(57)【要約】本発明は、野生型ｐ５３が本明細書に定義する不活性状態で存在する医学的組成、特に悪性黒色腫、及び望ましくない血管新生が関与する状態の治療に用いる薬剤組成物を調製するための、野生型ｐ５３を不活性非機能性構造から活性構造に転換することのできる１−アザビシクロ［２．２．２］オクタンの使用に関する。本発明はさらに、不活性野生型ｐ５３がモニター又は検出される、上述の能力に関してｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで化合物を試験する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性黒色腫及び／又は望ましくない血管新生が関与する病的状態の治療に用いる薬剤を調製するための、野生型ｐ５３を、Ｐａｂ２４０に反応性であるが、Ｐａｂ１６２０に反応性でない不活性構造から、アポトーシスを誘導することのできる活性構造に転換することのできる化合物の使用であって、化合物が式Ｉ：
【化１】
2006521375.tif 000005
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＣＨ２−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＲ５、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲ５から選択されるか、或いは
Ｒ１及びＲ２は、合わせて＝ＣＨ２であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ５、及び−Ｏ−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５から選択されるか、或いはＲ３及びＲ４は、合わせて＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨ、又はＮＲ５であり、
Ｒ５は、Ｈ、置換又は非置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０アルキニル、置換又は非置換のＣ３からＣ１２のシクロアルキル、置換又は非置換のベンジル基、置換又は非置換のアリール、或いは１つ又は複数のヘテロ原子を有する単環、二環、又は三環式の非置換又は置換の芳香族複素環及び非芳香族複素環から選択される同一であるか又は異なる基を表し（置換された基の置換基は、Ｃ１からＣ１０アルキル、Ｃ２からＣ１０アルケニル、Ｃ２からＣ１０アルキニル、ハロゲン、置換又は非置換アリール、置換又は非置換芳香族複素環化合物、非芳香族複素環、Ｃ１からＣ１０アルキルオキシ、Ｃ１からＣ１０アルキルアミノ、Ｃ２からＣ１０アルケニルアミノ、Ｃ２からＣ１０アルキニルアミノ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６、及びＣＯＯＲ６から選択される）、
Ｒ６は、Ｈ、非置換又は置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０アルケニル又はアルキニル、ベンジル、アリール、１つ又は複数のヘテロ原子を有する非置換又は置換芳香族複素環、及び非芳香族複素環から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、合わせて架橋ＣＨ２−ＣＨ２部分を形成するか、或いはＲ７及びＲ８は、共に水素である化合物、或いは薬剤として許容されるその塩又はプロドラッグから選択される］
の構造を有する化合物の使用。
【請求項２】
前記化合物が、次の式（ＩＩ）：
【化２】
2006521375.tif 000006
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ヒドロキシメチル、又はアミン置換フェニル基の窒素原子、プリン、８−アザプリン、若しくはベンズイミダゾール残基の環構造に含有される窒素原子に結合したメチレン基から独立して選択されるか、或いはＲ１及びＲ２は、合わせて二重結合メチレン基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素、ヒドロキシル、及びベンゾイルオキシから独立して選択されるか、又はＲ３及びＲ４は、合わせて二重結合である酸素原子を表すことができ、但し、Ｒ３及びＲ４のいずれかがベンゾイルオキシ基であるとき、Ｒ１及びＲ２は、共に水素である化合物である］
を有する化合物から選択されるか或いは薬剤として許容されるそれらの塩又はプロドラッグである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物が、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン、９−（アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン）−６−クロロ−９Ｈ−プリン、２−（ヒドロキシメチル）キヌクリジン−３，３−ジオール、２−（アデニン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−メチレン−３−キヌクリジノン、２−（２−アミノ−３−クロロ−５−トリフルオロメチル−１−メチルアニリン）−３−キヌクリジノン、２−（６−トリフルオロメチル−４−クロロベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（６−メトキシプリン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イルベンゾアート、２−（５，６−ジメチル−ベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−７−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（７−メチレン−１，３−ジメチル尿酸）−３−キヌクリジノン、又は２−（２，６−ジクロロ−９−メチレンプリン）−３−キヌクリジノン、或いは薬剤として許容されるそれらの塩から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤として許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と合わせた、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
悪性黒色腫を治療し、且つ／又は望ましくない血管新生を阻害する方法であって、式Ｉ：
【化３】
2006521375.tif 000007
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＣＨ２−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＲ５、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲ５から選択されるか、或いはＲ１及びＲ２は、合わせて＝ＣＨ２であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ５、及び−Ｏ−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５から選択されるか、或いはＲ３及びＲ４は、合わせて＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨ、又はＮＲ５であり、
Ｒ５は、Ｈ、置換又は非置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０のアルキニル、置換又は非置換のＣ３からＣ１２のシクロアルキル、置換又は非置換のベンジル基、置換又は非置換のアリール、或いは１つ又は複数のヘテロ原子を有する単環、二環、又は三環式の非置換又は置換の芳香族複素環及び非芳香族複素環から選択された同一であるか又は異なる基を表し（置換された基の置換基は、Ｃ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０のアルキニル、ハロゲン、置換又は非置換アリール、置換又は非置換芳香族複素環化合物、非芳香族複素環、Ｃ１からＣ１０のアルキルオキシ、Ｃ１からＣ１０のアルキルアミノ、Ｃ２からＣ１０のアルケニルアミノ、Ｃ２からＣ１０のアルキニルアミノ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６、及びＣＯＯＲ６から選択される）、
Ｒ６は、Ｈ、非置換又は置換のＣ１からＣ１０アルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル又はアルキニル、ベンジル、アリール、１つ又は複数のヘテロ原子を有する非置換又は置換芳香族複素環、及び非芳香族複素環から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、合わせて架橋ＣＨ２−ＣＨ２部分を形成するか、或いはＲ７及びＲ８は、共に水素である］
の構造を有する化合物から選択される化合物或いは薬剤として許容されるその塩又はプロドラッグの薬剤として有効な量を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項６】
野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換する能力に関して化合物を試験する方法であって、
Ａ．不活性野生型ｐ５３構造が存在する、野生型ｐ５３を有する細胞を提供するステップ、
Ｂ．細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験物質に暴露するステップ、及び
Ｃ．細胞不活性野生型ｐ５３構造を測定するステップ
を含む方法。
【請求項７】
ステップＣに代え、ステップＢにおける（機能性ｐ５３を有する）細胞に対する試験物質の影響を、ｐ５３を含まないか、又は非機能性ｐ５３を含む細胞又は組織に対する影響と比較するステップを含む、代替ステップＣ’を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
インテグリンαｖβ３が細胞に存在する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
不活性構造の野生型ｐ５３を検出するためにＰａｂ２４０を用いる、請求項６から８までに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物が試験される請求項６から９までのいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップＢで前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで動物において試験物質に暴露され、前記動物がその後屠殺される、請求項６から１０までのいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型ｐ５３が本明細書に定義する不活性状態で存在する医学的症状、特に悪性黒色腫の治療に用いる薬剤組成物を調製するための、野生型ｐ５３を不活性非機能性構造から活性構造に転換することのできるある種の化合物の使用に関する。本発明はまた、不活性野生型ｐ５３のレベルをモニターする、上述の能力に関する化合物の試験方法に関する。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で行うことができる。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３は、ヒトのほとんどの腫瘍で突然変異しているが、野生型（ｗｔ）ｐ５３は、悪性黒色腫において顕性である（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：４９〜５３（１９９１）、Ｓｐａｒｒｏｗ等、Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．１９９５．５：９３〜１００（１９９５）、及びＨａｒｔｍａｎｎ等、Ｉｎｔ  Ｊ  ｃａｎｃｅｒ、６７：３１３〜３１７（１９９６））。Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５９：２７２４〜２７３０（１９９９）は、Ｍａｂ  ＬＭ６０９、αｖβ３インテグリンに対する機能阻害モノクローナル抗体が、腫瘍アポトーシスを誘導することにより、Ｍ２１黒色腫の増殖を遮断することを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
悪性黒色腫は典型的に、化学薬剤又は放射能によるアポトーシス誘導に治療抵抗性である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は、悪性黒色腫細胞においてアポトーシスを誘導することのできるある種の化合物であって、式（Ｉ）の構造を有するものとして請求項１に定義される化合物、並びに薬剤として許容される式（Ｉ）の化合物の塩又はプロドラッグを見出した：
【化１】
2006521375.tif 000002
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＣＨ２−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＲ５、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲ５から選択されるか、或いは
Ｒ１及びＲ２は、合わせて＝ＣＨ２であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ５、及び−Ｏ−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５から選択されるか、或いは
Ｒ３及びＲ４は、合わせて＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨ、又はＮＲ５であり、
Ｒ５は、Ｈ、置換又は非置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０のアルキニル、置換又は非置換のＣ３からＣ１２のシクロアルキル、置換又は非置換のベンジル基、置換又は非置換のアリール、或いは１つ又は複数のヘテロ原子を有する単環、二環、又は三環式の非置換又は置換の芳香族複素環、及び非芳香族複素環から選択される同一であるか又は異なる基を表し（これらの置換された基の置換基は、Ｃ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０のアルキニル、ハロゲン、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換の芳香族複素環化合物、非芳香族複素環、Ｃ１からＣ１０のアルキルオキシ、Ｃ１からＣ１０のアルキルアミノ、Ｃ２からＣ１０のアルケニルアミノ、Ｃ２からＣ１０のアルキニルアミノ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６、及びＣＯＯＲ６から選択される）、
Ｒ６は、Ｈ、非置換又は置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル又はアルキニル、ベンジル、アリール、１つ又は複数のヘテロ原子を有する非置換又は置換の芳香族複素環、及び非芳香族複素環から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、合わせて架橋ＣＨ２−ＣＨ２部分を形成するか、或いは
Ｒ７及びＲ８は、共に水素である］。
【０００５】
環式の場合、アルキル基は、好ましくはＣ５からＣ１０であり、もっとも好ましくはＣ５からＣ７である。非環式の場合、アルキル基は、好ましくはＣ１からＣ６、より好ましくはメチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピル、イソプロピル）、ブチル（分枝又は非分枝）、又はペンチルであり、もっとも好ましくはメチルである。
【０００６】
本明細書では、「アリール」という用語は、フェニル、又はナフチル、或いは好ましくはＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含有する単環、二環、又は三環式芳香族複素環、例えばピリジル、ピロリル、キノリニル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、インドリル、ピラジニル、インダゾリル、ピリミジニル、チオフェネチル、ピラニル、カルバゾリル、アクリジニル、キノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、アザプリニル、シンノリニル、プテリジニルなどの芳香族基を意味する。
【０００７】
本明細書では、「官能基」という用語は、非保護基の場合、ヒドロキシ−、チオロ−、アミノ官能基、カルボン酸を意味し、保護基の場合、低級アルコキシ、Ｎ−、Ｏ−、Ｓ−、アセチル、カルボン酸エステルを意味する。
【０００８】
本明細書では、「ヘテロアリール」という用語は、好ましくはＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含有する芳香族基、例えばピリジル、ピロリル、キノリニル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、イミダゾリル、ピリミジニル、インドリル、ピラジニル、又はインダゾリルなどを意味する。
【０００９】
本明細書では、「非芳香族複素環」という用語は、好ましくはＮ、Ｏ、及びＳから選択される１つ又は複数のヘテロ原子を含有する非芳香族環基、例えばピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニルなどの環式アミノ基、又はテトラヒドロフラニルなどの環状エーテル、単糖などを意味する。
【００１０】
本明細書では、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を意味し、一般に塩素が好ましい。
【００１１】
本明細書では、他に別段の指定のないかぎり、「置換」という用語は、対象となる基が、ヒドロキシル、アミン、スルフィド、シリル、カルボン酸、ハロゲン、アリールなどの官能基で置換されていることを意味する。
【００１２】
本発明の化合物の好ましい基は、式ＩＩによって表される基である：
【化２】
2006521375.tif 000003
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ヒドロキシメチル、或いはアミン置換フェニル基の窒素原子、又はプリン、８−アザプリン、若しくはベンズイミダゾール残基の環構造に含有される窒素原子に結合したメチレン基から独立して選択されるか、或いはＲ１及びＲ２は、合わせて二重結合メチレン基を表すことができ、
Ｒ３及びＲ４は、水素、ヒドロキシル、及びベンゾイルオキシから独立して選択されるか、又はＲ３及びＲ４は、合わせて二重結合である酸素原子を表すことができ、但し、Ｒ３及びＲ４のいずれかがベンゾイルオキシ基であるとき、Ｒ１及びＲ２は、共に水素である］。
【００１３】
上記の式ＩＩの化合物において、Ｒ１のフェニル基又は窒素含有環構造、並びにＲ３及びＲ４のいずれかのベンゾイルオキシ基は、場合によって、例えばハロゲン、メチル、メトキシ、アミノ、及び／又は１〜３個のハロゲン原子を含有するはハロメチルで置換することができる。
【００１４】
本発明の化合物は、遊離形態、例えば両性形態、或いは塩、例えば酸付加塩又はアニオン塩の形態であることができる。遊離形態の化合物は、当分野で知られている方法で塩形態に転換することができ、その逆も同様である。
【００１５】
本発明の化合物はさらに、血管新生中に血管新生血管細胞においてアポトーシスを誘導することができ、それによって血管新生血管の退化を誘導し、種々のヒト腫瘍の増殖及び転移；例えば糖尿病性網膜症又は黄斑変性に起因する成人性失明；乾癬；例えば関節リウマチなどの慢性炎症状態；血管腫；並びに肥満症を含む血管形成及び／又は血管細胞生存に依存する種々の疾患状態を遮断することができると考えられる。
【００１６】
一態様において、本発明は、悪性黒色腫を治療し、且つ／又は望ましくない血管新生を阻害する方法であって、薬剤として有効な量の式Ｉの構造を有する化合物から選択される化合物を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明者等はさらに、腫瘍細胞において、これまで知られていない非常に予想外の不活性構造状態の野生型ｐ５３タンパク質を見出した。この不活性野生型ｐ５３構造が、悪性黒色腫細胞において見出された。さらに重要なことには、この不活性野生型ｐ５３構造は、アポトーシスを誘導可能な機能性活性構造に復帰することができる。これらの知見に基づいて、本発明は、他の態様において、不活性野生型ｐ５３構造を活性野生型ｐ５３構造に転換する能力に関して物質を試験することによって、悪性黒色腫を治療するのに適した物質を見出す方法を提供する。この方法は請求項６に定義する。この不活性野生型ｐ５３構造はまた、血管新生中に血管新生血管細胞に存在すると考えられているので、それらの物質はまた、血管新生が関与することが知られている病的状態において血管新生を阻害するのに有用であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
ｐ５３はヒトのほとんどの腫瘍で突然変異しているが、不可解なことに悪性黒色腫ではｐ５３突然変異の頻度は希少である。しかしながら、悪性黒色腫は、インテグリンαｖβ３を高レベルで発現し、このインテグリンは、黒色腫細胞の生存を促進し（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等、ＰＮＡＳ  ９１：８８５６〜８８６０（１９９４）、Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ等、１９９９、Ｈｓｕ等、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１４３５〜１４４２（１９９８））、内皮細胞においてｐ５３の活性を抑制する（Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：４２６〜４３３（１９９６）、Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３３７１〜１３３７４（２００２））。本発明者等はここに、インテグリンαｖβ３が、これまで知られていなかった不活性アンフォールド野生型ｐ５３構造の誘導により黒色腫野生型ｐ５３の活性を抑制することを提唱する。腫瘍細胞において、当該インテグリンαｖβ３調節性のｐ５３活性は、黒色腫細胞生存及び腫瘍増殖を支配することが認められている。ドミナントネガティブｐ５３（Ｈｉｓ１７５）並びにｐ５３ｓｉＲＮＡは、インテグリンαｖβ３を欠損している黒色腫細胞の細胞生存及び腫瘍増殖を回復させることが見出され、これはｐ５３のインテグリン介在性不活性化が、黒色腫細胞生存を制御することを示唆する。ＰＲＩＭＡ−１とも称され、ＷＯ０２２４６９２により突然変異ｐ５３構造を活性状態に復帰させる能力を有することがすでに知られている、化合物２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オンは、意外なことに黒色腫細胞において野生型ｐ５３の活性構造を回復させ、アポトーシスを誘導し、野生型ｐ５３に依存する方式で黒色腫腫瘍増殖を遮断した。これらの結果は、悪性黒色腫においてｐ５３突然変異が必要でないことを説明し、黒色腫治療の新規な原理を提示する可能性がある。
【００１９】
Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ，Ｓ．等（その全体を参照により本明細書の一部とする）は、上記で引用したＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：４２６〜４３３（１９９６）において、増殖内皮細胞がインテグリンαｖβ３のアンタゴニストに応答してアポトーシスとなり、血管新生血管の退行をもたらし、それによって種々のヒト腫瘍の増殖を遮断すること、及びインテグリンαｖβ３の遮断が、ｐ５３の活性化を引き起こすことを報告した。
【００２０】
上述の文献に報告された知見、及び本出願に開示された知見に基づいて、本発明者等は、本発明の化合物が血管新生中に増殖内皮細胞においてアポトーシスを誘導することができ、それによって血管新生血管の退行を誘導し、種々のヒト腫瘍の増殖及び転移、例えば糖尿病性網膜症又は黄斑変性に起因する成人性失明、乾癬、例えば関節リウマチなどの慢性炎症状態、血管腫、並びに肥満症を含む血管形成及び／又は血管細胞生存に依存する種々の疾患状態を遮断することができると考える。したがって、本明細書に開示の不活性野生型ｐ５３構造は、血管新生中の増殖内皮細胞にも存在すると考えられる。
【００２１】
黒色腫において、野生型ｐ５３の不活性構造はインテグリンαｖβ３によって誘導されると考えられるが、他の組織において類似した任意の不活性野生型ｐ５３状態を誘導する基礎的な機序は異なる可能性がある。しかしながら、本化合物の作用の実際の機序は完全には理解されていないため、この化合物はさらに、不活性野生型ｐ５３が存在する他の病的状態を治療するのに有用である可能性があると考えられる。
【００２２】
不活性野生型ｐ５３が存在する他の病的状態の治療に有用な物質は、本発明の一般的な方法によって見出すことができる。
【００２３】
本明細書では、「不活性野生型ｐ５３構造」という用語は、「不活性アンフォールド野生型ｐ５３構造」という用語と同じ意味で用いられ、モノクローナル抗体Ｐａｂ２４０と反応するが、モノクローナル抗体Ｐａｂ１２６０と反応しない野生型ｐ５３の構造を表す。さらに、この不活性構造はまた、ＰＲＩＭＡ−１と称される上述の化合物を用いて活性野生型ｐ５３構造に転換される能力を有する。不活性野生型ｐ５３構造はさらに、ＤＮＡに結合することができず、アポトーシスを媒介することができないことを特徴とする。
【００２４】
Ｐａｂ２４０はこれまで、非変性条件下で突然変異ｐ５３と反応性であり、変性条件下では突然変異ｐ５３と野生型ｐ５３とに同様に反応性であることのみが知られていた。しかしながら、本発明者等はここに、Ｐａｂ２４０はさらに、非変性条件下で、本明細書に定義する野生型ｐ５３の不活性状態にも反応することを見出した。
【００２５】
インテグリンαｖβ３は、皮膚黒色腫の進行に重要な役割を果たし、より温和な放射増殖期病変（ｒａｄｉｃａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ）に比べて、垂直増殖期黒色腫病変（ｖｅｒｔｉｃａｌｌｙ  ｇｒｏｕｔｈ  ｐｈａｓｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｌｅｓｉｏｎｓ）において発現増加を示す（Ａｌｂｅｄａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：６７５７〜６７６４（１９９０））。実験モデルにおいて、インテグリンαｖβ３の発現は、黒色腫細胞生存、腫瘍増殖、及び放射増殖期から垂直増殖期への変換を促進し、一方インテグリンαｖβ３の遮断は、アポトーシスを誘導することによって腫瘍増殖を阻害した（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８９：２０１８〜２２（１９９２）、Ｐｅｔｉｔｃｌｅｒｃ等、１９９９、Ｈｓｕ等、１９９８）。これはインテグリンαｖβ３が機能的に黒色腫細胞生存を調節することを含意する。実際、インテグリンαｖβ３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの３次元環境において、黒色腫細胞生存を促進することも認められている（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等、１９９４）。しかしながら、インテグリンαｖβ３がどのように黒色腫細胞生存を制御し得るのかは依然として明らかでない。
【００２６】
腫瘍サプレッサータンパク質ｐ５３は、種々のストレスに応答してアポトーシス細胞死を機能的に誘導する（Ｏｒｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．５：２２１〜２２７（１９９４）、Ｋｏ及びＰｒｉｖｅｓ、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：１０５４〜１０７２（１９９６）、Ｌｅｖｉｎｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：３２３〜３３１（１９９７））。活性化ｐ５３は、２つの経路でアポトーシスを誘発し得る（Ｖｏｕｓｄｅｎ、Ｃｅｌｌ  １０３：６９１〜６９４（２０００））。それら経路の一方は、死受容体及びカスパーゼ８の活性化に関連し（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ及びＤｉｘｉｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０５〜８（１９９８））、他方のアポトーシス経路は、ミトコンドリアシトクロムｃの放出、それに続くＡｐａｆ１及びカスパーゼ９の活性化によって媒介される（Ｇｒｅｅｎ及びＲｅｅｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９〜１２（１９９８））。さらに、ｐ５３は特定のＤＮＡ結合タンパク質として作用し、転写活性ｂａｘ（Ｍｉｙａｓｈｉｔａ等、Ｃｅｌｌ  ８０：２９３（１９９５））、ＰＩＧ３（ｐ５３誘導遺伝子３、Ｖｅｎｏｔ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：４６６８〜７９（１９９８））、ＰＵＭＡ（ｐ５３アップレギュレートアポトーシス調節因子、Ｎａｋａｎｏ及びＶｏｕｓｄｅｎ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．７：６８３〜６９４（２００１））、及びＡｐａｆ−１（アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１、Ｖｏｕｓｄｅｎ及びＬｕ、２００２）、並びに転写抑制ｂｃｌ−２（Ｚｈａｎ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：３７４３〜５１（１９９４））を含む種々の遺伝子の発現を活性化又は抑制する。これらの下流標的は、ある種のｐ５３媒介アポトーシス過程に機能的に関与する。
【００２７】
近年、ミトコンドリア膜上で直接作用するｐ５３誘導アポトーシスの新しい機序が、Ｍｉｈａｒａ，Ａ．等によって、「ｐ５３はミトコンドリアで直接的アポトーシス作用を有する（ｐ５３  ｈａｓ  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｐｏｐｔｏｇｅｎｉｃ  ｒｏｌｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、２００３年１月２７日刊、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌにおいて報告された。その文献によれば、ｐ５３は、迅速にミトコンドリアに移行することにより、効果的にｊｕｍｐ  ｓｔａｒｔし、アポトーシスに対する開始の遅い転写依存性効果を増幅する。
【００２８】
さらに、インテグリンαｖβ３のアンタゴニストは、増殖性内皮細胞のアポトーシスを誘導し、これはｐ５３の活性化に関連する（Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ等、１９９６、Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ等、２００２）。ｐ５３は、ほとんどのヒト腫瘍で突然変異しているが、野生型ｐ５３は、悪性黒色腫において顕性である（Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ等、１９９１、Ｓｐａｒｒｏｗ等、１９９５、Ｈａｒｔｍａｎｎ等、１９９６）。さらに、悪性黒色腫は典型的に、化学薬剤又は放射能によるアポトーシス誘導に治療抵抗性である。
【００２９】
実験
インテグリンαｖβ３に媒介されるｐ５３の調節が、黒色腫細胞生存を調節することを実証するために、後で詳しく説明する次の実験を行った。まず、インテグリンαｖβ３を発現するＭ２１ヒト黒色腫細胞、及びインテグリンαｖβ３を欠損しているＭ２１Ｌ亜集団を、病態生理的皮膚環境を模倣する３次元コラーゲンで分析した。インテグリンαｖβ３は、不活性野生型ｐ５３構造を誘導することにより、ｐ５３活性を阻害することが見出された。さらに、ドミナントネガティブｐ５３変異体（Ｈｉｓ１７５）又はｐ５３ｓｉＲＮＡの過剰発現は、Ｍ２１Ｌ（αｖβ３−）細胞生存及び腫瘍増殖を回復させ、これはｐ５３が黒色腫細胞生存を促進するインテグリンαｖβ３の主要な標的であることを示唆する。重要なことに、ＰＲＩＭＡ−１は、Ｍ２１細胞において野生型ｐ５３の活性構造を回復させることができ、それによって黒色腫細胞アポトーシスを誘導し、黒色腫腫瘍増殖を抑制する。これらの結果は、野生型ｐ５３の再活性化による黒色腫の治療に関する新規な原理を明らかにする。
【００３０】
インテグリンαｖβ３は黒色腫細胞の生存を促進する
図１Ａに関連して、インテグリンαｖβ３を発現する母親ヒト黒色腫細胞Ｍ２１、及びインテグリンαｖβ３を欠損しているＭ２１Ｌを、３次元コラーゲンゲル（３Ｄコラーゲン）で培養した。指示された時間に、ＦＩＴＣアネキシンＶ染色によってアポトーシスを検出した。ＦＡＣＳ分析は、αｖβ３を欠損するＭ２１Ｌ細胞が、Ｍ２１細胞（αｖβ３＋）に比べてはるかに高い割合でアポトーシスとなることを示し、インテグリンαｖβ３の発現が黒色腫細胞の生存に重要であることを示唆した。
【００３１】
インテグリンαｖβ３を欠損している母親ヒト黒色腫細胞Ｍ０；Ｍ０−２ｂａＶ、インテグリンαＶサブユニットの細胞質尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）を伴うインテグリンＩＩｂサブユニットの細胞外ドメインのキメラ（ｃｈｉｍｅｒ）を過剰発現するＭ０細胞；及び高レベルのインテグリンαＶサブユニットを発現するＭ０−αＶ細胞を、３Ｄコラーゲンで培養した。指示された時間に、ＦＩＴＣアネキシンＶ染色によってアポトーシスを試験した。図１Ｂに示したとおり、Ｍ０αＶ細胞（αｖβ３発現）は充分に生存するが、Ｍ０及びＭ０２ｂａＶ細胞はすべての時点で高い割合でアポトーシスとなることが、ＦＡＣＳ分析によって示された。これはインテグリンαＶサブユニット細胞外リガンド結合部が、黒色腫細胞の生存に重要であることを示している。
【００３２】
インテグリンαｖβ３及びインテグリンβ３サブユニットの細胞表面発現を、それぞれ抗αｖβ３ＭａｂＬＭ６０９及び抗β３ＭａｂＡＰ３で染色したヒト黒色腫細胞系Ｍ２１、Ｍ２１Ｌ、Ｍ０、Ｍ０−αＶ、及びＭ０−２ｂａＶにおいて分析した。図１Ｃに示すように、ＦＡＣＳ分析は、αｖβ３及びβ３サブユニットは共にすべてのＭ２１及びＭ０αＶ細胞で発現するが、Ｍ２１Ｌ及びＭ０細胞ではめったに発現しないことを示した。インテグリンβ３は実質的にすべてのＭ０−２ｂａＶ細胞で発現したが、インテグリンαｖβ３は存在しなかった。
【００３３】
非連結型のインテグリンαｖβ３は、カスパーゼ８の開裂を直接誘導することによって、アポトーシスを引き起こす可能性のあることが示唆されている（Ｓｔｕｐａｃｋ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５：４５９〜４７０（２００１））。したがって、３、５、及び７日後に、３Ｄコラーゲンから取り出したＭ２１及びＭ２１Ｌ細胞から調製された溶解産物を、カスパーゼ８及びカスパーゼ９の開裂に関してウエスタンブロットによって分析した。図１Ｄに関連し、これらの黒色腫細胞においてカスパーゼ８の開裂は認められないが、シクロヘキシミド処理Ｊｕｒｋａｔｅ細胞を用いるコントロールは、カスパーゼ８の開裂を示した。しかしながら、カスパーゼ９は、Ｍ２１（αｖβ３＋）細胞に比べてＭ２１Ｌ細胞（αｖβ３−）において高い割合で開裂し、インテグリンαｖβ３の欠損がＭ２１Ｌ細胞でアポトーシスを引き起こすこと、及びこのアポトーシスは、カスパーゼ９を伴うが、検出可能なカスパーゼ８の活性化を伴わないミトコンドリアアポトーシス経路によって媒介される可能性のあることを示唆した。
【００３４】
インテグリンαｖβ３は野生型ｐ５３のアンフォールド構造を誘導し、野生型ｐ５３活性を抑制する
Ｐａｂ４２１を用いるｐ５３スーパーシフトによる電気泳動ゲルシフト法（ＥＭＳＡ）を用いて、３Ｄコラーゲンから採取したＭ２１及びＭ２１Ｌ細胞において、特定のｐ５３ＤＮＡ結合活性を試験した。第０日では、ｐ５３活性はＭ２１及びＭ２１Ｌ細胞で類似していた。しかしながら、図２Ａの上図に示すように、インテグリンαｖβ３を欠損するＭ２１Ｌ細胞は、３Ｄコラーゲンで培養後、ｐ５３活性の増大を示したが、Ｍ２１細胞（αｖβ３＋）は示さなかった。
【００３５】
ｐ５３のタンパク質レベルを、抗ｐ５３Ｐａｂを用いるウエスタンブロットによって分析した。図２Ａの下図に関連して、Ｍ２１及びＭ２１Ｌ細胞のｐ５３タンパク質レベルは、３Ｄコラーゲンで７日以内に違いが認められなかった（試験は０、３、５、及び７日に行った）。負荷コントロールとしてアクチンレベルを試験した。これは、インテグリンαｖβ３がｐ５３タンパク質レベルに影響を及ぼすことなくｐ５３活性を調節することを示している。
【００３６】
特定のｐ５３ＤＮＡ結合活性を、それぞれ３Ｄコラーゲンで５日及び７日間インキュベートした後、Ｍ０及びＭ０αＶ細胞で試験した。ＥＭＳＡ検定により、ｐ５３活性が、Ｍ０αＶ細胞（αｖβ３＋）に比べて、インテグリンαｖβ３を欠損するＭ０細胞で高いことが示された（図２Ｂを参照のこと）。これは、第２の細胞系において黒色腫細胞ｐ５３活性化状態を調節するインテグリンαｖβ３の役割を実証する。
【００３７】
既知のｐ５３活性化のアセチル化部位であるリシン３８２でのｐ５３のアセチル化を、抗アセチル化ｐ５３−Ｌ３８２ｐａｂを用いて、ウエスタンブロットによって試験した。図２Ｃに示すように、アセチル化ｐ５３のレベルは、Ｍ２１Ｌ細胞（αｖβ３−）に比べてＭ２１細胞（αｖβ３＋）において低減したが、ｐ５３総レベルは同じままであった。さらに、ＰＵＭＡは、ｐ５３活性化と並行してＭ２１Ｌ（αｖβ３−）細胞でアップレギュレートされたが、Ｍ２１（αｖβ３＋）細胞ではアップレギュレートされず、ｐ５３活性がＰＵＭＡの転写を活性化する可能性を示唆した。
【００３８】
図２Ｄに関連して、ｐ５３の構造を、活性フォールドｐ５３構造を認識するＰａｂ１６２０、不活性アンフォールドｐ５３構造を認識するＰａｂ２４０、及びフォールド及びアンフォールド両方のｐ５３構造を認識するＤＯ１を用いて、ＥＬＩＳＡによって分析した。図２Ｄに示すデータは、Ｄ０１反応性（ｐ５３トータル）に対するＰａｂ１６２０及びＰａｂ２４０反応性の割合を示す。Ｍ２１細胞（αｖβ３＋）及びＭ２１Ｌ（αｖβ３−）は通常の２次元培養（第０日）で活性ｐ５３構造を示すことが認められた。しかしながら、３ＤコラーゲンでインキュベートしたＭ２１細胞（αｖβ３＋）は、インキュベート後、不活性アンフォールドｐ５３構造に転換したが、Ｍ２１Ｌ（αｖβ３−）は、活性ｐ５３構造を維持した。これは、インテグリンαｖβ３が病態生理的３次元環境にある黒色腫細胞において野生型ｐ５３構造を調節すること、及びインテグリンαｖβ３を発現する細胞のｐ５３活性の欠損は、アンフォールド不活性ｐ５３構造に起因することを示唆している。
【００３９】
インテグリンαｖβ３調節性ｐ５３は黒色腫細胞生存及び黒色腫腫瘍増殖を制御する
Ｍ２１Ｌ（αｖβ３−）細胞を、ドミナントネガティブｐ５３−Ｈｉｓ１７５で安定にトランスフェクトし、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−１、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８、及びＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−３２を含むいくつかのクローンを、５日間３Ｄコラーゲン中でインキュベートした後、ＥＭＳＡを用いてｐ５３活性を試験することにより同定した。これらのクローンのｐ５３活性は、αｖβ３を発現するＭ２１細胞と同様のレベルに低減した（図３Ａの下図）。Ｍ２１Ｌ−ｐ５３Ｈｉｓ１７５クローン、Ｍ２１Ｌ及びＭ２１細胞を３Ｄコラーゲン中でインキュベートし、図３Ａに示した時点でＦＩＴＣアネキシンＶ染色して、アポトーシスを試験した。ＦＡＣＳ分析は、アポトーシス細胞数が、Ｍ２１Ｌと比べてｄｎｐ５３クローンを有するＭ２１Ｌにおいて低く、Ｍ２１Ｌ−ｄｎｐ５３クローンでのアポトーシスの割合はインテグリンαｖβ３を発現するＭ２１細胞に類似していることを示し、ドミナントネガティブｐ５３の過剰発現が、インテグリンαｖβ３自体の発現と同程度にアポトーシスからＭ２１Ｌ細胞を救出し得ることを示唆した。
【００４０】
黒色腫腫瘍増殖におけるインテグリン調節性ｐ５３の役割をｉｎ  ｖｉｖｏで調べた。結果を図３Ｂに示す。Ｍ２１Ｌ、Ｍ２１、並びにＭ２１Ｌ−ｄｎｐ５３クローンＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０及びＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８を含む黒色腫細胞（１×１０６）を、６週齢Ｃ５７／ＢＬヌードマウスの背部の皮下に注射した。注射した各細胞種は、７匹のマウスを含んだ。腫瘍を２５日間増殖させた。Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８、及びＭ２１細胞（αｖβ３＋）では腫瘍の形成が認められたが、インテグリンαｖβ３を欠損するＭ２１Ｌ細胞は典型的に、この期間内に腫瘍を形成しなかった。
【００４１】
前パラグラフに記載する黒色腫増殖に関して腫瘍容積をモニターした。経時腫瘍容積を次式によって求めた。幅２×長さ×０．５２。図３Ｃにおいて、示した値は、各腫瘍細胞型の５〜７匹の動物による平均腫瘍容積である。この図で、◆はＭ２１、□はＭ２１Ｌ、▲はＬｐ５３Ｈｉｓ１７５−０、×はＬｐ５３Ｈｉｓ１７５−８を表す。Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０及びＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８は、Ｍ２１の腫瘍と同様に大きな腫瘍を形成した。しかしながら、インテグリンαｖβ３を欠損するＭ２１Ｌ細胞は典型的に、ごく小さく増殖するのみであるか、又は腫瘍を形成しない。
【００４２】
図３Ｄは、Ｍ２１、Ｍ２１Ｌ、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０、及びＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８の腫瘍湿重量の平均値±標準偏差を示す棒グラフである。図３Ｂに記載のとおり、ヌードマウスで皮下注射によって細胞は増殖した。
【００４３】
Ｍ２１Ｌ（αｖβ３−）細胞を、ｐ５３−ｓｉＲＮＡで安定にトランスフェクトし、Ｍ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ１６、Ｍ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ１７、Ｍ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ１８、Ｍ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ１９、Ｍ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ２１、及びＭ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ２２を含むいくつかのクローンを、ウエスタンブロットを用いて、ｐ５３タンパク質レベルを試験することによって同定した（図３Ｅの縦図）。Ｍ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡクローン、Ｍ２１Ｌ及びＭ２１細胞を３Ｄコラーゲン中でインキュベートし、図３Ｅに示した時点でＦＩＴＣアネキシンＶ染色して、アポトーシスを試験した。ＦＡＣＳ分析は、アポトーシス細胞数が、Ｍ２１Ｌと比べてｄｎｐ５３クローンを有するＭ２１Ｌにおいて低く、Ｍ２１Ｌ−ｐ５３ｓｉＲＮＡクローンでのアポトーシスの割合はインテグリンαｖβ３を発現するＭ２１細胞に類似していることを示し、ｐ５３ｓｉＲＮＡの過剰発現が、インテグリンαｖβ３自体の発現と同程度にアポトーシスからＭ２１Ｌ細胞を救出し得ることを示唆した。
【実施例】
【００４４】
本実施例では、ＰＲＩＭＡ−１がインテグリンαｖβ３陽性黒色腫細胞における活性ｐ５３構造を誘導し、ｐ５３転写標的を誘導し、特定のカスパーゼ活性化を含む、黒色腫細胞アポトーシスを促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの黒色腫腫瘍増殖を抑制することを実証する。
【００４５】
ＰＲＩＭＡ−１は、ＷＯ０２２４６９２により、変異ｐ５３タンパク質のアポトーシス誘導機能を再活性化できることが知られている物質である。ＰＲＩＭＡ−１が、インテグリンαｖβ３によって強化された黒色腫細胞において野生型ｐ５３のアンフォールド不活性構造に影響を及ぼすことができるかどうかを試験するために、Ｍ２１細胞（αｖβ３＋）及びＭ２１Ｌ細胞（αｖβ３−）を、７日間３Ｄコラーゲン中で１００μＭのＰＲＩＭＡ−１を用いて又は用いずにインキュベートした。ｐ５３構造を上に記載のとおり試験した。結果を図４Ａに示す。図に示すように、ＰＲＩＭＡ−１は、Ｍ２１細胞（αｖβ３＋）においてアンフォールド不活性状態から活性ｐ５３構造を回復させることができたが、コントロールＭ２１Ｌ細胞（αｖβ３−）では、ｐ５３構造はＰＲＩＭＡ−１の影響を受けなかった。これは、黒色腫細胞の野生型ｐ５３がアンフォールド状態及びフォールド状態間を構造的に変化し得ることを単独に実証するものである。より重要なことに、これらの結果は意外にも、黒色腫細胞の野生型ｐ５３アンフォールド構造がＰＲＩＭＡ−１によって活性構造に復帰され得ることを示している。この目的のために、さらにｐ５３構造を、３Ｄコラーゲンでインキュベートする前及び後に、インテグリンαｖβ３及び野生型ｐ５３を発現するＡＡヒト黒色腫細胞において分析した（図４Ｂ）。上図の結果は、ＡＡ細胞のｐ５３が２Ｄ培養条件下（０日）下で活性構造を有し、３Ｄコラーゲンでのインキュベートが不活性構造を誘導したことを示している。しかしながら、重要なことに、下図は、ＡＡ黒色腫細胞をＰＲＩＭＡ−１で処理することによって、ｐ５３が３Ｄコラーゲン中で活性構造に強化されたことを示している。これは、種々の黒色腫細胞において、ＰＲＩＭＡ−１を用いて野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換できることを示している。
【００４６】
１６、２４、３６、及び４８時間、ＰＲＩＭＡ−１で処理した又は処理しない３Ｄコラーゲン中又は２Ｄ培養条件下で増殖させたＭ２１細胞においてアポトーシスを分析した。結果を図４Ｃに示す。ＰＲＩＭＡ−１は、３Ｄコラーゲン中のＭ２１細胞（αｖβ３＋）において２Ｄ培養に比べてはるかに高度にアポートシスを促進し、ｐ５３活性化状態の調節が３Ｄ環境で選択的に黒色腫細胞の生存を制御することを示唆した。これはさらに、単独でｄｎｐ５３及びｐ５３−ｓｉＲＮＡを用いた結果（図３）を実証する。
【００４７】
図４Ｄは、すべてウエスタンブロットによって検出した、ＰＲＩＭＡ−１単回投与２４時間及び３６時間後の、ヌードマウスで増殖したＭ２１ヒト黒色腫細胞腫瘍における、ｐ５３−Ｌｙｓ３８２のアセチル化、ｐ５３−Ｓｅｒ１５のリン酸化並びにＡｐａｆ−１、ＰＵＭＡ、及びＢａｘのタンパク質レベルを示す。これらの結果は、ＰＲＩＭＡ−１がｉｎ  ｖｉｖｏで黒色腫腫瘍においてＡｐａｆ−１及びＰＵＭＡタンパク質レベル、並びにｐ５３アセチル化を誘導することを示している。したがって、ｐ５３−Ｌｙｓ３８２のアセチル化は、ＰＲＩＭＡ−１によるｐ５３活性化が関与している可能性があり、Ａｐａｆ−１及びＰＵＭＡはｉｎ  ｖｉｖｏでＰＲＩＭＡ−１及びｐ５３誘導黒色腫細胞アポトーシスの潜在的な下流メディエータである。
【００４８】
図４Ｅは、ウエスタンブロットによる検出で、ＰＲＩＭＡ−１単回投与２４時間及び３６時間後、ヌードマウスで増殖したＭ２１ヒト黒色腫細胞腫瘍においてカスパーゼ９は活性化したが、カスパーゼ８は活性化しなかったことを示している。これらの結果はＰＲＩＭＡ−１による誘導を示している。したがって、カスパーゼ９は、ｉｎ  ｖｉｖｏ黒色腫細胞においてＰＲＩＭＡ−１及びｐ５３誘導アポトーシスの潜在的な下流エフェクターである。
【００４９】
図４Ｆは、カスパーゼ９阻害剤Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ×ＴＦＡ（Ｃ１３５５）を用いた場合又は用いない場合、８０μＭのＰＲＩＭＡ−１を用いた場合又は用いない場合の３Ｄコラーゲン中３６時間後のＭ２１黒色腫細胞をアネキシンＶ染色してアポトーシスを検出した結果を示す。これらの結果は、ＰＲＩＭＡ−１が３Ｄコラーゲンで黒色腫細胞アポトーシスを誘導し、これが下流メディエータとしての活性カスパーゼ９に依存する可能性があることを示している。
【００５０】
ＰＲＩＭＡ−１による活性野生型ｐ５３構造の回復がｉｎ  ｖｉｖｏでも黒色腫細胞のアポトーシスを誘導し、それによって黒色腫腫瘍増殖を遮断し得るかどうかを試験するために、Ｍ２１及びＣ８１６１黒色腫細胞（１．５×１０６）を、６週齢Ｃ５７／ＢＬヌードマウスの背部の皮下に注射した。マウスを、腫瘍摂取６日後から開始して６日間、ＰＲＩＭＡ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いて又は用いずに処理した。図４Ｇのグラフは、各群の４匹のマウスに関して上に記載のとおり算出した平均腫瘍容積を示す。ＰＲＩＭＡ−１は、ＰＢＳコントロールと比べてＭ２１黒色腫増殖を著しく阻害したが、Ｃ８１６１黒色腫増殖には影響を及ぼさなかった。Ｃ８１６１細胞は不完全な非機能性ｐ５３を有し、Ｍ２１細胞は野生型ｐ５３を有することから考えると、これらの結果は、黒色腫増殖に対するＰＲＩＭＡ−１の影響が機能性ｐ５３に依存することを示している。
【００５１】
図４Ｈは、図４Ｇに記載したとおりＰＲＩＭＡ−１で処置した場合、又は処置しない場合の、黒色腫腫瘍形成２５日後の平均腫瘍湿重量±標準偏差を示している。ＰＲＩＭＡ−１は野生型ｐ５３を有する黒色腫細胞の腫瘍増殖を抑制することができるという発見は、インテグリンαｖβ３で不活性のままであった野生型ｐ５３の不活性構造を再活性化することによって、悪性黒色腫を治療するための新規な原理を提示する。
【００５２】
これらの予想外の発見に基づいて、本発明者等は、ＷＯ０２２４６９２に記載されているＰＲＩＭＡ−２及びＰＲＩＭＡ−３などのＰＲＩＭＡ−１構造類似体、並びに国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ０３／００２０６（非公開）に記載されているＰＲＩＭＡ−１の他の類似体も、ＰＲＩＭＡ−１と同様の活性を示すと考える。
【００５３】
本発明の薬剤組成物に用いる薬剤として許容される付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、及び硫酸などの鉱酸、並びに酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、及びアリールスルホン酸などの有機酸由来の塩が含まれる。本明細書に記載の薬剤として許容される賦形剤、例えばビヒクル、補助剤、担体、又は希釈剤は、当分野の技術者によく知られており、容易に入手可能である。薬剤として許容される担体は、活性化合物に化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用及び毒性を持たないものであることができる。薬剤の処方は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、調剤の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９９５）に記載されている。
【００５４】
本発明による化合物は、任意の投与形態、例えば経口、静脈内、皮内又は皮下、経鼻、筋肉内、或いは腹腔内投与用に調製することができる。担体又は他の材料の厳密な性質は、投与経路によって決まる。非経口投与の場合、発熱物質を含まず、必要とされるｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容される水溶液が用いられる。当分野の技術者は適切な溶液を調製することができ、多くの方法が文献に記載されている。薬剤送達方法の概説は、例えばＬａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）に記載されている。
【００５５】
哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、本発明においては、正当な期間にわたって哺乳動物に治療反応をもたらすのに充分な量であるべきである。当分野の技術者は、特定の化合物、患者の年齢、状態、及び体重、並びに疾患の病期／重症度を含む種々の要因によって用量が決まることを認識するであろう。用量は、経路（投与形態）、投与時期及び頻度によっても決まる。経口投与の場合、１日当たり式（Ｉ）の化合物約０．０１ｍｇから約１０００ｍｇ、又は薬剤として許容されるその塩の相当量であることができる。
【００５６】
本発明に従って用いることのできる化合物の好ましい特定の例は、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン（ＰＲＩＭＡ−１とも称される）、９−（アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン）−６−クロロ−９Ｈ−プリン（ＰＲＩＭＡ−２とも称される）、２−（ヒドロキシメチル）キヌクリジン−３，３−ジオール（ＰＲＩＭＡ−３とも称される）、２−（アデニン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−メチレン−３−キヌクリジノン、２−（２−アミノ−３−クロロ−５−トリフルオロメチル−１−メチルアニリン）−３−キヌクリジノン、２−（６−トリフルオロメチル−４−クロロベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（６−メトキシプリン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イルベンゾアート、２−（５，６−ジメチル−ベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−７−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（７−メチレン−１，３−ジメチル尿酸）−３−キヌクリジノン、又は２−（２，６−ジクロロ−９−メチレンプリン）−３−キヌクリジノン、或いは薬剤として許容されるそれらの塩である。
【００５７】
本発明によれば、より好ましい化合物群は、下記の式ＩＩＩによって定義される構造を有する化合物である：
【化３】
2006521375.tif 000004
［式中、
Ｒ１及びＲ２の一方は、水素であり、他方は、アミン置換フェニル基の窒素原子、プリン、８−アザプリン、又はベンズイミダゾール残基の環構造に含まれる窒素原子に結合したメチレン基であり、より好ましくは、メチレン基は、プリン、８−アザプリン、又はベンズイミダゾール残基の環構造に含まれる窒素原子に結合している］。
【００５８】
より好ましくは、式ＩＩ及びＩＩＩのＲ１及びＲ２の一方は、水素であるか、或いはＲ１及びＲ２は共に、ヒドロキシメチル基である。
【００５９】
以下の化合物は、ＰＲＩＭＡ−１と同様の、又はＰＲＩＭＡ−１より高い活性を示すと考えられる：２−（５，６−ジメチル−ベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−７−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（７−メチレン−１，３−ジメチル尿酸）−３−キヌクリジノン、２−（２，６−ジクロロ−９−メチレンプリン）−３−キヌクリジノン、及び２−（６−メトキシプリン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン。
【００６０】
野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換する能力に関して物質を試験するための一般的な手順
物質を試験するための本発明の方法は、以下に説明するとおり、直接又は間接的な方法で、不活性構造の野生型ｐ５３を検出することに基づく。
【００６１】
本発明の方法では、野生型のみが存在し、変異ｐ５３が存在しないことが重要である。したがって、本方法に用いられる任意の細胞において、野生型ｐ５３のみを発現すべきである。すなわちｐ５３遺伝子は突然変異されていてはならない。野生型ｐ５３の発現は、当分野の技術者によって、配列決定、質量分析、ＤＮＡ結合試験などの適切な通常の方法を用いて容易に求めることができる。
【００６２】
当然ながら、試験中に野生型ｐ５３の不活性形態が存在することも重要である。野生型ｐ５３の不活性形態の存在は、Ｐａｂ２４０を用いる直接的な方法によって適切に確立することができる。
【００６３】
より詳細には、本発明者等は、野生型ｐ５３が以下の条件下で不活性化されていることを見出した：３Ｄコラーゲンなどの３次元環境においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された黒色腫細胞、紫外線又はγ線照射後の組織培養黒色腫細胞、及びマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで増殖した黒色腫細胞である。本発明者等はさらに、野生型ｐ５３は血管新生中の血管新生血管細胞で不活性構造を取り、野生型ｐ５３不活性構造はさらなる細胞種及び組織にも存在でき、他の場合には他の処理手段によって誘導できることを予測する。
【００６４】
試験中に不活性野生型ｐ５３のレベルに生じる任意の変化をモニターする方法は、本発明によれば、その方法が不活性野生型ｐ５３のレベルの実質的な低減及びその結果として生じる活性ｐ５３誘導のレベルを検出できるかぎり、重要でない。
【００６５】
新しい不活性野生型ｐ５３状態の上述の定義、及び本発明の詳細な説明に基づいて、当分野の技術者は、一般的な知識を用いて不活性野生型ｐ５３のレベルを検出及び／又はモニターするための適切な方法を見出すことができるであろう。以下にさらに詳しく説明するとおり、そのような方法は一般に、野生型ｐ５３構造及び／又は活性状態を測定することに基づく。
【００６６】
試験中、不活性野生型ｐ５３のレベルは、例えば上述のＰａｂ２４０などの不活性形態のみを認識する適切な構造特異抗体を用いて確立することができる。野生型ｐ５３の総細胞レベルは、それぞれ不活性ｐ５３と活性ｐ５３とを合わせたレベルによって形成されるので、活性ｐ５３構造の測定は、不活性ｐ５３の間接的な測定として用いることもでき、すなわち活性ｐ５３の不在は、ｐ５３が不活性であることを示す。活性ｐ５３構造の測定は、Ｐａｂ１６２０などの適切な構造特異抗体を用いて行うこともできる。所望であれば、ＤＯ１などの野生型ｐ５３の不活性形態と活性形態とを識別しない適切な抗体を用いて、野生型ｐ５３の総レベルを測定することができる。
【００６７】
当然ながら、野生型ｐ５３の活性状態を反映する他の直接又は間接パラメータも用いることができる。したがって、例えば野生型ｐ５３の活性状態は、例えばレポーターとしてＧＦＰ又はルシフェラーゼを用いて、レポーターコンストラクトの発現の不在により、ＤＮＡに対するｐ５３の結合を測定することによって、並びに／或いはｐ５３活性を示す特定のｐ５３標的遺伝子又は遺伝子発現パターンを分析するマイクロアレイ関連技法を用いて、例えばＰＵＭＡ−１、Ａｐａｆ−１、ＰＩＧ−３、ＧＡＤＤ４５、Ｍｄｍ２、ｐ２１−ＣＩＰ１、ｂａｘ、ｂｃｌ−２、及び／又はカスパーゼ−３など、図２Ｃ及び４Ｄに示したｐ５３標的遺伝子を測定することによって、並びに／或いはアポトーシス、及び／又は増殖停止、及び／又は図４Ｅに示したカスパーゼ９及びカスパーゼ３の活性化など、ｐ５３の上流又は下流の経路に関与する分子の活性を誘導する野生型ｐ５３の能力を測定することによって、検出することができる。
【００６８】
さらに、図２Ｃ及び４Ｄに示したとおり、特定のｐ５３アセチル化も、ｐ５３活性の指標として用いることができる。同様に、ｐ５３のリン酸化も、ｐ５３活性の指標として考えられる。
【００６９】
しかしながら、抗体の使用は、特にＰａｂ２４０が用いられるとき、不活性野生型ｐ５３を検出及びモニターする実用的でより直接的な方法として本発明において好ましい。
【００７０】
本発明によって野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換する能力に関して物質を試験する一般的な方法は、したがって以下の一般的なステップを含むことになる。
Ａ．不活性野生型ｐ５３構造が存在する、野生型ｐ５３を有する細胞を提供するステップ、
Ｂ．細胞を試験物質に暴露するステップ、及び
Ｃ．例えば上述の任意の方法によって、不活性野生型ｐ５３構造の細胞レベルを測定するステップである。
【００７１】
上述の一般的な方法は、以下で容易に理解されるとおり、ステップＢにおいて細胞を試験物質にｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで暴露することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の両方に適応させることができる。
【００７２】
ステップＣは典型的に、ステップＢで細胞を試験物質に暴露する前及び後の両方で行う。
【００７３】
野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換する能力に関する物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
不活性ｐ５３構造を活性構造に復帰することのできる物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の場合、野生型ｐ５３を有する細胞を３次元環境で増殖し、それぞれ試験物質を添加するか又は添加せずに、例えば上述の任意の方法によって、ｐ５３の構造及び／又は活性状態を測定することができる。不活性野生型ｐ５３の構造及び／又は活性を変化し得ることが認められた場合、物質は機能性であると見なされる。別法として、不活性野生型ｐ５３構造を誘導するために、野生型ｐ５３を有する細胞を照射し、試験物質に暴露し、その後、ｐ５３構造及び／又は活性に関して分析することができる。別法として、天然に不活性野生型ｐ５３構造を示す細胞を用いるか、又は他の手段で不活性野生型ｐ５３構造を誘導し、その後、細胞を試験物質に暴露し、不活性ｐ５３状態に関して分析することができる。
【００７４】
ヒト又は動物由来の組織、器官、又はそれらの一部を培養し、処理し、上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞に関して記載したとおり、本発明の試験に用いることができる。そのようなモデルはｅｘ  ｖｉｖｏモデルと呼ばれることもあるが、本発明の物質の試験方法に用いられるとき、そのような方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の方法であると見なす。
【００７５】
別法として、物質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、血管新生モデルで行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの例には、これに限定されるものではないが、内皮細胞の管形成試験、幹細胞からの血管伸長、動物又はヒトから単離された脈管からの血管伸長、又は組織培養内皮細胞の分析が含まれる。
【００７６】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験手順は、例えば以下の一般的なステップを含む。
Ａ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて野生型ｐ５３を有する細胞を提供し、不活性野生型ｐ５３が存在しない場合、不活性野生型ｐ５３を誘導するステップ、
Ｂ．細胞を試験物質に暴露するステップ、及び
Ｃ．例えば上述の任意の方法によって、直接又は間接的に、不活性野生型ｐ５３構造の細胞レベルを測定するステップである。
【００７７】
ステップＣは典型的に、ステップＢで細胞を試験物質に暴露する前及び後の両方で行う。
【００７８】
野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換する能力に関する物質のｉｎ  ｖｉｖｏ試験
同様に、野生型ｐ５３構造及び／又は活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。例えば、黒色腫細胞異種移植片をｉｎ  ｖｉｖｏで用いて、不活性ｐ５３構造を活性ｐ５３に復帰させる能力に関して物質を試験することができる。この場合、そのような腫瘍異種移植片を有する動物を試験物質で処理し、上述のとおり、野生型ｐ５３構造及び活性に対するこの物質の影響を測定する。別法として、物質の試験は、黒色腫が自然に発生しているか、又は例えば紫外線放射、及び／又は発癌性化学物質、及び／又は遺伝子修飾で処置することによって黒色腫を誘発させる、動物黒色腫モデルで行うことができる。動物への試験物質の投与は、静脈内、腹腔内、皮下、腫瘍内、又は別の方法で行うことができる。
【００７９】
別法として、物質のｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、血管新生モデルで行うことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏモデルの例には、これに限定されるものではないが、ニワトリ胚絨毛尿膜の血管新生刺激、マウス又は他の動物への細胞外マトリクス又は比較物質の移植による血管新生刺激、血管新生化合物による角膜の血管新生刺激、低酸素による網膜の血管新生刺激、網膜又は他の場所での発生血管新生分析、及び腫瘍異種移植片又は他の異種移植片による血管新生の誘導が含まれる。血管新生の測定は、組織内の血管数の定量化、及び／又は血管細胞マーカーの定量化、及び／又は血管細胞アポトーシス及び／又は血管細胞増殖の測定、及び／又は類似の手段によって行う。
【００８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験手順は、例えば以下の一般的なステップを含む。
Ａ．不活性野生型ｐ５３構造が存在する、その組織において野生型ｐ５３を発現する動物を提供するステップ、
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏで動物の組織の細胞を試験物質に暴露するステップ、及び
Ｃ．例えば上述の任意の方法によって、直接又は間接的に、不活性野生型ｐ５３構造の細胞レベルを測定するステップである。
【００８１】
ステップＣは典型的に、ステップＢで細胞を試験物質に暴露する前及び後の両方で行う。
【００８２】
別法として、図４Ｇに例示のとおり、化合物の陽性試験は、機能性ｐ５３を有する細胞又は組織における試験物質の影響と、ｐ５３を含まないか、又は非機能性ｐ５３を含む細胞又は組織に対する影響とを比較することによって確立することもできる。明らかに、観測可能な影響は、例えば図４に記載した腫瘍容積又は重量、又は腫瘍細胞数の減少、或いはアポトーシスの誘導、又はその兆候と関連し得る。したがって、上述のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法において、ステップＣの代わりに代替ステップＣ’を用いることができ、これは、ステップＢの細胞又は組織（機能性ｐ５３を有する）に対する試験物質の影響を、ｐ５３を含まないか、又は非機能性ｐ５３を含む細胞又は組織に対する影響と比較するステップを含む。
【００８３】
別法として、化合物の試験は、野生型ｐ５３構造が調節に積極的な役割を果たす、例えば上に挙げた血管新生など、他の生理学及び病理学的機序に対する試験物質の影響を比較することによって試験することもできる。そのような場合、観察可能な影響は、特定の生理学又は病理学的事象、例えば血管新生によって形成された新しく作られた血管の量及び／又は血管細胞におけるアポトーシス又はその兆候の量に対する試験物質の影響であることができる。
【００８４】
これらの動物は典型的に、上述のｉｎ  ｖｉｖｏ物質試験の後、屠殺される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】インテグリンαｖβ３を発現するヒト黒色腫細胞Ｍ２１及びインテグリンαｖβ３を欠損しているＭ２１Ｌにおける、時間を関数としたアポトーシス細胞の割合を示す図である。
【図１Ｂ】インテグリンαｖβ３を欠損しているヒト黒色腫細胞Ｍ０、Ｍ０−２ｂａＶ、インテグリンαＶサブユニットの細胞質尾部を伴うインテグリンＩＩｂサブユニットの細胞外ドメインのキメラ（ｃｈｉｍｅｒ）を過剰発現するＭ０細胞、及び高レベルのインテグリンαＶサブユニットを発現するＭ０−αＶ細胞における、時間を関数としたアポトーシス細胞の割合を示す図である。
【図１Ｃ】種々のヒト黒色腫細胞系における、インテグリンαｖβ３及びインテグリンβ３サブユニットの細胞表面発現を例示する図である。
【図１Ｄ】カスパーゼ８及びカスパーゼ９の開裂に関する分析結果を示す図である。
【図２Ａ】上図は、Ｐａｂ４２１を用いるｐ５３スーパーシフトによる電気泳動ゲルシフト法（ＥＭＳＡ）を用いて、３Ｄコラーゲンから採取したＭ２１及びＭ２１Ｌ細胞における特定のｐ５３ＤＮＡ結合活性を示す図であり、下図は、負荷コントロールとしてアクチンと比較したｐ５３のタンパク質レベルを示す図である。
【図２Ｂ】図２Ａの上図と同様であるが、Ｍ０及びＭ０αＶ細胞を用いた図である。
【図２Ｃ】ウエスタンブロットによって検出された、３Ｄコラーゲンに７日間まで培養した後の３Ｄコラーゲン中のＭ２１（αｖ＋）及びＭ２１Ｌ（αｖ−）細胞のＰＵＭＡ、Ａｐａｆ１、Ｂａｘ、及びＢｃｌのタンパク質レベル、並びにリシン３８２でのｐ５３のアセチル化を示す図である。
【図２Ｄ】Ｍ２１（αｖβ３＋）細胞及びＭ２１Ｌ（αｖβ３−）細胞における、Ｄ０１反応性（ｐ５３トータル）に対するＰａｂ１６２０及びＰａｂ２４０の反応性の割合を示す図である。
【図３Ａ】上図は、Ｍ２１（αｖβ３＋）細胞、Ｍ２１Ｌ（αｖβ３−）細胞、並びにＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−１、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８、及びＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−３２を含む、ドミナントネガティブｐ５３−Ｈｉｓ１７５で安定にトランスフェクトされたＭ２１Ｌ細胞（αｖβ３−）のいくつかのクローンにおける、アポトーシス細胞の割合を示す図である。下図は、３Ｄコラーゲン中５日後の、それらのクローンにおけるｐ５３のＤＮＡ結合活性を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ａで用いた細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖を例示する図である。
【図３Ｃ】この図に示した各腫瘍細胞型の、５〜７匹の動物による経時平均腫瘍容積の値を示すグラフである。
【図３Ｄ】マウスのＭ２１、Ｍ２１Ｌ、Ｍ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−０、及びＭ２１Ｌｐ５３Ｈｉｓ１７５−８における、腫瘍増殖２５日後の腫瘍湿重量を示す棒グラフである。
【図３Ｅ】Ｍ２１（αｖ＋）、Ｍ２１Ｌ（αｖ−）、及び６種の個々のＭ２１Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡクローン（Ｌｐ５３ｓｉＲＮＡ）黒色腫細胞を、指示された期間、３Ｄコラーゲンで培養した。アネキシンＶ染色によって、アポトーシスを検出した。ｐ５３及びアクチンタンパク質レベルのブロットを、各レーンの直左に示した細胞に関して、縦向きに表示する。示した結果は、３回の独立した実験を代表する結果である。
【図４Ａ】１００μＭのＰＲＩＭＡ−１を用いて又は用いずに、５日間インキュベートしたＭ２１及びＭ２１Ｌ黒色腫細胞における、Ｐａｂ１６２０及びＰａｂ２４０によるｐ５３構造の試験結果を示す図である。
【図４Ｂ】上図は、２Ｄ培養条件下（０日）及び３Ｄコラーゲン中５日後のＡＡ黒色腫細胞における、Ｐａｂ１６２０及びＰａｂ２４０によるｐ５３構造の試験結果を示す図である。下図は、１００μＭのＰＲＩＭＡ１を用いた場合、又は用いない場合の３Ｄコラーゲン中５日後のｐ５３構造の試験を示す図である。
【図４Ｃ】上図は、１００μＭのＰＲＩＭＡ−１で処理した場合、処理しない場合に、３Ｄコラーゲン中１６、２４、３６、及び４８時間後のＭ２１黒色腫細胞において、アネキシンＶ染色によってアポトーシスを定量化した結果を示す図である。下図は、２次元培養条件下での同じ処理の結果を示す図である。
【図４Ｄ】ＰＲＩＭＡ−１の単回投与によって処理したヌードマウスで皮下注射によって増殖したＭ２１ヒト黒色腫腫瘍を、溶解し、ＰＲＩＭＡ−１投与２４及び３６時間後にウエスタンブロットによって、リシン３８２のｐ５３のアセチル化、Ｓｅｒ１５のｐ５３のリン酸化、並びにＰＵＭＡ、Ａｐａｆ１のタンパク質レベルに関して分析した結果を示す図である。
【図４Ｅ】図４Ｄに記載したとおりに処理したＭ２１黒色腫腫瘍において、カスパーゼ９はＰＲＩＭＡ−１によって活性化され、カスパーゼ８は活性化されないことを示す図である。
【図４Ｆ】ＰＲＩＭＡ−１誘導アポトーシスが３Ｄコラーゲン中カスパーゼ９阻害剤Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ×ＴＦＡ（Ｃ１３５５）によって遮断されることを示す図である。
【図４Ｇ】上図は、ＰＲＩＭＡ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いて又は用いずに６日間処理されたＣ５７／ＢＬヌードマウスにおいて増殖したＭ２１ヒト黒色腫細胞の経時平均腫瘍容積を示す図である。下図は、ＰＲＩＭＡ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いて又は用いずに６日間処理されたＣ５７／ＢＬヌードマウスにおいて増殖したＣ８１６１ヒト黒色腫細胞の経時平均腫瘍容積を示す図である。
【図４Ｈ】図４Ｇに記載したとおりＰＲＩＭＡ−１で処置した場合、又は処置しない場合の、Ｍ２１黒色腫腫瘍形成２５日後の腫瘍湿重量を示す図である。
【図１Ａ】
2006521375.tif 000008
【図１Ｃ−１】
2006521375.tif 000009
【図１Ｃ−２】
2006521375.tif 000010
【図２Ｄ】
2006521375.tif 000011
2006521375.tif 000012
【図３Ｃ】
2006521375.tif 000013
【図３Ｄ】
2006521375.tif 000014
【図３Ｅ】
2006521375.tif 000015
【図４Ａ】
2006521375.tif 000016
【図４Ｂ】
2006521375.tif 000017
【図４Ｃ】
2006521375.tif 000018
【図４Ｆ】
2006521375.tif 000019
【図４Ｇ】
2006521375.tif 000020
【図４Ｈ】
2006521375.tif 000021
【図１Ｂ】
2006521375.tif 000022
【図１Ｄ】
2006521375.tif 000023
【図２Ａ】
2006521375.tif 000024
【図２Ｂ】
2006521375.tif 000025
【図２Ｃ】
2006521375.tif 000026
【図３Ａ】
2006521375.tif 000027
【図４Ｄ】
2006521375.tif 000028
【図４Ｅ】
2006521375.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月20日(2005.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性黒色腫及び／又は望ましくない血管新生が関与する病的状態の治療に用いる薬剤を調製するための、野生型ｐ５３を、Ｐａｂ２４０に反応性であるが、Ｐａｂ１６２０に反応性でない不活性構造から、アポトーシスを誘導することのできる活性構造に転換することのできる化合物の使用であって、化合物が式Ｉ：
【化１】
2006521375.tif 000030
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＣＨ２−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＲ５、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲ５から選択されるか、或いは
Ｒ１及びＲ２は、合わせて＝ＣＨ２であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ５、及び−Ｏ−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５から選択されるか、或いはＲ３及びＲ４は、合わせて＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨ、又はＮＲ５であり、
Ｒ５は、Ｈ、置換又は非置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０アルキニル、置換又は非置換のＣ３からＣ１２のシクロアルキル、置換又は非置換のベンジル基、置換又は非置換のアリール、或いは１つ又は複数のヘテロ原子を有する単環、二環、又は三環式の非置換又は置換の芳香族複素環及び非芳香族複素環から選択される同一であるか又は異なる基を表し（置換された基の置換基は、Ｃ１からＣ１０アルキル、Ｃ２からＣ１０アルケニル、Ｃ２からＣ１０アルキニル、ハロゲン、置換又は非置換アリール、置換又は非置換芳香族複素環化合物、非芳香族複素環、Ｃ１からＣ１０アルキルオキシ、Ｃ１からＣ１０アルキルアミノ、Ｃ２からＣ１０アルケニルアミノ、Ｃ２からＣ１０アルキニルアミノ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６、及びＣＯＯＲ６から選択される）、
Ｒ６は、Ｈ、非置換又は置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０アルケニル又はアルキニル、ベンジル、アリール、１つ又は複数のヘテロ原子を有する非置換又は置換芳香族複素環、及び非芳香族複素環から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、合わせて架橋ＣＨ２−ＣＨ２部分を形成するか、或いはＲ７及びＲ８は、共に水素である化合物、或いは薬剤として許容されるその塩又はプロドラッグから選択される］
の構造を有する化合物の使用。
【請求項２】
前記化合物が、次の式（ＩＩ）：
【化２】
2006521375.tif 000031
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、水素、ヒドロキシメチル、又はアミン置換フェニル基の窒素原子、プリン、８−アザプリン、若しくはベンズイミダゾール残基の環構造に含有される窒素原子に結合したメチレン基から独立して選択されるか、或いはＲ１及びＲ２は、合わせて二重結合メチレン基を表し、
Ｒ３及びＲ４は、水素、ヒドロキシル、及びベンゾイルオキシから独立して選択されるか、又はＲ３及びＲ４は、合わせて二重結合である酸素原子を表すことができ、但し、Ｒ３及びＲ４のいずれかがベンゾイルオキシ基であるとき、Ｒ１及びＲ２は、共に水素である化合物である］
を有する化合物から選択されるか或いは薬剤として許容されるそれらの塩又はプロドラッグである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物が、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン、９−（アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−オン）−６−クロロ−９Ｈ−プリン、２−（ヒドロキシメチル）キヌクリジン−３，３−ジオール、２−（アデニン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−メチレン−３−キヌクリジノン、２−（２−アミノ−３−クロロ−５−トリフルオロメチル−１−メチルアニリン）−３−キヌクリジノン、２−（６−トリフルオロメチル−４−クロロベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（６−メトキシプリン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−９−メチレン）−３−キヌクリジノン、１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イルベンゾアート、２−（５，６−ジメチル−ベンズイミダゾール−１−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（８−アザアデニン−７−メチレン）−３−キヌクリジノン、２−（７−メチレン−１，３−ジメチル尿酸）−３−キヌクリジノン、又は２−（２，６−ジクロロ−９−メチレンプリン）−３−キヌクリジノン、或いは薬剤として許容されるそれらの塩から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤として許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と合わせた、請求項１から３までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
悪性黒色腫を治療し、且つ／又は望ましくない血管新生を阻害する方法であって、式Ｉ：
【化３】
2006521375.tif 000032
［式中、
ｎは、０、１、又は２であり、
Ｒ１及びＲ２は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＣＨ２−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ５、−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−Ｒ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨＲ５、及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＮＨＲ５から選択されるか、或いはＲ１及びＲ２は、合わせて＝ＣＨ２であり、
Ｒ３及びＲ４は、同一であるか又は異なっており、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ５、及び−Ｏ−ＣＯ−Ｃ６Ｈ５から選択されるか、或いはＲ３及びＲ４は、合わせて＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＨ、又はＮＲ５であり、
Ｒ５は、Ｈ、置換又は非置換のＣ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０のアルキニル、置換又は非置換のＣ３からＣ１２のシクロアルキル、置換又は非置換のベンジル基、置換又は非置換のアリール、或いは１つ又は複数のヘテロ原子を有する単環、二環、又は三環式の非置換又は置換の芳香族複素環及び非芳香族複素環から選択された同一であるか又は異なる基を表し（置換された基の置換基は、Ｃ１からＣ１０のアルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル、Ｃ２からＣ１０のアルキニル、ハロゲン、置換又は非置換アリール、置換又は非置換芳香族複素環化合物、非芳香族複素環、Ｃ１からＣ１０のアルキルオキシ、Ｃ１からＣ１０のアルキルアミノ、Ｃ２からＣ１０のアルケニルアミノ、Ｃ２からＣ１０のアルキニルアミノ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６、及びＣＯＯＲ６から選択される）、
Ｒ６は、Ｈ、非置換又は置換のＣ１からＣ１０アルキル、Ｃ２からＣ１０のアルケニル又はアルキニル、ベンジル、アリール、１つ又は複数のヘテロ原子を有する非置換又は置換芳香族複素環、及び非芳香族複素環から選択され、
Ｒ７及びＲ８は、合わせて架橋ＣＨ２−ＣＨ２部分を形成するか、或いはＲ７及びＲ８は、共に水素である］
の構造を有する化合物から選択される化合物或いは薬剤として許容されるその塩又はプロドラッグの薬剤として有効な量を、それを必要としている哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項６】
野生型ｐ５３を不活性構造から活性構造に転換する能力に関して化合物を試験する方法であって、
Ａ．野生型ｐ５３のみを有し突然変異ｐ５３は有さない細胞であって、不活性野生型ｐ５３構造が存在する細胞を提供するステップと、
Ｂ．前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験物質に暴露するステップと、
Ｃ．細胞不活性野生型ｐ５３構造を測定するステップと
を含む方法。
【請求項７】
ステップＣに代え、ステップＢにおける（機能性ｐ５３を有する）細胞に対する試験物質の影響を、ｐ５３を含まないか、又は非機能性ｐ５３を含む細胞又は組織に対する影響と比較するステップを含む、代替ステップＣ’を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
インテグリンαｖβ３が細胞に存在する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
不活性構造の野生型ｐ５３を検出するためにＰａｂ２４０を用いる、請求項６から８までに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物が試験される請求項６から９までのいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップＢで前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで動物において試験物質に暴露され、前記動物がその後屠殺される、請求項６から１０までのいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
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