(57)【要約】本発明は、バニラエキスの製造方法に関するものであり、この方法は、バニラの緑色の豆を、加速褐変と、これに続く抽出／酵素処理に付すことに本質がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バニラエキスの製造方法であって、以下の工程：
ａ）豆の褐変；
ｂ）豆の抽出と、これに続くセルラーゼ及びヘミセルラーゼ活性を伴う酵素系での処理；
ｃ）バニリンに富んだ濃縮物への生成物の精製
を含む方法。
【請求項２】
豆の褐変が、−１０〜−３０℃の範囲の温度での凍結と２°〜８℃の範囲の温度での融解とのサイクルを利用して行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
豆の褐変が、６０°〜６５℃の範囲の温度での水中熱処理と、これに続く１５°〜４５℃の範囲の温度でのインキュベーションとのサイクルを利用して行われる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
抽出が、２０〜８０％v/vの範囲のアルコール度の水性エタノール溶液で、室温〜８０℃の範囲の温度で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
抽出が、４０〜６０％v/vの範囲のアルコール度の水性エタノール溶液で、６０°〜７０℃の範囲の温度で行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
酵素処理が、エキスを２０００〜６０００IU/gの範囲のセルラーゼ活性を有する酵素と接触させることにより行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
３０００〜５０００IU/gの範囲の活性を持つ酵素が使用される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
４０００IU/gのセルラーゼ活性を持つ酵素が使用される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
酵素が、生豆に基づき０．０５〜０．４％の範囲の濃度で使用される、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
反応が、２５℃〜５０℃の範囲の温度で、２０〜７２時間の範囲の時間行われる、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
精製（工程ｂ）が、室温〜５０℃の範囲の温度で操作する、水性軟エキスの、又は、酵素処理エキスのエタノール希釈により得られる５０％v/v水性アルコール溶液の浄化のための、種々のアルコール度の水−エタノール溶液での一連の処理を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バニラ香料の新規な製造方法に関する。
【０００２】
バニラ香料は、Vanilla planifoliaというランの豆に含まれる、有機物質のバランスのとれた混合の成果である。
【０００３】
更に具体的には、主化合物のバニリンは、豆の成熟中にそのグルコシル化前駆体（グルコバニリン）から出発して、豆に存在する酵素による自然の酵素加水分解によって生成する。
【０００４】
よって従来のバニリンの抽出方法は、キュアリング期間を必要とするが、これは、長時間（収穫地に応じて、１〜５ヶ月）、多数の長期にわたる品質管理を要し、かつ環境条件に深く影響を受ける。結果として、このやり方は、最終生成物の顕著なばらつき及びバニリン含量の部分的消失を伴う。したがってこの方法は、工業的観点から非常に高くつく。
【０００５】
EP 0,555,466は、伝統的キュアリングに代わる方法を開示しており、この方法は、ヒドロラーゼ酵素（セルラーゼ、ペクチナーゼ、β−グルコシダーゼ）による適切に粉砕された緑色の豆の処理に本質があり、そしてこれらの酵素は、豆の植物組織を溶解して、活性成分の抽出を促進することにより、また一方放出されたグルコバニリンをバニリンへと加水分解することの両方により作用する。
【０００６】
本発明は、バニラエキスの製造方法に関するものであり、そしてこの方法は、バニラの緑色の豆を、抽出と、それに続く全体的な高溶解活性を持つ酵素系による生じたエキスの酵素溶解との複合処理に付すこととに本質がある。
【０００７】
本発明により、本製造法は、時間（数ヶ月という長さのインキュベーション）及び環境の両方に関して、現在知られている工業的製造法の制限がなく、同時にバニリンに富んだ濃縮生成物を高収率で提供する。よって本発明の方法は、容易さ、短さ、再現性及び収率に関して、既知の方法と比較して著しい利点を伴う。
【０００８】
本発明の方法は以下の工程：
ａ）豆の褐変の加速；
ｂ）褐変した豆の抽出と、これに続くセルラーゼ及びヘミセルラーゼ活性を含む酵素系での処理；
ｃ）バニリンに富んだ濃縮物を得るための生成物の精製
を含む。
【０００９】
豆の加速褐変である工程ａ）は、−１０°〜−３０℃の範囲の温度での緑色の豆の凍結と、これに続いての、目的の温度を達成するのに必要な時間（この時間は、通常０．５〜７日間の範囲である）遮光しての２°〜８℃の範囲の温度（好ましくは４℃）での融解とに本質がある。
【００１０】
あるいは、豆の加速褐変である工程ａ）は、緑色の豆を６０°〜６５℃の範囲の温度で水に３分間浸漬することによる緑色の豆の水中での熱処理と、これに続く１５°〜４５℃の範囲の温度（更に好ましくは３０℃）での褐色化を発現させるのに必要な通常０．５〜７日間の範囲の時間のこれらのインキュベートとに本質がある。
【００１１】
抽出は、２０〜８０％v/v（好ましくは４０〜６０％v/v）の濃度の水−エタノール溶液により、室温〜８０℃（好ましくは６０℃〜７０℃）の温度で、７０〜１００分間の抽出時間で、褐色の粉砕豆に直接行われる。次に生じたエキスを、約３５〜約２５％w/wの全固形分になるまで蒸発させる。次にこの濃縮物を、５〜２０％w/wの範囲の全固形分になるまで水で希釈して、酵素処理に付す。
【００１２】
本発明に使用される酵素系は、２０００〜６０００IU/g、好ましくは３０００〜５０００IU/gの範囲の、最も好ましくは４０００IU/gの顕著なセルラーゼ活性を特徴とする。この酵素系は、先行技術に引用される酵素（しばしば異なる型の複合混合物として使用される）とは、その全体的な高溶解活性において異なっており、このため、生豆に基づき０．１〜０．３％又はそれ以下という非常に低濃度の使用さえ可能になっている。このことは疑いもなく、工業的実現可能性及び費用に関する範囲だけでなく、得られる生成物の再現性にとっても利点である。
【００１３】
バニリンを放出させる酵素溶解は、非無菌環境で、スターラー（例えば、錨型スターラー）を取り付けたサーモスタット付きのタンク中で、連続的に穏やかに撹拌しながら又は静止状態で、あるいは間欠的に撹拌しながら行うことができる。本反応は、２５℃〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃の範囲の温度で、２０〜７２時間、好ましくは２４〜４０時間の範囲の時間行われる。生材料に基づき０．０５〜０．４％（好ましくは０．１〜０．３％）に相当する量の、２０００〜６０００IU/gのセルラーゼ活性を持つ酵素が加えられる。この混合物のｐＨは、３．５〜５．５、好ましくは４〜５の範囲であってよい。変換は、ＴＬＣ又はＨＰＬＣによりモニターすることができ、そして目的の成分の相当な増加が観測されるまで行われる。
【００１４】
精製（工程ｂ）は、最終的には、室温〜５０℃の範囲の温度で操作する、種々のアルコール度の水性エタノール溶液での、又は５０％v/v水性エタノール溶液での処理による、酵素処理エキスをエタノールで希釈することにより得られる水性軟エキスの精製を伴う。得られる水性エタノール画分を合わせて、＋４５℃以下の温度で真空下で濃縮することにより、粘性の水性濃縮物が得られる。
【００１５】
得られる生成物は、少量の濃エタノールを用いて更に精製することができる。
【００１６】
更に濃縮及び精製された生成物は、酢酸エチルでの抽出又はアルコール混合物での置換のような、更なる精製処理を利用して得ることができる。
【００１７】
バニリン含量についての中間段階及び最終生成物の分析は、ＴＬＣ及びＨＰＬＣにより行うことができる。
【００１８】
適切には、シリカゲル６０Ｆ２５４プレート（メルク（Merck））、溶出系：８５：１５のクロロホルム−メタノール、２５４nmでのＵＶ検出；続く反応性ＣＡＳ（硫酸アンモニウムセリウム二水和物、モリブデン酸アンモニウム四水和物、濃硫酸）との反応及び可視光下でのバンドの観察を用いる、ＴＬＣ分析が行われる。
【００１９】
ＨＰＬＣ分析は、適切にはゾルバックス・エクリプス（Zorbax Eclipse）ＸＤＢ−Ｃ１８（登録商標）カラム（２５０×４．６mm）５μmを用いて、０．３％  Ｈ3ＰＯ4／アセトニトリルの９５：５〜１０：９０線形勾配中で、流量１ml/分、λ  ２５４nm、ランタイム５５分で実施することができる。
【００２０】
中間体及び最終生成物の全固形分の測定は、便利には試料のアリコートを＋１０５℃のオーブン中で１５時間インキュベートすることにより行うことができる。あるいは、分析温度を＋１０５℃に設定した水分計（例えば、ザルトリウス（Sartorius）のモデルＭＡ１００）を使用することができる；試料の全固形分パーセントは、１mg/６０秒未満の減量が記録されるとき測定する。
【００２１】
エキスの品質は、感覚検査、及びＵＳＰ２６／ＮＦ２０＜１０６１＞によるＬ*、ａ*、ｂ*、ＹＩＥ３１３座標（ＣＩＥＬＡＢ座標）の測定による機器分析の観点の両方から評価される。最終生成物のＣＩＥＬＡＢ色座標は、適切には比色計（例えば、ハンターラブ（HunterLab）のモデル、カラーフレックス（ColorFlex））で測定することができる。最終生成物の色は、５０％v/vエタノールを希釈剤として用いて、全固形分の５．０％w/wの希釈液で測定する。
【００２２】
本発明の方法により得られる最終生成物は、出発材料の緑色の豆１kgにつき４．２〜８．５ｇのバニリン含量であり、そして先行技術の方法で得られる生成物よりも優れた官能的特性を持つ。
【００２３】
本発明の方法は、以下の実施例において更に詳細に例証される。
【００２４】
実施例１
１）抽出
緑色の豆を−２０℃で凍結して、４℃の温度にして７日間保持し（褐変豆；１３９kg、１．１９％w/wのバニリングルコシド及び０．１０％w/wのバニリン含量である）、次に４．５mm格子により粉砕してパーコレーターに装填した。この植物材料を５０％v/vエタノールで徹底的に抽出した。最初の抽出は、５０％v/vアルコール度の溶液を得るために、豆の含水率（約８０％w/w）に基づいて算出した量（即ち、１２４リットル）の９５％v/vエタノールで行った。続いての抽出（全部で８回）は、粉砕植物材料の重量（kgで表現）に相当する容量（即ち、１３９リットル）の５０％v/vエタノール（リットルで表現）で実施した。各抽出は、＋７０℃の温度で、かつ９０分間の接触時間で行った。得られた水性エタノール浸出液をプールして、真空下で＋３０℃で濃縮することにより、粘性の軟濃縮物を得て（３６kg、２７％w/w全固形分）、これをエタノールの添加により安定化させて、２０％v/vアルコール度（含水量から算出される％）を得て、生物学的変換に使用するまで＋４℃で貯蔵した。
【００２５】
２）酵素変換
生物学的変換の前に、水による２回置換を利用して、存在するエタノールを中間濃縮物から除去した。生じた濃縮物を水で希釈することにより、１０％全固形分溶液を得た。この溶液に、酵素のセルロシン（Cellulosin）ＡＣ４０（ＨＢＩ酵素社（HBI Enzymes Inc.））を、粉砕植物材料に基づき約０．２％w/wの量で加えた。この生物変換反応（２５０リットル反応器中の９５リットルの反応混合物）は、穏やかな撹拌下＋４０℃で４８時間行った。変換の終了後、この懸濁液を真空下で＋３０℃で濃縮して、エタノールの添加（存在する水に基づき２０％v/v）により安定化させて、乾燥残渣９．４kgを含む２９kgの軟残渣を得た。
【００２６】
３）浄化（depuration）
２０％v/v水−エタノール濃縮物を９５％v/vエタノールで希釈することにより、５０％v/vエタノールの水−アルコール溶液を得た（存在する水に基づく％）。この希釈混合液を撹拌下＋４５℃で約１時間保持し、次に室温で沈降させ、最後に濾過した。この濾過残渣を水にとって、＋４５℃でホモジェナイズし、エタノールで６０％v/vアルコール度まで希釈して、室温で一晩沈降させた。この水−アルコール溶液を次に濾過した。水−アルコール溶液を合わせて、真空下＋４５℃の温度で粘性の水性濃縮物が得られるまで濃縮した。温度を＋４５℃に保持しながら撹拌下、９５％v/vエタノールを、均質になるまで、そしてとにかく２０％v/v以上の最終アルコール度に達するまで加えた。
【００２７】
本製造法では、加工植物材料１kgにつき６．２９ｇのバニリンを得たが、これは植物材料について算出した全バニリンの９３．７％に対応する（遊離バニリンとグルコシド結合バニリンの合計として、植物材料１kgにつき６．７２ｇ）。
【００２８】
実施例２
１）抽出
緑色の豆（１９８．６ｇ、１．１２％w/wのバニリングルコシド及び０．０５％w/wのバニリン含量である）を＋６０℃に予熱した水中で３分間浸漬した。水中での熱処理後、この豆を＋３０℃で５日間インキュベートしたが、この間、植物材料は暗褐色になった。インキュベーションの終了後、観測される減量は１６％であった。褐変豆（１６６．７ｇ）を粉砕し、５０％v/vアルコール度（９５％v/vエタノール１４７mlの添加により得られる）に調整して、加熱ジャケット式パーコレーターに入れた。この植物材料を５０％v/vエタノールで徹底的に抽出した。各抽出（全部で９回）には５０％v/vエタノール５５０mlを使用した。各抽出は、＋７０℃の温度で、かつ１００分間の接触時間で行った。生じた水性アルコール浸出液を合わせて、真空下で＋４５℃で濃縮することにより、粘性の軟濃縮物を得た（３３．１ｇ、３６．４％w/w全固形分）。
【００２９】
２）酵素変換
生じた濃縮物を、２０％w/w全固形分溶液が得られるまで水で希釈した。この溶液に、酵素のセルロシンＡＣ４０（ＨＢＩ酵素社）を、粉砕植物材料に基づき約０．２％w/wの量で加えた。この生物変換反応は、穏やかな撹拌下＋４０℃で７２時間行った。
【００３０】
３）浄化
変換の終了後、アルコール度を５０％v/vに調整するための量の９５％v/vエタノールの添加により、反応をクエンチした。このエキスを真空下で＋４５℃で約１時間濃縮することにより、粘性の軟残渣を得た。３３．９％w/wの全固形分を含むエキス２６．９ｇを得た。
【００３１】
本製造法では、加工植物材料１kgにつき５．０６ｇのバニリンを得たが、これは植物材料について算出した全バニリンの８５．５％に対応する（遊離バニリンとグルコシド結合バニリンの合計として、植物材料１kgにつき５．９２ｇ）。
【００３２】
実施例３
１）抽出
凍結した緑色の豆（２１１７ｇ、１．１９％w/wのバニリングルコシド及び０．１０％w/wのバニリン含量である）を、＋４℃の温度で０．５日間保持した。インキュベーション（この間、植物材料は融解して暗褐色になった）の終了後、観測される減量は７．６％であった。褐変豆（２００６ｇ）を４．５mm格子により粉砕して、９５％v/vエタノール１８００mlを加えて、室温でパーコレーターに入れた。この植物材料を８０分間抽出し、次に最初の抽出液を回収した。この植物材料を５０％v/vエタノールで徹底的に抽出した。続いての抽出（全部で５回）は、粉砕植物材料の重量（kgで表現）に相当する容量（即ち、２リットル）の５０％v/vエタノール（リットルで表現）で行った。各抽出は、室温で８０分間の接触時間で行った。生じた水性アルコール浸出液をプールして、真空下で＋４５℃で濃縮することにより、粘性の軟濃縮物を得た（２６５ｇ、５３．８％w/w全固形分）。
【００３３】
２）酵素変換
得られた濃縮物を水で希釈することにより、２０％w/w全固形分溶液を得た。この溶液に、酵素のセルロシンＡＣ４０（ＨＢＩ酵素社）を、粉砕植物材料に基づき約０．２％w/wの量で加えた。この生物変換反応は、穏やかな撹拌下＋５０℃で４７時間行った。変換の終了後、アルコール度を５０％v/vに調整するための量の９５％v/vエタノールの添加（mlで表現される添加容量は、ｇで表現される反応混合物の重量の０．８９倍に相当する）により、反応をクエンチした。
【００３４】
３）浄化
希釈混合液を撹拌下＋４５℃で約１時間保持し、次に室温で沈降させ、最後に濾過した。この濾過残渣を水にとって、＋４５℃でホモジェナイズし、エタノールで６０％v/vアルコール度まで希釈して、室温で一晩沈降させた。最後にこの水性アルコール溶液を濾紙により濾過した。水性アルコール溶液を合わせて、真空下＋４５℃の温度で粘性の水性濃縮物が得られるまで濃縮した。温度を＋４５℃に保持しながら撹拌下、９５％w/wエタノールを、均質になるまで、そしてとにかく２０％v/v以上の最終アルコール度に達するまで加えた。
【００３５】
本製造法では、加工植物材料１kgにつき６．４５ｇのバニリンを得たが、これは植物材料について算出した全バニリンの７２．０％に対応する（遊離バニリンとグルコシド結合バニリンの合計として、植物材料１kgにつき８．９６ｇ）。
【００３６】
実施例４
１）抽出
緑色の豆を−２０℃で凍結して（３５０kg、１．３２％w/wのバニリングルコシド及び０．１０％w/wのバニリン含量である）、４．５mm格子により粉砕してパーコレーターに入れた。この粉砕植物材料を５０％v/vエタノールで徹底的に抽出した。最初の抽出は、５０％v/vアルコール度の溶液を得るために、豆の含水率（約８０％w/w）に基づいて算出した量（即ち、３１１リットル）の９５％v/vエタノールで行った。続いての抽出（全部で８回）は、粉砕植物材料の重量（kgで表現）に相当する容量（即ち、３５０リットル）の５０％v/vエタノール（リットルで表現）で実施した。各抽出は、＋７０℃の温度で、かつ９０分間の接触時間で行った。生じた水−アルコール浸出液を合わせて、真空下で＋３０℃で濃縮することにより、粘性の軟残渣を得て（９２．５kg、２６．３％w/w全固形分）、これをエタノールの添加により安定化させて、２０％v/vアルコール度（存在する水から算出される％）を得て、生物変換反応に使用するまで＋４℃で貯蔵した。
【００３７】
２）酵素変換
生物学的変換の前に、水による２回置換を利用して、存在するエタノールを中間濃縮物から除去した。生じた濃縮物を水で希釈することにより、１０％全固形分溶液を得た。この溶液に、酵素のセルロシンＡＣ４０（ＨＢＩ酵素社）を、粉砕植物材料に基づき約０．２％w/wの量で加えた。この生物変換反応（１０００リットル反応器中の２４０リットルの反応混合物）は、穏やかな撹拌下＋４０℃で４４時間行った。変換の終了後、この懸濁液を真空下で＋３０℃で濃縮して、エタノールの添加（存在する水に基づき２０％v/v）により安定化させて、乾燥残渣２４kgを含む６３kgの軟濃縮物を得た。
【００３８】
３）浄化
２０％v/v水性アルコール濃縮物を９５％v/vエタノールで希釈することにより、５０％v/v水性アルコール溶液を得た（含水量に基づく％）。この希釈混合物を撹拌下＋４５℃で約１時間保持し、次に室温で沈降させ、最後に濾過した。この濾過残渣を水にとって、＋４５℃でホモジェナイズし、エタノールで６０％v/vアルコール度まで希釈して、室温で一晩沈降させた。この水−アルコール溶液を次に濾過した。水性アルコール溶液を合わせて、真空下＋４５℃の温度で粘性の水性濃縮物が得られるまで濃縮した。温度を＋４５℃に保持しながら撹拌下、９５％v/vエタノールを、均質になるまで、そしてとにかく２０％v/v以上の最終アルコール度に達するまで加えた。
【００３９】
本製造法では、加工植物材料１kgにつき６．９６ｇのバニリンを得たが、これは植物材料について算出した全バニリンの９４％に対応する（遊離バニリンとグルコシド結合バニリンの合計として、植物材料１kgにつき７．４０ｇ）。
【００４０】
実施例５（比較実施例−EP 0,555,466法）
緑色の豆（２２０kg、１．２４％w/wのバニリングルコシド及び０．１０％w/wのバニリン含量である）を４．５mm格子により粉砕した。
【００４１】
１０００リットルのパーコレーターに、酵素のセルロシンＡＣ４０（ＨＢＩ酵素社）を植物材料に基づき約０．２％w/wの量で含む、粉砕植物材料の重量（kgで表現）の２倍に相当する水量（即ち、４４０リットル）（リットルで表現）を装填した。粉砕植物材料を、再循環システムを取り付けたこのパーコレーターに入れた。生物変換反応は、＋４０℃で２４時間行った。
【００４２】
反応混合物を浸出して、浸出液（５０６kg）に９５％v/vエタノール５００リットルを加えることにより、５０％v/vエタノール溶液を得た。この植物材料を５０％v/vエタノールで＋７０℃で連続して徹底的に抽出することにより、それぞれ２００リットルの水性エタノール画分５個を得た（全部で１０００リットル）。
【００４３】
２つ（水性及び水性アルコール性）の浸出液を別々に保持して、約３０℃の温度で真空下で濃縮した。次に、存在する水に基づき２０％v/vアルコール度に達するまで各濃縮物にエタノールを加えた。
【００４４】
以下の濃縮物を得た：
１．  水性抽出液からの水−エタノール濃縮物（乾燥残渣１０kgを含む３７．４kg）
２．  水−エタノール抽出液からの水−エタノール濃縮物（乾燥残渣３．５kgを含む３０．６kg）
【００４５】
生じた生成物を混合して、溶媒の留去により濃縮した。
【００４６】
本製造法では、加工植物材料１kgにつき４．２９ｇのバニリンを得たが、これは植物材料について算出した全バニリンの６１．３％に対応する（遊離バニリンとグルコシド結合バニリンの合計として、植物材料１kgにつき７．００ｇ）。
【００４７】
実施例６
１）最終生成物の全固形分の測定
実施例１〜５からの各軟エキスについて、以下の手順にしたがった。：各エキスの約１ｇアリコートをプレート（ガラス繊維フィルターを取り付けた）に均質に分散させ、水分計で正確に秤量した；加熱プログラムを＋１０５℃に設定して、試料の減量を時間の関数として記録した；試料重量は、その減量速度が１mg/６０秒未満であれば一定であると考えた；全固形分パーセント（ＴＳ％）は、開始重量に対する最終重量の比として算出した。
【００４８】
実施例１〜５の生成物についての記録値は、下記表１に報告した：
【００４９】
【表１】
2006513720.tif 000002
【００５０】
２）ＣＩＥＬＡＢ色座標の測定
実施例１〜５からの各抽出液のアリコートを５０％v/vエタノールで希釈することにより、５．０％w/w全固形分を含む溶液を得た。この溶液を比色計（ハンターラブのモデル、カラーフレックス）で分析することにより、ＵＳＰ２６／ＮＦ２０＜１０６１＞によるＬ*、ａ*、ｂ*、ＹＩＥ３１３座標を測定した。
【００５１】
３）最終生成物の官能分析
実施例１〜５からの各抽出液のアリコートを５０％v/vエタノールで希釈することにより、１．０％w/wのバニリン含量である溶液を得た（ＨＰＬＣ測定法）；各水性エタノール溶液を、嗅覚の感覚による性質について評価した。各希釈液の１．０ｇ以下（知覚限界まで）のアリコートを、加糖全乳（５％w/wサッカロース）で更に希釈して５０ｇにした。この乳希釈液を味覚の感覚による性質について評価した。
【００５２】
下記表２に、分析の結果を要約した：
【００５３】
【表２】
2006513720.tif 000003
【００５４】
報告データは、ＹＩＥ３１３＜２００の値が、ＹＩＥ３１３＞２００の値を持つエキスよりも感覚において優れたエキスに対応することを証明している。具体的には、実施例１〜３と実施例４〜５の間の比較により、褐変工程が、官能的品質の改善と、同時のＹＩＥ３１３値の減少を提供することが判る。
【国際調査報告】
2006513720.tif 000004
2006513720.tif 000005
2006513720.tif 000006