(57)【要約】本発明は、LXR活性化のための代理マーカー、およびLXR活性化に関連する疾患を診断する方法、LXR活性化に関連する疾患に罹患する患者の処置をモニタリングする方法、およびLXR活性を調節する化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表2および/または表3に記載される1つまたは複数の核酸を含む、LXR調節を検出またはモニタリングするためのマーカー。
【請求項２】
表2および/または表3に記載される1つまたは複数の核酸を含む、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカー。
【請求項３】
表3に記載される核酸および表2に記載される1つまたは複数の核酸を含む、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカー。
【請求項４】
表2および/または表3に記載される核酸によってコードされる1つまたは複数のポリペプチドを含む、LXR調節を検出またはモニタリングするためのマーカー。
【請求項５】
表2および/または表3に記載される1つまたは複数の核酸を含む、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカー。
【請求項６】
化合物と宿主を接触させる工程、ならびに表2および/または表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現を測定する工程を含む、LXR活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項７】
表2および/または表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現を対照と比較する、請求項10記載の方法。
【請求項８】
化合物と宿主を接触させる工程、ならびに表2および/または表3に記載される核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドの発現を測定する工程を含む、LXR活性を調節する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項９】
1つまたは複数の核酸が、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
1つまたは複数の核酸が、配列番号：1および/または21である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数の核酸が、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
LXR活性を調節する化合物がアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項8〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
LXR活性の修飾因子で処置された患者から単離された単球/マクロファージまたは全血液から、mRNAまたはタンパク質を精製する工程；ならびに
表2および/もしくは表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現、または表2および/もしくは表3に記載される1つの核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドの発現を測定する工程
を含む、LXR活性の調節不全に関連する疾患に罹患する患者の処置をモニタリングする方法。
【請求項１４】
表2および/もしくは表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現、または表2および/もしくは表3に記載される核酸によってコードされる少なくとも1つのタンパク質の発現を対照と比較する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
全血液または精製された単球/マクロファージからmRNAを抽出する工程；ならびに
表2および/もしくは表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現、または表2および/もしくは表3に記載される1つの核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドの発現を測定する工程
を含む、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断する方法。
【請求項１６】
表2および/もしくは表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現、または表2および/もしくは表3に記載される核酸によってコードされる少なくとも1つのタンパク質の発現を対照と比較する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
LXR調節のためのマーカーとしての、表2および/もしくは表3に記載される1つもしくは複数の核酸の使用、または表2および/もしくは表3に記載される核酸によってコードされる1つもしくは複数のポリペプチドの使用。
【請求項１８】
請求項8〜12のいずれか一項記載の方法により同定される化合物。
【請求項１９】
LXR活性の調節不全に関する疾患を処置するための薬物を製造するための、請求項8〜12いずれか一項記載の方法により同定される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
肝臓-X-受容体（Liver-X-Receptor：LXR）は、コレステロールおよび脂質の代謝、ならびに胆汁酸の合成に関与する遺伝子の発現を調節する核内ホルモン受容体である。LXRは、アテローム性動脈硬化症、異脂肪血症、および糖尿病などの多くの疾患に関係している。最近のデータは炎症における役割も示唆している。いくつかの遺伝子がLXRによって調節されることが示され、ABCA1（Costet, P., et al., Sterol-dependent transactivation of the ABC1 promoter by the liver X receptor/retinoid X receptor. J Biol Chem, 2000. 275(36): p. 28240-5; Schwartz, K., R.M. Lawn, and D.P. Wade, ABC1 gene expression and ApoA-I-mediated cholesterol efflux are regulated by LXR. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 274(3): p. 794-802）; 国際公開公報第02/070011号は、ABCA-1をPPAR活性化のための代理マーカーとして開示している；ABCG1(Kennedy, M.A., et al., Characterization of the human ABCG1 Gene; LXR activates an internal promoter that produces a novel transcript encoding an alternative form of the protein. J Biol Chem, 2001. 10: p.10); ApoC1(Stulnig, T.M., et al., Novel roles of liver X receptors exposed by gene expression profiling in liver and adipose tissue. Mol Pharmacol, 2002. 62(6): p. 1299-305); ApoE(Laffitte, B.A., et al., LXRs control lipid-inducible expression of the apolipoprotein E gene in macrophages and adipocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(2): p. 507-12); FAS(Joseph, S.B., et al., Direct and indirect mechanisms for regulation of fatty acid synthase gene expression by LXRs. J Biol Chem, 2002. 14: p.14); LDLR(Stulnig, T.M., et al., Novel roles of liver X receptors exposed by gene expression profiling in liver and adipose tissue. Mol Pharmacol 2002. 62(6): p. 1299-305); NR1H3; (Laffitte, B.A., et al., Autoregulation of the Human Liver X Receptor alpha Promoter. Mol Cell Biol, 2001. 21(22): p. 7558-68); SREBPF1(DeBose-Boyd, R.A., et al., Expression of sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBPF-1c) mRNA in rat hepatoma cells requires endogenous LXR ligands. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(4): p. 1477-82) 。関心対象となるUS2004/0023276は、LXR-リガンドが遺伝子とタンパク質を誘導したことを開示している。
【０００２】
本発明は、LXR活性化のための代理マーカー、およびLXR活性化に関連する疾患を診断する方法、LXR活性化に関連する疾患に罹患する患者の処置をモニターする方法、ならびにLXR活性を調節する化合物を同定する方法に関する。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、表2および/または表3に記載される核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含み、LXR調節の検出またはモニターするためのマーカーを提供する。本明細書において使用される「調節」という用語は、LXRの転写活性の活性化または抑制に関する。このように、該核酸はLXR活性の調節のための代理マーカーとして役立つことができる。
【０００４】
本明細書において使用される「マーカー」という用語は、単一の核酸もしくはポリペプチド、または複数の核酸もしくはポリペプチドのパネルを意味する。
【０００５】
好ましくは、核酸は表2に記載される核酸である。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。別の好ましい態様では、核酸は、配列番号：3、4、5および20を除く、表2に記載される核酸である。別の好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。さらに好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12または21からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1または21の少なくとも1つの核酸を含む。別の態様では、マーカーはより好ましくは、配列番号：20、22または26に記載の核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含み、さらに好ましくは、配列番号：22または26に記載の核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含み、最も好ましくは、マーカーは、配列番号：26に記載の核酸を含む。
【０００６】
別の好ましい態様では、マーカーは表3に記載される少なくとも1つの核酸を含む。より好ましくは、少なくとも1つの核酸は、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸からなる群より選択される。最も好ましい態様では、少なくとも1つの核酸は、配列番号：16または24からなる群より選択される。
【０００７】
本発明は、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカーにも関し、表2および/または表3に記載される核酸からなる群より選択される1つまたは複数の核酸を含む。したがって、核酸はLXR活性の調節のための代理マーカーとして役立つことができる。
【０００８】
好ましくは、核酸は表2に記載される核酸である。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。別の好ましい態様では、配列番号：3、4、5および20を除いては、核酸は表2に記載される核酸である。別のより好ましい態様では、前記マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。別のさらに好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12または21からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。最も好ましい態様では、マーカーは配列番号：1または21の少なくとも1つの核酸を含む。別の態様では、マーカーはより好ましくは、配列番号：20、22または26に記載の核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸、より好ましくは配列番号：22または26に記載の核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸を含む。
【０００９】
別の好ましい態様では、少なくとも1つの核酸は、表3に記載される核酸からなる群より選択される。より好ましくは、少なくとも1つの核酸は、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸からなる群より選択される。最も好ましくは、少なくとも1つの核酸は、配列番号：16および/または24からなる群より選択される。
【００１０】
本発明は、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカーにも関し、表3に記載される核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸、および、表2に記載される核酸からなる群より選択される1つまたは複数の核酸を含む。好ましくは、マーカーは、表3に記載される1つの核酸、および表2に記載される1つの核酸を含む。
【００１１】
表2および/または表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドもマーカーとして使用することが可能である。したがって、本発明はまた、LXR調節を検出またはモニタリングするためのマーカーを提供し、表2および/または表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つまたは複数のポリペプチドを含む。
【００１２】
好ましくは、ポリペプチドは、表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号：3、4、5および20を除いて、表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドである。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む。さらにより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12または21に記載の核酸によりコードされる少なくとも1つのポリペプチドを含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1または21に記載の核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドを含む。別の態様では、マーカーは、より好ましくは、配列番号：20、22または26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含み、より好ましくは、配列番号：22または26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
【００１３】
別の好ましい態様では、ポリペプチドは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。最も好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号：16および/または24に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。
【００１４】
別の好ましい態様では、本発明は、LXR調節を検出またはモニタリングするためのマーカーを提供し、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つもしくは複数のポリペプチドを含む。好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つのポリペプチド、および、表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つのポリペプチドを含む。より好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される2つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される2つのポリペプチドを含む。さらにより好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される3つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される3つのポリペプチドを含む。最も好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される4つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される4つのポリペプチドを含む。
【００１５】
これにさらに付け加えると、本発明は、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカーも提供し、表2および/または表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つまたは複数のポリペプチドを含む。
【００１６】
好ましくは、ポリペプチドは表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号：3、4、5および20を除く、表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドである。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む。さらに好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12または21からなる群より選択される核酸によりコードされる少なくとも1つのポリペプチドを含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1または21に記載の核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドを含む。別の態様では、マーカーは、より好ましくは配列番号：20、22または26に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含み、より好ましくは、配列番号：22または26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドを含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸によりコードされるポリペプチドを含む。
【００１７】
別の好ましい態様では、ポリペプチドは表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される。最も好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16および/または24に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される。
【００１８】
本発明は、LXR活性の調節不全に関する疾患を診断するためのマーカーに関するものであり、表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つまたは複数のポリペプチドを含む。好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される1つのポリペプチドを含む。より好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも2つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも2つのポリペプチドを含む。さらにより好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも3つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも3つのポリペプチドを含む。最も好ましくは、マーカーは、表3に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも4つのポリペプチド、および表2に記載される核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも4つのポリペプチドを含む。
【００１９】
本明細書において前述された新規のマーカーを構成する核酸およびポリペプチドはいくつかのプロセスにおいて重要である。宿主と化合物を接触させる工程、ならびに表2および/または表3に記載される核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸の発現を測定する工程を含む、LXR活性を調節する化合物をスクリーニングする方法が提供される。
【００２０】
好ましくは、核酸は、表2に記載される核酸である。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。別の好ましい態様では、核酸は、配列番号：3、4、5および20を除く、表2に記載される核酸である。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。さらにより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12または21からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1または21の少なくとも1つの核酸を含む。別の態様では、マーカーはより好ましくは、配列番号：20、22または26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含み、より好ましくは配列番号：22または26に記載の核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸を含む。
【００２１】
本明細書において前述された方法の1つの態様では、本明細書において前述された核酸からなる群より選択される少なくとも1つの核酸の発現を、対照における少なくとも1つの核酸の発現と比較する。対照は、処理前と同一の宿主もしくは異なる宿主であってよい未処理の宿主、および/または処理前のレベルに規格化するための適切な処理期間後の同一の宿主でありうる。前述された方法の好ましい態様では、LXR活性を調節する化合物は、アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００２２】
別の好ましい態様では、少なくとも1つの核酸は、表3に記載される核酸からなる群より選択される。より好ましくは、少なくとも同一の核酸は、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸からなる群より選択される。最も好ましくは、少なくとも1つの核酸は、配列番号：16および/または24からなる群より選択される。
【００２３】
核酸の発現を測定するためのいくつかの方法が利用可能である。ノーザンブロッティング、およびデンシトメトリーによるバンドの定量などの方法は当技術分野において良く知られている方法であり、十分に正確ではない可能性があるが、利用することができる。他の方法として、ジーンチップ、マイクロアレイ分析、ドットブロッティング、または異なる定量的PCRの方法論が含まれる。好ましくは、Taqmanまたはリアルタイム定量的PCRが利用される。好ましい態様では、配列番号：16〜26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸の発現レベルは、表1に記載されるフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを用いたTaqman定量的PCRによって決定される。より好ましい態様では、配列番号：20、21、22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸の発現レベルは、Taqman定量的PCRによって測定される。最も好ましい態様では、配列番号：20、21、22および26からなる群より選択される少なくとも1つの核酸を測定するために用いられるプライマーおよびプローブは、配列番号：39〜41（配列番号：20に記載の核酸の発現レベルを測定するため）、または配列番号：42〜44（配列番号：21に記載の核酸の発現レベルを測定するため）、または配列番号：45〜47（配列番号：22に記載の核酸の発現レベルを測定するため）、または配列番号：57〜59（配列番号：26に記載の核酸の発現レベルを測定するため）のプライマーおよびプローブである。
【００２４】
Taqman定量的PCRは次のように行われる：
3種類のオリゴヌクレオチドを用いる：フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ。これらのすべては標的に対して特異的であり、それに結合することが可能である。Taqman分析は、Taqポリメラーゼといった一般的に用いられている酵素の5'→3'ヌクレアーゼ活性を活用するプローブ技術を用いている。アッセイ効率は、この5'→3'ヌクレアーゼ活性に大きく依存する。このことについて、当業者はふさわしいポリメラーゼの選択に注意すべきである。製造者がポリメラーゼは5'-エキソヌクレアーゼ活性を有していると主張しているにもかかわらず、実際には、市販されているいくつかのポリメラーゼはリアルタイムRT-PCRに適切ではないようである。プローブは、5'末端にレポーター色素、および3'末端に消光剤色素を有するオリゴヌクレオチドである。蛍光レポーター色素は5'末端に共有結合的に付加されており、FAM（6-カルボキシフルオレセイン）、TET（テトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン）、JOE（2,7-ジメトキシ-4,5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン）、HEX（ヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン）、またはVICとすることができる。レポーターは、リンカーアームによって3'末端に結合されたTAMRA（6-カルボキシテトラメチルローダミン）によって消光される。DABCYL[4-(48-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸]は、消光剤色素として利用することも可能であるが、モレキュラービーコンプローブにおいてより多く使用されている。TaqManプローブとしてDABCYLを用いることの利点は、TAMRAと比較してその自己蛍光が弱いことである。プローブが無処置の場合、互いが近接することによって、消光剤色素はレポーター色素の蛍光を吸収する。消光剤と蛍光団の近接はFRETを可能にし、蛍光発光は起こらない。Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活性によって、プローブは加水分解され、レポーター色素は消光剤から分離され、蛍光発光の増加が引き起こされる。PCR増幅の間に、対象となる標的が存在する場合には、プローブは標的に特異的にアニールする。Taqポリメラーゼはプローブを切断し、これにより蛍光発光の増加が引き起こされる。この蛍光の増加はサイクル毎に測定され、増幅過程の直接的な結果となる（Giulietti, A., et al., An Overview of eal-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression. Methods 25, 386-401(2001)）。
【００２５】
本発明により提供される別の方法は、LXR活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であり、宿主と化合物を接触させる工程、ならびに表2および/または表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1つのポリペプチドの発現を測定する工程を含む。好ましくは、ポリペプチドは、表2に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、マーカーは、配列番号：3〜5および20を除く、表2に記載される核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドである。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。さらにより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12もしくは21に記載の核酸、またはこれらに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。最も好ましい態様では、マーカーは配列番号：1もしくは21に記載の核酸、またはこれらに記載の核酸によりコードされるポリペプチドを含む。別の態様では、マーカーは、より好ましくは、配列番号：20、22もしくは26に記載の核酸、またはこれらに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸、または配列番号：26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
【００２６】
別の好ましい態様では、ポリペプチドは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される。最も好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16および/または24に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。
【００２７】
本明細書において記述される方法の別の態様では、少なくとも1つのポリペプチドの発現を、対照における少なくとも1つのポリペプチドの発現と比較する。対照は未処理の宿主、または担体で処理された宿主であってもよい。担体は化合物が溶解または懸濁された溶媒となり得る。本明細書において記述された方法の好ましい態様として、LXR活性を調節する化合物は、アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかである。
【００２８】
本発明は、LXR活性の調節不全に関する疾患に罹患する患者の処置をモニタリングする方法も提供し、単球/マクロファージまたはLXR活性の修飾物質で処置した患者から単離された全血液からのmRNAまたはタンパク質の精製の工程、ならびに表2および/もしくは表3に記載される少なくとも1つの核酸、または表2および/もしくは表3に記載される1つの核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドを測定する工程を含む。
【００２９】
好ましくは、ポリペプチドは表2に記載される核酸によってコードされる。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、マーカーは、配列番号：3〜5および20を除く、表2に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によりコードされるポリペプチドを含む。さらにより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12または21に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1もしくは21に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の態様では、マーカーはより好ましくは、配列番号：20、22もしくは26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸、または配列番号：26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
【００３０】
別の好ましい態様では、ポリペプチドは、表3に記載される核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。最も好ましくは、ポリペプチドは、配列番号：16および/または24に記載の核酸によりコードされるポリペプチドからなる群より選択される。
【００３１】
対照は、処理前と同一の宿主もしくは異なる宿主であってよい未処理の宿主、および/または処理前のレベルに規格化するための処理を適切な期間行った後の同一の宿主であり得る。
【００３２】
本発明はLXR活性の調節不全に関する疾患を診断する方法も提供し、全血液または精製された単球/マクロファージから、mRNAまたはタンパク質を抽出する工程、および表2もしくは表3に記載される少なくとも1つの核酸の発現、または表2もしくは表3に記載される1つの核酸によってコードされる少なくとも1つのポリペプチドの発現を測定する工程を含む。
【００３３】
好ましくは、ポリペプチドは、表2に記載される核酸によってコードされる。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、マーカーは、配列番号：3〜5および20を除く、表2に記載される核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。さらにより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12もしくは21に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1もしくは21に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の態様では、マーカーは、より好ましくは配列番号：20、22もしくは26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含み、最も好ましくは、マーカーは配列番号：26に記載の核酸、または配列番号：26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
【００３４】
別の好ましい態様では、少なくとも1つの核酸またはポリペプチドは、表3に記載される核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、少なくとも1つの核酸またはポリペプチドは、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。最も好ましくは、当該の少なくとも1つの核酸またはポリペプチドは、配列番号：16および/もしくは24に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。
【００３５】
対照は、処理前と同一の宿主もしくは異なる宿主であってよい未処理の宿主、および/または処理前のレベルに規格化するための適切な期間の処理後の同一の宿主でありうる。
【００３６】
本明細書において記述される方法とマーカーに加えて、本発明は、LXR調節のためのマーカーとして、表2および/もしくは表3に記載される1つもしくは複数の核酸の使用、またはこれらの核酸によってコードされる1つもしくは複数のポリペプチドの使用を提供する。好ましくは、ポリペプチドは、表2に記載される核酸によってコードされる。より好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、4〜7、12、14、20〜22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の好ましい態様では、マーカーは、配列番号：3〜5および20を除く、表2に記載される核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別のより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、6、7、12、14、21、22および26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。さらにより好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1、12もしくは21に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。最も好ましい態様では、マーカーは、配列番号：1もしくは21に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含む。別の態様では、マーカーは、好ましくは、配列番号：20、22もしくは26に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドを含み、最も好ましくは、配列番号：26に記載の核酸、または配列番号：26に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。
【００３７】
別の好ましい態様では、少なくとも1つの核酸またはポリペプチドは、表3に記載される核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。より好ましくは、当該の少なくとも1つの核酸またはポリペプチドは、配列番号：16、17および23〜25に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。最も好ましくは、少なくとも1つの核酸またはポリペプチドは、配列番号：16および/もしくは24に記載の核酸、またはこれらの核酸によってコードされるポリペプチドからなる群より選択される。
【００３８】
本発明は、本明細書において記述される方法によって同定される化合物、およびLXR活性の調節不全に関する疾患の処置のための薬物の製造に関して本明細書において記述される方法によって同定される化合物の使用に関する。
【００３９】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することで説明されるが、本発明は本明細書に示す実施例に限定されるものではない。
【００４０】
細胞培養およびRNA調製
骨髄性単球の白血病細胞株（THP1; ATCC TID-202）を、2g/lグルコースおよび2mMグルタミン、10%ウシ胎児血清FBS(v/v) (Gibco)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン P/S (v/v) (Gibco)、50□M 2-メルカプトエタノール（Bio-Rad）および1% 100mMピルビン酸ナトリウム(v/v) (Gibco)を含む、フェノールレッド添加RPMI 1640培地中で培養した。細胞は37℃にて5.2%二酸化炭素でインキュベートされた。実験上の取り扱いのために、細胞を、それらが接着性のマクロファージに完全に分化するまで72時間、100nMホルボール12-ミリスチン酸 13-酢酸塩(PMA)を含む培地を加えた6-ウェルプレートに1x106/mlの密度で播種した。細胞を回収する6時間または24時間前に、培地を溶媒(DMSO)または試験化合物を加えたPMAを含む培地で置換した。全RNAをTriZol試薬(Life Technologies)またはRNeasy miniキット(Qiagen)を用いて、製造者のプロトコールに従って単離した。混入しているDNAを除去するために、試料をRNAse free DNAse(Gibco)で処理した。
【００４１】
DNAチップにより遺伝子発現測定
第1および第2のcDNA鎖の合成はSuperScript Choice Gene Chipキット(Life Technologies)およびGibcoの試薬を用いて行われた。導入されたT7 RNAポリメラーゼ結合部位を含む2重鎖DNAは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの混合物(Life Technologies)での抽出によって精製された。有機層および水層をPhase Lock Gel(Eppendorf)によって分離し、2重鎖DNAを製造者のプロトコールに従った沈殿によって回収し、次いで水に再懸濁した。
【００４２】
2重鎖cDNAは、T7キット(Ambion)およびビオチン含有リボヌクレオチド（biotin-containing ribonucleotides）(Enzo-LOXO GmbH)を用いて、インビトロ転写(IVT)によってビオチン標識cRNAに変換された。IVT-成分は未導入のリボヌクレオチドからRNeasy spin columns (Qiagen)を用いて精製された。精製の後、ビオチン標識1本鎖cRNAは、500mM酢酸カルシウム、150mM酢酸マグネシウム、pH8.1、95℃35分間でより短い断片に化学的に加水分解された。氷上で試料を冷却することにより反応を終了した。
【００４３】
プローブを〜12,000遺伝子を提示する特徴を有するHGU95AV2A GeneChip Microarray(Affymetrix)にハイブリダイズした。すべての洗浄、ハイブリダイゼーション、検出、およびシグナル増幅の段階は、GeneChip Fluidics Station(Affymetrix)を用いて行われた。蛍光強度データをGeneArrayスキャナー(Affymetrix)を用いて、ハイブリダイズされた遺伝子アレイから収集した。蛍光強度情報を含む生ファイルをAffymetrix Microarray Suite(MAS)ソフトウェアを用いてデータファイルに変換した。示差的に発現した遺伝子を、Roche Affymetrix Chip Experiment Analysis(RACE-A)ソフトウェアを用いて同定した。溶媒で処理したウェルと試験化合物で処理したウェル（1群あたりn=4）の差異はスチューデントt-検定により評価され、対照に対する倍数変化(fold change)として表された。
【００４４】
Taqman定量的PCRによる遺伝子発現測定
遺伝子発現レベルをABI PRISM 7700 sequence detection system(Applied Biosystems)上でTaqman定量的RT-PCRによって測定した。全RNAを、Superscript II RTキット(Life Technologies)を用いてcDNAに逆転写した。用いられたプライマー/プローブ配列を表1に記載する。プライマーはPrimerSelectソフトウェア(Perkin Elmer)を用いて設計された。溶媒で処理したウェルと試験化合物で処理したウェル（1群あたりn=4）との差異はスチューデントt-検定により評価され、対照に対する倍数変化として表された。TaqMan定量的PCRは、記載のように行われた（Giulietti, A., et al., An Overview of eal-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression. Methods 25, 386-401(2001)）。
【００４５】
実施例1
LXRαおよびLXRβは、RXRとヘテロ二量体化する核内受容体であり、ABCA1、ABCG1、SREBF1、FASN、LPLおよびCYP7A [1-9]などのいくつかの標的遺伝子の発現を調節することが示されている。治療法の有効性を評価するために、患者で測定可能な代理遺伝子を同定するために、THP1マクロファージを選択的LXRリガンドで処理した。200nMでT0901317[10]は選択的LXRアゴニストである（ヒトLXRαおよびヒトLXRβではそれぞれEC50=30nMおよび10nMである）。遺伝子発現変化を、遺伝子チップマイクロアレイ（Gene Chip Microarray）分析によって評価した。LXRアゴニストT0901317は、ABCA1、ABCG1、APOC1、APOE、ASM3A、C3F、CDC42EP4、CXCR4、FASN、LDLR、NR1H3、SREBF1、VLDLR、FADS1、FADS2、CYB561、IL15、PPFIA2、SERPINI1、KIAA0763、PPIC、LASS1、NFATC4、NR4A3、PRODH2、PRKCI(表2)の強力な誘導を示した。このように、これらの遺伝子のすべてがLXR調節のための代理マーカーであり、これらの活性を遺伝子チップマイクロアレイ技術を用いて測定することが可能である。
【００４６】
実施例2
代理マーカー遺伝子を測定する代替法を評価するために、THP1マクロファージを記載のようにT0901317で処理した。遺伝子発現変化を、ABCA1、ABCG1、APOC1、APOE、ASM3A、CDC42EP4、CXCR4、FASN、LDLR、NR1H3、VLDLRについてTaqMan定量的PCRによって測定した。選択的LXRアゴニストは、これらマーカー遺伝子（表3）のそれぞれの発現に関して強く且つ有意な増加をもたらした。まとめると、これらの結果は、複数の方法による代理マーカー遺伝子のmRNA発現の測定は、LXR治療法の治療学的な有効性を評価するために効果的に用いることができることを示唆している。
【００４７】
（表１）本研究で使用されたTaqmanプライマーおよびプローブ一覧
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2006525816.tif 000003
すべての配列は5'から3'の方向に示されている。Taqmanプローブは5'-FAMおよび3'-TAMRAで標識されており、HPLCにより精製された。
【００４８】
（表２）遺伝子チップマイクロアレイによるLXR活性化の代理マーカー遺伝子の同定
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遺伝子チップマイクロアレイ分析により測定されたLXRアゴニストT0901317で処理したTHP1マクロファージにおけるmRNAレベルの倍数変化。すべての値はmRNAにおける倍数変化であり、4つの対照に対する4つの処理の平均値における差異をす。処理の時間は、6時間または24時間である。*有意 p<0.05; **非常に有意、p<0.01。
【００４９】
（表３）遺伝子チップマイクロアレイによるLXR活性化の代理マーカー遺伝子の同定
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遺伝子チップマイクロアレイ分析により測定されたLXRアゴニストT0901317で処理したTHP1マクロファージにおけるmRNAレベルの倍数変化。すべての値は、mRNAにおける倍数変化、および4つの対照に対する4つの処理の平均値における差異を示す。処理の時間は、6時間または24時間である。*有意 p<0.05; **非常に有意、p<0.01。
【００５０】
（表４）Taqman定量的RT-PCRによるLXR活性化の代理マーカー遺伝子の評価
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Taqman定量的RT-PCRにより測定されたLXRアゴニストT0901317で処理したTHP1マクロファージにおけるmRNAレベルの倍数変化。すべての値はmRNAにおける倍数変化、および4つの対照に対する4つの処理の平均値における差異を示す。処理の時間は、6時間または24時間である。*有意 p<0.05; **非常に有意、p<0.01。
【配列表】
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【国際調査報告】
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