(57)【要約】組織、毛髪、歯、骨、植物材料、固形マトリックス、およびＤＮＡ抽出が一般に困難であると考えられている他の試料からＤＮＡを抽出するための方法および組成物を提供する。ＤＮＡは、酵素消化、またはフェノール、クロロホルム、グアニジンチオシアネート、または２−メルカプトエタノールのような毒性のある有機化学薬品を使用することなしに試料から短時間で、例えば、わずか５分間〜２時間で抽出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料からＤＮＡを抽出する方法であって、試料を、有効濃度のキレート化剤、有効濃度の安定剤、および有効濃度の緩衝剤を含んでなる高塩基性溶液と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２】
キレート化剤がアルカリ金属グルコン酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
安定剤がアルカリ金属ケイ酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
緩衝剤がアルカリ金属リン酸塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
キレート化剤がグルコン酸ナトリウムであり、安定剤がケイ酸ナトリウムであり、かつ、緩衝剤がリン酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
キレート化剤が約１〜５００ｍＭの濃度で含まれる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
安定剤が約１〜５００ｍＭの濃度で含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
緩衝剤が約１〜５００ｍＭの濃度で含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
キレート化剤が約１０〜５０ｍＭの濃度で含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
安定剤が約１０〜５０ｍＭの濃度で含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
緩衝剤が約５〜２００ｍＭの濃度で含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
グルコン酸ナトリウムが約２５ｍＭの濃度で含まれ、ケイ酸ナトリウムが約２５ｍＭの濃度で含まれ、かつ、リン酸ナトリウムが約７５ｍＭの濃度で含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
試料が毛髪を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
毛髪がヒトの毛髪である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
毛髪を抽出前に摩砕しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
試料が、固形マトリックス上または内の生物学的試料を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
固形マトリックスが紙である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
紙がＦＴＡ（商標）紙である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料が血液を含んでなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
試料が血液を含んでなり、かつ、固形マトリックスがＦＴＡ（商標）紙を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的試料からの、生物学的分子、特にＤＮＡ、の精製に有用な組成物、方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は法医学分析および鑑定に日常的に用いられ、これは細胞当たり数百から数千のコピー数で含まれるので確認分析に好ましい。ミトコンドリアＤＮＡは非常に小さなまたは極めて古いまたは分解した試料から回収することができる唯一の核酸であり、ミトコンドリアＤＮＡ抽出および分析は古い組織、毛髪、骨および歯のような困難な試料について極めて頻繁に行われている。これらの組織は分析に十分な核ＤＮＡを持たないが、ミトコンドリアＤＮＡの豊富な供給源である。
【０００３】
ミトコンドリアＤＮＡが分析に有用であるにも拘わらず、毛髪、骨および歯からのその抽出は極めて困難であり、抽出処理手続きはほとんど公表されていない。毛髪、骨および歯からｍｔＤＮＡを抽出するのに現在用いられている手法は、長く労力がかかり、毒性のある有機化学薬品を用いる必要がある。更に、試料からＤＮＡを放出するには、摩砕のような物理的崩壊が必要である。他の試料の混入を防止するために、試料の崩壊に用いた装置は通常は一回使用の後に廃棄されるかまたは再使用の前に濃酸で徹底的に正常化しなければならず、この手続きを費用がかかり且つ時間がかかるものとしている。
【０００４】
毛髪からｍｔＤＮＡの抽出のための市販製品が利用可能であるが、それらは毒性のある有機化学薬品、摩砕または他の物理的崩壊を用いており、酵素消化を必要とし、またはかなりの数の皮膚細胞並びに毛幹自身を含む毛根の存在が必要である。また、市販製品は高価であり、毒性のある有機化学薬品を含んでいるかまたは必要とすることがあり、労力がかかる。毛根を含まない毛幹や、歯および骨のような完全に保存された全細胞を含まない他の試料からミトコンドリアＤＮＡを抽出し、分析する必要があることも多い。毛髪からミトコンドリアＤＮＡを抽出するための周知であり且つ広く用いられている方法は、Wilson et al.によって公表された方法である。この方法は、FBI DNA Analysis Unit IIによって毛髪からミトコンドリアＤＮＡを抽出するための合衆国法医学標準として採用されている。この方法は、毛髪の摩砕から始めた後、プロテイナーゼＫと２〜２４時間インキュベーションし、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（ＰＣＩＡ）で核酸を抽出し、抽出したＤＮＡを遠心マイクロコンセントレーター(centrifugal microconcentrator)で濃縮する。たった１個の試料の抽出を完了するのに要する時間は２〜３日かかることがあり、またこの処理手続きは毒性の高い有機化合物であるフェノールおよびクロロホルムを用いる必要がある。
【０００５】
植物材料から葉緑体およびミトコンドリアＤＮＡの抽出も非常に困難である。植物からミトコンドリアおよび葉緑体ＤＮＡの抽出の以前に公表された方法は費用が非常にかかり、時間がかかり（非常に長いグラディエント遠心分離を必要とし）、毒性のある有機化学薬品を用いる必要があり、または率直に言って十分高純度レベルの十分なＤＮＡを得るには有効ではない。(Herrmann, 1982; Bookjans et al., 1984; Palmer, 1986; Maliga et al., 1995) (mtDNA: Crouzillat et al., 1987; Kohler et al., 1991; Mackenzie, 1994)。Baker et al.は、毛髪および歯からミトコンドリアＤＮＡの抽出にグラスミルク（glass milk）と組み合わせて変更グアニジニウムチオシアネート抽出法を用いた。しかしながら、この手続きでは、毒性のあるグアニジンチオシアネートが用いられ、且つ試料を微細に摩砕する必要があった。
【０００６】
Whatman Bioscience製ＦＴＡ（商標）紙は、核酸の保存のための特製の化学処理された紙である。血液のような生物学的試料をＦＴＡ紙にスポットすると、紙の化学処理によって溶解が起こり、ＤＮＡが濾紙上に固定される。本発明前は、ＦＴＡ紙からＤＮＡを除去する良好な方法がなかったので、試料中のＤＮＡの増幅および制限酵素消化は処理した紙で直接行われる。ＦＴＡ紙上に保存された生物学的試料は極めて安定であり、ＦＴＡ紙上にスポットした試料を長期間保管し且つＦＴＡ紙上に試料アーカイブを調製することは、多くの分野で標準的に実施されていることである。一般に、ＤＮＡはあらゆる以後の反応または操作中に紙に結合したままになっているので、生物学的試料をスポットした紙のそれぞれ２mmのパンチからは１反応しか行うことができない。従って、ＦＴＡ紙なしでＤＮＡを精製し、それを様々に使用することができる形態で回収することができることが極めて望ましい。更に、ＤＮＡ結合膜を組込んでいる装置を用いてＤＮＡを回収し、回収されたＤＮＡの純度が高く、増幅、シークエンシングまたはクローニングのような下流工程を妨げる可能性がある他の生体分子で汚染されないようにすることができることが極めて望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、新規なリーシス緩衝液の使用を、組織、毛髪、歯、骨、植物材料、固形マトリックス、およびＤＮＡ抽出が一般に困難であると考えられている他の試料からＤＮＡを抽出するための能率化されたシリカ結合法と組み合わせたものである。本発明では、従来技術での方法が多くの時間または日数を要したのと比較して、試料から迅速に、例えば、試料の種類によってほんの５分から２時間で抽出することができる。従来技術とは対照的に、本発明は酵素消化の使用、またはフェノール、クロロホルム、グアニジンチオシアネートまたは２−メルカプトエタノールのような毒性のある有機化学薬品の使用を必要としない。本発明では、リーシスの前に試料を摩砕する必要がなくなりまたは劇的に減少し、必要な工程数が従来技術の方法よりずっと少なく、従って、複数試料を平行して処理することができる。
【０００８】
本発明の一つの態様によれば、生物学的試料からＤＮＡを抽出する方法であって、試料を有効濃度のキレート化剤、有効濃度の安定剤および有効濃度の緩衝剤を含んでなる高塩基性溶液と接触させることを含んでなる方法が提供される。キレート化剤は、アルカリ金属グルコン酸塩、例えば、グルコン酸ナトリウムまたはカリウムであることができる。安定剤は、アルカリ金属ケイ酸塩、例えば、ケイ酸ナトリウムまたはカリウムであることができる。緩衝剤は、アルカリ金属リン酸塩、例えば、リン酸ナトリウムまたはカリウムであることができる。
【０００９】
キレート化剤は、約１〜５００ｍＭ、例えば、１０〜５０ｍＭ、または約２５ｍＭの濃度で存在することができる。安定剤は、約１〜５００ｍＭ、例えば、１０〜５０ｍＭ、または約２５ｍＭの濃度で存在することができる。緩衝剤は、約１〜５００ｍＭ、例えば、５〜２００ｍＭ、または約７５ｍＭの濃度で存在することができる。一つの態様では、グルコン酸ナトリウムは約２５ｍＭの濃度で存在することができ、ケイ酸ナトリウムは約２５ｍＭの濃度で存在することができ、リン酸ナトリウムは約７５ｍＭの濃度で存在することができる。
【００１０】
試料は、ＤＮＡ、例えば、染色体ＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡなどの染色体外ＤＮＡを含むまたは含むと思われる任意の生物学的試料であることができる。この試料は、原核生物起源であるか、または更に典型的には真核生物起源であることができる。この試料は、毛髪、例えば、ヒト毛髪を含むことができる。この方法は、歯、骨などの他の試料にも有効である。この試料は、抽出前に摩砕したりあるいは機械的に崩壊する必要はないが、必要に応じて、このような崩壊または摩砕を用いてもよい。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、発明の精神および範囲内の様々な変更および修正はこの詳細な説明から当業者には明らかになるので、詳細な説明および具体例は、発明の好ましい態様を示しているが、単に例示として挙げるものである。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明は、生物学的試料からＤＮＡを精製するのに用いる組成物、方法およびキットを提供する。本発明は、生物学的試料から毒性のある有機化学薬品を用いる必要のない高効率でＤＮＡを抽出する新規なリーシス試薬（lysis reagents）を提供する。本発明は、新規なリーシス試薬を含むＤＮＡを精製する方法およびキットも提供する。
【００１３】
生物学的試料
生物学的試料は、生物学的起源の任意の材料から構成されるまたはを含む任意の材料であることができる。試料としては、ヒトおよび動物組織、血液、骨、皮膚、毛髪、植物の葉、種子、若枝および茎、細菌および細胞培養物、ホルマリンで固定した組織、保存紙または固形マトリックス（Whatman製ＦＴＡ紙）にスポットした血液などが挙げられるが、これらに限定されない。この試料は、生物学的材料のみを含んでいる必要はない。試料は、衣類の切れ端の体液の染み、木片に埋設された組織片、または毛髪断片を含む埃の屑のような物理的マトリックス上または中の生物学的材料からなっていてもよい。
【００１４】
リーシス試薬
本発明者らは、予想外にも、有効濃度のキレート化剤および安定剤を含み、場合によっては緩衝剤を含む高塩基性溶液が、組織および他の核酸を含む試料からＤＮＡの抽出に極めて有効であることを見出した。特に、本発明者らは、有効濃度のグルコン酸ナトリウムのようなキレート化剤、有効濃度のケイ酸ナトリウムのような安定剤、および、有効濃度のリン酸ナトリウムのような緩衝剤を含む溶液がＤＮＡ抽出に極めて有効であることを見出した。
【００１５】
リーシス試薬は、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、または水酸化アンモニウムのような塩基が比較的高濃度で存在するため強塩基性である。当業者であれば、他の強塩基をこれらの塩基の代わりに用いることができることが分かるであろう。塩基は、典型的には０．１〜５Ｍ／ｌ、好都合には１〜５Ｍの最終濃度で、好都合には約１２より高いｐＨで含まれる。本発明による典型的溶液では、塩基は１．５〜２Ｍであり、好都合には約１．８Ｍ水酸化ナトリウムである。本発明の文脈では、高塩基溶液はｐＨが少なくとも１２であり、好都合にはｐＨが少なくとも約１３の溶液である。
【００１６】
キレート化剤は、金属イオンのキレートに有効な任意の組成物であることができる。キレート化剤の例は当該技術分野で周知であり、グルコン酸ナトリウムおよびＥＤＴＡが挙げられるが、当業者であれば他のキレート化剤を単独でまたは組み合わせて用いることができることが分かるであろう。キレート化剤は、１〜５００ｍＭ、典型的には１〜１００ｍＭ、好都合には約２５ｍＭの濃度で含まれることができる。
【００１７】
安定剤は、溶液を安定化し、且つ供給源組織または材料から抽出されるＤＮＡを安定化すると本発明者らが理論に束縛されることなく考える試薬である。安定剤は、例えば、メタケイ酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、セスキケイ酸ナトリウム、アルミノケイ酸ナトリウム、フルオロケイ酸ナトリウムであることができ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、典型的には１〜１００ｍＭ、好都合には約２５ｍＭの濃度で含まれることができる。
【００１８】
場合によっては含まれる緩衝剤は、ｐＨ緩衝剤として作用することができる任意の薬剤でよい。このような薬剤は当該技術分野で周知であり、ピロリン酸四ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ニトリロトリ酢酸三ナトリウム、フルオロホウ酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、トリリン酸ナトリウムが挙げられる。緩衝剤は、０〜５００ｍＭ、典型的には１〜２００ｍＭ、好都合には約２５〜１５０ｍＭの濃度で含まれることができる。
【００１９】
本発明の特に好都合な態様では、塩基は約１．５〜２Ｍの濃度で含まれ、キレート化剤は約１０〜５０ｍＭの濃度で含まれ、安定剤は約１５〜５０ｍＭの濃度で含まれ、緩衝剤は約５０〜１００ｍＭの濃度で含まれる。特に好都合な態様では、溶液は１．８Ｍ水酸化ナトリウム、２５ｍＭグルコン酸ナトリウム、２５ｍＭケイ酸ナトリウム、および７５ｍＭリン酸ナトリウムを含んでなる。
【００２０】
いかなる理論によっても束縛されることなしに、本発明者らは、本発明のリーシス試薬の高められた特性は少なくとも幾つかの場合には試薬のキレート化特性による可能性があると考えている。
【００２１】
当業者であれば、溶液成分を様々な組合せおよび様々な濃度で組み合わせてほぼあらゆる生物学的試料からＤＮＡの最適抽出を行うことができることが分かるであろう。当業者であれば、これらの添加剤について上記したナトリウム塩を他の適当な対イオン、例えば、カリウムまたはリチウムを含む塩に代えることができることも分かるであろう。
【００２２】
本発明は、上記のリーシス試薬を用いるＤＮＡの抽出および精製の新規な方法も提供する。
【００２３】
結合試薬
ＤＮＡの抽出については、結合試薬は、グアニジン塩酸塩のようなカオトロピック剤と酢酸と酢酸カリウムの混合物のような濃緩衝剤系から構成される溶液である。結合試薬中の緩衝剤はリーシス試薬を中和し、結合試薬をリーシス試薬と混合するときに、生成混合物のｐＨによりＤＮＡ結合マトリックスへ結合することができるようにするように処方される。リーシス試薬と結合試薬の混合物のｐＨ範囲は、典型的には４．０〜７．５である。場合によっては、結合試薬はエタノール、イソプロパノールのようなアルコールを２〜８０％の濃度で含むことができる。一つの態様では、結合試薬は４．２Ｍまたは約４．２Ｍのグアニジン塩酸塩、０．９Ｍまたは約０．９Ｍの酢酸カリウム、および０．６Ｍまたは約０．６Ｍ酢酸，ｐＨ４．４から構成される。
【００２４】
洗浄溶液
洗浄溶液は、典型的には低濃度のカオトロピック剤、およびエタノールまたはイソプロパノールのようなアルコールを含んでなる。例えば、洗浄溶液は、１Ｍグアニジン塩酸塩と６０％エタノール，ｐＨ７．０を含んでなることができる。
【００２５】
結合装置および結合マトリックス
結合装置は、タンパク質および生物学的試料の他の生化学成分に優先してＤＮＡに選択的に結合する結合マトリックスを含む任意の装置である。これらの装置は、単一チューブ、９６穴プレート、３８４穴プレートなど多種多様なフォーマットで広汎な会社（Qiagen, Marligen, Clontech, Promega, Genomed）から発売されている。結合マトリックスは、膜、ゲルまたは粒子、または例えばシリカ膜、シリカ樹脂、グラスミルク（glass milk）、およびイオン交換樹脂など生物学的分子の分離に一般に用いられる任意の他の材料でよい。結合マトリックスは、結合装置の一部であってもよく、または別個に加えることもできる。膜は通常は装置に組込まれるが、遊離樹脂は通常は別個に供給され、次いで分離装置に加えられる。これらの装置は、所望な任意のフォーマットで構築することができる。典型的な単一チューブ装置は、基部に非結合性の多孔性フリット、上部に１以上のシリカ膜の層、および最後にフリットと膜がチューブの基部に取り付けられるようにするための止め輪を含んでいる。これらの装置はそれぞれの液体を添加した後、添加した液体を遠心分離または真空によって膜を介して吸引することができる点で好都合である。結合装置は、多数の個々のウェルから構成されるプレートであってもよい。９６、３８４、および１５３６穴から構成されるプレートが、一般に高処理量平行分析に用いられる。プレートフォーマットは、結合マトリックスを介して液体を吸引する目的で遠心分離または真空、または両方を用いるように構築される。
【００２６】
溶出緩衝剤
結合マトリックスがシリカを主材料とするときには、溶出緩衝剤は典型的には水またはＴＥ緩衝剤（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）であるが、ｐＨが７．０−８．５の低イオン強度の任意の溶液であってもよい。結合マトリックスがイオン交換マトリックスであるときには、溶出緩衝剤は典型的には１．２５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５のような高塩溶液である。溶出緩衝剤の正確な組成は、それが結合マトリックスからＤＮＡを溶出する限り決定的なものではない。
【００２７】
一般的手続き
試料を一定容積のリーシス試薬に加える。試料を攪拌して、試料の総てがリーシス試薬と接触するようにする。次に、リーシス試薬中の試料を２０℃〜９９℃で０．５〜６０分間インキュベーションし、温度および時間は試料の性質によって変化させる。単純培養した細胞と新鮮な組織は室温（２０〜２５℃）で１〜２分間インキュベーションするだけでよいが、毛髪、ホルマリン固定した組織および植物材料は６５℃以上で１０分間インキュベーションする必要があることがある。インキュベーションの後、１〜５０容量の結合試薬を試料を含むリーシス試薬に加え、溶液を十分に混合する。ＤＮＡ抽出については、結合溶液をリーシス溶液と組み合わせているときには塩基を中和し、結合装置の膜にＤＮＡを結合するのに最適なｐＨおよび塩条件を提供する。中和した溶液を結合装置に加えて、液体を重力、遠心分離、真空またはポンプ吸引によってシリカ膜を介して吸引する。次に、試料を含む溶液を結合組織に加えて、核酸を核酸結合マトリックスに結合させる。溶液を加えて、核酸がマトリックスに結合したならば、試料の非結合成分を含む過剰の液体を遠心分離、真空、重力、ポンプ吸引、または未結合成分から結合成分を分離するための当該技術分野で知られている任意の他の方法によって除去する。洗浄溶液を結合装置に加え、結合マトリックスを通ってまたは介して吸引して、残留カオトロピック塩、緩衝剤塩、および結合マトリックスに低親和性で結合していることがある残留成分を洗浄除去する。高親和性でマトリックスに結合しているＤＮＡは、マトリックスに結合したままである。洗浄工程の目的は、シリカマトリックスにＤＮＡを保持したままタンパク質、生化学薬品、および試料の他成分を洗浄除去することである。この時点で、当該技術分野で知られている溶液で更に洗浄を行って、これを行わなければＤＮＡと一緒に精製されてしまう特定の汚染物質を除去することができる。このような汚染物質の例は、ＲＮＡ、内毒素（endotoxins）、植物樹脂、およびポリフェノール性化合物である。溶出緩衝剤を、小容量を結合マトリックスに加える。溶出緩衝剤を結合マトリックス上で０〜６０分間インキュベーションして、核酸をマトリックスから遊離させ、溶液相に移行させてもよい。このインキュベーションの後、核酸を含む溶出緩衝剤を遠心分離、真空、ポンプ吸引、または当該技術分野で知られている任意の他の方法によって回収する。
【００２８】
上記の処理手続きは、ＲＮＡおよびＤＮＡの精製の当業者によって行われるように多く変更が可能であるので、制限を意味するものではない。従って、本発明は下記の実施例を参照することによって一層容易に理解されるであろうし、これらの実施例は例示として提供されるものであり、本発明を制限しようとするものではない。
【実施例】
【００２９】
例１：  ヒト、イヌ、ネコおよびウマの毛根を含まない毛髪からミトコンドリアＤＮＡの精製
それぞれの種からの毛根を含まない２ｃｍ毛幹を、２ｍｌ微量遠心分離用試験管に入れた。５％ Terg-a-zymeの脱イオン水溶液１ｍｌを毛幹に加え、室温で音波処理水槽中で２０分間インキュベーションした。Terg-a-zyme洗浄溶液を捨てて、１００％エタノール１ｍｌを毛幹に加えて、これを完全に覆った。毛幹をエタノールに５分間浸漬した後、使い捨てピペットを用いてエタノールをできるだけ除いた。リーシス試薬（１．８Ｍ ＮａＯＨ、２５ｍＭグルコン酸ナトリウム、２５ｍＭケイ酸ナトリウム、７５ｍＭリン酸ナトリウム）５０μｌを毛幹を含むそれぞれの試験管に加え、ピペットチップを用いて毛幹を試験管の底部の液体中に押し込んだ。毛幹をリーシス緩衝剤中で６０℃で１０分間インキュベーションし、５分後および１０分間のインキュベーションの終了時に試験管を軽く渦流攪拌して、毛髪の物理的崩壊を促進した。４．２Ｍグアニジン塩酸塩、０．６Ｍ酢酸および０．９Ｍ酢酸カリウム，ｐＨ４．４含む結合緩衝剤６００ｍｌを消化した毛髪試料に加え、渦流攪拌によって十分に混合した。それぞれの試料を、シリカ膜を含む受器試験管にあるＤＮＡ結合カラムに加え、１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。カラムのフロースルーを廃棄し、カラムを受器試験管中で取り換えた。１Ｍグアニジンおよび６０％エタノールを含んでなる洗浄溶液７００μｌをカラムに加え、室温にて２分間インキュベーションした。次に、カラムを１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。受器試験管を廃棄し、ＤＮＡ結合カラムを清浄な受器試験管に置いた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を含んでなる溶出緩衝剤を６５℃に加熱し、加熱した溶出緩衝剤７５μｌをシリカ膜の中央に加え、１分間インキュベーションした。カラムを１２，０００ ｘ ｇで１分間遠心分離し、精製したミトコンドリアＤＮＡを含むフロースルーを受器試験管に集めて、−２０℃で保管した。本発明の方法と毛幹からのミトコンドリアＤＮＡを精製するためのWilson et al.の処理手続きとの比較を、図１に示す。精製したミトコンドリアＤＮＡを下記のプライマー配列：
ヒト、フォワードプライマー−  ＣＣＣＣＡＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＣＡＡＧＴ；
ヒト、リバースプライマー  −  ＴＧＧＣＴＴＴＡＴＧＴＡＣＴＡＴＧＴＡＣ；
イヌ、フォワードプライマー−  ＧＡＡＣＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＣＧＧＴＡＣＴＴ；
イヌ、リバースプライマー  −  ＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＧＣ；
ネコ、フォワードプライマー−  ＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＡＴＡＣＣＣＴＴＧＡＣＡ；
ネコ、リバースプライマー  −  ＧＡＡＡＧＡＧＣＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＴＣ、および
ウマ、フォワードプライマー−  ＣＣＣＴＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＡＴＣＣＧＴ；
ウマ、リバースプライマー  −  ＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＧＧＧＣＡＡＧＴＡＡ
を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．４）、１．５ｍＭ ＭｇＣ１２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭの各プライマー、および１ユニットのPlatinum Taq Polymerase (Invitrogen Corporation)を含んでいた。鋳型ミトコンドリアＤＮＡを９５℃で１０分間変性した後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーアニーリング、および７２℃で１分間のプライマーアニーリングを３５サイクル行って増幅した。３５サイクルが完了したならば、７２℃で更に１分間反応を延長した。ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ＤＮＡバンドを臭化エチジウム染色によって可視化した。加工処理を行った毛幹のそれぞれについて予想したサイズのバンドが検出され、ネガティブコントロールでは染色は見られなかった（図２参照）。
【００３０】
例２：  ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子型
ＤＮＡを含む５種類の試料を同一人から得た。試料１は、頭部から得た毛幹の２ｃｍ断片であり、毛根は付着していなかった。試料２および３は恥毛の２ｃｍ毛幹であり、毛根が付着していた。試料４は、全血をスポットしたＦＴＡ紙の２ｃｍパンチであった。試料５は全血５０μｌであった。ミトコンドリアＤＮＡを、例１に記載の本発明の方法によって試料１および２から抽出した。ＤＮＡを、Wilson et al.の方法によって試料３から抽出した。Wilson et al.の方法によってミトコンドリアＤＮＡを抽出するため、微小組織摩砕装置を用いて毛髪を摩砕し、ＤＮＡ抽出を行った。これらの摩砕装置は、乳鉢と乳棒の調和した組からなっている。外来ＤＮＡからの汚染を防止するため、摩砕装置は脱イオン水で丁寧に洗浄し、綿チップアプリケーターを用いて５％ Terg-a-zyme（商品名）と共にこすり洗いした。次に、摩砕装置を脱イオン水で洗浄し、１規定硫酸２００μｌに２０分間浸漬した。摩砕装置を脱イオン水で十分に洗浄した後、微小遠心分離機で１０，０００×ｇで脱水し、総ての残っている痕跡量の液体も除去した。
【００３１】
２ｃｍ毛幹を、２ｍｌ微小遠心分離試験管に加えた。５％ Terg-a-zymeの脱イオン水溶液１ｍｌを毛幹に加え、室温にて２０分間音波処理水槽中でインキュベーションした。Terg-a-zyme洗浄溶液を廃棄し、１ｍｌの１００％エタノールを毛幹に加えて、それを完全に覆った。毛幹をエタノール中で５分間浸漬した後、使い捨てピペットを用いてエタノールをできるだけ除いた。微小組織摩砕装置を含む試験管に、染色抽出緩衝剤２００μｌに続いて２ｃｍ毛幹を加えた。乳棒を上下させて、毛髪を乳鉢の底部に押しやった。次に、毛髪を、断片が見えなくなるまで摩砕した。乳棒を乳鉢から取り出し、均質液体を滅菌した１．５ｍｌの微小遠心分離試験管に移した。６００Ｕ／ｍｌのプロテイナーゼＫ １μｌを試験管に加え、低速での渦流攪拌によって十分に混合した。試験管を短時間遠心分離して総ての液体を試験管の底部に集めた後、試験管を５６℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーションの後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ＰＣＩＡ，２５：２４：１）を試験管に加え、次いで３０秒間渦流攪拌して、乳状エマルションを調製した。次に、試験管を１２，０００ ｘ ｇで３分間遠心分離して、水相と有機相を分離した。Microcon（商品名）１００微小濃縮装置（Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts）を組み立て、標識を付け、それぞれの濃縮装置のフィルター側（上部）に脱イオン水２００μｌを加えることによって使用の準備をした。フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールの水相（約２００μｌの上清）を試験管から慎重に除き、ピペット先端にタンパク質性界面が全く吸引されないように特に注意しながら微小濃縮装置に移した。Microcon（商品名）１００微小濃縮装置を３０００×ｇで５分間遠心分離した。濾液を廃棄し、濾液カップを濃縮装置に戻した。脱イオン水４００μｌを微小濃縮装置の保持液（retentate）側に加え、微小濃縮装置を３０００×ｇで遠心分離し、濾液を廃棄した。８０℃の脱イオン水６０μｌをMicrocon（商品名）１００濃縮装置の保持液側に加え、保持液カップをそれぞれの濃縮装置の上部に置いた。微小濃縮装置をその保持液カップと共に反転し、１０，０００×ｇで３分間遠心分離した。保持液カップはミトコンドリアＤＮＡを含む溶液を含んでいる。ＤＮＡを試料４（ＦＴＡ紙にスポットした血液）から本発明の方法によって抽出した。ＦＴＡ紙（Whatman）上に保存した乾燥血液からミトコンドリアＤＮＡを抽出するため、スポットした血液の２mmの円をＦＴＡ紙上の乾燥した血液スポットから打ち抜き、１．５ｍｌ微小遠心分離試験管に加えた。リーシス試薬（１．８Ｍ ＮａＯＨ、２５ｍＭグルコン酸ナトリウム、２５ｍＭケイ酸ナトリウム、７５ｍＭリン酸ナトリウム）１００μｌを毛幹を入れた試験管に加え、試験管を１分間激しく渦流攪拌した。溶液を６０℃で１０分間インキュベーションした後、再度１分間渦流攪拌した。４．２Ｍグアニジン塩酸塩、０．６Ｍ酢酸および０．９Ｍ酢酸カリウムを含む結合緩衝剤を６００ｍｌを消化した毛髪試料に加え、渦流攪拌によって十分に混合した。全試料を、シリカ膜を含む受器試験管にあるＤＮＡ結合カラムに加え、１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。カラムのフロースルーを廃棄し、カラムを受器試験管中で取り換えた。１Ｍグアニジンと６０％エタノールをを含んでなる洗浄溶液７００μｌをカラムに加え、室温で２分間インキュベーションした。次に、カラムを１２，０００×ｇで１分間遠心分離した。受器試験管を廃棄して、ＤＮＡ結合カラムを清浄な受器試験管に入れた。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０を含んでなる溶出緩衝剤を６５℃に加熱し、加熱した溶出緩衝剤７５μｌをシリカ膜の中央に加え、１分間インキュベーションした。カラムを１２，０００×ｇで１分間遠心分離し、精製したミトコンドリアＤＮＡを含むフロースルーを受器試験管に集めて、−２０℃で保管した。試料５からのＤＮＡは、Qiamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Corporation)を用いてキットと共に供給された使用説明書に準じて全血から抽出した。次に、それぞれの精製したＤＮＡ試料１０μｌを、Marligen Mitochondrial DNA Screening System (Marligen Biosciences, Ijamsville, MD)で供給された試薬およびプロトコールを用いて増幅し、遺伝子型を決定した。ポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）は、ミトコンドリアＤＮＡ超可変領域ＩＩに特異的なプライマーを用いて行った。ＰＣＲ産物は、製造業者の指示に従ってラテックスビーズに固定した対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドの懸濁配列（suspension array）を用いる対立遺伝子に特異的なハイブリダイゼーションによって遺伝子型を決定した。それぞれの対立遺伝子についての結果を、それぞれの座における総ての可能な対立遺伝子についての総シグナルの百分率として表す（図３）。得られた結果は、本発明の方法を用いて抽出した毛髪試料はWilson et al.の方法で得たのと同じ結果（フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽出によるプロテイナーゼＫ）、および市販のキットを用いて全血から抽出したＤＮＡで得たのと同じ結果が得られることを示している。同様に、ＦＴＡ紙にスポットした血液から抽出したＤＮＡでは、市販のキットを用いて全血から抽出したＤＮＡで得たのと同じ結果を得た。
【００３２】
参考文献:
1. Baker et al. (2001), Journal of Forensic Sciences 46: 126-130. 
2. Bookjans et al. (1984), Anal Biochem 141: 244-247.
3. Charity et al, 「ミトコンドリアＤＮＡ分析における処理手続きの改良: 新規な毛髪処理手続きおよび修飾した増幅/シークエンシングプライマーの確認および実行(Procedual Improvements in Mitochondrial DNA Analysis: Validation and Implementation of a New Hair Extraction Procedure and a Modified Amplification/Sequencing Primer)」The Bode Technology Group Inc., 7364 Steel Mill Drive, Springfield, Virginia, 22150. 第9回Promega Meetingでの発表の抄録。
4. Chomczynski and Sacchi (1987)Anal Biochem. 162: 156-9. 
5. Crouzillat et al. (1987) Theor Appl Genet. 74: 773-780. 
6. Herrmann (1982): Edelman M, Hallick RB and Chua NH (監修), 「葉緑体分子生物学の方法(Methods in Chloroplast Molecular Biology)」, pp 259-280. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam. 
7. Mackenzie (1994) Plant Mol Biol Manual D3, pp 1-12. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 
8. Triboush et al, Plant Molecular Biology Reporter 16: 183-189, 1998. 
9. Wilson and Chourey (1984) Plant Cell Rep 3: 237-239. 
10. Wilson et al. Biotechniques. 1995. Apr; 18(4): 662-9.
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】毛幹からミトコンドリアＤＮＡの抽出についての本発明の方法とWilson et al.の方法の比較。
【図２】毛根を含まないヒト、イヌ、ネコおよびウマの毛髪から抽出したミトコンドリアＤＮＡ配列のゲル電気泳動。
【図３】様々な方法により様々な試料から抽出したミトコンドリアＤＮＡからの遺伝子型決定の結果。試料１は、本発明の方法によって抽出した頭部の毛幹である。試料２は、本発明の方法によって抽出した恥毛の毛幹である。試料３は、Wilson et al.の方法によって抽出した恥毛の毛幹である。試料４は、本発明の方法によって抽出した血液をスポットしたＦＴＡ紙の２ｍｍパンチである。試料５は、Ｑｉａｍｐ血液ミニキット（Qiagen Corporation）で抽出した全血５０μｌである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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