(57)【要約】本発明は、1つの局面では、例えばACインピーダンス分光法によって、電極上の核酸層のインピーダンスを測定することによって核酸二本鎖内のミスマッチを検出するための方法および装置を提供する。
2006520198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するための方法：
a）電気化学回路内の電極に電気エネルギーを印加する段階；
b）該回路内の電極上の核酸二本鎖［B1］のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集する段階；および、
c）該核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す回路性能情報を入手するために該電気化学回路データを回路モデルへフィッティングする段階。
【請求項２】
電気化学回路データを収集する段階がインピーダンススペクトルを測定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
インピーダンススペクトルが周波数ドメイン内で測定される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
電気化学回路データが複素インピーダンスの測定値を含む、請求項1、2または3記載の方法。
【請求項５】
電気エネルギーがインピーダンス分光法システムに印加され、そして該インピーダンス分光法システムが別個の期間内に定周波数および定振幅で正弦波信号を印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
回路モデルが回路素子として、
溶液抵抗Rs；
電荷移動抵抗RCT；
一定位相素子CPE；
物質移動素子W（Warburgインピーダンス）；および、
並列抵抗Rx、を含み；
そして該回路素子が以下：
2006520198.tif 000020
のとおりに配列されている、請求項1、2、3、4または5記載の方法。
【請求項７】
核酸がデオキシリボ核酸である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸が核酸の第1鎖および核酸の第2鎖を含む金属含有核酸二本鎖を含み、該第1および第2核酸鎖がバックボーンによって共有結合された複数の含窒素芳香族塩基を含み、第1核酸鎖の含窒素芳香族塩基が第2核酸鎖の含窒素芳香族塩基へ水素結合により結合し、該第1および第2核酸鎖上の含窒素芳香族塩基が導電性金属含有核酸二本鎖の全長に沿って積み重ね配列で水素結合塩基対を形成し、該水素結合塩基対が芳香族含窒素芳香族塩基の1つにおいて窒素原子へ配位されたインターキレート化二価金属カチオンを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第1核酸二本鎖の回路性能情報を第2核酸鎖二本鎖の該回路性能情報と比較する段階をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第1核酸二本鎖がB-DNAであり、第2核酸鎖が核酸の第1鎖および核酸の第2鎖を含む金属含有核酸二本鎖であり、該第1および第2核酸鎖がバックボーンによって共有結合された複数の含窒素芳香族塩基を含み、第1核酸鎖の含窒素芳香族塩基が第2核酸鎖の含窒素芳香族塩基へ水素結合により結合し、第1および第2核酸鎖上の含窒素芳香族塩基が導電性金属含有核酸二本鎖の全長に沿って積み重ね配列で水素結合塩基対を形成し、水素結合塩基対が芳香族含窒素芳香族塩基の1つにおいて窒素原子へ配位されたインターキレート化二価金属カチオンを含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
回路性能情報がNyquistプロット上にプロットされる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
複数の核酸が電極上で核酸二本鎖の単分子層を形成する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
電気化学回路が電解質水溶液を含み、核酸が電解質水溶液中で結び付けられて溶媒和される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
水溶液中にレドックスプローブをさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
核酸二本鎖が二重らせんである、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するためのシステムであって、該システムは、
a）電気化学回路内の電極に電気エネルギーを印加するための手段；
b）該回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集するための手段；および、
c）該核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す回路性能情報を入手するために該電気化学回路データを回路モデルへフィッティングする手段、を含むシステム。
【請求項１７】
電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するためのシステムであって、該システムは、
a）電気化学回路内の電極へ電気エネルギーを印加するための電流源、
b）該回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集するためのコントローラ；および、
c）該核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す回路性能情報を入手するために電気化学回路データを回路モデルへフィッティングするためのアナライザ、を含むシステム。
【請求項１８】
回路性能情報を表示するためのディスプレイをさらに含む、請求項17記載のシステム。
【請求項１９】
回路性能情報を記録するためのレコーダをさらに含む、請求項17または18記載のシステム。
【請求項２０】
実質的に上記ならびに実施例および図面を参照しながら記載したように［B2］、電極上の核酸層のインピーダンスを測定することによって核酸二本鎖内のミスマッチを検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸化学の分野に、詳細には核酸分析のための電気化学技術の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAの電子伝導性は、DNAバイオセンサ、いわゆる「DNAチップ」（Bixon et al.,1999；Schena et al.,1996；Fodor et al.,1993）の開発に利用できる。DNAチップの1つの形態は、アレイフォーマット内で表面に付着した一本鎖DNAプローブから構成される。標的DNAは蛍光タグを用いて標識することができ、個々のプローブヘのハイブリダイゼーションが成功したかどうかは蛍光分析法によって検出できる。他方、電気化学的検出は信号の直接的読み取りを可能にする（Takagi,2001；Kelly et al.,1999）。電気化学技術には、ポテンシャルステップ・クロノアンペロメトリ、直流サイクリックボルタンメトリ、および電気化学インピーダンス法（Bard and Faulkner,2001）が含まれる。電気化学的DNAセンサは、検出マーカーとして金属配位錯体であるRu（bpy）32＋（Carter and Bard,1987；Millan et al.,1994）、電気活性色素（Hashimoto et al.,1994）、キノン類（Kertesz et al.,2000；Ambroise and Maiya,2000）、およびメチルブルー（Tani et al.,2001；Kelley et al.,1997）などの電気化学的に活性なDNA結合剤を利用できる。他の場合には、溶液中で単純レドックスプローブであるFe（CN）63-/4-が使用されてきた（Patolsky et al.,2001）。これらの技術の一部では、標的DNAを前もって標識する必要がない。
【０００３】
表面修飾電極の電子特性は、インピーダンス分光法および等価回路によってモデリングされたデータを用いて調べることができる（Macdonald,1987）。電気化学インピーダンス分光法の代替法は、例えばUnited States Patent No.6,556,001（参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている。近年は、金属表面上の自己集合アルカンチオール単分子層を通しての電子移動について集中的に研究されてきた（Ulman,1996）。自己集合単分子層を通しての不均質な電子移動を示す電極のインピーダンスは、通例はRandlesによって開発されたモデルに基づいて説明されている（Randles,1947）。
【０００４】
二本鎖DNAは積み重ねπ系を含有し、天然DNA（B-DNA）の導電性については激しい議論が戦わされてきた。近年の直接測定は、B-DNAが幅広いバンドギャップを備える半導体であることを示唆している（Storm et al.,2001）；（Rakitin et al.,2001）；（Porath et al.,2000）；（Murphy et al.,1993）。DNAの導電性はその全長に沿って銀原子を沈着させることによって改善できるが、そのプロセスは本質的に不可逆性である（Braun et al.,1998）。もう1つの可能性は、8.5を超えるpH値で二価金属イオン（Zn2＋、Co2＋およびNi2＋）を添加する段階によってB-DNAをM-DNAへ転換させる方法である（Lee et al.,1993）（Aich et al.,1999）。M-DNAでは、各塩基対において金属イオンがグアニンおよびチミンのイミノプロトンと置換されるが、この構造はEDTAを用いて金属イオンをキレート化することによって、またはpHを低下させることによってB-DNAへ逆転換させることができると提案されている。M-DNAを通しての電子輸送は、供与体および受容体の発色団を用いて反対端が標識された二本鎖についての蛍光分光法によってモニタリングすることができる。M-DNAが形成されると、供与体は受容体が同一DNA分子上にある場合にのみ消光される（Aich et al.,1999；Aich et al.,2002）。近年の直接測定では、M-DNAが金属様の導電性を示すこと、そして電子移動を500塩基対という長い二本鎖で観察できることが確証された（Rakitin et al.,2001）。このため、M-DNAは、DNAの状態についての直接電子読出しを可能にすることによってバイオセンサ用途において有用な可能性がある。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、様々な局面において電気化学的核酸分析のための方法および装置を提供する。
【０００６】
1つの局面では、本発明は、様々な周波数でインピーダンスを測定することによって核酸などのポリマーを特性解析するインピーダンス分光法システムのためのハードウエアおよびソフトウエアを提供する。ハードウエアは、例えば様々な周波数でサンプリングし、結果として生じるインピーダンスを測定するための電圧・電流入力部を提供できる。ソフトウエアは、複数のサンプルに対する等価回路パラメータを保存し、サンプルへのハードウエア入力部を制御し、測定データを表示し、結果を表示し、そして結果が設定限界値を超えるとオペレータに通知することができる。
【０００７】
様々な局面において、本発明は、電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するための方法を提供する。複数の核酸は、電極上に例えば核酸二本鎖の単分子層を形成することができる。これらの核酸は、DNAおよびRNAなどの天然型モノマーから構成されてよい、または広範囲のまた別のモノマー単位から構成される合成置換基を有していてもよい。
【０００８】
本発明の方法は、a）電気化学回路内の電極に電気エネルギーを印加する段階；b）前記回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集する段階；および、c）前記核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す回路性能情報を入手するために電気化学回路データを回路モデルへフィッティングする段階、を含むことができる。
【０００９】
また別の局面では、本発明は塩基対のミスマッチを検出するためのシステムを提供する。そのようなシステムは、例えば、a）電気化学回路内の電極へ電気エネルギーを印加するための電流源などの手段、b）前記回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集するためのコントローラなどの手段；および、c）前記核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す回路性能情報を入手するために電気化学回路データを回路モデルへフィッティングするためのアナライザなどの手段、を含むことができる。このようなシステムは、ディスプレイもしくは回路性能情報を表示するための手段；および/またはレコーダもしくは回路性能情報を記録するための手段、をさらに含むことができる。前記回路性能情報は、例えばナイキスト（Nyquist）プロット図上にプロットすることができる。
【００１０】
また別の態様では、電気化学回路データを収集する段階には、周波数ドメイン内で測定されたインピーダンススペクトルなどのインピーダンススペクトルを測定する段階を含むことができる。様々な電気化学回路パラメータは、核酸二本鎖のインピーダンスに関連するデータを提供する。例えば、核酸もしくは単分子層の実および仮想インピーダンスは、ワールブルク（Warburg）インピーダンス、単分子層のキャパシタンス（電気容量）、電荷移動抵抗および電子移動速度などの電気化学パラメータに関連している。このようなパラメータは、さらにまた完全に二本鎖のDNAサンプルからミスマッチDNAサンプルを識別するためにも使用できる。
【００１１】
本発明の電気化学回路データには複素インピーダンスの測定値を含むことができる。一部の態様では、インピーダンス分光法システムに電気エネルギーを印加することができ、そしてインピーダンス分光法システムは、別個の期間内に定周波数および定振幅で正弦波信号を印加する段階を含むことができる。選択された態様では、前記回路モデルは、
溶液抵抗Rs；
電荷移動抵抗RCT；
一定位相素子CPE；
物質移動素子W（Warburgインピーダンス）；および、
並列抵抗Rx、などの回路素子を含むことができ；
このとき前記回路素子は図1に例示したように配列されている。
【００１２】
一部の態様では、核酸はデオキシリボ核酸（DNA）であってよく、そして核酸二本鎖は二重らせんであってよい。一部の態様では、前記核酸は核酸の第1鎖および核酸の第2鎖を含む金属含有核酸二本鎖であるM-DNAを含んでいてよく、前記第1および第2核酸鎖はバックボーンによって共有結合された複数の含窒素芳香族塩基を含み、第1核酸鎖の含窒素芳香族塩基は第2核酸鎖の含窒素芳香族塩基へ水素結合により結合し、前記第1および第2核酸鎖上の含窒素芳香族塩基は導電性金属含有核酸二本鎖の全長に沿って積み重ね配列で水素結合塩基対を形成し、前記水素結合塩基対は芳香族含窒素芳香族塩基の1つにおいて窒素原子へ配位されたインターキレート化二価金属カチオンを含む。
【００１３】
本発明は、第1核酸二本鎖の回路性能情報を第2核酸鎖二本鎖の回路性能情報と比較する段階を含むことができる。例えば、第1核酸二本鎖はB-DNAであってよく、第2核酸鎖二本鎖は金属含有核酸二本鎖であるM-DNAであってよい。
【００１４】
電気化学回路は、例えば電解質水溶液を含んでいてよく、核酸は電解質水溶液中で結び付けられて溶媒和させられてよい。前記水溶液中にレドックスプローブを用意することができる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の1つの局面では、インピーダンス分光法を使用して金電極上のB-DNAおよびM-DNA自己集合単分子層の電子特性が調査されている。
【００１６】
背景を説明するために、図1は、通例はRandlesが開発したモデル（Randles,1947）に基づいて説明される、自己集合単分子層を通しての不均質な電子移動を示す電極のインピーダンスをモデリングする電子回路を例示している。等価電子回路（図1の破線の囲みの中）は、抵抗素子およびキャパシタンス素子から構成される。Rsは溶液抵抗、Rctは電荷移動抵抗、Cは二重層キャパシタンス、およびWは電極への物質移動に起因するWarburgインピーダンスである。一般に、Randles回路はアルカンチオール単分子層の挙動についての優れたモデルを提供する。極めて関心対象であるのは、共役したπ系を含有するHMB（4’-ヒドロキシ-4-メルカプトビフェニル）の単分子層はRandles回路によって適切には説明することができない；しかし、追加の抵抗を並列で追加すると（図1におけるRx）、スペクトルを良好にフィッティングさせることができる、という観察所見である（Janek et al.,1998）。
【００１７】
図2に示したように、M-DNAを形成するためにZn2＋を添加すると、これらのイオンはDNAらせん内に挿入され、ならびにらせんの外側でリン酸塩バックボーンへ結合する。B-DNAからM-DNAへの転換は、15塩基、20塩基および30塩基対二本鎖について観察されたインピーダンススペクトルにおける特徴的変化を生じさせる。並列抵抗であるRxを含む修飾Randles回路を使用すると実験データへの良好なフィッティングを生じさせられることが見いだされた（図1）。これらの条件下では、M-DNAはRxおよびRctの両方を低下させ、そして単分子層を通る電子移動を促進すると思われる。
【００１８】
本発明の様々な局面は、導電性金属を含有するオリゴヌクレオチド二本鎖の形態であるM-DNAを含む。本発明のまた別の局面では、導電性金属を含有するオリゴヌクレオチド二本鎖は第1核酸鎖および第2核酸鎖を含んでいてよく、前記第1および第2核酸鎖はバックボーンによって共有結合された複数の含窒素芳香族塩基を各々含む。前記第1核酸鎖の含窒素芳香族塩基は水素結合によって第2核酸鎖の含窒素芳香族塩基へ結合されてよい。前記第1および第2核酸鎖上の含窒素芳香族塩基は、導電性金属を含有するオリゴヌクレオチド二本鎖の全長に沿って積み重ね配置で水素結合塩基対を形成してよい。前記水素結合塩基対は、含窒素芳香族塩基の1つにおいて窒素原子へ配位されたインターキレート化金属カチオンを含んでいてよい。
【００１９】
前記インターキレート化金属カチオンはインターキレート化二価金属カチオンを含んでいてよい。前記二価金属カチオンは亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より選択することができる。または、前記金属カチオンは
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のカチオンからなる群より選択することができる。
【００２０】
第1および第2核酸鎖はデオキシリボ核酸を含んでいてよく、含窒素芳香族塩基はアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンからなる群より選択されてよい。二価金属カチオンは含窒素芳香族塩基のイミンプロトンと置換されてよく、含窒素芳香族塩基はチミンおよびグアニンからなる群より選択されてよい。少なくとも1つの含窒素芳香族塩基はN3窒素原子を有するチミンを含んでいてよく、そして前記二価金属カチオンはN3窒素原子によって配位されてよい。または、少なくとも1つの含窒素芳香族塩基はN1窒素原子を有するグアニンを含んでいてよく、そして前記二価金属カチオンはN1窒素原子によって配位されてよい。
【００２１】
本発明の様々な局面では、以下の実施例で開示するように、DNA単分子層は金電極表面上で集合することができ、サイクリックボルタンメトリ（cyclic voltammetry）（CV）またはX線光電子分光法（XPS）によって評価できる。実施例に示したように、CVスペクトルはFe（CN）63-/4-を良好に遮断して高密度単分子層に対する良好な証拠を提供できる。XPSからは、実施例では45Åであると計算されたAu 4f信号の指数減衰に基づいて膜厚を推定できる（Pressprich et al.,1989）。20塩基対二本鎖は約70Åの長さを有すると予想できるので、測定された45Åの膜厚は例えば約50°の角度で表面から突き出ているDNAと一致している。一般に、二本鎖DNAは、塩基対を通して付着することもできる一本鎖DNAに比較して、リンカーを通して付着する（Herne and Tarlov,1997）。実施例では、S2pピークについての162.4 eVの数値はアルキルチオールについての以前の報告と良好に一致し、これはDNAがS-Au結合を通して表面と相互作用することを示唆している（Ishida et al.,1999）。
【００２２】
ACインピーダンス分光法は、電極の界面特性解析を調査してモデリングするために知られている方法である（Bard and Faulkner,2001）。データは、例えば特徴的変化を容易に観察して解釈することのできるNyquistプロット（Zim対Zre）として表示できる。複素インピーダンスは、主として測定された電気化学システムの抵抗およびキャパシタンス各々に由来する実Zre（ω）、および仮想的Zim（ω）コンポーネントの合計として表示できる。本明細書で例示するように、裸電極についてのNyquistプロットは、その後に直線が続くZre軸上にある半円形領域である。より高い周波数で測定された半円形部分は、直接電子移動に限定されるプロセスに一致すると推定されるが、他方より低い周波数で観察された直線状部分は推定的に拡散が制御された電子移動プロセスを表すと推定される。有機層を用いた金属表面の修飾は、裸金属電極に比較して二重層キャパシタンスを減少させ、そして界面電子移動速度を緩徐化させる可能性がある（Finklea et al.,1993；Kharitonov et al.,2000）。
【００２３】
一部の態様では、データ分析は電気コンポーネントから構成される等価回路を用いた電極反応速度をモデリングする必要がある。多数の単分子層について、一般に許容される等価回路は、図1に示したようにRandlesモデルに基づいている。しかし本明細書に開示した実施例からのデータへの良好なフィッティングを入手するために、DNAを通しての電子移動へ名目的に一致するように、並列界面抵抗Rxを等価回路へ追加した。並列界面抵抗の証拠は、例えば酸化還元活性プローブであるFe（CN）63-/4-を用いないインピーダンス測定値によって提供することができる（図6を参照）。
【００２４】
多数の非荷電単分子層については、様々なレドックスプローブは定性的に類似の結果をもたらすが、これはおそらくプローブと単分子層との相互作用が静電性ではないためである（Boubour and Lennox,2000；Finklea,1996；Finklea et al.,1993）。しかしDNAは負に荷電し、このためRu（NH3）63＋/2＋などの正荷電プローブは単分子層に進入できるが、Fe（CN）63-/4-などの負荷電プローブは単分子層に進入できない。これらの差は例えば本明細書の実施例に示した結果に反映されており、このときRu（NH3）63＋/2＋を用いた場合のRctは裸電極に類似して約1kΩ（図8）であり、他方Fe（CN）63-/4-およびB-DNAを用いた場合の対応する数値はおぼ20kΩである。このため、電化移動が本質的に単分子層を迂回する可能性があるため、Ru（NH3）63＋/2＋はDNAにとって適切なプローブではない。
【００２５】
本明細書の実施例に開示した結果は、特定条件下では、RctおよびRxがどちらもM-DNAに対しては小さいのでM-DNAはB-DNAより優れた導体である可能性であることを例示している。実施例では、B-およびM-DNAについてのRct間の差は長さが増加するに伴って増加する傾向があるが、他方Rxにおける差はDNA二本鎖の長さが増加するにつれて減少する。実施例では、DNAは電極に直接的には付着しなかったので、RxおよびRctはどちらもリンカーを通してDNAから電極へ電子移動が生じるための一連の条件を含む。また別の態様では、DNAは直接的に、またはリンカーの影響を無効とするために様々な長さのリンカーを用いて付着させることができる。一部の態様では、B-とM-DNAとの相互転換は、RxおよびRctの両方を金属イオンまたはpHにおける変化を用いて変調できるシステムを提供することができる。
【実施例１】
【００２６】
以下でより詳細に説明する本発明の一部の局面の実施例では、15塩基、20塩基、および30塩基対のチオール標識DNA二本鎖の単分子層を金電極上で集合させた。電子移動についてレドックスプローブとしてFe（CN）63-/4-を用いる電気化学インピーダンス分光法によって、調査した。Nyquistプロットの形状にあるスペクトルは、DNAを通しての抵抗のために追加の並列コンポーネントRxを含む修飾Randle回路を用いて分析した。天然B-DNAについては、Rxおよび電荷移動抵抗であるRctはどちらも長さが増加するにつれて増加する。pH8.6でZn2＋を添加することによってM-DNAを形成させると、これはNyquistプロットにおける特徴的変化が生じたが、この変化はMg2＋の添加またはpH7.0では観察されなかった。RxおよびRctはさらにまたM-DNAについて二本鎖の長さが増加するにつれて増加したが、どちらもB-DNAに比較して有意に小さかった。このため、特定の金属イオンはDNA単分子層の電気化学的特性を変調させることができ、金属DNA膜を経由する電子移動は天然DNA膜を経由する電子移動より高速である。
【００２７】
化学薬品
ヘキサフェリシアン化カリウム、ヘキサフェロシアン化カリウム、ヘキサアミンルテニウム（III）クロライド、ヘキサアミンルテニウム（II）クロライドはAldrich社から入手したが、これらはACS試薬用であった。Zn（ClO4）2、Mg（ClO4）2およびTris-ClO4はFluka Co.から購入した。標準バッファーは、pH8.7またはpH7.0のいずれかの20mM Tris-ClO4であった。その他の化学薬品は分析用であった。全溶液はミリポア濾過水中で調製した。
【００２８】
DNA
プローブDNAは、Plant Biotechnology Instituteサスカトゥーン（Saskatoon）において標準DNA合成法を用いて合成かつ精製された。オリゴヌクレオチド塩基配列は、
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である。
【００２９】
電極の調製
金円板電極（幾何学的表面積、0.02cm2）およびAg/AgCl参照電極はBioanalytical Systems社から購入した。使用前に、電極は0.05μmのアルミナスラリーを用いて注意深く研磨し、次に数分間にわたり0.1M KOH溶液中で洗浄し、さらにミリポア水で2回洗浄した。これらの電極は、明白な欠陥がないことを確認するために顕微鏡によって注意深く検査した。最後に、以下で説明するように、Ag/AgClに対して1.1Vで安定した金酸化ピーク値が入手されるまで、0.5M H2SO4溶液中でAg/AgClに対して-0.1から＋1.25Vの電圧でのサイクリックスキャニング（cyclic scanning）によってセル中で電気化学的処理を実施した（Finklea,1996）。
【００３０】
DNA修飾金電極の調製
DNA二本鎖は、20℃で2時間にわたり、20mM NaClO4を含む50μlの20mM Tris-ClO4バッファー（pH8.7）中の10nmolの相補鎖へ10nmolのジスルフィド標識DNA鎖を添加することによって調製した。二本鎖DNAの最終濃度は約100μMであった。新しく調製した金電極を密封容器内で5日間にわたりDNA二本鎖と一緒にインキュベートした。これらの電極は、バッファー液（20mM Tris-ClO4および20mM NaClO4）を用いて徹底的にリンスし、電気化学セル内に装填した。pH8.7で2時間にわたり0.4mM ZnClO4を添加することによって、B-DNAをM-DNAへ転換させた。
【００３１】
X線光電子分光法
Al-Kα放射線源（1486.6eV）を装備したLeybold MAX200光電子分光計を使用してフォトエミッションスペクトルを収集した。測定中の基底圧は分析チャンバ内で10-9mbar未満に維持した。射出角は60°であった。ルーチンの計測器校正標準は、Au 4f7/2ピーク（結合エネルギー、84.0eV）であった。
【００３２】
電気化学検査
従来型の3電極セルを使用した。全実験を室温で実施した。セルはアースしたファラデーケージ内に封入した。参照電極は、電解液を含有するルギン管によって常にセルから絶縁した。塩橋参照電極を使用したのは、標準Ag/AgCl参照電極から測定システムへのCl-イオンの漏出を制限できるためであった。対電極は白金線であった。インピーダンス分光法は、Power Suite（Princeton Applied Research社）を実行するPC上でGPIBを経由してEG ＆ G 283型ポテンショスタット/ガルバノスタットと連結された1025型周波数特性分析器（FRA）を用いて測定した。インピーダンスはAg/AgClに対して250mVの電圧で測定し、そして±5mVの正弦波電圧変調上にスーパーインポーズした。インピーダンス測定のために使用する周波数は、100kHzから100mHzの範囲に及ぶ可能性がある。裸金電極、B-DNAおよびM-DNA修飾金電極についてのインピーダンスデータは、ZSimpWinソフトウエア（Princeton Applied Research社）を用いて分析した。全インピーダンススペクトルにおいて、記号は実験生データを表し、実線はフィッティングした曲線である。
【００３３】
結果
単分子層の集合
天然二本鎖B-DNAを「材料および方法」の項に記載したように金表面上に集合させた。この単分子層を、レドックスプローブとして4mM K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］（1：1）混合液を用いてサイクリックボルタンメトリーによって特性解析した。典型的スキャンは図3に示した；裸金電極は158mVのピーク分離度を備える特徴的な準可逆的酸化還元サイクルを示している。電極上に集合した20塩基対二本鎖については、ピーク電流が95％以上低下し、酸化ピークと還元ピークとの間の分離度が増加したが、これは電極上にDNAが存在すること、そして溶液と表面間の電子移動能力が低下したことを示している。
【００３４】
金表面についても、X線光電子分光法（XPS）によって分析した。図4に示したように、修飾した表面について予想されたように（Kondo et al.,1998；Ishida et al.,1999）、DNA（B-またはM-DNAのいずれか）が付着するとAu4fピークの強度は減少した。S2p（162.4eV）、P2p（133eV）およびN1s（400eV）のピークはB-およびM-DNAのスペクトル中では明白であるが、裸金のスペクトル中には存在せず、これは表面にジスルフィド結合DNAが付着したという良好な証拠を提供している。特に関心対象であるのは、B-およびM-DNA（pH8.7でのZn2＋の添加後）についてのN1sおよびO1sスペクトルが相違するという観察所見である。これは、DNA二本らせんと相互作用する亜鉛イオン、ならびにより詳細には塩基対の窒素および酸素原子と一致する（Lee et al.,1993；Aich et al.,1999）。
【００３５】
B-DNAについてのインピーダンス分光法
インピーダンス測定は、レドックスプローブとしての4mM K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］（1：1）混合液の存在下で実施した。図5Aは、その後に一貫性の勾配を備える直線の尾が続き、高周波数では原点の近くでは半円形であると説明できる、裸金電極についてのNyquistプロットを示している。他の研究者らも類似の曲線を報告し、これらのデータは図1のRandles回路によって適正にフィッティングすることができる。半円の直径は、電荷移動抵抗Rctの測定値である。20mer B-DNA（図5B）については、Rctは裸金電極に比較して相当に大きく増加するが、これは電極への電子移動が減少するためである。しかし、低周波数領域はもはや直線状ではないので、このため単純なRandles回路によって適正にフィッティングすることはできない。レドックスプローブの不在下でのB-DNA（およびM-DNA、下記を参照）のインピーダンス測定（図6）は、単純な絶縁体については予想されない非線形挙動を示した。しかし、図6の曲線は並列抵抗を備えるキャパシタからなる単純回路を用いるとフィッティングすることができた。この結果は、Randles回路へ並列で追加できる追加の界面抵抗Rxの存在を示唆している（図1）。図5Bに示したように、修飾回路は低周波数および高周波数ゾーンのどちらにおいても実験データへのすばらしいフィッティングを生じさせる。
【００３６】
M-DNAの形成
M-DNAを形成するためにpH8.7で20mer B-DNA修飾金電極へZn2＋を添加すると、インピーダンススペクトルは高周波数および低周波数の両方でZimおよびZreの減少を伴う独特のパターンで変化した（図5C）。コントロール実験は、M-DNA形成が2時間以内に完了することを証明した。同様に修飾Randles回路だけが実験データへの良好なフィッティングを生じさせた。さらに図5Dに示したのは、pH7.0でZn2＋を含む、および含まないバッファー中、ならびにpH8.7でMg2＋を含むバッファー中でのDNA修飾電極についてのインピーダンススペクトルである。これらの条件下では、M-DNAは形成されず、インピーダンススペクトルにおける小さな変化しか観察されない。Rs、Rx、Rct、CおよびWについての計算値は表1に列挙した。M-DNAの形成後にはRxおよびRctにおける有意な減少が生じるが、これはMg2＋を添加してもpH7.0でZn2＋を添加しても見いだされないことは明白である。
【００３７】
（表１）  表I.  pHおよびイオンタイプを伴うDNAa
2006520198.tif 000005
（a）それに対してデータを未修飾Randles回路へフィッティングした裸金（Au）電極を除いて、数値は修飾Randles回路から引き出した。
【００３８】
DNA配列長
提案したモデル内の素子に関する詳細な情報を提供するために、15塩基、20塩基、および30塩基対のDNA二本鎖を使用して金電極の表面を修飾した。図7に示したように、インピーダンススペクトルは全部が同一の特徴的形状を有し、修飾Randles回路へのフィッティングは極めて良好であった。Rs、Rx、Rct、CおよびWについての計算値は表2に列挙した。2つの明確な傾向が見られる。第1に、RxおよびRctはB-およびM-DNAのどちらについても長さが増加するにつれて増加する。第2に、二本鎖のいずれの長さについてもM-DNAについてのRxおよびRctはB-DNAについての対応する数値より小さかった。電極への物質移動を表すWarburgインピーダンスであるWは、より可変性であるが、全ての場合にM-DNA二本鎖についてより高かった。予想されたように、溶液抵抗であるRsは二本鎖の長さとは無関係であり、そして二重層キャパシタンスであるCは二本鎖の長さが増加するにつれて減少する。
【００３９】
（表２）  様々な長さの配列を備えるDNA
2006520198.tif 000006
【００４０】
Ru（NH3）63＋/2＋レドックスプローブ
本実施例で使用したレドックスプローブは負に荷電したFe（CN）63-/4-であったが、このためDNAのホスホジエステルバックボーンによって反発される可能性がある。他方、Ru（NH3）63＋/2＋は単分子層に浸透できると予想できる。そこでインピーダンス分光法を20塩基対B-DNAおよびM-DNA二本鎖のためのレドックスプローブとしてRu（NH3）63＋/2＋を用いて実施した（図8）。挿入図に示したように、その場合にはRctは相当に小さく、B-DNAおよびM-DNAについてのスペクトル間の差は相当に小さい。
【実施例２】
【００４１】
上記の実施例では、B-DNAおよびM-DNAの自己集合した単分子層（SAM）のインピーダンス分光法について記載し、各々がDNA長および金属イオン濃度に依存する抵抗（R）およびキャパシタンス（C）の特徴的数値を生じることが証明された。本実施例では、DNA内の単一の塩基対のミスマッチはさらにまたインピーダンススペクトルにおける良好に規定された変化を生じさせるので、ミスマッチを特定条件下で完全二本鎖から確実に識別できることを例示する。
【００４２】
ミスマッチのDNA配列および位置は図9および表3に示した。
【００４３】
（表３）
2006520198.tif 000007
【００４４】
本実施例で使用した方法は、他に特別に明記しない限り、実施例1に説明したとおりである。
【００４５】
完全二本鎖ならびにB-DNAおよびM-DNA条件下で中央部ミスマッチを含有する二本鎖についてのインピーダンススペクトルは図10に示した。各ポイントは、特定AC周波数で測定されたZiおよびZrについての数値を表している。0.1Hzおよび49Hzでのポイントは例えば強調されており、ZiおよびZrの対応する数値が完全二本鎖およびミスマッチについてならびにB-DNAおよびM-DNAについて極めて相違することを見て取ることができる。
【００４６】
図10に示したようなインピーダンススペクトルから、RおよびCの数値を（実施例1に記載したように）精密に計算し、これらを使用して完全二本鎖とミスマッチとを識別することが可能である。
【００４７】
一部の態様では、電極が相違すると相違するRおよびCの数値が生じる可能性がある。したがって、一部の態様では、ミスマッチの検出は適合する電極セットを使用して実施されてよい。また別の態様では、B-DNAおよびM-DNAについてのZ値間の差はより一貫性があって電極および実験条件には余り依存しない可能性があるので、Z値をB-DNAおよびM-DNAの両方について2種の周波数で測定することができる。そのようなデータから、完全二本鎖とミスマッチ二本鎖とを識別することが可能である。例えば、ΔLiは低周波数（0.1Hz）で測定されたB-DNAおよびM-DNAについてのZi間の差であると定義でき、そしてΔHrは高周波数（49Hz）で測定されたB-DNAおよびM-DNAについてのZr間の差であると定義できる。Y係数はY＝ΔLi×ΔLr×ΔHi×ΔHrであると定義できる。一部の態様では、完全二本鎖について測定したY係数は、例えば約1000であってよく、ミスマッチについては約1から約40であってよい。
【００４８】
1つの態様では、例えばY係数を測定するために使用できる器具が提供される。そのような器具は、その1つ1つへ個別にアドレス可能である1アレイの電極を含む。20mer二本鎖プローブなどのプローブはチオレート結合によって各電極へ付着させ、付着した一本鎖プローブだけを残すように二本鎖を変性させることができる。この方法は、一本鎖を直接的に付着させることに比較してより一貫性の電極表面を提供することができる。次に標的核酸を電極へハイブリダイズさせて、2種の周波数でインピーダンス測定を実施できる。これらの電極は、次に例えば0.2mM ZnClO4を用いて処理することによってM-DNAへ転換するように処理し、インピーダンス測定を繰り返すことができる。そのような態様では、測定された約100未満のY係数はミスマッチの指標と見なすことができる；他方、約100を越える数値は完全二本鎖を示すと見なすことができる。
【００４９】
一部の態様では、細心の注意を払った測定はミスマッチの位置の検出を可能にし、ミスマッチを例えば二本鎖の上部、中央部または下部に局在化することができる。単一ヌクレオチド多型（SNP）検出などの一部の態様では、異型接合体からのサンプルは、例えば中間Y値を生じさせることがある。
【００５０】
一部の態様では、多結晶金電極が使用されてよい。または、単結晶電極もまた使用されてよいが、これは識別を向上させ、システムの感受性を強化する可能性がある。
【００５１】
また別の態様では、本発明のシステムは、電極上の核酸の分子配置の形態で情報が記憶されるデータ記憶および読み取り装置として使用できることは理解されるであろう。
【実施例３】
【００５２】
本実施例では、電気化学的方法によって未標識二本鎖DNAにおける単一ヌクレオチドミスマッチの検出を提示する。インピーダンス分光法を使用して、完全二本鎖単分子層およびミスマッチの位置が相違する3種のDNA単分子層について特性解析した。単分子層は、B-DNAとして、およびM-DNAへの転換後にアッセイした。等価回路へのインピーダンスデータのモデリングは、4種の単分子層配置を識別することに有用であるパラメータを提供する。電荷移動への抵抗RCTは、M-DNAへの転換後には全二本鎖について低かった。驚くべきことに、RCTはさらにまたミスマッチを含有する二本鎖については減少することが見いだされた。しかし、RCTはミスマッチ検出の診断に役立つことが見いだされた。詳細には、RCTにおけるB-DNAとM-DNAとの間の差（ΔRCT）は、完全にマッチした二本鎖についての190（22）Ω・cm2から上部、中央部および下部の位置でのミスマッチについては各々95（20）Ω・cm2、30（20）Ω・cm2および85（20）Ω・cm2へ減少した。
【００５３】
本明細書で例示した本発明のまた別の局面では、ある方法を使用して、二本鎖脱ハイブリダイゼーションによって、標的鎖へ再ハイブリダイズすることのできる粗に充填された一本鎖（ss）-DNA単分子層が形成される。再ハイブリダイゼーション効率は40％〜70％の範囲内であった。不完全ハイブリダイゼーション条件下では、RCTはB-DNA条件下でマッチおよびミスマッチ二本鎖について同一であった。しかし、不完全ハイブリダイゼーション条件下でのB-およびM-DNA間のΔRCTはそれでも識別を提供した。完全二本鎖についてのΔRCTは76（12）Ω・cm2であったが、配列中央部におけるミスマッチは30（15）Ω・cm2のΔRCT値を生じさせた。検出限界を測定し、インピーダンス法は100pMという低い濃度で一本鎖DNA塩基対のミスマッチを確実に検出した。
【００５４】
材料
5’-ジスルフィド標識および未標識オリゴヌクレオチド鎖を、全自動DNA合成装置を使用して標準ホスホアミデート固相DNA合成法によって合成し、逆相HPLCによって精製し、次にエレクトロスプレーイオン化質量分析法によって特性解析した。DNA配列およびミスマッチの位置は表4に示した。
【００５５】
（表４）  実施例3における単分子層膜の調製に使用したDNA配列のリスト。ミスマッチ塩基対は、配列内で太字体で示されている。
【００５６】
2006520198.tif 000008
【００５７】
単分子層の調製
新しく清浄化した複数の金電極（BAS、直径1.6mm）を5日間にわたり0.05mM ss-DNAもしくはds-DNAのB-DNA、20mM Tris-ClO4バッファー液（pH8.6）中でインキュベートした。次にこれらの電極をTris-ClO4バッファー液を用いて洗浄し、電気化学セル内に装填した。一本鎖プローブ電極の脱ハイブリダイゼーションおよび再生は、10分間にわたり加熱した（60℃）の水：EtOH（60：40）浴中に電極を浸漬し、次に室温の20mM Tris-ClO4バッファー液でリンスする段階によって二本鎖DNAを変性させることによって達成した。様々な電極上での繰り返し測定について再現性の挙動が見いだされた。再ハイブリダイゼーションは、標的DNAの存在下で10分間にわたり37℃に加熱したSSCバッファー（300mM NaCl、30mMクエン酸ナトリウム、pH7）へss-DNA自己集合単分子層（SAM）を暴露させ、次にさらに3時間にわたり室温へと冷却させることによって実施した。B-DNAは、pH8.6で2時間にわたり0.4mM Zn（ClO4）2・6H2Oを添加することによってM-DNAへ転換させた。
【００５８】
単分子層の形成は、［Fe（CN）6］3-/4-を用いた標準遮断試験、X線光電子分光法（XPS）およびEISによって評価した。遮断試験は、レドックスプローブからAu表面への拡散減少に起因するピーク電流の低下を証明した。XPSデータは、Au-チオレート結合の存在および1：2単分子層についての44Åの膜厚を証明した。
【００５９】
電気化学的測定
従来型の3電極セルを使用した。全実験は室温（22℃）で実施した。セルはアースしたファラデーケージ内に封入した。参照電極は、Vycorチップで蓋を被せた3M KClの溶液を含むガラス管内にAg/AgCl線を密封することによって構築した。対電極は白金線であった。インピーダンススペクトルは、EG  ＆  G 283型ポテンショスタット/ガルバノスタットへ連結されたEG  ＆  G 1025型周波数特性分析器を使用して測定した。AC電圧振幅は5mVであり、EIS測定に使用した電圧周波数は100kHzから100mHzの範囲に及んだ。加電圧はAg/AgClに対して250mVであった（E0、レドックスプローブ［Fe（CN）6］3-/4-の見掛け電圧）。全測定は、統計的に有意な結果を入手するために別個の電極を用いて最低5回ずつ繰り返した。
【００６０】
結果
金電極の上の完全マッチB-DNAの単分子層は、オリゴヌクレオチド1とその完全マッチ相補鎖2から調製した。EISによってミスマッチの作用を評価するために、各々が相補鎖内に単一のピリミジン-ピリミジンミスマッチを含有する3タイプのミスマッチ単分子層を調製した。相補的ミスマッチ鎖3は、電極表面の遠位でミスマッチを生じさせる第2の上部塩基対内にミスマッチを含有する。相補的ミスマッチ鎖4は11位にGの代わりにTを含有し、その二本鎖の中央部でミスマッチを備える単分子層を生じさせる。相補的ミスマッチ鎖5は19位にAの代わりにCを有し、電極表面の近位でミスマッチを生じさせる。1：3、1：4、および1：5のミスマッチB-DNA単分子層を類似方法で調製した。インピーダンス測定は、溶液に基づくレドックスプローブとしての4mM  ［Fe（CN）6］3-/4-（1：1）混合液の存在下で20mM Tris-ClO4（pH8.6）中の全単分子層上で実施した。B-DNA単分子層は次に、本明細書の他の場所で記載したようにpH8.6で0.4mM ZnIIの添加によってM-DNA単分子層へ転換させた。インピーダンス測定は、全4種の単分子層についてM-DNA条件下で繰り返した。Nyquistプロットの形状にある、完全マッチ二本鎖（1：2）およびらせんの中央部にミスマッチを含有する二本鎖（1：4）のB-DNAおよびMDNA単分子層についての典型的なインピーダンススペクトルは図11に示した。各ポイントは、特定AC周波数で測定されたZimおよびZreの数値を表している。このスペクトルは、以前の観察から予測されるように40-44、B-DNAについてよりM-DNAについての方が低いインピーダンスを示している。より重要なことに、DNA二本鎖におけるミスマッチの存在はB-DNAのインピーダンスを減少させるが、M-DNAのインピーダンスは増加させる。この挙動についての理由付けを提供するために、修飾Randles等価回路を用いて全DNA膜のインピーダンススペクトルを分析した。回路の図面は図11に示した。同一モデルを使用して、この実施例に記載した全単分子層をフィッティングした。実験値への等価回路のフィッティングは実線として示した。この処理は、この実施例の全単分子層について表5に列挙した電子回路コンポーネントに関してインピーダンスデータの解釈を可能にする。等価回路は、以下に記載する5つの素子を含有する。
【００６１】
（表５）  本実施例の相補的DNA単分子層および一連のミスマッチDNA単分子層についての回路素子値。括弧内の数値は、非線形曲線フィッティング誤差ではなく数回の電極測定値（n＝5）からの標準偏差を表している。
【００６２】
2006520198.tif 000009
＊  CPEおよび関連単位は指数モディファイア＞0.9を備えるキャパシタであると解釈されている。
【００６３】
溶液抵抗を表す用語であるRsは、支持する電解液濃度および温度の同一条件下で5〜6Ω・cm2で一定のままである。この回路は、電極表面上の不均質性を説明するための非理想キャパシタとしてモデリングされた一定位相素子（CPE）を含有する。CPEは、指数モディファイアが0.9を超える状況におけるキャパシタであると解釈できる。これは、本実施例で提示した全単分子層に対して当てはまる。単分子層の組成および膜厚はCPEに対する寄与因子である。マッチした二本鎖1：2の膜についての、ならびに2つの上部および下部のミスマッチを有する二本鎖1：3および1：5についてのCPEの大きさは10〜25μF・cm-2の範囲内であった。しかし、中央部ミスマッチを含有する1：4のB-DNAおよびM-DNAの膜については、約40（2）μF・cm-2の有意に高いキャパシタンスが観察された。
【００６４】
等価回路のRxコンポーネントは、単分子層構造内のピンホールに帰すことができると推定される。Rxの数値はB-DNA単分子層の各々について類似であり、これはピンホールの数およびサイズが単分子層間で変化しないことを示していた。しかし、RxはM-DNAへ転換すると減少する傾向がある。Warburgインピーダンス素子Wは、［Fe（CN）6］3-/4-レドックスプローブの拡散速度に依存する。WarburgインピーダンスはB-DNAコンフォメーションにおける完全二本鎖については最小であるが、これはこれが最も規則正しい単分子層であることを示唆し、DNA単分子層を通しての溶液電気盆（solution electrophore）への接近を最小に抑える。
【００６５】
電荷移動抵抗を表す用語であるRCTは、（a）［Fe（CN）6］3-/4-レドックスプローブからDNA単分子層への電子の移動、（b）DNAらせんの塩基対間の電荷移動への抵抗、および（c）前記らせんから金電極の表面への電子の移動の結果として生じる抵抗の用語を含むと見なすことができる。全単分子層について、RCTはB-DNAよりM-DNAについての方が低い。RCTは単一ヌクレオチドミスマッチと完全マッチDNA膜との識別を可能にする。ミスマッチの存在は、本実施例におけるミスマッチを含有する全ての膜についてRCTにおける予想外の低下を引き起こす。ミスマッチ検出のためには、所与の膜についてのB-DNAとM-DNAとの間の電荷移動抵抗であるΔRCTは、完全二本鎖と二本鎖の上部もしくは下部の位置のどちらかで単一ミスマッチを含有する二本鎖とを識別するための手段を提供する。表5には全膜についてのΔRCTを列挙した。完全にマッチした二本鎖の膜1：2についてのΔRCTは190（22）Ω・cm2であるが、ミスマッチ膜についてのΔRCTは有意に小さい。興味深いことに、1：3の膜を含有する上部ミスマッチおよび1：5の膜を含有する下部ミスマッチについてのΔRCTは類似している（1：3については95（19）Ω・cm2および1：5については85（20）Ω・cm2）。中央部ミスマッチを含有を含有する二本鎖についてのΔRCTははるかに低い（1：4についての30（18）Ω・cm2）。ΔRCTの使用は例えばまた別の態様では有益な場合があるが、それは相違する電極形態は、B-DNAとM-DNAとの間の匹敵するインピーダンス測定値が再現性である状況では相違するインピーダンスを生じさせる可能性があるためである。
【００６６】
非理想条件下でのミスマッチ決定を例示するために、本明細書では再ハイブリダイゼーションの作用を例示する。このフォーマットでは、DNAプローブ配列をss-DNA単分子層（ハイブリダイゼーションにおける差を生じさせる可能性がある）を横断して洗浄した。ss-DNA単分子層の直接形成は、DNA鎖が密に充填されていて相補鎖の結合を妨害する可能性がある膜を産生する可能性がある。このため、本実施例ではds-DNA膜が形成され、次により粗に充填されたss-DNA単分子層へ脱ハイブリダイズさせた。この方法で、一部の態様では40％〜70％の範囲内の標的DNAに対する再ハイブリダイゼーション効率を達成できる。図12aは、ハイブリダイゼーション-脱ハイブリダイゼーション法を略図で例示している。高温（60℃）の水：EtOH（60：40）浴を用いてds-DNA膜を洗浄し、次に室温のTris-ClO4バッファーを用いたリンスは、脱ハイブリダイゼーションおよびDNA鎖1から構成されるss-DNA膜の形成を生じさせる。次にこの膜を相補的標的ss-DNAの溶液へ暴露させ、3時間にわたりハイブリダイズさせた。一部の態様では、加熱は単分子層に有害な作用をもたらす可能性があるが、しかしこれは本実施例におけるように、Rxコンポーネントが実質的に同一でとどまる、または増加する場合には妨害されるが、これはおそらく新規のピンホールまたは欠陥部位が作り出されなかったことを示している。本実施例では、脱ハイブリダイゼーション-再ハイブリダイゼーション法に続いて2もしくは4を使用してds-DNA膜が再形成されると、インピーダンス信号は図12bによって示されたような完全ds-DNA単分子層についての数値には戻らないが、これは結果として生じる膜がds-DNAおよびss-DNAから構成されることを示唆している。重要なことに、明らかに不完全な再ハイブリダイゼーションにもかかわらず、図13におけるインピーダンススペクトルによって証明されたように、依然としてミスマッチの存在を検出することができる。マッチする相補鎖2および鎖の中央部に単一ミスマッチを含有する鎖4を用いたss-DNA膜の再ハイブリダイゼーション後に、全スペクトルを上記に記載した同一等価回路へフィッティングし、電子回路パラメータを表6に示した。
【００６７】
（表６）  再ハイブリダイズした相補的DNA単分子層および再ハイブリダイズした中央部ミスマッチDNA単分子層にフィッティングしたインピーダンス値。括弧内の数値は、非線形曲線フィッティング誤差ではなく数回の電極測定値（n＝5）からの標準偏差を表している。
2006520198.tif 000010
＊  CPEおよび関連単位は、指数モディファイア＞0.9を備えるキャパシタであると解釈されている。
【００６８】
図13および表6の態様から、マッチおよびミスマッチDNA標的のハイブリダイゼーションの結果として生じるB-DNA膜は一部の条件下では識別できないことが明らかである。しかし、この態様では、M-DNA条件下では膜は明らかに相違を示す。さらに、RCTを使用するとマッチおよびミスマッチDNA膜間を識別することができる。B-DNAとM-DNAとの間のRCTにおける差は、ΔRCTが29（15）Ω・cm2へ減少するミスマッチ膜と比較して完全二本鎖については例示した態様における方が一貫して大きい（76（12）Ω・cm2）。
【００６９】
マッチ膜をミスマッチDNA膜から識別するために必要とされる標的ss-DNAの最小濃度の決定を例示するために、再ハイブリダイゼーション態様を様々な濃度の標的相補鎖で例示した。毎回、B-DNAおよびM-DNA膜についてインピーダンススペクトルを記録し、等価回路へフィッティングした。図14に示したように、ΔRCTは100pMの標的ss-DNAの濃度へ相当に一定して減少したままである。本明細書に例示したように、マッチおよびミスマッチDNA間の明白な識別は、B-DNAおよびM-DNA間のRCTにおける差によって入手できる。
【００７０】
参考文献
以下の文書は、参照として本明細書に組み入れられる。
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【００７１】
結論
本明細書では本発明の様々な態様を開示してきたが、当業者の一般的知識にしたがって本発明の範囲内で多くの改造および変更を加えることができる。そのような変更には、実質的に同様の方法で同様の結果を達成するために本発明のいずれかの局面にとって知られている同等物の置換が含まれる。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。用語「含んでいる」は本明細書では、「含んでいるが、それらに限定されない」という言い回しと実質的に同等の制限のない用語として使用され、そして用語「含む」は対応する意味を有する。本明細書で使用する単数形「1つの」および「その」には、前後関係が明らかにそれ以外を指示していない限り、複数対象が含まれる。そこで、例えば「1つのもの」の言及には1つより多くのそのようなものが含まれる。本明細書での参考文献の言及は、そのような参考文献が本発明にとっての先行技術であるという是認ではない。本明細書で言及した特許および特許出願を含むがそれらに限定されない全出版物は、各個別出版物が特別かつ個別に本明細書に参照として組み入れられる、そして本明細書に完全に記載されたと指示されたように、参照として本明細書に組み入れられる。本発明は、上記に記載した、そして実施例および図面を参照しながら全態様および変形を実質的に含む。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
（図１）B-DNAおよびM-DNAについての等価回路モードの図である。破線の囲み内の回路は標準Randles回路である。Rs：溶液抵抗、Rx：DNAを通る抵抗、Rct：電荷移動抵抗、CPE：一定位相素子。W：Warburgインピーダンス。
（図２）金電極表面上の天然DNA（B-DNA）および金属DNA（M-DNA）の略図である。図示したように、Zn2＋イオンはM-DNAの外側へ結合し、同時にらせん内に挿入されると考えることができる。
（図３）4mM K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］（1：1）、20mM NaClO4および20mM Tris-ClO4バッファー液（pH8.6）中の金電極上に集合した（a）裸金および（b）20塩基対二本鎖B-DNAに対するサイクリックボルタンモグラムの図である。スキャン速度、50mV/s。
（図４）（a）裸金電極、（b）金電極上に集合した20塩基対二本鎖B-DNA、および（c）金電極上に集合した20塩基対二本鎖M-DNAのXPSスペクトルの図である。
（図５）Ag/AgClに対する加電圧0.250Vで、20mM Tris-ClO4および20mM NaClO4溶液中のレドックスプローブとしての4mM Fe（CN）63-/4-（1：1）混合液を用いたNyquistプロット（Zim対Zre）を示しているグラフである。全ての場合に、測定データポイントはOとして表示し、Randles回路への計算によるフィッティングは- - -として、または修飾Randles回路への計算によるフィッティングは―として表示した。（A）裸金電極、（B）金電極上に集合した20塩基対二本鎖B-DNA、（C）金電極上に集合した20塩基対二本鎖M-DNA、および（D）pH7.0で0.4mM Zn2＋を用いて
2006520198.tif 000019
、またはpH8.6で0.4mM Mg2＋を用いて（□）金電極上に集合した20塩基対二本鎖B-DNA。
（図６）レドックスプローブの不在下での（A）金電極上に集合した20塩基対二本鎖B-DNA（□）、および（B）金電極上に集合した20塩基対二本鎖M-DNA（■）についのてNyquistプロットを示している。これらの実験データは図示した等価回路へフィッティングした。
（図７）レドックスプローブとしてFe（CN）63-/4-を用いた、B-DNA（□）またはM-DNA（■）としての15塩基対二本鎖単分子層、B-DNA（○）またはM-DNA（●）としての20塩基対二本鎖単分子層、およびB-DNA（△）またはM-DNA（▲）としての30塩基対二本鎖単分子層についてのNyquistプロットを示している。これらのデータポイントは、本文中で記載したように修飾Randles回路にフィッティングした。
（図８）Ag/AgClに対する加電圧-0.10Vで、5mM Ru（NH3）3＋/2＋、20mM Tris-ClO4バッファー液（pH、8.6）中のB-DNAおよびM-DNA修飾金電極に対するインピーダンス測定値のNyquistプロットを示している。
（図９）実施例2で考察したように、表面に付着した二本鎖内のDNAミスマッチを示している略図である。
（図１０）実施例2で考察したように、B-DNAおよびM-DNA条件下で完全二本鎖および中央部ミスマッチを含有する二本鎖についてのインピーダンススペクトルを示しているグラフである。
（図１１）20mM Tris-ClO4および20mM NaClO4溶液中のレドックスプローブとしての4mM  ［Fe（CN）6］3-/4-（1：1）混合液中の金電極上で集合した20塩基対相補的B-DNA（○）、中央部ミスマッチB-DNA（□）、相補的M-DNA（●）および中央部ミスマッチM-DNA（■）のNyquistプロット（-Zim対Zre）を示している。Ag/AgClに対する加電圧は250mV。［Znll］＝0.4mM；pH8.6。全ての場合に、測定したデータポイントは実線で示した等価回路へ計算によりフィッティングした記号として示した。挿入図：実験データは等価回路へフィッティングした。Rs：溶液抵抗、Rx：単分子層のピンホール/欠陥抵抗、Rct：電荷移動抵抗、CPE：一定位相素子、W：Warburgインピーダンス。
（図１２）a）ハイブリダイゼーション-脱ハイブリダイゼーション手順。i）60℃で10分間にわたり水：EtOH（60：40）浴中に浸漬し、次に室温の20mM Tris-ClO4バッファーを用いてリンスした。ii）SSCバッファー中に標的ss-DNAを添加し、37℃で10分間にわたり二本鎖形成を発生させ、次に室温に3時間置いた。b）1：2構築体の完全にハイブリダイズした「理想的」単分子層（○）、脱ハイブリダイゼーション手順後の1のss-DNA単分子層（□）、および再ハイブリダイゼーション手順後の1：2の再ハイブリダイズしたds-DNA膜（●）のNyquistプロットを示している。再ハイブリダイズした膜のインピーダンススペクトルは「理想的」な1：2膜のインピーダンススペクトルとは相違し、これはおそらく不完全ハイブリダイゼーションの結果として不均質性の単分子層が生じたことを示している。
（図１３）20mM Tris-ClO4および20mM NaClO4溶液中のレドックスプローブとしての4mM Fe（CN）63-/4-（1：1）混合液中の金電極上で集合した再ハイブリダイズした20塩基対相補的B-DNA（○）、中央部ミスマッチB-DNA（□）、相補的M-DNA（●）および中央部ミスマッチM-DNA（■）のNyquistプロット（-Zim対Zre）を示している。Ag/AgClに対する加電圧は250mV。［Znll］＝0.4mM；pH8.6。全ての場合に、測定したデータポイントは実線で示した等価回路への計算によるフィッティングを含む記号として示した。
（図１４）標的一本鎖DNA濃度の関数としてのB-DNAおよびMDNA間のRCTにおける変化をモニタリングする段階による検出限界値の決定を例示している。相補的DNA鎖（□）および中央部ミスマッチDNA鎖（○）。エラーバーは最小5個の電極から引き出される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年11月10日(2005.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するための方法であって、
a）電気化学回路内の電極に電気エネルギーを印加する段階；
b）該回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集する段階；
c）回路性能情報を入手するために該電気化学回路データを回路モデルへフィッティングする段階；および、
d）第1核酸二本鎖の回路性能情報を第2核酸二本鎖の回路性能情報と比較する段階であって、該第1核酸二本鎖がB-DNAであり、該第2核酸二本鎖が金属含有核酸二本鎖である段階、を含み；および
該比較が該核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す方法。
【請求項２】
電気化学回路データを収集する段階がインピーダンススペクトルを測定する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
インピーダンススペクトルが周波数ドメイン内で測定される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
電気化学回路データが複素インピーダンスの測定値を含む、請求項1、2または3記載の方法。
【請求項５】
電気エネルギーがインピーダンス分光法システムに印加され、そして該インピーダンス分光法システムが別個の期間内に定周波数および定振幅で正弦波信号を印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
回路モデルが回路素子として、
溶液抵抗Rs；
電荷移動抵抗RCT；
一定位相素子CPE；
物質移動素子W（Warburgインピーダンス）；および、
並列抵抗Rx、を含み；
そして該回路素子が以下：
2006520198.tif 000035
のとおりに配列されている、請求項1、2、3、4または5記載の方法。
【請求項７】
核酸がデオキシリボ核酸である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
金属含有核酸二本鎖が核酸の第1鎖および核酸の第2鎖を含み、該第1および第2核酸鎖がバックボーンによって共有結合された複数の含窒素芳香族塩基を含み、第1核酸鎖の含窒素芳香族塩基が第2核酸鎖の含窒素芳香族塩基へ水素結合により結合し、該第1および第2核酸鎖上の含窒素芳香族塩基が導電性金属含有核酸二本鎖の全長に沿って積み重ね配列で水素結合塩基対を形成し、該水素結合塩基対が芳香族含窒素芳香族塩基の1つにおいて窒素原子へ配位されたインターキレート化二価金属カチオンを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
回路性能情報がNyquistプロット上にプロットされる、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の核酸が電極上で核酸二本鎖の単分子層を形成する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
電気化学回路が電解質水溶液を含み、核酸が電解質水溶液中で結び付けられて溶媒和される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
水溶液中にレドックスプローブをさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
核酸二本鎖が二重らせんである、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するためのシステムであって、該システムは、
a）電気化学回路内の電極に電気エネルギーを印加するための手段；
b）該回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集するための手段；および、
c）回路性能情報を入手するために該電気化学回路データを回路モデルへフィッティングする手段；
d）第1核酸二本鎖の回路性能情報を第2核酸二本鎖の回路性能情報と比較するための手段であって、該第1核酸二本鎖がB-DNAであり、該第2核酸二本鎖が金属含有核酸二本鎖である手段、を含み；および
該比較が該核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示すシステム。
【請求項１５】
電気化学回路内の電極へ結び付けられた核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを検出するためのシステムであって、該システムは、
a）電気化学回路内の電極へ電気エネルギーを印加するための電流源、
b）該回路内の電極上の核酸二本鎖のインピーダンスに関連する電気化学回路データを収集するためのコントローラ；
c）該核酸二本鎖内の塩基対のミスマッチを示す回路性能情報を入手するために、電気化学回路データを回路モデルへフィッティングするための、および第1核酸二本鎖の回路性能情報を第2核酸二本鎖の回路性能情報と比較するためのアナライザであって、該第1核酸二本鎖がB-DNAであり、該第2核酸二本鎖が金属含有核酸二本鎖であるアナライザ、を含むシステム。
【請求項１６】
回路性能情報を表示するためのディスプレイをさらに含む、請求項15記載のシステム。
【請求項１７】
回路性能情報を記録するためのレコーダをさらに含む、請求項15または16記載のシステム。
【請求項１８】
実質的に上記ならびに実施例および図面を参照しながら記載したように、電極上の核酸層のインピーダンスを測定することによって核酸二本鎖内のミスマッチを検出するための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006520198000001.app
【国際調査報告】
2006520198.tif 000036
2006520198.tif 000037
2006520198.tif 000038
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