(57)【要約】【課題】            シグナルの緩和度を制御可能な磁気共鳴画像を得る。【解決手段】        ナノ粒子又はマイクロ粒子エマルジョンと結合するのに有用な化合物で、且つ、容易に該微粒子成分と結合する化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物：
2006516993.tif 000009
ここで、Ｃｈはキレート成分を表し；
ｍは０―３;
Ｒｌは非妨害性置換基であり；
ｌは０―２；
ＺはＳ又はＯ；
Ｒ２はＨ又はアルキル（１―４Ｃ）；
ｎは０又は１；及び
各Ｒ３は、独立して、任意的に置換された飽和又は不飽和の、少なくとも１０のＣを含むヒドロカルビル基である。
【請求項２】
ｎが１であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
スペーサーがＣＨ２ＣＨ２、且つ、Ｒ２がＨであることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＺがＳであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がＨであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ｌが０、且つ、ｍが１又は０であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
各Ｒ３ＣＯＯが天然に生じた脂肪酸の残基又は該残基の混合物であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１がＣＨ３Ｏであることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
スペーサーがペプチド又はポリアルキレングリコールを含むことを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｃｈと結合する、常磁性金属イオン又は放射性核種の金属を、更に、含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
親油性ナノ粒子又はマイクロ粒子と結合した請求項１に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１２】
親油性ナノ粒子又はマイクロ粒子と結合した請求項１０に記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
前記粒子が、請求項１に記載の化合物を少なくとも２０００コピー含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記粒子が、請求項１０に記載の化合物を少なくとも２０００コピー含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、更にターゲティング剤を含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、更にターゲティング剤を含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ターゲティング剤が、受容体リガンド又は抗体又はそれらのフラグメントであることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ターゲティング剤が、受容体リガンド又は抗体又はそれらのフラグメントであることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、更に生理活性剤を含むことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、更に生理活性剤を含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、リポソーム、油滴、ペルフルオロカーボンナノ粒子、脂質−皮膜蛋白粒子、又は、脂質‐皮膜多糖類であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、リポソーム、油滴、ペルフルオロカーボンナノ粒子、脂質−皮膜蛋白粒子、又は、脂質‐皮膜多糖類であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１２に記載の化合物と結合した組織をイメージングすることを含む、磁気共鳴画像又は放射性核種によって生成される画像を獲得する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００３年１月２４日付けで提出された米国第１０／３５１，４６３号の一部継続出願であるが、それは２００２年１月２４日付けで提出された米国第６０／３５１，３９０号に基づく利益を主張する。この出願は、また、２００３年７月９日付けで提出された米国仮特許出願第６０／４８５，９７０号に基づく利益を主張する。これらの出願内容は引用により本書に組み込む。
【政府の補助への謝辞】
【０００２】
本発明は部分的にアメリカ合衆国政府の補助金による支援を受けている。アメリカ合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の金属イオンのキャリアーとして有用なキレート剤（該キレートは、親油性の粒子又は小滴を含むキャリアーとして提供される）を指向している。更に、とりわけ、本発明は、ホスホグリセリドと任意にスペーサーを介して結合するキレート剤を指向する。
【背景技術】
【０００４】
核磁気共鳴画像法においては、有用な金属イオンを捕捉する様々な型のキレート剤の使用が、よく知られている。一般的にキレート剤は、相当数の非共有電子対、又は、負に荷電した若しくは潜在的に負に荷電した種（species）を含む。おそらく、これらの中で最も単純なのは、硬水軟化剤として一般に使用されているエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。しかし、多くの薬剤が知られており、その中には、非常に且つ一般的に使用されているジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びテトラアザシクロドデカン四酢酸（ＤＯＴＡ）及びそれらの誘導体を含む。米国特許第５，５７３，７５２号及び第６，０５６,９３９号を参照により本書に組み込むが、これらは有用なＤＯＴＡ（該ＤＯＴＡはベンジル又はイソチオシアネートで置換されたフェニル環であるフェニル成分と結合している）誘導体について詳しく開示している。このイソチオシアネートは、様々な付加的な化合物と結合する反応性のある基を提供する。これらの特許で記述されているように、イソチオシアネート基は、抗体又はそのフラグメントなどの標的薬剤にキレートを結合させるために使用出来る。
【０００５】
ＭＲＩ用にキレート化した金属を投与するのに使用される送達ビヒクル組成（delivery vehicle compositions）に関する一つの文献がある。これらの組成（compositions）の幾つかは、標的薬剤を含まない一方、その他の組成（compositions）は標的薬剤を含む。例えば、米国特許第５，６９０，９０７；５，７８０，０１０；５，９８９，５２０；５，９５８，３７１；及びＰＣＴ公開公報第ＷＯ ０２／０６０５２４号であるが、これらの中身は引用により本書の中に組み込むが、様々な標的薬剤、並びに、ＭＲＩ画像用薬剤、放射性核種、及び／又は生理活性物質のような所望の化合物に結合する全フッ素化炭素ナノ粒子のエマルジョン（乳濁液）について記述している。その他の標的イメージング（targeted imaging）のために使用される組成は、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ ９９／５８１６２；第ＷＯ ００／３５４８８号；第ＷＯ ００／３５８８７号；及び第ＷＯ ００／３５４９２号で開示されているものを含む。これらの公報の内容も、また引用により本書に組み込む。
【０００６】
本発明の一つの態様は、核磁気共鳴画像法で有用な造影剤の改良に焦点を合わせている；出願人らによる方法を理解する上で、この技術の幾らかの背景説明が必要である。
【０００７】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は診断及び研究のための有益な手段となっている。（本）技術は、組織及び体液中の水に含まれる水素原子核がラジオ波で励起された後に基底状態に戻る際放出されたエネルギーを検出することに基づいている。この現象の観察は、水素原子核スピンの分布が統計学的に磁場と整列するよう非観察領域内を横断する磁場を印加し、その後適切なラジオ波を課すことに依存する。この結果、当該統計学的な整列が乱される励起状態が生じる。そして、基底状態へと向かう前記分布の衰退は、エネルギーの放出として測定され得るが、そのパターンは画像として検出可能である。
【０００８】
実際には、関連する水素原子核の緩和速度は、独自の素子のままでは、検出可能なエネルギー量を生成するには遅すぎることが判明している。この状況を改善するために、画像化されるべき領域に造影剤、通常強力な常磁性金属を供給する。この造影剤は減衰を加速するための触媒として有効に作用し、検出可能なはっきりとしたシグナルの生成を可能とする十分な量のエネルギーの放出を可能にする。簡潔に説明すると、造影剤は、緩和時間を短縮し、かつ緩和時間の逆数、即ち、周囲の水素原子核の「緩和度」を増加させる。
【０００９】
二つの型の緩和時間が測定可能である。Ｔ１は、磁場分布が、磁場に関して縦方向に元の分布が６３％まで戻るのに要する時間であり、そして緩和度ρｌはその逆数である。Ｔ２は、磁場を横断する方向に分布の６３％が基底状態まで戻る時間を測定したものである。その逆数は緩和度の指数であるρ２である。一般的には、緩和時間及び緩和度は磁場の強度により変化する；これは縦方向の成分の場合に最も明白である。
【００１０】
従って、造影剤の望ましい性質は、ρ１及びρ２両者の緩和度を増強したシグナルを提供することである。本発明は、そのような造影剤を提供する。
【００１１】
被検体内に保持された場合に毒性を有するかもしれない常磁性イオンの排出を促進するのにも有利である。従って、細胞若しくは肝臓への取り込みを生じさせ得る粒子若しくは任意の脂質成分から、キレート化された金属イオンを切断する機構を提供するのに有利かもしれない。
【００１２】
キレート化常磁性金属を基礎とする造影剤に関する広範な文献が存在する。例えば、米国特許第５，５１２，２９４号及び同第６，１３２，７６４号は、ＭＲＩ造影剤として、その表面に金属キレートを有するリポソーム粒子について記載している。米国特許第５，０６４，６３６号及び同第５，１２０，５２７号は、消化管内のＭＲＩのための常磁性オイルエマルジョンについて記載している。米国特許第５，６１４，１７０号及び同第５，５７１，４９８号は、血液プール造影剤として、親油性ガドリニウムキレート例えばガドリニウム−ジエチレン−トリアミン−五酢酸−ビスオレアート（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ）を組み込むエマルジョンについて記載している。
【００１３】
米国特許第５，８０４，１６４号には、特別に設計されたキレート剤及び常磁性金属を含む水溶性親油性剤について記載されている。米国特許第６，０１０，６８２号及び同じパテントファミリーに属する他の公報には、リポソーム、ミセル又は脂質エマルジョンとして投与可能とされる常磁性金属を含む脂溶性キレート化造影剤について記載されている。
【００１４】
従って、一般的には、造影剤は、所望の画像領域に送達される常磁性金属が実質的な濃度になるような形態で、流動性のある希土類又は鉄のような常磁性金属の形態をとる。
【００１５】
造影剤の有用な濃度を提供する一つの方法が、本出願人によって、米国特許第５，７８０，０１０号及び同第５，９０９，５２０号に記載されている。ナノ粒子は、脂質/界面活性剤コーティングによって覆われた不活性コアから形成される。さらに、粒子は、特異的な部位への標的にするためのリガンドと結合され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の一つの視点は、シグナルの緩和度が制御され得、且つ、排出が促進され得るように、造影剤の設計における改良を提供することである。しかしながら、本発明の化合物は、他の局面すなわち核放出を基礎とするイメージングにおいて所望の位置への放射性核種の送達においても有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、リポソーム、フルオロカーボンナノ粒子、油滴などのような種々の親油性送達ビヒクルのキャリアーと容易に結合し得る化合物（該化合物は、これらの送達ビヒクルとの相対的な位置において、シグナルの緩和度の制御を提供する、また、好ましくは共鳴画像を増強する毒性を潜在的に有する常磁性イオンの排出を促進するための機構も提供する）を提供する。常磁性イオンのキレート化の代替法として、放射性核種も含まれるが、この核種の排出促進が望ましいのは明白である。常磁性イオン又は放射性核種は、以下の式のキレートを含む化合物の中で提供される：
2006516993.tif 000002
ここで、Ｃｈはキレート成分を表し；
ｍは０―３;
Ｒｌは非妨害性置換基であり；
ｌは０―２；
ＺはＳ又はＯ；
Ｒ２はＨ又はアルキル（１―４Ｃ）；
ｎは０又は１；及び
各Ｒ３は、独立して、任意的に置換された飽和又は不飽和の、少なくとも１０のＣを含むヒドロカルビル基である。
【００１８】
式（１）の化合物は、キレート剤と結合する少なくとも一つの常磁性イオン又は放射性核種を含んでいてもよい。
【００１９】
別の態様において、本発明は、式（１）の化合物と結合する親油性送達ビヒクルを含む組成物、並びに、これらの組成物を用いた磁気共鳴又は放射性核種イメージを得るための方法を目的とする。さらに別の態様において、本発明は、式（１）の化合物を調製する方法、及び、本発明の送達ビヒクル組成物を調製する方法を目的とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、一般に、式（１）の化合物（常磁性イオン又は放射性核種を含有する該化合物も含む）に向けられる。一つの実施態様において、本発明は、実施例１で説明する特異的構造を含有する組成物又は化合物を含まない。
【００２１】
式（１）の化合物は、適切な常磁性イオンを含む場合、簡便に調製されるＭＲＩ用造影剤を提供するが、それは少なくとも二つの有益な特徴を有する。まず、そのリン脂質への結合能によって、リポソーム、フルオロカーボンナノ粒子などの親油性送達ビヒクルと容易に結合する。第二に、一つのスペーサーを含有していてもよいので、シグナルの緩和度が、キャリアー送達ビヒクルからのスペーサーによって課される距離により制御され得る。任意の、三つ目の利点は、スペーサーが、一旦画像が取得された後に造影剤が粒子から解離され排出されるような切断部位を提供するかもしれない。式（１）の化合物は、キレート剤と結合するベンゼン環と共役するイソシアン酸塩又はイソチオシアネートから簡単に調製される。これらの基の反応性のため、共役は広範なスペーサー及びリン脂質との間でなされ得る。
【００２２】
Ｃｈで表されるキレート剤は、典型的には、少なくとも二つの、そして好ましくは多種多様な窒素を含む。該窒素は、アルキレン基によって間隔をあけられ、且つ、カルボン酸関連成分（carboxylic acid-bearing moieties）がそこに結合する。キレート剤は、所望の金属イオンを隔離ないし捕捉（sequester）するのに供される多重の非共有電子対又は潜在的な負電荷（potential negative charges）を含むことによって特徴付けられる。キレート剤として一般に使用されているものには、ポルフィリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン-N,N,N',N'',N''-ペンタアセテート（ＤＴＰＡ）、1,4,10,13-テトラオキサ-7,16-ジアザシクロオクタデカン-7（ＯＤＤＡ）、16-ジアセテート,N-2-(アゾール-1(2)-イル)エチルイミド二酢酸, 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸（ＤＯＴＡ）、1,7,13-トリアザ-4,10,16-トリオキサシクロ-オクタデカン-N,N',N''-トリアセテート（ＴＴＴＡ）、テトラエチレングリコール,1,5,9-トリアザシクロドデカン-N,N',N'',-トリス(メチレンホスホン酸（ＤＯＴＲＰ）、N,N',N''-トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びこれらのアナログが含まれる。本発明の化合物において、特に好ましいキレート剤は、ＤＯＴＡである。
【００２３】
キレート剤の目的は、勿論、所望の常磁性金属又は放射性核種を隔離ないし捕捉（sequester）することにある。適当な常磁性金属には、原子番号５８−７０のランタニド又は原子番号２１−２９、４２又は４４の遷移金属を含む―すなわち、例えば、スカンジウム、チタニウム、バナジウム、クロミウム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムで、最も好ましくは、ガドリニウム（III）、マンガン（II）、鉄、ユウロピウム、及び／又はジスプロシウムである。適当な放射性核種には、例えば、Ｓｍ、Ｈｏ、Ｙ、Ｐｍ、Ｇｄ、Ｌａ、Ｌｕ、Ｙｂ、Ｓｃ、Ｐｒ、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｕ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｓｎ、及びＰｂについての放射性の型を含む。
【００２４】
本発明はこれらの放射性核種及び常磁性イオンの組成に限定されるものではないが、前記で列挙したものは代表的なものである。
【００２５】
式（１）に含まれるホスホグリセリドは、天然に生成するレシチンから最も簡便に誘導される（但し、Ｒ３ＣＯＯによって表される基は、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等のような脂肪酸である）。しかしながら、本発明の方法で同じように有用なのは、各Ｒ３が任意的に置換されている飽和若しくは不飽和のヒドロカルビル成分である、ホスホグリセリドである。ヒドロカルビル成分は十分な親油性を授与されるためには、少なくとも１０のＣを含むべきである；しかし、それらの炭素は１以上のヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、又はＳから選択される）によって別々に隔てられてもよい。適当な置換基にはヘテロ原子含有−芳香族成分を含む置換基を含み、及び／又は、置換基はハロ、=Ｏ、ＯＲ、ＳＲ、及びＮＲ２でもよい（但し各Ｒは独立して任意的に置換されたアルキル(１‐６Ｃ)である）。Ｒ３によって表されるヒドロカルビル成分は分枝又は直鎖であってもよく、そして、１以上の環状部分を含んでいてもよい。各Ｒ３は、キャリアーを構成する親油性の微粒子又は小滴（droplets）と会合（association）する手段を提供するために、単純に十分に親油性でなければならない。熟練した技術者であれば、直ちに、この条件を満たすＲ３の態様を選択することが出来る。
【００２６】
式中に記載されているスペーサー成分は、存在しても存在していなくともよい。スペーサーはホスホグリセリド自体に起源を持つ部分を含んでいてもよい―例えば、一つの重要な態様において、スペーサーは、ホスファチジルエタノールアミンであるホスホジグリセリドから誘導されたＣＨ２ＣＨ２成分であるか、又は、それを含んでいてもよい（ここで、式（１）で示されるＮＲ２はホスファチジルエタノールアミンから誘導されたものである）。Ｒ２の好ましい態様には、メチル、エチル、及び、Ｈを含む。ある態様においては、スペーサーは、ペプチド、偽ペプチド、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールなどに由来する部分を含む。（偽ペプチドはペプチド結合がイソステリック結合で置換されたペプチドに類似したポリマーである―即ち、ここで、ＣＯＮＨ結合が例えばＣＨ２ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨなどで置換される。）スペーサーの長さは以下に記述するようにシグナルの緩和度を制御するために選択されてもよく、そして更に、キャリアー粒子からキレートの離脱を許容するような切断部位を含んでいてもよい。
【００２７】
式（１）のベンゼン環上にある「非妨害性置換基」Ｒ１は、アルキル（１‐６Ｃ）、ハロ、アルコキシ（１‐６Ｃ）などの任意の置換基であり、そして、「非妨害性置換基」Ｒ１は、分子の残部とキレート剤の結合を、又は、キレート剤が適切な金属イオンを捕捉する能力を、又は、イメージングにおいて式（１）の化合物を含有する組成物の使用を妨害しないものである。メトキシが好ましい。種々の置換基が化合物の本質的特徴を妨害せずに前記ベンゼン環上に存在し得ることが理解されている。金属のキレート化又はイメージングとの関係において、式（１）の化合物の性能を有意に低下させることが分かっている任意の置換基は、本発明の範囲内に含まれない。好適な置換基には、ＯＲ、ＮＲ２、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、ＳＯ３Ｈ、及びＲ（但しＲは、任意的に例えばハロ、＝Ｏなどで置換され、且つ、任意的にＯ、Ｓ、若しくはＮのようなヘテロ原子を含有するアルキル又はアルケニルである）を含む。
【００２８】
一般的には、式（１）の化合物は、次式の化合物：
2006516993.tif 000003
（ここで、ｍ、ｌ及びＲ１は上述のように定義される）と、次式の化合物から合成される
2006516993.tif 000004
ここで、Ｒ２、ｎ、及びＲ３は上述のように定義される。このタイプの反応は容易であり、そうした反応を行うための条件は当業者において既知である。典型的には、この反応は、弱塩基の存在下で非プロトン性の溶媒中で行う。
【００２９】
式（１）の化合物は、典型的には、金属と会合し、親油性送達ビヒクルを含有する組成物の中に含まれる。「送達ビヒクル」は、微粒子のキャリアーで、少なくともその表面は親油性であり、また、親水性又は水溶性の媒体中に懸濁されている。これらのビヒクルはマイクロ粒子又はナノ粒子であり、平均直径は１０ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは、５０ｎｍ〜５０μｍの範囲でよい。しかしながら、in vivoでの使用においては、直径の範囲は５０〜５００ｎｍ、好ましくは、５０〜３００ｎｍである。この粒子は種々の組成物であってよく、良く知られているリポソーム（種々の大きさであってよく、単層または多層であってよい）、ミセル、油滴、リポ蛋白のようなビヒクルを含み、それらは例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロン、フルオロカーボンナノ粒子、マイクロバブル（microbubbles）若しくはナノバブル（nanobubbles）で、又は、上述した範囲の大きさで少なくともその表面が親油性であり、更に以下に述べるような広範な種類の任意の粒子である。従って、これらナノ粒子の表面は、脂質、又は、界面活性剤、又は、その両者である。
【００３０】
式（１）の化合物は、常磁性イオン及びキャリアーシステム中に含有される親油性粒子と会合する場合、磁気共鳴画像を得るのに有用である。送達システム中のビヒクルは更に、造影剤を所望の組織又は器官に運ぶためのターゲティング剤のような他の有用な成分を含んでもよく、また、任意的に、治療薬又は生理活性剤を含んでいてもよい。ある態様においては、これらのビヒクルは放射性核種のような他のイメージング剤（imaging agents）を含んでもよく、又は、より一般的には、キレート中に代替的に該放射性核種を含んでよい。
【００３１】
ターゲティング剤は、典型的には抗体又はその免疫特異的な断片、所望の標的又は組織上に存在する受容体に対するリガンド、細胞成分を標的にするよう特異的に設計された分子（例えばインテグリンを標的にする環状ＲＧＤペプチドを基に設計された分子）などを含んでいてもよい。親油性粒子それ自体が、ターゲティング剤と結合し得る反応基を含んでいてもよい。
【００３２】
送達ビヒクルの脂質／界面活性剤成分は、脂質／界面活性剤成分中に含有されている機能性を介して、これらの反応基と結合可能である。例えば、ホスファチジルエタノールアミンはそのアミノ基を介して所望の成分と直接結合してもよく、又は、以下に記載するようなカルボキシル、アミノ、スルフヒドリル基を提供する短いペプチドのようなリンカーと結合してもよい。或いは、マレイミドのような標準的な連結剤（linking agents）を用いても良い。ターゲティングリガンドと補助物質をナノ粒子に結合させるために、種々の方法が使用されてよい；これらの戦略には、例えば、ポリエチレングリコール又はペプチドのようなスペーサーの使用も含む。
【００３３】
ターゲティングリガンド又はその他の有機成分と、外層成分との共有結合のために、種々のタイプの結合剤及び連結剤（linking agent）を使用することができる。そのような結合を形成するための典型的な方法には、カルボジアミドの使用によるアミドの形成、又はマレイミドのような不飽和成分の使用によるスルフィド結合の形成が含まれる。他の結合剤には、例えば、グルタルアルデヒド、プロパンジアール、又は、ブタンジアール、2-イミノチオランハイドロクロライド、スベリン酸ジスクシンイミジル、酒石酸ジスクシンイミジル、ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スル-ホンのような二機能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、N-(5-アジド-2-ニトロベンゾイルオキシ)スクシンイミド、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート、及び、スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチラートのようなヘテロ二機能性剤、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、4,4'-ジフルオロ-3,3'-ジニトロジフェニルスルホン、4,4'-ジイソチオシアノ-2,2'-ジスルホン酸 スチルベン、p-フェニレンジイソチオシアナート、カルボニルビス(L-メチオニン p-ニトロフェニル エステル)、4,4'-ジチオビスフェニルアジド、エリトリトールビスカルボナートのようなホモ二機能性剤、並びに、アジプイミド酸ジメチル塩酸塩、ジメチルスベルイミダート、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオンイミダート塩酸塩のような二機能性イミドエステルなどを含む。連結は、また、アシル化、スルホン化、還元的アミノ化等によっても成し得る。所望のリガンドを外層の１以上の成分に共有結合で結合する多様な方法が、当業者には既知である。その特性に適合性があるならば、リガンド自体が表層内に含まれていてもよい。例えば、リガンドが高親油性を有しているならば、リガンド自体を脂質／界面活性剤コーティング中に埋め込んでもよい。さらに、リガンドがコーティングに直接吸着され得るならば、この吸着は結合を形成するであろう。例えば、核酸は、その負電荷のためにカチオン性界面活性剤に直接吸着される。
【００３４】
ターゲティングリガンド又は抗体は、ナノ粒子に直接結合することもできる。即ち、リガンド又は抗体は、上述のようにナノ粒子自体と結合する。或いは、ビオチン／アビジンを介した間接的結合を使用してもよい。典型的には、ビオチン／アビジン媒介のターゲティングにおいて、リガンド又は抗体は、エマルジョンに結合するのではなく、むしろビオチン化の形態で、標的組織に結合する。
【００３５】
コーティング層に取り込まれることによりナノ粒子と結合してもよい付属的な薬剤には、放射性核種（常磁性イオンの代わりでも、又は、常磁性イオンに加えてもよい）が含まれる。放射性核種は、治療的なものでも診断的なものでもよい；そのような放射性核種を使用する診断イメージングは既知であり、また、好ましくない組織へ放射性核種を標的化することによって治療上の効果が得られることも同様に既知である。典型的な診断用放射性核種には、９９ｍＴｃ、９５Ｔｃ、ｌｌｌＩｎ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａが含まれ、治療用放射性核種には、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１４９Ｐｍ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１０３Ｐｄ、１０９Ｐｄ、１５９Ｇｄ、１４０Ｌａ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、６７Ｃｕ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、及び１９２Ｉｒが含まれる。放射性核種は、予め形成されたエマルジョンに種々の方法で供与することができる。例えば、９９Ｔｃ-ペルテクン酸（pertechnate）を、過剰量の塩化スズと混合し、予め形成されたナノ粒子エマルジョンの中に組み込むことができる。塩化スズの代わりに、オキシン酸第一スズ（Stannous oxinate）を使用することもできる。更に、市販のキット、例えばニコメドアマシャム（Nycomed Amersham）によりCeretek（登録商標）として販売されているＨＭ−ＰＡＯ(exametazine)キットも使用することができる。本発明のナノ粒子に種々の放射性リガンドを付着する手段は、当業者には既知である。上述のように、組成物が放射性核種を基礎とした診断的又は治療的目的で使用される場合、放射性核種は付属的な物質ではなく、常磁性イオンの代わりにキレート剤を占有してもよい。
【００３６】
その他の付属的な薬剤としては、フルオレセン、ダンシル、量子ドット（quantum dots）のようなフルオロフォアが含まれる。
【００３７】
本発明のある実施形態において、補助的薬剤として親油性キャリアービヒクルの中に含まれるものに、生理活性物質がある。このような生理活性物質は、例えばタンパク質、核酸、医薬等、多種多様なものであり得る。そのため、好適な医薬に含まれるものとして、抗悪性腫瘍薬、ホルモン、鎮痛薬、麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤若しくは駆虫薬、抗ウイルス薬、インターフェロン、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、鎮咳薬、抗凝血薬等がある。
【００３８】
前記の全てのケースにおいて、会合成分が組織若しくは器官に対するターゲティングリガンドであるか又は補助剤であるかに関わらず、規定の成分が、非共有結合的に親油性ビヒクルと結合してもよいし、ビヒクルの構成成分と直接に結合してもよいし、又は、スペーサー成分を介して該構成成分と結合してもよい。
【００３９】
多様性のあるビヒクルが本発明の組成物中で使用されてよい―例えば、リポソーム粒子がある。種々のタイプのリポソームについて記載した文献が広範に存在し、当業者には既知である。リポソーム自体が脂質成分を含んでいるため、上述の脂質及び界面活性剤がリポソーム自体に含有されている成分の記述において適用可能である。これらの親油性の構成成分は、不活性の核を有するナノ粒子上へのコーティングに関しては上述したものと同様の方法で、キレート剤に結合させるのに使用され得る。ミセルは、同様の材料から構成され、所望の材料特にキレート剤を結合させるこのアプローチはそれらに同様に適用される。固体状の脂質もまた使用される。
【００４０】
もう一つの例では、タンパク質又はその他のポリマーが、微粒子のキャリアーを形成するのに使用できる。これらの物質は、親油性のコーティングを施せるような不活性な核を形成することが可能であり、又は、キレート剤は、例えば、微粒子の固体担体（particulate solid supports）に結合親和剤中で使用するような技術により、直接に重合体物質に結合させることが可能である。よって、例を挙げれば、タンパク質から形成された粒子は、例えばカルボジイミドによって仲介される脱水反応を通してカルボン酸及び／又はアミノ基を含む分子と共に結合されることが可能である。硫黄含有‐蛋白質は、他の有機分子（該分子はキレート剤が結合する部分を一緒に含む）にマレイミド連結を介して結合され得る。微粒子キャリアーの性質に依存して、キレート剤の鋸歯状部分と粒子の表面との間でオフセット（本来の中心位置からある方向に移動して画像を表示すること）が得られるように結合する方法は、当業者には明白であろう。
【００４１】
さらに、もう一つの例では、国際特許出願国際公開W0 95/03829号により、薬物が油滴内部に分散又は溶解され、該油滴がリガンドによって特定の部位を標的にするオイルエマルジョンが記載されている。米国特許第5,542,935号には、ガス充填ペルフルオロカーボンミクロスフェアを用いた部位特異的薬物送達について記載されている。薬物送達は、ミクロスフェアの標的を目指した進行が可能となり、そして、ミクロスフェアの破裂が誘発されることによって達成される。ガス気泡（gas bubbles）を生成可能にするために、低沸点フルオロ化合物を用いて粒子を形成することもできる。
【００４２】
一つの重要な態様には、上掲米国特許第５，９５８，３７１号に記載されているような高沸点ペルフルオロカーボン液を基礎としたナノ粒子エマルジョンを含む。前記液体エマルジョンは、脂質及び／又は界面活性剤から構成された被膜（コーティング）によって囲まれた比較的高沸点のペルフルオロカーボンを含有するナノ粒子から構成される。周囲被膜（コーティング）は、ターゲティング成分に直接結合することができ、又はターゲティング成分−任意的にリンカーを介して−と共有結合する中間物を捉えることができ、又は、ビオチンのような非特異的カップリング剤を含んでもよい。或いは、被膜（コーティング）は、一般的には核酸とりわけアプタマーのような負荷電ターゲティング剤をその表面に吸着可能とするような、カチオンであってもよい。
【００４３】
好ましいエマルジョンは、１又は２以上の所望の成分の多数のコピーをナノ粒子に結合するためのビヒクルを提供する脂質／界面活性剤混合物である外被及びコアとしての高沸点ペルフルオロカーボンを含むナノ粒子システムである。基礎粒子の構築及びそれらを含むエマルジョンの形成について、外表面に結合する成分とは関係なく、上掲米国特許ないし特許出願第5,690,907号及び同第5,780,010号；及び娘出願（daughter applications）第5,989,520号及び同第5,958,371号として発行された米国特許に記載されている。これら文献は、引用を以って本書に繰り込み、ここに記載されているものとする。
【００４４】
高沸点フルオロケミカル液とは、沸点が体温すなわち３７℃より高いようなものを言う。従って、フルオロケミカル液の沸点は、好ましくは少なくとも３０℃、より好ましくは３７℃、一層好ましくは５０℃以上、最も好ましくは凡そ９０℃以上である。本発明に有用な「フルオロケミカル液」には、他の官能基を有するペルフルオロ化化合物（perfluorinated compounds）を含む直鎖状、分枝状及び環状ペルフルオロカーボンが含まれる。「ペルフルオロ化化合物」には、純粋なペルフルオロカーボン（だけ）ではなく、寧ろ他のハロ基（halo groups）も存在し得る化合物が含まれる。このような化合物には、例えばペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロジクロロオクタンが含まれる。
【００４５】
有用なペルフルオロカーボンエマルジョンは、米国特許第４，９２７，６２３号、同第５，０７７，０３６号、同第５，１１４，７０３号、同第５，１７１，７５５号、同第５，３０４，３２５号、同第５，３５０，５７１号、同第５，３９３，５２４号、及び同第５，４０３，５７５号に開示されており、これら文献の内容は引用を以って本書に繰り込み、ここに記載されているものとする。また、有用なペルフルオロカーボンエマルジョンは、含有されるペルフルオロカーボン化合物が、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロオクタン、ペルフルオロジクロロオクタン、ペルフルオロ-ｎ-オクチルブロミド、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロデカン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロモルホリン、ペルフルオロトリプロピルアミン、ペルフルオルトリブチルアミン、ペルフルオロジメチルシクロヘキサン、ペルフルオロトリメチルシクロヘキサン、ペルフルオロジシクロヘキシルエーテル、ペルフルオロ-ｎ-ブチルテトラヒドロフラン、及びこれらの化合物と構造的に類似する化合物、及びペルフルオロアルキル化エーテル、ポリエーテル又はクラウンエーテルを含む部分的又は完全にハロゲン化された（少なくともフッ素置換基を幾つか含む）又は部分的又は完全にフッ化された化合物、であるエマルジョンが含まれる。
【００４６】
高沸点ハロカーボンに加えて、本発明の組成物において有用な粒子は、マイクロバブル（microbubbles）又はナノバブル（nanobubbles）を含んでもよい事に、注意すべきである。従って、低沸点成分の粒子が、蒸発をもたらすin vivoの温度で、使用されてもよい。
【００４７】
更に、リポ蛋白及びカイロミクロンを使用してもよい。種々のタイプにリポ蛋白が良く知られており、例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ、及びＶＬＤＬが含まれる。
【００４８】
一つの態様において、脂質／界面活性剤被覆ナノ粒子は、エマルジョンを形成するための水性媒体中の懸濁において、コアを形成するフルオロカーボン脂質と、外層を形成する脂質／界面活性剤混合物との、微小流動化（microfluidizing）によって形成される。この方法では、脂質／界面活性剤は、ナノ粒子を被覆される際に付加的リガンドと既に結合していてもよく、又は単に後の結合のための反応基を含んでいてもよい。或いは、脂質／界面活性剤層に含有されるべき成分は、付属物質の溶解特性の効力によって、当該層に単に溶解するだけでもよい。水性媒体中の脂質／界面活性剤の懸濁を得るために、超音波処理及び他の技術が必要となることもある。典型的には、脂質／界面活性剤外層中の少なくとも１つの物質は、所望の付加的成分と結合するのに有用なリンカー又は官能基を含み、又は所望の付加的成分は、エマルジョンが調製される時には既に当該物質と結合していてもよい。
【００４９】
送達ビヒクル（結合リガンド、又は、所望の成分をその表面に結合するための試薬を含む）上の外被の形成に使用される脂質／界面活性剤には、天然又は合成型のリン脂質、脂肪酸、コレステロール、リソ脂質（lysolipids）、スフィンゴミエリン等が含まれ、更に脂質複合（conjugated）ポリエチレングリコールが含まれる。市販されている各種のアニオン性、カチオン性、及び非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン（Tweens）、スパン（Spans）、及びトライトン（Tritons）等も使用することができる。界面活性剤の中には、ペルフルオロヘキサン酸及びペルフルオロオクタン酸のようなペルフルオロ化アルカン酸（alkanoic acids）、ペルフルオロ化アルキルスルホンアミド、アルキレン４級アンモニウム塩（alkylene quaternary ammonium salts）等のようなそれ自体がフッ化されているものもある。更に、ペルフルオロ化アルコールリン酸エステルも使用することができる。外層に含まれるカチオン性脂質は、核酸、とりわけアプタマーのようなリガンドを保持するのに有利であり得る。典型的なカチオン性脂質には、DOTMA,N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロライド; DOTAP,1,2-ジオレオイルオキシ-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン; DOTB,1,2-ジオレオイル-3-(4'-トリメチル-アンモニオ)ブタノイル-ｓｎ-グリセロール,1,2-ジアシル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン; 1,2-ジアシル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン；1,2-ジアシル-sn-グリセロール-3-エチルホスホコリン；及び3β-[N',N'-ジメチルアミノエタン]-カルバモール]コレステロール-ＨＣｌが含まれる。
【００５０】
幾つかの態様においては、表面の脂質／界面活性剤中に、ターゲティングリガンド又は抗体、及び／又はイメージング若しくは治療のための補助的物質を結合するのに使用できる反応基が付随した成分を含む。
【００５１】
ＭＲＩにおける本組成の使用
磁気共鳴画像において使用する場合は、本発明の組成物は典型的にはキレート化構造中に常磁性イオンを含有する。そのような適用において、スペーサーの内包は特に有利である。
【００５２】
上に説明したようにスペーサーの機能は二つある：第一に、粒子からのキレート剤の距離を（それにより常磁性イオンを）制御することにより、粒子周囲の水中の水素への常磁性イオンの暴露を制御し、シグナルの緩和度を調整できる。第二に、スペーサーは、分断可能な基を含んでもよく、それにより、イメージングの機能が果たされた時にキレート化された金属イオンの排出を促進する。
【００５３】
第一の緩和度の効果に戻ると、得られる緩和度を最大にするには、スペーサーの寸法は、常磁性イオンが粒子の表面からオフセットされるような距離的には好ましくは少なくとも５又は１０Åである。
【００５４】
使用されている、ビヒクルの「表面（surface）」とは、キレート剤が結合する位置の粒子を構成する物質の外側限界を意味する。結局、粒子自体の平均直径は、常磁性イオンが存在する位置の中心からの平均距離に匹敵する。これは少なくとも５Å、好ましくは少なくとも１０Åであるべきである。
【００５５】
オフセットの程度は、オフセットによって与えられる緩和度への影響の立場から規定され得る。与えられた緩和度は、磁場の強度に依存する；粒子あたりの緩和度はもちろん粒子自体と結合している常磁性イオンの数により部分的には規定される。任意に選択された０．４７Ｔの磁場強度で、オフセットは、イオンあたりで少なくとも１．２倍に、好ましくは１．５倍に、より好ましくは２．５倍に、又は、ρ１及び同様の量のρ２について１０倍に、緩和度を増強するのに十分である。任意に選択された１．５Ｔの磁場強度において、オフセットは同様の要因により、これらの緩和度を増強する。４．７Ｔでは、好ましくはρ１の増強は、イオンあたり、少なくとも１．５倍、好ましくは２倍、及び、ρ２の増強は、少なくとも２倍、好ましくは３倍である。緩和度それ自体の単位に関しては、０．４７Ｔにおける(ｓ＊ｍＭ)‐１でρ１の値でみるとオフセットは少なくとも２０好ましくは２５、より好ましくは３０で；１．５ Ｔでは、これらの値は、少なくとも２０、好ましくは３０、及び、４．７Ｔでは、少なくとも１０、好ましくは１４である。ρ２に関しては、０．４７Ｔでの相当する値は、少なくとも２０、好ましくは３０、そして、より好ましくは３５で；１．５Ｔでは、少なくとも２０、好ましくは３０；及び、４．７Ｔでは、少なくとも２０、より好ましくは４０、最も好ましくは６０である。
【００５６】
適切にキレート剤を結合することにより、相当数のキレート剤及び常磁性イオンが粒子に結合出来る。典型的には常磁性イオン含有キレーターについては、粒子は少なくも２０００コピーを、典型的には少なくとも５０００コピーを、より典型的には少なくとも１０，０００又は１００，０００又は５００，０００コピーを含む。ターゲティング剤については、１若しくは２、又は、幾つか、又は、それ以上のコピーを含んでいてよい。種々の数の薬物分子が含まれていてもよい。
【００５７】
出願人らはビヒクル組成物に常磁性イオンを含有する多様なキレーターを適用出来るので、相当高い緩和度を粒子あたりで獲得し得る。粒子あたりのρ１及びρ２における増加倍数は、もちろん、イオンあたりのそれらの増加倍数と似ている。出願人らは、しかし、０．４７Ｔでの粒子あたり(ｓ＊ｍＭ)‐１の単位で、ρ１値を評価することが出来き、少なくとも１．８×１０６、好ましくは２．０×１０６、より好ましくは２．５×１０６であった。１．５Ｔでは、これらの値は似ており、そして、４．７Ｔにおいてはρ１に関する緩和度の値は少なくとも８×１０５、より好ましくは１×１０６、より好ましくは１. １×１０６である。
【００５８】
０．４７Ｔでのρ２に関しては、緩和度は、この単位において、好ましくは少なくとも２×１０６、より好ましくは２．５×１０６、そして、より好ましくは３×１０６である。１．５Ｔでは、ρ２に関する値は、少なくとも１．６×１０６、好ましくは２．５×１０６、そして、より好ましくは３×１０６である。４．７Ｔでは、ρ２は少なくとも３×１０６、より好ましくは４×１０６、そして、より好ましくは５×１０６である。
【００５９】
オフセットは、ホスホグリセリドがビヒクル表面で親油性物質と結合すると、ビヒクルの表面にスペーサーを介してキレートの鋸歯状部分の間隔を空けることによって成される。
【００６０】
分断可能なスペーサー（Cleavable Spacers）
スペーサーを使用する二番目の利点は、常磁性イオン又は放射性核種イオンキレートが、粒子から、又は、ビヒクルの部分を構成する脂質から、分離可能なように、スペーサーが分断されてもよいことである。排出を促進するために、親油性の状態にあるキレートを解放により排出が増大することは望ましいことである。それゆえに、スペーサーは、外部的に活性化されるような（例えば光活性化によって）、又は、細胞若しくは血流中に存在する酵素によって連続的に接近されるような、１以上の切断部位を有していてもよい。前者の例は、当業者に理解されているような、光活性化される又は超音波で切断されるような特別な連結（linkages）を含む。イメージング又は治療が終了した後に、ナノ粒子は、適切に切断を起こさせるような電磁波エネルギー又は超音波を受ける。二つ目の事例は、スペーサーが、循環しているプロテアーゼによる切断に感受性のあるアミノ酸配列を含むペプチドであるか又は該ペプチドを含んでもよく、或いは、そのような切断にそれ自体感受性のある多糖類を含んでもよい。そのような切断部位の任意の組み合わせが含まれてよい。切断するためのスペーサー又は繋ぎの感受性は、そのため、排出を促進し常磁性イオンの潜在的な毒性を減少させる。
【００６１】
もし連続的な分解が行われるならば、その率は、有効な酵素活性に従ってスペーサーを選択することにより、及び、所望の数の切断部位を供給することにより、調整してもよい。しかしながら、血流中を循環している任意のペプチドが最終的には循環しているプロテアーゼにより分解されることが知られているように、同様に、多糖類は内因性の酵素によって切断に供される。
【００６２】
調製の方法
本発明の組成物を調製するための明確なプロセスは一定しておらず、粒子ビヒクルの性質及びスペーサー分子の選択（それが存在する場合）に依存する。前述のように、反応基を含む固体粒子はスペーサーに直接結合し得る；オイルエマルジョン、固体脂質、リポソーム、フルオロカーボンなどのような脂質ベース粒子は、キレート剤の鋸歯状部分を支える（bear）連結成分に共有結合的に結合される反応基を含有する親油性物質を含む事が出来る。一つの微粒子の好ましい態様では、そのプロセスは、水性懸濁液中で、ナノ粒子の核及びその粒子に対して脂質／界面活性剤コーティング成分が形成された液体フルオロカーボン化合物を混合すること、微小流動化（microfluidizing）すること、及び、望ましいのであれば、微粒子を回収しサイジング（分粒）することを含む。結合されるべき構成成分は、１以上の脂質／界面活性剤コーティングへの最初の結合により元々の混合物中に含むことが出来るし、又は、微粒子が形成された後で付加的成分への結合を行うことも可能である。
【００６３】
キット
本発明のエマルジョンは、調製後に本発明の方法において直接使用してもよいし、或いは、エマルジョンの構成成分をキットの形で供給してもよい。キットは、バッファー中に又は凍結乾燥状態で、全ての所望の補助剤を含有する予め調製された標的化成分を含んでいてもよい。或いは、キットは式（１）の化合物を欠いたエマルジョンの及び／又は、別個に供給されるターゲティング剤との形態でもよい。ターゲティング剤が直接に結合される場合、エマルジョンはマレイミド基のような反応基（該反応基はエマルジョンがターゲティング剤と混合された際にターゲティング剤のエマルジョン自体への結合をもたらす）を含む。別個の容器で結合を行わせるのに有用な付属的薬剤を供給してもよい。あるいは、エマルジョンは、それ自体が反応基を含み別々に供給されるべき所望の成分と結合したリンカーに結合する反応基を含んでいてもよい。適切なキットを構築するための広範な種類のアプローチが想定されよい。最終的にエマルジョンを形成するための個々の成分は別個の容器で供給されてもよいし、又は、キットは単純に、キットそれ自体とは別個に供給される他の物質とを組み合わせるための試薬を含んでいてもよい。
【００６４】
網羅的に列挙できないが、組み合わせの例には以下のものが含まれる：脂質−界面活性剤層中に、フルオロフォア又はキレート化剤及びターゲティング剤との結合のための反応成分のような補助成分を含むエマルジョン調製物；逆に、エマルジョンがターゲティング剤と結合する所に、補助剤と結合するための反応基を含むもの；エマルジョンはターゲティング剤とキレート化剤の両方を含むが、キレート化されるべき金属はキットに含まれるか利用者によって別に用意されるもの；界面活性剤／脂質層を含むナノ粒子の調製物であって、該層中の物質は異なる反応基、即ちターゲティング剤のための１セットの反応基と補助剤のためのもう一つの反応基のセットを含むもの；前述の組み合わせの任意のものを含むエマルジョンの調製物であって、反応基が連結剤（linking agent）によって提供されるもの。
【００６５】
適用
エマルジョン及びその調製のためのキットは本発明の方法（組織の画像化及び治療剤の提供を含む）において有用である。
【００６６】
本発明の磁気共鳴画像法用造影剤は、米国特許第5,155,215号；同第5,087,440号；Margerstadt, et al., Magn. Reson. Med. (1986) 3: 808; Runge, et al., Radiology (1988) 166: 835; 及び Bousquet, et al., Radiology (1988) 166: 693に記載されているような他のＭＲＩ剤と同様に使用することができる。使用可能な他の剤には、米国特許公開第2002/0127182号に記載されているｐＨ感受性でかつパルスに依存してコントラスト特性が変化する剤もある。一般的には、造影剤の滅菌水溶液は、体重１ｋｇ当り０．０１〜１．０ｍモルの範囲の用量で患者に静脈内投与される。
【００６７】
通常、放射性画像のための診断用成分は、生理食塩水に溶かして、静脈内注入により、体重７０ｋｇ当り１〜１００ｍＣｉの用量、好ましくは５〜５０ｍＣｉの用量で投与される。イメージングは、既知の方法によって実行される。
【００６８】
治療用放射性医薬品は、通常生理食塩水に溶かし、静脈内注入により、体重１ｋｇ当り０．０１〜５ｍＣｉの用量、好ましくは体重１ｋｇ当り０．１〜４ｍＣｉの用量で投与される。比較可能な類似の治療用放射性医薬品に関しは、現在の臨床実務では、ゼバリン（登録商標）について０．３〜０．４ｍＣｉ／ｋｇ、標識されたソマトスタチンペプチドであるオクトレオセル（OctreoTher）（登録商標）について１〜２ｍＣｉ／ｋｇの範囲の用量が規定されている。このような治療用放射性医薬品については、癌細胞の殺傷と正常組織への毒性とりわけ放射能による腎炎とのバランスがある。これらのレベルでは、そのバランスは一般的には癌細胞殺傷効果の方に片寄っている。これらの用量はイメージング用の同位元素の相当量よりも高い。
【００６９】
本発明の組成物が標的送達ビヒクルを含む場合、適合性のある標的は癌組織、アテローム硬化型のプラーク、凝血塊などの任意の組織を含む。ターゲティング剤の選択はもちろん標的そのものの性質に依存する。例えば、アテローム硬化型のプラーク又は凝血塊を標的にするなら、坑フィブリン抗体は、α３β３受容体と相互作用するペプチド擬態のため適切である。癌に対する適当なターゲティング剤は、癌関連抗原に対して又は癌宿主組織との関係で調製された抗体を含む。特定の組織のイメージングは、受容体、又は、標的自体と関係するその他の特有な成分と相互作用するターゲティング剤を使用する。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、本発明の説明のためのものに過ぎず、本発明を限定することを意図したものではない。
【００７１】
調製Ａ
ナノ粒子の調製
常磁性ナノ粒子は、Lanza, G, et al., Circulation (1996) 94:3334-3340に記載された方法を修正した方法により作成した。簡潔にいえば、エマルジョンは、４０％（ｖ／ｖ）ペルフルオロオクチルブロマイド（ＰＦＯＢ；ＭＭＭ、セントポール、ミネソタ州）、２％（ｗ／ｖ）ベニバナ油、２％（ｗ／ｖ）界面活性剤共混合物、１．７％（ｗ／ｖ）グリセリン及び残部としての水から構成した。界面活性剤共混合物は、６３ｍｏｌ％レシチン(アヴェンティ・ポーラー・リピズ・インク.、アラバスター、アラバマ州)、１５ｍｏｌ％コレステロール（シグマ・ケミカル・コー、セントルイス、ミズーリ州）、２ｍｏｌ％ジパルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン（アヴェンティ・ポーラー・リピズ・インク、アラバスター、アラバマ州）及び２０ｍｏｌ％常磁性親油性キレートを含んでいた。親油性キレートは、ガドリニウムジエチレン−トリアミン−五酢酸−ビス−オレアート（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ；ゲートウェイ・ケミカル・テクノロジーズ、セントルイス、ミズーリ州）又はＤＴＰＡ−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰＡ−ＰＥ；ゲートウェイ・ケミカル・テクノロジーズ、セントルイス、ミズーリ州）の何れかであった。界面活性剤の成分は、クロロホルムに溶解し、減圧下で蒸発させ、５０℃真空乾燥器で終夜乾燥し、超音波処理により水中に分散した。（生じた）懸濁液は、ＰＦＯＢ、ベニバナ油及び蒸留脱イオン水と共にブレンダーで３０〜６０秒間前乳化処理したのち、２０，０００ＰＳＩで４分間、Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス乳化機（マイクロフルイディクス、ニュートン、マサチューセッツ州）で乳化処理した。完成した処方物は、圧着シールしたガラス瓶に入れ、窒素を封入した（blanketed）。粒径は、レーザー光散乱サブミクロン粒子寸法測定器（モルヴァン・インスツルメンツ、モルヴァン、ウスターシア州、英国）で３重測定した。
【００７２】
［実施例１］
式（１）の化合物の調製
ホスホエタノールアミンジグリセリド（ＰＥ）を、まず、ｔ‐ｂｏｃ保護トリグリシンに結合させる。N-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）又はヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）のいずれかと、ジイソプロピルカルボジイミド（若しくはそれと等価なもの）を用いて、ｔ−ｂｏｃ−トリグリシンの遊離酸の活性エステルを形成するような、標準的な結合技術を用い、そして、ｔ−ｂｏｃ−トリグリシン−ＰＥを精製する。
【００７３】
トリフルオロ酢酸によりｔ−ｂｏｃ−トリグリシン−ＰＥを処理することにより、トリグリシン−ＰＥが生成し、次いで、これをＤＭＦ／ＣＨＣｌ３中の過剰のＤＯＴＡ−ＮＣＳと５０℃で反応させる。溶媒を除去することにより、最終産物を分離し、次いで固形残滓を過剰の水でリンスし、過剰の溶媒と未反応又は加水分解されたＤＯＴＡ−ＮＣＳを除去する。
2006516993.tif 000005
【００７４】
トリグリシンスペーサーが、プロテアーゼに対する基質として、切断され得るリンカーであることは良く知られている。或いは、トリグリシンスペーサーの代わりに、カプロイルアミン‐ＰＥ（Avanti Polar Lipidsから市販されている）を用いて同様の構造を調製した。この物質は、上述のグリシンスペーサーに関して述べたのと類似の方法により、ＤＯＴＡ‐ＮＣＳと反応させる。
【００７５】
［実施例２］
ガドリニウムイオンの導入
ガドリニウムイオンのキレートへの導入は、最初にＤＯＴＡ‐ＮＣＳを金属化して行ってもよいし、又は、合成後に式（１）の化合物を金属化して行ってもよい。
【００７６】
ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＮＣＳの先行金属化はＧｄＣｌ３水溶液中で行った。反応混合物は凍結乾燥させて乾燥させ、ＰＥ又はトリグリシル-ＰＥと結合させる前に、更なる精製を行わずに使用した。塩が最後の結合においてネガティブな影響を与えないように、乾燥させたＭｅＯＤＯＴＡ‐Ｇｄ‐ＰＥ反応混合物を水でリンスした。
【００７７】
Ｇｄ２Ｏ３をＧｄＣｌ３の置換に使用してもよい―すなわち、ＭｅＯＨ／クロロホルム中でＧｄ２Ｏ３を含む溶液を長時間沸騰させることにより、「塩を除去した（salt free）」金属複合体が生成される。
【００７８】
結合したＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥの後の金属化は、沸騰したクロロホルムメタノール混合液中で、ＧｄＣｌ３で行う。
【００７９】
Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡはＨＰＬＣにより特徴づけを行った。ＬＣの条件は: Zorbax ＣＢ Ｃ８ カラム、２５％ アセトニトリル、０．２％ＴＦＡによるアイソクラティック溶出、２６０ｎｍで検出。非複合型のＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＮＣＳは３．８‐４.０分で溶出される。ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥは、ＬＣ及びＭＳにより特徴付けを行った。Ｇｄ‐ＭｅＯＤＯＴＡ‐ＰＥの特徴付けのためのＨＰＬＣの条件は： Astec、Pholipidecカラム；溶媒システム：溶媒Ａ（８０％ＣＨＣｌ３、１９％ＭｅＯＨ、１％ＮＨ４ＯＨ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）、勾配プロファイル:０‐１０分 １００−７５％ Ａ、０‐２５％ Ｂ；１０‐１５分 ２５‐１００％ Ｂ、１５‐２０分から１００％ Ｂで固定、２０‐２２分から１００‐０％ Ｂ、５分間１００％Ａで固定。ＥＬＳＤ及びＵＶ検出器を使用した。
【００８０】
Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＮＣＳ及び、それに対応する結合したＧｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴ‐ＰＥのＨＰＬＣの結果を、各々、図１Ａ及び図１Ｂに示す。得られたＧｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥの質量スペクトルを図２に示す。
【００８１】
［実施例３］
動物実験のための結合体の合成
Ａ. ＧｄＭｅＯＤＯＴＡ‐ＮＣＳの調製
ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＮＣＳ(ダウケミカル)（１８．７１ｇ、３３ｍｍｏｌ）を、脱イオン水（５００ｍＬ）中に溶解させた。ｐＨプローブを溶液の中に入れ、撹拌しながら、溶液のｐＨをＮａＯＨ（５０％）の添加により〜６に調整した。別のフラスコ中で、ＧｄＣｌ３×６Ｈ２０（Ohduch）（１８．３７ｇ）を１００ｍＬの脱イオン水に溶解した。Ｇｄ溶液を注意深く５ｍＬのアリコートで３回、撹拌中の溶液に添加した。各添加の後で、ｐＨを測定し、水酸化ナトリウム（５０％）の添加によりｐＨ６〜７にＰＲＮを調整した。溶液は凍結乾燥した。この過程により、４３．９ｇのかすかに緑色の粉末が得られ、純度は９２％であった。
【００８２】
Ｂ. Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥの調製
２リッターの三つ首丸底フラスコに、上記Ａで調製したＧｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＮＣＳ（４３．９ｇ、ｍｍｏｌ）；ＰＥ（１５ｇ、２２ｍｍｏｌ）；ＤＭＦ（５００ｍＬ）；Ｅｔ３Ｎ（４．５７ｍＬ）；及びＣＨＣｌ３（３００ｍＬ）を入れた。ＰＥは、アバンチ（Avanti）から得た1,2-ジパルミトイル-sn-グリセリン-3-ホスホエタノールアミンとして供給された。混合物を８時間、５０℃で加熱した。反応はＨＰＬＣでモニターした。溶媒を減圧下で除去し、得られた固体を水（〜１００ｍＬ）に懸濁し、そして、粗いフィルター漏斗を使って、Celpure社の濾過剤（８‐１０ｃｍ厚）上で濾過した。その固体を大量の水（１Ｌ‐１.５Ｌ）でリンスした。固体層から水の大部分を除いた後に、その固体をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（３：１）（約１Ｌ〜１．５Ｌの総容量）でリンスした。ろ液の有機溶媒は、硫酸ナトリウムで乾燥させた。混合物を濾過し減圧下で乾燥させると、２０ｇの明るいベージュ色のガラス状の固体が得られた。ＬＣでは、９０％の純度であった。
【００８３】
最終産物の調製のためのプロセスの流れ図を図３に示す。
【００８４】
［実施例４］
緩和度におけるスペーサーの長さの影響
本実施例では、キレーター（Ｃｈ）としてＤＴＰＡを、常磁性イオンとしてガドリニウムを用いた本発明の実施態様は、緩和度におけるスペーサーの長さの影響を示すのに使用したホスファチジルエタノールアミンと最終的に結合させた。Ｇｄ‐ＤＴＰＡ‐ＰＥ自体は本発明の化合物の範囲に入らないが、緩和度における組成物中の微粒子からキレート剤を離す影響を、本実施例のデータにより図示した。ＤＴＰＡ‐ＰＥはゲートウェイ・ケミカル・テクノロジーズ（セントルイス、ミズーリ州）から購入できる。ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸-ビソレアート（Ｇｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡ）（ゲートウェイから購入可能）によって生成される緩和度を比較した。
【００８５】
調製Ａにおいて記述したように調製したナノ粒子及びゲートウェイから購入したキレートとを、記述したように組み込んだ。ＤＴＰＡ‐ＰＥで処理されたナノ粒子への乳化ステップとは反対に過剰量の塩化ガドリニウムを添加した。非結合のガドリニウムは、滅菌脱イオン水（３００，０００ｍｗカットオフ、スペクトラムラボラトリーズ、ランコドミゲッチュ、カリフォルニア州）で透析することにより除去した。Ｇｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡは、記述したように、完成した化合物として組み込まれた。両組成物は、アルセナゾIII反応を用いて遊離Ｇｄ３＋を調べ、非結合のガドリニウムの兆候が無いことが示された。
【００８６】
Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ及びＧｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥナノ粒子は、以下の特性を有している：
表１：常磁性ナノ粒子の特性
2006516993.tif 000006
【００８７】
実施例１で調製したＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ及びＧｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥナノ粒子を蒸留脱イオン水で希釈して、０、４、６、８、１０及び１２％ＰＦＯＢ（ｖ/ｖ）を調製した。初期ナノ粒子処方物は、２６．１ｍｏｌ／Ｌ１９Ｆを含み、希釈アリコートは、それぞれ、０、３．９１５、５．２２、６．５２５及び７．８３ｍｏｌ／Ｌ１９Ｆを有していた。総ガドリニウム含量は、中性子放射化分析によって求めた。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡナノ粒子希釈物のガドリニウム含量は、それぞれ、０；０．３３６；０．５０４；０．６７２；０．８４；及び１．０１ｍｍｏｌ／ＬＧｄ３＋であった。 Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ試料中の常磁性イオン濃度は、それぞれ、０；０．５７９；０．８６９；１．１６；１．４５；及び１．７４ｍｍｏｌ／Ｌ Ｇｄ３＋であった。
【００８８】
各試料のプロトン縦及び横緩和速度（１／Ｔ１及び１／Ｔ２）は、４０℃、０．４７Ｔの磁場強度によりブルカーＭＱ２０ミニスペックＮＭＲアナライザーで測定した。Ｔ１は、１０反転遅延値によるインバージョンリカバリーシークエンスを用いて測定し、Ｔ２は、カー−パーセル−マイブーム−ジル（Carr-Purcell-Meiboom-Gill：ＣＰＭＧ）によって測定した。Ｔ１及びＴ２緩和度（即ちρ１及びρ２）は、縦及び横緩和速度対Ｇｄ３＋濃度（即ちイオン緩和度）又は縦及び横緩和速度対ナノ粒子濃度（即ち粒子緩和度）の線形最小自乗回帰の傾きから計算した。その単位は（ｓ＊ｍＭ）−１で示す。
【００８９】
標準的な１１ｃｍ径サーフェスコイルにより得られたクリニカルスキャナー（ジャイロスキャンＮＴ、パワートラック６０００、フィリップス・メディカル・システムズ、ベスト、オランダ）からのスピンエコー画像を用いて、１．５Ｔで２種のナノ粒子処方物の緩和度を測定した。６室ファントムにより、６つの希釈物をすべて並行して検査することができた。２種の常磁性処方物の異なる緩和時間に対応するために、異なるイメージングパラメータを適用した。Ｔ１は、インバージョンリカバリーＭＲＩパルスシークエンスから計算した。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡファントムに対する測定は、５０〜１５００ｍｓの範囲の６つの反転時間（ＴＩ）を含み、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ値は、５〜２００ｍｓの範囲の７つのＴ１値を使用した。各室からのシグナル強度（Ｓ１）は、式：
Ｓ１ＴＩ＝Ｓ１０×（１−ＥＸＰ（−ＴＩ／Ｔ１））    ［１］
にはめ込んだ。ここに、Ｓ１０は、平衡シグナル強度である。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡに対するＴ２値は、２０ｍｓ〜１６０ｍｓの範囲の８つのエコー時間（ＴＥ）によるマルチエコーシークエンスから導出した。４．５ｍｓ〜２００ｍｓの範囲のエコー時間による９つの異なる画像を用いて、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥファントムに対するＴ２緩和を計算した。ＭＲＩシグナル強度を式：
Ｓ１ＴＥ＝Ｓ１０×ＥＸＰ（−ＴＥ／Ｔ２）            ［２］
にはめ込んだ。２つの処方物に共通のイメージングパラメータは、ＴＲ＝１０００ｍｓ、ＴＥ＝５ｍｓ（特段に記載がない場合に限る）、シグナル平均数＝４、画像マトリックス＝１２８×１２８、ＦＯＶ＝７ｃｍ×７ｃｍ、フリップ角度＝９０°、スライス厚＝５ｍｍであった。
【００９０】
また、２つの常磁性処方物の緩和度は、５ｃｍバードケージコイルを用いヴァリアンＩＮＯＶＡコンソール（ヴァリアン・アソシエイツ、パロアルト、カリフォルニア州）に調整された４．７Ｔマグネットによって測定した。既に述べたように、６室ファントムを用いて種々のエマルジョンを並行して試験した。Ｔ１及びＴ２値は、それぞれ、インバージョンリカバリー（ＴＥ＝７．２ｍｓ、Ｔ１は１〜８００ｍｓの間で可変）及びスピンエコー（ＴＥは７．２〜１００ｍｓの間で可変）パルスシークエンスによって得た。画像は、ＴＲ＝３０００ｍｓ、シグナル平均数＝４、画像マトリックス＝２５６×２５６、ＦＯＶ＝４ｃｍ×４ｃｍ、フリップ角度＝９０°、スライス厚＝２ｍｍで収集した。
【００９１】
最後に、２つの常磁性調製物の緩和度を、カスタムビルト可変フィールドリラクソメータ（relaxometer）（サウスウエスト・リサーチ・インスティチュート、サンアントニオ、テキサス州）を用い０．０５Ｔ〜１．３Ｔの範囲の磁場（２〜５６ＭＨｚ）で独立的に測定した。試料は、３℃及び３７℃で測定した。３２増分τ値を有する飽和回復パルスシークエンスを用いてρ１を測定し、ρ２は、５００エコーを有するＣＰＭＧパルスシークエンス及び２ｍｓインターエコー遅延時間を用いて測定した。
【００９２】
表２に、３つの磁場強度において求めたＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ及びＧｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ常磁性処方物のＴ１及びＴ２緩和度を示す。
【００９３】
表２  ３つの異なる磁場強度におけるＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ及びＧｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥエマルジョンの緩和度
2006516993.tif 000007
【００９４】
（３つの）すべての磁場強度において、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ処方物のイオン緩和度ρ１及び粒子緩和度ρ１は何れもＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ剤のρ１より凡そ２倍大きかった（ｐ＜０．０５）。同様に、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ剤のイオン緩和度ρ２及び粒子緩和度ρ２は最小磁場強度（０．４７Ｔ）では何れもＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ系のρ２より凡そ２倍大きかった（ｐ＜０．０５）。この相対的差異は、最大磁場強度（４．７Ｔ）では３倍より大きかった（ｐ＜０．０５）。
【００９５】
一般的な医用イメージング磁場強度である１．５Ｔでは、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡのイオン緩和度ρ１及びρ２は、それぞれ、１７．７±０．２（ｓ＊ｍＭ）−１（平均値±標準誤差）及び２５．３±０．６（ｓ＊ｍＭ）−１であった。これは我々が以前報告した推定値（Flacke, S., et al., Circulation (2001) 104:1280-1285）と一致している。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥの組み入れにより、（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡとは対照的に）、イオン緩和度ρ１及びρ２は、それぞれ、３３．７±０．７（ｓ＊ｍＭ）−１及び５０．０±２（ｓ＊ｍＭ）−１に増加した。標的化された剤の観点からより重要な粒子緩和度ρ１及びρ２は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡに対しては、それぞれ、１，０１０，０００±１０，０００（ｓ＊ｍＭ）−１及び１，４４０，０００±３０，０００（ｓ＊ｍＭ）−１であり、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥナノ粒子に対しては、それぞれ、２，４８０，０００±５０，０００（ｓ＊ｍＭ）−１及び３，７００，０００±１００，０００（ｓ＊ｍＭ）−１であった。我々が知る限りでは、このような範囲の粒子ないし分子緩和度は、このような磁場強度における標的化された又は血液プール用の任意の常磁性造影剤について現在までに報告されている中で最も大きなものである。
【００９６】
緩和度に対する磁場の影響を図２に示す。イオン及び粒子縦緩和度の大きさは、磁場強度が０．４７Ｔから４．７Ｔに増加するに従って減少したが、イオン及び粒子横緩和度は、磁場強度が大きくなるに連れて連続的に増加した。粒子縦緩和度は４．７Ｔでは１．５Ｔと比べて凡そ５０％減少したが、粒子緩和度ρ１は、非常に高いレベルで維持された。リガンド−標的化造影剤としては、より大きい磁場強度における緩和度の減少は、ボクセルサイズの減少、より小さい部分体積希釈効果、及びシグナル対雑音比の改善によって効果的にオフセットされるであろう。
【００９７】
可変フィールドリラクソメトリー（relaxometry）測定により、２つのエマルジョンのρ１は、緩慢にタンブルするエマルジョン複合体（錯体）の長い相関時間（τｃ）によって支配されることが分かった（図３）。事実、粒子は比較的大きいので磁場依存性（拡散）はなかった。これに対し、ρ２値は、最初は、ρ１のそれに従うが、（τｃを伴う非拡散時間のため）ソロモン−ブルームバーゲンの式（Wood, M. L., J. Mag. Res. Imag. (1993) 3:149-156）に基づく予想通りに、より大きい磁場では減少しなかった。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡエマルジョンに対しては、緩和度ρ１の「ピーク」は、凡そ２５（ｓ＊ｍＭ）−１であり、ρ２の最大値は、３０（ｓ＊ｍＭ）−１であった。ρ１の値は、温度には殆ど依存しないが、ρ２は、比較的低い温度では増加した。しかしながら、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥエマルジョンに対しては、緩和度は遥かにより大きく、ρ１は４０ＭＨｚ（凡そ１．７Ｔ）で４０（ｓ＊ｍＭ）−１に達し、ρ２は５６ＭＨｚ（１．３Ｔ）で５０（ｓ＊ｍＭ）−１に達した。また、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥの温度依存性もＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡとは異なり、ρ１は低温では減少し、ρ２は温度とは無関係に維持された。リラクソメトリーの値は、０．４７Ｔ及び１．５Ｔでの類似の測定と一致した（表２）。更に、これらの曲線の温度依存性は、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥキレートはＧｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡと比べて水に対するより良好なアクセス（接近能）（即ちより迅速な交換）を有することを示唆している。
【００９８】
［実施例５］
ナノ粒子と結合した造影剤の増加した緩和度
Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥ及びＧｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ-トリグリシン-ＰＥ結合体は、調製Ａのように調製されたナノ粒子と結合された、そして、ナノ粒子との結合はその調製に記述されたように行われた。各微粒子は、凡そ３３，０００Ｇｄ３＋−キレートを含む。ρ１緩和度を、実施例４で記述したように、同等の量のＧｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡ及びＧｄ‐ＤＴＰＡ‐ＰＥと結合した同様のナノ粒子から得られた緩和度と比較した。イオンあたり及び粒子あたりの結果とを、各々、図４及び図５に示す。
【００９９】
Ｇｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡナノ粒子のイオンあたりのρ１値は２１．３ｓ＊ｍＭ‐１;Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥナノ粒子の場合は２９．８ｓ＊ｍＭ‐１、及び、Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐トリグリシン‐ＰＥナノ粒子は３３．０ｓ＊ｍＭ‐１であった。各微粒子が３３，０００Ｇｄ３＋‐キレートを保有しているので、微粒子の緩和度は、Ｇｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡ：７００，０００ｓ＊ｍＭ‐１、Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥ：９８０，０００ｓ＊ｍＭ‐１、及び、Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐トリグリシン‐ＰＥ：１，１００, ｓ＊ｍＭ‐１であった。トリグリシンスペーサーが緩和度を改善しており、そして、ＤＯＴＡ及びＰＥスペーサーを用いた両結合体に関する緩和度はＧｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡの緩和度を越えて改善されているのが、分かる。
【０１００】
［実施例６］
金属交換反応
上述のように、結合したナノ粒子は、血液プール造影剤のような非標的化（non-targeted）キレート剤と比較した場合、対象からのクリアランスを遅延させるターゲティング剤（targeting agent）と結合してもよい。これは、キレートによる有意な金属の保持をもたらす；ＤＯＴＡのような大環状のキレートによる金属の保持は、ＤＴＰＡ又はＥＤＴＡのような直鎖状のキレートよりも桁違いに強いことが知られている。更に、キレーター自体の一部ではない結合部位の使用は、キレート化の強度を犠牲にせずに効率的な結合をもたらす。
【０１０１】
過剰量の亜鉛をＧＤ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡ粒子における金属交換反応を起こさせるのに競合種として使用し、ナノ粒子を本発明の結合体（conjugate）に結合させた。ＤＯＴＡキレートが緩和度における高率又は高振幅いずれの変化も示さなかったのに対し、Ｇｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡナノ粒子の縦緩和度は、ＺｎＣｌ２の添加後すぐに減少し、本発明のＧｄ３＋複合体の改善された安定性を反映している。二つのＤＯＴＡキレートについての平衡状態で保持されたガドリニウムは（９１％）、ＤＴＰＡキレートの場合（７５％）に比較して非常に高かった。したがって、ＤＯＴＡキレートは、直鎖状のＧｄ‐ＤＴＰＡ‐ＢＯＡキレートに比較して、緩和度で４０‐５５％より高く、金属交換反応で６４％より低いことが証明された。
【０１０２】
［実施例７］
クリアランスにおける切断可能なリンカーの効果
Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥ及びＧｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ-トリグリシン-ＰＥナノ粒子を、標準的な用量すなわち４０ｗｔ％ペルフルオロカーボンエマルジョンを０．５ｍｌ／ｋｇで、Sprague−Dawleyラットの静脈内に投与した。各時点において各々の動物（各処置群あたりｎ＝３）から肝臓と脾臓を取り出し、ガドリニウムを解析した。その結果を、器官ごとに注入した用量のうち保持されたパーセントとして、図６Ａ及び６Ｂに示す。図に示すように、切断可能なトリグリシンリンカーを含む形態が、より速やかに消えている。
【０１０３】
［実施例８］
腫瘍イメージング
Ａ．ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド−メルカプト酢酸付加体
2006516993.tif 000008
【０１０４】
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)2000]をＤＭＦに溶解し、窒素又はアルゴンでのスパージングによって脱気する。この無酸素溶液をＤＩＥＡを用いてｐＨ７−８に調節し、メルカプト酢酸で処理する。開始材料が完全になくなったことが示されるまで外界温度で撹拌を続ける。この溶液は、以下の反応で直接利用する。
Ｂ．ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド−メルカプト酢酸付加体と坑腫瘍関連抗原との結合
【０１０５】
上記パートＡの生成物溶液を、ＨＢＴＵと十分なＤＩＥＡを加えることによりｐＨ８−９に維持しつつプレ活性する。この溶液に、腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体を加え、そして、その溶液を窒素の存在下室温で１８時間撹拌する。ＤＭＦを減圧下で除去し、粗生成物を調製用ＨＰＬＣで精製し、リンカーを介して坑腫瘍抗体に結合したＰＥを得る。
【０１０６】
Ｃ．ナノ粒子の調製：
常磁性ナノ粒子は、Flacke, S. , et al., Circulation (2001) 104: 1280-1285に記載されたようにして作成した。簡単にいえば、ナノ粒子エマルジョンは、４０％（ｖ／ｖ）ペルフルオロオクチルブロマイド（ＰＦＯＢ）、２％（ｗ／ｖ）界面活性剤共混合物、１．７％（ｗ／ｖ）グリセリン及び平衡を表す水から構成される。
【０１０７】
対照、即ち非標的化常磁性エマルジョンの界面活性剤は、６０モル％レシチン（アヴァンティ・ポーラー・リピズ・インク社、アラバスター、アラバマ州）、８モル％コレステロール（シグマ・ケミカル・コー社、セントルイス、ミズーリ州）、２モル％ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）アヴァンティ・ポーラー・リピズ・インク社、アラバスター、アラバマ州）及び３０モル％ガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸-ビソレアート（bisoleate）（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＯＡ、ゲートウェイ・ケミカル・テクノロジーズ社、セントルイス、ミズーリ州）を含んでいた。キレートの調製は、実施例１において記載されている。
【０１０８】
腫瘍−標的化常磁性ナノ粒子は、６０モル％レシチン、０．０５モル％の段落Ｂに記載のコンジュゲート、８モル％コレステロール、３０モル％のＧｄ３+含有キレート、及び１．９５モル％ＤＰＰＥを含む界面活性剤共混合物によって上述のように調製した。
【０１０９】
腫瘍−標的化非常磁性ナノ粒子は、親油性Ｇｄ３＋キレート（該キレートは増量されたレシチン（７０モル％）及びコレステロール（２８モル％）を含む界面活性剤共混合物において置換される）を加えたことを除いて、標的化形態のものと同じ方法で調製した。
【０１１０】
ナノ粒子処方物の各々の成分は、Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス乳化機（マイクロフルイディクス社、ニュートン、マサチューセッツ州）により、２０，０００ＰＳＩで４分間、乳化を行った。完成したエマルジョンは、クリンプシールされる小ビンに入れて窒素を封入した。
【０１１１】
Ｄ．腫瘍モデル
オスのニュージーランドホワイトラビット（〜２．０ｋｇ）をケタミン及びキシラジン（それぞれ、６５及び１３ｍｇ／ｋｇ）による筋肉内注射によって麻酔する。各個体の左後肢を剃毛し、膝窩上に小切開部を形成する前にマルカイン（Marcaine）（登録商標）で局所的に浸潤し滅菌処置する。２×２×２ｍｍ３のＶｘ−２癌腫瘍塊をドナー動物から新たに取得し、凡そ０．５ｃｍの深さで移植する。切開面を再び接合し、単一の吸収性縫糸で縫合する。最後に、皮膚の切開部をデルマボンド・スキン・グルー（Dermabond skin glue）で接着する。腫瘍移植処置の後、キシラジンの影響をヨヒンビンで覆滅し、ウサギを回復させる。
【０１１２】
Ｖｘ−２移植の１２日後、ウサギを１％〜２％イソフルラン（登録商標）で麻酔し、実験のため挿管し、人工呼吸し、ＭＲＩ装置の空洞部に配置する。静脈及び動脈カテーテルは、個々のウサギの両耳に（それぞれ１つ）セットすることにより、ナノ粒子の全身投与及び後述する動脈血のサンプリングのために使用する。ウサギは、ワシントン大学医学部動物実験委員会で承認された方法・手順に従って、実験中、生理学的にモニターする。
【０１１３】
移植後１２日目に、ニュージーランドラビットのＶｘ−２腫瘍体積は、腫瘍-標的化ナノ粒子が投与されたもの（１３０±３９ｍｍ３）と、非標的化ナノ粒子が投与されたもの（１４８±３６ｍｍ３）では異なっていた（Ｐ＞０．０５）。
【０１１４】
上述のように、Ｖｘ−２腫瘍が移植された１２匹のニュージーランドラビットは、無作為に３つの処置群に分けられ、各々以下の剤を投与される：
１）腫瘍−標的化常磁性ナノ粒子（腫瘍−標的化、ｎ＝４）、
２）非標的化常磁性ナノ粒子（即ち対照群、ｎ＝４）、又は
３）腫瘍−標的化非常磁性ナノ粒子、次いで、腫瘍−標的化常磁性ナノ粒子（即ち、競合群、ｎ＝４）。
【０１１５】
処置群１及び２では、ウサギに対し、基準ＭＲ画像を得た後、０．５ｍｌ／ｋｇの腫瘍−標的化常磁性ナノ粒子又は対照常磁性ナノ粒子を投与する。処置群３では、すべてのウサギに対し、ＭＲイメージングの２時間前に０．５ｍｌ／ｋｇの腫瘍−標的化非常磁性ナノ粒子を投与し、次いで０．５ｍｌ／ｋｇの腫瘍−標的化常磁性ナノ粒子を投与する。腫瘍及び筋肉領域におけるシグナル増強の初期変化をモニターするために、動的ＭＲ画像を、各ウサギに対し２時間に亘り、注射時と３０分毎に得る。ＭＲ分子イメージングの結果を確認するための組織学的検査のために、腫瘍をすべて摘出し凍結保存する。
【０１１６】
Ｅ．磁気共鳴画像法及び組織学的方法
腫瘍移植後１２日目に、動物に対し１．５テスラ・クリニカルスキャナー（ＮＴインテラ・ウィズ・マスター・グラジエンツ、フィリップス・メディカル・システムズ社、ベスト、オランダ）でＭＲＩスキャンを行う。各動物は、それぞれ、腫瘍付近の後肢に対向してセットされる１１ｃｍ径環状表面コイル（circular surface coil）を有するクアドラーチャ・ヘッド／ネック・バードケージ・コイル（quadrature head/neck birdcage coil）の内部に置く。クアドラーチャー体コイルは、全ての高周波放射のために使用する。バードケージコイルは、単純（scout）イメージング中の検出に使用する。表面コイルは、高分解能イメージング中の検出に使用する。ガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）ドープ水（doped water）を充填した１０ｍＬシリンジは、高分解能視野（ＦＯＶ）内にセットし、シグナル強度基準として使用する。
【０１１７】
腫瘍は、まず、Ｔ２-重み付け（weighted）ターボスピン-エコースキャン（ＴＲ：２０００ミリ秒、ＴＥ：１００ミリ秒、ＦＯＶ：１５０ｍｍ、断層（スライス）厚：３ｍｍ、マトリックス：１２８×２５６、シグナル平均：２、ターボファクター：３、スキャン時間：３分）によって移植部位で局在化する。腫瘍の、高分解能、Ｔｌ-重み付け、脂肪抑制（fat suppressed）、三次元、グラジエントエコースキャン（ＴＲ：４０ミリ秒、ＴＥ：５．６ミリ秒、ＦＯＶ：６４ｍｍ、断層厚：０．５ｍｍ、連続断層：３０、平面（in-plane）解像度：２５０マイクロメートル、シグナル平均：２、フリップ角度：６５°、スキャン時間：１５分）は、ベースラインで収集し、常磁性ナノ粒子の注入直後、並びに３０分後、６０分後、９０分後、及び１２０分後に繰り返し行う。
【０１１８】
腫瘍体積は、オフラインイメージプロセッシングワークステーション（イージーヴィジョン ｖ５.１、フィリップス・メディカル・システムズ社、ベスト、オランダ）で計算した。目的領域（ＲＯＩ）を、Ｔｌ-重み付けベースラインスキャンの各断層において腫瘍の周囲に手動で設定し、三次元対象へと連合させ、体積を算出する。
【０１１９】
時間経過による画像増強を定量するため、不偏（unbiased）画像分析プログラムを利用した。ナノ粒子の静脈注入前、直後、及び３０分後、６０分後、９０分後、１２０分後に収集したＴｌ-重み付け画像（各腫瘍の中心を通過する３つの連続断層）をＭＡＴＬＡＢ（ザ・マスワークス・インク社、ネーティック、マサチューセッツ州）で分析する。各時点における画像強度は、参照ガドリニウム基準を用いベースライン画像をもとに標準化する。連続画像は空間的に共記録し（co-registered）、コントラスト増強は、注入後の各時点においてピクセル毎に求める。ベースライン画像内にある後肢筋肉の一部分の周囲に、ＲＯＩを手動で描写し、ＲＯＩ内部のピクセル毎の平均シグナル増強を各時点において計算する。各個体に対するベースライン画像において、腫瘍の周囲に第２のＲＯＩを手動で描写し、腫瘍シグナルの標準偏差を計算する。シグナル強度がベースラインの腫瘍シグナル標準偏差の３倍以上に増加した時（即ち、ベースラインの偏差（variation）の９９％以上の増強が見られたとき）、ピクセルが増強したとみなす。孤立（Solitary）増強ピクセル、即ち、平面内のその周囲のピクセル全てが増強していないピクセルは、ノイズとして計算から除外する。残りの増強ピクセルクラスターから、直後、３０分後、６０分後、及び９０分後の画像をマッピングして、各時間間隔ごとの平均シグナル増加を求める。統計的な比較は、ＡＮＯＶＡ（ＳＡＳ、ＳＡＳ研究所、ケアリー、ノースカロライナ州）を利用して、各時点毎に、腫瘍及び筋肉について行う。処置手段（Treatment means）は、ＬＳＤ法（ｐ＜０．０５）を用いて分離する。
【０１２０】
イメージング後、腫瘍病理検証を行い関連する血管分布（vascularity）及び血管形成を評価するための組織学的及び免疫組織化学的検査のために、腫瘍を摘出する。腫瘍は、元の解剖学的体位及びＭＲＩ画像面に対する既知の配向で、ＯＣＴ培地中で凍結（−７８℃）する。アセトン中で−２０℃、１５分間固定し、終夜空気乾燥した（４℃）４ミクロン凍結薄片（ライカ・ミクロシステムズ・インク社、バノックバーン、イリノイ州）を、ヘマトキシリン−エオシン、マウス抗ヒト／ウサギ内皮抗体（ＱＢＥＮＤ／４０、１：１０希釈、リサーチ・ダイアグノスティクス・インク社、フランダース、ニュージャージー州）、又はマウス抗ヒトαｖβ３−インテグリン抗体（ＬＭ−６０９、１：２００希釈、ケミコン・インターナショナル社、テメクラ（Temecula）、カリフォルニア州）で染色する。免疫組織化学検査は、ベクタステイン（Vectastain）（登録商標）エリートＡＢＣキット（ベクター・ラボラトリーズ社、バーリンゲーム、カリフォルニア９４０１０）を使用し、ベクター（登録商標）ＶＩＰキットで顕色（developed）し、ベクター（登録商標）メチルグリーン-核-対比染色剤で対比染色することによって行う。スライドは、ニコン製デジタルカメラ（モデルＤＸＭ１２００）を備えニコンＡＣＴ−１ソフトウェアで取り込みを行うニコン・エクリプス・Ｅ８００検査顕微鏡（ニコンＵＳＡ社、メルヴィル、ニューヨーク州）により、観察する。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、各々、Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＮＣＳ及びＧｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥについての、ＨＰＬＣの結果を示している。
【図２】図２は、Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥの質量スペクトルを示している。
【図３】図３は、Ｇｄ‐ＭｅＯ‐ＤＯＴＡ‐ＰＥ調製過程のフローチャートを示している。
【図４】図４は、種々の粒子性キレート調製品のイオンを基準としたρ１（緩和度）の値を示す。
【図５】図５は、これらの粒子性キレートの粒子を基準としたρ１（緩和度）の値を示す。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、切断可能なトリグリシンリンカーを有するものと有しないものの粒子性キレートを投与された動物の肝臓及び脾臓に、各々、保持されたガドリニウムのパーセントを示したものである。
【図１】
2006516993.tif 000010
【図２】
2006516993.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月3日(2006.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式の化合物：
2006516993.tif 000016
ここで、Ｃｈはキレート成分を表し；
ｍは０―３;
Ｒｌは非妨害性置換基であり；
ｌは０―２；
ＺはＳ又はＯ；
Ｒ２はＨ又はアルキル（１―４Ｃ）；
ｎは０又は１；及び
各Ｒ３は、独立して、任意的に置換された飽和又は不飽和の、少なくとも１０のＣを含むヒドロカルビル基である。
【請求項２】
ｎが１であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
スペーサーがＣＨ２ＣＨ２であるか又はペプチド若しくはポリエチレングリコールを含み、且つ、Ｒ２がＨであることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ＺがＳであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
ｌが０、且つ、ｍが１又は０であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
各Ｒ３ＣＯＯが天然に生じた脂肪酸の残基又は該残基の混合物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がＣＨ３Ｏであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｃｈと結合する、常磁性金属イオン又は放射性核種の金属を、更に、含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
親油性ナノ粒子又はマイクロ粒子と結合した請求項１〜８のいずれかに記載の化合物を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
前記粒子が、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物を少なくとも２０００コピー含むことを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、更にターゲティング剤を含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ターゲティング剤が、受容体リガンド又は抗体又はそれらのフラグメントであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、更に生理活性剤を含むことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子又はマイクロ粒子が、リポソーム、油滴、フルオロカーボンナノ粒子、脂質−皮膜蛋白粒子、又は、脂質‐皮膜多糖類であることを特徴とする請求項９〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１１又は１２に記載の化合物と結合した組織をイメージングすることを含む、磁気共鳴画像又は放射性核種によって生成される画像を獲得する方法。
【国際調査報告】
2006516993.tif 000017