(57)【要約】本発明は、形質転換成長因子、（「ＴＧＦ」）−βシグナル化経路、特に、ｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のＩ型ＴＧＦ−βまたはアクチビン様キナーゼ（「ＡＬＫ」）−５受容体によるリン酸化の阻害剤である、新規ピラゾール誘導体、その製造方法および医薬、特にこの経路により介在される病態の治療および予防におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2006527722.tif 000062
［式中、
環Ｅは、飽和、不飽和または芳香族の５または６員のヘテロサイクルであり、該ヘテロサイクルは、炭素に加えて、窒素および酸素から独立して選択される１個以上の環ヘテロ原子を含有し、該ヘテロサイクルは、いずれの窒素原子上で、適当な場合、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキルから独立して選択される１個以上のＲＥａ基により置換されていてもよく、適当な場合、いずれの炭素原子上で、オキソ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシおよびハロから独立して選択される１個以上のＲＥｂ基により選択されていてもよく；
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロ、シアノまたはペルフルオロＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、水素またはハロである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体：ただし、式（Ｉ）で示される化合物は：
１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−５−［３−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジヒドロ−１，３−ジエチル−５−（３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−５−（３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１−エチル−１，３−ジヒドロ−３−メチル−５−［３−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−５−［３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−５−［３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１−エチル−６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
１−エチル−５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（２−プロポキシエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（１−プロポキシエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
１−メチル−６−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール；または
５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール、
以外の化合物。
【請求項２】
Ｅを含有するベンゾ縮合環系が、ベンズイミダゾール−６−イル、ベンズイミダゾール−５−イル、ベンゾキサゾール−６−イル、ベンゾキサゾール−５−イル、４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、ベンゾキオキサン−６−イル、キノリン−６−イルおよびベンゾトリアゾール−６−イルから選択される、請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項３】
ＸがＮである、前記請求項いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項４】
Ｒ２が、水素、Ｃ１−６アルキル、クロロまたはフルオロである、前記請求項いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項５】
Ｒ２が、水素、メチル、クロロまたはフルオロである、請求項４記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項６】
Ｒ２がメチルである、請求項５記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項７】
Ｒ３が水素である、前記請求項いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項８】
ＸがＮであり、Ｒ２がメチルである、請求項１〜３いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項９】
ＸがＮであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ３がＨである、請求項８記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１０】
ＸがＣＨであり、Ｒ２がメチルである、請求項１〜３いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１１】
ＸがＣＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ３がＨである、請求項１０記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１２】
４−［１−エチル−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［１−（２−メトキシエチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［１−（メチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［２−（メチル）−ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［２−（メチル）−ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［ベンゾキサゾール−５−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［２−メチル−ベンゾキサゾール−５−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール；
４−［４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール；
４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール；
４−［４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール；
４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール；
から選択される請求項１記載の化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体。
【請求項１３】
医薬として用いるための、ただし書きを除く請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１４】
ＡＬＫ−５阻害により介在される疾患または症状の治療または予防用の医薬の製造における、請求項１３記載の式（Ｉ）で示される化合物の使用。
【請求項１５】
哺乳動物の、ＡＬＫ−５阻害により介在される疾患または症状の治療方法であって、該哺乳動物に、有効量のただし書きを除く請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体を投与することを含む方法。
【請求項１６】
ＡＬＫ−５阻害により介在される疾患または症状が、好ましくは、慢性腎疾患、急性腎疾患、創傷治癒、関節炎、骨粗鬆症、腎臓病、鬱血性心不全、潰瘍（糖尿病性潰瘍、慢性潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍を含む）、眼疾患、角膜創、糖尿病性ネフロパシー、神経機能障害、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腹膜および皮下癒着、線維症が主な要因である疾患（限定するものではないが、肺線維症および肝臓線維症を含む）、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アルコール誘発肝炎、血色素症および原発性胆汁性肝硬変、再狭窄、後腹膜線維症、腸間膜線維症、子宮内膜症、ケロイド、骨機能異常、炎症性障害、瘢痕および光老化から選択される、請求項１３〜１５いずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物を医薬上許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物。
【請求項１８】
ＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストと組み合わせる、請求項１〜１２いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は形質転換成長因子（「ＴＧＦ」）−βシグナル伝達経路、特に、Ｉ型ＴＧＦ−βまたはアクチビン様キナーゼ（「ＡＬＫ」）−５受容体によるｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のリン酸化の阻害剤である新規ピラゾール誘導体、その製造法および医薬、特にこの経路により介在される症状の治療および予防におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ＴＧＦ−β１は、一回膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼ受容体のファミリーを介してシグナルを送る、ＴＧＦ−β、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質およびミュラー管阻害物質を含むサイトカインのファミリーの原型メンバーである。これらの受容体は２種のクラス、Ｉ型またはアクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体およびＩＩ型受容体に分類することができる。ＡＬＫ受容体は、（ａ）セリン／スレオニンが豊富な細胞内尾部を欠くこと、（ｂ）Ｉ型受容体間で非常に相同性であるセリン／スレオニンキナーゼドメインを有すること、および（ｃ）グリシンおよびセリン残基が豊富な領域からなるＧＳドメインと呼ばれる共通の配列モチーフを共有する点で、該ＡＬＫ受容体はＩＩ型受容体から区別される。ＧＳドメインは、細胞内キナーゼドメインのアミノ末端にあり、ＩＩ型受容体による活性化に重要である。いくつかの研究により、ＴＧＦ−シグナル伝達はＡＬＫとＩＩ型受容体の両方を必要とすることが示されている。特に、ＩＩ型受容体は、ＴＧＦ−βの存在下で、ＴＧＦ−β、ＡＬＫ５のＩ型受容体のＧＳドメインをリン酸化する。ついで、ＡＬＫ５は、細胞質タンパク質ｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３を２つのカルボキシ末端セリンでリン酸化する。リン酸化されたｓｍａｄタンパク質は核中に転位し、細胞外マトリックスの産生に寄与する遺伝子を活性化する。したがって、本発明の好ましい化合物は、これらがＩ型受容体、かくしてマトリックス産生を阻害するという点で選択的である。
【０００３】
ＷＯ０２／０６６４６２、ＷＯ０２／０６２７９４およびＷＯ０２／０６２７８７（Ｇｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、形質転換成長因子、（「ＴＧＦ」）−βシグナリング経路、特にＩ型ＴＧＦ−βまたはアクチビン様キナーゼ（「ＡＬＫ」）−５受容体によるｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のリン酸化の阻害剤である新規置換ピラゾール誘導体を開示する。該化合物は、ＡＬＫ５キナーゼ機構に介在される種々の病態の治療および予防に有効であると言われている。
【０００４】
ＷＯ０４／０１６６０６（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、形質転換成長因子、（「ＴＧＦ」）−βシグナリング経路、特にＩ型ＴＧＦ−βまたはアクチビン様キナーゼ（「ＡＬＫ」）−５受容体によるｓｍａｄ２またはｓｍａｄ３のリン酸化の阻害剤であるフェニルピリジル置換ピラゾール誘導体を開示する。
【０００５】
ＷＯ２００４／０２６３０６（Ｐｆｉｚｅｒ）は、形質転換成長因子、（「ＴＧＦ」）−βシグナリング経路の強力な阻害剤である新規ピラゾール化合物を開示する。該化合物は、例えば、癌および線維症を含む種々のＴＧＦ関連病態の治療に有用であると言われている。
【０００６】
発明の概要
意外にも、この度、ＡＬＫ５キナーゼの強力かつ選択的な非ペプチド阻害剤として機能する一群の新規ピラゾール誘導体が見いだされた。
【０００７】
発明の詳細な記載
第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2006527722.tif 000002
［式中：
環Ｅは、飽和、不飽和または芳香族５または６員のヘテロサイクルであり、該ヘテロサイクルは、炭素に加えて、窒素および酸素から独立して選択される１個以上の環ヘテロ原子を含有し、ここに、該ヘテロサイクルは、いずれの窒素原子上で、適当な場合、Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキルから独立して選択される１個以上のＲＥａ基により置換されていてもよく、いずれの炭素原子上で、適当な場合、オキソ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシおよびハロから独立して選択される１個以上のＲＥｂ基により置換されていてもよく；
Ｘは、ＮまたはＣＨであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、ハロ、シアノまたはペルフルオロＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、水素またはハロである］
で示される化合物、医薬上許容される塩、溶媒和物もしくは誘導体のＡＬＫ−５阻害により介在される疾患または症状の治療または予防用の医薬の製造における使用を提供する。
【０００８】
好ましくは、Ｅを含有するベンゾ縮合環系は、ベンズイミダゾール−６−イル、ベンズイミダゾール−５−イル、ベンゾキサゾール−６−イル、ベンゾキサゾール−５−イル、４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル、ベンゾキオキサン−６−イル、キノリン−６−イルおよびベンゾトリアゾール−６−イルから選択される。
【０００９】
より好ましくは、Ｅを含有するベンゾ縮合環系は、ベンズイミダゾール−６−イル、ベンズイミダゾール−５−イル、ベンゾキサゾール−６−イル、ベンゾキサゾール−５−イル、４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イルおよびベンゾキオキサン−６−イルから選択される。
【００１０】
好ましくは、Ｘは、ＮまたはＣＨである。より好ましくは、ＸはＮである。
好ましくは、Ｒ２は、水素、Ｃ１−６アルキル、クロロまたはフルオロである。より好ましくは、Ｒ２は、水素、メチル、クロロまたはフルオロである。さらにより好ましくは、Ｒ２はメチルである。
好ましくは、Ｒ３は水素である。
好ましくは、ＸがＮである場合、Ｒ２はメチルである。より好ましくは、ＸがＮであり、Ｒ２がメチルである場合、Ｒ３はＨである。
好ましくは、ＸがＣＨである場合、Ｒ２はクロロである。より好ましくは、ＸがＣＨであり、Ｒ２がクロロである場合、Ｒ３はＨである。
【００１１】
本発明は、上記した好ましい基のいずれもの組み合わせを有する化合物を含むことを意図することは明らかだろう。
【００１２】
「ＡＬＫ５阻害剤」なる用語は、ｐ３８またはＩＩ型受容体よりも優先的にＡＬＫ５受容体を選択的に阻害する、阻害ｓｍａｄ、例えばｓｍａｄ６およびｓｍａｄ７以外の化合物を意味する。
【００１３】
ＴＧＦ−β１軸の活性化および細胞外マトリックスの増大は、慢性腎疾患および血管疾患の発症および進行に早期に、そして持続的に関与する。Border W.A., et al, N. Engl. J. Med., 1994; 331(19), 1286-92。さらに、ＴＧＦ−β１は、ＴＧＦ−β受容体ＡＬＫ５によるｓｍａｄ３のリン酸化作用により、硬化性沈積物の成分である、フィブロネクチンおよびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１の形成において一の役割を果たす。Zhang Y., et al, Nature, 1998; 394(6696), 909-13; Usui T., et al, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1998; 39(11), 1981-9。
【００１４】
腎臓および心臓血管系での進行性の線維症は、罹患および死亡の主要な原因であり、かつ健康のケアの費用の重要な原因である。ＴＧＦ−β１は、多くの腎線維性障害に関係している。Border W.A., et al, N. Engl. J. Med., 1994；331(19), 1286-92。ＴＧＦ−β１は、急性および慢性糸球体腎炎（Yoshioka K., et al, Lab. Invest., 1993；68(2), 154-63）、糖尿病性ネフロパシー（Yamamoto, T., et al, 1993, PNAS 90, 1814-1818）、同種移植片拒絶反応、ＨＩＶ性ネフロパシーおよびアンジオテンシン誘導性ネフロパシー（Border W.A., et al, N. Engl. J. Med., 1994； 331(19), 1286-92）において上昇する。これらの疾患において、ＴＧＦ−β１発現レベルは、細胞外マトリックスの産生と同時に生じる。３系統の証拠が、ＴＧＦ−β１とマトリックスの産生との間の原因となる関係を示唆している。第１に、正常な糸球体メサンギウム細胞および非腎臓細胞が誘導され、細胞外マトリックスタンパク質が産生され、インビトロで外因性ＴＧＦ−β１によるプロテアーゼ活性が阻害され得る。第２に、ＴＧＦ−β１に対する抗体を中和することにより、腎症のラットにおいて細胞外マトリックスの蓄積を妨げることができる。第３に、ＴＧＦ−β１トランスジェニックマウスまたはインビボでの正常ラットの腎臓へのＴＧＦ−β１遺伝子のトランスフェクションにより、糸球体硬化症が早期に発症した。Kopp J.B., et al, Lab. Invest., 1996；74(6), 991-1003。かくして、ＴＧＦ−β１活性の阻害は、慢性腎疾患の治療的介入として示される。
【００１５】
ＴＧＦ−β１およびその受容体は、傷害を受けた血管で増加し、バルーン血管形成後の新生形成において示される。Saltis J., et al, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 1996； 23(3), 193-200。さらに、ＴＧＦ−β１は、インビトロの平滑筋細胞（「ＳＭＣ」）移動の強力な刺激因子であり、そして動脈壁でのＳＭＣの移動は、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の病因に関与する因子である。さらに、内皮細胞産生物の総コレステロールに対する多変量解析において、ＴＧＦ−β受容体であるＡＬＫ５は、総コレステロールと相関した（Ｐ＜０．００１）。Blann A.D., et al,  Atherosclerosis, 1996； 120(1-2), 221-6。さらに、ヒトアテローム性動脈硬化症の病巣由来のＳＭＣは、ＡＬＫ５／ＴＧＦ−βＩＩ型受容体の比を増加させる。ＴＧＦ−β１は、線維増殖性血管の病巣で過剰発現するため、受容体の変異細胞は、細胞外マトリックス成分を過剰産生しながら、ゆっくりであるが非制御の形態で増殖する。McCaffrey T.A., et al, Jr., J. Clin. Invest., 1995； 96(6), 2667-75。ＴＧＦ−β１は、活性マトリックス合成が生じている場所であるアテローム性動脈硬化症の病巣の非泡沫化マクロファージに免疫局在性であり、このことは、非泡沫化マクロファージが、ＴＧＦ−β依存性機序を介したアテローム性動脈硬化症のリモデリングにおいて、マトリックス遺伝子の発現の調節に関係することを示唆している。したがって、ＡＬＫ５でのＴＧＦ−β１作用を阻害することは、アテローム性動脈硬化症および再狭窄においても必要とされる。
【００１６】
ＴＧＦ−βは、創傷修復においても必要とされる。ＴＧＦ−β１抗体の中和を多くのモデルで用い、ＴＧＦ−β１のシグナル伝達の阻害が、治癒過程の過度の瘢痕形成を制限することにより、損傷後の機能回復で有益であることが示された。例えば、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２抗体を中和することにより瘢痕形成が低減され、ラットの単球およびマクロファージ数が低減し、ならびに皮膚のフィブロネクチンおよびコラーゲン蓄積が減少することにより、新真皮の細胞構築が改善された。Shah M., J. Cell. Sci., 1995, 108, 985-1002。さらに、ＴＧＦ−β抗体は、ウサギにおいて角膜創傷治癒を改善し（Moller-Pedersen T., Curr. Eye Res., 1998, 17, 736-747）、ラットにおいて胃潰瘍の創傷治癒を速めた（Ernst H., Gut, 1996, 39, 172-175）。これらのデータは、ＴＧＦ−β活性を制限することは、多くの組織において有益であることを強く示唆し、ＴＧＦ−βの慢性的上昇を伴う任意の疾患が、ｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３シグナル伝達経路を阻害することにより、有益であることを示唆している。
【００１７】
TGF-βは、また、皮膚の光老化に関する (Fisher GJ. Kang SW. Varani J. Bata-Csorgo Z. Wan YS. Data S. Voorhees JJ. , Mechanisms of photoaging and chronological skin aging, Archives of Dermatology, 138(11):1462-1470, 2002 Nov.およびSchwartz E. Sapadin AN. Kligman LH. 「Ultraviolet B radiation increases steady state mRNA levels for cytokines and integrins in hairless mouse skin- modulation by topical tretinoin」, Archives if Dermatological Research, 290(3):137-144, 1998 Mar.を参照)。
【００１８】
ＴＧＦ−βは、腹膜の癒着においても関与する。Saed G.M., et al, Wound Repair Regeneration, 1999 Nov-Dec, 7(6), 504-510。したがって、ＡＬＫ５の阻害剤は、外科処置後の腹膜および皮下の線維性癒着の予防において有益だろう。
【００１９】
したがって、ＡＬＫ−５阻害により介在される疾患または症状は、好ましくは、慢性腎疾患、急性腎疾患、創傷治癒、関節炎、骨粗鬆症、腎臓病、鬱血性心不全、潰瘍（糖尿病性潰瘍、慢性潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍を含む）、眼疾患、角膜創、糖尿病性ネフロパシー、神経機能障害、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腹膜癒着、皮下癒着および光老化、線維症が主な要因である疾患（限定するものではないが、肺線維症および肝臓線維症を含む）、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アルコール誘発肝炎、血色素症および原発性胆汁性肝硬変、再狭窄、後腹膜線維症、腸間膜線維症、子宮内膜症およびケロイドから選択される。
【００２０】
より好ましくは、ＡＬＫ−５阻害により介在される疾患または症状は、線維症である。好ましくは、腎臓線維症である。
【００２１】
式（Ｉ）で示される化合物のほとんどが新規である。したがって、第２の態様により、本発明は、第１の態様に定義した化合物を提供する：ただし、式（Ｉ）で示される化合物は：
１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−５−［３−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジヒドロ−１，３−ジエチル−５−（３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−５−（３−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１−エチル−１，３−ジヒドロ−３−メチル−５−［３−（３−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−５−［３−（４−フルオロ−３−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−５−［３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン；
１−エチル−６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
１−エチル−５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（２−プロポキシエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−（１−プロポキシエチル）−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−ブロモフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
１−メチル−６−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１Ｈ−ベンズイミダゾール；
６−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール；または
５−［３−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール
以外である。
【００２２】
第３の態様において、本発明は、第１の態様において定義した化合物を提供する：ただし、ａ）Ｅを含有するベンゾ縮合環系が、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン−５−イルである場合、ＸはＣＨ以外であり；ｂ）Ｅを含有するベンゾ縮合環系が、ベンズイミダゾール−５−イルまたはベンズイミダゾール−６−イルであり、ＸがＣＨである場合、Ｒ３はハロゲン以外であり、およびｃ）Ｅを含有するベンゾ縮合環系が、ベンズイミダゾール−６−イルであり、ＸがＮである場合、Ｒ２は水素以外である。
【００２３】
第４の態様において、本発明は、第１の態様において定義した化合物を提供する：ただし、ａ）Ｅを含有するベンゾ縮合環系が１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン−５−イルである場合、ＸはＣＨ以外であり；およびｂ）Ｅを含有するベンゾ縮合環系がベンズイミダゾール−５−イルまたはベンズイミダゾール−６−イルであり、Ｒ２は水素である。
【００２４】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防において有用な薬剤として特に興味がある式（Ｉ）で示される化合物は：
４−［１−エチル−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例１）；
４−［１−（２−メトキシエチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例２）；
４−［１−（メチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例３）；
４−［２−（メチル）−ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例４）；
４−［２−（メチル）−ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例５）；
４−［ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例６）；
４−［ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例７）；
４−［ベンゾキサゾール−５−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例８）；
４−［２−メチル−ベンゾキサゾール−５−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例９）；
４−［４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール（実施例１０）；
４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール（実施例１１）；
４−［４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール（実施例１２）；
４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール（実施例１３）；
およびその医薬上許容される塩、溶媒和物および誘導体から選択される。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「Ｃ１−６アルキル」なる用語は、それ自体または他の基の一部であっても、鎖長を限定しないかぎり、１〜６個の炭素原子の直鎖または分枝鎖飽和脂肪族炭化水素ラジカルを意味し、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルを含む。
【００２６】
基または他の基の一部として、「アルコキシ」なる用語は、アルキルエーテルラジカルを意味し、ここに、「アルキル」なる用語は上記と同意義である。かかるアルコキシ基は、特に、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシを含む。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「ペルフルオロアルキル」なる用語は、トリフルオロメチルのような化合物を含む。
「ハロ」または「ハロゲン」なる用語は、本明細書において同義的に用いられ、塩素、フッ素、ヨウ素および臭素から誘導されるラジカルを意味する。
【００２８】
疑念を回避するために、特記しない限り、「置換された」なる用語は、１つまたはそれ以上の特定の基により置換されていることを意味する。基が、多くの別の基から選択される場合、選択される基は同じであっても異なっていてもよい。
【００２９】
疑念を回避するために、用語は、１個以上の置換基を多くの可能性ある置換基から選択する場合、これらの置換基は同じであっても、異なっていてもよい。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「医薬上許容される誘導体」なる用語は、式（Ｉ）で示される化合物の、医薬上許容される塩、溶媒和物、エステルまたはアミド、あるいはかかるエステルまたはアミドの塩または溶媒和物、あるいは、受容者に投与した場合に、式（Ｉ）で示される化合物またはその活性代謝物もしくは残基を提供することができる（直接的または間接的に）他のいずれかの化合物、例えばプロドラッグを意味する。本発明の好ましい医薬上許容される誘導体は、いずれの医薬上許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグである。
【００３１】
式（Ｉ）で示される化合物の適当な医薬上許容される塩は、酸性塩、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩、または、例えば適当な酸、例えば有機カルボン酸、例えば酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸およびクエン酸；有機スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸ｐ−トルエンスルホン酸および無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミン酸とのモノまたはジ塩基性塩を含む。本発明の化合物のいくつかは、水性および有機溶媒のような溶媒から結晶化または再結晶することができる。かかる場合において、溶媒和物が形成されていてもよい。本発明は、水和物を含む化学量論的溶媒和物ならびに凍結乾燥の処理により生じうる種々の量の水を含有する化合物をその範囲内に含む。
【００３２】
以下、本明細書において、本発明のいずれの態様において定義される、化合物、その医薬上許容される塩、その溶媒和物および多形体（化学工程における中間体化合物を除く）は、「本発明の化合物」として称する。
【００３３】
本発明の化合物は、光学異性体、例えば、ジアステレオマーおよびすべての比でのその混合物、例えばラセミ混合物で存在することができる。本発明は、すべてのかかる形態、特に、純粋な異性体形態を含む。別個の異性体形態を、慣用的な方法により他から分離または分割することができるか、あるいは、所定のいずれの異性体を、慣用的な合成方法により、または立体特異的または不斉合成により得ることができる。
【００３４】
本発明の化合物は、１種またはそれ以上の互変異性体形態で存在することができる。すべての互変異性体およびその混合物は、本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
本発明の化合物は、医薬組成物において用いることを意図しているので、これらは、各々、好ましくは、実質的に純粋な形態、例えば、少なくとも６０％の純度、より適当には、少なくとも７５％の純度、好ましくは、少なくとも８５％、特に、少なくとも９８％の純度（重量に基づく重量％）で提供されることは、容易に理解されるだろう。化合物の純粋でない調製物は、医薬組成物で用いられるより純粋な形を製造するために用いることができ；化合物の純度が劣る調製物は、少なくとも１％、より適当には、少なくとも５％、好ましくは、１０〜５９％の本発明の化合物を含有すべきである。
【００３６】
本発明の化合物は、公知の種々の方法で調製することができる。下記反応スキームおよび以下において、特記しない限り、Ｒ１〜Ｒ３、ＸおよびＥは、第１の態様の記載と同意義である。これらの工程は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００３７】
本明細書を通じて、一般式は、ローマ数字（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）等で指定する。これら一般式のサブセットは、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）・・・（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）等として定義される。
【００３８】
式（Ｉａ）で示される化合物、すなわち、Ｅを含有するベンゾ縮合環系がベンズイミダゾール−６−イルである一般式（Ｉ）で示される化合物は、式（ＩＩ）で示される化合物から、反応スキーム１に従って、（ＩＩ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジエチルアセタールで、ＴＨＦおよび酢酸中室温にて処理し、ついで、ヒドラジンを室温で加えることにより調製することができる。
【００３９】
【化２】
2006527722.tif 000003
【００４０】
式（Ｉｂ）で示される化合物、すなわち、Ｅを含有するベンゾ縮合環系がベンゾキサゾール−６−イルである一般式（Ｉ）で示される化合物は、式（ＩＩＩ）で示される化合物から、反応スキーム２に従って、（ＩＩＩ）を、Ｐｄ／Ｃの存在下、適当な溶媒、例えばエタノールまたはテトラヒドロフラン中室温にて水素で処理し、ついで、式（ＩＶ）で示される化合物で、適当な溶媒、例えばエタノール中高温で処理することにより調製することができる。
【００４１】
【化３】
2006527722.tif 000004
【００４２】
式（Ｉｃ）で示される化合物、すなわち、Ｅを含有するベンゾ縮合環系がベンゾキサゾール−５−イルである一般式（Ｉ）で示される化合物は、式（Ｖ）で示される化合物から、反応スキーム３に従って、（Ｖ）を、Ｐｄ／Ｃの存在下、溶媒、例えばエタノールまたはテトラヒドロフラン中室温にて水素で処理し、ついで、式（ＩＶ）で示される化合物で、適当な溶媒、例えばエタノール中高温で処理することにより調製することができる。
【００４３】
【化４】
2006527722.tif 000005
【００４４】
式（Ｉｄ）で示される化合物、すなわち、Ｅを含有するベンゾ縮合環系が４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イルである一般式（Ｉ）で示される化合物は、式（ＶＩ）で示される化合物から、反応スキーム４に従って、（ＶＩ）を、Ｒ溶媒、例えばアセトン中、塩基、例えば炭酸セシウムの存在下高温で、Ｅａ−Ｈａｌ（ここに、Ｈａｌはハロゲンである）で処理し、ついで、溶媒、例えばアルコール中還流温度にて、塩酸で処理することにより調製することができる。
【００４５】
【化５】
2006527722.tif 000006
【００４６】
式（ＶＩ）で示される化合物は、式（ＶＩＩ）で示される化合物から、反応スキーム５に従って、（ＶＩＩ）を、溶媒、例えばアセトン中、塩基、例えば炭酸セシウムの存在下室温にて、ブロモ酢酸エチルで処理し、ついで、酢酸中高温にて、鉄で処理する事により調製することができる。
【００４７】
【化６】
2006527722.tif 000007
【００４８】
式（ＶＩＩ）で示される化合物は、式（Ｖ）で示される化合物から、反応スキーム６に従って、（Ｖ）を、溶媒、例えば塩化メチレン中、塩基、例えばトリエチルアミンの存在下室温にて、塩化トリチルで処理する事により調製することができる。
【００４９】
【化７】
2006527722.tif 000008
【００５０】
式（ＩＩＩ）で示される化合物（スキーム２を参照）は、式（ＶＩＩＩ）で示される化合物から、反応スキーム７に従って、反応スキーム１と類似の方法を用いて調製することができる。
【００５１】
【化８】
2006527722.tif 000009
【００５２】
式（Ｖ）で示される化合物（スキーム３を参照）は、式（ＩＸ）で示される化合物から、反応スキーム８に従って、反応スキーム１と類似の方法を用いて調製することができる。
【００５３】
【化９】
2006527722.tif 000010
【００５４】
式（ＩＩ）で示される化合物（スキーム１を参照）は、反応スキーム９に従って、式（Ｘ）で示されるアルデヒドを、式（ＸＩ）で示されるＮ，Ｐアセタールと反応させ、ついで、得られたエナミンを加水分解することにより調製することができる（M. Journet, Tetrahedron Letters, 1998, 39, 1717-1720およびI. W. Davies et al., J. Org. Chem., 2000, 65, 8415-8420を参照）。好ましい反応条件は、適当な溶媒、例えばテトラヒドロフランおよびイソプロピルアルコール中での適当な塩基、例えば炭酸セシウムまたはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドでの処理を含む。エナミンは、塩酸で加水分解することができる。
【００５５】
【化１０】
2006527722.tif 000011
【００５６】
式（ＶＩＩＩ）で示される化合物（スキーム７を参照）は、式（ＸＩＩ）で示されるアルデヒドおよび式（ＸＩ）で示されるＮ，Ｐアセタールから、反応スキーム１０に従って、反応スキーム９に記載の条件と同様の条件を用いて調製することができる。
【００５７】
【化１１】
2006527722.tif 000012
【００５８】
式（ＩＸ）で示される化合物（スキーム８を参照）は、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンズアルデヒド（ＸＩＩＩ）および式（ＸＩ）で示されるＮ，Ｐアセタールから、反応スキーム１１に従って、反応スキーム１０と類似の方法を用いて調製することができる。
【００５９】
【化１２】
2006527722.tif 000013
【００６０】
式（ＸＩ）で示される化合物は、式（ＸＩＶ）で示される化合物から、反応スキーム１２に従って、式（ＸＩＶ）で示される化合物を、アニリンおよび亜リン酸ジフェニルで、適当な溶媒、例えばイソプロパノール中で処理することにより調製することができる。
【００６１】
【化１３】
2006527722.tif 000014
【００６２】
式（Ｘ）で示される化合物（スキーム９を参照）は、スキーム１３に記載の一般方法に従って調製することができる。
【００６３】
【化１４】
2006527722.tif 000015
【００６４】
式（Ｉ）で示される化合物の製造法のさらなる詳細は実施例に示す。
【００６５】
本発明の化合物は、単一または少なくとも２個、例えば５〜１，０００個の化合物、より好ましくは１０〜１００個の化合物を含む化合物ライブラリーとして調製することができる。本発明の化合物のライブラリーは、コンビナトリアル「スプリットおよびミックス」手法により、または溶液相もしくは固相化学のいずれかを用いるマルチプル・パラレル合成により、当業者に既知の手法によって調製することができる。かくして、本発明のさらなる態様は、少なくとも２個の本発明の化合物を含む化合物ライブラリーを提供する。
【００６６】
本明細書において治療なる言及は、予防ならびに確立した症状の治療にも及ぶことは明らかだろう。さらに、本明細書における、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防なる言及は、ＴＧＦ−β関連疾患、例えば線維症、特に肝臓および腎臓線維症、癌進行、骨機能異常および炎症性障害および瘢痕の治療または予防を含むべきであることは明らかだろう。
【００６７】
本発明により治療することができる他の病理学的症状は、本明細書の導入部に記載してある。本発明の化合物は、特に、線維症および関連症状の治療に適している。
【００６８】
本発明の化合物は、他の治療剤、例えば、肝臓疾患用の抗ウイルス剤と組み合わせて、または腎臓病用のＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。
【００６９】
本発明の化合物は、当業者によく知られた慣用的な方法に従って、本発明の化合物を標準的な医薬担体または賦形剤と組み合わせることにより調製される慣用的な剤形で投与することができる。これらの方法は、混合、造粒および圧搾または、要すれば成分を所望の製剤に溶解することを含みうる。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、いずれの経路による投与用に処方してもよく、ヒトを含む哺乳動物に経口、局所または非経口で投与するのに適した形態を含みうる。
【００７１】
組成物は、いずれの経路による投与用に処方することができる。これらの組成物は、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、ロゼンジ、クリームまたは液体製剤、例えば経口または滅菌非経口溶液または懸濁液の形態であってもよい。
【００７２】
本発明の局所処方は、例えば、軟膏、クリームまたはローション、眼用軟膏および眼または耳用滴剤、含浸包帯およびエアロゾルとして提供され、適当な慣用的な添加剤、例えば油およびクリームにおいて、保存剤、薬剤の浸透を補助する溶媒、軟化剤を含有していてもよい。
【００７３】
また、処方は、適合する慣用的な担体、例えばクリームまたは軟膏基剤およびローション用のエタノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよい。かかる担体は処方の約１％〜約９８％として存在することができる。より一般的には、これらは処方の約８０％までである。
【００７４】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位投与剤形であってもよく、慣用的な賦形剤、例えば結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ポテトスターチ；または許容される湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含有していてもよい。錠剤は、通常の医薬手法でよく知られた方法に従ってコートすることができる。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、あるいは、使用前に水または他のビヒクルで復元するための乾燥製剤として提供することもできる。かかる液体製剤は、慣用的な賦形剤、例えば懸濁化剤、例えばソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用油、乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレアートまたはアカシア；非水性ビヒクル（ここに、食用油を含んでいてもよい）、例えばアーモンド油、油性エステル、例えばグリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルまたはソルビン酸、所望により、慣用的なフレーバーまたは着色剤を含有していてもよい。
【００７５】
坐剤は、慣用的な坐剤基剤、例えばココアバターまたは他のグリセライドを含有するだろう。
【００７６】
非経口投与に関して、流動体単位剤形は、化合物および滅菌ビヒクル、好ましくは水を利用して調製される。化合物は、使用するビヒクルおよび濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁または溶解することができる。溶液の調製において、化合物は、注射用水に溶解し、濾過滅菌し、ついで、濾液を適当なバイアルに充填し、シールすることができる。
【００７７】
別法として、局所麻酔剤、保存剤および緩衝化剤のような薬剤も、ビヒクル中に溶解させることができる。安定性を増強させるために、組成物をバイアルに充填した後冷凍し、減圧下で水を除去することができる。ついで、凍結乾燥した粉末をバイアル中に密封し、注射用水のバイアルと一緒に提供して、使用前に液体に復元することができる。非経口懸濁液は、化合物をビヒクル中に溶解する代わりに懸濁させ、滅菌が濾過により行えないこと以外は、実質的に同様の方法で調製する。化合物は、滅菌ビヒクル中に懸濁する前に、エチレンオキシドに暴露することにより滅菌することができる。有利には、界面活性剤または湿潤剤が、化合物の均一な分散を粗鋼心するために組成物中に含まれる。
【００７８】
組成物は、投与方法に応じて、０．１重量％、好ましくは１０〜６０重量％の活性物質を含有することができる。組成物が単位投与量を含む場合、各々のユニットは、好ましくは、５０〜５００ｍｇの活性成分を含有するだろう。成人に用いられる場合の投与量は、投与経路および頻度に応じて、好ましくは、１日あたり１００〜３０００ｍｇ、例えば１日あたり１５００ｍｇの範囲であるだろう。かかる投与量は、１日あたり１．５〜５０ｍｇ／ｋｇに対応する。適当には、投与量は、１日あたり５〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【００７９】
本発明の化合物の各々の投与の最適な量および間隔は、治療する症状の性質および広がり、投与の形態、経路および部位、および治療する特定の哺乳動物により決定されるだろうこと、およびかかる最適化は、慣用的な方法により決定されうることは、当業者には明らかだろう。治療の最適な方法、すなわち、所定の日数、１日あたりに投与される本発明の化合物の投与回数は、治療決定試験の慣用的な方法を用いて当業者により確認されうることは明らかだろう。
【００８０】
本発明の化合物を上記投与量範囲で投与する場合、毒性効果は示されなかった。
【００８１】
限定するものではないが、本明細書において示される特許および特許出願を含むすべての刊行物は、出典明示により本明細書に組み入れる。
【００８２】
本発明は、以下のさらなる態様を含むことは明らかだろう。第１の態様に関して記載した好ましい具体例は、これらのさらなる態様にまで及ぶ：
ｉ）本発明の化合物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物；
ｉｉ）医薬として用いるための本発明の化合物；
ｉｉｉ）哺乳動物の、慢性腎疾患、急性腎疾患、創傷治癒、関節炎、骨粗鬆症、腎臓病、鬱血性心不全、潰瘍（糖尿病性潰瘍、慢性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を含む）、眼疾患、角膜創、糖尿病性ネフロパシー、神経機能障害、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、腹膜および皮下癒着、線維症が主な要因である疾患（限定するものではないが、肺線維症および肝臓線維症を含む）、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アルコール誘発肝炎、血色素症および原発性胆汁性肝硬変、再狭窄、後腹膜線維症、腸間膜線維症、子宮内膜症、ケロイド、癌、骨機能異常、炎症性障害、瘢痕および光老化から選択される障害の治療または予防方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の化合物を投与することを含む方法；および
ｉｖ）本発明の化合物と、ＡＣＥ阻害剤またはアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストとの組み合わせ。
【００８３】
下記非限定実施例は本発明を説明する。
略語
ＡＰＴＳ−ｐ−トルエンスルホン酸
Ｂｉｎａｐ−２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル
ＣＨ２Ｃｌ２−ジクロロメタン
ＣＤＣｌ３−重クロロホルム
ＣＨ３ＣＮ−アセトニトリル
ＤＭＦ・ＤＭＡ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタール
ＥｔＯＨ−エタノール
ＥｔＯＡｃ−酢酸エチル
ｉＰｒＯＨ−イソプロパノール
ＭｅＯＨ−メタノール
ＮａＯＨ−水酸化ナトリウム
ＮａＨＣＯ３−炭酸水素ナトリウム
Ｎａ２ＳＯ４−硫酸ナトリウム
ＴＨＦ−テトラヒドロフラン
ＴＥＡ−トリエチルアミン
ＤＭＥ−ジメトキシエタン
Ｐｄ／Ｃ−活性炭素担持パラジウム
Ｐｄ２（ｄｂａ）３−トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ−塩化スズ（ＩＩ）二水和物
【００８４】
中間体１：２，４−ジブロモ−ニトロベンゼン
硫酸（２００ｍｌ）中の１，３−ジブロモベンゼン（１０ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、硝酸アンモニウム（３．３９ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を０℃で１０分間撹拌し、ついで、水に注いだ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。ペンタンでトリチュレーションした後、標題化合物を淡黄色固体として得た（８ｇ、６７．２％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：７．９５（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．６（ｄ，１Ｈ）。
【００８５】
中間体２：４−ブロモ−２−（メチルアミノ）−ニトロベンゼン
【化１５】
2006527722.tif 000016
ＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中の中間体１（８ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）の溶液に、水（２００ｍｌ）中のメチルアミン（４０％）を加え、混合物を２時間加熱還流した、ついで、冷却した。得られた沈殿物を濾過し、乾燥した。標題化合物を橙色固体として得た（５ｇ、７６％）；ｍ．ｐ．１３０−１３２℃。
【００８６】
中間体３：４−ブロモ−２−（エチルアミノ）−ニトロベンゼン
【化１６】
2006527722.tif 000017
中間体１（６ｇ、２８ｍｍｏｌ）およびエチルアミン（水中７０％溶液、２００ｍｌ）を、中間体２に関する記載のように反応させて、標題化合物を黄色固体として得た（５ｇ、９９．９％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：８．２５（ｌｓ，１Ｈ），８．１（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，１Ｈ），３．２５（ｍ，２Ｈ），１．３（ｔ，３Ｈ）。
【００８７】
中間体４：４−ブロモ−２−（２−メトキシエチルアミノ）−ニトロベンゼン
【化１７】
2006527722.tif 000018
中間体１（６ｇ、２８ｍｍｏｌ）を、２−メトキシエチルアミンと、中間体２に関する記載のように反応させて、固体として標題化合物を得た（６ｇ、９９．９％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：８．３（ｌｓ，１Ｈ），８．１（ｄ，１Ｈ），７．１（ｓ，１Ｈ），６．８５（ｄ，１Ｈ），３．８（ｍ，２Ｈ），３．６（ｍ，２Ｈ），３．５（ｓ，３Ｈ）。
【００８８】
中間体５：１−メチル−６−ブロモ−ベンズイミダゾール
【化１８】
2006527722.tif 000019
ＥｔＯＨ（２００ｍｌ）中の中間体２（５ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（９．８ｇ、４３ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を４時間加熱還流し、ついで、減圧下で濃縮した。残渣を水（２００ｍｌ）および１ＮのＮａＯＨ（１００ｍｌ）で処理した。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をトルエン（５０ｍｌ）中に溶解し、オルトギ酸トリメチル（２．６ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）およびＡＰＴＳ（０．２ｇ）を加え、混合物を２時間加熱還流し、ついで、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５／５）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。標題化合物をクリーム色粉末として得た（２．５ｇ、５４．７４％）；ｍ．ｐ．１２６−１２８℃。
【００８９】
中間体６：１−エチル−６−ブロモ−ベンズイミダゾール
【化１９】
2006527722.tif 000020
中間体３（５ｇ、２２ｍｍｏｌ）を、中間体５に記載のように反応させて、標題化合物を褐色油として得た（２．３ｇ、４７．２３％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：８．００（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ），４．２５（ｑ，２Ｈ），１．６（ｔ，３Ｈ）。
【００９０】
中間体７：１−（２−メトキシエチル）−６−ブロモ−ベンズイミダゾール
【化２０】
2006527722.tif 000021
酢酸（１００ｍｌ）中の中間体４（６ｇ、２２ｍｍｏｌ）の溶液に、６０℃で、激しく撹拌しながら、鉄（１２ｇ、２２０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６０℃で２時間加熱し、ついで、冷却した。反応混合物を、水酸化ナトリウムを添加することにより塩基性化し、セライトパッドで濾過し、濾液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、トルエン（８０ｍｌ）中に溶解し、オルトギ酸トリメチル（３．５ｍｌ、３２ｍｍｏｌ）およびＡＰＴＳ（０．６ｇ）を加え、混合物を一晩加熱還流した。ついで、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９／１）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。標題化合物を油として得た（６ｇ、９６．０７％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：８．１（ｓ，１Ｈ），７．８（ｄ，１Ｈ），７．７（ｓ，１Ｈ），７．５（ｄ，１Ｈ），４．４（ｔ，２Ｈ），３．８５（ｔ，２Ｈ），３．４（ｓ，３Ｈ）。
【００９１】
中間体８：１−メチル−６−ビニル−ベンズイミダゾール
【化２１】
2006527722.tif 000022
ジオキサン（１００ｍｌ）中の中間体５（２．５ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリブチル（ビニル）スズ（５．２ｍｌ、１８ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．６９ｇ、０．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２４時間加熱還流し、ついで、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５／５）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。標題化合物を油として得た（１．８ｇ、９６．１％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：７．９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，２Ｈ），６．８５（ｄｄ，１Ｈ），５．８（ｄ，１Ｈ），５．２５（ｄ，１Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ）。
【００９２】
中間体９：１−エチル−６−ビニル−ベンズイミダゾール
【化２２】
2006527722.tif 000023
中間体６（２．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、中間体８に関する記載のように反応させて、標題化合物を油として得た（１．５ｇ、８５．３１％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：７．９（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，２Ｈ），６．９５（ｍ，１Ｈ），５．８（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｍ，１Ｈ），４．２（ｑ，２Ｈ），１．５５（ｔ，３Ｈ）。
【００９３】
中間体１０：１−（２−メトキシエチル）−６−ビニル−ベンズイミダゾール
【化２３】
2006527722.tif 000024
中間体７（６ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）を、中間体８に関する記載のように反応させて、標題化合物を油として得た（３．５ｇ、７３．６４％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：７．９５（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．４（ｍ，２Ｈ），６．９（ｍ，１Ｈ），５．８５（ｄ，１Ｈ），５．２５（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｔ，２Ｈ），３．７５（ｔ，２Ｈ），３．３（ｓ，３Ｈ）。
【００９４】
中間体１１：１−メチル−６−ホルミル−ベンズイミダゾール
【化２４】
2006527722.tif 000025
ジオキサン（１００ｍｌ）および水（１４ｍｌ）中の中間体８（１．８ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、四酸化オスミウム（水中の２．５％溶液、６ｍｌ）を加え、混合物を５分間室温にて撹拌した。ついで、過ヨウ素酸ナトリウム（５．１ｇ、２３．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温にて３時間撹拌し、ついで、水に注いだ。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。標題化合物をクリーム色粉末として得た（１ｇ、５５％）；ｍ．ｐ．１３２−１３４℃。
【００９５】
中間体１２：１−エチル−６−ホルミル−ベンズイミダゾール
【化２５】
2006527722.tif 000026
中間体９（１．５ｇ、８．８ｍｍｏｌ）を、中間体１１に関する記載のように反応させて、標題化合物を油として得た（１．３ｇ，８５．６７％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１０．１（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｄ，１Ｈ），７．８５ｄ，１Ｈ），４．３（ｑ，２Ｈ），１．６（ｔ，３Ｈ）。
【００９６】
中間体１３：１−（２−メトキシエチル）−６−ホルミル−ベンズイミダゾール
【化２６】
2006527722.tif 000027
中間体１０（３．５ｇ、１７．３３ｍｍｏｌ）を、中間体１１に関する記載のように反応させて、標題化合物を油として得た（１．３ｇ、３６．７８％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１０．０５（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），８（ｓ，１Ｈ），７．９（ｄ，１Ｈ），７．８（ｄ，１Ｈ），４．４（ｔ，２Ｈ），３．７（ｔ，２Ｈ），３．３（ｓ，３Ｈ）。
【００９７】
中間体１４：（フェニルアミノ−ピリジン−２−イル−メチル）−ホスホン酸ジフェニルエステル
【化２７】
2006527722.tif 000028
ｉＰｒＯＨ（２００ｍｌ）中の２−ピリジンカルボキシアルデヒド（１５ｇ、１４０ｍｍｏｌ）の溶液に、アニリン（１．２等量、１５．６５ｇ、１６８ｍｍｏｌ）および亜リン酸ジフェニル（３７．５ｍｌ、１９７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、３０分間室温にて結晶化させた。イソプロパノール（３００ｍｌ）を加え、混合物を、２時間撹拌した。得られた固体を濾過し、乾燥して、標題化合物を白色固体として得た（５６ｇ、９６．１５％）；ｍ．ｐ．１３０−１３２℃。
【００９８】
中間体１５：［（６−メチルピリジン−２−イル）−フェニルアミノ−メチル］−ホスホン酸ジフェニルエステル
【化２８】
2006527722.tif 000029
６−メチル−２−ピリジンカルボキシアルデヒド（１０ｇ、８３ｍｍｏｌ）を、アニリンおよび亜リン酸ジフェニルと中間体１４に関する記載のように反応させて、標題化合物を白色固体として得た（４０ｇ、９９．５３％）；ｍ．ｐ．１１０−１１２℃。
【００９９】
中間体１６：２−［３−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル］−１−［６−メチルピリジン−２−イル］−エタノン
【化２９】
2006527722.tif 000030
ＴＨＦ（２００ｍｌ）およびｉＰｒＯＨ（２００ｍｌ）中の３−ヒドロキシ−４−ニトロ−ベンズアルデヒド（１５ｇ、９０ｍｍｏｌ）および中間体１５（３８．６２ｇ、９０ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（８８ｇ、２７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にて一晩撹拌した。混合物を、４ＮのＨＣｌを添加することによりｐＨ３に酸性化し、室温にて２時間撹拌し、ついで、水に注いだ。１ＮのＮａＯＨで中和した後、水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（８／２）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。標題化合物を橙色固体として得た（１５ｇ、６１．４％）；ｍ．ｐ．１２８−１３０℃。
【０１００】
中間体１７：２−［３−ヒドロキシ−４−ニトロフェニル］−１−［ピリジン−２−イル］−エタノン
【化３０】
2006527722.tif 000031
４−ニトロ−３−（ｔ−ブチル−ジメチルシリルオキシ）−ベンズアルデヒド（５ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）および中間体１４（７．４ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）を、中間体１６に関する記載のように反応させて、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９８／２）に付して、標題化合物を褐色固体として得た（３ｇ、６４．８５％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１０．５５（ｓ，１Ｈ），８．７（ｄ，１Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ），７．８５（ｔ，１Ｈ），７．５（ｍ，１Ｈ），７．１（ｓ，１Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ），４．５５（ｓ，２Ｈ）。
【０１０１】
中間体１８：２−［４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル］−１−［６−メチルピリジン−２−イル］−エタノン
【化３１】
2006527722.tif 000032
中間体１５（１４．２ｇ、３３ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−３−ニトロ−ベンズアルデヒド（５ｇ、３０ｍｍｏｌ）を、中間体１６に関する記載のように反応させ、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２）に付して、標題化合物を褐色油として得た（３．５ｇ、４２．９７％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１０．２５（ｓ，１Ｈ），８．７（ｄ，１Ｈ），８．２（ｓ，１Ｈ），７．７（ｍ，１Ｈ），７．１５（ｍ，１Ｈ），６．９（ｔ，１Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），４．５（ｓ，２Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ）。
【０１０２】
中間体１９：２−［１−メチル−ベンズイミダゾール−６−イル］−１−［６−メチルピリジン−２−イル］−エタノン
【化３２】
2006527722.tif 000033
中間体１１（３ｇ，１８．８ｍｍｏｌ）および中間体１５（９．６８ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）を、中間体１６に関する記載のように反応させて、固体として標題化合物を得た（１．１ｇ、２２．１４％）；ｍ．ｐ．９６−９８℃。
【０１０３】
中間体２０：２−［１−エチル−ベンズイミダゾール−６−イル］−１−［６−メチルピリジン−２−イル］−エタノン
【化３３】
2006527722.tif 000034
中間体１２（１．３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）および中間体１５（３．８６ｇ、９ｍｍｏｌ）を、中間体１６に関する記載のように反応させて、標題化合物を褐色油として得た（１ｇ、４７．９７％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：７．９（ｓ，１Ｈ），８（ｍ，１Ｈ），７．８５（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｍ，１Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），６．９（ｍ，１Ｈ），４．７（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｑ，２Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｔ，３Ｈ）。
【０１０４】
中間体２１：２−［１−（２−メトキシエチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−１−［６−メチルピリジン−２−イル］−エタノン
【化３４】
2006527722.tif 000035
中間体１３（１．３ｇ、６．４ｍｍｏｌ）および中間体１５（３．２９ｇ、７．６ｍｍｏｌ）を、中間体１６に関する記載のように反応させて、標題化合物を褐色油として得た（１．２ｇ、６０．９４％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：８．００（ｓ，１Ｈ），７．９（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．３（ｍ，１Ｈ），７．１（ｍ，１Ｈ），４．７（ｓ，２Ｈ），４．３（ｔ，２Ｈ），３．７（ｔ，２Ｈ），３．３（ｓ，３Ｈ），２．６（ｓ，３Ｈ）。
【０１０５】
中間体２２：４−［３−ヒドロキシ−４ニトロ−フェニル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化３５】
2006527722.tif 000036
ＴＨＦ（８０ｍｌ）および酢酸（１ｍｌ）中の、中間体１７（２ｇ、７．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ・ＤＭＡ（１．５ｍｌ）を加え、混合物を室温で５時間撹拌した。ついで、ヒドラジン水和物（３ｍｌ）を加え、混合物を室温で５時間撹拌し、ついで、水に注いだ。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５／５）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。標題化合物を褐色固体として得た（１ｇ、４６．１％）；ｍ．ｐ．１７０−１７２℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ２８３ＭＨ＋。
【０１０６】
中間体２３：４−［３−ヒドロキシ−４ニトロ−フェニル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化３６】
2006527722.tif 000037
中間体１６（１ｇ、３．６７ｍｍｏｌ）を、中間体２２に関する記載のように反応させて、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９／１）に付して、標題化合物を固体として得た（１．１ｇ、９９．９％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２９７ＭＨ＋。
【０１０７】
中間体２４：４−［４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェニル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化３７】
2006527722.tif 000038
中間体１８（３．５ｇ、１２．８７ｍｍｏｌ）を、中間体２２に関する記載のように反応させて、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９／１）に付して、標題化合物を黄色油として得た（１．２ｇ、３１．５％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１０．３５（ｓ，１Ｈ），８．２（ｍ，１Ｈ），７．７（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｓ，１Ｈ），７．４（ｍ，２Ｈ），７．２（ｍ，１Ｈ），７．１（ｍ，１Ｈ），２．６（ｓ，３Ｈ）。
【０１０８】
中間体２５：４−［４−アミノ−３−ヒドロキシ−フェニル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化３８】
2006527722.tif 000039
ＥｔＯＨ（１００ｍｌ）およびＴＨＦ（５０ｍｌ）中の中間体２２（１ｇ、３．５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ１０％（１００ｍｇ）を加え、混合物を、室温、１．５気圧下で５時間水素化した。反応混合物をアルゴンでパージし、触媒を濾過し、濾液を減圧下で濃縮した。標題化合物を赤色固体として得た（０．６８ｇ、７６．１％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ：２５３ＭＨ＋。
【０１０９】
中間体２６：４−［４−アミノ−３−ヒドロキシ−フェニル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化３９】
2006527722.tif 000040
中間体２３（１．１ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を、中間体２５に関する記載のように反応させ、標題化合物を橙色油として得た（０．９ｇ、９１．０４％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２６７ＭＨ＋。
【０１１０】
中間体２７：４−［３−アミノ−４−ヒドロキシ−フェニル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化４０】
2006527722.tif 000041
中間体２４（１．２ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）を、中間体２５に関する記載のように反応させ、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９／１）に付して、標題化合物を黄色油として得た（０．５ｇ、４６．３６％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２６７ＭＨ＋。
【０１１１】
中間体２８：４−［４−ヒドロキシ−３−ニトロ−フェニル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール
【化４１】
2006527722.tif 000042
ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍｌ）中の中間体２４（４．４７ｇ、１６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（３．４ｍｌ、２４ｍｍｏｌ）および塩化トリチル（６．８ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１６時間加熱還流し、ついで、水に注いだ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。標題化合物を油として得た（７．５ｇ、８４．２４％）；ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：８．１（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｍ，３Ｈ），７．３５ｔｏ７．１５（ｍ，１５Ｈ），６．９５（ｄ，１Ｈ），６．８（ｄ，１Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ）。
【０１１２】
中間体２９：４−［４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール
【化４２】
2006527722.tif 000043
アセトン（２００ｍｌ）中の中間体２８（７．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（７．３ｇ、２４ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸エチル（４ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にて２時間撹拌し、ついで、水に注いだ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２）により精製した。得られた黄色油（５ｇ、８ｍｍｏｌ）を酢酸（２５０ｍｌ）中に溶解し、鉄（４．５ｇ、８０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６０℃で３時間加熱し、ついで、水に注いだ。混合物を、ＮａＯＨ水溶液で塩基性化し、酢酸エチルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトパッドで濾過し、減圧下で濃縮した。標題化合物を褐色油として得た（３．２ｇ、４２．９８％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ５４９ＭＨ＋および３０７ＭＨ＋（−トリチル）。
【０１１３】
中間体３０：［（３−クロロフェニル）（フェニルアミノ）メチル］ホスホン酸ジフェニルエステル
【化４３】
2006527722.tif 000044
３−クロロ−ベンズアルデヒド（２６．５７ｇ、１８９ｍｍｏｌ）を、アニリンおよび亜リン酸ジフェニルと、中間体１４に関する記載のように反応させて、標題化合物を白色固体として得た（８２．４８ｇ、９９．７％）；ｍ．ｐ．１３０℃。
【０１１４】
中間体３１：１−（３−クロロフェニル）−２−［４−（メトキシ）−３−ニトロフェニル］エタノン
【化４４】
2006527722.tif 000045
中間体３０（２９ｇ、６６．２４ｍｍｏｌ）および４−メトキシ−３−ニトロ−ベンズアルデヒド（１０ｇ、５５．２ｍｍｏｌ）を、中間体１６に関する記載のように反応させて、シリカゲルのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ９／１）に付して、標題化合物をベージュの固体として得た（１６．８ｇ、９９．６％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝３０４ＭＨ−。
【０１１５】
中間体３２：３−（３−クロロフェニル）−４−［４−（メトキシ）−３−ニトロフェニル］−１Ｈ−ピラゾール
【化４５】
2006527722.tif 000046
中間体３１（１０ｇ、３２．７１ｍｍｏｌ）を、中間体２２に関する記載のように反応させて、シリカゲルのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ９／１）に付して、標題化合物を黄色固体として得た（１０．２ｇ、９４．６％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝３２８ＭＨ−。
【０１１６】
中間体３３：３−（３−クロロフェニル）−４−［４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニル］−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール
【化４６】
2006527722.tif 000047
ＤＭＦ（１２０ｍＬ）中の中間体３２（１０ｇ、３０．３ｍｍｏｌ）および塩化リチウム（１２．８５ｇ、３０３ｍｍｏｌ）の混合物を、１６時間加熱還流した。反応混合物を、塩化アンモニウムでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。シリカゲルのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ  ９／１）した後、３−（３−クロロフェニル）−４−［４−（ヒドロキシ）−３−ニトロフェニル］−１Ｈ−ピラゾールを、黄色固体として（９．５ｇ）得た。この化合物を、さらに精製することなく次の工程で反応させた。ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の３−（３−クロロフェニル）−４−［４−（ヒドロキシ）−３−ニトロフェニル］−１Ｈ−ピラゾール（９．５ｇ、３０．３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（４．６ｍｌ、４５．４５ｍｍｏｌ）および塩化トリチル（１２．６７ｇ、４５．４５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にて１８時間撹拌し、ついで、水に注いだ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。標題化合物を。シリカゲルのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ  ９／１）に付して、黄色固体として得た（５．４ｇ、３２％）。ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：１０．４８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝２．２６Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝１．７０，１．７０Ｈｚ，１Ｈ），７．４０−７．１３（ｍ，２０Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．６７Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１１７】
中間体３４：（｛４−［３−（３−クロロフェニル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ニトロフェニル｝オキシ）酢酸エチル
【化４７】
2006527722.tif 000048
アセトン（１３０ｍｌ）中の中間体３３（５．８ｇ、１０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（４．６７ｇ、１４．３３ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸エチル（１．６ｍＬ、１４．３３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温にて２４時間撹拌し、ついで、水に注いだ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ９／１）により溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を黄色固体として得た（６．６ｇ，９８．６％）。ＮＭＲ Ｈ１（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ｐｐｍ）δ：７．７８（ｄ，Ｊ＝２．２６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１−７．４８．（ｍ，１Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．１７（ｍ，２０Ｈ），６．９０（ｄ，Ｊ＝８．６７Ｈｚ，１Ｈ），４．７７（ｓ，２Ｈ），４．７９（ｑ，Ｊ＝７．１６Ｈｚ，２Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．１６Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１１８】
実施例
実施例１：４−［１−エチル−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化４８】
2006527722.tif 000049
ＴＨＦ（８０ｍｌ）および酢酸（０．３ｍｌ）中の中間体２０（０．５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ・ＤＭＡ（０．４ｍｌ）を加え、混合物を室温にて４時間撹拌した。ついで、ヒドラジン水和物（０．７ｍｌ）を加え、混合物を、室温にて４８時間撹拌し、ついで、水に注いだ。水相をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９／１）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。酢酸エチルから再結晶した後、標題化合物をクリーム色結晶として得た（０．１７ｇ、３１．３１％）；ｍ．ｐ．１８２−１８４℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝３０４ＭＨ＋。
【０１１９】
実施例２：４−［１−（２−メトキシエチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化４９】
2006527722.tif 000050
中間体２１（０．６ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を、実施例１に記載のように反応させて、エタノールから結晶化して、標題化合物を結晶として得た（０．３ｇ、４７．４１％）；ｍ．ｐ．１７２−１７４℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝３３４ＭＨ＋。
【０１２０】
実施例３：４−［１−（メチル）−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５０】
2006527722.tif 000051
中間体１９（０．５ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を、実施例１に記載のように反応させて、ペンタンでトリチュレーションした後、標題化合物を固体として得た（０．２１ｇ、３８．５１％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２９０ＭＨ＋。
【０１２１】
実施例４：４−［２−（メチル）−ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５１】
2006527722.tif 000052
ＥｔＯＨ（２０ｍｌ）中の中間体２５（０．５０４ｇ、２ｍｍｏｌ）の溶液に、エチルアセチミダート塩酸塩（０．２４７ｇ、２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、４時間加熱還流し、ついで、濃縮した。残渣を水およびＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９／１）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した。ペンタンでトリチュレーションした後、標題化合物をクリーム固体として得た（０．４２ｇ、７６．１％）；ｍ．ｐ．１３８−１４０℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２７７ＭＨ＋。
【０１２２】
実施例５：４−［２−（メチル）−ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５２】
2006527722.tif 000053
中間体２６（０．４５ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）およびエチルアセチミダート塩酸塩（０．３１５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を、実施例４に記載のように反応させて、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９／１）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーに付して、標題化合物をクリーム色の油として得た（０．３ｇ、６１．１５％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２９１ＭＨ＋。
【０１２３】
実施例６：４−［ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［ピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５３】
2006527722.tif 000054
中間体２５（０．５０４ｇ、２ｍｍｏｌ）およびホルムイミド酸エチル塩酸塩（０．２１９ｇ、２ｍｍｏｌ）を、実施例４に記載のように反応させて、ペンタンでトリチュレーションした後、標題化合物をクリーム色の固体として得た（０．２７ｇ、５１．５３％）；ｍ．ｐ．１７６−１７８℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２６３ＭＨ＋−。
【０１２４】
実施例７：４−［ベンゾキサゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５４】
2006527722.tif 000055
中間体２６（０．４５ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）およびホルムイミド酸エチル塩酸塩（０．２７８ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を、実施例４に記載のように反応させて、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９／１）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーに付して、標題化合物をクリーム色の油として得た（０．１４ｇ、２９．９８％）；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２７７ＭＨ＋。
【０１２５】
実施例８：４−［ベンゾキサゾール−５−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５５】
2006527722.tif 000056
中間体２７（０．２５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）およびホルムイミド酸エチル塩酸塩（０．１５５ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を、実施例４に記載のように反応させて、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２から結晶化して、標題化合物を黄色結晶として得た（０．１ｇ、３８．５５％）；ｍ．ｐ．２３６−２３８℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２７７ＭＨ＋。
【０１２６】
実施例９：４−［２−メチル−ベンゾキサゾール−５−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール
【化５６】
2006527722.tif 000057
中間体２７（０．２５ｇ、０．９４ｍｍｏｌ）およびエチルアセチミダート塩酸塩（０．１５４ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を、実施例４に記載のように反応させて、ＣＨ３ＣＮ／ＣＨ２Ｃｌ２から結晶化して、標題化合物を黄色結晶として得た（０．０４ｇ、１４．６７％）；ｍ．ｐ．２０８−２１０℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ＝２９１ＭＨ＋。
【０１２７】
実施例１０：４−［４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール
【化５７】
2006527722.tif 000058
アセトン（６０ｍｌ）中の中間体２９（１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（０．８８ｇ、２．７ｍｍｏｌ）およびヨウ化メチル（０．１７ｍｌ、２．７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を６０℃で４時間加熱し、ついで、水に注いだ。ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、メタノール（５０ｍｌ）および１ＮのＨＣｌ（１５ｍｌ）中に溶解し、混合物を３時間加熱還流した。冷却して、混合物を水に注ぎ、１ＮのＮａＯＨの溶液で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５／５）により精製した。ペンタンでトリチュレーションした後、標題化合物をクリーム色の固体として得た（０．１ｇ、１７．１２％）；ｍ．ｐ．２０４−２０６℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ３２１ＭＨ＋。
【０１２８】
実施例１１：４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール
【化５８】
2006527722.tif 000059
中間体２９（１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を、ヨウ化エチルと、実施例１０に記載のように反応させて、ペンタンでトリチュレーションした後、標題化合物をクリーム色の固体として得た（０．１６ｇ、２６．２５％）；ｍ．ｐ．１８２−１８４℃；［ＡＰＣＩＭＳ］ｍ／ｚ３３５ＭＨ＋。
【０１２９】
実施例１２：４−［４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール
【化５９】
2006527722.tif 000060
中間体３４（６．５ｇ、１０．０９ｍｍｏｌ）を酢酸（３００ｍｌ）中に６０℃で溶解し、鉄（５．６ｇ、１００．９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、６０℃で３時間撹拌し、ついで、水に注いだ。酢酸エチルで抽出した後、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、セライトパッドで濾過し、減圧下で濃縮した。シリカゲルのクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を白色固体として得た（３ｇ、９１．５％）；［ＥＳＭＳ］ｍ／ｚ＝３２６ＭＨ＋。
【０１３０】
実施例１３：４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピラゾール
【化６０】
2006527722.tif 000061
実施例１３（３ｇ、９．２３ｍｍｏｌ）を、トリエチルアミン（１．９５ｍｌ、１３．８５ｍｍｏｌ）および塩化トリチル（３．８６ｇ、１３．８５ｍｍｏｌ）と反応させ、混合物を２４時間加熱還流した。反応混合物を、水中に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮して、シリカゲルのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ  ９／１）に付して、４−［４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾールを黄色固体として得た。ＤＭＦ（５０ｍｌ）中の４−［４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール（５．３６ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸セシウム（４．６１ｇ、１４．１５ｍｍｏｌ）およびヨウ化エチル（１．１３ｍｌ、１４．１５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にて一晩撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ  ６／４）により精製して、４−［４−エチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（３−クロロフェニル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾールを白色固体として得た。この化合物（４．２ｇ）を、ＭｅＯＨ／１ＮＨＣｌ（３／２、８０ｍｌ）の混合物と反応させて、反応混合物を、３時間加熱還流した。冷却して、混合物を水に注ぎ、１ＮのＮａＯＨの溶液で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルのクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５／５）により精製して、標題化合物をアセトニトリルから再結晶して、白色固体として得た（１．６ｇ、４８％）；ｍ．ｐ．１６２℃；［ＥＳＭＳ］ｍ／ｚ＝３５４ＭＨ＋。
【０１３１】
生物学
本発明の化合物の生物学的活性は、下記のアッセイを用いて評価することができる。
【０１３２】
アッセイ１（細胞転写アッセイ）
本発明の化合物がＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する可能性は、例えば、下記のインビトロアッセイを用いて示すことができる。
該アッセイは、ルシフェラーゼ（ホタル）レポーター遺伝子に連結したＰＡＩ−１プロモーター（強力なＴＧＦ−β応答プロモーターとして知られている）で安定にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞において行った。化合物は、ＴＧＦ−βに曝露された細胞におけるルシフェラーゼ活性を阻害する能力に関して選択された。さらに、細胞を、ＴＧＦ−β応答プロモーターにより動かされず、毒性対照として用いられる第２のルシフェラーゼ（ウミシイタケ）遺伝子でトランスフェクトした。
【０１３３】
マルチドロップ装置を用いて、安定にトランスフェクトされた細胞株を２００μｌの血清含有培地中１ウェルあたり３５０００細胞の濃度で、９６ウェルマイクロプレートに播種した。これらのプレートを細胞インキュベーター中に置いた。
【０１３４】
１８〜２４時間後（２日目）、細胞インキュベーション法を開始した。細胞を、ＴＧＦ−βおよび５０ｎＭ〜１０μＭ（ＤＭＳＯ１％の最終濃度）の濃度範囲の候補化合物と一緒にインキュベートした。該試験に用いられたＴＧＦ−β（ｒｈＴＧＦβ−１）の最終濃度は、１ｎｇ／ｍＬであった。細胞を候補化合物と一緒に１５〜３０分インキュベートし、ついで、ＴＧＦ−βを添加した。試験反応物の最終容量は１５０μｌであった。各々のウェルは、ただ１つの候補化合物を含有し、そのＰＡＩ−１プロモーターに対する効果をモニターした。
【０１３５】
カラム１１および１２を対照として用いた。カラム１１は８ウェルを含み、その中で細胞を、ＴＧＦ−βの存在下、候補化合物を用いずにインキュベートした。カラム１１を用いて、「参照ＴＧＦ−β誘導性ホタルルシフェラーゼ値」を決定し、該値と試験ウェル（阻害活性を定量するための）における測定値を比較した。ウェルＡ１２〜Ｄ１２中において、細胞をＴＧＦ−β不含培地で増殖した。これらの位置から得られたホタルルシフェラーゼ値は、「基底ホタルルシフェラーゼ活性」を表す。ウェルＥ１２〜Ｈ１２中において、細胞を、ＴＧＦ−βおよび５００μＭの細胞毒性化合物ＣＰＯ（シクロペンテノン、Ｓｉｇｍａ）の存在下で培養した。毒性は、減少したホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性（カラム１１において得られた活性の約５０％）により示した。
【０１３６】
１２〜１８時間後（３日目）、ルシフェラーゼ定量法を開始した。デュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ・キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られた試薬を用いて、下記の反応を行った。細胞を洗浄し、１０μｌのＰａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。振盪（１５〜３０分）後、プレートのルシフェラーゼ活性を、デュアル−インジェクター・ルミノメーター（ＢＭＧ ｌｕｍｉｓｔａｒ）で読み取った。この目的のため、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬および５０μｌの「Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ」バッファーを連続的に注入して、両方のルシフェラーゼ活性を定量した。適当なソフトウェアを用いて、該測定から得られたデータを、処理し、分析した。ウェルＡ１１〜Ｈ１１（カラム１１、ＴＧＦ−βのみ）において得られた平均ルシフェラーゼ活性値は、１００％を示すと考え、ウェルＡ１２〜Ｄ１２（培地のみにおける細胞）において得られた値は基底レベル（０％）を与えると考えた。試験した各々の化合物に関して、濃度応答曲線を構築し、それからＩＣ５０値をグラフを用いて決定した。
【０１３７】
アッセイ２（Ａｌｋ５蛍光偏光アッセイ）
フルオロフォアに結合したキナーゼ阻害化合物を蛍光リガンドとして用いて、他の化合物の所定のキナーゼへのＡＴＰ競合的結合をモニターすることができる。該結合リガンドの溶液中への放出によって引き起こされる平面偏光の偏光解消の増加が偏光／異方性値として測定される。該プロトコールは、組み換え型ＧＳＴ−ＡＬＫ５（残基１９８−５０３）を用いるアッセイのためのローダミングリーン標識リガンドの使用を詳述する。
【０１３８】
アッセイバッファー成分：６２．５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）（Ｓｉｇｍａ Ｈ−４０３４）、１ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ Ｄ−０６３２）、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ Ｍ−９２７２）、１．２５ｍＭのＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃ−３０２３）
【０１３９】
プロトコール：固形化合物ストックを１００％ＤＭＳＯ中に１ｍＭ濃度まで溶解し、Ｕ底の９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３３６５）のカラム１、Ａ−Ｈ列に移して化合物プレートを作成した。該プレートのカラム１１まで化合物を連続希釈（１００％ＤＭＳＯ中３倍）して、各試験化合物につき１１段階の濃度を得た。カラム１２はＤＭＳＯのみを含有した。Ｒａｐｉｄｐｌａｔｅ（登録商標）−９６を用いて、各ウェルから１μｌの試料をＵ底の黒色９６ウェル未処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３７９２）中に移して、アッセイプレートを作成した。
【０１４０】
最終ＡＬＫ５濃度が該酵素の活性部位滴定に基づいて１０ｎＭになるように、ＡＬＫ５を上記成分および１ｎＭのローダミングリーン標識リガンドを含有するアッセイバッファーに加えた。該酵素／リガンド試薬（３９μｌ）を予め調製したアッセイプレートの各ウェルに添加した。低対照値のために、対照化合物（１μｌ）をカラム１２のＥ−Ｈ列に添加した。直ちに該プレートを、各々、４８５ｎｍ、５３０ｎｍおよび５０５ｎｍの励起、発光およびダイクロイック・フィルターを有するＬＪＬ  Ａｃｑｕｅｓｔ蛍光リーダー（Molecular Devices, serial number AQ1048）上で読み取った。各ウェルの蛍光偏光をＡｃｑｕｅｓｔリーダーによって算出し、ついで、濃度応答曲線の構築のための曲線適合ソフトウェア中に取り込んだ。標準化した応答は、高対照（カラム１２、Ａ−Ｄ列中における１μｌのＤＭＳＯ）および低対照（カラム１２、Ｅ−Ｈ列中における１μｌ対照化合物）に相対的に決定された。ついで、ＩＣ５０値を各化合物につき算出した。
【０１４１】
上記のアッセイを用いて、本発明のすべての実施例が、ＡＬＫ５受容体のモジュレーター活性（１〜１００ｎＭの範囲のＩＣ５０値を有する）およびＴＧＦ−β細胞活性（０．００１〜１０μＭの範囲のＩＣ５０値を有する）を示す。
【０１４２】
４−［１−エチル−ベンズイミダゾール−６−イル］−３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾール（実施例１）は、２５ｎＭのＡＬＫ５受容体モジュレーター活性および２０ｎＭのＴＧＦ−β細胞活性を示した。
【０１４３】
４−［４−メチル−４Ｈ−ベンゾ［１，４］オキサジン−３−オン−６−イル］−３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール（実施例１０）は、３２ｎＭのＡＬＫ５受容体モジュレーター活性および２０ｎＭのＴＧＦ−β細胞活性を示した。
【国際調査報告】
2006527722.tif 000063
2006527722.tif 000064
2006527722.tif 000065
2006527722.tif 000066