(57)【要約】本発明は、相互作用するタンパク質の複数の対を同定する方法と、当該方法で使用するプラスミドを提供する。プラスミドの対を、変更型ツーハイブリッドシステムでの使用のために適合させる。各プラスミドはリコンビナーゼ認識部位を含む。本方法は、試験ポリペプチドをコードするcDNAを提供する段階；cDNAを第一および第二のプラスミドに挿入する段階；第一および第二のプラスミドを組換えて組換えプラスミドを得る段階；組換えプラスミドを単離および消化する段階；制限フラグメントをユニバーサルアダプターに連結して、ユニバーサルアダプターが隣接する消化フラグメントのプールを得る段階；所望の配列を選択および増幅する段階；増幅配列からコンカタマーを作製する段階；およびコンカタマーを配列決定して、相互作用するタンパク質の複数の対をコードするヌクレオチド配列を決定する段階、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互作用するタンパク質の複数の対を同定するための方法であって、一対の相互作用するタンパク質が第一の試験タンパク質および第二の試験タンパク質から成り、第一および第二の試験タンパク質が一細胞中で互いに相互作用するものであり、以下のステップを含む方法；
ａ）cDNAライブラリーを提供するステップ；
ｂ）転写アクチベーターのDNA結合ドメインのためのコーディング配列、第一のリコンビナーゼ認識部位、第一の選択可能なマーカー、第一のIIS型制限部位、および第一の試験タンパク質をコードする第一の挿入されたcNDA、を含む第一のプラスミドを複数提供するステップ；
ｃ）前記転写アクチベーターの転写活性化ドメインのためのコーディング配列、第二のリコンビナーゼ認識部位、第二の選択可能なマーカーおよび第二のIIS型認識部位、および第二の試験タンパク質をコードする第二の挿入されたcDNA、を含む第二のプラスミドを複数提供するステップ；
ここで、前記第一および第二のリコンビナーゼ認識部位は同一であっても異なっていてもよく、第一および第二のIIS型認識部位は同一であっても異なっていてもよい、
ｄ）ｂ）およびｃ）からの第一および第二のプラスミドを同一の細胞に導入すること；
ｅ）リコンビナーゼの発現を誘導して、前記第一および第二の導入されたプラスミドを組換えるステップ；
ｆ）IIS型制限酵素を用いて、組換えられたプラスミドを単離および消化して、制限フラグメントを得、次いで当該制限フラグメントをユニバーサル・アダプターへ連結して、ユニバーサル・アダプター配列が隣り合う消化されたフラグメントのプールを提供するステップ；
ｇ）消化されたフラグメントのプールからコンカタマーを形成し、当該コンカタマーを配列決定して、相互作用するタンパク質の複数の対のアイデンティティを決定するステップ。
【請求項２】
前記ステップｂ）およびｃ）の第一および第二の挿入されたcDNAが、当該第一および第二のcDNAを第一および第二のプラスミドと各々相同組換えすることにより挿入されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記IIS型制限部位が、BsgI、BpmIおよびMmeI部位から成る群から選択されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記リコンビナーゼ認識部位が、半変異部位である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ステップｄ）が、第一および第二のプラスミドを同一の細胞へ、第一および第二の酵母細胞を接合することにより導入することを含み、第一の酵母細胞が、第一または第二のプラスミドのいずれかで形質転換されたものであり、第二の酵母細胞が、第一の酵母細胞を形質転換しなかった第一または第二のプラスミドで形質転換されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ステップｅ）で、第一および第二のプラスミドが導入される細胞を、前記第一および第二のcDNAによりコードされるタンパク質の相互作用により選択し、当該相互作用が、選択可能なマーカーの発現を誘導し、当該選択可能なマーカーの発現が細胞が生存することを許容するものである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記選択可能なマーカーが、LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ADE2およびLYS2から成る群から選択されるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
リコンビナーゼ認識部位、cDNAをプラスミドにクローニングするためのクローニング部位、少なくとも１つの選択可能なマーカー、IIS型制限部位、およびコーディング配列を、含むプラスミドであって、当該コーディング配列が、
ａ）cDNAによりコードされるタンパク質との融合タンパク質として、転写アクチベーターのDNA結合ドメインを発現し得るための、転写アクチベーターのDNA結合ドメインのためのコーディング配列、
ｂ）cDNAによりコードされるタンパク質との融合タンパク質として、転写アクチベーターのDNA転写活性化ドメインを発現し得るための、転写アクチベーターの転写活性化ドメインのためのコーディング配列、
から成る群から選択されるプラスミド。
【請求項９】
前記リコンビナーゼ認識部位が、Creリコンビナーゼ、タモキシフェン誘発性Creリコンビナーゼ、およびFLPリコンビナーゼから選択されるリコンビナーゼにより認識されるものである、請求項８記載のプラスミド。
【請求項１０】
前記転写アクチベーターがGal４である、請求項８記載のプラスミド。
【請求項１１】
前記IIS型制限部位が、BsgI、BpmI、およびMmeI部位から成る群から選択される、請求項８記載のプラスミド。
【請求項１２】
前記リコンビナーゼ認識部位が半変異部位である、請求項８記載のプラスミド。
【請求項１３】
前記部位が、lox71およびlox66部位から選択される、請求項１２記載のリコンビナーゼ認識部位。
【請求項１４】
前記選択可能なマーカーが、LUU2、URA3、HIS3、TRP1、ADE2およびLYS2から成る群から選択される、請求項８記載のプラスミド。
【請求項１５】
相互作用するタンパク質を決定するためのキットであって、
ａ）転写アクチベーターのDNA結合ドメインのためのコーディング配列、第一のcDNAによりコードされるタンパク質との融合タンパク質として、転写アクチベーターのDNA結合ドメインを発現し得るように、第一のcDNAを第一のプラスミドにクローニングするためのクローニング部位、第一のリコンビナーゼ認識部位、第一の選択可能なマーカー、および第一のIIS型制限部位、を含む第一のプラスミド；
ｂ）転写アクチベーターの転写活性化ドメインのためのコーディング配列、第二のcDNAによりコードされるタンパク質との融合タンパク質として、転写アクチベーターの転写活性化ドメインを発現し得るように、第二のcDNAを第二のプラスミドにクローニングするためのクローニング部位、第二のリコンビナーゼ認識部位、第二の選択可能なマーカー、および第二のIIS型制限部位、を含む第二のプラスミド；
ここで、第一および第二のリコンビナーゼ認識部位は同一であっても異なっていてもよく、第一および第二のIIS型制限部位は同一であっても異なっていてもよい、
を含むキット。
【請求項１６】
前記第一および第二のリコンビナーゼ認識部位が、Creリコンビナーゼ、タモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼ、およびFLPリコンビナーゼから成る群から選択されるリコンビナーゼにより認識されるものである、請求項１５記載の第一および第二のプラスミド。
【請求項１７】
前記転写アクチベーターがGal４である、請求項１５記載の第一および第二のプラスミド。
【請求項１８】
前記第一および第二のIIS型制限酵素が、BsgI、BpmIおよびMmeIから成る群から選択される、請求項１６記載の第一および第二のプラスミド。
【請求項１９】
前記第一および第二のリコンビナーゼ認識部位が半変異部位である、請求項１６記載の第一および第二のプラスミド。
【請求項２０】
前記第一のプラスミドが第一リコンビナーゼ認識部位lox71またはlox66いずれかを有し、前記第二のプラスミドがlox71またはlox66から選択される第二のリコンビナーゼ認識部位を有し、第二のリコンビナーゼ認識部が、前記第一のプラスミドが有さない部位である、請求項１６記載の第一および第二のプラスミド。
【請求項２１】
前記選択可能なマーカーが、LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ADE2およびLYS2から成る群から選択され、前記第一および第二のプラスミドが少なくともつの別個の選択可能なマーカーを有する、請求項１６記載の第一および第二のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2003年5月9日に出願された米国仮出願第60/469,342号−この開示内容は、本明細書に引用により組み込まれる−の優先権を主張する。
本発明は、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス(the National Institutes of Health)から譲渡番号GM68856により承継された。当該機関は、発明に関して所定の権利を有する。
本発明は概して、タンパク質の相互作用の分野に関し、より詳細には、タンパク質の相互作用を迅速に同定するのに有用な方法および組成物を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の間の結合は、実質上全ての生物学的プロセスにとって中枢であることが広く認められている。タンパク質の相互作用を解明するための枠組みとして様々な完成されたゲノム配列を用いて、ウイルス、バクテリア、酵母、ショウジョウバエ(Drosophila)および線虫(C.elegans)を含む単純な生物体のオープンリーディングフレームの全てについて、タンパク質の相互作用を明確にするいくつかの大規模なプロジェクトが試みられている。
タンパク質の相互作用を明確にする他の方法がいくつか可能であるが、ゲノム幅の分析のための最も高度に開発された方法は、相互作用を遺伝子発現の誘導によりモニターするオリジナルな酵母ツーハイブリッドシステムである。この技術は、哺乳動物細胞を含む、多様な細胞型に用いることができる。
【０００３】
ツーハイブリッド分析は、転写アクチベーターのDNA結合ドメイン(DBD)と活性化ドメイン(AD)を、その各々のコーディング配列を別個のベクターへクローニングすることにより、分離することにより行う。DBDおよびADコーディング領域の１個または両方を次いで、典型的にはcDNAライブラリーからの多くの別個のオープンリーディングフレーム(ORFs)へ融合する。ツーハイブリッドシステムを酵母にて用いる場合、各々選択可能なマーカーを含むDBDおよびADベクターを接合および使用することにより、DBDおよびADベクターを同一の細胞へ導入できる。
【０００４】
ORFから発現されたタンパク質(複数)が物理的に相互作用すると、転写アクチベーターの半分の２つが集合し、転写アクチベーターの機能が回復する。再構成された転写アクチベーターは次いで、栄養マーカー(nutritional marker)等の選択可能なマーカーの発現を駆動できる。レポーター遺伝子が検出される場合、相互作用しているDBDおよびADを有するプラスミドを酵母のコロニーから単離でき、相互作用しているORF'sをDNA配列決定により同定できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
酵母中の〜6,000のオープンリーディングフレームの全ての間で生じる相互作用の全てを解明するための大規模なプロジェクトが、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて行われている。しかし、10倍のオーダーで大きな複雑度を含む哺乳動物ゲノムへの適用は、評価されなければならない潜在的な相互作用が指数関数的に多数であるために、現在実行できない。つまり、複雑なタンパク質相互作用を有する生物体に関して、ゲノム幅のタンパク質の相互作用を同定する効果的な方法が必要とされている。本発明は、相互作用するタンパク質の多数の対の同定を可能とするツーハイブリッド技術の変法を提供することにより、この要請を満たしたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、相互作用するタンパク質の複数の対を同定するための方法、および当該方法に使用するためのプラスミドを提供するものである。
本発明は、変更されたツーハイブリッドシステムに用いるために適合されたプラスミドの対であって、第一のプラスミドが転写アクチベーターのDNA結合ドメインのためのコーディング配列を含み(「DBDプラスミド」)、第二のプラスミドが転写アクチベーターの転写活性化ドメインのためのコーディング配列を含み(「ADプラスミド」)、各プラスミドがリコンビナーゼ認識部位をさらに含むものを提供する。
【０００７】
本発明の方法は、試験ポリペプチドをコードするcDNAを提供するステップ；当該cDNAを第一および第二のプラスミドに挿入するステップ；第一および第二のプラスミドを組換えて、組換えプラスミドを得るステップ；組換えプラスミドを単離および消化するステップ；制限フラグメントをユニバーサルアダプターに連結して、ユニバーサルアダプターが隣り合う消化フラグメントのプールを提供するステップ；所望の配列を選択し、次いで増幅するステップ；増幅された配列からコンカタマー(concatamer)を形成するステップ；およびコンカタマーを配列決定して、相互作用しているタンパク質の複数の対をコードするヌクレオチド配列を決定するステップ、を含む。
【０００８】
本発明は、相互作用するタンパク質の対のアイデンティティ(identity)を決定するための組成物および方法を提供するものである。一態様では、相互作用するタンパク質の複数の対のアイデンティティを決定するための方法が提供される。「相互作用するタンパク質の対」なる文言は、第一および第二の試験タンパク質が一つの細胞中で互いに相互作用する第一の試験タンパク質と第二の試験タンパク質を含む。
概して、本発明の方法は以下のステップにより表現できる。
【０００９】
ａ）タンパク質-タンパク質の相互作用を評価する試験cDNAのライブラリーを提供するステップ；
ｂ）変更型ツーハイブリッドシステムに適合させた第一および第二のプラスミド−第一のプラスミドは転写アクチベーターの結合ドメインのコーディング領域を含み(DBDプラスミド)、第二のプラスミドは転写アクチベーターの転写活性化ドメインのコーディング領域を含み(ADプラスミド)、両プラスミドは、第一および第二の試験タンパク質をコードするcDNAとの相同組換えのためのエレメント、挿入されたcDNAの転写を駆動するためのプロモーター、薬物選択、栄養選択、複製起点およびリコンビナーゼ認識部位を有する−を提供するステップ；
【００１０】
ｃ）cDNAを第一および第二のプラスミドに挿入し、その結果、各プラスミドがその中に挿入された一つのcDNAを有するようにし、挿入がなされた第一および第二プラスミドのライブラリーを作製するステップ；
ｄ）ｉ）挿入がなされた第一および第二のプラスミドの対を宿主細胞に導入して、当該宿主細胞中で組換えプラスミドを得る；またはｉｉ）第一の挿入されたプラスミドを宿主細胞へ、第二の挿入されたプラスミドを他の宿主細胞へ導入し、２つの宿主細胞を接合させることにより、組換えプラスミドを得るステップ；
ｅ）組換えがされたプラスミドを単離および消化して、各組換えプラスミドから、当該２つの相互作用するタンパク質の各々からの配列を含む制限フラグメントを得るステップ；
ｆ）各制限フラグメントをユニバーサルアダプターのための配列と隣り合わせるステップ；
【００１１】
ｇ）ユニバーサルアダプターのための配列と隣り合わせた制限フラグメントを連結して、コンカタマーを作製するステップ−ここでコンカタマーは、5'〜3'まで、ユニバーサルアダプター配列、第一の試験タンパク質をコードする第一のcDNA配列、IIS型制限酵素認識配列、リコンビナーゼ認識配列、IIS型制限認識配列、および第二の試験タンパク質をコードする第二のcDNA配列を含み、当該第一および第二cDNA配列は単一の組換えプラスミド由来のものである−；
ｈ）コンカタマーを配列決定して、相互作用するタンパク質のアイデンティティを決定するステップ。
【００１２】
従って本発明は、ツーハイブリッド法を適合して、相互作用するタンパク質をコードするcDNAの物理的連結を可能とすること、および遺伝子発現の連続分析の変法(MAGE)の適用を可能とする変更により、相互作用するcDNA配列を同定する効率を改善することによる、cDNAライブラリーからの包括的なタンパク質相互作用マップの確立のためのベクターシステムおよび方法を提供するものである。MAGEのためのエレメントは、米国特許出願第10/227,719号−2002年8月26日に出願されたものであり、本明細書中に引用により組み込まれ、以下により詳細に考察する−に記載されている。本発明の変更型ツーハイブリッドシステムは、相互作用するタンパク質をコードする物理的に連結したcDNAであって、MAGEによる効果的な分析のためにコンカタマー化され得るものを作成するものである。このアプローチの利点は、複数の、別個のタンパク質-タンパク質相互作用を表現する、酵母の単一の混合プールまたは用いるツーハイブリッドシステムに適した他の細胞タイプから、相互作用するタンパク質の多くの対を同定できることである。加えて、データ圧縮技術MAGEを本発明にて適合して、cDNA配列決定ステップにおける効率が改善された。
【００１３】
本方法は、プラスミドの第一および第二のセットの各々にcDNAライブラリーを連結し、次いで当該プラスミドを細胞へ形質転換するステップを含む。cDNAライブラリーをプラスミドに連結する方法は当業者に周知である。例えば、cDNAおよびプラスミドを制限酵素で消化し、次いでインビトロで連結できる。別法として、cDNAライブラリーは、酵母細胞での使用のために特別に適合された5'および3'末端を用いて作製でき、cDNAライブラリーおよび線状化されたプラスミドを酵母細胞へ挿入し、酵母細胞の相同組換えシステムにより連結できる。
【００１４】
本発明の方法に従い、第一プラスミドは転写アクチベーターのDNA結合ドメインのためのコーディング配列を含み(「DBDプラスミド」)、第二のプラスミドは転写アクチベーターの転写活性化ドメインのためのコーディング配列を含み(「ADプラスミド」)、各プラスミドはリコンビナーゼ認識部位をさらに含む。DBDプラスミドへのcDNAの挿入が、DBDと、挿入されたcDNAによりコードされる第一の試験ポリペプチドの融合物の発現を生じるように、DBDコーディング配列を構成する。同様に、cDNAのADプラスミドへの挿入が、ADドメインと、cDNAによりコードされる第二の試験ポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を生じるように、ADコーディング配列を構成する。
【００１５】
DBDおよびADプラスミドが同じ細胞中に存在し、その各々のcDNAが互いに相互作用する試験ポリペプチドをコードする場合、相互作用する試験ポリペプチドは、その各々の融合されたDBDおよびADドメインを物理的に近接させ、その結果、選択可能なマーカーの転写が、DNA結合タンパク質が結合したプロモーターから駆動される。この方法で、相互作用する試験ポリペプチドをコードするcDNAを含むプラスミドの対を有する細胞を選択できる。
【００１６】
相互作用する試験ポリペプチドをコードするADおよびDBDプラスミドの両方を含む細胞が存在する場合、同じ細胞内で、リコンビナーゼが作用してリコンビナーゼ認識部位でベクターを組換え、相互作用する試験ポリペプチドをコードするcDNAの物理的連結を生じる。
組換えプラスミドを次いでIIS型制限酵素で消化し、生じた制限フラグメントをアダプターオリゴヌクレオチドに連結して、アダプターが隣り合った消化されたフラグメントのプールを得、当該フラグメントをPCRにより増幅し、コンカタマーへと形成し、次いで配列決定して、相互作用する試験ポリペプチドの対をコードするcDNAのヌクレオチド配列を決定できる。
【００１７】
プラスミド
本発明は従って、ADおよびDBDプラスミドを含むプラスミドシステムを提供するものである。ADプラスミドにおける活性化ドメインおよびDBDプラスミドにおけるDBDドメインに加えて、各プラスミドは抗生物質および/または栄養マーカー等の選択可能なマーカー、複製起点、プロモーター、転写終結点、野生型または変異型リコンビナーゼ認識部位、およびcDNAの挿入のためのクローニング部位を、以下により詳しく記載するように、含む。
【００１８】
原核生物および真核生物システムでの使用のための選択可能なマーカーは周知である。例えば、原核生物における使用のための選択可能なマーカーは典型的には、アンピシリン、カノマイシンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。真核生物のためには、ネオマイシン(G418またはジェネティシン)、gpt(ミコフェノール酸)、プロマイシンまたはヒグロマイシン耐性遺伝子が、選択可能なマーカーの適切な例である。栄養要求性マーカー (例えば、LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ADE2、LYS2) の遺伝子産物をコードする遺伝子が、酵母中の選択可能なマーカーとしてしばしば用いられ、かつ、当該分野で周知である。さらに、ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子により、種々の宿主におけるメトトレキセートでの選択が可能となる。
【００１９】
本発明のプラスミドを用いて含まれる複製起点は、１種以上の選択された宿主細胞において宿主染色体DNAとは独立にプラスミドを複製可能とする配列であると考えられ、自立複製配列を含む。そのような配列は種々の原核生物および真核生物での使用が周知である。真核生物宿主細胞中のプラスミドにおける使用のための複製起点の例には、複製の２ミクロン起点、ARS1、ARS4、ARS1およびCEN3の組み合わせ、ARS4およびCEN6の組み合わせが挙げられる。原核生物細胞中のプラスミドにおける使用のための複製起点の例にはpBR322およびpUCが含まれる。
【００２０】
本発明を実施するのに有用なプロモーターの例には、選択可能なマーカーの発現を駆動できるあらゆるプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターは、DBDドメインおよび転写ADを含む転写アクチベーターにより活性化され得るもの、例えばVP16またはGAL4プロモーターである。
一態様では、ADまたはDBDドメインを含む発現プラスミドは好ましくは、酵母ベクター、pACT2(Durfee等、Genes Dev. 7, 555, 1993)、pGADT7("マッチマーカーGal4ツーハイブリッドシステム3およびライブラリーズ ユーザー マニュアル" 1999)、Clontech, Palo Alto, Calif.により供給されるクローンテックPT3247-1またはpCD2(Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983))および、このような酵母プラスミドから誘導されるプラスミドである。
【００２１】
cDNAライブラリー
本発明のベクターへの挿入のためのcDNAは、周知の方法を用いるPCR増幅により得られる。一般に、トータルのRNAを周知の方法に従い細胞から単離し、逆転写酵素により合成されたmRNAを、第一鎖合成のためのランダムプライミングを用いて作製する。増幅の次なるラウンドは、標準的なPCR方を用いて行う。
本発明の一態様では、プラスミドベクターにおける配列と相同の配列フラグメントをRT-PCRおよび次なるPCR増幅における各cDNAの5'および3'末端に付加する。これは一対のPCRプライマー−付加される配列を組み込むもの−を用いて達成できる。当業者に従い、あらゆる配列をPCRプライマーに付加できる。
【００２２】
一態様では、SMARTIIIおよびCDSIIIプライマー配列を変更して、cDNAへのIIS型制限エンドヌクレアーゼ切断部位の導入を可能とする。変更されたSMARTプライマーを用いるcDNA合成は、ナノグラム量のトータルのRNAを用いて行うことができる。SMARTシステム(例えば、Clontech SMART PCR cDNAライブラリー構築キット(July 1988)CLONTECHniques XIII(3): 9-10)は、変更されたランダムプライマーを用いて、PCR反応での第一鎖の合成をプライムする。逆転写酵素(RT)が当該mRNAの5'末端に到達すると、いくつかの追加のヌクレオチド、主としてデオキシシチジンが、当該cDNAの3'末端に付加される。
【００２３】
SMARTプライマーは、その3'末端にオリゴ(G)配列を有する。このオリゴ(g)は3'デオキシシチジンとヒドラジド化し、拡張されたPCR鋳型を生じる。逆転写酵素(RT)が次いで鋳型をスイッチし、当該オリゴヌクレオチドの末端まで複製を続ける。生じた一本鎖cDNAは、SMARTプライマーに相補的な配列を含む。SMARTアンカー配列および変更されたCDSプライマー誘導配列を次いで、PCRによるエンド−トゥ−エンドのcDNA増幅のためのユニバーサルプライミング部位として用いる。一態様では、長距離PCR(「LD-PCR」)を、より長い配列の増幅を可能とする標準的な方法を用いて行うことができる。
【００２４】
挿入cDNA
cDNAを本発明のベクターに、周知の方法を用いて挿入できる。例えば、cDNAおよびプラスミドを制限酵素で消化して、互いにインビトロで連結できる。
別法として、本発明のADおよびDBAベクターのライブラリーを、酵母細胞の、高効率での相同組換えを促す固有の能力を用いることにより、作製できる。サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母は、効果的な相同組換えを行う固有の遺伝的機構を有する。この機構は、染色体の修復目的のために酵母細胞に利益があるものと考えられ、従来、ギャップ修復とも呼ばれる。酵母における相同組換えを用いることにより、cDNAなどの遺伝子フラグメントを連結ステップなしでプラスミドベクターにクローン化できる。従って、線状化されたプラスミドおよびcDNAは、宿主細胞、コンピテント酵母細胞などへ同時形質転換される。組換えクローンは、栄養選択媒地中での細胞の生存に基づき、または他の表現型マーカーに基づき、選択できる。線状化されたベクターまたはcDNA単独のいずれかを、組換えおよび形質転換の効率を決定するための対照として用いることができる。
【００２５】
一態様では、本方法は、線状および二本鎖のcDNAのライブラリー、および第一の線状化されたプラスミド、ADまたはDBDプラスミドのいずれかなどを、酵母細胞の第一のセットに形質転換するステップを含む。cDNA配列の各々は、cDNA配列の末端に5'-および3'-隣接配列を含む。cDNAの5'-および3'-隣接配列は、線状化されたプラスミドの5'-および3'-終結配列に対して十分相同で、相同組換えを可能とする。同じ方法を用いて、線状および二本鎖cDNA配列を酵母細胞の第二のセットに、第二の線状化されたプラスミドと共に(ADまたはDBDのいずれか)形質転換する。
【００２６】
相互作用するタンパク質をコードするcDNAのCre媒介組換えによる、プラスミドの組換え
相互作用するタンパク質の多くの対を同定する本発明の能力を実現するために、第一および第二のプラスミドを単一のプラスミドへと組換えることが必要である。一態様では、当該組換えは、ADプラスミドおよびDBDプラスミドの、哺乳動物細胞への標準的な方法を用いるトランスフェクションにより証明された。当該プラスミドは各々リコンビナーゼ認識部位を含むので、リコンビナーゼは、２つのプラスミドの、一つの組換えプラスミドへの組換えを触媒できる。
【００２７】
あらゆるリコンビナーゼを本目的のために使用できる。好ましいリコンビナーゼはCREリコンビナーゼである。CREは、バクテリオファージP1のcre(環状化リコンビナーゼ)遺伝子の38-kDaの産物であり、Intファミリーの部位特異的DNAリコンビナーゼである。CREはloxPと呼ばれるP1ゲノム上の34-bpの部位(P1の交叉の位置)を認識し、loxP部位の対の間の反転的保存的なDNAの組換えを効果的に触媒する。loxP部位は8bpの非パリンドロームのコア領域に隣接する２つの13-bpの反転したリピートから成る。２つの直線的に反復されるloxP部位の間のCRE-媒介認識は、それらの間のDNAの、共有結合で閉じた環としての切り出しを生じる。反転配向でのloxP部位の対の間でのCre媒介認識は、切り出しではなく、間に入っているDNAの反転を生じる。DNAの破壊および結合は、コア領域内での不連続な位置に限定され、酵素を用いるトランジェントなホスホチロシンDNA-タンパク質結合を用いて一時に鎖方向に進行する。
【００２８】
CREリコンビナーゼは、当該loxP配列に対する多数の異種または変異lox部位をも認識する。これらのCre認識部位の例には、イー.コリに見出されるloxB、loxLおよびloxR部位が含まれるが、これらには限定されない。他の異種lox部位には、loxB、loxL、loxR、loxP3、loxP23、lox.DELTA.86、lox.DELTA.117、loxP511、およびloxC2が含まれるが、これらには限定されない。本発明の１つの具体例では、lox66およびlox71部位の対をCre媒介認識のために用いることができるが、これらは、Creリコンビナーゼによる認識に耐性のある変異lox部位耐性を生じる。
【００２９】
非CREリコンビナーゼの例には、部位−バクテリオファージ．ラムダのIntリコンビナーゼにより認識されるatt部位(例えば、att1、att2、att3、attp、attB、attLおよびattR)、サッカロマイセス・セレビジエの2μプラスミドのFLPリコンビナーゼにより認識されるFRT部位、リゾルバーゼファミリーにより認識される組換え部位、およびバチラス・トルインギエンシス(Bacillus thruingiensis)のトランスポスアーゼにより認識される組換え部位が含まれる−特異的リコンビナーゼを含むがこれらには限定されない。
【００３０】
細胞内で相互作用するタンパク質をコードするcDNAを物理的に連結するために、リコンビナーゼのためのコーディング領域を細胞のゲノムに提供する。好ましいリコンビナーゼは、CreMerという名称の、グルココルチコイド応答エレメントを含む、DEX誘導性プロモーターの制御下のタモエキシフィン誘導性のCreである。グルココルチコイド応答エレメントは、DEXでの処置において、高レベルまでCreMer発現を誘導することを可能とするが、その不在下では非常に基礎的なレベルの発現しか示さない。さらに、CreのCreMer異種は、活性のためにタモキシフェンの存在を要する。この二重制御により厳密な制御が可能となり、Cre活性の発現に対して高程度の制御が可能となる。つまり、細胞がCreMerのためのコーディング領域および本発明のDBDおよびADプラスミドを含む場合、DEXおよびタモキシフェンを細胞に投与することにより、CreMerの発現が誘導され、ベクターの組換えが引き起こされる。
【００３１】
他の態様では、本発明のDBDおよびADベクターは各々、反対の性の酵母細胞に存在する。酵母は２つの性(aおよびα)を有するため、DBDおよびADベクターは、各々選択可能なマーカーを含むDBDおよびADベクターを接合させることにより、同一の酵母細胞へと容易に導入できる。従って、本発明の一態様では、DBDプラスミドを含む酵母細胞をADプラスミドを含む酵母細胞へと接合させる。当該プラスミドは選択可能なマーカーを用いて、例えば栄養選択によるなどして、互いから別個に維持できる。接合および、例えば酵母株の一つに内在するCreMer遺伝子から供給されたCreMerが活性化すると、lox部位が第一の融合試験タンパク質のcDNAと第二の融合試験タンパク質のcDNAの間に存在するように、ADおよびDBDプラスミドがそのlox部位にて組換えられる。ADとDBDタンパク質がその融合試験ポリペプチドにより相互作用し、次いでさらに別の選択可能なマーカー、栄養選択可能マーカーなどの発現を駆動することを必要とすることにより、組換えられるプラスミドは選択できる。最も一般的に用いられる酵母マーカーには、ura3-52、his3-D1、leu2-D1、trp1-D1およびlys2-201などの酵母中での特異的栄養要求性変異を補うURA3、HIS3、LEU2、TRP1およびLYS2が含まれる。
【００３２】
組換えベクターの配列決定
本技術の、タンパク質-タンパク質相互作用に関する広範な特性を提供する鍵となるのは、相互作用するタンパク質の対をコードするcDNAの効果的な配列決定を可能とすることによる。これは、高スループットフォーマットの遺伝子発現の連続増幅技術の変更バージョンを用いて行う。この技術は、変更されたSAGE技術(MAGE)と呼ばれる。従って、ベクターは変更された遺伝子発現の連続分析(MAGE)のためのエレメントを含む(2002年8月26日に出願され、本明細書中に引用により組み込むU.S特許出願第10/227,719号に記載されている)。
【００３３】
MAGEは、DNA配列の同定のための高スループットな方法である。当該方法は、挿入されたcDNAの隣のIIS型エンドヌクレアーゼ制限(BsgI、BpmIまたはMmeIなど)認識配列の導入によるものである。これらのIIS型制限エンドヌクレアーゼは、その認識配列の隣りの16、20、または21位のヌクレオチド−当該隣りのヌクレオチドの組成は無関係である−で、各々がDNAを切断する特性を有する。BsgIおよびMmeIの例を用いて、本発明はcDNA挿入部位の隣のcDNA配列の21ヌクレオチドまでの増幅を可能とするこの特性の利点を利用する。
【００３４】
この後、「配列タグ」と呼ばれる未知配列情報片を、これらが公知の配列のリピートにより分かたれるために、同定できる。本出願では、これは、ユニバーサルプライマーおよび隣りのベクター配列の両方に存在する制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いてPCR産物を連結することにより行う。配列タグの連結鎖を次いでクローニングおよび配列決定する。こうして、相互作用するタンパク質の対を表現する配列タグを、連結されたPCR産物から作成された配列から同定できる。
【００３５】
酵母を用いる本発明の一態様を説明する図を、図１〜３に示す。図１は、酵母のMAT-αおよびMAT-a株における、活性化ドメインADおよび結合ドメインDBDライブラリーの構築を示す。図２は、これらの株の接合；および相互作用するタンパク質をコードするcDNAを含むプラスミド間の組換えの誘導による相互作用タンパク質の選択の一態様を示す。図２は、サークルで示すMAT-アルファ-ADライブラリー(左)およびMAT-a-DBDライブラリー(右)により運搬されるプラスミドの、特定の態様を図示したものである。DEX応答エレメントの制御下のタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼ遺伝子が、記載のごとくMAT-アルファ株中に存在する。両株はUAS(G)の制御下のUra3およびHis3を運搬するが、ここではUra3遺伝子のみを示す。株を接合し、SD-URA、-HIS欠損培地を用いてツー-ハイブリッド相互作用により媒介されるUra3およびHis1遺伝子の活性化を選択する。選択後、相互作用するタンパク質をコードするcDNAの物理的連結を、DEXおよびタモキシフェンの添加を用いてCreMerの発現を誘導することにより行うことができる。当該ベクター配列の向きは、細菌のori配列、アンピシリン耐性遺伝子、単一のセントロメア配列およびTrpまたはLeuのいずれか(示さず)を運搬するプラスミド上に、融合したcDNAを残す、組換え分子の分解を可能とする。cDNA間の組換えにより、相互作用するタンパク質により媒介されるUra3およびHis3発現が欠損する。これが生じた細胞の選択は、5-FOAにおける生育により可能である(示さず)。
【００３６】
図３Ａ〜Ｃは、連結されたcDNAの回収およびMAGE法の変更を用いた配列データの圧縮を示す。図３Ａでは、連結された二本鎖のcDNAの２つの対を、組換えられたプラスミドに現れるように示す。ハッチング入のボックス中の「A」および「a」は、第一の対を示し、「B」および「ｂ」は、cDNAの第二の対を示す。MmeI認識部位(黒丸)、BpmI切断部位(矢印)、および組換えられたLox66/71部位も示す。
【００３７】
図３Ｂは、XbaI制限エンドヌクレアーゼを含むユニバーサルアダプター(「UA」)のライゲーション後のMmeI消化の産物を示す。検出されるべき当該cDNAは、組換えられたlox配列に相補的なビオチン化オリゴヌクレオチド(示さず)を用いて、ストレプトアビジン(SA)チューブ中で選択できる。図３Bに示すフラグメントは、UA配列に相補的なプライマーを用いてPCRにより増幅される。増幅産物をXbaIで消化し、連結して、図３Ｃに示すごとくコンカタマーを形成する。
【００３８】
図３Ｃから理解できるように、相互作用するタンパク質をコードするcDNAは、対の各々のcDNAがそのつがいから、lox配列を間に入れることにより分かたれ、かつ、cDNAの各対は、XbaI消化後に残っているUA配列により他の対から分離されるので、決定できる。
前記開示は、本発明を一般的に記載したものである。より完全な理解を、以下の詳細な実施例を参照して得ることができる。これらの例は、説明の目的のためにのみ記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。状況により便宜な事項が示唆ないし付加される場合があるため、形式上の変更および均等物の置換が意図される。特定の用語を本明細書中に用いたが、そのような用語は記述的意義にて意図されるものであり、限定目的のためのものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
[実施例１]
本実施例は、酵母にて本発明を実施するのに有用な１対のプラスミドの構築を説明するものである。本実施例では、ADおよびDBDベクターの構築の出発点は、pCAct2(ADベクター)およびpCD2(DBDベクター)であり、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手した。これらのベクターは低コピー数であり、CEN6配列エレメントを含む。本具体例ではこれらのベクターに２つの変更をなし、それらベクターが運搬するcDNAを物理的に連結するCre媒介性組換え用に、調製した。
【００４０】
まず、ADC1プロモーター、AD、cDNA挿入の部位、および転写終結部位を運搬するpCAct2の領域を、残るベクター配列に対して反転させる。これは、以下により詳細に記載するように、当該選択の最終段階において組換えプラスミドの分解を可能とするために必要なものである。第二に、lox配列をpCAct2およびpCD2の両方に挿入する。この具体例では、pCAct2は半部位変異lox71を受容し、pCD2は半部位変異lox66を受容した。これらのlox部位間での組換えにより、もはや有効な組換えを媒介することができず、Creの継続的存在下でもcDNA間の当該融合物を閉じ込めるlox66/71エレメントを作成した。
【００４１】
他の具体例では、多コピー数の２μmの複製起点を含むプラスミドのセットをさらに構築した。図５Ａに、pGADT7recおよびpGBKT7(clontech)からのプロモーター、AD(またはDBD)、クローニング部位、および終結点を除去し、次いでこれらをCENに基づく前記プラスミドからのADC1プロモーター、ADまたはBDB(図５Bのように)、cDNA挿入の部位、lox71配列(またはlox66、図５Bのように)および転写終結部位と置換することにより構築した、pGADT7/ACTrevlox71プラスミドを示す。
【００４２】
[実施例２]
本実施例は、SMARTIIIおよびCDSIII配列を含むcDNAの、ADおよびDBDプラスミドとの同時形質転換による、cDNAの前記ADおよびDBDプラスミドへの合成および組み込みの一態様を開示する。
本発明の一具体例において用いたClonTech(登録商標)pGADT7-Recベクターおよびクローニング法を図４に示す。ベクターの挿入部位と相同の終結部位を含むcDNAを調製し、当該cDNAと共に、線状化したベクターで酵母を形質転換した。相同配列でのその後の組換えにより所望の融合物を作成し、ベクターの再環状化により酵母中で生育させる。本アプローチは、後でMAGE(以下に示す)のために必要とされるBpmIまたはMmeI部位の挿入を可能とし、3'オリゴ配列(図４に示すCDSIIIオリゴに相当するもの)がcDNAの隣りにBpmIまたはMmeI認識配列を含むように変更されることのみを要する。ベクターの相同配列も、これを前記ADおよびDVDベクターにおいて反映するよう変更する。
【００４３】
１つの具体例では、プライマー配列は、
pAct2 lox71 MAGE/6プライマー：(配列番号１)
5'-GTATAGCATACATTATACGAACGGTAACCCTCTGAGCTGGAG-NNNNNN-3'
Xba I    Bpm I
PCD2 lox66 MAGE/6プライマー：(配列番号２)
5'-CGTATAATGTATGCTATACGAACGGTACCCTCTGAGCTGGAG-NNNNNN-3'
Xba I    Bpm I
【００４４】
BpmIおよびXbaI部位を太字で示す。6つのランダムなヌクレオチド(N)を用いて、第一鎖cDNA合成をプライムし、多くの場合に正確に当該cDNA配列を表す。
他の態様では、プライマー配列は、
Lox71 MmeI：(配列番号３)
5'-TATAATGTATGCTATACGAACGGTAGGATCCAACNNNNNN-3'
MmeI
Lox66 MmeI：(配列番号４)
5'-CATATCGTATGTAATATGCTTGCCATAGGTTGNNNNNN-3'
MmeI
である。
【００４５】
MmeI部位を太字で示す。６つのランダムなヌクレオチド(N)を用いて第一鎖cDNA合成をプライムし、殆ど全ての場合に当該cDNA配列を正確に表す。
cDNAをクローニングする前に、cDNAを標準化した。全集合物中のあらゆる特定のメッセージの濃度は、3〜4オーダーのマグニチュードに渡って変化し得、それゆえ、２つの稀な配列間の相互作用を見出す確率は、標準化段階なしでは低くなる。cDNAを標準化できる種々の方法が記載されており、これらの方法のいずれも本発明に用いることができる。本具体例では、標準化ステップは、ビオチン化したドライバーcDNAへのcDNAのハイブリダイゼーションの後、ドライバーおよび余ったcDNAをストレプトアビジン結合およびフェノール抽出により除去することにより行った。標準化の後、cDNAを細胞に、線状化したABおよびDBDプラスミドと共にトランスフェクトし、cDNAとプラスミド間の相同組換えを促した。
【００４６】
相同組換え媒介性ギャップ修復を用いる酵母の形質転換効率は、出発ベクター１μg当たり300,000コロニーを越える。この効率は十分大きく、100,000コロニーより多くのコロニーを含む包括的なcDNAライブラリーの作製が可能である。本態様では、用いた酵母の株は、Gal1プロモーターからのUra3選択を利用して、タンパク質の相互作用を検出する。Ura3の発現は、二両体化するパートナーの不在下でGal1プロモーターを自動活性化する融合タンパク質を排除する5-フルオロ-オロチン酸(5-FOA、Boeke等、1984)を使用することにより、任意に対抗選択することもできる。5-FOAの濃度の一般的に有用な範囲は、これまでの研究から見積もることができるが、5-FOAの濃度の、一部の形質転換細胞に対する滴定を行った。ここでは、約10,000個の形質転換体を、ベクターによりTRPまたはLEUのいずれかを欠くSD-URA培地中の各濃度に関して単一の15cmのプレートに播いた。同じ5-FOA濃度を並行して用いて、URA、TRPおよびLEUを含む培地中の宿主細胞における効果を試験した。cDNAライブラリーからのコロニーの生育を抑制することに最大の効果を有するが、宿主細胞においては最小の効果を有する濃度を、残りのステップのために選択した。
【００４７】
[実施例３]
本実施例は、本発明を用いた使用のための、CreMer遺伝子を内在的に有する宿主細胞を記載する。CreMer発現酵母株を作製するのに用いられる出発株は、YD116およびYD119であった。これらの株は共に(ura3-52 his3-200 leu2-trp1-901 can(R) gal4delta512 gal80delta338 lys2-801::UAS(G)-HIS3-lacZ ade2-101::GAL1-URA3)であり、YD116はMAT-アルファであり、YD119はMAT-aである。これらを誘導性Cre発現のために変更するために、タモキシフェン誘導性Cre変種(CreMer; Xhang等、1996)を、DEX誘導性グルココルチコイド応答エレメントの制御下に挿入した(Picard等、1990)。これは、pFA6a-kanMX6モジュールを用いるPCRに基づく遺伝子ターゲッティング(Bahler等、1998)およびG418での選択により行った。通用する組込みをPCRにより確認した。グルココルチコイド応答エレメントはDEXで処置した場合に高レベルまでの誘導を可能とするが、その不在下では非常に低い基本的レベルを示した。さらにCreのCreMer変種は、活性のためにタモキシフェンの存在を必要とする。この二重コントロールにより、厳密な調整が可能となり、Cre活性の発現に対して高程度のコントロールが可能となる。CreMer遺伝子および本発明のDBDまたはADプラスミドのいずれかを有する特定の性の酵母の株を、相補的なDBDまたはADプラスミドを有する反対の性の酵母と接合できる。この方法において、CreMerの活性化は、本発明の方法を用いる配列決定分析のためのプラスミドの組換えを触媒する。
【００４８】
[実施例４]
本実施例は酵母細胞の接合を示し、逆の性の細胞はDBDまたはADプラスミドいずれかを有し、当該細胞を接合することにより、DBDおよびADプラスミドの両方を有する細胞が提供される。前記のごとく作製されたライブラリーにおいて行われた〜100,000cDNA間の全相互作用の包括的な試験は、1×1010個の二倍体細胞が作製されることを要する。10%以上の接合効率を常に可能とする最適化された相互作用-接合プロトコールが開発されている(SoelickおよびUhrig, 2001)。これらの条件をここで用い、そしてこれらの条件では、約1×108細胞/ｍｌの低pHインキュベーションの後、細胞を2×107細胞/cm2の密度でフィルターに蒔くことが必要である。フィルターを寒天へ移し、選択条件へ移す4.5時間前に接合が起こるようにする。このプロトコールにより、フィルター面積のcm2当たり約2×106個の接合体を得る。1×1010個の二倍体細胞を得るためには、5000cm2の接合表面積当量を要する。15cmフィルターにより約176cm2の表面積が可能であるので、このようなフィルターを約30枚調製することが必要である。接合の後、細胞をフィルターから取り出し、プールした。少量をSD-Leu、SD-Trp、SD-Leu-Trpへ蒔き、生育能力および接合効率をモニターする。残る細胞をSD-Leu-Trp-Ura-Hisの15cmプレートに蒔き、相互作用しているタンパク質を選択する。300,000の潜在的相互作用の見積もりに基づけば、30プレートの各々は約10,000コロニーを含むが、実際数のコロニーを見積もり、コロニーをプールする。
【００４９】
[実施例５]
本実施例は、本発明のプラスミドをインビボで組み合わせることができることを示す。図５Ｄに示すように、標準的な方法を用いるHEK293細胞への、図５Ａおよび５Ｂに示すABおよびDBDプラスミドのトランジェントなトランスフェクションにより、当該プラスミドの組換えが生じる。
図５Ｄは、インビボでの(DBDプラスミド中の)Gal4DNA結合ドメインおよび(ADプラスミド中の)Gal4活性化ドメインの、3'cDNAクローニング部位の隣のlox66およびlox71配列間のCre依存性の標的組換えを示す。アンピシリン耐性遺伝子のフラグメントを用いてプローブされたサザンブロットとして示す。レーン１は空であり、レーン２は、HindIIIにより消化した２つのプラスミドを示す(ニンジン)。レーン３および４は対照反応であり、レーン５および６はHEK293細胞から回収したDNAを示す。細胞を、対照としてのpBluescriptと本発明の２つのプラスミドベクター(レーン５)、およびpPGKcreと２つのY2Hベクター(レーン６)の各々8mgでトランスフェクトした。DNAを単離し、HindIIIにより消化した。アスタリスクで示したバンドは、アンピシリン耐遺伝子を含む、Cre組換えの産物である。この例はそれゆえ、本発明のプラスミドがインビボでCre-媒介性組換えを行い得ることを示す。
【００５０】
[実施例６]
本実施例は、相互作用するタンパク質をコードするcDNAのCre媒介性の連結が、どのように、当該相互作用が起こっている酵母細胞内で行われ得るかを示す。トータル100ml(1×107細胞/ml)中約1×109酵母細胞の当該選択された二倍体細胞をタモキシフェンおよびDEXを含む液体培地に接種できる。組換えの不在下では、Ura3遺伝子の転写は、ADおよびDBDcDNA融合タンパク質の、Ura3プロモーターでの相互作用のために続く。lox部位での組換えは融合cDNAの発現を妨害することが期待され、相同組換えによる融合プラスミドの分解はTrpまたはLeu耐性のいずれかの欠損を導き得るので、Ura、His、TrpおよびLueが、本培地中に存在し得る。ADおよびDBDライブラリーを構築するのに用いられるベクターはセントロメアを運搬し、低コピー数であるので、ないしは、ADまたはDBDライブラリーの１つまたは他がセントロメアを運搬し、かつ低コピー数で存在する場合には、Cre媒介性組換えおよびURA3タンパク質の減成に十分な時間の後、当該培地にFOAを添加するのが有用であり得る。組換えの不在下では、Ura3プロモーターでのADおよびDBD cDNA融合タンパク質の相互作用のために、Ura3遺伝子の転写が続くので、これにより、lox部位が組換えられた細胞の選択が可能となる。有効な組換えおよびURA3活性の喪失に必要な時間は実験的に決定できる。
【００５１】
[実施例７]
本実施例は、組換えられたプラスミド(エピソーム) を回収できる方法およびMAGE法を用いる配列決定のために調製された連結されたcDNAを示す。エピソーム−その一部がハッチングされたボックスに、連結されたcDNA ；AおよびaとBおよびｂを含むもの−を、図３Ａに示す。これらを標準的な方法により酵母から回収し、MAGEの変更法を用いて、連結されたcDNAからの配列タグ情報を抽出する。連結された配列タグは、ダイマー-タグと呼ぶ。図３Ｂに、制限部位(XbaI)を一体化するユニバーサル・アダプター(UA)の、各MmeIフラグメントへの連結により、連結されたcDNAのプールへの連結用に調製した、２つのエピソームの領域を示す。XbaIでの次なる消化および当該フラグメントのコンカタマー化により、図３Ｃに示すlox66/71配列により互いから分かたれて連結された対(複数)を生じる。
【００５２】
所望の連結されたcDNA配列を含むフラグメントを特に選択するために、間に入っているlox部位をハイブリダイゼーションプローブとして用いる。連結産物を変性し、この配列に相同な3'ビオチン化オリゴヌクレオチドとアニールする。3'ビオチン化プローブの使用により、次なる重合反応におけるその関与を防ぐ。ハイブリッドをストレプトアビジンでコートしたPCRチューブ上で選択する−lox部位に相補的な3'ビオチン化オリゴヌクレオチドがcDNAの隣の当該lox部位にハイブリダイズし、それによりPCRチューブ中にcDNAを保持する。洗浄により、混入配列の大部分を除去し、洗浄ステップの後、アダプター配列のトップストランドに相同なオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして用いる。PCR反応産物をNotI−アダプター配列中に切断部位が存在する−で消化する。各フラグメントは、ダイマータグおよび2×21ヌクレオチド長のアダプターフラグメントを含むフラグメントを生じる。これらをアクリルアミドゲル上に電気泳動し、86bp長のフラグメントを回収し、コンカタマーへと連結し、配列決定のための細菌へクローニング化する。ハイブリダイゼーション選択ステップにより排除されなかったあらゆる残存混入cDNA配列をさらに、サイズ選択により当該集合物中で減らし、非常に少量の混入物のみとする。そのような混入物は配列決定中に容易に認識される。
【００５３】
個々の細胞堆積能力を有するBD FACS-Vantage(登録商標)を用いて、クローニングのためのマイクロタイタープレートに細菌を蒔く。標準的な高スループット技術を用いて、配列決定機−Beckman(登録商標)CEQまたはAmersham(登録商標)MegaBase1000キャピラリー・シークエンサーなど−に特有のプロトコールを用いる配列決定のためのプラスミドを調製する。各配列は、約500〜600ntの有用な配列を生じる。各ダイマー−タグは86ヌクレオチド長であるので、各配列から平均５個の相互作用するタンパク質の対を同定できた。これにより、タンパク質の相互作用のコスト的に有効で、かつ包括的なスクリーニングが提供される。
【００５４】
[実施例８]
本実施例は、Gal4のDBDに融合されたBrn2と相互作用する、AD試験ポリペプチドをコードするcDNAの配列タグ分析を示す。これらの結果は、DBDおよびADプラスミドを用いて酵母細胞において得られたものである。AD cDNAライブラリーは、性交後9.5日のマウス胎児からのポリA選択されたRNAから作製し、合成中に、cDNAの3'末端の隣にBpmI制限酵素部位を導入した。
表１は、クローン化および配列決定したコンカタマーを示す(タグに下線を引き、リンカー配列をイタリック体で示し、クローニングベクターは太字で示す)。表２は、表１中の配列番号５からデコンボリュートした配列タグを示し、表３は同定された配列タグにおいて行ったBLASTサーチからの結果、および単離したcDNAを表すcDNA GenBank受諾番号を示す。
【００５５】
【表１】
2006525817.tif 000002
【００５６】
【表２】
2006525817.tif 000003
【００５７】
【表３】
2006525817.tif 000004
【００５８】
本実施例はそれゆえ、相互作用してレポーター遺伝子の発現を駆動するタンパク質をコードする複数のcDNAを同定する、本発明の方法の能力を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、相同組換え媒介性ギャップ修復により酵母中でAD(左)およびDBD(右)ライブラリーの作製を達成し得る、一態様を図示したものである。
【図２】図２は、ADおよびDBDライブラリーを接合するためのスキームの一態様を図示したものである。MAT-アルファ-ADライブラリー(左)およびMAT-a-DBDライブラリー(右)株により運搬されるベクター(エピソーム)の図をサークルとして示す。DEX応答エレメントの制御下のタモキシフェン誘導性Cre-リコンビナーゼ遺伝子は、MAT-アルファ下部中に存在し、ボックスで囲った「CREmer」として示す。両株は、UAS(G)の制御下のUra3およびHis3を運搬し、ここではUra3遺伝子のみを示し、ボックスで囲った「URA3」として示す。
【図３】図３Ａ−Ｃは、結合されたcDNAの回収およびMAGE法の変法により同定される配列データの圧縮を図示したものである。図３Ａは、連結された二本鎖cDNAの対を、組換えプラスミド中に現れるように図示したものである。ハッチングをかけたボックス中の「Ａ」および「ａ」は第一の対を示し、「Ｂ」および「ｂ」は、cDNAの第二の対を示す。MmeI認識部位(黒丸)、MmeI切断部位(矢印)、および組換えられたLox66/71部位も示す。図３Ｂは、XbaI制限エンドヌクレアーゼを含むユニバーサルアダプター(「ＵＡ」)の連結後のMmeI消化の産物を図示したものである。図３Ｃは、図３ＢのポリヌクレオチドのXbaI消化フラグメントのコンカタマーを図示したものである。相互作用するタンパク質をコードするcDNAは、lox部位と隣り合っており、かつ、残るアダプターおよびXbaI配列により、相互作用するcDNAの他の対から分かたれる。
【図４】クローニングベクター(ClonTech pGADT7-Rec)と、cDNAライブラリーの構築法の一態様を表現したものを示す。ベクター中の挿入部位に相同な末端を含むcDNAおよび、相同組換えによる連結のためのcDNAと共に線状分子として酵母に導入されるベクターを調製する。CDSIIIオリゴヌクレオチドをIIS型制限酵素を含むように変更することにより、活性化ドメインとcDNAの間の融合点でのIIS型制限エンドヌクレアーゼ切断部位配列エレメントの挿入が生じる。
【図５Ａ】図５Ａは、3'cDNAクローニング部位の隣に統合されたlox71配列を有する、高コピー数の2μに基づくツーハイブリッドAD融合ベクターを図示したものである。種々の選択可能なマーカーおよび、cDNAとの相同性のための「3'cDNAホモロジー」および「5'cDNAホモロジー」部位も示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａに関して記載した追加的特性と共に、3'cDNAクローニング部位の隣に統合されたlox66配列を有する、低コピー数のCENに基づくツーハイブリッドDBD融合ベクターを図示したものである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、二重変異したlox66/71配列に隣接するcDNAクローニング部位にて生じるADおよびDBDプラスミド間の安定な部位指向性組換えの産物の一態様を図示したものである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、Gal4DNA結合ドメイン(DBD)およびGal4活性化ドメイン(AD)Y2Hベクターの3'cDNAクローニング部位の隣のlox66およびlox71配列間のインビボCre依存性組換えを立証するサザンブロットを示すものである。図は、アンピシリン耐性遺伝子のフラグメントでプローブしたサザンブロットを示す。レーンλはサイズラダーであり、レーン１は空であり、レーン２はHindIIIにより消化した各プラスミドである(ニンジン)。レーン３および４は対照であり、レーン５および６はpBluescriptと、図５Ａおよび５Ｂに示す２つのY2Hベクター(レーン５)、およびpPGKcreと２つのY2Hベクター(レーン６)の各々8mgでトランスフェクトした、HindIIIにより消化されたHEK293細胞から回収したDNAである。アスタリスクで示したバンドは、アンピシリン耐性遺伝子を含むCre組換えの産物である。  レーン１は30pg/eaの、HindIIIで消化されたpGADT7lox71およびpCDlox66であり、非組換えプラスミド(ニンジン)のサイズを示すためのものである。その隣は＃２であり、空のレーンである。当該マークは明らかにある種の人工的産物である。#３および#４は、遺伝子トラップベクターを用いるポジティブコントロールであることを意味するが、それらはきれいには現れなかったので、作用したかどうかを実際には断言できない。
【図１】
2006525817.tif 000005
【図２】
2006525817.tif 000006
【図３】
2006525817.tif 000007
【図４】
2006525817.tif 000008
【図５Ａ】
2006525817.tif 000009
【図５Ｂ】
2006525817.tif 000010
【図５Ｃ】
2006525817.tif 000011
【図５Ｄ】
2006525817.tif 000012
【配列表】
2006525817000001.app
【国際調査報告】
2006525817.tif 000013
2006525817.tif 000014