(57)【要約】本発明は、スピラマイシン生合成プロセスの新規の遺伝子の単離および同定、および、前記生合成に関与する新規のポリペプチドに関する。本発明はまた、前記ポリペプチドの製造方法に関する。本発明はさらに、得られたスピラマイシンにおける生産率および純度を増加させるための前記遺伝子の使用に関する。本発明は、特に、スピラマイシンＩを製造するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩは製造しない微生物、および、このような微生物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が、  
（ａ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列のいずれか１つ、
（ｂ）配列（ａ）の変異体からなる配列のいずれか１つ、
（ｃ）遺伝子コードの縮重により配列（ａ）および（ｂ）から得られた配列のいずれか１つ、
である、スピラマイシン生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
高ストリンジェントな条件下で、請求項１に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つとハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリヌクレオチドの、少なくとも１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０または１９００個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド同一性を示すポリヌクレオチド。
【請求項４】
ストレプトマイセス属の細菌から単離される、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
マクロライドの生合成に関与するタンパク質をコードする、請求項２〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、同一性を示すポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質に類似した活性を有するタンパク質をコードする、請求項２〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの発現によって生じるポリペプチド。
【請求項８】
配列が、
（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０の配列のいずれか１つ、
（ｂ）（ａ）に記載の配列のいずれか１つ（ただし、上記配列にわたり、１またはそれ以上のアミノ酸が、それらの機能特性に影響を与えることなく置換、挿入または欠失されている）、
（ｃ）配列（ａ）および（ｂ）の変異体からなる配列のいずれか１つ、
である、スピラマイシン生合成に関与するポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリペプチドの、少なくとも１０、１５、２０、３０〜４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０または６４０個の連続したアミノ酸を含むポリペプチドとの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のアミノ酸同一性を示すポリペプチド。
【請求項１０】
ストレプトマイセス属の細菌から単離される、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
マクロライドの生合成に関与するタンパク質をコードする、請求項９または１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
それが同一性を共有するポリペプチドの活性に類似した活性を有する、請求項９〜１１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む組換えＤＮＡ。
【請求項１４】
ベクターに含まれる、請求項１３に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１５】
ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、インテグレート可能なベクター、フォスミド、コスミド、シャトルベクター、ＢＡＣおよびＰＡＣから選択される、請求項１４に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１６】
ｐＯＳ４９．１、ｐＯＳ４９．１１、ｐＯＳＣ４９．１２、ｐＯＳ４９．１４、ｐＯＳ４９．１６、ｐＯＳ４９．２８、ｐＯＳ４４．１、ｐＯＳ４４．２、ｐＯＳ４４．４、ｐＳＰＭ５、ｐＳＰＭ７、ｐＯＳ４９．６７、ｐＯＳ４９．８８、ｐＯＳ４９．１０６、ｐＯＳ４９．１２０、ｐＯＳ４９．１０７、ｐＯＳ４９．３２、ｐＯＳ４９．４３、ｐＯＳ４９．４４、ｐＯＳ４９．５０、ｐＯＳ４９．９９、ｐＳＰＭ１７、ｐＳＰＭ２１、ｐＳＰＭ５０２、ｐＳＰＭ５０４、ｐＳＰＭ５０７、ｐＳＰＭ５０８、ｐＳＰＭ５０９、ｐＳＰＭ１、ｐＢＸＬ１１１１、ｐＢＸＬ１１１２、ｐＢＸＬ１１１３、ｐＳＰＭ５２０、ｐＳＰＭ５２１、ｐＳＰＭ５２２、ｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、ｐＳＰＭ５２５、ｐＳＰＭ５２７、ｐＳＰＭ５２８、ｐＳＰＭ３４、ｐＳＰＭ３５、ｐＳＰＭ３６、ｐＳＰＭ３７、ｐＳＰＭ３８、ｐＳＰＭ３９、ｐＳＰＭ４０、ｐＳＰＭ４１、ｐＳＰＭ４２、ｐＳＰＭ４３、ｐＳＰＭ４４、ｐＳＰＭ４５、ｐＳＰＭ４７、ｐＳＰＭ４８、ｐＳＰＭ５０、ｐＳＰＭ５１、ｐＳＰＭ５２、ｐＳＰＭ５３、ｐＳＰＭ５５、ｐＳＰＭ５６、ｐＳＰＭ５８、ｐＳＰＭ７２、ｐＳＰＭ７３、ｐＳＰＭ５１５、ｐＳＰＭ５１９、ｐＳＰＭ７４、ｐＳＰＭ７５、ｐＳＰＭ７９、ｐＳＰＭ８３、ｐＳＰＭ１０７、ｐＳＰＭ５４３、および、ｐＳＰＭ１０６から選択される、請求項１５に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項１８】
適切な発現ベクター、および、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの１またはそれ以上の発現が可能な宿主細胞を含む発現系。
【請求項１９】
原核性の発現系、および、真核性の発現系から選択される、請求項１８に記載の発現系。
【請求項２０】
細菌Ｅ．コリにおける発現系、昆虫細胞において発現が可能なバキュロウイルス発現系、酵母細胞において発現が可能な発現系、および、哺乳動物における細胞において発現が可能な発現系から選択される、請求項１９に記載の発現系。
【請求項２１】
請求項１〜６および１３〜１７のいずれか一項に記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、少なくとも１つの組換えＤＮＡ、および／または、少なくとも１つの発現ベクターが導入された宿主細胞。
【請求項２２】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドの製造方法であって：
ａ）ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つを、適切なベクターに挿入する工程；
ｂ）工程ａ）のベクターで予め形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な培地で培養する工程；
ｃ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程；
ｄ）上記培地から、または、工程ｃ）で得られた細胞抽出物から、上記ポリペプチドを分離および精製する工程；
ｅ）必要に応じて、製造された組換えポリペプチドを特徴付ける工程、
を含む、上記方法。
【請求項２３】
少なくとも１種のマクロライドの生合成経路の工程でブロックされた微生物。
【請求項２４】
マクロライドを生産する微生物におけるマクロライドの生合成に関与する少なくとも１つのタンパク質の機能を不活性化することによって得られる、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２５】
タンパク質の不活性化は、タンパク質をコードする遺伝子における変異誘発によって、または、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの１またはそれ以上の発現によって行われる、請求項２４に記載の微生物。
【請求項２６】
タンパク質の不活性化は、放射線照射による変異誘発、変異誘発化学薬剤の作用、部位特異的変異誘発、または、遺伝子置換によって行われる、請求項２５に記載の微生物。
【請求項２７】
変異誘発は、インビトロまたはインサイチュで、対象の遺伝子の１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加によって、または、遺伝子不活性化によって行われる、請求項２５または２６に記載の微生物。
【請求項２８】
微生物はストレプトマイセス属の細菌である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２９】
マクロライドはスピラマイシンである、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３０】
微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３１】
変異誘発は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の配列を含む遺伝子の少なくとも１つにおいて行われる、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３２】
変異誘発は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６
４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上で行われる、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３３】
変異誘発は、配列番号１３の配列に相当する配列を含む遺伝子の遺伝子不活性化からなる、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３４】
−Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］に、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９０９、Ｉ−２９１１、Ｉ−２９１２、Ｉ−２９１３、Ｉ−２９１４、Ｉ−２９１５、Ｉ−２９１６、または、Ｉ−２９１７で寄託された株のいずれか１つ、
−株ＳＰＭ５１０、
から選択される株である、ストレプトマイセス・アンボファシエンス株。
【請求項３５】
マクロライド生合成の中間体の製造方法であって：
ａ）請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
ｃ）上記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、上記生合成の中間体を分離および精製する工程、
を含む、上記方法。
【請求項３６】
生合成の中間体を請求項３５に記載の方法に従って製造し、このようにして生産された中間体を修飾する、マクロライドから得られた分子の製造方法。
【請求項３７】
中間体は、化学的に、生化学的に、酵素的に、および／または、微生物学的に修飾される、請求項３６に記載の製造方法。
【請求項３８】
中間体を基質として用いることによって中間体を修飾することができるタンパク質をコードする遺伝子の１またはそれ以上が、微生物に導入される、請求項３６または３７に記載の製造方法。
【請求項３９】
マクロライドはスピラマイシンである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項４０】
用いられる微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項４１】
スピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物。
【請求項４２】
スピラマイシンＩの生合成に必要な遺伝子の全てを含むが、配列番号１３の配列、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つを含む遺伝子は、発現されないか、または、不活性にされている、請求項４１に記載の微生物。
【請求項４３】
不活性化は、タンパク質をコードする遺伝子における変異誘発によって、または、タン
パク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現によ
って行われる、請求項４２に記載の微生物。
【請求項４４】
変異誘発は、コードされたタンパク質が不活性化されるように、または、それらからのその発現またはその翻訳が阻害されるように、この遺伝子のプロモーター中、コーディング配列中、または、非コーディング配列中で行われる、請求項４３に記載の微生物。
【請求項４５】
変異誘発は、放射線照射、変異誘発化学薬剤の作用、部位特異的変異誘発、または、遺伝子置換によって行われる、請求項４３または４４に記載の微生物。
【請求項４６】
変異誘発は、インビトロまたはインサイチュで、対象の遺伝子の１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加によって、または、遺伝子不活性化によって行われる、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４７】
微生物は、スピラマイシンの生合成経路の遺伝子を発現することによって得られ、これら遺伝子は、配列番号１３に相当する配列、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つを含む遺伝子を含まない、請求項４１または４２に記載の微生物。
【請求項４８】
微生物はストレプトマイセス属の細菌である、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４９】
微生物は、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産する出発株から得られる、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５０】
配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、同じ機能を有するその変異体のいずれか１つにおける変異誘発によって得られる、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５１】
微生物は、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産するＳ．アンボファシエンス株から得られ、ここで、配列番号１３に相当する配列、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の遺伝子不活性化が行われている、請求項４１〜５０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５２】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１０で寄託された株である、Ｓ．アンボファシエンス株。
【請求項５３】
スピラマイシンＩの製造方法であって：
（ａ）請求項４１〜５２のいずれか一項に記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
（ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
（ｃ）上記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、スピラマイシンＩを分離および精製する工程、
を含む、上記方法。
【請求項５４】
微生物のマクロライド生産を改善するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項５５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の配列を含む遺伝子の少なくとも１つに遺伝子修飾を有する、および／または、請求項１〜６のいずれか一項に記載の配列を含む遺伝子の少なくとも１つを過剰発現する、マクロライドを製造する突然変異微生物。
【請求項５６】
遺伝子修飾は、より高い活性を有するタンパク質の１またはそれ以上を発現させる目的で、または、このタンパク質をより高いレベルで発現させる目的で、対象の遺伝子における１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加からなる、請求項５５に記載の突然変異微生物。
【請求項５７】
対象の遺伝子の過剰発現は、この遺伝子のコピー数を増加させること、および／または、野生型プロモーターより活性なプロモーターを導入することによって得られる、請求項５５に記載の突然変異微生物。
【請求項５８】
対象の遺伝子の過剰発現は、マクロライドを生産する微生物を、請求項１３、１４または１７に記載の組換えＤＮＡコンストラクトでを形質転換させ、この遺伝子を過剰発現させることによって得られる、請求項５５または５７に記載の突然変異微生物。
【請求項５９】
遺伝子修飾は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上で行われる、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の突然変異微生物。
【請求項６０】
微生物は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８および１２０の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを過剰発現する、請求項５５〜５９のいずれか一項に記載の突然変異微生物。
【請求項６１】
微生物はストレプトマイセス属の細菌である、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の突然変異微生物。
【請求項６２】
マクロライドはスピラマイシンである、請求項５５〜６１のいずれか一項に記載の突然変異微生物。
【請求項６３】
微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の突然変異微生物。
【請求項６４】
マクロライドの製造方法であって：
（ａ）請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
（ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
（ｃ）上記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、生産された上記マクロライドを分離および精製する工程、
を含む、上記方法。
【請求項６５】
ハイブリッド抗生物質を製造するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の、配列、および／または、組換えＤＮＡ、および／または、ベクターの使用。
【請求項６６】
１またはそれ以上の生物変換反応を行うための、請求項１〜１７および２１のいずれか一項に記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、少なくとも１つの組換えＤＮＡ、および／または、少なくとも１つの発現ベクター、および／または、少なくとも１つのポリペプチド、および／または、少なくとも１つの宿主細胞の使用。
【請求項６７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド。
【請求項６８】
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子、
を過剰発現する、少なくとも１種のスピラマイシンを生産する微生物。
【請求項６９】
ストレプトマイセス属の細菌である、請求項６８または９０に記載の微生物。
【請求項７０】
ストレプトマイセス・アンボファシエンス種の細菌である、請求項６８、６９または９０に記載の微生物。
【請求項７１】
遺伝子の過剰発現は、微生物の発現ベクターでの形質転換によって得られる、請求項６８〜７０または９０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７２】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年１０月６日に、登録番号Ｉ−３１０１で寄託された、ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（１）株またはＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）株である、ストレプトマイセス・アンボファシエンス株。
【請求項７３】
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得ることができるポリヌクレオチド、または、
−このポリヌクレオチドの少なくとも１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０または１５００個の連続したヌクレオチドのフラグメント、
を含む、組換えＤＮＡ。
【請求項７４】
ベクターである、請求項７３または９１に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項７５】
発現ベクターである、請求項７３、７４または９１に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項７６】
請求項７３〜７５および９１のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡの少なくとも１つが導入されている宿主細胞。
【請求項７７】
ポリペプチドの製造方法であって：
ａ）少なくとも１つの請求項７５に記載の発現ベクターで、宿主細胞を形質転換させる工程；
ｂ）上記宿主細胞を、適切な培地で培養する工程；
ｃ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程；
ｄ）上記培地から、または、工程ｃ）で得られた細胞抽出物から、上記ポリペプチドを分離および精製する工程；
ｅ）必要に応じて、製造された組換えポリペプチドを特徴付ける工程、
を含む、上記方法。
【請求項７８】
遺伝子不活性化は、配列番号１３に相当する配列、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子、または、その一部のフェーズ内の欠失によって行われる、請求項５１に記載の微生物。
【請求項７９】
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得ることができる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子、
も過剰発現する、請求項４１〜５１または７８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８０】
配列番号４７の配列のポリヌクレオチド、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られたポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいてポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現が可能なプロモーターの制御下に置かれている、発現ベクター。
【請求項８１】
プラスミドｐＳＰＭ５２４またはｐＳＰＭ５２５である、請求項８０に記載の発現ベクター。
【請求項８２】
請求項８０または８１に記載のベクターで形質転換されたストレプトマイセス・アンボファシエンス株。
【請求項８３】
コーディング配列である配列番号４７、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから
得られたコーディング配列を有する遺伝子も過剰発現する、請求項４１〜５１、７８、７９および９２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８４】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年２月２６日に、登録番号Ｉ−２９７７で寄託された、ＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株である、請求項８３に記載の微生物。
【請求項８５】
スピラマイシンの製造方法であって：
（ａ）請求項６８、６９、７０、７１、７２、７８、７９、８２、８３、８４、９０および９２のいずれか一項に記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
（ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
（ｃ）上記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、スピラマイシンを分離および精製する工程、
を含む、上記方法。
【請求項８６】
配列が、配列番号１１２の配列、または、配列番号１４２の配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８７】
配列が、
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子
のコーディング配列から翻訳された配列に相当するポリペプチド。
【請求項８８】
ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて、請求項８６、８７または９３に記載のポリペプチドの発現が可能な発現ベクター。
【請求項８９】
プラスミドｐＳＰＭ７５である、請求項８８に記載の発現ベクター。
【請求項９０】
ポリメラーゼ連鎖増幅によって得ることができる遺伝子は、コーディング配列である配列番号１４１の遺伝子、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子である、請求項６８に記載の微生物。
【請求項９１】
ポリメラーゼ連鎖増幅によって得ることができるポリヌクレオチドは、配列番号１４１の配列のポリヌクレオチドである、請求項７３に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項９２】
ポリメラーゼ連鎖増幅によって得ることができる遺伝子は、コーディング配列である配列番号１４１の遺伝子、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子である、請求項７９に記載の微生物。
【請求項９３】
配列が、配列番号１４２である、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スピラマイシンの生合成経路の新規の遺伝子の単離および同定、ならびに、この生合成に関与する新規のポリペプチドに関する。本発明はまた、スピラマイシンの生産レベルと生産されたスピラマイシンの純度を高めるためのこれら遺伝子の使用に関する。
【０００２】
本発明はまた、新規の抗生物質の合成、または、スピラマイシンの誘導体化された型を可能にする突然変異体を構築するための、これら遺伝子の使用に関する。本発明はまた、これら遺伝子の発現によって生産された分子、および、最終的には、このような遺伝子の発現によって生産された分子の薬理学的に活性な組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ストレプトマイセスは、グラム陽性の土壌糸状菌である。ストレプトマイセスは、それらが分泌する多種多様な分解酵素により、有機物質の分解や無機質化において重要な役割を果たす。ストレプトマイセスは、原核生物に特有の形態学的な分化現象を示し、極めて多様な化学構造および生物活性を有する二次代謝産物の生産を特徴とする代謝的な分化を伴う。これら代謝産物としては、細菌ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）によって天然に生産されたスピラマイシンがある。
【０００４】
スピラマイシンはマクロライド系抗生物質であり、獣医学とヒトの医学の両方において使用可能である。マクロライドは、１またはそれ以上の糖がグラフトされたラクトン環の存在を特徴とする。ストレプトマイセス・アンボファシエンスは、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを自然に生産する（図１を参照）；しかしながら、スピラマイシンＩの抗生物質活性は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの活性よりも明らかに強い（Ｌｉｕ等，１９９９年）。スピラマイシンＩ分子は、プラテノライド（ｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅ）というラクトンベースのマクロサイクル、および、３個の糖：フォロサミン（ｆｏｒｏｓａｍｉｎｅ）、マイカミノース（ｍｙｃａｍｉｎｏｓｅ）およびマイカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）からなる（図１を参照）。スピラマイシンの抗生物質活性は、細菌のリボソームへの抗生物質の結合を含むメカニズムによって原核生物におけるタンパク質合成を阻害することによる。
【０００５】
マクロライド系のメンバーであり、またラクトン環を有する特定の化合物は、抗生物質分野以外での使が行われてきた。従って、ＦＫ５０６製品は、免疫抑制効果を有し、臓器移植、リウマチ様関節炎、および、より一般的には、自己免疫反応に関する病的状態の分野における治療用途に対する将来的な展望を提供している。なその他のマクロライド、例えばエバーメクチンは、殺虫活性および抗蠕虫活性を有する。
【０００６】
これまで、様々なクラスに属する抗生物質に関する多くの生合成経路、さらにその他の二次代謝産物（総論として、Ｋ，Ｃｈａｔｅｒ，１９９０年）が、すでにストレプトマイシートで研究されている。しかしながら、これまでのスピラマイシンに関する生合成経路の知識は極めて部分的なものにすぎない。
【０００７】
スピラマイシン生合成は、多くの工程を含み、多くの酵素が関与する複雑なプロセスである（Ｏｍｕｒａ等，１９７９ａ，Ｏｍｕｒａ等，１９７９ｂ）。スピラマイシンは、大規模なポリケチドのクラスに属し、特に土壌に見られる微生物に豊富な複合分子を含む。
これら分子は、構造的な類似性ではなく、それらの生合成経路の工程におけるある種の類似性によって共にグループ分けされる。特に、ポリケチドは、一連の複雑な反応によって生産されるが、これらの反応には、それらの生合成経路において「ポリケチドシンターゼ」（ＰＫＳ）という１またはそれ以上の酵素によって触媒された一連の反応が起こることが共通している。ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン（プラテノライド）のラクトンベースのマクロサイクルの生合成は、５種のＰＫＳ遺伝子によってコードされる一連の８個のモジュールによって行われる（Ｓ．Ｋｕｈｓｔｏｓｓ，１９９６年，米国特許第５，９４５，３２０号）。スピラマイシンは、このラクトン環から得られる。しかしながら、スピラマイシンが得られるような、糖合成、またそれらのラクトン環への付着、および、この環の修飾に関与する様々な工程および酵素は、これまでにまだわかっていない。
【０００８】
米国特許第５，５１４，５４４号は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいてｓｒｍＲと呼ばれる配列のクローニングを説明している。この特許において、ｓｒｍＲ遺伝子は、マクロライド生合成に関与する遺伝子の転写を調節するタンパク質をコードするという仮説が提唱されている。
【０００９】
１９８７年には、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等，１９８７年）は、Ｓ．アンボファシエンスのスピラマイシン耐性は、少なくとも３種の遺伝子によって付与されることを示しており、前記遺伝子は、ｓｒｍＡ、ｓｒｍＢおよびｓｒｍＣという。米国特許第４，８８６，７５７号は、より特定には、Ｓ．アンボファシエンスのｓｒｍＣ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの特徴付けを説明している。しかしながら、この遺伝子の配列は開示されていない。１９９０年には、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等，１９９０年）は、スピラマイシン生合成に関するｓｒｍＢに近接する３種の遺伝子が存在するという仮説を提唱している。米国特許第５，０９８，８３７号は、スピラマイシン生合成に関与する可能性のある５種の遺伝子のクローニングを報告している。これら遺伝子は、ｓｒｍＤ、ｓｒｍＥ、ｓｒｍＦ、ｓｒｍＧおよびｓｒｍＨと命名された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
スピラマイシンのような化合物を製造する際の主要な困難の１つは、比較的少量の産物を生産するのに極めて大量の発酵が必要となることにある。それゆえに、それらの生産コストを減少させるために、このような分子の生産効率の増加を可能にすることが望ましい。
【００１１】
スピラマイシンの生合成経路は複雑なプロセスであり、このプロセスの最中に存在する可能性のある寄生的反応を同定し、除去することが望ましいと考えられる。このような操作の目的は、より純粋な抗生物質を得ること、および／または、生産性の改善である。この点で、ストレプトマイセス・アンボファシエンスは、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを自然に生産する（図１を参照）；しかしながら、スピラマイシンＩの抗生物質活性は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの活性より明らかに強い（Ｌｉｕ等，１９９９年）。それゆえに、スピラマイシンＩのみを生産する株が得られるが望ましいと考えられる。
【００１２】
マクロライド系抗生物質の商業上の価値のために、新規の誘導体の生産、特に有利な特性を有するスピラマイシン類似体の生産が熱心に探索されている。特にスピラマイシン由来のハイブリッド抗生物質を製造する目的で、スピラマイシンまたはスピラマイシン誘導体の生合成経路の生合成中間体を十分量で生産可能になることが望ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、産物がスピラマイシン生合成に関与する遺伝子のクローニングの結果得られ
た。本発明はまず第一に、スピラマイシンの生合成経路の新規の遺伝子、および、この生合成に関与する新規のポリペプチドに関する。
【００１４】
生合成経路の遺伝子および関連するコーディング配列が、クローニングされており、それぞれのＤＮＡ配列が決定されている。クローニングされたコーディング配列は、以下のように命名される；ｏｒｆ１*ｃ、ｏｒｆ２*ｃ、ｏｒｆ３*ｃ、ｏｒｆ４*ｃ、ｏｒｆ５*、ｏｒｆ６*、ｏｒｆ７*ｃ、ｏｒｆ８*ｃ、ｏｒｆ９*、ｏｒｆ１０*、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９ｃ、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１ｃ、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３ｃ、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５ｃ、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７、ｏｒｆ１８、ｏｒｆ１９、ｏｒｆ２０、ｏｒｆ２１ｃ、ｏｒｆ２２ｃ、ｏｒｆ２３ｃ、ｏｒｆ２４ｃ、ｏｒｆ２５ｃ、ｏｒｆ２６、ｏｒｆ２７、ｏｒｆ２８ｃ、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０ｃ、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２ｃ、ｏｒｆ３３、および、ｏｒｆ３４ｃ。スピラマイシンの生合成経路において、これら配列によってコードされるタンパク質の機能は、以下の考察で展開させるが、これらは図４、５、６および８で説明される。
【００１５】
１）本発明の第一の目的は、スピラマイシン生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、前記ポリヌクレオチドの配列は、以下の通りである：
（ａ）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列のいずれか１つ、
（ｂ）配列（ａ）の変異体からなる配列のいずれか１つ、
（ｃ）遺伝子コードの縮重により配列（ａ）および（ｂ）から得られた配列のいずれか１つ。
【００１６】
２）本発明の目的はまた、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の段落１）に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つにハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
【００１７】
３）本発明はまた、上記の段落１）に記載のポリヌクレオチドの少なくとも１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０または１９００個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のヌクレオチド同一性を示すポリヌクレオチドに関する。
【００１８】
４）本発明はまた、ストレプトマイセス属の細菌から単離される、上記の段落２）または３）に記載のポリヌクレオチドに関する。
【００１９】
５）本発明はまた、マクロライドの生合成に関与するタンパク質をコードする、上記の段落２）、３）または４）に記載のポリヌクレオチドに関する。
【００２０】
６）本発明はまた、ハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、同一性を示すポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質に類似した活性を有するタンパク質をコードする、上記の段落２）、３）または４）に記載のポリヌクレオチドに関する。
【００２１】
７）本発明はまた、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）または６）に記載のポリヌクレオチドの発現によって生じるポリペプチドに関する。
【００２２】
８）本発明の他の形態は、スピラマイシン生合成に関与するポリペプチドに関し、前記ポリペプチドの配列は以下の通りである：
（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０の配列のいずれか１つ、
（ｂ）（ａ）で定義された配列のいずれか１つ（ただし、前記配列にわたり、１またはそれ以上のアミノ酸が、それらの機能特性に影響を与えることなく置換、挿入または欠失されている）、
（ｃ）配列（ａ）の変異体からなる配列のいずれか１つおよび（ｂ）。
【００２３】
９）本発明の他の目的は、上記の段落８）に記載のポリペプチドの、少なくとも１０、１５、２０、３０〜４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０または６４０個の連続したアミノ酸を含むポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％のアミノ酸同一性を示すポリペプチドに関する。
【００２４】
１０）本発明の他の形態は、ストレプトマイセス属の細菌から単離される、上記の段落９）に記載のポリペプチドに関する。
【００２５】
１１）本発明の他の形態は、マクロライドの生合成に関与するタンパク質をコードする、上記の段落９）または１０）に記載のポリペプチドに関する。
【００２６】
１２）本発明の他の形態は、それが同一性を共有するポリペプチドの活性に類似した活性を有する、上記の段落９）、１０）または１１）に記載のポリペプチドに関する。
【００２７】
１３）本発明の他の形態は、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）および６）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含む組換えＤＮＡに関する。
【００２８】
１４）本発明の他の形態は、前記組換えＤＮＡは、ベクターに含まれる、上記の段落１３）に記載の組換えＤＮＡに関する。
【００２９】
１５）本発明の他の形態は、前記ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、インテグレート可能なベクター、フォスミド、コスミド、シャトルベクター、ＢＡＣおよびＰＡＣから選択される、上記の段落１４）に記載の組換えＤＮＡに関する。
【００３０】
１６）本発明の他の形態は、ｐＯＳ４９．１、ｐＯＳ４９．１１、ｐＯＳＣ４９．１２、ｐＯＳ４９．１４、ｐＯＳ４９．１６、ｐＯＳ４９．２８、ｐＯＳ４４．１、ｐＯＳ４４．２、ｐＯＳ４４．４、ｐＳＰＭ５、ｐＳＰＭ７、ｐＯＳ４９．６７、ｐＯＳ４９．８８、ｐＯＳ４９．１０６、ｐＯＳ４９．１２０、ｐＯＳ４９．１０７、ｐＯＳ４９．３２、ｐＯＳ４９．４３、ｐＯＳ４９．４４、ｐＯＳ４９．５０、ｐＯＳ４９．９９、ｐＳＰＭ１７、ｐＳＰＭ２１、ｐＳＰＭ５０２、ｐＳＰＭ５０４、ｐＳＰＭ５０７、ｐＳＰＭ５０８、ｐＳＰＭ５０９、ｐＳＰＭ１、ｐＢＸＬ１１１１、ｐＢＸＬ１１１２、ｐＢＸＬ１１１３、ｐＳＰＭ５２０、ｐＳＰＭ５２１、ｐＳＰＭ５２２、ｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、ｐＳＰＭ５２５、ｐＳＰＭ５２７、ｐＳＰＭ５２８、ｐＳＰＭ３４、ｐＳＰＭ３５、ｐＳＰＭ３６、ｐＳＰＭ３７、ｐＳＰＭ３８、ｐＳＰＭ３９、ｐＳＰＭ４０、ｐＳＰＭ４１、ｐＳＰＭ４２、ｐＳＰＭ４３、ｐＳＰＭ４４、ｐＳＰＭ４５、ｐＳＰＭ４７、ｐＳＰＭ４８、ｐＳＰＭ５０、ｐＳＰＭ５１、ｐＳＰＭ５２、ｐＳＰＭ５３、ｐＳＰＭ５５、ｐＳＰＭ５６、ｐＳＰＭ５８、ｐＳＰＭ７２、ｐＳＰＭ７３、ｐＳＰＭ５１５、ｐＳＰＭ５１９、ｐＳＰＭ７４、ｐＳＰＭ７５、ｐＳＰＭ７９、ｐＳＰＭ８３、ｐＳＰＭ１０７、ｐＳＰＭ５４３、および、ｐＳＰＭ１０６から選択される、上記の段落１５）に記載の組換えＤＮＡに関する。
【００３１】
１７）本発明の他の形態は、上記の段落７）、８）、９）、１０）、１１）または１２）に記載のポリペプチドをコードする核酸配列の少なくとも１つを含む発現ベクターに関する。
【００３２】
１８）本発明はまた、上記の段落７）、８）、９）、１０）、１１）または１２）に記載のポリペプチドの１またはそれ以上の発現が可能な、適切な発現ベクターを含む発現系、および、宿主細胞に関する。
【００３３】
１９）本発明はまた、原核性の発現系、および、真核性の発現系から選択される、上記の段落１８）に記載の発現系に関する。
【００３４】
２０）本発明はまた、細菌Ｅ．コリにおける発現系、昆虫細胞において発現が可能なバキュロウイルス発現系、酵母細胞において発現が可能な発現系、および、哺乳動物細胞での発現が可能な発現系から選択される、上記の段落１９）に記載の発現系に関する。
【００３５】
２１）本発明はまた、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）、６）、１３）、１４）、１５）、１６）および１７）のいずれか１つに記載の、少なくとも１つのポリペプチド、および／または、少なくとも１つの組換えＤＮＡ、および／または、少なくとも１つの発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。
【００３６】
２２）本発明はまた、上記の段落７）、８）、９）、１０）、１１）または１２）に記載のポリペプチドの製造方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つを、適切なベクターに挿入する工程；
ｂ）工程ａ）のベクターで予め形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な培地で培養する工程；
ｃ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程；
ｄ）前記培地から、または、工程ｃ）で得られた細胞抽出物から、前記ポリペプチドを分離および精製する工程；
ｅ）必要に応じて、製造された組換えポリペプチドを特徴付ける工程。
【００３７】
２３）本発明の他の形態は、少なくとも１種のマクロライドの生合成経路の工程でブロックされた微生物に関する。
【００３８】
２４）本発明の他の形態は、前記マクロライドを生産する微生物における前記マクロライドの生合成に関与する少なくとも１つのタンパク質の機能を不活性化することによって得られる、上記の段落２３）に記載の微生物に関する。
【００３９】
２５）本発明の他の形態は、前記タンパク質の不活性化は、前記タンパク質をコードす
る遺伝子における変異誘発によって、または、１またはそれ以上の前記タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現によって行われる、上記の段落２４）に記載の微生物に関する。
【００４０】
２６）本発明の他の形態は、前記タンパク質の不活性化は、放射線照射による変異誘発、変異誘発化学薬剤の作用、部位特異的変異誘発、または、遺伝子置換によって行われる、上記の段落２５）に記載の微生物に関する。
【００４１】
２７）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、インビトロまたはインサイチュで、対象の遺伝子の１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加によって、または、遺伝子不活性化によって行われる、上記の段落２５）または２６）に記載の微生物に関する。
【００４２】
２８）本発明の他の形態は、前記微生物はストレプトマイセス属の細菌である、上記の段落２３）、２４）、２５）、２６）または２７）に記載の微生物に関する。
【００４３】
２９）本発明の他の形態は、前記マクロライドはスピラマイシンである、上記の段落２３）、２４）、２５）、２６）、２７）または２８）に記載の微生物に関する。
【００４４】
３０）本発明の他の形態は、前記微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である、上記の段落２３）、２４）、２５）、２６）、２７）、２８）または２９）に記載の微生物に関する。
【００４５】
３１）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）および６）のいずれか１つに記載の配列を含む遺伝子の少なくとも１つで行われる、上記の段落２３）、２４）、２５）、２６）、２７）、２８）、２９）または３０）に記載の微生物に関する。
【００４６】
３２）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上で行われる、上記の段落２５）、２６）、２７）、２８）、２９）、３０）または３１）に記載の微生物に関する。
【００４７】
３３）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、配列番号１３の配列に対応する配列を含む遺伝子の遺伝子不活性化からなる、上記の段落２５）、２６）、２７）、２８）、２９）、３０）、３１）または３２）に記載の微生物に関する。
【００４８】
３４）本発明の他の形態は、２００２年７月１０日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＣＮＣＭ）に、登録番号Ｉ−２９０９、Ｉ−２９１１、Ｉ−２９１２、Ｉ−２９１３、Ｉ−２９１４、Ｉ−２９１５、Ｉ−２９１６またはＩ−２９１７で寄託された株のいずれか１つから選択される株である、ストレプトマイセス・アンボファシエンス株に関する。
【００４９】
３５）本発明の他の形態は、マクロライド生合成の中間体の製造方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
ａ）上記の段落２３）、２４）、２５）、２６）、２７）、２８）、２９）、３０）、３１）、３２）、３３）または３４）のいずれか１つに記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
ｃ）前記培地から、または、工程ｂ）で得られた抽出物から、前記生合成の中間体を分離および精製する工程。
【００５０】
３６）本発明の他の形態は、生合成の中間体は、上記の段落３５）に記載の方法に従って製造され、このようにして生産された中間体は、修飾される、マクロライドから得られた分子の製造方法に関する。
【００５１】
３７）本発明の他の形態は、前記中間体は、化学的に、生化学的に、酵素的に、および／または、微生物学的に修飾される、上記の段落３６）に記載の製造方法に関する。
【００５２】
３８）本発明の他の形態は、中間体を基質として用いることによって中間体を修飾することができるタンパク質をコードする遺伝子の１またはそれ以上が、前記微生物に導入される、上記の段落３６）または３７）に記載の製造方法に関する。
【００５３】
３９）本発明の他の形態は、前記マクロライドはスピラマイシンである、上記の段落３６）、３７）または３８）に記載の製造方法に関する。
【００５４】
４０）本発明の他の形態は、用いられる前記微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である、上記の段落３６）、３７）、３８）または３９）に記載の製造方法に関する。
【００５５】
４１）本発明の他の形態は、スピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物に関する。
【００５６】
４２）本発明の他の形態は、スピラマイシンＩの生合成に必要な遺伝子の全てを含むが、配列番号１３の配列を含む遺伝子、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つは、発現されないか、または、不活性にされている、上記の段落４１）に記載の微生物に関する。
【００５７】
４３）本発明の他の形態は、前記不活性化は、前記タンパク質をコードする遺伝子における変異誘発によって、または、前記タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現によって行われる、上記の段落４２）に記載の微生物に関する。
【００５８】
４４）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、コードされたタンパク質が不活性化されるように、または、それらからのその発現またはその翻訳が阻害されるように、この遺伝子のプロモーター中、コーディング配列中、または、非コーディング配列中で行われる、上記の段落４３）に記載の微生物に関する。
【００５９】
４５）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、放射線照射、変異誘発化学薬剤の作用、部位特異的変異誘発、または、遺伝子置換によって行われる、上記の段落４３）または４４）に記載の微生物に関する。
【００６０】
４６）本発明の他の形態は、前記変異誘発は、インビトロまたはインサイチュで、対象の遺伝子の１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加によって、または、遺伝子不活性化によって行われる、上記の段落４３）、４４）または４５）に記載
の微生物に関する。
【００６１】
４７）本発明の他の形態は、前記微生物は、スピラマイシンの生合成経路の遺伝子を発現することによって得られ、これら遺伝子は、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つを含まない、上記の段落４１）または４２）に記載の微生物に関する。
【００６２】
４８）本発明の他の形態は、前記微生物はストレプトマイセス属の細菌である、上記の段落４１）、４２）、４３）、４４）、４５）、４６）または４７）に記載の微生物に関する。
【００６３】
４９）本発明の他の形態は、前記微生物は、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産する出発株から得られる、上記の段落４１）、４２）、４３）、４４）、４５）、４６）、４７）または４８）に記載の微生物に関する。
【００６４】
５０）本発明の他の形態は、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、同じ機能を有する、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つにおける変異誘発によって得られる、上記の段落４１）、４２）、４３）、４４）、４５）、４６）、４７）、４８）または４９）に記載の微生物に関する。
【００６５】
５１）本発明の他の形態は、前記微生物は、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産するＳ．アンボファシエンス株から得られ、ここで、配列番号１３に相当する配列、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の遺伝子不活性化が行われている、上記の段落４１）、４２）、４３）、４４）、４５）、４６）、４７）、４８）、４９）または５０）に記載の微生物に関する。
【００６６】
５２）本発明の他の形態は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１０で寄託された株であるＳ．アンボファシエンス株に関する。
【００６７】
５３）本発明の他の形態は、スピラマイシンＩの製造方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上記の段落４１）、４２）、４３）、４４）、４５）、４６）、４７）、４８）、４９）、５０）、５１）および５２）のいずれか１つに記載の微生物を、適切な培地で培養すること、
（ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収すること、
（ｃ）前記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、スピラマイシンＩを分離および精製すること。
【００６８】
５４）本発明の他の形態は、微生物のマクロライド生産を改善するための、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）および６）のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドの使用に関する。
【００６９】
５５）本発明の他の形態は、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）または６）のいずれか１つに記載の配列を含む遺伝子の少なくとも１つに遺伝子修飾を有し、上記の段落
１）、２）、３）、４）、５）および６）のいずれか１つに記載の配列を含む遺伝子の少なくとも１つを過剰発現する、マクロライドを製造する突然変異微生物に関する。
【００７０】
５６）本発明の他の形態は、前記遺伝子修飾は、より高い活性を有するタンパク質の１またはそれ以上を発現させる目的で、または、このタンパク質をより高いレベルで発現させる目的で、対象の遺伝子における１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加からなる、上記の段落５５）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７１】
５７）本発明の他の形態は、対象の遺伝子の前記過剰発現は、遺伝子のコピー数を増加させることによって、および／または、野生型プロモーターより活性なプロモーターを導入することによって得られる、上記の段落５５）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７２】
５８）本発明の他の形態は、対象の遺伝子の前記過剰発現は、上記の段落１３、１４または１７に記載の組換えＤＮＡコンストラクトで、マクロライドを生産する微生物を形質転換させ、この遺伝子を過剰発現させることによって得られる、上記の段落５５）または５７）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７３】
５９）本発明の他の形態は、前記遺伝子修飾は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上で行われる、上記の段落５５）、５６）、５７）または５８）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７４】
６０）本発明の他の形態は、前記微生物は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上を過剰発現する、上記の段落５５）、５６）、５７）、５８）または５９）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７５】
６１）本発明の他の形態は、前記微生物はストレプトマイセス属の細菌である、上記の段落５５）、５６）、５７）、５８）、５９）または６０）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７６】
６２）本発明の他の形態は、前記マクロライドはスピラマイシンである、上記の段落５５）、５６）、５７）、５８）、５９）、６０）または６１）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７７】
６３）本発明の他の形態は、前記微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である、上記の段落５５）、５６）、５７）、５８）、５９）、６０）、６１）または６２）に記載の突然変異微生物に関する。
【００７８】
６４）本発明の他の形態は、マクロライドの製造方法に関し、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）上記の段落５５）、５６）、５７）、５８）、５９）、６０）、６１）、６２）
、６３）および６４）のいずれか１つに記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
（ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
（ｃ）前記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、生産された前記マクロライドを分離および精製する工程。
【００７９】
６５）本発明の他の形態は、ハイブリッド抗生物質を製造するための、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）、６）、７）、８）、９）、１０）、１１）、１２）、１３）、１４）、１５）、１６）および１７）のいずれか１つに記載の、配列、および／または、組換えＤＮＡ、および／または、ベクターの使用に関する。
【００８０】
６６）本発明の他の形態は、１またはそれ以上の生物変換反応を行うための、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）、６）、７）、８）、９）、１０）、１１）、１２）、１３）、１４）、１５）、１６）、１７）および２１）のいずれか１つに記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、少なくとも１つの組換えＤＮＡ、および／または、少なくとも１つの発現ベクター、および／または、少なくとも１つのポリペプチド、および／または、少なくとも１つの宿主細胞の使用に関する。
【００８１】
６７）本発明の他の形態は、上記の段落１）、２）、３）、４）、５）または６）に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチドに関する。
【００８２】
６８）本発明の他の形態は、少なくとも１種のスピラマイシンを生産する微生物に関し、前記微生物は：
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子、
を過剰発現する。
【００８３】
６９）本発明の他の形態は、ストレプトマイセス属の細菌である、段落６８または９０に記載の微生物に関する。
【００８４】
７０）本発明の他の形態は、ストレプトマイセス・アンボファシエンス種の細菌である、段落６８、６９または９０に記載の微生物に関する。
【００８５】
７１）本発明の他の形態は、前記遺伝子の過剰発現は、前記微生物の発現ベクターでの形質転換によって得られる、段落６８、６９、７０または９０に記載の微生物に関する。
【００８６】
７２）本発明の他の形態は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年１０月６日に、登録番号Ｉ−３１０１で寄託されたＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（１）株またはＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）株である、ストレプトマイセス・アンボファシエンス株に関する。
【００８７】
７３）本発明の他の形態は、組換えＤＮＡに関し、本組換えＤＮＡは、以下を含む：
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得ることができるポリヌクレオチド、または、
−このポリヌクレオチドの少なくとも１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０または１５００個の連続したヌクレオチドのフラグメント。
【００８８】
７４）本発明の他の形態は、ベクターである、段落７３または９１に記載の組換えＤＮＡに関する。
【００８９】
７５）本発明の他の形態は、発現ベクターである、段落７３、７４または９１に記載の組換えＤＮＡに関する。
【００９０】
７６）本発明の他の形態は、段落７３、７４、７５および９１のいずれか１つに記載の少なくとも１つの組換えＤＮＡが導入されている宿主細胞に関する。
【００９１】
７７）本発明の他の形態は、以下の工程を含むポリペプチドの製造方法に関する：
ａ）段落７５に記載の少なくとも１つの発現ベクターで、宿主細胞を形質転換させる工程；
ｂ）前記宿主細胞を、適切な培地で培養する工程；
ｃ）  調整培地または細胞抽出物を回収する工程；
ｄ）前記培地から、または、工程ｃ）で得られた細胞抽出物から、前記ポリペプチドを分離および精製する工程；
ｅ）必要に応じて、製造された組換えポリペプチドを特徴付ける工程。
【００９２】
７８）本発明の他の形態は、前記遺伝子不活性化は、配列番号１３に相当する配列、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子、または、その一部のフェーズ内の欠失によって行われる、段落５１に記載の微生物に関する。
【００９３】
７９）本発明の他の形態は、段落４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１および７８のいずれか１つに記載の微生物に関し、以下の遺伝子も過剰発現する：
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得ることが
できる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子。
【００９４】
８０）本発明の他の形態は、前記配列番号４７の配列のポリヌクレオチド、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られたポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現が可能なプロモーターの制御下に置かれている、発現ベクターに関する。
【００９５】
８１）本発明の他の形態は、プラスミドｐＳＰＭ５２４またはｐＳＰＭ５２５である、段落８０に記載の発現ベクターに関する。
【００９６】
８２）本発明の他の形態は、段落８０または８１に記載のベクターで形質転換されたストレプトマイセス・アンボファシエンス株に関する。
【００９７】
８３）本発明の他の形態は、コーディング配列である配列番号４７、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られたコーディング配列を有する遺伝子も過剰発現する、段落４１、４２、４３．４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７８、７９および９２のいずれか１つに記載の微生物に関する。
【００９８】
８４）本発明の他の形態は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年２月２６日に、登録番号Ｉ−２９７７で寄託されたＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株である、段落８３に記載の微生物に関する。
【００９９】
８５）本発明の他の形態は、以下の工程を含むスピラマイシンの製造方法に関する：
（ａ）段落６８、６９、７０、７１、７２、７８、７９、８２、８３、８４、９０および９２のいずれか１つに記載の微生物を、適切な培地で培養する工程、
（ｂ）調整培地または細胞抽出物を回収する工程、
（ｃ）前記培地から、または、工程ｂ）で得られた細胞抽出物から、スピラマイシンを分離および精製する工程。
【０１００】
８６）本発明の他の形態は、配列番号１１２の配列、または、配列番号１４２の配列を含むポリペプチドに関する。
【０１０１】
８７）本発明の他の形態は、配列が、以下の遺伝子のコーディング配列から翻訳された配列に相当するポリペプチドに関する：
−以下の配列プライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡポリメラーゼを用いて連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子。
【０１０２】
８８）本発明の他の形態は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて、段落８６、８７または９３に記載のポリペプチドの発現が可能な発現ベクターに関する。
【０１０３】
８９）本発明の他の形態は、プラスミドｐＳＰＭ７５である、段落８８に記載の発現ベクターに関する。
【０１０４】
９０）本発明の他の形態は、ポリメラーゼ連鎖増幅によって得ることができる前記遺伝子は、コーディング配列である配列番号１４１の遺伝子、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子である、段落６８に記載の微生物に関する。
【０１０５】
９１）本発明の他の形態は、ポリメラーゼ連鎖増幅によって得ることができる前記ポリヌクレオチドは、配列番号１４１の配列のポリヌクレオチドである、段落７３に記載の組換えＤＮＡに関する。
【０１０６】
９２）本発明の他の形態は、ポリメラーゼ連鎖増幅によって得ることができる前記遺伝子は、コーディング配列である配列番号１４１の遺伝子、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子である、段落７９に記載の微生物に関する。
【０１０７】
９３）本発明の他の形態は、配列が、配列番号１４２であるポリペプチドに関する。
【０１０８】
一般的な定義
本発明の目的に関して、用語「単離された」は、元々の環境（天然に存在する環境）から分離した生体物質（核酸またはタンパク質）を意味する。
【０１０９】
例えば、植物または動物に天然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていない。このようなポリヌクレオチドが植物または動物のゲノムに天然に挿入されている隣接する核酸から分離された場合、このポリヌクレオチドは、「単離された」とみなされる。
【０１１０】
このようなポリヌクレオチドは、ベクターに含まれていてもよく、および／または、このようなポリヌクレオチドは、組成物に含まれていてもよく、および、は、ベクターまたは組成物はその天然の環境を構成するものではないため、それでもなお単離された状態のままとすることができる。
【０１１１】
用語「精製された」は、物質が、その他の化合物が存在しない完全に純粋な状態で存在することを要求しない。この用語はむしろ相対的な定義である。
【０１１２】
「精製された」ポリヌクレオチドとは、出発物質または天然物質を、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、選択的には４または５桁の規模で精製した後のことをいう。
【０１１３】
本発明の目的に関して、用語ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は、特に遺伝子のコーディング配列を意味するのに用いられている。
【０１１４】
本発明の目的に関して、表現「ヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチドまたは核酸いずれも意味するのに用いることができる。表現「ヌクレオチド配列」は、遺伝物質それ自体を包含し、それゆえに、その配列に関する情報に限定されない。
【０１１５】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」またあるいは「ヌクレオチド配列」は、２個以上のヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ配列、または、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を包含し、これらは一本鎖型または二本鎖型のいずれでもよい。
【０１１６】
用語「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、ｃ）、さらに、（１）プ
リン類似体、（２）ピリミジン類似体、または、（３）糖類似体のような少なくとも１つの修飾を含む修飾されたヌクレオチドの両方を意味し、このような修飾ヌクレオチドの例は、例えばＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／０４０６４で説明されている。
【０１１７】
本発明の目的に関して、第一のポリヌクレオチドの各塩基が、リバース方向の第二のポリヌクレオチドの相補的な塩基と対を形成する場合、第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチドに「相補的」であるとみなす。相補的な塩基は、ＡとＴ（または、ＡとＵ）、または、ＣとＧである。
【０１１８】
用語「スピラマイシンの生合成経路の遺伝子」はまた、調節遺伝子、および、生産微生物に耐性を付与する遺伝子も含む。
【０１１９】
本発明によれば、関連核酸の「フラグメント」という用語は、関連核酸より短く、共通部分に関連核酸と同一なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を意味するものとする。
【０１２０】
本発明によれば、このような核酸「フラグメント」は、必要に応じて、より大きいポリヌクレオチドに含まれてもよく、上記フラグメントはその構成要素である。
【０１２１】
このようなフラグメントは、長さが、本発明に係る核酸の、８、１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０または１９００個の連続したヌクレオチドの範囲のポリヌクレオチドを含む、またあるいは、からなる。
【０１２２】
本発明によれば、ポリペプチドの「フラグメント」という用語は、そのアミノ酸配列は、関連ポリペプチドのアミノ酸配列配列より短く、これら関連ポリペプチドと共通する部分全体にわたって同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味するものとする。
【０１２３】
このようなフラグメントは、必要に応じて、より大きいポリペプチドに含まれてもよく、上記フラグメントが一部となる。
【０１２４】
このような、本発明に係るポリペプチドのフラグメントとしては、長さが、１０、１５、２０、３０〜４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０または６４０個のアミノ酸が可能である。
【０１２５】
本発明の目的に関して、表現「高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、非相同な核酸鎖のハイブリダイゼーションには望ましくないハイブリダイゼーション条件を意味するものとする。例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔによって説明された（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８４年）緩衝液中での温度５５℃〜６５℃でのハイブリダイゼーション条件と説明することができ、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは５５℃であり、さらにより好ましくは６０℃であり、最も好ましくは６５℃である；それに続いて、２×ＳＳＣ緩衝液（１×ＳＳＣ緩衝液は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液に相当する）で、温度５５℃〜６５℃で、１回以上の洗浄が行われ、この温度は、好ましくは５５℃であり、さらにより好ましくは６０℃であり、最も好ましくは６５℃である；続いて、０．５×ＳＳＣ緩衝液で、温度５５℃〜６５℃で、１回以上の洗浄が行われる、この温度は、好ましくは５５℃であり、さらにより好ましくは６０℃であり、最も好ましくは６５℃である。
【０１２６】
当然ながら、上述のハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが検索される核酸の長さ、または、当業者既知の技術に従って選択された標識タイプの機能に応じて、調節することができる。例えば、適切なハイブリダイゼーション条件は、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）による著書に従って調節することができる。
【０１２７】
本発明に係る核酸の「変異体」という用語は、関連ポリヌクレオチドに比べて１またはそれ以上の塩基が異なる核酸を意味するものとする。変異核酸は、天然に存在する突然変異体のような天然起源のものでもよいし、または、例えば変異誘発技術によって得られた非天然変異体のものでもよい。
【０１２８】
一般的に、関連核酸と変異核酸との差異は、関連核酸と変異核酸のヌクレオチド配列が極めて近く、多くの領域において同一である程度に小さい。変異核酸に存在するヌクレオチド修飾はサイレントであってもよく、サイレントとは、それらが前記変異核酸によってコードされるアミノ酸配列を修飾しないことを意味する。
【０１２９】
しかしながら、変異核酸におけるヌクレオチド変化は、関連核酸によってコードされるペプチドに比べて、変異核酸によってコードされるポリペプチドに置換、付加および／または欠失を生じさせてもよい。加えて、コード領域におけるヌクレオチド修飾により、アミノ酸配列中に保存的または非保存的な置換を生じさせてもよい。
【０１３０】
好ましくは、本発明に係る変異核酸は、実質的に関連核酸のポリペプチドと同じ機能または生物活性、または、もとの核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体によって認識される能力を保存するポリペプチドをコードする。
【０１３１】
従って、いくつかの変異核酸は、突然変異した形態のポリペプチドをコードすることもあり、これらを系統的に研究することによって、問題のタンパク質の構造と活性との関係を推測することが可能になる。
【０１３２】
本発明に係るポリペプチドの「変異体」という用語は、主として、アミノ酸配列に、関連ポリペプチドのアミノ酸配列に比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基の１またはそれ以上の置換、付加または欠失を含むポリペプチドを意味するものとし、このようなアミノ酸置換は保存的または非保存的のどちらの可能性もあると理解される。
【０１３３】
好ましくは、本発明に係る変異ポリペプチドは、関連ポリペプチドと実質的に同じ機能または生物活性、または、もとのポリペプチドに対する抗体によって認識される能力を保存している。
【０１３４】
本発明の目的に関して、関連ポリペプチド「に類似した活性」を有するポリペプチドは、関連ポリペプチドの生物活性を測定するのに適した生物学的分析で測定された、関連ポリペプチドの生物活性に近い（ただし必ずしも同一でない）生物活性を有するポリペプチドを意味するものとする。
【０１３５】
本発明の目的に関して、用語「ハイブリッド抗生物質」は、組換えＤＮＡ技術を用いた人工的な生合成経路を構築することによって生じた化合物を意味するものとする。
【０１３６】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、より特定には、下記の詳細な説明で示される新規のスピラマイシンの生合成経路の遺伝子、および、この生合成に関与する新規のポリペプチドである。
【０１３７】
上記生合成経路の遺伝子をクローニングし、これら遺伝子のＤＮＡ配列を決定した。得られた配列を、ＦｒａｍｅＰｌｏｔプログラム（Ｊ．ＩｓｈｉｋａｗａおよびＫ．Ｈｏｔｔａ、１９９９年）を用いて解析した。オープンリーディングフレームのなかでも、ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示すものが同定された。この解析により、この領域は、酵素「ポリケチドシンターゼ」（ＰＫＳ）をコードし、ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示す５個の遺伝子のいずれかのサイドに位置する４４のＯＲＦを含むであることが示された。これらＰＫＳをコードする５個の遺伝子のいずれかのサイドに、下流と上流それぞれに１０個と３４個のＯＲＦが同定された（下流と上流は、全て同じ方向を向いた５つのＰＫＳ遺伝子の方向によって定義される）（図３および３７を参照）。従って、このタイプの、約４１．７ｋｂの領域を占める３４個のオープンリーディングフレーム（以下を参照；２５個のＯＲＦを含む３１ｋｂの第一の領域を示す配列番号１、および、約１２．１ｋｂの領域を示す配列番号１４０、そのうち１．４ｋｂが先行する配列（配列番号１）とオーバーラップし、そのうち約１０．７ｋｂがそれに続く配列に相当し、後者の約１０．７ｋｂの部分はさらなる９個のＯＲＦ（部分的配列の１個のＯＲＦを含む）を含む；また、下記の図３および３７も参照）が、ＰＫＳをコードする５個の遺伝子の上流に同定され、約１１．１ｋｂの領域を占める１０個のオープンリーディングフレーム（配列番号２および図３）をＰＫＳ遺伝子の下流で同定した。従って、５つのＰＫＳ遺伝子の下流に位置する１０個の遺伝子は、以下のように命名した；ｏｒｆ１*ｃ、ｏｒｆ２*ｃ、ｏｒｆ３*ｃ、ｏｒｆ４*ｃ、ｏｒｆ５*、ｏｒｆ６*、ｏｒｆ７*ｃ、ｏｒｆ８*、ｏｒｆ９*、および、ｏｒｆ１０*（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１）。遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、問題のＯＲＦに関して、コーディング配列が逆方向であること（それゆえに、コーディング鎖は、これら遺伝子について配列番号２で示される配列に相補的な鎖である）を意味する。同じ命名法を用いて、ＰＫＳ遺伝子上流の３４個のＯＲＦを、以下のようにと命名した；ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９ｃ、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１ｃ、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３ｃ、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５ｃ、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７、ｏｒｆ１８、ｏｒｆ１９、ｏｒｆ２０、ｏｒｆ２１ｃ、ｏｒｆ２２ｃ、ｏｒｆ２３ｃ、ｏｒｆ２４ｃ、ｏｒｆ２５ｃ、ｏｒｆ２６、ｏｒｆ２７、ｏｒｆ２８ｃ、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０ｃ、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２ｃ、ｏｒｆ３３、および、ｏｒｆ３４ｃ（配列番号２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９）（図３および３７を参照）。
【０１３８】
様々なプログラムを用いて、これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列を、以下の様々なデータベースに存在するタンパク質配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ，ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ）（これら３種のプログラムは、特に、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）（ベセスダ，メリーランド州，米国）から入手可能である）、ＦＡＳＴＡ（（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年）および（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）、ＢＥＡＵＴＹ（Ｋ．Ｃ，Ｗｏｒｌｅｙ等，１９９５年））（これら２種のプログラムは、特に、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｅｎｔｅｒ，エヴリー，フランス）から入手可能である）。これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のあるものを同定することができた。
【０１３９】
ＰＫＳをコードする遺伝子の下流に位置する遺伝子
上記領域の構成の図表示を図３に示す。以下で実証されるように、ＰＫＳをコードする遺伝子の下流で同定された１０個の遺伝子において、９個がスピラマイシンの生合成、または、スピラマイシンに対する耐性に関与するようである。それらは、以下の９個の遺伝子である：ｏｒｆ１*ｃ、ｏｒｆ２*ｃ、ｏｒｆ３*ｃ、ｏｒｆ４*ｃ、ｏｒｆ５*、ｏｒｆ６*、ｏｒｆ７*ｃ、ｏｒｆ８*、および、ｏｒｆ９*。
【０１４０】
下記の表１に、５つのＰＫＳ遺伝子の下流で同定された１０個の遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列に対するリファレンスを示す。
【表１】
2006501863.tif 000002
【０１４１】
遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、コーディング配列が逆方向であること（それゆえに、コーディング鎖は、これら遺伝子について配列番号２で示される配列に相補的な鎖である）を示す。
【０１４２】
同定されたポリペプチドの機能を決定するために、３つのタイプの実験を行った：同定された配列と機能がわかっている配列との比較、突然変異株の構築をもたらす遺伝子不活性化実験、および、スピラマイシンの生産、および、これら突然変異株によるスピラマイシン生合成中間体の解析。
【０１４３】
まず第一に、様々なプログラムを用いて、これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列を、以下の様々なデータベースに存在する配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ，ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ）、ＦＡＳＴＡ（（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年）および（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）、ＢＥＡＵＴＹ（Ｋ．Ｃ．Ｗｏｒｌｅｙ等，１９９５年））。これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のあるものを同定することができた。表２は、５つのＰＫＳ遺伝子の下流に位置する１０個の遺伝子の産物と強い類似性を示すタンパク質を示す。
【０１４４】
【表２】
2006501863.tif 000003
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１４５】
これらの結果を確認するために、遺伝子不活性化実験を行った。用いられた方法は、遺伝子置換を行うことにある。インタラプトさせようとする標的遺伝子は、抗生物質（例えば、アプラマイシン、ゲネチシンまたはハイグロマイシン）に対する耐性を付与するカセットでインタラプトされたこの遺伝子のコピーで置換される。用いられるカセットは、全てのリーディングフレームの翻訳終止コドンのいずれかの端に、および、ストレプトマイセスにおいて活性な転写ターミネーターのいずれかの端に隣接する。標的遺伝子へのカセットの挿入は、この標的遺伝子欠失を伴ってもよいし、または、伴わなくてもよい。カセットに隣接する領域のサイズは、数百から数千塩基対の範囲であり得る。第二のタイプのカセットは、遺伝子不活性化に用いることができ、このようなカセットは、「切り出し可能なカセット」と命名される。これらカセットは、Ｓ．アンボファシエンスのゲノムに導入された後の部位特異的な組換え現象によってストレプトマイセスにおいて切り出すことができるという利点を有する。この目的は、ストレプトマイセス株において、最終的な株において選択マーカーまたはその株に属さない大きいＤＮＡ配列を離脱させることなく特定の遺伝子を不活性することである。切り出しの後、約３０個の塩基対からなる短い配列のみ（「ｓｃａｒ」部位という）がその株のゲノムに残る（図１０を参照）。この系の使用は、最初のうちは、標的遺伝子の野生型コピーを、この標的遺伝子に切り出し可能なカセットが挿入されているコンストラクトで置換することにある（２回の相同な組換え現象に基づく，図９を参照）。このカセットの挿入は、標的遺伝子の欠失を伴う（図９を参照）。第二に、株のゲノムからの切り出し可能なカセットの切り出しが起こる。切り出し可能なカセットは、部位特異的な組換えの系に基づいて機能し、末端に耐性遺伝子を持たないストレプトマイセス突然変異体を得ることを可能にするという利点を有する。不活性化された遺伝子の下流に位置する遺伝子の発現に対して起こり得る極性作用も回避される（図１０を参照）。このようにして構築された株をそれらのスピラマイシン生産について試験した。
【０１４６】
配列比較実験により、ｏｒｆ１*ｃ、ｏｒｆ２*ｃ、ｏｒｆ３*ｃおよびｏｒｆ４*ｃ遺伝子は、比較的近い抗生物質の生合成に関与する遺伝子と比較的高い類似性を有するということを決定することができたことから、ｏｒｆ１*ｃ、ｏｒｆ２*ｃ、ｏｒｆ３*ｃおよびｏｒｆ４*ｃ遺伝子は、不活性化されなかった。従って、ｏｒｆ１*ｃ遺伝子は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするｔｙｌＭＩ遺伝子によってコードされたタンパク質と６６％の同一性を示すタンパク質をコードしており（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）、ここでＮ−メチルトランスフェラーゼとは、チロシンの生合成に関与し、ストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）（Ａ．Ｒ．Ｇａｎｄｅｃｈａ等，１９９７年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＣＡＡ５７４７３；ＢＬＡＳＴスコア：２８７）におけるマイカミノースの生産の際に３−Ｎ−メチル化を触媒するものである。これと、比較的近いその他の抗生物質に関する生合成経路、より特定にはマイカミノースの生合成に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ１*ｃ遺伝子は、フォロサミンまたはマイカミノースの生合成の際のＮ−メチル化に関与するＮ−メチルトランスフェラーゼをコードすることを示唆している（図５および６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ１*ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３を参照）。
【０１４７】
【表３】
2006501863.tif 000004
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１４８】
ｏｒｆ２*ｃ遺伝子は、ストレプトマイセス・フラジアエにおいてチロシンの生合成に関与するＮＤＰヘキソース３，４−イソメラーゼをコードするｔｙｌＭＩＩＩ遺伝子によってコードされたタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（３５％の同一性）（Ａ．Ｒ．Ｇａｎｄｅｃｈａ等，１９９７年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＣＡＡ５７４７１；ＢＬＡＳＴスコア：１３０）。これと、その他の近い抗生物質の生合成経路、より特定にはマイカミノースの生合成に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ*２ｃ遺伝子は、スピラマイシンの糖の１種（場合によってはマイカミノース）の生合成の際の異性化に関与するＮＤＰヘキソース３，４−イソメラーゼをコードすることを強く示唆している（図５および６を参照）。
【０１４９】
ｏｒｆ３*ｃ遺伝子は、ストレプトマイセス・フラジアエにおけるチロシン生合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼをコードするｔｙｌＭＩＩ遺伝子によってコードされたタンパク質（Ａ．Ｒ．Ｇａｎｄｅｃｈａ等，１９９７年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：
ＣＡＡ５７４７２，ＢＬＡＳＴスコア：４４８）と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（５９％の同一性）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ３*ｃ遺伝子は、グリコシルトランスフェラーゼをコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ３*ｃ遺伝子によってコード
されたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表４を参照）。
【０１５０】
【表４】
2006501863.tif 000005
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１５１】
ｏｒｆ４*ｃ遺伝子は、数種のクロトニル−ＣｏＡレダクターゼと強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ４*ｃによってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のクロトニル−ＣｏＡレダクターゼと相当な類似性を有する（Ｍ．Ｒｅｄｅｎｂａｃｈ等，１９９６年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６３０５５６；ＢＬＡＳＴスコア：７７２）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ４*ｃ遺伝子は、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼもコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ４*ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表５を参照）。
【０１５２】
【表５】
2006501863.tif 000006
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１５３】
ｏｒｆ６*遺伝子は、マクロライド抗生物質を生産するストレプトマイセス・マイカロファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｙｃａｒｏｆａｃｉｅｎｓ）に存在するｍ
ｄｍＢ遺伝子（ＨａｒａおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９９２年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ａ４２７１９；ＢＬＡＳＴスコア：４８９）とある程度の類似性を示す。この生産体において、上記遺伝子は、ラクトン環のアシル化に関与する。それゆえに、ｏｒｆ６*遺伝子は、アシルトランスフェラーゼをコードすると考えられる。この仮説は、ｏｒｆ６*遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表６を参照）。
【０１５４】
【表６】
2006501863.tif 000007
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１５５】
ｏｒｆ６*遺伝子の不活性化は、フェーズ内の欠失／逆位によって生じさせ、得られた株は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩは生産しないがスピラマイシンＩは生産することを示した（図１を参照）。これにより、ｏｒｆ６*遺伝子は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの合成に実際に関与することが確認される。この遺伝子によってコードされる酵素は、炭素の３位にアセチルまたはブチリル基を付加させることによるスピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの形成に関与する。ｏｒｆ６*遺伝子によってコードされたタンパク質を発現しなくなった株は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しなくなりスピラマイシンＩだけを生産するため、それらは特に有利である。上述したように、スピラマイシンＩの抗生物質活性は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの活性よりも明らかに高い（Ｌｉｕ等，１９９９年）。
【０１５６】
ｏｒｆ５*遺伝子は、数種のＯ−メチルトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ５*によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・マイカロファシエンス由来のＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．−）ＭｄｍＣと相当な類似性を有する（ＨａｒａおよびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９９２年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｂ４２７１９；ＢＬＡＳＴスコア：３５５）。これと、その他の抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ５*遺伝子は、Ｏ−メチルトランスフェラーゼもコードすることを強く示唆している。ｏｒｆ５*遺伝子は、ラクトン環に組み込まれた前駆体の形成に関与すると考えられている。実際には、配列比較によれば、ｏｒｆ５*遺伝子の産物は、ＦｋｂＧにも比較的近く，このＦｋｂＧは、Ｗｕ等，２０００年；Ｈｏｆｆｉｎｅｉｓｔｅｒ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＰ８６３８６；ＢＬＡＳＴスコア：２４７によれば、ヒドロキシマロニル−ＡＣＰのメチル化に関与する（図８を参照）。この仮説は、ｏｒｆ５*遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表７を参照）。
【０１５７】
【表７】
2006501863.tif 000008
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１５８】
切り出されたカセットのｏｒｆ６*遺伝子への挿入の極性作用のために、ｏｒｆ５*遺伝子は、スピラマイシンの生合成経路に必須であることを決定することができた。特に、ｏｒｆ６*遺伝子のコーディング部分へ切り出し可能なカセットを挿入することにより、スピラマイシン生産が完全に阻止される。しかしながら、挿入されたカセットが切り出されると（従ってｏｒｆ６*遺伝子が不活性化される場合のみ，実施例１４および１５を参照）、スピラマイシンＩの生産が再び観察される。これは、ｏｒｆ５*遺伝子は、その不活性化によりスピラマイシン生産が完全に阻止されるため、スピラマイシンの生合成経路に必須であることを示す。
【０１５９】
ｏｒｆ５*遺伝子は、数種のＯ−メチルトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。ｏｒｆ５*遺伝子は、プラテノライド合成、または、ＰＫＳによってプラテノライドに組み込まれたメチル化された前駆体（メトキシマロニル，図８を参照）の合成のいずれかに直接的に関与するＯ−メチルトランスフェラーゼと考えられている。この仮説を確かめるために、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋のＳ．アンボファシエンス株で、ＬＣ／ＳＭおよびＮＭＲ分析実験を行った。この株において、ｏｒｆ５*遺伝子は、ｏｒｆ６*遺伝子への転写ターミネーターを含むカセット挿入の極性作用により発現されない（実施例２７を参照）。この株は、スピラマイシンＩのＵＶスペクトルに類似したＵＶスペクトル状態を示すが、マススペクトルは８２９で分子イオンを示す分子を生産することが示された。スピラマイシンの質量に比べて質量が１４異なることは、ラクトン環の第四の炭素により生じる酸素にメチルが存在しないことことによって説明することができる（この化合物の構造を図３９に示す）。ＮＭＲによって得られた結果はこの仮説と一致する。８２９における化合物の存在により、スピラマイシン生合成におけるｏｒｆ５*の役割の仮説を確認することが可能になる。加えて、メチル基を含まないスピラマイシンに相当する産物は、微生物ミクロコッカス・ルテウスで試験すると、修飾されていないスピラマイシンと比べて極めて弱い微生物学的な活性を示す（１０倍弱い）。
【０１６０】
ｏｒｆ７*ｃ遺伝子は、ストレプトマイセス・マイカロファシエンスのｍｄｍＡ（生産体の酵素においてミデカマイシン耐性に関与するタンパク質をコードする）によってコードされたタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｈａｒａ等，１９９０年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ａ６０７２５；ＢＬＡＳＴスコア：３８０）。これと、その他の抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ７*ｃ遺伝子は、スピラマイシン耐性に関与するタンパク質もコードすることを強く示唆している。より特定には、ｏｒｆ７*ｃ遺伝子によってコードされた酵素は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて、メチルトランスフェラーゼ活性を有し、スピラマイシン耐性に関与する。この遺伝子は、ＭＬＳ（Ｉ型）の耐性を付与することが実証されており、この耐性は、２３ＳリボゾームＲＮＡのＡ２０５８位でのモノメチル化によることがわかっている（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９６年）。この仮説は、ｏｒｆ７*ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表８を参照）。
【０１６１】
【表８】
2006501863.tif 000009
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１６２】
ｏｒｆ８*遺伝子は、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてＡＢＣトランスポータータイプのタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｃａｍｐｅｌｏ，２００２年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＣＡＣ２２１１９；ＢＬＡＳＴスコア：１９１）。これと、ＡＢＣトランスポータータイプのタンパク質との類似性は、ｏｒｆ８*遺伝子は、スピラマイシン耐性に関与する可能性のあるＡＢＣトランスポータータイプのタンパク質もコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ８*遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表９を参照）。
【０１６３】
【表９】
2006501863.tif 000010
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１６４】
ｏｒｆ９*遺伝子は、ストレプトマイセス・グリセウスにおいてＡＢＣトランスポータータイプのタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｃａｍｐｅｌｏ，２００２年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＣＡＣ２２１１８；ＢＬＡＳＴスコア：２６９）。これと、ＡＢＣトランスポータータイプのタンパク質との類似性は、ｏｒｆ９*遺伝子は、スピラマイシン耐性に関与する可能性のあるＡＢＣトランスポータータイプのタンパク質もコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ９*遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１０を参照）。
【０１６５】
【表１０】
2006501863.tif 000011
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１６６】
ｏｒｆ１０*遺伝子は、機能が不明のタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。しかしながら、ｏｒｆ１０*に類似した遺伝子は、抗生物質生合成に関与する数種の遺伝子群の中央で見出されている。従って、ｏｒｆ１０*に近い遺伝子は、Ｓ．コエリカラーで発見されている（Ｒｅｄｅｎｂａｃｈ等，１９９６年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６２７４３２，ＢＬＡＳＴスコア：１０９）。近い遺伝子（ＣｏｕＹ）も、Ｓ．リシリエンシスで発見されている（Ｗａｎｇ等，２０００年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＧ２９７７９，ＢＬＡＳＴスコア９７）。
【０１６７】
ＰＫＳをコードする遺伝子の上流に位置する遺伝子
ＰＫＳをコードする遺伝子の上流に位置するＤＮＡ配列（下流と上流は、全て同じ方向を向いた５つのＰＫＳ遺伝子の方向によって定義される）（図３を参照）において、３４個のＯＲＦが同定された（上記を参照）。従って、このタイプの３４個のオープンリーディングフレームは、約４１．７ｋｂの領域を占める（以下を参照；２５個のＯＲＦを含む第一の３１ｋｂの領域を示す配列番号１、および、約１２．１ｋｂの領域を示す配列番号１４０、そのうち１．４ｋｂは先行する配列（配列番号１）オーバーラップし、そのうち約１０．７ｋｂは、それに続く配列に相当し、後者の約１０．７ｋｂの部分はさらに９個のＯＲＦ（ＯＲＦの部分的配列を含む）を含む、以下の図３および３７も参照）。上記領域の構成の図表示を、図５と３７に示す。同定された３４個の遺伝子を、以下のように命名した：ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９ｃ、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１ｃ、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３ｃ、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５ｃ、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７、ｏｒｆ１８、ｏｒｆ１９、ｏｒｆ２０、ｏｒｆ２１ｃ、ｏｒｆ２２ｃ、ｏｒｆ２３ｃ、ｏｒｆ２４ｃ、ｏｒｆ２５ｃ、ｏｒｆ２６、ｏｒｆ２７、ｏｒｆ２８ｃ、ｏｒｆ２９、ｏｒｆ３０ｃ、ｏｒｆ３１、ｏｒｆ３２ｃ、ｏｒｆ３３、および、ｏｒｆ３４ｃ。
【０１６８】
５つのＰＫＳ遺伝子上流で同定された３４個の遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列に対するリファレンスを以下の表１１に示す。
【０１６９】
【表１１】
2006501863.tif 000012
1； 遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、コーディング配列が逆方向であること（それゆえに、これら遺伝子について、コーディング鎖は、配列番号１または配列番号１４０で示される配列に相補的な鎖）を示す。
2； １つのｏｒｆに数種のタンパク質配列が示されている場合、対応するタンパク質は、数種の可能な翻訳開始部位から得られる。
【０１７０】
上記の表１１で同定されたポリペプチドの機能を決定するために３つのタイプの実験を行った：同定された配列と、機能がわかっている配列との同一性の比較、遺伝子不活性化実験、および、これら突然変異株によるスピラマイシン生産の解析。
【０１７１】
まず第一に、以下の様々なプログラムを用いて、これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列を全て、様々なデータベースに存在するタンパク質配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ，ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ）、ＦＡＳＴＡ（（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年）および（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）、ＢＥＡＵＴＹ（Ｋ．Ｃ．Ｗｏｒｉｅｙ等，１９９５年））、（上記を参照）。これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のあるものを同定することができた。表１２に、５個のＰＫＦ遺伝子の上流に位置する３４個の遺伝子と強い類似性を示すタンパク質を示す。
【０１７２】
【表１２】
2006501863.tif 000013
【０１７３】
【表１３】
2006501863.tif 000014
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１７４】
これらの結果を確認するために、遺伝子不活性化実験を行った。用いられた方法は、遺伝子置換を行うことにある。インタラプトさせようとする標的遺伝子は、抗生物質（例えば、アプラマイシンまたはハイグロマイシン）に対する耐性を付与するカセットでインタラプトされたこの遺伝子のコピーで置換される。用いられるカセットは、全てのリーディングフレームにおける翻訳終止コドンのいずれか、および、ストレプトマイセスにおいて活性な転写ターミネーターのいずれかの端に隣接する。標的遺伝子へのカセットの挿入は、この標的遺伝子欠失を伴ってもよいし、または、伴わなくてもよい。カセットに隣接する領域のサイズは、数百から数千塩基対の範囲であり得る。第二のタイプのカセットは、遺伝子不活性化に用いることができ、このようなカセットは、「切り出し可能なカセット」と命名される（上記を参照）。このようにして構築された株をそれらのスピラマイシン生産について試験した。
【０１７５】
ｏｒｆ１遺伝子は、数種のチトクロームＰ４５０ｓと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・フラジアエにおいてチロシンの生合成に関与するｔｙｌＩ遺伝子によってコードされたタンパク質と相当な類似性を有する（Ｌ．Ａ．Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ等，１９９４年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｓ４９０５１；ＢＬＡＳＴスコア：５３０）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ１遺伝子は、チトクロームＰ４５０もコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ１遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１３を参照）。
【０１７６】
【表１４】
2006501863.tif 000015
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１７７】
ｏｒｆ２遺伝子は、アネウリニバチルス・サーモアエロフィラス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）のｄＴＤＰ−６−デオキシ−３，４−ケトヘクスロースイソメラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｐｆｏｅｓｔｉ，Ａ．等，２００３年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡ００６３５１；ＢＬＡＳＴスコア：１１８）。この類似性は、ｏｒｆ２遺伝子は、スピラマイシン分子に存在する糖（この糖は、場合によってはマイカロースである）のいずれか１つの生合成に必要な異性化反応に関与するイソメラーゼをコードする（図５を参照）ことを強く示唆している。ｏｒｆ２遺伝子の不活性化を行った。得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ２遺伝子は、スピラマイシン生合成に実際に関与することが確認される。
【０１７８】
ｏｒｆ３遺伝子は、数種のアミノトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ３によってコードされたタンパク質は、オレアンドマイシン生合成に関与するストレプトマイセス・アンチバイオティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）のアミノトランスフェラーゼと相当な類似性を有する（Ｇ．Ｄｒａｅｇｅｒ等，１９９９年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ５９９３９；ＢＬＡＳＴスコア：４３１）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ３遺伝子は、スピラマイシンのアミノ糖のいずれか１種の生合成に必要なアミノ交換反応に関与する３−アミノトランスフェラーゼをコードすることを強く示唆している（図５を参照）。この仮説は、ｏｒｆ３遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１５を参照）。
【０１７９】
【表１５】
2006501863.tif 000016
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１８０】
ｏｒｆ３遺伝子を不活性した。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ３遺伝子は、スピラマイシン生合成に実際に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされる酵素は、明らかに、スピラマイシン生合成に必須な生物変換反応工程に関与する。スピラマイシン生産は、Ｓ．フラジアエのＴｙｌＢタンパク質発現によって補足することが可能である（実施例２３を参照）。これは、ｏｒｆ３遺伝子は、マイカミノース生合成に必要なアミノ交換反応に関与する３−アミノトランスフェラーゼをコードすることを実証している（図５を参照）。マイカミノースは、プラテノライドに付着される第一の糖であるため、ｏｒｆ３ノックアウト株（ＯＳ４９．６７）は、プラテノライドを蓄積するものと予想される。
【０１８１】
ｏｒｆ３遺伝子がノックアウトされた株の生合成中間体を研究した（実施例２０を参照）。これら実験は、この株は、２つの型のプラテノライド：プラテノライドＡとプラテノライドＢを生産することを実証することを可能にした（これら２種の分子の推測された構造を、図３６に示す）。この株はまた、プラテノライドＡ＋マイカロース、および、プラテノライドＢ＋マイカロースを生産する（実施例２０および図４０を参照）。これら化合物は糖を含むが、いかなるマイカミノースも含まない。加えて、それらをスピラマイシンと比較する場合（図１を参照）、これら化合物は、マイカミノースの代わりにマイカロースを含む。これらの結果は、マイカミノース生合成に関与し、マイカミノース生合成に必要なアミノ交換反応に関与する３−アミノトランスフェラーゼとしての役割を有するｏｒｆ３遺伝子産物と一致する（図５を参照）。通常マイカミノースによって占有されている位置に結合したマイカロースを有する分子が発見されていることから、グリコシル化の特異性は完全ではないようであるといえる（図４０を参照）。
【０１８２】
ｏｒｆ４遺伝子は、数種のＮＤＰ−グルコースシンセターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ４によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・ベネズエラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）のα−Ｄ−グルコース−１−リン酸チミジリルトランスフェラーゼと相当な類似性を有する（Ｙ．Ｘｕｅ等：１９９８；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＣ６８６８２；ＢＬＡＳＴスコア：４０４）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ４遺伝子は、スピラマイシン分子に組み込まれた３つの典型的な糖の生合成に必要なＮＤＰ−グルコースの合成に関与するＮＤＰ−グルコースシンセターゼをコードすることを強く示唆している（図４，５および６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ４遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１６を参照）。
【０１８３】
【表１６】
2006501863.tif 000017
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１８４】
ｏｒｆ５遺伝子は、数種のグルコースデヒドラターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ５によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・テネブラリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｅｎｅｂｒａｒｉｕｓ）のｄＴＤＰ−グルコース４，６−デヒドラターゼと相当な類似性を有する（Ｔ．Ｂ．Ｌｉ等，２００１年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＧ１８４５７，ＢＬＡＳＴスコア：４７６）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ５遺伝子は、スピラマイシン分子に組み込まれた３つの典型的な糖の生合成に必要なＮＤＰ−グルコースデヒドラターゼをコードすることを強く示唆している（図４，５および６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ５遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１７を参照）。
【０１８５】
【表１７】
2006501863.tif 000018
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１８６】
ｏｒｆ６遺伝子は、数種のチオエステラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコ
ードする。特に、ｏｒｆ６によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）のチオエステラーゼと相当な類似性を有する（Ｓ．Ｏｍｕｒａ等，２００１年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＢＡＢ６９３１５；ＢＬＡＳＴスコア：２３４）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ６遺伝子は、チオエステラーゼをコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ６遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１８を参照）。
【０１８７】
【表１８】
2006501863.tif 000019
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１８８】
ｏｒｆ７遺伝子は、数種のヘキソースデヒドラターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ７によってコードされたタンパク質は、チロシン生合成に関与するストレプトマイセス・フラジアエの  ｄＮＴＰ−ヘキソース２，３−デヒドラターゼ（ＴｙｌＣＶＩ遺伝子によってコードされる）と相当な類似性を有する（Ｌ．Ａ．Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ等，１９９４年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ２９３７９；ＢＬＡＳＴスコア：４６１）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ７遺伝子は、スピラマイシン分子に組み込まれた２つの典型的な糖の生合成に必要なヘキソース２−３−デヒドラターゼもコードすることを強く示唆している（図４および６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ７遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表１９を参照）。
【０１８９】
【表１９】
2006501863.tif 000020
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１９０】
ｏｒｆ８遺伝子は、数種のアミノトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ８によってコードされたタンパク質は、サッカロポリスポラ・スピノサ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａ）におけるフォロサミン生合成に関与する可能性があるアミノトランスフェラーゼと相当な類似性を有する（Ｃ．Ｗａｌｄｒｏｎ等，２００１年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＧ２３２７９；ＢＬＡＳＴスコア：４６５）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ８遺伝子は、フォロサミン生合成に必要なアミノ交換反応に関与する４−アミノトランスフェラーゼをコードすることを強く示唆している（図６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ８遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２０を参照）。
【０１９１】
【表２０】
2006501863.tif 000021
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１９２】
ｏｒｆ８遺伝子を不活性した。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ８遺伝子は、スピラマイシン生合成に実際に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされる酵素は、明らかに、スピラマイシン生合成に必須な生物変換反応工程に関与する。フォロサミン生合成においてｏｒｆ８遺伝子産物が果たす役割の仮説の確認は、ｏｒｆ８遺伝子が不活性化されたはフォロシジン（ｆｏｒｏｃｉｄｉｎ）を生産し、それゆえに、この突然変異体はフォロシジン段階でブロックされ、いかなるネオスピラマイシンも生産しないことによって提供される（図７および実施例２５を参照）。これらの結果は、フォロサミン生合成に関与するｏｒｆ８遺伝子産物と一致する（図６を参照）。
【０１９３】
ｏｒｆ９ｃ遺伝子は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいてすでに同定されており、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等によりｓｒｍＸと命名されている（Ｍ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等，１９９２年）。この遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のメチルトランスフェラーゼとの類似性は、ｏ
ｒ９ｃ遺伝子は、マイカミノースまたはフォロサミン生合成に必要なメチル化反応に関与するメチルトランスフェラーゼをコードすることを強く示唆している（図５および６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ９ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２１を参照）。
【０１９４】
【表２１】
2006501863.tif 000022
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０１９５】
ｏｒｆ１０遺伝子は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいてすでに同定されており、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等によってｓｒｍＲと命名されている（Ｍ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等，１９９２年）。この遺伝子によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて、スピラマイシンの生合成経路の調節に関与する。ｏｒｆ１０遺伝子を不活性した。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ１０遺伝子は、スピラマイシン生合成に実際に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされたタンパク質は、明らかにスピラマイシン生合成に必須である。
【０１９６】
加えて、ｏｒｆ１０の翻訳開始点を決定し、この遺伝子の過剰発現により、スピラマイシン生産における改善がもたらされることを示すことができた。翻訳開始部位は、ＡＴＧの上流に位置するＡＴＧに相当するが、これは、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等によって提唱された（Ｍ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等，１９９２年）。５’がトランケ−ションされたメッセンジャーは不活性であるため、この５’末端は、ｏｒｆ１０の機能に必須であることも実証された（実施例１７を参照）。それゆえに、スピラマイシン生産に対する望ましい作用を得るために、ｏｒｆ１０の過剰発現を有効にし、一方でｏｒｆ１０の５’がトランケ−ションされたメッセンジャーを発現しないようにすることが必須である。
【０１９７】
ｏｒｆ１１ｃ遺伝子は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいてすでに同定されており、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等（Ｍ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等，１９９２年）およびＳｃｈｏｎｅｒ等（Ｂ．Ｓｃｈｏｎｅｒ等，１９９２年）によりｓｒｍＢと命名されている。この遺伝子によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおけるスピラマイシン耐性に関与し、ＡＢＣ−タイプのトランスポーターである。
【０１９８】
ｏｒｆ１２遺伝子は、数種のヘキソースデヒドラターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１２によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・フラジアエのＵｒｄＱ遺伝子によってコードされるＮＤＰ−ヘキソース３，４−デヒドラターゼと相当な類似性を有し、ウルダマイシン生合成に関与する（Ｄ．Ｈｏｆｆｉｎｅｉｓｔｅｒ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ７２５５０；ＢＬＡＳＴスコア：６３４）。これと、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する
タンパク質との類似性は、ｏｒｆ１２遺伝子は、フォロサミン生合成に必要な脱水反応に関与する３，４−デヒドラターゼをコードすることを強く示唆している（図６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ１２遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２２を参照）。
【０１９９】
【表２２】
2006501863.tif 000023
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２００】
ｏｒｆ１２遺伝子を不活性化した。得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ１２遺伝子は、スピラマイシン生合成に実際に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされる酵素は、明らかに、スピラマイシン生合成に必須な生物変換反応工程に関与する。フォロサミン生合成においてｏｒｆ１２が果たす役割の仮説の確認は、ｏｒｆ１２遺伝子に関して不活性化された突然変異体は、フォロサミンを生産しなくなることによって提供される。しかしながら、この突然変異体は、少量のフォロシジンを生産する。それゆえに、この突然変異体はフォロシジン段階ででブロックされ、いかなるネオスピラマイシンも生産しない（図７および実施例２６を参照）。この突然変異体はまた、図３８に示す構造を有する化合物を生産する。後者の化合物は、２つの糖、マイカミノースおよびマイカロースを含むが、いかなるフォロサミンも含まない。加えて、この化合物とスピラマイシンの構造（図１を参照）とを比較すると、この化合物は、予想されたフォロサミンの位置に糖マイカロースを含む。これらの結果は、ｏｒｆ１２遺伝子産物が、フォロサミン生合成に関与することと一致する（図６を参照）。通常フォロサミンが占有している位置にマイカロースが結合した分子が観察されることから、グリコシル化の特異性は完全ではないといえる（図３８を参照）。
【０２０１】
ｏｒｆ１３ｃ遺伝子は、ストレプトマイセス・コエリカラーにおいて、機能が不明のタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。このタンパク質を、ＳＣ４Ｈ２．１７と命名した（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号：Ｔ３５１１６；ＢＬＡＳＴスコア：６１９）。ｏｒｆ１３ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質はまた、その他の生物の
その他のタンパク質との強い類似性を示す（表２３を参照）。
【０２０２】
【表２３】
2006501863.tif 000024
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２０３】
ｏｒｆ１３ｃによってコードされるタンパク質に近いタンパク質に起因する正確な機能はなかった。ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて、スピラマイシンの生合成経路におけるこの遺伝子の機能を研究する目的でｏｒｆ１３ｃ遺伝子を不活性した。得られた株がスピラマイシンを生産することを示すことができた。これは、ｏｒｆ１３ｃ遺伝子は、スピラマイシン生合成に必須ではなこと、および、細菌の生存に必須ではないこと示す。それゆえに、この遺伝子によってコードされる酵素は、スピラマイシン生合成に必須な生物変換反応工程に関与しない。
【０２０４】
ｏｒｆ１４遺伝子は、推定のレダクターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｍ．Ｒｅｄｅｎｂａｃｈ等，１９９６年；Ｂｅｎｔｌｅｙ等，２００２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＣＡＢ９０８６２；ＢＬＡＳＴスコア：１４７）。
【０２０５】
ｏｒｆ１４遺伝子を不活性した。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ１４遺伝子は、実際には、スピラマイシン生合成に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされる酵素は、明らかに、スピラマイシン生合成に必須な生物変換反応工程に関与する。ｏｒｆ１４遺伝子がノックアウトされた株の生合成中間体を研究した（実施例２０を参照）。これら実験は、この株は、プラテノライドＡを生産するがプラテノライドＢは生産しないことを実証することを可能にした（図３６を参照）。
【０２０６】
ｏｒｆ１５ｃ遺伝子は、数種のケトレダクターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１５ｃによってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・アンチバイオティカスにおいて３−ケトレダクターゼと相当な類似性を有する（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｔ５１１０２，ＢＬＡＳＴスコア：２８５）。この類似性は、ｏｒｆ１５ｃ遺伝子は、フォロサミン生合成に必要な還元反応に関与する３−ケトレダクターゼをコードすることを強く示唆している（図６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ１５ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２４を参照）。
【０２０７】
【表２４】
2006501863.tif 000025
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２０８】
ｏｒｆ１６遺伝子は、数種のイソメラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１６によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・フラジアエにおいてＮＤＰ−ヘキソース３，４−イソメラーゼと相当な類似性を有する（Ｇａｎｄｅｃｈａ等，１９９７年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＣＡＡ５７４７１，ＢＬＡＳＴスコア：２０９）。この類似性は、ｏｒｆ１６遺伝子は、スピラマイシン糖のいずれか１つの生合成に関与するタンパク質をコードすることを強く示唆している（図５および６を参照）。この仮説は、ｏｒｆ１６遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２５を参照）。
【０２０９】
【表２５】
2006501863.tif 000026
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２１０】
ｏｒｆ１７遺伝子は、数種のグリコシルトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１７によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・ベネズエラのグリコシルトランスフェラーゼと相当な類似性を有する（Ｙ．Ｘｕｅ等，１９９８；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＣ６８６７７；ＢＬＡＳＴスコア：４００）。ｏｒｆ１７遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のグリコシルトランスフェラーゼとの類似性は、この遺伝子は、グリコシルトランスフェラーゼもコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ１７遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質とある程度の類似性を示すことによって裏付けられる（表２６を参照）。
【０２１１】
【表２６】
2006501863.tif 000027
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２１２】
ｏｒｆ１８遺伝子は、数種のグリコシルトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１８によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・リシリエンシスのグリコシルトランスフェラーゼと相当な類似性を有する（Ｗａｎｇ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＧ２９７８５；ＢＬＡＳＴスコア：１８５）。ｏｒｆ１８遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のグリコシルトランスフェラーゼとの類似性は、この遺伝子は、グリコシルトランスフェラーゼもコードすることを強く示唆している。この仮説は、ｏｒｆ１８遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２７を参照）。
【０２１３】
【表２７】
2006501863.tif 000028
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２１４】
ｏｒｆ１９の遺伝子は、数種のケトレダクターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ１９によってコードされたタンパク質は、ストレプトマイセス・フラジアエのＮＤＰ−ヘキソース４−ケトレダクターゼと相当な類似性を有する（Ｔ
ｙｌＣＩＶ）（Ｂａｔｅ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＤ４１８２２；ＢＬＡＳＴスコア：２６６）。ｏｒｆ１９の遺伝子によってコードされたタンパク質と、近い抗生物質に関する生合成経路に関与するこのケトレダクターゼとの類似性は、この遺伝子は、マイカロース生合成に必要な還元反応に関与する４−ケトレダクターゼもコードすることを強く示唆している（図４を参照）。この仮説は、ｏｒｆ１９の遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２８を参照）。
【０２１５】
【表２８】
2006501863.tif 000029
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２１６】
ｏｒｆ２０遺伝子は、数種のヘキソースレダクターゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ２０によってコードされたタンパク質は、ｄＴＤＰ−４−ケト−Ｌ−６−デオキシヘキソース２，３−レダクターゼをコードするサッカロポリスポラ・エリスレア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅ）のＥｒｙＢＩＩと相当な類似性を有する（Ｒ．Ｇ．Ｓｕｍｍｅｒｓ等，１９９７年）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＢ８４０６８；ＢＬＡＳＴスコア：４９１）。ｏｒｆ２０遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のヘキソースレダクターゼとの類似性は、この遺伝子は、マイカロース生合成に必要な還元に関与する２，３−レダクターゼをコードすることを強く示唆している（図４を参照）。この仮説は、ｏｒｆ２０遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表２９を参照）。
【０２１７】
【表２９】
2006501863.tif 000030
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２１８】
ｏｒｆ２１ｃ遺伝子は、数種のヘキソースメチルトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。特に、ｏｒｆ２１ｃによってコードされたタンパク質は、ＮＤＰ−ヘキソース３−Ｃ−メチルトランスフェラーゼをコードするストレプトマイセス・フラジアエのＴｙｌＣＩＩＩ遺伝子と相当な類似性を有する（Ｎ．Ｂａｔｅ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＤ４１８２３；ＢＬＡＳＴスコア：６６９）：ｏｒｆ２１ｃ遺伝子によってコードされるタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のヘキソースメチルトランスフェラーゼとの類似性は、この遺伝子は、マイカロース生合成に必要なメチル化反応に関与するヘキソースメチルトランスフェラーゼをコードすることを強く示唆している（図４を参照）。この仮説は、ｏｒｆ２１ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３０を参照）。
【０２１９】
【表３０】
2006501863.tif 000031
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２２０】
ｏｒｆ２２ｃ遺伝子は、メトキシマロニル生合成に関与する酵素をコードするストレプトマイセス・ハイグロスコピカスｖｅｒ．アスコミセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｖａｒ．ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）のｆｋｂＨ遺伝子によってコードされたタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｋ．Ｗｕ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ８６３８７；ＢＬＡＳＴスコア：４６３）。ｏｒｆ２２ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い
マクロライドに関する生合成経路に関与するこのタンパク質との類似性は、この遺伝子は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおけるメトキシマロニル生合成に関与する酵素もコードすることを強く示唆している（図８を参照）。
【０２２１】
ｏｒｆ２３ｃ遺伝子は、メトキシマロニルに関与するアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするストレプトマイセス・ハイグロスコピカスｖｅｒ．アスコミセティカスのｆｋｂＩ遺伝子によってコードされたタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｋ．Ｗｕ，等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ８６３８８；ＢＬＡＳＴスコア：３８７）。ｏｒｆ２３ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとの類似性は、この遺伝子は、メトキシマロニル生合成に関与するアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードすることを強く示唆している（図８を参照）。この仮説は、ｏｒｆ２３ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３１を参照）。
【０２２２】
【表３１】
2006501863.tif 000032
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２２３】
ｏｒｆ２４ｃ遺伝子は、メトキシマロニル生合成に関与するアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）をコードすると考えられているストレプトマイセス・ハイグロスコピカスｖｅｒ．アスコミセティカスのｆｋｂＪ遺伝子によってコードされたタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｋ．Ｗｕ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ８６３８９；ＢＬＡＳＴスコア：８７）。ｏｒｆ２４ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近いマクロライドに関する生合成経路に関与するこのタンパク質との類似性は、この遺伝子は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおけるメトキシマロニル生合成に関与するタンパク質をコードすることを強く示唆している（図８を参照）。
【０２２４】
ｏｒｆ２５ｃ遺伝子は、メトキシマロニル生合成に関与するアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするストレプトマイセス・ハイグロスコピカスｖｅｒ．アスコミセティカスのｆｋｂＫ遺伝子によってコードされたタンパク質と比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする（Ｋ．Ｗｕ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ８６３９０；ＢＬＡＳＴスコア：２６８）。ｏｒｆ２５ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質と、その他の近い抗生物質に関する生合成経路に関与する数種のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとの類似性は、この遺伝子は、メトキシマロニル生合成に関与するアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードすることを強く示唆している（図８を参照）。この仮説は、ｏｒｆ２５ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３２を参照）。
【０２２５】
【表３２】
2006501863.tif 000033
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２２６】
ｏｒｆ２６遺伝子は、ストレプトマイセス・フラジアエにおけるチロシン生合成に関与するマイカノシルトランスフェラーゼをコードするｔｙｌＣＶ遺伝子によってコードされたタンパク質と６５％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする（Ｎ．Ｂａｔｅ，等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＤ４１８２４，ＢＬＡＳＴスコア：４７１）。より特定には、ＴｙｌＣＶは、チロシン合成の際にマイカロース分子に結合するグリコシルトランスフェラーゼである。これと、その他の比較的近い抗生物質に関する生合成経路、より特定にはマイカロース移動に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ２６遺伝子はグリコシルトランスフェラーゼであることを示唆している。この仮説は、ｏｒｆ２６遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３３を参照）。
【０２２７】
【表３３】
2006501863.tif 000034
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２２８】
ｏｒｆ２７遺伝子は、ストレプトマイセス・フラジアエにおけるチロシン生合成に関与するＮＤＰ−ヘキソース３，５−（または５−）エピメラーゼをコードするｔｙｌＣＶＩＩ遺伝子によってコードされたタンパク質と７０％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする（Ｎ．Ｂａｔｅ等，２０００年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＤ４１８２５，ＢＬＡＳＴスコア：２４３）。より特定には、ＴｙｌＣＶＩＩは、マイカロース生合成に関与するヘキソース３，５−（または、５−）エ
ピメラーゼである。これと、その他の比較的近い抗生物質に関する生合成経路、より特定にはマイカロース生合成に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ２７遺伝子はエピメラーゼをコードすることを示唆している。この仮説は、ｏｒｆ２７遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３４を参照）。ＢＬＡＳＴプログラムを用いて得られた近い配列の解析は、ｏｒｆ２７遺伝子は、マイカロース生合成に必要な異性化反応に関与する５−エピメラーゼをコードすることを強く示唆している（図４を参照）。
【０２２９】
【表３４】
2006501863.tif 000035
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２３０】
再配列解析の後、約４５０塩基対の領域の配列だけが決定されたことから、まず、ｏｒｆ２８ｃ配列を部分的に決定した（この領域は配列番号１０６の不完全な配列において「Ｎ」という記号で示す）。それでも、このＯＲＦの部分配列（配列番号１４１）を、上で説明した様々なコンピュータープログラムでの解析に用いた。このようにして、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子は、決定された配列（配列番号１１２，これはＯｒｆ２８ｃタンパク質の部分配列である）にわたって、ストレプトマイセス・サーモトレランス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）においてカルボマイシン生合成に関与する調節タンパク質をコードするａｃｙＢ２遺伝子によってコードされたタンパク質（Ａ．Ａｒｉｓａｗａ等，１９９３年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＪＣ２０３２，ＢＬＡＳＴスコア：３２９）と、６４％の同一性を示すタンパク質をコードすることを決定することができた（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）。これと、比較的近い抗生物質に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子は、スピラマイシン生合成に関与する調節タンパク質をコードすることを示す。この仮説は、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質はまた、ストレプトマイセス・フラジアエにおけるチロシン生合成に関与する調節タンパク質であるＴｙｌＲタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（Ｎ．Ｂａｔｅ等，１９９９年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ２９３８０，ＢＬＡＳＴスコア：１６７）。
【０２３１】
決定されていない配列のいずれかの端に位置するオリゴヌクレオチドを用いてｏｒｆ２８ｃ遺伝子を増幅し、それを発現ベクターにサブクローンするすることができた。このようにして、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現により、ＯＳＣ２株においてスピラマイシン生産を顕著に増加させることを実証することができた（実施例２４を参照）。これにより、ｏｒｆ２８ｃの過剰発現により、スピラマイシン生産を増加させることを実証しており、スピラマイシンの生合成経路の調節因子としてのその役割が確認される。
【０２３２】
続いて、ｏｒｆ２８ｃの部分配列を完成させ、約４５０塩基対が失われた領域を決定し
た（配列番号１４０および配列番号１４１を参照）。このＯＲＦの完全配列（配列番号１４１）を、上で説明した様々なコンピュータープログラムでの解析に用いた。このようにして、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子は、決定された配列（配列番号１４２，これは、Ｏｒｆ２８ｃタンパク質の完全配列である）にわたって、ストレプトマイセス・サーモトレランスにおいてカルボマイシン生合成に関与する調節タンパク質をコードするａｃｙＢ２遺伝子によってコードされたタンパク質（Ａｒｉｓａｗａ，Ａ．，等，１９９３年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＪＣ２０３２，ＢＬＡＳＴスコア：４５１）と、６９％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードするを決定することができた。これと、比較的近い抗生物質の生合成の調節に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子は、スピラマイシン生合成に関与する調節タンパク質をコードすることを示す。この仮説は、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質はまた、ＴｙｌＲタンパク質（ストレプトマイセス・フラジアエにおいてチロシン生合成の調節に関与する調節タンパク質である）との強い類似性を示す（Ｂａｔｅ，Ｎ等，１９９９年；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＦ２９３８０，ＢＬＡＳＴスコア：２２４）ことによって裏付けられる。この遺伝子の過剰発現の結果（実施例２４を参照）は、スピラマイシン生合成経路の調節因子としてのその役割を確認する。
【０２３３】
ｏｒｆ２８ｃ遺伝子を不活性化した。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子は、明らかに、スピラマイシン生合成に関与しており、スピラマイシン生合成に必須であることが確認される。これらの結果は、この遺伝子の過剰発現の結果とあわせて（実施例２４を参照）、Ｏｒｆ２８ｃはスピラマイシン生合成に必須な活性化因子としての役割を有することと一致する。
【０２３４】
ｏｒｆ２９遺伝子は、ソランギウス・セルローサム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ）においてソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）Ａ（ポリケチドクラスの抗真菌剤）生合成に関与する遺伝子群に位置する考えられるグリコシルヒドロラーゼ（Ｊ．Ｌｉｇｏｎ等，２００２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＡＫ１９８９０，ＢＬＡＳＴスコア：１３９）と、３１％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする。これと、比較的近い分子に関する生合成経路に関与するタンパク質との類似性は、ｏｒｆ２９遺伝子は、グリコシルヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを示す。この仮説は、ｏｒｆ２９遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３５を参照）。ｏｒｆ２９によってコードされたタンパク質のＣＤ−サーチプログラム（上記参照）での配列解析はまた、ｏｒｆ２９遺伝子は、グリコシルヒドロラーゼをコードすることも示す。
【０２３５】
【表３５】
2006501863.tif 000036
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２３６】
ＳｉｇｎａｌＰプログラム（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．等，１９９７年）を用いてｏｒｆ２９から推測されたタンパク質配列の解析は、このタンパク質は、３０位と３１位の間に予想の切断部位（ＱＳＡ／ＱＡ）を有するＣ末端シグナル配列を有することを示す。このタンパク質は細胞外であることが予想される。このタンパク質は、グリコシルトランスフェラーゼＧｉｍＡおよび／またはＧｉｍＢによるグリコシル化で不活性化されたスピラマイシンの再活性化において、グリコシルヒドロラーゼとして、役割を有すると考えられる（Ｇｏｕｎｎｅｌｅｎ等，１９９８年）。
【０２３７】
ｏｒｆ３０ｃ遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）におけるヌクレオシド−ニリン酸糖エピメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６００５９０，ＢＬＡＳＴスコア：８９）と、３１％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする。この類似性は、ｏｒｆ３０ｃ遺伝子はエピメラーゼをコードすることを示す。この仮説は、ＣＤ−サーチプログラム（上記を参照）での配列解析はｏｒｆ３０ｃ遺伝子はエピメラーゼをコードすることも示すことによって裏付けられる。
【０２３８】
ｏｒｆ３０ｃは、２つの可能性のある開始コドンを示し（配列番号１１５を参照）これらは、それぞれ３４５個および２８２個のアミノ酸からなる２種の可能性のあるタンパク質（配列番号１１６および１１７）を生じる。しかしながら、このコドンの使用は、第二のＡＴＧからのみストレプトマイセスに特徴的である；加えて、第一のＡＴＧと第二のＡＴＧとの間の配列の推測されたタンパク質配列は同定された近い配列とは並べていないが、それに対して、最も短いタンパク質配列（第二のＡＴＧから：配列番号１４４）は、これらタンパク質の初めに正しく並べられている。それゆえに、これから、第二のＡＴＧは、正しい開始コドンであること、それゆえに、このｏｒｆ配列は、配列番号１４３で示される配列であり、これが翻訳されれば、配列番号１４４の配列のタンパク質に相当すること推測することができる。
【０２３９】
ｏｒｆ３１遺伝子は、ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるオキシドレダクターゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６３１１４８，ＢＬＡＳＴスコア：２６１）と５２％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする。この類似性は、ｏｒｆ３１遺伝子はレダクターゼをコードすることを示す。この仮説は、ＣＤ−サーチプログラム（上記を参照）を用いた配列の分析はまた、ｏｒｆ３１遺伝子はレダクターゼをコードすることも示すによって裏付けられる。この仮説はまた、ｏｒｆ３１遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによっても裏付けられる（表３６を参照）。
【０２４０】
【表３６】
2006501863.tif 000037
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等
，１９９０年）。
【０２４１】
ｏｒｆ３１遺伝子を不活性した。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産し
なくなることを示すことができた。これにより、ｏｒｆ３１遺伝子は、スピラマイシン生合成に実際に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされる酵素は、明らかに、スピラマイシン生合成に必須な生物変換反応工程に関与する。
【０２４２】
第二の工程では５’位におけるコーディング配列しか決定されていないため、まず第一に、ｏｒｆ３２ｃの配列を部分的に決定した（実施例１９を参照）。しかしながら、このｏｒｆ部分配列（配列番号１２０）は、上で説明した様々なコンピュータープログラムでの解析に用いられた。このようにして、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子は、決定された（配列番号１２１，これは、ＯＲＦ３２ｃタンパク質の部分配列である）配列にわたって、ストレプトマイセス・コエリカラーにおけるＧｎｔＲファミリーの調節タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６２５５７６，ＢＬＡＳＴスコア：２２９）と、４７％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードすることを決定することができた。この類似性は、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子は、ＧｎｔＲファミリーの転写調節因子をコードすることを示す。この仮説は、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる。
【０２４３】
続いて、ｏｒｆ３２ｃの部分的配列を完全させ、失われた領域を決定した（配列番号１４０および配列番号１４５を参照）。このｏｒｆの完全配列は、ストレプトマイセス・アベルミチリスにおけるＧｎｔＲファミリーの調節タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿８２４６０４，ＢＬＡＳＴスコア：２８２）と４４％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする。この類似性は、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子は、ＧｎｔＲファミリーの転写調節因子をコードすることを示す。この仮説は、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子によってコードされたタンパク質は、その他の生物において類似の機能を有するその他のタンパク質との強い類似性を示すことによって裏付けられる（表３７を参照）。
【０２４４】
【表３７】
2006501863.tif 000038
*；配列類似性の大きさは、ＢＬＡＳＴスコアの高さに関連する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）。
【０２４５】
ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおけるスピラマイシン生合成経路でのこの遺伝子の機能を研究する目的で、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子を不活性化した。得られた株はスピラマイシンを生産することを示すことができた。これは、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子はスピラマイシン生合成に必須ではないこと、および、細菌の生存に必須ではないことことを示す。
【０２４６】
ｏｒｆ３３遺伝子は、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の仮説タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６３５５６４，ＢＬＡＳＴスコア：５４）と、４９％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードする。
【０２４７】
ｏｒｆ３４ｃの配列は部分的である。実際には、このｏｒｆの産物とデータベースとの間で行われた比較は、このタンパク質のＣ末端部分は、ヌクレオチド配列から推測された産物にはないことから、このｏｒｆは、配列解析された領域より長くそれを超えて連続していることを示す。しかしながら、このＯＲＦの部分配列は、上で説明した様々なコンピュータープログラムでの解析に用いられた。ｏｒｆ３４ｃ遺伝子は、決定された配列にわたって（配列番号１５０，これは、ＯＲＦ３４ｃタンパク質の部分配列である）、ストレプトマイセス・コエリカラー由来のアラビノフラノシダーゼ（Ｂｅｎｔｌｅｙ等，２００２；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿６３００４９，ＢＬＡＳＴスコア：６５４）と、９１％の同一性（ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定された）を示すタンパク質をコードすることを決定することができた。Ｓ．コエリカラーにおいて、このアラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子は、二次代謝産物の生合成に関与しないようである。それゆえに、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、この遺伝子は、スピラマイシン生合成に関与しないと思われる。
【０２４８】
本発明の目的はまた、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列のポリヌクレオチドの少なくとも１つ、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つとハイブリダイズするポリヌクレオチドである。選択的には、これら前記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス属細菌から単離され、より選択的には、これらポリヌクレオチドは、マクロライドの生合成に関与するタンパク質をコードし、さらにより選択的には、これらポリヌクレオチドは、それらがハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質に類似した活性を有するタンパク質をコードする。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、非相同な核酸鎖のハイブリダイゼーションに好ましくないハイブリダイゼーション条件と定義することができる。例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔによって説明された（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８４年）、緩衝液における、５５℃〜６５℃の温度でのハイブリダイゼーション条件と説明することができ、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは５５℃、さらにより好ましくは６０℃、最も好ましくは６５℃であり、続いて、２×ＳＳＣ緩衝液で、５５℃〜６５℃の温度で１回以上の洗浄が行われ、この温度は、好ましくは、５５℃、さらにより好ましくは６０℃、最も好ましくは６５℃であり、続いて、０．５×ＳＳＣ緩衝液で、５５℃〜６５℃の温度で１回以上の洗浄が行われ、この温度は、好ましくは５５℃、さらにより好ましくは６０℃、最も好ましくは６５℃である。上述のハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが検索される核酸の長さ、または、当業者既知の技術に従って選択された標識タイプに応じて調節することができる。適切なハイブリダイゼーション条件は、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）による著書に従って調節することができる。
【０２４９】
本発明はまた、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９のヌクレオチド配列からなる群より選択されたポリヌクレオチド、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つ、または、相補配列のポリヌクレオチドの、少なくとも１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０または１９００個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、および、最も好ましくは９８％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドに関する。選択的には、これら前記ポリヌクレオチドは、ストレプトマイセス属の細菌から単離され、より選択的にはこれらポリヌクレオチドは、マクロライドの生合成に関与するタンパク質をコードし、さらにより選択的にはこれらポリヌクレオチドは、それらが同一性を示すポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質に類似した活性を有するタンパク質をコードする。最も好ましくは、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９のヌクレオチド配列からなる群より選択されるか、または、相補配列のポリヌクレオチドである。
【０２５０】
比較のための配列の最適なアライメントは、既知のアルゴリズムを用いてコンピューターで行うことができ、このようなアルゴリズムとしては、例えばＦＡＳＴＡパッケージのアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）があり、特にＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能である。例として、パーセンテージ配列同一性は、ＬＦＡＳＴＡ（Ｋ．−Ｍ．Ｃｈａｏ等，１９９２年）またはＬＡＬＩＧＮ（Ｘ．ＨｕａｎｇおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１年）ソフトウェアを用いて決定してもよい。ＬＦＡＳＴＡおよびＬＡＬＩＧＮプログラムは、ＦＡＳＴＡパッケージの一部である。ＬＡＬＩＧＮは、最適なローカルアライメントを提供する；このプログラムはより精密であるが、ＬＦＡＳＴＡよりも遅い。
【０２５１】
本発明の他の形態は、上で定義された核酸配列の発現によって生じるポリペプチドに関する。選択的には、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０から選択されるポリペプチド、または、これら配列のいずれか１つ（ただし前記配列にわたり１またはそれ以上のアミノ酸が、それらの機能特性に影響を与えることなく置換、挿入または欠失されている）、または、これら配列の変異体のいずれか１つの、少なくとも１０、１５、２０、３０〜４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０または６４０個の連続したアミノ酸を含むポリペプチドと、少なくとも７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の、とのアミノ酸同一性を示す。選択的には、本発明に係るポリペプチドは、ストレプトマイセス属の細菌により天然状態で発現され、より選択的には、これらポリペプチドは、マクロライドの生合成に関与し、さらにより選択的には、これらポリペプチドは、それらが同一性を有するポリペプチドの活性に類似した活性を有する。好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０のポリペプチド配列からなる群より選択されるか、または、これら配列のいずれか１つ（ただし、前記配列にわたり１またはそれ以上のアミノ酸が、それらの機能特性に影響を与えることなく置換、挿入または欠失されている）、または、これら配列の変異体のいずれか１つである。最も好ましくは、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、３３、３５、３７、３８、３９、４１、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１７、１１９、１２１、１４２、１４４、１４６、１４８および１５０のポリペプチド配列からなる群より選択される。
【０２５２】
比較のための配列の最適なアライメントは、既知のアルゴリズムを用いてコンピューターで行うことができ、例えば、このようなアルゴリズムとしては、ＰＡＳＴＡパッケージのアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）があり、特にＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能である。例として、パーセンテージ配列同一性は、ＬＦＡＳＴＡ（Ｋ．−Ｍ．Ｃｈａｏ等，１９９２年）またはＬＡＬＩＧＮ（Ｘ．ＨｕａｎｇおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ，１９９１年）ソフトウェアを用いて、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）によって定義されたデフォルトパラメーターを用いて決定してもよい。ＬＦＡＳＴＡおよびＬＡＬＩＧＮプログラムは、ＦＡＳＴＡパッケージの一部である。ＬＡＬＩＧＮは、最適なローカルアライメントを提供する；このプログラムはより精密であるが、ＬＦＡＳＴＡよりも遅い。
【０２５３】
本発明の他の形態は、上述の組換えＤＮＡポリヌクレオチドに関する。選択的には、この組換えＤＮＡはベクターである。さらにより選択的には、ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、インテグレート可能なベクター、フォスミド、コスミド、シャトルベクター、ＢＡＣ（細菌人工染色体）およびＰＡＣ（Ｐ１由来人工染色体）から選択される。例として、ラムダファージおよびＭ１３ファージは、バクテリオファージとして述べることができる。プラスミドとしては、Ｅ．コリで複製するプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２およびその誘導体、ｐＵＣ１８およびその誘導体、ｐＵＣ１９およびその誘導体、ｐＧＢ２およびその誘導体（Ｇ．Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ等，１９８４年）、ｐＡＣＹＣ１７７（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ０６４０２）およびその誘導体、および、ｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ０６４０３）およびその誘導体が挙げられる。さらに、ストレプトマイセスで複製するプラスミド、例えば、ｐＵ１０１およびその誘導体、ｐＳＧ５およびその誘導体、ＳＬＰ１およびその誘導体、および、ＳＣＰ２*およびその誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）も挙げられる。ファージミドとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびその誘導体（特にストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ｐＧＥＭ−Ｔおよびその誘導体（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，ウィスコンシン州，米国）により市販されている）、［省略］ＩＳ１１７インテグレーションシステム（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）が挙げられる。フォスミドとしては、例えば、フォスミドｐＦＯＳＩ（ニューイングランドバイオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏａｂｓ  Ｉｎｃ．ビバリー，マサチューセッツ州，米国）により市販されている）およびその誘導体が挙げられる。コスミドとしては、例えば、コスミドＳｕｐｅｒＣｏｓおよびその誘導体（特に、ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、および、コスミドｐＷＥＤ１５（Ｗａｈｌ等，１９８７年）およびその誘導体が挙げられる。シャトルベクターに関してはとしては、例えば、Ｅ．コリ／ストレプトマイセスシャトルプラスミド、例えばｐＵ９０３およびその誘導体、一連のプラスミドｐＵＷＬ、ｐＣＡ０１０６、ｐＷＨＭ３、および、ｐＯＪ４４６およびそれらの誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、および、Ｅ．コリ／ストレプトマイセスシャトルＢＡＣ、例えば特許出願ＷＯ０１／４０４９７説明されたものが挙げられる。ＢＡＣ（細菌人工染色体）に関してはとしては、例えば、ＢＡＣｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ５１１１３）が挙げられる。ＰＡＣｓ（Ｐ１由来人工染色体）に関してはとしては、例えば、ベクターｐＣＹＰＡＣ６（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＦ１３３４３７）が挙げられる。最も好ましくは、本発明に係るベクターは、ｐＯＳ４９．１、ｐＯＳ４９．１１、ｐＯＳＣ４９．１２、ｐＯＳ４９．１４、ｐＯＳ４９．１６、ｐＯＳ４９．２８、ｐＯＳ４４．１、ｐＯＳ４４．２、ｐＯＳ４４．４、ｐＳＰＭ５、ｐＳＰＭ７、ｐＯＳ４９．６７、ｐＯＳ４９．８８、ｐＯＳ４９．１０６、ｐＯＳ４９．１２０、ｐＯＳ４９．１０７、ｐＯＳ４９．３２、ｐＯＳ４９．４３、ｐＯＳ４９．４４、ｐＯＳ４９．５０、ｐＯＳ４９．９９、ｐＳＰＭ１７、ｐＳＰＭ２１、ｐＳＰＭ５０２、ｐＳＰＭ５０４、ｐＳＰＭ５０７、ｐＳＰＭ５０８、ｐＳＰＭ５０９、ｐＳＰＭ１、ｐＢＸＬ１１１１、ｐＢＸＬ１１１２、ｐＢＸＬ１１１３、ｐＳＰＭ５２０、ｐＳＰＭ５２１、ｐＳＰＭ５２２、ｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、ｐＳＰＭ５２５、ｐＳＰＭ５２７、ｐＳＰＭ５２８、ｐＳＰＭ３４、ｐＳＰＭ３５、ｐＳＰＭ３６、ｐＳＰＭ３７、ｐＳＰＭ３８、ｐＳＰＭ３９、ｐＳＰＭ４０、ｐＳＰＭ４１、ｐＳＰＭ４２、ｐＳＰＭ４３、ｐＳＰＭ４４、ｐＳＰＭ４５、ｐＳＰＭ４７、ｐＳＰＭ４８、ｐＳＰＭ５０、ｐＳＰＭ５１、ｐＳＰＭ５２、ｐＳＰＭ５３、ｐＳＰＭ５５、ｐＳＰＭ５６、ｐＳＰＭ５８、ｐＳＰＭ７２、ｐＳＰＭ７３、ｐＳＰＭ５１５、ｐＳＰＭ５１９、ｐＳＰＭ７４、ｐＳＰＭ７５、ｐＳＰＭ７９、ｐＳＰＭ８３、ｐＳＰＭ１０７、ｐＳＰＭ５４３、および、ｐＳＰＭ１０６から選択される。
【０２５４】
本発明の他の形態は、適切な発現ベクターを含む発現系、および、生物系において上述の１またはそれ以上のポリペプチドの発現が可能な宿主細胞に関する。本発明に係る発現ベクターは、上述の１またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、当業者周知の種々の宿主細胞において様々な本発明に係るポリペプチドの発現を起こすようにすることができる。例えば、原核性の発現系、例えば細菌Ｅ．コリにおける発現系、および、真核性の発現系、例えば昆虫細胞における発現が可能なバキュロウイルス発現系、および、酵母細胞において発現が可能な発現系、または、哺乳動物における細胞において発現が可能な発現系、特にヒト細胞が挙げられる。このような系で用いることができる発現ベクターは、当業者周知である；原核細胞に関しては、例えば、Ｅ．コリでの発現ベクター、例えばｐＥＴ（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ＧＡＴＥＷＡＹファミリーのベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社（カールスバッド，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ｐＢＡＤファミリーベクター（インビトロジェン社（カールスバッド，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ｐＭＡＬファミリーのベクター（ニューイングランドバイオラボ社（ビバリー，マサチューセッツ州，米国）により市販されている）、および、文献Ｂ．Ｗｉｌｍｓ等，２００１年に記載のラムノース誘導性発現ベクターおよびそれらの誘導体が挙げられる；さらに、ストレプトマイセスにおける発現ベクター、例えば、ベクターｐＵ４１２３、ｐＵ６０２１、ｐＰＭ９２７、ｐＡＮＴ８４９、ｐＡＮＴ８５０、ｐＡＮＴ８５１、ｐＡＮＴ１２００、ｐＡＮＴ１２０１、および、ｐＡＮＴ１２０２およびそれらの誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）も挙げられる。酵母細胞に関しては、例えば、ベクターｐＥＳＣ（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）が挙げられる。昆虫細胞における発現が可能なバキュロウイルス発現系に関しては、例えば、ベクターＢａｃＰＡＫ．６（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，パロアルト，カリフォルニア州，米国）により市販されている）が挙げられる。哺乳動物細胞に関しては、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）前初期遺伝子プロモーターを含むベクター（例えば、ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されているベクターｐＣＭＶおよびその誘導体）、または、バキュオレーティングシミアンウイルス（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ  ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ）のＳＶ４０初期プロモーター（例えば、ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されているベクターｐＳＧ５）が挙げられる。
【０２５５】
本発明はまた、上述のポリペプチドの製造方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸を、適切なベクターに挿入する工程；
ｂ）工程ａ）のベクターで予め形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、適切な培地で培養する工程；
ｃ）例えば超音波破砕または浸透圧性ショックによって、調整培地または細胞抽出物を回収する工程；
ｄ）前記培地から、または、工程ｃ）で得られた細胞抽出物から、前記ポリペプチドを分離および精製する工程；
ｅ）必要に応じて、製造された組換えポリペプチドを特徴付ける工程。
【０２５６】
本発明に係る組換えポリペプチドは、当業者既知の方法に従って適切な一連のクロマトグラフィーカラムに通過させることによって精製することができ、例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）で説明されている。例えば、「ヒスチジンタグ」技術が挙げられ、この技術は、短いポリヒスチジン配列を生産しようとするポリペプチドに付加することにあり、それにより、このポリペプチドをニッケルカラムで精製することができる。本発明に係るポリペプチドは、インビトロでの合成技術で製造することもできる。このような技術の例として、ａ  本発明に係るポリペプチドは、特に、ロシュ・ダイアグノスティックス社・フランスＳ．Ａ．（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｓ．Ａ．，メラン，フランス）により販売されている、「ラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）」を用いて製造してもよい。
【０２５７】
本発明の他の形態は、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、少なくとも１つの組換えＤＮＡ、および／または、少なくとも１つの発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。
【０２５８】
本発明の他の形態は、少なくとも１種のマクロライドの生合成経路の工程でブロックされた微生物に関する。その利点は、第一に、突然変異タンパク質の機能を研究すること、第二に、生合成の中間体を生産する微生物を製造することにある。これら中間体は、場合により、分離の後、特定の成分を生産培地に加えること、または、中間体を基質として用いることによって中間体を修飾することができるタンパク質をコードする、このようにして突然変異したその他の遺伝子を微生物に導入することのいずれかによって修飾してもよい。このようにして、これら中間体は、化学的に、生化学的に、酵素的に、および／または、微生物学的に修飾することができる。マクロライドに関する生合成経路の工程でブロックされた微生物は、この（またはこれらの）マクロライドを生産する微生物においてこの（またはこれらの）マクロライドの生合成に関与する１またはそれ以上のタンパク質の機能を不活性化することによって得ることができる。不活性化されたタンパク質に応じて、この（またはこれらの）マクロライドに関する生合成経路の様々な工程でブロックされた微生物は、このようにして得ることができる。この（またはこれらの）タンパク質の不活性化は、当業者既知のあらゆる方法によって行うことができ、例えば、前記タンパク質をコードする遺伝子における変異誘発によって、または、前記タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的な１またはそれ以上のアンチセンスＲＮＡの発現によって行うことができる。例えば、変異誘発は、放射線照射、変異誘発化学薬剤の作用、部位特異的変異誘発（ｓｏｌｉｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、遺伝子置換、または、当業者既知のその他のあらゆる方法によって行うことができる。例えば、このような変異誘発に適した条件は、Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等（２０００年）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）による著作に記載の教示に従って調節することができる。変異誘発は、インビトロまたはインサイチュで、対象の遺伝子の１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加、もしくは、遺伝子不活性化により行うことができる。この変異誘発は、上述の配列を含む遺伝子において行うことができる。選択的には、マクロライドに関する生合成経路の工程でブロックされた微生物は、ストレプトマイセス属の細菌である。より選択的には、問題のマクロライド生合成に関与する１またはそれ以上のタンパク質の機能の不活性化は、変異誘発によって行われる。さらにより選択的には、問題のマクロライドはスピラマイシンであり、変異誘発が行われる微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である。より選択的には、変異誘発は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上で行われる。好ましくは、変異誘発は、遺伝子不活性化により���われる。最も好ましくは、変異誘発は、配列番号１３の配列に対応する配列を含む遺伝子の遺伝子不活性化からなる。
【０２５９】
例えば、このような微生物の例として、以下の微生物が挙げられる：ＯＳ４９．１６（ｏｒｆ３：：Ωｈｙｇ，実施例２を参照）、ＯＳ４９．６７（ｏｒｆ３のフェーズ内の欠失，実施例６を参照）、ＯＳ４９．１０７（ｏｒｆ８：：Ωｈｙｇ，実施例７を参照）、ＯＳ４９．５０（ｏｒｆ１０：：Ωｈｙｇ，実施例８を参照）、ＳＰＭ２１（ｏｒｆ２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−，実施例１０を参照）、ＳＰＭ２２（ｏｒｆ：：ａｔｔ３のフェーズ内の欠失，実施例１０を参照）、ＳＰＭ５０１（ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋，ｃｆ；実施例１４）、ＳＰＭ５０２（ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１のフェーズ内の欠失，実施例１４を参照）、ＳＰＭ５０７（ｏｒｆ１２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−，実施例１１を参照）、ＳＰＭ５０８（ｏｒｆ１３ｃ：：ａｔｔ３Ωａａｃ−，実施例１２を参照）、および、ＳＰＭ５０９（ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−，実施例１３を参照）、ＳＰＭ１０７（ｏｒｆ２８ｃ：：ａｔｔ３ａａｃ＋，実施例２９を参照）、ＳＰＭ５４３（ｏｒｆ３１：：ａｔｔ３ａａｃ＋，実施例３０を参照）、ＳＰＭ１０６（ｏｒｆ３２ｃ：：ａｔｔ３ａａｃ＋，実施例３１を参照）。
【０２６０】
本発明の他の形態は、上述のマクロライドに関する生合成経路工程でブロックされた微生物を用いた、マクロライド生合成の中間体の製造方法に関する。本方法は、上述のマクロライドに関する生合成経路工程でブロックされた微生物を、適切な培地で培養すること、例えば超音波破砕または浸透圧性ショックによって調整培地または細胞抽出物を回収すること、および、前記生合成の中間体を、前記培地から、または、先行する工程で得られた細胞抽出物から分離および精製することにある。このような微生物を培養する条件は、当業者周知の技術に従って決定してもよい。このような培地としては、例えば、ストレプトマイセス、特にストレプトマイセス・アンボファシエンス用には、ＭＰ５培地またはＳＬ１１培地が可能である（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。当業者であれば、ストレプトマイセスの培養に関して、特にＫｉｅｓｅｒ等（２０００年）による著書を参照してもよい。生産された中間体は、当業者既知のあらゆる技術によって回収することができる。例えば、当業者であれば、米国特許第３，０００，７８５号で教示された技術、より特定には、その特許で説明されたスピラマイシンの抽出方法を参照してもよい。
【０２６１】
本発明の他の目的は、上述のこのマクロライドに関する生合成経路工程でブロックされた微生物を用いた、マクロライドから得られた分子の製造方法に関する。本方法は、上記方法に従って生合成の中間体を得ること、および、培地から分離した後、場合によりこのようにして生産された中間体を修飾すること、にある。このような微生物を培養する条件は、当業者周知の技術に従って決定してもよい。このような培地としては、例えば、ストレプトマイセス、特にストレプトマイセス・アンボファシエンス用には、ＭＰ５培地またはＳＬ１１培地が可能である（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。当業者であれば、ストレプトマイセス培養に関して、特にＫｉｅｓｅｒ等（２０００年）による著書を参照してもよい。生産された中間体は、場合により、分離の後、生産培地に適切な成分を加えること、または、中間体を基質として用いることによって中間体を修飾することができるタンパク質をコードするその他の遺伝子を微生物に導入することのいずれかによって修飾してもよい。従って、これら中間体は、化学的に、生化学的に、酵素的に、および／または、微生物学的に修飾することができる。より選択的には、問題のマクロライドはスピラマイシンであり、変異誘発が行われる微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である。
【０２６２】
本発明はまた、スピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物に関する。この微生物はスピラマイシンＩの生合成に必要な全ての遺伝子を含むが、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つ、が発現されないか、または、不活性にされているために、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩは生産しない。このタンパク質の不活性化は、当業者既知のあらゆる方法によって行うことができ、例えば、前記タンパク質をコードする遺伝子における変異誘発によって、または、前記タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡの発現によって行うことができ、当然ながら、ｏｒｆ５*の発現がこの操作により影響を受ける場
合、ｏｒｆ５*遺伝子が正確に発現されるようにその他の修飾を行うことが必要となる。変異誘発は、コードされたタンパク質が不活性化されるように、または、それらからのその発現またはその翻訳が阻害されるように、コーディング配列でも非コーディング配列でも実行可能である。変異誘発は、部位特異的変異誘発、遺伝子置換または当業者既知のその他のあらゆる方法によって行ってもよい。例えば、このような変異誘発に適した条件は、Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等（２０００年）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）による著作に記載の教示に従って調節してもよい。変異誘発は、インビトロまたはインサイチュで、対象の遺伝子の１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加によって、または、遺伝子不活性化によって行ってもよい。このような微生物は、スピラマイシンの生合成経路の遺伝子を発現させることによって得てもよいが、ただし、配列番号１３の配列を含む遺伝子、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つが含まれない。選択的には、このような微生物は、ストレプトマイセス属の細菌である。より選択的には、スピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物は、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産する出発微生物から得られる。さらにより選択的には、このような微生物は、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、同じ機能を有する、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた、配列番号１４の配列のポリペプチドをコードする配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つにおける変異誘発によって得られる。さらにより選択的には、この変異誘発は、遺伝子不活性化によりによって行われる。好ましくは、このような微生物は、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つの遺伝子不活性化が行われている、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産するＳ．アンボファシエンス株から得られる。最も好ましくは、遺伝子不活性化は、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子、または、配列番号１３に相当する配列を含む遺伝子の一部、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つのフェーズ内の欠失によって行われる。例えば、スピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物として、ＳＰＭ５０２株（ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１，実施例１４を参照）が挙げられる。
【０２６３】
本発明はまた、上述のスピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物に関し、本微生物は、以下も過剰発現する：
−以下の配列のプライマー対：５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡ（より好ましくは、コーディング配列である配列番号１４１の遺伝子）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得ることができる遺伝子、
または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子。
【０２６４】
このような遺伝子の配列の例を、配列番号１１１（ＤＮＡ）に示す；しかしながら、この配列は、対応するコーディング配列の３’部分を含まないため、部分的である。コーディング配列のこの部分のタンパク質への翻訳を、配列番号１１２に示す。当業者であれば、それを特に実施例２４に記載の教示を用いて容易に完成させることができる。配列番号１１１において決定されていない配列を第二の工程で決定し、このｏｒｆ（ｏｒｆ２８ｃ）の完全配列を、配列番号１４１に示す。このコーディング配列のタンパク質への翻訳を、配列番号１４２に示す。実施例２４に、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子のクローニング方法と、ｏｒｆ２８ｃの発現が可能な発現ベクターの製造方法を示す。この実施例はまた、ＯＳＣ２株におけるｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現により、この株におけるスピラマイシン生産の改善がもたらされることも示す。ｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現は、この遺伝子のコピー数を増加させること、および／または、野生型プロモーターより活性なプロモーターを導入することによって得ることができる。好ましくは、前記遺伝子の過剰発現は、この遺伝子の過剰発現が可能な組換えＤＮＡコンストラクトを微生物に導入することによって得られる。好ましくは、この組換えＤＮＡコンストラクトは、前記遺伝子のコピー数を増加させ、前記遺伝子の過剰発現を得ることを可能にする。この組換えＤＮＡコンストラクトにおいて、上記遺伝子のコーディング配列は、野生型プロモーターより活性なプロモーターの制御下に置くことができる。例として、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて活性なｐｔｒｃプロモーター（Ｅ．Ａｍａｎｎ等，１９８８年）、さらにｅｒｍＥ*プロモーターが挙げられる。従って、好ましくは、コンストラクトｐＳＰＭ７５の場合と同様に、導入されたｏｒｆ２８ｃ遺伝子のコピーは、ｅｒｍＥ*プロモーターの制御下に置かれる（実施例２４を参照）。
【０２６５】
本発明はまた、コーディング配列である配列番号４７を有する遺伝子、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られたコーディング配列を有する遺伝子も過剰発現する、上述のスピラマイシンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物に関する。選択的には、この微生物は、ＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株であり、これは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年２月２６日に、登録番号Ｉ−２９７７で寄託されている。
【０２６６】
本発明はまた、スピラマイシンＩの製造方法に関する；本方法は、上述のスピラマイシ
ンＩを生産するが、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない微生物を適切な培地で培養すること、調整培地または細胞抽出物を回収すること、および、前記培地から、または、先行する工程で得られた細胞抽出物からスピラマイシンＩを分離および精製することにある。このような微生物を培養する条件は、当業者周知の技術に従って決定してもよい。このような培地としては、例えば、ストレプトマイセス、特にストレプトマイセス・アンボファシエンス用には、ＭＰ５培地またはＳＬ１１培地が可能である（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。当業者であれば、ストレプトマイセスの培養に関しては、特にＫｉｅｓｅｒ等（２０００年）による著書を参照してもよい。生産されたスピラマイシンＩは、当業者既知の技術によって回収することができる。当業者であれば、例えば、米国特許第３，０００，７８５号で教示された技術、より特定には、その特許で説明されたスピラマイシンの抽出方法を参照してもよい。
【０２６７】
本発明の他の形態は、微生物のマクロライド生産を改善するための、本発明に係るヌクレオチド配列の使用に関する。従って、本発明は、上で定義された配列を含む遺伝子の少なくとも１つに遺伝子修飾を有する、および／または、上で定義された配列を含む遺伝子の少なくとも１つを過剰発現する、マクロライドを製造する突然変異微生物に関する。このような遺伝子修飾は、より高い活性を有するタンパク質の１またはそれ以上を発現させる目的で、または、この（またはこれらの）タンパク質をより高いレベルで発現させる目的で、対象の遺伝子における１またはそれ以上の塩基の抑制、置換、欠失および／または付加からなり得る。対象の遺伝子の過剰発現は、この遺伝子のコピー数を増加させること、および／または、野生型プロモーターより活性なプロモーターを導入することによって得ることができる。例として、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて活性なｐｔｒｃプロモーター（Ｅ．Ａｍａｎｎ等，１９８８年）、さらにｅｒｍＥ*プロモーター（Ｂｉｂｂ等，１９８５年）、（Ｂｉｂｂ等，１９９４年）が挙げられる。従って、対象の遺伝子の過剰発現は、対象のマクロライドを生産する微生物に、この遺伝子の過剰発現が可能な本発明に係る組換えＤＮＡコンストラクトを導入することによって得ることができる。特に、特定のマクロライド生合成の工程は限定されており、これら限定された工程に関与する野生型タンパク質より活性な、または野生型タンパク質より高い発現レベルである１またはそれ以上のタンパク質が発現される場合、関連するマクロライドの生産を改善することができる。チロシン生産速度の増加は、例えば、ストレプトマイセス・フラジアエにおいて、限定されたメチルトランスフェラーゼ（これは、ｍａｃｒｏｃｉｎｅをチロシンに変換する）をコードする遺伝子の複製によって実現される（Ｒ．Ｂａｌｔｚ，１９９７年）。より活性なタンパク質の発現の生産は、特に変異誘発によって得ることができる；例えば、これに関して、当業者であればＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）による著書を参照してもよい。選択的には、それらのマクロライド生産に関して改善されたこれら突然変異微生物は、ストレプトマイセス属の細菌である。より選択的には、問題のマクロライドはスピラマイシンであり、変異誘発が行われる微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である。より選択的には、遺伝子修飾は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上で行われる。好ましくは、このような微生物は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、��６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１８、１２０、１４１、１４３、１４５、１４７および１４９の配列の１またはそれ以上に相当する配列のいずれか１つ、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子の１またはそれ以上を過剰発現する。好ましくは、このような微生物は、配列番号１１１または１４１に相当する配列、または、その変異体のいずれか１つ、または、遺伝子コードの縮重によりそれから得られた配列のいずれか１つを含む遺伝子を過剰発現する。配列番号１１１で示される配列は部分的である；しかしながら、当業者であれば、それを特に実施例２４に記載の教示を用いて容易に完成させることができる。配列番号１１１において決定されていない配列を第二の工程で決定し、このｏｒｆ（ｏｒｆ２８ｃ）の完全配列は、配列番号１４１で示される。このコーディング配列のタンパク質への翻訳を、配列番号１４２に示す。実施例２４に、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子のクローニング方法と、ｏｒｆ２８ｃの発現が可能な発現ベクターの製造方法を示す。この実施例はまた、ＯＳＣ２株におけるｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現により、この株におけるスピラマイシン生産の改善がもたらされることも示す。ｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現は、この遺伝子のコピー数を増加させること、および／または、野生型プロモーターより活性なプロモーターを導入することによって得ることができる。好ましくは、前記遺伝子の過剰発現は、この遺伝子の過剰発現が可能な組換えＤＮＡコンストラクトを微生物に導入することによって得られる。好ましくは、この組換えＤＮＡコンストラクトは、前記遺伝子のコピー数を増加させ、前記遺伝子の過剰発現を得ることを可能にする。この組換えＤＮＡコンストラクトにおいて、上記遺伝子のコーディング配列は、野生型プロモーターより活性なプロモーターの制御下に置くことができる。例として、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて活性なｐｔｒｃプロモーター（Ｅ．Ａｍａｎｎ等，１９８８年）、さらにｅｒｍＥ*プロモーターが挙げられる。従って、好ましくは、導入されたｏｒｆ２８ｃ遺伝子のコピーは、コンストラクトｐＳＰＭ７５の場合と同様に、ｅｒｍＥ*プロモーターの制御下に置かれる（実施例２４を参照）。
【０２６８】
本発明の他の形態は、上記段落で説明された微生物を用いたマクロライドの製造方法に関する。この方法は、上記段落で定義された微生物を、適切な培地で培養すること、調整培地または細胞抽出物を回収すること、および、前記培地から、または、先行する工程で得られた細胞抽出物から生産されたマクロライドを分離および精製することにある。このような微生物を培養する条件は、当業者周知の技術に従って決定してもよい。このような培地としては、例えば、ストレプトマイセス、特にストレプトマイセス・アンボファシエンス用には、ＭＰ５培地またはＳＬ１１培地が可能である（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。当業者であれば、ストレプトマイセスの培養に関しては、特にＫｉｅｓｅｒ等（２０００年）による著書を参照してもよい。生産されたマクロライドは、当業者既知の技術によって回収することができる。当業者であれば、例えば、米国特許第３，０００，７８５号で教示された技術、より特定には、その特許で説明されたスピラマイシンの抽出方法を参照してもよい。選択的には、このような方法で用いられる微生物は、ストレプトマイセス属の細菌である。より選択的には、問題のマクロライドはスピラマイシンであり、それらのスピラマイシン生産に関して改善された突然変異微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である。
【０２６９】
本発明の他の形態は、ハイブリッド抗生物質を製造するための本発明に係る配列および／またはベクターの使用に関する。特に、本発明に係るポリヌクレオチドは、基質特異性に変化を起こす１またはそれ以上の突然変異タンパク質を発現する微生物を得ることに用いてもよいし、または、ハイブリッド抗生物質を生成する目的で、多くの抗生物質を製造する微生物で発現させてもよい。従って、本発明に係るポリヌクレオチドは、生産微生物間の遺伝子トランスファーによって、有利な薬理学的特性を有するハイブリッド抗生物質の生産を可能にする（Ｈｏｐｗｏｏｄ等，１９８５ａ，Ｈｏｐｗｏｏｄ等，１９８５ｂ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ等，１９８９年）。まず第一に、遺伝子操作によりハイブリッド抗生物質の生産を起こすことができる原理は、Ｈｏｐｗｏｏｄ（Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９８１年）によって提唱された。それによれば、抗生物質の生合成に関与する酵素はしばしば、構造的に関連する基質を受け入れるが、それらの天然の基質は異なっていることを提唱し
ている。一般的には、抗生物質に関する生合成経路の遺伝子によってコードされた酵素の基質特異性は、一次代謝の酵素よりも厳密性が低いということが容認されている（Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９８１年，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９８８年，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，１９８８年）。従って、多数の非天然基質が、抗生物質を製造する微生物、それらの突然変異体、または、これら抗生物質に関する生合成経路の精製された酵素によって変換されることを示すことができた（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，１９８８年）。この教示を用いて、当業者であれば、ハイブリッド抗生物質を生成する目的で、基質特異性に変化を起こす１またはそれ以上の突然変異タンパク質を発現する微生物を構築することができる。
【０２７０】
本発明はまた、１またはそれ以上の生物変換反応を行うための、本発明に係る少なくとも１つのポリヌクレオチド、および／または、少なくとも１つの組換えＤＮＡ、および／または、少なくとも１つの発現ベクター、および／または、少なくとも１つのポリペプチド、および／または、少なくとも１つの宿主細胞の使用に関する。従って、本発明は、本発明に係る１またはそれ以上のタンパク質が、適切な発現シグナルの制御下で発現される細菌または真菌株を構築することを可能にする。このような株は、１またはそれ以上の生物変換反応を行うのに用いることができる。これら生物変換反応は、細胞全体を用いること、または、前記細胞の細胞抽出物を用いることのいずれかで行ってもよい。これら生物変換反応は、生合成経路の酵素を用いて分子を誘導体化された型に変換することを可能にする。例えば、Ｃａｒｒｅｒａｓ等は、新規のエリスロマイシン誘導体を製造するための、サッカロポリスポラ・エリスレア株、および、ストレプトマイセス・コエリカラー株の使用を説明している（Ｃａｒｒｅｒａｓ等，２００２年）。Ｗａｌｃｚａｋ等は、デスアセチルアドリアマイシン（ｄｅｓａｃｅｔｙｌａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）（アントラサイクリン類似体）の新規のアントラサイクリンへの生物変換反応のための、ストレプトマイセスＰ４５０モノオキシゲナーゼの使用を説明している（Ｗａｌｃｚａｋ等，２００１年）。Ｏｌｏｎａｏ等は、ε−ローダマイシノン（ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）のローダマイシン（ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎ）Ｄへの生物変換反応のための、改変されたストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）株の使用を説明している（Ｏｌｏｎａｏ等，１９９９年）。当業者であれば、この原理をあらゆる生合成の中間体に適用してもよい。
【０２７１】
本発明はまた、以下を含む組換えＤＮＡに関する：
−以下の配列のプライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡ（より好ましくは配列番号１４１の配列のポリヌクレオチドである）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって得ることができるポリヌクレオチド、または、
−前記ポリヌクレオチドの、少なくとも１０、１２、１５、１８、２０〜２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０または１５００個の連続したヌクレオチドのフラグメント。
【０２７２】
選択的には、この組換えＤＮＡはベクターである。さらにより選択的には、ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、インテグレート可能なベクター、フォスミド、コスミド、シャトルベクター、ＢＡＣ（細菌人工染色体）およびＰＡＣ（Ｐ１由来の人工染色体）から選択される。例として、ラムダファージおよびＭ１３ファージは、バクテリオファージとして述べることができる。プラスミドとしては、Ｅ．コリで複製するプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２およびその誘導体、ｐＵＣ１８およびその誘導体、ｐＵＣ１９およびその誘導体、ｐＧＢ２およびその誘導体（Ｇ．Ｃｈｕｒｃｈｗａｒｄ等，１９８４年）、ｐＡＣＹＣ１７７（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ０６４０２）およびその誘導体、および、ｐＡＣＹＣ１８４（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ０６４０３）およびその誘導体が挙げられる。さらに、ストレプトマイセスで複製するプラスミド、例えば、ｐＵ１０１およびその誘導体、ｐＳＧ５およびその誘導体、ＳＬＰ１およびその誘導体、および、ＳＣＰ２*およびその誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）も挙げられる。ファージミドとしては、例として、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびその誘導体（特に、ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ｐＧＥＭ−Ｔおよびその誘導体（プロメガ社（マディソン，ウィスコンシン州，米国）により市販されている）、および、λＺＡＰＩＩおよびその誘導体（特に、ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）が挙げられる。インテグレート可能なベクターとしては、例として、ストレプトマイセスでインテグレートするベクター、例えば、ＳＬＰ１由来のベクター（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ｐＳＡＭ２由来のベクター（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ＰｈｉＣ３１ファージインテグレーションシステム（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）（例えば、ｐＳＥＴ１５２（Ｂｉｅｒｍａｎ等，１９９２年））またはＶＷＢインテグレーションシステム（Ｌ．ｖａｎ  Ｍｅｌｌａｅｒｔ等，１９９８年）を用いるベクター、さらに、ＩＳ１１７インテグレーションシステムを用いるベクター（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）が挙げられる。フォスミドとしては、例えば、フォスミドｐＦＯＳＩ（ニューイングランドバイオラボ社（ビバリー，マサチューセッツ州，米国）により市販されている）およびその誘導体が挙げられる。コスミドとしては、例えば、コスミドＳｕｐｅｒＣｏｓおよびその誘導体（特に、ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、および、コスミドｐＷＥＤ１５（Ｗａｈｌ等，１９８７年）およびその誘導体が挙げられる。シャトルベクターとしては、例として、Ｅ．コリ／ストレプトマイセスシャトルプラスミド、例えば、ｐＵ９０３およびその誘導体、一連のプラスミドｐＵＷＬ、ｐＣＡ０１０６、ｐＷＨＭ３、および、ｐＯＪ４４６およびそれらの誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、および、Ｅ．コリ／ストレプトマイセスシャトルＢＡＣ、例えば特許出願ＷＯ０１／４０４９７で説明されたものが挙げられる。ＢＡＣ（細菌人工染色体）としては、例として、ＢＡＧ  ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ５１１１３）が挙げられる。ＰＡＣ（Ｐ１由来人工染色体）としては、例えば、ベクターｐＣＹＰＡＣ６（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ＡＦ１３３４３７）が挙げられる。より選択的には、この組換えＤＮＡは発現ベクターである。このような系で用いることができる発現ベクターは、当業者周知である；原核細胞に関しては、例えば、Ｅ．コリでの発現ベクター、例えばｐＥＴ（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ＧＡＴＥＷＡＹファミリーのベクター（インビトロジェン社（カールスバッド，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ｐＢＡＤファミリーベクター（インビトロジェン社（カールスバッド，カリフォルニア州，米国）により市販されている）、ｐＭＡＬファミリーのベクター（ニューイングランドバイオラボ社（ビバリー，マサチューセッツ州，米国）により市販されている）、および、文献Ｂ．Ｗｉｌｍｓ等，２００１年に記載のラムノース誘導性発現ベクターおよびそれらの誘導体が挙げられる；さらに、ストレプトマイセスにおける発現ベクター、例えば、ベクターｐＵ４１２３、ｐＵ６０２１、ｐＰＭ９２７、ｐＡＮＴ８４９、ｐＡＮＴ８５０、ｐＡＮＴ８５１、ｐＡＮＴ１２００、ｐＡＮＴ１２０１、および、ｐＡＮＴ１２０２およびそれらの誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）も挙げられる。酵母細胞に関しては、例えば、ベクターｐＥＳＣ（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）が挙げられる。昆虫細胞における発現が可能なバキュロウイルス発現系に関しては、例えば、ベクターＢａｃＰＡＫ６（ＢＤバイオサイエンス・クロンテック社（パロアルト，カリフォルニア州，米国）により市販されている）が挙げられる。哺乳動物細胞に関しては、例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）前初期遺伝子プロモーターを含むベクター（例えば、ベクターｐＣＭＶおよびその誘導体（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている））、または、バキュオレーティングシミアンウイルスのＳＶ４０初期プロモーター（例えば、ベクターｐＳＧ５（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている））が挙げられる。本発明の他の形態は、この段落で説明された少なくとも１つの組換えＤＮＡが導入されている宿主細胞に関する。
【０２７３】
本発明の他の形態は、ポリペプチドの生産方法に関し、前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）上記段落で説明された少なくとも１つの発現ベクターで、宿主細胞を形質転換させる工程；
ｂ）前記宿主細胞を、適切な培地で培養する工程；
ｃ）  調整培地または細胞抽出物を回収する工程；
ｄ）前記培地から、または、工程ｃ）で得られた細胞抽出物から、前記ポリペプチドを分離および精製する工程；
ｅ）必要に応じて、製造された組換えポリペプチドを特徴付ける工程。
【０２７４】
このようにして生産された組換えポリペプチドは、当業者既知の方法、例えばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ等（２００２年）で説明された方法に従って、適切な一連のクロマトグラフィーカラムを通過させることによって精製することができる。例としては、「ヒスチジンタグ」技術が挙げられ、これは、短いポリヒスチジン配列を生産しようとするポリペプチドに付加することにあり、それにより、このポリペプチドをニッケルカラムで精製することができる。このポリペプチドは、インビトロでの合成技術で製造することもできる。このような技術の例として、ポリペプチドは、特に、ロシュ・ダイアグノスティックス社・フランスＳ．Ａ．（メラン，フランス）により販売されている「ラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）」を用いて製造してもよい。
【０２７５】
本発明の他の形態は、少なくとも１種のスピラマイシンを生産し、以下を過剰発現する微生物に関する：
−以下の配列のプライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡ（より好ましくはコーディング配列である配列番号１４１の遺伝子である）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子、または、
遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子。
【０２７６】
このような遺伝子の配列の例を、配列番号１１１（ＤＮＡ）に示す；しかしながら、この配列は、対応するコーディング配列の３’部分を含まないため、部分的である。コーディング配列のこの部分のタンパク質への翻訳を、配列番号１１２に示す。当業者であれば、それを特に実施例２４に記載の教示を用いて容易に完成させることができる。従って、この実施例において、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子のクローニング方法と、ｏｒｆ２８ｃの発現が可能な発現ベクターの製造方法を示す。この実施例はまた、ＯＳＣ２株におけるｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現により、この株におけるスピラマイシン生産の改善がもたらされることも示す。好ましくは、
−以下の配列のプライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡ（より好ましくはコーディング配列である配列番号１４１の遺伝子である）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子、
を過剰発現する微生物は、ストレプトマイセス属の細菌であり、さらにより好ましくは、ストレプトマイセス・アンボファシエンス種の細菌である。好ましくは、前記遺伝子の過剰発現は、前記微生物の発現ベクターでの形質転換によって得られる；最も好ましくは、前記微生物株は、ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（１）株またはＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）株であり、これらは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年１０月６日に、登録番号Ｉ−３１０１で寄託されている。
【０２７７】
本発明の他の形態は、上記段落で説明された微生物を用いた、スピラマイシンの製造方法に関する。この方法は、上記段落で定義された微生物を、適切な培地で培養すること、調整培地または細胞抽出物を回収すること、および、前記培地から、または、先行する工程で得られた細胞抽出物から生産されたスピラマイシンを分離および精製することにある。このような微生物を培養する条件は、当業者周知の技術に従って決定してもよい。培地は、例えば、ストレプトマイセス、特にストレプトマイセス・アンボファシエンス用として、ＭＰ５培地またはＳＬ１１培地が可能である（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。当業者であれば、ストレプトマイセスの培養に関しては、特にＫｉｅｓｅｒ等（２０００年）による著書を参照してもよい。生産されたスピラマイシンは、あらゆる当業者既知の技術を用いて回収することができる。当業者であれば、例えば、米国特許第３，０００，７８５号で教示された技術、より特定には、その特許で説明されたスピラマイシンの抽出方法を参照してもよい。選択的には、このような方法で用いられる微生物は、ストレプトマイセス属の細菌である。より選択的には、このような微生物は、Ｓ．アンボファシエンス株である。
【０２７８】
本発明の他の形態は、配列番号４７の配列のポリヌクレオチド、または、遺伝子コードの縮重によりそれらから得られたポリヌクレオチドが、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現が可能なプロモーターの制御下に置かれている発現ベクターに関する。ストレプトマイセスにおいて用いることができる発現ベクターの例は、上で示した通りである。選択的には、このような発現ベクターは、プラスミドｐＳＰＭ５２４またはｐＳＰＭ５２５である。
【０２７９】
本発明の他の形態は、上記段落で定義されたベクターで形質転換されたストレプトマイセス・アンボファシエンス株に関する。
【０２８０】
本発明の他の形態は、配列番号１１２の配列を含むポリペプチドに関する。本発明はまた、配列が：
−以下の配列のプライマー対：
５’ＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣ３’（配列番号１３８）、および、
５’ＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧＣＣＧＣＧＣＡ３’（配列番号１３９）、
ならびに、マトリックスとしてコスミドｐＳＰＭ３６、または、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのトータルＤＮＡ（より好ましくはコーディング配列である配列番号１４１の遺伝子である）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得ることができる遺伝子のコーディング配列、または、
−遺伝子コードの縮重によりそれらから得られた遺伝子のコーディング配列、
から翻訳された配列に相当するポリペプチドに関する。選択的には、これらポリペプチドは、ストレプトマイセス属の細菌により天然状態で発現され、より選択的には、これらポリペプチドは、スピラマイシン生合成に関与する。
【０２８１】
本発明の他の形態は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて上記段落で定義されたポリペプチドの発現が可能な発現ベクターに関する。ストレプトマイセスにおいて用いることができる発現ベクターの例は、上で示した通りである。選択的には、問題の発現ベクターは、プラスミドｐＳＰＭ７５である。
【０２８２】
添付図面において；
図１は、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの化学構造である。
図２は、領域を配列解析するのに用いられるコスミドである。
図３は、スピラマイシンの生合成経路に関与する遺伝子群の構成である。
図４は、マイカロースに関するといわれている生合成経路である。
図５は、マイカミノースに関するといわれている生合成経路である。
図６は、フォロサミンに関するといわれている生合成経路である。
図７は、スピラマイシン分子および中間体への糖の付加の好ましい順番である。
図８は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてメトキシマロニルに関するといわれている生合成経路である。この経路は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスｖｅｒ．アスコミセティカスにおけるメトキシマロニル生合成との類似性によって提唱されている（Ｋ．Ｗｕ等，２０００年）。
【０２８３】
図９は、遺伝子不活性化を起こす工程である：
Ａ）Ｅ．コリでは複製するが、ストレプトマイセスにおいては複製しないベクターへの標的遺伝子のクローニング；
Ｂ）標的遺伝子への耐性カセットの挿入（クローニングまたは短い同一な配列間の組換えによる）；
Ｃ）ストレプトマイセス・アンボファシエンスへのプラスミドの導入（Ｅ．コリを用いた形質転換または接合による）、および、カセットがインテグレートされたクローンの選択、続いて、遺伝子置換が含まれるようにベクター部分が失われたクローンのスクリーニング；
Ｄ）標的遺伝子が遺伝子置換により不活性化される突然変異株の染色体領域。
【０２８４】
図１０は、図９で説明された方法による遺伝子不活性化の後に必要に応じた工程であり、この工程は、切り出し可能なカセットが標的遺伝子をインタラプトするのに用いられる場合に行ってもよい；
Ｅ）ｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子を有するプラスミドｐＯＳＶ５０８の突然変異株への導入であり、この遺伝子の産物は、ａｔｔＬとカセットに隣接するａｔｔＲ配列との部位特異的な組換えにより有効に切り出すことができる；
Ｆ）切り出し可能なカセットが失われており、カセットにより耐性が提供された抗生物質に対して感受性を有するクローンの生産；
Ｇ）抗生物質を含まない固形培地での成長と胞子形成の後、プラスミドｐＯＳＶ５０８は、高頻度で失われる。このようにして、チオストレプトンに対して感受性を有するクロ
ーンを得ることができ、このクローンにおいて、標的遺伝子はフェーズ内の欠失を含む。欠失した標的遺伝子の配列は、ＰＣＲ増幅とＰＣＲ産物の配列解析によって照査することができる。
【０２８５】
図１１は、相同組換え実験にを用いるための、切り出し可能なカセットの増幅である。短い相同配列による相同組換え技術は、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（２０００年）によって説明されている。これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する３９または４０個のデオキシヌクレオチドは、不活性化される遺伝子の配列に対応する配列を含み、最も端の３’位に位置する２０個のデオキシヌクレオチドは、切り出し可能なカセットの末端のいずれか１つの配列に相当する。
【０２８６】
図１２は、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年によって説明された技術を用いた、標的遺伝子を不活性化するためのコンストラクトの生産である。
図１３は、プラスミドｐＷＨＭ３．Ｓｔｒｅｐｔｏ  ｏｒｉ：ストレプトマイセスの複製起源のマップである。
図１４は、プラスミドｐＯＳＶ５０８のマップである。
図１５は、切り出し可能なカセットの構造の例である。これは、ａｔｔＲ部位とａｔｔＬ部位が隣接するΩｈｙｇカセットからなり（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ等，１９９７年）（Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）、これらの間で、組換え現象により、ｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子の発現に基づいきカセットの切り出しが可能になる。
図１６は、プラスミドｐＢＸＬ１１１１のマップである。
図１７は、プラスミドｐＢＸＬ１１１２のマップである。
【０２８７】
図１８は、ミクロコッカス・ルテウス株のスピラマイシンに対する感受性に基づく、スピラマイシン生産に関する微生物学的試験である。用いられるミクロコッカス・ルテウス株は、天然に、スピラマイシンに対して感受性であるが、コンゴシジン（ｃｏｎｇｏｃｉｄｉｎｅ）に対して耐性な株である。試験される様々なストレプトマイセス株を、ＭＰ５培地７０ｍｌを含む５００ｍｌアーレンマイヤーフラスコで培養し、初期濃度２．５×１０6個の胞子／ｍｌで植え付け、２７℃で、２５０ｒｐｍで回転させて振盪しながら成長させた。４８、７２および９６時間培養させた後、培養液のサンプルを採取し、遠心分離した。これら上清の滅菌培地での１０倍希釈液は、試験に用いられる。コンゴシジンに対して耐性であるがスピラマイシンに対して感受性を有するミクロコッカス・ルテウス指標株（Ｇｏｕｒｍｅｌｅｎ等，１９９８年）を１２×１２ｃｍ平方の培養皿で培養した。ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＡＡペーパーのディスクを、各上清の１０倍希釈液（７０ｌ）に浸し、培養皿の表面に置いた。様々な濃度のスピラマイシン溶液に浸したディスク（ＭＰ５培地で、２−４−８ｇ／ｍｌ）を標準範囲として希釈した。培養皿を３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。ディスクがスピラマイシンを含む場合、これが寒天に拡散し、ミクロコッカス・ルテウス指標株の成長を阻害する。この阻害によりディスクの周りに「輪」が形成され、この輪は、ミクロコッカス・ルテウス株が成長しなかった領域を示す。それゆえに、この輪の存在は、スピラマイシンの存在の指標であり、問題のＳ．アンボファシエンス株は、スピラマイシン生産体であるか、またはそうでないかを決定することを可能にする。標準範囲で得られた阻害の直径を比較することによって、この株によって生産されたスピラマイシンの量の指標を得ることを可能にする。
【０２８８】
図１９は、ＯＳＣ２株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２０は、ＳＰＭ５０１株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２１は、ＳＰＭ５０２株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２２は、ＳＰＭ５０７株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２３は、ＳＰＭ５０８株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２４は、ＳＰＭ５０９株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２５は、ＦＡＳＴＡプログラムを用いて得られたＯＲＦ３タンパク質（配列番号２９）とＳ．フラジアエのＴｙｌＢタンパク質（配列番号８７）とのアライメントである。
図２６は、ＦＡＳＴＡプログラムを用いて得られたＳ．マイカロファシエンスのＭｄｍＡタンパク質（配列番号８８）と、ＳｒｍＤタンパク質（配列番号１６）とのアライメントである。
【０２８９】
図２７は、切り出し可能なカセットを切り出した後の残りの部位配列の例である。Ｒａｙｎａｌ等（１９９８年）で定義された最小のａｔｔ２６部位を太字で示す。３３種のヌクレオチドのフェーズ１の配列（ａｔｔ１）を、配列番号１０４に示し、３４種のヌクレオチドフェーズ２の配列（ａｔｔ２）を、配列番号１０５に示し、および、３５種のヌクレオチドのフェーズ３の配列（ａｔｔ３）を、配列番号９５に示す。
図２８は、ｏｒｆ１０遺伝子、用いられるＰＣＲプライマーの位置、および、それぞれのプライマー対を用いて得られたコンストラクトの図表示である。
図２９は、カセットｐａｃ−ｏｒｉｔＴの構築である。
図３０は、コスミドｐＷＥＤ２のマップである。
【０２９０】
図３１は、スピラマイシンの生合成経路に関与する遺伝子群、および、Ｅ．コリにおいて、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株のゲノムＤＮＡライブラリーのコスミドを単離するのに用いられた３種のプローブの位置の図表示である（実施例１９を参照）。
図３２は、Ｅ．コリにおいてストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＯＣＳ２のゲノムＤＮＡライブラリーから単離されたコスミドのインサートの位置（実施例１９を参照）である。新規のコスミドＤＮＡライブラリー。
図３３は、コスミドｐＳＰＭ３６のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメント（プラスミドｐＳＰＭ５８のインサート）のサブクローニング、コスミドｐＳＰＭ３６のＳｔｕＩ−ＳｔｕＩフラグメント（プラスミドｐＳＰＭ７２のインサート）のサブクローニング、および、ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩ（プラスミドｐＳＰＭ７３のインサート）のサブクローニングである。
【０２９１】
図３４は、プラスミドｐＳＰＭ５８のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩインサート、および、プラスミドｐＳＰＭ７３のＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩインサートで同定されたオープンリーディングフレームの位置である。
図３５は、２３８ｎｍと２８０ｎｍで得られたＯＳ４９．６７株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムの並置（上部）、および、３３．４分および４４．８分で溶出した分子のＵＶスペクトル（下部）である。
【０２９２】
図３６は、プラテノライドＡとプラテノライドＢ分子の分子構造である。
図３７は、スピラマイシンの生合成経路に関与する遺伝子群の構成である。
図３８は、ＳＰＭ５０７株によって生産された生合成の中間体の分子構造である。
図３９は、スピラマイシンを過剰生産する株から得られた遺伝子型ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋のＳ．アンボファシエンス株によって生産された生合成の中間体の構造である。カセットａｔｔ１Ωｈｙｇ＋のｏｒｆ６*への挿入は極性作用に影響を与え、それによりｏｒｆ５*の発現が阻害される。
【０２９３】
図４０は、ＯＳ４９．６７株によって生産されたプラテノライドＡ＋マイカロース、および、プラテノライドＢ＋マイカロース分子の分子構造である。
図４１は、コスミドｐＳＰＭ３６のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメント（プラスミド（ｐＳＰＭ７９）のインサート）のサブクローニング、プラスミドｐＳＰＭ７９のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩインサートで同定されたオープンリーディングフレームの位置、および、配列番号１４０の配列の位置である。
【０２９４】
以下の実施例を用いて本発明を説明するが、これら実施例は、非限定的な説明とみなされるものとする。
【０２９５】
要約すれば、スピラマイシンの生合成経路の遺伝子を、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのゲノムＤＮＡライブラリーから単離した。このライブラリーは、ストレプトマイセス・アンボファシエンスのゲノムＤＮＡのＢａｍＨＩ制限酵素を用いた部分的消化によって得た。平均して３５〜４５ｋｂの大きいＤＮＡフラグメントを、コスミドｐＷＥＤ１５（Ｗａｈｌ等，１９８７年）から得られたコスミドｐＷＥＤ１にクローニングした（Ｇｏｕｒｍｅｌｅｎ等，１９９８年）。これらコスミドを、ファージ粒子を用いてＥ．コリに導入した。このようにして得られたライブラリーと、Ｓ．フラジアエのｔｙｌＢ遺伝子（Ｍｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９４年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ０８２２３）の部分に対応するプローブ（配列番号８６の配列）とをハイブリダイズさせた。より特定には、ハイブリダイゼーション後、プローブとハイブリダイズさせた４種のコスミドのうち１種のコスミドを選択した。次に、このコスミドをｐＯＳ４９．１と命名し、続いてＳａｃＩで消化し、プローブとハイブリダイズさせた領域を含む３．３ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＵＣ１９にサブクローニングし、配列解析した。４つのオープンリーディングフレームを同定し、そのうち１つは、Ｓ．フラジアエのＴｙｌＢタンパク質（配列番号８７）と強い配列類似性を示すタンパク質（配列番号２９）をコードする（図２５を参照）。この遺伝子を、ｏｒｆ３と命名し（配列番号２８）、Ｓ．アンボファシエンスにおいて不活性化した。ｏｒｆ３遺伝子が不活性化されたクローンはスピラマイシン生産しなくなることを実証することができた。これは、ｏｒｆ３遺伝子、または、スピラマイシン生合成において下流に位置する遺伝子の関与を示す。
【０２９６】
一度これが確認されたら、コスミドｐＯＳ４９．１のより大きい領域を配列解析し、ＳａｃＩフラグメントのいずれかの端を前もって研究した。このようにして、コスミドｐＯＳ４９．１から、７つのオープンリーディングフレーム全体と、これら７つのオープンリーディングフレーム全体のいずれかの端に位置するその他の２種の不完全なオープンリーディングフレームを含む領域の配列を得ることができた。データベースでの検索により、不完全なオープンリーディングフレームの一方は、ｓｒｍＧ遺伝子座（「ポリケチドシンターゼ」という酵素（ＰＫＳ）をコードする領域）に対応することを示すことができた。この対応する遺伝子は、Ｓ．Ｂｕｒｇｅｔｔ等（１９９６年）によってサブクローニングされている（米国特許第５、９４５、３２０号）。その上、他方のオープンリーディングフレーム、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、および、ｏｒｆ７（配列番号２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０）という７つのＯＲＦ全体、および、ｏｒｆ８（配列番号４３の配列）という８番目のＯＲＦの開始部は、データベースで発見されていなかった。
【０２９７】
続いて、スピラマイシン生合成に関与するその他の遺伝子をクローニングする目的で、この同じ領域におけるＳ．アンボファシエンスのゲノムのフラグメントを含むその他のコスミドを単離した。このために、コロニーに対してさらに一連のハイブリダイゼーションを、３種のプローブを用いて行った。第一のプローブは、ｐＯＳ４９．１からサブクローニングされたｏｒｆ１、ｏｒｆ２、および、ｏｒｆ３の開始部を含む３．７ｋｂのＤＮＡフラグメントに対応する。第二のプローブは、ｐＯＳ４９．１からサブクローニングされたｏｒｆ７の部分およびｏｒｆ８の部分を含む２ｋｂのＤＮＡフラグメントに対応する。第三のプローブも用いられた。この後者のプローブは、ｓｒｍＤ遺伝子を含む１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントに相当する。ｓｒｍＤ遺伝子は、スピラマイシン耐性を付与することができるＳ．アンボファシエンスから単離された遺伝子である。特に、これまでの研究で、Ｓ．アンボファシエンスの数種の耐性決定因子をクローニングし、Ｓ．グリセオフスカス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）株（スピラマイシン感受性株）（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）にスピラマイシン耐性をに付与することが可能となっている（Ｐｅｒ
ｎｏｄｅｔ等，１９９９年）。耐性遺伝子を単離するために、コスミドｐＫＣ５０５にＳ．アンボファシエンス株のゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーを生産した（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＭＡ等，１９８７年）。このコスミドのプールを、天然にスピラマイシンに対して感受性を有するＳ．グリセオフスカスに導入した。このようにして、Ｓ．グリセオフスカスにおいてアプラマイシン耐性とスピラマイシン耐性を付与することができる５つのコスミドが得られた。これら５つのコスミドのなかでも、ｐＯＳ４４．１というコスミドは、そのインサート中にｓｒｍＤ遺伝子を含み、この遺伝子は、ストレプトマイセス・マイカロファシエンスのｍｄｍＡ遺伝子によってコードされ、この生産生物におけるミデカマイシン耐性に関与するタンパク質とある程度の類似性を示すタンパク質をコードする（Ｈａｒａ等，１９９０年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ａ６０７２５）（図２６）。スピラマイシン生合成遺伝子の位置を確認するのに用いられた第三のプローブは、ｓｒｍＤ遺伝子を含む約１．８ｋｂのインサートであった。
【０２９８】
これら３種のプローブを、上述のゲノムＤＮＡライブラリーをハイブリダイズさせるのに用い、最も長いインサートを含む傾向があり、共通のバンドがない２種のコスミド（ｐＳＰＭ７、および、ｐＳＰＭ５）を選択することを可能にした。コスミドｐＳＭＰ５は、第一および第二のプローブとハイブリダイズさせたが、第三のプローブとはハイブリダイズせず、一方で、コスミドｐＳＰＭ７は第三のプローブだけとハイブリダイズさせた。これら２種のコスミドを「ショットガン配列解析」技術を用いて完全に配列解析した。これら２種のコスミド：ｐＳＰＭ７およびｐＳＰＭ５のインサートの配列は、オーバーラップしていないがそれぞれのインサートはその末端の一方に既知の配列を含むために、これらインサートの配列をアセンブルすることができた。特に、これらインサートのそれぞれは、「ポリケチドシンターゼ」という酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子のいずれか１種の配列のフラグメントを含んでいた。これら５個の遺伝子を、Ｓ．Ｂｕｒｇｅｔｔ等（１９９６年）（米国特許第５，９４５，３２０号）によってクローニングした（図２を参照）。従って、単一のＳ．アンボファシエンスのゲノムＤＮＡ配列を決定することができた。５’位において、第一のＰＫＳ遺伝子に位置するＥｃｏＲＩ部位から、３’位におけるＢａｍＨＩ部位までの範囲の３０９４３個のヌクレオチドの配列を、配列番号１に示す。この配列は、ＰＫＳ遺伝子上流の領域に相当する（図２および３を参照）。第五のＰＫＳ遺伝子に位置する５’位におけるＰｓｔＩ部位から、３’位におけるＢｓｔＥＩＩ部位までの範囲の１１１７１個のヌクレオチドの第二の領域を、配列番号２に示す。この領域は、ＰＫＳ遺伝子の下流の領域である（下流と上流は、５つのＰＫＳ遺伝子の方向で定義されるか、または、同じ方向を向いている）（図２および３を参照）。
【０２９９】
次に、スピラマイシン生合成に関与するその他の遺伝子をクローニングする目的で、この同じ領域にＳ．アンボファシエンスのゲノムのフラグメントを含むその他のコスミドを単離した（実施例１８および１９を参照）。
【０３００】
実施例１：Ｅ．コリにおける、ストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７のゲノムＤＮＡライブラリーの構築
１．１．ストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７のゲノムＤＮＡの抽出
ストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７（特にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）（マナサス，バージニア州，米国）から番号２３８７７で入手可能）をＹＥＭＥ（酵母エキストラクト−麦芽エキストラクト）（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ，等；２０００年）で培養し、この株のゲノムＤＮＡを抽出し、溶解と沈殿の標準的な技術に従って精製した（Ｋｉｅｓｅｒ  Ｔ．等，２０００年）。
【０３０１】
１．２．ゲノムＤＮＡライブラリーの構築
上記で単離されたストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７のゲノムＤＮＡを、約３５〜４５ｋｂのサイズを有するＤＮＡフラグメントが得られるように、ＢａｍＨＩ制限酵素で部分的に消化した。これらフラグメントを、予めＢａｍＨＩで消化したコスミドｐＷＥＤ１（Ｇｏｕｎｎｅｌｅｎ等，１９９８年）にクローニングした。コスミドｐＷＥＤ１は、コスミドｐＷＥ１５（Ｗａｈｌ等，１９８７年）から、哺乳動物において活性な発現モジュールを含む４．１ｋｂのＨｐａＩ−ＨｐａＩフラグメント（Ｇｏｕｎｎｅｌｅｎ等，１９９８年）を欠失させることによって得られた。次に、プロメガ社により市販されている「Ｐａｃｋａｇｅｎｅ(R)ラムダＤＮＡパッケージングシステム」を製造元の説明書に従ってを用いることにより、ライゲーション混合物をインビトロでラムダファージ粒子にキャプシド化した。得られたファージ粒子を、Ｅ．コリのＳＵＲＥ(R)株（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている））に感染させるのに用いた。コスミドｐＷＥＤ１はアンピシリン耐性を付与することから、ＬＢ培地＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）でクローンを選択した。
【０３０２】
実施例２：ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおけるスピラマイシン生合成に関与する遺伝子の単離および特徴付け
２．１．ストレプトマイセス・アンボファシエンスＡＴＣＣ２３８７７のゲノムライブラリーのＥ．コリのクローンのコロニーハイブリダイゼーション
約２０００種の上記で得られたライブラリーのＥ．コリのクローンを、コロニーハイブリダイゼーション用フィルターにトランスファーした。ハイブリダイゼーションに用いられるプローブは、ストレプトマイセス・フラジアエのｔｙｌＢ遺伝子の部分を含むＮａｅＩ−ＮａｅＩ  ＤＮＡフラグメント（配列番号８６）である。このフラグメントは、Ｌ．Ａ．Ｍｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＥ．Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅによって説明されたＤＮＡフラグメントのヌクレオチド２６６３〜３７０２に相当し（Ｌ．Ａ．Ｍｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＥ．Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９４年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ０８２２３）、それにおいて、ｔｙｌＢ遺伝子のコーディング配列は、ヌクレオチド２６７７〜３８４３に相当する。
【０３０３】
ストレプトマイセス・フラジアエのｔｙｌＢ遺伝子（配列番号８６）の部分を有するＮａｅＩ−ＮａｅＩ  ＤＮＡフラグメントを、ランダムプライミング技術（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社により市販されているキット）を用いて32Ｐで標識し、これをプローブとして用いてライブラリーの２０００種のクローンをハイブリダイズさせ、フィルターにトランスファーした。用いられたメンブレンは、アマシャム社（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），オルセー，フランス）により市販されているハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）Ｎナイロンメンブレンであり、ハイブリダイゼーションは、５５℃で、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８４年）によって説明された緩衝液中で行われた。２×ＳＳＣ中で、５５℃で、１５分間洗浄を行い、続いて、０．５×ＳＳＣ中で、５５℃で、２回連続、それぞれ１５分間洗浄した。これらのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、ハイブリダイズした２０００種のうち４種のクローンが、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。これら４種のクローンをＬＢ培地＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で培養し、対応する４種のコスミドを標準的なアルカリ溶解によって抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）。次に、ハイブリダイゼーションは、実際には、これら４種のコスミドのインサートに存在するＤＮＡフラグメントによるものであることを確認した。このために、コスミドを、数種の酵素（ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩ）で独立して消化した。消化産物をアガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレン上にトランスファーし、ストレプトマイセス・フラジアエのｔｙｌＢ遺伝子（上記参照）の部分を含むＮａｅＩ−ＮａｅＩ  ＤＮＡフラグメントと上記と同じ条件下でハイブリダイズさせた。４種のコスミドを確認することができ、より特定には、これらコスミドのうち１種を選択し、ｐＯＳ４９．１と命名した。
【０３０４】
２．２．同定された領域の関与の確認、および、コスミドｐＯＳ４９．１のインサートの配列解析
コスミドｐＯＳ４９．１のインサートの数種のフラグメントを、サブクローニングし、それらの配列を決定した。コスミドｐＯＳ４９．１を、ＳａｃＩ酵素で消化し、上述の条件下でのサザンブロッティングによって、３．３ｋｂのフラグメントは、ｔｙｌＢプローブとハイブリダイズする領域を含むことが示された。この３．３ｋｂのフラグメントを、０．８％アガロースゲルからのエレクトロエルーションによって単離し、続いて、ベクターｐＵＣ１９にクローニングし（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｍ７７７８９）、配列解析した。このようにして得られたプラスミドを、ｐＯＳ４９．１１と命名した。ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示す４つのオープンリーディングフレームを、このフラグメントで、ＦｌａｍｅＰｌｏｔプログラム（Ｊ．ＩｓｈｉｋａｗａおよびＫ．Ｈｏｔｔａ，１９９９年）を用いて同定することができた（２つの完全な、および、２つのトランケ−ションされたオープンリーディングフレーム）。ＦＡＳＴＡプログラムを用いた配列比較（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．ＪＬｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年を参照、特に、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能）により、これら４種のオープンリーディングフレームのうち１種から推測されたタンパク質は、Ｓ．フラジアエのＴｙｌＢタンパク質（配列番号８７；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ０８２２３）と強い配列類似性を示すことを示すことができた（図２５を参照）。このタンパク質を、ｏｒｆ３と命名した（配列番号２９）。
【０３０５】
対応する遺伝子（ｏｒｆ３遺伝子（配列番号〜２８））が、スピラマイシン生合成に関与するかどうかを試験するために、この遺伝子を、Ωｈｇｙカセット（Ｍ−Ｈ．Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ等，１９９７年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ９９３１５）でインタラプトした。このために、プラスミドｐＯＳ４９．１１を、ＸｈｏＩ酵素で消化し、４種のオープンリーディングフレーム（２つの完全な、および、２つのトランケ−ションされたオープンリーディングフレーム，その全体にｏｒｆ３を含む）を含むフラグメントを、ベクターｐＢＣ  ＳＫ＋（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）のＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、ｐＯＳ４９．１２と命名した。ｏｒｆ３を不活性化するために、ｏｒｆ３内のＰｍｌＩ−ＢｓｔＥＩＩフラグメントを、Ωｈｙｇカセットで、後者のプラスミドへの平滑末端化したクローニングにより置換した。このために、プラスミドｐＯＳ４９．１２を、ＰｍｌＩおよびＢｓｔＥＩＩ酵素で消化した（そのための特有の部位はｏｒｆ３遺伝子のコーディング配列にある）。このベクターに相当するフラグメントの末端を、クレノー酵素（ＤＮＡポリメラーゼＩ大フラグメント）での処理によって平滑末端化した。プラスミドｐＨＰ４５Ωｈｙｇ（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ等，１９９７年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ９９３１５）をＢａｍＨＩ酵素で消化することによって、Ωｈｙｇカセットを得た。Ωｈｙｇカセットに相当するフラグメントをアガロースゲルで回収し、その末端を、クレノー酵素での処理によって平滑末端化した。このようにして得られた２種の平滑末端化したフラグメント（Ωｈｙｇカセット、および、プラスミドｐＯＳ４９．１２）をライゲーションし、ライゲーション産物を用いてＥ．コリ細菌を形質転換した。このようにして得られたプラスミドはｐＯＳ４９．１４と命名され、これは、Ωｈｙｇカセットでインタラプトされたｏｒｆ３遺伝子を含む。
【０３０６】
ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩフラグメント形態（その末端はクレノー酵素での処理によって非接着性にされている）のプラスミドｐＯＳ４９．１４のインサートを、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした（プラスミドｐＯＪ２６０は、Ｅ．コリにおいて複製できるが、Ｓ．アンボファシエンスでは複製できない接合性プラスミドである（Ｍ．Ｂｉｅｒｍａｎ等，１９９２年）。このプラスミドは、Ｅ．コリとストレプトマイセスにアプラマイシン耐性を付与する）。得られたプラスミド（プラスミドｐＯＳ４９．１４のインサートを、プラスミドｐＯＪ２６０にクローニングした）を、ｐＯＳ４９．１６と命名した。後者を、Ｍａｚｏｄｉｅｒ等によって説明された接合したＥ．コリ株Ｓ１７−１（Ｍａｚｏｄｉｅｒ等，１９８９年）を用いた接合によってＳ．アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７にトランスファーした。Ｅ．コリ株Ｓ１７−１は、Ｅ．コリ株２９４（Ｓｉｍｏｎ等，１９８３年）から得られた（Ｓｉｍｏｎ等，１９８６年）。Ωｈｙｇカセットに含まれるハイグロマイシン耐性マーカーを有し、ｐＯＪ２６０に含まれるアプラマイシン耐性マーカーベクターが失われた接合完了体クローンを得ることができた。このために、接合の後、クローンを、それらのハイグロマイシン耐性について選択した。次に、ハイグロマイシン耐性クローンを、ハイグロマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地、および、アプラマイシン（抗生物質Ａ）含有培地それぞれで二次培養した（図９を参照）。ハイグロマイシンに対して耐性なクローン（ＨｙｇＲ）、および、アプラマイシンに対して感受性を有するクローン（ＡｐｒａＳ）は、原則的に、二重の組換え現象が起こったために、Ωｈｙｇカセットでインタラプトされたｏｒｆ３遺伝子を有するクローンである。ｏｒｆ３の野生型コピーの、インタラプトされたコピーでの置換を、２回の連続したハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中にカセットが存在することを確認するために、得られたクローンのトータルＤＮＡを、様々な酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、Ωｈｙｇカセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた（上記参照）。４種のオープンリーディングフレーム（２つの完全なオープンリーディングフレーム、および、２つのトランケ−ションされたオープンリーディングフレーム，その全体にｏｒｆ３を含む）を含むプラスミドｐＯＳ４９．１１のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩをプローブとして用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。このようにして得られ、その遺伝子型が確認されたｏｒｆ３：：Ωｈｙｇクローンの一つを選択し、ＯＳ４９．１６と命名した。
【０３０７】
このようにして得られたＯＳ４９．１６クローンのスピラマイシン生産を、以下で説明された生産試験（実施例１５を参照）を用いて試験した。このようにして、この株はスピラマイシンを生産しなくなることを実証することができ、ｏｒｆ３、および／または、下流に位置する遺伝子（例えばｏｒｆ４）のスピラマイシン生合成への関与が確認された。
【０３０８】
一度これが確認されたら、コスミドｐＯＳ４９．１のより大きい領域を、これまでに研究されたＳａｃＩフラグメントのいずれかの端で配列解析した。従って、コスミドｐＯＳ４９．１から、７つのオープンリーディングフレーム全体、および、これら７つのオープンリーディングフレームのいずれかの端に位置するその他の２種の不完全なオープンリーディングフレームを含む領域の配列を得ることができた。データベースでの検索によれば、不完全なオープンリーディングフレームの１つは、ｓｒｍＧ遺伝子座（「ポリケチドシンターゼ」という酵素（ＰＫＳ）をコードする領域）に相当することを示すことができた。対応する遺伝子を、Ｓ．Ｂｕｒｇｅｔｔ等（１９９６年）（米国特許第５，９４５，３２０号）によってクローニングした。その上、他方のオープンリーディングフレーム：７つのＯＲＦ全体（ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、および、ｏｒｆ７（配列番号２３、２５、２８、３０、３４、３６および４０）という）、ならびに、ｏｒｆ８という８番目のＯＲＦの開始部（このｏｒｆの全配列を、配列番号４３に示す）は、データベースでは発見されなかった。
【０３０９】
実施例３：ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおけるスピラマイシン生合成に関与するその他の遺伝子の単離および特徴付け
第二に、スピラマイシン生合成に関与するその他の遺伝子をクローニングする目的で、この同じ領域にＳ．アンボファシエンスのゲノムのフラグメントを含むその他のコスミド
を単離した。このために、さらなる一連のコロニーハイブリダイゼーションを、３種のプローブを用いて行った。
【０３１０】
−用いられた第一のプローブは、ＰＫＳ遺伝子のフラグメント、（ＰＫＳに相当する遺伝子を、Ｓ．Ｂｕｒｇｅｔｔ等（１９９６年）（米国特許第５，９４５，３２０号）によってクローニングした）、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、および、ｏｒｆ３の開始部を含む３．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡフラグメントに対応しており、これは、ｐＯＳ４９．１からサブクローニングされ、配列番号１の１位と指定されるＥｃｏＲＩ部位の上流の１３００塩基対に位置するＢａｍＨＩ部位から、２４７２位（配列番号１）に位置するＰｓｔＩ部位までのの範囲である。このＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、ｐＯＳ４９．１からプラスミドｐＢＣ  ＳＫ＋にサブクローニングし、プラスミドｐＯＳ４９．２８を得ることができた。
【０３１１】
−用いられた第二のプローブは、ｏｒｆ７およびｏｒｆ８のフラグメントを含む約２ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントに対応しており、これは、ｐＯＳ４９．１からサブクローニングされ、配列番号１の６６９３位に位置するＰｓｔＩ部位から、配列番号１の８７１４位に位置するＢａｍＨＩ部位の範囲である。このＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＯＳ４９．１から、プラスミドｐＢＣ  ＳＫ＋にサブクローニングし、プラスミドｐＯＳ４９．７６を得ることができた。
【０３１２】
−第三のプローブも用いられた。これは、ｓｒｍＤ遺伝子を含む１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントに対応する。ｓｒｍＤ遺伝子は、スピラマイシン耐性を付与することができるＳ．アンボファシエンスから単離された遺伝子である。特に、これまでの研究により、Ｓ．アンボファシエンスの数種の耐性決定因子をクローニングすること、Ｓ．グリセオフスカス株（スピラマイシン感受性株）（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）にスピラマイシン耐性をに付与することが可能である（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９９年）。耐性遺伝子を単離するために、Ｓ．アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７のゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーをコスミドｐＫＣ５０５で製造した（Ｍ．Ａ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ等，１９８７年）。このために、サイズが約３０〜４０ｋｂのフラグメントが得られるように、Ｓ．アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７のゲノムＤＮＡを、Ｓａｕ３ＡＩで部分的に消化した。このようにして消化されたゲノムＤＮＡ（３μｇ）と、予めＢａｍＨＩ酵素で消化されたｐＫＣ５０５（１μｇ）（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９９年）とをライゲーションした。次に、このライゲーション混合物をインビトロでファージ粒子にキャプシド化した。得られたファージ粒子を用いて、Ｅ．コリ株ＨＢ１０１を感染させた（特にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス，バージニア州，米国）から番号３３６９４で入手可能）。約２００００種のアプラマイシン耐性Ｅ．コリのクローンをプールし、これらクローンのコスミドを抽出した。このコスミドのプールを、天然にスピラマイシンに対して感受性を有するＳ．グリセオフスカス株ＤＳＭ１０１９１（Ｋ．Ｌ．ＣｏｘおよびＲ．Ｈ．Ｂａｌｔｚ，１９８４年）（Ｒ．Ｎ．Ｒａｏ等，１９８７年，この株は、特に、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｉｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，ＤＳＭＺ）（ブラウンシュヴァイク，ドイツ）から番号ＤＳＭ１０１９１で入手可能である）へのプロトプラスト形質転換によって導入した。アプラマイシンを含む培地で形質転換体が選択された。アプラマイシンを含む培地で成長する１３００種のクローンを５μｇ／ｍスピラマイシンを含む培地上にトランスファーした。数種のアプラマイシン耐性クローンもまたスピラマイシンを含む培地で成長し、これらコロニーのコスミドを抽出し、Ｅ．コリおよびＳ．グリセオフスカスを形質転換するのに用いた（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９９年）。このようにして、Ｅ．コリにアプラマイシン耐性、および、Ｓ．グリセオフスカスにアプラマイシンおよびスピラマイシンに対する共耐性を付与することができる５種のコスミドが得られた。これら５つのコスミドのなかでも、ｐＯＳ４４．１というコスミドは、そのインサートに、ストレプトマイセス・マイカロファシエンスのｍｄｍＡ遺伝子（配列番号８８）によってコードされるタンパク質とある程度の類似性を示すタンパク質（配列番号１６）をコードする遺伝子（配列番号１５）を含むことが���定され、この遺伝子を、ｓｒｍＤと命名した（図２６に示すアライメントを参照，これは、ＰＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤＪ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年を参照、特にＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能）を用いて行われた。
【０３１３】
プラスミドｐＯＳ４４．１に含まれる耐性決定因子を単離するために、後者を、サイズが約１．５〜３ｋｂのフラグメントが得られるようにＳａｕ３ＡＩ制限酵素で一部消化し、これらフラグメントを、ＢａｍＨＩ酵素で直線化されたベクターｐＵ４８６にライゲーションした（Ｗａｒｄ等，１９８６年）。プラスミドを、天然にスピラマイシンに対して感受性を有するＳ．グリセオフスカス株ＤＳＭ１０１９１（上記参照）においてスピラマイシン耐性を付与するその能力について選択した（Ｒ．Ｎ．Ｒａｏ等，１９８７年）。このために、ベクターｐＵ４８６にライゲーションされたｐＯＳ４４．１のＳａｕ３ＡＩフラグメントに相当するプラスミド（上記参照）のプールを、ＤＳＭ１０１９１株へのプロトプラスト形質転換によって導入し、形質転換体を、それらのチオストレプトン耐性（ｐＵ４８６が有するｔｓｒ遺伝子による）について選択した。チオストレプトン含有培地で成長するクローンを、スピラマイシンを含む培地にトランスファーした。また、数種のチオストレプトン耐性クローンがスピラマイシンを含む培地でも成長し、これらコロニーのプラスミドを抽出した。耐性を付与し、約１．８ｋｂのインサートを含むプラスミドを選択し、ｐＯＳ４４．２と命名した。この１．８ｋｂのインサートは、ベクター中でインサートのいずれかの端に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位とにより、容易に切り出すことができる。この１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩインサートを配列解析し、それを含む耐性遺伝子を、ｓｒｍＤと命名した。このようにして、このｓｒｍＤ遺伝子を含むフラグメントは、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで開環しているベクターｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｍ７７７８９）に容易にサブクローニングすることができ、得られたプラスミドを、ｐＯＳ４４．４と命名した。これのプラスミドの、ｓｒｍＤ遺伝子を含む１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩインサートを、プローブとして用いて、スピラマイシン生合成遺伝子の位置を確認した（以下を参照）。
【０３１４】
プラスミドｐＯＳ４４．４を含むエシェリキア・コリＤＨ５ａ株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ
Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１８で寄託された。
【０３１５】
上記で得られたライブラリーの約２０００種のクローン（実施例１を参照）を、従来技術に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）コロニーハイブリダイゼーション用フィルター上にトランスファーした。
【０３１６】
上述の３種のプローブを、ランダムプライミング技術（ロシュにより市販されているキット）を用いて32Ｐで標識し、これを用いて、ライブラリーの２０００種のクローンをハイブリダイズし、フィルター上にトランスファーした。ハイブリダイゼーションを、６５℃で、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８４年）によって説明された緩衝液中で行った。２×ＳＳＣ中で、６５℃で、１５分間洗浄を行い、続いて、０．５×ＳＳＣ中で、６５℃で、それぞれ１５分間、２回連続の洗浄を行った。これらのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、ハイブリダイズした２０００種のうち１６種のクローンが、少なくとも１つのプローブで強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。しかしながら、３種のプローブとハイブリダイズさせたコスミドはなかった。１６種のコスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。これら様々なコスミドの互いの制限プロファイルを比較することにより、領域の最も長いインサートを含む可能性があり、共通のバンドを有さない２種のコスミドを選択された。従って、２種のコスミドが選択され、一方はｐＳＰＭ５と命名され、他方はｐＳＰＭ７と命名された。コスミドｐＳＰＭ５は、プローブｏｒｆ１〜ｏｒｆ４およびプローブｏｒｆ８とハイブリダイズさせたが、プローブｓｒｍＤとはハイブリダイズしなかった。ｐＳＰＭ７は、プローブｓｒｍＤのみとハイブリダイズさせたが、その他の２種のプローブとはハイブリダイズしなかった。
【０３１７】
これら２種のコスミドを、「ショットガン配列解析」技術を用いて完全に配列解析した。これら２種のコスミド：ｐＳＰＭ７およびｐＳＰＭ５のインサートの配列は、オーバーラップしていないが、それぞれのインサートがその末端の一方に既知の配列を含むため、それらをアセンブルすることができた。特に、これらインサートのそれぞれは、「ポリケチドシンターゼ」という酵素（ＰＫＳ）をコードする遺伝子のいずれか１種の配列のフラグメントを含んでいた。これら５個の遺伝子を、Ｓ．Ｂｕｒｇｅｔｔ等（１９９６年）（米国特許第５，９４５，３２０号）によってクローニングした（図２を参照）。従って、単一のＳ．アンボファシエンスのゲノムＤＮＡ配列を決定することができた。５’位における第一のＰＫＳ遺伝子に位置するＥｃｏＲＩ部位から、３’位におけるＢａｍＨＩ部位までの範囲の３０９４３個のヌクレオチドの配列を、配列番号１に示す。この配列は、ＰＫＳ遺伝子上流の領域に相当する（図２および３を参照）。１１１７１個のヌクレオチドの第二の領域は、５’位におけるＰｓｔＩ部位から、第五のＰＫＳ遺伝子に位置する３’位におけるＮｃｏｌ部位までの範囲であり、これを配列番号２に示す。この第二の領域は、ＰＫＳ遺伝子の下流領域である（下流と上流は、全て同じ方向を向いた５つのＰＫＳ遺伝子の方向によって定義される）（図２および３を参照）。
【０３１８】
実施例４：スピラマイシン生合成に関与する遺伝子のヌクレオチド配列の解析、オープンリーディングフレームの決定、および、特徴付け
得られた配列を、ＦｌａｍｅＰｌｏｔプログラム（Ｊ．ＩｓｈｉｋａｗａおよびＫ．Ｈｏｔｔａ，１９９９年）を用いて解析した。これにより、オープンリーディングフレームのなかでも、ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示すオープンリーディングフレームを同定することができた。この解析により、この領域は、酵素「ポリケチドシンターゼ」（ＰＫＳ）をコードする５種の遺伝子のいずれかの端に位置する３５個のＯＲＦを含むことを決定することができた。これら遺伝子の下流と上流それぞれで１０個および２５個のＯＲＦを同定した（下流と上流は、全て同じ方向を向いた５つのＰＫＳ遺伝子の方向によって定義される）（図３を参照）。従って、このタイプの約３１ｋｂの領域を占める２５個のオープンリーディングフレーム（配列番号１および図３）が、５つのＰＫＳ遺伝子上流で同定され、約１１．１ｋｂの領域を占める１０個のオープンリーディングフレーム（配列番号２および図３）がＰＫＳ遺伝子の下流で同定された。上流領域の遺伝子を、以下のように命名した；ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ４、ｏｒｆ５、ｏｒｆ６、ｏｒｆ７、ｏｒｆ８、ｏｒｆ９ｃ、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１１ｃ、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３ｃ、ｏｒｆ１４、ｏｒｆ１５ｃ、ｏｒｆ１６、ｏｒｆ１７、ｏｒｆ１８、ｏｒｆ１９、ｏｒｆ２０、ｏｒｆ２１ｃ、ｏｒｆ２２ｃ、ｏｒｆ２３ｃ、ｏｒｆ２４ｃ、および、ｏｒｆ２５ｃ（配列番号２３、２５、２８、３０、３４、３６、４０、４３、４５、４７、４９、５３、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、および、８４）。下流領域の遺伝子を、以下のように命名した；ｏｒｆ１*ｃ、ｏｒｆ２*ｃ、ｏｒｆ３*ｃ、ｏｒｆ４*ｃ、ｏｒｆ５*、ｏｒｆ６*、ｏｒｆ７*ｃ、ｏｒｆ８*、および、ｏｒｆ９*、ｏｒｆ１０*（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および、２１）。遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、問題のＯＲＦに関して、コーディング配列が逆方向であること（それゆえに、コーディング鎖は、これら遺伝子について、配列番号１または配列番号２で示される配列に相補的な鎖である）ことを意味する（図３を参照）。
【０３１９】
様々なプログラムを用いて、これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列を、様々なデータベースに存在するタンパク質配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ，ＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ）（これら３種のプログラムは、特に、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ベセスダ，メリーランド州，米国）から入手可能である）、ＦＡＳＴＡ（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）、ＢＥＡＵＴＹ（Ｋ．Ｃ．Ｗｏｒｉｅｙ等，１９９５年））（これら２種のプログラムは、特に、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能である）；これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のある遺伝子を同定することが可能になった。
【０３２０】
実施例５：遺伝子不活性化：ノックアウトされたストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築原理
用いられた方法は、遺伝子置換を行うことにある。インタラプトさせようとする標的遺伝子は、抗生物質（例えば、アプラマイシンまたはハイグロマイシン）に対する耐性を付与するカセットでインタラプトされたこの遺伝子のコピーで置換される（図９で説明した通り）。用いられるカセットは、全てのリーディングフレームの翻訳終止コドンのいずれかの端に、および、ストレプトマイセスにおいて活性な転写ターミネーターのいずれかの端に隣接する。
【０３２１】
標的遺伝子へのカセットの挿入は、この標的遺伝子欠失を伴ってもよいし、または、伴わなくてもよい。カセットに隣接する領域のサイズは、数百から数千塩基対の範囲であり得る。
【０３２２】
カセットでの遺伝子不活性化に必要なコンストラクトを、Ｅ．コリ（組換えＤＮＡコンストラクトを得るための参照生物）で得た。インタラプトされた遺伝子を、Ｅ．コリでは複製するがストレプトマイセスでは複製できないプラスミドで得た。
【０３２３】
次に、Ｓ．アンボファシエンスにおいて望ましい遺伝子の形質転換と不活性化が可能なように、このコンストラクトをベクターにサブクローニングした。このために、２種のプラスミドを用いた：
−ｐＯＪ２６０（Ｍ．Ｂｉｅｒｍａｎ等，１９９２年）（実施例２を参照）、これは、Ｅ．コリにおいてはアプラマイシンおよびストレプトマイセス耐性を付与し、標的遺伝子がハイグロマイシン耐性を付与するカセットでインタラプトされた場合に用いられた。
【０３２４】
−ｐＯＳＫ１２０５（４７２６ｂｐ）。このプラスミドは、プラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）から得られ、このプラスミドにおいて、ネオマイシン／カナマイシン耐性をコードする配列を含むＡｖｒＩＩフラグメントが、ハイグロマイシン耐性をコードする配列で置換され、同時にＰＳＶ４０プロモーターが保存されている。このために、プラスミドｐＨＰ４５−Ωｈｙｇ（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ等，１９９７年）を、ＮｏｔＩおよびＰｆｌｍＩ酵素で消化し、ハイグロマイシン耐性を付与するフラグメントを、全ての末端をクレ
ノー酵素での処理によって平滑末端化した後、ベクターｐＢＫ−ＣＭＶのＡｖｒＩＩ部位にサブクローニングした。ｐＯＳＫ１２０５において、ハイグロマイシン耐性を付与するカセットはｐＳＶ４０プロモーターの前に置かれる。このプラスミドは、Ｅ．コリとストレプトマイセスにハイグロマイシン耐性を付与し、標的遺伝子が、アプラマイシン耐性を付与するカセットでインタラプトされた場合に用いられた。
【０３２５】
標的遺伝子に存在する制限部位を用いたクローニング、または、例えばＣｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（Ｍ．Ｋ．Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）説明されような、短い同一な配列間での組換えのいずれかによって、このカセットを、標的遺伝子に導入した。
【０３２６】
次に、カセットによってインタラプトされた遺伝子を有するプラスミドは、例えば、Ｅ．コリとストレプトマイセスとの接合によって（Ｐ．Ｍａｚｏｄｉｅｒ等，１９８９年）、ストレプトマイセス・アンボファシエンスに導入することができる。基礎のベクターがベクターｐＯＪ２６０である場合、この技術を用いた。第二の技術：組換え頻度を高めるための、アルカリ処理でＤＮＡを変性させた後のプロトプラスト形質転換技術（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等；２０００年）を用いてもよく、これは、例えば、ＯｈおよびＣｈａｔｅｒ（ＯｈおよびＣｈａｔｅｒ，１９９７年）で説明されている。基礎のベクターがｐＯＪ２６０またはｐＯＳＫ１２０５である場合、この技術を用いた（以下を参照）。次に、標的遺伝子に存在するカセットに対応する抗生物質を用いて形質転換体を選択する（図９，抗生物質Ｂを参照）。このようにして、１回または２回の組換え現象によるインテグレーションが生じたクローンの混合物を選択する。次に、耐性遺伝子がベクターに存在する（組換えカセットの外部に）抗生物質に対して感受性を有するクローン（図９，抗生物質Ａを参照）が、検索される。このようにして、原則的に２回の組換え現象が生じ、野生型遺伝子のカセットでインタラプトされたコピーでの置換が起こったクローンを選択することができる。これら工程は図９に図示される。
【０３２７】
数種のカセットは、標的遺伝子をインタラプトするのに用いることができる。例えば、ハイグロマイシン耐性を付与するΩｈｙｇカセット（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ等，１９９７年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ９９３１５）が用いることができる。
【０３２８】
実施例６：ｏｒｆ３遺伝子においてフェーズ内でノックアウトされたストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ｏｒｆ３遺伝子をΩｈｙｇカセットがインタラプトされると（実施例２．２を参照）、ｏｒｆ３：：Ωｈｙｇ株がスピラマイシンを生産しなくなることが実証でき、それにより、スピラマイシン生合成において、クローニングされた領域の１またはそれ以上の遺伝子が関与することが確認された（実施例２．２を参照）。それらの方向に関して、ＯＲＦ１〜７の共転写が考えられ（図３を参照）、観察された表現型（スピラマイシンの非生産体）は、ｏｒｆ３と共転写された１またはそれ以上の遺伝子の不活性化による可能性がある。ｏｒｆ３のスピラマイシン生合成への関与を確認するため、さらなるｏｒｆ３遺伝子の不活性化を行い、後者の不活性化はフェーズ内で行われた。このために、５０４塩基対からなるｏｒｆ３内部のＤｒａＩＩＩフラグメントを欠失させた。ｐＯＳ４９１から得られたＤＮＡフラグメントは、１位（配列番号１）に位置するＥｃｏＲＩ部位から、５２７４位（配列番号１）に位置するＳａｃＩ部位までの範囲であり、２５６３位と３０６７位との２つのＤｒａＩＩＩ部位の間に欠失を含み（５０４個のヌクレオチドが除去された）、このＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＯＪ２６０にクローニングした（Ｍ．Ｂｉｅｒｍａｎ等，１９９２年）。このようにして得られたプラスミドを、ｐＯＳ４９．６７と命名した。
【０３２９】
それゆえに、ｐＯＳ４９．６７のインサートは、ｏｒｆ１遺伝子、ｏｒｆ２遺伝子、ｏｒｆ３遺伝子（フェーズ内の欠失を含む）、ｏｒｆ４遺伝子、および、ｏｒｆ５の部分を
含むＳ．アンボファシエンスのＤＮＡフラグメントからなる。このインサートをサブクローニングしたベクターｉは、ｐＯＪ２６０であり、それゆえに、プラスミドｐＯＳ４９．６７はアプラマイシン耐性を付与し、プロトプラスト形質転換によって株ＯＳ４９．１６に導入された（実施例２を参照）。株ＯＳ４９．１６はハイグロマイシン耐性であるために、ｈｙｇＲおよびａｐｒａＲ形質転換体が得られた。非選択的培地でこのようなクローンを２回継代させた後、アプラマイシンおよびハイグロマイシンに対して感受性を有するクローン（ａｐｒａＳおよびｈｙｇＳ）を検索した。これらクローンのうちいくつかにおいて、実際には、相同配列間の組換え現象により、ベクターに存在するフェーズ内の欠失を含むｏｒｆ３のコピーでの、Ωｈｙｇカセット（ＯＳ４９．１６株のゲノムに含まれる）でインタラプトされたｏｒｆ３のコピーの置換が起こること予想される。この組換えで生じたクローンは、ベクター配列を除去した後、ａｐｒａＳとｈｙｇＳであると予想される。このようにして得られた株の遺伝子型は、ハイブリダイゼーション、または、ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって確認することができる（フェーズ内で欠失したｏｒｆ３のコピーが１つだけ得られたクローンのゲノムに存在することを確認するため）。このようにして、フェーズ内の欠失を有するｏｒｆ３のコピーを１つだけ有するクローンを得て、それらの遺伝子型を確認した。望ましい特徴を示すクローンをより特定して選択し、ＯＳ４９．６７と命名した。
【０３３０】
ＯＳ４９．６７株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１６で寄託された。
【０３３１】
実施例７：ｏｒｆ８遺伝子にノックアウトを含むストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ｏｒｆ８遺伝子の不活性化を行うために、Ωｈｙｇカセットがｏｒｆ８のコーディング配列に導入されたコンストラクトを得た。このために、まず第一に、プラスミドｐＯＳ４９．８８を構築した。プラスミドｐＯＳ４９．８８は、プラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｍ７７７８９）から、ｏｒｆ７の末端、ｏｒｆ８、および、ｏｒｆ９の開始部を含む３．７ｋｂのフラグメント（コスミドｐＳＰＭ５得られたＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント）の挿入によって得られ、これをｐＵＣ１９のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。「Ωｈｙｇカセット（クレノー酵素での処理によって平滑末端化したＢａｍＨＩフラグメントの形態）を、クレノー酵素での処理によって全ての末端を平滑末端化した後、ｏｒｆ８に位置するｐＯＳ４９．８８固有のＳａｌＩ部位にクローニングした。
【０３３２】
クローニングを平滑末端化したため、カセットの挿入方向に応じて２タイプのプラスミドが得られた：ｐＯＳ４９．１０６（ｈｙｇとｏｒｆ８遺伝子が同じ方向）、および、ｐＯＳ４９．１２０（ｈｙｇとｏｒｆ８遺伝子が逆の方向）。次に、プラスミドｐＯＳ４９．１０６のインサートをプラスミドｐＯＪ２６０にサブクローニングして、ｐＯＳ４９．１０７を得た。このために、プラスミドｐＯＳ４９．１０６を、Ａｓｐ７１８Ｉ酵素で消化し、末端を、クレノー酵素での処理によって平滑末端化した；この消化産物をＰｓｔＩ酵素で再消化し、Ωｈｙｇカセットが挿入されたｏｒｆ８遺伝子を含むフラグメントを、ベクターｐＯＪ２６０にクローニングした（上記を参照）。このために、ベクターｐＯＪ２６０を、ＥｃｏＲＶとＰｓｔＩ酵素で消化し、ライゲーションに用いた。それゆえに、この操作により、２つのフラグメントのそれぞれは、一方が平滑末端化され、他方がＰｓｔＩであることから、方向づけられたライゲーションを得ることができた。得られたプラスミドを、ｐＯＳ４９．１０７と命名した。
【０３３３】
プラスミドｐＯＳ４９．１０７を、プロトプラスト形質転換によってＳ．アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７に導入した（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）。プロトプラスト形質転換の後、クローンは、それらのハイグロマイシン耐性について選択される。次に、ハイグロマイシン耐性クローンは、それぞれ、ハイグロマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地、および、アプラマイシン（抗生物質Ａ）含有培地で二次培養される（図９を参照）。ハイグロマイシンに対して耐性なクローン（ＨｙｇＲ）、および、アプラマイシンに対して感受性を有するクローン（ＡｐｒａＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、Ωｈｙｇカセットでインタラプトされたｏｒｆ８遺伝子を含むクローンである。ｏｒｆ８の野生型コピーの、Ωｈｙｇカセットによってインタラプトされたコピーでの置換を、サザンブロッティングによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中にカセットが存在することを確認するために、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、Ωｈｙｇカセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして、プラスミドｐＯＳ４９．８８の中に、ｏｒｆ７の末端、ｏｒｆ８、および、ｏｒｆ９の開始部を含むサイズが約３．７ｋｂのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩインサートを用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。遺伝子型の確認  は、当業者既知のあらゆる方法によって行うことができ、特に、適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うことができる。
【０３３４】
ｏｒｆ８：：Ωｈｙｇクローンを選択し、ＯＳ４９．１０７と命名した。ＯＳ４９．１０７株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１７で寄託された。
【０３３５】
実施例８：ｏｒｆ１０遺伝子にノックアウトを含むストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ｏｒｆ１０遺伝子内部の１．５kbのＤＮＡフラグメントを、マトリックスとしてＳ．アンボファシエンスのゲノムＤＮＡ、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって得た：
ＳＲＭＲ１：５’ＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧ３’（配列番号８９）
ＳＲＭＲ２：５’ＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＧＴＣＧＧ３’（配列番号９０）。
【０３３６】
このＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントを、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロジェン社（カールスバッド，カリフォルニア州，米国）により市販されている）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、ｐＯＳ４９．３２と命名した。Ωｈｙｇカセット（ＢａｍＨＩフラグメントの形態、上記を参照）を、全ての末端を、クレノー酵素での処理によって平滑末端化した後、ｏｒｆ１０遺伝子のフラグメント内部の固有のＢｓｔＥＩＩ部位にクローニングした。クローニングを平滑末端化したため、カセットの挿入方向に応じて、２タイプのプラスミドを得た：ｐＯＳ４９．４３（ｈｙｇとｏｒｆ１０遺伝子が同じ方向）、および、ｐＯＳ４９．４４（ｈｙｇとｏｒｆ１０遺伝子が逆の方向）。プラスミドｐＯＳ４９．４３のインサートを、プラスミドｐＯＪ２６０のＥｃｏＲＶ部位にトランスファーし（末端をクレノー酵素での処理によって平滑末端化したＡｓｐ７１８１−ＸｂａＩフラグメントの形態で）、それにより、プラスミドｐＯＳ４９．５０を得ることを得ることができた。Ωｈｙｇカセットでインタラプトされたｏｒｆ１０遺伝子のフラグメントを含むプラスミドｐＯＳ４９．５０を、ストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７に導入した。形質転換の後、クローンを、それらのハイグロマイシン耐性について選択した。次に、ハイグロマイシン耐性クローンを、ハイグロマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地、および、アプラマイシン（抗生物質Ａ）含有培地それぞれで二次培養した（図９を参照）。ハイグロマイシンに対して耐性なクローン（ＨｙｇＲ）、および、アプラマイシンに対して感受性を有するクローン（ＡｐｒａＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、Ωｈｙｇカセットでインタラプトされたｏｒｆ１０遺伝子を含むクローンである。このようにして、カセットに含まれるハイグロマイシン耐性マーカーを含み、ベクターｐＯＪ２６０に含まれるアプラマイシン耐性マーカーが失われたクローンを得た。ｏｒｆ１０：：Ωｈｙｇインタラプトされたコピーを有するｏｒｆ１０の野生型コピーの置換からなる事象を、サザンブロッティングによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中にカセットが存在することを確認するために、得られたクローンのトータルゲノムＤＮＡを、数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、Ωｈｙｇカセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして、ｏｒｆ１０遺伝子における１．５ｋｂのＰＣＲ産物を用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った（上記を参照）。
【０３３７】
予想された特徴（ｏｒｆ１０：：Ωｈｙｇ）を示すクローンをより特定して選択し、ＯＳ４９．５０と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションに基づき、Ωｈｙｇカセットは、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、予想された消化プロファイルは、実際にこのクローンのゲノムにおける、野生型遺伝子の、Ωｈｙｇカセットでインタラプトされたコピーでの置換、それに続く二重の組換え現象の場合に得られることを確かめることができた。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０３３８】
実施例９：遺伝子不活性化：「切り出し可能なカセット」技術（図９および１０を参照）に従ってノックアウトされたストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築原理
第二のタイプのカセットは、遺伝子不活性化に用いることができ、このようなカセットは、「切り出し可能なカセット」と命名される。これらカセットは、Ｓ．アンボファシエンスのゲノムに導入した後に、部位特異的な組換え現象によってストレプトマイセスにおいて切り出すことができるという利点を有する。この目的は、ストレプトマイセス株において、最終的な株において選択マーカーまたはその株に属さない大きいＤＮＡ配列を離脱させることなく特定の遺伝子を不活性することである。切り出しの後、約３０の短い配列程度の塩基対（「ｓｃａｒ」部位という）だけがその株のゲノムに残る（図１０を参照）。
【０３３９】
まず第一に、このシステムの実施は、標的遺伝子の野生型コピーを、この標的遺伝子に切り出し可能なカセットが挿入されているコンストラクトで置換することにある（２回の相同な組換え現象に基づく，図９を参照）。このカセットの挿入は、標的遺伝子の欠失を伴う（図９を参照）。第二に、その株のゲノムからの切り出し可能なカセットの切り出しが起こる。切り出し可能なカセットは、部位特異的な組換えシステムに基づき機能し、最終的に耐性遺伝子を有さないストレプトマイセス突然変異体を得ることができるという利点を有する。不活性化された遺伝子の下流に位置する遺伝子の発現に対して起こり得る極性作用も回避される（図１０を参照）。
【０３４０】
切り出し可能なカセットの使用が説明されており、哺乳動物細胞や酵母細胞などの多くの生物、および、Ｅ．コリにおいて用いられている（Ｂａｙｌｅｙ等，１９９２年；ＢｒｕｎｅｌｌｉおよびＰａｌｌ，１９９３年；Ｃａｍｉｌｌｉ等，１９９４年；ＤａｌｅおよびＯｗ，１９９１；Ｒｕｓｓｅｌｌ等，１９９２年；Ｌａｋｓｏ等，１９９２年）。これら切り出し可能なカセットは全て、ｌｏｘ部位に作用するＣｒｅ部位特異的リコンビナーゼを用いる。この組換えシステムは、Ｐ１バクテリオファージが起源である。
【０３４１】
「切り出し可能なカセット」タイプのシステムをストレプトマイセスにを構築するために、ストレプトマイセス・アンボファシエンスの可動性の遺伝学的要素ｐＳＡＭ２に関して部位特異的な組換えシステム（Ｂｏｃｃａｒｄ等，１９８９ａおよびｂ）が、利用される。まず、このシステムの設定は、インタラプトしようとする遺伝子を含む組換えベクターを構築し、そこに切り出し可能なカセットを挿入することにある。標的遺伝子への切り出し可能なカセットの挿入は、標的遺伝子の欠失を伴う。これは、標的遺伝子に存在する制限部位を用いたクローニングによって、または、例えばＣｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ  ＭＫ等，２０００年）で説明されたような短い同一配列間の組換えによって行うことができる。切り出し可能なカセットは、例えばΩｈｙｇカセット（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ  Ｒｏｎａｕｌｔ等，１９９７年）を用いて構築することができる。このカセットは、ａｔｔＲおよびａｔｔＬ配列に隣接していた（通常、インテグレートされたｐＳＡＭ２のコピーの端に存在する）（図１５を参照）。ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列は、ｐＳＡＭ２またはこれら２つの領域間に位置するあらゆるＤＮＡフラグメントを切り出すことができる、部位特異的な組換えに必要な全ての部位を含む（Ｓｅｚｏｎｏｖ等，１９９７年，Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）。このようなカセットの構築は当然Ωｈｙｇカセットの使用に限定されず、このカセットを構築するためのベースとしてその他の耐性カセットを用いてもよい（例えば、ΩａａｃまたはΩｖｐｈカセット（Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ  Ｒｏｕａｕｌｔ等，１９９７年））。
【０３４２】
このコンストラクトを得た後、ストレプトマイセス株を組換えプラスミドで形質転換する。次に、標的遺伝子に存在するカセットに対応する抗生物質を用いて形質転換体を選択する（図９，抗生物質Ｂを参照，これは、例えば、切り出し可能なカセットがΩｈｙｇカセットから得られる場合、ハイグロマイシンでの選択を含む）。このようにして、１回または２回の組換え現象によるインテグレーションが生じたクローンの混合物を選択する。続いて、抗生物質（その耐性遺伝子がベクターに存在する（組換えカセットの外部に））に対して感受性を有するクローン（図９，抗生物質Ａを参照）が、検索される。このようにして、原則的に２回の組換え現象が起こり、カセットでインタラプトされたコピーでの野生型遺伝子の置換が生じたクローンを選択することができる。これら工程を図９に図示する；このようにして得られたクローンの遺伝子型をサザンブロッティングで確認し、望ましい特徴（切り出し可能なカセットでインタラプトされたコピーでの野生型遺伝子の置換）を示す株を選択する。
【０３４３】
次に、上で選択された株は、ｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子（これらはいずれもａｔｔＲ部位とａｔｔＬ部位との間での部位特異的な組換えに必要である）の発現が可能なプラスミドで形質転換される。この組換えにより、組換え現象に基づいた切り出し可能なカセットのその株のゲノムからの離脱がもたらされる（図１０を参照）（Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）。ストレプトマイセスにおいて比較的安定なベクター（例えば、ストレプトマイセスベクターｐＷＨＭ３から得られた（Ｖａｒａ等，１９８９年））から、ｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子を有するベクターを選択することが有利であり、これにより、選択圧力の非存在での数回の胞子形成サイクルの後、後者のベクターが失われた株を得ることを可能にする。
【０３４４】
カセットを切り出すために、例えばプラスミドｐＯＳＶ５０８（図１４を参照）を用いることができ、これは、切り出し可能なカセットでインタラプトされた遺伝子を含むＳ．アンボファシエンス株へのプロトプラスト形質転換によって導入される。プラスミドｐＯＳＶ５０８は、プラスミドｐＷＨＭ３（Ｊ．Ｖａｒａ等，１９８９年）（図１３を参照）に、ｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子（Ｆ．Ｂｏｃｃａｒｄ等，１９８９ｂ）が付加され、ｐｔｒｃプロモーター（Ｅ．Ａｍａｎｎ等，１９８８年）の制御下に置かれることによって得られる。ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置かれたｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝
子を、プラスミドｐＯＳｉｎｔ３（Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）からプラスミドｐＷＨＭ３にサブクローニングした（図１４を参照）。ｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子を有するプラスミドｐＯＳＶ５０８の、突然変異株への導入は、このカセットの端に存在するａｔｔＬおよびａｔｔＲ部位間での切り出し可能なカセットの部位特異的な組換えによって、有効な切り出しを可能にする（Ａ．Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）（図１０）。ｐＯＳＶ５０８に含まれるｔｓｒ遺伝子によるそれらのチオストレプトン耐性に関して選択された形質転換体のなかでも、カセットの存在により耐性が付与される抗生物質に対して感受性を有するようになったものが選択される（図１０を参照）。切り出しは有効であり、９０％超の形質転換体がこのタイプであったことが観察された。チオストレプトン非含有固形培地での１またはそれ以上の成長および胞子形成サイクルの後、プラスミドｐＯＳＶ５０８が失われたクローンが得られる。これらクローンは、それらのチオストレプトンに対する感受性によって検出することができる。欠失した標的遺伝子の配列は、ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって確認することができる。
【０３４５】
最終的には、得られた株は、不活性化された遺伝子に（例えば内部の欠失）、ａｔｔＲとａｔｔＬ部位との間の組換えで得られた最小のａｔｔＢ部位に相当する「ｓｃａｒ」ａｔｔ部位を有する（Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）。この残留した最小のａｔｔＢ部位は、天然にストレプトマイセス株・アンボファシエンス、ストレプトマイセス・プリスティナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）に存在する部位に類似している（Ｓｅｚｏｎｏｖ等，１９９７年）。
【０３４６】
不活性化が望ましい遺伝子は、下流に位置するその他の遺伝子と共転写することができる。オペロンにおいて下流の遺伝子の発現に対する極性作用を有する遺伝子のいずれか１つの不活性化回避するために、カセットの切り出し後にフェーズ内の欠失を得ることが重要である。上述の切り出し可能なカセットシステムによりこのような要求を満たすことができる。当業者であれば、実際に、３種の異なる切り出し可能なカセットを容易に構築することができ、前記カセットは、どのようなリーディングフレームでも、切り出し後に、停止コドンがなくてもそれぞれ３３、３４または３５個のヌクレオチドの配列を残すことができる。標的遺伝子の配列と、カセットの挿入に関する欠失のサイズがわかっている場合、切り出しによりフェーズ内の欠失が生産されるようにこれら３種の切り出し可能なカセットを選択することが可能である。付加された３３、３４または３５個のヌクレオチドのうち、２６個が最小のａｔｔＢ配列に相当する（図２７を参照）。
【０３４７】
本発明の場合、２種の切り出し可能なカセットが用いられた。これら２種のカセットは以下の通りである：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋（配列番号９１）、および、ａｔｔ３Ωａａｃ−（配列番号９２）；これらカセットは、切り出しの後、それぞれ  ３３および３５個のヌクレオチドを残す。それらは、それぞれΩｈｙｇカセットまたはΩａａｃカセットを含み、＋と−の記号は、耐性カセットの方向に相当する。これら２種のカセットを構築し、予めＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠失させたベクターｐＢＣ  ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。得られたプラスミドを、それぞれｐａｔｔ１Ωｈｙｇ＋、および、ｐａｔｔ３Ωａａｃ−と命名した。切り出し可能なカセットは、プラスミドをＥｃｏＲＶで消化することにより容易に取り出すことができる。
【０３４８】
実施例１０：ｏｒｆ２遺伝子においてノックアウトを有するストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ｏｒｆ２遺伝子の不活性化を切り出し可能なカセット技術（上記を参照）を用いて行った。用いられる開始株は、ＡＴＣＣ２３８７７株から得られるストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株である。しかしながら、ＯＳＣ２株は、可動性の遺伝学的要素ｐＳＡＭ２が失われている点でＡＴＣＣ２３８７７株とは異なる（Ｂｏｃｃａｒｄ等，１
９８９ａおよびｂ）。この可動性の要素は、ＡＴＣＣ２３８７７株のプロトプラスト化（細菌壁を消化し、菌糸体を分解するリゾチームの作用（Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年））、および、プロトプラストの再生の際に、自発的に欠失することができる。ｐＳＡＭ２要素が失われたクローンを選択するために、ＫｏｒＳＡ転写抑制因子によるｐｒａ遺伝子抑制（Ｓｅｚｏｎｏｖ等，１９９５年）に基づき、スクリーニングを設定した（Ｇ．Ｓｅｚｏｎｏｖ等，２０００年）。このために、ａｐｈ遺伝子（カナマイシン耐性を付与し、それ自身のプロモーターを欠く）上流に位置するｐｒａ遺伝子のプロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、不安定なベクターｐＷＨＭ３Ｈｙｇにクローニングしたが、後者は、ｔｏｒ遺伝子がｈｙｇ遺伝子で置換された（ハイグロマイシン耐性を付与する）プラスミドｐＷＨＭ３から得られる（Ｖａｒａ等，１９８９年）。このようにして得られたプラスミドを、ｐＯＳＶ５１０と命名した。ＡＴＣＣ２３８７７株を、プロトプラスト化の後、プラスミドｐＯＳＶ５１０で形質転換した。Ｐｒａプロモーターは、ＫｏｒＳＡ抑制因子により抑制されたプロモーターであり、後者をコードする遺伝子は、可動性のｐＳＡＭ２要素内に位置する（Ｓｅｚｏｎｏｖ  Ｇ．等，２０００年）。プラスミドｐＯＳＶ５１０で形質転換した後、形質転換された細菌が、それらのカナマイシン耐性に関して選択される（ｐＯＳＶ５１０に含まれるａｐｈ遺伝子により）。ｐＳＡＭ２のインテグレート可能な要素が失われたクローンは、ＫｏｒＳＡ抑制因子が欠失しており、Ｐｒａプロモーターは抑制されなくなり、ａｐｈカナマイシン耐性遺伝子の発現が可能になる。それゆえに、プラスミドｐＯＳＶ５１０で形質転換した後、カナマイシンで選択することにより、ｐＳＡＭ２のインテグレート可能な要素が欠失した（それゆえに、および、ＫｏｒＳＡ）クローン、および、プラスミドｐＯＳＶ５１０を含むクローンを選択することができる。プラスミドｐＯＳＶ５１０は不安定なため、抗生物質を用いない数回の胞子形成サイクルの後、単離されたクローンを、カナマイシンを含む培地、ハイグロマイシン含有培地、および、抗生物質を含まない培地で二次培養する。カナマイシンとハイグロマイシンに対して感受性を有するクローンは、ｐＯＳＶ５１０が失われている。ｐＳＡＭ２要素が失われていることを、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲによって確認した。望ましい特徴を示すクローンを選択し、ＯＳＣ２と命名した。
【０３４９】
ＯＳＣ２株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９０８で寄託した。
【０３５０】
切り出し可能なカセット技術（上記および図１０を参照）を用いて、ｏｒｆ２遺伝子の不活性化を行った。このために、４．５ｋｂのインサート、１位に位置するＥｃｏＲＩ部位から、４５２１位（配列番号１）に位置するＢａｍＨＩ部位までの配列を、コスミドｐＳＰＭ５からのプラスミドｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｍ７７７８９）。このようにして得られたプラスミドを、ｐＯＳ４９．９９と命名した。
【０３５１】
このプラスミドを、プラスミドｐＫＯＢＥＧ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）をすでに含むＥ．コリ株ＫＳ２７２に導入した（図１２を参照）。
【０３５２】
平行して、ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセット（配列番号９２，上記を参照）を、マトリックスとしてプラスミドｐＯＳＫ１１０２、および、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した（プラスミドｐＯＳＫ１１０２は、ベクターｐＧＰ７０４Ｎｏｔ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）から得られたプラスミドであり（Ｖ．Ｌ．ＭｉｌｌｅｒおよびＪ．Ｊ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，１９８８年）、これにおいて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットは、ＥｃｏＲＶフラグメントとして、ｐＧＰ７０４Ｎｏｔの固有のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされている）：
【化１】
2006501863.tif 000039
【０３５３】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する４０個のデオキシヌクレオチドは、標的遺伝子（この場合はｏｒｆ２）中の配列に対応する配列を含み、最も端の３’位に位置する２０個のデオキシヌクレオチド（上記では太字で示す）は、ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセットの末端のいずれか１種の配列に対応する（図１１を参照）。
【０３５４】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、プラスミドｐＫＯＢＥＧおよびｐＯＳ４９．９９を含むＥ．コリ株（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年で説明された）を形質転換した（図１２を参照）。従って、細菌を、エレクトロポレーションで形質転換し、それらのアプラマイシン耐性に関して選択した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、数種の制限酵素で消化し、得られた消化プロファイルが、標的遺伝子（ｏｒｆ２）へのカセット（ａｔｔ３Ωａａｃ−）の挿入が生じた場合、すなわち、実際にはＰＣＲ産物の末端と標的遺伝子との相同組換えが生じた場合に予想されるプロファイルに相当することを確かめた（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）。コンストラクトの確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。そのプラスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するプラスミドを、ｐＳＰＭ１７と命名した。このプラスミドは、ｏｒｆ２が、アプラマイシンカセットでインタラプトされたｐＯＳ４９．９９から得られる（図１２を参照）。
【０３５５】
カセットの挿入は、ｏｒｆ２における、ｏｒｆ２のコーディング部分のヌクレオチド２１１〜４９２での欠失を伴う。プラスミドｐＳＰＭ１７を、ＥｃｏＲＩ酵素で消化し、次に、末端をクレノー酵素での処理によって平滑末端化し、次に、この消化産物をＸｂａＩ酵素で消化し、欠失したｏｒｆ２遺伝子を含むインサートを、ベクターｐＯＳＫ１２０５にクローニングした（上記を参照）。このために、ベクターｐＯＳＫ１２０５を、ＢａｍＨＩ酵素で消化し、次に、末端を、クレノー酵素での処理によって平滑末端化した；次に、この産物をＸｂａＩ酵素で消化し、上記のようにｐＳＰＭ１７から得られたインサートでのライゲーションに用いた。それゆえに、この操作により、２つのフラグメントのそれぞれは、一方が平滑末端化され、他方がＸｂａＩであることから、方向づけられたライゲーションを得ることができる。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ２１と命名した；これは、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ベクター部分）、および、欠失したｏｒｆ２遺伝子がａｔｔ３Ωａａｃ−カセットで置換されたインサートを有する。
【０３５６】
ベクターｐＳＰＭ２１を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株（上記を参照）に導入した。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、それぞれアプラマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地およびハイグロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地（図９を参照）で二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）、および、ハイグロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＨｙｇＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたｏｒｆ２遺伝子を含むクローンである。これらクローンを選択し、ｏｒｆ２の野生型コピーの、カセットでインタラプトされたコピーでの置換を確認した。ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットの存在を、コロニーＰＣＲによって確認した。ハイブリダイゼーションも行った。このために、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、プラスミドｐＯＳ４９．９９（上記を参照）のインサートのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに対応する３ｋｂのプローブとハイブリダイズさせた。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０３５７】
予想された特徴を示すクローンを選択し、ＳＰＭ２１と命名した。ＰＣＲとハイブリダイゼーションを用いて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおいて、野生型遺伝子の、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られることを確かめることができた。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。
【０３５８】
ＳＰＭ２１株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１４で寄託した。
【０３５９】
カセットの切り出しを起こすために、ＳＰＭ２１株を、プロトプラスト形質転換によって、ベクターｐＯＳＶ５０８で形質転換した（図１４を参照）。プラスミドｐＯＳＶ５０８は、プラスミドｐＷＨＭ３（Ｊ．Ｖａｒａ等，１９８９年）から得られ（図１３を参照）、これにおいて、ｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子（Ｆ．Ｂｏｃｃａｒｄ等，１９８９ｂ）が付加され、ｐｔｒｃプロモーターの制御下に置かれている（Ｅ．Ａｍａｎｎ等，１９８８年）（図１４を参照）。ｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子を有するプラスミドｐＯＳＶ５０８をＳＰＭ２１株へ導入することにより、部位特異的な組換えにより、切り出し可能なカセットの端に存在するａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位との間で、切り出し可能なカセットの有効な切り出しが可能になる（Ａ．Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）（図１０）。ｐＯＳＶ５０８に含まれるｔｓｒ遺伝子によるそれらのチオストレプトン耐性に関して選択された形質転換体のなかでも、アプラマイシンに対して感受性を有するようになった（その耐性遺伝子はａｔｔ３Ωａａｃ−カセットに含まれる）形質転換体が選択される；実際に、切り出しにより、この耐性遺伝子の欠失がもたらされる（図１０を参照）。プラスミドｐＯＳＶ５０８は、不安定であり、抗生物質を含まない培地での２回の連続した継代の後、単離されたクローンは、チオストレプトン含有培地、および、チオストレプトン非含有培地で二次培養される。チオストレプトン感受性クローンは、ｐＯＳＶ５０８が失われている。ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって、このカセットの切り出しにより、実際にｏｒｆ２遺伝子においてフェーズ内の欠失が起こることを確認した；カセットの切り出しは、実際に、特徴的な「ｓｃａｒ」ａｔｔ３配列を残す（これは、ａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位との間の組換えの後、オリジンのａｔｔＢ部位に類似する）：
５’ＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＴ３’（配列番号９５）。
【０３６０】
このようにして得られた望ましい遺伝子型（ｏｒｆ２：：ａｔｔ３）を有する株を、ＳＰＭ２２と命名した。
【０３６１】
ＳＰＭ２２株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅ，２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１５で寄託した。
【０３６２】
実施例１１：ｏｒｆ１２遺伝子においてノックアウトを有するストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３ｃ、および、ｏｒｆ１４の不活性化のために、同じ開始プラスミド（ｐＳＰＭ５０４）を、様々な位置に「切り出し可能なカセット」タイプのカセットを導入するのに用いた。このプラスミドは、ｏｒｆ７〜ｏｒｆ１７の領域に相当する１５．１ｋｂのインサートを含む。このプラスミドを構築するために、コスミドｐＳＰＭ７の消化により得られた１５．１ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメント（上記を参照）を、ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＭＢＬ１８にクローニングした（Ｎａｋａｎｏ等；１９９５年）。ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ末端は適合するため、ライゲーションの後プラスミドｐＳＰＭ５０２が、得られる。次に、ｐＳＰＭ５０２のインサート全体を、プラスミドｐＯＳＫ１２０５（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩで消化した）にサブクローニングし（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩフラグメントの形態で）、それによりプラスミドｐＳＰＭ５０４を得ることを得ることができた。
【０３６３】
このプラスミドを、プラスミドｐＫＯＢＥＧをすでに含むＥ．コリ株ＫＳ２７２に導入した（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）（図１２を参照）。
【０３６４】
平行して、ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセットを、マトリックスとしてプラスミドｐＯＳＫ１１０２を用いたＰＣＲによって増幅した（プラスミドｐＯＳＫ１１０２は、ベクターｐＧＰ７０４Ｎｏｔ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）から得られたプラスミドであり（Ｖ．Ｌ．ＭｉｌｌｅｒおよびＪ．Ｊ．Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，１９８８年）、これにおいて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットは、ＥｃｏＲＶフラグメントとしてｐＧＰ７０４Ｎｏｔの固有のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされている）；用いられたプライマーは、以下の通りである：
【化２】
2006501863.tif 000040
【０３６５】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する４０個（ＥＤＲ８に関しては３９個のみ）のデオキシヌクレオチドは、標的遺伝子（この場合はｏｒｆ１２）中の配列に対応する配列を含み、最も端の３’位に位置する２０個のデオキシヌクレオチド（上記では太字で示す）は、ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセットの末端のいずれか１種の配列に対応する（図１１を参照）。
【０３６６】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）によって説明されたように、プラスミドｐＫＯＢＥＧ、および、ｐＳＰＭ５０４（上記を参照）を含むＥ．コリ株ＫＳ２７２を形質転換した（原理については図１２を参照、プラスミドｐＯＳ４９．９９は、プラスミドｐＳＰＭ５０４によって置換されるべきであり、得られたプラスミドは、ｐＳＰＭ１７ではなくなり、ｐＳＰＭ５０７となる）。従って、細菌を、エレクトロポレーションにより、このＰＣＲ産物で形質転換し、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、数種の制限酵素で消化し、得られた消化プロファイルが、カセット（ａｔｔ３Ωａａｃ−）の、標的遺伝子（ｏｒｆ１２）への挿入が生じた場合、すなわち、実際に、ＰＣＲ産物の末端と標的遺伝子との間の相同組換えが生じた場合に予想されたプロファイルに相当することを確かめた（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等；２０００年）。コンストラクトの確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。そのプラスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するプラスミドを、ｐＳＰＭ５０７と命名した。このプラスミドは、ｏｒｆ１２がａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされているｐＳＰＭ５０４から得られる（図１２を参照）。カセットの挿入は、ｏｒｆ１２遺伝子における欠失を伴い、インタラプトは、ｏｒｆ１２の３０番目のコドンから始まる。ｏｒｆ１２の最後の４６個のコドンは、カセットの後に残留する。
【０３６７】
ベクターｐＳＰＭ５０７を、プロトプラスト形質転換（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）によって、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入した（上記を参照）。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、それぞれアプラマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地およびハイグロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地（図９を参照）で二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）、および、ハイグロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＨｙｇＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたｏｒｆ１２遺伝子を含むクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ１２の野生型コピーの、カセットでインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットに対応するプローブとハイブリダイズさせ、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中のカセットの存在を確認した。プローブとして、ＰＣＲによって得られ、ｏｒｆ１２遺伝子のコーディング配列の極めて大きい部分に相当するＤＮＡフラグメントを用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。
【０３６８】
遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０３６９】
予想された特徴（ｏｒｆ１２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−）を示すクローンをより特定して選択し、ＳＰＭ５０７と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションに基づいて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおいて、野生型遺伝子の、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られることを確かめることができた。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ１２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有し、ＳＰＭ５０７と命名した。遺伝子の方向がわかっている場合（図３を参照）、ｏｒｆ１２の不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない。特に、ｏｒｆ１３ｃは、ｏｒｆ１２と逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、特にプラスミドｐＯＳＶ５０８の形質転換によって、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。ＳＰＭ５０７株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１１で寄託した。
【０３７０】
実施例１２：ｏｒｆ１３ｃ遺伝子においてノックアウトを有するストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセットを、マトリックスとしてプラスミドｐＯＳＫ１１０２を用い、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した（上記を参照）：
【化３】
2006501863.tif 000041
【０３７１】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する４０個のデオキシヌクレオチドは、標的遺伝子（この場合はｏｒｆ１３ｃ）における配列に対応する配列を含み、最も端の３’位に位置する２０個のデオキシヌクレオチド（上記では太字で示す）は、ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセットの末端のいずれか１種の配列に対応する（図１１を参照）。
【０３７２】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）によって説明されたように、プラスミドｐＫＯＢＥＧ、および、ｐＳＰＭ５０４を含むＥ．コリ株ＫＳ２７２（上記を参照）を形質転換した（原理については図１２を参照、プラスミドｐＯＳ４９．９９は、プラスミドｐＳＰＭ５０４によって置換されるべきであり、得られたプラスミドはｐＳＰＭ１７ではなくなり、ｐＳＰＭ５０８となる）。従って、細菌を、エレクトロポレーションにより、このＰＣＲ産物で形質転換し、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、数種の制限酵素で消化し、得られた消化プロファイルが、カセット（ａｔｔ３Ωａａｃ−）の標的遺伝子（ｏｒｆ１３ｃ）への挿入が生じた、すなわち、実際に、ＰＣＲ産物の末端と標的遺伝子との間の相同組換えが生じた場合の予想されたプロファイルに相当する（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）ことを確かめた。コンストラクトの確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。そのプラスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するプラスミドを、ｐＳＰＭ５０８と命名した。このプラスミドは、ｏｒｆ１３ｃがアプラマイシンカセットでインタラプトたｐＳＰＭ５０４から得られた（図１２を参照）。カセットの挿入は、ｏｒｆ１３ｃ遺伝子における欠失を伴い、インタラプトは、ｏｒｆ１３ｃの６番目のコドンから始まる。ｏｒｆ１３ｃの最後の３個のコドンは、カセットの後に残留する。
【０３７３】
ベクターｐＳＰＭ５０８を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，
２０００年）、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入した（上記を参照）。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、アプラマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地およびハイグロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地（図９を参照）それぞれで二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）、および、ハイグロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＨｙｇＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたｏｒｆ１３ｃ遺伝子を含むクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ１３ｃの野生型コピーの、カセットでインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中にカセットが存在することを確認するために、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして、ｏｒｆ１３ｃのコーディング配列の約１００塩基対上流および下流にわたる配列に相当するＰＣＲ産物を用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０３７４】
予想された特徴を示すクローン（ｏｒｆ１３ｃ：：ａｔｔ３Ωａａｃ−）をより特定して選択し、ＳＰＭ５０８と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションに基づいて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおいて、野生型遺伝子の、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られることを確かめることができた。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ１３ｃ：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有し、ＳＰＭ５０８と命名した。遺伝子の方向がわかっている場合（図３を参照）、ｏｒｆ１３ｃの不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない。ｏｒｆ１４がｏｒｆ１３ｃと逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。ＳＰＭ５０８株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１２で寄託した。
【０３７５】
実施例１３：ｏｒｆ１４遺伝子においてノックアウトを有するストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ａｔｔSΩａａｃ−切り出し可能なカセットを、マトリックスとしてプラスミドｐＯＳＫ１１０２、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した（上記を参照）：
【化４】
2006501863.tif 000042
【０３７６】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する４０個のデオキシヌクレオチドは、標的遺伝子（この場合はｏｒｆ１４）中の配列に対応する配列を含み、最も端の３’位に位置する２０個のデオキシヌクレオチド（上記では太字で示される）は、ａｔｔ３Ωａａｃ−切り出し可能なカセットの末端のいずれか一方の配列に相当する（図１１を参照）。
【０３７７】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）によって説明されたように、プラスミドｐＫＯＢＥＧ、および、ｐＳＰＭ５０４を含むＥ．コリ株ＫＳ２７２（上記を参照）を形質転換した（原理については図１２を参照、プラスミドｐＯＳ４９．９９は、プラスミドｐＳＰＭ５０４によって置換されるべきであり、得られたプラスミドはｐＳＰＭ１７ではなくなり、ｐＳＰＭ５０９となる）。従って、細菌を、エレクトロポレーションにより、このＰＣＲ産物で形質転換し、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、数種の制限酵素で消化し、得られた消化プロファイルが、標的遺伝子（ｏｒｆ１４）へのカセット（ａｔｔ３Ωａａｃ−）の挿入が生じた場合、すなわち、実際に、ＰＣＲ産物の末端と標的遺伝子との間の相同組換えが生じた場合に予想されたプロファイルに相当する（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）ことを確かめた。コンストラクトの確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。そのプラスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するプラスミドを、ｐＳＰＭ５０９と命名した。このプラスミドは、ｏｒｆ１４がアプラマイシンカセットでインタラプトされたｐＳＰＭ５０４から得られる（図１２を参照）。カセットの挿入は、ｏｒｆ１４遺伝子における欠失を伴い、インタラプトは、ｏｒｆ１４の第四のコドンから始まる。ｏｒｆ１４の最後のコドンは、カセットの後に残留する。
【０３７８】
ベクターｐＳＰＭ５０９を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入した（上記を参照）。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、アプラマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地およびハイグロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地（図９を参照）それぞれで二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）、および、ハイグロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＨｙｇＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたｏｒｆ１４遺伝子を含むクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ１４の野生型コピーの、カセットでインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中にカセットが存在することを確認するために、得られたクローンのトータルＤＮＡを、数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットに対応するプローブとハイブリダイ
ズさせた。プローブとして、ｏｒｆ１４のコーディング配列の約１００塩基対上流および下流にわたる配列に相当するＰＣＲ産物を用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０３７９】
予想された特徴を示すクローン（ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−）をより特定して選択し、ＳＰＭ５０９と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションに基づいて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおいて、野生型遺伝子の、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られることを確かめることができた。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有し、ＳＰＭ５０９と命名した。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ１４の不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない。ｏｒｆ１５ｃが、ｏｒｆ１４と逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。ＳＰＭ５０９株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１３で寄託した。
【０３８０】
実施例１４：ｏｒｆ６*遺伝子においてノックアウトを有するストレプトマイセス・アンボファシエンス株の構築
ｏｒｆ６*遺伝子の不活性化を、切り出し可能なカセット技術を用いて行った（上記および図１０を参照）。このために、コスミドｐＳＰＭ７をマトリックスとして用いて、以下のオリゴヌクレオチドを用いてｏｒｆ６*遺伝子のフラグメントを増幅した：
【化５】
2006501863.tif 000043
【０３８１】
これらオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する２０個のデオキシヌクレオチドは、ｏｒｆ６*遺伝子のコーディング部分に位置する配列（配列番号１３）に相当し、最も端の５’位に位置する６個のデオキシヌクレオチドは、その後のクローニングを容易にするＰｓｔＩ部位の配列に相当する。増幅されたＤＮＡフラグメントのサイズは約１．１１ｋｂである。このＰＣＲ産物を、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ，プロメガ社（マディソン，ウィスコンシン州，米国）により市販されている）にクローニングし、これにより、ｐＢＸＬ１１１１というプラスミドを得ることができた（図１６を参照）。
【０３８２】
次に、ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋切り出し可能なカセットを、ｏｒｆ６*遺伝子のコーディング配列に導入した。このために、プラスミドｐＢＸＬ１１１１を、ＳｍａＩおよびＡｓｐ７１８Ｉ制限酵素で消化し、消化産物をクレノー酵素で処理した。この操作により、ｏｒ
ｆ６*遺伝子のコーディング配列において１２０ｂｐの内部の欠失を生産することができた（図１５を参照）。加えて、制限部位のいずれかの端に、ｏｒｆ６*配列の５１１ｂｐと、４８５ｂｐがそれぞれ残留し、これにより、ｏｒｆ６*遺伝子の不活性化のための相同組換えが可能になる。ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋切り出し可能なカセットを、プラスミドｐａｔｔ１Ωｈｙｇ＋から、このプラスミドをＥｃｏＲＶで消化することによって製造した（上記を参照）。次に、後者を、予め上述のように（ＳｍａＩおよびＡｓｐ７１８Ｉでの消化、次に、クレノー酵素での処理）製造されたベクターｐＢＸＬ１１１１にサブクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＢＸＬ１１１２と命名した（図１７を参照）。このコンストラクトにおいて、ｏｒｆ６*遺伝子は、１２０ｂｐの欠失を含み、ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋カセットでインタラプトされている。
【０３８３】
次に、プラスミドｐＢＸＬ１１１２を、ＰｓｔＩ酵素で消化した（ＰＣＲオリゴヌクレオチドに存在するため、カセットに隣接する部位）、次に、ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋カセットでインタラプトされたｏｒｆ６*の部分を含む３．７ｋｂのＰｓｔＩインサートをプラスミドｐＯＪ２６０のＰｓｔＩ部位にクローニングした（上記を参照）。このようにして得られたプラスミドを、ｐＢＸＬ１１１３と命名した。
【０３８４】
ベクターｐＢＸＬ１１１３を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入した（上記を参照）。形質転換の後、クローンを、それらのハイグロマイシン耐性について選択した。次に、ハイグロマイシン耐性クローンを、ハイグロマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地、および、アプラマイシン（抗生物質Ａ）含有培地それぞれで二次培養した（図９を参照）。ハイグロマイシンに対して耐性なクローン（ＨｙｇＲ）、および、アプラマイシンに対して感受性を有するクローン（ＡｐｒａＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋カセットでインタラプトされたｏｒｆ６*遺伝子を含むクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ６*の野生型コピーの、カセットでインタラプトされたコピーでの置換を、サザンブロッティング技術によって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中にカセットが存在することを確認するために、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ｈｙｇ遺伝子に対応するプローブ（ＰＣＲによって得られた）とハイブリダイズさせた。プローブとして、ｏｒｆ６*遺伝子を含み、サイズが約１．１ｋｂであり、プラスミドｐＢＸＬ１１１１から得られたＰｓｔＩ−ＰｓｔＩインサート（上記および図１６を参照）を用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０３８５】
予想された特徴を示すクローン（ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋）をより特定して選択し、ＳＰＭ５０１と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションを用いて、ａｔｔ１Ωｈｇｙ＋カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおいて、野生型遺伝子の、ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られることを確かめることができた。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋を有し、ＳＰＭ５０１と命名した。ＳＰＭ５０１株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９０９で寄託した。
【０３８６】
ＳＰＭ５０１株を、カセットの切り出しを起こすために、プロトプラスト形質転換によって、ベクターｐＯＳＶ５０８で形質転換した（図１４を参照）。プラスミドｐＯＳＶ５０８は、ｐｔｒｃプロモーター（Ｅ．Ａｍａｎｎ等，１９８８年）の制御下に置かれているｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子（Ｆ．Ｂｏｃｃａｒｄ等，１９８９ｂ）が付加された（図１４を参照）プラスミドｐＷＨＭ３（Ｊ．Ｖａｒａ等，１９８９年）から得られる（図１３を参照）。ｐＳＡＭ２のｘｉｓおよびｉｎｔ遺伝子を有するプラスミドｐＯＳＶ５０８の、ＳＰＭ５０１株への導入により、部位特異的な組換えにより、切り出し可能なカセットの端に存在するａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位との間で、切り出し可能なカセットの有効な切り出しが可能になる（Ａ．Ｒａｙｎａｌ等，１９９８年）（図１０）。ｐＯＳＶ５０８に含まれるｔｓｒ遺伝子によるそれらのチオストレプトン耐性に関して選択された形質転換体のなかでも、ハイグロマイシンに対して感受性を有するようになる（その耐性遺伝子はａｔｔ１Ωｈｙｇ＋カセットに含まれる）形質転換体が選択される；実際に、切り出しにより、この耐性遺伝子の欠失がもたらされる（図１０を参照）。プラスミドｐＯＳＶ５０８は、不安定であり、抗生物質を含まない培地での２回の連続した継代の後、単離されたクローンは、チオストレプトン含有培地、および、チオストレプトン非含有培地で二次培養される。チオストレプトン感受性クローンは、ｐＯＳＶ５０８が失われている。ｏｒｆ６*遺伝子においてカセットの切り出しが、実際にフェーズ内で生じたことを、ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって確認した。インタラプトは、１５８番目のコドンから始まり、４０個のコドンが、欠失しており（１２０ｂｐ）、カセットの切り出しにより、３３ｂｐの特徴的な「ｓｃａｒ」ａｔｔ１配列が残る：
５’ＡＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＴ３’（配列番号１０４）。
【０３８７】
このようにして得られた望ましい遺伝子型（ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１）を有する株を、ＳＰＭ５０２と命名した。
【０３８８】
ＳＰＭ５０２株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に、登録番号Ｉ−２９１０で寄託した。
【０３８９】
実施例１５：ｏｒｆ２、ｏｒｆ３、ｏｒｆ８、ｏｒｆ１０、ｏｒｆ１２、ｏｒｆ１３ｃ、ｏｒｆ１４またはｏｒｆ６*遺伝子においてノックアウトを有するストレプトマイセス株・アンボファシエンスの解析
得られた様々な株のスピラマイシン生産を試験するために、ミクロコッカス・ルテウス株の感受性に基づく微生物学的試験を行った（Ａ．Ｇｏｕｒｍｅｌｅｎ等，１９９８年を参照）。用いられるミクロコッカス・ルテウス株は、天然にスピラマイシンに対して感受性を有するＤＳＭ１７９０株から得られた株である（この株は、特に、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｉｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，ＤＳＭＺ）（ブラウンシュヴァイク，ドイツ）から番号ＤＳＭ１７９０で入手可能である）；本試験で用いられた株は、コンゴシジンに対して耐性である点でＤＳＭ１７９０株とは異なる。この株は、高められたコンゴシジン量を含む培地での選択によって得られた自発的な突然変異体である。このような株は、ストレプトマイセス・アンボファシエンスは、スピラマイシンとコンゴシジンとを両方を生産するということによって選択された。目的は、ミクロコッカス・ルテウス株の感受性に基づく微生物学的試験を用いて得られた様々な株のスピラマイシン生産を分析することであるため、コンゴシジン耐性株を持つが必要である。
【０３９０】
試験される様々なストレプトマイセス株を、を含むＭＰ５培地７０ｍｌ（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）バッフルを有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコで培養した（バッフルを有するエルレンマイヤー）。様々なＳ．アンボファシエンス株を初期濃度２．５×１０6個の胞子／ｍｌでバッフルを有するエルレンマイヤーに植え付け、２５０ｒｐｍで回転させて振盪しながら２７℃で成長させた。培養の４８、７２および９６時間後、懸濁液のサンプル２ｍｌを取り、遠心分離した。次に、様々な上清を−２０℃で凍結させた。これら上清の滅菌培地での１０倍希釈液を、試験に用いる（図１８を参照）。
【０３９１】
コンゴシジンに対して耐性であるがスピラマイシンに対して感受性を有するミクロコッカス・ルテウス指標株を、５μｇ／ｍｌのコンゴシジンを含む２ＴＹ培地で、３７℃で４８時間培養した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）。培養液の光学密度（ＯＤ）を測定し、この培養液を希釈して光学密度を４に調節する。この予備培養液０．４ｍｌを、予め温度を約４５℃にしたＤＡＭ５培地（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）抗生物質培地５，ディフコ社により市販されている）４０ｍｌで希釈した。次に、この培地を１２×１２cm平方の培養皿に注ぎ、周囲温度で放置した。
【０３９２】
培地を冷却し、固化させたら、直径１２ｍｍのワットマンＡＡペーパーディスク（Ａ．Ｇｏｕｎｎｅｌｅｎ等，１９９８年を参照）を、各上清の１０倍希釈液７０μｌに浸し、培養皿の表面に置いた。様々な濃度のスピラマイシン溶液に浸したディスク（２−４−８μｇ／ｍｌ，ＭＰ５培地中）を、標準範囲として用いる。培養皿を４℃で２時間放置し、抗生物質を寒天に拡散させ、次に、３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。
【０３９３】
ディスクがスピラマイシンを含む場合、これが寒天に拡散し、ミクロコッカス・ルテウス指標株の成長を阻害する。この阻害によりディスクの周りに「輪」が形成され、この輪は、ミクロコッカス・ルテウス株が成長しなかった領域を示す。それゆえに、この輪の存在は、スピラマイシンの存在の指標であり、問題のディスクに対応するＳ．アンボファシエンスは、スピラマイシン生産体であるか、またはそうでないかを決定することを可能にする。標準範囲で得られた阻害の直径を比較することによって、この株によって生産されたスピラマイシンの量の指標を得ることを可能にする。
【０３９４】
それらのスピラマイシン生産を検出するために、前述の実施例で説明された様々な株をこの試験に用いた。得られた結果を表３８にグループ分けした。
【０３９５】
【表３８】
2006501863.tif 000044
【０３９６】
これらの結果により、スピラマイシン生合成に関与する様々な遺伝子の機能に関して、一定の結論を引き出すことが可能である。従って、ｏｒｆ３遺伝子は、スピラマイシン生合成に必須である。特に、この遺伝子におけるフェーズ内での不活性化により、スピラマイシンを生産しなくなる株（ＯＳ４９．６７，実施例６を参照）がもたらされる。フェーズ内での不活性化により、導入されたカセットの、ｏｒｆ３の下流に位置する遺伝子の発現に対する考えられる影響の仮説を排除することが可能になる。
【０３９７】
同様に、ＯＳ４９．１０７株およびＯＳ４９．５０株は、非生産体の表現型を有することから、ｏｒｆ８遺伝子およびｏｒｆ１０遺伝子は、スピラマイシン生合成に必須なタンパク質をコードする。加えて、これら後者の２つの株において、これは、様々なｏｒｆの方向を考慮すると（図３を参照）、導入されたコンストラクトは極性作用を有することができないことから、明らかに、この非生産体の表現型に関与する対応する遺伝子の不活性化である。
【０３９８】
切り出し可能なカセットを有する株の研究によっても、インタラプトされた遺伝子の機能に関して一定の結論を引き出すことが可能になる。ＳＰＭ５０７株は、遺伝子型：ｏｒｆ１２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ１２の不活性化の作用を研究するためには、カセットを切り出す必要がない。ｏｒｆ１３ｃは、ｏｒｆ１２と逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。ＳＰＭ５０７株の表現型は、非生産体である；それゆえに、これから、ｏｒｆ１２遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。
【０３９９】
ＳＰＭ５０８株は、遺伝子型：ｏｒｆ１３ｃ：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ１３ｃの不活性化の作用を研究するためには、カセットを切り出す必要がない。ｏｒｆ１４が、ｏｒｆ１３ｃと逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。ＳＰＭ５０８株の表現型は、生産体である；それゆえに、これから、ｏｒｆ１３ｃ遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子ではないと結論付けることができる。
【０４００】
ＳＰＭ５０９株は、遺伝子型：ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ１４の不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない；ｏｒｆ１５ｃが、ｏｒｆ１４と逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。ＳＰＭ５０９株の表現型は、非生産体である；それゆえに、これから、ｏｒｆ１４遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。
【０４０１】
ＳＰＭ２１株は、遺伝子型：ｏｒｆ２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。この株は、スピラマイシン非生産体の表現型を有する。しかしながら、ｏｒｆ１遺伝子〜ｏｒｆ８遺伝子の方向（図３を参照）は、これら遺伝子は共転写されることを意味する。従って、観察された表現型は、ｏｒｆ２に導入されたカセットの、オペロンにおいて下流に位置する遺伝子の発現に対する極性作用による可能性がある。ＳＰＭ２２株は、遺伝子型：ｏｒｆ２：：ａｔｔ３を有し、フェーズ内での導入されたカセットの切り出しの後得られた。カセットの切り出しにより、特徴的な「ｓｃａｒ」配列だけが残留した（実施例１０を参照）。ＳＰＭ２２株はまた非生産体の表現型を有することから、ｏｒｆ１遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてスピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。ここでは、ｏｒｆ２の不活性化による作用のみが観察される。
【０４０２】
ＳＰＭ５０１株は、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｇｙ＋を有する。この株は、スピラマイシン非生産体の表現型を有する。しかしながら、ｏｒｆ５*遺伝子およびｏｒｆ６*遺伝子（図３を参照）は同じ方向を有することから、観察された表現型は、ｏｒｆ６*に導入されたカセットの、ｏｒｆ５*の発現に対する極性作用による可能性がある。これら遺伝子の配置は、それらは共転写される可能性があることを意味する。この質問に応答するために、ＳＰＭ５０２株が、フェーズ内での導入されたカセットの切り出しの後に得られた。この株において、ｏｒｆ６*の不活性化の作用のみが観察される。この株は、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１を有する（実施例１４を参照）。カセットの切り出しにより、フェーズ内の「ｓｃａｒ」配列のみが残留する（実施例１４を参照）。ＳＰＭ５０２株は、生産体の表現型を有する（しかしながら、この株は、スピラマイシンＩのみを生産する（実施例１６を参照））。それゆえに、ＳＰＭ５０１株におけるそれらの間接的な不活性化により、非生産体の表現型がもたらされることから、ｏｒｆ５*遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてスピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。一方で、ｏｒｆ６*遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてスピラマイシンＩの生合成に必須な遺伝子ではない（一方で、これは、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの生産に必須である（実施例１６を参照））。
【０４０３】
実施例１６：得られた突然変異株におけるスピラマイシンI、IIおよびIIIの生産の分析
試験される様々な株をそれぞれ、７個のＭＰ５培地７０ｍｌを含む５００ｍｌのバッフルを有するエルレンマイヤーで培養した（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。エルレンマイヤーに、２．５×１０6個の胞子／ｍｌの様々なＳ．アンボファシエンス株を植え付け、２５０ｒｐｍで回転させて振盪しながら２７℃で７２時間成長させた。同じクローンに対応する培養液をプールし、場合により、ひだ付きフィルターでろ過し、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次に、様々な上清を−３０℃で保存した。
【０４０４】
イオン対高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析を行った。培地のＨＰＬＣ解
析により、３つの形態のスピラマイシンの濃度を正確に決定することことが可能になる。用いられたカラム（マッハライ・ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ））は、ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）のオクチルがグラフトしたシリカ相で充填される。粒子サイズは５μｍ、孔サイズは１００Åである。カラム内径は４．６ｍｍであり、長さは２５ｃｍである。可動相は、６．２５ｇ／ＬのＮａＣｌＯ4過塩素酸塩を含むＨ３ＰＯ４緩衝液（ｐＨ２．２）とアセトニトリルとの７０／３０（ｖ／ｖ）混合物である。解析は、均一系で、流速を１ｍｌ／分に固定して行われる。カラムは２３℃に温度制御される。検出は、２３８ｎｍでのＵＶ分光光度法による。サンプルは＋１０℃で冷却され、ピークの領域から定量化を行った（外部補正により）。これらの条件下で、３つの形態のスピラマイシンを含む市販サンプルを用いて確認できるように、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの保持時間はそれぞれ、約１７、２１および３０分間である。
【０４０５】
ＯＳＣ２株は、スピラマイシン生産体の表現型を有する。これは、切り出し可能なカセットを有する株を得るのに用いられた親株である（実施例１５を参照）。それゆえに、この株を３つの形態のスピラマイシンの生産に関するポジティブコントロールとして用いた。この株は、ＨＰＬＣによって確認されたように、明らかに３つの形態のスピラマイシンを生産する（図１９を参照）。
【０４０６】
切り出し可能なカセットを有する株の研究により、インタラプトされた遺伝子の機能に関して一定の結論を引き出すことが可能になる。ＳＰＭ５０７株は、遺伝子型：ｏｒｆ１２：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。ＳＰＭ５０７株の表現型は、非生産体である（実施例１５を参照）；それゆえに、これから、ｏｒｆ１２遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。この株は、ＨＰＬＣで確認されたように、スピラマイシンを生産しなくなる（図２２を参照）。この結果により、スピラマイシン生合成におけるｏｒｆ１２遺伝子の本質的な性質が確認される。
【０４０７】
ＳＰＭ５０８株は、遺伝子型：ｏｒｆ１３ｃ：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。ＳＰＭ５０８株は、スピラマイシン生産体の表現型を有する（実施例１５を参照）；それゆえに、これから、ｏｒｆ１３ｃ遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子ではないと結論付けることができる。この株は、ＨＰＬＣで確認されたように、スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩを生産する（図２３を参照）。この結果により、ｏｒｆ１３ｃ遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてスピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの生合成に必須な遺伝子ではないことが確認される。
【０４０８】
ＳＰＭ５０９株は、遺伝子型：ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−を有する。ＳＰＭ５０９株の表現型は、非生産体である；それゆえに、これから、ｏｒｆ１４遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。この株は、ＨＰＬＣで確認されたように、スピラマイシンを生産しなくなる（図２４を参照）。この結果により、スピラマイシン生合成におけるｏｒｆ１４遺伝子の本質的な性質が確認される。
【０４０９】
ＳＰＭ５０１株は、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋を有する。この株は、スピラマイシン非生産体の表現型を有する。この株は、ＨＰＬＣで確認されたように、スピラマイシンを生産しなくなる（図２０を参照）。しかしながら、ｏｒｆ５*、および、ｏｒｆ６*遺伝子（図３を参照）は同じ方向を有するため、観察された表現型は、オペロンにおいて、ｏｒｆ６*に導入されたカセットの、ｏｒｆ５*の発現に対する極性作用による可能性がある。これは、これら遺伝子は共転写されることを意味する。この質問に応答するために、ＳＰＭ５０２株を、導入されたカセットの切り出しによって得て、ｏｒ６*遺伝子にフェーズ内の欠失を製造し、ｏｒｆ５*の発現を復元した。この株は、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１を有する（実施例１４および１５を参照）。カセットの切り出しにより、フェーズ内の「ｓｃａｒ」ａｔｔ配列のみが残留する（実施例１４を参照）。ＳＰＭ５０２株は、スピラマイシン生産体の表現型を有する。しかしながら、ＨＰＬＣで証明されたように、この株は、スピラマイシンＩのみを生産し、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない（図２１を参照）。それゆえに、これらの結果から、ＳＰＭ５０１株におけるそれらの間接的な不活性化により、スピラマイシン非生産体の表現型がもたらされることから（図２０を参照）、ｏｒｆ５*遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてスピラマイシン生合成に必須な遺伝子であると結論付けることができる。一方で、この遺伝子の不活性化により、スピラマイシンＩ生産体の表現型がもたらされることから、ｏｒｆ６*遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてスピラマイシンＩの生合成に必須な遺伝子ではない（図２１を参照）。しかしながら、ｏｒｆ６*は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩの生産に必須である（実施例１６を参照））。それゆえに、ｏｒｆ６*遺伝子は、明らかに、３位でのプラテノライドの修飾に関与するアシルトランスフェラーゼをコードする（図１を参照）。
【０４１０】
実施例１７：ｏｒｆ１０の翻訳開始点の決定およびスピラマイシン生産の改善
１７．１．プラスミドｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、および、ｐＳＰＭ５２５の構築：
ｏｒｆ１０遺伝子が、ストレプトマイセス・アンボファシエンスにおいて同定され、Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等（Ｍ．Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ等，１９９２年）によりｓｒｍＲと命名された。ｏｒｆ１０遺伝子の不活性化を行った（実施例８を参照）。それにより、得られた株は、スピラマイシンを生産しなくなることを示すことができた（実施例１５を参照）。これにより、ｏｒｆ１０遺伝子は、明らかにスピラマイシン生合成に関与することが確認される。それゆえに、この遺伝子によってコードされたタンパク質は、明らかに必須であるスピラマイシン生合成に必須である。しかしながら、配列解析は、同じリーディングフレームに存在する２つのＡＴＧコドンを、ｏｒｆ１０の翻訳用いることができることを示す（図２８を参照）。２つの可能なコドンの１つ（最も上流のコドン）は、配列番号１で示される配列の１０６５６位から始まり、一方で、より下流に位置するその他の可能なコドンは、１０８０９位から始まる（配列番号１を参照）。ｓｒｍＲの過剰発現のスピラマイシン生産への可能な作用を試験する前に、まず翻訳開始点を決定することが重要である。
【０４１１】
翻訳開始部位を決定する目的で、３つの形態のｏｒｆ１０を含む３つのコンストラクトを製造した。これらの形態は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位またはＢａｍＨＩ制限部位のいずれかを含むオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって得た。
【０４１２】
増幅に用いられる第一の対は、以下のオリゴヌクレオチドに相当する：
【化６】
2006501863.tif 000045
【０４１３】
プライマー対ＥＤＲ３９−ＥＤＲ４２は、最も端の３’位に位置するＡＴＧ（配列番号１で示される配列の１０８０９位）を含むｏｒｆ１０フラグメントの増幅を可能にする（図２８を参照）。得られたフラグメントのサイズは約２ｋｂであり、続いて、「ショートｏｒｆ１０」と称される；これは、ｏｒｆ１０のプロモーターを含まない。この２ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージーにクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ５２０を得た。
【０４１４】
増幅に用いられる第二の対は、以下のオリゴヌクレオチドに相当する：
【化７】
2006501863.tif 000046
【０４１５】
プライマー対ＥＤＲ４０−ＥＤＲ４２は、最も端の５’位に位置するＡＴＧ（配列番号１で示される配列の１０６５６位）を含むｏｒｆ１０のフラグメントの増幅を可能にする（図２８を参照）。続いて、「ロングｏｒｆ１０」と称されるこの２．２ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージーにクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ５２１を得た；このプラスミドは、ｏｒｆ１０プロモーターを含まない。
【０４１６】
増幅に用いられた第三の対は、以下のオリゴヌクレオチドに相当する：
【化８】
2006501863.tif 000047
【０４１７】
プライマー対ＥＤＲ４１−ＥＤＲ４２は、２つのＡＴＧ、さらにそれ自身のプロモーターを有するｏｒｆ１０遺伝子の増幅を可能にする（図２８を参照）。続いて、「プロｏｒｆ１０」と称されるこの２．８ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージーにクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ５２２を得た。
【０４１８】
「プロｏｒｆ１０」フラグメントは、マトリックスとして、ＯＳＣ２株の染色体ＤＮＡを用いて得られた。「ショートｏｒｆ１０」および「ロングｏｒｆ１０」フラグメントそれ自身は、マトリックスとして予め精製された「プロｏｒｆ１０」フラグメントのＤＮＡを用いて得られた。
【０４１９】
次に、プラスミドｐＳＰＭ５２０、ｐＳＰＭ５２１、および、ｐＳＰＭ５２２のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサートを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ酵素で予備消化したベクターｐＵＷＬ２０１（プラスミドｐＵＷＬ１９９（Ｕ．Ｆ．Ｗｅｈｍｅｉｅｒ，１９９５年）から得られたプラスミドであり、プロモーター（ｅｒｍＥ*プロモーター）強度を増加させる突然変異を有するｅｒｍＥプロモーター領域のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（Ｂｉｂｂ等，１９８５年，特に図２を参照）（Ｂｉｂｂ等，１９９４年）が導入されている（Ｄｏｕｍｉｔｈ等，２０００年を参照））にサブクローニングした。従って、３種のプラスミドを得た：ｐＳＰＭ５２３（インサートとして「ショートｏｒｆ１０」型を含むｐＵＷＬ２０１から得られた）、ｐＳＰＭ５２４（インサートとして「ロングｏｒｆ１０」型を含むｐＵＷＬ２０１から得られた）、および、ｐＳＰＭ５２５（「プロｏｒｆ１０」型を含むｐＵＷＬ２０１から得られた）（図２８）。
【０４２０】
１７．２．コンストラクトｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、および、ｐＳＰＭ５２５でのＯＳ４９．５０株の形質転換：
ＯＳ４９．５０株（ｏｒｆ１０遺伝子にノックアウトを有する株，実施例８を参照）を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、独立して、プラスミドｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、および、ｐＳＰＭ５２５のそれぞれで形質転換した。ネガティブコントロールはまた、インサートを含まないプラスミドｐＵＷＬ２０１でＯＳ４９．５０株を形質転換させることによって製造した。プロトプラスト形質転換の後、クローンを、それらのチオストレプトン耐性について選択した。各プラスミドでのクローンの形質転換を、これらプラスミドの抽出によって確認した。従って、４種の新規の株を得た：ＯＳＣ４９．５０  ｐＵＷＬ２０１株は、インサートを含まないプラスミドｐＵＷＬ２０１での形質転換から得られた；ＯＳＣ４９．５０  ｐＳＰＭ５２３株は、プラスミドｐＳＰＭ５２３での形質転換から得られた；ＯＳＣ４９．５０  ｐＳＰＭ５２４株は、プラスミドｐＳＰＭ５２４での形質転換から得られた；および、最終に、ＯＳ４９．５０  ｐＳＰＭ５２５株は、プラスミドｐＳＰＭ５２５での形質転換から得られた。
【０４２１】
それぞれ４種の株のスピラマイシン生産をＨＰＬＣで試験した。これについて、試験される様々なストレプトマイセス株を、ＭＰ５培地７０ｍｌを含むバッフルを有する５００ｍｌのエルレンマイヤー（バッフルを有するエルレンマイヤー）で培養した（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。株が、プラスミドｐＵＷＬ２０１またはその誘導体のいずれか１つを含む場合、５μｇ／ｍｌのチオストレプトンが添加される。バッフルを有するエルレンマイヤーに、初期濃度２．５×１０6個の胞子／ｍｌで、様々なＳ．アンボファシエンス株を植え付け、培養液を、２７℃で２５０ｒｐｍで回転させて振盪しながら、９６時間インキュベートした。遠心分離で細胞を培地から分離し、上清をＨＰＬＣで解析し（実施例１６を参照）、生産されたスピラマイシン量を決定した。標準サンプルとピークの領域の測定に基づいて、これら株によって生産されたそれぞれのスピラマイシン量を決定することができた。この解析結果を表３９に示すが、データは、ｍｇ／リットル上清で示される。この結果は、スピラマイシンの総生産量に相当する（スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの生産足すことによって得られた）。
【０４２２】
【表３９】
2006501863.tif 000048
【０４２３】
表３９で示される結果で示されるように、ネガティブコントロール（プラスミドｐＵＷＬ２０１で形質転換されたＯＳ４９．５０株）は、スピラマイシンを生産しない。プラスミドｐＳＰＭ５２３（「ショートｏｒｆ１０」型を含む）がＯＳ４９．５０株に導入される場合、スピラマイシン生産は観察されない。一方で、プラスミドｐＳＰＭ５２４（「ロングｏｒｆ１０」型を含む）およびプラスミドｐＳＰＭ５２５（「プロｏｒｆ１０」型を含む）が存在する場合、宿主ＯＳ４９．５０株でスピラマイシン生産が復元される。従って、最も上流のＡＴＧを含むｏｒｆ１０フラグメントのみ、スピラマイシン合成を復元させることが可能である。
【０４２４】
これらの結果を確認するために、プラスミドｐＳＰＭ５２１（「ロングｏｒｆ１０」型を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔイージー）を、ＸｈｏＩ制限酵素で消化した（この酵素は、このプラスミドにおいて２つのＡＴＧの間に位置する特有の部位を有する（図２８を参照））。次に、ＸｈｏＩ末端をクレノー酵素での処理によって平滑末端化した。次に、プラスミドをＴ４  ＤＮＡリガーゼの作用によってそれ自体を閉じ、プラスミドｐＳＰＭ５２７を得た。最も上流のＡＴＧ（配列番号１で示される配列の１０６５６位）が翻訳開始部位として実際に用いられる場合、この処理は、リーディングフレームにおけるＸｈｏＩ部位でのシフトを生じさせ、活性化された活性を示さないタンパク質を製造する作用を有する。一方で、翻訳開始が最も下流のＡＴＧ（配列番号１で示される配列の１０８０９位）で生じる場合、この処理は、ｏｒｆ１０（転写開始点の位置を与える）の発現にわずかな作用しかないか、または作用しないはずであり、生産されたタンパク質に作用がないはずである。
【０４２５】
次に、ｐＳＰＭ５２７のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩインサートを、ベクターｐＵＷＬ２０１にサブクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ５２８を得た。このプラスミドをＯＳ４９．５０株に導入し、望ましいプラスミドを有するクローンがより特定に選択された。次に、得られた株のスピラマイシン生産をＨＰＬＣで試験した（実施例１６および上記を参照）。プラスミドｐＳＰＭ５２４で観察されたものとは異なり（表３９を参照）、ＯＳ４９．５０株におけるプラスミドｐＳＰＭ５２８の存在は、スピラマイシン生産を再構築しない。これにより、ｏｒｆ１０遺伝子の翻訳開始は、最も下流の位置に位置するＡＴＧである（ＡＴＧ１、図２８を参照）ことが確認される。
【０４２６】
１７．３．Ｓ．アンボファシエンスＯＳＣ２株のスピラマイシン生産の改善：
スピラマイシン生産に対するｏｒｆ１０遺伝子の過剰発現の作用を試験するために、プラスミドｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、ｐＳＰＭ５２５、および、ｐＳＰＭ５２８を、ＯＳＣ２株に導入した。このために、ＯＳＣ２株のプロトプラストを、独立して、各プラスミドｐＳＰＭ５２３、ｐＳＰＭ５２４、ｐＳＰＭ５２５、および、ｐＳＰＭ５２８で形質転換した（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）。ネガティブコントロールも、インサートを含まないプラスミドｐＵＷＬ２０１でＯＳＣ２株を形質転換させることによってによって生産した。プロトプラスト形質転換の後、クローンを、それらのチオストレプトン耐性について選択した。このようにして、５つの新規の株を得た：ＯＳＣ２  ｐＵＷＬ２０１株は、インサートを含まないプラスミドｐＵＷＬ２０１での形質転換から得られ、ＯＳＣ２  ｐＳＰＭ５２３株は、プラスミドｐＳＰＭ５２３での形質転換から得られた；ＯＳＣ２  ｐＳＰＭ５２４株は、プラスミドｐＳＰＭ５２４での形質転換から得られた；ＯＳＣ２  ｐＳＰＭ５２５株は、プラスミドｐＳＰＭ５２５での形質転換から得られた；および、最終に、ＯＳＣ２  ｐＳＰＭ５２８株は、プラスミドｐＳＰＭ５２８での形質転換から得られた。次に、これら株のスピラマイシン生産をＨＰＬＣで解析した（実施例１７．２と同じ方法で）。ＯＳＣ２株のスピラマイシン生産の解析も比較のために平行して行った。この解析結果を表４０に示すが、データはｍｇ／リットル上清で示される。結果は、スピラマイシンの総生産量に相当する（スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの生産量を足すことによって得られた）。
【０４２７】
【表４０】
2006501863.tif 000049
【０４２８】
このようにして、プラスミドｐＳＰＭ５２４またはプラスミドｐＳＰＭ５２５の存在が、ＯＳＣ２株のスピラマイシン生産を顕著に増加させることが観察される。これは明らかに、ｏｒｆ１０の過剰発現は、スピラマイシン生産にプラスの作用を有することを示す。一方で、プラスミドｐＳＰＭ５２８は、スピラマイシン生産に作用を有さない。
【０４２９】
同様に、プラスミドｐＳＰＭ５２５およびｐＵＷＬ２０１を、ＳＰＭ５０２株に導入した（実施例１４を参照）。従って、新規の２つの株を得た：ＳＰＭ５０２  ｐＵＷＬ２０１株は、インサートを含まないプラスミドｐＵＷＬ２０１での形質転換から得られた；および、ＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株は、プラスミドｐＳＰＭ５２５での形質転換から得られた。
【０４３０】
ＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株のサンプル（この株はプラスミドｐＳＰＭ５２５を含む，上記を参照）は、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年２月２６日に、登録番号Ｉ−２９７７で寄託した。
【０４３１】
ＳＰＭ５０２  ｐＵＷＬ２０１株、および、ＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株のスピラマイシン生産をＨＰＬＣで解析した（実施例１７．２と同じ方法で）。ＳＰＭ５０２株のスピラマイシン生産の解析も比較のために平行して行った。この解析結果を表４１に示すが、データはｍｇ／リットル上清で示される。結果は、スピラマイシンＩの生産に相当する。実際には、これら株は、スピラマイシンＩＩおよびＩＩＩを生産しない。
【０４３２】
【表４１】
2006501863.tif 000050
【０４３３】
このようにして、ＳＰＭ５０２株におけるｏｒｆ１０遺伝子の過剰発現は、スピラマイシンＩの生産を顕著に増加させることを観察することができた。
【０４３４】
実施例１８：コスミドｐＷＥＤ２における、Ｅ．コリでのストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株のゲノムＤＮＡライブラリーの構築
１８．１．コスミドｐＷＥＤ２の構築：
ストレプトマイセスにおける遺伝子不活性化を容易にするために、プラスミドＲＫ２のｏｒｉＴ配列（接合によって適切なＥ．ｃｏｌｉ株からストレプトマイセスへの導入を可能にする）を有し、さらに、ストレプトマイセスにおいて検出可能な表現型を付与する抗生物質耐性に関する遺伝子を有するコスミドを構築した。このようなストレプトマイセス・アンボファシエンスのゲノムＤＮＡの大きいインサートを含むコスミドは、遺伝子不活性化実験に用いることができる。
【０４３５】
このベクターを構築するために、ｐａｃ−ｏｒｉＴカセット（ＥｃｏＲＶフラグメント）を、コスミドｐＷＥＤ１５（Ｗａｈｌ等，１９８７年）から得られたコスミドｐＷＥＤ１に固有のＨｐａＩ部位に導入した（Ｇｏｕｒｍｅｌｅｎ等，１９９８年）。ｐａｃ−ｏｒｉＴカセットをＰＣＲによって得た。このために、ｐａｃ遺伝子を、以下のプライマーを用いたＰＣＲによってプラスミドｐＶＦ１０．４（Ｖａｒａ等，１９８５年；Ｌａｃａｌｌｅ等，１９８９年）から増幅した；ここで、第一のプライマーは、プライマーＡであり、その配列は、
【化９】
2006501863.tif 000051
であり、ＥｃｏＲＶ制限部位は下線で示され、太字の２０個のヌクレオチド配列は、ｐａｃ遺伝子のプロモーター上流の領域に相当し、および、第二のプライマーは、プライマーＢ（その配列は、
【化１０】
2006501863.tif 000052
であり、これは、その５’末端に、ｏｒｉＴ配列の開始部に相当する１２個のヌクレオチド配列（二重下線で示される）、および、ｐａｃ遺伝子の末端に相当する２０個のヌクレオチド配列（太字で）を含む（図２９の第一のＰＣＲを参照）。
【０４３６】
ｏｒｉＴ遺伝子に関して、プラスミドｐＰＭ８０３（Ｐ．Ｍａｚｏｄｉｅｒ等，１９８９年）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した；ここで、第一のプライマーは、プライマーＣであり、その配列は、
【化１１】
2006501863.tif 000053
であり、これは、その５’末端に、ｐａｃ遺伝子のコーディング配列の下流の配列に相当する１２個のヌクレオチド配列（太字で）、ｏｒｉＴ配列の開始部に相当する２０個のヌ
クレオチド配列を含み、第二のプライマーは、プライマーＤであり、その配列は、
【化１２】
2006501863.tif 000054
であり、これは、ＥｃｏＲＶ制限部位（一本下線で示される）、および、ｏｒｉＴ配列の末端に相当する２０個のヌクレオチド配列（二重下線で示される）を含む（図２９，第二のＰＣＲを参照）。
【０４３７】
プライマーＡとＢで得られた増幅産物、および、プライマーＣとＤで得られた増幅産物は、それらの末端の一方に、２４個のヌクレオチドからなる共通配列を有する。第三のＰＣＲは、得られた２つの増幅産物を予め混合し、プライマーとして、プライマーＡとＤを用いることによって行われた（図２９第三のＰＣＲを参照）。これにより、コンビネーションｐａｃ＋ｏｒｉＴに相当する増幅産物を得ることができた。次に、このｐａｃ−ｏｒｉＴフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（プロメガ社（マディソン，ウィスコンシン州，米国）により市販されている）にクローニングし、これにより、「プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ｐａｃ−ｏｒｉＴ」を得ることを得ることができた。次に、このプラスミドのインサートをコスミドｐＷＥＤ１にサブクローニングした。このために、プラスミドｐＧＥＭ−ｐａｃ−ｏｒｉＴを、ＥｃｏＲＶ酵素で消化し、コンビネーションｐａｃ＋ｏｒｉＴを含むＥｃｏＲＶインサートを、ＨｐａＩ酵素で予め開環したコスミドｐＷＥＤ１に挿入した。このようにして得られたコスミドを、ｐＷＥＤ２と命名した（図３０を参照）。
【０４３８】
このコスミドにより、ストレプトマイセスにおける遺伝子不活性化を容易にすることが可能になる。特に、このコスミドはｏｒｉＴ配列（適切なＥ．コリ株からストレプトマイセスへの接合によってその導入が可能）を有し、さらに、ストレプトマイセスにおいて検出可能な表現型を付与する抗生物質に対する耐性に関する遺伝子を有する。このようなストレプトマイセス・アンボファシエンスのゲノムＤＮＡの大きいインサートを含むコスミドは、遺伝子不活性化実験に用いることができる。
【０４３９】
このようにして、標的遺伝子を含むｐＷＥＤ２から得られたコスミドは、例えば、プラスミドｐＫＯＢＥＧを含むＥ．コリＫＳ２７２株（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年を参照）に導入することもでき、カセットは、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（２０００年）によって説明された技術に従って標的遺伝子へに導入される。次に、この技術によって得られたコスミド（標的遺伝子が不活性化されているコスミド）は、Ｓ１７．１株のようなＥ．コリ株、または、接合によってｏｒｉＴ配列を含むプラスミドをストレプトマイセスにトランスファーさせることができるその他のあらゆる株に導入することもできる。
【０４４０】
Ｅ．コリとストレプトマイセスとの接合の後、実施例２で説明したように、ストレプトマイセスのクローン（標的遺伝子の野生型コピーがインタラプトされたコピーで置換された）を得ることができる。
【０４４１】
この新規のコスミドに存在するストレプトマイセスで発現された耐性遺伝子は、ストレプトマイセス・アルボニガー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒ）のｐａｃ遺伝子（Ｊ．Ｖａｒａ等，１９８５年；Ｌａｃａｌｌｅ等，１９８９年）であり、これは、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードし、ピューロマイシン耐性を付与する。遺伝子不活性化実験において、二重の組換え現象が生じたクローンが検索される。これらクローンは、コスミドｐＷＥＤ２が除去されており、それゆえに、再度ピューロマイシンに対して感受性を有するようになる。
【０４４２】
１８．２．コスミドｐＷＥＤ２での、Ｅ．コリにおけるストレプトマイセス・アンボフ
ァシエンスＯＳＣ２株のゲノムＤＮＡライブラリーの構築
ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株のゲノムＤＮＡを、サイズが約３５〜４５ｋｂのＤＮＡフラグメントが得られるように、一部、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。次に、これらフラグメントを、予めＢａｍＨＩで消化されたコスミドｐＷＥＤ２にクローニングし、続いて、アルカリホスファターゼで処理した。次に、プロメガ社により市販されている「Ｐａｃｋａｇｅｎｅ(R)ラムダＤＮＡパッケージングシステム」（マディソン，ウィスコンシン州，米国）を製造元の説明書に従って用いて、ライゲーション混合物をインビトロでラムダファージ粒子にキャプシド化した。得られたファージ粒子を用いて、Ｅ．コリ株ＳＵＲＥ(R)（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）を感染させた。クローンをＬＢ培地＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）（コスミドｐＷＥＤ２は、アンピシリン耐性を付与する）で選択した。
【０４４３】
実施例１９：スピラマイシンの生合成経路の領域をカバーする新規のライブラリーのコスミドの単離。これらコスミドのフラグメントのサブクローニングおよび配列解析
１９．１．ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２のゲノムライブラリーのコロニー上でのハイブリダイゼーション：
ｏｒｆ１*〜ｏｒｆ１０*、または、ｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃの部分または全部、または、ｏｒｆ２５ｃより上流の領域をカバーするストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２の新規のライブラリーのコスミド（実施例１８を参照）を単離した。このために、実施例１８に従って得られたＥ．コリのコロニー上での連続したハイブリダイゼーションを以下の３種のプローブを用いて行った（図３１を参照）：
−用いられた第一のプローブは、マトリックスとして、コスミドｐＳＰＭ５、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された約０．８ｋｂのＤＮＡフラグメントに相当する：
ＯＲＦ２３ｃ：５’−ＡＣＧＴＧＣＧＣＧＧＴＧＡＧＴＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣ−３’（配列番号１３０）、および、
ＯＲＦ２５ｃ：５’−ＣＴＧＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＴＣＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣ−３’（配列番号１３１）。
【０４４４】
このようにして得られたＰＣＲ産物は、ｏｒｆ２３ｃの開始部、ｏｒｆ２４ｃ（全体）、および、ｏｒｆ２５ｃの末端のフラグメントを含む（図３１，プローブＩを参照）。
【０４４５】
−用いられた第二のプローブは、マトリックスとして、Ｓ．アンボファシエンス株ＡＴＣＣ２３８７７のトータルＤＮＡ、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅された約０．７ｋｂのＤＮＡフラグメントに相当する：
ＯＲＦ１*ｃ：５’−ＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＡＡＣＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１３２）、および、
ＯＲＦ２*ｃ：５’−ＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＧＣＣＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１３３）。
【０４４６】
このようにして得られたＰＣＲ産物は、ｏｒｆ１*ｃ末端、および、ｏｒｆ２*ｃの開始部のフラグメントを含む（図３１，プローブＩＩを参照）。
【０４４７】
−用いられた第三のプローブは、ｏｒｆ１、ｏｒｆ２およびｏｒｆ３を含み、プラスミドｐＯＳ４９．９９の消化によって得られた約３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに相当する（図３１，プローブＩＩＩを参照）。
【０４４８】
実施例１８．２で得られたライブラリーの約２０００種のクローンを、従来技術に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）、コロニーハイブリダイゼーション用フィルターにトランスファーした。
【０４４９】
第一のプローブ（図３１，プローブＩを参照）を、32Ｐで、ランダムプライミング技術（ロシュ社により市販されているキット）により標識し、フィルターへのトランスファーの後、ライブラリーの２０００種のクローンでのハイブリダイゼーションに用いた。６５℃で、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９８４年）によって説明された緩衝液中でハイブリダイゼーションを行った。２回の洗浄を、６５℃で、２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で、１回目は１０分間、および、２回目は２０分間行い、次に、三回目の洗浄を、６５℃で、０．２×ＳＳＣ（０．１％ＳＤＳ）中で３０分間継続した。これらのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、ハイブリダイズした２０００種のうち２０個のクローンが、第一のプローブで強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。これら２０個のクローンを、ＬＢ培地＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で培養し、対応する２０個のコスミドをアルカリ溶解で抽出し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）、次に、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。次に、消化産物をアガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレン上にトランスファーし、上記と同じ条件下で、第一のプローブとハイブリダイズさせた（上記を参照：  ＰＣＲ産物ＯＲＦ２３ｃ−ＯＲＦ２５ｃ，プローブＩ）。１２種のコスミドが、用いられたプローブと強くハイブリダイズしたＢａｍＨＩフラグメントを含んでいた。これら１２種のコスミドは、ｐＳＰＭ３４、ｐＳＰＭ３５、ｐＳＰＭ３６、ｐＳＰＭ３７、ｐＳＰＭ３８、ｐＳＰＭ３９、ｐＳＰＭ４０、ｐＳＰＭ４１、ｐＳＰＭ４２、ｐＳＰＭ４３、ｐＳＰＭ４４、および、ｐＳＰＭ４５と命名した。ＢａｍＨＩでの消化後のこれら１２種のコスミドのプロファイルを互いに比較し、および、コスミドｐＳＰＭ５のプロファイルと比較した。加えて、ｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃの領域においてすでに同定された様々な遺伝子に相当する様々なプライマーを用いたＰＣＲ増幅実験により、これらコスミドのいくつかのインサートを互いに位置付けることができ、さらに、これらインサートのすでにわかっているｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃの領域における位置を決定することができた（図３２を参照）。コスミドｐＳＰＭ３６は、ｏｒｆ２５ｃ上流の大きい領域を含む可能性があるため、より特定に選択した（図３１および３２を参照）。
【０４５０】
次に、上述の通りの同じ条件を用いて、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２のライブラリーの２０００種のクローンを、ＰＣＲ産物に相当する第二のプローブとハイブリダイズさせた：ＯＲＦ１*ｃ−ＯＲＦ２*ｃ（図３１，プローブＩＩを参照）。このハイブリダイゼーションにより、そのインサートがｏｒｆ１*ｃ〜ｏｒｆ１０*ｃの領域に位置するコスミドを単離することができた。用いられたハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズした２０００種のなかでも１６種のクローンが、この第二のプローブで強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。これら１６種のクローンを、ＬＢ培地＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で培養し、対応する１６種のコスミドを、アルカリ溶解で抽出し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）、次に、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。これら１６種のコスミドの消化プロファイル（ＢａｍＨＩでの消化の後）を、互いに、および、コスミドｐＳＰＭ７のプロファイルと比較した。プライマー  ＯＲＦ１*ｃとＯＲＦ２*ｃを用いたＰＣＲ増幅実験により、明らかにｏｒｆ１*ｃ、および、ｏｒｆ２*ｃ遺伝子を含み、そのプロファイルは共通のバンドを有するが異なるバンド有する２種のコスミドを選択することができた。加えて、領域ｏｒｆ１*ｃ〜ｏｒｆ１０*ｃにおける、すでに同定された様々な遺伝子に相当する様々なプライマーを用いたその他のＰＣＲ増幅実験により、これらコスミドのインサートを互いに位置付けることができ、および、すでにわかっている領域ｏｒｆ１*ｃ〜ｏｒｆ１０*ｃにおけるこれらインサートの位置も決定することができた（図３２を参照）。より特定に選択された２種のコスミドを、ｐＳＰＭ４７、および、ｐＳＰＭ４８と命名した（図３２を参照）。
【０４５１】
上述の条件と同じ条件を用いて、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２のライブラリーの２０００種のクローンも、プラスミドｐＯＳ４９．９９のＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメント（図３１，プローブＩＩＩを参照）に相当する第三のプローブとハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションにより、ｏｒｆ１〜ｏｒｆ３の領域を含み、ＰＫＳ遺伝子の大きい部分、または、スピラマイシンの生合成経路の遺伝子ｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃの大きい部分のいずれかを含む可能性があるコスミドを単離することができた。これらハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズした２０００種のなかでも３５種のクローンが、第三のプローブで強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。これら３５種のクローンを、ＬＢ培地＋アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）で培養し、対応する３５種のコスミドを、アルカリ溶解で抽出し（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年）、次に、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。これら３５種のコスミドをＢａｍＨＩで消化した後のプロファイルを、互いに、および、コスミドｐＳＰＭ５のプロファイルと比較した。加えて、領域ｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃにおけるすでに同定された様々な遺伝子に相当する様々なプライマーを用いたＰＣＲ増幅実験により、これらコスミドは、明らかに、領域ｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃにより得られたインサートを含むことを確認することができ、および、これらコスミドのインサートを、互いに、および、すでにわかっている領域ｏｒｆ１〜ｏｒｆ２５ｃに関して位置付けることができた（図３２を参照）。５種のコスミドをより特定に選択し、それらを、ｐＳＰＭ５０、ｐＳＰＭ５１、ｐＳＰＭ５３、ｐＳＰＭ５５、および、ｐＳＰＭ５６と命名した（図３２を参照）。
【０４５２】
１９．２．コスミドｐＳＰＭ３６のインサートの部分のサブクローニングおよび配列解析
プライマーＯＲＦ２３ｃとＯＲＦ２５ｃを用いたＰＣＲによって得られた約０．８ｋｂのプローブ（上記および図３１，プローブＩを参照）も、ＰｓｔＩ酵素で消化したＳ．アンボファシエンスＯＳＣ２のトータルＤＮＡに対するサザンブロッティング実験に用いられた。上述のハイブリダイゼーション条件下で、このプローブにより、ＰｓｔＩ酵素で消化したＳ．アンボファシエンスＯＳＣ２のトータルＤＮＡでハイブリダイズさせると、約６ｋｂの単一のＰｓｔＩフラグメントが明らかになった。ＰｓｔＩ部位は、ｏｒｆ２３ｃの領域に存在するが（配列番号８０を参照）、その他のＰｓｔＩ部位は、既知の配列の末端（ＢａｍＨＩ部位）までに存在しない（配列番号１を参照）。このＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントは、サイズが約１．４ｋｂである。６ｋｂのＰｓｔＩフラグメントは、ＰｓｔＩ酵素で消化したＳ．アンボファシエンスのトータルＤＮＡでハイブリダイズし、それゆえに、これは、ｏｒｆ２５ｃの上流に位置する約４．６ｋｂの領域を含む。この領域は、産物がスピラマイシンの生合成経路に関与するその他の遺伝子を含む可能性がある。消化によって、コスミドｐＳＰＭ３６は、実際に、この６ｋｂのＰｓｔＩフラグメントを含むことが確認された。ｏｒｆ２５ｃのさらに上流の配列を決定するために、このフラグメントを、ｐＳＰＭ３６から単離した。このために、コスミドｐＳＰＭ３６を、ＰｓｔＩ制限酵素で消化した。ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメント（サイズが約６ｋｂ）を、０．８％アガロースゲルからのエレクトロエルーションによって単離し、次に、ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（４５１２ｂｐ）（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ５８と命名し（図３３を参照）、そのインサートの配列を決定した。このインサートの配列を配列番号１３４に示す。しかしながら、決定された配列は全てではなく、約４５０個のヌクレオチドからなるキャップが残留し、決定されていない配列の部分は、対応する配列において連続した「Ｎ」で示した。
【０４５３】
１９．３．新規のヌクレオチド配列の解析、オープンリーディングフレームの決定、および、スピラマイシン生合成に関与する遺伝子の特徴付け
得られたコスミドｐＳＰＭ５８のインサートの配列を、ＦｌａｍｅＰｌｏｔプログラム（Ｊ．ＩｓｈｉｋａｗａおよびＫ．Ｈｏｔｔａ，１９９９年）を用いて解析した。これにより、オープンリーディングフレームのなかから、ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示すオープンリーディングフレームを同定することができた。この解析により、
このインサートは、ｏｒｆ２５ｃの上流に４種の新規のＯＲＦを含むことを決定することができた（図３４を参照）。これら遺伝子を、ｏｒｆ２６（配列番号１０７）、ｏｒｆ２７（配列番号１０９）、ｏｒｆ２８ｃ（配列番号１１１、ｐＳＰＭ５８のインサートの配列解析において、約４５０個のヌクレオチドからなるギャップが残るため、このｏｒｆの配列は、完全に決定されておらず、これら４５０個のヌクレオチドは、配列番号１１１の配列において連続した「Ｎ」の形態で示す）、および、ｏｒｆ２９（後者のｏｒｆの配列は、このインサートにおいて不完全である）と命名した。遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、問題のＯＲＦに関して、コーディング配列が逆方向であることを意味する（図３４を参照）。
【０４５４】
様々なプログラムを用いて、これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列を、様々なデータベースに存在するタンパク質配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ（これら２種のプログラムは、特に、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ベセスダ，メリーランド州，米国）から入手可能である）、ＦＡＳＴＡ（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）（このプログラムは、特に、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能である）。これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のあるものを同定することができた。
【０４５５】
１９．４．コスミドｐＳＰＭ３６のインサートのその他の部分のサブクローニングおよび配列解析
プライマーＯＲＦ２３ｃとＯＲＦ２５ｃを用いたＰＣＲによって得られた約０．８ｋｂのプローブ（上記および図３１，プローブＩを参照）も、ＳｔｕＩ酵素で消化したＯＳＣ２株のトータルＤＮＡでのサザンブロッティング実験に用いられた。上述のこのプローブに関するハイブリダイゼーション条件下で、このプローブにより、ＳｔｕＩ酵素で消化したＯＳＣ２株のトータルＤＮＡでハイブリダイズさせたら、約１０ｋｂの単一のＳｔｕＩフラグメントが明らかになった。ｏｒｆ２３ｃにおけるＳｔｕＩ部位の存在（配列番号８０を参照）、および、これ部位のＰｓｔＩ部位に対する位置を考慮すると、この１０ｋｂのフラグメントは、これまでに研究された全てのＰｓｔＩフラグメント（ｐＳＰＭ５８のインサート）を含み、まだ研究されていない約４ｋｂの領域を入手することができた（図３３を参照）。消化によって、コスミドｐＳＰＭ３６は、実際に、この１０ｋｂのＳｔｕＩフラグメントを含むことが確認された。ｏｒｆ２９の末端の配列、および、ｏｒｆ２９のさらに上流のその他の遺伝子の配列を決定するために、このフラグメントをコスミドｐＳＰＭ３６から単離した。このために、コスミドｐＳＰＭ３６を、ＳｔｕＩ制限酵素で消化した。サイズが約１０ｋｂのＳｔｕＩ−ＳｔｕＩフラグメントを、０．８％アガロースゲルからのエレクトロエルーションによって単離し、次に、ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（４５１２ｂｐ）（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ７２と命名した（図３３を参照）。次に、後者をＥｃｏＲＩ（ｐＳＰＭ５８のインサートにおけるＥｃｏＲＩ部位）およびＨｉｎｄＩＩＩ（ベクターのマルチクローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩ部位，インサートの末端のＳｔｕＩ部位の直後）で消化した（図３３を参照）。このようにして得られたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＳＰＭ７２のインサートのフラグメントに相当し（図３３を参照）、これを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ予めで消化されたベクターｐＢＣ−ＳＫ＋（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）にサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ７３と命名し、そのインサートの配列を決定した。このインサートの配列を、配列番号１３５に示す。
【０４５６】
ｐＳＰＭ５８、および、ｐＳＰＭ７３のインサートの配列のアセンブリを、配列番号１０６に示す。この配列は、ｏｒｆ２３ｃにおけるＰｓｔＩ部位（配列番号８０を参照）から始まり、ｏｒｆ３２ｃにおけるＳｔｕＩ部位（図３４を参照）に続く。ｏｒｆ２８ｃの配列（配列番号１１１）は完全ではないため（実施例１９．３を参照）、約４５０個のヌクレオチドの領域は、配列解析されておらず、これら４５０個のヌクレオチドは、配列番号１０６の配列において連続した「Ｎ」の形態で示される。
【０４５７】
１９．５．新規のヌクレオチド配列の解析、オープンリーディングフレームの決定、および、スピラマイシン生合成に関与する遺伝子の特徴付け
得られたコスミドｐＳＰＭ７３のインサートの部分配列を、ＦｌａｍｅＰｌｏｔプログラム（Ｊ．ＩｓｈｉｋａｗａおよびＫ．Ｈｏｔｔａ，１９９９年）を用いて解析した。これにより、オープンリーディングフレームのなかから、ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示すオープンリーディングフレームを同定することができた。この解析により、このインサートは、４種のＯＲＦを含み、１つは不完全であり、３つは完全であることを決定することができた（図３４を参照）。不完全なＯＲＦは、ｏｒｆ２９のコーディング配列の３’部分に相当し、これにより、プラスミドｐＳＰＭ５８のインサートの配列解析の際に得られたこの同じｏｒｆの部分配列に基づいて（実施例１９．２および１９．３を参照）、この遺伝子の配列を完成させることができた；このようにして、２つの配列のコンビネーションにより、ｏｒｆ２９の完全配列を得ることができた。このようにして、４種の遺伝子を、ｏｒｆ２９（配列番号１１３）、ｏｒｆ３０ｃ（配列番号１１５）、ｏｒｆ３１（配列番号１１８）、および、ｏｒｆ３２ｃ（配列番号〜１２０）と命名した。遺伝子の名前に付記された「ｃ」は、問題のＯＲＦに関して、コーディング配列が逆方向であることを意味する（図３４を参照）。
【０４５８】
これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列（ｏｒｆ２９については配列番号１１４、ｏｒｆ３０ｃについては配列番号１１６および１１７、ｏｒｆ３１については配列番号１１９、および、ｏｒｆ３２ｃについては配列番号１２１）を、以下の様々なプログラムを用いて様々なデータベースに存在する配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ（これら２種のプログラムは、特に、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ベセスダ，メリーランド州，米国）から入手可能である）、ＰＡＳＴＡ（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９０年）（このプログラムは、特に、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能である）。これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のあるものを同定することができた。
【０４５９】
１９．６．コスミドｐＳＰＭ３６のインサートの第三の部分のサブクローニングおよび配列解析
ｏｒｆ３２ｃ内部の配列に相当するプローブ（０．８ｋｂのＤＮＡフラグメント）を、マトリックスとしてストレプトマイセス・アンボファシエンス株のトータルＤＮＡ、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって得た：
ＫＦ３６：５’−ＴＴＧＣＣＧＴＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＧ−３’（配列番号１５１）、および、
ＫＦ３７：５’−ＣＡＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧ−３’（配列番号１５２）。
【０４６０】
このようにして得られたＰＣＲ産物は、ｏｒｆ３２ｃの内部配列を示す。このプローブを、ＯＳＣ２株の染色体ＤＮＡ、および、ＰｓｔＩ酵素で消化したコスミドｐＳＰＭ３６のＤＮＡでのサザンブロッティング実験に用いた。上述した条件と同じハイブリダイゼー
ション条件を用いて（実施例１９．１を参照）、このプローブにより、ＯＳＣ２株のトータルＤＮＡ、および、ＰｓｔＩ酵素で消化したコスミドｐＳＰＭ３６のＤＮＡにハイブリダイズさせたら、約３．４ｋｂと２．５ｋｂの２つのＰｓｔＩフラグメントが明らかになった。用いられたプローブにおけるＰｓｔＩ部位の存在を考慮すると、これらの結果を説明することができる。サイズが約３．４ｋｂの第一のＤＮＡフラグメントは、配列がすでに完全にわかっているフラグメントである。２．５ｋｂのフラグメントの配列は、７００ｂｐの領域にわたって部分的にしかわかっていない。このフラグメントを、ｏｒｆ３２ｃの末端の配列、および、後者の上流にあるその他の遺伝子の配列を決定するために、コスミドｐＳＰＭ３６から単離した。このために、コスミドｐＳＰＭ３６を、ＰｓｔＩ制限酵素で消化した。サイズが約２．５ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントを、０．８％アガロースゲルからの精製によって単離し、次に、ベクターｐＢＫ−ＣＭＶ（４５１８ｂｐ）（ストラタジーン社（ラホヤ，カリフォルニア州，米国）により市販されている）にクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ７９と命名し（図４１を参照）、そのインサートの配列を決定した。
【０４６１】
ｏｒｆ２８ｃの配列（配列番号１１１）は、完全ではなかった（実施例１９．３を参照）。特に、約４５０個のヌクレオチドの領域を決定することはできず、これら４５０個のヌクレオチドは、配列番号１０６の配列において連続した「Ｎ」の形態で示される。失われた領域全体の配列を、この領域を再配列解析することによって決定した。それゆえに、ｐＳＰＭ５８、および、ｐＳＰＭ７３のインサートの配列全体が決定された。ｏｒｆ２８ｃのコーディング部分の完全配列を、配列番号１４１に示し、この配列から推測されたタンパク質を配列番号１４２に示す。プラスミドｐＳＰＭ７９のインサートの配列を、配列番号１６１に示す。
【０４６２】
ｐＳＰＭ５８、ｐＳＰＭ７３、および、ｐＳＰＭ７９のインサートの配列のアセンブリを、配列番号１４０に示す（図４１を参照）。この配列は、ｏｒｆ２３ｃにおけるＰｓｔＩ部位（配列番号８０を参照）から始まり、ｏｒｆ３４ｃにおけるＰｓｔＩ部位まで続く（図４１を参照）。
【０４６３】
１９．７．新規のヌクレオチド配列の解析、オープンリーディングフレームの決定、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のある遺伝子の特徴付け
得られたプラスミドｐＳＰＭ７９のインサートの配列を、ＦｌａｍｅＰｌｏｔプログラム（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ＪおよびＨｏｔｔａ  Ｋ．１９９９年）を用いて解析した。これにより、オープンリーディングフレームのなかから、ストレプトマイセスに典型的なコドンの使用を示すオープンリーディングフレームを同定することができた。この解析により、このインサートは、３種のＯＲＦを含み、２種は不完全であり（ｏｒｆ３２ｃ、および、ｏｒｆ３４ｃ）、１種は完全である（ｏｒｆ３３）ことを決定することができた（図４１を参照）。
【０４６４】
第一の不完全なＯＲＦは、ｏｒｆ３２ｃのコーディング配列の５’部分に相当する。これにより、この遺伝子の配列を、プラスミドｐＳＰＭ７３のインサートの配列解析の際に得られたこの同じｏｒｆの部分配列に基づいて（実施例１９．４および１９．５を参照）完成させることができ、このようにして、２つの配列のコンビネーションにより、ｏｒｆ３２ｃの完全配列を得ることができた（配列番号１４５）。遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、問題のＯＲＦに関して、コーディング配列が逆方向であることを意味する（図４１を参照）。完全なｏｒｆを、ｏｒｆ３３と命名した（配列番号１４７）。第三のＯＲＦを、ｏｒｆ３４ｃと命名した（配列番号１４９）。遺伝子の名称に付記された「ｃ」は、問題のＯＲＦに関して、コーディング配列が逆方向であることを意味する（図３７を参照）。このｏｒｆの産物とデータバンクとの間で行われた比較により、このタンパク質のＣ末端部分は、そのヌクレオチド配列から推測された産物ではなく、それゆえに、このｏｒｆは、より長く、配列解析された領域を越えて継続していることが示される。
【０４６５】
様々なプログラムを用いて、これらオープンリーディングフレームから推測されたタンパク質配列を、様々なデータベースに存在するタンパク質配列と比較した：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）、ＣＤ−サーチ（これら２種のプログラムは、特に、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ベセスダ，メリーランド州，米国）から入手可能である）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．およびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、および、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．，１９９０年）（このプログラムは、特に、ＩＮＦＯＢＩＯＧＥＮリソースセンター（エヴリー，フランス）から入手可能である）。これらの比較により、これら遺伝子の産物の機能に関する仮説をまとめること、および、スピラマイシン生合成に関与する可能性のある遺伝子を同定することが可能になった。
【０４６６】
実施例２０：スピラマイシン生合成の中間体の生産の解析：
２０．１．サンプルの製造：
試験される様々な株をそれぞれ、７個のＭＰ５培地７０ｍｌを含む５００ｍｌのバッフルを有するエルレンマイヤーで培養した（Ｐｅｒｎｏｄｅｔ等，１９９３年）。エルレンマイヤーに、２．５×１０6個の胞子／ｍｌの様々なＳ．アンボファシエンス株を植え付け、２５０ｒｐｍで回転させて振盪しながら２７℃で９６時間成長させた。同じクローンに対応する培養液をプールし、場合により、ひだ付きフィルターでろ過し、７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
【０４６７】
次に、培養液のｐＨを水酸化ナトリウムで９に調節し、上清をメチルイソブチリルケトン（ＭＩＢＫ）で抽出した。次に、有機相（ＭＩＢＫ）を回収し、蒸発させた。次に、乾燥抽出物をアセトニトリル１ｍｌに吸収させ、次に、液体クロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ）解析に用いる前に、１／１０（１００μｌ適量を水で１ｍｌに）に希釈した。
【０４６８】
２０．２．LC／MSによるサンプルの解析：
試験しようとする株により合成された様々な産物の質量を決定するために、サンプルをＬＣ／ＭＳで解析した。
【０４６９】
用いられた高速液体クロマトグラフィーカラムは、クロマシル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ）Ｃ８  １５０* ４．６ｍｍｍ，５ｍｍｍ，１００Åカラムである。
【０４７０】
移動相は、アセトニトリルと０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液との混合物からなる濃度勾配であり、流速は１ｍｌ／分に固定される。カラムオーブンの温度は３０℃に維持される。
【０４７１】
カラム出口でのＵＶ検出を、２つの異なる波長：２３８ｎｍ、および、２８０ｎｍで行った。
【０４７２】
クロマトグラフィーカラムに連結されたマススペクトロメーターは、アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ）により市販されているシングル四重極装置（コーン電圧が３０Ｖおよび７０Ｖ）である。
【０４７３】
２０．３．ＯＳ４９．６７株によって生産された生合成中間体の解析：
ｏｒｆ３遺伝子がフェーズ内の欠失によって不活性化されたＯＳ４９．６７株は、スピラマイシンを生産しない（実施例６および１５を参照）。
【０４７４】
サンプルを、上述の方法（段落２０．１を参照）に従って製造し、上述した通りにＬＣ／ＭＳで解析した（段落２０．２を参照）。
【０４７５】
より特定には、クロマトグラフィーによる解析は、移動相として、時間Ｔ＝０〜５分は２０％アセトニトリル、次に、Ｔ＝３５分間で直線的に３０％に増加させ、続いてＴ＝５０分間までプラトー状態にすることによる溶媒の勾配で行った。
【０４７６】
これら条件下で、より特定には２種の産物、すなわち２３８ｍｎでの吸収（保持時間３３．４分）、および、２８０ｎｍでの吸収（保持時間４４．８分）（図３５を参照）が観察された。図３５は、２３８および２８０ｎｍで生産されたＨＰＬＣクロマトグラムの並置（上部）、さらに、３３．４分間と４４．８分間で溶出した分子のＵＶスペクトル（下部）を示す。
【０４７７】
連結されたマススペクトロメトリーの解析条件は以下の通りであった：スキャニングは、１００〜１０００Ｄａの質量範囲をカバーするスキャンモードで行われた。エレクトロマルチプライヤーのゲインを１Ｖとした。エレクトロスプレー源に関して、噴霧ガスの圧力は３５ｐｓｉｇ、乾燥ガスの流速は１２．０ｌ／分、乾燥ガスの温度は３５０℃、および、キャピラリー電圧はに＋／−３０００Ｖにした。これら実験により、分離された２つの産物の質量を決定することができた。これら質量はそれぞれ、最初に溶出した産物については３７０ｇ／モル（［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+＝３５３の主要な産物）、および、第二の産物については３６８ｇ／モル（［Ｍ−Ｈ2Ｏ］+＝３５１の主要な産物）であった。
【０４７８】
構造を得るために、上述の産物を、以下の条件下で単離および精製した：移動相は、０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液とアセトニトリルの７０／３０（ｖ／ｖ）混合物である。クロマトグラフィーは、固定流速１ｍｌ／分で、均一系で行われる。これら条件下で、２つの産物の保持時間はそれぞれ、８、および、１３．３分間である。加えて、この場合、製造されたサンプル（段落２０．１を参照）はに水で希釈しないで１０μｌを注入する。
【０４７９】
２つの産物は、クロマトグラム用カラムの出口で回収され、以下の条件下で単離される：オアシス（Ｏａｓｉｓ）ＨＬＢの１ｃｃ３０ｍｇのカートリッジ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））は、アセトニトリル１ｍｌ、次に、水／アセトニトリル（２０ｖ／８０ｖ）１ｍｌ、および、８０／２０の水／アセトニトリル１ｍｌで連続的に調節される。次に、サンプルを導入し、水／アセトニトリル（９５／５）１ｍｌ、および、水／重水素化アセトニトリル（９５／５）１ｍｌで連続してカートリッジを洗浄し、次に、４０／６０の水／重水素化アセトニトリル６００μｌで溶出する。次に、回収した溶液は、ＮＭＲで直接解析する。
【０４８０】
これら２つの化合物について得られたＮＭＲスペクトルは、以下の通りである：
−溶出した第一の産物：プラテノライドＡ：（スペクトル９６４６Ｖ）、ＣＤ３ＣＮにおける１Ｈスペクトル（化学シフト；ｐｐｍ）：0.90 (3H, t, J=6Hz), 0.93 (3H, d, J=5Hz), 1.27 (3H, d, J=5Hz), 1.27-1.40 (3H, m), 1.51 (1H, m), 1.95 (1H, m), 2.12 (1H, m), 2.30 (1H, d, J=12Hz), 2.50 (1H, d, J=11Hz), 2.58 (1H, dd, J=9 および 12 Hz), 2.96 (1H, d, J=7Hz), 3.43 (3H, s), 3.70 (1H, d, J=9Hz), 3.86 (1H, d, J=7Hz), 4.10 (1H, m), 5.08 (1H, m), 5.58 (1H, dt, J=3 および 12Hz), 5.70 (1H, dd, J=8 および 12 Hz), 6.05 (1H, dd, J=9 および 12 Hz), 6.24 (1H, dd, J=9 および 12Hz)。
【０４８１】
−溶出した第二の産物：プラテノライドＢ：（スペクトル９６４７Ｖ）、ＣＤ３ＣＮにおける１Ｈスペクトル（化学シフト；ｐｐｍ）：0.81 (3H, t, J=6Hz), 0.89 (1H, m), 1.17 (3H, d, J=5Hz), 1.30 (4H, m), 1.47 (2H, m), 1.61 (1H, t, J=10Hz), 2.20 (1H, m), 2.38 (1H, d, J=13Hz), 2.52 (1H, m), 2.58 (1H, m), 2.68 (1H, dd, J=8 および 13Hz), 3.10 (1H, d, J=7Hz), 3.50 (3H, s), 3.61 (1H, d, J=8Hz), 3.82 (1H, d, J=7Hz), 5.09 (1H, m), 6,20 (1H, m), 6.25 (1H, dd, J=9 および 12 Hz), 6.58 (1H, d, J=12 Hz), 7.19 (1H, dd, J=9 および 12Hz)。
【０４８２】
このようにして、これら実験により、これら２つの化合物の構造を決定することができた。溶出した第一の産物は、プラテノライドＡであり、第二の産物は、プラテノライドＢである；推測されたこれら２つの分子の構造を、図３６に示す。
【０４８３】
また、ＮＭＲとあわせてＬＣ／ＭＳ技術を上述の条件とはわずかに異なる条件下で（ただしその設定は当業者周知である）用いて、ＯＳ４９．６７株は、プラテノライドＡおよ
びＢに加えて、これら２つの化合物の誘導体を生産することも決定することもできた。それらは、プラテノライドＡ＋マイカロース、および、プラテノライドＢ＋マイカロースである（これら２つの化合物の構造を図４０に示す）。ＯＳ４９．６７株の培養液の解析結果を表４２に示す。
【０４８４】
【表４２】
2006501863.tif 000055
【０４８５】
２０．４．ＳＰＭ５０９株によって生産された生合成中間体の解析：
ｏｒｆ１４遺伝子が不活性化されているＳＰＭ５０９株（ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−）は、スピラマイシンを生産しない（実施例１３，１５および１６を参照）。サンプルを、上述の方法（段落２０．１を参照）に従って製造し、上述した通りにＬＣ／ＭＳで解析した（段落２０．２および２０．３を参照）。ＭＰ５培地で培養されたＳＰＭ５０９株の培養上清に存在する生合成中間体の解析により、この株は、プラテノライドのＢ型（「プラテノライドＢ」，図３６を参照）のみ生産し、Ａ型（「プラテノライドＡ」，図３６を参照）は生産しなかったことが示された。
【０４８６】
実施例２１：ｏｒｆ３遺伝子にノックアウトを有する株（ＯＳ４９．６７）のｏｒｆ１４遺伝子のインタラプト
ｏｒｆ１４遺伝子産物は、スピラマイシン生合成に必須である（実施例１３、１５および１６を参照：ＳＰＭ５０９株、この遺伝子は、インタラプトされて、スピラマイシンを生産しなくなっている）。ＭＰ５培地で培養されたＳＰＭ５０９株の培養上清に存在する生合成中間体の解析により、この株は、プラテノライドのＢ型のみを生産し、Ａ型は生産しないことが示された（実施例２０を参照）。この観察結果を説明できる仮説の一つは、ｏｒｆ１４の産物は、プラテノライドのＢ型を酵素的な還元工程によってＡ型にする変換に関与するということである。この仮説を試験するために、スピラマイシンを生産しなくなったが、プラテノライドのＡ型とＢ型を生産する突然変異体でｏｒｆ１４遺伝子を不活
性化した。これは、フェーズ内の欠失によってｏｒｆ３遺伝子が不活性化されたＯＳ４９．６７株（Δｏｒｆ３）の場合である（実施例６および２０を参照）。この株でｏｒｆ１４遺伝子を不活性するために、ＯＳ４９．６７株のプロトプラスト形質転換によってプラスミドｐＳＰＭ５０９を導入した（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）。ｏｒｆ１４遺伝子の不活性化は、ＯＳＣ２株の場合ですでに説明されている（実施例１３を参照）、および、ｏｒｆ１４遺伝子の不活性化についてもＯＳ４９．６７株に同じ手法を行った。プラスミドｐＳＰＭ５０９で形質転換した後、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、アプラマイシン含有培地、および、ハイグロマイシン含有培地それぞれで二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）、および、ハイグロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＨｙｇＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ｏｒｆ１４遺伝子が、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたｏｒｆ１４のコピーで置換されたクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ１４の野生型コピーの、カセットでインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットに対応するプローブとハイブリダイズさせ、遺伝子置換が実際に生じたことを確認した。遺伝子型の確認はまた、当業者既知のあらゆる方法によって行うこともでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって行うこともできる。
【０４８７】
予想された特徴を示すクローン（Δｏｒｆ３、ｏｒｆ１４：：ａｔｔ３Ωａａｃ−）をより特定して選択し、ＳＰＭ５１０と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションに基づいて、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおける野生型ｏｒｆ１４遺伝子の、ａｔｔ３Ωａａｃ−カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られることを確かめることができた。
【０４８８】
実施例２２：ｏｒｆ１４遺伝子のインタラプトの機能的な相補性：
２２．１．プラスミドｐＳＰＭ５１９の構築：
ｏｒｆ１４遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチド対：
【化１３】
2006501863.tif 000056
ならびに、マトリックスとして、ＯＳＣ２株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲによって増幅した。オリゴヌクレオチドＥＤＲ３１およびＥＤＲ３７はそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を有する（太字の配列）。このようにして得られた１．２ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（プロメガ社（マディソン，ウィスコンシン州，米国）により市販されている）にクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ５１５を得た。次に、このプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化した。得られた１．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩインサートを、同じ酵素で予めで消化されたベクターｐＵＷＬ２０１にクローニングした（実施例１７．１を参照）。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ５１９と命名した。
【０４８９】
２２．１．ＳＰＭ５０９およびＳＰＭ５１０株の、プラスミドｐＳＰＭ５１９での形質転換：
プラスミドｐＳＰＭ５１９を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ＳＰＭ５０９株（実施例１３を参照）およびＳＰＭ５１０株（実施例１７を参照）に導入した。形質転換の後、クローンを、それらのチオストレプトン耐性について選択した。次に、クローンをチオストレプトン含有培地で二次培養した。
【０４９０】
ＳＰＭ５０９株は、スピラマイシン非生産体株である（実施例１３、１５および１６ならびに図２４を参照）。ベクターｐＳＰＭ５１９で形質転換されたＳＰＭ５０９株のスピラマイシン生産（ＳＰＭ５０９  ｐＳＰＭ５１９という株）を、この株をＭＰ５培地でチオストレプトンの存在下で培養することによって解析した。次に、培養上清をＨＰＬＣで解析した（実施例１６および１７を参照）。この解析結果を表４３に示すが、データはｍｇ／リットル上清で示される。結果は、スピラマイシンの総生産量に相当する（スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの生産量を足すことによって得られた）。ＳＰＭ５０９株におけるベクターｐＳＰＭ５１９の存在により、スピラマイシン生産が復元されることが観察された（表４３を参照）。
【０４９１】
【表４３】
2006501863.tif 000057
【０４９２】
プラスミドｐＳＰＭ５１９で形質転換された株ＳＰＭ５１０を、ＳＰＭ５１０  ｐＳＰＭ５０９と命名した。
【０４９３】
実施例２３：Ｓ．フラジアエのｔｙｌＢ遺伝子によるｏｒｆ３遺伝子のインタラプトの機能的な相補性
２３．１．プラスミドｐＯＳ４９．５２の構築：
プラスミドｐＯＳ４９．５２は、Ｓ．アンボファシエンスにおいてＴｙｌＢタンパク質の発現が可能なプラスミドに相当する。これを構築するために、Ｓ．フラジアエのｔｙｌＢ遺伝子のコーディング配列（Ｍｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９４年，ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｕ０８２２３（領域の配列）、ＳＦＵ０８２２３（ＤＮＡ配列）およびＡＡＡ２１３４２（タンパク質配列））を、プラスミドｐＫＣ１２１８に導入した（Ｂｉｅｒｍａｎ等，１９９２，Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年，このプラスミドを含むＥ．コリ株は、特に、ＡＲＳ（ＮＲＲＬ）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ペオリア，イリノイ州，米国）から、番号Ｂ−１４７９０で入手可能である）。加えて、このコーディング配列を、ｅｒｍＥ*プロモーター（上記、特に実施例１７．１，Ｂｉｂｂ等，１９８５年，Ｂｉｂｂ等，１９９４年を参照）の制御下に置いた。
【０４９４】
２３．１．ＯＳ４９．６７株の、プラスミドｐＯＳ４９．５２での形質転換：
ｏｒｆ３遺伝子が、フェーズ内の欠失により不活性化されたＯＳ４９．６７株は、スピラマイシンを生産しない（実施例６および１５を参照）。プラスミドｐＯＳ４９．５２を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ＯＳ４９．６７株に導入した。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシン耐性について選択した。次に、クローンをアプラマイシンを含む培地で二次培養した。クローンをより特定して選択し、ＯＳ４９．６７  ｐＯＳ４９．５２と命名した。
【０４９５】
上記で実証したように、ＯＳ４９．６７株は、スピラマイシンを生産しない（実施例６および１５を参照）。ベクターｐＯＳ４９．５２で形質転換されたＯＳ４９．６７株のスピラマイシン生産を、実施例１５で説明された技術によって解析した。このようにして、この株は、スピラマイシン生産体の表現型を有することを実証することができた。従って
、ＴｙｌＢタンパク質は、ｏｒｆ１遺伝子のインタラプトの機能的な相補性を可能にする。
【０４９６】
実施例２４：ｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現によるスピラマイシン生産の改善
２４．１．プラスミドｐＳＰＭ７５の構築：
ｏｒｆ２８ｃ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位またはＢａｍＨＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチド対を用いたＰＣＲによって増幅した。これらプライマーは、以下の配列を有する：
【化１４】
2006501863.tif 000058
【０４９７】
プライマーＫＦ３０およびＫＦ３１はそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位（太字の配列）を有する。プライマー対ＫＦ３０およびＫＦ３１により、マトリックスとして、コスミドｐＳＰＭ３６（上記を参照）を用いて、サイズが約１．５ｋｂの、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増幅することができる。このようにして得られた１．５ｋｂのフラグメントを、ベクターｐＧＥＭ−Ｔイージー（プロメガ社（マディソン，ウィスコンシン州，米国）により市販されている）にクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ７４を得た。次に、プラスミドｐＳＰＭ７４を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、得られた約１．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩインサートを、予め同じ酵素で消化されたベクターｐＵＷＬ２０１にサブクローニングした（実施例１７．１を参照）。このようにして得られたプラスミドを、ｐＳＰＭ７５と命名した；これは、ｏｒｆ２８ｃのｅｒｍＥ*プロモーターの制御下に置かれたコーディング配列全てを含む。
【０４９８】
２４．２．ＯＳＣ２株の、プラスミドｐＳＰＭ７５での形質転換：
プラスミドｐＳＰＭ７５を、プロトプラスト形質転換によって（Ｔ．Ｋｉｅｓｅｒ等，２０００年）、ＯＳＣ２株に導入した。プロトプラスト形質転換の後、クローンを、それらのチオストレプトン耐性について選択した。次に、クローンをチオストレプトン含有培地で二次培養し、プラスミドでの形質転換を、プラスミド抽出によって確認した。２つのクローンをより特定に選択し、ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（１）およびＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）と命名した。
【０４９９】
ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）株のサンプルは、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ  ７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年１０月６日に、登録番号Ｉ−３１０１で寄託した。
【０５００】
ｏｒｆ２８ｃ遺伝子の過剰発現のスピラマイシン生産に対する作用を試験するために、ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（１）およびＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）クローンのスピラマイシン生産を実施例１５で説明された技術で試験した。ＯＳＣ２株のスピラマイシン生産の解析も比較のために平行して行った。このようにして、プラスミドｐＳＰＭ７５の存在が、ＯＳＣ２株のスピラマイシン生産を顕著に増加させることを観察することができた。
これは、ｏｒｆ２８ｃの過剰発現により、スピラマイシン生産の増加がもたらされることを実証しており、調節因子としてのその役割が確認された。
【０５０１】
また、ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（１）およびＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）クローンのスピラマイシン生産もＨＰＬＣで解析した（実施例１７．２と同じ方法で）。ＯＳＣ２株のスピラマイシン生産の解析も比較のために平行して行った。この解析結果を表４４に示すが、データはｍｇ／リットル上清で示される。結果は、スピラマイシンの総生産量（スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの生産量を足すことによって得られた）に相当する。
【０５０２】
【表４４】
2006501863.tif 000059
【０５０３】
このようにして、プラスミドｐＳＰＭ７５の存在が、ＯＳＣ２株のスピラマイシン生産を顕著に増加させることが観察される。これは明らかに、ｏｒｆ２８ｃの過剰発現は、スピラマイシン生産にプラスの作用を有することを示す。
【０５０４】
実施例２５：ｏｒｆ８遺伝子において不活性化された株によるスピラマイシン生合成中間体生産の解析：
ｏｒｆ８遺伝子が、Ωｈｙｇカセットの挿入によって不活性化されたＯＳ４９．１０７株は、スピラマイシンを生産しない（実施例７および１５を参照）。ｏｒｆ８遺伝子は、数種のアミノトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードし、ｏｒｆ８遺伝子は、フォロサミン生合成に必要なアミノ交換反応に関与する４−アミノトランスフェラーゼをコードする（図６を参照）ことを強く示唆している。それゆえに、スピラマイシン生合成は、フォロシジン段階でブロックされる（図７を参照）ことが予想される。それゆえに、スピラマイシン非生産体であるＯＳ４９．１０７株は、フォロシジンを生産する。
【０５０５】
ＯＳ４９．１０７株の上清のサンプルを、上述の方法に従って製造し（実施例１６を参照，ただしＭＩＢＫ抽出を除く）、上述した通りにＬＣ／ＭＳで解析した（段落２０．２および２０．３を参照）。ＳＩＭモードで、フォロシジンの分子イオンに関する質量５５８を選択し、数種のピークを検出した。質量５５８の化合物の存在は、フォロサミン合成において役割を有するｏｒｆ８の仮説と一致する。
【０５０６】
実施例２６：ｏｒｆ１２遺伝子において不活性化された株によるスピラマイシン生合成中間体の生産の解析：
ｏｒｆ１２遺伝子が不活性化されたＳＰＭ５０７株は、スピラマイシンを生産しない（実施例１１および１５を参照）。ｏｒｆ１２遺伝子は、フォロサミン生合成に必要な脱水反応に関与する３，４−デヒドラターゼをコードすると考えられている（図６を参照）。それゆえに、スピラマイシン生合成は、フォロシジン段階でブロックされることが予想される（図７を参照）。スピラマイシン非生産株であるＳＰＭ５０７株は、それゆえに、フォロシジンを生産するはずである。
【０５０７】
ＳＰＭ５０７株の上清のサンプルを、上述の方法に従って製造し（実施例１６を参照，
ただしＭＩＢＫ抽出を除く）、上述した通りにＬＣ／ＭＳで解析した（段落２０．２および２０．３を参照）。これら条件下で、フォロシジンの保持時間は約１２．９分間である。ＳＩＭモードで、フォロシジンの分子イオン［Ｍ＋Ｈ]+に関する質量５５８を選択し、ピークを検出した。５５８の化合物の存在により、ｏｒｆ１２の産物は、スピラマイシン生合成において役割を有するという仮説を確認することが可能になる。
【０５０８】
しかしながら、フォロシジンの存在量は比較的少量であり、これら条件下では、２３８ｎｍで吸収する産物のほうがより特定に観察される（保持時間１７．１分）。ＬＣ／ＭＳ解析により、この化合物の質量を、７４４．３ｇ／モル（［Ｍ＋Ｈ]+＝７４４．３，主要な産物）と決定することができた。
【０５０９】
構造を得るために、上述の産物を、上述の条件下で（段落２０．１を参照）単離および精製した。次に、有機相（ＭＩＢＫ）を回収し、蒸発させた。乾燥抽出物を水に吸収させ、ヘプタンで抽出した。次に、オアシスＨＬＢの１ｇのカートリッジ（ウォーターズＳＡＳ，Ｓｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ  ｅｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ，フランス）に結合させることによって、水溶液を抽出する。３０／７０の水／アセトニトリル混合物での溶出によって化合物を回収する。次に、この溶液を分析カラムに注入し（１００μｌ）、オアシスＨＬＢの１ｃｃ３０ｍｇのカートリッジ（ウォーターズ）でフラクションを回収する。使用前に、オアシスＨＬＢの１ｃｃ３０ｍｇのカートリッジ（ウォーターズ）は、アセトニトリル、続いて、水／アセトニトリル混合物（２０ｖ／８０ｖ）、および、８０／２０の水／アセトニトリル混合物で連続的に調節される。
【０５１０】
次に、オアシスＨＬＢの１ｃｃ３０ｍｇのカートリッジ（ウォーターズ）を、水／アセトニトリル（９５／５）１ｍｌ、および、水／重水素化アセトニトリル（９５／５）１ｍｌで連続して洗浄し、続いて、４０／６０の水／重水素化アセトニトリル６００μｌで溶出する。次に、回収した溶液をＮＭＲで直接解析する。
【０５１１】
この化合物に関して得られたＮＭＲスペクトルは、以下の通りである（１９３１２Ｖ  ＮＭＲスペクトル）：
ＣＤ３ＣＮ／Ｄ２０における１Ｈスペクトル（化学シフト；ｐｐｍ）：0.92 (3H, d, J=6Hz), 1.10 (1H, unresolved peak), 1.14 (3H, s), 1.17 (3H, d, J=6Hz), 1.22 (3H, d, J=6Hz), 1.25 (3H, d, J=6Hz), 1.40 (1H, unresolved peak), 1.75 (1H, dd, J=12 および 2Hz), 1.81 (1H, unresolved peak), 1.90 (1H, d, J=12Hz), 2.05 (1H, unresolved peak), 2.12 (3H, s), 2.15 (1H, unresolved peak), 2.35 (2H, unresolved peak), 2.45 (6H, broad s), 2.53 (1H, unresolved peak), 2.64 (1H, dd, J=12 および 9Hz), 2.80 (1H, dd, J=9 および 16Hz), 2.95 (1H, d, J=8Hz), 3.23 (2H, unresolved peak), 3.34 (1H, d, J=7Hz), 3.45 (3H, s), 3.49 (1H, unresolved peak), 3.93 (1H, dd, J=7 および 3Hz), 4.08 (1H, unresolved peak), 4.37 (1H, d, J=6Hz), 4.88 (1H, unresolved peak), 5.05 (2H, unresolved peak), 5.65 (2H, unresolved peak), 6.08 (1H, dd, J=8 および 12Hz), 6.40 (1H, dd, J=12 および 9Hz), 9.60 (1H, s)。
【０５１２】
このようにして、これら実験により、この化合物の構造を決定することができ、この構造を図３８に示す。
【０５１３】
実施例２７：ｏｒｆ５*遺伝子において不活性化された株によるスピラマイシン生合成中間体の生産の解析：
ＳＰＭ５０１株は、遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１  ｈｙｇ＋を有する。ｏｒｆ６*遺伝子へのａｔｔ１  ｈｙｇ＋カセットの挿入の極性作用に基づいて、ｏｒｆ５*遺伝子は、スピラマイシン生合成経路に必須であることを決定することができた。特に、ｏｒｆ６*遺伝子のコーディング部分への切り出し可能なカセットの挿入により、ｏｒｆ５*遺伝
子の発現に対する極性作用に基づき、スピラマイシン生産の完全な阻止がもたらされる。しかしながら、一度挿入されたカセットが切り出されると（それゆえに、ｏｒｆ６*遺伝子が不活性化される場合のみ，実施例１４および１５を参照）、スピラマイシンＩの生産は復元される。これは、ｏｒｆ５*遺伝子は、その不活性化によりスピラマイシン生産が完全に阻止されるため、スピラマイシン生合成に必須であることを実証している。
【０５１４】
ｏｒｆ５*遺伝子は、数種のＯ−メチルトランスフェラーゼと比較的強い類似性を示すタンパク質をコードする。ｏｒｆ５*遺伝子は、プラテノライド生合成に関与するＯ−メチルトランスフェラーゼと考えられている。この仮説を確かめるために、スピラマイシンを過剰生産する株から得られた遺伝子型：ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１  ｈｙｇ＋のＳ．アンボファシエンス株に、ＬＣ／ＭＳおよびＮＭＲ分析実験を行った。
【０５１５】
この株の上清のサンプルを、上述の方法に従って製造し（実施例１６を参照，ただしＭＩＢＫ抽出を除く）、上述した通りにＬＣ／ＭＳで解析した（段落２０．２および２０．３を参照）。しかしながら、用いられたカラムは、Ｘ−テラ（Ｔｅｒｒａ）カラム（ウォーターズＳＡＳ，Ｓｔ−Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｙｖｅｌｉｎｅｓ，フランス）であり、スペクトロメーターのコーン電圧は、解析される化合物の動揺（fermentation）が得られるように３８０Ｖに設定される。これら条件下で、保持時間が約１３．１分間の産物が観察される。この化合物のマススペクトルは、スピラマイシンＩのマススペクトルに類似した特徴を示すが、分子イオンは８２９である。スピラマイシンの質量と比較した質量の１４の差は、ラクトン環の第４の炭素により生じる酸素にメチル基が存在しないこと（この化合物の構造を、図３９に示す）によって説明することができる。８２９における化合物の存在により、ｏｒｆ５*は、スピラマイシン生合成において役割を有するという仮説を確認することが可能になる。Ｍ．ルテウス株の感受性に対して行われた微生物学的試験を用いて（実施例１５および図１８を参照）、ｏｒｆ６*：：Ωａｔｔｈｙｇ＋株によって生産された中間体分子（スピラマイシン−メチル基、この構造を、図３９に示す）は、４位にメチル基を有する源のスピラマイシンよりかなり活性が低い（係数１０程度）ことが実証された。
【０５１６】
実施例２８：新規の「切り出し可能なカセット」の構築：
新規の切り出し可能なカセットを構築した。これらカセットは、実施例９ですでに説明された切り出し可能なカセットに極めて類似している。以前のカセットと新規のカセットとの主要な違いは、後者において、Ωインターポゾンの末端に相当する配列（この配列はＴ４ファージにより得られた転写ターミネーターを含む）がないことである。
【０５１７】
ターミネーターを含まないカセットにおいて、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子には、切り出し可能なａｔｔＲおよびａｔｔＬ配列が端に存在する。その耐性遺伝子は、アプラマイシン耐性を付与するアセチルトランスフェラーゼをコードするａａｃ（３）ＩＶ遺伝子である。この遺伝子は、Ωａａｃカセット（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：Ｘ９９３１３，Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｍ．Ｈ．等，１９９７年）に存在し、これを、マトリックスとして、プラスミドｐＯＳＫ−１１０２（上記を参照）、および、プライマーとして、オリゴヌクレオチドＫＦ４２およびＫＦ４３（それぞれ５’位にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（太字で）（ＡＡＧＣＴＴ）を含む）を用いたＰＣＲによって増幅した。
【０５１８】
【化１５】
2006501863.tif 000060
【０５１９】
約１ｋｂの得られたＰＣＲ産物を、Ｅ．コリベクターｐＧＥＭＴイージーにクローニングし、プラスミドｐＳＰＭ８３を製造した。
【０５２０】
ベクターｐＳＰＭ８３を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した。インサートのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、０．８％アガロースゲルからの精製によって単離し、ａｃｃに相当するＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ａａｃ遺伝子単独に相当するＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに置換されるように、様々な可能な切り出し可能なカセットを有する様々なプラスミド（実施例９および図２７を参照）のａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。これにより、ａｔｔ１ａａｃ、ａｔｔ１ａａｃおよびａｔｔ３ａａｃカセットを得ることができた（望ましいフェーズに応じて，実施例９を参照）。ａｔｔＬ配列、および、ａｔｔＲ配列に対するａａｃ遺伝子の方向に応じて、ａｔｔ１ａａｃ＋、ａｔｔ１ａａｃ−、ａｔｔ２ａａｃ＋、ａｔｔ１ａａｃ−、ａｔｔ３ａａｃ＋、および、ａｔｔ３ａａｃ−を区別する（実施例９で用いられたのと同じ規則に従う）。
【０５２１】
実施例２９：ｏｒｆ２８c遺伝子にノックアウトを有するＳ．アンボファシエンス株の構築：
切り出し可能なカセット技術を用いて、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子を不活性した。切り出し可能なカセットａｔｔ３ａａｃ＋（実施例２８を参照）を、マトリックスとして、プラスミドｐＳＰＭ１０１（プラスミドｐＳＰＭ１０１は、ベクターｐＧＰ７０４Ｎｏｔ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）から得られたプラスミドである（Ｍｉｌｌｅｒ  ＶＬおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ  ＪＪ，１９８８年），これにおいて、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットが、ＥｃｏＲＶフラグメントとしてｐＧＰ７０４Ｎｏｔの固有のＥｃｏＲＶ部位にクローニングされている）、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
【化１６】
2006501863.tif 000061
【０５２２】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する３９個のヌクレオチドは、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子における配列に相当する配列を含み、最も端の３’位に位置する２６個のヌクレオチド（上記では、太字と下線で示す）は、切り出し可能なカセットａｔｔ３ａａｃ＋の末端のいずれか１つの配列に相当する。
【０５２３】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、コスミドｐＳＰＭ３６を含む、過剰に組換えされたＥ．コリ株ＤＹ３３０（Ｙｕ等，２０００年）（この株は、ラムダファージのｅｘｏ、ｂｅｔおよびｇａｍ遺伝子を含み、これらはその染色体にインテグレートされており、これら遺伝子は、４２℃で発現され、Ｅ．コリＫＳ２７２株（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）の代わりに用いられた）を形質転換した。従って、細菌を、エレクトロポレーションにより、このＰＣＲ産物で形質転換し、クローンを、それらのアプラマイシンに対する耐性について選択した。得られた消化プロファイルは、カセット（ａｔｔ３ａａｃ＋）のｏｒｆ２８ｃ遺伝子への挿入が生じている場合、すなわち、ＰＣＲ産物の末
端と標的遺伝子との間の相同組換えが実際に生じている場合に予想されたプロファイルに相当することを確かめるために、得られたクローンのコスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。また、コンストラクトは、当業者既知のあらゆる方法で確認することもでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析で確認することもできる。コスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するコスミドを、ｐＳＰＭ１０７と命名した。このコスミドは、ｏｒｆ２８ｃがａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたｐＳＰＭ３６誘導体である。カセットの挿入は、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子における欠失を伴い、インタラプトは、ｏｒｆ２８ｃの２８番目のコドンから始まる。カセットの後に、ｏｒｆ２８ｃの最後の１３７個のコドンが残留する。
【０５２４】
コスミドｐＳＰＭ１０７が、第一の工程において、Ｅ．コリ株ＤＨ５αに導入され、続いて、プロトプラスト形質転換によってストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入される。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシンに対する耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、アプラマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地、および、ピューロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地それぞれで二次培養した（図９を参照）。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）と、ピューロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＰｕｒｏＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたｏｒｆ２８ｃ遺伝子を有するクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ２８ｃの野生型コピーの、カセットによってインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中の予想された遺伝子座におけるカセットの存在が確認できるように、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた。また、遺伝子型は、当業者既知のあらゆる方法によっても確認することができ、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によっても確認することができる。
【０５２５】
予想された特徴を示すクローン（ｏｒｆ２８ｃ：：ａｔｔ３ａａｃ＋）をより特定して選択し、これをＳＰＭ１０７とする。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ２８ｃ：：ａｔｔ３ａａｃ＋を有し、ＳＰＭ１０７と命名した。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ２８ｃの不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない。ｏｒｆ２９が、ｏｒｆ２８ｃと逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、特にプラスミドｐＯＳＶ５０８での形質転換により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。
【０５２６】
スピラマイシン生産におけるｏｒｆ２８ｃ遺伝子の不活性化の作用を試験するために、ＳＰＭ１０７株のスピラマイシン生産を実施例１５で説明された技術で試験した。このようにして、この株は、スピラマイシン非生産の表現型を有するを実証することができた。これは、ｏｒｆ２８ｃ遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子であることを実証している。
【０５２７】
実施例３０：ｏｒｆ３１遺伝子においてノックアウトを有するＳ．アンボファシエンス株の構築：
ｏｒｆ３１遺伝子を切り出し可能なカセット技術を用いて不活性した。切り出し可能なカセットａｔｔ３ａａｃ＋を、マトリックスとして、プラスミドｐＳＰＭ１０１、および、オリゴヌクレオチドＥＤＲ７１およびＥＤＲ７２を用いたＰＣＲによって増幅した。
【化１７】
2006501863.tif 000062
【０５２８】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する３９個のヌクレオチドは、ｏｒｆ３１遺伝子における配列に相当する配列を含み、最も端の３’位に位置する２６個のヌクレオチド（上記で太字および下線で示される）は、切り出し可能なカセットａｔｔ３ａａｃ＋の末端のいずれか１つの配列に相当する。
【０５２９】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年）によって説明されたように（原理については図１２を参照、プラスミドｐＯＳ４９．９９は、コスミドｐＳＰＭ３６で置換されているはずであり、得られたプラスミドは、ｐＳＰＭ１７ではなくなり、ｐＳＰＭ５４３となる）、プラスミドｐＫＯＢＥＧおよびコスミドｐＳＰＭ３６を含むＥ．ｃｏｌｉ株ＫＳ２７２を形質転換した。従って、細菌を、エレクトロポレーションによってこのＰＣＲ産物で形質転換し、クローンを、それらのアプラマイシンに対する耐性について選択した。得られた消化プロファイルが、ｏｒｆ３１遺伝子へのカセット（ａｔｔ３ａａｃ＋）の挿入が生じている場合、すなわち、実際に、ＰＣＲ産物の末端と標的遺伝子との間で相同組換えが生じている場合に予想されたプロファイルに相当することを確認するために、得られたクローンのコスミドを抽出し、数種の制限酵素で消化した。また、コンストラクトは、当業者既知のあらゆる方法で確認することもでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析で確認することもできる。コスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するコスミドを、ｐＳＰＭ５４３と命名した。このコスミドは、ｏｒｆ３１がａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたｐＳＰＭ３６の誘導体である（図１２を参照）。カセットの挿入は、ｏｒｆ３１遺伝子における欠失を伴い、インタラプトは、ｏｒｆ３１の３６番目のコドンから始まる。カセットの後、ｏｒｆ３１の最後の３３個のコドンが残留する。
【０５３０】
コスミドｐＳＰＭ５４３を、プロトプラスト形質転換によって（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ等，２０００年）、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入した（上記を参照）。形質転換の後、クローンを、それらのアプラマイシンに対する耐性について選択した。次に、アプラマイシン耐性クローンを、アプラマイシン含有培地（抗生物質Ｂ）、および、ピューロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地（図９を参照）それぞれで二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）と、ピューロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＰｕｒｏＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたｏｒｆ３１遺伝子を有するクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ３１の野生型コピーの、カセットによってインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中の予想された遺伝子座におけるカセットの存在が確認できるように、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた。プローブとして、ＰＣＲによって得られ、ｏｒｆ３１遺伝子のコーディング配列の極めて大きい部分に相当するＤＮＡフラグメントを用いて、第二のハイブリダイゼーションを行った。
【０５３１】
また、遺伝子型は、当業者既知のあらゆる方法によって確認することもでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって確認することもできる。
【０５３２】
予想された特徴を示すクローン（ｏｒｆ３１：：ａｔｔ３ａａｃ＋）をより特定して選択し、ＳＰＭ５４３と命名した。実際に、２回のハイブリダイゼーションに基づいて、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットが、実際にこのクローンのゲノムに存在すること、および、このクローンのゲノムにおいて、野生型遺伝子の、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたコピーでの置換（二重の組換え現象の後に）の場合に予想される消化プロファイルが実際に得られたことを確かめることができた。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ３１：：ａｔｔ３ａａｃ＋を有し、ＳＰＭ５４３と命名した。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ３１の不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない。ｏｒｆ３２ｃが、ｏｒｆ３１と逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、特にプラスミドｐＯＳＶ５０８での形質転換により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。
【０５３３】
ｏｒｆ３１遺伝子の不活性化のスピラマイシン生産に対する作用を試験するために、ＳＰＭ５４３株のスピラマイシン生産を実施例１５で説明された技術で試験した。このようにして、この株は、スピラマイシン非生産の表現型を有するを実証することができた。これは、ｏｒｆ３１遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子であることを実証している。
【０５３４】
実施例３１：ｏｒｆ３２c遺伝子においてノックアウトを有するＳ．アンボファシエン
ス株の構築
ｏｒｆ３２c遺伝子を切り出し可能なカセット技術を用いて不活性した。切り出し可能なカセットａｔｔ３ａａｃ＋を、マトリックスとしてプラスミドｐＳＰＭ１０１を用いた、および、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
【化１８】
2006501863.tif 000063
【０５３５】
これらオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する４０個のヌクレオチドは、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子における配列に相当する配列を含み、最も端の３’位に位置する２６個のヌクレオチド（上記で太字および下線で示される）は、切り出し可能なカセットａｔｔ３ａａｃ＋の末端のいずれか１つの配列に相当する。
【０５３６】
このようにして得られたＰＣＲ産物を用いて、コスミドｐＳＰＭ３６を含む過剰に組換えされたＥ．コリ株ＤＹ３３０（Ｙｕ等，２０００年）を形質転換した。従って、細菌を、エレクトロポレーションによってこのＰＣＲ産物で形質転換し、クローンを、それらのアプラマイシンに対する耐性について選択した。得られた消化プロファイルが、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子へのカセット（ａｔｔ３ａａｃ＋）の挿入が生じている場合、すなわち、実際にＰＣＲ産物の末端と標的遺伝子との間で相同組換えが生じている場合に予想されたプロファイルに相当することを確認するために、得られたクローンのコスミドを抽出し、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。また、コンストラクトは、当業者既知のあらゆる方法によって確認することもでき、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によって確認することもできる。コスミドが予想されたプロファイルを有するクローンを選択し、対応するコスミドを、ｐＳＰＭ１０６と命名した。このコスミドは、ｏｒｆ３２ｃがａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたｐＳＰＭ３６の誘導体である。カセットの挿入は、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子における欠失を伴い、インタラプトは、ｏｒｆ３２ｃの１１２番目のコドンから始まる。カセットの後、ｏｒｆ３２ｃの最後の９１個のコドンが残留する。
【０５３７】
コスミドｐＳＰＭ１０６が、第一の工程において、Ｅ．コリ株ＤＨ５αに導入され、続いて、形質転換によってストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株に導入された。形質転換の後、クローンが、それらのアプラマイシンに対する耐性に関して選択される。次に、アプラマイシン耐性クローンを、アプラマイシン（抗生物質Ｂ）含有培地、および、ピューロマイシン（抗生物質Ａ）含有培地（図９を参照）それぞれで二次培養した。アプラマイシンに対して耐性なクローン（ＡｐｒａＲ）と、ピューロマイシンに対して感受性を有するクローン（ＰｕｒｏＳ）は、原則的に、事象の際に二重交叉が生じており、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットでインタラプトされたｏｒｆ３２ｃ遺伝子を有するクローンである。これらクローンをより特定に選択し、ｏｒｆ３２ｃの野生型コピーの、カセットによってインタラプトされたコピーでの置換を、ハイブリダイゼーションによって確認した。従って、得られたクローンのゲノムＤＮＡ中のカセットの存在が確認できるように、得られたクローンのトータルＤＮＡを数種の酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、メンブレン上にトランスファーし、ａｔｔ３ａａｃ＋カセットに対応するプローブとハイブリダイズさせた。また、遺伝子型は、当業者既知のあらゆる方法によっても確認することができ、特に適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲおよびＰＣＲ産物の配列解析によっても確認することができる。
【０５３８】
予想された特徴を示すクローン（ｏｒｆ３２ｃ：：ａｔｔ３ａａｃ＋）をより特定に選択した。それゆえに、このクローンは、遺伝子型：ｏｒｆ３２ｃ：：ａｔｔ３ａａｃ＋を有し、ＳＰＭ１０６と命名した。遺伝子の方向を考慮すると（図３を参照）、ｏｒｆ３２ｃの不活性化の作用を研究するために、カセットを切り出す必要はない。ｏｒｆ３３が、ｏｒｆ３２ｃと逆方向を向いているということは、これら遺伝子は共転写されないことを示す。一方で、切り出し可能なカセットの使用により、特にプラスミドｐＯＳＶ５０８での形質転換により、いつでも選択マーカーが除去される可能性を持たせることが可能になる。
【０５３９】
スピラマイシン生産におけるｏｒｆ３２ｃ遺伝子の不活性化の作用を試験するために、ＳＰＭ１０６株のスピラマイシン生産を実施例１５で説明された技術で試験した。このようにして、この株は、スピラマイシン製造の表現型を有することを実証することができた。これは、ｏｒｆ３２ｃ遺伝子は、Ｓ．アンボファシエンスにおいて、スピラマイシン生合成に必須な遺伝子ではないことを実証している。
【０５４０】
【表４５】
2006501863.tif 000064
【０５４１】
【表４６】
2006501863.tif 000065
【０５４２】
【表４７】
2006501863.tif 000066
【０５４３】
【表４８】
2006501863.tif 000067
【０５４４】
【表４９】
2006501863.tif 000068
【０５４５】
生体物質の寄託
以下の生物は、ブダペスト条約の規定に従って、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  Ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ］（ＣＮＣＭ），２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００２年７月１０日に寄託された。
−ＯＳＣ２株（登録番号Ｉ−２９０８）
−ＳＰＭ５０１株（登録番号Ｉ−２９０９）
−ＳＰＭ５０２株（登録番号Ｉ−２９１０）
−ＳＰＭ５０７株（登録番号Ｉ−２９１１）
−ＳＰＭ５０８株（登録番号Ｉ−２９１２）
−ＳＰＭ５０９株（登録番号Ｉ−２９１３）
−ＳＰＭ２１株（登録番号Ｉ−２９１４）
−ＳＰＭ２２株（登録番号Ｉ−２９１５）
−ＯＳ４９．６７株（登録番号Ｉ−２９１６）
−ＯＳ４９．１０７株（登録番号Ｉ−２９１７）
−プラスミドｐＯＳ４４．４を含むエシェリキア・コリ株ＤＨ５α（登録番号Ｉ−２９１８）。
【０５４６】
以下の生物は、ブダペスト条約の規定に従って、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年２月２６日に寄託された。
−ＳＰＭ５０２  ｐＳＰＭ５２５株（登録番号Ｉ−２９７７）。
【０５４７】
以下の生物は、ブダペスト条約の規定に従って、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに、２００３年１０月６日に寄託された。
−株ＯＳＣ２／ｐＳＰＭ７５（２）（登録番号Ｉ−３１０１）。
【０５４８】
引用された全ての文献および特許は、参照により本発明に加入させる。
【０５４９】
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【０５５０】
また、本発明は、新規の抗生物質またはスピラマイシンの誘導体型の合成をもたらすことができる突然変異体を構築するための、スピラマイシン生合成プロセスにおける遺伝子の使用に関する。最終的には、本発明は、前記遺伝子の発現によって生産された分子、および、このような遺伝子の発現によって生産されたいずれかの分子の薬理学的に活性な組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【０５５１】
【図１】スピラマイシンＩ、ＩＩおよびＩＩＩの化学構造である。
【図２】領域を配列解析するのに用いられるコスミドである。
【図３】スピラマイシンの生合成経路に関与する遺伝子群の構成である。
【図４】マイカロースに関するといわれている生合成経路である。
【図５】マイカミノースに関するといわれている生合成経路である。
【図６】フォロサミンに関するといわれている生合成経路である。
【図７】スピラマイシン分子および中間体への糖の付加の好ましい順番である。
【図８】Ｓ．アンボファシエンスにおいてメトキシマロニルに関するといわれている生合成経路である。
【図９】遺伝子不活性化を起こす工程である。
【図１０】図９で説明された方法による遺伝子不活性化の後に必要に応じた工程であり、この工程は、切り出し可能なカセットが標的遺伝子をインタラプトするのに用いられる場合に行ってもよい；
【図１１】相同組換え実験にを用いるための、切り出し可能なカセットの増幅である。
【図１２】Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ等，２０００年によって説明された技術を用いた、標的遺伝子を不活性化するためのコンストラクトの生産である。
【図１３】プラスミドｐＷＨＭ３．Ｓｔｒｅｐｔｏ  ｏｒｉ：ストレプトマイセスの複製起源のマップである。
【図１４】プラスミドｐＯＳＶ５０８のマップである。
【図１５】切り出し可能なカセットの構造の例である。
【図１６】プラスミドｐＢＸＬ１１１１のマップである。
【図１７】プラスミドｐＢＸＬ１１１２のマップである。
【図１８】ミクロコッカス・ルテウス株のスピラマイシンに対する感受性に基づく、スピラマイシン生産に関する微生物学的試験である。
【図１９】ＯＳＣ２株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２０】ＳＰＭ５０１株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２１】ＳＰＭ５０２株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２２】ＳＰＭ５０７株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２３】ＳＰＭ５０８株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２４】ＳＰＭ５０９株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２５】ＦＡＳＴＡプログラムを用いて得られたＯＲＦ３タンパク質（配列番号２９）とＳ．フラジアエのＴｙｌＢタンパク質（配列番号８７）とのアライメントである。
【図２６】ＦＡＳＴＡプログラムを用いて得られたＳ．マイカロファシエンスのＭｄｍＡタンパク質（配列番号８８）と、ＳｒｍＤタンパク質（配列番号１６）とのアライメントである。
【図２７】切り出し可能なカセットを切り出した後の残りの部位配列の例である。
【図２８】ｏｒｆ１０遺伝子、用いられるＰＣＲプライマーの位置、および、それぞれのプライマー対を用いて得られたコンストラクトの図表示である。
【図２９】カセットｐａｃ−ｏｒｉｔＴの構築である。
【図３０】コスミドｐＷＥＤ２のマップである。
【図３１】スピラマイシンの生合成経路に関与する遺伝子群、および、Ｅ．コリにおいて、ストレプトマイセス・アンボファシエンスＯＳＣ２株のゲノムＤＮＡライブラリーのコスミドを単離するのに用いられた３種のプローブの位置の図表示である（実施例１９を参照）。
【図３２】Ｅ．コリにおいてストレプトマイセス・アンボファシエンス株ＯＣＳ２のゲノムＤＮＡライブラリーから単離されたコスミドのインサートの位置（実施例１９を参照）である。
【図３３】コスミドｐＳＰＭ３６のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメント（プラスミドｐＳＰＭ５８のインサート）のサブクローニング、コスミドｐＳＰＭ３６のＳｔｕＩ−ＳｔｕＩフラグメント（プラスミドｐＳＰＭ７２のインサート）のサブクローニング、および、ＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩ（プラスミドｐＳＰＭ７３のインサート）のサブクローニングである。
【図３４】プラスミドｐＳＰＭ５８のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩインサート、および、プラスミドｐＳＰＭ７３のＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩインサートで同定されたオープンリーディングフレームの位置である。
【図３５】２３８ｎｍと２８０ｎｍで得られたＯＳ４９．６７株のろ過した培地上清のＨＰＬＣクロマトグラムの並置（上部）、および、３３．４分および４４．８分で溶出した分子のＵＶスペクトル（下部）である。
【図３６】プラテノライドＡとプラテノライドＢ分子の分子構造である。
【図３７】スピラマイシンの生合成経路に関与する遺伝子群の構成である。
【図３８】ＳＰＭ５０７株によって生産された生合成の中間体の分子構造である。
【図３９】スピラマイシンを過剰生産する株から得られた遺伝子型ｏｒｆ６*：：ａｔｔ１Ωｈｙｇ＋のＳ．アンボファシエンス株によって生産された生合成の中間体の構造である。
【図４０】ＯＳ４９．６７株によって生産されたプラテノライドＡ＋マイカロース、および、プラテノライドＢ＋マイカロース分子の分子構造である。
【図４１】コスミドｐＳＰＭ３６のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメント（プラスミド（ｐＳＰＭ７９）のインサート）のサブクローニング、プラスミドｐＳＰＭ７９のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩインサートで同定されたオープンリーディングフレームの位置、および、配列番号１４０の配列の位置である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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