(57)【要約】本発明は、患者について対象の初代細胞プロフィールを作成するための細胞の動態及び表現型の測定のための上記の装置及び方法に関する。さらに、本発明は、初代細胞プロフィールと治療計画を関連付けることに関する。最後に、本発明は、初代細胞プロフィールに対するその作用を測定することによって、生物活性について試験化合物をスクリーニングするための方法に関する。
2006523458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験患者からの初代細胞をインビトロモニタリングすることを含む、初代細胞プロフィールを作成する方法であって、該モニタリングが、細胞形態、分子マーカー発現パターン、選択的活性化、ローリングと接着性、遊出能力、および化学走化性よりなる群から選択される初代細胞の表現型と動態を試験することを含んでなる前記方法。
【請求項２】
初代細胞プロフィールのデータベースを作成することをさらに含んでなる請求項1に記載の方法であって、該データベースが少なくとも1人の健康患者と少なくとも1人の疾患患者についての初代細胞プロフィールを含む、前記方法。
【請求項３】
疾患を有する試験患者の治療結果を予測する方法であって、
a)請求項1の方法により試験患者の初代細胞プロフィールを作成し；
b)試験患者の上記初代細胞プロフィールを同じ疾患を有し治療を受けたプロフィール化患者の初代細胞プロフィールと比較し；
c)細胞形態、分子マーカー発現パターン、選択的活性化、ローリングと接着性、遊出能力、および化学走化性よりなる群から選択される初代細胞の表現型と動態に関する初代細胞プロフィールの類似性を決定し；
d)上記プロフィール化患者の治療の結果を決定し；そして
e)上記プロフィール化患者の治療の結果を、上記初代細胞プロフィールの類似性に基づいて上記試験患者の治療の結果を予測することと関連付ける、
ことを含んでなる前記方法。
【請求項４】
上記細胞プロフィールが初代白血球を使用して測定される、請求項1の方法。
【請求項５】
上記細胞プロフィールが単核細胞を使用して測定される、請求項1の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第60/462,315号(2003年4月14日出願)の利益を請求し、その開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、細胞運動性の以後の観察と測定のために細胞を所定の整列でパターン化するための装置と方法に関する。
【０００３】
本発明は、細胞または細胞群と基層との相互作用をモニターするための装置と方法に関する。特に本発明は、白血球遊走をモニターするための装置と方法に関する。本発明は一般に、微小流体系中で形成される勾配中で行われる生物学的測定法に関する。
【０００４】
本発明は一般に、細胞の運動性と化学走化性をモニターするための装置と方法に関する。
【０００５】
本発明は一般に、微小流体系中で形成される勾配中で行われる生物学的測定法に関する。
【０００６】
本発明はさらに、患者の対象初代細胞プロフィールを作成するために細胞動態と表現型を測定するための上記装置と方法を利用する方法に関する。さらに本発明は、初代細胞プロフィールを治療法と関連させる方法に関する。最後に本発明は、初代細胞プロフィールに対する作用を測定することにより、試験化合物を生物活性についてスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００７】
細胞挙動と細胞に対する外部刺激の影響の試験は、現代の生物学的研究では広く行われている。一般にこの研究では、細胞を外部刺激に曝露し、細胞の反応を研究することを含む。生きた細胞を種々の環境に置き、異なる外部刺激に曝露することにより、細胞の内部活動と細胞に対する外部刺激の影響の両方を測定し、記録し、よりよく理解することができる。
【０００８】
細胞を化学的刺激に曝露した時の細胞の挙動は、治療薬候補とその有効性を開発し評価するのに特に重要な問題である。化学的刺激（例えば治療薬）に対する細胞または細胞群の反応を記録することにより、化学的刺激の有効性をよりよく理解することができる。特に腫瘍学と細胞生物学の分野では、しばしば細胞の遊走と転移が研究される。代表的にはこれらの分野の研究は、種々の生物学的因子および抗癌剤候補について、生きた細胞の遊走と挙動を分析する。さらに、その結果生じる細胞の遊走、分化、および挙動は、しばしば腫瘍細胞の転移に関与する化学走化性プロセスをさらに理解するための助けになる。さらにこれらの研究はまた、組織再生、創傷治癒、炎症、自己免疫疾患、および他の多くの変性疾患および症状のプロセスを理解する助けになる。
【０００９】
細胞遊走測定法はしばしば、これらの種類の研究を実施するのに使用される。かかる測定法を作成するための市販の装置はしばしば、ボイデンチャンバー（Boyden chamber）（薄い多孔性膜で区切って2つの異なる重なったチャンバーを作成する容器）に基づくかまたはこれを利用する。トランスウェル（transwell）としても知られているボイデンチャンバーは、薄い多孔性膜の片側に遊走刺激物質を置き、他方に研究される細胞を置くことにより使用される。充分なインキュベーション期間後、細胞を固定し、染色し、計数して、膜を横切る細胞の遊走に対する刺激物質の影響を調べる。
【００１０】
トランスウェルの使用はいくつかの欠点がある。例えばトランスウェルを使用する測定法には、ハイスループットスクリーニングや処理に対応しにくい労働集約的実験計画が必要である。しばしば顕微鏡を使用して手動で行われる細胞の計数は、時間がかかり、面倒で高価な方法である。さらに細胞計数はまた主観的であり、統計的近似が関与する。特に、全フィルターを調べることによる時間と費用のために、ランダムに選択された代表的な領域のみが計数され、これらの領域が計数される時でさえ、もし細胞がフィルターを通して部分的に遊走しているなら、検査技師はこのような細胞を計数する時にも、技師自身の判断を加える必要がある。
【００１１】
上記にもかかわらずトランスウェルの使用のおそらく最も重要な欠点は、観察のために細胞がスライドに固定される時、これらが死滅することである。従っていったん細胞が観察されると、これはもう測定に再導入したり、以後の刺激物質への曝露期間において研究することができない。従って刺激に対する細胞の反応の進行を研究するために、刺激物質の導入の前後の種々の時点で、観察のために予定されているものを並行して測定することが必要である。信頼できるデータを得るのに必要な陽性対照および陰性対照以外に、各試験に多数の試料が必要であることを考慮すると、1つの化学走化性測定法に、数十個のフィルターが必要で、その各々を個々に観察し計数する必要があり、これは莫大で面倒な作業である。
【００１２】
細胞の遊走と分化はまた、正常および異常な無数の生物学的機能を理解するのに重要である。例えば組織再生と創傷治癒の研究、並びに炎症、自己免疫疾患および他の変性疾患の研究はすべて、自発的なまたは化学走化性因子に応答した細胞の動きまたは他の細胞シグナルを分析する。さらに種々の異常な細胞機能または疾患の治療法を研究するために、科学者は、臨床試験に進む前に細胞培養物中での細胞の動きに対する治療法候補の影響を分析することが必要である。
【００１３】
すなわち細胞遊走測定法は、細胞の成長、増殖、および遊走能力を測定するための細胞生物学者の有用な手段である。細胞の遊走に基づく測定法は有用ではあるが、測定法を実施するための便利な手段の利用が困難なため、使用が限定されている。現在細胞の遊走または化学走化性を研究するための市販の装置はボイデンチャンバーに基づいている。S. Boyden, J. Exp. Med. 115: 453-466 (1962)。時間依存性研究に関連する時間と費用のために、ボイデン法を使用してこのような研究を実施することは通常困難である。細胞の遊走挙動はいくつかの治療法の開発に使用できる可能性があるが、細胞運動性と遊走に対する標的薬物の作用をスクリーニングし定量するためには、よりよいインビトロ系が必要である。
【００１４】
上記欠点のいくつかを克服するために、ボイデン測定法の代替法が提唱されている。一般的には、P. Wilkinson, Methods in Enzymology, vol. 162（アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）、1988）、38-50頁；またGoodwin, 米国特許第5,302,515号；Guiruisら、米国特許第4,912,057号；Goodwin, 米国特許第5,284,753号、およびGoodwin, 米国特許第5,210,021号を参照されたい。これらの文献に記載の化学走化性装置と方法は元々のボイデン法および装置に対していくつかの利点を有するが、これらも欠点が無いわけではない。例えばこれらのすべての方法では、ボイデンチャンバーのようにフィルターを取り出し、非遊走細胞をフィルターからふき取るかまたはブラシで落としてから、遊走細胞を計数できる。さらにこれらの方法のほとんどは、細胞を固定し染色する必要があり、いずれも同じ細胞試料の化学走化性応答の動態または時間依存性研究が不可能である。さらにこれらの方法は、操作が面倒でハイスループットに向かない細胞の計数を含む。
【００１５】
細胞の遊走は組織の形態形成に必要である。細胞の運動の分子的基礎の理解が大きく進展している。しかし多細胞系の固有の複雑さのために、細胞の遊走がいかに細胞パターン形成を仲介するかについてはほとんどわかっていない。Bragwynneら（第22回国際学会講演集、2000年7月23〜28日）は、細胞接着を立体障害することにより、インビトロでのモデル哺乳動物組織の自発的パターン生成を報告している。彼らは、接着表面の空間制限により画定される視野内でウシ毛細管内皮細胞の共役した協調した遊走を観察した。Bragwynneらは、異なった細胞構成成分の間の集団的相互作用からパターン生成行動があらわれると推測した。Bragwynneらは、生じる細胞パターンが、遊走細胞群への立体的制約が自発的パターン形成を誘導できることを証明すると推定している。すなわち自発的パターン形成をさらに詳しく理解するために、所定のパターンで所定の位置に細胞をパターン化し、その遊走と自発的パターン形成を観察することを可能にする装置を有することが必要である。
【００１６】
細胞増殖、遊走、分化、および機能の制御における細胞−細胞相互作用の役割は、徐々に明らかになっている。細胞−細胞接触は、中胚葉相互作用および間葉−上皮転換のような発生過程に関与すると考えられている。Sargent, T.D.ら、Dev. Biol. 114:238-246 (1986); Lehtonen, E.ら、J. Embryol. Exp. Morphol. 33:187-203 (1975)。神経系では、神経細胞の遊走、軸索円錐成長とグリア細胞分化のパターンは、異種溶解性細胞−細胞相互作用に依存すると考えられる。Rakic, P.、「接触している細胞（The cell in contact）」、ニューヨーク：ワイリーインターサイエンシーズ（Wiley Intersciences）、67-91 (1985); Bently, D.ら、Nature 304:62-65 (1983)；Lillien, L.ら、Neuron, 4:525-534 (1990)。免疫系では、リンパ球の成長と活性化は、リンパ球の生活サイクル中の多くの異なる種類の細胞との接触に依存する。Kierny, P.C.ら、Blood 70:1418-1424 (1987)。さらに上皮細胞（例えば腸上皮細胞）の分化と機能は、一部は下層の間葉細胞との接触により制御される。Kedinger, M.ら、Cell Differ. 20:171-182 (1987)。異種細胞の接触の役割が明らかになるにつれて、細胞内連絡を研究するために設計されたインビトロ系が必要とされる。
【００１７】
種々の細胞プロセスにおける細胞内連絡の役割を調べるために、2つの異なる種類の組織または細胞の同時培養を利用する多くの実験的アプローチが使用されている。例えば胚誘導プロセスへの細胞−細胞相互作用の寄与は、胚組織片を多孔性膜の反対側に付着させる実験により解明された。Grobstein, C., Exp. Cell Res. 10:424-440 (1956)。細胞機能へのヘテロタイプな相互作用の効果の研究は、2つの異なる種類の細胞を同じ培養皿で同時培養した。Davies, P.F.ら、J. Cell. Biol. 101:871-879 (1985); Guguen-Guillouzo, C.ら、Exp. Cell Res. 143:47-54 (1983); Mehta, R.Pら、Cell 44:187-196 (1986); Orlidge, A.ら、J. Cell. Biol. 105:1455-1462 (1987); Shimaoka, S.ら、Exp. Cell Res. 172:228-242 (1987)。しかし、これらの同時培養は細胞の混合集団であるため使用が限定される。細胞形態に対する、または1種類の細胞独特の機能もしくはタンパク質に対する細胞内接触の作用を調べることができる：しかし、両方の細胞に共通の生化学的もしくは分子的プロセスの研究は不可能である。この限界を回避するために、組織培養細胞の同時培養で多孔性フィルターが使用されている。これらの研究において、1種類の細胞は通常組織培養皿中で増殖され、第2の種類の細胞は、組織培養皿にあてはまるチャンバー中の多孔性膜上で培養される。Hisanaga, K.ら、Dev. Brain Res. 54:151-160 (1990); Kruegar, G.G.ら、Dermatologic 179:91S-100S (1989); Ueda, H.ら、J. Cell Sci. 89:175-188 (1988)。
【００１８】
多くの因子が相乗作用して細胞の遊走に影響を与えることが測定されている。例えばWoodwardら、Journal of Cell Science 111:469-478 (1998)は、遊走チャンバーを使用して、αvβ3インテグリンとPDGF受容体が相乗作用して細胞の遊走を上昇させることを証明した。したがって、相乗作用を含む種々の因子に応答した細胞遊走のさらなる研究を可能にする測定装置もしくは方法は、細胞の運動性と遊走の理解の助けになるであろう。
【００１９】
細胞に影響を与える物質またはランダムな運動性に応答した細胞運動性を研究するために、所定の「出発」点から細胞の動きを追跡できることが好ましい。このために細胞は、その生存度が維持され、細胞応答（すなわち運動性またはその欠如）の複数の信号発信もしくはプローブ結合ができるように、その位置が画定できるように表面に置くか、付着させるか、または固定化しなければならない。細胞固定化に関する以前の方法では、細胞はしばしば不可逆的な固定化を受ける。例えば、細胞を「捕捉」するタンパク質のひもを有する自己集合膜上に細胞をパターン化することにより、細胞は固定化される。あるいは細胞は、それ自体が固定化表面に固定化された抗体との免疫反応により固定化される。他の固定化法には、適当な表面（例えばガラスまたはプラスチック）に単に細胞を付着させる方法があり、次にこれを隣接領域に遊走させる。
【００２０】
Ostuniらは、エラストマー膜を使用して、細胞培養で一般的に使用される表面への細胞の付着をパターン化した。細胞のパターン化は、足場依存性細胞の挙動を研究し制御するのに広く有用な実験プロトコールである。Chen, C.S.ら、Science 276:1425-1428 (1997); Ingber, D.E.ら、J. Cell. Biol. 109:317-330 (1989); Ingber, D.E.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3379-3583 (1990); Singhvi, R.ら、Science 264:696-698 (1994)。またこれは、応用細胞生物学、バイオセンサー、ハイスループットスクリーニング、および組織工学に直接関係する。Chen, C.S.ら、Science 276:1425-1428 (1997); Bhatia, S.N.ら、Biotechnol. J. 14:378-387 (1998); Borkholder, D.A.ら、J. Neurosci. Methods 77:61-66 (1997); Dodd, S.Jら、Biophys. J. 76:103-109 (1999); Fromherz, P., Phys. Rev. Lett. 78:4131-4134; Hickman, J.J.ら、J. Vac. Sci. Technol. A-Vac. Surf. Films 12:607-616 (1994); Humes, H.D.ら、Nat. Biotechnol. 17:451-455 (1999); Huynh, Tら、Nat. Biotechnol. 17:1088-1086 (1999); Kapur, R.ら、J. Biomech. Eng.-Trans. ASME 121:65-72 (1999); Pancrazio, J.J.ら、Sens. Actuators, B-Chem. 53:179-185 (1998); St. John, P.M.ら、Anal. Chem. 70:1108-1111 (1998); You, A.J.ら、Chem., Biol. 4:969-975 (1997)。
【００２１】
細胞生物学および生化学で有用な方法で1〜100μm範囲の大きさで表面をパターン化し、構造を作成する方法の組合せを提供するために、ソフトリソグラフィーが開発されている。Qin, D.ら、Adv. Mater. 8:917-919 (1996); Qin, D.ら、J. Vac. Sci., Technol., B 16:98-103 (1998); Xia, Y.ら、Agnew. Chem., Int. Ed. Engl. 37:550-575 (1998); Zhao, X.-M.ら、Adv. Mater. 8:837-840 (1996); Zhao, X.-M.ら、Adv. Mater. 9:251-254 (1997)。ミクロ接触印刷は、金の表面にアルカンチオレートの自己集合膜をパターン化することにより、タンパク質と細胞のパターンを生成する方法として特に有用である。Chen, C.S.ら、Science 276:1425-1428 (1997); Singhvi, R.ら、Science 264:696-698 (1994)；Lopez, G.P.ら、J. Am. Chem. Soc. 115:5877-5878 (1993); Kumar, A.ら、Appl. Phys. Lett. 63:2002-2004 (1993); Mrksich, M.ら、Trends Biotech. 13:228-235 (1995)。
【００２２】
Mrksichらは、金支持体を、疎水性アルカンチオレートと、低率の電気化学的活性のある末端基を提供する別のアルカンチオレートとでパターン化した領域に区切った。（Yousaf, M.N.; Houseman, B.T.; Mrksich, M. 提出中）。細胞が疎水性パターン上に付着して広がった後、短時間電圧を印加すると末端酸化還元中心の酸化状態と極性が変化した。この酸化状態と極性の変化は、ペプチド配列を与える基が表面と反応して、パターン化された細胞が広がることができる以後の表面を生成することを可能にする。この方法は、電気活性アルカンチオールの合成が必要であり、また電気化学的装置も必要である。
【００２３】
細胞分化と細胞の遊走を測定するために、アガロース下遊走研究を使用することが当該分野でさらに公知である。これらの方法は遅くて面倒であり、従ってハイスループット測定法の要求には適していない。
【００２４】
すなわち、生きた細胞をリアルタイムに追跡する装置と方法に対するニーズが存在する。既存の方法は面倒なプロトコールが必要とし、終点測定法として機能する。本発明はこのニーズを満足する。
【００２５】
炎症性応答は、感染または損傷後にホメオスタシスを回復し維持するための体の試みであり、体の防御に不可欠な部分である。体の防御要素のほとんどは血液中に存在し、炎症は、これらの要素が血液を離れて、損傷を受けたかまたは感染した部位の周りの組織に入る手段である。炎症の主要な目的は、損傷または感染の発生源を局在化かつ根絶させ、損傷または炎症部位の周りの組織を修復することである。
【００２６】
感染に対する最初の先天的な免疫応答の結果として、損傷組織中の肥満細胞のような食細胞は種々のサイトカインや炎症性メディエーター（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン、ブラジキニン、およびプロスタグランジン）を放出する。これらの炎症性メディエーターは、損傷組織の周りの血管の内表面の薄いこわれやすい細胞（内皮細胞として知られている）間の接合帯（junctional zone）を可逆的に開く。炎症性メディエーターはまた、血管透過性を亢進させ、血流速度を低下させた。血管中のこれらの変化の別の結果は、正常には血管の中心を移動する白血球が血管の内表面周辺に出て内皮細胞と相互作用することである。食細胞により放出されるサイトカインと炎症性メディエーターはまた、内皮細胞の表面上の接着分子の発現を誘導して、「活性化」内皮細胞にする。
【００２７】
活性化内皮細胞との白血球の最初の接触は「捕捉」として知られており、接着分子であるP-セレクチンとL-セレクチンを含むと考えられ、これらは炎症性メディエーターとの接触後に内皮細胞上でアップレギュレートされる。P-セレクチンとL-セレクチンは、セレクチンと呼ぶ接着分子のファミリーに属する。セレクチンは、活性化内皮細胞と白血球の表面で発現されるモノマー性の主要な膜糖タンパク質群である。セレクチンは、カルシウム依存性レクチンと構造相同性が有り、後ろに上皮細胞成長因子と相同的なドメインと、補体調節タンパク質中に存在する配列と類似の9個のコンセンサス繰り返し配列（CR）が続くN末端細胞外ドメインを含有する。炎症性応答に関与すると考えられる3つの主要なセレクチンがある：P-セレクチン；E-セレクチン；およびL-セレクチン。最も大きなセレクチンであるP-セレクチン（CD62P、GMP-140、およびPADGEMとしても知られている）は、活性化内皮細胞上で発現され；ELAM-1としても知られているE-セレクチンは、化学的またはサイトカイン誘導性炎症を有する内皮細胞上で発現され；L-セレクチン（LECAM-1、LAM-1、Mel-14抗原、gp90mel、およびLeu8/TQ-1抗原としても知られている）は最も小さなセレクチンであり、ほとんどの白血球上に存在する。3つのすべてのセレクチンは、少なくとも一部は炭水化物成分を介して、セレクチン結合リガンドと結合すると考えられている。
【００２８】
捕捉中に、P-セレクチンはその主要な白血球リガンドであるP-セレクチン糖タンパク質リガンド-1（PSGL-1）に結合すると考えられている。P-セレクチンの他のリガンドには、CD24とまだ性状解析されていないリガンドがある。機能性PSGL-1の構造は、シアリル-ルイスｘ成分を含む。さらに、捕捉中にL-セレクチンは内皮細胞上のそのリガンドに結合すると考えられている。L-セレクチンは、3つの既知の対受容体またはリガンド（MAdCAM-1、GlyCAM-1、およびCD34）と相互作用するが、捕捉に関与する正確なリガンドまたは対受容体は不明である。
【００２９】
白血球はいったん捕捉されると一時的に内皮細胞に接着して、内皮細胞に沿って「ロール」し始める。「ローリング」という用語は、内皮細胞と白血球との相対的運動により生じる液体引力の存在下で活性化内皮細胞に沿って白血球が文字通り回転することを意味する。ローリングには、P-セレクチン、L-セレクチン、およびE-セレクチンが関与すると考えられる。P-セレクチンとPSGL-1との結合が、主に内皮細胞を横断する白血球の「ローリング」を仲介すると考えられる。
【００３０】
損傷部位または感染部位で細胞により産生されるインターロイキン-1（IL-1）および腫瘍壊死因子-a（TNF-α）のような炎症促進性サイトカインは、内皮細胞を刺激して基底板の反対側にある内皮細胞の表面上で、インターロイキン-8（IL-8）およびインテグリン結合リガンド（例えば細胞内接着分子（ICAM）および血管細胞接着分子（VCAM））のようなケモカインを産生させる。ケモカインは、ケモカインがローリングする白血球の表面上でケモカイン受容体と相互作用するところの基底板と反対側の内皮細胞の表面に維持される。次にこの相互作用は、白血球の表面上のインテグリンと呼ぶ分子の活性化を開始する。インテグリンは、細胞を基底膜の細胞外マトリックスタンパク質または他の細胞上のリガンドに付着させるヘテロダイマー性膜貫通糖タンパク質のファミリーである。インテグリンは、大きなａサブユニットと小さなｂサブユニットとからなる。哺乳動物インテグリンは、異なるａサブユニットと結合する共通のｂサブユニットを共有するいくつかのサブファミリーを形成する。$2インテグリン（「CD-18ファミリー」）は以下の4つの異なるヘテロダイマーを含む：CD11a／CD18（リンパ球機能関連抗原-1（LFA-1））；CD11b／CD18（Mac-1）；CD11c／CD18（p150,95）、およびCD11d／CD18。白血球上の$1インテグリンサブファミリーの最も重要なメンバーは最晩期抗原（Very Late Antigen）4（VLA-4、CD49d／CD29、「4$1）である。ケモカインによるこれらのインテグリンの活性化は、ゆっくりローリングする白血球が「停止」して、内皮細胞のICAM、VCAM、および内皮細胞の他のインテグリン結合リガンド（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、およびフィブリノゲン）に強く結合することを可能にする。いったん内皮細胞に結合すると、次に白血球は扁平になり、内皮細胞の間に入り込んで血管を離れ、「遊出」と呼ぶプロセスにより損傷組織の中に入る。遊出は、血小板、内皮細胞接着分子-1（PECAM-1）、タイトジャンクション接着分子（JAM）、およびおそらくCD99（膜貫通タンパク質）により仲介されると考えられている。
【００３１】
感染と損傷との闘いにおけるその重要性にもかかわらず、白血球自体が組織損傷を促進することがある。異常炎症性応答の間、白血球は血管壁または非損傷組織で毒性物質を放出することにより、大きな組織損傷を引き起こすことがある。あるいは白血球は、これらの細胞で内皮の内側が覆われる程度に、毛細管壁に固着するか細静脈中で凝集する。かかる現象（「ペーブメンティング（pavementing）」と呼ぶ）は、動脈硬化症と関連疾患の発症に関連する。かかる異常炎症応答は、成人型呼吸窮迫症候群（ARDS）；心筋梗塞、ショック、卒中または臓器移植後の虚血−再潅流損傷；急性および慢性同種移植片拒絶；血管炎；敗血症；リウマチ様関節炎；および炎症性皮膚疾患を含む様々な他の臨床的障害の発病に寄与するとされている。
【００３２】
これらの種々の炎症性疾患に関与するとされている白血球遊走の過程を研究するためのいくつかの方法と装置が当該分野に存在する。例えば1つの方法は、マイクロタイタープレートの表面に単離した内皮細胞の単層を広げ、細胞を化学誘引物質で活性化し、次に標識白血球をプレートに入れる。試験薬（例えば接着インヒビター）は、随時プレートに加えられる。次に内皮細胞単層に接着したままの白血球の数が測定される。この方法の大きな欠点は、白血球はせん断流れの存在下では内皮細胞に曝露されないことであり、従ってこの方法はインビボでの生理的条件をシミュレートしない。
【００３３】
他の方法は、適当な媒体中の単離された白血球懸濁液を、顕微鏡スライド上にのせたヒト血管組織試料と接触させ、次に回転テーブル上で組織を細胞懸濁液とともにインキュベートする。接着した細胞は、固定され計数される。細胞は固定されているため、かかる方法はリアルタイムで白血球遊走を観察することができない。さらにこのような方法はヒトの血管組織が必要であり、これは入手が困難でありコストがかかる。
【００３４】
白血球遊走を研究するための当該分野で公知の他の方法は、マイクロスライドと呼ぶ2つのガラス管（1つのマイクロスライドはもう一方に差し込むことができる）からなる装置を含む。小さい方のマイクロスライドが大きい方に差し込まれて、選択された接着分子が存在できる平らな表面を有するフローチャネルが作成される。次に白血球の懸濁液は、シリンジポンプを使用して接着分子固定化表面上にフローチャネルを介して潅流される。次に白血球のローリングと接着が観察される。この装置のサイズと構成のために、かなりの取り扱いと操作が必要である。
【００３５】
炎症性応答中の白血球遊走を研究するための他の装置は、「血液成分の分析のための装置と方法および炎症性応答のインヒビターと促進剤の同定」と題するSpringerらの米国特許第5,460,945号に記載されている。この装置は、サイズの大きないくつかの異なる成分からなる。従って多大な取り扱いと位置合わせが必要であり、内皮細胞単層を汚染または損傷するリスクがある。この装置はまた、多数の細胞を使用する必要があり、したがって大量の試薬が必要である。
【００３６】
従って、血管の生理的条件をシミュレートする内皮細胞に沿った白血球遊走を研究するための改良された装置に対するニーズがある。また現在当該分野で公知の装置が必要とするような測定毎の白血球の数を必要とせずに、白血球と内皮細胞との相互作用に影響を与える可能性のある試験薬のハイスループットスクリーニングを可能にする装置に対するニーズがある。本発明はこれらのニーズを満足する。
【００３７】
化学走化性（chemotaxis）、接触走性（haptotaxis）、および化学侵入性（chemoinvasion）で使用されるような試験装置は公知である。このような装置は、例えば米国特許第6,329,164号、6,238,874号および5,302,515号に開示されている。
【００３８】
細胞の遊走に関与するこれらのプロセスは、化学走化性（chemotaxis）、接触走性（haptotaxis）、および化学侵入性（chemoinvasion）である。化学走化性は、可溶性化学走化性刺激の濃度勾配により誘導される細胞の運動として定義される。接触走性は、基質結合刺激の濃度勾配に応答した細胞の運動として定義される。化学侵入性は、バリアまたはゲルマトリックス中へのおよび／またはこれを介する細胞の運動として定義される。化学走化性／接触走性および化学侵入性並びにかかる挙動への外部刺激の影響の研究は、現代の生物学的研究で広く行われている。一般的にこの研究は、細胞を外部刺激に曝露して細胞の反応を研究する。生きた細胞を種々の環境に置き、そして異なる外部刺激に曝露することにより、細胞に対する外部刺激の影響を測定、記録、およびよりよく理解することができる。
【００３９】
化学的刺激に応答した細胞の遊走は、種々の疾患プロセスを理解するための、従ってこれらの疾患の治療候補を開発し評価するための特に重要な問題である。化学的刺激（例えば治療薬）に応答した細胞または細胞群の遊走を記録することにより、化学的刺激の有効性がよりよく理解できる。典型的には種々の医学分野（例えば腫瘍学、免疫学、血管形成、創傷治癒、および神経生物学）の疾患プロセスの研究は、生きた細胞の化学走化性および侵入性の分析を含む。例えば腫瘍学の分野において細胞の遊走は、転移過程の理解において重要な問題である。転移中に典型的な固形腫瘍の癌細胞は、隣接細胞への接着をゆるめて、元々の組織から逃げて、血管またはリンパ管に達するまで組織の細胞外マトリックスを分解することにより他の組織に侵入し、基底板と内皮細胞裏層を横断して循環流に入り、体の別のところで循環流から出て、新しい環境で生存し増殖して、最終的にそこにとどまる。従って癌細胞の遊走を研究することは、転移の過程の理解と、この過程を阻害する可能性のある治療薬の開発の助けになる。炎症性疾患分野では細胞の遊走はまた、炎症性応答を理解するために重要な問題である。炎症応答中、白血球は損傷組織に遊走し、感染との闘いまたは創傷治癒を補助する。白血球は毛細管中を遊走して、毛細管の裏を覆う内皮細胞に接着する。次に白血球は内皮細胞の間に入り込み、消化酵素を使用して基底板に沿ってゆっくり進む。従って、内皮細胞を横切って遊走し基底板に侵入する白血球を研究することは、炎症過程を理解し、炎症性疾患（例えば、成人型呼吸窮迫症候群（ARDS）、リウマチ様関節炎、および炎症性皮膚疾患）におけるこの過程を阻害する治療薬を開発する補助になる。
【００４０】
細胞の遊走はまた、血管形成の分野における重要な問題である。既存の小血管から毛細管が発芽する時、内皮細胞はまず既存の小血管の壁から伸びて新しい毛細管枝を生成し、偽足は毛細管の芽が周りの結合組織中へ発芽するのを案内する。これらの毛細管の新しい成長は、癌性増殖が拡大し、拡散して、例えば糖尿病に伴う失明の一因になることを可能にする。逆に毛細管産生が無いと、例えば心臓発作後の心筋中の組織死滅の原因となる。従って既存の毛細管から新しい毛細管が形成する時の内皮細胞の遊走を研究することは、血管形成を理解し、血管成長を阻止し血管機能を改善する薬物を最適化する補助になる。さらに細胞の遊走を研究することは、組織再生、臓器移植、自己免疫疾患および他の多くの変性疾患や症状の過程に対する情報を提供することができる。
【００４１】
細胞遊走測定法はしばしば、これらのタイプの研究を実施するのに使用される。かかる測定法を作成するための市販の装置は時に、トランスウェル系（薄い多孔性膜で区切って、上のコンパートメントと下のコンパートメントとを形成する容器）に基づくかまたはこれを利用する。細胞の化学走化性を研究するために細胞は上のコンパートメントに置かれ、下のコンパートメントに遊走刺激物質が置かれる。充分なインキュベーション期間後、細胞は固定、染色、および計数され、膜を横切る細胞の化学走化性への刺激の効果を調べる。
【００４２】
化学侵入性を研究するために、マトリゲル（MATRIGEL）（登録商標）マトリックスの均一層が膜の上に置かれて、膜の孔を塞ぐ。細胞を上のコンパートメントのマトリゲル（登録商標）マトリックス上に播種し、下のコンパートメントに化学誘引物質を入れる。侵入性細胞はマトリックスに付着し侵入して、多孔性膜を通過する。非侵入性細胞は塞がった孔を通して遊走できない。充分なインキュベーション期間後、細胞は固定、染色、および計数され、膜を横切る細胞の化学走化性への刺激の作用を調べる。
【００４３】
トランスウェルの使用はいくつかの欠点がある。トランスウェルを使用する測定法は、労働集約的実験計画が必要であり、これは容易にハイスループットスクリーニングや処理に適応できない。トランスウェル系の構成のために、既存のロボットによる液体取り扱い系や自動画像取り込み系と組合せることは困難である。
【００４４】
トランスウェルベースの測定法は、トランスウェル系で使用される薄膜による本質的な限界がある。膜はわずかに50〜30ミクロン（μm）の厚さであり、膜を横断して形成される化学濃度勾配は一時的であり、短時間しか続かない。細胞化学走化性測定法が、長い距離（＞100〜200μm）にわたって生成されて少なくとも2時間以上安定である化学走化性勾配を必要とするなら、現在利用可能なトランスウェル測定法は、充分使用することができない。
【００４５】
トランスウェルの最も大きな欠点は、化学走化性と化学侵入性のリアルタイム観察ができないことである。特に化学走化性中の細胞形態の変化は、トランスウェルを使用するとリアルタイムで観察することができない。上記したようにトランスウェル系は細胞を死滅させることを要求するため、単一の化学走化性測定法は、数十個のフィルターが必要で、その各々を個々に観察し計数する必要がある。
【００４６】
さらに最近、2つのウェルが互いに横に並置される構成を利用する、化学走化性と化学侵入性を測定するための装置が利用可能になった。装置のこの構成は1977年にSally Zigmondにより導入され、以後「ジグモンド（Zigmond）装置」と呼ばれ、1mmのブリッジにより分離された幅4mmで深さ1mmの2つの溝を有する25ミリメートル（mm）×75mmのガラススライドからなる。溝の1つは誘因物質が充填され、他の溝は対照溶液が充填されて、ブリッジを横断して濃度勾配が形成される。次に細胞が他の溝に加えられる。ピンクランプが入るように、スライドの各端に2つの穴が設けられる。クランプは、細胞のインキュベーションと観察中、カバーガラスを所定の位置に保持する。ジグモンド（Zigmond）チャンバーのサイズと構成のために、既存のロボットによる液体取り扱い系や自動画像取り込み系と組合せることはできない。さらに、トランスウェルベースの系と同様に、ジグモンドチャンバーを使用すると、細胞が観察のためにスライドに固定されるため、化学走化性中の細胞形態の変化をリアルタイムで観察することができない。さらにピンクランプはアレンレンチを用いて組み立てる必要があり、従ってこの装置は、測定を行う前に余分の取り扱い、位置合わせ、および整列が必要である。ガラススライド上のカバーガラスのかかる取り扱いと位置合わせ、ならびにカバーガラスの硬さが、ブリッジ上での表面処理を損傷または妨害する可能性がある。
【００４７】
リアルタイム観察ができない問題を解決するための化学走化性装置は、「ダン（Dunn）チャンバー」である。ダンチャンバーは、中央の円形のへこみと同心円状の環状溝を有する特別に構築されたマイクロスライドからなる。ダンチャンバーを使用する測定では、細胞は化学走化性刺激物質に向かってカバーガラス（これはダンチャンバー上で反転して置かれる）上を遊走する。細胞は、画像取り込みボードを有するコンピューターに連結されたビデオカメラを取り付けた位相差顕微鏡を使用して一晩モニターされる。
【００４８】
カバーガラスの硬さと既存のロボットによる液体取り扱い系への組み込みができないという問題以外に、ダンチャンバー測定法の主要な問題は、ほんのわずかの細胞（代表的には10個）しかモニターできないことである。この非常に少数の試料の平均挙動は、全体としての集団を代表しないかも知れない。第2の問題は、再現が限定されることである。各対照チャンバーと各処理チャンバーは、それぞれカメラとコンピューターと同様に取り付けた別の顕微鏡で観察しなければならない。
【００４９】
当該分野で公知の他の化学走化性装置は、Jarniganらの米国特許第6,238,874号（'874特許）に開示されている。'874特許は、化学走化性をモニターするのに使用される試験装置の種々の実施態様を開示する。しかし残念ながら、Jarnaginらの装置は、容易に密封もしくは組み立てもしくは分離および分解できない。すなわち組み立て中に化学的または生物学的に調製される表面を維持することが困難である。従って'874特許の試験装置は、1回のみの使用に適している。また細胞を損傷せずまたは細胞の位置を乱すことなく、細胞を分離および採取することが困難である。
【００５０】
先行技術は、化学走化性、接触走性、および／または化学侵入性をモニターするための、容易に組み立てと分解ができる試験装置を提供できていない。さらに先行技術は、化学誘引物質、化学的忌避物質（chemorepellant）、および化学的刺激物質の細胞遊走への影響を測定することに限定されない、化学走化性および／または化学侵入性をモニターするための試験装置を提供できていない。
【発明の開示】
【００５１】
発明の要約
本発明は、支持体；支持体と液体緊密に接触（fluid-tight contact）して置かれるように作成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；および第1層の上部表面と液体緊密に接触して置かれるように作成され、マクロオリフィスのパターンを画定する第2層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）、とを含んでなる装置を提供する。
【００５２】
第1層が支持体に対して置かれる時、第1層は好ましくは、支持体と共形接触して置かれるように構成される。第2層が第1層に対して置かれる時、第2層は好ましくは、第1層と共形接触して置かれるように構成される。支持体は、ガラス、ケイ素、融解石英、金属膜、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）、およびポリカーボネートよりなる群から選択される材料で作成される。第1層と第2層は、ガラス、エラストマー、硬質プラスチック、金属、ケイ素、および二酸化ケイ素よりなる群から選択される材料で作成される。好ましくは第1層と第2層はエラストマーから作成される。最も好ましくは第1層と第2層はPDMSである。好ましくは各マクロ領域は、少なくとも1つのマイクロ領域を包含し、好ましくは各マクロ領域は複数のマイクロ領域を包含する。
【００５３】
ある実施態様では各マクロウェルの壁は、第1層の上部表面と直角の断面中の曲線を画定する。
【００５４】
装置においてマイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンの少なくとも1つは、空間的にかつ大きさが標準的マイクロタイタープレートに対応する。好ましくはマイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンの少なくとも1つは、空間的にかつ大きさが、6ウェルマイクロタイタープレート、12ウェルマイクロタイタープレート、24ウェルマイクロタイタープレート、96ウェルマイクロタイタープレート、384ウェルマイクロタイタープレート、1,536ウェルマイクロタイタープレート、および9,600ウェルマイクロタイタープレートよりなる群から選択される標準的マイクロタイタープレートに対応する。
【００５５】
別の実施態様では装置はさらに、マクロウェルの少なくとも1つを密封するための少なくとも1つのキャップを含む。好ましくは装置は、マクロウェルのそれぞれを密封するための複数のキャップを含む。
【００５６】
装置はまた、マイクロオリフィスとマクロオリフィスとを位置あわせするための手段を含む。位置あわせするための手段は、支持体、第1層、および第2層の少なくとも1つの上にガイド機構を含む。ガイド機構は、支持体から延びる突出部と、その突出部を受けて支持体上の第1層と第2層のそれぞれのガイドオリフィスを位置あわせするための第1層と第2層中で画定されるガイドオリフィスとを含む。位置あわせするための手段は、支持体、第1層、および第2層の少なくとも1つの上にマークを含む。
【００５７】
別の実施態様では装置は、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；および支持体から第1層をとりはずすと支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、マクロオリフィスのパターンを画定する第2層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）、とを含む。
【００５８】
本発明はさらに、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；および支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、複数のリングを含む第2層（ここで、リングは各マクロオリフィスのパターンを画定し、リングの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、リングは壁を有しかつマクロ領域を画定する）、とを含んでなる装置を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、マクロオリフィスのパターンを画定する層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；および各プラグが各マクロウェル中に受け入れられるように作成されるプラグのセット（ここで、層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、プラグが層と支持体により画定される対応するマクロウェル中に受け入れられる時、各プラグは、支持体と液体緊密に接触して置かれるように改変した下の膜を含み、下の膜はさらにマイクロオリフィスのパターンを画定し、ここで、マイクロオリフィスの壁とマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように、プラグが支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）、とを含んでなる装置を含む。
【００６０】
本発明はまた、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように構成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；第1層の上部表面と液体緊密に接触して置かれるように構成され、マクロオリフィスのパターンを画定する第2層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）とを含んでなる、細胞を含む生物学的分子を整列させるための装置であって、第1層と第2層は、マイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンにより支持体上の生物学的分子および／または細胞の整列のために構成される、装置を提供する。
【００６１】
好ましくは、第1層が支持体に対して置かれる時、第1層は支持体と共形接触して置かれ、第2層が支持体に対して置かれる時、第2層は支持体と共形接触して置かれる。支持体は、ガラス、ケイ素、融解石英、金属膜、ポリスチレン、ポリ（メチルアクリレート）、およびポリカーボネートよりなる群から選択される材料で作成される。第1層と第2層は、ガラス、エラストマー、硬質プラスチック、金属、ケイ素、および二酸化ケイ素よりなる群から選択される材料で作成される。好ましくは第1層と第2層はエラストマーから作成され、より好ましくはPDMSである。
【００６２】
装置において好ましくは各マクロ領域は、少なくとも1つのマイクロ領域を包含し、さらに好ましくは各マクロ領域は複数のマイクロ領域を包含する。
【００６３】
装置において各マクロウェルの壁は、第1層の上部表面と直角の断面中の曲線を画定する。
【００６４】
好ましくは装置は、マイクロオリフィスのパターンの少なくとも1つを有し、マクロオリフィスのパターンは、空間的にかつ寸法が標準的マイクロタイタープレートに対応する。さらに、マイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンの少なくとも1つは、空間的にかつ寸法が、6ウェルマイクロタイタープレート、12ウェルマイクロタイタープレート、24ウェルマイクロタイタープレート、96ウェルマイクロタイタープレート、384ウェルマイクロタイタープレート、1,536ウェルマイクロタイタープレート、および9,600ウェルマイクロタイタープレートよりなる群から選択される標準的マイクロタイタープレートに対応する。
【００６５】
ある実施態様では装置はさらに、マクロウェルの少なくとも1つを密封するための少なくとも1つのキャップを含む。好ましくは装置は、マクロウェルのそれぞれを密封するための複数のキャップを含む。
【００６６】
装置はまた、マイクロオリフィスとマクロオリフィスとを位置あわせするための手段を含む。位置あわせするための手段は、支持体、第1層、および第2層の少なくとも1つの上にガイド機構を含む。ガイド機構は、支持体から延びる突出部と、その突出部を受けて支持体上の第1層と第2層のそれぞれのガイドオリフィスを位置あわせするための第1層と第2層中で画定されるガイドオリフィスとを含む。位置あわせするための手段は、支持体、第1層、および第2層の少なくとも1つの上のマークを含む。
【００６７】
支持体は、その上にコーティングを有してもよい上部表面を有する。コーティングは、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、小分子、脂質二重層、金属、および自己集合膜よりなる群から選択される物質を含む。
【００６８】
本発明はさらに、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように構成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；支持体と液体緊密に接触して置かれるように構成され、マクロオリフィスのパターンを画定する第2層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）とを含んでなる、生物学的分子および／または細胞を整列させるための装置であって、第1層と第2層は、マイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンにより支持体上の生物学的分子および／または細胞の整列のために構成される、装置を提供する。
【００６９】
本発明はまた、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；支持体と液体緊密に接触して置かれるように構成され、複数のリングを含む第2層（ここで、リングは各マクロオリフィスのパターンを画定し、リングの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各リングは壁を有しかつマクロ領域を画定する）とを含んでなる、生物学的分子および／または細胞を整列させるための装置であって、第1層と第2層は、マイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンにより支持体上の生物学的分子および／または細胞の整列のために構成される、装置を提供する。
【００７０】
別の実施態様では、支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように作成され、マクロオリフィスのパターンを画定する層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；および各プラグが各マクロウェル中に受け入れられるように構成されるプラグのセット（ここで、層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、プラグが層と支持体により画定される対応するマクロウェル中に受け入れられる時、各プラグは、支持体と液体緊密に接触して置かれるように改変した下の膜を含み、下の膜はさらにマイクロオリフィスのパターンを画定し、ここで、マイクロオリフィスの壁とマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように、プラグが支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）とを含んでなる、生物学的分子および／または細胞を整列させるための装置であって、第1層と第2層は、マイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンにより支持体上の生物学的分子および／または細胞の整列のために構成される装置。
【００７１】
本発明はさらに、生物学的分子および／または細胞を整列させるための方法であって、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；第2層を第1層の上部表面と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、かつ第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；および、各マイクロ領域中の複数の生物学的分子および／または細胞の少なくとも1つの生物学的分子および／または細胞を支持体上に固定化して、少なくとも1つの生物学的分子および／または細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして生物学的分子および／または細胞を、マイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列させる工程とを含んでなる、生物学的分子および／または細胞を整列させる方法を提供する。
【００７２】
別の実施態様では、支持体の上部表面にコーティングが適用される。コーティングは、細胞、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、小分子、脂質二重層、金属、および自己集合膜でもよい。
【００７３】
本発明はさらに、生物学的分子および／または細胞を整列させるための方法であって、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；各マイクロ領域中の複数の生物学的分子および／または細胞の少なくとも1つの生物学的分子および／または細胞を支持体上に固定化して、少なくとも1つの生物学的分子および／または細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして生物学的分子および／または細胞を、マイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列させる工程；固定化工程後に支持体から第1層を除去する工程；および、第2層を支持体と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）とを含んでなる、生物学的分子および／または細胞を整列させる方法を提供する。
【００７４】
別の実施態様では本方法は、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置し（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；第2層を支持体と液体緊密に接触するように配置し（ここで、第2層は複数のリングを含み、リングは各マクロオリフィスのパターンを画定し、リングの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各リングは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；および、各マイクロ領域中の複数の生物学的分子および／または細胞の少なくとも1つの生物学的分子および／または細胞を支持体上に固定化して、少なくとも1つの生物学的分子および／または細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして生物学的分子および／または細胞を、マイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列させることを含む。
【００７５】
別の実施態様では、本方法は、層を支持体と液体緊密に接触するように配置し（ここで、層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；プラグセットの各プラグを各マクロウェルに挿入し（ここで、層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、プラグが層と支持体により画定される対応するマクロウェル中に受け入れられる時、各プラグは、支持体と液体緊密に接触して置かれた下の膜を含み、下の膜はさらにマイクロオリフィスのパターンを画定し、ここで、マイクロオリフィスの壁とマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように、プラグが支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；および、少なくともマイクロ領域中の生物学的分子および／または細胞を支持体上に固定化して、マイクロウェル内に位置させ、こうして生物学的分子および／または細胞を、マイクロオリフィスの第1のパターンに対応するパターンで支持体上に整列させることを含む。
【００７６】
本発明はさらに装置の作成方法であって、支持体を提供し；支持体と液体緊密に接触して置かれるように構成された第1層を提供し（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；および、第1層の上部表面と液体緊密に接触して置かれるように構成された第2層を提供する（ここで、第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、かつ第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）ことを含む方法を提供する。
【００７７】
ある実施態様では本方法は、鋳型を提供し；マイクロオリフィスのパターンに対応するマイクロポストのパターンを有する鋳型に、液体形態のエラストマー材料を適用し；エラストマー材料を硬化させ；および鋳型から硬化したエラストマー材料を取り出す、ことを含む。適用は、エラストマー材料をスピンコーティングすることを含む。別の実施態様では、第2層が第1層に対して置かれる時、第1層と第2層の間に適用されるように改変した接着剤が提供される。
【００７８】
さらに別の実施態様では装置の作成方法は、第1前駆体層（好ましくはエラストマー、さらに好ましくはPDMS）を提供し；第1前駆体層を硬化させて第1層を形成させ（第1層は上部表面を有し、かつマイクロオリフィスのパターンを画定し、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有し、第1層の下部表面により画定される平面中のマイクロ領域を画定する）；マクロポストのパターンを有する鋳型を第1層の上部表面上に置き；第2前駆体層を第1層の上部表面上に提供し；第2前駆体層を硬化させて第2層を作成する（第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有し、かつ第2層の下部表面により画定される平面中のマクロ領域を画定する）ことを含む。
【００７９】
他の実施態様は、第1層と支持体との液体による緊密な接触を確立するために支持体に対して第1層を置き、ここで、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定し、かつ該各マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定することを含む。
【００８０】
さらに別の実施態様では、第2前駆体層を提供することは、各マクロポストにより作成されるマクロオリフィスが少なくとも1つのまたはそれ以上の、好ましくは複数のマイクロ領域を包含するように、マクロポストのパターンを有する鋳型に第2前駆体層を提供することを含む。
【００８１】
別の実施態様では、装置の作成方法であって、マイクロポストのパターンを有する第1の鋳型を提供し；マクロポストのパターンを有する第2の鋳型を提供し；第1の鋳型の上に第2の鋳型を置き；置く工程の後に、液体形態のエラストマー前駆体を第2の鋳型と第2の鋳型に適用して、マイクロポストとマクロポストの周りの空間をエラストマー前駆体で充填し；適用工程後にエラストマー前駆体を硬化させてエラストマー要素を提供し；第1の鋳型と第2の鋳型とからエラストマー要素を分離する（ここで、マイクロポストがエラストマー要素中のマイクロオリフィスのパターンを形成し、マクロポストがエラストマー要素中のマクロオリフィスのパターンを画定するように、マイクロポストのパターンとマクロポストのパターンが構成される）ことを含む方法が提供される。
【００８２】
本発明はまた、細胞の動きを測定する測定法を提供する。1つの実施態様は、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置し（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；第2層を第1層の上部表面と液体緊密に接触するように配置し（ここで、第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、かつ第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；各マクロ領域は少なくとも1つのマイクロ領域を包含し；各マイクロ領域中の複数の細胞の少なくとも1つの細胞を支持体上に固定化して、少なくとも1つの細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして細胞を、マイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列させ；マイクロ領域内で細胞をコンフルエンスまで増殖させ；複数の試験薬の少なくとも1つを少なくとも1つのマクロウェルに提供して、試験薬をコンフルエントな細胞に接触させ；該第1層と第2層を除去し；該マイクロ領域からの動きまたは動きの欠如について細胞をモニターし；そして、該マイクロ領域からの細胞の動きまたは動きの欠如を、細胞の動きに対する該試験薬の作用と相関させる、ことを含む。
【００８３】
好ましくは各マクロ領域は複数のマイクロ領域を包含する。各マクロウェルに複数の試験薬を提供することができる。
【００８４】
本発明はまた、該第1層を配置する前に、支持体の上部表面にコーティングを適用することを企図する。コーティングは、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、小分子、脂質二重層、金属、自己集合膜、細胞、細胞外マトリックスタンパク質、ヒドロゲル、およびマトリゲルよりなる群から選択される物質から作成される。
【００８５】
さらに別の実施態様では測定法は、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置し（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；各マイクロ領域中の複数の細胞の少なくとも1つの細胞を支持体上に固定化して、少なくとも1つの細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして細胞を、マイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列させ；マイクロ領域内で細胞をコンフルエンスまで増殖させ；固定化工程後に支持体から第1層を除去し；第2層を支持体と液体緊密に接触するように配置し（ここで、第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；各マクロ領域は少なくとも1つのマイクロ領域を包含し；複数の試験薬の少なくとも1つを少なくとも1つのマクロウェルに提供して、試験薬をコンフルエントな細胞に接触させ；該第2層を除去し；該マイクロ領域からの動きまたは動きの欠如について細胞をモニターし；該マイクロ領域からの細胞の動きまたは動きの欠如を、細胞の動きに対する該試験薬の作用と相関させる、ことを含む。
【００８６】
別の実施態様は、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；第2層を支持体と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、第2層は複数のリングを含み、リングは各マクロオリフィスのパターンを画定し、リングの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第2層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各リングは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；各マクロ領域は少なくとも1つのマイクロ領域を包含する工程；各マイクロ領域中の複数の細胞の少なくとも1つの細胞を支持体上に固定化して、少なくとも1つの細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして細胞を、マイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列させる工程；マイクロ領域内で細胞をコンフルエンスまで増殖させる工程；複数の試験薬の少なくとも1つを少なくとも1つのマクロウェルに提供して、試験薬をコンフルエントな細胞に接触させる工程；該第1層と第2層を除去する工程；該マイクロ領域からの動きまたは動きの欠如について細胞をモニターし；該マイクロ領域からの細胞の動きまたは動きの欠如を、細胞の動きに対する該試験薬の作用と相関させる工程、を含む。
【００８７】
別の実施態様では細胞の動きをモニターするための測定法は、層を支持体と液体緊密に接触するように配置する工程（ここで、層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）；プラグセットの各プラグを各マクロウェルに挿入する工程（ここで、層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、プラグが層と支持体により画定される対応するマクロウェル中に受け入れられる時、各プラグは、支持体と液体緊密に接触して置かれた下の膜を含み、下の膜はさらにマイクロオリフィスのパターンを画定し、ここで、マイクロオリフィスの壁とマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように、プラグが支持体と液体緊密に接触して置かれる時、各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；少なくともマイクロ領域中の細胞を支持体上に固定化して、マイクロウェル内に位置させ、こうして細胞を、マイクロオリフィスの第1のパターンに対応するパターンで支持体上に整列させる工程；マイクロ領域内で細胞をコンフルエンスまで増殖させる工程；複数の試験薬の少なくとも1つを少なくとも1つのマクロウェルに提供して、該試験薬をコンフルエントな細胞に接触させる工程；該プラグを含有する該層を除去する工程；該マイクロ領域からの動きまたは動きの欠如について細胞をモニターする工程；該マイクロ領域からの細胞の動きまたは動きの欠如を、細胞の動きに対する該試験薬の作用と相関させる工程、とを含む。
【００８８】
本発明はまた、細胞の動きをモニターするためのシステムであって、a)支持体；支持体と液体緊密に接触して置かれるように構成され、上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定する第1層（ここで、各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）；および第1層の上部表面と液体緊密に接触して置かれるように構成され、マクロオリフィスのパターンを画定する第2層（ここで、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定する）、を含む細胞を整列させるための装置；ここで、第1層と第2層は、マイクロオリフィスのパターンとマクロオリフィスのパターンにより支持体上の細胞の整列のために構成され；マイクロ領域内で細胞をコンフルエンスまで増殖させ；複数の試験薬の少なくとも1つを少なくとも1つのマクロウェルに提供して、該試験薬をコンフルエントな細胞に接触させ；該第1層と第2層とを除去し；該マイクロ領域からの動きまたは動きの欠如について細胞をモニターし；該マイクロ領域からの細胞の動きまたは動きの欠如を、細胞の動きに対する該試験薬の作用と相関させる；b)整列した細胞の動きまたは動きの欠如を観察するために構成された観察システム；並びにc)細胞を整列させるための装置の細胞の動きを該観察システムと協調させるために構成されたコントローラー、を含む細胞の動きをモニターするためのシステムを提供する。
【００８９】
観察システムは好ましくは、位相差顕微鏡または蛍光画像顕微鏡を含む。コントローラーはさらに、装置の動きを観察システムと協調させるように構成されたコンピューターインターフェースを含む。観察システムはさらに、細胞を整列させるための装置上に整列された細胞の画像を記録するために構成された記録装置を含む。記録装置は好ましくは、細胞を整列するための装置上に整列された細胞の画像を記録するために構成されたデジタルカメラを含み、ここで記録された画像はデジタル出力である。コンピューターインターフェースは好ましくは、該デジタル出力を受け取るように構成される。
【００９０】
本発明はまた、細胞増殖をモニターし画像作成する方法を提供する。これらの方法は、第1層を支持体と液体緊密に接触するように配置する（ここで、第1層は上部表面を有しかつマイクロオリフィスのパターンを画定し、該各マイクロオリフィスの壁と支持体上のマイクロ領域が一緒にマイクロウェルを画定するように第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれる時、マイクロオリフィスのパターンの各マイクロオリフィスは壁を有しかつ支持体上のマイクロ領域を画定する）ことを含む。さらに第2層は、第1層の上部表面と液体緊密に接触するように配置される（ここで、第2層はマクロオリフィスのパターンを画定し、マクロオリフィスの壁とマクロ領域が一緒にマクロウェルを画定するように、第1層が支持体と液体緊密に接触して置かれ、かつ第2層が第1層と液体緊密に接触して置かれる時、マクロオリフィスのパターンの各マクロオリフィスは壁を有しかつマクロ領域を画定し；各マクロ領域は少なくとも1つのマイクロ領域を包含する）。
【００９１】
複数の細胞の少なくとも1つの細胞を支持体上の各マイクロ領域中に固定化して、少なくとも1つの細胞を対応するマイクロウェル内に位置させ、こうして細胞はマイクロオリフィスのパターンに対応するパターンで支持体上に整列される。
【００９２】
マイクロ領域内で細胞をコンフルエンスまで増殖させる。複数の試験薬の少なくとも1つを少なくとも1つのマクロウェルに提供する。試験薬をコンフルエントな細胞に接触させる。次に第1層と第2層を除去する。次にマイクロ領域からの動きについて細胞をモニターする。モニタリングは、少なくとも2つの異なる時点のそれぞれについて画像を生成させるために少なくとも2つの時点で細胞の画像作成をして、少なくとも2つの画像を生成させ、少なくとも2つの画像の比較から細胞の動きを計算することを含む。
【００９３】
さらに別の実施態様では、少なくとも2つの画像の比較により、細胞成長、細胞複製、または増殖をモニターし、決定する。
【００９４】
本発明の別の実施態様は、捕捉した画像データから、a)画像データの第1の軸に沿って画像データシグナル強度の第1のヒストグラムを作成し；b)第1のヒストグラムから第1の粗い島の位置を同定し；c)第1の粗い島の位置の間で第1の軸上のすきまの境界をマークし；d)画像データの第2の軸に沿って画像データシグナル強度の第2のヒストグラムを作成し；e)第2のヒストグラムから第2の粗い島の位置を同定し；c)第2の粗い島の位置の間で第2の軸上のすきまの境界をマークすることを含む画像処理方法を提供する。
【００９５】
別の実施態様では第1および第2の粗い島の位置は、それぞれ第1および第2のヒストグラムの極大から決定される。あるいは第1および第2の粗い島の位置は、所定の閾値を超えるそれぞれ第1および第2のヒストグラムの部分から決定される。
【００９６】
別の実施態様では第1および第2のすきまの境界は、それぞれ第1および第2の粗い島の位置の間の中点でマークされる。別の実施態様は、第1および第2のすきまの境界に基づいて、複数の島境界ボックスを画定することを含む。
【００９７】
本発明の画像作成処理法の別の実施態様は、画像作成した細胞物質であるソース画像データから、ソース画像データの部分の各画素について；ソース画像データが、スキャニング円の領域中の細胞性物質の存在を示すかどうか決定し；もしそうなら、同時に捜した同様の大きさに取ったスキャニング円の画像データを第2の画像データに設定し；そして次に、第2の画像データに基づいて対象を同定することを含む。さらに画像データ中で同定された各対象の境界ボックスが画定される。
【００９８】
本発明はまた、その中に複数のチャンバーを画定するハウジングを含む白血球遊走をモニターするための装置を提供する。複数のチャンバーのそれぞれは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。少なくとも1つのチャネルは、そこに配置される少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを含む。一方で複数のチャンバーの少なくとも1つと、他方で複数のチャンバーの各1つの第1ウェル領域と第2ウェル領域が、標準的マイクロタイタープレートのピッチと一致するように互いに配置される。
【００９９】
本発明はまた、その中に複数のチャンバーを画定するハウジングを含む白血球遊走を追跡するための装置を提供する。複数のチャンバーのそれぞれは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。少なくとも1つのチャネルは、そこに配置される少なくとも1つの内皮細胞を含む。一方で複数のチャンバーの少なくとも1つと、他方で複数のチャンバーの各1つの第1ウェル領域と第2ウェル領域が、標準的マイクロタイタープレートのピッチと一致するように互いに配置される。
【０１００】
本発明はさらに、支持体メンバー；および上部メンバー（ここで、上部メンバーは、支持体メンバーと共形接触して置かれることにより、支持体メンバーに取り付けられ、ここで支持体メンバーと上部メンバーは一緒に少なくとも1つのチャンバーを画定するように構成される）を含んでなるハウジングを含む白血球遊走をモニターするための装置を提供する。少なくとも1つのチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。少なくとも1つのチャネルは、そこに配置される少なくとも1つの白血球遊走メディエーターまたは少なくとも1つの内皮細胞を含む。
【０１０１】
本発明はさらに、白血球遊走をモニターするためのキットを提供する。キットは、その中に複数のチャンバーを画定するハウジングを含む装置を含む。複数のチャンバーのそれぞれは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。一方で複数のチャンバーの少なくとも1つと、他方で複数のチャンバーの各1つの第1ウェル領域と第2ウェル領域が、標準的マイクロタイタープレートのピッチと一致するように互いに配置される。キットはまた、第1の白血球遊走メディエーターを含む。
【０１０２】
本発明はさらに、ハウジングとハウジング中の複数のチャンバーを画定するハウジングに関連する手段を含む白血球遊走を追跡するための装置を提供する。複数のチャンバーのそれぞれは、白血球を含む試料を受けるための入口手段；入口手段からの白血球を含む試料を受けるための、入口手段と流体連通している出口手段；および入口手段と出口手段とを互いに連結する連結手段とを含む。連結手段は、そこに配置される少なくとも1つの白血球遊走メディエーターまたは内皮細胞を含む。一方で複数のチャンバーの少なくとも1つと、他方で入口手段と出口手段が、標準的マイクロタイタープレートのピッチと一致するように互いに配置される。
【０１０３】
本発明はさらに、白血球遊走をモニターする方法を提供する。この方法は、その中に複数のチャンバーを画定するハウジングを含む装置を提供し、複数のチャンバーのそれぞれは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。一方で複数のチャンバーの少なくとも1つと、他方で複数のチャンバーの各1つの第1ウェル領域と第2ウェル領域が、標準的マイクロタイタープレートのピッチと一致するように互いに配置される。この方法はさらに、少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを少なくとも1つのチャネルに入れるか、または内皮細胞を少なくとも1つのチャネルに入れ、少なくとも1つのチャネルに白血球を含む試料を提供することを含む。ある実施態様ではこの方法はさらに、少なくとも1つのチャネルに少なくとも1つの試験薬を入れることを含む。この方法はさらに、白血球と、少なくとも1つの白血球遊走メディエーターまたは内皮細胞との相互作用を観察することを含む。試験薬が少なくとも1つのチャネルに入れられる実施態様では、この方法は、試験薬の存在下で、白血球と少なくとも1つの白血球遊走メディエーターまたは内皮細胞との相互作用を観察することを含む。
【０１０４】
本発明はさらに、その中に複数のチャンバーを画定するハウジングを含む装置を提供し、複数のチャンバーのそれぞれは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む装置を提供することを含んでなる、複数の試験薬をスクリーニングする方法を提供する。好ましくは複数の試験薬のそれぞれは互いに異なる。少なくとも1つのチャネルは、その中に配置された少なくとも1つの白血球遊走メディエーターまたはその中に配置された内皮細胞を含む。一方で複数のチャンバーの少なくとも1つと、他方で複数のチャンバーの各1つの第1ウェル領域と第2ウェル領域が、標準的マイクロタイタープレートのピッチと一致するように互いに配置される。本方法はさらに、複数のチャンバーの各1つのチャネルのそれぞれに白血球を提供し；複数の試験薬の少なくとも1つを複数のチャネルの各1つのチャネルのそれぞれに入れ；そして、試験薬の存在下で、白血球と少なくとも1つの白血球遊走メディエーターまたは内皮細胞との相互作用を観察することを含む。
【０１０５】
本発明はさらに、インビボでの血管の生理学的条件をシミュレートする方法を提供する。この方法は、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含むチャンバーを含む装置を提供することを含む。この方法はさらに、白血球のローリングを仲介できる第1の白血球遊走メディエーターを少なくとも1つのチャネルに入れ；白血球の停止を仲介できる第2の白血球遊走メディエーターを少なくともその1つのチャネルに入れ；約10μl〜約100μlの液体で白血球を含む懸濁液をその少なくとも1つのチャネルに提供し；そして、白血球を含む懸濁液をその少なくとも1つのチャネルに沿って流す、ことを含む。
【０１０６】
本発明はまた、固定化した生物学的分子の静的勾配とともに使用し得る動的勾配を確立するための微小流体装置を使用して行われる生物学的測定法を提供する。
【０１０７】
本発明はまた、支持体メンバーと上部メンバー（ここで、上部メンバーは、支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体メンバーに取り付けられ、ここで支持体メンバーと上部メンバーは一緒に少なくとも別個のチャンバーを画定するように構成される）を含んでなるハウジングを含む化学走化性または化学侵入性をモニターするための装置を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（第1ウェル領域はその中に試験薬を受けるように構成される）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、第2ウェル領域はその中に細胞試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１０８】
本発明はさらに、支持体メンバーと上部メンバーとを含むハウジングを含む、化学走化性または化学侵入性を追跡するための装置を提供する。上部メンバーは、支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体メンバーに取り付けられ、ここで支持体メンバーと上部メンバーは一緒に、その中の化学走化性または化学侵入性のモニターを可能にするために、別個のチャンバーを画定するように構成される。別個のチャンバーは、装置の試験方向で縦に上を向いた開口部を有する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（第1ウェル領域はその中に試験薬を受けるように構成される）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、第2ウェルはその中に細胞を含む試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１０９】
本発明はまた、支持体手段と、支持体手段と実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体手段とともに別個のチャンバーを画定するための支持体手段に取り付けられた手段とを含んでなる、化学走化性または化学侵入性をモニターするための装置を提供する。別個のチャンバーは、その中で化学走化性または化学侵入性のモニタリングを可能にするように改変される。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（少なくとも1つの第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成される）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、少なくとも1つの第2ウェルはその中に細胞を含む試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１０】
本発明はまた、支持体メンバーと上部メンバーを含んでなる、化学走化性または化学侵入性をモニターするための装置を提供する。上部メンバーは、支持体メンバーと実質的に即時的密封を形成することにより、支持体メンバーに取り付けられ、支持体メンバーと上部メンバーは一緒に別個のチャンバーを画定するように構成される。別個のチャンバーは、その中で化学走化性または化学侵入性のモニターを可能にするように改変される。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（少なくとも1つの第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成される）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、少なくとも1つの第2ウェルはその中に細胞を含む試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１１】
本発明はさらに、その中の化学走化性または化学侵入性をモニターすることを可能にするように改変したチャンバーを画定するハウジングを含む、化学走化性または化学侵入性をモニタリングするための装置を提供する。チャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（第1ウェル領域はその中に試験薬を受けるように構成される）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、少なくとも1つの第2ウェルはその中に細胞を含む試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる複数のチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１２】
本発明は、上記実施態様のチャネル中のゲルマトリックスの最適な封入を提供する。
【０１１３】
本発明は、支持体メンバー；支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体メンバーに取り付けられた上部メンバー（ここで支持体メンバーと上部メンバーは一緒に、別個のチャンバーを画定するように構成される）とを含むハウジングを含む装置を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１４】
本発明はさらに、試験装置のハウジングを形成するためのキットを提供する。キットは、支持体メンバー；支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体メンバーに取り付けられた上部メンバー（ここで上部メンバーが支持体メンバーに取り付けられる時、支持体メンバーと上部メンバーは一緒に、別個のチャンバーを画定するように構成される）を含む。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１５】
本発明はさらに、支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、試験装置のハウジングを形成するための支持体メンバーに取り付けられるように改変した上部メンバー（ここで上部メンバーが支持体メンバーに取り付けられる時、上部メンバーは支持体メンバーとともに別個のチャンバーを画定するように構成される）を含む。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１６】
本発明はまた、支持体メンバー；支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体メンバーに取り付けられた上部メンバー（ここで、支持体メンバーと上部メンバーは一緒に、別個のチャンバーを画定するように構成され、別個のチャンバーは装置の試験方向で縦に上を向いた開口部を有する）を含むハウジングを含む試験装置を提供する。
【０１１７】
本発明はさらに、支持体メンバーと上部メンバー（ここで、上部メンバーは支持体メンバーと実質的に即時的密封を形成することにより、支持体メンバーに取り付けられる）を含む試験装置を提供する。支持体メンバーと上部メンバーは一緒に別個のチャンバーを画定するように構成される。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１８】
本発明はさらに、チャンバーを画定するハウジングを含む試験装置を提供する。このチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる複数のチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１１９】
本発明はまた、支持体手段と；支持体手段と実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体手段とともに別個のチャンバーを画定するための支持体手段に取り付けられた手段とを含んでなる装置を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１２０】
本発明はさらに、支持体メンバーを提供し；上部メンバーを提供し；上部メンバーを支持体メンバーに取り付け（ここで、上部メンバーを提供することは、支持体メンバーと実質的に液体で緊密な共形接触を生成するために、支持体メンバーに対して置かれることにより、上部メンバーが支持体メンバーに取り付けられるように、上部メンバーのための所定の物質を選択することを含む）；そして、上部メンバーが支持体メンバーに取り付けられる時、上部メンバーと支持体メンバーが一緒に別個のチャンバーを画定するように、上部メンバーと支持体メンバーとを構成することを含んでなる、試験装置を提供する方法を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１２１】
本発明はさらに、支持体メンバーと実質的に液体で緊密な共形接触を生成するために、支持体メンバーに対して置かれることにより、上部メンバーが支持体メンバーに取り付けられるように、上部メンバーのための所定の物質を選択する工程；および上部メンバーが支持体メンバーに取り付けられる時、支持体メンバーと一緒に別個のチャンバーを画定するように、上部メンバーを構成する工程とを含んでなる、試験装置の上部メンバーの作成方法を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はさらに、装置の試験構成で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１２２】
本発明はさらに、支持体メンバーを提供し；上部メンバーを提供し；上部メンバーを支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置くことにより、上部メンバーを支持体メンバーに取り付け（ここで、上部メンバーが支持体メンバーが一緒に別個のチャンバーを画定するように、上部メンバーと支持体メンバーは構成され、別個のチャンバーは装置の試験方向で縦に上を向いた開口部を有する）を含んでなる、試験装置の作成方法を提供する。
【０１２３】
本発明は、細胞遊走測定法の画像データを分析するのに使用される画像処理方法を提供する。この方法は、画像データ中のチャネルの方向に垂直の画像データ内の主軸を画定し、主軸に沿った画像データ内の集合光強度を測定し、そして投影物からの画像データ内でチャネルの位置を同定することを含む。
【０１２４】
本発明は、接触走性をモニタリングする方法を提供する。この方法は、チャンバーを画定するハウジングを有する、接触走性をモニターするための装置を提供することを含む。チャンバーは、その中に試験薬を受けるように構成され、その中に固定化された生物学的分子をさらに含む、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域はその中に細胞を含む試料を受けるように構成され、さらに、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、その中に固定化された生物学的分子を含み、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。
【０１２５】
この方法はさらに、少なくとも1つの第1ウェルから少なくとも1つの第2ウェルまで生物学的分子の濃度を低下させることにより、チャンバーの長軸に沿って表面濃度勾配を形成することを含む。この方法はさらに、少なくとも1つの第2ウェルに細胞を含む第1の試料を入れることを含む。この方法はまた、細胞の接触走性をモニターすることを含む。
【０１２６】
本発明は、支持体メンバーを有する化学走化性をモニタリングするための装置；支持体メンバーと実質的に液体で緊密に共形接触して置かれることにより支持体メンバーに取り付けらる上部メンバー（ここで、支持体メンバーと上部メンバーは、これらが一緒に別個の測定チャンバーを画定するように、構成される）を提供することを含んでなる、化学走化性と化学侵入性とをモニターする方法を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（少なくとも1つの第1ウェルのそれぞれはその中に試験薬を受けるように改変される）；装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置された少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（少なくとも1つの第2ウェルはその中に細胞を含む試料を受けるように改変される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる複数のチャネルを含むチャネル領域とを含む。この方法はさらに、可溶性試験物質を少なくとも1つの第1ウェルに入れ；チャンバーの長軸に沿って溶液濃度勾配を形成させ；細胞を含む試料を少なくとも1つの第2ウェルに入れ；そして細胞の化学走化性をモニターすることを含む。
【０１２７】
本発明は、支持体メンバーと上部メンバー（ここで、上部メンバーは支持体メンバーに取り付けられ、支持体メンバーと上部メンバーは、これらが一緒に別個のチャンバーを画定するように構成される）を含むハウジングを含む、接触走性をモニターするための装置を提供する。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成され、さらにその中に固定化された生物学的分子を含む）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域は、その中に細胞を含む試料を受けるように構成され、さらに装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域（チャネル領域はさらに、その中に固定化された生物学的分子を含む）とを含む。
【０１２８】
本発明はさらに、別個のチャンバーを画定するハウジングを含む、接触走性をモニターするための装置を提供する。チャンバーは、装置の試験方向で縦に上を向いた開口部を有する。チャンバーはさらに、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（少なくとも1つの第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成され、さらにその中に固定化された生物学的分子を含む）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域は、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、少なくとも1つの第2ウェルはその中に細胞を含む試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域（少なくとも1つのチャネルはさらに、その中に固定化された生物学的分子を含む）とを含む。
【０１２９】
本発明はさらに、接触走性をモニターするための装置を提供する。本装置は、支持体メンバー；支持体メンバーとともに別個のチャンバーを画定するための支持体メンバーに取り付けられた手段を含む。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（少なくとも1つの第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成され、さらにその中に固定化された生物学的分子を含む）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域は、装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置され、この少なくとも1つの第2ウェルは、細胞を含む試料を受けるように構成される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域（少なくとも1つのチャネルはさらに、その中に固定化された生物学的分子を含む）とを含む。
【０１３０】
本発明はまた、支持体メンバーと、支持体メンバーと実質的に即時的密封を形成することにより支持体メンバーに取り付けられた上部メンバーとを含む、接触走性をモニターするための装置を提供する。支持体メンバーと上部メンバーは、これらが一緒に別個のチャンバーを画定するように、構成される。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（少なくとも1つの第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成され、さらにその中に固定化された生物学的分子を含む）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域は、その中に細胞を含む試料を受けるように構成され、さらに装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域（チャネル領域はさらに、その中に固定化された生物学的分子を含む）とを含む。
【０１３１】
本発明はさらに、チャンバーを画定するハウジングを含む、接触走性をモニターするための装置を提供する。このチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成され、さらにその中に固定化された生物学的分子を含む）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域は、その中に細胞を含む試料を受けるように構成され、さらに装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域（チャネル領域はさらに、その中に固定化された生物学的分子を含む）とを含む。
【０１３２】
本発明はさらに、チャンバーを画定するハウジングを含む、接触走性をモニターするためのキットを提供する。このチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域（第1ウェルはその中に試験薬を受けるように構成される）；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（第2ウェル領域は、その中に細胞を含む試料を受けるように構成され、さらに装置の試験方向で第1ウェル領域に対して横に並置される）；および、第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結させる少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。キットはさらに、生物学的分子を含む試料を含む。
【０１３３】
本発明の1つの側面は、薬物療法を対象患者の初代細胞プロフィールと関連付ける方法に関する。本発明の側面の1つの実施態様は、患者の初代細胞形態、分子マーカー発現パターン、選択的活性化の状態、そのローリングと接着性、遊走する能力、およびその化学走化性（単独または組合せで）を含む細胞の表現型と動態の測定に関する。ある実施態様では初代細胞プロフィールは、ある表現型についての少なくとも1つの「正常」または「健常」患者から作成される。疑われる「疾患」患者の初代細胞プロフィールは「健常」プロフィールと比較される。
【０１３４】
細胞の表現型と動態は、任意の種類の細胞について研究される。ある実施態様では初代細胞が使用される。別の実施態様では初代白血球が使用される。さらに別の実施態様では方法は単核細胞を使用する。
【０１３５】
本発明の装置は、先行技術による装置よりも、より少数の細胞の使用を可能にする。すなわちある実施態様では、例えばこの方法は、測定単位当たり約25,000〜約50,000個の単核細胞を使用する。
【０１３６】
本発明の別の側面は、初代細胞プロフィールを撹乱する能力を測定することによる、試験化合物の生物活性の試験に関する。本発明のこの側面のある実施態様では、初代細胞プロフィールは、初代細胞の形態、分子マーカー発現パターン、選択的活性化の状態、そのローリングと接着性、遊走する能力、および化学走化性についての情報を含む。本発明のこの側面の他の実施態様では、細胞は白血球である。別の実施態様では候補薬物は抗炎症薬である。
【０１３７】
本発明のこの側面の1つの実施態様は、複雑な初代細胞培養物について細胞性微小環境を作り出す方法に関する。ある実施態様では神経細胞が、基板上で所定の整列でパターン化した表面化学に基づいて培養される。さらなる例では、内皮細胞が管腔を形成するように培養される。
【０１３８】
詳細な説明
図1(a)は、本発明の実施態様の定性的細胞遊走システム190の略透視図である。定性的細胞遊走システム190は、定性的細胞遊走測定プレート100、観察システム110、コントローラー120を含む。この実施態様のコントローラー120は、ライン130を介して観察システム110とシグナル連通している。コントローラー120と観察システム110は、当業者が容易に認識できるように定性的細胞遊走測定プレート100の中または上の細胞の遊走、動き、および挙動を観察、記録、および分析できるように配置およびプログラムされる。
【０１３９】
本発明は、定性的細胞パターン化と遊走の定量のための細胞遊走測定プレート100を提供する。本発明の測定プレートの実施態様は、分かれた所定の整列で細胞のパターン化を可能にする。本発明はまた、「CMAs」とも呼ぶ細胞遊走／運動性測定法を提供し、これは好ましくは、本発明の定性的細胞遊走測定プレートを使用して細胞を別個の整列にパターン化し、本発明の細胞遊走システムを使用して測定の結果をモニターし記録する。本発明の細胞遊走測定プレート、細胞遊走システム、および細胞遊走／運動性測定法の実施態様は、ハイスループットスクリーニングの要求に適合し、処理能力と使用の容易さの両方で大きな進歩を示す。一般に本発明の定性的細胞遊走測定プレートの実施態様では、細胞は特定の配置にパターン化され、種々の細胞に影響を与える物質で処理され、細胞に影響を与える物質に応答して遊走または反応することが可能である。
【０１４０】
図1(b)は、線II-IIに沿って取った図1(a)に示す定性的細胞遊走測定プレート100の断面図である。例えば図1(a)と1(b)に示されるように本発明の細胞遊走測定プレートの実施態様は、その上に細胞が整列される支持体140、支持体140に細胞が整列されるパターンを提供する第1層150、および第2層160を含む。支持体140は、細胞がパターン化され、付着され、または可逆的もしくは不可逆的に固定化されるベースを与える。支持体140は上部表面140aを有する。第1層150は、複数のオリフィス300を画定し、以後「マイクロオリフィス300」と呼ぶ。マイクロオリフィス300は、細胞が支持体140の上部表面140aに沈積され、付着され、または可逆的もしくは不可逆的に固定化される位置を画定する。マイクロオリフィス300は、マイクロオリフィス300を画定する壁150aを有する。第2層160は、複数のオリフィス170を画定し、以後「マクロオリフィス170」と呼ぶ。マクロオリフィス170は、支持体140の上部表面140aに沈積され、付着され、または可逆的もしくは不可逆的に固定化された細胞に接触するように、試験薬または溶液が沈積されるパターンまたは整列で並べられる。マクロオリフィス170は、マクロオリフィス170を画定する壁160aを有する。
【０１４１】
支持体140のサイズは好ましくは、業界の標準的マイクロタイタープレートの大きさに一致する。例えば図3(a)と3(b)は、本発明のある実施態様の支持体140を示す。さらに詳しくは図3(a)は、長さＬと幅Ｗを有する支持体140を示す平面図である。ある実施態様では、支持体140の長さＬは約3インチ（75mm）であり、幅Ｗは約5インチ（125mm）である。好ましくは細胞遊走測定プレート100のすべての層は、対応する外側の大きさを有し、標準的な実験室プラットフォーム（例えば、マイクロタイタープレートリーダー、自動ハンドラー、および液体送達システム）で使用し易いであろう。
【０１４２】
図1(b)に示す例では、マイクロオリフィス300は第1層150の全厚さを通過して延びる。本発明の好適例では第1層150はマイクロオリフィス300の整列を画定し、これは別個の第1の位置の整列で配置される。さらに第1層150は好ましくは、支持体140と接触されると、支持体140と共形接触（すなわち形の一致する液体で緊密な接触）することができる。さらに第1層150は好ましくは、支持体140と自己密封（例えば、密封剤を使用することなく支持体140と密封を形成）することができる。第1層150を支持体140と接触させて液体で緊密な密封を作成する時、複数のウェル（以後「マイクロウェル」と呼ぶ）が形成される。各マイクロウェル141の壁は、第1層150内のマイクロオリフィス300の壁150aにより画定され、各マイクロウェル141の底は、支持体140の上部表面140a上の露出した領域により画定される。各マイクロウェル141は個々に液体を充当することが可能であり、例えば異なる液体を導入できることが、有利である。
【０１４３】
第1層150は、生物科学で通常使用される材料、例えばガラス、エラストマー（例えばPDMS）、硬質プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、PMMA）、金属、ケイ素、二酸化ケイ素および他の硬い支持体からなる。
【０１４４】
本発明のある実施態様では第1層150は、細胞付着に抵抗する材料で処理、調整または被覆され、従って第1層150が支持体から持ち上げられる時、細胞が損傷されるリスクが低い。タンパク質に抵抗性のコーティングは当該分野で公知であり、特に限定されないが、ウシ血清アルブミン（BSA）、ゼラチン、リゾチーム、オクトキシノール、ポリソルベート20（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、および酸化ポリエチレン含有ブロックコポリマー界面活性剤がある。逆に本発明の他の実施態様では第1層150は被覆されず、従って第1層150が除去される時、第1層150に付着した細胞は、第1層150が支持体から剥がされる時、損傷される可能性がある。細胞を損傷することにより、創傷治癒のような現象が観察されるかも知れない。
【０１４５】
図4(a)は、そこに配置された複数のマイクロオリフィス300を画定する第1層150を示す。記載の実施態様ではマイクロオリフィス300は別個の領域に群別される。これらの別個の領域は、種々の形とサイズを有する。記載の実施態様では、各領域は円形配置で並んだマイクロオリフィス300のクラスターを有する。第1層150のマイクロオリフィス300は、当業者の知識の範囲内の任意の他の配置、例えば長方形、六角形、円形または任意の他の配置でもよい。
【０１４６】
図4(a)で「d」として示すマイクロオリフィス300の直径（およびマイクロオリフィスの壁150aにより画定されるマイクロウェル141の直径）は、各マイクロウェル141中に入れられる細胞のタイプと所望の数により変化してもよい。例えばマイクロウェル141およびマイクロウェル141中に入れられる細胞の直径が両方とも10mmなら、各マイクロオリフィス300および各マイクロウェル141には1つの細胞のみを置くことができる。すなわちこの例では、マイクロオリフィス300の直径が100mmなら、マイクロオリフィス300により画定されるマイクロウェル141中に最大約100個の細胞を置くことができる。
【０１４７】
本発明の実施態様では、マイクロウェル141の直径dは、約1mm〜約500mmまで変化し、好ましくは約40mm〜約200mmである。多くの場合直径dは、実験で使用される細胞の直径より大きいが、特殊な測定法では、直径dは細胞の直径より小さいことがある。例えばもし単一の細胞を第1層150の各マイクロオリフィス300を通しマイクロウェル141に入れることが好ましいなら、直径dは約1ミクロン〜約20ミクロンの範囲でもよい。代表的には化学走化性測定法では、直径dは好ましくは細胞の直径の約0.3〜0.8倍である。さらに隣接するマイクロオリフィス300との距離（および、従ってマイクロオリフィス300により画定される隣接するマイクロウェル141との距離）は変化してもよい。この距離は、図4(a)で大きさ「p」として認識される。任意の距離pが使用されるが、距離pは本発明の種々の例示的実施態様に従って、直径の大きさdと同じ距離〜直径dの約10倍まで変化してもよい。
【０１４８】
第2層160は、生物科学で通常使用される材料、例えばガラス、エラストマー（例えばPDMS）、硬質プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、PMMA）、金属、ケイ素、二酸化ケイ素および他の硬い支持体からなる。好適な材料はPDMSであり、より好適な材料はPDMSと硬質プラスチック（例えばポリカーボネート）の組合せである。
【０１４９】
図1(b)に示す実施態様について、マクロオリフィス170は第2層160の全厚さを通過して延びる。本発明の好ましい実施態様では第2層160はマクロオリフィス170の整列を有する。さらに第2層160は好ましくは、第1層150の上部表面150bまたは支持体140の上部表面140aと接触させられると、共形接触、すなわち形の一致する液体で緊密な接触をすることができる。さらに第2層160は好ましくは、上部表面150bまたは上部表面140aと自己密封（例えば、密封剤を使用することなくこれらと共形の液体で緊密な密封を形成）することができる。図1(b)に示す本発明の実施態様では、第2層160を第1層150の上部表面150bと接触させて液体で緊密な密封を作成する時、複数のウェル151（以後「マクロウェル151」と呼ぶ）が形成される。各マクロウェル151の壁は、第2層160内のマクロオリフィス170の壁160aにより画定される。各マクロウェル151の底は、第2層160の下部表面161でマクロオリフィス151のサイズと形により画定される。例えば図1(b)に示す実施態様では、マクロウェル151の底は、支持体140の上部表面140aの一部、マクロウェル151により包含されるマイクロオリフィス300の壁150a、および包含されたマイクロウェル300内の第1層150の上部表面150bの露出した領域により画定する露出領域である。すなわち、明らかなように、マクロウェル151の底を構成する要素は、マイクロウェル141に対するマクロウェル151のサイズと位置に依存する。各マイクロウェル141は個々に液体でアドレス可能であり、例えば異なる液体を導入できることが、有利である。また、本発明の別の実施態様では第1層150は、マイクロオリフィス300を介して細胞を整列して、第2層160を支持体140の上部表面140aと接触させた後に、支持体140から除去される。この場合、マクロウェル151の底は、支持体140の上部表面140aの露出した領域であり、支持体140の上部表面140a上に前に整列した細胞または細胞の群を包含する。
【０１５０】
マクロオリフィス170により画定されるマクロウェル151は、1つのマクロオリフィス170に加えられる液体が包含されるマイクロウェル141まで流れるように、第1層150の別個の領域を包含するが、マクロウェル151により包含されない隣接または他のマイクロウェル141までは流れない。この実施態様ではマクロウェル151は溶液の容易な追加と除去を可能にするが、マイクロオリフィス300の第1層150は細胞の空間的パターン化を提供する。
【０１５１】
前記したようにマイクロオリフィス300は、1回に数個の細胞の通過、1回に1個の細胞の通過、または細胞の部分の通過を可能にするようにサイズが調整される。マイクロオリフィス300のサイズは、研究される特定の細胞および刺激を受け入れるように選択される。マイクロオリフィス300のサイズと位置に依存して、細胞は、支持体層140上の特定の領域、群またはパターンに置かれる。こうして、各細胞または細胞群の出発点が容易に同定でき、その移動距離が容易に測定され、種々の時点についてタイミングが合わせられる。好ましくは2つ以上の細胞が各オリフィスを通過する。
図5は、そこに画定される複数のマクロオリフィス170を有する第2層160を示す。記載例ではマクロオリフィス170は平面図が円形であるが、マクロオリフィス170は種々の形やサイズでもよいことを理解されたい。マクロウェル151の数、マクロオリフィス170の直径（およびまた、マクロオリフィス170の壁160aにより画定されるマクロウェル151の直径）（図5では大きさ「d」として示す）、および隣接するマクロウェル151との距離（図5では大きさ「p」として示す）は、それぞれ各マクロウェル151内に包含させたい細胞のタイプとマイクロウェル141の数、または実施される所望の方法に従って変化する。好ましくはマクロオリフィス300の配置、従ってこれにより画定されるマクロウェル151の配置は、標準的24-、96-、384-、および1536-ウェルマイクロタイタープレートの形に対応する。例えば種々の標準的マイクロタイタープレートの代表的大きさ（「ID」はマイクロタイタープレートのウェルの内径であり、「p」は隣接ウェル間の距離である）は以下の通りである：
器具              ID（mm）            p（mm）
24ウェル          9〜15               18
96ウェル          6                   9
384ウェル         3                   4.5
1536ウェル        1.5                 2.25
本発明のある実施態様では、第2層160はPDMSのようなエラストマーからなる。この実施態様ではマクロオリフィス170は、マイクロオリフィス300が第1層150中に形成されるような方法で、第2層160中に形成され、例えば前駆体PDMSは、サイズ（大きさと長さ）およびピッチが所望のマクロオリフィスに対応するポストを有する原型にスピンキャストされる。別の例では第2層160は、特に限定されないがガラス、硬質プラスチックまたは金属を含む硬い材料からなる。マクロオリフィス170は、当該分野で公知の方法（例えば、成形、エッチングおよび打抜き）によりこれらの材料中に形成される。
【０１５２】
本発明の種々の他の例では、第2層160のマクロオリフィス170は、個別のリングまたは相互に連結したリングを含む。例えばある実施態様では第2層160は、ポリプロピレンのような硬質プラスチックからなりマクロオリフィス170の所望の直径に等しい直径を有するリングを含む。硬いリングは、PDMSのようなエラストマーと一緒に成形されて第2層160を形成する。
【０１５３】
第1層150の厚さまたは高さ（これは図4(b)に示され、「2h」と呼ぶ）は、所望の数の細胞（例えば単一の細胞または複数の細胞）を受け入れるようにあらかじめ決められる。すなわち第1層150の厚さは、マイクロオリフィス300により形成されるマイクロウェル141の最大深さを決定する。第1層150の厚さを変えるために、同じ第1層150を互いの上に重ねて所望の厚さを達成してもよい。別の実施態様では第1層150は、所望の厚さを有するように作成されることができる。PDMSのようなエラストマーは、可逆的な共形接触を形成するため、層を重ねることは、所望の深さのマイクロオリフィスを達成することを可能にする。本発明に関連して「可逆的」とは、共形接触を形成している成分の構造の完全性を損なうことなく共形接触が達成されることである。
【０１５４】
図3(b)に示し「h」と記載した支持体140の厚さまたは高さは、必要に応じて選択される。同様に図5(b)に示し「h」と記載した第2層160の厚さまたは高さは、マクロオリフィス170により形成されるマクロウェル151中に加えられる溶液の所望の量を受け入れるように選択される。第2層160の好適な高さ「h」は約2mm〜約12mmの範囲である。
【０１５５】
その上に細胞が置かれるかまたはパターン化される支持体140は、細胞と適合性のある材料を含む。適当な材料は、細胞生物学で使用される標準的材料、例えばガラス、セラミックス、金属、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ならびにポリマー性薄膜を含む他のプラスチック、およびポリメチルメタクリレート（PMMA）を含む。好ましくはこの材料は、用手的にまたは自動実験室ハンドリング装置により取り扱うことを可能にする充分な硬さを提供する。好適な材料は、光学顕微鏡法でパターン化細胞を見ることを可能にするため、厚さ約0.2〜2mmの光学グレードのポリカーボネートである。
【０１５６】
さらに支持体140は、細胞遊走測定プレート100の追加の層との共形接触を提供する任意の材料からなる。共形接触を可能にする材料は当該分野で公知であり、エラストマーを含み、好適なエラストマーはポリジメチルシロキサン（PDMS）である。別の実施態様では支持体140および／または第1層150はエラストマーからなる。PDMSのようなエラストマーは、共形接触が、液体が第1層150または第2層160中の他のオリフィスに浸入することを防ぐため好ましい。他の実施態様では、密封剤または機械的密封装置（例えばクランプおよびガスケット）も使用して、支持体140と第1層150との間の密封、または第1層150と第2層160との密封を生成または増強する。2つの材料の間で液体で緊密な密封を生成することができる密封剤は当該分野で公知であり、糊、不活性ゲル、および膨潤性樹脂がある。
【０１５７】
図2(a)は、支持体210がコーティング220で処理される実施態様を示す。図2(a)に示した実施態様の断面図（線II-IIに沿って取った）を図2(b)に示す。あるいは、支持体210は、その上に所望の処理またはコーティング220を有する膜で重層される。
【０１５８】
コーティング220は、整列される細胞に所望の作用を及ぼす任意の物質から作成されるか、または細胞の整列を助ける任意の物質から作成されるか、またはこれは生物学的不活性のコーティングを含んでもよい。コーティング220はまた、タンパク質、タンパク質断片、ペプチド、小分子、脂質二重層、金属、自己集合膜を含んでもよい。自己集合膜は、非生物学的自己集合系の最も広く研究されており最もよく開発された例である。これらは、官能基化した長鎖有機分子の化学吸着および自己構築により、適切な基質の表面上に形成される。自己集合膜は通常、表面に対して反応性のリガンドを含有する溶液中に基質を浸漬することにより、または反応性分子種の蒸気に基質を曝露することにより調製される。自己集合膜を産生するための多くの系が当該分野で公知である。
【０１５９】
自己集合膜の最もよく分析されたシステムは、金の上のアルカンチオレートCH3(CH2)nS-である。アルカンチオレートは金表面上に自然に化学吸着し、吸着アルカンチオレートを形成する。金の表面に結合したイオウ原子はアルキル鎖を密接に接触させ、これらの接触はコンフォメーションエントロピーを閉め出して規則正しい構造を形成する。約20原子までの炭素鎖では、自己集合膜中の相互作用の程度は表面上の分子の密度の上昇およびアルキル骨格の長さの増加とともに増加する。ｎ＞11のアルカンチオレートのみが、金上に支持される、密接に充填された基本的に2次元の有機準結晶を形成し、これはソフトリソグラフィーで最も有用な自己集合膜を特徴づける。アルカンチオレートからの金の上の規則正しい自己集合膜の形成は、比較的速いプロセスである。金の上のヘキサンデカンチオレートの高度に規則正しい自己集合膜は、ヘキサンデカンチオールのエタノール溶液（約2mM）中に金を数分間浸漬することにより調製され、ミクロ接触印刷中の自己集合膜の形成は数秒間で起きる。
【０１６０】
整列表面を得るために、自己集合膜をパターン化することが好ましい。例えば、マイクロオリフィスもしくはマクロオリフィスの整列または他の任意の整列に一致する整列を有するように、自己集合膜をパターン化することが好ましいかも知れない。表面の平面で自己集合膜をパターン化することは、広範囲の技術（ミクロ接触印刷、光酸化、光架橋、光活性化、光リソグラフィー／メッキ、電子線描画、集束イオンビーム描画、中性準安定原子描画、SPMリソグラフィー、ミクロ機械加工、ミクロペン描画を含む）により行われている。好適な方法はミクロ接触印刷である。ミクロ接触印刷は、例えば米国特許第5,776,748号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１６１】
他の実施態様では、自己集合膜を含むコーティング220はミクロ接触印刷により「パターン化」される。自己集合膜パターンは、「印刷」工程でスタンプを使用して支持体に適用される（「インク」は、化学吸着して自己集合膜を形成することができる化合物を含む溶液からなる）。インクは、スタンプを使用してプレートの表面に適用され、スタンプ上のパターンにより決定されるパターンで支持体上に自己集合膜を沈積させる。支持体は、同じかまたは異なるスタンプを用いて種々の配置で、および同じかまたは異なる自己集合膜形成溶液を用いて、繰り返しスタンプされる。さらにスタンプ後、裸ですなわち自己集合膜により被覆されずに残る支持体の部分を誘導体化する。かかる誘導体化は、自己集合膜形成化合物を含む別の溶液への曝露を含む。自己集合膜形成溶液または誘導体化溶液は、パターンにより画定される最終支持体の領域が、生物学的材料に結合する能力が互いに異なるように選択される。例えば、格子の四角い領域が細胞親和性で細胞に結合するが、格子の線状の領域は細胞親和性ではなく細胞はこれらの領域に結合しないような格子パターンが作成される。
【０１６２】
例としてミクロ接触印刷の一般的な方法を以下に記載する。パターンを画定する隆起構造を有する鋳型にポリマー材料を入れて、スタンプを形成する。硬化後にスタンプ表面を有するスタンプを鋳型から分離する。スタンプに所望の「インク」（これは自己集合膜形成化合物を含む）で墨入れする。「墨入れした」スタンプを、随時表面材料の薄いコーティングで被覆した基質を含むプレートと接触させる。インクの自己集合膜形成化合物は材料表面に化学吸着して、スタンプのスタンプ表面に対応するパターンで表面領域を有する自己集合膜を形成する。次にプレートを、自己集合膜形成化合物を含む第2のすなわち充填溶液に曝露することができる。第2の溶液は、第2のすなわち充填自己集合膜で表面材料の裸の領域を充填する。パターン化した自己集合膜を有するプレートは次に、第1の自己集合膜の表面領域に選択的に結合するが、第2の自己集合膜の表面領域には結合しない（またはその逆）材料を有することができる。
【０１６３】
スタンプは、表面への化学吸着により自己集合膜を形成することができる溶液で墨入れされる。この墨入れは例えば、(1)インクで湿らせたけばの無い紙切れにスタンプを接触させる；(2)スタンプの上に直接インクを注ぐ；または(3)綿棒でスタンプにインクを適用する、ことにより行われる。次にインクをスタンプ上で乾燥させるか、または風を吹き付けて乾燥させ、液体状のインク（にじみを引き起こすことがある）をスタンプ上に残さないようにする。自己集合膜形成化合物は、急速にスタンプ表面に移行する。例えばスタンプ表面に化合物を約2秒間接触させると、一般には充分な移行を起こすのに充分であり、または実質的により長時間接触させてもよい。自己集合膜形成化合物は、かかる移行のための溶媒に溶解してもよく、これは本発明においてしばしば有効である。化合物が溶解する任意の有機溶媒が使用されるが、好ましくはスタンプ表面により自己集合膜形成化合物の吸着を助けるものが選択される。すなわち、例えばエタノール、THF、アセトン、ジエチルエーテル、トルエン、イソオクタンなどが使用される。PDMSスタンプで使用するために、エタノールが特に好適であり、トルエン及びイソオクタンはあまり吸収されないため好適ではない。インク溶液中の自己集合膜形成化合物の濃度は、1μMと低くてもよい。1〜10mＭの濃度が好適であり、100mMを超える濃度は推奨できない。
【０１６４】
次に支持体は、パターンを有する墨入れしたスタンプ表面がプレートの表面材料と接触するように、スタンプと接触させられる。これは、かるく指で押して手で行われるか、または機械装置により行われる。スタンプとプレートは、長時間接触させる必要は無く、1秒〜1時間の接触時間により、ヘキサンデカンチオール（エタノール中1〜10mM）インクの見かけ上同じパターンが、金表面を有するプレートに適用される。接触中、インクの自己集合膜形成化合物は、プレートの表面と反応し、こうしてスタンプが静かに除去されると、自己集合膜が、スタンプに対応するパターンでプレートに化学吸着する。
【０１６５】
インクとして溶液中で種々の化合物が使用され、種々の材料が、インクがスタンプされ自己集合膜が形成される表面材料を提供する。一般にインクの選択は、スタンプされる表面材料に依存する。一般に表面材料および自己集合膜形成化合物は、表面材料の表面に結合または化学吸着する官能基中の最初の末端で自己集合膜形成化合物が終端するように、選択される。本明細書において化合物の「末端」という用語は、分子の物理的末端、ならびに化合物が自己集合膜を形成する表面と結合を形成するのに利用できる分子の任意の部分を意味する。化合物は、スペーサー部分により分離される第1および第2の末端を有する分子を含み、第1の末端はプレートの表面材料に結合するように選択される第1の官能基を含み、第2の末端は所望の露出した官能基を有する表面材料上で自己集合膜を与えるように選択される第2の官能基を随時含む。分子のスペーサー部分は、生じる自己集合膜の特定の厚さを与えるように、ならびに自己集合膜形成を促進するように選択される。本発明の自己集合膜は厚さが変化するが、約50オングストローム未満の厚さを有する自己集合膜が一般的に好ましく、約30オングストローム未満の厚さを有するものがさらに好ましく、約15オングストローム未満の厚さを有するものがさらに好ましい。これらの大きさは一般に、化合物、特にそのスペーサー部分の選択の関数である。
【０１６６】
広範囲の表面材料および自己集合膜形成化合物が、本発明での使用に適している。表面材料および表面材料に結合する官能基の組合せの非限定例のリストは以下の通りである。以下のリストは、そこに強く結合するいくつかの好適な官能基を有するいくつかの好適な物質に分類されているが、以下の官能基の多くは、その中に分類されていない物質で使用するのにも適しており、かかる任意のおよびすべての組合せは本発明の範囲内に含まれる。表面材料として使用される好適な材料には、金属、例えば金、銀、銅、カドミウム、亜鉛、パラジウム、白金、水銀、鉛、鉄、クロム、マンガン、タングステン、およびイオウ含有官能基（例えばチオール、スルフィド、ジスルフィドなど）とともに使用される時の上記の任意の合金；シランおよびクロロシランで使用されるドープまたは非ドープケイ素；カルボン酸とともに使用される金属酸化物、例えばシリカ、アルミナ、石英、ガラスなど；亜硝酸およびイソニトリルとともに使用される白金またはパラジウム；ヒドロキサム酸とともに使用される銅、がある。追加の適当な官能基には、酸塩化物、無水物、スルホニル基、ホスホリル基、ヒドロキシル基、およびアミノ酸基がある。追加の表面材料には、ゲルマニウム、ガリウム、ヒ素、およびガリウムヒ素がある。さらにエポキシ化合物、ポリスルホン化合物、プラスチック、および他のポリマーが、本発明で表面材料としての使用に適している。生体分解性物質を形成するのに使用されるポリマー（特に限定されないが、ポリ無水物、およびポリ乳酸、およびポリグリコール酸を含む）もまた適している。本発明での使用に適したさらなる材料および官能基は、米国特許第5,079,600号（1992年1月7日発行）（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１６７】
本発明の特に好適な実施態様では、表面材料としての金と、少なくとも1つのイオウ含有官能基（例えばチオール、スルフィドまたはジスルフィド）を有する自己集合膜形成化合物との組合せが選択される。
【０１６８】
自己集合膜形成化合物は、種々の官能基の任意のもので表面材料に結合するように選択される官能基を有する末端基と反対の、第2の末端または「頭部末端基」で終わってもよい。すなわちこの化合物は、表面材料上で自己集合膜を形成する時、露出される官能基を含んでよい。かかる官能基は、種々の生物学的または他の化学的分子種などに選択的に結合する疎水性、親水性である自己集合膜を作成するのに選択される。例えば、イオン性、非イオン性、極性、非極性、ハロゲン化、アルキル、アリール、または他の官能基が、化合物の露出部分に存在してもよい。かかる官能基の非限定例のリストには、-OH、-CONH-、-CONHCO-、-NH2、-NH-、-COOH、-COOR、-CSNH-、-NO2-、-SO2-、-RCOR-、-RCSR-、-RSR、-ROR-、-PO4-3、-OSO3-2、-SO3-、-NHXR4-X+、-COO-、-SOO-、-RSOR-、-CONR2、-(OCH2CH2)nOH（ここでn=1〜20、好ましくは1〜8）、-CH3、-PO3H-、-2-イミダゾール、-N(CH3)2、-NR2、-PO3H2、-CN、-(CF2)nCF3（ここでn=1〜20、好ましくは1〜8）、オレフィンなど以外に、表面材料への結合のための官能基に関して上記したものを含む。上記リストにおいてRは、水素または有機基（例えば炭化水素またはフッ化炭化水素）である。本明細書において「炭化水素」という用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなどを含む。炭化水素基は、例えばメチル、プロペニル、エチニル、シクロヘキシル、フェニル、トリル、およびベンジル基を含む。「フッ化炭化水素」という用語は、上記炭化水素基のフッ化誘導体を意味する。
【０１６９】
さらに官能基は、自己集合膜を後述のように一般的または具体的に「生体親和性（biophilic）」にする広範囲の化合物またはその断片から選択される。一般的に生体親和性官能基は、生物学的物質（例えば、完全な細胞、分画した細胞、細胞小器官、タンパク質、脂質、多糖、単純炭水化物、複合炭水化物、および／または核酸）の結合、接着、または吸収を一般的に促進するものである。一般に生体親和性官能基は、-COO-、-PO3H-、または2-イミダゾロ基のような荷電した部分を有する疎水性基またはアルキル基、および化合物または化合物の断片（例えば、細胞外マトリックス、タンパク質フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、血清アルブミン、ポリガラクトース、シアル酸、および種々のレクチン結合糖）がある。特に生体親和性の官能基は、例えば物質の混合物から特定の物質を同定または単離するように、特定のタイプの生物学的物質を選択的または優先的に結合、接着、または吸収するものである。具体的な生体親和性物質には、抗体または抗体の断片およびこれらの抗原、細胞表面受容体およびこれらのリガンド、核酸配列、および当業者に公知の他の多くのものがある。適切な生体親和性官能基の選択は、結合させるべき生物学的物質、必要な結合の親和性、利用可能性、使用の容易性、自己集合膜を有効に形成する自己集合膜形成化合物の能力への影響、およびコストに依存する。かかる選択は、当業者の知識、能力および判断の範囲内である。
【０１７０】
あるいは官能基は、自己集合膜を後述のように「生体非親和性（biophobic）」にする広範囲の化合物またはその断片から選択される。生体非親和性自己集合膜とは、一般に生物学的物質（例えば、完全な細胞、分画した細胞、細胞小器官、タンパク質、脂質、多糖、単純炭水化物、複合炭水化物、および／または核酸）に対する結合、接着、または吸収の低い親和性を有するものである。生体非親和性官能基は、極性であるが非荷電基（不飽和炭化水素を含む）を含む。特に好適な生体非親和性官能基はポリエチレングリコール（PEG）である。
【０１７１】
自己集合膜形成化合物を含む分子の中心部分は一般に、表面材料および露出した官能基に結合するように選択された官能基を連結するスペーサー官能基を含む。あるいはスペーサーは、スペーサー以外に特に官能基が選択されないなら、基本的に露出された官能基を含む。自己集合膜の充填を破壊せず、自己集合膜を、有機または水性環境以外に種々の試薬（例えば後述のエッチング試薬）に対してやや非透過性にするスペーサーが適している。スペーサーは、極性；非極性；ハロゲン化または特にフッ化；陽性荷電；陰性荷電；あるいは非荷電でもよい。例えば、飽和または不飽和の直鎖または分岐鎖のアルキル、アリール、または他の炭化水素スペーサーが使用できる。
【０１７２】
種々の長さの自己集合膜形成化合物が本発明で使用できる。もし1回のスタンプ工程で2つ以上の異なる自己集合膜形成化合物が使用されるなら、例えば、もしインク中で2つ以上の異なる自己集合膜形成化合物が使用されるなら、これらの分子種が同様の長さを有することが有利である。しかし、第1の自己集合膜が表面に提供され、少なくとも第2の自己集合膜が表面に提供される1つ以上の工程が使用される時（種々の自己集合膜は連続的または非連続的である）、異なる長さを有する種々の自己集合膜の形成のための分子種を選択することが有利な場合がある。例えばスタンピングにより形成される自己集合膜が第1の分子の長さを有し、次に表面に誘導体化される自己集合膜がスタンプされた自己集合膜より長い第2の分子の長さを有するなら、複数の「ウェル」を有する連続的自己集合膜が得られる。これらのウェルは、より長い鎖を有する第2の自己集合膜により囲まれたスタンプされた自己集合膜の結果である。例えばウェル中に捕捉されている細胞のような特定の生物学的材料に横安定性を加えることが好ましい時、かかるウェルはいくつかの実施態様により有利に作成される。かかるウェルは反応容器の基礎を形成することもできる。
【０１７３】
さらに表面材料上に形成される自己集合膜は、種々の目的のためにかかる形成後に修飾される。例えば自己集合膜形成化合物は、自己集合膜中の表面材料の上に沈積され、この化合物は、自己集合膜のさらなる修飾を可能にするために除去される保護基を含む露出した官能基を有する。例えば光除去可能な保護基が使用され、この基は、これが一部である自己集合膜を損傷することなく除去されることが有利である。例えば保護基は、好ましくはo-ニトロベンジル誘導体またはベンジルスルホニルのようなニトロ芳香族化合物を含む種々の陽性の光反応性基から選択される。光除去可能な保護基は、例えば米国特許第5,143,854号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、およびPatchornik、JACS, 92, 6333 (1970)、およびAmitら、JOC, 39, 192 (1974)（いずれも参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。あるいは電子線リソグラフィー、Ｘ線リソグラフィー、または任意の他の放射線により活性化または不活性化される自己集合膜の露出した部分の上に反応性基が提供されることができる。かかる保護と脱保護は、既存の表面結合自己集合膜の化学的または物理的修飾、例えば自己集合膜を形成する既存の分子種を伸長することを助けるであろう。かかる修飾は、上記の米国特許第5,143,857号に記載されている。
【０１７４】
例えば第1層150に一致する整列を有するように自己集合膜をパターン化する別の好適な方法は、当該分野で公知のソフトリソグラフィー法である。ソフトリソグラフィーは、George M. Whitesidesにより開発され、例えば米国特許第5,976,826号およびPCT WO01/70389（これらの両方とも参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えばマイクロオリフィス300を有する第1層150は、自己集合膜の上に置かれる。第1層は、自己集合膜に対して密封することにより、支持体140と共形接触を作成する。次に第1層の上に修飾溶液が置かれ、マイクロオリフィス300により露出した自己集合膜表面に接触する。「修飾」溶液は、自己集合膜の頭部末端基を修飾して、所望の特性を達成するか、または頭部末端基に所望の生物学的分子を付加または除去するものである。例えば、自己集合膜頭部末端基につなぎ鎖（tether）が付加され、これが次にタンパク質を捕捉し、これが次に細胞に対する親和性を与えて、第1層150または第2層160を介して次にパターン化される。
【０１７５】
パターン化された自己集合膜の好適な表面部分は、細胞親和性（cytophilic）であり、すなわち細胞付着を促進するように改変される。細胞親和性表面を作成する分子は当業者に公知であり、抗原、抗体、細胞接着分子、細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、合成ペプチド、炭水化物など）がある。
【０１７６】
本発明の好適な実施態様では、自己集合膜は「スイッチ可能な表面」を有するように修飾される。例えば自己集合膜は、所望の分子を捕捉する「頭部末端基」を用いて設計される。次に頭部末端基は、所望の時点で修飾されて捕捉分子を放出する。本発明の好適な実施態様では、頭部末端基は、捕捉した細胞の放出後、頭部末端基が以後の細胞をもう誘引も付着もしないように修飾される。この放出は、パターン化細胞が遊走することを可能にするのに重要である。自己集合膜が「スイッチ可能な」頭部末端基を持たないなら、細胞の遊走が妨害される。「スイッチ可能な」制御の例は図14に記載される。この図は、細胞が自体に付着することを可能にする特定のペプチド提示化合物を記載する。電位の印加により、ペプチド提示化合物は切断されて、支持体からの細胞の放出を引き起こす。重要なことは、電位の印加後に残るペプチド提示化合物の部分は細胞に結合できず、従って非特異的細胞結合の可能性を排除することである。
【０１７７】
また、細胞、タンパク質、または任意の他の生物学的物質の非特異的吸着に抵抗するために、生体不活性支持体物質を使用することもしばしば好ましい。タンパク質の吸着に対するこの抵抗性を付与する最も有効な方法は、表面をポリ（エチレングリコール）PEGで被覆することである。PEGで表面を修飾するために、種々の方法（吸着、共有結合固定化、および放射線架橋を含む）が使用されている。炭水化物単位を含むポリマーもまた表面を不動態化するが、これらの物質はPEGほど安定でも有効でもない。広く使用されている方法は、他のタンパク質の吸着に抵抗するタンパク質（通常ウシ血清アルブミン）をあらかじめ吸着させることである。さらにエチレングリコール基［HS(CH2)11(OCH2CH2)nOH：n=2〜7］の短いオリゴマーで終わるアルカンチオールから調製される自己集合膜は、いくつかのモデルタンパク質の吸着に抵抗する。オリゴ（エチレングリコール）末端アルカンチオレートと混合すると、50％ものメチル末端アルカンチオレートを含有する自己集合膜でさえ、タンパク質の吸着に抵抗する。さらにオリゴ（エチレングリコール）基で終わる自己集合膜は、制御された環境下で種々の反応性基が自己集合膜中に導入されるため、不活性支持体として広い有用性を有する。
【０１７８】
生体不活性処理または支持体物質を使用することとは対照的に、適切な支持体または処理を選択することにより、表面はいかなる所望の機能性を有するように修飾されることもできる。支持体は固定化生物学的分子（例えば、他の細胞、DNA／RNA、化学物質、または他の生物学的もしくは化学的物質）を有するように処理することができる。例えば表面への足場依存性細胞の付着または拡散は、細胞外マトリックスのタンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンおよびコラーゲン）により仲介される。従って表面への細胞の付着を制御する共通の方法は、表面へのマトリックスタンパク質の吸着を制御することに依存する。従って好適なコーティング220は、細胞外マトリックスタンパク質またはヒドロゲル（マトリゲルを含む）または細胞外マトリックスを模倣する他のコーティングを含む。
【０１７９】
別の実施態様ではコーティングは、細胞の遊走または運動性の挙動に影響を与えるかまたは与えない固定化した物質（例えば、薬物、毒素、代謝物、試験薬などを含む）を含む。細胞を第1層150のオリフィスに入れた後、細胞は支持体の表面上に沈降し、こうして固定化物質により影響を受ける。
【０１８０】
さらに別の好適な実施態様では、コーティング220は、整列した細胞についてよりインビボ様の環境を提供するコーティングを含む。インビボの細胞は通常他の種類の細胞と接触しているため、および細胞対細胞接触は細胞の挙動に影響を与えるため、好適なコーティング220はまた、整列される初代細胞に対して2次的細胞タイプを含む。例えば、癌細胞は間質細胞に囲まれている。すなわち、インビトロの癌細胞の遊走または動きをインビボの現象とより正確に相関させるために、間質細胞のコーティング220を提供した後に、癌細胞をコーティング上にパターン化することが好ましい。2つの異なるタイプの細胞の増殖は、当業者により「同時培養」と呼ばれている。いくつかの通常知られている同時培養には、肝細胞／繊維芽細胞；星状細胞／樹状細胞；内皮細胞／白血球；および神経細胞／グリア細胞がある。本発明は、1つのタイプの細胞のコーティングを与え、次に第2のタイプを細胞被覆支持体上に整列させることによる同時培養系を利用することを企図する。
【０１８１】
本発明の別の実施態様では支持体140は、細胞の動きと遊走を可能にするために、「物理的」修飾の形の表面処理（例えば、線、溝、チャネル、およびくぼみを入れること）を含む。
【０１８２】
本発明の細胞遊走測定プレートは、広範囲のパターンを適用することを可能にする。例えば全支持体は、支持体全体に均一に分布するパターンを画定する。図6(a)は、本発明の1つの実施態様を示し、第1層150は、第1層150全体に均一に分布した複数のマイクロオリフィスを有する。図6(b)の第2層160を図6(a)に示す第1層150の上に置くと、図6(c)に示すマクロウェル170を有するマイクロウェル300の構成が作成される。
【０１８３】
図7(a)は、本発明の別の実施態様を示し、第1層150のマイクロオリフィス300を別個の幾何学パターンに整列することにより支持体140が構成される。次に図7(b)の第2層160を図7(a)に示す第1層150の上に置くと、図7(c)に示すマクロウェル170を有するマイクロウェル300の構成が作成される。これらの別個の領域は好ましくは、標準的マイクロタイタープレートと同じサイズとピッチを有する。別個の領域は、任意の好適な数の個々のパターン化細胞を含有してもよい。例示目的に図7(a)は、6個の別個の幾何学パターンを有する第1層150を示し、各パターンは第1層150の対応する領域を占める。これらの6個の別個の領域のそれぞれの中に10個のマイクロオリフィスがある。マイクロオリフィス300を介して細胞を支持体140に適用した後、得られるパターン化支持体140は6個のマクロ領域を画定し、これらのマクロ領域のそれぞれはパターン化細胞のマイクロ領域を画定する。各マイクロ領域は1つの細胞または複数の細胞を含有する。
【０１８４】
図7(a)〜7(c)について上記本発明の実施態様の説明は、本発明の細胞遊走測定プレートの柔軟性を証明する。測定プレート100の第1層150のマイクロオリフィス300および／または第2層160のマクロオリフィス170の数、サイズおよびピッチを変更することにより、細胞の任意の所望の構成またはパターンが達成される。本発明では測定プレートにより任意の数のマクロウェル151が画定され、さらに各マクロウェルは任意の数のマイクロウェル141を画定して、所望の幾何学パターンを作成する。上記したように本発明の好適な実施態様は、業界で使用されている標準的マイクロタイタープレートのフットプリントの数、サイズおよびピッチに一致する別個の領域を有する。例えばある好適な実施態様は、96ウェルマイクロタイタープレートのフットプリントに一致する96個の別個のマクロオリフィス170を有する第2層160を含む。96個の別個のマクロオリフィス170の各1つの中に位置するように第1層150の上に、例えば細胞の溶液を受けるように構成された100個のマイクロオリフィス300が整列される。得られる整列支持体140は96個の領域を有し、その各々が100個の分かれた細胞のマイクロ領域を有する。
【０１８５】
本発明の細胞遊走測定プレートの別の実施態様では、装置の層を位置合わせするための手段がある。例えば第1層150のマイクロオリフィス300を第2層160のマクロオリフィス170と位置合わせするために、第1層150は第2層160と正確に位置合わせしなければならない。図3(a)は、物理的位置合わせ手段190と視覚的位置合わせ手段192とを有し、これらの1つまたは両方が本発明で使用される。物理的位置合わせ手段190は、支持体から伸長する突出部、ピン、突起などを含む。本発明のある例では、物理的位置合わせ手段190は支持体140から突出する突起であり、そこに重層されたガイダンスオリフィス194を通過して伸長する。ガイダンスオリフィス194の例を図4(a)に示す。他の実施態様では支持体140は、例えば図3(a)に示す壁196のような、支持体140の境界端上の硬い物質からなる壁を含む隆起した外枠または稜線を有する。枠または壁196の空間的制約は、その上に置かれた層を正しい位置に導く。視覚的手段192は、支持体140および／または他の層の上のマークを含み、各追加の層が次の層の上への配置を導く。視覚的位置合わせ手段192は、特に限定されないが、点または網状模様のようなマークを含む。
【０１８６】
図8(a)は、本発明のさらに別の代替実施態様の細胞遊走測定プレート100の平面図である。この実施態様ではマクロウェル151は円筒形というよりも、ロート型である。さらにこの実施態様ではマクロウェル151は開いて外気に露出しているというより、キャップ820でふたをされている。キャップ820は、少なくとも一部が第2層160の上部表面に一致するように、およびマクロウェル151の開口部と密封して合わさるように構成された1つ以上の物質を含む。図8(b)に示す本発明の実施態様ではキャップ820は、マクロウェル151についてプラグとして作用する第1の物質で作成された密封930、および第2の物質で作成された第2層160の上部表面を通過して伸長する連続的被覆層835を含む。キャップ820は、マクロウェル151中に置かれた、および／または保存と輸送中の細胞遊走測定プレートの測定法溶液の蒸発を防ぐのに有用である。
【０１８７】
図8(a)と8(b)はまた、細胞遊走測定プレート100の各マクロウェル151を形成し裏張りするのに使用される裏張り835を示す。上端836と下端837とを有するこの裏張りは、細胞遊走測定プレート100の材料による以外の性質を有するマクロウェル151を提供できるように、細胞遊走測定プレート100の材料とは異なる材料から作成される。さらに裏張り835はまた、ある場所に裏張りを配置し、次に細胞遊走測定プレートの材料を底に注ぐことによるその製造中に、細胞遊走測定プレート100を形成するのに使用される。
【０１８８】
ロート型の裏張り835および対応するマクロウェル151は図8(b)に見られる。この図には、第1層150、支持体140、キャップ820、密封930、上端836、下端837も見られる。さらに図8(b)に見られるように、裏張り835はマクロウェル151の形を画定かつ形成し、第1層150を支持体140の上に密封できるように位置させる。
【０１８９】
図8(c)と8(d)は、プラグ320を含む細胞遊走測定プレート100の別の実施態様を示す。示した実施態様では、マクロオリフィス170を画定する第2層160が支持体140の上に置かれる。本発明のある実施態様では、マクロウェル151の内径「ID」より小さい外径「OD」を有するプラグ320は、マクロオリフィス170への挿入のために構成される。記載の実施態様では、プラグの高さ（「HP」として記載）は、次にマクロオリフィス170の開口部に試験薬を加えることを可能にするために、マクロウェル151の深さ（「DW」として記載）に対応する第2層の深さより短い。これらのプラグ320のそれぞれは、その底表面に膜350を有し、膜350は画定された幾何学パターンでマイクロ領域370を画定する。プラグ320は好ましくは、測定プレート100の各マクロウェル151に挿入できるような大きさである。
【０１９０】
本発明の細胞遊走測定プレートの別の例では、第2層160の上にキャップ185（示していない）が置かれる。キャップ185は、上記の硬いまたは柔軟性のある材料からなる。キャップ185は、マクロオリフィス170を介して装置上に置かれる測定法溶液の蒸発を防ぐのに有用である。
【０１９１】
定性的細胞遊走測定プレートの作成
第1層150と第2層160とを有する本発明の細胞遊走測定プレートは、本発明に従って2つの方法で製造される：1つは単一片作成法、もう1つは2片作成法（後述される）。しかし本発明はその範囲内に、当業者の知識の範囲内にある本発明の測定プレートを製造するための他の方法も含むことを理解されたい。
【０１９２】
流し込み、脱気、および硬化の単一の順序で本発明の細胞遊走測定プレートを作成することにより、製造サイクル時間が低減され、装置の第1層と第2層との密封が改善される。この方法の大きな利点は、好適な材料（薄いPDMS膜）の用手的操作を必要としないことである。本発明の種々の実施態様では、原型であるシリコーン／フォトレジスト膜マスターの上に装置が形成される単一片作成法が使用される。図9(a)は、第2層中のマクロオリフィスを形成するために、PDMS全体構造502のシラン化整列を含む装置を示す。これらの全体構造502は、図9(b)に示す標準的マイクロタイタープレート100（例えば96ウェルマイクロタイタープレート）に対してPDMSを鋳造して、得られる構造体をガラススライド504に密封することにより作成される。
【０１９３】
PDMS全体構造502の使用は、パターン化層を作成するための便利な方法となる。パーフルオロシランを使用するPDMSのシラン化は、その表面をPDMS前駆体による損傷に対して抵抗性にして、PDMSのポストへの架橋を排除する。全体構造は好ましくはPDMSを使用して作成されるが、多くの他の材料（例えば、テフロン（登録商標）、金属（例えばアルミニウム）、および他のポリマー）が使用できる。上記したように96ウェルプレートがマスターとして使用されるが、12、24、384、および1586ウェル構造に基づくより低密度および高密度も使用可能である。標準的マイクロタイタープレートのフットプリントが、このために多くの検出法が開発されているため、好ましい。PDMS全体構造502が空気プラズマ（300mTorr、6ワットで1分）で酸化した後、これらはフルオロシラン溶液（メタノール中1％容量）に浸漬してシラン化される。
【０１９４】
図10(a)〜10(c)は、本発明の方法の1つの実施態様に対応する各段階を模式的に示し、ここで本発明の測定プレートの実施態様の第1層と第2層は、上記したように全体構造502を使用して作成される。以下の説明は図1(a)〜7(c)の測定プレートの例についてのものであるが、図10(a)〜11(c)についておよび細胞パターン化についての方法が同様に、本発明の測定プレートの他の実施態様に適用できることを理解されたい。図10(a)に示す段階の実施の前に、PDMS前駆体は所望の形、直径およびピッチで整列されたフォトレジストポストのパターン上にスピンコーティングされて、第1層150のような第1層を製造する。好適な整列は、3"×3"整列の直径100μmのポスト（中心から中心が200μm）を有する。次に第1層150はマスター上で硬化される。次に図10(a)に示すように、シラン化した全体構造502は、膜の上に置かれ、重り503（約500〜1000ｇ）がガラス裏板504の上に置かれる。全体構造502は第1層150（すなわちPDMS膜）に対して密封される。図10(b)に示すようにPDMSプレポリマー505が第1層150の上に注がれ、全体構造502の周りに流れ、第1層150の上に厚い（約5mm）プレート505が形成される。図10(c)に示すようにPDMSの硬化後、重り503と全体構造502が除去され、生じる第1層150と第2層160は一緒にマスターから、第1層150単独より容易にかつ再現性良くはがされる。
【０１９５】
図11(a)〜11(c)は、本発明の方法の別の実施態様に対応する各段階を模式的に示し、これに従うと、本発明の測定プレート例の第1層と第2層は、上記したように全体構造502を使用して作成される。記載の方法は、図10(a)〜10(c)とは異なり、スピンコーティング工程を使用しない。その代わり、第1層150のような第1層と第2層160のような第2層が、同時に作成され硬化される。ここでは図11(a)に示すように全体構造502は、フォトレジストポスト506aでパターン化したシリコンウェーハー506の上に直接置かれる。次に図11(b)に示すようにPDMS前駆体は、シリコンウェーハー506の上に注がれる。次に図11(c)に示すように、装置に真空を加えて、全体構造中に捕捉された空気を除去し、PDMSがフォトレジストポスト506aの間のスペースおよびマクロポスト502の間のスペースを埋めるようにする。
【０１９６】
別の作成法（示してない）は、第2層160のような第2層と第1層150のような第1層を別々に形成して、次に層の接着により組み立てる。この方法は、大量処理が可能になるため有利であり、従来法（例えばスピンコーティングおよび成形）を使用して第1層と第2層を作成することが比較的容易である。第1層と第2層を作成後、これらは位置合わせされ、互いに結合される。薄膜成分を扱う時は注意しなければならない。
【０１９７】
2つの層150と160の組み立ては、多くの方法の1つ、例えばプラズマ酸化を用いて、接着層を使用して、両面テープを使用して、または機械的方法を使用して、行われる。接着層が使用される時、2つの層を結合するのにPDMS前駆体が使用されることができる。この前駆体は、熱的にまたは光化学的に架橋される。さらにPDMS表面に接着する任意の他の「糊」が使用される。本発明はまた、PDMSの表面に強く接着できる両面接着テープが使用できることを企図する。種々の他の実施態様では、機械的方法も使用される。ある応用では、実験の過程を通じて機械約圧力が層に維持される。PDMSは圧力で変形することがあり、「ガスケット」として作用するため、機械的密封は成分を組み立てるための現実的解決法である。糊やテープに対して機械的方法を使用する利点の1つは組み立てた構造が、装置またはパターン化物質に損傷を与えることなく迅速に分解できることである。
【０１９８】
本発明はまた、本発明の細胞遊走測定プレートを使用して細胞をパターン化する方法に関する。本発明の細胞をパターン化する好適な方法では、第1層150のような第1層が支持体140の上に置かれ、第2層160のような第2層は第1層の上に置かれる。マイクロオリフィス300より上にマクロオリフィス170を配置することは、上記の位置合わせ手段を使用して補助される。ある実施態様では細胞は第1層150を介してパターン化され、沈降され、支持体140に適用されて、接着した細胞のマイクロ領域を有する整列された支持体140を作成される。各マイクロオリフィス300は、同じ細胞を含有する溶液または異なる細胞を含有する溶液を受け入れることができる。次に第1層150は除去される。この実施態様では、第1層150はBSAまたは細胞付着に抵抗する他の細胞非親和性物質で被覆することが好ましい。次に第2層160は、整列された支持体140の上に位置合わせされる。マクロオリフィス170は、細胞の複数のマイクロ領域を包含するマクロウェル151を画定する。次に試験薬は、マクロウェル151を介して加えられて整列された細胞のマイクロ領域に接触する。各マクロウェル151は、同じかまたは異なる試験薬を受け入れることができる。
【０１９９】
別の例では、第1層150が支持体140の上に置かれ、第2層160が第1層150の上に置かれる。マイクロオリフィス300の上へのマクロオリフィスの配置は、上記の位置合わせ手段の使用により補助される。第1のタイプの細胞は第1層150を介してパターン化され、接着した細胞のマイクロ領域の作成するパターンで支持体140に適用される。第1層150が除去される。次に第2層160は支持体に結合される。第2層160は、第1の細胞タイプの複数のマイクロ領域を包含するマクロウェル151を有する。次に第2のタイプの細胞を有する溶液がマクロウェル151のそれぞれに入れられて、第1の細胞タイプのマイクロ領域の周りに充填される。細胞は支持体に付着される。次に試験薬がマクロウェルに加えられて、支持体140の上にある細胞に接触する。各マクロウェル151は同じかまたは異なる試験薬を受け入れることができる。図12(a)は、第1層150のマイクロオリフィス300にパターン化された第1のタイプの細胞、例えばMS1（内皮細胞性癌細胞）を記載する。第1層150の除去後、第2のタイプの細胞、例えば図12(b)に記載の3T3正常繊維芽細胞が第1のタイプの細胞の周りに整列されて、図12(c)に示す重層配置を作りだす。図12(a)〜(c)に記載の方法は、通常「同時培養」と呼ばれる。
【０２００】
別の実施態様では、第1層150と第2層160の両方が互いに接触され、支持体140の上に置かれる。細胞は第2層160のマクロウェル151と第1層150のマイクロオリフィス300を介してパターン化されて、下の支持体140に接触および付着する。得られるパターン化支持体140は、付着した細胞のマイクロ領域を有する。次に試験薬がマクロウェル151に加えられて、パターン化された細胞に接触する。各マクロウェル151は同じかまたは異なる試験薬を受け入れることができる。別の実施態様では、上記したように支持体140がコーティング220で被覆された後、第1層150が支持体に結合され、次にマイクロオリフィスは細胞の溶液を受け入れる。
【０２０１】
細胞は第1層150のマイクロオリフィス300を介する配置により所定の整列でパターン化されるため、細胞の正確な位置は既知で同定可能である。整列された細胞の動きまたは遊走への影響は、その出発位置からの細胞の動きまたは動きの欠如を測定することにより、より正確に研究することができる。さらに整列は第1層150のマイクロオリフィス300の制約によりもたらせるため、正確なパターンは、各マクロウェル151中のマイクロオリフィス300の同じ幾何学パターンを有することにより、複数のマクロウェル151のそれぞれにより包含される領域中で支持体を介して複製される。この支持体140上の細胞パターンの再現性は、他のマクロウェル151に対する各マクロウェル151中の細胞の動きの迅速で信頼できる比較を提供する。さらに各マクロウェル151内で、細胞の各マイクロ領域はマクロウェル151内の他のマイクロ領域を例示する。例えば各マイクロオリフィス300は同じサイズと形になるように作成され、同じ量の細胞が各マイクロオリフィス300に加えられるため、最初の時点で最初のマイクロオリフィス300によりパターン化される細胞のマイクロ領域を観察し、後に第2の時点で第2のマイクロオリフィス300によりパターン化される細胞の第2のマイクロ領域を観察し、2つの時点で記録された観察結果を比較する。各マイクロオリフィス300中の細胞は同じ条件に曝露される、同一のマイクロオリフィス300によりパターン化されたため、測定法の経時変化で以前観察されたマイクロ領域300に戻る必要は無い。
【０２０２】
さらに細胞は各マクロウェル151中の同じ所定の出発位置でパターン化されているため、最初のマクロウェル151中の細胞集団に対する最初の試験薬の影響は、第2のマクロウェル151中の細胞集団に対する第2の試験薬の影響と、より正確に比較することができる。
【０２０３】
本発明の細胞遊走測定プレートの柔軟性と本発明の細胞遊走測定プレートを使用する細胞のパターン化方法の柔軟性は、無数の細胞遊走測定法構成を与える。マイクロオリフィス300とマクロオリフィス170の種々の大きさ、数、形およびピッチを選択することにより、ならびに支持体140上のコーティング220を修飾することにより、実質的に無数の構成が可能である。
【０２０４】
本発明の細胞遊走システムおよび細胞遊走測定プレートを使用して、新規細胞遊走測定法を行うことができる。これらの測定法は、パターン化細胞の遊走または運動性を測定する。本発明は別の整列で細胞をパターン化することを提供するため、細胞の動き／遊走の測定は、第1層のマイクロオリフィスにより作成される所定の出発点からの運動性または遊走を測定するよりも、より正確である。さらに本発明の細胞遊走／運動性測定法は、細胞が光学顕微鏡または蛍光顕微鏡により視覚化することができ、ボイデンチャンバーが必要としたような計数のための固定や染色が必要無いため、進行中／リアルタイムの細胞のモニタリングが行われる。本発明は、無数のタイプの細胞の細胞の動きまたは遊走のモニタリングと観察を企図し、これは、細胞の動きの結果として起きる体内のプロセスについての必要な情報を提供する。
【０２０５】
体内の無数のシステムや応答に、細胞の動きが関与しているとされている。例えば炎症性応答や免疫応答には白血球の動きが関与している。細胞性免疫応答に参加する白血球クラスには、リンパ球、単核細胞、好中球、好酸球、および肥満細胞がある。白血球は、炎症部位に蓄積し、その顆粒内容物（例えば種々の加水分解酵素および他の毒性成分）を細胞外スペースに放出する。その結果、周りの組織が損傷を受ける。無数の慢性の炎症性疾患に、組織中の白血球の異常な存在が関与すると考えられている。これらの細胞の浸潤は、広範囲の炎症性および自己免疫疾患および臓器移植拒絶の原因である。これらの疾患には、一例を挙げるとリウマチ様関節炎、乾癬接触皮膚炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、サルコイドーシス、突発性肺線維症、同種移植片拒絶、および移植片対宿主反応疾患がある。
【０２０６】
体の他のプロセスでは、癌細胞は腫瘍から分離して、体の他の部位に転移する。すなわち癌細胞増殖および／または転移を阻害する薬物候補の能力について信頼できる研究を提供する細胞遊走測定法は、腫瘍学の分野に貴重な情報を提供するであろう。
【０２０７】
本発明の細胞遊走／運動性測定法のある例では、細胞はまず第1層150のマイクロオリフィス300を通過して遊走して支持体140に達し、整列した支持体140を生成する。細胞はマイクロオリフィス300内で付着しコンフルエンスまで増殖させる。次に第1層150を除去する。整列した支持体140の上に第2層160を置いて、パターン化細胞の領域を包含するマクロウェル151を形成する。第2層160のマクロオリフィス170を介して試験溶液を加え、整列した細胞に接触させる。次にこの試験溶液の細胞の動きまたは遊走への影響を観察する。図13(a)〜13(c)は、本発明の測定法の上記実施態様の段階を例示する。図13(a)は、第1層150に密封した第2層160を示す。図13(b)は、第1層と第2層150と160を介して支持体140にパターン化された細胞を示し、マイクロオリフィス300内でコンフルエンスまで増殖させる。この例を図13(d)に示す。図13(c)に示すように、次に第1層150を除去し、支持体140の上に整列した細胞を遊走させ、その例を図13(e)に示す。観察は当業者に公知の任意の方法（特に限定されないが光学顕微鏡および蛍光顕微鏡を含む）を使用して行われる。
【０２０８】
図1(a)〜7(c)に示す実施態様とともに使用される本発明の細胞遊走／運動性測定法の別の実施態様では、支持体140は試験薬で直接処理されるかまたは試験薬がその上に被覆された膜で被覆される。次にこの物質は、化学走化性を示すかどうか試験される。かかるシナリオでは第1層150のマイクロオリフィス300の直径は、蒔かれる個々の細胞のサイズより小さい。細胞が蒔かれ、支持体140上の化学走化性物質に応答してマイクロオリフィス300のあらかじめ画定した整列に入り込む。次に膜の支持体140が細胞について観察される。マイクロオリフィス300は所定の幾何学パターンで設計されているため、第1層150を介する支持体上への細胞の遊走の分析と測定により、細胞についての支持体140の迅速な視覚検査が可能になる。例えばマイクロオリフィスが10×10パターン（全部で100個の細胞について）で整列しているなら、支持体または膜を少し見れば科学者は何％の細胞がマイクロオリフィスを遊走したかがわかるであろう。高率の細胞が遊走していることは、強い化学走化性物質に対応し、低率は弱い化学誘引物質に対応する。上下のベースラインを確立することを含むトランスウェル化学走化性測定法に対して、上記測定法では化学走化性物質の強さや弱さを分析するためのベースライン測定値は必要無い。
【０２０９】
本発明の細胞遊走／運動性測定法の別の実施態様では、支持体140のような支持体は、まず細胞外マトリックスタンパク質またはマトリゲル（示していない）のようなコーティング220で被覆される。次に細胞は被覆支持体上に蒔かれる。マトリゲル中の細胞の遊走または動きが観察される。本発明の測定法のさらに別の実施態様では、マトリゲルが試験薬を含有することができる。
【０２１０】
本発明の細胞遊走／運動性測定法は、細胞の動きと細胞の形の両方に対する試験薬などの作用を調べることを可能にする。例えば細胞はマイクロオリフィス（例えば第1層150のマイクロオリフィス300）を介してパターン化される。細胞は支持体140に付着され、コンフルエンスまで増殖させられる。マイクロオリフィス300の壁は細胞を制約し、細胞はマイクロオリフィス300の形（例えば円形）を取る。マイクロオリフィス300を介して試験薬が適用され、細胞と接触する。第1層150が除去され、細胞が観察される。試験薬が細胞の動きに影響を与えるなら、細胞はパターン化された場所に「固着」され、形を変化させず、すなわちパターン化メンバーが円形オリフィスを有するなら円形のままである。一方試験薬が細胞の動きに影響を与えないなら、細胞はその元々のパターン化位置から動き去り、第1層150の制約が除かれているためパターン化された円形から変化するであろう。図15(a)は左の欄に、対照細胞が種々の時間（例えば2時間および5時間）に、元々のパターン（「0時間」として記載）から遊走していることを示す。これに対して一般的な抗癌剤タキソールで処理した細胞は、図15(a)の右の欄に示すように同じ時間間隔後に元々の円形パターンを保持している。図15(b)は、本発明の細胞遊走／運動性測定法で測定した細胞の動きに対する種々の濃度のタキソールの影響を示すグラフである。
【０２１１】
あるいは細胞がコンフルエンスまで増殖する前に試験薬を加えてもよく、すなわち細胞がマイクロオリフィス300を介してパターン化される前に試験薬を細胞に加えてもよい。細胞の動きに対して試験薬が何の作用も無い場合は、細胞は広がり、マイクロオリフィス300の形を取る。図16と17では、マイクロオリフィス300は円形である。図16と17の左の欄は対照パネルであり、細胞がコンフルエントな円形パターンに増殖したことを示す。残りの欄に示すように種々の試験薬（ノコダゾール、コルヒチン、ビンブラスチン、およびパクリタキセル）で処理した細胞は、細胞の動きが停止し、円形のコンフルエントなパターンを取らなかった。
【０２１２】
本発明のある例は、細胞の増殖ならびに細胞の動きに対する試験薬の作用を試験することを可能にする。これは、増殖速度が速い癌の研究に特に有用である。この実施態様ではパターン化される細胞は好ましくは、異なる染色物または標識物で染色されるかまたは蛍光標識される。核は細胞の他の部分とは異なる色素または蛍光標識物で染色される（すなわち、細胞質色素または標識物）。細胞は第1層150のマイクロオリフィス300を介してパターン化される。細胞は支持体140に付着しコンフルエンスまで増殖する。試験薬はマイクロオリフィス300を介して適用され、細胞に接触する。あるいは試験薬は、細胞がマイクロオリフィスを介してパターン化される前に、細胞に加えられる。第1層150が除去される。次に細胞は、遊走または動きおよび／または増殖について観察される。2つの異なる標識物または色素を使用すると、細胞数およびその増加、および／または細胞の動きの観察と記録が可能になる。この情報を組合せて使用すると、運動性の作用を増殖から切り離すことが可能である。すなわち細胞を後に観察すると、細胞は元々のパターンから移動しているので、測定の最初（すなわち0時間）での核の数をいくつかの後の時点の核の数と単に比較することにより、これは細胞の動きのみからか、増殖のみからか、または動きと増殖の組合せからかを決定することができる。
【０２１３】
図18は、本発明の測定法が細胞の動きを測定することができ、細胞分裂のみを測定するのではないことを証明する。経時的に細胞はその元々のパターンから拡散／移動していくが、数は基本的に一定である。
【０２１４】
本発明はまた、微生物の同定法、薬剤の活性のスクリーニング法、毒性物質の検出法、および細胞内反応の検出法を含む。これらの種々の方法では、所望の細胞に影響を与える物質を含有する溶液または懸濁物は、生きた細胞と密接に接触してマクロウェル／マイクロオリフィス中を流される。次に、細胞の動きまたは遊走に影響を与える物質の作用がモニターされ測定される。
【０２１５】
本発明は、広範囲の原核生物および／または真核生物細胞で使用してもよい。かかる細胞の例には、特に限定されないが、ヒトケラチン細胞、ネズミL繊維芽細胞、イヌMDCK上皮細胞、ハムスターBHK繊維芽細胞、ネズミCTLLリンパ球、腫瘍細胞および細菌がある。一般に、うまくパターン化されている任意の生きた細胞（トランスフェクトされた細胞を含む）が使用される。顕微鏡観察を助けるために、細胞は当該分野で公知の蛍光マーカー（フルオレセインなど）で標識される。
【０２１６】
細胞に影響を与える物質は、細胞の動きまたは遊走に影響を与える任意の物質である。細胞に影響を与える物質の例には、特に限定されないが、刺激物質、薬剤、毒素、他の細胞、受容体リガンド、受容体アゴニスト、免疫学的物質、ウイルス、病原体、パイロゲンおよびホルモンがある。かかる細胞に影響を与える物質の例はさらに、刺激物質、例えば塩化ベンザルコニウム、プロピレングリコール、メタノール、アセトン、ドデシル硫酸ナトリウム、過酸化水素、1-ブタノール、エタノール、およびジメチルスルホキシド；薬剤、例えばバリノマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、リバビリン、アミロリドおよびテオフィリン；ホルモン、例えばT3とT4、エピネフリンおよびバソプレシン；毒素、例えばシアニド、カルボニルシアニド、クロロフェニルヒジアゾン、エンドトキシンおよび細菌リポ多糖；免疫学的物質、例えばインターロイキン-2、上皮細胞成長因子、およびモノクローナル抗体；受容体アゴニスト、例えばイソプロテレノール、カルバコール、プロスタグランジンE1、およびアトロピン；並びに種々の他の種類の細胞に影響を与える物質、例えばホルボールミリステート酢酸、塩化マグネシウム、他の細胞、受容体リガンド、ウイルス、病原体およびパイロゲンを含む。さらに本発明はまた、いくつかの細胞に影響を与える物質が他の物質に及ぼす相乗作用を試験することができる。すなわち、その組合せ相乗作用をよりよく理解する必要に応じて、試験薬を組合せ混合する。
【０２１７】
本発明のある細胞遊走／運動性測定法では、細胞は第1層150のマイクロオリフィス300を介して支持体140の上にパターン化される。細胞は、ある細胞サイクル段階まで増殖させられ、その細胞増殖段階で停止される。次に試験薬をパターン化細胞に加え、剤の作用が観察されモニターされる。同じ試験薬が異なる生活サイクル段階中の同じ細胞に適用され、互いに比較されて、細胞サイクルの異なる時点における試験薬の作用が注目される。他の実施態様では細胞は、別の場所でインキュベートすることによりある細胞段階に「捕捉」されるが、細胞の特定の所望の生活サイクル（例えば、G1、S、G2、M（標準的細胞サイクル）、またはS、M（初期胚細胞サイクル））でのみ発現される細胞性「標識物」（例えば、タンパク質）を「つかむ」リガンドのコーティングを有する支持体上で捕捉される。かかる実施態様では被覆支持体は、所望の生活環段階の細胞のみを捕捉するであろう。
【０２１８】
本発明の定性的細胞遊走システム（例えば図1(a)に示すシステム190）では、観察システム110とコントローラー120を使用して、細胞が異なる種々の刺激に応答する時の細胞のリアルタイムの動きと挙動を観察し分析することができる。観察システム110とコントローラー120は、モニター（示していない）によるリアルタイム観察を提供する。これらはまた、これらの成分とともに組み込んだかまたはこれらに連結した記録システムにより後で再生することができる。いずれの場合も、これらの成分はまた、細胞が刺激に対して反応して進むところを追跡し分析することができる。システム190は、当業者の知識内にあるように、任意の適当な観察システムとコントローラーを含むことができる。
【０２１９】
観察システム110は、顕微鏡、高速ビデオカメラ、または高分解能デジタルカメラ、および／または多くのビデオカメラ、および多くの個々のセンサーを含むことができる。遊走を定量するために平行して、標準的光学顕微鏡法を使用することができる。好ましくは倒立光学位相差顕微鏡を使用して、生きた細胞を観察することができる。観察システムは、種々の観察パラメータの入力を受け取るためのコントローラーに連結している。観察システムにより観察されるデータは、通常の方法で処理するためにコントローラーに送られる。
【０２２０】
これらの実施態様のそれぞれは、刺激、反応物、または他の試験化合物が導入される前、その時、および後に、細胞の動きと挙動をモニタリングすることを可能にする。同時に観察システム110はまた、コントローラー120が解釈し分析するためのシグナルを生成する。この分析は、経時的に細胞の物理的動きならびにその形、活性レベルまたは任意の他の観察可能な特性の変化の測定を含む。各場合で試験される細胞は、リアルタイムで、後で、またはその両方で観察されることができる。
【０２２１】
図19は、本発明のある実施態様の細胞の遊走または運動性を測定するためのシステムの模式図である。このシステムは、図19に示す倒立顕微鏡1を使用し、これはカメラに1〜100×の倍率の対物レンズと電源2による白色光源（例えば、100Wの水銀アークランプまたは75Wのキセノンランプ）を使用する。別の実施態様ではこのシステムは、直立顕微鏡を使用する。このシステムはまた、顕微鏡対物レンズ上で定性的細胞遊走測定プレート4をXY方向に動かすためのXYステージ3を含む。Ｚ軸焦点ドライブ5は、焦点合わせのために対象をＺ方向に動かす。ジョイスティック6は、ＸＹＺ方向のステージの手動の動きを可能にする。高分解能デジタルカメラ7は、定性的細胞遊走測定プレート4上の各ウェルまたは位置から画像を得る。カメラの電源8は、カメラ7に電力を与える。自動コントローラー9は、観察システムの自動化側面を制御し、中央処理装置10に連結している。PC11は、ディスプレイ12を与え、関連するソフトウェアを有し、簡単に後述される。プリンター13は、観察された細胞の遊走／運動性に対応するデータを印刷する。顕微鏡接眼レンズ14は、システムのユーザーが見られるように位置している。
【０２２２】
本発明の好適な実施態様では、観察システムと制御システムは自動化され、画像を自動で採取するためにモーターを備える。ある実施態様では自動スキャンの開始時にオペレーターは、観察される試料と定性的細胞遊走測定プレートの構成に対応するパラメータを入力する。測定パラメータは、例えば細胞のタイプ、各マイクロオリフィス中にパターン化される細胞の数、マイクロオリフィスの形とピッチ、マクロオリフィスの形とピッチ、各画像捕捉（スキャン）間の時間、マクロウェルおよびスキャン1つ当たりの捕捉する画像の数などの変数を含む。他のパラメータには、使用される生物学的標識物などに一致するフィルター設定と蛍光チャネルがある。カメラ設定は、試料の明るさに一致するように調整される。これらのパラメータは、容易に検索し自動で実施できるようにシステムのデータベース中に保存することが有利である。ユーザーは、システムが測定プレートのどの部分をスキャンするか、そして各プレートで各マクロウェルでいくつの視野を分析するかを特定する。ユーザーが選択した設定モードにより、システムがプレートの「焦点を見つける」ために自動焦点法を使用してスキャンされるプレートの領域を自動であらかじめ焦点合わせするか、またはユーザーがスキャン領域を対話形式であらかじめ焦点合わせをする。
【０２２３】
自動スキャンの間ソフトウェアは、分析されているマクロウェル中の視野の数と、分析されている現在のマクロウェルと、取得された各独立の波長の画像とに対応するデータを表示することにより進行中のスキャンの状態、および取得された各マクロウェルについてのスクリーンの結果を動的に表示する。測定プレートは、例えば上から下、左から右、または装置内のマクロウェルからマクロウェルにモーターを備えた顕微鏡XYステージ3をソフトウェアが自動で動かすのに合わせてS字形などの、任意の数のスキャニングパターンでスキャンされる。プログラミングの熟練者は、例えば24、48、96および384ウェルプレートのような標準的マイクロプレートフォーマットのスキャニングのためにソフトウェアをいかに改変するかを認識しているであろう。全プレートのスキャンパターンならびに各ウェル内の視野のスキャンパターンは、プログラムされる。システムは、自動焦点法104を用いてＺ軸焦点ドライブ5により試料の焦点を調整し、モーターを備えたフィルターホイール19によりフィルター選択を随時制御し、画像を取得し分析する。
【０２２４】
自動焦点アルゴリズムは、先行技術でHarmsら、Cytometry 5 (1984) 236-243, Groenら、Cytometry 6 (1985), 81-91, およびFirestoneら、Cytometry 12 (1991), 195-206（これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。米国特許第5,989,835号は、上記方法の変法を記載する（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。自動焦点法は、ユーザーが選択した頻度で、典型的には最初のマクロウェルの最初の視野で、次に各マクロウェル内の4〜5視野毎に1回呼び出される。自動焦点法は、あらかじめ計算した平面焦点モデルから補間することにより、出発Ｚ軸点を計算する。この設定点の上または下のプログラム可能な距離で開始して、方法は、機械的Ｚ軸をいくつかの異なる位置で動かし、それぞれで画像を取得し、各画像のコントラストを推定する最大の計算された焦点スコアを見つける。最大の焦点スコアを有する画像のＺ位置が、特定の視野の最適な焦点を決定する。
【０２２５】
マイクロ領域とマクロ領域の位置と幾何学パターンはあらかじめ決められるため、システムはこれらの位置でプレートをスキャンするようにプログラムされる。細胞の遊走または運動性は、当該分野で公知の種々の任意の方法（視覚化モニタリング、蛍光標識抗体または他のリガンドの結合に基づく蛍光または分光的測定、細胞サイズまたは形態、或いは生物学的染色有りまたは無しの細胞の分光的透過、反射または吸収特性）により検出される。標準的光学顕微鏡または電子顕微鏡も使用できる。検出系が顕微鏡である時、これは測定プレートの上または下に位置してもよい。蛍光測定の場合、検出器ユニットは測定プレートの上、または測定プレートが光透過性の場合、測定プレートの下に置いても良い。透過分光光学測定法では、光透過性の測定プレートが使用され、電磁放射線源は測定プレートの片側に、そして検出器ユニットは反対側に置かれる。視覚化モニタリング以外に、物理的モニタリングも使用される。例えば細胞の動きは、測定プレート上に置いた検出器に接触し、検出器の変化を引き起こし、これはCPUにより受けられ分析される。本発明で許容される個々の単離された細胞の間の距離は短いため、光ファイバーを使用する検出器が特に好ましい。電磁放射線のかかる源および電磁放射線透過、反射または放射のためのかかる検出器は、当該分野で公知であり、本明細書に開示の本発明に容易に適用できる。
【０２２６】
自動検出器が使用される時、標準的または対照プレートも提供される。かかる測定プレートは、参照が提供され、検出器がかかるマイクロ領域を認識するように、細胞が遊走しなかったマイクロ領域を含むマイクロ領域を含有するであろう。さらに、検出器ユニットが対象の測定プレート上の細胞を分類するための参照となるように、既知のタイプの細胞を有するマイクロ領域が提供される。さらに支持体の性質または選択される支持体への処理により、異なるタイプの細胞が異なる親和性で測定プレートに接着する。すなわち試験される細胞と支持体またはコーティングの性質に依存して、まず試料に次に測定プレートに標準的細胞測定法が使用され、同じまたは実質的に類似の試料に本発明の方法を使用してシステムを較正する。
【０２２７】
画像を取得するために、カメラの露出時間を別々に調整する。細胞を蛍光色素で標識し、各チャネルから高品質画像が得られるように、各色素について露出時間を調整する。ユーザーの選択でソフトウェアを呼び出し、さらに測定する前に波長間の線形（XとY）シフトを考慮して波長間の登録シフトを補正する。試料の光退色を最小になるように、カメラの電子シャッターを調節する。ソフトウェアにより公知のアルゴリズムを使用して、バックグランドの陰影と不均一な照射も補正することができる。
【０２２８】
図31は、本発明の実施態様の細胞性物質を試験するための方法1100を示す。この方法では、まず物質の遊走と増殖に物理的制限を課す制約を画定する試験ベッドに細胞性物質を入れる（ブロック1110）。細胞性物質に試験薬を適用し、制約を除去する（ブロック1120、1130）。次に細胞性物質を定期的に画像作成する（ブロック1140）。生じる画像データを経時的に比較して、試験下で捕捉されるパラメータを測定する（ブロック1150）。記載したようにパラメータは、反応物の影響下の細胞成長、細胞複製、または細胞の遊走を含む。
【０２２９】
例えば細胞はマイクロオリフィス（例えば第1層1150のマイクロオリフィス1300）によりパターン化される。細胞を支持体1140に付着させ、コンフルエンスまで増殖させる。マイクロオリフィス1300の壁は細胞に制約を与える、細胞はマイクロオリフィス1300の形（例えば円形）を取る。第1層1150が除去され、細胞が観察される。
【０２３０】
本発明の実施態様は、前記方法と装置と一緒に使用するための画像取得と分析処理を提供する。1つ以上の試験段階で、イメージング装置は試験装置とその中の細胞性物質の画像データを捕捉する。記載したように、捕捉された画像データは、バックグランド物質またはノイズによる画像以外に、蛍光性細胞性物質、染色された核物質、または両方である。画像処理段階は、捕捉された画像データの内容物を分析して、試験装置内の細胞の群（「島」とも呼ぶ）を同定する。個々の島から、複数の測定値を計算して、動き（細胞運動性）、再生または複製（細胞増殖）、成長（細胞拡散）、サイズの縮小または低下（細胞の円形化）、或いは細胞死滅が評価される。
【０２３１】
本発明の実施態様では、画像データ内からの島の取得は、粗い取得段階と細かい取得段階から起きる。画像取得相は、試験装置中の島と島内の個々の細胞の同定を試みる。
【０２３２】
図34は、本発明の実施態様の粗い島取得を行う方法1400を示す。この方法は、捕捉した画像データ（ブロック1410）から始まり、マイクロオリフィス1210が画像データの横軸および縦軸で配向される。画像データから、方法1400は、粗い粒度でマイクロオリフィスの島の行と列の同定を試みる（ブロック1420、1430）。島の行の同定は、画像データの最初の軸（例えば、縦軸）に沿って画像データエネルギーのヒストグラムを作成することにより起きる（ブロック1440）。ヒストグラムから、粗い島位置が同定され（ブロック1450）、島の間で島の境界がマークされる（ブロック1460）。
図35は、画像データ例1510（製図工の制約内で作成される）とそこから作成されるヒストグラム1520を示す。図35は、島位置の同定のための2つのアプローチを示す。マイクロオリフィスの行1と2について示す最初のアプローチでは、島の中央がヒストグラムの相対的最大値1530、1540から同定される。最大値1530、1540は、マイクロオリフィスの各行の中心に一致すると見なされる。島の境界1550、1560は、これらの計算した行の中心の中点と見なされる。あるいは、例えばマイクロオリフィスが行間の所定の空間距離で存在することがわかっている場合は、ヒストグラム最大値1530、1540と所定の行の間隔を考慮して計算（例えば最小二乗適合）して行の中心が生成される。
【０２３３】
図35は、画像データの行3と4についてヒストグラム1520から島の位置を検出する第2の方法を示す。このアプローチでは、粗い島の位置は閾値を試験したヒストグラム1520から生成される。所定のエネルギー閾値1570がヒストグラムに適用され、ヒストグラムが超えるすべての縦の領域が各島に割り当てられる。隣接する領域の境界1590の中点1580は、島の行を分ける線として見なされる。再度マイクロオリフィス間の所定の位置関係（例えばマイクロオリフィスの間隔）がわかっている場合、中点1580の情報が位置情報のより大きな計算に組み込まれて島の位置を同定する。
【０２３４】
図34に戻って、方法1400は同様に画像データから島の列を同定する（ブロック1430）。画像データのセットから方法1400は、画像データの別の軸から取ったシグナル強度の別のヒストグラムを作成する（例えば、横軸）（ブロック1470）。この方法は、ヒストグラムから粗い島の位置を同定し（ブロック1480）、次に島の境界を島の位置の間にマークする（ブロック1490）。
【０２３５】
例示的な画像データ
図36と37は、図35の画像データ例について行った列の同定操作を示す。ある例では、個々の島は所定の列で互いに一致しないことが予測される。すなわち、例えば図33に示すようにジグザグ配置でマイクロオリフィスが位置する場合、または他の配置では、画像データ全体より画像データのサブセットについて個々に列の同定を行うことが適切なことがある。すなわち図36と37は、捕捉した画像データのそれぞれ奇数行と偶数行について行われた列の同定操作を示す。図36は、ヒストグラムの閾値試験を用いる列の同定操作が島の領域を画定することを示す。図37は、列の中心を同定するのにヒストグラムの最大値が使用される列の同定操作を示す。これらの操作は、上記の行の同定と同様に行われる。
【０２３６】
行と列の同定法1420、1430は、画像データ中の島の各行と列の間の分割線を作成する。これらの分割線を使用して、捕捉画像データ中の細胞の各島の境界を画定するボックス（本明細書において「境界ボックス」）を同定する。図36について、分割線1610、1620、1630および1640は、細胞の島1650についての境界ボックスを画定する。各境界ボックスの捕捉画像データは、後述の細かい分析プロセスによりさらに分析される。
【０２３７】
前記方法は、ほとんどすべてのフォーマットの捕捉画像データについて行われる。慣用的には、画像データは白黒の画像データ、グレイスケールの画像データ、またはカラー画像データとして存在する。白黒画像データの場合、代表的には各画素は1ビットの値（0または1）が割り当てられる。グレースケール画像データは代表的には、複数のビット値で各画素を示す（例えば、8ビット値により各画素に256の定量レベルが割り当てられる）。前記ケースのいずれかで、上記のヒストグラムは、画素値を各軸に沿って単に合計することにより作成される。例えばヒストグラムが画像データの縦軸に沿って作成されるなら、合計は、抽出画素の行に沿って行われ、縦軸に沿って特にする位置でヒストグラム値が作成される。
【０２３８】
カラー画像データは典型的には、各画素で各カラー成分について異なる値を含む。すなわち1つの画素は、赤色成分、緑色成分、および青色成分を有する。別の色システムは、輝度カラー成分と一対のクロミナンスカラー成分として画像情報を示す。ヒストグラムは、カラー成分の所定の1つを合計することにより、すべてのカラー成分を合計することにより、または成分から各画素の「エネルギー値」を計算して、計算されたエネルギー値を合計することにより、作成される。
【０２３９】
細かい島の同定プロセスは、上記の粗い同定プロセスに従う。図38は、先の実施態様から記載された境界ボックス（例えば、前記レベルからの境界ボックス）の画像データから島を同定する方法1800を示す。方法1800は、所定の予測距離に従ってサイズを決めた拡大核（dilation kernel）を画定することにより始まる（ボックス1810）。予測距離は、オペレーターが選択する任意の距離であり、同定される島のサイズに関連する。オペレーターは、必要に応じてより大きいまたは小さい同定された島を得るために、任意の時点で予測距離を変更することができる。例えば予測距離は、拡大核の半径または直径を画定してもよい。方法1800はまた、「拡大画像」のデータを初期化する（ボックス1820）。次にこの方法は、境界ボックス中の各画素を検討する。各画素についてこの方法は、その画素に中心のある拡大核内に入る捕捉画像データを検討する（ボックス1830）。拡大核の画像データが、細胞性物質がその中にあることを示すなら、方法1800は、拡大核により占められる画素を拡大画像データ中に入れる（ボックス1840、1850）。次に、またはもし画像データが細胞性物質がその中に無いことを示すなら、方法は次の画素に進む（ボックス1860）。
【０２４０】
方法1800は、捕捉データから第2の画像、拡大画像を作成する。すべての画素が検討されると、生じる画像（拡大画像と呼ぶ）は、1つ以上の拡大された島を含有する。
【０２４１】
ある実施態様では粗い島の取得と細かい島の両方の取得を提供するのに、図34と38の方法が捕捉画像データに連続して適用される。もちろん、他の実施法も可能である。画像が単一のマイクロオリフィスについて行われる試験である場合、島の粗い位置の境界ボックスを同定するのに図34の方法を行う必要は無いであろう。
【０２４２】
ある実施態様では、境界ボックスのすべての画素について方法を繰り返す必要は無い。方法は、各方向の互いの所定の間隔を有する画素を検討する（例えば、1つおきの画素、2つおきの画素など）。方法は、横切る境界ボックスの外の境界上の画素を検討する必要は無い。
【０２４３】
島取得方法1800の前記説明は、予測距離の概念を導入する。一般に予測距離は、同じ「島」の部分として細胞を検討することが適切な任意の2対の細胞の間の分離の最大予測距離に関連する。典型的には予測距離は、行われる生物学的試験から得られ、細胞タイプ、細胞数、試験薬の量と種類、および測定される生物学的性質に影響を与えることが公知の他の因子に依存する。従ってこれはケースバイケースで決定される。
【０２４４】
前記方法のように図38の方法は、種々のタイプの画像データに応用され、種々のレベルの感度で使用される。例えば白黒データでは、白色の画素（1の値を有するもの）は細胞性物質の存在を示す。従って拡大核データが細胞性物質であるかどうかを決定することは、単一の画素が1の値を有するかどうかで肯定的に解答される。同様にグレイスケールでは細胞性物質は、所定の値（例えば、半スケールまたはそれ以上、8ビット単語で127の値）を有する画素について同定される。再度、ある画素の値が閾値を超えるなら、方法はその中に細胞性物質が存在することを示す。カラー画像データについても同様の計算が行われる。細胞性物質は所定の波長で蛍光を発するため、画像データの所定のカラー成分のみを調べて、拡大核中に細胞性物質が存在するかどうかを決定することができる。
【０２４５】
図35〜37は、細胞性物質がマイクロオリフィスに閉じ込められた理想化したデータについての画像処理法の操作を示す。かかる提示は、方法の操作を説明するのに有用であるが、細胞の遊走、拡散、増殖、円形化、または死滅を捕捉する画像データに適用されると最も有用である。図39と40は、細胞性物質が制限無しで遊走できる画像データについての、前記方法の操作を示すスクリーンショットである。図39は、ソースデータの例と図34の方法1400の操作から同定される境界ボックスを示す。図40は、図39のソース画像データから展開される拡大画像データの例を示す。図40はまた、ソース画像データから認識されたかも知れない島を示す。これらは、自体の境界ボックスで囲ってある。
【０２４６】
細胞性物質の島を同定したら、画像取得プロセスは、島のいくつかの独立の測定値を生成し、これは統計的に有用な生物学的情報、およびさらに好ましくは細胞の動き、細胞成長、細胞増殖、細胞円形化、または細胞死滅の1つ以上に関連する情報を提供する。
【０２４７】
さらにマイクロオリフィス中に2つ以上のタイプが沈積する場合、細胞の全集団についてではなく混合細胞タイプの集団内で1つのタイプの細胞に基づいて測定値が計算される。これらの測定値は、マイクロオリフィス内で各タイプの細胞について計算され、次に互いに比較されて関連する生物学的情報を生成することができる。
【０２４８】
例えばマイクロオリフィス中に沈積する前に、各タイプの細胞は、マイクロオリフィス中の各タイプの細胞が区別し同定できるように、適切な標識物、タグ、染色物、または色素で処理される。
かかる情報は、例えば以下を含む：
画素化細胞領域；
拡大細胞面積；
縦および横の長さ；
細胞間の平均最小距離；
細胞間の平均距離；
島の中心周りの前半の極慣性モーメント；
島の中心周りの後半の極慣性モーメント；
細胞領域について標準化した島の中心周りの前半および／または後半の極慣性モーメント；
各測定値を順に考察する。
【０２４９】
画素化細胞領域の計算法はソース画像データから、細胞性物質の存在を示すある島中の画素の数を数える。拡大細胞面積は拡大画像データから、細胞性物質の存在を示す拡大島中の画素の数を数える。縦および横の長さの計算はそれぞれ、細胞性物質の島または拡大島の周りの境界ボックスの高さと幅を示す；これらの大きさは、必要に応じてソース画像データまたは島の拡大画像から取られる。
【０２５０】
この方法はまた、細胞間の平均最小距離および細胞間の平均距離を捕捉する。これらの測定値について、核を同定しこれらの間の距離を計算することが有用かも知れない。例えば細胞は、蛍光性物質以外に核染色剤が適用されてもよい。次に捕捉画像データは蛍光性物質として細胞質のみを捕捉してもよいが、これらはまた、画像内の蛍光から区別できる所定のカラーのみを捕捉してもよい。細胞の2つの画像（最初の画像は蛍光性物質を捕捉し、第2の画像は細胞の核を捕捉する）を捕捉することが有用なことがある。いずれの実施態様でも細胞の核が同定され、捕捉画像内で他のアーチファクトから区別される。
【０２５１】
距離パラメータは、ある島の種々の細胞核の位置を検討する。ある細胞集団内の細胞間の平均距離を計算するために、集団内の各細胞対の核間の距離を合計し、次に合計を集団内のユニークな対の数で割る。画像は異なる集団の細胞を含有してもよく、これは、境界ボックス内の単一の島により画定される細胞の集団、境界ボックス内の2つ以上の島により画定される細胞の集団、または境界ボックスにより画定される細胞の集団を含んでよい。
【０２５２】
細胞間の平均最小距離は、島中のある細胞と他のすべての細胞との距離も検討する。これらの距離の最小値を記録する。このプロセスは、各細胞について1つ、最小距離のセットが同定されるまで、島中のすべての他の細胞について繰り返される。次にこれらの最小距離値を平均して、細胞間の平均最小距離を決定する。
【０２５３】
前半の極慣性モーメントは、島の中心と中心からの細胞性物質の距離とを検討する。これは、島の中心と、この中心からの細胞性物質を示す各画素の測定値の計算を含む。次にこれらの画素のそれぞれの中心からのベクター距離の合計を積分し、島の面積の二乗を掛ける。
【０２５４】
後半の極慣性モーメントはまた、島の中心と、この中心からの細胞性物質を示す各画素の測定値の計算を含む。次に各画素の中心からのベクター距離の自乗の和の積分を適用する。
【０２５５】
前半または後半の極慣性モーメント計算は、ソース画像データまたは島の拡大画像データから行われる。
【０２５６】
さらに前半または後半の極慣性モーメント計算は、島の面積に対して標準化される。ソース画像データが極慣性モーメント計算について使用されるなら、当然島のソース画像面積は標準化のために使用することができる。同様に、慣性計算のために拡大画像データが使用されるなら、標準化のために島の拡大画像面積が使用される。
【０２５７】
上記測定値は、単独でまたは少なくとも1つの他の測定値と一緒に、生物学的に関連する情報、およびさらに好ましくは細胞の動き、細胞成長、細胞増殖、細胞円形化、または細胞死滅に関連する情報を提供することができる。
【０２５８】
例えば画素化した細胞面積の増加は、細胞の拡散および／または増殖を示すことができる。他の例として、画素化した細胞面積の減少は、細胞円形化または細胞死滅を示すことができる。
【０２５９】
拡大細胞面積の増加は、細胞増殖、細胞拡散、または細胞の動きの1つ以上を示すことができる。拡大細胞面積の減少は、細胞の円形化または細胞死滅を示すことができる。
【０２６０】
境界ボックスの横または縦の長さの変化、または細胞間の平均距離の変化、または細胞間の平均最小距離の変化は、細胞運動性、細胞増殖、細胞拡散、細胞の円形化または細胞死滅を示すことができる。
【０２６１】
これら（例えば細胞拡散、細胞円形化など）のそれぞれの相対レベルは、細胞質染色と核染色を組合せることにより容易に測定できる。例えば細胞を核染色物で染色すると、個々の細胞核は、細胞集団内の他の細胞核から区別され、こうして検出した核の数を合計することができる。検出した核の数は、集団中の細胞の数と正比例する。異なる時点で定量すると、経時的に検出される細胞核の数の変化を計算でき、これは、経時的な集団内の細胞数の変化と正比例することができる。細胞質染色とともに使用される核染色は、上記測定値の変化の原因を解明できる可能性がある。例えば、検出される細胞核の数に変化が無く、従って経時的に集団中の細胞の核の数に変化が無いと判定されることができる。測定値の変化（例えば、画素化細胞面積）は主にまたはすべて、細胞増殖または細胞死滅以外のパラメータによると結論できる。
【０２６２】
プレートのスキャンが完了後、画像とデータをシステムの画像見直し、データ見直し、および要約見直し機能を用いて見直すことができる。すべての画像、データ、およびスキャンの設定は、後の見直しのためにシステムのデータベース中に記録される。ユーザーは、対話的画像見直し法でシステムにより分析されたプレートの領域の画像を見直すことができる。カメラが作成したデジタル画像はコンピューター中に保存される。
【０２６３】
ユーザーは、対話式グラフ、測定した特性のデータスプレッドシート、および目的の測定プレートの領域の画像と対話式データ見直し法との組合せを使用してデータを見直すことができる。図41を参照されたい。対話式グラフ（例えばヒストグラムおよび分散プロット）によりデータが分析されるグラフプロット機能が提供される。ユーザーは、各マイクロ領域内のすべての細胞について蓄積されまとめられた要約データを、マイクロ領域対マイクロ領域の対話式グラフを用いて見直すことができる。グラフと画像のハードコピーを広範囲の標準的プリンターで印刷することができる。すべての画像とデータは、保存と検索のためにおよびネットワーク実験室管理情報システムを有するインターフェースのために、システムのデータベース中に保存される。データはまた、結果を表にし他のレポートを作成するために、第3者の統計パッケージに送出することもできる。
【０２６４】
完全なスキャンの最終段階として、測定した特性の1つ以上の統計量についてレポートを作成することができる。多くの統計量について複数のレポートが作成され、印刷されることができる。レポートは印刷する前に配置とデータについて校閲されることができる。
【０２６５】
定義
本明細書で使用される用語と定義は、具体例を説明するためであって本発明を限定するものではない。
【０２６６】
本明細書において用語「白血球」は、好中球、好酸球、好塩基球、単核細胞、およびリンパ球（Ｂ細胞とＴ細胞を含む）、および特に明記しない場合は血小板を意味する。用語「白血球」は、正常血液試料および病態血液試料の両方から得られる白血球を含む。
【０２６７】
用語「白血球遊走カスケード」は、血管の裏層である内皮細胞に沿った白血球の遊走を含む連続的な事象のカスケードを意味する。白血球遊走カスケードは、内皮細胞に沿ったかまたはこれを通過する白血球の捕捉、ローリング、停止、および遊出を含む。
【０２６８】
本明細書において用語「白血球遊走メディエーター」は、血管の裏層である内皮細胞に沿った白血球の遊走を仲介する任意の分子を意味する。「白血球遊走メディエーター」との関係で使用される「仲介する」は、例えば白血球遊走メディエーターのリガンドまたは対受容体への結合により、白血球の遊走に影響を与えることを意味する。特に用語「白血球遊走メディエーター」は、白血球遊走カスケードに関与する任意の分子を意味する。従って白血球遊走メディエーターは、白血球捕捉メディエーター、白血球ローリングメディエーター、白血球停止メディエーター、白血球遊出メディエーター、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０２６９】
本明細書において用語「捕捉」は、内皮細胞に沿った白血球の運動が易流動性の白血球を含有する液体の流れに対して一時的に遅れるように、血管の内皮細胞との白血球のつなぎ止めまたは最初の接触を特徴とする、白血球遊走カスケードの工程を意味する。
【０２７０】
本明細書において用語「白血球捕捉メディエーター」は、血管の内皮細胞上の白血球の捕捉を仲介する白血球遊走メディエーターを意味する。白血球捕捉メディエーターの非限定例はP-セレクチンおよびL-セレクチン結合リガンドである。
【０２７１】
用語「捕捉メディエーター結合パートナー」は、白血球捕捉メディエーターに結合する任意のリガンドまたは対受容体を意味する。捕捉メディエーター結合パートナーの非限定例はPSGL-1またはL-セレクチンである。
【０２７２】
本明細書において用語「ローリング」は、白血球遊走カスケードの1つの工程であり、内皮細胞リガンドまたは対受容体との接着結合を形成および破壊する白血球をさらに特徴とする内皮細胞上の受容体から受容体への、血管の内皮細胞に沿った白血球のころがりを特徴とする。
【０２７３】
本明細書において用語「白血球ローリングメディエーター」は、血管の内皮細胞に沿った白血球のローリングを仲介する白血球遊走メディエーターを意味する。白血球ローリングメディエーターの非限定例はP-セレクチン、E-セレクチン、およびL-セレクチン結合リガンドである。
【０２７４】
本明細書において用語「ローリングメディエーター結合パートナー」は、白血球ローリングメディエーターに結合する任意のリガンドまたは対受容体を意味する。ローリングメディエーター結合パートナーの非限定例はPSGL-1、E-セレクチン結合リガンド、およびL-セレクチンである。
【０２７５】
本明細書において用語「停止」は、血管の内皮細胞への白血球の接着を特徴とする白血球遊走カスケード中の1つの工程を意味する。
【０２７６】
本明細書において用語「白血球停止メディエーター」は、血管の内皮細胞上での白血球の停止を仲介する任意の白血球遊走メディエーターを意味する。停止メディエーターの非限定例は、インテグリン結合リガンド、例えば白血球の表面上で発現されるインテグリンに結合するICAM-1、ICAM-2、およびVCAM-1である。
【０２７７】
本明細書において用語「停止メディエーター結合パートナー」は、白血球停止メディエーターに結合する任意のリガンドまたは対受容体を意味する。停止メディエーター結合パートナーの非限定例は、LFA-1、Mac-1、p150,95、VLA-4およびVLA-5を含むインテグリンである。
【０２７８】
本明細書において用語「遊出」は、血管の内皮細胞間を通過して血管から周りの組織に白血球が出ていくことを特徴とする、白血球遊走カスケードの1つの工程を意味する。
【０２７９】
本明細書において用語「白血球遊出メディエーター」は、血管の内皮細胞を介して白血球の遊出を仲介する任意の白血球遊走メディエーターを意味する。白血球遊出メディエーターの非限定例はPECAM-1およびJAMである。
【０２８０】
本明細書において用語「遊出結合パートナー」は、白血球遊出メディエーターに結合する任意のリガンドまたは対受容体を意味する。
【０２８１】
用語「生理学的せん断流れ」は、正常状態および病的状態下のせん断流れを含む。正常な条件下での生理学的せん断流れ速度は、約0.1〜約20ダイン/cm.2である。
【０２８２】
本明細書において用語「試験薬」は、例えば捕捉、ローリング、停止、または遊出を阻害または促進することにより、白血球遊走を阻害または促進する任意の物質を意味する。
【０２８３】
本明細書において用語「ピッチ」は、装置の試験方向で隣接ウェル間の各縦の中央線の間の距離を意味する。
【０２８４】
本明細書において用語「ウェル領域」は、1つまたは複数のウェルを含む領域を意味する。
【０２８５】
本明細書において用語「ウェル」は、そこに液体を受けることができる任意の空洞を意味する。
【０２８６】
本明細書において用語「チャネル領域」は、その中に1つまたは複数のチャネルを含む領域を意味し、「チャネル」は任意の通路を意味する。
【０２８７】
本発明に関連して「共形接触」は、平面または非平面表面との実質的に液体で緊密なぴったり合う接触を意味し、「可逆的共形接触」は、共形接触を作成するメンバーの構造の完全性が損なわれることなく妨害される共形接触を意味する。
【０２８８】
本発明に関連して装置の「試験方向」は、白血球遊走のモニタリング中の装置の空間的方向を意味する。ある実施態様では白血球遊走のモニタリングに方法で使用される装置の試験方向は、任意の細胞のチャネル領域に沿った遊走経路が実質的に水平の面で起きるような、装置の配向を意味する。別の実施態様では白血球遊走のモニタリング方法で使用される装置の試験方向は、任意の細胞のチャネル領域に沿った遊走経路が実質的に水平の面で起きるような、装置の配向を意味する。
【０２８９】
本発明は一般に、細胞と基層との相互作用をインビトロでモニタリングするための装置と方法を提供する。本発明の装置と方法によりモニターされる細胞タイプの非限定例には、白血球、赤血球、血小板、非血液細胞、および腫瘍細胞がある。細胞と相互作用する基層のタイプの非限定例には、内皮細胞、固定化リガンド、物理吸着接着、およびローリング分子、基底板または基底板模倣物がある。特に本発明は、インビボで炎症応答に関与する事象のカスケードを試験するための、せん断流れの存在下での白血球遊走のインビトロモニタリングのための装置と方法を提供する。本発明はまた、これらの事象を標的とする可能性のある試験薬のハイスループットスクリーニングのための装置と方法を提供する。特に本発明は、内皮細胞上の、これに沿った、またはこれを介する白血球の捕捉、ローリング、停止、および遊出を研究し標的化することに関する（かかる事象はまとめて「白血球遊走カスケード」と呼ぶ）。
【０２９０】
図42〜47に模式的に示すように、装置10は一般に、その中に複数のチャンバー14を画定するハウジング12を含み、例えば図42〜47に記載のチャンバー14の実施態様がある。各チャンバー14は、少なくとも1つの第1ウェル18を含む第1ウェル領域16と少なくとも1つの第2ウェル22を含む第2ウェル領域20を含む。チャンバー14はさらに、第1ウェル領域16と第2ウェル領域20とを互いに連結する少なくとも1つのチャネル26を含むチャネル領域24を含む。図46と47に示すように、複数のチャンバーのそれぞれの第1ウェル領域16と第2ウェル領域20は、標準的マイクロタイタープレートのピッチに一致するように互いに配置される。複数のチャンバーはまた、標準的マイクロタイタープレートのピッチに一致するように互いに配置される。一般に第1ウェル18と第2ウェル22は白血球を含む試料を受けるように改変され、チャネル26は内皮細胞またはその上の白血球遊走メディエーターを受けるように改変され、これに沿った生理学的せん断流れを支持するように作成される。
【０２９１】
本発明のある実施態様では、チャネル26はその中に内皮細胞を配置して含有する。内皮細胞はチャネル26に曝露される前に活性化され、チャネル26への曝露時にその中に基底板の反対の表面にケモカインを固定化している。内皮細胞の付着を補助するために、種々の細胞親和性物質がチャネル26中に配置される。細胞親和性物質は一般に、細胞に対する親和性を有する物質または表面への細胞の付着を促進する物質であり、例えばゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリン、基底板があり、特に限定されないがマトリゲル（登録商標）または他のヒドロゲルがある。
【０２９２】
本発明の別の実施態様ではチャネル26は、その中に配置された少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを含む。好ましくは少なくとも1つの白血球遊走メディエーターは、複数の白血球遊走メディエーターを含む。さらに好ましくは複数の白血球遊走メディエーターは、少なくとも1つの第1の白血球遊走メディエーターと少なくとも1つの第2の白血球遊走メディエーターを含み、ここで少なくとも1つの第1の白血球遊走メディエーターと少なくとも1つの第2の白血球遊走メディエーターは互いに異なる。白血球遊走メディエーターはまた、第1ウェル20から第2ウェル22にむかって上昇する濃度でチャンバー14の縦軸に沿って表面濃度勾配を形成するように、チャネル26中に配置される。
【０２９３】
本発明の別の実施態様では、チャネル26は、ローリングする白血球の表面上のケモカイン受容体と相互作用するように、その中にケモカインを配置して含む。
【０２９４】
本発明はまた、白血球遊走をモニターする方法を企図する。チャネル26がその中に配置された内皮細胞を含有するある実施態様では、白血球を含む試料は第1ウェル18に入れられ（または第2ウェル22）、試料はチャネル26に沿って流され、白血球と内皮細胞との相互作用（相互作用の欠如を含む）が観察され、白血球を含む試料が第2ウェル22（又は第1ウェル18）中に採取され、白血球がチャネル26から出ていく。白血球を含有する試料が第1ウェル18（または第2ウェル22）に加えられる前に、内皮細胞を活性化するために化学誘引物質がチャネル26に加えられることができる。ある実施態様では、試験薬がチャネル26に入れられ、試験薬の存在下での白血球と内皮細胞との相互作用が観察される。
【０２９５】
チャネル26がその中に配置された白血球遊走メディエーターを含有するある実施態様では、白血球を含む試料が第1ウェル18（または第2ウェル22）中に入れられ、試料はチャネル26に沿って流され、白血球と白血球遊走メディエーターとの相互作用（相互作用の欠如を含む）が観察され、白血球を含む試料が第2ウェル22（または第1ウェル18）中に採取され、白血球がチャネル26を出ていく。ある実施態様では、試験薬がチャネル26に入れられ、試験薬の存在下での白血球と白血球遊走メディエーターとの相互作用が観察される。
【０２９６】
装置10または装置10の要素は、業界の標準的マイクロタイタープレートのフットプリントに一致するため、装置10の利点は、同じ装置で複数の測定を同時に行うのに、および種々の試験薬をハイスループットスクリーニングするのに使用されることができることである。図46に示すようにある例では、複数のチャンバー14の各1つの第1ウェル領域16と第2ウェル領域20は、標準的マイクロタイタープレートのピッチに一致するように、互いに配置される。Pを各ウェル18/22の間のピッチとすると、ウェルは、24ウェルマイクロタイタープレート、96ウェルマイクロタイタープレート、384ウェルマイクロタイタープレート、768ウェルマイクロタイタープレート、および1536ウェルマイクロタイタープレートのピッチに一致するように互いに配置される。例えば図46に示すチャンバー14の構成では、ピッチPは約9mmに設定される。好ましくは装置10自体は、業界の標準的マイクロタイタープレートのフットプリントに当てはまる。従って装置10は好ましくは、業界の標準的マイクロタイタープレートと同じ外部寸法と全体サイズを有する。図47に示す例えば装置10の構成では、各ウェル18／22が互いに配置されて、プレートの各ウェルのスペースに一致する各ウェルを有する標準的96ウェルマイクロタイタープレートのピッチに一致するように、装置10は標準的96ウェルプレートのフォーマットで設計される48のチャンバーを含む。この実施態様では、48の実験が行われる。あるいは図47Aに示すように、チャンバー14は標準的マイクロタイタープレートのピッチに一致するように互いに配置される。この代替実施態様では、チャンバー14は標準的マイクロタイタープレートの単一のウェルに通常必要な領域に適合するように、配置される。例えばこの実施態様では、96ウェルマイクロタイタープレート構成のフットプリントで設計された装置10は96個のチャンバーを有し、従って96個の実験を実施することが可能になる。標準的マイクロタイタープレートの正確な寸法と規格に一致することにより、装置10の実施態様は、液体取り扱い、保存、登録および検出の既存のインフラストラクチャに有利に適合する。装置10はまた、ロボットによる液体取り扱いと自動検出およびデータ解析を可能にするため、ハイスループットスクリーニングに誘導し易い。ロボットおよび自動システムの使用はまた、測定を実施し測定結果を解析するための時間を減少させる。さらに自動システムを使用することにより、装置10の使用は、測定の準備と実施およびデータ解析におけるヒトのエラーの発生を減少させる。さらにウェル18／22のサイズのために、装置10のチャンバー12全体のサイズは、マイクロタイタープレートのウェルのサイズに一致し、個々の測定を実施するのに必要な白血球数はわずかに約103〜約106の範囲である。これは、まれな白血球集団（例えば好塩基球またはあるリンパ球サブセット）の研究を可能にする。さらに、これらの物質の白血球遊走への影響をモニターする測定法を実施するために多量の試験薬（例えば白血球遊走のインヒビターや促進剤）が使用されることは必要ではない。
【０２９７】
装置10の構成に基づき本発明はまた、複数の試験薬のスクリーニング法を企図する。この実施態様では、試験薬のスクリーニング法は、複数のチャンバーを画定するハウジングを含む装置を提供する。各チャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結する少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域を含む。ある実施態様では少なくとも1つのチャネルは、その中に配置された少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを含む。別の実施態様では、少なくとも1つのチャネルは、その中に配置された内皮細胞を含む。どちらの実施態様でも、一方の複数のチャンバーの少なくとも1つと他方の複数のチャンバーの各1つの第1ウェル領域と第2ウェル領域とが、標準的マイクロタイタープレートのピッチに一致するように互いに配置される。試験薬をスクリーニングする方法は、さらに、複数のチャネルの各1つのチャネルのそれぞれに白血球を提供し；複数のチャンバーの各1つのチャンネルのそれぞれに複数の試験薬の少なくとも1つを入れ；そして、試験薬の存在下での白血球と内皮細胞との相互作用、または白血球と少なくとも1つの白血球遊走メディエーターとの相互作用を観察することを含む。例えば、試験薬が、捕捉、停止、または遊出した白血球の数に対する影響を有するかどうか、ならびに試験薬が、チャネル26に沿ってローリングする白血球の速度と数に対する影響を有するかどうかを測定することができる。試験薬は、任意の所望の生物学的、化学的、または電気的物質を含有してもよく、特に限定されないが、白血球遊走のインヒビター、白血球遊走の促進剤、または他の治療薬がある。試験薬のさらなる例には、タンパク質、核酸、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ホルモン、酵素、小分子、または薬剤がある。この方法は、複数の試験薬が単一の装置10でスクリーニングされる、薬剤発見の分野で特に有用である。従って、各試験薬互いに異なり、単一の試験薬が各チャネルに入れられることが好ましい。もちろん2つ以上の試験薬の相乗作用があるかどうかを調べるために、試験薬の組合せの作用を試験することが必要なら、複数の試験薬の2つ以上の試験薬を複数のチャンバーのそれぞれの各チャネルに入れても良い。
【０２９８】
本発明の装置はまた、正常なまたは病的生理学的せん断流れ条件下で、白血球遊走カスケードの段階をモニターするのに使用される。正常な生理学的流れ条件とは、非病的状態のせん断流れであって、約0.1ダイン/cm2〜約20ダイン/cm2の範囲である。病的生理学的流れ条件とは、炎症応答中のせん断流れ速度を意味し、一般に疾患状態により変化する。生理学的せん断流れは好ましくは静水圧または微小毛細管作用により発生するが、当該分野で公知の任意の手段により発生することができる。例えば白血球を含有する試料が第1ウェル18を介してチャネル26に導入されるなら、生理学的せん断流れは第2ウェル22に隣接する真空を介して圧力を加えることにより、または第1ウェル18に隣接するシリンジポンプを介して圧力を加えることにより発生させられる。せん断流れは、チャネルの寸法を変えることにより、または真空若しくはシリンジポンプを介して加えられる圧力の程度を変化させることで操作される。
【０２９９】
上記したように装置10の特別な実施態様およびこれらの実施態様の使用法について、チャネル26は内皮細胞をその中に配置するかまたは白血球遊走メディエーターをその中に配置する。内皮細胞はせん断流れの存在下または非存在下でチャネル26上で増殖される。チャネル26が内皮細胞をその中に配置するある実施態様では、白血球遊走カスケードの間の白血球と内皮細胞との相互作用を観察するためにいくつかの異なる測定が行われる。例えばローリングプロセスを研究するために、白血球を含有する試料を、第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入する。次に、ローリングする白血球の数ならびに白血球のローリング速度を測定する。ローリングの阻害を測定する測定法も、チャネル26に例えば白血球と内皮細胞との相互作用を阻止するインヒビターを加えることにより行われる。同様にローリングの増強を測定する測定法は、チャネル26に例えば白血球と内皮細胞との相互作用を促進する促進剤を加えことにより行われる。試験薬はまた、白血球と内皮細胞との相互作用への試験薬の作用を調べるためにチャネル26に加えられる。
【０３００】
停止のプロセスを研究するために、好ましくは内皮細胞を「活性化」するために化学誘引物質をチャネル26に導入する。化学誘引物質は、ICAMやVCAMのようなインテグリン結合リガンドを発現するように内皮細胞を刺激するのに適した任意の分子である。化学誘引物質の非限定例には、IL-1およびTNF-αのようなサイトカインがある。次に白血球を含む試料を、第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26中に導入する。好ましくは白血球を含む試料は、白血球の表面上の停止メディエーター結合パートナー（例えば、インテグリン）の活性化を刺激することができる化学誘引物質とともにプレインキュベートされる。化学誘引物質は、白血球によるインテグリン発現を刺激することができる任意の適当な物質であり、例えばホルミルペプチド、インタークリン、IL-8、GRO/MGSA、NAP2、ENA-78、MCP-1/MCAF、RANTES、I-309、他のペプチド、血小板活性化因子（PAF）、リンホカイン、コラーゲン、フィブリン、およびヒスタミンがある。次に停止した細胞の数が測定される。停止の阻害を測定する測定法も行われることができ、例えば化学誘引物質と白血球または内皮細胞の表面上の化学誘引物質受容体との相互作用を阻止するインヒビター、または白血球停止メディエーターと停止メディエーター結合パートナーとの相互作用を阻止するインヒビターを加えることにより行われる。試験薬はまた、試験薬の存在下で白血球と内皮細胞との相互作用を調べるためにチャネル26に加えられる。
【０３０１】
遊出プロセスを調べる別の例では、内皮細胞の層をチャネル26に入れる。インビボ条件をより厳密にシミュレートする好適な実施態様では、まずチャネル26をフィブロネクチンまたは任意の他の基底膜模倣物の層で被覆した後、内皮細胞をチャネル26に加える。好ましくは内皮細胞はエオタキシンまたはケモカイン（RANTESまたは単核細胞化学誘引タンパク質（MCP-3またはMCP-4）を含む）に曝露した後、白血球を含有する試料を導入する。次に白血球を含む試料は、第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入される。好ましくは白血球は、白血球の表面上の停止メディエーター結合パートナー（例えば、インテグリン）の活性化を刺激することができる化学誘引物質とともにプレインキュベートされる。チャネル26に沿って白血球が流された後、内皮細胞を介して遊出した細胞が計数される。遊出した細胞は、顕微鏡下で平らで色相が暗くなることで特徴付けられる。平らで色相が暗くなった細胞は、顕微鏡を使用して白血球と内皮細胞の焦点面を観察することにより、内皮細胞単層下にあることが確認される。定量点で50％を超える細胞が内皮細胞単層下にあるなら、細胞は遊出したと見なされる。遊出は、遊出細胞の数を計数した総細胞数で割ったものとして表される。内皮細胞の活性化の原因である化学誘引物質に結合する内皮細胞上の受容体を阻止し、次に内皮細胞を介して遊出する細胞の数を測定することにより、遊出の阻害を調べることもできる。試験薬はまた、試験薬の存在下で白血球と内皮細胞との相互作用を調べるために、チャネル26に導入される。
【０３０２】
別の実施態様ではチャネル26に配置された内皮細胞は、分子生物学の公知の方法により改変または修飾される。例えば細胞は、白血球遊走カスケードの原因である種々の白血球遊走メディエーターをコードする特定の遺伝子を過剰発現するように、または発現しないように、修飾される。かかる実施態様は、正確な白血球遊走メディエーターの発現に対する制御を可能にし、白血球遊走カスケードに関与するメディエーターのより自由な操作を可能にする。
【０３０３】
例えば内皮細胞は、白血球遊走カスケードに関与するタンパク質の解明を助けるために、白血球遊走カスケードに関与するタンパク質をコードすると考えられる遺伝子の発現を低下または阻害するように、遺伝的に修飾される。細胞を遺伝的に修飾する方法は当該分野で公知である。このような方法の1つは、Beachらの米国特許第6,025,192号に開示され、複製欠損レトロウイルスベクター、かかるベクターを含むライブラリー、レトロウイルスパッケージ細胞株とともにかかるベクターにより産生されるレトロウイルス粒子、本発明のレトロウイルス粒子から得られる完全なプロウイルス配列、および本発明の完全プロウイルス配列から切り出された環化プロウイルス配列を含む。
【０３０４】
別の非限定例では、内皮細胞は内皮細胞により発現されるタンパク質を遺伝的に修飾するベクターでトランスフェクトされる。哺乳動物細胞をトランスフェクトする種々の方法については、Keownら (1990) Methods in Enzymology 185:527-537を参照されたい。例えば内皮細胞は、試験されるタンパク質の変種を発現するように修飾される。例えばあるタンパク質がカスケードに関与すると考えられるなら、そのタンパク質を発現する遺伝子は変種を発現するように修飾される。次に本発明の装置と測定法を使用して、カスケードの種々の部分に対する変種の作用がモニターされることができる。
【０３０５】
変種は、当該分野で公知の技術を使用して、タンパク質をコードする配列に欠失、付加または置換を作成することにより作成される。ポリペプチドの「変種」は、1つ以上のアミノ酸により改変されるアミノ酸配列として定義される。同様の小さな変更もアミノ酸の欠失又は挿入、あるいはその両方を含むことができる。生物学的または免疫学的活性を除去することなくどのアミノ酸がいかに置換、挿入または欠失されるか調べるための指針は、例えばDNAStarソフトウェアのような当該分野で公知のコンピュータープログラムを使用して見つけることができる。「欠失」とは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較してそれぞれ1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基が欠如したアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化として定義される。「挿入」または「付加」は、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較してそれぞれ1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基が付加されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の変化である。「置換」は、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、異なるアミノ酸またはヌクレオチドにより1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドが置換されることにより生じる。変種は、「保存的」変化を有することがあり、置換アミノ酸は同様の構造的または化学的性質を有し、例えばロイシンがイソロイシンで置換される。さらにまれには変種は「非保存的」変化を有することがあり、例えばグリシンがトリプトファンで置換されるように、置換アミノ酸は同様の構造的または化学的性質を有さない。
【０３０６】
目的のタンパク質の変種を作成する以外に、公知の遺伝子修飾法を使用して、内皮細胞により発現されるタンパク質の発現の低下または阻害を行うことができる。例えばP-セレクチンのような白血球ローリングメディエーターを発現する内皮細胞を遺伝子修飾して、P-セレクチンの発現が、相同的組換え遺伝子「ノックアウト」法（例えば、Capecchi, Nature 344:105 (1990)およびそこに引用されている文献；Kollerら、Science 248:1227-1230 (1990)；Zijlstraら、Nature 342:435-438 (1989)を参照、これらの各々は参照することにより本明細書に組み込まれる；またSenaとZarling, Nat. Genet. 3:365-372 (1993)を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）を使用して低下または阻害されるようになる。標的遺伝子の「ノックアウト」は、標的遺伝子の機能の低下（好ましくは標的遺伝子発現が検出できなくなるか非常に小さくなる）を引き起こす遺伝子の配列の変化を意味する。遺伝子のノックアウトは、遺伝子の機能が実質的に低下しており、その結果タンパク質発現が検出できないかまたは非常に低いレベルであることを意味する。標的遺伝子の「ノックイン」は、例えば標的遺伝子の追加のコピーの導入により、または標的遺伝子の内因性コピーの発現増強を与える制御配列を作動可能に挿入することにより、標的遺伝子の発現の改変または上昇を引き起こす宿主細胞ゲノムの変化を意味する。
【０３０７】
内皮細胞による白血球遊走メディエーターの発現はまた、白血球遊走メディエーターをコードする核酸配列または核酸配列の一部に相補的なアンチセンス核酸配列を内皮細胞に提供することにより、低下または阻害される。核酸配列の発現を阻害するためにアンチセンス核酸配列を使用する方法は当該分野で公知であり、例えばGodsonら、J. Biol. Chem. 268:11946-11950 (1993)（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３０８】
研究されるその白血球遊走メディエーターに対する制御（発現される白血球遊走メディエーターのタイプおよび量に対する制御を含む）を生成する別の実施態様は、少なくとも1つの白血球遊走メディエーターがチャネル26の中に配置されている装置10の実施態様を含む。明瞭にするために本明細書において用語「白血球遊走メディエーター」は、特に明記しない場合は、必ず少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを意味する。白血球遊走メディエーターをチャネル26中に配置することにより、白血球遊走カスケードの基礎となるリガンド／受容体相互作用（このプロセスをさらに理解するためのカスケードの個々の事象を含む）を調べることが可能である。白血球遊走メディエーターをチャネル26中に配置することはまた、白血球遊走カスケードの個々の事象の基礎となるリガンド／受容体相互作用の正確な標的化を可能にする。
【０３０９】
例えばある実施態様では、装置10は白血球の捕捉を調べるために使用される（ここでチャネル26中に配置された白血球遊走メディエーターは白血球捕捉メディエーターを含むことができる）。感染に対する初期免疫応答の結果として、炎症性メディエーターは、内皮細胞表面での接着分子の発現を誘導し、その結果「活性化内皮細胞」を生じる。白血球と活性化内皮細胞との最初の接触は「捕捉」として知られており、捕捉メディエーター、P-セレクチンと捕捉メディエーター結合パートナー、L-セレクチンとを含むと考えられている。P-セレクチンは捕捉プロセスに関与する主要な接着分子であると考えられ、P-セレクチンのその主要な捕捉メディエーター結合パートナー、PSGL-1への結合はこのプロセスに関与すると強く示唆されている。L-セレクチンもまた捕捉に関与すると示唆されているが、内皮細胞上のその正確なリガンドは不明である。従って本発明のこの実施態様では、チャネル26中に配置された白血球捕捉メディエーターは、例えばP-セレクチンおよび／またはL-セレクチン結合リガンドを含有してもよい。
【０３１０】
本発明の別の実施態様では装置10は白血球のローリングを調べるのに使用され、ここで白血球遊走メディエーターは白血球ローリングメディエーターを含むことができる。いったん白血球が捕捉されると、これらは一時的に内皮細胞に接着し、内皮細胞に沿ってローリングし始める。白血球のローリングは、ローリングメディエーター、P-セレクチン；ローリングメディエーター結合パートナー、L-セレクチン；およびローリングメディエーター、E-セレクチンを含むと考えられているが、P-セレクチンがこのプロセスに関与する主要な接着分子であると考えられる。従って本発明のこの実施態様では、チャネル26中に配置された白血球ローリングメディエーターは、例えばP-セレクチン、E-セレクチンおよび／またはL-セレクチンリガンドを含有してもよい。
【０３１１】
本発明の別の実施態様では装置10は白血球の停止を調べるのに使用され、ここで白血球遊走メディエーターは白血球停止メディエーターを含む。すべてではないがほとんどの白血球は、内皮細胞に沿ってローリングした後にのみ内皮細胞に接着すると考えられている。この接着すなわち内皮細胞の上側の表面上の白血球の「停止」は、損傷部位で細胞により産生される化学誘引物質（例えばIL-1およびTNF-α）により開始される。これらの化学誘引物質は内皮細胞を刺激して、ケモカインを産生させ、基底板と反対側の内皮細胞の表面でメディエーターを停止させる。停止メディエーターは例えば、ICAM（ICAM-1、ICAM-2、または／およびICAM-3を含む）およびVCAM（VCAM-1および／またはVCAM-2を含む）のようなインテグリン結合リガンドを含む。ケモカインはローリングする白血球の表面上のケモカイン受容体と相互作用し、これは白血球の表面上の停止メディエーター結合パートナーの活性化を刺激する。停止メディエーター結合パートナーには、インテグリン（例えばIFA-1、Mac-1、およびp150,95およびVLA-4）がある。これらの停止メディエーター結合パートナーの活性化は、ゆっくりローリングする白血球を「停止」させ、内皮細胞上の停止メディエーター（例えばICAM-1、VCAM-1および他のインテグリン結合リガンド、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、およびフィブリノゲン）に強く結合させる。従って本発明のこの実施態様では、チャネル26中に配置された白血球停止メディエーターは、少なくとも1つのインテグリン結合リガンドを含有してもよい。
【０３１２】
本発明のさらに別の実施態様では装置10は白血球の遊出を調べるのに使用され、ここでチャネル26中に配置された白血球遊走メディエーターは白血球遊出メディエーターを含む。いったん内皮細胞に結合すると、白血球は平らになり内皮細胞の間に入り込んで血管を離れ、損傷組織に入る。白血球は、損傷組織領域中の細胞により放出される化学誘引物質の化学走化性勾配に従う。遊出については不明のことが多いが、遊出は血小板と内皮細胞接着分子-1（PECAM-1）により仲介されると考えられている。他の遊出メディエーター候補は、タイトジャンクション接着分子（JAM）、ICAM-1、E-カドヘリン、LFA-1、IAP、VLA-4、およびおそらくCD99（膜貫通タンパク質）であろう。従って本発明のこの実施態様では、チャネル26中に配置された白血球遊出メディエーターは、少なくとも1つの前記接着分子または遊出に関与すると確定されている任意の他の分子を含有してもよい。
【０３１３】
本発明の装置10は、白血球遊走カスケードの前記各工程を単独で、または白血球遊走カスケードの2つ以上の工程と組合せて、あるいは白血球遊走カスケード全体を研究するのに使用されることができる。例えばローリングを理解し標的としたいなら、白血球ローリングメディエーターのみがチャネル26中に配置される。白血球のローリングと停止の両方を研究したいなら、ローリングメディエーターと停止メディエーターの両方がチャネル26中に配置される。もし全白血球遊走カスケードを調べたいなら、捕捉メディエーター、ローリングメディエーター、停止メディエーター、および遊出メディエーターがチャネル26中に配置される。いくつかの分子は遊走メディエーターの2つ以上の分類に属する（例えば、P-セレクチンと内皮細胞リガンド結合L-セレクチンは捕捉メディエーターとしてもローリングメディエーターとしても機能する）ため、およびいくつかのメディエーターは一緒に存在することがある（例えば、自由流動性の白血球からの直接接着は極めてまれであると考えられるため、停止を研究するためにはローリングメディエーターと停止メディエーターの両方がチャネル26中に存在しなければならない）ため、現在入手できる情報では、いくつかの工程は単独にモニターできないかも知れない。炎症性応答中に起きるカスケード事象の具体的な詳細については不明なことが多いため、本発明は、これらの事象を制御する基礎的機構をさらに理解するために、白血球遊走をモニターするいくつかの方法を企図する。
【０３１４】
例えば捕捉プロセスを研究するために、捕捉メディエーターを含む白血球遊走メディエーターがチャネル26中に配置される。白血球を含む試料が、第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26中に導入される。捕捉事象は、捕捉メディエーターを含有するチャネル26の表面に最も近い自由流動性の白血球の接着性相互作用として定義され、従ってこれらは、チャネル26上の捕捉メディエーターと相互作用できる可能性のある唯一の白血球である。異なるタイプの初期白血球捕捉が性状解析、観察、およびモニターされる。例えばローリング運動を開始せずにチャネル26に短時間付着するのみの白血球を含む一過性捕捉、およびチャネル26上でローリングを続ける白血球を含むローリング捕捉を、調べることができる。捕捉白血球の各タイプの数を自由流動性の白血球の総数で割って、白血球の初期捕捉の頻度を決定する。
【０３１５】
白血球はまた、当該分野で公知の任意の方法により、および「試験装置とその作成方法」という標題の同時係属出願（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示された方法により観察することもできる。簡単に説明すると白血球は、顕微鏡（位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、微分干渉顕微鏡、暗視野顕微鏡、共焦点レーザースキャニング顕微鏡、デジタルデコンボルーション、およびビデオ顕微鏡を含む）；高速ビデオカメラ；多数の個々のセンサーを使用して観察される。例えばデジタルムービーカメラは、連続流条件下で白血球活性をモニターするのに使用され、特定の時点で静止写真画像を得るのにカメラが使用される。かかる観察は、白血球により発現される捕捉メディエーター結合パートナーと内皮細胞により発現される捕捉メディエーターとの相互作用を明らかにする。かかる相互作用を検出するために細胞は染色剤とともにインキュベートされ、次に適当な顕微鏡法を使用してカラーまたは強度のコントラストに基づいて検出される。あるいは蛍光標識を使用して、捕捉メディエーター結合パートナーが捕捉メディエーターに結合するかどうかを検出してもよい。
【０３１６】
別の実施態様では、遊走をモニターするのに非標識細胞が使用されることができる。例えば複数のタイプの細胞の不均一混合物を、チャネル26中の捕捉メディエーターと相互作用できる1つのタイプのみの細胞を有するチャネル26に導入する。細胞がチャネル26に導入された後、この細胞タイプの表面の任意の抗原に特異的な抗体を使用してこのタイプの細胞を標識することができる。複数のタイプの細胞が捕捉メディエーターと相互作用するなら、特定の蛍光物質で標識した抗体を使用して異なるタイプの細胞を区別することができる。
【０３１７】
ローリングプロセスの試験に関する別の実施態様では、ローリングメディエーターを含む白血球遊走メディエーターがチャネル26中に入れられる。白血球を含む試料が第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入される。ローリングする白血球の数および白血球のローリング速度を測定することができる。ある実施態様では装置10にカメラを機能できる形で結合させて、所定の時間にわたってチャネル26に沿ってローリングする白血球の画像を得る。この実施態様では、細胞のローリング速度は、カメラにより得られた画像中の細胞が移動した長さ（lフレーム）を測定し、画像の露出時間（t露出）を測定する。ローリング速度（V）を決定するために以下の式が使用される：
V＝c（lフレーム／t露出）（ここでcは、細胞が移動した実際の距離を決定するための変換因子である。これは画像毎に変わる）。
【０３１８】
別の実施態様では、異なるタイプの細胞に関連するローリング速度を解析し比較するために、異なるタイプの白血球を含むいくつかの異なる測定が行われる。ある実施態様では、異なるローリングメディエーターに関連する細胞のローリング速度を解析し比較するために、異なるローリングメディエーターを使用するいくつかの異なる測定が行われる。
【０３１９】
停止プロセスの試験に関する別の実施態様では、第1の白血球遊走メディエーターと第2の白血球遊走メディエーターとを含む白血球遊走メディエーター（第1の白血球遊走メディエーターと第2の白血球遊走メディエーターは互いに異なる）が使用される。明瞭にするために本明細書において用語「第1の白血球遊走メディエーター」は少なくとも1つの第1の白血球遊走メディエーターを意味し、本明細書において用語「第2の白血球遊走メディエーター」は少なくとも1つの第2の白血球遊走メディエーターを必ず意味する。この実施態様では、ローリングメディエーターを含む第1の白血球遊走メディエーターと停止メディエーターを含む第2の白血球遊走メディエーターが、チャネル26中に入れられる。白血球を含む液体試料は、白血球の表面上の停止メディエーター結合パートナー（例えばインテグリン）の活性化を刺激することができる化学誘引物質とともにプレインキュベートする。化学誘引物質は、白血球によるインテグリン発現を刺激することができる任意の適当な物質であり、例えばホルミルペプチド、インタークリン、IL-8、GRO/MGSA、NAP-2、ENA-78、MCP-1/MCAF、RANTES、I-309、他のペプチド、血小板活性化因子（PAF）、リンホカイン、コラーゲン、フィブリン、およびヒスタミンがある。次に停止した細胞の数が測定され、ローリングメディエーターのみで行われた測定法に似た測定を行うことができる。
【０３２０】
白血球遊走カスケード（特に白血球と内皮細胞上のその対受容体との相互作用）の基礎となっている生物学的影響をさらに理解するために、装置10を使用して白血球遊走カスケードに対する種々の試験薬の作用を分析する。これらの試験薬は、任意の生物学的、化学的または電気的物質を含有し、これらには、特に限定されないが、白血球遊走メディエーターのインヒビター候補または白血球遊走メディエーターにより仲介される遊走の促進剤候補がある。かかる試験薬のさらなる例には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、ホルモン、脂質、炭水化物、小分子、および薬剤がある。例えば装置を使用して、捕捉メディエーターと捕捉メディエーター結合パートナー相互作用；ローリングメディエーターとローリングメディエーター結合パートナー相互作用；停止メディエーターと停止メディエーター結合パートナー相互作用；および／または遊出メディエーターと遊出メディエーター結合パートナー相互作用を、競合的または非競合的に阻害または促進するインヒビターまたは促進剤を同定してもよい。前記したように、好ましくは白血球遊走メディエーターは第1の白血球遊走メディエーターと第2の白血球遊走メディエーターとを含み、第1の白血球遊走メディエーターと第2の白血球遊走メディエーターは互いに異なる。従ってある実施態様では試験薬は、第1の白血球遊走メディエーター、第2の白血球遊走メディエーター、またはその両方のインヒビター候補を含む。別の実施態様では、試験薬は、第1の白血球遊走メディエーター、第2の白血球遊走メディエーター、またはその両方により仲介される遊走の促進剤候補を含む。白血球遊走カスケードのインヒビターおよび促進剤を同定した後、これらのインヒビターと促進剤はインビボでの効力について試験され、そして最終的には治療薬として利用される。
【０３２１】
捕捉のインヒビター候補である試験薬をスクリーニングするために、捕捉メディエーターを含む白血球遊走メディエーターをチャネル26に配置する。阻害性試験薬候補を白血球を含む液体試料とインキュベート後、試料を第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入する。捕捉事象は、捕捉メディエーターを含有するチャネル26の表面に最も近い自由流動性の白血球の接着性相互作用として定義され、従ってこれらは、チャネル26上の捕捉メディエーターと相互作用できる可能性のある唯一の白血球である。異なるタイプの初期白血球捕捉が性状解析、観察、およびモニターされる。例えばローリング運動を開始せずにチャネル26に短時間付着するのみの白血球を含む一過性捕捉、およびチャネル26上でローリングを続ける白血球を含むローリング捕捉を、調べることができる。捕捉白血球の各タイプの数を自由流動性の白血球の総数で割って、阻害性試験薬候補とインキュベートした初期白血球捕捉の頻度を決定することができ、この頻度は、阻害性試験薬候補の非存在下での初期白血球捕捉の頻度と比較することができる。初期白血球捕捉の頻度は、試験薬の非存在下での初期白血球捕捉の頻度と比較して、試験薬の存在下ではより低く、従って試験薬は白血球捕捉のインヒビターである可能性がある。
【０３２２】
ローリングのインヒビター候補である試験薬をスクリーニングするために、ローリングメディエーターを含む白血球遊走メディエーターをチャネル26に配置する。阻害性試験薬候補を白血球を含む流体試料とインキュベート後、試料を第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入する。あるいは白血球がローリングを始めた時、チャネル26中の流体試料の通過中に阻害性試験薬候補を流体試料に導入する。試験薬の非存在下で観察されるローリングと比較して試験薬の存在下でのローリングの低下（その速度の低下、容量当たりのローリングする白血球の数の減少により測定される）は、その分子が捕捉および／またはローリングのインヒビターであることを示す。
【０３２３】
停止の阻害性試験薬候補を試験するために、第1の白血球遊走メディエーターと第2の白血球遊走メディエーターとを含む白血球遊走メディエーター（第1の白血球遊走メディエーターと第2の白血球遊走メディエーターは互いに異なる）が使用されることができる。ある実施態様では、ローリングメディエーターを含む第1の白血球遊走メディエーターと停止メディエーターを含む第2の白血球遊走メディエーターがチャネル26に入れられる。白血球を含む流体試料を、白血球の表面上の停止メディエーター結合パートナー（例えばインテグリン）の活性化を刺激することができる化学誘引物質とともにプレインキュベートする。流体試料を阻害性試験薬候補とプレインキュベートした後、第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入する。あるいは白血球がローリングを始めた時、チャネル26中の流体試料の通過中に阻害性試験薬候補を流体試料に導入する。試験薬の非存在下で観察されるローリングと比較して試験薬の存在下でのローリングの低下（停止される白血球のパーセントの低下、または容量当たりの停止白血球の数の減少により測定される）は、その分子が捕捉および／またはローリングのインヒビターであることを示す。
【０３２４】
試験薬が、白血球遊走カスケードの効力上昇させることによりまたはその機能性成分（例えば、捕捉メディエーター、ローリングメディエーター、停止メディエーター、または遊出メディエーター）として作用することにより、炎症性応答の促進剤として作用するかどうかを同定するのに、装置10を使用することもできる。かかる機能性成分は、かかる活性が欠如している白血球（チャンバー14のチャネル26に以前存在したローリングメディエーターまたは停止メディエーターの適切な細胞特異性の欠如のために、またはローリングメディエーターまたは停止メディエーターの欠如のために）の捕捉、ローリング、停止、または遊出を促進する能力により検出される。例えば、チャネル26に配置された、ローリングメディエーターを含む第1の白血球遊走メディエーターと停止メディエーターを含む第2の白血球遊走メディエーターを含む装置10を使用して、白血球遊走中に機能する停止メディエーターを同定してもよい。さらにチャネル26に配置された停止メディエーターおよび／またはローリングメディエーターを含む装置10は、白血球遊走中に機能するローリングメディエーターを同定することもできる。
【０３２５】
停止メディエーターを同定するために、ローリングメディエーターは、第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入される流体試料中の白血球の表面上に存在するローリング結合パートナーを有するチャネル26中に配置される。停止メディエーター結合パートナーを発現するように白血球を活性化することができる1つ以上の化学誘引物質は、白血球を含む流体試料とプレインキュベートされる。停止仲介機能について試験すべき試験薬は、チャネル26中に配置される。白血球を含む流体試料を第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入され、試料がチャネル26に停止した後、白血球がチャネル26上で停止したかどうかを測定する。白血球の停止は、試験薬が、ローリングメディエーター結合パートナーを発現する同じ白血球の表面上の停止メディエーター結合パートナーを認識する停止メディエーターであることを示す。
【０３２６】
ローリングメディエーターを同定するために、ローリングメディエーター機能について試験される試験薬はチャネル26に配置され、白血球を含む流体試料は第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入され、試料はチャネル26に沿って流される。チャネル26に沿った白血球のローリングは、試験薬がローリングメディエーター機能を有すること、および白血球がローリングメディエーターの結合パートナーを発現することを示す。ローリングメディエーターはまた、ローリングメディエーター機能について試験される試験薬をチャネル26に配置し、かつまた停止メディエーターをチャネル26に配置することにより同定される。停止メディエーター結合パートナー（例えばインテグリン）を発現するように白血球を活性化することができる1つ以上の化学誘引物質は、白血球を含む流体試料とプレインキュベートされる。白血球を含む流体試料は第1ウェル18または第2ウェル22を介してチャネル26に導入され、試料はチャネル26に沿って流される。白血球の停止は、試験薬がローリングメディエーター機能を有し、ローリングメディエーター結合パートナーと化学誘引物質を発現する白血球が、試験薬の結合パートナーも発現することを示す。
【０３２７】
試験薬はまた、ローリングまたは停止している白血球の数または割合の増加が、試験薬の非存在下でのかかる白血球の数または割合と比較して検出される上記方法により、白血球ローリングまたはローリングと停止プロセス中の機能性成分としてあるいはそのエンハンサーとして同定されることができる。白血球の遊走は、当該分野で公知の任意の方法により、および上記の「試験装置とその作成方法」という標題の同時係属出願に開示された方法により観察、モニター、記録、および分析することができる。
【０３２８】
本発明はまた、上記測定を実施するためのキットも提供する。例えばキットは、複数のチャンバー14を画定するハウジング12を含む装置を含む。複数のチャンバー14のそれぞれは、少なくとも1つの第1ウェル18を含む第1ウェル領域16；少なくとも1つの第2ウェル22を含む第2ウェル領域20；および第1ウェル領域16と第2ウェル領域20を互いに連結する少なくとも1つのチャネル26を含むチャネル領域24を含む。複数のチャンバー14のそれぞれの第1ウェル領域16と第2ウェル領域20は、標準的マイクロタイタープレートのピッチに一致するように互いに配置され、従って試験薬のハイスループットスクリーニングを有利に可能にする。キットはさらに、第1の白血球遊走メディエーターを含む。キットはまた、白血球を含む試料を含有する。第1の白血球遊走メディエーターと白血球を含む試料は、キット中で当該分野で公知の任意の方法でパッケージ化される。例えば第1の白血球遊走メディエーターはバイアルまたは容器に含有され、白血球を含む試料も同様に別のバイアルまたは容器に含有される。キットはさらに、第1の白血球遊走メディエーターとは異なる第2の白血球遊走メディエーターを含む。キットはさらに、第1の白血球遊走メディエーター、第2の白血球遊走メディエーター、またはこれらの両方により仲介される遊走を促進するように改変した促進剤を含む。キットはまた、装置でおよび具体的な測定法で使用するのに必要な任意の媒体と緩衝液を含む。
【０３２９】
好ましくは例えば図42と47に示されるように装置10の具体的な詳細について、装置10のハウジング12は支持体メンバー28および支持体メンバー28に取り付けられた上部メンバー30を含み、支持体メンバー28と上部メンバー30は、これらが一緒に複数のチャンバー14を画定するように構成される。好ましくはハウジングはまた、標準的マイクロタイタープレート、例えば24ウェルマイクロタイタープレート、96ウェルマイクロタイタープレート、384ウェルマイクロタイタープレート、768ウェルマイクロタイタープレート、および1536ウェルマイクロタイタープレートの寸法に一致するようにサイズを調整される。上部メンバーは当該分野で公知の任意の適当な材料（ガラス、プラスチック、またはポリジメチルシロキサン（PDMS）のようなエラストマー材料を含む）で作成される。支持体メンバーは、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、PDMSおよび他のプラスチックから作成される。好ましくは上部メンバー30は、支持体メンバー28と共形接触している。
【０３３０】
本発明の別の実施態様では、装置10は支持体メンバー28；および上部メンバー30を含み、上部メンバー30は支持体メンバー28との共形接触により支持体メンバー28に取り付けられている。支持体メンバー28と上部メンバー30は、これらが一緒に少なくとも1つのチャンバー14を画定するように構成される。少なくとも1つのチャンバー14は、少なくとも1つの第1ウェル18を含む第1ウェル領域R16、少なくとも1つの第2ウェル22を含む第2ウェル領域20；および第1ウェル領域16と第2ウェル領域20を互いに連結する少なくとも1つのチャネル26を含むチャネル領域24を含む。ある実施態様では、少なくとも1つのチャネル26は、その中に配置された少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを含む。別の実施態様では、少なくとも1つのチャネル26はその中に配置された内皮細胞を含む。好ましくは上部メンバー30は、支持体メンバー28と可逆的な共形接触にあるように構成される。従って上部メンバー30は支持体メンバー28と共形接触、好ましくは可逆的な共形接触をするように改変されることが好ましい。この実施態様では、特にかかる材料の柔軟性が、実質的に液体で緊密な密封を形成するように、上部メンバー30が支持体メンバー28に形が一致するように接着することを可能にする。共形接触は、支持体メンバー28の上の上部メンバー30が滑らないように充分強固でなければならない。共形接触が可逆的な場合、上部メンバー30は、上部メンバー30が簡単な剥がし操作により除去できるような構造完全性を有する材料で作成される。これは、実験後に上部メンバー30を支持体メンバー28から除去し、正しく洗浄し、次に将来の測定で再使用することを可能にするであろう。好ましくは剥がしプロセスは、支持体メンバー28上の表面処理（例えば白血球遊走メディエーターまたは内皮細胞）を損傷しない。さらに上部メンバー30と支持体メンバー28との共形接触のために上部メンバー30と支持体メンバー28との間で形成される実質的に液体で緊密な密封は、液体があるチャンバーから隣接チャンバーに洩れるのを防ぎ、また汚染物質がウェルに入ることを防ぐ。密封は好ましくは、外部圧力を維持する必要無く、実質的に即時に生成する。共形接触は、上部メンバー30を支持体メンバー28に密封するための密封剤を使用することを不要とする。本発明の実施態様は密封剤の使用を包含するが、好適な実施態様ではかかる使用が不要であるという事実は、コストと時間のかからない代替法を提供し、さらに各チャンバー14が密封剤で汚染されるリスクを排除する。好ましくは上部メンバー30は、分解しない材料で作成され、試験で何度も使用されても容易に損傷されず、これはその製造中に上部メンバーの作成に大きな多様性を与える。さらに好ましくは材料は、フォトリソグラフィーを使用して上部メンバー30を作成することを可能にするように選択されることができる。好適な実施態様では、材料は、シリコーン、天然ゴムまたは合成ゴム、またはポリウレタンのようなエラストマーを含む。より好適な実施態様では、材料はPDMSである。支持体メンバー28は、上部メンバー30がのることができる支持体を提供し、この機能に適した任意の材料で作成される。適当な材料は当該分野で公知であり、例えばガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、PMMA、ポリアクリレート、PDMS、および他のプラスチックがある。
【０３３１】
ある実施態様ではチャンバー14の部分について、ウェル領域16と20は装置10の試験配置で互いに縦に並置される。好適な実施態様ではウェル領域16と20は装置10の試験配置で互いに横に並置される。各チャンバー14の各ウェル領域16と20のウェル18と22は、その構成が特定の3次元の形に限定されず、その中に液体（好ましくは白血球を含む試料）を受けるように改変することのみが必要である。好ましくはウェル18と22は、図42〜47の例に示すように、これらが平面図で実質的に円形を画定するように構成される。しかし、当業者が容易に認識できるように、あるウェルの平面図における他の形も本発明の範囲内である。ウェルがその平面図で円形を画定する場合、および標準的96ウェルマイクロタイタープレートのピッチに一致するようにウェル領域が互いに配置される場合、ピッチPは約9mmに等しくなるように設定され、ウェルの平面図の形の直径Dwは約6mmに等しくなるように設定される。かかるケースにおいて各チャネル26の長さＬは約3mmに等しい。特に図43に示すように、ウェル18と22は一部は上部メンバー30中の各貫通孔18と22により画定され、一部支持体メンバー28の上部表面Ｕにより画定される。特に各ウェル18と22の側面は、上部メンバー30中の貫通孔18と22の各壁により画定され、ウェル18と22の底は、支持体メンバー28の上部表面Ｕの対応する部分により画定される。
【０３３２】
図43〜45にまとめて見られるようにチャンバー12のチャネル領域24について、チャネル26の長さＬは、その長軸方向に画定される。さらにチャネル26の深さＤは、ハウジング12の上部表面に直角な方向で画定され；チャネル領域26の幅Ｗは長さＬと深さＤに直角な方向で画定される。好ましくはチャネル領域24は、ウェル領域16と20の間で延びる複数の直線平行チャネル26を含む。好ましくはチャネル26は、図45に略図で示すように、実質的に同じ長さＬを有する。さらに好ましくは複数のチャネル26は、8個のチャネルを有する。複数のチャネルを使用することにより、白血球を含む1つの試料を使用して複数の測定を同時に行うことができる。かかる実施態様では、すべての測定は均一な一定の条件下で行われ、従って統計的により正確な結果を与える。チャネル26は好ましくはそれぞれ、幅Ｗが50 :m〜5mm；長さＬが約1〜10mm；および高さHが約10〜100:mを有する。さらに好ましくはチャネル26はそれぞれ、幅Ｗが約100ミクロン、長さＬが約3mm、および高さが約50:m〜約80:mを有する。チャネル領域24のチャネル26の大きさは、炎症性応答中の遊走をシミュレートする条件下で白血球の遊走を支持するように構成される。従ってチャネル領域は、せん断流れ下で白血球の遊走を支持し、その中に配置された少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを支持するように改変される。図42〜47に関連して記載される装置10の実施態様は単に例示のためであり、種々の他の構成が本発明の範囲内であることに注意されたい。装置10の構成のための他の例が、上記の「試験装置とその作成方法」という標題の同時係属出願に提供される。
【０３３３】
本発明の装置10は、標準的フォトリソグラフィー法により、本発明の方法の好適な実施態様に従って作成することができる。フォトリソグラフィー法は、上部メンバー30の所望の構成のネガ画像であるマスターを作成するために使用することができる。例えばチャンバー14の寸法、例えばウェル領域16と18のサイズ、またはチャネル領域24の長さは、有利な規格に適合するように改変することができる。マスターの適当なデザインがいったん選択され、このようなデザインに従ってマスターが作成されると、上部メンバー30の材料はマスターにスピンキャスト、射出、または注入され、硬化される。いったん鋳型が形成されると、このプロセスは必要なだけ繰り返される。このプロセスは上部メンバーのデザインの大きな柔軟性を与えるのみではなく、上部メンバーが大規模に複製されることを可能にする。
【０３３４】
いったん装置が作成されると、白血球遊走メディエーターはチャネル26中に沈積することができる。メディエーターが上部表面Ｕにより流れる白血球にアクセスできる限りは、白血球遊走メディエーターは、これらを支持体メンバー28の上部表面Ｕの上に固着することによりまたは直接生理学的吸着することにより、あるいは白血球遊走メディエーターを含む溶液または懸濁物を支持体メンバー28の上部表面Ｕの上に被覆することにより、チャネル26中に配置することができる。ある実施態様では白血球遊走メディエーターは、アミドを介する共有結合、エステルまたは側鎖結合あるいは吸着のような方法により、上部表面Ｕに直接共有結合的または非共有結合的に固着される。白血球遊走メディエーターを配置させる他の方法（支持体メンバー28の上部表面Ｕの上にこれらを固定化することを含む）は、上記の「試験装置とその作成方法」という標題の同時係属出願に開示されている。
【０３３５】
本発明はまた、ハウジング12；ハウジング12中で複数のチャンバー14を画定するハウジングに関連した手段を提供する。複数のチャンバー14のそれぞれは、白血球を含む試料を受ける入口手段：入口手段から白血球を含む試料を受けるための入口手段と流体連通している出口手段；および入口手段と出口手段を互いに連結する連結手段（連結手段はその中に配置された少なくとも1つの白血球遊走メディエーターを含む）を含む。ハウジング中で複数のチャンバーを画定するハウジングに関連した手段の例は、図47に示すように支持体メンバーに取り付けられた上部メンバーを含む。上記手段は、図42〜47の実施態様について実質的に証明および記載されている。他のかかる手段は、当業者の知識の範囲内である。
【０３３６】
本出願を通して、種々の刊行物、特許、および特許出願が参照される。これらの刊行物、特許、および特許出願の教示と開示は、本発明に関連する分野の現状をより詳細に説明するために、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３７】
ある実施態様では本発明は、勾配形成および／または流れ条件に依存するかまたは反応する生物学的現象を測定および研究するための方法を提供する。かかる生物学的現象は、例えば白血球接着とローリング中に起きているような細胞−表面相互作用のような体内のプロセスの多くを含む。さらに化学走化性、接触走性および細胞の遊走を含む研究は、勾配および／または流れ条件の存在下でかかる細胞の動きを研究できる測定法により、よりよく行われるであろう。
【０３３８】
生物学的システムの研究には種々のタイプの勾配が有用である。かかる有用な勾配には、静的勾配があり、これは固定または設定されているかまたは実質的に固定または設定されている濃度を有する。静的勾配の1つの例は、表面上に固定化された分子の勾配である。静的勾配の非限定例は、異なる濃度の固定化生物学的分子（タンパク質、抗体、核酸などを含む）または固定化化学成分（薬剤および小分子）の使用を含む。他の有用な勾配には動的勾配があり、これは変化してもよい濃度を有する。動的勾配の1つの例は、変化する濃度で分子を有する液体の流れの勾配である。液体勾配の非限定例には、変化する濃度の生物学的分子（例えば、増殖因子、毒素、酵素、タンパク質、抗体、炭水化物、薬剤または他の化学物質および小分子）を含有する液体流れの使用がある。
【０３３９】
本発明のある実施態様において、動的／溶液ベースの勾配は層流法により作成される。層流技術は典型的には、2つ以上の異なる供給源からの2つ以上の液体流を含む。これらの液体の流れは一緒にされて単一の流れとなり、乱流混合せずに互いに平行に流れるようにされる。異なる特性を有する液体（例えば変化する低レイノルズ数）は並んで流れ、乱流が無いと混合しない。これらの液体は混合しないため、これらは偽チャネルを形成する（液体間に物理的分離が無いという事実のために偽）。溶液と表面勾配の作成は、米国特許出願第2002/0113095号、および論文 Jeon, Noo Liら、Langumuir, 16, 8311-8316 (2000)で考察されている。これらの文献の両方とも参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３４０】
これらの文献において毛細管の微小流体ネットワークを介する勾配を作成するために、PDMS微小流体装置が使用された。異なる化学物質を含有する溶液を、3つの別個の入り口に導入し、毛細管のネットワーク中を流させた。液体流を繰り返し組合せ、混合し、分離することにより、分岐チャネルのそれぞれに明確な組成物を有する明確な混合物が得られた。すべての分岐を一緒にして、流れ方向に垂直な出口チャネルを横断する濃度勾配を確立した。図54を参照されたい。
【０３４１】
本発明の装置を動的勾配の形成と組合せて、装置の任意の部分を改変することにより膨大な数の測定パラメータを生成することができる。例えば開示された装置を細胞パターン化法を組合せることにより、動的勾配の導入とともに、無数の生物学的相互作用を試験するための種々の条件を作成することができる。さらに多くの細胞や生物学的材料は、インビボで存在して勾配や流れ条件に曝露されている時と比較して、勾配に曝露されていない時は、エクスビボで異なる挙動をするため、装置と測定法は薬物発見と薬物試験に有用であることができる。
【０３４２】
従って本発明の実施態様では、細胞はチャネルによりパターン化される。細胞パターン化は当該分野で公知の方法および本明細書に開示の方法（例えば特に限定されないが、ミクロ接触印刷またはエラストマーステンシルの使用）により行われる。次に所望の生物学的分子または化学物質／薬剤を含有する溶液は、パターン化細胞に流すことができる。さらに細胞は、まずアクチベーターのような生物学的分子により処理して生物学的システムをより近く再生し、次に化学物質または薬剤に曝露することができる。勾配（例えば層流）を作成することにより、異なる量の生物学的分子または化学物質／薬剤をパターン化細胞に与え、各生物学的分子または化学物質／薬剤を同時に互いに試験することができる。これは同時比較により、測定条件の変動を低減させることができる。
【０３４３】
本発明の装置と組合せて層流を有する動的勾配を作成すると、無数の測定法の構成が得られる。例えば表面上の細胞、チャネル中の生物学的分子、およびチャネル中の化合物の組合せを変えることにより、非常に多数の測定法を作成することができる。
【０３４４】
固定化細胞または他の固定化生物学的分子（例えば、タンパク質、抗体、核酸など）について、異なる測定構成が可能である。ある実施態様では1つのタイプの細胞が全チャネル領域に固定化される。別の実施態様では、細胞タイプの混合物が1つの領域に1つのタイプの細胞で固定化される。別の実施態様では、細胞タイプの混合物が全チャネル領域に固定化される。これは、細胞−細胞相互作用をモニターするのに有利である。さらに別の実施態様では、異なるタイプの細胞がそれぞれ異なる領域に固定化される。
【０３４５】
種々の固定化法以外に、チャネル中に存在する生物学的分子の周りにさらなる測定法設計の柔軟性がある。例えばある実施態様では、各チャネル中に同じ濃度で1つのタイプの生物学的分子が存在する。別の実施態様では、1つのタイプの生物学的分子が各チャネルに異なる濃度で存在する。別の実施態様では、異なる生物学的分子が各チャネルに存在する。別の実施態様では、各チャネルに生物学的分子の混合物がある。各チャネルは同じ混合物または異なる混合物を有してもよい。混合物が同じである場合、異なる生物学的分子の比または濃度は各チャネルで異なってよい。
【０３４６】
同様に薬剤または試験物質のような化合物について、本発明は測定法設計の柔軟性を提供する。例えばある実施態様では、1つの化合物がすべてのチャネルに同じ濃度で存在する。別の実施態様では、同じ化合物がすべてのチャネルに存在するが、各チャネルは異なる濃度の化合物を有する。別の実施態様では、各チャネルは異なる化合物を有する。別々の実施態様では、2つ以上の化合物がある。2つ以上の化合物がある場合は、各チャネルは化合物の同じ混合物を有するかまたは化合物の異なる混合物を有することができる。さらに、化合物の混合物が同じなら、各チャネルは異なる濃度のその混合物を受けることができる。さらに各チャネルは化合物の混合物を受け、各チャネルは互いに異なる比の化合物を有することができる。
【０３４７】
かかる測定系は、多くの無数の生物学的相互作用、細胞または他の生物学的分子に対する化学物質または薬剤の作用を試験するのに使用されることができる。例えば固定化生物学的分子を流れる低濃度から高濃度で存在する化合物の層流勾配を使用して、化合物のIC50を測定するために本発明の装置と測定法を使用してもよい。
【０３４８】
図55AAに示すように本発明のある実施態様では、例えば細胞化学走化性／接触走性および／または化学侵入性装置のような試験装置10は、支持体メンバー16と支持体メンバー16と実質的に液体で緊密に共形接触して置かれる支持体メンバー16に取り付けられた上部メンバー11を有するハウジング10aを含む。本発明に関連して「共形接触」は、実質的にぴったりフィットし実質的に液体で緊密な接触していることを意味する。支持体メンバー16と上部メンバー11は、示すように、これらが一緒に別個のチャンバー12を画定するように作成される。好ましくは試験装置10は、例えば図55Bの例に示すように複数の別個のチャンバーを含む。別個のチャンバー12は、少なくとも1つの第1ウェル13を含む第1ウェル領域13aと少なくとも1つの第2ウェル14を含む第2ウェル領域14aとを含み、装置の試験方向で第2ウェル領域はさらに第1ウェル領域に横に並置されている。装置の「試験方向」は、試験中の装置の空間的方向を意味する。図55Cに示すように装置10はさらに、第1ウェル領域13aと第2ウェル領域14aとを互いに連結する少なくとも1つのチャネル15を含むチャネル領域15aを含む。図55A〜55Cの例では、各ウェル領域は単一のウェルを含み、チャネル領域は単一のチャネルを含む。図55Cに見られるように、各ウェルは上部メンバー11中の貫通孔（ウェル13とウェル14に対応する）により画定され、支持体メンバー16の上部表面Ｕにより画定される。特に各ウェル13と14の側面は、上部メンバー11の貫通孔の壁により画定され、ウェル13と14の底は支持体メンバー16の上部表面Ｕにより画定される。本発明に関連して「上（top）」、「底」、「上（upper）」および「側面」は、装置の試験方向について画定される。図55Aと55Cによりまとめて見られるように、チャネル領域15aの長さＬは、チャネル領域15aの長軸方向に画定される。チャネル領域15aの深さＤは、支持体メンバー16の上部表面Ｕに直角な方向で画定される；幅Ｗは、チャネル領域15aの長さＬと深さＤに直角な方向で画定される。本発明のある実施態様ではチャンバーの第1ウェル13は、試験薬、可溶性試験物質、および／または固定化生物学的分子（これは化学走化性または接触走性に影響を与える可能性がある）を含む試験薬を受けるように改変される。生物学的分子には、特に限定されないが、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、炭水化物、細胞、化学物質、生化学物質、および小分子がある。チャンバーの第2ウェル14は、細胞の生物学的試料を受けるように改変される。固定化された生物学的分子は、支持体メンバーの周りに存在する引力（例えば液体媒体中に存在する溶媒和力および乱流力）より強い引力で支持体メンバー16に結合している生物学的分子である。試験薬の非限定例には、化学噴射剤、化学走化性インヒビター、および化学誘引物質（例えば、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、栄養物質、小分子、およびペプチド）がある。あるいはチャンバーの第1ウェル13は、細胞の生物学的試料を受けるように改変され、チャンバーの第2ウェル14は試験薬を受けるように改変される。
【０３４９】
本発明のある実施態様では、可溶性試験物質が試験薬として使用される場合、チャネル領域15aはゲルマトリックスを含有することが好ましい。ゲルマトリックスは、溶質が半透性のマトリックス（ゲルマトリックス）を介してより高濃度の領域（ウェル領域13a）から低濃度の領域（ウェル領域14a）に拡散するのにつれて、第1ウェル領域13aから第2ウェル領域14aへの溶液濃度勾配の生成を可能にする。細胞がマトリックス中を溶液濃度勾配の方向でウェル領域13aに向かって遊走するように可溶性試験物質が化学誘引物質を含むなら、細胞はマトリックス金属プロテアーゼのような酵素を放出してマトリックスを分解しなければならない。次にこの細胞化学走化性と侵入が観察、測定、および記録される。
【０３５０】
本発明のある実施態様では、固定化生物学的分子を試験薬として使用して、好ましくは生物学的分子は、チャネル領域15aの下にありウェル領域13aの貫通孔の下にある支持体メンバー16の一部に固定化または結合している。生物学的分子の濃度は、装置の縦軸に沿って低下してウェル領域13aからウェル領域14aへ向かって固定化生物学的分子の表面濃度勾配を生成し、細胞の生物学的試料はこの表面勾配に応答する可能性がある。次にこの細胞接触走性が観察、測定、および記録される。
【０３５１】
装置10の具体的な規格について上部メンバー11は、支持体メンバー16と共形接触、好ましくは可逆的な共形接触をするように改変された材料から作成される。本発明の実施態様では、特にかかる材料の柔軟性が、上部メンバーが支持体メンバー16の上部表面Ｕにぴったり接着して実質的に液体で緊密な密封を形成することを可能にする。共形接触は好ましくは、支持体メンバー表面の上部メンバーが滑ることを防ぐ。共形接触が可逆的である場合、上部メンバーは、上部メンバーが簡単な剥がし操作により除去できるような構造完全性を有する材料で作成される。これは、上部メンバー11を除去することを可能にし、ある時点で細胞を採取することを可能にする。好ましくは剥がし操作は支持体メンバー16の表面処理または細胞位置を乱さないものである。物理的な線、ポケット、SAM、ゲル、ペプチド、抗体、または炭水化物が支持体メンバー16の上に置かれ、次にこれらの構造を損傷しないように、上部メンバー11が支持体メンバー16の上に置かれる。さらに上部メンバー11と支持体メンバー16との共形接触により生成する上部メンバー11と支持体メンバー16の間の実質的に液体で緊密な密封は、液体が1つのチャンバーから隣接するチャンバーに洩れたり、汚染物質がウェルに入ったりすることを防ぐ。この密封は好ましくは、外部圧力を維持する必要無く、実質的に即時に生成する。共形接触は、上部メンバー11を支持体メンバー16に密封するための密封剤を使用することを不要とする。本発明の実施態様は密封剤の使用を包含するが、好適な実施態様ではかかる使用が不要であるという事実は、コストと時間のかからない代替法を提供し、さらに各チャンバー12が密封剤で汚染されるリスクを排除する。好ましくは上部メンバー11は、分解しない材料で作成され、試験で何度も使用されても容易に損傷されず、これはその製造中に上部メンバーの作成に大きな多様性を与える。さらに好ましくは材料は、フォトリソグラフィーを使用して上部メンバーを作成することを可能にするように選択される。好適な実施態様では、材料は、シリコーン、天然ゴムまたは合成ゴム、またはポリウレタンのようなエラストマーを含む。より好適な例では、材料はポリジメチルシロキサン（PDMS）である。
【０３５２】
本発明の別の実施態様では、装置10はチャンバーを画定するハウジングを含み、チャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域；および第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結する複数のチャネルを含むチャネル領域とを含む。好ましくは第2ウェル領域は、装置の試験方向で第1ウェル領域に横に並置されている。
【０３５３】
本発明の方法の別の好適な実施態様では、上部メンバー11の所望の構成のネガ画像であるシリコンマスターを作成するために、標準的フォトリソグラフィー法を使用することができる。例えばチャンバー12の寸法、例えばウェル領域13aと14aのサイズ、またはチャネル領域15aの長さは、有利な規格に適合するように改変することができる。マスターの適当なデザインがいったん選択され、このようなデザインに従ってマスターが作成されると、材料はマスターにスピンキャスト、射出、または注入され、硬化される。いったん鋳型が形成されると、このプロセスは必要なだけ繰り返される。このプロセスは上部メンバーのデザインの大きな柔軟性を与えるのみではなく、上部メンバーが大規模に複製されることを可能にする。本発明はまた、例えばe-ビームリソグラフィー、レーザー支援エッチング、および転写を含む、装置10を作成するための異なる方法を企図する。
【０３５４】
装置10は、業界の標準的マイクロタイタープレートのフットプリントに当てはまる。従って装置10は好ましくは、業界の標準的マイクロタイタープレートと同じ外部寸法と全体サイズを有する。さらにチャンバー12が複数のチャンバーを含む時、チャンバー12自体または各チャンバー12の壁は、業界の標準的マイクロタイタープレートと同じピッチを有してもよい。本明細書において用語「ピッチ」は、装置の試験方向で隣接チャンバーまたは隣接ウェル間の各縦の中央線の間の距離を意味する。図55Bに示す例えば装置10の実施態様では、プレートの各マクロウェルのスペースに一致する各ウェルを有する標準的96ウェルプレートのフォーマットで設計される48のチャンバーを含む。複数のチャンバー12のサイズと数は、標準的24-、96-、384-、768-、および1536-ウェルマイクロタイタープレートのフットプリントに対応する。例えば96ウェルマイクロタイタープレートについて装置10は48個のチャンバー12を有し、従って48回の実験を行うことができ、384ウェルマイクロタイタープレートについて装置10は192個のチャンバー12を有し、従って192回の実験を行うことができる。本発明はまた、適当な配置の任意の他の数のチャンバーおよび／またはウェルを企図する。例えばピッチまたはフットプリント基準が変化するかまたは新しい応用が新しい大きさを要求するなら、装置10はこれらの新しい寸法に合うように容易に変更することができる。標準的マイクロタイタープレートの正確な寸法と規格に一致することにより、装置10の実施態様は、液体取り扱い、保存、登録および検出の既存のインフラストラクチャに有利に適合する。したがって、装置10の実施態様は、ロボットによる液体取り扱いと自動検出およびデータ解析を可能にするため、ハイスループットスクリーニングに誘導し易い。
【０３５５】
上部メンバー11はさらに、いくつかの異なる変更および実施態様をとることができる。試験パラメータ（例えば、化学走化性、接触走性および／または化学侵入性をモニターする場合は、細胞タイプ、細胞数、または化学走化性もしくは接触走性が必要とされる距離）に依存して、上部メンバー11のチャンバー12は種々の実施態様を有し、そのいくつかのを本明細書において考察する。別個のチャンバー12に関して、チャネル領域15a中のチャネルの形、寸法、位置、表面処理、およびチャネル数、およびウェル13と14の形と数は変化してもよい。
【０３５６】
チャネル領域15aの形に関して、チャネル領域15a中の各チャネル15は、縦軸に垂直な面で取られる、特定の断面の形に限定されない。例えばあるチャネル15の断面は、6角形、円形、半円形、楕円形、長方形、正方形、または他の多角形、または曲線形でもよい。
【０３５７】
チャネル15の寸法に関して、あるチャネル15の長さＬは種々の試験パラメータに基づいて変化する。例えばあるチャネル15の長さＬは、化学走化性または接触走性が起きるのに必要な距離に関連して変化してもよい。例えば、細胞に移動のための充分な距離を与えるために、従って細胞の化学走化性／接触走性および化学侵入性を観察する充分な機会を得るために、あるチャネル15の長さＬは、約3μm〜約18mmの範囲でもよい。あるチャネル15の幅Ｗと深さＤもまた、種々の試験パラメータの関数として変化してもよい。例えばあるチャネル15の幅Ｗと深さＤは、試験される細胞の大きさによりおよびあるチャネル15にゲルマトリックスが加えられるかどうかにより、化学走化性、接触走性および／または化学侵入性装置中で変化してもよい。一般に試験装置が化学走化性、接触走性および／または化学侵入性装置である時、あるチャネル15の幅Ｗと深さＤは、ほぼ測定される細胞の直径の範囲内である。細胞が活性化される時、これらがあるチャネルの間に「入り込んで」試験薬の法に向かうことができるように、ランダムな細胞の動きを減少させるために、ゲルマトリックスをあるチャネル15に入れない時は、あるチャネル15の深さＤまたは幅Ｗの少なくとも1つは、好ましくは細胞の直径より小さい。もしあるチャネル15がゲルマトリックスを含有するなら、あるチャネル15の深さＤと幅Ｗは、測定される細胞の直径より大きくてもよい。例えば図55A〜56Cについて、直径が約3〜12μmの白血球のような懸濁細胞がウェル14の中にありチャネル15がゲルを含まないなら、チャネル15の幅Ｗは約3ミクロン〜約20μmの範囲であり、チャネル15の深さＤは約3ミクロン〜約20μmの範囲でなければならないが、チャネル15の深さＤまたは幅Ｗの少なくともいずれかは、細胞の直径より小さくなければならない。もし白血球がウェル14中にあり、チャネル15がゲルマトリックスを含有するなら、チャネル15の幅Ｗは約20〜約100μmの範囲であり、深さＤは約20〜約100μmの範囲でなければならず、チャネル15の幅Ｗと深さＤの両方は、測定される細胞の直径より大きいことができる。同様にもし接着前の直径が3〜10ミクロンの内皮細胞のような接着細胞がウェル14中にあり、チャネル15がゲルマトリックスを含有しないなら、チャネル15の幅Ｗと深さＤは約3〜約20μmの範囲であることができるが、チャネル15の幅Ｗまたは深さＤの少なくともいずれかは、測定される細胞の直径より小さくなければならない。もし接着細胞がウェル14中にありチャネル15がゲルマトリックスを含有するなら、チャネル15の幅Ｗと深さＤは約20〜約200μmの範囲であり、チャネル15の幅Ｗと深さＤの両方は、測定される細胞の直径より大きくなければならない。
【０３５８】
図56A〜56Cで見られるように、チャネル15は第1ウェル13を第2ウェル14に、図56Aと56Cに示すようにウェルの各側面で連結するか、または図56Bに示すようにウェルの中央部分で連結する。
【０３５９】
ウェル領域13aとウェル領域14aの間のチャネル領域15a中のチャネルの数は、変化してもよい。チャネル領域15aは、例えば図57A〜57cに示すように複数のチャネルを含むことができる。図57Aに示すように好適な構成では、ウェル13とウェル14の間の各チャネル15i-nの長さＬは同じである。別の実施態様では図57Bに見られるように、チャネル領域15aの各チャネル15i-15nの長さＬは、チャンバー12の側面部分12a中のチャネル15iから出発してチャンバー12の側面部分12b中のチャネル15nまで、ウェル14の方向に上昇する。ある実施態様では、図57Bに見られるように、チャンバー12の複数のチャネル15中の各連続チャネルの長さＬは、複数のチャネルの前のチャネルに対してチャネルの幅Ｗの方向に増加し、その結果第1ウェル領域と第2ウェル領域のうちの1つの（例えば記載のウェル領域13a）の各チャネル入口は、チャネルの幅Ｗの方向に沿って位置合わせされる。この構成では、特定のチャネル中で移動する細胞は、互いに縦に並置される点でチャネルを出てウェル14に入るが、チャネル領域15aの断面はウェル領域13aに最も近く配置され、その結果これらの間に縦の並置は無い。従って2つの隣接チャネルを比較する場合、チャネル15iに入る第1の群の細胞は、チャネル15jに入る第2の異なる群の細胞について縦に並置されることは無いが、チャネル15iを出る第1の群の細胞は、チャネル15jを出る第2の群の細胞から縦に並置された出口地点を有する。図57cに記載の本発明の異なる実施態様では、各チャネル15i〜15nの幅Ｗは、チャンバー12の側面部分12a中のチャネル15iから出発してチャンバー12の側面部分12b中のチャネル15nへ増加する。好ましくは複数のチャネルの各連続チャネルの幅Ｗまたは深さＤは、複数のチャネルの前のチャネルに対してチャネルの幅Ｗの方向に増加する。あるいは各連続チャネルの深さＤは、チャネルの幅Ｗの方向に沿って増加する（示していない）。チャネル領域15a中のチャネルの寸法を変更する種々の実施態様は本発明の範囲内であることを、当業者は理解されたい。例えばチャネル15i〜15nの長さは、図57Bに示すようにチャネル15iから15nへ連続的に増加する必要は無い。かわりにチャネル15i〜15nは、特定の秩序またはパターンに従わず異なる長さを有することがある。
【０３６０】
あるチャネル15の表面処理に関して、細胞が他の細胞に囲まれるインビボ条件をシミュレートするために、あるチャネル15の側面の壁が、細胞（例えば図58Bに示す内皮細胞40）で被覆される。内皮細胞の非限定例には、ヒト臍帯静脈内皮細胞または高内皮細静脈細胞がある。別の実施態様ではあるチャネル15は、ゼラチン、アガロース、コラーゲン、フィブリン、任意の天然もしくは合成細胞外タンパク質性マトリックス、または基底膜模倣物のようなゲルマトリックス（マトリゲル（登録商標）（ベクトンディッキンソンラボウェア（Becton Dickinson Labware）、またはECM GEL（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州））、またはある因子（サイトカイン、増殖因子、抗体、細胞表面受容体のリガンド、またはケモカインを）を含む他のヒドロゲルで被覆される。好ましくはゲルは実質的に高い水分含量を有し、細胞の化学走化性および侵入が起きるのに充分に多孔性である。上記したように、可溶性試験物質を含む試験薬をウェル13に入れると、ゲルはチャンバー12の縦軸に沿った溶液濃度勾配の生成を促進する。さらにゲルマトリックスをあるチャネル15に加えると、体内の自然の環境が刺激され、細胞外マトリックスによる酵素によるマトリックス分解が侵入プロセスの決定的に重要な工程になる。
【０３６１】
本発明では、各ウェル領域13aまたは14aの個々の壁は任意の形とサイズを有する。例えばある壁の平面図の形は、図55A〜56Cに示すように円形であるか、図5と6に示すように台形でもよい。あるいは、あるチャンバーの平面図の形は、図61に示すように一般に「8の字」の形でもよい。好ましくは試験薬として可溶性試験物質を使用する時、ウェル13の形は、容易に可溶性試験物質がチャネル15にアクセスでき、従ってチャネル15の長さＬに沿って必要な溶液濃度勾配が生成されるようなものである。好ましくはウェル14の形は、細胞が例えばウェル14のコーナー、側面または他のデッドスペースに蓄積して、第1ウェル14の外へ遊走するのを遅らせたり、とどまらせたり、または邪魔したりしないものである。ウェル14のデッドスペースへの細胞の蓄積可能性は特定の細胞数に限定されないが、多数の細胞が使用された場合はコーナーに細胞が蓄積する可能性が高い。従って多数の試料が使用された時、濃度勾配へのアクセスを最大にし細胞の「無駄使い」を最小にするためには、ウェル14の形は、充分に高率の細胞、特にチャネル15から最も遠いチャンバー14の領域中の細胞がウェル14の外に遊走できるようなものであることが重要である。細胞の無駄使いの問題についての異なる実施態様でもまた、ウェル14は、すべての細胞が濃度勾配にアクセスできる高い可能性を有するような形である。例えば図8に見られるように、その平面図中のウェル14の長さＬWは、ウェルの表面積を減少させるために最小にされる。従って細胞はチャネル15中で生成される濃度勾配により近づく。好適例ではウェル14のＬWは、約1mm〜約2mmである。
【０３６２】
別個のチャンバー12の成分の変動以外に本発明はまた、全体的チャンバー12の変動、ならびにチャンバーからチャンバーへの変動を含む。ある実施態様では全体的チャンバー12について、チャンバー12が96ウェルプレートの単一のウェルに通常必要な領域に適合するように、チャンバー12はサイズ調整される。この構成では、96ウェルプレートで96の異なる測定が可能である。別の実施態様では前記実施態様に存在するように、チャンバー12を修飾することにより、第1ウェル対第2ウェルの1：1の比が変化する。例えば、図63では、装置10は、互いに連結された複数の第1ウェル102、103、104、および105を有する第1ウェル領域13a、複数のウェル106、107、108、および109を有する第2ウェル領域14a、および第1ウェルの各ウェルを第2ウェルの各ウェルに連結する複数のチャネル15を有するチャネル領域15aとを有するチャンバー12を含む。第1ウェル領域13aの各ウェルは同じ試験薬を受け、第2ウェル領域14aの各ウェルは異なるタイプの細胞を受ける。あるいは第1ウェル領域13aの各ウェルが異なる試験薬を受け、第2ウェル領域14aの各ウェルが同じタイプの細胞を受けてもよい。この構成は、いくつかの異なるタイプの細胞または異なる試験薬を同時に試験することを可能にする。図64に示す別の実施態様では、チャネル領域15aの各チャネル15は、記載のようなサブチャネルを含む。この配置は、いくつかの異なるタイプの細胞または試験薬を同時に試験することを可能にするのみでなく、各試験薬または細胞タイプのいくつかの試験をつくり出す。
【０３６３】
図65は、本発明の別の実施態様の試験装置の別のチャンバー構成を示す。この実施態様ではチャンバー12は、単一のチャネル15を含むチャネル領域15aにより、単一のウェル14を含む第2ウェル領域14aに連結された第1ウェル領域13aを含む。第1ウェル領域は、複数の第1ウェル17a、18a、および19a、および複数の第1ウェルの各ウェルに連結された複数の毛細管、第1の周囲細管17、中央毛細管18、および第2の周囲細管19を含有する。すべての3つの毛細管はジャンクションに収束してチャネル15に入り、これは第2ウェル領域14aに連結される。ウェル領域13aは3つの毛細管のみを含有することに限定されず、任意の数の追加の毛細管（示していない）を含有することができる。第1ウェル17a〜19aは、例えば生物学的分子の溶液を受けるように改変され、これはチャネル15に流され、その上を生物学的分子含有溶液が流れる表面の領域に非特異的に吸着される。第1ウェル17a〜19aはまた、次に細胞を受けるように改変してもよい。
【０３６４】
ある実施態様ではチャンバーからチャンバーへの変動について、各チャネル15の長さＬは上部メンバー11の1つ以上の寸法に沿って、1つのチャンバーから隣接するチャンバーに増加する。別の実施態様ではすべてのチャンバー12は、同じ長さＬのチャネル15を有する。各チャネル15の幅Ｗもまた変動してもよく、上部メンバー11の1つ以上の寸法に沿って、1つのチャンバーから隣接するチャンバーに増加する。別の実施態様ではすべてのチャンバー12は、同じ幅Ｗのチャネル15を有する。図58aは本発明の実施態様の平面図であり、ここでは上部メンバー11内で、異なるチャンバーが種々のチャネルサイズと形を有し、かかるサイズと形は特に規則正しく、パターン化した、または整列したものではない。この変化のある構成を使用することによりある試験の最適なチャネル領域デザインが得られる。すなわち最適のチャネル領域デザインが決定される場合、これらの規格にのみ構成される新しい測定プレートを使用してもよい。
【０３６５】
装置10の支持体メンバー16は、その上に上部メンバー11がある支持体を提供し、この機能に適した任意の材料で作成することができる。適当な材料は当該分野で公知であり、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、PMMA、ポリアクリレート、および他のプラスチックがある。装置10が化学走化性、接触走性および／または化学侵入性装置である場合、支持体メンバー16は、支持体メンバー16の表面上に置かれる細胞と適合性のある材料を含む。適当な材料には、細胞生物学で使用された標準的材料があり、例えば、ガラス、セラミクス、金属、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ならびにポリマー薄膜を含む他のプラスチックがある。好適な材料は、厚さ約0.1〜約2mmのガラスであり、これは光学顕微鏡法で細胞を観察することを可能にするためである。
【０３６６】
上部メンバー11と同様に、支持体メンバー16はいくつかの異なる実施態様を有することができる。特に支持体メンバー16の構成と表面処理は変化してもよい。
【０３６７】
図66の支持体メンバー16の側面図から明らかなように、支持体メンバー16の上部表面Ｕ（これは上部メンバー11の下にある）は、所定の領域で水平面に対して90°未満の角度で傾斜してもよい。記載の例では所定の領域は各ウェルの底面に対応し、表面16aはウェル13の底面に対応し、表面16bはウェル14の底面に対応する。表面16cは次に、チャネル15の底面に対応する。この実施態様ではある構成は、懸濁細胞が支持体メンバー16の上部表面16bの下り斜面の方向に流れて、濃度勾配に容易に曝露されるようになることを促進する。可溶性試験物質が装置10のウェル13中で試験薬として使用されるなら、溶液濃度勾配の生成を促進するために、支持体メンバー16の上部表面16aもまた、水平面に対して90°未満の角度で下り傾斜してチャネル15への試験薬の曝露を促進してもよい。
【０３６８】
支持体メンバー16はまた、表面に処理を有するかまたは表面に埋め込まれてもよい。この処理は無数々の機能を果たし、例えば試験される細胞の配置、接着または運動を促進し、インビボ条件をシミュレートする。無数の表面構成および化学物質が、単独でまたはこの処理と組合せて使用される。
【０３６９】
例えばある実施態様では支持体メンバー16は、金の表面または他の適当な材料上にパターン化自己集合膜（SAM）を含む。SAMは代表的には、それぞれが特定の表面に選択的に結合する官能基を有する分子であって、各分子の残りが膜中の隣接分子と相互作用して比較的規則正しい整列を形成する分子から形成される。SAMを使用することにより、生物学的相互作用の種々の対照が使用される。例えばSAMは整列されるかまたは種々の「頭部末端基」で修飾されて、生物学的不活性頭部末端基の領域により囲まれた生体特異的表面の「島」を生成する。さらにSAMは修飾されて「スイッチ可能な表面」を有するようになり、これは細胞を捕捉するように設計され次に捕捉細胞を放出するように修飾される。さらに、細胞、タンパク質、または任意の他の生物学的試料の非特異的吸着に抵抗するような生物学的不活性支持体メンバー材料を利用することも好ましいであろう。従って支持体メンバー16上のSAMの使用は有利である。
【０３７０】
本発明はまた図67から明らかなように、細胞の化学走化性、接触走性、および化学侵入性を検出および分析するための、当該分野で公知の任意のシステムの使用を企図する。特に本発明は、細胞がチャネル15に沿って動く時の細胞形態の変化を視覚化するための、チャネル15中で細胞が移動する距離を測定するための、チャネル15中の特定の点に移動する細胞の数を定量するための、当該分野で公知の任意のシステムの使用を企図する。従って本発明は、化学走化性、接触走性、および化学侵入性の「リアルタイム」および「終点」分析の両方を企図する。ある実施態様では装置122は、観察システム120とコントローラー121とを含む。コントローラー121は、ライン122を介して観察システム120に連通している。コントローラー121と観察システム120は、装置中の細胞の化学走化性と化学侵入性を観察、記録、および分析するために配置しプログラムしてもよい。観察システム120は、多くのシステムの任意のものであり、顕微鏡、高速ビデオカメラ、および多数の個々のセンサーを含む。顕微鏡の非限定例には、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、微分干渉顕微鏡、暗視野顕微鏡、共焦点レーザースキャニング顕微鏡、デジタル脱回転顕微鏡、およびビデオ顕微鏡がある。これらの各実施態様は、試験薬が導入される前、その時、および後の細胞の動きと挙動を観察し感知する。同時に観察システム120は、コントローラー121が解釈し分析するためのシグナルを生成する。この分析は、経時的な細胞の物理的動きならびにその形、活動レベルまたは任意の他の観察可能な特性の変化の測定を含む。各例で試験される細胞は、リアルタイムで、後で、またはその両方で観察される。観察システム120とコントローラー121は、モニターを介してリアルタイム観察を提供することもある。これらはまた、これらの成分とともに組み込んだかまたはこれらに連結した記録システムにより後で再生することができる。例えばある実施態様では、所望の観察期間中の細胞挙動が、三眼複合顕微鏡の縦のオキュラーチューブ内に位置するか、倒立顕微鏡の本体内に位置し、高品質ビデオレコーダーに連結した標準的ビデオカメラにより、VHSフォーマットのビデオテープに記録される。ビデオレコーダーは次に、アナログデータをデジタル形に変換するためにデジタル化手段（例えばPCIフレームグラバー）に再生される。次に電子的読みとり可能な（デジタル化）データは、例えば米国特許第5,655,028号（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示のような適切な動的画像分析システムにより、アクセスされ処理される。このようなシステムは、ソルテック者（Solltech Inc.）（オークランド、アイオワ州）から商品名ディアス（DIAS）（登録商標）で市販されている。試料中に存在する可能性のある破片や他の検出アーチファクトからの細胞の区別を助けることができるソフトウェアも特に有利である。いずれの場合もこれらの成分はまた、細胞が試験薬に反応して進むところを分析する。
【０３７１】
ある実施態様では本発明は、図69に記載のように、チャネル15中で細胞が移動する距離を測定するデータを分析するための、およびチャネル15中の特定の点に移動する細胞の数を定量するための、自動分析システムの使用を企図する。図69は、自動分析システム100のブロック図であり、例えば画像前処理段階110、対象同定段階120，および遊走分析段階130を含む。画像前処理段階110は、デジタルカメラまたは他の上記画像装置からのチャンバー12のデジタル画像データを受け取る。このデータは典型的には、種々の空間位置（短縮して「画素」と呼ぶ）での複数の画像試料を含み、カラーデータまたはグレイスケールデータとして与えられる。画像前処理段階110は、捕捉画像データを変換して、他の段階のアルゴリズムがその上で機能するようにする。対象同定段階120は、画像データから対象を同定する。行われる試験に基づいて、種々の対象が同定される。例えば対象同定物は、チャネル15、画像データ内からの細胞または細胞群を同定する。遊走分析段階130は、試験用の遊走を分析する。
【０３７２】
図69は、画像前処理段階110内に含まれるブロックの数を示す。基本的に画像前処理段階110は、イメージャーまたは装置の欠陥の結果として捕捉画像データ中に存在する可能性のある画像アーチファクトを中和する。ある実施態様では画像前処理段階110は、画像等化ブロック140を含む。等化140は、捕捉画像データの試料値がデータが利用できる全量子化範囲を占めない場合に適用される。例えば8ビットのグレイスケールシステムは、入力データの256の異なる量子化レベル（0〜255）を可能にする。画像化プロセスの欠陥のために、画素値が狭い範囲、例えば20の量子化レベル（0〜20）に限定されることがある。量子化140は、試料値を再スケール化して、これらが8ビットシステムで利用できる全範囲を占めることを確実にする。
【０３７３】
別の実施態様では等化ブロック140は、カラーまたは波長に基づいて試料値を再スケール化する。従来の細胞分析法はしばしば、細胞が所定のカラーまたは所定の波長で現れるようにし、これがイメージャーにより捕捉された他の物質からの区別を可能にする。例えば蛍光応用では、細胞は所定の波長で発光する。核染色応用では、細胞核は所定のカラーの画像データで現れるようにする物質で染色される。等化ブロック140は、これらの予測されたカラーまたは波長と一致する成分を有する試料値を再スケール化する。こうして等化ブロック140は、他のカラーまたは波長を有効にフィルター除去して、これは後の画像処理において有利である。
【０３７４】
画像回転は、欠陥のある画像装置から発生する別の画像アーチファクトである。チャネル15は一般に画像データ中の画素の列と行に整列されるが、整列が改良されるなら、さらなる分析が促進される。従ってある実施態様では、画像前処理段階110は、このアーチファクトを中和するように捕捉画像データを回転させる画像整列ブロック150を含む。捕捉画像データから回転アーチファクトがいったん除去されると、個々のチャネル15からの画像は、画素データの正しい行または列と一致する可能性がある。
【０３７５】
図70は、本発明の実施態様の画像整列ブロック150の操作法を示し、図70に示す画像データ例に関連して説明される。図71の例ではチャネル15は一般に、回転アーチファクト以外の画像データの並びで整列される。回転アーチファクトを中和するために画像前処理装置は、第2ウェル14とチャネル15自体の間の境界と一致する画像データのバンドを同定することができる（ブロック1010）。図71の場合バンドはカラム310を構成する。一般に第2ウェル14の領域は、その中に存在する細胞の数が多いためチャネル15の領域に対して明るい。すなわちチャネル15の推定方向に沿った画像データ値のヒストグラムは、図72に示すように現れる。バンド310は、この方向に沿った画像データ値の急激な変化から同定される。
【０３７６】
検討すべき画像データのカラムが同定されると、カラム310は2つの境界ボックス320、330に分離される（ブロック1020）。2つの境界ボックス中の画像データの強度を合計し、合計した値を互いに比較して、回転アーチファクトの配向が決定される（ブロック1030、1040）。図71の例では、回転アーチファクトは、より多くの第2ウェル14が境界ボックス330より境界ボックス320の領域内に入るようにする（時計回りのアーチファクト）。画像データは反時計回りに回転され、各境界ボックス320、330の合計値のバランスが取られる。
【０３７７】
すなわちもし第1境界ボックスの画像強度が第2境界ボックス330のそれより大きいなら、画像データは第1方向に回転される（ブロック1050）。もし第2境界ボックス330の画像強度が第1境界ボックスのそれより大きいなら、画像データは第2方向に回転される（ブロック1060）。そして画像強度がバランスがとれる時、方法1000は、回転アーチファクトが補正されたと結論付ける。
【０３７８】
図69に戻って画像前処理段階110はまた、画像をチャネル15自体に占められる領域に取り入れることにより、捕捉画像を処理する（ブロック160）。上記したように各試験ベッドは、複数のチャネルにより相互連結された一対のウェルを含む。多くの遊走分析について、チャネル15内のみの細胞の動きまたは活性を測定することで充分である。第2ウェル14または第1ウェル13中の活性は検討しなくてもよい。かかる実施態様では、画像前処理段階110は、データを取り入れて、チャネル15の外にある画素を除去する。
【０３７９】
画像前処理段階110はまた閾値生成ブロック170を含み、埋め込み可能な医学装置の閾値検出を行う。閾値生成ブロック170は、所定の閾値を超えない再スケール化値を有する任意の試料を0まで切り捨てることができる。このような閾値生成は、捕捉画像データからノイズを除去するのに有用である。ある実施態様では閾値生成ブロック170は、上記等化ブロック140に組み込まれる。これは別の要素として存在する必要は無い。ある実施態様では、特に等化ブロック140が波長成分に従って画素値を測定する場合、閾値生成ブロック170は全く省略してもよい。画像前処理段階110の出力は、対象同定段階120の入力されることができる。
【０３８０】
対象同定段階120は、チャネル自体および随時個々の細胞を含む画像データ内からの対象を同定する。ある実施態様では、蛍光システムにおいて、チャネル15は、システムの主軸に沿って蛍光のヒストグラムを作成することにより同定される（ブロック180）。図73は、図71の例から測定されている画像データを示す。主軸は、細胞を受けるように改変したウェルとチャネル領域の間の境界に一致してもよい。チャネル領域15a領域内からの光の強度はこの軸に沿って合計されて、図73に示すデータセットを与える。第2の段階で、データセットは「拡大」される（ブロック190）。拡大は、データセットに高パスフィルターを適用することにより、または任意の他の類似の方法を適用することにより行われる。図20は、拡大されている図73のデータセットを示す。
【０３８１】
図74のデータセットから、チャネルが同定される。チャネル候補15は、データセットの相対最大値と一致することが同定される。あるいは、チャネル15間の境界の位置候補は、図74のデータセット内の相対的最小値から決定される。チャネル15位置の最終セットは、チャネル領域15a自体について既知のパラメータセットから決定される。例えばチャネル15がチャネル15間の規則的間隔を用いて提供されていることが既知であるなら、間隔を違反する任意のチャネル候補15は、検討から排除することができる。
【０３８２】
図69に戻って、チャネル15を同定する以外に、個々の細胞が画像データ内で同定される（ブロック200）。細胞が核染色でマークされる応用では、個々の細胞の同定には、マークされた核の数を同定し計数するための画像プロセッサーを必要とするのみである。現れる核は所定のカラーの点の数である。蛍光性細胞を使用する応用では、個々の細胞の同定はより複雑である。個々の細胞は比較的容易に同定することができ；これらは、画像データ内で比較的均一な領域の対象として現れる。集まった細胞の数を同定することは、より困難である。この場合細胞の数は、画像データ内のクラスターの面積または半径から決定される。クラスターは、面積またはクラスター半径を有する画像中で現れる可能性が高い。クラスターの面積または半径を個々の細胞の面積または半径と比較することにより、細胞の数が補間される。もちろん個々の細胞の同定は、遊走分析の要件に依存して省略してもよい。
【０３８３】
画像前処理システムの最終段階は、遊走分析130自体である。ある実施態様ではチャネル15中の各細胞の座標データが集められ記録される。しかし一部の試験はあまり複雑である必要は無い。最初の実施態様では、チャネル15中に提供される細胞の数を同定するだけで充分である。この場合個々の細胞の同定は、各チャネル15で検出された蛍光の量を単に合計することにより避けることができる。この測定から、個々の細胞を同定する処理費用を投資することなく、細胞の数を得ることができる。
【０３８４】
前記説明は、試験すべき単一のチャネル15に関連する画像分析を提供する。もちろん遊走分析130の要件に依存して、多数の異なるチャネル15の画像試料を生成することが必要かも知れない。さらに、異なる時点で単一のチャネル15の画像試料を作成することが好ましい。上記した画像処理は、異なるチャネル15について異なる時点で繰り返されてかかる試験シナリオに適応する。
【０３８５】
ある実施態様では画像処理は、個々のチャネル15の製造の欠陥の原因となることがある。画像処理中、製造の欠陥は細胞の遊走がチャネル15に入るのを妨害する。ある実施態様では、システム100がチャネル15中の細胞の数を計数する時（または同定された細胞位置から数を得る）、その数を予測閾値と比較する。この数が予測閾値より小さいなら、システム100は遊走分析からチャネル15を除外する。実際、遊走分析で試験条件が分析されるなら、この予測閾値は、正しく構成された細胞に入る可能性のある細胞の最小数として確立される。実際の細胞数がこの閾値より小さいなら、チャネル15阻止条件が存在する可能性があると結論される。
【０３８６】
分析システム100の前記操作と処理は、ソフトウェアを実行する汎用処理装置（例えばコンピューター、ワークステーションまたはサーバー）により行われる。あるいは操作または処理の一部は、デジタルシグナルプロセッサーまたはアプリケーション特異的集積回路（口語的には「ASIC」）で提供される。さらにこれらの操作や処理（特に画像処理に関連するもの）は、デジタル顕微鏡システムのプロセッサーに分布している。かかる変更は充分本発明の範囲内である。
【０３８７】
本発明はまた、化学走化性、接触走性、および化学侵入性の種々の要素を測定するための装置10の前記実施態様の使用を企図する。一般に本発明は、試験薬が化学走化性、接触走性、および化学侵入性に影響を与えるかどうかを測定するための、試験薬のハイスループットスクリーニングを含む最初の測定を提供する。試験薬は一般に、可溶性試験物質または固定化された試験生物学的分子を含み、一般に装置10のチャンバー12の第1ウェル領域13aに入れられる。化学誘引物質として作用してかつ化学走化性を促進または阻害することにより、化学防止剤として作用してかつ化学走化性を防止することにより、またはインヒビターとして作用して化学走化性を止めるかまたは阻害することにより、試験薬が化学走化性に影響を与えるかどうかを測定した後、試験化合物をスクリーニングする第2の測定を行う。試験化合物は一般に、治療薬または化学走化性／接触走性インヒビターを含み、一般に第2ウェル領域14aで導入され、これは細胞の生物学的試料を含有する。試験化合物をスクリーニングして、試験薬に応答した細胞の化学走化性または接触走性に影響を与えるかどうかおよびいかに与えるかについて決定される。
【０３８８】
特に本発明の実施態様の化学走化性／接触走性および／または化学侵入性測定法は、支持体メンバー16に取り付けられた上部メンバー11を含むハウジングを含む装置10が関与する。上部メンバーと支持体メンバーは、これらが一緒に別個の測定チャンバー12を画定するように作成される。別個の測定チャンバー12は、チャネル15により第2ウェル領域14aに連結された第1ウェル領域13aを含む。第1ウェル領域13aは少なくとも1つの第1ウェル13を含み、少なくとも1つの第1ウェル13のそれぞれは、その中に試験薬を受けるように改変される。第2ウェル領域14aは、装置の試験配向で第1ウェル領域13aについて横に並置される少なくとも1つの第2ウェル14を含み、少なくとも1つの第2ウェル14は細胞試料をその中に受けるように改変される。チャネル15は、第1ウェル領域13aと第2ウェル領域14aとを互いに連結する少なくとも1つのチャネルを含む。第1ウェル13に受けられた試験薬は、可溶性試験物質および／または固定化された試験生物学的分子である。試験薬が固定化された試験生物学的分子を含む時、生物学的分子は、ウェル領域13aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕ上に、並びにチャネル領域15aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕ上に固定化される。
【０３８９】
細胞の生物学的試料の非限定例には、リンパ球、単核細胞、白血球、マクロファージ、肥満細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、好塩基球、好酸球、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、ニューロン、腫瘍細胞、運動性配偶子、細菌の運動性型、および真菌、転移に関与する細胞、および炎症、損傷、または感染への応答に関与する任意の他の細胞がある。ウェル領域14aは1つのタイプの細胞のみ、または上記例のタイプの細胞の組合せを受ける。例えば上記したように、インビボ条件に似た環境をより有効に作り出すために、混合細胞集団を提供することがしばしば好ましい。ウェル領域14aはまた、特定の細胞サイクル相の細胞を受ける。例えばウェル領域14aは、G1期またはG0期のリンパ球を受ける。
【０３９０】
可溶性試験物質の非限定例には、化学誘引物質、化学的忌避剤、または化学走化性インヒビターがある。上記したように化学誘引物質は、細胞を引きつける化学走化性物質であり、いったんウェル領域14aに置かれると、細胞がウェル領域14aの方へ遊走するようにさせる。化学的忌避剤は、細胞に反発する化学走化性物質であり、いったんウェル領域14aに置かれると、細胞がウェル領域14aの方から離れて遊走するようにさせる。化学走化性インヒビターは化学走化性を阻害または停止させる化学走化性物質であり、いったんウェル領域14aに置かれると、細胞のウェル領域14aからの遊走を阻害するかまたは遊走が起こらないようにさせる。化学誘引物質の非限定例には、ホルモン、例えばT3とT4、エピネフリンおよびバソプレシン；免疫学的物質、例えばインターロイキン-2、表皮増殖因子、およびモノクローナル抗体；増殖因子；ペプチド；小分子；および細胞がある。細胞は化学走化性因子を放出することにより化学誘引物質として作用する。例えばある実施態様では、癌細胞を含む試料をウェル13に加える。異なるタイプの細胞を含む試料をウェル14に加える。癌細胞は増殖すると、化学誘引物質として作用する因子を放出してウェル14中の細胞を引き寄せてウェル13の方へ遊走させる。別の実施態様では内皮細胞をウェル13に加え、化学誘引物質（例えばTNF-αまたはIL-1）をウェル13に加えることにより活性化される。白血球をウェル14に加えると、ウェル14中の内皮細胞に引き寄せられる。
【０３９１】
化学的忌避剤の非限定例には、刺激物質、例えば塩化ベンザルコニウム、プロピレングリコール、メタノール、アセトン、ドデシル硫酸ナトリウム、過酸化水素、1-ブタノール、エタノール、およびジメチルスルホキシド；並びに毒素、例えばシアン化物、カルボニルシアン化物、クロロフェニルヒドラジン、エンドトキシン、および細菌リポ多糖；ウイルス；病原体；およびパイロゲンがある。
【０３９２】
固定化生物学的分子の非限定例には、上記の化学誘引物質、化学的忌避剤、および化学走化性インヒビターがある。固定化化学誘引物質のさらなる非限定例には、サイトカイン、ケモカイン及び小分子がある。固定化化学誘引物質のさらなる非限定例には、IL-8、GCP-2、GRO-α、GRO-β、MGSA-β、MGSA-γ、PF4、ENA-78、GCP-2、NAP-2、IL-8、IP10、I-309、I-TAC、SDF-1、BLC、BRAK、ボレキン、ELC、LKTN-1、SCM-1β、MIG、MCAF、LD7α、エオタキシン、IP-110、HCC-1、HCC-2、Lkn-1、HCC-4、LARC、LEC，DC-CK1、PARC、AMAC-1、mIP-2対象、ELC、エコソダス-3、ARC、エコソダス-1、6Cカイン、エコソダス-2、STCP-1、MPIF-1、MPIP-2、エオタキシン-2、TECK、エオタキシン-3、ILC、ITAC、BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1、MIP-2、MIP-3、MIP-4、MIP-5、RANTES、エオタキシン-1、エオタキシン-2、TARC、MDC、TECK、CTACK、SLC、リンホタクチン、およびフラクタルカイン；および他の細胞がある。化学的忌避剤のさらなる非限定例には、受容体アゴニストおよび他の細胞がある。
【０３９３】
可溶性試験物質を使用して化学走化性および／または化学侵入性測定法のような試験を行うために、まず試験装置10を作成する。本発明の装置の製造法の好適な実施態様を以下に説明する。標準的フォトリソグラフィーにより上部プレート11のネガであるマスターを作成する。所定の物質をマスターにスピンコーティングまたは射出成形する。次に所定の物質を硬化させ、マスターから剥がして上部メンバー11を作成し、支持体メンバー16上にのせる。
【０３９４】
試験装置10が化学走化性、接触走性、および／または化学侵入性装置である場合、好ましくは標準的マイクロタイタープレートフットプリントを有する硬いフレームを上部メンバー11の外周の周りに置く。ある実施態様ではゲルマトリックスをウェル領域13aに入れ、チャネル領域15a中に流す。ゲルマトリックスが硬化後、ウェル領域13aと14aから過剰のゲルを除去する。別の実施態様ではチャネル領域15aにゲルマトリックスを加えない。次に細胞の生物学的試料をウェル領域14aの中に入れ、試験薬をウェル領域13aに中に入れる。ある実施態様では細胞を活性化し測定開始を促進するために、低濃度の試験物質をウェル領域14aに入れる。あるいは試験される細胞と使用される可溶性試験物質により、細胞をウェル領域14aに入れる時または入れた後で、可溶性試験物質を導入する。拡散プロセスによりいったん可溶性試験物質が導入されたら、試験薬を含有するウェル領域13aから細胞の生物学的試料を含有するウェル領域14aに向かって、チャネル領域15aの縦軸に沿って試験物質の溶液濃度勾配が生成する。この溶液勾配の2次作用は、物理吸着された（固定化）勾配の生成である。この溶液勾配が確立されると、試験物質の溶質の一部分が支持体メンバー16上に吸着することができる。試験溶質のこの吸着層はまた、化学走化性と化学侵入性に寄与する。細胞の生物学的試料はこの濃度勾配に応答し、より高濃度の試験物質に遊走し、高濃度の試験物質から離れて遊走し、または高濃度の試験物質に応答した動きの阻害を示した。勾配に応答したこの化学走化性により、化学走化性物質の化学走化性作用が測定されることができる。化学走化性は、ウェル領域15a中の所定の点に到達するのに細胞が移動する距離と必要な時間、またはチャネル領域14a中（細胞が化学走化性物質から離れて動くようにさせる化学的忌避剤の場合）の所定の点に到達するのに細胞が移動する距離と必要な時間を測定することにより化学走化性が測定される。
【０３９５】
チャンバー12の別のデザインを含む装置10の別の実施態様を使用して、微小流体チャネル領域のネットワークを使用して溶液濃度勾配が生成される。図68に示すこの実施態様では、チャンバー12の第1ウェル領域13aは、微小流体毛細管23のネットワークによりチャネル領域15に連結された第1ウェル20、21、および22を有する。特に第1ウェル領域13aは、複数の第1ウェルと複数のサブ毛細管25（これは分岐して、複数のサブ毛細管は一端で複数の毛細管のそれぞれに連結し、他端でチャネル15に連結している）のそれぞれに連結された複数の毛細管24により連結された複数の第1ウェルを含む。第1ウェル20、21及び22のそれぞれは異なる濃度の可溶性試験物質を受ける。各第1ウェル20、21、および22に3つの異なる濃度の可溶性試験物質が同時に注入した後、連続的分離、混合、および再結合しながら溶液流はチャネル領域のネットワークに沿って移動する。分化サブ毛細管の数世代後、異なる比率の可溶性試験物質を含有する各サブ毛細管は、単一のチャネル15中に融合され、チャネル15を横切って流れ方向に垂直に濃度勾配を形成する。
【０３９６】
本発明のある実施態様では、生物学的分子は支持体メンバー16の上（好ましくは図55A〜68に示す実施態様のような、本発明の任意の1つの試験装置の実施態様のチャネル15の底部表面を構成する上部表面Ｕとウェル領域13aの上）に固定化される。生物学的分子の濃度は、装置の縦軸に沿ってウェル領域13aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面から、ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕに向かって増加または減少する。試験生物学的分子が支持体メンバー16上に固定化された後、上部メンバーは支持体メンバー16の上に置かれ、標準的マイクロタイタープレートフットプリントを有する硬いフレームが上部メンバー11の外周の周りに置かれ、細胞がウェル領域14aに加えられる。別の実施態様では、試験生物学的分子が支持体メンバー16の上に固定化され上部メンバーが支持体メンバー16の上に置かれた後、ゲルマトリックスがチャネル領域15aに加えられる。続いて細胞がウェル領域14aに加えられる。細胞の生物学的試料は固定化生物学的分子の濃度勾配に応答する可能性があり、試験生物学的分子のより高濃度に応答して試験生物学的分子のより高濃度に向かって遊走するか、試験生物学的分子のより高濃度から離れて遊走するか、または遊走が阻害される。表面勾配は、線形に、または自乗、3乗、もしくは対数関数として、またはステップアップもしくはダウンで近似できる任意の表面プロフィールで増加することができる。
【０３９７】
試験生物学的分子は付着され、K. EfimenkoとJ. Genzerの「調整可能な平面分子化学勾配を調製する方法（How to Prepare Tunable Planar Molecular Chemical Gradient）」、13 Applied Materials, 2001, No. 20, October 16；米国特許第5,514（参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載のように、当該分野で公知の種々の特異的または非特異的アプローチにより、支持体メンバー16の上部表面Ｕ上で表面勾配を生成することができる。例えばミクロ接触印刷法または他の当該分野で公知の任意の方法を使用して、支持体メンバー16の上部表面Ｕ上に、ヘキサデカンチオールを提示するSAMの層を固定化することができる。次に支持体メンバー16は、所望の勾配ミクロパターンのフォトリソグラフィーマスクにより、または白から黒への連続的勾配を有するグレイスケールマスクにより、高エネルギー光に曝露される。マスクを除去すると、ヘキサデカンチオールを提示するSAMの表面勾配が残る。次に支持体メンバー16は、エチレングリコール末端を有するアルカンチオールの溶液中に浸漬される。ヘキサデカンチオールを提示するSAMを有する支持体メンバー16の領域は生物学的分子を急速に吸着し、エチレングリコール基のオリゴマーを提示するSAMを有する支持体メンバーの領域はタンパク質の吸着に抵抗する。次に支持体メンバー16は所望の試験生物学的分子の溶液に浸漬され、生物学的分子は、ヘキサデカンチオールを提示するSAMを含有する支持体メンバー16の領域にのみ急速に吸着し、固定化生物学的分子の表面勾配を作成する。
【０３９８】
別の実施態様では試験生物学的分子は支持体メンバー16上に固定化され、例えば図55〜68に示す実施態様のような本発明の試験装置の実施態様の任意の1つの支持体メンバー16上に上部メンバー11が置かれた後に、溶液濃度勾配が生成する。この実施態様では、試験生物学的分子を含有する溶液の別個の濃度が連続的にウェル領域14a中に入れられ、非特異的に支持体メンバー16に吸着される。例えばまず、1ミリグラム／ミリリットル（mg/ml）溶液をウェル領域14aの中に置き；2番目に、1マイクログラム／ミリリットル（μg/ml）溶液をウェル領域14a中に入れ；最後に試験生物学的分子の1ナノグラム／ミリリットル（ng/ml）溶液をウェル領域14a中に入れる。溶液中の試験生物学的分子の異なる濃度は、支持体メンバー16上の異なる吸着量を与える。
【０３９９】
図65に見られるようにチャンバー12の別のデザインを含む装置10の別々の実施態様を利用して、多重平行液体流の層流の概念（当該分野で公知の方法）に基づき、固定化された生物学的分子の表面勾配が生成される。この概念に基づき、小さいレイノルズ数を有する2つ以上の流れが一緒になってレイノルズ数の小さい1つの流れになると、一緒になった流れは乱流混合することなく互いに平行に流れる。ある実施態様では、化学走化性生物学的分子の溶液が17aと19aに入れられ、タンパク質溶液は18aに入れられる。溶液はウェル領域14aで弱く吸引すると、チャネル領域15a中に流れる。生物学的分子は非特異的に表面領域に吸着され、この上で生物学的分子を含有する溶液が表面勾配を生成する。次にウェルに細胞懸濁物を充填すると、生物学的分子の濃度勾配が上昇する方向に細胞の接触走性が観察されモニターされる。一般的には、S. Takayamaら、「毛細管ネットワークにおいて多重液体層流を使用する細胞とその環境のパターン化」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96：5545−5548，May 1999を参照されたい。
【０４００】
本発明はまた、可溶性試験物質または固定化された試験生物学的分子が化学走化性と化学侵入性により大きく影響するかを調べるために可溶性の勾配及び表面勾配の両方を使用する測定法を企図する。この実施態様では、上記したように表面勾配を生成することにより測定が行われ、上記したように溶液勾配を生成することにより測定が行われ、両方の種類の勾配を生成することにより測定が行われ、すべての3つの測定の結果が比較される。組合せ勾配測定法について、試験生物学的分子は、ウェル領域13aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕ上に、およびチャネル領域15aの下にある支持体メンバー16の上部表面の上に固定化され、本発明の試験装置の実施態様の任意のもの（例えば図55A〜68に示した実施態様）で生物学的分子の濃度はチャンバー12の縦軸に沿ってウェル領域13aからウェル領域14aに向かって減少する。さらに可溶性試験物質がウェル領域13aに加えられる。かかる実施態様は、同じ方向に減少する表面および可溶性化学走化性濃度勾配を作り出す。もし組合せ濃度勾配が化学走化性および／または化学侵入性に対する相乗作用を有するなら、可溶性化学走化性物質の化学走化性リガンドに結合する細胞受容体および固定化生物学的分子に結合する細胞受容体の両方をスクリーニングするのに両方の勾配が使用される。両方のタイプの受容体は、これらの受容体を標的とする重要な治療薬として同定されるか、または治療薬の組合せ（1つは1つの受容体を標的とし、もう1つは他の受容体を標的とする）をスクリーニングすることができる。組合せ濃度勾配が相乗作用を持たないなら、化学走化性および／または化学侵入性をより強く促進する個々の勾配を同定することができ、勾配を生成する試験薬の化学走化性リガンドに結合する細胞受容体を標的とすることができる。
【０４０１】
最適の化学走化性リガンドと受容体対を同定することは、化学走化性および／または化学侵入性に関与するとされる生物学的経路の理解において、かつこれらの経路を標的とする治療薬の開発において重要である。従って本発明は一般に、細胞表面上に発現されたどの化学走化性受容体が最も強く化学走化性および／または化学侵入性に影響を与えるかを測定するために化学走化性試験薬を使用することを提供する。ある実施態様では本発明は、化学走化性および／または化学侵入性プロセスにどの受容体がより強く関与しているかを同定するために、化学誘引物質のクラス内の各化学誘引物質について細胞表面上に受容体を有する特定の細胞タイプを引きつけることが知られている化学誘引物質のクラスのハイスループットスクリーニングを提供する。この受容体を同定した後、本発明は、化学走化性および／または化学侵入性を促進することが好ましいかまたは防止することが好ましいかにより、この受容体を阻止するかまたはこの受容体に結合する可能性のある治療薬のハイスループットスクリーニングを企図する。別の実施態様では本発明は、どの化学誘引性リガンド／受容体対が化学走化性および／または化学侵入性により強く影響を与えるかを調べるために、特定の細胞タイプの表面上の同じ受容体に結合することが知られている異なる化学誘引物質のハイスループットスクリーニングを提供する。このリガンド／受容体対を同定後、本発明は、この受容体を標的とし、化学走化性および／または化学侵入性を促進することが好ましいかまたは防止することが好ましいかにより、この受容体を阻止するかまたはこの受容体を活性化する治療薬のハイスループットスクリーニングを企図する。
【０４０２】
本発明はまた、どの受容体が化学走化性と化学侵入性プロセスにより強く関与しているかを同定するために、細胞表面上の種々の化学走化性受容体を有する特定の細胞タイプの化学走化性を阻害することが知られている化学走化性インヒビターのクラスのハイスループットスクリーニングを提供する。この受容体を同定後、本発明は、この受容体を同様に阻止する可能性のある（かかる作用が所望の場合）治療薬のハイスループットスクリーニングを提供する。
【０４０３】
本発明のある実施態様では、試験化合物が癌細胞の浸潤を阻害するかどうかを調べるために測定が行われる。この実施態様では、未処理の癌細胞がウェル領域14aに入れられ、試験薬が、本発明の試験装置の任意の実施態様でチャンバー12（例えば図55A〜68に示した実施態様）のウェル領域13a中に入れられる。細胞化学走化性と浸潤が測定され記録される。適当な試験薬（癌細胞を化学的に引きつけるもの）が同定された後、チャンバー12で別の測定が行われる。以後の測定では癌細胞はウェル領域14aに入れられ、試験化合物（例えば治療薬）もまたウェル領域14aに入れられる。別の実施態様では試験化合物もまたチャネル領域15aに入れられる。ゲルマトリックスがチャネル領域15aに加えられるなら、試験化合物は、装置10の作成中にゲルがチャネル領域15aに接触する前に、ゲルマトリックスと混合することができる。最初の測定で同定された試験薬の以後の試料はウェル領域13aに入れられ、試験化合物で処理した細胞の化学走化性と浸潤は、試験化合物で処理しなかった細胞の化学走化性と浸潤と比較される。試験化合物の抗癌可能性は、処理した癌細胞が未処理の癌細胞より遅い化学走化性と浸潤速度を有するかどうかにより測定される。
【０４０４】
本発明の化学走化性および化学侵入性装置の別の使用例について、装置は炎症性応答に対する細胞の応答を測定するために使用することができる。体の組織の局所的感染または損傷は、炎症性応答の固定化された試験生物学的分子として損傷組織中に白血球を引きつける。炎症性応答は、肥満細胞、血小板、神経末端および白血球により損傷組織部位内で産生される種々のシグナル伝達分子により仲介される。これらのメディエーターのいくつかは毛細管内皮細胞に作用して、これらの隣接内皮細胞への付着をゆるめて毛細管がより透過性になるようにする。内皮細胞はまた刺激されて、血中の白血球表面に存在する特異的炭水化物を認識する細胞表面分子を発現するように刺激し、これらの白血球を内皮細胞に接着させる。損傷組織から放出される他のメディエーターは化学誘引物質として作用して、結合した白血球が毛細管内皮細胞間を遊走して損傷組織中に入るようにする。白血球の化学走化性を研究するために、ある実施態様では、チャネル領域15aが処理されて、炎症性応答中のヒト毛細血管に影響を与える状態をシミュレートする。例えばチャネル領域15aの側壁は、例えば図58Bに示すように細胞表面分子（例えばセレクチン）を発現する内皮細胞で被覆される。次に本発明の試験装置の任意のもの（例えば図55A〜68に示したもの）のウェル領域14aに白血球が加えられ、既知の化学誘引物質がウェル領域13aに加えられる。ウェル領域14aに加えることができる他の適当な細胞タイプは、好中球、単核細胞、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、または損傷または炎症への応答に関与する他のタイプの細胞である。チャネル領域15aを通過してウェル領域13aに向かう白血球の化学走化性が観察される。試験される感染のタイプに依存して、異なる範疇の白血球を使用することができる。例えば細菌感染に対する応答における細胞の化学走化性を研究する実施態様では、ウェル領域14aが好中球を受け取る。ウイルス感染に対する応答における細胞の化学走化性を研究する別の実施態様では、ウェル領域14aがＴ細胞を受け取る。
【０４０５】
血管形成プロセスをシミュレートする別の実施態様では、角膜に適用された増殖因子が、角膜の周りの高度に血管形成した組織の縁から、角膜の血管形成の少ない中心に向かって新しい血管の増殖を誘導することが当該分野で公知である。従って化学走化性および化学侵入性装置を使用する別の測定例では、角膜組織からの細胞が本発明の試験装置の任意のもの（例えば図55A〜68に示したもの）のウェル領域13aに入れられ、内皮細胞はウェル領域14aに入れられる。増殖因子がウェル領域13aに加えられ、内皮細胞の化学走化性が観察され、測定され、記録される。あるいは血管形成はまた腫瘍増殖（腫瘍マスに酸素と栄養物質を供給するために）において重要であるため、ウェル領域13aに増殖因子を加える代わりに、血管内皮増殖因子（VEGF）のような血管形成因子を産生する角膜組織からの癌細胞をウェル領域13aに入れることができ、正常な内皮細胞はウェル領域14aに入れられる。血管形成の研究に関連する異なる実施態様ではまた、修復、炎症、および組織増殖中に繊維芽細胞増殖因子を放出する肥満細胞、マクロファージ、および脂肪細胞がウェル領域13aに入れられ、内皮細胞がウェル領域14aに入れられる。血管形成の間、毛細管の新芽が周りの結合組織中に成長していくため、インビボの条件をさらにシミュレートするために、チャネル領域15aはゲルマトリックスで充填される。
【０４０６】
上記測定法にはいくつかの変法と実施態様がある。1つの実施態様は、装置10のチャンバー12のウェル領域13aとウェル領域14aを連結するチャネルの数を含む。例えば図57A〜57Cに示したような別の実施態様では、ウェル領域13aをウェル領域14aに連結する複数のチャネルがある。複数のチャネルを使用することにより、細胞の1つの生物学的試料を使用して複数の測定を同時に行うことができる。このような実施態様では、すべての測定は均一で一定の条件下で行われ、従って満足できるより正確な結果を提供する。例えば各測定は正確に同じ数の遊走細胞候補と正確に同じ濃度の試験薬とで始まる。いったん濃度勾配が生成すると、各測定は同じ期間勾配に曝露される。これらの複数のチャネルはまた、測定が失敗した時の重複となる。
【０４０７】
本発明の細胞浸潤と化学走化性測定法の他の実施態様は、例えば図55A〜68に示した実施態様のような本発明の試験装置の任意の実施態様において、チャンバー12のウェル領域14a中に細胞を入れることを含む。細胞は、ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕ上の特異的整列でパターン化されるか、または特異的なパターンも配置も無しでウェル領域14a中に単に沈積されてもよい。もし細胞が、ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕ上に特異的な整列でパターン化されるなら、装置10の作成中に好ましくはウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕはまず細胞でパターン化され、次に上部メンバー11が支持体メンバー16の上に置かれる。細胞が移動する距離と時間とを正確に測定するために、所定の「出発」点からの細胞の動きをモニターすることが好ましい。従ってある実施態様では、細胞の生存活性が維持されその位置が画定できて化学走化性と浸潤が観察できるように、第1ウェルの下の支持体メンバーの上に細胞が固定化されパターン化される。支持体メンバー上の別個の整列中に細胞を固定化しパターン化するためのいくつかの方法が当該分野で公知である。好適な方法は、同時係属出願第60/330,456号に記載されている。ある実施態様では、上部メンバー11のウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕ上の画定可能な領域中に細胞をパターン化するために、細胞位置パターン化メンバーが使用される。
【０４０８】
例えばウェル13と14がマイクロタイタープレート（示していない）のマクロウェルのサイズと形に対応するように、96ウェルマイクロタイタープレートのフットプリント中に上部メンバー11が作成されるなら、細胞位置パターン化メンバーは、ウェル13と14のサイズと形に一致する領域の輪郭を示している。輪郭を示した各領域は、そこを通して細胞がパターン化されるミクロ貫通孔を有する。細胞をパターン化するために、細胞位置パターン化メンバーは支持体メンバー16と接触され、細胞位置パターン化メンバーの輪郭を示した領域は、ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕの一部と整列させられ、最終的には上部メンバー11が支持体メンバー16に接触されると、ウェル領域14aに対応する。次に細胞は細胞位置パターン化メンバー上に沈積され、パターン化メンバーのミクロ貫通孔を介して、チャンバー12の第2ウェル領域14aに対応する貫通孔に対応する部位の下にある支持体メンバー上にろ過される。次に貫通孔14aが支持体メンバー16の領域（この中に細胞がパターン化される）の上に置かれるように、上部メンバー11は支持体メンバー16上に置かれる。これらのパターン化工程により、ウェル領域14a中で細胞の別個の整列が得られる。
【０４０９】
好ましくは細胞位置パターン化メンバーは、PDMSのようなエラストマー材料を含む。パターン化メンバーのためにPDMSを使用することは、パターン化メンバーと支持体メンバーとの間で実質的に液体で緊密な密封を与える。パターン化メンバーと支持体メンバーとの間にこのような密封が存在するなら、ウェルに入れた細胞は隣接ウェルに浸入しにくいため、この2つの成分の間の実質的に液体で緊密な密封は好ましい。パターン化メンバーのミクロ貫通孔の配置は、長方形、六角形、またはこれらの各形でパターン化される細胞を与える他の配置でもよい。各ミクロ貫通孔の幅は、パターン化される細胞のタイプと細胞の所望の数により変化する。例えば細胞とミクロ貫通孔の両方の幅が10ミクロンなら、1つの細胞のみが各ミクロ貫通孔を介して沈積するであろう。すなわちこの例では、ミクロ貫通孔の幅は100ミクロンであれば、約100個以上の細胞が沈積される。
【０４１０】
本発明はまた、本発明の試験装置の任意の実施態様（例えば図55A〜68に示したもの）のウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面上の2つ以上のタイプの細胞のパターン化を企図する。インビボでは1つのタイプの細胞が単離されて存在することはまれであり、その代わりに他のタイプの細胞と接触および連通しているため、体内の場合のような環境で細胞が測定されるシステムを持つことが好ましい。例えば、癌細胞は決して単離されて存在せず、正常細胞に囲まれているため、癌細胞に対する薬剤の影響を試験するように計画した測定法は、測定中の癌細胞が正常細胞に囲まれるなら、測定の結果はより正確となるであろう。抗癌剤を試験する場合、本発明の試験装置の任意の実施態様（例えば図55A〜68に示したもの）のウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面に、癌細胞はパターン化され、次に別のパターン化法により、癌細胞は間質細胞により囲まれる。ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面上の2つの異なるタイプの細胞をパターン化するために、上記したようにミクロ細胞位置パターン化メンバーを支持体メンバー16と接触させ、細胞位置パターン化メンバーの輪郭を示した領域をウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕの一部と整列させ、いったん上部メンバー11が支持体メンバー16と接触すると、最終的にウェル領域14aに対応する。最初のタイプの細胞は次に、細胞位置パターン化メンバー上に沈積され、ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕの一部の上にパターン化メンバーのミクロ貫通孔を介してろ過される。次にミクロ細胞位置パターン化メンバーは支持体メンバー16から除去される。ウェル13と14のサイズと形に対応する輪郭を示した領域を有するマクロ細胞位置パターン化メンバーは、従って96ウェルマイクロタイタープレートのマクロウェルのサイズと形に対応する。マクロ細胞位置パターン化メンバーはマクロ貫通孔を有する。マクロ細胞位置パターン化メンバーのマクロ貫通孔は、ミクロ細胞位置パターン化メンバーのミクロ貫通孔により画定される表面積より大きい面積を包含するが、チャンバー12のウェル領域14aにより画定される表面積より小さい。マクロ細胞位置パターン化メンバーは次に、支持体メンバー16と接触させられる。次に第2のタイプの細胞はマクロ細胞位置パターン化メンバーの上に沈積され、いったん上部メンバー11が支持体メンバー16と接触させられると、ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面Ｕの一部の上に、マクロ細胞位置パターン化メンバーのマクロ貫通孔を介してろ過される。かかるパターン化配置は、第1のタイプの細胞の周りにあり「重なる」第2の細胞のみを生じることができる。もし第2のタイプの細胞のみが第1のタイプの細胞に重なることが望ましければ、次に第1のタイプの細胞を沈積するのに使用されるのと同じミクロ細胞位置パターン化メンバーまたは第1のタイプの細胞を沈積するのに使用されるパターン化メンバーと正確に同じ構成を有する異なるミクロ細胞位置パターン化メンバーが、第2のタイプの細胞を沈積するのに使用される。細胞が支持体メンバー16上にパターン化された後、ウェル領域14aに対応する上部メンバー11中の貫通孔が���胞でパターン化された領域を包含するように、上部メンバー11は支持体メンバー16と接触させられる。これは基本的に、ウェル領域14a内で特定の整列で固定化される細胞を与える。
【０４１１】
ウェル領域14aの底面を構成する支持体メンバー16の上部表面上にいかに多くの異なるタイプの細胞がパターン化されるかに関わらず、細胞は当該分野で公知のいくつかの方法により支持体メンバー上にパターン化される。例えば細胞はSAMSを使用して支持体メンバー16の上にパターン化される。SAMを使用して細胞をパターン化するいくつかの方法が当該分野で公知であり、そのいくつかの方法の例は、Kumarらの米国特許第5,512,131号、Bambadらの米国特許第5,620,850号、Rudolphらの米国特許第5,721,131号、およびSinghviらの米国特許第5,776,748号および5,976,826号がある（参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０４１２】
前記パラメータを観察し測定するために細胞を標識する、いくつかの方法が当該分野で公知である。ある実施態様では、目的のタイプの細胞を含有する未精製試料を、種々のタイプの細胞により示差的に吸収される染色物質とともにインキュベートする。次に細胞は本発明の試験装置の任意の実施態様（例えば図55A〜68に示したもの）のチャンバー12のウェル領域14aに入れられる。次に、個々の染色された細胞は、任意の適当な顕微鏡法を使用してカラーまたは強度コントラストに基づいて検出され、かかる細胞は位置座標を与えられる。別の実施態様では、未精製細胞試料が、1つ以上の検出可能なレポーターとともにインキュベートされ、ここで各レポーターは、目的の特定のタイプの細胞に選択的に結合することができ、すべての標識細胞に特徴的な蛍光を付与する。次に試料は、本発明の試験装置の任意の例（例えば図55A〜68に示したもの）のチャンバー12のウェル領域14aに入れられる。次に試料に、適当な波長の光を照射し、蛍光性の細胞を検出し、位置座標を与える。未精製試料中の他の成分から選択された細胞を区別するための種々の方法が利用できることを、当業者は理解するであろう。例えばこれらの方法は、色素、ラジオアイソトープ、蛍光物質、化学発光物質、ビーズ、酵素、および抗体を含む。細胞タイプの特異的標識は、例えば蛍光標識抗体を使用して行うことができる。細胞を標識する方法は、特定のタイプの細胞を標識するのに使用される種々の蛍光色素とともに当該分野で公知である。
【０４１３】
選択されたタイプの細胞はまた、例えばかかる細胞に選択的および／または優先的に結合する検出可能なレポーターまたは検出可能なレポーターの選択された組合せを使用して混合細胞集団中で区別することができる。標識は、例えば発現されたCD、抗原、受容体などに選択的に結合するモノクローナル抗体を使用して行われる。腫瘍細胞抗原の例には、骨髄性細胞上に存在するCD13とCD33；Ｂ細胞上に存在するCD10とCD19；Ｔ細胞上に存在するCD2、CD5、およびCD7がある。種々の既知の細胞マーカーを同定する無数のマーカーが利用できることを、当業者は理解するであろう。さらに、追加のマーカーが絶えず発見されている。細胞を標識するのに有用なかかるマーカーは現在発見されているものも将来発見されるであろうものも、本発明の実施において使用されることができる。
【０４１４】
1つのタイプの細胞のみに絶対的に特異的なマーカーはあったとしてもほんのわずかなため、ある選択された細胞タイプを標識するのに、それぞれ異なる少なくとも2つのマーカーで標識することが好ましい。各選択された細胞タイプの複数のマーカーの検出は、化学走化性および化学侵入性分析が目的の細胞のみに限定されることを確実にするのに有用である。
【０４１５】
本発明はさらに、支持体手段；支持体手段と液体で緊密に共形接触して置かれることにより、支持体手段を有する別個のチャンバーを画定するための支持体手段に取り付けられた手段とを含む。別個のチャンバーは、少なくとも1つの第1ウェルを含む第1ウェル領域；少なくとも1つの第2ウェルを含む第2ウェル領域（ここで第2ウェル領域は装置の試験方向で第1ウェル領域と横に並置される）；および第1ウェル領域と第2ウェル領域とを互いに連結する少なくとも1つのチャネルを含むチャネル領域とを含む。支持体手段の実施態様は、図55A、55B、66および67に示す支持体メンバー16を含み、一方支持体メンバーに取り付けられた手段の実施態様は、図55A〜65、67および68に示した上部メンバー11を含む。他のかかる手段は、当業者に公知であろう。
【０４１６】
前記より、本発明の新規概念の精神と範囲を逸脱することなく、多くの修飾と変更が可能であることを理解されたい。例えば本発明の装置の異なる例を組合せてもよい。本発明の実施態様はさらに、異なる種類の測定法、例えば試験薬が化学走化性物質の代わりに緩衝液を含む測定法も企図する。かかる測定法において、チャネル領域15aを介する細胞の遊走は、化学走化性勾配の非存在下で観察される。
【０４１７】
本開示は本発明を例示することが目的であり、記載された例は発明を記載の具体例に限定するものではないことを理解されたい。本開示は、添付の特許請求の範囲により、その精神と範囲内のすべてのかかる修飾を包含するものである。
【０４１８】
別の実施態様では本発明は、勾配生成および／または流れ条件に依存するかまたはこれに反応する生物学的現象を測定し研究する方法を提供する。かかる生物学的現象は、体内の多くのプロセス、例えば白血球接着とローリング中に起きるような細胞−表面相互作用がある。さらに、化学走化性、接触走性、および細胞遊走を含む研究は、勾配および／または流れ条件の存在下でかかる細胞の動きを研究することができる測定法により、よりよく行われるであろう。
【０４１９】
生物学的システムの研究には種々のタイプの勾配が有用である。かかる有用な勾配には静的勾配があり、これは濃度が固定され設定されているか、または実質的に固定され設定されている。静的勾配の1つの例は、表面上に固定化された分子の勾配である。静的勾配の非限定例は、異なる濃度の固定化生物学的分子（タンパク質、抗体、核酸などを含む）または固定化化学成分（薬剤および小分子）の使用を含む。他の有用な勾配には動的勾配があり、これは変化してもよい濃度を有する。動的勾配の1つの例は、変化する濃度で分子を有する液体の流れの勾配である。液体勾配の非限定例には、変化する濃度の生物学的分子（例えば、増殖因子、毒素、酵素、タンパク質、抗体、炭水化物、薬剤または他の化学物質および小分子）を含有する液体流れの使用がある。
【０４２０】
本発明のある実施態様において、動的／溶液ベースの勾配は層流法により作成される。層流技術は典型的には、2つ以上の異なる供給源からの2つ以上の液体流を含む。これらの液体の流れは一緒にされて単一の流れとなり、乱流混合せずに互いに平行に流れるようにされる。異なる特性を有する液体（例えば変化する低レイノルズ数）は並んで流れ、乱流が無いと混合しない。これらの液体は混合しないため、これらは偽チャネルを形成する（液体間に物理的分離が無いという事実のために偽）。溶液と表面の勾配の作成は、米国特許出願第2002/0113095号、および論文 Jeon, Noo Liら、Langumuir, 16, 8311-8316 (2000)で考察されている。これらの文献の両方とも参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２１】
これらの文献において毛細管の微小流体ネットワークを介する勾配を作成するために、PDMS微小流体装置が使用された。異なる化学物質を含有する溶液を、3つの別個の入口に導入し、毛細管のネットワーク中を流させた。液体流を繰り返し組合せ、混合し、分離することにより、分岐チャネルのそれぞれに明確な組成物を有する明確な混合物が得られた。すべての分岐を一緒にして、流れ方向に垂直な出口チャネルを横断する濃度勾配を確立した。図86を参照されたい。
【０４２２】
本発明の装置を動的勾配の形成と組合せて、装置の任意の部分を改変することにより膨大な数の測定パラメータを生成することができる。例えば開示された装置を細胞パターン化法と組合せることにより、動的勾配の導入とともに、無数の生物学的相互作用を試験するための種々の条件を作成することができる。さらに多くの細胞や生物学的材料は、インビボで存在して勾配や流れ条件に曝露されている時と比較して、勾配に曝露されていない時は、エクスビボで異なる挙動をするため、装置と測定法は薬物発見と薬物試験に有用かも知れない。
【０４２３】
従って本発明の実施態様では、細胞はチャネルを横切ってパターン化される。細胞パターン化は当該分野で公知の方法および本明細書に開示の方法（例えば特に限定されないが、ミクロ接触印刷またはエラストマーステンシルの使用）により行われる。次に所望の生物学的分子または化学物質／薬剤を含有する溶液は、パターン化細胞に流すことができる。さらに細胞は、まずアクチベーターのような生物学的分子により処理して生物学的システムにより近く再生し、次に化学物質または薬剤に曝露することができる。勾配（例えば層流）を作成することにより、異なる量の生物学的分子または化学物質／薬剤をパターン化細胞に与え、各生物学的分子または化学物質／薬剤を同時に互いに試験することができる。これは同時比較により、測定条件の変動を低減させることができる。
【０４２４】
本発明の装置と組合せて層流を有する動的勾配を作成すると、無数の測定法の構成が得られる。例えば表面上の細胞、チャネル中の生物学的分子、およびチャネル中の化合物の組合せを変えることにより、非常に多数の測定法を作成することができる。
【０４２５】
固定化細胞または他の固定化生物学的分子（例えば、タンパク質、抗体、核酸など）について、異なる測定構成が可能である。ある実施態様では1つのタイプの細胞が全チャネル領域に固定化される。別の実施態様では、細胞タイプの混合物が1つの領域に1つのタイプの細胞で固定化される。別の実施態様では、細胞タイプの混合物が全チャネル領域に固定化される。これは、細胞−細胞相互作用をモニターするのに有利である。さらに別の実施態様では、異なるタイプの細胞がそれぞれ異なる領域に固定化される。
【０４２６】
種々の固定化法以外に、チャネル中に存在する生物学的分子の周りにさらなる測定法設計の柔軟性がある。例えばある実施態様では、各チャネル中に同じ濃度で1つのタイプの生物学的分子が存在する。別の実施態様では、1つのタイプの生物学的分子が各チャネルに異なる濃度で存在する。別の実施態様では、異なる生物学的分子が各チャネルに存在する。別の実施態様では、各チャネルに生物学的分子の混合物がある。各チャネルは同じ混合物または異なる混合物を有してもよい。混合物が同じである場合、異なる生物学的分子の比または濃度は各チャネルで異なる。
【０４２７】
同様に薬剤または試験物質のような化合物について、本発明は測定法設計の柔軟性を提供する。例えばある実施態様では、1つの化合物がすべてのチャネルに同じ濃度で存在する。別の実施態様では、同じ化合物がすべてのチャネルに存在するが、各チャネルは異なる濃度の化合物を有する。別の実施態様では、各チャネルは異なる化合物を有する。別々の実施態様では、2つ以上の化合物がある。2つ以上の化合物がある場合は、各チャネルは化合物の同じ混合物を有するかまたは化合物の異なる混合物を有する。さらに、化合物の混合物が同じなら、各チャネルは異なる濃度のその混合物を受ける。さらに各チャネルは化合物の混合物を受け、各チャネルは互いに異なる比の化合物を有する。
【０４２８】
かかる測定系は、多くの無数の生物学的相互作用、細胞または他の生物学的分子に対する化学物質または薬剤の作用を試験するのに使用される。例えば固定化生物学的分子を流れる低濃度から高濃度で存在する化合物の層流勾配を使用して、化合物のIC50を測定するために本発明の装置と測定法を使用してもよい。
【０４２９】
本発明はまた、薬物発見の前臨床段階を人体に適応させる能力を提供する。本発明の装置と測定法を使用して、患者プロフィールが作成され分析される。プロフィールを作成するのに、好ましくは初代細胞が使用される。
【０４３０】
本明細書において「初代細胞プロフィール」は、ヒト対象から採取し初代培養で増殖させた細胞に関する細胞の動的および表現型情報の組合せを意味する。本発明は、ドナー患者の初代細胞インビボ条件に初代細胞プロフィールを模倣させる種々の培養条件と測定法下で、初代細胞の表現型または動態の定量を企図する。初代細胞プロフィールは好ましくは、患者の初代細胞の形態、分子マーカー発現パターン、選択的活性化の状態、そのローリングと接着性、遊出能力および／またはその化学的、接触走性および化学侵入性をモニターする方法を使用して、細胞の表現型と動態を測定することにより決定される。図88と89。これらの方法は本明細書に開示される。
【０４３１】
本明細書に開示の技術は、広範囲の初代細胞タイプに容易に適応可能であるが、好適な初代細胞は白血球である。初代白血球プロフィールを確認するために使用される分子マーカー候補には、特に限定されないが、CD14、CD11（MAC-1）、およびCD62（L-セレクチン）がある。他の白血球マーカーには、Ｔ細胞抗原、CD1、CD2、CD58（LFA-3）、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、LeuCAM、CD11a (LFA-1)、CD11b、CD11c (CR4)、CD16 (FcR111)、CD21 (CR2)、CD23 (FCeR11)、CD25、CD30、CD35 (CR1)、CD41、CDS1、CD44、Mel-14、GRHL1、Mel-14、CD49a-f (VLA-1)、VLA-2、VLA-3、VLA-4、CD56、NKH1、CD71がある。図89を参照されたい。
【０４３２】
別の実施態様では本発明は単核細胞を利用する。さらに別の実施態様ではこの方法は、測定単位当たり約25,000〜約50,000個の単核細胞を使用する。図92。
【０４３３】
初代細胞プロフィールはまた、本明細書に開示の白血球遊走をモニターする方法から得られた情報を含む。本明細書に教示される方法は、培養白血球について活性化、ローリング／接着性、および遊出の確認、定量およびモニタリングに関する情報を提供する。
【０４３４】
初代細胞プロフィールはまた、本明細書に開示の細胞の化学走化性、接触走性および化学侵入性の確認、定量およびモニタリングに関する情報を提供する。特に本発明は、特定の点まで移動する細胞の細胞形態、細胞の動き、移動した距離と細胞数の変化を視覚化し定量するための、当該分野で公知の任意のシステムの使用を企図する。従って本発明は、化学走化性、接触走性、および化学侵入性の「リアルタイム」および「終点」分析の両方を企図する。
【０４３５】
本発明の1つの側面は、薬理学的治療法を対象患者から得られる初代細胞プロフィールと関連付けるための方法に関する。図88と89を参照されたい。本明細書に開示の方法から、初代細胞試料に基づくプロフィールは、容易に得られ、診断目的にまたは特定の治療法の効力を確認するために、健常者または疾患者から得られる以前のプロフィールと関連付けられる。例えば病態マーカーおよび分子マーカーの状態を含むプロフィールが測定され、疾患者と健常者が比較される。図88と89。これらは、白血球数の増加、活性化マーカーの変化、生化学的項目のアップレギュレーションとより強いシグナルを有する健常者に対する疾患者を示す。
【０４３６】
本発明の別の側面は、初代細胞プロフィールを撹乱する能力を測定することによる試験化合物の生物活性の試験に関する。特定の疾患について細胞培養ベースの測定法がインビボの細胞の状態に似ているほど、その疾患を治療するための薬剤候補を同定するのに測定法はより有効であろう。従来ヒト要素は、薬物発見／開発プロセスの臨床段階でのみ導入されてきた。しかしながら、本発明は薬物発見の前臨床段階をヒトに適合させることを視野に入れる。すなわち本発明者らは、ヒト要素を標的評価、リード化合物の最適化、およびADMETox段階に取り込む。図87を参照されたい。例えばこの方法は、薬理学者がその標的の一群の測定法に対する個体中の候補薬物のIC50プロフィールを容易に得ることを可能にする。これは、細胞のインビボの化学的および機械的環境を模倣する初代細胞培養物と細胞培養条件を作り出すことにより行われる。図93〜101を参照されたい。
【０４３７】
本発明のこの側面の1つの実施態様は、複合細胞培養物について初代細胞のインビボでの化学的および機械的環境を模倣する細胞微小環境を作り出す。図93。例えば神経細胞は、パターン化表面化学に基づいて基材上の所定の整列で増殖される。別の実施態様では内皮細胞が、管腔を形成するように内皮細胞足場を作成するように培養され、白血球遊走をモニターし内皮細胞活性化を測定するために剪断力に曝露される。
【０４３８】
ある実施態様では神経細胞は、パターン化表面化学に基づいて基材上の所定の整列で増殖される。図102。別の実施態様では、肝細胞と繊維芽細胞とを同時培養することにより制御された細胞微小環境が作成される。さらに別の実施態様では、非癌細胞と癌細胞とを同時培養することにより制御された細胞微小環境が作成される。
【０４３９】
本発明のこの側面の好適な実施態様では、細胞は白血球である。別の実施態様では試験化合物は抗炎症剤である。
【実施例】
【０４４０】
実施例1：細胞遊走測定プレートの作成法
複数のポストを有する局所的パターン化マスターをフォトリソグラフィーマスクから作成する。これらのポストはそのバックグラウンドから約100μm高い。ある実施態様ではパターンは、それぞれが500μm中心間隔の200μmのポストの円形整列を含む24のマイクロ領域からなる。あるいはポストの別個の領域を有する代わりに、マスターの全表面がポストを有してもよい。好適な実施態様ではマスターは、150mmシリコンウェーハー上にパターン化されたフォトレジストから作成される。このマスターを作成するために、1300rpmで遠心分離したSU-850nフォトレジストを使用し、業者の規格に従って処理した。
【０４４１】
2成分ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）プレポリマー（Gelest Optical Encapsulant 41）を混合し、真空下で脱気した後、マスター上に遠心分離した。ポリマー膜を製造するのに充分な高速でスピンコーティングを行った（すなわち、生じるPDMS膜の厚さは、マスター上の隆起の厚さより小さい）。プレポリマーを2250rpmで40秒間遠心分離した。次に標準的マイクロタイターフットプリントを有する硬いフレームを膜の外周のまわりに置いた。そして、マスター／膜／フレームをホットプレート109の上に置き、PDMSを95℃で7分間硬化させた。
【０４４２】
マスターが室温まで冷却後、一群の24個の硬いプラスチックリングに液体PDMSの薄膜で「墨入れ」した。このリングを次にマスター上のポスト列の周りに置き、全アセンブリーを再度ホットプレート100の上に置き、95℃で2分間加熱した。
【０４４３】
最後の作成段階は、リング間の領域をPDMSで充填して装置のバルクを作成することを含んだ。ここでPDMSをシリンジを使用してリング間のスペースに射出した。この時点で部分的に硬化したリング上のPDMS「インク」は、膜領域へのPDMSの漏れを防いだ。マスターを再度95℃のホットプレート100の上に置き、PDMSを30分間硬化させた。
【０４４４】
マスターから硬化した装置を取り出すために、上部表面をまずエタノールの薄い層でカバーすると、これは迅速にPDMSを湿潤化させた。とがっていないナイフを使用して、フレーム内部とポリマーの間の界面を切断し、これによりフレームがマスターから除去された。フレームがそのままで装置が取り出されるが（すなわちフレームは最終的装置の一部になる）、この例ではフレームは成形目的にのみ使用した。
【０４４５】
次に装置をエタノールの薄い層（粘着を防ぐため）で再度カバーし、マスターから手で剥がした。除去してから、装置をエタノールで1回すすぎ、次に窒素ガスで乾燥させ、溶媒留去のために65℃オーブン中に置いた。次に装置をポリスチレン皿で保存し、これは細胞の動きを試験するための支持体として随時使用した。
【０４４６】
実施例2：支持体上の細胞のパターン化
この例では、第1の層150とかみ合わせたステンシルのマクロウェルと支持体にPBSを満たし、2分間真空をかけて気泡を除去した。次に支持体をフィブロネクチン（50mg/ml）または他の細胞外マトリックスタンパク質で30分間処理し、次にPBSで2回洗浄した。PBSを吸引後、細胞を新鮮な加温培地上に5〜25×103 細胞/cm2で蒔いた（＝24ウェルプレート100のマクロウェル当たり1〜4×104 細胞、マクロウェル当たり300mlの容量；または2mlの容量で35mmの皿当たり5〜25×104細胞）。細胞は第1の層のマイクロオリフィスを介して沈積し、支持体に付着する。
【０４４７】
細胞が支持体に付着後（30分間〜2時間）、各マクロウェル中の細胞培養培地を新鮮な培地で置換する。細胞を37℃インキュベーター中で2時間〜一晩広げておく。細胞をPBSで洗浄し、目的の処理を含む培地をウェルに加える。次にステンシル／第1層を取り出し、細胞の動き、細胞の形または生存活性に対する試験化合物の影響を観察する。
【０４４８】
実施例3：画像取得
以下を備えた倒立顕微鏡を使用して画像化を行う：エピ蛍光、電動式プログラム可能なステージ、自動焦点機構、およびCCDカメラ。マクロウェル1つについてランダムに選択した3つの領域のうち2つを画像化する。ステージを1つのマクロウェルから次のマクロウェルに移動させ、自動フォーカス（Ｚ軸）を使用して画像の焦点を合わせる。画像は位相差又はエピ蛍光のいずれかで捕捉した。
【０４４９】
取得した画像は共通の名前であるが、マクロウェルの番号と位置に対応する異なる添え字を付けた。例えば1つのマクロウェル当たり1つの画像を取った時、24ウェルを用いるTESTとよぶ実験はTEST01-TEST24とした。画像を作成した後、試験化合物または他の外部刺激物質を処理後種々の時点で適用した。
【０４５０】
実施例4：データ解析
以下の順序で情報を処理するソフトウェアを使用して、自動データ解析を行った：a)連続的にファイルを呼び出す；b)細胞を特定する（閾値作成、浸食、勾配対比などの種々の方法を使用して）；c)クラスタリングアルゴリズムを使用してクラスター中の細胞を画定する；d)関連パラメータを測定する。関連パラメータの一部は細胞クラスターまたはマイクロ領域に基づく：外周、直径、表面積、単位面積当たりの細胞カバー率、外周対表面積比、および他のパラメータ。データ解析は、これらの任意のまたはすべてのパラメータを細胞の動きに関連付けることができる。最後のデータセットは、多重パラメータの標準化平均に基づくか、または1つの特定のパラメータは生物学的観察に基づく。
【０４５１】
実施例5：3T3/タキソール
支持体とかみ合わせたステンシルのマクロウェルオリフィスにPBSを充填し、2分間真空をかけて気泡を除去する。NIH-3T3繊維芽細胞（緑の細胞トラッカーであらかじめ標識、CMFDA、モレキュラープローブズ（Molecular Probes））をDMEM/10％仔牛血清に集め、マクロウェルに2×104細胞/cm2の濃度で蒔く。1時間後、非接着細胞を新鮮な培地で洗い流す。一晩インキュベーション後、増加する濃度のパクリタキセル（シグマ（Sigma）、0.1〜10mg/ml）を含有する新鮮な培地をウェルに加え、ステンシルを剥がす。対照細胞を未処理のままにする。遊走する細胞の画像を0〜24時間の時点で取る。
【０４５２】
実施例6：MS1とSVR中のファルネシルトランスフェラーゼ阻害
本発明の定性的細胞遊走測定プレートは生物学的経路（例えばRAS経路）の研究に有用である。この測定法は種々の代謝経路の研究を可能にし、細胞の動きまたは細胞の形に対する薬剤または生物学的物質（例えば細胞の遊走および／または運動性のインヒビター）の影響の分析を可能にする。RAS（グアニンヌクレオチド結合タンパク質）は、正常および形質転換細胞増殖の制御に重要な役割を果たす。種々の増殖因子やサイトカインで刺激すると、RASは下流のいくつかのエフェクターを活性化して、遺伝子転写と増殖を引き起こす。多くの癌では（膵臓癌の90％と結腸癌の50％）ras遺伝子突然変異が、活性状態のままとどまる変異RASを産生し、これは制御されない増殖シグナルを送る。RAS経路については多く（その阻害法を含む）がわかっている。例えばファルネシルトランスフェラーゼは、膜局在化においてRASを助けると考えられるため、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビターは細胞膜を標的とするRASを阻害する）。さらに下流のエフェクターであるP13-KとMAPKを阻害することができ、こうしてRASの作用を阻害する。
【０４５３】
標準的プロトコールを使用して、MS1（Ｔ抗原不死化内皮細胞、ATCC）とSVR（MS1のH-ras過剰発現誘導体、ATCC）をマクロウェルにDMEM／5％胎児牛血清中それぞれ12×103と6×103細胞/cm2の密度で蒔いた。1時間後、付着しなかった細胞を洗い流し、細胞に新鮮な培地を補充した。培地にはファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（FTI-277、カルビオケム（Calbiochem））も10mmの濃度で加えた。細胞を新鮮な培地中で37℃と5％CO2のインキュベーター中で一晩培養した。実験の開始時、支持体上のステンシル／第1層を除去して細胞の遊走をさせた。異なる時点（0時間と4時間目）に画像を取り、細胞の動きに対するFTI-277の作用を分析した。図21はMS1とSVR細胞においてファルネシルトランスフェラーゼ阻害を示す測定の結果を絵で示す。対照細胞は、FTIで処理した細胞より、元々の出発点から遠くに遊走したことがわかる。図22は、図21に示すものと同じ測定結果をグラフで示す。
【０４５４】
図23は、RAS経路のいくつかのインヒビターの作用を測定した結果を示す。グラフは、種々のインヒビター（P13-K、MAPK、およびこれらの混合物）は細胞の島の直径に影響を与えることを示す。測定は、0、2、4、6および8時間と増加させて行った。経時的に対照細胞は、インヒビターで処理した細胞よりも大きな直径の増加を示した。グラフは、併用療法が細胞の動きに対してより大きな影響を有することを明らかにする（細胞の動きが少なくなると直径の増加が小さくなった）。
【０４５５】
実施例7：マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害による腎細胞の動きの阻害
2つの腎細胞株を使用して、細胞の動きに対するマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）阻害の影響を調べた。標準的プロトコールを使用して、100 769-P細胞（腎癌、ATCCより購入）とHK-2（ヒトの腎臓からの近位尿細管、ATCCより）を定性的細胞遊走測定プレートに蒔いた。
【０４５６】
細胞を付着させて8時間広げ、ステンシルと第1層とを除去し、MMPインヒビター（GM6001、カルビオケム（Calbiochem））を種々の濃度で加えた。以下のデータは、MMP阻害が769-Pの細胞の動きを低下させるが、HK-2細胞株には何の影響も無いことを示す。定性的細胞遊走測定プレートとベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）のトランスウェル（6ウェル、8ミクロンの孔）を使用する従来の運動性測定法と比較すると、定性的細胞遊走測定プレートデータはトランスウェルデータに匹敵することを示した。図23を参照、これはCMAからのデータが細胞の動きのより高感度の測定であることを示す。
【０４５７】
実施例8：微小管実験
細胞の動きと細胞分裂には微小管形成が必要である。一般的な抗癌剤（例えば、コルヒチン、ノコダゾール、ビンブラスチンおよびパクリタキセル）は、細胞の微小管に作用することにより細胞の動きと遊走に影響を与えることが知られている。コルヒチン、ノコダゾール、およびビンブラスチンは、細胞の正常なチュブリン平衡を破壊する。これらの薬剤は、細胞質中に存在するチュブリンを「拘束」する。これは、微小管中に存在するチュブリンの分解を引き起こし、細胞質に再度入って平衡を再確立させる。これらの薬剤はまた、微小管上の結合部位と相互作用して微小管形成を破壊し、これらを分解する。
【０４５８】
複数のオリフィスを有する第1層150を支持体140に適用した。前に開示した標準的方法を使用して、タンパク質の吸着と細胞の接着に対してオリフィス（100mMの直径の孔、500mM離れる）を不活性にした：末端がエチレングリコール基であるシランをPDMS装置の表面と共有結合的に反応させた。ステンシルをPBSで3回洗浄し、2分間真空をかけて気泡を除去した。肺からのヒト微小血管内皮細胞（HMVEC-L、クローンティクス／バイオウィタカー（Clonetics/Biowhittaker））をステンシルのマクロウェルに5×103細胞/cm2の密度でプレートの増殖培地（EGM、クローンティクス／バイオウィタカー（Clonetics/Biowhittaker））中に接種し、初期付着時間30分間〜1時間後に洗浄した。膜中で一晩インキュベーション後、細胞を以下の微小管破壊物質で処理した：ノコダゾール（10mg/ml）、コルヒチン（10mg/ml）、ビンブラスチン（10mg/ml）、またはパクリタキセル（10mg/ml）。対照細胞は未処理のままとした。次に2つの異なる実験を行った。最初の実験では、ステンシルのマクロウェル内に維持しながら、細胞を化合物で処理した。2時間処理後、細胞を画像化し、ステンシルを剥がし、細胞を冷メタノール（−20℃）で10分間固定し、PBSで3回洗浄した。アルファチュブリンに対するモノクローナル抗体（1：100希釈、DM1a、シグマ（Sigma））、次にFITC結合ヤギ抗マウス抗体（25mg/ml、ロックランドイムノケミカルズ（Rockland Immunochemicals））とDAPI（3mg/ml、シグマ（Sigma））を使用して免疫蛍光染色を行って、核を染色した。染色した細胞にフルオロマウント（Fluoromount）G（サザンバイオテクノロジーアソーシエーツ（Southern Biotechnology Associates））とともにカバーガラスをのせ、ツァイス（Zeiss）蛍光顕微鏡で画像化した。
【０４５９】
第2の実験では、コンパウンド添加時にステンシルを剥がした。処理の2時間後、1セットの試料を固定し、前記したように染色した。別のセットの試料は処理コンパウンド中でそのままにし、経時的に画像化して細胞の動きをモニターした。画像は0、2、4、8および24時間目に取った。ImageProrPlus画像化ソフトウェアを使用して、マイクロ領域の平均直径を取って細胞の動きを測定した。
【０４６０】
実施例9：
Ｉ．白血球遊走を追跡するための装置の作成法
フォトリソグラフィーを使用して本発明の装置のマスターを作成する。適当なフォトレジストを使用して上部メンバーのネガパターンに基づき、シリコーン基材をパターン化する。次にポリジメチルシロキサン（PDMS）をマスターの上に注ぎ、真空下に置いてそこから気泡を取り出す。こうして注いだPDMS層を約30℃のオーブン中で約17時間硬化させる。次に装置を2％ ミクロ-90（インターナショナルプロダクツ社（International Products Corp.））で完全に洗浄し、「音波浴」中で70℃で10分間すすぎ、脱イオン水ですすぎ、次に100％エタノールですすぐ。次にPDMS層を窒素下で乾燥させる。同時にプレクリーンガラススライド（例えば、約4.9113±0.004インチ×約3.247±0.004インチの寸法で厚さが約1.75ミリメートル（mm）の長方形スライド）をエタノールで3回洗浄し、メタノールで2回洗浄する。好ましくはPDMS層と結合されるガラススライドの表面は一緒に約84秒間プラズマ酸化する。次にPDMS層とガラススライドをピンセットではさんで押しつけ、その間のエアポケットを追い出す。こうして上部メンバーとしてのPDMS層と支持体メンバーとしてのガラススライドの間で液体で緊密な共形接触が確立される。さらに上部メンバー材料として使用されているPDMSのおかげで、PDMS層とガラススライドの間の共形接触は可逆的である。
【０４６１】
上記の本発明の装置の作成法は単に例示目的であることに注意されたい。装置の作成法の1つの例は、前記した「試験装置とその作成方法」という標題の同時係属出願に記載されている。
【０４６２】
実施例10：
II. ローリングメディエーターがその中のチャネル中に配置された本発明の装置を使用する白血球遊走測定法
A. 白血球の単離
健常ボランティアからの5ミリリットル（ml）のヒト血液から好中球を単離する。5mlの血液をハンクス液（HBSS）で1：2の比率で希釈して、血液の総量を15mlにする。全血液希釈物を10mlのフィコールパークプラス（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Amersham Pharmacia Biotech AB）から得られる、カタログ#17-1440-02）上に重層する。次に血液を400ｇで室温で30分間遠心分離する。ペレットを乱さないように上清を吸引除去する。ペレットを10mlのHBSSに再懸濁し、150μlの6％デキストランで1％溶液を作成する。赤血球を室温で少なくとも1時間沈降させる。好中球は上清中に残り、赤血球はほとんど沈降してペレットを形成する。上清をピペットで取り、HBSSを使用して1：2に希釈する。この懸濁液を600ｇで10分間遠心分離する。上清を吸引し、ペレットを19mlの脱イオン水に溶解する。1分後、ペレットを1mlの10×PBSに再懸濁する。この懸濁液を400ｇで10分間遠心分離する。この操作で赤血球は溶解し、残る細胞はほとんど好中球である。得られるペレットをBSAを含有する培地に溶解して、室温で長時間後の細胞の凝集を避ける。血球計算器を使用して細胞数を計測して細胞密度を測定する。
【０４６３】
B. 白血球と白血球遊走メディエーターをチャンバーに入れる
セクションＩに開示した方法に従って作成した装置のチャンバーの第1のウェルに20μlの水をピペットで入れると、毛細管作用により水がチャネル中に引かれる。チャネル中に気泡が残っていないことを確認後、追加の10μlの水をピペットでチャンバーの第2のウェルに入れる。15分経過後、静水圧が平衡化し、50μg/mlの濃度の10μlのP-セレクチン（アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）、カタログ#ADP3）をピペットで両方のウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをしたプレートで2時間インキュベートする。インキュベーション後、チャネルをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を使用して4回洗浄する。最後の洗浄後、チャネル内にわずかに液体を残してウェル内のすべての液体をピペットで取り出す。20μlのPBS中0.1％BSAを第1ウェルに加え、10μlのPBS中BSAを第2ウェルに加える。15分経過後、静水圧が平衡化し、60μlの培地中のパートAに記載の方法により得られた好中球を各チャンバーの第1ウェルに加える（24ウェルプレートの1ウェルについて約103〜約106細胞、1ウェル当たり60μlの培地容量）（非標識および蛍光標識単核細胞株-U937（ATCCから得られる、カタログ#TIB-202）とTHP-1（ATCCから得られる、カタログ#CRL-1593.2）ならびに他の初代白血球も使用されることができる。図7に示すように、通常の生理学的条件下で流速の範囲（約0.1ダイン/cm2〜約20ダイン/cm2）を作成するために、40μl〜60μlの培地を使用することが好ましい。
【０４６４】
C. データ取得
白血球を含む試料を第1ウェルに加えた15秒後に開始して、アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。5分15秒間30秒毎に経時的に画像を取る。10×対物レンズを使用して、チャネルに沿ってローリングする細胞の数を観察し記録する。
【０４６５】
D. 白血球のローリング速度の測定
特定の時間の白血球のローリング速度を性状解析するために、パートCに記載の方法を使用して得られた画像を使用して、画像の露出時間の間に白血球が移動した距離を測定する。ローリング速度（V）を測定するために、以下の式が使用される：
Ｖ＝ｃ（l時間／t露出）、ここで
ｃ：細胞が移動した実際の距離を測定するための変換因子。この因子は画像毎に変わる。
l時間：捕捉画像中の白血球遊走の長さ。
t露出：画像の露出時間。
好ましくはt露出は、流速が約0.1ダイン/cm2〜約20ダイン/cm2の時、100ミリ秒（ms）である。
【０４６６】
実施例11：
III. その中のチャネルにローリングメディエーターと停止メディエーターが配置された本発明の装置を使用する白血球遊走測定法
A. 白血球の単離
好中球は、セクションIIのパートAに記載の方法に従って単離する。
【０４６７】
B. チャンバー中に白血球と白血球遊走メディエーターを入れる
セクションＩに開示した方法に従って作成した装置のチャンバーの第1ウェルに、ピペットで20μlの水を入れる。毛細管作用により水がチャネル中に引かれる。チャネル中に気泡が残っていないことを確認後、追加の10μlの水をピペットでチャンバーの第2ウェルに入れる。15分経過後、静水圧が平衡化し、50μg/mlの濃度の10μlのP-セレクチン（アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）、カタログ#ADP3）をピペットで第1ウェルに入れ、50μg/mlの濃度の10μlのICAM-1（アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）から得られる）をピペットで第2ウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをしたプレートで2時間インキュベートする。インキュベーション後、チャネルをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を使用して4回洗浄する。最後の洗浄後、チャネル内にわずかに液体を残してウェル内のすべての液体をピペットで取り出す。20μlのPBS中0.1％BSAを第1ウェルに加え、10μlのPBS中BSAを第2ウェルに加える。15分経過後、静水圧が平衡化し、60μlの培地中のパートAに記載の方法により得られた好中球を各チャンバーの第1ウェルに加える（24ウェルプレートの1ウェルについて約103〜約106細胞、1ウェル当たり60μlの培地容量）（非標識および蛍光標識単核細胞株-U937とTHP-1、ならびに初代白血球も使用される）。図48に示すように、通常の生理学的条件下で流速の範囲（約0.1ダイン/cm2〜約20ダイン/cm2）を作成するために、40μl〜60μlの培地を使用することが好ましい。
【０４６８】
C. データ取得
白血球を含む試料を第1ウェルに加えた15秒後に開始して、アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。5分15秒間30秒毎に経時的に画像を取る。10×対物レンズを使用して、チャネルに沿ってローリングしチャネルに接着する細胞の数を観察し記録する。
【０４６９】
実施例12
IV. 内皮細胞のコンフルエント層を使用する白血球遊走測定法
A. 白血球の単離
好中球は、セクションIIのパートAに記載の方法に従って単離する。
【０４７０】
B. チャンバー中に白血球と内皮細胞を入れる
セクションＩに開示した方法に従って作成した装置の第1ウェルに、10μlの10×希釈マトリゲル（登録商標）（ビーディーバイオサネンス（BD Bioscience）から得られる、カタログ#356231）を加える。10μlを第1ウェルに入れると、毛細管作用により溶液がチャネル中に引かれる。次にマトリゲルを室温で約15分間ゲル化させる。別の選択肢は、0.1％ BSA溶液を使用してフィブロネクチンの原液濃度を希釈して得られる1mg/ml濃度のフィブロネクチン（ギブコビーアールエル（Gibco BRL）から得られる、カタログ#33016-015）でチャネルを被覆することである。1mg/mlの濃度のフィブロネクチン5μlをピペットで第1ウェルに入れると、毛細管作用により溶液がチャネル中に引かれる。
【０４７１】
チャネルがマトリゲル（登録商標）またはフィブロネクチンで被覆されたら、接種のために内皮細胞を調製する。細胞は／バイオウィタカー（Biowhittaker））のクローンティクス（Clonetics）から低温バイアル中で得られる。これらを0.025％トリプシン／EDTAを使用して分離できるようになるまで、T75フラスコ中で増殖させる。細胞をチャネルに1測定につき5μlの培地で1×105細胞の密度で接種して約2日間内皮細胞のコンフルエント単層を形成させる。この2日間に、内皮細胞に40μlの新鮮な培地を各ウェルに加える。約2日後、内皮細胞を1ng/mlのTNF-α（または他のケモカインもかわりに使用できる）に37℃で4時間曝露させる。4時間の終了時、TNF-αを60μlの新鮮な培地で2回洗浄する。各ウェル内の培地の容量を15μlの新鮮な培地で置換する。60μlの培地中のセクションIIのパートAから単離した好中球をチャンバーの第1ウェルに加える（24ウェルプレートの1ウェルについて約103〜約106細胞、1ウェル当たり60μlの培地容量）（非標識および蛍光標識単核細胞株-U937とTHP-1、ならびに初代白血球も使用される）。もし単核細胞株が使用されるなら、細胞トラッカープローブ（モレキュラープローブズ（Molecular Probes）から得られる、カタログC-2925とC-2927）を使用して細胞を蛍光標識する。細胞を1μM濃度のプローブと37℃で30分間インキュベートする。次に培地を交換し、細胞をインキュベーター内にさらに30分間入れる。
【０４７２】
図48に示すように、通常の生理学的条件下で流速の範囲（約0.1ダイン/cm2〜約20ダイン/cm2）を作成するために、40μl〜60μlの培地を使用することが好ましい。
【０４７３】
C. データ取得
白血球を含む試料を第1ウェルに加えた15秒後に開始して、アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。5分15秒間30秒毎に経時的に画像を取る。10×対物レンズを使用して、チャネルに沿ってローリングする細胞の数を観察し記録する。
【０４７４】
D. 白血球のローリング速度の測定
特定の時間の細胞のローリング速度を性状解析するために、パートCに記載の方法を使用して得られた画像を使用して、画像の露出時間の間に白血球が移動した距離を測定する。ローリング速度（V）を測定するために、以下の式が使用される：
Ｖ＝ｃ（l時間／t露出）、ここで
ｃ：細胞が移動した実際の距離を測定するための変換因子。この因子は画像毎に変わる。
l時間：捕捉画像中の白血球遊走の長さ。
t露出：画像の露出時間。
好ましくはt露出は、流速が約0.1ダイン/cm2〜約20ダイン/cm2の時、100ミリ秒（ms）である。
【０４７５】
実施例13
V. その中のチャネルにローリングメディエーターと停止メディエーターが配置された本発明の装置を使用する白血球遊走測定法
A. 白血球の単離
好中球は、セクションIIのパートAに記載の方法に従って単離する。
【０４７６】
B. チャンバー中に白血球、P-セレクチン、およびP-セレクチン抗体を入れる
5つのチャンバーに関しては、セクションＩに開示した方法に従って作成した装置の各チャンバーの第1ウェルに、ピペットで20μlの0.1％ BSAを入れる。毛細管作用により水がチャネル中に引かれる。チャネル中に気泡が残っていないことを確認後、追加の10μlのBSAをピペットで各チャンバーの第2ウェルに入れる。15分経過後、静水圧が平衡化し、マルチピペッターを使用して10μlのP-セレクチン（50:g/ml）をピペットで第1ウェルに入れ10μlのICAM-1（50:g/ml）をピペットで第2ウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをした皿の中で2時間インキュベートする。インキュベーション後、各ウェルのチャネルをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を使用して4回洗浄する。5つの異なるチャンバーについて、100ng/mlのP-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#1の第1ウェルに入れ；10ng/mlのP-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#2の第1ウェルに入れ；1ng/mlのP-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#3の第1ウェルに入れ；100:g/mlのP-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#4の第1ウェルに入れ；PBS中0.1％ BSAをピペットでチャンバー#5の第1ウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをした皿の中で30分間インキュベートする。インキュベーション後、チャネルをまず20μlのBSA、次に10μlのBSA、次にPBS中0.1％ BSAで洗浄する。20μlの培地中の好中球を各チャンバーの第1ウェルに加える（24ウェルプレートの1ウェルについて約103〜約106、1ウェル当たり20μlの培地容量）（非標識および蛍光標識単核細胞株-U937とTHP-1、ならびに初代白血球も使用される）。白血球を含む試料を第1ウェルに加えた15秒後に開始して、アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。5分15秒間30秒毎に経時的に画像を取る。10×対物レンズを使用して、P-セレクチン抗体で処理後にローリングする細胞の数を観察し記録する。図49と50に示すように、細胞の回転を阻害するのは抗体の100ng/ml希釈液が好適な濃度である。図50の静止写真画像から明らかなように、ローリングし内皮細胞に接着する白血球の数は、抗P-セレクチンの存在下で低下する。
【０４７７】
C. チャンバー中に白血球、E-セレクチン、およびE-セレクチン抗体を入れる
セクションＩに開示した方法に従って作成した装置の各チャンバーの第1ウェルに、ピペットで20μlの0.1％ BSAを入れる。毛細管作用によりBSAがチャネル中に引かれる。チャネル中に気泡が残っていないことを確認後、追加の10μlのBSAをピペットで各チャンバーの第2ウェルに入れる。15分経過後、静水圧が平衡化し、マルチピペッターを使用して10μlのE-セレクチン（50:g/ml）をピペットで第1ウェルに入れ10μlのICAM-1（50:g/ml）をピペットで第2ウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをした皿の中で2時間インキュベートする。インキュベーション後、各ウェルのチャネルをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中の0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を使用して4回洗浄する。5つの異なるチャンバーについて、100ng/mlのE-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#1の第1ウェルに入れ；10ng/mlのE-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#2の第1ウェルに入れ；1ng/mlのE-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#3の第1ウェルに入れ；100:g/mlのE-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#4の第1ウェルに入れ；PBS中0.1％ BSAをピペットでチャンバー#5の第1ウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをした皿の中で30分間インキュベートする。インキュベーション後、チャネルをPBS中0.1％ BSAで4回洗浄する。20μlの培地中の好中球を各チャンバーの第1ウェルに加える（24ウェルプレートの1ウェルについて約103〜約106個の細胞、1ウェル当たり20μlの培地容量）（非標識および蛍光標識単核細胞株-U937とTHP-1、ならびに初代白血球も使用される）。白血球を含む試料を第1ウェルに加えた15秒後に開始して、アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。5分15秒間30秒毎に経時的に画像を取る。10×対物レンズを使用して、E-セレクチン抗体で処理後にローリングする細胞の数を観察し記録する。図10に示すように、細胞のローリングを阻害するのは抗体の100ng/ml希釈液が好適な濃度である。図51の静止写真画像から明らかなように、ローリングし内皮細胞に接着する白血球の数は、抗E-セレクチンの存在下で低下する。
【０４７８】
実施例14
VI. その中のチャネルに内皮細胞のコンフルエントな層が配置された本発明の装置を使用する白血球遊走の阻害測定法
A. 白血球の単離
好中球は、セクションIIのパートAに記載の方法に従って単離する。
【０４７９】
B. チャンバー中に白血球と内皮細胞を入れる
セクションIVのパートBに開示した方法に従って4つのチャンバー（#1〜#4）の4つの異なるチャネルに内皮細胞を入れ活性化する。5つ目（#5）のチャンバーには、内皮細胞をチャネルに入れるが、活性化しない。これらの5つの異なるチャンバーについて、100μg/mlのP-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#1の第1ウェルに入れ；100μg/mlのE-セレクチン抗体をピペットでチャンバー#2の第1ウェルに入れ；100μg/mlのVCAM-1抗体をピペットでチャンバー#3の第1ウェルに入れ；100μg/mlのPBS中のBSAをピペットでチャンバー#4の第1ウェルに入れる。装置を室温で、ウェルが乾燥するのを避けるためカバーをした皿の中で30分間インキュベートする。インキュベーション後、チャネルをPBS中0.1％ BSAで4回洗浄する。20μlの培地中の好中球を各チャンバーの第1ウェルに加える（24ウェルプレートの1ウェルについて約103〜約106個の細胞、1ウェル当たり20μlの培地容量）（非標識および蛍光標識単核細胞株-U937とTHP-1、ならびに初代白血球も使用される）。白血球を含む試料を第1ウェルに加えた15秒後に開始して、アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。5分15秒間30秒毎に経時的に画像を取る。10×対物レンズを使用して、図51に示すように抗体で処理後にローリングする細胞の数を観察し記録する。
【０４８０】
実施例15
VII. 層流により作り出した勾配中でのTNF-αの送達による内皮細胞の選択的活性化
本発明の装置の表面を内皮細胞で被覆し、コンフルエンスまで増殖させる（細胞の「菌叢（lawn）」を作成する）。層流を介して内皮細胞の菌叢にTNF-αを送達して内皮細胞を「活性化」する。TNF-αを含有する溶液の各流れは異なる濃度であり、こうしてチャネルに直角の勾配が作成される。この勾配はTNF-αを内皮細胞の菌叢に、異なる濃度で細胞の菌叢の異なる位置で有効に送達した。次に白血球を活性化内皮細胞の菌叢上に流した。TNF-αにより活性化された内皮細胞のみが、白血球の適当な「付着」部位を提供する。白血球は全菌叢に等しく結合はせず、高濃度のTNF-αに曝露された内皮細胞菌叢の領域に付着し、低濃度のTNF-αに曝露された菌叢の領域や、TNF-αには全く曝露されなかった領域には付着しなかった。これらの結果は、層流による濃度勾配の作成があったことを示す。図53を参照されたい。
【０４８１】
実施例16：化学侵入性装置の作成法
シリコンウェーハー（6インチ）をフォトレジスト（SU8-50）で2000rpmで45秒間スピンコーティングする。ウェーハーをホットプレート上で115℃で10分間焼いた後、ウェーハーを室温まで冷却する。マスクアライナー（EVG620）を使用して、フォトマスクを介してフォトレジストフィルムを露出させる。45秒間の露出後、もう一日間115℃で10分間焼く。このシリコンウェーハーを30分以上室温まで冷却する。架橋されていないフォトレジストをプロピレングリシンメチルエーテルアセテート（PGMEA）を使用して除去する。ウェーハーは窒素流下で乾燥され、パターン化フォトレジストは以後の処理のための準備ができる。
【０４８２】
ある例では、フォトレジストは他の層のSU8-100で1500rpmで45秒間スピンコーティングされる。上部メンバーのマクロな特徴（すなわちウェル）を選択的に曝露するのにマスクアライナーが使用されるが、ウェルと上部メンバーの他の領域とを連結するチャネル領域は曝露しない。ポストの曝露処理とフォトレジスト除去後、マスターは多重層の特徴を有する。この工程は、マスター上のマクロ特徴を導入するために繰り返され、これは約3mmの高さを有する。
【０４８３】
PDMSプレポリマーがマスターに対して鋳造されると、これはマスターの特徴を忠実に複製する。鋳造時、PDMSはマクロ特徴の高さよりわずかに低い量で加えられる。PDMSを65℃で4時間硬化後、PDMSをシリコーンマスターから剥がし、石けんと水で完全に洗浄し100％エタノールですすぐ。ガラスの支持体メンバーも洗浄し、エタノールですすぐ。PDMS膜とガラス支持体メンバーを、側面を上に向けて互いに結合させて1分間プラズマ酸化する。次にPDMS膜をガラス支持体メンバー上に置き、圧力をかけて、PDMS膜とガラス支持体メンバーとの間に生成している可能性のある気泡を除去する。次に、組み立てた装置を4ECに冷却する。PDMS膜とガラス支持体メンバーのプラズマ酸化15分以内に、20マイクロリットル（μl）のマトリゲル（任意の他のヒドロゲルも使用できる）を第1ウェルにそそぎ、毛細管中に流させる。装置を室温に15分間入れてマトリゲルを固定させる。次に真空とパスツールピペットを使用して、過剰のゲルを上部メンバーのウェルから除去する。
【０４８４】
実施例17：細胞化学侵入性測定法
細胞と試験薬をチャンバーに入れる
上部メンバーの第1ウェルと第2ウェルにリン酸緩衝化生理食塩水溶液（PBS）を満たす。第2ウェルの底をフィブロネクチン（1mg/ml）または他の細胞外マトリックスタンパク質で30分間処理し、次にPBSで2回洗浄する。PBSを吸引後、星状細胞（U87-MG）を第2ウェル中の50μlの新鮮な加温培地に入れる（24ウェルプレートの1ウェル当たり25,000細胞、1ウェル当たり50μlの溶液）。細胞はチャンバーの第2ウェルを介して沈積し、第2ウェルの底に付着する。
【０４８５】
細胞を付着させ、第2ウェルに37℃インキュベーター中で一晩広げる。実験の開始時に、細胞培地を新鮮な無血清培地と交換する。培地1ml当たり10μgのbFGF（塩基性繊維芽細胞増殖因子）を各チャンバーの第1ウェルに加える。
【０４８６】
画像取得とデータ解析
アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。4日間同じ時間に経時的画像を取る。
【０４８７】
実施例18：溶液勾配を使用する細胞化学侵入性阻害測定法
細胞と試験薬をチャンバー中に入れる
3つのチャンバーについて、上部メンバーの各チャンバーのウェルをPBSで満たす。第2ウェルの底をフィブロネクチン（1mg/ml）または他の細胞外マトリックスタンパク質で30分間処理し、次にPBSで2回洗浄する。PBSを吸引後、U87-MG細胞を第2ウェル中の50μlの新鮮な加温培地に入れる（24ウェルプレートの1ウェル当たり10,000細胞、1ウェル当たり50μlの培地）。細胞は各チャンバーの第2ウェルを介して沈積し、第2ウェルの底に付着する。
【０４８８】
細胞を付着させ、第2ウェルに37℃インキュベーター中で一晩広げる。実験の開始時に、細胞培地を新鮮な無血清培地または1％血清と交換する。培地1ml当たり1μgのbFGF（塩基性繊維芽細胞増殖因子）を各チャンバーの第1ウェルに加える。溶液勾配を1時間形成させる。
【０４８９】
3つの異なるチャンバーについて、100μMのLY294002をチャンバー#1の第2ウェルに入れ、10μMのLY294002をチャンバー#2の第2ウェルに入れ、1.0μMのLY294002をチャンバー#3の第2ウェルに入れる。
【０４９０】
画像取得とデータ解析
アキシオカム（AXIOCAM）（登録商標）を使用してツァイス（Zeiss）倒立顕微鏡でデジタル画像を取る。データをアキシオビジョン（AXIOVISION）（登録商標）ソフトウェアで解析する。4日間同じ時間に経時的画像を取る。
【０４９１】
実施例19：支持体メンバー上の生物学的分子の固定化
上記したように装置を組み立て後、チャネル領域を、(CH3CH2O)3Si(CH2)3NH2を含有するエタノール溶液で満たす。室温で20分後、チャネル領域をエタノールを使用して洗浄する。装置を105℃で1時間インキュベートして、支持体メンバー上に生成したシロキサン単層を架橋させる。装置をエタノールで洗浄して残渣を除去する。チャネル領域にジイソシアネートの溶液、ヘキサンメチレンジイソシアネートまたはトリルジイソシアネート（アセトニトリルまたはN-メチルピロリジノン中1％）を満たす。ジイソシアネートを、支持体メンバー上に生成したシロキサン単層の末端アミノ基と2時間反応させる。ジイソシアネートを洗い流す。チャネル領域にヘパラン硫酸または他の硫酸化炭水化物（例えば、ジアセチル化型のヘパリン、ヘパリン断片、硫酸化糖を含有するレクチンなど）の1mg/ml溶液を満たす。ヘパラン硫酸を支持体メンバーと反応させて固定化種を形成させる。ヘパラン硫酸溶液と他の試薬を洗い流す。ケモカイン溶液（任意のCC、CXC，CX3C、またはXCファミリーが使用される）をチャネル領域中に導入する。静電的相互作用により、高いpI（約9〜10）を有するケモカインは、陰性荷電硫酸化支持体メンバー上に吸着する。
【０４９２】
実施例20：表面勾配を使用する化学走化性阻害測定法
2つのウェルに50μlのPBSを満たし、静水圧を平衡化させる。5μlの抗hisx6抗体を第1ウェルに加え、5μlの緩衝液を第2ウェルに加えて静水圧を平衡化させる。拡散により、抗体濃度は第1ウェルから第2ウェルに勾配を生成する。室温で2時間後、50μlの緩衝液を第2ウェルに加えて第1ウェルから50μlを除去し、2つのウェルを洗い流す。物理吸着により、溶液勾配は表面に移って、表面勾配を生成する。25μg/ml濃度のIL-8溶液（HISx6融合タグを有する組換えヒトIL-8、アールアンドディーシステムズ（R + D Systems）、カタログ番号968-IL）をチャネル領域に加える。溶液を室温で30分間インキュベート士する。過剰のIL-8ケモカインを洗い流し、表面にIL-8を結合させる。好中球（健常ドナーから新たに単離）を第2ウェルに加える。典型的には20,000〜100,000細胞を10〜550μlの範囲の容量で加える。好中球を支持体メンバーに吸着させ、高濃度のIL-8に向かって遊走させる。遊走の阻害は、IL-8に対するポリクローナル抗体を加えることにより行われる。
【０４９３】
実施例21：層流により作成した勾配中のTNF-αの送達による内皮細胞の選択的活性化
本発明の装置の表面を内皮細胞で被覆し、コンフルエンスまで増殖させる（細胞の「菌叢」を作成する）。層流を介してTNF-αを内皮細胞の菌叢に送達して、内皮細胞を「活性化」する。TNF-αを含有する溶液の各流れは異なる濃度であり、こうしてチャネルに垂直に勾配が作成される。この勾配は、細胞の菌叢上で異なる位置で異なる濃度の内皮細胞の菌叢にTNF-αを有効に送達する。次に活性化内皮細胞の菌叢の上に白血球を流させる。TNF-αにより活性化された内皮細胞のみが、白血球の適当な「付着」部位を提供する。白血球は全菌叢に均等に付着はしなかったが、高濃度のTNF-αに曝露された内皮細胞菌叢の領域には付着し、低濃度のTNF-αに曝露されたかまたはTNF-αに全く曝露しなかった菌叢の領域には付着しなかった。これらの結果は、層流によるTNF-αの濃度勾配の作成が実際にあることを示す。図85を参照されたい。
【０４９４】
いくつかの例を上記で説明したが、これらは単に例示目的であり、本発明の精神と範囲内にある他の例も可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０４９５】
限定するためではなく例示のために本発明は添付の図面中の図により例示され、同様の参照符号は同様の要素を示す。
【図１（ａ）】図1(a)は、本発明の例示的な実施態様の定性的細胞遊走システムの透視図である。
【図１（ｂ）】図1(b)は、線II-IIに沿って取った図1(a)に示す定性的細胞遊走測定プレートの断面図である。
【図２（ａ）】図2(a)は、本発明の例示的な実施態様の定性的細胞遊走システムの透視図である。
【図２（ｂ）】図2(b)は、線IV-IVに沿って取った図2(a)に示す定性的細胞遊走測定プレートの断面図である。
【図３（ａ）】3(a)は、本発明の例示的な実施態様の定性的細胞遊走システムの支持体の平面図である。
【図３（ｂ）】図3(b)は、図3(a)に示す支持体の側面図である。
【図４（ａ）】図4(a)は、本発明の実施態様の定性的細胞遊走システムの第1層の平面図である。
【図４（ｂ）】図4(b)は、図4(a)に示す第1層の側面図である。
【図５（ａ）】図5(a)は、本発明の実施態様の定性的細胞遊走システムの第2層の平面図である。
【図５（ｂ）】図5(b)は、図5(a)に示す第2層の側面図である。
【図６（ａ）】図6(a)は、本発明の実施態様の定性的細胞遊走システムの第1層の平面図である。
【図６（ｂ）】図6(b)は、本発明の実施態様の定性的細胞遊走システムの第2層の平面図である。
【図６（ｃ）】図6(c)は、図6(a)に示す第1層の上に位置する図6(b)に示す第2層の平面図である。
【図７（ａ）】図7(a)は、本発明の他の実施態様の定性的細胞遊走システムの第1層の平面図である。
【図７（ｂ）】図7(b)は、本発明の他の実施態様の定性的細胞遊走システムの第2層の平面図である。
【図７（ｃ）】図7(c)は、図7(a)に示す第1層の上に位置する図7(b)に示す第2層の平面図である。
【図８（ａ）】図8(a)は、本発明の別の実施態様の定性的細胞遊走測定プレートの平面図である。
【図８（ｂ）】図8(b)は、線IX-IXに沿って取った図8(a)に示す定性的細胞遊走測定プレートの断面図である。
【図８（ｃ）】図8(c)は、本発明の別の実施態様の定性的細胞遊走測定プレートの平面図である。
【図８（ｄ）】図8(d)は、図8(c)に示す定性的細胞遊走測定プレートに挿入可能なプラグの断面図である。
【図９（ａ）】図9(a)は、本発明の実施態様の複数のマクロポストをその上に有するPDMS成型品の透視図である。
【図９（ｂ）】図9(b)は、図9(a)に示す成型品を成型するのに使用される96ウェルマイクロタイタープレートの透視図である。
【図１０】図10(a)〜10(c)は、本発明の実施態様の第1および第2のエラストマー層を作成するために行われる工程を示す。
【図１１】図11(a)〜11(c)は、本発明の別の実施態様の第1および第2のエラストマー層を作成するために行われる工程を示す。
【図１２（ａ）】図12(a)は、本発明のある実施態様のマイクロオリフィスにパターン化される第1の細胞タイプを示す。
【図１２（ｂ）】図12(b)は、図12(a)に示す第1の細胞タイプの周りに整列した第2の細胞タイプを示す。
【図１２（ｃ）】図12(c)は、図12(a)と12(b)に示す第1および第2の重層した構成を示す。
【図１３】図13(a)は、本発明の別の実施態様の第1層の上に位置する第2層を示す。図13(b)は、支持体の上にパターン化された細胞を有する図13(a)に示す第1および第2層を示す。図13(c)は、図13(b)に示す支持体上に整列した細胞が遊走できるように、図13(b)に示す第1層が除去されていることを示す。図13(d)は、図13(b)に示す第1および第2層により支持体上にパターン化され、コンフルエンスまで増殖した細胞を示す。図13(e)は、図13(c)に示すように第1および第2層の除去により遊走している細胞を示す。
【図１４】図14は、本発明のある実施態様の「スイッチ可能なヘッド」を有する自己集合膜を示す。
【図１５（ａ）】図15(a)は、本発明のある実施態様の、対照群と特定の細胞タイプの細胞の動きに対する試験薬の作用を示す。
【図１５（ｂ）】図15(b)は、図15(a)に示す細胞の動きに対する試験薬の作用をグラフで示す。
【図１６】図16は、本発明の種々の実施態様の、細胞群の細胞の動きに対する種々の物質の作用を示す。
【図１７】図17は、本発明の種々の実施態様の、細胞群の細胞の動きに対する種々の物質の作用を示す。
【図１８】図18は、本発明のある実施態様の、細胞増殖量に対する細胞の動きの量をグラフで示す。
【図１９】図19は、本発明のある実施態様の、細胞の遊走または運動性を測定するためのシステムの模式図である。
【図２０】図20は、本発明のある実施態様の、MS1とSVR細胞中のファルネシルトランスフェラーゼ阻害を示す、定性的細胞運動性測定プレートを使用する測定法の絵で示した結果である。
【図２１】図21は、本発明のある実施態様の、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害により影響を受けたMS1とSVR細胞の細胞の動きのデータ解析を示す。
【図２２】図22は、本発明のある実施態様のMMPインヒビターGM6001を使用した769-P運動性の阻害を調べる測定法の結果のグラフ、およびトランスウェルシステムで行われる測定の結果と、定性的細胞遊走測定プレートを使用して行われる測定の結果を比較するグラフを示す。
【図２３】図23は、本発明のある実施態様の、RAS経路のいくつかのインヒビターの作用が測定された測定法の結果を示す。
【図２４】図24は、物理的制約を使用して、所定の領域で細胞がパターン化された細胞遊走測定法を示す。物理的制約は除去され、そして細胞運動性がモニターされる。膜を持ち上げると、ウェルにより定義された細胞のパターンが作成されることができる。
【図２５】図25は、内皮細胞とかかる細胞のアゴニストとアンタゴニストを使用する特定の細胞運動性測定法を示す。記載の結果は、VEGFのインヒビターが加えられると、細胞の動きが影響を受けることを示す。通常VEGFは、図25Aに示すように細胞が遊走するように刺激する。図25Bでは、VEGFの濃度が固定される。VEGFに対する抗体が種々の濃度で加えられる。細胞の運動性は、抗体により用量依存性に影響を受ける。VEGF受容体に対するインヒビターが加えられると、図25Cに示すような遅い速度で細胞が遊走する。図25Dは、細胞の動きがキナーゼインヒビターにより影響を受けることを示す。通常、酵素阻害スクリーニングは、タンパク質およびその基質を含み細胞は含まない。図25Dは、細胞ベースの状態での酵素阻害スクリーニングを示す。
【図２６】図26は、細胞が置かれた支持体により細胞の遊走が影響を受けることを示す。これはまた、支持体への細胞の接着を促進するための細胞親和性物質としての支持体上のフィブロネクチンの使用を示す。
【図２７】図27は、パターン化による細胞サイクルの制御を示す。
【図２８】図28は、細胞分化への細胞パターン化の形の影響を示す。
【図２９】図29は、細胞をいくつかの制約にパターン化することによりもたらされる細胞分化を示す。
【図３０】図30は、単一細胞のパターン化と、細胞骨格安定性と再整列の以後の評価を示す。
【図３１】図31は、本発明の実施態様の測定のフローチャートを示す。
【図３２】図32は、本発明の実施態様の試験装置の例を示す。
【図３３】図33は、本発明の別の実施態様の試験装置の例を示す。
【図３４】図34は、本発明の実施態様の島獲得の実施方法を示す。
【図３５】図35は、本発明の実施態様で使用される理想化した画像データ例を示す。
【図３６】図36は、本発明の実施態様で使用される理想化した画像データ例を示す。
【図３７】図37は、本発明の実施態様で使用される理想化した画像データ例を示す。
【図３８】図38は、本発明の実施態様の島を同定する方法を示す。
【図３９】図39は、ソース画像データの実施態様のスクリーンショットを示す。
【図４０】図40は、ソース画像データの実施態様のスクリーンショットを示す。
【図４１】図41は、本発明の実施態様の測定法から得られたデータの種々の画像とデジタル画像を示す。アルゴリズムを使用してデジタル画像がコンピューターで読めるデータに変換され、これが次に使用可能なグラフィックインターフェースに変換される。
【図４２】図42は、本発明の白血球遊走をモニターする方法で使用されるように改変した装置の実施態様の透視図である。
【図４３】図43は、線II-IIに沿った図1の装置の断面図である。
【図４４】図44は、図1の装置の平面図である。
【図４５】図45は、本発明の白血球遊走のモニタリング法で使用されるように改変した装置のハウジングで画定されるチャンバーの他の実施態様の平面図である。
【図４６】図46は、互いに所定の関係で配置された図4のチャンバーのような複数のチャンバーの平面図である。
【図４７】図47は、本発明の白血球遊走のモニタリング法で使用されるように改変した装置の他の実施態様の上からの透視図である。
【図４７Ａ】図47Aは、本発明の装置の代替例の個々のウェルの平面拡大図であり、ここで、装置は標準的96ウェルマイクロタイタープレートの寸法とピッチを示す。
【図４８】図48は、異なる細胞懸濁液容量でせん断流れの速度を比較する棒グラフである。
【図４９】図49は、P−セレクチン抗体の異なる希釈率でローリングする細胞の数を比較するグラフである。
【図５０】図50は、P−セレクチン抗体の異なる希釈率でローリングおよび接着する細胞のグラフと経時的静止写真である。
【図５１】図51は、E−セレクチン抗体の異なる希釈率でローリングおよび接着する細胞のグラフと経時的静止写真である。
【図５２】図52は、E−セレクチン、P−セレクチン、およびVCAM−1に対する抗体の存在下で内皮細胞に接着する細胞のグラフと経時的静止写真である。
【図５３】図53は、層流によるTNF−αの濃度勾配の作成を含む実験の結果を示す。TNF−αは、内皮細胞のコンフルエント「菌叢（lawn）」に加えた。TNF−αに接触した内皮細胞は活性化し、こうして白血球に結合することができる。次に白血球を内皮細胞に加えた。図に示すように、高濃度のTNF−αを受けた内皮細胞の領域に白血球は結合したが、TNF−αに曝露されなかったかまたは非常に低濃度のTNF−αに曝露された領域は白血球を結合しなかった。
【図５４】図54は、層流勾配を作成するための微小流体装置の実施態様を示す。
【図５５Ａ】図55Aは、本発明の試験装置の実施態様の一部の部分的断面の上から見た透視図である。
【図５５Ｂ】図55Bは、本発明の試験装置の実施態様の上から見た透視図である。
【図５５Ｃ】図55Cは、図55Bの試験装置のチャンバーの1つの縦断面の側面図である。
【図５６Ａ】図56Aは、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの他の実施態様の平面図を示す模式図であり、チャネル領域は単一のチャネルを画定する。
【図５６Ｂ】図56Bは、図55Bの試験装置の実施態様で画定されるチャンバーの実施態様の平面図を示す模式図であり、チャネル領域は単一のチャネルを画定する。
【図５６Ｃ】図56Cは、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの他の実施態様を示し、チャネル領域は単一のチャネルを画定する。
【図５７Ａ】図57Aは、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの他の実施態様を示し、チャネル領域は同じ長さを有する複数のチャネルを画定する。
【図５７Ｂ】図57Bは、図57Aと同様の図であり、チャンバーの片側からチャンバーの別の側に延びる長さを有する複数のチャネルを画定するチャネル領域を示す。
【図５７Ｃ】図57Cは、図57Aと同様の図であり、チャンバーの片側からチャンバーの別の側に大きくなる幅を有する複数のチャネルを画定するチャネル領域を示す。
【図５８Ａ】図58Aは、図55Bと同様の図であり、本発明の試験装置の別の実施態様を示す。
【図５８Ｂ】図58Bは、チャネルの両側の細胞を示す図58Aのチャネルの拡大した略平面図である。
【図５９】図59は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、ウェルはその平面図で台形である。
【図６０】図60は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、ウェルはその平面図で台形である。
【図６１】図61は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、チャンバーはその平面図で8の字の形である。
【図６２】図62は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、装置の平面図において1つのウェルは長方形であり、他のウェルは円形である。
【図６３】図63は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、第1のウェル領域と第2のウェル領域はそれぞれ複数のウェルを画定し、チャネル領域は、各ウェル領域のそれぞれウェルを連結する複数のチャネルを画定する。
【図６４】図64は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、チャネル領域は、各ウェル領域のそれぞれウェルを連結する複数のチャネルを画定する。
【図６５】図65は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、第1のウェル領域は複数のウェルと各ウェルの各毛細管を有し、チャネル領域は単一のチャネルを有し、第2のウェル領域は単一のウェルを有する。
【図６６】図66は、本発明の支持体メンバーの一部の実施態様の側面断面図であり、本発明のチャンバーの縦軸に沿って支持体メンバーが示される。
【図６７】図67は、本発明のある実施態様の取得システムの等長図である。
【図６８】図68は、図56Aと同様の図であり、本発明の試験装置で画定されるチャンバーの別の実施態様を示し、第1のウェル領域は、毛細管ネットワークで相互に連結した複数のウェルを含み、チャネル領域は単一のチャネルを含み、第2のウェルは単一のウェルを含む。
【図６９】図69は、本発明の実施態様の自動分析システムのブロック図である。
【図７０】図70は、本発明の実施態様の方法の流れ図である。
【図７１】図71は、その上で図70の方法が作用する画像データの例を示す。
【図７２】図72は、図71の画像データから得られるヒストグラムを示す。
【図７３】図73は、画像データ例を示す。
【図７４】図74は、拡大した画像データ例を示す。
【図７５】図75は、ソフトリソグラフィー法を使用してパターン化された種々のタイプの細胞を示す。
【図７６】図76は、パターン化した生物学的分子を含む種々の生物反応を示す。
【図７７】図77は、本発明のある実施態様の装置とトランスウェルシステムを示す。トランスウェルシステムでは、化学誘引物質の濃度は一過性であり、化学走化性勾配は安定でも定量可能でもない。本発明の装置では、化学走化性勾配は内部で較正される。装置が複数のチャンバーを含む本発明のある実施態様では、細胞遊走測定法を較正するのに1つのチャンバーが使用され、細胞の遊走をモニターするのに他のチャンバーが使用される。任意の特定の時点で、異なるチャンバー中で化学誘引物質の特定の濃度で細胞の遊走がモニターされる。
【図７８】図78は、MCP−1勾配の生成と、勾配の方向へのチャネル中のTHP−1細胞の遊走を示す。
【図７９】図79は、ローダミンデキストランを使用したサイトカイン勾配の性状解析を示す。
【図８０】図80は、チャネル中でMCP−1勾配の方向への遊走するTHP−1細胞を示す。ヒドロゲルは装置のチャネルに充填される。チャネル中にゲルを入れる方法に従って、ゲルはチャネル中の明確な点で停止し、ウェル中にはこぼれない。
【図８１】この測定法では、MCP−1に向かって遊走するTHP−1細胞に対してインヒビターが影響を与えるかどうかを試験するために、既知のCCR2結合インヒビターが使用される。結果は、インヒビターが実際に細胞の遊走を阻害することを示す。本発明の装置を使用すると、薬理学的に関連するデータを細胞ベースのシステムに関連付けることが可能になる。
【図８２】図82は、本発明のある実施態様の装置の柔軟性を示す。チャネル幅、長さ、および構成は変化してもよい。本発明の装置を使用すると、細胞が移動した最大距離、細胞が移動した加重平均距離、細胞画素（任意の距離を移動したすべての細胞）、移動した平均距離、移動した細胞の数のモニターが可能である。遊出は、内皮細胞を移動する細胞を模倣する。ある実施態様ではチャネルの幅は2〜10ミクロンである。本発明のある実施態様では、装置は、ヒトの血管を模倣するチャネルの構成を使用してもよい。例えばチャネルの高さは80ミクロンでもよい。
【図８３】図83は、細胞の遊走の小分子阻害を示す。
【図８４】図84は、デジタル画像をデータに変換し、次に使用可能なグラフィックインターフェースに変換する本発明のアルゴリズムを示す。
【図８５】図85は、層流によるTNF−αの濃度勾配の作成を含む実験の結果である。TNF−αは内皮細胞のコンフルエントな「菌叢（lawn）」に加えた。TNF−αに接触した内皮細胞は活性化し、こうして白血球に結合することができる。次に白血球を内皮細胞に加えた。図に示すように、高濃度のTNF−αを受けた内皮細胞の領域に白血球は結合したが、TNF−αに曝露されなかったかまたは非常に低濃度のTNF−αに曝露された領域は白血球を結合しなかった。
【図８６】図86は、層流勾配を作成するための微小流体装置の実施態様を示す。
【図８７】（上）従来法では、薬物発見／開発過程の臨床段階でヒト成分が導入される。（下）本発明者らは、標的評価、リード化合物の最適化、およびADMETox段階にインビボ様条件を導入する点で、薬物発見の前臨床段階をヒトに適応させる方法を開示する。これは、細胞の制御と操作のための開示された方法および初代細胞株の使用により行われる。
【図８８】一般人から対象プロフィールが作成され、疾患対象に対して比較される。対象プロフィールを作成するのに細胞動態が使用される。細胞動態の例には、病態研究、FACS測定、および生化学的分析を含む。例えば対象の例では、白血球の増加、活性化マーカーの変化、および生化学的整列におけるアップレギュレーション／より強いシグナルがある。
【図８９】図89は、個々の対象プロフィールと薬理学的応答の相関を示す。ここで、分子マーカーCD14、CD11b、CD62L、標的1、標的2、標的3、標的4の分子発現パターンを測定することにより、ならびに活性化、ローリング／接着、遊出および化学走化性を測定する各白血球細胞測定法により示される細胞動態を定量することにより、健常人（SLs−374）と非健常人（SLs−373）についてドナー特異的初代白血球プロフィールが得られる。さらに、試験化合物SLs−001、SLs−002、SLs−003、SLs−004およびSLs−005の存在下で繰り返される実験は、その生物学的効力を測定し、初代細胞プロフィールの種々の成分に影響を与える。かかる測定法は、特定の標的についての一連の測定法より、個体中の化合物のIC50の迅速な測定を可能にする。
【図９０】感度の上昇は、科学者が特定の疾患状態について個体のサブクラス内で個々の標的発現レベルのプロフィールを作成することを可能にする。例えば全身性炎症を診断された患者は、いくつかの推定分子標的に関連する疾患原因を有するかも知れない。例えば乾癬性関節炎、リウマチ様関節炎、および骨関節炎へのより詳細な診断により、特定の分子標的またはこれらの組合せが示唆される。これらの疾患の個体の初代細胞プロフィールを分析することにより、推定の薬物標的を迅速に評価することができる。
【図９１】初代細胞動態を測定する一連の測定法による、3つの個体（SLs−384、SLs−270、SLs−373）からの初代細胞による2つの標的（標的1と2）に対する化合物のスクリーニング。
【図９２】500,000〜100万個の細胞を必要とする従来のマイクロタイタープレートベースの測定法およびトランスウェルベースの測定法に対して、本明細書に記載の測定法は約25,000〜50,000個の細胞を使用する。その経済性とは別に、これらの測定法はより多くのデータ点を使用し、より大きなシグナル対ノイズ比を与える。
【図９３】この図は、初代細胞を厳密に制御し、これらが増殖するその表面を修飾する開示された方法の能力を示す。左側では、異なるタイプの表面が異なるレベルの単核細胞活性化および／または接着を与える。右側では、異なるタイプの細胞外マトリックスゲルが異なるタイプの細胞とよく機能している。「X」は「悪い」ゲル／細胞組合せを示し、チェックは「良い」ゲル／細胞組合せを示す。
【図９４】この図は、種々の培養条件と表面処理に基づき、種々のタイプの内皮細胞の分化を制御する本発明者らの能力を示す。
【図９５】この図は、体内の条件をより厳密に模倣する内皮細胞の毛細管様構造を作成するように、細胞環境とパターン化を制御する能力を示す。毛細管構造は、従来の細胞培養法では形成しない。
【図９６】この図は、体内の条件を模倣するために、培養内皮細胞上で流れと剪断力を再現する本発明者らの能力を示す。流れが無い（静止）場合、細胞は異なる形態を示し、正確にインビボ様挙動を示さない。さらに複雑な勾配（右）は、TNF-アルファの濃度が上昇すると、こうして培養した内皮細胞の活性化が上昇することを示す。
【図９７】この図は、現在の炎症の分子および細胞モデルを示す。従って本発明は、初代白血球の分子および細胞動態を測定するための種々の測定法を企図し開示する。これらの測定法には、標的生化学的性状解析、内皮細胞活性化、接着、およびローリングする白血球、白血球の遊出、白血球の化学走化性、白血球の固定化ケモカイン活性化、並びに細胞運動性測定法がある。
【図９８】この図は、活性化単核細胞が非活性化単核細胞より、定量可能なより広く平坦な形態を示し、従って細胞質の表面積が増加することを示す。ここで単核細胞の活性化は、膜状仮足(lamellipodia)伸長経時ビデオにより測定される。
【図９９】この図は、培養内皮細胞上の初代白血球のローリングと接着を示す。システムの効力を示すために、白血球はサイトカインMCP−1を使用して活性化される。測定法中の初代白血球は、ドナーSLs-373とSLs-374から提供される。
【図１００】この図は、MCP−1勾配に対してドナーSLs-373とSLs-374から提供される初代単核細胞の化学走化性を測定するための測定法を示す。
【図１０１】この図は、種々のMCP−1濃度に対してドナーSLs-373とSLs-374から提供される初代単核細胞の遊出（血管外遊出）測定法を示す。
【図１０２】この図は、試験または培養初代細胞培養物に対する制御された細胞微小環境を示す。
【図１０３】これは、開示された技術の概観を示す。
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【図９（ａ）】
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【図９（ｂ）】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２（ａ）】
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【図１２（ｂ）】
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【図１２（ｃ）】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５（ａ）】
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【図１５（ｂ）】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図８０】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【国際調査報告】
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