(57)【要約】放射線を発することのできる１種以上の発光レポーターを含み、１種以上の発光レポーターが、少なくとも１細胞周期相の指標となり得る第一の発光レポーターを含む、細胞周期相データの決定方法であって、自動分類法を使用して個々の細胞を異なる細胞周期相に分類するための分類規則情報を記憶させる段階と、１種以上の発光レポーターによって発せられた放射線の検出によって作成された画像データを受け取る段階と、画像データを分析して、個々の細胞に対応する画像データ中の対象区域を同定する段階と、画像データを、同定された対象区域を基盤として分析して、選択した細胞について、その細胞の１種以上の細胞質成分に関連するパラメーターの測定値を含む、１以上の測定値を決定する段階と、分類情報を測定値に適用して、選択した細胞を、異なる細胞周期相にある細胞を各亜集団が有する複数の細胞亜集団のうちの選択された１亜集団に分類する段階とを含む方法。
2006521785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線を発することのできる１種以上の発光レポーターを含み、１種以上の発光レポーターが、少なくとも１細胞周期相の指標となり得る第一の発光レポーターを含む、細胞周期相データの決定方法であって、
自動分類法を使用して個々の細胞を異なる細胞周期相に分類するための分類情報を記憶させる段階と、
１種以上の発光レポーターによって発せられた放射線の検出によって作成された画像データを受け取る段階と、
画像データを分析して、個々の細胞に対応する画像データ中の対象区域を同定する段階と、
画像データを、同定された対象区域を基盤として分析して、選択した細胞について、その細胞の１種以上の細胞質成分に関連するパラメーターの測定値を含む、１以上の測定値を決定する段階と、
分類情報を測定値に適用して、選択した細胞を、異なる細胞周期相にある細胞を各亜集団が有する複数の細胞亜集団のうちの選択された１亜集団に分類する段階と
を含む方法。
【請求項２】
画像データを分析し、分類情報を、選択した複数の細胞それぞれに適用する段階と、選択した複数の細胞について、選択した細胞中の複数の亜集団の相対的なサイズの指標となる細胞周期相集団データを作成する段階とを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞を含む複数のウェルからの画像データで方法を実施する段階を含み、複数のウェルが異なる試験化合物を含んでいる、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
１種以上の発光レポーターが、細胞中の細胞下成分の位置の指標となる第二の発光レポーターをさらに含み、
画像データを受け取る段階が、
ａ）第一の発光レポーターによって発せられた放射線の検出によって作成された第一の画像データの受け取りと、
ｂ）第二の発光レポーターによって発せられた放射線の検出によって作成された第二の画像データを受け取り
とを含み、
画像データを分析して対象区域を同定する段階が、第二の画像データの分析を含み、
画像データを分析して１以上の測定値を決定する段階が、第一の画像データの分析を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
対象区域が、選択した細胞毎に、第一の型の対象区域と第二の型の対象区域とを含み、１以上の測定値が、第一の型の対象区域を使用して決定された第一の測定値と、第二の型の対象区域を使用して決定された第二の測定値とを含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
第一の型の対象区域を、主に細胞の核区域が選択されるように準備された方法を使用して同定する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
第二の型の対象区域を、主に細胞の細胞質区域が選択されるように準備された方法を使用して同定する、請求項５又は請求項６記載の方法。
【請求項８】
分類情報が、選択した細胞を複数の細胞亜集団のうちの第一の選択された亜集団に分類する第一の分類規則を含み、第一の分類規則が、第一の測定値及び第二の測定値の両方を考慮に入れるものである、請求項５乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
分類情報が、選択した細胞を複数の細胞亜集団のうちの第二の選択された亜集団に分類する第二の分類規則を含み、第二の分類規則が、第一の測定値及び第二の測定値の両方を考慮に入れるものである、請求項５乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
１以上の測定値が、一般に、選択した細胞の細胞質成分に相当する区域を考慮に入れた細胞質発光シグナル強度の測定値を含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
１以上の測定値が、一般に、選択した細胞の核成分に相当する区域を考慮に入れた核発光シグナル強度の測定値を含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
分類情報が、選択された、比較的弱い核発光シグナル強度及び比較的弱い細胞質発光シグナル強度を有する細胞を第１の細胞周期相亜集団に分類する効果を有する規則を含む、請求項１０又は請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
分類情報が、選択された、比較的弱い核発光シグナル強度及び比較的強い細胞質発光シグナル強度を有する細胞を第２の細胞周期相亜集団に分類する効果を有する規則を含む、請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
分類情報が、選択された、比較的強い核発光シグナル強度及び比較的小さい核対細胞質発光シグナル強度比を有する細胞を第３の細胞周期相亜集団に分類する効果を有する規則を含む、請求項１０乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
分類情報が、選択された、比較的強い核発光シグナル強度及び比較的大きい核対細胞質発光シグナル強度比を有する細胞を第４の細胞周期相亜集団に分類する効果を有する規則を含む、請求項１０乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
分類情報が、測定値から得た第一のパラメーターを考慮に入れたものであり、測定値から得た第二のパラメーターと合同で、異なる４細胞周期相亜集団の各亜集団を特有の形で同定する、請求項１０乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
画像データを受け取る段階が、第一の発光レポーターによって発せられた放射線の検出によって作成された第一の画像データの受け取りを含み、
画像データを分析して１以上の測定値を決定する段階が、第一の画像データの分析を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
画像データを分析して対象区域を同定する段階が、第一の画像データの分析を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
対象区域を、細胞の核区域及び細胞質区域の両方を含む区域が選択されるように準備された方法を使用して同定する、請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
１以上の測定値が、選択した細胞毎に、同定された対象区域を使用して決定された第一の測定値と、同定された対象区域を使用して決定された第二の測定値とを含む、請求項１７乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
第一及び第二の測定値を、同定された同じ対象区域を使用して決定する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
分類情報が、選択した細胞を複数の細胞亜集団のうちの選択された第一の亜集団に分類する分類規則を含み、分類規則が、第一の測定値及び第二の測定値の両方を考慮に入れたものである、請求項２０又は請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
１以上の測定値が、同定された対象区域を考慮に入れた発光シグナル強度の測定値を含む、請求項１７乃至請求項２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
１以上の測定値が、
同定された対象区域内の平均シグナル強度に関するパラメーター、
同定された対象区域内の平均シグナル強度から、所与の量を超えて逸脱した分の画素に関するパラメーター、
同定された対象区域内の、シグナル強度が所与の閾値を下回っている画素数に関するパラメーター、
同定された対象区域に相当する楕円形の輪郭の主軸と副軸の比に関するパラメーター、
同定された対象区域の最大幅に関するパラメーター、
同定された対象区域の平均幅に関するパラメーター、
同定された区域内のシグナル基調に関するパラメーター、
同定された対象区域の縁取りに関するパラメーター
からなる群から選択された１以上の測定値を含む、請求項１７乃至請求項２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
細胞が、
ｉ）少なくとも１細胞周期相に特異的な発現制御要素、及び
ｉｉ）破壊制御要素
に操作可能に連結され、かつこれらの制御下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードしている核酸配列を含む核酸レポーター構築物、好ましくはＤＮＡ構築物を含む、請求項１乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法を実施するために準備された装置。
【請求項２７】
請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法を実施するために準備されたコンピュータソフトウェア。
【請求項２８】
請求項２７のコンピュータソフトウェアを記憶するデータキャリヤ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１細胞周期相の指標となり得る発光レポーターを含む細胞についての細胞周期相データの決定方法に関する。本発明はさらに、そのような方法が実施されるように適合させた装置及びコンピュータソフトウェアに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、薬物の発見及び開発、並びに一般の生物学的調査では、細胞アッセイを的確に行うための方法及び装置が求められている。細胞アッセイを化学化合物の生物活性評価に使用すると有利なのである。
【０００３】
さらに、多数の化学化合物のスクリーニングを迅速かつ割安に行うことが求められている。様々な生化学ターゲット、例えば、受容体、酵素、及び核酸に対する活性を求めて化学化合物を試験することが日常茶飯事となっている製薬産業で、この必要は高まりつつある。これらの化学化合物は、大規模なライブラリーに集められ、時には異なる化合物が１００万種を超える。用語化学化合物の使用は、それだけに限らないが、単純な有機及び無機の分子、タンパク質、ペプチド、核酸、及びオリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、又は生物学的に注目される任意の化学構造を含むように広く解釈されるものとする。
【０００４】
化合物スクリーニングの分野では、細胞アッセイは、細胞集団に対して実施される。測定される応答は、通常は細胞集団の平均である。例えば、イオンチャネルアッセイ用の一般的な機器が、米国特許第５３５５２１５号明細書に記載されている。典型的な検定法は、イオン感応性染料の蛍光の時間依存性を測定することからなっており、蛍光は、化学化合物が加えられた結果として変化する細胞内対象イオン濃度の尺度である。染料は、マルチウェルプレートのウェルの底に配置された細胞集団に、測定前の時点で装入される。一般に、細胞の応答は、程度も時間も不均一である。この多様性は、化合物スクリーニングにとって重要な生物活性の観察をわかりにくくし、又はその妨げとなりかねない。不均一性は、実験供給源から生じることもあるが、より重大なのは、どんな細胞集団も根本的に不均一であることである。特に、多様性の起源は、集団間で生活環が相違しているためであるかもしれないし、又は活性のある目標分子の数が進化によって相違しためであるかもしれない。この変動を緩和し、補正し、又は利用しさえもする方法があれば、化学化合物の薬理活性を特徴付ける際の細胞アッセイの有用性が高まるはずである。
【０００５】
個々の細胞の応答を定量すると、細胞集団の個々の細胞の応答が一様でないことによって引き起こされる問題が回避される。集団の少数部分が刺激物質に応答する場合を考慮せよ。平均の応答を測定するデバイスは、個々の細胞応答を測定する装置よりも感度が劣る。後者の方法では、応答プロフィールの統計学的な特徴付けがなされ、活性細胞のサブセットが選択できるようになっている。集団の特徴付けをさらに行うと、応答プロフィールの解釈が高度になる。
【０００６】
細胞周期は、創薬の多くの領域にとって重要なポイントである。一方では、この基本の過程が、新規な抗癌剤ターゲット及び改良された化学療法を発見する機会になっており、他方、他の治療領域の薬物及びターゲットについては、細胞周期に望ましくない影響を及ぼさないかどうか試験しなければならない。歴史的に、細胞周期を全体的な生化学的過程として、かつ分子レベルで研究するための広範な技術が開発されてきている。
【０００７】
既知の方法としては、細胞集団の増殖活性を示すデータを作成するものが挙げられる。
【０００８】
シンチレーション計数による［１４Ｃ］若しくは［３Ｈ］−チミジン取込みの測定（Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｄ．及びＣｈｕ，Ｅ．Ｈ．（１９６６年）、「Ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第２８巻、１３９〜１４３頁）は、細胞増殖を測定する最も初期の方法の１つであったが、今日でもまだ広く使用されている。より最近の開発（Ｇｒａｖｅｓ，Ｒ．ら（１９９７）、「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ，  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｅｖｅｎｔｓ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｖ−７９  ｃｅｌｌ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２４８巻、２５１〜２５７頁）によって、均質なマイクロプレートアッセイフォーマットでチミジン取込みを測定できるようになった。
【０００９】
チミジン取込みアッセイに代わるいくつかの非放射性の方法が開発されている。これらには、ヌクレオチドブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を複製ＤＮＡに取り込ませるものである酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Ｐｅｒｒｏｓ，Ｐ．及びＷｅｉｇｈｔｍａｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９１年）、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  （ＥＬＩＳＡ）  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ」、Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｌｉｆ．第２４巻、５１７〜５２３頁；Ｗｅｍｍｅ，Ｈ．ら（１９９２年）、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ第１８５巻、７８〜８９頁）、及びＫｉ−６７などの増殖特異的抗原の染色（Ｆｒａｈｍ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９８年）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＥＬＩＳＡ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  （ＥＰＡ）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗ  Ｋｉ−６７−ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｋｉ−Ｓ３）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２１１巻、４３〜５０頁）が含まれる。
【００１０】
ミトコンドリア及び細胞の他の酵素による基質の変換に基づく比色法（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．（１９８３年）、「Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第６５巻、５５〜６３頁；Ｒｏｅｈｍ，Ｎ．Ｗ．ら（１９９１年）、「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌ  ＸＴＴ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第１４２巻、２５７〜２６５頁）も細胞増殖の測定に使用される。これらの検定法はしばしば、細胞増殖アッセイと呼ばれるが、厳密に言えば、細胞量アッセイである。チミジン又はＢｒｄＵの取込みを測定するのとは異なり、これらの検定法は、細胞周期の進行についての固有の尺度を何ら提供せず、細胞増殖の尺度、すなわち別の集団と比べた細胞数の増加しか提供しない。
【００１１】
電気インピーダンスの測定（Ｕｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．及びＢｈａｓｋａｒ，Ｓ．（２０００年）、「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２４４巻、１３３〜１３７頁）、溶存酸素の測定（Ｗｏｄｎｉｃｋａ，Ｍ．ら（２０００年）、「Ｎｏｖｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．第５巻、１４１〜１５２頁）、及びその他の測定に基づく、細胞増殖（すなわち、増加する細胞数）の他の測定方法が報告されている。しかし、上で論じた比色検定法のように、これらは細胞周期パラメーターを直接に報告するものでなく、広く採用されていない。
【００１２】
上記の方法は全て、調査中の細胞集団内の全般的な増殖についてのデータを提供するが、個々の細胞の状態を特定するものではない。これらの検定法を、例えば［３Ｈ］若しくは［１４Ｃ］−チミジン取込みのマイクロオートラジオグラフィー（Ｄｏｒｍｅｒ，Ｐ．（１９８１年）、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｎ−１４  ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｅｖｅｌ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．第１３巻、１６１〜１７１頁）又はＢｒｄＵの免疫細胞化学物質検出若しくは免疫蛍光検出（Ｄｏｌｂｅａｒｅ，Ｆ．（１９９５年）、「Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ：  ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｐａｒｔ  Ｉ：  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．第２７巻、３３９〜３６９頁）によって画像化に適合させると、Ｓ期に移行した細胞の同定が可能になるが、分析中の他の細胞の細胞周期位置についての情報は得られない。
【００１３】
集団中の全細胞の細胞周期の状態を決定するためには、分析技術によって少なくとも単一細胞のレベルまで解明できることが前提条件である。利用可能な２種の属性分析技術であるフローサイトメトリー及び鏡検法のうち、フローサイトメトリーは、細胞周期分布を分析するための標準の方法として確実に定着してきている。
【００１４】
細胞核のＤＮＡ含有量は、細胞周期を通して予測可能に変動する。すなわち、Ｇ２期又はＭ期の細胞のＤＮＡ含有量は、Ｇ１期の細胞の２倍であり、ＤＮＡ合成が行われているＳ期の細胞のＤＮＡ量は中程度である。したがって、細胞ＤＮＡを、ヨウ化プロピジウム（Ｎａｉｒｎ，Ｒ．Ｃ．及びＲｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．（１９８０年）、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３９巻、１〜１３頁）又は生細胞に対して適合性のある他の蛍光染料（Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｊ．ら（２０００年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ／ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｎｔ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ，  ＤＲＡＱ５，  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｃｏｎｆｏｃａｌ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第４０巻、２８０〜２９１頁）で染色した後、フローサイトメトリーにかけると、Ｇ１、Ｓ、及びＧ２／Ｍの各期の細胞の相対的な比率を測定することができる。しかし、ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリーによる分析は、必然的に破壊的であり、したがって細胞周期の進行を調査するのに多数のサンプルが必要となるが、何百ものサンプルを分析することになる場合では速度が制限されかねない。その上、Ｇ２／Ｍ期では、全ての細胞でＤＮＡ含有量が同じであるので、フローサイトメトリーでは、細胞周期位置の細かな解明が得られない。
【００１５】
ＤＮＡ染色をパルス標識ＢｒｄＵ取込みと組み合わせて（Ｄｏｌｂｅａｒｅ，Ｆ．ら（１９８３年）、「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８０巻、５５７３〜５５７７頁）使用すると、細胞周期位置をさらに解明することができる。ＤＮＡ染色及び／又はＢｒｄＵ取込みからなる二重パラメーター分析を、細胞表面マーカーに対する抗体と共に使用すると、規定された細胞亜集団の細胞周期分布の輪郭を描くこともできる（Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ａ．及びＭａｉｎｏ，Ｖ．Ｃ．（１９９７年）、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２０８巻、４９〜５９頁；Ｊｏｈａｎｎｉｓｓｏｎ，Ａ．ら（１９９５年）、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ：  ａ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第１１巻、３５５〜３６６頁；Ｐｅｎｉｔ，Ｃ．及びＶａｓｓｅｕｒ，Ｆ．（１９９３年）、「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ＢｒｄＵｒｄ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第１４巻、７５７〜７６３頁）。
【００１６】
これまで、依然としてフローサイトメトリーが細胞周期分析のための主流の方法となってはいるものの、上記の技術の多くが、顕微鏡分析にも適用されている（Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｗ．ら（１９９６年）、「Ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （ＬＳＣ）  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｉｔｏｓｅｓ  （ＦＬＭ）」、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．第２９巻、５３９〜５４７頁；Ｃｌａｔｃｈ，Ｒ．Ｊ．及びＦｏｒｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９８年）、「Ｆｉｖｅ−ｃｏｌｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ，  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第３４巻、３６〜３８頁）。
【００１７】
上述の方法は専ら、一時点からの様々な形の情報（例えば、ＤＮＡ含有量のためのヨウ化プロピジウム染色）、又は時間をかけてまとめられた情報（例えば、チミジン又はＢｒｄＵの取込み）を提供する。別の一技術である細胞分裂追跡法（Ｎｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｅ．ら（１９９９年）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｙ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｒａｃｋｉｎｇ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第７７巻、５２３〜５２９頁；Ｌｙｏｎｓ，Ａ．Ｂ．（１９９９年）、「Ｄｉｖｉｄｅｄ  ｗｅ  ｓｔａｎｄ：  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第７７巻、５０９〜５１５頁）では、細胞集団の複製履歴の分析が可能になる。この方法では、細胞にカルボキシ−二酢酸フルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）などの蛍光染料を装入するが、蛍光染料は、細胞分裂の連続する回転毎に娘細胞間で分割され、蛍光が２分の１になる。フローサイトメトリーによる後続の細胞蛍光分析では、集団中の各細胞が経験した細胞分裂の数が明らかになる。この技術は、ＢｒｄＵ染色及び増殖マーカー染色と組み合わせた多重パラメーター分析でも使用されている（Ｈａｓｂｏｌｄ，Ｊ．及びＨｏｄｇｋｉｎ，Ｐ．Ｄ．（２０００年）、「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第４０巻、２３０〜２３７頁）。
【００１８】
国際公開第０１／１１３４１号は、蛍光画像化法を使用して、細胞の分裂指数を自動的に測定する方法を記載している。この技術は、その核から発信されるシグナルによって、特に有糸分裂細胞についての報告を行う免疫蛍光法を使用するものである。別の蛍光チャネルで検出された核の数と比べた有糸分裂細胞数を検出することによって、分裂指数が決定される。この技術は、所与の閾値を上回るシグナルを有する細胞を単にカウントするものであり、有糸分裂以外の細胞周期相の検出に適するものではない。
【００１９】
ＧＦＰ及び画像化技術が細胞周期分析に応用されると、細胞周期を制御する分子事象のタイミングの理解において意味のある前進が遂げられるようになった。ＧＦＰに鍵となる細胞周期制御タンパク質（Ｒａｆｆ，Ｊ．Ｗ．ら（２００２年）、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｚｙ／Ｃｄｃ２０  ａｎｄ  Ｆｚｒ／Ｃｄｈ１  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ  ｉｎ  ｓｐａｃｅ  ａｎｄ  ｔｉｍｅ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１５７巻、１１３９〜１１４９頁；Ｚｅｎｇ，Ｙ．ら（２０００年）、「Ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ２７  （Ｋｉｐ１），  ａ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」、Ｂｉｃｏｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２７４巻、３７〜４２頁；Ｈｕａｎｇ，Ｊ．及びＲａｆｆ．Ｊ．Ｗ．（１９９９年）、「Ｔｈｅ  ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｌｌｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１８巻、２１８４〜２１９５頁；Ｗｅｉｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．ら（２００１年）、「Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｄｃ２  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｉｔｏｓｉｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ第１３巻、１９２９〜１９４３頁；Ａｒｎａｕｄ，Ｌ．ら（１９９８年）、「ＧＦＰ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ａｔ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ／ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ」、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ第１０７巻、４２４〜４２９頁）及び他の細胞成分（Ｋａｎｄａ，Ｔ．ら（１９９８年）、「Ｈｉｓｔｏｎｅ−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．第８巻、３７７〜３８５頁；Ｒｅｉｔｓ，Ｅ．Ａ．ら（１９９７年）、「Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１６巻、６０８７〜６０９４頁；Ｔａｔｅｂｅ，Ｈ．ら（２００１年）、「Ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｎ第３２巻、６７〜７４頁）が融合されると、細胞周期の背後にある分子構成への意義深い見識が得られた。しかし、これらの特殊化された手法は、関与する機序及び成分について価値あるデータを提供するにしても、細胞周期をモニターする包括的な方法ではない。
【特許文献１】米国特許第５３５５２１５号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／１１３４１号パンフレット
【非特許文献１】Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｄ．及びＣｈｕ，Ｅ．Ｈ．（１９６６年）、「Ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第２８巻、１３９〜１４３頁
【非特許文献２】Ｇｒａｖｅｓ，Ｒ．ら（１９９７年）、「Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ，  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｅｖｅｎｔｓ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｖ−７９  ｃｅｌｌ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第２４８巻、２５１〜２５７頁
【非特許文献３】Ｐｅｒｒｏｓ，Ｐ．及びＷｅｉｇｈｔｍａｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９１年）、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  （ＥＬＩＳＡ）  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ」、Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｌｉｆ．第２４巻、５１７〜５２３頁
【非特許文献４】Ｗｅｍｍｅ，Ｈ．ら（１９９２年）、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ：  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ第１８５巻、７８〜８９頁
【非特許文献５】Ｆｒａｈｍ，Ｓ．Ｏ．ら（１９９８年）、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＥＬＩＳＡ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  （ＥＰＡ）  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗ  Ｋｉ−６７−ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｋｉ−Ｓ３）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２１１巻、４３〜５０頁
【非特許文献６】Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．（１９８３年）、「Ｒａｐｉｄ  ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第６５巻、５５〜６３頁
【非特許文献７】Ｒｏｅｈｍ，Ｎ．Ｗ．ら（１９９１年）、「Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｏｌｏｕｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌ  ＸＴＴ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第１４２巻、２５７〜２６５頁
【非特許文献８】Ｕｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．及びＢｈａｓｋａｒ，Ｓ．（２０００年）、「Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２４４巻、１３３〜１３７頁
【非特許文献９】Ｗｏｄｎｉｃｋａ，Ｍ．ら（２０００年）、「Ｎｏｖｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．第５巻、１４１〜１５２頁
【非特許文献１０】Ｄｏｒｍｅｒ，Ｐ．（１９８１年）、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃａｒｂｏｎ−１４  ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｅｖｅｌ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．第１３巻、１６１〜１７１頁
【非特許文献１１】Ｄｏｌｂｅａｒｅ，Ｆ．（１９９５年）、「Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ：ａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｐａｒｔ  Ｉ：  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．第２７巻、３３９〜３６９頁
【非特許文献１２】Ｎａｉｒｎ，Ｒ．Ｃ．及びＲｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｍ．（１９８０年）、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３９巻、１〜１３頁
【非特許文献１３】Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｊ．ら（２０００年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｅｅｐ  ｒｅｄ／ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｎｔ  ＤＮＡ  ｐｒｏｂｅ，  ＤＲＡＱ５，  ｉｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第４０巻、２８０〜２９１頁
【非特許文献１４】Ｄｏｌｂｅａｒｅ，Ｆ．ら（１９８３年）、「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８０巻、５５７３〜５５７７頁
【非特許文献１５】Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ａ．及びＭａｉｎｏ，Ｖ．Ｃ．（１９９７年）、「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ４＋Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ第２０８巻、４９〜５９頁
【非特許文献１６】Ｊｏｈａｎｎｉｓｓｏｎ，Ａ．ら（１９９５年）、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ：  ａ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．第１１巻、３５５〜３６６頁
【非特許文献１７】Ｐｅｎｉｔ，Ｃ．及びＶａｓｓｅｕｒ，Ｆ．（１９９３年）、「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｓｔｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ＢｒｄＵｒｄ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第１４巻、７５７〜７６３頁
【非特許文献１８】Ｇｏｒｃｚｙｃａ，Ｗ．ら（１９９６年）、「Ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （ＬＳＣ）  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｉｔｏｓｅｓ  （ＦＬＭ）」、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．第２９巻、５３９〜５４７頁
【非特許文献１９】Ｃｌａｔｃｈ，Ｒ．Ｊ．及びＦｏｒｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９８年）、「Ｆｉｖｅ−ｃｏｌｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔｅｎｔ，  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第３４巻、３６〜３８頁
【非特許文献２０】Ｎｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ｅ．ら（１９９９年）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｙ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｒａｃｋｉｎｇ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第７７巻、５２３〜５２９頁
【非特許文献２１】Ｌｙｏｎｓ，Ａ．Ｂ．（１９９９年）、「Ｄｉｖｉｄｅｄ  ｗｅ  ｓｔａｎｄ：  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第７７巻、５０９〜５１５頁
【非特許文献２２】Ｈａｓｂｏｌｄ，Ｊ．及びＨｏｄｇｋｉｎ，Ｐ．Ｄ．（２０００年）、「Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉ」、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第４０巻、２３０〜２３７頁
【非特許文献２３】Ｒａｆｆ，Ｊ．Ｗ．ら（２００２年）、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｚｙ／Ｃｄｃ２０  ａｎｄ  Ｆｚｒ／Ｃｄｈ１  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ  ｉｎ  ｓｐａｃｅ  ａｎｄ  ｔｉｍｅ」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１５７巻、１１３９〜１１４９頁
【非特許文献２４】Ｚｅｎｇ，Ｙ．ら（２０００年）、「Ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ２７  （Ｋｉｐ１），  ａ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」、Ｂｉｃｏｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第２７４巻、３７〜４２頁
【非特許文献２５】Ｈｕａｎｇ，Ｊ．及びＲａｆｆ．Ｊ．Ｗ．（１９９９年）、「Ｔｈｅ  ｄｉｓａｐｐｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｌｌｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１８巻、２１８４〜２１９５頁
【非特許文献２６】Ｗｅｉｎｇａｒｔｎｅｒ，Ｍ．ら（２００１年）、「Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｄｃ２  ｔｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｉｔｏｓｉｓ」、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ第１３巻、１９２９〜１９４３頁
【非特許文献２７】Ａｒｎａｕｄ，Ｌ．ら（１９９８年）、「ＧＦＰ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｏ−ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ  １  ａｔ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｏｃｈｏｒｅ／ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ」、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ第１０７巻、４２４〜４２９頁
【非特許文献２８】Ｋａｎｄａ，Ｔ．ら（１９９８年）、「Ｈｉｓｔｏｎｅ−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．第８巻、３７７〜３８５頁
【非特許文献２９】Ｒｅｉｔｓ，Ｅ．Ａ．ら（１９９７年）、「Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１６巻、６０８７〜６０９４頁
【非特許文献３０】Ｔａｔｅｂｅ，Ｈ．ら（２００１年）、「Ｆｉｓｓｉｏｎ  ｙｅａｓｔ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ＧＦＰ−ｔａｇｇｅｄ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｎ第３２巻、６７〜７４頁
【非特許文献３１】Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．の「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」、第６版、１９９６年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、米オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の実施形態によれば、放射線を発することのできる１種以上の発光レポーターを含み、１種以上の発光レポーターが、少なくとも１細胞周期相の指標となり得る第一の発光レポーターを含む、細胞周期相データの決定方法であって、
自動分類法を使用して個々の細胞を異なる細胞周期相に分類するための分類情報を記憶させる段階と、
１種以上の発光レポーターによって発せられた放射線の検出によって作成された画像データを受け取る段階と、
画像データを分析して、個々の細胞に対応する画像データ中の対象区域を同定する段階と、
画像データを、同定された対象区域を基盤として分析して、選択した細胞について、その細胞の１種以上の細胞質成分に関連するパラメーターの測定値を含む、１以上の測定値を決定する段階と、
分類情報を測定値に適用して、選択した細胞を、異なる細胞周期相にある細胞を各亜集団が有する複数の細胞亜集団のうちの選択された１亜集団に分類する段階と
を含む方法が提供される。
【００２１】
本発明は、高処理量の化合物スクリーニングで使用するための、迅速かつ臨機応変な細胞集団の発光画像化分析の方法を提供する。
【００２２】
本発明の更なる特徴及び利点は、添付の図面に即して単なる実例として示す、以下の本発明の好ましい実施形態の説明から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、疾患治療用の薬剤の同定に有用である。本発明は、１種以上の発光マーカーを使用して生態応答を測定する、広範な生物学的検定法を実施するための高処理量の方法を提供する。そうした検定法は、それだけに限らないが、コンビナトリアルライブラリーで見られるものなどの薬物候補を含む、化学化合物又は生物学的に注目される任意の分子に対して実施することができ、それだけに限らないが、コンビナトリアルライブラリーで見られるものなどの薬物候補を含む、生物学的に注目される化学化合物の高処理量のスクリーニングを可能にする。
【００２４】
本発明の技術は、個々の細胞についてのデータが、統計学的に意味のある細胞集団サンプルを構成するのに十分な細胞数でデータが得られるよう十分に迅速に、細胞レベル又は細胞下レベルで得られる検定法で使用することができる。
【００２５】
これらの検定法では、フルオレセイン；ローダミン；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐ．の染色剤Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７、Ｈｏｅｃｈｓｔの核染色剤；及びクマリン染色剤を含むがこれに限らない既知の任意のフルオロフォア又は蛍光標識を使用することができる（Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．の「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」、第６版、１９９６年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、米オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅを参照のこと）。
【００２６】
光学的配置
図１は、本発明の第一の実施形態を示している。顕微鏡は、例えば、光学範囲が３５０〜７５０ｎｍの電磁気放射供給源１００若しくは１１０、円柱レンズ１２０、第一のスリットマスク１３０、第一のリレーレンズ１４０、ダイクロイックミラー１５０、対物レンズ１７０、二次元に並んだサンプルウェル１８２を含むマイクロタイタープレート１８０、チューブレンズ１９０、フィルタ２００、第二のスリットマスク２１０、及び検出器２２０を備える。これらの要素は、光軸ＯＡに沿って、図１の平面に垂直に伸びるマスク１３０、２１０中のスリット開口部１３２、２１２と位置が合っている。レンズ１４０、１７０、及び１９０の焦点距離、及びこれらレンズ間の間隔、並びにマスク１３０とレンズ１４０の間、対物レンズ１７０とマイクロタイタープレート１８０の間、レンズ１９０とマスク２１０の間の間隔は、共焦点顕微鏡を形成するようなものである。この実施形態では、円柱レンズ１２０を使用して、ランプ１００又はレーザー１１０からの電磁気放射の焦点を線形に結ぶ。線の形状は、第一のスリットマスク１３０によって最適化される。スリットマスク１３０は、光学系の像面、すなわち、物面と共役関係にある面に描かれている。スリットマスク１３０中の開口部１３２によって形成される照明ストライプは、レンズ１４０、ダイクロイックミラー１５０、及び対物レンズ１７０によって２次元に並んだサンプルウェル１８２を含むマイクロタイタープレート１８０へと中継される。図示する都合上、図１の光学要素は断面を描き、ウェルプレートは遠近法によって描いている。ウェルプレート１８０への照明ラインの投影は、ライン１８４によって描かれ、また図１の平面に垂直であると理解される。矢印Ａ及びＢが示すように、ウェルプレート１８０は、示していない手段によってアレイの縦横と平行に二次元（Ｘ，Ｙ）に動かすことができる。
【００２７】
代替実施形態では、スリットマスク１３０は、光学系のフーリエ平面、すなわち対物レンズ後部焦点平面（ＢＦＰ）１６０と共役関係にある面に属する。この場合では、開口部１３２は、図の平面に横たわっており、レンズ１４０は、開口部１３２によって形成された照明ストライプを対物レンズ１７０の後部焦点平面１６０へと中継し、対物レンズ１７０が、図１の平面に垂直な物面でそれをライン１８４に変換する。
【００２８】
追加の代替実施形態では、スリットマスク１３０は、完全に取り除かれる。この実施形態によれば、照明供給源はレーザー１１０であり、そこからの光が、対物レンズ１７０の後部焦点平面１６０に集められる。これは、図１に示すように、円柱レンズ１２０と球面レンズ１４０の組合せによって実現することができ、或いは円柱レンズ１２０によって、照明を直接に平面１６０上に集めることもできる。
【００２９】
サンプル区域、例えば、サンプルウェル１８２中のサンプルの像は、照明ラインをサンプル内の平面に投影し、そこからの蛍光発光を検出器２２０上に結像させ、検出器２２０による読みと同期させてプレート１８０を照明ラインに対して直角方向に動かすことによって得られる。図１に示した実施形態では、蛍光発光を、対物レンズ１７０によって集め、ダイクロイックビームスプリッタ１５０によって投影し、フィルタ２００及び第二のスリットマスク２１０を通して、レンズ１９０によって、無限遠補正対物レンズ１７０を備えた共焦点結像系に適するように検出器２２０上に結像させる。ダイクロイックビームスプリッタ１５０及びフィルタ２００は、照明波長で優先的に光を遮断する。検出器２２０は、実例を挙げれば、カメラであり、一次元又は二次元のどちらでもよい。一次元検出器を使用する場合、スリットマスク２１０は必要でない。照明、検出、及び変換の各手順は、指示された区域が画像化されるまで続けられる。サンプルが一定の速度で平行移動されるならば、機械の動きは単純になる。連続的な動きは、カメラによる読みの時間が露出時間と比べて短い場合、最も有用である。好ましい実施形態では、カメラの読み取りを連続的に行う。露出時間と読み時間を合計した時間中のサンプルの移動ｄは、照明ラインの幅Ｗより大きくても小さくてもよく、例えば０．５Ｗ≦ｄ≦５Ｗである。マルチウェルプレートの全部のウェルを同様にして画像化することができる。
【００３０】
或いは、顕微鏡は、光学系の視野によって元から限定される隣接するいくつかのウェルを差し渡して照明ラインの焦点が合わせられるように設計してもよい。最後に、１台以上の顕微鏡を同時に使用することもできる。
【００３１】
照明ストライプ１８４の大きさ及び形状は、対物レンズ後部焦点平面１６０中のフーリエ変換ストライプの幅及び長さによって決定される。例えば、ライン１８４の長さは、１６０でのラインの幅によって決定され、逆に、１８４での幅は、１６０での長さによって決定される。回折限界性能に対しては、１６０での照明ストライプの長さを、対物後部開口部いっぱいになるように選択する。当業者ならば、照明ストライプ１８４の大きさ及び形状が、対物レンズの収差及び対物レンズの視野によって課される制限の範囲内で、円柱レンズ１２０の焦点長さと１２０でのビームサイズの組合せ方、すなわち各寸法での有効な開口数によって制御できることは明白であろう。
【００３２】
照明ライン１８４の寸法は、シグナル対ノイズの比が最適となるように選択する。したがって、その寸法は、サンプルに応じて決まる。検定法に応じて、分解能は、回折限界、すなわち０．５μｍ未満と約５μｍの間で様々であってよい。ビーム長さは、対物レンズ視野によって決定されることが好ましく、例えば、０．５〜１．５ｍｍの間である。Ｎｉｋｏｎ  ＥＬＷＤ，０．６ＮＡ，１０倍対物レンズは、例えば、約０．７５ｍｍの視野を有する。６３３ｎｍの照射での、この対物レンズでの回折限界分解能は、約０．６μｍ又は約１１００分解能要素である。
【００３３】
有効深さ分解能は、主としてスリットマスク２１０中の開口部２１２の幅又は一次元検出器の幅によって決まり、像倍率は、対物レンズ１７０とレンズ１９０の連携によって生み出される。共焦点顕微鏡の最高深さ分解能は、１μｍにせまるものである。この出願では、５〜１０μｍの深さ分解能で十分であり、又は有利にさえなることもある。
【００３４】
例えば、生細胞などの問題のサンプルが回折限界体積中に含有するフルオロフォアが、十分に短い画像取得時間で妥当なシグナル対ノイズの映像を可能にするのに不十分であるとき、回折限界体積よりも大きい体積を照明しそれからの発光を集めることが有利である。イオンチャネル開口部などの一過性事象のビデオ速度動力学研究でも、同様の状況が効を奏する。これは特に、対物レンズの後部開口部をアンダーフィルする（ｕｎｄｅｒｆｉｌｌｉｎｇ）ことによって実現されるが、これは、照明開口部の直径を増大させることに等しい。照明の有効な開口数（「ＮＡ」）は、対物レンズのＮＡよりも小さい。しかし、蛍光発光は、対物レンズの全開ＮＡで集められる。開口部２１２の幅は、より大きな照明体積からの発光が検出されるように増大させなければならない。回折限界よりも数倍大きい開口幅では、幾何光学が、検出量要素の大きさの妥当な近似値を提供する。すなわち、
横幅：ａｄ＝ｄｄ／Ｍ、
軸幅：ｚｄ＝√２ａｄ√ｔａｎα
［式中、Ｍは倍率であり、ｄｄは、開口部２１２の幅であり、αは、対物レンズ１７０の弧に対する半値角である］。照明開口部１３２又は開口部を備えていない実施形態中のその同等物と検出開口部２１２を独立に制御可能であることが、本発明の重要な部分である。
【００３５】
多波長配置
ある種の検定法には、多波長蛍光画像化を可能にする実施形態が好ましい。この手段では、画像化される同じ区域の画像データを、異なる複数のそれぞれの色チャネルで同時に生成することができる。
【００３６】
独立した波長又は色の数は、実施する特定の検定法に応じて変わってくる。一実施形態では、３種の照明波長を使用する。図２Ａ及び２Ｂは、３色ライン走査共焦点画像化システムの波線経路をそれぞれ上面及び側面から示している。一般に、このシステムは、円柱レンズＣＬによって第一空間フィルタＳＦ１の所で焦点が結ばれて延長ビームになる平行ビームを作り出すための数箇所の電磁気放射供給源Ｓｎ、コリメーティングレンズＬｎ、及びミラーＭｎ；第一空間フィルタＳＦ１と第二空間フィルタＳＦ２間の共焦点顕微鏡；結像レンズＩＬ；ビームスプリッタＤＭ１及びＤＭ２；及びサンプルからの蛍光放射の異なる波長成分を分離し検出するための検出器Ｄｎを含む。空間フィルタＳＦ、ＳＦ１及びＳＦ２は、スリットマスクであることが好ましい。
【００３７】
詳細には、図２Ａは、色λ１、λ２、及びλ３のための供給源Ｓ１、Ｓ２、及びＳ３、並びにそれぞれの光源からの光をコリメートするレンズＬ１、Ｌ２、及びＬ３を描いたものである。レンズＬ１、Ｌ２、及びＬ３を調整して、システム中の他のレンズの任意の色度を補償することが好ましい。ミラーＭ１、Ｍ２、及びＭ３は、光源Ｓｎからの照明の色を合体させるのに使用する。ミラーＭ２及びＭ１は、部分的に透過性であり、部分的に反射性であり、ダイクロイックになることが優先される。Ｍ２は、例えば、λ３を優先的に透過させ、λ２を優先的に反射するはずである。すなわち、λ３がλ２よりも大きいことが優先される。
【００３８】
共焦点モードでの顕微鏡操作では、光源Ｓｎからの合体した励起ビームが物面ＯＰ中で「線形」、又は高度に偏心した楕円形に焦点を結ぶ必要がある。上記で図１に関して論じたように、様々な配置を使用して、これを実現することができる。図２に示した実施形態では、合体された照明ビームの焦点が円柱レンズＣＬによって空間フィルタＳＦ１中のスリットと符合した細長い楕円形に結ばれる。図２Ａ及び２Ｂに描かれているように、スリットマスクＳＦ１は、照明光の伝搬に対して垂直に、かつその長軸を図２Ａの頁の平面に取って並べられた、この系の像面に属する。レンズＴＬ及びＯＬは、ＳＦ１を含む平面から物面ＯＰに照明ラインを中継する。回転ミラーＴＭは、便宜上のものである。別の実施形態では、ＤＭ３は、ＴＬとＯＬの間にあり、ＣＬは、照明光の焦点を直接にＢＦＰへと結ぶ。当業者には、他の実施形態が明白となろう。
【００３９】
図２Ｂを参照すると、サンプルによって発せられ、対物レンズＯＬによって集められた光は、チューブレンズＴＬによって空間フィルタＳＦ２上に結像される。ＳＦ２は、頁平面に垂直に伸びるように並べられたスリットにすることが優先される。したがって、フィルタＳＦ２を通過した光が事実上照明ラインとなる。ＳＦ２は、主像面又はそれと共役関係にある任意の面に配置される。ＤＭ３は、部分的に反射性であり、部分的に透過性であり、さらに「マルチクロイック」であることが好ましい。ある波長バンドを優先的に反射し、他の波長バンドを優先的に透過する多波長「ダイクロイック」ミラー又は「マルチクロイック」ミラーを得ることができる。
【００４０】
ここで、δλ１は、λ１によって励起された蛍光発光であると規定する。δλ１は、一般に、λ１よりも幾分長い波長の分布となる。δλ２及びδλ３も同様に規定される。ＤＭ３は、λｎを優先的に反射し、δλｎ（ｎ＝１，２，３）を優先的に透過させる。ＳＦ２を透過した光は、主像面と共役関係にある平面に属する検出デバイス上に結像される。図２Ａでは、空間フィルタＳＦ２の像が、レンズＩＬによって３台全ての検出器Ｄｎに結像される。この実施形態は、それぞれの検出器によって生成される画像間でほぼ完璧な記録が必要とされる用途において好ましい。別の実施形態では、個々のレンズＩＬｎは、検出デバイスと連係しており、レンズの対ＩＬ及びＩＬｎが、空間フィルタＳＦ２の像をそれぞれの検出器Ｄｎに中継する働きをする。光は、ミラーＤＭ１及びＤＭ２によって検出器毎に分割される。ミラーは、部分的に透過性であり、部分的に反射性であり、ダイクロイックになることが優先される。ＤＭ１は、δλ１を優先的に反射し、δλ２及びδλ３を優先的に透過させる。遮断フィルタＢＦ１は、δλ１を優先的に透過させ、存在する他の全ての波長を効果的に遮断する。ＤＭ２は、δλ２を優先的に反射し、δλ３を優先的に透過させる。遮断フィルタＢＦ２及びＢＦ３は、それぞれδλ２及びδλ３を優先的に透過させ、存在する他の全ての波長を効果的に遮断する。
【００４１】
走査ミラーの配置
本発明の一部の実施形態では、ビデオ速度で像を形作ることによって迅速なデータ取得を提供する。ビデオ速度撮像によって、最高で毎秒３０フレーム又は６０フレームが可能になる。本発明の使用では、３０Ｈｚ程度のフレーム速度を含意するものとする。好ましい実施形態では、ビデオ速度撮像は、照明とサンプルの相互的な変換がなされるように、サンプル面の一方の寸法に沿って照明を当て、それに垂直な方向で照明ビームによる走査を行うことによって実現される。走査台は、一般に大きくて重い。そのため、十分にすばやく動かすことができない。
【００４２】
図３は、走査ミラーＳＭを利用する本発明の実施形態を描いたものである。ミラーは、対物レンズ後部焦点面（ＢＦＰ）と共役関係にある平面に配置されると有利である。ＢＦＰ（又はそれと共役関係にある平面）の回転によって、物面（ＯＰ）及びその共役面での変換が行われる。ＳＭの全走査範囲は、レンズＲＬ１及びＲＬ２の典型的な値の焦点長さではわずか数度で済む。図３に示すように、このレンズ対は、ＢＦＰを倍率１でＳＭに結像させるが、様々な倍率を有利に使用することができる。像取得速度の限定要因は、カメラの読み速度及びシグナル強度である。上述の画像化モードでは、カメラの読み速度、例えば１ＭＨｚでデータを連続的に取得することができる。走査ミラーを用いる場合では、データを一方向に取得することが好ましい。データの連続的な取得を可能にする理想化された走査運動は、のこ歯状である。実際には、旋回走査時間と戻り走査時間の合計が、走査期間の約１／３〜２／３を占める。５０％のむだな時間、５０Ｈｚのミラー振動周波数、及び１ＭＨｚの画素取得速度を想定して、毎秒５０フレームでフレーム毎に約１００００画素が実現されるはずであり、これは、フレームからフレームへと、細胞などの個々の物体の輪郭を明確にし、追跡するのに十分なものである。しかし、像あたり１０４画素は、一般に上であると考えられていたものの１０２分の１である。用途に応じて、高分解能で比較的小さい像、例えば、０．５−μｍ×０．５−μｍのピクセレーションで５０−μｍ×５０−μｍの像を得、又は低めの分解能で比較的大きい像、例えば、２−μｍのピクセレーションで２００−μｍ×２００−μｍの像を得ると有利である。
【００４３】
オートフォーカス
本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、画像化システムの物面に位置する。したがって、画像化システムの視野にあるサンプルの一部をこのシステムの物面内に保つオートフォーカス機構を使用する。平面性の正確さは、システムの被写界深度によって決定される。好ましい実施形態では、被写界深度は約１０μｍであり、視野は約１ｍｍ２である。
【００４４】
このオートフォーカスシステムは、ごくわずかな遅れを伴って作動し、すなわち、応答時間が像取得時間に比べて短く、例えば、０．０１〜０．１秒である。さらに、オートフォーカス光源は、照明光源及びサンプルの性質と無関係である。他の利点の中でも特に、この配置では、結像系の光軸に沿ったサンプル受けの位置が、物面の位置と無関係に決定できるようになる。
【００４５】
単一ビームオートフォーカスの実施形態を図２Ｃ及び３Ｃに示し、そこに、波長λ４の単独の光源Ｓ４及び検出器Ｄ４を示してある。波長λ４は、必ずサンプル蛍光と異なるものとし、サンプル中の蛍光を相当には励起できない波長であることが優先される。すなわち、λ４は、近赤外、例えば８００〜１０００ｎｍであることが優先される。部分的に透過性であり、部分的に反射性であるミラーＤＭ４は、ダイクロイックになることが優先され、λ４を反射し、λｎ及びδλｎを透過させる（ｎ＝１、２、３）。本発明の用途に適する光学系オートフォーカス機構は既知である。例えば、サーボ制御に適する位置誤差シグナルを生成するための非点レンズ系が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ第２３巻５６５〜５７０頁（１９８４年）に記載されている。「スキュービーム」を使用する焦点誤差検出系は、ＳＰＩＥ第２００巻７３〜７８頁（１９７９年）で開示されている。後者の手法は、Ｄ４をスプリット検出器とする図２Ｃ及び３Ｃに従って容易に実施される。
【００４６】
ウェル底部にサンプルを含むマイクロタイタープレートと共に使用するためには、サーボループを絶ってウェルの間を移動させなければならない。このため、照明を別のウェルに移動させる度に焦点を合わせ直す必要があるので、実質的な時間遅れが生じる。
【００４７】
図４に示す本発明の好ましい実施形態では、サンプル面と物面の相対位置の連続的な閉ループ制御を提供する。このシステムは、２本の独立した電磁気放射ビームを利用する。Ｓ５を供給源とする一方の焦点は、連続表面上、例えばマイクロタイタープレートの底で結ばれる。Ｓ４を供給源とする他方の焦点は、不連続な表面上、例えばマイクロタイタープレートのウェルの底で結ばれる。一実施形態では、Ｓ４及びＳ５を供給源とするビームの波長は、それぞれλ４及びλ５である。λ４は、Ｌ４によって平行にされ、アイリスＩ４によって絞られ（ａｐｅｒｔｕｒｅｄ）、対物レンズＯＬによって不連続な平面上で焦点が結ばれる。λ５は、Ｌ５によって平行にされ、アイリスＩ５によって絞られ、レンズＣＦＬによって対物レンズＯＬと共同して連続表面上で焦点が結ばれる。反射光は、それぞれレンズＩＬ４及びＩＬ５によって検出器Ｄ４及びＤ５上に焦点が結ばれる。部分的に透過性であり、部分的に反射性であるミラーＤＭ４は、ダイクロイックになることが優先され、λ４及びλ５を反射し、λｎ及びδλｎを透過させる（ｎ＝１、２、３）。ミラーＭ４、Ｍ５、及びＭ６は、部分的に透過性であり、部分的に反射性である。λ４及びλ５が異なるものである場合、Ｍ６は、ダイクロイックになることが優先される。
【００４８】
サンプルがマイクロタイタープレート中に存在する実施形態によれば、λ４は、ウェルの底で焦点が結ばれる。物面は、ウェルの底から可変距離で底上げすることができる。これは、Ｌ４を調整して、或いはサーボ制御ループ中のオフセット調整によって実現される。記載する都合上、λ４が物面中で焦点を結ぶことを想定する。
【００４９】
オートフォーカスシステムの運転は次の通りである。サンプルウェルの底が対物レンズＯＬの焦点面中にない場合、検出器Ｄ４は、Ｚ制御装置に対して、スイッチＳＷによって供給されるエラーシグナルを発する。Ｚ制御装置は、マイクロタイタープレートを対物レンズに向けて、又はそれから離して動かすためのモーター（非表示）を制御する。或いは、Ｚ制御装置は、対物レンズを動かすことができてもよい。マイクロタイタープレートのボトムＰＢが、レンズＣＦＬと対物レンズＯＬの組合せの焦点面にない場合、検出器Ｄ５は、Ｚ制御装置に対して、スイッチＳＷによって作動されるエラーシグナルを発する。ＸＹ制御装置は、レンズＯＬの物面ＯＰ中にあるマイクロタイタープレートを動かすためのモーター（非表示）を制御する。
【００５０】
示されている通り、走査全体がコンピュータ制御下にある。典型的な走査は次の通りである。特定のウェルで像が完成した時点で、コンピュータがＳＷを作動させて、サーボ機構の制御を、Ｄ４によって発信されるエラーシグナルからＤ５によって発信されるエラーシグナルへと切り替え、次いで、コンピュータが、プレートを次のウェルに移動するようＸＹ制御装置に指示を出し、その後サーボがＤ４に戻る。
【００５１】
プレートの底からのシグナルを利用する「粗い」焦点合わせ機構が使用されて、サンプル面の位置が、プレート底部の厚さの、ウェル毎の格差の範囲内に保たれるので、「細かな」機構によって調査する必要のある範囲が最小限に抑えられる。例えば、アイリスＩ５の直径が２ｍｍであり、ＩＬ５が１００ｍｍである場合、検出器上の像サイズは、約１００μｍになる。同様に、アイリスＩ４の直径が０．５ｍｍであり、ＩＬ４が１００ｍｍである場合、検出器上の像サイズは、約４００μｍとなる。後者は、「粗い」焦点合わせとして機能するよう、感度が劣るように選択する。
【００５２】
上述の単一ビーム実施形態でのように、波長λ４及びλ５は、必ずサンプル蛍光と異なるものとし、サンプル中の蛍光を相当には励起できない波長であることが優先される。すなわち、λ４及びλ５は、近赤外、例えば８００〜１０００ｎｍであることが優先される。さらに、２種の波長は、例えば、λ４＝８３０ｎｍ、λ５＝９８０ｎｍのように、異なるものであることが好ましい。
【００５３】
２ビームオートフォーカスの代替実施形態では、λ４＝λ５であり、２本のビームは、同じ供給源から生じてよい。２本のビームが互いに垂直に偏光し、Ｍ６が偏光ビームスプリッタであることが優先される。
【００５４】
次のように作動する単一ビームオートフォーカスの好ましい実施形態では、擬閉ループ制御装置を提供する。走査の終わりの時点で、コンピュータがＳＷを作動させて、プレートが次のウェルに移動する間、Ｚ制御装置の出力を一定レベルに保つサンプルホールド装置へと制御を切り替え、その後ＳＷはＤ４に戻る。
【００５５】
検出デバイス
物面と共役関係にある平面中にマニホルド、すなわち独立した検出要素を備えた検出デバイスを使用する。上で論じたように、ライン照明は、主として迅速に画像化する必要のある用途で有利である。ライン照明の平行性に固有の、ポイント照明と比べての潜在的なスピードの増大は、画像化システムが、サンプルの各点から発せられる光を照明ラインに沿って同時に検出することができる場合に限り実現される。
【００５６】
上述の従来技術の画像化システムの出力箇所に、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は他のカメラを配置することが可能である（Ｗｈｉｔｅらの米国特許第５４５２１２５号明細書、及びＢｒａｋｅｎｈｏｆｆ及びＶｉｓｓｃｈｅｒ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ第１７１巻１７〜２６頁（１９９３年））。得られる装置は、本発明と比べると、３つの重大な欠点を有する。１点目は、像を二次元の検出器に結像させ直す必要があり、これが装置に不必要な複雑さを加えることである。別の点は、通常はカメラの構成要素となる、１０００画素×１０００画素のアレイを上回る十分な品質を有する完全な二次元検出器が必要となることである。第三の欠点は、その二次元デバイスからの完全な像を読み取るのに追加の時間が必要となることである。
【００５７】
これらの欠点を回避し、高感度及び低ノイズ検出という制約の範囲内で、画像化速度だけでなく処理量も最適化するために、連続ライン読取りカメラを使用するが、好ましい実施形態では、長方形のＣＣＤをラインカメラとして使用する。どちらの実施形態も、像内のライン間又は像間のむだな時間を伴わない。更なる利点は、以下で論じるステージ走査実施形態で、より広い有効視野が実現されることである。
【００５８】
以下の好ましい実施形態を考慮に入れることによって、検出デバイスに必要な特性をさらに明らかにすることができる。対物レンズの分解能の限界は、＜  １μｍ、通常は約０．５μｍであり、検出器は、約１０００の独立した要素からなるアレイを含む。分解能、視野（ＦＯＶ）、及び像取得速度は、独立した変数ではなく、これらのパフォーマンスパラメーター間での妥協を余儀なくさせる。一般に、光学系の倍率は、分解能を犠牲にすることなく、できる限り広いＦＯＶで結像されるように設定する。例えば、約１ｍｍの視野は、１−μｍのピクセレーションで１０００要素のアレイに画像化することができるはずである。検出要素が２０μｍ２であれば、系の倍率は２０倍にセットされることになる。これでは１−μｍの分解能は得られないことを留意されたい。ピクセレーションは、分解能と同等ではない。例えば、対物レンズ固有の分解能の限界が０．５μｍであり、物面中の０．５μｍ×０．５μｍの各領域が画素上に写される場合、得られるデジタル画像の真の分解能は、０．５μｍでない。真の０．５−μｍ分解能を実現するためには、ピクセレーションが、物面中の領域約０．２μｍ×０．２μｍに対応する必要があるはずである。好ましい一実施形態では、画像化システムの倍率を、光学部品の真の分解能が実現されるように設定する。
【００５９】
現在、本発明の用途にとって十分な読出しスピードを有する、最高検出効率最低ノイズの検出デバイスは、ＣＣＤカメラである。図５には、ｍ×ｎ（ｍは、実質的にｎより少ない）アレイの検出要素を備えた長方形のＣＣＤカメラが描かれている。蛍光発光の像は、好ましくは読み記録器に最も近い一列を扱う。これによって、移動時間が最小限に抑えられ、照明を受けた列と読み記録器との間の列からのシグナルに誤ったカウントが蓄積されることが回避される。
【００６０】
原理としては、光学システムの倍率は、図５に示すようなＣＣＤカメラ上のスリットＳＦ２の像の高さが１ピクセルになるように設定できるはずである。実際には、照明ラインとカメラの列軸との完全なアラインメントを維持することは困難であり、図２及び図３に例示するような多波長実施形態で３台のカメラと照明とのアラインメントを維持することはさらに困難である。少数、例えば２〜５の検出要素をカメラの各カラムに集めることによって、アラインメントの状態を緩めることができ、その間、読取りノイズ又は読取り時間の欠点は最小限に抑えられる。
【００６１】
それぞれが物面と共役関係にある平面に配置された、図２及び図３の不定幅検出空間フィルタＳＦ２、及び図１の２１０と連係した、１台以上の長方形ＣＣＤカメラを検出デバイスとして備えた好ましい実施形態の更なる利点を以下で説明する。上で論じたように、本発明の一実施形態では、検出空間フィルタを省き、合体検出空間フィルタと検出デバイスを合体させたものとしてラインカメラを使用する。しかし、これも上で論じたように、不定幅検出空間フィルタは、サンプル依存的なシグナル対ノイズ比が最適化されるよう、検出量を最適化できるようにする。以下の好ましい実施形態は、ラインカメラの利点、すなわち、スピード、及び変動する検出量という柔軟性を保持している。倍率は、カメラの１列に高さｈの回折限界ラインが結像されるように設定する。検出空間フィルタの幅ｄは、変数ｈ≦ｄ≦１０ｈであることが好ましい。読取りの前にカメラの照明カラム中の検出装置が集められるが、これは、露出及び読取り時間に比べるとごくわずかな時間しか必要としない動作である。
【００６２】
好ましい一実施形態では、カメラは、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＮＴＥ／ＣＣＤ−１３４０／１００−ＥＭＤである。好ましい実施形態の読取り速度は、読取りノイズの少数電子系で１ＭＨｚである。画素フォーマットを１３４０×１００とし、カメラを問題の領域から離れた列の大部分（８０％）に移行するようにつなげてカメラを有効に１３４０×２０にすることができる。
【００６３】
連続読取りカメラの上述の利点、すなわち連続する各取得間のむだな時間がないことに加えて、長さがサンプルの程度によってのみ制限される長方形の像が取得できるようになることが更なる利点である。長さは、カメラの短い方の幅及びライン照明の程度によって決定される。好ましい実施形態では、９６穴マイクロタイタープレートの、直径７ｍｍのウェル底部にサンプルを配置する。１μｍ×１ｍｍの一片を照明し、照明区域から発せられる放射線を検出装置上に結像させる。視野が約〜１ｍｍ２になるように光学的な列を設計する。本発明によれば、ウェル底部の像を１×７−ｍｍの視野に１−μｍのピクセレーションで生成することができる。
【００６４】
環境の制御
本発明の実施形態では、生細胞で検定法が実施される。生細胞アッセイは、適切に実施するために、生理的条件に適度に近づける必要があることがたびたびある。特に重要なパラメーターは、温度である。温度を上下させる手段、特にサンプルの温度を３７℃に保つための手段を組み込むことが望ましい。別の実施形態では、生細胞の生存能力を維持するために、相対湿度及び／又はＣＯ２及び／又はＯ２の制御が必要である。さらに、湿度を制御して蒸発を最小限に抑えることが、サンプル体積を小さくするために重要である。
【００６５】
高めの温度、好ましくは３７℃でマイクロタイタープレートを用意する、ＬＣＩシステムと適合性のある３通りの実施形態を以下で述べる。
【００６６】
画像化システムは、耐光性囲い内に存在することが好ましい。第一の実施形態では、サンプルプレートは、囲いの内部全体をその温度に保って所望の温度を維持する。しかし、３７℃では、湿度が意図したように高めに保たれない限り、蒸発冷却によってサンプル体積が縮小されて、アッセイ期間が制限される。
【００６７】
第二の実施形態は、プレートを据え付けのカバーの下で移動させられるようにするマイクロウェルプレート用熱カバーを提供する。このカバーは、顕微鏡の光軸に沿って並べられたウェルの上に１箇所の開口部を有する。この開口部は、アクティブなウェルへの分注を可能にする一方で、加熱を維持し、残りのプレートへの循環の制限が続けられるようにする。遮熱カバープレートとマイクロウェルプレート間の約０．５ｍｍの間隔によって、マイクロウェルプレートの自由な移動が可能になり、蒸発が最小限に抑えられる。問題のウェルの中身は、分注開口部を介して長くとも数秒間しか周囲条件に曝されないので、中身は、測定の際にそれほどの温度変化を受けない。
【００６８】
第三の実施形態では、薄いサファイア色の遮熱ウィンドウをプレート底部囲いとして使用する。ウェルの隔離板に沿った型の抵抗加熱器が、ウィンドウ温度を所望のレベルに保つ。
【００６９】
追加の実施形態では、開示した３つの方法を様々に組み合わせることができる。
【００７０】
自動化されたスクリーニングアッセイで使用する、本発明の追加の好ましい実施形態では、画像化システムを、Ｚｙｍａｒｋ  Ｔｗｉｓｔｅｒなどのプレート取扱いロボットに組み込む。
【００７１】
データ処理システム
図６は、本発明に従って配置されるシステムのデータ処理構成要素の略図を示している。このシステムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）システムに基づくものであり、検出器Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、スイッチＳＷ、制御ユニット４０１、像データ記憶装置４０２、及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置４０４を含む、上述のような共焦点顕微鏡４００を含む。関連コンピュータ端末４０５は、中央処理装置（ＣＰＵ）４０８、メモリ４１０、ハードディスクドライブ４１２などのデータ記憶装置、並びにコンピュータとＭＤＰＵの相互連絡、及びコンピュータとスクリーン４２８のディスプレイ要素４３２の、スクリーンＩ／Ｏ装置４３０を介しての相互連絡をそれぞれ円滑にするＩ／Ｏ装置４０６を含む。オペレーティングシステムプログラム４１４は、ハードディスクドライブ４１２に記憶されており、コンピュータ端末４０５の低レベルの演算を既知の方法で制御する。プログラムファイル及びデータ４２０も、ハードディスクドライブ４１２に記憶されており、関連装置を介したオペレータへの出力を既知の方法で制御し、ハードディスクドライブに記憶されたデータを出力する。関連装置は、スクリーン４２８の要素としてのディスプレイ４３２；別のＩ／Ｏ装置（非表示）を介して、オペレータからの情報の入力を受け取り、オペレータに情報を出力する位置決め装置（非表示）及びキーボード（非表示）を含む。ハードドライブ４１２に記憶されたプログラムファイル４２０には、画像処理及び分析アプリケーション４１６、アッセイ制御アプリケーション４１８、及び顕微鏡４００から受け取った画像データ及びデータ処理中に作成された出力ファイルを記憶させるためのデータベース４２２が含まれる。画像処理及び分析アプリケーション４１８は、Ｍｅｄｉａ  ＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓのＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ（商標）など、既知の画像処理及び分析ソフトウェアパッケージのカスタマイズ版でよい。
【００７２】
共焦点顕微鏡４００を使用する検定法の性能は、制御アプリケーション４１８を使用して制御し、画像データを取得する。１種以上の検出器Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３によってマイクロタイタープレート中の少なくとも１個のウェルの画像データを取得し終えた後、画像データをコンピュータ４０５に送信し、コンピュータ端末ハードドライブ４１２のデータベース４２２に記憶させ、その時点で、画像処理及び分析アプリケーション４１６を使用して、以下でより詳細に述べるように画像データを処理することができる。
【００７３】
細胞中に発現される発光レポーター
以下で述べる検定法の数多くの変形形態を、本発明に従って実践することができる。一般に、細胞中の１種以上の発光レポーターの特有の空間的及び／又は経時的分布を使用して、検定法を定量化する。発光は、上述のようなライン走査共焦点顕微鏡を使用して本質的に平らな表面から観察すると有利である。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態では、発光レポーターは、我々の以前の国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ０２／００４２５８号に記載の方法で用意する。細胞集団の細胞周期中の位置は、
ａ）
ｉ）細胞周期相に特異的な１種以上の発現制御要素と、
ｉｉ）破壊制御要素
とに操作可能に連結され、かつその制御下にある検出可能な生細胞レポーター分子をコードしている核酸配列を含む核酸レポーター構築物、好ましくはＤＮＡ構築物を細胞中に発現させ、
レポーター構築物が、細胞周期の所定の時点で細胞中に発現されるステップ、及び
ｂ）レポーター分子によって発せられる発光をモニターして、細胞周期中の細胞の位置を決定するステップ
によって決定される。
【００７５】
核酸レポーター構築物が、細胞周期相に特異的な空間局在化制御要素に連結され、その制御下にあることも好ましい。
【００７６】
細胞周期相に特異的な発現制御要素は、通常は、１種以上の核酸配列の転写及び／又は翻訳を制御し、細胞周期特異的な発現の制御を可能にするＤＮＡ配列である。周期位置レポーター構築物の構築には、１以上の細胞周期相で特異的に活性を有するどんな発現制御要素を使用するのも適切である。
【００７７】
適切には、細胞周期相特異的な発現制御要素は、細胞周期特異的なプロモーター、及び転写若しくは翻訳の制御に対して細胞周期特異的に影響を及ぼす他の要素から選択される。発現制御要素がプロモーターである場合では、プロモーターの選択は、研究のために選択される細胞周期相に応じて決まる。
【００７８】
適切なプロモーターとしては、サイクリンＢ１プロモーター（Ｃｏｇｓｗｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５年）、第１５巻（５）、２７８２〜９０頁、Ｈｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５年）、第２７０巻（４７）、２８４１９〜２４頁、Ｐｉａｇｇｉｏら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（１９９５年）、第２１６巻（２）、３９６〜４０２頁）；Ｃｄｃ２５Ｂプロモーター（Ｋｏｒｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１年）、２７６巻（１３）、９６６２〜９頁）；サイクリンＡ２プロモーター（Ｈｅｎｇｌｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４年）、第９１巻（１２）、５４９０〜４頁、Ｚｗｉｃｋｅｒら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．（１９９５年）、第１４巻（１８）、４５１４〜２２頁）；Ｃｄｃ２プロモーター（Ｔｏｍｍａｓｉ及びＰｆｅｉｆｅｒ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５年）、第１５巻（１２）、６９０１〜１３頁、Ｚｗｉｃｋｅｒら、Ｅｍｂｏ  Ｊ（１９９５年）、第１４巻（１８）、４５１４〜２２頁）；Ｃｄｃ２５Ｃプロモーター（Ｋｏｒｎｅｒ及びＭｕｌｌｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００年）、第２７５巻（２５）、１８６７６〜８１頁、Ｋｏｒｎｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９７年）、第２５巻（２４）、４９３３〜９頁）；サイクリンＥプロモーター（Ｂｏｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９６年）、第１６巻（７）、３４０１〜９頁、Ｋｏｒｎｅｒ及びＭｕｌｌｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（２０００年）、第２７５巻（２５）、１８６７６〜８１頁）；Ｃｄｃ６プロモーター（Ｈａｔｅｂｏｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９８年）、第１８巻（１１）、６６７９〜９７頁、Ｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８年）、第９５巻（７）、３６０３〜８頁）；ＤＨＦＲプロモーター（Ｓｈｉｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８６年）、第２６１巻（３）、１４４５〜５２頁、Ｓｈｉｍａｄａ及びＮｉｅｎｈｕｉｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８５年）、第２６０巻（４）、２４６８〜７４頁）及びヒストンプロモーター（ｖａｎ  Ｗｉｊｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４年）、第９１巻、１２８８２〜１２８８６頁）が挙げられる。
【００７９】
適切には、細胞周期相に特異的な発現制御要素は、細胞周期特異的なＩＲＥＳ要素、及び翻訳の制御に対して細胞周期特異的に影響を及ぼす他の要素から選択される。ＩＲＥＳ要素は、リボソームの結合及び翻訳の開始が５’−キャップ構造領域でないｍＲＮＡの領域で行われるようにする、内部リボソーム侵入部位である。細胞周期特異的なＩＲＥＳ要素は、キャップ非依存的な翻訳の開始を細胞周期の特定の段階に限定する（Ｓａｃｈｓ，Ａ．Ｂ．、Ｃｅｌｌ（２０００年）、第１０１巻、２４３〜５頁）。発現制御要素をＩＲＥＳにするように選択する場合、その選択は、調査中の細胞周期相に応じて決まることが適切である。この場合では、構成的に発現されるプロモーター（例えば、ＣＭＶやＳＶ４０）又は誘導性のプロモーター（例えば、ｐＴｅｔ−ｏｎ  ｐＴｅｔ−ｏｆｆ系、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用すると、バイシストロン性ｍＲＮＡの転写を制御することができる（Ｓａｃｈｓ，Ａ．Ｂ．、Ｃｅｌｌ（２０００年）、第１０１巻、２４３〜５頁）。或いは、細胞周期相非依存的なＩＲＥＳ要素（例えば、ｐＩＲＥＳベクター中に見られるＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を細胞周期特異的なプロモーター要素と共に使用することもできる。或いは、細胞周期相特異的なプロモーターを細胞周期相特異的なＩＲＥＳ要素と共に使用して、レポーターの発現のより厳密な制御を実現することもできる。
【００８０】
本発明での使用に適するＩＲＥＳ要素としては、Ｇ２−ＩＲＥＳ（Ｃｏｒｎｅｌｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０００年）、第５巻（４）、５９７〜６０５頁）；ＨＣＶ  ＩＲＥＳ（Ｈｏｎｄａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０００年）、第１１８巻、１５２〜１６２頁）；ＯＤＣ  ＩＲＥＳ（Ｐｙｒｏｎｅｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０００年）、第５巻、６０７〜６１６頁）；ｃ−ｍｙｃ  ＩＲＥＳ（Ｐｙｒｏｎｎｅｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０００年）、第５巻（４）、６０７〜１６頁）；及びｐ５８  ＰＩＴＳＬＲＥ  ＩＲＥＳ（Ｃｏｒｎｅｌｉｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０００年）、第５巻（４）、５９７〜６０５頁）が挙げられる。
【００８１】
表１は、本発明に従って使用することのできる好ましい発現制御要素を挙げ、各要素が活性化される細胞周期相を示すものである。
【００８２】
【表１】
2006521785.tif 000003
【００８３】
破壊制御要素は、その配列を含むタンパク質の破壊を制御するタンパク質モチーフをコードしているＤＮＡ配列である。適切には、破壊制御要素は、細胞周期の影響を受けるもの、例えば、サイクリンＢ１  Ｄボックス（Ｇｌｏｔｚｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）、第３４９巻、１３２〜１３８頁、Ｙａｍａｎｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９８年）、第１７巻（１９）、５６７０〜８頁、Ｃｌｕｔｅ及びＰｉｎｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９年）、第１巻、８２〜８７頁）；サイクリンＡ  Ｎ末端（ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ及びＰｉｎｅｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００１年）、第１５３巻（１）、１２１〜３６頁、Ｇｅｌｅｙら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００１年）、第１５３巻、１３７〜４８頁）；ＫＥＮボックス（Ｐｆｌｅｇｅｒ及びＫｉｒｓｃｈｎｅｒ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ（２０００年）、第１４巻（６）、６５５〜６５頁）、サイクリンＥ（Ｙｅｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．（２００１年）、第２８１巻、８８４〜９０頁）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＣｌｎ２サイクリン（Ｂｅｒｓｅｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２年）、４４６３〜４４７６頁）、及びｐ２７Ｋｉｐ１（Ｍｏｎｔａｇｎｏｌｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．（１９９９年）、第１３巻（９）、１１８１〜１１８９頁、Ｎａｋａｙａｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（２０００年）、第１９巻（９）、２０６９〜８１頁、Ｔｏｍｏｄａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９９年）、第３９８巻（６７２３）、１６０〜５頁）でよい。
【００８４】
表２は、本発明に従って使用することのできる破壊制御要素を挙げ、各要素が活性化される細胞周期相を示すものである。
【００８５】
【表２】
2006521785.tif 000004
【００８６】
或いは、破壊制御要素は、Ｒｏｇｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６年）、第２３４巻、３６４〜８頁に記載されているようなＰＥＳＴ配列などの、細胞周期の影響を受けないものでもよい。細胞周期の影響を受けない破壊制御要素の例としては、カゼイン由来配列、オルニチン脱炭酸酵素、及びタンパク質半減期を短縮するタンパク質が挙げられる。このような細胞周期の影響を受けない破壊制御配列を本発明の方法で使用すると、細胞周期特異的なプロモーターによる発現が誘導されてからの細胞周期レポーターの残存時間を測定する手段となる。
【００８７】
適切には、核酸配列によってコードされる生細胞レポーター分子は、蛍光タンパク質及び酵素からなる群から選択することができる。好ましい蛍光タンパク質としては、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び野生型ＧＦＰのアミノ酸配列をアミノ酸の欠失、付加、又は置換によって変更したものである機能性ＧＦＰ類似体などのＧＦＰ誘導体が挙げられる。本発明で使用するのに適するＧＦＰ類似体としては、ＥＧＦＰ（Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ（１９９６年）、第１７３巻、３３〜３８頁）；ＥＹＦＰ及びＥＣＦＰ（米国特許第６０６６４７６号明細書、Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．ら）；Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ（米国特許第６１７２１８８号明細書、Ｔｈａｓｔｒｕｐ，Ｏ．ら）；ＢＦＰ（米国特許第６０７７７０７号明細書、Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．ら）が挙げられる。他の蛍光タンパク質として、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、及び他の新規な蛍光タンパク質（ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ及びＬａｂａｓ，Ｙ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００２年）、第９９巻、４２５６〜６１頁）、並びにＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。適切な酵素レポーターは、その酵素に対する基質中で検出可能な（例えば、蛍光又は発光）シグナルを発することのできるものである。特に適切な酵素／基質としては、ニトロ還元酵素／Ｃｙ−Ｑ（国際公開第０１／５７２３７号で開示されているようなもの）及びβ−ラクタマーゼ／ＣＣＦ４が挙げられる。
【００８８】
好ましい実施形態では、核酸レポーター構築物は、タンパク質の細胞下での局在化を細胞周期特異的に制御することのできるタンパク質モチーフをコードしているＤＮＡ配列を含む、細胞周期相に特異的な空間局在化制御要素を適宜含んできてよい。そのような局在化制御要素は、
ｉ）レポーターが特定の細胞下に局在することが望ましい場合、かつ／又は
ｉｉ）細胞周期位置のより厳密な決定が求められる場合
では、本発明に従って使用すると有利である。
【００８９】
レポーターの細胞下の局在性を決定して、その有効な働き及び／又は破壊を確実にする必要があることもある。局在化制御要素を使用すると、レポーターシグナルの強度及び局在性の両方を測定できるようになるので、細胞周期位置のより厳密な決定が可能となり得る。
【００９０】
適切な空間局在化制御要素としては、細胞周期制御タンパク質、例えば、サイクリンＢ１  ＣＲＳの局在化を調節するものが挙げられる。
【００９１】
用語「操作可能に連結された」とは、本明細書では、その要素が、その企図された目的に合わせて機能するように、例えば、転写がプロモーター中で開始され、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列によって進行するように配置されていることを指す。図７は、本発明によるＤＮＡ構築物の一般構造を図示するものであり、その中で、図７Ａは、細胞周期相に特異的なプロモーターを使用し、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素を使用しない構築物を示し、図７Ｂは、ＩＲＥＳ要素を使用して哺乳動物の選択を容易にする構築物を示し、図７Ｃは、構成的若しくは誘発性の哺乳動物プロモーターと、発現制御要素としての細胞周期相に特異的なＩＲＥＳを利用する構築物を示す。各事例で、Ａは、細胞周期相に特異的な発現制御（プロモーター）を表し、Ｂは、細胞周期相に特異的な破壊制御要素を表し、Ｃは、細胞周期相に特異的な局在化制御要素を表し、Ｄは、レポーター遺伝子を表し、Ｅは、細胞周期非特異的なＩＲＥＳ要素を表し、Ｆは、選択用哺乳動物マーカーを表し、Ｇは、構成的哺乳動物プロモーターを表し、Ｈは、細胞周期特異的なＩＲＥＳ要素を表す。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態では、構築物は、サイクリンＢ１プロモーター、サイクリンＢ１破壊ボックス（Ｄボックス）、サイクリンＢ１細胞質保留配列（ＣＲＳ）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。
【００９３】
一実施形態では、核酸レポーター構築物は、次の要素、すなわち、
ａ）次のものを含むベクター主鎖、
ｉ）細菌の複製起点
ｉｉ）細菌の薬物耐性遺伝子
ｂ）細胞周期相に特異的な発現制御要素、
ｃ）破壊制御要素、及び
ｄ）レポーター分子をコードしている核酸配列
を含む発現ベクターを含む。
【００９４】
核酸レポーター構築物は、適宜、細胞周期相に特異的な空間局在化制御要素及び／又は真核細胞薬物耐性遺伝子、好ましくは哺乳動物の薬物耐性遺伝子をさらに含む。
【００９５】
発現ベクターは、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナー／スプライスアクセプターの各シグナル、介在配列、転写促進因子配列、翻訳促進因子配列などの他の核酸配列を含んでいてもよい。薬物耐性遺伝子とレポーター遺伝子は、２種の遺伝子が別々のプロモーターから転写開始されるよりも、適宜、細胞周期特異的な内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Ｓａｃｈｓら、Ｃｅｌｌ（２０００年）、第１０１巻、２４３〜２４５頁）又は細胞周期非依存性の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（Ｊａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８８年）、第６２巻、２６３６〜２６４３頁；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）、第３３４巻、３２０〜３２５頁）によって操作可能に連結されていてよい。細胞周期非特異的ＩＲＥＳ要素を使用する際、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているｐＩＲＥＳ−ｎｅｏベクター及びｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏベクターを使用することができる。
【００９６】
特定の実施形態では、核酸レポーター構築物は、サイクリンＢ１プロモーターをコードしているＤＮＡ配列を、サイクリンＢ１のアミノ末端の１７１アミノ酸をコードしているＤＮＡ配列に操作可能に連結したものと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしているＤＮＡ配列とから組み立てられる（図８）。図８に示した構築物は、サイクリンＢ１プロモーター（Ａ）、サイクリンＢ１破壊ボックス（Ｄボックス）（Ｂ）、サイクリンＢ１  ＣＲＳ（Ｃ）、及びＧＦＰレポーター（Ｄ）を含んでいる。サイクリンＢ１の局在化及び破壊を制御するモチーフは全て、その分子のアミノ末端中の約１５０アミノ酸まで地図作成が済んでいる。したがって、パートナーキナーゼに結合し、それを活性化するのに必要となり、サイクリンボックスと呼ばれる特定の配列を欠いているために細胞周期の進行を妨げない（Ｎｕｇｅｎｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．（１９９１年）、第９９巻、６６９〜６７４頁）、サイクリンＢ１のアミノ末端由来の配列のみを使用して、人工の細胞周期マーカーを構築することができる。サイクリンＢ１のアミノ末端配列に必要となる調節性のキーモチーフは、次のものである。
ｉ）破壊ボックス（Ｄボックス）と呼ばれる９アミノ酸のモチーフ。これは、目標サイクリンＢ１のユビキチン化機構に必要であり、また１種以上のＣ末端リジン残基と共に、その細胞周期特異的な分解にも必要である。
ｉｉ）約１０アミノ酸の核輸出シグナル（ＮＥＳ）。このモチーフは、エクスポーチン１によって直接又は間接的に認識され、間期の間、細胞質中のサイクリンＢ１のかさを十分に維持する。
ｉｉｉ）ＮＥＳ中に位置しまたそれに隣接し、有糸分裂時に迅速な核の輸入、及び核の輸出の低減をもたらす、約４箇所の有糸分裂特異的なリン酸化部位。
【００９７】
この構築物は、真核細胞中で発現させると、内発的なサイクリンＢ１の発現及び分解と平行した、ＧＦＰレポーターの細胞周期特異的な発現及び破壊を示す。したがって、ＧＦＰの蛍光強度を測定すると、細胞周期のＧ２／Ｍ期にある細胞を同定することができる（図９）。さらに、この構築物の蛍光産物は、内発性サイクリンＢ１の空間局在性を模倣するので、細胞下の蛍光分布を分析すると、細胞周期位置をさらに精密に割り当てることができる。前期では、サイクリンＢ１は、核へと直ちに位置を変え、したがって、細胞中のＧＦＰ蛍光の精密な局在性を利用すると、間期から有糸分裂へと移行する細胞を識別することができる。細胞が中期に到達し、紡錘体アセンブリチェックポイントがクリアーされてしまうと、サイクリンＢ１は非常に急速に分解され、したがって、ＧＦＰ蛍光の消失を使用して、Ｍ期中期にある細胞を同定することができる。
【００９８】
同時性をもたない細胞集団中で構築物を発現させると、各細胞が、構築物からの蛍光産物の周期的な発現及び破壊を示して、集団中の全細胞から蛍光の連続的な点滅パターンがもたらされる。したがって、各細胞の蛍光強度を経時的に分析すると、各細胞の細胞周期状態の動的な情報が得られる。
【００９９】
第一の態様に従う核酸レポーター構築物の別の実施形態は、細胞周期の所望の区画を報告する細胞周期相レポーターが設計されるように、例えば、表１及び表２に示したものから、適切な代替細胞周期制御要素を選択して構築することができる。
【０１００】
発現ベクター及びプラスミドの構築及び使用については、当業者によく知られている。事実上、どんな哺乳動物細胞発現ベクターも、本明細書で開示する細胞周期マーカーと共に使用することができる。細菌及び哺乳動物の薬物耐性遺伝子と、細菌の複製起点とを含む適切なベクター主鎖の例としては、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＴｒｉＥｘ１（Ｎｏｖａｇｅｎ）が挙げられるがこれに限らない。適切な細菌の薬物耐性遺伝子としては、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、及びクロラムフェニコールが含まれるがこれに限らない抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。真核細胞の薬物選択マーカーとしては、ネオマイシン、ヒグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、マイコフェノール酸、ヒスチジノール、ゲンタマイシン、及びメトトレキサートなどの薬剤が挙げられる。
【０１０１】
ＤＮＡ構築物は、当業者によく知られている方法による制限消化、ライゲーション、形質転換、及びプラスミド精製といった標準の組換え分子生物学の技術によって調製することができ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ刊に記載されているようなものである。或いは、ＤＮＡ構築物は、確立されている方法、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８１年）、第２２巻、１８５９〜１８６９頁）が記載しているホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｈｅｓら（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８４年）、第３巻、８０１〜８０５頁）が記載している方法によって合成して調製することもできる。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成し、精製し、徐冷し、適切なベクターに連結し、クローン化する。ＤＮＡ構築物は、例えば、米国特許第４６８３２０２号明細書又はＳａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）、第２３９巻、４８７〜４９１頁）に記載されているように、特定のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製してもよい。ＰＣＲ法の総説は、ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９０年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ刊、米カリフォルニア州サンディエゴの中に見ることができる。
【０１０２】
ＤＮＡ構築物を調製する際、レポーターをコードしている遺伝子配列は、細胞周期相に特異的な破壊制御要素、及び適宜、空間局在化制御要素に、インフレームで連結されなければならない。次いで、得られるＤＮＡ構築物を、１以上の適切な細胞周期相に特異的な発現制御要素の制御下に置くべきである。
【０１０３】
構築物又はそのような構築物を含む発現ベクターの導入先となる宿主細胞は、その構築物を発現させることができるどんな細胞でもよく、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞、線虫細胞、魚類細胞、両生類細胞、植物細胞、及び昆虫細胞からなる群から選択することができる。
【０１０４】
調製されたＤＮＡレポーター構築物は、当業者によく知られている技術を使用して、宿主細胞に形質移入することができる。１つの手法は、化学的若しくは物理的手順を使用して、細胞を一時的に透過性にするものである。これらの技術には、電気穿孔法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６年）、第６巻、７１６〜７１８頁；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４年）、第８１巻、７１６１〜７１６５頁）、リン酸カルシウム法（例えば、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９７３年）、第５２巻、４５６〜４６７頁；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９０年）、第１０巻、６８９〜６９５頁）、又は直接微量注入法が含まれよう。
【０１０５】
或いは、カチオン脂質法による方法、例えば、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる（Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９２年）、第３巻、２６７頁；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ（１９９２年）、第６巻、２７１６頁；Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３年）、第２６１巻、２０９〜２１１頁；Ｌｅｄｌｅｙら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９８７年）、第１１０巻、１頁；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ（１９８３年）、第８０巻、１０６８頁；Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８２年）、第７２１巻、１８５〜１９０頁）。Ｊｉａｏら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９３年）、第１１巻、４９７〜５０２頁）は、遺伝子を輸送し、脳組織中で発現させるための、衝撃によって影響を与える遺伝子輸送プロトコルの使用を記載しているが、これを、宿主細胞へのＤＮＡの輸送に使用してもよい。
【０１０６】
ＤＮＡ構築物を細胞に形質移入するための別の代替法は、ウイルスが細胞に侵入する自然の力を利用する。このような方法としては、例えば、単純ヘルペスウイルス（米国特許第５２８８６４１号明細書）、サイトメガロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２年）、第１５８巻、１頁）、ワクシニアウイルス（Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６年、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ」、Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ編、米ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ刊、１１７〜１４８頁）、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２年）、第１５８巻、９７〜１２９頁）に基づくベクター及び形質移入プロトコルが挙げられる。
【０１０７】
適切な組換え宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ細胞、ベロ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｕ２ＯＳ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ  ３Ｔ３  ＭＤＣＫ、ＲＩＮ、ＨＥＫ２９３、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する他の哺乳動物細胞系が挙げられる。このような細胞系は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、米メリーランド州ベセズダから入手できる。哺乳動物から細胞を移した後、細胞を限られた期間培養してから樹立させた、一次細胞系由来の細胞も、本発明に含まれるものとする。
【０１０８】
細胞周期位置レポーターの安定な発現を示す細胞系は、標準の方法を使用して、遺伝子改変細胞の異種移植片を宿主動物中で樹立させる際に使用することもできる（Ｋｒａｓａｇａｋｉｓ，Ｋ．Ｊら、Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００１年）、第１８７巻（３）、３８６〜９１頁；Ｐａｒｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（１９９９年）、第１７巻（１０）、８１７〜２２頁）。細胞周期位置レポーターを発現させるように遺伝子改変された腫瘍細胞系の異種移植片は、モデル系の確立による、腫瘍細胞の分裂、静止、及び有糸分裂の研究、並びに新しい抗癌薬のスクリーニングを可能にする。
【０１０９】
細胞周期位置レポーターを発現させる遺伝子改変細胞系又はトランスジェニック組織を宿主動物中で同種移植片として使用すると、組織移植片の寛容性又は拒絶に影響を及ぼす機序の研究が可能になる（Ｐｙｅ  Ｄ及びＷａｔｔ，Ｄ．Ｊ．、Ｊ．Ａｎａｔ．（２００１年）、第１９８巻（第２部）、１６３〜７３頁；Ｂｒｏｄ，Ｓ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２０００年）、第６９巻（１０）、２１６２〜６頁）。
【０１１０】
細胞の細胞周期位置の決定方法を第二の態様に従って実施するためには、ＤＮＡレポーター構築物を形質移入した細胞を、レポーター分子が細胞周期の特定の段階で発現されるのに十分な条件下、かつ十分な時間をかけて培養することができる。通常、レポーター分子の発現は、形質移入後１６時間〜７２時間の間に起こるが、培養条件に応じて様々となり得る。レポーター分子が緑色蛍光タンパク質配列を主体とするものであれば、レポーターが、折り重なって蛍光性の高次構造になるのに所定の時間がかかることがある。この時間は、使用する緑色蛍光タンパク質誘導体の一次配列に応じて決まる。蛍光レポータータンパク質は、時間と共に色が変化してもよいが（例えば、Ｔｅｒｓｋｉｋｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）、第２９０巻、１５８５〜８頁を参照のこと）、その場合、形質移入してから特定の時間間隔で画像化を行う必要がある。
【０１１１】
核酸レポーター構築物が薬物耐性遺伝子を含む本発明の実施形態では、薬物耐性遺伝子を形質移入し、発現させた後（通常は１〜２日）、形質移入を受けた細胞が耐性を有する抗生物質存在下で細胞を増殖させて、選択用マーカー遺伝子によって、改変レポーター遺伝子を発現させる細胞を選択することができる。抗生物質を加える目的は、レポーター遺伝子を発現させる細胞、並びに、場合によっては、レポーター遺伝子がその関連するプロモーター、ＩＲＥＳ要素、エンハンサー、及び終止配列と共に細胞系のゲノムに組み込まれている細胞を選択することである。選択を行った後、構築物を発現させているクローンの細胞系を、標準の技術を使用して単離することができる。次いで、クローンの細胞系を標準の条件下で増殖させることができ、この細胞系が、レポーター分子を発現させ、細胞周期の特定の時点で検出可能なシグナルを発生させる。
【実施例】
【０１１２】
実施例１
安定細胞株産生の実施例
ＤＮＡ構築物の調製
ｉ）サイクリンＢ１の破壊ボックス（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｂｏｘ）及びＮＥＳをコードしている、サイクリンＢ１のＮ末端側３分の１のｍＲＮＡ（アミノ酸１〜１７１）を、標準のＰＣＲ法及び以下のプライマーを用いてＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ両端から増幅させた：
ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＧＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣＧＡＧＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣ
ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＡＴＴＣＡＣＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴ
ｉｉ）ｗｔＧＦＰの遺伝子を、融合タンパク質の構築を容易にするはずである制限部位を導入するよう設計されたプライマーで増幅させた。このＰＣＲ産物を、製造元の使用説明書に従ってｐＴＡＲＧＥＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングし、変異（Ｆ６４Ｌ／Ｓ１７５Ｇ／Ｅ２２２Ｇ）を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて導入した。自動ＤＮＡ配列決定法により構築物を確認した。次いで、この変異体ＧＦＰをコードしているＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限部位を使用してサイクリンＢ１  Ｎ末端領域の下流にクローニングした。
ｉｉｉ）サイクリンＢ１プロモーターの細胞周期依存性領域（−１５０−＞＋１８２）を、ＳａｃＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いて増幅し、サイクリンＢ１  Ｎ末端領域とＧＦＰの融合タンパク質の上流にクローニングした。
ｉｖ）このプロモーター及び組換えタンパク質をコードしているＤＮＡを切り出し、ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩで切断するｐＣＩ−Ｎｅｏ由来ベクター中のＣＭＶプロモーターの位置にクローニングした。
【０１１３】
実施例２
一時的にトランスフェクトした細胞を使用した、細胞周期相マーカー由来のＧＦＰ蛍光への細胞周期ブロッキング剤の効果
Ｕ２０Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６）を、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で培養した。ｐＣＯＲＯＮ４００４ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でサイクリンＢ１  Ｄ−ｂｏｘ、サイクリンＢ１  ＣＲＳ及びＧＦＰをコードしている配列に作動可能に連結させたサイクリンＢ１プロモーターを含む、実施例１により調製した細胞周期レポーター構築物を、トランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して細胞にトランスフェクトした。
【０１１４】
２４時間培養した後、細胞を、細胞周期特異的ブロッカーであるミモシン（Ｇ１／Ｓ移行期でブロックする）又はデメコルチン（Ｍ期でブロックする）に曝した。対照細胞は培地のみに曝した。
【０１１５】
細胞をさらに２４時間インキュベーションし、次いで自動画像解析を伴う共焦点走査イメージャ（ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して核におけるＧＦＰの発現について解析した。
【０１１６】
デメコルチンに曝した細胞では、対照細胞と比較すると蛍光が増大したが、ミモシンに曝した細胞では、対照細胞と比較すると蛍光が減少した。サイクリンＢ１のプロモーターが活性化する時期の前であるＧ１／Ｓ期で（ミモシン処理を行い）ブロックされた細胞では蛍光が減少するが、サイクリンＢ１のＤ−ボックスが作用する時期の前であるＭ期で（デメコルチン処理を行い）ブロックされた細胞では蛍光が増大する。
【０１１７】
実施例３
構築物のマイクロインジェクション
ＨｅＬａ細胞に、実施例１により調製した構築物を微量注入し、低速度撮影顕微鏡によりこれを調査した。微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像をそれに相当する蛍光画像と共に作成した。中期の細胞は核で明るい蛍光を示した。これと同一の細胞を同様にして、その後の時期である後期及び後期の後期（ｌａｔｅ  ａｎａｐｈａｓｅ）で画像を作成した。このＤＩＣ画像では、細胞が２個の娘細胞に分裂したことが示され、その相当する蛍光画像では、細胞周期が進行するにつれて、蛍光構築物の破壊に伴い蛍光が消失したことが示された。
【０１１８】
実施例４
安定細胞株の産生
Ｕ２−０Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−９６）に、実施例１に記載の構築物をトランスフェクトし、これを、その構築物を安定的に発現する細胞を選択するため１ｍｇ／ｍｌジェネテシンを含む培地中で数ヶ月間増殖させた。クローンをいくつか、標準の方法により（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、（１９９４年）Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃに記載されている）採取し、蛍光細胞を含むクローンを単離した。この細胞株を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む培地中で３７℃にて維持した。
【０１１９】
実施例５
より明るい安定細胞株の調製
実施例１に記載した、ベクター中の緑色蛍光タンパク質レポーター配列を、標準の方法により増強（ｅｎｈａｎｃｅｄ）ＧＦＰ（ＥＧＦＰ；Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ、（１９９６年）、第１７３巻、３３〜３８頁；ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で置換した。このＥＧＦＰ遺伝子は、変異Ｆ６４Ｌ及びＳ６５Ｔを含むより明るい種類のＧＦＰである。さらに、ＥＧＦＰは、哺乳類細胞中での発現を最適化するよう改変されているコドンを含む。この新たな構築物を、Ｕ２−０Ｓ細胞にトランスフェクトし、いくつかのコロニーをジェネテシンを加えて選択した後、蛍光活性化細胞選別装置（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）を使用して単一細胞を選別することにより単離を行った。このようなクローンでは、実施例４で生じるものより明るい蛍光が示され、予想の通り、蛍光の強度及び場所はその細胞の細胞周期相によって変化するようである。
【０１２０】
アッセイ及び画像取得
本発明の実施形態によると、スクリーニングアッセイを化合物からなるライブラリーを用いて行う。１種以上のマルチウェルプレートを、上記の細胞株を用いて調製する。以下の実施形態では、実施例１で上述した細胞周期レポーター構築物を含む細胞株を用いるが、本記載の細胞株の他のいかなる実施形態も、代替の実施形態において使用することができることを理解されたい。本明細書において集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と呼ぶ、制御された量の細胞群を、プレートのウェル中全てのキャリア溶液に加え、所定の期間、例えば２４時間定着させる。次いで、化合物からなるライブラリーの別の集団を制御された濃度及び量、各ウェルに加え、所定の期間、例えば２４時間定着させる。本発明の一実施形態では、撮像する前に核染色を追加して行う。本発明の別の実施形態では、撮像する前に核染色は追加されない。次いで、上記の共焦点顕微鏡を用いて、プレートの各ウェルについて順番に撮像する。各ウェルの底にある中心の狭い領域を撮像し、選択される領域の１種以上のチャネルにおける画像データを取得する。共焦点顕微鏡で検出された蛍光を１種以上のデジタル画像に変換し、この画像におけるデジタル値は、検出装置の各画素上に入射する蛍光放射線の強さに比例する。
【０１２１】
画像の処理及び解析
本発明による画像データの処理及び解析は通常、個別の段階をいくつか含む。画像データを解析して、個々の細胞に相当する画像データの領域を識別する。このような対象領域は、細胞核など個々の細胞の細胞下成分であってもよい。デジタル画像のうちの一つからバイナリマスクを作成するが、画像中で１種以上の基準を満たす値を全て１に置き換え、基準を満たさない値を全て０に置き換える。一般に、この１種以上の基準は、アッセイのセットアップ手順において取得される画像から判定される閾値を含む。値が１の隣接画素の集合を求めてマスクを検索し、個々の細胞に相当する対象領域を識別する。次いで、識別された対象領域を使用して、個々の細胞に関する測定値を作成する。この測定値に分類基準を適用し、個々の細胞を、様々な細胞周期相における細胞からなる複数の部分集団（ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のうちから選択されるものに分類する。識別された各対象領域について、同じ画像又は別の画像におけるそれに相当する画素の値を解析する。識別された対象領域に関する測定値を、画像における画素の位置及び画像中の画素の輝度から計算する。計算した測定値に分類基準を適用して、識別された各細胞を、解析された画像の部分から順に分類し、分類データをアッセイについての出力データファイルに書き込む。このようにして、ハイスループット自動化処理において、細胞集団中の複数の部分集団の相対的なサイズを示す細胞周期相データを測定することが可能となる。プレートのウェル全ての中から順に取得した１種以上の画像について、この処理をたて続けに繰り返す。
【０１２２】
第一の実施形態
使用した細胞周期相マーカーは、図１０で示すように細胞の細胞周期相によって変化する蛍光シグナルを有する。本発明の本実施形態では、異なる４つのパターンに分類することができる。
１．Ｇ０／Ｇ１／Ｓ期の細胞では、その細胞周期相マーカーが核及び細胞質の両方で相対的に低発現である。
２．Ｇ２細胞では、その細胞周期相マーカーが核で相対的に低発現であり、細胞質で相対的に高発現である。
３．Ｍ細胞では、その細胞周期相マーカーが核で相対的に高発現であり、細胞質でほとんど発現しない。
４．Ｐ細胞では、その細胞周期相マーカーが核及び細胞質で相対的に高発現である。
【０１２３】
対象領域の識別
細胞周期相マーカーとは異なる波長の蛍光を発する核マーカーを本実施形態で使用して、画像データの解析下で各細胞についての核領域を識別する。核マーカーは、インターカレーションさせる有毒な核染色（ＤＲＡＱ５（商標）又はＨｏｅｃｈｓｔ（商標）色素、例えばＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２など）のうちの一つであってもよい。別法としては、同一の細胞集団を撮像し解析して、その相対的な細胞周期部分集団を経時的研究で何度も判定するアッセイでは、毒性のない核マーカーを使用することができる。そのような毒性のないマーカーは、ＮＬＳ蛍光タンパク質融合の形態であってもよい。例えば、Ｑｌｏｎｔｅｃｈ（商標）ｐＨｃＲｅｄ１−Ｎｕｃベクターを本発明による細胞株にトランスフェクトすると、これは核中で赤色蛍光シグナルを発する。画像を取得する間に、細胞核の画像は、核マーカーに相当する第１のチャネルにおいて取得され、また細胞周期相の解析画像は、細胞周期相マーカーに相当する第２のチャネルにおいて取得されるが、この２つの画像は、各画像の画素が整列するよう共に記録される。
【０１２４】
細胞核の画像を最初に解析し、画像データ中の核領域を識別する。画像及びそれに相当する閾値画像を目で見て調査することによって、オペレータが細胞核画像において核シグナルの閾値を設定し、その閾値によって核領域の縁が正確に識別されることが保証される。領域分割（ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）アルゴリズム、例えばウォーターシェッド領域分割アルゴリズム（Ｓ．Ｂｅｕｃｈｅｒ，Ｆ．Ｍｅｙｅｒ、「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ、１：２１〜４６頁、１９９０年及びＶｉｎｃｅｎｔ，Ｓｏｉｌｌｅ、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ、１３：５８３〜５９８頁、１９９１年）を閾値画像に適用して、解析される個々の細胞全ての核領域をユニークに識別する。
【０１２５】
識別された各核対象領域から、細胞測定値が得られるはずである対象領域を定義する２種のバイナリマスクを作成する。それは、（核の中央部分で細胞周期相マーカーの輝度シグナルをサンプリングする）収縮核マスク（ｅｒｏｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｓｋ）及び（核近辺の細胞質中で細胞周期相マーカーの輝度シグナルをサンプリングする）細い細胞質リング（ｔｈｉｎ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｉｎｇ）である。核対象領域を所定の数の画素、例えば画素３個分だけ核対象物の縁から収縮させ、収縮核マスクを作成する。核に隣接した細胞質領域を示す細い細胞質リングを作成するには、核対象物をその縁から所定の数の画素、例えば画素２個分だけ膨張させる。
【０１２６】
個々の細胞に関する測定値
次いで、上記の通り個々の細胞全てについて作成した２種のマスクを細胞周期相解析の画像に適用する。
【０１２７】
収縮核マスク領域における各画素の蛍光シグナル強度を平均して、核領域全体の平均強度を示す平均核シグナル強度（Ｉｎ）を作成する。
【０１２８】
細い細胞質リングにおける各画素の蛍光シグナル強度を平均して、サンプリングする細胞質リングに含まれる平均強度を示す平均細胞質シグナル強度（Ｉｃ）を作成する。有糸分裂細胞の場合、「細胞質」発光シグナル強度は、通常、選択される細胞の細胞成分にほぼ相当する領域中で取得されるが、細胞の境界の主に外側のものになる（ので相対的に低くなる傾向がある）ことに留意されたい。
【０１２９】
次いで、測定された２つの平均強度の比をとり、核及び細胞質の平均強度の比を示す核／細胞質比
【０１３０】
【数１】
2006521785.tif 000005
【０１３１】
を作成する。
【０１３２】
細胞の分類
オペレータが細胞周期相の解析画像及び画像中で選択された対象物に関する測定値出力を調査することにより、さらに３種の閾値が設定され、自動分類処理が可能となる。オペレータが様々な細胞周期相それぞれに相当する細胞を手動で選択し、閾値を設定してこれらの相を正確に識別する。  核閾値（Ｔ
ｎ）を設定して、Ｇ０／Ｇ１／Ｓ及びＧ２期の細胞とＭ及びＰ期の細胞とを分離する。平均核シグナル強度が相対的に高い標準的なＭ及びＰ期の細胞の値と、平均核シグナル強度が相対的に低い標準的なＧ０／Ｇ１／Ｓ及びＧ２期の細胞の値とのほぼ中間値となるようこの値を選択する。
【０１３３】
細胞質閾値（Ｔｃ）を設定して、Ｇ０／Ｇ１／Ｓ期の細胞とＧ２及びＰ期の細胞とを分離する。平均細胞質シグナル強度が比較的高い標準的なＧ２及びＰ細胞の値と、平均細胞質輝度シグナルが相対的に低い標準的なＧ０／Ｇ１／Ｓ細胞の値とのほぼ中間値となるようこの値を選択する。
【０１３４】
核／細胞質輝度閾値（Ｔｎ／ｃ）を設定して、Ｍ期の細胞とＰ期の細胞とを分離する。相対的に低い標準的なＭ期の細胞についての核／細胞質比と、相対的に高い標準的なＰ細胞のものとのほぼ中間値となるようこの値を選択する。
【０１３５】
オペレータが個々の細胞対象物を選択し（例えば、画面で相当する核を示す場合はマウスをライトクリックすることにより）、このような３種の閾値を設定する。プレート中の異なるいくつかのウェルにおいてこの比較を繰り返すと、アッセイ全体にわたる諸設定の一貫性が保証される。
【０１３６】
別法としては、自動作成ヒストグラム（ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）又は各ウェル中の相当するパラメーターのスキャッタプロットに基づいて閾値を選択することができる。対照ウェル中のシグナルを測定し閾値を調節すると、各細胞周期相における細胞の期待される割合が分かるようになることに基づいた画像処理の適用によって、その閾値自体も自動的に測定することができる。別法としては、スキャッタプロット又はその他のデータ表示におけるパターンを認識することにより自動的に閾値を選択することができる。さらに別法としては、画像処理の適用を、これまでのアッセイで使用者が行った手動の選択に基づいて閾値を選択できるように適合させることができる。
【０１３７】
閾値を選択すると、アッセイで取得した全ての画像データに関する自動分類処理を行うことができる。閾値を参照して細胞相を識別するのに使用する分類基準は、本実施形態では以下の通りである：
Ｉｆ（Ｉｎ≦Ｔｎ  ＡＮＤ  Ｉｃ≦Ｔｃ）ＴＨＥＮ  ｏｂｊｅｃｔ＝Ｇ０／Ｇ１／Ｓ．
Ｉｆ（Ｉｎ≦Ｔｎ  ＡＮＤ  Ｉｃ＞Ｔｃ）ＴＨＥＮ  ｏｂｊｅｃｔ＝Ｇ２．
【０１３８】
【数２】
2006521785.tif 000006
【０１３９】
【数３】
2006521785.tif 000007
【０１４０】
データ出力
各プレートのウェル全て、又は少なくとも一部についての分類の結果は、各ウェルの識別子に対する、細胞周期のＧ０／Ｇ１／Ｓ、Ｇ２、Ｍ及びＰ期それぞれにおける集団（部分集団）の割合の形で出力される細胞周期相集団データを含むデータファイルとして出力される。さらに、又は別法として、細胞の細胞周期相が識別されると、細胞周期相データを細胞毎に出力することもできる。
【０１４１】
本実施形態を使用して得られた結果の例
図１１は、本発明によって行われたアッセイの一つで得られた結果を示す。安定的にトランスフェクトさせたＵ２ＯＳ細胞をコルヒチン（Ｍ期のブロッキング剤）又はミモシン（Ｇ０／Ｇ１／Ｓ細胞相でブロックを起こすと知られている薬剤）のどちらかで処理した。対照として非同調（ｕｎｓｙｎｃｈｒｏｎｉｓｅｄ）細胞を含む細胞を、本発明の方法を使用して分析した。蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）解析により細胞を分析すると、類似の結果が得られ、本発明の方法によって細胞周期相が確実に識別されたことが示された。
【０１４２】
第２の実施形態
本実施形態は、第１の実施形態に基づくものであり、上記の手順を使用し改変された細胞分類処理を伴う。上記の方法に基づいた追加の測定パラメーターを、各細胞について計算する。この追加のパラメーターを使用すると、その細胞分類基準は、より少ない種類の閾値に基づくものとなり得る。これには直接目で見られるという利点があり、したがってより直観的に理解でき使用しやすくなり、また定義するのに必要な分類閾値は２種だけである。
【０１４３】
本実施形態では、追加のパラメーターを以下のように定義する：
ρ＝｜１−Ｒ｜
ただし、Ｒは核／細胞質比である。このパラメーターは絶対値（絶対値）であり、その値は、平均核輝度シグナルＩｎと組み合わせて、各細胞相の違いを識別するために用いる。
【０１４４】
上記と同様に、オペレータが分類閾値を設定するが、本実施形態では設定すべき閾値は２種だけである。核閾値（Ｔｎ）を設定して、Ｇ０／Ｇ１／Ｓ及びＧ２期の細胞とＭ及びＰ期の細胞とを分離する。平均核シグナル強度が相対的に高い標準的なＭ及びＰ期の細胞の値と、平均核シグナル強度が相対的に低い標準的なＧ０／Ｇ１／Ｓ及びＧ２期の細胞の値とのほぼ中間値となるようにこの値を選択する。
【０１４５】
第２の閾値（Ｔρ）を設定して、Ｇ０／Ｇ１／Ｓ及びＰ期の細胞とＧ２及びＭ期の細胞とを分離する。パラメーターρの値が相対的に高い標準的なＧ０／Ｇ１／Ｓ及びＰ期の細胞の値と、パラメーターρの値が相対的に低い標準的なＧ２及びＭ期の細胞の値とのほぼ中間値となるようにこの値を選択する。
【０１４６】
本実施形態で使用した分類基準は、以下の通りである：
Ｉｆ（Ｉｎ≦Ｔｎ  ＡＮＤ  ｜１−Ｒ｜≦Ｔρ）ＴＨＥＮ  ｏｂｊｅｃｔ＝Ｇ０／Ｇ１／Ｓ．
Ｉｆ（Ｉｎ≦Ｔｎ  ＡＮＤ  ｜１−Ｒ｜＞Ｔρ）ＴＨＥＮ  ｏｂｊｅｃｔ＝Ｇ２．
Ｉｆ（Ｉｎ＞Ｔｎ  ＡＮＤ  ｜１−Ｒ｜≦Ｔρ）ＴＨＥＮ  ｏｂｊｅｃｔ＝Ｐ
Ｉｆ（Ｉｎ＞Ｔｎ  ＡＮＤ  ｜１−Ｒ｜＞Ｔρ）ＴＨＥＮ  ｏｂｊｅｃｔ＝Ｍ
このような分類基準の概略図を図１２に示す。
【０１４７】
第３の実施形態
本実施形態の方法は、細胞周期相マーカーのシグナルだけに基づいて、細胞周期の様々な相における細胞を自動的に分類する方法を提供するものであり、核マーカーの使用の必要性を除去する。細胞相マーカーの蛍光に相当するチャネルだけで画像を取得する。画像から閾値を判定して各細胞についてのバイナリ細胞マスクを作成する場合に、細胞領域分割アルゴリズムを適用する。オペレータが画像で標準的なＧ１Ｓ細胞を選択し、このような細胞中の平均核シグナル強度より高い閾値を設定することにより、シグナル閾値設定を使用して細胞マスク全体を作成した。
【０１４８】
次いで、細胞周期相の解析は、細胞周期の相それぞれに特異的な、強度、シグナルテクスチャ、サイズ及び形状の各パラメーターの組合せに基づくものである。以下にさらに詳細に記載する通りに、様々な細胞周期相である各細胞を相当する分類閾値を設定することによって識別する。
【０１４９】
本実施形態において、画像処理及び画像解析ソフトウェアの適用により計算された代表的な測定パラメーターは以下のものを含む：Ｉは細胞内の平均シグナル強度；Ｆは細胞内の平均シグナルから１０％超外れる画素の割合；Ｈは対象物内の穴面積（閾値以下の輝度を有する画素の集合）を示す不均質性；Ａは細胞輪郭（に最も適合する楕円）の主軸と短軸の比を示す外観；Ｒは細胞の全幅を示す半径；Ｌは細胞の平均幅を示す長さ；Ｃは塊状度（シグナルテクスチャ）；Ｍは辺縁度である。
【０１５０】
各パラメーターの特異的な組合せ及びそれらと細胞型に基づいてアッセイ毎に設定される閾値との関係を、自動細胞分類処理で識別される各細胞相に対する分類基準として使用する。好適に識別される相には、Ｇ０／Ｇ１／Ｓ、Ｇ２、Ｍ及びＰ期の細胞がある。さらに、本実施形態では、有糸分裂細胞をＭＰ（中期）細胞、Ａ（後期）細胞、Ｔ（終期）細胞及びＣ（細胞質分裂）細胞に分類することができる。このような細胞周期相における蛍光レポーターのシグナル強度及び分布の概略図を図１３に示す。本実施形態では、初期（ｅａｒｌｙ）のＧ１期の細胞も識別することができる。
【０１５１】
本実施形態で使用される一連の分類基準の例は、以下の通りである：
初期のＧ１＝Ｉ＜１００、Ａ＞１．５、Ｈ＜＝２０、０＜Ｆ＜０．１
Ｇ１＝Ｉ＜１００、Ｈ＞２０、Ｆ＜０．１
Ｇ２＝Ｉ＜４０、Ｉ＜１００、Ｆ＞０．１、Ｈ＞＝０、Ｒ＞４０
Ｐ＝Ｉ＞１００、Ｈ＜１０、Ｌ＞４５
ＭＰ＝Ｉ＞１００、Ａ＜１．５、Ｒ＜４０、Ｌ＜＝４５、Ｆ＞０．５
Ａ＝Ｉ＜１００、Ａ＜１．５、Ｒ＜４０、Ｌ＜＝５５、Ｆ＝０、Ｔ＞０
Ｔ＝Ｉ＜１００、Ａ＞１．５、Ｌ＞５５、Ｈ＝０、Ｆ＝０
Ｃ＝Ｉ＜＝１００、Ａ＜１．５、Ｒ＜７０、Ｈ＜＝２０、Ｆ＜０．２、Ｔ＝０
式中で、太字で示した閾値は、各アッセイについてオペレータによってリセットされ、イタリック体で示した閾値は、サイズ／細胞形状に依存しており、別の細胞型を使用する場合に限りリセットされる。
【０１５２】
辺縁度パラメーターＭは、上記の一連の分類基準の例で使用されていないが、代替の例では使用されることがあることに留意されたい。
【０１５３】
上記実施形態は本発明の例示的なものとして理解されるはずである。本発明のさらなる実施形態が予想される。本明細書で使用される「発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）」という用語は、蛍光並びに化学発光及びリン光などその他の種類の発光現象を含むよう意図されていることに留意されたい。本発明の代替の様々な実施形態において、レポーター分子の発現をモニターし、レポーターにより放たれる発光シグナルを適切な検出装置を使用して検出することによって、細胞の細胞周期位置を決定することができる。レポーター分子が蛍光シグナルを発する場合は、従来の蛍光顕微鏡又は共焦点型蛍光顕微鏡のどちらを使用してもよい。レポーター分子が発光している場合は、ルミノメーターなどの適切な装置を使用してもよい。こうした手法を用いると、レポーター分子を発現する細胞の割合を測定することができる。ＤＮＡ構築物が転座制御エレメントを含み、顕微鏡を使用して細胞を調べる場合は、レポーターの位置も決定することができる。本発明による方法で、ＤＮＡ構築物で形質転換又はトランスフェクトした細胞の蛍光を光学的方法により適切に測定することができる；例えば、分光光度計、蛍光計、蛍光顕微鏡、冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャ（走査イメージャや領域イメージャなど）、蛍光活性化細胞選別装置、共焦点顕微鏡又は走査共焦点装置などである。こうした場合、培養細胞のスペクトル特性を、光の励起及び放射の走査として測定することができる。
【０１５４】
上記実施形態では、初期設定された分類基準を使用して、選択した細胞を様々な細胞周期相の細胞からなる複数の部分集団のうちから選択されるものに分類するという処理方法を使用するが、神経回路網を使用するなど他の分類方法を実施してもよい。
【０１５５】
いずれかの実施形態に関して記載したいかなる特徴も、単独で、又は記載した他の特徴と組み合わせて使用することができ、また他のいかなる実施形態の１種以上の特徴と組み合わせても、或いは他のいかなる実施形態のいかなる組合せでも使用することができることを理解されたい。さらに、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、上述していない均等物及び変更形態も使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】本発明によるサンプルの画像化に使用するライン走査共焦点顕微鏡の第一の実施形態を示す略図である。
【図２ａ】それぞれ、走査ミラーなしの本発明の多色実施形態の光線経路を示す上面図及び側面図である。
【図２ｂ】それぞれ、走査ミラーなしの本発明の多色実施形態の光線経路を示す上面図及び側面図である。
【図２ｃ】単一ビームオートフォーカスの光線経路を示す上面図である。
【図３ａ】それぞれ、走査ミラー付きの本発明の多色実施形態の光線経路を示す上面図及び側面図である。
【図３ｂ】それぞれ、走査ミラー付きの本発明の多色実施形態の光線経路を示す上面図及び側面図である。
【図３ｃ】単一ビームオートフォーカスの光線経路を示す上面図である。
【図４】２ビームオートフォーカスシステムを示す側面図である。
【図５ａ】長方形ＣＣＤカメラ及び読出し記録器を示す図である。
【図５ｂ】長方形ＣＣＤカメラ及び読出し記録器を示す図である。
【図５ｃ】長方形ＣＣＤカメラ及び読出し記録器を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に従って配置した画像化データ処理システム中のデータ処理構成要素を示す略図である。
【図７】本発明の実施形態で使用する核酸細胞周期位置レポーター構築物を示す略図である。
【図８】細胞周期のＧ２／Ｍ期を決定するためのＤＮＡ構築物を示す図である。
【図９】細胞周期が進行する際のサイクリンＢ１による調節を示す略図である。細胞周期は、Ｓ期の終わりに発現を開始し、Ｇ２（Ａ）の間に最高点に達する細胞周期相に特異的なプロモーターによって転写が開始されるサイクリンＢ１の発現と共に、矢印の方向に進行する。有糸分裂の開始時（Ｂ）に、サイクリンＢ１は、細胞質から核へと位置を変え、中期以後（Ｃ）、このタンパク質は特異的に分解する。
【図１０】Ｇ０／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及び分裂（Ｍ）の各細胞周期相における、本発明の実施形態による蛍光レポーターを含む細胞での典型的なシグナル強度及び分布を示す略図である。
【図１１】同時性をもたない細胞集団、コルヒチン処理細胞集団、及びミモシン処理細胞集団のそれぞれで本発明による自動分析を使用して決定した、Ｇ０／Ｇ１／Ｓ、Ｇ２、前期、及び分裂期の各細胞周期相における、細胞亜集団の相対的なサイズを示す１揃いの円グラフである。
【図１２】本発明の第三実施形態における、閾値セットを基準とした、異なる細胞周期相の位置を示すグラフである。
【図１３】分裂期、後期、終期、及び細胞質分裂の核細胞終期層における、本発明の実施形態による蛍光レポーターを含む細胞での典型的なシグナル強度及び分布を示す略図である。
【符号の説明】
【０１５７】
１００  電磁気放射供給源  ランプ
１１０  レーザー
１１０  電磁気放射供給源
１２０  円柱レンズ
１３０  第一のスリットマスク
１３２  スリット開口部  照明開口部
１４０  第一のリレーレンズ
１５０  ダイクロイックミラー  ダイクロイックビームスプリッタ
１６０  対物レンズ後部焦点平面（ＢＦＰ）
１７０  対物レンズ
１８０  マイクロタイタープレート
１８２  サンプルウェル
１８４  ライン  照明ストライプ
１９０  チューブレンズ
２００  フィルタ
２１０  第二のスリットマスク
２１２  スリット開口部  検出開口部
２２０  検出器
４００  共焦点顕微鏡
４０１  制御ユニット
４０２  像データ記憶装置
４０４  入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置
４０５  関連コンピュータ端末
４０８  中央処理装置（ＣＰＵ）
４１０  メモリ
４１２  ハードディスクドライブ
４１４  オペレーティングシステムプログラム
４１６  画像処理及び分析アプリケーション
４１８  圧制制御アプリケーション
４２０  プログラムファイル及びデータ
４２２  データベース
４２８  スクリーン
４３０  スクリーンＩ／Ｏ装置
４３２  ディスプレイ要素
【図７】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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