(57)【要約】細胞接着に抵抗する被覆表面は、プラズマ処理されたポリマー表面と直接結合したヒアルロン酸を含む。リガンド結合ポリペプチド（抗体または抗体結合タンパク）の付着によるヒアルロン酸のさらなる修飾と同様に、この被覆表面を生成する方法が開示される。
2006501356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸（ＨＡ）、アルギン酸（ＡＡ）あるいはＨＡまたはＡＡの誘導体で物品の表面を被覆する方法であって、被覆表面を得るために、
ｉ）  プラズマで物品の表面を処理し、それによって前記表面上に窒素含有基を形成させるステップと、
ｉｉ）  カルボジイミドおよび反応中間体エステル安定化化合物の存在下で、ヒアルロン酸、アルギン酸またはそれらの誘導体を含む溶液に物品の処理表面をさらすステップから本質的になることを特徴とする方法。
【請求項２】
反応中間体エステル安定化化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスルホスクシンイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾロハイドレイトからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被覆表面を乾燥させる追加のステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記表面は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸およびセルロースからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記表面はポリスチレンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉ）は、ステップ（ｉ）の６０分以内に実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プラズマ処理はＮＨ３プラズマ処理であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プラズマ処理は、ポリマー物品をプラズマチャンバー内に置き、チャンバーを圧２０ミリトルのベース圧に排気し、３７５ミリトルのＮＨ３雰囲気を確立し、その後２５秒間プラズマ処理することによって実施されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＡの濃度は少なくとも約０．０５％  ｗ／ｖであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＡの濃度は少なくとも約０．５％  ｗ／ｖであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
カルボジイミドおよびエステル安定化化合物とＨＡ反復単位の比は、少なくとも１および０．５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
物品のプラズマ処理された表面を、ＨＡ、ＡＡあるいはＨＡまたはＡＡの誘導体で被覆する方法であって、前記表面は窒素含有基を含み
被覆表面を得るために、カルボジイミドおよび反応中間体安定化化合物の存在下で、ＨＡ、ＡＡまたは前記誘導体の溶液にプラズマ処理表面をさらすステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
物品のプラズマ処理された表面を、ＨＡ、ＡＡあるいはＨＡまたはＡＡの誘導体で被覆する方法であって、前記表面は窒素含有基を含み、
被覆表面を得るために、カルボジイミドおよび反応中間体安定化化合物の存在下で、ＨＡ、ＡＡまたは前記誘導体の溶液にプラズマ処理表面をさらすステップから本質的になることを特徴とする方法。
【請求項１４】
反応中間体エステル安定化化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスルホスクシンイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾロハイドレイトからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
被覆表面を乾燥させる追加のステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸およびセルロースからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面はポリスチレンであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
プラズマ処理表面はＮＨ３プラズマ処理表面であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記物品はPrimaria（商標）処理されていることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記プラズマ処理は、ポリマー物品をプラズマチャンバー内に置き、チャンバーを２０ミリトルベース圧に排気し、３７５ミリトルのＮＨ３雰囲気を確立し、その後２５秒間プラズマ処理することによって実施されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＡの濃度は少なくとも約０．０５％  ｗ／ｖであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＡの濃度は少なくとも約０．５％  ｗ／ｖであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カルボジイミドおよびエステル安定化化合物とＨＡ反復単位の比は、少なくとも１および０．５であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の方法によって形成されることを特徴とする表面。
【請求項２５】
請求項１２に記載の方法によって形成されることを特徴とする表面。
【請求項２６】
請求項２１または請求項２２に記載の表面を有することを特徴とする物品。
【請求項２７】
ポリマーを含むことを特徴とする請求項２３に記載の物品。
【請求項２８】
ペトリ皿、生物学的培養ボトルまたはフラスコ、組織スライド、多穴プレート、発泡体、繊維網、スキャポールド材からなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の物品。
【請求項２９】
複数の穴を有する組織スライドであることを特徴とする請求項２５に記載の物品。
【請求項３０】
有機溶媒に耐性であることを特徴とする、請求項１に記載の方法によって形成される表面。
【請求項３１】
少なくとも第１リガンド結合ポリペプチドを共有結合させた細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）固相表面を生成する方法であって、
（ａ）ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体でポリマー表面を被覆する、請求項１に記載のステップと、
（ｂ）前記ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体を酸化してアミン反応残基を生じさせるステップと、
（ｃ）前記酸化したＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体を第１リガンド結合ポリペプチドにさらして、前記ポリペプチドのアミノ基と前記アミン反応残基の間に共有結合を形成させ、その結果前記ポリペプチドのＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体との共有結合が生じるステップとを含み、
これによって、第１リガンド結合ポリペプチドと共有結合した前記ＣＡＲ表面が生成されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
（ｉ）前記酸化ステップ（ｂ）は、前記ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体上に反応アルデヒド基を生じさせる酸化剤を供給することによって実施され、
（ｉｉ）ステップ（ｃ）は、前記ポリペプチドに対する還元剤、および還元アミノ化を実施する前記表面を供給し、その結果、前記ポリペプチドの前記アミノ基と前記反応性アルデヒド基の間に前記共有結合が形成されるステップをさらに含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｂ）は、ステップ（ｃ）の前に、またはそれと同時に、カルボジイミドおよび反応中間体エステル安定化化合物にさらすことにより前記ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体のカルボン酸残基を反応性エステルに転換するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
反応中間体エステル安定化化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスルホスクシンイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾロハイドレイトからなる群から選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｃ）の後に、
（ｄ）第２ポリペプチドの第１ポリペプチドとの非共有結合が生じる条件下で、前記共有結合した第１リガンド結合ポリペプチドを、前記第１リガンド結合ポリペプチドのリガンドである前記第２ポリペプチドに接触させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｃ）の後に、
（ｄ）第２ポリペプチドの第１ポリペプチドとの非共有結合が生じる条件下で、前記共有結合した第１リガンド結合ポリペプチドを、前記第１リガンド結合ポリペプチドのリガンドである前記第２ポリペプチドに接触させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｃ）の後に、
（ｄ）第ポリペプチドの第１ポリペプチドとの非共有結合が生じる条件下で、前記共有結合した第１リガンド結合ポリペプチドを、前記第１リガンド結合ポリペプチドのリガンドである前記第２ポリペプチドに接触させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記表面は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸およびセルロースからなる群から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）の前記酸化剤は、過ヨウ素酸塩であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体、（ｂ）受容体、（ｃ）イムノグロブリン結合タンパク、（ｄ）アビジンまたはストレプトアビジン、（ｅ）レクチン、（ｆ）細胞接着分子または（ｆ）細胞外マトリックスタンパクあるいは（ｇ）合成ペプチドであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、天然または組換えブドウ球菌プロテインＡ、天然または組換えブドウ球菌プロテインＧ、ならびに組換えプロテインＡ／Ｇからなる群から選択されるイムノグロブリン結合タンパクであることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）イムノグロブリン結合タンパク、または（ｃ）アビジンまたはストレプトアビジンであることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）受容体、（ｃ）レクチン、（ｄ）細胞接着分子、（ｅ）細胞外マトリックスタンパクあるいは（ｆ）合成ペプチドであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４４】
（ａ）前記第１リガンド結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧ、または組換えプロテインＡ／Ｇであり、
（ｂ）前記第２リガンド結合ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）前記第１リガンド結合ポリペプチドは、アビジンまたはストレプトアビジンであり、
（ｂ）前記第２リガンド結合ポリペプチドは、ビオチン化抗体であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項２８のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞外マトリックスポリペプチドは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン１、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、骨シアロタンパク、軟骨マトリックスタンパク、フィブリノーゲン、フィブリン（fibrin）、フィブリン（fibulin）、ムチン、エンタクチン、オステオポンチン、プラスミノーゲン、リストリクチン（restrictin）、セルグリシン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、バーシカン、フォンウィルブランド因子、カドヘリン、コネキシン、およびセレクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞外マトリックスポリペプチドは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン１、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、骨シアロタンパク、軟骨マトリックスタンパク、フィブリノーゲン、フィブリン（fibrin）、フィブリン（fibulin）、ムチン、エンタクチン、オステオポンチン、プラスミノーゲン、リストリクチン（restrictin）、セルグリシン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、バーシカン、フォンウィルブランド因子、カドヘリン、コネキシン、およびセレクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
標的リガンドを含む標的細胞または標的分子を結合させるのに有用な物品であって、
（ａ）ＨＡ、ＡＡ、あるいはＨＡまたはＡＡの誘導体を含む層で被覆されたＣＡＲ表面と、
（ｂ）前記ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体と共有結合した、前記標的リガンドと結合することが可能である第１リガンド結合ポリペプチドとを含むことを特徴とする物品。
【請求項５１】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体、（ｂ）受容体、（ｃ）イムノグロブリン結合タンパク、（ｄ）アビジンまたはストレプトアビジン、（ｅ）レクチン、（ｆ）細胞接着分子、（ｆ）細胞外マトリックスペプチドまたはポリペプチド、あるいは（ｇ）合成ペプチドであることを特徴とする請求項４８に記載の物品。
【請求項５２】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、天然または組換えブドウ球菌プロテインＡ、天然または組換えブドウ球菌プロテインＧ、ならびに組換えプロテインＡ／Ｇからなる群から選択されるイムノグロブリン結合タンパクであることを特徴とする請求項４９に記載の物品。
【請求項５３】
前記共有結合している第１リガンド結合ポリペプチドと結合した請求項４８に記載の物品であって、
（ｃ）第２リガンド結合ポリペプチドであって、
（ｉ）前記第１リガンド結合ポリペプチドの標的リガンドを含み、
（ｉｉ）標的細胞または標的分子の標的リガンドと結合することが可能である、第２リガンド結合ポリペプチドをさらに含むことを特徴とする物品。
【請求項５４】
前記第２リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）イムノグロブリン結合タンパク、（ｃ）受容体、（ｄ）レクチン、（ｅ）細胞接着分子、（ｆ）細胞外マトリックスペプチドまたはポリペプチド、あるいは（ｆ）合成ペプチドであることを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項５５】
（ａ）前記第１リガンド結合ポリペプチドは、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、または組換えプロテインＡ／Ｇであり、
（ｂ）前記第２リガンド結合ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片であることを特徴とする請求項５２に記載の物品。
【請求項５６】
（ａ）前記第１リガンド結合ポリペプチドは、アビジンまたはストレプトアビジンであり、
（ｂ）前記第２リガンド結合ポリペプチドは、ビオチン化抗体であることを特徴とする請求項５２に記載の物品。
【請求項５７】
前記第１リガンド結合ポリペプチドは、ＣＤ３４に特異的なモノクローナル抗体あるいはその抗原結合性断片または誘導体であることを特徴とする請求項４８に記載の物品。
【請求項５８】
前記第２リガンド結合ポリペプチドは、抗ＣＤ３４モノクローナル抗体あるいはその抗原結合性断片または誘導体であることを特徴とする請求項５１に記載の物品。
【請求項５９】
前記細胞外マトリックスポリペプチドは、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン１、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、骨シアロタンパク、軟骨マトリックスタンパク、フィブリノーゲン、フィブリン（fibrin）、フィブリン（fibulin）、ムチン、エンタクチン、オステオポンチン、プラスミノーゲン、リストリクチン（restrictin）、セルグリシン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、バーシカン、フォンウィルブランド因子、カドヘリン、コネキシン、およびセレクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４９に記載の物品。
【請求項６０】
前記表面は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸およびセルロースからなる群から選択されることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラズマ処理されたポリマー表面と直接結合したヒアルロン酸またはアルギン酸を含む、細胞接着に抵抗する被覆表面、およびこの被覆表面を生成する方法に関する。本発明は、所望のタイプの細胞または分子と選択的に結合する抗体のようなリガンド結合ポリペプチドが結合しているこのような細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）被覆表面を含む、組成物、物品、物体、器具および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞接着に抵抗する表面が所望されていることは、とりわけ組織培養の分野では周知であり、このような表面を開発するため、過去にかなりの研究が行われてきている。これらは、組織培養だけでなく、例えば、細菌の細胞接着を防ぐことが所望される医療器具など他分野でも、一般に、そうでなければ微生物の付着による汚損にさらされるはずである表面に有用である。ヒアルロン酸（またはヒアルロナン）、略してＨＡは、これに関する多くの研究の対象であり、これを固定化したとき所望の抵抗特性を有する表面が生じることが判明している。しかし、このとき生じる１つの問題は、ＨＡが水溶性であり、時間が経つと水溶液中に溶解するので、ＨＡ層で表面を単に被覆することだけでは通常不十分であることが判明していることである。したがって、装用可能な被覆を作り出すため、一般に、安定な化学結合によってＨＡを表面に付着させることが必要とされている。
【０００３】
ＨＡおよびアルギン酸（ＡＡ）を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリＬ−リシン（ＰＬＬ）を中間結合層として用いてポリエチレン上に共有結合させ、固定化することができ、またはＨＡをプラズマ処理された表面と結合させる二官能性のアルコキシシラン結合剤（coupling agent）を用いて共有結合させることができることが開示されている（特許文献１）。この方法のどちらも、かなりの時間および労力の投入を要する。
【０００４】
特定の結合剤を使用する場合のアンモニアプラズマで処理したポリマーへのＨＡの固定化が開示されている（非特許文献１）。すなわち、表面をアンモニアプラズマで処理した後、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を濃縮剤として用いて、ＨＡを、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）とうまく結合させることができなかった。ＨＡを、アジピン酸ジヒドラジドで修飾したときのみ、ＨＡは、ＥＤＣによってこれらの処理されたポリマーとうまく結合した。すなわち、Masonらによれば、ＨＡは、表面のアミンとＨＡのカルボキシル基の間に「スペーサーアーム」（アジピン酸ジヒドラジド）が存在する場合のみ表面結合ＮＨ２基と結合する。しかし、ＨＡの修飾は望ましくなく、アジ化合物は一般に安全性の問題を有する。
【０００５】
したがって、細胞接着に抵抗する表面を調製する単純化された方法が依然として必要である。
【０００６】
多くの報告に、活性のある生体物質の、固体支持体への結合が記載されている。例えば、抗体をＰＳ皿に共有結合させ、パニングプロセスにおいて細胞除去手順にこの誘導体化された皿を使用する（非特許文献２）。イムノアッセイなどで使用する、抗体またはその断片との共有結合によるＰＳ表面の誘導体化が記載されている（非特許文献３および非特許文献４）。
【０００７】
Applied Immune Sciences, Inc.に譲渡された多数の特許、および同社の社員による科学刊行物は、ＰＳ表面を共有結合により誘導体化し、これを使用してリガンド結合タンパク、主に抗体を共有結合により固定化し、これを使用して混合細胞集団から特定の細胞サブセットを捕捉（正の選択）および除去（負の選択）することを開示している。（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献５、非特許文献６、および非特許文献７を参照されたい）。OkronglyまたはClarkに従って調製した器具（ＰＳ組織培養フラスコ）は、特定のマウス細胞集団の負の除去および正の選択に使用された。ある場合には、選択抗体を、表面と共有結合したマウス抗ラット抗体と非共有結合で結合させた。細胞上に示差的に発現する特定の糖類に特異性を有する、共有結合により固定化されたレクチンも開示された。これらの方法は、骨髄から機能的造血前駆細胞を濃縮する単一のステップまたは複数のステップで使用された（非特許文献８、非特許文献９）。
【０００８】
しかし、リガンド結合タンパクの結合を対象とする前記の文献は、そのようなタンパクが固定化される細胞接着抵抗性表面の使用を開示しておらず、そのような表面を作成するまたは使用する何らかの理由を示唆してもいない。したがって、本明細書に記載するように、タンパク、細胞などの接着／結合に抵抗するように設計された表面を、特定のリガンド結合分子がその抵抗性表面に付着することによってもその全体的な抵抗特性が失われずに、所定の分子、細胞表面構造などを選択的に引きつけることができることが見出されることは予想されなかった。
【０００９】
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【非特許文献４４】Roque-Barreira, MC et al., J. Immunol. 134: 1740 (1985)
【非特許文献４５】Gregory, RL, J. Immunol. Meth. 99: 101 (1987)
【非特許文献４６】EJM Van Damme et al., Handbook of Plant lectins: Properties and Biomedical Applications John Wiley & Sons, New York, 1998
【非特許文献４７】http://www.plab.ku.dk/tcbh/
【非特許文献４８】http://www.vectorlabs.com/Lectins/Lindex.html
【非特許文献４９】Goldstein, IJ et al., 1978, Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 35: 127-340
【非特許文献５０】D. Mirelman (ed.), Microbial Lectins and Agglutinins: Properties and Biological activity, Wiley, New York (1986)
【非特許文献５１】Goldstein, IJ, Indian J Biochem Biophys, 1990, 27: 368-369
【非特許文献５２】Glass, JR et al., Biomaterials 17: 1101-1108 (1996)
【非特許文献５３】Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques. 1996, San Diego: Academic Press
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＨＡが、結合剤の必要なしに、またＰＥＩ、ＰＬＬ、ポリＤリシン（ＰＤＬ）または他のポリ陽イオン性物質で表面を処理することなしにプラズマ処理表面と直接結合することができることが予期せず見出された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明の物品は、ＨＡを表面上に共有結合で固定化させて、細胞接着に抵抗する表面を得る方法を提供する。特に、本発明は、中間結合層の使用または化学的結合剤の使用を必要とせずに、プラズマ処理、およびそれに続くＨＡのその面上への固定化によって、ポリスチレンおよび他のポリマー表面上で直接窒素を含有する表面を得る方法を提供する。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、ポリエチレンイミンなど中間結合層の使用、または化学的結合剤の使用を要することなく、ＨＡを（ポリマー）窒素を含有する表面上に直接固定化する方法を提供する。
【００１３】
このような表面の例は、アンモニアプラズマ処理したポリマーおよびPrimaria（商標）処理したポリスチレン表面である。本発明において使用に適するポリマー基質には、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、セルロースなどがある。
【００１４】
さらなる他の実施形態では、本発明は、細胞接着に抵抗する表面を提供する。その表面は、ポリスチレンなどのポリマーとアミン残基を介して直接結合しているヒアルロン酸の層からなり、中間結合層またはＰＬＬなどのリンカー基（linker group）を含まない。
【００１５】
本発明の方法に従って形成された表面は、当分野で以前から知られていたＨＡまたはアルギン酸による被覆表面および他の細胞接着抵抗性表面と同じ目的に対して有用となる。さらなる処理を行わないとき、このような表面は、細胞接着および細胞増殖に対して抵抗性を持たせるのに有用となる。これらはまた、当分野で知られている手段によりさらに処理して、特定の所望の特性を有する追加の因子を選択的に付着させることもできる。場合によっては、標的細胞または化合物に特異的な親和性を有する、生物学的に活性な物質と結合させると有利となることがある。  本発明はさらに、リガンド結合ポリペプチド（ＬＢＰ）、好ましくは抗体を、非特異的な細胞およびタンパクの吸着を防ぐ、上述のような修飾された固体表面に固定化する方法を対象とする。これは、（ａ）細胞標的に対する抗体、または（ｂ）ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）、連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）などイムノグロブリン（Ｉｇ）分子と自然に結合する捕捉タンパク（capture protein）、などのように特定の方法で抗体と相互作用させることができる他のタンパクなどのＬＢＰと共有結合させることによって達成される。後者の「捕捉」タンパクの例は、可溶性の標的特異的抗体と化学的に結合したビオチンと非常に高い親和性で結合するアビジンまたはストレプトアビジンである。
【００１６】
この実施形態では、表面をまず上記のように修飾してＣＡＲ表面を作成する。例えば、ＨＡを表面に結合させた後、ＨＡの遊離水酸基を、例えば過ヨウ素酸塩（例えばＮａＩＯ４）を用いて酸化してアルデヒドにする。ポリペプチドはそのとき、その遊離第一級アミン残基（Ｎ末端、ＬｙｓまたはＡｒｇの側鎖など）を介してこのアルデヒド基と反応することができる。適切な還元剤、例えばシアノ水素化ホウ素などの水素化ホウ素の存在下で、還元アミノ化が起こり、その結果ＨＡ（またはＡＡ）の糖環上でポリペプチドと反応性アルデヒドの間に共有結合が生じる。
【００１７】
同様に、表面に結合しているＣＡＲ物質、好ましくはＨＡまたはＡＡのＣＯＯ−基を、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）の添加により活性化させて、反応中間体エステル（ｏ−アシルイソ尿素）を形成することができる。この中間体は、非常に不安定であり、加水分解を受けやすく、活性化エステル中間体の切断、イソ尿素の形成、および−ＣＯＯ−基の再生が生じる。この不安定な反応中間体を安定させ、反応収率を増大させるため、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）またはそれと同等の反応中間体安定剤を反応に添加する。ペプチドまたはポリペプチドの遊離アミノ基（Ｎ末端、ＬｙｓまたはＡｒｇの側鎖など）はそのとき、この反応中間体エステルまたは安定化された反応中間体エステルと反応し、安定なアミド結合を形成することができる。この結果、ＨＡまたはＡＡの糖環上でペプチドまたはポリペプチドと反応性エステルの間に共有結合が生じる。
【００１８】
本発明は、少なくとも第１リガンド結合ポリペプチドを共有結合させた細胞接着抵抗性（ＣＡＲ）固相表面を生成する方法であって、
（ａ）ポリマー表面を、ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体で被覆する、請求項１に記載のステップと、
（ｂ）ＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体を酸化してアミン反応残基を生じさせるステップと、
（ｃ）酸化したＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体を第１リガンド結合ポリペプチドにさらして、ポリペプチドのアミノ基とアミン反応残基の間に共有結合を形成させ、その結果としてポリペプチドのＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体との共有結合が生じるステップとを含み、
これによって、第１リガンド結合ポリペプチドと共有結合したＣＡＲ表面が生成される方法を提供する。
【００１９】
好ましい表面は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸およびセルロースからなる群から選択される。
【００２０】
上記の方法で、
（ｉ）酸化のステップ（ｂ）は、反応アルデヒド基をＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体上に生じさせる酸化剤、好ましくは過ヨウ素酸塩を供給することによって実施することができ、
（ｉｉ）ステップ（ｃ）はさらに、ポリペプチドに対する還元剤、および還元アミノ化を実施する表面を供給し、その結果として、ポリペプチドのアミノ基と反応性アルデヒド基の間に共有結合が形成されるステップを含む。
【００２１】
また、ステップ（ｂ）が、ステップ（ｃ）の前、またはそれと同時に、カルボジイミドおよび反応中間体のエステル安定化化合物にさらすことによりＨＡ、ＡＡ、またはそれらの誘導体のカルボン酸残基を反応性エステルに転換するステップをも含む、上記の方法が提供される。
【００２２】
上記の方法における反応中間体のエステル安定化化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ヒドロキシスルホスクシンイミドおよびヒドロキシベンゾトリアゾロハイドレートからなる群から選択される。
【００２３】
上記の方法は、ステップ（ｃ）の後、
（ｄ）第１ポリペプチドに第２リガンド結合ポリペプチドの非共有結合が生じる条件下で、第１リガンド結合ポリペプチドに対するリガンドである第２ポリペプチドに、共有結合された第１リガンド結合ポリペプチドを接触させるステップを含むことができる。
【００２４】
好ましい第１リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体、（ｂ）受容体、（ｃ）イムノグロブリン結合タンパク、（ｄ）アビジンまたはストレプトアビジン、（ｅ）レクチン、（ｆ）細胞接着分子または（ｆ）細胞外マトリックスタンパクあるいは（ｇ）合成ペプチドである。イムノグロブリン結合タンパクは、天然または組換えブドウ球菌プロテインＡ、天然または組換えブドウ球菌プロテインＧならびに組換えプロテインＡ／Ｇからなる群から選択することができる。第２リガンド結合ポリペプチドは、（ａ）抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）受容体、（ｃ）レクチン、（ｄ）細胞接着分子、（ｅ）細胞外マトリックスタンパクまたは（ｆ）合成ペプチドであってもよい。
【００２５】
一つの実施形態では、（ａ）第１リガンド結合ポリペプチドは、プロテインＡ、プロテインＧまたは組換えプロテインＡ／Ｇであり、（ｂ）第２リガンド結合ポリペプチドは、抗体またはその抗原結合性断片である。他の好ましい実施形態では、（ａ）第１リガンド結合ポリペプチドは、アビジンまたはストレプトアビジンであり、（ｂ）第２リガンド結合ポリペプチドは、ビオチン化抗体である。
【００２６】
前記の方法を使用して、捕捉因子（capture agent）として働く所望のＬＢＰを固定化すると有利である。好ましいＬＢＰは、例えば、単離、濃縮または除去すべき細胞と結合する所望の特異性を有する抗体である。一つの目的（articleive）は、この固定化された抗体を使用して、その表面上に、その抗体が特異性を有するエピトープまたは抗原を発現する細胞を正に選択することである。これに対して、この表面を同様に負の選択に使用することができる。ＣＤ３４マーカーが、単離されたとき有益な用途を多く有する初期の造血幹細胞および造血前駆細胞上に発現しているので、本発明に従って固定化し、使用するのに好ましい抗体は、抗ＣＤ３４である。
【００２７】
抗ＣＤ３４抗体を例示的抗体またはＬＢＰとして用いて、以下の実施形態を提供する。ＳｐＡまたはＳｐＧを、ＨＡまたはＡＡで処理したポリマー表面に固定化し、次いでこれを使用して、抗ＣＤ３４ｍＡｂを（非共有結合で）固定化する。他の実施形態では、アビジンまたはストレプトアビジンを、ＨＡまたはＡＡ表面に結合させ、これを使用してビオチン化抗ＣＤ３４抗体を（非共有結合で）固定化する。他の実施形態では、本明細書に記載のように、抗ＣＤ３４抗体をＨＡまたはＡＡで処理したポリマー表面に直接（共有）結合する。この結果、所望の抗体で被覆されているが、それと同時に、ＣＤ３４を発現していない細胞の非特異的な結合に抵抗する捕捉表面が得られる。
【００２８】
結合した抗体の領域が、抗体を欠くが細胞接着抵抗物質を提示している領域で分離されている、捕捉因子、好ましくは抗体の特異的なパターンを有する捕捉表面を作成することができる。このようなパターン化によって、特殊化した抗体捕捉アレイを開発することが可能になる。
【００２９】
固体表面に結合したＣＡＲ物質を含み、第１ＬＢＰまたは第２ＬＢＰと結合している第１ＬＢＰがＣＡＲ物質と接触している、好ましくは結合している、上記のいずれかの方法によって作成された物品も提供される。
【００３０】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態をさらに詳細に記載し、特定の実施例について以下に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の好ましい実施形態を説明する際、明瞭にするために特定の専門用語を使用する。しかし、本発明は、そのように選択された特定の専門用語に限定されないものとする。特定の各要素が、同様の目的を達成するために同様に働く、技術的に等価なものをすべて含むことが理解されるべきである。本明細書で引用した各文献は、それぞれが参照により個々に組み込まれるように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３２】
（略語）
ＣＡＲ：細胞接着抵抗性（resisting、またはresistantまたはresistive）
ＥＳＣＡ：化学分析電子分光法（Ｘ線光電子分光法）
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
ＭＥＳ：２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
スルホＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド
ＰＥＩ：ポリエチレンイミン
ＰＬＬ：ポリＬ−リシン
ＰＰ：ポリプロピレン
ＰＳ：ポリスチレン
ＰＥ：ポリエチレン
ＰＥＴ：ポリエチレンテレフタレート
ＰＴＦＥ：ポリテトラフルオロエチレン
ＬＢＰ：リガンド結合ポリペプチド
溶液は、他に指示がない場合、すべて脱イオン化Ｈ２Ｏ中のｗ／ｖである。
【００３３】
本明細書において、「ポリマー」または「ポリマー基質」という用語は、プラズマ処理しようとする、本発明に従ってＨＡ表面がその上で被覆される物品または表面の組成物を指すものとする。
【００３４】
従来技術中でＨＡ結合を促進するのに使用されていたＰＥＩ、ＰＬＬおよび他の被覆物は、ポリマー性の性格をもつものでよいが、一般に、結合剤 もしくはカップリング剤もしくは結合層、中間結合層および／または他の特定の機能を表す用語と呼ばれることになる。
【００３５】
（ＨＡ上のカルボキシル基と表面上のアミン残基の間の結合反応）
ＨＡは、β―１，４−グルクロン酸−β―１，３−Ｎ−アセチルグルコサミンの反復単位からなる陰イオン性の多糖である。ＨＡの各反復単位上に、反応性の−ＣＯ２基が存在し、これを使用して、本発明の方法を用いてＨＡを、アミンを含む表面に共有結合させることができる。エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）は−ＣＯＯＨと反応して、活性型エステル（ｏアシリソ尿素）中間体が生じる。この中間体は、非常に不安定であり、加水分解を受けやすく、活性化したエステル中間体の切断、イソ尿素の形成、および−ＣＯＯＨ基の再生が生じさせる。この不安定な反応中間体を安定させ、反応収率を増大させるため、スルホＮＨＳまたはそれと同等の他の反応中間体安定剤を反応に添加する。
【００３６】
本発明の方法により共有結合で固定化されているＨＡは、細胞接着、例えば、ネズミ頭蓋冠由来骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３細胞）の接着を防止することが実証されている。さらに、本発明の方法によって調製された表面は、長時間培養した後の剥離に耐性であった。
【００３７】
プラズマ処理表面に直接固定化されたＨＡは、中間ポリマー層（例えば、ポリエチレンイミン、ポリＤ−リシン、またはポリＬ−リシン）または他の「スペーサー」部分を必要としないという利点を有する。ＨＡ層は、その細胞接着を防止する性質を失わずに、ＰＳ表面上に直接固定化することができる。したがって本発明は、中間ポリマー層、例えば、ＰＥＩまたはポリリシン、あるいはスペーサー基を使用する工程を追加する必要がない。
【００３８】
本発明は、例えば、細胞接着および細胞増殖を防止するために細胞培養用製品を被覆するのに使用することができ、生物学的に関連のあるリガンド（例えば、ペプチド、ＥＣＭ、タンパク）でさらに修飾するための表面、細菌細胞の接着を防止する汚損しない表面、近接シンチレーションアッセイおよび蛍光偏光アッセイ用の表面を作成するのに使用することができる。以下にさらに詳細に記載するように、同じ組織培養器具上に特定のリガンド結合ポリペプチド、好ましくは抗体または抗体結合ポリペプチドを固定化することができる。
【００３９】
プラズマ技術の使用は、当業者にとっては良く知られた事項である（例えば、非特許文献１０および非特許文献１１を参照）。本発明では、プラズマ処理の方法は、直接と遠隔のプラズマ処理方法を含め、物品の表面上に取り込まれるべき窒素を生じさせ、その結果として、反応性アミンまたは他の窒素含有基を生じさせることが可能であるどんな方法でもよい。適切なプラズマ処理の例は、ガス相中で、窒素、窒素酸化物、二酸化窒素またはアンモニアなどの反応性ガスを、単独で、または、空気、アルゴンまたは他の不活性ガスと混合して使用するものであり、これはアルゴンまたは他の不活性ガスを使用する処理の前に行っても後に行ってもよい。プラズマは、処理時間中ずっと持続させてもよく、パルス式に与えてもよい。好ましくは、プラズマガスはアンモニアであり、投入電力１〜４００Ｗ、好ましくは１０〜１５０Ｗ、圧力１０ミリトル〜１０トル、処理時間１秒〜１時間、好ましくは１０秒〜３０分で処理を実施する。
【００４０】
例えば、基底圧０．３ミリトルに処理チャンバーを排気し、２００ミリトルのアルゴン雰囲気にし、アルゴンプラズマ処理を６０秒行い、それに続いて３７５ミリトルのＮＨ３のプラズマ処理を９５Ｗで１２０秒行うことによってプラズマ処理ポリスチレンを調製することができる。他の適切な処理は、当業者には周知であろう。実施例を以下に説明する。
【００４１】
プラズマ処理の目的は、共有結合したアミン残基の表面濃度を高くすることである。次いで表面を、水溶液中のＥＤＣ、または有機溶媒中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）など縮合剤の存在下で、ヒアルロン酸またはその誘導体、あるいはアルギン酸（アルギン酸塩）と反応させることができる。最適な結果を得るため、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ヒドロキシスルホスクシンイミドまたはヒドロキシベンゾトリアゾロハイドレイトなどＥＤＣによって促進される反応を増強することができる分子も存在すべきである。本発明の成否は特定の理論に依存するものではないが、ＨＡのアミン含有表面との接着は、（例えば、）ＥＤＣとＮＨＳが組合されて、アミンと結合可能なカルボキシル基を有する活性型エステル多糖を生じさせる機構によって行われると考えられる。結合が起こると、ＮＨＳは放出される。ＥＤＣとこのように反応することができ、反応中間体のエステル安定化化合物として働く、当業者に知られた他の化合物も、本発明に有効であるはずである。
【００４２】
アミンおよび他の窒素含有基を有する表面を生成するための他のプラズマ処理方法も適しており、当業者に知られている。被覆すべき表面にプラズマ処理を行った後、プラズマ処理表面を、カルボジイミド、好ましくはＥＤＣの存在下で、ＨＡまたはその誘導体、あるいはＡＡを含む水溶液にさらす。本明細書において、「さらす（exposeまたはexposing）」という用語は、液体と固体の間でなされる、例えば、それだけに限らないが、ピペッティング、注入、噴霧、滴下、液浸、注入、浸漬、注射などどんなタイプの接触をも含むものとする。
【００４３】
カルボジイミドによって形成された反応中間体を安定化させることによって結合収率をかなり増大させる反応中間体エステル安定化化合物も存在する。このような化合物は一般に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドならびにそのアリールまたはヘテロ環誘導体のクラスから選択される。好ましいＮ−ヒドロキシスクシンイミドには、それだけに限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾロハイドレイトが含まれる。
【００４４】
本発明において使用することができるＨＡの適切な誘導体は、当業者に知られている（例えば、特許文献６に記載されている）。これらには、脂肪族、アリール脂肪族（araliphatic）、脂環式およびヘテロ環系列のアルコールを含む、ヒアルロン酸の部分エステル、ならびに無機または有機塩基を含むそのような部分エステルの塩が含まれる。アルギン酸の類似の誘導体も有用であるはずである。
【００４５】
本発明の方法に従って調製された表面は、以下の本明細書の実施例で示すように、細胞の接着に抵抗するのに極めて有効であり、ＰＥＩ、ＰＬＬ、ＰＤＬなど窒素含有基を含む化合物の中間層を必要とするものよりはるかに経済的にかつ効率よく調製することができる。
【００４６】
(リガンド結合ポリペプチド（「ＬＢＰ」）)
本明細書において、ＬＢＰとは、本明細書では「標的」とも称される結合相手またはリガンドと親和性を有し、適切な条件下ではそれと結合する任意のポリペプチドである。好ましいＬＢＰは、標的が、タンパク、炭水化物、脂質であれ、あるいは糖タンパクまたは糖ペプチド、糖脂質、タンパク脂質などこれらの基本的な生化学的構成ブロックの組合せを含むいずれかの構造物であれ、細胞表面上にあるその標的と結合するものである。
【００４７】
有用なＬＢＰは、その天然の構造形態から直接単離することにより（または遺伝子操作により）得ることが可能な、天然に存在するポリペプチドとすることができる。例としては、インスリン受容体、グルカゴン受容体、タンパク性内分泌ホルモンの受容体、神経ペプチドの受容体、サイトカインの受容体などホルモンのポリペプチド受容体、Ｉｇ分子（例えば、細菌Ｉｇ結合分子、Ｆｃ受容体、抗Ｉｇ抗体）、補体の成分、炎症性ペプチド、植物レクチン（ダイズアグルチニン、コムギ胚芽アグルチニン、フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡなど、以下で詳細に説明する）がある。他のＬＢＰは、同じ（ホモタイプ）または異なる（ヘテロタイプ）細胞接着分子と結合する細胞接着分子である。
【００４８】
本発明の組成物および方法に有用なＬＢＰに要求されるのは、それが固定化された形になったとき、そのリガンドと特異的にかつ十分な親和性で結合して、本明細書で開示するような目的で細胞（または他の分子）の結合を可能にすることだけである。
【００４９】
本発明の最も好ましいＬＢＰは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。
【００５０】
その全体が参照により本明細書に組み込まれている、本発明の抗体および関連する免疫学的諸側面に関する標準的な文献には、（非特許文献１２）、（非特許文献１３）、（非特許文献１４）、（非特許文献１５）が含まれる。固定化された抗体の分析については、例えば、（非特許文献１６）を参照されたい。
【００５１】
本発明は、ＬＢＰとして、ポリクローナルとモノクローナルの両方の抗体を使用する。抗体は、（結合させる細胞の種に対して）異種、同種異系、同系であってもよく、ヒト化またはキメラ抗体（下記を参照のこと）などそれらの改変された形であってもよい。また「抗体」という用語は、完全な分子と、完全な抗体のＦｃ断片を欠くＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などその抗原結合性断片の両方を含むことを意味する。Ｆｖ断片（非特許文献１７、非特許文献１８）も含まれる。この種々の断片は、プロテアーゼ切断、化学切断など（例えば、非特許文献１９を参照のこと）のような従来技術を用いて生成する。
【００５２】
ポリクローナル抗体は、ウサギ、ヤギ、げっ歯類など免疫感作させた動物由来の血清として得られ、これをさらに処理せずに直接使用することもでき、これに硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど（非特許文献２０）のような従来の濃縮法または精製法を施すこともできる。ｍＡｂは、（非特許文献２１）によって導入された手順、およびそれを改変したもの（上記の一般的な免疫学の文献を参照のこと）などのような従来のハイブリドーマ技術を用いて生成することができる。市販されているｍＡｂが好ましい。
【００５３】
抗体は、正常な多量体構造の代わりに、単鎖抗体またはｓｃＦＶとして生成することができる。単鎖抗体は、関心のあるＩｇの超可変領域を含み、完全なＩｇのサイズの１分画でありながら天然Ｉｇの抗原結合部位を再現する（非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１）。
【００５４】
ハイブリッドまたはキメラ抗体は、遺伝子工学によって（例えば、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４を参照）または抗体を合成した後のタンパク操作によって調製することができる。そのようなハイブリッドＡｂ１−Ａｂ２抗体を構築する、生化学的方法およびハイブリドーマベースの遺伝子組換えによる方法は、例えば、（特許文献１５）およびその明細書で引用されている文献に開示されている。したがって本発明のハイブリッドまたはキメラ抗体は、１つはｍＡｂ１に特異性があり、他の１つはｍＡｂ２に特異性がある、２つの「半分の分子」を含む。このようなハイブリッド抗体は、二官能性結合剤によって形成される、従来技術で教示されている尾部同士の結合に関して複数の利点を有する。こうした利点には、調製しやすいこと、両方の抗体の化学量論的および立体化学的性質が保存されること、および各断片の結合親和性が保持されることがある。
【００５５】
（ＬＢＰ断片および合成ＬＢＰ）
ＬＢＰも、完全長ポリペプチドのリガンド結合性の断片、ドメインまたは部分を含むものとする。例えば、完全または天然ＬＢＰが細胞表面受容体タンパクである場合、最も有用なＬＢＰ断片は、受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であるかもしれない。抗体の場合、ＬＢＰ断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ断片など、どの抗原結合性断片でもよい。単鎖抗体（ｓｃＦｖ；非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６、非特許文献２７、および特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１）、キメラ抗体（特許文献１２および特許文献１３）、ＣＤＲを移植した抗体など、天然ＬＢＰを改変し、遺伝子工学で作り出した形のものは、本発明の範囲に含まれる。
【００５６】
（二重（サンドイッチ）ＬＢＰ）
本発明の一つの実施形態では、ＣＡＲ物質、好ましくはＨＡとの共有結合によって、標的構造物に結合させる予定のＬＢＰを固相に直接固定化する。直接固定化するＬＢＰの好ましい例は抗体である。しかし、他の実施形態では、第１ＬＢＰを固相に、ＨＡにまたは他のＣＡＲ被覆層に直接共有結合させること、第１ＬＢＰのリガンドでもあり、予定した標的の結合相手でもある第２ＬＢＰを、第１ＬＢＰと非共有結合で結合させることによって、標的（通常は細胞）捕捉の高い効率が達成される。一つの実施形態では、第１ＬＢＰは、最終標的を認識しそれと結合する抗体の能力を妨げずにその抗体を「捕捉」することができる抗体結合性ポリペプチドである。有用な抗体結合性ポリペプチドの例は、通常Ｉｇの抗原結合部位より遠位側のＦｃ部分で特定のＩｇ分子と結合する能力が生来的に有しているブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）およびプロテインＧ（ＳｐＧ）（以下を参照）など特定の細菌タンパクである。ポリペプチドを遺伝子工学によって作成して抗体結合性ポリペプチドとして機能させることができる。好ましい例は、ストレプトアビジンまたはアビジンであり、これは非常に高い親和性でビオチンと自然に結合する。したがって、ストレプトアビジンを、そのＨＡ（第１ＬＢＰ）との反応を介して固体表面に直接共有結合させた場合、非共有結合であるが非常に高い親和性で、それをビオチンが結合した抗体（第２ＬＢＰ）と結合させることができる。次いでこの抗体を用いて、標的と結合させ、例えば、細胞を捕捉することができる。
【００５７】
最終的なＬＢＰとして働く抗体またはその断片は、第１ＬＢＰであっても、第２ＬＢＰであっても、細胞表面上に発現されている、関心のあるどんなエピトープに特異的であるものでもよく、そのエピトープを発現している細胞を捕捉する手段としてこれを使用することができる。このような細胞表面エピトープは、その多くが特定の分化系統の抗原を提示している細胞の「マーカー」として知られ、当技術分野で周知であり、これを本明細書に記載することは不要である。同様に、このように知られている細胞表面マーカーに特異的なｍＡｂも当技術分野では周知である。その多くは市販されている。一例として、本発明の固定化された抗体および器具によって捕捉する予定の細胞が造血幹細胞である場合、幹細胞マーカーを選択するべきである。ＣＤ３４は初期の造血幹細胞上に存在する周知の抗原であり、また抗ＣＤ３４ｍＡｂも周知であり市販されている。図３〜７に示すように、本発明の方法を使用して抗ＣＤ３４ｍＡｂをＣＡＲ上に固定化する。このような組成物を使用して、抗ＣＤ３４ｍＡｂが結合している固相の層を含むＨＡがその一例であるＣＡＲ物質の不在下では起こるはずである、細胞の表面への望ましくない非特異的接着を起こさずに、ヒトＣＤ３４＋幹細胞を効率よく捕捉し単離／濃縮する。
【００５８】
（ＬＢＰとしてのイムノグロブリン結合性ポリペプチド）
上記に示したように、好ましい実施形態では、本発明は、Ｉｇ結合性タンパクがＣＡＲ固体表面に共有結合によって固定化され、その表面に抗体がさらに（非共有結合で）固定化される組成物、器具および方法を対象とする。次いでこの後者の抗体が標的構造物と結合して、本発明の最終目的を達成することができる。
【００５９】
Ｉｇ結合性タンパクの好ましい例は、ＳｐＡ、ＳｐＧ、組換えキメラ融合タンパク「プロテインＡ／プロテインＧ」（ｐＡ／Ｇ）、およびマンノース結合レクチン（ＭＢＬ、以前はマンナン結合タンパクまたはＭＢＰとして知られる）、ジャッカリン（jacalin）（植物由来）など他の供給源由来のタンパクである。
【００６０】
ＳｐＡは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）によって産生される非常に安定な表面受容体であり、多数の種に由来するＩｇ分子のＦｃ部分、特にＩｇＧ群のＦｃと結合する能力がある（非特許文献２８、非特許文献２９）。以下の表１を参照されたい。ＳｐＡは、分子量約４２ｋＤａ（沈降によるデータに基づく、非特許文献３０）であるが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上では異常にゆっくりと泳動する（見かけの分子量５５〜５６ｋｄ、同文献）。ＳｐＡは、単量体であり、Ｃｙｓ残基を欠いている。これは、ｐＩ４．８５〜５．１０であり、ｐＨ１．０〜１２．０で安定である。１分子のＳｐＡは少なくとも２分子のＩｇＧと同時に結合することができる（非特許文献３１）。ＳｐＡを固体支持体上に固定化して、ポリクローナルまたはモノクローナルのイムノグロブリンの精製および回収を促進させる。固定化されたＳｐＡを、様々な疾患の治療における体外免疫吸着（非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６、非特許文献３７）に使用し、in vivoでも使用して、抗体によって媒介される化学療法誘発の溶血性尿毒症症候群（非特許文献３８）の処置を行う。
【００６１】
組換えＳｐＧ（非特許文献３９、非特許文献４０）は、ランスフィールドＧ群の連鎖球菌属（Streptococcus sp.）に由来する非常に安定な表面受容体であり、大腸菌（Escherichia coli）内で産生され、多数の種に由来するＩｇ群のＦｃ部分、特にＩｇＧ群のＦｃと結合する能力がある（非特許文献２８）。表１を参照されたい。ＳｐＧは分子量２２．６ｋＤａであるが、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによるそのみかけのＭＷは３２ｋＤａである。ＳｐＧは、Ｃｙｓ残基を欠いている単量体である。そのｐＩは４．５であり、ｐＨ２〜１０で、また８０℃（ｐＨ７で１０分間）でも安定である。各プロテインＧ分子はＩｇＧ２分子と結合することができ、これによって沈降物の形成が可能になる。ＳｐＧを固体支持体上に固定化して、ポリクローナルまたはモノクローナルのイムノグロブリンの精製および回収を促進させる。
【００６２】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＳｐＡ、および連鎖球菌属（Streptococcus sp.）（ランスフィールドＧ群）由来のＳｐＧ、の両方は、多数の種に由来する多種多様なイムノグロブリン（Ｉｇ）の定常領域（Ｆｃ）に親和性を示す。これらのＦｃ結合性タンパクの特異性は異なるが、Ｉｇのクラス、サブクラスおよび種の範囲にはいくらかの重複が存在する（非特許文献２８、非特許文献２９）。種およびサブクラスに関して広い範囲のＦｃ結合活性を有する単一のタンパクを生成するために、ＳｐＡとＳｐＧの両方のＦｃ結合性ドメインをコードする遺伝子を融合させた。この構築物中では、血清アルブミン結合部位および膜アンカー領域をコードするＳｐＧ遺伝子配列を取り除いた。
【００６３】
比較的新しいＩｇ  Ｆｃ結合性タンパクであるｐＡ／Ｇは、分子量５０ｋＤａであり、ｐＩ６．９と統計的に決定された融合タンパクとして合成される。ｐＡ／Ｇは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）プロテインＡ遺伝子のＩｇ結合性ドメイン（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣを含む）、連鎖球菌（Streptococcus）プロテインＧ遺伝子のＩｇ結合性ドメイン（Ｃ２およびＣ３）からなるハイブリッド遺伝子に由来する組換えタンパクである。これは、大腸菌（Escherichia coli）内で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。この融合遺伝子産物は、４５５アミノ酸残基（リジン４１個、システインは含まない）、７個のＦｃ結合性ドメイン（５個はプロテインＡ由来、２個はプロテインＧ由来）を含む。ｐＡ／Ｇ融合タンパクは、ＳｐＡおよびＳｐＧと同様のＩｇ感受性を示し（表を参照）、ヒトＩｇに関しては、親タンパクの最良のものと比較しても同等またはそれ以上の結合力を示す（非特許文献４１、非特許文献４２）。また、これはＳｐＡまたはＳｐＧ単独よりも広い特異性を示す。（非特許文献４３）は、ｐＡ／Ｇ融合タンパクが霊長目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目、ウサギ目およびげっ歯目を含めた、ほとんどの哺乳動物種由来のＩｇと結合したが、長鼻目、有袋目または鳥類（avia）とは結合しなかったことを報告した。天然ＳｐＧと異なり、ｐＡ／Ｇは、ヒトまたはマウス血清由来のアルブミンと結合しない。これらの理由のため、ｐＡ／Ｇは、特定の免疫学的技術に関して、プロテインＡまたはプロテインＧ単独より多用途で便利な試薬とみなされている。ｐＡ／Ｇは、すべてのヒトＩｇＧサブクラス、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ、ならびにマウスＩｇＧサブクラス１、２ａ、２ｂ、および３のＦｃ部分と結合する。さらに、これは、サル、ウサギ、ブタ、モルモット、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマおよびヒツジを含めた、他の種由来のＩｇＧ群と結合する。これは、ラットＩｇ、ニワトリＩｇ、マウスＩｇＡまたはマウスＩｇＭとうまく結合しない。ｐＡ／Ｇは、ウシ、マウスまたはヒト血清アルブミンと結合しない。ｐＡ／Ｇは、ＳｐＡまたはＳｐＧが有用であると知られている場所ではどこでも使用することができる。
【００６４】
２種のＩｇ結合性レクチンが本明細書に記載されている（下記の本節から離れた箇所に特にレクチンに集中して記載している）。ジャッカリンとは、ジャックフルーツ（Artocarpus integrifolia）の種子に存在するレクチンである。ジャッカリンは、分子量約５０ｋＤａであり、１０ｋＤａのサブユニット２個と１６ｋＤａのサブユニット２個のサブユニット４個からなる。ジャッカリンは、ガラクトース（Ｇａｌ）と結合し、糖タンパク中でＯ−グリコシド結合で結合しているオリゴ糖と、好ましくはＧａｌ（β１，３）ＧａｌＮＡｃの構造物とのみ結合するようであり、この構造にはそれがモノまたはジシアル酸付加形で結合している。ジャッカリンは、特にヒト分泌型ＩｇＡと結合し、これを使用して、他のＩｇクラスを含めた他の血清糖タンパクからヒトＩｇＡを分離することができ、またＩｇＡ１との結合がより強いため、アガロース結合型ジャッカリンを使用してＩｇＡ１とＩｇＡ２を区別することができる（非特許文献４４、非特許文献４５）。
【００６５】
マンナン結合レクチンＭＢＬは、構造的に補体Ｃ１と関係する（分子量３２ｋＤａの）血漿タンパクであり、肝臓によって分泌され、細菌、酵母、寄生性原虫、およびウイルスを含めた様々な微生物の表面上の特定のマンノース含有炭水化物と結合し、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）を介して補体経路を活性化し、貪食を促進する。ＭＢＬは６組のホモ三量体からなるオリゴマー複合体である。ＭＢＬは、マンノースおよびＧｌｃＮＡｃとカルシウム依存的に結合する、カルシウム依存性Ｃタイプレクチンである。ＩｇＭ上にマンノースが存在するので、このタンパクはＩｇＭクラスの抗体と結合する。
【００６６】
（ＬＢＰとしてのレクチン）
レクチンは、通常、植物または海洋動物に由来するタンパクまたは糖タンパク（細菌、ウイルス、および哺乳動物由来のレクチンも周知である）であり、特定の糖または糖類、通常、単糖または二糖構造物と結合特異性がある。例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）はα−Ｄ−Ｇｌｃおよびα−Ｄ−Ｍａｎと結合する。レクチン結合は、抗体の抗原との結合と同様に、（通常、糖類リガンドの十分な濃度では）非共有結合的であり、可逆的である。したがって、例えば、グルコースまたはマンノース（またはαメチルマンノシド）溶液は、細胞または固定化された糖タンパクに結合していたＣｏｎＡを放出させる。植物レクチンの詳しい説明については、例えば、（非特許文献４６）、また市販のレクチンに関するウェブサイト（非特許文献４７および非特許文献４８）を参照されたい。他の有用な総説には、（非特許文献４９）、（非特許文献５０）、（非特許文献５１）がある。
【００６７】
レクチンを表面上のＣＡＲ物質に直接固定化することもでき、抗体の場合と同様にサンドイッチ方式で使用することもできる。この場合、第１ＬＢＰは（抗レクチン抗体、またはレクチンがビオチン化されているときのストレプトアビジンなど）レクチンに結合特異性および親和性を有し、このレクチンは「第２ＬＢＰ」として働き、第１ＬＢＰと非共有結合で結合する。レクチンは、その特異的な標的と結合する、好ましくは細胞表面上に特定の糖構造物を提示している細胞と結合する捕捉因子として働く。通常、そのような標的糖構造物は、糖タンパクまたは糖脂質上の炭水化物鎖の形態である。
【００６８】
下記の表２に、多数の有用なレクチンおよびその糖結合特異性を列挙する。
【００６９】
共有結合したレクチン−抗体、またはレクチン−抗原の複合体もＬＢＰとして本発明に含まれる（例えば、特許文献１６参照）。
【００７０】
細胞膜の脂質二重層に親和性がある基本分子、例えば、プロタミンおよびハチ毒ペプチドの膜結合部分であるメリチンは、本発明のさらに他のクラスのＬＢＰである。これらの標的構造物は形式的には「リガンド」とみなすことができないが、このＩＢＰが固体表面に固定化されているときそれに結合する細胞を親和性によって捕捉するという概念は同じである。
【００７１】
（ビオチン化第２ＬＢＰ）
本発明の一つの実施形態では、固相結合ＣＡＲ物質、好ましくはＨＡに、第１ＬＢＰとしてストレプトアビジンを共有結合で固定化する。次いで、このストレプトアビジンは、細胞上の構造物を標的として結合する第２ＬＢＰとして働くどんなビオチン化ポリペプチドとも高い親和性で結合する。ビオチン化ポリペプチドの例は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、トロンボスポンジン１、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、アグリカン、アグリン、骨シアロタンパク、軟骨マトリックスタンパク、フィブリノーゲン、フィブリン（fibrin）、フィブリン（fibulin）、ムチン、エンタクチン、オステオポンチン、プラスミノーゲン、リストリクチン（restrictin）、セルグリシン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、バーシカン、フォンウィルブランド因子、およびカドヘリン、コネキシン、セレクチンなどの細胞接着分子（ＣＡＭ）のようなＥＣＭポリペプチドである。
【００７２】
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド配列は、多数のＥＣＭタンパクの細胞接着ドメインであるので、一つの実施形態では、これを含む合成ペプチドをＥＣＭ模倣物として使用する。ＲＧＤペプチドは、多数のポリマー表面（ＰＴＦＥ、ポリアクリルアミド、ポリウレタン、および、ポリ（ＤＬ乳酸−ｃｏ−リシン）（ＰＬＡ）と、ポリ（ＤＬ乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）とのコポリマー、ポリ（エチレングリコール）アクリル酸コポリマー（ＰＥＧＡＡ））の修飾に使用されてきた（参照によりその全体が本明細書に組み込まれた（非特許文献５２）で論じられている）。Glassらは、ＲＧＤを含有するぺプチドを架橋されたＨＡと共有結合する方法、および過ヨウ素酸酸化を用いてＲＧＤペプチドを結合させた、架橋されたＨＡから作成した多孔性の３Ｄマトリックスを特に記載している。本発明では、当技術分野で知られているようなＲＧＤペプチドを、その生物活性を維持しながらビオチン化する。このビオチン化ペプチド（ＲＧＤ）は、固定化されたストレプトアビジンとの結合が可能であり、ＣＡＲ表面から突き出した、固定化されたＥＣＭ様の物質となる。
【００７３】
【表１】
2006501356.tif 000003
【００７４】
（文中に示した）プロテインG、プロテインA、プロテインA/G、マンナン結合タンパクおよびジャッカリンの種々のイムノグロブリンに関する相対親和性
w：弱い結合
S：強い結合
w/s：中程度
nb：非結合
-：情報なし
【００７５】
【表２−１】
2006501356.tif 000004
【００７６】
【表２−２】
2006501356.tif 000005
【００７７】
これらＲＧＤペプチドおよび他のどんな合成ペプチドも、合成後または合成の間に、合成プロセス中にビオチン化アミノ酸を使用することでビオチン化する。
【００７８】
第２ＬＢＰとして有用な他のビオチン化ポリペプチドは、細胞外受容体と結合する任意の既知の成長因子（例えば、表皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、神経成長因子、トランスフォーミング成長因子β、ならびにリンパ球および他の免疫系細胞を刺激する任意の造血成長因子またはインターロイキン）である。
【００７９】
また所望の標的と結合する非ポリペプチド分子も第２ＬＢＰの代わりに使用することができる。本明細書ではこれを「リガンド結合性分子」（ＬＢＭ）と称する。有用な第２ＬＢＭの例は、同様にビオチン化することができるグリコサミノグリカン、オリゴヌクレオチドを含めた核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
【００８０】
アビジンとビオチンを使用するのではなく、第１ＬＢＰとして上記分子のいずれかに特異的な抗体を共有結合で固定化し、これを使用して、本発明に記載のように、使用する固体表面に、この第２ＬＢＰ（および非ペプチドＬＢＭ）を結合させることができる。
【００８１】
ＣＡＲ物質に直接結合させることで、上記のペプチド、ポリペプチド、および非ペプチド分子もすべて第１ＬＢＰ（またはＬＢＭ）として働くことは言うまでもない。ポリペプチドおよび他の高分子をビオチン化する方法は当技術分野で周知である（非特許文献５３）。例えば、スルホＮＨＳビオチンを使用することができる。あるいは、５−（ビオチンアミド）ペンチルアミンまたはビオチンヒドラジドを試薬として選択してもよい。本明細書に示す目的でどのビオチン化剤を選択しそれをどのように使用するかは、当業者にとっては分かるであろう。
【００８２】
ポリマーまたはプラスチックに結合した特定のポリペプチドを測定する任意の既知の方法により、固体表面に結合している、結合された第１または第２（または第３）ＬＢＰの量を評価することができる。固定化されたポリペプチドの、検出可能なように標識されたどんな結合相手も付加することができ、表面と結合する結合相手の量は、標識に適した常法で、例えば蛍光、発色、化学発光で評価することができる。これは、Alexa Fluor 488（商標）を使用する抗体、蛍光標識したヤギ抗マウスＩｇを例にとって以下に説明する。  細胞を捕捉した後に、本明細書に記載の表面を使用してこれらの細胞を培養することができることにも留意されたい。したがって、表面の形状が適切である場合（例えば、皿またはフラスコ）、ＬＢＰに特異的に付着した細胞は、付着しない細胞を除去した後もそのままにすることができ、増殖させ、分化させ、それに因子（factor）を分泌させなどすることが可能である。この表面はＣＡＲ物質を含むように修飾されているので、接着性表面を必要としない細胞しかそのような容器中では増殖しないと予想される。そのような増殖後に細胞の機能的または「構造的」なアッセイを行うことは、当初の分離または濃縮の品質を評価する１つの方法となり得る。時間が経って細胞が固定化されたＬＢＰから剥離するとき、より生理的な細胞接着を支持する成長因子またはＥＣＭ分子の添加が、細胞増殖に必要となる可能性は高くなるであろう。
【００８３】
好ましい実施形態では、培養フラスコのＰＳ表面を（中間層を用いてまたは用いずに）ＨＡで被覆し、次いで第１または第２ＬＢＰである、抗ＣＤ３４ｍＡｂで被覆する。ＣＤ３４＋細胞を含む（または含むと思われる）未分画細胞集団をその表面に添加して接着させる。このような細胞集団は、骨髄、移動性の末梢血、胎盤または臍帯血に由来するものでもよい。接着しない細胞を洗浄して廃棄する。造血前駆細胞の増殖に最適な増殖培地でフラスコを所望の体積に満たす。好ましくは、接着しない細胞を除去した後、ＥＣＭ物質を加えられた培地に添加する。特異的に接着したＣＤ３４＋は刺激されて、増殖し、臨床的な使用のために多数に増殖される（例えば、幹細胞移植）ことができる。所望の場合、特異的な分化経路の誘導剤を選択した培養物に添加して、所望の経路（リンパ球系、顆粒球系、単球系）に沿って前駆細胞を分化させることができる。
【００８４】
他の実施形態では、本明細書に記載のＬＢＰで被覆された表面を使用して、細胞そのものではなく細胞溶解物または他の細胞成分調製物と結合させる。
【００８５】
ポリマー表面に予め選択したパターンで配置したドットのマイクロアレイパターンなど、どんなパターンまたは配置で分布している第１または第２ＬＢＰ（捕捉因子）を用いても、本発明のＣＡＲ表面を調製することができる。したがって、例えば１つまたは複数の様々な種類の抗体マイクロアレイを、本明細書に記載のようにＣＡＲ表面に固定化することができる。細胞そのものを捕捉すること、またはそれと結合することに加えて、本発明に記載のＬＢＰで被覆された表面を、例えば抗体マイクロアレイの形で使用して、細胞溶解物または他の細胞成分調製物中にある多数の対応する抗原またはエピトープのうちどんなものでも検出または定量することができる。したがって、本発明は、細胞表面受容体に対する抗体、リガンドなどのＬＢＰの高密度アレイを含む器具を作成する方法を提供する。このような器具は、細胞集団、例えば、選択した方法でin vitroで処理して分化または他の細胞活性を誘導した細胞の集団内における特定のタンパクの発現レベルを定量する方法で有用となり得る。この器具および方法は、薬剤などの試験剤で処理した（または処理しなかった）細胞の高い処理能力の分析に、容易に適応させることができる。例えば、様々な薬剤で処理した細胞群を溶解し、溶解物を得、または培養上清を得ることができ、抗体ライブラリーマイクロアレイまたは受容体リガンドペプチドライブラリーがその上に固定化されたＣＡＲ表面上に、これを載せることができる。
【００８６】
「レプリカプレーティング」または分割培養システムに、本発明を使用することができる。このシステムでは、細胞群を別々のウェル（穴）で増殖させ、または増殖用表面の別々の領域に接着させ、何らかの方法で処理し、機能的反応が起こるかどうかを観察しまたは試験する。各ウェル（穴）からの細胞または上清、あるいは特定の表面領域からの細胞のアリコートを、次いで本発明の対応するＣＡＲ表面に移す。この表面は、細胞そのものの上に発現している、細胞から分泌されている、または細胞内に存在し何らかの抽出または溶解手法によって放出させることができる特定の細胞産物が存在するかどうか、またはその量を試験するための抗体などのＬＢＰマイクロアレイを提示している。この分割またはレプリカ法により、例えば別個の集団の細胞の選択した１つまたは複数の機能的活性と、その発現タンパク産物の相関が得られる。
【００８７】
細胞全体を使用する他の実施形態では、本発明は、ペプチド、細胞外マトリックス分子、成長因子、サイトカイン、抗体、グリコサミノグリカン、レクチンなどを含むがそれだけに限らない固定化されたリガンドのライブラリーを用いて細胞表面受容体に応答させる方法を提供する。このようなシステムから読み取れる具体例は、細胞内レポーター遺伝子を使用しない機能アッセイである。
【００８８】
前記の方法および器具は、細胞または様々な体液を評価する免疫学的診断および他の診断の手法の一部として多くの用途を有する。
【００８９】
（所与のリガンド結合ポリペプチドの基本的固定化方法および選択肢）
本発明の一般的な一つの実施形態では、ＣＡＲ物質、好ましくは、本発明に記載のように置かれたＨＡに、ＬＢＰを固定化する。抗ＣＤ３４ｍＡｂを例として使用するとき（図３〜７も参照）、この方法は、本明細書に記載の還元アミノ化を用いて、過ヨウ素酸塩で活性化したＨＡ上に抗ＣＤ３４を直接共有結合で固定化するステップを含む。
【００９０】
第１および第２ＬＢＰが関与する他の実施形態では、プロテインＡまたはプロテインＧを、過ヨウ素酸塩で活性化したＨＡに固定化する。次いで抗ＣＤ３４ｍＡｂをプロテインＡまたはプロテインＧと非共有結合で結合させる。
【００９１】
第１および第２ＬＢＰが関与する他の実施形態では、アビジンまたはストレプトアビジンを過ヨウ素酸塩で活性化したＨＡに固定化する。ビオチンを抗ＣＤ３４ｍＡｂと結合させ、このビオチン化ｍＡｂをアビジン／ストレプトアビジンと結合させることができる。
【００９２】
（リガンド結合ポリペプチドのＣＡＲ被覆表面との共有結合）
ＨＡ、ＡＡまたは他のこのようなＣＡＲ物質で被覆した表面は、上記および実施例に記載されている。これらの多糖類が酸化すると、２つの隣接するヒドロキシル基の間にある糖環が開裂し、２つの反応性アルデヒド基が生じる。通常、アルデヒド部分（ＲＣＨＯ）は、第一級アミン部分（Ｒ’ＮＨ２）と反応するとき、比較的不安定なイミン部分（Ｒ’Ｎ  ＣＨＲ）である反応産物との間に平衡が成立する。上記に記載したのと同じ酸化条件下でこの結合反応を実施することができ、この条件は糖タンパクを損傷から保護するように設計されている。糖タンパクと生体物質表面の結合を安定化させるため、それに続いて、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、およびアミンボランなどの還元剤（すなわち安定化剤）を用いて、イミン部分の還元アルキル化を実施して、第二級アミン（Ｒ’ＮＨ−ＣＨ２Ｒ）を形成させる。またこの方法を、前記の酸化条件と同じ条件下で実施することもできる。しかし、通常、結合および安定化反応は、中性またはわずかに塩基性の溶液中で温度約０〜５０℃で実施する。結合および安定化反応では、ｐＨが約６〜１０であり、温度が約４〜３７℃であることが好ましい。これらの反応（結合および安定化）は数分間だけまたは何時間も進行させることができる。通常、この反応は、２４時間以内に終了する（すなわち、結合し、安定化している）。
【００９３】
他の方法では、酸化の代わりに、ＨＡ、ＡＡまたは他のこのようなＣＡＲ物質で被覆した表面を上記のセクション「ＨＡ上のカルボキシル基と表面上のアミン残基の間の結合反応」に記載のものと類似した方法で処理する。ここでは、ペプチドまたはポリペプチドを、ＨＡと、したがって表面と結合させるために、ＨＡ（または他のＣＡＲ物質）上のカルボキシル基をペプチドまたはポリペプチド（または他のアミン含有分子）上のアミン残基と反応させる。この概略を図４の右側に記載する。上記で論じたように、ＥＤＣの添加により、ＣＡＲ物質のＣＯＯ−基を活性化させて反応中間体ｏ−アシルイソ尿素エステルを形成させる。反応にＮＨＳ、スルホＮＨＳまたは他の反応中間体エステル安定化化合物を添加することにより、この不安定な中間体を安定化させるのが好ましい。ペプチドまたはポリペプチドの遊離アミノ基をこの中間体エステルと反応させて安定なアミド結合を形成させ、これによってペプチドまたはポリペプチドを表面に共有結合で固定化する。これらの反応は、１または２ステップで実施することができる。２ステップの反応は、第１に、安定化化合物を用いてまたは用いずにＨＡ、ＡＡまたは他のＣＡＲ物質をＥＤＣで処理するステップ、次いで第２ステップとして、ペプチドまたはポリペプチドを添加するステップを含む。単一のステップの反応では、構成要素をすべて組合せ（表面結合されたＨＡ、ＥＤＣ、任意の安定化化合物、およびポリペプチド）、結合を行わせる。
【００９４】
これまで本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することによって、それがさらに容易に理解されるであろう。これらの実施例は、実例として提供され、明記されない限り、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９５】
（無処理およびプラズマ処理ポリスチレンのＥＳＣＡ分析）
直径６０ｍｍのポリスチレンペトリ皿（Falcon, BD Biosciences）を以下のように準備した。  
１． 対照（無処理）
２． 空気プラズマ処理
プラズマチャンバーに定常速度８ｓｃｃｍで空気を流入させながら、圧力１４０ミリトルで、電力４０Ｗで、処理時間合計３０秒間プラズマ処理を行った。
【００９６】
処理の効率を評価するために、ＥＳＣＡ（化学分析のためのＸ線光電子分光法）を行った。モノクロメータによるＡｌＫα  Ｘ線源、半球型電子分析器、およびポリマー試料（絶縁体）を調べるときに帯電を補償するための低エネルギーエレクトロンフラッドガンを備えたＳＳＸ−１００分光装置（米国カリフォルニア州、Mountain View、Surface Science Incorporated）でＥＳＣＡを行った。通常、試料を約１０−４トルに維持された準備チャンバー内に導入し、次いで通常１０−８トルに維持されている分析チャンバー内に移した。この試料を通常、電子放出角度で分析した。この角度は試料表面と半球型分析器の位置の角度として定義される。３５°はおよそサンプリング深度５０〜１００Åに相当する。
【００９７】
この結果得られた表面組成物を表３に示す。
【００９８】
【表３】
2006501356.tif 000006
【００９９】
（＊）無処理ポリスチレンの酸素混入物の供給源は不明である。理論的に、PSのESCAスペクトルは100％炭素であるはずである。
【０１００】
無処理の皿への酸素混入についてははっきりしないが、これは微量のＳｉＯ２の混入によって生じた可能性がある。
【実施例２】
【０１０１】
（Primaria（商標）表面とＰＬＬ処理表面の比較）
この実施例では、リン酸カリウム緩衝液およびＥＤＣのみを用いて０．５％ＨＡで修飾する場合またはしない場合での、受け取られたPrimaria（商標）表面とＰＬＬ処理表面との比較を記載する。ＨＡ表面の安定性試験をエタノール中で行う。
【０１０２】
６０ｍｍのポリスチレンペトリ皿（Falcon, BD Biosciences）を以下の群に分割した。
【０１０３】
１．（２）無処理
２．（２）空気プラズマ処理
３．（２）空気プラズマ処理、ＰＬＬ修飾
４．（２）空気プラズマ処理、ＰＬＬ修飾およびＨＡ修飾（０．５％ＨＡ）
５．（２）空気プラズマ処理、ＰＬＬ修飾およびＨＡ修飾（０．５％ＨＡ）、エタノールで洗浄
３５ｍｍ  Primaria（商標）皿を以下の群に分割した。
【０１０４】
１．（２）Primaria（商標）
２．（２）Primaria（商標）、およびＨＡ修飾（０．５％ＨＡ）
３．（２）Primaria（商標）、およびＨＡ修飾（０．５％ＨＡ）、エタノールで洗浄
実施例１に記載のように（Primaria（商標）でない皿に）空気プラズマ処理を行った。合計処理時間は３０秒であり、速度８ｓｃｃｍの一定した空気流入を用いると、プラズマチャンバー内で１４０ミリトルの処理圧力が得られた。
【０１０５】
ポリＬ−リシン（ＰＬＬ）（Sigma）を脱イオン水（ＤＩＨ２Ｏ）に溶解させて０．０２５％溶液を作成し、このポリリシン溶液を満たした皿をインキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートすることにより、５群のプラズマ処理ポリスチレン皿を被覆した。翌朝、ポリリシン溶液を除去し、皿をＤＩＨ２Ｏで完全に洗浄し、次の修飾まで乾燥させた。
【０１０６】
直径４０ｍｍのPrimaria（商標）皿をBD Biosciences（Labware, Bedford）から購入し、受け取った状態のまま使用した。
【０１０７】
ＨＡ被覆。リン酸カリウム緩衝液中で０．５％ＨＡ（雄鶏の鶏冠由来、Sigma）溶液を調製した。ＥＤＣをリン酸カリウム緩衝液中に溶解させ、ＨＡ１反復単位につきＥＤＣ約１分子の比になるようにこれを加えた。ＰＬＬ被覆およびPrimaria（商標）表面をＨＡ／ＥＤＣのリン酸カリウム緩衝溶液５ｍｌで被覆し、静置して１晩反応させた。翌朝、ＨＡ溶液を除去し、各皿をＤＩＨ２Ｏで完全に洗浄して、非共有結合で接着したＨＡを除去し、空気乾燥させた。
【０１０８】
（細胞培養プロトコル）
Duke大学のL. D. Quarles博士によって確立され、University of North Carolina at Chapel HillのGayle E. Lester博士によって快く提供されたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を、本発明者らの実験室で標準的な細胞培養技術を用いて増殖させた。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は、その特徴がかなり明らかにされており、それが通常使用されるほとんどの組織培養用表面に積極的に接着するゆえに選択された、急速に増殖する骨芽細胞系統である。当業者が入手できる他の細胞系統でも、同様の結果が得られるはずである。
【０１０９】
当技術分野で知られている方法に従って、細胞培養用フラスコからトリプシンＥＤＴＡを用いて細胞を剥離させた。細胞を計数し、遠心し、１０％ウシ胎児血清（fetal calf serum）を含む培地中に再懸濁させた。この濃度のウシ胎児血清を添加することで、ＨＡ被覆表面上での細胞接着防止の試験がより厳密になる。
【０１１０】
細胞を播く直前に、各処理群から１枚のＨＡ被覆表面、例えばＨＡで被覆した１枚のＰＬＬ被覆表面および１枚のPrimaria（商標）表面をエタノール中に１時間浸漬し、この滅菌法に対するＨＡ被覆表面の安定性を調べた。
【０１１１】
（６０ｍｍ皿１枚当たり細胞約１００万個、３５ｍｍ皿１枚につき細胞８００，０００個で）細胞を播き、インキュベーター中で３７℃でインキュベートした。細胞を播いてから３０分後、５時間後、２０時間後、２９時間後、４４時間後、５日後、６日後および７日後に位相差顕微鏡で細胞接着をモニターした。細胞接着を以下に示すようにスコア化した。このスコアシステムは本明細書の実施例全体にわたって使用する。
スコア：＋＋  細胞が接着し広がり、コンフルエントな細胞単層を形成する
＋    細胞が接着し広がるが、コンフルエントな単層を形成しない
±    細胞が接着するが、広がらない（円形）
−    非常に少数の細胞しか接着せず、広がらない（円形）
−−  細胞が観察されない
ｎｄ  行っていない
この結果を表４に示す。
【０１１２】
【表４】
2006501356.tif 000007
【０１１３】
要約を述べると、ＥＤＣの存在下０．５％ＨＡで修飾したＰＬＬおよびPrimaria（商標）表面上で、コンフルエントな細胞層が形成された。エタノール洗浄した表面により、ＨＡ被覆の溶媒安定性が実証されている。すなわちＨＡ被覆は、エタノールで洗浄することができ、洗浄してもその性能は変化しない。
【０１１４】
ＥＳＣＡ分析（ＥＳＣＡの設定の記載については実施例１を参照）の結果を表５に示す。
【０１１５】
【表５】
2006501356.tif 000008
【０１１６】
（＊）無処理ポリスチレンの酸素混入物の供給源は不明である。理論的に、PSのESCAスペクトルは100％炭素であるはずである。
【０１１７】
空気プラズマ処理では酸素含有基が導入されるが、窒素は、ＰＬＬ修飾によって導入され、Primaria（商標）表面にも存在する。ポリＬ−リシンでは、各２つの窒素のうち１つが、ＨＡの共有結合に適した官能性［第一級］アミン残基に含まれる。
【０１１８】
ＨＡをさらに付加した後、Ｏ／ＣおよびＯ／Ｎ比が以下のように変化する。
【０１１９】
【表６】
2006501356.tif 000009
【０１２０】
Ｏ／ＣおよびＯ／Ｎ比は、ＨＡを付加した後すべての表面で増大し、このことから、これらの表面にいくつかのＨＡが結合したことが示唆される。しかし、ＰＬＬまたはPrimaria（商標）上で細胞接着の防止が認められなかったことから、本実施例に記載の手法に従って修飾された表面にあるＨＡの量が十分でなかったことが示唆される。
【実施例３】
【０１２１】
（ＥＤＣのみを用いるＨＡのＰＬＬ処理表面との結合に関するリン酸カリウムとＭＥＳ緩衝液の比較）
実施例１に記載のプラズマプロセスに従って、９６穴の平底マイクロタイタープレート１枚を空気プラズマ処理した。合計処理時間は６０秒であり、速度８ｓｃｃｍで一定して空気を流入させると、プラズマチャンバー内で約１４０ミリトルの処理圧力が得られた。
【０１２２】
ＰＬＬ（Sigma）をＤＩＨ２Ｏに溶解させて０．０５％溶液を作成し、これで、空気プラズマ処理した９６穴のプレート中の９穴の底を室温で２時間被覆した。次いでポリリシン溶液を除去し、穴をＤＩＨ２Ｏで完全に洗浄し、さらに修飾するまでプレートを室温で乾燥させた。
【０１２３】
実施例２に記載のようにＨＡ被覆を実施した。０．１Ｍ、ｐＨ５．３のリン酸カリウム緩衝液中で０．５％ＨＡ（雄鶏の鶏冠由来、Sigma）溶液を調製した。同様に、０．１Ｍ、ｐＨ３．６８のＭＥＳ緩衝液中で０．５％ＨＡ溶液を調製した。リン酸カリウムバッファー中またはＭＥＳバッファー中にＥＤＣを溶解させ、これをＨＡのリン酸カリウム緩衝液またはＨＡのＭＥＳ緩衝液にそれぞれ加えて、比がＨＡ１反復単位当たりＥＤＣ約１分子となるようにした。ＨＡ／ＥＤＣのリン酸カリウム緩衝液とＨＡ／ＥＤＣのＭＥＳ緩衝液のどちらによってもＰＬＬ処理表面が修飾されるように（１条件につき３反復）、ＨＡ／ＥＤＣ溶液１００μｌを加えて９６穴プレート中のＰＬＬ被覆表面を修飾した。翌朝、ＨＡ溶液を除去し、各穴をＤＩＨ２Ｏで完全に洗浄して、非共有結合で接着したどんなＨＡも除去し、プレートを細胞培養まで空気乾燥させた。
【０１２４】
実施例２に記載のように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を用いた細胞培養を実施した。１ウェル（穴）当たり約１０，０００個の細胞で細胞を播き、インキュベーター内で３７℃で培養した。
【０１２５】
細胞を播いてから３０分後、５０分後、１日後、２日後および５日後に位相差顕微鏡で細胞接着をモニターした。細胞接着を上記のようにスコア化した。結果を表７に示す。
【０１２６】
【表７】
2006501356.tif 000010
【０１２７】
1PPB＝リン酸カリウム緩衝液；
2MES＝2−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸
【０１２８】
要約を述べると、ＥＤＣを触媒としてＨＡをＰＬＬと結合させることにより、細胞が広がり、増殖するのを防止できない表面が生じる。しかし、ＭＥＳ緩衝液と組み合わせると、細胞接着が低下し、観察できるどんな細胞接着も、主に凝集塊の形であり、５日間の培養中ずっとそのままである。この観察結果は、部分的にＨＡで表面が被覆された結果である可能性があり、観察された細胞接着は、下に存在する（接着を支持する）ＰＬＬ被覆物の上にあるＨＡ被覆物の欠損に起因する可能性がある。
【実施例４】
【０１２９】
（ＥＤＣおよびＥＤＣ／ＮＨＳのＭＥＳ緩衝液によって触媒されたPrimaria（商標）ＨＡ結合表面）
Primaria（商標）処理２４穴の平底プレートをBD Biosciencesから購入し、受け取ったものを使用した。
【０１３０】
実施例２に記載のように、ＥＤＣ支持のＨＡ被覆を実施した。０．１Ｍ、ｐＨ３．６８のＭＥＳ緩衝液中で０．５％ＨＡ（雄鶏の鶏冠由来、Sigma）溶液を調製した。ＭＥＳ緩衝液中にＥＤＣを溶解させ、これをＭＥＳ緩衝液に溶解したＨＡに加えて、ＨＡ１反復単位につきＥＤＣ約１分子の比となるようにした。ＨＡ／ＥＤＣ溶液３ｍｌを加えて、Primaria（商標）プレート中の１０穴を修飾した。プレートを静置して、１晩反応させた。翌朝、ＨＡ溶液を除去し、各穴をＤＩＨ２Ｏで完全に洗浄して、非共有結合で接着したどんなＨＡも除去し、プレートを細胞培養まで空気乾燥させた。
【０１３１】
ＥＤＣ／ＮＨＳ支持のＨＡ被覆も、ＥＤＣのみを用いたＨＡ被覆と同様に調製した。０．１Ｍ、ｐＨ３．６８のＭＥＳ緩衝液中で０．５％ＨＡ（雄鶏の鶏冠由来、Sigma）を調製した。ＭＥＳ緩衝液中にＥＤＣおよびＮＨＳを溶解させ、これをＭＥＳ緩衝液に溶解したＨＡに加えて、ＨＡ１反復単位当たりＥＤＣ約１分子およびＮＨＳ０．５分子の比となるようにした。ＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液３ｍｌを加えて、Primaria（商標）プレート中の１０穴を修飾した。プレートおよび皿を静置して、１晩反応させた。翌朝、ＨＡ溶液を除去し、各皿および穴をＤＩＨ２Ｏで完全に洗浄して、非共有結合で接着したどんなＨＡを除去し、プレートおよび皿を細胞培養まで空気乾燥させた。
【０１３２】
実施例２に記載のように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を用いた細胞培養を実施した。
【０１３３】
播く細胞を異なる密度で、例えば、２４穴のPrimaria（商標）プレート中のPrimaria（商標）処理表面、Primaria（商標）処理しＨＡ／ＥＤＣ修飾した表面、およびPrimaria（商標）処理しＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ修飾した表面上の培養表面１ｍｍ２当たり１００個、２５０個、１０００個、および２０００個の細胞で、細胞を播いた。細胞を播いてから２．５時間後に、Primaria（商標）処理表面、Primaria（商標）処理しＨＡ／ＥＤＣ修飾した表面、およびPrimaria（商標）処理しＨＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ修飾した表面から培地および接着しなかった細胞を除去した。接着細胞を有する表面を培地で１回穏やかに洗浄し、試験期間中は接着細胞を維持するために培地２ｍｌを表面上に載せた。
【０１３４】
顕微鏡で観察する間、培養物はすべて、３７℃インキュベーター内で維持した。細胞を播いてから３０分後、２時間後、１日後、２日後および５日後に位相差顕微鏡で細胞接着をモニターした。細胞接着を上記のようにスコア化した。結果を表８に示す。
【０１３５】
これらの例示的な結果は、ＥＤＣとＮＨＳの組合せを有するＭＥＳバッファーを含む媒地を用いて調製したＨＡ表面上で、細胞接着が防止されたことを明らかに実証するものである。十分なアミン残基が存在するように表面をプラズマ処理する場合に以前は必要であると信じられていたＰＬＬまたはＰＥＩなどの中間層がなくても、ＨＡ１反復単位につきＮＨＳ約０．５分子の比でＮＨＳを加えるだけで、反応中間体を安定化させ、ＨＡ結合反応の収率を増大させるのに十分である。
【０１３６】
【表８】
2006501356.tif 000011
【０１３７】
「洗浄」とは、非接着細胞を2.5時間後に除去し、表面をPBSで洗浄し、これに培地を補充したことを意味する。
【実施例５】
【０１３８】
(アンモニアプラズマ処理６日後のヒアルロン酸被覆)
Primaria（商標）に加えて、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはアルギン酸（ＡＡ）からなる細胞接着に抵抗する層をポリマー表面と共有結合で直接接着させることのできるプラズマ処理条件を明らかにすることを目標に、追加実験を実施した。
【０１３９】
６０ｍｍポリスチレン皿（Falcon 1007、BD Labware）に、５種類の異なるアンモニアプラズマ処理（処理条件１つにつき４皿を使用）を施した。すべての処理で、９５ワット、１３．５６ＭＨｚのＲＦプレーナーダイオードで発生させたプラズマを使用し、下部の駆動電極上に試料を置き、上部電極を接地した。２つの電極は直径２０ｃｍであり、その間は６ｃｍ離れている。処理条件は、以下の通りである。
【０１４０】
条件Ａ：チャンバーをポンプによりベース圧２０ミリトルに排気し、３７５ミリトルのＮＨ３雰囲気を確立し、２５秒間プラズマ処理を行う。
【０１４１】
条件Ｂ：チャンバーをポンプによりベース圧２０ミリトルに排気し、３７５ミリトルのＮＨ３雰囲気を確立し、１２０秒間プラズマ処理を行う。
【０１４２】
条件Ｃ：チャンバーをポンプによりベース圧０．３ミリトルに排気し、２００ミリトルのアルゴン雰囲気を確立し、６０秒間プラズマ処理を行い、その後３７５ミリトルで２５秒間ＮＨ３プラズマ処理を行う。
【０１４３】
条件Ｄ：チャンバーをポンプによりベース圧０．３ミリトルに排気し、２００ミリトルのアルゴン雰囲気を確立し、６０秒間プラズマ処理を行い、その後３７５ミリトルで１２０秒間ＮＨ３プラズマ処理を行う。
【０１４４】
条件Ｅ：チャンバーをポンプによりベース圧２０ミリトルに排気し、アルゴン１７％およびＮＨ３８３％からなる３６０ミリトルの雰囲気を確立し、２５秒間プラズマ処理を行う。
【０１４５】
プラズマ処理後、以下の手順に従ってＨＡで被覆する前の６日間、室温（ＲＴ）で試料を貯蔵した。
【０１４６】
（ＥＳＣＡ分析）
化学分析にためのＸ線光電子分光法（ＥＳＣＡ）を使用して、アンモニアプラズマ処理ポリスチレン皿の化学組成を調べた。すべてのプラズマ処理皿は炭素、酸素、窒素を示し、少量（＜１％）のＣｌの混入を示すものもあった。Ｎ／ＣおよびＯ／Ｃ比を図１に示す。
【０１４７】
（ＨＡ被覆手順）：
実施例４に記載の手順に従って、プラズマ処理皿をＨＡ被覆した。
【０１４８】
（細胞培養）：
上記に記載のように処理したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を、播く細胞の密度を培養表面１ｍｍ２当たり約７００個の細胞にして皿中に播いた。インキュベーションの約４．５時間後、生きている培養物の位相差像を得た。細胞接着はすべての表面上で見られた。しかし、プラズマ処理の対照（コントロール）上にある細胞は、その時までにコンフルエントな単層を形成していたが、プラズマ処理しＨＡ被覆した皿の細胞接着はまだ斑状であり、皿の表面上に細胞が接着していないことを示す領域を伴っていた。
【０１４９】
上記に記載のように、プラズマ処理しＨＡ被覆した表面への細胞接着をスコア化し、表９にその結果を示す。
【０１５０】
【表９】
2006501356.tif 000012
【０１５１】
細胞接着は防止されなかったが、プラズマ処理とＨＡ被覆の間に６日間皿を「エージングさせた」とき、アンモニアプラズマ処理皿でこの開示の手順を用いてＨＡ被覆することによってこれはかなり低下した。
【実施例６】
【０１５２】
（アンモニアプラズマ処理１５分後のヒアルロン酸被覆）
６０ｍｍポリスチレン皿（Falcon 1007、BD Labware）に、実施例５に記載の５種のプラズマ処理条件から選択された、条件Ａ、条件Ｂおよび条件Ｅのプラズマ処理（処理条件１つにつき４皿を使用）を施した。
【０１５３】
（ＥＳＣＡ分析）：
上記に記載のように、ＥＳＣＡ分析を試料で実施した。実施例５と同様に、すべてのプラズマ処理皿は炭素、酸素、窒素を示し、少量（＜１％）のＣｌの混入を示すものもあった。
【０１５４】
（ＨＡ被覆手順）：
プラズマ処理後、実施例５で説明した手順に従って、試料をただちに（１５分以内に）ＨＡで被覆した。
【０１５５】
（細胞培養）：
細胞培養用フラスコからトリプシンＥＤＴＡを用いてＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を剥離した。細胞を計数し、遠心し、１０％ウシ胎児血清を含む培地中に再懸濁させた。播く細胞の密度を１ｍｍ２当たり細胞約４２０個で、細胞を皿中に播いた。インキュベーションを行ってから約３時間後、生きている培養物の位相差像を得、結果の要約を記載している表に対する説明文の記載に従って、プラズマ処理しＨＡ被覆した表面への細胞接着を再びスコア化した。細胞接着はすべての対照のプラズマ処理表面に見られた。しかし、プラズマ処理しＨＡ被覆したすべての皿では、接着していないように見える円形細胞が認められた。
【０１５６】
位相差顕微鏡観察の後、培地および非接着細胞を除去し、皿をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ホルマリン溶液（Sigma）３ｍｌで１晩インキュベーションすることによって細胞を固定した。翌朝、ホルマリンを除去し、皿をＰＢＳで２回洗浄し、皿１枚につき２ｍｌのヘマトキシリン溶液で細胞を染色した。図２に、すべての皿の染色を比較して示す。３枚すべてのプラズマ対照皿中で紫色に染色された細胞が見られた。それとは異なり、条件ＡおよびＢを用いてプラズマ処理しＨＡ被覆した皿中では、紫色の染色物は観察されなかった。条件Ｅを用いてプラズマ処理した後、ＨＡ被覆した皿では、わずかな染色物が見られ、このことから、この被覆手順ではＨＡ被覆に小さな欠損が生じ、これによって、その下にあるポリスチレン基質に細胞が接着することが示唆される。これらの結果から、プラズマ処理後ただちにアンモニアプラズマ処理皿に関するこの開示された手順を用いてＨＡ被覆することにより細胞接着が防止されたという、生きている培養物に関する観察結果が確認される。この予想しなかった知見から、ＰＥＩ、ポリリシン、または他のアミン含有化合物の中間層を必要とせずに、ヒアルロン酸を有する、優れた細胞接着抵抗性表面が形成され、これによって、実験器具および他の物品ならびにこのような表面を必要とする器具の生産が大いに単純化される。最適な結果を得るために、このような表面のＨＡ処理は、プラズマ処理後ただちに実施すべきである。しかし、約１時間まで遅れても許容できる結果が得られることが明らかとなっている。
【０１５７】
本発明によるＨＡ被覆表面は、４℃で乾燥させて貯蔵することが好ましく、この状態で貯蔵したとき、少なくとも５ヶ月間この細胞接着抵抗性を保持することが分かっている。
【実施例７】
【０１５８】
（抗ＣＤ３４を固定化した細胞接着抵抗性表面）
ＨＡをその表面に結合させたポリスチレン９６穴のマイクロプレートを以下に記載のように処理した。共有結合したＨＡ層を５０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム溶液で（１００μｌ／穴で２時間）処理してＨＡのグルクロン酸環中の隣り合ったヒドロキシル基を酸化した。酸化反応によって、グルクロン酸環が開裂し、反応性アルデヒドが形成される。図５〜７に示した濃度でプロテインＡ、プロテインＧまたはアビジン（ImmunoPure Avidin (Pierce)）の形態の第１ＬＢＰを穴に加えて、シアノ水素化ホウ素緩衝液（Sigma）の存在下で、これをＨＡに共有結合させた。最後に、図５〜７に示した濃度で、固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧにPharmingenからのマウス抗ＣＤ３４ｍＡｂ（ＩｇＧ１、κ）を加え、固定化されたアビジンにビオチン結合ラット抗マウスＣＤ３４モノクローナル抗体（Pharmingen）を加えた。この抗体をＬＢＰ（ＳｐＡ、ＳｐＧまたはアビジン）と４℃で１晩反応させた。
【０１５９】
各穴に固定した量１０μｇ／ｍｌの蛍光標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular ProbesのAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を加え、４℃で１時間置くことによって、結合した抗体の量を試験した。洗浄後、ＢＭＧマイクロ蛍光測定器を用いて穴内の蛍光を読み取った。図５〜７に示した結果は、直接の蛍光測定である。これらの値は、ＨＡ被覆表面に結合した抗体の量を反映している。抗ＣＤ３４ｍＡｂの結合について、３種の表面を評価した。
【０１６０】
表面１（図５）は、３種の濃度、例えば、１、１０、および１００μｇ／ｍｌのプロテインＧ（ＳｐＧ）で修飾されたＨＡであった。抗ＣＤ３４ｍＡｂをこれらの表面のそれぞれに３、３０、および３００μｇ／ｍｌ加え、９種の異なるＳｐＧ／抗ＣＤ３４ｍＡＢの組合せを得た。以下の表を用いて説明するように、種々の対照がこの実験に含まれていた。
【０１６１】
表面１は、以下の群を含んでいた。
【０１６２】
【表１０】
2006501356.tif 000013
【０１６３】
マイクロプレートのプレート割り付けを以下に示す。
【０１６４】
【表１１】
2006501356.tif 000014
【０１６５】
ＳｐＧをＬＢＰとして用いて固定化した抗ＣＤ３４ｍＡｂについて得られた蛍光の結果から、抗ＣＤ３４ｍＡｂが固定化されていたが、このことは（ここで調べた範囲内では）ＳｐＧおよびｍＡｂの濃度とは相対的に無関係であることが示唆された。
【０１６６】
表面２（図６）は、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌの４種の濃度のＳｐＡで修飾されたＨＡであった。０．３、３、１０、３０、または３００μｇ／ｍｌのいずれかの抗ＣＤ３４ｍＡｂをこれらの表面に加えた。これらの実験を２つの異なる９６穴プレートで行い、各データポイントは３回の反復実験に基づくものであった。様々な条件および種々の対照の要約を以下の表に示す。
【０１６７】
表面２は以下の群を含んでいた。
【０１６８】
【表１２】
2006501356.tif 000015
【０１６９】
抗ＣＤ３４ｍＡｂ、およびＬＢＰとして固定化されたＳｐＡを用いて得られた結果から、抗ＣＤ３４ｍＡｂが固定化され、（調べた範囲では）ＳｐＡおよび抗ＣＤ３４ｍＡｂの濃度が低いほど固定化の効率がよいようであることが示唆された。
【０１７０】
表面３は、１、１０および１００μｇ／ｍｌの３種の濃度のアビジンで修飾されたＨＡであった。さらに、上記に記載のように、蛍光抗イムノグロブリン抗体を用いて、固定化されたｍＡｂが存在するかどうかを検出した。表面３は以下の群を含んでいた。
【０１７１】
【表１３】
2006501356.tif 000016
【０１７２】
ビオチン化抗ＣＤ３４ｍＡｂの、ＬＢＰとして固定化されたアビジンとの結合を反映する結果から、抗ＣＤ３４ｍＡｂが非常に有効に固定化され、調べた濃度の範囲ではアビジンおよびビオチン化ｍＡｂの濃度が高いほど固定化が効率よく行われたことが示唆された。
【０１７３】
上記の観察結果を要約すると、ＳｐＧは、抗体をＨＡ被覆表面に固定化するために試験した３つのうち、最も効率の低いＬＢＰであることが判明した。実際、ＨＡ上のｍＡｂの直接の固定化（これらの実験での対照の穴）は、ＨＡ上に最初に固定化されるＳｐＧとの抗体の結合より多かった（結果は示さず）。
【０１７４】
ＨＡと共有結合したＳｐＡとの抗ＣＤ３４ｍＡｂの結合（固定化）は、ＳｐＧとの結合より有効であった。低濃度のＳｐＡおよび抗ＣＤ３４ｍＡｂ溶液を用いると、固定化の効率がより高くなると思われた。
【０１７５】
アビジンのＨＡとの共有結合およびビオチン化ｍＡｂのこの共有結合したアビジンへの固定化によって、最も大量にｍＡｂが表面に結合した。高濃度のアビジンが高濃度のビオチン化抗ＣＤ３４ｍＡｂと一緒になって、高い蛍光が得られ、これはｍＡｂがより効率よく固定化されたことを示唆していた。
【０１７６】
ここに示した結果から、アビジンとビオチン化ｍＡｂの固定化戦略によって、ＨＡ被覆表面との優れた抗体結合が得られることが示唆される。
【実施例８】
【０１７７】
（ＥＤＣ／ＮＨＳ結合を用いたＬＢＰのＨＡ表面との結合）
以下に記載のように、３つの異なる化学反応を用いて、ＨＡをその表面に結合させたポリスチレン９６穴マイクロプレートを処理して、種々のコラーゲンをＨＡと結合させた。
【０１７８】
（過ヨウ素酸酸化）
共有結合したＨＡ層を５０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム（５０μｌ／穴）で２時間処理してＨＡのグルクロン酸環中にある隣接したヒドロキシル基を酸化した。この酸化反応によって、環の隣り合ったＯＨ基の間にあるグルクロン酸環が開裂し、反応性アルデヒドが形成される。
【０１７９】
酸化後、１０ｍＭの酢酸緩衝液中に溶解させて１００μｇ／ｍｌにした、コラーゲンのタイプＩ、タイプＩＩＩ、またはタイプＩＶを含む溶液５０μｌを適当な穴に加えて、過ヨウ素酸で酸化されたＨＡ表面と反応させた。シアノ水素化ホウ素緩衝液（Sigma）５０μｌを各穴のコラーゲン溶液の上に加えた。このプレートを１晩インキュベートした。その後、トリス（GIBCO）５０μｌを各穴に加え、２時間インキュベートして、反応しなかったアルデヒド基をいずれもブロックした。その後、溶液を穴から除去し、この被覆表面をまずＮａＣｌ、酢酸および脱イオン化蒸留水（ＤＩＨ２Ｏ）の混合物で洗浄してイオン結合したコラーゲンをいずれも除去し、その後ＤＩＨ２Ｏで少なくとも３回それを洗浄した。表面を乾燥させ、以下に記載する実験に使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１８０】
（ＥＤＣ／ＮＨＳ前処理）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ３．６）中にＥＤＣとＮＨＳを両方とも濃度５ｍｇ／ｍｌで含む溶液３０μｌを各穴に加えて２０分間置くことにより、固定化された結合ＨＡ上のカルボン酸残基を活性化した。次いでＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を除去し、５０μｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ溶液１００μｌを穴に加え、１晩反応させた。その後、溶液を除去し、ＮａＣｌ／酢酸／ＤＩＨ２Ｏ混合物で穴を洗浄し、その後ＤＩＨ２Ｏで少なくとも３回それを洗浄した。ＮＨＳで安定化されていたＥＤＣが加水分解によって分解されて、反応中間体エステルが時間とともに生じるので、ブロッキングはこの場合不要であった。被覆表面を乾燥させ、以下に記載する実験に使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１８１】
（同時に行うＥＤＣ／ＮＨＳ活性化およびタンパク結合（「同時処理」））
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ３．６）中にＥＤＣおよびＮＨＳをそれぞれ濃度５ｍｇ／ｍｌで含む溶液をコラーゲンタイプＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ溶液に加えて、タンパクの終濃度が５０μｇ／ｍｌのＥＤＣ／ＮＨＳを含むタンパク溶液を得た。この溶液１００μｌを穴ごとに加え、１晩反応させた。その後、溶液を除去し、ＮａＣｌ／酢酸／ＤＩＨ２Ｏ混合物で穴を洗浄し、その後ＤＩＨ２Ｏで少なくとも３回それを洗浄した。ＮＨＳで安定化されていたＥＤＣが加水分解によって分解されて、反応中間体エステルが時間の経過とともに生じるので、ブロッキングはこの場合不要であった。被覆表面を乾燥させ、以下に記載する実験に使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１８２】
（結果）
１穴につき細胞約１０４個の密度で、上記に記載のように処理したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞を穴中に播いた。細胞を１晩接着させ広がらせた。次いで、生細胞の細胞質を染色するカルセインを用いて細胞を染色し、自動化顕微鏡による観察を用いて各穴における生細胞数を得た。種々の表面（３種の異なるコラーゲンが、ＰＳ表面と結合したＨＡと結合している）に接着している細胞数を以下の表１０に示す。
【０１８３】
（ＨＡがＰＳと結合し、タンパクは付加していない）ＣＡＲ表面を有する対照の穴では、細胞の接着および広がりは認められなかった。タンパク被覆ＨＡ表面の結果を以下に示す。
【０１８４】
【表１４】
2006501356.tif 000017
【０１８５】
接着生細胞がすべてのタンパク結合表面上で認められ、このことから、両方の化学反応、すなわち過ヨウ素酸酸化とカルボン酸活性化によって、タンパクがＨＡヒアルロン酸とうまく結合し、またこれらの反応により、タンパクがＡＡを含めた他のＣＡＲ物質、ならびにＨＡおよびＡＡ誘導体とも結合することが同様に予想されるはずであることが示唆される。このように作成されたＣＡＲ表面と共有結合したタンパクによって、細胞の生物学的機能、この場合では表面への接着能が維持される。
【０１８６】
明確に組み込まれたものであれ、そうでないものであれ、上記で引用した文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
本明細書で説明し論じた実施形態は、当業者に、本発明を作成し使用する、本発明者らが知っている最良の方法を教示するものにすぎず、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。当業者なら上記の教示に照らして理解するように、本発明から逸脱することなく、例示された本発明の実施形態を変更することも変形することもでき、要素を追加することも削除することもできる。したがって、特定して記載した以外の場合でも、特許請求の範囲およびそれと同等のものの範囲内で、本発明を実施することができることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】実施例５に記載された各プラズマ処理条件（Ａ〜Ｅ）でのＯ／ＣおよびＮ／Ｃ比を示す図である。
【図２】実施例７に記載のように、プラズマ処理しＨＡ被覆した皿中で固定しヘマトキシリンで染色したＭＣ３Ｔ３細胞を示す図である。陰影は、細胞が存在することを示す。３枚のプラズマ対照皿（最上段）は染色され［明るい紫色］、このことから、細胞層が存在することが示唆される。条件ＡおよびＢでプラズマ処理しＨＡ被覆した皿中では染色物は見られず、このことから、この表面に細胞が接着しなかったことが示唆される。条件Ｅでプラズマ処理しＨＡ被覆した皿２枚では、おそらく被覆に小さな欠損があるためにわずかな細胞接着が見られる。［またこれはＢ＆Ｗイメージに転換されている可能性があり、このとき明るい紫色は灰色であり、細胞を有さない表面は白色である］
【図３】ポリスチレン表面上に異なる「複数の層」が作り上げられていることが示されている、例示的なＬＢＰである抗ＣＤ３４ｍＡｂを固定化したＣＡＲ表面の概略を表す図である。
【図４】ＣＡＲ表面を修飾してＬＢＰ（単一ＬＢＰ、あるいは第１（１°）ＬＢＰと第２（２°）ＬＢＰの両方）を固定化する２つの異なるプロセスにおけるステップを表す概略図である。この実施形態では、ＣＡＲ物質の層は、ＰＳ表面とも直接結合することができ、ＰＳ表面と直接結合している中間層（ここではＰＥＩを例とする）とも結合することができるＨＡまたはＡＡを例とする。
【図５】ＢＭＧ蛍光測定器を用いた、本発明の表面と結合している抗体の直接蛍光測定を示す図である。ＨＡで被覆した９６穴マイクロプレートを処理して、マウスｍＡｂの固定化について異なる３つのタイプの表面を作成した。これらの表面との抗ＣＤ３４ｍＡｂの最大の結合量を評価した。表面１はＳｐＧで修飾されたものであった。蛍光色素Alexa 488（登録商標）と結合した蛍光２°抗体（抗Ｉｇ）を用いて、ｍＡｂの各表面との結合の効率を蛍光測定法で測定した（実施例を参照）。代表的な結果を示す。
【図６】ＢＭＧ蛍光測定器を用いた、本発明の表面と結合している抗体の直接蛍光測定を示す図である。ＨＡで被覆した９６穴マイクロプレートを処理して、マウスｍＡｂの固定化について異なる３つのタイプの表面を作成した。これらの表面との抗ＣＤ３４ｍＡｂの最大の結合量を評価した。表面２はＳｐＡで修飾されたものであった。蛍光色素Alexa 488（登録商標）と結合した蛍光２°抗体（抗Ｉｇ）を用いて、ｍＡｂの各表面との結合の効率を蛍光測定法で測定した（実施例を参照）。代表的な結果を示す。
【図７】ＢＭＧ蛍光測定器を用いた、本発明の表面と結合している抗体の直接蛍光測定を示す図である。ＨＡで被覆した９６穴マイクロプレートを処理して、マウスｍＡｂの固定化について異なる３つのタイプの表面を作成した。これらの表面との抗ＣＤ３４ｍＡｂの最大の結合量を評価した。表面３はアビジンで修飾されたものであった（またビオチン化抗ＣＤ３４ｍＡｂを用いて試験した）。蛍光色素Alexa 488（登録商標）と結合した蛍光２°抗体（抗Ｉｇ）を用いて、ｍＡｂの各表面との結合の効率を蛍光測定法で測定した（実施例を参照）。代表的な結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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