性の変化、あるいは存在量または活性の変化の比率（または比率の対数）を示す数のアレイを構成する。ひとつの好ましい実施態様において、具体的な薬物製剤の投与により発現が変えられる複数のｍＲＮＡ種の投与前と投与後の発現速度の比率は、発現プロファイルのひとつの型を構成する。上記の方法は、この発現プロファイルをベクトル表示に変換し、ついでこれらのベクトルを比較して、共効率相関と呼ばれる類似性の測定をなす。
【００９６】
この比較の目標は、限定でないが、与えられた薬物の２以上の異なるが、おそらく非常に類似の製剤、すなわち医薬均等物が、有益または所望の作用、副作用および毒性などの有害または望まない作用を含む処置から得られる臨床作用において有意の変化なしに、薬物の新しいまたは改変された製剤（製剤Ｂという）で薬物の標準的製剤（製剤Ａという）を代替えし得るために、患者の臨床作用において十分類似であるかどうかを決定することを含む。
【００９７】
この比較は、次のように行う。最初に、製剤Ａと比較すべき製剤を、医薬均等性を保持できるような環境で、類似の対象に投与する。これには、２製剤、ＡおよびＢが同じ活性成分（化学的に同一の活性薬物物質）を含有し、強度または濃度、用量形態および投与経路が同じであること、および対象が“類似”であることを要する。
【００９８】
このような環境において、２製剤の医薬作用は、２医薬均等の薬物製剤がまた“バイオ均等”であれば、唯一にそのことにより、同一である。これは、２薬物製剤における活性成分のバイオアベイラビリティの速度および程度が、これらの他の点で同一または非常に類似の試験条件で、有意に相違しないことを意味する。製剤Ｂを摂取する対象における発現プロファイルの改変は、製剤Ａについて上記したのとまったく同じ方法で決定する。この決定の結果は、製剤Ａについての発現プロファイルとしてのすべてまたは大部分のエレメントを含有する製剤Ｂについての発現プロファイルの作成である。ひとつの実施態様において、これらのエレメントは、改変されたｍＲＮＡ種の存在量、存在量の比率またはその比率の対数からなる。別の実施態様において、これらのエレメントは、タンパク質の存在量、存在量もしくはタンパク質活性の比率またはタンパク質活性の比率を含む。
【００９９】
すでに決定された製剤Ａについての発現プロファイルは、開示されたコンピューターシステムのひとつの実施態様のメモリー中に保存でき、比較処理時に使用者がインプットできる。ついで、製剤Ｂについての発現プロファイルをコンピューターシステム中になんらかの方法でインプットすると、ソフトウエアーが２製剤のバイオ均等性の程度を決定するのに必要な動作を行う。
【０１００】
この動作は次のことを含む：コンピューターのプロセッサーを起動する工程を実施する発現プロファイル解析ソフトウエアーを動かし、(a) 使用者のインプットからまたは内部データベースからの来る１以上の発現プロファイルを受ける; (b) 均等のベクトル表示を計算する; (c) これらのベクトルを比較して、その類似性の程度、すなわち共効率相関を決定する; (d) 類似性に基づきバイオ均等性を計算する; (e) この計算されたバイオ均等性を使用者フレンドリイにかつ臨床関連フォーマットでアウトプットする。もちろん、上記の計算は、手で、およびコンピューターや自動システムを用いないでも行い得る。
【０１０１】
ベクトルを比較して類似性の程度を決定する工程は、本明細書に開示する数学的方法のいずれかで達成できる。好ましい実施態様において、コンピューターが、多エレメント発現プロファイル・ベクトルの２ベクトル表示間の一般化されたコサイン角を計算し、値 −1 〜 ＋1 を持つ共効率相関を提供する。共効率相関 ＋1 は２ベクトルが同一であることを示し、共効率 0 は２ベクトル間に関係がないことを示す。共効率 −1 は完全な陰性関係を示し、従って、この例では、陰性共効率が関連しない。基礎的な生物学に関して、この技法の感受性は、極めて高く、共効率相関 ＋1 からの小さい偏向ですら２製剤ＡおよびＢ間のバイオ均等性における有意かつ臨床関連の変動を示す。
【０１０２】
当業者は、特定の生物学について、共効率相関の値における特定の変動が比較する薬物製剤の臨床効果にいかなる作用を有するかを決定するために多くの方法を考案できる。既知の薬物製剤における小さい変動は、患者または適当な動物モデルの臨床効果についてなされ、試験される。理想的には、これらの改変製剤は互いに医薬均等性であるが、バイオ均等性を決定する微妙な因子がわずかに異なる。観察された臨床の変動は２製剤について測定された共効率相関に相関し、共効率相関 １未満の臨床有意性の経験上の決定を生み出す。
【０１０３】
同様の決定を、医薬均等性であるが臨床的に非均等である薬物製剤について共効率相関を測定することでなし得る。このような薬物製剤の例は、薬物クロザピンおよびそのバイオ均等性のジェネリック品であり、他のよく知られる例は、種々の抗けいれん剤を含む (参照、Ronald et al., Neurology, Vol. 57, pp. 571−573 (2001); Keith, Int. J. Fertil. Womens. Med., Vol. 46, No. 6, pp. 286−295 (2001); Balter et al., Clin. Ther., Vol. 23, No. 10, pp. 1720−1731 (2001); Lam, J. Clin. Psychiatry, Vol. 62, Suppl. 5, pp. 18−22 (2001))。
【０１０４】
本発明方法により決定された共効率相関の値を、医療的効果または毒性もしくは副作用の臨床関連変動に相関せしめる別の手段は、当業者に明らかであろう。
【０１０５】
本発明のこの目的について、個々の生物学に依存する特定量未満の共効率相関は、２製剤間にバイオ均等性を臨床関連的に欠くことを示し、製剤Ｂが得られる処置の効力の有意かつ危険性ある変化なしには製剤Ａの代替えとなり得ないことを示す。従って、もし、ある実施態様において共効率相関が 0.90 より大きいと、好ましい実施態様において共効率相関が 0.95 より大きいと、さらに好ましい実施態様において共効率相関が 0.98 より大きいと、最も好ましい実施態様において共効率相関が 0.99 より大きいと、医薬均等性薬物製剤は有意にバイオ均等性と考えられて、代替えを可能にし、例えば、バッチ−バッチの薬物製剤の決定における満足すべき一致を示す。
【０１０６】
方法 ２：プレディクター遺伝子セット方法
バイオ均等性の程度を決定する第２の方法は、最初に、既知の標準的薬物製剤または化合物と標準的薬物製剤に匹敵する既知の程度の変動をもつ試験化合物とを識別する遺伝子の“プレディクター・セット”を確立することを含む。この試験化合物はプラセボなどの不活性化合物であり得、好ましい実施態様において、薬物製剤は標準的化合物に非常に類似、好ましくは医薬均等性の薬物であるが、完全にバイオ均等性であることが知られていない化合物である。上記したように、このような薬物製剤の例は、薬物クロザピンおよびそのバイオ均等性のジェネリック品であり、臨床家によく知られる他の例は、種々の抗けいれん剤を含む(参照、例えば、Ronald et al., Neurology, Vol. 57, pp. 571−573 (2001); Keith, Int. J. Fertil. Womens. Med., Vol. 46, No. 6, pp. 286−295 (2001); Balter et al., Clin. Ther., Vol. 23, No. 10, pp. 1720−1731 (2001); Lam, J. Clin. Psychiatry, Vol. 62, Suppl. 5, pp. 18−22 (2001))。
【０１０７】
ついで、この遺伝子のプレディクター・セットを用いて、既知の標準的薬物製剤を未知の薬物製剤と比較する。この方法は、未知の薬物が元の試験化合物として標準的薬物との比較でバイオ均等性に多かれ少なかれ類似であるかどうかを決定し得る。好ましい実施態様において、遺伝子のプレディクター・セットの開発に使用される試験化合物は、標準的製剤と医薬均等性の化合物であるが、そのバイオ均等性が臨床などの根拠から既知であり、検出可能で定量可能で臨床的に関連の程度にまで標準的薬物と相違する化合物である。
【０１０８】
本方法にしたがって比較を行うために、ヒト患者または試験動物もしくは細胞培養物であり得る多数の生物学的サンプルからの遺伝子発現プロファイルを、標準的薬物製剤で処置されたいくつか、および非バイオ均等性の製剤で処置されたいくつか（計 “n”サンプル) を編成する。得られたデータを選別し、活性化合物で処置された生物学的サンプルと不活性（または非バイオ均等性）化合物との間で有意に異ならない遺伝子を、例えば、非パラメーター ANOVA などの統計的検定の使用で除去する。遺伝子のこの選別リストを処置状態との相関にしたがって整理する。すなわち、サンプルが、標準的薬物製剤（活性化合物）またはプラセボまたは標準的製剤にバイオ均等でないことが知られている薬物製剤（不活性化合物）で処置されたか、またはこれらに暴露されたかである。ついで：
・各処置型に数値を割り当てる：1＝活性(標準的)化合物；0＝不活性(非均等)化合物
・各遺伝子について、すべてのサンプルを用いて、発現値と処置状態とのパーソン相関関係(参照、下記)を決定する。
【０１０９】
パーソン産物モーメント共効率相関、r は、−1.0 〜 1.0 を含む次元なしのインデクスであり、２データセット間の直線的関係の範囲を反映する。
回帰線の r 値 は：
【数６】
2006506046.tif 000007
【０１１０】
共効率相関の絶対値を、処置状態との陽性および陰性の両方の相関関係に同じウエイトを与えるように用いる。ついで遺伝子を最低から最高まで絶対的共効率相関により整理する。
【０１１１】
ついで“省き、省き（leave−out−out)”ストラテジイを適用して、最終のプレディクター・セットとして用いるのに最適の遺伝子数を決定する(参照、van't Veer, et al., “Gene Expression Profiling Predicts Clinical Outcome of Breast Cancer”, Nature, Vol. 415, pp. 530−536 (2002))。これは、遺伝子のモデルセットを明確にすること、モデルがいかに適合しているかを決定するときに、１サンプルを省くことでモデルを試験する。次のように行う。
【０１１２】
・トップ５遺伝子 (処置状態と最高の相関関係をもつもの) で始め、解析の１サンプルを取り出し、残りのサンプル(n−1) から各処置群（活性および不活性）について平均遺伝子発現プロファイルを計算する。
・省いたサンプルの発現プロファイルの、n−1 サンプルを用いて計算した平均の活性および不活性処置プロファイルとのパーソン相関関係を決定することにより、省いたサンプルについての結果を推定する。
【０１１３】
・共効率相関が、活性処置プロファイルと比較したときに、不活性プロファイルと比較したときよりも高ければ、サンプルを活性と分類し、値 1 を割り当てる。
・共効率相関が、不活性処置プロファイルと比較したときに、活性プロファイルと比較したときよりも高ければ、サンプルを不活性と分類し、値 0 を割り当てる。
【０１１４】
・この解析を、残りのサンプルを用いて、すべての n サンプルが一旦省かれるまで繰り返す。  
・誤陰性 (不活性と誤って分類された活性) および誤陽性 (活性と誤って分類された不活性）を計算することにより、正しいまたは正しくない推定事例の数を決定する。
【０１１５】
・リストのトップから、一度に追加のプレディクター遺伝子を加えた後に、すべての遺伝子が用いられるまで、“省き、省き”法を繰り返す。
・最低の誤差率となる遺伝子 (誤陽性および誤陰性の両方) の数が遺伝子プレディクターセットとして使用するモデルを明確する。
【０１１６】
プレディクター遺伝子の最適数を用いて、次の工程で、薬物製剤のバイオ均等性の正確な決定に用いる適当な閾値を計算する。
【０１１７】
・活性 (標準的薬物製剤) 化合物で処置されたサンプルのすべてを用いて、各々の最適プレディクター遺伝子についての平均発現値を計算する。これを“平均活性発現プロファイル”と定義する。
・各サンプルについて、平均活性発現プロファイルに対するプレディクター遺伝子についての発現値間のパーソン相関関係を計算する。
【０１１８】
・共効率相関によってサンプルを最高から最低までランクつけする。リストのトップにおくサンプルが活性発現プロファイルに最も密接に相関し、リストの最下部におくサンプルが活性発現プロファイルに最も少なく相関する (そして、不活性と標識する)。
【０１１９】
・共効率相関のすべての可能性ある閾値の予測の誤差率 (偽陰性および偽陽性) を計算する。
・“最適の正確性”の閾値は、共効率相関が、偽陰性および偽陽性の両方が最少数となる値を省いたものと定義する。
【０１２０】
しかし、いくつかの実施態様において、感受性についての閾値、例えば偽陰性数を減じるなど (偽陽性の増加で) を最適化することが望ましい。
【０１２１】
新規の未知の薬物製剤Ｂが標準的薬物製剤Ａにバイオ均等であるかを決定するために、類似の生物学的サンプルを未知の製剤に平均活性発現プロファイルの確立に用いたのと同じ条件で接触または処置する。標準的薬物製剤Ａに比較すべき製剤、製剤Ｂを類似の対象(または生物学的サンプル) に医薬均等性が保持し得るような条件で投与する。このことは、２製剤ＡおよびＢが同じ活性成分 (化学的に同一の活性薬物物質) を含有し、強度または濃度、用量形態および投与経路が同じであり、対象が “類似”であることを要する。上記で決定されたようなプレディクター遺伝子の遺伝子発現プロファイルを、決定された標準的薬物製剤およびパーソン相関についての平均活性発現プロファイルと比較する。
【０１２２】
・与えられた試験サンプルの共効率相関が予め決定された閾値値 (参照、上記)より大きいか、等しければ、そのサンプルを “活性”と分類し、共効率相関が閾値を下回ると“不活性”と分類する。
・試験サンプルの有意の数、例えば、過半数が“活性”と分類されると、未知の薬物製剤を “バイオ均等”と分類する。
【０１２３】
この分類は、未知の薬物製剤が遺伝子のプレディクター・セットを定義するのに使用した元の試験化合物であった標準的薬物製剤とバイオ均等性において類似または類似以上であったことの決定を構成する。逆に、共効率相関が予め決定された閾値を下回ることは、未知の薬物製剤がバイオ均等性において元の試験化合物よりも大きい相違を示すとの決定を構成する。
【０１２４】
従って、遺伝子プレディクター・セットを開発するのに用いられた元の未知の薬物製剤が臨床的基礎に対し、標準的薬物製剤の完全なバイオ均等代替えであることがわかり、試験した薬物が活性と分類されると、すなわち、上記で決定された共効率相関が予め決定された閾値より大きいか等しいと、この試験薬物も標準的薬物製剤の完全なバイオ均等代替えである。もし、上記で決定された共効率相関が予め決定された閾値を下回ると、試験した薬物が標準的薬物製剤の完全なバイオ均等代替えを下回ると考えられ、患者での臨床効果が顕著に異なり得る。
【０１２５】
この型の解析結果は、遺伝子プレディクター・セットを開発するのに用いられる未知の薬物製剤が標準的薬物製剤と異なれば異なるほど、解釈が難しくなる。従って、好ましい実施態様において、遺伝子プレディクター・セットを開発するのに用いられる試験化合物は、標準的製剤の医薬均等性である化合物、およびバイオ均等性が標準的薬物製剤と既知および臨床的に関連する程度に相違している化合物である。
【０１２６】
好ましい実施態様で以前の方法について記載したように、上記の工程は本明細書に記載のコンピューターシステムにより実施できる。すでに決定されたプレディクター遺伝子についての発現プロファイルは、開示されたコンピューターシステムの実施態様のひとつのメモリーに保存するか、比較の過程時に使用者がインプットできる。未知の化合物製剤Ｂについての発現プロファイルは、コンピューターシステムになんらかの方法でインプットし、ソフトウエアーを、２製剤のバイオ均等性の程度を決定するように作動せしめる。
【０１２７】
測定方法およびアレイ
本発明の試験方法は、細胞構成体の測定に依存する。測定された細胞構成体は、細胞の生物学的状態のいかなる態様にも由来し得る。これは、ＲＮＡ存在量が測定される転写状態、タンパク質存在量が測定される翻訳状態、およびタンパク質活性が測定される活性状態であり得る。細胞特性も混合された態様、例えば、１以上のタンパク質が他の細胞構成体のＲＮＡ存在量 (遺伝子発現) と一緒に測定する。この項は、薬物または経路の応答における細胞構成体を測定する例示的方法を記述する。本発明はこのような測定について他の方法にも適用可能である。 
【０１２８】
好ましくは、本発明において、他の細胞構成体の転写状態を測定する。転写状態は、次の項で記述するように、核酸または核酸模倣プローブのアレイへのハイブリダイゼーション法、またはその後の項に記載するように、別の遺伝子発現法により測定できる。しかし、測定結果は、通常ＤＮＡ発現比率（ＲＮＡ減成率の相違の不存在）を反映するｍＲＮＡ存在量および／または比率を表す量を含むデータである。
【０１２９】
本発明の種々の別の実施態様において、転写状態以外の生物学的状態の態様、例えば、翻訳状態、活性状態または混合態様を測定できる。
【０１３０】
転写状態の測定
好ましくは、転写状態の測定は、本項で記載する核酸のオリゴヌクレオチド・アレイへのハイブリダイゼーションによりなし得る。転写状態測定についてのある種の方法は、本項の後半で記載する。すべての実施態様において、細胞構成体の測定は、測定がなされる時点に比較的に独立の方法でなされるべきである。
【０１３１】
転写体アレイの一般
好ましい実施態様において、本発明は、“オリゴヌクレオチド・アレイ” (本明細書では、“ミクロアレイ”とも言う)を用いる。ミクロアレイは、細胞内の転写状態を解析するために、特に癌細胞の転写状態を測定するために用い得る。
【０１３２】
ひとつの実施態様において、転写体アレイを、細胞中に存在のｍＲＮＡを表す検出可能な標識ポリヌクレオチド (例えば、全細胞ｍＲＮＡから合成される蛍光標識ｃＤＮＡまたは標識ｃＲＮＡ) をミクロアレイにハイブリドすることによりつくる。ミクロアレイは、細胞または生物体中の多くの遺伝子、好ましくは大部分またはほとんどすべての遺伝子の産物についての結合（例えば、ハイブリダイゼーション）の部位のオーダーされたアレイをもつ表面である。ミクロアレイは、多くの方法でつくり得る。そのいくつかは下記する。しかし、つくられたミクロアレイは特定の特性を共有する。アレイは、再生産可能であり、つくられるべき与えられたアレイの多数の複写ができ、容易に互いに比較できる。好ましくは、ミクロアレイは、小さく、通常 5 平方 cm より小さく、結合 (例えば、核酸ハイブリダイゼーション) 条件で安定である材料からつくる。
【０１３３】
ミクロアレイ中の結合部位の与えられた結合部位または独特のセットは細胞中の単一遺伝子の産物に特異的に結合する。具体的なｍＲＮＡに付き１以上の物理的な結合部位 (本明細書では“部位”という) が存在し得るが、説明をわかりやすくするために、下記では、単一の部位と仮定する。具体的な実施態様において、各部位に既知の配列の付属核酸を含有する位置的にアドレス可能なアレイを用いる。
【０１３４】
細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡをつくり、ミクロアレイに適当なハイブリダイゼーション条件でハイブリドすると、いかなる特定の遺伝子に対応するアレイの部位へのハイブリダイゼーションのレベルが、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの細胞中の普及を反映することがわかる。例えば、検出可能に標識された (例えば、蛍光団で)全細胞ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡまたはｃＲＮＡを、ミクロアレイにハイブリドすると、細胞中で転写されない遺伝子 (すなわち、遺伝子の産物に特異的に結合し得る) に相補的なアレイ上の部位は、ほとんどまたは全くシグナル(例えば、蛍光シグナル) を持たず、そしてコードされたｍＲＮＡが普及的である遺伝子が比較的強いシグナルを有する。
【０１３５】
ミクロアレイの調製 
ミクロアレイは当技術分野で既知であり、遺伝子産物（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチドおよびその断片）に配列が対応するプローブが既知の位置で特異的にハイブリドまたは結合され得る。ひとつの実施態様において、ミクロアレイは、各位置が遺伝子によりコードされる産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）についての個別的な結合部位、結合部位が生物体における大部分またはほとんどすべての遺伝子の産物について存在する部位におけるアレイ (すなわち、マトリックス) である。好ましい実施態様において“結合部位”(以下、“部位”) は、特定の連結したｃＤＮＡまたはｃＲＮＡが特異的にハイブリドし得る核酸または核酸類似体である。結合部位の核酸または類似体は、例えば、合成オリゴマー、完全長ｃＤＮＡ、完全長より短いｃＤＮＡまたは遺伝子断片であり得る。
【０１３６】
好ましい実施態様において、ミクロアレイが標的生物体ゲノムにおける大部分またはほとんどすべての遺伝子の産物についての結合部位を含有しているが、このようなことはかならずしも必要でない。ミクロアレイは標的生物体における遺伝子のフラクションのみについて結合部位を有し得る。しかし、一般的に、ミクロアレイは、ゲノム中の遺伝子の少なくとも約 50%、しばしば、少なくとも約 75%、さらにしばしば少なくとも約 85%、さらにしばしば少なくとも約 90%、最もしばしば少なくとも約 99% に対応する結合部位を有する。好ましくは、ミクロアレイは、試験し確認する所望の生物学的ネットワーク・モデルに関連する遺伝子についての結合部位を有する。
【０１３７】
“遺伝子”は、生物体（例えば、単細胞）または多細胞生物体におけるいくつかの細胞中でｍＲＮＡが転写される、好ましくは少なくとも 40、80 または 99 アミノ酸のオープンリーディングフレーム（ORF) として同定する。ゲノム中の遺伝子の数は、生物体により発現されたｍＲＮＡの数から、またはゲノムのよく特性解明のなされた部分の外挿により知りうる。所望の生物体のゲノムについて配列がわかると、ORF 数を決定でき、ｍＲＮＡコード領域をＤＮＡ配列の解析により同定できる。例えば、Saccharomyces cerevisiae ゲノムについて配列は完全に解明され、99 アミノ酸より長い約 6,275 ORF を有すると報告される。これらの ORF の解析によると、タンパク質産物を特徴づけるであろう 5,885 ORF が存在する (参照、Goffeau et al., “Life With 6000 Genes”, Science, Vol. 274, pp. 546−567 (1996), 出典明示により本明細書の一部とする）。一方、ヒトゲノムは約 25,000−35,000 遺伝子を含有すると推定される。
【０１３８】
ミクロアレイについての核酸の調製
上記のように、特定の連結ｃＤＮＡが特異的にハイブリドする “結合部位”は通常、その結合部位に付着する核酸または核酸類似物である。ひとつの実施態様において、ミクロアレイの結合部位は、生物体ゲノム中の各遺伝子の少なくとも一部分に対応するＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡは、ゲノムＤＮＡからの遺伝子セグメントのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ｃＤＮＡ（例えばＲＴ−ＰＣＲによる）またはクローン配列で得られるか、または配列を、新たにチップ表面で、例えば、ホトリトグラフィ法（例えば、チップ上に直接のそのオリゴ体を合成するための種々の技法を用いる Affymetrix)で合成する。遺伝子またはｃＤＮＡの既知の配列に基づき PCR プライマーを選択すると、独特の断片(すなわち、ミクロアレイ上で他の断片と 10 を越える塩基の隣接同一配列を共有しない断片）の増幅をもたらす。
【０１３９】
コンピュータープログラムは、必要な特性および最適の増幅性 (参照、例えば、Oligo pl version 5.0, National Biosciences) をもつプライマーの設計に有用である。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、遺伝子の 3' 末端に近いセグメントを増幅して、オリゴ−dT プライムｃＤＮＡプローブをミクロアレイにハイブリドするようにするのが時に望ましく、完全長以下のプローブが効率的に結合する。ミクロアレイ上の典型的な各遺伝子断片は、約 20 bp 〜 約 2,000 bp、更に典型的に約 100 bp 〜 約 1,000 bp、通常、約 300 bp 〜 約 800 bp の長さにある。PCR 方法は周知であり、例えば、Innis et al., Eds., “PCR Protocols:  A Guide to Methods and Applications”, Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) （出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。明らかに、コンピューターのロボットシステムが核酸の単離および増殖に有用である。
【０１４０】
ミクロアレイのための核酸をつくる別の手段は、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成であって、例えば、N−ホスホネートまたはホスホラミディット化学を用いる (参照、Froehler et al., Nuc. Acid Res., Vol. 14, pp. 5399−5407 (1986); McBride et al., Tetra. Lett., Vol. 24, pp. 245−248 (1983))。合成配列は、約 15 〜 約 500 塩基、さらに典型的には約 20 〜 約50 塩基の長さである。いくつかの実施態様において、合成核酸は非天然の塩基、例えば、イノシンを含む。上記のように、核酸類似物をハイブリダイゼーションの結合部位として使用し得る。適当な核酸類似物の例はペプチド核酸である (参照、例えば、Egholm et al., “PNA Hybridizes to Complementary Oligonucleotides Obeying the Watson−Crick Hydrogen−Bonding Rules”, Nature, Vol. 365, pp. 566−568 (1993); さらに参照、米国特許 5,539,083)。
【０１４１】
別の実施態様において、結合 (ハイブリダイゼーション) 部位は、遺伝子、ｃＤＮＡ(例えば、発現配列タグ)またはそれからの挿入物のプラスミドまたはファージクローンからつくる (参照、Nguyen et al., “Differential Gene Expression in The Murine Thymus Assayed by Quantitative Hybridization of Arrayed cDNA Clones”, Genomics, Vol. 29, pp. 207−209 (1995))。さらに他の実施態様において、結合部位のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０１４２】
固体表面への付着核酸
核酸または類似物を固体の支持体に付着さす。これは、ガラス、プラスチック (例えば、ポリプロピレン、ナイロン)、ポリアクリルアミド、ニトロセルロースなどの材料からつくり得る。核酸を表面に付着さすのに好ましい方法は、ガラスプレート上でのプリントによる。一般的に、Schena et al., “Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterrns With a Complementary DNA Microarray”, Science, Vol. 270, pp. 467−470 (1995) に記載されている。 この方法は、ｃＤＮＡのミクロアレイを調製するのに特に有用である (参照、DeRisi et al., “Use of a cDNA Microarray to Analyze Gene Expression Patterns in Human Cancer”, Nature Genetics, Vol. 14, pp. 457−460 (1996); Shalon et al., “A DNA Microarray System For Analyzing Complex DNA サンプルs Using Two−Color Fluorescent Probe Hybridization”, Genome Res., Vol. 6, pp. 639−645 (1996); and Schena et al., “Parallel Human Genome Analysis; Microarray−Based Expression of 1000 Genes”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 10539−11286 (1995))（各文献を出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１４３】
ミクロアレイをつくるための第２の好ましい方法は、高密度オリゴヌクレオチド・アレイをつくることである。技法は既知で、明確にされた配列に相補的なオリゴヌクレオチドの何千を含有するアレイを、インシトゥ合成のためのホトリトグラフ法を用いて表面上の明確にされた位置でつくる (参照、Fodor et al., “Light−Directed Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis”, Science, Vol. 251, pp. 767−773 (1991); Pease et al., “Light−Directed Oligonucleotide Arrays For Rapid DNA Sequence Analysis”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, pp. 5022−5026 (1994); Lockhart et al., “Expression Monitorng by Hybridization to High−Density Oligonucleotide Arrays”, Nature Biotech., Vol. 14, p. 1675 (1996); 米国特許 5,578,832; 5,556,752; 5,510,270、各々を出典明示により本明細書の一部とする) または明確にされたオリゴヌクレオチドの迅速合成および配置のための他の方法でつくる (参照、Blanchard et al., “High−Density Oligonucleotide Arrays”, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 11, pp. 687−690 (1996))。これらの方法を用いるとき、既知配列のオリゴヌクレオチド (例えば、25−mers) 誘導ガラススライドなどの表面の上に直接合成する。通常、つくられたアレイは重複しており、ＲＮＡにつきいくつかのオリゴヌクレオチドをもつ。別にスプライスされたｍＲＮＡを検出するために、オリゴヌクレオチド・プローブを選択できる。 
【０１４４】
ミクロアレイをつくるのに別の方法、例えば、マスク法 (参照、Maskos et al., Nuc. Acids Res., Vol. 20, pp. 1679−1684 (1992)) も使用できる。原則的に、アレイのいずれの型、例えば、ナイロン・ハイブリダイゼーション膜上のドットブロット (参照、Sambrook et al., “Molecular Cloning−−A Laboratory Manual (2nd Ed.)”, Vols. 1−3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、出典明示により本明細書の一部とする）を使用できる。ただ、当業者によく知られているように、非常に小さいアレイが、ハイブリダイゼーション量が小さいことから、好ましい。
【０１４５】
標識プローブの作成
全およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡを調製する方法は、周知であり、一般的に Sambrook et al.（前出）に記載されている。ひとつの実施態様において、ＲＮＡを本発明で所望の種々の型の細胞から抽出する。グアニジウムチオシアネート分解、ついで CsCl 遠心分離を用いる (参照、Chirgwin et al., Biochemistry, Vol. 18, pp. 5294−5299 (1979))。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ−dT セルロース (参照、Sambrook et al., 前出) で選択する。所望の細胞には、野生型細胞、薬物暴露野生型細胞、修飾/変動の細胞構成体をもつ細胞、修飾/変動の細胞構成体をもつ薬物暴露細胞などがある。
【０１４６】
標識ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡまたは直接的にＲＮＡからオリゴ dT−プライムまたはランダムプライム逆転写によりつくる。両法とも当技術分野で既知である (参照、例えば、Klug et al., Methods Enzymol., Vol. 152, pp. 316−325 (1987))。逆転写は、検出可能の標識にコンジュゲートされた dNTP、特に好ましくは蛍光標識 dNTP の存在下で実施し得る。あるいは、単離されたｍＲＮＡを、標識 dNTP の存在下に２本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写により合成された標識アンチセンスＲＮＡへ転換し得る(参照、Lockhart et al., “Expression Monitoring by Hybridization to High−Density Oligonucleotide Arrays”, Nature Biotech., Vol. 14, p. 1675 (1996)、出典明示により本明細書の一部とする)。別の実施態様において、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブを検出可能な標識の不存在で合成でき、ついでビオチニレート dNTP または rNTP、または類似の手段(例えば、ビオチンのプソラレン誘導体のＲＮＡへの光クロス結合)の組み込みにより、ついで標識ストレプタビジン (例えば、フィコエリトリン・コンジュゲート・ストレプタビジン) またはその均等物の添加により標識できる。
【０１４７】
蛍光標識プローブを使用するとき、多くの適当な蛍光団が既知であり、フルオレセイン、リサミン、フィコエリトリン、ロダミン (Perkin Elmer Cetus)、 Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX (Amersham) および他の物 (参照、例えば、Kricka, “Nonisotopic DNA Probe Techniques”, Academic Press, San Diego, CA (1992))がある。顕著な放出スペクトルを有する蛍光団の対を選択して、容易に認識できるようにすることは、わかるであろう。
【０１４８】
別の実施態様において、蛍光標識以外の標識を用いる。例えば、放射活性標識または顕著な放出スペクトルをもつ放射活性標識の対を使用できる (参照、Zhao et al., “High Density cDNA Filter Analysis:  A Novel Approach For Large−Scale, Quantitative Analysis of Gene Expression”, Gene, Vol. 156, p. 207 (1995); Pietu et al., “Novel Gene transcripts Preferentially Expressed in Human Muscles Revealed by Quantitative Hybridization of a High Density cDNA Array”, Genome Res., Vol. 6, p. 492 (1996))。しかし、放射活性粒子の散乱および結果的な広いスペースの結合部位の必要のために、放射同位体の使用はあまり好ましい実施態様でない。
【０１４９】
ひとつの実施態様において、標識ｃＤＮＡを、0.5 mM dGTP、dATP、dCTP および 0.1 mM dTTP および蛍光デオキシリボヌクレオチド (例えば、0.1 mM ローダミン 110 UTP (Perken Elmer Cetus) または 0.1 mM Cy3 dUTP (Amersham)) を含有する混合物を、逆トランスクリプターゼ (例えば、SuperScript.TM. II, LTI Inc.) とともに 42℃ で 60 分間インキュベートすることにより合成する。
【０１５０】
ミクロアレイとのハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を選択して、プローブが特異的なアレイ部位に “特異的に結合する” または“特異的にハイブリドする”ようにする。すなわち、プローブは、相補的核酸配列をもつ配列アレイ部位にハイブリド、二重に、または結合するが、非相補的核酸配列をもつ配列アレイ部位にハイブリドしない。本明細書で使用するように、ひとつのポリヌクレオチド配列はもう一つの配列と、ポリヌクレオチドの短い方が 25 塩基以下であると、標準的塩基対形成ルールを用いるミスマッチがないときに、またはポリヌクレオチドの短い方が 25 塩基より長いと、ミスマッチが 5% を越えないときに、相補的であるとみなす。好ましくは、ポリヌクレオチドは完全に相補的 (ミスマッチなし) である。具体的なハイブリダイゼーション条件が、陰性対照を含むハイブリダイゼーションアッセイを実施することにより具体的なハイブリダイゼーションをもたらすことを、容易に表示できる (参照、例えば、Shalon et al., supra, and Chee et al.、前出)。
【０１５１】
最適のハイブリダイゼーション条件は、標識されたプローブおよび固定されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ(例えば、オリゴマー対 200 塩基より大きいポリヌクレオチド) および型 (例えば、RNA, DNA, PNA) に依存する。核酸についての特殊な (すなわち、ストリンジェント) ハイブリダイゼーション条件の一般的パラメーターは、Sambrook et al.（前出）および Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing and Wiley−Interscience, NY (1987) （出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。Schena et al. のｃＤＮＡミクロアレイを用いるとき、典型的なハイブリダイゼーション条件は、5 x SSC および 0.2% SDS で 65℃、4 時間のハイブリダイゼーション、ついで 25℃で低ストリンジェント洗浄緩衝液 (1 x SSC および 0.2% SDS) で洗い、ついで 10 分間 25℃で高ストリンジェント洗浄緩衝液 (0.1 x SSC および 0.2% SDS) で洗う(参照、Shena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, p. 10614 (1996))。有用なハイブリダイゼーション条件が、例えば、Tijessen, “Hybridization With Nucleic Acid Probes”, Elsevier Science Publishers B.V. (1993) and Kricka, “Nonisotopic DNA Probe Techniques”, Academic Press, San Diego, CA (1992)でも提供される。
【０１５２】
シグナル検出およびデータ解析
蛍光標識のプローブを用いるとき、転写体アレイの各部位での蛍光放出は、好ましくは共焦点レーザー顕微鏡の走査により検出できる。ひとつの実施態様において、適当な励起線を用いる分離スキャンを、使用した２蛍光団の各々に実施する。あるいは、使用された蛍光団に特異的な波長で標本の照度を可能にするレーザーを用いることができ、蛍光団からの放出を解析できる。好ましい実施態様において、アレイを、コンピューター制御 X−Y ステージおよび顕微鏡対象をもつレーザー蛍光スキャナーで走査する。蛍光団の連続的励起が多線混合ガスレーザーで生じ、波長で分割され、光増幅管で検出できる。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al., Genome Res., Vol. 6, pp. 639−645 (1996) および本明細書に引用の文献に記載されている。あるいは、フィーバー光学束（Ferguson et al., Nature Biotech., Vol. 14, pp. 1681−1684 (1996)）を使用して、多数の部位でのｍＲＮＡ存在量レベルを同時にモニターできる。
【０１５３】
シグナルを記録し、好ましい実施態様では、例えば、ディジタルボードに 12 ビットアナログを用いるコンピューターで解析する。ひとつの実施態様において、走査像をグラフプログラム (例えば、Hijaak Graphics Suite) でデスペックル（despeckled）し、ついで、各部位での各波長で、平均ハイブリダイゼーションの拡張シートをつくる像グリッディングプログラムを用いて解析する。
【０１５４】
The Agilent Technologies GENEARRAY（商標）スキャナーがベンチトップの 488 nM アルゴンイオン・レーザーに基づく解析装置である。このレーザーは 4 ミクロン以下のスポットサイズに焦点できる。精度は 20 ミクロンの小さいプローブをもつプローブアレイの走査が可能である。レーザービームがプローブアレイ上に集束して、蛍光標識のヌクレオチドを励起する。次々にアレイで用いられた染料についての選択フィルターを使用し走査する。直交等位での走査がプローブアレイを動かすことで達成される。レーザー放射を、ハイブリドサンプルに組み込まれた染料分子で吸収すると、蛍光放射を放出する。蛍光光は、レンズに視準され、波長選択のフィルターを通過する。ついで、光は、深識別のための開口部上に第２レンズで集束され、高感度光増幅管 (PMT) で検出される。
【０１５５】
PMT のアウトプット流が、アナログからデジタルへの転換機 (ADC) によりボルト読みに転換され、処理データをコンピューターに、サンプルポイントの蛍光強度レベルまたは容易に走査されるピクチャーエレメント (pixel) として戻す。さらに、サンプルの発現プロファイルを表示するすべてのサンプルの蛍光強度をコンピューター読み取りフォーマットに記録する。
【０１５６】
必要であると、２蛍光についてのチャネル間の “交叉トーク（cross talk）”(または重複）について実験的に決定される補正をなし得る。転写体アレイ上の特定のハイブリダイゼーション部位について、２蛍光団の放出の比率を計算できる。比率は、連結した遺伝子の絶対的発現レベルに独立的であるが、発現が薬物投与や遺伝子除去などの試験事象により有意に調整されているような遺伝子について有用であり得る。
【０１５７】
転写状態の測定についての他の方法
細胞の転写状態を当技術分野で既知の別の遺伝子発現法で測定し得る。このいくつかの技法が電気泳動解析についての制限された複雑さの制限断片のプールをつくる。例えば、相化プライマーと二重制限酵素消化を結合する方法 (参照、例えば、ヨーロッパ特許 0 534858 A1、出願 1992. 9. 24、Zabeau et al.) またはｍＲＮＡ末端に近接の部位をもつ制限断片を選択する方法 (参照、例えば、Prashar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 659−663 (1996)) である。他の方法は、ｃＤＮＡプールを統計的にサンプルし、例えば、各多数のｃＤＮＡ中の十分な塩基 (例えば、20−50 塩基) を配列決定することにより、または明確にされたｍＲＮＡ末端に対する既知の位置でつくられる短いタグ (例えば、9−10 塩基) を配列決定すること (参照、例えば、Velculescu, Science, Vol. 270, pp. 484−487 (1995)) による経路パターンである。
【０１５８】
他の態様の測定
本発明の種々の実施態様において、転写状態以外の生物学的状態、例えば翻訳状態、活性状態または混合の態様を、薬物および経路の応答を得るために、測定できる。これらの実施態様の詳細を本項で記載する。 
【０１５９】
翻訳状態の測定
遺伝子にコードされたタンパク質の発現を、検出可能に標識されたプローブまたは後に標識され得るプローブで検出できる。一般的に、プローブは、発現された遺伝子を認識する抗体である。 
【０１６０】
本明細書で使用する用語 “抗体”には、限定でないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体およびタンパク質に対する抗体断片の結合に十分な生物学的に機能性の抗体断片がある。
【０１６１】
開示された遺伝子のひとつによりコードされるタンパク質に対する抗体の産生のために、種々の宿主動物をポリペプチドまたはその部分の注射により免疫し得る。このような宿主動物には、限定でないが、ウサギ、マウス、ラットなど多数のものがある。種々のアジュバントを用いて、宿主の種類に応じて免疫応答を増強できる。それには、限定でないが、Freund's (完全または不完全)、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレシチンなどの表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエムルション、キーホール・リペット・ヘモシアニン、ジニトロフェニール、BCG (bacille Camette−Guerin) や Corynebacterium parvum などの使用可能なヒトアジュバントがある。
【０１６２】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子やその抗原機能的誘導体などの抗原で免疫された動物の血清から誘導される抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、上記のような宿主動物を、上記のアジュバントでも補われたコードタンパク質またはその部分の注射で免疫し得る。
【０１６３】
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体 (mAb) を、培養基における連続的細胞系による抗体分子の産生についてのいずれの技法によっても得ることができる。それには、限定でないが、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature, Vol. 256, pp. 495−497 (1975); 米国特許 4,376,110）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosbor et al., Immunology Today, Vol. 4, p. 72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, pp. 2026−2030 (1983)）および EBV−ハイブリドーマ法（Cole et al., “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc., pp. 77−96 (1985))がある。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD を含む免疫グロブリンクラスおよびそのサブクラスであり得る。本発明の mAb をつくるハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養し得る。インビボでの高力価 mAbs の産生が現在のところ好ましい産生方法である。
【０１６４】
さらに、“キメラ抗体”の産生のために開発された技法（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, pp. 6851−6855 (1984); Neuberger et al., Nature, Vol. 312, pp. 604−608 (1984); Takeda et al., Nature, Vol. 314, pp. 452−454 (1985)）は、適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングせしめるものであり、使用することができる。キメラ抗体は、異なる動物種から誘導された部分をもつ分子であり、例えば、ネズミ mAb から誘導の可変または高度可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域をもつものである。
【０１６５】
あるいは、単一鎖抗体の産生について記載の技法（米国特許 4,946,778; Bird, Science, Vol. 242, pp. 423−426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, pp. 5879−5883 (1988); Ward et al., Nature, Vol. 334, pp. 544−546 (1989)）を適用して、分別的に発現された遺伝子−単一鎖抗体をつくり得る。単一鎖抗体は、Fv 領域の重鎖と軽鎖の断片とを、アミノ酸橋を介して連結せしめると形成し、単一鎖ポリペプチドとなる。
【０１６６】
さらに好ましくは、“ヒト化抗体”の産生に有用な技法を採用して、タンパク質、断片またはその誘導体に対する抗体を作り得る。この技法は、米国特許 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,661,016；5,770,429 に開示されている。
【０１６７】
特異的抗原決定基を認識する抗体断片は、既知の技法でつくり得る。例えば、その断片には、限定でないが、抗体分子のペプシン消化によりつくられる F(ab')2 断片および F(ab')2 のジスルフィド橋を減じることによりつくられる Fab 断片がある。あるいは、Fab 発現ライブラリーを構築して（Huse et al., Science, Vol. 246, pp. 1275−1281 (1989))、所望の特異性をもつモノクローナル Fab 断片の迅速かつ容易な同定を可能にできる。
【０１６８】
既知のタンパク質がサンプル中で発現される程度は、上記抗体を利用するイムノアッセイ法で決定する。このようなイムノアッセイ法には、限定でないが、ドットブロット法、ウエステンブロット法、競合的および非競合的タンパク質結合アッセイ法、酵素連結イムノソルバントアッセイ法 (ELISA)、免疫組織化学法、蛍光活性化細胞ソーティング法 (FACS)、および他の通常的に使用され、科学および特許文献に広く記載され、また多くが商業的に採用されているものがある。
【０１６９】
検出の容易性から特に好ましいのは、サンドウイッチ ELISA であり、多くの変法が存在し、そのすべてを本発明に含まれるものとする。例えば、典型的な先進アッセイにおいて、非標識抗体を固体基質上で免疫化し、試験すべきサンプルを、適当なインキュベーション期間、抗体−抗原の二重複合体の形成に十分な時間、結合分子と接触せしめる。この点において、検出可能シグナルを誘発し得るレポーター分子で標識された第２抗体をついで加え、抗体−抗原−標識抗体の三重複合体の形成に十分な時間、インキュベートする。未反応の材料を洗浄除去し、抗原の存在を、シグナルの観測で決定するか、既知の量の抗原を含有する対照サンプルとの比較により定量できる。 
【０１７０】
先進アッセイ法の変法には、サンプルと抗体の両方を結合抗体に同時に加える同時的アッセイ法、または標識抗体と試験するサンプルとを最初に結合せしめ、インキュベートし、非標識表面結合抗体に加える逆アッセイ法がある。これらの技法は当技術分野で既知であり、小さい変法の可能性はすぐにわかる。本明細書で用いる用語 “サンドウイッチアッセイ法”は、基本的な２部位技法についてのすべての変法を含むものである。本発明のイムノアッセイについて唯一の制限的因子は、標識された抗体が、所望の遺伝子により発現されたタンパク質に特異的な抗体であることである。
【０１７１】
この型のアッセイで最も通常的に使用されているレポーター分子は、酵素、蛍光団含有分子または放射性核種含有分子である。酵素イムノアッセイにおいて、酵素は第２抗体に、通常グルタルアルデヒドまたはペリオデートの手段により結合している。しかし、容易に認識されるように、当技術分野で周知の異なる結合方法について広範な変法が存在する。よく使用されている酵素には、ホースラジッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどがある。具体的な酵素と使用される基質は、対応の酵素による加水分解の際に検出可能な色変化をつくるために選択し得る。例えば、p−ニトロフェニルホスフェートがアルカリホスファターゼ・コンジュゲートとの使用に適しており、ペルオキシダーゼに 1,2−フェニレンジアミンまたはトルイジンが通常使用される。
【０１７２】
上記の化学原基質よりも蛍光産物を生じる蛍光原基質を用いることもできる。適当な基質を含有する溶液を三重複合体に加える。基質が第２抗体に結合の酵素と反応し、定性的な視覚シグナルを生じ、これを通常分光計量的に更に定量すると、血清サンプル中に存在するタンパク質の量を調べられる。 
【０１７３】
あるいは、フルオレセンおよびローダミンなどの蛍光化合物を抗体に、その結合能を変えないで化学的に結合し得る。特定の波長光の照出により活性化されるとき、蛍光色素標識の抗体が光エネルギーを吸収し、分子中の励起状態を起こし、特徴的な長い波長で光を放出する。放出は、光顕微鏡で視覚的検出可能な特徴的な色として現れる。 
【０１７４】
免疫蛍光および EIA 法はともに、当技術分野で周知であり、本発明方法で特に好ましい。しかし、他のレポーター分子、例えば、放射性同位元素、化学的発光分子またはバイオ発光分子も使用できる。どのようにして必要な使用に適する方法に変えうるかは、当業者に明らかであろう。
【０１７５】
翻訳状態の測定もいくつかの追加の方法に従って実施できる。例えば、タンパク質の全ゲノムモニター法 (すなわち、“プロテオーム”、Goffeau et al.、前出) を、結合部分が細胞ゲノムによりコードされた複数の免疫タンパク質種に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含むミクロアレイを構築することにより、実施できる。好ましくは、抗体は、コードされたタンパク質の実質的なフラクションについて、または少なくとも所望の生物学的ネットワークモデルを試験または確認するために関連するタンパク質について存在する (参照、例えば、Harlow and Lane, “Antibodes:  A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, NY (1988)、出典明示により本明細書の一部とする)。ひとつの好ましい実施態様において、モノクローナル抗体は、細胞のゲノム配列に基づき設計された合成ペプチド断片に対してつくる。このような抗体アレイでもって、細胞由来のタンパク質をアレイに接触せしめ、その結合を当技術分野で既知のアッセイ法で検定する。
【０１７６】
あるいは、タンパク質を二次元ゲル電気泳動システムで分離できる。二次元ゲル電気泳動は当技術分野で周知であり、典型的には第一次元のイソ電気的焦点化に続く第二次元の SDS−PAGE 電気泳動を含む (参照、例えば、Hames et al., “Gel Electrophoresis of Proteins:  A Practical Approach”, IRL Press, NY (1990); Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp. 1440−1445 (1996); Sagliocco et al., “Yeast”, Vol. 12, pp. 1519−1533 (1996); Lander, Science, Vol. 274, pp. 536−539 (1996))。得られた電気泳動パターンを、種々の技法、例えば、質量分析法、ウエステンブロット法、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いるイムノブロット法、内部およびＮ末端ミクロ配列決定法により解析できる。これらの技法を用いて、薬物に暴露された細胞中（例えば酵母中）または特異的な遺伝子の削除または過発現により改変された細胞中を含む与えられた生理的条件下でつくられるすべてのタンパク質の実質的フラクションを同定できる。
【０１７７】
生物学的状態の他の態様に基づく実施態様 
ｍＲＮＡ以外の細胞構成体のモニターが現状ではｍＲＮＡで見られないある種の技術的困難を有するが、本発明の使用で細胞機能の特性に関連するタンパク質の活性を測定できることは当業者に明らかであろう。本発明の実施態様はかかる測定に基づいている。活性測定は、特性化される特定の活性に適する機能的、生化学的または物理的手段により実施できる。活性が化学的形質転換を含むとき、細胞タンパク質を天然の基質に接触せしめ、形質転換の速度を測る。活性がマルチマー単位での結合、例えば、ＤＮＡとの活性化ＤＮＡ結合複合体の結合を含むとき、結合タンパク質または結合の２次的結果の量、例えば形質転換されたｍＲＮＡの量を測定できる。また、機能的活性のみが、例えば細胞周期の対照として既知の場合、機能の遂行を測定できる。しかし、知られ、測定されると、タンパク質活性の変化が本発明の上記の方法により解析される応答データを形成する。
【０１７８】
別の非制限的実施態様において、応答データを細胞の生物学的状態の混合態様から形成し得る。応答データを、例えば、ある種のｍＲＮＡ存在量の変化、ある種のタンパク質存在量の変化およびタンパク質活性の変化から構築し得る。
【０１７９】
コンピューター解析システムおよび使用方法 
上記の解析方法は、コンピューターシステムなどの自動システムの手段で行うのが好ましい。従って、本項では、本発明方法の実施に使用し得る例示的なコンピューターシステムならびにそのコンピューターシステムを操作する方法およびプログラムを記載する。
【０１８０】
図１は、本発明の解析方法の実施に適する例示的コンピューターシステムを示す。コンピューターシステム 101 は外的構成成分に結合した内的構成成分を含む。このコンピューターシステムの内的構成成分は、主メモリー 105 に結合されたプロセッサー・エレメント 102 を含む。例えば、コンピューターシステム 101 は、200 MHz 以上のクロック速度および 32 MB 以上の主メモリーをもつ Intel Pentium を基にするプロセッサーであり得る。
【０１８１】
外的構成成分は、マス保存手段 104 を含む。このマス保存手段は１以上のハードディスク(典型的にはプロセッサーおよびメモリーとともにパッケイジされている)であり得る。このハードディスクは典型的には 1 GB 以上の保存能力をもつ。 
【０１８２】
他の外的構成成分は、モニターであり得るユーザー・インターフェイス装置 105 ならびに“マウス”であり得る指示装置 106、他のグラフインプット装置（表示せず）および／またはキーボードを含み得る。印刷装置 (表示せず) もコンピューターシステム 101 に接続し得る。
【０１８３】
典型的には、コンピューター 101 はネットワークリンク 107 にも接続する。これは、１以上の他のローカル・コンピューターシステム、１以上の遠方コンピューターシステムまたは１以上の広域交信ネットワーク、例えばインターネットとの Ethernet リンクの部分であり得る。ネットワークリンクはコンピューターシステム 101 が他のコンピューターシステムとデータおよび操作を共有するのを可能にする。 
【０１８４】
コンピューターシステム 101 の操作の際にメモリー中にロードされるのは、当技術分野で標準的なものと本発明に特異的なものと両方のいくつかのソフトウエア構成成分である。これらのソフトウエア構成成分は、総合的に本発明方法に従ってコンピューターシステムを機能する。ソフトウエア構成成分は通常マス保存手段 104 に保存されている。例えば、ソフトウエア構成成分 110 は、指令コンピューターシステム 101 およびそのネットワーク相互連絡を司る操作システムを表す。操作システムは、例えば、Windows95、Windows98、WindowsNT などのマイクロソフト Windows ファミリーまたは Sun Solaris などの Unix 操作システムであり得る。
【０１８５】
ソフトウエア構成成分 110 は、コンピューターシステム 101 に通常存在する共通の言語および機能を表し、本発明に特異的な方法の実行のプログラムを助ける。多くの高または低レベル・コンピューター言語を用いて、本発明の解析法のプログラムを行う。指示は、操作時に解釈でき、または後の実行のために操作前に解釈できる(すなわち、編集して）。好ましい言語には、C、C＋＋ および好ましさの低い JAVAO を含む。
【０１８６】
最も好ましくは、本発明方法が、使用されるアルゴリズムを含む式および高レベル明細のシンボル的エントリーが可能な計算ソフトウエア・パッケイジにプログラムされる。このようなソフトウエア・パッケイジは、使用者が必要に応じ個別の式またはアルゴリズムを操作上自由にプログラムできるので、好ましい。 
【０１８７】
本発明のコンピューターシステムに使用し得る例示的計算ソフトウエア・パッケイジには、Mathworks (Natick, MA) の Matlab、Wolfram Research (Champaign, IL)の Mathernatica またはMath Soft (Cambridge, MA)の S−Plus がある。
【０１８８】
最後に、ソフトウエア構成成分 112 は、操作上の言語またはシンボル・パッケイジにプログラムされた本発明の解析方法を表す。好ましい実施態様において、コンピューターシステムは発現プロファイルのデータベース 113 も含有する。
【０１８９】
ある実施態様において、ソフトウエア構成成分 110 は、本発明の解析方法を実行し得る解析ソフトウエア 112 を含む。ひとつの実施態様において、この解析ソフトウエアは、コンピューターシステムのプロセッサーを起動し、下記の工程を実行する： (a) １以上のバイオ均等性実験、好ましくは複数のバイオ均等性実験からデータを受け、２以上の薬物製剤または組成物を比較する; (b) 実験データを発現プロファイルおよびベクトル均等物に転換する; (c) 発現プロファイルを表す２以上のベクトル間の類似性を決定する; (d) この類似性に基づき、試験される２以上の薬物製剤または組成物のバイオ均等性の程度を決定しアウトプットする。 
【０１９０】
発現プロファイル実験からのデータは、例えば、使用者がこのデータをメモリーにロードすることにより受け得る。例えば、使用者は、このデータをメモリー中に、モニター 105 およびキーボード 105 から、ネットワーク接続 107 によりつながっている他のコンピューターシステムから、または CD−ROM やフロッピーデスクなどの持ち運び可能の保存メディア 104 からロードし得る。
【０１９１】
好ましくは、ソフトウエア構成成分 110 は、本発明の解析方法を実行し得る解析ソフトウエア構成成分 112 を含む。特に、解析ソフトウエア構成成分 110 がベクトル表示の発現プロファイルを比較し得る構成成分を含むことが好ましい。
【０１９２】
好ましくは、このような解析ソフトウエア構成成分はプロセッサーを起動して下記の工程を実行する:  (a) １以上の発現プロファイルを受ける; (b) 均等性のベクトル表示を計算する; (c) これらのベクトルを比較して、その類似性の程度を決定する；(d) この類似性の程度に基づくバイオ均等性を計算する；(e) この計算されたバイオ均等性を使用者フレンドリイかつ臨床関連のフォーマットにアウトプットする。
【０１９３】
特に好ましい実施態様において、受けた発現プロファイルデータを、複数の既知の薬物製剤または組成物からの発現プロファイルデータを含むダイナミックデータベースシステム中に保存された発現プロファイルデータのデータベースと比較する。あるいは、受けた発現プロファイルデータを、使用者、例えば、上記の手段のいずれかがロードし得る。 
【０１９４】
最後の実施態様において、ソフトウエア構成成分 110 は、１以上の発現プロファイルを比較し得る解析ソフトウエア構成成分 112 も含有する。特に、解析ソフトウエア構成成分 112 は、コンピューターシステムのプロセッサーを起動して下記の工程を実行することが好ましい: (a) 第１発現プロファイルを受ける; (b) 第２発現プロファイルを受ける；(c) 受けた発現プロファイルをベクトルに転換する; (d) 第１と第２発現プロファイル・ベクトル間の類似性を上記手段のいずれかで計算する。
【０１９５】
ある実施態様において、受けた第１および第２発現プロファイル・ベクトルを使用者がインプットできる。あるいは、受けた発現プロファイル・ベクトルを、各々が既知の標準的薬物製剤または組成物に関連する発現プロファイル・ベクトルのデータベースから得ることができる。
【０１９６】
コンピューターシステムの使用
例示的実行において、本発明の方法を行うために、使用者は最初に発現プロファイルデータをコンピューターシステム 101 にロードする。これらのデータは、使用者が、メモリー中に、モニター 105 およびキーボード 105 から、ネットワーク接続 107 によりつながっている他のコンピューターシステムから、または CD−ROM やフロッピーデスクなどの持ち運び可能の保存メディア（表示せず）から直接的に入れ得る。
【０１９７】
次に、使用者は、発現プロファイル解析ソフトウエア 112 を動かす。これは、プロセッサーを起動して、下記の工程を実行する:  (a) １以上の発現プロファイルを受ける。これは、使用者インプットまたは内部データベースから受け得る; (b) 均等のベクトル表示を計算する; (c) これらのベクトルを比較して、その類似性の程度を決定する; (d) この類似性の程度に基づきバイオ均等性を計算する;  (e) この計算されたバイオ均等性を使用者フレンドリイかつ臨床関連のフォーマットでアウトプットする。   
【０１９８】
好ましさが低い実施態様において、使用者は、すべての発現プロファイルデータをロードし、上記の工程を解析ソフトウエア 112 で実行する。
【０１９９】
本発明はまた、本発明方法によるバイオ均等性決定に使用する発現プロファイルのデータベースを提供する。本発明のデータベースは、複数の既知および／または標準的薬物製剤または組成物についての発現プロファイルを含み、同じデータベースを用いていくつかの異なるバイオ均等性決定をモニターできる。好ましくは、このようなデータベースは、図１に表示および前出のものなどのコンピューターシステム中にロードし得る電子形態中にある。この電子形態は、本発明方法を実行するのに用いるコンピューターシステムの主メモリー 104、ネットワーク接続 107 によりつながっている他のコンピューターシステムの主メモリー、マス保存メディア 104 または CD−ROM やフロッピーデスクなどの持ち運び可能の保存メディアにロードされたコンピューターシステムを含む。
【０２００】
好ましい実施態様において、本発明の解析方法は、特定の薬物製剤または組成物の発現プロファイルを決定するためのキットの使用により実施できる。このキットは、上記したようなアレイまたはミクロアレイを含み得る。キットに含有されるミクロアレイは表面などの固体相を含み、これにプローブが固体相の既知の位置でハイブリドまたは結合する。好ましくは、このプローブは、既知の異なる配列の核酸からなり、各核酸はそれから誘導体されるＲＮＡ種またはｃＤＮＡにハイブリドされ得る。特に、本発明のキットに含有されるプローブは、具体的な薬物製剤への暴露に対する応答を増加または減少することが知られているＲＮＡ種から誘導される核酸配列に特異的にハイブリドし得る核酸、またはキットによりモニターしようとする具体的な薬物製剤のバイオ均等性の決定に特定の興味のある核酸である。
【０２０１】
本発明のキットに含有されるプローブは、具体的な薬物製剤への暴露に対する応答を増加または減少することのないＲＮＡ種にハイブリドする核酸を実質的に除外し、あるいは他の点ではキットによりモニターしようとする具体的な薬物製剤のバイオ均等性の決定に特定の興味あるものである。好ましい実施態様において、本発明のキットはまた、発現プロファイルのデータベースまたは上記のデータベースなどの均等ベクトル表示を含有する。
【０２０２】
他の好ましい実施態様において、本発明のキットは、上記の項に記載し、図１に表示したようなコンピューターシステムのメモリー中にロードでき得る発現プロファイル解析ソフトウエアをさらに含有する。本発明のキット中に含有される発現プロファイル解析ソフトウエアは、上記の発現プロファイル解析ソフトウエア 112 に基本的に同じである。好ましくは、このソフトウエアは、コンピューターシステムのプロセッサーを起動して、下記の工程を実施する：(a) １以上のバイオ均等性実験、好ましくは複数のバイオ均等性実験からデータを受けて、２以上の薬物製剤または組成物を比較する；(b) 実験データを発現プロファイルおよび均等ベクトルに転換する; (c) 発現プロファイルを表す２以上のベクトル間の類似性を決定する; (d) この類似性に基づき、試験すべき２以上の薬物製剤または組成物のバイオ均等性を決定しアウトプットする。
【０２０３】
ある実施態様において、第１または第２発現プロファイルまたはベクトルあるいは両方を使用者がインプットできる。あるいは、受けられた発現プロファイル・ベクトルは、各々が既知および／または標準的な薬物製剤または組成物に関連する発現プロファイル・ベクトルのデータベースから得ることができる。
【０２０４】
本発明の解析方法を実行するための代替えのシステムおよび方法は、当業者に明らかであり、添付の請求項の範囲内に包含される。特に、添付の請求項は、当業者に明らかである本発明の方法を実行するための代替えのプログラム構造を含むことを意図する。
【０２０５】
実施例
下記の実施例は、上記した発明の説明のために表示するものであって、本発明を制限するものではない。
実施例１：ピメクロリムス (ASM981) の経口製剤のバイオ均等製剤の決定
ピメクロリムス (ELIDEL （登録商標）または ASM981 ともいう) は、抗炎症性のアスコマイシン・マクロラクタム誘導体である。ELIDEL （登録商標）または ASM981 の化学名はエピクロロ−33−デスオキシアスコマイシンである。ASM981 は、局所製剤で用いて炎症性皮膚疾患に対して動物モデルおよび臨床試験で有用な結果が得られている。
【０２０６】
さらに最近、局所的 ASM981 すなわち ピメクロリムス は、1% クリームの形態で、乾癬、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎の処置に非常に有効俚に使用されている。さらに、経口製剤を用いて、中程度から重程度のプラーク乾癬の患者の処置に使用され、また非常に有効である。
【０２０７】
ASM981 は、マクロラクタム誘導体ファミリーに属し、このファミリーの他のメンバーとともにマクロフィリン 12 に結合し、カルチニューリンを阻害する。ASM981 は、T 細胞およびマスト細胞の活性ならびに炎症性サイトキニンの合成および放出をブロックする。
【０２０８】
乾癬は、原型丘疹鱗屑状であり、銀状のよくデルマケートされた紅斑丘疹およびプラークを特徴とする。乾癬は、少なくとも部分的に、遺伝子的に決定されている。これは通常、表皮の増殖および皮膚炎症の慢性状態である。乾癬は、最も普通は成人の初期に始まるが、いずれの年齢でも始まり得る。この疾患は、非常に局在する範囲にとどまるか、継続的な全身的疾患を起こすことがあり、時に、紅斑症といわれる全身紅斑およびスケールとなる。
【０２０９】
正確な乾癬の病理は未知であるが、免疫を基にする慢性炎症疾患であることは知られている。疾患の進行の際に白血球が活性化され、皮膚を透過し、皮膚が疾患の標的臓器となる。ヒト白血球抗原 (HLA) HLA BW17、B13、BW37 をもつ個体で乾癬はよく増進し、30% の患者が、遺伝的素因を示す疾患の家族歴を有する。基本的な改変は、表皮細胞数の増加における細胞周期を促進し、迅速な表皮細胞の増殖を頂点に達しせしめる。細胞代謝回転が７倍に増加し、角質層の基底層から最上層までの移行時間が通常の２８日から３−４日になる。この迅速な角化細胞の迅速な代謝回転は角化を変え、厚い表皮 (丘疹およびプラークとして見られる) および汎角化角質層 (銀状) となる。T リンパ球が役割を演じるが、この良性の増殖反応をなすメカニズムははっきりとはわかっていない（参照、Cecil Textbook of Medicine, 21st Ed., Goldman, Bennett, Eds., W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (2000) (especially pp. 2281−2281))。
【０２１０】
“33−エピクロロ−33−デオキシ−アスコマイシン”の構造
【化１】
2006506046.tif 000008
【０２１１】
ピメクロリムスすなわち ELIDEL（登録商標）
乾癬患者を処置するための臨床試験を ASM981 (ピメクロリムス) の標準的経口製剤で始めた。この試験の目的は、ピメクロリムスの標準的経口製剤の投与で起こされた遺伝子発現プロファイルの改変の本質を調べることと、試験すべきピメクロリムスの他の医薬均等性の経口製剤のバイオ均等性を可能にするのに必要なデータをつくることである。
【０２１２】
本試験に使用する ピメクロリムス (ASM981) の経口製剤を下記のようにつくる。ピメクロリムスの“固体分散”製剤は、ASM981 20%、ポロキサマー188 10% および HPMC 70% からなる。この製剤の製造は、米国特許 6,004,973 および 6,197,781 （両者を出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。さらに、ピメクロリムスおよび配合および経口製剤は、米国特許 6,197,781 および 6,004,973; ヨーロッパ特許 0 427 680 B1、WO 01/90110 A1 および WO 97/03654 （出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
【０２１３】
本試験で使用する経口製剤 (製剤 A) は下記からなる 20 mg 錠である。
【表１】
2006506046.tif 000009
【０２１４】
20 mg 活性錠に対とするプラセボ錠を下記のように製剤する。
【表２】
2006506046.tif 000010
【０２１５】
使用の用量は 60 mg/日で、１日２回 30 mg 投与した (b.i.d.)。この用量をつくるために、20 mg 錠を特別のカッター(Tablettenteiler NR.96)で半分に切断し、30 mg の ASM981 または対のプラセボを得た。
【０２１６】
ASM981 の評価を乾癬の処置について経口量 60 mg (30 mg b.i.d) 、4 週間の臨床試験で行った。使用の経口製剤は、大量につくられ得る高度に標準化された経口用量形態にあり、高度の均一組成をもつ。これを経口製剤Ａとする。
【０２１７】
この群は 10 患者を含む：8 人が経口製剤Ａを、2 人がプラセボを摂取した。最初の投与の前に血液サンプルを採取し、遺伝子発現ベースラインとし、ASM981 またはプラセボでの処置後 13 または 14 日にサンプルを採取し、化合物の作用メカニズムを調べるために遺伝子発現解析に供した。
【０２１８】
臨床データによると、8 人の ASM981 処置患者で乾癬が減少した。各血液サンプルからのＲＮＡを抽出し、個々のＤＮＡミクロアレイで試験すると、ASM981 処置の前と後の遺伝子発現を各患者について比較できる。本発明のひとつの態様は、処置患者における乾癬の臨床的退化および／または可能性ある副作用についてのわれわれの理解に関与する遺伝子調節のプロファイルを確立することである。一貫して調節される、すなわち２よりも大きい因子の変化の遺伝子を機能性カテゴリーに整理する。表４は、これらのシンボルをもつ同定遺伝子、ユニジーンクラスター番号、タンパク質アクセス番号、GenBank アクセス番号を、Affymetrix プローブの設計に使用された配列について示す。
【０２１９】
ASM981 の一貫ゲノムプロファイル(約 160 遺伝子) を同定した。化合物は、血液細胞中の、マクロラクタム標的経路 (マクロフィリン 12)、細胞活性化および増殖 (ヒストン 2、ヒストン 3.3、サイクリン D2) を下方調節し、炎症メディエター (ロイコトリエン A4 ヒドロナーゼ、プロスタグランジン・エンドペルオキシド・シンターゼ) を強く下方調節する。臨床的に認められる ASM981 効力は、LFA−1、P−セレクチン、セレクションおよび L−セレクションを含む炎症部位でのケモタクシスおよび細胞移動に必要な遺伝子の劇的な下方調節にもよる。
【０２２０】
この試験において、この ASM981 の経口製剤での処置が喘息生理病理に関与するのが知られているいくつかの遺伝子を顕著に下方調節することを発見した。これらには、RANTES、ガレクチン−3 およびトロンボキサン A2 受容体がある。この発見は、ASM981 がこの適用および他の炎症疾患に有用であることも示す。既知の害副作用に関与する遺伝子の改変についての一貫していないパターンが観察されたことも発見した。
【０２２１】
処置の前および後の 8 乾癬患者からの末梢血のゲノム解析が ASM981 の一貫したゲノム“記号”を示した。この記号はこの具体的な経口製剤の特徴的な遺伝子発現プロファイルを構成した。表１３に示す。この表は、各遺伝子の番号および名前ならびに遺伝子発現産物の比率または倍率変化を表し、薬物暴露の前と後を比較し、これは ASM981 のこの具体的な経口製剤、すなわち製剤Ａについての遺伝子発現プロファイルを構成する。この遺伝子発現プロファイルは、本発明の方法により、ASM981 の未知または新規であるが医薬均等性製剤の遺伝子発現プロファイルと比較し、バイオ均等性およびもって置換の可能性を決定する。
【０２２２】
データによるとまた、ASM981 は、多数の標的を介し、および主に抗炎症活性により作用する。ASM981 処置後の遺伝子発現プロファイリングにより同定されるマーカーは、化合物についての興味ある適応、喘息や炎症性腸疾患を示唆する。
【０２２３】
サンプルからのＲＮＡの抽出、標的の調製、ハイブリダイゼーおよびアレイの解析を、 Affymetrix により推奨されるプロトコールおよび方法に従って実施した。全ＲＮＡを、 0 日および 14 日に収集した血液サンプル（リンパ球）から TRIZOL （商標）(Life Technologies) 抽出し、必要に応じ RNEASY（商標）カラム (Qiagen) で精製した。良質全ＲＮＡ (5 mg) を用いて、２本鎖ｃＤＮＡの合成を SUPERSCRIPT CHOICE システム（商標） (Life Technologies) で行った。ついで、ｃＤＮＡをインビトロ転写すると (MEGASCRIPT（商標） T7 キット, Ambion) 、ビオチン標識のｃＲＮＡを形成した。ｃＲＮＡの質を、Affymetrix の推奨に従い、試験アレイで調べた。ついで、12−15 mg の標識ｃＲＮＡをプローブアレイに 16 時間、45℃でハイブリドした。アレイを EukGE−WS2 プロトコール (Affymetrix) に従い洗い、10 mg/mL のストレプタビジン−フィコエリトリシン・コンジュゲート (Molecular Probes) で着色した。このシグナルは、2 mg/mL アセチル化 BSA (Life Technologies)、100 mM MES、1 M [Na＋]、0.05% Tween 20、0.005% アンチオフォーム (Sigma)、0.1 mg/mL ヤギ IgG および 0.5 mg/mL ビオチン化で増殖され、そしてストレプタビジン液で再着色された抗体である。洗浄後、アレイを２回 GENE ARRAY（登録商標）スキャナー (Affymetrix) で走査した。 
【０２２４】
データの解析は、各個々の患者について、処置の前と後の遺伝子発現レベルを比較した。少なくとも 5 患者で一貫して調節された遺伝子のみを関連とみなした。これらの変化をプラセボ処置患者にみられる遺伝子発現の変化とも比較した。解析中、１チップ (処置前の患者 44) が非常に少数の正しくハイブリドされた遺伝子を有し、解析中にバイアスを導入したようである。この対を除外し、平均フォールド変動を確立した。大多数の遺伝子が下方調節された。160 の調節された遺伝子の表を確立した。それは、140 (88%) 下方調節された遺伝子および 20 の上方調節された遺伝子を含む (参照、付記１−１２および表１３)。 
【０２２５】
一貫して調節された全 163 遺伝子を下記のように機能的カテゴリーに分けた。
・免疫抑制関連遺伝子 (13 遺伝子)
−FK506/ASM981 免疫抑制経路に関する遺伝子 (4 遺伝子) 
−HLA および抗原提示関連遺伝子 (9 遺伝子)
・白血球トラフィッキング関連遺伝子 (24 遺伝子)
−ケモタクシスおよび移動 (13 遺伝子)
−細胞骨格および細胞変形関連遺伝子 (11 遺伝子)
・炎症関連遺伝子 (12 遺伝子）
・細胞活性化および増殖 (105 遺伝子)
−リボソームタンパク質 (52 遺伝子)
−タンパク質合成および細胞内トラフィッキング (14 遺伝子) 
−増殖関連遺伝子 (10 遺伝子)
−DNA−/RNA−結合タンパク質および転写因子 (9 遺伝子)
−細胞内情報伝達 (7 遺伝子)
−細胞代謝 (12 遺伝子)
・既知の機能のないタンパク質をコードする遺伝子 (10 遺伝子)
完全なリストを調節された遺伝子の記載を表１−１３に示す。
【０２２６】
免疫抑制関連遺伝子
FK506/ASM981 免疫抑制経路に関する遺伝子 (表 1)
４リスト遺伝子、マクロフィリン 12 (FKBP 12)、ニューラグラニン、カルモヂュリンおよびカルシウム調節シクロフィリンリガンドが同定された免疫抑制経路に属する。
【０２２７】
HLA および抗原表示関連遺伝子 (表 2)
HLA システムの不変化部分が各患者に共通し、一貫して下方調節された遺伝子中にある。これらの下方調節はクラス I 様およびクラス II 遺伝子ならびに低程度のクラス I 遺伝子に影響を与える。
【０２２８】
白血球トラフィッキング関連遺伝子
免疫または自動免疫応答の際に、エフェクター・リンパ球の外因性または内因性標的の場所への移動は、成功的反応のために肝要の工程である。
【０２２９】
細胞移動も炎症反応の際に重要である。移動は通常、標的場所で細胞を引きつけるケモテタクシス・シグナルにより始まる。白血球は活性化された内皮を認識でき、それに付着する。ASM981 処置は、この事象の連続の各部分に属する遺伝子の発現を下方調節するようである。
【０２３０】
ケモテタクシスおよび移動 (表 3)
LFA1 の下方調節がヘテロダイマーの両構成成分に影響を与えるようである。この付着分子は、特に興味深く、皮膚炎症性疾患の処置のための標的とされている (FSC 提唱 RD−1999−03563)。MIC−2 は LFA−1 発現を調節するようである。
【０２３１】
RANTES は主要ケモテタクシス分子であり、いくつかの免疫仲介炎症反応における要のメジエーターとして同定されている。
P−セレクチンリガンドおよび L−セレクチンは、白血球が炎症の炎症部位への到達を行う。
【０２３２】
細胞骨格および細胞変形関連遺伝子 (表 4)
炎症関連遺伝子 (表 5)
細胞活性化および増殖 (表 6−12) 
リボソームタンパク質 (表 6)
タンパク質合成および細胞内トラフィッキング (表 7)
増殖関連遺伝子 (表 8)
DNA−/RNA−結合タンパク質および転写因子 (表 9)
細胞内情報伝達 (表 10)
細胞代謝 (表 11)
既知機能のないタンパク質をコードする遺伝子 (表 12)
【０２３３】
Ｔリンパ球についてのマーカー
ASM981 を免疫抑制能について試験したので、Ｔリンパ球下方調節についてのマーカーが特に注意を引く。CD8、グランチーム B および A、ならびに CD3 鎖の挙動を観測した。結果を表 13 に挙げる。ASM981 は、血中の T 細胞発現 CD3 の割合に影響を与えない。CD8 ＋T リンパ球は処置後に僅かに多く現れ、グランチーム A および B の増加を説明し得た。 CD4 は、チップ上で CD4 プローブとの具体的なハイブリダイゼーションを欠くことからモニターできなかった。
【０２３４】
４つの異なる遺伝子がマクロラクタム免疫抑制経路に連結し得る。ASM981 は、FK506 のように、カルシニューリン阻害剤であり、それと FKBP12 としてのマクロフィリン結合の能力を共有するが、FK506 よりアフィニティーが３倍弱い（参照、Bochelen et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol. 288, No. 2, pp. 653−659 (1999))。FKBP12 ＲＮＡ合成のレベルで強く下方調節されるが、ASM981 は FKBP12 タンパク質に結合する。FKBP12 の ASM981 によるキレート化合物合成がｍＲＮＡ発現の増加を代償メカニズムとして誘導すると思われるが、得られた発現パターンは、ASM981 も FKBP12 の発現を転写レベルでブロックして、細胞なしの FKBP12 貯蔵の再補充を防ぐ。CAMLG はシクロスポリン A リガンドについての天然のリガンドであって、この下方調節は、ASM981 がタンパク質のイムノフィリンファミリーメンバー中の異なるメンバーを標的とすることを表す。
【０２３５】
カルモジュリンおよびニューラグラニンは、カルシウムの貯蔵放出および細胞内分配に関与する２カルシウム結合タンパク質であり、情報導入経路をも阻止し得る。
【０２３６】
ASM981 プロファイルは、細胞増殖マーカー、タンパク質合成、細胞代謝およびリボソームタンパク質の下方調節とともに見られるような細胞活性の低下を示す。この作用は、活性化および増殖のブロックを含むカルシニューリン阻害の結果であり得る。リボソームタンパク質発現は深く影響を受け、いくつかの細胞が増殖を停止することを示す。
【０２３７】
ASM981 も HLA クラス I 様遺伝子 (例えば、HALF) および HLA クラス II (Ii 不変鎖、クラス II 複合体の適当な細胞内プロセシングに必要) の発現に影響を与える。HLA クラス Ib 遺伝子は、多様な細胞型により発現されるが、クラス II 遺伝子は、マクロファージなどの抗原提示細胞、Ｂ細胞および樹状細胞により発現される。この型の下方調節は免疫または自動免疫反応の保持を弱め得る。
【０２３８】
炎症の進展には、その部位での細胞の移動を要する。ASM981 が化学誘因としての移動、白血球ローリング、内皮への堅い付着および溢血の多工程を弱める。
【０２３９】
化学誘引性 RANTES の下方調節は炎症部位に到達する細胞の能力に非常に影響を与える。RANTES 発現の低下は特に興味深い。これが ASM981 について報告されているインビトロ作用に完全に適合するからである。すなわち、炎症メジエーター放出の弱化、IgE プロモーター活性の減少、Ｔ細胞の活性化および増殖の低下である (参照、Bochelen et al.、前出)。
【０２４０】
L−セレクチンおよび P−セレクチンリガンド、白血球ローリング工程の要の分子も下方調節される。P−セレクチンリガンドは、種々のレクチンに結合し、細胞/内皮の相互作用に関与できる。このタンパク質は転写後に改変され、改変変種のひとつが CLA (皮膚のリンパ球抗原) として知られる。 CLA はリンパ球の皮膚への標的化に関与すると考えられる。CLA の下方調節も創傷溢血部位でのリンパ球移動を弱めるのであろう。
【０２４１】
ASM981 処置も炎症関連遺伝子を下方調節する。LFA−1 タンパク質の両鎖、αおよびβが下方調節される。LFA−1 は浸潤およびＴ細胞活性化過程における要の分子である。LFA−1 に対する抗体がフェーズII試験で乾癬患者に有効であることが証明されている (参照、Grassberger et al., Br. J. Dermatol., Vol. 141, No. 2, pp. 264−273 (1999))。LFA−1 の阻害剤はマウスモデルでアレルギー性接触皮膚炎を強力に阻害する。本発明では、ASM981 が炎症過程の重要な点をブロックし得る。
【０２４２】
ASM981 はまた、細胞骨格タンパク質を下方調節して、プロスタグランジン・エンドペルオキシド・シンターゼとしての細胞主要酵素を弱め、ロイコトリエン A4 ヒドロラーゼを下方調節し、キニスタチン、キニン生成の阻害剤を上方調節する。ASM981 は、循環細胞の炎症性力価を効果的にブロックするようである。
【０２４３】
まとめたデータによると、ASM981 は下記の事項を下方調節し得る：
・マクロフィリン調節経路 
・細胞の活性化および増殖
・HLA 発現 
・炎症部位での細胞移動
・炎症
【０２４４】
明白な毒性作用を発現プロファイルで認めなかった。可能性ある害エフェクターまたは毒性経路に関連する遺伝子が調節されることは認めなかった。 
【０２４５】
観測された遺伝子発現プロファイルは、処置により影響を受ける細胞サブセットの決定を可能としなかった。この下方調節はすべての型の白血球またはそのあるもののみに影響を与え得る。しかし、Ｔ細胞の割合は、無変化の CD3 発現レベルが示すように一定にとどまるようである (CD3 のみがＴ細胞の存在を述べ、その活性状態を示さない)。CD8 およびグランチームの発現の僅かな増加は異なるリンパ球サブセットに対する分別作用のしるしであり得る。これは、臨床データおよび／または他のサンプルの解析により確認されることを要する。これはまた、免疫システムのいくつかの領域が無能力でないことを示し得る。ASM981 は、皮膚疾患を処置するために抗炎症性化合物として標的にされる。
【０２４６】
ASM981 は、動物モデルの接触皮膚炎に局所適用および経口経路で有効であることが証明されている(参照、Grassberger et al.、前出)。ASM981 の臨床試験は、局所製剤を用いてアトピー性皮膚炎または乾癬に実施され、臨床的減成が得られている(参照、Gottlieb et al., J. Am. Acad. Dermatol., Vol. 42, No. 3, pp. 428−435 (2000); Meingassner et al., Br. J. Dermatol., Vol. 137, No. 4 (1997)。ASM981 の抗炎症性が、脳の虚血後の再灌流を含む別の実験的システムで成功裡に試験されている(参照、Bochelen et al.、前出)。
【０２４７】
上記したように、RANTES、付着分子およびトロンボキサン A2 受容体などの炎症性タンパク質(喘息における気管支収縮の原因となる) に対する強力な影響は、ASM981 のこの経口製剤が喘息の処置に有効であり得ることを示す。
【０２４８】
喘息は、その正確な病因が未知である臨床症候である。しかし、炎症がこの疾患で大きい役割を果たすことは知られている。臨床的に喘息は次の３つの明白な構成を特徴とする：(1) 自発的にまたは処置の結果として解消される気道閉塞の繰り返し起きるエピソード; (2) 非喘息者にほとんどまたは全く作用のない刺激に対して過剰な気管支収縮応答、気道過剰応答として知られる現象; (3) 種々の評価基準により定義される気道の炎症。 
【０２４９】
喘息は、男性および女性に等しく起きる非常にありふれた疾患である。大まかに言って、米国の成人人口の 5% に喘息の診断に一致する徴候および症状がある。大部分の事例は 25 歳前に始まるが、喘息は生涯のいずれの時でも進展し得る。世界的に喘息の罹患が 1970 年代の後半以来３０％増加している。喘息の最も大きい増加は、“工業化”生活様式を近年に有する国でおきている。さらに、重い喘息による負担が都市部の社会経済的弱者に対して不均等に掛かっている。喘息の流行の全体的増加または都市部での事例の不均衡な割合の原因は不明である。
【０２５０】
喘息は、医学処置が求められている最も普通の理由を有している。米国で喘息のために年間約 15 百万人の外来患者があり、2 百万近くの患者入院日がある。喘息治療のための年間の直接および間接の経費は６０億ドル以上であり、その 80% 以上が医療処置または喘息薬物処置に対する直接の出費に要している。
【０２５１】
さらに、興味深いことに、下方調節される炎症関連遺伝子の大きいパネルによると、炎症性腸疾患 (IBD) が、喘息および炎症を含む他の疾患に加えて ASM981 についての強力な指標である。潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む IBD は消化管の慢性炎症疾患である (喘息および IBD の炎症について、参照、Cecil Textbook of Medicine, 21st Ed., Goldman and Bennett, Eds., W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA (2000))。
【０２５２】
バイオ均等性の決定
上記したように、ASM981 標準的経口製剤、例えば、製剤Ａの投与の結果としての複数のｍＲＮＡの改変の測定によりつくられた発現プロファイルを用いて、ASM981 の異なるが医薬均等性の経口製剤のバイオ均等性を決定できる。 
【０２５３】
この比較の目標は、ASM981 の異なるが医薬均等性の経口製剤が、得られる処置の臨床効果において有意の変化なしに、標準的製剤Ａの代替えとなり得るかを決定することにある。この比較は次のように行う。最初に、製剤Ａと比較しようとする製剤を、類似の対象に、完全な医薬均等性を保持できる環境で投与する。それには、２製剤ＡおよびＢが同じ活性成分 (化学的に同一の活性薬物物質) を含有し、強度または濃度、形態、投与経路が同じであり対象が“類似”であることを要する。
【０２５４】
上記の環境下で、この２医薬均等薬物製剤が“バイオ均等”であると、２製剤の医薬効果が同一であり、２薬物製剤の活性成分のバイオアベイラビリティの速度および程度が、他の点では同一である試験条件で有意に相違しないことを意味する。製剤Ｂを摂取した対象において遺伝子発現プロファイルの改変は、上記のように製剤Ａについてと全く同じ方法で決定する。この決定の結果が、表１３に示す製剤Ａについての発現プロファイルとしての 163 エレメント（改変されたｍＲＮＡ種）のすべてまたは大部分を含有する製剤Ｂについての発現プロファイルの作成である。
【０２５５】
すでに決定された製剤Ａについての発現プロファイルを、開示のコンピューターシステムの実施態様のひとつのメモリー中に保存するか、比較過程時に使用者がインプットできる。ついで、製剤Ｂについての発現プロファイルをなんらかの方法でコンピューターシステム中にインプットし、必要なソフトウエアを起動して、２製剤のバイオ均等性の程度を決定する。
【０２５６】
これらの操作は次のことを含み得る。発現プロファイル解析ソフトウエアを起動して、下記の工程を実行するコンピューターのプロセッサーを起動する工程を実施する：(a) １以上の発現プロファイルを受ける。これらは使用者のインプットまたは内部データベースに由来する; (b) 均等のベクトル表示を計算する; (c) それらのベクトルを比較して、類似性の程度を決定する; (d) 類似性の程度に基づきバイオ均等性を計算する; (e) この計算されたバイオ均等性を使用者フレンドリイおよび臨床関連フォーマットでアウトプットする。
【０２５７】
類似性の程度を決定するためのベクトルの比較工程は、上記で開示された数学的方法のいずれかで類似性の程度を決定する。例えば、コンピューターが、多エレメント発現プロファイルの２ベクトル表示間の一般化されたコサイン角を計算し、それによって −1 〜 ＋1 の値をもつ共効率相関を提供する。共効率相関 ＋1 は２ベクトルが同一であることを示し、共効率 0 は２ベクトル間に関係のないことを示す。共効率 −1 は完全な陰性関係を示し、従って、この例では、陰性共効率が関連しない。この技法の感受性は、基礎となる生物学に関して、極度に高く、共効率相関 ＋1 からの小さい偏向すら有意かつ臨床的に関連する変動を、製剤ＡとＢの間でのバイオ均等性において表示する。
【０２５８】
この例の目的について、共効率相関 0.98 は２製剤間に臨床関連のバイオ均等性の欠失を示し、製剤Ｂが、結果としての処置の有効性または副作用において有意かつ場合により危険な変化なしには、製剤Ａの代替えとなり得ないことを表す。
【０２５９】
【表３】
2006506046.tif 000011
【０２６０】
【表４】
2006506046.tif 000012
【０２６１】
【表５】
2006506046.tif 000013
【０２６２】
【表６】
2006506046.tif 000014
【０２６３】
【表７】
2006506046.tif 000015
【０２６４】
【表８】
2006506046.tif 000016
【表９】
2006506046.tif 000017
【０２６５】
【表１０】
2006506046.tif 000018
【０２６６】
【表１１】
2006506046.tif 000019
【０２６７】
【表１２】
2006506046.tif 000020
【０２６８】
【表１３】
2006506046.tif 000021
【０２６９】
【表１４】
2006506046.tif 000022
【０２７０】
【表１５】
2006506046.tif 000023
【０２７１】
【表１６】
2006506046.tif 000024
【表１７】
2006506046.tif 000025
【表１８】
2006506046.tif 000026
【表１９】
2006506046.tif 000027
【表２０】
2006506046.tif 000028
【０２７２】
引用について
本明細書で引用されたすべての文献などは、各個々の文献、特許または特許出願がすべての目的のためにその全体を本明細書の一部とすると具体的におよび個々に表示されたのと同様に、出典明示により完全に本明細書の一部とする。その引用についての説明は、その著者らの記述を要約することを単に意図するものであって、いかなる引用も先行技術を構成すると認めるものでない。出願人は、引用文献などの正確性および妥当性を争う権利を留保する。
【０２７３】
さらに、本明細書で引用されたすべての GenBank アクセス番号、ユニジーンクラスター番号およびタンパク質アクセス番号で示されるものは、各個々の番号がすべての目的のためにその全体を本明細書の一部とすると具体的におよび個々に表示されたのと同様に、出典明示により完全に本明細書の一部とする。
【０２７４】
本発明は、本出願中に記載された特定の実施態様の見地から限定されるべきでない。実施態様は本発明の個々の態様の単なる説明を意図する。当業者に明らかなように、本発明の多くの修飾および改変を、その精神および範囲を逸脱することなしになし得る。本明細書に例示したものに加えて、本発明の範囲内で機能的に均等の方法および装置が、上記の説明および添付の図面から当業者に明らかであろう。このような修飾および改変は添付の請求項の範囲内にあるものとする。本発明は、添付の請求項がもつ均等の完全な範囲とともに、請求項の用語によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、本発明方法を実行するのに有用なコンピューターシステムの例示的実施態様を示す。
【図１】
2006506046.tif 000029
【国際調査報告】
2006506046.tif 000030
2006506046.tif 000031
2006506046.tif 000032
2006506046.tif 000033