(57)【要約】本発明は、海洋棘皮動物Holothuria scabra由来の非極性蛍光色素の抽出、精製及びキャラクタリゼーション法、該色素を含有する組成物及び該色素の各種用途を開示する。該色素は、天然、細胞透過性、非毒性及び環境に優しい非極性の蛍光色素である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
潮間帯から水中の浅瀬及び深海に棲み、通常は窪み、割れ目、岩礁、張出しなどの陰になった岩場及び砂地の生息地に多い、鈍色から明色をした、外骨格及び内骨格を持つ又は持たない、固着性定在性の漂流体であり、様々な泳力で遊泳し、習性は通常夜行性、積極的捕食を免れない、ＵＶＢ、ＵＶＡ、可視カラースペクトル及び赤外スペクトルの数ないし全波長領域で発光する発光色素及び蛍光色素を持つ又は持たない非生物発光性の海洋生物ホロツリア・スカブラHolothuria scabraの卵巣細胞のアルコール抽出物から得られた非極性及び非タンパク質性蛍光色素を含有する生物活性抽出物。
【請求項２】
請求項１に記載のようにして得られ、以下の特徴：
i．還元剤によって脱色しない、
ii．天然化合物である、
iii．色素の粗抽出物はオレンジ色である、
iv．半精製された色素溶液は肉眼には明るいオレンジ色である、
v．管光下で可視光スペクトルの様々な色を発する、
vi．タンパク質部分から分離された色素は水及びアルコールに不溶である、
vii．部分精製された染料色素はエーテルに可溶である、
viii．色素はｐＨ７．０の非極性色素である、
ix．還元性（還元可能な）発色団の不在、
x．色素溶液は、それが色素溶液単独であるか又は色素が透過及び付着した細胞であるかによって、エピフルオレセンス顕微鏡の蛍光キューブのＵＶ及び可視領域の３種類の異なる波長で６種類の異なる着色蛍光を発する、
xi．青色蛍光の発光は、励起領域３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの紫外キューブＷＵ下での励起で４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの領域で発生する、
xii．黄緑色蛍光の発光は、励起領域４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのＷＢキューブ下での励起で５１０ｎｍ〜５７０ｎｍの領域で発生する、
xiii．オレンジ色蛍光の発光は、励起領域５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのＷＧキューブ下での励起で６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で発生する、
xiv．色素は、エピフルオレセンス顕微鏡の通常の透過光電球下で１００倍の油浸レンズで見た場合、灰黄色の色調を発する、
xv．色素は、１：９０００００倍の希釈範囲でも蛍光色を発する、
xvi．抽出物の蛍光は、約４℃で保存した場合、１年までも持続した、
xvii．色素の蛍光は高度に光安定で、直射光への長時間暴露によっても劣化しない、
xviii．色素の蛍光は、発光生物由来の抽出物の場合と同様、分子が活性化に必要なエネルギーを得ることができない温度である−２０℃で凍結させても変化しない、
xix．色素は、真核生物及び原核生物（大腸菌）の生細胞に対して非毒性である。
xx．色素は細胞膜に対して透過性がある、
xxi．色素は、死んだ真核細胞及び死んだ原核細胞に対して非透過性である、そして
xxii．色素は、細胞成分の染色後も非分解性である、
を有する天然蛍光色素として有用な生物活性抽出物。
【請求項３】
異なる励起波長における前記色素の多色発光が、市場で入手できる蛍光色素顕微鏡用染色剤に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項４】
本色素の青色蛍光が、同一波長の励起で、生化学、細胞生物学、免疫化学及び分子生物学の非放射性標識キットの成分として使用されるＤＡＰＩ蛍光色素による同色の発光に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項５】
可視領域における前記色素の黄色蛍光が、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるオーラミンの同色発光に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項６】
可視領域における前記色素の黄色蛍光が、生化学、細胞生物学、免疫化学及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＦＩＴＣの同色発光に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項７】
前記オレンジ色の蛍光発光が、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるヨウ化プロピジウム蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項８】
前記オレンジ色の蛍光発光が、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるローダミン蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項９】
前記オレンジ色の蛍光発光が、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＴＲＩＴＣ蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する、請求項１に記載の色素。
【請求項１０】
前記色素が室温で安定であり、長期貯蔵寿命を有する、請求項１に記載の色素。
【請求項１１】
前記色素の分子キット及び放射性キットが室温で輸出できる、請求項１に記載の色素。
【請求項１２】
前記色素が、市場で入手できる少なくとも１００種類の異なる蛍光色素、すなわちＤＡＰＩ、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＦＩＴＣ、アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ、及びヨウ化プロピジウムの特徴を有している、請求項１に記載の色素。
【請求項１３】
前記色素が、フィコビリタンパク質の代わりにあらゆる用途に使用される、請求項１に記載の色素。
【請求項１４】
蛍光顕微鏡の明視野下で前記色素を１０倍の対物レンズ下で見た場合、灰青色の色調が、細胞遺伝学、細胞学、及び組織化学的スライドの迅速スクリーニングに有用な位相差効果を生じ、顕微鏡に位相差アクセサリ成分を追加する費用を節約する、請求項１に記載の色素。
【請求項１５】
通常の透過光顕微鏡の１００倍油浸レンズ下での前記色素は、活発に分裂している卵割細胞の卵黄、核質及びクロマチンのタンパク質が、前者は黄茶色、後者は黄色、そして最後の細胞成分は暗青色の色調をした異なる染色の色を示し、このことは効果の迅速バイオアッセイに有用であり、細胞の種々の組織化学的成分について見ることができる、請求項１に記載の色素。
【請求項１６】
蛍光色の発光が蛍光のストークス則に従う、請求項１に記載の色素。
【請求項１７】
コダックフィルムロールによる顕微写真が、エピフルオレセンス下での青色蛍光のように隣接色発光波長の色調も示す、請求項１に記載の色素。
【請求項１８】
コダックフィルムロールによる顕微写真が、エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真に黄色蛍光が見られた場合、緑色の色調も認められるように、隣接色発光波長の色調も示す、請求項１に記載の色素。
【請求項１９】
エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真にオレンジ蛍光色が見られた場合、赤色の色調も認められる、請求項１に記載の色素。
【請求項２０】
全蛍光下で見た細胞遺伝学的スライドが、試料がなく色素のみが存在する背景色に対する細胞及び細胞成分の対比染色効果を示す、請求項１に記載の色素。
【請求項２１】
１：４，５０，０００〜１：９，００，０００倍を超える比で水で希釈された色素が、３種類の異なる波長で６色の蛍光を提供する、請求項１に記載の色素。
【請求項２２】
海洋ナマコ、ホロツリア・スカブラHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を適切な添加剤と共に含む、以下の有用な用途：
i．各種の塗料、インク、繊維に有用な蛍光色被覆組成物及びインクの調製；
ii．分子診断学のためのin situハイブリッド形成キットの蛍光分子プローブとして；
iii．零下の温度地域にある野外ステーションで実施される、各種用途の蛍光色素を必要とする実験での使用；
iv．エピフルオレセンス顕微鏡検査のための蛍光色素染色剤として有用；
v．細胞透過性色素組成物に有用；
vi．ポリマーの漂白及び増白用の蛍光色素組成物；
vii．全スペクトルの蛍光色素を用いる漏れ検出；
viii．自動化学計測システムでの使用；
ix．墜落航空機、救助艇、及び機材例えばロケットの位置表示；
x．海中プローブ；
xi．化粧品のクリーム及びローションの色素細胞日焼け止め成分；
xii．分子診断学のための蛍光in situハイブリッド形成用キット成分；
xiii．ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び酵素を標識するための生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分；
xiv．免疫蛍光検出；
xv．ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ及び抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメントの対比染色；
xvi．単一及び複数フローサイトメトリー用；
xvii．エピフルオレセンス顕微鏡検査用蛍光色素染色剤；
xviii．健康食品産業、化粧品産業、製薬及び化学産業における生物汚染の迅速チェック用；
xix．実験室培養物中の生物汚染（混入）物の迅速評価用；
xx．野外条件下での生物汚染物質の迅速チェック用；
xxi．死滅及び生存大腸菌の迅速チェック用；
xxii．天然着色剤；
xxiii．エーテル中１：９０００００の比の蛍光色素の生物活性組成物でも３種類の異なる波長で６色の蛍光を生じ、透過光下で位相差効果を生じるのに十分である；
xxiv．零下の温度地域で実施される各種の蛍光用途用の色素；
xxv．各種の生物分子との複合体形成用色素；
xxvi．細胞透過膜色素組成物用；
xxvii．組織培養物中の死細胞及び生細胞の識別用；
xxviii．バイオセンサにおける色素組成物用；
xxix．分子キット及び微生物キットの色素組成物として；及び
xxx．脂質及び油の検出用非極性色素
のための組成物。
【請求項２３】
ホロツリア・スカブラHolothuria scabraナマコ由来の天然蛍光色素を含有する生物活性抽出物の製造法であって、以下のステップ：
a）海岸から海洋生物を採集し、
b）前記生物を、海水を含有するタンクに機械的エアレーションをせずに一晩維持し、
c）洗浄した動物を解剖して雌生殖腺を取り出し、
d）７０％エチルアルコールで抽出して黄橙色の溶液を得、
e）抽出工程を３〜４回繰り返して着色溶液を得、
f）前記溶液をホワットマンＮｏ．１ろ紙を通してろ過して部分精製抽出物を得、
g）ステップ（f）で得られた抽出物を溶媒のエーテルに溶解し、そして
h）ホワットマンＮｏ．１ろ紙を通してろ過し、“非極性蛍光色素溶液”と命名された透明黄色溶液を得る
を含む方法。
【請求項２４】
前記色素溶液をさらに水／海水で１：４００，０００〜１：９００，０００倍の範囲の比に希釈し、３種類の異なる励起波長で６色の蛍光を発する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
真核及び原核細胞の生存に対する前記色素の非毒性の性質を査定するために、バイオアッセイが、１：４５００００、１：２０００００、１：１０００００、１：５００００及び１：２５０００倍の範囲の生物活性抽出物の希釈液を用いて実施される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋無脊椎動物ホロツリア・スカブラ(Holothuria scabra)の卵巣組織のアルコール抽出物から抽出された天然の非極性及び非タンパク質性蛍光色素を含有する生物活性抽出物に関する。本発明はまた、この新規非極性色素の抽出、部分精製及びキャラクタリゼーション法も提供する。前述の海洋無脊椎動物は特にナマコ(sea cucumber)である。ナマコは棘皮動物、すなわち体表がトゲに覆われた動物群の一員で、これにはヒトデ及びウニも含まれる。科学的にはナマコ(Holothurian)と呼ばれ、弾性のある長い管状体を有し骨性の骨格は持たない。分類学的位置は以下の通りである。
【背景技術】
【０００２】
ナマコの分類学的位置は次の通りである。
亜界：後生動物(Metazoa)
門：棘皮動物門(Echinodermata)
亜門：遊在亜門(Eleutherozoa)
綱：ナマコ綱(Holothuroidea)
亜綱：楯手亜綱(Aspidochirotacea)、樹手亜綱(Dendrochirotacea)、無足亜綱(Apodacea)
目：樹手目(Dendrochirota)、楯手目(Aspidochirota)、板足目(Elasipoda)、隠足目(Molpadonia)及び無足目(Apoda)
これらの目の中で、ナマコHolothuria scabraは、
目：楯手目(Aspidochirota)
科：クロナマコ科(Holothuriidae)
属：ホロツリア(Holothuria)
種：スカブラ(scabra)
に属する。
【０００３】
棘皮動物は海だけに棲む体腔無脊椎動物で、群体を形成せず、成体は分節がなく基本的に５部分に分かれた放射相称で、頭部も脳もなく、骨格及び体腔の構造的特異性によって他の全ての動物と区別される。ナマコ綱に属する動物は左右相称の体を持ち、その体は通常、口−反口軸に伸び、その一端又はその付近に口、他端又はその付近に肛門を持つ。体表は粗く、内骨格は顕微鏡的大きさに縮小した針状骨又は板状骨で、体壁に包埋されている。口は水管系に接続した一群の触手に囲まれている。足又は管足は通常存在し、運動性である。消化管は長くコイル状になっており、排出腔には通常呼吸樹もある。雌雄は通常分離しており、生殖腺は単一又は対になった細管の房である。硬い基盤に付着するか、又は柔らかい堆積物の中に穴を掘って潜り込み、前端及び後端を突き出している定在性の形態を取る。ナマコの種類は１０００種を超える。体長は２ｃｍ〜２ｍまで様々である。生息地が海洋の深さによって制限されない数少ない動物の一つである。種の中には５０％の生命体が水深４０００ｍで、９０％が水深８０００ｍで生活するものもあると報告されている。Holothuria scabraの種は、時にMetriatyla scabra Jaegeaと呼ばれることもあるが、東アフリカ、紅海、ベンガル湾、東インド、オーストラリア、日本、南太平洋、フィリピン、インド洋及びその他のインド太平洋地域に広く分布している。サバ、マレーシア及びインドネシア、並びにその他のインド太平洋諸国で人／動物の消費用に使用されている。
【０００４】
蛍光色素は蛍光プローブ産業で無限の価値を有しており、研究者らはこれによって鋭敏な感受性及び選択性を有する生細胞を含む複合生物分子集合体の特定の成分を検出することが可能になる｛Iain D. Johnson“Introduction to fluorescence techniques（蛍光技術入門）”第１章、pp1、Richard P. HaughlandによるThe Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals（蛍光プローブ及びリサーチ用化学物質ハンドブック）中、第６版、印刷：米国、1996年｝。蛍光色素は、例えばイムノアッセイで蛍光顕微鏡によって生物構造の存在場所を調べるための分子プローブの標識に、in situハイブリッド形成試験用のヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの標識に、高分子マイクロスフェアへの結合に、そして画像化試験に使用する細胞の染色に広く使用されている。色素はまた、光力学療法の技術におけるように細胞の選択的破壊にも使用される（Haughland, R. P及びKang, H.C.米国特許第4,774,339号、1988年9月27日；Haughland, R. P及びKang, H.C.米国特許第5,248,782号、1993年9月28日）。
【０００５】
非極性色素は、中性脂質及び他の非極性液体の検出に有用である。非極性の蛍光体は、研究者の要求するところによれば、各種の生物分子と複合体を形成するのに最も適している。２種類の非極性プローブ、すなわちＮＢＤプローブのＮＢＤジヘキサデシルアミン（Ｄ−６９）及びＮＢＤヘキサデシルアミン（Ｈ−４２９）が主にＴＬＣによって分離された脂質の蛍光検出に使用されてきた｛Richard P. HaughlandによるThe Molecular probes Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals（蛍光プローブ及びリサーチ用化学物質の分子プローブハンドブック）、第６版、印刷：米国、1996年、pp.321〜322｝。同じ著者らは、非極性構造と長波長吸収と蛍光の珍しい組合せを提供するｂｏｄｉｐｙ蛍光体の３種類の非極性誘導体も報告している。これらの色素は、中性脂質の染色剤として、また油及び他の非極性液体のトレーサーとして利用できる可能性があると記載されている。例えば、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３（Ｄ−３９２２）は、細胞の脂質滴に対してナイルレッド（Ｎ−１１４２）による染色より特異的である。ＢＯＤＩＰＹ５０５／５１５（Ｄ−３９２１）は、生きているミノカサゴ(Zebrafish)胚の細胞膜を迅速に透過し、細胞質の卵黄小板を選択的に染色する（Mark Cooper, ワシントン大学、Richard P. HaughlandによるMolecular probes The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals、第６版、印刷：米国、1996年、pp.322によって引用）。Ｂｏｄｉｐｙ色素は、小さな蛍光、典型的には８０，０００ｃｍ−１Ｍ−１より大きいストークスシフト吸光係数、及び水中で低下しない高い蛍光量子収量（メタノール中Ｄ−３９２１の場合０．９４）を有する。それらの光安定性は一般的に高い。これらのＢｏｄｉｐｙ色素はフラッシュランプ励起レーザ色素に使用される。Ｂｏｄｉｐｙ６６５／６７６（Ｂ−３９３２）は、長波長蛍光の検出を要する用途には、Ｈｅ−Ｎｅレーザの６３３ｎｍスペクトル線又はＡｒ−Ｋｒレーザの６４７ｎｍスペクトル線を用いて励起することができる（Richard P. Haughland，Molecular probes（分子プローブ）。The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals（蛍光プローブ及びリサーチ用化学物質ハンドブック）、第６版、印刷：米国、1996年、pp.321〜322）。
【０００６】
産業用途における色素成分としての非極性蛍光色素は米国特許に報告されている｛Fischer, Wolfgang; Deckers, Andreas; Guntherberg, Norbert; Jahns, Ekkehard; Haremza, Sylke; Ostertag, Werner; Schmidt, Helmut.米国特許第5710197号、1998年1月20日発行、発明の名称“Crosslinked polymer particles containing a fluorescent dye（蛍光色素を含有する架橋ポリマー粒子）”；米国特許第5304493号、1994年4月19日付、Nowak, Anthony V, 発明の名称“Method for detecting a marker dye in aged petroleum distillate fuels（老化石油留出物燃料中のマーカー色素の検出法）”；米国特許第4063878号、1977年12月20日付、Weeks, Bruce W, 発明の名称“Applying sublimation indicia to pressure sensitive adhesive tape（粘着テープへの昇華インクの適用）”｝
ウェブサイト、http://www.uniulm.de/uni/fak/natwis/oc2/ak_wuert/publications.htmで、A. K. Wuerthnerの３９個の文献が報告されている。これらの大部分は、屈折率材料及び光屈折性有機ガラスのためのクロマトホアの合成及び設計に関するものである。９個の国際特許も開示されている｛S. Beckman, F. Effenberger, F. Wurthner, F. Steybe, DE 44 16 476(16. 11. 1995), WO 95/30679, Preparation of oligothiophenes for use in nonlinear optical materials（非線形光学材料に使用するオリゴチオフェンの製造）; K-H. Etzbach, C.Krah, R. Sens, F. Wurthner, DE 19.611.351(22.03.1996), WO 97/35926(02.10.1997); Farbstoffmischungen, enthaltend Thienyl- und/oder Thiazolazofarbstoffe; Dye mixtures containing thiophene and/or thiazole azo dyes（チオフェン及び／又はチアゾールアゾ色素含有色素混合物）Farbstoffmischungen, enthaltend Thienyl- und/oder Thiazolazofarbstoffe; Dye mixtures containing thiophene and/or thiazole azo dyes（チオフェン及び／又はチアゾールアゾ色素含有色素混合物）；C. Grund, H. Reichelt, A. J. Schmidt, F. Wurthner, R. Sens, S. Beckmann, DE19648564 A1(28.05.1998), DE 196 50 958 A1(10.06.1998); WO 98/23688(04.06.1998)Indoleninmethinfarbstoffe auf Basis von Trifluormethylpyridonen; Trifluormethylpyridone Based Indolenine Methine Dyes（トリフルオロメチルピリドンベースのインドレニンメチン色素）；Indoleninmethinfarbstoffe auf Basis von Trifluormethylpyridonen; Trifluormethylpyridone Based Indolenine Methine Dyes（トリフルオロメチルピリドンベースのインドレニンメチン色素）；F. Wurthner, H.-W. Schmidt, F. Haubner, DE 19643097 A1(23.04.1998), Vernetzbare Triarylaminverbindungen und deren Verwendung als Ladungstransportmaterialien; Crosslinkable triarylamines bearing ethynyl groups for use as charge transport materials（電荷輸送材料として使用するためのエチニル基保持架橋性トリアリールアミン）；F. Wurthner, R. Sens, G. Seybold, K.-H. Etzbach, DE 197 11 445 A1(24.09.1998), WO 98/41583(24.09.1998) Farbstoffsalze und ihre Anwendung beim Farben von polymerem Material; Colorant Salts and their Use in Dying Polymeric Materials（着色剤塩類及びポリマー材料の染色におけるそれらの使用）｝。
【０００７】
ウェブサイト、www.sigma-aldrich com及びSigma-Aldrichのカタログ“Biochemicals and reagents for life sciences research（ライフサイエンス研究のための生化学物質及び試薬） 2000-2001”の免疫化学セクションに、標識試薬及び細胞リンカー標識キットが記載されている（pp.1454〜1456）。３個の米国特許、Horan, Paul K, Jensen, Bruce D, Siezak, Sue E, 米国特許第4783401号（1988年11月8日）；Horan, Paul K, Siezak, Sue E, 米国特許第4762701号（1988年8月9日）及びHoran, Paul K, Jensen, Bruce D, Siezak, Sue E, 米国特許第4859584号（1989年8月22日）にそれぞれ、“生細胞標識”、インビボにおける細胞追跡、及び細胞質膜中のシアニン色素濃度の変化の測定による細胞増殖速度の測定が開示されている。
【０００８】
非毒性及び細胞透過性の蛍光色素は、生細胞機能の研究、薬物送達、種々の細胞小器官の研究、及びその他多数の用途に適用できるので非常に求められている。真核細胞は膜に囲まれたいくつかのコンパートメントを有しうるが、細菌細胞は単一のコンパートメントから成り立ちうる。透過性の特異性は細胞膜の特徴である。良好な色素は、一つの発光及び異なる発光で細胞の異なる部分を示すことができるものである（Richard P. HaughlandによるThe Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals、第６版、印刷：米国、1996年）。
【０００９】
様々なタンパク質に結合した蛍光体を有する色素が合成されており、Richard P. HaughlandによるHandbook of Fluorescent probes and Research Chemicals、1996年、126~128ページに記載されている。青色蛍光のカスケードブルー及び新規なＡＭＣＡ−Ｓ色素から赤色蛍光のテキサスレッド色素及びフィコビリタンパク質に至る範囲が包含されている。会社は、ハイライトオレゴングリーン複合体、ロドールグリーン(Rhodol Green)複合体；Ｂｏｄｉｐｙ複合体；エオシン標識２次試薬；赤色蛍光ローダミンＲｄ−Ｘ及びテキサスレッド−Ｘ複合体；フィコビリタンパク質複合体；カスケードブルー及びＡＭＣＡ−Ｓ複合体を有している。
【００１０】
これらの色素はいずれも合成で、それぞれは一つの特定のスペクトル領域で発光する。従って、２〜３種類の色素の組合せを製造して多色実験用に供する。同じ会社は、細胞透過性Ｆ−アクチンプローブとして、海綿Jaspis johnstoniから単離された大環状ペプチドのジャスプラキノリド(Jasplakinolide)も提供している。しかしこれは有毒で、殺真菌、殺虫、及び抗増殖活性を示す。現在市場で入手できるほとんどの色素は合成である。Stainsfile-Dyes Aは、２６４種類の色素インデックスを提供している。そのうちの２５８種類は合成で、わずか６種類が天然色素である(http://members.pgonline.com/~bryand/dyes/dyes.htm)。
【００１１】
合成色素の製造は、高温で、強酸、アルカリ及び触媒として重金属の使用を必要とすることが多い。このことは、プロセス及び排出される廃液に環境劣化の問題を生じさせる。染料業界は、既存の色素へのより安価でより環境に優しいルートを絶えず探し求めている｛Hobson及びWales, 1998. Green Dyes（グリーン色素）, Journal of the Society of Dyers and Colorists(JSDC),1998, 114, 42〜44｝。入手できる全ての色素が蛍光性というわけではない。Bitplane productsは、市場にある１２３種類の蛍光色素のリストとそれらの励起及び発光スペクトルを示している(http://www.bitplane.ch/public/support/standard/fluorochrome.htm)。
【００１２】
蛍光は、原子又は分子が高い電子状態から低い電子状態に遷移する過程で放射線を発する現象である。蛍光放射線の波長は励起放射線の波長よりいつも長いというストークスの法則に従う。蛍光のプロセスは燐光及びバイオルミネセンスとは極めて異なる。蛍光という用語は、励起作用と放射線の放出間の間隔が非常に短い（１０−８〜１０−３秒）ときに使用される。燐光の場合、吸収と発光間の間隔が１０−３秒〜数時間と様々でありうる（R. Norman Jones, 1966, The encyclopaedia of chemistry、第２版、1966年、435〜436ページ中）。バイオルミネセンスは、化学反応の結果として生きている生物の体内の特定の細胞で特定の時間に発生する光について使用される用語である。
【００１３】
多数の蛍光色素が、Richard P. Haughlandにより“The Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals”、第６版、印刷：米国、1996年に報告されている。同じ本の１〜６ページにIan D. Johnson(1996)が、蛍光のプロセスと、蛍光体又は蛍光色素と彼が呼ぶところのある種の分子中でのその検出法を詳細に説明している（一般的にはポリ芳香族炭化水素又はヘテロ環）。現在使用されている最も万能な蛍光色素はフルオレセイン、フルオレセインベースの色素、ＢＯＤＩＰＹ色素、及びそれらの誘導体である。著者らは、これら全ての色素の欠点も論じ、色素の特徴の好みも記載している。
【００１４】
蛍光色素の多くの誘導体及びそれらの合成法が米国特許に開示されている（Haughland, R. P. 及びKang, H. C. 米国特許第4,774,339号、1988年9月27日発行；Haughland, R. P. 及びKang, H. C. 米国特許第5,248,782号、1993年9月28日；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,187,288号、1993年2月16日発行；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,274,113号、1993年12月28日及び；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,433,896号、1995年7月18日；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,451,663号、1995年9月19日発行）。Rosenblum Barnett B, Spurgeon S, Lee Linda G, Benson Scott C 及びGraham Ronald Jは、国際特許番号WO00058406、公開日2000年10月5日、の中で４，７−ジクロロローダミン色素が分子プローブとして有用であると報告している。
【００１５】
R. Norman Jonesは、The encyclopaedia of chemistry、第２版、1966年、435〜436ページの中で、良好な蛍光体の特性を記載している。彼によれば、Ａ蛍光分子は、励起エネルギーを吸収するための良好な色素産生（発色団）系と、蛍光遅延作用が発生しうる前に励起エネルギーがあまりに迅速に散逸して振動運動に入らないようにする遮蔽機構を持たねばならない。彼はまた、分子構造と化合物の蛍光の関係はよく分からないが、何らかの基（団）があって、その存在が蛍光と関連している、と述べている。例えば、有機分子ではフタレイン及び芳香族構造、例えばアントラセン及びナフタセンの存在が明るい蛍光と特に関連している。ごくわずかな無機化合物が液態及び固体で強く蛍光発光するが、蛍光は微量不純物の存在によって変更（修飾）されることが多い。
【００１６】
色素は無機型及び有機型のカテゴリーに属する。前者は無機化合物で、各種の装飾及び塗装目的などに使用される。有機染料のような有機色素は古代に遡る。ブラジルボク、ロッグウッド、ペルシャベリーインディゴ及びアカネのような植物由来の色素の使用は、聖書時代の以前ですら近東及び極東諸国から報告されている（George L. Clark, 1966“Encyclopaedia of chemistry”、第２版、833〜835ページ）。
【００１７】
Debra K. Hobsonand, David S. Walesは“グリーン色素”について記載している。これは、真菌、藍藻類、ウニ、ヒトデ、節足動物、及び珊瑚礁腔腸動物のような生物の一部の群から二次代謝産物として産生される（Joournal of the Society of Dyers and Colourists(JSDC), 114, 42〜44,1998）。これらはアントラキノン化合物で、染料産業では歴史的に極めて重要である。
【００１８】
様々なカロテノイド色素がカロテノイド産生細菌種から報告されている（米国特許第5,935,808号、1999年8月10日発行、発明者：Hirschbergら、及び米国特許第5,858,761号、1999年1月12日、発明者：Tsubokuraら）。Collin; Peter Donaldは、彼の2000年5月2日発行の米国特許第6,055,936号の中で、ナマコカロテノイドの脂質画分及びプロセスを開示している。Bandaranayake, W. M.及びDes Rocher, A, 1999（Marine biology 133; 163〜169）は、オーストラリア産Holothuria atraの体壁、卵巣及び内蔵由来のカロテノイド色素について記載している。
【００１９】
しかしながら、これらの着色剤及び色素はいずれも蛍光性でない。蛍光色素は、その大部分が合成であるが、いくつかの国際特許及び米国特許に開示されている。これらは各種の用途に使用されている。この分野における特許の数はこれらの色素の重要性を示している。合成パラゾアントキサンチンＡ（分子量２１４．２）は、λ（ｅｍ）４２０ｎｍで蛍光を発するが、コリンエステラーゼの純粋な競合拮抗薬であることがわかった。Sepcic K, Turk T, Macek P (Toxicon, 36(6):937〜940, 1998)。Welch; David Emanuel（米国特許第5,989,135号、1999年11月23日発行）は、発光ゴルフボールを開示している。
【００２０】
Whiteら（米国特許第6,110,566号、2000年8月29日付、及びWO9920688）は、耐久性のある蛍光色を示す可撓性ポリ塩化ビニルフィルムについて記載している。
Dipietro Thomas C（国際特許WO9938916）は、各種の塗料、インク及び繊維に使用する蛍光高分子色素を開示している。Cramer Randall J（特許番号EP0206718、1986年12月30日公開）は、ポリマーの漂白及び増白用の蛍光色素を有する組成物を記載している。
【００２１】
何人かが開示している漏れ検出も別の用途である（Leighley; Kenneth C. 米国特許第6,056,162号、2000年5月2日付）。Cooperらの米国特許第6,165,384号（2000年12月26日発行）は、同じ目的のための全スペクトル蛍光色素組成物を開示している。Lichtwardtらによる米国特許第5,902,749号（1999年5月11日付）は、自動化学計測システムにおける蛍光色素の使用について記載している。
【００２２】
入手できる数少ない天然蛍光色素に関する報告もある。グリーン蛍光タンパク質ＧＦＰは太平洋クラゲAequora aequoraに由来することが、Shimomura, O. Johnson, F.H.及びSaiga, Y.によりJournal of cellular and comparative physiology, 59, 223〜239, 1962に記載されている。Chalfie Mは、1: Photochem Photobiol 1995 Oct 62 (4):651〜6に“Green fluorescent protein（グリーン蛍光タンパク質）”；Youvan DC, Michel-Beyerie MEは、National Biotechnology 1996 Oct.14 (10): 1219〜20に“Structure and fluorescence mechanism of GFP（ＧＦＰの構造及び蛍光のメカニズム）”について記載している。Chalfie M, Yuan Tu, Ghia Euskirchen, William W. Ward, Douglas C Prasherは、SCIENCE 263(1994)802〜805に、精製されたＧＦＰは２３８個のアミノ酸のタンパク質であると報告している。これは３９５ｎｍで青色光を最大に吸収し、マイナーピークが４７０ｎｍにある。そして緑色光をピーク発光５０９ｎｍで発光し、５４０ｎｍに肩がある。この蛍光は非常に安定で、実質的に光退色は観察されない。
【００２３】
赤色及び黄色の領域の他の波長に蛍光を持つＧＦＰは、非生物発光性花虫類動物、特にDiscosomaサンゴに由来すると記載されている。Gurskaya NG, Fradkov AF, Terskikh A, Matz MV, Labas YA, Martynov VI, Yanushevich YG, Lukyanov KA, Lukyanov SAは、1: FEBS Lett 2001 Oct 19; 507(1): 16〜20nに、遠赤蛍光タンパク質源としてＧＦＰ様色素タンパク質を記載している。Wachter RM, Elsliger MA, Kallio K, Hanson GT, Remington SJ は、1: Structure 1998 Oct 15; 6(10): 1267〜77で、“Structural basis of spectral shifts in the yellow-emission variants of green fluorescent protein（グリーン蛍光タンパク質の黄色発光変異体におけるスペクトルシフトの構造的基礎）”について記載している。Fradkov AF, Chen Y, Ding L, Barsova EV, Matz MV, Lukyanov SA“Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence（Discosomaサンゴ由来の新規蛍光タンパク質及びその変異体は特有の遠赤蛍光を有する）”。1: FEBS Lett 2000 Aug. 18:479(3): 127〜30中。彼らは、５９３ｎｍに発光極大を持つ画期的レッドシフトタンパク質の新規遺伝子をDiscosomaサンゴからクローニングしたと記載している。dsFP593と名付けられたこのタンパク質は、最近報告された５８３ｎｍに発光極大を持つＧＦＰ様タンパク質drFP583と極めて相同的である。彼らはこれら両方の遺伝子の各種変異体を開発した。ハイブリッド突然変異体は、６１６ｎｍに特異的に再シフトした発光極大を持つ突然変異体になった。Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML, Lukyanov SA。1: Nat Biotechnolo 1999 Dec:17(10):969〜73。
【００２４】
南東及び南太平洋諸国では、ナマコは食品として、又は特に関節の炎症、捻挫及びその他の治療用の各種薬剤組成物の成分として健康食品及び製薬産業での使用がよく知られている。いくつかの米国及び国際特許を記録し選別した（Fan Hui-Zeng, Yu Song, Yamanaka E, Numata K, Oka T, Suzuki N, Muranaka Y,米国特許第5519010号、1996年5月21日付；Weiman, Bernard, 米国特許第5,888,514号、1999年3月30日発行；Katsukura, Kitazato, Kenji Yamazaki, Yasundo, 米国特許第5,993,797号、1999年11月30日付；Henderson, R.W; Henderson, T 及びHammd,T 米国特許第6255295号、2001年7月3日付；Shinya 米国特許第6203827号、2001年3月20日；Collin Peter Donaldによる米国特許第5770205号、1998年6月23日発行及びＷＯ特許第0001399号、2000年1月13日公開；Kovalev V G, Sementsov V K, Slutskaja, Akulin V N, Timchishina G N、RU2147239、2000年4月10日公開；Li Zhaoming, Zhu Beiwei、CN1286926、2001年3月14日付；Qu Jianhong, Song Xiuqin, Zheng Fuqiang、CN1223131、1999年7月21日付；Wufa Zhuang Wufa, Meizheng Zhuang、CN1142365、1997年2月12日付；Fang Hua、CN1312031、2001年9月12日付及びDing Cunyi、CN1173290、1998年2月18日付；Collin Peter Donald、WO9937314、1999年7月29日公開）。ナマコ由来の成分の、抗ＨＩＶ薬への使用が開示されている（Hoshino Hiroo、EP410002、1991年1月30日付及びHoshino Hiroo EP495116、1992年7月22日付）。それらの重要性に鑑み、該動物は捕獲下での養殖が試みられている｛Annie Mercier, S C Battaglene及びJean-Francois Hamel、Journal of experimental Marine Biology and Ecology Volume 249 issue 1: 89〜110, 2000“Settlement preferences and early migration of the tropical sea cucumber Holothuria scabra（熱帯ナマコHolothuria scabraの定住嗜好及び初期移住）”｝。Gu Zaishi, Wang Shuhai, Zhou Weiは、1998年4月22日付の特許番号CN1179261の中で、“Ecological reproducing method for Stichopus japonicus（マナマコStichopus japonicusの生態学的繁殖法）”を開示している。
【００２５】
しかしこれらの特許はいずれも本発明の主題に直接関連していないので、これらは参考文献として含まれない。
Goswami, Usha及びGanguly, Anutoshは、海洋無脊椎動物由来の天然蛍光色素に関する特許を出願している（CSIR, NF-140/2001; 米国特許出願第09/820654号、2001年3月30日出願）。これは、異なるＵＶ及び可視スペクトル領域の光で励起すると３種類の異なる波長で蛍光性を持つHolothuria scabra由来の粗抽出物に関する。該発明は、ナマコ由来の部分精製天然色素である該新規色素の抽出、精製及びキャラクタリゼーション法も提供している。該色素のエピフルオレセンス染色剤及びin situハイブリッド形成試験の分子プローブの標識に有用な非放射性蛍光色素としての有用性が、該色素の薬物としてのその他いくつかの特性のほかに記載されている。この特許の先行技術の中で、我々は、陸生植物及び微生物由来の顔料、合成色素及び天然色素について詳細に扱っている。（米国特許第4,452,822号、1984年6月5日発行、発明者Shrikhande, Anil J；米国特許第5,321,268号、1994年6月14日、Crosby David A及びEkstrom Philip Aによる；米国特許第5,405,416号、1995年4月11日発行、著者Swinton; Robert J；米国特許第5,858,761号、1999年1月12日発行、発明者Tsubokuraら；米国特許第5,902,749号、1999年5月11日、発明者Lichtwardtら；米国特許第5,908,650号、1999年6月1日発行、発明者Lenobleら；米国特許第5,920,429号、1999年7月6日発行、Burnsら；米国特許第5,935,808号、1999年8月10日、Hirschbergら；米国特許第5,989,135号、1999年11月23日、発明者Welch; David Emanuel；米国特許第6,055,936号、2000年5月2日、Collin; Peter Donald；米国特許第6,056,162号、2000年5月2日、Leighley; Kenneth C.；米国特許第6,103,006号、2000年8月15日、DiPietro; Thomas C.；米国特許第6,110,566号、2000年8月29日、Whiteら；米国特許第6,140,041号、2000年10月31日、LaClair; James J.；米国特許第6,165,384号、2000年12月26日、Cooperら；米国特許第6,180,154号、2001年1月30日、Wrolstadら；EP0206718、1986年12月30日公開、発明者Cramer Randall J；IE901379、1991年1月30日、Lee Linda G; Mize Patrick D；WO9010044、1990年7月7日、Swinton; Robert J；AU704112、1997年10月7日公開、発明者Burns David M; Pavelka Lee A；DE19755642、1999年6月24日、Weimer Thomas DR.；WO9938919、1999年9月28日、Laclair James J；WO0058406、2000年10月5日、Rosenblum Barnett Bらによる；WO9938916、2000年8月15日、発明者DiPietro; Thomas C；WO9920688、2000年8月29日、発明者Pavelka Leeら；WO9920688、2000年8月29日、発明者Whiteら）。分子生物学研究、工業用途、及び救命装置などにおける蛍光色素の複数の使用も報告されている。Collin, P. Dは、1998年6月23日、1999年3月2日及び1999年11月16日の彼の米国特許（それぞれ米国特許第5,770,205号、5,876,762号及び5,985,330号）の中で、ナマコの体の各部分の治療的特性を記載している。
【００２６】
別の特許出願において、本願の発明者ら、すなわちGoswami, Usha及びAnutosh Ganguly（米国仮出願第60/317,190号、2001年9月6日出願）は、海洋無脊椎動物Holothuria scabraの体壁抽出物から精製した新規な有機ケイ素Ｓｉ−Ｏ−Ｒ型化合物及び多重蛍光天然色素について記載している。該化合物は、フェノール性の蛍光体部分を有する多糖類の蛍光色素であり、スルフェート結合を通じてその周囲のケイ素マトリックスに接続している。このケイ素部分はコア分子の（不可欠な）構成部分で、該動物の代謝に役割を果たしている。該化合物は硫黄に富んでいる。該発明は、生きている海洋生物、特にナマコ由来の新規化合物及び多重蛍光色素の抽出、精製及びキャラクタリゼーション法も提供している。さらに、該化合物は、染料産業、化粧品産業及び製薬産業の組成物に容易に混和可能な成分となりうる。
【００２７】
本特許には、Richard P. HaughlandによるThe Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals（蛍光プローブ及びリサーチ用化学物質ハンドブック）、第６版、印刷：米国、1996年に報告されている蛍光色素に関する一連の多数の文献が取り込まれている。米国及び国際特許に該蛍光色素の多数の誘導体及びそれらの合成法が開示されている（Haughland, R. P. 及びKang, H. C. 米国特許第4,774,339号、1988年9月27日発行；Haughland, R. P. 及びKang, H. C. 米国特許第5,248,782号、1993年9月28日；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,187,288号、1993年2月16日発行；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,274,113号、1993年12月28日及び；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,433,896号、1995年7月18日；Kang, H. C.及びHaughland, R. P. 米国特許第5,451,663号、1995年9月19日発行；Rosenblum Barnett B, Spurgeon S, Lee Linda G, Benson Scott C 及びGraham Ronald J、国際特許番号WO0058406、公開日2000年10月5日、は、４，７−ジクロロローダミン色素が分子プローブとして有用であると報告している）。
【００２８】
これらの参考文献は本発明にも関連する。
本出願人らは、本出願人らの以前の特許及び他の研究者の報告したものとは異なるアプローチを採用した。
【００２９】
我々の以前の特許で報告した色素は天然ではあったものの有毒であった。種々の励起波長における発光スペクトル領域も異なっていた。色素は有毒で、生細胞のin situ試験にふさわしくなかった。バイオメディカル及びエンジニアリング科学におけるそれらの用途及び使用は異なっていた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
今回報告する色素は、非生物発光性無脊椎動物の雌の生殖腺から抽出した、同じく天然色素であるが非極性の多重蛍光体である。海洋動物源はHolothuria scabraと呼ばれるナマコで、これが非極性蛍光色素の新しい供給源である。該色素は、合成色素とは異なって環境に優しく、製造時に強酸及びアルカリの介入ステップが必要ない。以前報告されたナマコ卵巣由来のカロテノイド色素と異なり、当該色素はカロテノイド色素ではない。それは非極性の蛍光体で、負に帯電したタンパク質である複合体生物分子から容易に分離できる。
【００３１】
大部分の合成蛍光色素と異なり、我々の色素は異なる波長で異なる蛍光色調を得るのに別の色素と混合する必要がない。該色素自体が３種類の異なる励起波長で６種類の異なる色の蛍光を発光するので、複数の用途を有しうる。細胞成分は、色素溶液のみが存在する背景とはコントラストの染色を示す。
【００３２】
本色素は細胞透過性で、細胞質膜、サイトゾル、核膜、核質及び染色体を透過する。
該色素はひとたび細胞膜に付着すると室温で数ヶ月間安定で、光退色も微生物汚染もされない。その蛍光は、一部の藻類及び発光生物の抽出物とは異なり、高温及び低温で劣化しない。
【００３３】
該色素は、大腸菌及び河口性及び海洋性動物の性細胞及び幼生に対して非毒性である。従って、その廃液は幼生期の海洋及び河口性動物を殺さない。該色素は非毒性で生態に優しい色素である。
【００３４】
該色素の別の重要な特徴は、生きている及び固定された組織でしか蛍光を示さないことである。死んだ組織は染色されず、いかなる蛍光も発しない。該色素の一つの重要な側面は、分子プローブの非放射性in situ標識及び対比染色のためのその作製用組成物及びキットである。異なる励起波長で、該色素は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ及びＰＩ、並びに他の市販蛍光プローブの色と等価の効果を提供する。該色素は天然の多重蛍光色素である。実際、この一つの色素で、現在市場で知られている１２３種の蛍光色素の波長スペクトルの色を網羅する｛インターネットでBitplane products(Fluorochrome)参照、(http://www.bitplane.ch/public/support/standard/Fluorochrome.htm)｝。
【００３５】
さらに別の側面は、生細胞のエピフルオレセンス顕微鏡検査における非毒性の蛍光色素染色剤としてのその使用である。該色素は天然色素で合成でなく、種々の膜を透過してそれらを差別的に染色する。本願は、蛍光in situハイブリッド形成技術を用いる分子診断学、組織培養物や食品産業及び工業調製物における生物汚染の迅速診断、フローサイトメトリーなどのような多数の用途のために、細胞遺伝学的標本の簡便かつ迅速なチェック法を提供する。
【００３６】
該色素のさらに別の側面は、生細胞機能の研究にタンパク質色素が必要とされる先端分子生物学用の非放射性標識キットの成分としてのその使用である。
発明の目的
本発明は、海洋棘皮動物の卵巣組織の７０％アルコール溶液由来の蛍光色素溶液の抽出、精製及びキャラクタリゼーション法を開示する。これは天然色素で、非極性の着色部分を有する。卵巣細胞のアルコール抽出物から抽出した天然の非極性及び非タンパク質性蛍光色素を含有する生物活性抽出物及び海洋棘皮動物の卵巣抽出物由来の蛍光色素の抽出、精製及びキャラクタリゼーション法。該色素は非極性蛍光体の天然色素である。該色素は、ＵＶ及び可視光スペクトルの複数の蛍光励起領域で蛍光を発する。本発明はさらに、該色素の化学的、物理的、エピフルオレセント顕微鏡的性質も開示する。非毒性、細胞膜透過性が見られる。
【００３７】
本発明の主目的は、ナマコHolothuria scabraの卵巣組織由来の天然非毒性、環境に優しい非極性の多色蛍光色素を提供することである。
本発明の別の目的は、非生物発光性の海洋無脊椎動物である海洋動物Holothuria scabra由来の前記色素の抽出、部分精製及びキャラクタリゼーション法を提供することである。
【００３８】
本発明の別の目的は、細胞膜透過性で、細胞区画の境界をはっきりと示し、そしてＵＶ及び可視光スペクトル波長の単一及び複数の発光領域で視覚効果を有する色素を提供することである。
【００３９】
本発明の別の目的は、高い蛍光量子を有する色素を開発することである。
本発明の別の目的は、光退色の少ない色素を開発することである。
本発明の別の目的は、室温で長期間光安定な色素を開発することである。
【００４０】
本発明の別の目的は、動物及び細菌細胞の生存及び成長をチェックするために該色素を使用することである。
本発明のさらに別の目的は、Holothuria scabraの組織から得られた色素を用いる組成物を提供することである。
【００４１】
本発明のさらに別の目的は、３種類の波長による特別の励起でＵＶ及び可視光スペクトルの６種類の異なる波長領域で蛍光を発する色素を提供することである。
本発明の別の目的は、その蛍光及び可視分光分析及び発光波長の領域を観察することである。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、エピフルオレセンス顕微鏡検査用キューブのＵＶ及び可視領域における該色素の６種類の異なる蛍光着色発光を観察することである。
本発明のさらに別の目的は、本発明の色素を使用することによって、染色体、細胞及び組織をスクリーニングするための細胞遺伝学的スライドの蛍光染色の効果を観察することである。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、細菌を用いた実験を実施することによってその非毒性の性質を見ることである。
本発明のさらに別の目的は、海洋動物細胞を用いた実験を実施することによってその非毒性の性質を見ることである。
【００４４】
本発明のさらに別の目的は、食品産業における細菌汚染のチェックにそれを適用することである。
本発明のさらに別の目的は、その蛍光及び可視分光分析及び発光波長の領域を観察することである。
【００４５】
本発明のさらに別の目的は、該色素が蛍光分子プローブの非放射性標識として有用なことである。
本発明のさらに別の目的は、該色素が励起光中で迅速に消光せず、スライドのスクリーニング中に光退色が起きないことである。
【００４６】
本発明のさらに別の目的は、その蛍光及び可視分光分析及び発光波長の領域を観察することである。
本発明のさらに別の目的は、該色素が蛍光分子プローブの非放射性標識として有用なことである。
【００４７】
本発明の別の目的は、該色素がそれ自体でも細胞膜に付着したときでも室温で非常に安定なことである。
本発明のさらに別の目的は、その蛍光の質が極めて高温及び低温でも劣化しないことである。
【００４８】
さらに本発明の別の目的は、分子プローブ及び対比染色の非放射性標識用キットを開発することである。
さらに本発明の別の目的は、フローサイトメトリー、マイクロアレイ、イムノアッセイ及び研究者の要求に従っていくつかのその他の分子用途に使用する生物分子−複合体を合成するために該蛍光体を工業的に使用することである。
【００４９】
本発明のさらに別の目的は、分子プローブ用のin situハイブリッド形成非放射性標識キットのような該蛍光色素を含有するキットを開発することである。
本発明のさらに別の目的は、動物細胞用の低価格の「生／死」生存率／細胞毒性キットを開発することである。
【００５０】
本発明のさらに別の目的は、細菌用の低価格の「生／死」生存率／細胞毒性キットを開発することである。
本発明のさらに別の目的は、精子用の低価格の「生／死」生存率キットを開発することである。
【００５１】
本発明のさらに別の目的は、酵母細胞用の低価格の「生／死」生存率キットを開発することである。
本発明のさらに別の目的は、動物細胞用の低価格の「生／死」生存率キットを開発することである。
【００５２】
本発明のさらに別の目的は、低価格の細菌のグラム染色及び「生／死」生存率キットを開発することである。
本発明のさらに別の目的は、低価格の「生」細菌のグラム染色キットを開発することである。
【００５３】
本発明のさらに別の目的は、低価格の細菌計数キットを開発することである。
本発明のさらに別の目的は、簡便なステップを用いる低価格の動物細胞用キットを開発することである。
【００５４】
本発明のさらに別の目的は、細胞培養物の汚染検出のための蛍光色素含有キットを開発することである。
本発明のさらに別の側面は、特異性及び信頼性である。生細胞は着色し蛍光を発するが、死細胞は何らの蛍光も示さない。
【００５５】
本発明のさらに別の側面は、現在使用されている生／死細胞検出用の２色素の代わりに単一の色素をキットに使用することである。
本発明のさらに別の側面は、放射性同位体技術よりも低価格で危険有害性のない増殖アッセイを開発することである。
発明の要旨
従って、本発明は、ナマコHolothuria scabraと呼ばれる非生物発光性海洋生物の卵巣細胞から得られたアルコール抽出物から抽出された天然の非極性及び非タンパク質性蛍光色素を含有する生物活性抽出物を提供する。本発明はまた、タンパク質複合体から分離された蛍光体である前記色素の抽出、単離及びキャラクタリゼーション法も提供する。前記色素は部分精製され、溶液の形態である。該色素は、動物及び細菌の生細胞に対するその非毒性について試験される。該色素組成物は、蛍光エピフルオレセンス顕微鏡用染色剤として、バイオメディカル、分子生物学、微生物学、細胞生物学、組換え技術などにおける各種用途の蛍光色素成分として、及び蛍光プローブに適用するための新規な生物分子複合体の形成に有用であろう。
発明の詳細な説明
いくつもの研究を重ねた結果、本出願人らは今回、海洋動物、特に無脊椎動物、さらに特にナマコHolothuria scabraの組織から得られる新規な天然の非毒性蛍光色素を確認するに至った。
亜界：後生動物(Metazoa)
門：棘皮動物門(Echinodermata)
亜門：遊在亜門(Eleutherozoa)
綱：ナマコ綱(Holothuroidea)
亜綱：楯手亜綱(Aspidochirotacea)
目：楯手目(Aspidochirota)
科：クロナマコ科(Holothuriidae)
属：ホロツリア(Holothuria)
種：スカブラ(scabra)
本発明はさらに、動物の卵巣から得られ、生細胞に対して非毒性である天然の非極性の多重蛍光色素を提供する。また、該色素の物理及び化学的性質、並びに直射光、高温及び低温におけるその安定性についても記載する。前記色素は、ＵＶ及び可視光スペクトルの３種類の異なる励起波長で６色の蛍光発光を有する。本発明はまた、汚染及び細胞生存の迅速チェックのための蛍光顕微鏡下での細胞スクリーニングにも関する。本発明はまた、先端分子診断学のためのタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子プローブの非放射性標識として、染色体、細胞及び組織の一重、二重及び多重染色のためのエピフルオレセンス顕微鏡検査用、蛍光in situハイブリッド形成用、及び生物汚染チェック用、水産養殖及び繁殖力増強のためのバイオメディカル科学用、生細胞に対する試験を要するキットの成分として、新規な遠隔感知装置用、海中プローブ用、救命装置用、墜落航空機、救命筏及び防衛機材例えばロケットの位置表示用、零下の温度条件下での各種蛍光用途用、及びその他多数の用途における該色素の使用にも関する。該色素は、河口性及び海洋性動物の幼生を殺さないので環境的に生態に優しい。
【００５６】
本発明は、生理的機能のために日光を吸収するか又は長時間日光に暴露されているため異なる波長の蛍光の進化した機構を有していると思われる海洋動物から得られた蛍光色素について記載する。植物プランクトン、ピコプランクトン及び光合成細菌がそれらの光合成機能のために日光を吸収するのと同様、必要な波長の光スペクトルが化学経路に使用され、余分の光はストークス則に従って放出される。
【００５７】
殻や目立つ防御器官のような特別な外甲殻を持たず、硬い棘状の皮膚を有し、骨片の形態の強靱な内骨格を有する無脊椎動物は、定在性又は動きが緩慢であり、長時間直射日光に曝され、砂地又は割れ目に棲み、蛍光を示すことがある。
【００５８】
本発明は、先行技術に固有の欠点を、海洋無脊椎動物由来の色素の高度に効率的及び選択的な抽出、精製及びキャラクタリゼーション法、並びに非放射性標識を用いる分子診断学用キットの製造、分子マーカー、エピフルオレセンス顕微鏡検査、陸上及び海中プローブ用の新規設備の成分、化粧品産業、食品産業及び防衛目的などにおける多様な使用を提供することによって克服しようとするものである。
【００５９】
前記海洋無脊椎動物は、分類学的にはナマコ綱(Holothuroidea)に属するHolothuria scabraと呼ばれる棘皮動物である。本発明の産物は、初めて報告される新規な非毒性多色蛍光タンパク質色素である。該動物はインドの中央西海岸の海岸から干潮時に採集し、研究室に運んで、標準あたり塩分３０〜３２％の海水を含有するガラス槽の中で維持した。該動物は成体で、性的に成熟していた。分類学的位置は上記の通りと確認された。
【００６０】
実際、入手できる大部分の色素は合成である。天然色素はわずか６種類しかない。全ての生物から得られる色素はこれに含まれる。本発明で報告する蛍光色素は、海洋ナマコの卵巣組織から抽出された多色蛍光非毒性、生細胞膜透過性というその特性で唯一であり、生物分子に複合する能力を有する。
【００６１】
本明細書中で使用している色素という用語は、色素溶液のために用いられ、これは還元剤で脱色されない。前記色素は、繊維、セルロース、細胞膜などに色を付与する。前記色素は、海岸沿い、浅瀬及び深海の自然の中に普通に見られる海洋動物が供給源なので天然色素と呼ばれ、合成色素でない。蛍光色素は、特定の波長で励起すると高から低電子状態への遷移中の極めて短い時間内に発光する色素である。
【００６２】
多色蛍光とは、異なる領域の波長で励起すると異なる色の光を発することを意味する。それは、異なるＵＶ及び可視光スペクトルで励起すると、青、黄緑及び橙赤色の色調の蛍光を発する。
【００６３】
細胞膜透過性とは、該色素が生細胞の孔及び細胞の核膜を通過し、ＵＶ、青及び緑の波長領域のどれで励起するかによって、青、青白、緑、黄橙及び橙赤の色調の多色蛍光を細胞に付与することを意味する。
【００６４】
該色素は動物でも細菌でも既に死んだ細胞は染色しない。
生細胞に対して非毒性とは、海洋動物及び細菌（大腸菌）の両方の生細胞に対して試験した場合にそれらの細胞が死なないことを意味する。
【００６５】
室温で光安定性とは、室温（〜２８℃）で台に放置した場合、蛍光の質が劣化しないことを意味する。細胞膜に付着後の色素の光安定性とは、前記色素で生きている及び固定された細胞を染色後、蛍光発光が持続することを意味する。
【００６６】
本明細書中で使用している分子診断学とは、分子細胞遺伝学における蛍光in situハイブリッド形成法用分子プローブの非放射性標識として、並びにマイクロアレイ及び分子生物学的研究におけるマーカーとして該色素を使用することを意味する。
【００６７】
エピフルオレセント顕微鏡検査とは、ここでは、本色素を染色剤として使用し、異なるキューブ配置下で観察すると公知蛍光色素による励起で特定の色を発光する異なる色の蛍光を記録することによる細胞遺伝学的スライド標本の顕微鏡検査に関する。蛍光色素キューブＷＵＢ、ＷＢ、ＷＧは、異なる波長用のオリンパスBX-FLA反射光蛍光アタッチメントの指定フィルタキューブ配置である。
【００６８】
従って、本発明は、潮間帯から水中の浅瀬及び深海に棲み、通常は窪み、割れ目、岩礁、張出しなどの陰になった岩場及び砂地の生息地に多い、鈍色から明色をした、外骨格及び内骨格を持つ又は持たない、固着性定在性の漂流体であり、様々な泳力で遊泳し、習性は通常夜行性、積極的捕食を免れない、ＵＶＢ、ＵＶＡ、可視カラースペクトル及び赤外スペクトルの数ないし全波長領域で発光する発光色素及び蛍光色素を持つ又は持たない非生物発光性の海洋生物ホロツリア・スカブラHolothuria scabraの卵巣細胞のアルコール抽出物から得られた非極性及び非タンパク質性蛍光色素を含有する生物活性抽出物を提供する。
【００６９】
本発明の一態様は、海洋生物から得られ、以下の特徴を有する天然蛍光色素として有用な生物活性抽出物に関する。すなわち、
i．還元剤によって脱色しない、
ii．天然化合物である、
iii．色素の粗抽出物はオレンジ色である、
iv．半精製された色素溶液は肉眼には明るいオレンジ色である、
v．管光下で可視光スペクトルの様々な色を発する、
vi．タンパク質部分から分離された色素は水及びアルコールに不溶である、
vii．部分精製された染料色素はエーテルに可溶である、
viii．色素はｐＨ７．０の非極性色素である、
ix．還元性（還元可能な）発色団の不在、
x．色素溶液は、それが色素溶液単独であるか又は色素が透過及び付着した細胞であるかによって、エピフルオレセンス顕微鏡の蛍光キューブのＵＶ及び可視領域の３種類の異なる波長で６種類の異なる着色蛍光を発する、
xi．青色蛍光の発光は、励起領域３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの紫外キューブＷＵ下での励起で４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの領域で発生する、
xii．黄緑色蛍光の発光は、励起領域４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのＷＢキューブ下での励起で５１０ｎｍ〜５７０ｎｍの領域で発生する、
xiii．オレンジ色蛍光の発光は、励起領域５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのＷＧキューブ下での励起で６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で発生する、
xiv．色素は、エピフルオレセンス顕微鏡の通常の透過光電球下で１００倍の油浸レンズで見た場合、灰黄色の色調を発する、
xv．色素は、１：４００００倍の希釈範囲でも蛍光色を発する、
xvi．抽出物の蛍光は、約４℃で保存した場合、１年までも持続した、
xvii．色素の蛍光は高度に光安定で、直射光への長時間暴露によっても劣化しない、
xviii．色素の蛍光は、発光生物由来の抽出物の場合と同様、分子が活性化に必要なエネルギーを得ることができない温度である−２０℃で凍結させても変化しない、
xix．色素は、真核生物及び原核生物（大腸菌）の生細胞に対して非毒性である。
xx．色素は細胞膜に対して透過性がある、
xxi．色素は、死んだ真核細胞及び死んだ原核細胞に対して非透過性である、そして
xxii．色素は、細胞成分の染色後も非分解性である。
【００７０】
本発明の別の態様は、異なる励起波長における該色素の多色発光が、市場で入手できる蛍光色素顕微鏡用染色剤に匹敵する、というものである。
さらに別の態様は、本色素の青色蛍光が、同一波長の励起で、生化学、細胞生物学、免疫化学及び分子生物学の非放射性標識キットの成分として使用されるＤＡＰＩ蛍光色素による同色の発光に匹敵する、というものである。
【００７１】
さらに別の態様は、可視領域における該色素の黄色蛍光が、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるオーラミンの同色発光に匹敵する、というものである。
【００７２】
さらに別の態様は、可視領域における前記色素の黄色蛍光が、生化学、細胞生物学、免疫化学及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＦＩＴＣの同色発光に匹敵する、というものである。
【００７３】
本発明のさらに別の態様は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるヨウ化プロピジウム蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する、オレンジ色の蛍光発光を有する色素を提供する。
【００７４】
本発明のさらに別の態様は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるローダミン蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する、オレンジ色の蛍光発光を有する色素を提供する。
【００７５】
本発明のさらに別の態様は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＴＲＩＴＣ蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する、オレンジ色の蛍光発光を有する色素を提供する。
【００７６】
本発明のさらに別の態様は、室温で安定な、長期貯蔵寿命を有する色素を提供する。
本発明のさらに別の態様は、前記色素の分子キット及び放射性キットが室温で輸出できる、というものである。
【００７７】
本発明のさらに別の態様は、市場で入手できる少なくとも１００種類の異なる蛍光色素、すなわちＤＡＰＩ、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＦＩＴＣ、アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ、及びヨウ化プロピジウムなどの特徴を有する色素を提供する。
【００７８】
本発明のさらに別の態様は、フィコビリタンパク質の代わりにあらゆる用途に使用される色素を提供する。
本発明のさらに別の態様は、蛍光顕微鏡の明視野下で前記色素を１０倍の対物レンズ下で見た場合、灰青色の色調が、細胞遺伝学、細胞学、及び組織化学的スライドの迅速スクリーニングに有用な位相差効果を生じ、顕微鏡に位相差アクセサリ成分を追加する費用が節約される、というものである。
【００７９】
本発明のさらに別の態様は、通常の透過光顕微鏡の１００倍油浸レンズ下での前記色素は、活発に分裂している卵割細胞の卵黄、核質及びクロマチンのタンパク質が、前者は黄茶色、後者は黄色、そして最後の細胞成分は暗青色の色調をした異なる染色の色を示し、このことは効果の迅速バイオアッセイに有用であり、細胞の種々の組織化学的成分について見ることができる、というものである。
【００８０】
本発明のさらに別の態様は、蛍光色の発光が蛍光のストークス則に従う、というものである。
本発明のさらに別の態様は、コダックフィルムロールによる顕微写真が、エピフルオレセンス下での青色蛍光のように隣接色発光波長の色調も示す、というものである。
【００８１】
本発明のさらに別の態様は、コダックフィルムロールによる顕微写真が、エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真に黄色蛍光が見られた場合、緑色の色調も認められるように、隣接色発光波長の色調も示す、というものである。
【００８２】
本発明のさらに別の態様は、エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真にオレンジ蛍光色が見られた場合、赤色の色調も認められる、というものである。
さらに別の態様は、全蛍光下で見た細胞遺伝学的スライドが、試料がなく色素のみが存在する背景色に対する細胞及び細胞成分の対比染色効果を示す、というものである。
【００８３】
さらに別の態様は、１：４，５０，０００〜１：９，００，０００倍を超える比で水で希釈された色素が３種類の異なる波長で６色の蛍光を提供する、というものである。
本発明のもう一つの態様は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を適切な添加剤と共に含む、以下の有用な用途のための組成物を提供する。すなわち、
i．各種の塗料、インク、繊維に有用な蛍光色被覆組成物及びインクの調製；
ii．分子診断学のためのin situハイブリッド形成キットの蛍光分子プローブとして；
iii．零下の温度地域にある野外ステーションで実施される、各種用途の蛍光色素が必要な実験での使用；
iv．エピフルオレセンス顕微鏡検査のための蛍光色素染色剤として有用；
v．細胞透過性色素組成物に有用；
vi．ポリマーの漂白及び増白用の蛍光色素組成物；
vii．全スペクトルの蛍光色素を用いる漏れ検出；
viii．自動化学計測システムでの使用；
ix．墜落航空機、救助艇、及び機材例えばロケットの位置表示；
x．海中プローブ；
xi．化粧品のクリーム及びローションの色素細胞日焼け止め成分；
xii．分子診断学のための蛍光in situハイブリッド形成用キット成分；
xiii．ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び酵素を標識するための生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分；
xiv．免疫蛍光検出；
xv．ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ及び抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメントの対比染色；
xvi．単一及び複数フローサイトメトリー用；
xvii．エピフルオレセンス顕微鏡検査用の蛍光色素染色剤；
xviii．健康食品産業、化粧品産業、製薬及び化学産業における生物汚染の迅速チェック用；
xix．実験室培養物中の生物汚染（混入）物の迅速評価用；
xx．野外条件下での生物汚染物質の迅速チェック用；
xxi．死滅及び生存大腸菌の迅速チェック用；
xxii．天然着色剤；
xxiii．エーテル中１：４０００００の比の蛍光色素の生物活性組成物でも３種類の異なる波長で６色の蛍光を生じ、透過光下で位相差効果を生じるのに十分である；
xxiv．零下の温度地域で実施される各種の蛍光用途用の色素；
xxv．各種の生物分子との複合体形成用色素；
xxvi．細胞透過膜色素組成物用；
xxvii．組織培養物中の死細胞及び生細胞の識別用；
xxviii．バイオセンサにおける色素組成物用；
xxix．分子キット及び微生物キットの色素組成物として；及び
xxx．脂質及び油の検出用非極性色素。
【００８４】
本発明のもう一つの態様は、Holothuria scabraナマコ由来の天然蛍光色素を含有する生物活性抽出物の製造法に関し、前記方法は以下の各ステップを含む。
a）海岸から海洋生物を採集し、
b）該生物を、海水を含有するタンクに機械的エアレーションをせずに一晩維持し、
c）洗浄した動物を解剖して雌生殖腺を取り出し、
d）７０％エチルアルコールで抽出して黄橙色の溶液を得、
e）抽出工程を３〜４回繰り返して着色溶液を得、
f）前記溶液をホワットマン(Whatman)Ｎｏ．１ろ紙を通してろ過して部分精製抽出物を得、
g）ステップ（f）で得られた抽出物を溶媒のエーテルに溶解し、そして
h）ホワットマンＮｏ．１ろ紙を通してろ過し、“非極性蛍光色素溶液”と名付けられた透明黄色溶液を得る。
【００８５】
本発明の別の態様は、前記色素溶液をさらに水／海水で１：４００，０００〜１：９００，０００倍の範囲の比に希釈し、３種類の異なる励起波長で６色の蛍光を発する、というものである。
【００８６】
本発明のさらに別の態様は、真核及び原核細胞の生存に対する該色素の非毒性の性質を査定するために、バイオアッセイが、１：４５００００、１：２０００００、１：１０００００、１：５００００及び１：２５０００倍の範囲の生物活性抽出物の希釈液を用いて実施される、というものである。
【００８７】
本発明は、天然非極性非毒性細胞膜透過性多重蛍光色素の抽出、部分精製及びキャラクタリゼーション法を提供する。本発明はさらに、該色素が、生きている真核及び原核細胞をそれらを殺すことなく検出できる組成物も提供する。該方法は、
・野外からの材料の採集及び実験室条件下での維持、
・棘皮動物のナマコHolothuria scabraの卵巣の７０％アルコール抽出物由来の色素の抽出、及び該色素の部分精製、
・生物活性の試験
を含む。
【００８８】
本発明の生物活性抽出物は、海洋ナマコHolothuria scabraの卵巣組織の７０％アルコール抽出物から得られる。この抽出物は天然蛍光色素として有用で以下の特徴を有する。すなわち、
1）還元剤によって脱色しない、
2）合成化合物でない、
3）該色素の粗抽出物は黄橙色である、
4）該色素は、卵巣細胞からのその抽出に２ステップを有し、ステップ１でアルコール溶液を抽出し、放置して蒸発させ、ステップ２で溶媒のエーテルを該乾燥塊に加え、ホワットマンろ紙１を通してろ過する、
5）部分精製された蛍光体を含有する色素溶液が製造される。
6）該色素溶液は明るいオレンジ色である、
7）管光下で可視光スペクトルの様々な色を発する、
8）該色素は水及びアルコールに不溶である、
9）純染料色素は溶媒のエーテルに可溶であり、所定の手順に従うことによって更なる希釈ができる、
10）非極性色素である、
11）約７のｐＨを有する、
12）還元性（還元可能な）基の不在、
13）該蛍光体はタンパク質と会合しており、タンパク質は加熱及び凝固により除去される、
14）溶液中の色素は、それが色素溶液単独であるか又は色素が付着した細胞であるかによって、エピフルオレセンス顕微鏡の蛍光キューブのＵＶ及び可視領域の３種類の異なる波長で６種類の異なる着色蛍光を発する、
15）青色蛍光の発光は、励起領域３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの紫外キューブＷＵ下で励起すると４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの領域で発生する、
16）黄緑色蛍光の発光は、励起領域４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのＷＢキューブ下で励起すると５１０ｎｍ〜５７０ｎｍの領域で発生する、
17）オレンジ色蛍光の発光は、励起領域５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのＷＧキューブ下で励起すると６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で発生する、
18）該色素は、エピフルオレセンス顕微鏡の通常の透過光電球下で１００倍の油浸レンズで見た場合、灰黄色の色調を発する、
19）該色素は、１：４０００００〜１：９００，０００倍以上の希釈範囲でもこれらの蛍光色を発する、
20）該抽出物の蛍光は、約４℃で少なくとも１年後までも持続した、
21）該色素の蛍光は高度に光安定で、室温でもひとたび細胞が染色されると直射光への長時間暴露によっても劣化しない、
22）該色素の蛍光は、発光生物由来の抽出物の場合と同様、分子が活性化に必要なエネルギーを得ることができない温度である−２０℃で凍結させても変化しない、
23）該色素は、真核生物の生細胞に対して非毒性である、
24）該色素は、原核生物（大腸菌）対しても非毒性である。
25）該色素は細胞膜透過性である、
26）該色素は、死んだ動物細胞に対して非透過性である、
27）該色素は、死んだ大腸菌に対して非透過性である、
28）該色素は、細胞膜の非分解性染色剤である。
【００８９】
該色素の物理的及びその他の特徴は以下のステップによって査定できる。すなわち、
a．色素の色及び溶解度、
b．光安定性、
c．光退色、
d．非毒性、
e．細胞膜の選択的染色、
f．ＵＶトランスイルミネーター２６０〜２８０ｎｍ領域下での発光の物理的チェック、
g．生きているカキ卵及び精子を用いたスライドの作製、
h．生細菌のスライドの作製、
i．空気乾燥法による固定細胞スライドの作製、
j．色素によるスライドの染色、
k．色素を加えない各実験用の対照の保存、
l．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での生きている真核細胞スライドのエピフルオレセント顕微鏡によるスクリーニング、
m．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での固定真核細胞のエピフルオレセント顕微鏡によるスクリーニング、
n．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での死んだ真核細胞のエピフルオレセント顕微鏡によるスクリーニング、
o．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での生きている細菌細胞のエピフルオレセント顕微鏡によるスクリーニング、
p．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での死んだ細菌細胞のエピフルオレセント顕微鏡によるスクリーニング、
q．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での色素を加えていない生きている対照細胞のエピフルオレセント顕微鏡によるスクリーニング、
r．いかなる細胞もないスライド領域における発光蛍光の顕微写真撮影、
s．蛍光色素キューブＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及び明視野下での細胞遺伝学的スライドの発光蛍光の顕微写真撮影、
t．該色素について、発光の蛍光色調の波長領域及び蛍光色素キューブの励起領域の波長領域のチェック、
u．該色素で染色した細胞について、発光の蛍光色調の波長領域及び蛍光色素キューブの励起領域の波長領域のチェック、そして
v．細胞質膜、細胞質、核膜、核質及び染色体の細胞膜透過性のチェック。     
【００９０】
本発明は、海洋動物由来の非極性天然蛍光色素を提供し、該色素は、エピフルオレセンス顕微鏡のＵＶ及び可視光スペクトルキューブの３種類の異なる領域の波長で励起すると、青、黄、及び橙赤の色調の６種類の異なる着色蛍光を発する。該色素溶液の発光領域と該色素で染色した細胞の発光領域は異なる。本発明はさらに、この色素をエピフルオレセント顕微鏡の染色剤として用いることによる真核及び原核生物の生きている、固定された及び死んだ細胞標本のエピフルオレセンス顕微鏡検査にも関する。当該色素は、種々の分子科学、バイオメディカル科学及びエンジニアリング科学における蛍光in situハイブリッド形成法による分子診断学のための非放射性標識キットの作製に使用できるであろう。
【００９１】
一態様において、該色素の供給源は、亜界：後生動物(Metazoa)、門：棘皮動物門(Echinodermata)、亜門：遊在亜門(Eleutherozoa)、綱：ナマコ綱(Holothuroidea)、名称：ホロツリア・スカブラ(Holothuria scabra)に属する海洋無脊椎動物である。
【００９２】
さらに別の態様において、該Holothuria scabraは、ナマコを含む群から選ばれ、世界中、特にインド太平洋海域の海岸、浅瀬、深海に広く分布している。ナマコに最も近いよく知られた近縁動物は、ウニ及びヒトデなどである。
【００９３】
さらに別の態様において、Holothuria scabraを解剖し、その卵巣を分離して秤量する。ステップ１で、湿潤重量１ｍｇの卵巣組織に、３ｍｌ×３回の７０％アルコールを加える。これを、卵巣組織の７０％アルコール抽出物と呼ぶ。
【００９４】
さらに別の態様において、ステップ２で、該溶液を加熱してタンパク質を凝固させ、アルコールを蒸発させる。乾燥塊は非極性溶媒のエーテルにのみ溶解する。
さらに別の態様において、該着色溶液をホワットマンNo. 1ろ紙を通してろ過することにより部分精製する。
【００９５】
さらに別の態様において、該色素溶液を入れたねじ蓋付きバイアルに、“非極性色素溶液”とラベルを付けて４℃の冷室に保管する。
さらに別の態様において、該色素溶液の色を肉眼及び管光でチェックする。
【００９６】
さらに別の態様において、該色素はエーテルに可溶であることがわかった。実験のための更なる希釈は所定の手順に従って実施できる。
さらに別の態様において、室温における該色素の溶液中及び染色細胞上での光安定性がわかった。つまり、該色素は室温でもひとたび細胞膜に付着しても非分解性であることを示した。
【００９７】
さらに別の態様において、電気泳動によって該色素の電荷試験を実施する。黄色スポットは非極性のふるまいを示し、いずれの極の方にも移動しない。
さらに別の態様において、該色素は、ろ紙を着色し細胞膜を染色するので染料である。
【００９８】
さらに別の態様において、該色素は７．０のｐＨを有する。
さらに別の態様において、本色素を単離した７０％アルコール抽出物の色素溶液１ｍｌを取り、０．２ｇのジチオエリトリトールを配合した。溶液は脱色されなかった。すなわち、該溶液の着色部分に還元性の（還元可能な）基は不在であることを示していた。
【００９９】
さらに別の態様において、本発明の色素を単離した７０％アルコール抽出物９ｍｌを１００℃の水浴中で熱に当てた。凝固が観察された。つまり、ステップ１の色素溶液中にはタンパク質が存在することが確認された。
【０１００】
さらに別の態様において、出発材料からタンパク質を除去すると着色部分は分離され、エーテルだけに溶解する。
さらに別の態様において、該アルコール抽出物を、４ｍｌの硫酸及びアントロン試薬を用いることによってアントロン試験（Ｒｅｆ）にかけた。１ｍｌの水、４ｍｌの濃硫酸及びアントロン試薬をブランクとして取り置いた。ブランクは５分後にかすかに緑色であったが、抽出物は５分後に明るい緑色に変わった。この試験から、該アルコール抽出物には炭水化物が存在することが証明された。
【０１０１】
該色素溶液の蛍光活性は、負に帯電したタンパク質に結合した非極性蛍光体を含む着色成分による。該タンパク質は、タンパク質を凝固させると容易に分離される。
さらに別の態様において、該色素の真核細胞生存に対する非毒性試験を実施した。
【０１０２】
該色素を、カキ精子に対する細胞毒性について試験した。実験枠内での精子の生存は非毒性を示すパラメータとみなされた。カキの雄生殖腺を取り出し、精子を１００％海水中に放出した。これらをマスクリンクロス(muscline cloth)を通してろ過し、残屑（デブリ）があればそれを除去した。１ミリリットル（ｍｌ）の精子溶液を取り、異なる濃度（１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ及び５μｌ）の色素溶液を加えた。半時間ごとに、精子生存の観察を顕微鏡下で実施した。この実験を２４時間続けた。対照は色素を加えずに維持した。色素を加えても精子の生存率に何の影響もないことが分かった。これにより該色素の非毒性の性質が証明された。
【０１０３】
さらに別の態様において、該色素の非毒性試験を原核生物の生存に対して実施した。該抽出物をグラム陰性大腸菌に対する細胞毒性について、該細菌の生存又は死滅を観察することによって試験した。生きている大腸菌を含む水滴（５０μｌ）を顕微鏡のスライドに載せた。これに、０．５μｌ〜１．０μｌのエーテル抽出物を加えた。該混合物を撹拌針を用いて混合した。蒸発しないようにスライドを封じた。顕微鏡下で、該細菌はそれらが溶液中にある限り、２４時間生存し続けていることが観察された。溶液が乾燥すると死滅した。対照実験を実施した。これにより該色素は細菌に対して非毒性であることが証明された。さらに別の態様において、該細菌は凝集作用を示さない。別の態様において、カキの卵、精子は凝集作用を示さない。
【０１０４】
本出願人らは該色素の性質を研究し、該色素が異なる励起波長で、既に市場にある蛍光色素顕微鏡用染色剤に匹敵する多色発光を呈することを見出した。本色素の青色蛍光は、同一波長の励起で、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識キットの成分として使用されるＤＡＰＩ蛍光色素による同色の発光に匹敵する。可視領域における前記色素の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるオーラミンの同色発光に匹敵する。
【０１０５】
可視領域における前記色素の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＦＩＴＣの同色発光に匹敵する。
【０１０６】
オレンジ色の蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるヨウ化プロピジウム蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する。
【０１０７】
オレンジ色の蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＴＲＩＴＣ蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する。
【０１０８】
該色素は室温で安定であり、長期貯蔵寿命を有する。前記色素の分子キット及び放射性キットは室温で輸出できる。該色素は、現在市場にある（Bitplane products）少なくとも１２３種類の異なる蛍光色素、すなわちＤＡＰＩ、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＦＩＴＣ、アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ、及びヨウ化プロピジウムなどの特徴を有する。顕微鏡の通常光下で該色素は、灰色の色調が、細胞遺伝学、細胞学、及び組織化学的スライドの迅速スクリーニングに有用な位相差効果を生じ、顕微鏡に位相差アクセサリ成分を追加する費用が節約される。蛍光色の発光は蛍光のストークス則に従う。
【０１０９】
さらに別の態様において、エピフルオレセンス顕微鏡検査は、この色素を１：４０００００超に希釈して染色剤として用い、異なるキューブで励起した場合の発光を記録し、色調を公知の蛍光色素と比較することによって行う。
【０１１０】
さらに別の態様において、スクリーニングは、オリンパス反射光のＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及びＢＦキューブによるＵＶ光及び可視光スペクトルの励起を用いて実施した。
さらに別の態様において、ＷＵキューブの波長領域は３３０ｎｍ〜３８５ｎｍである。
【０１１１】
さらに別の態様において、ＷＢキューブの波長領域は４５０ｎｍ〜４８０ｎｍである。
さらに別の態様において、ＷＧキューブの波長領域は５１０ｎｍ〜５５０ｎｍである。
さらに別の態様において、ＢＦは通常のタングステン電球で光を出す場合の明視野のことである。
【０１１２】
さらに別の態様において、異なる励起領域における該色素の発光領域を見出した。エピフルオレセンス顕微鏡写真の卵の背景が該色素の発光色を示す。
さらに別の態様において、ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの領域で蛍光の発光が見られた。
【０１１３】
さらに別の態様において、４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５１０ｎｍ〜５７０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
さらに別の態様において、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
【０１１４】
さらに別の態様において、ＢＦで灰黄色の色調が見られた。
さらに別の態様において、細胞膜への染色後の該色素の異なる励起領域における発光領域を見出した。
【０１１５】
さらに別の態様において、該色素を、死んだ、生きている及び固定されたカキの卵に蛍光顕微鏡用染色剤として使用した。スライドはエピフルオレセンス顕微鏡下でスクリーニングした。死細胞は色素を取り込まず、蛍光を示さないことが分かった。
【０１１６】
さらに別の態様において、該色素を生きているカキの卵に蛍光顕微鏡用染色剤として使用した。スライドはエピフルオレセンス顕微鏡下でスクリーニングした。生細胞は蛍光を示すことが分かった。励起スペクトル領域と発光した蛍光は厳密にストークス則に従っていた。これらの領域は、蛍光発光する細胞の背景を表す該色素の発光領域とは異なっていた。
【０１１７】
さらに別の態様において、該色素を、３：１のエタノール及び酢酸の固定液に固定されたカキの卵に蛍光顕微鏡用染色剤として使用した。スライドはエピフルオレセンス顕微鏡下でスクリーニングした。固定細胞は蛍光を示すことが分かった。励起スペクトル領域と発光した蛍光は厳密にストークス則に従っていた。これらの領域は、蛍光発光する細胞の背景を表す該色素の発光領域とは異なっていた。
【０１１８】
さらに別の態様において、ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で、細胞では４７０ｎｍ〜５００ｎｍの領域で蛍光が発光した。
さらに別の態様において、４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５７０ｎｍ〜６１０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
【０１１９】
さらに別の態様において、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
さらに別の態様において、死んだ卵を明視野下でエピフルオレセント顕微鏡スクリーニングすると、可視スペクトルの全白色領域の光を発光し、細胞成分の密度に応じて位相差効果のような灰黄色の色調を示した。
【０１２０】
さらに別の態様において、生きている卵を明視野下でエピフルオレセント顕微鏡スクリーニングすると、可視スペクトルの全白色領域の光を発光し、細胞成分の密度に応じて位相差効果のような灰黄色の色調を示した。
【０１２１】
さらに別の態様において、固定卵（エタノール：酢酸＝３：１の固定液）を明視野下でエピフルオレセンス顕微鏡スクリーニングすると、可視スペクトルの全白色領域の光を発光し、細胞成分の密度に応じて位相差効果のような灰黄色の色調を示した。
【０１２２】
さらに別の態様において、該色素を大腸菌の顕微鏡染色剤として使用した。顕微鏡スライド上の５０マイクロリットルの水に１ループの生きている大腸菌を落とし、混合した。これに０．５〜１マイクロリットル（μｌ）の色素溶液を細菌懸濁液滴の外縁の方に加えた。スライドを台上に４〜５秒間放置して抽出物中のエーテルを蒸発させた。次に二つの液滴を混合し、カバーガラスをサンプルに載せ、直ちに密封した。同様に、色素を加えない細菌の水中懸濁液の対照標本も作製した。
【０１２３】
さらに別の態様において、二つのスライドをエピフルオレセンス顕微鏡の油浸レンズ下（対物レンズ１００倍、接眼レンズ１０倍）でスクリーニングし、蛍光をチェックした。死細胞は色素を取り込まず、蛍光を示さないことが示された。
【０１２４】
さらに別の態様において、生きている細菌細胞は蛍光を示した。励起スペクトル領域と発光した蛍光の波長は厳密にストークス則に従っていた。これらは色素溶液とは異なっており、以下のようであった。
【０１２５】
さらに別の態様において、ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で、４７０ｎｍ〜５００ｎｍの領域で蛍光が発光した。
さらに別の態様において、４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５７０ｎｍ〜６１０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
【０１２６】
さらに別の態様において、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
さらに別の態様において、色素を全く含まない対照の大腸菌も蛍光を示さなかった。
【０１２７】
さらに別の態様において、該色素をエピフルオレセンス顕微鏡検査の染色剤として使用したスライドの顕微写真撮影を行った。
さらに別の態様において、細胞入りスライドの領域で発光している蛍光と、色素だけによる色の発光を表す周囲背景の顕微写真撮影を、ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域下で４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムを用い、５０〜６０秒間の露出時間で行った。
【０１２８】
さらに別の態様において、細胞入りスライドの領域で発光している蛍光と、色素だけによる色の発光を表す周囲背景の顕微写真撮影を、ＷＢ４５０ｎｍ〜４８０ｎｍの領域下で４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムを用い、５０〜６０秒間の露出時間で行った。
【０１２９】
さらに別の態様において、細胞入りスライドの領域で発光している蛍光と、色素だけによる色の発光を表す周囲背景の顕微写真撮影を、ＷＧ５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの領域下で４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムを用い、５０〜６０秒間の露出時間で行った。
【０１３０】
さらに別の態様において、細胞入りスライドの領域で発光している蛍光と、色素だけによる色の発光を表す周囲背景の顕微写真撮影を、明視野下で４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムを用い、５０〜６０秒間の露出時間で行った。
【０１３１】
さらに別の態様において、細胞膜への色素の透過が見出された。カキの未受精卵、受精卵及び幼生を該色素で染色し、１：５０マイクロリットルの比の卵懸濁液を蛍光顕微鏡下でスクリーニングした。蛍光は細胞質膜、核膜及びクロマチンに認められることが分かった。発光の波長領域は同じで色も同じ色調であったが、細胞のこれらの部分の境界ははっきりと区別することができた。これにより、該色素は卵の細胞質膜、細胞質、核膜、核質及びクロマチンの生きている及び固定された細胞膜を透過することが証明された。
【０１３２】
さらに別の態様において、死細胞における細胞のこれらの部分に蛍光が見られないことから、色素は死んだ細胞膜に対して非透過性であることが示された。
蛍光顕微鏡の異なる励起キューブには異なる染色剤が使用される。例えば、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ染色、青色発光）、フルオレセイン−ｄＵＴＰ；ヘキスト３３２５８、３３３４２は、３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの励起キューブによる励起下で；ＦＩＴＣ、アクリジンオレンジ（ＤＮＡ、ＲＮＡ用、帯緑／帯黄色の色調を発光）、オーラミンは４５０ｎｍ〜４８０ｎｍの励起キューブ下で、そしてローダミン、ＴＲＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＤＮＡ、オレンジ色の色調を発光）は５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの励起キューブ下で見える。
【０１３３】
一態様において、このエピフルオレセンスに１滴の希釈抽出物を載せ、３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの波長のスペクトル領域を有するＷＵフィルタで励起すると、細胞学的スライドの顕微鏡スクリーニングができる。
【０１３４】
別の態様において、細胞学的スライドのエピフルオレセンス顕微鏡スクリーニングは、１滴の抽出物を載せ、４５０ｎｍ〜４８０ｎｍの波長のスペクトル領域を有するＷＢフィルタで励起することによって行われる。
【０１３５】
別の態様において、細胞学的スライドのエピフルオレセンス顕微鏡スクリーニングは、１滴の抽出物を載せ、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの波長のスペクトル領域を有するＷＧフィルタで励起することによって行われる。
【０１３６】
さらに別の態様において、細胞学的スライドのエピフルオレセンス顕微鏡スクリーニングは、明視野対物レンズ下でこの色素を用い、透過光によって行われる。
さらに別の態様において、該色素で染色した細胞学的スライドのエピフルオレセンス顕微鏡スクリーニングは、それぞれの励起によって発光する蛍光色の色調を観察することによって行われる。
【０１３７】
別の態様において、ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で、４７０ｎｍ〜５００ｎｍの領域で蛍光が発光した。
別の態様において、４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５７０ｎｍ〜６１０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
【０１３８】
さらに別の態様において、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。
別の態様において、明視野下で透過光を用いる細胞学的スライドのエピフルオレセンス顕微鏡スクリーニングは、細胞成分の密度に応じて可視スペクトルの全白色領域で発光し、位相差効果を示す。
【０１３９】
さらに別の態様において、該色素を７０％エチルアルコール中で１：９０００倍に希釈し、蒸発させて、乾燥物を再度３ｍｌのエーテルに溶解し、同量のエーテル中への溶解を３回繰り返し、さらに水に混合して１：５０倍にすると、該色素の総希釈は１：４０００００倍を超える。これが３種類の異なる波長で６色の蛍光を発する。
【０１４０】
さらに別の態様において、本発明は、３種類の異なる波長で６色の蛍光と、透過光下で位相差効果を得るために、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた抽出物を１：４０００００の比率で含有する生物活性組成物を提供する。
【０１４１】
一態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、被覆組成物及びインクの製造に有用な組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、漏れの検出に有用な組成物を提供する。
【０１４２】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、海中プローブに有用な組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、分子診断学用のin situハイブリッド形成キットの蛍光プローブとして有用な組成物を提供する。
【０１４３】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、生化学、細胞生物学、免疫化学及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として有用な組成物を提供する。
【０１４４】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、免疫蛍光検出に有用な組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ及び抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメントの対比染色剤として有用な組成物を提供する。
【０１４５】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、フローサイトメトリーにおける単一及び複数細胞定量的蛍光に有用な組成物を提供する。
【０１４６】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、エピフルオレセンス顕微鏡検査の蛍光色素染色剤として有用な組成物を提供する。
【０１４７】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、健康食品産業、化粧品産業、製薬及び化学産業における生物汚染の迅速チェックに有用な組成物を提供する。
【０１４８】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、実験室培養物中の生物汚染（混入）物の迅速評価に有用な組成物を提供する。
【０１４９】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、野外条件下での生物汚染物質の迅速チェックに有用な組成物を提供する。
【０１５０】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、微生物キットに有用な組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコHolothuria scabraから得られた生物活性抽出物を従来の添加剤と共に含み、天然着色剤として有用な組成物を提供する。
【０１５１】
さらに別の態様において、該色素溶液は、顧客本位の色素組成物を製造するためにタンパク質及び他の生物分子と複合できる蛍光体を含有する。
表の説明
表１：オリンパスエピフルオレセンス顕微鏡の異なる波長の蛍光フィルタキューブで励起したときの、色素溶液及び原核細胞の細胞膜に付着している場合についての蛍光色素の異なる色の蛍光の発光。
表２：オリンパスエピフルオレセンス顕微鏡の異なる波長の蛍光フィルタキューブで励起したときの、色素溶液及び真核細胞の細胞膜に付着している場合についての蛍光色素の異なる色の蛍光の発光。
表３：本発明のナマコから抽出した３種類の天然蛍光色素の商業的に重要な様々な特徴を示す表。
【０１５２】
本発明は、インドの中央西海岸及び世界のインド太平洋地域に沿って広く分布する棘皮動物（ナマコ綱：Holothuria scabra）由来の蛍光色素である新規な天然非極性色素の抽出、部分精製及びキャラクタリゼーション法に関する。
【０１５３】
本発明はさらに、該動物の卵巣組織由来の新規な蛍光タンパク質色素を提供するが、７０％のエチルアルコール中に−４℃以下で貯蔵することによって同じ組織から３〜４回繰り返し抽出できるので、天然資源の乱開発をせずに済む。
【０１５４】
本発明はまた、前記色素が、ＵＶ及び可視光スペクトルの３種類の異なる励起波長で、現在多色蛍光検出に使用されている６種類の異なる蛍光色素（ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ及びＰＩ）及びフィコビリタンパク質及びローダミンによる発光と等価の６色の蛍光を発光することも意図している。該色素は実際、蛍光顕微鏡検査プローブ用に現在市場で販売されている約１２３種類の蛍光色素の波長発光スペクトルを網羅している。染色細胞は同じ励起で異なる色の発光を示すが、ストークス則に厳密に従っている。要するに、オリンパスＢＸ−６０顕微鏡フィルタの同じ励起で該色素は６色を発する。
【０１５５】
該色素は生きている大腸菌及び真核細胞に対して非毒性である。
該色素は、種々の細胞成分の膜を透過し、それらを蛍光染色する。
該色素は細胞膜に細胞膜を染色することによってひとたび付着すると非分解性である。該色素は細菌及び動物細胞の凝集作用を示さない。該色素はエーテル溶液中で蛍光体である。該蛍光体は卵巣組織の７０％アルコール溶液中ではタンパク質に複合している。
【０１５６】
従って、該色素は、単純なプロトコルに従って染色体、細胞及び組織を一重、二重及び三重染色するためのエピフルオレセンス顕微鏡検査用の天然非毒性細胞透過性多重蛍光色素として商業化できる。
【０１５７】
本発明はまた、該色素を、分子生物学における蛍光in situハイブリッド形成用のタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡプローブの非放射性標識に使用することも意図している。
従って、使用の好適な態様において、該色素は分子標識及び検出キットの成分となりうる。そのようなキットの大部分は輸入され高価格で販売されている。
【０１５８】
これらの標識キットは、迅速な分子細胞遺伝学及びマイクロアレイ技術を用いる分子診断学用に広く探し求められている。
該色素のさらに別の利点は、その蛍光が非常に希薄な溶液（１：４００００〜４０００００以上）でも見えることである。
【０１５９】
該色素のこの特性及び非毒性で生態に優しい性質は、救命胴衣の成分として、また墜落航空機、救命筏及び防衛機材例えばロケットの位置を示すための救命装置、産業における漏れチェックなどに利用できる。
【０１６０】
本発明は、単一及び複数細胞用フローサイトメーターで蛍光を定量的に測定するのにも有用であろう。
本発明は、天然環境及び組織培養物のような制御された環境における生物汚染、汚染、並びに健康、食品及び化粧品産業における産業汚染の迅速評価にも好都合であろう。
【０１６１】
使用の別の好適な態様において、該色素のボトルは適正に密封してあれば室温で長期貯蔵寿命を有する。
使用の別の好適な態様において、該色素は、細胞が蛍光顕微鏡分析によるチェック時のようにひとたび染色されると、室温で長期貯蔵寿命を有する。
【０１６２】
該蛍光色素の別の用途は、光波長の感受性に基づくデータが必要とされる新規な遠隔感知装置及び海中プローブの成分としての用途である。
本発明を以下の実施例によって説明するが、決してこれを本発明の発明的範囲に対する制限と取ってはならない。
【実施例】
【０１６３】
色素の単離、部分精製、キャラクタリゼーション法、並びにエピフルオレセンス顕微鏡検査によって該色素の非極性、非毒性、細胞透過性、非凝集性及び多重蛍光効果をチェックするために実施した実験の詳細を開示する。
【０１６４】
実施例１
材料の採集：
本発明の材料は以下の分類学的詳細を有するナマコである。
亜界：後生動物(Metazoa)；門：棘皮動物門(Echinodermata)；亜門：遊在亜門(Eleutherozoa)；綱：ナマコ綱(Holothuroidea)；亜綱：楯手亜綱(Aspidochirotacea)；目：楯手目(Aspidochirota)；属：ホロツリア(Holothuria)；種：スカブラ(scabra)。
【０１６５】
材料は、インドの中央西海岸の海岸から干潮時に採集した。動物を実験室に運び、次に使用するまで標準あたり塩分３０〜３２（３０％０）の海水を含有するガラス槽で維持した。
【０１６６】
実施例２
色素の抽出
色素の抽出は２段階の工程である。以下のように、第一にアルコール抽出物を製造し、第二に該アルコールを蒸発させ、蛍光体を分離して溶媒のエーテルに溶解する。
ステップ１：動物をまず水道水で、次にMilliq水（超純水）で洗浄した。体を鋭利な鋏で切開し、雌の生殖腺を確認して取り出した。卵巣の色は黄色からオレンジ色まで様々であった。１ミリグラム（１ｍｇ）の卵巣組織を秤量し、７０％エチルアルコールを１：３の比（重量対体積比）でそれに加えた。黄橙色の色素が現れた。該色素溶液をデカントした。残りの組織に再度７０％エチルアルコールを加え、着色溶液を取り出した。色素抽出のため卵巣組織をホモジナイズせずにこのステップを３回繰り返した。抽出物をホワットマンNo.1ろ紙を通してろ過した。該抽出物をねじ蓋付きバイアルに４℃で保存し、これを“ストック色素溶液”と名付けた。卵巣組織由来の淡黄色及びオレンジ色の色素を持つ抽出物を以下の方法によってキャラクタライズした。特性は同じであることが分かった。１ｍｇの卵巣組織：３ｍｌの７０％エチルアルコール（３回）すなわち、９ｍｌ又は９０００マイクロリットルのアルコール中に１ｍｇの色素。
ステップ２：１５ｍｌの７０％アルコール色素溶液を取り、加熱してタンパク質を凝固させ、８０℃の水浴中でゆっくり蒸発乾固させた。該乾燥材料は水及びアルコールに不溶であった。エーテルに可溶であった。エーテルを乾燥材料に加え、室温で１５分間放置した。着色部分が溶解した。次にこれをホワットマンNo.1ろ紙でろ過し、透明な黄色溶液を得た。これに“非極性蛍光色素”とラベルを付けた。
【０１６７】
実施例３：
色素の物理的特徴：
色及び溶解度：
前記色素溶液は肉眼でオレンジ色である。昼光／管光下で様々な色の発光をする。該色素は水には不溶であるが非極性溶媒のエーテルには可溶である。従って、該色素は非極性色素である。該色素は７．０のｐＨを有する。
【０１６８】
実施例４：
前記抽出物をろ紙電気泳動にかけた。ホワットマンNo.1ろ紙をｐＨ７のリン酸緩衝液（０．１Ｍ）に浸漬し、電気泳動チャンバに置いた。２つの電極をリン酸緩衝液に浸した。５マイクロリットル（μｌ）の色素でスポットを作り、４０ボルトでろ紙電気泳動にかけた。黄色スポットはどちらの側にも移動しない。さらに、それは非極性溶媒のエーテルにしか溶解しない。該色素はエーテルにしか溶解しないので、それは非極性色素である。
【０１６９】
実施例５：
光安定性：
色素のエーテル抽出物は室温で安定である。しかしながら、蒸発から保護するために、色素のエーテル溶液は冷所に保管する。ひとたび細胞を該色素で標識すると、蛍光は室温で何ヶ月間も続けて残留する。
【０１７０】
実施例６：
電気泳動による色素の電荷試験：
前記抽出物をろ紙電気泳動にかけた。ホワットマンNo.1ろ紙をｐＨ７のリン酸緩衝液（０．１Ｍ）に浸漬し、電気泳動チャンバに置いた。２つの電極をリン酸緩衝液に浸した。５マイクロリットル（μｌ）の色素でスポットを作り、４０ボルトでろ紙電気泳動にかけた。黄色スポットはどちらの側にも移動しない。
【０１７１】
しかしながら、単離第１相の７０％アルコール溶液を試験すると、着色スポットは正極の方に移動した。このことは、卵巣組織の第１相のアルコール抽出物中の本色素の非極性色素は何らかの負のタンパク質に結合していることを示している。化学及びＨＰＬＣ分析から、該アルコール抽出物中にはタンパク質及び炭水化物が存在することが分かった。
【０１７２】
実施例７：
色素の化学的性質：
卵巣のアルコール抽出物である色素溶液１ｍｌを取り、０．２ｇのジチオエリトリトールを配合した。該溶液は脱色しない。つまり、蛍光色素の着色部分は還元性（還元可能な）基を含有しないことを示す。
【０１７３】
実施例８：
色素の非タンパク質性の試験
ステップ１の抽出物５ｍｌを１００℃の水浴中で加熱した。該アルコール抽出物中に凝固が観察された。このことは出発のアルコール抽出物中にタンパク質が存在することを裏付けているが、タンパク質は凝固によって除去された。着色溶液は乾燥物をエーテルに溶解することによって得られたものである。従って、タンパク質部分は除去されており、該色素は非タンパク質性であると言える。
【０１７４】
実施例９：
生物活性の凝集の不在
顕微鏡スライド上の５０マイクロリットルの水に１ループの生きている大腸菌を落とし、混合した。これに１マイクロリットル（１μｌ）の色素溶液を加えた。該スライドを台上に１０〜１５秒間放置してアルコールを蒸発させた。次に、カバーガラスを細菌標本に載せ、密封した。同様に、色素を全く加えない細菌の対照標本も作製した。
【０１７５】
二つのスライドをエピフルオレセンス顕微鏡の油浸レンズ下（対物レンズ１００倍、接眼レンズ１０倍）でスクリーニングし、凝集生物活性と、ＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及びＢＦ下での蛍光をチェックした。細菌は凝集塊の形成を全く示さないことがわかった（図１０、１０ａ）。
【０１７６】
しかしながら、凝集作用は、単離第１相で卵巣組織から取り出された７０％アルコール溶液には認められた。しかし、タンパク質は単離第２相で除去されており、本色素溶液は非タンパク質性であった。
【０１７７】
本色素溶液の存在下で細胞が凝集する傾向がないということは、それがレクチン様糖タンパク質をもはや含有していないことを示している。
実施例１０：
真核性精子についての凝集生物活性試験
カキ精子（１００マイクロリットル）の１ミリリットル溶液を植物プランクトンのカウントに使用されているSedgewickカウンターのキャビティに入れた。１マイクロリットル（１μｌ）の色素溶液を加えた。スライドを顕微鏡の４０倍の対物レンズ下１０倍の接眼レンズでスクリーニングした。精子は凝集塊を形成していないことが観察され、色素にレクチン様活性がないことが裏付けられた。
【０１７８】
実施例１１：
第１相材料の７０％アルコール溶液における蛍光体とタンパク質の会合（しかし単離第２相の本色素には見られない）に関する試験
実施例４及び６で述べたように、蛍光体は非極性のふるまいを示す。しかし、単離第１相の卵巣組織の７０％アルコール溶液では、ろ紙電気泳動時に着色スポットが正極の方に移動するようである。該相では蛍光体は負に帯電した何らかの成分に結合していると思われる。７０％アルコール溶液のＨＰＬＣデータによればタンパク質と炭水化物しか検出されなかった。炭水化物は電荷を持たないので、第１相（７０％アルコール溶液）の本色素の着色成分は、負に帯電した何らかのタンパク質に付着していることが示唆された。しかしながら、本色素が生まれる単離第２相では、加熱による凝固でタンパク質から分離されている。本発明の非極性色素溶液を形成するのは第２相の色素溶液である。
【０１７９】
実施例１２：
実験における非極性色素の使用法
該色素はエーテルに可溶なので、色素を実験動物に添加するのに特別の方法が採用される。生細胞を清浄なスライド上に取る。これに、細胞が管理下で培養され生存状態を保っている媒体に応じて、計量した量の超純水／海水を加える。計量した量の色素を液滴の外縁に置き、２〜３秒間蒸発させる。次に該溶液をエッペンドルフ型ピペットの先で混合する。直ちにカバーガラスを試料に被せ密封する。該スライドにラベルを貼り、エピフルオレセンス顕微鏡下で見る。
【０１８０】
実施例１３：
真核細胞に対する色素の非毒性試験
抽出物のカキ精子に対する非毒性を試験した。実験枠内における精子の生存は非毒性を示すパラメータとみなされた。
【０１８１】
カキの雄生殖腺を取り出し、精子を１００％海水中に放出した。これらをマスクリンクロス(muscline cloth)を通してろ過し、残屑（デブリ）があればそれを除去した。１ミリリットル（ｍｌ）の精子溶液を取り、異なる濃度（１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ及び５μｌ）の色素溶液を加えた。半時間ごとに、精子生存の観察を顕微鏡下で実施した。この実験を２４時間続けた。対照は色素を加えずに維持した。色素を加えても精子の生存に何の悪影響もないことが分かった。これにより該色素の河口性及び海洋性動物細胞に対する非毒性の性質が証明された。
【０１８２】
実施例１４：
原核生物に対する色素の非毒性試験
抽出物のグラム陰性大腸菌に対する毒性を、それらの生存／死亡を観察することによって試験した。生きている大腸菌を清浄なスライド上に取った。これに２５μｌの超純水を加えた。１μｌの色素を液滴の外縁に置き、２〜３秒間蒸発させる。次に該溶液をエッペンドルフ型ピペットの先で混合する。直ちにカバーガラスを試料に被せ密封する。該スライドにラベルを貼り、細胞をエピフルオレセンス顕微鏡下で見る（図１、１ａ、２及び２ａ）。死んだ細菌は蛍光を全く示さない（図３、３ａ）。
【０１８３】
実施例１５：
カキ卵における色素の透過性試験
カキの未受精卵、受精卵及び幼生を該色素で染色し、１：５０マイクロリットルの比の卵懸濁液を蛍光顕微鏡下でスクリーニングした。蛍光は細胞質膜、核膜及びクロマチンに認められることが分かった。発光の波長領域は同じで色も同じ色調であるが、細胞のこれらの部分の境界ははっきりと区別することができた（図４、４ａ、５、５ａ、及び６、６ａ）。これにより、該色素は卵の細胞質膜、細胞質、核膜、核質及びクロマチンの生きている及び固定された細胞膜を透過することが証明された。死細胞における細胞のこれらの部分に蛍光が見られないことから、色素は死んだ細胞膜に対して非透過性であることが示された。
【０１８４】
実施例１６：
培養物中の生きている及び死んだ細菌の検出
水（２５μｌ）中生存大腸菌の１滴を顕微鏡のスライド上に取った。これに１μｌの色素を加えた。該スライドを一時的に封じて蒸発を防いだ。細菌は、ＷＵ、ＷＢ及びＷＧのような全てのフィルタ励起領域で蛍光を発していることが顕微鏡下で見られた。対照は、染色していない生きている大腸菌及び死んだ大腸菌について維持した。どちらの対照も細菌は蛍光を示さなかった。このことは、該色素が培養物中の生きている及び死んだ細菌のふるい分けに使用できることを示していた（図３、３ａ）。
【０１８５】
実施例１７：
細胞毒性バイオアッセイの結果のチェックに有用な色素
生きている及び固定された細胞では蛍光を示し、死んだ細胞では示さないという特性は、各種化合物の細胞毒性及び抗菌活性を調べるのに有用である。それには、バイオアッセイを実施し、その結果をこの色素でチェックすればよい。
【０１８６】
実施例１８：
細菌汚染のチェックに有用な色素
生きている及び固定された細胞では蛍光を示し、死んだ細胞では示さないという特性は、細菌の有無を調べる必要のある環境及び産業試料中の汚染のチェックに有用である。
【０１８７】
実施例１９：
蛍光体のエピフルオレセンス顕微鏡検査
エピフルオレセンス顕微鏡検査は、この色素を１：１００の希釈で染色剤として使用し、異なるキューブで励起した場合の発光を記録し、公知蛍光色素と色調を比較することによって行われる。該蛍光体を用いると、色調は同じでも発光はかなり強いことが認められた。スクリーニングは、オリンパス反射光のＷＵ、ＷＢ、ＷＧ及びＢＦキューブによってＵＶ光及び可視光スペクトルの励起を用いて行った。キューブの詳細は次の通りである。すなわち、
ＷＵキューブの波長領域は３３０〜３８５ｎｍである。
ＷＢキューブの波長領域は４５０〜４８０ｎｍである。
ＷＧキューブの波長領域は５１０〜５５０ｎｍである。
ＢＦは通常のタングステン電球で光を出す場合の明視野のことである。
【０１８８】
実施例２０：
異なる励起領域における該色素の発光領域を見出した。ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で４５０ｎｍ〜４７０ｎｍの領域で蛍光の発光が見られた。４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５１０ｎｍ〜５７０ｎｍの領域で蛍光が発光した。５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。ＢＦで灰黄色の色調が見られた。
【０１８９】
実施例２１：
カキ細胞における蛍光発光
該色素をカキの死んだ、生きている及び固定された卵の顕微鏡染色剤として使用した。スライドはエピフルオレセント顕微鏡下でスクリーニングした。死細胞は色素を取り込まず蛍光を示さないことが分かった（図４、４ａ、５、５ａ、６、６ａ、７、７ａ、８及び８ａ）。蛍光は、色素を最初に使用して５日後及びスライドを室温に放置していても卵に観察された。
【０１９０】
生きている及び固定された細胞は蛍光を示した。励起スペクトル領域及び発光蛍光はストークス則に厳密に従っていた。これらは色素溶液とは異なっており、以下に示すとおりであった。
ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で、４７０ｎｍ〜５００ｎｍの領域で蛍光が発光した。４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５７０ｎｍ〜６１０ｎｍの領域で蛍光が発光した。５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。死んだ、生きている及び固定された卵を透過光を用いて明視野下でエピフルオレセント顕微鏡スクリーニングすると、可視スペクトルの全白色領域の光を発光し、細胞成分の密度に応じて位相差効果のような灰色の色調を示した。
【０１９１】
実施例２２：
大腸菌細胞における蛍光発光
該色素を大腸菌の顕微鏡染色剤として使用した。スライドをエピフルオレセント顕微鏡下でスクリーニングした。死細胞は色素を取り込まず、蛍光を示さないことが分かった（図３、３ａ）。生細胞は蛍光を示した。励起スペクトル領域及び発光蛍光はストークス則に厳密に従っていた。これらは色素溶液とは異なっており、以下に示すとおりであった。
ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域による励起で、４７０ｎｍ〜５００ｎｍの領域で蛍光が発光した。４５０ｎｍ〜４８０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＢフィルタによる励起で、５７０ｎｍ〜６１０ｎｍの領域で蛍光が発光した。５１０ｎｍ〜５５０ｎｍのスペクトル領域を有するＷＧフィルタによる励起で、６１０ｎｍ〜６５０ｎｍの領域で蛍光が発光した。色素を含まない対照大腸菌は蛍光を全く示さなかった。
実施例２３：
色素を染色剤として使用した蛍光細胞の顕微写真撮影
ＷＵ３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの領域、ＷＢ４５０ｎｍ〜４８０ｎｍの領域、ＷＧ５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの領域及び明視野下での、細胞を含まない及び試料細胞を含むスライド領域における発光蛍光の顕微写真撮影は、４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムにより露出時間５０〜６０秒で行った。
現在市場に出回っている色素に優る利点
1）該色素は、天然源由来で合成でないので非放射性である。
2）該色素は、河口性、海洋性動物、及びグラム陰性大腸菌に対して非毒性である。
3）該色素は細胞膜透過性であり、それ自体で核膜及びクロマチンにも付着する。
4）該色素は細胞質及び核質に対して透過性である。
5）該色素は、非生物発光性海洋動物由来の非極性蛍光色素である。
6）該色素は部分精製された溶液中蛍光体である。
7）この色素は、その単一の形態で６種類の合成蛍光色素と等価であり、ＵＶ及び可視光スペクトルの大部分の蛍光色の発光を網羅する。
8）該色素は、迅速な顕微鏡染色剤として使用でき、顕微鏡の位相差アクセサリに何ら追加の支出をせずとも、そして試料の固定及び保存に何ら長々しいプロトコルを必要とせずとも位相差効果を提供し、特に生きている試料の現場での特性チェックに有用である。
9）室温で蛍光の質が非分解性なので、該色素の輸出時に冷蔵の必要がない。現在市場に出回っている蛍光色素は−２０℃に等しい冷蔵下で輸出されている。
10）染色された細胞上の蛍光の質が長期間非分解性なので、染色されたスライドの輸出時に冷蔵の必要がない。色素溶液は４℃で流通可能である。現在市場に出回っている蛍光色素は−２０℃に等しい冷蔵下で輸出されている。
11）該色素は７．０の範囲内のｐＨを有しているので、組成物中で該産物のｐＨが劇的に変化することはないと思われる。
12）該蛍光体は他の生物分子に複合できる。
13）該色素は非極性である。
14）それはエーテルに可溶である。
15）該色素は天然の条件下で非分解性である。
16）該色素は天然の条件下でも、ひとたび細胞膜に付着してからも非分解性である。このことは、生きている細胞の機能、細胞小器官の構造の研究、細胞選別及びフローサイトメトリーに計り知れない価値を有しうる。
17）該色素溶液は、生きている細菌及びカキの卵及び精子に対して非毒性である。
18）該色素の非毒性の性質は、生細胞の分析を扱うキットの色素成分になりうるという利点を有する。
19）該色素の非毒性の性質は、海洋学におけるその場での操作的研究を扱うキットの色素成分になりうるという利点を有する。
20）該色素は死んだ細菌に対しては染色せず蛍光も示さない。このことは、組織培養で生細胞及び死細胞をチェックするのに有用である。
21）生細胞に対して非毒性の該色素は、細胞株の追跡に有用でありうる。
22）該色素は、生きている及び固定された細胞において細胞膜透過性である。これは天然色素なので、生態により優しいため、合成色素に優る利点がある。
23）該色素は、選択された励起で、より広い発光波長の領域を網羅する。このことは、該色素を、現在市販されている二重発光色素キットに第三の発光色領域を追加するための成分として非常に許容しうるものにしている。
24）該色素は、顕微鏡下でスクリーニング中に光退色を受けない。
25）該色素は、スライド上の細胞をひとたび染色すると光退色を示さない。このことは該色素を組織化学的研究に有用なものにしている。
26）該色素は、１：４０００００〜１：９０００００倍の希釈範囲でもこれらの蛍光色を発した。
27）異なる励起波長における該色素のこれらの多色発光は、既に市場にある蛍光色素の顕微鏡染色剤に匹敵する。
28）本色素の青色蛍光は、同一波長の励起で、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識キットの成分として使用されるＤＡＰＩ蛍光色素による同色の発光に匹敵する。
29）本色素の青色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるヘキスト３３２５８による色の発光にも匹敵する。
30）本色素の青色蛍光は、同一波長の励起で、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるヘキスト３３３４２蛍光色素による色の発光にも匹敵する。
31）可視領域における前記色素の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるアクリジンオレンジの同色発光に匹敵する。
32）可視領域における前記色素の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるオーラミンの同色発光に匹敵する。
33）可視領域における前記色素の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＦＩＴＣの同色発光に匹敵する。
34）オレンジ色の蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるヨウ化プロピジウム蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する。
35）オレンジ色の蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるローダミン蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する。
36）オレンジ色の蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分として使用されるＴＲＩＴＣ蛍光色素のオレンジ蛍光色に匹敵する。
37）同じ目的のために使用されている合成の市販色素とは異なり、本色素は室温で安定で、長期貯蔵寿命を有する。前記色素の分子非放射性キットは室温で輸出できる。
38）前記単一の色素は、現在市場にある少なくとも１２３種類の異なる蛍光色素（ＤＡＰＩ、ヘキスト３３２５８、ヘキスト３３３４２、ＦＩＴＣ、アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ、及びヨウ化プロピジウムなど）の特徴を有する。
39）通常光の顕微鏡下で、灰色の色調が、細胞遺伝学、細胞学、及び組織化学スライドの迅速スクリーニングに有用な位相差効果を生じるので、顕微鏡に位相差アクセサリ成分を追加する費用を節約する。蛍光色の発光は蛍光のストークス則に従う。
40）コダックフィルムロールによる顕微写真は隣接色の発光波長の色調を示す。エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真に青色蛍光が見える場合に緑色の色調も現れるのと同様である。
41）コダックフィルムロールによる顕微写真は隣接色の発光波長の色調を示す。エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真に黄色蛍光が見える場合に緑色の色調も現れるのと同様である。
42）該色素は、エピフルオレセンス顕微鏡下の顕微写真にオレンジ色蛍光が見える場合、赤色の色調も現れる。
43）全蛍光下で見た細胞遺伝学的スライドは、試料がなく色素のみが存在する背景と細胞の対比染色効果を示す。
44）該色素は、各種の塗料、インク、及び繊維の蛍光色に使用できる。
45）該色素は、ポリマーの漂白及び増白用の蛍光色素組成物に使用できる。
46）該色素は、全スペクトルの蛍光色素を用いる漏れ検出に使用できる。
47）該色素は自動化学計測システムにも使用できる。また、墜落航空機、救命艇、及び機材例えばロケットの位置表示にも使用できる。さらに海中プローブにも使用できる。
48）該色素の非毒性及び細胞透過性の性質は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び酵素を標識するための生化学、細胞生物学、免疫化学、及び分子生物学の非放射性標識及び検出キットの成分、免疫蛍光検出、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ及び抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメントの対比染色、フローサイトメトリーにおける単一及び複数細胞の定量的蛍光、エピフルオレセンス顕微鏡検査用蛍光色素染色剤として使用できる。
49）該色素は、健康食品産業、化粧品産業、製薬及び化学産業における生物汚染の迅速チェック用、実験室培養物中の生物汚染（混入）物の迅速評価用、野外条件下での生物汚染物質の迅速チェック用に使用できる。
50）該色素は、非毒性色素が必要とされる組成物に使用できる。
51）該色素は環境に優しい。該色素は河口性／海洋性動物の幼生を殺さない。
52）該色素は天然着色剤に使用できる。３種類の異なる波長で６色の蛍光を得るため、及び透過光下で位相差効果を得るために１：４００００〜１：４０００００の比の海洋性色素の生物活性組成物。
53）非極性の該色素は、各種の生物分子に容易に付着できる。
54）該色素は、一つの発光及び異なる発光で細胞の異なる部分を示すので、業界の良好な色素要件の規準に適合する。
【０１９２】
【表１】
2006501317.tif 000002
【０１９３】
【表２】
2006501317.tif 000003
【０１９４】
【表３−１】
2006501317.tif 000004
【０１９５】
【表３−２】
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【０１９６】
【表３−３】
2006501317.tif 000006
【０１９７】
【表３−４】
2006501317.tif 000007
【０１９８】
【表３−５】
2006501317.tif 000008
【０１９９】
【表３−６】
2006501317.tif 000009
【０２００】
【表３−７】
2006501317.tif 000010
【０２０１】
【表３−８】
2006501317.tif 000011
【０２０２】
【表３−９】
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【０２０３】
【表３−１０】
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【０２０４】
【表３−１１】
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【０２０５】
【表３−１２】
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【０２０６】
【表３−１３】
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【０２０７】
【表３−１４】
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【０２０８】
【表３−１５】
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【０２０９】
【表３−１６】
2006501317.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】４５０〜４８０ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＢフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の緑色蛍光発光と色素が付着している細菌細胞（矢印）の黄色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。
【図１ａ】図１のカラー写真である。
【図２】５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＧフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の暗赤色蛍光発光と色素が付着している細菌細胞（矢印）のオレンジ色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。
【図２ａ】図２のカラー写真である。
【図３】蛍光を示さない死んだ細菌のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。
【図３ａ】５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＧフィルタキューブ下における同じもののカラー写真である。
【図４】５１０ｎｍ〜５５０ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＧフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の暗赤色蛍光発光と色素が付着しているカキ卵細胞のオレンジ色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。核膜及びクロマチンが見えている。
【図４ａ】図４のカラー写真である。
【図５】４５０〜４８０ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＢフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の緑色蛍光発光と色素が付着している生きている卵細胞（矢印）の黄色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。該色素の細胞透過性により、卵膜及び核膜及び細胞質及び核質が染色されていることが示されている（矢印）。
【図５ａ】図５のカラー写真である。精核のクロマチンも見えている。
【図６】３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＵフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の暗青緑色蛍光発光と色素が透過している生きている卵細胞（矢印）の青色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。該色素の細胞透過性により、卵膜及び核膜及び細胞質及び核質が染色されていることが示されている。
【図６ａ】図６のカラー写真である。核内のクロマチンも見えている。
【図７】３３０ｎｍ〜３８５ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＵフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の暗青緑色蛍光発光と色素透過５日後のカキ胚細胞（矢印）の明青白色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。
【図７ａ】図７のカラー写真である。
【図８】４５０〜４８０ｎｍの励起領域を有するオリンパスＢＸ−６０顕微鏡のＷＢフィルタキューブで色素を励起した場合の、色素の暗青緑色蛍光発光と色素透過５日後のカキ胚細胞（矢印）の黄色発光のエピフルオレセンス顕微鏡検査結果を示す白黒図である。
【図８ａ】図８のカラー写真である。
【図９】フローチャートである。
【図１】
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【図１ａ】
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【図２】
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【図２ａ】
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【図３】
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【図３ａ】
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【図４】
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【図４ａ】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図６】
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【図６ａ】
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【図７】
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【図７ａ】
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【図８】
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【図８ａ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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