(57)【要約】カーボンナノ構造、特にカーボンナノチューブに対する結合親和力を有するペプチドが生成された。本発明のペプチドは、概してアミノ酸約１２個の長さである。カーボンナノチューブ結合ペプチドを生成する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）無作為に生成されたペプチドのライブラリを準備し、
ｂ）カーボンナノ構造のサンプルを準備し、
ｃ）（ａ）のライブラリを（ｂ）のカーボンナノ構造と接触させ、それによって（ａ）のペプチドライブラリのサブセットを該ナノ構造に結合させて第１のペプチドサブライブラリを創製し、そして
ｄ）（ｃ）の第１のペプチドサブライブラリを同一配列のマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）の存在についてスクリーニングする
ことを含んでなり、配列の少なくとも１つのマルチプルの存在がカーボンナノ構造結合ペプチドを示すカーボンナノ構造結合ペプチドの生成方法。
【請求項２】
該無作為に生成されたペプチドのライブラリを、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、イーストディスプレイおよび組合わせ固相ペプチド合成（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）よりなる群から選択される方法によって生成せしめる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
カーボンナノ構造がカーボンナノチューブである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
カーボンナノチューブが、多層（ｍｕｌｔｉｗａｌｌｅｄ）ナノチューブおよび単層（ｓｉｎｇｌｅｗａｌｌｅｄ）ナノチューブよりなる群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１のサブライブラリをカーボンナノ構造サンプルと接触させることによりステップ（ｃ）および（ｄ）を反復し、追加的なサブライブラリを生成せしめ配列マルチプルの頻度を増大させる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ライブラリを洗浄剤の存在下でカーボンナノ構造サンプルと接触させる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは化学的に等価なアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するカーボンナノチューブ結合ペプチド。
【請求項８】
ａ）一般構造：
Ｎ−Ｍ−Ｃ
[式中、
Ｎは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端部分であり、
Ｍは７５％が疎水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドの中間部分であり、
Ｃは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端部分である]
を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドを固定化し、そして
ｂ）カーボンナノ構造を（ａ）の固定化されたペプチドと接触させ、それによってナノ構造を固定化する
ことを含んでなるカーボンナノチューブの固定化方法。
【請求項９】
カーボンナノチューブ結合ペプチドが、配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは化学的に等価なアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）溶液中のロープ形態におけるカーボンナノチューブの集団を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）のカーボンナノチューブの集団を
一般構造
Ｎ−Ｍ−Ｃ
[式中、
Ｎは７５％がその親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端部分であり、
Ｍは７５％が疎水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドの中間部分であり、
Ｃは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端部分である]
を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドと接触させ、
それによってカーボンナノチューブロープを分散させる
ことを含んでなるカーボンナノチューブロープの集団の分散方法。
【請求項１１】
カーボンナノチューブ結合ペプチドが、配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは化学的に等価なアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）溶液中のファージ発現ペプチドのライブラリを準備し、
ｂ）カーボンナノ構造の集団を準備し、
ｃ）（ａ）のファージを（ｂ）のナノ構造とナノ構造へのファージの結合を可能にするのに十分な時間接触させ、ファージ−ナノ構造複合体を形成せしめ、
ｄ）非結合ファージを除去し、
ｅ）（ｃ）のファージ−ナノ構造複合体を適切な細菌宿主と接触させ、それによって細菌をファージによって感染させ、
ｆ）ステップ（ｅ）の感染した細菌をファージおよび発現ペプチドの複製を可能にするのに十分な時間生育させ、そして
ｇ）ペプチドがカーボンナノ構造に結合するステップ（ｆ）の複製されたファージおよび発現ペプチドを単離する
ことを含んでなるカーボンナノ構造結合ペプチドの生成方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの化学種のカーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材をカーボンナノチューブの集団と接触させ、それによってカーボンナノチューブを被覆された基材に結合させてアセンブルすることを含んでなるカーボンナノチューブのアセンブル方法。
【請求項１４】
カーボンナノチューブ結合ペプチドを場合により固定化に先だってファージに付着させる請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
固形基材が、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリレート、置換ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリ−メタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ガラス、セラミック、および金属よりなる群から選択される材料を含んでなる請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
固形基材が、ガラスおよびポリスチレンよりなる群から選択される材料を含んでなる微小球である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
固形担体が、場合により非ＣＮＴ結合ペプチドで少なくとも部分的に被覆される請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
非ＣＮＴ結合ペプチドが、配列番号：２８および配列番号：３４よりなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号：２８および配列番号：３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する非ＣＮＴ結合ペプチド。
【請求項２０】
カーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材を含んでなる組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つのカーボンナノチューブが結合したカーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材を含んでなる組成物。
【請求項２２】
カーボンナノチューブ結合ペプチドをファージ上に付着させる請求項２０または２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願明細書は、２００２年９月２５日に出願された米国仮出願第６０／４１３２７３号明細書、および２００２年６月４日に出願された米国特許出願第６０／３８５６９６号明細書の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、カーボンナノチューブの操作、精製、および性質決定のための方法、および有用な組成物に関する。より具体的には本発明は、カーボンベースのナノ構造に結合するペプチド、それらの合成および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、１９９１年の発見以来、熱心な研究の対象になっている。ＣＮＴは、小さなサイズおよび電気伝導度などのユニークな特性を有し、それによって、分子電子工学、ナノ電子構成要素、および電界放出ディスプレーにおける構造材料としての使用をはじめとするとする広範な用途において適切なものとなる。カーボンナノチューブは多層（ＭＷＮＴ）または単層（ＳＷＮＴ）のどちらであっても良く、ナノメーター範囲の直径を有する。それらの原子構造次第でＣＮＴは、金属または半導体のどちらかの特性を有しても良く、これらの特性はそれらの小さな寸法と組み合わさって、ナノデバイスの製作において、それらの使用を特に魅力的なものにする。
【０００４】
ナノデバイス製作工程におけるＣＮＴの実装の欠点の一つは、均一な長さまたはキラリティーを有するＣＮＴサンプルを得ることの困難性である。さらにナノデバイス制作のためのＣＮＴの固定化および操作のために利用できる手軽な方法はない。
【０００５】
ほとんどのＣＮＴ合成方法は、「ロープ」の絡まったチューブの混合物である生成物を生じ、直径、キラリティー、および壁の数が異なるＣＮＴを与える。ナノチューブ分離のために酸洗い、ウルトラソニフィケーション、ポリマーラッピングなどの種々の方法および界面活性剤の使用が用いられている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。しかしナノチューブロープの特定のもつれを解く、またはそれらを離散した大きさ、キラリティーまたは伝導特性を有する集団に分離するための方法の報告はない。
【０００６】
基材を特異的に識別する能力のために、種々のタンパク質は、ＣＮＴ分離／精製課題を解決する一つの可能な径路を示し、並びにＣＮＴ固定化のための可能な手段を提供する。種々のカーボンベースの構造に対する抗体を産生させるいくつかの試みがなされている。例えばチェン（Ｃｈｅｎ）らの特許文献１は、接合フラーレンを使用して、ハプテンとしてのＣ60フラーレンに対するモノクローナル抗体を産生した。しかしウシチログロブリンに接合されたこのＣ60フラーレン誘導体によるマウスの免疫化によって産生された抗体集団は、Ｃ７0フラーレンと交差反応するサブ集団を含んだ。今日まで、カーボンベースのナノチューブに対する抗体を産生する試みはなされていない。
【０００７】
１９８５年における導入以来、ファージディスプレイは、ドラッグターゲットのためのペプチド、タンパク質および小型分子をはじめとする様々なリガンドを発見するために広く使用されている（非特許文献５）。用途は、タンパク質折りたたみ、新規触媒活性、および新しい特異性を有するＤＮＡ結合タンパク質の研究などのその他の分野にも拡大されている。非特許文献６は、ファージディスプレイ技術を使用して、異なる結晶学的形態の無機半導体基材と特異的に結合できるペプチド配列を同定した。ファージディスプレイによって大型で多種多様なペプチドライブラリを生成する方法はかねてから知られているが、ＣＮＴの結合および操作において有用かもしれないペプチドを発見する課題には応用されていない。
【０００８】
従って解決すべき課題は、ＣＮＴおよびその他のカーボンベースのナノ構造に対する結合特異性を有する材料を提供して、ナノデバイス製作のためにこれらの構造の分離および固定化で、それらが使用できるようにすることである。出願人らは、ＣＮＴに対する高い親和性および特異性を有する一連のカーボンナノチューブ結合ペプチドを提供することで、提示された課題を解決した。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０１／１６１５５  Ａ１号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．リュー（Ｌｉｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０、１２５３（１９９８）
【非特許文献２】Ａ．Ｇ．リンツラー（Ｒｉｎｚｌｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．、６７、２９（１９９８）
【非特許文献３】Ａ．Ｃ．ディロン（Ｄｉｌｌｉｏｎ）ら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、１１、１３５４（１９９９）
【非特許文献４】シュリットラー（Ｓｃｈｌｉｔｔｌｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２、１１３６（２００１）
【非特許文献５】ディキシット（Ｄｉｘｉｔ）Ｓ．、Ｊ．ｏｆＳｃｉ．  ＆  Ｉｎｄ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５７、１７３〜１８３、（１９９８）
【非特許文献６】ワーレイ（Ｗｈａｌｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、４０５：６６５（２０００）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、
ａ）無作為に生成されたペプチドのライブラリを準備し、
ｂ）カーボンナノ構造のサンプルを準備し、
ｃ）（ａ）のライブラリを（ｂ）のカーボンナノ構造と接触させ、それによって（ａ）のペプチドライブラリのサブセットを該ナノ構造に結合させて第１のペプチドサブライブラリを創製し、そして
ｄ）（ｃ）の第１のペプチドサブライブラリを同一配列のマルチプル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）の存在についてスクリーニングする
ことを含んでなり、
配列の少なくとも１つのマルチプルの存在がカーボンナノ構造結合ペプチドを示すカーボンナノ構造結合ペプチドの生成方法を提供する。
【００１１】
本発明のペプチドを生成する好ましい方法としては、ファージディスプレイ、バクテリアディスプレイ、イーストディスプレイおよび組合わせ固相ペプチド合成（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が挙げられる。
【００１２】
本発明は、配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは化学的に等価なアミノ酸による少なくとも１つのアミノ酸置換を含有する配列番号：１〜２４、配列番号：３５〜３９、配列番号：４０〜８５、配列番号：８６〜１１３、配列番号：１１４〜１４７、および配列番号：１４８〜１７７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドをさらに提供する。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）一般構造：
Ｎ−Ｍ−Ｃ
[式中、
Ｎは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端部分であり、
Ｍは７５％が疎水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドの中間部分であり、
Ｃは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端部分である]
を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドを固定化し、そして
ｂ）カーボンナノ構造を（ａ）の固定化されたペプチドと接触させ、それによってナノ構造を固定化する
ことを含んでなるカーボンナノチューブの固定化方法を提供する。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）溶液中のロープ形態におけるカーボンナノチューブの集団を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）のカーボンナノチューブの集団を
一般構造：
Ｎ−Ｍ−Ｃ
[式中、
Ｎは７５％がその親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端部分であり、
Ｍは７５％が疎水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドの中間部分であり、
Ｃは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端部分である]
を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドと接触させ、
それによってカーボンナノチューブロープを分散させる
ことを含んでなるカーボンナノチューブロープの集団の分散方法を提供する。
【００１５】
さらに本発明は、
ａ）溶液中のファージ発現ペプチドのライブラリを準備し、
ｂ）カーボンナノ構造の集団を準備し、
ｃ）（ａ）のファージを（ｂ）のナノ構造とナノ構造へのファージの結合を可能にするのに十分な時間接触させ、ファージ−ナノ構造複合体を形成せしめ、
ｄ）非結合ファージを除去し、
ｅ）（ｃ）のファージ−ナノ構造複合体を適切な細菌宿主と接触させ、それによって細菌をファージによって感染させ、
ｆ）ステップ（ｅ）の感染した細菌をファージおよび発現ペプチドの複製を可能にするのに十分な時間生育させ、そして
ｇ）ペプチドがカーボンナノ構造に結合するステップ（ｆ）の複製されたファージおよび発現ペプチドを単離する
ことを含んでなるカーボンナノ構造結合ペプチドの生成方法を提供する。
【００１６】
少なくとも１つの化学種のカーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材をカーボンナノチューブの集団と接触させ、それによってカーボンナノチューブを被覆された基材に結合させてアセンブルすることを含んでなるカーボンナノチューブのアセンブル方法もここで提供される。
【００１７】
さらに本発明で有用なのは、配列番号：２８および配列番号：３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する非ＣＮＴ結合ペプチドである。
【００１８】
カーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材を含んでなる組成物、並びに少なくとも１つのカーボンナノチューブが結合したカーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材を含んでなる組成物もここで提供される。
【００１９】
配列リスト
以下の配列は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ」）に準じ、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８）、ＥＰＯおよびＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および実施細則の２０８節および付録Ｃ）に合致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用したシンボルおよびフォーマットは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００２０】
配列番号：１〜２４および３５〜３９は、本発明のカーボンナノチューブ結合ペプチドである。
【００２１】
配列番号：２５および３２は、ポリグリシンテールを有する誘導体化カーボンナノチューブ結合ペプチドである。
【００２２】
配列番号：２６および２７は、第６位でトリプトファンの代わりにセリン置換を有する突然変異カーボンナノチューブ結合ペプチドである。
【００２３】
配列番号：２８は、カーボンナノ構造に対する結合親和力をほとんどあるいは全く有さない対照ペプチドである。
【００２４】
配列番号：２９は、カーボンナノチューブ結合ペプチドの荷電部分である。
【００２５】
配列番号：３０は、カーボンナノチューブ結合ペプチドの極性部分である。
【００２６】
配列番号：３１は、カーボンナノチューブ結合ペプチドの疎水性部分である。
【００２７】
配列番号：３３は、Ｍ１３ファージの配列決定をするのに使用されたプライマーである。
【００２８】
配列番号：３４は非ＣＮＴ結合ペプチドである。
【００２９】
配列番号：４０〜８５は、単層ナノチューブに対して産生され、それに結合するペプチドである。
【００３０】
配列番号：８６〜１４７および１７７は、多層カーボンナノチューブに対して産生され、それに結合するペプチドである。
【００３１】
配列番号：１４８〜１７６は、グラファイトクリーニングしたカーボンナノチューブに対して産生され、それに結合するペプチドである。
【００３２】
発明の詳細な記述
本発明は、ペプチドファージディスプレイ法によって生成された種々のカーボンナノチューブ結合ペプチドを提供する。ペプチドは、ナノデバイスの製作における、並びに混合ＣＮＴ集団からのナノチューブの分離と精製における、カーボンベースのナノ構造の操作のために有用である。
【００３３】
本発明のペプチドは、カーボンナノチューブおよび関連分子を電界放出トランジスタ、人工アクチュエータ、分子濾過膜、エネルギー吸収材料、分子トランジスタ、およびその他の光学エレクトロニクス装置などのエレクトロニクス用途において、並びにガス貯蔵、単一電子装置、化学および生物学的センサーにおいて使用するための伝導ナノデバイスにアセンブリーするのに、特にリガンドとして有用である。
【００３４】
本願明細書では、いくつかの用語と略語が使用される。次の定義が提供される。
「ＣＮＢＰ」とはカーボンナノチューブ結合ペプチドを意味する。
「ＨＲＴＥＭ」とは高解像度透過電子顕微鏡法意味する。
「ＭＷＮＴ」とは多層ナノチューブを意味する。
「ＳＷＮＴ」とは単層ナノチューブを意味する。
「ＰＥＧ」とはポリエチレングリコールを意味する。
「ｐｆｕ」とはプラーク形成単位を意味する。
「ＴＥＭ」とは透過電子顕微鏡法を意味する。
「ＣＮＴ」とはカーボンナノチューブを意味する。
【００３５】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いに連結した２つ以上のアミノ酸を指す。ペプチドは、プロセシングおよびその他の翻訳後修飾などの自然過程だけでなく、化学修飾技術によって修飾されたものをも含む。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端をはじめとするペプチドのどこでも生じることができる。修飾の例としては、アミド化、アシル化、アセチル化、架橋、環化、グリコシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、ラセミ化、およびヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体などの種々の部分の共有結合が挙げられるが、これに限定されるものではない（例えば「タンパク質−構造および分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、第二版、クライトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）Ｗ．Ｈ．、Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）および「タンパク質の翻訳後共有結合修飾（Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ｂ．Ｃ．ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）を参照されたい）。
【００３６】
ここでの用法では、「ペプチド」および「ポリペプチド」と言う用語は区別なく使用される。
【００３７】
「ナノチューブ」と言う用語は、約１〜２００ｎｍの狭い寸法（直径）と長い寸法（長さ）を有して、長い寸法と狭い寸法との比率、すなわち縦横比が少なくとも５である中空製品を指す。概して縦横比は、１０〜２０００の間である。
【００３８】
「カーボンベースのナノチューブ」、または「カーボンナノチューブ」とは、ここでは主に炭素原子から構成される中空構造を意味する。カーボンナノチューブは、例えば金属などのその他の要素でドープ処理できる。
【００３９】
「カーボンナノチューブ生成物」と言う用語は、単層カーボンナノチューブまたは多層カーボンナノチューブのどちらかである、巻いたグラフェンシートからできた円柱状構造を指す。
【００４０】
「カーボンナノチューブロープ」と言う用語は、非整列ナノチューブの集団を意味する。
【００４１】
「カーボンナノ構造結合ペプチド」と言う用語は、カーボンナノ構造と結合するように選択されたペプチドを指す。カーボンナノチューブに対する特定の親和性でペプチドが生成された場合、これらのペプチドは、カーボンナノチューブ結合ペプチドまたはＣＮＢＰと称される。
【００４２】
「ストリジェンシー」と言う用語は、選択されたＣＮＢＰに適用される場合、ＣＮＴからペプチドを溶出するのに使用される溶出剤（通常洗浄剤）の濃度を意味する。
【００４３】
「ペプチド−ナノチューブ複合体」と言う用語は、ペプチド上の結合部位を通じてナノチューブに結合したペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００４４】
「ナノ構造」と言う用語は、チューブ、ロッド、円筒、バンドル、ウェーハ、ディスク、シート、プレート、平面、円錐体、スライバー、顆粒、楕円体、楔、ポリマーファイバー、天然ファイバー、および約１００ｎｍ未満の少なくとも１つの特徴的寸法を有するその他のこのような物体を意味する。
【００４５】
「固形基材」と言う用語は、直接的化学的手段またはコーティングなどの中間材料経由のどちらかによって、カーボンナノチューブまたは結合ペプチドを付着させても良い材料を意味する。
【００４６】
「同一性」と言う用語は、配列を比較することで判定される、２つ以上のポリヌクレオチド配列、または２つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。「同一性」および「類似性」は、「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  分析  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｕ）」フォン・ハインユ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ）Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７、（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）、グリスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ）Ｍ．およびデヴェルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１、および「配列データのコンピュータ分析、第１部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １）」グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ａ．Ｍ．およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４）」で述べられたものをはじめとするが、これに限定されるものではない既知の方法によって容易に計算できる。
【００４７】
「アミノ酸」と言う用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学的構造単位を指す。ここでは以下の略語を使用して、特定のアミノ酸を同定する。
【００４８】
【表１】
2006516240.tif 000002
【００４９】
「変種」と言う用語は、それぞれ基準ポリヌクレオチド、またはポリペプチドとは異なるが、本質的特性を保持するポリヌクレオチド、またはポリペプチドを指す。変種のヌクレオチド配列中の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもしなくても良い。ヌクレオチドの変化は、基準配列によってコード化されたポリペプチド中のアミノ酸置換、欠失、付加、融合、および切り詰めをもたらしても良い。ポリペプチドの典型的な変種は、アミノ酸配列が、１つもしくはそれ以上の置換、付加、欠失のあらゆる組み合わせで、別の基準ポリペプチドと異なっても良い。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされたものであってもなくても良い。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は対立遺伝子変種など自然発生的であっても良く、または自然発生的変種として知られていないくても良い。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非自然発生的変種は、直接合成、突然変異誘発技術、あるいは技術分野で既知のその他の組み換え法によって作られても良い。
【００５０】
「化学的に等価なアミノ酸」と言う用語は、そのタンパク質の化学的または機能的性質を変更することなく、特定のタンパク質中で別のアミノ酸を置換しても良いアミノ酸を指す。例えば特定部位で化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、エンコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない遺伝子の変更が一般的であることは、技術分野で周知である。本発明の目的では、置換は以下の５群の１つにおける交換として定義される。
疎水性
小型の脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒＰｒｏ、Ｇｌｙ；
大型の脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌＣｙｓ；および
大型芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；
親水性
極性、負に荷電した残基とそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
したがって疎水性アミノ酸であるアラニンは、疎水性がより低い残基（グリシンなど）または疎水性がより高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）によって置換されても良い。同様に１つの負に荷電した残基の別のもの（アスパラギン酸によるグルタミン）への置換、または１つの正に荷電した残基の別のもの（リジンによるアルギニン）への置換をもたらす変化もまた、機能的に同等の生成物を生じられることが予期される。さらに多くの場合、タンパク質分子Ｎ末端およびＣ末端部分の変更は、タンパク質の活性を変更しないことが予期される。
【００５１】
「遺伝子」は、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）、そしてその後ろに続く制御配列（３’非コード配列）をはじめとする、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、それ自体の制御配列と共に自然界に存在する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に一緒にはない、制御およびコード配列を含んでなる、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導された制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが自然界にあるのとは異なるやり方でアレンジされた、制御配列およびコード配列を含んでなっても良い。「外来」遺伝子とは、常態では宿主生物中にないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物またはキメラ遺伝子に挿入された天然遺伝子を含んでなることができる。
【００５２】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を使用して化学的に合成されたオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルすることができる。これらの構成単位をライゲートさせアニールさせて遺伝子断片を形成せしめ、次にそれらを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築せしめる。「化学的に合成された」はＤＮＡ配列との関連で、構成要素ヌクレオチドを生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でアセンブルさせたことを意味する。ＤＮＡのマニュアル化学的合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販される機械の１つを使用して自動化学的合成が実施できる。したがって遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適遺伝子発現のために調整できる。当業者は、コドンの使用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合に、成功する遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの判定は、配列情報が得られる宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づくことができる。
【００５３】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）または下流（３’非コード配列）に位置し、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造が挙げられる。
【００５４】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは全て天然遺伝子から誘導されても、あるいは自然界にある異なるプロモーターから誘導された異なる要素から構成されても、あるいは合成ＤＮＡ断片を含んでなっても良い。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に応えて、遺伝子発現を指揮しても良いことは、当業者によって理解される。ほとんどの場合、ほとんどの細胞タイプにおいて遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。ほとんどの場合において、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しても良いことがさらに理解される。
【００５５】
「発現」と言う用語は、ここでの用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指しても良い。
【００５６】
「形質転換」と言う用語は、遺伝子的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノム中への核酸断片の移入を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００５７】
「宿主細胞」と言う用語は、形質転換または形質移入された、あるいは外来性ポリヌクレオチド配列によって形質転換または形質移入できる細胞を指す。
【００５８】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二重鎖ＤＮＡ分子の形態である、染色体外の要素を指す。このような要素は、選択された遺伝子生成物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳の配列と共に細胞中に導入できるユニークな構造体に、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組み換えされた、あらゆる供給源から誘導される一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直鎖または環状、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であっても良い。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする要素を有する、特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて外来宿主中でのその遺伝子の増強された発現を可能にする要素を有する、特定のベクターを指す。
【００５９】
「ファージ」または「バクテリオファージ」と言う用語は、細菌に感染するウイルスを指す。本発明の目的のためには、変造形態を使用しても良い。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３およびラムダと称される２つの「野生型」ファージから誘導される。ラムダファージは、約１０〜２０ｋｂ範囲のＤＮＡ断片をクローン化するのに使用される。これらは溶菌ファージであり、すなわちそれらの宿主細胞を溶解し、より多くのファージを放出して複製する。Ｍ１３系は、細菌内で生育できるので、それが感染した細胞を破壊しないが、新しいファージを連続的に作らせる。これは一本鎖ＤＮＡファージである。
【００６０】
「ファージディスプレイ」と言う用語は、バクテリオファージまたはファージミド粒子表面の機能的外来ペプチドまたは小型タンパク質の呈示を指す。ペプチドをそれらの天然表面タンパク質断片として呈示するのに、遺伝子改変ファージが使用できる。ペプチドライブラリは、異なる遺伝子配列を有するファージの集団によって製造されても良い。
【００６１】
ここで使用する標準的組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「（分子クローニング：実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）、シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクィスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．，「遺伝子融合実験（実験ｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ、ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．他「分子生物学の現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）で述べられている。
【００６２】
本発明は、カーボンナノ構造に結合するペプチド、並びにそれを生成して使用する方法を提供する。
【００６３】
カーボンナノ構造
本発明は、カーボンナノ構造、特にナノチューブに対する結合親和性を有するペプチドの生成に関する。本発明のカーボンナノ構造は、チューブ、ロッド、円筒、バンドル、ウェーハ、ディスク、シート、プレート、平面、円錐体、スライバー、顆粒、楕円体、楔、ポリマーファイバー、天然ファイバー、および約１００ｎｍ未満の少なくとも１つの特徴的寸法を有するその他のこのような物体の形態を取る炭素を主に含んでなる構造である。本発明の好ましいカーボンナノ構造は、ナノチューブである。
【００６４】
本発明のナノチューブは概して直径が約１〜２００ｎｍであり、狭い寸法に対する長さ寸法の比率、すなわち縦横比が少なくとも５である。概して縦横比は１０〜２０００の間である。カーボンナノチューブは、主に炭素原子を含んでなるが、例えば金属などのその他の要素でドープ処理されても良い。本発明の炭素ベースのナノチューブは、多層ナノチューブ（ＭＷＮＴ）または単層ナノチューブ（ＳＷＮＴ）のどちらかであることができる。例えばＭＷＮＴは、それぞれが異なる直径を有するいくつかの同心性ナノチューブを含む。したがって最も小さい直径のチューブはより大きな直径のチューブによって包まれ、それは次に別のより大きい直径のナノチューブによって包まれる。他方、ＳＷＮＴは１本のナノチューブのみを含む。
【００６５】
カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）は、種々の方法によって製造されても良く、さらに市販もされる。ＣＮＴ合成方法としては、グラファイトのレーザー蒸発（Ａ．テス（Ｔｈｅｓｓ）他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３、４８３（１９９６））、アーク放電（Ｃ．ジュルネ（Ｊｏｕｒｎｅｔ）他、Ｎａｔｕｒｅ  ３８８、７５６（１９９７））、およびＨｉＰＣｏ（高圧一酸化炭素）法（Ｐ．ニコラエフ（Ｎｉｋｏｌａｅｖ）他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３１３、９１〜９７（１９９９））が挙げられる。化学蒸着（ＣＶＤ）もカーボンナノチューブを製造するのに使用できる（Ｊ．コング（Ｋｏｎｇ）他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２９２，５６７〜５７４（１９９８）；Ｊ．コング（Ｋｏｎｇ）他、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５，８７８〜８７９（１９９８）；Ａ．キャッセル（Ｃａｓｓｅｌｌ）他、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０３，６４８４〜６４９２（１９９９）；Ｈ．ダイ（Ｄａｉ）他、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０３，１１２４６〜１１２５５（１９９９））。
【００６６】
さらにＣＮＴは、溶液中と固形基材上のどちらにおいても触媒工程を通じて成長しても良い（ヤン・リ（Ｙａｎ  Ｌｉ）他、Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．；２００１；１３（３）；１００８〜１０１４）；（Ｎ．フランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ）およびＨ．ダイ（Ｄａｉ）Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１２，８９０（２０００）；Ａ．キャッセル（Ｃａｓｓｅｌｌ）他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，７９７５〜７９７６（１９９９））。
【００６７】
ペプチド生成
本発明のペプチドは無作為に生成され、次にカーボンナノ構造の集団に対して、ＣＮＴへの結合親和力について選択される。ペプチドライブラリの無作為ライブラリの生成は周知であり、バクテリアディスプレイ（ケンプ（Ｋｅｍｐ）Ｄ．Ｊ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８（７）：４５２０〜４５２４，１９８１、およびヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）Ｄ．Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０（１）：３１〜３５，１９８３）、イーストディスプレイ（チェン（Ｃｈｉｅｎ）ＣＴ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９１年１１月１日；８８（２１）：９５７８〜８２）組合わせ固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）およびファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）をはじめとする様々な技術によって達成されても良い。このような生物学的ペプチドライブラリを生成する技術については、ダニ（Ｄａｎｉ）Ｍ．のＪ．  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＆  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．，２１（４）、４４７〜４６８（２００１）で述べられている。
【００６８】
ペプチドを無作為に生成する好ましい方法は、ファージディスプレイによる。ファージディスプレイは生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択技術であり、ペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質に遺伝的に融合して、ファージビリオンの外面上の融合タンパク質の呈示をもたらす一方、ＤＮＡはビリオン内に融合残基をコード化する。この呈示されたタンパク質とそれをコード化するＤＮＡ間の物理的リンケージは、「バイオパニング」と称される単純な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択手順によって、それぞれが対応するＤＮＡ配列にリンクした膨大な数のタンパク質の変種をスクリーニングするのを可能にする。最も単純な形態では、バイオパニングは、プレートまたはビーズ上に固定化された興味の対象となるターゲットと共に、ファージディスプレイされた変種のプールを培養し、非結合ファージを洗い流して、ファージとターゲット間の結合相互作用を乱すことで特異的に結合したファージを溶出して実施される。次に溶出されたファージを生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）増幅し、工程を反復して、最も密接な結合配列を支持するファージプールの段階的濃縮をもたらす。３回以上の選択／増幅の後、個々のクローンをＤＮＡ配列決定によって特性を明らかにする。
【００６９】
したがって、
ａ）溶液中のファージ発現ペプチドのライブラリを準備し、
ｂ）カーボンナノ構造の集団を準備し、
ｃ）（ａ）のファージを（ｂ）のナノ構造とナノ構造へのファージの結合を可能にするのに十分な時間接触させ、ファージ−ナノ構造複合体を形成せしめ、
ｄ）非結合ファージを除去し、
ｅ）（ｃ）のファージ−ナノ構造複合体を適切な細菌宿主と接触させ、それによって細菌をファージによって感染させ、
ｆ）ステップ（ｅ）の感染した細菌をファージおよび発現ペプチドの複製を可能にするのに十分な時間生育させ、そして
ｇ）ペプチドがカーボンナノ構造に結合するステップ（ｆ）の複製されたファージおよび発現ペプチドを単離する
ことを含んでなるカーボンナノ構造結合ペプチドの生成方法を提供することが本発明の目的である。
【００７０】
ペプチド選択
適切なペプチドライブラリが生成された後、次にそれらをカーボンナノ構造またはナノチューブの適切な集団と接触させる。ナノチューブは、典型的に溶液中に懸濁されながらペプチドライブラリに呈示されるが、ＣＮＴまたはペプチドを固形基材上に固定化させて結合を促進できることも理解される。このような実施態様では、適切な固形基材としては、シリコンウェーハや、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリグリシジルメタクリレート、置換ポリスチレン（例えばアミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニルなど）などの合成ポリマー基材や、ガラス、アガロース、ニトロセルロース、およびナイロンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７１】
好ましい溶液は、界面活性剤を含有する緩衝食塩水である。適切な溶液は０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水である。溶液は、さらに、ペプチドのナノチューブに対する結合を増大させるために、あらゆる手段によって撹拌できる。
【００７２】
接触に際して、いくつかの無作為に生成されたペプチドを、ＣＮＴに結合させてペプチド−ナノチューブ複合体を形成する。非結合ペプチドおよびＣＮＴは、（固定化される場合）洗浄によって、あるいは遠心分離または濾過などのあらゆるその他の手段によって除去されても良い。あらゆる非結合材料を除去した後、様々な強度の界面活性剤を有する緩衝液中での選択的洗浄によって、ＣＮＴに対する様々な程度の結合親和性を有するペプチドを分画しても良い。洗浄緩衝液中の界面活性剤濃度が高いほど、選択されるストリジェンシーもより高くなる。使用するストリジェンシーを増大させることで、ペプチド−ナノチューブ複合体中のペプチドとナノチューブ間の結合の必要な強度を増大させる。
【００７３】
酸性ｐＨ１．５〜３、塩基性ｐＨ１０〜１２．５、ＭｇＣｌ２  ３〜５Ｍ、ＬｉＣｌ  ５〜１０Ｍなどの高塩濃度、水、エチレングリコール２５〜５０％、ジオキサン５〜２０％、チオシアネート１〜５Ｍ、グアニジン２〜５Ｍ、尿素２〜８Ｍ、そしてＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）などの種々の濃度の異なる界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）が好ましい）をはじめとするが、これに限定されるものではないいくつかの材料を使用して、ペプチド選択における緩衝液溶液のストリジェンシーを変化させても良い。材料は、トリスＨＣｌ、トリスボラート、トリス酸性酸、トリエチルアミン、リン酸緩衝液、グリシンＨＣｌをはじめとするが、これに限定されるものではない緩衝液溶液中で調製され、．２５ＭグリシンＨＣｌ溶液が好ましい。
【００７４】
ストリジェンシーが増大する緩衝液を使用して選択工程を繰り返すことで、ＣＮＴ基材に対するより大きな結合親和性を有するペプチドが溶出されても良いことが理解される。
【００７５】
溶出されるペプチドは技術分野で既知のあらゆる手段によって同定され、配列決定され、製造できる。
【００７６】
カーボンナノチューブ結合ペプチド
上の工程によって選択された本発明のペプチドが同定されている。特にカーボンナノチューブに対する高い結合親和性を有する多数のペプチドが単離され、配列番号：１〜２４および３５〜１７７で述べたアミノ酸配列を有する。
【００７７】
本発明がこれらの特定の配列に限定されず、ペプチドがＣＮＴに結合する能力を妨げない化学的に等価なアミノ酸置換を含んでなるアミノ酸配列を含むことを当業者は理解するであろう。ゆえに、例えば配列番号：１４中のアミノ酸のそれぞれに対する化学的に等価な置換を以下の表で詳述する。
【００７８】
【表２】
2006516240.tif 000003
【００７９】
本発明の選択されたペプチドの配置および分析は、カーボンナノ構造またはナノチューブ結合特性が、ペプチドの二次的特性に関連していることを示す。例えば本発明のペプチドのために、親水性または疎水性の理由になる単純なペンダントモデルが開発された。これは全ての共通配列が、末端が親水性で中間は疎水性の本質的に対称性の界面活性剤であることを実証する。モデルは、全てのペンダントの基を親水性（ｈ＝−１）または疎水性（ｈ＝１）のどちらかとして分類することで、アミノ酸ペンダント基の親水性または疎水性の程度を表現する。塩基性、酸性または無電荷の極性のいずれかである側鎖は親水性であり、一方非極性である側鎖は疎水性である。本発明の方法によって選択されたペプチドのいくつかを下にモデルした。
【００８０】
【表３】
2006516240.tif 000004
【００８１】
【表４】
2006516240.tif 000005
【００８２】
【表５】
2006516240.tif 000006
【００８３】
【表６】
2006516240.tif 000007
【００８４】
これらのペプチドを広範な洗浄剤濃度（０．６％〜３％）にわたり選択したが、それでもなお親水性および疎水性の同一パターンを示す。２、３の例外を除き、ｈ＝−１は主に末端にあり、ｈ＝１は中央に集中している。
【００８５】
従って本発明の目的は、一般構造：
Ｎ−Ｍ−Ｃ
[式中、
Ｎは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端部分であり、
Ｍは７５％が疎水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドの中間部分であり、
Ｃは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端部分である]
を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドを提供することである。
【００８６】
組み換え法によるペプチド生成
ひとたび適切な結合特性を有するペプチドが同定されると、それは組み換え的に大量に製造されても良い。ナノチューブ結合ペプチドをコード化する遺伝子は、異種の宿主細胞中、特に微生物宿主細胞中で製造されても良い。
【００８７】
ナノチューブ結合ペプチド発現のために好ましい異種の宿主細胞は、
真菌または細菌系統群に広く存在し、広範な温度、ｐＨ値、および溶剤耐性にわたって生育する微生物宿主である。転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は細胞原料にかかわりなく同一であるので、細胞有機体を生成するのに使用された炭素原料にかかわりなく機能的遺伝子が発現した。宿主菌種の例としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの真菌または酵母種、あるいはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８８】
様々な発現系を使用して、本発明のペプチドを生じることができる。このようなベクターとしては、例えば細菌プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、挿入配列から、酵母エピソームから、バキュロウイルスから、レトロウイルスなどのウイルスから誘導されるベクター、およびプラスミドとコスミドおよびファージミドなどのバクテリオファージ遺伝的要素とから誘導されるものなど、それらの組み合わせから誘導されるベクターなどの染色体、エピソーム、およびウイルスから誘導されるベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。発現系コンストラクトは、発現を制御し、並びに発生させる制御領域を含有しても良い。概してこの関連で発現のために、宿主細胞中でポリヌクレオチドまたはポリペプチドを維持し、増殖し、または発現するのに適したあらゆるシステムまたはベクターを使用しても良い。微生物発現系および発現ベクターは、宿主細胞の生育に比べて高レベルの外来タンパク質の発現を指揮する制御配列を含有する。制御配列は当業者には周知であり、例としては、例えばエンハンサー配列などのベクター中に存在しても良い制御要素の存在をはじめとする化学的または物理的刺激に応えて、遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらのいずれでも使用して、あらゆるナノチューブ結合ペプチドの生成のためにキメラ遺伝子をコンストラクトできる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝を適切な微生物に導入し、高レベルのペプチド発現を提供できる。
【００８９】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、技術分野で周知である。典型的にベクターまたはカセットは、当該遺伝子の転写および翻訳を指揮する配列、１つもしくはそれ以上の選択可能マーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始コントロールを内部にもつ遺伝子の５’領域、および転写終結をコントロールするＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方のコントロール領域が、形質転換宿主細胞と相同の遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このようなコントロール領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定の種に天然の遺伝子から誘導されなくても良いものと理解される。選択可能マーカー遺伝子は、形質転換宿主細胞の選択のために、大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性などの表現型的形質を提供する。
【００９０】
遺伝子は、所望の宿主細胞中での本ＯＲＦ発現を駆動するのに有用である開始コントロール領域またはプロモーターが、多数で当業者になじみ深いように、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現のために）、そして場合によりオペレーターまたはコントロール要素のコントロール下に置くことができる。実質的にこれらの遺伝子を駆動できるあらゆるプロモーターが本発明にとって適切であり、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中での発現に有用な）；ＡＯＸ１（ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）中での発現に有用な）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中での発現に有用な）並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび種々のファージプロモーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９１】
終結コントロール領域は、好ましい宿主に天然である種々の遺伝子から誘導されても良い。場合により終結部位は不必要であるかもしれないが、含まれれば最も好ましい。
【００９２】
上で述べた適切なＤＮＡ配列を含有するベクター、並びに適切なプロモーターまたはコントロール配列を用いて、適切な宿主を形質転換して、宿主が本発明のペプチドを発現するのを可能にしても良い。また細胞フリー翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡコンストラクトから誘導されるＲＮＡを使用して、このようなペプチドを生成できる。
【００９３】
場合により形質転換宿主の分泌生成物として、本遺伝子生成物を生じることが所望されるかも知れない。増殖培地中への所望のタンパク質の分泌は、単純で経費のかからない精製手順という利点を有する。分泌シグナル配列が細胞膜を超えた発現可能タンパク質の能動輸送を促進する上で有用なことが多いことは、技術分野で周知である。分泌できる形質転換宿主の作成は、宿主生成宿主中で機能性の分泌シグナルをコード化するＤＮＡ配列の組み込みによって達成されても良い。適切なシグナル配列を選択する方法は、技術分野で周知である（例えばＥＰ  ５４６０４９号明細書、国際公開第９３２４６３１号パンフレットを参照されたい）。分泌シグナルＤＮＡまたはファシリテーターは、発現をコントロールするＤＮＡと本遺伝子または遺伝子断片との間、および後者の同一読み枠内に位置しても良い。
【００９４】
ナノデバイス制作
本発明のカーボンナノチューブ結合ペプチド（ＣＮＢＰ）は、ビ−、トリ−（またはそれ以上の）結合官能基を有する実体中の１つの要素であることができる。ＣＮＢＰは、下で示すように図示できる。
【００９５】
【化１】
2006516240.tif 000008
【００９６】
式中、
「Ｃ」は、カーボンナノチューブを示唆し、結合官能基は「⊂」によって描写される。しかし一端に描かれているにもかかわらず、それはペプチド配列の限局性でなく集合的特性として解釈されるべきである。全体的実体は、ＣＮＢＰと、「＞」によって描写される結合官能基を有する別の本体「Ｂ」との「融合」によってコンストラクトされ、その組み合わせを下に図示する。
【００９７】
【化２】
2006516240.tif 000009
【００９８】
これは最小の例を示すことを意図し、融合はより高い順位（計数上）の官能価を作り出すことができる。Ｂの例としては、ＤＮＡ結合タンパク質、例えばシステインのようなアミノ酸残基に直接結合したＡｕなどの金属性電極、またはＣＮＢＰ固定化のための硬質基材（例えばＳｉまたはＳｉＯ２）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００９９】
カーボンナノチューブの有用な構造への定方向自己アセンブリーはＣＮＢＰ結合とあらかじめパターン化された基材とを組み合わせることで達成できる。例えば結合官能基「Ｂ」が一連のシステイン残基であった場合、（ａ）カーボンナノチューブの希釈懸濁液の調製、（ｂ）ＣＮＢＰによる選択されたタイプの官能性付与、そして（ｃ）パターン化されたＡｕ電極付き基材の洗浄の手順は、ナノエレクトロニクス装置に妥当な距離内で、ペプチドを通じたカーボンナノチューブの金属電極への付着をもたらす。より高い順位の官能価を得るための要素の組み合わせにおける生化学的ツールキットの多様性のために、ひとたび基本的結合モチーフが同定されると、多くのその他のこのような方法を思いつくことができる。
【０１００】
様々な用途におけるカーボンナノチューブ使用の大きな障害は、全ての製造工程が、絡まったチューブの混合物を生じるという事実である。生成物中の個々のチューブは、直径、キラリティー、および壁の数が異なる。さらに長いチューブは、「ロープ」に凝集する強い傾向を示す。これらのロープは、ナノチューブの大きな表面積のために形成し、１本のロープに数十から数百のナノチューブを含むことができる。その上個々のチューブの構造は、材料内に共存する掛け椅子、ジグザグまたはその他の鏡像異性形態から変化に富み、そしてそれらの電気的特性もそれに従って劇的に変動する（金属性または半導電型）。したがって単一形態（掛け椅子、ジグザグまたは鏡像異性形態など）のカーボンナノチューブの単離に対する必要性が存在する。
【０１０１】
例えば酸洗い、超音波洗浄、および界面活性剤使用など、このような生成物を分離する現存の方法は、ナノチューブのタイプに関して非特異性である。ペプチド結合は通常高度に特異的であるので、ＣＮＢＰの主な効用は特異的分離をもたらすことである。１つの可能な方法は、異なるタイプの結合ＣＮＢＰでパターン化された基材の上に流して分離された、カーボンナノチューブの希釈懸濁液を使用することである。結合の強度と特異性に基づいてパターン化を順序づけるように選択し、すなわち高度に選択的な結合ペプチドが、特異性のより低いものよりも先に混合物に作用するように配置される。分離を達成する多くのその他のやり方を思いつくことができる。「Ｂ」が磁性の粒子に結合するならば、連続フローの一段階においてカーボンナノチューブに結合するために接合実体が使用でき、別の段階では結合したナノチューブが磁力的に分離できる。
【０１０２】
したがって
ａ）溶液中のロープ形態におけるカーボンナノチューブの集団を準備し、
ｂ）ステップ（ａ）のカーボンナノチューブの集団を
一般構造：
Ｎ−Ｍ−Ｃ
[式中、
Ｎは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＮ末端部分であり、
Ｍは７５％が疎水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドの中間部分であり、
Ｃは７５％が親水性である約４個のアミノ酸を有するペプチドのＣ末端部分である]
を有するカーボンナノチューブ結合ペプチドと接触させ、
それによってカーボンナノチューブロープを分散させる
ことを含んでなるカーボンナノチューブロープの集団の分散方法を提供することが、本発明の目的である。
【０１０３】
当業者は、ナノチューブの集団を分別して、種々の結合特性について選択することが有用であることを理解するであろう。ＣＮＴ結合ペプチドを発現するＣＮＴ結合ペプチドまたは単離ファージをこの目的のために使用することが考察される。例えばＣＮＴの特異的集団に親和性を有するＣＮＴ結合ペプチドまたはそれを発現するファージを固形基材上に固定化して、次にＣＮＴの混合集団と接触させても良い。所望のＣＮＴを固定化されたペプチドまたはファージに結合させて所望されないＣＮＴを洗い落としても良い。代案としてはビーズまたは微小球などの固形基材をＣＮＴ結合ペプチドまたはファージで被覆して使用し、ＣＮＴをアセンブルしても良い。固形担体として適切な材料は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）などの合成ポリマーから、あるいはガラス、セラミック、金属などのその他の材料からできていても良い。これらの材料をフィルム、マイクロタイタープレート、ウェル、ビーズ、スライド、粒子、ピン、ペグ、または膜として使用しても良い。
【０１０４】
したがって本発明は、少なくとも１つの化学種のカーボンナノチューブ結合ペプチドで被覆された固形基材をカーボンナノチューブの集団と接触させ、それによってカーボンナノチューブを被覆された基材に結合させてアセンブルすることを含んでなるカーボンナノチューブのアセンブル方法である。
【０１０５】
当業者は、特定の固形担体上のＣＮＴ結合ペプチドのパターン化が、ナノデバイスの設計および製作において有用な技術であることを理解するであろう。場合によっては、ＣＮＴを忌避するまたはそれに親和性を有さない材料で、担体の一部を部分的および選択的にマスキングしてパターン化を達成しても良い。この目的のために様々な材料を使用しても良いが、ＣＮＴ結合ペプチドに対して同様の物理的特性を有する非ＣＮＴ結合ペプチドが特に適している。非ＣＮＴ結合ペプチドは、ＣＮＴ結合ペプチドのためのあらゆる選択工程のはじめの頃に、容易に選択され同定される。これらを使用して固形担体を製造し、担体．上のＣＮＴ結合のパターン化をもたらしても良い。ここに提供するいくつかの実施例は、配列番号：２８および３４に示すペプチドを含む。
【実施例】
【０１０６】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例証のみのを目的とするものと理解される。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を解明でき、その精神と範囲を逸脱することなく本発明の種々の変更と修正をして、それを種々の使用法および条件に適応させられる。
【０１０７】
一般的方法
実施例で使用した標準的組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野で周知であり、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「（分子クローニング：実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）（「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）、シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクィスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．，「遺伝子融合実験（実験ｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ、ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）、およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．他「分子生物学の現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）で述べられている。
【０１０８】
細菌培養の維持および生育のために適切な材料および方法は、技術分野で周知である。以下の実施例で使用するのに適した技術は、「一般的細菌学の方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグズ・フィリップス（Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４））またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業微生物学テキスト第二版（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）に述べられている。特に断りのない限り、細菌細胞の増殖と維持のために使用したあらゆる試薬、制限酵素、および材料は、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手した。
【０１０９】
ファージライブラリ調製
本発明で使用しファージライブラリは、ニュー・イングランド・バイオラブ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）（カタログ番号Ｅ８１１０Ｓ、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイ・ペプチド・ライブラリキット）から購入した。キットは、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合した、無作為ペプチド１２ｍｅｒｓの組合わせライブラリをベースとする。呈示されたペプチド１２ｍｅｒはｐＩＩＩのＮ末端で発現され、すなわちシグナルペプチドが切断された後は、コートタンパク質の第１の残基が、呈示されたペプチドの第１の残基である。ライブラリは、呈示エピトープ中に２．７×１０９（１００μＬ）の変種を含有する。１０μＬの容量は約５５コピーの各ペプチド配列を含有する。ライブラリ中にバイアスを持ち込むのを避けるために、実験の各初回は、製造元によって提供されたオリジナルライブラリを使用して実施した。
【０１１０】
ファージの配列決定
無作為Ｍ１３ファージプラークを選び、製造元の使用説明（マサチューセッツ州ベバリーのニュー・イングランド・ラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ）Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に従って単一プラーク溶菌液を調製した。一本鎖ファージゲノムＤＮＡをＱｉａ遺伝子キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３ｋｉｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２７７０４）によって精製した。一本鎖ＤＮＡを−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）配列番号：３３で配列決定した。呈示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置する。
【０１１１】
マルチ配列分析
ソフトウェア使用説明に従って、ソフトウェア、ＤＮＡスター（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ）（バージョン５．０２）またはクラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）を使用して、ファージディスプレイ実験からの配列を分析した。配置は、選択された配列間に類似性を提供し、特定のアミノ酸残基の重要な機能を予測した。
【０１１２】
実施例１
カーボンナノチューブの調製
ＣＮＴ−７と呼ばれるカーボンナノチューブは、マサチューセッツ州ケンブリッジのＭＩＴの物質科学部のイェット・ミン・チャン（Ｙｅｔ−Ｍｉｎｇ  Ｃｈｉａｎｇ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＩＴ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から得た。ＳｉＣ（シリコンカーバイド）を真空下で１７００℃に加熱して、ナノチューブを調製した。シリコンはサンプルから「蒸発」し、ナノチューブをはじめとするカーボンの折りたたみ構造を形成するカーボンが残った。
【０１１３】
単層カーボンナノチューブは、テキサス州ヒューストンのＣＮＩ（Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）から購入した。これらのナノチューブはレーザー・オーブン技術またはＨｉＰＣＯ（高圧一酸化炭素）工程（Ｐ．ニコラエフ（Ｎｉｋｏｌａｅｖ）他、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．３１３，９１〜９７（１９９９））によって製造された。
【０１１４】
ＣＮＴ−７サンプルが多層および単層カーボンナノチューブをはじめとする種々のカーボン構造を含有したのに対し、ＣＮＩサンプルはほとんどが単層カーボンナノチューブであった。
【０１１５】
実施例２
カーボンナノチューブ結合ペプチドの選択
ＣＮＴ−７およびＣＮＩカーボンナノチューブを０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）含有トリス緩衝食塩水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁した。次にコネチカット州ダンベリーのブランソン・ソニック・パワーからのＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒモデル４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｏ．，（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ））によって、出力設定４〜５、負荷サイクル７０〜８０％で３回、カーボンナノチューブ溶液を超音波分解した。１０μＬのＭ１３ファージライブラリ（約１０１１個のファージを含有する）を１ｍｌのカーボンナノチューブに添加した。混合物を穏やかに撹拌しながら６０分間、室温で培養した。ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・インストゥルメント（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）からのエッペンドルフ５４１５Ｃ遠心機内で、１４，０００ｒｐｍ（１６，１１０×ｇ）の１０分間の高速回転によって、非結合ファージをナノチューブサンプルから分離した。引き続いて下のデータに示すように選択したサイクルでＴｗｅｅｎ−２０の濃度がその中で増大する各１ｍｌのＴＢＳ−Ｔで、ファージ／ナノチューブ複合体を１０回洗浄した。例えば一実験では、Ｔｗｅｅｎ２０の濃度を１回目の０．２％から２回目の０．３％、４回目の０．４％、５回目の０．５％、６回目の０．６％、７回目の０．７％、８回目の１％、９回目の２％、１０回目の３％、１１回目の６％、そして１２回目の１０％に増大させた。最後の（１０回目）の洗浄ステップの後、０．５ｍｌの０．２５ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ３．０と共に１０〜１５分間室温で培養して結合ファージを溶出した。ファージおよびナノチューブを１４，０００ｒｐｍ（１６，１１０×ｇ）で１０分間遠心分離し、透明な上清が溶出したファージを含有した。ファージ滴定によって、上清中のファージの存在および濃度を判定した。ひとたびサンプルをファージの存在について確認すると、ファージ増幅のためにそれらを使用して大腸菌を接種し、次回のための「プール」として増幅されたファージサンプルを使用した。典型的な実験では、対数期はじめに２０ｍｌの大腸菌培養液に全溶離液を添加した。培養液を３７℃でさらに４．５時間培養してファージを増殖させた。培養終了時に、培養液を４℃で１０分間１６，０００×ｇで遠沈した。透明になった上清中のファージを４℃でＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させた。遠心分離後、ファージを２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、濃度を滴定によって求めた。引き続いてこのサンプルを次回の実験のためのストックとして使用した。次回の実験を実施するために、１０１１個のファージを投入「プール」として使用し、洗浄のための増大するストリジェンシー、すなわち増大する濃度のＴｗｅｅｎ−２０で上記のように選択工程を反復した。洗浄剤濃度０．５％以上での選択によって有用なペプチドを得て、これらのペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。
【０１１６】
【表７】
2006516240.tif 000010
【０１１７】
これらのペプチドのＣＮＴへの結合は、図１に示すように、単層ＣＮＴに結合するいくつかの対象ペプチドを示すＴＥＭ顕微鏡写真によってさらに確認された。
【０１１８】
実施例３
ナノチューブ結合ペプチドの構造および機能的性質決定
以下の実施例は、カーボンナノチューブのためのペプチド結合親和力に対する保存アミノ酸の重要性を例証する。
【０１１９】
選択されたペプチド配列の配置は、１位のヒスチジン、および６位のトリプトファンが結合に重要であることを強く示す。下で表３に示す１００を超えるファージクローンのさらに詳しい分析からは、呈示によって選択されたペプチド組成物中で、ＨｉｓおよびＴｒｐが２個の主要なアミノ酸であることが明らかにされる
【０１２０】
【表８】
2006516240.tif 000011
【０１２１】
【表９】
2006516240.tif 000012
【０１２２】
部位定方向突然変異誘発を使用して、配列番号：１３（ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ）および配列番号：１４（ＨＷＳＡＷＷＩＲＳＮＱＳ）のペプチドに６位でのＴｒｐ−＞Ｓｅｒの突然変異を導入し、ペプチドＨＷＫＨＰＳＧＡＷＤＴＬ（配列番号：２６）およびＨＷＳＡＷＳＩＲＳＮＱＳ（配列番号：２７）をそれぞれ生成した。上述のように、洗浄剤濃度０．４％におけるＣＮＴ−７に対する結合活性について、これらの突然変異を運搬するファージをアッセイした。Ｔｒｐ６での突然変異は、双方のペプチドでＣＮＴ−７に対する結合を低下させた。データを下の表４に示す。プラーク形成単位の数は、コントロールペプチド（ＬＰＰＳＮＡＳＶＡＤＹＳ）配列番号：２８およびペプチド配列番号：１３、１４、および突然変異ペプチド配列番号：２６および２７についてチャートした。表４に示す結合データは、ナノチューブに対する結合におけるＴｒｐの重大な役割を確認する。
【０１２３】
【表１０】
2006516240.tif 000013
【０１２４】
実施例４
ナノチューブの集団に対するペプチド結合の影響
以下の実施例は、カーボンナノチューブ「ロープ」をほどく、カーボンナノチューブ結合ペプチドの能力を例証する。
【０１２５】
合成ペプチドおよび単層カーボンナノチューブ（ＣＮＩ／レーザー・オーブン）および結合ペプチド配列ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬＧＧＧ［配列番号：２５］を用いて実験を行った。このペプチドは実施例２で述べたようにして選択され、ポリ−グリシンテールの付加がある配列番号：１３に示すペプチドを代表する。
【０１２６】
ＨＲＴＥＭで試験すると、配列番号：２５のペプチドが濃度４ｍｇ／ｍｌでナノチューブロープを分散させることが分かったのに対し、ポリグリシンテールＨＷＫＨＰＳＧＡＷＤＴＬＧＧＧ［配列番号：３２］を含有する突然変異ペプチド配列番号：２６、およびコントロールペプチド配列番号：２８  ＩＤ番号は、同一濃度でナノチューブを分散させなかった。結果を図２に示す。図２のパネルＡは、いかなるペプチドでも処理されていないナノチューブロープの電子顕微鏡写真である。図２のパネルＢは、ナノチューブ分散を示す、カーボンナノチューブ結合ペプチド配列番号：１３による処理後の単層ナノチューブの電子顕微鏡写真である。図２のパネルＣは、ナノチューブ結合親和力をほとんどまたは全く有さないコントロールペプチドである配列番号：２８のペプチドで処理した後の単層ナノチューブの電子顕微鏡写真である。
【０１２７】
実施例５
グラファイトクリーニングした結合ペプチド
カーボンナノチューブに対する特異的結合を有するペプチドを見つけるために、「グラファイトクリーニングした」ファージライブラリを使用して、実施例２で述べたようにして、ＣＮＴ−７カーボンナノチューブ基材についてファージディスプレイ実験を実施した。グラファイト−クリーニングしたファージライブラリは、最初に完全なファージライブラリを熱分解グラファイト基材上で洗浄して生成した。洗浄されたまたはクリーニングされたライブラリから、このようにしてグラファイトに結合するファージが剥奪される。セロハンテープを使用して、ペンシルベニア州ウェストチェスターのＳＰＩサプライズ（ＳＰＩ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ））からの高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ  ＳＰＩ−２）をペトリ皿に付着し、グラファイトの新鮮な層を露出した。ＴＢＳ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）中の約１０11ｐｆｕのＭ１３ファージをグラファイト基材に添加して、結合のために室温で４５〜６０分間静置した。確定Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）濃度で、過剰な（ＴＢＳ−Ｔ）によって非結合ファージを洗い落とした、結合ファージをｐＨ２．３のグリシン−ＨＣｌ緩衝液で溶出した。次に非結合ファージ（グラファイト−クリーニングしたライブラリ）を使用して、実施例２で述べたようにしてＣＮＴ−７についてファージディスプレイ実験を実施した。上述の標準的分子生物学方法を使用して、個々のファージを単離してＤＮＡ配列を得た。
【０１２８】
グラファイト−クリーニングしたライブラリを用いたＣＮＴ−７についての４回のファージディスプレイ後、（４回め、０．５％濃度のＴｗｅｅｎ−２０（登録商標））、２つの共通配列が出現した。これらは、ＨＨＨＨＬＲＨＰＦＷＴＨ（配列番号：２３）およびＷＰＨＨＰＨＡＡＨＴＩＲ（配列番号：２４）である。
【０１２９】
これらの配列の結合が、グラファイトクローンに比べてＣＮＴ−７に特異的なことが推測される。知見の意義は、新たに切断されたグラファイトに結合するグラフェンシートと、カーボンナノチューブ表面の間の密接な関係である。カーボンナノチューブ表面は本質的に湾曲した、またはグラフェンシートである。それ自体として対象を、カーボンナノチューブおよびグラファイトの双方に結合させても良い。結合が２つを識別するものに追加的な意義があるかもしれない。この結果は、ペプチドが異なる炭素同素体を識別することを例証する。
【０１３０】
実施例６
ペプチドが促進するＣＮＴの微小球への結合
実施例６ではＣＮＴ結合ペプチドで被覆された微小球が、単層ナノチューブに結合させて微小球のアセンブリーを押し進めるのに効果的であることを例証する。
【０１３１】
ファージ被覆された微小球の調製
精製したファージクローンを増幅した。インディアナ州フィッシャーズ、テクニカル・ドライブのバングズラボラトリー（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，（９０２５  Ｔｅｃｈｉｎｉｃａｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｉｓｈｅｒｓ  ＩＮ  ４６０３８−２８８６））からの抗マスウ抗体ＩｇＧ被覆微小球（直径７μｍ）をニュージャージー州ピスカタウェイ、セントラル・アベニューのアマシャム・ファーマシア・バイオイテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（８００  Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ  Ａｖｅｎｕｅ  ＰＯ  Ｂｏｘ１３２７  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ  ０８８５５））からの抗Ｍ１３モノクローナル抗体で被覆した。精製したファージクローンで、ＴＢＳ緩衝液中のこれらの微小球を被覆した。１０ｇのアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＸＡＤ−４（ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８  ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８））含有の１ＬのＴＢＳ緩衝液中で、ファージ被覆微小球を１０％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１６５分散ＳＷＮＴ  ７．５μｇ／ｍｌと共に透析チューブ内で一晩インキュベートした。次に微小球を水で３回洗浄した。ビーズをＳＥＭ下で検査した。
【０１３２】
ペプチド被覆微小球の調製
選択された配列をＮＨ2−ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬＧＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号：２５）、およびＮＨ2−ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ−ＣＯＯＨ（配列番号：１３）をはじめとする遊離ペプチドとして合成した。ＥＤＣリンカー（イリノイ州ロックフォードのピアス（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．（３７４７  Ｎ．Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｒｏａｄ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１１７，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ６１１０５））、ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８  ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ６３１７８））を通じて、インディアナ州フィッシャーズ、テクニカル・ドライブのバングズラボラトリー（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，（９０２５  Ｔｅｃｈｉｎｉｃａｌ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｉｓｈｅｒｓ  ＩＮ  ４６０３８−２８８６））からのアミノ変性微小球（直径０．６６μｍ）をＣ末端で合成ペプチドに架橋した。１０ｇのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４含有の１ＬのＴＢＳ緩衝液中で、ペプチド被覆微小球を１０％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１６５を分散したＳＷＮＴ  ７．５μｇ／ｍｌと共に透析チューブ内で一晩インキュベートした。次に微小球をＴＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ビーズをＳＥＭ下で検査した。
【０１３３】
ＣＮＴをＣＮＴ結合ファージまたは単離ペプチドのどちらかで被覆された微小球と接触させた結果を図３ａ〜ｄに示す。図３（ａ）は対照ファージクローンで被覆された微小球表面が、ペプチド配列ＮＨ２−ＩＤＶＥＳＹＫＧＴＳＭＰ−ＣＯＯＨ（配列番号：３４）を発現していることを示す。明らかにカーボンナノチューブと、この表面との会合はない。図３（ｂ）は、結合ファージクローン配列ＮＨ２−ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ−ＣＯＯＨ（配列番号：１３）で被覆された微小球の表面を示す。これはファージとナノチューブバンドル間の強力な会合を実証する。同様の結果が、その他のナノチューブ結合ファージクローンで得られている。対照ペプチドＮＨ２−ＬＰＰＳＮＡＳＶＡＤＹＳＧＧＧ−ＣＯＯＨ（配列番号：２８）で被覆された図３（ｃ）は、ナノチューブと微小球との会合を示さない。確かに微小球の懸濁液は高度に分散されたままであった。図３（ｄ）は結合ペプチドＮＨ２−ＨＷＫＨＰＷＧＡＷＤＴＬ−ＣＯＯＨ（配列番号：１３）で被覆された微小球とナノチューブ間の強力な会合を示す。本質的にナノチューブは微小球を架橋し、微小球の分散の損失と微小球の大型クラスターの形成をもたらす。
【０１３４】
実施例７
様々なカーボンナノチューブ基材に対して生成されたＣＭＢＰ
この実施例は、ＨｉＰＣｏ工程によって製造されたもの、および種々のクリーニング工程を経たものをはじめとする、様々なカーボンナノチューブ基材に対して、カーボンナノチューブ結合ペプチドが生成できることを例証する。
【０１３５】
カーボンナノチューブ結合ペプチドを選択するための一連の実験を実施例２に述べたようにして実施した。使用した第１の基材は、ＨｉＰＣｏ工程を使用して調製されたＣＮＩからのＳＷＮＴであり、それは酸クリーニング、トルエン中での分散、および乾燥、マット形成のみによって調製された。選択工程後に得られたペプチドを配列番号：３９〜８５に列挙する。
【０１３６】
実施例２で述べたように選択工程で使用された第２の基材は、マサチューセッツ州ケンブリッジのＭＩＴの物質科学部のイェット・ミン・チャン（Ｙｅｔ−Ｍｉｎｇ  Ｃｈｉａｎｇ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＩＴ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から得られたＭＷＮＴであった。選択されたペプチドを配列番号：１〜４、６、８、１０〜１３、１５、１６、１８〜２２、２８、３６、９２、１１４〜１４７、および１７７に列挙した。同一供給源から得られた新鮮なＭＷＮＴを使用して、上の実施例を繰り返して得られたペプチドを配列番号：９４〜１１３および１７７に列挙した。
【０１３７】
マサチューセッツ州ケンブリッジのＭＩＴの物質科学部のイェット・ミン・チャン（Ｙｅｔ−Ｍｉｎｇ  Ｃｈｉａｎｇ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＩＴ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から得られたグラファイトクリーニングしたＭＷＮＴを実施例５に述べたようにして調製し、基材としても使用した。得られたペプチドを配列番号：１４８〜１７６に列挙する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】カーボンナノチューブ表面のカーボンナノチューブ結合ペプチドを有するファージのＴＥＭ画像である。
【図２Ａ】未処理ナノチューブロープの電子顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】配列番号：１３で示されるカーボンナノチューブ結合ペプチドで処理された単層ナノチューブの電子顕微鏡写真である。
【図２Ｃ】ＣＮＴに対する結合親和力をほとんどまたは全く有さない、対照ペプチドで処理された単層ナノチューブの電子顕微鏡写真である。
【図３Ａ】ＳＷＮＴへの曝露後の非ＣＮＴ結合対照ファージで被覆された微小球の電子顕微鏡写真である。
【図３Ｂ】ＳＷＮＴへの曝露後のＣＮＴ結合ファージで被覆された微小球の電子顕微鏡写真である。
【図３Ｃ】ＳＷＮＴへの曝露後の非ＣＮＴ結合ペプチドで被覆された微小球の電子顕微鏡写真である。
【図３Ｄ】ＳＷＮＴへの曝露後のＣＮＴ結合ペプチドで被覆された微小球の電子顕微鏡写真である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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