(57)【要約】第１の結合部位と第２の結合部位とを有する標的分析物を検出する方法。少なくとも第１および第２のパターン形成された伝導体を有し、第１の伝導体が第２の伝導体から隔離されていることを特徴とする基板を提供する。パターン形成された伝導体の構成により少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成される。該方法は、標的分析物の第１の結合部位に特異的に結合する捕捉プローブを基板に接触させる工程と、標的分析物の第２の結合部位に特異的に結合する結合部位が結合している電導性のナノ粒子を提供する工程とを含むこともできる。よって、基板および電導性ナノ粒子をハイブリダイゼーション条件下で標的分析物と接触させると、標的分析物は基板および電導性ナノ粒子に結合することになる。こうして伝導体の間にある電導性ナノ粒子を電気的に検出可能することができる。ナノ粒子の銀沈積により検出力を向上させることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の、少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位とを有する少なくとも１つの第１の標的分析物を電気的に検出するための装置であって、
少なくとも第１および第２のパターン形成された伝導体を表面上に有する基板であって、第１のパターン形成された伝導体は第２のパターン形成された伝導体から隔離されており、第１のパターン形成された伝導体および第２のパターン形成された伝導体のパターンにより該第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることを特徴とする基板と、
第１の標的分析物の第１の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、実質的に非電導性のギャップのうち少なくとも１つのギャップ内で基板表面に固定化されている捕捉プローブと
からなり、
第１の標的分析物に結合し、同標的分析物がさらに少なくとも１つの捕捉プローブに結合している少なくとも１つの検出用コンジュゲートの存在を、電気的に検出可能であることを特徴とする装置。
【請求項２】
パターン形成された伝導体が交互嵌合していることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
交互嵌合している伝導体と少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップとが、基板上の約０．５平方ミリメートル〜約２平方ミリメートルにわたってパターンを形成することを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップそれぞれが、幅約１０μｍ〜約１００μｍで実質的に線状であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
基板が、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間にパターン形成された絶縁体をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
各検出用コンジュゲートが、
金ナノ粒子と、
金ナノ粒子に付着させた、第１の標的分析物の第２の結合部位に特異的に結合可能なプローブと
からなることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
各検出用コンジュゲートが、
標識と、
標識に付着させた、第１の標的分析物の第２の結合部位に特異的に結合可能なプローブと
からなることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項８】
電気的検出に、金ナノ粒子上で凝集した銀を検出することがさらに含まれる請求項６に記載の装置。
【請求項９】
電気的検出に、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間の電導性を測定することが含まれる請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
電気的検出に、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間の電導性を測定することが含まれる請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
試料中の、少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位とを有する少なくとも１つの第２の標的分析物をさらに検出可能な装置であって、
基板表面上の少なくとも第３および第４のパターン形成された伝導体と、第３のパターン形成された伝導体は第４のパターン形成された伝導体から隔離されていることと、第３のパターン形成された伝導体および第４のパターン形成された伝導体のパターンにより該第３のパターン形成された伝導体と第４のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることと、
第２の標的分析物の第１の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉プローブであって、第３のパターン形成された伝導体と第４のパターン形成された伝導体との間の少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップの範囲内で基板表面に固定化されている捕捉プローブと、
からさらになり、
第２の標的分析物に結合し、同標的分析物がさらに第２の捕捉プローブに結合している少なくとも１つの検出用コンジュゲートの存在を、電気的に検出可能であることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
検出用コンジュゲートが、
粒子と、
粒子に付着させた、第１の標的分析物の第２の結合部位に特異的に結合可能なプローブと
からなり、
少なくとも１つの捕捉プローブと第１の標的分析物との間、および第１の標的分析物と検出用コンジュゲートとの間で特異的結合作用が生じるのに有効な条件下で、第１の標的分析物と検出用コンジュゲートとを少なくとも１つの捕捉プローブと接触させたとき、検出用コンジュゲート、第１の標的分析物、および少なくとも１つの捕捉プローブが、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間に電気的に検出可能な変化を生じる複合体を形成することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
試料中の、少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位とを有する少なくとも１つの第１の核酸を電気的に検出するための装置であって、
少なくとも第１および第２のパターン形成された伝導体を表面上に有する基板であって、第１のパターン形成された伝導体は第２のパターン形成された伝導体から隔離されており、第１のパターン形成された伝導体および第２のパターン形成された伝導体のパターンにより該第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることを特徴とする基板と、
第１の核酸の第１の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉プローブであって、実質的に非電導性のギャップのうち少なくとも１つの範囲内で基板表面に結合している捕捉プローブと
からなり、
第１の核酸に結合し、同核酸がさらに少なくとも１つの捕捉プローブに結合している少なくとも１つの検出用コンジュゲートの存在を、電気的に検出可能であることを特徴とする装置。
【請求項１４】
パターン形成された伝導体が交互嵌合していることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
交互嵌合している伝導体と少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップとが、基板上の約０．５平方ミリメートル〜約２平方ミリメートルにわたってパターンを形成することを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップそれぞれが、幅約１０μｍ〜約１００μｍで実質的に線状であることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１７】
基板が、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間にパターン形成された絶縁体をさらに備えることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１８】
電気的検出に、検出用コンジュゲート上で凝集した銀を検出することがさらに含まれる請求項１３に記載の装置。
【請求項１９】
電気的検出に、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間の電導性を測定することが含まれる請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
試料中の、少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位とを有する少なくとも１つの第２の核酸をさらに検出可能な装置であって、
基板表面上の少なくとも第３および第４のパターン形成された伝導体と、第３のパターン形成された伝導体は第４のパターン形成された伝導体から隔離されていることと、第３のパターン形成された伝導体および第４のパターン形成された伝導体のパターンにより該第３のパターン形成された伝導体と第４のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることと、
第２の核酸の第１の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの第２の捕捉プローブであって、第３のパターン形成された伝導体および第４のパターン形成された伝導体の間の少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップの範囲内で基板表面に結合している捕捉プローブと
からさらになり、
第２の核酸に結合し、同核酸がさらに少なくとも１つの第２の捕捉プローブに結合している少なくとも１つの検出用コンジュゲートの存在を、電気的に検出可能であることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項２１】
試料中の、少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位とを有する第１の標的分析物と、少なくとも第１の結合部位と第２の結合部位とを有する第２の標的分析物とを最低限検出するための装置であって、
基板を含んでなり、該基板が
表面上の第１および第２のパターン形成された伝導体であって、第１のパターン形成された伝導体は第２のパターン形成された伝導体から隔離されていることと、第１のパターン形成された伝導体および第２のパターン形成された伝導体のパターンにより該第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることとを特徴とする伝導体と、
表面上の第３および第４のパターン形成された伝導体であって、第３のパターン形成された伝導体は第４のパターン形成された伝導体から隔離されていることと、第３のパターン形成された伝導体および第４のパターン形成された伝導体のパターンにより該第３のパターン形成された伝導体と第４のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることとを特徴とする伝導体と、
を備えていることと、
第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体とで共に第１の検出領域が構成され、第３のパターン形成された伝導体と第４のパターン形成された伝導体とで共に第２の検出領域が構成されることと、
第１および第２の標的分析物の第１の結合部位が電気的に伝導性の粒子からなる検出用コンジュゲートに結合し、同標的分析物の第２の結合部位が第１の検出領域に付着可能な第１の捕捉プローブおよび第２の検出領域に付着可能な第２の捕捉プローブに結合すると
、第１および第２の検出領域におけるそれぞれ第１および第２の標的分析物の存在が電気的に検出可能であることと
を特徴とする装置。
【請求項２２】
パターン形成された伝導体が交互嵌合していることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
第１の検出領域および第２の検出領域が、基板上の約０．５平方ミリメートル〜約２平方ミリメートルにわたってパターンをそれぞれ形成することを特徴とする請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
実質的に非電導性のギャップそれぞれが、幅約１０μｍ〜約１００μｍで実質的に線状であることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２５】
基板が、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間にパターン形成された絶縁体をさらに備えることを特徴とする請求項２１に記載の装置。
【請求項２６】
電気的検出に、電気的に伝導性の粒子上で凝集した銀を検出することがさらに含まれる請求項２１に記載の装置。
【請求項２７】
電気的検出に、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間の電導性を測定することが含まれる請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
第１の結合部位と第２の結合部位とを有する標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）少なくとも第１および第２のパターン形成された伝導体を有する基板であって、第１のパターン形成された伝導体は第２のパターン形成された伝導体から隔離されており、第１のパターン形成された伝導体および第２のパターン形成された伝導体のパターンにより少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成されることを特徴とする基板を提供する工程と、
（ｂ）基板に、少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップの範囲内で基板表面に固定化される、標的分析物の第１の結合部位に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉プローブの標的分析物の第１の結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドを接触させる工程と、
（ｃ）電気的に伝導性の粒子と、
電気的に伝導性の粒子に付着した、標的分析物の第２の結合部位に特異的に結合可能なプローブと
からなる少なくとも１つの検出用コンジュゲートを提供する工程と、
（ｄ）工程（ａ）および（ｃ）においてそれぞれ提供された基板および少なくとも１つの検出用コンジュゲートを、標的分析物を少なくとも１つの捕捉プローブに結合させ、かつ少なくとも１つの検出用コンジュゲートを標的分析物に結合させるためにハイブリダイゼーション条件下で標的分析物と接触させる工程と、
（ｅ）標的分析物に結合し、同標的分析物がさらに少なくとも１つの捕捉プローブに結合している少なくとも１つの検出用コンジュゲートを電気的に検出する工程と
からなる方法。
【請求項２９】
電気的に伝導性の粒子が金ナノ粒子である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
電気的に伝導性の粒子が、銀ナノ粒子、および金ナノ粒子により凝集させた銀からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
パターン形成された伝導体が交互嵌合していることを特徴とする請求項２８に記載の方
法。
【請求項３２】
捕捉プローブがアレイ作製ロボットによって基板に塗布される請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
交互嵌合している伝導体と少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップとが、基板上の約０．５平方ミリメートル〜約２平方ミリメートルにわたってパターンを形成することを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップそれぞれが、幅約１０μｍ〜約１００μｍで実質的に線状であることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
基板が、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間にパターン形成された絶縁体をさらに備えることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
標的分析物がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
標的分析物がヒト、細菌、ウイルス、または真菌由来である請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
標的分析物が疾患に関連する遺伝子である請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
標的分析物が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に修飾された天然もしくは合成ＲＮＡ、または構造的に修飾された天然もしくは合成ＤＮＡである請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
電気的検出が電気的に伝導性のナノ粒子の銀沈積により増強される請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
電気的検出が第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間の電導性を測定することからなる請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの検出用コンジュゲートが、電気的に伝導性のナノ粒子をさらに含んでなる第２の種類の検出用コンジュゲートの結合部位に特異的に結合するプローブからさらになることを特徴とし、
少なくとも１つの検出用コンジュゲートを第２の種類の検出用コンジュゲートと接触させる工程と、
基板に結合した標的分析物に結合した第２の種類の検出用コンジュゲートを電気的に検出する工程と
からさらになる請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
電気的検出が電気的に伝導性のナノ粒子の銀沈積により増強される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
第１の結合部位と第２の結合部位とを有する核酸を検出する方法であって、
相補的な対として構成された複数のパターン形成された伝導体を有する基板であって、伝導体の相補的な対全てについて第１のパターン形成された伝導体がその対の第２のパターン形成された伝導体から隔離されていることと、各対の第１のパターン形成された伝導体および第２のパターン形成された伝導体のパターンにより少なくとも２つの実質的に線状で実質的に非電導性のギャップが形成されることと、伝導体の相補的な対それぞれが基板の少なくとも１平方ミリメートルを占めることを特徴とする基板を提供する工程と、
基板に、核酸の第１の結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドをロボットにより接触さ
せる工程と、
核酸の第２の結合部位に相補的なオリゴヌクレオチドが結合した金ナノ粒子を提供する工程と、
（ａ）および（ｃ）においてそれぞれ提供された基板および金ナノ粒子を、核酸を基板および金ナノ粒子に結合させるためにハイブリダイゼーション条件下で核酸と接触させる工程と、
金ナノ粒子を銀染色する工程と、
核酸に結合し、同核酸がさらに基板に結合している銀染色された金ナノ粒子を、パターン形成された伝導体対の間の電導力の変化を測定することにより電気的に検出する工程とからなる方法。
【請求項４５】
パターン形成された伝導体が交互嵌合していることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
交互嵌合している伝導体と少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップとが、基板上の約０．５平方ミリメートル〜約２平方ミリメートルにわたってパターンを形成することを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップそれぞれが、幅約１０μｍ〜約１００μｍで実質的に線状であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
基板が、第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間にパターン形成された絶縁体をさらに備えることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
電気的検出が金ナノ粒子上で凝集した銀を検出することからさらになる請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
電気的検出が第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間の電導性を測定することからなる請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも２つの結合部位を有する核酸を検出する方法であって、
（ａ）核酸を、オリゴヌクレオチドが第１および第２のパターン形成された電極の間に配置された状態で付着している基板に接触させる工程であって、
第１のパターン形成された電極および第２のパターン形成された電極のパターンにより、第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間に少なくとも２つの実質的に非電導性のギャップが形成され、
オリゴヌクレオチドが前記核酸の配列の第１の結合部位に相補的な配列を有し、接触は基板上のオリゴヌクレオチドと前記核酸とのハイブリダイゼーションが可能となるのに有効な条件下で実施されることを特徴とする工程と、
（ｂ）基板に結合した前記核酸を、電導性の材料で作製されている第１の種類の標識と接触させる工程であって、該標識には１以上の種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが前記核酸の配列の第２の結合部位に相補的な配列を有し、接触は、標識上のオリゴヌクレオチドと前記核酸とのハイブリダイゼーションが可能となり標識と複合体化された試験物質が形成されるのに有効な条件下で実施されることを特徴とする工程と、
（ｃ）試験物質を、非特異的に結合した標識を十分除去するのに有効な塩濃度の塩水溶液と接触させる工程と、
（ｄ）観察可能な変化を検出する工程と
からなる方法。
【請求項５２】
観察可能な変化を検出する工程が、第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化を検出することを含み、第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の該変化が、電導性、抵抗、電気容量、またはインピーダンスの変化を含むことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
１つの核酸の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはこれら両方が可能となるように基板上に複数の電極対がアレイ状に配置されており、各電極対がその電極の間の基板に付着した１種類のオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
標識が金属製である請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
標識がナノ粒子を含んでなる請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
標識が金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を含んでなる請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
標識が金ナノ粒子を含んでなる請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
基板を銀染色液と接触させて電導性に変化を生じさせることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
（ｄ）基板に結合した第１の種類の標識を、電導性の材料で作製されかつオリゴヌクレオチドが付着している第２の種類の標識と接触させる工程であって、第２の種類の標識上の少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが第１の種類の標識上の１種類のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を含み、接触は、第１および第２の種類の標識上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能となるのに有効な条件下で実施されることを特徴とする工程と、
（ｅ）第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化を検出する工程と
からさらになる請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化が、電導性、抵抗、電気容量、またはインピーダンスの変化を含むことを特徴とする請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
第１の種類の標識上の少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが第２の種類の標識上の少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有することを特徴とし、
（ｆ）基板に結合した第２の種類の標識を第１の種類の標識と接触させる工程であって、第１および第２の種類の標識上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能となるのに有効な条件下で実施されることを特徴とする工程と、
（ｇ）第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化を検出する工程と
からさらになる請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化が、電導性、抵抗、電気容量、またはインピーダンスの変化を含むことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
工程（ｄ）、または工程（ｄ）および（ｆ）を１回以上繰り返し、電導性の変化を検出
することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
（ｄ）基板に結合した第１の種類の標識をオリゴヌクレオチドが付着した凝集プローブと接触させる工程であって、凝集プローブの標識が電導性の材料で作製されており、凝集プローブ上の少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが第１の種類の標識上の１種類のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を含み、接触が、凝集プローブ上のオリゴヌクレオチドと第１の種類の標識上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能となるのに有効な条件下で実施されることを特徴とする工程と、
（ｅ）第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化を検出する工程と
からさらになる請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
第１のパターン形成された電極と第２のパターン形成された電極との間の電気的特性の変化が、電導性、抵抗、電気容量、またはインピーダンスの変化を含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
塩水溶液が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の２以上の組合せ、これらの塩のうち１つをリン酸緩衝液に含めたもの、およびこれらの塩の２以上の組合せをリン酸緩衝液に含めたものからなる群から選択される塩を含んでなる請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
塩溶液が塩化ナトリウムをリン酸緩衝液に含めたものである請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
塩水溶液が約０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムと約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液とを含んでなる請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
塩水溶液が約０．００５〜０．１Ｍの塩化ナトリウムと約１０ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液とを含んでなる請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
検出可能な変化を観察する工程が、ハイブリダイゼーションが起きたかどうかを判定することからなる請求項５１に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも第１および第２のパターン形成された伝導体を表面上に備え、第１のパターン形成された伝導体が第２のパターン形成された伝導体から隔離されている基板を使用するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを向上させる方法であって、第１および第２のパターン形成された伝導体のパターンにより該第１のパターン形成された伝導体と第２のパターン形成された伝導体との間に少なくとも２つの実質的に非伝導性のギャップが形成され、基板には、実質的に非伝導性のギャップのうち少なくとも１つのギャップ内の捕捉オリゴヌクレオチドと、ミスマッチ塩基を有する核酸を含む試料中の１以上の標的核酸をハイブリダイゼーション反応により捕捉および検出するための標識されたオリゴヌクレオチドの検出用プローブとが結合され、捕捉プローブ、標的核酸、および検出用プローブがハイブリダイズした複合体を備えた基板を塩水溶液によって洗浄する工程を含めることから改良がなされる方法。
【請求項７２】
塩水溶液が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の２以上の組合せ、これらの塩のうち１つをリン酸緩衝液に含めたもの、およびこれらの塩の２以上の組合せをリン酸緩衝液に含めたものからなる群から選択される塩を含んでなる請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
塩溶液が塩化ナトリウムをリン酸緩衝液に含めたものである請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
塩水溶液が約０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムと約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液とを含んでなる請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
塩水溶液が約０．００５〜０．１Ｍの塩化ナトリウムと約１０ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液とを含んでなる請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
検出用プローブがナノ粒子‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含んでなる請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
コンジュゲートが金ナノ粒子‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含んでなる請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然物であれ合成物であれ、また修飾体であれ非修飾体であれ、核酸などの標的分析物を検出する方法に関し、より具体的には、核酸その他の標的分析物を電気的に検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００２年５月１４日出願の米国仮特許出願第６０／３８０，４４１号の利益を主張するものであり、同仮特許出願は引用によりその全体が本願に組み込まれる。
配列選択的なＤＮＡの検出は、科学者が疾患の遺伝的基礎を解明し、その新たな情報を医学的な診断および治療に利用する際にますます重要となってきている。オリゴヌクレオチドで修飾した基板上でのＤＮＡハイブリダイゼーション試験は、溶液中の特異的なＤＮＡ配列の存在を検出するために一般的に使用されている。遺伝情報を探査するためのコンビナトリアルＤＮＡアレイの展望が明らかになりつつあり、その結果これらの不均一系配列アッセイの今後の科学における重要性が示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
一般に、ハイブリダイゼーション試験を促進する基板部材の上または中に試料を置く。これらの部材は顕微鏡用のスライドガラスもしくはポリマー製スライドまたはポリマー製マイクロタイタープレートでよい。大抵のアッセイでは、蛍光体（フルオロフォア）で標識された標的物が表面に結合したプローブにハイブリダイズするのを蛍光顕微鏡またはデンシトメトリー法によりモニターする。しかしながら、蛍光検出は実験機器が高価であることやほとんどの一般的な基板からバックグラウンドの発光が生じることにより限界がある。さらに、標識されたオリゴヌクレオチド標的は、完全に相補的なプローブを１塩基のミスマッチを有するプローブから見分けて選択する能力に乏しいので、一塩基多型の検出に関しては表面ハイブリダイゼーション試験の利用には限界がある。蛍光検出法の簡便性、感度および選択性を改良する検出スキームがあれば、コンビナトリアル法による配列分析の可能性が十分実現されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本システムは、一態様においては、ＤＮＡハイブリダイゼーション事象および他の特異的結合事象を、微細加工した平面的な電極のアレイを用いて着実に電気的に検出することを可能にする。本発明の一実施形態では、少なくとも３つの電極を使用してＤＮＡハイブリダイゼーション事象を検出する。
【０００５】
本発明の別の態様では、ハイブリダイゼーションを検出可能な表面領域が最大となるように電極を設計する。一実施形態では、少なくとも１つの電極が少なくとも３つの側面を有し、該側面のうち２つの少なくとも一部分が別の電極に近接し、該２つの側面と他の電極とがギャップにより隔離されているように電極を設計する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（定義）
本明細書中で使用される「分析物」または「標的分析物」は、本発明を用いて試験試料中に検出しようとする物質である。分析物は、天然の特異的結合メンバー（例えば、抗体、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、ウイルスなど）が存在する、あるいは特異的結合メンバーを用意することができる任意の物質であってよく、該分析物はアッセイにおいて１つ以上の特異的結合メンバーに結合することができる。「分析物」は、任意の抗原性
物質、ハプテン、抗体、およびそれらの組合せであってもよい。分析物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与された薬物および不法な目的で投与された薬物などの薬物、細菌、ウイルス、ならびに前記物質のいずれかの代謝物または前記物質のいずれかに対する抗体であってもよい。
【０００７】
本明細書中で使用される「捕捉プローブ」は、直接または間接的に基板に付着された、分析物に結合可能な特異的結合メンバーである。捕捉プローブの一例は、標的核酸の少なくとも一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであって、スペーサー（例えば末端ポリＡ）および該オリゴヌクレオチドを支持体に付着させるための官能基を含んでも良い。捕捉プローブの別例には、支持体表面上への共有結合または吸着によって支持体に結合されている、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与された薬物および不法な目的で投与された薬物などの薬物、細菌、ウイルス、ならびに前記物質のいずれかの代謝物または前記物質のいずれかに対する抗体がある。捕捉プローブの例は、例えば国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号明細書（ナノスフェアー  インコーポレイテッド）に記載されており、同明細書は引用によりその全体が本願に組み込まれる。
【０００８】
本明細書中で使用される「特異的結合メンバー」とは、特異的結合対（すなわち一方の分子が化学的手段または物理的手段によりもう一方の分子に特異的に結合する別個の２分子）の一員である。抗原と抗体の特異的結合対に加えて、他の特異的結合対には、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的なヌクレオチド配列（標的核酸配列を検出するＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用されるプローブと捕捉される核酸配列など）、相補的なペプチド配列、エフェクタ分子と受容体分子、酵素補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素、細胞、ウイルスなどがある。さらに、特異的結合対には本来の特異的結合メンバーの類似体であるメンバーも含まれる。分析物と共通の少なくとも１つのエピトープを有する限りは、例えば分析物の誘導体または断片、すなわち分析物類似体を使用可能である。免疫反応の特異的結合メンバーには、抗原、ハプテン、抗体、およびこれらの複合体があり、それらを組換えＤＮＡ法またはペプチド合成により作製したものも含まれる。
【０００９】
本明細書中で使用される「試験試料」とは、検出しようとする標的分析物を含有し本発明を用いてアッセイされる試料を意味する。試験試料は分析物に加えて他の成分を含んでも良いし、液体の物理特性を有しても固体の物理特性を有してもよく、いかなる大きさでも容量でもよく、例えば流動する液体でもよい。試験試料は、特異的結合メンバーの特異的結合を妨害したり分析物を妨害したりしない物質である限りは、分析物以外の任意の物質を含みうる。試験試料の例には、血清、血漿、痰、精液、尿、その他の体液、ならびに地下水、廃水、土壌抽出物、空気および残留農薬などの環境試料があるが、これらに限定はされない。
【００１０】
「オリゴヌクレオチドの種類」とは、同一の配列を有する複数のオリゴヌクレオチド分子を指す。オリゴヌクレオチドが付着している１つの「種類の」ナノ粒子、コンジュゲートなどは、同じ種類（一種または複数種）のオリゴヌクレオチドが付着している複数のナノ粒子、コンジュゲートなどを指す。
【００１１】
「オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子」とは、「ナノ粒子‐オリゴヌクレオチドコンジュゲート」「ナノ粒子コンジュゲート」と呼ばれることもあり、本発明の検出方法の場合には、「ナノ粒子‐オリゴヌクレオチドプローブ」「ナノ粒子プローブ」「検出プローブ」、または単に「プローブ」と呼ばれることもある。ナノ粒子に結合されるオリゴヌクレオチドは、例えば標的核酸に相補的であるなどの認識特性を備えていてもよいし、繋ぎまたはスペーサーとして使用されてもよいし、特定の標的分析物（例えばリガンド
）に対する特異的結合対のメンバー（例えば受容体）にさらに結合されてもよい。標的分析物に対する多様な結合対メンバーを備えたナノ粒子を用いる検出プローブの例は、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号明細書（ナノスフェアー  インコーポレイテッド）に記載されており、同明細書は引用によりその全体が本願に組み込まれる。
【００１２】
蛍光法を改良する一検出技法は、検出用プローブを使用する、チップを用いた電気的ＤＮＡ検出法である。プローブには、特定の標的分析物に相補的な合成ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を使用すればよい。その核酸合成鎖にはシグナル機構を付着させる。シグナルが存在すれば（すなわちシグナル機構が存在すれば）、該合成鎖が試料中の核酸に結合したということであり、標的核酸が試料中に存在すると考えられる。逆に、シグナルが存在しないということは標的核酸が試料中に存在しないことを示す。
【００１３】
シグナル機構の一例は、三成分のサンドイッチアッセイ方式で基板上にハイブリダイズした特定のＤＮＡ配列の存在を示すための、比較的直径の小さい（１０〜４０ｎｍ）、オリゴヌクレオチドで修飾された金ナノ粒子プローブである。例えば、「オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子およびそれらの使用（Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefore ）」と題され、その全体が引用により本願明細書に組み込まれる米国特許第６，３６１，９４４号を参照のこと。また、ティ．エイ．タトン（T.A. Taton）、シー．エイ．ミルキン（C.A. Mirkin ）、アール．エル．レツィンガー（R.L. Letsinger）、２０００年、サイエンス誌（Science ）第２８９巻、ｐ．１７５７も参照のこと。ハイブリダイズさせたこれらのナノ粒子プローブが相補的なＤＮＡ配列をミスマッチを有するＤＮＡ配列から見分けて選択する能力は、ナノ粒子がアレイ表面から非常に迅速に解離する（または「融解」する）という理由から、蛍光体で標識されたプローブの選択能力よりも本質的に高い。さらに、アレイに結合したナノ粒子を、金促進型の銀の還元によって増幅させることにより、蛍光標識した遺伝子チップを共焦点方式で蛍光を画像化して一般的に観察する場合よりも高感度で、フラットベッド・スキャナを用いて該アレイを白黒画像とすることが可能であった。該スキャン方法を適用したＤＮＡミスマッチの特定が成功している。
【００１４】
固定化した捕捉プローブ（例えばオリゴヌクレオチドなど）と標的分析物を金ナノ粒子などの電導性粒子と組み合わせて使用して、相補的ＤＮＡ一本鎖間の結合事象を検出することは困難である。電導性粒子、例えば金ナノ粒子または他の電導性もしくは半導体ナノ粒子は、結合事象が起きると二電極間に電気的に検出可能な架橋（または接点）を作成することができる。そのような架橋は二電極間の電気的特性を変化させる。例えば、この架橋が電気的インピーダンス特性を（例えば高インピーダンスから低インピーダンスへと）変化させる結果、マルチメーターやＬＣＲメーターなどのすぐに入手可能な機器を用いて抵抗もしくは他の何らかの変数（電気容量、インダクタンス、ＡＣシグナルなど）の変化を信頼性高く測定することが可能となる。
【００１５】
本発明の実施において有用なナノ粒子には、金属（例えば金、銀、銅および白金）、半導体（例えばＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳもしくはＣｄＳｅでコーティングされたＺｎＳ）ならびに磁性（例えば強磁性）コロイド材料がある。本発明の実施において有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２、Ｓ３、Ｉｎ２、Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３、Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓが挙げられる。ナノ粒子の大きさは約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）であることが好ましく、約５ｎｍ〜約５０ｎｍがより好ましく、約１０ｎｍ〜約３０ｎｍが最も好ましい。
【００１６】
金属ナノ粒子、半導体ナノ粒子、および磁性ナノ粒子を作製する方法は、当業界で周知である。例えば、シュミット、ゲー．（Schmid, G.）編「クラスターとコロイド（Cluste
rs and Colloids ）」、ヴァインハイム（Weinheim）所在のＶＣＨ、１９９４年；ハヤト、エム．エイ．（Hayat, M.A. ）編「金コロイド：原理、方法および応用（Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications ）」米国サンディエゴ所在のアカデミック・プレス（Academic Press）；マサート、アール．（Massart, R. ）、ＩＥＥＥトランスアクションズ・オン・マグネティクス誌（IEEE Transactions On Magnetics）第１７巻、ｐ．１２４７、１９８１年；アーマディ、ティ．エス．（Ahmadi, T.S.）ら、サイエンス誌、第２７２巻、ｐ．１９２４、１９９６年；ヘングレイン、エイ．（Henglein, A.）ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第９９巻、ｐ．１４１２９、１９９５年；カーティス、エイ．シー．（Curtis, A.C.）ら、アンゲヴァンテ・ヒェミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ誌（Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. ）第２７巻、ｐ．１５３０、１９８８年を参照のこと。
【００１７】
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２、Ｓｅ３、Ｃｄ３、Ｐ２、Ｃｄ３、Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓのナノ粒子を作製する方法は、当業界で周知である。例えば、ウェラー（Weller）、アンゲヴァンテ・ヒェミー・インターナショナル・エディション・イン・イングリッシュ誌（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. ）第３２巻、ｐ．４１、１９９３年；ヘングレイン（Henglein）、トピックス・イン・カレント・ケミストリー誌（Top. Curr. Chem.）第１４３巻、ｐ．１１３、１９８８年；ヘングレイン（Henglein）、ケミカル・レビューズ誌（Chem. Rev.）第８９巻、ｐ．１８６１、１９８９年；ブラス（Brus）、アプライド・フィジックス・エイ誌（Appl. Phys. A.）第５３巻、ｐ．４６５、１９９１年；バーンクマン（Bahncmann ）「太陽エネルギーの光化学変換と貯蔵（Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy）」、ペリツェッティ（Pelizetti ）およびスキアヴェロ（Schiavello）編、１９９１年、ｐ．２５１；ワン（Wang）およびヘロン（Herron）、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第９５巻、ｐ．５２５、１９９１年；オルシャフスキー（Olshavsky ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）第１１２巻、ｐ．９４３８、１９９０年；ウシダ（Ushida）ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第９５巻、ｐ．５３８２、１９９２年を参照のこと。適切なナノ粒子は、例えばテッド・ペラ・インコーポレイテッド（Ted Pella, Inc. ）（金）、アマシャムコーポレイション（Amersham Corporation）（金）およびナノプローブズ・インコーポレイテッド（Nanoprobes, Inc.）（金）から市販もされている。
【００１８】
金コロイド粒子は、該粒子に独自の色彩を与える帯域に高い吸光係数を有する。これらの強烈な色彩は粒子の大きさ、濃度、粒子間の距離、ならびに凝集の程度および凝集物の形状（幾何学的形状）によって変化するので、これらの材料は比色アッセイにとって特に魅力的となっている。例えば、金ナノ粒子に付着させたオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドおよび核酸とハイブリダイズさせると、裸眼で見ることのできる迅速な色彩の変化が生じる。さらに、金ナノ粒子は電気的伝導性に優れているため本システムとともに使用するのに特に好適である。半導体ナノ粒子もまた、独自の電気特性および発光特性を有するのでナノレベルの微細加工（ナノファブリケーション）において使用するのに好適である。
【００１９】
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるために、ナノ粒子、オリゴヌクレオチド、または両方を官能化する。その方法は当業界において周知である。例えば、アルカンチオールで３’末端または５’末端を官能化したオリゴヌクレオチドは簡単に金ナノ粒子に付着する。例えば、ホワイトサイズ（Whitesides）、米国テキサス州ヒューストンにおけるロバート  エイ．ウェルチ基金（Robert A. Welch Foundation）第３９回ケミカル・リサーチ・ナノフェイズ・ケミストリー（Chemical Research Nanophase Chemistry ）会議会報、ｐ．１０９〜１２１、１９９５年を参照のこと。また、マキック（Mucic ）ら、ケミ
カル・コミュニケーションズ誌（Chem. Commun. ）ｐ．５５５〜５５７、１９９６年も参照されたい（３’チオールＤＮＡを平らな金表面に付着させる方法について記載されている。この方法を用いてオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させることができる）。アルカンチオール法を用いて、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および磁性コロイド、ならびにその他の上記に列挙したナノ粒子に付着させることもできる。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるための他の官能基には、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド‐ホスホロチオエートの金表面への結合には米国特許第５，４７２，８８１号を参照されたい）、置換アルキルシロキサン（例えば、オリゴヌクレオチドのシリカ表面およびガラス表面への結合についてはバーウェル（Burwell ）、ケミカル・テクノロジー誌（Chemical Technology ）第４巻、ｐ．３７０〜３７７、１９７４年ならびにマットイッチ（Matteuicci）およびカルサース（Caruthers ）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）第１０３巻、ｐ．３１８５〜３１９１、１９８１年を、アミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様の結合についてはグラバー（Graber）ら、アナリティカル・ケミストリー誌（Anal. Chem. ）第６７巻、ｐ．７３５〜７４３を参照されたい）。
【００２０】
末端が５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドであるオリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドを固体表面に付着させてもよい。ビオチン標識したオリゴヌクレオチドとストレプトアビジン‐金コンジュゲートのコロイドとを用いて、金ナノ粒子をオリゴヌクレオチドに付着させてもよい。この場合、ビオチン‐ストレプトアビジン相互作用によりコロイドがオリゴヌクレオチドに付着する。シャイウ（Shaiu ）ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ誌（Nucleic Acids Research）第２１巻、ｐ．９９、１９９３年を参照されたい。以下の参照文献には、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるために使用可能なその他の方法が記載されている：ヌッツォ（Nuzzo ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）第１０９巻、ｐ．２３５８、１９８７年（金上のジスルフィド）；アラーラ（Allara）およびヌッツォ（Nuzzo ）、ラングミュア誌（Langmuir）第１巻、ｐ．４５、１９８５年（アルミニウム上のカルボン酸）；アラーラ（Allara）およびトンプキンス（Tompkins）、ジャーナル・オブ・コロイド・アンド・インターフェイス・ソサイエティ誌（J. Colloid Interface Sci. ）第４９巻、ｐ．４１０〜４２１、１９７４年（銅上のカルボン酸）；アイラー（Il er）「シリカの化学（The Chemistry Of Silica ）」、第６章、ワイリー（Wiley ）社、
１９７９年（シリカ上のカルボン酸）；ティモンズ（Timmons ）およびジスマン（Zisman）、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第６９巻、ｐ．９８４〜９９０、１９６５年（白金上のカルボン酸）；ソリアガ（Soriaga ）およびハッバード（Hubbard ）、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）第１０４巻、ｐ．３９３７、１９８２年（白金上の芳香環化合物）；ハッバード（Hubbard ）、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ誌（Acc. Chem.
Res. ）第１３巻、ｐ．１１７、１９８０年（白金上のスルホラン、スルホキシドおよびその他の官能化溶媒）；ヒックマン（Hickman ）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ誌（J. Am. Chem. Soc. ）第１１１巻、ｐ．７２７１、１９８９年（白金上のイソニトリル）；マオズ（Maoz）およびサギブ（Sagiv ）、ラングミュア誌（Langmuir）第３巻、ｐ．１０４５、１９８７年（シリカ上のシラン）；マオズ（Maoz）およびサギブ（Sagiv ）、ラングミュア誌、第３巻、ｐ．１０３４、１９８７年（シリカ上のシラン）；ヴァッサーマン（Wasserman ）ら、ラングミュア誌、第５巻、ｐ．１０７４、１９８９年（シリカ上のシラン）；エルテコーヴァ（Eltekova）およびエルテコフ（Eltekov ）、ラングミュア誌、第３巻、ｐ．９５１、１９８７年（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；レック（Lec ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー誌（J. Phys. Chem.）第９２巻、ｐ．２５９７、１９８８年（金属上の剛性（rigid ）リン酸）。
【００２１】
各ナノ粒子には複数のオリゴヌクレオチドが結合していても良く、その結果、各ナノ粒子‐オリゴヌクレオチドコンジュゲートは相補的な配列を有する複数の標的分析物に結合することができる。本発明は基板表面上の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子の検出に関する。基板の表面には、１つ以上の標的分析物に対して特異的に結合する相補物（すなわち捕捉プローブ）を含む複数のスポットが備えられる。基板上のスポットのうちの１つを、標的分析物が１つ以上存在する場合にそこでナノ粒子が複合体を形成するための試験スポット（試験試料を含む）とすればよい。別の１スポットは、対照スポットとしても第２の試験スポットとしてもよい。感染性疾患について試験する場合、例えば、対照スポット（または陽性対照スポットおよび陰性対照スポット）を用いて、試験試料中に標的分析物が存在するか否かを検出するために試験スポットと比較してもよい。標的分析物を、例えば特定の細菌またはウイルスの代表的なものとすることができよう。陽性対照スポットは、核の捕捉鎖を介して基板に直接結合された金属ナノ粒子でもよいし、基板上に直接プリントされた金属ナノ粒子でもよいし、既知の標的物に対して複合体形成させた金属ナノ粒子についての陽性結果でもよい。遺伝子の配置（例えばどの遺伝子配列が存在するか）について試験する場合は、第２の試験スポットを使用しても良い。例えば、一塩基多型などの遺伝子配列の比較のために第２の試験スポットを２つ使用する。
【００２２】
本発明の実施において、様々な目的のために所定の配列のオリゴヌクレオチドを使用する。所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法はよく知られている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular cloning: A
Laboratoy Manual ）」（第２版、１９８９年）およびエフ．エクスタイン（F. Eckstein ）編「オリゴヌクレオチドと類似体（Oligonucleotides and Analogues）」第１版、１９９１年、米国ニューヨーク所在のオックスフォード大学出版（Oxford University Press ）を参照されたい。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドのいずれについても固相合成法が好ましい（この良く知られたＤＮＡ合成法はＲＮＡ合成にも有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドを酵素的に調製することもできる。
【００２３】
本システムにより標的分析物を電気的に検出することが可能となる。核酸やタンパク質などの任意の種類の標的分析物を検出可能であり、この方法を用いて疾患または感染を診断したり、薬物や汚染物質を特定したり、核酸の配列決定を行ったりすることができる。本発明の方法により検出可能な核酸の例には、遺伝子（例えば特定の疾患に関連する遺伝子）、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡの断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖の核酸、天然核酸および合成核酸などが挙げられる。
【００２４】
従って、核酸検出方法の用途の例としては、ウイルス性疾患（例えばヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、およびエプスタイン‐バーウイルス）、細菌性疾患（例えば結核、ライム病、Ｈ．ピロリ感染、大腸菌感染、レジオネラ感染、マイコプラズマ感染、サルモネラ感染）、性行為感染症（例えば淋病）、遺伝性障害（例えば嚢胞性線維症、デュシェンヌ（Duchene ）型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血症）、およびがん（例えばがんの発症に関連する遺伝子）の診断および／または監視；鑑識；ＤＮＡ配列決定；親子鑑定；細胞株の確認；遺伝子治療のモニタリング；ならびにその他多くの目的が挙げられる。
【００２５】
検出しようとする核酸を周知の方法で単離しても良いし、細胞、組織試料、生体液（例えば、唾液、尿、血液、血清）、ＰＣＲ成分を含んだ溶液、大過剰のオリゴヌクレオチドもしくは高分子量ＤＮＡを含んだ溶液、およびその他の試料中で直接検出してもよく、これは当業界でも知られている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular cloning: A Laboratoy Manual ）」（第２版、１９８９
年）ならびにビィ．ディ．ハームス（B.D. Hames）およびエス．ジェイ．ヒギンズ（S.J.
Higgins）編「遺伝子プローブ１（Gene Probes 1 ）」、米国ニューヨーク所在のアイアールエルプレス（IRL Press ）、１９９５年を参照されたい。ハイブリダイゼーションプローブを用いて検出するための核酸の調製方法は、当業界で周知である。例えば、サムブルックら、「分子クローニング：実験マニュアル」（第２版、１９８９年）ならびにビィ．ディ．ハームスおよびエス．ジェイ．ヒギンズ編「遺伝子プローブ１」、米国ニューヨーク所在のアイアールエルプレス、１９９５年を参照されたい。存在する核酸の量が少ない場合、当業界で知られた方法で増幅してもよい。例えば、サムブルックら、「分子クローニング：実験マニュアル」（第２版、１９８９年）ならびにビィ．ディ．ハームスおよびエス．ジェイ．ヒギンズ編「遺伝子プローブ１」、米国ニューヨーク所在のアイアールエルプレス、１９９５年を参照されたい。増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅である。
【００２６】
核酸を電気的に検出することにより着実なハイスループット検出が可能となるので、この検出法は、例えば研究および分析の実験室でＤＮＡを配列決定する場合、野外で特定の病原体の存在を検出する場合、診療室で迅速に感染を特定して治療薬を処方する助けとする場合、ならびに家庭や保健医療施設で安価に第一次スクリーニングする場合に特に適している。
【００２７】
ここで図面について言及すると、図１ａは、４つのチップパターンを備えた７．６２ｃｍ（３”）ウェハマスクの見取り図であり、ここで各チップパターンは、相補的にパターン形成された伝導体または電極１２および１２ａによって形成された１０個の電気的検出領域を有する。各々の電気的検出領域は核酸の存在を検出するのに適している。ウェハマスクの大きさとチップパターンの数とはシステムの基準によって変わりうる。図１ａに示すように、少なくとも２つのコンタクトパッド１０が各検出領域について備えられる。コンタクトパッド１０は図のように電極１２に電気的に接続される。このような１対のコンタクトパッド１０および複数の電極１２の例を図１ｂ（図１ａの丸で囲まれた部分）に示す。
【００２８】
ガラス基板上に４チップウェハを製造する方法の例は次の通りである。第１に、ウェハおよび用具をアセトン／ＩＰＡ／水／ＩＰＡ／窒素で洗浄する。次いで、ウェハを１０分間ピラニア洗浄（Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２  １：４）し、二酸化シリコン層をウェハ表面に成膜する。次に、ｅビーム蒸着により５０Åのチタン層および９００Åの金の層をウェハ上に成膜する。次に、ウェハをホットプレートにより１１５℃で５分間焼いて完全に乾燥させてから、ウェハ上にフォトレジスト（シプリィ（Shipley ）１８１８など）１．５ｍＬを５，０００ｒｐｍで回転成膜する。次いでウェハを再度ホットプレートにより１１５℃で１分間焼いてレジストの残留溶媒を全て取り除く。次に、ウェハを整列させて１１秒間露光してから、１分間現像する。次いで、ウェハをホットプレートにより１１５℃で２分間焼いてフォトレジストを硬化させる。次にウェハを３０秒間エッチング（金層）してからさらに２４秒間エッチング（クロム層）し、すすいで乾燥させる。次に、シプリィ（Shipley ）１１６５などの除去剤を用いてフォトレジストを取り除き、またさらにプラズマによりフォトレジストを剥し取る。ウェハにフォトレジストが残留していないかを調べてから、ウェハをコンタクトパッドの間でさいの目に切って４チップ分となるようにする。ガラスウェハを製造するための非常に類似した手法が使用される。図１ｂにこの製法の概要を断面図として示す。
【００２９】
図１ｃに示すように、電極は複数存在する（全部で１６個）。システムにおいて必要であれば使用する電極はこれより多くても少なくてもよい。電極を「交互嵌合した（interdigitated）」パターンに構成してもよい。従って電極は相互にかみ合わされ、非電導性のギャップで隔離される。一部の実施形態では、窒化物または酸化物などの絶縁体をパター
ン形成して電極間のギャップとすることも有用であろう。一態様では、少なくとも３つの電極が使用される。２つの電極を一方向に配置し、第３の電極を反対方向に配置すればよい。
【００３０】
図１ｃに示すように、典型的な電極は複数の辺を有し（図１ｃの５辺の電極など）、少なくとも１辺が電導性のトレース１４に接続される。さらに、少なくとも１つの電極（例えば１２ａで示す電極）が他の電極に近接する少なくとも２つの辺を備え、該２辺と他の電極とは非電導性のギャップにより隔離されているように電極が配置される。例えば、辺１６および辺１８が他の電極に近接し、非電導性のギャップにより隔離されている。
【００３１】
上記に論じたように、図１ａは４つのチップパターンを備えたウェハマスクを示している。各チップを、幾何学的形状の点でアレイ作製装置（アレイヤー）および顕微鏡スライドの方式に対応するように設計することが可能である。ある標準的なアレイ作製装置用顕微鏡スライドには３つのチップが合う、または３つのチップで構成可能である。各チップには、検出領域内の任意の地点での検出を可能にする一連の交互嵌合した電極を備えているので、アレイ作製装置で領域上に捕捉プローブを配置または「スポット」する場合の許容誤差が大きい。微細加工により、より密度の高い電極アレイと一層整合性の高い測定値が得られる。
【００３２】
デバイスをクリーンルームの環境で加工することができる。任意の好適な基板を使用可能であるが、例えば、基板は両面が研磨された７．６２ｃｍ（３”）シリコンウェハでもよい。例えば、基板はシリコンのかわりにガラス（例えば標準的なアレイ作製装置用顕微鏡スライド）で構成されてもよい。絶縁層は装置の全ての実施形態に必ずしも不可欠ではないが、酸化物（ＳｉＯ２）などの絶縁層を高湿の温熱環境下でウェハ上に成膜してもよい。その他の絶縁材料には、窒化シリコンおよびポリアミドが挙げられるがこれらに限定はされない。金属層（金、白金、アルミニウム、クロミウムまたは銅）などの電導性の層をウェハ上に成膜し、フォトリソグラフィ法を用いてパターン形成してもよい。代替実施形態において、電導層が半導体材料を含んでもよい。
【００３３】
ウェハのフォトリソグラフィ、化学的現像およびエッチングの結果、微細加工された電極が得られる。電導性架橋が形成されなければ、各電極対の間には高いインピーダンスが存在する。ウェハをさいの目に切って各々２５ｍｍ×２５ｍｍ角にすると、ナノ粒子を電気的に検出しうるパターン形成された電極の相補的セットを複数含みうる「チップ」となる。例えば、図１ａのウェハは４つのチップパターンを有し、各チップはナノ粒子を感知するための９セットのパターン形成された電極を有する。各チップを酸素プラズマ環境下で完全に洗浄して全ての有機材料を除去してから、不動態化する。その後、オリゴヌクレオチドの捕捉鎖などの捕捉プローブをアレイ作製装置でチップにスポットする。
【００３４】
図２ａは、電極の間隔を均等にした設計の代替実施形態を示す。アレイ作製ロボットで１以上の捕捉鎖を含むスポットを施すことができる。図２には、アレイ作製ロボットが捕捉鎖を「スポット」または配置しうる場所の印として図の中央にドットが示されている。アレイ作製ロボットは、自動化されてはいるが、捕捉鎖を配する場所の精度は様々である。例えば、スポットの位置の許容誤差は一般に±１ｍｍである。この図においては、アレイ作製装置によって捕捉鎖がスポットされ、その一部が電極間のギャップ内にある限りは、該捕捉鎖に（直接または間接に）結合したナノ粒子を電気的に検出することが可能であろう。
【００３５】
図２ｂは、相補的で交互嵌合している電極を１０セット備えたチップの代替実施形態を示す。この実施形態により、電極間のギャップで形成された、より大きな正方形の検出領域が得られる。検出領域の有用な大きさは、例えば５００μｍ２〜２ｍｍ２であろう。
【００３６】
パターン形成された電極は、２つの電極によって形成される終端間の単一のギャップよりも基板上の遥かに広い部分に及ぶので、本来アレイ作製ロボットには配置誤差があるにもかかわらずアレイ作製ロボットを用いてスポットすることが可能である。さらに、その幾何学的形状から１つのチップ上に複数のスポットを配置することが可能であり、その結果検出の信頼性が向上しうる。最終的には、スポット内に捕捉鎖の濃度の差異をつくることも可能である。電極の設計次第で任意の可能な差異が得られる。というのも、パターン形成された電極で作られた検出領域内に、スポットのわずか一部分ではなくスポット全体を配置することができるからである。図３は、電導性トレース１４を介してコンタクトパッド１０に接続された六角形の形状の代替電極１２および１２ａを示す。
【００３７】
図４は、本発明の別の実施形態を示す。その前の図と同様に、電極１２および１２ａは電導性トレース１４を介してコンタクトパッド１０に接続されている。電極１２および１２ａは、図１ｂのように互いの間に挟まれているというよりは、互いの間にギャップまたは酸化物層を備えて互いに隣接している。この電極およびコンタクトパッドの特定の構成により、小型で高密度の幾何学的構成が可能となる。
【００３８】
図５は基板２２の表面２０の上にパターン形成された電極１２および１２ａの断面図である。捕捉プローブ２４は、電極１２および１２ａの間の実質的に非電導性のギャップ２６の中に固定化される。固定化捕捉プローブ２４、標的分析物を電導性粒子と組み合わせて用いて、適合する一本鎖ＤＮＡ間の結合事象が起きると、電極１２および１２ａの間の電気的特性が測定可能な変化を示す。例えば、検出プローブの金ナノ粒子により電極間の実質的に非電導性のギャップが架橋され、電極間の電導力が増大する可能性がある。
【００３９】
ナノ粒子は個々のナノ粒子でも互いに結合した「樹状」ナノ粒子でもよいことに注意されたい。図６ａおよび６ｂに、基板上における標的分析物の検出の模式図を示す。図６ａは、基板２２の表面２０に固定化された捕捉プローブ２４に個々の金ナノ粒子を結合させている標的分析物を示している。図６ｂは、基板２２の表面２０に固定化された捕捉プローブ２４に樹状ナノ粒子を結合させている標的分析物を示している。図６ａおよび６ｂにおいて、ａ、ｂ、ｃは異なる結合部位（例えばオリゴヌクレオチド配列）を表し、一方ａ’、ｂ’、ｃ’はそれぞれａ、ｂ、ｃに相補的な結合部位（オリゴヌクレオチド配列など）を表す。
【００４０】
樹状ナノ粒子では個々のナノ粒子に比べてシグナル感度が増大し、ハイブリダイズした金ナノ粒子の樹状物は基板上の暗い領域として裸眼で観察可能なことが多い。樹状ナノ粒子を使用しない場合、または樹状ナノ粒子により生じるシグナルをさらに増幅するためには、ハイブリダイズした金ナノ粒子を銀染色液で処理することが可能である。樹状ナノ粒子は染色過程を加速させ、個々のナノ粒子に比べて標的核酸の検出がより速くより高感度になる。金促進型の銀の還元または樹状ナノ粒子により電導力が増大すれば、試料中の１またはごくわずかしか存在しない個々の標的分析物を検出することが可能である。
【００４１】
微小流体カートリッジの土台（プラスチックまたはそれ以外）、発熱体、または回路基板などの別の環境に、容易にチップを組み込むことも可能であろう。
以下は、既知のオリゴヌクレオチドを用いた特異的結合事象の電気的検出についての実施例である。
【実施例１】
【００４２】
（金プローブ濃度に関する実験）
１．金ナノ粒子プローブを、米国特許第６，５０６，５６４号（引用により本願に完全に組み込まれる）に記載されているように調製した。使用したオリゴヌクレオチド配列は
２０Ａの繰り返し配列とした。
【００４３】
２．次の金プローブ濃度、すなわち１０ｆＭ、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭのアリコートを調製。
３．チップを０．２％ＳＤＳ溶液で５分間洗浄し、Ｎａｎｏｐｕｒｅ（登録商標）水で洗い流す。無水エタノールに１分間浸し、遠心して乾燥させる。
【００４４】
４．約１ｍＬのポリＬリシン０．０１％「ストック」溶液（シグマ（Sigma ）社２５９８８‐６３‐０）を９つのチップのうち４つにピペッタ（分注器）で直接分注し、低速で３０分間遠心した。
【００４５】
５．チップ上の９対の各電極上に４μＬを載せることのできる「ウェル」を備えたダウコーニング（Dow Corning ）のＳｙｌｇａｒｄ（登録商標）１８４ガスケットを取り付ける。
【００４６】
６．各濃度４μＬを各電極（全部で５つ）上にスポットする。最大で３つの電極を「陰性対照」（ＮＣ）のための予備とする。
７．チップを湿らせたＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）の入ったプラスチック製トレイの中で１時間インキュベートする。
【００４７】
８．銀現像液、例えば１：１で混合したシグマ社（米国ミズーリ州セントルイス所在）の銀増強溶液Ａ（Silver Enhancement Solution A ）（部品番号Ｓ‐５０２０）および増強溶液Ｂ（Enhancement Solution B）（部品番号Ｓ‐５１４５）などを用いて、チップ全体に銀現像剤を供し、シェーカー・プレートに載せて低速で、またはペトリ皿（商標）を手動で揺らしながら２分間現像する。
【００４８】
９．水槽で現像剤とチップを穏やかに冷却し、遠心し、各電極の電気抵抗を記録する。
１０．各電極についてシグナルが得られるまでステップ７を繰り返す。
この実験において、金ナノ粒子プローブが結合した後の電気間の抵抗の変化は、使用した金プローブの濃度によって変わり、約５×１０８Ωから１ＫΩまで電気抵抗が低下した。電導性の増大が最適となる銀現像時間は約１２分間〜約１６分間と様々であり、この場合も金プローブの濃度によって変わる。
【実施例２】
【００４９】
（表面の評価／２つの点突然変異を有する配列）
１．シリル化したチップ（「非処理群」とする）を次のように調製した：
・チップを０．２％ＳＤＳ溶液、水およびエタノールで洗浄し、乾燥させた。
【００５０】
・シリル化したオリゴヌクレオチド捕捉鎖（濃度２０μＭ）を、手動ピペッタを用いて２μＬの小滴として手動でスポットした。捕捉鎖は以下の配列：
５’ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＴ  Ｃ  ＰｅｇＰｅｇＰｅｇ３’（陽性対照の捕捉鎖）
５’ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  Ｃ  ＰｅｇＰｅｇＰｅｇ３’（変異体捕捉鎖）
とした。プローブは陽性対照の捕捉鎖に相補的な配列：
３’エピ‐Ａ２０‐ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  Ａ
とした。
【００５１】
２．シラン修飾チップ（「処理群」とする）を次のように調製した：
・チップを無水エタノールに溶解した５％イソシアネートに１時間浸漬し、次いで乾燥させた。
【００５２】
・アミン修飾したオリゴヌクレオチド捕捉鎖（濃度２０μＭ）を、手動ピペッタを用いて２μＬの小滴として手動でスポットした。捕捉鎖は以下の配列：
５’ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＴ  Ｃ  ＰｅｇＰｅｇＰｅｇ３’（陽性対照の捕捉鎖）
５’ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  Ｃ  ＰｅｇＰｅｇＰｅｇ３’（変異体捕捉鎖）
とした。プローブは陽性対照の捕捉鎖に相補的な配列：
３’エピ‐Ａ２０‐ＧＡＴ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＴＣ  Ａ
とした。
【００５３】
・いずれの場合にも、適合（マッチする）プローブ配列に対応する「陽性対照」捕捉鎖を３つの電極にスポットし、同じ適合プローブ配列とは２塩基対異なる「変異体」捕捉鎖を３つの電極にスポットした。
【００５４】
・残りの電極にはスポットせず、よって「陰性」対照とした。
・チップを１０ｎＭの陽性対照プローブを用いて４０℃で２時間ハイブリダイズさせた。
【００５５】
・銀現像の現像時間は３分ずつを単位として全部で９分であった。
この実験において、金ナノ粒子プローブが結合した後の電気間の抵抗の変化は、約４０分間の銀現像の後、約５×１０８Ωから１００Ωまで電気抵抗が低下した。変異体捕捉鎖では測定可能な抵抗の変化は示されず、３つの陰性対照のうち２つについても測定可能な変化は示されなかった。３つめの陰性対照には不具合があり、約１００ＫΩの一定した抵抗値を示した。
【実施例３】
【００５６】
（第Ｖ因子に関する実験）
１．前処理およびチップの準備は（表面の評価／２つの点突然変異を有する配列）の実験と同じである。
【００５７】
２．ガラス（Ｐｙｒｅｘ：登録商標）基板のチップ（「処理群」のイソシアネートチップおよび「非処理群」のシリル化チップの両方）に野生型第Ｖ因子、プロトロンビン、陰性対照、および陽性対照の各配列をスポットした。スポットしたオリゴヌクレオチドの濃度は２０μＭで、配列は次の：
捕捉鎖：野生型第Ｖ因子
表示名：ＦａｃｔｏｒＶ  ４３Ｈ
配列：ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  ＴＡ‐（ｐｅｇ）３‐ＮＨ２
捕捉鎖：陽性対照
表示名：ＰＨＡ２Ｈ
配列：ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＴ  Ｃ‐（ｐｅｇ）３‐ＮＨ２
捕捉鎖：陰性対照
配列：ＡＣＴ  ＴＴＡ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  Ｇ‐（ｐｅｇ）３‐ＮＨ２
長さ：１３
捕捉鎖：野生型プロトロンビン
表示名：ＰＲＯ  １９Ｈ
配列：ＣＴＣ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＡＧ‐（ｐｅｇ）３‐ＮＨ２
１．ハイブリダイゼーションには、ＰＣＲ量の野生型第Ｖ因子を濃度１０ｎＭの金プローブとともに使用した。金プローブは上記の実施例１に記載されているように調製した。
【００５８】
２．ハイブリダイゼーション時間は３８℃で３０分とした。
３．銀現像の現像時間は３分ずつを単位として全部で９分であった。
この実験において、陰性対照と野生型のシグナルの電極間のシグナル強度が少なくとも１００倍異なる、野生型第Ｖ因子の存在を示す電気抵抗の変化が、９分の間に生じた。
【００５９】
当然のことであるが、例証した実施形態は単なる例示であり、本発明を限定するものとしてとらえるべきではない。特許請求の範囲は、その旨について言及しない限り、記載された順序または要素に限定されると解釈すべきではない。従って、特許請求の範囲内にある全ての実施形態およびそれらの等価物を本発明と主張する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１ａ】４つのチップパターンを備えた７．６２ｃｍ（３”）ウェハマスクの略図。
【図１ｂ】パターン形成された電極を作製するために使用可能なウェハ加工工程を示す図。
【図１ｃ】図１ａで強調表示された部分の１対の電極を示し、交互嵌合したパターンの電極を示す図。
【図２ａ】アレイ作製ロボットが捕捉鎖をスポット可能な場所を表すためのドットが各電極パターンの中央に備えられた、図１ａのウェハの１チップを一層詳細に示す図。
【図２ｂ】交互嵌合した電極の代替実施形態の１チップを示す図。
【図２ｃ】図２ｂの実施形態のパターン形成された電極対を一層詳細に示す図。
【図２ｄ】捕捉鎖を「スポット」された、図２ｃのパターン形成された電極により形成された検出領域を示す拡大写真。
【図３】別の設計のパターン形成された電極を示す図。
【図４】さらに別の設計のパターン形成された電極を示す図。
【図５】基板上の１対のパターン形成された電極と捕捉プローブとを示す断面図。
【図６ａ】１種類のナノ粒子を用いてＤＮＡが標的に結合するのを検出するシステムを示す概略図。
【図６ｂ】樹状ナノ粒子を用いてＤＮＡが標的に結合するのを検出するシステムを示す概略図。
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【図１ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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