(57)【要約】本発明は、特にコラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害するペプチドおよびモノクローナル抗体である薬剤の同定および使用について示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
α１β１インテグリンと結合するコラーゲンＸIII の能力を中和するための遮断剤の患者への投与を含んで成る、慢性炎症性疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項２】
慢性炎症性疾患が、単球、リンパ球、またはその両方の浸潤からもたらされる進行性の病原により特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
慢性炎症性疾患が、腎臓繊維症、肺繊維症、肝臓繊維症、関節性リウマチ、乾せん、実験的大腸炎または半月状糸球体腎炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記遮断剤がペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記遮断剤が中和抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記遮断剤が、末梢血単球および/またはリンパ球上のα１β１インテグリンと慢性炎症性組織の血管内皮細胞上のコラーゲンＸIII との相互作用を遮断する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する活性化剤の被験者への投与を含んで成る、α１β１-陽性間質性単球および/またはリンパ球の蓄積が観察される炎症性疾患または他の状態を有する被験者を治療する方法。
【請求項８】
上記活性化剤がコラーゲンＸIII とα１β１インテグリンの結合を遮断する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記遮断剤がペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記遮断剤が抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記炎症性疾患または他の状態が、腎臓繊維症、肺繊維症、肝臓繊維症、関節性リウマチ、乾せん、実験的大腸炎または半月状糸球体腎炎である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
上記活性化剤が、末梢血単球および/またはリンパ球上のα１β１インテグリンと慢性炎症性組織の血管内皮上のコラーゲンＸIII との相互作用を遮断する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
末梢血単球および/またはリンパ球上のα１β１インテグリンと、コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する活性化剤との接触を含んで成る、インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的流出を減少させる方法。
【請求項１４】
インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的流出の減少が、α１β１インテグリンと、α１β１インテグリンと特異的に結合するコラーゲンＸIII のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドとの接触を含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的流出の減少が、コラーゲンＸIII の結合部位の遮断のために有効な条件下における、炎症性組織の血管/毛細管の内皮細胞の細胞表面上のコラーゲンＸIII リガンドと結合する抗体の接触を含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的流出の減少が、細胞表面上のコラーゲンＸIII のタンパク質の発現を阻害するために有効な条件下における、血管内皮と小阻害性ＲＮＡとの接触を含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
α１β１インテグリンとの結合からコラーゲンＸIII を遮断することを含んで成る、単球および/またはリンパ球の慢性炎症性組織の間隙への流出の速度を減少させる方法。
【請求項１８】
上記遮断が、コラーゲンＸIII リガンドの遮断を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記遮断が、α１β１インテグリンの遮断を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記遮断が、上記インテグリンとα１β１インテグリンの結合部位を含むコラーゲンＸIII のペプチドフラグメントとの接触を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記遮断が、コラーゲンＸIII リガンドとモノ-特異性抗体との接触を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
α１β１インテグリンとの結合からコラーゲンＸIII を遮断することを含んで成る、α１β１インテグリンとの結合からコラーゲンＸIII の遮断を単球および/またはリンパ球の慢性炎症性組織の間隙への流出の速度を減少させる方法。
【請求項２３】
単球および/またはリンパ球、血管内皮、あるいは、その両方と、α１β１インテグリン上のコラーゲンＸIII 結合部位を占有するか、あるいはコラーゲンＸIII 上のα１β１結合部位を遮断する、いずれかの薬剤との接触を含んで成る、末梢血単球およびまたはリンパ球上のα１β１インテグリンと慢性炎症性組織の血管内皮細胞上のコラーゲンＸIII の相互作用を遮断する方法。
【請求項２４】
α１β１インテグリン上のコラーゲンＸIII 結合部位を占有する上記薬剤が、ペプチド阻害剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
コラーゲンＸIII 上のα１β１結合部位を遮断する上記薬剤が、中和モノクローナル抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する薬剤を同定することを含んで成る、間質性単球またはリンパ球が関係するモデルの間隙への単球の流出を阻害する上記薬剤の同定方法。
【請求項２７】
上記薬剤が、Ａｌｅｘａ接合精製化α１β１インテグリンのＭＣＰ-１で処理した第一内皮細胞に対する結合を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
上記薬剤が、Ａｌｅｘａ接合精製化α１β１インテグリンとＭＣＰ-１で処理した培養血管内皮細胞との相互作用を遮断する抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害するペプチドである、配列ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する単離ペプチド。
【請求項３０】
配列ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する請求項２９に記載の単離ペプチド。
【請求項３１】
８-１６のアミノ酸を有する請求項２９に記載の単離ペプチド。
【請求項３２】
１２-１６のアミノ酸を有する請求項３１に記載の単離ペプチド。
【請求項３３】
ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）からなる単離ペプチド。
【請求項３４】
ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）からなる単離ペプチド。
【請求項３５】
コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する、ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）と７０％以上の配列一致を有するアミノ酸配列を有する単離ペプチド。
【請求項３６】
コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する、ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と７０％以上の配列一致を有するアミノ酸配列を有する単離ペプチド。
【請求項３７】
請求項２９に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項３８】
請求項３０に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項３９】
請求項３３に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項４０】
請求項３４に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項４１】
請求項３５に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項４２】
請求項３６に記載のペプチドに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
特異的なインテグリン受容体、インテグリンα１β１は、Ａｌｐｏｒｔ症候群に関連する間質性疾患の進行において役割を果たす。この有効性は、Ａｌｐｏｒｔマウスとインテグリンα１遺伝子のノックアウトマウスとの交配により説明された（Cosgrove et al.,Am.J.Path.,157,1649-1659(2000))。そのインテグリンノックアウト突然変異は、腎臓において広く発現しているにも関わらず、正常なマウス中の腎臓の発達または機能において明白な有効性を有さない（Gardner et al.,Dev.Biol.175,301-313(1996))。しかしながら、α１インテグリン突然変異をＡｌｐｏｒｔマウスの遺伝的背景に加えると、糸球体性および尿細管間質性の両疾患は顕著に減弱した。糸球体性病原の減弱は、ＧＢＭ中の糸球体間質の拡大および糸球体間質のラミニンの沈着における有効性に関連する（Cosgrove et al.,Am.J.Path.,157,1649-1659(2000))。しかしながら、尿細管間質性疾患におけるα１インテグリン無し突然変異は明らかでない。
【発明の開示】
【０００２】
本発明は、Ａｌｐｏｒｔマウスの肝臓の血管内皮細胞表面における特異的な誘導性リガンドの存在の発見に基づく。有意に、これは広範な種々の治療方法およびこれらの治療方法における使用に適当な化合物（例えば、小有機分子およびペプチド）を同定する方法を供する。
【０００３】
好ましくは、その特異的な誘導性リガンドは、Ａｌｐｏｒｔマウスの腎臓（ただし正常な腎臓ではない）の血管内皮細胞の表面に存在する。そのリガンドは、精製したインテグリンα１β１と結合し、そして、Ａｌｐｏｒｔ腎臓中の単球はインテグリンα１β１陽性である。骨髄由来単球（１０％）の分画だけがインテグリンα１β１-陽性であるが、単球輸送アッセイに基づくと、新たに流出した単球はインテグリンα１β１-陽性である。インテグリンα１β１-欠損Ａｌｐｏｒｔ（ＤＫＯ）マウス中の単球の流出の速度は、非Ａｌｐｏｒｔマウスよりも極めて遅い。精製化インテグリンα１β１（Chemicon,Temecula,Caから購入）の注射による機能的なリガンドの遮断は、Ａｌｐｏｒｔマウスの間隙への単球の流出速度を減少させる。この証拠を合わせると、Ａｌｐｏｒｔ血管内皮にインテグリンα１β１の誘導性リガンドが存在すること証明し、それは間質へのインテグリンα１β１-陽性単球の選択的な流出を媒介する。精製したα１β１インテグリンの注射によるリガンド遮断のデータと合わせて、極めて緩徐な流出の速度を伴う流出の遅延した開始を示すＤＫＯのデータは、このリガンド（純粋な１２９Ｓｖ/Ｊの遺伝的背景における７週齢のＡｌｐｏｒｔマウスの尾静脈への本試薬の注射の６時間以内におけるＡｌｅｘａ標識化インテグリンα１β１と結合する腎臓内の物質として定義する）の機能的な遮断が単球の流出の速度を減少させるであろうことを示し、インテグリンα１β１−陽性間質の単球/リンパ球の蓄積が観察される場合、それはいかなる慢性炎症性疾患にとっても治療的に有益であろう。
【０００４】
ある態様において、本発明は慢性炎症性疾患を有する患者の治療方法を供する。その方法は、α１β１インテグリンと結合するコラーゲンＸIII の能力を中和するために、遮断剤（例えば、ペプチドまたは中和抗体）の患者への投与を含む。その慢性炎症性疾患は、好ましくは、浸潤している単球、リンパ球、またはその両方から生じる進行性病原により特徴づけられる。これらの慢性炎症性疾患の例は、腎臓繊維症、肺繊維症、肝臓繊維症、関節リウマチ、乾せん、実験的大腸炎または半月状糸球体腎炎を含む。好ましくは、その遮断剤は、末梢血単球および/またはリンパ球上のα１β１インテグリンと慢性炎症性組織の血管内皮上のコラーゲンＸIII との相互作用を遮断する。
【０００５】
他の態様において、本発明は、インテグリンα１β１-陽性の間質性単球および/またはリンパ球の蓄積が観察される炎症性疾患または他の状態を有する患者の処理方法を供する。その方法は、コラーゲンＸIII およびα１β１インテグリン間の相互作用を分裂させる活性化剤の患者への投与を含む。好ましくは、その活性化剤はコラーゲンＸIII （慢性炎症性組織の血管内皮上）およびα１β１インテグリン（末梢血単球および/またはリンパ球上）の結合を遮断する。好ましくは、その遮断剤はペプチドまたは抗体である。好ましくは、その炎症性疾患または他の状態は腎臓繊維症、肺繊維症、肝臓繊維症、関節リウマチ、乾せん、実験的大腸炎または半月状糸球体腎炎である。
【０００６】
他の態様において、本発明は、インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的な流出を減少させる方法を供する。その方法は、末梢血単球および/またはリンパ球におけるα１β１インテグリンと、コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する活性化剤との接触を含む。これはいくつかのの異なる方法において達成される。例えば、インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的な流出を減少させることは、α１β１インテグリンとα１β１インテグリンと特異的に結合するコラーゲンＸIII のアミノ酸配列の少なくとも一部を有するペプチドとの接触を含む。あるいは、インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織への流出を減少させることは、コラーゲンＸIII の結合部位を遮断するための有効な条件下における炎症性組織の血管/毛細管内皮細胞の細胞表面上のコラーゲンＸIII リガンドと結合する抗体の接触を含む。さらに他の態様において、インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織への流出を減少させることは、細胞表面におけるコラーゲンＸIII タンパク質の発現を防ぐために有効な条件下における、血管内皮と小阻害性ＲＮＡとの接触を含む。
【０００７】
他の態様において、本発明は単球および/またはリンパ球の慢性炎症性組織の間隙への流出の減少方法を供する。その方法は、α１β１インテグリンとの結合からコラーゲンＸIII を遮断することを含む。これはコラーゲンＸIII リガンドの遮断により起こることができ、あるいは、α１β１インテグリンの遮断により起こることができる。１つの態様において、その遮断剤は、α１β１インテグリンの結合部位を含むコラーゲンＸIII のペプチド断片である。もう一方の態様において、その遮断剤は、炎症性組織の血管/毛細管内皮細胞表面上のコラーゲンＸIII と結合するモノ-特異性抗体である。
【０００８】
さらに他の態様において、本発明は、単球および/またはリンパ球の炎症性組織の間隙への流出の減少方法を供する。その方法は、α１β１インテグリンと結合からコラーゲンＸIII を遮断することを含む。
【０００９】
他の態様において、本発明は、末梢血単球および/またはリンパ球上のα１β１インテグリンと、慢性炎症性組織の血管内皮におけるコラーゲンＸIII との相互作用を遮断する方法を供する。その方法は、単球および/またはリンパ球、血管内皮、またはその両方と、α１β１インテグリン上のコラーゲンＸIII 結合部位を占有する（例えば、ペプチド阻害因子）、あるいはコラーゲンＸIII 上のα１β１結合部位を遮断する（例えば、中性モノクローナル抗体）、いずれかの薬剤との接触を含む。
【００１０】
本発明は、間質の単球またはリンパ球が結び付けられるモデルの間隙への単球の流出を阻害する薬剤を同定する方法を供する。その方法は、コラーゲンＸIII とα１β１インテグリンの間の相互作用を阻害する薬剤を同定することを含む。ある態様において、その薬剤は、ＭＣＰ-１で処理した一次内皮細胞に対するＡｌｅｘａ-接合精製化α１β１インテグリンの結合を阻害する。他方の態様において、その薬剤は、ＭＣＰ-１で処理した培養血管内皮細胞に対するＡｌｅｘａ接合精製化α１β１インテグリンの相互作用を遮断する抗体である。
【００１１】
また、本発明は、配列ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を有する単離ペプチドを供し、そこで、そのペプチドはコラーゲンＸIII とα１β１との間の相互作用を阻害する（例えば、遮断する）。好ましくは、その単離ペプチドは配列ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である。ある態様において、その単離ペプチドは、長さにおいて、８-１６アミノ酸である。他の態様において、その単離ペプチドは、長さにおいて、１２-１６アミノ酸である。ある態様のため、その単離ペプチドはＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）から成る。ある態様のため、その単離ペプチドはＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）から成る。
【００１２】
また、本発明は、ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）と７０％以上一致する配列を有するアミノ酸配列を有する単離ペプチドを供し、そのペプチドはコラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する。他の態様において、本発明は、ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と７０％以上一致する配列を有するアミノ酸配列を有する単離ペプチドを供し、そのペプチドはコラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する。
【００１３】
また、本発明は本明細書において説明されるペプチドに対する抗体を供する。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つまたはそれ以上（または少なくとも１つ）、例えば、活性化剤の組み合わせ（すなわち、活動的な酸化的張力調節剤）のように、本発明の組成物および方法において使用できる。このように、「ａ」ポリペプチドを含む組成物は、１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む組成物を意味する。
【００１５】
本明細書において「アミノ酸」は一般式：ＮＨ2-ＣＲＨ-ＣＯＯＨの化学化合物を意味して使用され、式中、側鎖であるＲはＨ、または有機群である。式中、Ｒは有機であり、Ｒは変動することができ、極性または非極性（すなわち、疎水性）のいずれかである。本発明のアミノ酸は、天然に発生するか、または合成（しばしば、非タンパク性を意味する）されてもよい。本明細書において使用される場合、有機群は脂肪族群、環式群または脂肪族と環式群の組み合わせとして分類される炭化水素群である。「脂肪族群」の語は、飽和または不飽和直鎖または分岐鎖の炭化水素群を意味する。この語は、例えば、アルキル、アルケニル、およびアルキニル基を包含するために使用される。「環式群」は脂環式、芳香族群、または複素環群として分類される閉環式炭化水素群を意味する。「脂肪族群」の語は、これらの脂肪族群と似た特性を有する環式炭化水素群を意味する。「芳香族群」は単-また多環式芳香族炭化水素群を意味する。本明細書において使用される場合、有機群は置換されていても、置換されていなくてもよい。
【００１６】
本明細書において、「ポリペプチド」および「ペプチド」の語は、アミノ酸のポリマーを意味して互換的に使用される。これらの語はアミノ酸のポリマーの特定の長さを意味しない。このように、組み換え技術、化学もしくは酵素合成、または天然に発生したものを使用して生産しても、例えば、オリゴペプチド、タンパク質、および酵素の語は、ポリペプチドまたはペプチドの定義に含まれる。また、この語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等により修飾され、あるいは、誘導されたポリペプチドを含む。
【００１７】
出願を通して、以下の省略が使用される。
【表１】
2006516024.tif 000002
【００１８】
本発明の実例となる態様の詳細な説明
本発明は、Ａｌｐｏｒｔマウス腎臓の血管内皮細胞表面上の特異的な誘導性リガンドの存在の発見に基づく。有意に、これは、誘導性リガンドとその受容体（α１β１インテグリン）との間の相互作用を阻害することを目的とした広範な種々の治療方法を供する。
【００１９】
その特異的な誘導性リガンドはコラーゲンＸIII である。コラーゲンＸIII ｍＲＮＡはコントロールと比較して、Ａｌｐｏｒｔ腎臓由来の内皮細胞中で誘導される。精製したα１β１インテグリンの結合は、ＭＣＰ-１および過酸化水素により誘導される。Ａｌｐｏｒｔマウス（しかし、正常なマウスではない）の尾静脈に注射した標識化α１β１インテグリンは血管内皮と結合する。しかしながら、コラーゲンＸIII の発現の基礎的レベルは、正常なマウスの血管内皮および未処理の培養内皮細胞において観察されることに注意すべきである。他の因子は「誘導性」結合に寄与するようである。おそらく候補物質はセレクチンであり、それは血管内皮上のリンパ球、単球、およびｂ-細胞の「ゆっくりとした回転」を促進するタンパク質のファミリーである。このゆっくりとした回転は、さらに古典的なリガンド/受容体相互作用を介して強硬な接着を促進するために必要とされる。セレクチンは炎症性組織（但し、正常な組織ではない）の血管内皮において誘導される。
【００２０】
有意に、本発明は、炎症性疾患またはインテグリンα１β１-陽性の間質の単球および/またはリンパ球の蓄積が観察される他の状のための治療方法を供する。そのような方法は、そのような状態に苦しむ患者に対して、誘導性リガンドコラーゲンＸIII とその受容体であるα１β１インテグリンとの相互作用を阻害する（例えば、遮断あるいは中和する）活性化剤の投与を含む。そのような状態は、例えば、腎臓繊維症、肺繊維症、肝臓繊維症、関節リウマチ、乾せん、実験的大腸炎または半月状糸球体腎炎を含む。また、本発明は、これらの治療方法における使用に適当な薬剤（例えば、小有機分子、ペプチド、抗体、ＳｉＲＮＡ）を同定する方法を供する。
【００２１】
有意に、以下の発見は、本明細書において供される。：誘導性リガンドは精製したインテグリンα１β１と結合する。；Ａｌｐｏｒｔ腎臓中の全ての単球はインテグリンα１β１-陽性である；骨髄由来単球（１０％）の分画のみがインテグリンα１β１-陽性であるが、単球輸送アッセイに基づき、新たに流出した単球は、インテグリンα１β１-陽性である。；インテグリンα１β１-欠損Ａｌｐｏｒｔ（ＤＫＯ）マウス中の単球流出の速度は、非Ａｌｐｏｒｔマウスよりも極めて遅い。；そして、精製したインテグリンα１β１の注射による機能的なリガンドの遮断は、Ａｌｐｏｒｔ腎臓の間隙への単球の流出速度を減少させる。合わせれば、この証拠はＡｌｐｏｒｔ血管内皮上にインテグリンα１β１の誘導性リガンドが存在し、それが間質へのインテグリンα１β１-陽性単球の選択的な流出を媒介することを証明する。
【００２２】
このように、本発明は、インテグリンα１β１-陽性単球の慢性炎症性組織の間質への選択的な流出の遮断/減少方法を供する。この方法は、循環している末梢血単球/リンパ球上のα１β１インテグリンと本明細書において説明される活性化剤（例えば、α１β１インテグリンと特異的に結合するコラーゲンＸIII の一部の組成物を伴うペプチド）との接触を含む。あるいは、この方法は、結合した活性化剤（例えば、抗体）がコラーゲンＸIII のための結合部位を遮断し、したがって、末梢血単球/リンパ球上のα１β１インテグリンと血管/毛細管内皮細胞上のコラーゲンＸIII との結合を阻害するような方法において炎症性組織の血管/毛細管内皮細胞の細胞表面上のコラーゲンＸIII リガンドと結合するであろう活性化剤（例えば、人工のモノ-特異性抗体調製剤）の投与を含む。さらに、この方法は、細胞表面上のコラーゲンＸIII タンパク質の発現を阻害し、したがって、α１β１インテグリン-陽性単球/リンパ球の炎症性組織への接着/遊出の阻害/減少させるような方法において、血管内皮を標的とする活性化剤（例えば、小さな阻害性ＲＮＡ）の使用を含んでもよい。
【００２３】
精製化インテグリンα１β１の注射によるリガンド遮断のデータを併用した流出の極めて緩徐な速度を伴う流出の開始の遅延を示すＤＫＯデータは、このリガンド（純粋な１２９Ｓｖ/Ｊの遺伝的背景における７週齢のＡｌｐｏｒｔマウスの尾静脈への本試薬の注射の６時間以内のＡｌｅｘａ標識化インテグリンα１β１と結合する腎臓内の物質として定義される）の機能的な遮断が単球の流出の速度を減少させるであろうことを示す。
【００２４】
このように、本発明は単球（および/またはリンパ球）の慢性炎症性組織の間隙への流出の速度を減少させる方法を供する。この方法は、特に、循環している末梢血単球またはリンパ球の表面上に、コラーゲンＸIII リガンドとしてα１β１インテグリン受容体が存在する場合、リンパ球および/または単球の細胞表面上のα１β１インテグリンとコラーゲンＸIII とα１β１インテグリンとの間の相互作用を阻害する（例えば、遮断あるいは中和する）薬剤とを接触させることにより、α１β１インテグリンα１βインテグリンとの結合からコラーゲンＸIII を遮断することを含む。これは、活性化剤、例えば、α１β１インテグリンの結合部位を含むコラーゲンＸIII のペプチド断片の使用に起因してよい。あるいは、この方法は、循環している末梢血単球/リンパ球上のα１β１インテグリンとの相互作用（例えば、結合）から血管内皮細胞上のコラーゲンＸIII の能力を遮断し、したがって、インテグリンα１β１-陽性リンパ球/単球の炎症性組織の間隙への接着および遊出を阻害/減少させるような方法において、炎症性組織の血管/毛細管内皮細胞表面上のコラーゲンＸIII と結合する活性化剤、例えば、モノ-特異性抗体の使用を含んでもよい。
【００２５】
Ａｌｅｘａ-５６８デキストラン負荷単球での骨髄輸送実験は、コントロールと比較してα１インテグリン無しマウス由来の細胞のための単球の流出速度の有意な減少を示した。結合パートナーの相互作用を検出するために、ファージディスプレイ法を使用し、コラーゲンＸIII はα１β１インテグリンの内皮細胞リガンドとして同定した。この独特な細胞膜結合性コラーゲンは、α１β１インテグリンと結合することが以前に示されたが、しかし、明細書に記載した発見以前にその機能は知られていない。コントロールと比較して増加したコラーゲンＸIII の発現はＡｌｐｏｒｔマウス由来の内皮細胞上で起こる。コラーゲンＸIII は培養腎臓内皮細胞で単球ケモ-誘引性タンパク質１（ＭＣＰ-１）、Ａｌｐｏｒｔ腎臓中の誘導化物として前述したケモカイン、および、慢性炎症性組織中の単球の漸増における役割のために特徴付けられるウェルにより誘導される。α１β１インテグリンと結合するためのコラーゲンＸIII の能力の遮断は、インテグリンα１β１-陽性間質単球の蓄積が観察されるいかなる慢性炎症性疾患のために治療的に有益である。このように、本発明は、慢性炎症性疾患、例えば、腎臓繊維症、肺繊維症、肝臓繊維症、関節リウマチ、乾せん、実験的大腸炎または半月状糸球体腎炎の治療方法を供する。その方法は、コラーゲンＸIII のα１β１インテグリンとの結合を遮断する（または、別に相互作用を中和する）ことを含む。本明細書において、「治療」はその状態の１以上の臨床的な兆候において改善があることを意味する。例えば、治療は、単球/リンパ球の慢性炎症部位の間隙への流出を阻害することまたは減少させることにより慢性炎症性状態の進行の緩徐または抑止を含んでよい。
【００２６】
本明細書に説明したＡｌｅｘａ-接合デキストラン注射法を使用して、当業者は、間質の単球またはリンパ球が関係する場合、単球モデル（例えば、マウスモデル）の間隙への流出を阻害する能力のために、治療薬（すなわち、活性化剤）をアッセイすることができた。本明細書中、「阻害する」は、末梢血リンパ球/単球細胞表面におけるα１β１インテグリン受容体の炎症性組織の血管/毛細管内皮上のコラーゲンＸIII リガンドに対する接着を遮断することまたは減少させることにより、リンパ球/単球の末梢血循環から炎症性組織の間隙への経内皮遊走の速度を抑止すること、または減少させることを意味する。
【００２７】
このようなアッセイは、例えば、２以上の実験的ストラテジーを含む。最初のアッセイは、Ａｌｅｘａ-接合精製化α１β１インテグリンのＭＣＰ-１処理一次内皮細胞への結合を阻害する問題における、治療薬の能力の分析を含む。これは、例えば、９６ウェルマイクロプレートフォーマットおよび特異的方法において説明された蛍光プレートリーダーを使用して行うことができる。製剤は、結合アッセイにおいて滴定することができ、そしてそれらの相対的有効性は結合を阻害するために必要な濃度により判断する。それから、ペプチド、抗体、またはＳｉＲＮＡを、様々な用量でＡｌｐｏｒｔマウスモデルに導入することができる。in vivo における有効性は、本明細書において説明する特異的な方法に従いＡｌｅｘａ蛍光色素-接合デキストランにより定量的にアッセイできる。間質中の標識化細胞は全て単球（例えば、図３Ａおよび３Ｂ参照のこと）である。年齢および性別を一致させた媒体-注射したＡｌｐｏｒｔマウスと比較したＡｌｅｘａ-標識化単球の数におけるパーセンテージ（％）の減少は、in vivo での問題における特定の薬剤の有効性の直接的な測定と考えてよい。
【００２８】
２番目のアッセイはモノ-特異性抗体の使用を含む。これらの抗体は、ペプチド抗原に対する免疫応答を誘発するために、コラーゲンＸIII のインテグリン結合性ドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含んで成るペプチド抗原をマウスまたはラットへ注射することにより増やす。これらの動物由来の抗体-生産Ｂ細胞は、脾臓から単離し、そして簡便な技術（ポリエチレングリコール融合法）を使用してミエローマ細胞と融合する。抗体生産細胞（ハイブリドーマ）のクローン群由来のその培養液の上澄みはそのモノ-特異性（またはモノクローナル）抗体を含む。この方法により調製した抗体を、それらのＭＣＰ-１-処理培養血管内皮細胞に対するＡｌｅｘａ-接合精製化α１β１インテグリンの相互作用を遮断するために、明細書で説明するように最初にアッセイする。この特性を有するモノ-特異性抗体はin vivo でアッセイされるだろう。その抗体をプロテインＡセファロースと結合させ、それから溶出させること（抗体のハイブリドーマ上澄みからの精製/濃縮のために標準化された手順）により培養液の上澄みから精製する。その抗体の有効量をＡｌｐｏｒｔマウスモデルに注射し、そして２４時間後、同じマウスにＡｌｅｘａ-接合デキストランを注射する。デキストランの注射から３日後、その脾臓を摘出し、そして、凍結切片をＦＩＴＣ-接合抗-ＣＤ１１ｂ抗体（単球を標識するため）で対比染色し、そして、そのＡｌｅｘａ-陽性単球をカウントする。そのＡｌｅｘａ-陽性単球の数を、等量のアイソタイプを一致させた無関係な抗体を与えた年齢および性別を一致させたＡｌｐｏｒｔマウスのものと比較する。Ａｌｅｘａ-陽性（新たに流出した）単球における有意な減少は、医療的に有益な可能性を有する抗体を示す。このような治療薬は、制限されることなく、小有機分子、配列ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）、またはより特別には、ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有する単離ペプチド、それらのペプチドに対する抗体、および小阻害因子ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）を含む。本明細書において、「単離」ペプチドは天然に発生するか、あるいは、合成的に誘導され、そして自然環境には存在しないものである。
【００２９】
好ましくは、単離ペプチドは、８以上のアミノ酸を有してよい。さらに好ましくは、それらは１２以上のアミノ酸を有する。そのペプチドの長さは、その所望される機能を得るために十分である。ある態様のために、それらは長さにおいて、１６アミノ酸より大きくない。
【００３０】
血管内皮上のコラーゲンＸIII におけるこのアミノ酸配列は循環している白血細胞上のα１β１インテグリンと相互作用する。追加的には、活性化ペプチド（すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２の活性化類似体）は、ＧＡＥＧＳＰＧＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）または、より特別にはＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）と７０％以上一致する配列を有するこれらのものを含んでよい。好ましくは、活性化類似体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と８０％以上の同一性、より好ましくは、９０％以上、さらにより好ましくは、９５％以上の同一性である構造的な類似性を有する。これらのペプチドはコラーゲンＸIII を含まない。
【００３１】
また、１以上のこれらのペプチドに対して、あるいは、α１β１インテグリンに対して作成された中和抗体は、コラーゲンＸIII のα１β１インテグリンに結合する能力を阻害するために使用できる。また、コラーゲンＸIII 転写物の細胞内破壊をもたらし、したがって、翻訳されたコラーゲンＸIII タンパク質が内皮細胞表面に達することを防いでいる内皮細胞に送達された小阻害因子ＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）を使用することもできる。
【００３２】
これらの薬剤は、インテグリンα１β１-陽性単球/リンパ球の慢性的炎症性組織の間隙への経内皮遊走を部分的にまたは全体的に阻害するため単独で、または一緒に使用できる。
【００３３】
これらの阻害因子は、本明細書において「活性化剤」を意味する。有意に、それらの活性化剤は単独で、または様々な組み合わせにおいて、特異的な組織部位、または組織（器官）の採取物において、患者の体を通して所望する効果を生じるのに十分な用量で医薬性または食品性（例えば、栄養剤）サプリメントとして患者（例えば、ヒトを含む動物）に適用できる。
【００３４】
本明細書において説明されるポリペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸を含むこれらのもの）は、それらの遊離酸形態において存在でき、またはＣ-末端カルボキシル化群においてアミ化してもよい。
【００３５】
上記において議論したように、本発明は、また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のポリペプチドの類似体を含み、それらは構造的な類似を有するポリペプチドを含む。また、これらのペプチドはより大きなペプチドの一部を形成してもよい。ポリペプチドの「類似体」は、少なくとも、ポリペプチドの一部を含み、その一部は、１以上の隣接の、または非隣接のアミノ酸の欠失または追加を含み、あるいは１以上のアミノ酸置換を含む。このように、「類似体」は上記に挙げたポリペプチドの片方または両方の末端において追加的なアミノ酸を含んでもよい。本発明のポリペプチド中のアミノ酸の置換は、好ましくは、保存された置換であり、それは、そのアミノ酸に属するクラスの他のメンバーから選択される。例えば、特定の大きさまたは特性（例えば、帯電、疎水性および親水性）を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸は、一般に、ポリペプチドの構造を実質的に変化させることなく他のアミノ酸に置換できることは、タンパク質生物化学の当業界において周知である。
【００３６】
本発明の目的のために、保存的なアミノ酸置換は、以下の残基クラス由来のアミノ酸残基の交換に起因するように限定される。：クラスＩ：Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，およびＰｒｏ（小脂肪族の側鎖およびヒドロキシル基側鎖を表している）；クラスII：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，およびＴｙｒ（-ＯＨまたは-ＳＨ基を含む側鎖を表している）；クラスIII ：Ｇｌｕ，Ａｓｐ，ＡｓｎおよびＧｌｎ（側鎖を含むカルボキシル基）：クラスIV：Ｈｉｓ，ＡｒｇおよびＬｙｓ（基本側鎖を表している）；クラスＶ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，ＰｈｅおよびＭｅｔ（疎水性側鎖を表している）；およびクラスVI：Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＨｉｓ（芳香族側鎖を表している）。またクラスは関連するアミノ酸、例えば、クラスＩ中の３Ｈｙｐおよび４Ｈｙｐ；クラスII中のホモシステイン；クラスIII 中の２-アミノアジピン酸、２-アミノピメリン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、β-カルボキシアスパラギン酸、および対応するアミノ酸アミド；クラスIV中のオルニチン、ホモアルギニン、Ｎ-メチルリジン、ジメチルリジン、トリメチルリジン、２，３-ジアミノプロピオン酸、２，４-ジアミノ酪酸、ホモアルギニン、サルコシンおよびヒドロキシリジン；クラスＶ中の置換されたフェニルアラニン、ノルロイシン、ノルバリン、２-アミノオクタン酸、２-アミノヘプタン酸、スタチンおよびβ-バリン；およびクラスVI中のナフチルアラニン、置換されたフェニルアラニン、テトラヒドロイソキノリン-３-カルボン酸、およびハロゲン化チロシンを含む。
【００３７】
上述のように、活性化類似体は、構造的類似性（すなわち、配列の一致）を有するポリペプチドを含む。構造的類似性は、一般に、それらの配列の長さにそって同一アミノ酸の数を最適化するために２つのアミノ酸配列の残基を整列させることにより決定する；たとえ、各配列中のアミノ酸が、それらの適当な規則において維持しなければならないとしても、いずれかまたは両方の配列中のギャップは、いくつかのアミノ酸を最適にするために、整列を作ることを可能にする。好ましくは、２つのアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴ２サーチアルゴリズムのＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＢ、バージョン２．２．６を使用して比較する。好ましくは、全てのＢＬＡＳＴ２検索パラメーターのデフォルト値はタンパク質のわずかな差異を使用した。：Search for Short Nearly Exact Matches は
【表２】
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において入手可能である。ＢＬＡＳＴサーチアルゴリズムを使用する２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は「一致」を意味する。
【００３８】
そのようなペプチド阻害因子は天然に、例えば、注目のタンパク質を認識するためにファージディスプレイ法または酵母菌ｔｗｏ-ハイブリッド法に由来してもよく（好ましくは、単離化および精製化）、あるいは、それらは公知のペプチドポリマー化技術を使用して合成的に作成できる。自然に発生しても、あるいは、合成的に作成しても、これらのペプチドは本明細書において「単離」を意味する。例えば、本発明のペプチドは、ｔ-ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）または９-フルオレニルメトキシ-カルボニル（ＦＭＯＣ）のいずれかに基づく標準的な方法を使用して固相法により合成してもよい。この方法は、G.B.Fields et al.in Synthetic Peptides:A User's Guide,W.M.Freeman＆Company,New York,pp.77-183(1992)により説明される。
【００３９】
本発明の方法において使用されるペプチドは、一価の状態（すなわち、遊離ペプチドまたは担体分子にカップリング化した１つのペプチド断片）において利用してもよい。また、そのペプチドは、１つの担体分子と結合する１以上の（同じまたは異なる）ペプチド断片を有する接合体として利用してもよい。その担体は生物学的担体分子（例えば、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、アルブミン等）または合成ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコールまたは合成クロマトグラフィー担体）であってよい。一般に、オブアルブミン、ヒト血清アルブミン、他のタンパク質、ポリエチレングリコール等は担体として利用できる。これらの修正は、ペプチドの明白な親和性および/または安定性の変化を増加できる。各担体に会合または結合するペプチド断片の数は変化してもよいが、１担体分子当たりおよそ４から８ペプチドは、一般に、標準的なカップリング状態下で得られる。
【００４０】
例えば、ペプチド/担体分子接合体は、ペプチドおよび担体分子の混合物をカップリング試薬、例えば、カルボジイミドで処理することにより調製できる。カップリング試薬はペプチドまたは担体分子のいずれかにおいてカルボキシル基を活性化できるため、カルボキシル基は、ペプチド/担体分子の他のメンバー上の求核基（例えば、アミノまたはヒドロキシル基）と反応でき、ペプチドと担体分子の共有結合をもたらす。例えば、オブアルブミンとカップリングしたペプチド接合体は、小容量の水中で凍結乾燥したペプチドおよびオブアルブミンの等量を溶解することにより調製できる。２番目のチューブにおいて、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノ-プロピル）-カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ；ペプチドの１０倍量）を小容量の水中で溶解する。そのＥＤＣ溶液をペプチド/オブアルブミン混合物に加え、そして、数時間反応させた。それから、その混合物を、ペプチド／オブアルブミン接合体の精製した溶液を得るために、透析（例えば、リン酸緩衝食塩水中で）してもよい。この方法により調製されたペプチド/担体分子接合体は、一般に、１オブアルブミン分子当たり、およそ４から５のペプチドを含む。
【００４１】
本発明は、さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むペプチドに対して、７０％以上（より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、そしてさらに好ましくは９５％以上）の配列一致を有するペプチドと特異的に結合することができる抗体を供する。ある態様において、その抗体はモノクローナル抗体であり、そして他の態様において、その抗体はポリクローナル抗体である。他の態様において、その抗体は抗体断片であり、それは抗体の語の使用に含まれる。その抗体はマウス、ラット、ヒトまたはウサギから得ることができる。ペプチドに対する抗体の調製方法は、当業者において周知である。好ましい例において、その抗体は、ヒト由来、ラット由来、マウス由来、またはウサギ由来であってよい。タンパク質結合抗体断片およびキメラ断片もまた周知であり、そして、本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
また、本発明は、本発明の１以上の活性化剤および１以上の担体、好ましくは医薬的に受容可能な担体を含む組成物を供する。本発明の方法は、患者（すなわち、被験者）、好ましくは、哺乳動物、そしてより好ましくはヒトへの、その肌への、所望される効果を生じるための有効量における本発明の組成物の投与または塗布を含む。本発明の活性化剤は、外骨膜投与（口腔、直腸等）または非経口投与（注射、内部ポンプ等)のために処方される。その投与は、組織への直接注射、間質注射、介在的注射、または内部投与手順、例えば、インプラントポンプの使用を介して、あるいは、組成物と、組成物の粘膜を通した伝達を促進するために設計された担体における粘膜との接触を介して、例えば、座薬、目薬、吸入器または類似した投与方法で、あるいは、シロップ、液体、ピル、カプセル、ゲルコート化タブレットの形態における経口投与または他の類似した経口投与法を介して行うことができる。その活性化剤は、絆創膏、パッチ、ゴム等に組み入れてもよく、あるいは、カプセル化または調節した放出のために生物浸食性(bio-erodible)マトリックスに組み入れることができる。
【００４３】
内部投与のための担体は、組成物、例えば、血漿、無菌食塩水、IV溶液等の内部投与を促進するために一般に使用されるいかなる担体でもよい。粘膜を通した投与のための担体は、当業界において周知のいかなるものであってもよい。経口的な投与のための担体は、当業界において周知のいかなる担体であってもよい。
【００４４】
その製剤は、単投量形態において簡便に存在することができ、そして、医薬の当業界におけるいかなる周知の方法によっても調製できる。全ての方法は活性化剤と担体との会合をさせる工程を含み、１以上の副成分を構成する。一般に、その製剤は、活性化剤を、液体担体、きれいに分離した固体担体、またはその両方との均一および密接な会合に導くことにより、それから、必要であれば、その生成物を所望した薬剤へと形を整えることにより調製できる。
【００４５】
簡便な非経口的投与の適当な製剤は、活性化剤の無菌水性調製剤、または活性化剤の無菌粉末分散剤を含み、好ましくは、レシピエントの血液を伴う等張性である。水性調製剤に含まれる等張性試薬は、糖、バッファー、および塩化ナトリウムを含む。その活性化剤溶液は、水中で、任意的に無毒性の界面活性剤と混合して調製することができる。その活性化剤の分散剤は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、グリセロールエステル、およびそれらの混合物中で調製することができる。その究極的な剤形は、無菌、液体であり、そして製造および保管条件下で安定である。その必要な流動性は、例えば、リポソームを使用することにより、分散剤の場合に適当な特定の大きさを利用することにより、あるいは界面活性剤を使用することにより達成できる。液体調製剤の無菌化は、活性化剤の生物活性を保存するいかなる簡便な方法により、好ましくは、ろ過滅菌により達成できる。粉末の調製に好ましい方法は、無菌の注射可能溶液の真空乾燥、および凍結乾燥を含む。後に続く微生物の夾雑は、様々な抗微生物剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等を含む抗細菌、抗ウイルスおよび抗真菌剤を使用して防ぐことができる。長期間にわたる活性化剤の吸収は、遅延のための薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含ませることにより達成できる。
【００４６】
経口投与に適当な本発明の製剤は、分離ユニット、例えば、タブレット、トローチ、カプセル、錠剤、オブラート、またはカシェ剤として存在してもよく、粉末もしくは顆粒として、活性化剤を含むリポソームとして、または、水性液体もしくは疎水性液体、例えば、シロップ、エリキシル剤、乳液、またはドラフト中の溶液もしくは上澄み液としての活性化剤の予定された量をそれぞれ含む。活性化剤の量は、投与量レベルが、被験者において所望される結果を生じるために有効となる量である。
【００４７】
経鼻性スプレー製剤は、防腐剤および等張剤を伴う活性化剤の精製した水性溶液を含む。これらの製剤は、好ましくは、ｐＨおよび鼻の粘膜での等張状態の互換性を適合させる。直腸または膣投与のための製剤は、適当な担体、例えば、ココアバター、または水素化脂肪、または水素化脂肪性カルボン酸を伴う座薬として存在してもよい。
【００４８】
眼製剤は、ｐＨおよび等張因子を好ましくは眼に合うように適合させることを除き、経鼻性スプレーと同様の方法により調製する。
【００４９】
局所的な製剤は、１以上の媒体、例えば、ミネラル油、ＤＭＳＯ、ポリヒドロキシアルコール、または局所的な医薬製剤に使用される他の塩基中で溶解または懸濁する活性化剤を含む。
【００５０】
その活性化剤の有用な投与量は、それらのin vitro 活性および動物モデル中のin vivo 活性を比較することにより決定できる。マウスおよび他の動物中の、ヒトに対する有効的な投与量の外挿方法は当業界において公知である。
【００５１】
また、タブレット、トローチ、ピル、カプセル等は、以下の１以上を含んでよい。：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン；付形剤、例えば、リン酸二カルシウム；分散剤、例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギニン酸等；潤滑剤、例えば、マグネシウムスレアレート；甘味剤、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトースまたはアスパルテーム；および天然または人工芳香剤。投与量ユニットの形態がカプセルである場合、さらに、液体担体、例えば、植物油またはポリエチレングリコールを含んでもよい。様々な他の材料は、コーティング剤として、あるいは、固体投与形態の物理的形態を変形させるために存在してもよい。例えば、タブレット、ピル、またはカプセルは、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖等でコーティングされてよい。シロップまたはエリキシル剤は１以上の甘味剤、防腐剤、例えば、メチル-またはプロピルパラベン、糖の結晶化を遅延させるための薬剤、いかなる他の成分の溶解性を向上させるための薬剤、例えば、ポリヒドリックアルコール、例えば、グリセロールまたはソルビトール、色素および芳香剤を含んでもよい。いかなる単投与形態の調製において使用される材料は、利用する量において実質的に無毒である。その活性化剤は徐放性の調整剤および装置に組み入れてもよい。
【００５２】
本発明の目的および利点は、さらに以下の実施例により説明するが、これらの実施例において列挙される特定の材料およびその量、並びに、他の条件および詳細は、本発明を不当に制限して解釈すべきではない。
【実施例】
【００５３】
導入
Ａｌｐｏｒｔ間質性疾患におけるインテグリンα１の役割の根底にあるメカニズムにおける洞察を獲得するために、アフィメトリックス（Affymetrix)遺伝子チップ法を使用して遺伝子発現のグローバル分析を利用した。これらの実験は、Sampson et al.,J.Biol.Chem.,276,34182-34188(2001)において説明される。７週齢のＡｌｐｏｒｔマウスを７週齢のＤＫＯ（インテグリンα１およびコラーゲンα３（IV）が共に無い２重ノックアウトマウス）と比較した。上昇または下降調節した遺伝子を、Adams et al.,Nature,377,3-174(1995)の分類手順を使用して選別し、そして、ＧＥＮＥ ＣＬＵＳＴＥＲおよびＴＲＥＥＶＩＥＷプログラムを使用してカテゴリーの中に集めた。得られた観察の中で、多くの単球/マクロファージ-特異性転写物がＡｌｐｏｒｔマウス中で観察されたことが示された。これらはマクロファージケモ誘引性タンパク質１（ＭＣＰ-１）、マクロファージ誘導性タンパク質（ＩＰ-１０）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）、マクロファージマンノース受容体、およびＦ４/８０を含んだ。全てのこれらの転写物は、コントロールの同腹仔と比較して、Ａｌｐｏｒｔマウス中で６から２４倍上昇した。７週齢ＤＫＯマウス由来の腎臓において、これらの遺伝子の全ての発現は野生型レベルまで回復した。これらの実験は、我々を、Ａｌｐｏｒｔ尿細管間質性疾患においてインテグリンα１の有効性が、組織単球により媒介されうるという結論に導いた。単球特異性マーカー（ＣＤ１１ｂ）での免疫染色は、ＤＫＯマウスには単球がほとんどなく、一方、Ａｌｐｏｒｔマウスの間質には大量に存在することが明らかであるとするこれらの疑惑を裏付けた（Sampson et al.,J.Biol.Chem.,276,34182-34188(2001))。Ｔ細胞およびＢ細胞は、Ａｌｐｏｒｔ腎臓繊維症において実質的に非存在である（Rodger et al.,Kidney Int.,63,1338-1355(2003))。
【００５４】
α１β１インテグリンの遮断は、間接性リウマチ、実験的大腸炎、および半月状糸球体腎炎を含む他の慢性炎症性疾患モデルの進行を減弱することを示した。この影響は白血球の組織への遊走を阻害することを含み得ることが提唱され；しかしながら、この提唱された影響に働くメカニズムは未だ明らかでない。最近、単球がＡｌｐｏｒｔマウスモデル中の腎臓の炎症の進行に関係する細胞の破壊を媒介していることが示された（Rodgers et al.,Kidney Int.,1338-135(2003))れ、慢性炎症性疾患に関係する症状における間質単球の蓄積の重要性が強調されている。
【００５５】
本明細書において、骨髄中の単球の小群がα１β１インテグリンを発現すること、そしてＡｌｐｏｒｔマウスの尿細管間質中の単球がα１β１インテグリン陽性であることが示された。単球輸送アッセイは、Ａｌｐｏｒｔマウスと比較して、α１β１-無Ａｌｐｏｒｔマウス中の単球の著しく減弱した流出を示すために使用し、Ａｌｐｏｒｔマウス中、実質的に全ての新たに流出した単球が、α１β１インテグリンを発現した。Ａｌｅｘａ-接合精製化α１β１インテグリンを使用して、インテグリンはＡｌｐｏｒｔマウス（ただし、正常なマウスではない）の血管内皮細胞と結合し、そして、精製したインテグリンの注射は単球の流出を抑制することが証明された。さらに、α１インテグリン-無Ａｌｐｏｒｔマウスに移植した正常なマウス由来の標識化単球は、インテグリンα１無マウス由来の単球に比べて、皮質の間隙により効率的に流出する。組み合わせると、これらのデータは、腎臓の血管内皮上のα１β１インテグリンの誘導性リガンド（α１β１インテグリン-陽性単球の血管内皮への流出を媒介する）の存在を強く示唆する。内皮細胞由来ファージの使用は、「バイオパニング」法を併用したライブラリーを示し、コラーゲンＸIII は、ａ１ｂ１インテグリンの内皮細胞リガンドとして同定した。単球上のα１β１インテグリンの相互作用は慢性炎症性疾患における間隙への遊出を媒介する。初期の研究において、単球は、繊維症のプロセスに関する尿細管間質性の損傷の原因であるという抗しがたい証拠が供された（Rodgers et al.,Kidney Int.,63,1338-1355(2003))。このように、内皮細胞-特異性リガンドの同定は、有意に重要な治療的標的を供することができる。そのリガンドの中和抗体またはペプチド阻害因子での遮断は、単独で、または末梢血単球上のα１β１インテグリンの遮断との組み合わせにおいて適用できる。このストラテジーは、他の慢性炎症性疾患との関係を有するであろう。
【００５６】
方法
Ａｌｅｘａ５６８デキストラン複合体の手順
蛍光デキストランはLuby-Phelps により説明された方法に従い調製した（Methods in Cell Biology,Vol.29,Chap.4,pp59-73,(1989))。端的には、１ｍｇの蛍光プローブ、Ａｌｅｘａ５６８（Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を、ピリジン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、およびジラウリン酸スズ（tindilaurate）（Sigma-Aldrich Co.St,Louis,MO)の存在下において、３９ｍｇのデキストラン（Mol.Wt.Approximately144,000)と混合した。標識化デキストランを９５％エタノールで沈殿させ、ガラス蒸留水中で透析し、凍結乾燥した。それから、その乾燥生成物を、デシケーター中−２０℃で５００マイクログラム（μｇ）分量で保管し、光から保護した。
【００５７】
オスの野生型１２９ＳＶおよび１２９ＳＶＪマウス（４-１２週齢）に加えて、コラーゲンIVα３（-/-）（Ａｌｐｏｒｔ：５-８週齢）およびコラーゲンIVα３（-/-）/インテグリンα１（-/-）ダブルノックアウト（ＤＫＯ：８-１２週齢）マウスの尾静脈に、１００マイクロリットル（μＬ）の Hanks Balanced Salt Solution(ｐＨ７．２）中で再構成した５０μｇのＡｌｅｘａ５６８標識化デキストランを注射した。注射から３日後、動物に、アベリチンの致死的注射（１キログラムの体重に対して（ｇ/ｋｇ）０．５５グラム；ｉｐ）をし、その後、心臓を氷冷ＰＢＳで灌流した。腎臓を摘出し、そして、増加している濃度の氷冷スクロース（最大３０％）に浸し、それからＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ 封入培地に包埋し、それから−８０℃で保管した。
【００５８】
新鮮な凍結組織の切片（４μｍ）を２％パラホルムアルデヒドに５分間固定し、そして、４℃で一昼夜乾燥させ、その後、−２０℃での保存し、それぞれ１：１００および１：２００の希釈でのモノクローナルα-ＣＤ１１ｂ（Cedar Lane laboratories,Hornby,Ontario)およびヤギ抗ラットＡｌｅｘａ４８８（Molecular Probes,Inc.Engene,OR)抗体を使用した単球の免疫組織化学的検出をした。ベクターシールド封入剤（Vector Crop.Burlingme,CA)とともに切片にカバーガラスをかぶせた。緑色および赤色フィルターを完備したOlympus BH2-RFCA 顕微鏡を使用して１００マイクロメーター（μｍ）以下の間隔で３つの切片でそれぞれ約１０枚の写真を撮った。緑色蛍光単独、並びに、共存２重蛍光は、Image Pro Plus ソフトウェア（Media Cybernetics,Inc.Silver Spring,MD)を使用して測定した。
【００５９】
ＡＤＣ５６８標識化単球の移植
７週齢のＤＫＯマウスに、α１インテグリン欠損した、あるいは、野生型マウスの骨髄から単離したＡｌｅｘａ５６８接合デキストラン（ＡＤＣ５６８）標識化単球を静脈注射した。骨髄は、大腿骨および脛骨の骨髄腔を２％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）およびペニシリン/ストレプトマイシンで補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で流すことにより採取した。１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（またはハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ））中で細胞を２Ｘ洗浄した。赤血球を塩化アンモニウム（２０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、ｐＨ７．２）で除去し、その後、ＤＭＥＭ中で、２％ＦＣＳで２回洗浄し、最後にＨＢＳＳで洗浄した。細胞を、５％ＣＯ2を伴う加湿チャンバーの中で、２％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）およびペニシリン/ストレプトマイシンで補足したＤＭＥＭ中、３７℃で２４時間培養した。細胞を２×ＨＢＳＳで洗浄し、そして、新鮮な培養上清の１２５μｇのＡＤＣ５６８/ｍｌを加えた。洗浄した細胞をＡＤＣ５６８溶液中で再懸濁し、そして、５％ＣＯ2を伴う加湿チャンバー中３７℃で２４時間インキュベートした（光への露光が最小になるように努めた）。細胞を３×ＨＢＳＳで洗浄した。細胞をカウントし、そして、ＡＤＣ５６８の蛍光化を蛍光顕微鏡で確認するために細胞試料を調製した。尾静脈注射を介して、蛍光化単球をレシピエントＤＫＯマウスに注射した（マウスはα１インテグリン-無の、あるいは、野生型の単球の等量で注射した）。尾静脈注射から７２時間後、腎臓をレシピエントマウスから摘出した。新鮮な凍結ブロックを調製し、そして、蛍光スコープでの可視化およびImage Pro Plus での分析のために４μｍの不連続な断片に切断した。
【００６０】
α１β１インテグリン/ＣＤ３１ ｃＤＮＡライブラリーおよびファージディスプレイ
組み換えＶＬＡ１でコーティングした金属ビーズの調製：Ｍ４５０金属ビーズを、製造業者の手順に従い、組み換えタンパク質でコーティングした。端的には、１×１０8のビーズを、金属チャンバーを使用して、リン酸バッファー（１００ｍＬのｄｄＨ2Ｏ中、０．２６ｇのＮａＨＰＯ4、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４）中で洗浄した。ビーズ（/１０7ビーズ/５ｍｇのタンパク質）を５０μｇの精製したヒトα１β１インテグリン（Chemicon International,Inc.,Temecula CA)と混合し、そして３７℃で１６時間ニューテーターに置いた。ビーズを２×バッファーＤ｛ＰＢＳ：０．１％ＢＳＡを伴う１００ｍｌのｄｄＨ2Ｏ中、０．８８ｇのＮａＣｌ、０．２６ｇのＮａＨＰＯ4、１．４４ｇのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．４｝中、４℃で５分間、１×バッファーＥ｛０．１％ＢＳＡを伴う０．２Ｍのトリス、ｐＨ８．５｝中３７℃で４時間洗浄した。ビーズをバッファーＤ中に＋４℃で保管した。１ｍＭのＭｇＣｌ2および１ｍＭのＣａＣｌ2で補充したバッファーＤ中で、α１β１インテグリンでコーティングしたビーズと共に４℃で３０分間インキュベートした。
【００６１】
抗-ＣＤ３１金属ビーズの調製：ストレプトアビジン結合化マグネチックビーズ（ＤＮaseＩ認識ドメインリンカー）（DYNAL Inc.,Lake Successs,NY)をリン酸バッファー中で洗浄し、そして、１．０μｇ/１×１０7ビーズでビオチン化抗-ＣＤ３１抗体（ABCAM,Ltd.,Cambridgeshire UK)と混合した。その金属ビーズ/抗-ＣＤ３１混合物を室温で３０分間ニューテーターに置いた。インキュベーション後、ビーズをリン酸バッファー中で２回洗浄し、その後、追加的にバッファーＤ中で洗浄した。ビーズを４℃で保管した。
【００６２】
ＶＬＡ１結合性マウス腎臓内皮細胞からのｍＲＮＡの単離：１０週齢の４匹のＤＫＯマウスに、致死量のアベルチンを与えた。動物を氷冷ＰＢＳで灌流した。腎臓を摘出し、そして素早く氷上のＨＢＳＳ（Gibco BRL9)中に置いた。腎臓を細分し、そして２０ｍＬの（４つの細分した腎臓を２０ｍＬのコラーゲナーゼＡ中で消化した）１ミリグラム毎ミリリットル（ｍｇ/ｍＬ）コラーゲナーゼＡ（Roche Diagnostics Corp.,Indianapolis,IN)のＨＢＳＳ溶液中、穏やかに撹拌しながら３７℃で４５分間消化した。消化した材料を７０μｍのナイロンメッシュを通してろ過し、そして５０ｍＬのコニカルチューブ中に採取した。
【００６３】
細胞をその消化物から回収し（１分間当たり１０００回転（ｒｐｍ）で室温において５分間）、そして、２×ＰＢＳ中で洗浄し、その後、最後にバッファーＤ中で洗浄した。その組織消化由来の産出物を、各２０ｍＬのコラーゲナーゼＡのために６ｍＬのバッファーＤ中で再懸濁した。１ミリリットル（１ｍＬ）の細胞懸濁液を１×１０7の抗-ＣＤ３１金属ビーズと混合し、そして、ニューテーター上で４℃で３０分間混合した。ロゼット細胞を０．１％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中で４×洗浄した。ＤＮase 溶液（遊離バッファー）中でロゼッタを室温で１５分間インキュベートすることにより、その金属ビーズを単離した内皮細胞から遊離させた。内皮細胞を、０．１％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中で再懸濁し、ＶＬＡ１接合金属ビーズと混合し、それからニューテーターで３０分間４℃に保った。ロゼッタ細胞を、０．１％ＢＳＡを伴うＰＢＳ中で４×洗浄した。各洗浄液を保存し、そして、非結合内皮細胞を沈降させ、溶解バッファー（Ambion Inc.,Aistin TX)中で再懸濁し、そしてｍＲＮＡを抽出した。最後の洗浄後、ロゼッタ細胞を溶解バッファー（Ambion Inc.,Aistin TX)中で再懸濁した。室温で５分後、金属ビーズを除去し、そしてｍＲＮＡをＶＬＡ１結合内皮細胞から抽出した。
【００６４】
Ｏｒｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓ(Novagen,Inc.,Madison WI)を使用したＴ７選択ファージ中のｃＤＮＡライブラリーの調製：制限酵素で消化できないｃＤＮＡを産生するためSuperscript III （Invitrogen,Corp.,Carlsbad CA)逆転写酵素およびメチル化ｄＮＴＰ、並びにＨＩＮＤIII ランダムプライマーを使用した。メチル化ｃＤＮＡ上に平滑消化可能末端を産出させるため標準ｄＮＴＰおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、そしてＥｃｏＲＩ/ＨＩＮＤ III リンカーと結合させ、その後、ＨＩＮＤIII およびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。その消化した生成物をサイズ分別カラム（Novagen,Inc.,Madison WI)を通してろ過し、そして３００塩基対（ｂｐ）より大きいｃＤＮＡを採取した。それから、Ｔ７選択ファージパッケージング抽出液（Novagen,Inc.,Madison WI)を使用したファージライブラリーの調製のために、その採取したｃＤＮＡをＴ７選択ベクターのアームと接合させ、そして組み換え物の数を、細菌株ＢＬＴ５４０３（Novagen,Inc.,Madison WI)を使用したプラークアッセイにより測定した。プラークアッセイ後、そのファージライブラリーを、プレート可溶化増幅により増幅し、抽出バッファー（２０ミリモル（ｍＭ）のトリス-ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＭｇＳＯ4）で溶出させ、滴定し、そして、−７０℃での長期間の保存のため、０．１容量の無菌８０％グリセロールを加えて調製した。
【００６５】
ＣＤ３１/ＶＬＡ１ｃＤＮＡファージライブラリーの完全合成は、Ｔ７選択プライマー、以下の試薬：１０μＬのファージ溶解液；ＭｇＣｌ2バッファー（Novagen)を伴う５μＬの１０×ＮＯＶＡＴＡＱ；１μＬのＴ７選択上昇プライマー（ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３))；１μＬのＴ７選択下降プライマー（ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４))；１μＬのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）；１．２５ＵのＮＯＶＡＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen)；および５０μＬにするのに十分量なＰＣＲグレード水を使用してＰＣＲにより確認した。その反応物を２分間８０℃まで過熱し、続いて、９４℃で５０秒間（sec)、５０℃で１分間、そして、７２℃で１分間、３５サイクル行った。最後の伸長を７２℃で６分間行った。
【００６６】
ＶＬＡ１結合性発現化タンパク質配列のバイオパニング：９６ウェル高結合性プラスチックプレートを、コーティングバッファー（０．０３５Ｍ ＮａＨＣＯ3、０．０１５Ｍ Ｎａ2ＣＯ3）中、４℃で一昼夜、５μｇ/ｍＬにおいて、組み替えヒトα１β１インテグリン（ＶＬＡ１）でコーティングした。ＶＬＡ１でのコーティング後、ウェルを１×２０ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ７．４）、０．５ＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）で×３洗浄し、５％脱脂乳ＴＢＳバッファーで遮断し、それから、蒸留水で５×洗浄した。増幅させたファージライブラリーの計算した力価に基づき、８×１０8（ＶＬＡ１-ＣＤ３１）および５．９×１０8（ＣＤ３１）のファージプレップを、２００μＬのバイオパニングバッファー（ｐＨ８．０の１０ｍＭのトリスＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ-２０、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＣａＣｌ2）中のＶＬＡ１コート化ウェルに加え、そして、室温に４５分間保った。ウェルをバイオパニングバッファーで×５洗浄し、そして結合ファージを溶出バッファー（中性の２０ｍＭのトリス、１．０％ＳＤＳ）で２０分間溶出した。それから、その溶出において採取されなかったであろう高親和性ファージを回収するためにＢＬＴ５４０３細菌細胞をコート化ウェルに加えた。９０パーセント（９０％）の溶出したファージを５０ｍＬの細菌細胞培養液にＯＤ600＝０．５で混合し、そして、振盪しながら３７℃で３時間増幅させた。残存している１０％を、バイオパニングの各ラウンドから回収したファージの数を測定するために使用した。バイオパニングの各ラウンドからの増幅したファージをプラークアッセイにより滴定した。そのバイオパニングの手順を、１×１０8ファージ/ＶＬＡ１コート化ウェルで×３繰り返し、そして、各ライブラリーのための２つのコート化ウェルだけを、全４ラウンドのバイオパニングのためにスクリーニングした。
【００６７】
ＶＬＡ１選択性プラークのＰＣＲおよび配列決定：４ラウンド目のバイオパニング後に採取し増幅したファージライブラリーを、１００ｐｆｕ/プレート以下にするために十分に希釈した。１２の個々のプラークを掻き出し、そして、掻き出した各プラークのプラグを各ライブラリーのために採取した。１ミリリットルのファージ抽出バッファーを各プラグに加え、そして４℃で保管した。ピペットチップで上層アガロースを掻き出すことにより採取したプラークを、１００μＬの１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に分散させ、ボルテックスし、そして６５℃で１０分間保った。試料を室温まで冷やし、そして１４０００×ｇで３分間遠心分離した。
【００６８】
ＰＣＲは以下の試薬を使用して行った。：２μＬの明らかにしたファージ溶解液；５μＬの１０×ＴＡＱ Ｇｏｌｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Perkin Elmer)；５μＬの２５ｍＭのＭｇＣｌ2；１μＬのＴ７選択上昇プライマー（ＧＧＡＧＣＴＧＴＣＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:３))；１μＬのＴ７選択下降プライマー（ＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:４))；１μＬのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）；０．５μＬのＴＡＱ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer)；および５０μＬにするのに十分量なＰＣＲグレード水。その反応物を、ＤＮＡポリメラーゼと共に９４℃で２分間、続いて、９４℃で５０秒間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間加熱し、３５サイクル行った。その最後の伸長は７２℃で６分間行った。
【００６９】
ＰＣＲ反応物の１０マイクロリットル（１０μＬ）を、ＴＡＥ（４０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭの氷酢酸）およびＥｔＢｒ（１０μｇ/ｍＬ）で調製した１％アガロースゲル上に流した。維持しているＰＣＲ反応物を、蒸留水で１５０μＬに調整した。これをＮＡＮＵ０３０プレートに移動し、そしてそのプレートを２０分間真空乾燥させた。そのＰＣＲ生成物を、４０μＬの超純水(nanopure water)をプレート中の適当なウェルに加えることにより回収した。５マイクロリットル（５μＬ）の生成物を、１μＬのフォワードまたはリバースプライマーのいずれか、２μＬのReady Reaction Mix(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)および２μＬの５×バッファー（Applied Biosystems Inc）と混合した。
【００７０】
サイクル配列決定後、４０μＬの７０％エタノール（ＥｔＯＨ）を加え、そしてその混合物を室温で１５分間インキュベートした。それから、その混合物を３４００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ＰＣＲチューブのキャップをはずし、チューブを反転し、そして１０００ｒｐｍで短く（１分間）スパンした。その沈殿した生成物を３０分から１時間乾燥させた。その生成物を色素を添加したホルムアミド溶液中で再懸濁し、その混合物を９６℃で３分間インキュベートし、氷の上に２分間置き、それから試料をホルムアミド溶液を加えてから１５分以内に、シークエンシングゲル中に載せた。
【００７１】
内皮細胞ＭＣＰ-１Ｈ2Ｏ2実験
一次内皮細胞を、野生型マウスの腎臓から、抗-ＣＤ３１コート化金属ビーズを使用して単離した。細胞を、２０％ＦＣＳを含む内皮細胞培地（ＤＭＥＭ/Ｆ１２、５０μｇ/ｍｌの内皮マイトジェン、１％ペニシリン/ストレプトマイシン、２０ｍＬのＬ-グルタミン、および１Ｕ/ｍＬの新鮮でろ過していないヘパリン）中で培養した。無菌ＰＢＳ中の１％ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレート中の５×１０4の細胞/ウェルの３２のウェルを準備した。細胞が集密に達するまで、細胞を２０％ＦＣＳを伴う内皮細胞培地中に維持した。集密細胞をＨＢＳＳで洗浄し、それから、２００μＬ/ウェルにおいて、血清を除いた内皮細胞培地でカバーし、そして、３７℃、５％ＣＯ2での加湿チャンバー中に保った。２４時間後、血清を除いた新鮮な内皮細胞培地を加え、そして、α１β１インテグリンと結合している細胞のためのアッセイを行う２４または４８時間前に、以下の表１中に示すように、様々な濃度のＭＣＰ-１およびＨ2Ｏ2を加えた。
【００７２】
【表３】
2006516024.tif 000004
【００７３】
免疫沈降
内皮細胞培地を集密まで育成し、そして血清を含まない内皮細胞培地中に２４時間置いた。それから、細胞を、血清を含まない条件において１６００ピコグラム（ｐｇ）のヒト組み換えＭＣＰ-１または２００μＭのＨ2Ｏ2で４８時間処理した。細胞を氷冷ＨＢＳＳで×２洗浄し、そして細胞を、プロテアーゼ阻害因子を伴うインテグリン溶解バッファー（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、１ｍＭのＭｇＣｌ2、１０％グリセロール）中、氷上で超音波処理した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Bradford Assay)（BioTad)により測定した。等濃度の溶解液を、プロテイン-Ａセファロースビーズで前処理した。組み換えヒトＶＬＡ１（０．２μｇ）を前処理した溶解液に加え、そして４℃で1時間インキュベートし、その後、ウサギ抗ＶＬＡ１抗体（Chemicon)およびプロテイン-Ａセファロースビーズを加えた。試料を、回転させながら４℃で一昼夜インキュベートした。ビーズをインテグリン溶解バッファーおよびプロテアーゼ阻害因子で、４℃で６×洗浄し、それから５０μＬの６Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ試料バッファーと混合し、５分間沸騰させ、そして氷の上に保った。
【００７４】
試料を１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上に流し、そしてＰＶＤＦ膜（BioRad)に移動した。膜をコラーゲンＸIII 抗体と共に、４℃で一昼夜インキュベートし、Dr.Taina Pihlajaniemiにより供されたＮＣ３ドメインの合成ペプチド(Hagg et al.,J.Biol.Chem.273,15590-15597)に対するウサギにおいて評価し、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ（ｐＨ７．４）、０．５ＭのＮａＣ（ＴＴＢＳ）中で１：２０００に希釈した。その膜をＴＴＢＳ中で何回か洗浄し、そのヤギ抗ウサギ-ＨＲＰとともにインキュベートしたものを、１％ＢＳＡ ＴＴＢＳ中で１時間１：２５０００に希釈した。バンドは化学蛍光検出キット（Amersham)およびＸ線フィルムで検出した。
【００７５】
ＲＴ-ＰＣＲ
商業者の説明に従い、Ｔｒｉｚｏｌ(BibCo/BRL,Gaithersberg,MD)を使用して全ＲＮＡを調製した。２マイクログラムの全ＲＮＡを、ファーストストランド（first strand)ｃＤＮＡ合成キット SuperScriptIII （GibCo BRL)を使用して逆転写した。ＲＴ-ＰＣＲにより特異的プライマーを使用して、コラーゲンＸIII ｍＲＮＡ転写物を半定量的に分析した。内部標準として、グリセルアルデヒド３-リン酸ヒドロゲナーゼ（ＧＡＡＰＤＨ）の発現、細胞のハウスキーピング遺伝子も分析した。ＰＣＲ反応は、ＰＴＣ１００（M.J.Research,Waltham,MA)中で、amplitaq gold (Applied Biosystems,Branchburg,NJ)を使用して、９４℃で２分間を１サイクル、９４℃で６０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で９０秒間を３０サイクル、続いて、７２℃で１０分間、それから４℃に保持して行った。使用したオリゴヌクレオチドプライマー対は、以下の表２中に挙げる。
【００７６】
【表４】
2006516024.tif 000005
【００７７】
プライマーを公開された配列に基づき設計した。増幅した生成物を、２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウムで染色後、ＵＶトランスイルミネーターにより可視化し、そして写真を撮った。全ＰＣＲ実験は、完全ＤＮＡを除く全成分を含むコントロール反応を含んだ。これらのコントロール反応において検出されたバンドは無かった。全ＰＣＲ生成物は、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７８】
免疫蛍光
４ミクロンの新鮮な凍結した腎臓切片をスライドに乗せ、そして氷冷アセトンで固定した。組織切片を、内皮細胞に特異的な一次抗体（抗-マウスＣＤ３１（Abcam))またはコラーゲンＸIII （Dr.Taina Pihlajaniemiによる寄贈）（Hagg et al.,J.Biol.Chem.273,15590-15597)を、１％ＢＳＡ、５％マウス血清、１×ＰＢＳ中、それぞれ１：１００および１：２００濃度で使用して免疫蛍光顕微鏡観察により検査した。腎臓切片を一次抗体中で６０分間インキュベートし、１×ＰＢＳで３×洗浄し、それから、１％ＢＳＡ、５％マウス血清、１×ＰＢＳ中でそれぞれ１：２００の濃度で調製した抗-ウサギＡｌｅｘａ蛍光５６８（赤-ｃｏｌＸIII ）、抗-ラットＡｌｅｘａ蛍光４８８（緑-ＣＤ３１）（Molecular Probes,Inc.Eugene,OR,USA)で、６０分間インキュベートした。１×ＰＢＳで３×洗浄した後、乗せている培地（０．１ｇのＮ-プロピル-没食子酸塩、５ｍｌの１×ＰＢＳ、５ｍｌのグリセロール）を加え、そしてその試料にカバーガラスをかけた。
【００７９】
免疫染色を視覚化し、そしてＯｌｙｍｐｕｓ ＢＨ２ＲＦＣＡ 蛍光顕微鏡（Hitschfel Instruments Inc.,St.Louis,MO)で捕獲し、ＳＰＯＴ-ＲＴ-Ｓｌｉｄｅｒイメージングシステムおよびソフトウェア（Diagnostic Instruments Inc.,Sterling Heights,MI)で、２００×倍でマウントした。
【００８０】
結果
単球のＡｌｐｏｒｔ腎臓への流出はインテグリンα１β１の内皮細胞表面のリガンドを介して媒介される。
【００８１】
初期の報告（Sampson et al.,J.Biol.Chem.,276,34182-34188(2001))において、インテグリンα１β１も無いＡｌｐｏｒｔマウス（ＤＫＯ'ｓ）の腎臓に存在する単球および筋線維芽細胞の数が、同じ年齢のＡｌｐｏｒｔマウスのものよりも極めて少ないことが示された。このデータは明らかに繊維症におけるα１β１インテグリンの役割を示すが、その観察の根底にあるメカニズムは明らかにされなかった。多数の可能な説明が存在するが（例えば、管状内皮細胞によるケモカイン/サイトカインの発現におけるα１β１インテグリンの影響、または、緩徐な糸球体の症状の下流の影響）、単球が尿細管間質へ流出することにおけるα１β１インテグリンの直接的な役割が調査された。Ａｌｐｏｒｔ尿細管間質中の単球はα１β１インテグリンに対して主に陽性である（図１）。これは末梢血由来のα１β１インテグリン-陽性単球の漸増、または、尿細管間質への侵入後の単球中のα１β１インテグリン発現の活性化を反映しているようである。
【００８２】
ＣＤ１１ｂに対する蛍光タグ抗体（単球のマーカー、図２中のヒストグラムのＹ軸においてモニターした蛍光強度）およびα１β１インテグリン（図２中のＸ軸に沿ってモニターした蛍光強度）を使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、骨髄由来単球を分析した。図２中に示された結果は、骨髄中の単球の分画がα１β１インテグリンを発現することを示す。新たに流出した単球がα１β１インテグリンを発現するかどうかを測定するため、デキストランをＡｌｅｘａ５６８（分子プローブ由来の赤色蛍光タグ）で標識した。末梢血中の単球は食細胞だけであるため、これらのデキストランを尾静脈に注射した場合、単球のみを標識する。注射から３日後、腎臓を摘出し、そして凍結切片を、ＦＩＴＣ-接合（緑）抗-ＣＤ１１ｂ抗体で免疫染色した。図３Ａおよび３Ｂの結果は、Ａｌｅｘａ-標識化細胞が単球であることを示す。２番目の切片を、ＦＩＴＣ-接合抗α１β１インテグリン抗体で免疫染色した。図３Ｃおよび３ＤはＡｌｅｘａ-標識化細胞がα１β１インテグリンに対して免疫陽性であることを示す。これらのデータを合わせると、尿細管間質へ輸送している単球のモニタリングのために標識化デキストラン法の特異性を示し、そして、新たに流出した単球がα１β１インテグリンを発現することを示し、尿細管間隙への侵入の促進において、このインテグリンの直接的な役割の可能性を支持している。
【００８３】
仮に、α１β１インテグリンが単球の流出を媒介するならば、Ａｌｐｏｒｔマウス中の流出の速度は、α１β１-欠損Ａｌｐｏｒｔ（ＤＫＯ）マウスよりも速いはずである。時間経過実験において、これらの２つのモデルに標識化デキストランを注射した。注射から３日後、腎臓を摘出し、そしてＦＩＴＣ接合抗-ＣＤ１１ｂで免疫染色した。標識した単球を、１０切片、１００μＭ間隔で２０フィールド、カウントした。２つの独立した動物を、各時点において使用した。図４中の結果は、ＤＫＯマウス中の単球の流出の開始がＡｌｐｏｒｔマウス中よりも極めて遅いことを示す。さらに重要なことには、Ａｌｐｏｒｔマウスと比較して、ＤＫＯマウス中では単球が尿細管間隙へ侵入する速度が極めて遅く、尿細管間質への単球の流出の媒介において、α１β１インテグリンの直接的な役割の更なる証拠を供する。図４中のバーは、標準誤差、非標準偏差を表す。単球の流出がまばらであるため、縦軸の凍結切片の全末梢性腎臓皮質を表すフィールドを表示し、カウントした。
【００８４】
仮にそのような直接的な役割が存在するならば、Ａｌｐｏｒｔマウスの腎臓皮質性血管内皮上に、正常なマウス中には不存在であるα１β１インテグリンのリガンドが存在するはずである。それらのリガンドの存在を試験するために、精製したインテグリン（Chemicon,Temecula,CA から購入した）をＡｌｅｘａ５６８で標識し、そして、標識したインテグリンを正常なマウス、Ａｌｐｏｒｔマウス、およびＤＫＯマウスの尾静脈に注射した。注射から２４時間後、腎臓を摘出し、そして、凍結切片を検査した。Ａｌｐｏｒｔマウスは血管内皮において強い標識化を示すが（図５Ｂ）、図５Ａの結果は、コントロールマウスにおける標識の不存在を示す。単球は標識化デキストランを食菌するため、インテグリンとして解釈されたものは、単球中の食菌されたインテグリンであろう。図５Ｂおよび５Ｃの比較は、単球およびＡｌｅｘａ標識化インテグリンα１β１が共存しないことを示す（２つのパネル中、重複している蛍光が無いため）。これらのデータは、Ａｌｐｏｒｔ血管内皮中のα１β１インテグリンのリガンドの存在を示す。同じ年齢のＤＫＯマウス中の存在は、さらに、これらのマウス中のα１β１インテグリンの不存在が単球の流出の緩徐な速度を説明し得ることを示唆する。
【００８５】
疾患した腎臓への単球の流出におけるα１β１インテグリンの機能のための、より明確な試験を供する試みにおいて、５μｇの精製したα１β１インテグリンをＡｌｐｏｒｔマウスの尾静脈に毎日注射し、標識化デキストランの注射前１日目から開始し、そしてデキストランの注射から３日後に腎臓を摘出した。Ａｌｅｘａ-接合インテグリンα１β１でのパイロット実験を遮断実験の前の安定性を評価するために行った。その精製したインテグリンは７２時間以上安定であることがわかった（データ無し）。仮に、単球の間隙への経内皮遊走が、部分的に内皮細胞上のリガンドの結合を通して媒介されるならば、年齢が一致する未処理のＡｌｐｏｒｔマウスと比較して、α１β１インテグリンで処理したＡｌｐｏｒｔマウス中の標識化単球の減少が観察されるべきである。なぜなら、精製したインテグリンはリガンドを占有するはずであり、単球に結合する可能性を減少させるからである。図４Ｂにおける結果は、精製したα１β１インテグリンで処理したマウスの単球の流出における減少の傾向を示す。それは、Ａｌｐｏｒｔマウスの腎臓中の間隙への単球の漸増において、そのリガンドが実際に機能することを示唆する。
【００８６】
末梢血単球上のα１β１インテグリンの影響が、繊維症腎臓の間隙への遊出を促進するか否かのさらなる試験のために移植法を使用した。照射法および化学的な骨髄切除のストラテジーは、Ａｌｐｏｒｔマウス中の毒性、繊維症を促進させることを示した。正常のコントロールまたはα１インテグリン無しマウスのいずれかの骨髄由来の単球が、Ａｌｅｘａ-５６８蛍光色素接合デキストリンの存在下における培養細胞により標識される場合、受動的な移植法を選択した。その標識化細胞をインテグリンα１-欠損Ａｌｐｏｒｔ（ＤＫＯ）マウスに注射し、そして移植３日後に間質の蛍光細胞をカウントすることにより経内皮遊走の速度を評価した。以下の表３は５つの独立した実験の結果を示す。その数値は、ある動物実験の組と他の組とではばらつきがあったが、正常な単球を移植した場合と比較して、全てのケースにおいてインテグリンα１-欠損単球を移植したマウス中の遊出した単球の数において有意に減少した。
【００８７】
【表５】
2006516024.tif 000006
【００８８】
インテグリンα１β１、コラーゲンＸIII の血管内皮細胞のリガンドのクローニングおよび同定。
ここまでのデータは、α１β１インテグリンのリガンドが、繊維症の進行の間、腎臓の血管内皮細胞上で発現されることを予測する。そのリガンドをクローンするため、いくつかの方法が追求されたが、腎臓の内皮細胞特異性ファージディスプレイライブラリーのバイオパニング法が成功的に使用された。α１インテグリン欠損Ａｌｐｏｒｔマウス由来の内皮細胞を金属ビーズと接合した抗体を使用して単離した。腎臓を細かく刻み、そして間質マトリックスから細胞を解放するためにコラゲナーゼで処理した。その細胞を、商業的に利用可能な内皮細胞に特異的な抗体（抗-ＣＤ３１）と化学的に接合する金属ビーズと混合した。結合した細胞を、磁石を使用して非結合細胞から分離し、そして数回洗浄した。その結果の細胞を、ＲＮＡを調製するために直接的に使用するか、あるいは、精製したα１β１インテグリンと接合する金属ビーズを使用してさらに選択し、それからＲＮＡの調製のために使用した。その２つの異なるＲＮＡ調製物は、ポリ-Ａ選択にかけ、そして、そのポリＡ＋ＲＮＡを、繊維状ファージのディスプレイライブラリーを作成するために使用した。その繊維状ファージは、微細繊維のある末端上のペプチドとして、クローン化ｃＤＮＡの小部分をディスプレイするために利用した。特異的な注目のペプチドは、「バイオパニング」といわれる方法を使用して選択することができる。プラスチックミクロタイタープレートを、相互作用的に結合するパートナーを探すためのタンパク質でコーティングした（この場合、これは精製したα１β１インテグリンである）。それから、一般的にインテグリン/リガンド相互作用を促進する条件下で、ファージのライブラリーを、コーティングしたプレートと反応させた。反応に失敗したファージは洗い流し、そして、その結合したファージを溶出し、増幅した。この工程は連続的に数回繰り返され、３回以上の連続的な結合および増幅工程は、プレートをコーティングするために使用したタンパク質と特異的に相互作用するファージの精製をもたらす。この場合において、この技術を使用して単一のファージクローンのみを精製した。その挿入断片のＤＮＡ配列分析は、そのファージが、原形質膜結合性コラーゲンである（Hagg et al.,J.Biol.Chem.,273,15590-15597,1998)、コラーゲンＸIII の断片を供していることを明らかにした。興味深いことに、コラーゲンＸIII と結合することが示された唯一の受容体はα１β１インテグリンである（Nykvist et al.,Biol.Chem.,275,8255-8261,2000)。コラーゲンＸIII /α１β１相互作用の生物学的機能は完全に未知であるが、細胞/細胞接着と何か関係があるものと考えられている。ファージディスプレイアッセイの技術者のおかげで、コラーゲンＸIII がα１β１インテグリンの内皮細胞リガンドとして同定されたことは強調すべきである。ファージに挿入した、コラーゲンＸIII の類似体である小型のＤＮＡのために、α１β１インテグリンの結合部位もまた識別された。このアミノ酸配列を含んで成るペプチド阻害因子の有効性の試験に許容されるために、これは有意な事実である。クローン化断片のアミノ酸配列（すなわち、結合性α１β１インテグリンに関係するコラーゲンＸIII の一部は、以下のものである：ＧＥＫＧＡＥＧＳＰＧＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）)��コラーゲンＸIII は慢性炎症性腎臓由来の血管内皮細胞上で誘導される。
【００８９】
内皮細胞のポリＡ＋ｍＲＮＡは、上述したように、正常および７週齢のＡｌｐｏｒｔ（進行した繊維症）腎臓から調製し、そしてＲＴ-ＰＣＲを使用してコラーゲンＸIII の発現を分析した。図６に示すように、コラーゲンＸIII の発現は、正常なマウスと比較してＡｌｐｏｒｔ腎臓の血管内皮細胞中で誘導される。並行反応は、ＧＤＰＤＨ、コントロールとしてのハウスキーピング遺伝子を増幅した。ＧＡＰＤＨの転写は２つの試料において極めて類似していた。
【００９０】
単球ケモ-誘引性タンパク質-１（ＭＣＰ-１）が、正常な腎臓と比較してＡｌｐｏｒｔ腎臓中で顕著に誘導されることが以前に示された（Sampson et al.,J.Biol.Chem.,276,34182-34188(2001)）。炎症性組織の間質への単球およびリンパ球の遊出を促進するこの強力なケモカインの能力の広範な文献が存在する（Conti et al.,Allergy Asthma Pric.,22,133-7(2001)を参照のこと）。これは、接着分子および/またはそれらの各リガンドの誘導を通して、広く媒介されると考えられる（Kim,J.Neurol.Sci.,137,69-78(1996))。これに基づき培養一次腎臓内皮細胞を、組み替えＭＣＰ-１の濃度を変化させて処理し、そして、Ａｌｅｘａ-５６８接合α１β１インテグリンへの接着を測定した。図７は、未処理細胞と比較して、ＭＣＰ-１で前処理した内皮細胞へのα１β１インテグリンの有意に上昇した接着を示す。その増加した接着は時間および容量依存の両方である。
【００９１】
ケモカインに加えて、酸性ストレスが、炎症性組織の内皮においてサイトカイン、マトリックスタンパク質、メタロプロテイナーゼ、および細胞接着分子の誘導に関連していた（Yoon et al.,2002 J.Biol.Chem.,277,30271-30282);Roebuck,Int.J.Mol.Med.,4,223-30(1999))。In vivo において、これは、主に、内皮の酸化窒素シンセターゼ（ｅＮＯＳ）および誘導性酸化窒素シンセターゼ（ｉＮＯＳ）の上昇した発現に起因し、それは、過酸化水素の生成に導く（Heeringa et al.,J.Pathology,193,224-32(2001))。図８において、過酸化水素がＡｌｅｘａ-接合α１β１インテグリンと一次腎臓内皮細胞との結合を促進することを示す。この効果は、濃度および時間-依存である。
【００９２】
培養した血管内皮細胞上のα１β１インテグリン結合活性が、実際にコラーゲンＸIII であるか否かを決定するため、間接的に免疫共沈降法を行った。内皮細胞をＭＣＰ-１の存在下または不存在下で、４８時間培養した。その細胞をインテグリン結合性バッファー中で溶解し、そして精製したインテグリンα１β１を、透明な混合体に加えた。インキュベーション後、抗-インテグリンα１-特異性抗体を加え、そして、複合体をプロテインＡセファロースビーズで免疫沈降させた。その免疫沈降した材料を、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）により分画し、そして、抗-コラーゲンＸIII 抗体を使用してウェスタンブロット法により分析した。図９中の結果は、以前の報告（Hagg et al.,J.Biol.Chem.273,15590-15597(1998);Hagg et al.,Matrix Biology,19,727-742(2001))と一致するタイプＸIII のコラーゲン（８５から９５ｋＤａ）の適当な分子サイズを有する１本のバンドを示す。
【００９３】
コラーゲンＸIII が、in vivo 血管内皮上で誘導されるか否かを決定するため、コラーゲンＸIII およびＣＤ３１（特異的な内皮細胞マーカー）の抗体を使用して、正常およびＡｌｐｏｒｔマウス由来の腎臓の凍結切片の２重免疫蛍光分析を行った。図１０中に示されたそのデータは、Ａｌｐｏｒｔ腎臓皮質中のコラーゲンＸIII およびＣＤ３１の明らかな共局在の範囲を示す（囲まれた範囲）。コントロール中にはこれらの２つのタンパク質の共局在は観察されなかった。
【００９４】
議論
以前の研究は、間質性繊維症の進行は、同じ近効系バックグランド（１２９Ｓｖ）のＡｌｐｏｒｔマウスよりもインテグリンα１無しＡｌｐｏｒｔ（ＤＫＯ）マウスにおいて緩徐であることを示した（Cosgrove et al.,Am.J.Path.,157,1649-1659(2000);Rodgers et al.,Kidney Int.,63,1338-1355(2003)）。この研究は、インテグリンα１無しマウスモデル（Gardner et al.,Dev.Biol.,175,301-313(1999))、並びに、関節性リウマチ（De Fougerolles et al.,The Journal of Clinical Investigation,105,721-729(2000))、半月状糸球体腎炎（Cook et al.,Am.J.Path.,161,1265-1272(2002))、および実験的大腸炎（Krieglstein et al.,J.Clin.Invest.,110,1173-1782(2002))を含む他の炎症性疾患の進行の速度の緩徐における有効性のための中性抗体法とともに使用する関連した実験に拡大された。インテグリンα１β１の中和の有利な効果は、全てのケースにおいて有意であるが、これらの観察の根底にあるメカニズムは知られていなかった。
【００９５】
間質の不可抗力的な破壊における単球および筋繊維芽細胞の関連する役割を決定することを目的とした行われた実験は、組織の単球が、腎臓繊維症の進行に関係する組織の破壊に寄与する腎臓細胞のアポトーシスを媒介することを結論した（Rodgers et al.,Kidney Int.,63,1338-1355(2003))。本明細書において、インテグリンα１無しＡｌｐｏｒｔマウス中の間質単球の蓄積は、Ａｌｐｏｒｔマウス中と比較して、顕著に減少したことを示す。この示された減少速度は、単球の間隙への流出速度および/または間質の単球の増殖における影響が減少したことに起因するのかもしれない。本出願において、蛍光色素接合デキストランの注射を介し、Ａｌｐｏｒｔマウスと比較して、インテグリンα１欠損Ａｌｐｏｒｔマウス中で単球の間隙への流出の速度が極めて緩徐であることが証明された。実際に、このアッセイにおいて、Ａｌｐｏｒｔ間質中で観察された蛍光色素標識化単球は、主にインテグリンα１β１-陽性細胞であった。野生型およびインテグリンα１-欠損マウスの骨髄由来の蛍光色素で標識した培養単球を使用した移植実験は、α１インテグリン-欠損Ａｌｐｏｒｔマウスに注射した場合、流出の速度において有意な減少を確認し、末梢血単球上のインテグリンα１β１が、慢性炎症性腎臓の間隙への経内皮遊走のそれらの速度を増強することを直接的に示している。
【００９６】
このような、および追加的な補足証拠により、活動的に繊維症を起こしているＡｌｐｏｒｔ腎臓の内皮細胞表面上にα１β１インテグリンのリガンドが存在するはずであることが推測された。Ａｌｐｏｒｔマウス、インテグリンα１-欠損Ａｌｐｏｒｔマウス、および正常なコントロールマウスの尾静脈への蛍光色素接合精製化α１β１インテグリンの注射は、インテグリンが、正常でない、疾患したマウスの血管内皮に接着することを確認した。α１β１-陽性末梢血単球の内皮細胞受容体としてのコラーゲンＸIII を確認するために、注目のタンパク質を同定するためのファージディスプレイ法（Ruoslahti et al.,Cancer Biology,10,435-442(2000);Laakkonen et al.,Nature Medicine,8,751-755(2002)を使用した。コラーゲンＸIII は原形質膜コラーゲンである（Hagg et al.,J..Biol.Chem.,273,15590-15597(1998))。それは、α１β１インテグリンの特異的なリガンドとして特徴付けられた（Nykvist et al.,J.Biol.Chem.,275,8255-8261(2000))、しかし、インテグリンの機能的な役割は不明なままであった。興味深いことに、我々のファージディスプレイ法で同定したコラーゲンＸIII ペプチドのアミノ酸配列は、クラスＡスカベンジャー受容体のコラーゲンのドメインに対して相同的であり（アミノ酸配列中６７％一致）、それは、マクロファージのコラーゲンへの接着のメカニズムとして同定されていた（Gowen et al.,J.Leuk.Biol.,69,575-582(2001);Kosswig et al.,J.Biol.Chem.,278,34219-34225(2003))。
【００９７】
以前の報告は、コラーゲン結合性インテグリンα１β１およびα２β１が、活性化Ｔ細胞の炎症性組織への遊走に関係することを示唆したが、この効果を媒介する細胞のメカニズムは説明されていなかった（Andreasen et al.,J.Immunol.,171,2804-2811(2003))。関節炎を伴うヒトにおいて、α１β１-陽性リンパ球が、タイプIVコラーゲンへの接着のために抗原刺激されたＴ細胞のサブセットとして発見され（Bank et al.,Clinical Immunol.,105,247-258(2002))、ヒトの慢性的な炎症の促進におけるα１β１-陽性リンパ球の特異的な役割を示唆している。
【００９８】
本明細書において提示された実験は、これらのコンセプトを同時にもたらし、炎症性組織が循環している単球およびリンパ球のこの亜集団をどのように選択するかの説明を提供している。しかしながら、遊出のためのこれらの細胞の選択の生物学的理由は不明のままである。α１β１インテグリンシグナリングを介したこれらの細胞の活性化は、炎症性状態の回復に正常で有益な特性与えることが可能である。炎症-関連性単球はＴＧＦ-β１に免疫陽性であるが、常在性単球はそうではないことが観察された（Rodgers et al.,Kidney Int.,63,1338-1355(2003)。急性の上昇は炎症性の状態を回復するのに有益となり得るが、上昇したＴＧＦ-βへの持続的な暴露は、悪名高く破壊的である（Border et al.,Nature(London),346,371-374(1990))。
【００９９】
このメカニズムの生物学的理由は不明のままであるが、本出願において説明した研究に基づき、慢性炎症性疾患に関係する組織破壊の制御のためのリンパ球/単球のα１β１インテグリンの媒介する遊走の遮断の潜在的な治療的有益性は明白である。本明細書が供する移植データは、単球の腎臓間質への遊出の効果にも関わらず、α１β１の中和が有意性を有することを示す。慢性炎症性モデルにおいて、単球の浸潤を御する他のメカニズムが明らかに存在する。リンパ球/単球の遊出を制限することを目的として向けられた治療的パラダイムは、慢性炎症性疾患、例えば、ヒトの乾せん、炎症性腸疾患および多発性硬化症の進行の緩徐において有効性を有した（Harlan et al.,Crit.Care Med.,30,S214-9(2002))。いくつかのさらに特徴付けられた方法は、通常、モノクローナル抗体の中和を介する受容体およびそのリガンドの両方の遮断を含む。この方法は、ＬＦＡ-１/ＩＣＡＭ-１相互作用（白血球の炎症性組織への流出の制御）およびＶＬＡ-４/ＶＣＡＭ-１相互作用（リンパ球および単球の炎症性組織への流出の抑制）に対してうまく適用された（Yusuf-Makagiansar et al.,Med.Res.Rev.,22,146-67(2002))。最近、内皮細胞上で発現される新規な接着分子、血管接着タンパク質-１（ＶＡＰ-１）が、肝臓の慢性炎症と関連するリンパ球の接着および遊出において重要な役割を果たしていることが示された（Lalor et al.,J..Immunol.,169,983-92(2002))。この調査群を合わせると、炎症性細胞の慢性炎症性組織への結合、活性化、および、流出に影響しているメカニズムの多様性を強調する。
【０１００】
本明細書における証拠によれば、インテグリンα１β１/コラーゲンＸIII の相互作用が、慢性炎症性腎臓中の単球の流出の媒介において重要な役割を果たすことは明らかである。α１β１インテグリン-特異性中和抗体および/またはインテグリンα１-欠損マウスを利用する実験は、このメカニズムが、関節性リウマチ、半月状糸球体腎炎、および実験的大腸炎に関係することを示す。この治療的方法は、α１β１インテグリン-陽性単球/リンパ球が関与する場合、おそらく、いかなる慢性炎症性疾患に対しても利益を供するであろう。
【０１０１】
本明細書に引用された、全ての特許、特許出願、公報、並びに、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ目録番号およびＥＭＢＬ目録番号を含む核酸およびタンパク質データベースエントリーの完全な公開は、本明細書において、個々に組み入れられたように、引例により本明細書に組み入れられている。本発明の様々な変更および変化は、本発明の範囲および意図と離れることなく、当業者に明確となるであろう。そして、本明細書において説明した態様を不当に制限することなく理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】１Ａおよび１Ｂ：Ａｌｐｏｒｔ間質における単球は、主に、インテグリンα１β１-陽性である。パネルは、示された年齢での、ＣＤ１１ｂ（図１Ａ）およびインテグリンα１β１（図１Ｂ）に対する抗体を使用したＡｌｐｏｒｔ腎臓皮質由来の組織切片の免疫蛍光免疫染色を示す。全ての単球がα１β１インテグリンに免疫陽性であることに注目すべきである。
【０１０３】
【図２】２Ａ−２Ｅ：約１０％の骨髄由来単球がインテグリンα１β１を発現する。単球（ＣＤ１１ｂＰＥ）およびインテグリンα１β１（ＶＬＡ Ａｌｅｘａ）の抗体マーカー、並びに、アイソタイプが同じコントロール抗体を使用した蛍光活性化選別（ＦＡＣＳ）は、骨髄由来単球の２色の分析に使用した。また、約１０％のＣＤ１１ｂ-陽性細胞は、インテグリンα１β１に陽性だった（図２Ｅ、ヒストグラムの上右象現の両-陽性細胞）。
【０１０４】
【図３】３Ａ−３Ｄ：Ａｌｅｘａ５６８-標識化デキストランの尾静脈注射は、ＣＤ１１ｂ-陽性単球の輸送を許容する。；Ａｌｐｏｒｔマウスの尿細管間質へ漸増する全ての単球はインテグリンα１β１に陽性である。７週齢のＡｌｐｏｒｔマウスに１μｇのＡｌｅｘａー５６８-接合デキストランを注射した。注射３日後、腎臓を摘出し、ＯＣＴ水性包埋培地に包埋し、そして、凍結切片にした。組織切片を、ＦＩＴＣ-接合抗-インテグリンα１β１-特異性抗体（図３Ｃ）、または、ＦＩＴＣ-接合抗-ＣＤ１１ｂ抗体（図３Ａ）のいずれかで免疫染色した。その結果は明らかに、Ａｌｐｏｒｔ尿細管間質へと新たに浸潤したＡｌｅｘａ-標識化細胞は全て単球であり、そして、全てインテグリンα１β１-陽性であることを示した。図３Ｂおよび３Ｄは、Ａｌｅｘａ５６８-接合デキストランの尾静脈注射から３日後のＡｌｐｏｒｔ腎臓の間質中のＡｌｅｘａ５６８-陽性細胞を示す。単球のみ（ＣＤ１１ｂは単球に特異的なマーカーである）が標識される（図３Ｂ中の全ての蛍光シグナルは図３Ａの蛍光シグナルでラインナップする）。新たに流出した単球（図３Ｄ）は、全てインテグリンａ１ｂ１（ＶＬＡ１、図３Ｃ）に免疫-陽性である。
【０１０５】
【図４】４Ａおよび４Ｂ：単球流出は遅延し、そしてＡｌｐｏｒｔマウスと比較してインテグリンα１β１-欠損Ａｌｐｏｒｔマウスの腎臓皮質において、単球流出の速度が減少している。精製したα１β１インテグリンを使用したこのリガンドの遮断は単球の間質への流出の速度を減少しうる。図４Ａ。Ａｌｅｘａ５６８-標識化デキストランの尾静脈注射を介して評価される単球の輸送を、腎臓疾患の発達の機能として、α１β１インテグリン-欠損（ＤＫＯ）Ａｌｐｏｒｔマウスと比較してＡｌｐｏｒｔマウス中で分析した。データは、２つの独立した動物の、代表的な２０フィールド（２００×拡大率）を表す。イメージＰｒｏ-Ｐｌｕｓ（Media Cybernetics,Bethesda,MD)ソフトウェアを使用して、ＣＤ１１ｂ-陽性/Ａｌｅｘａ-陽性シグナルのみを記録した。その明白なデータは、単球の流出の開始がＡｌｐｏｒｔマウスと比較してＤＫＯマウス中で遅延ことを示す。そのカーブの勾配（Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ（Sigma,St.Louis,MO)ソフトウェア）を使用した直線的回帰に由来する）は、ＤＫＯマウス中の単球の流出の速度が、Ａｌｐｏｒｔマウスよりも顕著に低いことを示す。図４Ｂ。Ａｌｐｏｒｔマウスに、標識したデキストリンでの注射１日前に、５μｇの精製したα１β１インテグリンを注射し、あるいは、しないで、そして、標識化デキストリンの注射後、３日間、毎日５μｇを追加免疫した。凍結切片を単球（抗-ｃｄ１１ｂ）のために染色し、そして上記のように２重標識した細胞をカウントした。結果は精製したインテグリンで注射したマウス中の単球の流出の減少を示し、単球の尿細管間隙への流出を媒介するための機能を決定している。バーは標準誤差を示す。
【０１０６】
【図５】５Ａ−５Ｃ：α１β１インテグリンはＡｌｐｏｒｔ腎臓の血管内皮と結合するが、正常な腎臓とは結合しない。精製したα１β１インテグリンをＡｌｅｘａ５６８蛍光色素と接合し、そして、正常な（Ａ）マウスおよびＡｌｐｏｒｔ（Ｂ）マウスの尾静脈中に注射した。２４時間後、腎臓を摘出し、凍結切片にし、そして蛍光顕微鏡を使用して像を写した。２つのシグナル（図５Ｂのシグナルと図５Ｃのシグナルの位置を比較する）が共存しないことから、図５ＣはＡｌｅｘａ-標識化インテグリンの結合が、単球中の食菌されたインテグリンではないことを示す。
【０１０７】
【図６】コラーゲンＸIII ｍＲＮＡを、コントロールと比較して、Ａｌｐｏｒｔマウス由来の血管内皮細胞中で誘導する。内皮細胞は野生型およびＡｌｐｏｒｔ腎臓から単離し、それから、ＲＮＡを抽出した。オリゴｄＴプライマーでＲＮＡを逆転写した。ＧＡＰＤＨ（レーン１-３）およびコラーゲンＸIII -８８０ｂｐ（レーン４-６）でＰＣＲ増幅した。レーン１：水コントロールＧＡＰＤＨ；レーン２：野生型ＧＡＰＤＨ；レーン３；ＡｌｐｏｒｔＧＡＰＤＨ；レーン４：水コントロールコラーゲンＸIII ；レーン６ＡｌｐｏｒｔコラーゲンＸIII ；およびレーンＭ：１００ｂｐラダー。
【０１０８】
【図７】ＭＣＰ-１はin vitro においてＶＬＡ１組み換えタンパク質の内皮細胞結合を促進する。マウス腎臓由来の培養した一次内皮細胞を、示した濃度の組み替えＭＣＰ-１で処理した。精製した蛍光色素-接合インテグリンα１β１と結合する能力のために、３通りのウェルを分析した。データは３つの独立した実験の平均および標準偏差を示す。
【０１０９】
【図８】過酸化水素は、in vitro においてＶＬＡ１組み換えタンパク質の内皮細胞結合を促進する。マウス腎臓由来の培養した一次内皮細胞を、示した濃度の過酸化水素で処理した。精製した蛍光色素-接合インテグリンα１β１と結合する能力のために、３通りのウェルを分析した。データは３つの独立した実験の平均および標準偏差を示す。
【０１１０】
【図９】培養した腎臓内皮細胞由来のコラーゲンＸIII の間接的な免疫沈降。未処理またはＭＣＰ-１処理一次内皮細胞を、間接的に免疫沈降分析にかけた。細胞を溶解し、そして精製したα１β１インテグリンを溶解液に加えた。複合体を抗-α１インテグリン抗体で免疫沈降させた。その免疫沈降物を、抗-コラーゲンＸIII 抗体でのウェスタンブロッドプローブにより分析した。そのコラーゲンＸIII の予測したバンド（それぞれ、９３および１１５ダルトン）を矢頭で示す。
【０１１１】
【図１０】図１０．コラーゲンＸIII はＡｌｐｏｒｔ腎臓中では血管内皮細胞マーカーＣＤ３１と共存するが、正常な腎臓中では共存しない。免疫蛍光分析は、正常なコントロールおよびＡｌｐｏｒｔマウス由来の腎臓凍結切片において、コラーゲンＸIII またはＣＤ３１のいずれかに対する抗体を使用して行った。領域中の囲んだ部分は、コラーゲンＸIII が血管内皮と明確にラインナップしている領域である。これらの領域は、繊維症の腎臓中のみ観察された。
【配列表フリーテキスト】
【０１１２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１  ペプチド
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２  ペプチド
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９  プライマー
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０  プライマー
【図１】
2006516024.tif 000007
【図２】
2006516024.tif 000008
【図３】
2006516024.tif 000009
【図４】
2006516024.tif 000010
【図５】
2006516024.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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