(57)【要約】本発明は試験試料中にＳＡＲＳコロナウイルスの存在を判断するに有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは検出プローブ、捕捉プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドに含まれるか、またはそれらの様々な組み合わせで使用し得る。１つの実施形態において、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を決定するために使用するための検出プローブであって、該プローブは長さが１００塩基までであり、かつ、該プローブは、配列番号１の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を含み、該プローブはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを、該条件下で形成しない、検出プローブを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を決定するために使用するための検出プローブであって、該プローブは長さが１００塩基までであり、かつ、該プローブは、配列番号１の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を含み、該プローブはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを、該条件下で形成しない、検出プローブ。
【請求項２】
前記標的配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を前記標的結合領域が含む、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記標的配列またはその相補配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を前記標的結合領域が有する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
前記プローブは配列番号２、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項５】
上記プローブの塩基配列が配列番号２、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項６】
前記標的結合部分の塩基配列は配列番号１の塩基配列またはその相補配列の全てまたは一部と完全に相補性であり、前記プローブは前記条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１に記載のプローブ。
【請求項７】
配列番号１またはその相補領域の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を前記標的結合領域が有する、請求項６に記載のプローブ。
【請求項８】
配列番号１またはその相補領域の少なくとも１５個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を前記標的結合領域が有する、請求項６に記載のプローブ。
【請求項９】
前記プローブが前記標的配列がない場合に前記条件下で自己ハイブリダイズするプローブである、請求項６に記載のプローブ。
【請求項１０】
前記プローブが相互作用するラベルペアを有する、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記相互作用ラベルペアが発光剤／消光剤ペア、発光剤／付加物ペア、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペアおよび染料二量体からなる群より選択される、請求項１０に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記プローブが検出可能なラベルを有する、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記条件に約６０℃の温度と約０．６Ｍ〜約０．９Ｍの塩濃度が含まれる、請求項１に記載のプローブ。
【請求項１４】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法であって、以下：
（ａ）前記条件下、試験試料を請求項１に記載の前記プローブと接触させる工程；
（ｂ）前記試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の指標としての前記ハイブリッドが前記試験試料中に存在するかどうかを判断する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を決定するために用いられる検出プローブであって、前記プローブは１００塩基までの長さであり、配列番号３の配列またはその相補配列中に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有するプローブであり、前記プローブは、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを、前記条件下で生成しない、検出プローブ。
【請求項１６】
前記標的結合部分は標的配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を有する、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１７】
前記標的結合部分が前記標的配列またはその相補配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域と相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を有する、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１８】
前記標的結合部分の塩基配列は塩基配列番号３またはその相補配列の全てまたは一部と完全に相補性であり、前記プローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１９】
配列番号３の配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を前記標的結合部分が有する、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２０】
配列番号３の配列またはその相補配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を前記標的結合部分が有する、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項２１】
前記プローブが配列番号４、配列番号５および配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項２２】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号４、配列番号５および配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、前記プローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記条件下でハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号４、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれる、請求項２２に記載のプローブ。
【請求項２４】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号４、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項２３に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記プローブの塩基配列が配列番号４、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
前記標的結合部位の塩基配列が配列番号５、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれる、請求項２２に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号５、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項２６に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記プローブの塩基配列が配列番号５、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項２７に記載のプローブ。
【請求項２９】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号６、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれる、請求項２２に記載のプローブ。
【請求項３０】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号６、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項２９に記載のプローブ。
【請求項３１】
前記プローブの塩基配列が配列番号６、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
前記プローブが前記条件下および前記標的配列がない場合に自己ハイブリダイズするプローブである、請求項１８に記載のプローブ。
【請求項３３】
前記プローブが相互作用するラベルペアを有する、請求項３２に記載のプローブ。
【請求項３４】
作用ラベルの前記ペアが発光剤／消光剤ペア、発光剤／付加物ペア、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペアおよび染料二量体からなる群より選択される、請求項３３に記載のプローブ。
【請求項３５】
前記プローブが検出可能なラベルを有する、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項３６】
前記条件が約６０℃の温度と約０．６Ｍ〜約０．９Ｍの塩濃度を含む、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項３７】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法であって、以下：
（ａ）試験試料を該条件下に請求項１６に記載の該プローブと接触させる工程；
（ｂ）該試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の指標としての該ハイブリッドが該試験試料中に存在するかどうかを判断する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅条件下で増幅可能な少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記標的領域は配列番号８またはその相補配列内に含まれる、オリゴヌクレオチドセット。
【請求項３９】
前記セットが：
配列番号９の配列またはその相補配列内に含まれる第１標的配列と増幅条件下で結合するか、またはその配列を介して伸長する、長さが１００塩基までの第１オリゴヌクレオチドと；
配列番号１０の配列またはその相補配列内に含まれる第２標的配列と増幅条件下で結合するか、またはその配列を介して伸長する、長さが１００塩基までの第２オリゴヌクレオチド
を有する、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４０】
前記第１標的配列が配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９およびそれらの相補配列からなる群より選択される、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４１】
前記第２標的配列が配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、およびそれらの相補配列からなる群より選択された、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４２】
前記第２標的配列が配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、およびそれらの相補配列からなる群より選択された、請求項４０に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４３】
前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群から選ばれた塩基配列を有する、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４４】
前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４５】
前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する、請求項４３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４６】
前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列が、以下：
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれる、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４７】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と任意に組み合わせた前記の配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれる、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４８】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識される、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と任意に組み合わせた前記の配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれる、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項４９】
前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と任意に組み合わせた前記の配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５０】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、およびＲＮＡポリメラーゼで認識される、ならびにＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と任意に組み合わせた前記の配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５１】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼにより開始または伸長を促す５’配列と任意に組み合わせた前記の配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項４９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５２】
前記第１および第２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つががＴ７プロモーター配列を有する、請求項５１に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の前記標的領域由来の標的領域の存在の判断に使用するための第３オリゴヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記第３オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、前記標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有し、前記第３オリゴヌクレオチドはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを前記ストリンジェントな条件下で形成しない、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５４】
前記標的結合部位が配列番号１またはその相補配列に相補性である、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５５】
前記標的結合部位の塩基配列が配列番号１、その相補配列、およびそのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、前記第３オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項５４に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５６】
前記第３オリゴヌクレオチドが前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、および前記標的配列がない場合に自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５７】
前記第３オリゴヌクレオチドは相互作用するラベルペアを有する、請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド
【請求項５８】
前記第３オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択される塩基配列でなる、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項５９】
前記第３オリゴヌクレオチドが検出可能なラベルを有する、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項６０】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の前記標的領域を含む標的核酸の単離・精製に用いられる第３オリゴヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記第３オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群より選択された標的配列に相補性である標的結合部分を有し、前記第３オリゴヌクレオチドは分析条件下で前記標的配列に安定にハイブリダイズする、請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項６１】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記標的結合部分の塩基配列が配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７の相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、前記第３オリゴヌクレオチドが前記分析条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項６０に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項６２】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記標的結合部分の塩基配列が配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項６１に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項６３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の前記標的領域を含む標的核酸の単離・精製に用いられる第４オリゴヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記第４オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群より選択された標的配列に相補性である標的結合部分を有し、前記第４オリゴヌクレオチドは分析条件下で前記標的配列に安定にハイブリダイズする、請求項５３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項６４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅する方法であって、以下：
（ａ）試験試料を前記少なくとも２個の請求項３８に記載のオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｂ）前記試験試料中に存在する場合、前記標的領域が増幅される様に前記試験試料を前記増幅条件に晒す工程
を包含する、方法。
【請求項６５】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法であって、
（ａ）試験試料を前記増幅条件下で請求項３９に記載の第１および第２オリゴヌクレオチドに接触させる工程；
（ｂ）ＳＡＲＳ−ＣｏＶが前記試験試料中に存在する場合、前記標的領域を増幅する工程；
（ｃ）前記試験試料を第３オリゴヌクレオチドに接触させる工程であって、前記第３オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、前記標的領域内に含まれるか、または前記標的領域と相補性である配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有し、前記第３オリゴヌクレオチドはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では形成しない工程；
（ｄ）前記試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の指標としての前記ハイブリッドが前記試験試料中に存在するかどうかを判断する工程と、
包含する、方法。
【請求項６６】
前記第３オリゴヌクレオチドが前記増幅工程前、またはその工程中に前記試験試料に供給される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記判断工程の少なくとも一部が前記増幅工程中に行われる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅条件下で増幅可能な少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記標的領域が配列番号２３の配列またはその相補配列内に含まれる、セット。
【請求項６９】
配列番号２４の配列またはその相補配列に含まれる第１標的領域に増幅条件下で結合するか、それを介して伸長する、長さが１００塩基までの第１オリゴヌクレオチドと；
配列番号２５の配列またはその相補配列に含まれる第２標的領域に増幅条件下で結合するか、それを介して伸長する、長さが１００塩基までの第２オリゴヌクレオチド
を有する、請求項６８に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７０】
前記第１標的配列が配列番号２６および配列番号２７、およびそれらの相補配列からなる群より選択される、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７１】
前記第２標的配列が配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、およびそれらの相補配列からなる群より選択される、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７２】
前記第２標的配列が配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、およびそれらの相補配列からなる群より選択される、請求項７０に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７３】
前記第１オリゴヌクレオチドが配列番号２６および配列番号２７、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択される塩基配列を有する、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７４】
前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択される塩基配列を有する、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７５】
前記第２オリゴヌクレオチドが配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択される塩基配列を有する、請求項７３に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７６】
前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２６および配列番号２７、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択される塩基配列内に含まれる、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７７】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択される塩基配列内に含まれる、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７８】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択される塩基配列に含まれる、請求項７６に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項７９】
前記第１オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２６、および配列番号２７、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択される塩基配列でなる、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８０】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、ならびにＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択される塩基配列でなる、請求項６９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８１】
前記第２オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、それらのＤＮＡ等価配列、およびＲＮＡポリメラーゼで認識される、ならびにＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列と組み合わせた前記の任意の配列からなる群より選択される塩基配列でなる、請求項７９に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８２】
前記第１および第２オリゴヌクレオチドの少なくとも１つがＴ７プロモーター配列を有する、請求項８１に記載にオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の前記標的領域由来の標的領域の存在の判断に使用するための第３オリゴヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記第３オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、前記標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有し、前記第３オリゴヌクレオチドはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成しない、請求項６８に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８４】
前記標的結合部分が配列番号３の配列またはその相補配列に相補性である、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８５】
前記標的結合部位の塩基配列が配列番号３、その相補配列、およびそのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、前記第３オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８６】
前記標的結合部分の塩基配列が配列番号４、配列番号５および配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、前記第３オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記ストリンジェントな条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８７】
前記第３オリゴヌクレオチドは前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、および前記標的配列がない場合に自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである、請求項８６に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８８】
前記第３オリゴヌクレオチドが相互作用するラベルのペアを有する、請求項８７に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項８９】
前記第３オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号４、配列番号５および配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項９０】
前記第３オリゴヌクレオチドが検出可能なラベルを有する、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項９１】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の前記標的領域を含む標的核酸の単離・精製に用いられる第３オリゴヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記第３オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群より選択された標的配列に相補性である標的結合部分を有し、前記第３オリゴヌクレオチドは分析条件下で前記標的配列に安定にハイブリダイズする、請求項６９に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項９２】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記標的結合部分の塩基配列が配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７の相補配列、およびそのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、前記第３オリゴヌクレオチドが前記分析条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項９１に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項９３】
前記第３オリゴヌクレオチドの前記標的結合部分の塩基配列が配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７の相補配列、およびそのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列でなる、請求項９２に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項９４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の前記標的領域を含む標的核酸の単離・精製に用いられる第４オリゴヌクレオチドをさらに有するオリゴヌクレオチドセットであって、前記第４オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群より選択された標的配列に相補性である標的結合部分を有し、前記第４オリゴヌクレオチドは分析条件下で前記標的配列に安定にハイブリダイズする、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチドセット。
【請求項９５】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅する方法であって、
（ａ）試験試料を請求項６８に記載の少なくとも２個のオリゴヌクレオチドに接触させる工程；
（ｂ）前記試験試料中に標的領域が存在する場合、前記標的領域が増幅される様に前記試験試料を前記増幅条件に晒す工程
を包含する、方法。
【請求項９６】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法であって、以下：
（ａ）前記増幅条件下、試験試料を請求項６９記載の前記第１および第２オリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｂ）標的領域が試験試料中に存在する場合、前記標的領域を増幅する工程；
（ｃ）前記試験試料を第３オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記第３オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、前記標的領域内に含まれるか、または前記標的領域と相補性である配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分をし、前記第３オリゴヌクレオチドはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では形成しない工程；
（ｄ）前記試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の指標としての前記ハイブリッドが前記試験試料中に存在するかどうかを判断する工程
を包含する、方法。
【請求項９７】
前記増幅工程の前、またはその後に前記第３オリゴヌクレオチドが前記試験試料に供給される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記判断工程の少なくとも一部が前記増幅工程中に行われる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法であって、
（ａ）長さが１００塩基までであり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの５’リーダー配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドを形成する標的結合部分を有する検出プローブと試験試料を接触させる工程であって、前記プローブがＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを前記条件下で形成しない工程；
（ｂ）前記試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の指標としての前記ハイブリッドが前記試験試料中に存在するかどうかを判断する工程
を包含する、方法。
【請求項１００】
前記標的配列が転写制御配列のコア配列またはその相補配列を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記コア配列が配列番号３８の配列またはその相補配列の少なくとも５個の隣接ヌクレオチドでなる、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記コア配列が配列番号３８の配列またはその相補配列でなる、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記試験試料を増幅条件下で増幅オリゴヌクレオチドのペアと接触させる工程を有する方法であって、増幅オリゴヌクレオチドの前記ペアの各メンバーが、前記５’リーダー配列の少なくとも一部またはその相補配列に前記増幅条件下で結合するか、またはそれを介して伸長する標的結合部位を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
増幅オリゴヌクレオチドの前記ペアの各メンバーの前記標的結合領域が５’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域に前記増幅条件下で結合し、前記増幅オリゴヌクレオチドがＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記増幅条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記試験試料を増幅オリゴヌクレオチドのペアと増幅条件下で接触させる工程をさらに有する方法であって、増幅オリゴヌクレオチドの前記ペアの第１メンバーの標的結合部分が、前記５’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域に前記増幅条件下で結合し、増幅オリゴヌクレオチドの前記ペアの第２メンバーの標的結合部位が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの３’共通末端配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域に前記増幅条件下で結合し、前記増幅オリゴヌクレオチドがＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記増幅条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０６】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅する方法であって、以下：
（ａ）試験試料を増幅条件下で少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記増幅オリゴヌクレオチドの第１はＳＡＲＳ−ＣｏＶ５’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域と前記条件下で結合する標的結合部位を有し、前記第１増幅オリゴヌクレオチドは前記増幅条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない工程；
（ｂ）標的領域が前記試験試料中に存在する場合、前記標的領域が増幅される様に、前記試験試料を前記条件に晒す工程
を有する、方法。
【請求項１０７】
前記標的領域が転写制御配列のコア配列またはその相補配列を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記コア配列が配列番号３８の配列またはその相補配列の少なくとも５個の隣接ヌクレオチドでなる、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記コア配列が配列番号３８の配列またはその相補配列でなる、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記試験試料を前記増幅オリゴヌクレオチドのペアと前記条件下で接触させ、前記増幅オリゴヌクレオチドの第２が、前記５’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域に前記条件下で結合する標的結合部分を有し、前記第２増幅オリゴヌクレオチドが前記条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法であって、
（ａ）長さが１００塩基までであり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの３’共同末端配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドを形成する標的結合部分を有する検出プローブと試験試料を接触させる工程であって、前記プローブが前記標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に形成し、前記プローブがＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを前記条件下では形成しない工程；
（ｂ）前記試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の指標としての前記ハイブリッドが前記試験試料中に存在するかどうかを判断する工程と、を包含する、方法。
【請求項１１２】
前記試験試料を増幅オリゴヌクレオチドのペアと増幅条件下で接触させる工程をさらに有する方法であって、増幅オリゴヌクレオチドの前記ペアの各メンバーが、３’共通末端配列またはその相補配列の少なくとも一部に前記増幅条件下で結合するか、またはそれを介して伸長する標的結合部分を有する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
増幅オリゴヌクレオチドの前記ペアの各メンバーの前記標的結合部分が、３’共通末端配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域と前記増幅条件下で結合し、前記増幅オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と前記増幅条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅する方法であって、
（ａ）試験試料を増幅条件下に少なくとも１つの増幅オリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、前記増幅オリゴヌクレオチドの第１が、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの３’共通末端配列またはその相補配列内に含まれる標的領域に前記条件下で結合する標的結合部位を有する工程；
（ｂ）標的領域が試験試料中に存在する場合、前記標的領域が増幅される様に前記試験試料を前記条件に晒す工程
を有する、方法。
【請求項１１５】
前記試験試料が前記増幅オリゴヌクレオチドのペアと前記条件下で接触し、前記増幅オリゴヌクレオチドの第２が３’共通末端配列内またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域に前記条件下で結合する標的結合部分を有し、前記第２増幅オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に前記条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない、請求項１１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本発明は２００３年５月９日付け米国仮出願番号第６０／４６９，２９４号、２００３年４月２５日付け第６０／４６５，４２８号、および２００３年４月１７日付け第６０／４６４，０４８号の利益を請求するものであり、これらの出願それぞれの全文を本明細書に引用して援用する。
【０００２】
技術分野
本発明は試験試料中のＳＡＲＳコロナウイルス（Ｓｅｖｅｒｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）の存在の指標として、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関連する新規コロナウイルス由来の核酸の存在を決定するために用いられる組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒトに重篤な疾患を引き起こす新規コロナウイルスが同定されている。この病気自体は、「重症急性呼吸器症候群」または「ＳＡＲＳ」と呼ばれる種々の臨床所見として現れる。そのウイルスは最初に中国で確認され、他の国に急速に伝播する可能性がある。治療法は知られておらず、このウイルスによる肺炎を発症した患者の死亡率は高い。ＳＡＲＳの兆候と症状は多くの疾患と共通である。現在のところ、この病気の伝播を食い止めるために、病気から回復しても、その後の１０日間は患者を隔離することが推奨されている。
【０００４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶのゲノムの配列が最近同定され、ウイルスに対する抗体を検出するための試験と、ウイルス配列を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む初期診断試験法が開発されている。しかしながら、ウイルスに対する抗体が検出可能なレベルに増加するためには１０〜１４日を要するので、抗体試験は不適当である。最初に開発されたＰＣＲ試験は特異性が高いと思われたが、疑わしい症例の５０％のみが感受性であった。この様なＰＣＲ試験はゲノム中のヌクレオチド約１５，０００〜約１９，０００の領域に存在する配列をすべて増幅した。
【０００５】
これらの初期のＰＣＲ試験の低感度にはいくつかの理由がある。例えば、ＰＣＲプライマーが試料中の他の配列と交差反応し得るので、その結果望ましくない増幅生成物が製造される。また、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の量が検出の閾値以下であるか、または反応混合物中の阻害剤が標的核酸を消化するか、または増幅および／または検出を妨害しているのかもしれない。さらに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶがゲノムＲＮＡを含むので、これらの初期ＰＣＲ試験がＰＣＲによる増幅前に不十分な逆転写工程を行っている可能性もある。従って、迅速で感度が高く、特異的な試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸の検出が可能な方法が必要である。さらに、この様な方法が臨床的に重要な方法になるためには、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在をヒトコロナウイルス種２２９Ｅ（ＨＣｏＶ−２２９Ｅ）およびＯＣ４３（ＨＣｏＶ−ＯＣ４３）から区別することが可能でなければならない。その理由は後者の２種のウイルスは軽症上部気道疾患の約３０％の原因であるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の要旨）
現在利用できるＰＣＲ法より優れ、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸を高感度で特異的に検出する組成物および方法を提供することが、本発明の主な目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの実施形態では、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断するのに使用するための検出プローブが提供されるが、そのプローブは長さが１００塩基までであり、そのプローブは以下の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有する：
【０００８】
【化１】
2006523460.tif 000002
【０００９】
本実施形態のプローブは、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成しない。
【００１０】
プローブの標的結合部分は、標的配列またはその相補配列と実質的に相補性であることが好ましい。より好ましくは、標的配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を標的結合領域が有し、標的配列またはその相補配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を有することがより好ましい。好ましい実施形態では、プローブは以下の塩基配列、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する：
【００１１】
【化２】
2006523460.tif 000003
【００１２】
より好ましい実施形態では、標的結合部分の塩基配列は配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１またはその相補配列の塩基配列の全てまたは一部、と相補性であることが好ましく、プローブはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない。この実施形態では、標的配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域をプローブの標的結合領域が有することが好ましく、標的配列またはその相補配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を有することがより好ましい。かつ、最も好ましい実施形態では、プローブの塩基配列は配列番号２、その相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列で構成される。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を決定するために用いられる検出プローブが提供され、そのプローブは１００塩基までの長さであり、以下の配列またはその相補配列中に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントな条件下で形成する標的結合部分を有する：
【００１４】
【化３】
2006523460.tif 000004
【００１５】
本実施形態のプローブは、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で生成しない。
【００１６】
プローブの標的結合部分は、標的配列またはその相補配列と実質的に相補性であることが好ましい。より好ましくは、標的結合部分は標的配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を有し、標的配列またはその相補配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域と相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を有することがより好ましい。
【００１７】
好ましい実施形態では、標的結合部分の塩基配列は塩基配列番号３の配列またはその相補配列の全てまたは一部と完全に相補性であり、そのプローブはストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない。この実施形態では、プローブは標的配列またはその相補配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域と完全に相補性である、標的配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域を有することが好ましく、標的配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域またはその相補配列と完全に相補性である、標的配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域を有することがより好ましい。
【００１８】
特に好ましい実施形態では、プローブは以下の塩基配列、それらの相補配列、およびそのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する：
【００１９】
【化４】
2006523460.tif 000005
【００２０】
より好ましい実施形態では、プローブの標的結合部分の塩基配列は配列番号４、配列番号５および配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内に含まれ、そのプローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない。以下のプローブ配列が、自己ハイブリダイゼーションによりストリンジェントな条件下でヘアピン分子を形成し得るプローブの例であり（相補性の下線部分を参照）、プローブの標的結合部分は配列番号４の塩基配列のＲＮＡ等価配列中に含まれている：
【００２１】
【化７】
2006523460.tif 000006
【００２２】
さらにより好ましい実施形態では、プローブの標的結合部分は配列番号４、配列番号５、配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択される。かつ、最も好ましい実施形態では、プローブの塩基配列は配列番号４、配列番号５、配列番号６、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択される塩基配列で構成される。
【００２３】
検出プローブの標的結合部分はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせで構成されるか、または核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）であるか、または少なくとも１個の修飾ヌクレオシド（例えば、リボフラノシル部分に２’−Ｏ−メチル置換を有するリボヌクレオシド）を含んでもよい。本発明のプローブは長さ１０〜１００塩基、より好ましくは長さ１５〜５０塩基、最も好ましくは長さ１８〜２０、２５、３０または３５塩基のオリゴヌクレオチドである。
【００２４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定に結合しない標的結合部分の塩基部分に加えて、本発明の検出プローブは少なくとも１個の塩基配列を含み得る。追加塩基配列は、それがＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定に結合しないか、標的核酸へのプローブの安定なハイブリダイゼーションを阻止する限り、任意の所望の塩基配列を有してもよい。例えば、追加塩基配列は捕捉プローブの固定化プローブ結合領域を構成し、例えば、固定化プローブ結合領域は固体担体に直接または間接に、５’ポリｄＴ（チミン）領域にストリンジェントな条件下で結合したポリヌクレオチドの３’ポリｄＡ（アデニン）領域を有する。また、追加塩基配列はＲＮＡポリメラーゼで認識される、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する５’配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーター配列）でもあり得る。標的結合部分が例えば、「分子ビーコン」プローブ等の自己ハイブリダイズするプローブ（すなわち、標的配列がない場合に、分析条件下で相互にハイブリダイズすることが可能な異なった塩基領域を有するプローブ）中に取り込まれる場合、少なくとも１個の塩基配列が含まれ得る。分子ビーコンプローブはＴｙａｇｉら、「検出可能にラベルされた二重立体配座オリゴヌクレオチドプローブ、分析とキット（Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，  Ａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  Ｋｉｔｓ）」、米国特許第５，９２５，５１７号に開示され、少なくとも相互に相補性である、「幹」または「アーム」と呼ばれる領域を有する、２個の塩基配列が結合するか、それが重なる標的結合部分を含む。分子ビーコンプローブのより詳しい説明は、以下の題名「有用なラベル付けシステムおよび検出可能部分（Ｕｓｅｆｕｌ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  Ｍｏｉｅｔｉｅｓ）」の節に提供される。追加された塩基領域は標的結合部分に直接連結するか、または例えば、非ヌクレオチドリンカー（例えば、ポリエチレングリコールまたは非塩基領域）により連結してもよい。
【００２５】
必ずしも必要ではないが、検出プローブに検出可能ラベルまたは相互作用するラベル群が含まれることが好ましい。ラベルは放射性同位体、酵素、酵素共同因子、酵素基質、染料、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、燐光分子、電子化学発光分子、発色団、上記条件下で標的核酸に安定に結合できない塩基配列領域、およびそれらの混合物を含むがそれに限定されない、任意のラベル化物質でよい。特に好ましい実施形態の１つでは、ラベルはアクリジウムエステルであり、４−（２−スクシニミジルオキシカルボニルエチル）−フェニル−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルフネート（以後「標準ＡＥ」と称する）であることが好ましい。プローブペアを有する有用な相互作用するラベルの群（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、「競合的均一分析（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）」、米国特許第５，９２８，８６２号参照）には酵素／基質、酵素／共同因子、発光剤／消光剤、燐光剤／付加化合物、染料二量体およびＦｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペアが含まれるが、それらに限定されない。フルオレセインとＤＡＢＣＹＬ等の相互作用する発色剤／消光剤のペアが特に好ましい。
【００２６】
本発明のさらに別な実施形態では、試験試料中にＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断する方法が提供される。この方法では、上記の任意のプローブを、ストリンジェントな条件下にＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むと思われる試験試料と接触させる。プローブが試験試料中に存在するＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸とハイブリダイズするに十分な時間後、試験試料中にＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を示すプローブ：標的ハイブリッドについて試験試料をスクリーニングする。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸はゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはその増幅産物でもよい。
【００２７】
本発明のさらに別な実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅条件下で増幅可能な少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを有する第１オリゴヌクレオチドセットが提供され、その標的領域は以下の配列またはその相補配列内に含まれる：
【００２８】
【化８】
2006523460.tif 000007
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドセットは第１および第２オリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、各オリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、セットの第１オリゴヌクレオチドは、増幅条件下に以下の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に結合するか、またはそれを通じて伸長する：
【００３０】
【化９】
2006523460.tif 000008
【００３１】
セットの第２オリゴヌクレオチドは、増幅条件下に以下の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に結合するか、またはそれを通じて伸長する：
【００３２】
【化１０】
2006523460.tif 000009
【００３３】
第１オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の配列群およびそれらの相補配列より選ばれることが好ましい：
【００３４】
【化１１】
2006523460.tif 000010
【００３５】
具体的には、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群から選ばれた塩基配列を有する、またはそれらに相当する塩基配列を含む塩基配列を第１オリゴヌクレオチドが有することが好ましい。さらに具体的に言うと、第１オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、およびＲＮＡポリメラーゼで認識される、またはＲＮＡポリメラーゼにより開始または伸長を促進する５’配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列）と任意に組み合わせた前記の配列からなる群より選択された塩基配列で構成される、またはその中に含まれる塩基配列であることが好ましい。
【００３６】
第２オリゴヌクレオチドの標的配列は以下に配列およびそれらの相補配列の群から選ばれることが好ましい：
【００３７】
【化２０】
2006523460.tif 000011
【００３８】
より具体的には、第２オリゴヌクレオチドは配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有する、またはそれらに実質的に対応する塩基配列を有することが好ましい。さらにより具体的には、第２オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、およびＲＮＡポリメラーゼで認識される、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する５’配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列）と組み合わせた任意の前記の配列からなる群より選択された塩基配列で構成される、またはその塩基配列内に含まれる塩基配列であることが好ましい。
【００３９】
本発明のまた別な実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅条件下で増幅可能である、少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを有する第２オリゴヌクレオチドのセットが提供され、標的領域は以下の配列またはその相補配列中に含まれる：
【００４０】
【化２３】
2006523460.tif 000012
【００４１】
本実施形態のオリゴヌクレオチドのセットは第１および第２オリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、それぞれのオリゴヌクレオチドが１００塩基の長さであり、セットの第１オリゴヌクレオチドは以下の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に増幅条件下で結合、またはその配列を通って伸長する：
【００４２】
【化２４】
2006523460.tif 000013
【００４３】
セットの第２オリゴヌクレオチドは、以下の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に増幅条件下で結合、またはその配列を通って伸長する：
【００４４】
【化２５】
2006523460.tif 000014
【００４５】
第１オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の配列およびその相補配列の群から選ばれることが好ましい：
【００４６】
【化２６】
2006523460.tif 000015
【００４７】
より具体的には。第１オリゴヌクレオチドは配列番号２６および配列番号２７、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を含むか、それに実質的に対応する塩基配列を有することが好ましい。さらにより具体的には、第１オリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号２６および配列番号２７、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、およびＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する５’配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列）と組み合わせた任意の前記の配列からなる群より選択された塩基配列で構成されるか、その塩基配列内に含まれる塩基配列であることが好ましい。
【００４８】
第２オリゴヌクレオチドの標的配列以下の配列およびその相補配列の群から選ばれることが好ましい：
【００４９】
【化２８】
2006523460.tif 000016
【００５０】
より具体的には、第２オリゴヌクレオチドは配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列を有するか、その配列に実質的に対応する塩基配列を有することが好ましい。さらにより具体的には、第２オリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３、それらの相補配列、およびそれらのＤＮＡ等価配列、およびＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促進する５’配列（例えば、ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター配列）と組み合わせた任意の前記の配列からなる群より選択された塩基配列で構成されるか、その塩基配列内に含まれる塩基配列であることが好ましい。
【００５１】
本発明の増幅オリゴヌクレオチドは長さが変り得るが、好ましい増幅オリゴヌクレオチドの標的結合部分は長さが１８〜４０塩基であり、予測されるＴｍが４２℃以上を目標とする、好ましくは少なくとも約５０℃を有する。上記に示した様に、本発明の増幅オリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーター配列をさらに含んでもよい。Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーター配列が好ましい。以下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が特に好ましい：
【００５２】
【化３４】
2006523460.tif 000017
【００５３】
第１および第２オリゴヌクレオチドセットのそれぞれは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲＮＡの標的領域由来の標的領域を判断するために使用される第３オリゴヌクレオチドを有してもよい。本実施形態の第３のオリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、標的配列による検出に安定であるハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有する。第３のオリゴヌクレオチドは、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の標的配列による検出に安定であるハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成するハイブリッドを形成しない。第３のオリゴヌクレオチドは、第１オリゴヌクレオチドセットに含まれる場合、配列番号１の配列またはその相補配列に相補性であり、第２オリゴヌクレオチドセットに含まれる場合、配列番号３の配列またはその相補配列に相補性である標的結合部分を有する上記の検出プローブの任意のものでよい。
【００５４】
上記の第３オリゴヌクレオチドの代わり、またはそれに加えて、第１および第２オリゴヌクレオチドセットはさらに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲＮＡの標的領域を含む標的核酸の単離または生成に使用する第４のオリゴヌクレオチドを有し得る。本実施形態の第４のオリゴヌクレオチドは長さが１００塩基までであり、以下の配列からなる群より選択された標的配列に相補性である標的結合部分を有する：
【００５５】
【化３５】
2006523460.tif 000018
【００５６】
第４オリゴヌクレオチドは標的配列と分析条件下で安定にハイブリダイズする。第４オリゴヌクレオチドの標的結合部分の塩基配列は配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７の相補配列、およびそれらに等価なＤＮＡで構成されるか、それらの中に含まれることが好ましい。第４オリゴヌクレオチドは、相補塩基ペア形成またはリガンド／ライゲート（例えば、アビジン／ビオチン）相互作用等の手段により、第４オリゴヌクレオチドを固体担体に直接的または間接的に結合させる領域または分子を含む。本発明による捕捉プローブを上記のオリゴヌクレオチドとは独立に備えてもよい。
【００５７】
本発明の他の実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域の増幅法が提供される。この方法では、第１および第２オリゴヌクレオチドを有する任意の上記オリゴヌクレオチドセットをＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むと推定される試験試料と接触させる。この試験試料を増幅条件に晒し、標的領域が試験試料中に存在する場合はそれが増幅される。ＳＡＲＳ−ＣｏＶが試験試料中に存在するかどうかを決めるためには、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と、ＨＣｏＶ−ＯＣ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸とを区別可能な上記のような第３のオリゴヌクレオチドを試験試料に備える。試験試料を増幅条件に晒す前、晒している間および／または晒した後に、オリゴヌクレオチドを試験試料に備えてもよい。検出法の感度を増加するため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸を単離精製し、その結果資料中に存在すると思われる非標的核酸および核酸阻害剤の少なくとも一部を除去するために、試験試料を増幅オリゴヌクレオチドと接触させる前に第４オリゴヌクレオチドを試験試料に備えてもよい。上記のオリゴヌクレオチドセットの他のメンバーの何れも必要としない標的核酸の単離精製法で、第４オリゴヌクレオチドを使用し得る。
【００５８】
本発明のさらに別な実施形態では、試験試料を長さ１００塩基までの検出プローブと接触させる工程を含む、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在の測定法が提供される。この方法では、上記の任意のプローブをＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むと推定される試験試料とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させる。プローブが試験試料中に存在するＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸とハイブリダイズするに十分な時間後、試験飼料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を示すプローブ：標的ハイブリッドの存在につき、試験試料をスクリーニングする。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸はゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等の天然起源ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸であるか、その増幅産物でもよい。
【００５９】
本発明の他の実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの複数の領域が検出の標的である方法が提供される。特に好ましい実施形態では、検出のために選ばれた少なくとも１個の領域がＳＡＲＳ−ＣｏＶのサブゲノムｍＲＮＡ中にも存在し、そのために方法の感度がさらに増加する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの標的とする複数の領域は本発明の方法をＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの突然変異に対してより低感度にし、従って標的領域の１つまたはいくつかが突然変異を含む場合、誤った負の結果を与えることがより少なくなる。ニドウイルスの突然変異率が高いことが知られているので、本発明のこの特徴はコロナウイルスと動脈炎ウイルスの双方を含むニドウイルスの場合に特に重要である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノム中の複数の標的配列を標的とすることは、低コピー数の試料中にウイルスＲＮＡが存在する場合、ウイルスＲＮＡが分解、表面上への吸着、希釈または試料採集、輸送、保存または試料加工のためにＲＮＡが失われた場合に起こり得る感度の減少を最少にする。検出のために標的とする領域がＳＡＲＳ−ＣｏＶ増幅配列内に含まれることが好ましい。
【００６０】
従って、本発明の好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡの５’リーダー配列または共通３’末端配列（３’共通末端配列）が増幅および／または検出のために標的とされる。本明細書で用いる用語「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ・ＲＮＡ」とは、完全な長さプラス鎖ゲノムＲＮＡと、ウイルスが細胞に感染した場合のウイルスのライフサイクル中のサブゲノムｍＲＮＡセットを指す。ＳＡＲＳ−ＣｏＶのゲノムはキャップされポリアデニル化された鎖状ＲＮＡであり、その一部はウイルスがその宿主細胞に感染し、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ・ＲＮＡに特異的なＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）を生産する場合に翻訳される。レプリカーゼはＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムＲＮＡの完全な負鎖コピーの他、一連のサブゲノムｍＲＮＡを作成する。サブゲノムｍＲＮＡのそれぞれは完全長プラス鎖状ゲノムＲＮＡに見出される５’リーダー配列で始まり、同じ３’共通末端領域で終わる。５’リーダー配列内に含まれる、またはその配列由来の配列、または３’共通末端領域の配列を直接、または増幅工程後に検出し得る。
【００６１】
この方法の１つの実施形態では、長さ１００塩基までであり、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ５’リーダー配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合領域を有する検出プローブと、試験試料とを接触させるが，プローブはＨＣｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成しない。標的配列が転写制御配列のコア配列またはその相補配列を有することが好ましい。標的とするコア配列が以下の配列の少なくとも５個の隣接ヌクレオチドを有することが好ましい：
配列番号３８：ｕａａａａｃｇａａｃ
標的とするコア配列が配列番号３８の配列またはその相補配列で構成されることがより好ましい。
【００６２】
本方法のさらに別な実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むと推定される試験試料を増幅条件下で増幅オリゴヌクレオチドのペアと接触させる増幅法で標的配列が使用されるが、増幅オリゴヌクレオチドペアの各メンバーは増幅条件下に標的とする５’リーダー配列またはその相補配列の少なくとも一部に結合する、またはその配列を通して伸長される。増幅オリゴヌクレオチドペアの各メンバーの標的結合部分が、標的とする５’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域と増幅条件下で結合することが好ましく、増幅オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と増幅条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない。別な方法では、増幅オリゴヌクレオチドのペアの第１メンバーの標的結合領域が標的とする５’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域と増幅条件下で結合し、増幅オリゴヌクレオチドのペアの第２メンバーの標的結合領域がＳＡＲＳ−ＣｏＶ・ＲＮＡに存在する標的とする３’リーダー配列またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域と増幅条件下で結合するが、増幅オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と増幅条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない。この方法の増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、標的とする５’リーダー配列またはその相補配列と、増幅条件下で転写制御配列のコア配列と結合する。コア配列は配列番号３８の少なくとも５個の隣接ヌクレオチドまたはその相補ヌクレオチドで構成されることが好ましく、配列番号３８の配列またはその相補配列で構成されることがより好ましい。
【００６３】
この方法の他の実施形態では、試験試料を長さが１００塩基までであり、３’共通末端配列またはその相補配列内に含まれる標的配列による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成する標的結合部分を有する検出プローブと接触させるが、そのプローブはＨＣｏ−Ｖ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ由来の核酸による検出に対して安定なハイブリッドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で形成しない。
【００６４】
この方法のさらに別な実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むと予期される試験試料を増幅オリゴヌクレオチドのペアと増幅条件下で接触させる増幅法中で標的配列が作成されるが、増幅オリゴヌクレオチドのペアの各メンバーは、標的結合部分を有する３’共通末端配列の少なくとも一部と増幅条件下で結合するか、それを通して伸長する標的結合領域を有する。増幅オリゴヌクレオチドのペアの各メンバーの標的結合領域が、標的とする３’共通末端またはその相補配列内に完全に含まれる標的領域と増幅条件下で結合することが好ましいが、増幅オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸と増幅条件下で安定にハイブリダイズする他の塩基配列を何ら含まない。
【００６５】
本発明のさらに別な実施形態では、本発明の検出法はＳＡＲＳと関連し得る他の寄与する、または２次試薬の存在を判断するための手段を含むパネル試験に含まれる。同じ、または別なパネル試験に含まれるのは、ＳＡＲＳに関連する同じ兆候または症状を与える他の微生物またはウイルスの存在を判断するための手段である。これらの微生物またはウイルスにはＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび他のヒト呼吸器コロナウイルスが含まれる。
【００６６】
本発明の検出プローブは、それらが試験試料中で標的とするＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の配列に特異性を有する様に設計されているが、試験試料中に存在するとは予期されていない他の微生物またはウイルスの配列と相同である領域も標的とし得る（例えば、プローブがゼブラフィッシュＤＮＡ配列と相同であるＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノム領域を標的とし得る）。本発明の捕捉プローブと増幅オリゴヌクレオチドがその標的配列に対して特異性を有する様に設計されることが好ましいが、これが本発明の要請ではない。
【００６７】
本発明の方法を用いて作成した増幅生成物が、増幅生成物中に含まれる配列に対して特異性である検出プローブを用いて検出されるが、増幅された配列を検出・同定するために用いられる別な方法も公知である。これらの方法には例えば、核酸配列判断、制限フラグメントマッピング、およびゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーおよびマススペクトロスコピーを用いるサイズ分離が含まれる。
【００６８】
本発明の他の特徴と利点は、その好ましい実施形態の以下の説明とクレームから明らかになると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
好ましい実施形態の説明
本明細書に開示するのは、試験試料中に存在するＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の選択的・高感度検出法である。本発明の方法を、例えば、ＳＡＲＳ診断を助けるか、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染個体の治療をモニターするために使用することができる。
【００７０】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の存在の検出に使用する候補オリゴヌクレオチドを同定するため、公開されたＳＡＲＳ−ＣｏＶのウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号  ＮＣ＿００４７１８）と、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ以外の微生物またはウイルス由来の配列と相同である領域につき、全てのＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＰＤＢ配列を含むがＥＳＴ、ＳＴＳ，ＧＳＳおよびフェーズ０、１および２ＨＴＧＳ配列を除外したデータベースとを比較してＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索をいった。本発明により予想される、特に好ましい検出プローブのオリゴヌクレオチド配列は非相同領域を標的とすることを意図しているが、試料中に存在するとは予想されない、または増幅工程で増幅されないと思われる微生物またはウイルスと配列同一性を共有するＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡ領域を標的とする様にも設計されている。
【００７１】
特に好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドが標的とする少なくともある領域には５’リーダー配列、好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムＲＮＡの５’末端由来のサブゲノムｍＲＮＡの５’リーダー配列、および全てのＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡに共有の３’末端配列が含まれる。サブゲノムｍＲＮＡの５’リーダー配列は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの５’最末端遺伝子領域由来である。ＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するその遺伝子はウイルスゲノムのほぼ２５０位で始まると信じられている。３’末端領域はＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡの３’末端の最後の遺伝子を包含する。
【００７２】
非特異的捕捉または増幅の程度を緩和するために特定の応用を設計した場合、本発明による捕捉プローブまたは増幅オリゴヌクレオチドはＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に特異性である必要がないことを、当業者は理解し得ると思われる。また、本発明のオリゴヌクレオチドは複数の機能を提供し得る。例えば、本発明による捕捉プローブの標的結合領域は検出プローブとして働き、本発明による検出プローブを増幅オリゴヌクレオチドまたはヘルパーオリゴヌクレオチドとして使用し、増幅オリゴヌクレオチドを検出プローブまたはヘルパープローブとして使用し、ヘルパーオリゴヌクレオチドを別な検出分析で検出プローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして使用し得る。
【００７３】
Ａ．定義
異なった意味を有すると明らかに示されない限り、以下の用語は明細書中で指示された意味を有する。
【００７４】
「試料」または「試験試料」とは、ヒト、動物または環境試料から得られた任意の組織またはポリヌクレオチド含有物質を意味する。本発明による試料には喉または鼻咽頭綿棒または吸引物、気管支腺房灌流液、血液、大便および多分汗が含まれるが、それに限定されない。試料を組織または細胞構造を破壊する様に処理し、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤等を含み得る溶液中に細胞内成分を放出する。痰等のあるタイプの試験試料は前処理が必要であると思われ、全文を本明細書に引用して援用するＫａｃｉａｎ、「バクテリア分析用の試料調製技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｓｓａｙｓ）」、米国特許第５，３６４，７６３号に開示される様に、ＤＮＡ消化剤（例えば、ＤＮａｓｅ）と組み合わせてジスルフィド結合還元試薬（例えば、ジチオトレイトール）で液状化し得る。クレーム中で、用語「試料」および「試験試料」はその生の形の試料、または試料中の標的ウイルス由来の核酸を放出、単離および精製するための任意の段階の処理を指す。従って、使用クレームの方法の中で「試料」または「試験試料」を個々に参照することは、処理の異なった段階における標的ウイルス由来の核酸を含むと推定される物質を指し、クレーム中の物質の最初の形に制限されない。
【００７５】
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、およびポリヌクレオチドの相補配列を有する第２分子とのハイブリダイゼーションを妨げないアナログを意味する。
【００７６】
「検出可能ラベル」は、検出し得る、または検出し得る反応を導く化学種を意味する。本発明による検出可能ラベルはポリヌクレオチドプローブと直接的または間接的に結合可能であり、放射性同位体、酵素、ハプテン、染料等の発色団または検出し得る色を与える粒子（例えば、ラテックスまたは金属粒子）、発光化合物（例えば、生物発光、燐光または化学発光化合物）および蛍光化合物を含む。
【００７７】
「相互作用するラベルペア」は、プローブが標的配列と結合しているか否かによって検出可能な異なったシグナルを発する、プローブと会合する化学種を意味する。相互作用するラベルペアを有する化学種は同じであっても異なっていてもよい。相互作用するラベルペアには発光剤／消光剤ペア、発光剤／付加物ペア、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペア、および染料二量体が含まれる。
【００７８】
「均一検出可能ラベル」は、ラベルが標的配列にハイブリダイズしたプローブ上にあるかどうかを判断することにより均一な条件で検出可能であるラベルを意味する。すなわち、ラベルまたはラベルしたプローブのハイブリダイズした形をハイブリダイズしない形から物理的に除去しないで、均一検出可能ラベルを検出することができる。これらのラベルはＡｒｎｏｌｄら、「均一保護分析（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）」、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、「ラベル技術を用いる複数の被分析物の検出または定量（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、米国特許第５，６５６，２０７号；およびＮｅｌｓｏｎら、「多重特異性核酸配列の同時検出および定量のための組成物と方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に報告され、全文を本明細書に引用して援用する。均一分析に使用するに好ましいラベルには化学発光化合物が含まれる。好ましい化学発光ラベルは標準ＡＥまたはその誘導体等（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルソ−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７-ジメチル−ＡＥ、４，５-ジメチル−ＡＥ、オルソジブロモ−ＡＥ、オルソジメチル−ＡＥ、メタジメチル−ＡＥ、オルソメトキシ−ＡＥ、オルソメトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルソメチル−ＡＥ、オルソフルオロ−ＡＥ、１−または３−メチルオルソフルオロ−ＡＥ、１−または３−メチルメタジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）のアクリジウムエステル（ＡＥ）化合物である。
【００７９】
「増幅」は標的核酸配列、その完全相補配列またはそのフラグメントの複数のコピーを得るためのインビトロ工程を意味する。標的核酸配列のコピーはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡとの双方である。
【００８０】
「増幅条件」は核酸増幅が可能な条件を意味する。転写系増幅法における本発明の増幅オリゴヌクレオチドを用いる、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の標的核酸配列に対する好ましい増幅条件を以下の実施例部分が提供するか、用いた特定の増幅法によっては他の利用し得る増幅条件も当業者が容易に確認し得る。
【００８１】
「標的核酸」または「標的」は、標的核酸配列を含む核酸を意味する。
【００８２】
「標的核酸配列」または「標的配列」は、１本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部、およびそれに完全に相補性であるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００８３】
「転写系増幅」は、核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写生成物を生成するためにＲＮＡポリメラーゼを使用する任意のタイプの核酸増幅を意味する。転写系増幅は一般にＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、リボヌクレオシド三燐酸、およびＲＮＡポリメラーゼで認識されるプロモーター配列を含むテンプレート相補性オリゴヌクレオチドを使用する。転写系増幅の例には自己持続配列複製（３ＳＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）および核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。Ｆａｈｙら、「自己持続配列複製（３ＳＲ）：ＰＣＲに代わる等温転写系増幅システム（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ＳＥｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （３ＳＲ）：Ａｎ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ＰＣＲ）」、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：２５−３３（１９９１）；Ｋａｃｉａｎら、「核酸配列増幅法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｋａｃｉａｎら、「核酸配列増幅法、組成とキット（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｋｉｔ）」、米国特許第５，５５４，５１６号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、「プロモーター含有プライマー配列を用いる核酸増幅法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、Ｍａｌｅｋら、「核酸増幅促進プロセス（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」、米国特許第５，１３０，２３８号；Ｄａｖｅｙら、「核酸増幅プロセス（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）」、米国特許第５，５５４，５１７号；およびＢｕｒｇら、「標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、米国特許第５，４３７，９９０参照。前記の参考文献のそれぞれの全文を本明細書に引用して援用する。本明細書に開示されたタイプの核酸増幅手順を実行するためにはＫａｃｉａｎらの方法が好ましい。
【００８４】
「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも２個の、一般に約５から１００の間の化学サブユニットであって、各サブユニットはヌクレオチド塩基部分、糖部分、およびサブユニットを線状空間形状で結合する連結部分である。共通のヌクレオチド塩基部分はグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）であるが、水素結合が可能な他の希な、または修飾されたヌクレオチド塩基も当業者に公知である。オリゴヌクレオチドは任意に糖部分、塩基部分および骨格構成物の任意のアナログを含んでもよい。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドのサイズは約１０〜約１００残基の範囲である。オリゴヌクレオチドを天然起源から精製し得るが、様々な公知の酵素的または科学的方法の任意のものを用いて合成することが好ましい。
【００８５】
「検出プローブ」または「プローブ」は、核酸中、好ましくは増幅された核酸中の標的配列に、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で特異的にハイブリダイズし、検出に対して安定なハイブリッドを生成するオリゴヌクレオチドを有する分子を意味する。プローブはプローブの末端（単数または複数）に付加し得るか、またはプローブの中間にある検出可能な部分を任意に含み得る（例えば、ビオチン化ヌクレオチドの場合の様に、検出可能な部分を標的配列とハイブリダイゼーション後にプローブに連結してもよい）。プローブの配列内部の検出可能部分の場合の様に、標的ヌクレオチドと組み合わされるプローブのヌクレオチドは厳密に隣接している必要はない。検出は直接的（すなわち、標的配列または増幅された核酸に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）、または間接的（すなわち、プローブを標的配列または増幅された核酸に連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってよい。プローブの「標的」は、一般に標準的な水素結合（すなわち、塩基ペア形成）を用いてプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅された核酸配列内に含まれる配列を指す。プローブは標的特異性配列と、任意に検出される標的配列に相補性でない他の配列を含み得る。これらの非特異性配列にはプロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、またはプローブの三次元配位に寄与する配列が含まれる（Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号参照）。「十分に相補性」である配列により、プローブの標的特異性配列に完全に相補性でない標的配列にプローブオリゴヌクレオチドが安定にハイブリダイズすることができる。
【００８６】
「標的結合部分」は、使用する特定の条件下で標的配列と安定なハイブリッドを形成可能なオリゴヌクレオチドの塩基部分を意味する。検出プローブの場合は、標的結合部分は検出プローブがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸による検出に対して安定なハイブリッドを形成し得る塩基領域である。増幅オリゴヌクレオチドの場合は、標的結合部分はプライマー内に含まれる塩基領域（すなわち、プライーマーまたはプロモーター−プライマー）であるか、増幅オリゴヌクレオチドが増幅条件下で標的核酸に安定にハイブリダイズし得るプライミング機能を持たない増幅オリゴヌクレオチドのテンプレート結合部分（例えば、そこからの伸長を阻止するために３’末端で修飾されたＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を有するスプライステンプレート）である。かつ、捕捉プローブの場合は、標的結合領域は捕捉ローブがストリンジェントな条件下に標的核酸に安定にハイブリダイズし得る塩基領域である。
【００８７】
「相補配列（相補体）」は、特に指定されない限り、参照された配列の完全な相補体である配列を意味する（「相補配列」は参照された配列と同じ長さであり、その正確な相補体である）。
【００８８】
「安定に」、「安定」または「検出の安定」は、反応混合物に温度が核酸二重鎖の溶融温度より少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度が核酸二重鎖の溶融温度より少なくとも５℃低いことがより好ましく、反応混合物の温度が核酸二重鎖の溶融温度より少なくとも１０℃低いことがさらに好ましい。
【００８９】
「ヘルパープローブ」または「ヘルパーオリゴヌクレオチド」は、検出プローブの座より異なった座で標的核酸にハイブリダイズし、その結果標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーション速度が増加するか、またはプローブの溶融温度（Ｔｍ）が増加するか、またはその両方である様に設計されたオリゴヌクレオチドを意味する。
【００９０】
「増幅オリゴヌクレオチド」は、標的核酸またはその完全相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドを意味する。増幅オリゴヌクレオチドは一般に増幅プライマーであるが、核酸増幅反応に関与する任意のオリゴヌクレオチドを含む（例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌら、「リガーゼ連鎖反応を用いるＲＮＡ配列の増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、米国特許第５，６８６，２７２号；およびＫａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号（例えば、スライステンプレート）参照）。
【００９１】
「増幅プライマー」または「プライマー」は、核酸合成の開始のために標的核酸にハイブリダイズ可能でプライマーおよび／またはプロモーターテンプレート（例えば、相補鎖を合成し、機能性プロモーター配列を形成するために）として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。増幅プライマーがＲＮＡ合成を開始する様に設計されている場合、プライマーは標的配列に非相補性であるが、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼで認識される塩基配列を含み得る。増幅プライマーはプライマー伸長の速度または量を阻止または減少する様に修飾された３’末端を含んでもよい（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、「プロモーター含有プライマー配列を用いる核酸増幅法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、米国特許第５，７６６，８４９号、開示されたプライマーおよびプロモーター−プライマーは修飾された、またはブロックされた３’末端を有する）。本発明の増幅プライマーは化学的に合成されるかベクターから誘導されるが、それらは天然起源核酸分子ではない。
【００９２】
「実質的に相同」、「実質的に対応している」または「実質的に対応する」は、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価体を除く）に対し少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは１００％の相同性である少なくとも１０個の隣接塩基領域を含む塩基配列を、対象のオリゴヌクレオチドが有することを意味する。様々な相同性の割合でハイブリダイゼーション分析条件に置かれ、受容し得ないレベルの非特異性ハイブリダイゼーションを阻止する一方、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にする修飾を、当業者は容易に理解し得ると考えられる。２つの配列を形成する核酸塩基の順番を考慮するが、その構造の差が相補性塩基との水素結合を妨害しない場合、２つの配列の間に存在するその他の構造の鎖を考慮せずに相同性の程度が決められる。２つの配列間の相同性の程度を、比較される少なくとも１０個の隣接塩基の各セット内に存在する塩基ミスマッチ数でも表現し得るが、その数は０〜２個の塩基の差である。
【００９３】
「実質的に相補性」は、対象のオリゴヌクレオチドが標的核酸配列内（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価体を覗く）に存在する少なくとも１０個の隣接塩基領域と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは１００％の相同性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を有することを意味する。（様々な相補性の割合でハイブリダイゼーション分析条件に置かれ、受容し得ないレベルの非特異性ハイブリダイゼーションを阻止する一方、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にする修飾を、当業者は容易に理解し得ると考えられる。）２つの配列を形成する核酸塩基の順番を考慮するが、その構造の差が相補性塩基との水素結合を妨害しない場合、２つの配列の間に存在するその他の構造の鎖を考慮せずに相補性の程度が決められる。２つの配列間の相補性の程度を、比較される少なくとも１０個の隣接塩基の各セット内に存在する塩基ミスマッチ数でも表現し得るが、その数は０〜２個の塩基の差である。
【００９４】
「十分に相補性」は、一連の相補性塩基間で水素結合により他の塩基にハイブリダイズし得る隣接核酸塩基配列を意味する。相補性塩基配列は標準塩基ペア形成（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ）を用いるオリゴヌクレオチドの塩基配列中の各位置で相補性であるか、または標準の水素結合形成を用いて相補性ではないが、適当なハイブリダイゼーション条件下で全相補性塩基配列が他の塩基配列と特異的にハイブリダイズ可能な少なくとも１つの残基を含み得る。隣接塩基は、オリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズしようとする配列と好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約１００％の相補性である。適当なハイブリダイゼーション条件は公知であり、塩基配列組成に基づいて容易に予測できるか、または通常の試験を用いて実験的に判断し得る（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「モレキュラークローニング：ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１、１１．１２−１１．１３、および１１．４７−１１．５７節（第２版、１９８９年）参照）。
【００９５】
「優先的にハイブリダイズする」は、ストリンジェントな分析条件下で本発明のプローブがその標的核酸とハイブリダイズし、標的とするウイルスの存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッド（検出可能なハイブリッド）を形成することができ、十分な数の標的としないウイルスまたは微生物の存在を示す安定なプローブ：非標的ハイブリッド（検出不可能ハイブリッド）の形成がないことを意味する。従って、プローブは非標的核酸にハイブリダイズするよりも十分に大きい程度で標的核酸によりハイブリダイズし、当業者がＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の存在（または不在）を正確に検出し、その存在を試験試料中に存在し得る他のウイルスまたは微生物から区別することが可能である。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を減少することは、オリゴヌクレオチドがその標的領域とハイブリダイズする程度または速度を減少すると思われる。しかしながら、少なくとも１個の非相補性塩基を含むことは、オリゴヌクレオチドが非標的微生物を識別する能力を増進すると思われる。
【００９６】
優先的ハイブリダイゼーションを、発光、質量変化、電導度の変化または濁度を含むがそれに制約されない方法に基づき、公知の様々な技術を用いて測定し得る。いくつかの検出手段が本明細書に記載され、そのうちの１つが特に以下の実施例で用いられる。試験試料中の標的と非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差があり、より好ましくは少なくとも１００倍の差があり、最も好ましくは少なくとも５００倍の差がある。試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベルより大きくないことが好ましい。
【００９７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェント条件」は、検出プローブがＨｃｏＶ−ＯＣ４３またはＨＣｏＶ−２２９Ｅ等の非標的微生物またはウイルス由来の核酸以上に標的核酸に優先的にハイブリダイズし得る条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件はＧＣ含有量およびプローブの長さ、プローブの長さと試験試料中に存在し得る非標的配列の長さとの間の類似度、および標的配列を含む因子によって変わり得る。ハイブリダイゼーション条件にはハイブリダイゼーション試薬または溶液の温度および組成が含まれる。以下の実施例の部分は、本発明のプローブを用いるＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーション条件を提供するが、他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件も当業者により容易に確認し得ると思われる。
【００９８】
「分析条件」はオリゴヌクレオチド（例えば、捕捉プローブ）が標的核酸に安定にハイブリダイズし得る条件を意味する。分析条件は、オリゴヌクレオチドの標的核酸への優先的なハイブリダイゼーションを必要としない。
【００９９】
「由来」は、核酸が標的ウイルスから直接得られるか、または核酸増幅生成物として間接的に得られることを意味し、その生成物は例えば、標的ウイルス中に存在しないアンチセンスＲＮＡ分子であってもよい。
【０１００】
「捕捉プローブ」は、標的配列および固定化オリゴヌクレオチドを塩基ペアハイブリダイゼーションにより特異的に結合する手段を提供する、少なくとも１個の核酸オリゴヌクレオチドを意味する。捕捉プローブは標的配列結合領域と、同じオリゴヌクレオチド上で一般的に隣接している固定化プローブ結合領域との２つの結合領域を含むことが好ましいが、これらの領域は別々のオリゴヌクレオチド上に存在し、少なくとも１個のリンカーで連結していてもよい（例えば、Ｂｅｃｋｅｒら、「修飾プライマーを用いる標的核酸の増幅法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒｓ）」、米国特許第６．１３０，０３８号参照）。または、捕捉プローブはアビジン／ビオチン結合等のリガンド−ライゲート結合ペアにより固体担体に結合していてもよい。
【０１０１】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」は、捕捉プローブを固定化担体に直接、または関節に結合する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の結合した標的配列の未結合物質からの分離を促進する固体担体に結合したオリゴヌクレオチドである。
【０１０２】
「単離」または「単離する」は、試料中に存在する標的核酸の少なくとも一部が反応容器中、または反応器具または固体担体（例えば、試験管、キュベット、ミクロタイタープレートウエル、ニトロセルロースフィルター、スライドまたはピペットの先端）上に固定された、または放出可能な方法で濃縮され、標的核酸が容器、器具または担体から有意の損失なしに精製し得ることを意味する。
【０１０３】
「精製」または「精製する」は、試験試料の少なくとも１つの成分が試料の少なくとも１つの他の成分から除去されることを意味する。タンパク質、炭水化物、脂質、非標的核酸および／または標識プローブ等の望ましくない物質も含まれる、一般に水溶液相中のウイルス、核酸または特に標的核酸が、精製される試料成分に含まれ得る。精製工程が資料中に存在する望ましくない成分を少なくとも７０％除去することが好ましく、少なくなくとも９０％を除去することがより好ましく、少なくなくとも９５％を除去することがさらに好ましい。
【０１０４】
「ＲＮＡおよびＲＮＡ等価配列」または「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基」は、相補性塩基ペアハイブリダイゼーションの同じ性質を有するＲＮＡおよびＤＮＡを意味する。ＲＮＡおよびＲＮＡ等価配列は異なった糖部分（すなわち、リボースに対しデオキシリボース）を有し、ＲＮＡにおけるウラシル、ＤＮＡにおけるチミンの存在で異なっている。等価配列が特定の配列に対し同じ程度の相補性を有しているので、ＲＮＡとＤＮＡ等価配列との間の差は相同性の差には寄与しない。
【０１０５】
「（〜で）本質的に構成される」は、本発明の基本的で新規の特性を著しく変化させない追加成分、組成または方法の工程が本発明の組成と方法に含まれ得ることを意味する。この様な特性には試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来核酸の補足能、増幅能または選択的検出能が含まれる。本発明の基本的で新規な特性に著しい効果を有する任意の成分、組成または方法の工程は、この用語の範囲外である。
【０１０６】
増幅法
本発明の関連で有用な増幅法には転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応の逆転写型（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖移動増幅（ＳＤＡ）、および自己複製ポリヌクレオチド分子とＭＤＶ−１ＲＮＡおよびＱ−ベータ酵素等の複製酵素とを用いる増幅法が含まれる。これらの様々な増幅技術それぞれを行う方法は以下を見れば分かる：Ｋａｃｉａｎら、米国特許第５，３９９，４９１号；Ｄａｖｅｙら、米国特許第５，５５４，５１７号；ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎら、「核酸の定量（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）」、米国特許第５，８３４，２５５号；Ｍｕｌｌｉｓら、「熱安定酵素を用いる核酸配列の増幅、検出および／またはクローニングプロセス（Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ，  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｉｕｅｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｅｎｚｙｍｅ）」、米国特許第４，９６５，１８８号；Ｗａｌｋｅｒ、「鎖移動増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、米国特許第５，４５５，１６６号；Ｃｈｕら、「複製ＲＮＡレポーターシステム（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、米国特許第４，９５７，８５８号；Ｓｔｅｆａｎｏ、「触媒および自己触媒複製特性を有する核酸構造および使用法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ）」、米国特許第５，４７２，８４０号。前記の参考資料のそれぞれを本明細書に引用して援用する。
【０１０７】
本発明のきわめて好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸配列がＴＭＡプロトコールを用いて増幅される。このプロトコールによれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性を備える逆転写酵素も内因性ＲＮａｓｅＨ活性を有する。この手順で用いられる増幅オリゴヌクレオチドの１つは、増幅される標的核酸の１本の鎖に相補性である配列の上流に位置するプロモーター配列を含む。増幅の第１工程では、プロモーター−プライマーがＳＡＲＳ−ＣｏＶの標的核酸に一定の部位でハイブリダイズする。プロモーター−プライマーの３’末端からの伸長により、逆転写酵素は標的ＲＮＡの相補性ＤＮＡコピーを生成する。反対鎖プライマーと新たに合成されたＤＮＡ鎖との相互作用の後、逆転写酵素によりプライマーの末端からＤＮＡの第２鎖が合成され、二重鎖ＤＮＡ分子が生成する。ＲＮＡポリメラーゼはこの二重鎖ＤＮＡテンプレート中のプロモーター配列を認識し、転写を開始する。新たに合成されたＲＮＡ増幅産物のそれぞれがＴＭＡプロセスに再び入り、新しいラウンドの複製のためのテンプレートとなり、ＲＮＡ増幅産物の指数的拡大を生じる。ＤＮＡテンプレートのそれぞれはＲＮＡ増幅産物の約１００〜約１０００コピーを作成し得るので、この増幅の結果、１時間以内に１００億個もの多さの生成物を生産することができる。全プロセスは自己触媒的であり、一定温度で行われる。
【０１０８】
増幅オリゴヌクレオチドの構造的特徴
上記の様に、「プライマー」とはテンプレート核酸にハイブリダイズすることが可能で、ＤＮＡポリメラーゼ活性により伸長し得る任意に修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの５’領域は標的核酸に非相補性であってもよい。５’非相補性領域がプロモーター配列を含む場合、それは「プロモーター−プライマー」と呼ばれる。当業者であれば分かることであるが、プライマー（すなわち、標的配列に特異的にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼ活性により延長することが可能な３’末端を有するオリゴヌクレオチド）として機能し得る任意のオリゴヌクレオチドが５’プロモーター配列を含むように修飾可能であり、従ってプロモーター−プライマーとして機能し得る。同様に、任意のプロモーター−プライマーは、プロモーター配列を除去することまたはプロモーター配列なしに合成することによって改変されも、なおも、そのプロモーター−プライマー配列は、プライマーとして機能する。
【０１０９】
修飾された塩基部分がＧ、Ａ、Ｃ、ＴおよびＵと非共有結合形成能を維持し、少なくとも１個の修飾されたヌクレオチド塩基部分またはアナログを有するオリゴヌクレオチドが１本鎖核酸とハイブリダイズすることが立体的に妨害されない限り、プライマーのヌクレオチド塩基部分を修飾し得る（例えば、プロピン基の付加により）。有用なプローブの化学組成との関連で以下に示す様に、本発明によるプライマーの窒素含有塩基は通常の塩基（Ｇ、Ａ、Ｃ、ＴおよびＵ）、その既知のアナログ（すなわち、塩基部分としてヒポキサンチンを有するイノシンまたは「Ｉ」（例えば、Ｒｏｇｅｒ、Ｌ．Ｐ．ら、「核酸の生化学（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、第１１版、１９９２年」参照））、プリンまたはピリミジン塩基の既知の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルでオキシグアニン、デアザ−またはアザ−プリンおよびアザ−ピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６または８位に修飾基または置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオピリミジン、４−アミノピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキルピリミジン（例えば、Ｃｏｏｋら、「修飾オリゴヌクレオチド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、米国特許第５，６２３，０６５参照））、および骨格がポリマーの少なくとも１つの残基に窒素塩基を含まない「非塩基」残基（Ａｒｎｏｌｄら、「ヌクレオチドプローブに対する連結試薬（Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ）」、米国特許第５，５８５，４８１号参照）でもよい。プライマー骨格を有する共通の糖部分にはリボースおよびデオキシリボースが含まれるが、２’−Ｏ−メチルリボース（ＯＭｅ）（Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，１３０，０３８号参照）、ハロゲン化糖、およびその他の修飾糖部分も使用し得る。通常、プライマー骨格の連結基は燐含有部分であり、もっとも普通にはホスフォジエステル結合であるが、例えば、ホスフォロチオエート、メチルホスフォネート、および「ペプチド核酸（ＰＮＡ）」中に見出されるペプチド様結合等の燐を含まない結合も本明細書に開示した分析での使用に向いている。
【０１１０】
有用なプローブラベルシステムおよび検出可能部分
特定の核酸ハイブリダイゼーションをモニターするために使用し得る任意のラベリングおよび検出システムを、本発明の関連で使用することは基本的に可能である。有用なラベル類に含まれるのは放射性ラベル、酵素、ハプテン、連結オリゴヌクレオチド、化学発光分子および電子検出法に使用し得る酸化還元活性部分である。好ましい化学発光分子にはＡｒｎｏｌｄらにより米国特許第５，２８３，１７４号に開示されたホモジニアス・プロテクション・アッセイに関連して使用されるタイプ、および一回の反応で複数の標的を定量する分析に関連して使用されるＷｏｏｄｈｅａｄらによる米国特許第５，６５６，２０７号に開示されるタイプのアクリジニウムエステルが含まれる。好ましい電子ラベリングおよび検出アプローチはＭｅａｄｅら、「核酸媒介電子遷移（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」、米国特許第５，５９１，５７８号、およびＭｅａｄｅ、「再編成エネルギーを用いる被分析物の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）」、米国特許第６，０１３，１７０号に開示されている。本発明におけるラベルとして有用な酸化還元活性部分にはＣｄ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｐｄ、ＺｎおよびＲｕ等の遷移金属が含まれる。
【０１１１】
本発明によるプローブとして特に好ましい検出可能なラベルは、ホモジニアス・アッセイ・システムで検出可能である（すなわち、混合物中で結合したラベルプローブは、非結合ラベルプローブと比較して安定性または分解の差等の検出可能な変化を示す）。ホモジニアス・アッセイで使用するための好ましいラベルは化学発光化合物である（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許第５，６５８，７３７号；およびＡｒｎｏｌｄら、「ホモジニアス・プロテクション・アッセイ（Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）」、米国特許第５，６３９，６０４号参照）。特に好ましい化学発光ラベルには標準ＡＥまたはその誘導体等、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４,５-ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチルオルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ等のアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物が含まれる。
【０１１２】
使用目的によって、プローブが標的核酸に結合した場合、本発明のプローブは検出し得る立体配座変化を行う様に設計されている。これらのプローブは、相互に近接している場合に連携作業してシグナルを発生する、相互作用ラベルのペアを含むことが好ましい。このシグナルは、この様なラベルが遠く離れてその連携作業が減ったときに発生するシグナルとは異なっている。これらのラベルは少なくとも１個の分子構成要素と会合し得る。この様な分子構成要素の例には以下に開示されるプローブ構成が含まれるが、それらに限定されない：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、「競合的均一分析（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｓｓａｙ）」、米国特許第５，９２８，８６２号（二分子プローブ）；Ｌｉｖａｋら、「自己消光蛍光プローブを用いるハイブリダイゼーション分析（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｌｆ−Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｂｅ）」、米国特許第６，０３０，７８７号（単一分子プローブ）；およびＢｅｃｋｅｒら「分子トーチ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｒｃｈｅｓ）」、米国特許第６，３６１，９４５号（分子トーチプローブ）およびＴｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号（分子ビーコンプローブ）により開示された自己ハイブリダイズプローブ。標的核酸にハイブリダイズした場合にプローブが検出可能なシグナルを発するので、これらのプローブは均一分析、特にリアルタイム増幅法で有用である。
【０１１３】
米国特許第６，３６１，９４５号に開示された分子トーチプローブは、「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる自己相補性の明確な領域を有するが、これらのドメインは連結領域で連結し、所定のハイブリダイゼーション分析条件下で相互にハイブリダイズする。変性条件に晒された場合、分子トーチプローブの相補領域（完全または部分的に相補性であり得る）は融解し、所定のハイブリダイゼーション分析条件が復活した場合、標的配列へのハイブリダイゼーションに利用できる標的結合ドメインを残す。かつ、鎖移動条件に晒された場合、標的配列の一部が標的結合ドメインに結合し、標的閉鎖ドメインを標的結合ドメインから移動させる。分子トーチドメインは、標的閉鎖ドメイン以上に標的結合ドメインが標的配列へのハイブリダイゼーションに有利である様に設計されている。分子トーチプローブの標的結合ドメインと標的閉鎖ドメインとは複数の相互作用ラベル（例えば、発光／消光ラベル）を含み、分子トーチプローブが標的核酸にハイブリダイズした場合とは反対に、分子トーチプローブが自己ハイブリダイズした場合は異なったシグナルを発し、その結果、可変ラベルを有する未ハイブリダイズプローブまたはそれと会合したラベルの存在で試験試料中のプローブ：標的二重螺旋の検出を可能にする。
【０１１４】
米国特許第５，９２５，５１７号に開示された分子ビーコンプローブは、標的相補性配列を有する核酸分子、標的核酸配列がない場合にプローブを閉じた立体配座に保つ親和性ペア（または核酸のアームまたは幹）、およびプローブが閉じた立体配座にある場合に相互作用するラベルペアを有する。標的核酸と標的相補配列とのハイブリダイゼーションは親和性ペアのメンバーを分離し、プローブを開いた立体配座に移動する。開放立体配座への移動はラベルペアの相互作用の減少によって検出可能であるが、このペアは例えば、蛍光基と消光基でもよい（例えば、ＤＡＢＣＹＬとＥＤＡＮＳ）。
【０１１５】
異なったタイプの相互作用するラベルを、プローブが立体配座の変化を行ったかどうかを判断するために使用できる。例えば、相互作用するラベルは発光剤／消光剤ペア、発光剤／付加物ペア、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペアまたは線量ダイマーでもよい。少なくとも１種のラベルが特定の分子上に存在し得る。
【０１１６】
発光剤／消光剤ペアは、化学発光または蛍光ラベル等の少なくとも１種の発光ラベルで作成される。蛍光／消光基ペアが、立体配座変化を行ったプローブを検出するために使用される。蛍光ラベルは特定の波長または波長範囲の光を吸収する。消光剤は部分的または完全に励起蛍光ラベルから発光したシグナルを減衰させる。消光剤は異なった蛍光剤からのシグナル発生を減衰させることができる。例えば、４−（４’−ジメチルアミノフェニラキソ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタリン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、ローダミンおよびフルオレセインから発生したシグナルを約９５％のシグナルを消光することができる。
【０１１７】
蛍光および消光ラベルの異なった数とタイプを使用できる。例えば、複数の蛍光ラベルを開放トーチからのシグナル発生を増加するために使用でき、標的配列がない場合に励起蛍光分子がほとんど、または全くシグナルを発生しないことを確認することを助けるために複数の消光ラベルを使用できる。蛍光剤にはアクリジン、フルオレセイン、スルフォローダミン１０１、ローダミン、ＥＤＡＮＳ、テキサスレッド、エオシン、ボディピーおよびルシファーイエローが含まれる。例えば、Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：４９−５３（１９９８）参照。消光剤の例にはＤＡＢＣＹＬ、タリウム、セシウム、およびｐ−キシレン−ビスピリジニウムブロマイドが含まれる。
【０１１８】
発光剤／付加物ペアは少なくとも１個の発光ラベルと、発光分子（単数または複数）と付加物を形成し、発光分子（単数または複数）からのシグナル発生を減少する少なくとも１個の分子で形成される。溶液中の遊離のリガンドを用いる発光分子からのシグナルを変化させるための付加物の使用は、Ｂｅｃｋｅｒら、「付加物保護分析（Ａｄｄｕｃｔ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）」、米国特許第５，７３１，１４８号により開示されている。
【０１１９】
Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペアは２個のラベルで生成し、第１ラベルの発光スペクトルが第２ラベルの励起スペクトルに重なる。第１ラベルが励起され、第２ラベルの発光特性を測定してレベルが相互作用するかどうかを決めることができる。Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー遷移ペアの例にはフルオレセインとローダミン、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとローダミン、フルオレセインとテトラメチルローダミン、フルオレセインとフルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳとフルオレセイン、およびＢＯＤＩＰＹＦＬとＢＩＯＤＩＰＹＦＬの各ペアが含まれる。
【０１２０】
染料ダイマーは、二量体を形成して相互作用し、染料が二量体立体配座でない場合は異なったシグナルを発生する２個の染料で生成する。線量二量体はＰａｃｋａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１６４０−１１６４５（１９９６）に開示されている。
【０１２１】
合成技術、およびラベルを核酸に結合し、ラベルを検出する方法は公知である。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｃｈ．１０（第２版、１９８９年）；Ｂｅｃｋｅｒら、米国特許第６，３１６，９４５号；Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号；Ｔｙａｇｉら、「非ＦＲＥＴ蛍光消光を有する核酸検出プローブ、およびこの様なプローブを含むキットおよび分析（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｎｏｎ−ＦＲＥＴ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｔａ  ａｎｄ  Ａｓｓａｙｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｓｕｃｈ  Ｐｒｏｂｅｓ）」、米国特許第６，１５０，０９７号；Ｎｅｌｓｏｎら、米国特許ｄａｉ５，６５８．７３７号；Ｗｏｏｄｈｅａｄら、米国特許第５，６５６，２０７号；Ｈｏｇａｎら、「非ウイルス微生物の検出および／または定量のための核酸プローブ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」、米国特許第５，５４７，８４２号；Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号；Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら、「核酸の検出および特性付けの方法、またはこの方法の応用のための反応物（Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｏｒ  Ｒｅａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ）」、米国特許第４，５８１，３３３号；およびＢｅｃｋｅｒら、米国特許第５，７３１，１４８号を参照のこと。
【０１２２】
プローブの化学組成
本発明によるプローブはポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログを有し、それに共有結合した検出可能なラベルまたは相互作用するラベル群を任意に有する。プローブのヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログは窒素含有塩基または塩基アナログを有し、ヌクレオシドが例えば、ホスフォジエステル結合により相互に連結してポリヌクレオチドを形成する。従って、プローブは通常のリボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を有し得るが、これらの分子の化学的アナログを有してもよい。プローブの「骨格」は、少なくとも１個の糖−ホスフォジエステル結合、ペプチド−核酸結合（Ｎｉｅｌｓｅｎら、「ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）」、米国特許第５，５３９，０８２号に記載の様に「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」と呼ばれる）、ホスフォロチオエート結合、メチルホスフォネート結合、またはそれらの組み合わせを含む公知の様々な結合を形成し得る。プローブの糖部分はリボースまたはデオキシリボースの何れか、または例えば、２’−Ｏ−メチルリボースおよび２’はライド置換（例えば、２’−Ｆ）等の既知の置換基を有する類似の化合物である。窒素含有塩基は通常の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その既知のアナログ（例えば、イノシンまたは「Ｔ」（Ｒｏｇｅｒ、Ｌ．、Ｐ  Ａｄａｍｓら、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（第１１版、１９９２年）））、プリンまたはピリミジン塩基の既知のアナログ（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリンおよびデアザ−またはアザ−ピリミジン、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２、６または８位に変更または置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオピリミジン、４−アミノピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキルピリミジン（Ｃｏｏｋら、米国特許第５，６２３，０６５号参照））、および骨格がポリマーの少なくとも１個の残基で窒素含有塩基を含まない「非塩基」残基（例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号）でもよい。プローブはＲＮＡおよびＤＮＡ中に見出される通常の糖、塩基および結合のみを有してもよく、または通常の成分と置換体の双方を有してもよい（例えば、メトキシ骨格を経由して結合した通常の塩基、または通常の塩基と少なくとも１個の延期アナログを含む核酸）。
【０１２３】
異なった長さと延期組成のオリゴヌクレオチドプローブをＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸を検出するために使用し得るが、本発明の好ましいプローブは１００塩基までの長さを有することが好ましく、６０個のヌクレオチドまでの長さを有することがより好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドに対する好ましい長さは１０〜１００塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基の間の長さであり、最も好ましくは１８〜２０、２５、３０または３５塩基の長さである。しかしながら、プローブ配列が核酸クローニングベクターまたは転写産物またはその他のより長い核酸中に備えられてもよく、これらもＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸を検出するために使用することができる。
【０１２４】
増幅オリゴヌクレオチドの選択およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異性検出プローブ
所望の特性を有する増幅オリゴヌクレオチドおよび検出プローブを設計するための有用なガイドラインが本明細書に記載される。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の増幅およびプローブ核酸に対する最適部位は、それぞれ長さ約１５塩基であり、隣接配列の約２００塩基内に含まれる２個、好ましくは３個の保存領域を含む。増幅オリゴヌクレオチドのセットで観察される増幅度はオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズする能力と、酵素的に延長する能力を含むいくつかの因子に依存する。ハイブリダイゼーション反応の程度と特異性はいくつかの因子に影響されるので、これらの因子を操作するとその標的に完全に相補性であるかないかという、特定にオリゴヌクレオチドの正確な感度と特異性を判断すると思われる。分析条件を変える効果は公知であり、Ｈｏｇａｎら、「非ウイルス微生物の検出および／または定量のための核酸プローブ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ）」、米国特許第５，８４０，４８８号に開示されている。
【０１２５】
標的核酸配列の長さ、従って増幅オリゴヌクレオチドおよび／またはプローブ配列の長さは重要である。ある場合は、位置と長さが異なる特定の標的領域があり、それが所望のハイブリダイゼーション特性を有する増幅オリゴヌクレオチドを生じると思われる。核酸がハイブリダイズするには完全に相補性でないことも可能であるが、通常は完全に相同の塩基配列の最も長い鎖がまずハイブリッドの安定性を判断する。
【０１２６】
増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非核酸ハイブリッドの安定性を最少にする様に位置しなければならないが、「非標的」は標的核酸配列の配列に類似の配列を含む非標的微生物またはウイルス由来の核酸である。増幅オリゴヌクレオチドおよび検出プローブが標的と非標的配列との間を区別しえることが好ましい。増幅オリゴヌクレオチドとプローブとを設計する場合、これらのＴｍ値の差はできるだけ大きい必要がある（例えば、少なくとも２℃、好ましくは少なくとも５℃）。
【０１２７】
非特異的延長（プラマー−二量体コピー）の程度も増幅効率に影響する。この理由で、プライマーは特に配列の３’末端で低い自己または交差相補性を有する様に選ばれる。擬似プライマー延長を減少するため、長いホモポリマーの連続と高いＧＣ含有量は避けられる。市販コンピューターソフトウエアがこの設計の特徴の助けになり得る。入手可能なコンピュータープログラムにはＭａｃＤＮＡＳＩＳ２．０（商標：Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｔｄ．；Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、およびＯＬＩＧＯバージョン６．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ；Ｃａｓｃａｄｅ、ＣＯ）が含まれる。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションが相補核酸の２本の１本鎖の会合を含み、水素結合２本鎖を形成することは、当業者が理解し得ると思われる。２本の鎖の１本が完全または部分的にハイブリッドに含まれる場合、その鎖は新しいハイブリッドの形成に参加する可能性が低いことは自明である。関連する配列のかなりの部分が１本鎖である様に増幅オリゴヌクレオチドおよびプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの速度と程度を大きく増加し得る。標的が組み込まれたゲノム配列である場合、それは自然に２本鎖型で生じる(ポリメラーゼ連鎖反応の生成物の場合の様に)。これらの２本鎖標的は当然プローブによるハイブリダイゼーションに阻害性であり、ハイブリダイゼーション工程前に変性することが必要である。
【０１２９】
ポリヌクレオチドがその標的にハイブリダイズする速度は、標的結合領域中における標的２次構造の熱安定性の目安である。ハイブリダイゼーション速度の標準的な測定は、リッター・秒あたり増幅されるヌクレオチドのモル数として測定されるＣ０ｔ１／２である。従って、それはその濃度で最大増幅の５０％を生じる時間で増幅されるプローブの濃度である。この値は一定時間でさまざまな量のポリヌクレオチドを行った医療の標的にハイブリダイズすることによって測定される。Ｃ０ｔ１／２は当業者に公知の標準手順によってグラフ上で見出される。
【０１３０】
好ましい増幅オリゴヌクレオチド
増幅反応を行うに有用な増幅オリゴヌクレオチドは、標的結合に関与しない外来性配列の存在を受容するために異なった長さを有することが可能であるが、それが増幅または検出手順に実質的に影響しないと思われる。例えば、本発明による増幅反応を行うために有用なプロモーター−プライマーは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの標的核酸にハイブリダイズする少なくとも最少の長さを有し、プロモーター配列はその最少配列の上流に位置している。しかしながら、標的結合位置とプロモーター配列との間に配列を挿入することは、増幅反応におけるその有用性を損なわずにプライマーの長さを変更し得る。さらに、これらのオリゴヌクレオチドの配列が所望の相補配列をハイブリダイズするための最少必要限度の要請に従う限り、増幅オリゴヌクレオチドおよび検出プローブの長さは選択の問題である。
【０１３１】
本発明の特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドは、他のコロナウイルスのＲＮＡ中の対応する領域に対して比較的保存されているＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲＮＡ領域を標的とする。「保存された」は、増幅オリゴヌクレオチドが標的とするＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡ由来の領域が他のコロナウイルス（例えば、ＨＣｏＶ−Ｃ４３およびＨＣｏＶ−２２９Ｅ）のＲＮＡ由来の対応する領域に少なくとも約６０％の相同性、好ましくは少なくとも約７０％の相同性、より好ましくは少なくとも約８０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の相同性、最も好ましくは１００％の相同性であることを意味する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶの保存領域の領域が配列相同性のより少ない領域より経時的により少ない突然変異を示すと思われるので、これらの領域が本発明の増幅オリゴヌクレオチドにより標的とされることが好ましい。
【０１３２】
増幅オリゴヌクレオチドが選択した増幅条件下で標的領域に結合するに十分な相補性がある場合、本発明の増幅オリゴヌクレオチドの標的結合領域とＳＡＲＳ−ＣｏＶの標的領域との間の完全な相補性は必要でない。しかしながら、増幅オリゴヌクレオチドがポリメラーゼで延長する場合、３’最末端の塩基が標的領域内のその相補性塩基に選択した増幅条件下で結合する様に増幅オリゴヌクレオチドの配列を設計する必要がある。増幅オリゴヌクレオチドがプライマーの３’末端近く、またはポリメラーゼによるプライマー配列の延長を減少または妨害するテンプレート結合配列の修飾を含むプロモーター−プライマーである場合、この設計の性質は必要ないと思われる。妨害されたプロモーター−プライマーはＭｃＤｏｎａｌｄら、米国特許第５，７６６，８４９号に開示されている。
【０１３３】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶの保存領域に選択した増幅条件下で結合する標的結合領域を有する増幅オリゴヌクレオチドが、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号の配列を比較することにより同定された：ＮＣ＿００４７１８（ＳＡＲＳコロナウイルス、完全ゲノム）、ＡＹ２７８５５４（ＳＡＲＳコロナウイルス、ＣＨＵＫ−Ｗ１、完全ゲノム）、ＡＹ２６９３９１（ＳＡＲＳコロナウイルスベトナム株２００３００５９２ポリメラーゼ遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９９０（ラットシアロダクリオアデニーチスコロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、Ｚ３４０９３（ポリメラーゼ部位に対する伝染性胃腸炎ウイルス（Ｐｕｒｄｕｅ−１１５）ｍＲＮＡ）、ＡＦ３０４４６０（ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，完全ゲノム）、Ｍ９５１６９（トリ感染性気管支炎ウイルスｐｏｌタンパク質、スパイクタンパク質、小ビリオン会合タンパク質、膜たんぱく質、およびヌクレオカプシドタンパク質遺伝子、完全ｃｄｓ）、ＡＦ２２０２９５（ウシコロナウイルス株Ｑｕｅｂｅｃ、完全ゲノム）、ＡＦ２０１９２９（マウス肝炎ウイルス株２、完全ゲノム）、Ｍ９４３５６（トリ感染性気管支炎ウイルスＯＲＦ１ａ（Ｆ１）およびＯＲＦ１ｂ（Ｆ２）遺伝子、）完全ｃｄｓ；Ｓタンパク質遺伝子、部分ｃｄｓ；および未知の遺伝子）、Ｍ５５１４８（マウスコロナウイルス開放読み取り枠１ａ（遺伝子１）、完全ｃｄｓ、および開放読み取り枠１ｂ（遺伝子２）３’末端）、Ｘ６９７２１（ＲＮＡポリメラーゼおよびプロテアーゼ用ヒトコロナウイルス２２９ＥｍＲＮＡ）、ＡＦ１２４９９２（ブタ伝染性胃腸炎ウイルスＲＮＳＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８９（ヒトコロナウイルス（株ＯＣ４３）ＲＮＡ指向ＲＮＡＳポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８７（ネコ感染性腹膜炎ウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８６（イヌコロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８５（ウシコロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、Ｘ５１９３９（ウイルスポリメラーゼ開放読み取り枠１ｂに対するマウス肝炎ウイルスＲＮＡ）、ＡＪ０１１４８２（ブタ伝染性胃腸炎ウイルスミニゲノム）、ＡＪ３１１３１７（とり感染性気管支炎ウイルス（株Ｂｅａｕｄｅｔｅ  ＣＫ）完全ゲノムＲＮＡ）、Ｚ３０５４１（キメラ遺伝子用トリ感染性気管支炎ウイルスｍＲＮＡ）、ＡＦ２０８０６７（マウス肝炎ウイルス株ＭＬ−１０、完全ゲノム）、ＡＪ２７１９６５（伝染性胃腸炎ウイルス完全ゲノム、ゲノムＲＮＡ）、ＡＦ３９１５４２（ブタコロナウイルス単離ＢＣｏＶ−ＬＵＮ、完全ゲノム）、ＡＦ３９１５４１（ウシコロナウイルス単離ＢＣｏＶ−ＥＮＴ、完全ゲノム）、ＡＦ２０８０６６（マウス肝炎ウイルス株Ｐｅｎｎ９７−１、完全ゲノム）、ＡＦ０９２２４８（マウス肝炎ウイルス株ＭＨＶ−Ａ５９Ｃ１２突然変異体、完全ゲノム）、Ｚ６９６２９（感染性気管支炎ウイルスＲＮＡ（欠陥ＲＮＡ  ＣＤ−６１））、ＡＦ２０７９０２（マウス肝炎ウイルス株ＭＬ−１１  ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｏｒｆ１Ａ）、ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｏｒｆ１ｂ）、非構造タンパク質（ｏｒｆ２Ａ）、赤血球凝集素エステラーゼタンパク質（ｏｒｆ２Ｂ）、スパイク糖タンパク質前駆体（ｏｒｆ３）、非構造タンパク質（ｏｒｆ５Ａ）、エンベロープ糖蛋白質Ｅ（ｏｒｆ５Ｂ）、マトリックス糖蛋白質（ｏｒｆ６）、およびヌクレオカプシド蛋白質（ｏｒｆ７）遺伝子、完全ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９９１（七面鳥コロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８８（ブタ血液凝集脳脊髄炎ウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）。
【０１３４】
本発明のある実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅条件下で増幅可能な少なくとも１個のオリゴヌクレオチドを有する第１オリゴヌクレオチドセットが提供され、標的領域は配列番号８の配列またはその相補配列内に含まれる。好ましい様式では、第１オリゴヌクレオチドセットには第１および第２オリゴヌクレオチドが含まれ、各オリゴヌクレオチドの長さは１００塩基までである。第１オリゴヌクレオチドセットの第１オリゴヌクレオチドは、配列番号９の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に増幅条件下に結合するか、その配列を通して延長する様に選ばれることが好ましい。第１オリゴヌクレオチドセットの標的配列は以下の配列およびそれらの相補配列から選ばれることがより好ましい：配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９。第１オリゴヌクレオチドセットの第２オリゴヌクレオチドは配列番号１０の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に、増幅条件下で結合するか、その配列を通して延長する様に選ばれることが好ましい。第２オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の配列およびそれらの相補配列から選ばれることがより好ましい：配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２。
【０１３５】
本発明の他の実施形態では、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の標的領域を増幅条件下で増幅可能な少なくとも１個のオリゴヌクレオチドを有する第２オリゴヌクレオチドセットが提供され、その標的領域は配列番号２３の配列またはその相補配列内に含まれる。好ましい様式では、第２オリゴヌクレオチドセットには第１および第２オリゴヌクレオチドが含まれ、各オリゴヌクレオチドの長さは１００塩基までである。第２オリゴヌクレオチドセットの第１オリゴヌクレオチドは、配列番号２４の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に増幅条件下に結合するか、その配列を通して延長する様に選ばれることが好ましい。第１オリゴヌクレオチドセットの標的配列は以下の配列およびそれらの相補配列から選ばれることがより好ましい：配列番号２６および配列番号２７。第２オリゴヌクレオチドセットの第２オリゴヌクレオチドは配列番号２５の配列またはその相補配列内に含まれる標的配列に、増幅条件下で結合するか、その配列を通して延長する様に選ばれることが好ましい。第２オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の配列およびそれらの相補配列から選ばれることがより好ましい：配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３。
【０１３６】
増幅オリゴヌクレオチドのこのセットの増幅オリゴヌクレオチドの少なくとも１つにはＲＮＡポリメラーゼで認識されるか、ＲＮＡポリメラーゼによる開始または伸長を促す５’配列が含まれてもよい。それが含まれている場合、第１増幅オリゴヌクレオチドには配列番号３４の配列を有するＴ７プロモーター配列が含まれることが好ましい。
【０１３７】
本発明の特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドはゲノムＲＮＡ中に存在する５’リーダー配列、または全てのＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡ中に存在するサブゲノムｍＲＮＡ配列および／または３’末端配列の少なくとも１個の５’リーダー配列を標的とする。リ−ダー配列および３’共通末端配列は一般に試験試料中の複数のコピー中に存在し、より高い分析感度が得られる標的配列の固有の増幅が可能であるので、これらの配列が好ましい。リーダー配列転写制御配列（ＴＲＳ）中にコア配列も含むが、この配列は少なくとも１個の増幅オリゴヌクレオチドが標的とし得る保存モチーフである。本発明の増幅オリゴヌクレオチドがＴＲＳコア配列を標的とする場合、増幅オリゴヌクレオチドの３’末端が増幅条件下でコア配列に結合し、底から延長することが好ましい。
【０１３８】
５’リーダーおよび３’末端配列の結合を性格に定義するために、これらの配列を他のコロナウイルスに感染した細胞中で位置を決めるための様々な手順が当業者に公知である。例えば、ＳＡＲＳ−ＣｏＶをＶｅｒｏ細胞中に伝播させる。この様な細胞からの全ｍＲＮＡを、ポリアデニル化ｍＲＮＡを精製するために当業者に公知の標準法を用いて単離し得る。このウイルスＲＮＡをプラス鎖ウイルスゲノムの３’末端配列に相同の捕捉プローブを用いて標的捕捉によりさらに濃縮し、５’末端配列を保存する方法を用いてクローニングする。これらの方法には、３’ポリ（Ａ）テールにハイブリダイズしたオリゴｄＴ増幅オリゴヌクレオチドを用いるウイルスＲＮＡからｃＤＮＡが合成される方法が含まれる。テールそのものがクローニング前にホモポリマーで延長される。
【０１３９】
３’最末端の５０〜１００個のオリゴヌクレオチドおよび５’最末端の２５０個のオリゴヌクレオチドに相補性のプローブを、療法の領域由来の配列を含むクローンを同定するために用いることができる。次いでこれらのクローンを配列判断し、比較してウイルスＲＮＡのそれぞれ中に存在する５’リーダー配列および３’リーダー配列を有する正確な配列を毛呈する。
【０１４０】
または、ポリアデニル化ｍＲＮＡを逆転写酵素およびプラス鎖ウイルスゲノムの３’最末端ヌクレオチドに相補性の増幅オリゴヌクレオチドを用いてコピーし得る。得られたｃＤＮＡは例えば、３’末端でオリゴＣがテールになり、得られたｃＤＮＡがＰＣＲで増幅される。このアンプリコンをゲル電気泳動でサイズによって分離し、配列判断する。
【０１４１】
我々のアプローチは、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有する１２個の公開されたＳＡＲＳ−ＣｏＶ配列を比較して、５’リーダー配列が位置する領域を同定することであった：ＡＹ２６８０４９（ＳＡＲＳコロナウイルスタイワンＲＮＡ-指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＹ２６９３９１（ＳＡＲＳコロナウイルスベトナム株２００３３００５９２ポリメラーゼ、部分ｃｄｓ）、ＡＹ２７４１１９（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２、完全ゲノム）、ＡＹ２７８４８７（ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０２、部分ゲノム）、ＡＹ２７８４８８（ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０、完全ゲノム）、ＡＹ２７８４８９（ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０１、部分ゲノム）、ＡＹ２７８４９０（ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０３、部分ゲノム）、ＡＹ２７８４９１（ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ−３９８４９、完全ゲノム）、ＡＹ２７８５５４（ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ−Ｗ１、完全ゲノム）、ＡＹ２７８７４１（ＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ、完全ゲノム）、ＡＹ２７９３５４（ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０４、部分ゲノム）、およびＮＣ＿００４７１８（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２、完全ゲノム）。
【０１４２】
ＳＡＲＳ  ＴＯＲ２株（ＢｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００４７１８）に対し利用できる第１配列を用いて、本発明者らは最初にＳＡＲＳ−ＣｏＶゲノムの最初の５２０ヌクレオチドに沿って「ウォーキング」し、６〜７ヌクレオチドの長さを有する可能な全てのサブ配列を選択した。次いでこれらのサブ配列のそれぞれをＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２ゲノム配列と比較し、ゲノムの何れかの場所に完全に一致する配列を同定した。８〜１１の予期された範囲でいくつかの一致を示した配列を調べ、ＳＡＲＳ  ＴＯＲ２株で利用できる第１配列バージョン（すなわち、２１４７７に対し参照したＧｅｎＢａｎｋファイル（スパイク等蛋白質）、２５２５３、２５６７４、２６１０２（小エンヴェロープタンパク質）、２７０５９、２７２５８、２８１０５（ヌクレオカプシド蛋白質）および２８１１５）中で同定された各潜在的遺伝子の開始点の５’の５０ヌクレオチド以内にサブ配列が位置するかどうかを判断した。（２００４年３月２４日に発表された、ＳＡＲＳ  ＴＯＲ２株に利用できる第３配列バージョンに対し参照したＧｅｎｅＢａｎｋファイル中で、各潜在的遺伝子の開始点が以下の様に同定された：２１４９２（スパイク当タンパク質）；２５２６８（ｏｒｆ３）；２５６８９（ｏｒｆ４）；２６１１７（小エンベロープ蛋白質Ｅ）；２６３９８(膜糖蛋白質Ｍ)；２７０７４（ｏｒｆ７）；２７２７３（ｏｒｆ８）；２７６３８（ｏｒｆ９）；２７７７９（ｏｒｆ１０）；２７８６４（ｏｒｆ１１）；２８１２０（ヌクレオカプシド蛋白質）；２８１３０（ｏｒｆ１３）；および２８５８３（ｏｒｆ１４））。潜在性遺伝子配列の主要部分の開始点の５０ヌクレオチド以内に位置するこれらの配列は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶのＴＲＳコア配列に対する潜在的候補である。
【０１４３】
本発明者らは次に開始コドのンの前から開始コドンを通る１００個のヌクレオチドから伸びる配列の他、５’末端の最初の未翻訳領域を調べ、想定されるＴＲＳの位置、およびＴＲＳコア配列が長さで６〜７ヌクレオチド以上に及ぶかどうかを実証した。各セグメント中で、長さが７〜１０ヌクレオチドであり、ｕａ［ａ］［ａ］［ａ］ｃｇａａｃ（配列番号３８）のヌクレオチド配列を共有する配列を見出した。ここで括弧はＴＲＳのコア配列中に存在し得る追加ヌクレオチドを示す。このコア配列はＳＡＲＳ  ＴＯＲ２ゲノム配列（本配列のバージョン３のヌクレオチド６４〜７２）のバージョン１のヌクレオチド４９〜５７に及んだ。
【０１４４】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡが合成される場合、５’未翻訳領域中のリーダー配列が各ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムｍＲＮＡの５’末端中に取り込まれている必要があるが、リーダー配列はＲＮＡのそれぞれで若干異なっている。従って、本発明の特に好ましい増幅オリゴヌクレオチドは、ＴＲＳコア配列で終わる５’未翻訳領域の一部内の、またはそれに相補性である標的配列と、増幅条件下で結合する。好ましい様式では、向かい合う増幅オリゴヌクレオチドのセットが用いられ、増幅オリゴヌクレオチドのセットの各メンバーがリーダー配列またはその相補配列の別な領域に結合する。また別な実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドのセットは、それぞれ増幅条件下でリーダー配列に含まれる標的配列またはその相補配列に結合する増幅オリゴヌクレオチドと、３’末端遺伝子中の標的配列またはその相補配列に結合する増幅オリゴヌクレオチドとを含み得る。非標的微生物またはウイルスの配列に対する相補性を最少にする様に、増幅オリゴヌクレオチドが選ばれることが好ましい。
【０１４５】
成熟ウイルス粒子に加えて感染細胞を含む試料、または感染細胞由来の材料では、分析の感度は少なくとも１個の５’リーダー配列および／または感染細胞中で生成するサブゲノムｍＲＮＡのセットの各メンバー中に存在する３’末端遺伝子配列を標的とすることにより、分析の感度を増進し得る。従って、１個以上の５’リーダー配列および／または３’末端遺伝子中に見出される配列の増幅を行う増幅オリゴヌクレオチドセットを選ぶことにより、標的がヨリ豊富で分析感度がより大きい増幅を行い得る。これらの配列は成熟ウイルスそのもののゲノムＲＮＡの末端にも存在するので、その起源由来の追加標的分子も試料中に存在し得る。さらに、少なくとも１個の増幅オリゴヌクレオチドが１個以上の５’リーダー配列に位置し、対向増幅オリゴヌクレオチドが３’末端遺伝子に位置する対向増幅オリゴヌクレオチドを、対向増幅オリゴヌクレオチドの間に位置する対向ゲノムＲＮＡおよびサブゲノムＲＮＡを増幅するために使用することができる。
【０１４６】
本発明の増幅オリゴヌクレオチドはラベルされていないことが好ましいが、検出プローブと組み合わせて、または検出プローブを除外して標的核酸の検出を容易にするため、１個以上のレポーターグループを含み得る。増幅された標的配列を検出するために様々な方法が使用できる。例えば、ヌクレオチド基質または増幅オリゴヌクレオチドは、新しく合成されたＤＮＡ中に取り込まれる検出可能なラベルを含むことができる。次に得られたラベル突き増幅生成物を一般的には未ラベルヌクレオチドまたは増幅オリゴヌクレオチドから分離し、分離された生成物分画中でラベルが検出される(例えば、Ｗｕ、「２次捕捉プローブおよび試験キットを用いる増幅された拡散の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ）」、米国特許第５，３８７，５１０号参照)。
【０１４７】
例えば、増幅オリゴヌクレオチドが供与体／受容体染料二量体を形成する２種の染料に結合することにより修飾された場合、分離工程は不要である。増幅オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズし、２つの染料を物理的に分離しない限り、１つの染料二量体メンバーが他の染料二量体メンバーで消光された状態である様に、修飾された増幅オリゴヌクレオチドを設計することができる。さらに、２つの染料の間に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、修飾増幅オリゴヌクレオチドと標的核酸との間にハイブリッドを生成した場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が二重鎖となり、適当なエンドヌクレアーゼにより切断する、または切れ目を入れるために利用し得る様に、増幅オリゴヌクレオチドをさらに修飾することもできる。次いでハイブリッドの切断または切れ目は２つの染料を分離し、消光が増加するために蛍光が変化する結果となり、それを試験試料中の標的ウイルスの存在を示すものとして検出することができる。このタイプの修飾された増幅オリゴヌクレオチドはＮａｄｅａｕら、「蛍光消光による核酸の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）」、米国特許第６，０５４，２７９号に開示されている。
【０１４８】
有用な検出可能ラベルとして作用する物質は公知であり、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、発色団の他、直接検出されないが、それらの特異的結合パートナー、例えば、アビジンおよび抗体それぞれとの反応により容易に検出されるビオチンおよびハプテン等のリガンドが含まれる。
【０１４９】
他のアプローチは、検出可能にラベルされたプローブとハイブリダイズし、得られたハイブリッドを任意の便利な方法で測定することにより、増幅生成物を検出することである。特に、化学発光アクリジニウムエステルラベル−オリゴヌクレオチドプローブを標的配列とハイブリダイズし、非ハイブリダイズプローブ上に存在するアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、残ったアクリジニウムエステルから発光する蛍光を測定することにより、生成物を分析できる（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、およびＮｏｒｍａｎ  Ｃ．  Ｎｅｌｓｏｎら、「非アイソトープ標識、ブロッティング、および配列判断（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」、ｃｈ１７、Ｌａｒｒｙ  Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ編集、第２版、１９９５年参照)。
【０１５０】
好ましい検出プローブ
本発明の他の特徴は、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の存在を検出するために用いられる検出プローブとして、または検出プローブ中に組み込んで使用できるオリゴヌクレオチドに関する。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸中に存在する標的核酸の増幅法は、アンプリコンを検出する任意の別な工程を含むことができる。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の検出手順には、試験試料を標的核酸配列またはその相補配列と優先的にハイブリダイズする検出プローブとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に接触さ、それにより検出に安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する工程が含まれる。次に、プローブ：標的ハイブリッドが、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸の存在または不在の指標として試験試料中に試験試料中に存在するかどうかを測定する工程がある。測定工程はプローブ：標的ハイブリッドの直接検出を含み得る。
【０１５１】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸配列を検出するために有用な検出プローブには、ＳＡＲＳ−ＣｏＶの標的核酸配列またはその相補配列に実質的に相補性である塩基配列が含まれる。従って、本発明のプローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶの標的核酸配列またはその相補配列の１つの鎖にハイブリダイズする。これらのプローブは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸に相補性であってもなくてよい、標的核酸領域の外側に任意に追加塩基を有し得る。
【０１５２】
好ましい検出プローブは標的核酸配列またはその相補配列に対し十分に相補性であり、塩濃度が約０．６〜０．９Ｍである場合、その配列と約６０℃の温度に相当するストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。好ましい塩には演歌リチウムが含まれるが、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等の他の塩もハイブリダイゼーション溶液中で使用することができる。高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約６０℃の温度で０．４８Ｍの燐酸ナトリウム緩衝液、０１％ドデシル硫酸ナトリウム、およびそれぞれ１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより、または約６０℃の温度で０．６ＭのＬｉＣｌ、１％のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、６０ｍＭのクエン酸リチウムおよびそれぞれ１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡで別途提供される。
【０１５３】
本発明の好ましい検出プローブおよび増幅オリゴヌクレオチドは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ中の「保存領域」を標的にする様に選択される。保存領域は上記の題名「好ましい増幅オリゴヌクレオチド」の節に定義され、公表されたＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ２７４１１９（ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２、完全ゲノム）、ＮＣ＿００４７１８（ＳＡＲＳコロナウイルス、完全ゲノム）、ＮＣ＿００１４５１（トリ感染性気管支炎ウイルス、完全ゲノム）、ＮＣ＿００３０４５（ウシコロナウイルス、完全ゲノム）、ＮＣ＿００２３０６（伝染性胃腸炎ウイルス、完全ゲノム）、ＮＣ＿００１８４６（マウス肝炎ウイルス、完全ゲノム）、およびＮＣ＿００３４３６（ブタ流行性下痢ウイルス、完全ゲノム）、およびＮＣ＿００２６４５（ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、完全ゲノム）、およびＡＹ２７８７４１（ＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ、完全ゲノム）を比較することにより我々が同定した。重要なことは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡを、試験試料中に存在し得る他のコロナウイルス（例えば、最低限ヒト呼吸器病原体ＨＣｏＶ−２２９ＥおよびＨＣｏＶ−ＯＣ４３）から区別するためにプローブが標的とする領域中に十分な可変性がなければならないことが重要である。上記に同定した配列の比較に基づき、好ましいプローブを最初に選択した。配列番号１、配列番号３から選んだ配列、およびそれらの相補配列の全てまたは一部に結合する様に、これらの好ましいプローブを選択した。
【０１５４】
本発明の特に好ましい検出プローブには、配列番号２、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群より選択された塩基配列、それらの相補配列、およびＲＮＡ等価配列を含む、それらでなる、それらに実質的に対応する、またはその中に含まれる標的結合部分が含まれる。他の好ましい実施形態では、プローブの全塩基配列は配列番号２、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群より選択された塩基配列、それらの相補配列、およびＲＮＡ等価配列を含む、それらでなる、それらに実質的に対応する、またはその中に含まれる。
【０１５５】
本発明の検出プローブは長さが１０〜１００塩基であることが好ましく、長さが１５〜５０塩基であることがより好ましく、長さが１８〜２０、２５、３０または３５塩基であることがもっとも好ましい。好ましい実施形態では、プローブは標的配列の少なくとも１０個の隣接塩基領域、またはその完全な相補配列に完全に相補性である、少なくとも１０個の隣接塩基領域を有する。より好ましい実施形態では、プローブは標的配列の少なくとも１５個の隣接塩基領域、またはその完全な相補配列に完全に相補性である、少なくとも１５個の隣接塩基領域を有する。標的結合領域に加えて、本発明のプローブはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸またはその相補配列に安定に結合しない少なくとも１個の塩基領域を含み得る。例えば、試験試料中のハイブリダイズしたプローブを単離するための捕捉テールとして、追加塩基領域を使用してもよく、またプローブが標的核酸またはその相補配列に結合していない場合は、追加塩基領域ペアを閉じた立体配座（例えば、自己ハイブリダイズした幹ループ構造）を促進するために備えてもよい。ある場合は、標的およびプローブ重複の標的結合部位がない場合、塩基領域がプローブの閉じた立体配座を促進するために使用される。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態のプローブは少なくとも１個の検出可能ラベルを含む。ある実施形態では、非ヌクレオチドリンカーによりアクリジニウムエステルラベルがプローブに連結する。例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号および５，６３９，６０４号に実質的に記載される、全文を本明細書に引用して援用する様な化学発光アクリジニウムエステル化合物で検出プローブがラベルされる。本発明の特に好ましいプローブは以下の配列を有する、以下の配列でなる、実質的に以下の配列に対応する、または以下の配列内に含まれる塩基は配列、およびそれらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列を有し、非ヌクレオチドリンカーは以下に星印で示されるヌクレオチド間に位置している：
【０１５７】
【化２Ａ】
2006523460.tif 000019
【０１５８】
本発明の他の実施形態では、相互に近接した場合（すなわち、プローブがもう１つの核酸にハイブリダイズした場合のそれらの相互の関係）、プローブは少なくとも１つのペアの相互作用するラベルを含み、ラベル間の共同作業が減少する様にプローブが相互に遠く離れた場合に（すなわち、プローブがもう一つの核酸にハイブリダイズしない場合のそれらのプローブ間の相互の相対的関係）、この様なラベルから発生する第２シグナルから異なって検出可能な第１シグナルを発生する。化学発光または蛍光ラベル等の、少なくとも１つの発光ラベルと、少なくとも１つの消光分子とで作成された発光／消光ペアが好ましい。
【０１５９】
プローブが核酸（すなわち、標的核酸またはその相補配列）に結合しているかどうかによって異なって検出可能な立体配座をとる様に設計された、本発明によるプローブの例は、以下の塩基配列を有する：
【０１６０】
【化７Ａ】
2006523460.tif 000020
【０１６１】
プローブは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで完全に構成され、配列の下線の部分は標的がない場合はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相互にハイブリダイズし、幹ループ構造を形成する相補アームを示す。このプローブは標的へのハイブリダイゼーションに有利である。このプローブの標的結合部分は配列番号４に等価である２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドであり、従って５’アームとこのプローブの標的結合部分とは４個の塩基で重なる。本明細書に記載される他のプローブは、当業者により二重立体配座プローブである様に容易に修飾し得る。二重立体配座の２つの基本的な立体配座（すなわち、自己ハイブリダイズまたはもう１つの核酸にハイブリダイズ）は試験試料中で異なって検出可能であるので、それらは試験試料中に存在する増幅が標的配列の増幅中にモニターされるにリアルタイム増幅法に特に有用である。
【０１６２】
感度を改善するため、本発明の好ましい方法はＳＡＲＳ−ＣｏＶ中に存在するか、それ由来の複数の領域を標的とする検出プローブを用いるか、または全てのゲノムｍＲＮＡ配列に共通の少なくとも１個のサブゲノムｍＲＮＡ５’リーダー配列および／または３’末端配列を標的とする。少なくとも１個のリーダー配列がプローブの標的となる場合、各プローブに標的結合部分にはＴＲＳコア配列の全てまたは一部にハイブリダイズする塩基配列が含まれる。
【０１６３】
別な好ましい実施形態では、本発明による検出プローブが、増幅オリゴヌクレオチドまたは増幅オリゴヌクレオチドのセットを用いて作成されたアンプリコン中に存在する標的配列に結合する方法を提供し、少なくとも１個の増幅オリゴヌクレオチドはゲノムＲＮＡ５’リーダー配列、または好ましくはＳＡＲＳ−ＣｏＶの５’リーダー配に列増幅条件下で結合する。好ましい様式では、増幅オリゴヌクレオチドのセットの少なくとも１つのメンバーが、ＴＲＳコア配列、またはその相補配列、または３’末端ゲノムまたはその相補配列中に含まれる配列を標的とする。
【０１６４】
上記に示す様に、任意の数の異なった骨格構造を本発明の検出プローブに核酸塩基配列の足場として使用できる。ある極めて好ましい実施形態では、使用されるプローブ配列にはメトキシ骨格、または少なくとも１個の核酸骨格中のメトキシ結合が含まれる。
【０１６５】
好ましいヘルパープローブ
ヘルパープローブがない場合より容易に検出プローブがプローブ：標的核酸二重螺旋を形成する様に、その意図する標的核酸への検出プローブのハイブリダイゼションを促進するためにヘルパープローブを本発明の方法に使用することができる（ヘルパープローブはＨｏｇａｎら、「核酸ハイブリダイゼーションを促進するための手段と方法（Ｍｅａｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」、米国特許第５，０３０，５５７号）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション分析条件下でヘルパープローブ：標的核酸二重鎖を形成するために、標的核酸配列に対し十分に相補性であるオリゴヌクレオチドを各ヘルパープローブが含む。与えられたヘルパープローブで用いられるストリンジェントなハイブリダイゼーション分析条件は、関連する検出プローブが標的核酸へ優先的にハイブリダイズするために用いられる条件によって判断される。
【０１６６】
１本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡの領域を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション分析条件下でも２次および３次構造に含むことができる。このような構造は、検出プローブの標的プローブへのハイブリダイゼーションを立体的に阻止または妨害することができる。ヘルパープローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、標的核酸の２次または３次構造を変化させ、検出プローブが標的領域により容易に接近し得る様にする。その結果、ヘルパープローブは検出プローブ：標的二重螺旋の生成速度および／または融点を増大する。ヘルパープローブは一般的に、検出プローブの標的領域の近くに位置する核酸配列にハイブリダイズする様に選ばれる。
【０１６７】
本発明のヘルパープローブは、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸内に含まれる標的配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で結合するオリゴヌクレオチドを有する。ヘルパープローブが実質的にその意図する標的配列に相補性であることが好ましい。検出プローブとその関連するヘルパープローブは、同じ標的核酸内に含まれる異なった標的プローブにハイブリダイズする様に設計されている。本発明のヘルパープローブは好ましくは長さが１００塩基まで、より好ましくは長さが１２〜５０塩基、最も好ましくは長さが１８〜３５塩基であるオリゴヌクレオチドである。ヘルパープローブはその対応する標的領域に対し少なくとも９０％の相補性であることが好ましく、完全に相補性であることがより好ましい。
【０１６８】
捕捉プローブの選択と使用
好ましい捕捉プローブには、固体担体上に固定化するために標的となる「テール」部分（例えば、塩基部分）に共有結合で繋がるＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の標的プローブに相補性である塩基は入れるが含まれる。捕捉プローブの核酸塩基ユニットに連結する任意の骨格を使用し得る。ある好ましい実施形態では、捕捉プローブには骨格中の少なくとも１個のメトキシ結合が含まれる。テール部分が塩基配列（例えば、ポリ（Ｔ）配列）である場合、それは捕捉プローブの３’末端に位置していることが好ましく、実質的に相補性であるポリヌクレオチドに結合して、試験試料中の他の成分に優先して結合したＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸を捕捉するための手段を提供することができる。
【０１６９】
相補性塩基配列にハイブリダイズする任意の塩基配列をテール配列中に使用し得るが、ハイブリダイズする配列が約５〜５０拡散残基の長さに及ぶことが好ましい。特に好ましいテール配列は約１０〜約４０の核酸残基、より好ましくは約１４〜約３０残基を含む、実質的にホモポリマーである。本発明による捕捉プローブにはＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的核酸を特異的に結合する第１配列と、固体担体に固体化されたオリゴ（Ｔ）鎖を特異的に結合する第２配列を含んでもよい。
【０１７０】
試験試料中にＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在を判断するための好ましい分析には、捕捉プローブによりＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的核酸を捕捉する工程と、少なくとも２個の増幅オリゴヌクレオチドを用いて標的核酸中に存在する標的領域を増幅する工程と、まず増幅された核酸中に含まれる標的配列に検出プローブをハイブリダイズし、次いで試験試料中にＳＡＲＳ−ＣｏＶが存在する指標としてのプローブ：標的ハイブリッドの生成を検出することによる増幅された核酸を検出する工程とが含まれる。好ましい捕捉プローブは５’リーダー配列中に存在する配列、または全てのサブゲノムｍＲＮＡ配列の共通３’末端配列を標的とする。
【０１７１】
本発明の分析の捕捉工程には、ハイブリダイゼーション条件下にＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の核酸中に存在する標的配列にハイブリダイズする補足プローブが用いられることが好ましく、標的核酸が試料の他の成分から分離されるリガンド等の結合ペア（ビオチン−アクチン結合ペア）の１つの成分となるテール部分が含まれる。捕捉プローブのテール部分は、固体担体得融資上に固定化された相補性配列のハイブリダイズする塩基配列であることが好ましい。液相ハイブリダイゼーション速度を利用するために、捕捉プローブと標的核酸とが溶液中で接触することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、捕捉プローブのテール部分と、実質的に相補性の塩基配列を有する固定化プローブとのハイブリダイゼーションにより、捕捉プローブ：標的複合体を生成する。結果として標的核酸、捕捉プローブおよび固定化プローブを含む複合体が得られる。固定化プローブがテール配列（例えば、ポリ（ｄＴｄＡ）またはポリ（ｄＴ））に相補性であり、固体担体に結合した反復配列（例えば、ポリ（ｄＡｄＴ））またはホモポリマー配列（例えば、ポリ（ｄＡ））を含むことが好ましい。捕捉プローブは捕捉プローブの標的結合配列と、標的核酸または固定化プローブを結合する機能のないテール配列との間に位置する、少なくとも１個のヌクレオチド等の「スペーサー」残基を含んでもよい。標的：捕捉プローブ複合体を固定化するために任意の担体を使用し得る。有用な担体は溶液中に浮遊するマトリックまたは粒子である（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、硝子、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリエステル、シランポリプロピレン、および好ましくは磁気的に吸引し得る粒子）。固定化プローブを固体担体に結合する方法は公知である。固体担体は、標準法（例えば、遠心分離、磁気吸引等）を用いて溶液から回収できる粒子であることが好ましい。好ましい固相担体は均一サイズ±５％の常磁性の単分散粒子である。
【０１７２】
試験試料中の標的捕捉プローブ：固定化プローブ複合体（複合体）を回収することは、標的核酸を効果的に濃縮（試験試料中の濃度に対して）し、標的核酸を試験試料中に存在し得る増幅阻害剤から分離する。捕捉された標的を１回以上洗浄し、標的核酸を精製できる。これは例えば、付着した複合体を有する粒子を上記の洗浄溶液中に再懸濁することで行われる。好ましい実施形態では、捕捉工程は捕捉プローブを標的核酸と逐次ハイブリダイズし、次いでハイブリダイゼーション条件を調節してテール配列を固定化プローブとハイブリダイズさせることで行われる。Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、「ポリヌクレオチドの２段階ハイブリダイゼーションおよび捕捉（Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、米国特許第６，１１０，６７８号参照。捕捉工程と任意の洗浄工程を行った後、標的配列を増幅することができる。操作工程数を制限するため、捕捉プローブから遊離せずに標的核酸を任意に増幅してもよい。
【０１７３】
本発明の好ましい実施形態では、捕捉プローブはコロナウイルスＲＮＡの保存領域を標的とする様に選ばれる。何が保存領域を構成し、コロナウイルスの保存領域をどの様にして同定するかは、上記の題名「好ましい増幅オリゴヌクレオチド」および「好ましい検出プローブ」の節に議論されている。本発明の好ましい捕捉プローブを、ＧｅｎＢａｎｋに公開され、以下のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を有する配列を比較して同定した：ＡＹ２７８７４１（ＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ、完全ゲノム）、ＡＦ１２４９９０（ラットシアロ涙腺炎コロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ３５３５１１（ブタ流行性下痢ウイルス株ＣＶ７７７、完全ゲノム）、ＡＦ３０４４６０（ヒトコロナウイルス２２９Ｅ，完全ゲノム）、Ｍ９５１６９（トリ感染性気管支炎ウイルスｐｏｌタンパク質、スパイクタンパク質、小ビリオン会合タンパク質、膜たんぱく質、およびヌクレオカプシドタンパク質遺伝子、完全ｃｄｓ）、ＡＦ２２０２９５（ウシコロナウイルス株Ｑｕｅｂｅｃ、完全ゲノム）、ＡＦ２０１９２９（マウス肝炎ウイルス株２、完全ゲノム）、Ｍ９４３５６（トリ感染性気管支炎ウイルスＯＲＦ１ａ（Ｆ１）およびＯＲＦ１ｂ（Ｆ２）遺伝子、完全ｃｄｓ；Ｓタンパク質遺伝子、部分ｃｄｓ；および未知の遺伝子）、Ｍ５５１４８（マウスコロナウイルス開放読み取り枠１ａ（遺伝子１）、完全ｃｄｓ、および開放読み取り枠１ｂ（遺伝子２）３’末端）、Ｘ６９７２１（ＲＮＡポリメラーゼおよびプロテアーゼに対するヒトコロナウイルス２２９ＥｍＲＮＡ）、ＡＦ１２４９９２（ブタ伝染性胃腸炎ウイルスＲＮＳＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８９（ヒトコロナウイルス（株ＯＣ４３）ＲＮＡ指向ＲＮＡＳポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８７（ネコ感染性腹膜炎ウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８６（イヌコロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８５（ウシコロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、Ｘ５１９３９（ウイルスポリメラーゼ開放読み取り枠１ｂに対するマウス肝炎ウイルスＲＮＡ）、ＡＪ０１１４８２（ブタ伝染性胃腸炎ウイルスミニゲノム）、ＡＪ３１１３１７（トリ感染性気管支炎ウイルス（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株）完全ゲノムＲＮＡ）、Ｚ３０５４１（キメラ遺伝子に対するトリ感染性気管支炎ウイルスｍＲＮＡ）、ＡＦ２０８０６７（マウス肝炎ウイルス株ＭＬ−１０、完全ゲノム）、ＡＪ２７１９６５（伝染性胃腸炎ウイルス完全ゲノム、ゲノムＲＮＡ）、ＡＦ３９１５４２（ブタコロナウイルス単離ＢＣｏＶ−ＬＵＮ、完全ゲノム）、ＡＦ３９１５４１（ウシコロナウイルス単離ＢＣｏＶ−ＥＮＴ、完全ゲノム）、ＡＦ２０８０６６（マウス肝炎ウイルス株Ｐｅｎｎ９７−１、完全ゲノム）、ＡＦ０２９２４８（マウス肝炎ウイルス株ＭＨＶ−Ａ５９Ｃ１２突然変異体、完全ゲノム）、Ｚ６９６２９（感染性気管支炎ウイルスＲＮＡ（欠陥ＲＮＡ  ＣＤ−６１））、ＡＦ２０７９０２（マウス肝炎ウイルス株ＭＬ−１１  ��ＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｏｒｆ１Ａ）、ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｏｒｆ１Ｂ）、非構造タンパク質（ｏｒｆ２Ａ）、赤血球凝集素エステラーゼタンパク質（ｏｒｆ２Ｂ）、スパイク糖タンパク質前駆体（ｏｒｆ３）、非構造タンパク質（ｏｒｆ５Ａ）、エンベロープ糖蛋白質Ｅ（ｏｒｆ５Ｂ）、マトリックス糖蛋白質（ｏｒｆ６）、およびヌクレオカプシド蛋白質（ｏｒｆ７）遺伝子、完全ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９９１（七面鳥コロナウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）、ＡＦ１２４９８８（ブタ血液凝集脳脊髄炎ウイルスＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子、部分ｃｄｓ）。好ましい捕捉プローブを、配列番号３５、配列名ｂ号３６および配列番号３７、およびそれらの相補配列の全て、または一部に結合する様に選択した。本発明の特に好ましい捕捉プローブには、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、それらの相補配列、およびそれらのＲＮＡ等価配列からなる群より選択された塩基配列内を有する、それらで構成される、実質的にそれらに対応する、またはそれらの中に含まれる塩基配列を有する塩基配列を含む標的結合部分が含まれる。好ましい捕捉プローブはまた、以下の配列を有する柔軟な３’テールを有する様に設計された：
【０１７４】
【化３９】
2006523460.tif 000021
【０１７５】
ある場合は、免疫手法を用いてウイルス粒子そのものを単離するのが有利と考えられる。従来技術は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異性抗体が感染患者によって生産されることを示している。これらの抗体、または動物中またはモノクローン抗体製造法を用いて製造される同等の特異性を有する抗体が、ウイルス粒子を抗体に結合し、試料から取り出すことによりウイルス粒子の単離、濃および精製に使用できる。直接、または様々なリガンド／ライゲート結合反応により、アビジン／ビオチンまたは第１のウイルス特異性抗体を含む第２抗体等のウイルス／抗体複合体の分離を促進するため、抗体を固体担体に結合することができる。バイオアッセイに使用するための他のリガンド／ライゲートペアは当業者に公知であり、核酸分析で試験する前にＳＡＲＳ−ＣｏＶ粒子を試料から単離、濃縮および精製する方法に容易に用いることができる。固体担体の使用に加えて、免疫沈澱または抗原／抗体複合体を混合しない液相中へ分配する方法が公知であり、採用できる。
【０１７６】
他の公知の方法も、本明細書中に開示した方法を用いて試験前にＳＡＲＳ−ＣｏＶを試料から精製するために用い得る。これらには細胞要素、破砕物、およびウイルス粒子より大きい他の成分を除去するための試料の遠心分離と、その後のウイルス粒子自体を沈降するためのより高い速度での遠心分離とが含まれる。ウイルス粒子の沈降は、この目的のために通常用いられるポリエチレングリコール等の沈殿剤の助けを受ける。固体マトリックス上へのウイルスの吸着、超遠心分離、ゲル濾過、密度勾配および等密度遠心分離、およびポリマー相分離が、試験前にウイルスを単離、濃縮および精製するために用い得る他のウイルス精製である。
【０１７７】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸を検出するための診断システム
本発明はまた、キットの形の診断システムを検討する。本発明の診断システムには、少なくとも１回の分析に十分な量の任意の、梱包製品中の本発明の検出プローブ、捕捉プローブおよび／または増幅オリゴヌクレオチドを含み得る。典型的には、キットはまた、梱包されたプローブおよび／または増幅オリゴヌクレオチドを試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在またはその量の測定用の、増幅および／または検出分析で使用するために明白な形で記載された（例えば、紙または電子媒体上に含まれる）使用説明書も含む。さらに、キット中にヘルパープローブが含まれてもよい。
【０１７８】
診断システムの様々な部品を、多様な形で提供し得る。例えば、必要な酵素、ヌクレオシド三燐酸、検出プローブおよび／または増幅オリゴヌクレオチドを凍結乾燥試薬として提供してもよい。再構成すると分析に直ちに使用できる各成分の適切な比率を有する完全な混合物を形成する様に、これらの凍結乾燥試薬をあらかじめ混合してもよい。さらに、本発明の診断システムはキットの凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ由来の標的核酸を増幅するための好ましいキットでは、再構成された場合、本発明の増幅法に使用するために適切な試薬を形成する単一の凍結乾燥試薬としてヌクレオシド三燐酸および酵素に必要な共同因子が提供される。これらのキットでは、凍結乾燥増幅オリゴヌクレオチド試薬も提供される。他の好ましいキットでは、凍結乾燥プローブ試薬が提供される。
【０１７９】
典型的な梱包材料には、本発明の一定限度の検出プローブ、捕捉プローブ、ヘルパープローブおよび／または増幅オリゴヌクレオチド内に保持され得る硝子、プラスチック、紙、箔、ミクロ粒子等が含まれる。従って、梱包材料にはサブミリグラム（例えば、ピコグラムまたはナノグラム）量の想定プローブまたは増幅オリゴヌクレオチドを含む様に用いられる硝子バイアルを含むか、またはその材料は本発明のプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドが作動的に固定された、すなわち、本発明の増幅および／または検出法に関与し得る様に結合したマイクロタイタープレートである。
【０１８０】
使用説明書は典型的には試薬および／または試薬の濃度と、例えば、一定量の試料あたり使用する試薬の相対量であると思われる少なくとも１回の分析法とを示す。さらに、保守、期間、温度および緩衝条件等の仕様も含まれる。
【０１８１】
本発明の診断システムは、個別に提供されるか、または上記の好ましい組み合わせの１つである、試験試料中のＳＡＲＳ−ＣｏＶの存在または量を増幅または測定するための、本明細書に記載の検出プローブ、捕捉プローブおよび／または増幅オリゴヌクレオチドの任意のものを有するキットを想定している。
【実施例】
【０１８２】
本発明の異なった態様および実施形態を示す実施例を以下に示す。当業者であれば分かることであるが、これらの実施例が本発明を本明細書に記載の特定の実施形態に制限するものではない。
【０１８３】
実施例１
リアルタイムＳＡＲＳ−ＣｏＶ分析の感度
本実験において、本発明者らはＳＡＲＳ−ＣｏＶのＲＮＡ転写マッピングがレプリカーゼ遺伝子（転写産物）を標的とするＳＡＲＳ−ＣｏＶ分析システムの感度を試験した。分析システムは転写産物を単離するための標的捕捉工程（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら、米国特許第６，１１０，６７８号参照）と、転写媒介増幅（ＴＭＡ）法における２セットのプライマーとプロモーター−プライマーを用いる増幅工程（Ｋａｃｉａら、米国特許第５，３９９，４９１号参照）と、分子ビーコンプローブによりリアルタイムでアンプリコンの生成を検出する検出工程（Ｔｙａｇｉら、米国特許第５，９２５，５１７号参照）とを含むものとした。この実験のオリゴヌクレオチドは標準ホスフォロアミダイト化合物を用いて合成されたが、その様々な方法は公知である(Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：２８７（１９８７）参照)。オリゴヌクレオチドの合成をＥｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９核酸シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行うことができ、それを用いて行った。３’ＤＡＢＣＹＬ  ＣＰＧ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ；カタログ番号２０−５９１２−１４）とフルオレセインホスフォルアミダイト（ＢｉｏＧｅｎｅｘ、Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＣＡ；カタログ番号ＢＴＸ−３００８−０１）とを用いて、相互作用するフルオレセインとＤＡＢＣＹＬラベルを含む様に分子ビーコンプローブを合成した。反応を９６ウエルプレート上で行い、増幅・検出工程をＤＮＡエンジンオプティコン（ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ（登録商標））連続蛍光検出システム（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡ）上で行った。
【０１８４】
転写産物を最初に転写緩衝液（７９０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）、２３０ｍＭのクエン酸、１０％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、６８０ｍＭのＬｉＯＨ、および０．０３％（ｗ／ｖ）のＦｏａｍ  Ｂａｎ（Ｕｌｔｒａ  Ａｄｄｉｔｉｖｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｂｏｏｍｆｉｅｌｄ、ＮＪ；カタログ番号ＭＳ−５７５））中で希釈し、０、１０、１００、１０００、１０，０００または１００，０００個の転写産物のコピーを含む３０μＬ分の転写緩衝液をＴｅｎ−Ｔｕｂｅユニット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；カタログ番号ＴＵ００２２）に供給した。各コピー数に対し２個の転写産物が含まれていた。次いで本発明者らは転写緩衝液と同等の標的捕捉試薬に、約１０μｇのＳｅｒａ−Ｍａｇ（商標）炭水化物修飾ＭＧ−ＣＭ（Ｓｅｒａｄｙｎ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ；カタログ番号２４１５２１０５−０５０２５０）、１ミクロンの共有結合したオリゴ（ｄＴ）１４を有する超常磁性粒子をさらに加えたものを１００μＬ、Ｔｅｎ−Ｔｕｂｅユニットの各チューブに加えた。標的捕捉試薬を配列番号３７の配列と、配列番号３９の配列を有する３’テール標的結合部分でなる標的捕捉プローブとで、４ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度に標的捕捉試薬中でスパイクした。次いでＴＴＵに蓋をし、１０〜２０秒間渦攪拌し、６０℃の水浴中で２０分間インキュベーションして捕捉プローブの標的結合部分を転写産物にハイブリダイズさせ、室温で１５分間冷却してオリゴ（ｄＡ）３０配列の磁気粒子に結合したオリゴ（ｄＡ）１４へのハイブリダイゼーションを促した。（テール部分は標的結合部分とオリゴ（ｄＴ）３０配列との間に介在し、捕捉プローブを固定化オリゴ（ｄＴ）１４により結合しやすくするために５’−ｔｔｔ−３’スペーサー配列を誘導する）試料の冷却後、磁気粒子を単離し洗浄するためにＤＴＳ（商標）１６００標的捕捉システム（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ；カタログ番号５２０２）を用いた。ＤＴＳ１６００標的捕捉システムは、ＴＴＵの位置を決め、且つそれに磁場を照射するための試験管ベイを有する。ＴＴＵをＤＴＳ１６００標識捕捉システム上に５分間、試験管内の時期粒子を単離するために磁場の存在下で試験管ベイ上に置き、その後試料溶液をＴＴＵから吸引した。各試験管に１ｍＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６．５ｍＭのＮａＯＨ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．０２％ｗ／ｖ）のメチルパラベン、０．０１％のプロピルパラベン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）のラウリル硫酸ナトリウム、および４ＭのＮａＯＨ）を加えｐＨ７．５とし、試験管に蓋をして磁気粒子を再懸濁するために１０〜２０秒間渦流攪拌した。ＴＴＵをＤＴＳ１６００標的捕捉システムの試験管ベイに戻し、洗浄緩衝液を吸引する前に室温で約５分間放置した。１ｍｌの洗浄緩衝液の代わりに１００μＬを用いて洗浄工程を繰り返した。洗浄後、ＴＴＵを回収する前に４０μＬの純水を各試験管に加え、１分間渦流攪拌し、６０℃で５分間インキュベーションして転写産物を磁気粒子から溶出した。試験管をＤＴＳ１６００標的捕捉システ���上の試験管ベイに再び置き、磁気粒子を溶出した転写産物から分離するために室温で約５分間放置した。
【０１８５】
増幅工程では、２０μＬ分の試料を試験管（磁気粒子なし）からプライマーと、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（配列番号７）を有する分子ビーコンプローブでスパイクした２０μＬの増幅試薬（４．６１６ｇのＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝液、２．３６４ｇのＴｒｉｚｎａ塩酸塩緩衝液、４３ｍＬのＭｇＣｌ２、１Ｍ溶液、３．４７４ｇのＫＣｌ２、６６．６ｍＬのグリセロール、０．０２２ｇの酢酸亜鉛、２０ｍＬのｄＡＴＰ、１００ｍＭ溶液、２０ｍＬのｄＣＴＰ、１００ｍＭ溶液、２０ｍＬのｄＧＴＰ、１００ｍＭ溶液、２０ｍＬのｄＴＴＰ、１００ｍＭ溶液、０．４ｍＬのＰｒｏＣｌｉｎ３００Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ（Ｓｕｐｅｌｃｏ、Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ、ＰＡ；カタログ番号４８１２６）、４０ｍＬのＡＴＰ、３２５ｍＭ溶液、２４，６ｍＬのＣＴＰ、３２５ｍＭ溶液、４０ｍＬのＧＴＰ、３２５ｍＭ溶液、２４．６ｍＬのＵＴＰ、３２５ｍＭ溶液、純水で全容積８５ｍＬにし、６ＭのＨＣｌでｐＨ８．２にする）を含む９６ウエルプレートの反応ウエルに移し、各ウエル中の各プライマーとプローブとの最終濃度をそれぞれ１５０ｐｍｏｌ／ｍＬおよび２００ｐｍｏｌ／ｍＬとした。この反応のプライマーは以下のヌクレオチド配列を有し、プロモーター−プライマーはさらに配列番号３４の５’プロモーター配列を含んでいた：
【０１８６】
【化４０】
2006523460.tif 000022
【０１８７】
次いでプライマーをＤＮＡエンジンオプティコン連続蛍光検出システムに負荷し、６０℃で５分間インキュベーションして、温度を３７℃に１分間下げる前にＴ７プロモーター−プライマーを転写産物にハイブリダイズさせた。この時点で、２０μＬの酵素試薬（７０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＳＬＣ）、１０％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２界面活性剤、１６ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のナトリウムアジド、２０ｍＭのＴｒｉｚｍａ塩基、５０ｍＭのＫＣｌ２、２０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１５０ｍＭのトレハロース、４ＭのＮａＯＨ（ｐＨ７に）、２２４ＲＴＵ／micronＬのＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素、および１４０Ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ；ここで活性の１ユニッをＭＭＬＶ逆転写酵素の場合３７℃、１５分間の５．７５ｆｍｏｌのｃＤＮＡの合成と放出と定義し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの場合３７℃、２０分間の５．０ｆｍｏｌのＲＮＡ転写産物の生成と定義する）を各反応ウエルに加え、プレートを５〜１０秒間渦流攪拌し、装置に再ロードした。ＤＮＡエンジンオプティコン連続蛍光検出システムは、最初の蛍光の読み取りを行う前にプレートを４２．５℃で１５分間加熱する様にプログラムされた。増幅反応が完了する前に、その後の蛍光の読み取りを基本的に４２．５℃の一定温度で、全体で１００回の蛍光の読み取りを２６秒の間隔で行った。
【０１８８】
この分析システムにおける検出は、分子ビーコンがアンプリコンにハイブリダイズしたときの分子ビーコンの立体配座の変化によって発生する検出可能蛍光シグナルに基づいている。分子ビーコンプローブがヘアピン立体配座を維持する限り、すなわち、転写産物の増幅生成物にハイブリダイズしなかった場合、蛍光ラベルからの蛍光発光は一般にＤＡＢＣＹＬラベルにより消光された。しかしながら、より多くのビーコンプローブが反応ウエル中のアンプリコンにハイブリダイズすると、検出可能な蛍光シグナルが増加した。従って、時間によって増加する蛍光発光は、転写産物の標的領域が活発に増幅することを示した。ＤＮＡエンジンオプティコン連続蛍光検出システムをこの実験の分子プローブを用いて得られた結果を解析するために使用した。その結果を図１のグラフに示す。ｙ軸上に各反応ウエルから検出した蛍光単位を、ｘ軸上に時間サイクル数を示す。バックグラウンド以上に上昇（約０．４〜０．７蛍光単位の範囲）し、４０時間サイクル以内のシグナルを正の増幅であると考えた。これらの基準を用いると、反応の１つが１００コピーの感度を有しており、少なくとも１０００コピーの転写産物を有する反応は全て陽性となった。
【０１８９】
本発明者らは別な実験で、以下の２’−Ｏ−メチルリボヌクレアーゼ配列を有する分子ビーコンプローブが、この実験のプライマーセットを用いるリアルタイム増幅分析で転写産物アンプリコンにあまりハイブリダイズしないことが分かった：
【０１９０】
【化４４】
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【０１９１】
これらの分子ビーコンプローブが、最適分析で転写産物由来の標的アンプリコンに検出可能にハイブリダイズし得るか、またはこれらのプローブの標的結合部分が標的となるアンプリコンに検出可能にハイブリダイズすると思われる鎖状検出プローブ中に取り込まれ得ることは可能である。
【０１９２】
実施例２
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ分析の特異性および感度
この実験は、レプリカーゼ遺伝子に対するＳＡＲＳ−ＣｏＶ転写産物マッピング（転写産物）を目標とするＳＡＲＳ−ＣｏＶ分析システムの特異性と感度を評価するために設計された。ヒトコロナウイルス株２２９Ｅ（ＨｃｏＶ）、ヒト免疫欠失ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびパルボウイルス由来のウイルス核酸が、この分析システムの交差反応性を評価するために含まれた。分析システムには捕捉プローブ、標的捕捉試薬、材料、装置および実施例１のプロトコールが含まれ、増幅工程はＴＭＡ反応中の実施例１のプライマー／プロモーター−プライマーセット、およびハイブリダイゼーション保護分析（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号）におけるアクリジンエステル（ＡＥ）標識プローブによるアンプリコンの生成を検出するための検出工程が用いられる。上記の様に、この実験のオリゴヌクレオチドを標準のホスフォロアミダイト化合物を用いて合成したが、その様々な方法は公知である。オリゴヌクレオチド合成はＥｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９核酸合成装置を用いて可能であり、それを用いてオリゴヌクレオチドを合成した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出プローブは塩基配列番号４６：ｕｇｃｇｕｇｇａｕｕｇｇｃｕｕｕｇａｕｇｔと、ヌクレオチド１４と１５との間に位置する非ヌクレオチドリンカーによりプローブに連結した２−メチル−ＡＥラベル（グローアー）（Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，５８５，４８１号および第５，６３９，６０４号参照）とを有していた。デオキシヌクレオチドである３’最末端ヌクレオシドを除いて、検出プローブのヌクレオチドは全て２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであった。条件が増幅を支持するに十分であることを確認するため、各試料はＨＩＶ核酸由来の内部標準と、内部標の増幅および検出のためのオリゴヌクレオチドとを含んでいた。内部標準のアンプリコンを検出するために使用したオリゴヌクレオチドは、非ヌクレオチドリンカーによりオリゴヌクレオチドに連結したオルソフルオロＡＥラベル（フラッシャー）を含んでいた。
【０１９３】
使用した標的捕捉試薬は４ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度のＳＡＲＳ−ＣｏＶ捕捉プローブと、４．４ｐｍｏｌ／ｍＬの濃度の内部標準捕捉プローブとを含んでいた。このストックから、内部標準の約２５０コピーを含む４００μＬの標的捕捉試薬をこの実験に使用したＴＴＵの各試験管に加えた。ウイルス（ＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶは不活性化した）を含む試料の５００μＬ分を以下の表１に示す様に試験管に供給した。表に示した試料の各濃度に対し１０個の転写産物を分析したが、ＨＣｏＶ−２２９Ｅは例外で５個の転写産物しか分析しなかった。また、内部標準を含む１０個の負対照のみも分析した。
【０１９４】
【表１】
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【０１９５】
ＨＣｏ−２２９ＥをＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓｓ、ＶＡ）からＡＴＣＣ番号ＶＲ７４０として入手した。表１の「力価」の見出しでは、「ＴＣＩＤ５０」は５０％の組織培養感染用量を表し、「ｃ」はコピー数を表し、「ＩＵ」は国際単位を表す。
【０１９６】
標的捕捉プロトコールの最終工程では、残っている洗浄緩衝液を全て試験管から除去した。標的捕捉工程後、実施例１の増幅試薬を含む７５μＬのプライマー／プロモーター−プライマーを各試験管に加えた。実施例１の様に、プライマーとプロモーター−プライマーの最終濃度は各試験管あたり１５０ｐｍｏｌ／ｍＬであった。試験管に２００μＬのシリコーン油を加え、ＴＴＵを６０℃の水浴中で１０分間インキュベーションする前に蓋をして１０〜２０秒、渦流攪拌した。次いで実施例１の酵素試薬２５μＬを試験管に加える前にＴＴＵを４１．５℃の水浴中で１０分間インキュベーションした。酵素試薬を添加後、ＴＴＵに蓋をし、水浴から取り出し、増幅および酵素試薬を十分に混合するために手で振った。ＴＴＵを再び４１．５℃の水浴中に置き、標的配列の増幅を促進するために６０分間インキュベーションした。増幅後、ＴＴＵを４１．５℃の水浴から取り出し、室温に冷却した。
【０１９７】
検出のため、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出プローブで２．５×１０７ＲＬＵ／ｍＬの濃度、および内部コントロールプローブで７．５×１０６ＲＬＵ／ｍＬにスパイクした１００μＬのプローブ試薬（７５ｍＭのクエン酸、３．５％（ｗ／ｖ）のＬＬＳ、７５ｍＭのＬｉＯＨ、１５ｍＭのアルドリチオール、１ＭのＬｉＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、３％（ｖ／ｖ）のエチルアルコール、およびＬｉＯＨでｐＨ４．２）を各試験管に添加した。ここで「ＲＬＵ」は化学発光の目安である相対光単位を表す。プローブ試薬を添加後、ＴＴＵを６０℃の水浴中で１５分間インキュベーションし、検出プローブをＳＡＲＳ−ＣｏＶ転写産物または内部標準の任意の増幅生成物中に含まれるそれぞれ対応する標的配列とハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、２５０ｍＬの選択試薬（６００ｍＭの硼酸、２３５ｍＭのＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００界面活性剤、およびＮａＯＨでｐＨ９）を試験管に加え、ＴＴＵに蓋をして１０〜２０秒間渦流攪拌し、次いで６０℃の水浴中で１０分間インキュベーションして未ハイブリダイズプローブに会合するアクリジニウムエステルを加水分解した。１ｍＭの硝酸と０．１％（ｖ／ｖ）過酸化水素を含む溶液の自動注入器を備えたＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ＋Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＧｅｎＰｒｏｂｅ；カタログ番号４７４７）中で分析する前に、１９〜２７℃に保った水浴中で試料を１０分間冷却し、その後１Ｎ水酸化ナトリウムを含む溶液を自動注入した。
【０１９８】
結果を以下の表２にまとめるが、図２にグラフ表示する様に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ分析は８０ｃ／ｍＬで反応率が１００％であり、２５および５０ｃ／ｍＬの双方で反応率は約９０％であった。この分析の結果はさらに、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出プローブがＨＣｏＶ−２２９Ｅ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、パルボウイルスまたは１０個のＨＣＶ転写産物の９個と交差反応しなかったことを示す。しかしながら、ＢＬＡＳＴ分析はＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出プローブとＨＣＶ  ＲＮＡとの間の如何なる配列類似性を示さなかったので、１個の反応性ＨＣＶ転写産物は交差汚染試料の結果であると信じられる。
【０１９９】
【表２】
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【０２００】
表２に現れる試験した異なったコピーレベルに対する変動系数（％ＣＶ）は、転写産物の平均に対する転写産物の標準偏差（％）を表す。転写産物のあるものは増幅されるが他のものは増幅されず、その結果転写産物間の標準偏差が高くなるので、これらの値は転写産物の濃度が下がると共に一般に大きくなる。
【０２０１】
ＨＩＶ核酸由来の内部対照を含む他の実験で、あるプライマーが内部対照またはそのプライマーと交差ハイブリダイズすると信じられていることに、本発明者らは注意した。これらのプライマーには配列番号３３の配列と完全に相補性である塩基配列を有するプラーマー、および以下の配列を有するプライマーが含まれた：
【０２０２】
【化４７】
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【０２０３】
この理由で、配列番号４２および配列番号４３の非Ｔ７プライマーが上記実施例で好ましい。配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３３の塩基配列を標的とする非Ｔ７プライマーをＳＡＲＳ−ＣｏＶ核酸の増幅に使用し得るが、内部対照が分析に含まれる必要がある場合、内部対照と関連するプライマーに選択に注意しなければならないと思われる。
【０２０４】
いくつかの好ましい実施形態を参照してかなり詳細に本発明を説明し示してきたが、当業者は本発明の他の実施形態も容易に理解し得ると思われる。従って、本発明は以下に付属するクレームの精神と範囲内に包含される全ての変更と変法を含むとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】図１は１００〜１０００コピーの感度を示す、ＳＡＲＳ−ＣｏＶリアルタイム増幅分析のグラフ表示である。
【図２】図２は１ｍＬあたり８０コピーにおける終点検出によるＳＡＲＳ−ＣｏＶ増幅分析の１００％反応性を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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