(57)【要約】本発明は、癌の検出のための診断および予後方法において有用な、切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォーム（ＣＤＰ/Ｃｕｘ）に対する抗体を供する。さらに、癌の検出のために、ｐ７５をコードするＲＮＡ転写物の検出方法を供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームの増加レベルが癌の存在またはステージを示す、試料中の切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームの検出を含んで成る癌の存在またはステージを診断する方法。
【請求項２】
上記切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームが、タンパク質分解的にプロッセッシングされたｐ２００のアイソフォームを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記タンパク質分解的にプロッセッシングされたｐ２００のアイソフォームが、ｐ１００またはｐ１１０を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームがｐ７５またはｐ７５ポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームのレベルの検出が、試料と切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスアイソフォームを特異的に認識する抗体とを接触させ、これにより抗体を切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームと結合させ；結合抗体を検出し；そして、切頭されたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームのレベルを既知のスタンダードと比較することを含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質分解的にプロセッシングされたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスｐ２００のアイソフォームを特異的に認識する抗体。
【請求項７】
上記タンパク質分解的にプロセッシングされたＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスｐ２００のアイソフォームがｐ１００またはｐ１１０を含んで成る、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのｐ７５アイソフォームを特異的に認識する抗体。
【請求項９】
ＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームのレベルの検出が、ｐ７５ポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物のレベルの評価、および、試料中のｐ７５ＲＮＡ転写物レベルと既知のスタンダードとの比較を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームを特異的に認識する抗体を含んで成る、ＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/Ｃｕｔホメオボックスのアイソフォームの存在の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＣＣＡＡＴ-置換タンパク質/ｃｕｔホメオボックス（ＣＤＰ/Ｃｕｘ）は全ての後生動物中に存在する転写因子のファミリーに属し、そして、増殖および分化の制御に関係する（Nepveu (2001) Gene 270 : 1-15)。キイロショウジョウバエにおいて、多くの表現型は、Ｃｕｔ、ＣＤＰ/Ｃｕｘホモログの組織特異的なエンハンサーと干渉する転移性の絶縁体配列の挿入に起因する（Jack,et al.(1991) Development 113:735-747;Jack and DeLotto(1995) Genetics 139:1689-1700;Modolell,et al.(1983) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1678-1682;Cai and Levine(1997) EMBO J.16:1732-1741;Dorsett(1993) Genetics 134:1135-1144)。その影響された組織は、翼（「ｃｕｔ翼」）、脚、外感覚器、マルピーギ尿細管、気管系、および中枢神経系中のいくつかの構造を含む（Jack,et al.(1991) supra;Jack(1985) Cell 42:869-876;Jack and DeLotto(1992) supra;Liu,et al.(1991) Genetics 127:151-159;Liu and Jack(1992) Dev.Biol.150:133-143;Bodmer,et al.(1987) Cell 51:293-307;Blanc(1942) Univ.Calif.Publ.Zool.49;Braun(1942) J.Exp.Zool.84:325-350;Hertweck(1931) J.Exp.Zool.139:559-663)。マウスおよびニワトリがＣｕｘ-１およびＣｕｘ-２を有するように、ヒトは、２つのＣＤＰ/Ｃｕｘ遺伝子であるＣＤＰ-１およびＣＤＰ-２を有する（Neufeld,et al.(1992) supra;Valarche,et al.(1993) Development 119:881-896;Quaggin,et al.(1996) J.Biol.Chem.271:22624-22634)。Ｃｕｘ-２は最初に神経組織中で発現されるが、Ｃｕｘ-１は主に組織に存在する（Neufeld et al.(1992) supra;Andres,et al.(1992) Development 116:321−334;Ellis,et al.(2001) Genes Dev.15:2307-2319)。Ｃｕｘ-１ノックアウトマウスは、ねじれた頬髯、成長遅延、肺上皮の遅延した分化、改変した毛の濾胞形態形成、オスの生殖不能、並びにＴおよびＢ細胞中の欠損を含む様々な器官における表現型を示す（Ellis,et al.(2001) supra;Sinclair,et al.(2001) Blood 98:3658-3667;Luong,et al.(2002) Mol.Cell.Biol.22:1424-1437;Tufarelli,et al.(1998) Dev.Biol.200:69-81)。小型のｃｕｘ-１ノックアウトマウスと比べ、Ｃｕｘ-１を発現する遺伝子組み換えマウスは、ＣＭＶエンハンサー/プロモーターの制御下において、多臓器過形成および臓器肥大を示す（Ledford,et al.(2002) Dev.Biol.245:157-171)。このように、ショウジョウバエおよびマウスにおける遺伝子実験は、ＣＤＰ/Ｃｕｘ/Ｃｕｔ遺伝子が様々な組織の発達および恒常性において重要な役割を果たすことを示す。
【０００２】
組織培養液中で、ＣＤＰ/Ｃｕｘの発現および活性化は細胞の増殖に関係し（Holthuis,et al.(1990) Science 247:1454-1457;van Wijnen,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2573-2577;Coqueret,et al.(1998) EMBO J.17:4680-4694)、その遺伝子の抑圧は末期の分化細胞中で起こり（Pattison,et al.(1997)J.Virol.71:2013-2022;Lawson,et al.(1998)Blood 91:2517-2524;van Gurp,et al.(1999) Cancer Res.59:5980-5988;O'Connor,et al.(2000) J.Virol.74:401-410;Skalnik,et al.(1991) J.Biol.Chem.266:16736-16744;Teerawatanasuk,et al.(1999) J.Neurochem.72:29-39)、そして、マトリックス付着領域の調節が起こった（Liu,et al.(1997) Mol.Cell.Biol.17:5275-5287;Banan,et al.(1997) J.Biol.Chem.272:18440-18452;Chattopadhyay,et al.(1998) J.Biol.Chem.273:29838-29846;Wang,et al.(1999) Mol.Cell.Biol.19:284-295;Stunkel,et al.(2000) J.Virol.74:2489-2501)。ＣＤＰ/Ｃｕｘ/Ｃｕｔタンパク質はＤＮＡ結合性ドメインを含む。全てのタンパク質は、少なくともＣｕｔホメオドメイン（ＨＤ）および３つのＣｕｔ反復（ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３）を含む。ホメオボックス遺伝子のｃｕｔスーパークラスは、３つのクラスに分割された：ＣＵＸ、ＯＮＥＣＵＴおよびＳＡＴＢ（Burglin and Cassata(2002) Int.J.Dev.Biol.46:115-123)。ショウジョウバエＣｕｔ、ヒトＣＤＰおよびマウスＣｕｘ遺伝子は３つのＣｕｔ反復を含み、各種においてもまた、１つのＣｕｔ反復を含むＯＮＥＣＵＴ遺伝子が存在する（Neufeld,et al.(1992) supra;Valarche,et al.(1993) Decelopment 119:881-896;Blochlinger,et al.(1988) Nature 333:629-635;Lemaigre,et al(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9460-9464;Lannoy,et al.(1998) J.Biol.Chem.273:13552-13562)。ＳＡＴＢ１は２つのＣｕｔ反復様ドメインおよび多岐にわたるＣｕｔ様ホメオドメインを含む（Dickinson,et al.(1997) J.Biol.Chem.272:11463-11470)。
【０００３】
個々のＣｕｔ反復はそれら自身上のＤＮＡと結合することできないが、２番目のＣｕｔ反復またはＣｕｔホメオドメインと協力する必要がある（Moon,et al.(2000) J.Biol.Chem.275:31325-31334)。２つのＣＤＰ/ＣｕｘＤＮＡ結合活性は、細胞中において報告された。ＣＤＰ/Ｃｕｘ ｐ２００は、ＣＲ１ＣＲ２と同様に、一過性にＤＮＡと結合し、そして、ＣＣＡＡＴ-置換活性を輸送する（Neufeld,et al.(1992) supra;Skalnik,et al.(1991) supra;Moon,et al.(2000) supra;Barberis,et al.(1987) Cell 50:347-359)。細胞周期のＧ１/Ｓの移行において、ｐ２００のタンパク質分解性の切断はＣＤＰ/Ｃｕｘ ｐ１１０を産出し、それは、ＣＲ２ＣＲ３ＨＤを含み、そして、異なるＤＮＡ結合特異性およびキネティクスを示す（Moon,et al.(2001) Mol.Cell.Biol.21:6332-6345)。特に、ｐ１１０はＤＮＡと安定な相互作用を形成することができる。さらには、ｐ１１０アイソフォームは、子宮平滑筋腫において、高レベルで発現される（Moon,et al.(2001) supra)。
【０００４】
現在の乳癌のための予後マーカーは不十分である。良好な予後乳癌をともなう患者の７０％のみが、手術のみで実際に治癒するが、３０％は癌が再発する。さらに、乳癌において最も有効な予後因子であるリンパ管状態の確立は、合併症無しでは存在しない。例えば、リンパ浮腫、腋窩管切開の可能性のある交配的な合併症は、患者の２４％未満において発生しうる。それゆえ、乳房腫瘍の診断上における予後的および予測的な指標の改良が必要である。
【０００５】
このたび、新規のＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォーム、ｐ７５は、ＣＤＰ/Ｃｕｘ座のイントロン２０中で開始されるｍＲＮＡによりコードされることが発見された。この新規なアイソフォームは、ｐ２００、ｐ１１０およびｐ１００ＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームのものとは別々のＤＮＡ結合性を示す。イントロン２０中で開始されるｍＲＮＡの発現は、ある組織または細胞に制限されるが、その発現は、乳房腫瘍細胞株中および初期のヒトの乳房腫瘍中、並びに、他の癌組織中で活性化される。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、癌を有する、あるいは、有する疑いのある患者から単離した資料中のＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームのレベルを検出することによる、癌の診断方法を供する。切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームの増加レベルは、癌の存在またはステージを示す。
【０００７】
ある態様は、試料中の切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームのレベルを検出するための抗体結合アッセイを使用すること、および、上記レベルを既知のスタンダードと比較することを供する。
【０００８】
他の態様は、試料中のｐ７５転写レベル評価すること、および、上記レベルを既知のスタンダードと比較することを供する。
【０００９】
また、資料中の切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームの検出キットを供する。
【００１０】
本発明のこれらおよび他の観点は、以下の発明の説明中でより詳細にする。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームのレベルを検出することにより、癌の存在およびステージを診断する方法を供する。ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォームは、一般的に、ｐ２００のタンパク質分解的にプロセッシングされたアイソフォームである。すなわち、ｐ２００は完全長アイソフォーム以下に産出するためにプロテアーゼにより切断される。特に、ｐ１００およびｐ１１０の切頭化アイソフォームは、ＣＤＰ/Ｃｕｘ座のイントロン２０中で開始されたｍＲＮＡによりコードされる新たに発見されたｐ７５アイソフォームとして是認される。
【００１２】
ｐ７５アイソフォームは、ＣＤＰ-Ｃｕｘ座のエクソン１９、２０および２１を含むリボプローブを使用してＲＮａｓｅ マッピング分析において同定した。予測より小さな保護されたフラグメントは、ある出所、特に、ヘラ細胞および胎盤由来のＲＮＡサンプルで産出した。この結果は、エクソン２１を含んだもう１つのＣＤＰ/Ｃｕｘ転写物が存在したがエクソン２０は含まなかったことを示した。また、ｐ７５をコードするこのＲＮＡ転写物は、本明細書において、Ｉ２０-ｍＲＮＡを意味する。その新規な転写物の５’末端は、リバースプライマーとして２つの連続的なエクソン２１由来のオリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡ末端の急速な増幅（ＲＡＣＥ）方法により、胎盤からクローン化した。ＤＮＡ配列決定分析は、エクソン２１のＲＡＣＥ-増幅化配列の上流がイントロン２０から始まり、そして、イントロン２０/エクソン２１ジャンクションの上流、少なくとも５００ｎｔに及んだことを示した。ＲＡＣＥ反応において、夾雑しているゲノムＤＮＡが鋳型として貢献した可能性を除外するため、フォワードプライマーとして、エクソン１９またはイントロン２０由来のオリゴヌクレオチドを、および、リバースプライマーとして、エクソン２２由来のヌクレオチドを使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）分析を行った。異なる大人のヒト組織（Clonetech,Palo Alto,CA)由来の第１鎖ｃＤＮＡの調製物を、材料の出所として使用した。エクソン１９および２２のプライマーを使用して６０９ｂｐのフラグメント、並びに、イントロン２０およびエクソン２２のプライマーを使用して４７４ｂｐのフラグメントを得た。後者は、イントロン２０、エクソン２１およびエクソン２２に由来する配列を含むｍＲＮＡの予想した大きさと一致する。この結果は、エクソン２１の上流を開始し、そして、エクソン２０を含まないＣＤＰ/Ｃｕｘの存在を確認した。マウスの組織から単離したＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ分析は、類似する転写物が、そのマウスの胎盤および胸腺において高レベルで発現されることを確認した。マウスのＩ２０-ｍＲＮＡは成熟および未成熟Ｔ細胞中で発現したが、成熟ＣＤ８+Ｔ細胞中よりも成熟ＣＤ+４細胞中において高レベルで発現した。このため、これらの発見は、Ｉ２０-ｍＲＮＡが組織および細胞型に特異的な様式において発現することを示す。
【００１３】
予想した大きさのＲＴ-ＰＣＲ生成物は、エクソン２１の上流、約５００、１５００、２５００に位置したフォワードプライマーで得た。エクソン２１の上流３０００および３５０００ｎｔに位置したオリゴヌクレオチドで得た生成物はなかった。それから、エクソン２１の上流、−２２７０から−２９７８に位置するヌクレオチドを含むリボプローブで、ＲＮａｓｅマッピング分析を行った。独特な、約２００ヌクレオチドの保護されたフラグメントが観察され、Ｉ２０-ｍＲＮＡの転写が、イントロン２０/エクソン２１ジャンクションの上流、約２．５ｋｂｐで開始することを示している。イントロン２０のこの領域に対応する核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として供する。これらの結果は、組織特異的な様式において発現し、そしてエクソン２１の上流で開始される新規なＣＤＰ/Ｃｕｘ ｍＲＮＡを限定する。
【００１４】
そのＩ２０-ｍＲＮＡは、長い５’-非翻訳配列、続いて、エクソン２１の始まりを開始する開いた読み枠（open reading frame)を含む。ＡＵＧコドンは、ＨＳＣＤＰ ｃＤＮＡ配列のｎｔ３２２４に対応する位置に存在する（目録Ｎｏ.Ｍ７４０９９）。この位置における配列、ＣＣＧＡＵＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、Ｋｏｚａｋコンセンサスに一致しない。さらに、タンパク質は in vitro 転写/翻訳系において発現し、そしてＵＵＣのＡＵＧでの置換は完全に翻訳を除去した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の、マウスＩ２０-ｍＲＮＡをコードする核酸配列を宿す発現ベクターでのトランスフェクションは、マウスの胸腺中に存在するタンパク質と共遊走する７５ｋＤａの新規なタンパク質を増加させた。このタンパク質は、Ｃ末端α１３００抗体で検出されたが、α２３Ｎ末端ＣＤＰ/Ｃｕｘ抗体では検出されなかった。
【００１５】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において、トランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞由来の核抽出物は、α１３００ ＣＤＰ/Ｃｕｘ抗体でスーパーシフトされることができるが、無関係の抗体ではされない遅延した複合体を産出した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、そのカルボキシ終端にインフルエンザウイルスのヘマトグルチニン（hematoglutinin)（ＨＡ）タグを伴うｐ７５を発現するベクターでトランスフェクションすると、トランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の核中に、間接的な免疫蛍光による特異的なシグナルが検出された。これらの結果は、Ｉ２０-ｍＲＮＡが、ＤＮＡに局在化し、そして結合する７５ｋＤａのＣＤＰ/Ｃｕｘタンパク質をコードすることを実証する。
【００１６】
ＣＤＰ/Ｃｕｘ ｐ１１０アイソフォームはＣＲ２、ＣＲ３およびＨＤを含み、一方、ｐ７５アイソフォームはＣＲ３およびＨＤを含む。２つのアイソフォームのＤＮＡ結合性を、細菌性発現化、ヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化融合タンパク質およびトランスフェクションした哺乳動物細胞由来の核抽出物を使用して比較した。その精製したｐ１１０およびｐ７５のヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化タンパク質は、それぞれ、０．７×１０-9Ｍおよび１．１×１０-9Ｍの見かけ上の解離定数を伴う類似したＤＮＡ結合アフィニティを示した。反対に、ｐ１１０およびｐ７５のＤＮＡ結合キネティクスは異なった。；ｐ７５のＤＮＡに対する結合はｐ１１０よりも安定的であった。これらの発見に一致して、ｐ１１０およびｐ７５の解離速度は、それぞれ、０．８および６．１５分であった。これらの結果は、ｐ７５ ＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームは、Ｓ期において発現するｐ１１０アイソフォームよりもＤＮＡに対して安定的に相互作用することを示す。ｐ７５およびｐ１１０ＣＤＰ/Ｃｕｘの転写調節特性は、レポーターアッセイを使用して並行して分析した。様々な実験結果は、ｐ１１０およびｐ７５タンパクともに、ｐ２１WAF1/CIP1レポーターを抑制し、類似した様式において、ＤＮＡｐｏｌαレポーターからの発現を刺激したことを示した。このように、ｐ７５ ＣＤＰ/Ｃｕｘは核に局在し、ＤＮＡと結合し、そして、標的遺伝子の転写を調節することができる。
【００１７】
ＣＤＰ/Ｃｕｘの完全長およびＩ２０-ｍＲＮＡの発現は、乳房腫瘍細胞株のパネル中、およびヒトの乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）中で分析した。ＲＮａｓｅ保護分析による調査では、Ｉ２０-ｍＲＮＡに対応するフラグメントは、ＭＣＦ７、ＳｋＢｒ３、ＢＴ２０、ＭＤＡ４３６、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４６８、およびＭＣＦ１０Ａ中で検出されたが、ＢＴ５４９、ＭＤＡ４３５ｓ、またはＭＣＦ１２Ａ乳房腫瘍細胞株では検出されなかった。ＲＴ-ＰＣＲアッセイにおいて、Ｉ２０-ｍＲＮＡに対応するフラグメントは、分析した全ての乳房腫瘍細胞株で検出された（ＭＣＦ１２Ａ、ＭＣＦ１０Ａ、ＭＣＦ７、ＢＴ２０、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４３６、ＳｋＢｒ３、Ｔ４７ＤおよびＺＲ-７５-１）。同様に、ウェスタンブロット分析での調査によると、ｐ７５タンパク質は、ＭＤＡ２３１、ＭＣＦ１０Ａ、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７乳房腫瘍細胞株中で検出されたが、ＨＭＥＣ細胞中では検出されなかった。細胞株の２対中のＩ２０-ｍＲＮＡの発現をさらに分析した。Ｉ２０-ｍＲＮＡの発現は、腫瘍化Ｈｓ５７８Ｔ細胞株中の方が、その対応細胞である非腫瘍化Ｈｓ５７８Ｂｓｔ中よりも３-４倍高かった（Hackett,et al.(1977) J.Natl.Cancer Inst.58:1795-1806)。不死化および形質転換化したマウス器官の乳房内皮細胞株の対、ＨＣ１１およびノッチ-ＨＣ１１（Diecart,et al.(1999) Oncogene 18:5973-5981)は、また、マウスＣＤＰ/Ｃｕｘ Ｉ２０-ｍＲＮＡが形質転換した株中において、高レベル（約２倍）で発現したことを示した。このように、これらの発見は、ＣＤＰ/Ｃｕｘ Ｉ２０-ｍＲＮＡおよびｐ７５タンパク質の発現が多くの乳癌細胞中で活性化されることを示す。
【００１８】
ｐ７５が、乳房上皮細胞に細胞の形質転換に関係する特性を与えるか否かを決定するため、ｐ７５を安定的に発現するＴ４７Ｄ細胞株を評価した。Ｔ４７Ｄ細胞は、乳房腫瘍に由来するが、それらはコラーゲン中で尿細管を分化し、そして形成する能力を保持する（Keely(2001) Methods Enzymol.333:256-266;Keely,et al.(1995) J.Cell.Sci.108:595-607)。このため、これらの細胞は、推定上の発癌遺伝子の効果の研究のための細胞モデルを供する。興味深いことに、ｐ７５を発現するＴ４７Ｄクローンは、もはや、コラーゲン中で尿細管を形成することができなかった。さらに、ｐ７５を発現するＴ４７Ｄクローンにより産出されたコロニーは、凹窩シストではなく、しかし、代わりに中央の管腔を欠く細胞の緻密な凝集であった。これらの結果は、ＣＤＰ/Ｃｕｘ ｐ７５、Ｔ４７Ｄの強制的な発現において、細胞が、組織化された上皮シートを形成する能力を失うことを示す。
【００１９】
Ｉ２０-ｍＲＮＡは、多くの乳癌において発現するが、正常な乳房組織では発現しない。ＲＴ-ＰＣＲ分析を使用して、Ｉ２０-ｍＲＮＡは、既知の乳房の症状を除く女性由来の縮小乳房形成組織の試料から単離したＲＮＡ中では検出されなかった。この結果は、Ｉ２０-ｍＲＮＡが、正常なマウス乳腺中で発現しなかったという発見と一致する。しかしながら、３つの乳癌のケース、Ｃ８９２１Ｄ、Ａ１６８ＡおよびＣ８９６１Ｂ腫瘍において、強力なＩ２０-ｍＲＮＡシグナルが観察された。これらの腫瘍の２つ、Ｃ８９２１ＤおよびＣ８９６１Ｂは、浸潤性小葉癌腫であり、一方、Ａ１６８Ａは、極めて散在性の成長パターンを伴う浸潤性の管、小葉混合癌腫に分類された。低い（Ｃ９９７８Ｂ、Ｃ９９９１Ｂ、Ａ３５Ｃ、Ａ６７Ａ、Ｂ１１３０５Ｄ、Ｃ１０５４４Ｂ、Ｃ１０５４４Ｂ、Ｃ８００Ａ、Ｃ８６６４４ＡおよびＣ８９９６Ｄ腫瘍）または無（Ｃ９０９６ＡおよびＣ７９０３Ａ腫瘍）のＩ２０-ｍＲＮＡ発現を示す全ての他の腫瘍は、管癌腫として分類された。
【００２０】
Ｉ２０-ｍＲＮＡの発現は、より散在的な成長パターンに関係しているように見える。このため、管、小葉または小葉/管混合癌腫のいずれかの分類に基づき選択された浸潤性癌腫の拡大パネルにおいて、Ｉ２０-ｍＲＮＡ発現を試験した。Ｉ２０-ｍＲＮＡ発現レベルは、浸潤性管癌腫と比較して、浸潤性小葉および浸潤性小葉/管混合癌腫と有意に関係した（表１）。
【表１】
2006506645.tif 000002
【００２１】
これらの結果は、Ｉ２０-ｍＲＮＡが、粘着性のクラスターおよび細管を形成する能力を示す乳房腫瘍と比較して、より散在的な成長パターンを示す乳房腫瘍のサブセットにおいて高レベルで発現することを示す。これらの結果は、乳房上皮細胞が、Ｉ２０-ｍＲＮＡの強制的な発現におけるコラーゲン中での細管を形成するそれらの能力を喪失したことを示す組織培養液アッセイと一致する。
【００２２】
Ｉ２０-ｍＲＮＡおよびｐ７５は、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）細胞株中で発現する。ＣＤＰ/Ｃｕｘ α１３００抗体によるウェスタンブロッド分析において、４つのＡＭＬ細胞株、ＫＧ-１ａ、ＭＶ４−１１、ＲＳ４-１１およびＴＦ１中にｐ７５の存在を検出した。このように、ＲＴ-ＰＣＲ分析により測定されたように、Ｉ２０-ｍＲＮＡに対応するフラグメントは、ＡＭＬ細胞株、ＫＧ-１ａ、ＲＳ４-１１およびＴＦ１中で検出されたが、ＫＧ-１、ＭＶ４-１１、ＨＬ-６０、またはＨＥＬでは検出されなかった。これらの結果は、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームが、癌腫、並びに、他のクラスの癌の検出に有用であることを示す。
【００２３】
腫瘍および腫瘍細胞株は、ｐ１００、ｐ１１０、ｐ７５およびｐ７５をコードするＲＮＡ転写物（Ｉ２０-ｍＲＮＡ）のレベルが上昇した。特に、より散在的な成長パターンを示す腫瘍は、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームのレベルが上昇した。したがって、これらの切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘタンパク質および核酸配列は、診断上の、予後的な、もしくは予測的な方法またはアッセイの一部として使用できる。それによって、患者のｐ１００、ｐ１１０、ｐ７５またはｐ７５をコードするＲＮＡ転写物のレベルの増加または上昇を試験することができる。本発明の診断方法を使用して、熟練した臨床家は癌の存在を決定すること、癌の感染度またはステージの程度を決定すること、発達する転移の可能性を評価すること、および、様々な治療法に対する応答を予想することが可能となるだろう。
【００２４】
一般的に、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームを検出するためのアッセイは、試料、例えば、癌を有する、または、有するおそれのある患者由来の組織診試料、組織、細胞または液体（例えば、全血または血清）の単離を含んで成る。それから、ｐ１００、ｐ１１０、ｐ７５またはｐ７５ＲＮＡ転写物（Ｉ２０-ｍＲＮＡ）のレベルを、本明細書において供した方法に従い評価する。検出できる癌は、制限することなく、脳（グリア芽細胞腫、髄芽腫、星細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫）、肺、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、小腸、血球、リンパ管、結腸、直腸、乳房、子宮内膜、胃、前立腺、精巣、卵巣、子宮、皮膚、頭部および頸部、食道、骨髄、血液または他の組織の癌を含む。特に、本発明の方法は、癌腫、例えば、基底および扁平細胞癌腫、消化管癌腫（例えば、結腸直腸癌、食道の癌腫、並びに、膵臓、肝臓および胆道癌腫）および乳房、子宮、卵巣、精巣、前立腺、および膀胱癌腫の検出に有用である。好ましい態様において、本発明の方法は、乳癌の分析において使用される。
【００２５】
本発明のある観点は、試料、ＣＤＰ/Ｃｕｘのｐ７５アイソフォームをコードするＲＮＡ転写物において、検出するための方法を供する。一般的に、核酸は、標準的な方法に従い（例えば、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York) 試料中に含まれる細胞から単離する。理想的には、試料中に存在する正常な細胞から腫瘍細胞を単離するために、その腫瘍の顕微解剖に従い調製する。核酸は、全細胞ＲＮＡまたはポリ-Ａ+への分画であってよい。そのＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換することを所望してもよい。通常は、その核酸を増幅する。
【００２６】
試料から単離した核酸中に存在するｐ７５ＲＮＡ転写物（Ｉ２０-ｍＲＮＡ）のレベルを評価または定量するために、様々な方法が使用できる。例えば、ｐ７５ＲＮＡ転写物（Ｉ２０-ｍＲＮＡ）のレベルは、周知の方法、例えば、ノーザンブロット分析;オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡがチップまたはウェハー上のアレイ中に設定される、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡフラグメントハイブリダイゼーション；本明細書中に例示したような、ＲＮａｓｅ保護分析またはＲＴ-ＰＣＲを使用して評価できる（例えば、Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning ,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New Yorkを参照のこと）。
【００２７】
そのような検出方法に有用な、適当なプライマー、ブローブ、またはオリゴヌクレオチドは、本明細書において例示され、あるいは、ｐ７５ＲＮＡ転写物（Ｉ２０-ｍＲＮＡ）中に含まれるが、それより大きなＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームすなわち、ｐ１００、ｐ１１０、およびｐ２００の転写物には不存在の核酸配列を含んで成る、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として供される配列から、当業者により産出されてもよい。本明細書において定義される、プライマーの語は、鋳型依存の工程において新生の核酸の合成をプライミングすることが可能ないかなる核酸をも包含することを意味する。一般的に、プライマーは、その長さにおいて、１０から２０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を利用してもよい。プライマーは、１本鎖形態であることが好ましいが、２本鎖または１本鎖形態においても供することができる。プローブは、プライマーとしても作用できるが、別に定義される。プローブは、おそらくプライミングが可能であるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡと結合するために設計され、そして、増幅工程において使用する必要はない。好ましい態様において、プローブまたはプライマーは、例えば、放射性化学種（32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ、3Ｈ、または他の標識）またはフルオロフォア（ローダミン、フルオレッセイン）で標識する。本出願によれば、そのプローブまたはプライマーは非放射性のものを使用、即ち非標識にしてもよく、そしてＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を標識する。
【００２８】
試料中のｐ７５ＲＮＡ転写物の存在レベルを評価するために、様々なＲＴ-ＰＣＴの方法を利用することができる。臨床的な試料が可変的な量および質である場合、相対的な定量ＲＴ-ＰＣＲ反応は、内部標準を用いて行うことができる。その内部標準は、標的ｃＤＮＡフラグメントよりも大きな増幅可能なｃＤＮＡフラグメントであってよく、そして、内部標準をコードするｍＲＮＡの存在量が、その標的をコードするｍＲＮＡよりもおよそ５-１００倍高くてもよい。このアッセイは、相対的な存在量を測定するが、それぞれのｍＲＮＡ種の存在量は測定しない。
【００２９】
外部の標準プロトコルを用いて、よりありふれた相対的な定量ＲＴ-ＰＣＲアッセイを使用して、他のアッセイを行うことができる。これらのアッセイは、それらの増幅カーブの直線部分におけるＰＣＲ生成物をサンプリングする。サンプリングに最適なＰＣＲサイクルの数は、各標的ｃＤＮＡフラグメントに対して経験的に決めなければならない。付け加えると、様々な試料から単離した各ＲＮＡ群の逆転写酵素生成物は、等濃度の増幅可能なｃＤＮＡのために慎重に規準化しなければならない。アッセイが絶対的なｍＲＮＡの存在量を測定するために、この考慮は極めて重要である。絶対的なｍＲＮＡの存在量は、規準化した試料中でのみ、異なる遺伝子発現の測定として使用できる。増幅カーブの直線範囲の経験的な決定およびｃＤＮＡ調製の規準化は退屈で時間を費やす工程であるが、ＲＴ-ＰＣＲアッセイの結果を、内部標準を用いた相対的な定量ＲＴ-ＰＣＲアッセイ由来のものよりも優れたものにできる。
【００３０】
本発明により特に意図するものは、チップに基づくＤＮＡ技術である。端的には、これらの技術は、迅速且つ正確な大量の遺伝子分析のための定量方法を含む。オリゴヌクレオチドでのタギング、または固定したプローブアレイを使用することにより、あるものは、ハイブリダイゼーションに基づくこれらの分子の高密度アレイおよびスクリーンとして、標的分子を分離するためのチップ技術を利用できる（例えば、Pease,et al.(1994) Science 251(4995):767-73 を参照のこと)。
【００３１】
そのフォーマットに基づき、視覚的な手段（例えば、ゲルの臭化エチジウム染色）により、検出を行うことができる。あるいは、その検出は、化学発光、蛍光標識の放射標識を介する、あるいは、電気的なまたは温度的な衝撃シグナルを介する生成物の間接的な同定を含んでもよい（Bellus (1994) J.Macromal.Sci.Pure Appl.Chem.A311:1355-1376)。
【００３２】
本発明の他の観点は、試料中の、ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォーム、例えば、ｐ７５、ｐ１００、およびｐ１１０の検出方法を供する。従って、ｐ７５、ｐ１００およびｐ１１０を特異的に認識する抗体を供する。様々なＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォーム（すなわち、ｐ７５、ｐ１００、ｐ１１０、およびｐ２００）を識別することができ、そして、抗原-抗体の複合体を形成するために唯一のアイソフォームと結合できる場合、抗体は、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームを特異的に認識すると言える。例えば、ｐ７５を特異的に認識する抗体は、ｐ７５のみと結合し、ｐ１００、ｐ１１０またはｐ２００とは結合しないであろう。同様に、ｐ１１０を特異的に認識する抗体は、ｐ１１０にだけ結合し、ｐ７５、ｐ１００、またはｐ２００とは結合しない。
【００３３】
ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォームを特異的に認識する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであってよい。さらに、それらの抗体は、天然物または、部分的もしくは全体的な合成産出物であってよい。また、ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォームと特異的に結合および認識する能力を維持する、全てのフラグメントまたはその誘導体も含まれる。その抗体は、いかなるヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ，およびＩｇＥを含む、いかなる免疫グロブリンクラスのメンバーであってよいが、しかしながら、本発明においては、ＩｇＧクラスの誘導体が好ましい。
【００３４】
抗体フラグメントは、完全長以下の抗体のいかなる誘導体であってよい。好ましくは、その抗体フラグメントは、少なくとも完全長抗体の特異的な結合能の有意な一部を維持する。抗体フラグメントの例は、制限することなく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ完全体、またはＦｄフラグメントを含む。その抗体フラグメントは、いかなる方法により産出されてもよい。例えば、その抗体フラグメントは、無処置の抗体の断片化により酵素的にまたは化学的に産出してもよく、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み替え的に産出してもよい。その抗体フラグメントは任意的に、１本鎖抗体フラグメントであってもよい。あるいは、そのフラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によって共に結合する多重鎖を含んで成ってよい。また、そのフラグメントは、任意的に、多分子複合体であってよい。機能的な抗体フラグメントは、一般的に、約５０以上のアミノ酸を含んで成り、そして、さらに一般的には、約２００以上のアミノ酸を含んで成るであろう。
【００３５】
本発明の抗体は、古典的なクローニングおよび細胞融合技術を使用して産出できる。例えば、注目の抗原は、一般的に、野生型もしくは近郊系マウス(例えば、ＢＡＬＢ/ｃ）または所望した抗体を生産する遺伝子組み換えマウス、または、ラット、ウサギ、または、原生もしくはヒト抗体を産出することができる他の動物に対して投与する（例えば、腹腔内注射）。その抗原は、ｐ７５、ｐ１００、ｐ１１０またはそのフラグメントであってよい。好ましい態様において、その抗原は、ｐ７５、ｐ１００またはｐ１１０の新規なＮ-終端である。その抗原は、単独で、またはアジュバントと混合して、またはベクター（ＶＥＥレプリコンベクター）から発現させて、または、ＤＮＡとして、または、免疫応答を誘導するための融合タンパク質として投与できる。融合タンパク質は、キャリアータンパク質、２、３例を挙げると例えば、ヒスチジンタグ（ｈｉｓ）、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメイン、β-ガラクトシダーゼ、グルタチオン、Ｓ-トランスフェラーゼ、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、または、ウシ血清アルブミンとカップリングすることが所望される免疫応答に対するペプチドを含んで成る。これらのケースにおいて、ペプチドは、我々にとって、キャリアータンパク質を伴うハプテンとして役立つ。例えば、２回以上、動物に追加免疫した後、脾臓を摘出し、そして、スプレノサイトを抽出し、そして、周知の方法を使用してミエローマ細胞と融合させる（Kohler and Milstein(1975) Nature 256:495-497;Harlow and Lane(1988) Antbodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。それから、その結果生成した、所望するモノクローナル抗体を産出するハイブリッド細胞を、慣習的な方法、例えば、限界希釈、および生成したクローンを使用してクローン化し、培養する。
【００３６】
あるいは、ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォームを特異的に認識する抗体は、ファージディスプレイ法により由来する。ファージディスプレイ抗体の産出方法は当業界において周知である（例えば、Huse,et al.(1989) Science 246(4935):1275-81)。
【００３７】
ＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォーム特異性抗体の選択は、ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォームに対する結合アフィニティに基づき、そして、in vitro、in vivo、または in situ で行うことができる、酵素結合免疫吸着法、免疫分散化学発光法、免疫蛍光法、免疫組織化学法、放射免疫アッセイ、凝集、補体固定法、免疫電気泳動、および免疫沈降アッセイ等を含む様々な周知の免疫アッセイにより決定してもよい。これらの標準技術は当業者にとって周知である（例えば、"Method in Immunodiagnosis",2nd Edition,Rose and Bigazzi,eds.John Wiley＆sons,1980;Campbell et al.,"Methods and Immnology",W.A.Benjamin,Inc.,1964;and Oellerich,M.(1984) J.Clen.Chem.Clin.Biochem.22:895-904 を参照のこと)。それから、抗体は、抗原の免疫吸着、続いて、無処置のＣＤＰ/Ｃｕｘに対応する架橋ペプチドでの２サイクルの免疫枯渇により、精製できる。
【００３８】
一度、完全に特異性を特徴付けたら、健康組織および疾患組織中のｐ７５、ｐ１００またはｐ１１０アイソフォームのレベルを評価するために、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、または免疫組織化学法といった技術を介して、診断上の、予後的および予測的な方法を使用することができる。これらの抗体の使用は、将来的な癌の前兆としての悪性度の存在もしくは不存在のための、または、組織学的クラスもしくは癌のタイプを同定するためのスクリーンを供する。さらにこの方法は、単独でも、または、他の周知な腫瘍診断方法との組み合わせにおいても使用できる。例えば、抗-ｐ７５、抗-ｐ１００または抗-ｐ１１０抗体を使用する乳房腫瘍切片の免疫組織化学的分析は、ｅｒｂＢ２発現の腫瘍切片の免疫組織化学的分析を含む、乳房腫瘍の診断的な特徴付けのために、現在の手順に加えてもよい。
【００３９】
切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームを検出するための一般的な方法は、試料と、ＣＤＰ/Ｃｕｘの切頭されたアイソフォームを特異的に認識する抗体との接触を供する。その抗体は、抗体-抗原複合体を形成するために、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームと結合することを許容する。その抗体-抗原複合体を形成するために必要とする条件および時間は変えることができ、そして、試験試料および使用される検出方法に依存する。例えば、試料の洗浄により、一度、非特異的な総合作用を除去し、その抗体-抗原複合体を、上述した抗原を検出および/または定量するための適切ないくつかの周知な免疫アッセイのいかなる免疫アッセイを使用して検出する（例えば、Harlow and Lane(1988) supra を参照のこと)。そのような周知の免疫アッセイは抗体捕獲アッセイ、抗原捕獲アッセイ、および２抗体サンドウィッチアッセイを含む。
【００４０】
免疫アッセイは、一般的に、標識化抗原、抗体、または検出のための２次試薬に依存する。これらのタンパク質は、放射性化合物、酵素、ビオチン、または、蛍光色素で標識してもよい。このうち、放射性標識は、ほぼ全てのタイプのアッセイに使用できる。酵素接合標識は、特に、放射性を回避しなければならない場合、または、すぐに結果が必要である場合に有用である。ビオチンカップリング試薬は、通常、標識化ストレプトアビジンとともに標識する。ストレプトアビジンは、密接に、かつ素早くビオチンと結合し、そして、ラジオアイソトープまたは酵素で標識化してもよい。蛍光色素は、それらの使用に高価な設備が必要であるが、極めて高感度な検出方法である。これらの普通の当業者は、本発明において利用できる他の適当な標識法を知っているであろう。これらの標識の抗体またはそのフラグメントとの結合は、標準技術を使用して達成でき（例えば、Kennedy,et al(1976) Clin.Chim.Acta 70:1-31;Schurs,et al.(1977) Clin.Chim Acta 81:1-40)、そして、これらの標識を検出する方法もまた、当業者に周知である。
【００４１】
試料中に存在するｐ７５、ｐ１００、ｐ１１０またはｐ７５ＲＮＡ転写物のレベルの検出後、与えられた患者において示された結果を、既知のスタンダードと比較する。既知のスタンダードは、試料が得られたその患者に関連する診断上の、予後的、または予測的な情報を供するために、正常な患者および癌を有する患者の統計的に有意な基準群でよい。そのスタンダードは、腫瘍の複数のクラスに由来する複数の腫瘍試料の診断的な分析を行うことにより産出できる。例えば、乳房腫瘍の既知のスタンダードは、組織学的タイプ（乳輪（aveolar)または管）、腫瘍の段階、リンパ管浸潤、標識指数（または腫瘍細胞の増殖）、ｅｒｂＢ２発現レベル、エストロゲンまたはプロゲステロン受容体、およびｐ５３状態、疾患を除いた生存率、および全体的な生存率を含む、様々な臨床的および生物学的パラメータを含んで成ってよい。
【００４２】
また、本発明は、本発明を実施するために有用なキットを供する。本キットは、切頭されたＣＤＰ/Ｃｕｘアイソフォームを特異的に認識する抗体を含む容器を含んで成る。また、そのキットは、本発明を実施するために必要または便利な他の溶液を含んで成る。その容器は、ガラス、プラスチックまたは箔で作られていてもよく、そして、バイアル、ビン、ポーチ、チューブ、バッグ等として作られてもよい。また、そのキットは、記載情報、例えば、本発明を実施するための手順または分析的情報、例えば、最初の容器中に含まれる試薬量を含んでよい。その容器は、他の容器、例えば、箱、またはバッグ中に、記載情報とともに存在してもよい。
【００４３】
本発明は、以下の制限の無い実施例により、さらに詳細に説明される。
【実施例１】
【００４４】
ＲＮＡの調製、ＲＮａｓｅマッピング、逆転写酵素-ＰＣＲ
【００４５】
ＲＮＡは、商業者の指示に従い、ＴＲＩＺＯＬTM（Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を使用して調製し、そして、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅにより３７℃で３０分間処理した。
【００４６】
ＲＮａｓｅマッピングのためのリボプローブを周知の方法を使用して調製した（Zeng,et al.(2000) Gene 241:75-85)。８０％ホルムアミド、０．４ＭのＮａＣｌ、０．４Ｍのピペラジン-Ｎ,Ｎ-ビス（２-エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、４０μｇの全ＲＮＡを８×１０5ｃｐｍの標識化リボプローブへと５４℃１６時間アニールした。ＲＮＡ-ＲＮＡハイブリッドを、１ｍｌ当たり３０ユニットのＲＮａｓｅ Ｔ２（Gibco BRL,Gaithersburg,MD)で、３７℃で１時間消化した。それから、ハイブリッドを２０μｇのｔＲＮＡ、２９５μｌの４Ｍのグアニジンチオシアネートおよび５９０μｌのイソプロパノールで沈殿させた。ペレットを、８０％ホルムアルデヒド、１×ＴＢＥおよび０．１％キシレンシアノール＋ブロモフェノールブルー中で最懸濁し、変性させ、そして、４％アクリルアミド-８Ｍ 尿素ゲル上で電気泳動した。
【００４７】
逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ-ＰＣＲ）を、基準化したＨｕｍａｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ（ＭＴＣTM）を行い、第一鎖ｃＤＮＡ調製物を異なる大人のヒト組織（Clonthech,Palo Alto,CA)から得た。マウス組織、胸腺細胞、乳房腫瘍細胞株、および乳房腫瘍試料（Mnitoba Breast Tumor Bank,Canada)由来のｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ IIＲＮａｓｅＨ-逆転写酵素（Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を使用して、商業者の指示に従い調製した。使用したプライマーは、：
Ｆｉ２０  ５’-ＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＴＴＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（ヒト、イントロン２０中ｎｔ−４０から−１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のｎｔ１９６２−１９８４）；
Ｂ２２  ５’-ＴＣＣＡＣＡＴＴＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ヒト、目録ｎｏ：Ｍ７４０９９のｎｔ３６３０−３６０９、マウス、目録ｎｏ：ＮＭ_００９９８６のｎｔ３３４５-３３２４）；
Ｆ１９  ５’-ＡＧＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＣＴＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ヒト、目録ｎｏ：Ｍ７４０９９のｎｔ３０２１-３０４１）；
Ｆｉ２０ｍ  ５’-ＣＧＡＣＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（マウス、イントロン２０中ｎｔ−１１１から−８８）；
およびＦ１８  ５’-ＣＡＡＧＣＧＣＴＧＡＧＴＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）（マウス目録ｎｏ：ＮＭ_００９９８６のｎｔ２４０６-２４２０）を含む。
【００４８】
プライマーは、５μｌの１０×キナーゼバッファー（７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＤＴＴ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの１５ユニットおよび０．８ｍＣｉのγ32Ｐ-ＡＴＰを含む、最終容量５０μｌ中で標識し、そして３７℃で１時間インキュベートした。取り込まれなかったヌクレオチドを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５スピンカラムを使用して除去した。ＰＣＲを１ｎｇのｃＤＮＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、３μｌの標準１０×ＰＣＲバッファー（２００ｍＭのトリス-ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５００ｍＭのＫＣｌ）、０．４５μＭの各プライマー、０．１２ｍＭのｄＮＴＰ、および１ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を含む最終容量３０μｌ中で行った。９５℃で４分間の最初の変性工程、続いて、９５℃で４５秒間の変性、６１℃で５０秒間のアニーリング、そして、７２℃で６０秒間の伸長の２５サイクル、続いて、７２℃で７分間の最後の伸長により行った。反応条件がプラトーに達しなかったことを保証するため、パイロット反応を行った。
【実施例２】
【００４９】
細胞培養
Ｈｅｌａ、ＨＥＬ、２９３およびＮＩＨ３Ｔ３細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を追加した、イーグルのダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。乳房腫瘍細胞株ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４６８、Ｔ４７Ｄ、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ４３５ｓ、およびＢＴ５４９は、５％ＦＢＳを追加したＤＭＥＭ中で培養した。ＭＤＡ４３６細胞は、１５％ＦＢＳおよび１０ｍｇ/ｍｌのインスリン（Gibco BRL,Gaithersburg,MD)を追加したレイボビッツ（Leibovitz)培地中で培養した。ＭＣＦ１０ＡおよびＭＣＦ１２Ａ細胞は、５％ヘパリンスルフェート、１０ｍｇ/ｍｌのインスリン、０．５ｍｇ/ｍｌのヒドロコルチゾール（SIGMATM-Aldrich,St.Louis,MO)、０．１ｍｇ/ｍｌのコレラエンテロトキシン（Gibco BRL,Gaithersburg,MD)、および２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Boehringer Mnngeim,Germany)を追加した５０％ＤＭＥＭ-Ｆ１２培地中で培養した。ＨＭＥＣ細胞は、商業者の培地および指示（Clonetics,San Diego,CA)を使用して培養した。トランスフェクションは、ＥｘＧｅｎｅ５００（MBI Fermentas,Germany)を使用して、商業者の指示に従い行った。
【実施例３】
【００５０】
プラスミド作成
ヒトのイントロン２０-ｍＲＮＡの発現のために、イントロン２０由来の配列と結合するＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ部位を含む５’末端プライマー（５’-ＡＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＧＣＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＣＡＴＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）およびＨＳＣＤＰのｎｔ３８６２-３８４１に対応する３’末端プライマー（目録番号Ｍ７４０９９）（５’-ＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。その生産物をＸｈｏＩおよびＢｓｔＸＩ（ＨＳＣＤＰのｎｔ３６２５）で消化し、そして、ＨＳＣＤＰのｎｔ３６２５から４５１１を含むＢｓｔＸＩ-ＮｏｔＩフラグメントで連結した。それから、ＮｏｔＩフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１ベクター（INVITROGENTM,Carlsbad,CA)の対応部位に導入し、そして、ＸｈｏＩ-ＮｏｔＩフラグメントをｐＭＸ１３９ベクターへ挿入した。
【実施例４】
【００５１】
Ｔ４７Ｄコラーゲンアッセイ
Ｔ４７Ｄ細胞を１μｇのｐＳＶ-ＮＥＯとともに１０μｇのｐＭＸまたはｐＭＸ-ｐ７５でトランスフェクションした。安定的にタンパク質を発現している細胞株を４００μｇ/ｍｌのＧ４１８（Bibco BRL,Gaithersburg,MD)で３週間選別した。細管形成の検出のためのアッセイを、２×１０5細胞/ｍｌを５％ＦＢＳで追加したＤＭＥＭ中の１．３ｍｇ/ｍｌのコラーゲンに加えることにより行った（Keely(2001) supra;Keely,et al.(1995) supra)。細胞を１０日間培養した。Ｒｅｔｉｇａ １３００デジタルカメラ（QIMGINGTM,Burnaby,BC,Canada)および１０×対物レンズを伴うＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ １３５顕微鏡（Carl Zeiss Canada Ltd.,Toronto,Canada)を使用して、細管を可視化させた。それから、コラーゲン中の細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして切片化した（８μＭ）。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。４０×対物レンズを使用してＰｉｘＣｅｌｌ IITM ＬＣＭシステム（Arcturus Engineering Inc.,Mountain View,CA)を使用してイメージを得た。
【実施例５】
【００５２】
ｐ７５の局在性および結合性アッセイ
周知方法（Moon,et al.(2000) supra)を使用して核抽出物を調製した。
【００５３】
マウス胸腺タンパク質の抽出物を、バッファーＸ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、０．４ＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＮａＦ、４ｍＭのＮａＶＯ３、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ-４０、１０％グリセロール、およびプロテアーゼ阻害因子（Roche,Indianapolis,IN))中での均質化により調製した。
【００５４】
ＣＲ２ＣＲ３ＨＤおよびＣＲ３ＨＤを発現するｐＥＴ-１５ｂベース（NOVAGEN（登録商標）,Madison,WI)細菌性発現ベクターを、ＢＬ２１（ＤＭ３）大腸菌（E.coli)中に導入し、ＩＰＴＧで誘導した。その融合タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーを使用して商業者の指示に従い精製した。
【００５５】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行い、そして周知方法（Moon,et al.(2000) supra;Moon,et al.(2001) supra)を使用して、ＤＮＡ結合性のキネティックスおよびアフィニティを測定した。
【００５６】
標準技術（Moon,et al.(2000) supra）を使用してルシフェラーゼアッセイを行った。
【００５７】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をカバーガラス上に置き、そして５μｇのｐＭＸ-ｐ７５-ＨＡでトランスフェクションした。２日後、細胞を２分間、１００％メタノールで固定した。１×リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄後、細胞を５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ中で１０分間消光化し、１０分間可溶化し（９５％ＰＢＳ＋５％ＦＢＳ＋０．５％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ-１００）、そして抗-ＨＡ抗体（１：１００００）で、室温において１時間インキュベートした。広範な洗浄後、２番目の抗体（抗マウス ａｌｅｘａ ４８８-接合化、１：１０００）を遮光中、室温で３０分間インキュベートした。Ｒｅｔｉｇａ １３００デジタルカメラ（QIMGINGTM,Burnaby,BC,Canada)および６３×対物レンズを伴うＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｅｒｔ １３５顕微鏡（Carl Zeiss Canada Ltd.,Toronto,Canada)を使用して、細胞を可視化させた。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．０（Empix Imaging,Missisauga,Canada)を使用してイメージを分析した。
【実施例６】
【００５８】
ヒト乳癌検体分析
２つのサブグループ（Monitoba Breast Tumor Bank,Canada)での分析のため、４１の浸潤性管癌腫を選別した。整合させた鏡像パラフィンおよび凍結組織ブロックを産出するため、全てのケースを一律に行った。ＲＮＡ抽出およびＲＴ-ＰＣＲ分析（Hiller,et al.(1996) Biotechniquis 21:38-44)のために使用した凍結組織切片と直接近接した組織由来の高品質パラフィン切片中で、腫瘍の症状および特徴を直接的にアッセイした。その最初のグループは散在性または浸潤性成長パターンを伴わない、ネストまたは腺性配列を形成する腫瘍細胞の大きな粘着性クラスターを示す浸潤性管癌腫（ｎ＝２１）を含んで成った。２番目のサブグループ（ｎ＝２１）は、散在型浸潤性成長パターンを選択した浸潤性腫瘍を含んで成った。これらは、有意な小葉成分または「小葉」成長パタンーンを伴うが、局所的な腺性形成および/または管タイプの細胞学的特色のいずれかを伴う、「管＆小葉癌腫」（ｎ＝９）および浸潤性小葉癌腫（ｎ＝１１）を含んだ（Pereira,et al.(1995) Histopathology 27:219-226;Ellis et al.(1992) Histopathology 20:479-489）。
【配列表】
2006506645000001.app
【国際調査報告】
2006506645.tif 000003