(57)【要約】本発明は、標識を適当な基質からＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）融合タンパク質に転移させる方法、適当な融合タンパク質、ＡＧＴの適当な変異体及び得られる新規な標識された融合タンパク質に関する。問題のタンパク質はＡＧＴ融合タンパク質に組み込まれ、ＡＧＴ融合タンパク質を標識を有するＡＧＴ基質と接触させ、そしてＡＧＴ融合タンパク質は標識を認識及び／又は処理するようにデザインされたシステムにおいて標識を使用して検出及び／又は処理される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核内受容体タンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞区画にタンパク質をターゲッティングする原因である配列を有するタンパク質、一般に標識又はアフィニティータグとして使用されるタンパク質、及び前記タンパク質のドメイン又はサブドメインからなる群より選ばれる対象のタンパク質、但しファージλの主要頭部タンパク質Ｄ（ｇｐＤ）及びタンパク質
【表１】
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及びＳＳＮ６を除く、を含む標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２】
対象のタンパク質が膜タンパク質である、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項３】
対象のタンパク質がキナーゼである、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項４】
対象のタンパク質が核内受容体タンパク質である、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項５】
対象のタンパク質がホスファターゼである、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項６】
対象のタンパク質がプロテアーゼである、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項７】
ＡＧＴのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端でＡＧＴに融合された１種又はそれより多くの対象のタンパク質、及び標識を有する基質からなる、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項８】
ＡＧＴが１個又はそれより多くのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するヒトＡＧＴの変異体である、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項９】
ＡＧＴが、Ａｓｎ１５７がＧｌｙにより置換され、そしてＳｅｒ１５９がＧｌｕにより置換されている変異体、又はＧｌｙ１６０がＡｌａ又はＴｒｐにより置換されている変異体である、請求項８に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１０】
ＡＧＴが、Ａｓｎ１５７がＳｅｒにより置換され、Ｓｅｒ１５９がＨｉｓにより置換され、そしてＧｌｙ１６０がＡｓｎにより置換されている変異体である、請求項８に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１１】
標識が、分光学的プローブ、；放射性標識された分子；相手に特異的に結合することができる特異的結合対の一方である分子；他の生体分子と相互作用すると推測される分子；他の生体分子と相互作用すると推測される分子のライブラリー；他の分子に架橋することができる分子；Ｈ２Ｏ２及びアスコルベートに曝露されるとヒドロキシルラジカルを発生することができる分子；光に照射されると反応性ラジカルを発生することができる分子；固体支持体に共有結合した分子；その相補鎖と塩基対形成を行うことができる核酸又はその誘導体；膜挿入性を有する脂質又は他の疎水性分子；望ましい酵素的、化学的又は物理的性質を有する生体分子；又は上記に列挙された性質のいずれかの組み合わせを有する分子である、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１２】
標識が発蛍光団、発色団、磁性プローブ又は造影剤である、請求項１１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１３】
標識が発蛍光団である、請求項１２に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１４】
標識が、相手に特異的に結合することができる特異的結合対の一方である分子である、請求項１１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１５】
標識が、他の分子に架橋することができる分子である、請求項１１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１６】
標識が、固体支持体に結合した分子である、請求項１１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１７】
固体支持体が化学的に修飾された酸化物表面、ガラス表面、ポリマー表面、官能化されたポリマー、貴金属表面である、請求項１６に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１８】
固体支持体がビーズ、マイクロタイタープレート又はセンサーエレメントの形態にある、請求項１７に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項１９】
標識が、その相補鎖と塩基対形成を行うことができる核酸又はその誘導体である、請求項１１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２０】
複数の標識を含む、請求項１に記載の標識されたＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２１】
酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核内受容体タンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞区画にタンパク質をターゲッティングする原因である配列を有するタンパク質、一般に標識又はアフィニティータグとして使用されるタンパク質、並びに前記タンパク質のドメイン又はサブドメインからなる群より選ばれる対象のタンパク質、但しファージλの主要頭部タンパク質Ｄ（ｇｐＤ）及びタンパク質
【表２】
2006501286.tif 000015
及びＳＳＮ６を除く、を含むＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２２】
対象のタンパク質が膜タンパク質である、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２３】
対象のタンパク質がキナーゼである、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２４】
対象のタンパク質が核内受容体タンパク質である、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２５】
対象のタンパク質がホスファターゼである、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２６】
対象のタンパク質がプロテアーゼである、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２７】
ＡＧＴのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端でＡＧＴに融合された１種又はそれより多くの対象のタンパク質及び標識を有する基質からなる、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２８】
ＡＧＴが１個又はそれより多くのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するヒトＡＧＴの変異体である、請求項２１に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項２９】
ＡＧＴが、Ａｓｎ１５７がＧｌｙにより置換され、そしてＳｅｒ１５９がＧｌｕにより置換されている変異体、又は及びＧｌｙ１６０がＡｌａ又はＴｒｐにより置換されている変異体である、請求項２８に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項３０】
ＡＧＴが、Ａｓｎ１５７がＳｅｒにより置換され、そしてＳｅｒ１５９がＨｉｓにより置換され、そしてＧｌｙ１６０がＡｓｎにより置換されている変異体である、請求項２８に記載のＡＧＴ融合タンパク質。
【請求項３１】
Ａｓｎ１５７がＧｌｙにより置換され、そしてＳｅｒ１５９がＧｌｕにより置換されているか、又はＧｌｙ１６０がＡｌａ又はＴｒｐにより置換されているか、又はＡｓｎ１５７がＳｅｒにより置換され、Ｓｅｒ１５９がＨｉｓにより置換されそしてＧｌｙ１６０がＡｓｎにより置換されている、ヒトＡＧＴの変異体。
【請求項３２】
ＡＧＴ融合タンパク質に組み込まれた対象のタンパク質を、標識を有する適当なＡＧＴ基質と接触させ、そして標識を認識又は処理するようにデザインされたシステムにおいてこの標識を使用して、ＡＧＴ融合タンパク質を検出しそして場合により更に処理することを特徴とする、対象のタンパク質を検出及び処理する方法。
【請求項３３】
対象のタンパク質とＡＧＴからＡＧＴ融合タンパク質を形成する段階を更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象のタンパク質が、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核内受容体タンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞区画にタンパク質をターゲッティングする原因である配列を有するタンパク質、一般に標識又はアフィニティータグとして使用されるタンパク質、並びに前記タンパク質のドメイン又はサブドメインからなる群より選ばれ、但しファージλの主要頭部タンパク質Ｄ（ｇｐＤ）及びタンパク質
【表３】
2006501286.tif 000016
及びＳＳＮ６を除く、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
対象のタンパク質が膜タンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
対象のタンパク質がキナーゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
対象のタンパク質が核内受容体タンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
対象のタンパク質がホスファターゼである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
対象のタンパク質がプロテアーゼである、請求項３４に記載の穂方法。
【請求項４０】
ＡＧＴ融合タンパク質が、ＡＧＴのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端でＡＧＴに融合された１種又はそれより多くの対象のタンパク質からなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
ＡＧＴ融合タンパク質におけるＡＧＴが、ヒトＡＧＴ、または１個又はそれより多くのアミノ酸置換、欠失又は付加を有するヒトＡＧＴの変異体である請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識を適当な基質からＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ融合タンパク質に転移させる方法及び得られる新規な標識された融合タンパク質に関する。
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素のような求電子剤の突然変異誘発作用及び発がん作用は主としてＤＮＡのグアニンのＯ６−アルキル化による。ＤＮＡアルキル化に対して自分自身を保護するために、哺乳動物及びバクテリアは、これらの損傷を修復するタンパク質、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を有する。ＡＧＴは、アルキル基をアルキル化されたグアニン及びグアニン誘導体の位置Ｏ−６からそれ自身のシステインの１つのメルカプト基に転移させて、不可逆的にアルキル化されたＡＧＴを生じさせる。基礎となる機構は、メチル基のみならずベンジル基も容易に転移されるかの理由を説明するＳＮ２型の求核反応である。腫瘍細胞におけるＡＧＴの過剰発現はアルキル化薬物、例えば、プロカルバジン、デカルバジン、テモゾロミド及びビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソ尿素に対する耐性の主な理由であるので、ＡＧＴの阻害剤は化学療法における増感薬（ｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ）として使用するために提唱された（Ｐｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５１：１６７−２２３，１９９５）。
【０００３】
ＤＥ１９９０３８９５は、ＡＧＴのビオチニル化をもたらすビオチニル化Ｏ６−アルキルグアニン誘導体とＡＧＴとの反応に頼るＡＧＴのレベルを測定するためのアッセイを開示している。これは例えばＥＬＩＳＡアッセイにおけるストレプトアビジンコーテッドプレート上のＡＧＴの分離及びその検出、を可能とする。このアッセイは腫瘍組織のＡＧＴのレベルを監視するため及びＡＧＴ阻害剤のスクリーニングに使用するために示唆される。
【０００４】
Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．４：２８５−２８７，２００１は、ＡＧＴを標識する化学的プローブとして使用するためのオリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれた修飾されたＯ６−アルキル化グアニン誘導体を開示している。この場合も、がん細胞におけるこの酵素のレベルを検出することを容易にして研究及び化学療法を助けるためのものである。
【０００５】
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０１６３６は、問題のタンパク質をＡＧＴに融合させそしてＡＧＴ融合タンパク質を標識を有するＡＧＴ基質と接触させ、そしてＡＧＴ融合タンパク質を検出しそして場合により更に標識を使用して処理する、問題のタンパク質を検出及び／又は操作する方法を開示している。使用されるべきいくつかのＡＧＴ融合タンパク質、ＡＧＴ基質の一般構造原理及び広範な種類の標識及びこの方法において有用な標識を検出するための方法が記載されている。
【０００６】
発明の要約
本発明は、問題のタンパク質をＡＧＴ融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を標識を有する適当なＡＧＴ基質と接触させ、そして標識を認識及び／又は取り扱うようにデザインされたシステムにおいてこの標識を使用して、ＡＧＴ融合タンパク質を検出するか又は操作するか又は検出及び操作の両方をいかなる順序においても行う、問題のタンパク質を検出及び／又は操作する方法に関する。
【０００７】
本発明に従う問題のタンパク質は、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核内受容体タンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小単量体ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞区画にタンパク質をターゲッティングする責任を持つ配列を有するタンパク質、一般に標識又はアフィニティータグとして使用されるタンパク質及び前記タンパク質のドメイン又はサブドメインよりなる群から選ばれ、但し、ファージλの主要頭部タンパク質Ｄ（ｇｐＤ）及びＰＣＴ／ＧＢ０２／０１６３６（ＷＯ０２／０８３９３７）に開示されたこれらの特定の問題のタンパク質を除く。
【０００８】
ＡＧＴ融合タンパク質は、ＡＧＴのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ及びＣ末端でＡＧＴに融合した１種又はそれより多くの、例えば、１種、２種又は３種のタンパク質からなることができる。ＡＧＴはヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ）、他の哺乳動物ＡＧＴ又は１個又はそれより多くのアミノ酸置換、欠失又は付加を有する野生型ＡＧＴの変異体であることができる。
【０００９】
本発明は、新規なＡＧＴ融合タンパク質自体にも関し、特に、標識を有する基質に共有結合したＡＧＴ融合タンパク質を含む本発明の方法で得られる標識されたＡＧＴ融合タンパク質に関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明においては、問題のタンパク質又はペプチドはＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に融合される。問題のタンパク質又はペプチドは、いかなる長さであってもよくそして第二級、第三級又は第四級構造を有していてもいなくてもよく、そして好ましくは、少なくとも１２個そして２０００個までのアミノ酸、好ましくは５０〜１０００個のアミノ酸からなる。
【００１１】
本発明に従う問題のタンパク質は、
酵素、例えば、
トランスフェラーゼ（ＥＣ２）、更に特定的にはメチル基以外のアルキル又はアリール基を転移させるトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５）、特にグルタチオントランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１８）、又はキナーゼ、即ち、リン含有基を転移させるトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７）、特に、アクセプターとしてのアルコール基に関するキナーゼ（ＥＣ２．７．１）、例えば、基質タンパク質におけるリン酸化標的部位としてのセリン及びトレオニンに関するプロテインキナーゼ、例えば、酵母からのカゼインキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３７）もしくはチロシンプロテインキナーゼ（ＥＣ２．７．１．１１２）；又は例えば、酸化還元酵素（ＥＣ１）、更に特定的にはアクセプターとしてペルオキシドに対して作用する酸化還元酵素（ＥＣ１．１１）、特に酵素シトクロームＣペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．５）；又は例えば、ヒドロラーゼ（ＥＣ３）、更に特定的にはエステル結合に作用するヒドロラーゼ（ＥＣ３．１）、特にホスホリックモノエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．３）、例えば、プロテインホスホリックモノエステルヒドロラーゼ；又はペプチダ―ゼもしくはプロテアーゼ（ＥＣ３．４）としても知られているペプチド結合を加水分解するヒドロラーゼ、特にカスパーゼ；
ＤＮＡ結合タンパク質、更に特定的にはｍＲＮＡ合成を抑制するタンパク質因子である転写リプレッサータンパク質、特定的にはＥ．ｃｏｌｉにおけるｍＲＮＡ合成を抑制するタンパク質因子、特にＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン；
転写調節タンパク質、更に特定的には転写リプレッサータンパク質、特にトリプトファン／アスパラギン酸反復構造を含有する転写リプレッサータンパク質、特定的にはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転写リプレッサーＴｕｐ１；
膜タンパク質、例えば、少なくとも１つの膜貫通ヘリックスを示す膜タンパク質、更に特定的には小胞体（ＥＲ）膜からの膜タンパク質、特にＥＲへのタンパク質トランスロケーションにおいて活性である膜タンパク質、例えば、ＥＲ膜貫通タンパク質Ｓｅｃ６２；
又は例えば、７回膜貫通ヘリックス（７−ＴＭ）タンパク質のファミリーからのタンパク質、更に特定的にはＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である７−ＴＭタンパク質、特に１ｋＤａを越える分子量を有する高分子リガンドに結合するこれら、例えば、哺乳動物、例えばヒトの、ニューロキニン１レセプター（ＮＫ１）；
又は、例えば、細胞膜からの膜貫通イオンチャンネルタンパク質、特にリガンド開口性イオンチャンネルタンパク質（ｌｉｇａｎｄ  ｇａｔｅｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、更に特定的にはセロトニンに感受性のリガンド開口性イオンチャンネルタンパク質、例えば、セロトニン受容体５−ＨＴ３；
又は、例えば、イオンチャンネル及びＧタンパク質共役型タンパク質以外の膜タンパク質；
又は、例えば、特に酵母からのペルオキシソーム膜タンパク質、例えば、プロテインＰｅｘ１５；
核内受容体タンパク質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、例えば、転写因子のファミリーからの核内受容体タンパク質、更に特定的にはリガンド誘導性転写因子のファミリーからの核内受容体タンパク質、特に、ステロイド、例えば、エストロゲン受容体のファミリーからの核内受容体、例えば、ヒトエストロゲン受容体ｈＥＲ；
核局在化シグナルタンパク質、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からの核局在化シグナル；
タンパク質補因子、例えば、それらの遺伝子構造中にユビキチン配列を含有するタンパク質；
小単量体ＧＴＰアーゼ、更に特定的には膜付着性小単量体ＧＴＰアーゼ、例えば、Ｒａｓファミリーのメンバー；
ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質、例えば、多重薬物耐性タンパク質；
細胞内構造タンパク質、更に特定的には細胞骨格のタンパク質、更に特定的にはヒト細胞質β−アクチン；
タンパク質を特定の細胞区画、例えば、ゴルジ装置、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、形質膜又はペルオキシソームにターゲッティングする原因である配列を有するタンパク質；
一般に標識又はアフィニティータグとして使用されるタンパク質、例えば、紫外線又は可視光線で励起すると蛍光シグナルを示す蛍光タンパク質、特にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）として知られたファミリーからの蛍光タンパク質、例えば、エンハンスドシアノ蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）として知られた蛍光タンパク質；
及び上記したタンパク質のドメイン又はサブドメイン；
よりなる群から選ばれる。
【００１２】
更に、本発明に従う問題のタンパク質はソースに従って選ばれる。特に、問題のタンパク質は、バクテリアの種、例えば、サルモネラ、更に特定的にはｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ又はｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、マイコバクテリア、更に特定的にはｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｅｎｓｉｓ、又はぶどう球菌、更に特定的にはｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに存在するタンパク質、あるいはウイルスソース、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトインフルエンザウイルス又は肝炎ウイルスからのタンパク質である。
【００１３】
問題のタンパク質の好ましい群は、例えば、
レセプター、例えば、膜レセプター、特に７−ＴＭレセプター（ＧＰＣＲｓ）、酵素活性を有するレセプター、特に活性であるために二量体化を必要とすることがあるキナーゼ型のレセプター、イオンチャンネル、並びにウイルスドッキング（ｖｉｒｕｓ  ｄｏｃｋｉｎｇ）及びウイルスエンタリング（ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｅｒｉｎｇ）細胞に関与する膜タンパク質、又は、例えば、細胞内レセプター、特に膜を横断する化合物のためのレセプター、例えばステロイドホルモンのためのレセプター；
細胞外シグナル伝達分子及びシグナル伝達因子、例えば、インターロイキン、成長因子、放出ホルモン、プロスタグランジン、インスリン及びグルカゴン；
細胞内シグナルカスケードのタンパク質、例えば、ホスファチジニル−イノシトールシグナル伝達並びにｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ発生に関与する酵素及び補因子、膜付着性及び遊離キナーゼ、キナーゼ−キナーゼ並びにホスファターゼ、及び細胞内シグナル伝達カスケードの最終的に活性化される又は脱活性化される酵素、特にカスパーゼを活性化する酵素；
ホルモン、並びにホルモンの合成、遊離、活性化、レセプター活性及び脱活性化に関与する酵素；
細胞の状態と相関する膜表面マーカー、例えば、αフェトプロテイン；
及び血圧制御及び心臓機能に関与するタンパク質、例えば、ＡＣＥ阻害剤、腎臓レセプター及び腎臓チャンネルタンパク質、及び心臓カリウムチャンネルタンパク質；
である。
【００１４】
本発明の特許請求の範囲から排除されるのは、ファージλの主要頭部タンパク質Ｄ（ｇｐＤ）との融合タンパク質及びＰＣＴ／ＧＢ０２／０１６３６（ＷＯ０２／０８３９３７に開示された問題のタンパク質との融合タンパク質、特に、
【００１５】
【表４】
2006501286.tif 000002
【００１６】
更にメチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）及びアラニン（Ａ）を含む短いペプチドＨｉｓ６の融合タンパク質、
【００１７】
【表５】
2006501286.tif 000003
【００１８】
ｈＡＧＴ、短いリンカーペプチド、マウスからのジヒドロ葉酸レダクターゼ及びＨＡエピトープの融合タンパク質；
【００１９】
【表６】
2006501286.tif 000004
【００２０】
Ｖ５エピトープ、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化配列、人工転写アクチベーターＢ４２、リンカーペプチド及びｈＡＧＴの融合タンパク質；
【００２１】
【表７】
2006501286.tif 000005
【００２２】
ｈＡＧＴ、Ｈａエピトープ及び酵母酵素オロト酸デカルボキシラーゼＵｒａ３の融合タンパク質；及びｈＡＧＴ−ＳＳＮ６、ｈＡＧＴ、短いリンカーペプチド及びＳＳＮ６と名付けられたＤＮＡ転写の酵母リプレッサーの融合タンパク質である。
【００２３】
片側の野生型ヒトＡＧＴ（ｈＡＧＴ）、他の哺乳動物ＡＧＴ、例えば、ラット又はマウスＡＧＴ、又はこのようなＡＧＴ  ＤＮＡの変異体と、本発明の融合タンパク質をもたらす該ＡＧＴ  ＤＮＡ配列のＮ末端（Ｎ）又はＣ末端（Ｃ）側、又はＮ末端及びＣ末端側のいずれかに結合した配列をコードする問題の（上記したとおりの）タンパク質とで作られる融合タンパク質が開示される。融合タンパク質は、更に、適当なリンカー、例えば、ＡＧＴと問題のタンパク質間及び／又は融合タンパク質における問題の２つのタンパク質間の適当な条件下に酵素開裂を受けやすいことがありうるリンカーを含有することができる。このようなリンカーの例は、適当な制限酵素によるＤＮＡ段階で開裂可能なリンカー、例えば、ＢｇｌＩＩにより開裂可能なＡＧＡＴＣＴ及び／又はタンパク質段階で適当な酵素、例えば、タバコエッチウイルスＮｌａ（ＴＥＶ）プロテアーゼにより開裂可能なリンカーである。
【００２４】
融合タンパク質は原核生物宿主、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ又は真核生物宿主、例えば、ユーバクテリア、酵母、昆虫細胞又は哺乳動物細胞において発現されうる。
【００２５】
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）は、基質上に存在する標識を融合タンパク質のＡＧＴ形成部分のシステイン残基の１つに転移させる性質を有する。好ましい態様では、ＡＧＴは既知のヒトＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、ｈＡＧＴである。酵素のマウス又はラット形も、それらがヒトＡＧＴと同様に基質と反応することにおいて同様な性質を有するとの条件下に、考えられる。本発明では、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼは、１つ又はそれより多くの、例えば、１つ、２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換、欠失又は付加により異なることができるが、基質上に存在する標識を融合タンパク質のＡＧＴ部分に転移させる性質を依然として保持する野生型ＡＧＴの変異体も含む。ＡＧＴ変異体は当業者に周知の技術を使用する化学的修飾により得ることができる。好ましくは、当業者に周知のタンパク質工学技術を使用して、及び／又は新規なＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼを発生及び選択するために分子進化を使用して、ＡＧＴ変異体を製造することができる。このような技術は、例えば、飽和突然変異誘発、配列のどこにでも変異を導入するためのエラープローンＰＣＲ、飽和突然変異誘発及び／又はエラープローンＰＣＲの後に使用されるＤＮＡシャッフリング又はいくつかの種からの遺伝子を使用するファミリーシャッフリングである。
【００２６】
ファージディスプレー法の助けにより、本発明のＯ６−ベンジルグアニン及びＡＧＴ基質に対する有意に増加した活性を有する突然変異体が見出される。ｈＡＧＴはファージλ上の主要頭部タンパク質Ｄとの融合タンパク質として機能的にディスプレーされることができ、そしてｈＡＧＴの独特な機構を使用して野生型ファージλの混合物からｈＡＧＴをディスプレーするファージλを選ぶことができる（Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．４：２８５−２８７，２００１）。ｈＡＧＴは、ファージキャプシドタンパク質ｐＩＩＩとの融合タンパク質として繊維状ファージ上に機能的にディスプレーされることもできる。
【００２７】
その活性部位でＯ６−ベンジルグアニンと結合したｈＡＧＴの構造において、４個のアミノ酸はベンジル環の近くにあるか（Ｐｒｏ１４０、Ｓｅｒ１５９、Ｇｌｙ１６０）又はヌクレオ塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のＮ９と接触することができる（Ａｓｎ１５７）。位置Ｐｒｏ１４０及びＧｌｙ１６０における突然変異は、ｈＡＧＴのＯ６−ベンジルグアニンとの反応に影響を与えることが以前に示された（Ｘｕ−Ｗｅｉｌｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ５８：１２７９−８５，１９９９）：位置１４０におけるプロリンはベンジル環とのその相互作用のために必須であると考えられ、そして突然変異Ｇｌｙ１６０ＴｒｐはＯ６−ベンジルグアニンに対するｈＡＧＴの反応性を増加させることが示された。本発明において考慮された特定の変異体は、位置１４０にＰｈｅ又はＭｅｔを、位置１５７にＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、又はＴｒｐ、特にＧｌｙを、位置１５９にＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ又はＧｌｎ、特にＧｌｕを、そして位置１６０にＡｌａ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ又はＶａｌ、特にＴｒｐを有する変異体である。好ましい変異体は、Ａｓｎ１５７がＧｌｙにより置換されそしてＳｅｒ１５９がＧｌｕにより置換されている変異体、及びＧｌｙ１６０がＡｌａ又はＴｒｐにより置換されている変異体である。最も好ましいのはＡｓｎ１５７がＳｅｒにより置換され、そしてＳｅｒ１５９がＨｉｓにより置換されそしてＧｌｙ１６０がＡｓｎにより置換されている変異体である。
【００２８】
問題のタンパク質及びＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を、標識を有する特定の基質と接触させる。反応の条件はＡＧＴが基質と反応しそして基質の標識を転移させるように選ばれる。通常の条件は室温、例えば２５℃付近のｐＨ７付近の緩衝剤溶液である。しかしながら、ＡＧＴは様々な他の条件下でも反応し、そしてここに述べたこれらの条件は本発明の範囲を限定するものではないことは理解される。
【００２９】
ＡＧＴは不可逆的にアルキル基をその基質、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡからそのシステイン残基の１つに転移させる。ｈＡＧＴと迅速に反応する基質類似体はＯ６−ベンジルグアニンであり、二次速度定数は約１０３秒−１Ｍ−１である。ベンジル環のＣ４におけるＯ６−ベンジルグアニンの置換はＯ６−ベンジルグアニン誘導体に対するｈＡＧＴの反応性に有意に影響を与えず、そしてこの性質はベンジル環のＣ４に結合した標識をＡＧＴに転移させるのに使用された。
【００３０】
基質の標識部分は、融合タンパク質の意図する用途に依存して当業者により選ぶことができる。ＡＧＴを含む融合タンパク質を基質と接触させた後、標識を融合タンパク質に共有結合させる。標識されたＡＧＴ融合タンパク質は次いで更に処理され及び／又は次いで転移された標識により検出される。
【００３１】
いかなる物理的又は化学的処理も「操作」であると理解される。例えば、操作は細胞からの単離、標準精製技術、例えば、クロマトグラフィーによる精製、化学試薬との反応又は特に結合相手が固体相に固定されている場合に、結合対の結合相手との反応、等を意味することができる。このような操作は、標識Ｌに依存することができ、そして標識された融合タンパク質の「検出」に追加して行うことができる。標識された融合タンパク質が操作と検出の両方をなされる場合に、検出は操作の前又は後であることができ、又は本明細書で定義された操作期間中に行うことができる。
【００３２】
特定のＡＧＴ基質は、式１
【００３３】
【化１】
2006501286.tif 000006
【００３４】
式中、Ｒ１〜Ｒ２はＡＧＴにより基質として認識される基であり、
Ｘは酸素又は硫黄であり、
Ｒ３は芳香族又はヘテロ芳香族基であるか、又はＣＨ２に結合した二重結合を有する場合により置換されていてもよい不飽和のアルキル、シクロアルキル又はヘテロサイクリル基であり、
Ｒ４はリンカーであり、そして
Ｌは標識、複数の同じもしくは異なる標識、Ｒ４をＲ１に連結して環状基質を形成する結合、又は更なる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である、
の化合物である。
【００３５】
基Ｒ１〜Ｒ２において、残基Ｒ１は好ましくはＡＧＴにより基質として認識される、１〜５個の窒素原子を含有するヘテロ芳香族基、好ましくは式２
【００３６】
【化２】
2006501286.tif 000007
【００３７】
式中、
Ｒ２は水素、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル又は糖部分であり、
Ｒ５は水素、ハロゲン、例えば、クロロもしくはブロモ、トリフルオロメチル、又はヒドロキシであり、そして
Ｒ６は水素、ヒドロキシ又は置換されていないアミノもしくは置換されたアミノである、
のプリン基である。
【００３８】
Ｒ５又はＲ６がヒドロキシであるならば、プリン基は主として互変異性形態で存在し、この互変異性形態においては、Ｒ５又はＲ６を有する炭素原子に隣接した窒素は水素原子を有し、この窒素原子とＲ５又はＲ６を有する炭素原子との間の二重結合は単結合となりそしてＲ５又はＲ６はそれぞれ二重結合した酸素となる。
【００３９】
置換されたアミノ基Ｒ６は、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキルアミノ又はアシルアミノであり、ここで、アシル基は１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルカルボニル、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ−もしくはイソプロピルカルボニル又はｎ−、イソ−もしくはｔｅｒｔ−ブチルカルボニル、又はアリールカルボニル、例えばベンゾイルである。
【００４０】
Ｒ６が置換されていないアミノもしくは置換されたアミノでありそしてプリン基の結合に連結された残基Ｘが酸素であるならば、式２の残基はグアニン誘導体である。
【００４１】
糖部分Ｒ２はグアニン塩基のＮ９位置に可変長のスペーサーで連結された糖モノマー又はオリゴマーである。この状況におけるスペーサーは、好ましくは１〜１５個の炭素原子のアルキル鎖、１〜２００個のエチレングリコール単位からなるポリエチレングリコールスペーサー、アミド基−ＣＯ−ＮＨ−、エステル基−ＣＯ−Ｏ−、アルキレン基−ＣＨ＝ＣＨ−、又はアルキル鎖、ポリエチレングリコール基、アミド基、エステル基及びアルキレン基の組み合わせである。
【００４２】
本発明に関して、糖部分Ｒ２は、更にβ−Ｄ−２’−デオキシリボシル、又は２〜９９個のヌクレオチドの長さを有する１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれているβ−Ｄ−２’−デオキシリボシルを含み、ここでグアニン誘導体Ｒ１はオリゴヌクレオチド配列内のいかなる位置も占める。
【００４３】
本発明の他の好ましい態様では、基Ｒ１〜Ｒ２は、式２の基の部分Ｃ−Ｒ５が窒素により置き換えられており、そしてＲ２及びＲ６が式２で定義された意味を有する８−アザプリン基である。
【００４４】
Ｘは好ましくは酸素である。
【００４５】
芳香族もしくはヘテロ芳香族基、又は場合により置換されていてもよい不飽和のアルキル、シクロアルキル又はヘテロサイクリル基としてのＲ３は、Ｒ３−Ｒ４−Ｌ単位の融合タンパク質への共有結合転移（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を可能にするＡＧＴにより立体的及び電子的に受容される基（その反応機構に従って）である。Ｒ３−Ｒ４−Ｌ単位において、Ｒ４−Ｌは複数の同じもしくは異なる標識Ｌを有する複数の同じもしくは異なるリンカーＲ４の意味を有することもできる。
【００４６】
芳香族基としてのＲ３は好ましくはフェニル又はナフチル、特にフェニル、例えば、パラもしくはメタ位置でＲ４により置換されたフェニルである。
【００４７】
ヘテロ芳香族Ｒ３は、単環式又は二環式ヘテロアリール基であって、該ヘテロアリール基は、０、１、２、３、又は４個の環窒素原子及び０又は１個の酸素原子及び０又は１個の硫黄原子を含み、但し少なくとも１個の環炭素原子は窒素、酸素又は硫黄原子により置換されているものとし、そして５〜１２個、好ましくは５又は６個の環原子を有し、そして置換基Ｒ４を有することに加えて、低級アルキル、例えば、メチル、低級アルコキシ、例えば、メトキシもしくはエトキシ、ハロゲン、例えば、塩素、臭素もしくはフツ素、ハロゲン化低級アルキル、例えば、トリフルオロメチル、又はヒドロキシからなる群より選ばれる１個もしくはそれより多くの、特に１個の更なる置換基により置換されていなくても置換されていてもよい単環式又は二環式ヘテロアリール基である。好ましくは、ヘテロアリール基Ｒ３は、トリアゾリル、特に、４−位置又は５−位置に更なる置換基Ｒ４を有する１−トリアゾリル、テトラゾリル、特に、４−位置又は５−位置に更なる置換基Ｒ４を有する１−テトラゾリル又は５位置に更なる置換基を有する２−テトラゾリル、イソオキサゾリル、特に５位置に更なる置換基を有する３−イソオキサゾリル、又は３位置に更なる置換基を有する５−イソオキサゾリル、又はチエニル、特に３−、４−もしくは５−位置、好ましくは４−位置に更なる置換基Ｒ４を有する２−チエニル、又は４−位置に更なる置換基Ｒ４を有する３−チエニルである。
【００４８】
場合により置換されていてもよい不飽和アルキル基Ｒ３は、１又は２位置、好ましくは２一に更なる置換基Ｒ４を有する１−アルケニル、又は１−アルキニルである。１−アルケニルにおいて考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシ、又はハロゲニル、例えばクロロである。
【００４９】
場合により置換されていてもよい不飽和シクロアルキル基は、いかなる位置にでも更なる置換基Ｒ４を有する、１位置で不飽和の３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基、例えば、１−シクロペンチル又は１−シクロヘキシルである。考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシ、又はハロゲニル、例えばクロロである。
【００５０】
場合により置換されていてもよい不飽和ヘテロサイクリル基は、３〜１２個の原子、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる１〜５個のヘテロ原子を有しそしてヘテロサイクリル基をメチレンＣＨ２に連結する位置に二重結合を有する。考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシ、又はハロゲニル、例えばクロロである。特に、場合により置換されていてもよい不飽和ヘテロサイクリル基は、ヘテロ芳香族基Ｒ３について前記に定義された部分的に飽和したヘテロ芳香族基である。このようなヘテロサイクリル基の例は、イソオキサゾリジニル、特に、５位置に更なる置換基を有する３−イソオキサゾリジニル、又は３位置に更なる置換基を有する５−イソオキサゾリジニルである。
【００５１】
リンカー基Ｒ４は、好ましくは標識Ｌ又は複数の同じ又は異なる標識Ｌを基質に連結する柔軟性リンカーである。リンカー単位は、意図する用途に関係して選ばれ、即ち、ＡＧＴを含む融合タンパク質への基質の転移において選ばれる。それらは適当な溶媒中の基質の溶解度も増加させる。使用されるリンカーは実際の用途の条件下に化学的に安定である。リンカーはＡＧＴとの反応も標識Ｌの検出も妨害せず、式１の化合物とＡＧＴを含む融合タンパク質との反応の後ある時点で開裂されるように構築されうる。
【００５２】
リンカーＲ４は、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキレン基であって、場合により、
（ａ）１個又はそれより多くの炭素原子が酸素により置き換えられ、特に３番目毎の炭素原子が酸素により置き換えられ、例えば、１〜１００個のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基であり、
（ｂ）１個又はそれより多くの炭素原子が水素原子を有する窒素により置き換えられそして隣接炭素原子がオキソにより置換され、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を表し、
（ｃ）１個又はそれより多くの炭素原子が酸素により置き換えられそして隣接炭素原子がオキソにより置換され、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を表し、
（ｄ）２つの隣接した炭素原子間の結合が二重又は三重結合であり、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−又は−Ｃ≡Ｃ−を表し、
（ｅ）１個又はそれより多くの炭素原子がフェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、橋かけヘテロ芳香族基又は橋かけ飽和もしくは不飽和ヘテロサイクリル基により置き換えられており、
（ｆ）２個の炭素原子がジスルフィド連結−Ｓ−Ｓ−により置き換えられている、
１〜３００個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキレン基、又は前記（ａ）〜（ｆ）で定義された２個又はそれより多くの、特に２個又は３個のアルキレン及び／又は修飾されたアルキレン基の組み合わせであり、これらは場合により置換基を含有していてもよい。
【００５３】
考慮される置換基は、例えば、低級アルキル、例えばメチル、低級アルコキシ、例えばメトキシ、低級アシルオキシ、例えばアセトキシ、又はハロゲニル、例えばクロロである。
【００５４】
考慮される更なる置換基は、例えば、α−アミノ酸、特に天然に存在するα−アミノ酸が、炭素原子が（ｂ）で定義されたアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−により置き換えられているリンカーＲ４に組み込まれている場合に得られる置換基である。このようなリンカーにおいては、アルキレン基Ｒ４の炭素鎖の一部は、基−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−、式中、ｎは１〜１００でありそしてＲはα−アミノ酸の様々な残基を表す、により置き換えられる。
【００５５】
更なる置換基は、光開裂可能な（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｂｌｅ）リンカーＲ４をもたらす置換基、例えばｏ−ニトロフェニル基である。特にこの置換基ｏ−ニトロフェニルは、アミド結合に隣接した炭素原子に位置しており、例えば、基−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−Ｏ−のように位置し、又はポリエチレングリコール鎖における置換基として、例えば基−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−Ｏ−のように位置する。考慮される他の光開裂可能なリンカーは、例えば、フェナシル、アルコキシベンゾイン、ベンジルチオエーテル及びピバロイルグリコール誘導体である。
【００５６】
前記（ｅ）で定義された炭素原子を置き換えるフェニレン基は、例えば、１，２−、１，３−又は好ましくは１，４−フェニレンである。前記（ｅ）で定義された炭素原子を置き換える飽和又は不飽和シクロアルキレン基は、例えば、シクロペンチレン又はシクロヘキシレンであるか又は例えば、１−位置又は２−位置において不飽和であるシクロヘキシレンでもある。前記（ｅ）で定義された炭素原子を置き換える飽和又は不飽和ビシクロアルキレンは、例えば、場合により２−位置で不飽和であるか又は２−位置及び５−位置で二重に不飽和であってもよい、ビシクロ［２．２．１］ヘプチレン又はビシクロ［２．２．２］オクチレンである。前記（ｅ）で定義された炭素原子を置き換えるヘテロ芳香族基は、例えば、トリアゾリデン、好ましくは１，４−トリアゾリデン又はイソオキサゾリデン、好ましくは、３，５−イソオキサゾリデンである。前記（ｅ）で定義された炭素原子を置き換える飽和又は不飽和ヘテロサイクリル基は、例えば、２，５−テトラヒドロフランジイル又は２，５−ジオキサンジイル、又はイソオキサゾリジネン、好ましくは３，５−イソオキサゾリジネンである。考慮される特定のヘテロサイクリル基は、糖部分、例えば、α−もしくはβ−フラノシル又はα−もしくはβ−ピラノシル部分である。
【００５７】
リンカーＲ４は、１個又はそれより多くの同じ又は異なる標識、例えば、１〜１００個の同じ又は異なる標識、特に、１〜５個の、好ましくは、１個、２個又は３個、特に１個又は２個の同じ又は異なる標識を有することができる。
【００５８】
基質の標識部分Ｌは、融合タンパク質の意図する用途に依存して当業者により選ばれうる。標識は、例えば、標識された融合タンパク質がその環境から容易に検出又は分離されるようなものであることができる。考慮される他の標識は、標識された融合タンパク質の環境の変化を感知及び誘導することができる標識及び／又は、標識により融合タンパク質に特定的に導入された物理的及び／又は化学的性質により融合タンパク質を処理するのを助ける標識である。
【００５９】
標識Ｌの例は、分光学的プローブ、例えば、発蛍光団、発色団、磁性プローブ又はコントラスト試薬；放射性標識された分子；相手に特異的に結合することができる特異的結合対の一方である分子；他の生体分子と相互作用すると推測される分子；他の生体分子と相互作用すると推測される分子のライブラリー；他の分子に架橋することができる分子；Ｈ２Ｏ２及びアスコルベートにさらされるとヒドロキシルラジカルを発生することができる分子、例えば、繋ぎ止められた金属キレート（ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｍｅｔａｌ−ｃｈｅｌａｔｅ）；光で照射されると反応性ラジカルを発生することができる分子、例えば、マラカイトグリーン；固体支持体に共有結合した分子であって、固体支持体がガラススライド、マイクロタイタープレートであることができるか又は当業者に知られているいかなるポリマーであってもよい固体支持体に共有結合した分子；その相補鎖と塩基対形成を行うことができる核酸又はその誘導体；膜挿入性を有する脂質又は他の疎水性分子；望ましい酵素的、化学的又は物理的性質を有する生体分子；又は上記に列挙された性質のいずれかの組み合わせを有する分子を含む。
【００６０】
標識Ｌが発蛍光団、発色団、磁性標識、放射性標識等である場合に、検出は標識に適合した標準手段によりそしてその方法がｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用されるかどうかによる。この方法は、問題のタンパク質に遺伝子的に融合されそして生きている細胞におけるタンパク質の研究を可能とするグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の適用に匹敵することができる。非線形光学的性質を示すホウ素化合物又は標識された基質がＡＧＴ融合タンパク質と反応するとその分光学的性質を変えるＦＲＥＴ対のメンバーも標識Ｌの特定の例である。
【００６１】
標識Ｌの性質に依存して、問題のタンパク質及びＡＧＴを含む融合タンパク質は固体支持体に結合させることができる。ＡＧＴを含む融合タンパク質と反応する基質の標識は、ＡＧＴとの反応に入るとき既に固体支持体に結合されていてもよく、又はその後に、即ち、ＡＧＴへの転移の後に使用してＡＧＴ融合タンパク質を固体支持体に結合させることができる。標識は、特異的結合対の一方のメンバーであることができ、その他方のメンバーは固体支持体に共有結合により又はいかなる他の手段によっても結合されるか又は結合可能である。考慮される特異的結合対は、例えば、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンである。結合対のどちらのメンバーも基質の標識Ｌであることができ、他方は固体支持体に結合される。固体支持体への好都合な結合を可能とする標識の更なる例は、例えば、マルトース結合タンパク質、糖タンパク質、ＦＬＡＧタグ、又は反応性置換基であって、このような置換基と固体支持体の表面の相補性官能基との化学的選択性反応を可能とする反応性置換基である。反応性置換基と相補性官能基とのこのような対の例は、例えば、アミドを形成するアミン及び活性化されたカルボキシ基、１，３−双極性付加環化反応を受けるアジ化物及びプロピオル酸誘導体、活性化されたビス−ジカルボン酸誘導体の型の  添加された二官能性リンカー試薬と反応して２つのアミド結合を生じさせるアミン及び他のアミン官能性基、又は当該技術分野で知られている他の組み合わせである。
【００６２】
好都合な固体支持体の例は、例えば、化学的に修飾された酸化物表面、例えば、二酸化ケイ素、五酸化タンタル（ｔａｎｔａｌｕｍ  ｐｅｎｔｏｘｉｄｅ）、二酸化チタン、ガラス表面、例えば、ガラススライド、ポリマー表面、例えば、マイクロタイタープレート、特に官能化されたポリマー（例えばビーズの形態にある）、又は化学的に修飾された金属表面、例えば、貴金属表面、例えば、金又は銀表面、及び前記した材料のいずれかから作られた適当なセンサーエレメントである。次いで不可逆的に結合及び／又はスポッティングする（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）ＡＧＴ基質を使用して、ＡＧＴ融合タンパク質を、タンパク質マイクロアレー、ＤＮＡマイクロアレー又は小さな分子のアレーを表す固体支持体上に、空間分解方式（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で、特にスポッティングにより結合させることができる。
【００６３】
標識Ｌが外部の刺激にさらされると反応性ラジカル、例えば、ヒドロキシルラジカルを発生することができる場合には、発生したラジカルは次いでＡＧＴ融合タンパク質及びＡＧＴ融合タンパク質の極めて近くにあるこれらのタンパク質を不活性化することができ、これらのタンパク質の役割を調べることを可能とする。このような標識の例は、Ｈ２Ｏ２及びアスコルベートにさらされるとヒドロキシルラジカルを生成する束縛された金属キレート錯体、及びレーザー照射によりヒドロキシルラジカルを生成する発色団、例えばマラカイトグリーンである。発色団及びレーザーを使用してヒドロキシルラジカルを発生させることは発色団支援レーザー誘導不活性化（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）（ＣＡＬＩ）として当該技術分野で知られている。本発明では、ＡＧＴ融合タンパク質を発色団、例えば、マラカイトグリーンにより標識すること及びその後のレーザー照射は、ＡＧＴ融合タンパク質及びＡＧＴ融合タンパク質と相互作用するこれらのタンパク質を時間制御されそして空間的に分割された方式（ｔｉｍｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｎｄ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｍａｎｎｅｒ）で不活性化する。この方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で適用することができる。更に、ＡＧＴ融合タンパク質の極めて近くにあるタンパク質は、特異的抗体によってそのタンパク質の断片を検出することによるか、高解像度二次元電気泳動ゲルにおけるこれらのタンパク質の消失によるか、又は分離及び配列決定技術、例えば、質量分析法又はＮ末端分解によるタンパク質配列決定による開裂されたタンパク質断片の同定によりそれ自体を同定することができる。
【００６４】
標識Ｌが他のタンパク質に架橋することができる分子、例えば、マレイミド、活性エステルもしくはアジド及び当業者に知られている他の官能基の如き官能基を含有する分子である場合には、このような標識されたＡＧＴ基質を他のタンパク質と相互作用するＡＧＴ融合タンパク質と接触させると（ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで）、ＡＧＴ融合タンパク質と標識を介してその相互作用するタンパク質との共有結合架橋が得られる。これはＡＧＴ融合タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能とする。光架橋のための標識Ｌは、例えば、ベンゾフェノンである。架橋の特定の観点では、標識Ｌは、それ自体ＡＧＴ融合タンパク質の二量体化をもたらすＡＧＴ基質である分子である。このような二量体の化学構造は対称（ホモ二量体）又は非対称（ヘテロ二量体）であることができる。
【００６５】
考慮される他の標識Ｌは、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ）、中性子捕捉処理のためのボラン、例えばセルフアドレッシングチツプのためのヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸及び金属キレート、例えば、ＤＮＡに特異的に結合する白金キレートである。
【００６６】
基質が２個又はそれより多くの標識を有するならば、これらの標識は同一であるか又は相異なることができる。
【００６７】
本発明は、ＡＧＴ融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で標識する方法を提供する。ＡＧＴ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ標識化という用語は、細胞のすべての区画で標識すること及び細胞外空間に向いているＡＧＴ融合タンパク質の標識化を含む。ＡＧＴ融合タンパク質の標識化がｉｎ  ｖｉｖｏでなされそしてＡＧＴに融合されるタンパク質が膜タンパク質、更に特定的には形質膜タンパク質であるならば、融合タンパク質のＡＧＴ部分は膜のいずれの側にも結合することができ、例えば、形質膜の細胞質側又は細胞外の側に結合することができる。
【００６８】
標識化がｉｎ  ｖｉｔｒｏでなされるならば、融合タンパク質の標識化は細胞抽出物において行うか又は精製されたもしくは濃縮された形態のＡＧＴ融合タンパク質により行うことができる。
【００６９】
標識化がｉｎ  ｖｉｖｏ又は細胞抽出物中でなされるならば、宿主の内因性ＡＧＴの標識化は有利に考慮される。宿主の内因性ＡＧＴがＯ６−アルキルグアニン誘導体又は関連化合物を基質として受け入れないならば、融合タンパク質の標識化は特異的である。哺乳動物細胞において、例えば、ヒト、マウス又はラット細胞において、内因性ＡＧＴの標識化が可能である。内因性ＡＧＴ及びＡＧＴ融合タンパク質の同時標識化に問題があるこれらの実験では、既知のＡＧＴ欠失細胞系を使用することができる。
【００７０】
特定の観点では、本発明は、候補化合物又は候補化合物のライブラリーと標的タンパク質又は標的タンパク質のライブラリーとの相互作用を決定する方法を提供する。候補化合物及び標的タンパク質の例は、リガンド及びタンパク質、薬物及び薬物の標的又は小さな分子及びタンパク質を含む。本発明のこの特定の方法では、ＡＧＴに融合される問題のタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン及び転写因子の活性化ドメインを含む。その物質の推定タンパク質標的又はタンパク質のライブラリーは、機能的転写因子が形成されるような方法で、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は活性化ドメインのいずれかに連結され、そして本発明に従うＡＧＴ基質の標識Ｌは標的物質（１種又は複数種）と相互作用すると推測される候補化合物又は候補化合物のライブラリーである。基質の一部である候補化合物又は候補化合物のライブラリーは、次いでＡＧＴ融合タンパク質に転移される。転移されると、標的物質を含むＡＧＴ融合タンパク質は、今や候補化合物で標識される。ＡＧＴ融合タンパク質に結合した候補化合物とＤＮＡ結合ドメイン又は活性化ドメインのいずれかに融合した標的タンパク質との相互作用は、機能的転写因子の形成をもたらす。活性化された転写因子は、次いでレポーターの発現を駆動することができ、このレポーターは、この方法が細胞内で行われる場合に、レポーターの発現が細胞に対する選択有位性を与えるならば検出されうる。特定の態様では、この方法は、１つ又はそれより多くの更なる段階、例えば、候補化合物又は標的物質を検出、単離、同定又は特徴付けることを伴うことができる。
【００７１】
特定の例では、標識Ｌは、まだ同定されていないタンパク質Ｙに結合する薬物又は生物学的に活性な小さな分子である。未知の標的タンパク質Ｙを発現することが予測される生物のｃＤＮＡライブラリーは転写因子の活性化ドメインに融合され、そしてＡＧＴは転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合されるか、又は別法として、未知の標的タンパク質Ｙを発現すると予測されるｃＤＮＡライブラリーは転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合され、そしてＡＧＴは転写因子の活性化ドメインに融合される。このような標識Ｌを含む本発明のＡＧＴ基質を加えると、この分子が、ｃＤＮＡライブラリーに存在しそしてそれぞれ活性化ドメイン又は結合ドメインに融合されたその標的タンパク質Ｙに結合する場合にのみ、機能的転写因子の形成及び遺伝子発現をもたらす。もし遺伝子発現が選択有位性に結び付けられているならば、薬物又は生物活性な分子の標的タンパク質Ｙをコードする遺伝子を有するプラスミドを有する対応する宿主を同定することができる。
【００７２】
更なる特定の例では、標識Ｌは化学的分子のライブラリーである。このライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下に既知の薬物標的タンパク質Ｙに結合するまだ同定されていない化合物を含有すると予測される。標的タンパク質Ｙは転写因子の活性化ドメインに融合されそしてＡＧＴは転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合されるか、又は、標的タンパク質Ｙは転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合されそしてＡＧＴは転写因子の活性化ドメインに融合される。化合物のライブラリーを有する基質を加えると、それぞれ転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子の活性化ドメインに融合されているＡＧＴへのライブラリーの化合物の共有結合をもたらすであろう。ＡＧＴ融合タンパク質に結合したライブラリーの化合物（標識を表す）と標的タンパク質Ｙとの相互作用は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン又は転写因子の活性化ドメインに共有結合のＡＧＴ−基質結合によって連結された化学ライブラリーの化合物が、それぞれ、転写因子の活性化ドメイン又は転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合された標的タンパク質Ｙに結合する場合にのみ、機能的転写因子の形成及び遺伝子発現をもたらす。遺伝子発現が選択有利性に結び付けられているならば、宿主の増殖をもたらすライブラリーのこれらの分子を同定することができる。
【００７３】
ＬがＲ４をＲ１に連結して環状基質を形成する結合である場合には、好ましい化合物はＲ４からＲ１への結合がリンカーＲ４を式２で定義されたアミノ基Ｒ６に連結する結合である。このような好ましい環状基質において、Ｒ２は好ましくはオリゴヌクレオチド、即ち、上記に詳しく述べた２〜９９ヌクレオチドの長さを有する一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれているβ−Ｄ−２’−デオキシリボシルである。このオリゴヌクレオチドは、それが検出されることができ、それゆえ標識として機能するように更に化学的に修飾されることができる。置換基の化学修飾は標識Ｌについて上記したのと同じ性質であることができる。
【００７４】
Ｌが更なる基−Ｒ３−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２である場合には、基質はＡＧＴを含む融合タンパク質と反応して二量体化された融合タンパク質をもたらす二量体化合物である。
【００７５】
実施例
実施例１：グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
ｈＡＧＴは、発現ベクターｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＢａｍＨ１部位とＥｃｏＲ１部位との間にクローニングする。タンパク質発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＪＭ８３で行う。指数関数的に増殖する培養を１ｍＭＩＰＴＧで誘導しそして発現を２４℃で３．５時間行う。収穫した細胞を１ｍＭＰＭＳＦ及び２μｇ／ｍＬアプロチニンを補充されたＰＢＳ中に懸濁させそしてリゾチーム及び音波処理により破壊する。ＤＮＡを取り除くために、ＭｇＣｌ２を１ｍＭに調節しそしてＤＮアーゼＩ（ＤＮＡｓｅ  Ｉ）を０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように加える。細胞片が４００００×ｇでの遠心により分離される前に、細胞を３０分間氷上に放置する。抽出物を平衡化されたグルタチオンセファロースに適用し、これを次いで１床容積のトリスＨＣｌｐＨ８．５及び２０床容積のＰＢＳで洗浄する。次いでＧＳＴ−ｈＡＧＴ融合タンパク質を、５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ７．９中の１０ｍＭ還元型グルタチオンで溶離する。精製したタンパク質を５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２；１ｍＭＤＴＴ；３０％グリセロールに対して透析し、次いで−８０℃で貯蔵する。精製したＧＳＴ−ｈＡＧＴをＯ６−ベンジルグアニン（Ｓｉｇｍａ）又はＯ６−４−ブロモテニルグアニンとｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベーションする。９０μＬの総反応容積において、０．４μＭＧＳＴ−ｈＡＧＴを５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．２；１ｍＭＤＴＴ中の基質２μＭと室温でインキュベーションする。いくつかの時点で、アリクォートを、Ｏ６位置を介してビオチン基に連結されている８．５ピコモル（ｐｍｏｌ）Ｏ６−ベンジルグアニンオリゴヌクレオチド（Ｒ．Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ４：２８５，２００１）で１０分間クエンチしそしてウエスタンブロッティング分析（ニュートラビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ），Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｌｕｓ（ＮＥＮ））のためにＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合する。対応するバンドの強度をＫｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ４４０により定量する。
【００７６】
実施例２：オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼＵｒａ３（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
酵母シャトルベクターｐＲＳ３１４に基づくプラスミドを使用する（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｈｉｅｔｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−２７，１９９９）。ｐＲＳ３１４のＢａｍＨ１制限部位とＥｃｏＲ１制限部位との間に銅誘導性プロモーター（ＣＵ−プロモーター）を挿入する。Ｕｒａ３遺伝子（Ｎ末端ＨＡ−タグを有する）をＢｇｌＩＩ部位とＫｐｎＩ部位との間に挿入し、そしてｈＡＧＴをＥｃｏＲ１部位とＢｇｌＩＩ部位との間に挿入して、ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３融合タンパク質をもたらす。
【００７７】
ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３融合タンパク質の発現レベルは、０．３のＯＤ６００を有する培養物５ｍＬを０．１ｍＭＣｕＳＯ４で誘導しそして培養物を３時間インキュベーションすることにより監視される。培養物３ｍＬを遠心により収穫し、５０μｌ  ２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中に再懸濁させそして３サイクルの凍結−解凍により破壊する。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングしそしてウエスタンブロッティングを行う（マウスＨＡ．１１抗体（ＢＡＢＣＯ）；ペルオキシダーゼコンジュゲーテッド抗マウス抗体Ａ４４１６（Ｓｉｇｍａ）；Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｌｕｓ（ＮＥＮ））。
【００７８】
ＣｕＳＯ４を含有しそしてウラシルを欠くプレート上で形質転換細胞を増殖させることによりＵｒａ３の活性を決定する。ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３融合タンパク質の活性をＥＬＩＳＡにより決定する：ＣＭ培地は０．１ｍＭＣｕＳＯ４及び１００μＭＯ６−ベンジルグアニンを補充されそして静置増殖一夜培養物（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｇｒｏｗｎ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｃｕｌｔｕｒｅ）５ｍＬを接種される。タンパク質発現をＯＤ６００が１．０に達するまで約５時間行う。収穫された細胞を酵母溶解緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣｌ；５ｍＭＥＤＴＡ；１％ＴＸ１００；１ｍＭＤＤＴ；１ｍＭＰＭＳＦ；２μｇ／ｍＬアプロチニン）中に再懸濁させそして３回の凍結−解凍サイクルにより破壊する。得られる抽出物３００μＬを、Ｏ６位置を介してビオチン基に連結されている５ピコモルＯ６−ベンジルグアニンオリゴヌクレオチド（Ｒ．Ｄａｍｏｉｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ４：２８５，２００１）と２０分間インキュベーションし、次いで予めブロックされたＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌプレート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に１時間コーティングする。次いでＥＬＩＳＡを標準方法（ＨＡ．１１及びＡ４４１６抗体による検出；ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳ（１．０ｍｇ／ｍＬ  ＡＢＴＳ、クエン酸ナトリウム１００ｍＭ中の０．０１％Ｈ２Ｏ２）による展開；４０５ｎｍで読み取り）により展開する。
【００７９】
実施例３：ユビキチン（Ｎ）Ｕｒａ３（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
Ｎ末端アルギニンを有するｈＡＧＴを発生させるために、線状ユビキチン−ｈＡＧＴ融合タンパク質をＰＣＲにより構築する。このＰＣＲでは構築物はＥｃｏＲ１制限部位及びＢｇｌＩＩ制限部位で隣接する。構築物を実施例２に記載の構築物ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３のＥｃｏＲ１部位とＢｇｌＩＩ部位との間に挿入して、ユビキチン−ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３融合タンパク質をもたらす。
【００８０】
ユビキチン−ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３融合タンパク質の発現レベル及び得られる融合タンパク質の活性を実施例２におけるｈＡＧＴ−Ｕｒａ３について記載のとおりに監視する。
実施例４：Ｔｕｐ１（Ｎ）Ｗ１６０ｈＡＧＴ融合タンパク質
Ｔｕｐ１を転写のグルコース抑制に関与する（Ｆ．Ｅ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｒ．Ｔｒｕｍｂｌｙ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：６５００−１１，１９９０）。この核局在化タンパク質を、クローニング部位ＮｃｏＩを含有しそしてＴｕｐ１の最後のアミノ酸ＡｓｎをｈＡＧＴの最初のアミノ酸Ｍｅｔと連結するリンカーＤＨＧＳＧによりＷ１６０ｈＡＧＴのＮ末端に融合させる。抗体検出のために、エピトープＨＡをｈＡＧＴのＣ末端に直接融合させ、次いで停止コドンを融合させる。クローニングのためのプライマーはａｋ１２１（Ｎ，Ｔｕｐ１）：
【００８１】
【表８】
2006501286.tif 000008
【００８２】
である。Ｔｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴタンパク質がｐｃｕｐ１プロモーターの制御下にある発現ベクターｐ３１４ＡＫ１を含有するＬ４０酵母細胞の培養物を、０．６のＯＤ６００となるように増殖させる。Ｔｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴの発現をＣｕＳＯ４を１００μＭの濃度となるように加えることにより誘導し、そして細胞培養物を２．５時間インキュベーションする。凍結／解凍サイクルにより酵母細胞の溶解の後、細胞抽出物をウエスタンブロッティング（１．抗ＨＡ抗体（Ｂａｂｃｏ），２．抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ））を使用して発現されたＴｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴ融合タンパク質の存在について分析する。活性は、核融合タンパク質（ｎｕｃｌｅａｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がｉｎ  ｖｉｖｏでＢＧＡＦ（アミド結合によりｐ−アミノメチル基に連結された５（６）−カルボキシフルオレセイン残基のジアセテートを有するＯ６−（ｐ−アミノメチル）ベンジルグアニン）で標識されるとき、蛍光顕微鏡検査法により証明される。
【００８３】
ＢＧＡＦは下記の方法で製造される：
Ｏ６−（４−アミノメチル−ベンジル）グアニン６．０ｍｇ（０．０２２ミリモル）をアルゴン雰囲気下に乾燥ＤＭＦ２ｍＬ（４０℃、３０分間音波処理された）に溶解する。室温に冷却した後、トリエチルアミン４．６μＬ（０．０３３ミリモル）及び５（６）−カルボキシフルオレセインＮ−スクシンイミジルエステル（異性体の混合物）１４．８ｍｇ（０．０２７ミリモル）を加える。室温で１時間攪拌した後、溶媒を除去しそして生成物をジクロロメタン中のメタノール（１：２０，１：１０，１：５）の段階勾配を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製する。これらの条件下に、ＢＧＡＦ及びＢＧＡＦの加水分解された誘導体（ＢＧＦＬと呼ばれる）を単離し、そして各々４００μＬＤＭＳＯに溶解する。ＢＧＦＬの溶液の濃度は、フルオレセインの吸光係数（ｐＨ７．４におけるε４９２＝９８．４×１０３Ｍ−１ｃｍ−１）によりλ＝４９２ｎｍにおける吸光度により決定する。ＢＧＦＬの濃度は、４．４ｍＭとして計算される。収率：１．１１ｍｇ（０．００１８ミリモル、８％）。Ｒｆ＝０．０２（メタノール／ジクロロメタン１／１０）。ＭＳ（ＥＳＩ）６２９．２７（１００［Ｍ＋Ｈ］＋）。Ｃ３４Ｈ２４Ｎ６Ｏ７  Ｍ＝６２８．６１ｇ／モル。ＢＧＡＦの濃度は、Ｏ６−（４−アミノメチル−ベンジル）グアニン及びフルオロセインの加算された吸光係数（ε２８０＝（７．１＋５３．３）ｍＭ−１ｃｍ−１＝６０．４ｍＭ−１ｃｍ−１）を使用してλ＝２８０ｎｍにおける吸光度により決定される。ＢＧＡＦの濃度は０．８ｍＭとして計算される。収率：０．２３ｍｇ（０．３μモル、１．５％）。Ｒｆ＝０．３８（メタノール／ジクロロメタン１／１０）。ＭＳ（ＥＳＩ）７１３．３５（１００［Ｍ＋Ｈ］＋）。Ｃ３８Ｈ２８Ｎ６Ｏ９  Ｍ＝７１２．６８ｇ／モル。
【００８４】
実施例５：Ｔｕｐ１（Ｎ）エンハンスドシアノ蛍光タンパク質ＥＣＦＰ（Ｃ）Ｗ１６０ｈＡＧＴ融合タンパク質
Ｔｕｐ１を実施例４で記載のリンカーＤＨＧＳＧによりＷ１６０ｈＡＧＴのＮ末端に融合させる。しかしながら、ｈＡＧＴのＣ末端に融合されたエピトープＨＡに続いて蛍光タンパク質ＥＣＦＰが融合される。クローニングのためのプライマーはａｋ１２１（Ｎ，Ｔｕｐ１）（配列番号１）、ａｋ１２２（Ｃ，Ｔｕｐ１）（配列番号２）、ａｋ１２５（Ｎ，ｈＡＧＴ）（配列番号３）、ａｋ１２６（ＥＣＦＰ，ＨＡ）：
【００８５】
【表９】
2006501286.tif 000009
【００８６】
である。Ｔｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰタンパク質がｐｃｕｐ１プロモーターの制御下にある発現ベクターｐ３１４ＡＫ１を含有するＬ４０酵母細胞の培養物を、０．６のＯＤ６００となるように増殖させる。Ｔｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰの発現をＣｕＳＯ４を１００μＭの濃度となるように加えることにより誘導し、そして細胞培養物を２．５時間インキュベーションする。凍結／解凍サイクルにより酵母細胞の溶解の後、細胞抽出物をウエスタンブロッティング（１．抗ＨＡ抗体（Ｂａｂｃｏ），２．抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ））を使用して発現されたＴｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰ融合タンパク質の存在について分析する。活性は、核融合タンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏでＢＧＡＦで標識されるとき、蛍光顕微鏡検査法により証明され、そして核は残留細胞から区別される。
【００８７】
実施例６：ＬｅｘＡ（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
ＬｅｘＡは酵母ツーハイブリッド法において使用されるＥ．ｃｏｌｉ転写レギュレーターのＤＮＡ結合ドメインである。ｈＡＧＴは、そのＣ末端に、酵母発現ベクターｐＨｙｂＬｅｘＺｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の制限部位ＥｃｏＲ１とＮｏｔＩとの中間で融合させる。使用されるプライマーは：
【００８８】
【表１０】
2006501286.tif 000010
【００８９】
である。
【００９０】
実施例７：シトクロムＣペルオキシダーゼＣＣＰ（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
ｈＡＧＴ−Ｕｒａ３構築物（実施例２）において、Ｕｒａ３を突然変異Ｄ２１７Ｐ及びＤ２２４Ｙ（Ｉｆｆｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  ｃｏｍｍｕｎ２８６：１２６−１３２，２００１）を有するＣＣＰ（そのミトコンドリアターゲッティング配列のない）により置き換える。融合タンパク質としてＣＣＰの活性を試験するために、ｈＡＧＴ−ＣＣＰの発現をもたらすベクターで形質転換された酵母コロニーをニトロセルロースに移しそして（３回の凍結−解凍サイクルの後）０．０２％Ｈ２Ｏ２を含有する５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４緩衝液中の５又は２０ｍＭ  ＡＢＴＳにさらす。コロニーは数分以内に暗緑色に染まったが、これに対して該タンパク質を発現しないコロニーは極めてかすかにしか染まらなかった。
【００９１】
実施例８：エンハンスドシアノ蛍光タンパク質ＥＣＦＰ（Ｃ）Ｗ１６０ｈＡＧＴ融合タンパク質
蛍光タンパク質ＥＣＦＰをＷ１６０ｈＡＧＴのＣ末端に融合させ、次いで停止コドンを融合させる。ＰＣＲによる融合は、融合タンパク質Ｔｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰ（実施例５）の場合と同じプライマーにより行う。タンパク質Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰを、哺乳動物発現ベクターｐＮｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に制限部位ＮｈｅＩとＢａｍＨＩの間に組み込む。
【００９２】
ＡＧＴに欠けたＣＨＯ細胞をＷ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰをコードするベクターでトランスフェクションする。２４時間の一過性発現の後、０．１８ｍｍ厚さのガラススライド上に増殖した細胞を灌流チャンバに移しそしてＢＧＦＬ（５μＭ）と５分間インキュベーションする。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して過剰の基質を除去する。蛍光測定のために、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡を使用する（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）。フルオレセイン又はＥＣＦＰシグナル（４８８ｎｍにおける励起）の検出を適当なフィルターにより達成する。走査速度及びレーザー強度を調節して蛍光プローブの光漂白、及び細胞の損傷又は形態変化を回避する。
【００９３】
実施例９：ＥＲ  Ｓｅｃ６２の膜タンパク質／ＤＨＦＲ（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
タンパク質Ｓｅｃ６２ｐのＮ末端ドメインのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、ペルオキシソーム膜タンパク質Ｐｅｘ１０ｐ及びＰｅｘ１５ｐの完全長ＯＲＦ、及び酵母カゼインキナーゼ（ＹＣＫ１）のＮ末端断片のＯＲＦをコードする断片は、テンプレートとして酵母ゲノムＤＮＡ及びそれぞれ所望のＤＮＡ断片の５’及び３’端部に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより得られる。すべての５’プライマーは追加のＢａｍＨＩ部位を含有し、そしてすべての３’プライマーは、追加の制限部位を含有し、ｐＲＳ３１４ベクター上のＣＵＰ１−ｈＡＧＴモジュールに対する３’フレーム内融合を可能とするか又はｐＲＳ３０４ベクター上のＹＣＫ１のＤＮＡ断片を可能とする。タンパク質Ｓｅｃ６２ｐのＮ末端ドメインのＯＲＦは、ＣＵＰ１−ｈＡＧＴモジュールと、ＨＡエピトープタグ（Ｄｈａ）をコードする追加の配列により延長されているマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする配列との間にフレーム内に挿入される（ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎ  ｆｒａｍｅ）。ＣＵＰ１−ｈＡＧＴモジュールは、テンプレートとして完全長ＡＧＴを含有するプラスミドＤＮＡ及びｈＡＧＴのＯＲＦの５’及び３’端部に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより得られる。３’−プライマーは追加のＢａｍＨＩ部位を含有しそして５’−プライマーは、ｐＲＳ３１４及びｐＲＳ３０４ベクター上の酵母ＣＵＰ１プロモーターに対する３’融合を可能とするために追加のＥｃｏＲ１部位を含有する。プラスミドＣＵＰ１−ｈＡＧＴ−ＳＥＣ６２−３１４、ＣＵＰ１−ｈＡＧＴ−ＰＥＸ１０−３１４及びＣＵＰ１−ｈＡＧＴ−ＰＥＸ１５−３１４は酵母細胞に形質転換される。プラスミドの存在は、トリプトファンを欠く選択性培地での増殖により制御される。ｈＡＧＴ−ＹＣＫ１融合遺伝子の完全長バージョンを得るために、ＣＵＰ１−ｈＡＧＴ−ＹＣＫ１−３０４をＳａｌ１で切断して、切断されたプラスミドの酵母への形質転換の後染色体ＹＣＫ１との相同性組換えを可能とする。成功した組換えは、プライマーとして適当なオリゴヌクレオチドを使用する診断ＰＣＲにより証明される。
【００９４】
ｈＡＧＴ−Ｓｅｃ６２−Ｄｈａ融合タンパク質の機能的アッセイ：ｈＡＧＴ−Ｓｅｃ６２−Ｄｈａを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞１００ｍＬを〜０．５のＯＤ６００となるように３０℃で増殖させ、そして細胞抽出の４時間前に１００μＭＣｕＳＯ４を補充する。遠心の後、液体窒素中での粉砕により細胞は開かれそしてタンパク質は１５０１ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する緩衝液中で抽出される。４℃で２０．０００ｒｐｍでの１５分の遠心の後、透明になった抽出物を基質ＢＧＢＴを含有するオリゴヌクレオチド１０ピコモル（ｐｍｏｌ）で室温で２０分間処理する。細胞抽出物をダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）１５μＬと４時間インキュベーションしそしてビーズを抽出緩衝液１ｍｌで５回洗浄する。洗浄されたビーズをＬａｅｍｍｌｉ緩衝液３０μＬ中で煮沸しそして抽出物をＳＤＳ  ＰＡＧＥに付す。精製されたｈＡＧＴ−Ｓｅｃ６２−Ｄｈａをニトロセルロース上へのウエスタンブロッティングの後、マウスモノクローナルＨＡ抗体及びセイヨウワサビペルオキシダーゼをカップリングさせたラビット抗マウス抗体との引き続く（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）インキュベーションにより検出する。
【００９５】
実施例１０：セロトニン受容体５−ＨＴ３（Ｎ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
セロトニン受容体５−ＨＴ３（マウス）を含有するベクターｐＥＡＫ８−５ＨＴ３Ｒは、Ｈ．Ｖｏｇｅｌのグループ（ＥＰＦＬ  Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。Ｗ１６０ｈＡＧＴを、突然変異誘発により導入された制限部位ＳｎａＢＩとＰａｃＩとの間の受容体の第４ループ（細胞質の）に組み込む。Ｗ１６０ｈＡＧＴの増幅のためのプライマーはａｋ１４４（Ｎ、Ｗ１６０ｈＡＧＴ）：
【００９６】
【表１１】
2006501286.tif 000011
【００９７】
である。ＡＧＴに欠けたＣＨＯ細胞を５−ＨＴ３−（Ｗ１６０ｈＡＧＴ）ｌｏｏｐ４受容体をコードするベクターでトランスフェクションする。２４時間の一過性発現の後、０．１８ｍｍ厚さのガラススライド上に増殖した細胞を灌流チャンバに移しそしてＢＧＦＬ（５μＭ）と５分間インキュベーションする。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して過剰の基質を除去する。蛍光測定のために、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡を使用する（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）。フルオレセインシグナル（４８８ｎｍにおける励起）の検出を適当なフィルターにより達成する。走査速度及びレーザー強度を調節して蛍光プローブの光漂白、及び細胞の損傷又は形態変化を回避する。
【００９８】
実施例１１：ヒトエストロゲン受容体ｈＥＲ（Ｃ）ｈＡＧＴ融合タンパク質
ヒトエストロゲン受容体を含有するベクターｐＣ１−ｈＥＲは、Ｈ．Ｖｏｇｅｌのグループ（ＥＰＦＬ  Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。Ｗ１６０ｈＡＧＴを受容体のＣ末端に制限部位ＮｈｅＩとＸｈｏＩの間で融合させる。Ｗ１６０ｈＡＧＴの増幅のためのプライマーはａｋ１３６（Ｎ、Ｗ１６０ｈＡＧＴ）：
【００９９】
【表１２】
2006501286.tif 000012
【０１００】
である。ＡＧＴに欠けたＣＨＯ細胞をＷ１６０ｈＡＧＴ−ｈＥＲをコードするベクターでトランスフェクションする。２４時間の一過性発現の後、０．１８ｍｍ厚さのガラススライド上に増殖した細胞を灌流チャンバに移しそしてＢＧＦＬ（５μＭ）と５分間インキュベーションする。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して過剰の基質を除去する。蛍光測定のために、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡を使用する（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）。フルオレセインシグナル（４８８ｎｍにおける励起）の検出を適当なフィルターにより達成する。走査速度及びレーザー強度を調節して蛍光プローブの光漂白、及び細胞の損傷又は形態変化を回避する。
【０１０１】
実施例１２：ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化配列ＮＬＳ（Ｃ）ｈＡＧＴ及びＮＬＳ／ＥＣＦＰ（Ｃ）ｈＡＧＴ
シミアンウイルス４０ラージＴ抗原の核局在化シグナルの３つのコピー（ＮＬＳ３）を、Ｗ１６０ｈＡＧＴのＣ末端に融合されたＨＡタグに融合された蛍光タンパク質ＥＣＦＰのＣ末端に融合させてＷ１６０ｈＡＧＴ−ＨＡ−ＥＣＦＰ−ＮＬＳ３を生じさせるか、又はＷ１６０ｈＡＧＴのＣ末端に直接融合させてＷ１６０ｈＡＧＴ−ＮＬＳ３を生じさせる。融合タンパク質Ｔｕｐ１−Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＥＣＦＰ（実施例５）の場合と同じプライマーを使用して、ＰＣＲによる融合を行う。ついで、Ｗ１６０ｈＡＧＴ−ＨＡ−ＥＣＦＰ−ＮＬＳ３又はＷ１６０ｈＡＧＴ−ＮＬＳ３を、それぞれ、哺乳動物発現ベクターｐＮｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に制限部位ＮｈｅＩとＢｇｌＩＩとの間で組み込む。プライマーはａｋ１３６（Ｎ、Ｗ１６０ｈＡＧＴ）（配列番号１２）、ａｋ１３７（Ｃ、ＥＣＦＰ）：
【０１０２】
【表１３】
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【０１０３】
である。ＡＧＴに欠けたＣＨＯ細胞をＷ１６０ｈＡＧＴ−ＨＡ−ＥＣＦＰ−ＮＬＳ３又はＷ１６０ｈＡＧＴ−ＮＬＳ３をコードするベクターｐＮｕｃでトランスフェクションする。２４時間の一過性発現の後、０．１８ｍｍ厚さのガラススライド上に増殖した細胞を灌流チャンバに移しそしてＢＧＦＬ（５μＭ）と５分間インキュベーションする。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して過剰の基質を除去する。蛍光測定のために、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点顕微鏡を使用する（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）。フルオレセイン又はＥＣＦＰシグナル（４８８ｎｍにおける励起）の検出を適当なフィルターにより達成する。走査速度及びレーザー強度を調節して蛍光プローブの光漂白、及び細胞の損傷又は形態変化を回避する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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