(57)【要約】【課題】ソマトトロピン受容体遺伝子の多型の分析に基づいた、一定の乳生産能力を有する動物の選択のための方法及びキット【解決手段】本発明は、動物の中で、乳生産能力及び乳組成の形質を識別するのに用いる遺伝子マーカーに関する。該マーカーは、ソマトトロピン（成長ホルモンとも呼ばれる）受容体（ＧＨ−Ｒ）のアミノ酸位置２７９をコードする遺伝子における変異（膜貫通ドメインにおけるフェニルアラニンのチロシン置換）であり、ウシに存在する二つの型のソマトトロピン受容体を生じる。本発明はまた、ウシが、優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型を有しているか、又は優れた乳組成の形質を示す遺伝子型を有しているかを判定するための方法及びキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の中で優れた乳産出量の形質を有する動物を、優れた乳組成の形質を有する動物から識別するための遺伝子マーカーであって、前記マーカーは、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ）遺伝子における多型である遺伝子マーカー。
【請求項２】
前記多型は、ＧＨ−Ｒ遺伝子のエキソン８に位置している、請求項１に記載の遺伝子マーカー。
【請求項３】
前記多型は、ＧＨ−Ｒコード配列のヌクレオチド位置８３６における、Ｔ（アレルＰｈｅ）からＡ（アレルＴｙｒ）への移行であり、結果として、アミノ酸位置２７９において、フェニルアラニンからチロシンへの移行が生じ、ここで、Ｔｙｒアレルは、乳産出量には有利であり、乳組成には好ましくなく、Ｐｈｅアレルは乳組成には有利であり、乳産出量には好ましくない、請求項２に記載の遺伝子マーカー。
【請求項４】
前記Ｐｈｅ／Ｐｈｅ遺伝子型は優れた乳組成に関係し、前記Ｐｈｅ／Ｔｙｒ及びＴｙｒ／Ｔｙｒ遺伝子型は優れた乳産出量に関係する、請求項２及び３に記載の遺伝子マーカー。
【請求項５】
ウシが、優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型を有しているか、又は優れた乳組成の形質を示す遺伝子型を有しているかを判定するための方法であって、該方法は、前記ウシにおいて請求項１〜４の何れかに記載の遺伝子マーカーを分析する工程を含む方法。
【請求項６】
前記ウシからゲノムＤＮＡを単離することから成る第一の工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子マーカーは、ＧＨ−Ｒ遺伝子のエキソン８に位置する多型である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子マーカーは、ＧＨ−Ｒコード配列のヌクレオチド位置８３６におけるＴ（アレルＰｈｅ）からＡ（アレルＴｙｒ）への移行であり、結果として、アミノ酸位置２７９においてフェニルアラニンからチロシンへの移行が生じ、ここで、該Ｔｙｒアレルは、乳産出量には有利であり、乳組成には好ましくなく、Ｐｈｅアレルは乳組成には有利であり、乳産出量には好ましくない、請求項５〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子マーカー分析は、アレル特異的ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項５〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子マーカー分析は、以下のプライマーまたはそれらに相当するものを用いたアレル特異的ＰＣＲを用いて行われる、請求項５〜９の何れかに記載の方法：
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTA-3' (配列番号：1)  アレルTyrに特異的、
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTT-3' (配列番号：2)  アレルPheに特異的、及び、
5'-GTAGTCACTAGCCTCACCCTC-3' (配列番号：3)  リバースプライマー。
【請求項１１】
前記遺伝子マーカー分析は、以下のオリゴヌクレオチド、又はそれらに相当するものを用いたリアルタイムＰＣＲを用いて行われる、請求項５〜９の何れかに記載の方法：
5'-CAGTGACATTATATTTACTC-3' (配列番号：4)  アレルTyrに特異的、
5'-CAGTGACATTATTTTTACTC-3' (配列番号：5)  アレルPheに特異的、
5' CCAGTTTCCATGGTTCTTAATTATTATCTT-3' (配列番号：6)  フォワードプライマー、
及び
5'-GCTAAATAACTGGCAAAACATATCAGAGT-3' (配列番号：7)リバースプライマー。
【請求項１２】
ウシが、優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型を有しているか、又は優れた乳組成の形質を示す遺伝子型を有しているかを判定するためのキットであって、該キットは、前記ＧＨ−Ｒ遺伝子の断片のアレル特異的増幅及び／又は検出を行うためのオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドは、ＧＨ−Ｒコード配列の位置８３６におけるヌクレオチドを包含するｔｇｅ  ＧＨ−Ｒ遺伝子の断片の増幅及び／又は検出を可能にするオチゴヌクレオチドである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
以下のプライマー又はそれらに相当するものを含む、請求項１２に記載のキット：
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTA-3' (配列番号：1)  アレルTyrに特異的、
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTT-3' (配列番号：2)  アレルPheに特異的、及び
5'-GTAGTCACTAGCCTCACCCTC-3' (配列番号：3)  リバースプライマー。 
【請求項１５】
以下のオリゴヌクレオチド又はそれらに相当するものを具備する、請求項１２に記載のキット：
5'-CAGTGACATTATATTTACTC-3' (配列番号：4)  アレルTyrに特異的、
5'-CAGTGACATTATTTTTACTC-3' (配列番号：5)  アレルPheに特異的、
5' CCAGTTTCCATGGTTCTTAATTATTATCTT-3' (配列番号：6)  フォワードプライマー、及び
5'-GCTAAATAACTGGCAAAACATATCAGAGT-3' (配列番号：7)  リバースプライマー。
【請求項１６】
ＰＣＲ試薬及び／又はコントロール核酸及び／又はゲノムＤＮＡ抽出のための物質及び／又は電気泳動ゲル及び／又は染料をさらに具備する、請求項１２〜１５の何れかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、酪農業及び育種の分野に関し、異なる乳形質に関係する遺伝子マーカーを提供する。より正確には、本発明はソマトトロピン受容体（成長ホルモン受容体、又はＧＨ−Ｒとも称される）遺伝子における多型に関係し、これは、乳の生産と組成のような、動物における形質を示す遺伝子マーカーとして用いることが出来る。
【０００２】
哺乳類における特定の形質の選択は、現在、非常に費用がかかり、また非常に遅い。通常、その選択方法は、長期間に渡るその哺乳類のヒストリーの系統学的評価を必要とする。この評価は、乳産出量、乳中のタンパク質及び脂肪の割合、形態形質などのような動物の種々の形質に基づいている。
【０００３】
現在まで、特定の形質を示す動物を選択する方法の殆どは、時間フレームを経た特定の形質を視覚的に特徴づけるか、又は特定の時期に動物の体重を量っている。次いで、期待される形質を有する動物を、同様の動物と繁殖させ、その特定の形質が次の世代又は後に続く世代で優性であることを期待する。
【０００４】
それ故、哺乳類の形質選択のための現在の方法は、時間が長くかかることも多く、例えば飼育者のようなその分野における専門家の判断に陥りやすい。例えば、良好に乳を生産する雌牛を選ぶためには、選択に３６〜４８ヶ月を要し、そしてこれはしばしば仮説と飼育者の判定に基づいている。さらにその上、選択された形質が、次世代に渡っても優性であるという確証は決してない。動物の形質選択の現在の方法に関わる不確定度、費用、及び時間の観点から、現在、選択方法をうまく改良するさらなる技術的アプローチに基づいた新しい方法が開発されている。
【０００５】
家畜の遺伝子的改良は、基本的に、所望の形質に対する、飼育集団内の動物の遺伝子値の正確な評価に依存している。一つのそのような方法は、特定の遺伝子が形態形質又は性能形質と関係し、それ故、所望の特定の形質を選択するための分子マーカーとして使用できるかどうかを判定するために、候補の遺伝子を研究する。この方法は、初めに、所望の形質と関係する候補の遺伝子または不明の遺伝子マーカーの同定が必要である。候補遺伝子アプローチを成功させるために、遺伝子は、最初に所望の種で同定され、効率的な定量的遺伝子的方法及び統計的方法を用いて所望の形質と相関させる必要がある。
【０００６】
ソマトトロピンシステムは、このシステムが成長、乳の分泌、生殖、免疫と関係しているために、動物中での特定の形質の制御の役割を果たす幾つかの遺伝子を含んでいる。ソマトトロピンの投与は、ＵＳＡでは合法的に承認されているが、哺乳類の乳生産の制御における、ソマトトロピン中枢の役割を明らかに示している。ソマトトロピンシステムは極めて複雑であり、視床下部レベルでは、ソマトクリニン及びソマトスタチン（somatostatin）に関与し；肝臓レベルでは、ソマトトロピン受容体及びソマトトロピン血漿輸送タンパク質に関与し；及び、細胞レベルでは、ソマトトロピン受容体、インスリン成長因子-１及びインスリン成長因子輸送タンパク質に関与する。ソマトトロピンシステムは、下垂体レベルでも存在し、これは哺乳類のソマトトロピン合成に責任を有する。
【０００７】
本発明は、ソマトトロピン（成長ホルモンとも称される）−受容体遺伝子（これ以後、ＧＨ-Ｒ遺伝子と称する）を、動物中の特定の形質、特に乳産出量及び組成を特徴付けるための遺伝子マーカーとして選択することに基づく。
【０００８】
ソマトトロピン受容体は、ソマトトロピンホルモンと交差反応して細胞反応を誘導し、生理学的プロセスを変調する。それ故、この遺伝子の何らかの変異は、ホルモン活性を減少させるか増大させるかによって変化し、結果として、動物の異なる形質の結果に影響する多型になる。ウシにおけるソマトトロピン受容体（ＧＨ-Ｒ）の欠乏は、微小条件と関係して、成熟したウシで通常のサイズの伸長及び体重の約７０％という結果になる。正常に成長するために、体内で生産された成長ホルモンは血液中を移動し肝臓及び他の組織の中のＧＨ−Ｒに結合し、そして、他の成長調節ホルモン、インスリン様成長因子-Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）を生産する。
【０００９】
ウシの膜貫通ＧＨＲのｃＤＮＡは、ハウザー（Hauser）ら（１９９０）によって配列決定されている。それは９エキソンから成り、染色体２０に関係している（Moody, Pomp et al. 1995）。ヒトヌクレオチド配列から推論されるように、ＧＨＲは２４６のアミノ酸の細胞外ホルモン結合ドメイン、２４アミノ酸の一つの膜貫通領域、及び長細胞質内ドメインを含む６２０のアミノ酸のタンパク質である。細胞外ドメインは、７つのシステイン残基と５つの潜在的Ｎ−結合グリコシル化サイト及びホルモンがその受容体に結合した後のシグナル伝達のために重要な２つの箱を含む（Leung, Spencer et al. 1987; Wang and Wood 1995）。
【００１０】
Hojらは、制限酵素Taql, BgIII, Dral, EcoRV, HindIII, PstI, Pvullを用い、また異種性ウサギGHR cDNAプローブによるハイブリダイゼーションを用いても、赤毛のデンマーク仔ウシ及びノルウェーの赤毛の若雌牛で何らのＲＦＬＰを認めなかった(Hoj, Fredholm et al. 1993)。
【００１１】
この研究とは対照的に、受容体の細胞内Ｃ−末端部分のコード配列を含む同種性ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションの後に、本発明者らは、ホルスタイン−フリーシアンＡｌ（Holstein-Friesian  Al）雌牛において９つの遺伝子型を与える６つの制限酵素Ｔａｑｌバンド（7.1, 6.2, 5.7, 5.4, 4.2 及び3.3 kb）を同定した（Falaki, Gengler et al. 1996）。この多型が、乳タンパク質の割合の値に及ぼす影響は、非常に重要であり（P < 0.005）、まれな（６．６％）５．７ｋｂ及び５．４ｋｂパターンに都合がよい。他の興味深い観点は、アランツらによって報告された、染色体２０における定量的な形質座位（ＱＴＬ）の分離であり、これはホルスタイン−フリーシアン乳牛集団において乳産出量と組成に影響する(Arranz, Coppieters et al. 1998)。
【００１２】
以下に、より詳細に記載するように、本発明者らは、２０の異なる動物のＤＮＡのＧＨ−Ｒ遺伝子に対応するＤＮＡ配列（エキソン８）を直接配列決定することによって、ソマトトロピン受容体の膜貫通ドメインにおける、アミノ酸２７９位置におけるフェニルアラニンからチロシンへの置換から成る多型を同定した。
【００１３】
本発明者らは、次いで、この多型が、乳産出量及び組成のような動物の形質を特徴づけるために使用可能であることを示した。３つの遺伝子型、ホモ接合性Ｐｈｅ／Ｐｈｅ、ホモ接合性Ｔｙｒ／Ｔｙｒ、及びヘテロ接合性Ｐｈｅ／Ｔｙｒを生じる二つのアレル、Ｐｈｅ及びＴｙｒは、アレル特異的ＰＣＲ方法又はリアルタイムＰＣＲ方法を用いてＧＨ−Ｒ遺伝子で識別される（例１）。Ｐｈｅ／Ｐｈｅ遺伝子型は、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ又はＴｙｒ／Ｔｙｒ遺伝子型よりも頻度が低かった。
【００１４】
Ｔｙｒアレルは、乳産出量には好ましく、脂肪及びタンパク質の割合及び細胞スコア平均値には好ましくなく、一方、Ｐｈｅアレルは、脂肪及びタンパク質の割合及び細胞スコア平均値には好ましく、乳産出量には好ましくないことが、得られたデータから示された（例３）。
【００１５】
この知見は、動物のある形質の指標のための遺伝子マーカーとしての、ＧＨ−Ｒ遺伝子における多型の使用を可能にする。一旦、これらの特定の形質が確認されれば、その動物は、それらの優れた形質のために、高値で農家に提供されることができる。
【００１６】
本発明は、遺伝子マーカーを用いて乳生産における形質を選択する技術的方法を提供することによって、動物の形質を選択する現在の方法の幾つかの不都合を克服することを目標とする。
【００１７】
従って、動物において形質を選択するための遺伝子マーカーを提供することは、本発明の目的である。また、本発明は、乳の生産又は組成の優れた形質を有する動物の特性を決定する方法を提供する。
【００１８】
本文を通して幾つかの用語を用いるが、それらの意味は、以下の定義に従って理解される：
本明細書で用いるように、「動物」はウシである。  
「アレル」は、遺伝子座の代替形式の一つである；それぞれの遺伝子座の一つのアレルは、それぞれの親から別々に遺伝される。同じ遺伝子座の二つのアレルは、３つの遺伝子型、即ち、二つのホモ接合性遺伝子型及び一つのヘテロ接合性遺伝子型を生じさせる。
【００１９】
「多型」という用語は、個体間のＤＮＡ配列における相違を指す。対立遺伝子の変異を示す、集団のゲノムにおける同時出現は、例えば制限パターンに影響するＤＮＡにおける変化、又は、異なる表現型を生じさせるアレルのように理解できる。
【００２０】
本明細書は、ＧＨ−Ｒ遺伝子における多型を開示しており、これはそのコード配列（Ａ又はＴ）の８３６位置に存在するヌクレオチドに依存して、二つの対立遺伝子形態を有することができ、結果として、アミノ酸の２７９位置において変異（Ｔｙｒ又はＰｈｅ）を生じさせる。ウシのＧＨ−Ｒの配列は、ハウザーら（１９９０）によって開示されており、ジンバンク（GenBnk）において番号Ｘ70041で見つけられる。以下に明らかにするように、アレルＡ（Ｔｙｒ）は乳生産の高収量と関連し、一方アレルＴ（Ｐｈｅ）は乳中の高い脂肪及びタンパク質の割合及び細胞スコア平均値と関連する。
【００２１】
ここで用いるように、「形質（trait）」という用語は、任意の特性、特に一つの動物を他のものから識別するものを包含する。
【００２２】
本文を通して、「優れた乳組成」という句は、他のものよりも高い脂肪及び／又はタンパク質の割合、及び／又は高い細胞スコア平均値を有する乳を認定するために用いられる。この定義に従って、高い脂肪割合及び高い細胞スコア平均値、及び乳「Ｂ」と略同じタンパク質含量を有する乳「Ａ」は、前記乳「Ｂ」よりも優れた組成を有すると見なされる。
【００２３】
「優れた乳産出量（milk yield）」という句は、ここでは、ある雌牛が、他の雌牛よりも、容積に関してより多くの乳を産生することができるという事実を表現するために用いられる。「優れた乳生産能力」という語は、しばしば同じ意味で用いられる。  
他の定義は、本文の中で明らかになるであろう。
【００２４】
本発明の第一の側面は、ウシの中で優れた乳産出量の形質を有するものを、優れた乳組成の形質を有するものから識別するための遺伝子マーカーであって、前記マーカーは、成長ホルモン受容体（ＧＨ−Ｒ）遺伝子における多型である。
【００２５】
本発明の好ましい遺伝子マーカーは、ＧＨ−Ｒ遺伝子のエキソン８に位置する多型であり、より好ましくは、アミノ酸位置２７９においてフェニルアラニンからチロシンへ移行を生じさせる、ＧＨ−Ｒコード配列のヌクレオチドの８３６位置におけるＴからＡへの移行である。
【００２６】
例３において説明したように、Ｔｙｒアレルは乳生産能力（即ち、乳産出量）のためには好ましく、乳中の脂肪及びタンパク質の割合、及び細胞スコア平均値のためには好ましくなく、また、Ｐｈｅアレルは乳組成には好ましく乳産出量には好ましくない。
【００２７】
本発明者らは、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ及びＴｙｒ／Ｔｙｒ遺伝子型が何れも優れた乳産出量と関連し、一方でＰｈｅ／Ｐｈｅ遺伝子型が優れた乳組成と関連するために、Ｔｙｒアレルが優性であることを示した。本発明の遺伝子マーカーは、それ故、ウシの乳形質についての表現型情報を迅速且つ容易に推論するために用いられることができる。
【００２８】
従って、本発明は、上記のように前記ウシにおける遺伝子マーカーを分析することによって、ウシが、優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型を有しているのか、或いは、優れた乳組成形質を示す遺伝子型を有しているのかを判定する方法にも関連する。この方法は、動物の運命をあるいはその生涯の非常に早い時期に決定するためにも有用である。
【００２９】
実際、前記乳の目的先によって、乳の「品質」を評価するのに異なる判定基準が適している。例えば、飲用のためだけの乳を販売することを望む酪農場は、より量の多い乳を生産する雌牛、及び、低脂肪乳を生産する雌牛を好み、他方、チーズ生産者は、特にパルメザンのようなある種のチーズのためには、タンパク質と脂肪に富む乳を好むであろう。この故に、雌牛によって生産される乳の品質を、その最初の乳汁分泌の前であっても測定する方法及び試験は非常に有用である。
【００３０】
上記方法の一つの態様において、第一の工程は、前記ウシからゲノムＤＮＡを単離するために行われる。この工程は、動物から、これに限定されないが、精液、血液、細胞、生検組織、毛球などのようなサンプルを得ることを必要とする。次いで、その得られた検体から、サンブロック（Sambrook）ら（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition 2001）によって開示されているような当該分野で既知の方法を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出する。本発明の方法を実施する際に、ＤＮＡを単離するために用いる特異的な技術は、精液にはウォルシュ（Walsh, Biotechniques, 10:506 (1991)）によって開示されている方法、或いは血液には、レヴィン及びステヴァルト-ハイネス（Lewin and Stewart-Haynes Biotechniques, 13:522.）によって開示されている方法である。売買で入手可能なキットも使用できる。この工程は続いて、必要であれば、技術者に既知の任意の方法、例えば、サンブロックら（supra）に開示されたような標準的なＰＣＲ方法を用いて、ＧＨ−Ｒ遺伝子の少なくとも断片を増幅する工程を行うこともできる。ＧＨ−Ｒ遺伝子の断片の増幅にＰＣＲを用いる場合、２ mMのＭｇＣｌ2を含む50μｌかそれ以下の反応容量でゲノムＤＮＡを増幅することが好ましい。当然ながら、多型分析はｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ上でも行うことができる。それ故、本発明の方法は、前記ｍＲＮＡを単離する工程を含んでよく、必要であれば、ｃＤＮＡを得るためにそれらの逆転写を行う。
【００３１】
本発明の方法の好ましい態様において、遺伝子マーカーは、ＧＨ−Ｒ遺伝子のエキソン８に位置する多型である。より好ましくは、この遺伝子マーカーは、上記のように、アミノ酸２７９位置におけるフェニルアラニンからチロシンへの移転を生じる、ＧＨ−Ｒコード配列のヌクレオチド８３６位置におけるＴ（アレルＰｈｅ）からＡ（アレルＴｙｒ）への移行である。
【００３２】
サンプルを得た直後に、又は、ゲノムＤＮＡを抽出する必要がある時の何れでも、ソマトトロピン受容体断片における変異を検出するために、技術者に既知の幾つかの方法を用いることができる。変異を検出するために任意の検出方法を用いることができる。これらの方法の例には、アレル特異的ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、配列決定、プロッサー（Prosser, Trends Biotech 11:238-246 (1993)）及びサンブロックら（supra）によって開示されているＳＮＰｓ及び一塩基変異が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
よって、本発明は、ウシが優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型を有するか、或いは、優れた乳組成の形質を示す遺伝子型を有するかを判定するための方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
（１）前記ウシから、核酸、例えばゲノムＤＮＡを単離する、
（２）ＧＨ−Ｒコード配列の８３６位置におけるヌクレオチドを含む前記核酸の断片を単離する及び／又は増幅する、
（３）前記ＧＨ−Ｒコード配列のヌクレオチド８３６位置に存在するヌクレオチドを決定する、及び
（４）ウシが、優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型（Ａ／Ａ及びＡ／Ｔ遺伝子型）を有するか、或いは、優れた乳組成の形質を示す遺伝子型（Ｔ／Ｔ遺伝子型）を有するかを推測する。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、遺伝子マーカー分析は、アレル特異的ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲを用いて行われる。
【００３５】
アレル特異的ＰＣＲを用いて分析を行う場合、以下のプライマーを用いることができる：
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTA-3' (配列番号：1) アレルTyrに特異的、
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTT-3' (配列番号：2) アレルPheに特異的、及び
5'-GTAGTCACTAGCCTCACCCTC-3' (配列番号：3) リバースプライマー。
【００３６】
例１及び図１に示したように、これらのプライマーはＴｙｒ又はＰｈｅアレルのそれぞれの283pb断片を増幅させる。代わりのオリゴヌクレオチド5'-CGAATGTGTCTTGAATCCTCATACA-3' (配列番号：8)を、配列番号１及び２のプライマーを用いたアレル特異的増幅のためのリバースプライマーとして用いることもできる。
【００３７】
当然ながら、他のプライマーセットをアレル特異的ＰＣＲを行うために用いることもできる。例えば、異なるリバースプライマーを、同じ特異的プライマーと共に用いてもよく、或いは、他のＤＮＡ鎖にハイブリダイズする特異的プライマーを備えて設計された完全なセットであってもよい。
【００３８】
アレル特異的ＰＣＲによる遺伝子マーカー分析を行う際、ＰＣＲ反応に以下の条件を用いることができる：８８℃〜９８℃で１０〜１５分；及び９０℃〜１００℃で約１分、続いて、９０℃〜１００℃で２０〜４０秒；４０℃〜６０℃で１〜５分；及び６８℃〜８０℃で約１〜５分；を２５〜５０サイクル。最後の工程は、６８℃〜８０℃で８〜１２分でのサイクルを含んでもよい。
【００３９】
次いで、サンプルを、例えばエチジウムブロミドのような染色剤と共にアガロースゲル上で電気泳動させて、増幅産物を確認することができるが、任意の適切な染色剤を断片の確認に用いることができる。
【００４０】
上述したように、本発明の方法の特定の態様には、リアルタイムＰＣＲを用いて行われる遺伝子マーカー分析が含まれる。このリアルタイムＰＣＲは、例えば以下のオリゴヌクレオチドを用いて行われることができる：
5'-CAGTGACATTATATTTACTC-3' (配列番号：4) アレルTyrに特異的,
5'-CAGTGACATTATTTTTACTC-3' (配列番号：5) アレルPheに特異的,
5' CCAGTTTCCATGGTTCTTAATTATTATCTT-3' (配列番号：6) フォワードプライマー、及び、
5'-GCTAAATAACTGGCAAAACATATCAGAGT-3' (配列番号：7) リバースプライマー。
【００４１】
リアルタイムＰＣＲは、当分野で開示されているように行うことができる。それぞれのアレルの増幅がデバイスによって直ちに検出されるように、特異的オリゴヌクレオチドは通常の方法に従って、異なるように標識化される。
【００４２】
本発明は、上記の方法に限定されず、ここで確認された特異的変異にあてはまる変異を検出するための任意の方法を包含する。
【００４３】
本発明はまた、ウシが、優れた乳産出量の形質を示す遺伝子型を有するか、或いは、乳組成の形質を示す遺伝子型を有するかを判定するためのキットに関し、該キットは、ＧＨ−Ｒ遺伝子断片のアレル特異的増幅及び／又は検出を行うためのオリゴヌクレオチドを具備する。
【００４４】
本発明のキットは、例えば以下のプライマーを含む：
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTA-3' (配列番号：1) アレルTyrに特異的、
5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTT-3' (配列番号：2) アレルPheに特異的、及び
5'-GTAGTCACTAGCCTCACCCTC-3' (配列番号：3) リバースプライマー。
【００４５】
或いは、本発明のキットは、以下のオリゴヌクレオチドを具備してもよい：
5'-CAGTGACATTATATTTACTC-3' (配列番号：4) アレルTyrに特異的、
5'-CAGTGACATTATTTTTACTC-3' (配列番号：5) アレルPheに特異的、
5' CCAGTTTCCATGGTTCTTAATTATTATCTT-3' (配列番号：6) フォワードプライマー、及び
5'-GCTAAATAACTGGCAAAACATATCAGAGT-3' (配列番号：7) リバースプライマー。
【００４６】
当然ながら、どちらの技術を用いようとも、アレルＴｙｒ及びＰｈｅの検出が可能であるオリゴヌクレオチドの任意のセットが、上記のオリゴヌクレオチドのセットと交換可能である。これらのプライマーは、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド長であり、より好ましくは１５〜３０のヌクレオチドを含む。
【００４７】
アレル特異的増幅方法を行うためには、それぞれのアレルに特異的なプライマーは、特定のアレルの増幅を特異的に引き起こすために、プライマーの３’末端において又はその近辺で、ＧＨ−Ｒコード配列の８３６位置におけるヌクレオチドを包含する必要があることは明らかである。これらのプライマーは、遺伝子の何れかの鎖に相補的であり、リバースプライマーは他の鎖に相補的である。技術者は、ＧＨ−Ｒ遺伝子−多型領域を含む−の断片の増幅が、一つの又は他のアレル特異的プライマーを用いて可能であるようなリバースプライマーを選択するであろうし、これは、それが前記アレル特異的プライマーから伸長された鎖にアニール可能であることを意味する。アレル特異的ＰＣＲ方法のためのプライマーの融解温度は、好ましくは互いに近づけられる。上記の、ＧＨ−Ｒ遺伝子の断片のアレル特異的増幅を可能にする何れかのプライマーセットは、配列番号１〜３のプライマーに存するプライマーセットの機能的等価物と見なされる。
【００４８】
上記及び例におけるように、リアルタイムＰＣＲを行うために、アレル特異的オリゴヌクレオチドは、特定のアレルに特異的にハイブリダイズするように、当然ながら、ＧＨ−Ｒコード配列の８３６位置におけるヌクレオチドを含む。これらのプライマーは、遺伝子の何れかの鎖に相補的であることができるが、しかし好ましくは、何れも同じ鎖（即ち、コード又は非コードのもの）に相補的である。フォワード及びリバースプライマーは、ＧＨ−Ｒコード配列の８３６位置におけるヌクレオチドを含むＧＨ−Ｒ遺伝子の断片の増幅を可能にするような方法で当業者によって選択される。
【００４９】
上記及びリアルタイムＰＣＲによってＧＨ−Ｒ遺伝子の多型分析を可能にする任意のプライマーセットは、配列番号４〜７のプライマーに存するプライマーのセットの機能的等価物であると見なされる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を算出するため、及び、本発明の方法を行うため及び本発明のキットを構成するための適切なプライマーセットを設計するために、当業者は、プライマーエクスプレス（Applied Biosystems）のような種々のソフトウェアを使用することができる。
【００５１】
本発明のキットは、ＰＣＲ試薬、コントロールとして用いられる核酸、試薬及び／又はゲノムＤＮＡ抽出のためのカラム、電気泳動ゲル、染料等のような他の成分をさらに含んでもよい。もちろん、該キットは、上記の要素の部分のみを具備してもよい。キットの内容物は、利用する検出方法によって変動し、技術者は、用いる方法に従って、及びあるいはその使用者に従って、キットを適応させる。
【００５２】
本発明とその利点をさらに説明するために、以下に具体的な例を記載する。それらが説明のためにのみ意図され、限定されないことは理解されるであろう。
【例】
【００５３】
１．ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ
商業的に入手可能な１１００の登録されたカナディアン・ホルスタイン-フリーシアン雄牛のゲノムＤＮＡを、ルーシーら（Domest. Anim. Endocrinol. 10: 325(1993)）が開示したように精液から抽出した。  
ソマトトロピン受容体遺伝子の膜貫通ドメイン（エキソン８）の突然変異を、アレル特異的ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ分析によって明らかにした。
【００５４】
Ａ．アレル特異的ＰＣＲ方法は、以下の通り：フェニルアラニン（Ｔ）アレルとチロシン（Ａ）アレルのための特異的ＰＣＲプライマーは、ソマトトロピン受容体遺伝子のエキソン８から設計した。用いたプライマーの配列は、アレルＴｙｒに特異的なプライマーとして、5'TGGGCTAGCAGTGACATTGTA-3'（配列番号１）であり、アレルＰｈｅに特異的なプライマーとして5'-TGGGCTAGCAGTGACATTGTT-3'（配列番号２）であり、リバースプライマーとして5'-GTAGTCACTAGCCTCACCCTC-3'（配列番号３）であった。
【００５５】
これらのプライマーは、２ｍＭのＭｇＣｌ2を含む２５μｌの反応容積中でゲノムＤＮＡ断片を標準的な手順によって増幅するために用いた。条件は、９６℃、３分間、続いて９４℃、１分、６５．２℃、１分、及び、７２℃で１分を３５サイクルとした。最後の工程は、７２℃で１０分とした。ＰＣＲ産物（283 bp）は、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲルで電気泳動した（図１）。
【００５６】
Ｂ．リアルタイムＰＣＲ特異的方法：この技術は、一つの装置の中で、サーマルサイクリング、蛍光検出、及び、アプリケーション-特異的ソフトウェアを組み合わせるものである。ＭＧＢ蛍光を有する特異的オリゴヌクレオチドは、一つの多重検出においてアレルＴｙｒ又はアレルＰｈｅを特異的に同定するように設計されている。この方法において、それぞれのアレルは、デバイス（この場合ではアプライド・バイオシステムの７７００モデル。他のデバイスも使用可能である。）によって直ちに検出される。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
ＦＡＭで標識された、アレルＴｙｒに特異的なプライマー（配列番号４）
5'-CAGTGACATTATATTTACTC-3'、
ＶＩＣで標識された、アレルＰｈｅに特異的なプライマー（配列番号５）
5'-CAGTGACATTATTTTTACTC-3' 
フォワードプライマー（配列番号６）(非標識)
5'-CCAGTTTCCATGGTTCTTAATTATTATCTT-3'
リバースプライマー（配列番号７）(非標識)
5'-GCTAAATAACTGGCAAAACATATCAGAGT-3'。
【００５７】
これらのプライマーは、標準的なリアルタイム方法により、2.5μｌの「タックマン・ユニバーサル（Taqman Unibersal)ＰＣＲマスターミックス（Master Mix）３」（ref.430443）を含む５μｌ容積中でゲノムＤＮＡの部分を増幅するために用いた。条件は、５０℃で２分、及び９５℃で  分、続いて９５℃、１５秒、６０℃、１分を４０サイクルであった。ＰＣＲ産物は、７９００リアルタイムＰＣＲアプライド・バイオシステム装置で可視化した。
【００５８】
２．動物
試験日データは、ホルスタイン種のためのカナディアン・デイリー・ネットワークによって提供され、これは、２０００年５月のカナダにおいて遺伝子評価に用いられた同じデータである。この研究においては、最初の乳汁分泌データのみを分析した。これらのデータは、１９８２〜１９９９の間に生産された1,656,599雌牛の12,858,741の試験日記録を含む。集団の構造は、現在のカナディアン・ホルスタイン集団を表している。雌牛辺り１日辺りの平均生産及び標準偏差は、乳が24.56±6.4 kg、脂肪が903±237ｇ、タンパク質が792±192ｇ、及び、体細胞スコア（体細胞スコア＝ｌｏｇ2（ＳＣＳ））が5.79±1.76であり、ここで、ＳＣＳは乳中で測定された体細胞の量である（細胞壊死組織片、正常細胞、細菌などを含む））。系統ファイルは、ホルスタイン・カナディアン・データベースから抽出し、1909から1999の間に生まれた2,755,041の動物（雌牛及び祖先）を含んだ。９６１のカナディアン・ホルスタイン雄牛の精液サンプルが、セメックス・アライアンス（Semex Alliance）によって提供された。
【００５９】
３．統計的分析
３．Ａ．モデル
公式のモデルに代わる試験日モデルを用いた。この分析モデルは、多項式を使用することによって、固定部分に適応性を与え、また、ランダム部分のパラメーターを最小数にする。ランダム回帰効果は、回帰係数の間の相関を減少させるために変形ルジャインドルの多項式を用いてモデル化した。
【００６０】
三次の多項式の使用（定数、線形、及び二次）は、固定された乳汁分泌曲線の周囲でランダム変動を記載する単一の産出量形質のために十分であった（Gengler et al., 1999）。用いた３つの変形ルジャインドルの多項式は、
【数１】
2006506995.tif 000002
【００６１】
であり、ここで：
x = -1 + 2 ((DIM -1) / (305 -1))
及び DIM = 乳の日数（days in milk）である。
【００６２】
最初の乳汁分泌試験日記録における異なる効果の評価のために用いたモデルは、
ｙ＝ｑ1ａ1＋ｑ2ａ2＋Ｈｈｔｄ＋Ｓｓａｒｃ＋Ｗ（Ｚｐ＋Ｚ*ａ）＋ｅ
であり、ここで、
ｙ＝産生データのベクトル（試験日産出量）−12,858,741レベル
ａ1＝第一のアレルの回帰効果−１レベル
ａ2＝第二のアレルの回帰効果−１レベル
ｈｔｄ＝家畜及び試験日固定効果のベクトル−1,320,824レベル
ｓａｒｃ＝季節、グループの年齢、区域及び乳汁分泌固定効果の分類のベクトル−560レベル。
【００６３】
９月〜３月、及び４月〜８月の二つの出産シーズンが存在した。出産年齢の４つのグループを定義した：第一は＜２５月、第二は２５〜３０月、第三は３０〜３５月及び最後は＞３５月。領域は、州又は州群とした。１０の異なる州を、次の領域に定義した：ブリティッシュコロンビア（領域１）、アルベルタ（領域２）、サスカチェワン（領域２）、マニトバ（領域２）、ニューファンドランド（領域３）、オンタリオ（領域５）、ケベック（領域４）、ニューブルンスウィック（領域３）、ノバスコシア（領域３）及びプリンスエドワード島（領域３）。１４の乳汁分泌時期を分類した。これらのグループは、２５日（＜２５，４５，６５・・・）から３０５日までの２０のＤＩＭのグループに対応する。
【００６４】
ｐ＝持続性の環境的なランダム効果のベクトル−1,656,599レベル
ａ＝遺伝子的ランダム効果のベクトル−2,755,058レベル
ｅ＝残基効果のベクトル
Ｈ，Ｓ，Ｚ  ｅｔ  Ｚ*＝頻度マトリクス
ｑ1＝最初のアレルの評価されたアレル頻度のベクトル
ｑ2＝第二のアレルの評価されたアレル頻度のベクトル
Ｗ＝ルジャンドルの多項式の共変動マトリクス。
【００６５】
両方のアレルの回帰はモデル中で維持され、アレル頻度が評価され、それ故、それらの頻度の合計は１）とは異なり得た。アレル頻度はそれ自身が評価され、従って、観察されたアレル頻度と比較した評価における変動の損失が観察されたという事実を、調整していないということは、認められる必要があるであろう。
【００６６】
アレル頻度の評価を以下に示す。前条件接合体勾配（preconsitioned conjugate gradient）（ＰＣＧ）ソルバー（solver）を、分析モデルを解くために用いた。アレル置換効果は、第二のアレルのコピーを第一のもので置換することによって得られた、異なる表現型として定義された。この効果は、
1/2（a2-a1）のように評価され、ここで、
a1＝第一のアレルの効果の解
a2＝第二のアレルの効果の解
である。
【００６７】
３．Ｂ．結果
＜遺伝子型頻度＞
二つの推奨される突然変異の検出方法の双方を用いたところ、１１００のホルスタイン雄牛の遺伝子型頻度は、Ｐｈｅ／Ｐｈｅパターンが58.69％、Ｔｙｒ／Ｐｈｅパターンが34.86％、Ｔｙｒ／Ｔｙｒパターンが6.45％であった。
【００６８】
Ｔｙｒ及びＰｈｅアレルの頻度は、Ｔｙｒの23.88％及びＰｈｅの76.12％での最尤法により評価した。
【００６９】
＜フェニルアラニンのチロシン置換の乳生産との関連性＞
乳牛における、ソマトトロピン受容体多型と乳形質の関連を、代替（alternative）試験日モデルで示した。
【００７０】
第二のアレル（Ｐｈｅ）のコピーの、第一のアレル（Ｔｙｒ）のコピーによる置換の評価された生産効果は、
乳では、＋２９５ｇ／日、
脂肪では、−８．１４ｇ／日、
タンパク質では、−１．８３ｇ／日、及び
細胞スコアでは、−０．２２／日である。
【００７１】
平均生産に関しては、第二のアレル（Ｐｈｅ）のコピーの第一のアレル（Ｔｙｒ）のコピーによる置換の効果は、
乳平均生産    ＋１．１１％、
脂肪平均生産    −０．９５％、
タンパク質平均生産    −０．１９％、及び
細胞スコア平均値    −１．７％である。
【００７２】
これらの結果は、Ｔｙｒアレルが乳産出量に好都合であり、脂肪及びタンパク質の割合、及び細胞スコア平均値には不都合であること、一方、Ｐｈｅアレルは乳組成には好都合であり、乳産出量には不都合であることを示した。
【００７３】
３．Ｃ．まとめ
アレル特異的ＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲ方法を用いて、ソマトトロピン受容体遺伝子の二つのアレルが識別された。この多型は、アミノ酸位置２７９において観察され、ソマトトロピン受容体遺伝子の膜貫通ドメイン（エキソン８）における、フェニルアラニンからチロシンへの置換から成る。
【００７４】
Ｐｈｅ／Ｐｈｅパターンは、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ又はＴｙｒ／Ｔｙｒパターンよりも頻度が低かった。ＧＨ−Ｒ  Ｔｙｒアレルの優位性は、乳産出量で観察され、一方ＧＨ−Ｒ  Ｐｈｒアレルの優位性は、タンパク質及び脂肪割合及びセルスコアで観察された。
【００７５】
興味深いことに、これらの発見は、関係する形質に及ぼす効果の識別のための、代替試験日モデルの有用性を示している。
【００７６】
［参考文献］
Arranz, J. J., W. Coppieters, et al. (1998). "A QTL affecting milk yield  and composition maps to bovine chromosome 20: a confirmation." Anim Genet  29(2): 107-15.   
Falaki, M., N. Gengler, et al. (1996). "Relationships of polymorphisms for  growth hormone and growth hormone receptor genes with milk production  traits for Italian Holstein- Friesian bulls." J Dairy Sci 79(8): 1446-53.   
Hauser, S. D., M. F. McGrath, et al. (1990). "Cloning and in vivo  expression of bovine growth hormone receptor mRNA." Mol Cell Endocrinol  72(3): 187-200. 
Hoj, S., M. Fredholm, et al. (1993). "Growth hormone gene polymorphism  associated with selection for milk fat production in lines of cattle."  Anim Genet 24(2): 91-5.   
Leung, D. W., S. A. Spencer, et al. (1987). "Growth hormone receptor and  serum binding protein: purification, cloning and expression." Nature  330(6148): 537-43.   
Moody, D. E., D. Pomp, et al. (1995). "Assignment of the growth hormone  receptor gene to bovine chromosome 20 using linkage analysis and somatic  cell mapping." Anim Genet 26(5): 341-3.   
Wang, Y. D. and W. I. Wood (1995). "Amino acids of the human growth  hormone receptor that are required for proliferation and Jak-STAT  signaling." Mol Endocrinol 9(3): 303-11.
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】３頭のホルスタイン−フリーシアン雄牛において観察されたソマトトロピン受容体遺伝子に特異的なプライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲパターンを示す電気泳動ゲル。レーン１及び２は、ホモ接合性Ｔｙｒ雄牛からのＰｈｅ−及びＴｙｒ−アレル特異的増幅であり、レーン３及び４は、ヘテロ接合性のもの、レーン５及び６はホモ接合性Ｐｈｅ雄牛のものである。
【図２】ウシ種属のソマトトロピン受容体遺伝子の膜貫通ドメインの配列決定後に得られた、アミノ酸配列を示す（配列番号：９及び１０）。突然変異に影響されたアミノ酸は、太字のものである。
【図３】ＧＨ−Ｒ遺伝子（配列番号：１１）のエキソン８の下流領域の配列決定によって得られたヌクレオチド配列を示す。アレル特異的増幅に用いたプライマーは、配列中の下線部である。多型位置のヌクレオチドは、太字部分である。垂直方向の矢印は、エキソン８の終点とイントロン８の開始点の間の境を示す。
【図１】
2006506995.tif 000003
【図２】
2006506995.tif 000004
【図３】
2006506995.tif 000005
【配列表】
2006506995000001.app
【国際調査報告】
2006506995.tif 000006
2006506995.tif 000007