(57)【要約】【課題】鉄キレート化剤を含め、細胞膜を透過しかつ細胞内のＦｅをキレート化することが可能な、治療上許容される金属イオンキレート化剤が必要とされている。また、抗増殖活性を有する臨床上有用な鉄キレート化剤も必要である。【解決手段】本発明は、金属イオンをキレート化することが可能な化合物に関する。特に、本発明は、鉄イオンを含めた金属イオンをキレート化することが可能な（チオ）セミカルバゾン化合物および（チオ）ヒドラジン化合物に関する。また、かかる化合物および／またはそれらの金属イオン錯体の、細胞増殖に関連する疾病の治療法を含めた治療的使用も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１、
【化１】
2006516979.tif 000043
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
Ａは
【化２】
2006516979.tif 000044
であって、Ｚ’、Ｙ’、Ｘ’、およびＷ’は独立してＣＲ４、ＮＲ８、Ｓ、およびＯから選ばれ、Ａにおけるヘテロ原子の総数は１、２、または３であり、
ｍは０または１であり、
Bは
【化３】
2006516979.tif 000045
であって、Ｚ、Ｙ、Ｘ、Ｗ、およびＶは独立してＣＲ４、ＮＲ８、Ｓ、およびＯから選ばれ；さらにＢにおけるヘテロ原子の総数は０、１、２、または３であり；
qは０または１であり；
各Ｒ４は独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ；
各Ｒ８は独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、ベンジル、ベンジルカルバメートから選ばれ；
Ｒ’はＨ、または金属イオンキレート化を妨害しない基であり；
−ＧはＮＲ２Ｒ３またはＣＲ２Ｒ３Ｒ５であって、
ＣとＲ５の間の結合は単結合、二重結合、または三重結合でよく；ＣとＲ５の間の結合が二重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の一方がなく、ＣとＲ５の間の結合が三重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の双方がなく；
Ｒ５は水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基からなる群より選ばれ；
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基から選ばれ；
あるいは−Ｇは任意に置換された複素芳香族基、任意に置換された二環基、任意に置換された芳香族基、任意に置換されたアルキル基；任意に置換されたシクロアルキル基、または任意に置換されたヘテロシクロアルキル基であって；
（ｉ）  ＥがＯであり、ＡおよびＢが各々
【化４】
2006516979.tif 000046
である場合には、
−Ｇは、−ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃｌ、
【化５】
2006516979.tif 000047
ではなく；かつ
（ｉｉ） ＥがＳであり、ＡおよびＢが各々
【化６】
2006516979.tif 000048
である場合には、
−Ｇは、−ＮＨ２、
【化７】
2006516979.tif 000049
ではないという条件つきである］の化合物。
【請求項２】
Ｒ’が水素である、請求項１の化合物。
【請求項３】
ＡおよびＢが同じである、請求項１の化合物。
【請求項４】
ＡおよびＢが異なっている、請求項１の化合物。
【請求項５】
Ａが、任意に置換されたピリジル、任意に置換されたピリミジニル、任意に置換されたトリアジニル、任意に置換されたオキサゾリル、および任意に置換されたピロリルから選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項６】
Ｂが、任意に置換された５−または６−員の芳香環、および任意に置換された５−または６−員の複素芳香環から選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項７】
Ｂが、任意に置換されたフェニル、任意に置換されたナフチル、任意に置換されたピリジル、任意に置換されたピリミジニル、任意に置換されたトリアジニル、任意に置換されたオキサゾリル、任意に置換されたピロリル、および任意に置換されたフラニル基から選ばれる、請求項６の化合物。
【請求項８】
前記任意の置換基の各々が、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ６−１０アリール、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ニトロ、シアノ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）、およびＣ（Ｏ）Ｎ（アルキル）２から選ばれる、請求項６または７の化合物。
【請求項９】
式２：
【化８】
2006516979.tif 000050
［式中、
Ａは
【化９】
2006516979.tif 000051
から選ばれ、
各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
nは０、１、２、３、または４であり；さらに
Ｂ、Ｅ、およびＧは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである
］の化合物。
【請求項１０】
Ａが
【化１０】
2006516979.tif 000052
であって、Ｒ４およびｎが請求項９に定義された通りである化合物。
【請求項１１】
Ｂが、
【化１１】
2006516979.tif 000053
から選ばれ、各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
ｐは０から７までの整数であり、かつ
Ａ、Ｅ、およびＧは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである、請求項１の化合物。
【請求項１２】
ｐが０、１、２、３、または４である、請求項１１の化合物。
【請求項１３】
Ｂが、
【化１２】
2006516979.tif 000054
であり、Ｒ４が請求項１１に定義された通りであり、かつｐが０、１、２、３、または４である、請求項１１の化合物。
【請求項１４】
式３：
【化１３】
2006516979.tif 000055
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
ｎは０、１、２、３、または４であり、
ｐは０、１、２、３、または４であり、さらに
各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、さらに
−Ｇは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである］の化合物。
【請求項１５】
式４：
【化１４】
2006516979.tif 000056
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；かつ
−Ｇは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである］の化合物。
【請求項１６】
【化１５】
2006516979.tif 000057
から選ばれる化合物。
【請求項１７】
【化１６】
2006516979.tif 000058
から選ばれる化合物。
【請求項１８】
製薬上許容される希釈剤または担体および、請求項１、９、１４、１５、１６、および１７の任意の１項による少なくとも一つの化合物か、またはその金属イオン錯体を含む製薬組成物。
【請求項１９】
製薬上許容される希釈剤または担体および、請求項１、９、１４、１５、１６、および１７の任意の一つによる化合物の少なくとも一つの金属イオン錯体を含んでおり、前記金属イオンが鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、パラジウム（ＩＩ）、白金（ＩＩ）、およびガリウム（ＩＩＩ）から選ばれる製薬組成物。
【請求項２０】
前記金属イオンが、鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）から選ばれる、請求項１９の組成物。
【請求項２１】
条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、治療上有効な量の、式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む、哺乳類における鉄キレート化療法。
【請求項２２】
治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む、哺乳類における鉄過剰症の治療方法。
【請求項２３】
前記鉄過剰症がβ−サラセミア（thalassaemia）である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
細胞増殖を阻害する方法であって、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物と、細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２５】
哺乳類において細胞増殖を阻害する方法であって、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物と、哺乳類細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２６】
哺乳類において増殖性疾患を治療する方法であって、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記増殖性疾患が、血管新生依存性疾患、細胞増殖性疾患、および癌から選ばれる、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記癌が、悪性腫瘍か、または良性腫瘍である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記癌が、固形腫瘍か、または非固形腫瘍である、請求項２７の方法。
【請求項３０】
細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３１】
細胞増殖を阻害し、かつ細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項３２】
哺乳類においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記哺乳類に、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
哺乳類においてアポトーシスを誘導しかつ細胞増殖を阻害する方法であって、前記哺乳類に、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記金属イオンが、鉄、銅、亜鉛、パラジウム、白金、およびガリウムから選ばれる遷移金属イオンである、請求項２４〜３３のいずれか１項の方法。
【請求項３５】
前記金属イオンが、鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）から選ばれる、請求項２４〜３４のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属イオンをキレート化することが可能な化合物に関する。特に、本発明は、鉄イオンを含めた金属イオンをキレート化することが可能な（チオ）セミカルバゾン化合物および（チオ）ヒドラジン化合物に関する。本発明はまた、かかる化合物および／またはそれらの金属イオン錯体の、細胞増殖に関連する疾病の治療法を含めた治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄（Ｆｅ）は、基本的に多くの重要な細胞プロセスに関与している。たとえば、Ｆｅ含有タンパク質は、エネルギー代謝、呼吸、およびＤＮＡ合成に関係する鍵反応を触媒する。細胞のＦｅ奪取は、結果としてＧ１／Ｓ停止およびアポトーシスを生じる１，２。腫瘍細胞は、おそらくはその増大した増殖速度のため、正常細胞よりも鉄の枯渇に対してはるかに感受性である。腫瘍細胞の増大した鉄要求は、血清のＦｅ輸送タンパク質、トランスフェリン（Ｔｆ）と結合するトランスフェリン受容体1の増大した発現に反映される。新生細胞もまた、より高いレベルのＦｅ含有酵素、リボヌクレオチド還元酵素、を発現しており、そのことはＤＮＡ合成の重要な律速段階である。細胞の鉄プールはそれゆえ重要な治療標的であり、鉄をキレート化することが可能な化合物は、鉄関連性の疾患および障害の治療における有用な治療薬、ならびに潜在的な抗腫瘍剤であってよい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）は、鉄過剰症の治療のために現在使用されている鉄キレート化剤である。しかしながら、抗癌剤としてのＤＦＯの使用は、そのあまり大きくはない抗増殖活性によって制限されている。
【０００４】
鉄キレート化剤を含め、細胞膜を透過しかつ細胞内のＦｅをキレート化することが可能な、治療上許容される金属イオンキレート化剤が必要とされている。また、抗増殖活性を有する臨床上有用な鉄キレート化剤も必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の観点によれば、式１
【０００６】
【化１７】
2006516979.tif 000002
【０００７】
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
Ａは
【０００８】
【化１８】
2006516979.tif 000003
【０００９】
であって、Ｚ’、Ｙ’、Ｘ’、およびＷ’は独立してＣＲ４、ＮＲ８、Ｓ、およびＯから選ばれ、Ａにおけるヘテロ原子の総数は１、２、または３であり、
ｍは０または１であり、
Bは
【００１０】
【化１９】
2006516979.tif 000004
【００１１】
であって、Ｚ、Ｙ、Ｘ、Ｗ、およびＶは独立してＣＲ４、ＮＲ８、Ｓ、およびＯから選ばれ；さらにＢにおけるヘテロ原子の総数は０、１、２、または３であり；
qは０または１であり；
各Ｒ４は独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ；
各Ｒ８は独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、ベンジル、ベンジルカルバメートから選ばれ；
Ｒ’は水素、または金属イオンキレート化を妨害しない基であり；
−ＧはＮＲ２Ｒ３またはＣＲ２Ｒ３Ｒ５であって、
ＣとＲ５の間の結合は単結合、二重結合、または三重結合でよく；ＣとＲ５の間の結合が二重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の一方がなく、ＣとＲ５の間の結合が三重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の双方がなく；
Ｒ５は水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基からなる群より選ばれ；
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基から選ばれ；
あるいは−Ｇは任意に置換された複素芳香族基、任意に置換された二環基、任意に置換された芳香族基、任意に置換されたアルキル基；任意に置換されたシクロアルキル基、または任意に置換されたヘテロシクロアルキル基であって；
（ｉ）  ＥがＯであり、ＡおよびＢが各々
【００１２】
【化２０】
2006516979.tif 000005
【００１３】
である場合には、
−Ｇは、−ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃｌ、
【００１４】
【化２１】
2006516979.tif 000006
【００１５】
ではなく；かつ
（ｉｉ） ＥがＳであり、ＡおよびＢが各々
【００１６】
【化２２】
2006516979.tif 000007
【００１７】
である場合には、
−Ｇは、−ＮＨ２、
【００１８】
【化２３】
2006516979.tif 000008
【００１９】
ではないという条件つきである］の化合物が提供される。
【００２０】
本発明の第１の観点に関しては、ＡおよびＢは同じかまたは異なってよい。一つの態様においては、ＡおよびＢは同じである。もう一つの態様においては、ＡおよびＢは異なっている。
【００２１】
いくつかの態様においては、Ａは任意に置換されたピリジル、任意に置換されたピリミジニル、任意に置換されたトリアジニル、任意に置換されたオキサゾリル、および任意に置換されたピロリルから選ばれてよい。
【００２２】
別の態様においては、Ｂは任意に置換された５−または６−員の芳香環、および任意に置換された５−または６−員の複素芳香環から選ばれてよい。たとえば、Ｂは任意に置換されたフェニル、ナフチル、ピリジル、ピリミジニル、トリアジニル、オキサゾリル、ピロリル、およびフラニル基から選ばれてよい。任意の置換基は、電子吸引基および電子供与基を含んでよい。任意の置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、Ｃ６−１０アリール、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ニトロ、シアノ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ（アルキル）、およびＣ（Ｏ）−Ｎ（アルキル）２を含んでよい。
【００２３】
一つの態様においては、Ｒ’は水素である。
【００２４】
別の態様においては、ＥがＯである場合、−Ｇは、任意に置換された−Ｃ１−８−アルキル、Ｃ１−８−アルケニル、アリール、ヘテロアリール、−ＣＨ２（アリール）、および−ＣＨ（アリール）２から選ばれる。他の態様においては、ＥがＳである場合、−Ｇは、任意に置換された−Ｃ１−８−アルキル、Ｃ１−８−アルケニル、−ＣＨ２（アリール）、−ＣＨ（アリール）２、およびヘテロアリールから選ばれる。さらなる態様においては、ＥがＳである場合、−Ｇは、任意に置換された−ＮＨ（Ｃ１−６−アルケニル）および−Ｎ（アリール）２から選ばれる。
【００２５】
本発明の第２の観点によれば、式２：
【００２６】
【化２４】
2006516979.tif 000009
【００２７】
［式中、
Ａは
【００２８】
【化２５】
2006516979.tif 000010
【００２９】
から選ばれ、
各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
nは０、１、２、３、または４であり；さらに
Ｂ、Ｅ、およびＧは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである
］の化合物が提供される。
【００３０】
一つの態様においては、Ａは
【００３１】
【化２６】
2006516979.tif 000011
【００３２】
であって、各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、さらに
nは０、１、２、３、または４である。
【００３３】
一つの態様においては、Ｂは
【００３４】
【化２７】
2006516979.tif 000012
【００３５】
から選ばれ、各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、さらに
ｐは０から７までの整数であり、
Ａ、Ｅ、およびＧは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである。
【００３６】
一つの態様においては、ｐは０、１、２、３、または４である。
【００３７】
一つの態様においては、Ｂは
【００３８】
【化２８】
2006516979.tif 000013
【００３９】
である。
【００４０】
本発明の第３の観点によれば、式３：
【００４１】
【化２９】
2006516979.tif 000014
【００４２】
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
ｎは０、１、２、３、または４であり、
ｐは０、１、２、３、または４であり、さらに
各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、さらに
−Ｇは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである］の化合物が提供される。
【００４３】
本発明の第４の観点によれば、式４：
【００４４】
【化３０】
2006516979.tif 000015
【００４５】
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；かつ
−Ｇは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて式１に定義された通りである］の化合物が提供される。
【００４６】
本発明の一つの態様においては、ＥがＯである場合、式４の化合物はジ−２−ピリジルケトン４，４−ジフェニルセミカルバゾン（ＰＫ４４ｐＨと略記）である。もう一つの態様においては、ＥがＯである場合、式４の化合物はジ−２−ピリジルケトン・オクタノイック・ヒドラゾン（ＰＫｏｃｔＨと略記）である。
【００４７】
本発明のさらなる態様においては、ＥがＳである場合、式４の化合物はジ−２−ピリジルケトン４−エチル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ｅＴと略記）である。もう一つの態様においては、ＥがＳである場合、式４の化合物はジ−２−ピリジルケトン４−アリル−３−チオセミカルバゾン（Ｄｐ４ａＴと略記）である。
【００４８】
式１、２、３、または４の化合物は、金属イオンをキレート化することが可能でよい。したがって、本発明のもう一つの観点においては、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めるかまたは除外して、本発明の第１〜第4の観点の任意の一つにおいて定義された式１、２、３、または４の化合物の金属イオン錯体が提供される。
【００４９】
一つの態様においては、式１、２、３、または４の化合物の金属イオン錯体は、銅、鉄、亜鉛、パラジウム、白金、またはガリウムイオン錯体のような、遷移金属イオン錯体でよい。一つの態様においては、金属イオンは鉄（ＩＩ）である。もう一つの態様においては、金属イオンは鉄（ＩＩＩ）である。
【００５０】
一つの態様においては、式１、２、３、または４の化合物は、三座配位子として機能してよい。一つの態様においては、式１、２、３、または４の二つの化合物は、金属イオン、たとえば、鉄（ＩＩ）または鉄（ＩＩＩ）と六配位錯体を形成してもよい。
【００５１】
本発明の第５の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物と一緒に、製薬上許容される希釈剤、補助剤、または担体を含む製薬組成物が提供される。
【００５２】
一つの態様においては、本発明の製薬組成物は、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて、本発明の第１〜第4の観点の任意の一つによる式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物を含む。
【００５３】
本発明のいくつかの態様においては、製薬組成物は式１、２、３、または４の化合物の、一以上の金属イオン錯体を含んでもよい。適切な金属イオンは遷移金属イオンを含むたとえば、金属イオンは鉄（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、パラジウム（ＩＩ）、白金（ＩＩ）、またはガリウム（ＩＩＩ）でよい。
【００５４】
条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、および４の化合物、およびそれらの組成物は、インビトロまたはインビボの金属イオンキレート化に使用されてよい。一つの態様においては、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、および４の化合物、およびそれらの組成物は、鉄のキレート化に使用されてよい。したがって、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、および４の化合物、およびそれらの組成物は、鉄キレート化療法または、鉄過剰症の治療に適してよい。条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、および４の化合物、およびそれらの組成物はまた、鉄を含めて、細胞の金属イオンをキレート化することにより、細胞機能を修正するために使用されてよい。たとえば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、および４の化合物、およびそれらの組成物は、細胞増殖を阻害するためおよび／またはアポトーシスを誘導するために使用されてよい。条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、および４の化合物、およびそれらの組成物はまた、鉄濃度に感受性のある遺伝子の発現を修飾するためにも使用されてよい。かかる遺伝子の実例は、ＷＡＦ１、ＧＡＤＤ４５、およびＮｄｒｇＩを含む。
【００５５】
本発明による製薬組成物は、皮下または静脈内注射、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸内適用に向けて製剤されてよい。本発明の一つの態様においては、組成物は静脈内投与用に製剤される。もう一つの態様においては、組成物は経口投与用に製剤される。
【００５６】
本発明の第６の観点によれば、哺乳類における鉄キレート化剤療法であって、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法が提供される。
【００５７】
本発明の第７の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物の、鉄キレート化療法用の薬物の調製のための用途が提供される。
【００５８】
本発明の第8の観点によれば、哺乳類における鉄過剰症の治療法であって、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに治療上有効な量の、本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法が提供される。
【００５９】
本発明の第９の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物の、鉄過剰症の治療用薬物の製造のための用途が提供される。
【００６０】
本発明の第8および第９の観点に関して、一つの態様においては、鉄過剰症はβサラセミア（thalassaemia）である。
【００６１】
本発明の第１０の観点によれば、細胞増殖を阻害する方法であって、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物に対し、細胞を暴露することを含む方法が提供される。
【００６２】
本発明の第１０の観点に関して、一つの態様においては、式１、２、３、および４の化合物またはその金属イオン錯体か、または前記化合物またはその金属イオン錯体を含む組成物は、インビトロの細胞増殖を阻害するべく用いられてよい。もう一つの態様においては、式１、２、３、および４の化合物またはその金属イオン錯体か、または前記化合物またはその金属イオン錯体を含む組成物は、インビボの細胞増殖、たとえば、哺乳類における細胞増殖を阻害するべく用いられてよい。
【００６３】
本発明の第１１の観点によれば、哺乳類における細胞増殖性疾患を治療する方法であって、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法が提供される。
【００６４】
本発明の第１２の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体の、細胞増殖を阻害するための薬物製造のための用途が提供される。
【００６５】
本発明の第１３の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体の、増殖性疾患の治療用の薬物を製造するための用途が提供される。
【００６６】
本発明の第１１または第１３の観点に関して、増殖性疾患は血管新生依存性疾患、細胞増殖性疾患（乾癬、ＩＢＤ、悪性疾患、再狭窄のような）、炎症性疾患、自己免疫性疾患、血管疾患、血栓症、癌から選ばれてよい。増殖性疾患は関節炎であってよい。癌は悪性腫瘍かまたは良性腫瘍でよい。悪性腫瘍は転移性であってもよい。癌は固形腫瘍かまたは非固形腫瘍でよい。たとえば、癌は白血病かまたはリンパ腫であってもよい。
【００６７】
一つの態様においては、本発明の化合物または組成物が唯一の活性物質として投与される場合、哺乳類の白血球数は変化する結果となり、特に、化合物または組成物の投与の後に、高々１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％まで低減される。同様に、一つの態様においては、本発明の化合物または組成物が唯一の活性物質として投与される場合、哺乳類の赤血球数は変化する結果となり、特に、化合物または組成物の投与の後に、高々１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％まで低減される。
【００６８】
本発明の第１４の観点によれば、細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物と接触させることを含む方法が提供される。
【００６９】
本発明の第１５の観点によれば、細胞増殖を阻害し、かつ細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物と接触させることを含む方法が提供される。
【００７０】
本発明の第１６の観点によれば、哺乳類においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記哺乳類に、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００７１】
本発明の第１７の観点によれば、哺乳類においてアポトーシスを誘導しかつ細胞増殖を阻害する方法であって、前記哺乳類に、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
【００７２】
本発明の第１８の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体の、アポトーシスの誘導用の薬物製造のための用途が提供される。
【００７３】
本発明の第１９の観点によれば、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体の、アポトーシスを誘導しかつ細胞増殖を阻害するための薬物製造のための用途が提供される。
【００７４】
本発明の第２０の観点によれば、細胞増殖を阻害すること、増殖性疾患を治療すること、癌を治療すること、アポトーシスを誘導すること、イオンキレート化療法、または鉄過剰症を治療することの、任意の一以上のために使用される場合に、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物が提供される。
【００７５】
本発明の第２１の観点によれば、増殖性疾患、癌、鉄過剰症からなる群より選ばれる症状を哺乳類において治療または阻害するか、哺乳類においてアポトーシスを誘導するか、または哺乳類においてアポトーシスを誘導しかつ細胞増殖を阻害する方法であって、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは用いずに本文において定義された式１、２、３、または４の少なくとも一つの化合物またはその金属イオン錯体か、または前記化合物または錯体を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む組成物を前記哺乳類へ投与することを含んでおり、結果として得られる白および／または赤血球数は哺乳類において変化し、特に、前記哺乳類への化合物または組成物の投与の後に、各々、高々１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％まで低減される方法が提供される。
【００７６】
本発明の第５と第１０〜第２１の観点の任意の一つについては、金属イオンは遷移金属イオンでよい。たとえば、金属イオンは鉄、銅、亜鉛、パラジウム、白金、およびガリウムから選ばれてよい。一つの態様においては、金属イオンは鉄（ＩＩ）である。もう一つの態様においては、金属イオンは鉄（ＩＩＩ）である。
【００７７】
本発明の第６、第８、第１０、第１１、第１６、第１７、および第２１の観点の任意の一つについては、哺乳類はヒト、非ヒト霊長類、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、鳥類、ネコ、ブタ、またはイヌでよい。一つの態様においては、哺乳類はヒトである。
【００７８】
本発明の第２２の観点によれば、抗増殖化合物を同定するためのプロセスであって：
一以上の細胞周期阻害剤をコードしている遺伝子を有する細胞または細胞抽出物を、鉄をキレート化することの可能な化合物と接触させること、
前記遺伝子の発現レベルを測定すること、
前記遺伝子の発現レベルが、前記化合物なしの前記遺伝子の発現に比較して異なるかどうかを測定すること；
および、それにより前記化合物が抗増殖活性を有するかどうかを測定すること、
を含むプロセスが提供される。
【００７９】
本発明の第２３の観点によれば、一以上の抗増殖化合物を同定するべく多数の化合物をスクリーニングするためのプロセスであって：
一以上の細胞周期阻害剤をコードしている遺伝子を有する細胞または細胞抽出物を、鉄をキレート化することの可能な多数の化合物と接触させること、
任意の前記化合物が前記核酸の発現レベルを修飾するかどうかを測定すること、および、もしそうであれば、前記遺伝子の発現レベルを各化合物について別々に測定すること、
前記発現レベルが、各々の前記化合物の不在下での前記発現レベルの比較と異なるかどうかを測定すること；
および、それにより各々の前記化合物が抗増殖活性を有するかどうかを測定すること、
を含むプロセスが提供される。
【００８０】
本発明の第２２および第２３の観点に関連して、一つの態様においては、遺伝子の発現はアップレギュレートされる。もう一つの態様においては、遺伝子の発現はダウンレギュレートされる。一つの態様においては、細胞周期阻害剤を発現する遺伝子はＷＡＦ１でよい。もう一つの態様においては、細胞周期阻害剤を発現する遺伝子はＧＡＤＤ４５でよい。さらなる態様においては、遺伝子はＮｄｒ１である。
【００８１】
本発明の第２２および第２３の観点に関連して、前記化合物の不在下における遺伝子の発現（たとえばｍＲＮＡ、タンパク質）は、前記化合物の存在下における前記遺伝子の発現の測定の前または後に、別個に測定されてよい。
【００８２】
本発明の第２２および第２３の観点に関連して、一つの態様においては、前記化合物または多数の化合物は、金属イオンをキレート化することが可能である。もう一つの態様においては、前記化合物または多数の化合物は、鉄をキレート化することが可能である。さらなる態様においては、化合物は、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは除外して、本文において定義された式１、２、３、または４の化合物である。
【００８３】
本発明の第１〜第２３の観点の任意の一つに関しては、一つの態様において、式１、２、３、または４の前記化合物の各々は、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて、本発明の第１〜第4の観点の任意の一つにおいて定義された通りである。
【００８４】
本発明はその範囲内に、式１、２、３、および４の化合物およびその金属イオン錯体の、すべての異性体の形状を含む。適切な例として、本発明は、化合物および／またはその金属錯体の、すべての可能なエナンチオマー、ジアステリオマー（diasteriomers）、ラセミ体、シス異性体、トランス異性体、（Ｒ）、（Ｓ）、（＋）、（−）、Δ、およびΛ異性体を含む。
（定義）
【００８５】
以下は、本発明の記載の理解に役立つかもしれないいくつかの定義である。これらは一般的な定義として意図されたものであり、決して本発明の範囲をこのような用語のみに制限するものではないが、以下の記述のより良き理解のために提案されている。
【００８６】
本文において単数の整数、段階、または要素として列挙された本発明の整数、段階、または要素は、状況が他を必要としないかまたは特にそれと反対に述べない限り、明らかに、単数および複数の双方の、列挙された整数、段階、または要素を含む。
【００８７】
本明細書を通して、用語「含む（comprise）」または、「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」のような変形は、状況が他に必要としない限り、整数また段階または要素、あるいは整数または段階または要素の集団を含意するが、何ら他の整数または段階または要素、あるいは整数または要素の集団を排除することを意味しないことが理解されるであろう。したがって、本明細書の状況においては、用語「含んでいる」は、「主として含んでいるが、必ずしも単独ではない」ことを意味する。
【００８８】
当業者は、本文に記述された本発明が、具体的に記述されたもの以外の変形および修飾を受けることが可能であることを認識するであろう。本発明がかかる変形および修飾のすべてを包含することが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において言及または表示されたすべての段階、特徴、組成物、および化合物を個別的または集合的に、かつ前記段階または特徴の任意およびすべての組み合せか、または任意の二以上を含む。
【００８９】
本出願において引用された参考文献は、その記載全体が参考として本明細書に明確に含まれる。
【００９０】
本文において用いられる場合、用語「アルキル基」は、その意味の中に、１から１０までの炭素原子、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族基か、３から8までの炭素原子、たとえば３、４、５、６、７、または8個の炭素原子を有する環式飽和脂肪族基、または７、８．９、または１０個の炭素原子を有する二環式飽和脂肪族基を含む。たとえば、用語アルキルは、メチル、エチル、１−プロピル、イソプロピル、１−ブチル、２−ブチル、ｔ−ブチル、アミル、１，２−ジメチルプロピル、１，１−ジメチルプロピル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、4−メチルペンチル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、２−エチルペンチル、３−エチルペンチル、ヘプチル、１−メチルヘキル、２，２−ジメチルペンチル、３，３−ジメチルペンチル、４，４−ジメチルペンチル、１，２−ジメチルペンチル、１，３−ジメチルペンチル、１，４−ジメチルペンチル、１，２，３−トリメチルブチル、１，１，２−トリメチルブチル、１，１，３−トリメチルブチル、５−メチルヘプチル、１−メチルへプチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロプロピル、２−メチルシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、２−メチルシクロペンチル、３−メチルシクロペンチル、シクロヘキシルなどを含むが、これに制限されない。
【００９１】
用語「アルケニル基」は、その意味の中に、２から８までの炭素原子、たとえば、２、３、４、５、６、７、または８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の不飽和脂肪族炭化水素基か、３から８の炭素原子、たとえば、３、４、５、６、７、または8個の炭素原子を有する環式不飽和脂肪族炭化水素基、および、該当する場合にはＥまたはＺのいずれかの、少なくとも一つの二重結合を有するそれらの組合せを含む。アルケニル基の実例は、エテニル、ビニル、アリル、１−メチルビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテンチル（butentyl）、１，３−ブタジエニル、１−ペンテニル、２−ペンテンチル（pententyl）、３−ペンテニル、4−ペンテニル、１，３−ペンタジエニル、２，４−ペンタジエニル、１，４−ペンタジエニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１，３−ヘキサジエニル、１，４−ヘキサジエニル、２−メチルペンテニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテンチル（heptentyl）、３−ヘプテニル、１−オクテニルなどを含むが、それに制限されない。
【００９２】
用語「アルキニル基」は、本文において用いられる場合、その意味の中に、２から8までの炭素原子、たとえば、２、３、４、５、６、７、または8個の炭素原子を有しており、かつ少なくとも一つの三重結合を有する、直鎖または分枝鎖の不飽和脂肪族炭化水素基を含む。アルキニル基の実例は、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−メチル−２−ブチニル、３−メチル−１−ブチニル、１−ペンチニル、１−ヘキシニル、メチルペンチニル、１−ヘプチニル、２−ヘプチニル、１−オクチニル、２−オクチニルなどを含むが、それに制限されない。
【００９３】
用語「ヘテロ原子」は、本文において用いられる場合、炭素または水素以外の、たとえば酸素、窒素、および硫黄を含めた任意の原子を指す。
【００９４】
用語「ハロゲン化物」または「ハロ原子」は、本文において用いられる場合、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
【００９５】
用語「アミノ基」または「アミノ」のような変形は、本文において用いられる場合、−ＮＲ６Ｒ７の形状の基を指し、Ｒ６およびＲ７は独立して水素、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、および任意に置換されたアリール基を含む群から選ばれるが、それに制限されない。
【００９６】
用語「芳香族基」または「アリール」のような変形は、本文において用いられる場合、６から１４の炭素原子、たとえば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の炭素原子を有する芳香族炭化水素の、単一の、多核の、共役した、および縮合した残基を指す。かかる基の実例は、フェニル、トリル、ビフェニル、ナフチル、フェナントリルなどを含む。
【００９７】
用語「複素芳香族基」または「へテロアリール」のような変形は、本文において用いられる場合、その意味の中に、１、２、３、または4個のヘテロ原子を有する任意の５〜１６員、たとえば５−、６−、７−、８−、９−、１０−、１１−、１２−、１３−、１４−、１５−、または１６−員の、単環か、二環、または三環の芳香族基を含む。実例は、ピロリル、ピリジル、フェナントリル、キノリル、イソキノリル、イミダソリル、チオフェニル、フラニル、プリニル、インドリル、イソインドリル、フェナントリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、ベンゾフラニルなどを含むが、それに制限されない。
【００９８】
用語「ヘテロシクロアルキル基」は、本文において用いられる場合、その意味の中に、１、２、または３のヘテロ原子を有する任意の３〜１０−員の飽和または不飽和の、単環または二環系を含む。実例は、ピペリジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テチラヒドロピロリル、モルフォリニル、テトラヒドロチエニルなどを含むが、それに制限されない。
【００９９】
用語「任意に置換された」は、本文において用いられる場合、この用語が指している基が、未置換か、または、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、ニトロ、アミノ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキルから独立して選ばれる一以上の基によって置換されてよいことを意味する。
【０１００】
用語「治療上有効な量」は、その意味の中に、本発明の化合物または組成物の、非毒性の、しかし所望の治療効果を提供するべく充分な量を含むことが意図されている。化合物または組成物の正確な治療上有効な量は、動物の疾患のタイプ、動物の年齢、性別、および体重、投与の様式、および、化合物または組成物の、細胞膜を透過しかつ、鉄のような金属イオンを動物の細胞においてキレート化する能力といった因子によって変わるであろう。投与レジマ（regima）は、最適の治療応答を提供するべく調整されることが可能である。たとえば、いくつかの分割量が毎日投与されることが可能であり、あるいは用量は、治療状況の危急性によって示される通りに比例して低減されることが可能である。
【０１０１】
本文において用いられる場合、用語「治療」は、疾病の状態または症状を直すか、疾病の成立を予防するか、または、疾病または他の望ましくない症状の進行を、いかなる任意の方法においても防止するか、妨げるか、遅らせるか、逆戻りさせる、任意のおよびすべての使用を含む。
【０１０２】
略号
ＤＦＯ−  デスフェリオキサミン
ＥＤＴＡ−  エチレンジアミン四酢酸
ＭＴＴ−  ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル・テトラゾリウム］
Ｔｆ−  トランスフェリン
「３１１」−  ２−ヒドロキシ−１−ナフチルアルデヒド・イソニコチノイル・ヒドラゾン
「３１１ｍ」−  ２−ヒドロキシ−１−ナフチルアルデヒド・ニコチノイル・ヒドラゾン
ＤｐＴ−  ジ−２−ピリジルケトン３−チオセミカルバゾン
Ｄｐ２ｍＴ−  ジ−２−ピリジルケトン２−メチル−３−チオセミカルバゾン
Ｄｐ４ｍＴ−  ジ−２−ピリジルケトン４−メチル−３−チオセミカルバゾン
Ｄｐ４４ｍＴ−  ジ−２−ピリジルケトン4，4−ジメチル−３−チオセミカルバゾン
Ｄｐ４ｅＴ−  ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−３−チオセミカルバゾン
Ｄｐ４ａＴ−  ジ−２−ピリジルケトン４−アリル−３−チオセミカルバゾン
Ｄｐ４ｐＴ−  ジ−２−ピリジルケトン４−フェニル−３−チオセミカルバゾン
ＰＣＢＨ−  ２−ピリジルケトン・ベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＣＢＢＨ−  ２−ピリジルケトン３−ブロモベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＣＡＨ−  ２−ピリジルケトン４−アミノベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＣＨＨ−  ２−ピリジルケトン４−ヒドロキシベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＣＩＨ−  ２−ピリジルケトン・イソニコチノイル・ヒドラゾン
ＰＣＴＨ−  ２−ピリジルケトン２−チオフェンカルボキサルデヒド・ヒドラゾン
ＰＫＩＨ−  ジ−２−ピリジルケトン・イソニコチノイル・ヒドラゾン
ＰＫＢＨ−  ジ−２−ピリジルケトン・ベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＫＨＨ−  ジ−２−ピリジルケトン4−ヒドロキシベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＫＢＢＨ−  ジ−２−ピリジルケトン３−ブロモベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＫＡＨ−  ジ−２−ピリジルケトン４−アミノベンゾイル・ヒドラゾン
ＰＫＴＨ−  ジ−２−ピリジルケトン２−チオフェンカルボキサルデヒド・ヒドラゾン
ＰＫ４４ｐＨ−  ジ−２−ピリジルケトン４，４−ジフェニルカルボキサルデヒド・セミカルバゾン
ＰＫｏｃｔＨ−  ジ−２−ピリジルケトン・オクタノイック・ヒドラゾン
ＱＣＩＨ−  ２−キノリンカルボキサルデヒド・イソニコチノイル・ヒドラゾン
ＱＣＴＨ−  ２−キノリンカルボキサルデヒド２−チオフェンカルボキサルデヒド・ヒドラゾン
ＱＣＢＨ−  ２−キノリンカルボキサルデヒド・ベンゾイル・ヒドラゾン
ＱＣＢＢＨ−  ２−キノリンカルボキサルデヒド３−ボロモベンゾノイル・ヒドラゾン
ＱＣＡＨ−  ２−キノリンカルボキサルデヒド４−アミノベンゾノイル・ヒドラゾン
ＱＣＨＨ−  ２−キノリンカルボキサルデヒド４−ヒドロキシベンゾノイル・ヒドラゾン
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０３】
本発明は、金属イオンをキレート化することの可能な化合物に関する。特に、本発明は式１、２、３、および４：
【０１０４】
【化３１】
2006516979.tif 000016
【０１０５】
［式中、Ｅ、Ａ、Ｚ、Ｙ、Ｘ、Ｗ、Ｖ、Ｚ’、Ｙ’、Ｘ’、Ｗ’、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、およびＧは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて、前文に定義されている］の、（チオ）セミカルバゾンおよび（チオ）ヒドラゾン化合物に関する。
【０１０６】
本発明はまた、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて、または除外して、本分において定義された式１、２、３、および４の化合物の用途にも関係する。したがって、本発明は以下の式１ａ、２ａ、３ａ、および４ａ：
【０１０７】
【化３２】
2006516979.tif 000017
【０１０８】
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
Ａは、
【０１０９】
【化３３】
2006516979.tif 000018
【０１１０】
であって、Ｚ’、Ｙ’、Ｘ’、およびＷ’は、独立してＣＲ４、ＮＲ８、Ｓ、およびＯから選ばれ、Ａにおけるヘテロ原子の総数は１、２、または３であり、
ｍは０または１であり、
Ｂは、
【０１１１】
【化３４】
2006516979.tif 000019
【０１１２】
であって、Ｚ、Ｙ、Ｘ、およびＷは、独立してＣＲ４、ＮＲ８、Ｓ、およびＯから選ばれ；かつＢにおけるヘテロ原子の総数は０、１、２、または３であり；
ｑは０または１であり；
各Ｒ４は、独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ；
各Ｒ８は、独立して水素、ハロゲン、アルキル、アルケニル、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、ベンジル、ベンジルカルバメートから選ばれ；
Ｒ’は水素、または金属イオンキレート化を妨害しない基であり；
−ＧはＮＲ２Ｒ３またはＣＲ２Ｒ３Ｒ５であって、
ＣとＲ５の間の結合は単結合、二重結合、または三重結合でよく；ＣとＲ５の間の結合が二重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の一方がなく、ＣとＲ５の間の結合が三重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の双方がなく；
Ｒ５は水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基からなる群より選ばれ；
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基から選ばれ；
あるいは−Ｇは、任意に置換された複素芳香族基、任意に置換された二環基、任意に置換された芳香族基、任意に置換されたアルキル基；任意に置換されたシクロアルキル基、または任意に置換されたヘテロシクロアルキル基であり］；
【０１１３】
【化３５】
2006516979.tif 000020
【０１１４】
［式中、
Ａは：
【０１１５】
【化３６】
2006516979.tif 000021
【０１１６】
から選ばれ、各Ｒ４は、独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ；
nは０、１、２、３、または４であり；さらに
Ｂ、Ｅ、およびＧは式１ａについて定義された通りであり］；
【０１１７】
【化３７】
2006516979.tif 000022
【０１１８】
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
nは０、１、２、３、または４であり、
ｐは０，１、２、３、または４であり、さらに
各Ｒ４は、独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
さらに、−Ｇは式１ａについて定義された通りであり］；および
【０１１９】
【化３８】
2006516979.tif 000023
【０１２０】
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；かつ
−Ｇは式１ａについて定義された通りである］の化合物の用途を含む。
【０１２１】
したがって、「条件（i）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない式１、２、３、および／または４の化合物」、および「条件（i）および（ｉｉ）を含むかまたは除外した式１、２、３、および／または４の化合物」という表現は、式１、２、３、および４、ならびに式１ａ、２ａ、３ａ、および４ａの化合物を含むことと理解されるべきである。
【０１２２】
本文において用いられる場合、総称「（チオ）セミカルバゾン」はその範囲の中に、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、およびそれらの誘導体または関連する類似体を含む。同様に、本文において用いられる場合、総称「（チオ）ヒドラゾン」はその範囲の中に、ヒドラゾン、チオヒドラゾン、およびそれらの誘導体または関連する類似体を含む。
【０１２３】
式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａに関して、ＥがＯである場合には、化合物は時に本文において「ＰＫＩＨ類似体」または「ＰＫＩＨシリーズ」と呼ばれ、ＥがＳである場合には、化合物は時に本文において「ＤｐＴ類似体」または「ＤｐＴシリーズ」と呼ばれる。
【０１２４】
式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物は、金属イオンをキレートして金属イオン錯体を形成してよい。式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物と金属イオン錯体を形成することの可能な金属イオンの実例は、たとえば、鉄、銅、亜鉛、パラジウム、白金、およびガリウムイオンといった遷移金属イオンを含む。一つの態様においては、金属イオンは鉄（ＩＩＩ）である。もう一つの態様においては、金属イオンは鉄（ＩＩ）である。さらなる態様においては、金属イオンは亜鉛（ＩＩ）である。
【０１２５】
本発明はまた、条件（ｉ）および（ｉｉ）を用いるかまたは含めて本文において定義された式１、２、３、および／または４の少なくとも一つの化合物、および／または各々の前記化合物の金属イオン錯体を含む製薬製剤を包含する。本発明はまた、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含むかまたは除外して本文において定義された式１、２、３、および４の化合物か、またはかかる化合物および／またはそれらの金属イオン錯体を含む組成物の治療的使用に関係する。
【０１２６】
式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物は、（チオ）セミカルバゾンまたは（チオ）ヒドラゾン骨格を含む。基ＡおよびＢの少なくとも一つは、金属イオンのキレート化に関係することが可能なヘテロ原子を含む。一つの態様においては、式１、２、３、および４の化合物は、三座配位子として機能する。一つの態様においては、ＡおよびＢの少なくとも一つは、２−ピリジル基であり、ピリジル基の窒素、イミノ基（Ｃ＝Ｎ）の窒素、およびカルボニル（Ｃ＝Ｏ）またはチオカルボニル（Ｃ＝Ｓ）基は、各々適当な金属イオンと配位結合するための配位原子として役立つ。当業者は、ＡおよびＢが同じでない場合、Ｃ＝Ｎの二重結合についてシス／トランス立体異性化があってよい。したがって、一つの態様においては、ＡおよびＢが同じではない任意に置換された複素芳香環である場合、式１の化合物は、 シス／トランス立体化学に依存して、環Ａまたは環Ｂのヘテロ原子を通して、金属イオン錯体を形成することができてよい。このことは、以下に図式的に説明されており、これにおいてMは適当な金属イオンである：
【０１２７】
【化３９】
2006516979.tif 000024
【０１２８】
式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物は、三座配位子として機能してよく、二つの化合物は適当な金属イオン、たとえば、八面体型錯体を形成することが可能な金属イオンと六配位金属イオン錯体を形成してよい。
【０１２９】
式１、２、３、および４の化合物を合成するための適当な方法は、当業者に周知であり、いくつかは、たとえば、マーチ（J. March）著、「アドバンスド・オーガニック・ケミストリー（Advanced Organic Chemistry）」第4版（ジョン・ウィリー＆サンズ（John Wiley & Sons）、ニューヨーク、１９９２年）；および「フォーゲルズ・テキストブック・オブ・プラクティカル・オーガニック・ケミストリー（Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry）」第５版（ジョン・ウィリー＆サンズ、ニューヨーク、１９８９年）に記述されている。
【０１３０】
本発明の式１、２、３、および４の化合物は、シッフ塩基縮合反応によって調製されてよく、それにおいてケトンまたはアルデヒドは、酸ヒドラジドまたは酸チオセミカルバジドのいずれか一方と縮合され、所望の置換パターンを有する式１、２、３、または４の、対応する（チオ）セミカルバゾンまたは（チオ）ヒドラゾン化合物を生成する。
【０１３１】
（チオ）セミカルバゾンおよび（チオ）ヒドラゾン化合物の適当な合成法は、たとえば、バッキ（Bacchi）ら（１９９６年）により記述されている。式１、２、３、および４のＰＫＩＨ類似体を調製するための一般的な合成経路の典型的な実例は、以下の反応機構に代表される：
【０１３２】
【化４０】
2006516979.tif 000025
【０１３３】
式４のＰＫＩＨ類似体の調製のための合成経路の実例は、化合物ＰＫ４４ｐＨおよびＰＫｏｃｔＨについて以下に例示される：
【０１３４】
【化４１】
2006516979.tif 000026
【０１３５】
ＤｐＴを調製するための適当な方法は、ジョンソン（Johnson）ら（１９８２年）によって記述されている。本文において定義された式１、２、３、および４のＤｐＴ類似体を調製するための一般的な合成経路の実例は、以下の一般的な反応機構に代表される：
【０１３６】
【化４２】
2006516979.tif 000027
【０１３７】
本文において定義された式４のＤｐＴ類似体を調製するための合成経路の実例は、以下にＤｐ４ｅＴおよびＤｐ４ａＴについて例示される：
【０１３８】
【化４３】
2006516979.tif 000028
【０１３９】
前文に示された縮合反応は、当業者に周知の条件下に行なわれてよい。たとえば、適当な溶媒系はエタノール、メタノール、エタノール／水、メタノール／水、または他のアセトン、ベンゼン、トルエンといった一般的な有機溶媒を含む。式１、２、３、および４の化合物は、適当な溶媒からの再結晶化およびカラムクロマトグラフィーを含めた、標準的な技術を用いて精製されてよい。
【０１４０】
別の合成においては、チオセミカルバゾンおよびチオヒドラゾンは、対応するセミカルバゾンおよびヒドラゾン化合物から、丁重に、当業者に周知の方法を用いて調製されてよい。たとえばＣ＝Ｏ基は、標準的な条件下に、ロウェッソン（Lawesson）の試薬を用いてＣ＝Ｓ基へ転換されてよい。たとえば、式１、２、３、または４のセミカルバゾンまたはヒドラゾン化合物は、トルエンまたはベンゼンといった適当な溶媒中で、ロウェッソン（Lawesson）の試薬とともに灌流下で加熱されてよく、対応するチオ−化合物を産生する。式４の化合物の調製は、以下の一般式に例示される：
【０１４１】
【化４４】
2006516979.tif 000029
【０１４２】
当業者には、本発明に従って化合物を合成する工程において、必要に応じ、あるいは適宜、保護基が用いられることが可能であることが理解されよう。適当な保護基は、当業者には周知である。たとえば、一般的なＮ−保護基は、t−ブチルカルバメートおよびベンジルカルバメートといった、ベンジルおよびカルバメートを含む。保護基は、グリーン＆ウーツ（Theodora W. Greene & Peter G. M. Wuts）共著、「プロテクティブ・グループ・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）」第２版、ジョン・ウィリー＆サンズ、インク（１９９１年）に記述されており、その内容は参考文献として本文に取入れられている。
【０１４３】
本発明による使用に適した（チオ）セミカルバゾンおよび（チオ）ヒドラゾン誘導体の実例は、以下を含む：ジ−２−ピリジルケトン・イソニコチノイル・ヒドラゾン
（「ＰＫＩＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン・ベンゾイル・ヒドラゾン（「ＰＫＢＨ」）；
ジ−２−ピリジルケトン4−ヒドロキシベンゾイル・ヒドラゾン（「ＰＫＨＨ」）；
ジ−２−ピリジルケトン３−ブロモベンゾイル・ヒドラゾン（「ＰＢＢＨ」）；２−ピリジルケトン４−アミノベンゾイル・ヒドラゾン（「ＰＫＡＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン２−チオフェンカルボキサルデヒド・ヒドラゾン（「ＰＫＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン４，４−ジフェニルカルボキサルデヒド・セミカルバゾン（「ＰＫ４４ｐＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン・オクタノイック・ヒドラゾン（「ＰＫｏｃｔＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン４−メチル−３−チオセミカルバゾン（「Ｄｐ４ｍＴ」）；ジ−２−ピリジルケトン２−4，4−ジメチル−３−チオセミカルバゾン（「Ｄｐ４４ｍＴ」）；ジ−２−ピリジルケトン４−エチル−３−チオセミカルバゾン（「Ｄｐ４ｅＴ」）；ジ−２−ピリジルケトン４−アリル−３−チオセミカルバゾン（「Ｄｐ４ａＴ」）；ジ−２−ピリジルケトン４−フェニル−３−チオセミカルバゾン（「Ｄｐ４ｐＴ」）。
【０１４４】
また、構造的にはＰＫＩＨ類似体に相当するが、Ｃ＝Ｏの代わりにＣ＝Ｓを有するチオヒドラゾン類似体も本文において開示される。かかる化合物は、ジ−２−ピリジルケトン・イソニコチノイル・チオヒドラゾン（「ＰＫＩＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン・ベンゾイル・チオヒドラゾン（「ＰＫＢＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン4−ヒドロキシベンゾイル・チオヒドラゾン（「ＰＫＨＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン３−ブロモベンゾイル・チオヒドラゾン（「ＰＢＢＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン4−アミノベンゾイル・チオヒドラゾン（「ＰＫＡＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン２−チオフェンカルボキサルデヒド・チオヒドラゾン（「ＰＫＴＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン4，４−ジフェニルカルボキサルデヒド・チオセミカルバゾン（「ＰＫ４４ｐＴＨ」）；ジ−２−ピリジルケトン・オクタノイック・チオヒドラゾン（「ＰＫｏｃｔＴＨ」）を含む。
【０１４５】
本発明による鉄錯体は、Ｆｅ［ＰＫＩＨ］２、Ｆｅ［ＰＫＢＨ］２、Ｆｅ［ＰＫＨＨ］２、Ｆｅ［ＰＢＢＨ］２、Ｆｅ［ＰＫＡＨ］２、Ｆｅ［ＰＫＴＨ］２、Ｆｅ［ＰＫ４４ｐＨ］２、Ｆｅ［ＰＫｏｃｔＨ］２、Ｆｅ［Ｄｐ４ｍＴ］２、Ｆｅ［Ｄｐ４４ｍＴ］２、Ｆｅ［Ｄｐ４ｅＴ］２、Ｆｅ［Ｄｐ４ａＴ］２、およびＦｅ［Ｄｐ４ｐＴ］２を含む。鉄イオンはＦｅ（ＩＩ）またはＦｅ（ＩＩＩ）でよい。
【０１４６】
本発明の式１、２、３、および４のＰＫＩＨおよびＤｐＴ類似体の金属イオン錯体は、当業者に周知の技術および試薬を用いて容易に調製されてよい。たとえば、適当な金属イオン塩は、金属ハロゲン化物、硝酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、酢酸塩、およびトリフラートを含むが、それに制限されない。鉄錯体の形成に適した鉄塩、ＦｅＣｌ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、Ｆｅ（ＯＡｃ）３、およびＦｅ（ＣｌＯ４）３３を含むが、それに制限されない。
【０１４７】
式１の定義においては、基Ｒ’は「水素または、化合物が金属イオンをキレート化するのを妨げない基」として定義される。Ｒ’がメチルである場合、Ｆｅキレート化は妨害される。
【０１４８】
式１、２、３、および４の化合物の１−位における二つの有機基の存在（すなわち、芳香族および／または複素芳香族基ＡおよびＢ）は、その位置に二つのかかる基のない化合物に比較して、一般に化合物の親油性を増大する。式１、２、３、および４のＰＫＩＨ、およびＤｐＴ類似体は、細胞膜を透過することが可能であってよい。
【０１４９】
ＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ（図１Ｃ）、ＰＫＩＨ、およびＤｐＴシリーズの化合物の構造活性連関は、このような種類の化合物がたとえ類似した金属結合部位を有するように見えても、個々の種類の親油性、金属イオンキレート化効力、および抗増殖活性は、実質的に異なってよいことを示している。
【０１５０】
本発明による式１、２、３、および４の（チオ）セミカルバゾンおよび（チオ）ヒドラゾン化合物は、金属イオン錯体を形成することの可能な三座配位子として機能してよい。鉄錯体の一般的な実例は、以下に式１の化合物について表される。
【０１５１】
【化４５】
2006516979.tif 000030
【０１５２】
［式中、ＥはＯまたはＳである］。
【０１５３】
さらなる実例として、配位子ＰＫＡＨの鉄錯体は、以下に例示される。
【０１５４】
【化４６】
2006516979.tif 000031
【０１５５】
また、配位子Ｄｐ４ｍＴの鉄錯体は、以下に例示される。
【０１５６】
【化４７】
2006516979.tif 000032
【０１５７】
本発明によれば、ＤｐＴまたはＰＫＩＨ配位子の鉄イオン錯体は、中性かまたは荷電してもよい。
【０１５８】
また本文においては、抗増殖性化合物を同定するためのプロセスであって、一以上の細胞周期阻害剤をコードしている遺伝子を有する細胞または細胞抽出物を、鉄をキレート化することの可能な化合物で暴露すること（たとえば、接触させること、またはインキュベートすること）、遺伝子の発現レベルを測定すること、前記化合物の不在下での遺伝子の発現に比較して、遺伝子の発現レベルが異なるかどうかを測定すること；および、それにより前記化合物が抗増殖活性を有するかどうかを測定すること、を含むプロセスが開示される。
【０１５９】
同様のプロセスは、一以上の抗増殖性化合物を同定するべく多数の化合物を査定するために使用されてよく、該プロセスは、一以上の細胞周期阻害剤をコードしている遺伝子を有する細胞または細胞抽出物を、鉄をキレート化することの可能な多数の化合物で暴露すること（たとえば、接触させること、インキュベートすること）、任意の前記化合物が前記遺伝子の発現レベルを修飾するかどうかを測定すること、および、もしそうであれば、前記遺伝子の発現レベルを各化合物について別々に測定すること、前記発現レベルを、各々の前記化合物の不在下での前記遺伝子の発現レベルと比較して異なるかどうかを測定すること；および、それにより各々の前記化合物が抗増殖活性を有するかどうかを測定することを含む。
【０１６０】
遺伝子は、細胞の鉄濃度に感受性であってよい。遺伝子の発現は、Ｆｅの枯渇に反応してアップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされてよい。遺伝子の実例は、ＷＡＦ１、ＧＡＤＤ４５、およびＮｄｒｇ１を含む。化合物の不在下における遺伝子の発現（たとえばｍＲＮＡ、タンパク質）は、該化合物の存在下における該遺伝子の発現の測定の前または後に、別個に測定されてよい。
（細胞機能の修飾）
【０１６１】
細胞の鉄をキレート化することが可能な化合物は、細胞機能を、たとえば酵素阻害、遺伝子発現の修飾（アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを含めて）、翻訳の阻害（たとえば、ｐ２１を含めたタンパク質の）、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生などを介して修飾することが可能であり、細胞増殖を阻害するため、および／またはアポトーシスを誘導するため、治療上有用であってよい。たとえば、細胞の鉄の枯渇は、リボヌクレオチド還元酵素のような、鉄依存性酵素の活性を修飾してよい。鉄の奪取はまた、Ｇ１−Ｓ細胞停止およびアポトーシスも誘導することが可能である。
【０１６２】
遺伝子ＷＡＦ１およびＧＡＤＤ４５は、Ｇ１−Ｓ停止に必須の細胞周期阻害剤（ｐ２１ＣＩＰ１／ＷＡＦ１のようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含めて）をコードする３０。このような遺伝子の、たとえば鉄枯渇を介したアップレギュレーションは、細胞周期停止を誘導してよい。遺伝子Ｎｄｒｇ１（Ｎ−ｍｙｃのダウンレギュレートされた遺伝子１）は、細胞の鉄濃度に感受性である。たとえば、細胞の鉄枯渇に反応したＮｄｒｇ１の過剰発現は、
結果としてＧ１−Ｓ細胞停止を生じてよい。Ｎｄｒｇ１の過剰発現はまた、腫瘍細胞の増殖を遅らせ、腫瘍細胞の転移を阻害することが示されている４−７。
【０１６３】
本発明による式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物は、鉄イオンを含め、細胞の金属イオンをキレート化することが可能である。したがって、式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物は、リボヌクレオチド還元酵素の阻害により、ＤＮＡ合成を阻害することが可能であってよい。リボヌクレオチド還元酵素は、ＤＮＡ合成の律速段階であり、新生細胞では正常細胞に比較してより高いレベルで発現される。式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物はまた、結果としてＷＡＦ１、ＧＡＤＤ４５、およびＮｄｒｇ１のような、Ｆｅ感受性遺伝子の過剰発現を生じてよく、それゆえ細胞増殖を阻害するために有用であってよい。ＷＡＦ１、ＧＡＤＤ４５、およびＮｄｒｇ１のようなＦｅ感受性遺伝子の過剰発現は、ｍＲＮＡレベルで起きてよい。ＷＡＦ１、ＧＡＤＤ４５、およびＮｄｒｇ１の発現をモニタリングすることは、Ｆｅを含めた金属イオンをキレート化する化合物の抗増殖ポテンシャルについて、有用な指標を提供してよい。
【０１６４】
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、細胞のターンオーバーにおいて不可欠な役割を果たす。アポトーシスは、細胞の鉄枯渇に反応して誘導されることが可能である。カスパーゼ酵素は、アポトーシスの共通した実行者である８、９。アポトーシスを調節する二つのカスパーゼ活性化カスケードが記述されており、その一つは死受容体（たとえば、ＣＤ９５）を通して開始されるのに対し、他はミトコンドリアの完全性における変化によってトリガーされる８、１０。前者においては、死受容体がそのリガンド（たとえば、ＣＤ９５）によってふさがれることが、死を誘導するシグナリング複合体の形成をもたらす８。活性化された死受容体はカスバーゼ８を補充および活性化し、そのことがカスパーゼ３を含めた「実行者」カスパーゼを起動する。ミトコンドリア依存性のアポトーシスにおいては、ホロ−チトクロームｃ（ｈ−ｃｙｔｃ）のサイトゾルへの放出が、結果として、ｈ−ｃｙｔｃ、Ａｐａｆ−１、およびプロ−カスパーゼ−９を含有する「アポトソーム」の形成を生じる８、９。アポトソームにおいては、プロセス−カスパーゼ−９は活性化されるようになり、実行者カスパーゼをトリガーし、そのことが、死受容体経路によって誘導されるものと重複する末端事象を開始する８、９。アポトーシスのミトコンドリア経路の主要なモジュレーターは、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ遺伝子ファミリーを含む８、１１、１２。Ｂｃｌ−２群のタンパク質は、ミトコンドリア外膜にいおいて見出され、その安定性に役割を果たしている８、１１。対照的に、Ｂａｘタンパク質はサイトゾルの分子であり、アポトーシスシグナルを受取るとミトコンドリアへ移動し、そこでそれらは膜透過性遷移孔に結合する８、１２。Ｂｃｌ−２およびＢａｘの不均衡は選択的なイオン透過性の喪失を誘導し、結果としてｈ−ｃｙｔｃの放出を生じ、そのことがアポトーシスの原因となるカスパーゼカスケードを開始する８、１２。式１、２、３、および４の化合物による、鉄およびおそらくは亜鉛といった細胞の金属イオンのキレート化は、カスパーゼカスケードを開始してよく、アポトーシスを誘導する。
【０１６５】
細胞の鉄の枯渇を含め、細胞の金属イオンの枯渇は、アポトーシスをもたらしてよい。アポトーシスはまた、ミトコンドリアからのｈ−ｃｙｔｃの放出およびＢｃｌ−２／Ｂａｘ発現の不均衡をもたらすことが可能な酸化ストレスに応答して誘導されてもよい。式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物の、Ｆｅ錯体を含めた金属イオン錯体は、活性酸素種の発生を介してアポトーシスを誘導することができてよい。したがって、式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物、ならびに式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物の金属イオン錯体（鉄錯体を含めて）は、たとえば抗腫瘍剤として、治療上有用であってよい。
（疾病の治療および／または予防）
【０１６６】
本文において開示された式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａのＤｐＴおよびＰＫＩＨ化合物は、脊椎動物における種々の障害および疾患の治療において有用であってよい。障害および疾患の実例は、以下を含む幅広いカテゴリーに分類されてよい：血管新生依存性疾患、細胞増殖性疾患（乾癬、ＩＢＤ、悪性疾患、再狭窄のような）、癌。
【０１６７】
癌は、癌性腫瘍および、結腸−直腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部腫瘍、肝癌、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、脳腫瘍、膀胱癌、前立腺癌、および、尿／生殖管癌といった上皮起源の腫瘍；肉腫のような間葉性腫瘍；およびＢ細胞リンパ腫のような造血性腫瘍を含むが、それに制限されない。たとえば、癌は血液学的腫瘍、固形腫瘍、非固形腫瘍、（たとえば、白血病、リンパ腫）でよい。
【０１６８】
本文において開示された式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａのＤｐＴおよびＰＫＩＨ類似体は、化学療法および放射線療法を含め、外科手術および／または治療薬といった、他の既知の治療と併用して用いられてよい。たとえば、固形腫瘍の治療において使用される場合、本発明の化合物は：アドリアマイシン、タキソール、フルオロウリシル（fluorouricil）、メルファラン、シスプラチン、アルファ−インタフェロン、ＣＯＭＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびプレジニソン）、エトポシド、ｍＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドクソルビシン、ソクロホスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメサタン）ＰＲＯＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プレドニソン、メトトレキサート（ｗ／リューコビン・レスキュー（leucovin rescue））、ドクソルビシン、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニソン、およびプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ポリ硫酸ペントサン、血小板因子４、アンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン（Techgalan）、サリドマイド、ＳＰ−ＰＧなどのような化学治療薬とともに投与されてよい。
他の化学療法薬は、メクロエタミン（mechloethamine）、メルファン、クロランブシル、シクロホスファミド、およびイフォスファミドを含めたナイトロジェンマスタード；カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、およびストレプトゾシンを含めたニトロソウレア；ブサルファンを含めたアルキルスルホネート；ダカルバジンを含めたトリアジン；チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含めたエチエニミン（ethyenimine）；メトトレキサートを含めた葉酸類似体；５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含めたピリジジン類似体；６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニンを含めたプリン類似体；アクチノマイシンＤを含めた抗腫瘍抗生物質；ドクソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、およびミトラマイシンを含めたアンスラサイクリン；タモキシフェン、およびコルチコステロイドを含めたホルモンおよびホルモン類似体、および、シスプラチンおよびブレキナー(brequinar)を含めたその他の薬剤といった、アルキル化剤を含む。
【０１６９】
本発明によって治療されるべき生理的系（たとえば、肝臓系、膵臓系）は、式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの一以上の化合物の投与に先立ち、外科手術によるかまたはその間に単離されてよい。
（製薬および／または治療用の製剤）
【０１７０】
本発明によれば、疾病の治療に使用される場合、式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物は単独で投与されてよい。別法として、化合物は、式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの少なくとも一つの化合物、および／またはその金属イオン錯体を含む製薬製剤として投与されてよい。式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物はまた、製薬上許容される塩として存在してもよい。
【０１７１】
製薬上許容される塩により、確実に根拠のある医学的判断の範囲内において、不適当な毒性、刺激、アレルギー反応などなしに、ヒトおよび、より下等な動物の組織と接触した使用に適しており、かつ妥当な損益比にふさわしい塩が意味される。製薬上許容される塩は、この技術において周知である。
【０１７２】
たとえば、本発明によるＰＫＩＨおよびＤｐＴ類似体の、適当な製薬上許容される塩は、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、炭酸、酒石酸、またはクエン酸といった製薬上許容される酸を、本発明の化合物と混合することにより調製されてよい。適当な製薬上許容される本発明の化合物の塩は、それゆえ酸付加塩を含む。
【０１７３】
たとえば、ベルジェ（S. M. Berge）らは、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンセズ（J. Pharmaceutical Sciences）、１９７７年、第６６巻、ｐ．１−１９において、製薬上許容される塩を詳細に記述している。塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にインシトゥにおいて、または遊離の塩基性官能基を適当な有機酸と反応させることにより別個に調製されることが可能である。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、りんご酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム  カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがそれに制限されない非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンを含む。
【０１７４】
便利な投与様式は、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸内適用を含む。投与の経路に依存して、酵素の作用、酸、および他の、類似体の治療活性を不活性化する天然の条件から類似体を保護するべく、類似体は物質でコートされてよい。化合物はまた、非経口的に、または腹腔内へ投与されてもよい。
【０１７５】
式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａの化合物の分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中に、および油中に調製されてよい。通常の貯蔵および使用の条件下では、製薬組成物は、微生物の増殖を防止するべく保存料を含有してよい。
【０１７６】
注射に適した製薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調合製剤のための無菌粉末を含む。理想的には、組成物は製造および貯蔵の条件下に安定していて、細菌および真菌類のような微生物の汚染作用に対して組成物を安定化するべく、保存料を含有してもよい。
【０１７７】
好ましい態様においては、化合物は、たとえば不活性な希釈剤か、または同化可能な食用の担体とともに経口投与される。化合物および他の成分はまた、ハードまたはソフトシェルのゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、または個人の食事へ直接取込まれてもよい。経口の治療用投与には、類似体は賦形剤とともに取込まれてよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形状で使用される。適切には、かかる組成物および製剤は少なくとも１重量％の活性化合物を含有してよい。製薬組成物および製剤中の、式１、１ａ、２、２ａ、３、３ａ、４、および４ａのＰＫＩＨまたはＤｐＴ類似体のパーセントは、もちろん変更されることが可能であり、たとえば、単位用量の重量の約２％から約９０％まで、約５％から約８０％まで、約１０％から約７５％まで、約１５％から約６５％まで；約２０％から約６０％まで、約２５％から約５０％まで、約３０％から約４５％まで、または約３５％から約４５％まで、便利に変動することが可能である。治療上有用な組成物中の類似体の量は、適当な容量が得られるようにする。
【０１７８】
用語「製薬上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤抗菌および抗真菌剤、等張、および吸収遅延剤などを含むことが意図される。製薬上の作用物質のための、かかる媒体および薬剤は、この技術において周知である。任意の通常の媒体または薬剤が類似体と不適合である場合を除いて、治療用組成物および治療法においてそれらを使用することが検討される。本発明によると補助的な活性化合物が組成物に組み込まれていてもよい。用量単位の非経口組成物を、投与しやすさおよび用量の均一性のため、用量単位の形状に製剤することは特に有利である。本文において使用される用量単位の形状は、治療されるべき固体のための単一の用量として適した、物理的に別個化された単位を指し；あらかじめ決められた量の類似体を含有する各単位は、必要な薬剤担体と共同して所望の治療効果を生じるべく計算される。本発明の新規な用量単位の形状についての表示（指定、仕様、規格、明確化）は、（ａ）類似体の特有の性質および特に達成されるべき治療効果、および（ｂ）かかる類似体を、固体における増殖性疾患、鉄関連性の症状、または鉄過剰症の治療のために調剤する技術における固有の限界に、規定されかつ直接的に依存する。主要な類似体は、許容される用量単位において、適当な製薬上許容される担体とともに有効な量で、便利で効果的な投与のために調剤される。補助的に活性をもつ成分を含有する組成物の場合には、用量は、前記成分の通常の用量および投与の方式を参照することにより決定される。
【０１７９】
一つの態様においては、担体は経口投与可能な担体である。もう一つの態様においては、担体は静脈内投与に適している。
【０１８０】
製薬組成物の一つの適当な形状は、経口投与に適した腸溶性の顆粒、錠剤、またはカプセルとして製剤された用量形状である。
【０１８１】
注射可能な溶液の場合には、担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適当な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒であることが可能である。適切な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒子サイズに維持により、および界面活性剤の使用により、維持されることが可能である。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および／または抗真菌剤を含有することで達成されることが可能である。適当な薬剤は、当業者には周知であり、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、チメロサールなどを含む。多くの場合、等張剤、たとえば、糖や、マンニトール、ソルビトールといったポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含有することが好ましいかもしれない。注射可能な組成物の持続性の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを、組成物中に含めることによりもたらされることが可能である。
【０１８２】
無菌の注射可能な溶液は、濾過による滅菌の後、必要であれば前文に列挙された成分の一つまたは組み合せとともに、必要な量の類似体を、適当な溶媒中に取込むことによって調製されることが可能である。一般に分散液は、基本的な分散媒と、前文に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する無菌の媒体中へ取込むことにより調製される。
【０１８３】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどはまた、以下のものを含有することが可能である：グラガカント（gragacanth）ガム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスター、バレイショデンプン、アルギン酸などといった崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味料、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリーフレーバーのような着香料。容量単位の形状がカプセルである場合、上記のタイプの物質に加えて、液体担体を含むことが可能である。様々な他の物質が、コーティングとして、あるいは容量単位の物理的形状を他の状態に修飾するべく、存在することが可能である。たとえば、錠剤、丸薬、またはカプセルは、シェラック、糖、または双方でコートされることが可能である。シロップまたはエリキシルは、類似体、甘味料としてのスクロース、保存料としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーのような色素および香料を含むことが可能である。もちろん、任意の用量単位の形状の調製において使用される任意の物質は、製薬上純粋かつ使用される量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、式１、２、３、および４の化合物は、徐放性製剤および配合物へ取込まれてよい。
【０１８４】
製薬組成物はさらに、酸加水分解を最少化するべく、適当な緩衝剤を含有してよい。適当な緩衝剤は当業者には周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、およびそれらの混合物を含むが、それに制限されない。
【０１８５】
本発明による製薬組成物の、単回または多回の投与が行なわれてよい。当業者は、日常の実験により、本発明の化合物および／または組成物の効果的な非毒性の用量レベルと、化合物および組成物がそれに対して適用可能な、障害および疾患の治療に適するような投与パターンとを測定することができるであろう。
【０１８６】
さらに、当業者には、定められた日数について、一日当たりに与えられる本発明の化合物または組成物の用量数といった最適な治療コースが、通常の治療決定試験のコースを用いて確認されることが可能であることが明らかであろう。
【０１８７】
一般に、２４時間当たりの効果的な用量は、ｋｇ体重当たり約０．０００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ；適切には、ｋｇ体重当たり約０．００１ｍｇ〜約７５０ｍｇ；ｋｇ体重当たり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ；ｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ；ｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ；またはｋｇ体重当たり約１．０ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲内でよい。さらに適切には、２４時間当たりの効果的な用量は、ｋｇ体重当たり約１．０ｍｇ〜約２００ｍｇ；ｋｇ体重当たり約１．０ｍｇ〜約１００ｍｇ；ｋｇ体重当たり約１．０ｍｇ〜約５０ｍｇ；ｋｇ体重当たり約１．０ｍｇ〜約２５ｍｇ；ｋｇ体重当たり約５．０ｍｇ〜約５０ｍｇ；ｋｇ体重当たり約５．０ｍｇ〜約２０ｍｇ；またはｋｇ体重当たり約５．０ｍｇ〜約１５ｍｇの範囲内でよい。
【０１８８】
別法として、効果的な用量は約５００ｍｇ／ｍ２まででよい。一般に、効果的な用量は、約２５〜約５００ｍｇ／ｍ２、約２５〜約３５０ｍｇ／ｍ２、約２５〜約３００ｍｇ／ｍ２、約２５〜約２５０ｍｇ／ｍ２、約５０〜約２５０ｍｇ／ｍ２、または約７５〜約１５０ｍｇ／ｍ２の範囲内でよい。
【０１８９】
単なる例として、本発明の適当な容量形状は、以下のものを含む：
【０１９０】
【表１】
2006516979.tif 000033
【０１９１】
当業者には、幅広く記述された本発明の精神または範囲からはずれることなく、特定の態様において示された本発明に対し、多くの変形および／または修飾がなされてよいことが認識されるであろう。本態様は、それゆえ、すべての点において例証的なものであり、制限的なものではないと見なされるべきである。
【０１９２】
本発明は次に、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない具体的な実施例を参照して、さらに詳細に記述される。
【実施例】
【０１９３】
実施例１−化合物の合成
本文において「ＰＣＩＨ」および「ＱＣＩＨ」類似体と呼ばれる比較用の２−ピリジル−およびキノリル−アロイルヒドラゾン類似体は、各々、２−ピリジルカルボキサルデヒドまたは２−キノリンカルボキサルデヒドと、適当な酸ヒドラジンとのシッフ塩基縮合により合成された。
【０１９４】
比較化合物、ピリドキサール・イソニコチノイル・ヒドラゾン（ＰＩＨ）および２−ヒドロキシ−１−ナフチルアルデヒド・イソニコチノイル・ヒドラゾン（３１１）は、リチャードソン＆バーンハート（Richardson & Bernhardt）（１９９３年）の方法により合成された３。
【０１９５】
ＰＣＩＨ、ＱＣＩＨアロイルヒドラゾンシリーズの化合物、および「３１１」の代表的な構造は、図１Ｂおよび１Ｃに提供されている。
【０１９６】
（実施例１ａ−ＰＫＩＨ類似体の合成）
代表的なＰＫＩＨ類似体は、バッキ（Bacchi）ら（１９９６）の方法に従って、２−ジ−ピリジルケトンを適当な酸ヒドラジンと縮合することにより合成された13。適当な溶媒は、エタノール、メタノール、エタノール／水、メタノール／水、アセトン、ベンゼン、トルエンを含む。代表的なＰＫＩＨ類似体は、図２Ｂに示されている。
【０１９７】
ＰＫＡＨのＸ線結晶構造は、図９に提供されている。Ｘ線結晶学的データは、以下に提供される。
結晶データコレクション：
ＣＡＤ−４ソフトウエア（エンラフ−ノニウス（Enraf - Nonius）、１９８９年）；セルリファインメント：ＣＡＤ−４ソフトウエアのＳＥＴ４；データリダクション：Ｘｔａｌ（ホール（Hall）ら、１９９２年）；構造解明に使用されたプログラム：ＳＨＥＬＸ８６（シェルドリック（Sheldrick）、１９９０年）；構造精密化に使用されたプログラム：ＳＨＥＬＸＬ９７（シェルドリック、１９９７年）；分子グラフィック：ＰＬＡＴＯＮ（スペック（Spek）、１９９０年；結晶学的データを生み出すために使用されたソフトウエア：ＳＨＥＬＸＬ９７。
【０１９８】
データコレクションは、リチャードソン、ベッカー、およびバーンハート（D. R. Richardson, E. Becker and P. V. Bernhardt）（１９９９年）によって記述されたものと同様の一般条件下に得られた。
【０１９９】
結晶データおよび構造決定の詳細：ＰＫＡＨ（Ｃ１８Ｈ１６Ｎ５Ｏ）Ｐ−１（２）Ｚ＝２
結晶データ
実験式：    Ｃ１８Ｈ１６Ｎ５Ｏ，Ｏ
式量 ３３４．３６
結晶系      三斜晶系
空間群      Ｐ−１  （Ｎｏ．２）
ａ，ｂ，ｃ［オングストローム］  ８．６６７（２）  ９．９７７（２）  １１．１９７（２）
アルファ、ベータ、ガンマ［度］９１．０１０（１０）  １０９．２０（２）  １０９．６３（２）
Ｖ［Ａｎｇ＊＊３］ ８５２．２（３）
Ｚ   ２
Ｄ（ｃａｌｃ）［ｇ／ｃｍ＊＊３］ １．３０３
Ｆ（０００）３５０
Ｍｕ（ＭｏＫａ）［／ｍｍ］０．１
ＰＫａＨ（Ｃ１８Ｈ１６Ｎ５Ｏ）Ｐ−１（２）Ｚ＝２についての最終的な構造因子の計算
１．ｓ．パラメータ総数＝２４０  最大ベクトル長＝５１１ 必要メモリ＝２３８０／２２９９５
ｗＲ２＝０．１７６７  サイクル２１前の２９８５データおよび０／２４０パラメータについて
ＧｏｏＦ＝Ｓ＝０．９８７；制止ＧｏｏＦ＝０．９８７  ０制止について
重量＝１／［シグマ＾２（Ｆｏ＾２）＋（０．１０００＊Ｐ）＾２＋０．００＊Ｐ］式中、
Ｐ＝（最大（Ｆｏ＾２，０）＋２＊Ｆｃ＾２）／３
Ｒ１＝０．０５０３  １４９７Ｆｏ＞４ｓｉｇ（Ｆｏ）について、および０．１２６５  全２９８５データについて
ｗＲ２＝０．１７６７、ＧｏｏＦ＝Ｓ＝０．９８７、制止ＧｏｏＦ＝０．９８７  全データについて
非対称単位の占有合計＝２５．００  非水素について、および１６．００  水素原子について
【０２００】
結合の長さおよび角度
Ｃ１−      距離      角度
Ｎ１    １.３３７８（０.００３６）
Ｃ２    １.３７７５（０.００４２）  １２２.４９（０.２７）
Ｃ６    １.４９６７（０.００３８）  １１６.２０（０.２６）  １２１.２６（０.２７）
Ｃｌ−              Ｎ１            Ｃ２
Ｃ２−      距離      角度
Ｃ３    １.３７３８（０.００４２）
Ｃ１    １.３７７５（０.００４１）  １１９.２０（０.３１）
Ｃ２−            Ｃ３
Ｃ３−      距離      角度
Ｃ４    １.３６２３（０.００４９）
Ｃ２    １.３７３８（０.００４２）  １１８.９１（０.３３）
Ｃ３−            Ｃ４
Ｃ４−      距離      角度
Ｃ３    １.３６２３（０.００４９）
Ｃ５    １.３６６８（０.００４７）  １１８.８１（０.３１）
Ｃ４−              Ｃ３
Ｃ５−      距離      角度
Ｎ１    １.３４２０（０.００３８）
Ｃ４    １.３６６８（０.００４７）  １２３.６５（０.３２）
Ｃ５−              Ｎ１
Ｃ６−      距離      角度
Ｎ３    １.２９７２（０.００３３）
Ｃ７    １.４７７７（０.００３９）  １２８.７１（０.２５）
Ｃ１    １.４９６７（０.００３８）  １１１.３１（０.２４）  １１９.９８（０.２４）
Ｃ６−            Ｎ３            Ｃ７
Ｃ７−      距離      角度
Ｎ２    １.３２６５（０.００３７）
Ｃ８    １.３８７１（０.００４０）  １２１.３７（０.２８）
Ｃ６    １.４７７７（０.００３９）  １１７.６６（０.２５）  １２０.９６（０.２７）
Ｃ７−            Ｎ２            Ｃ８
Ｃ８−      距離      角度
Ｃ９    １.３６９８（０.００４４）
Ｃ７    １.３８７１（０.００４０）  １１９.８１（０.３１）
Ｃ８−            Ｃ９
Ｃ９−      距離      角度
Ｃ１０    １.３４８９（０.００５０）
Ｃ８      １.３６９８（０.００４４）  １１９.２７（０.３３）
Ｃ９−            Ｃ１０
Ｃ１０−      距離      角度
Ｃ９      １.３４８９（０.００５０）
Ｃ１１    １.３６４１（０.００５２）  １１７.９７（０.３５）
Ｃ１０−            Ｃ９
Ｃ１１−      距離      角度
Ｎ２      １.３４２３（０.００４１）
Ｃ１０    １.３６４１（０.００５２）  １２４.５４（０.３６）
Ｃ１１−            Ｎ２
Ｃ１２−      距離      角度
Ｏ１      １.２２０２（０.００３２）
Ｎ４      １.３６９０（０.００３４）  １２０.５４（０.２７）
Ｃ１３    １.４６４９（０.００３９）  １２２.８０（０.２６）  １１６.５６（０.２５）
Ｃ１２−            Ｏ１            Ｎ４
Ｃ１３−      距離      角度
Ｃ１４    １.３９１３（０.００３８）
Ｃ１８    １.３９２７（０.００３８）  １１６.６５（０.２６）
Ｃ１２    １.４６４９（０.００３９）  １２４.９１（０.２５）  １１８.４２（０.２６）
Ｃ１３−            Ｃ１４            Ｃ１８
Ｃ１４−      距離      角度
Ｃ１５    １.３７９４（０.００３９）
Ｃ１３    １.３９１３（０.００３８）  １２１.５２（０.２６）
Ｃ１４−            Ｃ１５
Ｃ１５−      距離      角度
Ｃ１４    １.３７９４（０.００３９）
Ｃ１６    １.３８７８（０.００４０）  １２０.８０（０.２８）
Ｃ１５−            Ｃ１４
Ｃ１６−      距離      角度
Ｎ５      １.３６７７（０.００３５）
Ｃ１５    １.３８７８（０.００４０）  １２１.４９（０.２８）
Ｃ１７    １.３９３９（０.００４０）  １２０.６０（０.２７）  １１７.９０（０.２７）
Ｃ１６−            Ｎ５            Ｃ１５
Ｃ１７−      距離      角度
Ｃ１８    １.３５９２（０.００４０）
Ｃ１６    １.３９３９（０.００４０）  １２０.７１（０.２７）
Ｃ１７−            Ｃ１８
Ｃ１８−      距離      角度
Ｃ１７    １.３５９２（０.００４０）
Ｃ１３    １.３９２７（０.００３８）  １２２.４０（０.２７）
Ｃ１８−            Ｃ１７
Ｎ１−      距離      角度
Ｃ１    １.３３７８（０.００３６）
Ｃ５    １.３４２０（０.００３８）  １１６.８７（０.２８）
Ｎ１−            Ｃ１
Ｎ２−      距離      角度
Ｃ７      １.３２６５（０.００３７）
Ｃ１１    １.３４２３（０.００４２）  １１７.０２（０.２８）
Ｎ２−            Ｃ７
Ｎ３−      距離      角度
Ｃ６    １.２９７２（０.００３３）
Ｎ４    １.３６３９（０.００３０）  １１９.６４（０.２３）
Ｎ３−            Ｃ６
Ｎ４−      距離      角度
Ｎ３      １.３６３９（０.００３０）
Ｃ１２    １.３６９０（０.００３４）  １１８.１０（０.２３）
Ｎ４−            Ｎ３
Ｎ５−      距離      角度
Ｃ１６    １.３６７７（０.００３５）
Ｎ５−
Ｏ１−      距離      角度
Ｃ１２    １.２２０２（０.００３２）
０１−
【０２０１】
非水素原子の最終座標および等価等方性原子変位パラメータ：ＰＫＡＨ（Ｃ１８Ｈ１６Ｎ５Ｏ）Ｐ−１（２）Ｚ＝２
【０２０２】
【表２】
2006516979.tif 000034
【０２０３】
（実施例１ｂ−ＤｐＴ類似体の調製）
ＤｐＴ類似体は、２−ジ−ピリジルケトンと、各々のチオセミカルバジドまたは酸ヒドラジドとのシッフ塩基縮合により、標準的な方法（ジョンソン（Johnson）ら、１９８２年）１４を用いて合成された。反応を行なうための適当溶媒は、エタノール、メタノール、エタノール／水、メタノール／水、アセトン、ベンゼン、トルエンを含む。
【０２０４】
代表的なＤｐＴ類似体の構造は、図２Ａに示されている。
【０２０５】
（実施例１ｃ−鉄錯体の調製）
ＰＫＩＨ類似体の鉄錯体は、リチャードソン＆バーンハート（Richardson & Bernhardt）、１９９９年３により記述された技術を用いて調製された。一般に、１モル当量のＦｅ（ＩＩＩ）塩は、２モル当量のＰＫＩＨ類似体とともに、熱エタノール中で１時間灌流された。暗緑／黒色の錯体の固体が形成され、減圧下の濾過により母液から単離された。その錯体はそれからエタノールで洗われ、空気乾燥された。
【０２０６】
ＤｐＴ類似体の鉄錯体は、類似の方法で調製された。
【０２０７】
実施例２−ＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ、およびＰＫＩＨ類似体の親油性および活性の比較
親油性は、平均ｌｏｇＰ値（ｎ−オクタノール−水の分配計数）として、すべてのキレート化剤について測定された。ｌｏｇＰ値は、ブロートの方法（ブロート（Broto）ら、１９８４年）１５、クリッペンのフラグメンテ−ション法（ゴース＆クリッペン（Ghose & Crippen）、１９８７年）１６、またはビシュバナダハンのフラグメンテ−ション法（ビシュバナダハン（Viswanadhan）ら、１９８７年）１７に従って、Ｃｈｅｍ  Ｄｒａｗ  Ｐｒｏ（ｖ．４．５、ケンブリッジ・ソフトウエア（Cambridge Software）、１９９７年）を用いて概算された（表１）。これらの値の平均値（平均ｌｏｇＰ計算値；表１）は、次にＩＣ５０値か、またはキレート化剤が５９Ｆｅの動員を誘導するかまたは５９Ｆｅの取込みを妨げる能力の、いずれかに対してプロットされた。これらのプロットは、親油性と、試験化合物の抗増殖活性またはＦｅキレート化効率との間に強い相関関係がないことを示している（すべての相関：r＜０．５２）（データは示さず）。
【０２０８】
【表３】
2006516979.tif 000035
【０２０９】
比較用のＱＣＩＨ類似体は、単一のキノリン環の存在のため、調べられた化合物の中で最も親油性であった（表１）。しかしながら、ＱＣＩＨシリーズの鉄キレート化効率および抗増殖活性は非常に低い（実施例３ａ、３ｂ、および４ａ参照）。
（インビボおよびインビトロの研究）
【０２１０】
（実施例３〜１０の一般方法論）
ＤＦＯはノバルティス（Novartis）（スイス、バーゼル）から購入された。
３１１は標準的な方法３に従って調製された。
Ｔｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）（３−アミノピリジン−２− カルボキサルデヒド・チオセミカルバゾン；図１Ｂ）は、バイオン・ファーマスーティカルズ（Vion Pharmaceuticals）米国、ニュージャジー州、からの寄贈であった。
【０２１１】
化合物の提示
化合物はすべて、実験の直前に１０ｍＭの保存溶液としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解され、次いで１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；コモンウェルス・シーラム・ラボラトリーズ（Commonwealth Serum Laboratories）、オーストラリア、メルボルン）中に、最終ＤＭＳＯ濃度が０．５％（ｖ／ｖ）以下になるように希釈された。
【０２１２】
細胞培養物の調製
ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮細胞腫細胞系、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８メラノーマ細胞、およびＭＣＦ−７乳癌細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）、米国、メリ−ランド州、ロックビル、から購入された。正常な細胞タイプ、ＭＲＣ−５線維芽細胞およびＬ８ラット骨格筋細胞もまた、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、米国、メリ−ランド州、ロックビル、から購入された。細胞は、１０％ＦＣＳ（コモンウェルス・ラボラトリーズ、オーストラリア、メルボルン）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（ギブコ（Gibco））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）、米国、ミズーリ州、セントルイス）、１００μg／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（ギブコ）、および０．２８μg／ｍｌのフンギゾン（スクイブ・ファーマスーティカルズ（Squibb Pharmaceuticals）、カナダ、モントリオール）を含有するイーグル変法最少必須培地（ＭＥＭ；ギブコ ＢＲＬ、オーストラリア、シドニー）中で増殖された。この増殖培地は、後に「完全培地」と呼ばれる。細胞はインキュベーター（フォーマ・サイエンティフィック（Forma Scienttific）、米国、オハイオ州）中で、３７℃において、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿雰囲気中で増殖され、継代培養された。細胞の増殖および生存率は、位相差顕微鏡およびトリパンブルー染色を用いて慎重に査定された。
【０２１３】
ＭＴＴ細胞増殖アッセイ
細胞増殖は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）アッセイを用いて、本質的には先に記述されたものと同様の方法で調べられた１８。細胞は９６穴マイクロタイタープレート中に、上記の２．２節において記述されたようなすべての補足物（完全培地）および１．２５μＭのヒトのジフェリックトランスフェリンも含有する０．１ｍＬのＭＥＭ培地中に、１５０００細胞／ウエルに播種された。この播種濃度は、細胞の指数増殖をアッセイの期間にわたって生じる結果となる。細胞は一晩増殖され、次いで、試験されるべき化合物が、１．２５μＭのジフェリックトランスフェリンを含有する０．１ｍＬの完全培地において添加された。化合物の最終濃度は０．３９〜５０μＭであった。対照サンプルは、完全培地および１．２５μＭのジフェリックＴｆを含んでいた。細胞は、化合物とともに、９５％空気および５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で、３７℃において９０時間インキュベートされた。このインキュベーションの後、０．０１ｍＬのＭＴＴが各ウエルに添加され、プレートは３７℃において２時間インキュベートされた。細胞は次いで、０．１ｍＬの、０．０１M  ＨＣｌ中の１０％ＳＤＳ−５０％イソブタノールの添加により可溶化され、プレートは次に、走査型マルチウエル分光光度計（タイターテック・マルチスキャン（Titertek Multiscan）；ベックマン・インスツルメンツ・インク（Beckman Instruments Inc）、カリフォルニア州）で、５７０ｎｍにおいて読取られた。ＭＴＴの発色は、生細胞の数に正比例していた。ＭＴＴアッセイの結果は、対照値のパーセントとして表される。
【０２１４】
統計学
実験データは、スチューデントのペアードｔ検定を用いて比較された。結果は、p＜０．０５であるとき、統計学的に有意であると見なされた。結果は、２〜５の別個の実験についての平均±標準偏差（ＳＤ）として表される。
【０２１５】
実施例３−鉄の動員／取込み実験
５９Ｆｅを用いたトランスフェリンの標識化
アポトランスフェリン（シグマ・ケミカル社、米国、セントルイス）が用意され、５９Ｆｅ（０．１Ｍ  ＨＣｌ中の塩化第二鉄として、デュポン（Dupont）ＮＥＮ、米国、マサチューセッツ州）を用いて、リチャードソン＆ベーカー（Richardson & Baker）、１９９２年、により記述された標準的な方法を用いて標識化され、５９Ｆｅ−トランスフェリン（５９Ｆｅ−Ｔｆ）を生成した。
【０２１６】
(実施例３ａ−プレラベルされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮細胞腫細胞からの鉄の動員に対するＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ、およびＰＫＩＨ類似体の影響の比較)
方法論：鉄動員アッセイ
プレラベルされた細胞からの５９Ｆｅの放出に対するキレート化剤の影響は、標準的な方法を用いて研究された１８。細胞は５９Ｆｅ−トランスフェリン（０．７５μＭ）を用いて、３７℃において３時間にわたってプレラベルされた。次いで細胞は氷上に置かれ、氷冷されたＢＳＳで4回洗浄され、次に培地のみ（対照）か、あるいはＤＦＯ（１００μＭ）または他の化合物（５０μＭ）を含有する培地の存在下に、３７℃において３時間にわたって再びインキュベートされた。次いで重層された培地は除去され、γ−計数管に入れられた。細胞は、プラスチックスパチュラを用いてペトリ皿から１ｍｌのＢＳＳ中に除去され、別のセットのγ−計数管へ移された。
【０２１７】
ＱＣＩＨおよびＰＫＩＨ類似体のＦｅキレート化効率は、それらの活性をＤＦＯおよび対応するＰＣＩＨ類似体に対して比較することによって調べられた。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮細胞腫細胞から５９Ｆｅを動員する化合物の能力は、５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５μＭ）との、３７℃における３時間の標識時間の後に査定された。細胞は次いで洗浄され、内部標準ＤＦＯ（１００μＭ）または他の５０μＭのキレート化剤（図３および図４）の存在下および不在下に、３７℃において３時間にわたり再度インキュベートされた。ＤＦＯは、このキレート化剤の、細胞からの５９Ｆｅの動員および５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅの取込みの防止における低い効率のため、１００μＭの濃度において使用された。
【０２１８】
一般に、ＰＫＩＨシリーズは、対応するＰＣＩＨ対照化合物以上の、プレラベルされた細胞からの５９Ｆｅの動員能を示した（図３Ａ）。ＰＫＩＨおよびＰＣＩＨ群の間の活性の最大の相違は、これらのシリーズ（表１参照）から、より親水性の化合物、すなわちＰＣＡＨとＰＫＡＨ、またはＰＣＨＨとＰＫＨＨが比較された場合に見られる。
【０２１９】
一般に、比較用のＱＣＩＨ類似体は、ＰＣＩＨまたはＰＫＩＨ類似体と同様の様式では挙動せず、５９Ｆｅ動員の誘導の観点からいえば、ほとんど活性を示さなかった（図３Ｂ）。ＱＣＩＨシリーズのうちで最も効果的なキレート化剤は、親化合物ＱＣＩＨであり、ＰＣＩＨに匹敵する細胞の５９Ｆｅ動員を示した（図３Ｂ）。
【０２２０】
これらの三群の化合物に関する５９Ｆｅ動員データについての分析は、ＰＫＩＨシリーズのジピリジル置換基が、ヒドラジド置換に関係なく、キレート化剤に高いＦｅキレート化活性を与えるように見えることを示唆した（図３Ａ）。対照的に、比較用ＱＣＩＨシリーズの化合物における単一のキノリン環の存在は、結果として低いＦｅキレート化活性を生じるように見える（図３Ｂ）。
【０２２１】
（実施例３ｂ−５９Ｆｅ標識トランスフェリンからの細胞の鉄取込みに対するＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ、およびＰＫＩＨキレート化剤の影響の比較）
方法論：鉄取込みアッセイ
ＰＫＩＨ類似体の、５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みの、細胞の取込みを阻害する能力が、標準的な方法を用いて調べられた１８。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５μＭ）および、ＤＦＯ（１００μＭ）か、またはＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ、またはＰＫＩＨシリーズ（５０μＭ）のうちの（のうちの）一つの化合物のいずれかを含有する培地中で、３７℃において３時間インキュベートされた。細胞は次に氷上に置かれ、氷冷されたハンクスの平衡塩類溶液（ＢＳＳ）で4回洗浄され、非特異的に結合した５９Ｆｅ−Ｔｆを除去した。次に細胞は一般的なタンパク質分解酵素、プロナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに４℃において３０分間インキュベートされ、膜結合性の５９ＦｅおよびＴｆを除去した。
【０２２２】
ＰＫＩＨ類似体はすべて、５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みの阻害において非常に効果的であった（図４Ａ）。特に、ＰＫＡＨおよびＰＫＨＨ配位子は著しい活性を示したが、一方、対照のＰＣＩＨ類似体、ＰＣＡＨおよびＰＣＨＨは、ほとんど効果を示さなかった（図４Ａ）。一般に、ＱＣＩＨ配位子は、ＰＣＩＨおよびＰＫＩＨ類似体よりも、５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みの防止において効力が低い（図４Ｂ）。
【０２２３】
（実施例３ｃ−細胞の鉄動員およびトランスフェリンからの鉄取込みに対するＰＫＩＨ類似体濃度の影響）
方法論：鉄動員アッセイ
５９Ｆｅ動員に対するＰＫＩＨ類似体の効力が、化合物濃度の関数として査定された（図５Ａ）。細胞は、５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５μＭ）を用いて、３７℃において３時間にわたってプレラベルされ、洗浄され、次いで濃度範囲（０．５〜５０μＭ）のＰＫＩＨ化合物と、３７℃で３時間、再度インキュベートされた。
【０２２４】
同様に、５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みに対するキレート化剤濃度の影響は、ＰＫＩＨ類似体（０．５〜５０μＭ）を、５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５μＭ）とともに３７℃において３時間インキュベートすること、および次いで細胞が洗浄されることによって査定された（図５Ｂ）。ＰＣＴＨは、内部対照として使用された。
【０２２５】
ＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、およびＰＫＢＨは、１０μＭ未満の濃度では、細胞の５９Ｆｅの動員において、ＰＣＴＨよりもさらに有効であった（図５Ａ）。たとえば、１μＭの濃度では、ＰＫＩＨが細胞の５９Ｆｅの２６％を放出するのに対し、ＰＣＴＨは１０％を放出するに過ぎなかった（図５Ａ）。同様に、ＰＫＩＨ、ＰＫＢＨ、およびＰＫＴＨは、５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みの防止において、対照ＰＣＴＨよりも高い効力を有していた（図５Ｂ）。より親水性の配位子、ＰＫＡＨおよびＰＫＨＨ（表１）は、５９Ｆｅ取込みおよび５９Ｆｅ動員アッセイにおいて、より低い効力を示した。
【０２２６】
（実施例３ｄ−プロラベルされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞からの鉄動員に対するＤｐＴ類似体の影響）
方法論：鉄動員アッセイ
アポトランスフェリン（シグマ）は、５９Ｆｅ（デュポン−ＮＥＮ、米国、マサチューセッツ州）により、標準的な方法を用いて標識化され１８、５９Ｆｅトランスフェリン（５９Ｆｅ−Ｔｆ）を産生した。細胞は５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５μＭ）を用いて、３７℃において３時間にわたってプレラベルされ、洗浄され、次いでキレート化剤（２５μＭ；図１１Ａ）とともに、３７℃において３時間、再度インキュベートされた。ＤＦＯおよび３１１は、内部標準として使用された。
【０２２７】
ＤｐＴ類似体の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞から５９Ｆｅを直接的に動員する能力が調べられた（図１１Ａ）。ＤｐＴおよびＤｐ２ｍＴは、結果として全細胞５９Ｆｅの６〜７％の流出を生じたが、一方、培地のみと再度インキュベートされた対照細胞は、５９Ｆｅの５％を放出した（図１１Ａ）。化合物Ｄｐ２ｍＴは、チオセミカルバゾンの２位におけるメチル基の存在が鉄キレート化を妨げるため、ネガティブ対照として作用する。ＤＦＯは、結果として細胞５９Ｆｅの１１％の動員を生じるにすぎない（図１１Ａ）。調べられた他のＤｐＴ化合物は、５９Ｆｅの動員において、ＤＦＯよりも有意に（p＜０．０００１）より有効であり、結果として細胞５９Ｆｅの３７〜４７％の放出を生じた（図１１）。Ｄｐ４４ｍＴは、最も効率的であり、５９Ｆｅの４７％の放出を生じた（図１１）。５９Ｆｅ流出を誘導することにおけるＤｐＴ類似体の効力は、それらの抗腫瘍活性と充分に相互関係があった（実施例４ｄ、表３）。
【０２２８】
（実施例３ｅ−ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞による５９Ｆｅ標識されたトランスフェリンからの細胞の鉄取込みに対するＤｐＴ類似体の影響）
方法論：鉄取込みアッセイ
ＤｐＴ類似体の、５９Ｆｅ−Ｔｆからの細胞の５９Ｆｅの取込みを阻害する能力は、標準的な方法１８を用いて調べられた。細胞によって内在化される（internalized）５９Ｆｅの量は、一般的なタンパク質分解酵素プロナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）とともに４℃において３０分間インキュベートして膜結合性の５９ＦｅおよびＴｆを除去することにより測定された。
【０２２９】
ＤｐＴ類似体の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞による５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みを阻害する能力は、ある範囲のＤｐＴ類似体（２５μＭ）の不在または存在下に、３７℃において３時間にわたって調べられた（図１１Ｂ）。５９Ｆｅを動員するその低い能力と一致して、ＤｐＴおよびＤ２ｍＴは、５９Ｆｅ取込みにおいてほとんど効果がない。３１１およびＤｐ４４ｍＴを含めて、試験された最も効率的な化合物は、対象の５〜９％まで５９Ｆｅ取込みを制限し、その活性はＤＦＯよりも有意に大きかった（p＜０．０００１）（図１１Ｂ）。これらの結果は、これらの配位子が細胞５９Ｆｅを動員する能力と一致する（図１１Ａ）。調べられたすべてのＤｐＴ類似体（ＤｐＴおよびＤｐ２ｍＴを除いて）は、細胞による５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みを防止することにおいて、ＤＦＯよりもはるかに大きい効力を示した（図１１Ｂ）。
【０２３０】
腫瘍細胞増殖を阻害するＤｐＴの能力（表３）は、５９Ｆｅ放出を誘導し（図１１Ａ）かつ５９Ｆｅ取込みを防止する（図１１Ｂ）それらの効力と相関することが示された。Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴのＦｅキレート化活性は、ＤＦＯにより仲介されるものよりはるかに大きかった。
【０２３１】
（実施例３ｆ−Ｔｆからの鉄取込みおよびＭ１０９細胞からの鉄動員に対するＤｐ４４ｍＴの影響）
マウスのＭ１０９肺癌細胞の増殖を阻害する、化合物Ｄｐ４４ｍＴの能力が査定された。研究は、培養にあるM１０９癌細胞を用いて行なわれ、これらの細胞から５９Ｆｅを動員すること（図１１Ｃ）および５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みを阻害すること（図１１Ｄ）に対するＤｐ４４ｍＴの影響を測定した。内部対照として、細胞はＤＦＯおよび３１１とともにインキュベートされた。M１０９細胞から５９Ｆｅ動員を増大することに対する化合物濃度の影響は、細胞を５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５ｍＭ）で３７℃において３時間標識化すること、続いて洗浄すること、および各々の化合物（０．２〜２５μＭ）とともに、３７℃で３時間再度インキュベートすることにより調べられた（図１１Ｃ）。ＤＦＯは調べた化合物の中で最も効力がなく、２５μＭにおいて、細胞からわずか１２±１％の５９Ｆｅを放出したに過ぎず、一方対照培地は、８±１％を放出した（図１１Ｃ）。対照的に、３１１は細胞の５９Ｆｅ放出を、８±１％（対照培地）から、５μＭにおいて６０±１％まで増大させた（図１１Ｃ）。Ｄｐ４４ｍＴに関しては、５９Ｆｅ放出は２μＭにおいて横ばい状態になり、結果として４８±２％の５９Ｆｅの流出を生じた（図１１Ｃ）。
【０２３２】
化合物３１１は、M１０９細胞による５９Ｆｅ−Ｔｆ（０．７５μＭ）からの、細胞の５９Ｆｅ取込みの阻害において、調べたうちで最も活性のある化合物であった（図１１Ｄ）。１μＭにおいて、３１１は５９Ｆｅ取込みを対照の４０±４％まで減少させた。対照的に、ＤＦＯはほとんど影響がなかった。Ｄｐ４４ｍＴは５μＭの濃度までは３１１と同様の活性を有していたが、そこで５９Ｆｅ取込みを、対照の３０±１％まで低減させた（図１１Ｄ）。
【０２３３】
実施例４−インビトロにおける細胞増殖の阻害
【０２３４】
（実施例４ａ−ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞に対するＰＫＩＨ類似体の影響）
方法論：細胞増殖アッセイ
ＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ、およびＰＫＩＨシリーズの化合物の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞系の増殖に対する影響が研究された（表２）。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞の増殖に対する化合物の影響は、ＭＴＴアッセイ（前文に記述）を用いて調べられた。ＭＴＴ発色は、トリパンブルー染色によって測定された生細胞の数に正比例した。すべての実験において、化合物３１１およびＤＦＯは、関連する内部対照として使用された。
【０２３５】
【表４】
2006516979.tif 000036
【０２３６】
ＰＫＩＨの細胞毒性は、細胞の形態学的外観および細胞数の著しい減少から明らかであった。ＰＫＩＨ類似体は、非常に低いキレート化剤濃度においても、非常に高い抗増殖活性を示した（表２）。化合物、ＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、ＰＫＢＨ、およびＰＫＢＢＨは、３１１に非常に類似した抗増殖活性を示した（表２）。
【０２３７】
ＰＫＩＨ類似体とは対照的に、ＰＣＩＨおよびＱＣＩＨ類似体は、細胞増殖に対してほとんど影響がなかった（表２）。ＰＣＩＨおよびＱＣＩＨシリーズのすべての化合物は、４０μＭ〜５０μＭを超えるＩＣ５０値を有していた。これらの結果は、位相差顕微鏡およびトリパンブルー染色による細胞形態学の検査と強く一致しており、そのことはＰＣＩＨおよびＱＣＩＨシリーズの化合物がほとんど細胞毒性を示さないことを証明した。
【０２３８】
（実施例４ｂ−ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮細胞腫細胞の増殖に対するＰＫＩＨ類似体のＦｅ（ＩＩＩ）錯体の影響）
実験は、ＰＫＩＨ類似体がＦｅ（ＩＩＩ）と複合した場合、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の増殖の阻害において有効であるかどうかを測定するべく行なわれた。キレート化剤対Ｆｅのモル比１：１および２：１において、すべてのＰＫＩＨ−Ｆｅ錯体は、遊離の配位子に関して見られたものと同様のレベルの抗増殖活性を示した（データは示されず）。同一の研究における関連の対照として、３１１のＦｅ錯体のための１：１および２：１の化合物もまた調製され、査定された。３１１のＦｅ錯体は、５０μＭまでの濃度において、増殖に対し何ら有意の影響をもたなかった（データは示されず）。
【０２３９】
（実施例４ｃ−線維芽細胞およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞の増殖に対するＰＫＩＨ類似体の影響の比較）
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞およびＭＲＣ−５線維芽細胞の増殖に対するＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、ＰＫＢＨ、およびＰＫＢＢＨの影響が調べられた（図６）。ＭＲＣ−５細胞タイプは、正常なヒト肺線維芽細胞の細胞系であり、インビトロでの多数の継代の後は致死性および老化性であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞タイプは不死である。増殖を阻害することにおけるＰＫＩＨ類似体の影響は、線維芽細胞よりもＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において増大した。たとえばＰＫＩＨ類似体は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞では１〜３μＭのＩＣ５０値を有していたのに対し、線維芽細胞におけるＩＣ５０値は、ＰＫＢＢＨ、ＰＫＢＨ、ＰＫＴＨ、およびＰＫＩＨについて各々８、１１、１６、および＞２５μＭであった。
【０２４０】
（実施例４ｄ−ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞の増殖に対するＤｐＴ類似体の影響）
ＤｐＴ類似体（図２Ａ）の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞増殖を阻害する能力が査定された（図１０）。化合物（０〜２５μＭ）は、細胞とともに７２時間インキュベートされ、このインキュベーション期間の終わりに、上述のように細胞密度がＭＴＴアッセイにより測定された。Ｄｐ２ｍＴはネガティブ対照として役割を果たした。ＭＴＴアッセイを用いて得られたデータは、光学顕微鏡によって概算された細胞数と正比例した。
【０２４１】
Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴは、非常に高い抗増殖活性を示した（ＩＣ５０＝０．０３〜０．０６μＭ；表３）。これらのＤｐＴ類似体は、ＤＦＯ（ＩＣ５０＝５μＭ）よりも有意に（p＜０．０００１）、より活性があり、３１１（ＩＣ５０＝０．３μＭ；表３）のような他のＦｅキレート化剤よりも大きい効力があった。確立された細胞毒性物質、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞におけるドキソルビシンの抗増殖活性（ＩＣ５０＝０．０２μＭ；表３）に比較して、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴは類似した効力を有する。鉄キレート化、Ｔｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）（図1Ｂ）は、上記のＤｐＴ類似体よりも低い活性（ＩＣ５０＝０．２６μＭ；表３）を有していた。Ｄｐ４ｍＴもまたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対してかなりの活性を見せており、０．１９μＭのＩＣ５０値を有して、Ｔｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）に匹敵するものであった（表３）。
【０２４２】
【表５】
2006516979.tif 000037
【０２４３】
ＤｐＴ類似体はまた、ＳＫ−ＭｅＬ−２８メラノーマおよびＭＣＦ−７乳癌細胞系に対しても査定された（表３）。Ｄｐ２ｍＴは、２位のメチル基がＦｅキレート化を妨害することから、ネガティブ対照としての役割を果たした。化合物Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴは、ＳＫ−ＭｅＬ−２８メラノーマおよびＭＣＦ−７乳癌細胞の増殖を阻害することにおいて、各々、ＤＦＯよりも活性があった（p＜０．０００１）（表３）。これらの細胞系に対し、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴは最も活性があり（ＩＣ５０＝０．０６〜０．１０μＭ；表３）、Ｄｐ４４ｍＴはすべての腫瘍細胞タイプを査定して、最も効果的な抗増殖剤であった。全体的に、活性のあるＤｐＴ類似体の効力は、３１１およびＴｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）のそれよりも大きく、またドキソルビシンに関して見られたものよりも良好であった（表３）。意義深いことに、不死の腫瘍細胞に対するＤｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴの著しい抗増殖活性とは対照的に、これらの化合物は致死性のＭＲＣ−５繊維芽細胞の増殖に対しては、驚くほど低い影響を示した（ＩＣ５０値＞２５μＭ）（図１０および表３）。
【０２４４】
（実施例４ｅ−ある範囲の細胞型に関する増殖阻害の比較）
化合物３１１、ＤＦＯ、ＤＯＸ、ＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ｐＴ（０〜５０μＭ）は、細胞とともに７２時間インキュベートされた。インキュベーション時間の最後に、細胞密度がＭＴＴアッセイ（上記）により測定された。結果は表４に示されている。
【０２４５】
【表６】
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【０２４６】
いくつかの非常に攻撃的な癌に由来するある範囲の腫瘍細胞系に対する、より有効な化合物の抗増殖活性が査定された。これらの実験においては、ＤＦＯおよび３１１は適当な標準として用いられた。さらに、これらの研究は、現在の臨床的使用において最も有効な抗腫瘍剤の一つである、細胞毒性物質、ドキソルビシン（ＤＯＸ）を含んでいた。調べられた最も有効性の少ないキレート化剤は、内部標準、ＤＦＯであり、鉄過剰症の治療のための臨床的使用において現行の薬物である。調べられた最も有効な化合物は、三つのＤｐＴ類似体、すなわちＤｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、およびＤｐ４ｐＴを含んでいた。特に、いくつかの癌細胞系におけるこれらのＤｐＴ類似体の活性は、ＤＯＸのものよりもさらに顕著であった。たとえば、肝癌細胞系、ＨｅｐＧ２においては、Ｄｐ４ｅＴのＩＣ５０は０．０２μＭであり、ＤＯＸについて見出されたもの（２．６１μＭ）より１０倍を超えて低かった。ＰＫＩＨ類似体、ＰＫＩＨおよびＰＫＴＨの活性もまた印象的であり、３１１に類似しており、かつＤＯＸよりもわずかに有効性が低かった。重要なことには、ＤｐＴおよびＰＫＩＨ類似体はＤＯＸに対して非常に異なる作用機構によって作用しており、ＤＯＸに抵抗性の癌細胞タイプでは、あるいは有用であってもよい。
【０２４７】
実施例５−Ｍ１０９肺癌の増殖についてのインビボの用量依存性阻害
一般方法論
ＣＤ２１ハイブリッドマウスにおける最大耐量の測定
ＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２マウスは、アニマル・リソーセズ・センター（Animal Resources Center）（ニューサウスウェールズ大学（ＵＮＳＷ）、オーストラリア、シドニー）から入手され、交配されてＣＤ２F１動物を生じた（用いたすべての方法は、動物倫理委員会（Animal Ethics Committee, UNSW）により承認された）。8匹の雌のＣＤ２F１マウス（８〜１０週齢）の群は、自由に餌および水が与えられ、２週間にわたり毎週５日、６時間間隔で一日２回、０．９％の無菌食塩水中の３０％プロピレングリゴール中の調査される化合物を用いて、尾静脈から注射された。最大耐量（ＭＴＤ）は、コホート（同齢集団）の３０％が死んだかまたは１０％を超えて体重が減少した用量として定義された１９。
【０２４８】
インビボの鉄キレート化によるＭ１０９肺癌細胞増殖の阻害
8〜１０週齢の雌のＣＤ２Ｆ１マウスは、１x１０５個のＭ１０９細胞が皮下移植された。腫瘍細胞は、腫瘍からブライを調製すること、およびそれを皮下に注射することにより、ＣＤ２Ｆ１マウスにおいて継代された２０。Ｄｐ４４ｍＴは、食塩水中の３０％（ｖ／ｖ）プロピレングリコール中に溶解され、腫瘍移植の４日後に、一日２回、５日間にわたって静注され、その後に動物が注射されない２日間の「休止期間」が続けられた。腫瘍移植後１２日目に、マウスはメトキシフルオランを用いて犠牲にされ、心臓穿刺が行なわれた。血球数および赤血球指数は、シスメックス・ブラッド・カウンタ（Sysmex Blood Counter）（プリンス・オブ・ウェールズ病院（Prnce of Wales Hospital）、オーストラリア、シドニー）を用いて測定された。処置期間の間のマウスの体重変化が記録された。腫瘍は秤量され、組織学検査用に固定された。実験群は、対照および各処置についてマウス８匹で構成された（表５）。
【０２４９】
図１２Ａは、4日から連続５日にわたり一日２回静脈内注射された後の、腫瘍増殖に対する０．１５、０．３、および０．４ｍｇ／ｋｇのＤｐ４４ｍＴ（ＭＴＤ＝０．４ｍｇ／ｋｇ）の影響を示している。関連するポジティブ対照として、動物はＴｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）を、そのＭＴＤ（６ｍｇ／ｋｇ）において投与された。腫瘍重量は、腫瘍細胞移植後１２日目に測定された。
【０２５０】
【表７】
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【０２５１】
Ｄｐ４４ｍＴの投与は、腫瘍増殖を用量依存性の様式で阻害し（図１２Ａ）、０．４ｍｇ／ｋｇにおいて、腫瘍重量を対照値の４７％まで（p＜０．０１）低減させた。対照群では、Ｄｐ４４ｍＴで処理された動物に比較して、マウスの体重減少または白血球数には何ら有意差はなかった（表５）。しかしながら、対照に比較して、ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球および血小板数におけるわずかな（ｐ＜０．０５）減少が、Ｄｐ４４ｍＴを用いて、そのＭＴＤ（０．４ｍｇ／ｋｇ）において処理された動物では観察されたが、より低い用量では観察されなかった（表５）。Ｄｐ４４ｍＴの、０．１５および０．３ｍｇ／ｋｇにおける投与は、血小板数を増大した（表５）。Ｔｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）はＤｐ４４ｍＴよりも有効であり、腫瘍重量を対照の１０％まで有意に（p＜０．００１）低減した（図１２Ａ）。しかしながら、Ｄｐ４４ｍＴとは対照的に、Ｔｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）はそのＭＴＤ（６ｍｇ／ｋｇ）において著しく、かつ有意に（p＜０．０００１）、動物の重さ、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、赤血球および白血球数を低減し（表５）、このような条件下ではＴｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）が全身的毒性であることを示唆している。
【０２５２】
実施例６−３Ｈ−チミジン、３Ｈ−ロイシン、および３Ｈ−ウリジンの取込みに対するＰＫＩＨ類似体の影響
方法論：３Ｈ−チミジン、３Ｈ−ロイシン、および３Ｈ−ウリジンの取込みアッセイ
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞の、類似体の選択物との２０時間のインキュベーションの後、３Ｈ−チミジン、３Ｈ−ロイシン、および３Ｈ−ウリジン（１μＣｉ／ｍｌ）が、３７℃において２時間にわたり添加された。細胞は、Ｃａ（ＩＩ）／Ｍｇ（ＩＩ）なしのＰＢＳ中の１ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて９６穴プレートから剥離され、セル・ハーベスタ（トムテック・ハーベスタ（Tomtc Harvester）９６、リンブルック、オーストラリア、クイーンズランド）を用いて収集および洗浄された。放射能は、β−シンチレーションカウンタ（ＬＫＢウォレス（Wallace）、フィンランド、トゥールク（Turku））で測定された。
【０２５３】
（実施例６ａ−３Ｈ−チミジン取込みに対するＰＣＩＨ、ＱＣＩＨ、およびＰＫＩＨシリーズの化合物の影響）
３Ｈ−チミジン取込みに対するＰＫＩＨシリーズの化合物の影響は、対応するＰＣＩＨおよびＱＣＩＨ類似体と、また関連する対照としてＤＦＯおよび３１１とも比較された（表６）。
【０２５４】
【表８】
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【０２５５】
ＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、ＰＫＢＨ、およびＰＫＢＢＨは、３Ｈ−チミジン取込みを阻害するそれらの能力の観点からいえば、調べられた最も有効な化合物であり、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、３１１と同じかまたはわずかに高い活性を示した（表６）。実際、ＰＫＩＨ類似体で処理された細胞では、３Ｈ−チミジンはほとんど検出不能のレベルであった。たとえば、ＰＫＢＢＨは３Ｈ−チミジンの取込みを、対照の０．０２％まで低減した（表６）。いくつかの、より親水性のＰＫＩＨ類似体、すなわちＰＫＡＨ、およびＰＫＨＨ（表１）は、有意に（p＜０．０００１）低い活性を示し、３Ｈ−チミジンの取込みを、各々対照の２３％および２５％まで阻害した。しかしながら、これら後者の化合物の、３Ｈ−チミジン取込みの阻害における比較的低い効力は、このシリーズの最も親水性の類似体（ＰＫＩＨ；表１）が非常に高い活性を持つことから（表６）、ただ単にそれらの親水性のみに帰されることはできない。
【０２５６】
３１１およびＰＫＩＨ類似体との比較において、ＱＣＩＨ類似体は３Ｈ−チミジン取込みの阻害においてかなり低い活性を示しており、対照の４１〜８３％まで取込みを低減した（表６）。
【０２５７】
（実施例６ｂ−３Ｈ−ロイシンおよび３Ｈ−ウリジンの取込みに対するＰＣＩＨおよびＰＫＩＨシリーズの化合物の比較）
３Ｈ−チミジン取込みに対するＰＫＩＨ群の類似体の著しい効果を考慮して、これらの化合物の、３Ｈ−ロイシン（表７）および３Ｈ−ウリジン（表８）の取込みに対する影響も査定された。得られた結果は、高いＦｅキレート化活性を示すが、低い抗増殖効果を示すＰＣＩＨシリーズの類似体と比較された。
【０２５８】
【表９】
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【０２５９】
【表１０】
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【０２６０】
３Ｈ−チミジン取込みの阻害という観点から最も活性のあるＰＫＩＨ類似体、すなわちＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、ＰＫＢＨ、およびＰＫＢＢＨは、３Ｈ−ロイシンおよび３Ｈ−ウリジンの、各々タンパク質およびＲＮＡへの取込みの阻害において（表７および８）、有意に（p＜０．０００１）効力が低かった。さらに、これらのＰＫＩＨ類似体は、３Ｈ−ロイシンの取込みに対し、３１１よりも有意に（p＜０．００１）低い効果を有していた（表７）。全般的にＰＫＩＨ類似体は、３Ｈ−ロイシンまたは３Ｈ−ウリジンの取込みの阻害において、ＰＣＩＨ類似体よりも有効であった（表７および８）。ＰＫＢＢＨは、３Ｈ−ロイシンまたは３Ｈ−ウリジンの取込みの阻害において、最大の効力を示した。
【０２６１】
実施例７−ＷＡＦ１およびＧＡＤＤ４５ｍＲＮＡの発現に対するＰＫＩＨ類似体の影響
方法論：ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、トータルＲＮＡアイソレーション・リエイジェント（Total RNA Isolation Reagent）（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（AdvancedBiotechnologies Ltd）、英国、サーリー）を用いて全ＲＮＡを単離することによって行なわれた。膜は、ヒトＷＡＦ１、ＧＡＤＤ４５、およびβ−アクチンに特異的なプローブとハイブリダイズされた。ＷＡＦ１プローブは、ｐＳＸＶからの１ｋｂフラグメントから構成された（ＡＴＣＣ；Ｃａｔ．Ｎｏ．７９９２８）。ＧＡＤＤ４５プローブは、ｐＨｕ１４５Ｂ２（アルバート・フォルナーチェ（Albert Fornace）博士、国立癌研究所、ＮＩＨ、メリーランド州、のご厚意により提供された）へクローニングされた、ヒトＧＡＤＤ４５ｃＤＮＡからの７６０ｂｐのフラグメントから構成された。β−アクチンプローブは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−へクローニングされた、ヒトβ−アクチンｃＤＮＡからの１．４ｋｂフラグメントから構成された（ＡＴＣＣ；Ｃａｔ．Ｎｏ．３７９９７）。
【０２６２】
Ｇ１−Ｓ停止に必須の細胞周期阻害剤をコードしている遺伝子、ＷＡＦ１およびＧＡＤＤ４５の発現に対するＰＫＩＨ類似体の影響が査定された。内部対照ＤＦＯ、ＰＣＢＢＨ、および３１１は、ＧＡＤＤ４５およびＷＡＦ１のｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションを引き起こしたが、一方ＰＣＢＨおよびＰＣＩＨはほとんど効果を示さなかった（図７）。ＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、ＰＫＢＨ、およびＰＫＢＢＨは、それらの著しい抗増殖活性と良好に相関して顕著な効果があり、対照に比較して、ＧＡＤＤ４５およびＷＡＦ１ｍＲＮＡレベルを有意に（p＜０．０００１）増大した。ＰＫＩＨ類似体は、ＷＡＦ１およびＧＡＤＤ４５ｍＲＮＡ発現の誘導において、有意に（p＜０．０１）３１１よりもさらに効力があった（図７）。
【０２６３】
実施例８−Ｎｄｒｇ１ｍＲＮＡ発現の誘導
ＭＣＦ−７細胞は、ある範囲の金属イオンキレート化剤とともに２４時間インキュベートされた。細胞膜不透過性のキレート化剤、ＥＤＴＡ（２５０μＭ）は、抗増殖活性を示さず（ＩＣ５０＞２５０μＭ）、より透過性のある、各々低いおよび高い抗増殖活性を示すキレート化剤と比較された。ＭＣＦ−７細胞において低い抗増殖活性をもつ化合物は、ＤＦＯ（ＩＣ５０＝２０μＭ）、Ｌ１（デフェリプロン、ＩＣ５０＝１８０μＭ）、およびジピリジル（ＩＣ５０＞２５０μＭ）を含んでおり、これらは２５および２５０μＭにおいて査定された。化合物３１１およびｄｐ４４ｍＴは、ＭＣＦ−７細胞に対して高い抗腫瘍活性を示し（ＩＣ５０＝各々０．６μＭおよび０．１μＭ）、２５μＭにおいて査定された（図１６）  ペニシラミンは周知の銅キレート化剤であり、比較のため査定された。Ｄｐ２ｍＴは、ネガティブ対照として用いられた。
【０２６４】
濃度２５μＭにおいては、ＤＦＯ、ペニシラミン（ＰＥＮ）、ｄｐ２ｍＴ、ＥＤＴＡ、ジピリジル、およびＬ１は、Ｎｄｒｇ１のアップレギュレーションにおいて何ら影響がなかった（図１６）。対照的に、３１１およびｄｐ４４ｍＴは、著しくＮｄｒｇ１レベルを増大した（図１６）。
【０２６５】
実施例９−鉄調節タンパク質ＲＮＡ結合活性に対するＰＫＩＨ類似体の影響
方法論：ゲル遅延アッセイ
ゲル遅延アッセイは、鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）と鉄反応エレメント（ＩＲＥ）
の間の相互作用を測定するべく、確立された技術２１を用いて使用された。細胞はＤＦＯ（１００μＭ）、ＦＡＣ（１００μg／ｍｌ）、およびＰＫＩＨ類似体（２５μＭ）とともに、３７℃において２０時間インキュベートされ、細胞ライゼートが調製された。次いでＩＲＰ−ＲＮＡ−結合活性が、ゲル遅延アッセイにより査定された。細胞ライゼートの、２μgのタンパク質を含有するアリコートは、３２P−標識された０．１ｎｇ（約１x１０５ｃｐｍ）のリボプローブとともに、室温において３０分間インキュベートされた。このプロトコールを用いる場合、添加されたＲＮＡレベルは飽和していた。保護されていないプローブは、１ＵのＲＮアーゼＴ１との、室温で１０分間のインキュベーションにより分解された。次いでヘパリン（５ｍｇ／ｍｌ）がさらに１０分間にわたって添加され、非特異的な結合が除外された。ＩＲＥ−タンパク質複合体は、６％の未変性ポリアクリルアミドゲルで分析された。平行実験では、サンプルはＩＲＥプローブの添加に先立ち、フェリシアニド（ＦｅＣＮ、５ｍＭ）および５％β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）で処理された。この方法はＩＲＰ１を、自発性に活性があるか否かにかかわらず、活性のあるＩＲＥ−結合型へ転換する結果を生じる２２。
【０２６６】
ＩＲＰ−ＩＲＥ機構は、Ｆｅキレート化に応答する、細胞のＦｅホメオスタシスの主要なレギュレータである。それゆえ、ＩＲＰ−ＲＮＡ結合活性に対するＰＫＩＨ類似体の影響が測定された（図８）。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞は、キレート化剤（２５ｍＭ）とともに３７℃において２０時間インキュベートされた。Ｆｅキレート化剤ＤＦＯ（１００μＭ）、３１１（２５ｍＭ）、またはＦｅ供与体クエン酸アンモニウム鉄（ＦＡＣ；１００μg／ｍｌ）は、対応する対照としてすべての実験に用いられた３、２３。ＰＣＡＨは、ＩＲＰ−ＲＮＡ−結合活性を低減することが知られている２４ことから、さらなる対照として使用された。
【０２６７】
ＤＦＯおよび３１１とインキュベートされた細胞では、ＩＲＰ−ＲＮＡ結合に有意な（p＜０．００５）増加を生じたが、一方ＦＡＣおよびＰＣＡＨは有意に（p＜０．００１）ＲＮＡ結合を減少させた（図８）。ＰＫＩＨシリーズを用いた細胞の処理の後は、対照に比較して、ＩＲＰ−ＲＮＡ結合活性に有意な（p＜０．０１）増加があり（図８）、細胞のＦｅプールに結合するそれらの能力を反映していた。細胞ライゼートへのβ−メルカプトエタノールおよびＦｅＣＮの添加は、すべてのキレート化剤とのインキュベーションの後のＩＲＰ−ＲＮＡ結合活性の全量に、何ら変化を生じないことを証明した（データは示されず）。
【０２６８】
実施例１０−アポトーシスの誘導
（実施例１０ａ−マウスからのＤｐ４４ｍＴ処理された腫瘍サンプルにおける増大したアポトーシス細胞と、Ｄｐ４４ｍＴとのインキュベーション後の培養Ｍ１０９細胞におけるアポトーシスの検査）
フローサイトメトリーを用いたアポトーシスアッセイ
アポトーシス細胞は、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識されたアネキシン（Annexin）Vの、トランスロケートした形質膜ホスファチジルセリン（ＰＳ）への結合を用いて２３、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、米国、カリフォルニア州）により検出された。ヨウ化プロピオジウム（ＰＩ）が添加され、細胞膜の完全性の低下が確認されたが、それは壊死細胞の指標である。
【０２６９】
ＤＮＡ切断は、ターミナルトランスフェラーゼ介在性のｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）反応に２６より査定された。インシトゥのＴＵＮＥＬアッセイを用いて、Ｄｐ４４ｍＴ（０．４ｍｇ／ｍｌ）（図１２Ｂ（ｉｉ））で処理された動物からの腫瘍試料は、媒体処理された対照（図１２Ｂ（ｉ））に比較して、増大したアポトーシス細胞死の明らかな証拠を示した。Ｄｐ４４ｍＴにより誘導されたアポトーシス経路をさらに調査するため、培養Ｍ１０９細胞はＤｐ４４ｍＴとともに２４時間インキュベートされ、アポトーシスおよび細胞死について、各々アネキシン  V−ＦＩＴＣおよびＰＩ染色を用いて分析された。Ｄｐ４４ｍＴ処理の後、アポトーシスおよび死細胞のパーセントにおいて、用量依存性の増加があった（図１３Ａ）。１μＭのＤｐ４４ｍＴに対する細胞の暴露は、アポトーシスおよび死細胞の有意な（p＜０．０５）増加を引き起こした。この増加は、１００μＭのＤｐ４４ｍＴ濃度において最大となり、その結果として４０±７％のアポトーシス細胞および２７±３％の死細胞からなる集団となった（図１３Ａ）。２５０μＭにおけるＤｐ４４ｍＴとのインキュベーションの後、アポトーシス細胞の数は２０±２％まで減少し、また死細胞集団は４２±６％まで増加しており、用量依存性の細胞毒性を示唆していた。
【０２７０】
Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）によるアポトーシスの誘導もまた、時間依存性であった（図１３Ｂ）。１μＭのＤｐ４４ｍＴとの１２時間のインキュベーションの後、アポトーシス細胞における有為な（p＜０．００１）増加が検出された。したがって、１μＭにおいて、Ｄｐ４４ｍＴは５９Ｆｅ放出を著しく促進し（図１１Ａ、Ｃ）、５９Ｆｅ取込みを阻害し（図１１Ｂ、Ｄ）、かつアポトーシス細胞死を誘導した（図１３Ｂ）。
【０２７１】
（実施例１０ｂ−Ｄｐ４４ｍＴとのインキュベーション後のＭ１０９細胞におけるカスパーゼ−３、８、および９のタンパク質レベルおよび活性）
全般的な方法論
抗体
ウサギ抗活性カスパーゼ−３抗体、ウサギ抗活性カスパーゼ−８抗体、およびアネキシンVフルオレセイン・イソチオシアエネート（ＦＩＴＣ）は、ＢＤファーミンジェン（PharMingen）（サンディエゴ、米国、カリフォルニア州）からであった。抗ｈ−ｃｙｔｃＭｏＡｂは、Ｒ＆Ｄシステムズ（米国、ミネソタ州、ミネアポリス）からであった。ウサギ抗活性カスパーゼ−９抗体、マウス抗Ｂｃｌ−２、およびマウス抗Ｂａｘ抗体は、サンタクルズ（Santa Cruz）（米国、カリフォルニア州、サンタクルズ）から入手された。マウス抗マウスβ−アクチン抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギ、および抗マウスＩｇＧは、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Co.）（米国、ミズーリ州、セントルイス）からであった。
【０２７２】
カスパーゼ活性化および活性アッセイ
培養Ｍ１０９細胞は、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）を用いて、または用いずに、３７℃において０〜４８時間処理された。細胞は溶解され２７、カスパーゼ活性は、ＢＤ  ＡｐｏｌｅｒｔＴＭカスパーゼ・アッセイ・プレート（ＢＤバイオサンエンセズ（Biosciences）、米国、カリフォルニア州）を用いて測定された。細胞透過性のパン−カスパーゼ−３、−８、および−９阻害剤（ＢＤバイオサンエンセズ）は、阻害性の対照として含まれた。
【０２７３】
Ｍ１０９細胞におけるＤｐ４４ｍＴ誘導性のアポトーシスにおけるカスパーゼ活性化の役割を決定するため、活性カスパーゼ−３、−８、および−９のタンパク質レベル（図１４Ａ、Ｂ）およびそれらの酵素活性（図１４Ｃ、Ｄ）が調べられた。Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）との２時間の短いインキュベーションは、カスパーゼ−３および−９のタンパク質レベルを、各々対照の１６８および１７１％まで増大したが、カスパーゼ−８は増大されなかった。
【０２７４】
Ｍ１０９細胞の、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）との６時間にわたるインキュベーションは、結果として対照の４００％までのカスパーゼ−３の顕著な増加を生じたが、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−８における増加はそれほど顕著ではなく、各々対照の２８０％および１５０％まで高められた。（図１４Ａ、Ｂ）Ｄｐ４４ｍＴとの１２時間のインキュベーションは、結果として対照の４００％までの、カスパーゼ−８タンパク質レベル増加を生じたが、一方カスパーゼ−３および−９のそれは、６時間において見られたものとほぼ同じレベルのままであった（すなわち、各々対照の３８０％および２８０％）。Ｄｐ４４ｍＴとの２４時間のインキュベーションは、すべてのカスパーゼのタンパク質レベルを、対照細胞の約4倍まで増大したが、一方４８時間後では、カスパーゼ−３、−８、および−９レベルは、対照細胞のそれの５．５−、３．４倍、および１０倍を超える（図１４Ａ、Ｂ）であった。
【０２７５】
カスパーゼ−３活性は、６時間後に最も著しく増大しており、これは、４８時間後の対照について見られたものの２９倍まで、時間依存の様式で起きていた（図１４Ｃ）。カスパーゼ−８および−９の活性は、Ｄｐ４４ｍＴとの１２時間のインキュベーションの後では、対照の２９９％および３５４％まで、はるかに少なく増加していた（図１４Ｃ）。これら後者の酵素の活性は、２４時間後に対照の約４００〜６００％において横ばい状態になった（図１４Ｃ）。各カスパーゼの膜透過性の阻害剤は、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）とともにインキュベートされた場合、それらの活性化を逆転させ、観察された活性の特異性を証明した（図１４Ｄ）。
【０２７６】
これらの結果は、Ｄｐ４４ｍＴがカスパーゼ−３および−９のタンパク質レベルを２時間以内に増大したのに対し、カスパーゼ−８のタンパク質レベルは、4時間または６時間後でも、わずかに増加したにすぎなかったことを示している（図１４Ａ、Ｂ）。酵素活性における最も著しい増加は、カスパーゼ−３について観察され、Ｄｐ４４ｍＴとの４８時間のインキュベーションの後に、対照に比較して３００倍まで増大した（図１４Ｃ）。
【０２７７】
（実施例１０ｃ−Ｄｐ４４ｍＴとのインキュベーション後のＭ１０９細胞のミトコンドリアからサイトゾルへのホロ−チトクロームｃ（ｈ−ｃｙｔｃ）の放出）
アポトーシスの誘導時の、ミトコンドリアからのｈ−ｃｙｔ放出の重要性のため８、このプロセスにおけるＤｐ４４ｍＴの影響についてさらに研究調査された（図１５Ａ）。サイトゾルおよびミトコンドリア分画の調製、およびウェスタンブロッティングは、標準的な技術を用いて行なわれた２７。対照のＭ１０９細胞（すなわち、０時間）のサイトゾル分画においては、ｈ−ｃｙｔｃの発現は非常にわずかであり、最大量のｈ−ｃｙｔｃは、この時間にはミトコンドリア中に見出された（図１５Ａ）。しかしながら、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）への２時間の暴露の後、ｈ−ｃｙｔｃはＭ１０９細胞のサイトゾル分画中に見出され、一方ミトコンドリアのｈ−ｃｙｔｃレベルには、随伴する減少があった（図１５Ａ）。サイトゾルへのｈ−ｃｙｔｃの放出は、Ｄｐ４４ｍＴとの4時間のインキュベーションの後に横ばい状態となり、次いで２４および４８時間後に対照細胞において見られるものまで減少した。サイトゾルのｈ−ｃｙｔｃにおけるこの増加は、ミトコンドリアからの消失と相関していた（図１５Ａ）。２４および４８時間におけるｈ−ｃｙｔｃの、サイトゾルからのほぼ完全な消失は、細胞からのその放出か、またはその分解によるのかもしれない２８（図１５Ａ）。
【０２７８】
Ｄｐ４４ｍＴとのわずか２時間のインキュベーションは、結果としてミトコンドリアからのｈ−ｃｙｔｃ放出を生じ（図１５Ａ）、このことは、カスパーゼ−３、−８、および−９の活性化と同様の時間か、または先立って起きた（図１４Ａ−Ｃ）。特定の作用機序に制限されることを意図した（ｎｏｔｅ）とはいえ、この観察は、Ｄｐ４４ｍＴがアポトーシスのミトコンドリア経路を誘導し、かつ少なくとも一部は、カスパーゼの著しい活性化の原因となることと一致している。
【０２７９】
（実施例１０ｄ−Ｄｐ４４ｍＴとのインキュベーション後のＭ１０９細胞におけるＢｃｌ−２およびＢａｘの発現）
アポトーシスのミトコンドリア経路におけるＢｃｌ−２およびＢａｘの役割、およびｈ−ｃｙｔｃ放出におけるそれらの役割を考慮して８、１１、１２、これらの分子のタンパク質レベルに対するＤｐ４４ｍＴ（１μＭ）の影響が査定された（図１５Ｂ）。Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）とのインキュベーション後、抗アポトーシス分子、Ｂｃｌ−２は時間の関数として徐々に減少し、２および４８時間のインキュベーションの後では、各々０時間の時点での６９％および３７％まで減少した（図１５Ｂ）。反対に、Ｂａｘ発現は、Ｄｐ４４ｍＴとの４８時間のインキュベーションの後にのみ著しく増加し、０時間の時点で見られるものの５００％に達した（図１５Ｂ）。
【０２８０】
２時間以内に観察されたｈ−ｃｙｔｃの放出（図１５Ａ）は、ミトコンドリアからのｈ−ｃｙｔｃ放出を妨げることに関係づけられる８、ミトコンドリアのＢｃｌ−２発現における減少と合致していた（図１５Ｂ）。しかしながら、ｈ−ｃｙｔｃ放出およびカスパーゼ活性化に役割を果たす８Ｂａｘの発現の著しい増加は、４８時間後に見られたにすぎない（図１５Ｂ）８。Ｂｃｌ−２およびＢａｘ発現の不均衡は、結果として、別の条件下に見出されるような、ミトコンドリアのｈ−ｃｙｔｃ放出を生じたのかもしれない８。ミトコンドリアからのｈ−ｃｙｔｃ流出を考慮すれば、先の研究は、オキシダントストレスが、その放出、ならびにＢｃｌ−２のダウンレギュレーション、プロアポトーシスタンパク質（たとえば、Ｂａｘ）のアップレギュレーション、およびカスパーゼ活性化の強力な誘導物質であることを証明している２７。
【０２８１】
（実施例１０ｅ−Ｄｐ４４ｍＴとのインキュベーション後の細胞内のロス発生の増加）
細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）アッセイ
細胞内のＲＯＳ発生は、細胞透過性色素、２’，７’−ジクロロフルオレセイン−ジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）（シグマ）を用いて査定された。ＤＣＦ−ＤＡは容易に細胞内へ拡散し、Ｏ２・‐、Ｈ２Ｏ２、またはＯＨ−によって酸化されると高度に蛍光性になる２９。細胞の蛍光強度は、細胞内ＲＯＳのレベルに正比例する２９。Ｍ１０９細胞（１x１０５細胞／ウエル）は、１μＭのＤｐ４４ｍＴを用いるかまたは用いずに０〜４８時間にわたり、あるいは５０μＭのＨ２Ｏ２（ポジティブ対照）とともに３７℃において１０分間インキュベートされた。細胞は次に、ＤＣＦ−ＤＡ（５μＭ）とともに３７℃において２０分間インキュベートされ、２回洗浄され、培養プレートから剥離された。細胞内で酸化されたＤＣＦの蛍光は、フローサイトメトリーを用いて測定された２９。
【０２８２】
ミトコンドリアからのｈ−ｃｙｔｃ放出の誘導（図１５Ａ）およびＢｃｌ−２／Ｂａｘ発現の不均衡（図１５Ｂ）が、ＲＯＳの存在によるものであったかどうかを調べるため、Ｏ２・‐、Ｈ２Ｏ２、またはＯＨ−によって酸化されると蛍光性になるＤＣＦＨ−ＤＡプローブを用いたフローサイトメトリーにより、細胞内のＲＯＳが測定された２９。Ｍ１０９細胞の、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）とのインキュベーションは、酸化されたプローブのレベルを時間の関数として増加した。２時間後、酸化されたＤＣＦＨ−ＤＡの蛍光において、０時間の時点に比較して２５±１０％の増加が見られ、これは４８時間後に４８６±９６％まで増加した（図１５Ｃ）。比較用には、ポジティブ対照、Ｈ２Ｏ２（５０μＭ）との１０分間のインキュベーションが、０時間の時点の１３１２±４６％まで蛍光を増大した（図１５Ｃ）。
【０２８３】
本研究では、ＲＯＳの増加はＤｐ４４ｍＴとの２時間のインキュベーションの後に検出されており（図１５Ｃ）、このことはｈ−ｃｙｔｃ放出と合致する（図１５Ａ）。このような観察は、ｈ−ｃｙｔｃ放出の誘導におけるＲＯＳの役割と一致するが、他の機構を除外することはできない。
【０２８４】
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【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】（Ａ）使用された番号づけ方法を示している一般的な化合物の構造である。（Ｂ）ＤＦＯ、３１１、およびＴｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）の構造；（ｃ）比較用ＰＣＩＨおよびＱＣＩＨ化合物の一般構造。
【図２】（Ａ）代表的なＤｐＴ類似体の構造；ＤｐＴ、Ｄｐ２ｍＴ、Ｄｐ４ｍＴ、Ｄｐ４４ｍＴ、Ｄｐ４ｅＴ、Ｄｐ４ａＴ、およびＤｐ４ｐＴを含む。（Ｂ）代表的なＰＫＩＨ類似体の構造；ＰＫＩＨ、ＰＫＴＨ、ＰＫＰＨ、ＰＫＡＨ、ＰＫＨＨ、ＰＫＢＨ、ＰＫ４４ｐＨ、およびＰＫｏｃｔＨを含む。
【図３】プレラベルされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞からの５９Ｆｅ動員に対するキレート化剤の影響についての棒グラフである。（Ａ）ＰＫＩＨおよびＰＣＩＨ類似体の比較；（Ｂ）ＱＣＩＨおよびＰＣＩＨ類似体の比較。結果は、行なわれた二つの実験のうちの典型的な一つの実験における３つの反復測定の平均値±ＳＤとして表されている。
【図４】ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞による５９Ｆｅ−トランスフェリン（５９Ｆｅ−Ｔｆ）からの５９Ｆｅ取込みに対するキレート化剤の影響の棒グラフである。（Ａ）ＰＫＩＨおよびＰＣＩＨ類似体の比較；（Ｂ）ＱＣＩＨおよびＰＣＩＨ類似体の比較。結果は、行なわれた二つの実験のうちの典型的な一つの実験における３つの反復測定の平均値±ＳＤとして表されている。
【図５】（Ａ）細胞の５９Ｆｅ動員および（Ｂ）５９Ｆｅ−トランスフェリン（５９Ｆｅ−Ｔｆ）からの内在化された５９Ｆｅ取込み、についてＰＣＴＨに対して比較されたＰＫＩＨ類似体の濃度の影響の線グラフである。結果は、行なわれた二つの実験のうちの典型的な一つの実験における３つの反復測定の平均値±ＳＤとして表されている。
【図６】ＭＲＣ−５線維芽細胞（F）に対して比較したＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞（Ｎ）の増殖に対する各ＰＫＩＨ類似体、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、および２−ヒドロキシ−１−ナフチルアルデヒド・イソニコチノイル・ヒドラゾン（３１１）の影響の線グラフである。各データポイントは、各実験における二つの反復測定を用いた、３つの別個の実験の平均値を表す。
【図７】ＲＫＩＨシリーズのＦｅキレート化剤のメンバーは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞種におけるＷＡＦ１およびＧＡＤＤ４５のｍＲＮＡ発現を著しく増大する。ＰＫＩＨ類似体の影響が、ＤＦＯ、３１１、およびＰＣＩＨシリーズのいくつかのキレート化剤に対し比較されている。（Ａ）（ｉ）アガロースゲルのエチジウムブロマイド染色、（ｉｉ）ＧＡＤＤ４５、（ｉｉｉ）ＷＡＦ１、および（ｉｖ）β−アクチンｍＲＮＡレベル；（Ｂ）β−アクチンの負荷対照に対しノーマライズされた（Ａ）の結果のデンシトメトリー分析。全ＲＮＡは、培地のみ（対照）か、またはＤＦＯ（１００μＭ）または他のキレート化剤（２５μＭ）を含有する培地を用いた、３７℃における２０時間のインキュベーションの後に細胞から抽出された。ノーザンブロッティングは、標準的な方法（実施例６参照）を用いて行なわれた。例示された結果は、行なわれた３つの実験からの典型的な一つの実験である。
【図８】ＰＫＩＨ類似体は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞における鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）−ＲＮＡ結合活性を増大する。（Ａ）活発なＩＲＰ−ＲＮＡ結合活性；（Ｂ）（Ａ）の結果のデンシトメトリー分析。ＰＫＩＨ類似体の影響は、内部対照（すなわち、ＤＦＯ、３１１、ＰＣＢＢＨ、およびＰＣＡＨ）として作用するいくつかのキレート化剤、およびＦｅ供与体、クエン酸アンモニウム鉄（ＦＡＣ）に対しても比較された。細胞はＤＦＯ（１００μＭ）、ＦＡＣ（１００μg／ｍｌ）、および残りのキレート化剤（２５μＭ）とともに３７℃において２０時間インキュベートされた。ＩＲＰ−ＲＮＡ結合能は、次にゲル遅延アッセイにより、通常の技術を用いて査定された。例示された結果は、行なわれた３つの実験からの典型的な一つの実験である。
【図９】X線結晶学により測定されたＰＫＩＨの結晶構造であり、３０％の熱振動楕円体および水の溶媒和を示している。
【図１０】ＤｐＴおよび３１１（内部対照）は、正常でないＭＲＣ−５線維芽細胞（Ｆ）に比較して、正常なＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞（Ｓ）に対し、選択的な抗増殖活性を示す。細胞は化合物（０〜２５μＭ）の存在または非存在下に、３７℃において７２時間インキュベートされた。このインキュベーションの後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞密度が測定された。各データポイントは、行なわれた少なくとも３〜５実験のうちの典型的な一つの実験の平均値を表す。
【図１１】ＤＦＯおよび３１１に対して比較されたＤｐＴ類似体の、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞およびＭ１０９細胞における５９Ｆｅ−トランスフェリン（５９Ｆｅ−Ｔｆ）からの５９Ｆｅ動員および細胞の５９Ｆｅ取込みに対する影響。（Ａ）プレラベルされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ神経上皮腫細胞からの５９Ｆｅ動員に対するキレート化剤の影響。（Ｂ）ＳＫ−Ｎ−ＭＣによる５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みの防止におけるキレート化剤の影響。（Ｃ）プレラベルされたＭ１０９細胞からの５９Ｆｅ動員に対するキレート化剤の、キレート化剤濃度の関数としての影響。（Ｄ）Ｍ１０９細胞による５９Ｆｅ−Ｔｆからの５９Ｆｅ取込みの防止におけるキレート化剤の、キレート化剤濃度の関数としての影響。結果は、行なわれた３つの実験のうちの典型的な一つの実験における３つの反復測定の平均値±ＳＤとして表されている。
【図１２】（Ａ）Ｄｐ４４ｍＴおよび、かなりの程度にＴｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）は、５日間の治療レジメンの後、マウスのＭ１０９肺癌の増殖を著しく低減しており、また（Ｂ）は、ＴＵＮＥＬアッセイにより判定された（ｉ）媒体対照または（ｉｉ）Ｄｐ４４ｍＴの注射後の腫瘍におけるアポトーシスの誘導である。
【図１３】（Ａ）キレート化剤濃度および（Ｂ）インキュベーション時間の関数としての、Ｍ１０９細胞のアポトーシスまたは壊死／後期アポトーシスに対するＤｐ４４ｍＴの影響。（Ａ）Ｍ１０９細胞は、０〜２５０μＭのＤｐ４４ｍＴとともに３７℃において２４時間インキュベートされた。細胞のアポトーシスまたは壊死／後期アポトーシスは、各々アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩ染色により測定された（詳細は材料および方法を参照）。（Ｂ）Ｍ１０９細胞は、様々なインキュベーション時間（０〜４８時間）にわたり、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）で処理された。細胞のアポトーシスおよび壊死／後期アポトーシスは（Ａ）に記述されたように測定された。データプロットは、３つの別個の実験の平均±ＥＳＭである。
【図１４】細胞透過性カスパーゼ阻害剤の不在下（Ｃ）および存在下（Ｄ）における培養Ｍ１０９細胞における、（Ａ、Ｂ）活性カスパーゼ−３、−８、および−９のタンパク質レベル、および（Ｃ、Ｄ）カスパーゼ−３、−８、および−９の活性に対するＤｐ４４ｍＴ（１μＭ）の影響。（Ａ）ウェスタンブロッティングにより検出された、Ｄｐ４４ｍＴ処理後の示された時間におけるカスパーゼ−３、−８、および−９のレベル（上部パネル）。抗β−アクチン抗体は、等しいタンパク質の負荷を確証するべく用いられた（下部パネル）。（Ｂ）β−アクチンに対してノーマライズされた、時間の関数としてのカスパーゼ−３、−８、および−９発現についてのデンシトメトリー分析  （Ｃ）０〜４８時間の、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）により誘導されたカスパーゼ活性は、０時間の時点のパーセントとして表された。（Ｄ）カスパーゼ−３、−８、および−９の、１μＭの細胞透過性阻害剤は、Ｄｐ４４ｍＴ（１μＭ）と４８時間インキュベートされた場合、これらの酵素の活性化を防止した。結果は、別個の３つの実験の平均値±ＳＥＭである。
【図１５】培養Ｍ１０９細胞におけるＤｐ４４ｍＴ（１μＭ）の：（Ａ）サイトゾルおよびストロマのミトコンドリア膜（ＳＭＭ）分画中のホローチトクロームｃ（ｈ−ｃｙｔｃ）レベル；（Ｂ）Ｂｃｌ−２およびＢａｘのミトコンドリアタンパク質レベル；（Ｃ）細胞内ＲＯＳ産生、に対する影響。
【図１６】２５μＭにおいて調べられた場合、膜透過性キレート化剤３１１および高い抗増殖活性およびＦｅキレート化効力をもつＤｐ４４ｍＴのみが、Ｎｄｒｇ１タンパク質発現を増大する。ＭＣＦ−７細胞は、２５μＭのＤＦＯ、３１１、ペニシラミン、ｄｐ４４ｍＴ、ｄｐ２ｍＴ、ジピリジル、Ｌ１、またはＥＤＴＡとともに、３７℃において２４時間インキュベートされた。Ｎｄｒｇ１の発現およびβ−アクチンのタンパク質レベルは、ウェスタンブロッティングにより査定された。結果は、行なわれた３つの実験からの典型的な一つの実験である。
【図１】
2006516979.tif 000059
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月6日(2004.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式３：
【化１】
2006516979.tif 000075
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；
ｎは０、１、２、３、または４であり、
ｐは０、１、２、３、または４であり、さらに
各Ｒ４は独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれ、さらに
−ＧはＮＲ２Ｒ３またはＣＲ２Ｒ３Ｒ５であって、
ＣとＲ５の間の結合は単結合、二重結合、または三重結合でよく；ＣとＲ５の間の結合が二重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の一方がなく、ＣとＲ５の間の結合が三重結合である場合は、Ｒ２およびＲ３の双方がなく；
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基から選ばれ；
Ｒ５は水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された複素芳香族、任意に置換された二環基、および任意に置換された芳香族基からなる群より選ばれ；
あるいは−Ｇは、任意に置換された複素芳香族基、任意に置換された二環基、任意に置換された芳香族基、任意に置換されたアルキル基；任意に置換されたシクロアルキル基、または任意に置換されたヘテロシクロアルキル基であって；
（ｉ）  ＥがＯであり、ｎが０であり、かつｐが０のとき、
−Ｇは、−ＮＨ２；−ＣＨ２Ｃｌ；２−フラニル；２−チオフェニル；フェニル；２−ハロフェニル；３−ハロフェニル；４−ハロフェニル；これにおいてハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり；２−アミノフェニル；4−アミノフェニル；２−ヒドロキシフェニル；4−ヒドロキシフェニル；２−ピリジル；4−ピリジル；
【化２】
2006516979.tif 000076
ではなく；かつ
（ｉｉ）   ＥがＳであり、ｎが０であり、かつｐが０のとき、
−Ｇは、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３；−ＮＨフェニル；−ＮＨ（ベンジル）；−ＮＨ（ベンジル）２；−ＮＨ（２−ピリジル）；−ＮＨ−ＣＨ２−（２−ピリジル）；−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２；−Ｎ−ピロリジニル；−Ｎ−ピペリジニル；−Ｎ−モルフォリニル；２−チオフェニル；２−フラニル；２−ヒドロキシフェニル；
【化３】
2006516979.tif 000077
ではないという条件つきである］の化合物。
【請求項２】
ｎが１または２であり、各Ｒ４が独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、任意に置換されたアミノ、ヒドロキシル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、ニトロ、およびシアノから選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項３】
ＥがＳであり；−Ｇが、任意に置換された複素芳香族基、任意に置換された芳香族基、任意に置換されたアルキル基；およびＮＲ２Ｒ３から選ばれ、Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、アルキル、アルケニル、および任意に置換された芳香族基から選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項４】
ＥがＯであり；かつＧが、任意に置換された５−または６−員の複素芳香族基、任意に置換された芳香族基、任意に置換されたアルキル基、任意に置換されたヘテロシクロアルキル基、およびＮＲ２Ｒ３から選ばれ、Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、アルキル、アルケニル、および任意に置換された芳香族基から選ばれる、請求項１の化合物。
【請求項５】
前記任意の置換基の各々が、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ６−１０アリール、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ニトロ、シアノ、Ｃ（Ｏ）−アルキル、Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、およびＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、式４：
【化４】
2006516979.tif 000078
［式中、
ＥはＯまたはＳであり；かつ
Ｇは、条件（ｉ）および（ｉｉ）を含めて請求項１に定義された通りである］の化合物である、請求項１の化合物。
【請求項７】
【化５】
2006516979.tif 000079
から選ばれる化合物。
【請求項８】
【化６】
2006516979.tif 000080
から選ばれる化合物。
【請求項９】
前記金属イオンが、鉄、銅、亜鉛、パラジウム、白金、およびガリウムから選ばれる、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、請求項１〜８のいずれか１項の化合物の金属イオン錯体。
【請求項１０】
前記金属イオンが、鉄（ＩＩＩ）および鉄（ＩＩ）から選ばれる、請求項９の金属イオン錯体。
【請求項１１】
式
【化７】
2006516979.tif 000081
［式中、
ｎは０、１、２、３および４から選ばれる整数であり；
Ｂは、
【化８】
2006516979.tif 000082
からなる群より選ばれ、かつ、
各Ｒ４およびＲ５は同じかまたは異なってよく、独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、任意に置換されたアミノ、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
ｐは０、１、２、３、４、および５から選ばれる整数であり；
Ｇは、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、およびＮＲ２Ｒ３からなる群より選ばれ；
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換された芳香族基、および任意に置換された複素芳香族基から選ばれる］を有する
化合物。
【請求項１２】
式
【化９】
2006516979.tif 000083
［式中、
ｎは０、１、２、３および４から選ばれる整数であり；
Ｂは、
【化１０】
2006516979.tif 000084
であり、
各Ｒ４およびＲ５は同じかまたは異なってよく、独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、任意に置換されたアミノ、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
ｐは０、１、２、３、４、および５から選ばれる整数であり；
Ｇは、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、およびＮＲ２Ｒ３からなる群より選ばれ；
Ｒ２は、水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、およびヘテロアリールからなる群より選ばれ、
Ｒ３は、アルケニル、シクロアルケニル、またはアルキニルであり；
ｐが０であり、ＧがＮＲ２Ｒ３であり、かつＲ２がＨであるとき、Ｒ３は、
−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、または置換または未置換のシクロヘキセニルではなく；かつ
Ｇが ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールであるとき、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロアリール基はＮ−へテロ原子を介してＣ＝Ｓへ付着されない、という条件つきである］を有する化合物。
【請求項１３】
式
【化１１】
2006516979.tif 000085
［式中、
ｎは０、１、２、３および４から選ばれる整数であり；
Ｂは、
【化１２】
2006516979.tif 000086
から選ばれ、
各Ｒ４およびＲ５は同じかまたは異なってよく、独立してハロゲン、アルキル、アルケニル、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル、任意に置換されたアミノ、ニトロ、およびシアノから選ばれ、
ｐは０、１、２、３、４、および５から選ばれる整数であり；
Ｇは、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、およびＮＲ２Ｒ３からなる群より選ばれ；
Ｒ２およびＲ３は同じかまたは異なってよく、独立して水素、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたシクロアルケニル、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールから選ばれ；
（ｉ）  Ｂが３−ピリジルまたは4−ピリジルであり、ｎ＝０およびｐ＝０であるとき、ＧはＮＨＭｅまたはＮＭｅ２ではなく；かつ
（ｉｉ）  Ｂが２−チアゾリニルであり、ｎ＝０およびｐ＝０であるとき、ＧはＮＭｅ２、ＮＨブチル、
【化１３】
2006516979.tif 000087
ではない、という条件つきである］を有する化合物。
【請求項１４】
Ｂが、
【化１４】
2006516979.tif 000088
である、請求項１３の化合物。
【請求項１５】
前記金属イオンが、鉄、銅、亜鉛、パラジウム、白金、およびガリウムから選ばれる、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、請求項１１〜１４のいずれか１項の化合物の金属イオン錯体。
【請求項１６】
前記金属イオンが、鉄（ＩＩＩ）および鉄（ＩＩ）から選ばれる、請求項１５の金属イオン錯体。
【請求項１７】
製薬上許容される希釈剤または担体および、請求項１〜８または１１〜１４の任意の一項による少なくとも一つの化合物含む製薬組成物。
【請求項１８】
製薬上許容される希釈剤または担体および、請求項９、１０、１５、または１６の任意の一項による少なくとも一つの金属イオン錯体を含む製薬組成物。
【請求項１９】
哺乳類における鉄キレート化療法であって、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、治療上有効な量の、請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による、少なくとも一つの化合物か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による、少なくとも一つの化合物を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法。
【請求項２０】
哺乳類における鉄過剰症を治療する方法であって、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、治療上有効な量の、請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による、少なくとも一つの化合物か、あるいは条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による、少なくとも一つの化合物を製薬上許容される希釈剤、補助剤、または賦形剤と一緒に含む製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記鉄過剰症がβ−サラセミアである、請求項２0の方法。
【請求項２２】
細胞増殖を阻害する方法であって、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による、少なくとも一つの化合物か、または請求項９、１０、１５、または１６の任意の１項による金属イオン錯体か、または、化合物ビス（２−ピリジル）ケトン・チオセミカルバゾンを除外した、請求項１７または１８の製薬組成物と、細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２３】
哺乳類において増殖性疾患を治療する方法であって、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない、請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による、少なくとも一つの化合物か、または請求項９、１０、１５、または１６の任意の１項による金属イオン錯体か、または、化合物ビス（２−ピリジル）ケトン・チオセミカルバゾンを除外した、請求項１７または１８の製薬組成物を、前記哺乳類へ投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記増殖性疾患が、血管新生依存性疾患、細胞増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、血管疾患、血栓症、および癌から選ばれる、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記癌が、悪性腫瘍か、または良性腫瘍である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記癌が、固形腫瘍か、または非固形腫瘍である、請求項２４の方法。
【請求項２７】
細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による少なくとも一つの化合物か、または請求項９．１０、１５、または１６の任意の１項による金属イオン錯体か、または請求項１７または１８の製薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２８】
細胞増殖を阻害し、かつ細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞を、有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による少なくとも一つの化合物か、または請求項９、１０、１５、または１６の任意の１項による金属イオン錯体か、または請求項１７または１８の製薬組成物と接触させることを含む方法。
【請求項２９】
哺乳類においてアポトーシスを誘導する方法であって、前記哺乳類へ、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による少なくとも一つの化合物か、または請求項９．１０、１５、または１６の任意の１項による金属イオン錯体か、または請求項１７または１８の製薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３０】
哺乳類においてアポトーシスを誘導しかつ細胞増殖を阻害する方法であって、前記哺乳類へ、治療上有効な量の、条件（ｉ）および（ｉｉ）を満たす若しくは満たさない請求項１〜８または１１〜１４の任意の１項による少なくとも一つの化合物か、または請求項９．１０、１５、または１６の任意の１項による金属イオン錯体か、または請求項１７または１８の製薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記鉄錯体が、鉄（ＩＩ）錯体である、請求項２２〜３０のいずれか１項の方法。
【請求項３２】
前記鉄錯体が、鉄（ＩＩＩ）錯体である、請求項２２〜３０のいずれか１項の方法。
【国際調査報告】
2006516979.tif 000089
2006516979.tif 000090
2006516979.tif 000091
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