(57)【要約】本発明は一般的に核酸ポリメラーゼの基質としてのリン酸３つ以上を有する末端リン酸標識ヌクレオチドの使用、及び、ＤＮＡ増幅におけるその使用に関する。使用される標識はケミルミネセント、蛍光、電子化学及び発色原の部分、並びに、質量タグであり、そして、直接検出可能であるか、酵素活性化の後に検出可能であるか、又は他の工程に供されて異なるシグナルを発生させるものを包含する。結合した染料から発生する信号は増幅の量を測定するためにも使用してよい。更にまた、水溶液中の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の安定性を増強させるための安定化剤、及び、これ等のヌクレオシドの非酵素的加水分解を低減することによりバックグラウンドを低下させるために有用なアークも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸鋳型、プライマー、核酸ポリメラーゼ及び１以上のヌクレオシドポリリン酸のポリメラーゼ反応を包含する核酸増幅のための方法において、１種以上の末端標識ヌクレオシドポリリン酸の存在下に該ポリメラーゼ反応を実施することを含む進歩。
【請求項２】
増幅をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）により行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
該核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、プライマーゼ、テロメラーゼ又はこれ等の組合せからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ＤＮＡポリメラーゼが古細菌ポリメラーゼである請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ＤＮＡポリメラーゼがテルモコッカス・バロシＤＮＡポリメラーゼ、テルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラーゼ、テルモコッカス・コダカレンシスＮＡポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオシスＤＮＡポリメラーゼ、ピロコッカスＧＢ−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ又はこれ等のポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠乏変異体から選択される請求項３記載の方法。
【請求項６】
増幅をマンガン塩の存在下に実施する請求項１記載の方法。
【請求項７】
増幅を非酵素的加水分解に対して末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を安定化させる安定化剤の存在下に実施する請求項１記載の方法。
【請求項８】
該安定化剤が有機添加物、無機添加物又は両方の混合物である請求項７記載の方法。
【請求項９】
該有機添加剤が有機塩である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該無機添加剤が無機塩である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
該無機塩が硫酸塩、モリブテン酸塩、タングステン酸塩又はこれ等の組合せから選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
増幅を異なる標識を有する末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸２つ以上の存在下に実施する請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸がポリリン酸鎖中にリン酸基４つ以上を含む請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸が下記式：
【化１】
2006513705.tif 000030
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルホスホネート又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基、ハロアルキル基又はアミノ基を含む標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識である］で示される請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸がＰとＬとの間にリンカーを含む請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該等部分がリボシル、２′−デオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アジドリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル、２′−メルカプトリボキシル、２′−アルキルチオリボシル、炭素環、非環式及び他の修飾された糖類からなる群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該塩基がウラシル、チミン、シトシン、グラニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−デアミノプリン及びその類縁体からなる群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
該ホスホリル化標識が酵素活性化可能な標識であり、そして、ケミルミネセント化合物、蛍光発生染料、発色原染料、質量タグ、電子化学タグ及びそれらの組合せからなる群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
該酵素活性化標識が２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセインジホスフェート、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びその誘導体からなる群から選択される蛍光発生部分である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該酵素活性化可能な標識が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドキシルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びその誘導体からなる群から選択される発色原部分である請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
該ケミルミネセント化合物がアルカリホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物である請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
該１，２−ジオキセタン化合物が２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２‘−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、クロロアダマント−２′−イリデンメトキシフェノキシホスホリル化ジオキセタン、３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン及びその誘導体からなる群から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
下記工程：
（ａ）核酸増幅反応を実施することにより標識されたポリリン酸を生成すること、ここで該反応は１種以上の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸及び核酸ポリメラーゼを包含するものであること、及び、
（ｂ）該標識ポリリン酸を検出すること、
を含む資料中の核酸配列の存在を検出する方法。
【請求項２４】
該検出工程が（ａ）該標識ポリリン酸をホスファターゼで処理することにより検出可能な物質種を生成すること、及び（ｂ）該検出可能な物質種を検出することを包含する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該処理工程及び該実施工程を同時に行う請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
検出工程を該検出可能な物質種の生成とリアルタイムで該検出工程を実施する請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該核酸ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、テロメラーゼ、プライマーゼ又は末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
該ホスファターゼがアルカリホスファターゼ又は酸ホスファターゼである請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
該アルカリホスファターゼがＥ．ｃｏｌｉアルカリホスファターゼ、ウシ腸アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ及びＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓアルカリホスファターゼからなる群から選択される請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
標識されたポリリン酸の量を測定することにより資料中の該核酸を定量する工程を更に含む請求項２３記載の方法。
【請求項３１】
ＰＣＲ、ＲＣＡ、ＳＤＡ又はＮＡＳＢＡにより増幅を行う請求項２３記載の方法。
【請求項３２】
該実施工程をＰＣＲにより行い、そして該反応が更に対立遺伝子特異的プライマーを包含する請求項２３記載の方法。
【請求項３３】
該末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸が下記式：
【化２】
2006513705.tif 000031
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識である］で示される請求項２３記載の方法。
【請求項３４】
該末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸がＰとＬとの間にリンカーを含む請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
下記成分：
（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、及び、
（ｂ）ポリメラーゼ、
を含む核酸標的を増幅又は定量するためのキット。
【請求項３６】
ホスファターゼを更に含む請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸安定化剤を更に含む請求項３５記載のキット。
【請求項３８】
更にマンガン塩を含む請求項３５記載のキット。
【請求項３９】
ランダム配列プライマーのセットを含む請求項３５記載のキット。
【請求項４０】
プライマーが４〜１０ヌクレオチドの長さである請求項３９記載のキット。
【請求項４１】
プライマーが６量体である請求項３９記載のキット。
【請求項４２】
プライマーがヌクレアーゼ耐性である請求項３９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に核酸増幅に関する。より精しくは、本発明は核酸増幅における末端リン酸標識ヌクレオチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高い特異性及び感度を有する試料中の特定の核酸又は分析対象を検出するための方法が知られている。このような方法は一般的にはまず標的配列又は分析対象の存在に基づいた核酸配列を増幅することを必要とする。増幅の後、増幅された配列を検出して定量する。核酸に関わる従来の検出システムは蛍光標識の検出、蛍光酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出を包含する。
【０００３】
これ等の方法の１つの難点は、標識された生成物が標識原料からのある種の分離を要するのみならず、標識が生成物に結合しているために同定すべき天然の産物とは異なる点である。従って、未修飾の生成物を形成すると同時に進行している反応に特徴的なシグナルを発生する方法及び基質を使用することが有利である。発生されたシグナルが原料からの分離を必要としなければ更に有利であるが、分離が必要であったとしても、多くの場合において未修飾の生成物を生成する利点のほうが凌駕している。
【０００４】
末端リン酸標識ヌクレオチドは上記の利点を与える。例えば、核酸ポリメラーゼによるＤＮＡ又はＲＮＡへのガンマ−又はデルタ−標識ヌクレオチドの取り込みにより未修飾のＤＮＡ又はＲＮＡが生産され、そしてそれと同時に、生成した標識ピロリン酸を用いて標的を検出、特性化及び／又は定量することができる。これ等が増幅反応に使用できれば、それらは標的配列の検出及び定量のための有用な道具を与えるのみならず、修飾を伴わない標的配列の厳密なコピーである増幅産物をその後の試験に用いることができる。
【０００５】
多くの増幅方法によるＤＮＡ増幅は高温において実施される。例えば、ＰＣＲにおいては、９５℃における変性、６０℃前後におけるアニーリング及び７０℃前後における伸長の反復サイクルによりｄＮＴＰの顕著な分解が起こる。これはその後のサイクルにおける生成物の収率に大きく影響する場合がある。他の増幅方法、例えばＲＣＡ及びＮＡＳＢＡは等熱であるが、やはり、より高温で行われる。４１℃で実施されるＮＡＳＢＡの場合は、ヌクレオチドの安定性はそれほど厳密ではないが、使用するポリメラーゼ及び増幅すべき配列の複雑性に応じてより高温で行われる場合があるＲＣＡにおいては、ヌクレオチドの安定性はこれ等の条件化における問題点となりえる。末端リン酸標識ヌクレオチドの分解が起こるとすれば、発生した分解の量は増幅工程に直接関連する何れのシグナルも凌駕することになる。従って、温度のこのような反復サイクル又は一定であるがなお高温における長時間の加熱を克服でき、これにより増幅の後期のサイクルにおいても高収率及び低分解を維持でき、恐らくは所望の増幅を達成するために必要なサイクル／時間を低減できるようなヌクレオチドを保有することが望まれている。従って、ガンマ−リン酸標識ヌクレオチドは核酸合成及び増幅のために通常使用されている条件下ではポリメラーゼに対する極めて不良な基質である。核酸の長ストレッチの合成（数百〜数千塩基長）はサイクル当り数時間〜１日を要する。Ｈａｒｄｉｎｇ等（国際特許出願０２４４４２５Ａ２）は高温におけるＤＮＡ合成のためのアミノナフタレンスルホネート−ガンマ−アミド−ｄＡＴＰの使用を記載している。しかしながら、本発明者等によれば、この場合、合成は、アミノナフタレンスルホネートが核酸を加水分解して放出した後のみに進行し、そしてＤＮＡの形成のためにポリメラーゼにより使用されるものはｄＡＴＰである。これは当然ながら、発生した染料がＤＮＡ合成とは無関係であることから、標的配列の検出又は定量のためには不要である。
【０００６】
多くのリアルタイム試験がＤＮＡの定量のために開発されている。これ等の大部分は２つのグループに分類できる。比較的使用が容易である第１のグループはインターカレーションにより増強された蛍光を有するインターカレーション染料の使用を含む。多くの核酸染色、例えば臭化エチジウム。ＳＹＢＲグリーン（登録商標）染料、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＴＯＴＯ（登録商標）又は類縁体がリアルタイム試験用のインターカレーターとして開発されている。しかしながらこれ等は、部分的にはプライマー二量体の間のインターカレーションにより、そして、部分的にはそれらがインターカレーションされない場合においても弱くはあるが蛍光を発するため、顕著なバックグラウンドシグナルを発生する。
【０００７】
リアルタイム試験の他のグループは染料とクエンチャーの間の蛍光共鳴エネルギー転移の使用に基づく。これ等の試験の多くはＦＲＥＴプローブ又はプライマー、例えばＴａｑｍａｎ、ＭＧＢＥｃｌｉｐｓｅＴＭ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、分子ビーコン、サンライズプライマー等を用いて開発されている。これ等のプローブ／プライマーは、増幅が起こるまでエネルギー転移によりクエンチングされ、そしてクエンチャーは物理的には染料から分離されるか、又は切断される。これ等の試験の感度は大部分がプローブの設計に依存しており、そして多くの旨適化を必要とする。更にまた、最も旨適化されたプローブを用いた場合も、完全なクエンチングは達成されない。従って、これ等の試験は増幅により数倍のシグナル増強をもたらすのみであり、初回サイクルにおいてはバックグラウンドシグナルは真のシグナルよりもはるかに高値となる。
【０００８】
従って、増幅を合理的な時間内で実施（未修飾ｄＮＴＰと同様）することができ、そして生成する標識の量が形成される生成物に比例するような末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いた増幅方法の開発は利益を与えるものである。更に、末端リン酸標識ヌクレオチドからのシグナルの干渉を受けることなく生成した標識の量を独立して検出できるリアルタイム試験法を保有することが望ましい。標識は増幅が進行するまでは完全に暗であるようなリアルタイム試験法を保有することが望ましい。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は核酸増幅における末端リン酸標識ヌクレオチド（末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸とも称する）を用いた方法を提供する。方法はまた選択的増幅による標的配列の検出及び定量を可能とする。更にまた増幅中の標的配列のリアルタイムの検出及び定量のための方法が提供される。
【００１０】
本発明はａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの反応を含む核酸増幅を実施すること、ここでその反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすこと、ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及びｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を含む核酸配列の存在を検出するための方法を提供する。本発明におけるホスファターゼの定義はリン酸モノエステル、リン酸チオエステル、ホスホロアミダイト、ポリリン酸及びヌクレオチドを切断して無機のリン酸を放出する何れかの酵素を包含する。本発明の範囲内においては、この酵素は末端標識ヌクレオシドリン酸を切断しない（即ち、末端リン酸標識ヌクレオチドは実質的にはホスファターゼに対して非反応性である）。ホスファターゼの定義は本明細書においては特にアルカリホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１）及び酸ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２）を包含するが、これに限定されない。本明細書においては、ヌクレオチドの定義は天然及び修飾されたヌクレオシドリン酸を包含する。
【００１１】
本発明はａ）マンガン塩の存在下に核酸増幅反応を実施すること、ここで反応は末端リン酸標識ヌクレオチドの反応を包含し、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及びｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を包含する核酸配列の存在を検出する方法を提供する。
【００１２】
本発明は更に、ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及びｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を包含するＤＮＡ配列の存在を検出する方法を提供する。
【００１３】
本発明は更に、ａ）末端リン酸標識ヌクレオチド及びマンガン塩の存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及びｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を包含するＤＮＡ配列の存在を検出する方法を提供する。
【００１４】
本発明は更に、ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、ｂ）標識されたポリリン酸の存在を検出すること、の工程を包含するＤＮＡ配列の存在を検出する方法を提供する。
【００１５】
更に提供されるものは、（ａ）ポリリン酸鎖内にリン酸基４つ以上を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増殖反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸を検出すること、の工程を包含する核酸配列の存在の検出方法である。
【００１６】
更に提供されるものは、（ａ）マンガン塩及び１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増殖反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸を検出すること、の工程を包含する核酸配列の存在の検出方法である。
【００１７】
更に提供されるものは、（ａ）マンガン塩及びポリリン酸鎖内にリン酸基４つ以上を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増殖反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸を検出すること、の工程を包含する核酸配列の存在の検出方法である。
【００１８】
更に本発明は、（ａ）ポリリン酸鎖内にリン酸基４つ以上を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増殖反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及び（ｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を包含する核酸配列の存在の検出方法に関する。
【００１９】
本発明の別の特徴は（ａ）核酸増幅反応を実施すること、ここで反応は末端リン酸標識ヌクレオチドを含むものであり、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて核酸の量に実質的に比例した量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を測定すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することにより核酸の量を測定すること、の工程を包含する核酸配列を定量する方法に関する。
【００２０】
更にまた、本発明は、（ａ）マンガン塩及びポリリン酸鎖内にリン酸基４つ以上を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増殖反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及び（ｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を包含する核酸配列の存在を検出する方法に関する。
【００２１】
本発明の更に別の特徴は（ａ）マンガン塩の存在下に核酸増幅反応を実施すること、ここで反応は末端リン酸標識ヌクレオチドを含むものであり、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて核酸の量に実質的に比例した量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を測定すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することにより核酸の量を測定すること、の工程を包含する核酸を定量する方法に関する。
【００２２】
本発明は更に、（ａ）マンガン塩及び末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡポリメラーゼ反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させてＤＮＡ配列の量に実質的に比例した量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を測定すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することによりＤＮＡの量を測定すること、の工程を包含するＤＮＡ配列を定量する方法に関する。
【００２３】
本発明は更に、（ａ）マンガン塩及び末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、その反応はＤＮＡ配列の量に実質的に比例した量の標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸を測定すること、及び（ｃ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することによりＤＮＡの量を測定すること、の工程を包含するＤＮＡ配列を定量する方法に関する。
【００２４】
本発明の別の特徴は核酸配列中の単一のヌクレオチドの同一性を決定するための方法に関し、これは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、対立遺伝子特異的プライマーの存在下に核酸増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、及び（ｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定すること、の工程を包含する。
【００２５】
本発明の別の特徴は核酸配列中の単一のヌクレオチドの同一性を決定するための方法に関し、これは、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、対立遺伝子特異的プライマー及びマンガン塩の存在下に核酸増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種の存在を検出すること、及び（ｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定すること、の工程を包含する。
【００２６】
更に提供されるものは、核酸配列中の単一のヌクレオチドの同一性を決定するための方法に関し、これは、（ａ）ポリリン酸鎖内にリン酸基４つ以上を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、（ｃ）該検出可能な物質種の存在を検出すること、及び（ｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定すること、の工程を包含する。
【００２７】
更に提供されるものは、核酸配列中の単一のヌクレオチドの同一性を決定するための方法に関し、これは、（ａ）マンガン塩及びポリリン酸鎖内にリン酸基４つ以上を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下に核酸増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、（ｃ）該検出可能な物質種の存在を検出すること、及び（ｄ）取り込まれたヌクレオシドを同定すること、の工程を包含する。
【００２８】
本発明は更に、酵素試験におけるバックグラウンドシグナル発生を低減するために、金属塩、例えばマンガン、マグネシウム、亜鉛、カルシウム又はコバルトの塩の存在下の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸と組合せて、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸安定化剤、例えばポリオール（グリセロール、スレイトール等）、ポリエーテル、例えば環状ポリエーテル、ポリエチレングリコール、有機又は無機の塩、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、有機スルホネート等の存在下に核酸配列を増幅する方法を提供する。
【００２９】
本発明は更に、核酸検出キットを包含し、ここでそのキットは下記成分：
（ａ）下記式：
【００３０】
【化１】
2006513705.tif 000002
【００３１】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルホスホネート又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基、ハロアルキル基又はアミノ基を含む標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であり、そしてＰとＬとの間のリンカーを含んでよい］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、及び、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、
を包含する。
【００３２】
本発明は更に、核酸定量キットを包含し、ここでそのキットは下記成分：
（ａ）下記式：
【００３３】
【化２】
2006513705.tif 000003
【００３４】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルフォスフォネート又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基、ハロアルキル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であり、そしてＰとＬとの間のリンカーを含んでよい］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、及び
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ。
【００３５】
本発明はさらに核酸検出又は定量キットを包含し、ここでそのキットは下記成分
（ａ）下記式：
【００３６】
【化３】
2006513705.tif 000004
【００３７】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であり、これは好ましくはリン酸が除去された場合に独立して検出可能となる］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、
（ｃ）ホスファターゼ、
（ｄ）安定化剤、及び、
（ｅ）マンガン塩を含有する反応緩衝物質、
を包含する。
【００３８】
本発明は更に、核酸検出又は定量キットを包含し、ここでそのキットは下記成分：
（ａ）下記式：
【００３９】
【化４】
2006513705.tif 000005
【００４０】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であリ、これは好ましくはリン酸が除去された場合に独立して検出可能となる］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、及び、
（ｃ）ホスファターゼ、
を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
図１は異なるポリメラーゼによる末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いた標的配列のＰＣＲ増幅を示すゲルである。
【００４２】
図２は異なる標識又は塩基による末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いたｐＵＣｐ５３ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【００４３】
図３は異なる標識又は塩基による末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いたｐＵＣ１８ＤＮＡのＰＣＲ増幅を示す。
【００４４】
図４は硫酸アンモニウムによるｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯの安定化を示す。
【００４５】
図５は種々の有機及び無機の塩によるｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯの安定化を示す。
【００４６】
図６は安定化剤存在下の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸によるＰＣＲ増幅を示す。
【００４７】
図７はＡＢＩ７９００装置上における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸による定量的ＰＣＲ増幅を示す。
【００４８】
図８は末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いた定量的ＰＣＲの間に生成したＰＣＲ産物を示す。
【００４９】
図９は末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いた染色体ＤＮＡの線状増幅を示す。
【００５０】
図１０は増殖の初期段階に生成した産物の量がインプットＤＮＡの量に直接比例していることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
「ヌクレオシド」という用語は本明細書においては、プリン、デアザプリン、ピリミジン又は糖又は糖誘導体に連結された修飾された塩基を包含する化合物である。
【００５２】
「ヌクレオチド」という用語は本明細書においては、ヌクレオシドのリン酸エステルを指し、ここでエステル化部位は典型的にはペントース糖のＣ−５部位に連結したヒドロキシル基に相当する。
【００５３】
「オリゴヌクレオチド」という用語はデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド等を含むヌクレオチド又はその誘導体の線状オリゴマーを包含する。明細書全体を通じて、オリゴヌクレオチドを文字の列により示す場合は、常時、ヌクレオチドは左から右に５′→３′の順序にあり、ここで、特段の記載が無い限り、Ａはデオキシアデノシンを示し、Ｃはデオキシシチジンを示し、Ｇはデオキシグアノシンを示し、そして、Ｔはチミジンを示す。
【００５４】
「プライマー」という用語は独特の核酸配列に特異的な態様においてアニーリングし、その独特の配列の増幅を可能にする線状オリゴヌクレオチドを指す。
【００５５】
「標的核酸配列」及び類似の表現は、その配列同一性又はヌクレオシドの順序又は位置が本発明の方法の１つ以上により決定される核酸を指す。
【００５６】
本発明は核酸ポリメラーゼ活性を介してＲＮＡ又はＤＮＡの合成をモニタリングするために試験を使用する、試料中のポリヌクレオチドの検出方法に関する。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは成長中のオリゴヌクレオチド鎖の３′ヒドロキシルへのヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）からのヌクレオシドモノリン酸の転移を介してオリゴヌクレオチドを合成する。この反応を駆動する力は無水物結合の切断と無機ピロリン酸の同時形成である。本発明はヌクレオチドの末端リン酸の構造的修飾がポリメラーゼ反応において機能するその能力を低減させないという知見を利用している。オリゴヌクレオチド合成反応はヌクレオチドのα−及びβ−ホスホリル基のみにおける直接の変化を包含し、これにより末端リン酸位置における修飾を有するヌクレオチドが核酸ポリメラーゼ反応のための基質として価値あるものとなっている。
【００５７】
特定の実施形態においては、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩ又はＤＮＡポリメラーゼα、β、γ、又は末端デオキシンウクレオチジルトランスフェラーゼ又はテロメラーゼである。別の実施形態においては、適当なポリメラーゼは、例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、プライマーゼ、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）である。
【００５８】
本発明により提供される方法はヌクレオシドポリリン酸、例えばヌクレオシドポリリン酸、デオキシヌクレオシドポリリン酸を利用しており、これは末端リン酸に連結した電子化学標識、質量タブ又は比色染料、ケミルミネセント又は蛍光の標識を有する。核酸ポリメラーゼがこの類縁体を基質として使用する場合は、標識はホスホリル転移の無機ポリリン酸副生成物上に存在することになる。この標識は直接読み取るか、又は、好ましい場合においては、標識は酵素活性化可能であり、そして、リン酸の除去後に読み取ることができる。後者の場合においては、ホスファターゼを介したホスホリル転移のポリリン酸産物の切断によりそこに結合した標識における検出可能な変化がもたらされる。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは修飾された末端ホスホリル基を有するヌクレオチドを認識することはできるが、本発明者等はこの原料がホスファターゼに関する鋳型ではないことを明らかにしている。以下に示すスキームは本発明の方法における幾つかの該当する分子、即ち末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副生成物及び酵素活性化標識を示している。
【００５９】
【化５】
2006513705.tif 000006
【００６０】
上記したスキームにおいて、ｎは１以上、Ｒ１はＯＨ、そしてＲ２はＨ又はＯＨであり、Ｂはヌクレオシド塩基又は修飾複素環塩基であり、ＸはＯ、Ｓ、ＣＨ２又はＮＨ、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ３であり、そして、Ｌは発色原、蛍光発生、ケミルミネセント分子、質量タグ又は電子化学タグであってよいホスファターゼ活性化可能な標識である。質量タグは質量の相違により他の成分から容易に識別できる質量スペクトル分析に適する小分子量の部分である。電子化学タグは容易に酸化又は還元可能な物質種である。ｎが１である場合に比べて、ｎが２以上である場合、このヌクレオチドはポリメラーゼの基質として極めて良好であることが見いだされている。従って、好ましい実施形態においては、ｎは２、３又は４であり、Ｘ及びＹはＯであり、Ｂはヌクレオシド塩基であり、そして、Ｌは発色原、蛍光発生又はケミルミネセントの分子であってよい標識である。
【００６１】
本明細書に記載する核酸配列の存在を検出する方法の１つの実施形態においては、工程は、（ａ）核酸増幅反応を実施すること、ここで反応は末端リン酸標識ヌクレオチドに加えてホスファターゼに対して実質的に非反応性の１種以上のヌクレオチドを含み、ここでポリメラーゼ反応は標識ポリリン酸を形成するものであること、（ｂ）標識ポリリン酸をリン酸エステルの加水分解に適するホスファターゼと反応させ、そして検出可能な物質種を生成させること、及びｃ）適当な手段により検出可能な物質種の存在を検出すること、を包含する。この実施形態において、核酸ポリメラーゼ反応のために使用する鋳型はヘテロポリマー又はホモポリマーの鋳型であって良い。末端リン酸標識ヌクレオチドとは、明細書全体を通じて、成長中のヌクレオチド鎖内へのヌクレオシドモノリン酸の取り込みの後に同時に放出された標識されたポリリン酸を直接読み取ってよいか、又は、酵素活性化標識の場合は、ホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成してよいことを意味する。ホスファターゼに対して実質的に非反応性である反応に包含される他のヌクレオチドは、例えば、標識されたヌクレオチドから生成した検出可能な物質種の検出のために使用される方法により検出可能な物質種の生成をもたらさない部分により末端リン酸においてブロックしてよい。この特定の実施形態における検出のための核酸は、ＲＮＡ、天然又は合成のオリゴヌクレオチド、ミトコンドリア又は染色体ＤＮＡを包含してよい。
【００６２】
本明細書に記載する核酸配列の存在を検出する方法の１つの実施形態においては、工程は、（ａ）Ｍｎ塩の存在下に核酸増幅反応を実施すること、ここで反応は末端リン酸標識ヌクレオチドに加えてホスファターゼに対して実質的に非反応性の１種以上のヌクレオチドを含み、ここでポリメラーゼ反応は標識ポリリン酸を形成するものであること、（ｂ）標識ポリリン酸をリン酸エステルの加水分解に適するホスファターゼと反応させ、そして検出可能な物質種を生成させること、及びｃ）適当な手段により検出可能な物質種の存在を検出すること、を包含する。
【００６３】
本発明は更に（ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、ここでその反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及び（ｃ）該検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を含むＤＮＡ配列の存在を検出する方法を提供する。検出のためのＤＮＡ配列は細胞から単離されたＤＮＡ，化学的に処理されたＤＮＡ，例えば重亜硫酸処理メチル化ＤＮＡ又は当該分野で知られた方法に従って化学的又は酵素的に合成されたＤＮＡを包含する。このような方法はＰＣＲ、及び、参照により本明細書に組み込まれるＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（Ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載されているものを包含する。ＤＮＡ配列は更に染色体ＤＮＡ及び天然及び合成のオリゴヌクレオチドを含有してよい。ＤＮＡはまた２本鎖又は１本鎖のいずれかであってよい。
【００６４】
本発明は更に（ａ）Ｍｎ塩及び末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、ここでその反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて検出可能な物質種を生成すること、及び（ｃ）該検出可能な物質種の存在を検出すること、の工程を含むＤＮＡ配列の存在を検出する方法を提供する。
【００６５】
本発明の方法は更にポリメラーゼ反応において１つ以上の別の検出試薬を含む工程を包含してよい。別の検出試薬は検出可能な物質種とは検出可能に異なる応答が可能であってよい。例えば別の検出試薬は抗体であってよい。
【００６６】
ポリメラーゼ反応における基質として添加するための適当なヌクレオチドはヌクレオシドポリリン酸、例えばデオキシリボヌクレオシドポリリン酸、リボヌクレオシドポリリン酸及びこれ等の類縁体を包含する。特に望ましいものは、ポリリン酸鎖内に３、４又は５リン酸基を含むヌクレオチドであり、ここで末端リン酸は標識されている。
【００６７】
ホスホリル転移の標識ポリリン酸副生成物はホスファターゼ処理を用いることなく検出しても良いことは本発明で意図されている範囲内である。例えば、天然又は修飾されたヌクレオシド塩基、特にグアニンは、蛍光マーカーのクエンチングを誘発できる。従って、末端リン酸標識ヌクレオチドにおいては、標識は塩基により部分的にクエンチングされる。ヌクレオシドモノリン酸の取り込みにより、ポリリン酸副生成物の標識はその増強された蛍光により検出してよい。或は、蛍光、比色、ケミルミネセンス又は電子化学的検出による同定よりも前に、クロマトグラフィー又は他の分離方法により標識ポリリン酸生成物を物理的に分離することも可能である。更にまた、質量スペクトルは質量の相違により生成物を検出するために使用される。
【００６８】
本発明の方法は１種以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの存在下にポリメラーゼ反応を実施することを包含する。適当な核酸ポリメラーゼはまたプライマーゼ、テロメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及び逆転写酵素を包含する。核酸鋳型はまたポリメラーゼ反応が起こるために必要であり、ポリメラーゼ反応溶液に添加してよい。本発明の検出方法における工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全ては単一の均質な反応混合物を用いて同時に行うか、逐次的に行なわれる。
【００６９】
本発明において有用な増幅方法は例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）又は核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）を包含する。例えば、標的分子が核酸ポリマー、例えばＤＮＡである場合は、これはＤＮＡ分子へのガンマ−リン酸標識ヌクレオチド塩基、例えばアデニン、チミン、シトシン、グアニン又は他の窒素複素環塩基のＰＣＲ取り込みにより検出してよい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法はＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２３９，ｐ．４８７，１９８８，Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許４，６８３，１９５及びＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ（１９８０），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９９），Ｗｕ，Ｒ．（Ｅｄ．），Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ＩＩ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｚｕｍｕｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，（１９９５）に記載されている。ＰＣＲを使用しながら、検出の標的分子、例えばＤＮＡを、ＰＣＲ試薬及び適切なプライマーの入った反応容器に直接添加することにより、これを増幅する。典型的には、プライマーは標的核酸の少なくとも一部分に対し配列が相補であるものを選択する。
【００７０】
本発明の工程（ａ）を実施するために適する核酸増幅反応は更に核酸配列の増幅の種々のＲＣＡ法を包含してよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬｉｚａｒｄｉ  Ｐａｕｌ  Ｍへの米国特許５，８５４，０３３号に開示されているものが有用である。ポリメラーゼ反応はまた核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）も包含し、ここではシステムはＤＮＡではなくＲＮＡの増幅を包含し、増幅は等温であり、１つの温度（４１℃）で起こる。ＮＡＳＢＡによる標的ＲＮＡの増幅は、試料標的ＲＮＡに対して指向されたオリゴヌクレオチドプライマーと共に３種の酵素、即ち逆転写酵素、ＲＮＡｓｅＨ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの強調活性が関わるものである。これ等の酵素は４工程、即ち、伸長、分解、ＤＮＡ合成及び環状ＲＮＡ増幅において、標的の１本鎖ＲＮＡの指数的増幅を触媒する。
【００７１】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ及びＮＡＳＢＡの方法は一般的には増幅産物の定量により初期量の標的核酸を間接的に測定することを必要とする。増幅産物は典型的にはまずアガロースゲル上の電気泳動により原料から分離して増幅が良好に行えたことを確認し、次に、核酸に関わる従来の検出系、例えば蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出のいずれかを用いて定量する。これとは対照的に、本発明の方法はポリメラーゼ反応の産物をこれ等の産物の検出が可能となるよりも前に原料から分離する必要性をなくしている。例えば、本発明においては、レポーター分子（蛍光、ケミルミネセント又は発色団）又は他の有用な分子を、リン酸結合によりマスキングされている特定の条件下においては検出不可能である態様で、ヌクレオチドに結合させる。しかしながら、成長中のオリゴヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの取り込み及び反応のホスファターゼ処理の後に、標識をこれ等の条件下で検出する。例えば１，３−ジクロロ−９，９−ジメチル−アクリジン−２−オン（ＤＤＡＯ）の３重環構造の側鎖上のヒドロキシル基がヌクレオチドの末端リン酸位に結合している場合は、ＤＤＡＯは６５９ｎｍでは蛍光を発さない。ヌクレオシドモノリン酸がＤＮＡに取り込まれた後には、他の生成物、即ちＤＤＡＯポリリン酸（６５９ｎｍではやはり蛍光を発さない）がホスファターゼの基質である。脱ホスホリル化してＤＤＡＯを形成した後には、染料部分は６５９ｎｍで蛍光を発するようになり、従って検出可能となる。ポリリン酸産物の特異的な分析はポリメラーゼ反応溶液中で実施することができ、原料からの反応産物の分離を省略できる。このスキームによりポリメラーゼ反応の間に形成された核酸の検出、そして場合により定量が、スペクトル分析のような日常的装置を用いて可能となる。
【００７２】
上記した方法において、増幅反応工程は更に、検出可能な標識に標識ポリリン酸副生成物を変換するホスファターゼの存在下にポリメラーゼ反応を実施することを包含する。このため、検出可能な物質種の形成の連続的モニタリングを可能にする核酸配列の存在を検出するための好都合な試験法が確立される。これは単一の試験管内で実施できる均質な試験フォーマットを示す。
【００７３】
上記した試験方法の１つのフォーマットは、例えば検出可能な物質種を生成することができる末端リン酸標識ヌクレオチドの単一の型の存在下に増幅反応を実施することを包含する。例えば１つについて染料標識ＡＴＰを使用し、残りの３つは染料ではない部分を保有し、該部分はホスファターゼに対して非反応性のヌクレオチドを構成する。本実施例において、該部分は該染料を検出するために使用される条件下では検出可能ではない。
【００７４】
別の試験フォーマットにおいては、増幅反応は各々の方が独特に検出されえる物質種を生成するような末端リン酸標識ヌクレオチドの１つ以上の型の存在下において実施してよい。例えば、試験はまず、ホスホリル転移の無機ポリリン酸副生成物から酵素的に遊離された場合に第１の波長で光を発する第１の標識と会合している第１のヌクレオチド（例えばアデノシンポリリン酸）及び第２の波長において光を発する第２の標識と会合している第２のヌクレオチド（例えばグアノシンポリリン酸）を包含してよい。望ましくは、第１及び第２の波長の発光の重複は、殆ど無いか皆無とする。その後、ヌクレオチド配列情報に基づいた複数の同時試験を、ポリリン酸から放出された特定の標識に基づいて誘導することができる。
【００７５】
上記した核酸配列の存在を検出する方法の１つの特徴において、末端リン酸標識ヌクレオチドは下記構造：
【００７６】
【化６】
2006513705.tif 000007
【００７７】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であリ、これは好ましくはリン酸が除去された場合に独立して検出可能となる］により表してよい。
【００７８】
別の特徴において、Ｌはアルキルホスホネートを形成するために適するハロアルキル基を含んでよい。この特徴において、標識リン酸又は標識ポリリン酸は検出可能な物質種である。
【００７９】
特定の実施形態においては、式Ｉの糖部分はリボシル、２′−デオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル及び他の修飾された糖から選択してよいが、ただし、その修飾は更に核酸鎖が伸長することを妨げない。例えば糖部分の３′位は、導入されるヌクレオシドモノリン酸がこの位置に結合できるように、ヒドロキシル基を有さなければならない。
【００８０】
更にまた、式Ｉにおいて、塩基は、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はその類縁体を包含する。
【００８１】
末端リン酸標識ヌクレオチドの末端リン酸位置において結合している標識は、１，２−ジオキセタンケミルミネセント化合物、蛍光発生染料、発色原染料、質量タグ及び電子化学タグからなる群から選択される。これにより、発色、蛍光発生、ケミルミネセンス、質量タグ、電子化学検出又はその組合せの何れかの存在により検出可能な物質種が検出可能となる。
【００８２】
更に、ドナー染料とアクセプター染料をコンジュゲートすることにより作成したエネルギー転移染料もまた本発明において有用である。
【００８３】
末端リン酸基に直接、又は、リンカーを介して結合してよい標識の例を以下の表１〜２に示す。末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の一部の例を表３に示す。
【００８４】
【表１】
2006513705.tif 000008
【００８５】
【表２】
2006513705.tif 000009
【００８６】
【表３】
2006513705.tif 000010
【００８７】
【表４】
2006513705.tif 000011
【００８８】
【表５】
2006513705.tif 000012
【００８９】
【表６】
2006513705.tif 000013
【００９０】
【表７】
2006513705.tif 000014
【００９１】
【表８】
2006513705.tif 000015
【００９２】
【表９】
2006513705.tif 000016
【００９３】
式Ｉにおけるホスホリル化標識が蛍光発生部分である場合は、これは以下のもの（全てホスホモノエステルとして示す）、即ち：商品名ＥＬＦ９７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）で販売されている２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセインジホスフェート（４アンモニウム塩）、フルオレセイン３′（６′）−Ｏ−アルキル−６′（３′）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸（ジアンモニウム塩）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（遊離の酸）、レソルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びその誘導体から選択される。これ等の染料の構造は以下に示す通りである。
２−（５′−クロロ−２′−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４（３Ｈ）−キナゾリノン
【００９４】
【化７】
2006513705.tif 000017
【００９５】
【化８】
2006513705.tif 000018
【００９６】
【化９】
2006513705.tif 000019
【００９７】
上記式Ｉのホスホリル化標識部分が発色原部分である場合は、それは以下のもの、即ち：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドキシルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びその誘導体から選択される。これ等の発色原染料の構造を以下にホスホモノエステルとして示す。
【００９８】
【化１０】
2006513705.tif 000020
【００９９】
末端リン酸位置における部分は更にケミルミネセント化合物であってよく、この場合、ホスファターゼ活性化１，２−ジオキセタン化合物であることが望ましい。１，２−ジオキセタン化合物は例えば、商品名ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で販売されている２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−（５−クロロ）トリシクロ［３，３，１−１３，７］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、商品名ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）で販売されているクロロアダマンタ−２′−イリデンメトキシフェノキシホスホリル化ジオキセタン、及び、商品名ＡＭＰＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ）で販売されている３−（２′−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３″−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンを包含する。これ等の市販のジオキセタン化合物の構造は米国特許５，５８２，９８０、５，１１２，９６０及び４，９７８，６１４にそれぞれ開示されており、これ等は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
上記した方法は更に核酸配列を定量する工程を包含してよい。関連する特徴において、検出可能な物質種は増幅された核酸配列の量に実質的に比例する量で生成される。核酸配列を定量する工程は望ましくは既知のスペクトルを有する検出可能な物質種により発生するスペクトルの比較により行われる。
【０１０１】
本発明は更に、酵素試験におけるバックグラウンドシグナル発生を低減するために、金属塩、例えばマンガン、マグネシウム、亜鉛、カルシウム又はコバルトの塩の存在下の末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸と組合せて、末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸安定化剤、例えばポリオール（グリセロール、スレイトール等）、ポリエーテル、例えば環状ポリエーテル、ポリエチレングリコール、有機又は無機の塩、例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、有機スルホネート等の存在下に核酸配列を増幅する方法を提供する。マンガンの存在下の核酸重合反応の間、従来技術においては弱いキレート化剤のような添加剤が使用されている。しかしながらその目的はマンガンにより生じるヌクレオチドの誤取り込みの比率を低減することであった。図６に示す通り、添加剤の非存在下であっても、ポリメラーゼによる末端リン酸標識ヌクレオチドの誤取り込みは起こっていない。従って、本発明において添加剤を添加する目的は、単に、バックグラウンドを低下させるために金属塩により誘発される末端リン酸標識ヌクレオチドの非酵素的加水分解を低減することである。
【０１０２】
１つの実施形態においては、本発明は（ａ）核酸増幅反応を実施すること、その増幅反応は末端リン酸標識ヌクレオチドの反応を包含し、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすこと、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて定量すべき核酸の量に実質的に比例する量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を検出すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することにより核酸の量を測定すること、の工程を含む核酸を定量する方法を提供する。核酸の定量方法のこの実施形態においては、定量すべき核酸はＲＮＡであってよい。核酸は更に天然又は合成のオリゴヌクレオチド、染色体ＤＮＡ又はＤＮＡであってよい。
【０１０３】
別の実施形態においては、本発明は（ａ）マンガン塩の存在下に核酸増幅反応を実施すること、その増幅反応は末端リン酸標識ヌクレオチドの反応を包含し、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすこと、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて定量すべき核酸の量に実質的に比例する量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を検出すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することにより核酸の量を測定すること、の工程を含む核酸を定量する方法を提供する。
【０１０４】
本発明は更に（ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて定量すべきＤＮＡ配列の量に実質的に比例した量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を測定すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することによりＤＮＡの量を測定すること、の工程を含むＤＮＡ配列を定量する方法を提供する。本実施形態においては、定量のためのＤＮＡ配列は天然又は合成のオリゴヌクレオチド、又は、染色体ＤＮＡを包含する細胞から単離されたＤＮＡを包含する。
【０１０５】
本発明は更に（ａ）マンガン塩及び末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下にＤＮＡ増幅反応を実施すること、その反応は標識されたポリリン酸の生成をもたらすものであること、（ｂ）標識されたポリリン酸をホスファターゼと反応させて定量すべきＤＮＡ配列の量に実質的に比例した量の検出可能な副生成物物質種を生成すること、（ｃ）検出可能な物質種を測定すること、及び（ｄ）既知の標準物質を用いて測定値を比較することによりＤＮＡの量を測定すること、の工程を含むＤＮＡ配列を定量する方法を提供する。
【０１０６】
上記した核酸配列を定量するこれ等の方法の各々において、ポリメラーゼ反応工程は更にホスファターゼの存在下にポリメラーゼ反応を実施することを包含する。明細書において上述した通り、これは核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリング、即ち、定量のための標的核酸配列のリアルタイムの検出を可能とする。
【０１０７】
本明細書に記載した核酸配列を定量する方法のために有用な末端リン酸標識ヌクレオチドは以下に示す式Ｉで表される。酵素活性化標識は検出可能な物質種が精製するような態様に標識と天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸との間のリン酸エステル連結部を変化させるホスファターゼの酵素活性を介して検出可能となる。検出可能な物質種は比色、蛍光発生、ケミルミネセンス、質量の相違又は電子化学的ポテンシャルの何れか１つ又は組合せの存在により検出される。既に記載した通り、酵素活性化標識は１，２−ジオキセタンケミルミネセント化合物、蛍光染料、発色原染料、質量タグ又は電子化学タグ又はこれ等の組合せであってよい。適当な標識は上記したものと同様である。
【０１０８】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１０９】
【化１１】
2006513705.tif 000021
【０１１０】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルホスホネート又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基、ハロアルキル基又はアミノ基を含む標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であり、そしてＰとＬとの間のリンカーを含んでよい］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、及び、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、
を包含する核酸検出キットに関する。
【０１１１】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１１２】
【化１２】
2006513705.tif 000022
【０１１３】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルホスホネート又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基、ハロアルキル基又はアミノ基を含む標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であり、そしてＰとＬとの間のリンカーを含んでよい］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、及び、
（ｃ）マンガン塩を含有する反応緩衝液、
を含む核酸検出キットに関する。
【０１１４】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１１５】
【化１３】
2006513705.tif 000023
【０１１６】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル、アルキルホスホネート又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基、ハロアルキル基又はアミノ基を含む標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であり、そしてＰとＬとの間のリンカーを含んでよい］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、
（ｃ）マンガン塩を含有する反応緩衝液、及び、
（ｄ）安定化剤、
を含む核酸検出キットに関する。
【０１１７】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１１８】
【化１４】
2006513705.tif 000024
【０１１９】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であリ、そしてＰとＬとの間のリンカーを含んでよい］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、及び、
（ｂ）１種以上の核酸ポリメラーゼ、
（ｃ）ホスファターゼ、
を含む核酸検出キットに関する。
【０１２０】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１２１】
【化１５】
2006513705.tif 000025
【０１２２】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であリ、これは好ましくはリン酸が除去された場合に独立して検出可能となる］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）熱安定性１種以上の核酸ポリメラーゼ、
（ｃ）ホスファターゼ、及び、
（ｄ）マンガン塩を含有する反応緩衝液、
を含む核酸検出キットに関する。
【０１２３】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１２４】
【化１６】
2006513705.tif 000026
【０１２５】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であリ、これは好ましくはリン酸が除去された場合に独立して検出可能となる］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）熱安定性１種以上の核酸ポリメラーゼ、
（ｃ）ホスファターゼ、
（ｄ）マンガン塩を含有する反応緩衝液、及び、
（ｅ）安定化剤、
を含む核酸検出キットに関する。
【０１２６】
本発明の別の特徴は下記成分：
（ａ）下記式：
【０１２７】
【化１７】
2006513705.tif 000027
【０１２８】
［式中、Ｐはリン酸（ＰＯ３）及びその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又はイオウ原子であり、Ｂは窒素含有複素環塩基であり、Ｓは糖部分であり、Ｌは天然又は修飾されたヌクレオチドの末端リン酸においてリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート連結部を形成するために適するヒドロキシル基、スルフィドリル基又はアミノ基を含む酵素活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌはホスホリル化標識であリ、これは好ましくはリン酸が除去された場合に独立して検出可能となる］の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド、
（ｂ）熱安定性１種以上の核酸ポリメラーゼ、及び、
（ｃ）ホスファターゼ、
を含む核酸検出キットに関する。
【０１２９】
キットに含まれる末端リン酸標識ヌクレオチドにおける糖部分は例えばリボシル、２′−デオキシリボシル、２′−アルコキシリボシル、２′−アミノリボシル、２′−フルオロリボシル及び他の修飾された糖を包含する。
【０１３０】
塩基は例えばウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン及び２，６−デアミノプリン及びその類縁体を包含する。
【０１３１】
更にまた、上記した通り、酵素活性化標識は１，２−ジオキセタンケミルミネセント化合物、蛍光染料、発色原染料、質量タグ、電子化学タグ又はこれ等の組合せであってよい。ヌクレオチドの末端リン酸位置におけるコンジュゲーションのための適当な化合物は上記したものと同様である。
【０１３２】
以下の実施例は特定の好ましい実施形態を説明するものであって、全ての実施形態を説明するものではない。
【実施例１】
【０１３３】
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシチミジン−５′−四リン酸（ｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及び関連化合物の製造
ＴＴＰのＴＥＡ塩１０μモルを蒸発乾固させた。残留物に対し、トリブチルアミン４０μモル及び乾燥ピリジン５ｍｌを添加した。溶液を再度蒸発乾固させた。乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３ｍｌと共に２回共蒸発させた後、残留物を乾燥ＤＭＦ２００μｌに再溶解し、アルゴンでフラッシュし、蓋をした。シリンジを用いて、乾燥ＤＭＦ１００μｌ中に溶解したカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）５０μモル（８ｍｇ）を添加した。フラスコを周囲温度で４時間攪拌した。
【０１３４】
上記反応が進行している間、ＤＤＡＯリン酸３５ｍｇ（８３μミリモル）及びトリブチルアジン１６６μミリモルを乾燥ＤＭＦ中に溶解した。ＤＤＡＯリン酸を蒸発乾固させ、その後乾燥ＤＭＦと共に３回共蒸発させた。残留物を乾燥ＤＭＦ３００μｌに溶解した。
【０１３５】
４時間の反応時間の後、無水メタノール３．２μｌをＴＴＰ−ＣＤＩ反応物に添加した。反応物を３０分間攪拌した。この混合物に対し、ＤＤＡＯリン酸溶液を添加し、混合物を１８時間周囲温度で攪拌した。逆相ＨＰＬＣ（Ｘｔｅｒｒａ４．６ｘ１００カラム、０．１ＭＴＥＡＡ／アセトニトリル）で反応を確認した。蒸発により反応物の容量を２００μｌまで減少させ、反応を８０時間進行させた。
【０１３６】
８０時間後、０．１ＭＴＥＡＢ１５ｍｌを添加して反応を停止した。希釈した混合物を１９ｘ１００ＸｔｅｒｒａＲＰカラムに適用し、０．１ＭＴＥＡＢ中のアセトニトリルの勾配で溶離した。純粋なＤＤＡＯＴ４Ｐを含有する画分を蒸発乾固し、エタノールと２回共蒸発させた。残留物をＭｉｌｌｉＱ水で希釈再調製した。収率：１．１０μモル、１１％、４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度＞９８％、ＭＳ：Ｍ−１＝８５０．０７（計算値：８４９．９５）。
【０１３７】
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシグアニシン−５′−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及びδ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシシチジン−５′−四リン酸（ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及びδ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシアデノシン−５′−四リン酸（ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）はＤＤＡＯリン酸３．５等量を８．３等量の代わりに使用した以外は上記した通り製造した。Ｃ１８精製の後、試料をＭｏｎｏＱ１０／１０カラムを用いたイオン交換により精製した。
【０１３８】
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシグアノシン−５′−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収率０．５７μモル、５．７％、４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度９９％、ＭＳ：Ｍ−１＝８７５．０３（計算値：８７４．９６）。
【０１３９】
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシシチジン−５′−四リン酸（ｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収率０．２４μモル、２．４％、４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度９９％、ＭＳ：Ｍ−１＝８３５．０３（計算値：８３４．９５）。
【０１４０】
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−デオキシアデノシン−５′−四リン酸（ｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）：収率０．３８μモル、３．８％、４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度９９％、ＭＳ：Ｍ−１＝８５９．０７（計算値：８５８．９７）。
【０１４１】
【化１８】
2006513705.tif 000028
【実施例２】
【０１４２】
末端リン酸標識ヌクレオチドポリリン酸を用いた標的配列のＰＣＲ増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物（２０μｌ）を２０ｍＭトリス塩酸′ｐＨ８．７５）、１０ｍＭＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭＭｇＳＯ４、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン及び０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００の組成とした。ヌクレオチドの終濃度は各々２０μＭとし、各反応にはＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を使用した。初期鋳型ＤＮＡ（１〜５ｎｇ）はｐＵＣ１８又はｐＵＣｐ５３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の何れかとした。プライマーの配列及びｐＵＣｐ５３の増幅されたセグメントの配列を表４に示す。プライマーの初期量は各々２ｐｍｏｌとし、そして記載したＤＮＡポリメラーゼ２．５単位を使用した。反応は９０℃３０秒、５５℃６０秒、そして７２℃３００秒を１５サーマルサイクル行った。大部分のＰＣＲ反応は終濃度０．０８〜０．２ｍＭでＭｎＣｌ２も含有させた。反応産物は１．６％アガロースゲルにロードした。ゲルをＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて製造元の説明書に従って染色し、そして、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて５３２ｎｍで走査した。ゲルサイズマーカーは１００ｂｐラダー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とした。
【０１４３】
これ等の実験に使用したＤＮＡポリメラーゼはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｂａ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｉｉ由来、米国特許５６０２０１１、Ｄ１４１Ａ及びＥ１４３Ａアミノ酸置換を有するもの、米国特許５８８２９０４）、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を含むものであった。
【０１４４】
【表１０】
2006513705.tif 000029
【０１４５】
図１は数種のＤＮＡポリメラーゼ及び正常ヌクレオチド（レーン１０〜１２）又はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び□−ＤＤＤＡＯｄＴ四リン酸（ＤＤＡＯ−ｄＴ４Ｐ）の混合物の何れかを用いたＰＣＲの結果を示す。この実験については、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（レーン１〜３、１２）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（レーン７〜９、１１）又はＴｂａｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（レーン４〜６、１０）を使用した。ＭｎＣｌ２濃度はレーン１、４、７及び１０〜１２において分解された反応については０ｍＭ、レーン２、５及び８は０．２ｍＭ、レーン３、６及び９では０．４ｍＭであった。全ての試料につき鋳型ＤＮＡはｐＵＣｐ５３とし、プライマーはＰ５３ＳＮＰ２２Ｃ−５１Ｆ及びＰ５３ＳＮＰ２２Ｇ１３１Ｒとした。図に示す通り、ＰＣＲ産物の大部分の量は正常ヌクレオチドを用い３種全てのポリメラーゼにより作成されたが、ＤＤＡＯ−ｄＴ４ＰがｄＴＴＰを置き換えた場合にはＴｂａｅｘｏ−ポリメラーゼによる場合のみであり、そのＰＣＲ収率は０．２〜０．４ｍＭＭｎＣｌ２の存在下では５倍以上増大している。同様の実験（示さず）において、生成物の収率は僅か０．０４ｍＭＭｎＣｌ２そして１．０ｍＭＭｎＣｌ２もの存在下においても増大した。正常ｄＮＴＰを使用する場合はＭｎＣｌ２は必要ではなく、そして実際、ＭｎＣｌ２はこれ等のＰＣＲ増幅の収率を低下させる（データ示さず）という点は興味深い。更にまた、ＰＣＲ産物はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ及びＫＯＤＸＬＤＮＡポリメラーゼによっても、同じ条件下で作成される。同じく興味深い点として、一部のポリメラーゼが増幅産物の生成ができないことは、Ｔｂａｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ及び他のポリメラーゼによる良好な増幅はリン酸修飾ヌクレオチドの単純な分解により達成されたわけではないことを示唆している。
【実施例３】
【０１４６】
蛍光によるＰＣＲ産物の検出
エビアルカリホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．１単位を図１のレーン２及び５に示した反応の産物に添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。次にＦａｒＣＹｔｅ蛍光プレートリーダー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて励起６５０ｎｍ及び発光６７０ｎｍで蛍光を測定した。Ｔａｑポリメラーゼ（検出可能なＰＣＲ産物の生成は僅かであるか皆無である）の反応産物は５５００蛍光単位の読取値を示した。Ｔｂａｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼの反応産物は３１，０００蛍光単位の読取値を示した。このことは、遊離ＤＤＡＯ蛍光を検出する単純な蛍光の読取値を用いて良好なＰＣＲ増幅を検出できることを示している。
【実施例４】
【０１４７】
別のヌクレオチド、鋳型及びプライマーによるＰＣＲ
図２は同じプライマーによる図１と同じ鋳型の増幅産物を示す。図３は２１フォワードプライマー及び２８リバースプライマー（表１）を用いたｐＵＣ１８ＤＮＡの増幅産物を示す。両方の図において、レーン１にロードした増幅反応は正常ｄＮＴＰを用いてＭｎＣｌ２の非存在下に実施した。２のマークのレーンではｄＴＴＰをｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯと置き換え、反応には０．２ｍＭＭｎＣｌ２を添加した。３のマークのレーンでは、ｄＧＴＰをｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯと置き換え、４のマークのレーンでは、ｄＧＴＰをｄＧ４Ｐ−Ｍｅクマリンと置き換え、ここでも０．２ｍＭＭｎＣｌ２を使用した。全ての増幅で良好に期待されたサイズの産物が生成し、増幅は修飾ヌクレオチドにおける塩基又は染料の部分とは無関係であることが示唆された。
【実施例５】
【０１４８】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の非酵素的加水分解に対する添加剤の作用
５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭＭｎＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１μｍｄｄＴ４Ｐ−ＥｔＦｌ、１００ｎＭプライマー／鋳型、０．００３６単位／μｌＳＡＰを含有する試料７０μｌを、５％グリセロールの存在下又は非存在下に、１０回反復して９５℃３０秒及び５０℃３分のサイクルに付した。形成した遊離の染料の量を蛍光計で確認した。グリセロールの非存在下においては、形成した染料の濃度は１５１ｎＭであったのに対し、グリセロールの存在下では僅か１９ｎＭであった（マンガン非存在下において観察された数値８ｎＭに近似）。明らかに高温においてはグリセロールはマンガンにより誘発される分解の量を低減する。
【実施例６】
【０１４９】
ＭｎＣｌ２の存在下における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の非酵素的加水分解に対する添加剤としての硫酸アンモニウムの作用
０．５ｍＭＭｎＣｌ２、１μｍｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ及び１０ｍＭ塩（図４参照）を含有する２０μｌの２５ｍＭトリス塩酸ｐＨ９．０を６０分間９５℃で加熱した。各反応混合物４μｌをＨｅｐｅｓ中ＢＡＰ溶液（０．００５単位ＢＡＰ／μｌ）１６μｌと混合し６０分間３７℃でインキュベートした。試料をＴｅｃａｎウルトラレトリーダー上で読み取った。非加熱試料及びＭｎＣｌ２未添加非加熱試料を対照として使用した。１００％分解試料としてのヘビ毒ホスホジエステラーゼ加水分解試料からの蛍光計数値を用いて蛍光計数値生データを％分解に変換した。図４は明らかに、硫酸アンモニウムの添加はｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯを顕著に安定化することを示している。一部の安定化作用はまた、スルフェートイオン（ＭｇＳＯ４）及びアンモニウムイオン（ＮＨ４Ｃｌ）の存在下にも観察された。
【実施例７】
【０１５０】
ＭｎＣｌ２の存在下における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸の非酵素的加水分解に対する添加剤としての他の塩の作用
０．５ｍＭＭｎＣｌ２、１μｍｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ及び１０又は２５ｍＭの無機又は有機の塩（図５参照）を含有する２０μｌの２５ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ８．１を６０分間９５℃で加熱した。各反応混合物４μｌを上記した通りＢＡＰで処理し、そしてＴｅｃａｎウルトラレトリーダーで読み取った。ＭｎＣｌ２添加の非加熱試料（水レーン）及びＨｅｐｅｓとＭｎＣｌ２未添加の加熱試料を対照として使用した。蛍光計数値は上記した通り％分解に変換した。図５のデータは明らかに、硫酸アンモニウム、ホスホノアセテート、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及びバナジウム酸ナトリウムがヌクレオチドを安定化させることを示している。一方、プロパンスルフェートによる安定化は最小限であった。
【実施例８】
【０１５１】
ヌクレオチド安定化添加剤の存在下における末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いたＰＣＲ増幅
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物（２０μｌ）には２５ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．１），１０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ４、０．２５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０及び１０〜２５ｍＭ塩を図６の通り含有させた。各試料にはまた、２０μｍのｄＡ４Ｐ−Ｍｅ、ｄＴ４Ｐ−Ｍｅ、ｄＣ４Ｐ−Ｍｅ各々、２００μｍｄＧ４Ｐ−ＦｌＥｔ、０．００６単位／μｌＢＡＰ、Ｔ．ｂａポリメラーゼ２単位、０．１μｍ４０Ｍ１３フォワードプライマー、０．１μｍ２８Ｍ１３リバースプライマー及び０．２ｎＭ１３ＤＮＡを添加した。末端リン酸標識ヌクレオチドのほかに、末端メチルブロッキングｄＮＴＰを正常ｄＮＴＰの代わりに使用することによりＢＡＰ（ホスファターゼ）による分解を防止した。後者は、ポリメラーゼによりＤＮＡにヌクレオチドが取り込まれた後に染料ポリリン酸からのシグナルの発生のために必要とされる。反応は９０℃３０秒、５５℃３０秒及び６５℃３００秒の３５サーマルサイクルで行った。反応産物は１．６％アガロースゲルにロードした。ゲルをＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて製造元の説明書に従って染色し、そして、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて５３２ｎｍで走査した。ゲルサイズマーカーは１００ｂｐラダー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とした。
【０１５２】
図６に示す通り、ＰＣＲ産物は硫酸アンモニウム、モリブデン酸ナトリウム及びタングステン酸ナトリウムの存在下、並びに、何れの安定化剤の非存在下においても分離された。メタバナジウム酸ナトリウム又はホスホノアセテートの存在下では産物は形成されなかった。硫酸アンモニウム、モリブデン酸ナトリウム及びタングステン酸ナトリウムが末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を安定化させるのみならず、ＤＮＡ増幅も可能にすることを考慮すると、これ等の塩は定量的な増幅方法における使用のために極めて有用である。
【実施例９】
【０１５３】
末端リン酸標識ヌクレオシドポリリン酸を用いた定量的ＰＣＲ
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）混合物（２０μｌ）には２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０），１０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＳＯ４、０．２５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有させた。各試料にはまた、２０μｍのｄＡ４Ｐ−Ｍｅ、ｄＴ４Ｐ−Ｍｅ、ｄＣ４Ｐ−Ｍｅ各々、２００μｍｄＧ４Ｐ−ＦｌＥｔ、０．００５単位／μｌＢＡＰ、ｐｆｕ（Ａ４８６Ｙ突然変異有り）ポリメラーゼ２単位、０．１μｍ４０Ｍ１３フォワードプライマー、０．１μｍ２８Ｍ１３リバースプライマー及び１．２ｘ１０６−１．２ｘ１０９コピーのＭ１３ＤＮＡを添加した。末端リン酸標識ヌクレオチドのほかに、残余のヌクレオチドは末端リン酸上のメチル基でブロックすることによりＢＡＰによる分解を防止した。反応はＡＢＩ７９００装置上で９０℃３０秒、５５℃３０秒及び６５℃３００秒の５０サーマルサイクルで行った。各反応につき蛍光計数値が特定の閾値（増幅産物の所定量に相当）に達した時点におけるサイクル数をインプットＭ１３ＤＮＡコピー量に対してプロットすることにより得られた直線（図７）は方法は所定の試料中の標的ＤＮＡコピー数の定量のために使用できることを示している。
【０１５４】
反応産物はまた１．６％アガロースゲルにロードした。ゲルをＳＹＢＲＧｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて製造元の説明書に従って染色し、そして、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光スキャナー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて５３２ｎｍで走査したところ、ＰＣＲ産物の形成が示された（図８）。ゲルサイズマーカーは１００ｂｐラダー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とした。
【実施例１０】
【０１５５】
末端リン酸標識／ブロックヌクレオシドポリリン酸を用いたローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によるＤＮＡ増幅
種々の量の変性サケ精子染色体ＤＮＡを、５ｍＭ硫酸アンモニウム、７５ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＭｎＳＯ４、０．０１％ツイーン−２０、４００ｎｇＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、４０μｍヌクレアーゼ耐性ランダム６量体、０．０３単位のＢＡＰ及び各々５０μｍのｄＡ４Ｐ−Ｍｅ、ｄＧ４Ｐ−Ｍｅ、ｄＣ４Ｐ−Ｍｅ及びｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯを含有する２５ｍＭトリス：ホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．０中に投入した。反応はＴｅｃａｎ蛍光プレートリーダー中３０℃でインキュベートし、ＤＤＡＯについて旨適化した励起及び発光の波長において５分おきに読み取った。蛍光計数値の生データを時間の関数としてプロットした。
【０１５６】
図９は明らかに、インプットＤＮＡの非存在下においてシグナルが発生しないことを示している。ＤＮＡ量が増大するに従って、蛍光の量、即ち生成した産物の量が増大する。更にまた、各反応の増幅の直線期（２０〜４０分）の傾きをＤＮＡインプットの関数としてプロットすると（図１０）、インプットＤＮＡ量と産物形成速度との間に直線相関が観察され、この方法がＤＮＡを定量するために使用できることを示している。
【０１５７】
本発明の特定の所望の実施形態を上記の通り記載したが、これを通して本発明の意図する範囲を逸脱することなく変更が行える。本発明の真の範囲は添付する請求項に記載する通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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