(57)【要約】マスト細胞又は好塩基性細胞化学走性に影響するヒスタミン受容体モジュレーターの同定のための方法ならびに喘息及び／又はアレルギー応答あるいは喘息又はアレルギー応答により調節されるか、影響されるか、又は引き起こされる疾患及び／又は状態の予防、処置、誘導又は他の所望の調節のためのそのようなヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの使用を開示する。マスト細胞又は好塩基性細胞化学走性応答、例えば特定の部位への移動あるいはマスト細胞又は好塩基性細胞化学走性により調節されるか、影響されるか、又は引き起こされる疾患及び／又は状態の予防、処置、誘導又は他の所望の調節のためのヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの使用も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性の推定モジュレーター化合物を哺乳類ヒスタミンＨ４受容体及び既知のヒスタミン受容体Ｈ４リガンドと合わせ；
ｂ）タンパク質機能又はリガンドに結合するその能力へのモジュレーターの効果を測定する（ここで該効果は阻害、活性化、アンタゴニスト、アゴニスト及び逆アゴニスト活性より成る群から選ばれる調節である）
ことを含んでなる哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性を調節する化合物の同定の方法であって、該モジュレーター化合物がマスト細胞化学走性又は好塩基性細胞化学走性のモジュレーターである方法。
【請求項２】
段階ｂ）で測定される効果が、受容体への結合に関する段階ａ）のモジュレーターと既知のヒスタミン受容体Ｈ４リガンドの間の競合による阻害である請求項１の方法。
【請求項３】
段階ｂ）で測定される効果がヒスタミンＨ４受容体細胞内二次メッセンジャーの調節である請求項１の方法。
【請求項４】
細胞内二次メッセンジャーがｃＡＭＰ、カルシウム及びリポーター遺伝子産物より成る群から選ばれる請求項３の方法。
【請求項５】
該化合物がマスト細胞化学走性のモジュレーターである請求項１の方法。
【請求項６】
該化合物が好塩基性細胞化学走性のモジュレーターである請求項１の方法。
【請求項７】
請求項１の方法を用いて同定される化合物であって、生体内もしくは試験管内における哺乳類ヒスタミンＨ４受容体機能の阻害剤ならびにマスト細胞化学走性又は好塩基性細胞化学走性の阻害剤である化合物。
【請求項８】
請求項１の方法を用いて同定される化合物であって、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体のアゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストである化合物。
【請求項９】
請求項１の方法を用いて同定される化合物であって、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードする遺伝子の発現を調節する化合物。
【請求項１０】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体であって、マスト細胞化学走性又は好塩基性細胞化学走性を調節する抗体。
【請求項１１】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質のヒスタミン結合又は活性化を妨げる請求項１０の抗体。
【請求項１２】
請求項１の方法において活性な化合物及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなり、ここで該化合物が喘息又はアレルギー応答のモジュレーターである製薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１２の製薬学的組成物の投与を含んでなる、喘息又はアレルギー応答あるいは喘息又はアレルギー応答及びヒスタミンＨ４受容体により媒介される疾患もしくは状態を調節する処置の必要のある患者の処置の方法。
【請求項１４】
請求項１の方法において活性な化合物及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなり、ここで該化合物がマスト細胞化学走性のモジュレーターである製薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１４の製薬学的組成物の投与を含んでなる、喘息又はアレルギー応答あるいはマスト細胞化学走性及びヒスタミンＨ４受容体により媒介される疾患もしくは状態を調節する処置の必要のある患者の処置の方法。
【請求項１６】
請求項１の方法において活性な化合物及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなり、ここで該化合物が好塩基性細胞化学走性のモジュレーターである製薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１６の製薬学的組成物の投与を含んでなる、喘息又はアレルギー応答あるいは好塩基性細胞化学走性及びヒスタミンＨ４受容体により媒介される疾患もしくは状態を調節する処置の必要のある患者の処置の方法。
【請求項１８】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性を調節する化合物及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなり、該化合物が試験管内もしくは生体内におけるマスト細胞もしくは好塩基性細胞化学走性のモジュレーターである製薬学的組成物。
【請求項１９】
化合物がマスト細胞化学走性を阻害する請求項１８の製薬学的組成物。
【請求項２０】
化合物が好塩基性細胞化学走性を阻害する請求項１８の製薬学的組成物。
【請求項２１】
化合物が哺乳類ヒスタミンＨ４受容体のアゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストである請求項１８の製薬学的組成物。
【請求項２２】
化合物が哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードする遺伝子の発現を調節する請求項１８の製薬学的組成物。
【請求項２３】
化合物がさらに試験管内もしくは生体内で好酸球の形の変化を調節する請求項１８の製薬学的組成物。
【請求項２４】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性を調節する化合物及び製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物の投与を含んでなる、喘息又はアレルギー応答あるいはマスト細胞もしくは好塩基性細胞化学走性及びヒスタミンＨ４受容体により媒介される疾患もしくは状態を調節する処置の必要のある患者の処置の方法であって、該化合物が試験管内もしくは生体内におけるマスト細胞もしくは好塩基性細胞化学走性のモジュレーターである方法。
【請求項２５】
製薬学的組成物がマスト細胞化学走性を阻害する化合物を含む請求項２４の方法。
【請求項２６】
製薬学的組成物が好塩基性細胞化学走性を阻害する化合物を含む請求項２４の方法。
【請求項２７】
製薬学的組成物が哺乳類ヒスタミンＨ４受容体のアゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストである化合物を含む請求項２４の方法。
【請求項２８】
製薬学的組成物が哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードする遺伝子の発現を調節する化合物を含む請求項２４の方法。
【請求項２９】
製薬学的組成物が試験管内又は生体内で好酸球の形の変化を調節する化合物を含む請求項２４の方法。
【請求項３０】
ａ）ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターとして調べられている試験化合物の存在下もしくは不在下で、マスト細胞のヒスタミンに向かう動きを可能にする条件下でマスト細胞をヒスタミンに近接して置き；
ｂ）ヒスタミンに向かうマスト細胞の動きへのヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの効果を測定する（ここでヒスタミンに向かうマスト細胞の動きの速度におけるか、あるいはヒスタミンに向かって動くマスト細胞の数における増加もしくは減少が、ヒスタミンへのマスト細胞のヒスタミンＨ４受容体−媒介化学走性を試験化合物が調節することの指標となる）
ことを含んでなる、ヒスタミンへのマスト細胞の哺乳類ヒスタミンＨ４受容体−媒介化学走性を調節する化合物の同定の方法。
【請求項３１】
ａ）ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターを用いる予備−処置の存在下もしくは不在下で、モジュレーターの不在下では哺乳類の気管においてあらかじめ決められた量の上皮−下マスト細胞蓄積を生ずるであろう管理下に、ヒスタミン又はアレルゲンを含んでなるエアゾールに哺乳類を暴露し；
ｂ）ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの存在下及び不在下における哺乳類の気管中の上皮−下マスト細胞蓄積を比較し、モジュレーターの不在下と比較される時のモジュレーターの存在下における上皮−下マスト細胞蓄積の変化を、ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターが、ヒスタミン又はアレルゲンへの暴露に応答した哺乳類の気管におけるマスト細胞の上皮−下蓄積を調節することの指標とする
ことを含んでなる、ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターがヒスタミンもしくはアレルゲンへの暴露に応答した哺乳類気管におけるマスト細胞の上皮−下蓄積を調節するか否かの決定の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
これは、２００２年９月６日に申請された米国暫定出願公開第６０／４０８，７３６号明細書の利益を主張し、それは引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。関連出願には、２００２年３月８日に申請された米国特許出願公開第１０／０９４，３５７号明細書、２００２年９月６日に申請された米国暫定出願公開第６０／４０８，５６９号明細書及び２００２年９月６日に申請された米国暫定出願公開第６０／４０８，５７９号明細書が含まれ、それらの開示は引用することによりそれらの全体が本明細書の内容となる。
発明の分野
本発明は、アレルギー応答、喘息あるいは喘息もしくはアレルギー応答により調節されるか、影響されるかもしくは引き起こされる疾患及び／又は状態の予防、処置、誘導あるいは他の望ましい調節のためのヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒスタミンは、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を介して細胞内経路に連結する細胞表面受容体を介して信号する多機能化学伝達物質である。この種類のヒスタミン結合細胞表面受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体又はＧＰＣＲと呼ばれる受容体の広い群の一部である。現在、薬理学的に定義され、且つＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ４類別（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）に分類されている４つのヒスタミン受容体のサブタイプがある（非特許文献１；非特許文献２）。Ｈ１ヒスタミン受容体はクローニングされており（非特許文献３）、アレルギー応答における平滑筋へのヒスタミンの効果を遮断するためのジフェンヒドラミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ）のような薬剤の標的である。Ｈ２ヒスタミン受容体はクローニングされており（非特許文献４）、胃における酸分泌へのヒスタミンの効果を遮断するためのラニチジン（ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ）のような薬剤の標的である。１９８３年（非特許文献５）に存在すると仮定されたＨ３ヒスタミン受容体はクローニングされており（非特許文献６）、現在、中枢神経系薬剤の開発のための標的である。ヒトにおいては、未知の種類のヒスタミン受容体により媒介され得る多数の追加のヒスタミンの機能があり、例えばヒスタミンは喘息において役割を果たすことが知られているが、Ｈ１及びＨ２ヒスタミン受容体を標的とする現在の抗ヒスタミン薬は、喘息の処置において、もしあったとしても小さい利用性しか有していない（非特許文献７）。
【非特許文献１】Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，４９（３），１９９７年，２５３−２７８
【非特許文献２】Ｈｏｕｇｈ著，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，２００１年，４１５−４１９
【非特許文献３】Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８（２４），１９９１年，１１５１５−１１５１９
【非特許文献４】Ｇａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８（２），１９９１年，４２９−４３３
【非特許文献５】Ａｒｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３０２（５９１１），１９８３年，８３２−８３７
【非特許文献６】Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５，１９９９年，１１０１−１１０７
【非特許文献７】Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，２１，２００１年，２８Ｓ−３３Ｓ
【発明の開示】
【０００３】
発明の概略
本発明は、喘息及び／又はアレルギー応答ならびに喘息及び／又はアレルギー応答により媒介される疾患及び状態の処置及び／又は予防のためヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの使用に関する。ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターがＨ４受容体活性のアゴニストであるか、逆アゴニスト（ｉｎｖｅｒｓｅ  ａｇｏｎｉｓｔ）であるか、又はアンタゴニストであるかに依存して、ヒスタミンＨ４受容体のモジュレーターを、アレルギー応答の誘導ならびに阻害を含む哺乳類におけるアレルギー応答の調節のために用いることができる。白血球、好塩基性細胞、好酸球又はマスト細胞により媒介される喘息及びアレルギー応答は、ヒスタミンＨ４受容体のアンタゴニスト又は阻害剤を用いる処置により阻害される。
【０００４】
１つの態様において本発明は、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性の推定モジュレーター化合物を哺乳類ヒスタミンＨ４受容体及び既知のヒスタミン受容体Ｈ４リガンドと合わせ；Ｈ４受容体タンパク質機能又はリガンドに結合するその能力へのモジュレーターの効果を測定し、ここで効果は阻害、活性化、アンタゴニスト、アゴニスト又は逆アゴニスト活性であることを含んでなり、ここで該モジュレーター化合物がマスト細胞化学走性のモジュレーターである、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性を調節する化合物の同定の方法を提供する。
【０００５】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体も提供し、ここで該抗体はマスト細胞化学走性を調節する。
【０００６】
他の側面において本発明は、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質活性の推定モジュレーター化合物を哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質及び既知のヒスタミン受容体Ｈ４リガンドと合わせ；タンパク質機能又はリガンドに結合するその能力へのモジュレーターの効果を測定し、ここで該効果は阻害、活性化、アンタゴニスト、アゴニスト又は逆アゴニスト活性であることを含んでなり、ここで該モジュレーター化合物が好塩基性細胞化学走性のモジュレーターである、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質活性を調節する化合物の同定の方法を提供する。
【０００７】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質と免疫学的に反応性の単一特異性抗体も提供し、ここで該抗体は試験管内又は生体内で好塩基性細胞化学走性を調節する。
【０００８】
本発明はそのいくつかの側面の１つにおいて、ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの存在下もしくは不在下で、マスト細胞がヒスタミンに向かって動くことを可能にする条件下でマスト細胞をヒスタミンに近接して置き；ヒスタミンに向かうマスト細胞の動きへのヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの効果を測定し、ここでヒスタミンに向かうマスト細胞の動きの速度におけるか、あるいはヒスタミンに向かって動くマスト細胞の数における増加もしくは減少が、ヒスタミンへのマスト細胞のヒスタミンＨ４受容体−媒介化学走性を試験化合物が調節することの指標であることを含んでなる、ヒスタミンへのマスト細胞の哺乳類ヒスタミンＨ４受容体−媒介化学走性を調節する化合物の同定の方法を提供する。
【０００９】
他の側面において本発明は、ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターがヒスタミンもしくはアレルゲンへの暴露に応答した哺乳類気管におけるマスト細胞の上皮−下蓄積を調節するか否かの決定の方法を提供し、該方法はヒスタミンＨ４受容体モジュレーターを用いる予備−処置の存在下もしくは不在下で、モジュレーターの不在下では哺乳類の気管においてあらかじめ決められた量の上皮−下マスト細胞蓄積を生ずるであろう管理下に、ヒスタミン又はアレルゲンを含んでなるエアゾールに哺乳類を暴露し；ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの存在下及び不在下における哺乳類の気管中の上皮−下マスト細胞蓄積の量を比較し、モジュレーターの不在下と比較される時のモジュレーターの存在下におけるマスト細胞蓄積の変化は、ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターが、ヒスタミン又はアレルゲンへの暴露に応答した哺乳類の気管におけるマスト細胞の上皮−下蓄積を調節することの指標であることを含んでなる。
【００１０】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の図、詳細な記述及び実施例を参照することにより理解されるであろう。
図面の簡単な記述
図１：ヒスタミンに応答したマウス骨髄−由来マスト細胞化学走性。
【００１１】
図２：ヒスタミンに応答したマウス骨髄−由来マスト細胞の化学走性は、ヒスタミンＨ４受容体−特異的アンタゴニストにより遮断され得るが、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３受容体アンタゴニストによっては遮断されない。
【００１２】
図３：ヒスタミンに応答したマウス骨髄−由来マスト細胞の化学走性は、３８ｎＭのＩＣ５０を有するヒスタミンＨ４受容体−特異的アンタゴニストにより遮断され得る。
【００１３】
図４：マウス気管におけるマスト細胞の生体内ヒスタミン−誘導蓄積は、ヒスタミンＨ４受容体−特異的アンタゴニストにより妨げられ得る。
【００１４】
図５：Ｈ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いて処置されたマウスにおける、オボアルブミン−誘導肺炎症モデルからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の示差細胞カウント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）。Ｓｔｕｄｅｎｔの非対ｔ−テストからのｐ−値は以下の通りに示される：＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。図５Ａ：処置に関して用いられる記号は以下の通りである：
【００１５】
【表１】
2006510590.tif 000002
【００１６】
図５Ｂ：処置に関して用いられる記号は以下の通りである：
【００１７】
【表２】
2006510590.tif 000003
【００１８】
図６：Ｈ４受容体アンタゴニスト（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いて処置されたマウスにおける、オボアルブミン−誘導肺炎症モデルからのＢＡＬ液中の示差細胞カウント。Ｓｔｕｄｅｎｔの非対ｔ−テストからのｐ−値は以下の通りに示される：＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。処置に関して用いられる記号は以下の通りである：
【００１９】
【表３】
2006510590.tif 000004
【００２０】
図７：マウス（ｎ＝８）中のオボアルブミン−誘導肺炎症モデルにおける気道高−反応性へのＨ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンの効果。Ｓｔｕｄｅｎｔの非対ｔ−テストからのｐ−値は以下の通りに示される：＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。処置に関して用いられる記号は以下の通りである：
【００２１】
【表４】
2006510590.tif 000005
【００２２】
本発明の詳細な記述及び好ましい態様
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ分子はクローニング及び特性化されており、且つＧタンパク質共役型受容体の種類のメンバーに相当する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．著，（２００１）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５９，２００１年，４２０−４２６；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，２９９（１），２００１年，１２１−１３０）。組換え発現系を用い、これらのヒスタミンＨ４受容体をコードする機能性ＤＮＡ分子がマウス、ラット、モルモット及びヒトから単離された。組換えタンパク質は、ヒトヒスタミンＨ４受容体のモジュレーターの同定を含むがこれに限られない多様な目的のために有用である。
【００２３】
マウス、ラット及びモルモットのヒスタミンＨ４受容体は、種々の哺乳類の種の間で観察される薬理学的差の解決を含むがこれに限られない多様な用途を有し、それは特にモルモット、ラット及びネズミの種が通常、モジュレーターとして機能する新規な化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の臨床前評価において用いられるからである。そのようなモジュレーターには例えばアゴニスト、アンタゴニスト及び逆アゴニストが含まれ得る。本明細書で開示されるアッセイで同定されるモジュレーターは、例えば治療薬、予防薬及び診断薬として有用である。そのような治療薬に関する適応症には、喘息、アレルギー、炎症、心臓血管及び脳血管障害、インスリン非依存性糖尿病、高血糖症、便秘症、不整脈、神経内分泌系の障害、ストレス及び痙性ならびに酸分泌、潰瘍、気道収縮及び前立腺機能不全が含まれるが、これらに限られない。特定の態様において、Ｈ４受容体の発現、活性又は接近性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を下方−調節する（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）モジュレーターは、アレルギー性鼻炎及び／又は喘息の処置のための治療薬として用いられる。本明細書で用いられる場合、「ヒトヒスタミンＨ４受容体」という用語は、ヒスタミンに関する特異的受容体として機能することができるＨ４サブクラスのタンパク質を指す。
【００２４】
アレルギー及び喘息は、最も普通の呼吸の問題の２つである。アレルギーは典型的にくしゃみ、水鼻（ｒｕｎｎｙ  ｎｏｓｅ）、かゆい目又は涙目及び鼻のうっ血により特徴付けられる。より重症のアレルギーは、重要性が増す追加の症状を伴い得る。ほとんどの場合、アレルギーは環境的アレルゲンへの暴露、例えば花粉、ほこりダニ、カビ胞子又は動物のふけのような空気で運ばれるアレルゲンの吸入により引き金を引かれる。他のアレルゲンは食物又は飲料と一緒に摂取される。アレルギーと同様に、喘息はアレルゲンの吸入により引き起こされ得るが、それは非特異的刺激物及び運動のような他の因子によっても引き起こされ得る。それは、それが気道の炎症、気管支の高−反応性及び気道閉塞を特徴とする点でアレルギーと異なる。喘息の症状は、典型的にはぜん鳴、せき、胸苦しさ（ｃｈｅｓｔ  ｔｉｇｈｔｎｅｓｓ）及び息切れを含む。
【００２５】
ＩｇＥ及びマスト細胞は、アレルギー及び喘息の両方において重要な役割を果たす。事実、マスト細胞数の増加は慢性アレルギー性鼻炎及びアレルギーにおいて、ならびに抗原への暴露の後に見受けられる（Ｃｒｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．，１４４，１９９１年，１２８２；Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉｓ．，１３６，１９８７年，３７９；Ｓｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｌａｒｙｎ．Ｏｔｏｌ．，１１０，１９９６年，９２９；Ｇａｕｖｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６１，２０００年，１４７３；Ａｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６２，２０００年，２２９５；及びＫａｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，３１，２００１年，１４３２）。多様な刺激がマスト細胞の活性化を引き起こし得、続いてそれらを特定の位置に移動させ（動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ））及び／又は脱顆粒を受けさせ得る。これらの刺激は免疫学的（例えば抗原又はアレルゲン）あるいは非−免疫学的（例えば化学的薬剤）性質のものであり得る。活性化されたマスト細胞は複数の炎症媒介物、例えばヒスタミンを放出し、それは血管透過性の向上、気管支収縮、血管拡張及び炎症細胞の補充を含む急性期応答に含まれる。炎症細胞の流入は、今度は応答を助長し、且つ長期化させる追加の媒介物の放出に導く。両方の状態に伴う組織のリモデリングに導くのはこの慢性炎症プロセスである。最近、ヒスタミン受容体Ｈ４がクローニングされ、マスト細胞を含むがこれに限られない多様な細胞において発現されることが示された。
【００２６】
他の重要な細胞型は好塩基性細胞であり、それは、通常環境と直接境を接する組織にあるマスト細胞と対照的に、血液中を循環しているのが見出された。炎症刺激に応答して、好塩基性細胞は炎症の部位に移動する。マスト細胞と同様に、それらはＩｇＥ又は他の薬剤に応答し、ヒスタミンのような炎症媒介物を放出する。アレルギー性鼻炎及びアレルギーの両方の場合に、気道における好塩基性細胞の数の増加があり、それらは気道で後期応答における役割を果たすと考えられる（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．著，同上，１９８７年；Ｇａｕｖｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．著，同上，２０００年；及びＢｒａｕｎｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６４，２００１年，８５８）。
【００２７】
一般に、例えば抗ヒスタミン薬（すべてＨ１受容体アンタゴニスト）及びうっ血除去薬によりアレルギーを抑制することができるが、まだ疾患−緩和薬に対する必要性がある。喘息の場合にも同じことが当てはまり、その場合には吸入される気管支拡張薬及びステロイドが主な治療薬である。注目すべきことは、ヒスタミン及びマスト細胞が両方の状態に関して重要であると考えられるが、現在利用できるＨ１及びＨ２受容体アンタゴニストはアレルギーの処置においてのみ有用であり、喘息においては、もしあっても小さい利益しか有していないことである。これは、喘息の場合、他のヒスタミン受容体、例えばＨ４受容体が役割を果たすことを示唆している。
【００２８】
多数の医学書が出版され、且つ関連する技術分野における熟練者に入手可能である。さらに、多数の科学的及び医学的研究出版物がアレルギー及び喘息の分野において出版されている。炎症を主題とする入手可能な出版教本の例にはＢａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ＣＯＰＤ：Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２００２）；Ｅｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  Ａｓｔｈｍａ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）；Ｍｙｇｉｎｄ著，Ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｎｄ  Ｎｏｎ−Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｈｉｎｉｔｉｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ｇｒａｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ著，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ’ｓ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００２）；Ｃｅｃｉｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８８）；及びＳｔｅａｄｍａｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙが含まれる。
【００２９】
本発明は、ヒスタミンＨ４受容体が喘息及びアレルギー応答に含まれ、特に刺激の部位へのマスト細胞もしくは好塩基性細胞補充に含まれること、ならびにこの受容体に関するアンタゴニストが有効な抗−喘息及び／又は抗−アレルギー薬であることを示す。本発明は、現在好ましいある態様において、ヒスタミンＨ４受容体により直接もしくは間接的に媒介される喘息又はアレルギー応答を調節するための方法を提供する。本発明は、その側面の１つにおいて、ヒスタミンＨ４受容体のモジュレーターを用いる哺乳類の処置を介し、ヒスタミンＨ４受容体により媒介される喘息又はアレルギー応答を阻害するか、予防するか、改善するか、誘導するか、あるいは他のように影響を与えるための方法も提供する。本発明の方法において有用なヒスタミンＨ４受容体のモジュレーターには、ヒスタミンＨ４受容体に結合する抗体及び抗体フラグメント、ヒスタミンＨ４受容体をコードする遺伝子の発現を調節するＲＮＡｉ、アンチセンス又は他の薬剤ならびにタンパク質、核酸もしくは他の有機分子を含むがこれらに限られないヒスタミンＨ４受容体の阻害剤、活性化剤、アンタゴニスト、アゴニスト及び逆アゴニストが含まれるが、これらに限られない。これらのモジュレーターは、必要のあるヒトへの投与のために有用であり、且つヒト以外の（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）哺乳類を含むがこれに限られないヒト以外の動物に投与する獣医学的目的のためにも有用である。
【００３０】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体への単一特異性抗体は、Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，１９７５年，４９５−４９７）の方法を用い、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体に対して反応性の抗体を含有する哺乳類抗血清から精製され、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体と反応性のモノクローナル抗体として調製される。本明細書で用いられる場合、単一特異性抗体は、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体に関する均一な結合特性を有する単一の抗体種もしくは複数の抗体種として定義される。本明細書で用いられる場合、均一な結合は、特異的な抗原もしくはエピトープ、例えば上記のような哺乳類ヒスタミンＨ４受容体に関連するものに結合する抗体種の能力を指す。単一特異性ポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製法は、当該技術分野において日常的過程である。
【００３１】
単一特異性抗体の周知の調製法を用い、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体ポリペプチドフラグメント又は全長新生哺乳類ヒスタミンＨ４受容体ポリペプチドあるいは個々の哺乳類ヒスタミンＨ４受容体エピトープに関して特異的な抗体を調製できることも、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになる。特に、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体の１つの種のみの一部又は完全に機能性のヒスタミンＨ４受容体に関して特異的な単一特異性抗体を生成させ得ることは、当該技術分野における熟練者に容易に明らかになる。ヒスタミンＨ４受容体に関して特異的な抗体が、受容体を活性化もしくは不活性化させるか、そのリガンドへの結合を妨げるか、その結合リガンドの放出を妨げるか、あるいはヒスタミンＨ４受容体に関連する正常なやり方で機能するのを妨げることを含むがこれらに限られない、受容体の機能的な活性における変化を起こさせ得ることも当該技術分野における通常の熟練者に容易に明らかになる。
【００３２】
ヒトもしくは他の哺乳類のヒスタミンＨ４受容体コードＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列をアンチセンス治療のために合成することができる。これらのアンチセンス分子はＤＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体、例えばホスホロチオエートもしくはメチルホスホネート、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体、例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ又は他のヒトヒスタミンＨ４受容体アンチセンスオリゴヌクレオチドミメティックスであることができる。微量注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リポソーム封入（ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）又はアンチセンス配列を保有するベクターからの発現により、ヒトヒスタミンＨ４受容体アンチセンス分子を細胞中に導入することができる。ヒトヒスタミンＨ４受容体アンチセンス治療は、ヒトヒスタミンＨ４受容体活性を低下させるのが有益である疾患の処置のために特に有用であり得る。
【００３３】
ヒトもしくは他の哺乳類のヒスタミンＨ４受容体遺伝子治療を、標的生物の細胞中にヒスタミンＨ４受容体を導入するために用いることができる。ヒスタミンＨ４受容体遺伝子をウイルスベクター中に連結することができ、それは受容宿主細胞の感染により、ヒトヒスタミンＨ４受容体ＤＮＡの転移を媒介する。適したウイルスベクターにはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが含まれる。あるいはまた、リガンド−ＤＮＡ複合体もしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体を用いる受容体−媒介標的化ＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ）又は直接微量注入を含む非−ウイルス法により、ヒトヒスタミンＨ４受容体ＤＮＡを遺伝子治療のために細胞中に転移させることができる。これらの方法及びそれらの変形は、生体外ならびに生体内ヒトヒスタミンＨ４受容体遺伝子治療に適している。ヒトヒスタミンＨ４受容体遺伝子治療は、ヒトヒスタミンＨ４受容体活性を高めるのが有益である疾患の処置に特に有用であり得る。
【００３４】
ヒスタミンは、ほとんどすべての生理学的及び病態生理学的状況において、いくらかの能力で機能する生理活性アミン伝達物質である。ヒスタミンは中枢神経系において神経伝達物質及びニューロモジュレーター（ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）として働き、喘息及びアレルギー応答を媒介し、気道機能を調節し、胃における酸分布を制御し、心臓血管機能ならびに動脈及び静脈応答を調節し、且つまだ決定されていないプロセスに含まれるようである。これらの効果を媒介するヒスタミン受容体は、完全には特性化されていない。これらのプロセスにどのヒスタミン受容体が含まれるかを理解する１つの方法は、研究道具及び治療物質（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）として受容体の化学的モジュレーター（例えばアゴニスト、アンタゴニスト及び逆アゴニスト）を開発することである。哺乳類ヒスタミンＨ４受容体を発現する組換え宿主細胞を用い、そのようなアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためのスクリーニング法のための材料を得ることができる。従って本発明は、研究道具として有用であることが証明され得るか、又はヒスタミン受容体を直接もしくは間接的に含む障害、例えばアレルギー応答及び喘息の処置のための治療薬として用いられ得るヒスタミンＨ４受容体の新規なアゴニスト及びアンタゴニストの同定のための方法を提供する。ヒスタミンＨ４受容体の化合物相互作用又は調節を検出するためのアッセイには、直接リガンド結合アッセイ、競合的（又は置き換え）リガンド結合アッセイあるいは例えばｃＡＭＰの生産又は好ましい態様におけるようにマスト細胞もしくは好塩基性細胞化学走性により、リガンドへの受容体の応答を測定する機能性アッセイが含まれるがこれらに限られない。この一般的な型のアッセイは当該技術分野における熟練者に周知であるが、それらは以前、本明細書に記載される組換え分子を得る前には可能でもなかったし、Ｈ４受容体を遮断する生理学的効果、例えば中でもマスト細胞化学走性の阻害を発明者等が発見する前には、それらが実際の利用性を有すると認識されてもいなかった。
【００３５】
代表的な競合結合アッセイは以下の段階を含む：
１．ヒスタミンＨ４受容体をコードする核酸分子で哺乳類培養細胞を過的にトランスフェクションし、その後培養中で生育させる。
２．トランスフェクションされた細胞から、細胞の均質化及び例えば遠心による膜画分の分離により細胞膜を調製する。
３．標準として、過剰のヒスタミンの存在下又は不在下で検出可能的に標識されたヒスタミン（例えばトリチウム化ヒスタミン）と一緒に細胞膜をインキュベーションする。
４．試験試料として、種々の濃度の単数もしくは複数の調べられるべき化合物の存在下で、上記の検出可能的に標識されたヒスタミンと一緒に細胞膜をインキュベーションする。
５．既知の方法に従ってＫｉ値を計算する。
【００３６】
本発明のある態様は、ヒスタミンへのマスト細胞又は好塩基性細胞の化学走性へのヒスタミンＨ４モジュレーターの効果を測定するための試験管内アッセイを提供する。マスト細胞に適用される場合、これらのアッセイのために、動物源（例えばマウス）から骨髄を得、マスト細胞の分化を促進する培地中で適した時間培養する。適した孔寸法の区分された（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）培養ウェルにフィブロネクチンをコーティングする。フィブロネクチンの除去の後、ヒスタミンを含有する培地を区分されたウェルの下の室に加える。上のウェルに種々の濃度の調べられるべき化合物をマスト細胞のアリコートと一緒に加える。上の室から下の室へのマスト細胞の移動を可能にする条件下でウェルをインキュベーションする。インキュベーションに続き、下の室中の細胞の数を、例えばフローサイトメトリーによりカウントする。
【００３７】
さらに本発明は、別のそのいくつかの側面において、気管中のマスト細胞のヒスタミン−もしくはアレルゲン−誘導表皮−下蓄積へのヒスタミンＨ４モジュレーターの効果を評価するための生体内動物モデルを提供する。連続する数日（例えば２日）に短時間（例えば２０分間）、試験動物（例えばマウス）を、食塩水（標準）又はヒスタミンを含んでなるエアゾールに暴露する。試験動物の場合、エアゾールでヒスタミンが与えられる（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ）マウスに、食塩水又は調べられるべき化合物を各エアゾールの前に予備−投薬する。処置の後、動物を犠牲にし、気管の切片を取り出し、切開する。免疫組織化学的又はトルイジンブルーを用いる選択的染色により、マスト細胞を定量的に検出する。マスト細胞を、気管切片内のそれらの位置に依存して、粘膜−下又は上皮−下としてさらに定量することができる。上皮−下空間中へのマスト細胞の移動は、アレルギー応答の指標である。
【００３８】
本発明の好ましい方法は、例えばヒスタミンＨ４受容体のアゴニスト、アンタゴニスト又は逆アゴニストとして働く化学化合物を同定するために用いられる。実施例１にもっと詳細に記載される通り、Ｈ４受容体の候補化合物への結合を含むスクリーニングアッセイは、受容体に結合するいくつかの種類の化合物を同定した。これらの化合物の結合親和性は、ヒスタミンへのマスト細胞の化学走性を阻害する化合物の能力と正に関連した。代表的な化合物を生体内モデルにおいてさらに調べ、そこで化合物が気管の上皮−下空間中へのマスト細胞のヒスタミン−媒介移動を減少させるか、又は妨げることが示された。そのような移動は、アレルゲン暴露されると起こると考えられるものに類似している。
【００３９】
従ってヒスタミンＨ４受容体のモジュレーターの同定の方法の他に、本発明の現在好ましい態様は、本明細書に記載される種々のスクリーニングアッセイにより同定されるＨ４受容体のモジュレーターを提供する。これらのモジュレーターは試験管内で組換えＨ４受容体に結合する。好ましい態様においてそれらは、本明細書で規定される条件下で、１μＭ未満、より好ましくは、好ましさが増す順にそれぞれ９００ｎＭ、８００ｎＭ、７００ｎＭもしくは６００ｎＭ未満の受容体に関するＫｉを有する。より好ましい態様において、それらは５００ｎＭ未満、さらにもっと好ましくは４００ｎＭ未満、さらにずっと好ましくは３００ｎＭ未満、そしてさらにもっと好ましくは２００ｎＭ未満の受容体に関するＫｉを有する。特に好ましい態様において、Ｋｉは好ましさが増す順にそれぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ及び１０ｎＭ未満である。そのような化合物のＫｉが試験管内においてヒスタミン−媒介マスト細胞化学走性を阻害する化合物の能力と正に関連することが示されたので、より大きな結合親和性を有する化合物を、アレルギー及び喘息を含むがこれらに限られないＨ４−媒介シグナル伝達に関連する病理学的状態の処置における治療薬として特に有利に用いることができることが、当該技術分野における熟練者により認識されるであろう。本発明に従うと、下記の実施例にもっと詳細に記載する通り、いくつかの種類の化合物が上記の必要な結合及び化学走性−調節の特徴を有することが示された。
【００４０】
本発明は、そのいくつかの側面の１つにおいて、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現ならびに哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質の機能を試験管内及び生体内で調節する化合物のスクリーニングのための方法も目的とする。これらの活性を調節する化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非−タンパク質性有機分子であることができる。化合物は、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現あるいは哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質の機能を向上させるかもしくは減衰させることにより調節することができる。哺乳類ヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現あるいは哺乳類ヒスタミンＨ４受容体タンパク質の機能を調節する化合物を、多様なアッセイにより検出することができる。アッセイは、受容体をコードする核酸の発現における変化あるいは受容体タンパク質の機能又は活性における変化があるか否かを決定する単純な「イエス／ノー」アッセイであることができる。試験試料の発現又は機能を、標準試料における受容体発現又は受容体タンパク質機能のレベルと比較することにより、アッセイを定量的にすることができる。この方法で同定されるモジュレーターは、治療薬、研究道具及び診断薬として有用である。
【００４１】
受容体結合又は本明細書に記載される他の機構を介する哺乳類ヒスタミンＨ４受容体活性のモジュレーターを含んでなる製薬学的に有用な組成物を既知の方法に従って、例えば製薬学的に許容され得る担体の混合により、調製することができる。そのような担体及び調製法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。有効な投与に適した製薬学的に許容され得る組成物の調製のために、そのような組成物はモジュレーター又は他の生物学的に活性な薬剤の有効量を含有するであろう。
【００４２】
本発明の治療用又は診断用組成物は、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体−関連活性の調節が必要である障害の処置又は診断に十分な量で患者に投与される。有効量は、患者の状態、体重、性別及び年令のような多様な因子に従って変わり得る。他の因子には投与の様式が含まれる。皮下、局所的、経口的、鼻内及び筋肉内のような多様な経路により製薬学的組成物を患者に与えることができる。
【００４３】
「化学的誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部ではない追加の化学的置換基もしくは部分を含有する分子を記述する。そのような部分は、基本分子の溶解度、半減期、吸収などを向上させることができる。あるいはまた、該部分は基本分子の望ましくない副作用を減衰させることができるか、あるいは基本分子の毒性を低下させることができる。そのような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような多様な教本に記載されている。
【００４４】
本明細書に開示される方法に従って同定される化合物を、日常的な試験により規定される適した投薬量で単独で用い、可能な毒性を最小にしながら哺乳類ヒスタミンＨ４受容体もしくはその活性の最適阻害を得ることができる。さらに、他の薬剤の共−投与又は逐次的投与は望ましいかも知れない。
【００４５】
本発明は、別のそのいくつかの側面において、本発明の処置法における使用のための適した局所用、経口用、全身用及び非経口用製薬学的調剤も提供する。哺乳類ヒスタミンＨ４受容体の調節において用いるための活性成分として、本発明に従って同定される化合物又はモジュレーターを含有する組成物を、投与のための通常のビヒクル中の多様な治療用投薬形態物において投与することができる。例えば化合物又はモジュレーターを錠剤、カプセル（それぞれ時機放出（ｔｉｍｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）及び徐放性調剤を含む）、丸薬、粉剤、顆粒剤、エリキサー、チンキ剤、溶液、懸濁剤、シロップ及び乳剤のような経口的投薬形態物において、あるいは注入により投与することができる。同様に、それらを静脈内（ボーラス及び輸液の両方）、腹腔内、皮下、閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を用いるかもしくは用いない局所的あるいは筋肉内形態で投与することもでき、すべて製薬学的技術分野における通常の熟練者に周知の形態物を用いる。有効だが無毒性の量の所望の化合物を、哺乳類ヒスタミンＨ４受容体−調節剤として用いることができる。
【００４６】
製品の１日の投薬量は、１日当たり患者につき０．０１〜１，０００ｍｇの広い範囲に及んで変わることができる。経口的投与の場合、組成物は、処置されるべき患者への投薬量の症状的調整のために、好ましくは０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０及び５０．０ミリグラムの活性成分を含有する刻み付きもしくは非−刻み付き錠剤の形態で与えられる。薬剤の有効量は通常１日当たり体重のｋｇにつき約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇの投薬量レベルで供給される。範囲は、さらに特定的には１日当たり体重のｋｇにつき約０．００１ｍｇ〜１０ｍｇである。哺乳類ヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの投薬量は、組み合わされる場合、所望の効果を達成するために調節される。他方、これらの種々の薬剤の投薬量を独立して最適化し、組み合わせ、いずれかの薬剤が単独で用いられる場合より病状が軽減する相乗的結果を達成することができる。
【００４７】
処置の必要のある患者の気道に送達するために、組成物は好ましくはエアゾールとして調製され、それを鼻的に、又は当該技術分野で周知の通り吸入器により送達することができる。活性成分の量は、標準的方法に従ってこの送達の形態のために調節される。
【００４８】
有利には、本発明の化合物又はモジュレーターを１日１回の投薬量において投与することができるか、あるいは１日の合計投薬量を１日２、３又は４回の分割された投薬量において投与することができる。さらに、経口的及び鼻内／吸入送達の他に、当該技術分野における通常の熟練者に周知の経皮パッチの形態を用い、経皮経路を介して本発明の化合物又はモジュレーターを投与することができる。経皮送達系の形態で投与するために、投薬量の投与はもちろん投薬管理を通じて断続的ではなくて継続的であろう。
【００４９】
１種より多い活性薬剤を用いる組み合わせ処置のために、活性薬剤が分離された投薬調剤にある場合、活性薬剤を同時に投与することができるか、あるいはそれらをそれぞれ別々にずれた時期に投与することができる。
【００５０】
本発明の化合物又はモジュレーターを用いる投薬管理は、患者の型、種、年令、体重、性別及び医学的状態；処置されるべき状態の重度；投与の経路；患者の腎臓及び肝臓機能；ならびに用いられるそれらの特定の化合物を含む多様な因子に従って選ばれる。通常の熟練した医師又は獣医は、状態の進行を予防するか、それに対抗するか、又はそれを止めるのに必要な薬剤の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性なく有効性を生ずる範囲内の薬剤の濃度の達成における最適な精密さ（ｏｐｔｉｍａｌ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）は、標的部位にとっての薬剤の利用性の速度論に基づく管理を必要とする。これには薬剤の分布、平衡及び消失の考慮が含まれる。
【００５１】
本発明の好ましい方法において、活性薬剤成分又は成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｒ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）は、１種もしくはそれより多い本明細書に記載される化合物又はモジュレーターを含むことができ、好ましくは目的とされる投与の形態、すなわち経口用錠剤、カプセル、エリキサー、シロップなどに関して適切に選ばれ、且つ通常の製薬学的習慣と一致する適した製薬学的希釈剤、賦形剤又は担体（本明細書で集合的に「担体」材料と呼ばれる）との混合物において投与され得る。
【００５２】
例えば錠剤又はカプセルの形態における経口的投与の場合、単数種もしくは複数種の活性薬剤成分を経口用無毒性の製薬学的に許容され得る不活性担体、例えばエタノール、グリセロール、水などと合わせることができる。さらに、望ましいかもしくは必要な場合、適した結合剤、崩壊剤及び着色剤を混合物中に導入することもできる。適した結合剤にはデンプン、ゼラチン、天然の糖類、例えばグルコース又はベータ−ラクトース、コーン甘味料、天然及び合成ゴム、例えばアラビアゴム、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれるが、制限ではない。これらの投薬形態物中で用いられる滑沢剤にはオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれるが、制限ではない。崩壊剤にはデンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどが含まれるが、制限ではない。
【００５３】
液体形態物の場合、活性薬剤成分を、合成及び天然ゴム、例えばトラガカント、アラビアゴム、メチル−セルロースなどのような適切に風味付けられた懸濁化もしくは分散剤中で合わせることができる。用いられ得る他の分散剤にはグリセリンなどが含まれる。非経口的投与の場合、無菌の懸濁剤及び溶液が好ましい。一般に適した防腐剤を含有する等張調製物は、静脈内投与が望ましい場合に好ましい。
【００５４】
活性薬剤成分を含有する局所用調製物を当該技術分野において周知の多様な担体材料、例えばアルコール、アロエベラゲル、アラントイン、グリセリン、ビタミンＡ及びＥ油、鉱油、ＰＰＧ２プロピオン酸ミリスチルなどと混合し、例えばアルコール溶液、局所用クレンザー、クレンジングクリーム、皮膚用ゲル、皮膚ローション及びクリームもしくはゲル調剤中のシャンプーを形成することができる。
【００５５】
本発明の化合物又はモジュレーターをリポソーム送達系、例えば小さい単層小胞、大きい単層小胞及び多層小胞の形態で投与することもできる。リポソームは、多様なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンから形成することができる。
【００５６】
化合物分子をカップリングさせる個別の担体としてモノクローナル抗体を用いることにより、本発明の化合物を送達することもできる。本発明の化合物又はモジュレーターを、標的化可能な薬剤担体としての可溶性ポリマーとカップリングさせることもできる。そのようなポリマーにはポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリル−アミドフェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルタミドフェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが含まれ得る。さらに、制御された薬剤の放出の達成に有用なある種の生分解性ポリマー、例えばポリ酢酸（ｐｏｌｙｌａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及びヒドロゲルの架橋されたもしくは両親媒性ブロックコポリマーに本発明の化合物又はモジュレーターをカップリングさせることができる。
【００５７】
経口的投与のために、化合物又はモジュレーターをカプセル、錠剤又は大型丸剤形態で投与することができるか、あるいはまたそれらを動物の飼料と混合することができる。カプセル、錠剤及び大型丸剤は、適した担体ビヒクル、例えばデンプン、タルク、ステアリン酸マグネシウム又はリン酸二カルシウムと組み合わされた活性成分を含む。これらの単位投薬形態物は、均一な混合物が得られるように、希釈剤、充填剤、崩壊剤及び／又は結合剤を含む適した微粉砕不活性成分と活性成分を緊密に混合することにより調製される。不活性成分は、化合物又はモジュレーターと反応せず、且つ処置されている動物に無毒性のものである。適した不活性成分にはデンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴム及び油などが含まれる。これらの調剤は、処置されるべき動物種の大きさ及び型ならびに症状の型及び重度のような多数の因子に依存して広く変わり得る量の活性及び不活性成分を含有することができる。化合物を飼料材料と単に混合することにより、又は飼料の表面に化合物を適用することにより、活性成分を飼料への添加物として投与することもできる。あるいはまた活性成分を不活性担体と混合し、得られる組成物を次いで飼料と混合するか、又は動物に直接供給することができる。適した不活性担体にはコーン粉、柑橘類の粉、発酵残渣、あらひきダイズ（ｓｏｙａ  ｇｒｉｔｓ）、乾燥穀粒などが含まれる。活性成分は、最終的組成物が０．００１〜５重量％の活性成分を含有するように、微粉砕、攪拌、磨砕又はタンブリング（ｔｕｍｂｌｉｎｇ）によりこれらの不活性担体と緊密に混合される。
【００５８】
あるいはまた、化合物又はモジュレーターを、不活性液体担体中に溶解された活性成分から成る調剤の注入を介して、非経口的に投与することができる。注入は筋肉内、管腔内、気管内又は皮下であることができる。注入可能な調剤は、適した不活性液体担体と混合された活性成分から成る。許容され得る液体担体には植物油、例えばピーナツ油、綿実油、ゴマ油などならびに有機溶媒、例えばソルケタール、グリセロールホルマールなどが含まれる。あるいはまた、水性非経口用調剤を用いることもできる。植物油は好ましい液体担体である。調剤は、最終的調剤が０．００５〜１０重量％の活性成分を含有するように、活性成分を液体担体中に溶解するかもしくは懸濁させることにより調製される。
【００５９】
化合物又はモジュレーターの局所的適用は、本化合物又はモジュレーターを水溶液もしくは水性懸濁液として含有する液体飲薬（ｌｉｑｕｉｄ  ｄｒｅｎｃｈ）又はシャンプーの使用を介して可能である。これらの調剤は一般に懸濁化剤、例えばベントナイトを含有し、通常は消泡剤も含有するであろう。０．００５〜１０重量％の活性成分を含有する調剤が許容可能である。好ましい調剤は、０．０１〜５重量％の本化合物又はモジュレーターを含有するものである。
【００６０】
本発明の例示の目的で以下の実施例を提示するが、本発明はそれらに制限されない。
【実施例１】
【００６１】
哺乳類発現ベクター中へのヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡのクローニング
ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡｓ（集合的にｐＨ４Ｒと呼ばれる）を哺乳類発現ベクターｐＣＩｎｅｏ中にクローニングした。ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡクローンをヒト視床ｃＤＮＡライブラリから単離した。クローニングのために、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１部位を有する特異的プライマーを用いるＰＣＲのための鋳型として全長ｃＤＮＡを用いた。ＰＣＲ産物をカラム（ＰｒｏｍｅｇａからのＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キット）上で精製し、Ｎｏｔ１及びＥｃｏＲ１（ＮＥＢ）で消化して付着末端を形成した。生成物を低融点アガロースゲル電気泳動により精製した。ｐＣＩｎｅｏベクターをＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１酵素で消化し、続いて低融点アガロースゲル上で精製した。ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡ挿入片への連結に線状ベクターを用いた。組換え体を単離し、ヒトヒスタミンＨ４受容体と称し、ＣａＰＯ４−ＤＮＡ沈降による哺乳類細胞（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）のトランスフェクションに用いた。Ｇ４１８の存在下における生育により安定な細胞クローンを選択した。１種のＧ４１８耐性クローンが単離され、無損傷のヒトヒスタミンＨ４受容体遺伝子を含有することが示された。Ｋｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２（４），１９９１年，３３１−３３７）の方法に従ってヒスタミンに応答するアデニル酸シクラーゼの阻害を測定することにより、あるいはＦｌａｓｈｐｌａｔｅｓ（ＮＥＮ）を用いるラジオイムノアッセイによってｃＡＭＰ蓄積を直接測定することにより、ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡｓを含有するクローンをｐＨ４Ｒ発現に関して分析した。［３Ｈ］−ヒスタミン結合アッセイ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２１０（１），１９９２年，３１−３５）を用いても発現を分析した。ヒトヒスタミンＨ４受容体をコードするＤＮＡを含有する組換えプラスミドを用い、哺乳類ＣＯＳ７又はＣＨＯ細胞あるいはＨＥＫ２９３又はＬ−細胞あるいはＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を形質転換した。
【００６２】
安定して、又は過的にヒトヒスタミンＨ４受容体を発現する細胞を用い、ヒトヒスタミンＨ４受容体の発現及び［３Ｈ］−ヒスタミン結合活性に関して調べた。これらの細胞を用いて他の化合物を、ヒトヒスタミンＨ４受容体を調節、阻害もしくは活性化する、ならびに放射性ヒスタミン結合に関して競合するそれらの能力に関して同定し、且つ調べた。
【００６３】
プロモーターに関して正の配向でヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡを含有するカセットを、プロモーターの適した制限部位３’中に連結し、制限部位マッピング及び／又は配列決定により同定した。これらのｃＤＮＡ発現ベクターを、エレクトロポレーション又は化学的方法（カチオン性リポソーム、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム）を含むがこれらに限られない標準的方法により、繊維芽細胞宿主細胞、例えばＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ１６５１）及びＣＶ−１  ｔａｔ［Ｓｉｅｃｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８，１９８７年，１５７５−１５７８］、２９３，Ｌ（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ６３６２）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ＃  ＨＴＢ−１０）中に導入した。トランスフェクションされた細胞及び細胞培養上澄み液を収穫し、本明細書に記載する通りにヒトヒスタミンＨ４受容体発現に関して分析した。
【００６４】
哺乳類の一過的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に用いられるベクターのすべてを、ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現する安定な細胞系の確立に用いることができる。発現ベクター中にクローニングされた非改変ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡ構築物は、ヒトヒスタミンＨ４受容体タンパク質を生産するように宿主細胞をプログラミングすると思われる。トランスフェクション宿主細胞にはＣＶ−１−Ｐ［Ｓｉｅｃｋｅｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．著，同上］、ｔｋ−Ｌ［Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｃｅｌｌ，１１（１），１９７７年，２２３−２３２］、ＮＳ／０及びｄＨＦｒ−ＣＨＯ［Ｒａｎｄａｌｌ  Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ａ．Ｓｈａｒｐ著，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９，１９８２年，６０１−６２１］が含まれるが、これらに限られない。
【００６５】
ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡを、Ｇ４１８、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ；ハイグロマイシン、ハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ；ＡＰＲＴ、キサンチン−グアニンホスホリボシル−トランスフェラーゼを含むがこれらに限られない薬剤選択プラスミドと一緒に含有するベクターの共−トランスフェクションは、安定にトランスフェクションされた細胞の選択を可能にするであろう。ヒトヒスタミンＨ４受容体の量は、本明細書に記載されるアッセイにより定量される。
【００６６】
ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡ構築物を、可能な最高量のヒトヒスタミンＨ４受容体を合成する哺乳類細胞クローンの生産のために、増幅可能な薬剤−耐性マーカーを含有するベクター中にも連結した。細胞中へのこれらの構築物の導入に続き、プラスミドを含有するクローンを適した薬剤を用いて選択し、増加する用量の薬剤中における選択により、プラスミドの高いコピー数を有する過剰−発現クローンの単離が行なわれた。
【００６７】
組換えヒトヒスタミンＨ４受容体の発現は、全長ヒトヒスタミンＨ４受容体ｃＤＮＡの哺乳類宿主細胞中へのトランスフェクションにより達成された。
ヒトヒスタミンＨ４受容体の特性化
ヒトＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞をｐＨ４Ｒでトランスフェクションし、ネオマイシンの存在下で１０日間選択した。個々のコロニーを採集し（ｐｉｃｋｅｄ）、６−ウェル皿中で生育させた。次いで細胞を９６−ウェルプレート上に平板培養し、密集まで生育させた。細胞をイソブチルメチルキサンチン（１ｍＭ）と一緒に２０分間インキュベーションした。ヒスタミン（１００ｐＭ〜１００μＭ）を用いて細胞を５分間刺激した。次いでフォルスコリン（３μＭ）を用いて細胞を刺激し、３７℃で２０分間インキュベーションした。細胞を０．１Ｎ  ＨＣｌで処理した。細胞を凍結し、解凍した。標準的ｃＡＭＰラジオイムノアッセイキット（Ｆｌａｓｈｐｌａｔｅｓ，ＮＥＮ）を用い、上澄み液のアリコートをそれらのサイクリックＡＭＰ含有量に関して分析した。フォルスコリン処理はｃＡＭＰの細胞内濃度を向上させる。フォルスコリンに応答するｃＡＭＰ含有量を減少させることによりヒスタミンに応答した細胞は、活性な機能性ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現すると考えられた。本明細書に記載されるヒトヒスタミンＨ４受容体−コードＤＮＡ分子から発現される組換えヒトヒスタミンＨ４受容体は、ヒスタミンにより特異的に活性化されることが示された。
【実施例２】
【００６８】
組換えヒトヒスタミンＨ４受容体についての結合アッセイ
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞又はＣＯＳ７細胞をｐＨ４Ｒで過的にトランスフェクションし、１５０ｃｍ２の組織培養皿中で生育させた。細胞を食塩溶液で洗浄し、細胞スクレーパー（ｃｅｌｌ  ｓｃｒａｐｅｒ）でこすり取り、遠心（１０００ｒｐｍ，５分）により集めた。高速で１０秒間ポリトロン組織ホモジナイザーを用い、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で細胞ペレットを均質化することにより、細胞膜を調製した。ホモジネートを４℃において１０００ｒｐｍで５分間遠心した。次いで上澄み液を集め、４℃において２０，０００ｘｇで２５分間遠心した。最終的ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁させた。細胞膜を３Ｈ−ヒスタミン（５〜７０ｎＭ）と一緒に、過剰のヒスタミン（１００００ｎＭ）の存在下又は不在下でインキュベーションした。インキュベーションは室温で４５分間行なわれた。Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｃフィルター上における迅速な濾過により膜を収穫し、氷−冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌで４回洗浄した。次いでフィルターを乾燥し、シンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）と混合し、放射能に関してカウントした。ヒトヒスタミンＨ４受容体を発現するＳＫ−Ｎ−ＭＣ又はＣＯＳ７細胞を用い、上記の混合物を種々の濃度の調べられるべき阻害剤又は化合物の存在下でインキュベーションすることにより、他の化合物の結合の親和性ならびに３Ｈ−リガンド結合に取って代わるそれらの能力を測定した。３Ｈ−ヒスタミンを用いる競合的結合研究のために、実験的に決定される５ｎＭのＫＤ値及び５ｎＭのリガンド濃度に基づき、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２，１９７３年，３０９９−３１０８）：Ｋｉ＝（ＩＣ５０）／（１＋（［Ｌ］／（ＫＤ））に従ってＫｉ値を算出した。
【００６９】
競合的結合研究の結果を、３種類の化合物の範囲内の種々の化合物に関して表１に示し、それらは米国特許出願公開第１０／０９４，３５７号明細書（国際公開第０２／０７２５４８号パンフレットも参照されたい）、米国暫定出願第６０／４０８，５６９号明細書ならびに米国暫定出願第６０／４０８，７２３号明細書に記載されている通りに製造することができ、これらの明細書の開示は引用することによりその記載事項が本明細書の内容となる。
【００７０】
１つの種類は頭部基（ｈｅａｄｇｒｏｕｐ）
【００７１】
【化１】
2006510590.tif 000006
【００７２】
１Ｈ−インドールを含み、本明細書で「インドール」種と呼ばれる。
【００７３】
他の種類は以下の頭部基の１つを含み、本明細書で「二環式ピロール」種と呼ばれる：
【００７４】
【化２】
2006510590.tif 000007
【００７５】
第３の種類は頭部基
【００７６】
【化３】
2006510590.tif 000008
【００７７】
１Ｈ−ベンゾイミダゾールを含み、本明細書で「ベンゾイミダゾール」種と呼ばれる。
表１                                        
化合物 Ｋｉ（ｎＭ）
（５−クロロ−７−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                      １
（２−クロロ−３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                    ３
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ５
（２，３−ジメチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                          ５
（２，３−ジクロロ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                      ５．５
（７−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                              ６．６
（７−アミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ７
（５−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ８
（５，７−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                            １０
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン  １０
（２，３−ジクロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                          １０
（５−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  １１
（４，５−ジクロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                            １１
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（５−トリフルオロメチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−メタノン                                              １１
（５−フルオロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                １８
（５，７−ジフルオロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                          １９
（５−アミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  １９
（５−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                              １９
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン                                                ２１
（７−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ２３
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−［４−（２−ヒドロキシ−エチル）−ピペラジン−１−イル］−メタノン                                              ２５
（２−クロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                ２５
（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                          ２５
（５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                        ２６
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（３，４−ジメチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                            ２７
（５，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                  ２８
（５，７−ジメチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                            ３０
（２−クロロ−３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン                                                    ３０
（４−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                          ３１
（１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                      ３２
（６−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                          ３２．５
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（（Ｒ）−３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                          ３４
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（（Ｓ）−３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                          ３６
（４−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ４０
（２−クロロ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                ４０
（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ４１
（５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン                                                                        ４２
（７−アミノ−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン  ４３
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（５−ニトロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−メタノン                                                                  ４６
（７−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                              ４７
（６−クロロ−５−フルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                            ５３
（７−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                  ５５
（２−クロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン                                                                ５６
（３−ブロモ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                ５６
（３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン                                                                ８０
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン                                                            ８５
（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン                                                                          ８７
１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルボン酸（８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−アミド                                            ８９
（５−ブロモ−ベンゾフラン−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                      ９５
（１Ｈ−インドール−２−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン
１００
（１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン
１１７
（６−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                １２４
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−（４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン                                                          １２５
（１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタンチオン                                                                        １３２
（４−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−ピペラジン−１−イル−メタノン                                                                        １３５
（２，３−ジメチル−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                          １４０
［５−（３−メトキシ−フェニル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                            １４５
（４−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                        １５６
（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−（３−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−メタノン                                              １６１
（２−クロロ−６Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピロール−５−イル）−（ヘキサヒドロ−ピロロ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）−メタノン                          １７６
（６−ブロモ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                                                １８８
５−メチル−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−カルボン酸（８−メチル−８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−アミド                              ６１３（３−ブロモ−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）−（３−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン                                              ９８０
【実施例３】
【００７８】
哺乳類ヒスタミンＨ４受容体へのリガンド結合
ラット、マウス、モルモット及びヒトヒスタミンＨ４受容体に関する３Ｈ−ヒスタミンの親和性を、本明細書に記載される標準的方法を用いて決定した。適したヒスタミンＨ４受容体が安定にトランスフェクションされたＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞からの膜につき、飽和結合を行なった。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット（結合／遊離対結合）の線形回帰の−１／傾斜からＫＤ値を誘導した。結果を表２に示す。
【００７９】
【表５】
2006510590.tif 000009
【００８０】
数種の既知のヒスタミン受容体リガンドの相対的親和性を、３０ｎＭの３Ｈ−ヒスタミンの競合的結合により決定した。Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｃｏｆｆ（Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋［３Ｈ−ヒスタミン］／Ｋｄ）の方法に従って、各リガンドに関するＫｉ値を算出した。３Ｈ−ヒスタミンに関するＫＤ値は表２に示したものであった。結果を表３に示す。
【００８１】
【表６】
2006510590.tif 000010
【実施例４】
【００８２】
ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストによる
試験管内におけるヒスタミン−誘導マスト細胞化学走性の阻害
この実施例は、ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストが刺激に応答するマスト細胞の化学走性応答を遮断できるという発見を初めて示す。
方法
骨髄マスト細胞培養
ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ｂｌ／６ｊマウスに由来する骨髄からマスト細胞を分化させた。マウスを９５％ＣＯ２下で窒息により犠牲にし、大腿骨を取り出した。大腿骨から骨髄を無菌的に単離した。１０％  ＦＣＳ、０．１ｍＭ  非−必須アミノ酸、５０μｇ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシン及び２０％  条件ＷＥＨＩ−３培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ＷＥＨＩ−３  ｍｅｄｉｕｍ）を含むＲＰＭＩから成る培地中で、３７℃において５％ＣＯ２を用い、細胞（５ｘ１０５個／ｍＬ）を培養した。条件ＷＥＨＩ−３培地は、１０％  ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ  炭酸ナトリウム、０．０５μＭ  ベータ−メルカプトエタノール及び５０μｇ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩｓｃｏｖｅｓ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ培地中で培養されたＷＥＨＩ−３細胞（ＡＴＣＣ）から調製された。濾過された上澄み液を条件ＷＥＨＩ−３培地として用いた。培養中で１６時間の後、骨髄細胞を新しいフラスコに移した。培地を１週間に１回新しくした。４週間後、ＩｇＥ受容体及びＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）発現に関してフローサイトメトリーにより細胞を調べた。マスト細胞を抗−ＤＮＰ  ＩｇＥ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）又はビヒクルと一緒に３０分間インキュベーションし、続いてＦＩＴＣ標識抗−ＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又はＦＩＴＣ標識ＣＤ１１７（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と一緒に氷上で３０分間インキュベーションした。培養されたマスト細胞は均一な集団から成り、それは＞９９％  ＩｇＥ受容体陽性且つ＞９９％ＣＤ１１７陽性であった。４〜８週間の培養時間のマスト細胞を実験に用いた。
化学走性アッセイ
８μｍの孔寸法のトランスウェル（Ｔｒａｎｓｅｗｌｌｓ）（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に、１００ｎｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）の１００μＬを室温で２時間コーティングした。フィブロネクチンの除去の後、ヒスタミン（１．２５〜２０μＭの範囲）の存在下で５％  ＢＳＡを含む６００μＬのＲＰＭＩを下の室に加えた。種々のヒスタミン受容体アンタゴニストを調べるために、化合物の１０μＭ溶液を上及び下の室に加えた。マスト細胞（２ｘ１０５個／ウェル）を上の室に加えた。プレートを３７℃で３時間インキュベーションした。トランスウェルを取り出し、下の室中の細胞の数を、フローサイトメーターを用いて６０秒間カウントした。
結果
ヒスタミンはＨ４受容体を介して化学走性を媒介する。
【００８３】
トランスウェルシステムを用い、ヒスタミンに向かうマスト細胞の化学走性能力を研究した。マスト細胞を上の室に加え、ヒスタミンを下の室に加えた。ヒスタミンは、下の室中の移動マスト細胞における用量−依存的増加を誘導した（図１）。
【００８４】
特異的ヒスタミン受容体アンタゴニストを用い、どのヒスタミン受容体がヒスタミンに向かう化学走性を担うかを区別した。ヒスタミンＨ１、Ｈ２又はＨ３受容体に関して特異的なアンタゴニストは、ヒスタミン−誘導化学走性を変化させなかった（図２）。しかしながら、特異的ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストは、用量−依存的やり方でマスト細胞化学走性を阻害した（図２及び３）。
【００８５】
下記の表４に示される結果は、化合物のＫｉとマスト細胞化学走性を阻害するその能力の間の正の関連性を示し；すなわち一般に化合物がより有力な程、阻害が優れている。
【００８６】
【表７】
2006510590.tif 000011
【実施例５】
【００８７】
生体内におけるヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストによる
ヒスタミン−誘導マスト細胞化学走性の阻害
１０匹の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（８〜１２週）のグループを食塩水標準又は０．１Ｍヒスタミンのエアゾールに、連続する２日に２０分間暴露した。エアゾールでヒスタミンが与えられるマウスに、各エアゾールから１５分前に食塩水又は２０ｍｇ／ｋｇのＨ４モジュレーター（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを、皮下経路（５ｍｌ／ｋｇ）を介して予備−投薬した。最終的なエアゾール投与から４時間後、ペントバルビトン過剰投薬を介してマウスを犠牲にし、気管の切片を取り出し、ホルマリン中で固定した。気管のパラフィン包埋及び縦切開を行い、トルイジンブルーを用いてマスト細胞を染色した。マスト細胞を、各気管切片内のそれらの位置に依存して、粘膜−下又は上皮−下として定量した。Ｓｔｕｄｅｎｔｓ非対ｔ−試験を用いて統計を行なった。結果（図４）は、ヒスタミンが上皮−下空間中へのマスト細胞の移動を誘導することを示す。そのような動きは、アレルゲン暴露されると起こると思われるものに類似している。この移動を特異的Ｈ４受容体アンタゴニストにより妨げることができる。
【実施例６】
【００８８】
喘息及びアレルギー性鼻炎の動物モデルにおける
Ｈ４受容体アンタゴニストによるマスト細胞化学走性の阻害
マスト細胞がアレルギー性炎症に応答して蓄積するという観察ならびにこの蓄積をＨ４受容体アンタゴニストにより妨害できるという観察を調べるために、この実施例において示される動物モデルを用いる。本発明の化合物をこのモデルにおいて調べ、アレルギー性鼻炎又は喘息のための処置薬としてのそれらの使用を示す。０日及び１４日にオボアルブミン／ミョウバン（０．２ｍＬのＡｌ（ＯＨ）３中の１０μｇ；２％）の腹腔内注入によりマウスを感作する。２１日から２３日まで、ＰＢＳ又はオボアルブミンによりマウスに挑戦し、２４日に、最後の挑戦から２４時間後にマウスを犠牲にする。気管の切片を取り出し、ホルマリン中で固定する。気管のパラフィン包埋及び縦切開を行い、続いてトルイジンブルーでマスト細胞を染色する。あるいはまた、凍結切開のために気管をＯＣＴ中で凍結し、ＩｇＥ染色によりマスト細胞を同定する。各気管切片内におけるマスト細胞の位置に依存して、それらを粘膜−下又は上皮−下として定量する。アレルゲンへの暴露は上皮−下マスト細胞の数を増加させ、この効果を遮断するＨ４受容体アンタゴニストの能力が測定される。
【実施例７】
【００８９】
ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストによる好塩基性細胞化学走性の阻害
標準的方法（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３３（１−２），２０００年，１３−２０）を用い、ヒト血液から好塩基性細胞を単離する。室温で２時間、１００ｎｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）の１００μＬがコーティングされた８μｍの孔寸法のトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用い、化学走性アッセイを行なうことができる。フィブロネクチンの除去の後、ヒスタミン（１．２５〜２０μＭの範囲）の存在下で５％  ＢＳＡを含む６００μＬのＲＰＭＩを下の室に加える。種々のヒスタミン受容体アンタゴニストを調べるために、化合物の１０μＭ溶液を上及び下の室に加えることができる。好塩基性細胞を上の室に加えることができる。プレートを３７℃で３時間インキュベーションする。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓを取り出し、下の室中の細胞の数を、フローサイトメーターを用いて６０秒間カウントすることができるか、あるいはＷｒｉｇｈｔの染色を用いる染色による定量することができる。
【実施例８】
【００９０】
抗原への暴露後の患者における
マスト細胞及び好塩基性細胞集団における増加の測定
ネコのふけ又は草の花粉のような特定のアレルゲンにアレルギーを有する患者に、直接気管支投与又は他の方法を介し、適切な抗原で挑戦する。気管支粘膜及び鼻粘膜中のマスト細胞及び好塩基性細胞の数を、組織生検の後に標準的な免疫組織化学的染色法を用いて定量する。抗原の挑戦の後のマスト細胞及び好塩基性細胞の増加へのヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの効果を、抗原の挑戦の前に複数の異なる経路によりモジュレーターを投与することによって研究する。
【実施例９】
【００９１】
患者における組織マスト細胞及び好塩基性細胞集団の測定
アレルギー性鼻炎及び／又は喘息を有する患者は、健康な被験者に比べて彼らの気道中のマスト細胞及び好塩基性細胞の両方が増加していることが既知である。気道中に存在するマスト細胞及び好塩基性細胞の集団へのヒスタミンＨ４受容体モジュレーターの効果を、与えられた期間、複数の異なる経路によりモジュレーターを投与することによって調べる。処置の前、その間及びその後の気道中に見出されるマスト細胞及び好塩基性細胞の数の比較を行なうことができる。組織生検の後、標準的免疫組織−化学的染色法を用いて細胞を定量する。
【実施例１０】
【００９２】
ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストを用いる、
患者における喘息又はアレルギー応答の処置
アレルギー又は喘息の患者にヒスタミンＨ４受容体アンタゴニスト又はプラシーボを、与えられた期間与える。喘息の処置の経過中ずっと、患者の重度の得点、１秒間の努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）及び気管支収縮薬に関する気管支高反応性（ＢＨＲ）を測定する。ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストを用いる処置の後の喘息の重度の得点における減少、ＦＥＶ１における増加及びＢＨＲにおける低下はすべて、疾患への正の効果の指標である。さらに、ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストを用いて処置した時の炎症応答における低下を、可溶性インターロイキン２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）、ＩＬ−４及び可溶性細胞内付着分子  １（ｓＩＣＡＭ−１）の血清濃度；末梢血好酸球カウント；ならびに好酸球性カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）における変化により決定することができる。さらに、気管支生検を用い、炎症細胞集団、例えば好酸球、Ｔ細胞、マスト細胞、好塩基性細胞などにおける変化を定量することができる。
【実施例１１】
【００９３】
ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストを用いる、
患者におけるアレルギー応答の処置
アレルギー性鼻炎を有する患者にヒスタミンＨ４受容体アンタゴニスト又はプラシーボを、与えられた期間与える。昼間の鼻の症状の得点（うっ血、かゆみ及びくしゃみの平均）、目の症状、夜間の症状、個々の昼間の鼻の症状、全体的な評価（患者の及び医師の）ならびに生活の質の得点の比較により、有効性を測定する。さらに、アレルギー性結膜炎への効果を、眼の赤さ、かゆみ及び症状のない日数の測定を用いて定量することができる。
【実施例１２】
【００９４】
ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストによる
ヒスタミン−誘導好酸球形変化の阻害
この実施例は、ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニストが、ヒスタミンへのヒト好酸球の形変化応答を遮断できることを示す。好酸球における形の変化は、付着、化学走性、脱顆粒及び食作用を含む数種の生物学的結果の１つもしくはそれより多くに導く初期の事象である。これらの下流の事象は、アレルギー性鼻炎及び喘息を含むアレルギー及び他の炎症／免疫応答を伴う。
方法
ヒト顆粒球をＦｉｃｏｌｌ勾配によりヒト血液から単離した。５−１０Ｘ  Ｑｉａｇｅｎ溶解バッファーを用い、室温で５〜７分間赤血球を溶解した。顆粒球を収穫し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。反応緩衝液中でｍＬ当たり２ｘ１０６個の細胞の密度において細胞を再懸濁させた。特異的ヒスタミン受容体アンタゴニストによる阻害を調べるために、９０μＬの細胞懸濁液（〜２ｘ１０５個の細胞）を、種々の試験化合物の溶液の１つの１０μＭと一緒にインキュベーションした。３０分後、種々の濃度のヒスタミンの１つの１１μＬを加えた。１０分後、細胞を氷に移し、２５０μＬの氷−冷固定緩衝液（２％ホルムアルデヒド）を用いて１分間固定した。ゲート自己蛍光前進散乱アッセイ（ｇａｔｅｄ  ａｕｔｏｆｌｕｏｅｓｃｅｎｃｅ  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ  ａｓｓａｙ）（ＧＡＦＳ）（Ｂｙｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．著，Ａｍ．Ｊ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６５，２００２年，１６０２−１６０９）を用い、形の変化を定量した。
結果
下記の表中のデータは、ヒスタミンが好酸球における用量−依存的な形の変化を誘導することを示す。どのヒスタミン受容体が形の変化を担うのかを区別するために、ヒスタミン受容体（ＨＲ）アンタゴニストを用いた。ヒスタミンＨ１受容体に特異的なアンタゴニスト（ジフェンヒドラミン）又はＨ２受容体に特異的なアンタゴニスト（ラナチジン）は、ヒスタミン−誘導形変化を変更させなかった。しかしながら、二重（ｄｕａｌ）Ｈ３／Ｈ４アンタゴニスト（チオペラミド（ｔｈｉｏｐｅｒａｍｉｄｅ））及び特異的ヒスタミンＨ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノン（Ｋｉ＝５ｎＭ）は、それぞれ１．５及び０．２７μＭのＩＣ５０でヒスタミン−誘導好酸球形変化を阻害した。データを表５に示す。
【００９５】
【表８】
2006510590.tif 000012
【実施例１３】
【００９６】
Ｈ４受容体アンタゴニストはヒトアレルギー性炎症のモデルにおける応答を調節する
この実施例は、Ｈ４受容体アンタゴニストが動物において、ヒトアレルギー性炎症に関する通常の動物モデルであるオボアルブミン−誘導肺炎症へのアレルギー応答を調節することを示す。
方法
動物への感作及び挑戦
０日及び１４日に、オボアルブミン／ミョウバンの腹腔内注入により、マウス（ｎ＝グループ当たり８）を感作した。２１日から２４日の毎日、ＰＢＳ又はオボアルブミンを用いる２０分間の挑戦の前に、ビヒクル又は（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いてマウスを１５分間予備処置した。
代表的Ｈ４受容体アンタゴニストの投与
１つの実験において、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを５、２０又は５０ｍｇ／ｋｇにおいて経口的に投与した。第２の実験において、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを０．５、２又は５ｍｇ／ｋｇにおいて経口的に投与した。第３の実験において、（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを２０、６０又は１００ｍｇ／ｋｇにおいて皮下的に投与した。
細胞測定／データ収集
最後の挑戦から２４時間後、マウスを犠牲にし、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の細胞の合計数ならびに示差細胞カウントを決定した。
気道高−応答性監視
オボアルブミン−感作動物における気道高−応答性を、意識のあるマウスにおいて全身プレチスモグラフィ（Ｂｕｘｃｏ）により監視した。マウス（ｎ＝グループ当たり８）を細胞測定のために上記の通りに処置した。
結果
ＢＡＬ液の分析
オボアルブミンを用いる挑戦の後、ＢＡＬ液中の細胞の合計数における劇的な増加があり、それは主に好酸球の数の増加の故であった。図５に示す通り、合計細胞数及び好酸球の数の両方は、５ｍｇ／ｋｇ及びそれより多い（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンのすべての用量において有意に減少した。好酸球の数における最大の減少は５０％であった。好酸球における最大減少を与えた同じ用量は、リンパ球の数も有意に減少させた。調べられた最高の用量（５０ｍｇ／ｋｇ）において、マクロファージの数における減少及び好中球の数における増加があった。マクロファージにおける減少は、第２の実験において５ｍｇ／ｋｇの用量でも見られた。これらのデータは、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンのようなＨ４受容体アンタゴニストが抗−炎症性を有することを示す。
【００９７】
別のＨ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンもこのモデルで調べた。図６は、ＢＡＬ液中の示差細胞カウントに関する結果を示す。合計細胞数及び好酸球の数の両方が６０及び１００ｍｇ／ｋｇの（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンにおいて有意に減少した。好酸球の数における最大減少は５０％であった。好酸球における減少を与えた同じ用量において、リンパ球の数も有意に減少した。
気道高−応答性の分析
メタコリンへの気道高−応答性の応答を図７に示す。感作された動物の最後のオボアルブミン挑戦から２４時間後、気管支収縮の指数であるＰｅｎｈ（増強休止期（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ））により測定される通り、メタコリンへの気道の応答における劇的な向上があった。この高−応答性は、最初の３つの用量のいずれにおいても、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いる処置により低下した。これらのデータは、Ｈ４受容体アンタゴニストが気道炎症を妨げるのみでなく、アレルギー性気道高活性にも影響し、かくしてヒトにおけるアレルギー及び／又は喘息の処置において有用であろうことを示す。
【００９８】
本発明の特徴及び利点は当該技術分野における通常の熟練者に明らかである。概略、詳細な記述、背景、実施例、図面及び請求項を含む本開示に基づき、当該技術分野における通常の熟練者は、種々の条件及び利用に修正及び応用を成し得るであろう。これらの他の態様も本発明の範囲内である。本明細書で引用された公開文献は、そのような引用によりそれらの全体が本明細書の内容となる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ヒスタミンに応答したマウス骨髄−由来マスト細胞化学走性。
【図２】ヒスタミンに応答したマウス骨髄−由来マスト細胞の化学走性は、ヒスタミンＨ４受容体−特異的アンタゴニストにより遮断され得るが、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３受容体アンタゴニストによっては遮断されないことを示す図。
【図３】ヒスタミンに応答したマウス骨髄−由来マスト細胞の化学走性は、３８ｎＭのＩＣ５０を有するヒスタミンＨ４受容体−特異的アンタゴニストにより遮断され得ることを示す図。
【図４】マウス気管におけるマスト細胞の生体内ヒスタミン−誘導蓄積は、ヒスタミンＨ４受容体−特異的アンタゴニストにより妨げられ得ることを示す図。
【図５Ａ】Ｈ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いて処置されたマウスにおける、オボアルブミン−誘導肺炎症モデルからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の示差細胞カウント。
【図５Ｂ】Ｈ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いて処置されたマウスにおける、オボアルブミン−誘導肺炎症モデルからの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液中の示差細胞カウント。
【図６】Ｈ４受容体アンタゴニスト（５−クロロ−１Ｈ−インドール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンを用いて処置されたマウスにおける、オボアルブミン−誘導肺炎症モデルからのＢＡＬ液中の示差細胞カウント。
【図７】マウス中のオボアルブミン−誘導肺炎症モデルにおける気道高−反応性へのＨ４受容体アンタゴニスト、（５−クロロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−メタノンの効果。
【図１】
2006510590.tif 000013
【図２】
2006510590.tif 000014
【図３】
2006510590.tif 000015
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2006510590.tif 000018
【図６】
2006510590.tif 000019
【図７】
2006510590.tif 000020
【国際調査報告】
2006510590.tif 000021
2006510590.tif 000022
2006510590.tif 000023