(57)【要約】本発明は、サルモネラ（Salmonella）の迅速かつ特異的スクリーニングに有用な、サルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的なSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーと；また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の迅速かつ特異的検出方法とに関し、該方法は、遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、PCR産物をゲル上で流す工程、および寄生体を検出する工程とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増菌有りまたは無しで得られる、種々の供給源からのすべての種類の血清型のサルモネラ（Salmonella）のエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的な、SEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
増菌有りまたは無しで得られる、種々の供給源からのすべての種類の血清型のサルモネラ（Salmonella）のエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的な、SEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の迅速かつ特異的検出方法であって、
i. 遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、
ii. PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、
iii. PCR産物をゲル上で流す工程、および
iv. 寄生体を検出する工程
とを含む方法。
【請求項３】
前記遺伝子はサルモネラの血清型から配列決定される、請求項2の方法。
【請求項４】
前記プライマーは、増菌有りまたは無しで水1ml当たり最大約1個の細胞を検出することができる、請求項2の方法。
【請求項５】
前記プライマーは、増菌有りまたは無しで血液1ml当たり最大約10個の細胞を検出することができる、請求項2の方法。
【請求項６】
前記プライマーは、増菌有りまたは無しで1ｇの食物および臨床試料当たり最大約1個の細胞を検出することができる、請求項2の方法。
【請求項７】
血液およびバックグランドの微生物叢からのDNAがPCRアッセイを妨害しない、請求項2の方法。
【請求項８】
水の品質管理および細菌サルモネラの診断に使用することができる、請求項2の方法。
【請求項９】
前記被験体はヒトまたは動物である、請求項2の方法。
【請求項１０】
SEQ ID No.1と2のプライマーセットが200bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１１】
SEQ ID No.3と4のプライマーセットが207bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１２】
SEQ ID No.5と6のプライマーセットが1318bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１３】
SEQ ID No.7と8のプライマーセットが450bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１４】
前記プライマーの濃度は1pM〜100pMの範囲である、請求項2の方法。
【請求項１５】
PCR産物の視覚化は0.3％〜2.7％の範囲の濃度のゲル上で行われる、請求項2の方法。
【請求項１６】
PCRは、93℃〜97℃で30秒〜7分の最初の変性、そして23〜50サイクルの93℃〜97℃で3秒〜2分、50〜67℃で10秒〜2分、70℃〜75℃で10秒〜2分、そして最後に70℃〜75℃で2分〜10分の伸長を含む、請求項2の方法。
【請求項１７】
DNAは、純粋な培養物、水、食物、および臨床試料から単離される、請求項2の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、サルモネラ（Salmonella）の迅速かつ特異的スクリーニングに有用な、サルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的なSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーと；また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の迅速かつ特異的検出方法とに関し、該方法は、遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、PCR産物をゲル上で流す工程、および寄生体を検出する工程とを含む。
【０００２】
発明の背景
サルモネラ種は、上皮細胞の粘膜に侵入する通性細胞内寄生体であり、主に水、肉、卵および家禽産物を介してヒトに伝搬される。サルモネラ感染症は、動物からヒトに伝搬される最も高頻度の食物由来の消化管疾患である。腸チフスは、いまだに多くの開発途上国で風土病であり、非チフス性サルモネラ症はまた世界的に主要な食物由来の疾患であり、毎年500人を超えるヒトの死亡の原因になり、アメリカ合衆国だけで毎年10億ドル〜15億ドルのコストがかかっていると予測されている（Threlfall, 1996；Meadら、1999）。インドではこれらの数字は充分に記録されておらず、これよりはるかに大きいと予測される。サルモネラ感染を予防するためには、優れたモニタリングとスクリーニングプログラムが必要である。従来の細菌学的方法によるサルモネラの検出は時間がかかり、通常5日が必要である。従ってサルモネラを検出するのに必要な時間を短縮させ、その方法の感度を上昇させるための努力が、多くの研究者により行われている（Notermansら、1997；Ferrettiら、2001；Carliら、2001）。
【０００３】
食物由来の汚染と疾病の健康関連の影響や経済的影響への国民の意識の向上により、病原体の検出と同定のためのより高感度の方法を開発する試みが広がっている。分子生物学的技術（特にポリメラーゼ連鎖反応（PCR））の進歩により、より信頼できる微生物の同定と監視が可能になった。PCRはまた、食物由来の伝染病大発生の研究と微生物伝染病の原因菌の同定の有用な手段になっている。PCRにより感度の上昇が得られ、より迅速な処理時間が可能になり、細菌病原体の検出が向上した。食物の分析以外にPCRはまた、臨床試料や環境試料の病原性微生物の検出と同定にうまく応用されている（Simon, 1999；White, 1992）。
【０００４】
毒素原性（Enterotoxigenicity）は、細菌を含む下痢の明確な病原的性質の1つであるとして認識されている。サルモネラの血清型（これは、ヒトや動物の胃腸炎や下痢との関連について知られている）はまた、エンテロトキシンを産生することが証明されている。stn遺伝子は、サルモネラ・リフィムリウム（Salmonella lyphimurium）染色体上のほぼ89分に位置し、完全なstn遺伝子は、サルモネラの全体的な病原性に大きく寄与する。ここで我々は、サルモネラの検出マーカーとしてのstn遺伝子の使用を示す。
【０００５】
本発明の目的
本発明の主目的は、寄生体サルモネラの検出のためのプライマーを開発することである。
本発明の他の主目的は、寄生体サルモネラの検出のための迅速かつ効率的方法を開発することである。
本発明のさらに別の主目的は、食物、生物試料などからの寄生体サルモネラの検出方法を開発することである。
【０００６】
本発明の要約
本発明は、サルモネラの迅速かつ特異的スクリーニングに有用な、サルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的なSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーと；また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の迅速かつ特異的検出方法とに関し、該方法は、遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、PCR産物をゲル上で流す工程、および寄生体を検出する工程とを含む。
【０００７】
本発明の詳細な説明
従って本発明は、サルモネラの迅速かつ特異的スクリーニングに有用な、サルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的なSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーと；また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の迅速かつ特異的検出方法とに関し、該方法は、遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、PCR産物をゲル上で流す工程、および寄生体を検出する工程とを含む。
【０００８】
本発明の実施態様において、サルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的なSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーは、サルモネラの迅速かつ特異的スクリーニングに有用である。
本発明の別の実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのSEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の迅速かつ特異的検出方法において、該方法は、
・遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、
・PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、
・PCR産物をゲル上で流す工程、および
・寄生体を検出する工程、
とを含む。
【０００９】
本発明のさらに別の実施態様において遺伝子は、サルモネラの血清型から配列決定される。
本発明のさらに別の実施態様においてプライマーは、増菌有りまたは無しで水1ml当たり最大約1個の細胞を検出することができる。
本発明のさらに別の実施態様においてプライマーは、増菌有りまたは無しで血液1ml当たり最大約10個の細胞を検出することができる。
本発明のさらに別の実施態様においてプライマーは、増菌有りまたは無しで1ｇの食物および臨床試料当たり最大約1個の細胞を検出することができる。
本発明のさらに別の実施態様において、血液およびバックグランドの微生物叢からのDNAはPCRアッセイを妨害しない。
本発明のさらに別の実施態様において該方法は、水の品質管理および細菌サルモネラの診断に使用することができる。
本発明のさらに別の実施態様において、被験体はヒトまたは動物である。
【００１０】
本発明のさらに別の実施態様において、SEQ ID No.1と2のプライマーセットは200bpのアンプリコンを生成する。
本発明のさらに別の実施態様において、SEQ ID No.3と4のプライマーセットは207bpのアンプリコンを生成する。
本発明のさらに別の実施態様において、SEQ ID No.5と6のプライマーセットは1318bpのアンプリコンを生成する。
本発明のさらに別の実施態様において、SEQ ID No.7と8のプライマーセットは450bpのアンプリコンを生成する。
本発明のさらに別の実施態様において、プライマーの濃度は1pM〜100pMの範囲である。
本発明のさらに別の実施態様において、PCR産物の視覚化は0.3％〜2.7％の範囲の濃度のゲル上で行われる。
本発明のさらに別の実施態様においてPCRは、93℃〜97℃で30秒〜7分の最初の変性、そして23〜50サイクルの93℃〜97℃で3秒〜2分、50〜67℃で10秒〜2分、70℃〜75℃で10秒〜2分、そして最後に70℃〜75℃で2分〜10分の伸長を含む。
本発明のさらに別の実施態様においてDNAは、純粋な培養物、水、食物、および臨床試料から単離される。
【００１１】
本発明のさらに別の実施態様において、Stn遺伝子はいくつかの血清型のサルモネラから配列決定し、配列が保存されていることがわかった。サルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）に基づく特異的タンパク質を使用して、サルモネラの検出のためのPCRベースのプロトコールが開発されている。これらのプライマーとPCRプロトコールは我々が設計したものであり、初めて報告されている。この方法は極めて特異的で、前増菌無しで水1ml当たり最大1個の細胞および血液1ml当たり10個未満の細胞を検出することができる。これらのプライマーは、非サルモネラDNAを増幅する傾向は示さない。血液およびバックグランド微生物叢からのDNAは、非特異的PCRアンプリコンを生成してまたはPCRアッセイを阻害してPCRアッセイを妨害することはない。この方法は、水の品質管理およびヒトおよび動物のサルモネラによる菌血症の診断に使用してもよい。
【００１２】
本発明のさらに別の実施態様において、stn遺伝子（サルモネラエンテロトキシン遺伝子）に基づいて設計されポリメラーゼ連鎖反応で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、1fg〜10μgのDNAおよび任意の熱安定性DNAポリメラーゼ酵素を使用して、次にPCR産物を0.5％〜2.5％のアガロースゲル上で視覚化して、純粋な培養物、水、食物および臨床試料からポリメラーゼ連鎖反応に適した任意の既知の方法によりDNAを単離後に、93℃〜97℃で30秒〜7分の最初の変性、そして23〜50サイクルの93℃〜97℃で3秒〜2分、50〜67℃で10秒〜2分、70℃〜75℃で10秒〜2分、そして最後に70℃〜75℃で2分〜10分の伸長を含むPCRによる、サルモネラの迅速かつ特異的検出に有用である。
【００１３】
本発明のさらに別の実施態様において、サルモネラの検出のための迅速法で選択されるプライマーは以下の通りである：
以下はそれぞれSEQ ID No.1と2のプライマーのセット1である。またQVR133とQVR134とも言う。
【化１】
2006513718.tif 000002
以下はそれぞれSEQ ID No.3と4のプライマーのセット2である。またQVR135とQVR136とも言う。
【化２】
2006513718.tif 000003
以下はそれぞれSEQ ID No.5と6のプライマーのセット1である。またQVR137とQVR138とも言う。
【化３】
2006513718.tif 000004
以下はそれぞれSEQ ID No.7と8のプライマーのセット1である。またQVR139とQVR140とも言う。
【化４】
2006513718.tif 000005
【００１４】
本発明のさらに別の実施態様において、サルモネラの検出のための請求項1と2に記載のプライマーと迅速法において、使用されるプライマーの濃度は、1pM〜100pMの範囲であり、セット1、セット2、セット3およびセット4はそれぞれ特異的アンプリコン200bp、207bp、1318bp、および450bpを生成する（図１）。
【００１５】
本発明のさらに別の実施態様において、サルモネラの検出のためのプライマーと迅速法において、サルモネラのすべての種類の血清型（図3）は、食物、臨床試料（図2）および水試料のような種々の供給源から、増菌有りまたは無しで、プライマー1mlまたは1ｇ当たりわずかに1個の細胞が検出され、サルモネラの検出のための請求項1〜4に記載の迅速法において、サルモネラのすべての種類の血清型は、増菌有りまたは無しで、25mlまたは25ｇの試料当たり1個の細胞を含む種々の供給源から検出することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様において、プライマーとサルモネラの純粋な培養物の検出において、熱ショック溶解物の調製物を含む任意の既知の方法による染色体DNA単離はPCRで使用することができ、次にPCR産物を0.5％〜2.5％のアガロースゲル上で視覚化することができる。
【００１７】
方法
プロトコールは3つの主要な工程からなる：
・鋳型DNAの調製
・ポリメラーゼ連鎖反応
・アガロースゲル上の生成物の視覚化
PCRのためのDNA単離：1mlの液体培養物からの細胞ペレットと寒天培地上の単一コロニーを100μlの無菌ミリポア（Millipore）水に懸濁し、乾燥浴中で100℃で5分インキュベートした。直ちに混合物を氷浴に移し、3分間放置した。得られた細胞溶解物を7000rpmで3分間遠心分離し、上清2μlを直接20μlのPCR反応に使用した。
【００１８】
必要であればいつも、単離した染色体DNAを使用してアッセイを行った。純粋な染色体DNAの単離のために、培養物を普通ブイヨン中で6時間増殖させ、DNAをGES法により単離した（Pitcherら、1989）。通常10ngのDNAを20μlの反応アッセイに使用した。
血液からの鋳型調製：血液からのDNAの単離のために、DNA単離キット（M/S Bio Basic、カナダ）を使用した（図2）。
水からの鋳型調製：水由来の細菌からのDNAの単離のために、1mlの試料を5mlのエッペンドルフチューブ中で7000rpmで3分遠心分離し、上清を捨て、各チューブに10μlのオートクレーブしたミリポア（Millipore）水を加えた。得られた懸濁液をボルテックス混合し、乾燥浴中で100℃で5分インキュベートし、全容量を20μlの反応アッセイに使用した。
増菌：血液の場合、250μlの試料を5mlの液体培地に接種し、水については1mlのアリコートを1mlの2倍ブレインハートインフュージョン培地（ハイメディア（HiMedia）、インド）に接種し、37℃で5時間インキュベートした。細胞溶解物を上記のように調製した。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】サルモネラの検出に使用されるすべての4つのPCR産物を示す1％アガロースゲルを示す。レーン1：1kbのDNAラダー（Fermentas）。レーン2：プライマーQVR133とQVR134によるPCR増幅（200bp）；レーン3：プライマーQVR135とQVR136によるPCR増幅（207bp）；レーン4：プライマーQVR137とQVR138によるPCR増幅（1318bp）；レーン5：プライマーQVR139とQVR140によるPCR増幅（450bp）；レーン6：プライマーQVR139とQVR140による陰性対照。
【図２】プライマーQVR137とQVR138による血液からの異なる数のサルモネラ細胞の検出を示す1％アガロースゲルを示す。レーン1：1kbのDNAラダー（Fermentas）；レーン2：陽性対照；レーン3：約1個の細胞を加え、5時間前増菌した血液試料？レーン4：陰性対照（未接種血液試料）；レーン5：10個未満の細胞を加え、前増菌無しでPCRを行った血液試料；レーン6：10個の細胞を加え、前増菌無しでPCRを行った血液試料；レーン7：103個の細胞を加え、前増菌無しでPCRを行った血液試料。
【図３】サルモネラの検出に使用されるネステッドPCRのPCR増幅産物を示す1％アガロースゲルを示す。最初のPCR反応は、プライマーQVR137とQVR138により行い、ネステッドPCRの反応はプライマーQVR139とQVR140により行った。レーン1：1kbのDNAラダー（Fermentas）；レーン2〜7：サルモネラの異なる血清型、およびレーン8：陰性対照。
【図１】
2006513718.tif 000006
【図２】
2006513718.tif 000007
【図３】
2006513718.tif 000008
【配列表】
2006513718000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月2日(2004.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増菌有りまたは無しで得られる、種々の供給源からのすべての種類の血清型のサルモネラ（Salmonella）のエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的な、SEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
増菌有りまたは無しで得られる、種々の供給源からのすべての種類の血清型のサルモネラ（Salmonella）のエンテロトキシン遺伝子（stn）に特異的な、SEQ ID No.1〜21のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、寄生体サルモネラの存在についての被験体中のサルモネラエンテロトキシン遺伝子（stn）の検出方法であって、
i. 遺伝子のDNA鋳型を調製する工程、
ii. PCRによりプライマーを使用して鋳型を増幅する工程、
iii. PCR産物をゲル上で流す工程、および
iv. 寄生体を検出する工程（PCR産物の存在は被験体中のサルモネラの存在を示す）
とを含む方法。
【請求項３】
前記遺伝子はサルモネラの血清型から配列決定される、請求項2の方法。
【請求項４】
前記プライマーは、増菌有りまたは無しで水1ml当たり最大約1個の細胞を検出する、請求項2の方法。
【請求項５】
前記プライマーは、増菌有りまたは無しで血液1ml当たり最大約10個の細胞を検出する、請求項2の方法。
【請求項６】
前記プライマーは、増菌有りまたは無しで1ｇの食物および臨床試料当たり最大約1個の細胞を検出する、請求項2の方法。
【請求項７】
血液およびバックグランドの微生物叢からのDNAがPCRアッセイを妨害しない、請求項2の方法。
【請求項８】
水の品質管理および細菌サルモネラの診断に使用される、請求項2の方法。
【請求項９】
前記被験体はヒトまたは動物である、請求項2の方法。
【請求項１０】
SEQ ID No.1と2のプライマーセットが200bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１１】
SEQ ID No.3と4のプライマーセットが207bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１２】
SEQ ID No.5と6のプライマーセットが1318bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１３】
SEQ ID No.7と8のプライマーセットが450bpのアンプリコンを生成する、請求項2の方法。
【請求項１４】
プライマーの濃度は1pM〜100pMの範囲である、請求項2の方法。
【請求項１５】
PCR産物の視覚化は0.3％〜2.7％の範囲の濃度のゲル上で行われる、請求項2の方法。
【請求項１６】
PCRは、93℃〜97℃で30秒〜7分の最初の変性、そして23〜50サイクルの93℃〜97℃で3秒〜2分、50〜67℃で10秒〜2分、70℃〜75℃で10秒〜2分、そして最後に70℃〜75℃で2分〜10分の伸長を含む、請求項2の方法。
【請求項１７】
DNAは、純粋な培養物、水、食物、および臨床試料から単離される、請求項2の方法。
【国際調査報告】
2006513718.tif 000009
2006513718.tif 000010
2006513718.tif 000011
2006513718.tif 000012
2006513718.tif 000013
2006513718.tif 000014