(57)【要約】肺癌を診断するための組成物および方法が開示される。このような方法は、初期の腫瘍を検出するために、または適当な病期／悪性度分類情報または腫瘍特異性を提供するために有用である。組成物は、１つまたはそれ以上の肺腫瘍タンパク質、その免疫原性部分、またはそのような部分をコードするポリヌクレオチドを含み得る。そのような組成物を、例えば肺癌の診断および予後を改善するために、および潜在的にＮＳＣＬＣとＳＣＬＣとを識別するために使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌細胞の存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）該生物学的サンプルを、互いに関連しない独立のポリヌクレオチド配列に対して特異的な２つ以上のオリゴヌクレオチド対と接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチド対が、中程度のストリンジェントな条件下で、それぞれのポリヌクレオチドおよびその相補体にハイブリダイズする、工程；
（ｃ）該ポリヌクレオチドを増幅する工程；ならびに、
（ｄ）該増幅されたポリヌクレオチドを検出する工程；
を包含し、１つ以上の該増幅されたポリヌクレオチドの存在が、該患者における肺癌細胞の存在を示す、方法。
【請求項２】
患者における肺癌細胞の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）該患者から得た生物学的サンプルを、２つ以上の肺腫瘍タンパク質をコードする二つ以上のポリヌクレオチドにハイブリダイズする２つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｃ）該生物学的サンプル中で、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズするポリペプチドの量を検出する工程；
（ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較する工程であって、そこから該患者における肺癌細胞の存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
患者における肺癌の進行をモニタリングするための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者から１番目の生物学的サンプルを得る工程；
（ｂ）該１番目の生物学的サンプルを、肺腫瘍タンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｃ）該１番目の生物学的サンプル中に、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする該ポリヌクレオチドの少なくとも１種の量を検出する工程；
（ｄ）その後の時点で該患者から得た２番目の生物学的サンプルを使用して、工程（ｂ）および工程（ｃ）を繰り返す工程；ならびに、
（ｅ）工程（ｄ）で検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｃ）で検出された量と比較する工程であって、そこから該患者における肺癌の進行をモニタリングする工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号２１および配列番号２６からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術的分野）
本発明は、一般的に癌診断の分野に関連する。より具体的には、本発明は、異なる型、病期、および悪性度分類の腫瘍を有する患者において肺癌を検出するための方法、組成物、およびキットに関連し、それはオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび／または増幅を採用して、肺癌細胞を含むと疑われる生物学的サンプルにおいて、２つまたはそれ以上の組織特異的ポリヌクレオチドを同時に検出する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
肺癌は、依然として世界中で大きな健康問題である。伝統的な肺癌治療レジメの失敗は通常、部分的には、疾患の診断の遅れに帰することができる。肺癌診断の領域で顕著な進歩がなされたが、依然として早期で、信頼性の高い、かつ高感度の、肺癌細胞の存在の決定を可能にする、改善された検出方法の必要性が存在する。
【０００３】
（関連技術の説明）
肺癌は、あらゆる癌のうち最も高い死亡率を有し、そして早期に診断するのが最も困難なものの１つである。世界中で年間推定１００万人がこの疾患のために死亡している。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによると、２００２年のみにおいて、推定１６９，２００件の診断された新規症例および約１５４，９００件の死亡があった。代表的には、肺癌は２つの主な型：扁平上皮癌、腺癌、および大細胞癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に分類される。これらのグループは、それぞれ全肺腫瘍の約７５％および２５％を占め、腺癌および扁平上皮癌が最も流行している形式のＮＳＣＬＣであり、大細胞癌は〜１０％である。ＮＳＣＬＣのグループ内で、より若い人々、全ての年齢の女性、生涯の非喫煙者、および長期の前喫煙者において、腺癌が現在最も顕著な形式の肺癌である。ＳＣＬＣは、代表的には２つのサブタイプ、燕麦細胞および中間細胞に分けられる。より通常でない腫瘍は、特にカルチノイドおよび中皮腫を含むが、これらは全ての肺腫瘍のうち低い割合しか占めない。ほとんど全ての症例において、ＮＳＣＬＣの初期診断はわかりにくく、そしてほとんどの肺癌は、検出された時には既に転移している。最初の診断において、１６．７％のみしか局在化していない。もし腫瘍が限定されている時点でそれを検出し得るなら、化学療法および放射線の組み合わせが成功の可能性を有するが、全体の５年予後は非常に悪く、１０−１５％のみの生存率である。ＳＣＬＣを有する臨床像はさらに厳しく、最初の診断時に６％のみが局在化、および５年生存率は約６％である。
【０００４】
胸部および腹部のＸ線およびコンピューター断層撮影が、肺腫瘍の診断において多くの場合使用されるが、小さい病巣を検出する感受性を欠き、そして通常既に転移した腫瘍を検出する。ハイリスクの個体における可能性のあるスクリーニング方法としての痰細胞学は、部分的に有効なだけであり、そして多くの場合腫瘍の型を明らかにしない。疾患の病期を決定するために、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩまたは骨スキャンを使用して、疾患の広がりを評価する。肺癌の治療は、代表的には外科療法、放射線療法、もしくは化学療法またはその組み合わせであるが、通常疾患の診断が遅いために結果は良くない。
【０００５】
現在の肺癌の試験は、初期の腫瘍を検出する臨床的感受性を欠くか、または不適当な病期／悪性度分類情報を提供するか、またはそれらが他の腫瘍型から生じたか、もしくは良性の肺疾患に存在するために、腫瘍特異性を欠くかのいずれかである。従って、肺癌診断および予後を改善し、そして潜在的にＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ間を識別し得る特異的な試験を開発する必要性が存在する。本発明は、組織特異的ポリヌクレオチド、特に腫瘍特異的ポリヌクレオチドの同定に有用な方法、およびその疾患に苦しむ患者における癌細胞の検出およびモニタリングのための抗体および方法、組成物およびキットを提供することによって、これらの目的および他の関連する目的を達成する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、患者における肺癌細胞の存在を検出するための方法を提供する。そのような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）その生物学的サンプルを、互いに無関係の独立したポリヌクレオチド配列に特異的な、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対と接触させる工程であって、そのオリゴヌクレオチド対は、中程度にストリンジェントな条件下で、それぞれのポリヌクレオチドおよびそれらの相補鎖にハイブリダイズする、工程；（ｃ）そのポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｄ）増幅されたポリヌクレオチドを検出する工程であって、ここで１つまたはそれ以上の増幅されたポリヌクレオチドの存在は、患者における肺癌細胞の存在を示す工程。
【０００７】
いくつかの実施形態によって、増幅されたポリヌクレオチドの検出は、例えばゲル電気泳動のような分画工程の後に続き得る。あるいは、またはそれに加えて、増幅ポリヌクレオチドの検出を、中程度にストリンジェントな条件下でそのようなポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって達成し得る。オリゴヌクレオチドの標識化を、放射性標識ヌクレオチドを組み込むことによって、または蛍光標識を組み込むことによって達成し得る。
【０００８】
特定の好ましい実施形態において、特定の組織型の細胞を、検出工程の前に生物学的サンプルから濃縮し得る。濃縮を、細胞捕獲および細胞枯渇からなる群より選択される方法によって達成し得る。例示的な細胞捕獲方法は、イムノキャプチャー（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅ）を含み、そして以下の工程を含む：（ａ）組織特異的細胞表面に対する抗体を、当該生物学的サンプルの細胞に吸着させる工程；（ｂ）抗体が吸着した組織特異的細胞を、残りの生物学的サンプルから分離する工程。例示的な細胞枯渇を、赤血球および白血球の架橋、続く架橋細胞を除去する分画工程によって達成し得る。
【０００９】
本発明の代替的な実施形態は、患者において肺癌の存在または非存在を決定する、以下の工程を含む方法を提供する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、２つまたはそれ以上の肺腫瘍タンパク質をコードする２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）サンプルにおいてオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のレベルを検出する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、前もって決定したカットオフ値と比較し、そしてそこから患者における肺癌の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量を、例えば上記で引用したようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって検出する。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量を、上記で引用したようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを採用する、ハイブリダイゼーション技術を用いて検出する。
【００１０】
関連する局面において、以下の工程を包含する、患者において肺癌の進行をモニタリングするための方法が提供される：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、肺腫瘍タンパク質をコードする２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）サンプルにおいてオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；（ｃ）続く時点で患者から得られた生物学的サンプルを用いて工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；および（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）において検出された量と比較し、そしてそれから患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００１１】
本発明の特定の実施形態は、当該最初のポリヌクレオチドおよび当該２番目のポリヌクレオチドの増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成することを提供する。
【００１２】
本発明はまた、本発明の検出方法を実施するために適切なキットを提供する。例示的なキットは、オリゴヌクレオチドプライマー対を備え、それらの１つはそれぞれ別のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。特定の実施形態において、本発明によるキットはまた、核酸ポリメラーゼおよび適当な緩衝液を備え得る。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の局面が、以下の詳細な説明および添付された図を参照して明らかとなる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、それぞれが個々に組み込まれたように、これによってその全体が参考として参考文献に援用される。
【００１４】
（配列識別名の簡単な説明）
配列番号１は、決定されたｃＤＮＡ配列Ｌ７６２Ｐである。
配列番号２は、配列番号１の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３は、決定されたｃＤＮＡ配列Ｌ９８４Ｐである。
配列番号４は、配列番号３の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号５は、決定されたｃＤＮＡ配列Ｌ５５０Ｓである。
配列番号６は、配列番号５の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号７は、決定されたｃＤＮＡ配列Ｌ５５２Ｓである。
配列番号８は、配列番号７の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｌ５５２Ｓ  ＩＮＴフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１０は、Ｌ５５２Ｓ  ＩＮＴリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１１は、Ｌ５５２Ｓ  ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
配列番号１２は、Ｌ５５０Ｓ  ＩＮＴフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１３は、Ｌ５５０Ｓ  ＩＮＴリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１４は、Ｌ５５０Ｓ  ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
配列番号１５は、Ｌ７２６Ｐ  ＩＮＴフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１６は、Ｌ７２６Ｐ  ＩＮＴリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１７は、Ｌ７２６Ｐ  ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
配列番号１８は、Ｌ９８４Ｐ  ＩＮＴフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号１９は、Ｌ９８４Ｐ  ＩＮＴリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、Ｌ９８４Ｐ  ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
配列番号２１は、Ｌ７６３Ｐの決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２２は、配列番号２１の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号２３は、Ｌ７６３Ｐ  ＩＮＴフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２４は、Ｌ７６３Ｐ  リバースプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２５は、Ｌ７６３Ｐ  ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
配列番号２６は、Ｌ５８７の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号２７は、配列番号２６の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号２８は、Ｌ５８７  ＩＮＴフォワードプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号２９は、Ｌ５８７  ＩＮＴリバースプライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号３０は、Ｌ５８７  ＴａｑｍａｎプローブのＤＮＡ配列である。
配列番号３１は、Ｌ５２３の決定されたｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２は、配列番号３１の配列によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号３３は、Ｌ５２３プライマーのＤＮＡ配列である。
配列番号３４は、Ｌ５２３プライマーのＤＮＡ配列である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
上記で述べたように、本発明は、一般的に組織特異的ポリヌクレオチドの同定に適した方法、および肺癌の診断およびモニタリングに適した方法、組成物およびキットに関し、特にこのような方法、組成物およびキットは、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの診断、識別および／または予後における使用に適している。このような診断方法は、肺組織における肺癌転移を検出、ならびに血液および離れた転移の縦隔リンパ節における足場非依存性肺癌細胞を検出するための、分子診断試験の基礎を形成する。
【００１６】
種々の遺伝子が、肺腫瘍、特にＮＳＣＬＣの扁平上皮癌または腺癌形態または小細胞癌において過剰発現していると同定された。これらとしては、Ｌ７６２Ｐ、Ｌ９８４Ｐ、Ｌ５５０Ｓ／Ｌ５４８Ｓ、Ｌ５５２Ｓ／Ｌ５４７Ｓ、Ｌ５５２／Ｌ５４７Ｓ、Ｌ２００Ｔ、Ｌ５１４Ｓ、Ｌ５５１Ｓ、Ｌ５８７Ｓ、Ｌ７６３Ｓ、Ｌ７７３Ｐ、Ｌ８０１Ｐ、Ｌ９８５Ｐ、Ｌ１０５８Ｃ、Ｌ１０８１Ｃ、Ｌ５２３Ｓ、ＯＦ１７８３Ｐ、Ｂ３０７Ｄが挙げられるが、これに限定されない（ＷＩＰＯ国際特許出願番号ＷＯ９９／４７６７４、１９９９年９月２３日公開；ＷＯ００／６１６１２、２０００年１０月１９日公開；ＷＯ０２／００１７４、２００２年１月３日公開；ＷＯ０２／４７５３４、２００２年６月２０日公開；ＷＯ０１／７２２９５、２００１年１０月４日公開；ＷＯ０２／０９２００１、２００２年１１月２１日公開；ＷＯ０１／００８２８、２００１年１月１日公開；ＷＯ０２／０４５１４、２００２年１月１７日公開；ＷＯ０１／９２５２５、２００２年１２月６日公開；ＷＯ０２／０２６２３、２００２年１月１０日公開。Ｗａｎｇら、米国特許第６，４８２，５９７号、２００２年１１月２２日発行；Ｗａｎｇら、同第６，５１８，２５６号、２００３年２月１１日発行；Ｗａｎｇら、同第６，４２６，０７２号、２００２年７月３０日発行；Ｒｅｅｄら、同第６，２１０，８８３号、２００１年４月３日発行；Ｗａｎｇら、同第６，５０４，０１０号、２００３年１月７日発行；Ｗａｎｇら、同第６，５０９，４４８号、２００３年１月２１日発行；Ｗａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ：２１（４９）：７５９８−６０４、２００２（コラーゲンＸＩ型αＩ））。
【００１７】
これらの遺伝子は、ＰＣＲおよびｃＤＮＡライブラリーサブトラクションおよびそれぞれの腫瘍型を個々に用いた電気的サブトラクションを用いて同定され、そして特徴付けられた。同定されたｃＤＮＡを次いでマイクロアレイによって評価し、次いで組織パネルにおけるリアルタイムＰＣＲによって評価して特異的な発現パターンを同定した。表１はこれら遺伝子のＮＳＣＬＣの腺癌または扁平上皮癌形態のいずれかまたは両方に関する特異性、および小細胞肺癌に特異的な遺伝子を強調する。いくつかの場合には、大細胞癌との反応性もリアルタイムＰＣＲ分析によって同定された。
【００１８】
【表１】
2006521110.tif 000002
（組織特異的ポリヌクレオチドの同定）
本発明の特定の実施形態は、異なる型、病期、および悪性度分類の腫瘍を有する患者由来の生物学的サンプルにおいて肺癌細胞を検出する方法、組成物およびキットを提供する。これらの方法は、患者の生物学的サンプルから１つまたはそれ以上の組織特異的ポリヌクレオチドを検出する工程を包含し、そのポリヌクレオチドの過剰発現は、患者の生物学的サンプルにおける肺癌細胞の存在を示す。従って、本発明はまた、組織特異的ポリヌクレオチドの同定に適した方法を提供する。本明細書中で使用される場合、「組織特異的ポリヌクレオチド」または「腫瘍特異的ポリヌクレオチド」という語句は、１つまたはそれ以上のコントロール組織と比較して、少なくとも２倍過剰発現している全てのポリヌクレオチドを含むよう意味する。本明細書中の下記でさらに詳細に議論するように、所定のポリヌクレオチドの過剰発現を、例えばマイクロアレイおよび／または定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲＴＭ）方法によって評価し得る。
【００１９】
組織特異的ポリヌクレオチドを検出するための例示的な方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）遺伝的サブトラクションを実施して、目的の組織からポリヌクレオチドのプールを同定する工程；（ｂ）ＤＮＡマイクロアレイ分析を実施して、目的の上記ポリヌクレオチドのプールの最初の部分集合を同定する工程であって、ここで上記最初の部分集合の各ポリヌクレオチドのメンバーは、コントロール組織と比較して目的の上記組織において少なくとも２倍過剰発現している、工程；および（ｃ）上記最初の部分集合内のポリヌクレオチドに対して定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析を実施して、上記コントロール組織と比較して少なくとも２倍過剰発現している２番目の部分集合のポリヌクレオチドを同定する工程。
【００２０】
（一般的なポリヌクレオチド）
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、一般的にＤＮＡまたはＲＮＡ分子のいずれかを指す。ポリヌクレオチドは、血液、血清、リンパ節、骨髄、痰、尿、および腫瘍生検サンプルのような生物学的サンプルにおいて通常見出されるように、天然に存在し得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、例えば核酸ポリマー化反応によって合成的に得られたものであり得る。当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは１本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または２本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子としては、イントロンを含み、そしてＤＮＡ分子と１対１の様式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が挙げられる。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、必ずしもその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に結合し得るが、必ずしもその必要はない。
【００２１】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、肺腫瘍タンパク質のような腫瘍タンパク質、またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、またはそのような配列の改変体、または生物学的機能性等価物または抗原的機能性等価物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、下記でさらに説明するように、１つまたはそれ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。「改変体」という用語はまた、異種由来の相同的遺伝子を含む。
【００２２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を比較する場合、下記で記載するように、２つの配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、最大限の対応で整列した場合に同じである場合、２つの配列は「同一」であると言われる。２つの配列間の比較を、代表的には比較ウィンドウにわたる配列を比較し、局所領域の配列類似性を同定および比較することによって実施する。本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続する位置、通常３０〜約７５個、４０〜約５０個の断片を指し、その中で２つの配列を最適に整列した後、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較し得る。
【００２３】
比較するための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ総合ソフトウェア中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、デフォルトパラメーターを用いて実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献で記載されたいくつかの整列スキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻、補遺３、３４５−３５８頁の、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６−６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【００２４】
あるいは、比較するための配列の最適な整列を、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性探索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または検査によって実施し得る。
【００２５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切な、１つの好ましいアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を、例えば本明細書中で記載されるパラメーターで使用して、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列同一性パーセントを決定し得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公共で入手可能である。１つの説明的な例において、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターＭ（マッチする残基対に対するリワードスコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア（ｐｅｎａｌｔｙ  ｓｃｏｒｅ）；常に＜０）を用いて、累積スコアを計算し得る。アミノ酸配列に関して、累積スコアを計算するために、スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用し得る。各方向におけるワードヒット（ｗｏｒｄ  ｈｉｔ）の伸長は、累積整列スコアがその最大達成値より量Ｘだけ下がった場合；１つまたはそれ以上のネガティブスコアリング残基整列の蓄積のために、累積スコアがゼロまたはそれ以下になった場合；またはどちらかの配列の末端に達した場合、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度およびスピードを決定する。（ヌクレオチド配列に対する）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとしてワードの長さ（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）は１１、および期待値（Ｅ）は１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）整列（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００２６】
好ましくは、「配列同一性のパーセント」を、少なくとも２０位置の比較ウィンドウで２つの最適に整列した配列を比較することによって決定し、ここで比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列に関して、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれより低い、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を明らかにし、マッチした位置の数を参照配列の位置の全数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、そして結果を１００倍して配列同一性のパーセントを出すことによって、パーセンテージを計算する。
【００２７】
従って、本発明は、本明細書中で開示される配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列、例えば本明細書中で記載された方法（例えば下記で記載するような、標準的なパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ分析）を用いて本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれより高い、配列同一性を含むものを含む。当業者は、コードの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置等を考慮に入れて、これらの値を適当に調整して２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定し得ることを認識する。
【００２８】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中で開示される１つまたはそれ以上の配列と同一の、またはそれらと相補的な、種々の長さの連続的な配列の範囲を含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本明細書中で開示された１つまたはそれ以上の配列の、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００またはそれ以上、およびその間の全ての中間の長さの連続的なヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。この文脈において、「中間の長さ」は、例えば、１６、１７、１８、１９等；２１、２２、２３等；３０、３１、３２等；５０、５１、５２、５３等；１００、１０１、１０２、１０３等；１５０、１５１、１５２、１５３等；２００−５００；５００−１０００等の間の全ての整数を含むような、引用した値の間のあらゆる長さを意味することが、容易に理解される。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントは、コード配列自体の長さに関わらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコーディング部分等のような、他のＤＮＡ配列と組み合わせ得るので、その全体の長さはかなり異なり得る。従って、ほとんどあらゆる長さの核酸フラグメントを採用し得ることが企図され、全長は好ましくは意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける調製および使用の簡便さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長等（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡ部分が、本発明の多くの実行において有用であることが企図される。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で提供されたポリヌクレオチド配列、またはそれらのフラグメント、またはそれらの相補配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドに関する。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。説明の目的のために、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するための、適した中程度にストリンジェントな条件としては、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中で前洗浄；５０℃−６５℃で、５×ＳＳＣで、一晩ハイブリダイズ；続いて０．１％のＳＤＳを含む２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれで、６５℃で２０分間２回洗浄が挙げられる。
【００３１】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中で記載したようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者によって理解される。これらポリヌクレオチドのいくつかは、いかなる天然遺伝子のヌクレオチド配列とも最低限の相同性しか有さない。それにも関わらず、コドンユーセージにおける違いのために異なるポリヌクレオチドは、本発明によって特に企図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換のような、１つまたはそれ以上の変異の結果として変化した内因性遺伝子である。生じるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、必ずしもその必要はない。対立遺伝子を、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較）を用いて同定し得る。
【００３２】
（マイクロアレイ分析）
本発明の方法による検出に適したポリヌクレオチドを、下記でより詳細に記載するように、組織および／または腫瘍関連発現（例えば、本明細書中で提供される代表的なアッセイを用いて決定されるような、腫瘍において正常組織より少なくとも２倍多い発現）に関してｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって同定し得る。そのようなスクリーニングを、例えばＳｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を製造会社の指示に従って用いて、（および本質的にはＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９（１９９６）およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５（１９９７）によって記載されたように）実施し得る。
【００３３】
マイクロアレイは、多数の遺伝子を評価するために有効な方法であるが、限られた感受性に起因して、少量の遺伝子の完全な組織分布を正確に決定し得ないか、またはシグナルの飽和に起因して、より多量の遺伝子の過剰発現の程度を過小評価し得る。マイクロアレイ発現プロファイリングによって過剰発現を示す遺伝子に関して、より大きな感受性の動的範囲を含む、ＴａｑｍａｎＴＭプローブ検出に基づく定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、さらなる分析を行った。いくつかの異なる正常組織のパネルおよび腫瘍組織のパネル、遠位の転移および細胞株をこの目的のために使用した。
【００３４】
（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）
本発明による適したポリヌクレオチドを、例えばリアルタイムＰＣＲ方法のような、定量的ＰＣＲ方法を採用することによって、さらに特徴付け得るか、またはあるいは、最初に同定し得る。この方法によって、例えば転移腫瘍サンプルのような、組織サンプルおよび／または腫瘍サンプルを、対応する正常組織サンプルおよび／または関連のない正常組織サンプルのパネルと並べて試験し得る。
【００３５】
リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１、１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４、１９９６を参照のこと）は、増幅中のＰＣＲ産物の蓄積レベルを評価する技術である。この技術は、複数のサンプルにおけるｍＲＮＡレベルの定量的評価を可能にする。簡単には、ｍＲＮＡを腫瘍組織および正常組織から抽出し、そして標準的な技術を用いてｃＤＮＡを調製する。
【００３６】
例えば、リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ  ７７００  ＰｒｉｓｍまたはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のいずれかにおいて行い得る。７７００システムは、１つの末端に５’蛍光リポーター色素、および他方の末端に３’クエンチャー色素を有する特異的なプローブ（ＴａｑｍａｎＴＭ）と組み合わせた、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用する。リアルタイムＰＣＲを、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う場合、プローブは切断され、そして蛍光を発し始め、反応を蛍光の増加によってモニターすることが可能になる（リアルタイム）。５７００システムは、２本鎖ＤＮＡのみに結合する蛍光色素であるＳＹＢＲ（登録商標）グリーン、および７７００装置と同じ前向きおよびリバースプライマーを用いる。マッチするプライマーおよび蛍光プローブを、プライマー発現プログラムによって設計し得る（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。プライマーおよびプローブの最適な濃度は、当業者によって最初に決定される。コントロール（例えばβ−アクチン）プライマーおよびプローブを、例えばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から商業的に得ることができる。
【００３７】
サンプルにおいて特定のＲＮＡの量を定量するために、目的の遺伝子を含むプラスミドを用いて、標準曲線を作成する。標準曲線を、リアルタイムＰＣＲにおいて決定したＣｔ値を用いて作成し、それはアッセイで用いた初期ｃＤＮＡ濃度と関連する。目的の遺伝子の、１０−１０６コピーの範囲の標準希釈が通常十分である。さらに、標準曲線を、コントロール配列に関して作成する。これは、比較の目的のために、コントロールの量に対する組織サンプルの初期ＲＮＡ含有量の標準化を可能にする。
【００３８】
上記によって、および下記でさらに記載するように、本発明は、配列番号１、３、５、７、２１および２６で記載される配列を有する、例示的な肺組織および／または腫瘍特異的ポリヌクレオチドＬ５５２Ｓ、Ｌ５５０Ｓ、Ｌ７６２Ｐ、Ｌ９８４Ｐ、Ｌ７６３Ｐ、およびＬ５８７、配列番号２、４、６、８、２２および２７で示されるアミノ酸配列を有し、それによってコードされる例示的なポリペプチドを提供し、それを癌、より具体的には肺癌の検出に適切に採用し得る。
【００３９】
（癌検出のための方法）
一般的に、患者から得られた生物学的サンプル（例えば血液、リンパ節、骨髄、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）の細胞内の１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドの存在に基づいて、癌細胞を患者において検出し得る。言い換えれば、そのようなポリヌクレオチドをマーカーとして使用して、例えば肺癌のような癌の存在または非存在を示し得る。
【００４０】
本明細書中でさらに詳細に議論するように、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチドの同時検出の方法を提供することによって、これらおよび他の関連する目的を達成し、その存在は、生物学的サンプルにおける肺癌細胞の存在の診断である。本明細書中で開示される種々の癌検出方法のそれぞれは、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブをハイブリダイズする工程を共通に有し、そのハイブリダイゼーションは、腫瘍および／または組織特異的ポリヌクレオチドの存在を示す。企図される正確な適用に依存して、１つまたはそれ以上の、イントロンを貫くオリゴヌクレオチドを採用することが好ましくあり得、それらのオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのポリヌクレオチドに対しては無効であり、従って、これらのオリゴヌクレオチドは、生物学的サンプル中のゲノムＤＮＡの検出を、実質的に低減および／または排除するのに有効である。
【００４１】
試験する生物学的サンプルを、１つまたはそれ以上の細胞捕獲および／または細胞枯渇方法に供することによって、これらの検出方法の感度を増強する方法が、本明細書中でさらに開示される。
【００４２】
本発明の特定の実施形態によって、患者における肺癌細胞の存在を、以下の工程を採用することによって決定し得る：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、本明細書中で記載されたような２つまたはそれ以上の肺腫瘍タンパク質をコードする、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチドにハイブリダイズする２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）サンプルにおいて、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）のレベルを検出する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、前もって決定したカットオフ値と比較し、そしてそれから患者における肺癌の存在または非存在を決定する工程。
【００４３】
アッセイ条件下でハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド長、および好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長の肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部分に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、上記で定義したような中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で記載したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中で記載される診断方法において有用に採用され得るオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは少なくとも１０−４０ヌクレオチド長である。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１、３、５、または７で引用した配列を有するＤＮＡ分子の、少なくとも１０個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイのどちらについての技術も、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）。
【００４４】
本発明はまた、患者において肺癌細胞の存在を検出するための、増幅に基づく方法を提供する。例示的な方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から生物学的サンプルを得る工程；（ｂ）上記生物学的サンプルを、互いに無関係な独立したポリヌクレオチド配列に特異的な２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチド対と接触させる工程であって、ここで上記オリゴヌクレオチド対は、中程度にストリンジェントな条件下で、それらのそれぞれのポリヌクレオチドおよびそれらの相補体にハイブリダイズする工程；（ｃ）ポリヌクレオチドを増幅する工程；および（ｄ）増幅したポリヌクレオチドを検出する工程；ここで１つまたはそれ以上の増幅したポリヌクレオチドの存在は、患者における肺癌細胞の存在を示す。
【００４５】
本発明による方法は、例えば、特に血液、血清、リンパ節、骨髄、痰、尿および腫瘍生検サンプルのような、広範な種々の生物学的サンプルから得られたポリヌクレオチドを同定する工程に適している。
【００４６】
本発明の特定の例示的な実施形態は、検出されるポリヌクレオチドが、Ｌ７６２、Ｌ９８４、Ｌ５５０、Ｌ５５２、Ｌ７６３、およびＬ５８７からなる群より選択される方法を提供する。あるいは、および／またはそれに加えて、検出されるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、２１および２６で示されたものからなる群より選択され得る。
【００４７】
本発明の方法に従って使用し得る適した例示的なオリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーが、本明細書中で開示される。ゲノムＤＮＡのバックグラウンド検出を排除する、特定の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドはイントロンを貫通するオリゴヌクレオチドであり得る。
【００４８】
企図される正確な適用に依存して、当業者には、放射性標識を検出する工程、およびフルオロフォアを検出する工程によって、組織および／または腫瘍特異的ポリヌクレオチドを検出することが好ましくあり得る。より具体的には、オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーは、例えば放射性標識および／またはフルオロフォアのような検出可能な部分を含み得る。
【００４９】
あるいは、またはそれに加えて、本発明の方法はまた、組織および／または腫瘍特異的ポリヌクレオチドの検出の前に、例えばゲル電気泳動のような、分画工程を包含し得る。
【００５０】
他の実施形態において、本明細書中で記載された方法を使用して、癌の進行をモニタリングし得る。これらの実施形態によって、肺癌の診断のために提供されたアッセイを、長期にわたって行い得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価する。例えば、アッセイを６ヶ月から１年間の期間にわたって、２４−７２時間ごとに行い、そしてその後は必要に応じて行い得る。一般的に、検出されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが時間と共に増加する患者において、癌は進行している。対照的に、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが、一定のままであるか、または時間と共に減少する場合は、癌は進行していない。
【００５１】
特定のインビボ診断アッセイを、腫瘍に対して直接行い得る。１つのそのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。結合した結合剤を、次いで直接、またはリポーター基を介して間接的に検出し得る。そのような結合剤をまた、組織学的適用においても使用し得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブを、そのような適用内で使用し得る。
【００５２】
上記で述べたように、感度を改善するために、複数の肺腫瘍タンパク質マーカーを、所定のサンプルにおいてアッセイし得る。本明細書中で提供される、異なるタンパク質に特異的な結合剤を、単一のアッセイで合わせ得ることが明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブを同時に使用し得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定する日常的な実験に基づき得る。それに加えて、またはあるいは、本明細書中で提供される腫瘍タンパク質のアッセイを、他の公知の腫瘍抗原のアッセイと組み合わせ得る。
【００５３】
（細胞濃縮）
本発明の他の局面において、本明細書中で開示された種々の検出方法の感度を改善するために、ポリヌクレオチド検出の前に細胞捕獲技術を使用し得る。
【００５４】
例示的な細胞濃縮方法は、細胞表面マーカーに対する特異的モノクローナル抗体、または４量体抗体複合体で覆われた免疫磁気ビーズを採用し、この方法をサンプルにおいてまず癌細胞を濃縮または積極的に選択するために使用し得る。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む、種々の市販で入手可能なキットを使用し得る。当業者は、他の容易に入手可能な方法およびキットも、望ましい細胞集団を濃縮または積極的に選択するために適切に採用し得ることを認識する。
【００５５】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織に発現する２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂで覆われた磁気ビーズを備える。被覆されたビーズを、サンプルに添加し得、そして次いでそのサンプルを磁石に適用し、それによってビーズに結合した細胞を捕獲する。望ましくない細胞は洗い流され、そして磁気的に単離された細胞はビーズから溶出され、そしてさらなる分析に使用される。
【００５６】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を濃縮するために使用され得、そして種々の望ましくない細胞を標的とする４量体抗体の混液からなり、そしてそれらをサンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡに架橋し、ロゼットを形成する。Ｆｉｃｏｌｌで遠心した場合、標的細胞は遊離ＲＢＣと共にペレット化する。
【００５７】
枯渇混液における抗体の組み合わせが、どの細胞を除去するかを決定し、そして従ってどの細胞を回収するかを決定する。利用可能な抗体としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥ、およびＴＣＲαβが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、本発明において、肺腫瘍抗原に特異的なｍＡｂを産生し、そして同様の方式で使用し得ることが企図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂを磁気ビーズに結合するか、または４量体抗体複合体に処方し、そしてサンプルから転移性肺腫瘍細胞を濃縮または積極的に選択するために使用し得る。そのような系を使用して、異なる形態の肺癌、特にＮＳＣＬＣの腺癌形態および扁平上皮癌形態および小細胞癌由来の血液サンプルを、本明細書中で記載されたような本発明の複合ＰＣＲアッセイを用いて、循環腫瘍細胞の存在について評価し得る。
【００５８】
一旦サンプルが濃縮されるかまたは積極的に選択されると、細胞をさらに分析し得る。例えば、細胞を溶解し、そしてＲＮＡを単離し得る。ＲＮＡを、次いで、本明細書中で記載されたようなリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、肺腫瘍特異的複合プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析に供し得る。
【００５９】
本発明の別の局面において、細胞捕獲技術をリアルタイムＰＣＲと組み合わせて用いて、肺腫瘍抗原を発現する転移細胞を検出するためのより高感度なツールを提供し得る。
【００６０】
採用し得るさらに別の方法は、抗ガングリオシドＧＭ１／ＧＭ２細胞捕獲抗体系である。ガングリオシドは、細胞膜結合グリコスフィンゴ脂質であり、そのいくつかの種は、神経外胚葉および上皮由来のほとんどの癌、特に肺癌の細胞表面に過剰発現することが示された。ＧＭ２の細胞表面発現が、いくつかの型の肺癌、特にＳＣＬＣにおいて見られ、それは、モノクローナル抗体に基づく肺癌免疫治療のため、およびＧＭ１と組み合わせた捕獲方法として使用するための魅力的な標的である。
【００６１】
（プローブおよびプライマー）
上記で述べたように、および本明細書中でさらに詳細に記載するように、本発明による特定の方法、組成物およびキットは、肺癌の検出のために２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対を利用する。そのような核酸プローブの目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力が、それらを生物学的サンプルにおける相補的配列の存在を検出するのに有用であることを可能とする。
【００６２】
あるいは、他の実施形態において、本発明のプローブおよび／またはプライマーを、核酸ハイブリダイゼーションによる検出のために採用し得る。そういうものとして、検出されるポリヌクレオチドの１５ヌクレオチド長の連続する配列と同じ配列を有するか、またはそれと相補的である、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続する配列の配列領域を含む核酸部分が特に有用であると見出されることが企図される。より長い連続する同一配列または相補的配列（例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間の長さを含む）および全長配列までのものさえ）も、特定の実施形態において有用である。
【００６３】
検出されるポリヌクレオチドと同一の、またはそれに相補的な、１０−１４、１５−２０、３０、５０、または１００−２００ヌクレオチドくらいでさえの長さの（中間の長さも含む）連続的なヌクレオチドからなる配列領域を有するポリヌクレオチドプライマーが、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）のような増幅反応において使用するためのプライマーとして特に企図される。これは、例えば血液、リンパ節および骨髄のような、多様な生物学的サンプルにおいてポリヌクレオチドを分析することを可能にする。
【００６４】
約１５−２５ヌクレオチド長のプライマーの使用は、安定かつ選択的でもある２本鎖分子の形成を可能にする。ハイブリッドの安定性および選択性を増加させるために、そしてそれによって得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度を改善するために、１５塩基長より長い範囲で連続的な相補的配列を有する分子が一般的に好ましい。一般的に１５〜２５、または望ましい場合はより長い、連続的なヌクレオチドの遺伝子相補的な範囲を有するプライマーを設計することが好ましい。
【００６５】
プライマーを、検出されるポリヌクレオチドのあらゆる部分から選択し得る。必要なことは、プライマーとして利用することが求められる、約１５−２５ヌクレオチド長から全長配列までおよびそれを含む、本明細書中で示した例示的なポリヌクレオチドのような配列、またはその配列のあらゆる連続的な部分を検討することだけである。プライマー配列の選択は、種々の因子によって支配され得る。例えば、全配列の末端から末端へ向かったプライマーを採用することが望ましくあり得る。本明細書中で開示される例示的なプライマーを、配列番号１、３、５、７、２１および２６で示されたもののような、目的のポリヌクレオチド全体の相補的な範囲と選択的に２本鎖分子を形成する能力のために、必要に応じて使用し得る。
【００６６】
本発明はさらに、種々の例示的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列を提供し、それを、本明細書中でさらに詳細に記載するように、癌検出のために本発明の方法によって使用し得る。
【００６７】
本発明によるオリゴヌクレオチドプライマーを、例えば、通常自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて実施されるような化学的手段によってプライマーを直接合成する工程を包含する、当業者に通常利用可能な方法によって、日常的に容易に調製し得る。構想される適用に依存して、代表的には標的配列に対するプローブの選択性の程度を変化させるために、変動するハイブリダイゼーション条件を採用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用のために、代表的にはハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を採用することが望ましく、例えば約５０℃〜約７０℃の温度で約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩濃度によって提供されるような、比較的低塩および／または高温の条件が選択される。そのような選択的な条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間に、もしあるとしてもわずかなミスマッチしか許容せず、そして関連配列を単離するために特に適切である。
【００６８】
（ポリヌクレオチド増幅技術）
肺癌の検出に関して本明細書中で概略を述べた特定の実施形態はそれぞれ、１つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブのハイブリダイゼーションによる組織および／または腫瘍特異的ポリヌクレオチドの検出を共通に有する。生物学的サンプルに存在する相対的な癌細胞数および／または各肺癌細胞内のポリヌクレオチド発現レベルのような因子に依存して、検出工程を実施する前に増幅工程を実施することが好ましくあり得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて採用し、生物学的サンプルに由来する肺腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわちハイブリダイズする）。増幅したｃＤＮＡを、必要に応じて例えばゲル電気泳動のような分画工程に供し得る。
【００６９】
サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために、多くのテンプレート依存的プロセスが利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、それは米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号において詳細に記載される。簡単には、ＰＣＲＴＭにおいて、標的配列の反対の相補鎖の領域に相補的な２つのプライマー配列を調製する。過剰のデオキシヌクレオシド３リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑポリメラーゼ）と共に反応混合物に加える。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーは標的に結合し、そしてヌクレオチドを加えることによって、ポリメラーゼがプライマーを標的配列にそって伸長させる。反応混合物の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは標的から分離して反応産物を形成し、過剰なプライマーが標的および反応産物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順を行い得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法は、当該分野において周知である。
【００７０】
ポリヌクレオチド増幅のために好ましい１つの方法は、ＲＴ−ＰＣＲを採用し、ここでＰＣＲを逆転写と組み合わせて適用する。代表的には、ＲＮＡを血液、血清、リンパ節、骨髄、痰、尿および腫瘍生検サンプルのような生物学的サンプルから抽出し、そして逆転写してｃＤＮＡ分子を産生する。少なくとも１つの特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅はｃＤＮＡ分子を産生し、それを例えばゲル電気泳動を用いて分離および視覚化し得る。患者から、および癌に罹患していない個体から取った生物学的サンプルに対して増幅を行い得る。増幅反応を、２つの次数の程度に及ぶ、ｃＤＮＡのいくつかの希釈について行い得る。非癌性サンプルの同じ希釈と比較して、試験患者サンプルのいくつかの希釈における発現において、２倍またはそれより高い増加は、代表的には陽性とみなされる。
【００７１】
種々の市販で入手可能なキットのいずれかを使用して、増幅工程を行い得る。１つのそのような増幅技術は、インバースＰＣＲ（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６、１９８８を参照のこと）であり、これは制限酵素を使用して遺伝子の既知の領域にフラグメントを産生する。そのフラグメントを次いで分子内ライゲーションによって環状化し、そして既知の領域から得られた多岐にわたる（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プライマーと共にＰＣＲのテンプレートとして使用する。代替的なアプローチにおいて、部分的な配列に隣接する配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーと共に増幅することによって回収し得る。増幅した配列を、代表的には、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な２番目のプライマーと共に２回目の増幅に供する。既知の配列から反対の方向に伸長を始める２つのプライマーを採用する、この手順のバリエーションが、ＷＩＰＯ  国際特許出願番号ＷＯ９６／３８５９１に記載される。別のこのような技術は、「ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ）」または「ＲＡＣＥ」として知られる。この技術は、内部プライマーおよび外部プライマーの使用を包含し、それはポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズして、既知の配列の５’および３’である配列を同定する。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（ｃａｐｔｕｒｅ  ＰＣＲ）（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９、１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（ｗａｌｋｉｎｇ  ＰＣＲ）（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０、１９９１）が挙げられる。増幅を採用する他の方法も、全長ｃＤＮＡ配列を得るために採用し得る。
【００７２】
増幅のための別の方法は、欧州特許出願公開番号第３２０，３０８号において開示された、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲと呼ばれる）である。ＬＣＲにおいて、２つの相補的なプローブ対を調製し、そして標的配列の存在下で、各対が標的の反対の相補鎖に隣接するように結合する。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対は連結して単一の単位を形成する。ＰＣＲＴＭにおけるような温度サイクルによって、結合し、ライゲーションした単位は標的から分離し、そして次いで過剰なプローブ対のライゲーションのための「標的配列」として作用する。米国特許第４，８８３，７５０号は、プローブ対の標的配列への結合に関して、ＬＣＲと同様の代替の増幅方法を記載する。
【００７３】
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０において記載される、Ｑｂｅｔａレプリカーゼも、本発明においてさらに別の増幅方法として使用し得る。この方法において、標的の領域と相補的な領域を有するＲＮＡの複製可能な配列を、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに加える。ポリメラーゼは、複製可能な配列をコピーし、それを次いで検出し得る。
【００７４】
等温増幅方法も、本発明における核酸の増幅に有用であり得、この方法では、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の１つの鎖にヌクレオチド５’−［α−チオ］３リン酸を含む標的分子の増幅を達成する（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２）。
【００７５】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、核酸の等温増幅を行う別の方法であり、それは複数回の鎖置換および合成、すなわちニック翻訳を包含する。修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）と呼ばれる同様の方法は、本発明において有用であり得る別の増幅方法であり、そして増幅の標的となる領域全体でいくつかのプローブをアニーリングする工程を包含し、続いて４つの塩基のうち２つしか存在しない修復反応が続く。他の２つの塩基を、容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加し得る。同様のアプローチを、ＳＤＡにおいて使用する。
【００７６】
サイクリックプローブ反応（ＣＰＲ）を用いても配列を検出し得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’および５’配列ならびに標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部または「中間」配列を有するプローブが、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション時に、反応物をＲＮａｓｅＨで処理し、そして消化後に放出されるシグナルを産生することによって、プローブの産物を特有の産物として同定し得る。もとのテンプレートが別のサイクリングプローブにアニーリングし、そして反応が繰り返される。従って、ＣＰＲは、プローブの標的遺伝子特異的発現核酸へのハイブリダイゼーションによって産生されるシグナルを増幅する工程を包含する。
【００７７】
英国特許出願番号第２２０２３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される、さらに他の増幅方法を、本発明に従って使用し得る。前者の適用において、「修飾」プライマーを、ＰＣＲ様のテンプレートおよび酵素依存性合成において使用する。プライマーを、捕獲部分（例えばビオチン）および／または検出器部分（例えば酵素）で標識することによって修飾し得る。後者の適用において、過剰の標識プローブを、サンプルに添加する。標的配列の存在下で、プローブは結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列はインタクトで放出され、過剰のプローブによって結合される。標識プローブの切断は、標的配列の存在を示す。
【００７８】
他の核酸増幅手順としては、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲを含む、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ８８／１０３１５）が挙げられる。ＮＡＳＢＡにおいて、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離に関しては標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの熱変性、溶解緩衝液およびミニスピンカラムによる処理、またはＲＮＡの塩酸グアニジン抽出によって、核酸を増幅のために調製し得る。これらの増幅技術は、標的配列に特異的な配列を有するプライマーをアニーリングする工程を包含する。ポリマー化に続いて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮａｓｅＨで消化し、一方２本鎖ＤＮＡ分子を再び熱変性させる。いずれの場合においても、１本鎖ＤＮＡは、２番目の標的特異的なプライマーの添加、続くポリマー化によって完全に２本鎖になる。次いでこの２本鎖ＤＮＡ分子を、Ｔ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって転写し、増加させる。等温循環反応において、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、そして再びＴ７またはＳＰ６のようなポリメラーゼによって転写される。生じた産物は、切断されたか、または完全であるかのいずれにせよ、標的特異的配列を示す。
【００７９】
欧州特許出願公開番号第３２９，８２２号は、１本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の周期的な合成を含む核酸増幅プロセスを開示し、それは、本発明によって使用され得る。ｓｓＲＮＡは、最初のプライマーのオリゴヌクレオチドに対する最初のテンプレートであり、これは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される。次いで、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの２本鎖におけるＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって、ＲＮＡを、生じたＤＮＡ：ＲＮＡ２本鎖から除去する。生じたｓｓＤＮＡは、２番目のプライマーに対する２番目のテンプレートであり、それは、そのテンプレートに対する相同性に対して５’に、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列も含む。このプライマーは次いでＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」フラグメントによって例示される）によって伸長され、プライマー間の元のＲＮＡの配列と同じ配列を有し、そしてさらに１つの末端においてプロモーター配列を有する、２本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子を生じる。このプロモーター配列を適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用して、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製し得る。これらのコピーを次いで周期に再び入れて、非常に迅速な増幅を引き起こし得る。酵素の適切な選択によって、この増幅を各周期で酵素を添加することなく等温で行い得る。このプロセスの周期的性質のために、開始配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡいずれかの形式であるよう選択し得る。
【００８０】
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０６７００は、標的１本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）に対するプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、続く配列の多くのＲＮＡコピーの転写に基づいた核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは循環しない、すなわち新しいテンプレートは、生じたＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法としては、当業者に周知である、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）、および「ワンサイドＰＣＲ（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲ）」（Ｏｈａｒａ、１９８９）が挙げられる。
【００８１】
（癌検出のための組成物およびキット）
本発明はさらに、上記の診断方法のいずれかで使用するためのキットを提供する。このようなキットは、代表的には診断的アッセイを行うために必要な２つまたはそれ以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、キット中の１つの容器は、肺腫瘍タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントを、上記で記載したように支持材料に結合して提供し得る。１つまたはそれ以上のさらなる容器が、試薬または緩衝液のような、アッセイで使用する要素を封入し得る。このようなキットはまた、またはあるいは、抗体結合の直接的または間接的検出に適したリポーター基を含む、上記で記載したような検出試薬を含み得る。
【００８２】
本発明はまた、本発明の検出方法を実施するために適したキットを提供する。例示的なキットは、オリゴヌクレオチドプライマー対を含み、それらのそれぞれ１つは別のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。特定の実施形態において、本発明によるキットはまた、核酸ポリメラーゼおよび適した緩衝液を含み得る。本発明のキットに適した例示的なオリゴヌクレオチドプライマーが、本明細書中で開示される。本発明のキットに適した例示的なポリヌクレオチドが、本明細書中で開示される。
【００８３】
あるいは、生物学的サンプルにおいて、肺腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために、キットを設計し得る。このようなキットは一般的に、上記で記載したような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含み、それは肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。そのようなオリゴヌクレオチドを、例えばＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用し得る。そのようなキットに存在し得るさらなる構成要素は、肺腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を促進するために、２番目のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬または容器を含む。
【００８４】
他の関連する局面において、本発明はさらに、本明細書中で開示される方法において有用な組成物を提供する。例示的な組成物は、２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、それらのそれぞれ１つは別のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。本発明の組成物に適した例示的なオリゴヌクレオチドプライマーが、本明細書中で開示される。本発明の組成物に適当な、典型的なポリヌクレオチドが、本明細書中で開示される。
【００８５】
以下の実施例が、限定のためではなく、例証のために提供される。
【実施例】
【００８６】
（実施例１）
（肺腫瘍の複合検出）
４つの肺癌特異的遺伝子：Ｌ７６２（配列番号１）、Ｌ９８４（配列番号３）、Ｌ５５０（配列番号５）、およびＬ５５２（配列番号７）の発現を同時に検出するために、複合リアルタイムＰＣＲアッセイを確立した。単一の肺癌特異的遺伝子の発現分析に依存する検出アプローチと対照的に、この複合アッセイは試験した全ての肺腫瘍サンプルを検出し、そして腺癌、扁平上皮癌、小細胞および大細胞肺腫瘍における、それらの合わせたｍＲＮＡ発現プロファイルを分析することができた。Ｌ５５２ＳおよびＬ５５０Ｓは、主に腺癌の検出においてお互いに補完し、Ｌ７６２Ｓは、扁平上皮癌を検出し、そしてＬ９８４Ｐは小細胞癌を検出する（表１を参照のこと）。
【００８７】
ゲノムＤＮＡとのあらゆる反応性を完全に除去するために、プライマーおよびプローブはイントロンを貫くように設計し（エキソン特異的）、そのためＤＮＡアーゼでｍＲＮＡサンプルを処理する必要がなく、血液サンプルにおいて使用するために適切であった。それらをまた、必要な場合、最終産物のゲル分別を可能にするために、異なるサイズの単位複製配列を生成するよう設計した。
【００８８】
アッセイを、以下のように行った：Ｌ５５２Ｓ（配列番号７）、Ｌ５５０（配列番号５）、Ｌ７６２（配列番号１）、Ｌ９８４（配列番号３）、および特異的プライマー、および特異的Ｔａｑｍａｎプローブを使用して、肺腫瘍におけるそれらの組み合わせたｍＲＮＡ発現プロファイルを分析した。そのプライマーおよびプローブを以下に示す：
Ｌ５５２Ｓ：フォワードプライマー（配列番号９）：５’ＧＡＣＧＧＣＡＴＧＡＧＣＧＡＣＡＣＡＣＡ。リバースプライマー（配列番号１０）：５’ＣＣＡＴＧＴＣＧＣＧＣＡＣＴＧＧＧＡＴＣ。プローブ（配列番号１１）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＣＴＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡ。
【００８９】
Ｌ５５０Ｐ：フォワードプライマー（配列番号１２）：５’ＧＧＣＣＡＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＴＴＣ。リバースプライマー（配列番号１３）：５’ＧＡＡＧＡＡＴＣＣＡＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣ。プローブ（配列番号１４）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＣＣＡＣＡＡＡＣＣ。
【００９０】
Ｌ７６２Ｓ：フォワードプライマー（配列番号１５）：５’ＡＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＴＣ。リバースプライマー（配列番号１６）：５’ＴＴＣＡＡＣＣＡＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＡ。プローブ（配列番号１７）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）ＴＣＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧＡＧＣＣＣ。
【００９１】
Ｌ９８４Ｐ：フォワードプライマー（配列番号１８）：５’ＴＴＡＣＧＡＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＣ。リバースプライマー（配列番号１９）：５’ＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＣＴＧＡＣＡＡ。プローブ（配列番号２０）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＣＣＡＧＧＣＣＧＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＣＣ。
【００９２】
アッセイ条件は、以下のようであった：
Ｔａｑｍａｎ  プロトコール（７７００  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）：
２５μｌの最終容量において：１×緩衝液Ａ、５ｍＭのＭｇＣｌ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＵＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．０１Ｕ／μｌのＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ、０．０３７５Ｕ／μｌのＴａｑＧｏｌｄ、８％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．０５％（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ）、ゼラチン、０．０５％（ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ）、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％  ｖ／ｖ（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ７６２Ｐのフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ３００ｍＭ、（Ｌ５５２Ｓ、Ｌ９８４Ｐ、Ｌ５５０Ｓ、Ｌ９８４Ｐ）からフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ５０ｍＭ、各遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｌ５５２Ｓ、Ｌ５５０Ｓ、Ｌ９８４Ｐ）をそれぞれ２ｐｍｏｌ、およびテンプレートｃＤＮＡ。ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、および６８℃で１分間を５０サイクル行った（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＯ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。
【００９３】
複合アッセイにおいて各プライマーのセットは固有の長さのバンドを生じるので、目的の４つの遺伝子の発現シグナルを、アガロースゲル分析によって個々に測定した。４つの遺伝子全ての組み合わせた発現シグナルも、ＡＢＩ  ７７００  Ｐｒｉｓｍ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）においてリアルタイムで測定し得る。特定のプライマーを本明細書中で記載したが、異なるプライマー配列、異なるプライマーまたはプローブ標識および異なる検出システムを、この複合アッセイを行うために使用し得る。例えば、２番目の蛍光発生リポーター色素を、リアルタイムＰＣＲによる参照遺伝子の同時検出のために組み込み得る。または、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ検出システムを、Ｔａｑｍａｎプローブアプローチの代わりに使用し得る。表２は、異なる肺腫瘍型および正常肺組織での複合ＰＣＲの反応性を示す。
【００９４】
（表２  肺腫瘍および正常肺における肺癌複合遺伝子（Ｌ７６２Ｐ、Ｌ５５２Ｓ、Ｌ５５０Ｓ、Ｌ９８４Ｐ）の発現）
【００９５】
【表２】
2006521110.tif 000003
カットオフ値＝平均正常肺＋３ＳＤ＝０．９０１
＊１つの試料はカットオフ上
（実施例２）
（肺腫瘍の複合検出）
認められた肺抗原：Ｌ７６２（配列番号１）、Ｌ９８４（配列番号３）、Ｌ５５０（配列番号５）、Ｌ５５２（配列番号７）、Ｌ７６３（配列番号２１）、およびＬ５８７（配列番号２６）の様々な組み合わせの発現を同時に検出するために、６つのさらなる複合リアルタイムＰＣＲアッセイを確立した。上記６つの群は以下からなる：
群１：Ｌ７６２、Ｌ５５２、Ｌ５５０およびＬ９８４
群２：Ｌ７６３、Ｌ５５２、Ｌ５５０およびＬ９８４
群３：Ｌ７６３、Ｌ５５２、Ｌ５８７およびＬ９８４
群４：Ｌ７６３、Ｌ５５０、Ｌ５８７およびＬ９８４
群５：Ｌ７６３、Ｌ５５０およびＬ５８７
群６：Ｌ７６２、Ｌ９８４、Ｌ５５０およびＬ５８７
上記の実施例１で記載したアッセイを行って、肺腫瘍における組み合わせたｍＲＮＡ発現プロファイルを分析した。Ｌ５５２Ｓ、Ｌ５５０Ｐ、Ｌ７６２Ｓ、Ｌ９８４Ｐのプライマーおよびプローブは、実施例１で記載した通りである。Ｌ７６３およびＬ５８７のプライマーおよびプローブを、以下に記載する：
Ｌ７６３Ｓ：フォワードプライマー（配列番号２３）：５’ＡＴＴＣＣＡＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴ。リバースプライマー（配列番号２４）：５’ＧＴＴＴＡＴＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡ。プローブ（配列番号２５）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＴＧＴＧＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＴＡＧＧＣＡＣＴＣＣ。
【００９６】
Ｌ５８７：フォワードプライマー（配列番号２８）：５’ＣＣＣＡＧＡＧＣＴＧＴＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＣ。リバースプライマー（配列番号２９）：５’ＧＴＴＡＡＧＣＧＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＡ。プローブ（配列番号３０）（ＦＡＭ−５’−３’−ＴＡＭＲＡ）：ＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＣＣＧＴＡＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＣＣ。
【００９７】
６つの複合アッセイを構成する肺抗原は、試験した全ての肺腫瘍サンプルを検出することができ、そして腺癌、扁平上皮癌、小細胞および大細胞肺腫瘍におけるそれらの組み合わせたｍＲＮＡ発現プロファイルを分析した。これらのアッセイの結果を表３に示す。
【００９８】
（表３  肺腫瘍および正常肺における、肺癌複合遺伝子の発現）
【００９９】
【表３−１】
2006521110.tif 000004
【０１００】
【表３−２】
2006521110.tif 000005
カットオフ値（ＣＯ）＝平均正常肺＋３ＳＤ
群１、４および６を用いた複合アッセイを次に使用して、種々の型の処置を受けている１７人の肺癌患者由来の末梢血液サンプルにおいて、循環腫瘍細胞を検出した。さらに、肺抗原Ｌ５２３（配列番号３１）を用いた単一遺伝子アッセイを、配列番号３３および３４において記載したプライマーを用いて同時に行った。６人の正常なドナーをコントロールとして含めた。アッセイを、上記の実施例１で記載したように行った。アッセイにおける検出のカットオフ値は、正常肺サンプルの平均＋３標準偏差である。
【０１０１】
群１抗原は、試験した５／１７サンプル中で検出された。群４抗原は、４／１７サンプル中で検出され、そして群６抗原は８／１７サンプル中で検出された。Ｌ５２３は、試験した７／１７サンプル中で単一遺伝子として検出された。群６の抗原の組み合わせが、試験した群の組織および血液における肺腫瘍検出に対して最も感受性が高かった。
【０１０２】
前述のものから、本発明の特定の実施形態が説明の目的のために本明細書中で記載されたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変をし得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外に制限されない。
【配列表】
2006521110.tif 000006
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2006521110.tif 000017
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2006521110.tif 000019
2006521110.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月17日(2006.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006521110000001.app
【国際調査報告】
2006521110.tif 000021
2006521110.tif 000022