(57)【要約】本発明において、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、その野生型酵母株がクラブトリー陽性であるグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を開示する。グルコース耐性Ｃ２炭素源依存性酵母株を選択する方法およびグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性酵母株を利用してピルビン酸またはその塩を生産する方法も開示する。本発明において、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを有しているＧＣＳＩ酵母株をさらに開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、その野生型株がクラブトリー陽性であるグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株。
【請求項２】
サッカロミセス属、カンジダ属、シゾサッカロミセス属、トルラスポラ属、クルイベロミセス属、チゴサッカロミセス属およびデッケラ属からなる群から選択される属に属する、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３】
サッカロミセス属、カンジダ属、シゾサッカロミセス属およびクルイベロミセス属からなる群から選択される属に属する、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４】
クルイベロミセス・サーモトレランスである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項５】
チゴサッカロミセス・バイリーである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項６】
サッカロミセス属に属する、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項７】
サッカロミセス・セレビシエである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項８】
遺伝子型ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ  ３−５２を有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項９】
遺伝子型ｐｄｃ１，５，６Δを有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１０】
シゾサッカロミセス・ポンベである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１１】
トルラスポラ・グロボサおよびトルラスポラ・デルブルッキーからなる群から選択される酵母株である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１２】
デッケラ・ブルクセレンシスである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１３】
カンジダ・グラブラタである、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１４】
該ＧＣＳＩ酵母株がＣ．グラブラタであり、かつ、Ｃ．グラブラタ株が炭素源として使用することができる糖を含有する無機培地で培養した場合に、約７００ｍＭを上回るピルビン酸またはその塩を産生することが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１５】
（Ａ）野生型酵母株で発現され得る少なくとも１つのＰＤＣ構造遺伝子；（Ｂ）野生型酵母株で発現され得る少なくとも１つのＰＤＣ調節遺伝子；（Ｃ）ＰＤＣ構造遺伝子のプロモーター；および（Ｄ）ＰＤＣ調節遺伝子のプロモーターを含んでなり、（Ａ）〜（Ｄ）の少なくとも１つが（ｉ）突然変異しているか、（ii）破壊されているか、または（iii）欠失している、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１６】
突然変異した野生型酵母株で発現され得るＰＤＣ構造遺伝子総てを有する、請求項１５に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１７】
該ＧＣＳＩ酵母株と野生型酵母株を本質的に同じ培養条件下で増殖させた場合に、トレオニンアルドラーゼの活性レベルが野生型酵母株ほど高くない、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１８】
好気性バッチ培養で増殖させることが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項１９】
好気性ケモスタットで増殖させることが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２０】
グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デンプン加水分解物、ガラクトース、ラクトース、高フルクトースコーンシロップおよびリグノセルロース加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含有する培養培地で増殖させることが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２１】
バッチ培養培地がバッチ培養増殖開始時に約１ｍＭ〜１Ｍの間のグルコースを含有する、グルコースを唯一の炭素源とする無機培地である好気性バッチ培養で増殖させることが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２２】
バッチ培養培地が約１００ｍＭ〜６１０ｍＭの間のグルコースを含有する、請求項２１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２３】
バッチ培養培地が約２５０ｍＭ〜６１０ｍＭの間のグルコースを含有している、請求項２１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２４】
ケモスタット培養培地が約１ｍＭ〜１Ｍの間のグルコースを含有する、グルコースを唯一の炭素源とする無機培地である好気性ケモスタットで増殖させることが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２５】
無機培地において好気性バッチ培養により培養した場合に、１リットル当たり少なくとも約０．５モル濃度のピルビン酸を産生することが可能である、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２６】
１リットル当たり少なくとも約０．８モル濃度のピルビン酸を産生することが可能である、請求項２５に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２７】
１リットル当たり少なくとも約１．５３モル濃度のピルビン酸を産生することが可能である、請求項２６に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２８】
ｐＨ約４．８〜５．２の間で培養される、請求項２５に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項２９】
無機培地がグルコースを唯一の炭素源として含有している、請求項２５に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３０】
該ＧＣＳＩ酵母株で発現され得る外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなり、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３１】
ｐＨ約５．０で乳酸を産生することが可能である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３２】
グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で培養した場合に、１００グラムのグルコース当たり約７０グラムを上回る乳酸を産生することが可能である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３３】
サッカロミセス・セレビシエである、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３４】
遺伝子型ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２  ＹＥｐＬｐＬＤＨを有するサッカロミセス・セレビシエである、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３５】
外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カゼイ、バチルス・メガテリウム、リゾプス・オリザエまたはバチルス・ステアロサーモフィラス乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３６】
外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がラクトバチルス・プランタラム乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３７】
約１００ｇｌ−１を上回る乳酸を産生することが可能である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３８】
該ＧＣＳＩ酵母株の染色体が外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでいる、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項３９】
外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む少なくとも１つのプラスミドを含有している、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４０】
プラスミドが２ミクロンプラスミドである、請求項３９に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４１】
外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がプロモーターに作動可能なように連結されている、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４２】
プロモーターがトリオースリン酸イソメラーゼプロモーターである、請求項４１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４３】
プロモーターがピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびＬ−トレオニンデヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択される、請求項４１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４４】
プロモーターがクルイベロミセス属ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーターである、請求項４１に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４５】
Ｌ−乳酸から本質的になる乳酸を産生することが可能である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４６】
好気条件下、グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で培養した場合に、乳酸を産生することが可能である、請求項３０に記載のＧＣＳＩ酵母株。
【請求項４７】
（ａ）好気性炭素制限ケモスタットで酵母培養物を増殖させること、ここで、その酵母培養物の増殖は、培養物の増殖開始時にグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有する第１の無機培地に、その野生型酵母株がクラブトリー陽性であるＰｄｃ陰性酵母株を接種することにより開始される、
（ｂ）ケモスタットでの酵母培養物の増殖中に第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度を、第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度が目的範囲である全炭素の約１０％〜０％の間に達するまで低減すること、
（ｃ）Ｃ２炭素源の濃度が目的範囲に達したら、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない少なくとも１種のＣ２炭素源非依存性酵母株をケモスタット酵母培養物から回収すること；および
（ｄ）グルコースをバッチ培養での唯一の炭素源とする第２の無機培地を用いて一連の好気性バッチ培養によりＣ２炭素源非依存性酵母株を培養すること、ここで、その一連のバッチ培養を通じてグルコースの濃度を高め、一連の各バッチ培養物にその一連のバッチ培養で先にバッチ培養増殖させた酵母を播種する、さらに
（ｅ）その一連のバッチ培養物から、Ｃ２炭素源なしにグルコースを唯一の炭素源として用いて増殖させることが可能である、回収したＣ２炭素源非依存性酵母株より高いグルコース耐性を有し、かつ、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株を回収すること
を含む選択工程により回収される、グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株。
【請求項４８】
グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を選択する方法であって、
（ａ）好気性炭素制限ケモスタットで酵母培養物を増殖させること、ここで、その酵母培養物の増殖は、培養物の増殖開始時にグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有する第１の無機培地に、その野生型酵母株がクラブトリー陽性であるＰｄｃ陰性酵母株を接種することにより開始される、
（ｂ）ケモスタットでの酵母培養物の増殖中に第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度を、第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度が目的範囲である全炭素の約１０％〜０％の間に達するまで低減すること、
（ｃ）Ｃ２炭素源の濃度が目的範囲に達したら、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない少なくとも１種のＣ２炭素源非依存性酵母株をケモスタット酵母培養物から回収すること；および
（ｄ）グルコースをバッチ培養での唯一の炭素源とする第２の無機培地を用いて一連の好気性バッチ培養によりＣ２炭素源非依存性酵母株を培養すること、ここで、その一連のバッチ培養を通じてグルコースの濃度を高め、一連の各バッチ培養物にその一連のバッチ培養で先にバッチ培養増殖させた酵母を播種する、さらに
（ｅ）その一連のバッチ培養物から、Ｃ２炭素源なしにグルコースを唯一の炭素源として用いて増殖させることが可能である、回収したＣ２炭素源非依存性酵母株より高いグルコース耐性を有し、かつ、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株を回収すること
を含む、酵母株選択方法。
【請求項４９】
グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を選択する方法であって、
無機培地に、その野生型酵母がクラブトリー陽性であるＰｄｃ陰性酵母株を接種すること、
Ｐｄｃ陰性酵母株を好気培養すること、ここで、酵母培養物の増殖開始時に、無機培地はグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有する、
酵母培養物が増殖するにつれてＣ２炭素源の濃度を、その培養物がＣ２炭素源なしで増殖可能になるまで低減すること、
酵母培養物が増殖するにつれてグルコースの濃度を上昇させること、および
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のない少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株を回収すること
を含む、酵母株選択方法。
【請求項５０】
好気性ケモスタットにおいてＣ２炭素源の濃度を低減する段階とグルコースの濃度を上昇させる段階が同時に行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
グルコースの濃度を上昇させる段階がＣ２炭素源の濃度を低減する段階の前に行われ、各段階は好気性ケモスタットにおいて実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
Ｃ２炭素源の濃度を低減する段階がグルコースの濃度を上昇させる段階の前に行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
無機培地に、その野生型酵母がクラブトリー陽性であるＰｄｃ陰性酵母株を接種すること、
Ｐｄｃ陰性酵母株を好気培養すること、ここで、酵母培養物の増殖開始時に、無機培地はグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有する、
酵母培養物が増殖するにつれてＣ２炭素源の濃度を、その培養物がＣ２炭素源なしで増殖可能になるまで低減すること、
酵母培養物が増殖するにつれてグルコースの濃度を上昇させること、および
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のない少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株を回収すること
を含む選択工程により得られる、グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性酵母株。
【請求項５４】
ピルビン酸またはその塩を生産する方法であって、
グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を第１の培養培地で好気培養すること
を含む、生産方法。
【請求項５５】
ＧＣＳＩ酵母株がバッチ培養で培養される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
バッチ培養がｐＨ制御される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
培養が約２．５〜８の間にｐＨ制御される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
培養が約３〜６の間にｐＨ制御される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
培養が約４．５〜５．５の間にｐＨ制御される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ＧＣＳＩ酵母株を培養ｐＨが制御されているケモスタットで培養する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
ＧＣＳＩ酵母株がサッカロミセス・セレビシエである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
ＧＣＳＩ酵母株がカンジダ・グラブラタである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
第１の培養培地がグルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デンプン加水分解物、高フルクトースコーンシロップおよびリグノセルロース加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含有している、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
第１の培養培地がスクロースまたはグルコースの少なくとも１種を含有している、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ＧＣＳＩ酵母株を少なくとも１種の糖を含有する第１の培養培地において好気性バッチ培養により培養した場合に、１リットル当たり少なくとも約０．５モルピルビン酸が生産される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
１リットル当たり少なくとも約０．８モルピルビン酸が生産される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
１リットル当たり少なくとも約１．５３モルのピルビン酸が生産される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
培養がｐＨ約４．８〜５．２の間となるようにｐＨ制御される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
炭素源がグルコースを唯一の炭素源として含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸アンモニウムおよびピルビン酸カルシウムからなる群から選択される少なくとも１種の塩を生産する、請求項５４に記載の方法。
【請求項７１】
塩がピルビン酸カリウムである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
ピルビン酸またはその塩を精製する段階をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項７３】
精製段階が蒸留、イオン交換、ナノフィルトレーションまたは溶媒抽出の少なくとも１つを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
第１の培養培地が無機培地である、請求項５４に記載の方法。
【請求項７５】
乳酸またはその塩を生産する方法であって、
組換え型酵母株で発現され得る外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを有し、グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で増殖させた場合に、１００グラムグルコース当たり少なくとも約７０グラム乳酸を産生することが可能であるグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を第１の培養培地で好気培養することを含み、その発現の結果として生じるタンパク質が乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、生産方法。
（ＧＣＳＩ）酵母株を第１のが乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、生産方法。
【請求項７６】
寄託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６５１を有する、ＧＣＳＩ酵母株。
【請求項７７】
寄託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０７４２を有する、プラスミドＹＥｐＬｐＬＤＨ含有ＧＣＳＩ酵母株。
【請求項７８】
寄託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６５０を有する、Ｃ２炭素源非依存性酵母株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、好気性環境においてグルコースを用いて増殖させた場合に、多量のエタノールを産出することなく比較的高い濃度のピルビン酸またはその塩を産生する、クラブトリー(Crabtree)陽性酵母由来の酵母に関する。本発明は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性がなく、かつ、ピルビン酸またはその塩を産生するためのグルコースまたは他の糖を含有している無機培地において好気性環境で増殖させることが可能である、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のようなクラブトリー陽性酵母に関する。本発明はまた、培養した場合に、比較的に高い濃度の乳酸を産生し得る酵母にも関する。
【背景技術】
【０００２】
過剰の炭水化物（例えば、グルコース）の存在下では、特定のサッカロミセス・セレビシエ株を利用して、嫌気性環境においても好気性環境においても糖をエタノールと二酸化炭素へと迅速に発酵させることができることは当技術分野では周知のことである。エタノールの他、商品価値のある特定の他の化学物質の製造にサッカロミセス・セレビシエや特定の他の真菌を利用することができる。商用プロセスにおける製品収量および／または濃度を最大化することが望ましい。このような目的で、使用されている１つの方法では、アルコール発酵から所望の生成物の生産への炭素フラックスの方向転換が必要である。
【０００３】
総ての生細胞の糖代謝における共通の中間体であるピルビン酸（およびその塩）の回収は商業的に興味深い。ピルビン酸またはその塩は、特定の医薬品の化学合成において出発物質として使用することができる。ピルビン酸およびその塩は、特定の作物保護剤、高分子化合物、化粧品および食品添加剤の製造においても有用であり得る。ピルビン酸塩がヒトに関して健康上の利点もあることを示唆するいくつかの証拠がある。さらに、ピルビン酸またはその塩から商業的に価値ある特定の化学薬品を生化学的に得ることができる。例えば、ピルビン酸から単一酵素反応により乳酸塩またはアラニン各々を製造することができる。同様に、リンゴ酸塩を２段階酵素反応により製造することもできる。
【０００４】
サッカロミセス・セレビシエのような酵母は、糖または炭水化物供給材料からのピルビン酸、その塩およびその化学的誘導体の製造用に優れた生物として関心を集めている。これは、それらの酵母が高解糖フラックス（例えば、ピルビン酸生成率が比較的高い）および酸耐性といった所望の特性を兼ね備えているためである。
【０００５】
特定の酵母、特に、クラブトリー陽性酵母では、過剰の炭素源を用いて酵母を増殖させたときの脱炭酸の主要経路では、ピルビン酸デカルボキシラーゼが必要である。クラブトリー陽性酵母は、過剰の糖（例えば、グルコース）の存在下、好気条件下において、または培養物の比増殖速度が臨界比増殖速度よりも速いときにピルビン酸塩からアルコールを生成する。クラブトリー陽性酵母の例は、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）（当技術分野で公知のいくつかある名前の中で特に、トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)の別名で知られる）、チゴサッカロミセス・バイリー（Zygosaccharomyces bailii）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）の間で見られる。通性発酵酵母（例えば、アルコール発酵または呼吸あるいはその両方で成長を遂げ得る酵母）では、２つの酵素：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼを介してピルビン酸の脱炭酸が起こり得る。炭素フラックスをエタノール生産から方向転換して培養によるピルビン酸塩およびその誘導体の収量および濃度を高めるためには、ピルビン酸の脱炭酸を制限することが望ましい。
【０００６】
サッカロミセス・セレビシエでは、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．１）がピルビン酸塩のアセトアルデヒドへの変換を触媒し、これが発酵糖代謝の第１段階となる。ピルビン酸デカルボキシラーゼはその異化作用に加え、生合成機能も果たすことは提示されている。特定のピルビン酸デカルボキシラーゼ陰性（Ｐｄｃ陰性）の（例えば、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない）サッカロミセス・セレビシエ株は、グルコースが唯一の炭素源である場合、少量のエタノールまたは酢酸塩（例えば、増殖に必要な５％の炭素）の添加なしでは、好気性グルコース制限ケモスタットにおいて合成培地で増殖できないことは当技術分野では周知のことである。このようなＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株が、唯一のそれ以外の炭素源としてグルコースを含有する合成培養培地でのバッチ培養では少量のエタノールまたは酢酸塩の存在下でさえも増殖しないことも分かっている。これに対して、糖で好気増殖させた場合、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していないクラブトリー陰性酵母はこのような増殖要件を示さない。
【０００７】
当技術分野ではさらに、Ｐｄｃ陰性トレオニンアルドラーゼを過剰発現するサッカロミセス・セレビシエが好気性糖制限ケモスタットで増殖し得るということから、Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエにおいては、酵母におけるトレオニンアルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．２．５）の過剰産生により、特定の条件下でピルビン酸デカルボキシラーゼの生合成活性の喪失を回避することができることが分かっている。しかしながら、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のないトレオニンアルドラーゼ過剰産生株は高糖濃度において増殖障害がある。
【０００８】
乳酸（２−ヒドロキシプロピオン酸、ＣＨ３ＣＨＯＨＣＯＯＨ）は、発酵または化学合成により合成できる天然に存在するヒドロキシル酸である。乳酸は、保存剤および香味増強剤として食品に用いることができる。乳酸誘導体は、塗料および電着塗装のような工業用途、医薬品および化粧品に用いることができる。乳酸の脱水により生成し得る重要な化合物がポリ（乳酸）プラスチックである。
乳酸デヒドロゲナーゼを有する（例えば、ＬＤＨを有する）プラスミドで形質転換した野生型Ｓ．セレビシエは、培養すると多少の乳酸を産生し得る。ポリマー用供給材料として使用する場合には、乳酸を回収し、可能な限り最高の純度に精製することが好ましい。有機不純物（例えば、複合窒素源から生じたもの）、無機不純物（培地成分および中和剤に関連したもの）および発酵中に産生生物によって分泌される代謝中間体は、総て除去することが好ましい。
【０００９】
発明の開示
特定の実施形態において、本発明は、サッカロミセス・セレビシエ酵母株と、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しておらず、かつ、比較的高い濃度のピルビン酸およびその塩を生成するための唯一の炭素およびエネルギー源として比較的高い濃度のグルコースを含有している合成培地において好気性バッチ培養により増殖し得る特定の他のクラブトリー陽性酵母株に向けられる。このような酵母株は、代謝工学を利用せず、本発明の特定の実施形態を用いることによって得ることができる。特定の実施形態において、それらの酵母のトレオニンアルドラーゼの活性レベルは野生型株ほど高くない。
【００１０】
本発明の特定の実施形態は、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、その野生型酵母株がクラブトリー陽性であるグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株に向けられる。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株は、とりわけ、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、デンプン加水分解物、ガラクトース、高フルクトースコーンシロップ 、ラクトースおよびリグノセルロース加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含有する培養培地で増殖させることが可能である。本発明の特定のＧＣＳＩ酵母株は、合成培地において好気性バッチ培養により培養した場合に、１リットル当たり少なくとも約０．５モル濃度のピルビン酸を産生することが可能である。いくつかの実施形態において、そのＧＣＳＩ酵母株はＳ．セレビシエ酵母である。別の実施形態において、そのＧＣＳＩ酵母株はカンジダ・グラブラタである。本発明の特定のＧＣＳＩカンジダ・グラブラタ酵母株は、カンジダ・グラブラタ酵母株が炭素源として使用することができる糖（例えば、グルコース）を含有する無機培地で培養した場合に、約７００ｍＭを上回るピルビン酸またはその塩を産生することが可能である。
【００１１】
本発明の特定の実施形態は、ＧＣＳＩ酵母株を選択する方法に向けられ、別の実施形態は、このような方法を用いて選択され得る酵母株に向けられる。本選択方法は、好気性炭素制限ケモスタットで酵母培養物を増殖させることを含む。酵母培養は、第１の無機培地にＰｄｃ陰性酵母株を接種することにより開始される。Ｐｄｃ陰性酵母株の野生型酵母株は、クラブトリー陽性である。Ｐｄｃ陰性酵母株は、野生型酵母株のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を取り除いて得られる酵母株である。
【００１２】
第１の無機培地は、培養物の増殖開始時にグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として含有しており、２つの炭素源の濃度は酵母培養物を増殖させるのに十分なものである。ケモスタットでの酵母培養物の増殖中に供給培地のＣ２炭素源の濃度を、Ｃ２炭素源の濃度が目的範囲内である全炭素の約１０％〜０％の間となるように低減する。
【００１３】
Ｃ２炭素源の濃度が目的範囲に達したら、少なくとも１種のＣ２炭素源非依存性酵母株をケモスタット酵母培養物から回収する。回収するＣ２炭素源非依存性酵母株は、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していないものである。次いで、そのＣ２炭素源非依存性酵母株を、第２無機培地を用いて１回の好気性バッチ培養によるか、または一連の好気性バッチ培養により培養する。グルコースをバッチ培養での唯一の炭素源とし、グルコースの濃度をその一連のバッチ培養を通じて高める。バッチ培養またはその一連のバッチ培養を開始する最初のバッチ培養におけるグルコースの濃度は、Ｃ２炭素源非依存性酵母株が増殖する濃度である。「増殖するグルコースの量」で始めることが、実質的に、グルコース耐性についての最初の選択となる。よって、特定の実施形態において、Ｃ２炭素源非依存性酵母株は、Ｃ２炭素源非依存性酵母株が突然変異し、バッチ培養によりグルコースの存在下で増殖し始めるまで、低グルコースを唯一の炭素源とする場合でさえ増殖できない。選択する突然変異株は、グルコースを唯一の炭素源として用いて増殖させることが可能なものである。一連のバッチ培養では、一連の各バッチ培養物にその一連のバッチ培養で先にバッチ培養増殖させた酵母を播種する。
【００１４】
その一連のバッチ培養のバッチ培養物から少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株を回収する。そのＧＣＳＩ酵母株は、Ｃ２炭素源なしにグルコースを唯一の炭素源として用いて増殖させることが可能なものである。回収するＧＣＳＩ酵母株は、回収したＣ２炭素源非依存性酵母株より高いグルコース耐性を有し、かつ、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していないものである。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株は、（Ａ）野生型酵母株で発現され得る少なくとも１つのＰＤＣ構造遺伝子；（Ｂ）野生型酵母株で発現され得る少なくとも１つのＰＤＣ調節遺伝子；（Ｃ）ＰＤＣ構造遺伝子のプロモーター；および（Ｄ）ＰＤＣ調節遺伝子のプロモーターを含んでなる。（Ａ）〜（Ｄ）の少なくとも１つが、（ｉ）突然変異しているか、（ii）破壊されているか、または（iii）欠失している。（Ａ）〜（Ｄ）の少なくとも１つの突然変異、破壊または欠失は、特定の実施形態において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を消失するものであり得る。
【００１５】
特定の実施形態は、グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を選択する方法とこのような方法を用いて選択されたＧＣＳＩ酵母株に向けられる。本方法は、無機培地にＰｄｃ陰性酵母株（例えば、上記のようなＰｄｃ陰性酵母）を接種することを含む。Ｐｄｃ陰性酵母株を好気培養する。酵母培養物の増殖開始時に、無機培地はグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有している。酵母培養物が増殖するにつれてＣ２炭素源の濃度を、その培養物がＣ２炭素源なしで増殖可能になるまで低減する。酵母培養物が増殖するにつれてグルコースの濃度を上昇させる。最後に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のない少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株を回収する。特定の実施形態において、Ｃ２炭素源の濃度を低減する段階とグルコースの濃度を上昇させる段階は同時に行われ、好ましくは、それらの同時に起こる段階が好気性ケモスタットにおいて実施される。別の実施形態において、グルコースの濃度を上昇させる段階はＣ２炭素源の濃度を低減する段階の前に行われ、好ましくは、それらの段階が好気性ケモスタットにおいて実施される。さらに別の実施形態において、Ｃ２炭素源の濃度の低減はグルコースの濃度を上昇させる段階の前に行われる。低減する段階を最初に行う場合、特定の実施形態において、上昇させる段階と低減する段階の両方をケモスタットにおいて実施してもよいし、あるいは、低減する段階をケモスタットにおいて行い、上昇させる段階を一連のバッチ培養を通じて行ってもよい。
【００１６】
本発明の特定の実施形態は、ピルビン酸またはその塩を生産する方法に向けられる。本方法は、グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を第１の培養培地で好気培養して、ピルビン酸またはその塩を産生させることを含む。ＧＣＳＩ酵母株の野生型株は、クラブトリー陽性である。第１の培養培地は、とりわけ、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、デンプン加水分解物、高フルクトースコーンシロップおよびリグノセルロース加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含有している。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株を第１の培養培地において好気性バッチ培養により培養した場合に、１リットル当たり少なくとも約１．５３モルのピルビン酸が生産される。第１の培養培地は、特定の実施形態において、無機培地であり、特に、グルコースを唯一の炭素源として含有する無機培地である。生産されたピルビン酸またはその塩は、当技術分野で公知の方法を用いてさらに精製してもよい。
【００１７】
本発明の特定の実施形態は、該ＧＣＳＩ酵母株で発現され得る外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むゲノムを含んでなる、上述のようなＧＣＳＩ酵母株に向けられる。外来乳酸遺伝子の発現の結果として生じるタンパク質は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有している。いくつかの実施形態において、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＣＳＩ−Ｌ）を有するＧＣＳＩ酵母株は、グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で培養した場合に、１００グラムグルコース当たり約７０グラムを上回る乳酸を産生することが可能である。ＧＣＳＩ−Ｌ株は、特定の実施形態において、遺伝子型ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２  ＹＥｐＬｐＬＤＨを有するサッカロミセス・セレビシエである。いくつかの実施形態において、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ウシ、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、リゾプス・オリザエ(Rhizopus oryzae)またはバチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophylus)乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。このような遺伝子の核酸配列の例は、Ｇｅｎｂａｎｋで、それぞれ、受託番号ＡＪ２９３００８、ＮＰ  ７７６５２４、Ｍ７６７０８、Ｍ２２３０５、Ｑ９Ｐ４Ｂ６およびＭ１９３９６として入手できる。外来ＬＤＨを有するＧＣＳＩ酵母株は、特定の実施形態において、最少培地で好気培養した場合に、培養ブロス中、約１００ｇｌ−１を上回る乳酸を産生することが可能である。いくつかの実施形態において、外来ＬＤＨを有するＧＣＳＩ酵母株は、Ｌ−乳酸から本質的になる乳酸を産生することが可能である。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、乳酸またはその塩を生産する方法に向けられる。本方法は、ＧＣＳＩ−Ｌ酵母株を第１の培養培地で好気培養することを含む。外来ＬＤＨを有するＧＣＳＩ酵母株は、グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で増殖させた場合に、１００グラムグルコース当たり少なくとも約７０グラム乳酸を産生することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」（Ｐｄｃｐ）とは、ピルビン酸塩のアセトアルデヒドへの変換を触媒し得るタンパク質（例えば、酵素）をさす。「ＰＤＣ」とは、ピルビン酸デカルボキシラーゼの特定の野生型遺伝子をさす。「ｐｄｃ」とは、特定の突然変異ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子をさす。「検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有さない」とは、これまでに記述されている方法（２４）を用いたときに、酵母におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が１ｍｇタンパク質当たりの検出限界０．００５マイクロモル／分に満たないことをさす。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、当技術分野で公知の方法を用いて低下させ、または本質的に酵母株から取り除くことができる。例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ構造遺伝子、ピルビン酸デカルボキシラーゼ構造遺伝子のプロモーター、ピルビン酸デカルボキシラーゼ構造遺伝子の発現を調節する遺伝子またはその調節遺伝子のプロモーターを突然変異させてもよいし、破壊させてもよいし、あるいは遺伝子の少なくとも一部を欠失させてもよい。こうすることによって、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低下するか、または酵母株には検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性がなくなってしまう。さらに、当技術分野で公知の他の方法を用いて遺伝子発現を改変してもよい。例えば、アンチセンス構築物を酵母株に導入することによって、ピルビン酸デカルボキシラーゼｍＲＮＡのピルビン酸デカルボキシラーゼタンパク質への翻訳を低減することができる。
【００２０】
「Ｐｄｃ陰性酵母株」とは、検出可能なピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しておらず、かつ、好気性環境においてグルコースを唯一の炭素源とする合成培養培地で増殖できない酵母をさす。少なくとも一部のＰｄｃ陰性株は、好気性環境において無機培地での増殖中、検出可能な量のエタノールを産生しない。好気性グルコース制限ケモスタットにおいて合成培地で増殖させるＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエは、少量のＣ２炭素源（例えば、エタノール、アセトアルデヒドおよび／または酢酸塩）の添加を必要とする。この同じＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株は、唯一の炭素源としてグルコースを含有する合成培地でのバッチ培養では少量のエタノールまたは酢酸塩の存在下でさえも増殖しない。Ｐｄｃ陰性株に対応するその同系野生型株は、クラブトリー陽性である（以下の考察を参照）。この野生型株は、検出可能なピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有している。唯一の炭素源としてグルコースを含有している培養培地で増殖させることができないＰｄｃ陰性株は、野生型株からピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を取り除いて得られる（例えば、とりわけ、構造遺伝子の破壊もしくは突然変異によるか、または遺伝子発現の調節阻害による）。
【００２１】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」（Ｌｄｈｐ）とは、ピルビン酸塩の乳酸塩への変換を触媒するタンパク質（例えば、酵素）をさす。「ＬＤＨ」とは、発現されたときに乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が産生する野生型遺伝子をさす。「ｌｄｈ」とは、突然変異乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をさす。本願で使用するＬＤＨとしては、当技術分野では乳酸デヒドロゲナーゼとして選ばれていないが、発現されたときに乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質を産生する遺伝子を含む場合がある。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、立体特異性を有している場合がある。すなわち、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、Ｌ−乳酸塩だけまたはＤ−乳酸塩だけを生成する反応を触媒し得る。Ｌ−およびＤ−乳酸塩の両方を生成する反応を触媒する他の乳酸デヒドロゲナーゼもある。Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ピルビン酸塩のＬ−乳酸塩への変換を触媒するものである。
【００２２】
「野生型酵母」とは、そのゲノムに遺伝的な遺伝子変化が導入されたときに、酵母突然変異体が生じる酵母をさす。言い換えれば、その酵母突然変異体株は、野生型酵母株のゲノムには存在しない特定の突然変異、欠失または挿入がそのゲノムに導入されているということから、その野生型株とは異なる遺伝子型を有している。このように、野生型酵母株にはその酵母突然変異体株のゲノムに存在する変化はない。酵母突然変異体株は、場合によっては、その野生型株とは異なる表現型を有している。酵母突然変異体株は、とりわけ、相同組換え、特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発を伴うものをはじめとする当技術分野で公知の方法により作製することができる。特定の場合において、酵母突然変異体株は、自然選択を伴う工程によって回収される。
【００２３】
「親酵母」とは、新生酵母株が直接誘導された由来となる酵母をさす。例えば、親株として、そのゲノムに外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する、増殖にＣ２炭素源（以下を参照）を必要とする酵母を含むかもしれない。その親株から酸耐性についての選択工程を通じて、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する酸耐性酵母株が誘導される可能性がある。その酸耐性Ｃ２炭素源依存性酵母株が、今度は、酸耐性酵母株のＣ２炭素源非依存性についての選択工程を通じて、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する酸耐性Ｃ２炭素源非依存性酵母株の親株となる可能性がある。親株は、場合によっては、野生型株であるが、このことが要件ではない。
【００２４】
「Ｃ２炭素源非依存性酵母株」とは、検出可能なピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、唯一の炭素源としてグルコースを含有している無機培地で培養した場合に、Ｃ２炭素源を必要としない酵母をさす。Ｃ２炭素源非依存性酵母株は、グルコースを好気性グルコース制限ケモスタットでの唯一の他の炭素源とする無機培地で増殖させるためにＣ２炭素源を必要とするＰｄｃ陰性親株の操作（例えば、とりわけ、選択または部位特異的突然変異誘発）を通じて誘導される。Ｃ２炭素源非依存性酵母株のトレオニンアルドラーゼの活性レベルは、いくつかの実施形態において、同一条件下で増殖させたその野生型株ほど高くない。
【００２５】
「グルコース耐性酵母株」とは、本明細書において、Ｐｄｃ陰性またはＣ２炭素源非依存性酵母親株から単一または多段階選択工程によって誘導された酵母をさす。グルコース耐性酵母株は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない。グルコース耐性酵母株とその親株を同一条件下（例えば、とりわけ、ｐＨ、温度）、同じ無機培地で増殖させた場合、グルコース耐性酵母株は、親株が増殖し得るグルコース濃度より高いグルコース濃度の培地で増殖し得る。また、グルコース耐性酵母株とその親株を同一または類似の条件下、グルコースを唯一の炭素源とする、同じグルコース濃度の同じ培地で増殖させた場合、グルコース耐性酵母株は、その親株（例えば、Ｐｄｃ陰性株がＣ２炭素源非依存性酵母株の親株であり、それからＣ２炭素源非依存性酵母株が誘導され得る）より高い細胞密度まで増殖し得る。また、グルコース耐性酵母株とその親株を同一または類似の条件下、グルコースを唯一の炭素源とする、同じグルコース濃度の同じ培地で増殖させた場合、グルコース耐性酵母株は、その親株より高い比増殖速度を有し得る。本発明の特定の実施形態において、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していないグルコース耐性酵母株は、１リットル当たり少なくとも０．５ｇのグルコースを含有している無機培地で増殖し得る。
【００２６】
「より高いグルコース耐性」とは、その酵母株と別の酵母株を本質的に同じ条件下、唯一の炭素源としてグルコースを含有している本質的に同じ培養培地で増殖させた場合に、その酵母株を別の酵母株より高いグルコース濃度で増殖させることが可能であることをさす。また、この用語は、その酵母株と別の酵母株を唯一の炭素源であるグルコースを本質的に同じ濃度で含有している本質的に同じ培養培地で増殖させた場合に、その酵母株を別の酵母株よりも高い培養密度まで増殖させることが可能であることをさす場合もある。より高いグルコース耐性を有する酵母株は、その酵母株と別の酵母株を同一または類似の条件下、グルコースを唯一の炭素源とする、本質的に同じグルコース濃度の本質的に同じ培地で増殖させた場合に、別の酵母株より高い比増殖速度を有し得る。
【００２７】
「クラブトリー効果」とは、（ａ）過剰の酸素および過剰の糖（例えば、炭水化物）（特定の実施形態において「過剰の糖」とは、約１ｍＭを上回る濃度であることである）を含有している環境において、または（ｂ）酵母株の比増殖速度がグルコースでの臨界比増殖速度より速い（例えば、グルコースでの最大比増殖速度の約３分の２）培養において酵母株によって行われるアルコール発酵と定義される。酵母株がクラブトリー効果を示す場合にはその酵母株は「クラブトリー陽性」であり、クラブトリー陽性酵母株は、過剰の糖の存在下でその主要なピルビン酸脱炭酸経路としてピルビン酸デカルボキシラーゼ経路を使用する。クラブトリー陽性酵母の例は、とりわけ、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・グラブラタ（とりわけ、トルロプシス・グラブラタの別名で知られる）、チゴサッカロミセス・バイリーおよびシゾサッカロミセス・ポンベの間で見られる。「クラブトリー陰性酵母株」は、ピルビン酸脱炭酸のその主要な機構としてピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の反応を利用する。過剰な糖を用いて好気増殖させる場合、クラブトリー陰性酵母株ではアルコール発酵がほとんど起こらず、呼吸ピルビン酸代謝が主として起こる。クラブトリー陰性酵母株においてピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を除去しても、糖での好気増殖には影響がないようである。クラブトリー陰性酵母の例は、カンジダ・ウチリス（Candida utilis）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）およびヤローウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)の間で見られる。
【００２８】
「トレオニンアルドラーゼ」（例えば、Ｇｌｙｌｐ）とは、トレオニンを化合物、アセトアルデヒドおよびグリシンへと変換する反応を触媒し得るタンパク質（例えば、酵素）をさす。「トレオニンアルドラーゼ活性がない」とは、これまでに記述されている方法（２４）を用いたときに、ある株におけるトレオニンアルドラーゼ活性が１ｍｇタンパク質当たりの検出限界０．００５マイクロモル／分に満たないことと定義される。「トレオニンアルドラーゼ活性が低い」とは、特定の酵母株が示すその活性が同一または類似の条件下で増殖させた親酵母株またはその野生型株のトレオニンアルドラーゼ活性よりも低いことと定義される。本発明において使用する「トレオニンアルドラーゼの過剰発現」とは、特定の酵母株のトレオニンアルドラーゼ活性が同一または類似の条件下で増殖させた野生型株で見られるその活性より高いことをさす。
【００２９】
「培養培地」とは、微生物（例えば、酵母）が増殖し得る、少なくとも１種の炭素源を含む十分な栄養素を含有している固体または液体培地をさす用語である。ケモスタットまたはバッチ培養では、培地は液体である。
【００３０】
「液体培地で培養すること」とは、微生物を増殖させ、および／または液体培養培地において微生物によって産生された乳酸およびピルビン酸を継続的に蓄積させることを指す。
【００３１】
「炭素源」とは、微生物（例えば、酵母）が吸収でき、新しい細胞材料を作製するのに使用できる有機化合物（例えば、グルコース）または有機化合物の混合物をさす。
「Ｃ２炭素源」とは、２個の炭素を含有している炭素源を指す。Ｃ２炭素源の例は、酢酸塩、アセトアルデヒドおよびエタノールである。
【００３２】
「無機培地」、「最少培地」または「合成培地」とは、窒素源、塩、微量元素、ビタミンおよび炭素源を含有しており、これらの全てが規定されている、微生物（例えば、酵母）増殖用培養培地をさす。炭素源は、とりわけ、グルコース、スクロース、ラクトース、ガラクトースまたはフルクトースの少なくとも１種を含んでいてよい。合成培地には、例えば、複合培養培地に使用することもある、とりわけ、コーンスティープリカー、酵母抽出物またはペプトンのような組成が規定されていない栄養源は含めない。特定の実施形態において、無機培地は、（ＮＨ４）２ＳＯ４；ＫＨ２ＰＯ４；ＭｇＳO４、ＥＤＴＡ、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４；ＣａＣｌ２；ＦｅＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４、Ｈ３ＢＯ３；ＫＩ、および、所望により、消泡剤を含んでいてよい。
【００３３】
「固体培養培地で増殖させることが可能である」とは、コロニーが肉眼で確認できないように固化培養培地にストリークしたか、または塗布した微生物（例えば、酵母）が、好適な環境（例えば、とりわけ、ｐＨおよび温度）でしばらくの間インキュベートした後に肉眼で確認できる少なくとも１つのコロニーを生じる能力をさす。
【００３４】
「液体培養培地で増殖させることが可能である」とは、好適な培養条件（例えば、とりわけ、ｐＨおよび温度）下で液体培養培地に添加した微生物（例えば、酵母）が、培養物のバイオマスが培養の増殖期中に増加するように複製する能力をさす。
【００３５】
「ケモスタット」とは、比増殖速度と細胞数の両方を独立に制御することができる、微生物（例えば、酵母）の連続培養が可能である装置をさす。連続培養とは、本質的に、培地が連続的に添加され、オーバーフローが連続除去されるという一定量のフローシステムである。このようなシステムが平衡状態になると、細胞数および栄養状態が変化しなくなり、このシステムは定常状態となる。ケモスタットは、希釈率と炭素源または窒素源のような制限栄養素の濃度の変更を通じて、集団密度と培養物の比増殖速度の両方を制御することができる。
【００３６】
微生物の突然変異体の選択にケモスタットを使用し得ることは当技術分野では周知のことである。培養物をケモスタットで増殖させる条件を変更する（例えば、とりわけ、接種株の増殖に必要な第２の炭素源の濃度を低減する）ことにより、変更した条件でより速く増殖し得る集団に属する微生物が選択され、増殖させることで新しい条件下では同様に機能しない微生物と分けられる。一般に、このような選択では、少なくとも１種の培養成分を、ケモスタット培養増殖を通じて段階的に増加するか、または低減する必要がある。
【００３７】
「バッチ培養」とは、（ａ）増殖している生物体の作用によって増殖に適さなくなるまで継続的に変更され続ける、一定量の培養培地で増殖が起こっている微生物の閉鎖系、または（ｂ）バイオマスが取り出されることなく、栄養素が微生物の培養物に供給される（例えば、ケモスタットなどの場合）、微生物がそれらの培地（例えば、環境）を変更している系のいずれかをさす。バッチ培養（例えば、振盪フラスコ）による微生物の拡大培養を利用して、接種株が増殖しないか、または接種株の増殖が悪いと思われる条件下で比較的よく増殖する自然発生突然変異体について選択し得ることは当技術分野では周知のことである。
【００３８】
「一連のバッチ培養」は、その一連のバッチ培養を通じて変更しようとする少なくとも１種の規定成分（すなわち、特定の炭素源の濃度）を含有する培養培地における、第１の酵母株の第１のバッチ培養増殖を伴う。増殖させた第１のバッチ培養物の１アリコートを用いて第２のバッチ培養物に接種する。増殖させた第２のバッチ培養物の１アリコートをさらに用いて第３の培養物に接種するなどである。一連の段階数は様々である。その一連のバッチ培養を通じて、規定成分の濃度が高められるか、または低減される。一連のものの特定の段階（例えば、バッチ培養）においてその条件下で最大の増殖をし得る微生物が選択され（例えば、特定の培養条件下では同様に増殖しない他の微生物と分けられる）、それらの微生物がその次のバッチ培養の接種材料として使用される。このように、その一連のバッチ培養を通じて、第１の酵母株が増殖し得ない条件下で増殖し得る微生物か、または同じ増殖条件下で第１の酵母株よりよく増殖する微生物を選択することができる。さらに、選択された培養物から個々の純粋株を単離することは当技術分野では周知のことである。この単離は、少量の生物体培養物をストリーク培養することによるか、または当技術分野で公知の他の方法により行うことができる。
【００３９】
「選択マーカー」とは、その発現がその核酸配列を含有する細胞の同定を容易にする表現型を与える核酸配列をさす。選択マーカーとしては、有毒化学薬品に耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性）を与えるもの、栄養欠乏（例えば、ウラシル、ヒスチジン、ロイシン）を補足するもの、または視覚的に目立つ特徴（例えば、色の変化、蛍光性）与えるものが挙げられる。
【００４０】
「選択」とは、酵母を特定の遺伝子型または特定の遺伝子型群を有する細胞の増殖に有利な条件下に置くことをさす。選択された酵母の後代が増殖により親と分けることができ、および／または親に取って代わることができるように、選択された酵母は、特定の環境条件下で特定の遺伝子型（多くの場合、遺伝子突然変異による）という利点を有するものである。
【００４１】
「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはＲＮＡ分子をコードする染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他のＤＮＡ、および発現の調節に関連するコード配列のフランキング領域をさす用語である。
「プラスミド」とは、自己複製する染色体外環状ＤＮＡ断片をさす。
【００４２】
「２ミクロンプラスミド」とは、特定の酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ）内で複製可能な酵母クローニングベクターをさす。プラスミド内に存在し得る特定の遺伝子は、酵母宿主細胞（例えば、２ミクロンプラスミドで形質転換された酵母）において認識され、使用されるプロモーターにそのプラスミドにおいて作動可能なように連結された場合に、発現させることができる。
【００４３】
「ゲノム」とは、宿主細胞内にある染色体とプラスミドの両方を包含する用語である。
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖の塩基対合による相補鎖との結合能力をさす。ハイブリダイゼーションは、２核酸鎖の相補配列が互いに結合して起こる。
【００４４】
「突然変異」とは、核酸配列の変化または変更をさす。点突然変異、フレームシフト突然変異およびスプライシング突然変異をはじめとするいくつかのタイプのものが存在する。突然変異は、特異的にまたはランダムに行われる。
「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのある領域をさす。
【００４５】
「プロモーター」または「プロモーター領域」とは、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位を提供することによりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の産生を制御するエレメントおよび／または適正部位での転写開始に必要な他の因子を含むＤＮＡ配列をさす用語である。
【００４６】
「転写」とは、ＤＮＡ鋳型から相補的ＲＮＡを作製するプロセスをさす。
「翻訳」とは、メッセンジャーＲＮＡからのタンパク質の産生をさす。
「収量」とは、ピルビン酸またはその塩を生産し、バイオマスがこの変換を触媒するプロセスの所望の終了時点において、生産されたピルビン酸またはその塩の総量（ｇ／ｌ）を消費されたグルコース量（ｇ／ｌ）で除したものをさす用語である。
【００４７】
「ピルビン酸」とは、解離型２−オキソプロパン酸と非解離型２−オキソプロパン酸とを合わせたものと定義される。
「少なくともある濃度の」とは、特定の酵母培養物において調整可能な最小濃度（例えば、ｇ／ｌまたはｍＭのピルビン酸）をさす。
【００４８】
本発明において使用する「乳酸」とは、解離していない酸と乳酸塩の両方を包含する。よって、Ｘｇ乳酸／１００ｇグルコースとは、発酵用に供給した各１００ｇグルコースについての解離していない乳酸と乳酸陰イオンとを合わせた総量をさす。発酵ブロスのｐＨ値が約３．０〜４．５の間である場合には、多量の非解離型乳酸が存在している。実際にｐＨが３．０である場合には、解離していない乳酸と乳酸イオンの２５℃でのモル比は約７．０であり、ｐＨが約４．５の場合には、２５℃でのその比は約０．２３である。溶液中に存在する解離していない乳酸の総量は、溶液のｐＨと混合物としての乳酸の濃度との両方に依存する。溶液のｐＨが低くなるほど、非解離型として存在する乳酸の割合が高くなる。例えば、培地が乳酸のｐＫａ（約３．８）と等しい場合、乳酸の５０％が非解離型として存在する。ｐＨ４．２では、乳酸の約３１％が非解離型であり、ｐＨ４．０および３．９では、それぞれ、乳酸の約４１％および４７％が非解離型である。ｐＨが高くなると解離していない乳酸の割合はさらに低くなり、ｐＨ４．５では１８％、ｐＨ５．０では６．６％となる。
【００４９】
「発酵ブロス」とは、微生物（例えば、酵母）を液体発酵培地で培養したときに生じるブロスをさす。発酵ブロスは、液体発酵培地の総ての未使用成分と生物体による発酵の結果として生じる代謝産物または生成物の総てを含んでなる。
【００５０】
「酸素制限」または「酸素供給の制限」とは、気相から液相への酸素移動容量が微生物の酸素要求量より低い状況と定義される。この状況は、溶存Ｏ２圧がゼロに近いことによって示されるが、溶存Ｏ２圧が高い場合でも起こり、使用する微生物のＯ２親和性に依存している。
【００５１】
本明細書において記載するトルロプシス・グラブラタなどの特定の種名は、Barnet, Payne and Yarrow（１）による種の記載で付けられた名前を参照していることに注目すべきである。
【００５２】
図１を参照すれば、本発明の特定の実施形態をより良く理解することができる。Ｐｄｃ陰性株１に対して選択を行い、Ｃ２炭素源非依存性株２を回収する。Ｐｄｃ陰性株の野生型は、クラブトリー陽性である。Ｐｄｃ陰性酵母株は、野生型クラブトリー陽性酵母株のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を取り除いて得られる酵母株である。Ｐｄｃ陰性酵母株は、サッカロミセス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、トルラスポラ属(Torulaspora)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）およびデッケラ属（Dekkera）（当技術分野で公知のいくつかある名前の中で、特に、ブレタノミセス属(Brettanomyces)の別名で知られる）からなる群から選択される属に属するものである。好ましくは、Ｐｄｃ陰性酵母株が、サッカロミセス属、カンジダ属、シゾサッカロミセス属およびクルイベロミセス属から選択される属、より好ましくは、サッカロミセス属に属するものである。特定の実施形態において、Ｐｄｃ陰性酵母株は、クルイベロミセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans)株、チゴサッカロミセス・バイリー株、サッカロミセス・セレビシエ株、シゾサッカロミセス・ポンベ株、トルラスポラ・グロボサ(Torulaspora globosa)株、トルラスポラ・デルブルッキー(Torulaspora delbruckii)株、デッケラ・ブルクセレンシス(Dekkera bruxellensis)株またはカンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタの別名で知られる）株に属するものである。
【００５３】
好ましくは、酵母株は、サッカロミセス・セレビシエまたはカンジダ・グラブラタに属するもの、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシエに属するものである。
【００５４】
Ｐｄｃ陰性酵母株は、（Ａ）野生型酵母株で発現され得る少なくとも１つのＰＤＣ構造遺伝子；（Ｂ）野生型酵母株で発現され得る少なくとも１つのＰＤＣ調節遺伝子；（Ｃ）ＰＤＣ構造遺伝子のプロモーター；および（Ｄ）ＰＤＣ調節遺伝子のプロモーターを含んでいてよい。特定の実施形態において、（Ａ）〜（Ｄ）の少なくとも１つは、Ｐｄｃ陰性突然変異株作出の一環として、（ｉ）突然変異しているか、（ii）破壊されているか、または（iii）欠失している。特定の実施形態において、Ｐｄｃ陰性酵母株は、不活性化した（例えば、突然変異、欠失、破壊またはアンチセンスｍＲＮＡの使用による）野生型酵母株で発現され得るＰＤＣ構造遺伝子総てを有する。野生型ＰＤＣ構造遺伝子は、例えば、当技術分野で公知のｌｏｘＰ系を使用してノックアウトすることができる。野生型ＰＤＣ構造遺伝子は、相同組換えによりその遺伝子に選択マーカーを挿入することによって破壊することもできる。さらに別の実施形態においては、アンチセンスＲＮＡ（例えば、当技術分野で公知の方法）を使用してＰＤＣ  ｍＲＮＡまたはＰＤＣ調節遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、野生型株からピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を取り除くことができる。好ましくは、Ｐｄｃ陰性酵母株が、Ｓ．セレビシエに属するものであり、そのＰｄｃ陰性酵母株が、遺伝子型ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰを有している。いくつかの実施形態において、Ｐｄｃ陰性酵母は、遺伝子型ｐｄｃ１，５，６Δ（例えば、ＰＤＣ１，５，６構造遺伝子の一部が欠失または完全に欠失）を有するサッカロミセス・セレビシエである。特定の実施形態において、Ｐｄｃ陰性酵母株１と野生型株を本質的に同じ条件下で増殖させた場合、Ｐｄｃ陰性酵母株１のトレオニンアルドラーゼの活性レベルは野生型株ほど高くない。いくつかの実施形態において、Ｐｄｃ陰性酵母株は、とりわけ、ｕｒａ、ｌｅｕまたはｈｉｓ栄養要求性酵母株であり得る。特定の実施形態において、Ｐｄｃ陰性酵母株は、ｕｒａ栄養要求性酵母株である。
【００５５】
Ｃ２炭素源非依存性酵母株２の選択は、好気性炭素制限ケモスタットで酵母培養物を増殖させることを含む。第１の無機培地にＰｄｃ陰性酵母株１を接種する。ケモスタットでの培養物の増殖開始時にグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有する第１の無機培地を使用する。ケモスタットでの酵母培養物の増殖中に第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度を、第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度が目的範囲である全炭素の約１０％〜０％の間、より好ましくは、約５％〜０％の間、最も好ましくは、約０％に達するまで低減する。Ｐｄｃ陰性株の増殖のためのＣ２炭素源要件が異なる酵母株も存在し得るため、異なる酵母株では、Ｃ２炭素源の目的範囲が変わることがある。例えば、あるＰｄｃ陰性酵母株は全炭素の２％で増殖するかもしれず、このケースでは、目的範囲は２％未満、好ましくは、０％であろう。Ｐｄｃ陰性酵母株１が栄養要求性酵母株（とりわけ、ｌｅｕ−、ｈｉｓ−およびｕｒａ−）である特定の実施形態においては、酵母の増殖に必要な栄養要求性関連化合物が培養物を増殖させるのに十分な量で培地に添加される。例えば、酵母株がｕｒａマイナスであるならば、第１の無機培地がＰｄｃ陰性酵母株１の栄養要求性を救済するのに十分な量でウラシルを含んでいてよい。
【００５６】
ケモスタットでの酵母培養物の増殖中、第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度が目的範囲に達したら、少なくとも１種のＣ２炭素源非依存性酵母株２を培養物から回収する。Ｃ２炭素源非依存性酵母株２は、Ｐｄｃ陰性酵母株１に関して以上で記載した属または種に属するものであることが好ましい。Ｃ２炭素源非依存性酵母株２は、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない。このような検出可能な活性の欠如は、Ｐｄｃ陰性親株から受け継がれる突然変異に起因していることが好ましい。特定の実施形態において、Ｃ２炭素源非依存性酵母２と野生型株を本質的に同じ条件下で増殖させた場合、Ｃ２炭素源非依存性酵母２のトレオニンアルドラーゼの活性レベルは野生型株ほど高くない。Ｃ２炭素源非依存性酵母２は、当技術分野で公知の方法を用いて回収することができる。例えば、Ｃ２炭素源が目的範囲内となったときの培養物から１アリコートを、唯一の炭素源として２％エタノールを含有している固体培養培地に塗布する。場合によっては、当技術分野では周知であるように、平板に塗布する前にそのアリコートを希釈する必要がある場合もある。次いで、培地の酵母をその増殖を促す環境においた後、個々のコロニーを、当技術分野で公知の方法を用いて、固体培養培地から単離することができる。個々のコロニーから増殖させた培養物は、単一遺伝子型を有する酵母で構成されているはずである。また、単離酵母株が実際にＣ２炭素源非依存性であるということを確認するためにその単離酵母株を試験してもよい。さらに、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２が検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していないことを確証するためにそのＣ２炭素源非依存性酵母株２を試験してもよい。特定の実施形態において、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２は、無機増殖培地のグルコース濃度が比較的高い（例えば、約５ｍＭを上回る）場合には十分に増殖せず、場合によっては、唯一の炭素源として少量のグルコースを含有する無機培地でさえも増殖しない。
【００５７】
いくつかの実施形態においては、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２を、第２の無機培地を用いて一連の好気性バッチ培養により増殖させ、グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株３を選択することができる。グルコースは、第２の無機培地における唯一の炭素源である。一連の各バッチ培養物にその一連のバッチ培養で先にバッチ培養増殖させた酵母を播種する。その一連のバッチ培養は、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２を増殖させる培地にある量のグルコースを存在させることから開始される。最初のバッチ培養で増殖するＣ２炭素源非依存性酵母株は、Ｃ２炭素源非依存性酵母株の突然変異株（例えば、ＧＣＳＩ株）であり得、その突然変異株はグルコースを唯一の炭素源として用いて増殖する能力を有し得る（例えば、最初のバッチ培養での増殖は、選択によって生じ得る）。グルコースの濃度は、第２の無機培地においてその一連のバッチ培養を通じて高められる。特定の実施形態において、一連の各バッチ培養は、その直前のバッチ培養より高いグルコース濃度で開始する。別の実施形態においては、いかなるバッチ培養においても、その一連のバッチ培養を通じてその濃度を高めない。例えば、一連の連続した５回のバッチ培養では、以下のグルコース濃度、１００ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭおよび４００ｍＭであるかもしれない。少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株３は、最初のバッチ培養物から、またはその一連のバッチ培養のそれ以外のバッチ培養物から回収することができる。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株３は、培養物の１アリコートを、グルコースを唯一の炭素源として含有する固体培地平板に塗布することを含む上記の方法を用いて単離することができる。
【００５８】
特定の実施形態において、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２を、グルコースを唯一の炭素源として含有する第２の無機培地を用いて１回の好気性バッチ培養により増殖させて、グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株３を選択することができる。すなわち、１回のバッチ培養（一連のバッチ培養ではなく）で培養させただけで、グルコースを唯一の炭素源として用いて増殖し得るＣ２炭素源非依存性酵母株２の突然変異株をＧＣＳＩ酵母株３として回収することができる。
【００５９】
特定の実施形態においては、一連のバッチ培養を用いてＧＣＳＩ酵母株３を選択する代わりに、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２を好気性ケモスタットにおいて第２の無機培地で培養してもよい。ケモスタットは、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２の選択に使用したものと同じでもよいし、または異なるケモスタットでもよい。グルコースは、第２の無機培地における唯一の炭素源であり、ケモスタット培養開始時の培地のグルコース濃度は、Ｃ２炭素源非依存性酵母株２の増殖制限となるような濃度である。培養物が増殖するにつれて、別の培地成分が増殖制限となり、グルコースが培養物中に過剰に存在するように、ケモスタットの供給培地のグルコース濃度を徐々に高める。一連のバッチ培養に関して以上で記載したように、少なくとも１種のＧＣＳＩ酵母株３をケモスタットから回収することができる。
【００６０】
ＧＣＳＩ酵母株３は、グルコースを唯一の炭素源として用いて増殖させることが可能であり、ＧＣＳＩ酵母株３は、回収したＣ２炭素源非依存性酵母株２より高いグルコース耐性を有している。さらに、ＧＣＳＩ酵母株３は、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない。このような検出可能な活性の欠如は、Ｐｄｃ陰性株から受け継がれる突然変異に起因していることが好ましい。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母３と野生型株を本質的に同じ条件下で増殖させた場合、ＧＣＳＩ酵母３のトレオニンアルドラーゼの活性レベルは野生型株ほど高くない。ＧＣＳＩ酵母株３は、好気性バッチ培養および／または好気性ケモスタットで増殖させることが可能である。なお、ＧＣＳＩ酵母株３は、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ラクトース、デンプン加水分解物、ガラクトース、高フルクトースコーンシロップおよびリグノセルロース硫酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の炭素源、好ましくは、グルコースを含有する培養培地で増殖させることが可能である。
【００６１】
グルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株３を第１の培養培地で好気培養することにより、ピルビン酸またはその塩を産生させることができる。ＧＣＳＩ酵母株３の野生型株は、クラブトリー陽性である。ＧＣＳＩ酵母株３は、Ｐｄｃ陰性酵母株に関して以上で記載した属または種に属するものであることが好ましい。好ましくは、ＧＣＳＩ酵母株３が、サッカロミセス・セレビシエまたはカンジダ・グラブラタに属するもの、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシエに属するものである。ＧＣＳＩ酵母３の野生型株はクラブトリー陽性である。
【００６２】
ピルビン酸またはその塩４を産生させる際のＧＣＳＩ酵母株３の培養に使用する第１の培養培地は、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、ラクトース、デンプン加水分解物、高フルクトースコーンシロップおよびリグノセルロース加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含んでいてよい。好ましくは、第１の培養培地が、スクロースまたはグルコースの少なくとも１種を含有しており、より好ましくは、グルコースが培地における唯一の炭素源である。第１の培養培地は、ＧＣＳＩ酵母株の栄養要求性を克服するための化合物も含んでいてよい。異なる酵母では、使用する化合物と栄養要求性の性質が変わることがある。例えば、酵母がサッカロミセス・セレビシエであり、およびその酵母がｕｒａ−であるならば、酵母を増殖させるために培地にウラシルを添加してよい。あるいは、酵母に機能的遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）を導入して、サッカロミセス・セレビシエのｕｒａ−栄養要求性を克服してもよい。例えば、栄養要求性が克服されるように、プラスミドから発現され得る遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）を形質転換またはエレクトロポレーションにより酵母に導入することができる。第１の培養培地は、いくつかの実施形態において、無機培地であり得る。第１の培養培地が無機培地である場合には、その培地が、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、ガラクトースおよびラクトース、好ましくは、スクロースまたはグルコースからなる群から選択される少なくとも１種の炭素源、より好ましくは、グルコースを含んでいてよい。
【００６３】
特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株３を、好気条件下、グルコースを唯一の炭素源として含有する無機培地において好気性バッチ培養またはケモスタットで増殖させることができる。無機培地は、バッチ培養増殖開始時に約１ｍＭ〜１Ｍの間のグルコースを含有する、グルコースを唯一の炭素源とするものであることが好ましい。いくつかの実施形態において、バッチ培養培地は、約１００ｍＭ〜６１０ｍＭの間のグルコースを含んでいてよく、別の実施形態において、バッチ培養培地は、約２５０ｍＭ〜６１０ｍＭの間のグルコースを含んでいる。
【００６４】
ピルビン酸またはその塩４を生産するためにＧＣＳＩ酵母株３を培養する場合には、培養物をバッチ培養、好ましくは、ｐＨ制御されたバッチ培養で増殖させることができる。ＧＣＳＩ酵母株３のバッチ培養のｐＨを制御する場合には、好ましくは、約２．５〜８の間、より好ましくは、約３〜６の間、最も好ましくは、約４．５〜５．５の間に制御する。同様に、ピルビン酸またはその塩の生産を目的として、ＧＣＳＩ酵母株３をケモスタットで培養する場合には、ケモスタットでの培養ｐＨを同様に制御する（例えば、バッチ培養の場合と同様のｐＨ）ことが好ましい。
【００６５】
特定の実施形態においては、ＧＣＳＩ酵母株３を第１の培養培地において好気性バッチ培養により培養した場合に、１リットル当たり少なくとも約０．５モルのピルビン酸４を生産することが可能であり、より好ましくは、１リットル当たり少なくとも約０．８モルのピルビン酸４を生産することが可能であり、最も好ましくは、１リットル当たり少なくとも約１．５３モルのピルビン酸４を生産することが可能である。ピルビン酸４を生産させる場合には、培養ｐＨが約４．８〜５．２の間であることが好ましい。第１の培養培地は、無機培地であり得る。一部の無機培地は、グルコースを唯一の炭素源として含み得る。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株３は、炭素源として少なくともグルコースを含有している培養培地において好気性バッチ培養により培養した場合に、１ｇグルコース当たり少なくとも約０．５４ｇ量のピルビン酸を産生することが可能である。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株３は、カンジダ・グラブラタであり、かつ、カンジダ・グラブラタが炭素源として使用することができる糖（例えば、グルコース）を含有する無機培地で培養した場合に、約０．７Ｍを上回るピルビン酸またはその塩４を産生することが可能である。
【００６６】
ＧＣＳＩ酵母株の培養により生産し得るピルビン酸の塩４としては、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸アンモニウムおよびピルビン酸カルシウムが挙げられる。存在するならば、その塩がピルビン酸カリウムであることが好ましい。培養物には２種以上の塩が存在し得る。
【００６７】
ピルビン酸および／またはその塩４をＧＣＳＩ酵母株３培養物から精製することができる５。好ましくは、発酵ブロスからバイオマスを取り出す。バイオマスは、当技術分野で公知の方法により取り出すことができる。例えば、とりわけ、遠心分離または濾過によりバイオマスを取り出すことができる。当技術分野で公知の方法を用いて、発酵ブロスからピルビン酸またはその塩４を回収し、および／または精製することができる。発酵ブロスを、例えば、濃縮してもよい。特定の実施形態においては、ピルビン酸またはその塩４を含んでいる発酵ブロスに、特定の不純物の沈降および除去を含む最初の精製段階を行ってもよい。精製に、発酵ブロス中により多くの遊離有機酸を得るための酸性化も含めてよい。ピルビン酸またはその塩４を含んでいる発酵ブロスの精製に、濾過による固体の慎重な分離、所望により、膜濾過による大型溶質分子種の分離も含めてよい。さらに、陽イオン交換体により陽イオンを除去してもよいし、通常の固体陰イオン交換体により無機酸を除去してもよい。よって、上述のように、当技術分野で公知の方法を用いて発酵ブロスを精製することができ、このような方法に精製ピルビン酸またはその塩５を得るための蒸留、イオン交換、ナノフィルトレーションまたは溶媒抽出の少なくとも１つを含めてもよい。
【００６８】
本発明の特定の実施形態は、無機培地にＰｄｃ陰性酵母株を接種することを含むグルコース耐性Ｃ２炭素源非依存性（ＧＣＳＩ）酵母株を選択する方法に向けられる。培養物の好気増殖開始時に、第１の無機培地はグルコースとＣ２炭素源を唯一の炭素源として、酵母培養物を増殖させるのに十分な濃度で含有している。酵母培養物の増殖中に第１の無機培地のＣ２炭素源の濃度を低減し、酵母培養物の増殖中にグルコースの濃度を高める。特定の実施形態において、Ｃ２炭素源の濃度を低減する段階とグルコースの濃度を上昇させる段階は同時に行われる。両段階は、好気性ケモスタットにおいて行われることが好ましい。別の実施形態において、グルコースの濃度を上昇させる段階はＣ２炭素源の濃度を低減する段階の前に行われる。両段階が単一好気性ケモスタットにおいて実施されるか、あるいは、上昇させる段階が一好気性ケモスタットにおいて起こり、低減する段階が別の好気性ケモスタットにおいて起こることが好ましい。さらに別の実施形態において、Ｃ２炭素源の濃度を低減する段階はグルコースの濃度を上昇させる段階の前に行われる。低減する段階が好気性ケモスタットにおいて行われ、一方、上昇させる段階がそのケモスタットにおいて、別の好気性ケモスタットにおいて、１回のバッチ培養においてまたは一連のバッチ培養を通じて行われることが好ましい。炭素源の濃度とｐＨは、上述のとおりである。上昇させる段階と低減する段階が行われた後に、当技術分野で公知の方法を用いてＧＣＳＩ酵母株を回収することができる。特定の実施形態においては、選択工程における中間段階としてＣ２炭素源非依存性酵母株を回収しない。回収したＧＣＳＩ酵母株は上述のものである。
【００６９】
本発明の特定の実施形態は、上述のような、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＣＳＩ−Ｌ）を含むゲノムを含んでなるＧＣＳＩ酵母株に向けられる。ＬＤＨは、ＧＣＳＩ酵母株において発現され得るものであり、その発現の結果として生じるタンパク質は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有している。いくつかの実施形態において、ＧＣＳＩ酵母株の染色体は外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでいる。いくつかの実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ株は、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む少なくとも１つのプラスミドを含有している。いくつかの実施形態において、プラスミドは２ミクロンプラスミドであり得る。好ましくは、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子がプロモーターに作動可能なように連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーターおよびＬ−トレオニンデヒドロゲナーゼプロモーターからなる群から選択され得る。好ましくは、プロモーターがトリオースリン酸イソメラーゼプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、クルイベロミセス属ピルビン酸デカルボキシラーゼプロモーターであり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ株は、ｐＨ約５．０にて乳酸を産生することが可能である。ＧＣＳＩ−Ｌ株は、ｐＨ約５．０〜２．６７の間にて乳酸を産生することが可能である。グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で培養した場合、ＧＣＳＩ−Ｌ株は１００グラムグルコース当たり約５０グラムを上回る乳酸を産生することが可能である。グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で培養した場合に、ＧＣＳＩ−Ｌ株が１００グラムグルコース当たり約６０グラムを上回る乳酸を産生することが可能であることがより好ましく、１００グラムグルコース当たり約７０グラムを上回る乳酸を産生することが可能であることが最も好ましい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ株は、サッカロミセス属、カンジダ属、シゾサッカロミセス属およびクルイベロミセス属からなる群から選択される属に属するものである。好ましくは、ＧＣＳＩ−Ｌ酵母株が、サッカロミセス・セレビシエである。いくつかの実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ株は、遺伝子型ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２  ＹＥｐＬｐＬＤＨを有するサッカロミセス・セレビシエであり得る。特定の実施形態は、寄託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０７４２を有する、プラスミド  ＹＥｐＬｐＬＤＨ含有Ｓ．セレビシエであるＧＣＳＩ酵母株に向けられる。
【００７２】
ＹＥｐＬｐＬＤＨは、ラクトバチルス・プランタラムＬＤＨを含有する酵母プラスミドであり（配列３を参照））、以下でさらに詳細に説明する。いくつかの実施形態において、外来ＬＤＨは、ラクトバチルス・プランタラム、ウシ、ラクトバチルス・カゼイ、バチルス・メガテリウム、リゾプス・オリザエまたはバチルス・ステアロサーモフィラス乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であり得る。このような遺伝子の核酸配列の例は、Ｇｅｎｂａｎｋで、それぞれ、受託番号ＡＪ２９３００８、ＮＰ  ７７６５２４、Ｍ７６７０８、Ｍ２２３０５、Ｑ９Ｐ４Ｂ６およびＭ１９３９６として入手できる。好ましくは、外来乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、ラクトバチルス・プランタラム乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である。
【００７３】
特定の実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ株は、最少培地で好気培養または酸素制限培養した場合に、培養ブロス中、約６０ｇｌ−ｌを上回る乳酸を産生することが可能である。ＧＣＳＩ−Ｌ株が、最少培地で好気培養した場合に、培養ブロス中、約８０ｇｌ−ｌを上回る乳酸を産生することが可能であることが好ましく、ＧＣＳＩ−Ｌ株が、約１００ｇｌ−ｌを上回る乳酸を産生することが可能であることより好ましい。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ酵母株は、Ｌ−乳酸から本質的になる乳酸を産生することが可能である。特定の実施形態において、ＧＣＳＩ−Ｌ酵母株は、好気条件下、グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で培養した場合に、乳酸を産生することが可能である。
【００７４】
本発明の特定の実施形態は、乳酸またはその塩を生産する方法に向けられる。。本方法は、グルコースを唯一の炭素源として含有する最少培地で増殖させた場合に、１００グラムグルコース当たり少なくとも約７０グラム乳酸を産生することが可能であるＧＣＳＩ−Ｌ株を第１の培養培地で好気培養することを含む。特定の実施形態において、その培養は、好気性バッチ培養により行うことができる。特定の実施形態において、本方法は、乳酸またはその塩を回収し、精製する段階をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、精製段階は、蒸留、イオン交換、ナノフィルトレーションまたは溶媒抽出の少なくとも１つを含み得る。
【００７５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明することを目的としている。当業者にとっては当然のことながら、以下の実施例で開示する技術は、本発明の実施において十分に機能する、発明者によって見い出された技術であり、従って、その好ましい実施態様を構成するものであると考えられる。しかしながら、当業者ならば、本開示内容に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示している特定の実施形態に数多くの変更を施すことが可能であり、それらの変更を行ってもなお類似の結果が得られることは分かるであろう。
【実施例】
【００７６】
実施例１
２ラウンドの自然選択を利用して、検出可能な量のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ由来のグルコース耐性を有するＣ２炭素源非依存性サッカロミセス・セレビシエを得た。Ｐｄｃ陰性株の性質は、図２を参照することにより、より良く理解することができる。
【００７７】
サッカロミセス・セレビシエにおいてピルビン酸デカルボキシラーゼ（反応ａ）をコードする総ての遺伝子を欠失させることにより、２つの重要なプロセス（点線）に障害をもたらす。第一に、アルコールデヒドロゲナーゼ（反応ｂ）を介する細胞質のＮＡＤＨの再酸化が阻止される。そのため、細胞質のＮＡＤＨは、ミトコンドリアの外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（反応ｃ）を介してまたはレドックスシャトル系を介して酸化されなければならない。第二に、アセトアルデヒドからの細胞質のアセチル−ＣｏＡの形成が阻止される。その代わりとして、リジンおよび脂肪酸生合成（反応ｄ）用の細胞質のアセチル−ＣｏＡに必要なＣ２炭素源化合物をその環境から取り込まなければならない。酸素消費量がグルコースのピルビン酸塩への酸化に必要な酸素を超えるにつれて、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（反応ｅ）を介するピルビン酸塩のミトコンドリア酸化とトリカルボン酸サイクル（ＴＣＡサイクル）が起こり、その結果としてＣＯ２が生成し、内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（反応ｆ）を介するＮＡＤＨの酸化がもたらされる。
【００７８】
Ｐｄｃ陰性株由来の酢酸塩非依存性突然変異株を、炭素制限（例えば、グルコースおよび酢酸塩を唯一の炭素源とした）好気性ケモスタット培養を通じて供給中の酢酸塩を漸減することにより得た。好気性振盪フラスコにおいてグルコース耐性についてのさらなる選択をした結果、グルコースを唯一の炭素源として含有する合成培地での好気性バッチ培養により増殖し得、かつ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有しておらず、またはトレオニンアルドラーゼを過剰発現しないサッカロミセス・セレビシエ突然変異株（ＴＡＭ）が得られた。ＴＡＭ株の生理学的特徴付けでは、強いピルビン酸塩生産性が示された。ｐＨ制御したバッチ培養では、１３５ｇ／ｌピルビン酸塩（ピルビン酸塩はピルビン酸の分子量を用いて算出した）の濃度を得ることができ、指数増殖期中のピルビン酸塩比生産速度は約６〜７ｍｍｏｌ（ｇバイオマス）−１時間−１であり、全収量は最大約０．５４ｇピルビン酸塩／ｇグルコースである。
【００７９】
株と維持  実施例で使用した総てのサッカロミセス・セレビシエ株（表１）は、類似遺伝子型ＣＥＮ．ＰＫファミリー由来のものであった（１９）。振盪フラスコまたはケモスタット培養物から、培養物に２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを添加し、滅菌バイアルに２ｍｌアリコートを入れ、８０℃にて保存することにより、保存培養物を調製した。総ての選択株を、株識別用の陰性対照としてのウラシル栄養要求性について慣例通り調べた。
【００８０】
【表１】
2006525025.tif 000002
【００８１】
株の構築  ＣＥＮ．ＰＫ１８２とＣＥＮ．ＰＫ１１１−６１Ａ（いずれもDr. P. Kotter, Frankfurt, Germanyの提供品）との交配によりＲＷＢ８３７を得た。得られた２倍体を胞子形成させ、胞子を５６℃にて１５分間加熱した。その後、その交配物を、０．２％酢酸塩を炭素源として含有するＹＰ（酵母ペプトン培地）で培養した。生じたコロニーを、グルコースまたはエタノールを含有するＹＰ培地での増殖について試験した。グルコースで増殖し得なかったコロニーを、続いて、ＰＣＲにより、破壊されたＰＤＣ６遺伝子の存在と交配型について調べた。存在する栄養要求性マーカーを決定することにより、このケースでは、ｕｒａ３−５２、ＲＷＢ８３７とした。以下で記載するように選択された最終的な（ＴＡＭ）株を、Gietz and Woodsによって記載されている高効率プロトコール（９）に従って、ＹＥｐｌａｃｌ９５（８）で形質転換し、原栄養性（ｕｒａ＋）ＴＡＭ＋ＹＥｐｌａｃｌ９５株を得た。
【００８２】
１つの態様において、本発明は、本明細書において開示するようなグルコース耐性とＣ２炭素源非依存性を有する真菌宿主細胞および細胞培養物、特に、ＲＷＢ８３７、ならびにＴＡＭ、とりわけ、Ｃ２炭素源非依存性であるもの、または炭素源非依存性でもグルコース耐性でもあるもの（例えば、ＴＡＭ）をはじめとするその誘導体を含むサッカロミセス・セレビシエ株細胞を開示し、主張する。
【００８３】
このような細胞および細胞培養物は、単一株を含んでなる、単一株から本質的になるまたは単一株からなる、実質的に生物学的に純粋な培養物であり得る。本発明の実施形態は、ＲＷＢ８３７（ＭＡＴａ  ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２）、ＲＷＢ８３７＊（“ＭＡＴａ  ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２”  ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、Ｃ２炭素源非依存性、グルコース不耐性ｕｒａ−酵母）およびＴＡＭ（“ＭＡＴａ  ｐｄｃ１（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ５（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｐｄｃ６（−６，−２）：：ｌｏｘＰ  ｕｒａ３−５２”  ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有していない、Ｃ２炭素源非依存性、グルコース耐性ｕｒａ−酵母）株の生物学的に純粋な培養物として、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下で特許商標庁長官によって権限があると認められた者は、本特許出願の係属中に、培養物を入手できることを保証されているという条件により寄託された。本願またはその子孫の対応特許出願が提出されている国々の外国特許法で要求されるとおりに、寄託物は入手できる。しかしながら、寄託物が入手できるからといって、行政行為によって付与された特許権を損わしめて本発明の実施する権利を構成するものではないことを理解すべきである。
【００８４】
さらに、本培養物寄託物は、微生物の寄託に関するブタペスト条約の規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされる。すなわち、これらの寄託物を汚染させることなく生存させておくために必要なあらゆる注意を払いつつ、該寄託物のサンプルの分与に係る最新の請求を受領した後少なくとも５年間、該寄託物を保管するものとし、いかなる場合にも、寄託の日の後少なくとも３０年間、または培養物を開示して発行される特許の権利行使可能な期間中は、該寄託物を保管する。請求を受けた受託施設が、寄託物の状態が原因でサンプルを分譲できない場合には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである。本培養物寄託物の一般への入手可能性に関する総ての制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久に取り除かれる。
【００８５】
培養物ＣＥＮ．ＰＫ１１３．７Ｄ、ＣＥＮ．ＰＫ  １８２、ＣＥＮ．ＰＫ１１１−６１Ａ、ＲＷＢ８３７、ＲＷＢ８３７＊およびＴＡＭを、ブタペスト条約に基づき、２００３年４月２９日に、Northern Regional Research Center (NRRL), Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research, US Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U. S. A.のパーマネントコレクションに寄託し、それぞれ、受託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６４６、ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６４７、ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６４８、ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６４９、ＮＲＲＬ  Ｙ−３０６５０およびＮＲＲＬ  Ｙ−３０６５１を受けた。
【００８６】
ケモスタット培養  好気性炭素制限または窒素制限ケモスタット培養を、これまでに記載されている（２３）ように行った。栄養要求性を救済するために、培地にウラシル（１５）を添加した。グルコース制限ケモスタット培養用の合成培地には２５０ｍＭ基質炭素を含めた。酢酸塩を含める場合には、２５０ｍＭグルコース由来炭素が優位となるように基質炭素に対して０〜５％の範囲の酢酸塩を添加した。窒素制限培養では、合成培地のグルコース濃度を、培養ブロスの残留グルコース濃度が約１００ｍＭとなるように調整した。
【００８７】
振盪フラスコ培養  ５００ｍｌ振盪フラスコに１００ｍｌ合成培地（２７）を入れ、回転式振盪培養器（２００ｒｐｍ）において３０℃にてインキュベートした。栄養要求性を救済するために、培地に０．１５ｇｌ−１ウラシル（１５）を添加した。ＲＷＢ８３７の前培養物を２％エタノールで増殖させた。他の総ての振盪フラスコ培養物に対しては、炭素源としてグルコースを２〜１０％の範囲の濃度で使用した。選択株をウラシル栄養要求性について慣例通り調べて、培養物の純度を示した。
【００８８】
発酵槽バッチ培養  好気性バッチ培養を、作業容積１リットルの２Ｌ発酵槽(Applikon, Schiedam, the Netherlands)において３０℃にて行った。ｐＨは、１０Ｍ  ＫＯＨの自動添加(Applikon ADI 1030 biocontroller)により５．０に制御した。溶存酸素濃度は、攪拌速度を８００〜１０００ｒｐｍの間に、空気流量を０．５０〜０．７５ｌ分−１の間に調整することにより、常に、空気飽和の１０％以下にならないように維持した。Verduyn et al. （２７）によって記載されている濃度の２倍を含有している合成培地を使用した。開始時のグルコース濃度は、１００ｇｌ−１であった。繰り返しバッチ中、非滅菌固形グルコース１００ｇを、接種から３２時間後と４８時間後の２回添加した。必要に応じて、発酵槽に消泡剤（ＢＤＨ）を添加した。発酵終了時に顕微鏡により培養物の純度を調べたところ、汚染物質は観察されなかった。
【００８９】
マイクロアレイ解析  ケモスタットからの細胞サンプリング、プローブ調製およびAffymetrix社製GeneChip（登録商標）マイクロアレイとのハイブリダイゼーションを、これまでに記載されている（１４）ように行った。それらの結果は、独立に培養した２つの選択Ｐｄｃ陰性株複製物から得られたものと独立に培養した３つの野生型複製物から得られたものである。
【００９０】
マイクロアレイデータの収集と解析  アレイ画像の収集と定量化およびデータのフィルタリングを、Affymetrix社製ソフトウェアパッケージ：Microarray Suite v5.0、MicroDB v3.0およびData Mining Tool v3.0を使用して行った。さらなる統計解析には、Microsoft社製Excel用Significance Analysis of Microarrays(SAM; vl. 12) add-inを、最小予想５０％偽陽性率に対応するデルタ値と最小変化２倍を用いて、使用した（１８）。本発明者らの経験では、これらの基準により、独立した研究室でも再現可能なデータセットが構築される（１４）。
【００９１】
比較の前に、Microarray Suite v5.0、MicroDB v3.0を使用し、総てのアレイを、あらゆる遺伝子特徴の平均的なシグナルを用いてグローバルに目標値１５０とした。フィルターを適用して、ＹＧ−Ｓ９８アレイの９，３３５個の転写産物特徴から、６，０８４個の異なる遺伝子が存在する６，３８３個の酵母オープンリーディングフレームを抽出した。この不一致は、最適次善のプローブセットをアレイ設計に使用したときに、いくつかの遺伝子が２回以上表示されるためであった。最も少ない９００個の転写産物を正確に測定できなかったため、比較解析のためにそれらのレベルを値１２と設定した。
【００９２】
プロモーター解析を、これまでに記載されている（２）ように、ウェブベースのソフトウェア“Regulatory Sequence Analysis Tools”（２０）を用いて行った。
【００９３】
分析手順  乾燥重量の測定、グルコース、酢酸塩および代謝産物の分析、ガス分析ならびにピルビン酸脱炭酸酵素およびトレオニンアルドラーゼアッセイを、これまでに記載されている（２４）ように行った。全細胞のタンパク質量を変形ビュレット法（２５）により測定した。
【００９４】
結果
ケモスタット培養によるＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエからのＣ２炭素源非依存性サッカロミセス・セレビシエの選択  この研究では、Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエのＣ２炭素源要件を排除する（４，５）目的で、微生物の選択手段としてのケモスタット培養の能力（３，１０）を利用した。選択には、ｐｄｃ１、５、６Δｕｒａ３Δサッカロミセス・セレビシエ株（ＲＷＢ８３７）を使用した。培養物の純度に関し、対照として、ｕｒａ３Δ栄養要求性マーカーを使用した。まず、炭素ベースで５％酢酸塩と９５％グルコースの混合物においてＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエの定常状態を得た。この培養物の代謝は、消費された酸素に対する発生した二酸化炭素の比である呼吸商により示されるように、完全に呼吸性であり、炭素に対するバイオマス収量は１４．６ｇバイオマスＣｍｏｌ−１であり、グルコースと酢酸塩は総て消費された。次いで、合成培地の酢酸塩量を連続した５段階で全炭素量の５％からゼロまで低減した。各段階では、５容量変化を行った。このゆっくりとした変化の中、ＲＷＢ８３７は、希釈率０．１０時間−１において、グルコースを唯一の炭素源として用いた好気性炭素制限ケモスタット培養での増殖に適応した。このグルコース制限培養でのバイオマス収量（１４．７ｇバイオマスＣｍｏｌ−１）、酸素消費速度および二酸化炭素発生速度（両方２．９ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１）から、Ｃ２炭素源非依存性（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性がないことおよびエタノールが生成しないこと）サッカロミセス・セレビシエ株の完全な呼吸代謝が示され、これらの条件下での野生型サッカロミセス・セレビシエのこれらの能力（２１）に劣っていないことが分かった。
【００９５】
Ｃ２炭素源非依存性Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株のトランスクリプトーム解析  Ｃ２炭素源非依存性サッカロミセス・セレビシエ株のグルコース制限ケモスタット培養物のトランスクリプトーム解析を行った。Ｃ２炭素源非依存性Ｐｄｃ陰性株を野生型のグルコース制限ケモスタット培養物と比較した（１４）。選択株において、すでに機能が分かっている遺伝子のうち、１８個の遺伝子だけがアップレギュレートされ、１６個の遺伝子だけがダウンレギュレートされた。これらのアップレギュレートされた遺伝子には、減数分裂または胞子形成に関与する１１個の遺伝子（ＨＯＰ２、ＩＭＥ２、ＲＥＣ１Ｏ２、ＲＥＣ１Ｏ４、ＲＥＤ１、ＳＬＺ１、ＳＰＯＩ３、ＳＰＯＩ６、ＳＰＲＩ、ＹＥＲ１７９およびＺＩＰ１）が含まれた。アップレギュレートされた他の７個の遺伝子は、ＣＡＲ１、ＥＣＭ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ４、ＩＲＥ１、ＮＵＦ１およびＮＵＦ２であった。ダウンレギュレートされた遺伝子には、十分予想可能な４個の遺伝子（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６およびＵＲＡ３）と、加えて、とりわけ、ＡＬＰ１、ＡＱＹ１、ＧＮＤ２、ＦＵ１１、ＨＳＰ３０、ＨＸＴ５、ＭＥＰ２、ＭＬＳ１、ＰＤＲＩ２、ＰＨＯ４、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４が含まれた。過剰発現させた場合に、Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエのＣ２炭素源栄養要求性を救済し得る遺伝子である、ＧＬＹ１の、選択株における発現には有意な変化はなかった。
【００９６】
振盪フラスコ培養によるグルコース耐性についての選択  Ｃ２炭素源非依存性についての選択後、ケモスタット培養物の小アリコートをウラシルと２０ｇｌ−１グルコースを含有する合成培地を入れた振盪フラスコに移した。これまでの結果から予想されるとおり、起源のＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエもＣ２炭素源非依存性株も、ウラシルとグルコースの合成培地の寒天平板では増殖せず、また、ウラシルとエタノールの合成培地の寒天平板でも両株は増殖しなかった（図３）。
【００９７】
このことに一致して、Ｃ２炭素源非依存性株のグルコースでの最初の振盪フラスコ培養の最初の７日間は増殖が観察されなかった。しかしながら、Ｃ２炭素源非依存性株の長期培養では、かなりのバイオマスが産生し、このことにより自然グルコース耐性突然変異株が蓄積されていることが分かった。観察された比増殖速度は、０．０１時間−１をはるかに下回っていた。ピルビン酸排出による培養物の酸性化によって比較的低いバイオマス密度で起こる増殖の停止後、培養物の１ｍｌを同じ合成培地１００ｍｌを入れた次の５００ｍｌ振盪フラスコに移した。
【００９８】
連続した移行工程を合計２７回繰り返した。６回目の振盪フラスコにおけるＰｄｃ陰性株の比増殖速度は、すでに、２０ｇｌ−１グルコースにおいて０．１０時間−１であった。１４回の振盪フラスコ培養後、比増殖速度０．１８時間−１を得て、培地のグルコース量を連続培養により３２、５４、６９および１００ｇｌ−１に上げた。この高濃度のグルコースにおいて得られたＣ２炭素源非依存性、グルコース耐性Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株は、振盪フラスコにおいて、唯一の炭素源としてのグルコースにより、比増殖速度０．２０時間−１にて増殖した。
【００９９】
異なる自然発生突然変異体の混合物として存在している可能性のある培養物をグルコースとウラシルの合成培地の寒天平板にストリークした。生じたコロニーのうち４個のコロニーを振盪フラスコによるグルコースでの増殖について試験したところ、比増殖速度において有意な差は認められなかった。これらの培養物のうちの１つをさらなる研究用に選択した。このＣ２炭素源非依存性グルコース耐性Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株を、以下の考察ではＴＡＭと呼ぶ。
【０１００】
グルコースまたはエタノールを唯一の炭素源として含有する合成培地での、起源Ｐｄｃ陰性（ＲＷＢ８３７）、Ｃ２炭素源非依存性酵母株、ＴＡＭ株および野生型間の増殖の違いを、図３に示す寒天平板増殖により明示した。
【０１０１】
図３では、両方の平板に、Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株の栄養要求性を救済するためのウラシルを補給している。エタノール平板を７日間インキュベートし、グルコース平板を３日間インキュベートした。エタノール（左側の平板）またはグルコース（右側の平板）を唯一の炭素源として含有する合成培地寒天平板において、使用した株は以下のものであった：ａ．ＲＷＢ８３７（Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ）、ｂ．ＲＷＢ８３７＊（選択Ｃ２炭素源非依存性サッカロミセス・セレビシエ）、ｃ．ＴＡＭ（選択Ｃ２炭素源非依存性、グルコース耐性サッカロミセス・セレビシエ）、ｄ．ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ（野生型）。
【０１０２】
ＴＡＭ株の誘導期は３日長かったが、４つの株は総て、エタノールを炭素源として含有する平板で増殖した。上記のように、グルコースを炭素源とした場合には、起源Ｐｄｃ陰性株（ＲＷＢ８３７）とＣ２炭素源非依存性株は増殖しなかった。振盪フラスコによるグルコースでの増殖と一致して、選択ＴＡＭ株と、当然、野生型は、グルコースを含有する寒天平板でよく増殖している（図３）。
【０１０３】
発酵培養での選択ＴＡＭ株によるピルビン酸塩の生産
振盪フラスコでのグルコース耐性についての選択中に、ピルビン酸塩排出による培養物の急速な酸性化が観察された。ＴＡＭ株のピルビン酸塩生産への可能性をさらに評価するために、発酵を、繰り返しバッチとして、固形グルコースを発酵槽に添加することにより継続した（図４）。発酵槽において、一定のｐＨにて、１００ｇリットル−１開始時グルコースでの好気性バッチ培養を行った。この繰り返しバッチ段階中に比増殖速度が徐々に低下して、増殖が停止した。これは、おそらく、培地における栄養素制限によるものと思われる。指数増殖期（図４）にあるＴＡＭ株の最大比増殖速度は０．２０時間−１であり、振盪フラスコでの最大比増殖速度と同等であった。振盪フラスコでの観察結果と一致して、発酵培養により多量のピルビン酸塩が生産された。上清のピルビン酸塩濃度は、発酵槽への接種後６０時間以内に１００ｇｌ−１を超えた。指数増殖期中のピルビン酸塩生産速度は、６〜７ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１であった。低バイオマス濃度（ＯＤ６６０  ０．１）で開始して、このバッチの最初の４０時間で、ピルビン酸塩濃度５０ｇｌ−１を得、収量は０．５５ｇピルビン酸塩ｇグルコース−１であった。１００時間後に得られたピルビン酸塩の終濃度は１３５ｇｌ−１であり、全収量は０．５４ｇピルビン酸塩ｇグルコース−１であった。
【０１０４】
ＴＡＭ株のグルコース制限ケモスタット培養  グルコースでのバッチにより得られたＴＡＭ株の最大比増殖速度は、０．２０時間−１であった。野生型サッカロミセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄは、同一条件下でより速い最大比増殖速度０．３７時間−１で増殖した（データは示していない）。この増殖のズレをさらに研究するために、ＴＡＭ株のグルコース制限ケモスタット培養を、希釈率を高めて行った。ＴＡＭ株は、希釈率０．１０時間−１において、完全な呼吸により、消費したグルコースを二酸化炭素と水にした。野生型（０．４８ｇバイオマスｇグルコース−１）と比べて選択株の収量が低いこと（０．４３ｇバイオマスｇグルコース−１）を考慮し、van Hoek et alt. （２１）により記載されているように、他の生理的パラメーターを野生型と同じようにした。ＴＡＭ株は、希釈率０．１５時間−１において、バイオマス収量が０．４７ｇバイオマスｇグルコース−１に増加したが、この値は野生型のこの希釈率での０．５０ｇバイオマスｇグルコース−１よりも依然として低い。ＴＡＭ株は、希釈率０．２０時間−１においても、グルコース制限ケモスタット培養により増殖させることが可能であったが、この増殖に伴って起こるピルビン酸塩生産は、極めて変わりやすいものであった（０．２５〜０．４５ｍｍｏｌピルビン酸塩ｇバイオマス−１時間−１）。ＴＡＭ株は、希釈率０．２３時間−１において、ケモスタットから消えた。このことにより、グルコース制限ケモスタット培養におけるこの株の最大比増殖速度が０．２０時間−１〜０．２３時間−１であることが示された。この長期グルコース制限ケモスタット培養後に、培養物の１アリコートを１００ｇｌ−１のグルコースを入れた振盪フラスコに移した。この振盪フラスコでは急速な増殖が観察され、このことにより、培養物がグルコース耐性表現型を維持していることが分かった。
【０１０５】
ＴＡＭ株の窒素制限ケモスタット培養  選択ＴＡＭ株と野生型サッカロミセス・セレビシエＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄとの比較は、培地中、高グルコース濃度にて、かつ、Ｃ２−化合物不在下で行うことが最も適している。グルコースを唯一の炭素源とした場合と同じ希釈率での窒素制限ケモスタット培養は、これらの条件と生理学的定量研究におけるケモスタット培養の利点を合わせ持つ。合成培地のグルコース濃度を、両株の培養においてほぼ同じ残留グルコース濃度が得られるように選択した（表２）。
【０１０６】
表２は、ＴＡＭ（ＧＣＳＩサッカロミセス・セレビシエ）株と同系野生型ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄの、希釈率０．１０時間−１での好気性窒素制限ケモスタット培養における特性をまとめたものである。野生型データは、Boer et al. (2003)（２）が使用したものと同じ培養から得られる。平均および平均偏差は、それぞれ、非依存性定常状態培養に関する２回（ＴＡＭ）および３回（野生型）の試験から得られたものである。炭素回収率の算出は、バイオマスの炭素量４８％（ｗ／ｗ）に基づいて行い、ブロスの残留グルコース濃度を含む。ＹＳＸ、ＹＮＸおよびＹＡＴＰは、グルコース、窒素およびＡＴＰに対するバイオマス収量である。ＹＡＴＰは、Verduyn (1992)（２７）に従って、固定Ｐ／Ｏ比１として算出した。
【０１０７】
【表２】
2006525025.tif 000003
【０１０８】
野生型は、サッカロミセス・セレビシエのグルコース過剰の条件下での特徴であるように、アルコール発酵を示した。この結果、グルコースでのバイオマス収量は低く（０．０９ｇバイオマスｇグルコース−１）、エタノール生産速度は８．０ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１であり、呼吸商は４．５ｍｍｏｌ発生二酸化炭素ｍｍｏｌ消費酸素−１であった。タンパク質量（０．２９ｇタンパク質ｇバイオマス−１）および窒素でのバイオマス収量（１８．８ｇバイオマスｇ窒素−１）は、野生型の窒素制限ケモスタット培養に関してこれまでに公開されている値（２２，２３）と十分一致している。
【０１０９】
アルコール発酵ができない場合に呼吸に完全に依存するＴＡＭ株は、同一条件下でグルコースでのバイオマス収量がより高く（０．２１ｇバイオマスｇグルコース−１）、唯一の副生成物としてピルビン酸塩を２．８ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１の速度で生産した（表２）。酸素消費速度は、野生型の２．７ｍｍｏｌ  ｇバイオマス−１時間−１に対して、４．０ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１であった。ピルビン酸塩形成時に生じるＮＡＤＨの呼吸による酸化により、呼吸商が消費酸素１ｍｍｏｌ当たり発生二酸化炭素０．７０ｍｍｏｌまで下がった。ＴＡＭ株でのバイオマスのタンパク質量は、野生型での量（０．２９ｇタンパク質ｇバイオマス−１）に比べて少し多かった（０．３３ｇタンパク質ｇバイオマス−１）。このように細胞のタンパク質量がより多いことから、窒素でのＴＡＭ株の収量が野生型（１８．８ｇバイオマスｇ窒素−１）に比べてかなり低い（１４．７ｇバイオマスｇ窒素−１）ことについてある程度の説明がつく。
【０１１０】
ＴＡＭ株のトランスクリプトーム解析  トランスクリプトーム解析では、比較に適した培養条件を選択することが重要である。選択ＴＡＭ株の場合、その表現型を明らかにするためには、ブロス中、Ｃ２−化合物が不在であり、かつ、グルコースが高濃度にて存在することが常である。トランスクリプトーム解析用には、マイクロアレイ研究（１４）におけるケモスタット培養の利点とグルコース過剰の要件を合わせ持つように、ＴＡＭ株と同系野生型ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄの窒素制限ケモスタット培養を選択した。
【０１１１】
窒素制限ケモスタット培養物の比較により、３０５個の遺伝子でｍＲＮＡレベルがＴＡＭ株において野生型より少なくとも２倍高いことが示された。１６８個の遺伝子で、ｍＲＮＡ量がＴＡＭ株において、野生型より少なくとも２倍少なかった。ｍＲＮＡレベルが少なくとも２倍変化した全遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエゲノム全体のほぼ８％を含んでなる。これらの変化した遺伝子のうち、２７３個の遺伝子（５８％）の機能は未知であり、このような遺伝子の割合は完全サッカロミセス・セレビシエゲノムにおいて完全には注釈付けされていない遺伝子の割合（４７％）より高い。
【０１１２】
選択株においてアップレギュレートされた遺伝子の上流領域の配列解析により、これらの遺伝子間で可能性あるＭｉｇ結合部位の過剰発現が示された。主として転写後（７）レギュレートされたＭＩＧ１の転写量に変化はなかったが、ＭＩＧ１との相同性が極めて高いＭＩＧ２の転写量はおよそ１１倍ダウンレギュレートされた。ＴＡＭ株では、グルコース以外の炭素源での増殖に必要な数多くの遺伝子がアップレギュレートされた。このような遺伝子としては、グルコース新生およびエタノール利用に関与する遺伝子（ＡＣＳ１、ＡＤＨ２、ＡＤＲ１、ＣＡＴ８、ＦＢＰ１、ＳＩＰ４）、脂肪酸代謝に関与する遺伝子（ＣＡＴ２、ＣＲＣ１、ＥＣＩ１、ＦＡＡ２、ＦＯＸ２、ＰＥＸ１１、ＰＯＴ１、ＰＯＴ１、ＹＡＴ２）、ガラクトース代謝に関与する遺伝子（ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ４）、マルトース代謝に関与する遺伝子（ＹＤＬ２４７Ｗ、ＹＦＬ０５２Ｗ、ＹＪＲＩ６０Ｃ）およびピルビン酸および乳酸代謝に関与する遺伝子（ＤＬＤ１、ＪＥＮ１）が含まれていた。
【０１１３】
観察結果で注目すべきは、ヘキソース輸送体をコードする遺伝子の発現の変化であった。ＴＡＭ株では、窒素制限下、高グルコース濃度であるにもかかわらず、低親和性輸送体（ＨＸＴ１およびＨＸＴ３）が野生型の場合に比べて５０倍ダウンレギュレートされた（図５）。この株では、既知高親和性輸送体（ＨＸＴ６およびＨＸＴ７）も同様にダウンレギュレートされた（４倍）（図５）。結果として、ＴＡＭ株では、窒素制限下、アレイ上に示された総てのＨＸＴ類の合計転写産物量（ＨＸＴ１〜１０．ＨＸＴ１２、ＨＸＴ１４およびＨＸＴ１６）が、野生型の場合より４倍少ない。野生型と比較して、ＴＡＭ株で起こった、ＨＸＴ類のグルコース応答性調節ネットワーク（１６）における唯一の重大な転写変化が、グルコース濃度依存性発現モジュレーターであるＳＴＤ１の１２倍ダウンレギュレーションであった。
【０１１４】
ＴＡＭ株は、グルコース耐性であるだけでなく、グルコースでの増殖に関し、Ｃ２−化合物非依存性でもあったため、転写変化がどの程度まで、得られたＣ２炭素源非依存性に関与しているかを知ることが重要である。これまでに証明されている細胞質Ｃ２−化合物源（２４）であるＧＬＹ１の転写産物量は、ＴＡＭ株では２．５倍アップレギュレートされた。しかしながら、ＴＡＭ株におけるトレオニンアルドラーゼ活性は、それでも検出限界０．００５マイクロモル／分ｍｇタンパク質−１に満たない。さらに、アセチル−ＣｏＡを伴う反応を含むアルギニン代謝の２つの遺伝子（ＣＡＲ１およびＣＡＲ２）がＴＡＭ株において６倍アップレギュレートされた。トランスクリプトーム解析の結論として、選択Ｐｄｃ陰性株においてアップレギュレートされた遺伝子の大集団が、交配（３個の遺伝子）、減数分裂（１７個の遺伝子）および胞子形成（８個の遺伝子）に関与するものであったこと述べるべきであろう。起源株（ＲＷＢ８３７）と選択Ｐｄｃ陰性株はいずれも、確認された半数体であるため、初期減数分裂転写因子ＩＭＥ１をはじめとする、これらの遺伝子の発現背景にある機構および起源は、依然として不明である。選択Ｐｄｃ陰性株においてアップレギュレートされた遺伝子の上流領域の配列解析により、減数分裂の調節に関与するＵＭＥ６およびＩＭＥ１いずれもの結合部位の過剰発現も明示された。
【０１１５】
ＴＡＭ株および野生型サッカロミセス・セレビシエにおける代謝フラックス
希釈率０．１時間−１における炭素制限増殖中、最終ＴＡＭ株と野生型サッカロミセス・セレビシエのいずれもが完全呼吸グルコース代謝を提示したが、ＴＡＭ株のバイオマス収量はおよそ１０％低かった。希釈率０．１時間−１、選択グルコース耐性表現型を提示するのにより好適な環境での窒素制限ケモスタット培養では、ＴＡＭ株の酸素消費速度（４．０ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１）が野生型より速かった（２．７ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１）（表２）。酸素消費の増加（４．０−２．７＝１．３ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１）がピルビン酸塩生成時に生じる、細胞質のＮＡＤＨを再生するのに必要な酸素量（０．５×２．８＝１．４ｍｍｏｌｇバイオマス−１時間−１）とほぼ等しいことが分かり興味深い。この希釈率での窒素制限ケモスタット培養では、ＴＡＭ株と野生型サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアによる酸化的ピルビン酸代謝速度は明らかに同じである。
【０１１６】
これらの窒素制限培養のエネルギー効率の影響は、ＴＡＭ株のＡＴＰ（ＹＡＴＰ）に対する実験的バイオマス収量（±８．３ｇバイオマスｍｏｌＡＴＰ−１）と野生型のＡＴＰ（ＹＡＴＰ）に対する実験的バイオマス収量（±６．８ｇバイオマスｍｏｌＡＴＰ−１）を比較することによって得られる。ＴＡＭ株のＹＡＴＰは野生型のＹＡＴＰより少し高いが、窒素制限培養での両株の値は、サッカロミセス・セレビシエの別の窒素制限ケモスタット培養でこれまでに観察された（１１）ように、グルコース制限条件下での測定値の約半分である（２６）。ＹＡＴＰが高いことと、ピルビン酸塩形成時に生じるＮＡＤＨの酸化的再生が組み合わさって、ＴＡＭ株の窒素制限下でのグルコースに対するバイオマス収量には、野生型と比べて、２倍を超える増加が起こる。
【０１１７】
野生型サッカロミセス・セレビシエの窒素制限ケモスタット培養のフラックスにはつじつまが合わないところがあることを留意しなければいけない（表２）。二酸化炭素発生速度は、エタノール生成と酸素消費を総括した速度より１３％速かった（表２）が、これらの値はほとんど等しいとすべき値であった。消費炭素の回収率が比較的低いことから判断すると、二酸化炭素生成を過大評価して、このズレを生んでいるとは思えない。そのため、この不一致は、エタノールまたは他の揮発性化合物、例えば、アセトアルデヒドの蒸発を過小評価していることが原因であるかもしれない。
【０１１８】
選択ＴＡＭ株によるピルビン酸塩の過剰蓄積．ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が低いか、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のないサッカロミセス・セレビシエによるピルビン酸塩の排泄がこれまでに観察されている（６，１７）。しかしながら、ＴＡＭ株はグルコースを含有する合成培地において急速な増殖を提示し、一方で、Ｐｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエ株はこれらの条件下では増殖しない。さらに、ＴＡＭ株には、検出可能な量のエタノールを副生成物として有していないという利点もあり、ピルビン酸塩を産生する多くの他の微生物とは対照的に、特定の化合物を培地に添加したり、または培地から排除したりする必要はない（１２）。ＴＡＭ株の培養により、少なくとも約１３５ｇｌ−１の濃度のピルビン酸塩を生産することができる。ピルビン酸塩比生産速度が高い（６〜７ｍｍｏｌピルビン酸塩ｇバイオマス−１時間−１）場合には、低密度接種材料（ＯＤ６６０  ０．１）で開始しても、６０時間たたないうちに１００ｇｌ−１のピルビン酸塩が得られた。
【０１１９】
実施例２
本実施例は、ＹＥｐＬｐＬＤＨで形質転換したＴＡＭ株の生産特性に関する。この株をＬＤＨ遺伝子の過剰発現用の宿主として使用することにより、解糖フラックスを少なくとも部分的に乳酸塩生産に移行させることができる。
試験は、３０℃、ｐＨ５．０（ＫＯＨ  １０Ｍにより滴定）における無機培地での酸素制限を行った２つのバッチ培養で実施する。
【０１２０】
プラスミドの構築
Ｌ．プランタラムゲノムＤＮＡからのＬＤＨ遺伝子の増幅：
ＬＤＨ遺伝子を増幅するために、Ｌ．プランタラムからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを行った。プラスミド構築物の一部として配列するＬＤＨ遺伝子の配列は、以下に配列３として記載する。コード配列  アミノ酸配列は、以下に配列４として記載する。
オリゴ：
ＬＤＨ  ｆｗ
配列１  ５’  ＴＧＡ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＴ  ３’
ＬＤＨ  ｒｅｖ
配列２  ５’  ＡＴＣ  ＧＴＡ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＴＴ  ３’
ＰＣＲ条件：
2006525025.tif 000004
配列３（遺伝子コード６１〜１０２３）
【化１】
2006525025.tif 000005
配列４
Ｌ．プランタラムの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
【化２】
2006525025.tif 000006
【０１２１】
増幅したＰＣＲ断片の大腸菌(E. coli)ベクターへのサブクローニング（ｐＳＴｂｌｕｅ−１、ｐＳＴｐｌＬＤＨの作製）：
得られた新規断片を、キット："Perfectly Blunt（登録商標）Cloning Kit"(Novagene社製)を用いてベクターｐＳＴｂｌｕｅ−１（市販品、処理済（ＥｃｏＲＶ部位にて切断し、平滑末端化））にサブクローニングした。このサブクローニング工程によりプラスミドｐＳＴｐｌＬＤＨを得た。
【０１２２】
配列決定：
このようにして得られたプラスミドの１つを配列決定し、得られたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を寄託されている配列とアライメントした（添付ファイルを参照）。
【０１２３】
増幅した断片のＳ．セレビシエ組込み発現ベクターへのサブクローニング（ｐＹＸ０２２、ｐ０２２ＴＬＰの作製）：
作製し、配列決定したプラスミドｐＳＴｐｌＬＤＨから、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてｐｌＬＤＨのコード配列を切り出した。得られた断片を、続いて、ＥｃｏＲＩ切断し、脱リン酸化したＳ．セレビシエ組込み発現ベクターｐＹＸ０２２(R&D Systems)にサブクローニングした。得られた発現プラスミドを：ｐＹＸ０２２ＴＬＰと名づけた。ｐＹＸ０２２ＴＬＰは、Paola Branduardiにより調製されたものである。
【０１２４】
プラスミドｐＹＸ０２２ＴＬＰをＡａｔIIで切断し、リンカーをこの部位に連結し、ＡａｔＩＩ部位を５つの新しい部位、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ／ＸｍａＩおよびＮｈｅＩで置き換えた。新しいプラスミド、ｐＹＸ０２２ＬｐＬＤＨ−ＡａｔをＮｈｅＩおよびＳａｃＩで消化した。ＴＰＩ１プロモーターとＬ．プランタラムＬＤＨを含む断片を、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで切断したＹＥｐｌａｃ１９５に連結し、ＹＥｐＬｐＬＤＨ（Ron Winklerにより調製されたプラスミド）を得た。
【０１２５】
株と維持
使用した株は、酵母プラスミドｐＬｐＬＤＨを含有するＴＡＭであった。ＴＡＭ宿主株は、上記のとおりである。ＹＥｐＬｐＬＤＨは、ｔｐｉプロモーターに作動可能なように連結されたラクトバチルス・プランタラム株由来のＬＤＨ遺伝子を含有する。酵母プラスミドｐＬｐＬＤＨを含有するＴＡＭを、ブタペスト条約に基づき、２００４年４月２３日に、Northern Regional Research Center (NRRL), Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research, US Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U. S. A.のパーマネントコレクションに寄託し、受託番号ＮＲＲＬ  Ｙ−３０７４２を受けた。
【０１２６】
その株を、グルコースを含有する無機培地で振盪フラスコにおいて３０℃にて増殖させた。２４時間後、培養物にグリセロールＰ．Ａ．を添加して２０％（ｖ／ｖ）グリセロールとし、２ｍｌバイアルに入れて−８０℃にて保存した。これらのバイアルをその後の総ての試験での接種物として使用した。
【０１２７】
培地
【表３】
2006525025.tif 000007
【０１２８】
ＥＤＴＡおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏを７５０ｍｌの脱塩水に溶かし、ＮａＯＨ（ｐ．ａ．）を用いてｐＨを６．０に維持した。続いて、ｐＨを維持しながら、他の成分を１つずつ溶かした。総て溶かしたら、ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌを用いて４．０に調整し、容量を１リットルに調整した。その溶液を１２１℃で２０分間滅菌処理した。
【０１２９】
【表４】
2006525025.tif 000008
【０１３０】
ビオチンを１０ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨに溶かした。この溶液に７５０ｍｌの脱塩水を添加し、ｐＨを１Ｍ  ＨＣｌを用いて６．５に調整した。ｐＨを６．５に維持しながら、後の溶液の総ての成分を１つずつ溶かした。総ての成分を添加した後、容量を１０００ｍｌ，ｐＨ６．５に調整した。
【０１３１】
【表５】
2006525025.tif 000009
【０１３２】
振盪フラスコ培養
振盪フラスコ試験を、丸底フラスコにより、温度３０℃にて、回転式振盪培養器において行った。全容積５００ｍｌの振盪フラスコに最大容積の１／５まで入れて、２００ｒｐｍにて振盪することにより好気条件を維持した。
【０１３３】
発酵培養
発酵培養を作業容積１リットルのバイオリアクター(Applikon Dependable Instruments, Schiedam, The Netherlands)において実施した。ｐＨは、１０Ｍ水酸化カリウムで滴定して、ｐＨ５．０に自動制御した。水酸化カリウムの添加量を重量で測定した(Balance Mettler Toledo PB3001-5, Tiel)。温度は、加熱フィンガーを通じて加熱した水を循環することによって３０℃に維持した。培地に消泡剤、シリコーン(BDH, Poole England)を添加した。
【０１３４】
攪拌速度は、２つのRushton社製インペラーを使用して、８００ｒｐｍで一定にした。ガス流量は、０．５ｌ．分−１にて維持し、２つのBrooks社製５８７６マスフローコントローラー(Brooks BV, Veenendaal, The Netherlands)を使用して７０ｍｌ空気／分と４３０ｍｌ  Ｎ２ガス／分で構成した。
ｐＨ、ＤＯＴ（溶存酸素圧）およびＫＯＨ供給速度を、オンラインデータ収集と制御システム(Bioscada, TUDelftにて学内開発)を利用して継続的に監視した。
【０１３５】
バッチ条件
バッチ発酵は、２つの異なる段階に区別した。酸素供給を一定に保つと、株は、酸素が制限となるまで最大増殖速度で増殖した。酸素が制限となると同時に、バイオマス生成、乳酸塩生産およびグルコース消費は、グルコースが枯渇するまで線形となった。
グルコースが枯渇したらすぐに、追加のグルコースを粉末として添加し、１００ｇｌ−１とした。
ｐＨ、ＤＯＴおよびＫＯＨ供給速度を、オンラインデータ収集と制御システム(Bioscada, TUDelftにて学内開発)を利用して継続的に監視した。
【０１３６】
排ガス分析
発酵培養での排ガスを冷却器（２℃）で冷却し、Perma Pure社製乾燥器（型ＰＤ−６２５−１２Ｐ）で乾燥させた。酸素および二酸化炭素濃度をＡＤＣ  ７０００ガス分析器を用いて測定した。排ガス流量をSaga デジタルフローメーター(Ion Science, Cambridge)で測定した。二酸化炭素発生と酸素消費の比速度を、これまでに記載されている（２８）ように算出した。
【０１３７】
サンプル調製
バイオマス、基質および生成物分析用のサンプルを氷上で収集した。発酵ブロスのサンプルおよび細胞を含まないサンプル（１０．０００×ｇにて１０分間の遠心分離により調製した）を後の解析用に−２０℃にて保存した。
【０１３８】
ＨＰＬＣ測定
Aminex社製ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００Ｘ７．８ｍｍ, BioRad）を装備したWaters社製ＨＰＬＣ２６９０システムを使用して（６０℃、０．６ｍｌ／分  ５ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４）、糖、有機酸およびポリオールを同時に測定した。Waters社製２４８７  ＵＶ検出器およびWaters社製２４１０屈折率検出器と接続して行った。
【０１３９】
乾燥重量の測定
培養物中の酵母の乾燥重量を、０．４５μｍフィルター(Gelman sciences)で５ｍｌの培養物を濾過することにより測定した。必要に応じて、サンプルを終濃度５〜１０ｇｌ−１の間に希釈した。使用前にフィルターの乾燥重量が測定できるように、フィルターを８０℃のインキュベーター内に少なくとも２４時間置いた。サンプル中の酵母細胞をフィルター上に残留させ、１０ｍｌの脱塩水で洗浄した。次いで、細胞を含むフィルターを、電子レンジ（Amana Raderrange、１５００ワット）で２０分間、５０％量に乾燥させた。乾燥させた細胞含有フィルターを２分間冷却した後、秤量した。細胞含有フィルターの重量からフィルターの重量を引いて、乾燥重量を算出した。
【０１４０】
光学密度（ＯＤ６６０）測定
酵母培養物の光学密度を、分光光度計； Novaspec II(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)を使用し、４ｍｌキュベットに入れて、６６０ｎｍで測定した。必要に応じて、サンプルを、光学密度０．１〜０．３の間が得られるように希釈した。
発酵試験の結果の概要を、表６ａおよび６ｂに示す。各発酵についての詳細な説明を、表および図６〜１３に示す。
【０１４１】
【表６−ａ】
2006525025.tif 000010
【０１４２】
【表６−ｂ】
2006525025.tif 000011
【０１４３】
両発酵での酸素供給量を一定にすることにより２４時間後に実現された酸素制限によって、グルコースの線形消費プロフィール、ならびに乳酸塩の線形生産プロフィールが得られた。
【０１４４】
発酵１
バッチは、開始時の濃度９９．２ｇグルコースｌ−１で開始し、それに振盪フラスコ前培養物を接種した。バッチ発酵の最初の２４時間は、バイオマスが０．１３±０．０２時間−１にて指数関数的に増加するように、酸素供給を制限しなかった。この段階の後、酸素がグルコース消費およびバイオマス生成の制限となり、乳酸塩、ピルビン酸塩およびコハク酸塩は、線形トレンドを示した（表１および図１〜５を参照）。開始時のグルコース濃度の消費には８０時間かかった。この段階での乳酸塩生産性は０．６９ｇ．ｌ．時間−１であり、比生産性は０．５３ｇｇ−１時間−１であり、グルコースに対する収量は０．６３ｇｇ−１であった。ピルビン酸塩生産性は０．０５ｇｌ−１時間−１であり、比生産性は０．０７ｇｇ−１時間−１であり、グルコースに対する収量は０．０４５ｇｇ−１であった。図６〜９を参照のこと。
【０１４５】
グルコースの最初のバッチが枯渇したら、追加のグルコースを粉末として添加し、グルコース濃度を９８．４ｇグルコースｌ−１とした。この段階での乳酸塩生産性は０．０３９ｇｌ−１時間−１であり、比生産性は０．５６ｇｇ−１時間−１であり、グルコースに対する収量は０．４２ｇｇ−１であった。ピルビン酸塩生産性は０．１５ｇｌ−１時間−１であり、比生産性は０．２６ｇｇ−１時間−１であり、グルコースに対する収量は０．１５ｇｇ−１であった。全体としての乳酸塩の生産性は１００ｇｌ−１時間−１であり、全体としての収量は０．４８ｇｇ−１であり、乳酸塩比生産性は０．５３ｇｇ−１時間−１であった。
【０１４６】
発酵２
バッチは、開始時の濃度９６．３ｇグルコースｌ−１で開始し、それに振盪フラスコ前培養物を接種した。バッチ発酵の最初の２４時間は、バイオマスが０．１３±０．０２時間−１にて指数関数的に増加するように、酸素供給を制限しなかった。この段階の後、酸素がグルコース消費およびバイオマス生成の制限となり、乳酸塩、ピルビン酸塩およびコハク酸塩は、線形トレンドを示した（表１および図１〜５を参照）。開始時のグルコース濃度の消費には１０６時間かかった。この時間は、２段階発酵の場合より３０時間以上長く、このことから、酸素制限がはるかに厳しかったことが示される。この段階での乳酸塩生産性は０．８８ｇｌ−１時間−１であり、比生産性は０．２２ｇｇ−１時間−１であり、グルコースに対する収量は０．７０ｇｇ−１であった。ピルビン酸塩生産性は０．１２ｇｌ−１時間−１であり、比生産性は０．２２ｇｇ−１時間−１であり、グルコースに対する収量は０．０９３ｇｇ−１であった。図１０〜１３を参照のこと。
【０１４７】
実施例３
本実施例は、ＹＥｐＬｐＬＤＨで形質転換したＴＡＭ株の生産特性に関する。試験は、３２℃にて、ｐＨ制御を行わない、無機培地でのバッチ培養で実施する。
【０１４８】
株
使用した株は、酵母プラスミドｐＬｐＬＤＨを含有するＴＡＭであった。ＴＡＭ宿主株は、上記のとおりである。ＹＥｐＬｐＬＤＨは、ｔｐｉプロモーターに作動可能なように連結されたラクトバチルス・プランタラム株由来のＬＤＨ遺伝子を含有するものであり、以上で記載している。
その株をグルコースを含有する無機培地で振盪フラスコにおいて３２℃にて増殖させた。発酵を、培地１００ｍｌを入れた２５０ｍｌトリプルバッフル付振盪フラスコにおいて実施した。培地組成は、以下に表で示している。
【０１４９】
培地
グルコース７５ｇ／Ｌ、以下に示す微量元素、ビタミンおよび塩
【０１５０】
【表７】
2006525025.tif 000012
【０１５１】
【表８】
2006525025.tif 000013
【０１５２】
【表９】
2006525025.tif 000014
【０１５３】
グルコースを半量ずつの保存溶液にし、別々にオートクレーブにかけた。細胞を活性な生理学的段階でよりよく維持するために、特定量のＣａ＋２を添加した。本実施例では、合計１１１２ｐｐｍのＣａ＋２を添加した。発酵を、New Brunswick社製Ｇ−２５振盪培養器により、３２℃にて、１８０ｒｐｍで振盪しながら実施した。ＴＡＭ  ＹＥｐＬｐＬＤＨの結果を以下の表１０および図１４に示す。
【０１５４】
【表１０】
2006525025.tif 000015
【０１５５】
表およびグラフから分かるように、乳酸の生成速度は６３時間経過後に低下した。発酵時間が（６３時間から１１１時間まで）長くなると、乳酸塩の濃度だけがさらに７．１４ｇ／Ｌ高まった。グルコースに対する収率（ｗｔ／ｗｔ）は、６２．８％であった。
【参照文献】
【０１５６】
以下の参照文献は、本明細書に示されているものの例示的手順またはその他詳細な補足説明を示すということで、具体的に引用することにより本明細書の一部とする。
【表１１】
2006525025.tif 000016
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2006525025.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】本発明の一実施形態の模式図である。
【図２】グルコースで増殖するＰｄｃ陰性サッカロミセス・セレビシエの代謝の模式図である。
【図３】（ａ）サッカロミセス・セレビシエＰｄｃ陰性株、（ｂ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性のないサッカロミセス・セレビシエＣ２炭素源非依存性株、（ｃ）ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性がなく、かつ、Ｃ２炭素源非依存性（例えば、ＧＣＳＩ酵母）でもある本発明のサッカロミセス・セレビシエグルコース耐性株、および（ｄ）野生型（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有している）サッカロミセス・セレビシエのエタノール（左側の平板）またはグルコース（右側の平板）を唯一の炭素源として含有する合成培地寒天平板での増殖を示す。
【図４】ＧＣＳＩサッカロミセス・セレビシエ（例えば、本発明の選択ＴＡＭ株）のグルコースでの好気性繰り返しバッチ培養中の増殖とピルビン酸塩生成を示すグラフである。示した結果は一典型的なバッチ試験によるものである。反復試験では、本質的に同じ結果が得られた。黒色の四角は、ピルビン酸塩濃度を示している。白色のマークは、グルコース濃度（菱形）またはＯＤ６６０（円）を示している。
【図５】グルコースを唯一の炭素源として用いる窒素制限ケモスタット培養においての、主要なヘキソース輸送体（ＨＸＴ１〜７）の転写量の、本発明のＧＣＳＩサッカロミセス・セレビシエおよびその同系野生型間での比較である。野生型のデータは、Boer et al. (2003)（２）が使用したものと同じ培養から得られる。示したデータは、独立した２回（ＴＡＭ）または３回（野生型）のケモスタット培養から得られたものである。灰色のバーが野生型であり、黒色のバーがＴＡＭ株（例えば、ＧＣＳＩ株）である。
【図６】発酵１の第１段階：バッチ経過時間に応じた乾燥重量、グルコース、乳酸塩およびピルビン酸塩濃度。バッチの通気速度は、一定にし、空気７０ｍｌ／分とＮ２  ４３０ｍｌ／分のエアーを混合して使用した。２４時間の時点から酸素供給速度または量を制限した。
【図７】発酵１の第１および第２段階：バッチ経過時間に応じた乾燥重量、グルコース、乳酸塩およびピルビン酸塩濃度。バッチの通気速度は、一定にし、空気７０ｍｌ／分とＮ２  ４３０ｍｌ／分を混合して使用した。２４時間の時点から酸素濃度を制限し、開始時のグルコースが枯渇したらすぐに、追加のグルコースを粉末として添加して、再び、グルコースの濃度を１００ｇｌ−１とした。
【図８】発酵１の第１および第２段階：バッチ経過時間に応じたグルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩およびグリセロール濃度。バッチの通気速度は、一定にし、空気７０ｍｌ／分とＮ２  ４３０ｍｌ／分を混合して使用した。２４時間の時点から酸素濃度を制限し、開始時のグルコースが枯渇したらすぐに、追加のグルコースを粉末として添加して、濃度を１００ｇｌ−１とした。
【図９】発酵１：２４〜８２時間（バッチ経過時間に応じて、酸素供給を制限している期間）の乾燥重量、グルコース、乳酸塩およびピルビン酸塩濃度。
【図１０】発酵２の第１段階：バッチ経過時間に応じた乾燥重量、グルコース、乳酸塩およびピルビン酸塩濃度。バッチの通気速度は、一定にし、空気７０ｍｌ／分とＮ２  ４３０ｍｌ／分を混合して使用した。２４時間の時点から酸素濃度を制限した。
【図１１】発酵２の第１および第２段階：バッチ経過時間に応じた乾燥重量、グルコース、乳酸塩およびピルビン酸塩濃度。バッチの通気速度は、一定にし、空気７０ｍｌ／分とＮ２  ４３０ｍｌ／分を混合して使用した。２４時間の時点から酸素濃度を制限した。開始時のグルコースが枯渇したらすぐに、追加のグルコースを粉末として添加して、濃度を１００ｇｌ−１とした。
【図１２】発酵２の第１および第２段階：バッチ経過時間に応じたグルコース、乳酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩およびグリセロール濃度。バッチの通気速度は、一定にし、空気７０ｍｌ／分とＮ２  ４３０ｍｌ／分を混合して使用した。２４時間の時点から酸素濃度を制限した。開始時のグルコースが枯渇したらすぐに、追加のグルコースを粉末として添加して、濃度を１００ｇｌ−１とした。
【図１３】発酵２：２４〜８２時間（バッチ経過時間に応じて、酸素供給を制限している期間）の乾燥重量、グルコース、乳酸塩およびピルビン酸塩濃度。
【図１４】ＴＡＭ  ＹＥｐＬｐＬＤＨを、ｐＨを制御していないバッチ培養で培養した場合の１１１時間の乳酸塩とグルコース濃度のグラフ。
【図１】
2006525025.tif 000019
【図２】
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【図３】
2006525025.tif 000021
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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