(57)【要約】組換え細菌ならびにその作製方法および使用方法を提供する。組換え細菌は、染色体に挿入された少なくとも１つの異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する組換えバチルス属であり、この組換えバチルス属はゲノム中に挿入された少なくとも１つの前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有さない対応する野生型バチルス属よりも大量のケラチナーゼを産生する。バチルス属は、バチルス・リケニフォルミスおよびバチルス・ズブチルスであり、ｋｅｒＡコードセグメントはバチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・ズブチルスのｋｅｒＡコードセグメントでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組換えバチルス属を培地中で培養するステップと、ここで、前記組換えバチルス属は、染色体に挿入された少なくとも１つの異種ｋｅｒＡコードセグメントを有し、前記組換えバチルス属は、ゲノム中に挿入された少なくとも１つの前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有さない対応する野生型バチルス属よりも大量のケラチナーゼを産生し、
（ｂ）前記ケラチナーゼを前記培地から回収するステップと
を含む、ケラチナーゼの製造方法。
【請求項２】
前記培地が３％以下のタンパク質基質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が１％のダイズおよび１％の羽毛粉を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バチルス属が、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バチルス属が、バチルス・リケニフォルミスである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、バチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・ズブチルスのｋｅｒＡコードセグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、バチルス・リケニフォルミスｋｅｒＡコードセグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記対応する野生型バチルス属が、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えバチルス属が、染色体に挿入された複数の前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えバチルス属が、染色体に挿入された３個から５個の前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えバチルス属が、プロテアーゼ欠損バチルス属である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、構成性プロモーターと作動可能に関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、Ｐ４３プロモーターと作動可能に関連している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
染色体に挿入された少なくとも１つの異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する組換えバチルス属であって、前記組換えバチルス属が、ゲノム中に挿入された少なくとも１つの前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有さない対応する野生型バチルス属よりも大量のケラチナーゼを産生することを特徴とする組換えバチルス属。
【請求項１５】
前記バチルス属が、バチルス・リケニフォルミスおよびバチルス・ズブチルスからなる群から選択される、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項１６】
前記バチルス属が、バチルス・リケニフォルミスである、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項１７】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、バチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・ズブチルスのｋｅｒＡコードセグメントである、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項１８】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、バチルス・リケニフォルミスｋｅｒＡコードセグメントである、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項１９】
前記対応する野生型バチルス属が、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１である、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項２０】
染色体に挿入された複数の前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項２１】
染色体に挿入された３個から５個の前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項２２】
前記組換えバチルス属が、プロテアーゼ欠損バチルス属である、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項２３】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、構成性プロモーターと作動可能に関連している、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項２４】
前記ｋｅｒＡコードセグメントが、Ｐ４３プロモーターと作動可能に関連している、請求項１４に記載の組換えバチルス属。
【請求項２５】
培養培地中に請求項１４に記載の組換えバチルス属を含む細菌培養物。
【請求項２６】
前記培養培地が３％以下のタンパク質基質を含む、請求項２５に記載の細菌培養物。
【請求項２７】
前記培養培地が１％のダイズおよび１％の羽毛粉を含む、請求項２５に記載の細菌培養物。
【請求項２８】
（ａ）ｋｅｒＡコードセグメントを、組み込みバチルス属発現ベクターに挿入するステップと、ここで、前記ｋｅｒＡはプロモーターと作動可能に関連し、前記プロモーターはバチルス属細菌中で作動可能であり、
（ｂ）前記組み込みバチルス属発現ベクターによってバチルス属を形質転換するステップと
を含む、請求項１４に記載の組換えバチルス属の作製方法。
【請求項２９】
前記組み込みバチルス属発現ベクターが、α−アミラーゼ５’フランキングＤＮＡセグメントおよび３’フランキングＤＮＡセグメントを含み、前記ｋｅｒＡコードセグメントは前記αアミラーゼ５’フランキングセグメントと３’フランキングセグメントとの間に挿入される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組み込みバチルス属発現ベクターがプラスミドベクターである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２００２年９月１３日提出の米国特許仮出願６０／４１０，７１０号（その開示全体が本明細書中で参照することにより組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、組換えバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ株（以後「Ｔ１」株）の構築およびこのような組換えバチルス・リケニフォルミスＴ１株を使用することによるケラチナーゼを含む粗酵素抽出物の発酵産生、より具体的には大量産生に関する。
【背景技術】
【０００３】
ケラチナーゼは、羽毛粉中のケラチンタンパク質を特異的に分解することができるセリンプロテアーゼであり、羽毛分解細菌バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１から首尾よく産生され、単離されている。羽毛ケラチンの加水分解の促進に加えて、ケラチナーゼは、カゼイン、コラーゲン、エラスチンを含む広範なタンパク質基質を加水分解することができ、当分野で公知のほとんどの他のプロテアーゼよりも高いタンパク質分解活性を示す。
【０００４】
多くの他の適用のうちでケラチナーゼの１つの重要な潜在的な商業的適用は、栄養補助家禽用飼料の消化性および栄養価を改良するような方法における、栄養補助家禽用飼料への飼料添加物としての、ケラチナーゼ産生バチルス・リケニフォルミス株由来の乾燥無細胞粗発酵産物の使用である。
【０００５】
しかし、ケラチナーゼの商品化における主な問題は、このような酵素の産生コストが高いことである。
【０００６】
したがって、このような問題を解決するために以下の２つのアプローチが取られている。（１）ケラチナーゼ産生が改良された細菌株を開発するための株の開発；および（２）ケラチナーゼ酵素の発酵および抽出のための効率の良い産生ストラテジーをデザインするためのプロセスの開発。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ケラチナーゼを過剰産生し、野生型バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１株よりも有意に高い酵素収率を示す組換えバチルス・リケニフォルミス株を提供することにある。
【０００８】
本発明の別の目的は、飼料添加物としてのこのような粗発酵産物の適用および感染性プリオンの破壊、および生化学研究用の精製発酵産物に適応させたケラチナーゼ酵素の商業化が実現可能な大量生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、染色体に挿入された少なくとも１つの異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する組換えバチルス属であって、この組換えバチルス属はゲノム中に挿入された少なくとも１つの前記異種ｋｅｒＡコードセグメントを有さない対応する野生型バチルス属よりも大量のケラチナーゼを産生する。バチルス属は、バチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・ズブチルスであり、ｋｅｒＡコードセグメントは、バチルス・リケニフォルミスまたはバチルス・ズブチルスのｋｅｒＡコードセグメントでもよい。対応する野生型バチルス属は、バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１である。好ましい実施形態では、組換えバチルス属は、その染色体に挿入された複数の異種ｋｅｒＡコードセグメントを有し、特に好ましい実施形態では、その染色体に挿入された３個から５個までの異種ｋｅｒＡコードセグメントを有する。好ましい実施形態では、組換えバチルス属は、プロテアーゼ欠損バチルス属である。ｋｅｒＡコードセグメントは、プロモーター、好ましくはＰ４３プロモーターなどの構成性プロモーターと作動可能に関連している。
【００１０】
本発明の第２の態様は、培養培地中に本明細書中に記載の組換えバチルス属を含む細菌培養物である。培養培地は、好ましくは、３％以下のタンパク質基質を含み、特に好ましい実施形態では、培養培地は、１％のダイズおよび１％の羽毛粉を含む。
【００１１】
本発明の第３の態様は、（ａ）組み込みバチルス属発現ベクターにｋｅｒＡコードセグメントを挿入するステップと、ここで、前記ｋｅｒＡコードセグメントはプロモーターと作動可能に関連し、前記プロモーターはバチルス属細菌中で作動可能であり、（ｂ）バチルス属を前記組み込みバチルス属発現ベクターにより形質転換するステップとを含む、本明細書中に記載の組換えバチルス属の製造方法である。好ましくは、組み込みバチルス属発現ベクターは、α−アミラーゼ５’フランキングＤＮＡセグメントおよび３’フランキングＤＮＡセグメントを含み、ｋｅｒＡコードセグメントはαアミラーゼ５’フランキングセグメントと３’フランキングセグメントとの間に挿入される。ｐＬＡＴ１０ベクターが特に好ましい。
【００１２】
本発明の第４の態様は、（ａ）本明細書中に記載の組換えバチルスを培地中で培養するステップと、（ｂ）前記ケラチナーゼを前記培地から回収するステップとを含む、ケラチナーゼの製造方法である。好ましくは、培地は、３％以下のタンパク質基質を含み、特に好ましい実施形態では、培地は、１％のダイズおよび１％の羽毛粉を含む。
【００１３】
本発明の上記および他の目的および態様を、本明細書中の図面および下記の記述でさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明を、当業者の知識および米国特許第５，７１２，１４７号、米国特許第５，５２５，２２９号、米国特許第５，１８６，９６１号、米国特許第５，１７１，６８２号、米国特許第５，０６３，１６１号、米国特許第４，９５９，３１１号、米国特許第４，９０８，２２０号、米国特許出願番号２００３０１０８９９１号（タイトル「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｓｉｓ」）；米国特許出願番号２００２０１９２７３１号（タイトル「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ」）、および米国特許出願番号２００２０１７２９８９号（タイトル「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｐｒｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」）（参照することによりこれら全ての開示全体が本明細書中に組み込まれる）に記載の情報に照らして本明細書中に記載の開示に基づいて実施することができる。
【００１５】
＜組換えバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ株の構築＞
ケラチナーゼ酵素を過剰産生することができるより良好な細菌株の開発のために、以下の２つのアプローチを使用して、酵素を過剰産生させた。１）プラスミド含有株を介したバチルス属中の遺伝子コピー数の増加、または２）細菌株の染色体中の複数の遺伝子コピーの作製。
【００１６】
ｋｅｒＡ遺伝子をクローニングし、バチルス・ズブチルス（Ｌｉｎ，Ｘ．，Ｓ．Ｌ  Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｓ．Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｈ．Ｓｈｉｈ．（１９９７），Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＷＤ−１  ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｊ  Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，１９：１３４−１３８）および大腸菌（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｈ．Ｓｈｉｈ（１９９９），Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＰＷＤ−１  ａｎｄ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｊ  Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：６０８−６１６）から発現させた。しかし、発酵時の分離不安定性によりバチルス属におけるプラスミドベースの酵素発現は安定ではなかった。封入体の形成およびプロケラチナーゼのインビトロ再折りたたみの複雑さにより大腸菌発現系でのケラチナーゼ発現が困難になり、それにより酵素収率が制限された。遺伝子発現を改良するために染色体組み込みが頻繁に使用されているが、タンデムに増幅した染色体遺伝子の不安定性が報告されている（Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ａ．Ｇａｌｉｚｚｉ（１９８５），Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：１２０３−１２１１；Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．（１９８４），Ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：１９１３−１９２１）。
【００１７】
本発明は、ｋｅｒＡ遺伝子を保有する組み込みベクターを構築し、その後このようなベクターを形質転換してプロテアーゼ欠損無芽胞性（ａｓｐｏｒｏｇｅｎｉｃ）宿主株バチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄに組み込む。単純交差キャンベル組換えにより、ｋｅｒＡ遺伝子の複数の組み込みコピーがバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄの染色体に組み込まれる。得られた組換えバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ株は、野生型バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１株と比較して有意に増加した酵素産生が示される。
【００１８】
本発明では、図１に示すように、ｋｅｒＡ遺伝子を単離するためにバチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１（ＡＴＣＣ  ５３５７５）を使用した。クローニングおよび発現研究用の宿主としてバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ（ＤＳＭ，ＮＶ，Ｈｅｔ  Ｏｖｅｒｌｏｏｎ  １，６４１１  ＴＥ  Ｈｅｅｒｌｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから提供され、以下の特許文献に記載されている。ＰＣＴ  ＷＯ８５／００３８号；ＰＣＴ  Ｗ０８８／０６６２号；ＰＣＴ  Ｗ０９１／１３１５号；欧州特許第０５７２０８８号；欧州特許第０６３５５７４号）を使用した。クローニングのための遺伝子供給源としてＰ４３プロモーター（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｉ，１９８７）およびｋｅｒＡを保有するプラスミドｐＬＢ２９を使用した。完全なベクターの宿主染色体への組み込みを容易にするためにα−アミラーゼ５’および３’フランキング領域を含むｐＬＡＴ８（ＤＳＭ，ＮＶ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから提供）由来の組み込みバチルス属発現ベクターｐＬＡＴ１０を使用した。ＰＷＤ−１を、５０℃の羽毛粉、ダイズ、またはＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で増殖させた。バチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ株を、日常的な形質転換および遺伝子発現のために２０〜５０μｇ／ｍＬネオマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で増殖させた。
【００１９】
＜ＤＮＡの操作＞
バチルス属由来のプラスミドを、迅速なアルカリ性ドデシル硫酸ナトリウム法（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｔａｉｔ，１９８３）によって調製した。ＰＷＤ−１の染色体ＤＮＡを、Ｄｏｉ（１９８３）に記載の方法を使用して単離した。制限酵素およびＤＮＡリガーゼをＰｒｏｍｅｇａおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから購入し、製造者が推奨するように使用した。Ｐｆｕ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）またはＴａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを使用し、以下の条件下でＰＣＲを行った。９４℃で１分間、５６℃で１．５分間、７２℃で２分間（３０サイクル）、および７２℃で５分間。ＤＮＡフラグメントを、０．８〜１．２％のアガロースゲルで分離した。所望のＤＮＡフラグメントおよびＰＣＲ産物を回収し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ，ＣＡ）によってそれぞれ精製した。
【００２０】
＜遺伝子クローニング、形質転換、およびバチルス・リケニフォルミスＤＢ１０４への組み込み＞
ｋｅｒＡ（１．４ｋｂ）およびＰ４３−ｋｅｒＡ（１．７ｋｂ）を、以下の表１に記載のプライマーを使用したＰＣＲによってｐＬＢ２９プラスミドから増幅させた。
【００２１】
【表１】
2006510351.tif 000002
【００２２】
図１に示すように、ｋｅｒＡまたはＰ４３−ｋｅｒＡを含む増幅ＤＮＡフラグメントを、ベクターへの消化プラスミドのα−アミラーゼ５’フランキングＤＮＡ配列とα−アミラーゼ３’フランキングＤＮＡ配列との間にライゲーションし、全てのα−アミラーゼＤＮＡ配列を置換した。
【００２３】
上記の新規に構築したプラスミド（ｐＮＫＥＲｌ、ＰＮＫＥＲ２、およびｐＮＫＥＲ４３）を、バチルス・ズブチルスＤＢ１０４にさらに形質転換した。バチルス・ズブチルスＤＢ１０４を、以前に記載のようにコンピテント細胞法によって形質転換した（Ｌｉｎ  ｅｔ．ａｌ，１９９７）。制限酵素消化分析によってベクター中のｋｅｒＡインサートの忠実度を評価した。
【００２４】
２０ｍｇ／Ｌネオマイシンを含むＬＢ培地での陽性形質転換体を増殖させた後、表２に示すように、形質転換体ｐＮＫＥＲｌ／ＤＢ１０４、ＰＮＫＥＲ２／ＤＢ１０４、およびｐＮＫＥＲ４３／ＤＢ１０４由来のケラチナーゼ活性を検出した。
【００２５】
【表２】
2006510351.tif 000003
【００２６】
＜バチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄの形質転換、組み込み、および発現＞
新規に構築した組み込みプラスミドｐＮＫＥＲ１およびｐＮＫＥＲ４３をバチルス・リケニフォルミスＤＢ１０４から単離し、改変プロトプラスト法によってバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄに形質転換した（Ｓａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）。全ての可能な形質転換体候補の遺伝子挿入について制限消化およびＰＣＲ増幅によってさらに確認した。単純交差キャンベル組換え（完全なプラスミドが宿主染色体の相補的な５’または３’−α−アミラーゼフランキング領域のいずれかに組み込まれる）によって組み込まれる。達成された最終的なおよその安定コピー数を、サザンブロット分析によって決定した。
【００２７】
＜形質転換体のスクリーニングおよび安定化＞
再生寒天プレート由来の形質転換体を、ミルク寒天プレートにて３７℃で一晩増殖させた。ハロ形成に基づいてケラチナーゼを産生する新規のクローンを、選択マーカーとして異なるレベルのネオマイシン（１０〜１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地でインキュベートした。３７℃で一晩のＬＢ培地での増殖後、培養物を、遊離プラスミドを除去するために４５℃で４〜６時間インキュベートした。その後、これらの形質転換体を非選択性１％ダイズ培地に移すことによって安定化し、３７℃で２日間インキュベートした。培養物の上清を、アゾカゼイン／アゾケラチンアッセイによってプロテアーゼ活性について分析した。ケラチナーゼを過剰発現した株についての候補を、新鮮な非選択性培地に少なくとも数世代さらに移して新規の株の安定性を確認した。
【００２８】
５００個を超える陽性形質転換体（ミルク寒天プレートにおけるハロ形成に基づく）を、種々のレベルのネオマイシン（０〜１００μｇ／ｍＬ）を含む固体培地および液体培地の両方でスクリーニングした。１０世代超後、ケラチナーゼ収率に基づいて、１８個（以下の表３に示すＰＪＴ１〜ＰＪＴ１８）のＴ３８８Ｄ形質転換体を選択した。
【００２９】
【表３】
2006510351.tif 000004
【００３０】
コロニーＰＣＲを使用して、これらの形質転換体中のｋｅｒＡ遺伝子の組み込みを同定した。全ての選択された株は、１．４ｋｂのｋｅｒＡ遺伝子を含んでおり、細胞中に遊離プラスミドは検出されなかった。
【００３１】
同一の増殖条件で野生型バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１と比較した場合、これらの新規の形質転換体から産生されたプロテアーゼ活性は２．７倍に増加した。これらの形質転換体（ＰＪＴ１６、ＰＪＴ３、およびＰＪＴ４）由来のケラチナーゼ収率を、ウェスタンブロットによってさらに分析した（データ示さず）。
【００３２】
結果は、新規のクローンから発現したプロテアーゼを、抗ケラチナーゼ抗血清によって特異的に探索することができることを示した。ゲルバンド密度の測定による酵素発現の定量後、ＰＪＴ１６、ＰＪＴ３、およびＰＪＴ４から産生されたケラチナーゼは、それぞれ１．６倍、２．９倍、および２．１倍増加した。
【００３３】
＜遺伝子およびタンパク質の分析＞
形質転換ＤＮＡの組み込み遺伝子コピー数を、サザンハイブリッド形成技術によって分析した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，１９８９）。全単離染色体ＤＮＡを単離し、制限酵素で消化した。電気泳動後、ＤＮＡをニトロセルロースメンブレン（Ｓｉｇｍａ）に移した。ｋｅｒＡ遺伝子検出用のジゴキシゲニン標識プローブを、ＰＣＲ  ＤＩＧ標識ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したＰＣＲによってｐＬＢ２９から増幅した。製造者が推奨するようにハイブリッド形成緩衝液を使用して、ハイブリッド形成オーブンにて４２℃でハイブリッド形成を行った。
【００３４】
形質転換体の培養培地を回収し、タンパク質分解活性およびケラチン分解活性についてアッセイした（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。５％ＴＣＡによって沈殿させ、濃縮タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）によって分析した。Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）に記載のように、ウェスタンブロッティングを改変した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに移し、抗ケラチナーゼウサギ抗血清で探索した。
【００３５】
Ｃｈｅｍｉｌｍａｇｅｒ（商標）４４００  ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍおよびＰｈａＥａｓｅ（商標）Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ，ＣＡ）の使用によって、サザンブロットおよびウェスタンブロット由来のＤＮＡおよびタンパク質の濃度を定量した。
【００３６】
以前に（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）に記載のように、アゾケラチン加水分解によってケラチナーゼ活性を測定した。アゾカゼイン加水分解を改変し、総タンパク質活性の決定に使用した（Ｓａｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｃｒｏａｓｓａｙ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６）によって、タンパク質濃度を決定した。
【００３７】
＜多染色体組み込みからのタンパク質発現＞
多遺伝子染色体組み込みを、サザンブロット分析によって確認した。５つの新規の株を分析に選択した。結果は、染色体への多遺伝子コピーの組み込みによって酵素産生が増大するが、タンパク質分泌は遺伝子コピー数に比例しないことを示した。６つを超えるｋｅｒＡ遺伝子コピーが組み込まれた株では酵素収率が減少した。染色体中のケラチナーゼ発現の増加に適切な遺伝子コピー数は、３〜５個であった。
【００３８】
ケラチナーゼ産生に及ぼす構成性プロモーターＰ４３および培地の影響。表４に示すように、ｋｅｒＡの前にクローン化した場合、構成性プロモーターＰ４３により、Ｔ３９９Ｄにおけるケラチナーゼ発現が改良された。
【００３９】
【表４】
2006510351.tif 000005
【００４０】
Ｐ４３プロモーターを発現ベクターから排除した場合、ケラチナーゼ発現レベルはＰＷＤ−１のレベルよりも低下した。Ｐ４３プロモーターを使用せずにｐＮＫＥＲから形質転換した全ての陽性クローンは、ケラチナーゼ収率がＰＷＤ−１よりも低い。ＰＷＮ３３９（最良のクローン）は、このクローンが多遺伝子コピーを含むにもかかわらず、ＰＷＤ−１の酵素活性の８０％しか産生しなかった。この結果は、バチルス・ズブチルスおよびバチルス・リケニフォルミスの両方においてＰ４３プロモーターがｋｅｒＡの転写効率を有意に改良することを示した。
【００４１】
単離組み込み体由来のケラチナーゼ産生に及ぼす培地の影響を特徴付けるために、より高濃度の基質を使用した。図２に示すように、より高濃度のダイズまたは羽毛粉を発酵培地に含めた場合、総プロテアーゼ活性が増加した。３％を超えるタンパク質基質を使用した場合、酵素収率は減少することが認められた。至適培地条件は１％羽毛粉と混合した１％ダイズを含み、この培地では、ケラチナーゼ活性はＰＷＤ−１と比較して約４倍に増加した。
【００４２】
本発明では、ケラチナーゼを過剰産生させるために染色体中に複数の組み込みｋｅｒＡを保有する安定なバチルス・リケニフォルミス株を構築した。染色体中に１個から８個までの範囲の異なる遺伝子コピー数（データ示さず）を、選択培地中のある程度のネオマイシンの組み込みによって首尾よく単離した。バチルス・ズブチルス発現系と比較して、より高い酵素活性が得られる安定な組み込み体を開発した。バチルス・ズブチルスのプラスミド含有発現系と異なり、バチルス・リケニフォルミス中のｋｅｒＡの染色体組み込みにより、複製プラスミドに共通する分離および構造不安定性が回避された（Ｂｒｏｎ  ａｎｄ  Ｌｕｘｅｎ，１９８５；Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｐｒｉｍｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｅｈｒｌｉｃｈ，１９８１）。
【００４３】
一定のコピー数を超えた染色体中の複数の遺伝子コピー（データ示さず）はケラチナーゼのより高い産生に不利であることも証明された。染色体中に約１６個の遺伝子コピーを有する形質転換体はより少数のコピー数の株よりもケラチナーゼ活性が低かった。染色体あたり３個〜５個のコピー数の株は、ケラチナーゼ産生に最適であることが認められた。
【００４４】
Ｐ４３プロモーターを発現カセットに移入し、Ｔ３９９Ｄ株に組み込まれた場合、ケラチナーゼ収率は、天然のプロ−モーターのみを有する組み込み体と比較して有意に増加した。これらの結果は、この強力プロモーターが転写効率の改良に有用であり、且つＴ３９９Ｄ由来のケラチナーゼ発現で重要な役割を果たすことを示した。
【００４５】
新規の株を３％までのダイズまたは羽毛粉を含む培地で増殖させることができ、この培地中で酵素活性の倍加が証明された（図２に示す）。対照的に、２％を超えるレベルのダイズまたは羽毛粉を含む同一の培地でＰＷＤ−１を増殖させた場合、酵素産生は抑制された（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｉｈ，１９９９）。この結果は、大量発酵におけるケラチナーゼ産生を改良するために培地中でのより高い濃度のタンパク質基質の使用を容易にするものであった。
【００４６】
まとめると、バチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄの染色体に組み込まれた複数のｋｅｒＡコピーを含む新規の株を開発した。組み込み体中の遺伝子のコピー数および発現を、それぞれサザンブロットおよびウェスタンブロットで決定した。形質転換株を１％ダイズおよび１％羽毛粉（ＦＭ）の培地条件下で増殖させた場合、ケラチナーゼ活性は約４〜６倍に増加した（図２に示す）。
【００４７】
＜組換えバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ株を使用した粗ケラチナーゼ酵素の発酵産生＞
組換えバチルス・リケニフォルミスＴ３９９Ｄ株（以後、「バチルス・リケニフォルミスＴ１株」）を使用して、ケラチナーゼ産生のための大量発酵ストラテジーをデザインした。
【００４８】
＜ＬＢ培地でのフラスコ培養＞
製造者の説明書に従って調製した、１．０Ｌの蒸留水、１５ｇのＢａｃｔｏ寒天、１０ｇのＮａＣｌ、１０ｇのＢａｃｔｏトリプトン、および５．０ｇ酵素抽出物を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中でフラスコ培養を行った。バチルス・リケニフォルミスＴ１株を、グリセロールストックからＬＢプレートを画線し、３７℃で１８時間増殖させた。バチルス・リケニフォルミスＴ１株の１つのコロニーを、ＬＢプレートから５００ｍｌのＬＢ培地を含むフラスコに移し、３７℃で６時間増殖させながら細胞増殖を６６０ｎｍでの光学密度の測定（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  Ｓｅｒｉｅｓ  ６６０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）によってモニタリングした。６時間の増殖後、ＯＤ660は１．０以上であった。
【００４９】
＜種培養＞
バチルス・リケニフォルミスＴ１株の種培養物を、０．７ｇ／ＬＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ  脱脂ＮＵＴＲＩＳＯＹ（登録商標）大豆粉（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｏ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬから市販されている）、および０．１  ｇ／Ｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４または２８９（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている）を含む培地中で増殖させた。種培養物の初期ｐＨを、１ＭのＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００５０】
５００ｍｌのフラスコ培養物を、種培養培地を含む約１０Ｌ〜２０Ｌの第１段階の種発酵槽に移し、２．５％〜５％の接種物サイズに達するまで３７℃で８時間増殖させた。第１段階の種培養物を、１００Ｌ、２５０Ｌ、または８００Ｌの第２段階の種発酵槽に移し、３７℃で８時間増殖させた。
【００５１】
＜産生培地＞
バチルス・リケニフォルミスＴ１株に使用した産生培養培地は、０．７ｇ／ＬＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１３ｇ／Ｌ  脱脂ＮＵＴＲＩＳＯＹ（登録商標）大豆粉（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｏ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ，ＵＳＡから市販されている）、４０ｇ／Ｌ  Ｌｏｄｅｘ５（Ｃｅｒｅｓｔａｒ  ＵＳＡ，Ｈａｍｍｏｎｄ，ＩＮからＣ*ｄｒｙ  ＭＤ０１９６０として商品化されている）、１３ｇ／Ｌ羽毛粉、および０．１  ｇ／Ｌ  Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４または２８９（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから市販されている）を含む。産生培地の初期ｐＨを、１Ｍ  ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００５２】
第２段階の種培養物を、最終段階の培養のための産生培養培地を含む産生発酵槽に移した。３７℃で２６時間最終段階の培養を行い、これにより回収前に総培養期間が４８時間に達した。
【００５３】
培養培地の初期ｐＨを７．０に調整したが、上記培養段階ではｐＨ調整は行わなかった。バチルス・リケニフォルミスＴ１株の至適溶存酸素レベルは約３０％である。接種物サイズは約２．５〜５％であり、接種物の齢は約１２時間であった。
【００５４】
＜回収およびその後の処理＞
回収前に産生培養物の酵素活性をチェックした。遠心分離によって培養上清と細胞塊とを分離し、その後限外濾過または蒸発によって濃縮した。濃縮液体酵素を吹き付け乾燥させた。
【００５５】
あるいは、培養上清を細胞塊からの分離後に濃縮せずに直接吹きつけ乾燥させた。
【００５６】
＜酵素収率および酵素活性＞
１００Ｌの産生培養物について、回収前にアゾカゼインアッセイによって測定した酵素活性は３０，０００〜３５，０００Ｕ／ｍＬであり、細胞数は６×１０9ＣＦＵ／ｍＬであった。１００Ｌの産生培養物の総乾燥重量は、４０ｇ／Ｌであり、これには、１５ｇ／Ｌの不溶性乾燥重量および２５ｇ／Ｌの可溶性乾燥重量を含んでいた。
【００５７】
直接乾燥させた培養上清の粗酵素収率は２０ｇ／Ｌであり、１０ｋＤａ分子量カットのＰｅｌｌｉｃｏｎ濾過によって得られた培養濃縮物由来の粗酵素収率では１６ｇ／Ｌであった。乾燥粗酵素の酵素活性は、アゾカゼインアッセイによって測定したところ、１，０００，０００Ｕ／ｇを超えた。
【００５８】
上記の方法に従って産生された乾燥粗ケラチナーゼ酵素抽出物を、家禽用飼料の消化性および栄養価を改良する方法のための飼料添加物として家禽類飼料に補完することができる。
【００５９】
［文献］
【表５Ａ】
2006510351.tif 000006
【表５Ｂ】
2006510351.tif 000007
【表５Ｃ】
2006510351.tif 000008
【００６０】
本発明は、種々の例示的な実施形態、特徴、および態様に関して記載しているが、これらによって本発明の有用性は制限されることがなく、むしろ、種々の他の修正形態、変更形態、および他の実施形態に拡大して含まれ、これらは本明細書中の開示に基づいて容易にその内容を当業者に示唆することが認識される。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲の精神および範囲内にこのような全ての修正形態、変更形態、および他の実施形態を含むと広く解釈されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】バチルス・リケニフォルミスＰＷＤ−１からのｋｅｒＡの単離を示す図である。
【図２】新規の形質転換体ＰＪＴ−３由来のケラチナーゼ産生に及ぼす培地の影響を示す図である。アゾカゼインアッセイによってプロテアーゼ活性を決定した。
【図１】
2006510351.tif 000009
【図２】
2006510351.tif 000010
【国際調査報告】
2006510351.tif 000011
2006510351.tif 000012