(57)【要約】一態様において、本発明は変異を導入し、改善されたRNA分子を選択するためのRNA-レプリカーゼの使用に関する。本発明はまた、標的核酸分子を複製または転写する間に、1個または複数の変異を導入するための方法におけるリバビリンまたはその誘導体/アナログの使用に関する。これらの方法を使用して、核酸、またはそれらによってコードされる活性が改変されたか、または新規活性を有する蛋白質をスクリーニングすることができる。本発明はまた、変異誘発方法で使用するためのリバビリンまたはその誘導体/アナログを含むキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子を複製または転写する間に1個または複数の変異を導入する方法であって、
(i)前記標的核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、前記標的核酸を転写または複製する間に変異の導入を可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートする工程、および
(ii)変異した標的核酸分子を選択するか、または導入した変異の効果について選択する工程、
を含む方法。
【請求項２】
工程(i)および/または工程(ii)をin vitroまたは無細胞系で実施する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程(i)および/または工程(ii)を細胞内で実施する請求項1に記載の方法。
【請求項４】
工程(ii)が変異標的核酸分子を選択することを含む請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記変異核酸分子が、改変された特性または活性を有する請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記改変された特性または活性が、工程(i)の変異導入前のポリペプチドの発現レベルと比較したときの、コードポリペプチドの増加した発現である請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記改変された特性または活性が、工程(i)の変異導入前の安定性のレベルと比較したときの、増加した安定性である請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記改変された特性または活性が、工程(i)の変異導入前の触媒活性のレベルと比較したときの、改変された触媒活性である請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前のRNA干渉活性のレベルと比較したときの、増加したRNA干渉活性である請求項5に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前のアンチセンス活性のレベルと比較したときの、増加したアンチセンス活性である請求項5に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異核酸分子が、改変された特性または活性を有する蛋白質をコードする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
所望する特性を有する変異蛋白質を同定する方法であって、
(i)標的核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、前記標的核酸の転写または複製を可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートする工程、
(ii)工程(i)で生成した核酸によってコードされた蛋白質を生成する工程、および
(iii)前記蛋白質を所望する特性についてスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項１３】
前記コード蛋白質を生成する前に、工程(i)で生成した核酸をリバビリンまたはその誘導体/アナログの非存在下でコピーする請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
工程(ii)で生成した前記蛋白質が、そのコードしている核酸分子と関連する請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛋白質が、リボソーム複合体を介してそのコードするRNA分子と関連する請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛋白質が、RNA結合分子を介してそのコードするRNA分子と関連する請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛋白質が、同一細胞またはウイルス粒子内の関係または位置に基づいてそのコードする核酸分子と関連する請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記コードしている核酸分子を回収する工程をさらに含む請求項14から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記コードする核酸分子が、逆転写、RT-PCR増幅またはPCR増幅によって回収される請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記蛋白質が、全体濃度で約0.1mMから約10mMの間である酸化および/または還元グルタチオンを含む翻訳系で生成される請求項12から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程(i)で生成した前記核酸がRNAであり、前記方法がさらに蛋白質生成前にRNAをDNAに逆転写する工程を含む請求項12から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記DNAを適切なベクターにクローニングし、蛋白質生成前に宿主細胞に形質転換/またはトランスフェクトする請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼがDNA依存性RNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がDNA分子である請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記DNA依存性RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼおよびT3 RNAポリメラーゼからなる群から選択される請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がDNA分子である請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記DNA依存性DNAポリメラーゼが、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼ I クレノウフラグメントおよびT4 RNAポリメラーゼからなる群から選択される請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリメラーゼがRNA依存性DNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がRNA分子である請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記RNA依存性DNAポリメラーゼがAMV逆転写酵素、M-MLV逆転写酵素、SuperScript IIIおよびTth ポリメラーゼからなる群から選択される請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリメラーゼがRNA依存性RNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がRNA分子である請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記RNA依存性RNAポリメラーゼがQβレプリカーゼ、C型肝炎RdRp、水疱性口内炎ウイルスRdRp、カブ黄斑モザイクウイルスレプリカーゼおよびRNAバクテリオファージphi 6 RNA依存性RNAポリメラーゼからなる群から選択される請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記複製または転写を、少なくとも1種の他の変異誘発方法と組み合わせて実施する請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも1種の他の変異誘発方法が化学的変異原の添加を含む請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
リバビリンまたはその誘導体/アナログおよび核酸分子の複製または転写に必要な少なくとも1種類の試薬を含むキット。
【請求項３４】
前記少なくとも1種類の試薬が、ポリメラーゼ、ポリメラーゼをコードする核酸分子、反応緩衝液およびヌクレオシドまたはヌクレオチドからなる群から選択される請求項33に記載のキット。
【請求項３５】
前記ポリメラーゼが、校正活性が減少しているか、または欠損している請求項34に記載のキット。
【請求項３６】
前記キットにはさらに少なくとも1種の他の変異原が含まれる請求項33から35のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
リバビリンまたはその誘導体/アナログおよび少なくとも1種類のその他の変異原を含むキット。
【請求項３８】
請求項1から32のいずれか一項に記載の方法で使用するための請求項33から37のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
改変された特性または活性を示す変異RNA分子を同定する方法であって、
(i)RNA依存性RNAポリメラーゼがRNA分子を複製するが、変異を導入し、それによって変異RNA分子集団を生じる条件下で、標的RNA分子を前記RNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートする工程、および
(ii)改変された特性または活性を示す変異RNA分子を選択する工程、
を含む方法。
【請求項４０】
前記改変された特性または活性が、工程(i)の変異導入前のポリペプチドの発現レベルと比較したときの、コードポリペプチドの増加した発現である請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前の安定性のレベルと比較したときの、増加した安定性である請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前の触媒活性のレベルと比較したときの、改変した触媒活性である請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前のRNA干渉活性のレベルと比較したときの、増加したRNA干渉活性である請求項39に記載の方法。
【請求項４４】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前のアンチセンス活性のレベルと比較したときの、増加したアンチセンス活性である請求項39に記載の方法。
【請求項４５】
工程(i)で前記RNA分子に導入された前記変異が、RNA分子によってコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変化させない請求項39に記載の方法。
【請求項４６】
さらに、DNA構築物を転写して複製可能なRNAを生成する工程を含む請求項39から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
工程(i)および/または工程(ii)をin vitro系で実施する請求項39から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
工程(i)および/または工程(ii)を細胞内で実施する請求項39から46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
工程(i)を少なくとも1種のその他の変異誘発方法と組み合わせて実施する請求項39から48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも1種の他の変異誘発方法が化学的変異原の添加を含む請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学的変異原がリバビリンまたはその誘導体/アナログである請求項50に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子に変異を組み込む方法に関する。一態様では、本発明はRNAに変異を導入し、改善されたRNA分子を選択するためにRNAレプリカーゼを使用することに関する。他の態様では、本発明は、核酸分子に変異を導入する手段としてのリバビリンおよび関連ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログに関する。この方法は、特に、RNA、DNAおよび蛋白質のin vitro進化のため、および診断または治療に有用な改変RNA分子または蛋白質変種を生成し、選択するための方法において、使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
RNA分子の進化
RNA分子は、生体系における重要ないくつかの機能を実施する。たとえば、RNA分子は、
(i)いくつかの種類のウイルスおよびバクテリオファージのゲノム、
(ii)蛋白質合成のためにコードした情報を運ぶメッセンジャーRNA分子、
(iii)蛋白質合成においてアミノ酸を運ぶtRNA分子、
(iv)リボソームおよび核複合体の一部としての構造分子、
(v)天然に生じるリボザイムおよびRNAスプライシングで役割を果たすRNAなどの調節分子、および
(vi)導入されたリボザイム、アンチセンスRNAおよび干渉RNAなどの人工的調節因子として作用する。
【０００３】
RNA分子の機能は、1次構造(核酸配列)並びに2次および3次構造(折り畳み構造および関連)を組み合わせることによって決定される。ヌクレオチド配列は、折り畳み構造だけでなく、安定性、翻訳可能性および結合蛋白質およびその他の分子による認識を含めたその他のRNA特性の主要な決定要素である。
【０００４】
化学雑誌において、生体機能に影響を及ぼすRNA分子に天然に、または人工的に変化を起こさせることについての報告がいくつかなされており、次にこれらの変化がこのような機能を維持するために重要な配列および構造の同定の一助となることも報告されている。
【０００５】
たとえば、テトラヒメナ(Tetrahymena)の天然に生じたリボザイムは、その安定性および活性に重要な複雑な構造に折り畳まれる。リボザイム配列が変異すると、50倍まで折り畳み率に影響を及ぼし得ることが示された(Deras and Woodson、2002)。このような変異は折り畳まれた分子を安定化し、熱安定性および活性化を増大させる(Guo and Cech、2002)。RNA折り畳み構造パターンにおける変異誘発スイッチはまた、天然における進化(Falmm他、2001)の重要な現象であり、ハーベイ肉腫ウイルスなどのRNAウイルスのゲノムの安定性およびアセンブリに潜在的に影響を及ぼすことが報告された(Ramussen他、2002)。
【０００６】
哺乳類細胞では、mRNAの安定性は、mRNAの3'非翻訳領域の「不安定領域」に蛋白質が結合することによって調節されることが多い。たとえば、CD40リガンド蛋白質をコードするmRNAのCUリッチ領域は、該RNAを安定化する蛋白質に結合し、もしこの領域が変異すると安定性が低下する(Kosinski他、2003)。さらに、β-グロビン遺伝子は、遺伝子の3'非翻訳領域に欠失変異が天然に生じた結果、RNAプロセシングの効果がなくなって発現が減少することが示された(Bilenoglu他、2002)。
【０００７】
対照的に、多くのサイトカインおよび受容体遺伝子は、mRNAの3'非翻訳領域に不安定配列AUUUAを含有し、この配列を変異させたり、除去したりするとRNAの安定性および遺伝子発現が増加する(Stoecklin他、2001、Schaaf and Cidlowski、2002)。同様に、ftz蛋白質をコードするキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)は、mRNAに不安定性をもたらす3個のエレメントを含有する。興味深いことに、これらのうち1つはRNAの3'非翻訳領域にあるが、その他の2つはコード領域内にある。これらのエレメントを変化させると、RNAの安定性および蛋白質発現の増大が引き起こされる(Ito and Jacobs-Lorena、2001)。
【０００８】
細菌系においては、mRNAはRNA分解酵素Eなどのエキソヌクレアーゼの作用に関連した「デグラドソーム」によって該分子の3'末端から分解される。哺乳類細胞におけるように、不安定配列を除去すると、該mRNAによってコードされた蛋白質の発現の増加を引き起こすことができる(Leroy他、2002、Cisneros他、1996)。
【０００９】
安定性に加えて、mRNA分子のその他の特性は、遺伝子発現を駆動する活性に影響を及ぼす。これらには、蛋白質配列を変更することなくコドン利用に影響を及ぼすサイレント塩基置換が含まれ、発現を行う生物においてtRNAがより豊富なコドンを変異させることによって蛋白質発現濃度を増加させることができる(Widersten他、1996、Sutiphong他、1987、Sharp and Li、1986)。蛋白質のコード配列を変化させる変異はまた、おそらく生成物の安定性を増大させることによって、蛋白質発現の最終的濃度に影響を及ぼす可能性があるが、RNAの2次構造に影響を及ぼす変異は、翻訳機構の翻訳開始配列への進入しやすさを改変することによって蛋白質発現を改変することができる(Sutiphong他、1987)。
【００１０】
したがって、mRNA分子の多くの特性は、コード蛋白質を生成し、発現系から単離することができるレベルの決定に相互作用する。同様に、多くの状況が、非コード生体機能を有するRNA分子の生物学的活性の決定に相互作用する。これらの特性の正確な相互作用は、RNA毎に、および生体系毎に異なるので、最適な蛋白質生成を含めた最適な生体機能のためにRNA分子を正確に仕立て上げることは未だに不可能である。したがって、効果的に開始RNA分子の変種を産生し、最も好ましい生物学的特性を備えたRNAの選択を可能にできる系が必要である。安定性、折り畳み構造、結合活性または蛋白質発現を含めた全種類の特性についてRNAの最適化を実現するために、配置と種類両方の可能性全てを網羅する変異を評価して、変異を備えた開始分子の可能な変種全種類を入手することが必要である。たとえば、G-CおよびC-Gが極めて低い程度で交換するエラープローンPCR(EvoGenix Pty Ltd、結果は公表されていない)などの変異系では、より完全な変異誘発系であれば入手できるRNA特性の潜在的に有用な多くの変化を明らかにすることができないだろう。したがって、所望する特性を備えた変異RNA分子を生成し選択する改善された方法が必要である。
【００１１】
[RNA特異的RNAポリメラーゼ]
Qβバクテリオファージは、大腸菌(E.coli)に感染するRNAファージである。これは、コリファージQβの1本鎖RNAゲノムを複製するための効率の良いレプリカーゼ(RNA依存性RNAポリメラーゼは、レプリカーゼまたは合成酵素と称する)である。Qβレプリカーゼは誤りを起こしやすく、in vivoにおいては、塩基103〜104個毎に1個の割合で、RNAに変異を導入する。Qβレプリカーゼの忠実度は低く、鋳型の複製に強いバイアスを生じさせる(Rohde他、1995)。これらの教示によって、長期間にわたる複製は、所望する蛋白質の合成に適さない変異鎖の蓄積をもたらすことが示唆される。+鎖と-鎖の両方がレプリカーゼの鋳型として働くが、ウイルスゲノムでは、+鎖にQβレプリカーゼが結合し、相補鎖(-)の鋳型として利用される。RNA複製を起こさせるために、該レプリカーゼにはよく定義された特異的RNA配列/構造エレメントが必要である(Brown and Gold  1995、Brown and Gold  1996)。小さな組換えRNAを0.14フェムトグラム含有する反応は、Qβレプリカーゼによって30分で129ナノグラムに増幅されることが報告された(Lizardi他、1988)。
【００１２】
RNA特異的RNAポリメラーゼは、適合性のある鋳型上で指数関数的にRNAを複製することが知られている。適合性のある鋳型は、MDV-1 RNAに見られるものなどの2次構造を有するRNA分子である(Nishihara他、1983)。この点に関して、RNAは複製に必要な配列および2次構造(MDV-1 RNA)を有し、in vitroでQβゲノムRNAと同様の方法で複製するので、ベクターは複製可能なmRNAを構築するために記載されてきた。MDV-1 RNA配列(Qβレプリカーゼの天然に生じる鋳型)は、QβレプリカーゼによるRNAの増幅に適合したいくつかの天然鋳型の1つで(米国特許第4786600号)、はめ込まれたmRNA配列の安定性を高める、ほとんどのファージRNAの末端に生じる構造と同様のtRNA様構造を末端に有する。プラスミドの直線化によって、さらに組み換えられたMDV-1 RNAを合成するための鋳型として役立つことが可能になる(Lozardi他、1988)。従来技術における教示によって、外来遺伝子のQβレプリカーゼによる複製延長には、MDV-1 RNAなどのQβの天然に生じる鋳型の1つにそれをRNAとしてはめ込むことが必要である。
【００１３】
[蛋白質の進化]
蛋白質のin vitro進化には、公知の遺伝子配列に変異を導入して変異配列ライブラリーを作製し、該配列を翻訳して変異蛋白質を生成し、次に所望する特性を有する変異配列を選択することが必要である。この方法は、診断、治療または産業への用途が広がった蛋白質を生成するために有望である。しかし、残念なことに、この方法の可能性は、無作為に変異を導入するために使用できるが、変異頻度が制御されるという方法の限界によって制限されてきた。変異誘発に使用した最も一般的な方法のいくつかには、直接置換、エラープローンPCR、RNAレプリカーゼおよびDNA断片の再結合点に変異をもたらし得る組み換えが含まれる。
【００１４】
最近報告されたin vitro進化の効果的な1方法は、対象とする遺伝子のRNAコピーに変異を導入するために、RNA複製酵素を使用する方法である。これらの酵素は、校正機能を欠くためにRNAを複製するときに誤りを導入することが示された(WO99/58661)。この方法は、RNAコピー変種の生成には効果的であるが、この方法を使用するにはいくつかの欠点がある。たとえば、これらの酵素にはRNA鋳型が必要であり、その酵素は入手が困難であり得る。
【００１５】
核酸の変異誘発のその他の取り組みはまた、いくつかの問題点（すなわち、幾つかは変異を核酸分子に沿って無作為に導入するよりもクラスターまたは「ホットスポット」に導入してしまうという問題点がある一方で、他の幾つかは、制御が困難で、過剰な変異を導入して、生成した変異核酸分子の利用性に損失をもたらす可能性があるという問題点がある）によって阻まれている。これらの理由のために、本発明等は核酸分子に変異を導入する他の取り組みを探究した。
【非特許文献１】Deras and Woodson、2002
【非特許文献２】Guo and Cech、2002
【非特許文献３】Falmm他、2001
【非特許文献４】Ramussen他、2002
【非特許文献５】Kosinski他、2003
【非特許文献６】Bilenoglu他、2002
【非特許文献７】Stoecklin他、2001
【非特許文献８】Schaaf and Cidlowski、2002
【非特許文献９】Ito and Jacobs-Lorena、2001
【非特許文献１０】Leroy他、2002
【非特許文献１１】Cisneros他、1996
【非特許文献１２】Widersten他、1996
【非特許文献１３】Sutiphong他、1987
【非特許文献１４】Sharp and Li、1986
【非特許文献１５】Sutiphong他、1987
【非特許文献１６】Rphde他、1995
【非特許文献１７】Brown and Gold  1995
【非特許文献１８】Brown and Gold  1996
【非特許文献１９】Lizardi他、1988
【非特許文献２０】Nishihara他、1983
【特許文献１】米国特許第4786600号
【非特許文献２１】Lozardi他、1988
【特許文献２】WO99/58661
【非特許文献２２】Helgstrand他、2002
【非特許文献２３】Roberts(1999)
【非特許文献２４】Nemoto他(1997)
【非特許文献２５】Roberts and Szostak(1997)
【非特許文献２６】Deiman他、1997
【非特許文献２７】Ojala and Bamford、1995
【非特許文献２８】Kramer他、1978
【非特許文献２９】Munishkin他、1991
【非特許文献３０】Melton他、1984a
【非特許文献３１】Melton他、1984b
【非特許文献３２】J.Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984)
【非特許文献３３】J. Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)
【非特許文献３４】T. A. Brown(著)、Essential Molecular Biology:A Practical Approach、1巻および2巻、IRL Press (1991)
【非特許文献３５】D. M. GloverおよびB. D. Hames (著)、DNA Cloning: A Practical Approach、1-4巻、IRL Press(1995および1996)
【非特許文献３６】F. M. Ausubel他(著)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの改訂版を全て含める)
【非特許文献３７】Markland他、2000
【非特許文献３８】Durr and Lindh、1975
【非特許文献３９】Hruska他、1982
【非特許文献４０】von Herrath他、2000
【非特許文献４１】Wyde、1998
【非特許文献４２】McCormick他、1986
【非特許文献４３】McHutchison他、1998
【特許文献３】WO97/26883
【特許文献４】WO01/45509
【特許文献５】米国特許第6153594号
【非特許文献４４】Izant and Weintraub、1984
【非特許文献４５】Izant and Weintraub、1985
【非特許文献４６】Marcus-Sakura、1988
【非特許文献４７】Haseloff and Gerlach 1988
【非特許文献４８】Perriman他、1992
【非特許文献４９】Shippy他、1999
【非特許文献５０】Dougherty and Parks(1995)
【非特許文献５１】Waterhouse他(1998)
【特許文献６】WO99/32619
【特許文献７】WO99/53050
【特許文献８】WO99/49029
【特許文献９】WO01/34815
【非特許文献５２】Fire他(1988)
【非特許文献５３】Sharp(1999)
【非特許文献５４】brown and Gold 1995
【非特許文献５５】brown and Gold 1996
【非特許文献５６】He and Taussig、1997
【非特許文献５７】Mattheakis他、1994
【非特許文献５８】Zubay、1973
【非特許文献５９】Irving他、1996
【非特許文献６０】Scopes、R.、Protein Purification、Springer-Verlag、NY(1982)
【非特許文献６１】Leung他、1989
【非特許文献６２】Caldwell and Joyce、1992
【非特許文献６３】Stemmer、(1994)
【非特許文献６４】Volkov and Arnold(2000)
【特許文献１０】米国特許出願番号第20030194763号
【特許文献１１】米国特許出願番号第20030186356号
【特許文献１２】米国特許出願番号第20030119764号
【非特許文献６５】Hambraeus他、2002
【非特許文献６６】Emory and Belasco、1990
【非特許文献６７】Schmittgen他、2000
【非特許文献６８】Heid他、1996
【非特許文献６９】Wittwer他、1997
【非特許文献７０】Wittrup、2001
【特許文献１３】WO91/17271
【特許文献１４】WO91/18980
【特許文献１５】WO91/19818
【特許文献１６】WO93/08278
【非特許文献７１】Felici他、1995
【非特許文献７２】Hoogenboom、2002
【非特許文献７３】Lowman他、1991
【非特許文献７４】Jiang他、1997
【非特許文献７５】Stolz他、1998
【非特許文献７６】Joelson他、1997
【非特許文献７７】Buchholz他、1998
【非特許文献７８】Boder and Wittrup、1997
【非特許文献７９】Cho他、1998
【非特許文献８０】Stahl and Uhlen、1997
【非特許文献８１】Chen and Georgiou、2002
【非特許文献８２】Jung他、1998
【非特許文献８３】Fields and Song、1989
【非特許文献８４】Lichitra and Liu、1996
【非特許文献８５】Vidal他、1996
【特許文献１７】WO99/58661
【非特許文献８６】Ghee他、1996
【非特許文献８７】Ryabova他、1997
【非特許文献８８】Spirin他、1988
【非特許文献８９】Sumper and Luce(1975)
【非特許文献９０】Makeyev and Bamford(2000、The EMBO J19、124-1133)
【非特許文献９１】Cao and Parker(2001)
【非特許文献９２】Mitchell and Nair、2000
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明では、RNAとDNAの両方に適用することができ、リバビリン、またはそのアナログまたは誘導体を含めることによって、標的核酸分子を複製または転写する間に1個または複数の変異を導入することができる変異誘発方法を開発した。該方法を使用して、コード蛋白質の安定性または発現の増大を含めた、機能性が向上したRNAまたはDNA分子、並びに活性または特性の改善された蛋白質をコードする核酸分子を創生することができる。
【００１７】
この方法は、リバビリンが、RNAまたはDNAを複製または転写する間に、異なる様々なポリメラーゼのいずれか1つと組み合わせて使用すると、効果的な変異原であり、イントクトな細胞が変異導入に必要ないという驚くべき知見に基づいている。本発明はまた、リバビリンを使用すると比較的低い程度で変異が導入され、それによって得られたRNAまたはDNA分子に限定された変化がもたらされることを知見した。リバビリンは、複製サイクルの一部としてRNA中間体を有するウイルスを処理する効果的な抗ウイルス剤として知られている。これは、ウイルスに死をもたらす高レベルの変異が導入されるためと考えられる。DNAまたはRNA分子の進化の間に所望する変異を導入するために、リバビリンを使用することは今まで考えられたことはなかった。リバビリンは、適切な条件下で使用すると比較的低レベルでの変異を導入することができるという本発明者等による驚くべき知見は、この目的に特に適していることを示している。
【００１８】
本発明者等はまた、エラープローンRNA依存性RNAポリメラーゼを使用した変異誘発方法を使用して、変異RNA分子を生成することができ、この分子は、必ずしもコード蛋白質の改善された特性に基づくことはなく、RNA分子自体の改善された機能に基づいて選択または使用することができることを認識した。
【００１９】
したがって、本発明の第1の態様では、標的核酸分子を複製または転写する間に、1個または複数の変異を導入する方法であって、
(i)標的核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該標的核酸を転写または複製する間に変異を導入することを可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートすること、
(ii)変異標的核酸分子を選択するか、または導入した変異の効果について選択することを含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の第1の態様の方法は、たとえば、精製したコンポーネントを含有するin vitro系において、または組成がわからないクルードなコンポーネントを含有する(真核細胞または原核細胞源から得られた)無細胞系において実施することができる。当業者であればわかるように、該方法は、核酸の転写および/または複製を可能にするいかなる条件下でも実施される。一実施形態では、該方法は、無細胞系、たとえば、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ麦芽または大腸菌溶解物で実施されるが、それだけには限定されない。
【００２１】
あるいは、該方法は、酵母、細菌、哺乳類細胞、植物細胞またはRNA依存性RNAポリメラーゼ以外の酵素によって核酸を複製し、かつ/または転写するその他の細胞において、in vivoで実施することができる。好ましい実施形態では、該細胞はウイルス感染していない。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、標的核酸分子を複製または転写する間に1個または複数の変異を導入する方法であって、核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該標的核酸の転写または複製を可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートすることを含み、該ポリメラーゼはRNA依存性RNAポリメラーゼではない方法を提供する。
【００２３】
第1の態様の方法を使用して、改変された表現型または所望する活性を備えた核酸分子を生成することができる。たとえば、第1の態様の方法を使用して、高まった安定性を示すか、またはポリペプチドの発現レベルが増加した変異RNA分子またはDNA分子を生成することができる。他の例では、第1の態様の方法を使用して、調節エレメント、たとえば、エンハンサーまたはプロモーターまたはそれらの断片に変異が生じた変異RNAまたはDNA分子を生成することができ、該RNAまたはDNA分子は改変された調節活性を示す。他の例では、該標的核酸分子は、リポザイムまたはDNA酵素(DNAzyme)などの触媒分子であり、該方法を使用して改変された触媒活性を示す変異分子を生成する。
【００２４】
改変された表現型はまた、該核酸によってコードされた蛋白質の改変された活性であることができる。該改変活性は、変異前の核酸によってコードされた蛋白質が所有しない新規機能であってよく、または既存の機能の活性程度の改変であってもよい。
【００２５】
第1の態様の方法は、核酸分子に変異を導入する数多くの方法に適合させることができる。変異を導入した後で、(さらにリバビリンまたはその誘導体/アナログを存在させて、または存在させないで)該核酸をコピーするかまたは増幅し、改変された表現型(所望する活性)を分析し、あるいは改変表現型を有する蛋白質をコードする能力を分析することができる。他のコピー工程または増幅工程には、DNAからRNAへ、またはその逆の核酸変換を含めることができる。変異した核酸がDNAの場合、該DNAによってコードされた蛋白質を生成する前にRNAに転写する必要がある。
【００２６】
第2の態様では、本発明は所望する特性を有する変異蛋白質を同定する方法であって、
(i)標的核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該標的核酸の転写または複製を可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートすること、
(ii)工程(i)から生成した核酸によってコードされた蛋白質を生成すること、および
(iii)該蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすることを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の第2の態様の方法は、精製したコンポーネントを含有するin vitro系において、または組成がわからないクルードなコンポーネントを含有する(真核細胞または原核細胞源から得られた)無細胞系において実施することができる。当業者であればわかるように、該方法は、核酸の転写および/または複製を可能にするいかなる条件下でも実施される。一実施形態では、該方法は、無細胞系、たとえば、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ麦芽または大腸菌溶解物で実施されるが、それだけには限定されない。
【００２８】
あるいは、該方法または第2の態様は、酵母、細菌、哺乳類細胞、植物細胞またはRNA依存性RNAポリメラーゼ以外の酵素によって核酸を複製し、かつ/または転写するその他の細胞において、in vivoで実施することができる。好ましい実施形態では、該細胞はウイルス感染していない。
【００２９】
第2の態様のさらに他の実施形態では、コード蛋白質を生成する前に、工程(i)で生成した核酸をリバビリンまたはその誘導体/アナログの非存在下でコピーする。
【００３０】
第2の態様のさらに他の実施形態では、蛋白質を生成する前に、工程(i)から生成した核酸またはそのコピーを安定なベクターにクローニングして、宿主細胞に形質転換/トランスフェクトする。
【００３１】
第2の態様のさらに他の実施形態では、工程(i)から生成した核酸はRNAであり、該方法にはさらに蛋白質を生成する前にRNAを逆転写し、得られたDNAを単離することが含まれる。該DNAは、蛋白質を生成する前に宿主細胞に形質転換/トランスフェクトすることができる。
【００３２】
第2の態様の一実施形態では、該蛋白質はコード核酸分子に関連する。
【００３３】
本明細書では「関連する」という用語は、翻訳された蛋白質と対応する核酸分子との間の関連を意味しており、選択した蛋白質をコードするRNAまたは対応DNAを回収できるように、該関連は翻訳および選択過程を通して維持される。翻訳した蛋白質およびそのコードRNAまたはDNAは、いくつかの適切な手段を介して互いに関連することができる。
【００３４】
具体的な一実施形態では、翻訳された蛋白質およびコードRNA分子は、インタクトな三要素リボソーム複合体によって関連する。リボソーム複合体は、少なくとも1個のリボソーム、少なくとも1個のRNA分子および少なくとも1個の翻訳されたポリペプチドを含むことが好ましい。この複合体によって、翻訳された蛋白質の「リボソームディスプレイ」が可能になる。翻訳後三要素リボソーム複合体をインタクトに維持するために適切な条件は、公知である。たとえば、コード配列3'末端から翻訳終止コドンを削除または除去するとインタクトな三要素リボソーム複合体が維持される。スパルソマイシンまたは同様の化合物を添加して、該リボソーム複合体の分離を防ぐことができる。マグネシウム塩を特定の濃度に維持し、GTPレベルを低下させることによってまた、インタクトなリボソーム複合体の維持を助けることができる。
【００３５】
他の実施形態では、該関連はRNA結合分子によって促進される。この実施形態では、コードRNAには、対象とする蛋白質をコードした配列、RNA結合分子をコードした配列、および新たに翻訳されたRNA結合分子が結合することができる配列(たとえば、RNA結合モチーフまたはドメイン)が含まれる。該RNA結合分子は、RNA結合蛋白質であってよい。適切なRNA結合蛋白質の例は、TR 19-nt RNAヘアピン構造(レプリカーゼ翻訳オペレーター)と複合体を形成するファージMS2のコート蛋白質である。たとえば、Helgstrand他、2002を参照のこと。RNA結合蛋白質の他の例は、伝染性ファブリキウス嚢症ウイルス(IBDV)のVP1蛋白質である。IBDVのVP1蛋白質は、それが結合するRNA配列によってコードされる。したがって、該コードRNAがVP1のコード配列を含むならば、翻訳されたVP1蛋白質は自身のRNA配列に結合し、一緒になって四要素リボソーム複合体を維持する。
【００３６】
さらに他の実施形態では、翻訳された蛋白質はそのコードRNAに融合する。mRNA-蛋白質融合体はRoberts(1999)に記載されている。mRNAと翻訳された蛋白質の間の共有結合は、Nemoto他(1997)およびRoberts and Szostak(1997)によって報告されたように、ピューロマイシンによって形成することができる。
【００３７】
あるいは、蛋白質は、同一細胞またはウイルス粒子内の関係または位置によってそれらをコードする核酸分子と「関連する」ことができる。好ましくは、該翻訳蛋白質は、たとえば、細胞またはウイルス粒子表面上に発現することによって、そのコードDNA(またはRNA)と同じ細胞またはウイルス粒子と「関連する」。
【００３８】
第2の態様の他の実施形態では、工程(i)および(ii)は単一または複数に仕切られた容器の中で同時に実施され、該複数に仕切られた容器は、仕切りの間を液体が移動することが可能である。
【００３９】
好ましくは、該蛋白質は、全体濃度が約0.1mMから約10mMの間である酸化および/または還元グルタチオンを含む翻訳系で生成される。より好ましくは、該グルタチオンの濃度は、約2mMから約7mMの間である。さらにより好ましくは、該翻訳系には、濃度約2mMの酸化グルタチオンおよび濃度が約0.5mMと約5mMとの間である還元グルタチオンが含まれる。
【００４０】
第2の態様の他の実施形態では、該方法にはコードしている核酸分子を回収する工程が含まれる。該コード核酸分子は、逆転写、RT-PCR増幅またはPCR増幅によって回収することができる。
【００４１】
第2の態様の一実施形態では、該方法には、
(a)標的DNA分子をリバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該標的DNAの転写を可能にする条件下で、DNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートし、それによって変異RNA分子を生成すること、
(b)工程(a)から生成した変異RNA分子によってコードされた蛋白質を生成すること、および
(c)該蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすることが含まれる。
【００４２】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)標的DNA分子をリバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該標的DNAの複製を可能にする条件下で、DNA依存性DNAポリメラーゼと共にインキュベートし、それによって変異DNA分子を生成すること、
(b)工程(a)から生成した変異DNA分子によってコードされた蛋白質を生成すること、および
(c)該蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすることが含まれる。
【００４３】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)複製可能なRNA分子をリバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該RNA分子の複製を可能にする条件下で、RNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートし、それによって変異RNA分子を生成すること、
(b)工程(a)から生成した変異RNA分子によってコードされた蛋白質を生成すること、および
(c)該蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすることが含まれる。
【００４４】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)RNA分子をリバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、該RNA分子の逆転写を可能にする条件下で、RNA依存性DNAポリメラーゼと共にインキュベートし、それによって変異DNA分子を生成すること、
(b)工程(a)から生成した変異DNA分子によってコードされた蛋白質を生成すること、および
(c)該蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすることが含まれる。
【００４５】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、DNA依存性RNAポリメラーゼを使用してDNA鋳型からRNAを転写し、それによって変異RNA分子を生成すること、
(b)工程(a)で生成した変異RNA分子を、翻訳後、変異蛋白質がそのコードRNA分子と関連するように変異蛋白質集団の合成をもたらす条件下で翻訳系とインキュベートすること、
(c)該変異蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすること、および
(d)場合によって該コードRNA分子を回収することが含まれる。
【００４６】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、RNA分子の複製を可能にする条件下で、複製可能案RNA分子をRNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートし、それによって変異RNA分子を生成すること、
(b)工程(a)で生成した変異RNA分子を、翻訳後、変異蛋白質がそのコードRNA分子と関連するように変異蛋白質集団の合成をもたらす条件下で翻訳系とインキュベートすること、
(c)該変異蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすること、および
(d)場合によって該コードRNA分子を回収することが含まれる。
【００４７】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、DNA依存性RNAポリメラーゼを使用してDNA鋳型からRNAを転写し、それによって変異RNA分子を生成すること、
(b)工程(a)で生成した変異RNA分子を逆転写し、それによって対応する変異DNA分子を生成すること、
(c)工程(b)で生成した変異DNA分子を、翻訳後、変異蛋白質がそのコードDNA分子と関連するように変異蛋白質集団の合成をもたらす条件下で、転写/翻訳系に曝露すること、
(d)該変異蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすること、および
(e)場合によって該コードDNA分子を回収することが含まれる。
【００４８】
第2の態様の他の実施形態では、該方法には、
(a)リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、RNA分子の複製を可能にする条件下で、複製可能なRNA分子をRNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートし、それによって変異RNA分子を生成すること、
(b)工程(a)で生成した変異RNA分子を逆転写し、それによって対応する変異DNA分子を生成すること、
(c)工程(b)で生成した変異DNA分子を、翻訳後、変異蛋白質がそのコードDNA分子と関連するように変異蛋白質集団の合成をもたらす条件下で、転写/翻訳系に曝露すること、
(d)該変異蛋白質を所望する特性についてスクリーニングすること、および
(e)場合によって該コードRNA分子を回収することが含まれる。
【００４９】
第1および第2の態様の他の実施形態では、該ポリメラーゼには、校正活性が低いか、または不十分であることによって、本質的に高い変異率が備わっている。しかし、本発明にはまた、T7 RNAポリメラーゼなどのエラー率が低く、まだ確実に変異が取り込まれるポリメラーゼの使用が含まれる。いくつかのDNA依存性RNAポリメラーゼなどのエラー率が低いポリメラーゼの利点は、一般的に商用としてより入手しやすく、変異率が高いポリメラーゼよりも遙かに安価であることである。
【００５０】
第1および第2の態様の方法には、さらに転写の際に変異数を増加させる工程を含めることができる。たとえば、変異を導入するRNA依存性RNAポリメラーゼ、たとえばQβレプリカーゼ、C型肝炎RdRp、水疱性口内炎ウイルスRdRp、カブ黄斑モザイクウイルスレプリカーゼおよびRNAバクテリオファージphi6RNA依存性RNAポリメラーゼであるが、これだけには限定されないポリメラーゼの作用によって該RNAをコピーすることができる。
【００５１】
本発明の第1および第2の態様の方法はさらに、標的核酸を、リバビリンまたはその誘導体/アナログとは別の、複製または転写の間にまた変異を導入する少なくとも1個のその他の変異原、および/または変異誘発を促進する方法に曝露することが含まれる。このようなその他の変異原/変異誘発方法を使用して、たとえば、標的核酸分子に導入される変異の総数を増加させることができる。これらその他の変異原/変異誘発方法は、本発明の複製または転写の前後または最中に、リバビリンまたはその誘導体/アナログの存在下で使用することができる。したがって、好ましい実施形態においては、複製または転写は、少なくとも1種類のその他の変異原、好ましくは化学的変異原の存在下で実施する。
【００５２】
本発明の第1および第2の態様の場合では、対象とする変異蛋白質を選択する任意の方法を使用することができる。たとえば、標的分子への結合または変異蛋白質によって影響を受ける生体応答の測定によって選択を実施することができる。
【００５３】
たとえば、対象とする蛋白質が酵素の場合、該選択方法には、変異蛋白質を酵素基質などの標的分子に曝露すること、および変異蛋白質の酵素活性をモニターすることを含めることができる。該酵素活性は、たとえば、全細胞または該変異蛋白質を含む細胞抽出物を分析することによってモニターすることができる。
【００５４】
他の例では、対象とする蛋白質が細胞増殖または分割を促進または減少させる因子の場合、該選択方法は、変異蛋白質を細胞集団に曝露し、その細胞の生体応答をモニターすることを含めることができる。
【００５５】
他の例では、該変異蛋白質が受容体リガンドの場合、該方法には、該受容体を発現する細胞に変異蛋白質を曝露し、該受容体のシグナル伝達によってもたらされる生物学的応答をモニターすることを含めることができる。
【００５６】
好ましい実施形態では、所望する活性は標的細胞に結合する能力である。標的分子の例には、DNA分子、蛋白質、受容体、細胞表面分子、代謝物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスが含まれるが、それだけには限定されない。
【００５７】
該標的分子は、マトリックスに結合させることが好ましい。さらに、該マトリックスには磁気ビーズを含めることが好ましい。
【００５８】
第1の態様および第2の態様の一実施形態では、該ポリメラーゼはDNA依存性RNAポリメラーゼであり、該標的核酸分子はDNA分子である。DNA依存性RNAポリメラーゼは、当業界で公知のこのような任意の分子であることができる。好ましいDNA依存性RNAポリメラーゼには、T7 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼおよびT3 RNAポリメラーゼが含まれるが、それだけには限定されない。
【００５９】
第1の態様および第2の態様の他の実施形態では、該ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼであり、該標的核酸分子はDNA分子である。例には、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNA ポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、大腸菌などの細菌から得られたDNAポリメラーゼIクレノウフラグメントおよびT4 DNAポリメラーゼが含まれるが、それだけには限定されない。
【００６０】
第1の態様および第2の態様の他の実施形態では、該ポリメラーゼはRNA依存性DNAポリメラーゼであり、該標的核酸分子はRNA分子である。例には、AMV逆転写酵素およびM-MLV逆転写酵素、SuperScriptIIIおよびTthポリメラーゼが含まれるがそれだけには限定されない。
【００６１】
第1の態様および第2の態様のさらに他の実施形態では、該ポリメラーゼはRNA依存性RNAポリメラーゼであり、該標的核酸分子はRNA分子である。例には、Qβレプリカーゼ、C型肝炎RdRp、水疱性口内炎ウイルスRdRp、カブ黄斑モザイクウイルスレプリカーゼおよびRNAバクテリオファージphi6RNA依存性RNAポリメラーゼであるが、これらだけには限定されない。
【００６２】
本発明の方法にはさらに、標的核酸分子とポリメラーゼとのインキュベートの前、または最中に、ヌクレオシドまたはヌクレオチドなどの核酸前駆体を添加することを含めることができる。好ましくは、該前駆体は、三リン酸塩(すなわち、ヌクレオチド三リン酸)として提供する。しかし、ヌクレオシド/ヌクレオチドは、リン酸化されていない、モノリン酸塩型または二リン酸塩型で供給し、in vitro系、無細胞系または生細胞内に存在する酵素によって三リン酸型に変換することができる。RNAを転写または複製方法によって生成するとき、提供されたヌクレオチドはリボヌクレオシド三リン酸、rATP、rCTP、rGTPおよびrUTPであることが好ましいだろう。DNAを転写または複製方法によって生成するとき、提供されたヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシド三リン酸、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPであることが好ましいだろう。
【００６３】
第3の態様では、本発明はリバビリンまたはその誘導体/アナログおよび核酸分子の複製または転写に必要な少なくとも1種類の試薬を含むキットを提供する。
【００６４】
好ましくは、該少なくとも1種類の試薬は、ポリメラーゼまたはポリメラーゼをコードする核酸分子、反応緩衝液およびヌクレオシドまたはヌクレオチドからなる群から選択される。
【００６５】
好ましくは、該ポリメラーゼは、校正活性が減少しているか、または欠損している。校正活性が減少しているか、または欠損しているポリメラーゼは、平均して、好ましくは1000bp重複鎖当たり少なくとも0.05個の変異、より好ましくは1000bp重複鎖当たり少なくとも0.075個の変異、より好ましくは1000bp重複鎖当たり少なくとも0.1個の変異、より好ましくは1000bp重複鎖当たり少なくとも0.2個の変異、さらに好ましくは1000bp重複鎖当たり少なくとも0.4個の変異を引き起こす。
【００６６】
該キットにはまた、対照核酸鋳型を含めることができる。キットに添えられた指示書に従って、当業者はリバビリンまたはその誘導体/アナログの存在下で、対照核酸の転写または複製の際に一定量の変異が予測されるであろう。対照の一定量の変異が観察されない場合は、該方法が正確に実施されていないことを示している。当然であるが、このことから、当業者は基本的な実験を実施して、該キットを最適に使用していることを確認することができる。
【００６７】
好ましくは、該キットにはさらに、リバビリンまたはその誘導体/アナログ以外の変異原が含まれる。
【００６８】
他の態様では、本発明はリバビリン、またはその誘導体/アナログおよび少なくとも1種類のその他の変異原を含むキットを提供する。好ましくは、該その他の変異原は、化学的変異原である。適切な変異原の例には、i)亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたは蟻酸などの変異原、ii)ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、5-ホルミルウリジン、イソグアノシンまたはアクリジン並びにそれらの誘導体/アナログなどのヌクレオチド/ヌクレオシド前駆体のその他のアナログ、およびiii)プロフラビン、アクリフラビンおよびキナクリンなどの挿入剤が含まれるが、それだけには限定されない。
【００６９】
好ましくは、リバビリン、またはその誘導体/アナログは、一、二または三リン酸塩として提供されるが、少なくともいくつかの実施形態では、リバビリン、またはその誘導体/アナログは、in vitro系、無細胞系または生細胞内に存在する酵素によって三リン酸型に変換される。
【００７０】
好ましくは、本発明の方法で使用したリバビリン、またはその誘導体/アナログの濃度は、約10μMと約20mMとの間、より好ましくは約100μMと約10mMとの間で、さらに好ましくは約500μMと約5mMとの間である。一実施形態では、リバビリン、またはその誘導体/アナログの濃度は、約1000μMである。他の実施形態では、リバビリン、またはその誘導体/アナログの濃度は、約2000μMである。
【００７１】
第4の態様では、本発明は改変された特性または活性を示す変異RNA分子を同定する方法であって、
(i)RNA依存性RNAポリメラーゼはRNA分子を複製するが、変異を導入し、それによって変異RNA分子集団生じる条件下で、標的RNA分子をRNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートすること、および
(ii)改変された特性または活性を示す変異RNA分子を選択することを含む方法を提供する。
【００７２】
第4の態様の一実施形態では、改変された特性または活性は、工程(i)における変異導入前のポリペプチドの発現レベルと比較したとき、コードされたポリペプチドの発現が増加していることである。
【００７３】
第4の態様の他の実施形態では、改変された特性または活性は、工程(i)における変異導入前の安定性の程度と比較したとき、安定性が増加していることである。
【００７４】
第4の態様の他の実施形態では、改変された特性または活性は、工程(i)における変異導入前の触媒程度と比較したとき、触媒活性が改変していることである。
【００７５】
第4の態様の他の実施形態では、改変された特性または活性は、工程(i)における変異導入前のRNA干渉活性と比較したとき、RNA干渉活性が増加していることである。
【００７６】
第4の態様の他の実施形態では、改変された特性または活性は、工程(i)における変異導入前のアンチセンス活性の程度と比較したとき、アンチセンス活性が増加していることである。
【００７７】
第4の態様の他の実施形態では、工程(i)でRNA分子に導入された変異はRNA分子によってコードされた蛋白質のアミノ酸配列を改変しない。
【００７８】
当業界で公知のいくつかのRNA特異的RNAポリメラーゼ(他に、レプリカーゼまたはRNA合成酵素として知られている)は単離されており、第4の態様の方法で使用するために適している。これらの例には、バクテリオファージRNAポリメラーゼ、植物ウイルスRNAポリメラーゼおよび動物ウイルスRNAポリメラーゼが含まれる。本発明の好ましい実施形態では、該RNA特異的RNAポリメラーゼは、比較的高頻度で、好ましくは104塩基当たり少なくとも1個の変異の頻度で、より好ましくは103塩基当たり1個の変異の頻度で、複製されたRNA分子に変異を導入する。より好ましい実施形態では、RNA特異的RNAポリメラーゼは、Qβレプリカーゼ、C型肝炎RdRp、水疱性口内炎ウイルスRdRp、カブ黄斑モザイクウイルスレプリカーゼ(Deiman他、1997)およびRNAバクテリオファージphi 6RNA依存性RNAポリメラーゼ(Ojala and Bamford、1995)からなる群から選択される。最も好ましくは、該RNA特異的RNAポリメラーゼは、Qβレプリカーゼである。
【００７９】
RNA特異的RNAポリメラーゼは、精製蛋白質として転写/翻訳系に含めることができる。あるいは、RNA特異的RNAポリメラーゼは、RNA分子の複製中に発現する遺伝子鋳型の形態で含めることができる。
【００８０】
さらに好ましい実施形態では、RNA特異的RNAポリメラーゼは標的分子と融合させるか、または関連させることができる。理論に結びつけることは望まないが、場合によっては、標的への翻訳蛋白質の結合親和性はRNA分子へのレプリカーゼの親和性よりも大きい可能性があることが予測される。変異蛋白質/RNA複合体が標的分子/RNA特異的RNAポリメラーゼ融合構造物に結合することによって、RNAはRNA特異的RNAポリメラーゼの近隣にもたらされるだろう。これによって、優先的にさらに複製が生じ、対象とするRNA分子の変異が生じることが可能である。
【００８１】
様々なRNA依存性RNAポリメラーゼによって複製されるRNA鋳型は、当業界では公知で、本発明に使用するのに適した複製可能なRNAを生成するためのベクターとして役立ち得る。Qβレプリカーゼの公知の鋳型には、RQ135RNA、MDV-1 RNA、微小変異型RNA、ナノ変異型RNA、CT-RNAおよびRQ120RNAが含まれる。Qβレプリカーゼによってまた複製されるQβ RNAは、シストロンを有するため、さらにはそのシストロンの産物が蛋白質合成を制御するため、好ましくない。好ましいベクターには、MDV-1 RNA(Kramer他、1978)およびRQ135 RNA(Munishkin他、1991)(RQ135)が含まれる。これらは、周知のDNA合成技術によってDNA型にすることができる。
【００８２】
好ましい実施形態では、該方法にはさらに、DNA構築物を転写して複製可能なRNAを生成する工程が含まれる。組み換えRNAをコードするDNAは、プラスミドの形態にすることができる（しかしながｔら、必要はない。プラスミド、および該遺伝子配列をはめ込んだ複製可能なRNAをコードする配列の末端で、またはその近くで該プラスミドを切断するエンドヌクレアーゼを使用することが好ましい。直線化は、別に実施するか、または転写-複製-翻訳と結合させることができる。しかし、直線DNAは、好ましくは多くの有用なDNA複製反応のいずれか1つによって、最も好ましくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の技術によって生成する。いくつかの系では、エンドヌクレアーゼを有さない非直線化プラスミドであることが好ましい可能性がある。適切なプラスミドは、たとえば、T7 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼ(Melton他、1984aおよび1984b)などのバクテリオファージRNAポリメラーゼによる組み換えプラスミドのin vitroでの転写によるRNAの生成方法に関する以下のMelton他(1984a、b)の教示によって調製することができる。転写は複製可能なRNAをコードする配列の最初のヌクレオチドで開始することが好ましい。
【００８３】
本発明の第4の態様の方法の工程(i)および/または工程(ii)は、精製したコンポーネントを含有するin vitro系において、または組成がわからないクルードなコンポーネントを含有する(真核細胞または原核細胞源から得られた)無細胞系において実施することができる。一実施形態では、該方法は、無細胞系、たとえば、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ麦芽または大腸菌溶解物で実施されるが、それだけには限定されない。
【００８４】
あるいは、本発明の第4の態様の方法の工程(i)および/または工程(ii)は、細胞内で実施することができる。
【００８５】
本発明の前記の態様は標的RNA分子に変異を導入する方法に関するので、変異誘発を増加させることが知られている方法をこれらの方法と組み合わせて使用することができる。したがって、第4の態様の方法はさらに、標的核酸を、複製または転写中に変異を導入するリバビリンまたはその誘導体/アナログなどのその他の変異原、および/または変異誘発を促進する方法に曝露することが含まれる。このようなその他の変異原を使用して、標的RNA分子に導入される変異の総数を増加させることができる。好ましい実施形態においては、複製は、少なくとも1種類の化学的変異原の存在下で実施する。
【００８６】
変異導入後、変異RNA集団をコピーするか、または増幅し改変表現型(所望する活性)について分析することができる。他のコピー工程または増幅工程にはRNAからDNAへの核酸変換を含めることができる。
【００８７】
本発明の方法によって生成したRNAおよびDNA分子は、特に治療薬または予防薬として有利であることが理解されよう。たとえば、コードポリペプチドの安定性および発現が高められたRNAおよびDNA分子は、遺伝子治療法または核酸ワクチン組成物において特に有用である。高い安定性、または触媒活性またはアンチセンス活性の増大を示す触媒RNA分子、dsRNA分子およびアンチセンス構築物はまた、特に有利な治療薬である。
【００８８】
したがって、本発明の他の一実施形態では、ワクチン成分として、または遺伝子治療用に使用する、対象とする蛋白質をコードするRNAは、本発明の方法のいずれかによって変異させ、ヌクレアーゼを含めた潜在的不活性化単位に対する安定性の増加で選択する。ワクチン接種または遺伝子治療を必要とする患者に、このような投与のために公知の多くの技術のいずれかによって、この安定化RNAを直接投与する。このような安定化RNAは、有用であるが限定された期間、コードした蛋白質を発現することが期待できる。DNA投与に関連した、無期限の長期発現および宿主細胞ゲノムへの潜在的組み込みに関する問題は、本発明の安定化RNAを使用することによって回避される。
【００８９】
他の態様では、本発明は本発明を使用して生成した変異核酸、および/またはそれによってコードされた変異蛋白質を提供する。本発明の方法を使用して生成した変異核酸、および/またはそれによってコードされた変異蛋白質もまた、医学、農学または産業で使用するために提供される。
【００９０】
明らかなように、本発明の一態様の好ましい特徴および特性は、本発明の多くのその他の態様に適用することができる。
【００９１】
本明細書で使用した「含む(comprise)」、「含む(comprises)」および「含んでいる(comprising)」という用語は、さらなる成分または特性あるいはさらなる成分または特性の群を含む、または含まない、一定の成分または特性あるいは成分または特性の群を含めることを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９２】
[一般的な技術および定義]
特に指示がなければ、本発明で利用した組換えDNA技術は、当業者には周知の標準的方法である。このような技術は、本明細書に参照により援用したJ.Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning、John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T. A. Brown(著)、Essential Molecular Biology:A Practical Approach、1巻および2巻、IRL Press (1991)、D. M. GloverおよびB. D. Hames (著)、DNA Cloning: A Practical Approach、1-4巻、IRL Press(1995および1996)、およびF. M. Ausubel他(著)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの改訂版を全て含める)などの文献類に記載され、説明されている。特に、これらの文献は、核酸分子の転写または複製の詳細な方法およびそれらに必要な適切な条件を説明している。
【００９３】
本明細書で使用した「ヌクレオシド」とは、ペントースに共有結合したプリン(グアニン(G)またはアデニン(A))またはピリミジン(チミン(T)、ウリジン(U)またはシチジン(C))塩基からなる化合物のことであり、一方「ヌクレオチド」とは、そのペントースヒドロキシル基の1つがリン酸化されたヌクレオシドのことである。「XTP」、「XDP」および「XMP」はリポヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの一般名称で、当業界の標準的用例に合わせて「TP」は三リン酸を表し、「DP」は二リン酸を表し、「MP」は一リン酸を表す。リボヌクレオチドの亜属名称は、「NMP」、「NDP」または「NTP」であり、デオキシリボヌクレオチドの亜属名称は「dNMP」、「dNDP」または「dNTP」である。本明細書で使用した「ヌクレオシド」に含まれるものは、前記のヌクレオシドの基質として通常使用する物質で、たとえば、これらの塩基の修飾型(たとえば、メチルグアニン)またはイノシンなどの当業界でこのような用途で周知の合成物質でもある。
【００９４】
[リバビリンおよびその誘導体/アナログ]
商標名ビラゾール(インターフェロン-αと組み合わせてレベトロンとしても知られている)として知られているリバビリン(1-ベータ-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール)(式I)は、1972年にSidwellおよび共同研究者によって見出された広範な抗ウイルスヌクレオシドである。リバビリンは、商業的供給業者(たとえば、SigmaおよびICN)から入手できる。リバビリンは、アレナウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ピコナウイルス、レオウイルスおよび2本鎖RNA中間体を介して複製するいくつかのDNAウイルスの仲間から得られたRNAウイルスを含む細胞培養物においては、広範囲のウイルスに対して抗ウイルス活性を示す(Markland他、2000)。リバビリンの有効性は、動物モデル系においては限定され、一般的により限定されたRNAウイルス群のみに対して効果がある(Durr and Lindh、1975、Hruska他、1982、von Herrath他、2000)。ヒトにおいては、リバビリンは呼吸系発疹ウイルス(Wyde、1998)およびラッサ熱ウイルス(McCormick他、1986)の重症例の治療に現在使用しており、インターフェロン-αと組み合わせてC型肝炎ウイルス感染(McHutchison他、1998)の治療に使用されている。
【００９５】
【化１】
2006504438.tif 000002
【００９６】
本発明の方法に有用なリバビリン誘導体/アナログには、一般式IIからVに含まれる分子が含まれるが、それだけには限定されず、式中、XはO、S、CH2、CHOHまたはN-CO-R11であり、A、BおよびCは独立してN、P、CH、C-OH、C-CH3、C-アルキル、C-アルケニル、C-CH2、-CN、C-ハロゲン、C-CN、C-COOCH3、C-NH2、C-SNH2、C-SO2-NH2、C-CONH2、C-CS-NH2、C-C(NH)NH2、CPO2-NH2、またはC-複素環系であり、DはS、Se、Te、PH、NHまたはNR12であり、R1はH、(CH2)p(OH)、ハロゲン、CN、(CH2)pONH2、(CH2)pNH2、CH3、CH2SPHまたは(CH2)-複素環であり、R2はH、OH、OCH3、SH、SCH3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2、NHCH3(CH2)OH、(CH2)pNH2、CH3、またはCOOMeであり、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は独立して、H、OH、OCH3、SH、SCH3、ハロゲン、CN、NH2、ONH2、NHCH3(CH2)OH、(CH2)pNH2、CH3、またはCOOMeまたはフェニルであり、R9はH、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COOMe、SNH2、SO2NH2、P02NH2、(CH2)p、(CH2)p-複素環系または(CH2)p-グルコースであり、R10はH、ハロゲン、NH2、CH3、CONH、CSNH2、COOMe、SNH2、SO2NH2、P02NH2、(CH2)p、(CH2)p-複素環系または(CH2)p-グルコース、O-CH3、O-CH2CH3またはアミノ酸であり、YはO、S、NH・HCI、NOH、NOCH3またはNOCH2PHであり、R10&Yは一緒になってチアゾール、イミダゾールなどの複素環系であり、R11はCH3(CH2)pNH2、(CH2)p-複素環、(CH2)p-アミノ酸または(CH2)p-糖(グルコースなど)であり、pは0と8との間の整数である。
【００９７】
これらの誘導体/アナログは、WO97/26883およびWO01/45509に記載されたような当業界で公知の方法によって合成することができる。
【００９８】
リバビリン、およびそれらの誘導体/アナログは、非リン酸化型またはリン酸化型で使用することができる。
【００９９】
リバビリン、およびその誘導体/アナログは、L配置またはD配置のいずれかであることができる。したがって、商標名「レボビリン」として販売されているL配置のリバビリン、いわゆる(1-β-L-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキシアミド)はまた、本発明の方法に有用である。
【０１００】
リバビリンの誘導体/アナログには、脂肪酸エステルが含まれる。特に、該脂肪酸は、一般的に米国特許第6153594号に記載されたようなモノ飽和C18またはC20酸であることができる。このような脂肪酸エステルは特に、リバビリンの誘導体/アナログが細胞膜を横断することが必要なin vivoまたは全細胞での変異誘発に有用である。
【０１０１】
本発明の方法に有用なリバビリン、およびその誘導体/アナログはまた、DNAポリメラーゼによってDNA分子に容易に取り込まれ得る2'-デオキシリボースを含むことができる。
【０１０２】
さらに、他のリバビリン誘導体/アナログは、合理的な創薬設計およびコンビナトリアル化学の従来の技術を使用して創生することができる。ある取り組みでは、リバビリンの化学構造をコンピューターで読み取り可能な媒体に記録し、1種または複数のモデル化ソフトウェアアプリケーションプログラムによって処理する。次に、仮想ライブラリーで創り出されたモデル化リバビリン誘導体/アナログと同一の構造を有する化合物を、従来の科学技術を使用して創生するか、または化学的原料から得ることができる。次に、新たに製作したリバビリン誘導体/アナログを本発明の方法で使用するためにスクリーニングする。
【０１０３】
【化２】
2006504438.tif 000003
【０１０４】
リバビリン、およびその誘導体/アナログの可能なプロドラッグ型は全てまた、本発明の方法で使用するのに適している。特に企図したプロドラッグ型には、in vivoまたは無細胞系に存在し得るアミノヒドロラーゼ、オキシドレダクターゼまたはトランスフェラーゼなどの酵素作用によって化合物から酵素的に除去することができる共有結合修飾が含まれるが、それだけには限定されない。
【０１０５】
[標的核酸およびその転写/複製]
標的核酸は、機能的核酸配列(たとえば、プロモーターまたはエンハンサーエレメントなどの調節エレメント、触媒分子、dsRNAまたはアンチセンス分子)であってよく、または対象とする蛋白質をコードしてよい。状況によっては、標的核酸は未知である。好ましい実施形態では、該標的核酸は、i)標的結合蛋白質ライブラリーまたはii)単一の標的結合蛋白質をコードしており、該標的には細胞表面分子、受容体、酵素、抗体またはそれらの断片、ホルモン、ウイルスなどの微生物、またはその他の分子または複合体またはそれらの誘導体のいずれかを含めることができる。
【０１０６】
該標的核酸はまた、コードされた蛋白質の精製を助けるために融合させたか、そうでなければ結合させたタグであるドメインをコードすることができる。適切なタグ部分には、たとえば、Hisタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、「FLAG」エピトープ(DYKDDDDK)(配列番号1)(International Biotechnologies)、またはヒトまたはマウス抗体の定常ドメインのいずれかが含まれる。該タグは、マウスモノクローナル抗体の定常ドメイン、たとえば定常領域1C3であることが好ましい。他の好ましいタグは、ヒトIgM抗体の定常ドメインである。
【０１０７】
該標的核酸はさらに、5'および3'非翻訳領域を含んでよい。該5'非翻訳領域は、該核酸の転写を促進する適切な制御因子を必要とする。いくつかの実施形態では、転写されたRNAは蛋白質に翻訳されるので、該核酸鋳型はまた、リボソーム結合部位を含むことが可能である。
【０１０８】
状況によっては、該鋳型は、翻訳終止(停止)ヌクレオチド配列を含むDNAである。しかし、いくつかのDNA鋳型構築物、特にコードされた蛋白質をリボソームディスプレイによって調べる場合の構築物においては(以下参照)、遊離因子による認識、およびその後のリボソーム遊離を防ぐために停止コドンを存在させるべきではないと考えられる。これらの状況においては、アンチセンスssrAオリゴヌクレオチド配列などの因子を添加して、その後の3'非翻訳領域のC-末端プロテアーゼ部位の添加を防ぐ。スパルソマイシンまたはその他の同様の化合物の添加、あるいは温度の低下はまた、mRNAおよび新規合成蛋白質からのリボソームの遊離を防ぐ。
【０１０９】
他の実施形態では、該標的核酸を変異させ、転写、および場合によっては翻訳に必要な調節領域を含む適切な発現ベクターにクローニングする。
【０１１０】
[アンチセンス化合物]
「アンチセンス化合物」という用語は、標的mRNA分子の少なくとも一部と相補的(Izant and Weintraub、1984、Izant and Weintraub、1985)で、mRNA翻訳などの転写後の現象を妨害することができるDNAまたはRNA分子を包含する。標的とするコードmRNAの少なくとも約15個の連続したヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴマーは、合成が容易で、標的mRNA生成細胞に導入するとき大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が少ないので、好ましい。アンチセンスを使用する方法は、当業界でよく知られている(Marcus-Sakura、1988)。
【０１１１】
[触媒RNA分子]
触媒RNAという用語は、特異的に異なる基質を認識し、この基質の化学修飾を触媒するRNAまたはRNA含有分子(「リボザイム」としても知られている)のことである。触媒核酸における核酸塩基は、塩基A、C、G、TおよびU、並びにそれらの誘導体であることが可能である。これら塩基の誘導体は、当業界でよく知られている。
【０１１２】
一般的に、該触媒核酸には、標的核酸を特異的に認識するためのアンチセンス配列、および酵素活性を結びつけた核酸(本明細書では、「触媒ドメイン」とも呼ぶ)が含有される。
【０１１３】
本発明に特に有用なリボザイムの種類は、ハンマーヘッドリボザイム(Haseloff and Gerlach 1988、Perriman他、1992)およびヘアピンリボザイム(Shippy他、1999)である。
【０１１４】
本発明で使用したリボザイムは、当業界で周知の方法を使用して化学的に合成することができる。該リボザイムはまた、RNAポリメラーゼプロモーター、たとえば、T7 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼに操作可能に結合させた(転写時に、RNA分子を産生する)DNA分子から調製することができる。該ベクターがまた、DNA分子に操作可能に結合させたRNAポリメラーゼプロモーターを含有するとき、該リボザイムは、RNAポリメラーゼおよびヌクレオチドと共にインキュベートして、in vitroで生成することができる。他の実施形態では、該DNAを発現カセットまたは転写カセットに挿入することができる。
【０１１５】
[dsRNA]
dsRNAは、特定の蛋白質の産生を特異的に阻害するために特に有用である。理論に結びつけることは望まないが、Dougherty and Parks(1995)は、dsRNAを使用して蛋白質産生を減少させることができる機構のモデルを提唱した。このモデルは、Waterhouse他(1998)によって変更され、拡大された。この技術は、対象とする遺伝子のmRNAと本質的に同一な配列を含有するdsRNA分子が存在することに基づいている。便利なことに、組み換えベクターまたは宿主細胞における単一のオープンリーディングフレーム（センスおよびアンチセンス配列が関係のない配列を挟んでいる）で、該dsRNAを生成することができ、センスおよびアンチセンス配列がハイブリダイズすることによってループ構造を形成する関係のない配列を有するdsRNA分子が形成される。対象とする遺伝子を標的とした適切なdsRNAの設計および生成は、特にDougherty and Parks(1995)、Waterhouse他(1998)、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029およびWO01/34815を考慮すれば、当業者の技能の範囲内である。
【０１１６】
本明細書で使用したように、「小さな干渉RNA」および「RNAi」という用語は、遺伝子産物を特異的に標的とし、それによって無発現表現型、または低形質表現型を生じる相同2本鎖RNA(dsRNA)のことである。具体的に、該dsRNAには、標的RNAから得られ、アニールすることによって、おそらく転写後の工程で標的遺伝子の発現を妨害することができるように、自己相補性を有する2種類のヌクレオチド配列を含む。RNAi分子は、Fire他(1988)によって記載され、Sharp(1999)によって概説されている。
【０１１７】
[Qβレプリカーゼによる変異]
Qβレプリカーゼ作用の結果、1本鎖RNA鋳型の複数コピーが生じる。これらのコピーは変異を取り込み、両RNA鎖が等温条件下で同等に鋳型としての効果を有するので、Qβレプリカーゼによるさらなる増幅の鋳型としてそれ自体役立つことができる。
【０１１８】
当業界の教えるところでは、Qβなどのファージから得られた完全長RNAに存在する複雑かつ安定な2次および3次構造は、蛋白質開始部位にリボソームが接近するのを制限する。しかし、本発明者等は、小さなRNA配列はレプリカーゼの結合に適しており、したがって完全長鋳型の代わりに使用できることを知見した。好ましい配列は、Qβレプリカーゼによる増幅に適合したシュードノット(brown and Gold 1995、1996)として知られる小さな合成RNA配列である。本発明の場合では、シュードノットを使用することによって、RNAおよびそれに融合した配列のQβレプリカーゼ増幅に必要かつ十分な結合部位を維持しながら蛋白質開始部位へのリボソーム接近の問題を克服することができる。
【０１１９】
[発現ベクター]
改変した表現型を有する蛋白質は、本発明の方法を使用して得られた核酸を適切な宿主細胞にクローニングし、これらの組換え細胞によって産生された蛋白質の所望する活性をスクリーニングすることによって同定することができる。あるいは、標的核酸を適切なベクターにクローニングすることが可能で、このベクターに無細胞系で本発明の変異誘発を行い、得られた生成物を適切な宿主細胞に形質転換/トランスフェクトすることができる。
【０１２０】
本明細書で説明した発現ベクターを使用して、本発明の方法で生成するが、蛋白質には翻訳されない機能性核酸を転写または複製することができる。このような機能性核酸の例には、リボザイム、dsRNAおよびアンチセンスポリヌクレオチドが含まれる。
【０１２１】
本発明の方法に有用な発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターであるか、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれであってもよい。一般的に、これらの発現ベクターには、変種蛋白質をコードする核酸に機能的に結合した転写および翻訳調節核酸が含まれる。本明細書では、「制御配列」という用語またはその文法的に同等な用語は、特定の宿主生物における機能的に結合したコード配列の発現に必要な核酸配列のことである。原核細胞に適した制御配列には、たとえば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１２２】
核酸は、他の核酸配列に機能的関係に置かれるとき、「機能的に結合している」。たとえば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆蛋白質として発現させるならば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーをコードするDNAを、該ポリペプチドをコードするDNAに機能的に結合させる。コード配列の転写に影響を与えるならば、プロモーターまたはエンハンサーを、該配列に機能的に結合させる。コード配列の翻訳を容易にするように配置するならば、リボソーム結合部位は、該配列に機能的に結合させる。一般的に、「機能的に結合した」とは、結合している核酸配列同士が近接しており、分泌リーダーの場合は、近接してリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接させる必要はない。結合は、便利な制限部位で連結することによって実現することができる。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター、リンカーまたは組換え方法を従来の方法に従って使用する。転写および翻訳調節核酸は、一般的に融合蛋白質を発現するために使用した宿主細胞に適切であり、たとえば、アスペルギルスの転写および翻訳調節核酸配列は、アスペルギルスにおける蛋白質の発現に使用することが好ましい。当業界では、様々な宿主細胞用に、数多くの種類の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が知られている。
【０１２３】
一般に、該転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、およびエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得るが、それだけには限定されない。調節配列にはまた、たとえばRNAスプライシングに影響を与えることによって他の遺伝子の活性を調節する、独立した核酸分子を含めることができる。好ましい実施形態では、該調節配列にはプロモーターおよび転写開始配列および終止配列が含まれる。プロモーター配列には、構成型または誘導型いずれかのプロモーターが含まれる。該プロモーターは、天然に生じるプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。1個以上のプロモーターのエレメントを一緒にしたハイブリッドプロモーターはまた当業界では公知で、本発明において有用である。
【０１２４】
さらに、該発現ベクターには、他のエレメントを含めることができる。たとえば、該発現ベクターは、2個の複製系を有することが可能で、したがって、2種類の生物内で維持することが可能で、たとえば、糸状菌細胞内で発現させ、原核細胞宿主でクローニングおよび増幅させることができる。さらに、発現ベクターを完全なものにするために、該発現ベクターをゲノムに無作為に組み入れるか、または宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも1個の配列において、好ましくは、発現構造物に隣接した2個の相同な配列において含めることができる。組み込まれたベクターは、該ベクターに含めるための適切な相同配列を選択することによって、宿主細胞の特異的遺伝子座に特異的にすることができる。組み込むベクターの構造は、当業界で周知である。さらに、好ましい実施形態では、該発現ベクターは形質転換した宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択遺伝子は、当業界では周知で、使用した宿主細胞によって変わる。
【０１２５】
[in vitro翻訳系]
本発明の方法では、蛋白質の翻訳は無細胞翻訳系内で起こさせることができる。該翻訳系は、当業界で公知の、原核細胞または真核細胞から得られた系を含めた、このような任意の系であることができる。例には、ウサギ網膜細胞溶解物(He and Taussig、1997)または大腸菌S-30転写翻訳ミックス(Mattheakis他、1994、Zubay、1973)の使用が含まれる。真核細胞におけるmRNA合成には、該mRNAは、過剰なジグアノシン三リン酸を添加することによってキャップを実施することが好ましいが、商用供給業者PromegaおよびNovagen製のウサギ網膜細胞系は、キャップ化合物の添加を不要とする成分を系内に有している。転写/翻訳共役系は、変異DNAQ遺伝子を有し、したがって校正エラーの結果として複製中にDNAにさらに無作為変異を導入させる大腸菌変異細胞MUTD5-FIT(Irving他、1996)から抽出することができる。該共役系にグルタチオンを添加すると、ディスプレイされた蛋白質の正確な折り畳みが促進され、したがって、その後の対受容体または抗原への結合および選択が促進される。
【０１２６】
さらに、無細胞in vitro進化系において分子を正確に折り畳むためには、要求される必要条件がある。原核細胞の場合、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)およびシャペロンを使用することができ、並びにC末端アンカードメインによって正確に折り畳むことができる。後者は、原核細胞蛋白質は折り畳まれる前にリボソームから遊離する(Ryabova他、1997)ので、必要であり、したがって、ペプチドをリボソームに固定する場合、全蛋白質はリボソームから離れていることが必要である。これとは対照的に、真核細胞系では、蛋白質は合成時に折り畳まれ、原核細胞PDIおよびシャペロンを添加する必要はない。しかし、特定範囲のグルタチオン濃度を添加すると、三要素リボソーム複合体上に正確に折り畳まれた蛋白質のディスプレイが促進され、ライブラリー選択に有益である。
【０１２７】
[in vivo翻訳系]
本発明の方法では、蛋白質の翻訳は細胞全体で起こさせることができる。該核酸を、単独で、または発現ベクターと組み合わせて、該細胞内に導入する。本明細書では、「に導入する」またはこれと文法的に同等な表現は、核酸のその後の発現に適した方法で該核酸を該細胞に入れることを意味する。該導入方法は、以下に説明するように、標的とする細胞種類によって概ね決定される。方法の例には、PEG媒介プロトプラスト形質転換、CaPO4沈殿法、リポソーム融合、Lipofectin(商標)(たとえば、陽イオン性脂質の形成)、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが含まれる。該核酸は、(従来のプラスミドを使用して、標準調節配列、選択マーカーなどを利用して)宿主ゲノムに安定して組み込まれるか、細胞質に一時的に、または安定的に存在することができる。
【０１２８】
本発明の方法を使用して生成した変異核酸によってコードされた蛋白質は、該蛋白質をコードする核酸を含有する発現ベクターまたは該蛋白質のみをコードする核酸のいずれかで形質転換された宿主細胞を、該蛋白質の発現を誘導するか、引き起こす適切な条件下で、培養することによって産生することができる。蛋白質発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変化し、当業者であれば容易に基本的な実験を通じて確認できよう。たとえば、該発現ベクターで構成的プロモーターを使用する場合、宿主細胞の成長および増殖の最適化が必要である一方、誘導性プロモーターを使用する場合には誘導するために適切な増殖条件が必要である。
【０１２９】
適切な宿主細胞には、酵母、細菌、古細菌、菌類、並びに昆虫および哺乳類細胞を含めた動物細胞が含まれる。具体的な例には、キイロショウジョウバエおよびその他の昆虫細胞、パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)およびPchia pastorisなどのその他の酵母、大腸菌(E.coli)、バシラス(bacillus)種、SF9細胞、C129細胞、293細胞、パンカビ(Neurospora)種、トリコデルマ(Trichoderma)種、アスペルギルス(Aspergillus)種、フサリウム(Fusarium)種、ペニシリウマ(Penicilliuma)種、ストレプトマイセス(Streptomyces)種およびBHK、CHO、COSなどの哺乳類細胞が含まれるが、これだけには限定されない。
【０１３０】
一実施形態では、該蛋白質は哺乳類細胞内で発現する。哺乳類細胞発現系はまた、当業界で公知で、レトロウイルス系が含まれる。哺乳類プロモーターは、哺乳類RNAポリメラーゼに結合し、融合蛋白質のコード配列のmRNAへの下流(3')転写を開始することができる任意のDNA配列である。プロモーターは、通常該コード配列の5'末端に近接して配置される転写開始領域、および通常該転写開始部位の25〜30塩基対上流に位置するTATAボックスを有する。該TATAボックスは、RNAポリメラーゼIIに特異的で、正確な部位でRNA合成を開始すると考えられる。哺乳類プロモーターはまた、一般的にTATAボックスの上流100から200塩基対に位置する上流プロモーター因子(エンハンサー因子)を含有する。上流プロモーター因子によって、転写開始速度、および作用方向も決定される。哺乳類プロモーターとしての特に使用されるのは、哺乳類ウイルス遺伝子のプロモーターであり、なぜならば、ウイルス遺伝子は発現性が高く、宿主範囲が広いからである。例には、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純疱疹ウイルスおよびCMVプロモーターが含まれる。
【０１３１】
一般的に、哺乳類細胞によって認識される転写停止配列およびポリアデニル化配列は翻訳終止コドンの3'に位置する調節領域で、したがって、該プロモーター因子と一緒に、コード配列に隣接する。成熟mRNAの3'末端は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化によって形成される。転写終結因子およびポリアデニル化シグナルの例には、SV40から得られたものが含まれる。
【０１３２】
外来核酸を哺乳類宿主並びにその他の宿主に導入する方法は、当業界で周知であり、使用する宿主細胞によって変化させる。技術には、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、および核酸の核内への直接マイクロインジェクションが含まれる。
【０１３３】
当業者であればわかるように、本発明で使用した哺乳類細胞の種類は、大きく変更することができる。当業者であればわかるように、シュードタイピングによる系の変更によって全真核細胞、好ましくは高等真核細胞を使用することが可能であるが、基本的に、任意の哺乳類細胞を使用することが可能で、マウス、ラット、霊長類およびヒトの細胞が特に好ましい。したがって、適切な哺乳類細胞の種類には、全種類の腫瘍細胞(特に、メラノーマ、骨髄性白血病、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎癌、前立腺癌、膵臓癌および睾丸癌)、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球(T細胞およびB細胞)、マスト細胞、好酸球、血管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含めた白血球、(分化および脱分化因子のスクリーニングに使用するための)造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞幹細胞などの幹細胞、破骨細胞、軟骨細胞およびその他の結合組織細胞、表皮細胞、メラニン形成細胞、肝細胞、腎細胞および脂肪細胞が含まれるが、それだけには限定されない。適切な細胞にはまた、ジャーカットT細胞、NIH3T3細胞、CHO、COS(ATCC細胞系カタログを参照、これによって明白に参照により援用する)などを含めた公知の研究細胞が含まれるが、それだけには限定されない。
【０１３４】
一実施形態では、該細胞はさらに遺伝子操作されてよく、すなわち、該細胞は本発明の方法を使用して生成した組換え核酸以外の外来核酸を含有する。
【０１３５】
好ましい実施形態では、該蛋白質は細菌系で発現する。細菌発現系は、当業界でよく知られている。適切な細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼに結合し、蛋白質のコード配列のmRNAへの下流(3')転写を開始することができる任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、通常コード配列の5'末端に近接して配置された転写開始領域を有する。この転写開始領域は、一般的にRNAポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を形成する。例として、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースなどの糖代謝酵素から得られたプロモーター配列、およびトリプトファンなどの生合成酵素から得られた配列が含まれる。バクテリオファージのプロモーターもまた使用することができ、当業界で公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用で、たとえば、tacプロモーターはtrpおよびlacプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターには、細菌RNAポリメラーゼに結合して転写を開始する能力を有する、非細菌由来の天然に生じるプロモーターを含めることができる。
【０１３６】
プロモーター配列を機能化することに加えて、効率的なリボソーム結合部位が所望される。大腸菌では、該リボソーム結合部位は、シャイン-ダルガルノ(SD)配列と呼ばれ、開始コドンおよび開始コドンの3〜11個ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド長3〜9個の配列が含まれる。
【０１３７】
該発現ベクターにはまた、細菌で発現した蛋白質の分泌をもたらすシグナルペプチド配列を含めることができる。当業界で周知なように、該シグナル配列は一般的に、該細胞から蛋白質の分泌を起こさせる疎水性アミノ酸を含むシグナルペプチドをコードする。該蛋白質は増殖培地(グラム陽性細菌)または細胞の内膜と外膜との間に位置する細胞膜周辺腔(グラム陰性細菌)に分泌することができる。発現した蛋白質はまた、細菌細胞壁内の封入体に蓄積することができる。細菌における発現では、通常、再結合核酸に操作可能に結合した細菌分泌リーダー配列が好ましい。
【０１３８】
細菌発現ベクターにはまた、形質転換した細菌種の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含めることができる。適切な選択遺伝子には、細菌をアンピシリン、クロラームフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬剤に耐性にさせる遺伝子を含めることができる。選択マーカーはまた、生合成遺伝子、たとえば、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路における遺伝子を含めることができる。これらの構成エレメントは発現ベクターに組み込まれる。細菌の発現ベクターは当業界では周知で、中でも枯草菌(Bacillus subtilis)、大腸菌、ストレプトコッカスクレモリス(Streptococcus cremoris)、およびストレプトコッカスリビダンス(Streptococcus lividans)のベクターが含まれる。
【０１３９】
該細菌発現ベクターは、たとえば、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーションその他の当業界で周知の技術を使用して細菌宿主細胞を形質転換する。
【０１４０】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質は昆虫細胞で産生される。昆虫細胞を形質転換するのための発現ベクター、特にバキュロウイルスをベースにした発現ベクターは当業界では周知である。
【０１４１】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質は酵母細胞で産生される。酵母発現系は当業界で周知で、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)およびC.マルトーサ(C.maltosa)、ハンセヌラポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセスフラジリス(Kluyveromyces fragilis)およびK.ラクチス(K.lactis)、ピヒアグイレリモンジ(Pichia guillerimondii)およびP.パストリス(P.pastoris)、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)およびヤロビアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)の発現ベクターが含まれる。酵母での発現に好ましいプロモーター配列には、誘導性GAL 1,10プロモーター、アルコール脱水素酵素エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸-デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼおよびその酸ホスファターゼ遺伝子のプロモーターが含まれる。酵母選択マーカーには、ツニカマイシンに対する耐性を付与するURA3、ADE2、HIS4、LEU2、TRP1、およびALG7、G418に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、銅イオン存在下での酵母の増殖を可能にするCUP1遺伝子が含まれる。
【０１４２】
さらに、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質はさらに、所望するならば、たとえば発現を増加させるため、または安定性を増大させるために、その他の蛋白質に融合することができる。
【０１４３】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質を発現させた後精製または単離する。該蛋白質は、試料中に他にどんな成分が存在するかに応じて、当業者に公知の様々な方法で単離または精製することができる。標準的精製方法には、電気泳動、分子学的、免疫学的技術並びに、イオン交換、疎水性、アフィニティおよび逆相HPLCクロマトグラフィーを含めたクロマトグラフィー技術並びにクロマトフォーカシングが含まれる。たとえば、該蛋白質は、標準的抗体カラムを使用して精製することができる。限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた、蛋白質濃縮と相まって有用である。適切な精製技術における一般的な指針については、Scopes、R.、Protein Purification、Springer-Verlag、NY(1982)を参照のこと。必要な精製程度は、使用する蛋白質に応じて変化させる。精製が必要ない場合もある。
【０１４４】
[他の変異誘発方法または変異原の使用]
本発明の方法はさらに、標的核酸を、リバビリンまたはその誘導体/アナログ以外の、やはり複製または転写の間に変異を導入するその他の変異原、および/または変異誘発を促進する方法に曝露することを含めることができる。このようなその他の変異原/変異誘発方法を使用して、標的核酸分子に導入する変異の総数を増加させることができる。これらその他の変異原/変異誘発方法は、本発明の複製または転写工程を実施する前後または最中に使用することができる。
【０１４５】
変異頻度を増加させるために当業界で通常使用される因子はたくさんあり、(一般的には、校正活性が減少しているか、または欠損しているポリメラーゼの結果として)エラー率が高いポリメラーゼの使用、変異頻度を増加させる条件下での反応の実施(エラープローンPCR)、照射、DNAシャッフリング技術、(リバビリンまたはその誘導体/アナログ以外の)ヌクレオチド/ヌクレオシドアナログおよび挿入剤が含まれるがそれだけには限定されない。
【０１４６】
エラープローンPCRには、長い配列に無作為に点突然変異を低濃度で導入する忠実度の低い重合化条件を使用する(Leung他、1989、Caldwell and Joyce、1992)。エラープローンPCRは一般的に、様々な量のマンガンおよびdGTPを添加してPCR反応を実施することが必要である。TaqポリメラーゼなどのDNA依存性DNAポリメラーゼは、活性および忠実度にMg2+を必要とする。Mn2+を該PCR反応物に(Mn2+最大濃度650μMまで)添加することによって、Taqポリメラーゼの忠実度は減少し、DNA鋳型に沿って取り込み間違いを起こさせる。この取り込み間違いは、Mn2+濃度を上限で固定し、さらにdGTPを添加して(40から300μM)ヌクレオチドプールを偏らせることによって、さらに増加させることができる。PCRをこのように変更することによって、変異率は理論的に調整し、PCR反応物に添加したMn2+の濃度およびdGTP濃度に応じて1000塩基対当たり2から8変異の変異率をもたらすことができる。
【０１４７】
BD Biosciences製のDiversify(商標)PCRランダム突然変異誘発キットを使用したエラープローンPCRは、表1に概略を示したように実施することができる。各緩衝液条件には、異なる濃度のMn2+およびdGTPを含めた。各緩衝液条件について予測されるエラー率もまた該表に含め、BD Biosciencesによって蓄積されたデータをベースとする。
【０１４８】
【表１】
2006504438.tif 000004
【０１４９】
使用可能な熱サイクル条件の一例は、
94℃30秒を1回
94℃30秒
68℃60秒を25回
68℃60秒を1回
である。
【０１５０】
あるいは、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって他の変異を鋳型ポリヌクレオチドに導入することができる。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発では、ポリヌクレオチドの短い配列を、制限酵素消化を使用してポリヌクレオチドから除去し、元の配列から様々な塩基を変更した合成ポリヌクレオチドと置換する。
【０１５１】
DNAシャッフリング法は、いくつかの親配列の遺伝物質を混合し、連結することに基づく。当業界で公知のこの方法には多くの変法があり、たとえば、Stemmer、(1994)、Volkov and Arnold(2000)、米国特許出願番号第20030194763号および米国特許出願番号第20030186356号を参照されたい。
【０１５２】
該ポリヌクレオチド配列はまた、化学的変異誘発によって改変することができる。化学的変異原には、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたは蟻酸が含まれる。ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体のアナログであるその他の薬剤には、ニトロソグアニジン、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、5-ホルミルウリジン、イソグアノシン、アクリジンおよびN4-アミノシチジン、N1-メチル-N4-アミノシチジン、3,N4-エテノシチジン、3-メチルシチジン、5-ヒドロキシシチジン、N4-ジメチルシチジン、5-(2-ヒドロキシエチル)シチジン、5-クロロシチジン、5-ブロモシチジン、N4-メチル-N4-アミノシチジン、5-アミノシチジン、5-ニトロソシチジン、5-(ヒドロキシアルキル)-シチジン、5-(チオアルキル)-シチジンおよびシチジングリコール、5-ヒドロキシウリジン、3-ヒドロキシエチルウリジン、3-メチルウリジン、O2-メチルウリジン、O2-エチルウリジン、5-アミノウリジン、O4-メチルウリジン、O4-エチルウリジン、O4-イソブチルウリジン、O4-アルキルウリジン、5-ニトロソウリジン、5-(ヒドロキシアルキル)-ウリジンおよび5-(チオアルキル)-ウリジン、1,N6-エテノアデノシン、3-メチルアデノシンおよびN6-メチルアデノシン、8-ヒドロキシグアノシン、O6-メチルグアノシン、O6-エチルグアノシン、O6-イソプロピルグアノシン3,N2-エテノグアノシン、O6-アルキルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、2,N3-エテノグアノシンおよび8-アミノグアノシン並びにそれらの誘導体/アナログが含まれる。適切なヌクレオシド前駆体およびその合成の例は、米国特許出願番号第20030119764号に詳細に記載されている。一般的に、これらの薬剤を複製または転写反応に添加して、それによって該配列を変異させる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどの挿入剤もまた使用することができる。
【０１５３】
ポリヌクレオチド配列の無作為変異誘発はまた、X線または紫外線の照射によって実施することができる。
【０１５４】
表現型が改変した核酸または蛋白質/ペプチドの選択方法
「改変表現型」、「所望する活性」および「改変された活性」という用語は、本明細書では一般的に交換可能に使用される。
【０１５５】
本発明の具体的な実施形態では、変異した核酸またはそれによってコードされた蛋白質の改変された表現型を同定するために測定を行う。改変表現型を同定するために適切な方法には、以下に説明する方法が含まれるが、それだけには限定されない。
【０１５６】
[発現が増加したRNA分子の選択]
RNA分子中の変異がコードされた蛋白質の発現増加を引き起こす様々な方法がいくつかあることは当業者にはわかるだろう。たとえば、該変異によって、安定性の増大、発現宿主用の好ましいコドン利用、RNAの翻訳機構への接近しやすさが高まったことによるより効果的な蛋白質合成、またはこれらのエレメントの組み合わせがもたらされ得る。
【０１５７】
一実施形態では、該選択方法には、細胞または無細胞翻訳系においてコードされた蛋白質を発現し、該コード蛋白質に結合する分子に対してパニングすることが含まれる。この実施形態では、該方法には、適切な濃度の結合相手を、正確に折り畳み、結合できる任意の変種の選択を可能にするパニング工程で使用することが含まれる。RNA特性が改善/改変された変種を選択するために、注意深く結合相手の濃度を選択することが重要である。一実施形態では、翻訳蛋白質は、限定された量の可溶性ビオチン化結合相手と混合し、したがって該結合相手は該蛋白質より過剰となるが、該結合相手の量は野生型コード蛋白質の解離定数(Kd)と同等の濃度となる。該結合相手に結合する蛋白質は次に、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して選択することができる。前記パニング方法を使用して選択した変種について、次に結合測定法を行う。該結合測定法、たとえば、ELISA測定法を使用して、野生型の応答よりも大きな応答をもたらすクローンを同定する。この結合測定法によって同定された変種は、結合親和性が改変されているので、非常に少量で高い応答性を示す。しかし、この結合測定法で同定された変種の大部分は、RNA安定性または有効性の増大により応答性が高い一方、結合親和性は野生型RNA分子から得られた蛋白質の親和性と同一または類似のままである。
【０１５８】
[安定性の増大したRNA分子の選択]
安定性の増大したRNA分子を選択するために適した方法は、当業界では公知である。たとえば、該安定性は、以下の方法によって評価することができる。
【０１５９】
RNAのin vivoにおける半減期の測定は、変異RNAを生成し、所定期間中宿主細胞から様々な時点でRNAを抽出することによって実施することができる。次に、抽出試料中における変異RNAの濃度は、(Hambraeus他、2002に記載されている通りに)ノーザンブロット分析またはノーザン分析後RT-PCRによって測定することができる。
【０１６０】
in vitroにおけるRNA濃度の測定は、RNA試料を室温で所定の時間インキュベートすることによって実施することができる。次に、RNA濃度は、SuperScript 1工程RT-PCR(Gibco-BRL)を使用した逆転写PCR(RT-PCR)およびサザン分析によって測定することができる。
【０１６１】
一実施形態では、該インキュベーションは、血液成分または真核細胞または原核細胞細胞外溶解物(たとえば、in vitro翻訳を実施するために使用したもの)の存在下で実施することができる。
【０１６２】
他の実施形態では、該RNAのインキュベーションは、高温で、またはリボヌクレアーゼの存在下で実施することができる。
【０１６３】
mRNA安定性の分析には、感度の良い、正確かつ信頼性のおける特異的mRNA配列の測定法が必要である。mRNAを定量するために使用することができる従来の技術には、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション、およびRNA分解酵素保護測定法(Emory and Belasco、1990)などのハイブリダイゼーションをベースとした方法が含まれる。逆転写とポリメラーゼ連鎖反応の組み合わせ(RT-PCR)による個々のRNA分子の増幅もまた使用しようすることができ、少量の核酸が指数関数的に増幅するのでより高い感受性が示された。この感度によって、少量のRNA試料からmRNAを検出することが可能である(Schmittgen他、2000)。
【０１６４】
定量的RT-PCR技術の最近の進歩には、リアルタイム定量PCR(Heid他、1996)の開発が含まれる。リアルタイムRT-PCRには、各反応サイクルの後PCR産物を検出する特定の技術が組み込まれている。リアルタイムPCRによって生じたDNAの検出には、2重標識蛍光発生ハイブリダイゼーションプローブ(TaqManプローブ)(Heid他、1996)およびSYBR green I minor groove DNA結合色素(Wittwer他、1997)を含めたいくつかの方法が有用である。リアルタイムPCRによって、DNA産物の高感度の検出が可能で、増幅の直線範囲における検出が確実で、PCR後の分析の必要性がなくなり、データ分析を簡略にするために特化されたソフトウェアを組み込まれている。
【０１６５】
[RNA2次構造の分析]
RNAの2次構造は、RNA折り畳み構造プログラムを使用して分析することができる。このようなプログラムの例は、オーストラリア、アデレードのアデレード大学の微生物学ウェブサイトから入手することができる(http://www.microbiology.adelaide.edu.au)。
【０１６６】
[蛋白質/ペプチドディスプレイ]
所望する活性、たとえば、予め決められた生物学的大分子(たとえば、受容体)への結合を備えた、本発明の方法を使用して生成した変異核酸によってコードされた蛋白質の1同定方法には、蛋白質/ペプチドの大きなライブラリーの該蛋白質/ペプチドのアミノ酸配列によって付与された所望する構造または機能的特性を備えた個々のライブラリー構成エレメントをスクリーニングすることが必要である。
【０１６７】
ペプチドライブラリーを作製するためには、直接的化学合成法に加えて、数種の組換えDNA法もまた報告されている。ある種には、バクテリオファージ粒子または細胞の表面上に、ペプチド配列、抗体、またはその他の蛋白質をディスプレイすることが必要である(Wittrup、2001の総説参照)。一般的に、これらの方法では、各バクテリオファージ粒子または細胞は、天然のバクテリオファージまたは細胞の蛋白質配列に加えて1種類のディスプレイペプチドをディスプレイする個々のライブラリー構成エレメントとして役立つ。各バクテリオファージまたは細胞は、ペプチド配列をディスプレイした粒子をコードするヌクレオチド配列情報を含有し、したがって、ディスプレイされたペプチド配列は、単離されたライブラリー構成エレメントのヌクレオチド配列を決定することによって確認することができる。
【０１６８】
周知のペプチドディスプレイ法は、ペプチド配列を繊維状バクテリオファージの表面上に一般的にはバクテリオファージコート蛋白質として提示することが必要である。該バクテリオファージライブラリーは、固定化した、予め決定された大分子または小分子(たとえば、受容体)と共にインキュベートすることができ、したがって、固定化した大分子に結合するペプチド配列を示すバクテリオファージ粒子が、予め決定された大分子に結合するペプチド配列を示さないバクテリオファージとは区別して分画することができる。次に、固定化した大分子に結合したバクテリオファージ粒子(すなわち、ライブラリーの構成エレメント)を回収し複製して、その後のアフィニティ濃縮およびファージ複製工程のために選択バクテリオファージ亜集団を増幅した。何回かアフィニティ濃縮およびファージ複製を行った後で、このように選択したバクテリオファージライブラリー構成エレメントを単離して、ディスプレイしたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を決定し、それによって予め決定した大分子(たとえば、受容体)に結合するペプチドの配列を同定する。このような方法はさらに、WO91/17271、WO91/18980、WO91/19818およびWO93/08278に記載されている。
【０１６９】
WO93/08278には、一般的に様々な配列を含み、予め決定された大分子に潜在的に結合するために使用できる第1のポリペプチド部分、および個々の融合蛋白質をコードするDNAベクターなどのDNAに結合する第2のポリペプチド部分からそれぞれの融合蛋白質が構成されている融合蛋白質ライブラリーの作製を必要とするペプチドリガンドをディスプレイするための組換えDNA方法について記載している。形質転換された宿主細胞を融合蛋白質の発現を可能にする条件下で培養するとき、該融合蛋白質はそれをコードするDNAベクターに結合する。宿主細胞が溶解するとき、該融合蛋白質/ベクターDNA複合体は、バクテリオファージ粒子をファージをベースとしたディスプレイ系でスクリーニングするのと大体同じ方法で、選択したライブラリーペプチド配列の同定の基礎として役立つ選択融合蛋白質/ベクターDNA複合体中のDNAベクターを複製し、配列決定して、予め決定された大分子に対してスクリーニングすることができる。
【０１７０】
ディスプレイされた蛋白質/ペプチド配列の長さは変化させることが可能であり、一般的にはアミノ酸長3個から5000個以上であり、しばしばアミノ酸長5個から100個であり、アミノ酸長約8個から15個であることが多い。ライブラリーは、様々な長さのディスプレイペプチド配列を有する構成エレメントを含むことができ、または、長さが固定されたディスプレイペプチド配列を有する構成エレメントを含むことも可能である。ディスプレイされたペプチド配列の一部または全ては、ランダム、疑似ランダム、規定セットのカーナル(defined set kernal)、固定などであることができる。該ディスプレイ方法には、可変領域配列および結合特異性に広い多様性を有するscFvライブラリーの大規模スクリーニングを可能にする、ポリソーム上の新生scFVまたはファージ上にディスプレイされたscFvなどの1本鎖抗体のin vitroおよびin vivoディスプレイ方法が含まれる。
【０１７１】
アフィニティ濃縮方法によって、非常に大きなペプチドライブラリーおよび1本鎖抗体のスクリーニング並びに所望するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列または1本鎖抗体の選択が可能である。次に、ポリヌクレオチドのプールを単離しシャッフルして、選択したペプチド(またはそれらの予め決定した部分)のアミノ酸配列または1本鎖抗体(またはそれらのVH、VL、またはCDR部分のみ)を組み合わせによって再結合することができる。これらの方法を使用して、分子に対して所望する結合親和性を有するようなペプチドまたは1本鎖抗体を同定することができ、本発明の方法を利用して、所望する高親和性ペプチドまたはscFvを迅速に近寄らせることができる。次に、任意の適切な用途(たとえば、治療薬または診断薬として)のために、従来の方法によって該ペプチドまたは抗体を大量に合成することができる。
【０１７２】
一実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質はウイルスの表面上にディスプレイされる。ファージディスプレイ系は当業界では周知で、市販されている(Felici他、1995、およびHoogenboom、2002の総説を参照)。ファージディスプレイ系の例には、M13(Lowman他、1991)、T7(Novagen、Inc.)、T4(Jiang他、1997)、ラムダ(Stolz他、1998)、トマトブッシースタントウイルス(Joelson他、1997)およびレトロウイルス(Buchholz他、1998)が含まれるが、これだけに限定されるものではない。
【０１７３】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質は酵母の表面上にディスプレイされる。適切な酵母ディスプレイ系は当業界では公知である(Boder and Wittrup、1997、Cho他、1998)。
【０１７４】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質は細菌の表面上にディスプレイされる。適切な細菌ディスプレイ系は当業界では公知である(Stahl and Uhlen、1997、Chen and Georgiou、2002、Jung他、1998)。
【０１７５】
[酵母2-ハイブリッドスクリーニングおよび関連技術]
本発明の方法を使用して得られた核酸によってコードされた蛋白質/ペプチドは、蛋白質-蛋白質相互作用を検出するいくつかの酵母をベースとした方法で使用することができる。周知の1系は、相互作用する蛋白質を同定し、対応するコード遺伝子を単離するために使用した酵母2-ハイブリッド系(Fields and Song、1989)である。この系では、正の増殖選択を可能にする独立栄養選択マーカーを、蛋白質-蛋白質相互作用の同定を容易にするレポーター遺伝子として使用する。使用できる関連系には、酵母3-ハイブリッド系(Licitra and Liu、1996)および酵母逆2-ハイブリッド系(Vidal他、1996)が含まれる。このような方法は当業者には公知である。
【０１７６】
[無細胞系連続in vitro進化変異誘発]
本発明の他の使用では、該方法を無細胞系連続in vitro進化変異誘発系に適用することができる。無細胞系連続in vitro進化変異誘発の1例では、WO99/58661に記載されたのと同様の系を利用する。
【０１７７】
したがって、本発明の無細胞系連続in vitro進化法には、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、ポリメラーゼの作用によって直接的に、または間接的に生成した変異RNA分子を、変異蛋白質集団の産生をもたらす条件下で翻訳系に曝露することが含まれる。これらの変異蛋白質は、翻訳元のRNAに結合させ、変異蛋白質/RNA複合体集団を形成する。この変異蛋白質/RNA複合体の集団を標的分子への結合などの所望する結合活性についてスクリーニングする。所望する活性を有する変異蛋白質/RNA複合体を単離して、該RNAによってコードされた蛋白質の配列を標準的技術によって特徴付けることができる。
【０１７８】
無細胞系連続in vitro進化のための翻訳系は、当業界で公知の、原核細胞または真核細胞から得られたものを含めた任意の系であることができる。例としては、ウサギ網膜細胞溶解物(He and Taussig、1997)または大腸菌S-30転写翻訳ミックス(Mattheakis他、1994、Zubay、1973)の使用が含まれる。真核細胞におけるmRNA合成のためには、該mRNAはキャップされることが好ましく、過剰なジグアノシン三リン酸塩を添加することによって実施するが、商用供給業者PromegaおよびNovagen製のウサギ網膜細胞系は、キャップ成分の添加を不要とする成分を系内に有している。転写/翻訳共役系は、変異DNAQ遺伝子を有し、したがって校正間違いの結果として複製中にDNAにさらに無作為変異の導入を可能にする大腸菌変異細胞MUTD5-FIT(Irving他、1996)から抽出することができる。該共役系にグルタチオンを添加すると、ディスプレイされた蛋白質の正確な折り畳み構造が促進され、したがって、その後の対受容体または抗原への結合および選択が促進される。
【０１７９】
変異mRNAを翻訳することによって、好ましくは新規合成蛋白質用の特異的コードmRNAを含む三要素リボソーム複合体のリボソームに結合した蛋白質分子のライブラリーを作製する(Mattheakis他、1994)。翻訳蛋白質およびリボソームからmRNAが分離するのを防ぐいくつかの方法が知られている。たとえば、スパルソマイシンまたは同様の化合物を添加することができ、スパルソマイシンは研究した生物全てにおいてペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、リボソームと不活性複合体を形成することによって作用することができる(Ghee他、1996)。マグネシウム塩を高濃度に維持し、GTP濃度を低下させることによってまた、前記に詳述した発現単位の構造と相まってリボソーム/mRNA/蛋白質複合体の維持に役立つことができる。三要素リボソーム複合体を維持する好ましい手段は、コード配列の末端の翻訳終止コドンを除去することである。
【０１８０】
さらに、無細胞in vitro進化系において分子を正確に折り畳むために要求される必要条件がある。原核細胞の場合、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)およびシャペロン並びに正確な折り畳み構造を確実にするC末端アンカードメインを使用することができる。後者は、原核細胞の蛋白質は折り畳まれる前にリボソームから遊離するので必要であり(Ryabova他、1997)、したがって該ペプチドがリボソームに固定される場合は、蛋白質全体はリボソームから離れていることが必要である。これとは対照的に、真核細胞系では、蛋白質は合成されるときに折り畳まれ、原核細胞PDIおよびシャペロンを添加する必要はない。しかし、グルタチオンを特定範囲の濃度で添加すると、三要素リボソーム複合体上に正確に折り畳まれた蛋白質のディスプレイが増加し、ライブラリー選択に有益である。
【０１８１】
RNA複製を何回も行うと、翻訳時に蛋白質ライブラリーを作製するRNA分子のライブラリーが作製される。標的分子結合マトリックス(たとえば、抗原コーティングDynabead)を反応物に添加して、リボソーム複合体を捕捉することができる。該ライブラリーの個々の構成エレメントは、該マトリックス(Dynabead)上に固定された抗原と競合する。親和性の高い分子は親和性の低い分子と置き換わる。この過程が終了すると、マトリックス(Dynabead)に結合した複合体(mRNA/リボソーム/蛋白質)を回収することができ、cDNAは該複合体中のmRNAから合成することができ、コード遺伝子配列からの高濃度発現用に適したベクターにクローニングすることができる。
【０１８２】
(リボソームを含めた)基質を確実に供給する温度制御式容器および試薬を使用して、かつ不必要な生成物を除去して、循環流動系(Spirin他、1988)を無細胞系連続in vitro進化系に適用することができる。転写/翻訳共役系、変異した複製、新規合成蛋白質の三要素リボソーム複合体表面上でのディスプレイおよび最も高い結合親和性を有するものを選択するための三要素リボソーム複合体上にディスプレイされた蛋白質の抗原への競合結合を含めた無細胞系連続in vitro進化の全過程は、この容器内で実施することができる。結合しなかった試薬、生成物およびディスプレイされた蛋白質は、洗浄用緩衝液をながすことによって除去し、結合した三要素リボソーム複合体は、温度を上昇させ、該緩衝液からマグネシウムを除去することによって分離する。この後、洗浄用緩衝液工程以外の前工程全てを実施するために必要な試薬全てを添加する。スパルソマイシンまたは同様の化合物を添加するなどの方法を蛋白質およびリボソームからのmRNAの分離を防ぐために使用することができ、マンガン塩の特定の濃度を維持し、GTP濃度を低下させることもまた、リボソーム/mRNA/蛋白質複合体の維持並びに反応温度の低下または翻訳終止コドンの除去に役立つことができる。温度を制御し、連続流能力を備えた容器を使用することによって、リボソーム/mRNA/蛋白質複合体の維持に重要な試薬、たとえばスパルソマイシン、Mgの濃度を変化させたとき、リボソームから選択したmRNAをリボソームから分離し、さらに複製し、変異させて翻訳することができる。
【０１８３】
本発明は以後、以下の非限定的な実施例によって説明する。
【実施例】
【０１８４】
(実施例1：Qβレプリカーゼの調製方法)
[Qβレプリカーゼウイルスサブユニットのクローニングおよび発現]
酵素EcoRIおよびNotIによる制限酵素消化のための部位をコードした、Qβレプリカーゼを増幅するためのプライマーとして使用したオリゴヌクレオチドおよびその配列をここに示す。
5'TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCATGTCTAAGACAGCATCTTCG(配列番号2)
5'TTTATAATCTGCGGCCGCCGCCTCGTGTAGAGACGCAAC(配列番号3)
【０１８５】
該PCR産物は、QIA quick PCR精製キット(QIAGEN)を使用して精製した。精製したDNAを、標準的分子生物学的技術を使用してベクターpGCのEcoRIおよびNotI部位にクローニングした。該ベクターpGCおよびそれからの組換え体の発現は、文献に記載されており、本明細書に参照により援用した。イソプロピルチオガラトシド(IPTG)1mMを培地に添加することによって誘導されたpGC中のQβレプリカーゼ遺伝子の発現のように、PCR増幅およびQβレプリカーゼ遺伝子のベクターへのクローニングおよび酵素発現用大腸菌の形質転換は、当業者には明らかである。
【０１８６】
プロモーターλPLを有するpBR322をベースにしたベクターでのQβレプリカーゼ遺伝子の発現および精製は、以下に詳述するように実施した。rep14 Billeter株は、Christof Biebricher、Max Planck、Gottingenから入手した。大腸菌株は、20lの発酵漕に入れた栄養培地2%、酵母抽出物1.5%、NaCl 0.5%、グリセロール0.4%、アンピシリン100mg/lで、通気を十分に行い、30℃で、光学密度が2(660nM)になるまで増殖させた。温度を37℃まで上げた後、通気を5時間継続した。該細胞を氷上で冷却し、遠心によって収穫した(収量は湿潤細胞量で約180g)。
【０１８７】
[Qβレプリカーゼの精製]
緩衝液A:0.05M  Tris.HCl緩衝液(pH7.8)、β-メルカプトエタノール1mM、20%v/vグリセロール。
緩衝液B:0.05M  HEPES.Na緩衝液(pH7.0)、β-メルカプトエタノール1mM、20% v/vグリセロール。
【０１８８】
収穫した大腸菌180gを、Ultra-Turrax T25ホモジナイザー(Janke and Kunkel、IKA Labortechnik)を使用して0.05M  Tris.HCl緩衝液(pH7.8)  360ml、β-メルカプトエタノール1mMと共にホモジナイズした。リゾチームおよびEDTAをそれぞれ最終濃度100μg/mlおよび0.5mMまで添加し、該溶液を0℃で30分間ゆっくり撹拌した。8%デオキシコール酸ナトリウム43.2ml、フェニルメタンスルホニルフルオリド(20mg/mlプロパノール-2溶液)0.86ml、バシトラシン(10mg/ml)0.54ml、0.1Mベンズアミジン0.54ml、10%トリトン-X-100、11.9mlおよび最終濃度10mMのMgCl2を添加した。(前述のように)ホモジナイズすることによって高い粘度が減少した。固形NaClを最終濃度0.5Mまで添加し、0.3%ポリエチレンイミン(pH8)17.3mlを0℃で20分かけてゆっくり撹拌しながら入れた。該懸濁物をJA-17またはJA-10ローター(Beckman J2-21 M/E)で15000xgで30分間遠心した。上清を5倍体積の0.05M  Tris.HCl緩衝液(pH7.8)、β-メルカプトエタノール  1mMで希釈した後、DEAEセルローススラリー(Whatman  DE52、緩衝液Aで平衡化)360mlを添加し、0℃で20分間ゆっくり撹拌した。次に、この混合物を撹拌しないで40分間静置して、上清をデカンテーションして除去した。沈殿物を緩衝液Aに懸濁して、直径2.5cmのガラス製カラムに注ぎ、0.05M  Tris.HCl緩衝液(pH7.8)1.4l、β-メルカプトエタノール  1mMで洗浄して、緩衝液A+NaCl180mM  0.9lで溶出した。画分を収集し、以下の活性測定法を使用してQβレプリカーゼの存在を測定した。
【０１８９】
[Qβレプリカーゼの活性測定法]
これは、14C-ATPおよびRQ-EGX認識配列中にはめ込まれたDHFR mRNAを含有するssRNA鋳型を使用した放射活性測定法である。シンチレーション係数を使用して、増幅RNA生成物への14C取り込みを検出した。標準反応液には、以下のものが含有される。
ssRNA鋳型*          50ng
rGTP                10mM
rCTP                10mM
rUTP                10mM
rATP                1mM
14C-ATP              0.05μCi
Tris-HCl(pH7.9)      40mM
MgSO4                18mM
スペルミジン         2mM
ジチオスレイトール   10mM
リファンピシン       0.05μg
Qベータレプリカーゼ  100nM
*ssRNA鋳型は、SmaI直線化ベクターpEGX200からT7 RNAポリメラーゼ転写によって生成した。
【０１９０】
各反応の1-5μlをGFC濾紙(Whatman、0.5×0.5cmに切断)上にスポットして、室温で乾燥させた。濾紙を最初に氷冷した10%  TCA  10mlで時々撹拌しながら15分間洗浄して、次に氷冷した5%  TCA  10mlで10分間第2の洗浄を行った。最後に、該濾紙を氷冷した70%エタノールで氷上で30分間洗浄して、次に、さらに100%エタノールで10分間洗浄した。濾紙を室温で乾燥させ、24ウェルシンチレーションプレート(Optiplates、PACKARD)に移し、TpoCount Microplateシンチレーションカウンター(PACKARD)で係数値を測定する前に、シンチレーション用液体(MicroscintTM-40、PACKARD)5mlを添加した。
【０１９１】
[Qβレプリカーゼのさらなる精製]
活性画分を集め、1倍体積の緩衝液Aで希釈し、緩衝液A+NaCl  0.1Mで平衡化したDEAE-セファロースFFのカラム125mlに添加した。該酵素を緩衝液Aに溶かしたNaCl  0.1-0.4Mのリニアグラジエント(2×250Ml)で溶出した。活性画分を集め、固形(NH4)2SO4  39g/100mlを添加して、酵素を沈殿させた。該ペレットを遠心によって収集し、緩衝液B  20mlに溶解した。
【０１９２】
該酵素は、電気伝導率が緩衝液B+NaCl  0.2Mより少なくなるまで希釈し、緩衝液Bで平衡化した10ml  Fractogel EMD SO3-カラムに添加し、緩衝液Bに溶かしたNaCl  0.2-0.8Mのリニアグラジエント(2×50ml)で溶出した。NaCl約0.65Mで溶出した活性ピークを収集し、該酵素を固形(NH4)2SO4(39g/100ml溶液)で沈殿させた。該ペレットを遠心によって収集し、緩衝液A+50%グリセロール1mlに溶解し、-80℃で保存した。
【０１９３】
以下の工程をSumper and Luce(1975)に従ってスモールスケールで実施した。
【０１９４】
Qβレプリカーゼ4mgを(塩を除去するために希釈または透析した)緩衝液Aで平衡化したQAE-セファデックスA-25のカラム1.6×14.5cmに添加し、緩衝液Aに溶かしたNaCl  0.05-0.25Mのグラジエント(2×200ml)で溶出した。核およびホロ酵素の2つの別々のピークを集め、緩衝液Aで1:1に希釈し、QAE-セファデックスカラムに添加し、それぞれ、2mlは核、6mlはホロレプリカーゼであった。該カラムを緩衝液A+50%グリセロールで洗浄し、該レプリカーゼを緩衝液A+50%グリセロール+(NH4)2SO4  0.2Mで溶出した。活性画分を-80℃で保存した。装置がRNAで汚染されるのを回避するために極力注意を払った。
【０１９５】
(実施例2：QβレプリカーゼによってRNAの複製および変異誘発を実施する方法)
RNA鋳型のQβレプリカーゼ増幅は、増幅とRNAへの変異の導入の両方のために使用する。
【０１９６】
方法は以下の通りである。
ssRNA鋳型           20-100ng*
rGTP                10-25mM*
rCTP                10-25mM*
rATP                10-25mM*
rUTP                10-25mM*
Tris-HCl(pH6-9*)    40mM
MgSO4                6-21mM*
スペルミジン        2mM
ジチオスレイトール  10mM
Qβレプリカーゼ     100nM
該反応は25-55℃*で0.5-24時間*インキュベートする。
*濃度および条件は、増幅する遺伝子配列および必要な変異誘発濃度によって変化する。
【０１９７】
該RNA鋳型は、pEGX207などの適切なベクターを使用して生成することができる(図1)。
【０１９８】
(実施例3：他のRNAレプリカーゼの生成および使用)
RNA鋳型のPhi6 RNAレプリカーゼ(P2)増幅は、増幅とRNAへの変異の導入の両方のために使用する。
【０１９９】
該方法は以下の通りであった。
ssRNA鋳型             20-100ng*
rGTP                  1-10mM*
rCTP                  1-10mM*
rATP                  1-10mM*
rUTP                  1-10mM*
Tris-HCl(pH6-9.5*)    50mM
NH40Ac                 80mM
PEG4000                6%(w/v)
MgSO4                  1-10mM*
トリトンX-100          0.1%
EDTA                   0.1mM
MnC12                  0.1-5mM*
ジチオスレイトール     2mM
Phi 6レプリカーゼ(P2)  100nM
該反応は25-37℃*で0.5-24時間*インキュベートする。
*濃度および条件は増幅する遺伝子配列および必要な変異誘発濃度によって変化する。
【０２００】
(実施例4：Phi6 P2レプリカーゼの調製方法)
[Phi6ウイルスレプリカーゼ(P2)のクローニングおよび発現]
重複するオリゴヌクレオチドを使用し、当業者に明らかな方法を使用してP2レプリカーゼ配列を構築した。該遺伝子配列は、QIA quick PCR精製キット(QIAGEN)を使用して精製した。精製した該DNAを、標準的分子生物学的技術を使用してベクターpGCのEcoRIおよびNotI部位にクローニングした。該ベクターpGCおよびそれからの組換え体の発現は、文献に記載されており、本明細書に参照により援用した。イソプロピルチオガラトシド(IPTG)  1mMを培地に添加することによって誘導されたpGC中のP2レプリカーゼ遺伝子の発現のように、PCR増幅およびQβレプリカーゼ遺伝子のベクターへのクローニングおよび酵素発現用大腸菌の形質転換は、当業者には明らかである。
【０２０１】
プロモーターλPLを有するpBR322をベースにしたベクターでP2レプリカーゼ遺伝子を発現および精製することは以下に詳述するように実施した。該大腸菌株BL21(DE3)は、Novagenによって供給された。細胞は、20lの発酵槽に入れた栄養培地2%、酵母抽出物1.5%、NaC10.5%、グリセソール0.4%、アンピシリン100mg/lで、通気を十分に行い、30℃で、光学密度が2(600nM)になるまで増殖させた。温度を37℃まで上げた後、通気を5時間継続した。該細胞を氷上で冷却し、遠心によって収集した(収量は湿潤細胞量で約180g)。
【０２０２】
[Phi6レプリカーゼの精製]
収穫した大腸菌500gを、高速ミキサーで0.05M  Tris.HCl緩衝液(pH8.7)  1L、β-メルカプトエタノール1mMと共にホモジナイズした。リゾチームおよびEDTAをそれぞれ最終濃度100μg/mlおよび0.5mMで添加し、該溶液を0℃で30分間ゆっくり撹拌した。8%デオキシコール酸ナトリウム120ml、フェニルメタンスルホニルフルオリド(20mg/mlプロパノール-2溶液)2.4ml、バシトラシン(10mg/ml)1.5ml、0.1Mベンズアミジン1.5ml、10%トリトン-X-100、33mlを添加し、該溶液をMgCl2が最終濃度10mMになるまで調整した。高速で混合することによって高い粘度が減少した。固形NaClを最終濃度0.5Mまで添加し、0.3%ポリエチレンイミン(pH8)48mlを撹拌しながら入れた。0℃で20分間撹拌した後、該懸濁液を12000xgで2.5時間遠心した(Beckman J2-21 M/E)。
【０２０３】
以下の工程をMakeyev and Bamford(2000、The EMBO J19、124-1133)に従ってスモールスケールで実施した。
【０２０４】
上清画分をシバクロンブルー3GA色素アフィニティカラム(Sigma)に添加した。該カラムに結合した蛋白質は、NaCl  500mM、50mM  Tris-HCl  pH8.0およびEDTA  1mMで溶出した。P2を含有する画分を集め、氷冷した蒸留水で5倍に希釈し、ヘパリンアガロースカラム(Sigma)に添加した。蛋白質は、50mM  Tris-HCl  pH8.0およびEDTA  1mMで緩衝化した0.1-1M  NaClのリニアグラジエントで溶出した。P2を含有する画分を集め、20mM  Tris-HCl  pH8.0で10倍に希釈し、濾過して、Resource  Qカラム(Pharmacia)に20℃で通過させた。結合した蛋白質の溶出は、50mM  Tris-HCl  pH8.0およびEDTA  0.1mMで緩衝化した0-0.5M  NaClのグラジエントで実施した。精製したP2蛋白質は、緩衝液A+50%グリセロール中で保存した。該溶液は-80℃で保存した。
【０２０５】
(実施例5：安定性が高まった変異RNA分子の生成)
本発明は、実施例6で示すように、野生型結合蛋白質(12Y-2)をコードする開始RNAのヌクレオチド配列と、高いレベルでコード蛋白質を発現することが見出された変異配列とを比較した。この変異配列は、コード蛋白質のアミノ酸配列を改変する変異を含有していなかったので、認められた蛋白質発現の増加は、RNA安定性の増加、該RNAの翻訳しやすさの増大、またはこれらのある組み合わせによって引き起こされたものという結論に達した。本発明者等は、コンピュータプログラム(RNAdraw v1.1)を使用してこれら2種類のRNAの可能なRNA構造を比較した。推定構造を図2に示す。これらの分析によって、驚いたことに、確認されたヌクレオチド変化の導入によって開始AUGコドンの近くに(矢印で示した)小さなステムループ構造が形成されることが示された(図2b)。該構造は、野生型RNA(図2a)には存在しない。該変異RNAには、開始から約30ヌクレオチドの位置に変異が見られた。このことは、mRNAの3'から5'への分解はmRNAの5'構造に依存したmRNA特異的分解速度と相関することを示したCao and Parker(2001)によるmRNA代謝回転のコンピュータモデルと一致した。同時に、AUGコドンの環境変化は、リボソームの翻訳機構への接近しやすさに影響を及ぼす可能性がある。
【０２０６】
(実施例6：リボソームディスプレイおよびRNA安定性/効率性選択のプロトコール)
以下に示した実施例では、マラリア(Plasmodium falciparum)寄生虫(メロゾイト)の赤血球への結合および侵入に必要な単一の膜貫通ドメイン蛋白質である頂端膜抗原1(AMA-1)を利用する。AMA-1に対する抗体は、メロゾイトの侵入を阻止する。12Y-2と称する単一のドメイン抗体(NAR)は、AMA-1に結合し、メロゾイトの侵入を防御する。
【０２０７】
[リボソームディスプレイで使用した緩衝液]
緩衝液A:リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)、MgCl2  50mM
緩衝液B:緩衝液A、0.05%(v/v)Tween20
緩衝液C:緩衝液B、ヘパリン  2.5mg/ml
緩衝液E:緩衝液A、10%(w/v)脱脂乳粉末
【０２０８】
[in vitro翻訳反応]
該方法の工程は全て、氷冷溶液を使用し、可能であれば氷上で実施した。
【０２０９】
[翻訳ミックス]
RNasin  20単位
KCl  100mM*
酢酸Mg  2mM*
各アミノ酸  50μM
Flexiウサギ網状赤血球溶解物(Promega)  33μl
12Y-2  RNA#  1-10μg
dH2O 翻訳ミックス最終量の50μlまで
*濃度は経験的に決定した。Mg2+およびK+濃度は、翻訳ミックス中で産生される蛋白質の量に直接関連するリボソームディスプレイの効率と共にin vitro翻訳の効率に影響を与える。
#12Y-2RNAは、Qβレプリカーゼ変異誘発を使用して生成した。
【０２１０】
該翻訳ミックスは、30℃で30分間インキュベートして、次に氷冷緩衝液C  200μlおよび氷冷緩衝液E  64μlで希釈した。一定量100μlをビオチン化AMA-1  50-300nMを含有するパニング試験管(AMA-1に対する12Y-2の結合定数は、250+/-100nMと概算されるので、ビオチン化AMA-1の濃度範囲は、正確な濃度が使用されたことを確認するために使用した)に入れ、氷上で60分間インキュベートして、正確に折り畳まれた12Y-2/リボソーム/RNA複合体をビオチン化AMA-1に結合させる。
【０２１１】
ビオチン化AMA-1に結合した12Y-2/リボソーム/RNA複合体は、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して回収し、緩衝液Bで2回、緩衝液Aで2回洗浄した。(関連AMA-1/12Y-2/リボソーム/RNA複合体を有する)ビーズを12Y-2配列に特異的なプライマー対を使用して1工程RT-PCR反応(Invitrogen)で直接使用した。増幅したcDNAは、NcoIおよびNotIで同時に消化して、pGC4C26Hに連結し、大腸菌(HB2151株)に形質転換した。
【０２１２】
個々のクローンを、アンピシリン100μg/mlを含有する栄養培地200μlで30℃で6時間増殖させ、次にIPTG  1mMを添加することによって蛋白質合成を誘導し、20℃で一晩インキュベートした。個々のクローンそれぞれの上清をAMA-1でコーティングした96ウェルトレイに移した。結合した12Y-2は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)に結合した抗Flag抗体で視覚化した。クローンの応答を野生型12Y-2の応答と比較した。応答性が増加したクローン(野生型の2倍)を選択して、発現増加を分析した。選択したクローンは、アンピシリン100μg/mlを含有する栄養培地80mlでOD600値が1.0になるまで増殖させ、その後IPTG  1mMを添加した。IPTG添加して0、2、4、7時間後に試料1mlを取り出した。該試料を遠心して、細菌細胞を除去した。培養上清10μlをSDSポリアクリルアミドゲルで泳動して、ナイロン膜に移し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗flag抗体(Sigma)で調べた。
【０２１３】
図3aのデータは、変異していない遺伝子から得られた蛋白質は誘導後16時間まで検出できないのに、変異蛋白質は誘導後4時間位内に検出可能なレベルで発現することを示している。この実施例で例示した蛋白質を生じる該RNA種は、いずれも同一アミノ酸配列をコードし、いずれの蛋白質もAMA-1に対する結合性を保持している。しかし、変異クローンの核酸配列は、サイレント変異を含むように改変されている。第2の実施例では、精製後に示したように、12Y-2をコードする野生型配列から得られた2種類の異なる変異RNAの蛋白質生成物が、野生型RNA配列によってコードされた蛋白質と比較して高レベルで発現することがわかった(図3b)。該データは、該方法によって、RNAを安定化し、かつ/またはRNAのより容易な発現を可能にする変異が導入され、かつ選択され、高レベルでの蛋白質産生が引き起こされることを示している。
【０２１４】
様々な発現系における外来蛋白質の産生は、外来蛋白質を得た生物では豊富なある種のtRNAが少ないために制限されることが多いことはよく知られている。大腸菌を含めた様々な系において、外来蛋白質を高レベルで発現させると、希少なtRNAプールが枯渇し、翻訳が失速し、産生する生成物の量の減少を引き起こされる可能性がある。アミノ酸配列を変更することなく、より豊富なtRNAを使用するために開始RNAのコドンのバイアスを変更することによって、本発明の実施例で示すように、様々な発現系における外来蛋白質の高レベル発現の改善がもたらされる。
【０２１５】
(実施例7：リアルタイムRT-PCRのための方法)
以下に概略を述べた方法を使用してRNA安定性を測定することができる。具体的には、本発明の方法を使用して変異RNA分子を生成させ、得られた生成物はRNA分解を促進する条件化に曝露することができ、次に、たとえば以下のRT-PCR法を使用して、残存RNA分子の存在を測定することができる。変異RNA分子が高レベルで増幅生成物をもたらすことは、変異RNA分子が野生型分子よりも安定であることを示す。
【０２１６】
[RNA抽出および逆転写]
DNAを含まない(残存するプラスミドDNAは、RNA溶液をRNA分解酵素を含まないDNA分解酵素I(Promega)15単位と共に、40mM  Tris.HCl(pH8)、MgCl2  10mMおよびCaCl2  1mM中で37℃で10分インキュベートすることによって消化し、次に65℃で15分インキュベートすることによってDNA分解酵素Iを不活性化した)12Y-2RNAは、RNeasy  RNA単離キット(Qiagen)で(Flexiウサギ網膜細胞溶解物、血清または緩衝液のいずれかの)溶液から単離した。該RNA溶液は、以下のように逆転写反応で使用した。50mM  Tris-HCl(pH8.3)、ジチオスレイトール  10mM、配列特異的プライマー  10pmole、MgCl2  3mM、デオキシヌクレオチド三リン酸  0.5mM、RNasin(Promega)3単位およびRNA分解酵素Hを含まないモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素を含有する反応液においてRNA  0.1-1μgを使用した。該反応は、42℃で45分、その後90℃で3分間インキュベートしてRNAの2次構造を変性させた。cDNAは、TaqManを用いたリアルタイムPCRを使用して定量した。
【０２１７】
[リアルタイムPCR]
TaqMan検出法を用いたリアルタイムPCR(PE Biosystems)の反応液は、lx TaqMan緩衝液A、dATP、dGTP、およびdCTP  200nM、dUTP  400nM、MgCI2  4.5mM、ウラシル  N-グリコシラーゼ  0.25単位、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ  0.6単位、フォワードおよびリバースプライマー  250nM、2標識発光発生ハイブリダイゼーションプローブ  250nM、1:10に希釈したcDNA、5μlから構成された。
【０２１８】
リアルタイムPCRは、PE BIosystems GeneAmp 5700配列検出系で、Micro-Amp光学キャップでキャップしたMicroAmp 96ウェルプレートにおいて実施した。該反応は、50℃で2分間インキュベートしてウラシルN'-グリコシラーゼを活性化し、その後95℃で10分間インキュベートしてウラシルN-グリコシラーゼを不活性化し、Amplitaq Goldポリメラーゼを活性化した後、95℃15秒、55℃30秒を40回および72℃30秒を回行った。
【０２１９】
RNA分解は、分解条件で得られたRNAの量を、10mM  Tris緩衝液  pH7.5で維持されたRNAの同一濃度で正規化することによって測定した。
【０２２０】
(実施例8：リバビリンの存在下でDNA依存性RNAポリメラーゼを使用したジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)における変異の導入)
リバビリン5'三リン酸(dTRV)1000μMを添加したT7 RNAポリメラーゼを使用して、プラスミドpEGX2000上のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR)遺伝子から(DHFR)(-)RNAを転写した。該RNAをその後M-MuLV逆転写酵素を使用してcDNAに変換し、適切な制限酵素で切断し、pPCR-Script AMP(+)(Stratagene)に挿入した。該プラスミド混合物を使用して大腸菌を形質転換し、DHFR cDNAを含有するクローンを無作為に選択し、DHFR領域を配列決定した。該配列データは、知見された各ヌクレオチド変異の数および相対的な遺伝子位置を示す(表2および図4)。リバビリン存在下でのDHFR配列を転写することによって、この実験で生成したクローンに数多くの変異がもたらされた。対照的に、リバビリンを含まない反応でDHFR配列をT7 RNAポリメラーゼによって転写した対照反応では、変異は見いだされなかった。
【０２２１】
【表２】
2006504438.tif 000005
【０２２２】
該データは、dTRVがT7 RNAポリメラーゼで認められる点突然変異の数の有意な増加を引き起こすことを示す。T7 RNAポリメラーゼエラー率は、約0.01%(すなわち、ヌクレオチド10000個につき塩基変化1個)なので、該データで示されたように、DHFR遺伝子の長さ(472bp)の配列では有意な変異の発生は期待されないだろう。dTRVを添加することによって、20個のうち6個のクローンが1個または複数の点突然変異を有しており(表2および図4)、T7 ポリメラーゼはdTRVと組み合わせることによって転写中にエラーを導入することが明らかに示される。
【０２２３】
(実施例9：リバビリンの存在下でDNA依存性RNAポリメラーゼを使用したβ-ラクタマーゼ遺伝子(bla)における変異の導入)
リバビリン5'三リン酸(dTRV)1000μMを添加したT7 RNAポリメラーゼを使用して、プラスミドpEGX205のbla遺伝子(抗生物質耐性のβ-ラクタマーゼ遺伝子)から(-)RNAを転写した。該bla RNAをその後M-MuLV逆転写酵素を使用してcDNAに変換し、Pfu DNAポリメラーゼで増幅し、適切な制限酵素で切断し、プラスミドpEGX212に挿入した。セフォタキシムの濃度を高めても耐性のあるクローンを選択し、配列決定を行った(野生型bla遺伝子の最小阻止濃度(MIC)は0.02μg/mlであった)。1回目の変異/選択過程で、2個のアミノ酸置換を含有し、野生型よりもセフォタキシム耐性が2000倍増加した変異bla配列(クローンCefR E1)を選択した(表3)。  
【０２２４】
クローンCefR E1 RNAを2回目のT7 ポリメラーゼ/dTRV変異誘発で採取したとき、3個以上の変異を含有し、野生型よりセフォタキシム耐性が10000倍の増加した1個のクローン(F-E1-1)を選択した。T7ポリメラーゼのみを使用した変異/選択実験では、耐性変異体は単離されなかった。該データは、T7ポリメラーゼ/dTRV変異誘発は、蛋白質の変異(進化)に使用できる多様な核酸ライブラリーを作製するために効率的な手段であることを示す。
【０２２５】
【表３】
2006504438.tif 000006
【０２２６】
(実施例10：変異頻度に対するリバビリンの効果についての他のポリメラーゼの試験)
[DNA依存性RNAポリメラーゼ]
3種類のDNA依存性RNAポリメラーゼ、いわゆるT7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼは、DNA鋳型を使用して試験した(表4)。直線状DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)DNA鋳型(0.2ng-10μg)を、rCTP、rGTP、rATPおよびrUTPそれぞれ1mM、40mM  Tris-HCl(pH7.9、25℃)、NaCl  10mM、MgCl2  6mM、スペルミン  2mM、RNAsin(Promega)  3U、無機ピロリン酸塩(NEB)  4U/ml、DTT(Promega)  10mM、+/-dTRV  1000-2000uMおよびT7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼ(Promega)  40Uと一緒にして、37℃で2-18時間インキュベートした。
【０２２７】
得られたRNAは、実施例7で説明したようにDNA分解酵素で処理し、RNeasy Miniキット(QIAGEN)を使用して精製し、RNA分解酵素分解酵素を含まないdH2Oに再懸濁した。
【０２２８】
該RNA溶液は、SuperScript III 1工程反応ミックス、DHFR特異的フォワードおよびリバースプライマー  10pmole、Mg2+  5mM、RNA  0.1-1.0μgおよびSuperScript II逆転写/プラチナTaqミックスを組み合わせることによって、1工程逆転写反応(SuperScript 1工程RT-PCR-Invitrogen)で使用した。該反応を50℃で45分間し、その後94℃で2分間インキュベートして逆転写酵素を不活性化し、次にPCR増幅(94℃30秒/54度1分/68℃2分)を40回および68℃7分を1回行った。
【０２２９】
DHFR遺伝子産物に対応するPCR産物は、標準的方法(NucleoSpinゲル溶出キット:Macherey-Nagel)を使用してゲル精製した。該PCR断片は、dATP、dGTP、dCTP、dTTP  5mM、ポリッシュ緩衝液(Stratagene)およびクローニングしたPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)  0.5Uを添加して72℃で30分間インキュベートすることによって末端をポリッシュした。ポリッシュしたPCR断片は、pPCR-Script AMP(+)(Stratagene)にクローニングされた平滑末端である。DHFR DNAを含有するクローンを無作為に選択して、配列決定した。
【０２３０】
DNA依存性RNAポリメラーゼはそれぞれ、リバビリンによって変異率の増加が認められた。さらに、SP6ポリメラーゼが用量依存性の効果を示すとき、リバビリン濃度を1000μMから2000μMに増加させると、変異の数の増大が生じた。該SP6ポリメラーゼは、2種類の濃度のリバビリンで試験した唯一の酵素であるが、その他のポリメラーゼを使用しても同様の用量依存効果が得られるものと予測される。したがって、リバビリン、またはその誘導体/アナログを、2000μMを上回る濃度で使用すると、変異率が既に基準値を上回る系では変異率がさらに増加し、今まで変異に応答しなかった系では変異を導入できることが予測できる。
【０２３１】
[RNA依存性DNAポリメラーゼ]
3種類のRNA依存性DNAポリメラーゼ、いわゆるSuperScript III(invitrogen製)、AMVおよびM-MuLVは、RNA鋳型を使用して試験した(表4)。
【０２３２】
AMV逆転写酵素では、DHFR RNA鋳型(0.2ng-2.0μg)をDHFR特異的フォワードおよびリバースプライマー  10pmoleと一緒にして、70℃で10分間インキュベートして、次に氷上に置いてから、dCTP、dGTP、dATPおよびdTTPそれぞれ20nMol、50mM  Tris-HCl(pH8.5、20℃)、MgCl2  8mM、KC1  30mM、DTT(Promega)  1mM、RNasin  RNA分解酵素阻害剤(Promega)  25U、+/- dTRV  1000μMおよびAMV逆転写酵素(Roche)  40Uを添加した。該反応混合物は、42℃で60分間インキュベートした。該反応は70℃で10分間インキュベートすることによって不活性化した。
【０２３３】
M-MuLV逆転写酵素では、DHFR RNA鋳型(0.2ng-2.0μg)をDHFR特異的フォワードおよびリバースプライマーと一緒にして、70℃で10分間インキュベートして、次に氷上に置いてから、dCTP、dGTP、dATPおよびdTTPそれぞれ20nMol、50mM  Tris-HCl(pH8.3、37℃)、MgCl2  6mM、KC1  40mM、DTT(Promega)  1mM、RNasin  RNA分解酵素阻害剤(Promega)  25U、+/-dTRV  1000μMおよびM-MuLV逆転写酵素(Roche)40Uを添加し、37℃で60分間インキュベートした。該反応は70℃で10分間インキュベートすることによって不活性化した。
【０２３４】
SuperScript IIIでは、DHFR  RNA鋳型(0.1ng-5μg)をDHFR特異的フォワードおよびリバースプライマー2pmoleおよびdCTP、dGPT、dATPおよびdTTPそれぞれ20nMolと一緒にした。該混合物を65℃で5分間加熱し、次に氷上に置いて、First Strand緩衝液(Invitrogen)、DTT(Promega)  1mM、RNasin RNA分解酵素阻害剤(Promega)25U、+/-dTRV  1000μMおよびSuperScript III逆転写酵素(Invitrogen)  200Uを添加し、50℃で60分間インキュベートした。該反応は70℃で10分間インキュベートすることによって不活性化した。
【０２３５】
該逆転写反応から得られた生成物は、忠実度の高いDNAポリメラーゼを使用して増幅した。該cDNAを20mM  Tris-HCl(pH8.8、25℃)、KCl  10mM、(NH4)2SO4  10mM、0.1%トリトンX-100、DHFR特異的フォワードおよびリバースプライマー10pmoleおよびディープベントDNAポリメラーゼ(NEB)  4Uと混合した。該反応をサーマルサイクラーで94℃でインキュベートし、次にPCR増幅(94℃30秒/68℃2分)40回および68℃7分を1回を行った。
【０２３６】
AMVおよびM-MuLVポリメラーゼを使用して核酸をコピーするとき、変異頻度は、リバビリンが存在すると有意に増加した。リバビリンをSuperScript IIIポリメラーゼと一緒にしたときは、有意な変異濃度は認められなかったが、リバビリンが存在すると1変異が示され、一方リバビリンが存在しないと変異は認められず、リバビリンはRNAをDNAにコピーする際に変異原として作用し得ることが確かめられた。
【０２３７】
[Tth DNA依存性DNAポリメラーゼ]
DHFR DNA鋳型(0.1-50ng)は、Tth DNAポリメラーゼ(BioTech)を使用して増幅した。該DNAを20mM  Tris-HCl(pH8.8、25℃)、KCl  10mM、(NH4)2SO4  10mM、0.1%トリトンX-100、DHFR特異的フォワードおよびリバースプライマー10pmoleおよびディープベントDNAポリメラーゼ(NEB)  4Uと混合した。該反応をサーマルサイクラーで94℃でインキュベートし、次にPCR増幅(94℃30秒/68℃2分)40回および68℃7分を行った。
【０２３８】
該Tth DNA依存性DNAポリメラーゼは、リバビリンが存在すると変異頻度が有意に増加するDNA鋳型を使用して試験した(表4)。
【０２３９】
【表４】
2006504438.tif 000007
【０２４０】
(実施例11：セフォタキシムに対する耐性が改善したβ-ラクタマーゼ酵素を変異させ、選択するためのQβレプリカーゼおよびリバビリンの使用)
セフォタキシムに対する耐性が改善したβ-ラクタマーゼ酵素の変異および選択は、本質的に以下のように実施する。細菌β-ラクタマーゼをコードする遺伝子は、DNAベクターに含有されるRQ135配列に連結し、T7 RNAポリメラーゼを使用して転写する。次に、該転写は、以下に概略を示した条件下で、リバビリンの存在下でQβレプリカーゼを使用して増幅する。
RNA鋳型(10ng)
ATP(200μM)
CTP(200μM)
GTP(200μM)
UTP(200μM)
リバビリン(1000μM)
レプリカーゼ緩衝液(40mM  Tris-HCl  pH7.9、MgCl2  21mM、DTT  10mM、スペルミジン  2mM)
Qβレプリカーゼ(1.50pmol)
【０２４１】
Qβレプリカーゼおよびリバビリンによって増幅された転写物は、Qβレプリカーゼのみによって処理された転写物の対照集団と共に、その後RT-PCRによってDNAに変換する。RT-PCRのプライマーは、
5'CGAGGCGGCCGCGGTCATGAGATTATCAAAAAGG(配列番号4)および
5'TCGAGCCATGGCTCATGAGAGACAATAACCCTG (配列番号5)。
【０２４２】
該逆転写酵素反応は、SuperScript(商標) II H-逆転写酵素(Invitrogen)を使用した標準条件を使用し、その後得られたcDNAをTaqポリメラーゼで、再度標準条件を使用して増幅する。得られたDNA分子は、次に自己複製原核細胞プラスミドに連結し、(標準的形質転換方法を使用して)形質転換によって大腸菌細胞に導入する。
【０２４３】
次に、形質転換細胞は、濃縮(形質転換細胞を栄養豊富な培地で37℃で1時間増殖させた後、アンピシリン100μg/mlを追加した新鮮な栄養豊富な培地に移し、37℃で6時間培養する)および選択(細胞は、該アンピシリン培地から取り出して、セフォタキシム5または20μg/mlのいずれかを含有する新鮮な栄養豊富な培地に入れ、37℃で18時間増殖させてから、セフォタキシム5または20μg/mlのいずれかを含有する固形の栄養豊富な培地に入れる)の工程で採取する。次に、高い濃度のセフォタキシム(たとえば、セフォタキシム  5μg/ml(耐性は250倍増加)またはセフォタキシム20μg/ml(耐性は1000倍増加)以上)に対して耐性のあるクローンを選択する。
【０２４４】
1回目の後選択されたクローンを次に配列決定によって特徴付けることができる。
【０２４５】
(実施例12：DNAおよびRNAワクチン用に安定性および発現が増加した変異ヌクレオチド配列の生成)
RNAおよびDNA配列の両方をワクチンとして樹状細胞またはその他の種類の細胞と共にin vitroおよびin vivoで使用して、局部的または全身的免疫を惹起することができる。しかし、免疫の誘発の成功は、特にRNAが接近するヌクレオチド配列の安定性に左右される。トランスフェクションのためにRNAを使用する主な欠点は、RNAがDNAよりも不安定な分子であることである。RNAの半減期は、血清を含まない培地では約5時間と推定されるが、血清が10%存在する場合は、ほんの数分と推定される。したがって、同一アミノ酸配列をコードし、安定性および分解耐性がより顕著なRNAを導き出すことによって、トランスフェクション効率を上げることが主な利点である。DNAワクチン配列はまた、翻訳効率およびトランスフェクション後の原位置での発現濃度を増加させる同様の試みを使用することによって、著しく有益となり得る。
【０２４６】
以下の方法を使用して、安定性または発現の増加について選択したヌクレオチド変種を試験する。
【０２４７】
[樹状細胞の単離および精製]
樹状細胞の単離には、不連続Percoll勾配を使用して単球を選択することが必要である。単球の豊富な低密度画分から、細胞特異的磁気ビーズ(Dynal)を使用して、B、Tおよび/またはNK細胞を激減させることができる。未熟な樹状細胞を生じさせるために、グルタミン(2mM)、HEPES(15mM)および1%  NHS(Sigma)を追加したRPMI1640またはGM-CSF(50ng/ml)およびIL-4(100ng/ml)を追加した血清を含まないAIM V培地(Life Technologies)のいずれかで精製した単球を培養することができる。TNF-a(1ng/ml)およびPGEJ(500nM)は、DC成熟のために使用することができる(Weissman他、2000)。
【０２４８】
[in vitro転写]
発現ベクターは、ヌクレオチド配列を構築するための基本プラスミドとして使用することができ、in vitro  mRNA転写の鋳型としても使用することができる。ルシフェラーゼ遺伝子は、レポーター配列として使用することができる。mRNA転写は、実施例10で既に概略を示したように、T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼのいずれかを使用して、該混合物と5'7meGpppG5'(Integrated Sicences)  3mMとをインキュベートすることによってmRNAの末端にm7GpppG-capを添加して、SmaI直線化プラスミド鋳型上で実施することができる。自己複製mRNAは、ワクチン効果を高めるために使用することができる。自己複製mRNAは、T7、T3またはSP6 RNAポリメラーゼのいずれかで直線化DNAから、転写物コード、いずれか/および/またはTEV(タバコetchウイルス)などのリーダー配列、非構造ポリ蛋白質またはセムリキ森林熱ウイルスのレプリカーゼまたはアルファウイルス属のその他の因子(Liljestrom  and  Garoff、1991)、リポーター配列、ポリ(A)テール、または転写、翻訳、安定性または輸送を促進するその他の内部または5'および3'ヌクレオチド配列で生成することができる。たとえば、ベータグロビンmRNAの5'および3'非翻訳領域の取り込みは、細胞にトランスフェクトしたRNAを非常に安定化し、トランスフェクト細胞でのレポーター遺伝子発現を1000倍以上増加させる(Mitchell and Nair、2000)。RNA転写は、DNA分解酵素Iで消化した後、RNeasy RNA精製キット(Qiagen)を使用して精製することによって精製することができる。DNAは、MinEluteカラム(Qiagen)を使用して精製することができる。リン酸緩衝液存在下でリポフェクチン(Life Technologies)に結合させることによって(Kariko他、1998)細胞に輸送するmRNAまたはプラスミドあるいはmRNAまたはDNAの一定量は、血清を含まない、洗浄樹状細胞、B細胞、単球、T細胞、またCD4+T細胞またはその他のT細胞に60分間直接添加することができ、次に、適切な宿主に導入するために該細胞を新鮮培地またはPBSに再懸濁することができる。ワクチンは、直接、皮膚またはその他の器官内のランゲルハンス細胞など樹状細胞のトランスフェクションによって作用すると考えられているので、mRNA、mRNA/脂質複合体またはDNAの一定量を直接皮内注射、脾臓またはその他の内部器官への注射、または粘膜への直接曝露によって生物全体に導入することもできる。
【０２４９】
[細胞培養]
RNAまたはDNA配列は、裸のヌクレオチド配列として、ヌクレオチド/リポソーム(またはその他の担体)複合体として、あるいは樹状細胞または組織培養中のその他の細胞にトランスフェクトを実施する遺伝子銃または微粒子銃のいずれかで輸送することができる。次に、成熟した細胞は、細胞分離カラムを使用した負の選択によって、または細胞種特異的磁気ビーズ(Dynal)を使用した正の選択によって精製することができる。
【０２５０】
[リポーター遺伝子生成物分析]
ルシフェラーゼ酵素活性は、細胞培養溶解試薬(Promega、Madison、WI)中で細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質(Promega)を添加し、照度計で光強度を測定することによって示すことができる。
【０２５１】
[免疫および抗原による免疫誘発]
BALB/cマウス(6-8週齢)またはその他の実験動物を使用して、各ワクチンまたは免疫経路を試験することができる。一般的に、動物は、様々な経路で2週間隔で3回免疫し、2〜3週間休息させ、次に膣内または直腸内において抗原による誘発を行うことができる。膣内または直腸内投与は動物を麻酔する必要があるのに対して、PBSに懸濁した粒子による経鼻的免疫では麻酔をせずに実施することができる。動物は、仰向けに20分維持する。筋肉内免疫は、大腿部の筋肉に行うことができる。
【０２５２】
当業者には、概括的に説明した本発明の精神および範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態で示した本発明に数多くの変更および/または変化を行うことができることは明らかであろう。したがって、本発明の実施形態は、あらゆる点で、例示するものであって、限定するものではないと考えられる。
【０２５３】
前述の発行物は全て、本明細書に全体を援用する。
【０２５４】
本明細書に含めた書類、法律文書、材料、装置、物品などは、ただ単に本発明の状況を説明するためだけものである。これらの事柄のいずれかまたは全ては、この出願のそれぞれの請求範囲の優先日より前に、特にオーストラリアにおいて存在したように、基礎となる従来技術の一部を形成しておらず、または本発明に関連のある分野の一般知識ではないことを承認する。
[参考文献]
2006504438.tif 000008
2006504438.tif 000009
2006504438.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】プラスミドpEGX207の図である。pEGX207の構築に使用した基本となるプラスミドは、PstIとSmaI制限部位の間のpUC18のマルチクローニング部位にT7 RNAプロモーターおよびRQ-EGXが挿入されたpUC18であった。該T7 RNAプロモーター配列の後にはQbポリメラーゼによるRNA増幅を可能にするRQ135配列が続く。
【図２】コンピュータプログラム(RNAdraw  v1.1)によって作製された結合蛋白質をコードするRNA分子の推定構造を示した図である。図2(a)は、野生型RNA分子の推定構造を示し、図2(b)は本発明の方法によって、発現を増加させるため、変異誘発後選択された変異型RNA分子の推定構造を示す。
【図３ａ】野生型12Y-2と比較した(pEGX248によってコードされた)12Y-2変異型蛋白質の発現分析を示した図である。
【図３ｂ】野生型12Y-2と比較した(pEGX248によってコードされた)12Y-2変異型蛋白質の精製を示した図である。
【図４】T7ポリメラーゼを用いた場合に対して、本発明の方法に従ってリバビリン5'-三リン酸と組み合わせたT7ポリメラーゼを用いた場合に生成したジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)における変異の数を示した図である。
【図１】
2006504438.tif 000011
【図２】
2006504438.tif 000012
【図３ａ】
2006504438.tif 000013
【図３ｂ】
2006504438.tif 000014
【図４】
2006504438.tif 000015
【配列表】
2006504438000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月29日(2005.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子を複製または転写する間に1個または複数の変異を導入する方法であって、
(i)前記標的核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、前記標的核酸を転写または複製する間に変異の導入を可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートする工程、および
(ii)変異した標的核酸分子を選択するか、または導入した変異の効果について選択する工程、
を含む方法。
【請求項２】
工程(i)および/または工程(ii)をin vitroまたは無細胞系、または、細胞内で実施する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程(ii)が変異標的核酸分子を選択することを含む請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記変異核酸分子が、改変された特性または活性を有する請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記変異核酸分子が、改変された特性または活性を有する蛋白質をコードする請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
所望する特性を有する変異蛋白質を同定する方法であって、
(i)標的核酸分子を、リバビリン、またはその誘導体/アナログの存在下で、前記標的核酸の転写または複製を可能にする条件下で、ポリメラーゼと共にインキュベートする工程、
(ii)工程(i)で生成した核酸によってコードされた蛋白質を生成する工程、および
(iii)前記蛋白質を所望する特性についてスクリーニングする工程、
を含む方法。
【請求項７】
前記コード蛋白質を生成する前に、工程(i)で生成した核酸をリバビリンまたはその誘導体/アナログの非存在下でコピーする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
工程(ii)で生成した前記蛋白質が、そのコードしている核酸分子と関連する請求項6または7に記載の方法。
【請求項９】
前記コードしている核酸分子を回収する工程をさらに含む請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程(i)で生成した前記核酸がRNAであり、前記方法がさらに蛋白質生成前にRNAをDNAに逆転写する工程を含む請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼがDNA依存性RNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がDNA分子である請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がDNA分子である請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼがRNA依存性DNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がRNA分子である請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼがRNA依存性RNAポリメラーゼであり、前記標的核酸分子がRNA分子である請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記複製または転写を、少なくとも1種の他の変異誘発方法と組み合わせて実施する請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
リバビリンまたはその誘導体/アナログおよび核酸分子の複製または転写に必要な少なくとも1種類の試薬を含むキット。
【請求項１７】
前記少なくとも1種類の試薬が、ポリメラーゼ、ポリメラーゼをコードする核酸分子、反応緩衝液およびヌクレオシドまたはヌクレオチドからなる群から選択される請求項16に記載のキット。
【請求項１８】
リバビリンまたはその誘導体/アナログおよび少なくとも1種類のその他の変異原を含むキット。
【請求項１９】
改変された特性または活性を示す変異RNA分子を同定する方法であって、
(i)RNA依存性RNAポリメラーゼがRNA分子を複製するが、変異を導入し、それによって変異RNA分子集団を生じる条件下で、標的RNA分子を前記RNA依存性RNAポリメラーゼと共にインキュベートする工程、および
(ii)改変された特性または活性を示す変異RNA分子を選択する工程、
を含む方法。
【請求項２０】
前記改変された特性または活性が、工程(i)の変異導入前のポリペプチドの発現レベルと比較したときの、コードポリペプチドの増加した発現である請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前の安定性のレベルと比較したときの、増加した安定性である請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前の触媒活性のレベルと比較したときの、改変した触媒活性である請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前のRNA干渉活性のレベルと比較したときの、増加したRNA干渉活性である請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
前記改変された特性または活性が、工程(i)における変異導入前のアンチセンス活性のレベルと比較したときの、増加したアンチセンス活性である請求項19に記載の方法。
【請求項２５】
工程(i)で前記RNA分子に導入された前記変異が、RNA分子によってコードされた蛋白質のアミノ酸配列を変化させない請求項19に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、DNA構築物を転写して複製可能なRNAを生成する工程を含む請求項19から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程(i)および/または工程(ii)をin vitro系または細胞内で実施する請求項19から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
工程(i)を少なくとも1種のその他の変異誘発方法と組み合わせて実施する請求項19から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学的変異原がリバビリンまたはその誘導体/アナログである請求項28に記載の方法。
【国際調査報告】
2006504438.tif 000016
2006504438.tif 000017
2006504438.tif 000018
2006504438.tif 000019
2006504438.tif 000020