(57)【要約】本発明はウイルスデリバリー系及び細胞をウイルスに感染させる方法に関する。上記ウイルスデリバリー系は低温学的に保存されうる及びそれらはワクチン、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドの製造において使用されうる。本発明は、低温保存容器及び上記低温保存容器中に含まれる凍結防止剤との混合物の複数のウイルス感染細胞を含む、宿主細胞を感染させるための低温学的に保護されたウイルスデリバリー系を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温保存容器及び上記低温保存容器中に含まれる凍結防止剤との混合物の複数のウイルス感染細胞を含む、宿主細胞を感染させるための低温学的に保護されたウイルスデリバリー系であって、上記ウイルス感染細胞の濃度は１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌであり、ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の上記混合物は−２０℃以下の温度であり、上記低温保存容器中に含まれる細胞の生存能力は少なくとも５０％であり；及び上記低温保存容器中に含まれる細胞の平均細胞直径は同じ型の感染していない細胞の平均細胞直径より少なくとも０．５μｍ大きい、前記低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項２】
ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の上記混合物は−７０℃以下の温度である、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項３】
ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の上記混合物は実質的に細胞外ウイルス粒子及び消費されたインキュベーション培地を含まない、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項４】
上記ウイルス感染細胞は真核生物細胞又は昆虫細胞である、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項５】
上記ウイルス感染細胞は組換えウイルスに感染している、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項６】
上記ウイルス感染細胞はバキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、インフルエンザウイルス、カナリポックスウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシ呼吸性シンシチウム（ＲＳ）ウイルス、ネコカリシウイルス、クラミヂアウイルス、イヌコロナウイルス、汎白血球減少症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）及び２型（ＨＩＶ−２）、サイトメガロウイルス、ヒトＴ−リンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）及びＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、脳炎ウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸性シンシチウム（ＲＳ）ウイルス、ロタウイルス、痘瘡ウイルス、チフスワクチンウイルス、水痘ウイルス、黄熱ワクチンウイルス、及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれるウイルスに感染している、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項７】
上記ウイルス感染細胞は組換えバキュロウイルス又はプロモーターに機能可能に結合された異種のポリヌクレオチドを有するバキュロウイルスに感染した昆虫細胞である、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項８】
上記ウイルス感染細胞はインフルエンザウイルスに感染した哺乳類細胞である、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項９】
上記ウイルス感染細胞はアデノウイルス又は組換えアデノウイルスに感染した哺乳類細胞である、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系。
【請求項１０】
請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系中に含まれる混合物から得られる複数の冷凍ウイルス感染細胞を提供すること；感染していない宿主細胞の濃度は１０5細胞／ｍｌ〜１０7細胞／ｍｌである、複数の感染していない宿主細胞を提供すること；場合により上記ウイルス感染細胞を解凍し、洗浄し及び／又は溶解すること；及び上記感染していない宿主細胞の少なくとも一部を上記ウイルス感染細胞の少なくとも一部で接種することにより得られるウイルス感染細胞及び感染していない宿主細胞の混合物であって、請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系中に含まれる混合物から得られるウイルス感染細胞の温度は−２０℃以下である、前記混合物。
【請求項１１】
請求項１に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系中に含まれる混合物から得られるウイルス感染細胞の温度は−７０℃以下である、請求項１０に記載の混合物。
【請求項１２】
複数のウイルス感染細胞を凍結防止剤と混合し、１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌのウイルス感染細胞の濃度を有する混合物を得ること、及び冷凍された混合物の温度が−２０℃以下であるために及び冷凍された混合物中の細胞の生存能力が少なくとも５０％であるために十分な時間及び条件下で上記混合物の少なくとも一部を冷凍することを含む、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の製造方法。
【請求項１３】
ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の上記混合物は実質的に細胞外ウイルス粒子及び消費されたインキュベーション培地を含まない、請求項１２に記載の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の製造方法。
【請求項１４】
ウイルス感染細胞の濃度は１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌであり、ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の混合物は−２０℃以下の温度であり、及び低温保存容器中に含まれる細胞の生存能力は少なくとも５０％である、低温保存容器中に含まれる凍結防止剤との混合物の複数のウイルス感染細胞を提供すること、感染していない宿主細胞の濃度は１０5細胞／ｍｌ〜１０7細胞／ｍｌである、複数の感染していない宿主細胞を提供すること、場合により上記ウイルス感染細胞を解凍し、洗浄し及び／又は溶解すること、上記感染していない宿主細胞の少なくとも一部を上記ウイルス感染細胞の少なくとも一部で接種すること、及び組成物中の細胞の少なくとも２０％がウイルス感染している組成物を提供するのに十分な時間及び条件下でインキュベーション培地の存在下で上記接種された細胞をインキュベートすることを含む、細胞をウイルス感染させる方法。
【請求項１５】
複数の感染していない宿主細胞を複数のウイルス及び／又は複数のウイルス感染細胞で接種すること、複数のウイルス感染細胞を得るのに十分な時間及び条件下でインキュベーション培地の存在下で上記接種された細胞をインキュベートすること及びインキュベーション中に上記インキュベートされた細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径をモニターすることを含むウイルス感染細胞の選択方法であって、上記モニタリングは上記インキュベートされた細胞の少なくとも１のアリコートを除去すること及び上記等分中の細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径を決定することを含み、上記等分中の細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径を決定することは細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径を計測することができる装置内に上記細胞の少なくとも一部を入れること、上記細胞の計測された細胞生存能力及び平均細胞直径を観察する及び／又は記録すること、及び上記インキュベートされた細胞が少なくとも５０％の生存能力及び少なくとも０．５μｍ増大した平均細胞直径を有する時点で上記インキュベーションを停止することを含む、前記選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００２年１１月６日出願の米国仮出願６０／４２４，２３８号から、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §  １１９（ｅ）の下、優先権を主張する。
発明の分野
本発明はウイルスデリバリー系及び細胞をウイルスに感染させる方法に関する。上記ウイルスデリバリー系は低温学的に保存されうる及びそれらはワクチン、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドの製造において使用されうる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
高い収率で及び一定の（すなわち、再現可能な）様式でウイルス及びウイルス製品を製造する能力は多くの産業及び医療適用に重要である。例えば、大量の安定なウイルスは遺伝子治療、予防接種プロトコル、及びポリペプチド及びポリヌクレオチドの製造における使用のために必要とされる。
【０００３】
遺伝子治療は、組換えウイルスが治療用剤をコードする遺伝子を患者の特定の細胞にデリバリーするために使用される方法である。遺伝子治療は、例えば、体内でのインスリン生成の不足から生ずるインスリン依存性糖尿病、及び体内での第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の不十分な生成から生ずる血友病の如き、決定的なタンパク質をコードする１以上の遺伝子の不十分な発現により引き起こされる、それらの疾患を治療するために使用されうる。Ａｕｇｕｓｔ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｅｄ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｖｏｌ．  ４０（１９９７）を参照のこと。標的化遺伝子治療もまたそれらの特定の遺伝子が欠損し、及びその結果これらの遺伝子を収容する宿主においてのみ複製しうるウイルスを使用する。このことは、例えば、癌細胞又は正常細胞における標的化複製及びウイルスのデリバリーを許容する。Ｂｒａｄｂｕｒｙ，  Ｊ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２：７１２（２００１）；  Ｌｉｎｄｓｅｙ，  Ｈ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ３：２６４（２００２）を参照のこと。遺伝子治療の効果的な使用は安定な及び感染性のウイルス源からの大量のウイルスのすばやい生成をしばしば必要とする。
【０００４】
ワクチンの効果的な使用もまた安定な及び感染性のウイルス源から大量のウイルスをすばやく生成することができることに因る。ワクチンのすばやい開発及びそれらの豊富な使用可能性は多くのヒト及び動物疾患と闘うことにおいて重要である。ワクチン製造における遅延及びそれらの量における不足は疾患の発生を扱うことにおいて問題を引き起こしうる。例えば、最近の研究は、流行性インフルエンザに対するワクチンを製造するために必要とされる長いリード時間についての関係に原因があることを示唆する。Ｗｏｏｄ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｐａｎｄｅｍｉｃ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，  Ｐｈｉｌｏｓ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ｂ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．，  ３５６（１４１６）：１９５３−６０（２００１）を参照のこと。
【０００５】
伝統的に、インフルエンザワクチンの製造はウイルス生育のための胚を有する鶏卵の入手可能性に因り、そのことは非常に煩わしく及び多くの不都合を伴うことが証明された。Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  （Ｖｅｒｏ）  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １６（９−１０）：９６０−６８（１９９８）を参照のこと。最近の技術発展はＶｅｒｏ、ＢＨＫ／ＢＲＳ、及びＭＤＣＫ細胞系を用いてインフルエンザワクチンがかなり早く開発されることを許容している。Ｉｄ．；  Ｍｅｒｔｅｎ，  ＯＷ．，  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ａｄｖ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ３９７：１４１−５１（１９９６）を参照のこと。それでもなお、インフルエンザワクチンを効率的に製造し及び分配することの不能に関してかなりの関心がまだある。Ｗｏｏｄ，  Ｊ．  Ｍ．，  ３５６（１４１６）：１９５３−６０（２００１）；Ｍｏｒｇａｎ，  Ｒ．，  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐａｓｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔ，  Ｎ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．，  ９８（１０）：２７−３４（２００１）を参照のこと。
【０００６】
さらに、例えば、Ｑ−ＢＩＯｇｅｎｅのＡＤＥＮＯＥＸＰＲＥＳＳ  ａｎｄ  ＡＤＥＡＳＹ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＡＤＥＮＯ−Ｘ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （“ＢＥＶＳ”）の如き、ウイルス発現系を用いた異種のタンパク質の生成を含む、ウイルスポリペプチド製品の産業的なスケールの製造もまた高い収率及び一定の結果を必要とする。Ｍｉｌｌｅｒ  Ｌ．  Ｋ．  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ａｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，  ４２：１７７−１９９（１９８８）を参照のこと。ウイルス発現系は、例えば、組換え及び非組換えポリペプチドの如きウイルス製品の製造における選択の系になっている。特に、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍは異種のタンパク質生成のために大学で及び産業で広く使用されている。Ｓｕｍｍｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．，  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｔｅｘ．  Ａｇｒｉ．  Ｅｘｐ．  Ｓｔｎ．  Ｂｕｌｌ．，  １５５５：５６（１９８７）を参照のこと。
【０００７】
典型的に、ウイルス又はウイルス製品の製造は選択された宿主細胞に感染させるためにウイルスストックを使用することを含む。上記感染プロセスの効率は宿主細胞を感染させるために使用された感染性ウイルス粒子の相対量（すなわち、感染の多数性又は“Ｍ．Ｏ．Ｉ．”）に因る。したがって、ウイルス製品又はウイルスの高い収率及び一定の生成を確実にするために、Ｍ．Ｏ．Ｉ．は慎重にモニターされ、及び制御されなければならない。適切なＭ．Ｏ．Ｉ．を決定するために、使用される特定のウイルスストックは感染性ウイルス粒子の濃度を決定するために滴定されなければならない。
【０００８】
典型的に、あるウイルスストック中の感染性ウイルス粒子の濃度は、例えば、プラーク形成単位分析の如き、滴定分析を用いて概算される。上記プラーク形成単位分析はある量の希釈されたストックについて宿主細胞の層上に形成されたウイルスプラークの数を評価し、したがって、ミリリットル当たりのプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌ）として計測されたタイターを与える。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  Ｄ．  Ｒ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｌ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｌｕｃｋｏｗ，  Ｖ．  Ａ．，  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  −  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  （１９９２）；  Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ  Ｓ．  ａｎｄ  Ｈｅｉｔｚ  Ｊ．  Ｈ．，  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ：  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，  （１９９３）；  ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＢＥＶＳ）  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  （２００２）。上記プラーク分析の代替のものは組織培養感染用量手順（ＴＣＩＤ50）であり、それは直接の免疫蛍光により抗原のための細胞内染色の機能として感染性を見積もる。より最近は、フローサイトメトリー又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーター）分析が細胞培養物中の感染細胞の数を計測するために使用されている。Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １９７（１）：３３９−４８（１９９３）を参照のこと。全てのこれらの滴定手順は実質的な量の試薬及び研究室装置、複数の熟練した者を必要とし、及び完了するのにかなりの時間、しばしば１〜２週間かかりうる。
【０００９】
最も伝統的なウイルスストックはよく知られているように不安定であり、及び毎回の使用前に繰り返して滴定されなければならない。ウイルスストック中のウイルス粒子を安定化することは非常に困難でありうる。冷凍又は凍結乾燥（フリーズドライ）はウイルスストックを保存するために使用されているが、これらの技術の両方はしばしば失敗する又は顕著に感染性を減少させる。例えば、ＬｅＢｌａｎｃ  ＆  Ｏｖｅｒｓｔｒｅｅｔは、４８時間の乾燥はＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｐｅｎａｅｉを不活性化したことを報告する。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ５７：２７７−２８６（１９９１）を参照のこと。ウイルス及び／又はウイルス感染性の損失は一般的に当業者にとっての関心であるので、標準の方法は冷蔵庫内のウイルスストックの貯蔵を要求する。冷蔵温度で貯蔵されたウイルスストックは時間にわたりタイターを失いうることも当業者により一般的に知られている。したがって、上記ストックを用いた一定の感染を確実にするために冷蔵ウイルスストックを日常的に滴定することは、上記に引用されるものの如き標準の研究室マニュアルにおいて強く勧められている。
【００１０】
当業者により一般的に許容されているように、あるストック中の感染性ウイルス粒子の濃度は時間にわたり減少するであろう。したがって、適切なＭ．Ｏ．Ｉ．を計算するために及びウイルス製品又はウイルスの付随の高い収率及び一定の生成を達成するために、あるウイルスストックはしばしば、及びより好ましくは毎回の使用前に滴定されることが強く勧められ及び高く所望される。
【００１１】
ウイルスストックの繰返しの滴定はウイルス製品又はウイルスの高い収率及び一定の生成を得るために必要な源及び時間、優れた製造実施の必要性を大いに増す。消費される源及び時間を最小限にすることは、生成のスケールが大きい及びコスト考慮が致命的に重要なことである、商業的な産業においては決定的に重要なことである。例えば、バキュロウイルス発現系を用いる標準の方法は、典型的にミリリットルの開始ウイルスストック（しばしば“ｐａｓｓａｇｅ  １”について“Ｐ１”と呼ばれる）の生成、続いて相当の大きさの典型的にリットルのワーキングウイルスストックに到達するまでの何ラウンドかの滴定及び増幅を要求する。Ｓｕｍｍｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．，  １５５５：５６（１９８７）；  Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ＢＥＶＳ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００２）を参照のこと。標準の方法はまた冷蔵庫内の大きな体積のウイルスストックの貯蔵をも要求する。冷蔵庫内で貯蔵されたバキュロウイルスストックの非常な不安定性のために、ウイルスストックが貯蔵に際してタイターが減少している又はほとんど消耗していることがわかったとき、何ラウンドかの滴定、増幅、及び発現試験が繰り返されなければならないことは稀ではない。したがって、特に商業的な又は産業的な設定においてウイルス及びウイルス製品の製造のための新規な、より効率的な及び時間を無駄にしない方法についての必要性が残っている。
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約
本発明の１の態様は、低温保存容器及び上記低温保存容器中に含まれる凍結防止剤との混合物の複数のウイルス感染細胞を含む、宿主細胞を感染させるための低温学的に保護されたウイルスデリバリー系を提供し、ここで、上記ウイルス感染細胞の濃度は１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌであり、ここで、ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の上記混合物は−２０℃以下の温度であり、及びここで、上記低温保存容器中に含まれる細胞の生存能力は少なくとも５０％である。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、複数のウイルス感染細胞を凍結防止剤と混合し、１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌのウイルス感染細胞の濃度を有する混合物を得ること、及び冷凍された混合物の温度が−２０℃以下であるために及び冷凍された混合物中の細胞の生存能力が少なくとも５０％であるために十分な時間及び条件下で上記混合物の少なくとも一部を冷凍することを含む、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系を調製する方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様は、ウイルス感染細胞の濃度は１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌであり、ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の混合物は−２０℃以下の温度であり、及び低温保存容器中に含まれる細胞の生存能力は少なくとも５０％である、低温保存容器中に含まれる凍結防止剤との混合物の複数のウイルス感染細胞を提供すること；感染していない宿主細胞の濃度は１０5細胞／ｍｌ〜１０7細胞／ｍｌである、複数の感染していない宿主細胞を提供すること；場合により上記ウイルス感染細胞を解凍し、洗浄し及び／又は溶解すること；上記感染していない宿主細胞の少なくとも一部を上記ウイルス感染細胞の少なくとも一部で接種すること；及び組成物中の細胞の少なくとも２０％がウイルスに感染している組成物を提供するのに十分な時間及び条件下でインキュベーション培地の存在下で上記接種された細胞をインキュベートすることを含む、細胞をウイルスに感染させる方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、複数の感染していない宿主細胞を複数のウイルスで接種すること；複数のウイルス感染細胞を得るために十分な時間及び条件下でインキュベーション培地の存在下で上記接種された細胞をインキュベートすること及び上記インキュベーション中に上記インキュベートされた細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径をモニターすること、及び上記インキュベートされた細胞が少なくとも５０％の生存能力及び少なくとも０．５μｍ増大した平均細胞直径を有する時点で上記インキュベーションを停止させることを含む、ウイルス感染細胞を選択する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、さまざまな方法で、例えば、組換え及び非組換えポリペプチドの生成において、ワクチンの生成において、ウイルスストックの生成等において、使用されうるウイルスデリバリー系及び細胞感染の方法を提供する。本発明の主な新規特徴は、特定の特徴を有するウイルス感染細胞の、好ましくは慎重に選択され及びモニターされる条件下での、調製である。それらの感染細胞は感染していない細胞を感染するために使用されうるデリバリー系の形態で提供される。新たに感染した細胞はそれ自体さまざまな方法で使用されうる。
【００１７】
ある態様においては、本発明は、特に細胞外でウイルスを低温保存することから生ずる安定性及び感染性に対する予測できない効果と比較するとき、ウイルス感染細胞はウイルスの感染ポテンシャルをほとんど喪失することなしに低温保存されうるという発見を活用する。ウイルス感染細胞が慎重に選択され、低温保存され及び解凍されるとき、感染周期は拘束されていた点から解凍に際して再開するということが発見された。上記低温保存及び解凍はウイルス感染細胞の安定性及び生存能力に対してほとんど効果を有しないので、本発明に係るウイルスデリバリー系及び方法は高い収率で及び一定の結果でウイルス製品を提供する。
【００１８】
本発明の特に顕著な利点は、それがウイルスストックを生成する、貯蔵する及び使用する慣用の方法により必要とされる繰返しの及び時間のかかる滴定を不必要にすることである。例のためにのみ、本発明は、バキュロウイルスを用いて産業的スケールで、ポリペプチド及びウイルスを含むウイルス製品を生成するためにかかる時間を６〜８週間から２〜３週間まで減少しうる。
【００１９】
本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系は容器及び上記容器内に含まれる凍結防止剤との混合物の複数のウイルス感染細胞を含む。上記複数のウイルス感染細胞は所望のいかなる方法によっても得られうる。しかしながら、感染細胞を含む混合物はそのパフォーマンスを最大限にするある性質及び特徴を有するべきなので、本発明は本発明の追加の局面を構成するいくつかの有用な細胞モニタリング、選択及び貯蔵方法を提供する。
【００２０】
ウイルス
本明細書中で使用されるとき、上記用語「ウイルス」及び「ウイルス粒子」は相互変換可能に使用され、及び選択された宿主細胞に感染することができる及び通常タンパク質カプシド及びときには脂質エンベロープにより包み込まれたゲノムから成るウイルスの一般的な形態学的特徴を有する完全なウイルス又はウイルスの一部を意味すると理解される。
【００２１】
ウイルスはそれらが感染することができる細胞型により特徴付けられうる。多くの型のウイルスは本発明にしたがって使用され及び生成されうる。上記ウイルスは、例えば、原核生物のウイルス、真核生物のウイルス、動物のウイルス、昆虫のウイルス、鳥類のウイルス、哺乳類のウイルス、霊長類のウイルス、ヒトのウイルス、マウスのウイルス、イヌのウイルス、ネコのウイルス、ウシのウイルス、ブタのウイルス、ウマのウイルス、さまざまなワクチン型ウイルス又はそれらの組み合わせを含む。
【００２２】
本発明に係るデリバリー系及び方法において使用される好ましいウイルスはバキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、及びインフルエンザウイルスを含む。また好ましいものはカナリポックスウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、パラインフルエンザ３型ウイルス、ウシ呼吸性シンシチウム（ＲＳ）ウイルス、ネコカリシウイルス、クラミヂアウイルス、イヌコロナウイルス、汎白血球減少症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）及び２型（ＨＩＶ−２）、サイトメガロウイルス、ヒトＴ−リンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）及びＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、脳炎ウイルス、はしかウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸性シンシチウム（ＲＳ）ウイルス、ロタウイルス、痘瘡ウイルス、チフスワクチンウイルス、水痘ウイルス、黄熱ワクチンウイルス又はそれらの組み合わせである。
【００２３】
本発明に関連して使用されるウイルスは非組換え又は組換えでありうる。本明細書中で使用されるとき、上記用語「組換えウイルス」は組換えポリヌクレオチドを含むウイルスを意味すると理解される。組換えポリヌクレオチドは、通常１種類以上の生物からのポリヌクレオチド分子を切り分け及び特定のポリヌクレオチド断片を共にスプライシングすることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで典型的に調製される、遺伝子工学的に作製されたポリヌクレオチドである。組換えポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子及び遺伝子の部分の如きポリヌクレオチド断片が、例えば、相同的組換えによる又は制限酵素を用いて断片を削除し及びその後端をつなげることによるように除去されたポリヌクレオチドを含む。好ましくは、上記組換えウイルスは生物学的に活性なポリペプチドをコードする少なくとも１の異種のポリヌクレオチドを含む。上記異種のポリヌクレオチドはウイルスゲノム中に統合され又はポリヌクレオチドベクター上で運ばれうる。
【００２４】
細胞
広くさまざまな細胞が本発明において使用されうる。特定の型の細胞の選択は当業者によく知られる基準に基づいてなされうる。例えば、細胞はあるウイルスにより感染されるそれらの能力及び／又は感染後に繁殖するそれらの傾向に基づいて選択されうる。
【００２５】
本明細書中で使用されるとき、上記用語「宿主細胞」は問題の特定のウイルス（すなわち、宿主細胞を感染させるために使用されるウイルス）に感染しやすい細胞を意味すると理解される。宿主細胞は真核生物又は原核生物でありうる。好ましくは、それらは真核生物である。本発明において使用される細胞は好ましくは上記に示されるウイルス型の１に対応する、すなわち、原核生物の細胞、真核生物の細胞、動物の細胞、昆虫の細胞、鳥類の細胞、哺乳類の細胞、霊長類の細胞、ヒトの細胞、マウスの細胞、イヌの細胞、ネコの細胞、ウシの細胞、ブタの細胞、ウマの細胞又はそれらの組み合わせ。上記細胞が原核生物細胞であるとき、それらは好ましくは細菌細胞、最も好ましくはＥ．  ｃｏｌｉ細胞である。
【００２６】
上記宿主細胞はまた不死化細胞系であり又はそれに由来しうる。不死化細胞系は制限のない増殖を許容するよう形質転換されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系である。好ましくは、上記不死化細胞系はクローンとして相同である。クローンとして相同な細胞系は、細胞が同一の遺伝子材料を有するものである。クローンとして相同な細胞系は商業的に又は例えば、例えばＢｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ’ｓ  ＦＡＣＳ  ＶＡＮＴＡＧＥ装置の如き１の細胞を１のウェルにソートすることができる細胞ソーティング装置を利用する標準の「制限連続希釈クローニング」法を用いることによる又は標準の研究室「クローニング管」を用いることによるような、本分野において通常使用されるいかなる方法によっても得られうる。
【００２７】
好ましい不死化細胞系はＰ６Ｖ、Ｓｆ９、Ｓｆ＋（すなわち、ｅｘｐｒｅｓＳｆ＋）、Ｓｆ２１、Ｔｎ５Ｂ１−４（すなわち、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）、ＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、ＢＨＫ、ＮＳ０、Ｖｅｒｏ、ＭＤＢＫ、Ｌ、Ｌ−ｔｋマイナス、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ｄｈｆｒマイナス、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ、ＮＳ１、ＢＨＫ−２１、ＣＶ−１、Ｕ９３７、ＨｅＬａ、２９３  ＥＢＮＡ、２９３  Ｔ、２９３  Ｆ、２９３  Ｈ、ＨＴＢ  ９、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫ、３Ｔ３、３Ｔ３−Ｌ１、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、ＮＩＨ／３Ｔ３、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ、ＷＩ−３８、ＴＨＰ−１、ＫＧ−１、ＨＥＬ  ２９９、ＭＲＣ−５、ＭＲＣ−９、ＷＩ−３８、ＨｅｐＧ２、Ｓｐ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、Ｃａｃｏ  ２、ＷＥＨＩ  ３、ＭＣＦ７、Ｃ１２７、ＫＧ−１、ＩＭ−９、Ｄａｕｄｉ、ＭＯＰ−８、ＢｍＮ、Ｂｍ５、ＴＮ３６８又はそれらの組み合わせを含む。より好ましくは、上記不死化細胞系はＣＨＯ、ＮＳ０、ＢＨＫ−２１、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＨＥＫ  ２９３、Ｖｅｒｏ又はそれらの組み合わせである。さらにより好ましくは、上記不死化細胞系はＳｆ９、ＨＥＫ  ２９３、Ｖｅｒｏ又はそれらの組み合わせである。
【００２８】
感染細胞の作製
本発明に係るデリバリー系は、宿主細胞をウイルスに感染させるために本分野において通常使用されるいかなる方法によっても作製されうる、複数のウイルス感染細胞を必要とする。好ましい方法は複数の感染していない宿主細胞を複数のウイルスで接種すること、複数のウイルス感染細胞を得るために十分な時間及び条件下でインキュベーション培地を含む組成物中で上記接種された細胞をインキュベートすること、及びその後実質的に全ての消費されたインキュベーション培地及び細胞外ウイルス粒子から複数のウイルス感染細胞を分離し及び容器中に上記複数のウイルス感染細胞を回収することを含む。
【００２９】
本明細書中で使用されるとき、上記用語「感染していない宿主細胞」は問題の特定のウイルス（すなわち、上記感染していない宿主細胞を感染させるために使用されるウイルス）に感染していない細胞を意味すると理解される。
【００３０】
好ましくは、ウイルス感染細胞の作出に関連する全ての段階（例えば、接種すること、インキュベートすること、分離すること及び回収すること）は汚染微生物の存在を避けるために無菌的に行われる。上記用語「汚染微生物」は、本明細書中で使用されるとき、本発明の主な目的である宿主細胞及びウイルス（すなわち、接種段階において使用される宿主細胞及びウイルス）以外の微生物を意味すると理解される。
【００３１】
ウイルスストックが感染していない宿主細胞を接種するために使用される場合、上記ストックはそのはじめの使用について滴定されうる又は滴定されない。しかしながら、上記はじめの感染後、本発明にしたがって製造されるウイルスデリバリー系は滴定なしに感染していない宿主細胞を接種するためにそれ自体使用されうる。
【００３２】
ウイルスストックの滴定はウイルスストックを滴定するために本分野において通常使用されるいかなる方法を用いても達成されうる。例えば、プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）分析が使用されうる。上記ｐ．ｆ．ｕ．分析は上記ストックウイルスに感染しやすい宿主細胞のコンフルエント単層を調製すること、滴定されるべきストック中のウイルスの連続希釈物を調製すること、上記細胞の単層に上記ウイルスの希釈物を置くこと、上記ウイルスが上記細胞に感染し及び同定可能なプラークを形成するのに十分な時間及び条件下で上記細胞及びウイルスをインキュベートすること、及び上記細胞単層上に形成されたプラークの数をカウントすることを含む。上記ウイルスストックのタイターはその後希釈されていないウイルスストックについて数学的に計算されうる。
【００３３】
滴定されたウイルスストックの適切な量は上記宿主細胞を接種するために決定され及び使用されうる。使用される試薬の量の及び使用されるインキュベーション条件の決定は当業者によく知られる因子に基づいてなされうる。
【００３４】
感染されていない宿主細胞のウイルスでの接種は本分野において通常使用されるいかなる接種手順を使用してもなされうる。例えば、細胞をヒトアデノウイルスで感染させる場合、２９３−ＥＢＮＡ細胞が５％ウシ胎児血清で補充された２９３  ＳＦＭ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １１６８６）培地中で約０．７５×１０6生存可能細胞／ｍｌの最終細胞濃度になるまで生育され、及びウイルスストックの、例えば、０．０１〜１ｍｌの如き小サンプルで感染されうる。好ましくは、感染していない宿主細胞はインキュベーション培地を含む振騰フラスコ内で生育され、例えば、バキュロウイルスの場合には、Ｓｆ９細胞はＦＢＳを含むＳＦ−９００−ＩＩ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０９０２−０９６）培地中で約０．７５×１０6生存可能Ｓｆ９細胞／ｍｌの最終細胞濃度になるまで生育されうる。上記細胞はその後ウイルスストックの、例えば、０．１〜２０ｍｌの如き小サンプルで感染される。好ましくは、使用されるウイルスストックは少なくとも１×１０7〜１×１０11ウイルス粒子／ｍｌのタイターを有する。好ましくは、十分なウイルスストックが、上記細胞が適切な感染の多数性（“Ｍ．Ｏ．Ｉ．”）でウイルスで接種されることを確実にするために使用される。当業者は、上記適切なＭ．Ｏ．Ｉ．は使用されるウイルスの型に因り変化するであろうことを認識するであろう。例えば、バキュロウイルスを用いるとき、適切なＭ．Ｏ．Ｉ．は好ましくは少なくとも０．０１、より好ましくは少なくとも０．１、最も好ましくは少なくとも１である。アデノウイルスを用いるとき、適切なＭ．Ｏ．Ｉ．は好ましくは少なくとも１、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０である。
【００３５】
一旦感染していない宿主細胞が接種されたら、上記接種された細胞は複数のウイルス感染細胞を得るために十分な時間及び条件下でインキュベートされるべきである。上記接種された細胞は、例えば、上記接種された細胞を適切なインキュベーション温度で振騰フラスコ中で振ることによるように、ウイルス感染細胞をインキュベートするために本分野において通常使用される条件下でインキュベートされうる。当業者は、異なるウイルス及び宿主細胞型について、適切なインキュベーション温度を含むインキュベーション条件が変化するであろうことを認識するであろう。好ましくは、インキュベートされる細胞は２７〜３７℃でおだやかに振騰しながら振騰フラスコ中でインキュベートされる。
【００３６】
好ましくは、上記感染及びインキュベーションは容器中のインキュベートされる細胞全体の大きな割合がウイルス感染されることを確実にするために十分な条件下で行われる。感染した細胞の割合は上記細胞を感染させるために使用されたウイルスの量及び感染プロセスの効率により特に影響される。ウイルス感染細胞の割合はこの目的のために本分野において通常使用されるいかなる方法によっても決定されうる。
【００３７】
好ましくは、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（“ＧＦＰ”）を発現する問題のウイルスの組換え変形を利用するＧＦＰ法がウイルス感染細胞の割合を決定するために使用される。上記ＧＦＰ法は宿主細胞を感染させるためにＧＦＰ−組換えウイルスを用いることを含む。ＧＦＰ−組換えウイルスに感染した細胞は緑色光（すなわち、蛍光）を発する。上記細胞のサンプルはその後除去され、連続希釈され、及び例えば、ＦＩＴＣ  ｃｕｂｅ（カタログ番号  Ｒ６２０−０７）を伴うＮｉｋｏｎ  ＴＥ  ３００顕微鏡の如き蛍光顕微鏡下で視覚的に分析される。緑色光発光細胞の数及び細胞総数がカウントされ、及び上記数はコンピュータ処理され、ウイルス感染細胞の割合を与える。
【００３８】
より好ましくは、ウイルス感染細胞の割合はフローサイトメトリーを用いて決定される。フローサイトメトリーは単一細胞のレベルでの懸濁物中の細胞の自動化迅速分析のための非常に有用な方法になっている。Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｒａｎ，  Ｐ．Ｋ．，  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：  Ｒａｐｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １７１：５４９−５８１（１９８９）を参照のこと。フローサイトメトリーはウイルス学研究において広く使用されている。ＭｃＳｈａｒｒｙ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ７：５７６−６０４（１９９４）を参照のこと。ウイルス学研究におけるフローサイトメトリーのほとんどの適用は、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＭｃＳｈａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２８：１８６４−１８６６（１９９０））、ヒト免疫不全ウイルス（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ２１：１９７−２０２（１９９５））、ロタウイルス（Ｂａｒａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ７４：３１−３８（１９９８））、及び狂犬病ウイルス（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０５：１８１−１８６（２００２））の検出の如き、免疫蛍光によるウイルス検出に基づく。
【００３９】
上記フローサイトメトリー法は（例えば、ウイルス感染細胞が懸濁培養物中の代わりにＰｅｔｒｉ皿中でインキュベートされる場合の如き、必要な場合のみ）それらが生育した表面から問題のウイルスに感染した宿主細胞を引き離すことを含む。上記細胞をその後ＴＷＥＥＮ  ２０を含むＰＢＳを用いて洗浄し、及びｐ−フォルムアルデヒド及び、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｎｏ．  ３４９２０２の如き溶解試薬を含む溶液での処理により浸透する。上記洗浄され及び浸透された細胞をその後、例えば、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質の如き、問題のウイルスにより発現されるタンパク質に特異的な蛍光結合抗体と共にインキュベートする。上記抗体処理細胞をその後フローサイトメトリーを用いて、好ましくは、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  ＶＡＮＴＡＧＥ装置の如き、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（“ＦＡＣＳ”）を用いることにより分析する。当業者は、蛍光剤に結合した及び問題のウイルスにより発現されるタンパク質に特異的な抗体は周知であり、及びフローサイトメトリーでの使用のために容易に得られうることを容易に認識するであろう。
【００４０】
好ましくは、感染していない宿主細胞は接種され、及び上記接種された細胞は、ウイルス感染細胞がインキュベートされた細胞総数の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％を示すことを提供するのに十分な時間及び条件下でインキュベートされる。
【００４１】
細胞生存能力及び平均細胞直径
上記に示されるように、本発明に係るデリバリー系における細胞は、それらがあるパフォーマンス特徴及び性質を有するよう、製造され、選択され及び回収されうる。既に挙げられたものはウイルスに感染した細胞の割合である。回収された細胞の２の他の特徴及び性質は細胞生存能力及び平均細胞直径である。
【００４２】
本明細書中で使用されるとき、「細胞生存能力」はＤｏｙｌｅ，  Ａ．，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｎｅｗｅｌｌ，  Ｄ．  Ｇ．，  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，  Ｍｏｄｕｌｅ  ４Ｂ：１  −  Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｓ  ａｎｄ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，  ４Ｂ：１．１−４Ｂ：１．５，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ，  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）中に示されるＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄを用いて決定される生存可能な細胞の割合を意味すると理解される。上記Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄは手動で又は本明細書中に示される及び例示されるものの如き自動化装置の助けと共に行われうる。
【００４３】
当業者は、平均細胞直径は直接的に計測されうる又は例えば、細胞円周、細胞半径又は細胞体積の如き、いくつかの他の細胞計測を用いて計算されうることを容易に認識するであろう。またしても、本明細書中に示される及び例示されるものの如き自動化装置が使用されうる。当業者はまた、全ての細胞が必ずしも丸いわけではなく、及び細胞形はわずかに変化する場合があり、したがって個々の細胞についての直径計測はそれに応じて変化するであろうということをも認識するであろう。
【００４４】
ウイルスで接種された宿主細胞集団の細胞生存能力及び平均細胞直径は一般的に感染プロセスがインキュベーション中に進むに連れて変化するであろう。典型的に、感染細胞はそれらが最大平均細胞直径に達するまで膨張し（すなわち、平均細胞直径において増大し）、及びその後上記平均細胞直径は安定水準に達し、及びしばらくの間本質的に一定のままになる。ＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞のインキュベーション中に観察される平均細胞直径における増大を図１は図解し、及び実施例１は示す。図１中に見られうるように、細胞の平均細胞直径は感染約１８時間後（“ｈｐｉ”）まで増大し、及びその後５６ｈｐｉの最終時点まで安定水準に達する。
【００４５】
平均細胞直径における増大は感染した細胞の内部で起こるウイルス複製、及びその結果、細胞がウイルスで満たされるためであると考えられている。当業者は、感染細胞の平均細胞直径における増大は使用されるウイルス及び宿主細胞の型に因って変化するであろうということを認識するであろう。
【００４６】
ウイルス感染細胞のインキュベーション中のある時点で、細胞の生存能力は減少しはじめる。ＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞のインキュベーション中に観察される細胞生存能力における減少を図２は図解し、及び実施例１は示す。図２は、細胞の生存能力は約３０ｈｐｉで減少しはじめることを図解する。図２の、図１における平均細胞直径グラフとの比較は、細胞生存能力は平均細胞直径が安定水準に達した後の時点で減少することを示す。
【００４７】
生存能力は部分的には「バーストし」及びウイルスを放出するウイルス感染細胞のために減少すると考えられている。この理論は２の観察により支持される：第一は、図１中に図解され及び実施例１中に示されるように、インキュベーション中の溶液中に見られる細胞外ウイルスの量は平均細胞直径が増大するのとおよそ同じ時間に増大しはじめ、及び平均細胞直径が安定水準に達しはじめた直後にピークに達することである；第二は、図１及び２を比較した場合、細胞外ウイルスにおける増大は生存能力における減少と相関することが明らかであることである。したがって、一旦細胞がウイルスで満たされ及びそれらの最大平均細胞直径に達したら、それらはバーストし及びウイルスを放出しはじめ、その時点で細胞生存能力は減少し、及び溶液中に存在する細胞外ウイルスの量は増大するということが仮定される。
【００４８】
したがって、上記に示される観察に基づいて、ウイルス感染細胞は上記ウイルス感染細胞がウイルスで満たされていることを確実にするために平均細胞直径が安定水準に達した直後のインキュベーション中の時点で、及びウイルスがまだ上記細胞内にある間に回収されることを確実にするために細胞生存能力が高く及び細胞外ウイルスの量が低いとき、分離され及び回収されることが好ましい。
【００４９】
モニタリング
細胞生存能力及び平均細胞直径が接種された細胞のインキュベーション中にモニターされることは一般的に好ましい。典型的に、モニタリングはインキュベーションプロセス中のインキュベーション培養物のサンプルを除去すること、及び上記サンプル中の細胞の少なくとも一部の細胞生存能力及び平均細胞直径を決定することを含む。好ましくは、上記決定をなすために使用される手順は比較的迅速である。
【００５０】
比較的迅速な手順が好ましい理由は、ウイルス感染細胞はインキュベート中の細胞の生存能力及び平均細胞直径が所望の値に達するとき分離され及び回収されるべきだからである。生存能力及び平均細胞直径を計測するために使用される手順が長くかかり過ぎる場合、特に上記インキュベーションがその間に進む場合、細胞の生存能力及び平均直径は上記手順を行うためにかかる時間の間に変化しうる。したがって、上記手順が長くかかり過ぎる場合、細胞が適切な生存能力及び平均細胞直径に達したことが決定されるときまでに、上記細胞の生存能力及び平均細胞直径は実質的に変化してしまいうる。
【００５１】
好ましくは、生存能力及び／又は平均細胞直径は、一般的に平均細胞直径により細胞の大きさ、及び細胞生存能力を計測する／モニターすることができる自動化装置を用いることにより決定される。この目的のために好適な装置は、標準のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染色プロトコルを用いて細胞生存能力、及びデジタルイメージプロセッシングにより細胞の大きさを決定するためのイメージングフローセルに基づいて構築された自動化システムである、Ｂｅｃｋｍａｎにより製造されるＶＩ−ＣＥＬＬ装置；光分散技術をとおして細胞の大きさ及びＶＩＡＣＯＵＮＴ試薬（Ｇｕａｖａ  ＃４０００−００４０）中のＤＮＡ−結合色素の差異透過率に基づいて細胞生存能力を決定する、Ｇｕａｖａにより製造されるＰＥＲＳＯＮＡＬ  ＣＥＬＬ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ；及びＩｎｎｏｖａｔｉｓにより製造されるＣＥＤＥＸ装置を含む。
【００５２】
上記ＣＥＤＥＸ装置はＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄに基づいて標準化された及び完全に自動化された手順を用いて平均細胞直径及び細胞生存能力を決定する。上記Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄは、死にかかっている又は死んだ細胞は色素を引き寄せ及び染まり、一方生存可能な細胞は上記色素を寄せつけず及び染まらないという原理に基づいている。Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｎｅｗｅｌｌを参照のこと。ＣＥＤＥＸ装置はＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄの基本的な手動の段階を自動化し、したがって上記手順を行うために必要とされる時間を大いに減少させる。一般的に、ＣＥＤＥＸ装置により作出された細胞生存能力の結果及び手動のＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄを用いて得られた結果は統計学的に同じである。Ｋｗｏｋ，  Ｓ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  （ＣＥＤＥＸ）  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐａｐｅｒ  ＢＩＯＴ−２２９，  ２２４  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ，  Ａｕｇｕｓｔ  １８−２２（２００２）を参照のこと。
【００５３】
基本的なＣＥＤＥＸ手順は試験される細胞懸濁物を含むサンプルカップへのＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ色素の吸引を含む。好ましくは、０．２％  Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ溶液が使用される。好ましくは、上記細胞懸濁物は５×１０4〜５×１０7細胞／ｍｌの細胞濃度範囲を有する。上記細胞懸濁物／色素混合物はその後シリンジ及びサンプルカップの間のポンプ活動により混合され、及びその後多くの自動化計測のそれぞれに使用される正確な時間インキュベートされる。上記染色された細胞懸濁物はその後少量で計測チャンバーに移され、そこで上記サンプルの設定された数の顕微鏡イメージが取られ、及び計測システムにおける統合されたインターフェースを介してコンピュータ分析ソフトウェアに移される。ＣＥＤＥＸ装置はその後平均細胞直径及び細胞生存能力の計測を提供する。
【００５４】
細胞生存能力及び平均細胞直径のモニタリングは典型的に、インキュベーション中のさまざまな時点でインキュベーション培養物の、例えば、０．１〜１００ｍｌの如き小等分を除去すること、場合により上記サンプルを希釈すること、及び上記等分中の細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径を決定することを含む。上記等分中の細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径を決定することは典型的に上記細胞の少なくとも一部を細胞生存能力及び平均細胞直径を計測することができる自動化装置内におくことを含む。好ましくは、例えば、上記に示されるＣＥＤＥＸ装置及び基本的なＣＥＤＥＸ手順の如き、細胞生存能力及び平均細胞直径について上記に示される自動化装置の１が使用される。好ましくは、上記等分中の細胞の細胞生存能力及び平均細胞直径を決定することは上記インキュベーション培養物からの上記等分の除去後３０分未満で、より好ましくは１０分未満で、最も好ましくは５分未満で行われうる。
【００５５】
典型的に、開始平均細胞直径決定は感染していない細胞集団とのウイルスストックの混合後５分以内になされる。上記開始平均細胞直径決定は同じ型の感染していない細胞の平均細胞直径を示す。上記開始平均細胞直径決定は、上記開始決定が平均細胞直径の後の決定と同じ培地条件下でなされることを確実にするために、好ましくは感染していない細胞集団とのウイルスストックの混合直後に決定される。本明細書中で使用されるとき上記用語「同じ培地条件」は、細胞が溶液中にある培地が、特に細胞の大きさに顕著に影響しうる培地の容量オスモル濃度に関して、同じ又は非常に似た成分を有することを意味すると理解される。当業者は、細胞が培地中でインキュベートされるとき、上記細胞は一般的に生育し及び代謝し、それゆえ特に栄養素の濃度に関して培地の内容量を変えるであろうということを認識するであろう。したがって、平均細胞直径の開始決定のための培地条件はインキュベーションプロセス中に後になされる決定のための培地条件と全く同じではない傾向があるであろう。
【００５６】
インキュベーションが進むにつれて、平均細胞直径は最大安定水準値まで増大するであろう。本発明に係るデリバリー系のさまざまな態様にしたがって、インキュベートされた細胞は好ましくは、インキュベートされた細胞の平均細胞直径が開始平均細胞直径決定に比較して、少なくとも０．５μｍ、より好ましくは少なくとも１μｍ増大した時点で分離され及び回収される。
【００５７】
さらに本発明に係るデリバリー系のさまざまな態様にしたがって、インキュベートされた細胞は好ましくは、インキュベートされた細胞の生存能力が５０％超、より好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超である時点で分離され及び回収される。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、ウイルスで接種された宿主細胞のインキュベーション中の生存能力及び平均細胞直径をモニターすること、及び上記インキュベートされた細胞が５０％超、より好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超の生存能力、及び開始平均細胞直径決定に比較して、少なくとも０．５μｍ、より好ましくは少なくとも１μｍ増大した平均細胞直径を有する時点で上記インキュベーションを止めることを含む、ウイルス感染細胞の選択方法である。
【００５９】
さらに他の態様は上記インキュベートされた細胞が５０％超の生存能力及び少なくとも０．５μｍ増大した平均細胞直径を有する時点、より好ましくは上記細胞が５０％超の生存能力及び少なくとも１μｍ増大した平均細胞直径を有する時点、さらにより好ましくは上記細胞が９０％超の生存能力及び少なくとも０．５μｍ増大した平均細胞直径を有する時点、最も好ましくは上記細胞が９０％超の生存能力及び少なくとも１μｍ増大した平均細胞直径を有する時点で上記インキュベーションを止めることを含む。
【００６０】
細胞生存能力及び平均細胞直径をモニターすることは本分野において通常使用される手順を用いて行われうる。好ましくは、モニタリングは、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎにより製造されるＶＩ−ＣＥＬＬ装置、Ｇｕａｖａにより製造されるＰＥＲＳＯＮＡＬ  ＣＥＬＬ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ又はＩｎｎｏｖａｔｉｓにより製造されるＣＥＤＥＸ装置の如き自動化装置を用いて行われる。最も好ましくは、モニタリングはＣＥＤＥＸ装置を用いて行われる。
【００６１】
本明細書中で使用されるとき上記句「インキュベーションを止める」は、例えば、生育及び複製の如き、細胞及びウイルス活動を拘束することを意味すると理解されるべきである。当業者は、例えば、細胞及び／又はウイルスの温度を低下させ、それにより細胞の及びウイルスの活動速度を遅延させることによる、及び／又は細胞及び／又はウイルスを栄養素から分離することによるような、細胞及びウイルス活動を拘束する多くの方法があることを容易に認識するであろう。当業者はまた、細胞及びウイルス活動を拘束するために使用される方法はおそらくこれらの活動を完全には止めないであろうということをも認識するであろう。
【００６２】
インキュベーションは、例えば、遠心分離を介してインキュベーション混合物中の細胞をペレット化し及び上清を注ぎ、それによりインキュベーション培地中に存在する栄養素から細胞を分離することによるような、インキュベーションを止めるための本分野において通常使用されるいかなる方法によっても止められうる。好ましくは、遠心分離はインキュベーション混合物の５０ｍｌ分を５０−ｍｌ円錐形遠心分離管に入れ、及び１５０×ｇで１０分間遠心分離することを含む。あるいは、インキュベーションは、例えば、インキュベーション混合物を氷上に置くことによるように、インキュベートされた細胞の温度を低下させることにより止められうる。好ましくは、インキュベーション混合物中の細胞の温度は少なくとも１０℃以下に低下される。
【００６３】
典型的に、インキュベーションは、モニタリング段階中になされた決定がインキュベートされた細胞が所望の細胞生存能力及び平均細胞直径を達成したことを示した直後に止められる。好ましくは、インキュベーションは決定が所望の値を示したときから１２時間以内、より好ましくは２時間以内、さらにより好ましくは３０分以内、またより好ましくは１０分以内、最も好ましくは５分以内に止められる。
【００６４】
分離／単離
一旦インキュベーションが複数のウイルス感染細胞を得るために十分な時間及び条件下で進み、及び上記インキュベートされた細胞が上記に示される1以上の特徴を有したら、上記ウイルス感染細胞は分離され及び回収され、そのことは典型的に上記インキュベーションプロセスを止めるであろう。
【００６５】
容器中の複数のウイルス感染細胞の分離及び回収はこの目的のために本分野において通常使用されるいかなる方法又はいかなる方法の組み合わせによってもなされうる。当業者は、分離及び回収段階は同時に又は別々に行われうること、及び別々に行われる場合、２の段階はいかなる順序でも行われうることを認識するであろう。好ましくは、ウイルス感染細胞は遠心分離により及び上清を注ぐことにより同時に分離され及び回収される。
【００６６】
遠心分離はウイルス感染細胞及び消費されたインキュベーション培地を含むインキュベートされた培養物を容器中に入れること、及び、例えば、約１５０×ｇで約５〜１０分間遠心分離することを含む。遠心分離装置の例はＩＥＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙにより製造されるＣＥＮＴＲＡ  ＣＬ２である。一旦細胞がペレット化されたら、消費されたインキュベーション培地及び細胞外ウイルス粒子を含む上清は、好ましくは注ぐこと又はピペッティングにより又は大部分の消費されたインキュベーション培地を注ぎ及びできるだけ多くの残りの消費されたインキュベーション培地をピペッティングして捨てることにより除去されうる。
【００６７】
好ましくは、ウイルス感染細胞は少なくとも１０ｍｌ、より好ましくは少なくとも５０ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも２５０ｍｌ、最も好ましくは少なくとも１０００ｍｌの大きさを有する容器中に回収される。細胞を回収するために本分野において通常使用されるいかなる容器も使用されうる。好ましくは、上記容器は１５ｍｌ又は５０ｍｌ円錐形管（Ｆａｌｃｏｎ／Ｃｏｒｎｉｎｇ）又は２５０−ｍｌ、５００−ｍｌ又は１０００−ｍｌ遠心分離ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）である。
【００６８】
好ましくは、ウイルス感染細胞は、容器中に含まれるウイルス感染細胞が実質的に消費されたインキュベーション培地を含まず、及び実質的に細胞外ウイルス粒子を含まないような様式で回収され及び分離される。
【００６９】
消費されたインキュベーション培地は細胞が生育したインキュベーション培地を意味すると理解される。本明細書中で使用されるとき、「実質的に消費されたインキュベーション培地を含まない」は、消費されたインキュベーション培地が回収された細胞の総体積の５０％未満を示すことを意味する。より好ましくは、分離及び回収段階後に残る消費されたインキュベーション培地の量は３０％未満、最も好ましくは１０％未満である。
【００７０】
したがって、上清がインキュベートされた細胞の遠心分離された培養物から注がれ、ピペッティングされ又は吸引された後に残りうる少量の消費されたインキュベーション培地は上記に示される「実質的に消費されたインキュベーション培地を含まない」の意味から除外されない。
【００７１】
分離及び回収段階後に残る消費されたインキュベーション培地の実際の量は上記消費されたインキュベーション培地中に存在する「マーカー」物質の量を計測することにより決定されうる。例えば、消費されたインキュベーション培地がグルコースを含む場合、除去された希釈していない消費されたインキュベーション培地（例えば、上記に示される遠心分離プロトコルにおける上清）中のグルコース濃度が決定される。ペレット化された細胞はその後ある体積のグルコースを含まない及び上記細胞の完全性を破壊しない溶液中に再懸濁され、上記細胞はその後再び回収され及び分離され、及び上記除去された溶液のグルコース濃度が決定される。上記除去された溶液のグルコース濃度は、はじめの回収及び分離段階後に残った少量の消費されたインキュベーション培地が寄与する濃度を示すはずである。したがって、この情報を用いて、はじめの分離及び回収段階後に残った消費されたインキュベーション培地の量を数学的に計算しうる。グルコース濃度は好ましくは、例えば、ＹＳＩ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより製造されるＹＳＩ  ２７００  ＳＥＬＥＣＴの如き生化学分析器により決定されうる。
【００７２】
細胞外ウイルス粒子は細胞の壁又は細胞質膜の境界の外側に位置するそれらのウイルス及びウイルスの部分である。本明細書中で使用されるとき「実質的に細胞外ウイルス粒子を含まない」は細胞外ウイルス粒子が、存在するウイルス粒子の総数の１０％未満であることを意味すると理解されるべきである。より好ましくは、分離及び回収段階後に存在する細胞外ウイルス粒子は存在するウイルス粒子の総数の３％未満、最も好ましくは１％未満である。
【００７３】
細胞外ウイルス粒子であるウイルス粒子の総数の割合を計算するために、典型的に存在するウイルス粒子の総数及び存在する細胞外ウイルス粒子の数を決定し、及びその後割合を数学的に計算する。
【００７４】
分離及び回収段階後に存在するウイルス粒子の総数は好ましくは細胞及び残りの消費されたインキュベーション培地を希釈して１０6細胞／ｍｌの最終細胞濃度にし、上記細胞を溶解し、及び上記溶解物についてｐ．ｆ．ｕ．分析を行うことにより決定されうる。
【００７５】
分離及び回収段階後に存在する細胞外粒子の数は好ましくは、例えば、上記細胞をインキュベートするために使用したのと同じ培地の如き液体培地中に上記細胞を再懸濁し、例えば、遠心分離による又は上記培地及び細胞外ウイルス粒子をとおすが、上記細胞はとおさないのに十分小さな孔サイズを有するフィルターをとおしたろ過によるように、上記液体培地から上記細胞をおだやかに除去し、及びその後上記分離した培地についてｐ．ｆ．ｕ．分析を行うことにより決定されうる。
【００７６】
好ましくは、ウイルス感染細胞は容器中の分離され及び回収された細胞の総数の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％を示す。
【００７７】
容器中のウイルス感染細胞の割合は本分野において通常使用されるいかなる方法によっても決定されうる。好ましくは、ウイルス感染細胞の割合を決定するために使用される方法は、例えば、インキュベーションプロセス中にウイルス感染細胞の割合を計測するための上記に示される好ましいＧＦＰ法の如き、ＧＦＰ−組換えウイルスを利用する。より好ましくは、ウイルス感染細胞の割合は、例えば、インキュベーションプロセス中にウイルス感染細胞の割合を計測するための上記に示される好ましいフローサイトメトリー法の如き、フローサイトメトリーを用いて決定される。
【００７８】
好ましくは、分離され及び回収された細胞は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％の生存能力を有する。
【００７９】
好ましくは、分離され及び回収された細胞の平均細胞直径は同じ型の感染していない細胞の平均細胞直径より少なくとも０．５μｍ大きい、より好ましくは１μｍ大きい。
【００８０】
好ましくは、生存能力及び／又は平均細胞直径は、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎにより製造されるＶＩ−ＣＥＬＬ装置、Ｇｕａｖａにより製造されるＰＥＲＳＯＮＡＬ  ＣＥＬＬ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ又はＩｎｎｏｖａｔｉｓにより製造されるＣＥＤＥＸ装置の如き、細胞生存能力及び平均細胞直径を計測するための上記に示される自動化装置の１を用いて決定される。最も好ましくは、生存能力及び／又は平均細胞直径はＣＥＤＥＸ装置を用いて決定される。典型的に、細胞のサンプルは除去され、連続希釈され、及びＣＥＤＥＸ装置を用いて分析される。
【００８１】
好ましくは、分離され及び回収されたウイルス感染細胞は氷上で維持され、及び回収及び分離段階の間、例えば、上記細胞を過度に揺り動かさない又は上記培養物に泡を形成させないことによるようにきめ細かに扱われる。上記用心は細胞膜の完全性を保つのを助け、及び付随して細胞生存能力、平均細胞直径及びウイルス感染細胞である容器中の細胞の総数の割合を回収及び分離手順の間に実質上変化しないまま保つのを助けるはずである。したがって、これらの値はウイルス感染細胞を回収する及び分離する前にインキュベーション中に計測されたそれらの値とほとんど同じであるはずである。
【００８２】
低温保存されたデリバリー系の調製
本発明の好ましい態様においては、低温学的に保存されたウイルスデリバリー系は上記に示される１以上の所望の特徴を有する複数のウイルス感染細胞を選択し、上記ウイルス感染細胞を凍結防止剤と混合し、及びその後上記細胞内のウイルスの感染周期を拘束するために上記細胞を慎重に冷凍することにより調製される。冷凍プロトコルは細胞の生存能力を保つよう、及びそのため上記細胞内のウイルスが解凍に際してそれらの感染周期を再開しうるよう選択されるべきである。
【００８３】
好ましくは、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系を作出することに関連する全ての段階（例えば、混合、等分、冷凍）は汚染微生物の存在を避けるために無菌的に行われる。上記用語「汚染微生物」は本明細書中で使用されるとき、本発明の主な目的である宿主細胞及びウイルス（すなわち、接種段階において使用される宿主細胞及びウイルス）以外の微生物を意味すると理解される。
【００８４】
一般的に、本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系は複数のウイルス感染細胞及び少なくとも１の凍結防止剤の混合物を含む低温保存容器を含む。
【００８５】
上記凍結防止剤は冷凍プロセスの悪い効果から細胞を保護するために本分野において通常使用されるいかなる物質又は物質の組み合わせでもありうる。好ましい凍結防止剤はＤＭＳＯ、グリセロール、血清、血清アルブミン、スキムミルク、デキストラン、ポリヴィニルピローリドン、スクロース、トレハロース及びそれらの混合物である。より好ましくは、凍結防止剤はＤＭＳＯ、血清、血清アルブミン、グリセロール又はそれらの混合物である。本明細書中で使用されるとき「血清」は血液が凝固したとき残される流動体として定義される。好ましい血清はウシ胎児血清である。好ましくは、組成物中に存在する凍結防止剤の濃度は約０．１％（ｖ／ｖ又は固体形の場合ｗ／ｖ）〜約９０％（ｖ／ｖ又は固体形の場合ｗ／ｖ）、最も好ましくは約１％（ｖ／ｖ又は固体形の場合ｗ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ又は固体形の場合ｗ／ｖ）である。当業者は、凍結防止剤の最適濃度は使用される凍結防止剤の特定の型に因り変化するであろうということを認識するであろう。
【００８６】
低温保存容器を含むさまざまな容器がウイルス感染細胞及び凍結防止剤を含むために使用されうる。低温保存容器の大きさ及び組成は必要に応じて選択されうる。
【００８７】
好ましい低温保存容器はポリプロピレン試験管、低温保存管、バイアル又は瓶を含む。より好ましくは、低温保存容器は以下の容器型の１である（全てのカタログ番号はＶＷＲカタログを示す）：以下の大きさのポリプロプレン、滅菌、蓋付きＶＷＲブランド低温フリーザーバイアル：１ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−２５１；２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−２８４；及び５ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−４００、以下の大きさのポリプロピレン、滅菌、スクリューキャップ付きＣｏｒｎｉｎｇ  ＣｏｓｔａｒブランドＢＩＯＦＲＥＥＺＥバイアル：１．２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ２９４４２−５３６；２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ２９４４２−５４０；２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ２９４４２−５３８；及び６．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ２９４４２−５４２、以下の大きさのポリプロピレン、滅菌、クロージャー付きＣｏｒｎｉｎｇブランド低温保存バイアル：１．２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９７２；２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９７６；２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９７４；４．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９７８；５．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９８０；１．２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９４０；２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９４２；４．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９４６；４．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９４８；５．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９５０；５．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９７０；１．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９１９；及び２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９２０、以下の大きさのポリプロピレン、滅菌、スクリューキャップ付きＮａｌｇｅｎｅブランド低温保存バイアル；１．２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−７０６；２．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−７２８；及び５．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−７３２、以下の大きさのポリプロピレン、滅菌、スクリューキャップ付きＷｈｅａｔｏｎブランドＣＲＹＵＬＥバイアル：１ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−８７４；及び２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−７５０、以下の大きさのポリプロピレン、滅菌、スクリューストッパー付きＷｈｅａｔｏｎブランドＣＲＹＵＬＥバイアル：２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−９５２；４ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−９５３；５ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−９５４；１．２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−９５５；２ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−９５６；及び４ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６００８−９５７、以下の大きさのポリプロピレン、滅菌、スクリューストッパー付きＮｕｎｃブランドＣＲＹＯＴＵＢＥバイアル：１．０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９９３；１．８ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９８６；３．６ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９８９；及び４．５ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  ６６０２１−９９１、以下の大きさのＰＥＴＧ、滅菌Ｎａｌｇｅｎｅブランドスクエア培地ボトル：３０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１２６；６０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１２８；１２５ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１３０；２５０ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１３２；５００ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１３４；１０００ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１３６；及び２０００ｍｌ、ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１５９−１３８。特に好ましい容器はＶＷＲブランドの１．２−ｍｌ、２．０−ｍｌ、及び５．０−ｍｌ低温フリーザーバイアル（ＶＷＲ＃６６００９−２５１、６６００８−２８４、及び６６００８−４００）である。
【００８８】
好ましくは、低温保存容器の容積は２５０ｍｌ以下、より好ましくは３０ｍｌ以下、最も好ましくは６ｍｌ以下である。好ましい低温保存容器は１２ｍｌ以下の容積を有するバイアル、より好ましくは６ｍｌ以下の容積を有するバイアルである。最も好ましくは、上記容器は６ｍｌ以下の容積を有するポリプロピレンバイアルである。
【００８９】
いかなる所望の方法も感染細胞を低温保存容器内の凍結防止剤と混合するために使用されうる。
【００９０】
複数のウイルス感染細胞が上記に示されるプロトコルの１により提供されるとき、例えば、それは遠心分離された細胞のペレットの形態でありうる。上記細胞は好ましくは実質的に細胞外ウイルス粒子を含まず、及び実質的に消費されたインキュベーション培地を含まない。上記ペレットは場合により洗浄され、凍結防止剤と混合され、及び複数の低温保存容器へ等分されうる。あるいは、上記感染細胞は等分され、及び低温保存容器内の凍結防止剤と混合されうる。
【００９１】
ウイルス感染細胞及び凍結防止剤は本分野において通常使用されるいかなる様式でも混合されうる。好ましくは、凍結防止剤（単数又は複数）はピペットを用いて細胞に添加される。より好ましくは、凍結防止剤は、１以上の凍結防止剤に加えてまた緩衝液又は例えば、ＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭの如きインキュベーション培地をも含む冷凍培地の一部として添加される。細胞は好ましくはおだやかな振騰又はヴォルテックスによりこの冷凍培地中に懸濁される。
【００９２】
好ましくは、ウイルス感染細胞は凍結防止剤と混合され、ウイルス感染細胞の濃度が１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌ、より好ましくは５×１０6細胞／ｍｌ〜５×１０8細胞／ｍｌであることを提供する。ウイルス感染細胞の濃度は、例えば、上記細胞の小サンプルを除去し、上記サンプルを連続希釈し、上記連続希釈物の少量をスライド上に置き、顕微鏡を用いてある体積の上記希釈サンプル中の細胞数をカウントし、及びその後希釈されていない混合物中の全ての細胞の濃度を数学的に計算することによるような、本分野において通常使用されるいかなる方法によっても決定されうる。この情報及び上記に示されるＧＦＰ又はフローサイトメトリー法により決定されるウイルス感染細胞の割合で、容器中のウイルス感染細胞の濃度を計算することができる。
【００９３】
好ましくは、一旦ウイルス感染細胞及び凍結防止剤が混合され、及び低温保存容器中へ等分されたら、低温保存容器のそれぞれは１０5〜１０12のウイルス感染細胞、より好ましくは１０6〜１０10のウイルス感染細胞、最も好ましくは５×１０6〜５×１０8のウイルス感染細胞を含む。好ましくは、上記低温保存容器のそれぞれ中に含まれる混合物の体積は０．１ｍｌ〜２００ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｌ〜２０ｍｌ、最も好ましくは１ｍｌ〜４ｍｌである。これは適切な体積の凍結防止剤が既知の体積及び濃度の複数のウイルス感染細胞と混合されるよう選択することにより、及び既知の量を低温保存容器中に等分することにより容易になされる。好ましくは、低温保存容器中に含まれる混合物の体積は上記低温保存容器の総容積の少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６６＋２／３％、最も好ましくは少なくとも８０％を示す。
【００９４】
冷凍
ウイルス感染細胞及び凍結防止剤の混合物は好ましくは低温保存容器中で制御された条件下で冷凍される。上記条件が細胞の生存能力及び感染性が可能な限り保たれるよう選択されるべきであることに留意して、好適な冷凍プロトコルが使用されうる。本明細書中で使用されるとき上記用語「冷凍された」は熱の抽出のために固体形であることを意味すると理解される。
【００９５】
好ましくは、上記混合物は、細胞生存能力、平均細胞直径及びウイルス感染細胞である容器中の細胞の総数の割合がインキュベーション中に計測されたそれらの値から実質上変化しないままであることを提供する条件下で冷凍される。したがって、これらの計測についての好ましい範囲は上記に引用される好ましい値から変化しないままである。しかしながら、冷凍プロセスは細胞安定性に影響しうる複雑な現象を含むので、冷凍された細胞が上記に示される所望の特徴の全てを顕著に保持することは許容される。例えば、所望の（冷凍前の）細胞生存能力の５０％までの喪失については許容がなされうる。
【００９６】
したがって、ウイルス感染細胞が氷結晶の大きさ及び形成を制御する及びそれゆえ細胞の安定性を保持する制御された冷却プロセスを経験することは重要である。上記用心は細胞膜の完全性を保つのを助け、及び付随して細胞生存能力、平均細胞直径及びウイルス感染細胞である容器中の細胞の総数の割合を上記冷凍手順中に変わらないまま維持するのを助けるはずである。細胞生存能力、平均細胞直径及びウイルス感染細胞である容器中の細胞の総数の割合は、それらが上記に示されるのと本質的に同じプロトコルを用いることにより冷凍された後、ウイルス感染細胞について決定されうる。
【００９７】
ＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞の生存能力が冷凍プロセスのためにどのように実質的に変わらないままであるかを図２及び３は図解し、及び実施例１は示す。図２はインキュベーション中のさまざまな時点のインキュベートされた細胞の生存能力を示す。図３は、実施例１中に示されるように分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され、３７℃で解凍され、及びＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１：２０で希釈された後の、図２中に示されるインキュベーション中の６、１２、１８、及び２４時間の時点で捕らえられたインキュベートされた細胞の生存能力を示す。図２中のインキュベートされた細胞の生存能力及び図３中の０時点の細胞の生存能力を比較するとき見られうるように、細胞が冷凍され及び解凍されても、生存能力は実質上変わらないままである（すなわち、細胞生存能力はＣＥＤＥＸ装置を用いて計測されるとき約９５％残存する）。
【００９８】
冷却のために本分野において通常使用されるいかなる方法も上記混合物を冷凍するために使用されうる。好ましくは、均一な、制御された冷却を達成するために、例えば、Ｐｌａｎｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｌｔｄにより製造されるＫＲＹＯ  １０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩの如き、プログラム可能な速度の細胞冷凍装置が使用される。他の例はＮａｌｇｅｎｅ  “Ｃｒｙｏ  １  Ｄｅｇｒｅｅ  Ｃ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ”（ＶＷＲ  ＃５５７１０−２００）であり、それもまた均一な、制御された冷却速度（１℃／分）を達成するために使用されうる。
【００９９】
好ましくは、上記混合物は１℃／分〜５℃／分、より好ましくは１℃／分の速度で温度を減少させることにより冷凍される。好ましくは、上記混合物は上記混合物の温度が−２０℃以下、より好ましくは−７０℃以下、最も好ましくは−１３０℃以下であることを提供するのに十分な時間及び条件下で冷凍される。上記冷凍された混合物はその後フリーザー内で又は液体窒素中で貯蔵されうる。
【０１００】
本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系は低温保存容器中に含まれる濃縮された感染細胞の冷凍混合物を含む。
【０１０１】
好ましくは、本発明に係るデリバリー系の低温保存容器中の細胞は５０％超、より好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超の生存能力を有する。
【０１０２】
好ましくは、生存能力及び／又は平均細胞直径は、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎにより製造されるＶＩ−ＣＥＬＬ装置、Ｇｕａｖａにより製造されるＰＥＲＳＯＮＡＬ  ＣＥＬＬ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ又はＩｎｎｏｖａｔｉｓにより製造されるＣＥＤＥＸ装置の如き、細胞生存能力及び平均細胞直径の計測のための上記に示される自動化装置の１を用いて決定される。最も好ましくは、生存能力及び／又は平均細胞直径はＣＥＤＥＸ装置を用いて決定される。典型的に、冷凍された混合物のサンプルは除去され、３７℃の水浴中で解凍され、連続希釈され、及びＣＥＤＥＸ装置を用いて分析されうる。
【０１０３】
好ましくは、本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の低温保存容器中のウイルス感染細胞は上記容器中の細胞の総数の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％を示す。
【０１０４】
低温保存容器中のウイルス感染細胞の割合は本分野において通常使用されるいかなる方法によっても決定されうる。好ましくは、ＧＦＰを発現する問題のウイルスの組換え変形を利用するＧＦＰ法がウイルス感染細胞の割合を決定するために使用される。ＧＦＰ−組換えウイルスは低温学的に保護されたウイルスデリバリー系のウイルス感染細胞を作出する宿主細胞を感染させるために使用される。ＧＦＰ−組換えウイルスに感染した細胞は緑色光（すなわち、蛍光）を発する。上記細胞のサンプルはその後除去され、３７℃の水浴中で解凍され、連続希釈され、及び例えば、ＦＩＴＣ  ｃｕｂｅ（カタログ番号  Ｒ６２０−０７）を伴うＮｉｋｏｎ  ＴＥ  ３００顕微鏡の如き蛍光顕微鏡下で視覚的に分析される。緑色光発光細胞の数及び細胞の総数はカウントされ、及び上記数はコンピュータ処理され、ウイルス感染細胞の割合を与える。
【０１０５】
より好ましくは、ウイルス感染細胞の割合はフローサイトメトリーを用いて決定される。この方法は細胞のサンプルを除去すること、３７℃の水浴中で上記サンプルを解凍すること、ＴＷＥＥＮ  ２０を含むＰＢＳを用いて上記細胞を洗浄すること、及びその後ｐ−フォルムアルデヒド及び、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｎｏ．  ３４９２０２の如き溶解試薬を含む溶液での処理によりそれらを浸透させることを含む。上記洗浄され及び浸透された細胞はその後、例えば、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質の如き、問題のウイルスにより発現されるタンパク質に特異的な蛍光結合抗体と共にインキュベートされる。上記抗体処理細胞はその後フローサイトメトリーを用いて、好ましくは、例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  ＶＡＮＴＡＧＥ装置の如きＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（“ＦＡＣＳ”）を用いることにより分析される。当業者は、蛍光剤に結合した及び問題の多くのウイルスにより発現されるタンパク質に特異的な抗体は周知であり、及び使用のために容易に選択されうることを容易に認識するであろう。
【０１０６】
低温保存容器中のウイルス感染細胞の濃度は一般的に１０6細胞／ｍｌ〜１０9細胞／ｍｌ、より好ましくは５×１０6細胞／ｍｌ〜５×１０8細胞／ｍｌである。上記容器中のウイルス感染細胞の濃度は、例えば、冷凍混合物のサンプルを除去し、３７℃の水浴中で上記混合物を解凍し、上記サンプルを連続希釈し、上記連続希釈物の少量をスライド上に置き、顕微鏡を用いてある体積の上記希釈サンプル中の細胞数をカウントし、及びその後希釈されていない混合物中の全ての細胞の濃度を数学的に計算することによるような、本分野において通常使用されるいかなる方法によっても決定されうる。この情報及び上記に示されるＧＦＰ又はフローサイトメトリー法により決定されるウイルス感染細胞の割合で、上記容器中のウイルス感染細胞の濃度を計算しうる。
【０１０７】
好ましくは、低温保存容器中に含まれる混合物の体積は０．１ｍｌ〜２００ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｌ〜２０ｍｌ、最も好ましくは１ｍｌ〜４ｍｌである。低温保存容器中の混合物の体積は、例えば、目盛りを定めた容器中に上記混合物を入れ、及び視覚的な観察により体積を決定することによるような、本分野において通常使用されるいかなる方法を用いても決定されうる。
【０１０８】
好ましくは、低温保存容器は１０5〜１０12のウイルス感染細胞、より好ましくは１０6〜１０10のウイルス感染細胞、最も好ましくは５×１０6〜５×１０8のウイルス感染細胞を含む。低温保存容器中のウイルス感染細胞の数は好ましくは上記に示されるＧＦＰ及び蛍光顕微鏡法を用いて、より好ましくは上記に示されるフローサイトメトリー法を用いて決定される。
【０１０９】
好ましくは、本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系は実質的に細胞外ウイルス粒子を含まず、及び実質的に消費されたインキュベーション培地を含まない。
【０１１０】
本明細書中で使用されるとき「実質的に細胞外ウイルス粒子を含まない」は、細胞外ウイルス粒子が、存在するウイルス粒子の総数の１０％未満であることを意味すると理解されるべきである。より好ましくは、分離及び回収段階後に存在する細胞外粒子は、存在するウイルス粒子の総数の３％未満、最も好ましくは１％未満である。
【０１１１】
細胞外ウイルス粒子であるウイルス粒子の総数の割合を計算するために、典型的に、存在するウイルス粒子の総数及び存在する細胞外ウイルス粒子の数が決定され、及びその後上記割合が数学的に計算される。
【０１１２】
冷凍段階後に存在するウイルス粒子の総数は好ましくは、例えば、３７℃の水浴中に上記混合物を置くことによるように冷凍された混合物を解凍し、上記混合物を希釈して１０6細胞／ｍｌの最終細胞濃度にし、上記細胞を溶解し、及び上記溶解物についてｐ．ｆ．ｕ．分析を行うことにより決定されうる。
【０１１３】
冷凍段階後に存在する細胞外粒子の数は好ましくは、例えば、３７℃の水浴中に上記混合物を置くことによるように冷凍された混合物を解凍し、及び例えば、遠心分離による又は上記培地及び細胞外ウイルス粒子をとおすが上記細胞はとおさないのに十分小さな孔サイズを有するフィルターをとおしてろ過することによるように上記解凍された混合物から上記細胞をおだやかに除去し、及びその後上記分離された培地についてｐ．ｆ．ｕ．分析を行うことにより決定されうる。
【０１１４】
本発明の特に好ましい態様はウイルス感染細胞が組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞である、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系である。
【０１１５】
本発明の他の好ましい態様はウイルス感染細胞がバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターに機能可能に結合された異種のポリヌクレオチドを有する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞である、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系である。
【０１１６】
本発明のさらに好ましい態様はウイルス感染細胞がアデノウイルスに感染した哺乳類細胞である、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系である。
【０１１７】
本発明のさらに他の好ましい態様はウイルス感染細胞がアデノウイルスに感染したＨＥＫ−２９３細胞である、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系である。
【０１１８】
本発明のさらに好ましい態様はウイルス感染細胞が組換えアデノウイルスに感染したＨＥＫ−２９３細胞である、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系である。
【０１１９】
本発明のさらに好ましい態様はウイルス感染細胞がインフルエンザウイルスに感染した哺乳類細胞である、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系である。
【０１２０】
低温保存されたデリバリー系の使用
本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系はさまざまな目的のために使用されうる。例えば、それらは宿主細胞を感染させ、及びその結果高い収率で及び一定の（すなわち、再現可能な）様式でウイルス及びウイルス製品を生成するために使用されうる。
【０１２１】
それが長い期間冷凍状態で貯蔵されても、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系中に含まれる細胞の生存能力、及び上記系が感染を開始する能力は実質上変化しないままであるので、一般的に上記デリバリー系を使用前に滴定することは不要である。
【０１２２】
低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の生産的感染を開始する能力は図４及び５中に図解され、及び実施例１中に示される。図４及び５は、実施例１中に示されるように分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され、３７℃で解凍され、ＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１：２０で希釈され、及び再びインキュベートされた後の、インキュベーション中の６及び１２時間の時点で捕らえられたＢＡＣＥを発現するバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞がどのようにインキュベーション中に膨張し（すなわち、平均細胞直径が増大し）続けたかを図解する（それぞれ、図４及び５中のＴ＝６及びＴ＝１２）。図４及び５はまた、細胞を回収する前に、接種された細胞のはじめのインキュベーション中に観察された細胞の大きさにおける増大をも示す。見られうるように、細胞の大きさの増大速度は６時間、１２時間及びはじめのインキュベーションサンプルについて同様である。細胞の大きさの増大速度における類似性は、低温学的に保存されたウイルスデリバリー系はインキュベーションが衰えず進んでいたかのように、細胞が回収された時点から感染プロセスを再開することができることを示唆する。
【０１２３】
低温学的に保護されたウイルスデリバリー系は複数の感染していない宿主細胞を上記冷凍混合物で接種することにより感染プロセスを開始するために直接的に使用されうる。あるいは、上記冷凍混合物は感染していない宿主細胞に添加する前に、はじめに部分的に又は完全に解凍されうる。例えば、低温学的に保護されたウイルスデリバリー系を上記冷凍混合物が液化するまで３７℃の水浴中に置くことによるような、細胞懸濁物を解凍するために本分野において通常使用されるいかなる方法も使用されうる。
【０１２４】
一般的に、細胞を感染させる方法は低温学的に保護されたウイルスデリバリー系中に含まれる混合物から得られた複数のウイルス感染細胞を提供すること、好ましくは１×１０5細胞／ｍｌ〜１×１０7細胞／ｍｌの感染していない宿主細胞の濃度を有する、複数の感染していない宿主細胞を提供すること、場合により上記ウイルス感染細胞を解凍し、洗浄し及び／又は溶解し、及び上記感染していない宿主細胞の少なくとも一部を上記複数のウイルス感染細胞の少なくとも一部で接種することを含む。
【０１２５】
感染していない宿主細胞の濃度は上記目的のために本分野において通常使用されるいかなる方法によっても決定されうる。好ましくは、感染していない宿主細胞の濃度は上記細胞の小サンプルを除去し、上記サンプルを連続希釈し、少量の上記連続希釈物をスライド上に置き、顕微鏡を用いてある体積の上記希釈サンプル中の細胞数をカウントし、及びその後希釈されていない混合物中の細胞濃度を数学的に計算することにより決定される。より好ましくは、感染していない宿主細胞の濃度は、例えば、ＣＥＤＥＸ装置の如き細胞濃度を計測することができる自動化装置を用いることにより決定される。
【０１２６】
感染していない宿主細胞は、上記に示される本発明において使用されうる広くさまざまな好ましい細胞型のいずれかでありうる。当業者は、選択される細胞型は、例えば、上記細胞型が問題のウイルスに感染しやすいかどうかのような、さまざまな基準に因り変化するであろうということを認識するであろう。
【０１２７】
感染していない宿主細胞を接種するために使用される混合物は好ましくは本発明に係る低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の記述において示されるものと同じ特徴を有し、及び上記に示されるのと同じプロトコルを用いて決定される。特に、上記混合物中のウイルス感染細胞の濃度は上記に示されるフローサイトメトリー法を用いて決定されるとき好ましくは１×１０6細胞／ｍｌ〜１×１０9細胞／ｍｌであり、上記混合物中の細胞の生存能力は上記に示されるＣＥＤＥＸ装置を用いて決定されるとき好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％であり、上記混合物は−２０℃以下、より好ましくは−７０℃以下の温度であり、及び上記混合物の体積は目盛りを定めた容器中での視覚的な観察を用いて決定されるとき好ましくは０．１ｍｌ〜２００ｍｌである。
【０１２８】
感染していない宿主細胞が、上記感染していない宿主細胞に添加されるウイルス感染細胞の数が細胞総数の１０％以下、より好ましくは細胞総数の１％以下を示すことを提供するよう接種されることが好ましい。ウイルス感染細胞の割合は、接種において使用されるウイルス感染細胞の適切な体積及び濃度、及び複数の感染していない宿主細胞の体積及び細胞濃度を選択することにより容易に制御されうる。
【０１２９】
低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の混合物中に含まれるウイルス感染細胞は場合により感染していない宿主細胞を接種する前に洗浄されうる。洗浄は上記混合物中の所望されない成分を除去するために使用されうる。細胞の洗浄は細胞を洗浄するために本分野において通常使用されるいかなる方法を用いても行われうる。好ましくは、細胞は上記細胞を緩衝液又は例えば、ＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭの如きインキュベーション培地中に希釈し、及びその後例えば、上記希釈された細胞を約１５０×ｇで１０分間遠心分離し及び上清を注ぐことによるように上記緩衝液から上記細胞を回収し及び分離することにより洗浄される。上記ペレット化された細胞はその後、例えば、上記ペレット化された細胞をインキュベーション培地と混合し及び上記混合された細胞を感染していない宿主細胞を接種するために用いることによるように、感染プロセスを開始するために使用されうる。
【０１３０】
低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の混合物中に含まれるウイルス感染細胞は場合により感染していない宿主細胞を接種する前に溶解されうる。典型的に、感染プロセスを実際に開始させるのは低温学的に保護されたウイルスデリバリー系中に含まれるウイルスであるので、一般的に感染していない宿主細胞との混合前に上記細胞を溶解することは不利益ではない。したがって、上記混合物中の細胞は、例えば、上記混合物を超音波処理することによる、上記混合物を繰返し凍結し及び解凍することによる、低張溶液中に上記混合物中の細胞を入れることによる又はウイルスバースト又は溶解プロセスを部分的に又は完全に進めるのに十分な時間インキュベーション培地の存在下で上記混合物中の細胞をインキュベートすることによるような、細胞を溶解するために本分野において通常使用されるいかなる方法によっても溶解されうる。好ましくは、上記細胞はウイルスバースト又は溶解プロセスを部分的に又は完全に進めるのに十分な時間インキュベーション培地の存在下で混合物中でインキュベートされる。
【０１３１】
接種された細胞はその後好ましくは、組成物中の細胞の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％がウイルス感染するのに十分な時間及び条件下でインキュベーション培地を含む組成物中でインキュベートされる。上記組成物中のウイルス感染細胞の割合は好ましくは上記に示されるＧＦＰ又はフローサイトメトリー法を利用して決定されうる。
【０１３２】
さらに、接種された細胞は、上記組成物中のウイルスの濃度が１０7ウイルス／ｍｌ〜１０11ウイルス／ｍｌになるのに十分な時間及び条件下でインキュベートされることが好ましい。上記組成物中のウイルスの濃度は上記組成物のサンプルを除去し、上記組成物中の細胞を溶解し、及び上記溶解物についてｐ．ｆ．ｕ．分析を行うことにより決定されうる。
【０１３３】
さらに、接種された細胞は、上記組成物中のポリペプチド濃度が０．０００１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌになるのに十分な時間及び条件下でインキュベートされることが好ましい。組換えポリペプチドの濃度は好ましくは、例えば、Ｄ．  Ｊ．  Ｒｅｅｎ，  Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２：４６１−４６６（１９９４）中に示されるＥＬＩＳＡプロトコルにしたがうことによるように、酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を用いることにより決定されうる。
【０１３４】
使用されるインキュベーション条件の及び使用される培地の決定は当業者によく知られる因子に基づいてなされうる。
【０１３５】
ウイルス製品の製造
例えば、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの如き、多くの型のウイルス製品が本発明に係るデリバリー系及び方法を用いて製造されうる。ウイルス製品はウイルスにより天然に生成されるものでありうる又は組換えでクローニングされた異種のポリヌクレオチドの結果として生成されうる。ウイルス製品はウイルス全体又は部分に加えて、例えば、タンパク質、酵素、ホルモン、サイトカイン、受容体、抗原、抗体、及びそれらの融合タンパク質の如き異種の又は同種のポリペプチドを含む。本明細書中で使用されるとき上記用語「異種の」は問題のウイルス又は宿主細胞により天然に生成されるもの以外を意味すると理解され、及び上記用語「同種の」は問題のウイルス又は宿主細胞により天然に生成されるものを意味すると理解される。
【０１３６】
本発明に係る組換えウイルスが有する異種のポリヌクレオチドは異種のポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳を駆動するために本分野において通常使用される異種の又は同種のプロモーターに機能可能に結合されうる。好ましくは、上記プロモーターはＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＴＫ、ＳＶ４０、Ｔ７、Ｓｐ６、ＥＭ７、ｂｌａ、Ａｃｔｉｎ、ＭＴ（メタロチオネイン）、ＥＦ−１アルファ、ＴＥＴ、エクヂステロイド応答プロモーター、ＭＭＴＶ、ＨＳＶ、ＨＳＶ−ＩＥ  １７５、ＭｕＬＶ、ＲＳＶ、ＥＦ−１又は例えば、バキュロウイルスポリヘドリン（すなわち、ｐｏｌｈ）、ｐ１０、３５ｋｄ  タンパク質、ＸＩＶ、（ｌａｔｅ）ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ、（ｅａｒｌｙ）ＥＴＬ、コアタンパク質（ｃｏｒ）、ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（例えば、ＩＥ０、ＩＥ１、ＩＥ−Ｎ、及びｐｅ３８）、及び（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅａｒｌｙ）ＤＥプロモーターの如きバキュロウイルスプロモーターである。より好ましくは、上記プロモーターはバキュロウイルスポリヘドリン、ＣＭＶ、ＣＭＶ−ＩＥ、ＳＶ４０、ＥＦ−１アルファ、ＭＴ又はＴＥＴプロモーターである。最も好ましくは、上記プロモーターはバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターである。本明細書中で使用されるとき上記用語「機能可能に結合される」は、プロモーターがその転写及び／又は翻訳を指令し及び制御するよう異種のポリヌクレオチドに十分に結合されることを意味すると理解される。
【０１３７】
本発明に係る方法を用いて作出されるウイルス製品は本分野において通常使用される多くのプロトコルの１を用いて単離され／採取され／回収されうる。
【０１３８】
好ましくは、ウイルスははじめにウイルス感染細胞を溶解してウイルスを放出させ、及びその後上記ウイルスを採取することにより単離されうる。上記細胞の溶解は、例えば、細胞への少量のクロロフォルムの添加及び生ずる懸濁物の混合の如き、本分野において通常使用されるさまざまな方法を用いて行われうる。細胞のいくらかの溶解は感染プロセスの自然の結果として既に起こっている場合があり、それゆえ、いくつかのウイルスは溶液中に既に存在しうることもありうるということに留意すべきである。さらに、いくつかのウイルス型は必ずしも細胞を溶解することなしに宿主細胞を出うる。したがって、ウイルス感染細胞の溶解はウイルスにより既に溶解された細胞又はウイルスの自然な分泌の結果として溶液中に存在する十分なウイルスのために必要でない場合もある。
【０１３９】
一旦ウイルス感染細胞が溶解されたら、ウイルスは、例えば、溶液を１０，０００×ｇで１０分間２回遠心分離することによるような、本分野において通常使用されるいかなる方法によっても細胞くず及び残りの細胞から分離されうる。上記部分的に精製されたウイルスはその後、例えば、生ずる上清を、例えば、４０，０００×ｇの如きより速いスピードで３０分間遠心分離し、部分的に精製されたウイルスペレットを回収することによるような、溶液からウイルスを回収するために本分野において通常使用されるいかなる方法によっても回収されうる。上記再懸濁されたペレット中のウイルスはその後、例えば、上記ペレットを、例えば、ＴＥ緩衝液の如き緩衝液中に再懸濁し、及び例えば、５％／４０％スクロース段階勾配をとおした４０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によるように、上記再懸濁したペレットをスクロース段階勾配をとおして遠心分離することによるような、本分野において通常使用されるいかなる方法によってもさらに精製されうる。５％／４０％スクロース段階勾配において、ウイルスは２層のスクロースの間に集まり、及びピペットで集まったウイルスを除去することにより採取される。
【０１４０】
好ましくは、感染細胞により分泌されないウイルス以外のウイルス製品は、例えば、上記細胞を２，５００×ｇで５分間スピンダウンし、例えば、５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００の如き細胞を溶解するための本分野において既知の界面活性剤を含む緩衝液中で上記細胞をインキュベートすることにより上記細胞を溶解し、４５，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより細胞くずを除き、及び問題のウイルス製品を含むはずである上清を回収することによるような、この目的のために本分野において通常使用されるいかなる方法を用いても感染細胞を回収することにより単離されうる。
【０１４１】
好ましくは、分泌されるウイルス製品は単に２，５００×ｇで５分間上記培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、及びその後問題の分泌されたウイルス製品を含むはずである上清を回収することにより単離されうる。
【０１４２】
以下の実施例は本発明のプロセス及び組成をさらに例示するために提供される。これらの実施例は例示のためのみであり、及びどのようにも本発明の範囲を制限するとは意図されない。
【実施例】
【０１４３】
実施例１
ｈｉｓ−タグ付きＢｅｔａ−部位ＡＰＰ（Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）切断酵素（ＢＡＣＥ）を発現するバキュロウイルス発現系に感染したＳｆ９昆虫細胞を用いた低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の調製
ｈｉｓ−タグ付きＢｅｔａ−部位ＡＰＰ（Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）切断酵素（ＢＡＣＥ）タンパク質（ＢＡＣＥはｉｎｔｅｒ  ａｌｉａで、本出願の所有者以外のグループにより所有される、米国公開特許出願番号２００２／００４９３０３、及び国際公開明細書番号ＷＯ００４７６１８、ＷＯ０１００６６３、ＷＯ００１７３６９及びＷＯ００５８４７９中に示される）を発現する組換えバキュロウイルスをＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Ｇｉｂｃｏ＃１０６０８−０１６）を用いて構築した。４．７×１０8ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌのウイルスストックを作製した。
【０１４４】
Ｓｆ９不死化細胞系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた。
ＳＦ９細胞を２００ｍｌの以下に示される培地を含むフラスコ中で７．５×１０5生存可能細胞／ｍｌになるまで生育させた：
【０１４５】
培地：
ＳＦ  ９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０９０２−０８８）
１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）
５ｍｇ／Ｌ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５７１０−０７２）
【０１４６】
上記細胞培養物をその後３のＭ．Ｏ．Ｉ．で、滴定したバキュロウイルス−ＢＡＣＥストックに感染させ、及び２７℃、ＣＯ2及び湿度制御なし、及び１３０ｒｐｍでインキュベートした。細胞外バキュロウイルスの濃度及び細胞の大きさ（すなわち、平均細胞直径）（図１を参照のこと）に加えて、細胞生存能力（図２を参照のこと）をモニターした。
【０１４７】
細胞生存能力及び細胞の大きさをＣＥＤＥＸ分析手順を用いることにより決定した。
細胞外バキュロウイルスの濃度をプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）分析手順を用いることにより決定した。
【０１４８】
インキュベーションの約６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３８時間、及び５０時間後、約２０ｍｌ、１７ｍｌ、１４ｍｌ、１３ｍｌ、１３ｍｌ、１３ｍｌ、及び１７ｍｌの培養物を除去し、それぞれ、５０−ｍｌ円錐形遠心分離管に入れ及び６８０ｒｐｍで１０分間スピンダウンさせた。上記上清を注ぎ、及びプラーク及び他の分析を行うために冷蔵温度で貯蔵した。上記ペレットをその後冷凍培地中に再懸濁し、約１×１０7細胞／ｍｌの生存可能細胞濃度を与えた。
【０１４９】
冷凍培地：
９０％（ｖ／ｖ）Ｓｆ  ９００  ＩＩ  ＳＦＭ  （Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０９０２−０８８）
１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン
１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ
【０１５０】
１ｍｌ等分の細胞懸濁物をその後Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからの滅菌１．８ｍｌ低温保存バイアル、Ｎｕｎｃブランド（３７７２６７）ＶＷＲカタログ番号  ６６０２１−９８６中へピペットで入れた。上記バイアルをその後１℃／分  Ｃｒｙｏ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｎａｌｇｅｎｅ  ＃  ５１００−０００１）中に置き、及びその後上記容器を−７５℃フリーザーに一晩置いた。上記バイアルをその後長期貯蔵のために約−１５０℃の液体窒素貯蔵タンクに入れた。
【０１５１】
６時間、１２時間、１８時間、及び２４時間低温保存バイアルのそれぞれの１を液体窒素貯蔵から除去し、３７℃の水浴中ですばやく解凍し、及びＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１：２０で希釈し、及び生存能力をＣＥＤＥＸ法によりモニターした。図３は、これらの低温保存感染細胞がそれらの生存能力をあまり喪失することなしに回復されたことを示す。感染６時間及び１２時間後に捕らえられ、スピンダウンされ、冷凍培地中に再懸濁され、冷凍され及び液体窒素中に貯蔵された感染細胞は感染プロセスが妨げられなかった場合と同じくそれらの感染プロセスを本質的に再開しうることを図４及び５から留意することもまた興味深い。図４及び５はこの点を示すために細胞直径増大を使用した。さらに、２４時間バイアルの１を液体窒素フリーザーから除去し、及び３７℃の水浴中ですばやく解凍した。上記解凍されたウイルスデリバリー細胞懸濁物を１００ｍｌのＳＦ  ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地に添加した（１：１００希釈）。１ｍｌの上記希釈された細胞懸濁物を１００ｍｌのＳＦ  ９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地中の以下の濃度のＳｆ９細胞懸濁物を含む３の培養フラスコのそれぞれに添加した：
【０１５２】
フラスコ１：０．５０×１０6Ｓｆ９細胞／ｍｌ
フラスコ２：０．７５×１０6Ｓｆ９細胞／ｍｌ
フラスコ３：１．００×１０6Ｓｆ９細胞／ｍｌ
【０１５３】
生ずる懸濁物を２７℃、ＣＯ2及び湿度制御なし、及び１３０ｒｐｍでインキュベートした。１．５ｍｌ等分を感染２４、４８、７２、９６及び１２３時間後に除去した。上記等分を１６，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を注ぎ、及び−２０℃で貯蔵した。上記上清をその後解凍し、及びｔｅｔｒａ−ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ  ＃  ４６７０）を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析を介して分析した。フラスコ１、フラスコ２、及びフラスコ３からの７２時間及び９６時間上清は全てコントロールサンプルと等しい又はそれよりよいＢＡＣＥ発現を示した。コントロールサンプルは伝統的なウイルスストック（すなわち、細胞外ウイルスストック）を用いた感染していないＳｆ９細胞又はＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞の感染から生ずる最もよいＢＡＣＥ発現を示す。同等なＢＡＣＥ発現はまた、感染していないＨｉ−Ｆｉｖｅ細胞が低温学的に保護された、ＢＡＣＥバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞に感染したときも得られた。
【０１５４】
実施例２
切り取られたｈｉｓ−ＦＡＫｃｄポリペプチドを発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を用いた低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の調製
ＦＡＫ（焦点接着キナーゼ）タンパク質のｃｄ（触媒ドメイン）の一部を発現する組換えバキュロウイルスをＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０６０８−０１６）を用いて構築した。１．３×１０8ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌのウイルスストックを作製した。
【０１５５】
Ｓｆ９不死化細胞系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた。
Ｓｆ９を０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５７１０−０６４）で補充したＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０９０２−０８８）インキュベーション培地中で生育させた。１００ｍｌの５×１０5細胞／ｍｌのＳｆ９細胞を３８マイクロリットルのウイルスストックで接種した。
【０１５６】
上記接種された細胞を以下の条件下でインキュベートした：２７℃、ＣＯ2及び湿度制御なし、及び１３０ｒｐｍ。細胞濃度、細胞生存能力、及び細胞直径（細胞体積を計算するために使用されうる）をＩｎｎｏｖａｔｉｓからのＣＥＤＥＸユニットを用いてモニターした。
【０１５７】
インキュベーション約２８．５時間後、上記細胞の大きさが増大し及び安定水準に達し、及び細胞生存能力が約９５％であったとき、５０ｍｌ分の上記細胞を５０−ｍｌ円錐形遠心分離管中に入れ、及びＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＴＪ−２５遠心分離器内で６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞外ウイルス粒子及び消費されたインキュベーション培地を含む上記上清をその後注いだ。
【０１５８】
上記ペレットをその後９０％（ｖ／ｖ）ＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、及び１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む冷凍培地中に再懸濁し、及びその後Ｎｕｎｃブランド１．８−ｍｌ  ＣＲＹＯＴＵＢＥＳ中に等分し、それぞれの等分は１ｍｌの体積を有し及び約１×１０7生存可能細胞を含み、全ての段階は無菌的に行われた。
【０１５９】
バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を含むバイアルをその後約−７５℃の最終温度になるまで約１℃／分の速度で冷凍し、及びその後上記バイアルを長期貯蔵のために液体窒素キャニスター内に移した。
【０１６０】
１のバイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、３７℃で解凍し、及び０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシンで補充した１００ｍｌのＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地に添加した。フラスコ全体をその後１．１×１０6細胞／ｍｌの細胞濃度の０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １５７１０−０６４）で補充したＳｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃  １０９０２−０９６）中で生育させた１０リットルの感染していないＳｆ９細胞に添加した。上記細胞をその後以下の条件下でインキュベートした：２７℃、１リットル／分トップエアー、１２０ｒｐｍ、散布された酸素で５０％超の飽和にＤ．Ｏ．制御、ｐＨ制御なし。１０−Ｌ培養物全体を７０時間のインキュベーション後に採取した。同じ培地中で生育させたコントロール１０−Ｌ  Ｓｆ９培養物を１．０のＭ．Ｏ．Ｉ．で慣用のウイルスストックに１．９×１０6細胞／ｍｌの細胞濃度で感染させた。それを感染６８．５時間後に採取した。並行した精製に際して、２の１０−Ｌ採取物はそれぞれ２５及び１０ｍｇの精製ＦＡＫｃｄを産出した。
【０１６１】
実施例３
実施例３の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系を用いて作製された切り取られたｈｉｓ−ＦＡＫポリペプチドの精製
実施例２の低温学的に保護されたウイルスデリバリー系で接種したＳｆ９細胞培養物（すなわち、切り取られたｈｉｓ−ＦＡＫｃｄ組換えポリペプチドを発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞）に由来する１３０ｇの細胞ペーストを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＴＣＥＰ及びＣＯＭＰＬＥＴＥプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ）を含む３倍体積（４００ｍｌ）の緩衝液Ａ中に再懸濁した。上記細胞をマイクロフルイダイザー上の１のパスで溶解させ、及び細胞くずをＳｏｒｖａｌ  ＳＬＡ−１５００ローター内での４℃で１４，０００ｒｐｍで３５分間の遠心分離により除去した。上記上清をクリーンな管に移し、及び６．０ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を添加した。上記懸濁物を４℃で１時間のおだやかな振騰でインキュベートし、及びその後スウィングバケットローター内での７００×ｇの遠心分離にかけた。上記上清を捨て及び上記アガロースを２０．０ｍｌの緩衝液Ａ中に再懸濁し、及びＦＰＬＣにつなげたＸＫ−１６カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に移した。上記アガロースを５倍カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、及び３００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａの段階勾配で上記カラムから溶離した。上記溶離画分を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、４００ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１ｍＭ  ＴＣＥＰを含む緩衝液Ｂに緩衝液交換した。緩衝液交換に続いて、トロンビンを１：３００（ｗ／ｗ）の割合で上記集められた画分に添加し、及び１３℃で一晩インキュベートし、Ｎ−末端ｈｉｓ−タグを除去した。上記反応混合物を緩衝液Ａで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラム上に再びロードし、及びフロースルーを回収した。上記フロースルーを１．７ｍｌになるまで濃縮させ、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２００ｍＭ  硫酸アンモニウム及び０．１ｍｌ  ＴＣＥＰを含む緩衝液Ｃで平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ  ２００  ＨＩＬＯＡＤ  １６／６０プレップグレードカラム上に直接的にロードした。所望のタンパク質は８５〜９５ｍｌの間で溶離した。上記タンパク質を等分し、及び−７５℃で冷凍貯蔵した。
【０１６２】
実施例４
ＰＤＥ−１Ｂ−１３ポリペプチドを発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を用いた低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の調製
ＰＤＥ−１Ｂタンパク質の触媒領域の一部（ＰＤＥ−１Ｂ−１３と示される）を発現するバキュロウイルスをＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０３５９−０１６）を用いて構築した。ウイルスストックを作製したが、滴定しなかった。
Ｓｆ９はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた。細胞濃度、細胞生存能力、及び細胞直径をＩｎｎｏｖａｔｉｓからのＣＥＤＥＸユニットを用いて決定した。
【０１６３】
Ｓｆ９を５ｍｌ／Ｌ抗生剤／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２４０−０６２）で補充したＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０９０２−０８８）インキュベーション培地中で生育させた。１．６８×１０6細胞／ｍｌの１リットルのＳｆ９細胞を２０ミリリットルの上記ストックウイルスに感染させた。２４時間のインキュベーション後、上記細胞の大きさが約３．８μｍ増大し、及び細胞生存能力が８８．８％であったとき、上記細胞をスピンダウンし、上清を注ぎ、ペレットを８０％（ｖ／ｖ）ＳＦ−９００ ＩＩ ＳＦＭ、２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、及び２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む２×冷凍培地中に再懸濁し、及びそれぞれ約１×１０8生存可能細胞／ｍｌを含む１．０ｍｌ等分に分配し、全ての段階は無菌的に行われた。上記バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を含むバイアルをその後約−７５℃まで約１℃／分の速度で冷凍し、及びその後長期貯蔵のために液体窒素キャニスター内に移した。
【０１６４】
２の冷凍したバイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、３７℃で解凍し、及び１と２分の１バイアルの内容物を１０ｍｌ／Ｌ抗生剤／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２４０−０６２）で補充した４００ｍｌのＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃  ９６−００１−１０）に添加した。上記フラスコ全体をその後１．５４×１０6細胞／ｍｌの細胞濃度の、１０ｍｌ／Ｌ抗生剤／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２４０−０６２）で補充したＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃  ９６−００１−１０）中で生育させた１００リットルの感染していないＳｆ９細胞に添加した。上記１００−Ｌ培養物全体を７２時間のインキュベーション後に採取した。上記１００−Ｌ採取物からのＰＤＥ−１Ｂ−１３の発現レベル及び回復収率は慣用のバキュロウイルス調製物又はＰＤＥ−１Ｂ−１３を発現するバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞で感染させた、振騰フラスコ、１０−Ｌ攪拌タンク又は１０−Ｌ  Ｗａｖｅバイオリアクター中でのより小さいスケールの感染のそれらと同等である。
【０１６５】
実施例５
切り取られたＧＳＫ３−ｂｅｔａポリペプチドを発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を用いた低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の調製
ＧＳＫ３−ｂｅｔａタンパク質の切り取られた一部を発現するバキュロウイルスをＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０６０８−０１６）を用いて構築した。ウイルスストックを作製したが、滴定しなかった。
【０１６６】
Ｓｆ９はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた。細胞濃度、細胞生存能力、及び細胞直径をＩｎｎｏｖａｔｉｓからのＣＥＤＥＸユニットを用いて決定した。
【０１６７】
Ｓｆ９を０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５７１０−０６４）で補充したＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０９０２−０８８）中で生育させた。１．９２×１０6細胞／ｍｌの１０００ｍｌのＳｆ９細胞を１ｍｌの上記ストックウイルスに感染させた。約３６時間のインキュベーション後、上記細胞の大きさが増大し及び安定水準に達したとき、上記細胞をスピンダウンし、上清を注ぎ、ペレットを９０％（ｖ／ｖ）ＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、及び１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む冷凍培地中に再懸濁し、及びそれぞれ約１×１０7細胞／ｍｌを含む１ｍｌ等分に分配し、全ての段階は無菌的に行われた。上記バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を含むバイアルをその後約−７５℃まで約１℃／分の速度で冷凍し、及びその後長期貯蔵のために液体窒素キャニスター内に移した。
【０１６８】
冷凍したバイアルの１を液体窒素貯蔵から取り出し、３７℃で解凍し、及び０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５７１０−０６４）で補充した１００ｍｌのＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０９０２−０８８）インキュベーション培地に添加した。上記フラスコ全体をその後１×１０6細胞／ｍｌの細胞濃度の、０．５ｍｌ／Ｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５７１０−０６４）で補充したＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０９０２−０８８）中で生育させた１０リットルの感染していないＳｆ９細胞に添加した。上記１０−Ｌ培養物を７２時間のインキュベーション後に採取した。上記１０−Ｌ採取物からの切り取られたＧＳＫ３−ｂｅｔａタンパク質の発現は、Ｓｆ９又はＳｆ２１細胞が慣用のバキュロウイルス調製物又は切り取られたＧＳＫ３−ｂｅｔａを発現するバキュロウイルスに感染した昆虫細胞に感染した振騰フラスコにおける発現と同等であった。
【０１６９】
実施例６
ＧＦＰポリペプチドを発現するアデノウイルス感染ＨＥＫ−２９３細胞を用いた低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の調製
Ａｄ５．ＣＭＶ−ＧＦＰアデノウイルスストックはＱ−Ｂｉｏｇｅｎｅ（カタログ番号  ＡＤＶ００３０）から得られた。これはＧＦＰタンパク質を発現する組換えウイルスである。製造業者の仕様書は約１〜１．５×１０11ウイルス粒子／ｍｌのウイルスタイターを示した。
【０１７０】
ＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）−２９３不死化細胞系、２９３−ＥＢＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた（カタログ番号  Ｒ６２０−０７）。
【０１７１】
２９３−ＥＢＮＡを５％ウシ胎児血清、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び２５０ｍｇ／Ｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎで補充した２９３  ＳＦＭ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１６８６）インキュベーション培地中で生育させた。７．５×１０5細胞／ｍｌの１００ｍｌの２９３−ＥＢＮＡ細胞を３７．５マイクロリットルの上記Ａｄ５．ＣＭＶ−ＧＦＰ（ＡＤＶ００３０）ウイルスストックで接種した。予測されるＭ．Ｏ．Ｉ．は５０〜７５であった。
【０１７２】
上記接種された細胞を以下の条件下でインキュベートした：３６．５℃、５％ＣＯ2、７５％湿度、及び１３０ｒｐｍ。細胞濃度、細胞生存能力、及び細胞直径（細胞体積を計算するために使用されうる）をＩｎｎｏｖａｔｉｓからのＣＥＤＥＸユニットを用いてモニターした。ウイルス感染細胞の割合をＦＩＴＣ  ｃｕｂｅ（部品番号ＦＩＴＣ  ＨＱ  Ｃ−２７７６６）蛍光顕微鏡を伴うＮｉｋｏｎ  ＴＥ  ３００顕微鏡を用いてＧＦＰの発現のために緑色蛍光を発する細胞の割合を視覚的に計測することにより決定した。
【０１７３】
上記細胞の大きさが増大し及び安定水準に達したとき、及び細胞の６０％超がＧＦＰ陽性であり、及び細胞生存能力が約６９％であったとき、３０ｍｌ分の上記細胞を５０−ｍｌ円錐形遠心分離管中に入れ及び約１５０×ｇで５分間遠心分離した。細胞外ウイルス粒子及び消費されたインキュベーション培地を含む上清をその後注いだ。
【０１７４】
上記ペレットをその後７０％（ｖ／ｖ）生育培地、２０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、及び１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む冷凍培地中に再懸濁し、０．９×１０7細胞／ｍｌのウイルス感染細胞の濃度を得、及びその後Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌからの１．８ｍｌ低温保存バイアル、Ｎｕｎｃブランド＃３７７２６７（ＶＷＲ  ＃６６０２１−９８６）に等分し、それぞれの等分は１ｍｌの体積を有し及び約１×１０7生存可能細胞を含んだ。
【０１７５】
上記アデノウイルス感染２９３−ＥＢＮＡ細胞を含むバイアルをその後約−７５℃の最終温度まで約１℃／分の速度で冷凍し、及びその後上記バイアルを長期貯蔵のために液体窒素キャニスター内に移した。上記バイアル中の細胞の生存能力はＣＥＤＥＸ分析を用いることにより約５２％であると冷凍後に決定された。ウイルス感染細胞の濃度はＧＦＰ法を用いることにより約０．９×１０7細胞／ｍｌであると決定された。ウイルス感染細胞である細胞全部の割合はＧＦＰ法により約６０％であると決定された。
【０１７６】
上記冷凍アデノウイルス感染２９３−ＥＢＮＡ細胞の１のバイアルをその後液体窒素貯蔵から取り出し、約３７℃で解凍し、及び５％ウシ胎児血清、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び２５０ｍｇ／Ｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎで補充した１００ｍｌの２９３  ＳＦＭ−ＩＩ培地に添加し、「マスターウイルスフラスコ（ＭＶＦ）」を作出した。上記細胞をその後以下の条件下でインキュベートした：３６．５℃、５％ＣＯ2、７５％湿度、及び１３０ｒｐｍ。０、２４、４８又は７２時間のインキュベーション後、上記ＭＶＦからの一部を１：１０の割合で感染していない２９３−ＥＢＮＡ細胞に添加し、「中間ウイルスフラスコ（ＩＶＦ）」を作出した。７２時間のインキュベーション後、上記ＩＶＦの一部を１：１００の割合で感染していない２９３−ＥＢＮＡ細胞に添加し、「最終ウイルスフラスコ（ＦＶＦ）」を作出した。時点サンプルを細胞濃度、細胞生存能力、細胞直径、及びＧＦＰ決定のためにＭＶＦ、ＩＶＦ、及びＦＶＦから取った。上記ＭＶＦが４８又は７２時間インキュベートされた好ましい条件下で、上記ＦＶＦにおける４８時間のインキュベーション後、ＦＩＴＣ  ｃｕｂｅ（部品番号  ＦＩＴＣ  ＨＱ  Ｃ−２７７６６）蛍光顕微鏡を伴うＮｉｋｏｎ  ＴＥ  ３００顕微鏡を用いてＧＦＰの発現のために緑色蛍光を発する細胞の割合を視覚的に計測することにより決定されるように、最大８０〜９０％の細胞がウイルス感染した。コントロール条件、すなわち、商業的に入手可能な及び伝統的なＡｄ５．ＣＭＶ−ＧＦＰウイルス調製物が５０〜７５のＭ．Ｏ．Ｉ．で直接的に２９３−ＥＢＮＡ細胞を感染させるために使用されたとき、最大７５〜８０％の細胞が２４時間でＧＦＰ陽性であった。
【０１７７】
実施例７
Ｇタンパク質を発現するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞を用いた低温学的に保護されたウイルスデリバリー系の調製
Ｇタンパク質のアルファ、ベータ、及びガンマサブユニットを発現する組換えバキュロウイルスはＢｉｏＳｉｇｎａｌから得られた（それぞれ、カタログ番号  ＢＣＶ−１０６、ＢＣＶ−１０５、及びＢＣＶ−１６１）。製造業者の仕様書は、上記ウイルスストックのウイルスタイターは約２〜５×１０8ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌであることを示した。上記市販のウイルスについてはじめに標準のバキュロウイルス拡張法にしたがって、体積を拡張した。ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＥＶＳ）ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００２）を参照のこと。アルファ、ベータ、及びガンマサブユニットについての新規に拡張したウイルスストックは、それぞれ、７、１０、及び８×１０8ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌのタイターを有した。
【０１７８】
Ｓｆ９不死化細胞系はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られた。
Ｓｆ９を５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンで補充したＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ｃａｔ．  １０９０２−０８８）中で生育させた。５×１０5細胞／ｍｌの２２０ｍｌのＳｆ９細胞をＧタンパク質のアルファサブユニットを発現する７３．３マイクロリットルの上記拡張したバキュロウイルスストックで接種した。
【０１７９】
上記接種された細胞を以下の条件下でインキュベートした：２７℃、ＣＯ2及び湿度制御なし、及び１３０ｒｐｍ。細胞濃度、細胞生存能力、及び細胞直径（細胞体積を計算するために使用されうる）をＩｎｎｏｖａｔｉｓからのＣＥＤＥＸユニットを用いてモニターした。
【０１８０】
約４６時間のインキュベーション後、上記細胞の大きさが約１４から約１８〜１９ミクロンまで増大し、及び細胞生存能力が９０％超であったとき、５０ｍｌ分の上記細胞を５０−ｍｌ円錐形遠心分離管中に入れ、及びＢｅｃｋｍａｎ  ＣＰＲ遠心分離器内で６８０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞外ウイルス粒子及び消費されたインキュベーション培地を含む上清をその後注いだ。
【０１８１】
上記ペレットをその後９０％  ＳＦ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、及び１０％ＤＭＳＯを含む冷凍培地中に再懸濁し、及びその後Ｎｕｎｃブランド１．８ｍｌ  ＣＲＹＯＴＵＢＥＳ中に等分し、それぞれの等分は１．１ｍｌの体積を有し及び約１×１０7生存可能細胞を含み、全ての段階は無菌的に行われた。
【０１８２】
上記バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞（ＢＩＩＣ−Ａ）を含むバイアルをその後約−７５℃の最終温度まで約１℃／分の速度で冷凍し、及びその後上記バイアルを長期貯蔵のために液体窒素キャニスター内に移した。
【０１８３】
上記に示されるのと同じプロトコルを用いて、Ｇタンパク質のベータ又はガンマサブユニットを発現するバキュロウイルスに感染したウイルス感染細胞（それぞれＢＩＩＣ−Ｂ、ＢＩＩＣ−Ｇ）を含むバイアルもまた調製した。さらに、Ｇタンパク質のアルファ、ベータ及びガンマサブユニットを発現するバキュロウイルスに感染したウイルス感染細胞（ＢＩＩＣ−ＡＢＧ）を含むバイアルを、７３．３マイクロリットルのそれぞれの３のウイルス（アルファ、ベータ、及びガンマ）をＳｆ９細胞を感染させるために使用したことを除いては、同様に調製した。
【０１８４】
ＢＩＩＣ−Ａ、ＢＩＩＣ−Ｂ、ＢＩＩＣ−Ｇ、及びＢＩＩＣ−ＡＢＧウイルス感染細胞のそれぞれの１のバイアルをその後液体窒素貯蔵から取り出し、３７℃で解凍し、及び１．０ｍｌを５ｍｇ／Ｌゲンタマイシンで補充した１００ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地に添加し、希釈されたＡ、Ｂ、Ｇ、及びＡＢＧフラスコを作出した。上記細胞をその後以下の条件下でインキュベートした：２７℃、ＣＯ2及び湿度制御なし、及び１３０ｒｐｍ。約５分間のインキュベーション後、上記希釈されたＡ、Ｂ、及びＧフラスコのそれぞれからの１ｍｌを９．６７×１０5細胞／ｍｌの細胞濃度の、２％不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ  ＃１６１４０−０７１）、１％脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ  ＃２１９００−０３０）、及び１％抗生剤／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ  ＃１５２４０−０６２）で補充したＩＰＬ−４１培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃１１４０５０８１）中で生育させた１００ｍｌの感染していないＳｆ９細胞に添加し、Ａ＋Ｂ＋Ｇ最終フラスコを作出した。また、上記希釈されたＡＢＧフラスコからの１ｍｌを同じ細胞濃度の、同じ培地中で生育させた１００ｍｌの感染していないＳｆ９細胞に添加し、ＡＢＧ最終フラスコを作製した。時点サンプルを細胞濃度、細胞生存能力、細胞直径、及びＧタンパク質の発現についてのウェスタン分析を分析するために上記Ａ＋Ｂ＋Ｇ及びＡＢＧ最終フラスコから取った。上記Ａ＋Ｂ＋Ｇ又は上記ＡＢＧ最終フラスコからの７２時間及び９６時間サンプルは免疫反応性Ｇタンパク質の同等の生成を示した。アルファ、ベータ、及びガンマサブユニットを発現する慣用のウイルスストックが感染していないＳｆ９細胞を共感染するために使用されたとき、コントロールが得られた。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１】図１はＢｅｔａ−部位ＡＰＰ（Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ（“ＢＡＣＥ”）を発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞のインキュベーション中の細胞外バキュロウイルス濃度及び細胞の大きさの相関関係を示すグラフである。細胞外バキュロウイルスの濃度はｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌでログスケールで示され（−黒四角−）、及び平均細胞直径はμｍ直径として示される（−白丸−）。上記感染細胞培養物のサンプルをインキュベーション中のさまざまな時点（感染後の時間（“ｈｐｉ”）としてグラフ中に示される）で除去し、及び細胞外バキュロウイルスの濃度及び平均細胞直径を、それぞれ実施例１中に示されるように、プラーク分析及び平均細胞直径を計測することができる自動化装置（ＣＥＤＥＸ装置）を用いることにより決定した。平均細胞直径は約１８ｈｐｉでピークに達し、及びその後安定水準に達する。細胞外バキュロウイルス濃度は約１２ｈｐｉで増大しはじめ、及び約４０ｈｐｉでピークに達する。
【図２】図２は、ＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞のインキュベーション中の細胞生存能力及び生存可能細胞濃度を示すグラフである。生存可能細胞濃度は生存可能細胞数／ｍｌとしてログスケールで示され（−黒四角−）、及び生存能力は％生存可能細胞として示される（−白丸−）。上記感染細胞培養物のサンプルをインキュベーション中のさまざまな時点（ｈｐｉとしてグラフ中に示される）で除去し、及び生存可能細胞濃度及び細胞生存能力を、実施例１中に示されるように、生存可能細胞濃度及び細胞生存能力を計測することができる自動化装置（ＣＥＤＥＸ装置）を用いることにより決定した。
【図３】図３は、実施例１中に示されるように分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され、３７℃で解凍され、及びＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１：２０で希釈された後の、はじめのインキュベーション（図２中に示される）中の６、１２、１８、及び２４時間の時点で捕らえられたＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞の生存能力を示すグラフである。上記希釈された細胞をインキュベートし、及びサンプルをさまざまな時点（ｈｐｉとしてグラフ中に示される）で除去し、及び細胞生存能力を実施例１中に示されるように、細胞生存能力を計測することができる自動化装置（ＣＥＤＥＸ装置）を用いることにより決定した。生存能力は６（−黒四角−）、１２（−白丸−）、１８（−白三角上向き−）、及び２４時間（−白三角下向き−）の時点について％生存可能細胞として示される。
【図４】図４は、実施例１中に示されるように分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され、３７℃で解凍され、及びＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１：２０で希釈された後の、図２中に示されるはじめのインキュベーション中の６時間の時点で捕らえられたＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞の平均細胞直径における増大を示すグラフである。上記希釈された細胞をインキュベートし、及びサンプルをさまざまな時点（ｈｐｉとしてグラフ中に示される）で除去し、及び平均細胞直径を実施例１中に示されるように、平均細胞直径を計測することができる自動化装置（ＣＥＤＥＸ装置）を用いることにより決定した。比較のために、分離及び回収前の、はじめのインキュベーション中の感染細胞の平均細胞直径増大もまた示される。平均細胞直径は６時間の時点について（−白丸−）、及び回収前のはじめのインキュベーションについて（−黒四角−）μｍ直径として示される。分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され及び解凍された６時間サンプル、及び分離及び回収前のはじめのサンプルの平均細胞直径における増大を比較するとき見られうるように、細胞の大きさにおける増大は互いによく似ており、そのことは感染プロセスが衰えていないかのように進むことを示唆する。
【図５】図５は、実施例１中に示されるように分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され、及び３７℃で解凍され、及びＳＦ  ９００−ＩＩ  ＳＦＭ培地中に１：２０で希釈された後の、図２中に示されるはじめのインキュベーション中の１２時間の時点で捕らえられたＢＡＣＥを発現する組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞の平均細胞直径増大を比較する。上記希釈された細胞をインキュベートし、及びサンプルをさまざまな時点（ｈｐｉとしてグラフ中に示される）で除去し、及び平均細胞直径を実施例１中に示されるように、平均細胞直径を計測することができる自動化装置（ＣＥＤＥＸ装置）を用いることにより決定した。比較のために、分離及び回収前の、はじめのインキュベーション中の感染細胞の平均細胞直径増大もまた示される。細胞の大きさは１２時間の時点について（−白三角上向き−）及び回集前のはじめのインキュベーションについて（−黒四角−）μｍ直径として示される。分離され及び回収され、凍結防止剤と混合され、冷凍され及び解凍された１２時間サンプル、及び分離及び回収前のはじめのサンプルの細胞の大きさにおける増大を比較するとき見られうるように、細胞の大きさにおける増大は互いによく似ており、そのことは感染プロセスが衰えていないかのように進むことを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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