(57)【要約】本発明は、標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォアを、他端に消光基を含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブに標的核酸をハイブリッド形成させることにより、標的核酸のヌクレアーゼによる開裂を検出する方法を提供する。プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブは、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するようにフルオロフォアとクエンチャーが近接した構造をとり、プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるためにフルオロフォアとクエンチャーを十分分離させる。一旦ハイブリッド形成されると、該方法はプローブ−標的ハイブリッドを、標的核酸を選択的に開裂させ、これによりそのままのプローブを放出させるために十分な量でヌクレアーゼ活性を有する作用物質と接触させる。プローブの放出の検出を次いで、プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較して、フルオロフォアの蛍光シグナルの減少に従うことにより測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸のヌクレアーゼによる開裂を検出する方法であって：
（ａ）標的核酸を、該標的核酸と相補性であり、一端にフルオロフォアを含有し、他端に消光基を含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ（ここにおいて、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブはクエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するほど近くにフルオロフォアとクエンチャーがある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を軽減するために十分なほどフルオロフォアとクエンチャーを分離させる）；
（ｂ）標的核酸を選択的に開裂させて、これにより無傷のプローブを放出させるために十分な量のヌクレアーゼ活性を有する作用物質とプローブ−標的ハイブリッドを接触させ；
（ｃ）プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較してフルオロフォアの蛍光シグナルの減少を測定することによりプローブの放出を検出することを含む方法。
【請求項２】
作用物質がＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素である請求項１記載の方法。
【請求項３】
作用物質が、ＨＩＶ逆転写酵素、イー・コリＲＮａｓｅＨ１、イー・コリＲＮａｓｅＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１、ヒトＲＮａｓｅＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
プローブがＤＮＡであり、標的がＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド基質である請求項１記載の方法。
【請求項５】
プローブが少なくとも１８のヌクレオチドの長さである請求項１記載の方法。
【請求項６】
プローブが標的核酸とハイブリッド形成していない場合、プローブは、フルオロフォアとクエンチャーを近接させるヘアピン二次構造をとる請求項１記載の方法。
【請求項７】
ヌクレアーゼ反応が化合物の存在下で行われ、同じ反応が化合物の不在下で行われる場合に観察される減少と比較した、ヌクレアーゼ反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルの減少率の差が、該化合物が作用物質のヌクレアーゼ活性を阻害するかまたは向上させるかのいずれかの能力の指標である請求項１記載の方法。
【請求項８】
ヌクレアーゼ反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルをモニターすることをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
作用物質のＲＮａｓｅＨ活性を測定する方法であって：
（ａ）標的ＲＮＡを、該標的ＲＮＡと相補性であり、一端にフルオロフォアを含有し、他端に消光基を含有する蛍光標識されたオリゴデスオキシリボヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ（ここにおいて、（ｉ）プローブが標的ＲＮＡとハイブリッド形成しない場合、プローブはクエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するほど近くにフルオロフォアとクエンチャーがある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分にフルオロフォアとクエンチャーを分離させる）；
（ｂ）標的ＲＮＡを選択的に開裂させて、これにより無傷のプローブを放出させるために十分な量の作用物質とプローブ−標的ハイブリッドを接触させ；
（ｃ）プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較してフルオロフォアの蛍光シグナルの減少を測定することを含む方法。
【請求項１０】
作用物質がＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
作用物質が、ＨＩＶ逆転写酵素、イー・コリＲＮａｓｅＨ１、イー・コリＲＮａｓｅＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１、ヒトＲＮａｓｅＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
プローブが少なくとも１８のヌクレオチドの長さである請求項９記載の方法。
【請求項１３】
プローブが標的ＲＮＡとハイブリッド形成していない場合、そのプローブはフルオロフォアとクエンチャーを近接させるヘアピン二次構造をとる請求項９記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮａｓｅ−Ｈによる反応が化合物の存在下で行われ、同じ反応が該化合物の不在下で行われる場合に観察される減少と比較した、ＲＮａｓｅＨによる反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルの減少率の差が、該化合物が作用物質のＲＮａｓｅＨ活性を阻害するかまたは向上させるかのいずれかの能力の指標である請求項９記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮａｓｅ−Ｈによる反応中、フルオロフォアの蛍光シグナルをモニターすることをさらに含む請求項９記載の方法。
【請求項１６】
作用物質のヌクレアーゼ活性のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、
（ａ）標的核酸を、該標的核酸と相補性であり、一端にフルオロフォアを含有し、他端に消光基を含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ（ここにおいて、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブはクエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するほど近くにフルオロフォアとクエンチャーがある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分にフルオロフォアとクエンチャーを分離させる）；
（ｂ）プローブ−標的ハイブリッドを含有する２つのサンプルを調製し；
（ｃ）標的核酸を選択的に開裂させて、これにより無傷のプローブを放出させるために十分な量の作用物質と第一のサンプルのプローブ−標的ハイブリッドを接触させ；
（ｄ）標的核酸を選択的に開裂させて、これにより無傷のプローブを放出させるために十分な量の作用物質と第二のサンプルのプローブ−標的ハイブリッドを、該作用物質のヌクレアーゼ活性を調節する能力について試験される候補化合物の存在下で接触させ；
（ｅ）プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較してフルオロフォアの蛍光シグナルの減少を測定することにより各サンプルにおけるプローブの放出を検出し；
（ｆ）２つのサンプル中のフルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少率を比較する（ここにおいて、２つのサンプルのヌクレアーゼ反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少率の差は、該化合物が作用物質のヌクレアーゼ活性を阻害するかまたは向上させるかのいずれかの能力の指標である）
ことを含む方法。
【請求項１７】
第一のサンプルと比較して、第二のサンプルにおけるフルオロフォアの蛍光シグナルの減少の程度または相対速度が大きいことは、候補化合物が作動物質であることを示す請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
第一のサンプルと比較して、第二のサンプルにおけるフルオロフォアの蛍光シグナルの減少の程度または相対速度が小さいことは、候補化合物が拮抗物質であることを示す請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸と、該標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォアを含有し、他端にクエンチャーを含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブとを含む作用物質のヌクレアーゼ活性を測定するためのキットであって、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブは、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するほど近接してフルオロフォアとクエンチャーがある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアとクエンチャーを十分分離させてフルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるところの、キット。
【請求項２０】
プローブが少なくとも１８のヌクレオチドの長さである請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、該プローブはフルオロフォアとクエンチャーを近接させるヘアピン二次構造をとる請求項１９記載のキット。
【請求項２２】
プローブがＤＮＡであり、標的核酸がＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド基質である請求項１９記載のキット。
【請求項２３】
さらに作用物質を含む請求項１９記載のキット。
【請求項２４】
作用物質が、ＲＮａｓｅＨ、逆転写酵素、イー・コリＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
逆転写酵素がＨＩＶ逆転写酵素である請求項２３記載のキット。
【請求項２６】
標的核酸と、該標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォアを含有し、他端にクエンチャーを含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブとを含む、作用物質のヌクレアーゼ活性を測定するためのアッセイ混合物であって、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブはクエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するように近接してフルオロフォアとクエンチャーがある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成はフルオロフォアとクエンチャーを十分分離させてフルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるところの、アッセイ混合物。
【請求項２７】
プローブがＤＮＡであり、標的核酸がＲＮＡである請求項２６記載のアッセイ混合物。
【請求項２８】
プローブおよび標的核酸が互いにハイブリッド形成して、プローブ−標的ハイブリッドを形成する請求項２６記載のアッセイ混合物。
【請求項２９】
さらに作用物質を含む請求項２８記載のアッセイ混合物。
【請求項３０】
作用物質が、ＲＮａｓｅＨ、逆転写酵素、イー・コリＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される請求項２９記載のアッセイ混合物。
【請求項３１】
逆転写酵素がＨＩＶ逆転写酵素である請求項３０記載のアッセイ混合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、２００２年１２月２３日に提出された米国仮出願番号６０／４３６１２５号（出典明示により全体として本発明の一部として参照される）の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ＲＮａｓｅＨ活性をリアルタイムで検出し、モニターすることができるアッセイに関する。さらに詳細には、本発明は蛍光消光によりＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の酵素的分解をモニターするためのアッセイに関する。
【０００３】
（背景技術）
ＲＮａｓｅＨ
ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡテンプレートとハイブリッド形成したＲＮＡを分解する公知酵素である。例えば、イー・コリＲＮａｓｅＨ１酵素は、ＤＮＡ合成中にリーディング鎖およびラギング鎖からＲＮＡプライマーを除去することに関与する。ＲＮａｓｅは、細菌、ウイルスおよびヒトゲノムの複製のための重要な酵素でもある。例えば、ＨＩＶ逆転写ホロ酵素は、ｐ６６サブユニットのＣ末端に位置するＲＮａｓｅ活性を有し（Ｈａｎｓｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８，７：２３９−２４３）、該酵素活性の抑制はウイルスのライフサイクル内の少なくとも３つの独特の時点で影響を及ぼす（Ｓｃｈａｔｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８９，２５７：３１１−３１４；Ｍｉｚｒａｈｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：５３５９−５３６３；Ｆｕｒｆｉｎｅ  ＆  Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６：４０６−４１２）。さらに、ＨＩＶ  ＲＮａｓｅＨ活性に影響を及ぼす突然変異もウイルス感染性を根絶し（Ｔｉｓｄａｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９１，７２：５９−６６）、抗ウイルス標的としての該酵素の有用性を強調する。
【０００４】
ＲＮａｓｅＨ活性を検出でき、モニターできるアッセイおよび方法、ならびに酵素活性に影響を及ぼすかまたは調節できる化合物の同定はかなりの関心を集めている。しかし、現行のＲＮａｓｅＨ活性のアッセイ、ならびに核酸開裂が起こるかどうか、およびどの程度起こるかを立証する他の方法は、典型的には時間がかかり、困難である。これは、使用者が、例えば新規阻害物質の効果を特徴づけるために、酵素についての正確な動力学的情報の確証を望む場合に特に不利である。
【０００５】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
標識されたオリゴヌクレオチドプローブの配列特異性ハイブリダイゼーションが、選択されたヌクレオチド配列の検出および同定のための手段として使用されており、かかるプローブの蛍光標識での標識は、プローブハイブリダイゼーションの検出を促進するための比較的感受性の非放射性手段を提供する。最近の検出法は、プローブハイブリダイゼーションを検出するために、蛍光強度の直接検出よりも蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを用いる。蛍光エネルギー移動は、ドナーフルオロフォア（fluorophore）とクエンチャー（quencher）色素（フルオロフォアであっても、フルオロフォアでなくてもよい）間で、一方（クエンチャー）の吸収スペクトルが他方（ドナー）の発光スペクトルと重なり合い、２つの色素が近接する場合に起こる。これらの特性を有する色素をドナー／クエンチャー色素対またはエネルギー移動色素対と称する。
【０００６】
ドナーフルオロフォアの励起状態エネルギーは、共鳴双極子誘起双極子相互作用により隣のクエンチャーに移動する。この結果、ドナー蛍光が消光される。場合によっては、クエンチャーもフルオロフォアであるならば、その蛍光の強度は向上され得る。エネルギー移動の効率はドナーとクエンチャー間の距離に極めて依存し、これらの関係を予測する式がＦｏｒｓｔｅｒ（Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．１９４８，２：５５−７５）により開発されている。エネルギー移動が５０％であるドナーとクエンチャー色素間の距離は、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離（ＲＯ）と称する。例えば電荷移動および動的消光をはじめとする蛍光消光の他のメカニズムも公知である。
【０００７】
消光をもたらす近接した２つの色素間の相互作用に依存するエネルギー移動および他のメカニズムは、ヌクレオチド配列の検出または同定にとって、かかるアッセイが同種の様式で行われるので、魅力的な手段である。異種アッセイは一般にフリーな標識からハイブリッド形成した標識を分離するための追加の工程を必要とするため、同種のアッセイ様式は、一つのフルオロフォア標識の蛍光の検出に依存する慣用のプローブハイブリダイゼーションアッセイよりも簡単である。伝統的に、ＦＲＥＴおよび関連する方法は、２つの相補性オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりひとまとめにされた場合に、一方または両方の色素標識の蛍光特性における変化をモニターすることを利用する。この様式において、蛍光特性における変化は、エネルギー移動の量における変化として、または蛍光消光の量における変化として測定することができ、典型的には色素の一方の蛍光強度における増加として示される。このようにして、ハイブリッド形成されていないオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドを分離することなく、興味のあるヌクレオチド配列を検出することができる。ハイブリダイゼーションは、一方がドナーフルオロフォアで標識され、他方がクエンチャーで標識された２つの独立した相補性オリゴヌクレオチド間で起こる。二本鎖形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドと比較して、ドナー蛍光の減少（消光の増大）および／またはエネルギー移動の増大がある。
【０００８】
ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイのいくつかの様式は、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；特に３１１−３５２ページ参照）に概説されている。あるいは、ドナーおよびクエンチャーは一つのオリゴヌクレオチドと結合して、オリゴヌクレオチドがその相補性配列とハイブリッド形成していない場合対その相補性配列とハイブリッド形成している場合の一方または両方の蛍光特性において検出可能な相違がある。この様式において、オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する場合にはドナー蛍光は典型的には増大し、エネルギー移動／消光は減少する。例えば、各末端で標識された自己相補的オリゴヌクレオチドはヘアピンを形成し、これにより２つのフルオロフォア（すなわち５’および３’末端）が空間的に近接し、エネルギー移動および消光が起こり得る。自己相補的オリゴヌクレオチドの第二のオリゴヌクレオチドにおけるその相補性配列に対するハイブリダイゼーションはヘアピンを崩壊させ、２つの色素間の距離を増大させ、従って消光は減少する。ヘアピン構造の欠点は、非常に安定であり、消光されないハイブリッド形成された形態への変換がしばしばゆっくりであり、よくても中程度で、その結果、性能が不良になることである。Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９６，１４：３０３−３０８）は、ステムを形成するヘアピンの自己相補的アーム間のループにおいてディテクター配列を含む前記のようにして標識されたヘアピンを記載している。塩基対ステムは、ディテクター配列を標的とハイブリッド形成させ、消光を減少させるために、融解しなければならない。「ダブルヘアピン」プローブおよびその使用法は、Ｂａｇｗｅｌｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４，２２：２４２４−２４２５；米国特許第５，６０７，８３４も参照）により記載されている。これらの構造はヘアピン内に標的結合配列を含み、従って標的とヘアピンの自己相補的配列間の競合的ハイブリダイゼーションを含む。Ｂａｇｗｅｌｌはヘアピンをミスマッチで不安定化させることにより、望ましくないハイブリダイゼーション動力学の問題を解決する。
【０００９】
核酸増幅の検出のためにエネルギー移動または蛍光消光の他のメカニズムを用いる同種法も記載されている。Ｌｅｅら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９３，２１：３７６１−３７６６）は二重標識されたディテクタープローブがＰＣＲ中に標的増幅特異的方法で開裂されるリアルタイム検出法を開示している。ディテクタープローブは増幅プライマーの下流でハイブリッド形成し、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がディテクタープローブを消化し、エネルギー移動対を形成する２つの蛍光色素を分離する。蛍光強度はプローブが開裂する際に増大する。
【００１０】
増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流の標的配列とハイブリッド形成するシグナルプライマー（ディテクタープライマーとも称する）は核酸増幅の同種検出に関して記載されている（米国特許第５，５４７，８６１号）。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長と同様にしてポリメラーゼにより伸長される。増幅プライマーの伸長は、標的増幅に依存した方法でシグナルプライマーの伸長生成物を移動させ、標的増幅の指標として検出できる二本鎖第二増幅産物を製造する。一本鎖シグナルプライマーに関する使用についての同種検出法の例は、米国特許第５，５５０，０２５号（親油性色素および制限部位の組み入れ）および米国特許第５，５９３，８６７号（蛍光偏光検出）に記載されている。最近になって、シグナルプライマーはＦＲＥＴ法を用いて核酸標的の検出のために適合させられている。米国特許第５，６９１，１４５号は、一本鎖シグナルプライマーの標的結合配列に対して５’に付加されたドナー／クエンチャー色素対を含有するＧ−カルテット構造を開示している。標的増幅中の相補鎖の合成はＧ−カルテットを伸ばし、ドナーとクエンチャー色素間の距離が増大し、その結果、ドナー蛍光において検出可能な増大が生じる。ドナー／プライマー色素対で標識された部分的に一本鎖、部分的に二本鎖のシグナルプライマーも最近記載されている。例えば、ＥＰ０８７８５５４は、一本鎖制限エンドヌクレアーゼ制限部位に隣接するドナー／クエンチャー色素対を有するシグナルプライマーを開示している。標的の存在下で、制限部位は二本鎖になり、制限エンドヌクレアーゼにより開裂可能になる。開裂は色素対を分離させ、ドナー消光を減少させる。ＥＰ０８８１３０２は、分子内塩基対構造が付加されたシグナルプライマーを記載している。分子内塩基対構造に結合したドナー／クエンチャー色素対のドナー色素は、該構造が折り畳まれた場合に消光されるが、標的の存在下で分子内塩基対構造に対して相補性の配列が合成される。これは分子内塩基対構造を展開し、ドナーとクエンチャー色素を分離させ、その結果、ドナー消光が減少する。Ｎａｚａｒｅｎｋｏら（米国特許第５，８６６，３３６号）は、増幅プライマーが、ドナー／クエンチャー色素対を有するヘアピン構造で構成される類似の方法を記載している。
【００１１】
従って、ＲＮＡおよび他の核酸の、例えばＲＮａｓｅＨなどの酵素による分解を検出および／またはモニターできるアッセイおよび方法が依然として必要とされる。特に、かかる活性をリアルタイムで検出し、モニターできるアッセイおよび方法が必要とされる。
この節または本出願の本文全体における参考文献の記載は、かかる文献が本明細書において記載され、請求される発明の「先行技術」として利用可能であることを認めない。
【特許文献１】米国仮出願番号６０／４３６１２５号
【特許文献２】米国特許第５，６０７，８３４号
【特許文献３】米国特許第５，５４７，８６１号
【特許文献４】米国特許第５，５５０，０２５号
【特許文献５】米国特許第５，５９３，８６７号
【特許文献６】米国特許第５，６９１，１４５号
【特許文献７】ＥＰ０８７８５５４
【特許文献８】ＥＰ０８８１３０２
【特許文献９】米国特許第５，８６６，３３６号
【非特許文献１】Ｈａｎｓｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８，７：２３９−２４３
【非特許文献２】Ｓｃｈａｔｚら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８９，２５７：３１１−３１４
【非特許文献３】Ｍｉｚｒａｈｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９０，１８：５３５９−５３６３
【非特許文献４】Ｆｕｒｆｉｎｅ  ＆  Ｒｅａｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６：４０６−４１２
【非特許文献５】Ｔｉｓｄａｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９１，７２：５９−６６
【非特許文献６】Ｆｏｒｓｔｅｒ、Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．１９４８，２：５５−７５
【非特許文献７】Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；特に３１１−３５２ページ参照
【非特許文献８】Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９６，１４：３０３−３０８
【非特許文献９】Ｂａｇｗｅｌｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４，２２：２４２４−２４２５
【非特許文献１０】Ｌｅｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９３，２１：３７６１−３７６６
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、（ａ）標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォアを含有し、他端に消光基（quenching group）を含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸をハイブリッド形成させ（ここにおいて、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブはフルオロフォアとクエンチャーを、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するほど近接した位置にある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分なほどフルオロフォアとクエンチャーを分離させる）；（ｂ）プローブ−標的ハイブリッドを、標的核酸を選択的に開裂させ、これによりそのままのプローブを放出させるために十分な量のヌクレアーゼ活性を有する作用物質と接触させ；（ｃ）プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較したフルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少を測定することにより、プローブの放出を検出することにより、標的核酸のヌクレアーゼによる開裂を検出する方法を提供することにより、先行技術の欠点を克服する。
【００１３】
本発明の別の具体例は、標的ＲＮＡに対して相補性であり、一端にフルオロフォア、他端にクエンチャーを含有する蛍光標識されたオリゴデスオキシリボヌクレオチドプローブと標的ＲＮＡをハイブリッド形成させ（ここにおいて、（ｉ）プローブが標的ＲＮＡとハイブリッド形成しない場合、プローブは、フルオロフォアの蛍光シグナルをクエンチャーが消光するほど近接してフルオロフォアとクエンチャーがある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分フルオロフォアとクエンチャーを分離させる）；プローブ−標的ハイブリッドを、標的ＲＮＡを選択的に開裂させ、これによりそのままのプローブを放出させるために十分な量の作用物質と接触させ；プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較して、フルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少を測定することにより、作用物質のＲＮａｓｅＨ活性を測定する方法を提供する。
【００１４】
一具体例において、作用物質は、ＲＮａｓｅＨ、逆転写酵素、イー・コリＲｎａｓｅＨ１およびＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される。好ましい具体例において、逆転写酵素はＨＩＶ逆転写酵素である。さらに別の具体例において、逆転写酵素はＲＮａｓｅドメインを含有する。
本発明の別の具体例において、プローブはＤＮＡであり、標的はＤＮＡ：ＲＮａｓｅハイブリッド基質である。さらに本発明の一具体例においては、プローブは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
【００１５】
本発明において、プローブは、標的核酸またはＲＮＡとハイブリッド形成しない場合、フルオロフォアとクエンチャーを近接させるヘアピン二次構造をとる。加えて、ＲＮａｓｅＨまたはヌクレアーゼ反応が化合物の存在下で行われる場合、同じ反応が化合物の不在下で行われる場合に観察される減少と比較したヌクレアーゼ反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルの減少率における差は、物質のヌクレアーゼ活性を阻害または向上させる化合物の能力の指標である。
本発明の一具体例において、該方法はＲＮａｓｅＨまたはヌクレアーゼ反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルをモニターする。
【００１６】
本発明はさらに、標的核酸を、標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォア、他端に消光基を含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成させ（ここにおいて、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブは、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するほどフルオロフォアとクエンチャーが近接した位置にある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分フルオロフォアとクエンチャーを分離させる）；プローブ−標的ハイブリッドを含有する２つのサンプルを調製し；第一サンプルのプローブ−標的ハイブリッドを、標的核酸を選択的に開裂させ、これによりそのままのプローブを放出するために十分な量の作用物質と接触させ；第二サンプルのプローブ−標的ハイブリッドを、標的核酸を選択的に開裂させ、これによりそのままのプローブを放出させるために十分な量の作用物質と、該作用物質のヌクレアーゼ活性を調節するその能力について試験される候補化合物の存在下で接触させ；プローブ−標的ハイブリッドのシグナルと比較して、フルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少を測定することにより、各サンプルにおけるプローブの放出を検出し；２つのサンプルにおけるフルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少率を比較する（ここにおいて、２つのサンプルのヌクレアーゼ反応中のフルオロフォアの蛍光シグナルにおける減少率の差は、作用物質のヌクレアーゼ活性を阻害または向上させる化合物の能力の指標である）ことにより、作用物質のヌクレアーゼ活性のモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。
【００１７】
好ましい具体例において、第一のサンプルと比較して第二のサンプルにおけるフルオロフォアの蛍光シグナルの減少の程度または相対的割合が高いことは、候補化合物が作動物質であることを示す。別の具体例において、第一のサンプルと比較して第二のサンプルにおけるフルオロフォアの蛍光シグナルの減少の程度または相対的割合が小さいことは、候補化合物が拮抗物質であることを示す。
本発明はさらに、標的核酸および、標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォアを、他端にクエンチャーを含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む作用物質のヌクレアーゼ活性を測定するためのキットも提供し、ここにおいて、（ｉ）プローブが標的核酸に対してハイブリッド形成されない場合、プローブは、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するようにフルオロフォアとクエンチャーが近接した位置にある構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分フルオロフォアとクエンチャーを分離させる。
【００１８】
キットの一具体例において、プローブは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。キットの別の具体例において、プローブは、標的核酸とハイブリッド形成しない場合、フルオロフォアとクエンチャーを近接させるヘアピン二次構造をとる。
キットの好ましい具体例において、プローブはＤＮＡであり、標的核酸はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド基質である。
キットの一具体例において、本発明はさらに作用物質を有する。好ましい具体例において、作用物質は、ＲＮａｓｅＨ、逆転写酵素、イー・コリＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される。さらにもう一つの具体例において、逆転写酵素はＨＩＶ逆転写酵素である。
【００１９】
本発明はさらに、作用物質のヌクレアーゼ活性を測定するためのアッセイ混合物であって、標的核酸および、標的核酸に対して相補性であり、一端にフルオロフォア、他端に消光基を含有する蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む混合物を提供し、ここにおいて、（ｉ）プローブが標的核酸とハイブリッド形成しない場合、プローブは、クエンチャーがフルオロフォアの蛍光シグナルを消光するように近接してフルオロフォアとクエンチャーが位置する構造をとり、（ｉｉ）プローブ−標的ハイブリッドの形成は、フルオロフォアの蛍光シグナルの消光を減少させるために十分フルオロフォアとクエンチャーを分離させる。
【００２０】
アッセイの好ましい具体例において、プローブはＤＮＡであり、標的核酸はＲＮＡである。さらにもう一つの態様において、プローブおよび標的核酸は互いにハイブリッド形成して、プローブ−標的ハイブリッドを形成する。
アッセイ混合物の一具体例において、作用物質も存在する。好ましい具体例において、作用物質は、ＲＮａｓｅＨ、逆転写酵素、イー・コリＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ヒトＲＮａｓｅＨ１およびＨ２、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＢＶ逆転写酵素、およびインテグラーゼからなる群から選択される。さらに別の具体例において、逆転写酵素はＨＩＶ逆転写酵素である。
【００２１】
（図面の簡単な記載）
図１Ａ〜１ＢはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ反応により合成される基質ＲＮＡのＰＡＧＥ分析を示す。図１Ａは、変性（７Ｍ尿素１５％ポリアクリルアミド）ゲル上で評価したＲＮＡ生成物を示し、図１Ｂは非変性（天然１５％ポリアクリルアミド）ゲルを示す。両ゲルにおける核酸は、エチジウムブロミド染色により検出された。両図におけるゲルは次のようにロードした：
レーン１：４９−ｍｅｒテンプレートＤＮＡ（配列番号２）；
レーン２：対照ＲＮＡ１２５−ｍｅｒ；
レーン３〜６：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ反応から誘導されるＲＮＡ；および
レーン７：４９−ｍｅｒテンプレートＤＮＡ。
図２Ａ〜２ＤはＰＡＧＥにより評価された、放射標識されたＲＮＡ−ＤＮＡ基質を示す。図２Ａは基質ＲＮＡ（配列番号１）にアニールされた基質ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。図２Ｂは、３３Ｐ−末端標識されたＤＮＡにアニールされた未標識ＲＮＡをロードされた非変性ゲルの画像を示す。図２Ｃおよび２Ｄはそれぞれ変性および非変性ポリアクリルアミドゲルであって、両方とも内部放射標識されたＲＮＡおよび未標識ＤＮＡをロードされたゲルを示す。核酸検出の方法は、リン光画像（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒｙ）による。
【００２２】
図３Ａ〜３Ｂは、ＲＮａｓｅＨ活性のＰＡＧＥベースのアッセイから得られる結果を示す。図３Ａは未標識ＲＮＡ／末端標識ＤＮＡ基質を使用したアッセイの具体例から得られる結果を示し、図３Ｂは標識されたＲＮＡ／未標識ＤＮＡ基質を使用した別の具体例についての結果を示す。
図４は、ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性のアッセイにおいて消化された未標識ＲＮＡ／末端標識されたＤＮＡハイブリッドをロードされたポリアクリルアミドゲルの画像を示す。
図５Ａ〜５Ｂは、それぞれ図３Ａおよび図４において示されるＰＡＧＥゲルの定量分析から確認されるＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性のプロットを示す。
図６Ａ〜６Ｃは、１Ｕ（１９ｆｍｏｌ≒２．２ｎｇ）ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ酵素と共に（図６Ａ）または無しで（図６Ｂ）インキュベートしたｓｓＲＮＡ基質を用いて行ったＰＡＧＥゲル、およびＲＮａｓｅＨ活性を実証するために酵素と共に２．５ピコモルのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質をインキュベートしたＰＡＧＥゲル（図６Ｃ）を示す。
図７は、放射標識されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質とともにｐｏｌｙＡ（レーン２〜３）、ｐｏｌｙＵ（レーン４〜５）および１８Ｓ  ＲＮＡ（配列番号５；レーン６〜７）を用いて行ったＲＮａｓｅＨアッセイから得られるＰＡＧＥゲルである。
【００２３】
図８は、本明細書においてＯｌｉｇｏ１（配列番号６；レーン３〜５）；Ｏｌｉｇｏ２（配列番号７；レーン６〜８）およびＯｌｉｇｏ３（配列番号８；レーン９〜１１）と称する「汚染オリゴヌクレオチド」を用いて行ったＲＮａｓｅＨアッセイから得られるＰＡＧＥゲルを示す。
図９Ａ〜９Ｄは、ＨＩＶ  ＲＮａｓｅＨ（図９Ａ）、ＭＭＬＶ  ＲＮＡｓｅＨ（図９Ｂ）および突然変異ＭＭＬＶ  ＲＮａｓｅＨ（図９Ｃ）を用いたＰＡＧＥベースのＲＮａｓｅＨアッセイから得られる結果を示す。これらのデータの定量分析を図９Ｄにおいてプロットする。
図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の好ましいリアルタイムＲＮａｓｅＨアッセイの概略図を提供する。図１０Ａは、フルオロフォア部分（Ｆ）およびクエンチャー部分（Ｑ）で標識されたＤＮＡプローブ（配列番号９）にアニールされたＲＮａｓｅＨ基質（配列番号１０）を示す。ＤＮＡプローブの５’−３’領域は、ＲＮＡ基質がＲＮａｓｅＮＨにより消化された後、互いにアニールでき、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を、クエンチャー部分がフルオロフォア部分により発せられる検出可能なシグナルの少なくとも一部を吸収するように十分近接させる（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、ＲＮａｓｅＨがこのアッセイにおいてＲＮＡ基質を分解する際にリアルタイムで観察できる典型的な蛍光シグナルを示す。
図１１Ａ〜１１Ｂは、ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ（図１１Ａ）およびイー・コリＲＮａｓｅＨ１（図１１Ｂ）を使用した本発明のリアルタイムＲＮａｓｅＨアッセイから得られる蛍光強度測定値のプロットである。
【００２４】
（発明の詳細な記載）
本発明はＲＮａｓｅＨ活性をリアルタイムでモニターするための蛍光分析法に関する。特に、本発明は蛍光における減少によるＲＮａｓｅＨ活性の定量的評価法に関する。
定義
本発明に従って、当業者の技術範囲内で通常の分子生物学、細菌学および組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献において十分説明され、かかる技術を説明するために本発明において用いられる用語は一般に当該分野において通常用いられる意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書においては「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」と称する）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｅ．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）参照。
【００２５】
「蛍光標識」または「フルオロフォア」なる用語は、検出可能な範囲において蛍光を示すことができる物質またはその一部を意味する。本発明に従って用いることができるフルオロフォアの例としては、フルオロセインイソチオシアネート、フルオロセインアミン、エオシン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、Ｃｙ５、Ｃｙ３およびヨーロピウムが挙げられる。他の蛍光標識は、当業者には公知であろう。感受性蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブを設計するための一般的指針は、ＨｅｌｌｅｒおよびＪａｂｌｏｎｓｋｉの米国特許第４，９９６，１４３号において見いだすことができる。この特許は、蛍光プローブを設計する場合に考慮すべきパラメータ、例えば蛍光部分の間隔（すなわち、蛍光標識の対が本発明の方法において用いられる場合）、およびオリゴヌクレオチドの基本単位と蛍光部分を結合させるリンカーアームの長さを論議している。本明細書において用いられる「リンカーアーム」なる用語は、内部末端が結合しているプリンまたはピリミジン塩基からその外部末端のフルオロフォアまでの距離（オングストローム）として定義される。
【００２６】
「酵素による開裂」なる用語は、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、ヘリカーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはレトロウイルスインテグラーゼなどの酵素により触媒されるＤＮＡまたはＲＮＡの開裂を意味する。核酸開裂に影響する他の酵素は、当業者に公知であり、本発明の実施において用いることができる。これらの酵素の一般論はＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）の第５章において見いだすことができる。
本明細書において用いられる場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語は、検出されるプライマー、プローブ、オリゴマーフラグメント、オリゴマー対照および未標識ブロッキングオリゴマーを意味し、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有）ならびにキメラポリヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースおよびＤ−リボースヌクレオチドを含有）、およびプリンまたはピリミジン塩基、または修飾プリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドである他の種類のポリヌクレオチドの総称である。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」なる用語間で考えられる長さの差はなく、これらの用語は交換可能に用いられる。従って、これらの用語は二本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを包含する。好ましくは、本発明のアッセイに関連して用いられるオリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、さらに好ましくは約１０から１００ヌクレオチドの間の長さであり、約２５〜５０ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドが一層好ましい。
【００２７】
オリゴヌクレオチドは任意の既存の配列または天然の配列から単離される物理的に誘導される種に限定される必要はなく、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写またはその組み合わせをはじめとする任意の方法で生成させることができる。「オリゴヌクレオチド」または「核酸」なる用語は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリオリゴヌクレオチドであって、その起源または操作に基づいて：（１）天然に関連するポリヌクレオチドの全部または一部と関連しない；および／または（２）自然には結合しないもの以外のポリヌクレオチドと結合する；および（３）天然でない（自然界において見いだされない）であるポリオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’ホスフェートが一方向においてその隣の３’酸素とホスホジエステル結合により結合するような方法でオリゴヌクレオチドを製造するために反応させたモノヌクレオチドからなり、その５’ホスフェートがモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と結合しないならばオリゴヌクレオチドの「５’末端」と称し、次にその３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’ホスフェートと結合しないならば「３’末端」と称する。核酸配列は、さらに大きなオリゴヌクレオチドに取り込まれるとしても５’および３’末端を有するということができる。同じ直線状相補核酸配列の２つの異なる領域とアニールし、従って１つのオリゴヌクレオチドの３’末端が他方の５’末端に向いている２つの別個の非重複オリゴヌクレオチドは、「上流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ、後者は「下流」オリゴヌクレオチドと呼ばれる。一般に、「下流」とは、一本鎖オリゴヌクレオチド上の３’方向にある位置を意味するか、あるいは二本鎖オリゴヌクレオチドにおいては、参考ヌクレオチド鎖の３’方向にある位置を意味する。
【００２８】
「プライマー」なる用語は、精製された制限消化におけるように自然に単離されるか、または合成により調製されるかにかかわらず、１以上のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、合成されたプライマー伸長生成物が核酸鎖に対して相補性である反応条件下におかれた場合に、相補鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に沿って合成を開始する地点として作用できなければならない。これらの反応条件は、４つの異なるデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートおよび重合誘発剤、例えばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在を包含する。反応条件は、適合性緩衝液（コファクターであるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす成分を含む）を最適温度で使用することを含む。プライマーは増幅反応において最大効率を得るためには好ましくは一本鎖である。
【００２９】
相補核酸配列は、核酸配列と整列させられた場合に一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対をなすようなオリゴヌクレオチドを意味する。この結合は、「逆平行」と称する。天然の核酸において通常見いだされない修飾塩基類似体は、プライマー、プローブまたは本発明の伸長生成物を包含するが、これに限定されない核酸中に（酵素または合成により）組み入れることができ、たとえば、イノシンおよび７−デアザグアニンを含むことができる。２つの核酸鎖の相補性は完全でなくてもよく；ある安定な二本鎖はミスマッチの塩基対またはマッチしない塩基を含有してもよく、核酸技術の当業者は、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチド中のシトシンおよびグアニン塩基の濃度、イオン強度、ｐＨおよびミスマッチした塩基対の数、頻度および位置をはじめとする多くの変数を考慮することによりその安定性を仮定することができる。核酸二本鎖の安定性は、融解温度または解離温度、または「Ｔｍ」により測定される。特定の反応条件下での特定の核酸二本鎖のＴｍ。これは塩基対の半分が解離する温度である。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、「標的配列」または「標的核酸配列」なる用語は、増幅されるか、検出されるか、またはその両方であるオリゴヌクレオチドの領域を意味する。標的配列は、増幅に用いられるか、または逆転写された一本鎖ｃＤＮＡ生成物として用いられる２つのプライマー配列間にある。標的配列はサンプルまたは検体から自然に誘導されるか、または合成的に製造することができるかのいずれかである。
本明細書において用いられる場合、「プローブ」は、標的領域における配列に対するリボ−オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの配列の相補性のために、標的核酸おける配列と二重構造を形成するリボ−オリゴヌクレオチドを含む。プローブは、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または逆転写（ＲＴ）反応をプライムするために用いられる配列に対して相補性である配列を含有しない。プローブはキメラである、すなわちＤＮＡの一部を構成する。キメラプローブが用いられる場合、該プローブの３’末端は、この末端がプローブのプライマー伸長生成物中への組み入れを防止するためのＤＮＡ部分を構成するならば一般にブロックされる。ビオチン、フルオレセイン、ローダミンおよびさらには最後のデオキシリボヌクレオチド塩基の３’ヒドロキシル上のホスフェート基などの化学部分の付加は、３’末端ブロッキング基としての働きをすることができ、特定の場合においては検出可能な標識またはクエンチャーとしての働きを同時にすることができる。さらに、プローブはハイブリダイゼーション、重合または加水分解のさらなる制御を可能にするために修飾された塩基または修飾された結合を組み入れることができる。
【００３１】
「標識」なる用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）リアルタイムシグナルを提供するために用いることができる任意の原子または分子を意味する。検出可能な標識は、核酸プローブまたはタンパク質と結合させることができる。標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、比色（ＥＬＩＳＡ）、Ｘ線回折または吸収、磁気学、酵素活性のいずれか、またはこれらの組み合わせにより検出可能なシグナルを提供する。
「アブソーバー／エミッター部分」なる用語は、１つの波長の光エネルギーを吸収でき、同時に別の波長の光エネルギーを発することができる化合物を意味する。これはリン光および蛍光部分を含む。アブソーバー／エミッター対を選択するための要件は次のとおりである：（１）これらは容易に官能化され、プローブとカップリングされなければならない；（２）アブソーバー／エミッター対は官能化されたプローブのその相補性核酸標的配列とのハイブリダイゼーションを妨害してはならない；（３）最終発光（蛍光）は当業者が検出し、測定するために最大限で十分であり、十分長く持続しなければならない；（４）適合性クエンチャーの使用は任意のさらなる発光の十分な無効化を可能にしなければならない。
【００３２】
本出願において用いられる場合、「リアルタイム」とは、長時間にわたってシグナルを特徴づけるために複数の読みとりをすることを含む、シグナルの動的生産の検出を意味する。例えば、リアルタイム測定は、検出可能な生成物の増加率の測定を含むことができる。あるいは、リアルタイム測定は、標的配列が検出可能なレベルまで増幅されるまでに必要な時間の決定を含み得る。
「化学発光および生物発光」なる用語は、発光反応に関与する部分を包含する。化学発光部分（触媒）は、ペルオキシダーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、官能化鉄−ポルフィリン誘導体などを包含する。
【００３３】
本明細書において定義されるように、「ヌクレアーゼ活性」とは、テンプレート特異性リボ核酸ヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅＨの活性を意味する。本明細書において用いられる場合、「ＲＮａｓｅＨ」なる用語は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ部分を特異的に分解する酵素を意味する。この酵素は一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを開裂せず、典型的にはＰＣＲ中に遭遇する温度で活性のままである熱安定性ハイブリッドが利用可能である。一般に、酵素はヌクレアーゼ活性を開始し、これによりリボヌクレオチドが除去されるか、またはプローブが標的ＤＮＡ配列にアニールする場合に形成されるＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖においてリボオリゴヌクレオチドが開裂される。
「ハイブリダイゼーションまたは反応条件」なる用語は、標識されたプローブのその相補性標的核酸配列への選択的ハイブリダイゼーションを可能にするアッセイ緩衝液条件を意味する。これらの条件は、標的核酸配列に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションが最適化され、同時にプローブ−標的ハイブリッドのヌクレアーゼ酵素によるか、またはヌクレアーゼ活性を有する他の作用物質による開裂（これに限定されない）を同時に可能にする。反応条件は、コファクター、イオン強度、ｐＨおよび温度について最適化される。
【００３４】
ＲＮａｓｅＨ分子ビーコンアッセイ
好ましい具体例において、本発明のアッセイおよび方法は、本明細書において「分子ビーコンアッセイと称するアッセイにおいて核酸のＲＮａｓｅＨ活性および／または他のヌクレアーゼによる開裂を検出する。かかるアッセイの具体例を図１０Ａ〜１０Ｃに概略的に図示する。アッセイは、オリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つの領域または一部とアニールされる、好ましくはＲＮＡ基質である核酸基質の分解を検出する。好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドプローブはＤＮＡプローブ（例えば、デオキシオリゴヌクレオチドプローブ）であり、これは本発明に関連してＤＮＡ「基質」部分とも称する。典型的には、オリゴヌクレオチドプローブおよびＲＮＡ基質はどちらも、約１０から約１００ヌクレオチドの間の長さであり、例えば約１０〜５０ヌクレオチドの間の長さであり、さらに好ましくは１５〜２５ヌクレオチドの間の長さであるオリゴヌクレオチド分子である。好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドプローブは少なくとも１８ヌクレオチドの長さである。
【００３５】
図１０Ａは、配列番号１０に記載されるヌクレオチド配列対を有し、配列番号９に記載されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡプローブとアニールされたＲＮＡ基質の例を示す。しかしながら、これらの配列は本発明を説明し、より良く説明するための一例にすぎない。ＲＮＡ基質および／またはオリゴヌクレオチドプローブの実際の配列は重要ではなく、当業者は実験を行うことなく他の適当な配列を容易に設計できるであろう。
それにもかかわらず、基質およびプローブ配列は好ましくはある特性を有する。特に、オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、本明細書において５’−領域および３’−領域と称し、それぞれオリゴヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列の領域を含む。これらの５’−および３’−領域は好ましくは、互いに相補性であるヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチドプローブがＲＮＡ基質にアニールされていない場合、２つの領域は互いにハイブリッド形成することができ、これによりヘアピンループ、例えば図１０Ｂに例示されるヘアピンループを形成できる。
【００３６】
オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、プローブの５’−領域とその３’−領域間にある第三の領域を含むのが好ましく、従って本明細書においてはオリゴヌクレオチドプローブの「中心領域」と称される。この中心領域の実際の配列は本発明の実施に重要ではない。オリゴヌクレオチドプローブの中心領域がＲＮＡ基質の少なくとも一部と、２つの分子がアッセイ条件下で互いにハイブリッド形成するために十分相補性であることで十分である。
本発明の分子ビーコンアッセイにおいて用いられるオリゴヌクレオチドプローブは、好ましい具体例において、検出可能な蛍光標識を発する蛍光または「フルオロフォア」部分を含む検出可能な標識を含むこともできる。さらに好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブはさらに、フルオロフォア部分と十分近接した位置にある場合に、該フルオロフォア部分により発せられる蛍光シグナルの少なくとも一部を吸収できる「クエンチャー」クエンチャー部分を含む。適当な蛍光標識およびこれと共に使用される適当なクエンチャーは当該分野において周知である。例えば、好ましい一具体例において、フルオロフォア部分はフルオレセインであり、クエンチャー部分はｄａｂｃｙｌである。これらの標識はどちらも、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア）から商業的に入手可能である。しかしながら、様々な他のこのような部分は一般的に利用可能および／または当該分野において公知であり、かかる他のフルオロフォアおよびクエンチャー部分の使用も本発明において意図される。当業者らは、本発明の分子ビーコンまたは他のアッセイに適当であり、使用できる他の標識およびクエンチャーを容易に同定することができるであろう。
【００３７】
フルオロフォアおよびクエンチャー部分は、好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの相対する末端に結合する。従って、図１０Ａにおけるオリゴヌクレオチドプローブの例は、オリゴヌクレオチドプローブの３’−領域（例えば３’−末端上）に結合したフルオロフォア部分を有し、クエンチャー部分はオリゴヌクレオチドプローブの５’−領域（例えば、５’−末端）に結合しているとして表されている。しかしながら、クエンチャー部分が３’−領域に結合し、フルオロフォア部分が５’−領域に結合した例も考慮され、一般に等しく好ましい。
従って、どのフルオロフォアまたはクエンチャー部分がオリゴヌクレオチドプローブのどの末端と結合しているかは重要ではない。しかしながら、２つの部分は好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブがＲＮＡ基質とアニールする場合、フルオロフォアとクエンチャー部分が互いに十分無関係であり、クエンチャー部分がフルオロフォア部分からの検出可能な量のシグナルを吸収しないような位置にある。しかしながら、オリゴヌクレオチドプローブの５’−および３’−領域が互いにハイブリッド形成するおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブがヘアピンロープを形成する場合（例えば図１０Ｂに示すように）、フルオロフォアとクエンチャー部分は十分近接して、フルオロフォアにより発せられる蛍光シグナルの少なくとも一部がクエンチャーにより吸収され、サンプルからの蛍光シグナルの強度が検出可能に減少する。
【００３８】
従って、好ましい具体例において、アッセイの分子ベーコンは、オリゴヌクレオチドプローブおよびＲＮＡ基質を含有するサンプルを用いて、図１０Ａに示すようにオリゴヌクレオチドプローブとＲＮＡ基質が互いにアニールするような条件下で開始される。酵素、またはＲＮＡを分解するかまたは分解すると思われる他の分子（例えば、ＲＮａｓｅＨ酵素）を次にサンプルに添加し、所望により酵素活性を調整すると思われる化合物も添加することができる。プローブおよび基質を次いで酵素および任意の試験化合物の存在下でインキュベートし、サンプルの蛍光シグナル強度を測定する。特定の理論または作用機序に限定されないが、ＲＮＡ基質がサンプル中で消化される際に、自己ハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブのフラクションが増大し、例えば図１０Ｂに示すようなヘアピンループを形成する。従って、ＲＮａｓｅ反応が進行するにつれ、クエンチャー部分がフルオロフォア部分と近接するような構造をとるオリゴヌクレオチドプローブが増え、その蛍光シグナルが効率よく軽減されるかまたは「消光」される。この効果は、サンプルの蛍光強度をモニターすることにより反応が進行するにつれて観察される。特に、ＲＮＡ基質が消化されるにつれ、観察される蛍光強度は経時的に減少して、図１０Ｃに示すような特性をもたらす。
【００３９】
利点および用途
速度ベースまたは動力学的アッセイは、ＲＮａｓｅＨ活性を評価するために開発された。アッセイの検出力は、複数のフルオロフォアを使用する能力、薬剤開発、および速度定数の迅速な評価のための高スループットスクリーニングへのこのアッセイの適用により強調される。放射活性フォーマットにおいて行われるアッセイとの組み合わせにおいて、本発明者らは、このアッセイが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド基質におけるＲＮＡの分解に対して特異的であることを示した。このアッセイは、いくつかの（ゲルベースおよび放射性非ＴＣＡ沈殿性カウント、およびＩＧＥＮ捕捉アッセイ）基準により文献における他のｐＲＮａｓｅＨアッセイよりも優れている。
【００４０】
第一に、アッセイは迅速で、多穴フォーマット（９６、３８４、１５３６穴フォーマットを包含するが、これに限定されない）における高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に適用可能である。第二に、このアッセイの感度はポリアクリルアミドゲルベースのアッセイに対して同程度またはよりすぐれている。このアッセイは、伝統的な放射能放出アッセイよりも桁違いに感受性である（例えば、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７６，７３：１０８７−１０９１；Ｐａｐａｐｈｉｌｉｓ  ＆  Ｋａｍｐｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５，１４５：１６０−１６９；Ｋｒｕｇ  ＆  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８９，８６：３５３９−３５４３；Ｃｒｏｕｃｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００１，３４１：３９５−４１３；Ｌｉｍａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００１，３４１：４３０−４４０；Ｓｙｎｄｅｒ  ＆  Ｒｏｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００１，３４１−４４０−４５２参照）。第三に、ＩＧＥＮアッセイ（９６穴フォーマット）に対して、これはＲＮａｓｅＨ活性の直接的決定法であり、酵素活性の検出または酵素活性の阻害のための検出用生成物の捕捉を利用しない。第四に、アッセイは速度ベースであり、阻害定数の直接的決定を可能にする。合わせると、このアッセイは、放射能放出アッセイよりも速く放射性ゲルベースのアッセイの感度を提供し、ＩＧＥＮ捕捉アッセイのように酵素活性の検出のために第二の事象を必要としない。
このアッセイの商業的価値は薬剤開発である。このアッセイの改良法はＨＩＶインテグラーゼまたは他のＲＮＡおよびＤＮＡ代謝酵素などの新規アッセイの開発を可能にする。
【００４１】
（実施例）
本発明を以下の実施例により説明する。しかしながら、これらまたは本明細書における他の実施例の使用は例示のみであって、本発明または例示された語句の範囲および意味をなんら制限するものではない。同様に、本発明は本明細書に記載された具体例に限定されない。実際、本明細書を読むと本発明の多くの修正および変更は当業者には明らかであり、その精神および範囲から逸脱することなく行うことが可能である。本発明は従って請求の範囲およびその等価物の範囲内の語句によってのみ限定されるのではない。
【００４２】
実施例１：エンドポイントアッセイにおけるＲＮａｓｅＨ活性の測定
この実施例は、２つのＲＮａｓｅＨ酵素：イー・コリＲＮａｓｅＨ１およびＨ２逆転写酵素の活性を測定するためにエンドポイントＰＡＧＥ分析ベースのアッセイを使用する実験を記載する。ＨＩＶにおいて、ｐ６６／ｐ５１逆転写酵素（ＲＴ）ホロ酵素はｐ６６サブユニットのＣ末端に位置するＲＮａｓｅ活性を有する（Ｈａｎｓｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９８８，７：２３９−２４３；Ｋｏｈｌｓｔａｅｄｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２，２５６：１７８３−１７９０；およびＳａｒａｆｉａｎｏｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２００１，２０：１４４９−１４６１）。酵素のＲＮａｓｅＨ活性に影響を及ぼす突然変異もウイルス感染性（Ｉｄ）を排除し、ＲＮａｓｅＨを新規抗ウイルス療法の興味ある標的にする。
【００４３】
材料および方法
ＲＮａｓｅＨ
ＨＩＶｐ６６／ｐ５２ヘテロダイマーのサンプルをＥｎｚｙｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｒｅｐｌｉｄｙｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＣＯ）から入手した。この酵素の組み換え発現、精製およびキャラクタライゼーションの方法はすでに記載されている（Ｔｈｉｍｍｉｇ  ＆  ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３，２６８：１６５２８−１６５３６）。酵素サンプルの純度は、ポリアクリルアミドゲル上で確認した。その比活性も分析し、２７ｄＮＴＰｉｎｃ／μｇ／６０分と測定され、これは他のＨＩＶ  ＲＴ酵素の比活性に匹敵する。イー・コリＲＮａｓｅＨ１のサンプルをＥＰＩＣＥＮＴＲ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。
【００４４】
ＲＮＡ−ＤＮＡ基質
初期反応は、相補ＤＮＡ配列にアニールされたｓｓＲＮＡ分子を使用した。簡単に説明すると、配列番号１（以下に示す）に記載される配列決定されたヌクレオチドを有するｓｓＲＮＡ分子を、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ高収率転写キット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘａｓ）を用いたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ反応により調製した。簡単に説明すると、アニールされたオリゴマー（配列番号ＡおよびＢ、以下に記載）を配列番号１（以下に記載）に記載されるＲＮＡ配列のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用した合成のＤＮＡ基質として使用した。
【００４５】
この反応において生じたＲＮＡをエチジウムブロミド（ＥｔＢＲ）染色された変性（図１Ａ）および非変性（図１Ｂ）ポリアクリルアミドゲル上で定量分析した。これらのゲルは所望の２９ｍｅｒＲＮＡ産物を分割するが、約４５〜４９ヌクレオチドの長さであると推定される、有意な量の「スナップバック（ｓｎａｐｂａｃｋ）」ＲＮＡ産物も示す。
放射標識されたＲＮＡは、３３Ｐ−ＡＴＰをＴ７ＲＮポリメラーゼ反応において組み入れることにより生成され、配列番号２（以下に示す）に記載されるヌクレオチド配列を有する未標識ｓｓＤＮＡ４９ｍｅｒにアニールした。これらの実験の別のバージョンにおいて、相補ＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号２）をＴ４ＰＮＫにより５’末端で３３Ｐで放射標識し、未標識２９ｍｅｒｓｓＲＮＡ（配列番号１）にアニールした。
【表１】
2006511223.tif 000002
【００４６】
これらの放射標識されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質の質をポリアクリルアミドゲル上で定量的に評価した。図２Ｂは、３３Ｐ−末端標識されたＤＮＡ（配列番号２）にアニールされた未標識ＲＮＡ（配列番号１）をロードされた非変性ゲルの画像を示し、図２Ｃ〜２Ｄは、未標識ＤＮＡ（配列番号２）にアニールされた放射標識されたＲＮＡ（配列番号１）をロードされた変性（図２Ｃ）および非変性（図２Ｄ）ゲルの画像を示す。変性ゲル（図２Ｃ）における標識されたＲＮＡの定量的リン光画像は、汚染「スナップバック」ＲＮＡが全ＲＮＡの約３５〜４０％であることを示す。予想されるように、該ゲルにおけるＲＮＡ分子の分離は、異なるＲＮＡ種の構造およびサイズの両方に依存するが、図２Ｃの変性ゲルにおける分離は天然の分子の構造に依存しないので、「スナップバック」ＲＮＡ種は天然（すなわち非変性）ゲル（図２Ｄ）においては見られない。
【００４７】
結果：
ＲＮａｓｅＨによる時間依存性ＲＮＡ分解
０．５ピコモルの放射標識されたＤＮＡ−ＲＮＡ基質（２５ｎＭ濃度）および０．１ＵのＨＩＶ逆転写酵素（０．０９５ｐＭ濃度で１．９ｆｍｏｌ）を含有するアリコートを、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ（０から３０ｍＭの間）、３％グリセロール、０．２％ＮＰ−４０、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）中でインキュベートした。平行実験において、０．５ピコモルの標識されたＤＮＡ−ＲＮＡ基質（２５ｎＭ濃度）を含有するアリコートも、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３％グリセロール、０．０２％ＮＰ−４０および５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で０．０１Ｕのイー・コリＲＮａｓｅＨ１酵素とともにインキュベートした。様々なアリコートを３７℃で、０（すなわち＜３０秒）、５、１０、２０、３０、４０および６０分間インキュベートして、ＲＮａｓｅＨ酵素によるＲＮＡ分解を行い、その後、等体積の１００ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止させた。反応生成物をＰＡＧＥにより分析した。
【００４８】
結果を図３Ａ〜３Ｂに示す。特に、図３Ａは、ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ（レーン１〜７）およびイー・コリＲＮａｓｅＨ１（レーン９〜１４）で消化された未標識ＲＮＡ／末端標識されたＤＮＡの基質について行われたポリアクリルアミドの画像を示す。レーン８は、酵素が存在しない（ＮＥ）対照実験から得られる結果を示す。予想されるように、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに対応するバンドの強度は、アリコートをさらに長時間インキュベートすると減少し、標識されたＤＮＡの基質単独に対応するバンドの強度は増大する。
図３Ｂは、３Ｕ  ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅ（６．６ｎＭ中６６ｆｍｏｌ）と５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、０．０２％ＮＰ−４０、５μｇ／μｌＢＳＡ、３％グリセロールおよび２ｍＭ  ＤＴＴで消化された、標識されたＲＮＡ／未標識ＤＮＡハイブリッド基質について行われた同じポリアクリルアミドゲルの画像を示す。ＲＮａｓｅ酵素の開裂生成物は見ることができ、図３Ａと同様の速度に依存して分解される。
【００４９】
アッセイが異なるレベルのＲＮａｓｅ活性を区別する能力を調べるために、異なる濃度のＨＩＶ−ＲＴ酵素および／または基質を使用してさらなる実験を行った。１５０ｎＭの未標識ＲＮＡ／末端標識されたＤＮＡハイブリッド基質を前記の条件下で０．３または０．１ＵのＨＩＶ−ＲＴ酵素の何れかと共にインキュベートした。
これらの実験から得られる定量的結果を図４Ａ〜４Ｂに示す。特に、図４Ａは０．３ＵのＨＩＶ−ＲＴ酵素で消化された基質をロードされたポリアクリルアミドゲルの画像を示し、図４Ｂは０．１ＵのＨＩＶ−ＲＴ酵素により消化された基質をロードされたポリアクリルアミドゲルの画像を示す。これらのデータの定量的プロットは、消化が時間と共に進行するにつれ観察されるｓｓＤＮＡの％を示し、それぞれ図５Ａ〜Ｂに示す。予想されるように、低濃度のＲＮａｓｅ酵素を用いた場合に同じ時間にわたって低い消化レベルを検出した。
【００５０】
ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨはｓｓＲＮＡを分解しない。
前記結果に影響を及ぼし得るＲＮａｓｅＨ酵素による非特異性ＲＮａｓｅＨ酵素による非特異的ＲＮＡ分解があるかどうかを確認するために実験を行った。ここで、放射標識されたｓｓＲＮＡ基質の０．１μＭのアリコートを、１Ｕ  ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ酵素と共に、前記実験について記載された条件下でインキュベートし、反応生成物を変性ポリアクリルアミドゲル（図６Ａ）にかけた。対照として、同じｓｓＲＮＡアリコートを同じ条件であるがＲＮａｓｅＨを含まない条件下でインキュベートし、これらの対照アリコートも変性ゲル上にかけた（図６Ｂ）。検出された、放射標識されたＲＮＡ基質の量は、各反応時間について類似し、小さな分解生成物は観察されず、このことはｓｓＲＮＡがＲＮａｓｅＨ酵素により分解されないことを示す。ＲＮａｓｅＨ活性の程度をＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質を用いた平行実験（図７Ｃ）においてモニターし、これらの実験において用いられる酵素は機能的であったことが確認される。
【００５１】
一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ汚染物質はＲＮａｓｅＨ活性に影響を及ぼさない。
ｓｓＲＮＡおよび／またはｓｓＤＮＡ汚染物質または反応生成物が、例えば酵素を阻害することによりＲＮａｓｅＨ活性の測定に影響を及ぼすかどうかを確認するために実験を行った。まず、０．１ｎＭ（５ピコモル）のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質および１Ｕ（２．２ｎｇまたは３ｆｍｏｌ）のＨＩＶ  ＲＴ酵素を含有するアリコートを、５、１０および５０ピコモルのホモポリマーｐｏｌｙＡ（配列番号３）またはｐｏｌｙＵ（配列番号４）またはヘテロポリマー（１８Ｓ）ＲＮＡ（配列番号５）と共にインキュベートし、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質に対するモル比はそれぞれ１：１、２：１および１０：１であった。
【表２】
2006511223.tif 000003
【００５２】
各アリコートを３７℃でインキュベートし、反応生成物をポリアクリルアミドゲルにかけた（図７）。顕著な二次構造を含む１２５−ｍｅｒ１８ＳＲＮＡの滴定は、各反応後の末端標識されたｓｓＤＮＡの測定された量により決定されるように、用量に依存してＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨを阻害した。しかしながら、かかる汚染物質は任意の「リアル」ＲＮａｓｅＨアッセイにおいて存在し難い。二次構造を示さないホモポリマーＵおよびＡはＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性を阻害しなかった。
同様の実験を行い、０．１μＭ（５ピコモル）のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質および１Ｕ（２．２ｎｇまたは１９ｆｍｏｌ）のＨＩＶ  ＲＴ酵素を含有するアリコートを下記の表Ｉに記載する一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの一つと共にインキュベートした。これらのオリゴヌクレオチド（本明細書においてＯｌｉｇｏ１、Ｏｌｉｇｏ２およびＯｌｉｇｏ３と称する）もそれぞれ配列番号６〜８により同定される。異なるアリコートにおける基質に対する各ｓｓＤＮＡオリゴマーのモル比は１：１、２：１および１０：１（すなわち、５、１０および５０ピコモル）であった。ここでも、アリコートを３７℃でインキュベートして、ＲＮａｓｅＨによりＲＮＡ分解を行い、次いで３０分後急冷し、ＰＡＧＥにより分析した（図８）。結果は、ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性がｓｓＤＮＡにより阻害されないことを示す。従って、アッセイにおける一本鎖ＲＮＡまたはｓｓＤＮＡの存在（例えば酵素活性の結果として生成）は、仮にあったとしてもごくわずかしかＲＮａｓｅ活性の評価に影響を及ぼさない。
【００５３】
【表３】
2006511223.tif 000004
【００５４】
ＲＮＡ分解は競合的ＲＮａｓｅＨ活性を必要とする。
これらの実験において観察されるＲＮａｓｅＨ活性分解は実際にＲＮａｓｅＨにより、ＲＴホロ酵素の他の活性によらないことを確認するために、アッセイは異なる供給源からのＲＴ酵素を用いて行った。特に、０．１μＭ（５ピコモル）のＲＮＡ−ＤＮＡ基質を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した１ＵのＨＩＶ  ＲＴ酵素（２．２ｎｇまたは１９ｆｍｏｌ）、１ＵのＭＭＬＶ  ＲＴ酵素（１０ｎｇまたは１５ｆｍｏｌ）の何れかと共にインキュベートした。既に記載され、ＲＮａｓｅＨ活性を有すると特徴づけられている同量の突然変異ＭＭＬＶ  ＲＴ酵素を用いて、同じ実験を行った（Ｒｏｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５，２６０：９３２６；Ｔａｎｅｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８，８５：１９７７）。
【００５５】
各サンプルのアリコートを３７℃で＜３０秒、１０、２０、３０および６０分間インキュベートし、その後、反応を停止させ、反応生成物を前記実験において既に記載したようにＰＡＧＥにより分析した。実験から得られる結果を図９Ａ（ＨＩＶ  ＲＮａｓｅＨ）、図９Ｂ（ＭＭＬＶ  ＲＮａｓｅＨ）および図９Ｃ（ＭＭＬＶ  ＲＮａｓｅＨ−突然変異体）に示す。反応後の各アリコート中に残存する基質の量を、式：
残存する基質（％）＝（基質）／（基質＋生成物）×１００％
を用いてリン光画像に従った体積分析により定量的に決定した。
この定量分析の結果を図９Ｄにおいてプロットし、これらの分析において観察されるＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドからＲＮＡの見かけの分解が機能的ＲＮａｓｅＨ活性の結果であることを確認する。
【００５６】
実施例２：ＲＮａｓｅＨ活性のリアルタイムアッセイ
この実施例は、リアルタイムでＲＮａｓｅＨ活性を検出し、モニターできる好ましいアッセイの具体例を示す。例のアッセイは、フルオロフォア部分とクエンチャー部分を含むＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質を使用する。フルオロフォア部分は、蛍光または他の検出可能なシグナルを発することができる部分を含む。クエンチャー部分は、反対に、フルオロフォア部分により生じるシグナルを吸収できる部分を含む。
例えば、本明細書に記載される具体例において、フルオロフォア部分はフルオロセインであり、クエンチャー部分はｄａｂｃｙｌであり、どちらも例えばＳｔｒａｔａｇｅｎ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。しかしながら、蛍光およびクエンチャー部分の正確な同一性は重要ではなく、本発明において使用できる様々なかかる部分は商業的に入手可能および／または当該分野において一般的に公知である。使用できる他の一般的フルオロフォアの例としては、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５およびＣｙ５．５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪから入手可能）、ならびにテキサスレッド、フルオロセイン、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ローダミンレッド、ローダミングリーン、カルボキシローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、６−ＳＯＥ、クマリンおよびオレゴングリーンが挙げられるが、これに限定されず、これらはすべて、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｒｇｅｎｅ，  ＯＲ）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商業的に入手可能である。クエンチャー部分の例としては、ＤＡＢＣＹＬ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲから入手可能）ならびにＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（“ＢＳＱｓ”，Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｖａｔｏ  ＣＡから入手可能）、例えばＢＨＱ１、ＢＨＱ−２およびＢＨＱ−３が挙げられる。
【００５７】
かかるアッセイにおいて用いることができるＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質の例を図１０Ａに概略的に示す。この実施例において、ＤＮＡ基質は配列番号９に示すヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ基質は配列番号１０に示すヌクレオチド配列を含む。当業者らは、ＤＮＡ−ＲＮＡ基質の正確な配列は本発明の実施に重要ではないことを理解するであろう。しかしながら、配列は好ましくはある特性を有する。特に、ＤＮＡ基質の配列は好ましくは、それぞれデオキシオリゴヌクレオチドの５’−および３’−末端に位置する５’−領域および３’−領域を含む。好ましくは、５’−領域および３’−領域は相補的であり、アッセイ条件下で互いにハイブリッド形成できる。ＤＮＡ基質も好ましくはＲＮＡ基質の少なくとも一部に対して相補性である中心領域を含み、ＤＮＡ基質およびＲＮＡ基質はアッセイ条件下で互いにハイブリッド形成でき、これによりＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質が形成される。例示の目的で、３’−領域（例えば、デオキシオリゴヌクレオチドの３’−末端）に結合したフルオロフォア部分を有し、５’−領域（例えば、デオキシオリゴヌクレオチドの５’−末端）に結合したクエンチャー部分を有するＤＮＡ基質の例を図１０Ａに示す。しかしながら、クエンチャー部分が３’−領域（例えば、デオキシオリゴヌクレオチドの３’−末端）に結合し、フルオロフォア部分が５’−領域（例えば、デオキシオリゴヌクレオチドの５’−末端）に結合した例も考慮され、一般的には等しく好ましい。
【００５８】
特定の理論または作用機序に限定されないが、ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質においてＲＮＡを分解し、ＤＮＡの５’−および３’−末端は互いにアニールして、オリゴヌクレオチドプローブは図１０Ｂに示すような構造をとり、フルオロフォア部分により発せられる検出可能なシグナルの少なくとも一部をクエンチャー部分が吸収するのに十分なほどフルオロフォア部分とクエンチャー部分を近接させる。従って、ＲＮａｓｅＨ活性は、蛍光の低下または減少を検出することにより検出し、モニターすることができる（図１０Ｃ）。
その有効性を示すために、ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨおよびイー・コリＲＮａｓｅＨ１の両方を、このアッセイフォーマットを用いて調べた。前記実施例１に記載したようにしてＲＮａｓｅＨ酵素およびＲＮＡ基質（配列番号１０）を調製した。常法に従ってＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９）も調製し、３’−末端をフルオロセインで、５’−末端をｄａｂｃｙｌで標識した（これらはどちらもＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）から入手可能である）。
【００５９】
実験の第一組において、フルオロフォアテキサスレッドおよびＤＡＢＣＹＬクエンチャー部分で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号９）をＲＮＡ（配列番号１０）に１：１および１：２（ＤＮＡ：ＲＮＡ）のモル比でアニールした。各アッセイを２５℃で、基質および阻害剤を表示された量または濃度で含有する、最終体積２５μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、任意のＫＣｌ（０〜３０ｍＭ）、３％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％ＮＰ−４０および５０μｇ／ｍｌＢＳＡを含む）中で行った。基質加水分解を反応中、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ蛍光マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎｂ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）（それぞれ５８５ｎｍおよび６１５ｎｍでのフィルターでセットされた励起および発光波長、１０ｎｍバンドパスを有する）を用いて、時間の関数としてモニターした。基質を酵素サンプルに添加して、反応を開始した。装置データを、Ｗｉｎｄｏｗｓ９５／９８／ＮＴの全能力を利用して設計された３２ビットウインドウズワークステーションソフトウェアと互換性のあるパソコンでモニターした。蛍光測定を３０秒ごとに行い、図１１Ａにプロットする。同様の実験を行い、ここにおいて０．１μＭおよび０．３μＭのＤＮＡ−ＲＮＡ基質を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３％グリセロール、０．０２％ＮＰ−４０、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中で０．０００３および０．００１Ｕのイー・コリＲＮａｓｅＨ１と共にインキュベートした。これらのサンプルにおいて測定された蛍光シグナルをリアルタイムの関数として図１１Ｂにおいてプロットする。
これらのデータは、前記アッセイフォーマットが着実で有効であることを示す。蛍光シグナルにおいて減少が観察され、これはインキュベーション時間と酵素濃度両者の関数であり、該酵素によるＲＮＡ分解速度と一致する。
【００６０】
参考文献
本発明の記載において、特許、特許出願および様々な刊行物を包含する多くの参考文献を記載し、議論する。かかる文献の記載および／または議論は本発明の説明を単に明らかにするためだけであって、かかる文献が本明細書に記載された発明の「先行技術」であることを認めるものではない。本明細書において記載された全ての文献はその全体として出典明示により本発明の一部として参照される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】変性（７Ｍ尿素１５％ポリアクリルアミド）ゲル上で評価したＲＮＡ生成物を示す。
【図１Ｂ】非変性（天然１５％ポリアクリルアミド）ゲルを示す。
【図２Ａ】基質ＲＮＡ（配列番号１）にアニールされた基質ＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２Ｂ】３３Ｐ−末端標識されたＤＮＡにアニールされた未標識ＲＮＡをロードされた非変性ゲルの画像を示す。
【図２Ｃ】変性ポリアクリルアミドゲルであって、内部放射標識されたＲＮＡおよび未標識ＤＮＡをロードされたゲルを示す。
【図２Ｄ】非変性ポリアクリルアミドゲルであって、内部放射標識されたＲＮＡおよび未標識ＤＮＡをロードされたゲルを示す。
【図３Ａ】未標識ＲＮＡ／末端標識ＤＮＡ基質を使用したアッセイの具体例から得られる結果を示す。
【図３Ｂ】標識されたＲＮＡ／未標識ＤＮＡ基質を使用した別の具体例についての結果を示す。
【図４】ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性のアッセイにおいて消化された未標識ＲＮＡ／末端標識されたＤＮＡハイブリッドをロードされたポリアクリルアミドゲルの画像を示す。
【図５Ａ】図３Ａにおいて示されるＰＡＧＥゲルの定量分析から確認されるＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性のプロットを示す。
【図５Ｂ】図４において示されるＰＡＧＥゲルの定量分析から確認されるＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ活性のプロットを示す。
【図６Ａ】１Ｕ（１９ｆｍｏｌ≒２．２ｎｇ）ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ酵素と共にインキュベートしたｓｓＲＮＡ基質を用いて行ったＰＡＧＥゲルを示す。
【図６Ｂ】１Ｕ（１９ｆｍｏｌ≒２．２ｎｇ）ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨ酵素なしでインキュベートしたｓｓＲＮＡ基質を用いて行ったＰＡＧＥゲルを示す。
【図６Ｃ】ＲＮａｓｅＨ活性を実証するために酵素と共に２．５ピコモルのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質をインキュベートしたＰＡＧＥゲルを示す。
【図７】放射標識されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド基質とともにｐｏｌｙＡ（レーン２〜３）、ｐｏｌｙＵ（レーン４〜５）および１８Ｓ  ＲＮＡ（配列番号５；レーン６〜７）を用いて行ったＲＮａｓｅＨアッセイから得られるＰＡＧＥゲルである。
【図８】本明細書においてＯｌｉｇｏ１（配列番号６；レーン３〜５）；Ｏｌｉｇｏ２（配列番号７；レーン６〜８）およびＯｌｉｇｏ３（配列番号８；レーン９〜１１）と称する「汚染オリゴヌクレオチド」を用いて行ったＲＮａｓｅＨアッセイから得られるＰＡＧＥゲルを示す。
【図９Ａ】ＨＩＶ  ＲＮａｓｅＨを用いたＰＡＧＥベースのＲＮａｓｅＨアッセイから得られる結果を示す。
【図９Ｂ】ＭＭＬＶ  ＲＮＡｓｅＨを用いたＰＡＧＥベースのＲＮａｓｅＨアッセイから得られる結果を示す。
【図９Ｃ】突然変異ＭＭＬＶ  ＲＮａｓｅＨを用いたＰＡＧＥベースのＲＮａｓｅＨアッセイから得られる結果を示す。
【図９Ｄ】データの定量分析をプロットしたもの。
【図１０Ａ】フルオロフォア部分（Ｆ）およびクエンチャー部分（Ｑ）で標識されたＤＮＡプローブ（配列番号９）にアニールされたＲＮａｓｅＨ基質（配列番号１０）を示す。
【図１０Ｂ】ＤＮＡプローブの５’−３’領域は、ＲＮＡ基質がＲＮａｓｅＮＨにより消化された後、互いにアニールでき、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を、クエンチャー部分がフルオロフォア部分により発せられる検出可能なシグナルの少なくとも一部を吸収するように十分近接させる。
【図１０Ｃ】ＲＮａｓｅＨがこのアッセイにおいてＲＮＡ基質を分解する際にリアルタイムで観察できる典型的な蛍光シグナルを示す。
【図１１Ａ】ＨＩＶ  ＲＴ  ＲＮａｓｅＨを使用した本発明のリアルタイムＲＮａｓｅＨアッセイから得られる蛍光強度測定値のプロットである。
【図１１Ｂ】イー・コリＲＮａｓｅＨ１を使用した本発明のリアルタイムＲＮａｓｅＨアッセイから得られる蛍光強度測定値のプロットである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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