(57)【要約】本発明は、造血幹細胞数の増大のための装置および方法を提供する。幹細胞を培養して、分化した細胞および内因性成長因子を除去し（枯渇させ）、長期間の培養および幹細胞の増大を可能とする。造血幹細胞は多くの治療的手順において使用される。
2006525013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、バイオプロセスデバイス：
a)第1の細胞培養チャンバー;
b)第2の細胞培養チャンバー;
c)第1のチャンバーおよび第2のチャンバーと調節可能な液体で連絡している導管;
ここで、第1の細胞培養チャンバー、第2の細胞培養チャンバー、および導管の内部表面は、環境に対して実質的に閉鎖している。
【請求項２】
第1の細胞培養チャンバーまたは第2の細胞培養チャンバーの少なくとも1つが、酸素ガスおよび二酸化炭素ガスに対して半透過性であるが、液体に対しては実質的に不透過性である、請求項1記載のデバイス。
【請求項３】
第1の細胞培養チャンバーまたは第2の細胞培養チャンバーの少なくとも1つがポンプデバイスに適合される、請求項1記載のデバイス。
【請求項４】
導管がさらに選択エレメントを含む、請求項1記載のデバイス。
【請求項５】
選択エレメントが、分化した造血細胞によって発現される1種またはそれ以上の抗原についての親和性を有する、請求項4記載のデバイス。
【請求項６】
選択エレメントが、lin+抗原、CD2、CD3、CD4、CD8、CD13、CD14、CD16、CD19、CD24、CD38、CD45、CD56、CD66b、およびグリコホリンAからなる群より選択される1種またはそれ以上の抗原についての親和性を有する、請求項5記載のデバイス。
【請求項７】
システムがモジュール式であり、かつ第1のチャンバー、第2のチャンバー、または導管が脱着可能である、請求項1記載のデバイス。
【請求項８】
導管が少なくとも1つの磁石をさらに含む、請求項1記載のデバイス。
【請求項９】
導管が磁化可能なエレメントをさらに含む、請求項1記載のデバイス。
【請求項１０】
以下の工程を含む、細胞培養の方法：
a)未分化の造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手する工程;
b)未分化の造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および閉鎖条件下で、造血細胞の試料を培養する工程;
c)分化した造血細胞または成長因子から、未分化の造血細胞を閉鎖条件下で分離する工程;ならびに
d)閉鎖条件下で分離された未分化造血細胞をさらに培養し、それによって分離された未分化造血細胞の増殖を引き起こす工程。
【請求項１１】
成長因子が培養培地の交換によって未分化造血細胞から分離される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
分化した造血細胞がアフィニティー分離によって未分化造血細胞から分離される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
分化した造血細胞が免疫アフィニティー分離によって未分化造血細胞から分離される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
免疫アフィニティー分離が、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD66b抗体、および抗グリコホリンA抗体からなる群より選択される抗体またはそのフラグメントを有する選択エレメントを使用して実行される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含む、細胞を保存する方法：
a)未分化の造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手する工程;
b)未分化の造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および閉鎖条件下で、造血細胞の試料を培養する工程;
c)分化した造血細胞または成長因子から、未分化の造血細胞を閉鎖条件下で分離する工程;
d)閉鎖条件下で分離された未分化造血細胞をさらに培養し、それによって分離された未分化造血細胞の増殖を引き起こす工程;ならびに
e)分離された未分化造血細胞を凍結し、それによって細胞を保存する工程。
【請求項１６】
成長因子が培養培地の交換によって未分化造血細胞から分離される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
分化造血細胞がアフィニティー分離によって未分化造血細胞から分離される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
分化造血細胞が免疫アフィニティー分離によって未分化造血細胞から分離される、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
分離が、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD66b抗体、および抗グリコホリンA抗体からなる群より選択される抗体またはそのフラグメントを有する選択エレメントを使用して達成される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程を含む、哺乳動物を治療する方法：
a)不十分な数の造血細胞によって特徴付けられる障害を有する哺乳動物を同定する工程;
b)未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手する工程;
c)未分化造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および閉鎖条件下で、造血細胞試料を培養する工程;
d)分化した造血細胞または成長因子から、未分化造血細胞を分離する工程;
e)分離された未分化造血細胞を培養し、それによって分離された未分化造血細胞のさらなる増殖を引き起こす工程;ならびに
f)適切な量の培養された未分化造血細胞を哺乳動物に供給する工程
ここで、培養された未分化造血細胞が哺乳動物中の造血細胞の数を増加し、それによって障害を治療する。
【請求項２１】
障害が血球減少症である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
血球減少症が放射線治療または化学療法によって誘導される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
障害が貧血または造血細胞の欠乏である、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
培養された未分化造血幹細胞において少なくとも4倍の増加があり、かつ該細胞は哺乳動物への移植に適する、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程を含む、細胞集団を供給するための方法：
a)未分化ヒト造血細胞を含む出発試料細胞を供給する工程;および
b)未分化ヒト造血細胞の増殖を促進する閉鎖条件下で細胞を成長させる工程
ここで、未分化ヒト造血細胞の数が、細胞集団を形成するために培養中で少なくとも4倍増加している。
【請求項２６】
以下の工程を含む、哺乳動物に治療タンパク質を供給する方法：
a)治療タンパク質の必要のある哺乳動物を同定する工程;
b)未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手する工程;
c)少なくとも1つの未分化造血細胞に、治療タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程;
d)未分化造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および閉鎖条件下で、該遺伝子を有する未分化造血細胞を培養する工程;
e)分化した造血細胞または成長因子から、該遺伝子を有する未分化造血細胞を分離する工程;ならびに
f)該遺伝子を有する分離された未分化造血細胞を培養し、それによって該遺伝子を有する造血細胞のさらなる増殖を引き起こす工程;ならびに
g)治療タンパク質をコードする遺伝子を有する、適切な量の培養された未分化造血細胞を移植物として哺乳動物に供給する工程、
ここで、該遺伝子を有する培養された未分化造血細胞は哺乳動物中で増殖し、かつ治療タンパク質は哺乳動物中で発現される。
【請求項２７】
哺乳動物が、移植後に、遺伝子を有する培養された未分化造血細胞に対する免疫応答を示さない、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程を含む、哺乳動物に血液を提供する方法：
a)不十分な数の造血細胞を有する哺乳動物を同定する工程;
b)未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手する工程;
c)未分化造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および閉鎖条件下で、造血細胞の試料を培養する工程;
d)分化した造血細胞または成長因子から、未分化造血細胞を分離する工程;
e)分離された未分化造血細胞を培養し、それによって分離された未分化造血細胞のさらなる増殖を引き起こす工程;ならびに
f)適切な量の培養された未分化造血細胞を、移植物として哺乳動物に供給する工程
ここで、培養された未分化造血細胞が、移植後に哺乳動物中での造血細胞の数を増加する。
【請求項２９】
対象への移植の前に、培養中の長期的に再増殖する未分化造血細胞の数において少なくとも4倍の増加がある、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
実質的に純粋な培養された未分化造血幹細胞の集団を含み、ここで培養された未分化造血幹細胞において少なくとも4倍の増加があり、かつ該細胞は哺乳動物への移植に適する、細胞培養物。
【請求項３１】
培養された未分化造血幹細胞が、移植後に哺乳動物において対宿主性移植片病を引き起こさない、請求項30記載の細胞培養物。
【請求項３２】
未分化造血細胞の亜集団を有する細胞培養物中の1つまたはそれ以上の成長因子のレベルを減少する工程を包む、細胞増殖を調節する方法であって、ここで成長因子のレベルの減少が、未分化造血細胞が細胞の実質的な系統の方向付けなしに培養中で数を増大することを可能にする、方法。
【請求項３３】
成長因子がTGF-βまたはMIP-1-αである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
成長因子が造血素である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
成長因子のレベルが亜集団分離によって、または培地交換もしくは培地希釈によって減少される、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
未分化造血細胞がCD34+、CD34+Lin-、CD133+、NOD/SCID再増殖細胞、および迅速に再増殖するNOD/SCID細胞からなる群より選択される表現型を有する、請求項10、15、20、25、26、28、または32記載の方法。
【請求項３７】
以下の工程を含む、哺乳動物のために血液を保管する方法：
a)未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を哺乳動物から入手する工程;
b)未分化造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および閉鎖条件下で、造血細胞の試料を培養する工程;
c)分化した造血細胞または成長因子から、未分化造血細胞を分離する工程;ならびに
d)分離された未分化造血細胞を培養し、それによって分離された未分化造血細胞のさらなる増殖を引き起こす工程;ならびに
e)適切な量の培養された未分化造血細胞を、移植物として、哺乳動物に供給する工程、
ここで、培養された未分化造血細胞は、移植後に、哺乳動物中の造血細胞の数を増加させる。
【請求項３８】
哺乳動物への移植に適した、培養された未分化造血細胞の実質的に純粋な試料を含み、移植手順において細胞を使用するための指示書をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、制御可能なバイオプロセスシステム中で幹細胞または前駆細胞を増大（expand）するため、幹細胞または前駆細胞の増大を提供するため、内因性因子の産生を制御するため、ならびに移植(造血レスキュー)および他の治療的処置のために有用である細胞集団(幹細胞、前駆細胞、および成熟細胞の混合物)を提供するための装置ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
造血幹細胞は、胎児骨髄、臍帯血、成体骨髄、および末梢血において同定されているまれな細胞であり、骨髄性赤血球系細胞(赤血球、顆粒球、単球)、巨核球(血小板)、およびリンパ球系細胞(T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞)の各系統に分化することが可能である。さらに、これらの細胞は長寿命で、さらなる幹細胞を産生することが可能であり、このプロセスは自己複製と呼ばれる。幹細胞は、系統が制限された前駆細胞への方向付けを最初に受け、これは半流動性培地中でコロニーを形成する能力によってアッセイされ得る。前駆細胞は、多数の系統に分化する能力が制限されており、自己複製する能力を失っている。前駆細胞は最終的には、血液の各々の機能的なエレメントに分化および成熟する。成熟血液細胞の一生の維持は、高いがおそらく制限されている自己複製についての能力を有する少数の多能性造血幹細胞の増殖活性から生じる。培養においては、造血幹細胞は、分化細胞型に迅速に方向付けられ、これは不可逆的に培養中に優勢となる。この特性は、血液中で比較的希少であることともに、長期的で安定な多能性造血幹細胞の培養物の作製を困難としている。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
本発明は、培養において造血系統の未分化多能性細胞を増大するための装置および方法を提供し、それによって細胞は培養中で増殖し、方向付けおよび分化をほとんど伴うことないものから、それを全く伴わないものまである。未分化造血細胞は一般的に、CD34+、CD34+Lin-、CD133+、NOD/SCIDの再増殖細胞、および迅速に再増殖するNOD/SCID細胞である表現型を有する。
【０００４】
このバイオプロセスは、1つの局面において、第1の細胞培養チャンバー、第2の細胞培養チャンバー、ならびに第1のチャンバーおよび第2のチャンバーと調節可能な液体で連絡している導管を備えるバイオプロセスデバイスを含む。1つの態様において、第1の細胞培養チャンバー、第2の細胞培養チャンバー、および導管の内部表面は、環境に対して実質的に閉鎖している。別の態様において、第1の細胞培養チャンバー、第2の細胞培養チャンバー、および導管の1つまたはそれ以上の内部表面が、環境に対して実質的に開放されている。このデバイスは、第1の細胞培養チャンバーまたは第2の細胞培養チャンバーが酸素ガスおよび二酸化炭素ガスに対して半透過性であるが、液体に対しては実質的に不透過性である態様を含む。他の態様において、第1の細胞培養チャンバーまたは第2の細胞培養チャンバーの少なくとも1つがポンプデバイスに適合される。特定の態様において、このバイオプロセスシステムはモジュール式であり、かつ第1のチャンバー、第2のチャンバー、または導管が脱着可能である。
【０００５】
1つの局面において、導管は選択エレメントを備える。この選択エレメントは、未分化細胞から分化細胞を分離するために使用され、1つの態様において、分化した造血細胞によって発現される1種またはそれ以上の抗原(例えば、lin+抗原、CD2、CD3、CD4、CD8、CD13、CD14、CD16、CD19、CD24、CD38、CD45、CD56、CD66b、およびグリコホリンAからなる群より選択される抗原であるがこれらに限定されない)についての親和性を有する。1つの態様において、導管は、細胞亜集団の分離を容易にするために、磁石または磁化可能なエレメントをさらに備える。
【０００６】
細胞培養の方法もまた提供される。未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料が得られる。造血細胞の試料は、未分化造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および条件下で培養される。未分化造血細胞は、分化した造血細胞または成長因子から分離され、分離された未分化造血細胞はさらに培養され、それによって分離された未分化造血細胞の増殖を引き起こす。この方法は、閉鎖系または開放系のいずれかの培養条件において実行可能である。種々の態様において、成長因子は、培養培地の交換によって、希釈によって、または培養の潅流によって、未分化造血細胞から分離される。他の態様において、分化した造血細胞は、アフィニティー分離、免疫アフィニティー分離によって未分化造血細胞から分離され、この免疫アフィニティー分離は、例えば、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD66b抗体、および抗グリコホリンA抗体であるがこれらに限定されない抗体またはそのフラグメントを有する選択エレメントを使用して実行される。
【０００７】
本発明はまた、細胞を保存する方法を提供する。未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料が得られる。造血細胞を、未分化造血細胞の亜集団の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および条件下で培養する;未分化造血細胞を分化造血細胞および望ましくない成長因子から分離する;細胞をさらに培養し、それによって分離された未分化造血細胞の増殖を引き起こす。次いで、分離された未分化造血細胞を、例えばDMSO中、グリセリン中、または別の適切な凍結保存剤中に凍結する。これらの方法は、閉鎖系および開放系の態様において実行可能である。種々の他の態様において、成長因子は、培養培地の交換によって、希釈によって、または培養物の灌流によって、未分化造血細胞から分離される。別の態様において、分化した造血細胞は、アフィニティー分離、免疫アフィニティー分離によって未分化造血細胞から分離され、この免疫アフィニティー分離は、例えば、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD16抗体、抗CD19抗体、抗CD24抗体、抗CD38抗体、抗CD45抗体、抗CD56抗体、抗CD66b抗体、および抗グリコホリンA抗体であるがこれらに限定されない抗体またはそのフラグメントを有する選択エレメントを使用して実行される。
【０００８】
別の局面において、本発明は、哺乳動物を治療する方法を含む。最初に、不十分な数の造血細胞によって特徴付けられる障害を有する哺乳動物を同定し;造血細胞の試料を、例えば同種移植のためのドナーから、または自系移植のためにその哺乳動物から入手し、その試料は未分化造血細胞のサブセットをさらに含み;造血細胞試料を、未分化の造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および条件下で培養し;未分化造血細胞を、分化した造血細胞または成長因子から分離し;および分離された未分化造血細胞をさらに培養し、それによって分離された未分化造血細胞のさらなる増殖を引き起こす。哺乳動物は、適切な量の培養された未分化造血細胞を提供され、培養された未分化造血細胞が哺乳動物中の造血細胞の数を増加し、それによって障害を治療する。本発明の態様は、開放系および閉鎖系を含む。治療に適した障害には、例えば、異常なレベルの血液細胞、または癌(例えば、移植片対腫瘍アプローチ)を生じる、癌治療または遺伝的欠損によって誘導されるものなどの血球減少症または貧血が含まれるが、これらに限定されない。1つの態様において、長期的な再増殖能を有する未分化造血細胞の培養は、哺乳動物への移植の前に少なくとも4倍増大される。1つの態様において、本発明は、未分化ヒト造血細胞の細胞集団を提供するための方法を含み;ここで、未分化ヒト造血細胞の数は、細胞集団を形成するために少なくとも20倍増加される。
【０００９】
本発明はまた、1つの局面において、哺乳動物に治療用タンパク質を供給する方法を含む。治療タンパク質の必要のある哺乳動物を同定し;未分化造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手し;治療タンパク質をコードする遺伝子を少なくとも1つの未分化造血細胞に導入し;この遺伝子を有する未分化造血細胞を、未分化造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および条件下で培養し;この遺伝子を有する未分化造血細胞を、分化した造血細胞または成長因子から分離し;ならびにこの遺伝子を有する分離された未分化造血細胞を培養し、それによってこの遺伝子を有する造血細胞のさらなる増殖を引き起こし;ならびに治療タンパク質をコードする遺伝子を有する、適切な量の培養された未分化造血細胞を、移植物として哺乳動物に供給する。この遺伝子を有する培養された未分化造血細胞は哺乳動物中で増殖し、治療タンパク質を哺乳動物中で発現する。1つの態様において、哺乳動物は移植後に、移植物に対する病理学的な免疫応答を示さない。別の態様において、哺乳動物は、導入遺伝子、またはその発現産物に対する病理学的な免疫応答を示さない。
【００１０】
別の局面において、本発明は、哺乳動物に血液を提供する方法を提供する。不十分な数の造血細胞を有する哺乳動物を同定し;未分化の造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を入手し;造血細胞の試料を、未分化の造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および条件下で培養し;未分化の造血細胞を、分化した造血細胞または成長因子から分離し;分離された未分化造血細胞をさらに培養し、それによって分離された未分化造血細胞の増殖を引き起こし;ならびに、この哺乳動物に移植物として適切な量の培養された未分化造血細胞を供給し、ここでこの培養された未分化造血細胞は、移植後に哺乳動物中での造血細胞の数を増加する。1つの態様において、哺乳動物への移植の前に、長期的な再増殖能を有する未分化造血細胞の培養物は、少なくとも4倍増大される。別の態様において、本発明は、未分化ヒト造血細胞の細胞集団を提供するための方法を含み;ここで未分化ヒト造血細胞の数は、細胞集団を形成するために少なくとも20倍増加する。細胞の培養は、閉鎖系または開放系のいずれかを使用して実行される。種々の態様において、未分化造血幹細胞は、移植後に哺乳動物中で対宿主性移植片病を引き起こさない。
【００１１】
本発明はまた、種々の局面において、細胞増殖を制御する方法を提供する。未分化造血細胞の亜集団を有する細胞培養中の1種またはそれ以上の成長因子のレベルが減少され、ここで成長因子のレベルの減少により、未分化の造血細胞が細胞の実質的な系統への方向付けなしに培養中で数を増大することが可能となる。減少される成長因子は、例えば、造血素、TGF-β、またはMIP-1-αであるがこれらに限定されない。種々の態様において、成長因子レベルは、亜集団分離によって、または培地交換もしくは培地希釈によって、または培養物の灌流によって減少される。細胞培養は、閉鎖系であっても開放系であってもよい。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、哺乳動物のために血液を保管する方法を提供する。未分化の造血細胞のサブセットをさらに含む造血細胞の試料を哺乳動物から入手し;造血細胞の試料を、未分化の造血細胞の増殖を引き起こすために適切な培養培地中および条件下で培養し;分化した造血細胞または成長因子から未分化の造血細胞を分離し;分離された未分化造血細胞をさらに培養し、それによって分離された未分化造血細胞のさらなる増殖を引き起こし;ならびに、哺乳動物に適切な量の培養された未分化造血細胞を含む移植物を供給し、ここで培養された未分化造血細胞は移植後に、哺乳動物中の造血細胞の数を増加させる。細胞培養は、閉鎖系または開放系のいずれかで実行される。特定の態様において、本発明は、患者への移植に適した、培養された未分化造血細胞の試料を、収集、増大、および患者のために保管するための市販のプロセスを含む。試料はドナーによって提供され、かつ同種移植で使用されるか、または患者が開始試料を提供し、培養された未分化造血細胞が自系移植で使用される。
【００１３】
種々の他の局面において、本発明は移植キットを提供する。このキットは、培養中で少なくとも4倍に増大され、かつ哺乳動物、特にヒトへの移植に適した未分化造血細胞の集団を含む。このキット中に供給される細胞は、閉鎖系または開放系のいずれかで培養される。このキットには、移植手順において細胞を使用するための指示書も含まれる。
【００１４】
種々の他の態様が、本明細書に提供される教示に鑑みて明らかであり、かつ本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
詳細な説明
造血幹細胞(HSC)の増大を容易にするエクスビボ培養条件の開発は、細胞移植、遺伝子治療、および組織工学を含む次世代の治療の臨床的実施を大きく加速するであろう。実際、過去数年間、移植治療においてこのような細胞の臨床的有用性の増加が示されてきた(1〜4)。不運なことに、一貫して効率的にHSCをインビトロで増殖させることを可能にする培養条件の確立は、とらえどころがなかった。主として成長因子補充および間質細胞支持を通しての、HSCを増大することを目的とする現在のストラテジーは一般的に成熟前駆細胞の増大を生じるが、短期間の培養後のより始原的な細胞の損失(5〜9)または中程度の増大(7、8、10〜12)のため、複雑である。これらの結果は、いくぶん驚くべきことである。なぜなら、HSCはインビボでは広範な増殖能を有することが示されているからである。マウスにおける長期的な定植（engraftment）が、単一のマウス(13〜15)またはヒト(16)の細胞の子孫によって達成され得ること、および単一のクローンの子孫が複数の二次レシピエントを再増殖し得ること(17、18)を示す実験により、この能力が証明されている。さらに、マウスにおける一連の移植研究において、再増殖する幹細胞のインプット数およびアウトプット数を各継代においてモニターおよび定量し、再増殖している幹細胞は、理論的には150〜8400倍の増大が計算される保持されたインビボ増大が可能であることが確証的に示されている(19、20)。それゆえに、単純な培地補充が、大部分のインビトロ系において見られる増殖阻害効果を克服するために十分ではないことは明らかである。
【００１６】
免疫表現型決定は、細胞表面抗原の発現に基づいて造血細胞を特徴付けするために使用される得る方法である。これらのマーカーは、識別可能な細胞の亜集団上で発現されており、特定の細胞表面抗原を発現する細胞の体系的な機能的分析と組み合わせて、系統の関連性に基づく分類化を導いてきた。
【００１７】
本明細書で使用される用語「未分化造血細胞」、「未分化細胞」、「造血幹細胞(HSC)」、および「始原細胞」は、哺乳動物に移植されたときに長期的なインビボ増大および再増殖が可能である多能性造血幹細胞を記載するために交換可能に使用される。大部分の始原細胞型は、BMにおける幹細胞および前駆細胞の接着において重要な役割を果たすと考えられている膜貫通糖リンタンパク質である細胞表面抗原CD34を発現することが確立されている(72)。CD34を発現し、かつCD38抗原を欠く細胞集団(すなわち、CD34+CD38-細胞)は、始原細胞の能力を示すことが示されている。例えば、SRCの大多数は、CD34+CD38-細胞画分において見られ、より分化した細胞型を含むと考えられているCD34+CD38+細胞集団においては見られない(7)。CD34+CD38-表現型はまた、LTC-IC特性を有する細胞の富化と関連付けられている(73)。長期間の複数系統の再増殖が可能であるマウスおよびヒトのCD34-HSCの存在により、CD34抗原それ自体がHSCの能力とは独立して調節される可能性があること、およびCD34発現それ自体は不可欠なHSCマーカーではないことが示される(14、74〜77)。始原細胞はまた、T細胞関連マーカーであるThy-1の発現に基づいて同定されている(78)。Thy-1発現は、UCB、BM、およびヒト胎児肝臓単核球細胞(MNC)からのLTC-ICの回収を可能にし(79)、かつマウスBM中に存在するすべての再増殖細胞(Thy-1.1lo)の割合を占める(80)。別のマーカーCD133(AC133)は膜貫通レセプター糖タンパク質であり、これもまた初期の造血前駆細胞の富化と同時に見られることが示されている(81)。UCBから単離されたCD34+CD133+細胞画分は、始原前駆細胞(82)、および二次レシピエントに定植する能力をさらに有するSRC(83、84)でさらに富化されている。最近、血管増殖因子レセプター2(KDR)は、始原細胞型のためのマーカーであることが示唆された。BM由来CD34+KDR+の単離はヒトLTC-ICおよびSRCの富化を生じることが、研究により示されている(85)。
【００１８】
特異的抗原が存在しないこともまた、始原性造血幹細胞集団を特徴付け単離するために使用することが可能である。例えば、HLA-DR(86)またはCD45RA/CD71(87)を欠くヒトCD34+細胞は、自己複製および複数の造血細胞系統への分化が可能である始原性の多能性造血細胞を特定する。さらに、成熟骨髄性細胞およびリンパ細胞と関連するマーカーを欠く細胞を単離することは、始原細胞型について富化するための方法である。
【００１９】
本明細書で使用される用語「分化した造血細胞」、「分化した細胞」、または「前駆細胞」とは、系統が方向付けられた造血細胞をいう。これらの細胞は典型的には、抗原CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、およびグリコホリンAの1つまたはそれ以上を発現し、系統マーカー(lin+)と呼ばれる。lin+抗原の検出により、多能性特性の損失、およびその細胞が分化または系統が方向付けられたことが示される。従って、これらのlin+抗原はまた、本明細書に記載されるように、分化した細胞の標的化分離のための適切な抗原を提供し、これらの抗原に対する抗体は、免疫分離手順のために広範に利用可能である。
【００２０】
上記のように、今日までに研究された培養条件の大部分は、分化した細胞型の優勢、それに伴って始原細胞の頻度および数の減少を生じ、最終的に培養物は死滅する。この望ましくない結果は、培養動態に影響を与え得るいくつかの競合する要因により生じる。1つのこのようなパラメーターは、調節分子の内因性分泌の効果であり、これは培養中の造血細胞の異なる亜集団によって、HSC増殖に対して刺激性または阻害性であり得る。遺伝子発現およびタンパク質分泌分析を使用して、HSC増大を阻害することが知られている種々の因子が、前駆細胞と成熟細胞型の両方によって発現および分泌されることが示された(21〜28)。例えば、単球は、トランスフォーミング成長因子(TGF)-β1およびマクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1αを分泌することが知られている(21、28)。好中球は、TGF-β1、MIP-1α、および腫瘍壊死因子(TNF)-αの分泌と関連付けられてきたのに対して(21、25)、巨核球はインターロイキン(IL)-3を分泌する(23)。同様の知見が、TGF-β1を分泌することが示されている赤血球系および巨核球の前駆細胞について報告されている(27)。さらに、多数のこれらの分泌因子は、他の細胞型による阻害因子の二次的な分泌を刺激できることが、研究により示されている。例えば、単球によるIL-12、TNF-α、IL-1、またはIL-10の産生は、リンパ球がMIP-1αを産生するように刺激することができる(29、30)。これらの阻害因子は、HSCを静止状態のままにすること、アポトーシスを受けさせること、および/または成熟細胞型に分化させることによって、インビトロでHSC増大を妨害することが知られている(31〜35)。
【００２１】
この現象は、サイトカインレセプターがHSCに対して特異的ではないが、その代わりに血液発生の異なる段階において細胞上でも見い出されることによって悪化される。c-kit、flk2/flt3、c-mpl、IL-6R、およびGM-CSFR(それぞれ、SCF、FL、TPO、IL-6、およびGM-CSFのレセプター)は、幹細胞区画からの細胞上だけでなく、前駆細胞および成熟細胞の集団上でも差示的に発現され得ることが示されている(36〜43)。造血ヒエラルキー全体に渡るこれらのレセプターの存在は、補充されたサイトカインの作用がHSCに特異的ではなく、より分化した細胞も標的とすることを意味する。例えば、サイトカインは、巨核球(44、45)、顆粒球(46)、およびマクロファージ(47)の前駆細胞の最終的分化および増殖を刺激することが示されている。HSC増大培養の細胞の不均一性のために、サイトカイン補充は、幹細胞(および前駆細胞)の同時の増殖および/または分化を刺激し、最終的には大量の前駆細胞および最終まで分化した成熟細胞集団が形成される。この状況において、これらの生成した細胞集団は次いで、阻害因子の分泌を通してHSC増大をインビトロで妨害する可能性がある。
【００２２】
分化した細胞が幹細胞増殖を阻害する可能性があることを示すさらなる証拠は、マウス再増殖幹細胞のインビボ増大能力が実際に、幹細胞の移植数の増加によって制限される得ることが示されたマウス移植研究から得られる(19、20)。これらの報告は、注入された再増殖細胞から生じるレシピエントマウスにおける成熟血液細胞の回収および産生が、最終的には幹細胞増殖を制限する阻害メカニズムを活性化することの原因であり得ることを示唆した。従って、培養培地中で成長因子の局所的濃度を減少させる目的で、例えばこれらに限定されないが、培地希釈、培地交換、灌流などによって、培養中のこれらの成長因子から未分化細胞を分離する。
【００２３】
内因性に分泌された因子が培養アウトプットに負の影響を与え得ることの実証は、個々の阻害因子に対して特異的に指向されるブロッキング抗体またはアゴニスト(すなわち、オリゴヌクレオチドまたは競合的レセプターブロッカー)が、インビボモデルとインビトロモデルの両方において、TGF-β1、MIP-1α、(MCP)-1、およびSDF-1などの既知のインヒビターの効果を首尾よく逆転または妨害した研究から得られる(48〜52)。不運にも、このようなブロッキングスキームを用いては、再増殖しているHSCのより高度な増大につながらなかった。おそらく、複数の分泌因子がこの集団を阻害するための原因であるからであろう(31)(31、48〜55)。
【００２４】
幹細胞増大についての1つのモデルは、サイトカイン補充培地中で生じる分化した血液細胞がHSC増大を直接的または間接的に妨害する可溶性因子を産生する、ネガティブフィードバック制御メカニズムを含む。このメカニズムは、これらの細胞またはこれらの細胞によって生成される内因性因子の除去が、幹細胞に対して提示されるシグナルのバランスを(すなわち、補充されたサイトカインおよび分泌されたサイトカインから)増大を妨害するものから増大を促進するものにすることにより、HSC増大に対するブロックを除去することを示す。これらの細胞の除去はまた、刺激因子を分泌し得る細胞について富化するためのメカニズムを提供し得る。刺激因子および阻害因子の内因性の産生を制御および調節する使用可能な方法はこのように、現在のHSC発現系の制限を克服する。本明細書に記載される発明は、部分的には、内因性に産生された阻害因子および刺激因子の全体的な効果を制御することによって、エクスビボでHSCを増大するための装置およびプロセスを述べる。
【００２５】
培地交換と組み合わせて培地から特異的標的細胞を除去することは、培地中に存在する阻害因子の内因性産生および全体的な濃度を同時に減少し、次にHSC集団のさらなる増大を生じる(56)。
【００２６】
本明細書に記載のように生成させたHSCは、種々の臨床的用途に使用できる。例えば、増大されたHSCは、集中的な治療の後に免疫および造血の回復を増強または加速する目的で、放射線治療または抗癌剤を使用する化学療法によって誘導された血球減少および貧血を緩和するために移植することができる。代替的には、本発明は、リンパ球減少症、例えば慢性HIV感染に見られるCD4+T細胞欠損などに関連する感染性疾患の予防および治療のために使用できる。HSCは、特定の血液細胞型を産生するために分化因子とともに培養され得る。例えば、本発明を使用して産生されるHSCは、公知の生物学的薬剤を使用して所望の集団および機能の細胞に分化するように誘導され得る。この様式において、本発明は、患者への最高の配慮を提供するように確立された、複数の機能を持つ「デザイナー移植物」を作成することが可能である。HSCはまた、低い免疫原性および多能性特性を利用して、レシピエント対象において導入遺伝子を発現するために遺伝子治療において使用できる。
【００２７】
本発明は、幹細胞または前駆細胞、特に造血細胞系統のものを増大することを提供する。このプロセスは全体として、造血幹細胞および前駆細胞、例えばlin-細胞について富化されている造血細胞を入手する工程、および適切な増殖培地にそれらを導入する工程を含む。細胞を培養中に維持して増殖させる。分化した細胞および内因性の成長因子は、培養の間に連続的に、あるいは培養プロセスの間に断続的にかのいずれかで、例えば培養中に残っている細胞に培地交換をすることによって、そして分化した細胞を標的として分離し除去することによって除去される。残存している未分化幹細胞を培養して、さらに増殖させる。複数サイクルの培養および選択/培地交換を実行し、細胞を増大させる。代替的には、系統の方向付けの種々の相における分化した細胞を選択し、本発明に従ってさらに増殖させることができる。同様に、1つまたはそれ以上の造血素を、強制的に分化または系統の方向付けをするために培養に加えることができる。細胞増大および選択は、FDAならびに血液製剤の取り扱いおよび処理を規制している他の規則に従って、完全に制御可能で、環境が閉鎖された系において実行されること、および無菌状態を維持することが好ましい。これらの方法およびこのバイオプロセスを実行するための代表的な装置は、以下に詳細に議論する。
【００２８】
本明細書に開示されるバイオプロセスは、実施例に例証されるように、開放系としてまたは閉鎖系として実施され得る。閉鎖系は一般的に、環境から密閉されており、より調節可能な無菌微小環境を培養に提供する。閉鎖系に対するさらなる利点には、生物学的液体の取り扱いにおける研究者および医療従事者のための安全性の増加が含まれる。現在のFDAおよび他の管理ガイドラインは、ヒトにおける使用のために設計された血液細胞および製剤の取り扱いおよび処理のために閉鎖系を求めているため、そのようなものが好ましい。しかし、造血幹細胞の増大のための開放系があり(例えば、本明細書に記載されるようなもの、および例えば米国特許第5,674,750号および同第5,925,567号(各々その全体が参照により本明細書に組み入れられる))、また他の公知の系を本明細書に提供される教示に従って修飾し、適切な開放系バイオプロセスを作成することができる。
【００２９】
本発明は、細胞の試料を受容し、かつそれを含むことが可能な、1つまたはそれ以上の細胞培養チャンバーからなる。この細胞培養チャンバーは、例えば細胞培養フラスコもしくはディッシュの場合には実質的に剛性（rigid）であってよく、または例えば細胞培養バッグの場合には半剛性であってよい。Corning Costarによって製造されているものなど、多くの型および種類の細胞培養容器(チャンバー)が市販されている。適切な素材は、オートクレーブおよびγ放射などの種々の滅菌技術に耐えることができるものであり、また、細胞と直接接触する成分は生物学的に不活性であるべきである。適切な細胞培養チャンバーの選択はこれらの観点からなされ、所望される容量、透明度、ガス拡散、開放または閉鎖設計、ならびにチャンバーの型および種類の特定の選択などのその他のファクターは、提供される教示から当業者には明らかであろう。現在好ましい態様は、酸素ガスおよび二酸化炭素ガスに対しては半透過性であるが、水蒸気および細胞培養培地などの液体に対しては実質的に不透過性である細胞培養バッグを利用し、培養の間に増殖培地を全く損失しないか、またはほとんど損失しない。フッ素化エチレンポリマーは、この目的に適した材料の例である。ガス透過性ではないが、適切な基準を満たす他の材料としては、ポリプロピレン、ステンレス鋼、および他の医薬グレードの材料、特にポリマーが挙げられる。
【００３０】
細胞培養チャンバーは、1つまたはそれ以上のポート、交換可能なキャップまたはカバー、自己シーリングセプタム、例えば、ラバーストッパー、バルブ、または、外部環境に対してバイオプロセスの内部を実質的に曝露させずに、ユーザーがチャンバーから物質を加えたりまたは除去したりすることを可能にする同様の手段を含み得る。例えばこれらのメカニズムは、環境的に閉鎖された系を維持しながら、細胞、培地、および他の成分、例えば抗体および成長因子などをチャンバーに導入することを可能にし、培地、細胞、内因性可溶性成長因子などをチャンバーから除去することを可能にする。外部ガス(例えば、酸素または空気)もしくは液体(例えば培養培地)の供給源を取り付けるため、またはポンプもしくは圧力デバイスを取り付けるための、ベント、レギュレーター、または他のポートを提供してもよい。
【００３１】
現在の好ましい態様において、第1の細胞培養チャンバーは、最初の培養および細胞の増大のために使用される。選択後、第2の細胞培養チャンバーを、所望の細胞を引き続き増大させるために使用する。閉鎖系を維持するために、この態様は、第1の細胞培養チャンバーと第2の細胞培養チャンバー間の液体での連絡を達成するための手段を提供する導管を備える。細胞培養チャンバー間の液体の移動は、導管を通して、上記のようなフローレギュレーター、ポートもしくはバルブ、ポンプ、または同様のデバイスによって調節できる。
【００３２】
導管は、導管の内腔中に位置しても外部にあってもよい選択エレメントを備え得る。選択エレメントは例えば、富化マトリックスの形態を取り得、これは例えば導管の内部に含まれるマイクロビーズなどであり、リガンドに対して特異的な親和性を有し、または特定の電荷を有し、例えば抗CD34モノクローナル抗体が共有結合したAffi-Gelビーズなどである。
【００３３】
選択エレメントは、特定の表現型、例えば分化した細胞に特徴的なものを有する細胞を標的として選択する。選択エレメントの1つの役割は、選択表面に分化した細胞を固定化し、それによって培養中の分化した細胞の数を減少させること、およびそれらを未分化細胞から分離することである。例えば、選択エレメントは、全（pan-）分化した造血細胞に対して免疫特異的な抗体を有するビーズ、例えば、StemCell Technologies製のものを含み得る。抗体は、分化した細胞のアフィニティー分離のための優秀な手段を提供する。なぜなら、分化した細胞に対する多くの抗原性マーカーが存在し、これらの抗原に対する抗体は市販されているからである。しかし、抗体は、標的化された免疫分離のための1つの手段を提供するものであり、F(ab)またはF(ab)2フラグメント、Fvフラグメント、および二特異性抗体(またはフラグメント)も使用することができ、免疫グロブリン全体での細胞分離の本明細書の記載は例示的でありかつ非限定的であることが意図される。細胞は、多数の他の手段、例えば、FACS、レクチン親和性、および当技術分野で公知の他の方法によって分離することができる。
【００３４】
選択エレメントは、未分化造血幹細胞に特徴的な抗原性マーカーを有する細胞を標的化および選択し、不均一な培養からそれらを取り出す。例えば、CD34+発現細胞を、CD34親和性を有する富化エレメントと接触させてそれに固定化させ得る。いずれかの態様において、表示的なポジティブ選択およびネガティブ選択は、標的化される特定の細胞、使用される選択エレメント、および選択エレメントが分化した細胞を標的化するか未分化細胞を標的化するかに関して適用され、例えば、標的細胞がCD34+でありかつ選択エレメントがCD34に対する親和性を有するならば、CD34+細胞の単離はポジティブ選択の例であるが;標的細胞がCD34+でありかつ選択エレメントが全分化した造血細胞に対して親和性を有するならば、マトリックスへの結合によるCD34+細胞の単離、および分化した細胞の培養物からの除去はネガティブ選択の例となる。
【００３５】
分化した細胞は、多くの方法によって未分化細胞から分離され得る。ポジティブまたはネガティブ選択法が好ましい。選択は、装置内の特定の部位、例えば選択エレメントを使用して導管内で達成され得、細胞は、1段階で、例えば導管を通過する間に、分離され得る。あるいは分離は、いくつかの段階を取ってもよい。例えば、磁気コロイドおよびlin+抗原に親和性を有する二特異性抗体を、磁気コロイドとともに細胞培養物に加える。このプロセスは、磁気コロイドをlin+細胞に効果的に結合する。磁気的に標識された細胞を、導管(これ自体が磁場中に配置されている)に通過させる。他の修飾は本明細書に記載されており、提供される教示に鑑みて当業者には明らかである。このように、未分化細胞および分化した細胞の分離は日常的であると考えられる。
【００３６】
本明細書に記載のバイオプロセスは、増殖および選択の連続的プロセス、または増殖および選択の非連続的プロセスを利用し得る。連続的プロセスにおいては、細胞を培養し、標的細胞の選択(ポジティブ選択またはネガティブ選択のいずれか)を、培地から細胞を除去せずに、あるいは細胞培養プロセスを妨害することなく行う。不連続的プロセスにおいては、培養および選択を段階的な様式で進める。モジュール式閉鎖系装置を使用する場合、不連続的バイオプロセスを利用する方が便利である可能性がある。なぜなら、組み立てられた装置を保持する必要なく、チャンバーを導管から取り外してインキュベーター中に配置できるからである。
【００３７】
ほとんどの場合、エクスビボHSC培養により造血を繰り返し、このようなものとして、最終的に造血系の成分を含む不均一な細胞集団を形成する。これらの細胞の全体的な発生の能力および始原性に対する洞察は、特定の培養法の始原細胞型を増大する能力に関する情報を提供する。この知見を発展させることは、分化の異なる段階にある細胞の強固かつ定量的なモニタリングを必要とする。別個の機能的特性に基づいて、これらの細胞を同定する種々のアッセイが開発されている。細胞機能は、形態学的に区別可能であるコロニーの形成に基づいて、方向付けられたおよび多能性の前駆細胞の存在を検出する確立された既存のアッセイを使用してインビトロで照会され得る。コロニー形成細胞(CFC)は、半固形培地(メチルセルロース)中で2〜3週間培養後に、赤血球系、骨髄性、または混合の(すなわち、赤血球系と骨髄性の両方)細胞を含有するコロニーの形成によって検出され得る前駆細胞である。長期培養開始細胞(LTC-IC)はCFCよりも始原的であり、間質細胞を用いる培養の5週間よりも後にCFCを生じる能力によって数えることができる(57、58)。間質細胞エレメントは、線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および骨形成原細胞を含む間葉細胞から構成され、LTC-ICの長期的増殖および維持を支える種々の可溶性因子を産生する。このアッセイの感度は、LTC-ICの検出および維持を増強することが知られている因子を分泌する、遺伝子操作されたマウス線維芽細胞(M2-10B4)細胞株の使用を通して増加させることができる(59、60)。
【００３８】
インビボ機能性アッセイは、造血細胞集団の発生的能力の最良の指標を提供する。なぜなら、このアッセイは、幹細胞集団が、静脈内注射後に特定の器官、組織、または系の発生または再発生に寄与する能力を直接的に試験するからである。例えば、免疫無防備状態で血液学的に易感染性の宿主への移植後に造血を再構成する能力に基づいて、マウスHSCが同定された。TillおよびMcCulloch(61)が、このような細胞型の存在を初めて報告し、彼らは、照射したマウスレシピエントに同系のBM細胞を注射し、脾臓において複数系統コロニーの形成を観察した。興味深いことに、これらのコロニーは、第二の宿主に移植した際にさらなるコロニーを形成し得る細胞を含んでいた。
【００３９】
多くの動物モデルがヒトHSCの存在を検出するために開発されてきたが(62〜65)、最も広範に使用されているものは、非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全(NOD/SCID)マウスを含む(66、67)。これらのレシピエントに定植することが可能な細胞は、NOD/SCID再増殖細胞(SRC)と呼ばれ(68)、マウスBMに存在し、かつそれに定植するヒトHSCであるとみなされており、ここで、これらは引き続き増殖し、かつ複数の血液細胞系統に分化する(69、70)。このアッセイは、所与の細胞試料中のHSC含量を定量するための手段として、標準的な限界希釈分析(LDA)を用いて、首尾よく使用されている(71)。
【００４０】
本発明は、例えば哺乳動物の血液を再増殖させるための治療的移植において、使用される造血幹細胞および前駆細胞を増大させるための装置および方法を提供する。これらの細胞は比較的まれであるので、出発細胞集団はまず、当技術分野において公知の方法を使用して入手する。血液、例えば動化した（mobilized）末梢血(PB)および骨髄(BM)が適切な供給源であるが、臍帯血(UCB)がこれらの未分化細胞の富化された供給源を提供する。これらの供給源から、培養前に、例えば単核球細胞(MNC)画分を精製することによって、造血幹細胞または前駆細胞含量をさらに富化することもできる。これは、例えばFicoll勾配などを通して、遠心分離を使用することによって達成され得る。造血幹細胞および前駆細胞のさらに富化された集団の単離は、蛍光活性化細胞ソーティング、ガラスウールへの固定化、カラム分離もしくはビーズ分離の技術、または他の公知の富化法を使用して達成され得る。多くの適切な型が当技術分野において公知である。
【００４１】
本発明に従って、培養中のHSCは、分化および特定の系統への方向付けされることを防ぐために、(亜集団選択および/または培地交換の手順を通して)阻害性造血素から分離される。造血素は、造血性成長因子(HGF)または造血性サイトカインに与えられた総称であり、造血系細胞に作用する。これらの因子は発生の全段階において活性であるため、これらの造血素をHSC分化を防ぐためにバイオプロセスから除去する。
【００４２】
造血性成長因子は、造血系に属さないものを含む多くの異なる細胞型によって産生される。これらの因子は分泌されるか、または膜結合型もしくはマトリックス結合型で存在する。これらはまた、異なる作用様式、例えば、オートクリン、パラクリン、またはジャクスタクリン性の成長制御を有し得る。造血因子の産生は厳密に調節されている。すなわち、常時構成的に産生されるのではなく、特定の条件下で活性化された細胞によって合成される。多くの観察により、造血系の発生に関与する因子の秩序だったヒエラルキーおよび協調的な作用の存在が指摘されている。これらの因子は、造血幹細胞の維持、増殖、異なる造血系統への分化のために、および増殖と分化との間の安定な平衡の維持のために必要である。これらの因子は、生物が必要に応じて、例えばストレス条件下でこの平衡を一方または他方にシフトすることを可能にする。これらの因子の多くは生物学的活性が重複している。目的論的には、これは、高い効率を保証し、また、例えば病理学的な条件下ではその機能が損なわれるかもしれない個々の構成成分の置換および/または相補を可能にする。さらに、これらの因子によって誘発された応答は通常、状況に応じる。すなわち、これらの応答は、応答細胞の環境中の他のサイトカインおよび/または因子の存在および濃度に依存する。HSC増大をインビトロで刺激することを目的とする研究の大部分は、外因性サイトカイン補充ストラテジーの使用に焦点を当てている。サイトカインは、3つのクラスの膜貫通レセプター:1)固有のチロシンキナーゼ活性を有するもの、2)gp130サブユニットと相互作用するもの、および3)Janusキナーゼ(JAK)と相互作用するものを介して、HSCと相互作用する(88、89)。何年間もにわたって、表現型アッセイおよび機能的アッセイの使用により、始原性造血細胞に対して異なる刺激効果を有する多数のサイトカインが同定されてきた。これらには、flk2/flt3リガンド(FL)、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン(IL)-6、IL-6/可溶性IL-6レセプター(SIL-6R)、IL-11、トロンボポエチン(TPO)、IL-3、IL-1、IL-12、顆粒球-コロニー刺激因子(G-CSF)および顆粒球-マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF)が含まれる(90〜101)。IL-1、IL-3、IL-6、G-CSF、GM-CSF、およびSCFを含む、間質を含まないサイトカイン補充培養の最初に報告された使用により、コロニー形成単位-顆粒球-マクロファージ(CFU-GM)前駆細胞の有意な増大(66倍)が示された(102)。従って、これらの造血素は、HSCの分化を調節するためにバイオプロセスに導入してもよく、除去してもよい。
【００４３】
上記したものなどの一部の因子は、造血のプロセスをネガティブに調節する。例えば、これらは、ある型の造血細胞の増殖を選択的に阻害する可能性があり、時には細胞死をも誘導し得る。例えば、造血細胞培養へのTGF-βの添加は、再増殖している幹細胞(103)、LTC-IC(48)、および始原CFC(104、55)の増大を直接的に阻害するが、より成熟した前駆細胞には効果を有さない(105)ことが示されている。TGF-βがCD34+CD38-細胞の増殖を優先的に阻害するのに対して、より成熟したCD34+CD38+細胞への影響は乏しい(106)という知見も同様である。TGF-βの機能的効果は、細胞が細胞周期を通して進行することを妨害する能力に帰される。TGF-βの存在下において、始原細胞集団(CD34+細胞を含む)は、G0からG1に、またはG1からS期のいずれかの移行が不可能であることが示されている。これはおそらく、サイクリン依存性キナーゼ(cdk)インヒビターp15、p27、およびp21(31、107)のアップレギュレーションに起因する。最後に、TGF-βはまた、シグナル伝達がHSCのインビトロ増殖に重要であるレセプタータイプ(c-kit(108、109)、c-mpl(100)、およびflt3/flk2(107、110)を含む)の発現をダウンレギュレートすることによってその作用のいくつかを誘発し得る。MIP-1αは、刺激因子の存在下でさえ、始原造血細胞(CFU-GEMMおよびCFU-GMを含む)を増殖を阻害することが示されている(33、111〜113)。マウス(C3H/HeJおよびBDF1系統)へのMIP-1αのインビボ投与は、チミジン殺傷アッセイ(これは細胞周期にある細胞を効果的に殺傷する)(114)を使用してアッセイして、サイクル中で始原前駆細胞の数を有意に減少し、かつヒドロキシウレアの細胞毒性効果から幹細胞および前駆細胞を保護する(115)。興味深いことに、MIP-1αは、より成熟した前駆細胞に対してはほとんど効果を有さない、または刺激効果さえ有し(116)、MIP-1αが多面的な因子である可能性が示唆される。IL-3は、阻害機能を有すると考えられている別のサイトカインである。これは、HSC増大を刺激または阻害する能力に関して矛盾する報告があり、議論の余地があるサイトカインである。IL-3は、LTC-ICおよびCFCを含む始原細胞の増殖に関連付けられており、増大培地中で有効であると報告されたサイトカインの組み合わせにおいて見い出されることが多い(117)。逆に、一部の研究により、IL-3は濃度依存的な様式で始原幹細胞の増大および自己複製を無効にすることが可能である(118)ことが示されており、ヒトとマウスの両方のモデルにおいて、IL-3はHSCの再構築能力を損なうことが示されている(35、119)。これらの観察は、IL-3が、CXCR4レセプターを通して間質由来因子-1(SDF-1)に対する走化性応答を損なうことによって、HSCがBMに存在することを妨害し得(120)、それによって非造血組織における潜在的な定植細胞のインビボクリアランスおよび破壊を生じるという最近の知見によって、いくぶん明らかにされている。さらに、SCF(121)およびFL(34、122)を含む刺激性サイトカインで補充された培養中のTNF-αの存在は、おそらくFas(TNFレセプターファミリーのメンバー)シグナル伝達を通してアポトーシスを促進することにより(123)、前駆細胞の増殖を強力に阻害し得る(124)。他の阻害性サイトカインの例としては、単球化学誘引タンパク質(MCP)-1(52)およびSDF-1(125、126)が挙げられる。これらの造血素は、記載されたように、バイオプロセスに導入または除去され得る。
【００４４】
全体として、これらの因子の多くの作用は、幹細胞の連続培養に関連する問題を強調している。なぜなら、造血素は一般的に、系統の方向付けを妨害するために除去される必要があるからである。代替的には、これらは、強制的に系統の方向付けをするために特定の培養に加えられ得る。対照的に、特定の造血素は、CD34+細胞の未処置および未分化状態を保存することが可能であり、バイオプロセスにおけるそれらの付加または富化は収率を改善し得る。従って、バイオプロセス中の造血素の調節は、本明細書に提供される教示に鑑みて当業者の能力の範囲内と見なされる。
【００４５】
HSCを増殖するための例示的な培養条件は実施例に示されているが、全体としては本発明に従って、始めにHSCのサブセットを含む細胞の試料を入手し、次いで培養する。培養された細胞を次いで、増殖させるのに適切な増殖期間の間維持し、これは可溶性成長因子を除去するための培地交換を含み得、その後、HSCを他の分化した細胞から分離する。次いでHSCを、記載のように再度増殖させる。必要であれば、分化した細胞を再度分離することができる。培養期間の最後に、増大されたHSCを、例えばグリセリン、DMSO、または適切な凍結保存剤の添加後に凍結することによって保存することができ、または治療的手順に直接使用することができる。上記の工程は、組み立てられたバイオプロセス装置全体を用いて、または細胞培養が細胞分離と独立して実行される別々の部品中で実行可能であることに注意することが重要である。
【００４６】
HSCの臨床的使用には、例えば、血液の癌の治療的処置、貧血の治療、遺伝性血液障害の治療、癌の治療における高用量の照射および化学療法の後での血液細胞の再補充、癌の移植片対腫瘍治療、自己免疫障害の治療、および遺伝子治療アプローチにおけるものが含まれる。
【００４７】
血液の癌(リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病(CML)、ホジキン病、多発性骨髄腫、および非ホジキン・B細胞リンパ腫を含む)の治療的処置のためには、まず、患者自身の癌性造血細胞を、高用量の照射および化学療法によって破壊する。一致したドナー(同様のHLAプロフィールを有する)が、移植可能なHSCの供給源を提供し、これを本明細書に提供される方法に従って、単離および増大する。未分化細胞の移植は、レシピエントの血液の長期的な再増殖を提供する。HSC治療による処置に供しうる非癌性血液障害としては、再生不良性貧血および他の型の貧血が挙げられる。未分化細胞の移植は、レシピエントの血液の長期的な長期的な再増殖を提供する。UCBを使用して、多数の研究により、細胞用量が幹細胞移植シナリオにおいて患者の生存の重要な決定要因であることが実証されている(127)。Wagnerら(2002)は、1.7×105CD34+細胞/kg体重より少量を受容する患者において、定植の速度が減少することを報告した(72%、多くの用量を受けた患者における93%に対して)(128)。同様に、3.7×108MNC/kgの移植は、3.7×107MNC/kg(すなわち、1対数少ない)のみを受容した患者よりも迅速な定植を生じたが、より低い細胞用量を受容した患者もまた、良好な定植を示したことが見い出された(127、129)。これらの結果に基づいて、UCB移植の最小細胞用量は3.7×107MNC/kgとすることが推奨された(127)。典型的なUCBコレクションは平均で約1.4×109MNCを含む(Cairo, Blood, 1997, 90:4665)ことから、平均的な臍帯血試料は、最大約37kg(約81lbs)の体重の患者に移植するのに十分であると計算された。同様の計算によって、Toronto Umbilical Cord Blood Bankにある4000件を超える保管試料の75%が、小児科の骨髄移植に有用であるだけに十分である細胞を含むと報告された(すなわち、約24kgまたは約53lbsの体重の患者)(130)。それゆえ、これらおよび他の保管試料が、成体の単回または複数回の移植のためのHSCの有用な供給源となるように、または複数の組織再生治療のために、HSC含量を増加する必要がある。本明細書に記載されるHSCのエクスビボ増大により、このような解決が提供される。このバイオプロセスはまた、成体供給源から未分化細胞を増大するために使用することもでき、例えば、ドナーが自分自身の骨髄または臍帯血を提供することによって、ドナーにこれらの細胞を移植し戻す際の免疫性ミスマッチが排除される。代替的には、このバイオプロセスは、同種異型であるが免疫原性でなく、従って移植目的に適切な、多能性造血細胞を増大するために使用され得る。
【００４８】
このバイオプロセスは、治療タンパク質をコードする導入遺伝子を取り込むようにエクスビボで遺伝子改変された未分化細胞から治療用タンパク質を発現するために使用され得る。造血細胞を得、導入遺伝子でトランスフェクトし、そして記載のように培養中で増大する。分化した細胞を培養から除去し、未分化細胞を導入遺伝子の発現についてアッセイする。導入遺伝子をポジティブに発現する細胞を哺乳動物に移植する。幹細胞は免疫原性が低いため、この細胞型は遺伝子治療に非常に適する。
【００４９】
本発明の他の用途が意図される。例えば、本バイオプロセスは、後に凍結保存され得るか、または移植手順に使用され得る未分化細胞(例えば、lin-、CD133+、CD34+、長期的に再増殖するNOD/SCID、および他の未分化細胞)の亜集団を増大するために、営利および非営利の血液保管組織によって使用され得る。ドナーが細胞試料を提供してもよく、または医学的手順を受けようとする患者が、増大される細胞の供給源を提供してもよい。後者の場合、細胞はレシピエントと免疫学的に完全に一致する。このように、未分化細胞を保存、処理、および提供する市販の方法は、本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
このように、本発明は上記例によって具体的な語句で述べられたが、これは単に例示するのみであって、非限定的かつ特定の態様であることを意図しており、本発明の完全な範囲は特許請求の範囲のみによって決定されるべきである。
【００５１】
実施例
1. 細胞試料の収集および精製
UCB試料を、Mt. Sinai Hospital(Toronto, ON, Canada)の倫理委員会によって受理された手順に従って、同意したドナーから収集し、10%ペンタスターチ(Bristol-Myers Squibb Canada, Montreal, QC, Canada)上で遠心分離し、単核球細胞(MNC)画分を得た。このMNC画分から、製造業者のプロトコール(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada)に従ってStemSep(商標)システムを使用して、系統枯渇(lin-)細胞を単離した。手短に述べると、MNCを、2%ヒト血清(HS)を含むHanks緩衝化生理食塩水溶液(HBSS, Gibco, Rockville, MD)中で、50×106細胞/mlの濃度で収集した。次いで、選択抗体カクテルを100μl/ml細胞懸濁液の濃度で加えた。使用した抗体カクテルは、CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b、およびグリコホリンAを発現する細胞を除去する。次いで、細胞を室温で(RT)15分間インキュベートし、その後磁気コロイドを60μl/ml細胞懸濁液の濃度に加えた。次いで、細胞を、RTでさらに15分間インキュベートした。これらの工程は、出発MNC試料から除去されるべき標的細胞(lin+細胞)に磁気粒子を効果的に結合する。次いで、細胞を、磁気ビーズを含む磁気カラムに通し、lin-細胞画分を単離した。磁気カラムは分離工程の前に外部磁場中に配置した。
【００５２】
2. バイオプロセスの組み立て
バイオプロセス装置を以下の手順を使用して組み立てた。
【００５３】
2つの3ml FEP培養バッグ(VueLife(登録商標)、American Fluoroseal Corporation, Gaithersburg, MD)を細胞培養チャンバーとして使用して、選択前および選択後の細胞を培養した。各バッグを、自己シーリングラバーセプタム(InterLink, American Fluoroseal Corporation)に入口ポートで適合させた。
【００５４】
約4〜5インチ長の1/8インチ内径FEP裏打ちTygon(登録商標)チュービング(Cole-Parmer, Vernon Hills, IL)を導管として使用し、富化ビーズの形態で選択エレメントを収納するために適合させた。ビーズをチュービング中に保持するために、まず80メッシュ430ステンレス鋼ふるい(Stem Cell Technologies)の0.12インチ〜0.15インチ直径のピースを2つ打ち抜き、それらをチュービングの内径にすっぽりとフィットさせて成形した(すべて機械化された打ち抜きおよび成形を使用して行った)。次いで、ふるいの1つを、小さな金属プランジャーを使用してチュービング中に(ほぼ真ん中に)配置した。ふるいの平らな面がチュービングの長さ方向に対して垂直になるように挿入するよう注意を払った。次いで、富化ビーズ(Stem Cell Technologies)を、約1インチの長さを満たすまでチュービング中に配置し、その後、第2のふるいを、ビーズを場所に保持するためにチュービング中に挿入した。これらのビーズは、上記のように、細胞の磁気分離を補助する。次いで、1/8インチのオスのルアーフィッティング(Cole-Parmer)をチュービングの各端に配置し、そこに2つのネジ付きロックカニューレ(American Fluoroseal Corporation)を結合させた。このカニューレは、培養バッグを滅菌充填、サンプリング、または空にするための自己シーリングラバーセプタムと対合する。この選択エレメントは「富化エレメント」とも呼ばれる。
【００５５】
次いで、富化エレメントを、セプタムおよびカニューレの対合を介して2つの培養バッグ間に接続した。ここで、全体の組み立てられた製品は、その全体を「バイオプロセス装置」または「バイオプロセス」と呼ぶ。上述のように、バイオプロセスは、全体的に組み立てられ、または不連続な部分として使用することができ、細胞分離とは別に細胞培養を実行することができる。1つの修飾型として、単一の組み立て製品としてのバイオプロセスの使用は、三方コック(Cole-Parmer)を培養バッグの1つとチュービングの間に配置することを必要とする。このコックにより、培養バッグを細胞および増殖培地で満たすことが容易となる。この場合、滅菌セプタムをコックの入り口ポートに結合する。
【００５６】
3. 開放系における細胞播種および培養
lin-細胞を、Iscove's MDM、1% BSA、10μg/ml rh インスリン、200μg/mlヒトtransferring、10-4M 2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを含むStemSpan(商標)培地(Stem Cell Technologies)中に、1×105細胞/mlで播種した。この培地に、100ng/ml SCF(Amgen, Thousand Oaks, CA)、100ng/ml FL(Amgen)、および50ng/ml TPO(R&D Systems, Minneapolis, MN)を補充した。次いで、約1.5mlの細胞懸濁物を24ウェルプレートのウェルに配置し、空気中5% CO2の加湿大気中、37℃で8日間維持した。培養4日後に再選択(すなわち、培養中に生成したlin+細胞を除去するため)を行った。
【００５７】
4. バイオプロセスにおける細胞播種および培養 
lin-細胞を、Iscove's MDM、1% BSA、10μg/ml rh インスリン、200μg/mlヒトトランスフェリン、10-4M 2-メルカプトエタノール、および2mM L-グルタミンを含むStemSpan(商標)培地(Stem Cell Technologies)中に、1×105細胞/mlで播種した。この培地に、100ng/ml SCF(Amgen)、100ng/ml FL(Amgen)、および50ng/ml TPO(R&D Systems)をさらに補充した。次いで、約2〜3mlの細胞懸濁物を、ネジ付きカニューレに結合した滅菌シリンジを使用して、3ml培養バッグに(セプタムを通して)注入した。次いでこの培養バッグおよび細胞内容物を、空気中5% CO2の加湿大気中、37℃で維持した。培養4日後、再選択(すなわち、培養中に生成したlin+細胞を除去するため)を記載のように実行した。
【００５８】
5. バイオプロセスにおける細胞選択および培地交換
バイオプロセスにおけるlin-細胞選択を行った。抗体カクテルおよび磁気コロイドとの細胞のインキュベーションを、増殖培地中に残存している細胞を含む培養バッグ内部で実行した。抗体カクテルおよび磁気コロイドは、製造業者によって示唆される量の半量を使用した。次いでこれらの工程の後、細胞を富化エレメントを通過させた(流れをコックに通過させて、またはセプタム/カニューレ対合を介して富化エレメントにバッグを結合させて)。流速実験のためには、ペリスターポンプを、第1の細胞培養容器に適合させた。StemSep(商標)システムと同様に、富化エレメントを備える導管を、分離の前に外部磁場に配置した。導管、従って富化エレメントを通過させ、精製されたlin-細胞を第2の培養チャンバーに流入させ、さらなる処理のために収集した。
【００５９】
培地交換を、培養バッグ中の富化されたlin-細胞に対して実行し得る。手短に述べると、培養バックを15または50mlコニカル遠心チューブ中に配置して、細胞を遠心分離する(バッグを安定化するため、およびバッグが倒れるのを防ぐためにティッシュペーパーを使用し得る)。次いで、チューブを5分間、約1000rpmで遠心分離すると、細胞ペレットが培養バッグの底に見える。次いで、培地を、滅菌シリンジを使用して、自己シーリングセプタムを通して注意深く除去する。細胞が除去されないように注意を払わなければならない。次いで、新鮮な培地を同じセプタムを通して加える。このプロセスを自動化培地交換に適合させることができる。
【００６０】
6. 表現型分析
表現型分析を、フローサイトメトリーを使用して実行した。CD34、CD38、CD19、およびCD33の発現を、まず細胞を収集してから、2% HSAを含む氷冷HBSS(HBSS-HS)中で細胞を洗浄して分析した。次いで、5×104細胞から100×105細胞を、飽和量の適切な抗体またはアイソタイプ対照を含む100μlのHBSS-HS中に、氷上で30分間再懸濁した。次いで、染色された細胞を、HBSS-HSを用いて洗浄し、10%ホルマリン溶液(Fisher, Nepean, ON, Canada)中に再懸濁した。固定された細胞をすぐにフローサイトメトリーを使用して分析するか、または後の分析のために4℃に置いた。CD45およびHLA-abc発現を下記のように評価した。フローサイトメトリー分析を、4-Color Expoソフトウェアを用いるCoulter EPICS XLを使用して、またはEliteソフトウェアを用いるCoulter EPICS Elite(Beckman Coulter, Miami, FL)を使用して実行した。CD34、CD38、CD19、CD33、CD45、およびHLA-abcの発現を、抗CD34-PE、抗CD38-FITC、抗CD19-PE、抗CD33-PE、抗CD45-PE/FITC、および抗HLA-abc-FITC(Beckman Coulter)を使用して評価した。アイソタイプ対照を、抗IgG1-PE、抗IgG1-FITC、および抗IgG2a-FITC(Beckman Coulter)を使用して試験した。
【００６１】
7. コロニー形成細胞(CFC)アッセイおよび長期培養開始細胞(LTC-IC)アッセイ
培養していない細胞または培養後の細胞を、Iscove's MDM、30% FBS、1% BSA、10-4 M 2-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhGM-CSF、10ng/ml rhIL-3および3単位/ml rhEPO中に1%メチルセルロースを含むメチルセルロース培地(MethoCult(商標)、Stem Cell Technologies)に500個の細胞をプレートすることによって、CFC含量についてアッセイした。インキュベーション14日後、2つ組または3つ組の培養を、CFC含量および頻度についてスコア付けした。
【００６２】
LTC-ICアッセイを、6ウェルプレート中の照射ヒト間質細胞(M2-10B4)に、まず2000個の細胞を播種することによって実行した。α-MEM、12.5% HS、12.5% FBS、0.2mMイノシトール、20mM葉酸、10-4M 2-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、および10-6Mの新たに溶解したヒドロコルチゾンを含むMyeloCult(商標)培地(Stem Cell Technologies)を使用して毎週半分培地を交換し、37℃で5週間、細胞をインキュベートした。5週間後、各ウェルの全内容物を、トリプシン処理によって収集し、メチルセルロース培地(上記を参照されたい)にプレートした。次いで、LTC-IC含量および頻度を、14日後に存在するCFCを分析して決定した。
【００６３】
8. 非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全(NOD/SCID)マウスへの細胞の移植
新鮮なlin-細胞、または記載した培養条件を使用して増殖させたlin-細胞の子孫のいずれかを、致死量以下で照射した(3.6Gy)8〜10週齢NOD/SCIDマウスに、静脈内注射(LT-SRCについて試験するため)または大腿内注射(R-SRCについて試験するため)のいずれかを使用して移植した。NOD/SCIDマウスは、新鮮なlin-細胞、またはバイオプロセスを使用して増殖された(上記を参照されたい)lin-細胞の子孫のいずれかの移植物を受容した。静脈内実験については、以前に報告されているように(71)、標準化された尾静脈注射法を介して細胞を導入した。大腿内実験については、まず、2.5%アベルチン溶液を使用してマウスを麻酔した。次いで、右の膝を折り曲げ、25μlの細胞試料を膝関節を通して右大腿骨のBM腔に直接注射した(131)。
【００６４】
実験の終わりに(IVについては6〜8週;IFについては2週)、マウスを屠殺し、右および左の大腿骨から骨髄を収集し、ヒト細胞定植について分析した。IVで細胞を受容したマウスの骨髄は分析の前にプールし、一方IF移植を受けたマウスからの骨髄試料は別々に分析した。塩化アンモニウム溶解(Stem Cell Technologies)を使用して赤血球を除去し、細胞を100μlのHBSS-HSに懸濁し、飽和量のCD45/HLA-abc抗体またはアイソタイプ対照とともに氷上で30分間インキュベートして、ヒト定植片を決定した。次いで、染色された細胞を洗浄し、死滅した細胞内容物を染色するためにヨウ化プロピジウム(PI)を含むHBSS-HS中に再懸濁した。次いで、細胞を、ヒト細胞含量(CD45+)について、フローサイトメトリーを使用して分析した。移植されたNOD/SCIDマウスを、FACS分析を使用して、収集されたBM細胞の少なくとも0.1%がヒトCD45を発現した場合にポジティブであるとスコア付けした。
【００６５】
9. 逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)
TGF-βおよびMIP-1αのmRNA発現をRT-PCRを使用して決定した。手短に述べると、500μlのTrizol試薬(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)中に細胞を5分間溶解し、続いて100μlのクロロホルムを加えることによって、総細胞mRNAを収集した。12,000gで15分間の遠心分離の後、水相を収集し、イソプロパノールを混合して、mRNAを沈殿させた。次いで、12,000gで10分間の遠心分離によってmRNAペレットを得、70%エタノール中で洗浄し、滅菌水中に再懸濁した。次いでmRNA濃度を、microQuantプレートリーダー(Biotek Instruments, Winooski, VT)を使用して決定した。
【００６６】
微量遠心チューブ中、1〜5μgの総mRNAを、1μlのオリゴ-dTおよび滅菌水と混合して最終容量12μlとして、mRNAのcDNAへの合成を実行した。次いで、この混合物を70℃で10分間加熱し、氷上で急冷した。次いで、4μlの5×第1鎖緩衝液、2μlの0.1M DTT、および1μlの10mM dNTPミックス(各10mMのdATP、dGTP、dCTP、およびdTTP)の混合物をチューブ(Invitrogen)に加え、内容物を42℃で2分間インキュベートし、その後1μlの逆転写酵素(SUPERSCRIPT(商標)、Invitrogen)を加えた。ゲノム対照を、特定の試料に酵素を加えないことによって確立した。次いで、この混合物をさらに50分間42℃でインキュベートし、続いて70℃で15分間の不活性化を行った。次いで、得られたcDNAをPCRに使用した。
【００６７】
手短に述べると、2μlのcDNA溶液を、10μl 10×PCR緩衝液、2〜3μl 50mM MgCl2、1μl 10mM dNTPミックス、1μlセンスプライマー(25μM)、1μlアンチセンスプライマー(25μM)、1μl Taqポリメラーゼ(5U/ml)および80mlオートクレーブ水(Invitrogen)を含む23μlの溶液と混合して、PCRを実行した。PCR反応は、選択したプライマーに特異的な最適化された試薬濃度および温度を使用して実行した。使用したプライマーは以下の通りであった:
2006525013.tif 000003
【００６８】
次いで、PCR産物を、1%アガロースゲル上で試料を泳動して臭化エチジウム溶液で染色し、UV光源下でバンドを可視化して分析した。
【００６９】
10. 半定量的RT-PCR
半定量的RT-PCRを、以前に記載されたもの(132)を少し修飾して実行した。最初に、cDNAが連続的に10倍希釈される(全部で4試料について)希釈シリーズを作製した。次いで、これらの試料を記載のようにPCRに供した。処理間での定量的比較のために、増幅の直線範囲にある試料のみを分析した。β-アクチンを内部標準として使用した。
【００７０】
11. 酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
TGF-βおよびMIP-1αの分泌を、Quantikine ELISAキット(R&D Systems, Minneapolis, MN)を使用して測定した。両方とも、製造業者のプロトコールに従って行った。各試料中のタンパク質の量を、標準曲線に対する比較によって決定した。VERSAmaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用して、データの取得および分析を行った。
【００７１】
12. 統計学的分析
本明細書において示されるデータは、平均の±標準誤差(SEM)である。試験群間の有意差が示されている場合には、これはStudent T検定を使用して決定したものである。
【００７２】
R-SRCまたはLT-SRCの増大を、シングルヒットモデルに対してポアソン統計を適用し、限界希釈分析を使用して定量した(71)。R-SRCまたはLT-SRCの頻度は、以前に記載されたように最大可能性推定量（maximum likelihood estimator）を使用して計算した(133)。すべての場合において、計算されたχ2値は有意ではなく(p>0.10)、実験間のデータの収集が妥当であることが示された。
【００７３】
13. バイオプロセスにおける全細胞および前駆細胞の増大:培地交換を使用しない亜集団選択
バイオプロセスを試験するために行う最初の研究において、富化エレメントが全体の細胞増殖に対して有し得る効果を試験するために、培養細胞を、培地交換を使用しない亜集団選択に供した。表現型アッセイおよび機能的アッセイを使用して、通常の培養ディッシュまたはバイオプロセスのいずれかを使用して増殖させた全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、およびCFCの増大を比較した。これらの2つのシステムを試験するために、パラレル培養を確立した。パラレル培養は、3×105lin-細胞を単離し、1×105細胞/mlを、1)24ウェルプレートの2つのウェル(1.5ml/ウェル)にプレーティング、または2)3ml細胞培養バッグに注入した。次いで、細胞を4日間増殖させ、その後これらを亜集団選択に供した(培養の最初の4日間の間に生成したいかなるlin+細胞をも除去するために)。24ウェルプレート中で培養された細胞を、標準的なStemSep(商標)カラムおよびプロトコールを使用して富化した。次いで選択後、細胞をそのままさらに4日間増殖させた。
【００７４】
図2および3は、150,000(すなわち、24ウェルプレートの1ウェル中のインプット細胞の数)の開始細胞試料に標準化された種々の細胞型についての反応速度論的増殖プロフィール、およびインプット数と比較した細胞の全体の増大をそれぞれ示す。これらの研究結果により、バイオプロセスを用いることによって、標準的な培養ディッシュを使用して得られたものよりも高くないとしても、それと等価なほど、全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、およびCFCを増殖させることができることが示された。バイオプロセスを使用して増殖した細胞は、標準的な培養ディッシュ中で増殖した細胞と同様の機能的および表現型の特性も維持する。このデータはまた、細胞死を最小限に抑えながら(トリパンブルー色素排除を使用してアッセイした)、少なくとも8日間の培養期間にわたって全細胞および前駆細胞型の増大をバイオプロセス中で維持できることを示す。重要なことに、これらの結果は、選択エレメントおよび全体の選択プロセス(すなわち、培養バッグを行き来する細胞、フロースルーチュービングなど)が全体の細胞増殖に対してネガティブな影響を有さないことを示している。
【００７５】
14. 内因性因子産生の制御
培養操作が始原前駆細胞増大を増加させることが可能であったという知見に基づいて、阻害因子の内因性分泌に対する亜集団選択および培地交換の効果を決定する実験を設計した。これらの実験において、4つの異なる培養条件を試験した:1)選択なし、培地交換なし、2)選択なし、培地交換あり、3)選択あり、培地交換なし、および4)選択あり、培地交換あり。RT-PCRおよびELISA分析を使用した最初の研究により、TGF-β1およびMIP-1αが、未操作の制御培養における細胞によって発現および分泌されることが示された(図4)。TNF-α、IL-3、およびSDF-1αを含む他の阻害因子について試験したところ、これらはいずれも培養上清中に検出されなかった。結果的に、以降の分析は、本発明者らの培養操作がいかにしてTGF-β1およびMIP-1αの濃度および産生に影響しているかを決定することに焦点を当てた。
【００７６】
TGF-β1の産生は、亜集団選択によって有意に影響を受けることが見い出された。TGF-β1分泌速度を分析(細胞あたりベースで)したところ、培地交換を行ったか否かに関わらず、亜集団選択により分泌速度が有意に低くなることが示された(図5A)。このことは、選択プロセスにより、インビトロでTGF-β1を生成および分泌する細胞の集団が除去されるということを示唆する。この知見を確認するために、lin+細胞を、TGF-β1を発現および分泌する能力について詳細に分析した。これらの研究において、lin+細胞は、選択カラム(すなわち、カラム中に保持された細胞)またはFACSソーティングのいずれかによって収集された。図5Bに示されているように、lin+細胞は、収集の方法に関わらず、TGF-β1を発現および分泌する能力を有することが見い出された。lin+細胞は、6.8±0.1pg/細胞/時間(×106)の速度でTGF-β1を分泌することが見い出された。これらの知見により、選択プロセスが、確かにTGF-β1を分泌する細胞を除去することが示された。
【００７７】
MIP-1α産生の分析は、異なる現象を示した。MIP-1αの分泌速度は、亜集団選択が行われたか否かに関わらず、培地交換が行われた場合に影響を受けることが見い出された(図6A)。この知見により、本発明者らの培養へ新鮮な培地を添加すると、培養上清中にすでに存在しているMIP-1αが単純に希釈されるか、またはMIP-1αの生成を担う細胞によるMIP-1α発現および/もしくは分泌が直接的もしくは間接的にダウンレギュレーションされるかのいずれかを生じることが示唆された。次いで、MIP-1α発現が培地交換によって影響されるか否かを決定するための手段として、MIP-1α発現の半定量的RT-PCRを用いた。これらの実験において、細胞を4日間（この時点は、MIP-1α発現が高いことが知られている(以前の実験)）増殖した。次いで、培地交換を模倣するために、細胞を24時間、新鮮な培地に配置した。24時間のインキュベーション時間後、次いで、細胞を収集および分析した。図6Bに示されるように、MIP-1αの発現は、新鮮な培地中に配置した細胞において有意に低いようであった。このことは、より低いレベルのMIP-1α産生は、MIP-1α遺伝子発現の減少に起因する可能性があることを示唆する。
【００７８】
15. 哺乳動物移植用の臍帯血由来造血幹細胞増大のためのバイオプロセス
近年、臍帯血(UCB)が、血液学的障害および非血液学的障害を有する患者において造血を再構成するための骨髄移植(BMT)療法において使用するための、造血幹細胞(HSC)の重要な供給源として確立されている(134、135)。これらの細胞は、同種異系関連および非関連の両方の造血細胞移植のために使用されており、今日まで、2000件を超える移植が、全世界で子供と成人の両方で行われている(127、136)。UCBを使用する利点としては、対宿主性移植片病(GvHD)の発生の低さ、ドナーに対するリスクがないこと、ドナー摩擦（attrition）がないこと、およびドナーから患者へのウイルス伝播の低さが挙げられる(137)。重要なことには、UCB細胞は、HSCの数および増殖能力を損失することなく凍結保存および選択することが可能であるため、ドナーのプールを増強するための手段として、臍帯血保存のための可能性を提供する(138)。
【００７９】
移植に関するUCBの主な欠点は、典型的な臍帯血コレクションから収集され得る幹細胞の数が限定されていることである(139、140)。移植された細胞用量と患者の回復との間に直接的な正の相関関係が存在するという知見により、UCB由来のHSCのエクスビボ増大に関する集中的な研究が行われている(127〜129)。最近、多数のヒト臨床試験により、エクスビボで増大されたHSCが、集中的な骨髄破壊的療法後の免疫および造血の回復を補助する可能性が示されている(1〜4、141〜146)。これらの研究は有望ではあるが、再増殖している幹細胞が培養中にのみ維持される可能性があることを示唆する非増大細胞を用いて行われた研究(147)と比較して、一貫して有利な血液学的回復を実証したわけではない。しかし、本明細書に開示されるバイオプロセスのような、増加量のHSCをしっかりと産生することが可能な培養プロセスが、強く求められている。
【００８０】
一般的に、移植のための未分化細胞の産生に適したプロセスは、患者に投与される細胞製品の効力および安全性の両方を注意深く考慮しなくてはならない。このようなものとして、これらのプロセスはまた、米国食品医薬品局(FDA)によって概説されている基準を満たすべきであり、これは、閉鎖系であること（すなわち、環境または環境夾雑物への曝露がない）、プロセスは生体適合可能な材料で設計されること、およびプロセスは無菌で、滅菌可能な、パイロジェン（pyrogen）を含まないこと、という要件を含む(FDA、2003)。単回使用のバイオプロセスは、反復使用が避けられるので、細胞の夾雑の発生が低くなる。移植用にHSCを増大するためのこれらの要件を満たす閉鎖系培養の構成は、ガス透過性バッグの培養チャンバー(148)、攪拌/回転フラスコ(149、150)、およびフラットベッド灌流バイオリアクター(151)を含む。
【００８１】
本発明者らは、成熟血液細胞(系統関連マーカーを発現する;lin+)が、インビトロでHSC増大を妨害する可溶性因子を産生することを示した。亜集団選択(すなわち、これらの因子を分泌する成熟細胞の除去)および培地の希釈/交換のプロセスを通して、培養中のこれらの阻害性造血素の濃度を減少することによって、始原前駆細胞ならびに短期的および長期的に再増殖する幹細胞の有意な増大を支えることが可能である培養条件が確立された。この培養技術を臨床的状況に適用するために、本発明者らは、インライン-亜集団選択および培地の希釈/交換能を組み入れたエクスビボHSC増大のための閉鎖系バイオプロセスを設計した。ここで、本発明者らは、このバイオプロセスが、CFC、LTC-IC、および長期的な非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全(NOD/SCID)再増殖幹細胞(LT-SRC)を含む、UCB由来の造血幹細胞および前駆細胞を増大可能であることを示す。本発明者らはまた、非特異的な細胞の損失が亜集団選択プロセスの間に起こり、これは究極的には、バイオプロセスの全体的な増大能力を低下させること、およびこれらの損失は、バイオプロセス操作条件を制御することによって最小限に抑えられることを示す。従って、記載の閉鎖系バイオプロセスは、哺乳動物への治療的移植のために、臨床的に関連するレベルにまでHSCを増大することが可能である。
【００８２】
本発明者らは、HSCの増大のための、亜集団選択および培地希釈/交換のプロセスを実行する能力を有する閉鎖系バイオプロセスを設計した。記載されるバイオプロセスは、2つの細胞培養チャンバー、より具体的には培養バッグ、および成熟血液細胞(lin+)を培養から除去する亜集団選択エレメントからなる。選択エレメントは、ステンレス鋼ビーズを含むチューブを有する導管を備え、2つの培養チャンバーバッグを接続してシステムを形成する(図7A)。さらに、このバイオプロセスのデザインは、各成分が細胞接触領域を外部環境の夾雑物に露出することなく(すなわち、選択エレメントおよび細胞培養バッグ中で)分離され得るような、モジュール式である。最後に、このバイオプロセスは、単回使用システムであり、反復使用による細胞夾雑のリスクが排除されるので、臨床的適用に関心が寄せられる。
【００８３】
このバイオプロセスの応用はまず、UCB由来の系統枯渇(lin-)未分化細胞を、滅菌自己シーリングラバーセプタムを通して第1の細胞培養バッグに導入することを含む。次いで、この細胞を培養中に維持し、特定の時間後、培養中に生成されたlin+未分化細胞を除去する。これは、lin+未分化細胞を、デキストランコートされた鉄粒子に結合させ、続いてそれらを選択エレメントに通すことによって達成される。選択エレメントを外部の磁場に配置することにより、粒子標識された細胞が選択エレメント中に保持される。流速は、重力を利用して確立される。次いで、選択エレメントを通過する富化されたlin-細胞集団は、第2の培養バッグに導かれ、そこで、容器を遠心分離すること、使用済み培地を滅菌自己シーリングラバーセプタムを通して除去すること、および同じセプタムを通して新鮮な培地を再導入することによって、培地希釈/交換が実行される。次いで、細胞を増殖させる。さらなる分離および培地交換が実行され得る。lin+細胞の化学的標的化、遠心分離的選別、電磁気的分離、または文献に記載される他の方法を含む、lin+細胞枯渇の他の方法が想定され得る。
【００８４】
亜集団選択および培地希釈/交換
最初の研究は、バイオプロセスの性能を試験するために行った。まず最初に、亜集団選択エレメントが培養からlin+細胞を除去する能力を試験した。比較のために、不均一な細胞試料からlin+細胞を効率的に除去する、市販のStemSep(商標)選択カラムを使用する選択も行った。これらの実験において、培養した(4〜24日間)UCB由来lin-細胞を選択プロセスに露出させた(バイオプロセスおよびStemSep(商標)カラム)。フローサイトメトリー分析により、これらの培養時間の間に、約19.9±2.8%(範囲:2.5〜49.0)の細胞がlin+細胞表面マーカーを発現したことが示された。インプットの細胞数は、バイオプロセスについては、1.1×106〜3.5×106、およびStemSep(商標)カラムについては、1.7×106〜3.5×106の範囲であった。細胞を、lin+マーカーの存在について、選択前および選択後の両方で染色した。
【００８５】
フローサイトメトリー分析により、亜集団選択エレメントが、培養された細胞試料からlin+細胞を効率的に除去可能であることが確認された(図7B)。選択エレメントから出て行く細胞は、lin-細胞について高度に富化されており、99.7±0.2%の純度であった。これは、99.6±0.1%の純度が観察されたStemSep(商標)カラムを用いた結果に匹敵するものであった。さらに、細胞は、トリパンブルー色素排除で亜集団選択後に生存していることが示され、このプロセスの間に損傷されていなかった。
【００８６】
培地希釈/交換プロセスを試験するための実験も開始した。これを試験するために、5×105から2×106個の範囲の細胞を3mlまたは7mlの培養バッグに導入した。次いで、このバッグを1000rpmの遠心分離に供し、その後、使用済み培地を除去し、自己シーリングラバーセプタムを通して新鮮な培地で置き換えた。次いで、このプロセスの間に細胞損失が起こったか否かを決定するために、ここで再供給された細胞の細胞数を調べた。最終的に結果は、培地希釈/交換は、98.9±0.7%の平均細胞回収率で、有意な細胞の損失なしで実行され得ることを示した。最後に、培養容器が、顕著な損傷なしに遠心分離に耐えることが可能であったことに注意することは重要である。
【００８７】
バイオプロセスにおける全細胞および前駆細胞増大:亜集団選択および培地交換
造血前駆細胞を増殖するためのバイオプロセスの全体的有効性を決定するために、UCB lin-細胞を8日間の培養に供し、ここで細胞を、4日目に亜集団選択および培地希釈/交換のプロセスにさらした。表現型アッセイならびにインビトロ機能アッセイを用いて、全細胞および前駆細胞(CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CFCおよびLTC-ICを含む)の増大を、インプットにおいて、ならびに4日目および8日目に定量した。
【００８８】
種々の細胞型の反応速度論的増殖プロフィールの分析により、バイオプロセスが、8日間の培養期間にわたって、全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CFCおよびLTC-ICの絶対数を効果的に増加させることが可能であったことが明らかとなった(図8)。さらに、全細胞、CFC、およびLTC-ICの観察された増大倍率は、上記に記載された標準的な組織培養ディッシュを使用して得られたものに匹敵するものであった(図9)。バイオプロセスにおいて増殖された細胞は、インプット値と比較して、全細胞、CFC、およびLTC-ICについて、それぞれ32.0±2.7、25.9±3.7、および20.8±4.6の増大を生じたのに対して、組織培養ディッシュ中で増殖された細胞は、同じ細胞型について、30.8±2.6、20.7±5.2、および14.6±1.6の増大を示した。興味深いことに、標準的な組織培養ディッシュに対して比較して、CD34+およびCD34+CD38-細胞における有意な(p<0.05)増加が、8日間の培養期間にわたってバイオプロセス中に生じた(図9)。バイオプロセスにおいて、CD34+およびCD34+CD38-細胞は、それぞれ26.0±5.8および77.0±4.3の増大を示したのに対して、培養ディッシュにおいては、12.9±2.5および35.5±7.3の値が観察された。
【００８９】
造血幹細胞型および前駆細胞型の増大は、細胞死を最小限に抑えつつ(7-AAD排除を使用してアッセイした)、バイオリアクター中で維持され得ることもデータから示され、亜集団選択エレメントおよび全体の選択プロセス(すなわち、培養バッグを行き来する細胞、フロースルーチュービングなど)が、全体的な細胞生存度に対してネガティブな影響を有さないことが示された。
【００９０】
NOD/SCIDマウスにおけるヒト細胞定植
バイオリアクター中で増殖した細胞が、長期的な再増殖能力を有することが可能であるか否かを決定するために、NOD/SCIDマウスモデルを使用してLDAを行った。新鮮なUCB lin-細胞(n=24)または培養細胞(n=25)をNOD/SCIDマウスに静脈内注射し、そして8週間後、マウスを屠殺して、フローサイトメトリーを使用してヒト細胞(すなわち、CD45+HLA-abc+)の存在について試験した(図10A)。定植は、1.0×105(14/15マウス)、5.0×104(4/5マウス)および2.0×104(1/4マウス)の新鮮なlin-細胞が移植された場合に検出された(図10Bi)。増大された集団はlin-細胞についてさらに富化されないので、より高い接種範囲をバイオリアクター増大細胞の移植のために用いた。定植は、7.5×105細胞(6/8マウス)、3.75×105細胞(3/5マウス)および1.5×105細胞(3/8マウス)の細胞用量で観察されたが、5.0×104細胞(0/4マウス)では定植は観察されなかった(図10Bii)。このデータに基づいて、新鮮なlin-細胞中で再増殖しているHSCの頻度は、約1/37900(95%信頼区間、1/22076〜1/66961)であると見い出されたのに対して、増大した集団中のそれは1/464100(95%信頼区間、1/266200〜1/888300)であり、これらは両方とも、最大可能性推定量を使用して計算された。これらの実験についての全体の細胞増大と合わせて、約4.2倍のLT-SRCについての計算された増大が観察された。
【００９１】
亜集団選択エレメントにおける細胞の損失
増大研究を実行する際に、選択エレメントを出て行くlin-細胞の実際の数は、予測された細胞の理論値と相関しないことが見い出された。表1はこれらの知見を要約し、これらの結果を得るために使用された計算の詳細な説明を提供する。すべての例において、選択エレメントを出て行く細胞の(理論値と比較して)より少ない数が観察され、非特異的な細胞の損失の発生が示唆された。この非特異的な損失は、StemSep(商標)カラムを用いても観察された。非特異的細胞損失の程度は、バイオプロセスおよびStemSep(商標)カラムについて、それぞれ34.49±6.45%および32.38±12.99%と計算された(表1)。
【００９２】
細胞損失を抑制するために、細胞損失を減少および/または妨害するための可能性のあるメカニズムとして、流速をまず試験した。以前の研究により、流速は、類似の免疫磁気選択カラムの性能に有意に影響を与え得ることが示されている。バイオリアクターを通じて流速を制御するために、ペリスターポンプを用いて、第1の細胞培養バッグから、選択エレメントを有する導管を通して、第2の細胞培養バッグに細胞を「押し出し」た。第1の細胞培養バッグを、さらなるポートをつけて製造されたもの（図11A）と単純に置き換えることによって、ペリスターポンプをプロセスの上流に結合して、流速を制御するために使用され得る。試験された平均流速には、0.45±0.03(重力誘導性流速)、0.62±0.04、0.76±0.06、および1.25±0.07ml/分が含まれた。
【００９３】
（表1） 亜集団選択エレメントを通して送る非特異的細胞損失の程度を示す実験
2006525013.tif 000004
【００９４】
細胞損失パーセントは、まず選択エレメントを通過するはずである細胞の理論数［すなわち、全体のインプット細胞数-(全体のインプット細胞数*%lin+細胞)］と、選択エレメントから出て行く実際の細胞数との間の差を取り、この値を理論細胞数で除算し、そして100倍することによって計算される。
【００９５】
各流速について、種々の量のlin+細胞およびインプット細胞数を含む細胞試料を、第1の細胞培養バッグに配置した。次いで、細胞を、亜集団選択プロセスに供した。選択後細胞を収集し、計数し、そしてフローサイトメトリーを使用してlin+細胞の存在について分析した。この結果、流速を増加することにより、選択エレメントを通しての非特異的細胞損失が有意に減少されることが説得力をもって示された(表2)。試験した最大流速である1.25±0.07ml/分において、約98.05±1.27%のlin-細胞集団が回収され、これは、0.45±0.03、0.61±0.04、および0.76±0.06ml/分の流速において、それぞれ65.51±6.45、75.88±3.17、および80.54±4.81%回収が観察された、試験した他のすべての流速よりも有意に良好であった(p<0.05)(図11B)。
【００９６】
この増加した流速において、出て行くlin-細胞集団の純度が影響を受けないことを示すために、選択エレメントを通過した細胞を収集し、夾雑するlin+細胞の存在について染色した。結果、1.25±0.70の流速において、選択エレメントを出て行くlin-細胞の純度は、約97.98±1.40%であった(図11B)。興味深いことに、試験されたすべての流速が高レベルの純度を提供し、流速は%回収率に影響を与えるが、細胞の純度に対しては有意な影響を有さないことが示唆された。まとめると、これらの研究により、本発明者らは、非特異的細胞損失の影響を最小限に抑えるために、本発明のバイオリアクターは、少なくとも1.25ml/分の至適流速で操作されるべきであると結論付けた。
【００９７】
減少した細胞損失に応答する種々の細胞型の予測される増大を決定するため、理論的計算を行った。これらの値は、観察された増大を、非特異的細胞損失のパーセンテージ(約34.49%)を反映する補正係数で乗算することによって計算された。補正係数の値は、1.3449であった。これらの補正値は図9に反映されている。
【００９８】
（表2）亜集団選択プロセスに露出されたlin-細胞の収率および純度に対する流速の効果
2006525013.tif 000005
【００９９】
インビトロにおけるHSCの増大は、幹細胞移植の分野において非常に関心の高い領域である。造血前駆細胞を増大する能力、ならびに亜集団選択（すなわち、培養からのlin+細胞の除去）および培養物中の阻害因子の濃度を減少させるための培地交換ストラテジーを組み入れた新規な方法論を使用して幹細胞を再増殖させることにより、HSCの供給源が提供される。閉鎖系バイオプロセスを用いる研究の結果は、このバイオプロセスがUCB由来の幹細胞および前駆細胞(CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CFC、LTC-IC、およびLT-SRCを含む)の増大を支持することを示す。
【０１００】
亜集団選択エレメントは、夾雑するlin+細胞を培養から効率的に除去することが示された。しかし、このプロセスの間に、顕著な量の非特異的細胞損失が起こることが観察され(すなわち、lin-細胞が選択エレメント中に保持され)、バイオプロセスの完全な増大能力が実現されていなかったことが示された。本明細書に提示される研究は、非特異的細胞損失が、流速増加の関数として減少可能であることを示した。流速を増加させるためにペリスターポンプを利用することによって、本発明者らは、全体のlin-細胞回収を増加させることができた。理論に束縛されることはないが、この観察に関する説明としては、亜集団選択エレメント中の細胞の存在時間が減少したことである可能性がある。選択エレメント中に存在する時間が短いほど、エレメント中に細胞を保持する可能性がある非特異的な結合部位と接触する細胞の確率が減少する。また、単純に重力による遅い流速は、(おそらく表面張力に起因して)選択エレメントの孔内に細胞懸濁液を「プール」または「トラップ」する可能性も考えられ、この場合、単に増加した流速が、細胞懸濁液が選択エレメントをより効率的に通過することを可能にしているのかもしれない。同様の免疫磁気選択カラムを使用して、本発明者らは、流速が非特異的細胞損失に有意に影響を与えたことを示す。細胞損失の減少は、バイオプロセス中で造血幹細胞および前駆細胞の有意に高い増大を生じるので、重要である。細胞損失について補正された理論値は、図9に反映されている。
【０１０１】
興味深いことに、標準的な組織培養ディッシュと比較して、有意に(p<0.05)大きな数のCD34+およびCD34+CD38-細胞が、CFC、LTC-IC、およびLT-SRCの付随する増加を伴わずに、バイオプロセス装置中で一貫して生成された。可能性のある説明は、表現型の直接的な変化が、細胞がインビトロ培養条件に曝露されたときに起こり得るという観察から得られる(von Laerら、2000)。しかし、両方の系がインビトロ培養を表すので、これらの表現型で規定された細胞集団の増大の差は、さらに培養構成の変化に帰すのかもしれない。構成の違いは、例えば、酸素濃度、pH、代謝副産物濃度、および局所的サイトカイン濃度などのパラメーターを含む、類似でない培養の微小環境として現れうる。表現型が規定された細胞(CD34+CD38-細胞)の増大が、機能的前駆細胞数の比例的な増加を常に生じるわけではないという矛盾が報告されている(Danetら、2001;Dorrellら、2000;Mobestら、1999;Spangrudeら、1995)。
【０１０２】
選択エレメントの主要な機能は、分化したlin+細胞を培養から除去することであるが、特徴的な表現型を有する任意の細胞型が除去され得るように使用することも一般的である。この特徴のため、本バイオプロセスは、種々の代替的適用における使用に用途が広い。例えば、ドナーT細胞は、対宿主性移植片病(GvHD)の発症の原因である(Hoら、2001)。CD8を発現するものを含むドナーT細胞のサブセットを除去することにより、同種異系幹細胞移植を受ける患者において急性GvHDの発症を減少させ得ることが示唆されている(Baronら、2002)。バイオプロセスは、細胞表面表現型に基づく単純な細胞選択処理を組み入れているので、培養ストラテジーを立てて、夾雑しているT細胞を培養の間に同時に除去することができる。このように、このバイオプロセスを使用して産生される、得られる細胞移植物は、再増殖している幹細胞について富化されているのみならず、GvHDの原因となる細胞を欠いており、首尾よい長期的な定植の確率を増加する。
【０１０３】
広範な細胞数が代表的な臍帯血コレクションから入手でき(Cairoら、1997)、本バイオプロセスを、広範なインプット細胞数にわたって実行できることが示唆される。バイオプロセスのモジュール性がこれを実行可能にする。すべての臍帯血試料について細胞の培養濃度を一定に保つことにより(本研究においては、100,000細胞/mlを使用した)、細胞数の変動に適合させるためのバイオプロセスへの唯一の変化は、異なる体積容量を有する細胞培養バッグの使用である。細胞培養バッグは、細胞接触領域に影響を与えることなくバイオプロセスから取り出され得るので、この目的のためにバッグを交換することが可能である。さらに、異なるUCBおよび骨髄の試料から得られた始原細胞(すなわち、CD34+)の増大は、高度に変動性であることが以前に報告されている(De Bruynら、1997;Kollerら、1996)。それゆえ、バイオプロセスは、細胞をより大きな体積のバッグに移すことが必要となる可能性がある高度な増殖能を有しうる試料に順応することが可能である。これは、閉鎖条件下、バイオプロセス中で細胞の流れを1つのバッグから別のバッグに制御する(すなわち、選択エレメントを通して)能力により実行可能である。これらの点に関するバイオプロセスの多用性により、高度に変動性の細胞数および増殖ポテンシャルを有する臍帯血試料の培養を、標準化されたプロセスで培養することが可能となる。
【０１０４】
本明細書に記載される閉鎖系バイオプロセスは、造血幹細胞および前駆細胞を効率的かつ強固に増大することが可能である。このように、これらの型の細胞を必要とする臨床的移植治療の開発、実行、および成功のための価値あるツールであることが証明される。
【０１０５】
16. 本発明の方法の修飾
収集段階において、試料は、例えば重力流により250mlのBaxter収集バッグ中に収集される。収集は、分娩の15分以内に(または未分娩の胎盤上で)開始される。試料を収集し、生存度を低下させることなく一時的に25℃に保存する。例えば、試料は処理の72時間前まで保存され、FACSによって評価される全体の細胞生存度の減少は無視できる。
【０１０６】
処理段階において、試料は、細胞富化に関する技術分野において公知の方法によって、ペンタスターチと混合される。処理段階の試料はまた、スターチまたはフィコールの添加なしで遠心することができ(12分間遠心)、直接バッグ中で処理してもよい。試料はDMSOとともに凍結される。NYBC融解プロセスも有用である。細胞を一晩培養することは必ずしも必要ではない。RBCは塩化アンモニウムによって溶解する。細胞をStepSepカラムに流し、すべての洗浄は、HANKS緩衝液またはPBS緩衝液中、約4℃から約37℃までの温度において行う。
【０１０７】
細胞を、2から7日間(好ましくは4日間)、無血清培地および成長因子、例えば、SCF［約100ng/ml］、TPO［約50ng/ml］、Flt-3L［約100ng/ml］中で培養する。細胞をStepSepカラムに流し、すべての洗浄は、HANKS緩衝液またはPBS緩衝液中、約4℃から約37℃で行う。細胞を、約2から約7日間(好ましくは4日間)、新鮮な無血清培地および成長因子:SCF(約100ng/ml)、TPO(約50ng/ml)、Flt-3L(約100ng/ml)中で培養する。表現型分析、例えば、CD34またはCD38発現標的細胞または他のこのようなマーカーのFACS検出を行う。インビトロ検出および活性アッセイは、CFCまたはLTC-ICを含む。インビボ検出および活性アッセイは、マウスNOD-SCIDまたはIFを含む。RBC枯渇は、典型的には凍結前に実行される。増殖期間は、好ましくは4日間サイクルプラス培地交換である。休止期間は、典型的には不要である。
【０１０８】
本明細書に開示される結果により、特許請求されるバイオプロセス装置および方法が、細胞富化および培地交換に基づいて、制御可能な閉鎖系において、造血幹細胞または前駆細胞を増大するための方法論を提供することが示される。全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CFC、およびLTC-ICを増大するその能力において、バイオプロセスは、当技術分野において公知の標準的なシステム(すなわち、培養ディッシュ)と比較して良好ではないにしても等価な性能を有する。さらに、ビルトイン（built-in）細胞富化プロセスは、培養からlin+細胞を除去する際に市販のカラムと同程度に効率的であることが示され、細胞を損失することなく培地交換を容易に実行することができる。
【０１０９】
17. 哺乳動物への移植のための開放系における全細胞および前駆細胞の増大
臍帯血(UCB)由来の造血幹細胞(HSC)は、種々の血液学的障害を治療するための細胞の治療的に有効な供給源を提供する(134、135)。不運にも、典型的なUCB供与から単離されるHSCは数が少なく、この治療を小児科の患者に限定している(130、134)。有効なHSC増大は魅力的な解決法であるが、この目標は、20年を超える動物モデルおよびヒト臨床試験における実験にも関わらず、とらえどころがないままである(147)。培養を使用する一見達成可能な目標−骨髄破壊的化学療法後の患者における好中球および血小板回復時間(143〜145)を短縮するために生成された前駆細胞でさえ、全体としては有効でなかった(147)。
【０１１０】
エクスビボで幹細胞増大を刺激するための実質的にすべての以前の試みは、公知の(補充された)または未知の(支持細胞または馴化培地によって供給される)サイトカインおよび成長因子の種々の組み合わせの効果に焦点を当ててきた(147、152)。このアプローチの難点は、HSCに独占的または優先的に作用し、それらの分化した子孫(これらは最終的には幹細胞区画から脱却する)には作用しない因子を同定することである。原理的には、このような因子は、不均一であるか、または迅速に不均一になりつつある動的な培養の微小環境の中で、対称的な自己複製的な分裂を受けるように(分化の誘導とは反対に)HSCを誘導しなくてはならない。造血ヒエラルキーの全体にわたって発現される一連の分子(26、27)を考慮すると、このアプローチを使用して成功することは困難であることが理解され、実際、非肥満性糖尿病/重症複合型免疫不全(NOD/SCID)マウスを使用する移植研究により、サイトカイン補充ストラテジーは一般的に、ヒト再増殖幹細胞の損失、維持、または中程度の増大を生じることが示されている(5、8〜10、153、154)。典型的にHSC発生を標的とする細胞タンパク質(例えば、ヘッジホッグタンパク質(155)、HOXB4タンパク質(156)およびWntタンパク質(157))を使用する最近の研究でさえ、ヒトHSC増大には限界があった。
【０１１１】
造血前駆細胞および成熟血液細胞集団は、HSC増殖を阻害および/または幹細胞分化を誘導することが知られている調節タンパク質を分泌する(21、22、24、27、158)。従って、誘導されたか、または典型的にはすべての幹細胞培養の間に起こる「バックグラウンド」の分化に起因するこれらの細胞の生成、およびそれらの分泌産物が、インビトロでHSC増大を制限する可能性は高い。しかし、これらの内因性に分泌されたネガティブレギュレーターの効果は現在調査中である。ここで、本発明者らは、このような因子の分泌が、分化した血液細胞がHSCの増殖性状態に有意に影響を与え得るフィードバック制御メカニズムを表すことを示す。本発明者らはさらに、ネガティブレギュレーター産生の全体的な制御が、インビトロで観察されるHSC増大に対するブロックを克服するための簡便な手段を表すことを示す。このことを示すために、本発明者らは、始原前駆細胞ならびに短期的および長期的に再増殖するヒトHSCを選択的に増大することが可能である培養の微環境を生じるよう、外因性因子の補充とは独立した様式で、ネガティブレギュレーターの産生を積極的に制御するための、半連続的な亜集団選択および培地希釈に基づいて、簡便な全体的培養操作(GCM)技術を開発した。
【０１１２】
全体的培養操作は、始原前駆細胞の増大を選択的に標的化する
亜集団選択(S)、選択なし(NS)、培地希釈/交換(E)、交換なし(NE)またはこれらの組み合わせを使用して、HSCアウトプットに対するGCMの役割を決定するために、lin-UCB細胞を、4つの異なる条件下で8日間の培養に供した。第1の条件において、細胞は、8日間の培養期間の間、何も操作しなかった(図12、NS/NE)。第2および第3の条件については、lin-細胞を最初に4日間増殖し、次いで亜集団選択(図12、S/NE)または培地希釈(図12、NS/E)のいずれかにそれぞれ供した。亜集団選択により、培養の最初の4日間の間に生じたlin+細胞(成熟血液細胞)が除去された。第4の条件は、4日目に亜集団選択および培地希釈を受けた(図12、S/E)。8日間の培養の最後に、表現型アッセイおよび機能的アッセイを、全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CFC、およびLTC-ICの増大に対するGCMの影響を試験するために実行した。すべての培養を、個々の操作の効果を特定するために、同じ成長因子(SCF、FL、およびTPO)を補充した同じ培地中で増殖させた。
【０１１３】
亜集団選択、培地希釈、または両方の組み合わせは、全細胞、CD34+細胞、またはCD34+CD38-細胞の増大に対しては有意な効果を有さなかった(図13a)。CFC増大もまた、異なる培養条件間で統計学的に同様であったが、S/E条件下ではより高いCFCの増大に向かう傾向が存在した(図13b)。対照的に、LTC-IC増大の分析結果は、亜集団選択および培地希釈の相乗作用的効果を示した。S/E条件は、未操作対照(NS/NE)培養(6.6±1.8倍)よりも有意に(p<0.05)高いLTC-IC増大(14.6±1.6倍、インプットと比較して)を生じた(図13c)。亜集団選択のみまたは培地希釈のみを受けた培養は、対照培養と統計学的に区別が不可能であり、サイトカイン、グルコース、および/または代謝副産物枯渇などのパラメーター(これらのすべてが全体の細胞増殖を阻害することが知られている)は、前駆細胞アウトプットの違いを説明しないようであることが示された。これらの知見は、亜集団選択および培地希釈を使用するGCMは、成熟前駆細胞の産生に対して効果を有しない一方、優先的に始原細胞型の増殖を標的とすることを示す。
【０１１４】
亜集団選択および培地希釈は、インビボ移動能力を持つR-SRCを独特に増大する
ホーミングに対する効果とは独立した、初期の血液前駆細胞の発生能力の増大に対するGCMの効果を決定するために、本発明者らは、増大研究においては初めて、最近開発された大腿骨内NOD/SCIDアッセイ(131、159)を使用した。これらの研究において、4つの培養条件下で培養されたlin-細胞の子孫を、マウスの右大腿骨に直接注射した。各移植物のサイズは、すべての条件について、マウスあたり3×105細胞であった。2週間後、右と左の両方の大腿骨へのヒト細胞定植の試験を、フローサイトメトリーによって評価した。データは、すべての培養条件が、注射された右大腿骨へ急速に再増殖(すなわち、2週間)する能力を有する細胞を産生することが可能であったことを示す(図14a)。これらのR-SRCは、少なくとも、短期間に再増殖する血液幹細胞集団と見なすことができるが、大腿骨内アッセイの以前の使用は、これらの細胞はまた、長期的な定植能力を有することを示していた(131)。興味深いことに、R-SRCのより高い定植レベルが、S/E条件からの細胞を受容する注射されたマウスの右大腿骨において測定され、ヒト細胞からなる収集された全BM細胞の平均22.1±7.6%(範囲:2.8から54.9)であった。S/E群からの細胞はまた、独特に、注射されていない左の大腿骨中のヒト細胞定植が可能であった[6匹のマウスのうちの6匹が3.2±0.9%(範囲:0.1から5.9)の平均定植で定植された;図14a、bvi]。このことにより、移植された細胞が、定植可能であることのみならず、第2の骨部位への移動も可能であることが示された。R-SRCのこの移動は、高度に始原的な幹細胞および前駆細胞集団の指標であり、S/E条件が、HSC移植に必要とされる機能的な能力(すなわち、可動化および組織ホーミング)を有する細胞を生成することが示唆される。
【０１１５】
注射した右の大腿骨から注射していない左の大腿骨までの移動が可能なR-SRCの増大を定量するために、限界希釈分析をこのアウトプットについて行った。NOD/SCIDマウスは、新鮮な(培養していない)lin-細胞(n=28)、または亜集団選択および培地希釈の両方を受けている培養されたlin-細胞の子孫(n=46)のいずれかの用量範囲にわたって、大腿骨内移植を受容した。ヒト細胞定植のパーセンテージ、ならびに左大腿骨における定植の頻度を、各細胞用量について計算した。少なくとも0.1%ヒト細胞含量を含むマウスのみがポジティブとスコア付けされた。未培養lin-細胞からの左大腿骨定植は、1.4×105細胞(4/4マウス)、7.2×104細胞(2/4マウス)、および3.6×104細胞(1/4マウス)を使用して観察された;1.3×103から1.1×104細胞が注射されたときには定植は観察されなかった(0/16マウス;図14ci)。マウスに8日目のS/E増大細胞を移植した場合、定植は、3.0×105細胞(6/6マウス)、2.5×105(6/16マウス)、および1.5×105細胞(9/20マウス)を用いて観察された(図14cii)。7.5×104細胞を使用すると、定植は検出されなかった(0/4マウス)。最大可能性推定量(133)を用いて、新鮮なlin-細胞およびS/E増大子孫における移動するR-SRCの計算された頻度はそれぞれ、1/89700(95%信頼区間、1/43500〜1/217000)および1/291900(1/198200〜1/452400)であった。これらの実験についての全体の細胞増大値と組み合わせた場合には、亜集団選択および培地希釈は、インプット値を超えて、移動するR-SRCの12.1倍の増大を支持した。
【０１１６】
全体的培養操作はLT-SRCの増大を生じる
亜集団選択および培地希釈がLT-SRCの有意な増大を生じるか否かを決定するために、限界希釈分析を、静脈内注射したNOD/SCIDマウスに対して、標準的な方法(71)を使用して実行した。マウスは、新鮮なlin-細胞(n=24)またはS/E培養細胞(n=25)のいずれかの移植を受け、8週間後に屠殺され、フローサイトメトリーを使用してヒト細胞の存在について試験した(図15a)。1.0×105細胞(14/15マウス)、5.0×104細胞(4/5マウス)、および2.0×104細胞(1/4マウス)の新鮮なlin-細胞が移植されたときに、定植が検出された(図15bi)。S/E増大された細胞を用いる移植は、7.5×105細胞(6/7マウス)、3.75×105細胞(4/7マウス)、および1.5×105細胞(3/7マウス)の細胞用量で定植を生じたが、5.0×104細胞(0/4マウス)では生じなかった(図15bii)。新鮮なlin-細胞中でのLT-SRCの頻度は、1/37900(1/22100〜1/67000)と見い出されたのに対して、増大集団におけるそれは1/391500(1/226500〜1/734800)であった。全細胞増大およびこれらの頻度とを組み合わせて、結果は、培養の8日後にS/E条件が、インプットよりも約5.2倍多いLT-SRCを送達可能であったことを示す。
【０１１７】
培養細胞はインビボで複数の系統の分化を生じる
定植した培養細胞が、リンパ系統および骨髄系統の両方の細胞に分化する能力を保持することを確認するために、S/E増大細胞を移植された、定植したNOD/SCIDマウスのBMを、フローサイトメトリーを使用してさらに分析した。大腿骨内注射後に定植したマウスのCD45+(ヒト)集団に導かれる系統マーカーの分析は、CD45+CD19+リンパ系細胞(図16aii)およびCD45+CD33+骨髄性細胞(図16aiii)の存在を示し、これらの短期間の再増殖細胞がリンパ骨髄能力を有することが示された。B細胞定植のレベルの減少は、2週間の時点での遅延した定植を示す、以前の反応速度論的分析と一致している。同様に、静脈内注射によって導入され、および8週目で分析された細胞もまた、リンパ系(図16bii)および骨髄系(図16biii)能力を示した。総合すると、これらのデータは、増大した細胞集団が、成熟血液細胞への複数系統分化のための能力を有する、短期的におよび長期的に再増殖するヒト血液幹細胞の両方を含むことを示す。
【０１１８】
内因性に産生されたネガティブレギュレーターの分泌は、全体的培養操作を使用して操作され得る
GCM後のHSC増大の根底にあるメカニズムを決定するために、本発明者らは、ELISAおよび半定量的RT-PCRを使用して、種々の既知の内因性に産生されるネガティブレギュレーターの分泌プロフィールを測定した。操作されていない培養の分析により、TGF-β1およびMIP-1αが、培養の間に細胞によって発現および分泌されたことが示された。他の阻害因子(腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-3、および間質由来因子(SDF)-1を含む)は検出感度よりも下であった。
【０１１９】
TGF-β1の分泌速度(細胞あたりベースで)は、培地希釈が実行されたか否かに関わらず、亜集団選択を受けた条件では有意に低いことが見い出され、培養上清中のTGF-β1の濃度の全体的な減少を生じる(図17a)。対照培養(NS/NE条件)はTGF-β1を21.8×10-6±1.1×10-6pg/細胞/時間(バルク濃度:2297±426pg/ml)の速度でTGF-β1を産生したのに対して、亜集団選択単独(S/NE)または亜集団選択および培地希釈(S/E)を受けた培養は、それぞれ13.0×10-6±1.4×10-6(バルク濃度:1528±167pg/ml)pg/細胞/時間および13.0×10-6±1.7×10-6(バルク濃度:1002±281pg/ml)pg/細胞/時間の値を生じた。これらの知見は、亜集団選択がTGF-β1を分泌する細胞集団を除去することを示す。選択カラムから直接的に、または蛍光活性化セルソーティング(FACS)によってかのいずれかで収集された、独立して分析されたlin+細胞は、TGF-β1 mRNAを発現し、かつ検出可能なレベルでTGF-β1を分泌(図17b)することが示され、この知見を確証した。
【０１２０】
対照的に、MIP-1α産生は亜集団選択に影響されなかったが、培地希釈によって有意に影響された。対照培養において、培地希釈単独を受けた培養(NS/E)、ならびに培地希釈および亜集団選択(S/E)を受けた培養において、MIP-1αは、それぞれ3.3×10-6±0.8×10-6(バルク濃度:206±36pg/ml)pg/細胞/時間、0.5×10-6±0.2×10-6(バルク濃度:70±30pg/ml)pg/細胞/時間、および0.5×10-6±0.2×10-6(バルク濃度:53±13pg/ml)pg/細胞/時間の速度で分泌された(図17c)。これらの知見は、新鮮な培地の添加が、MIP-1α転写物の定常状態レベルの減少、および/またはMIP-1α分泌メカニズムのダウンレギュレーションのいずれかを生じることを示した。MIP-1α発現の半定量的RT-PCRを、4日間増殖させた細胞上で行い、このとき、培地希釈は典型的には実行されており、かつMIP-1α発現は存在することが知られており、そして細胞は新鮮な培地中に24時間配置された。MIP-1αの発現は、24時間新鮮な培地中に配置された細胞中では有意に低いことが見い出された(図17d)。これらの結果は、より低いレベルのMIP-1α産生は、培地希釈に応答したMIP-1α遺伝子発現の定常状態レベルの減少に起因したことを示唆する。LTC-ICの最高の増大を有し、かつ短期間および長期間の血液幹細胞増大を独特に生じたS/E条件が、TGF-β1およびMIP-1αの両方の低い産生レベルを有する唯一の条件であった(図17aおよび17c)。これらの知見は、培養中に生成された阻害因子の濃度と、より低い濃度がより高い増大を生じる始原性細胞型の増大との間に相関が存在する可能性があることを示唆する。
【０１２１】
ネガティブレギュレーターの内因性産生は、インビトロでHSC増殖を制限するフィードバック制御メカニズムとして作用する。これらのネガティブレギュレーターが産生され得る、2つの独立したメカニズムが存在する：1)分化している細胞による分泌(例えば、TGF-β1)、および2)培養馴化培地による細胞の刺激(例えば、MIP-1α)。本発明者らか開発したGCMストラテジー(すなわち、亜集団選択および培地希釈)は、それまでは達成することができなかった、短期的および長期的で再増殖する幹細胞の両方の増大を生じる、HSCに対するこれらのフィードバックメカニズムの影響を制御できた。これらの培養操作、ならびにHSC増大を生じる有益な効果の背後にあるメカニズム解明の本発明者らの組み合わせにより、広範に適用可能であるインビトロ幹細胞培養のための新規なストラテジーが提供される。
【０１２２】
本明細書に記載される研究は、初めて、再増殖にのみ基づくのではなく、定植後の通常のHSCの輸送/機能にも基づいて、HSC増大を定量的に分析するものである。最近開発された大腿骨内NOD/SCIDアッセイ(131)を使用して、本発明者らは、定植後に二次的な骨部位に移動する能力を有する、(短期的に)再増殖するHSCを同定することができた。本発明者らはさらに、これらの細胞の増大および維持は、細胞が亜集団選択および培地希釈の両方に曝されたときにのみ達成可能であることを示した。これらの細胞は、インビボでBMの微小環境に可動化、移動、およびホーミングする能力を有しており、全身性のHSC輸送は、通常のHSC機能のための必要条件であることが示されているので(160)、本発明者らは、これらの移動細胞は、移植部位に定植可能であるのみの細胞よりも、より始原的な細胞集団を提示する可能性があると結論付けた。本発明者らの知見によると、これは、この独特な移動能力を有する幹細胞の増大を定量するアッセイの使用に関する初めての報告である。
【０１２３】
これらのGCMストラテジーは、夾雑する細胞型の複雑な効果を減少することによって、補充されたサイトカインおよび成長因子に対する幹細胞の、真に根底にある応答の解明を可能にする。本発明者らの結果は、多くの異なるサイトカインが、HSCの自己複製に対する効果について試験された場合に、最初のいくつかの幹細胞の分裂に対しては刺激効果を有するが、培養の複雑さが発達するにつれて、迅速に幹細胞分化をもたらすという観察(161)の間の見かけの矛盾に洞察を与える。本発明者らの結果は、種々の増殖誘導性サイトカインを使用してHSCの自己複製は誘発され得るが、インビトロ培養の間、幹細胞の増殖を阻害および/または分化を誘導する、関連するレベルのネガティブレギュレーターが増加し、最終的には幹細胞増殖を制限するという仮説を支持する。
【０１２４】
最後に、遺伝子発現およびタンパク質分泌分析により、種々の公知のネガティブレギュレーターが、異なるクラスの分化した血液細胞(21、22、24、27、158)によって発現および分泌されることが説得力を持って示され、典型的な増大期間の間に生成される細胞および細胞生成物のタイプが、現在のHSC培養系にネガティブに影響を与える可能性が示唆された。従前の研究により、個々のネガティブレギュレーター(TGF-β、MIP-1α、SDF-1、および単球化学誘因性タンパク質(MCP)-1を含む)の中和が、前駆細胞サイクリングおよび増大を、インビトロモデルおよびインビボモデルの両方で開始および支持し得ることが示されている(48〜51)。不運にも、このようなブロッキングスキームの使用は、本明細書で報告されているようには、LT-SRCを含むほとんどの始原的な細胞集団の増大を生じなかった(31)。これらの知見は、通常の増大培養においては、種々のネガティブレギュレーターの産生は、幹細胞増大を阻害すること、および個々の因子のみをブロックすることは、このメカニズムの効果を無効にしないことを示唆する。それゆえ、記載のGCMストラテジーは、この問題を克服するための最も効率的な方法論を代表する可能性がある。なぜなら、これは、標的化された細胞集団からの、既知および未知の両方のネガティブレギュレーターの全体的な産生を標的とするからである。培地希釈ストラテジーは前駆細胞の維持のために重要であると記載されてきたが(162)、観察された効果の背後にあるメカニズムは、主として代謝副産物の調節(163)および間質細胞由来の因子の分泌(164)に帰することに注目することは重要である。亜集団選択および培地希釈(独立して制御可能な操作)の際に、調節因子ファミリーの遺伝子発現の全体的な変化を試験するように設計された進行中のマイクロアレイ研究により、どの細胞を除去するか、選択のタイミング、および培地希釈の頻度に関して、この方法論を最適化するための強固なストラテジーが提供される。この理解は、治療的適用のために、臨床的に関連する量の機能的血液幹細胞を産生することが可能である制御増大バイオプロセスの設計において、重要な段階を表す。
【０１２５】
等価物
本発明の特定の態様の上記の詳細な説明から、独特なバイオプロセス装置および方法が記載されてきたことは明らかであるはずである。特定の態様が本明細書で詳細に開示されてきたが、これは、例証のみの目的のための例示として行われており、特許請求の範囲に関して限定することを意図するものではない。例えば、細胞培養培地および他の培養条件または細胞の選択は、本明細書に記載される発明の概念から逸脱することなく、変更することが可能である。特に、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の置換、変更、および改変が本発明になされ得ることが本発明者らによって意図される。
【０１２６】
文献
本文書全体および本項目に引用される文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】バイオプロセスのために使用される装置の図である。この図に示される細胞培養チャンバーは、ガスに半透過性である培養バッグを採用している。示されている導管は、分化され方向付けられたlin+造血細胞からCD34+細胞を分離する富化エレメントを備える。
【図２】従来的な培養ディッシュを使用するか、または本発明を使用する、全細胞(A)、CD34+細胞(B)、CD34+CD38-細胞(C)、およびCFC(C)の反応速度論的増殖を比較するグラフを示す。
【図３】従来的な培養ディッシュを使用するか、または本発明を使用することによって増大された、全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、およびCFCの増大の程度を示すグラフである。
【図４】図4Aは、種々の阻害因子の発現レベルを示す培養された造血細胞のRT-PCR分析を示す。β-アクチンが対照として使用された。図4Bは、培養中の阻害因子の分泌を示すELISA分析のグラフである。TGF-β1およびMIP-1αの検出が図示されている。
【図５】図5Aは、細胞分泌および富化に応答したTGF-β1分泌速度の変化を示すELISA分析のグラフである。図5Bは、カラム単離されかつFACS分別されたlin+細胞がTGF-β1を発現することを示すRT-PCR分析を示す。β-アクチンを対照として使用した。
【図６】図6Aは、培地交換に応答したMIP-1α分泌速度の変化を示すELISA分析のグラフである。図6Bは、新鮮な培地に応答してMIP-1α発現が減少することを示す半定量的RT-PCR分析を示す。β-アクチンを対照として使用した。
【図７】図7Aは、閉鎖系バイオプロセスの模式図である。このバイオプロセスは、亜集団選択エレメントを有する導管を通して結合される2つの細胞培養バッグ(3または7ml)からなる。この亜集団選択エレメントは、夾雑しているlin+細胞を培養から除去するために使用される。図7Bは、亜集団選択エレメントの効果を示す。lin+細胞の量を示す代表的なフローサイトメトリープロットは、選択前(7Bii)および選択後(7Biii)を示す。lin+抗体カクテルで標識されなかった陰性対照も示す(7Bi)。市販のStemSep(商標)カラムに対して比較した(7Biv、ii、iii)。このプロットにより、亜集団選択エレメントを有する導管を通過する際、lin+細胞が首尾よく除去されることが示される。
【図８】バイオプロセスにおいて産生される造血細胞の絶対数を示す。精製UCB lin-細胞(1×105細胞/ml)をこのバイオプロセスで、亜集団選択および培地の希釈/交換を4日目に行なって、8日間培養した。全細胞(A)、CD34+細胞(A)、CD34+CD38-細胞(A)、CFC(B)、およびLTC-IC(B)についての8日間の培養期間にわたる反応速度論的増殖プロフィールが示される(n=4)。
【図９】バイオプロセスを使用して増殖された細胞についてのインプットと比較した、全細胞、CD34+細胞、CD34+CD38-細胞、CFC、およびLTC-ICの計算された増大を示す。比較のために、標準的な組織培養ディッシュを使用して増殖された細胞の結果も提供する。細胞の損失の減少に伴ってバイオプロセス中で観察されるはずである理論的な増大も示す(セクション4.2.5を参照されたい)。この値は、観察された増大に、非特異的細胞損失のパーセンテージを反映する補正係数を乗じることによって計算された。補正係数の値は1.3449であった。
【図１０】静脈内注射後のNOD/SCIDマウスにおけるヒト細胞定植を図示する。(A)NOD/SCIDマウスにおけるヒトCD45+HLA-abc+細胞の存在を示す代表的なフローサイトメトリープロット(Aiii)。細胞を受容しなかった対照NOD/SCIDマウス(Aii)を、代表的なアイソタイプ対照(Ai)とともに示す。(B)新鮮なUCB lin-細胞(n=24)および増大された細胞(n=25)において存在するLT-SRCの頻度を決定するために、NOD/SCIDマウスにおいて限界希釈分析を行った。新鮮なlin-細胞(Bi)および培養細胞(Bii)について得られた定植頻度を各細胞用量について示し、最大可能性推定量からの結果を表す曲線と重ね合わせた。アイソタイプ対照を、各試料について確立した。
【図１１】図11Aは、流速制御を可能にするバイオプロセス構成を示す。ペリスターポンプを使用して、亜集団選択エレメントを有する導管を通して細胞を「押し出す」。図11Bは、亜集団選択エレメントから出て行くlin-細胞の回収および純度に対する流速の増加の効果を示す。細胞を0.45±0.03(重力誘導性流速;n=4)、0.61±0.04(n=4)、0.76±0.06(n=4)、および1.25±0.07 ml/分(n=5)で選択エレメントを通過させて亜集団選択を行った。1.25±0.07ml/分の流速において、lin-細胞の回収パーセントと純度パーセントの両方が最大となった。重力誘導性の流速比較を、斜線カラムおよび詰まった黒い四角形で強調して示す。
【図１２】実験的プロトコールの模式図である。4つすべての試験条件の実験設計を示す。亜集団選択および/または培地希釈を4日目に行い、全ての培養をトータルで8日間インキュベートした。培養は、TPO、SCF、およびFLを含む培地中で新鮮なUCB lin-細胞を用いて確立した。S:亜集団選択;E:培地希釈/交換;NS:選択なし;NE:培地希釈/交換なし。
【図１３】造血前駆細胞集団の増大に対する亜集団選択および培地希釈の効果を示す。精製されたUCB lin-細胞(1×105細胞/ml)は、図1に示される4種類の培養条件を使用して8日間培養した。8日の培養期間の最後に、全細胞(A)および前駆細胞(A、B、C)増大を、表現型アッセイおよびインビトロ機能アッセイを使用して分析した。示される増殖倍率値は、新鮮なUCB lin-細胞に対する比較である。(*)は、操作されていない対照培養(NS/NE)に対する有意差(p<0.05)を表す。
【図１４】大腿骨内注射後のNOD/SCIDマウスにおけるヒト細胞定植を図示する。これらはいわゆる迅速再増殖幹細胞である。移植後の「迅速定植」を可能にすることによって臨床的な有用性が増強されている可能性がある。(A)示された4種類の培養条件を使用して増殖された合計3×105細胞を、NOD/SCIDマウスの大腿骨内に注射した。右と左の両方の大腿骨におけるヒト細胞定植の試験を2週間後に評価した。(B)S/E条件からの細胞を用いて移植され、右大腿骨(Bv)と左大腿骨(Bvi)の両方の定植を示す代表的なマウスを、対応するアイソタイプ対照(Biv)とともに表す。移植を受けなかった非移植対照マウス(アイソタイプ、Bi;右大腿骨、Bii;左大腿骨、Biii)も示す。(C)限界希釈分析を行い、大腿骨内NOD/SCIDアッセイを使用して新鮮なUCB lin-細胞および培養細胞中の移動するR-SRCの頻度を決定した。新鮮なUCB lin-(Ci)および増大した(Cii)細胞についての定植頻度を各細胞用量について示す。移動するR-SRCの頻度は、これらの分析の結果を表す重ね合わせた曲線を用いて最大可能性推定量を使用して計算した。R-SRCの計算された頻度をプロット上に示す。アイソタイプ対照を各試料について確立した。
【図１５】静脈内注射後のNOD/SCIDマウスにおけるヒト細胞定植を図示する。(A)静脈内注射されたNOD/SCIDマウスにおけるヒトCD45+HLA-abc+細胞の存在を示す、典型的なフローサイトメトリープロット(Aiii)。細胞を受容しなかった対照NOD/SCIDマウス(Aii)も、代表的なアイソタイプ対照(Ai)とともに示す。(B)限界希釈分析を行って、新鮮なUCB lin-細胞および増大された細胞中に存在するLT-SRCの頻度を決定した。新鮮なlin-細胞(Bi)および培養された細胞(Bii)についての得られた定植頻度を各細胞用量について示し、最大可能性推定量の結果を表す曲線と重ね合わせた。アイソタイプ対照を各試料について確立した。
【図１６】NOD/SCIDマウスに定植した細胞の多数の系統の分化を示す。ヒト細胞定植(CD45+)を示すことが見い出されたマウスを、リンパ系統と脊髄系統の両方の細胞に分化する能力についてフローサイトメトリーを使用して分析した。(Aii、Bii)大腿骨内(Aii)または静脈内(Bii)に注射されたマウスからの定植細胞上でのCD19発現を示す代表的なFACS分析のドットプロット。ポジティブ染色により、細胞がリンパ分化可能であることが示された。(Aiii、Biii)大腿骨内(Aiii)または静脈内(Biii)注射されたマウスからの定植細胞上のCD33発現により、細胞が脊髄分化も可能であることが示された。対応するアイソタイプ対照も示す(Ai、Bi)。
【図１７】阻害因子の内因性分泌が亜集団選択および培地希釈によって調節されることを示す。(A)亜集団選択および/または培地希釈に応答したTGF-β1分泌速度の変化を示すELISA分析。亜集団選択を受ける条件は、有意に低いTGF-β1産生レベルを生じた。(B)カラム単離されFACS分別されたlin+細胞はTGF-β1を発現することを示すRT-PCR分析。(C)亜集団選択および/または培地希釈に応答したMIP-1α分泌速度の変化を示すELISA分析。培地希釈は、MIP-1αの分泌を有意に減少した。(D)MIP-1α定常状態レベルが新鮮な培地に応答して減少することを示す半定量的RT-PCR分析。すべての実験について、β-アクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。段階的希釈(各段階において10倍)を、発現レベルを定量するための手段としてすべてのRT-PCR実験のために行った。ゲルイメージの上に、対応する希釈倍率を示す(「ニート」は希釈していない試料を示す)。試験されたすべての希釈について、ゲノムの夾雑は観察されなかった。(*)は、操作されていない対照培養(NS/NE)に対して比較した有意差(p<0.05)を表す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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