(57)【要約】本発明は、三つ葉型ドメイン含有ポリペプチドおよび三つ葉型ペプチド断片を投与することにより、上皮病変および疾患を治療および予防するための組成物および方法を特徴とする。三つ葉型ドメイン含有ポリペプチドおよび三つ葉型ペプチド断片を、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における上皮病変を治療または予防するための方法であって、三つ葉型（trefoil）ドメイン含有ポリペプチド(TDCP)または三つ葉型ペプチド断片を投与する段階を含む方法。
【請求項２】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片が、hITF25-62、hITF22-62、hITF21-62、hITF25-70、hITF22-70、hITF21-70、hITF25-72、hITF22-72、hITF21-72、hITF25-73、hITF22-73、hITF21-73、およびEA-hITF15-73からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
三つ葉型ペプチド断片がITF15-73である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
TDCPにITF15-73が含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項５】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片に、SEQ ID NO:3〜5のいずれか一つと実質的に同一のアミノ酸配列を有する三つ葉型ドメインが含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片に、SEQ ID NO:6と実質的に同一のアミノ酸配列を有する三つ葉型ドメインが含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片は、ホモ二量体またはヘテロ二量体として投与される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
上皮病変が上部消化管の病変である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
上皮病変が、アフタ性口内炎、粘膜炎、歯肉炎、食道病変、逆流性食道炎により引き起こされる病変、またはベーチェット病により引き起こされる病変である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
上皮病変が真皮または表皮の病変である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
病変が、外傷性病変、熱傷、圧迫潰瘍、湿疹、接触性皮膚炎、乾癬、疱疹性病変、またはにきびである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
皮膚病変が、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染により引き起こされる、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
上皮病変が、膣上皮、頸部上皮、または子宮上皮病変である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
皮膚病変が、細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染により引き起こされる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
上皮病変が胃腸管の上皮病変である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
上皮病変が腸遠位の病変である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
病変が、腸炎もしくは直腸炎である、またはクローン病もしくは潰瘍性大腸炎により引き起こされる、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
上皮病変が気道上皮病変である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
病変が、アレルギー反応、喘息、慢性閉塞性肺疾患、または、煙、粒状物質、もしくは化学物質の吸入により引き起こされる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
上皮病変が角膜上皮病変である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
病変が、表在点状角膜炎、角膜潰瘍、ヘルペスもしくはアデノウイルスにより引き起こされる角結膜炎、フリクテン性角結膜炎、円錐角膜、結膜、乾性角結膜炎(ドライアイ)、眼部炎症（ocular inflammation）、瘢痕性類天疱瘡（cicatricial penhigoid）、細菌感染または原虫感染である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
病変が、抗腫瘍化学療法または抗腫瘍放射線療法により引き起こされる、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
三つ葉型ドメイン含有ポリペプチド(TDCP)または三つ葉型ペプチド断片、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項２４】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片が、hITF25-62、hITF22-62、hITF21-62、hITF25-70、hITF22-70、hITF21-70、hITF25-72、hITF22-72、hITF21-72、hITF25-73、hITF22-73、hITF21-73、およびEA-ITF15-73からなる群より選択される、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
三つ葉型ペプチド断片がITF15-73である、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
TDCPにITF15-73が含まれる、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片に、SEQ ID NO:3〜5のいずれか一つと実質的に同一のアミノ酸配列を有する三つ葉型ドメインが含まれる、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片に、SEQ ID NO:6と実質的に同一のアミノ酸配列を有する三つ葉型ドメインが含まれる、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片がホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
静脈内注射、筋肉内注射、または皮下注射に適した、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
口腔洗浄液、経口噴霧剤、または摂取可能な液体として製剤化される、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
坐剤、浣腸剤、腟坐剤、または膣洗浄液として製剤化される、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
吸入用に製剤化される、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
眼への投与用に製剤化される、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
第二の治療剤をさらに含む、請求項23記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
第二の治療剤は、鎮痛剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、抗増殖剤、抗炎症剤、またはステロイドである、請求項35記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
hITF21-72またはhITF21-73を産生するための方法であって、組換えhITF21-72または組換えhITF21-73を発現できる微生物を提供する段階、および該微生物を約pH 5.0で培養する段階を含む方法。
【請求項３８】
微生物が酵母である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
酵母がP.パストリス(P. pastoris)である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
hITF15-72またはhITF15-73を産生するための方法であって、組換えhITF15-72または組換えhITF15-73を発現できる微生物を提供する段階、および該微生物を約pH 6.0〜pH 6.5で培養する段階を含む方法。
【請求項４１】
微生物が酵母である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
酵母がP.パストリスである、請求項41記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、上皮細胞の病変の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
上皮組織は、身体および内部器官の表面を裏打ちし、それらを外部環境から保護する役割を果たす。例えば、皮膚の上皮細胞は、乾燥およびUV照射の有害な作用を阻止または軽減し、体温の恒常性に役立ち、化学物質によるおよび熱による損傷ならびに微生物病原体による感染を防ぐ防御の最前線となる。しかしながら、これらの組織は、外部環境と内部器官との間の境界に及んでいるため、上皮細胞は同様に、栄養素の移動を制御するならびに身体の内部および外部に副産物を廃棄する手段も供与している。例えば、胃腸管(GI管)の上皮組織は、下層組織を消化酵素、胃酸、および摂取した微生物の有害な作用から保護する。上皮細胞により、栄養摂取のための吸収表面も供与される。
【０００３】
上皮細胞に対する損傷および感染により、組織の障壁および吸収機能が損なわれる可能性がある。従って、多くの上皮細胞集団は、高い再生能および回復能を有する。しかしながら、 多くの病的状態および環境障害は、上皮組織の余力を圧倒する可能性があり、これにより、生物全体に有害な影響が及ぼされる。従って、正常な上皮組織の維持は、全般的な健康や快適な暮らしにとって明らかに有益である。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、三つ葉型（trefoil）ドメイン含有ポリペプチド(TDCP)または三つ葉型ペプチド断片を、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて利用して哺乳類(例えば、ヒト)における上皮病変を治療または予防するための(すなわち、三つ葉型療法を提供するための)、治療法および組成物を特徴とする。本発明のTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片には、SEQ ID NO:3〜6のいずれか一つと実質的に同一のアミノ酸配列を有する一つまたは複数の三つ葉型ドメインが含まれることが好ましい。特に有用な三つ葉型ペプチド断片には、例えば、hITF15-73、hITF25-62、hITF22-62、hITF21-62、hITF25-70、hITF22-70、hITF21-70、hITF25-72、hITF22-72、hITF21-72、hITF25-73、hITF22-73、およびhITF21-73が含まれる。一つの特に有用なTDCPは、EA-hITF15-73である。
【０００５】
本発明の三つ葉型療法は、口腔、舌、食道、胃、小腸および大腸ならびに腸遠位を含む消化管; 真皮または表皮; 膣上皮または頸部上皮; 気道上皮; または角膜上皮もしくは結膜上皮の上皮病変を治療または予防するための方法に利用することができる。
【０００６】
上部消化管の病変は、例えば、粘膜炎およびアフタ性口内炎を含み、または、例えば、抗腫瘍化学療法、化学物質による、熱による、もしくは放射線による熱傷、歯肉炎、虫歯、生検手順もしくは外科的介入、ベーチェット病、逆流性食道炎、および細菌感染、ウイルス感染、もしくは真菌感染により引き起こされ得る。腸遠位の病変は、例えば、粘膜炎、腸炎、直腸炎、クローン病、および潰瘍性大腸炎を含み、または、抗腫瘍化学療法、化学物質による、熱による、もしくは放射線による熱傷、生検手順、外科的介入、腫瘍切除、および細菌感染、ウイルス感染、もしくは真菌感染により引き起こされ得る。胃腸管の他の病変には、胃潰瘍が含まれる。
【０００７】
真皮または表皮の病変は、例えば、疱疹性病変、にきび、圧迫潰瘍、湿疹、乾癬を含み、または、例えば、外傷、外科的処置、アレルゲン、化学物質による、熱によるもしくは放射線による熱傷、および細菌感染、ウイルス感染、もしくは真菌感染により引き起こされ得る。
【０００８】
膣上皮および頸部上皮病変は、例えば、性感染症、抗腫瘍療法、外傷、アレルゲン、生検、外科的処置、化学物質による、熱によるまたは放射線による熱傷、および細菌感染、ウイルス感染、または真菌感染により引き起こされる。
【０００９】
気道上皮病変は、例えば、アレルギー反応、喘息、化学物質曝露、アスベスト曝露、外傷、煙または粒状物質の吸入、薬剤誘発性の肺損傷、外科的処置、挿管による外傷、慢性閉塞性肺疾患、高圧酸素療法、および細菌感染、真菌感染、またはウイルス感染により引き起こされる。
【００１０】
本発明の方法および組成物を用いて治療を施すことができる眼の疾患には、例えば、表在点状角膜炎、角膜潰瘍、ヘルペスもしくはアデノウイルス感染により引き起こされる角結膜炎、外傷性の肉体的損傷、眼科手術、化学物質曝露、UV線曝露、円錐角膜、結膜、乾性角結膜炎(ドライアイ)、眼部炎症（ocular inflammation）、瘢痕性類天疱瘡（cicatricial penhigoid）、細菌感染または原虫感染が含まれる。
【００１１】
本発明のTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、罹患組織に治療用ポリペプチドを輸送するのに適した任意の経路による投与を目的に製剤化することができる。例えば、TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、皮下注射剤、もしくは眼内注射剤として、または口腔洗浄液、経口噴霧剤、摂取可能な液体、坐剤、浣腸剤、腟坐剤、膣洗浄液、乾燥粉末吸入器、噴霧液、もしくは点眼液として製剤化することができる。
【００１２】
三つ葉型療法は、第二の治療剤と併用して施すこともできる。第二の治療剤は、TDCPおよび/または三つ葉型ペプチド断片と同じまたは異なる薬学的組成物中に、かつ同じまたは異なる経路により投与されうる。また、第二の療法は、三つ葉型療法と同じ頻度または同じ期間で施す必要はない。適当な第二の治療剤には、例えば、鎮痛剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、抗増殖(すなわち、化学療法)薬、抗炎症剤、およびステロイドが含まれる。
【００１３】
関連する局面において、本発明は、単離された核酸分子ならびに三つ葉型ドメイン含有ポリペプチド(TDCP)および三つ葉型ペプチド断片をコードする単離された核酸分子を含有するベクター、それらの核酸を発現する宿主細胞(例えば、大腸菌(E. coli)、P.パストリス（P. pastoris）、分裂酵母(S. pombe)、出芽酵母(S. cerevisiae)、乳酸菌(Lactobacillus)類、および植物細胞(例えば、米、小麦、トウモロコシ、大麦、およびライ麦のような単子葉植物))を特徴とする。
【００１４】
他の局面において、本発明は、hITF21-72またはhITF21-73を発現できる微生物(例えば、細菌および酵母)または培養ヒト細胞のような宿主細胞を提供する段階およびその宿主細胞を約pH 4.5〜5.5で培養する段階により、組換えhITF21-72またはhITF21-73を産生するための方法を特徴とする。細胞は、約pH 5.0で培養されることが好ましい。
【００１５】
他の局面において、本発明は、hITF15-72またはhITF15-73を発現できる微生物(例えば、細菌および酵母)または培養ヒト細胞のような宿主細胞を提供する段階およびその宿主細胞を約pH 5.8〜6.7で培養する段階により、組換えhITF15-72またはhITF15-73を産生するための方法を特徴とする。細胞は、約pH 6.0〜6.5で培養されることが好ましい。
【００１６】
本発明のTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、単量体、ホモ二量体、ヘテロ二量体、または多量体とすることができる。二量体はホモ二量体またはヘテロ二量体とすることができ、ヘテロ二量体は、1本の完全長の三つ葉型ペプチド(例えば、HITF)と本発明のTDCPもしくは断片のいずれかとを含んでもよく、またはTDCPおよび断片のいずれかの組合せを含んでもよい。二量体のメンバーはともに、生物学的に活性であることが望ましい。三つ葉型ドメイン含有ポリペプチドおよび三つ葉型ペプチド断片は、グリコシル化、ジペプチド付加、またはタンパク質分解性切断により、翻訳後修飾されてもよい。
【００１７】
「三つ葉型ペプチド」とは、ヒト鎮痙性ポリペプチド(hSP; TFF2としても知られる、GenBankアクセッション番号NM_005423)、ヒトpS2(TFF1としても知られる、GenBankアクセッション番号XM_009779)、ヒト腸三つ葉型因子(hITF; TFF3としても知られる)の全ての哺乳類相同体を指す。
【００１８】
哺乳類の三つ葉型ペプチドは1982年に発見された。哺乳類の三つ葉型ペプチドの一種であるヒト腸三つ葉型因子(hITF; TFF3)については徹底した性状分析が行われており、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第6,063,755号および第6,221,840号に記述されている。他の二種類の既知の三つ葉型ペプチドは鎮痙性ポリペプチド(SP; TFF2)およびpS2(TFF1)である。文献(例えば、Sands et al., Ann. Rev. Physiol. 58: 253-273, 1996)に詳細に記述されている腸三つ葉型ペプチドは、胃腸管において発現し、保存されたシステイン残基間の鎖内ジスルフィド結合によって形成される三ループ構造を持つ。これらのペプチドは、腸管を損傷から保護し、消化性潰瘍および炎症性腸疾患のような腸管障害を治療するのに用いることができる。これらのヒトポリペプチドの相同体がヒト以外の多くの動物種において見出されている。本明細書では、ヒトおよびヒト以外のこのタンパク質ファミリーの全てのメンバーを、三つ葉型ペプチドとよぶ。
【００１９】
「三つ葉型ドメイン」という用語は、hpS230-70、hSP130-71、hSP280-120、およびhITF24-64の三つ葉型ドメインに関して、それぞれ、SEQ ID NO:3〜6のいずれかと実質的に同一の配列からなり且つ特徴的な三つ葉型の二次構造を有するポリペプチドを指す。同定された4種類のヒト三つ葉型ドメインのポリペプチド配列のアラインメントを、図1Cに示す。保存された6個のシステイン残基の機能の一つは、特徴的な三ループ(三つ葉)構造をタンパク質に与えることであるということが当技術分野において認められている。このループ構造は、cys1-cys5(hITF; SEQ ID NO:1のアミノ酸残基25および51に相当)、cys2-cys4(hITF; SEQ ID NO:1のアミノ酸残基35および50に相当)、およびcys3-cys6(hITF; SEQ ID NO:1のアミノ酸残基45および62に相当)の一般的なペプチド鎖内ジスルフィド構造と一致する。
【００２０】
「断片」とは、三つ葉型ペプチドについて言及する場合、断片の全長にわたって、天然に存在する三つ葉型ペプチドと同一であり且つ三つ葉型ドメインを含む任意のポリペプチドを指す。従って、hITF/hTFF3の断片は72個のまたはそれより少ないアミノ酸を有し、hpS2/hTFF1 (GenBankアクセッション番号NP_003216)の断片は83個のまたはそれより少ないアミノ酸を有し、およびhSP/hTFF2 (GenBankアクセッション番号1909187A)の断片は105個のまたはそれより少ないアミノ酸を有する。いずれの場合にも、断片は、完全長のタンパク質よりも有意に短くすることができる。例えば、断片には、65個のもしくはそれより少ない、58個のもしくはそれより少ない、52個のもしくはそれより少ない、またはわずか42個のアミノ酸しか含まれていなくてもよい。特に有用なhITF/TFF3の断片には、例えば、hITF15-73、hITF25-62、hITF22-62、hITF21-62、hITF1-62、hITF25-70、hITF22-70、hITF21-70、hITF1-70、hITF25-72、hITF22-72、hITF21-72、hITF1-72、hITF25-73、およびhITF22-73が含まれる(図1A)。
【００２１】
「三つ葉型ドメイン含有ポリペプチド」または「TDCP」とは、三つ葉型ドメインを含み且つ、その断片の全長にわたって、天然に存在する三つ葉型ペプチドと同一ではないポリペプチドを指す。TDCPは、第二のポリペプチドもしくはタンパク質が共有結合した三つ葉型ペプチド断片からなってもよく、またはTDCPは、三つ葉型ドメインが組み込まれたポリペプチドからなってもよい。第二のポリペプチドまたはタンパク質により、三つ葉型ペプチドに通常起因するものとは異なる、他の生物学的または治療的な活性が与えられてもよい。前者の場合には、三つ葉型ペプチド断片は、N末端、C末端に共有結合されてもよく、または第二のポリペプチドのシステイン残基と、例えば、断片の付加的な(7番目の)システイン残基との間のシスルフィド結合のような、内部結合を有していてもよい。この立体構造では、7番目のシステインが三つ葉型ドメインのC末端であることが好ましい。後者の場合には、三つ葉型ドメインは、天然のまたは人工のポリペプチドとできる「担体」タンパク質に組み込まれてもよい。担体タンパク質の選択は、そのタンパク質に起因する所望の生物学的または特異的結合/標的化活性(またはその欠如)を基礎としてもよい。担体タンパク質は、例えば、TDCPまたは断片のみと比べて、結合させた分子の薬物動態特性または薬力学特性を変化させてもよい。例えば、血清アルブミンとの三つ葉型ドメインまたは三つ葉型ペプチド断片の共有結合により、TDCPの血清半減期が増加されてもよい。
【００２２】
TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、単量体、二量体、または多量体として存在してもよい。TDCPまたは断片の単量体は、鎖間ジスルフィド結合を形成して、二量体を形成してもよく、例えば、ITFの単量体は、三つ葉型ドメインの外側にあるシステイン残基で鎖内ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ヒトITFの71位のシステインは、二量体形成を促進する。
【００２３】
TDCPは、天然に存在するタンパク質(すなわち、内在性の哺乳類タンパク質)であってもまたは天然には存在しないポリペプチドであってもよい。天然には存在しないTDCPは、その全長にわたって、天然に存在するタンパク質と100%のアミノ酸配列の同一性はない。しかしながら、天然には存在しないTDCPは、天然に存在するタンパク質と実質的に同一であることが好ましい。
【００２４】
「実質的に同一」とは、SEQ ID NO:3〜6の三つ葉型ドメインについて言及する場合、4個、3個、2個、または1個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失によってのみ異なるアミノ酸配列を指す。
【００２５】
「ホモ二量体」とは、同じアミノ酸配列の別のTDCPと鎖間共有結合(例えば、ジスルフィド結合)を形成して、二量体を形成しているTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片を指す。「ヘテロ二量体」とは、異なるアミノ酸配列のTDCPもしくは断片とまたは他のいずれかの三つ葉型ペプチドと鎖間共有結合を形成しているTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片を指す。例えば、ヘテロ二量体には、ITFポリペプチドおよび任意のTDCPが一本含まれてもよい。または、TDCPのヘテロ二量体には、生物学的に活性でない三つ葉型ペプチドまたは非三つ葉型ペプチドがジスルフィド結合したTDCPが一本含まれてもよい。鎖間ジスルフィド結合は、例えば、hITFのcys71に相当する、三つ葉型ペプチドの7番目のシステイン残基で起こることが望ましいものと思われる。しかしながら、二量体化は、生物学的な活性を妨げることのない任意の鎖間ジスルフィド結合により達成されることができる。「多量体」とは、一つまたは複数のTDCPおよび/または他のポリペプチドと、一つまたは複数の鎖間ジスルフィド結合を形成するTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片を指す。または、多量体は、非共有結合的な方法で、特異的相互作用を介して形成されてもよい。例えば、ITFのホモまたはヘテロ二量体は、ムコ多糖類を認識して特異的に結合し、多量体を形成することができる。
【００２６】
「複数の三つ葉型ドメイン含有ポリペプチド」または「MTDCP」とは、二つまたはそれ以上の三つ葉型ドメインを有する、天然には存在しないポリペプチドであって、ここで、三つ葉型ドメインがアミノ酸2個を超えるリンカー配列により分離されたポリペプチドを指す。MTDCPは、本発明の任意のTDCPまたは三つ葉型ペプチドと交換可能である。キメラMTDCPの構築のための方法は、組換えDNA技術を用いる技術分野において十分に確立されている。
【００２７】
「三つ葉型療法」とは、一つまたは複数の本発明のTDCPおよび/または三つ葉型ペプチド断片を含むまたは利用する治療用組成物または方法を指す。
【００２８】
「翻訳後修飾」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の共有結合修飾、酵素修飾、または化学修飾を指す。翻訳後修飾は、特定のアミノ酸で、またはペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に内在する別のアミノ酸配列との関連で起こり得る。典型的な翻訳後修飾には、セリン残基で起こるO結合グリコシル化、アスパラギン残基で起こるN結合グリコシル化、リン酸化(セリン、スレオニンおよびチロシンで起こるO結合リン酸化; ヒスチジン、リジンおよびアルギニンで起こるN結合リン酸化)、水酸化、硫酸化、アセチル化、アシル化、およびカルボキシル化が含まれる。最も一般的な翻訳後修飾のうちの一つは、特異的および非特異的タンパク質分解酵素による、ならびに化学的加水分解(例えば、酸加水分解およびCNBrによるメチオニン切断)によるような非酵素的手段を介する、タンパク質分解性切断である。特異的タンパク質分解酵素には、α因子分泌配列のようなシグナル配列を切断するように作用する前駆タンパク質転換酵素(PC)、セリンプロテアーゼ(例えば、キモトリプシンおよびトリプシン)、およびメチオニン・アミノペプチダーゼが含まれる。他のタンパク質分解酵素には、エラスターゼ、コラゲナーゼ、アスパルターゼ、カスパーゼ、およびメタロプロテアーゼが含まれる。翻訳後修飾には、野生型タンパク質へのアミノ酸またはペプチドの付加も含まれる。例えば、リジン残基はユビキチン化を受け得る、またはタンパク質のアミノ末端残基はジペプチド、トリペプチドまたはポリペプチド付加を受け得る。
【００２９】
望ましい態様において、TDCPまたは断片は翻訳後修飾されて、タンパク質分解性プロセシング、ジペプチド付加、およびグリコシル化を受ける。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質には、一つまたは複数の翻訳後修飾が含まれてもよい。
【００３０】
「同時製剤化」とは、二種類またはそれ以上の治療的または生物学的に活性な物質を含む任意の単一の薬学的組成物を指す。
【００３１】
「薬学的組成物」とは、少なくとも一種類の治療的または生物学的に活性な物質を含み且つ患者への投与に適した任意の組成物を指す。本発明の目的のため、表層上皮への治療剤の送達に適した薬学的組成物には、経口錠剤および経口溶液、生分解性フィルム、粘膜接着剤、ミクロスフィア、クリーム、ローション、点眼液、吸入剤、坐剤、浣腸剤、ならびにペースト剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの製剤はいずれも、当技術分野の容認された周知の方法によって調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20eh ed,), ed. A.R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照されたい。
【００３２】
「治療的有効量」とは、医学的利益を供与するのに十分な量を指す。本明細書に記述される方法によりヒト患者にTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片を投与する場合、治療的有効量は通常、投与1回当たり活性な三つ葉型療法約1〜2500 mgである。治療的有効量は、最低で投与1回当たり10、25、50、100、200 mgから最高で投与1回当たり300、500、750、100、1500、または2000 mgまでの範囲に及び得る。
【００３３】
「腸管」とは、小腸および大腸(腸遠位を包含する)を含む、幽門括約筋より遠位の消化器系の任意の部分を指す。
【００３４】
「腸遠位」とは、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびS状結腸、直腸、ならびに肛門括約筋を含む消化器系の部分を指す。
【００３５】
「上部消化管」とは、胃の噴門括約筋(噴門食道括約筋)より近位の消化器系の部分を指す。具体的には、上部消化管は、口腔およびそれに伴う構造(例えば、舌、歯肉組織および舌下組織、ならびに硬口蓋および軟口蓋)ならびに食道を含むように意図される。
【００３６】
「消化管」には、上部消化管、胃、腸管、および肛門括約筋の末端が包含される。
【００３７】
「生物学的に活性」とは、三つ葉型ペプチド、TDCP、または断片について言及する場合、その関連した、天然に存在するファミリーメンバーに共通の活性を示し、且つその活性が天然に存在する腸三つ葉型ペプチドのファミリーに共通である任意のポリペプチドを指す。本明細書で実証される活性に加えて、生物学的な活性には、例えば、哺乳類における胃腸運動の変化能、ムコ多糖体の結合、粘膜の維持、および損傷時の粘膜構造の修復が含まれる(例えば、Taupin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:799-804, 1999を参照されたい)。
【００３８】
「抗菌剤」とは、細菌もしくは真菌細胞、原生動物、またはウイルスの増殖を変化させて、それにより増殖を阻止、安定化、もしくは阻害するか、または微生物を死滅させる任意の化合物を指す。換言すれば、抗菌剤は、殺菌剤または静菌剤とすることができる。
【００３９】
「抗腫瘍療法」とは、ガンを治療するために用いられる任意の治療計画を指す。典型的な抗腫瘍療法には、化学療法および放射線療法が含まれる。
【００４０】
詳細な説明
本発明により、上皮細胞病変の治療のための方法および組成物が提供される。本発明の方法および組成物を用いて治療を施すことができる病変には、真皮および表皮(皮膚)、口腔、食道、胃、小腸および大腸(肛門括約筋、直腸、および結腸、特にS状結腸および下行結腸)の上皮を含む消化管、尿生殖路(特に膣管、頚部、および子宮)、気管、肺、鼻腔、ならびに眼の上皮病変が含まれる。これらの病変は、単独でのまたは第二の治療剤との併用での、本発明のTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片の局所適用により(すなわち、三つ葉型療法の提供により)治療される。本発明のTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片は、適当な標的部位に治療剤を輸送するのに有用な任意の経路により投与されてもよい。
【００４１】
薬学的製剤
消化管用組成物
浣腸剤
本発明の三つ葉型療法を送達するために使用される浣腸剤は、瀉下浣腸剤ではなく、停留浣腸剤である。浣腸剤を約50 mL未満の容量で投与した場合、治療剤は直腸およびS状結腸に送達される。しかしながら、約150 mL〜250 mLの浣腸剤容量を使用すると、治療剤を下行結腸、横行結腸、および、場合によっては、上行結腸まで送達することができる。
2006516964.tif 000002
【００４２】
坐剤
坐剤は、直腸およびS状結腸への薬剤の送達を目的とした直腸内への挿入用の固体剤形である。通常、挿入後に、坐剤は、内腔液の中で軟化するか、融解するか、分散するか、または溶解する。成人用の直腸坐剤は、通常、それぞれ約2〜5グラムであり、両端で先細になっている。幼児用の坐剤は、通常、成人用製剤の約半分のサイズである。
【００４３】
脂溶性または水溶性の/水混和性の坐剤の基剤を、本発明の組成物に使用することができる。適当な油脂性の基剤には、例えば、カカオバター、カカオ脂、エステル化、水素化により改変された植物性油脂、グリセリンゼラチンおよび高分子量のポリエチレングリコールが含まれる。治療剤の持続放出および/または長期接触は、油脂性の坐剤の基剤を適切に選択することにより達成することができる。カカオバターは、例えば、体温で素早く融解するが、体液と混合せず、その結果、患部への脂溶性治療剤の持続性の但し低濃度の送達がもたらされる。あるいは、水溶性のまたは水混和性の基剤(例えば、ポリエチレングリコールおよびグリコール-界面活性剤の混合物)は、通常、素早く溶解するかまたは分散し、その結果、患部への治療剤の迅速送達がもたらされる。
【００４４】
例示的な坐剤製剤を下記に示す。
2006516964.tif 000003
【００４５】
本製剤は、低融点を有し、かつ、固体状態で維持するのに冷蔵が必要な可能性がある。TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片はタンパク様であるため、冷蔵が望ましい可能性がある。製剤の低融点により、結果的に挿入後の迅速な坐剤融解が起こり、その結果、患者の快適性がいっそう高まる。冷蔵が可能でないならば、または熱成形技術が使われるならば、ポリエチレングリコール4000の量を増加させて、十分に熱安定的な製剤を実現することができる。
【００４６】
三つ葉型含有溶液に関する他の技術的特徴は、特定の薬学的製剤および治療される臨床適応症に適合するように容易に改変される。例えば、製剤のpHおよび浸透圧を調整して、胃腸管への刺激および感受性を最小限に抑えながら、三つ葉型ペプチドを安定させることができる。
【００４７】
口腔の噴霧剤、洗浄液、および乳濁液
噴霧システムは治療剤を上部消化管および気道に送達するのに特に有用である。適当な噴霧送達システムには、加圧および非加圧(ポンプ作動式)送達手段の双方が含まれる。口腔噴霧剤として送達される三つ葉型含有溶液は、水溶液であることが好ましい。しかしながら、有機および無機成分、乳化剤、賦形剤、ならびに感覚刺激特性を増強する薬剤(すなわち、着香料または着臭剤)が含まれてもよい。任意で、溶液には微生物の増殖を防ぐ保存剤(すなわち、メチルパラベン)が含まれてもよい。水そのものが担体全体を占めてもよいが、典型的な液体噴霧製剤には、水不溶性成分の可溶化および混和を補助するために、共溶媒、例えば、プロピレングリコール、コーンシロップ、グリセリン、ソルビトール溶液、界面活性剤および同様のものが含まれる。従って、一般に、本発明の組成物には、共溶媒が、好ましくは約1〜95% v/vおよび、最も好ましくは約5〜50% v/v含まれる。噴霧剤として調製された場合には、患者は通常、1日当たり1〜5回自己投与する。噴霧送達システムは、通常、1回の動作で50〜100 μlを送達するように設計されており、治療には、1用量当たり1〜5回の動作が必要な可能性がある。噴霧製剤の流動学的特性は、飛沫形成のために剪断および噴霧を可能とするように最適化されている。さらに、噴霧送達手段は、上部消化管または気道の粘膜表面での滞留を促進する飛沫サイズを作り出すように設計されている。
【００４８】
口腔噴霧剤または消化管に適した組成物は、口腔洗浄液またはうがい薬として処方することもできる。これらの製剤を用いたTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片の投与は、通常、この製剤を口腔内でグチュグチュするか、うがいをするか、またはすすぐことにより行われる。任意で、これらの製剤を嚥下することができ、その結果、三つ葉型ペプチド療法が食道、胃、および/または腸にも提供される。この送達方法は、腸上皮の関連疾患に苦しむ患者を治療するのに特に有用である。例えば、抗腫瘍化学療法を受けている患者は、口腔粘膜炎に加えて、胃および腸上皮病変のような、より遠位の胃腸管の病変を発現していることが多い。腸三つ葉型ペプチド、特にhITFは、胃のpHで安定であることがよく知られている。従って、口腔粘膜炎を治療するために主に設計された三つ葉型含有溶液の嚥下により、下部消化管(すなわち、胃および腸)の病変にも役立つ可能性がある。
【００４９】
三つ葉型含有溶液に関する他の技術的特徴は、特定の薬学的製剤および治療される臨床適応症に適合するように容易に改変される。例えば、製剤のpHおよび浸透圧を調整して、口腔への刺激および感受性を最小限に抑えながら、三つ葉型ペプチドを安定させることができる。
【００５０】
軟膏、ペースト剤、およびゲル
外傷に起因する口腔および食道上皮病変には、軟膏、ペースト剤、またはゲルとして送達されるTDCP療法を施すことができる。これらのタイプの製剤は粘性質なので、創傷部位に直接塗布することができる。任意で、創傷部位を被覆材で被覆して、三つ葉型含有組成物を滞留させ、外傷から病変を保護し、および/または滲出液を吸収することができる。下記にさらに考察されるように、これらの製剤は、例えば、抜歯、組織生検、または腫瘍切除のような外傷的な外科手術後に、上皮の完全性を回復するのに特に有用である。そのような粘性の製剤はまた、局所的な障壁効果を有することができ、それによって刺激および疼痛を軽減することができる。
【００５１】
チュアブル錠、トローチ剤、および菓子類
チュアブル錠、トローチ剤、またはチューインガムのような菓子類として三つ葉型含有組成物を調製すると、従来の薬物送達手段に比べていくつかの有利な点がある。第一に、標的部位(口および食道)で長期接触および持続放出が達成される。第二に、そのような製剤により、特に三つ葉型ペプチドを小児に投与する場合には、結果的に患者の服薬遵守がいっそう高くなることが多い。
【００５２】
チュアブル錠のための製剤はよく知られており、通常は、糖、デンプン、または脂質および着香料の基剤を含む。典型的なチュアブル錠の製剤を下記に示す。
2006516964.tif 000004
【００５３】
チューインガムおよび他の菓子類型の製剤に治療剤を組み込むことは、当技術分野において周知である(例えば、米国特許第5,858,391号)。どんなチュアブル剤または口腔滞留性製剤にも着香料、例えば、サッカリンナトリウムまたはペパーミント油が含まれてもよい。
【００５４】
尿生殖器用組成物
膣洗浄液
膣洗浄液、または膣内洗浄液は、膣および頸部の細胞に腸三つ葉型ペプチドを送達するのに使用される。約50〜300 mLの膣内洗浄液量を使用することができる。
2006516964.tif 000005
【００５５】
膣坐剤および膣坐剤
坐剤は、膣、頚部、および子宮への薬剤の送達を目的とした膣内への挿入用の固体剤形である。通常、挿入後に、坐剤は、軟化するか、融解するか、分散するか、または溶解する。膣坐剤は、通常、それぞれ約1〜7グラムであり、両端で先細になっている。脂溶性または水溶性の/水混和性の坐剤の基剤を本発明の組成物に使用することができる。適当な油脂性の基剤には、例えば、カカオバター、デンプン、カカオ脂、エステル化、水素化により改変された植物性油脂、グリセリンゼラチン、および高分子量のポリエチレングリコールが含まれる。治療剤の持続放出および/または長期接触は、油脂性の坐剤の基剤を適切に選択することにより達成することができる。カカオバターは、例えば、体温で素早く融解するが、体液と混合せず、その結果、患部への脂溶性治療剤の持続性の但し低濃度の送達がもたらされる。膣坐剤および膣坐剤の調製および使用は、当技術分野においてよく知られている。製剤の多くは、直腸坐剤のものに類似している。
【００５６】
膣用の軟膏、ペースト剤、およびゲル
膣上皮および頸部上皮病変ならびに外生殖器およびその周囲の皮膚の病変は、軟膏、ペースト剤、またはゲルとして送達される三つ葉型療法を施すことができる。これらのタイプの製剤の粘性質により、創傷部位に直接塗布することができる。任意で、創傷部位を被覆材で被覆して、三つ葉型含有組成物を滞留させ、病変を保護し、および/または滲出液を吸収することができる。下記にさらに考察されるように、これらの製剤は、外傷的な外科手術(例えば、会陰切開術)後に、上皮の完全性を回復するのに特に有用である。そのような粘性の製剤はまた、局所的な障壁効果を有することができ、それによって刺激および疼痛を軽減することができる。あるいは、軟膏、ペースト剤、またはゲルの組成物には、TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片に加えて、抗真菌剤のような抗菌剤が含まれてもよい。これらの組合せは、膣感染症およびある種の性行為感染症を治療するのに特に有用である。
2006516964.tif 000006
【００５７】
粘膜接着剤
粘膜接着性賦形剤を上述の薬学的組成物のいずれかに加えることができる。粘膜接着性製剤は病変領域をコーティングし、その結果、腸三つ葉型ペプチドを病変部に滞留させて、保護とし、刺激を阻害して、炎症組織または損傷組織の治癒を促進させる。これらの薬学的製剤での使用に適した粘膜接着性製剤は、当技術分野においてよく知られている(例えば、米国特許第5,458,879号)。特に有用な粘膜接着剤は、例えば、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリジン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、キトサン、およびその混合物のような水溶性ポリマーを約0.05〜20％含むヒドロゲルである。これらのポリマー製剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム(0.5〜5.0％)のような分散剤を含むこともできる。
【００５８】
液体組成物用の他の好ましい粘膜接着性賦形剤は、組成物を流動性の液体として投与可能とするが、組成物を管腔の環境中でまたは細胞外液もしくは分泌液との接触時にゲル化させて、これにより、治療剤を病変部に長時間にわたって保持させるように作用する生体接着作用を示す。陰イオン性多糖類であるペクチンおよびゲランは、適当な組成物の中に製剤化される場合、管腔液の中でゲル化する材料の例である。これらのタイプの粘膜接着性製剤は、相対的に高い陽イオン濃度のため、消化管、とりわけ上部消化管および腸遠位で特に有用である。ペクチンまたはゲランを含有する液体組成物は、通常、0.01〜20% w/vのペクチンまたはゲランの水溶液または水性緩衝系からなる。
【００５９】
粘膜接着性および表層上皮における治療剤の持続性の滞留を促進する他の有用な組成物は、シリカまたは二酸化チタンのような2〜50%のコロイド粒子を含むコロイド分散剤である。このような製剤は、浣腸剤として適当な粘稠性の低い流動性の液体として形成されるが、その粒子は糖タンパク質、特にムチンと相互作用して、液体を粘稠なゲルに変えて、有効な粘膜接着性を示す(例えば、米国特許第5,993,846号および第6,319,513号)。
【００６０】
別の製剤では、TDCPおよび/または他の治療剤は、製剤の液相に溶解されるのではなく生分解性ミクロスフィアに封入されることができる。多種多様なマイクロカプセル封入薬剤送達システムが開発されており、多くは、生分解性フィルム(下記)に使用される類似したポリマー性組成物を有する。ミクロスフィアの形成に通常使用されるポリマーには、例えば、ポリ-ε-カプロラクトン、ポリ(ε-カプロラクトン-Co-DL-乳酸)、ポリ(DL-乳酸)、ポリ(DL-乳酸-Co-グリコール酸)およびポリ(ε-カプロラクトン-Co-グリコール酸)が含まれる(例えば、Pitt et al., J. Pharm. Sci., 68:1534, 1979; Davis et al. Microsphere and Drug Therapy, Elsevier, 1984; Benoit et al. Biodegradable Microspheres: Advances in Production Technologies, Chapter 3, Ed. Benita, S, Dekker, New York, 1996; Microencapsulation and Related Drug Processes, Ed. Deasy, Dekker, 1984, New York; 米国特許第6,365,187号を参照されたい)。好ましくは、ミクロスフィアは、生体接着性であるかまたは生体接着性の賦形剤を含有する製剤に調製される。
【００６１】
生分解性フィルム送達手段（device）
ポリマー性フィルム手段により、口腔への治療剤の送達について幾つかの利点が得られる。洗浄液、ペースト剤、ゲル、および他の流動性の組成物とは異なり、フィルム手段は、口腔内に長時間(数時間から数日)滞留し、その滞留の間に、持続放出を実現する。通常、フィルムは部分的にまたは完全に生分解性であり、フィルムを口腔粘膜に固定するための粘膜粘着性の層を含む。治療剤を送達するための用途のほかに、フィルム手段により、病変部位の機械的損傷または微生物感染に対する防御も得られる。この物理的障壁機能は、粘膜炎またはアフタ性口内炎のような症状を治療する際に特に有利である。また、下記にさらに考察されるように、フィルム手段を使用して、TDCPを直接的に下層の粘膜に、口腔の内腔に、またはその双方の組合せに放出することができる。
【００６２】
フィルム手段は、少なくとも2つの層、つまりフィルムを口腔粘膜に接着させるのに適した粘膜接着性の層および活性治療剤を含むバルク層からなる。多くの適当な粘膜接着剤は、当技術分野において周知であり、上記に論じられている。任意で、一つまたは複数の治療剤を接着性の層の中に供与することもできる。
【００６３】
組成物の送達手段のバルク層は、一つまたは複数の生分解性ポリマー素材で構成されることができる。適当なポリマー(重合体)には、例えば、デンプン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの共重合体、ポリテトラメチレングリコール、ポリエーテルウレタン、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギネート、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-グリコール酸共重合体)(PLGA)、カルシウムポリカルボフィル、ポリエチルメタクリレート、酢酸セルロース、プロピレングリコール、ポリアクリル酸、架橋ポリアクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート/メチルメタクリレート共重合体、シリコン/エチルセルロース/ポリエチレングリコール、ウレタンポリアクリレート、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリ(アミノ酸)、部分的におよび完全に加水分解されたアルキレン-酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルの重合体、ポリビニルアルキルエーテル、スチレンアクリロニトリル共重合体、ポリ(エチレンテレフタラート)、ポリアルキレン、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリエステルならびにこれらの重合体の二つまたはそれ以上の組合せが含まれる。
【００６４】
特に有用なバルク層のポリマーは、PLGAおよびエチルセルロースからなる。PLGAは生分解性であり、広い範囲の条件および速度で分解するように製剤化することができる。エチルセルロースは水不溶性のポリマーであり、フィルムが形成される際にPLGAの可塑剤として作用できるが、体液中では分解されるものと思われる。エチルセルロースは、フィルムを形成する際にPLGAの可塑剤として機能できる水不溶性のポリマーであるが、体液中では分解されるものと思われる。水不溶性であるため、これは、得られるフィルムの膨潤の程度と速度にも影響を及ぼす。
【００６５】
TDCP/断片に対して不浸透性である任意の第3層をカシェ剤に加えることもできる。この障壁層も生分解性であることが好ましい。適当な障壁層のポリマーには、エチルセルロース、ポリ(アクリル酸)、または他の高分子電解質が含まれる。一つの形状として、障壁層を接着層に対して、バルク層の反対側に配置し、それにより、放出される治療剤は、内腔液で希釈されるのではなく、接触した上皮に向けられる。この形状は、舌、舌下組織、または頬粘膜の散在性の病変(粘膜炎またはアフタ性口内炎)を治療するのに特に有用である。フィルム手段の別の形状として、障壁層をバルク層と接着層との間に配置する。この形状は、治療剤の放出を口腔の内腔に向けるので、舌、口腔、および食道のいっそう広範性の病変を治療するのに有用である。この形状は、高濃度で投与したときに細胞傷害性となる治療剤を送達するのにも有用である。これは、治療剤を含有するフィルムとの直接的な接触から下層の組織を保護する効果を有するためである。
【００６６】
皮膚製剤: 軟膏、ペースト剤、クリーム、ゲル、洗浄液、および組織接着剤
外傷または炎症に起因する病変のような皮膚の上皮病変は、軟膏、ペースト剤、またはゲルとして投与される三つ葉型療法が可能である。これらのタイプの製剤の粘稠性により、創傷部位への直接的な塗布が可能となる。任意で、創傷部位は、三つ葉型含有組成物の滞留、病変の保護および/または滲出液の吸収のために被覆材で被覆することができる。後述の通り、これらの製剤は外傷性外科的手技(例えば、皮膚生検)後の上皮完全性の回復に特に有用である。このような粘稠性の製剤は局所的なバリア効果も示し、これによって、刺激および疼痛を緩和することが可能である。さらに、前述のような粘膜接着剤を本発明の軟膏、クリーム、ペースト剤、ゲル、および油の中に組み入れることができる。粘膜接着剤により、病変部位での三つ葉型含有製剤の滞留が持続される。
【００６７】
生体接着剤および生分解性ポリマーは、代替の創傷閉鎖法として有用であり、および薬物送達担体として有用とすることができる。生体接着剤は、皮膚が特に脆い高齢者での創傷閉鎖に関して、縫合に対する特に有用な代替法となる。よく知られている生体接着剤またはポリマーのいずれも、本発明のTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片とともに使用するのに適している(例えば、米国特許第5,990,194号、第6,159,498号、および第6,284,235号)。TDCPおよび断片は、他の任意の治療剤をこれらの製剤に組み込むのに適した任意の方法によって接着剤またはポリマーに組み込まれる。個々の方法は、製剤の化学的組成および製造工程に依存するであろう。
【００６８】
さらに、TDCPおよび断片は、外科用の周知の洗浄液(例えば、0.9%生理食塩液またはリンゲル液)のいずれかに存在していてもよい。
【００６９】
縫合材料および創傷被覆材
縫合材料、無菌の創傷被覆材、生分解性ポリマーおよび組織接着剤は、本発明のTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片を含浸させて、真皮および表皮の治癒を促進するために切開部位に使用することができる。
【００７０】
これらの製剤は、このような製剤を調製するための周知かつ慣例的な方法に従って作製することができる。例えば、モノフィラメントから作られる縫合糸は、押出成形前にポリマー溶液にTDCPまたは断片を加えることによって含浸させることができる。三つ葉型を含む溶液を用いて浸漬/乾燥のサイクルを繰り返すことによっても、縫合材料に含浸させることができる。サイクル数は、浸漬液中のTDCP/断片の濃度および縫合糸に含められるべき終量に依存する。TDCP/断片は表面の輪郭線に保持されるため、浸漬は編み込み状の縫合材料において特に有効な含浸方法である。
【００７１】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片を含浸させた、創傷および熱傷用の無菌の被覆材およびガーゼは、標準的な方法によっても調製することができる。典型的には、TDCP/断片は、創傷に接着しない透過性繊維によって皮膚病変から分離される粘稠なゲル(例えば、ヒドロゲル)に存在させることができる。
【００７２】
眼疾患の治療
角膜上皮への損傷により、露出した角膜表面を覆う細胞層が迅速に形成され、その結果、感染や失明が阻止される。創傷後、表層上皮の再封鎖が数時間にわたって起こり、結果的に、移動性の前縁の形成に至る。有糸分裂の群発(mitotic burst)による増殖が、36時間後、元の創縁周囲の細胞で観察される。
【００７３】
本発明は、三つ葉型療法の投与による、患者の眼疾患(外傷または病変)を治療するための方法を特徴とする。眼疾患は、眼の各部、例えば、角膜、強膜、網膜、結膜、毛様体、後眼房、または前眼房に影響を及ぼす可能性がある。好ましい態様として、眼疾患は、角膜、例えば、角膜上皮、または結膜に影響を及ぼす。眼疾患には、以下に限定されるわけではないが、表在点状角膜炎、角膜潰瘍、単純ヘルペス角結膜炎、眼部帯状疱疹、フリクテン性角結膜炎、円錐角膜、結膜、乾性角結膜炎(ドライアイ)、眼部炎症、角膜潰瘍および瘢痕性類天疱瘡(penhigoid)が含まれる。眼疾患は、ウイルス(例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス)、眼瞼炎、乾燥角膜炎、トラコーマ、角膜異物、紫外線曝露(例えば、溶接光、太陽灯)、コンタクトレンズの長時間装着、全身性の薬物(例えば、アデニンアラビノシド)、局所性の薬物、細菌、原虫、真菌により、または既知もしくは未知の抗原に対する過敏反応により引き起こされ得る。
【００７４】
物理的な眼外傷も眼疾患を引き起こし得る。眼への物理的外傷には、角膜の剥離(例えば、異物により引き起こされる)、角膜のせん孔(例えば、角膜の連続性を破壊する鈍的損傷により引き起こされる)、もしくは角膜の化学的熱傷(例えば、NaOHへの曝露)、または外科手術によるもの(例えば、角膜移植および眼内注射)が含まれる。眼疾患は一般に、眼の機能または構造の損傷および破壊を引き起こす。例えば、この疾患により、角膜上皮が引き裂かれる、角膜の壊死が引き起こされる、角膜潰瘍が引き起こされる、または結膜が損なわれ得る。上記の眼疾患のいずれも三つ葉型療法で治療することができる。
【００７５】
治療剤
三つ葉型ドメイン含有ポリペプチドおよび三つ葉型ペプチド断片
TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、治療される病変の性質および症状、予想される治療頻度および治療期間、投与経路、ならびに三つ葉型療法を送達するのに使用される薬学的組成物のタイプに応じて、1用量当たり1〜5000 mg、好ましくは1用量当たり5〜2500 mg、またはより好ましくは10〜1500 mgで投与される。三つ葉型療法は通常、1日当たり1〜5回投与される。
【００７６】
生物学的な活性を保持している特に有用なTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片には、図1Aのアミノ酸残基15〜73(hITF15-73)に相当するポリペプチドが含まれる。他の有用な断片には、hITF21-73、hITF22-73、およびhITF25-73が含まれる。生物学的に活性なITFポリペプチド断片は、C末端のフェニルアラニン残基(すなわち、hITF1-72、hITF15-72、hITF21-72、およびhITF22-72、およびhITF25-72)の切断後に、最後から2番目のシステイン残基(すなわち、hITF1-62、hITF21-62、およびhITF22-62、およびhITF25-62)での切断または終結後に、最後のシステイン残基(すなわち、hITF1-70、hITF15-70、hITF21-70、およびhITF22-70、およびhITF25-70)の前部での切断または終結後に形成される。
【００７７】
本発明のTDCPおよび断片を、任意の適当な方法により産生することができる。例えば、所望のTDCPをコードするcDNAは、組換えタンパク質を産生させるために当技術分野において知られる任意の方法で使用することができる。典型的な方法が本明細書に示されている。全てのTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片、特にhITF15-73およびhITF21-73は、発酵培養液が約pH5.0に維持される場合、完全長のhITFまたはITF21-73のような、三つ葉型ペプチド断片の類をコードするcDNAを形質転換したピキア酵母発現系(例えば、米国特許第4,882,279号および第5,122,465号を参照されたい)により産生させることができる。
【００７８】
抗増殖剤
本発明の組合せで投与できる特に有用な抗増殖剤は、微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プラチン、アルキル化剤、および代謝拮抗剤である。典型的な抗増殖剤には、パクリタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロフォスファミド、シタラビン、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムツズマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン(melphalen)、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツヅマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれる。
【００７９】
本発明の化合物の組合せは、新生物の治療に有用である。併用療法は、単独でまたは他の療法(例えば、外科手術、放射線療法、化学療法、生物学的療法)と併せて行われてもよい。さらに、新生物を発症する危険性が高いヒト(例えば、遺伝的に新生物の素因があるヒトまたは以前に新生物があったヒト)は予防的治療を受けて、新生物の形成を阻害するかまたは遅延させることができる。併用療法の期間は、治療している疾病または疾患のタイプ、患者の年齢および症状、患者の疾病のステージおよびタイプ、ならびに治療に対する患者の反応の具合に依存する。
【００８０】
組合せのなかの各成分の用量、頻度および投与方法は、個別に制御することができる。例えば、一つ目の化合物(すなわち、ピリジノン誘導体)は1日当たり3回局所的に投与することができ、その一方で、二つ目の化合物(すなわち、抗増殖剤)は1日当たり1回経口投与することができる。併用療法は、患者の身体がこれまでに予想されなかった何らかの副作用から回復する機会を持てるような休息期間を含む、オン・オフ周期で施すことができる。化合物は、1回の投与で双方の化合物が送達されるよう、一緒に製剤化されてもよい。
【００８１】
抗炎症剤
任意の適当な抗炎症剤を三つ葉型ペプチドと共に製剤化して、本発明の方法を用いて利用することができる。適当な抗炎症剤には、非ステロイド系抗炎症剤(例えば、サリチル酸誘導体、インドメタシン、イブプロフェン、タクロリムス、アセトアミノフェン)、ロフェコキシブ(Vioxx(登録商標))、セレコキシブ(Celebrex(登録商標)、エトドラク、およびニメスライド)のようなシクロオキシゲナーゼ-2特異的阻害剤、局所性糖質コルチコイド薬およびTリンパ球機能に向けた特異的サイトカインが含まれるが、これらに限定されるわけではない。直腸投与後に有効であることが知られている抗炎症性濃度を使用することができる。例えば、イブプロフェンは、病変に対して1日当たり25〜800mgを送達するのに十分な濃度で組成物に存在させることができる。副腎皮質ステロイドを直腸局部に用いるのに有効であることが知られている濃度で、三つ葉型ペプチドと共に同時製剤化してもよい。
【００８２】
抗菌剤
多くの周知の抗菌剤のいずれも、これらの薬剤に対して一般的に用いられる濃度で本発明の組成物に使用することができる。抗菌剤には、抗細菌剤、抗真菌剤、抗原虫剤、および抗ウイルス剤が含まれる。
【００８３】
抗細菌剤(抗生物質)の例には、ペニシリン類(例えば、ペニシリンG、アンピシリン、メチシリン、オキサシリン、およびアモキシリン)、バシトラシン、セファロスポリン類(例えば、セファドロキシル、セフォラニド、セフォタキシム、およびセフトリアキソン)、テトラサイクリン類(例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびテトラサイクリン)、アミノ配糖体類(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、クラリスロマイシン、およびエリスロマイシン)、フルオロキノロン類(例えば、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、およびノルフロキサシン)、ならびにクロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロセリン、イソニアジド、リファンピン、およびバンコマイシンを含むその他の抗生物質が含まれる。
【００８４】
抗ウイルス剤は、ウイルスの複製を無効化または抑制できる物質である。抗ウイルス剤の例には、1,-D-リボフラノシル-1,2,4-トリアゾール-3カルボキサミド、9-2-ヒドロキシ-エトキシメチルグアニン、アダマンタナミン、5-ヨード-2'-デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシド、プロテアーゼ阻害剤、チミジンキナーゼ阻害剤、糖または糖タンパク質合成阻害剤、構造タンパク質合成阻害剤、付着および吸着阻害剤、ならびにアシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、およびガンシクロビルのようなヌクレオシド類似体が含まれる。
【００８５】
抗真菌剤には、例えば、アンホテリシンB、ブチルパラベン、クリンダマイシン、エコナキソール、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビン、ナイスタチン、シクロピロックス、およびケトコナゾールのような、殺真菌剤および静真菌剤の双方が含まれる。
【００８６】
抗原虫剤は、原虫感染の治療を対象とする。抗原虫化学療法薬の例は、アメーバ症、ジアルジア症、およびトリコモナス症を治療するために使用される抗アメーバ薬(ジロキサニドフロエート、ヨードキノール、パラモマイシン、デヒドロエメチン、メトロニダゾール(metronidizole)、チニダゾール(tinidizole)およびオルニダゾール)である。
【００８７】
鎮痛剤および麻酔剤
一般的に使用される局所鎮痛剤のいずれも、本発明の組成物に使用することができる。鎮痛剤は、リドカインの場合、腸遠位病変に対して0.5〜5%の濃度が供与されるような量で存在する(例えば、溶液の投与1回当たり20〜40 mlに5〜50 mg/ml)。他の有用な麻酔剤の例には、プロカイン、リドカイン、テトラカイン、ジブカイン、ベンゾカイン、p-ブチルアミノ安息香酸2-(ジエチルアミノ)エチルエステル塩酸、メピバカイン、ピペロカイン、およびジクロニンが含まれる。
【００８８】
その他の鎮痛剤には、例えば、モルヒネ、コデイン、ヒドロコドン、デメロール(demorol)、およびオキシコドンのようなオピオイドが含まれる。これらの鎮痛剤のいずれも、アセトアミノフェン、アスピリンおよびイブプロフェンのような、鎮痛作用または抗炎症作用を持つ他の化合物と共に同時製剤化することもできる。
【００８９】
ステロイド
ステロイドは腸遠位の病変を治療するのに使用することができる。例えば、潰瘍性大腸炎は、トリアムシノロン(0.1%)、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、ブデゾニド、またはベクロメタゾンのペースト製剤を用いて治療することができる。
【００９０】
5-アミノサリチル酸誘導体
5-アミノサリチル酸(5-ASA)誘導体は、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾患を治療するのに有用であることが知られている。特に有用な5-ASA誘導体には、例えば、スルファサラジン、メサラミン、オルサラジン、およびバルサラジドが含まれる。スルファサラジンは通常、3%浣腸剤液として、または用量500〜1000 mgで経口的に、投与される。メサラミンは通常、3〜6週間、1グラム浣腸剤として毎日、または、3〜6週間、500 mg坐剤として毎日2〜3回投与される。同様の製剤を任意の5-ASA誘導体について調製することができる。
【００９１】
眼科用抗菌剤
眼の感染症には、実際の臨床において定期的に遭遇する。眼感染症および抗菌化学療法薬の例は、下記の通りである。涙嚢炎(涙嚢への感染)、麦粒腫および眼瞼炎(眼臉への感染)、結膜炎ならびに角膜炎は最も一般的には、微生物病原体、例えば、ヘルペス(herpespes)ウイルス、帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎連鎖球菌(Streptococccus pneumoniae)、ヘモフィルス(Haemophilus)属およびナイセリア(Neisseria)属による感染が原因である。眼科用の局所性抗生物質のおよび局所性抗真菌剤の溶液および軟膏は、通常、病原菌を治療するのに、0.1〜5% (w/v)溶液に調製される。抗ウイルス溶剤のイドクスウリジン、トリフルリジン、およびビダラビンの軟膏または溶液は、0.1〜1% w/vに調製されるが、一方、フォスカネット、アシクロビル、ガンシクロビル、フォルミウィルセン(formivirsen)、およびシドフォルビル(cidoforvir)は、経口的に、経静脈的に、眼に局所的に、または硝子体内(intravitral)インプラントを介して投与される。
【００９２】
TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片の産生
TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、組換えタンパク質の発現に関する技術分野において周知の任意の方法により産生することができる。所望のポリペプチドをコードする核酸は、発現のための種々の細胞型または無細胞系に導入することができ、それにより、小規模の、大規模の、および商業規模の産生、精製および患者治療が可能となる。
【００９３】
TDCPまたは三つ葉型ペプチド断片をコードする配列がプラスミドまたは他のベクターに導入された、真核生物および原核生物の発現系を作出することができ、次いで、これを使用して生細胞を形質転換する。三つ葉型ペプチドのcDNAがその読み取り枠全体またはその生物学的に活性な断片を含んだ構築物を、発現プラスミドに正しい方向で挿入して、タンパク質発現のために使用することができる。原核生物および真核生物の発現系により、TDCP/断片がアミノ末端側またはカルボキシ末端側でタグ分子に共有結合的に連結された融合タンパク質の発現および回収が可能となり、これにより同定および/または精製が容易になる。使用できるタグの例には、ヘキサヒスチジン、HA、FLAG、およびc-mycエピトープが含まれる。酵素的または化学的切断部位を三つ葉型ペプチドとタグ分子との間に、精製後にタグを除去できるよう遺伝子工学的に作り出すことができる。
【００９４】
典型的な発現ベクターには、プラスミド保有細胞において、挿入された腸三つ葉型ペプチドの核酸に対応するmRNAの大量合成を方向付けるプロモーターが含まれる。それらには、宿主生物内でその自立的複製を可能とする真核生物または原核生物の複製起点配列、本来なら毒性である薬物の存在下で、ベクター含有細胞を選択可能とする遺伝形質をコードする配列、および合成されたmRNAの翻訳効率を高める配列が含まれてもよい。安定的な持続性ベクターは、例えば、ウイルスの調節要素(例えば、Epstein-Barrウイルスゲノム由来のOriP配列)を用いることにより、自由複製体として維持することができる。ベクターをゲノムDNAに組み込んだ細胞株を作出することも可能であり、このような方法で、遺伝子産物を連続的に産生させる。TDCPまたは断片を発現する安定な細胞株は、所望の核酸配列を含むベクターの単一の組込コピーまたは複数の組込コピーを有することができる。三つ葉型ペプチドをコードする核酸配列は、当技術分野において知られる種々の方法により、例えば、メトトレキサート選択によりインサイチューで増幅させることができる。
【００９５】
大腸菌(Escherichia coli)のような細菌内での外来性配列の発現には、細菌発現ベクターへの腸三つ葉型ペプチドの核酸配列の挿入が必要になる。そのようなプラスミドベクターには、細菌内でのプラスミドの増殖に、およびプラスミドに挿入されたDNAの発現に必要ないくつかの要素が含まれる。プラスミドを保有する細菌のみの増殖は、プラスミドに、本来なら毒性である薬物の存在下でプラスミド保有細菌を増殖可能とする選択可能マーカーをコードする配列を導入することにより達成される。プラスミドには、クローニングされた遺伝子から大量のmRNAを産生できる転写プロモーターも含まれる。そのようなプロモーターは、誘導により転写を開始する誘導性プロモーターとすることができる(しかし、必ずしもそうであるとは限らない)。プラスミドには、ベクター内において、正しい方向で遺伝子の挿入を容易にするポリリンカーも含まれることが好ましい。
【００９６】
他の細菌種を使用して、大腸菌を用いるのと類似の方法で、腸三つ葉型ペプチドおよび断片を増殖させるおよび/または発現させることもできる。例えば、乳酸菌種を使用して、可溶性細胞質タンパク質として、もしくは、シグナルペプチドが周辺質領域中に発現したタンパク質を細菌の外面に方向付けるようなキメラ融合タンパク質を作製することにより、または、細胞外への分泌産物として、TDCP/断片を発現させることができる。乳酸菌種をさらに利用して、消費可能な食品の調製時に、例えば、ヨーグルトまたは他の乳製品の製造時に、外来性タンパク質を発現させることができる。
【００９７】
哺乳類細胞を使用して、三つ葉型ペプチドを発現させることもできる。安定性または一過性の細胞株クローンは、可溶型(切断型およびタグ型)の三つ葉型ペプチドを産生するための腸三つ葉型ペプチド発現ベクターを用いて作出することができる。適切な細胞株には、例えば、COS、HEK293T、CHO、およびNIH-3T3のようなNIH細胞株が含まれる。
【００９８】
適当な発現ベクターを構築したら、それらを、以下に限定されるわけではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE-デキストラントランスフェクション法、エレクトロポレーション法、衝撃法、マイクロインジェクション法、プロトプラスト融合法、デンドリマーを介したトランスフェクション法、またはリポソームを介したトランスフェクション法のような形質転換法により、適当な宿主細胞に導入する。本発明のベクターを形質導入する宿主細胞には、(以下に限定されるわけではないが)大腸菌もしくはその他の細菌、酵母、真菌、昆虫細胞(例えば、SF9昆虫細胞での発現にはバキュロウイルスベクターを使用する)、またはマウス、ヒト、もしくはその他の動物に由来する細胞を含めることができる。クローン化DNAによりコードされる三つ葉型ペプチド、融合体またはポリペプチド断片のインビトロ発現を利用することもできる。分子生物学に関する当業者は、多種多様な発現系および精製系を利用して、組換え三つ葉型ペプチドおよびその断片を産生できること、例えば、無細胞系インビトロ翻訳の場合には、無細胞の小麦胚芽抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、HeLa細胞抽出液、Kreb's抽出液、および大腸菌抽出液が当技術分野において一般に利用されることを理解するであろう。これらの系のいくつかについては、例えば、Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY 2000)に記述されている。
【００９９】
遺伝子導入植物、植物細胞および藻類も、本発明の方法および組成物で用いる組換えTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片を作製するのに特に有用である。例えば、三つ葉型ペプチドを発現する遺伝子導入タバコ植物または遺伝子導入培養タバコ細胞は、当技術分野において周知の技術を用いて作出することができる(例えば、米国特許第5,202,422号および第6,140,075号を参照されたい)。遺伝子導入藻類発現系を使用して、組換えタンパク質を産生させることもできる(例えば、Chen et al., Curr. Genet. 39:365-370, 2001を参照されたい)。タンパク質の単離が必要とされないという付加的恩典も伴うので、組換えTDCPまたは断片を発現する、遺伝子組換え食用作物を産出することができる。好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物であり、より好ましくは、単子葉植物はトウモロコシ、大麦、小麦、オート麦、ライ麦、米、およびサトウモロコシである。遺伝子導入単子葉植物発現系は、当技術分野においてよく知られている(例えば、米国特許第5,850,018号、第5,866,793号、第5,888,789号、第5,889,189号、第6,365,807号、第6,399,861号、および第6,403,862号を参照されたい; これらは参照として本明細書に組み入れられる)。
【０１００】
好ましい態様として、TDCPおよび断片は酵母で; 好ましくは、出芽酵母、分裂酵母、またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）で発現される。より好ましくは、発現は、メチロトローフ酵母であるピキア・パストリス発現系が容易である。ピキア・パストリスは、メタノールを炭素源として利用することができる。典型的には、TDCP/断片の核酸配列を、5'および3'プロモーターならびにメタノール誘導性の、アルコール酸化酵素(AOX1)遺伝子の調節配列を含むピキア発現ベクターに導入する。このベクターにより、ピキアゲノムへの標的組込み、および高レベルのメタノール誘導性のタンパク質産生の双方が可能となる。ポリペプチドは、可溶性細胞質タンパク質または好ましくは分泌シグナルペプチドと読み枠を合わせて融合させた可溶性細胞質タンパク質として発現させることができる、および分泌型組換えタンパク質として発現させることができる。分泌シグナルは、A因子分泌シグナルまたはα因子分泌シグナルに基づくことが好ましい。メタノール誘導後、A因子分泌シグナルまたはα因子分泌シグナルを持つ組換えキメラタンパク質は、細胞の外側に輸送されるので、さらなる精製を目的として培地から回収することができる(例えば、米国特許第4,808,537号、第4,837,148号、第4,879,231号、第4,882,279号、第4,818,700号、第4,895,800号、および、第4,812,405号、第5,032,516号、第5,122,465号、第5,268,273号を参照されたい; これらは参照として本明細書に組み入れられる)。
【０１０１】
酵母発現系におけるTDCPの同定
本発明者らは、ピキア・パストリスで三つ葉型ペプチドを産生させると、タンパク質分解性切断およびジペプチド付加を含む翻訳後事象に至ることを観察した。ITF1-73ポリペプチド断片の切断は、アミノ末端のleu20とser21との間でおよびカルボキシ末端のthr72とphe73との間で起こることが実証されている。この断片(図1Aのアミノ酸21〜72; 以降ITF21-72)の産生は、発酵の間に起こることが明らかにされており、時間とpHの双方に依存する。本発明者らの研究から、発酵時間を長くすると、結果的にITF21-72の収量が増加することが明らかとなった。本発明者らにより、ITF21-72およびITF21-73の最適収量は約pH 5で起こり; 一方、ITF15-72およびITF15-72の最適収量はpH 6.0〜6.5で起こることも観察された。ITF15-73およびITF21-72の等電点(pI)はそれぞれ、5.1および6.9であるので、この二つの産物の分離は、イオン交換クロマトグラフィーにより行うことができる。
【０１０２】
または、hITF25-62、hITF22-62、hITF21-62、hITF25-73、hITF22-73、およびhITF21-73のようなTDCPの産生は、開始メチオニン(AUG)のすぐ後に対応する核酸配列を融合させることで達成することができる。結果的に生じるmRNAが任意の原核細胞または真核細胞宿主で翻訳されると、メチオニン・アミノペプチダーゼ(MetAP)による開始メチオニンの切断が起こるものと思われる。MetAPは十分に研究されており、弟2位(すなわち、メチオニンの後)のアミノ酸がグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン、システイン、またはバリンであるならば、開始メチオニン残基を切断することが明らかにされている(Arfine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7714-7718, 1995; Bradshaw et al., Trends Biochem. Sci., 23:263-267, 1998; Lowther and Matthews, Biochim. Biophys. Acta, 1477:157-167, 2000)。
【０１０３】
ジペプチド付加は、TDCPの生物学的な活性に著しく影響を及ぼすことはない。最も一般的には、グルタミン-アラニン(EA)-N末端付加が観察されており、ピキア酵母発現系のシグナル配列の選択的プロセシング部位から生じる。下記に詳述されるように、EA-N末端付加はITF15-73の産生で起こり、結果的に61アミノ酸の産物(EA-hITF15-73)が生ずる。これは単量体、ホモ二量体、およびITF15-73と結合したヘテロ二量体として検出された。
【０１０４】
当然のことながら、真核細胞発現系におけるTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片の発現には、適当な細胞小器官内で翻訳後にプロセシングされるという付加利益があると考えられる。例えば、TDCPのグリコシル化は、分泌の前に、小胞体またはゴルジ体で促進されることができる。分泌タンパク質は、前駆タンパク質転換酵素(PC)のような、細胞の細胞外表面に存在するタンパク質分解酵素によるタンパク質分解性プロセシングによりプロセシングされることができる。
【０１０５】
組換えタンパク質が発現されたら、このタンパク質を、細胞質タンパク質として発現された場合には細胞溶解物から、または分泌タンパク質として発現された場合には培地から単離することができる。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーのようなタンパク質精製技術を利用して、不要な細胞タンパク質から腸三つ葉型ペプチドを単離することができる。単離されたら、組換えタンパク質は、必要に応じて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC; 例えば、Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, Eds., Elsevier, 1980を参照されたい)によりさらに精製することができる。
【０１０６】
本発明のTDCPおよび三つ葉型ペプチド断片は、例えば、メリフィールド固相合成法、液相合成法、または両者の併用法(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記述の方法を参照されたい)を利用した化学合成により産生することもできる。任意で、TDCPは続いて標準的なペプチド結合法により縮合される。
【０１０７】
または、TDCPおよび三つ葉型ペプチドは、プレプロドラッグ、プロドラッグ、または三つ葉型ドメインを含む前駆体分子として任意の適当な方法で産生することができる。そのような分子は体内に導入されると、宿主内でいったん、さらにプロセシングを受け得ると考えられる。例えば、アミノまたはカルボキシ末端にさらなるアミノ酸配列を持つTDCPまたは断片がタンパク質分解性切断を受けて、三つ葉型療法に使用される活性種を産生する。これは、内在性タンパク質分解酵素、例えば、キモトリプシン、ペプシン、およびトリプシンにより促進されてもよい。
【０１０８】
用量
三つ葉型成分を含めて、本発明の局所用組成物に用いられる全ての治療剤は、これらの薬剤について現時点で知られ且つ用いられている用量範囲で使用することができる。以下は、本発明の組成物の有効成分に関する用量範囲の実例である。患者の臨床状態、治療の目的(治療または予防)、および薬剤が投与される損傷の予想される持続期間または重症度に応じて、TDCP/断片または他の薬剤の異なる濃度を用いることができる。用量選択におけるさらなる検討事項には、疾患の原因、患者の年齢(小児、成人、高齢者)、全般的な健康状態および併存疾患が含まれる。
【０１０９】
以下の実施例は、本発明の原理および三つ葉型ペプチド療法が適応される状況について例証することを意図する。以下の実施例は、限定することを意図するものではない。
【０１１０】
実施例1: 酵母を利用した組換えhITF断片の産生
α因子分泌シグナルに融合され且つAOX-1メタノール応答性プロモーターにより調節される、安定的に組み込まれた組換えhITF断片(hITF15-73)をコードするピキア・パストリス(CCM280)の凍結培養液をYPD寒天プレートに広げて、30℃で2日間増殖させた。個々のコロニーをYPD液体培地10 mL中で増殖させるための種菌として使用し、30℃の恒温振盪機中でさらに増殖させた。調製および増殖は下記の通りである。
【０１１１】
培地調製および組換え酵母の増殖
16 g/Lグリセロール(w/v)を含有する基本塩(Basal salt)/微量塩(Trace salt)の溶液1 Lをフェルンバッハフラスコ(Fisher Scientific)中で調製して、YPD培養液10 mLを植菌した。基本塩の溶液(2 ml/L; グリセロール有りまたは無し)は、酵母を植菌する前に加えた。この混合液を激しく振盪させながら30℃で2日間インキュベートした。2日後、液体培養液を取り除いて、9000 rpmで10分間遠心分離した。上清を捨てて、沈殿物を1/5容量の基本塩/微量塩 + 1.5% (w/v)メタノール溶液に再懸濁させた。この段階では、グリセロールを加えなかった。フェルンバッハフラスコをチーズクロスで覆って、激しく振盪させながら30℃で48時間インキュベートした。
【０１１２】
48時間の終了時に、液体培養液を取り除いて、9000 rpmで15分間遠心分離した。培地には、約5 mg/LのITF15-73が含まれていた。
【０１１３】
この培地を再蒸留水で、数回交換しながら十分に透析した。その後、透析液は、後に使用するために凍結乾燥させて、4℃に保存した。培養液40〜60リットルから得られた凍結乾燥済みのITF15-73を集めて、20 mMギ酸緩衝液(pH 4.0) 50〜100 mLに再懸濁し、ギ酸緩衝液(20 mM pH 4.0; 2回交換)に対して透析した。
2006516964.tif 000007
【０１１４】
基本塩の溶液は、激しく撹拌しながら調製し、続けてオートクレーブ滅菌を行った。グリセロールを存在させる場合には、基本塩の溶液に16 g/Lで加える。グリセロールを省く場合には、水酸化アンモニウム5 mLを加えることにより、容量を補完する。
【０１１５】
P. パストリスの培養液は、増殖の間に適当なpHを達成するためにオルトリン酸(OP)またはヘキサメタリン酸(HMP)緩衝液を添加した、基本塩の培地中で増殖させた。表1に明記される以下のpHおよび増殖条件を分析した。典型的なクロマトグラムを図3〜図10に示す。
【０１１６】
（表１）発酵ブロスのpHおよび増殖条件
2006516964.tif 000008
【０１１７】
メタノールで誘導後、約T0時間、T24時間、T36時間、T48時間、T72時間、およびT96時間の時点で、分析のために試料10ミリリットルを取り除いた。試料を遠心分離して、上清をデカントし、後に分析するために急速凍結した。
【０１１８】
実施例2: 発酵ブロスにおける組換えhITFの分析
試料調製
均質に精製して0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液中に調製した組換えhITF15-73を、質量分析法の標準物質として使用した。
【０１１９】
実施例1で産生された凍結発酵ブロス試料を融解して、分析のため、分注液90 μLに0.1% (v/v) TFA水溶液10 μLを加えた。試料をボルテックスし、9000 rpm(室温)で5分間遠心分離した。上清を取り除いて、予洗(アセトニトリル/0.1% TFA 300 μL)かつ平衡化(0.1% TFA 500 μL)済みのC18 Trapカートリッジ(Michrom BioResources; CA, Part No. 004/25109/02)に添加した。負荷(添加)後のTrapカートリッジを0.1% TFA 1 mLで洗浄して、結合した物質を20%アセトニトリル/0.1% TFA溶液100 μLで溶出させた。試料をN2下でまたは凍結乾燥により乾燥させ、0.1% TFA 50〜100 μLに再懸濁させて、もう一度、9000 rpmで5分間遠心分離した。上清の分注液10 μLについて、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を行った(図2)。
【０１２０】
液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)
研究の過程で、いくつかのクロマトグラフ系を使った。分析について最も上手くいった条件は、以下の通りであった。
2006516964.tif 000009
【０１２１】
結果
LC-MSの最適化は、上述の組換えhITF15-73標準物質を用いて行った。得られたクロマトグラフプロファイルは、図2に示されており、17.40分、17.87分、および21.1分に溶出したものを含めて、いくつかの主要な成分が示されている。極力、観察された成分からESI-MSスペクトルを得た。質量分析プロファイルからのデコンボリューション後のデータを下記表2に要約する。
【０１２２】
（表２）hITF15-73標準物質のLC-MS結果の要約
2006516964.tif 000010
【０１２３】
同じLC-MS条件を用いて、発酵ブロスの試料(実行16 L-5、pH 5、表1を参照されたい)を分析し、図3に示されるUVクロマトグラムを作成した。予想どおり、このクロマトグラムは、ボイド領域と約22分との間に溶出する分析物が最も多くなり、複雑なプロファイルを示している。分析の間に得られたESI-MSを注意深く調べたが、有意なhITF15-73の存在を実証することができなかった。
【０１２４】
しかしながら、この分析の間に、質量が11764 DaであってLC-MSの間の溶出位置が約15.7分である、注目すべきタンパク質が検出された(図3を参照されたい)。その質量、クロマトグラフ上での挙動、および明らかに多量なことから、このタンパク質がhITF15-73と関連する可能性が示唆された。従って、さらなる研究では、任意のジスルフィド結合を取り除こうとして、発酵ブロスを強力な還元剤(DTT)の存在下で加熱(37℃で2時間)した。この結果得られたクロマトグラムを図4に示す。15.70分に溶出したピークが存在しないようであるが、その一方で今回は、前には検出されなかった多数の成分が、22〜26分の領域に認められる。これらの分析物のESI-MSスペクトルの検討から、これらが酸化タンパク質の潜在的単量体であることが示唆される。特に、25.7分のピークは、11764 Daの二量体の単量体型と一致した質量を有する。表3は、クロマトグラムの22〜26分の領域から得られたMSデータの要約を示す。
【０１２５】
（表３）DTT処理発酵ブロスのLC-MS(22〜26分)の要約
2006516964.tif 000011
【０１２６】
この場合もやはり、単量体/二量体の溶出順の不規則な挙動は、hITF15-73について観察されるものに特徴的であり、実際に、主要なタンパク質種の単量体と二量体の双方の質量はLeu20とSer21との間のN-末端切断のhITF(すなわち、hITF21-73)と一致する。
【０１２７】
一連の発酵ブロス試料(16L-5; 表1を参照されたい)をLC-MSにより分析した。予想どおり、発酵時間0時間では、相対的に「単純な」クロマトグラフプロファイルが得られた(図5A)。クロマトグラムの複雑性は、発酵時間0時間、22時間、および71時間の結果をそれぞれ示した図5A〜5Cに図解されるように、発酵が進むにつれて増大した。発酵22時間の試料のESI-MSデータから、0時間または91時間では検出されなかった幾つかの微量産物の存在が示唆される。しかしながら、91時間の試料では、11764 Daの質量の切断型に対する証拠が示されていた。
【０１２８】
最終的な一連の実験では、16L-9(表1を参照されたい)の発酵ブロスから得られた培養液のいくつかの時点をLC-MSにより分析した。0時間、47.5時間、72時間および96時間から得られたクロマトグラムをそれぞれ、図6〜9に示す。非常に注目すべき成分が約18.5分に検出されており、ここでは、発酵が進むにつれて面積が顕著に増加しているように思われる。図10Aおよび10Bは、18.5分のピークのMSデータを示しており、hITF15-73に対して予想されるものと一致している。有意なhITF15-73の「切断」型は検出されなかった。
【０１２９】
18.5分のピークのピーク面積測定値は、クロマトグラム由来から得られたものであり、hITFの標準物質による外部参照物質に基づいたhITF濃度の推定値とともに、表5に示されている。
【０１３０】
二つのさらなる、主要なUV反応成分も検出されている(図6〜9を参照されたい)。8.5分に溶出した一方は、割当て可能なMS反応を示さなかった。23.5分に見られたもう一方では、6879 Daの質量を示すMSスペクトルが得られた。
【０１３１】
（表４）16L-9発酵ブロスにおけるhITF推定濃度
2006516964.tif 000012
【０１３２】
総合すると、これらの結果は、TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片、とりわけhITF15-73ポリペプチド(断片およびアイソフォーム)の調製は、特定の増殖条件に影響され得ることを実証している。pH 5のオルトリン酸緩衝液中での、または、pH 7のヘキサメタリン酸緩衝液中でのhITF15-73発現ピキア・パストリスの増殖およびメタノール誘導では、結果的に切断型hITFポリペプチドの蓄積が起こる。特に、これらの条件により、Leu20とSer21との間のhITF15-73の切断(hITF21-73)が促進される。しかしながら、ヘキサメタリン酸またはオルトリン酸培地緩衝液中にてpH 6での同一酵母の増殖では、この切断が促進されず、結果的にhITF15-73の蓄積が起こる。必要ならば、断片は、HPLC法、ゲル濾過法、またはイオン交換クロマトグラフィー法のような、従来法により相互から分離することができる。
【０１３３】
上記の例は、安定的に組み込まれた組換えhITF15-73をコードするピキア・パストリスに関して特徴付けられているが、この酵母を遺伝子工学的に改変させて、一つまたは複数のTDCPまたは三つ葉型ペプチド断片をコードさせることができる。さらに、本明細書に記述した原理と一致した、培養条件の通常の最適化を利用して、所望のTDCPまたは断片の産生ならびにその翻訳後の化学的および酵素的プロセシングを最大限とすることができる。
【０１３４】
実施例3: 組換えhITF15-73由来のTDCPの生物学的な活性
組換え三つ葉型ペプチド断片の生物学的な活性は、Dignass et al. (J. Clin. Invest. 94:376-383 (1994))により報告されているようなインビトロ創傷/遊走アッセイを利用して測定した。手短に言えば、原発性腸上皮IEC-6細胞(継代数17の)を5% FCS (v/v)、5 μg/μlインスリン、および10 mMペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(PSG)添加ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。細胞は37℃で5% CO2の湿潤恒温槽内でコンフルエントまで増殖させた。
【０１３５】
生物学的力価アッセイを行う前に、培地を除去し、0.1% FCS/DMEMで2回洗浄して、0.1% FCS/DMEMに入れて37℃および5% CO2で一晩血清飢餓状態とした。かみそりの刃で細胞を引っ掻くことにより、1ウェル当たり2つの模擬創傷を付けた。次いで、細胞を0.1%FCS/DMEMで1回洗浄した。hITF15-73ならびにその断片およびアイソフォームの試料は、前述のように、ピキア・パストリスで産生させて、それから精製した。次いで、TDCP混合液を断片につき濃度100 μg/0.1% FCS/DMEM μlで個別のプレートに添加した。後で解析するために、既知の有糸分裂促進剤である形質転換成長因子-β(TGF-β)を用いた陽性対照を20 ng/mL培地で含有させて、0.1% FCS/DMEMだけの陰性対照を取り入れた。細胞を37℃で24時間インキュベートした。インキュベーションから24時間後に、細胞を氷冷PBSで洗浄して、冷MeOHに入れて固定した。その後、創傷辺縁を越えていた細胞の数を計測することにより、各プレートを走化性についてアッセイした。
【０１３６】
hITF15-73の断片およびアイソフォーム(TDCP)は、以下の方法で調製した。SP FastFlowカラム(Pharmacia)に樹脂約200 mLを充填した。樹脂を1カラム容量(cv)の2 M NaCl含有0.5 M NaOHで調製し、その後、5 cvの20 mMギ酸緩衝液(pH 3.7)で平衡化した。未精製のTDCP含有溶液をSP FastFlowカラムに負荷した(約2 mL/分)。カラムを1 cvの20 mMギ酸緩衝液(pH 3.7)で、次に1 cvの0.11 M NaClの20 mMギ酸緩衝液(pH 3.7)で洗浄した。TDCPは2 cvの20 mMクエン酸ナトリウム(pH 6.0)により溶出させた。OD280の物質(ペプチド)に富むpH 4.4〜5.8の画分を回収した。回収した画分をプールして、20 mM Tris(pH 7.5)の中で透析した。
【０１３７】
必要に応じて、二度目のクロマトグラフ段階を取り入れた。Q-セファロースカラム(Pharmacia)に樹脂約200 mLを充填した。樹脂を5 M NaCl含有0.2 M HClで調製し、その後、5 cvの20 mM Tris(pH 7.5)で平衡化した。SP FastFlowカラムからの透析後のピークをQ-セファロース含有カラムに、流速約2 mL/分で負荷した。カラムを2カラム容量の20 mM Tris(pH 7.5)で洗浄した。hITF15-73ならびにその断片およびアイソフォームの溶出は、2 cvの0.1 M NaCl含有20 mM Tris(pH 7.5)で行った。これにより、単量体の類がほとんど溶出されると考えられる。2 cvの0.15 M NaCl含有20 mM Tris(pH 7.5)を用いたさらなる溶出により、二量体化アイソフォームの溶出が促進された。
【０１３８】
生物学的力価アッセイを行うため、三度目のクロマトグラフ段階を取り入れた。Q-セファロースカラムから得られた回収画分を次に、蒸留水(絶えず交換しながら)の中で十分に透析した。次いで、透析液を凍結乾燥し、2回蒸留脱イオン化HPLC用水に再懸濁して、YMCフェニル充填120 Aカラムを使い、逆相HPLCにより精製した。主要なピークに相当する溶出画分を回収して、生物学的力価を、上述のように、インビトロ創傷治癒アッセイにより評価した。
【０１３９】
表5には、図11に図解した生物学的力価試験に用いた試料の分子量の割当てが要約されている。表6には、分子量に基づいたhITF15-73種(すなわち、断片およびアイソフォーム)の同定が要約されている。図11において、プレート番号1は、20 ng/mL形質転換成長因子-β(TGF-β)、つまり既知の走化性因子で処理された。プレート番号2は、DMEM/0.1% FBS(陰性対照)の存在下でのIEC-6細胞に対する作用を示している。プレート番号3は、前述のように調製した、100 μg/mLの組換え精製hITF15-73標準物質(陽性対照)の作用を示している。プレート番号4〜10は、ピキア・パストリスにおけるhITF15-73産生後に回収したhITFの断片およびアイソフォームの走化性作用(100 μg/mLでの)を実証している。
【０１４０】
（表５）hITF産生ピキア・パストリスから回収した試料
2006516964.tif 000013
【０１４１】
（表６）hITF15-73種の分子量の同定
2006516964.tif 000014
【０１４２】
TDCPおよび三つ葉型ペプチド断片の生物学的な活性を測定するための代替アッセイを行うことができる。そのようなアッセイは、例えば、Taupin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:799-804)に記載されている。
【０１４３】
実施例4: 組換えhITF15-73由来の個々のTDCPの生物学的な活性の比較
組換えhITF15-73は、前述のようにピキア・パストリスで産生した。発酵産物は、流動層クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む二段階工程により精製した。組換えhITF種は、限外濾過および透析濾過、引き続いて凍結乾燥により精製した。予備分析により、hITF15-73ホモ二量体、EA-hITF15-73ホモ二量体、およびhITF15-73/EA-hITF15-73ヘテロ二量体の存在が確認された。
【０１４４】
二量体は、逆相HPLCおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、各画分の同定は、LC-MS(MALDIおよびナノスプレー)により確定した。また、N末端配列解析を10サイクルの間行った。二量体の画分は、後に使用するため、続けて脱塩し、凍結乾燥して、-20℃に保存した。hITF二量体の同定を表7に示す。
【０１４５】
（表７）組換えhITF15-73二量体の性質決定
2006516964.tif 000015
【０１４６】
生物学的な活性は、前述のインビトロIEC-6創傷/細胞遊走アッセイを利用し、以下の修正を加えて試験した。IEC-6細胞を24ウェルのマルチウェルプレートでコンフルエントまで培養し、ピペットで1回傷を付けて、各ウェルに4〜5 mm×1 cmの創傷を作った。細胞を洗浄し、上で同定した3種類の組換えhITF二量体のうちの1種類（0.1〜1.0 mg/ml）存在下で、ヒト結腸糖タンパク質(hCGP; 2 mg/ml)を含むまたは含まない血清除去培地中で19時間維持した。ウシ血清アルブミン(0.1〜1.0 mg/ml)をhITF二量体の代わりに加えた。創傷修復は、100×顕微鏡写真(倒立型Nikon Diaphor TMS, Nikon N6006カメラ)を用いて、創傷辺縁を越えたIEC-6細胞の数を計測することにより決定した。
【０１４７】
実施例2で調製した、組換えhITF15-73は、BSA対照と比べて、創傷辺縁を越えて遊走したIEC-6細胞を約3倍に増加させた(図12)。hITF15-73ホモ二量体、hITF15-73/EA-hITF15-73ヘテロ二量体、およびEA-hITF15-73ホモ二量体の相対活性はそれぞれ、100%、95.6%、および85.3%であった。
【０１４８】
他の態様
本明細書に引用される全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として本明細書に組み入れられると示されるかのごとく、参照として本明細書に組み入れられる。上記の発明は、理解を明確にするため、説明および実施例により詳細に記述されてきたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変更および変形が可能であることは容易に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図1A〜図1Cは、三つ葉型ペプチドのアミノ酸および核酸配列である。図1Aおよび図1Bはそれぞれ、ヒト腸三つ葉型因子のアミノ酸配列(アクセッション番号BAA95531; SEQ ID NO:1)およびcDNA配列(GenBankアクセッション番号NM_003226; SEQ ID NO:2)である。図1Cは、ヒトpS2/TFF1、SP/TFF2、およびITF/TFF3由来の三つ葉型ドメインの多重配列アライメントである。Xは任意のアミノ酸残基を指す。4つの三つ葉型ドメイン間で同一性を共有するアミノ酸は太字になっている。
【図２】精製された組換えhITF15-73標準物質を含有する試料のLC-MSクロマトグラムプロファイルである。
【図３】メタノール誘導後にpH 5の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-5)由来の発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。
【図４】メタノール誘導後にpH 5の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-5)由来の発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。試料は、ジチオスレイトール(DTT)の存在下でさらに2時間穏やかに加熱した。
【図５】図5A〜図5Cは、メタノール誘導後にpH 5の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-5)由来の発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムであり、培養時間に対する発酵ブロスの複雑性の増大を実証している。試料はT0時間(図5A)、T22時間(図5B)、およびT71時間(図5C)の時点で抽出した。
【図６】メタノール誘導後にpH 6の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-9)のT0時間で採取した発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。
【図７】メタノール誘導後にpH 6の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-9)のT47.5時間で採取した発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。
【図８】メタノール誘導後にpH 6の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-9)のT72時間で採取した発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。
【図９】メタノール誘導後にpH 6の培養ブロスの中で30℃にて増殖させたhITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-9)のT96時間で採取した発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。
【図１０】図10Aおよび図10Bは、図6〜9で見られた蓄積性の（accumulating）18.5分の溶出の、hITF15-73産生ピキア・パストリス(実行16L-9)由来の発酵ブロスの試料のLC-MSクロマトグラムである。図10Aは、質量/電荷比を示す質量スペクトルプロファイルである。図10Bは、デコンボリューションされたプロファイルを原子質量単位で示している。
【図１１】原発性腸上皮IEC-6細胞に対するITFおよびITFのポリペプチド断片の生物学的な活性を実証する棒グラフである。走化性アッセイは、0.1%ウシ血清アルブミンのダルベッコ最少イーグル培地(DMEM)の中で行った。プレート番号1は、既知の走化性因子である、20 ng/mL形質転換成長因子-βで処理した。プレート番号2は、DMEM/0.1% FBSの存在下でのIEC-6細胞に対する作用を示している。プレート番号3は、100 μg/mLの組換え精製hITF15-73の作用を示している。プレート番号4〜10は、ピキア・パストリスにおけるhITF産生後に回収したhITF断片(100 μg/mL)の走化性作用を実証している。
【図１２】図12Aは、実施例4に記載されたように処理したコンフルエント培養IEC-6細胞の顕微鏡写真である。下のパネルは、t=0時間の創傷辺縁を示す。上のパネルは、1 mg/ml hITF15-73と19時間インキュベーションした後の創傷辺縁を示す。図12Bは、1 mg/mlウシ血清アルブミン(BSA; 白バー)または1 mg/ml hITF15-73(hITF; 黒バー)のいずれかとの19時間のインキュベーションの間に創傷辺縁を越えて遊走したIEC-6細胞の数を定量化している棒グラフである。
【図１】
2006516964.tif 000016
【図２】
2006516964.tif 000017
【図３】
2006516964.tif 000018
【図４】
2006516964.tif 000019
【図５Ａ】
2006516964.tif 000020
【図５Ｂ】
2006516964.tif 000021
【図５Ｃ】
2006516964.tif 000022
【図６】
2006516964.tif 000023
【図７】
2006516964.tif 000024
【図８】
2006516964.tif 000025
【図９】
2006516964.tif 000026
【図１０Ａ】
2006516964.tif 000027
【図１０Ｂ】
2006516964.tif 000028
【図１１】
2006516964.tif 000029
【図１２】
2006516964.tif 000030
【配列表】
2006516964000001.app