(57)【要約】椎間円板を補強するおよび／または修復する方法であって、幹細胞材料を該円板中に投与することによる方法である。該幹細胞は、未分化の細胞であってよいし、またはそれらは、分化した後、脱分化した細胞であってよい。該幹細胞は、所望の分化を誘導するように計画された物質および／または環境にそれらを暴露することによって、線維芽細胞、軟骨細胞または脊索細胞のようなヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導することができる。いくつかの態様において、該幹細胞材料は、コラーゲンの多い格子であってよいコラーゲンを主成分とする材料と一緒にして提供することができる。該幹細胞材料は、非幹細胞材料を実質的に含まなくてよい幹細胞単離物として提供することができる。他の治療薬は、該幹細胞材料と一緒に投与することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間円板を処置する方法であって、椎間円板に幹細胞材料を外科的に加えることを含む方法。
【請求項２】
前記幹細胞材料が、分化を開始したことがない幹細胞から本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞材料が、分化を開始したが、未分化の状態に戻った幹細胞から本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞材料が、分化を開始したが、実質的に未分化の状態に戻った幹細胞から本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞材料が、分化を開始したが、部分的に分化した状態に戻った幹細胞から本質的になる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞材料が、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞材料が、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように選択的に誘導された幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞材料が、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−□、アスコルビン酸−２−リン酸、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、□−グリセロリン酸、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンからなる群より選択されるメンバーと該幹細胞材料を接触させることによって、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように選択的に誘導されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞材料が、所望の表現型を有する成熟細胞と該幹細胞材料を接触させることによって、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように選択的に誘導されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞材料が、線維芽細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞材料が、線維芽細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された幹細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞材料が、軟骨細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞材料が、軟骨細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された幹細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞材料が、脊索細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞材料が、脊索細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された幹細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞材料が、分化した細胞から誘導されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞材料が、未分化の細胞から誘導されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞材料を、該組成物を外科的に加えられる予定のヒトから採取する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記幹細胞材料を、非幹細胞材料から分離後、該材料を椎間円板に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞材料が、実質的に非幹細胞材料を含まない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞を、コラーゲンの多い格子中に配置する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記コラーゲンの多い格子材料を、該組成物を外科的に加えられる予定のヒトから採取する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
コラーゲン基材料を含む成熟細胞を、椎間円板腔に加える工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
幹細胞が椎間円板細胞に分化するように誘導するのに有効な材料を、椎間円板腔に加える工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
幹細胞が椎間円板細胞に分化するように誘導するのに有効な前記材料が、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−□、アスコルビン酸−２−リン酸、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、□−グリセロリン酸、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
幹細胞が椎間円板細胞に分化するように誘導するのに有効な前記材料が、所望の表現型を有する成熟細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記外科的に加える工程が、前記幹細胞材料を椎間円板中に注射することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、本質的に幹細胞材料からなる組成物を、椎間円板に外科的に加えることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記幹細胞材料を、ゲルとして椎間円板に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記幹細胞材料を、溶液または懸濁液として椎間円板に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記幹細胞材料を、架橋剤を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞材料を、放射性造影剤を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記幹細胞材料を、鎮痛薬を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記幹細胞材料を、抗生物質を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記幹細胞材料を、少なくとも一つの多糖を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記幹細胞材料を、プロテオグリカン類を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記幹細胞材料を、増殖因子を更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞材料を、該円板の治癒、修復、再生および／または回復（restoration）を促進するのに、および／または適正な円板機能を容易にするのに有効な細胞の一つまたはそれを超える他のタイプを更に含む製剤として提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
幹細胞材料を椎間円板に外科的に加えることによって処理された椎間円板。
【請求項４０】
前記円板が、分化を開始したことがない幹細胞を加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項４１】
前記円板が、分化を開始したが、未分化の状態に戻った幹細胞を加えることによって処理ている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項４２】
前記円板が、分化を開始したが、実質的に未分化の状態に戻った幹細胞を加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項４３】
前記円板が、分化を開始したが、部分的に分化した状態に戻った幹細胞を加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項４４】
前記円板が、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項４５】
前記円板が、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように選択的に誘導された幹細胞を加えることによって処理されている、請求項４４に記載の椎間円板。
【請求項４６】
前記幹細胞材料が、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−□、アスコルビン酸−２−リン酸、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、□−グリセロリン酸、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンからなる群より選択されるメンバーと該幹細胞材料を接触させることによって、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように選択的に誘導されている、請求項４５に記載の椎間円板。
【請求項４７】
前記幹細胞材料が、所望の表現型を有する成熟細胞と該幹細胞材料を接触させることによって、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように選択的に誘導されている、請求項４５に記載の椎間円板。
【請求項４８】
前記幹細胞材料が、線維芽細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項４４に記載の椎間円板。
【請求項４９】
前記幹細胞材料が、線維芽細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された幹細胞を含む、請求項４５に記載の椎間円板。
【請求項５０】
前記幹細胞材料が、軟骨細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項４４に記載の椎間円板。
【請求項５１】
前記幹細胞材料が、軟骨細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された幹細胞を含む、請求項４５に記載の椎間円板。
【請求項５２】
前記幹細胞材料が、脊索細胞の少なくとも一つの特徴を発現する幹細胞を含む、請求項４４に記載の椎間円板。
【請求項５３】
前記幹細胞材料が、脊索細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された幹細胞を含む、請求項４５に記載の椎間円板。
【請求項５４】
前記幹細胞材料が、分化した細胞から誘導されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項５５】
前記幹細胞材料が、未分化の細胞から誘導されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項５６】
前記幹細胞材料を、該組成物を外科的に加えられる予定のヒトから採取する、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項５７】
前記幹細胞材料を、非幹細胞材料から分離後、該材料を椎間円板に加える、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項５８】
前記幹細胞材料が、実質的に非幹細胞材料を含まない、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項５９】
前記幹細胞を、コラーゲンの多い格子中に配置する、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６０】
前記コラーゲンの多い格子材料を、該組成物を外科的に加えられる予定のヒトから採取する、請求項５９に記載の椎間円板。
【請求項６１】
前記椎間円板が、外科的に植え込まれたコラーゲン基材料を更に含む、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６２】
前記椎間円板が、幹細胞が椎間円板細胞に分化するように誘導するのに有効な材料を更に含む、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６３】
幹細胞が椎間円板細胞に分化するように誘導するのに有効な前記材料が、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−□、アスコルビン酸−２−リン酸、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、□−グリセロリン酸、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、ヒドロコルチゾンからなる群より選択されるメンバーを含む、請求項６２に記載の椎間円板。
【請求項６４】
幹細胞が椎間円板細胞に分化するように誘導するのに有効な前記材料が、所望の表現型を有する成熟細胞を含む、請求項６２に記載の椎間円板。
【請求項６５】
前記円板が、本質的に幹細胞材料からなる材料を、椎間円板に外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６６】
前記円板が、幹細胞材料および架橋剤を外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６７】
前記円板が、幹細胞材料および放射性造影剤を外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６８】
前記円板が、幹細胞材料および鎮痛薬を外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項６９】
前記円板が、幹細胞材料および抗生物質を外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項７０】
前記円板が、幹細胞材料および少なくとも一つの多糖を外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項７１】
前記円板が、幹細胞材料およびプロテオグリカンを外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項７２】
前記円板が、幹細胞材料および増殖因子を外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項７３】
前記円板が、幹細胞材料と、該円板の治癒、修復、再生および／または回復を促進するのに、および／または適正な円板機能を容易にするのに有効な細胞の一つまたはそれを超える他のタイプを外科的に加えることによって処理されている、請求項３９に記載の椎間円板。
【請求項７４】
幹細胞材料が、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導する方法であって、幹細胞材料を椎間円板腔中に導入し、そして該幹細胞材料を、形態形成性の増殖因子または分化因子と接触させることを含む方法。
【請求項７５】
幹細胞材料が、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導する方法であって、幹細胞材料を椎間円板腔中に導入し、そして該幹細胞材料を、所望の表現型を有する成熟細胞と接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、椎間円板を補強するおよび／または修復するための材料および方法に関し、より詳しくは、幹細胞材料で椎間円板を補強するおよび／または修復するための材料および方法に関する。
【０００２】
発明の背景
健全な椎間円板は、椎骨対間の運動を容易にし、衝撃を吸収し且つ分配する。その円板は、二つの部分、すなわち、荷重の大部分を有する軟質中心コア（髄核）、およびそのコア材料を保持し且つ安定化させる頑丈な外環（線維輪）から構成されている。
【０００３】
自然の老化過程が進行するにつれて、その円板は、脱水し且つ変性して、椎体を適切に衝撃緩和し且つ支持するその能力に悪影響を及ぼすことがありうる。この自然の乾燥は、その一層進行した状態において、磁気共鳴画像法［ＭＲＩ］での円板の脱水した外観のために、しばしば、「黒色円板」と称されるが、それは、椎骨が互いに一層接近するにつれて患者に不快感を引き起こす、すなわち、脊髄神経を圧迫し且つ痛みを引き起こすことがありうる。
【０００４】
変性円板疾患を解決しようとする技術は、これまでは、主に、円板置換法に頼っていた。脱水した円板および／または変性している円板を、円板置換が必要になる前に補強した場合、その補強材料は、主に、円板中に植え込まれた場合に膨張する、膨張している、または膨張する要素を配置する合成デバイスであった。
【０００５】
最近の研究では、多分化能性（pluripotent）および／または多能性（multipotent）幹細胞が、医学的用途に潜在的に有用であると示唆された。多分化能性幹細胞は、体内で見出される２００種類を超える異なった細胞タイプのいずれか一つに分化することができる自己更新性細胞である。胚の多分化能性および／または多能性幹細胞は、胎生期癌（「ＥＣ」）細胞か、胚生殖（「ＥＧ」）細胞かまたは胚幹（「ＥＳ」）細胞として特徴付けすることができる。非胚多分化能性および／または多能性幹細胞は、成体の体細胞源より得ることができる。非胚多能性幹細胞には、例えば、神経幹細胞、間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、および脂肪吸引より得られる幹細胞が含まれる。本開示の目的のために、胚の多分化能性または多能性細胞および非胚多分化能性または多能性細胞を全て、「幹細胞」と称する。言い換えると、成熟細胞タイプに分化していない細胞は全て、本開示の目的のために「幹細胞」と称してよい。
【０００６】
間葉系幹細胞は、骨髄間質、血液、真皮および骨膜を含めた多数の源に由来する成体多能性細胞である。これら細胞は、自発的分化を伴うことなく、in vitroで連続培養することができる。しかしながら、適正な条件下において、間葉系幹細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、腱細胞、靱帯原性細胞、筋原性細胞、骨髄間質細胞および皮膚原性細胞を含めた間葉系統の細胞に分化するように誘導することができる。
【０００７】
造血系幹細胞は、赤血球、巨核球、単球／マクロファージ、顆粒球、肥満細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞を含めた多数の血液細胞への分化および自己更新が可能な多能性細胞である。造血系幹細胞は、胎児肝、成体骨髄、または星細胞（stellite cells）と称される単核性筋前駆細胞より得ることができる。
【０００８】
ごく最近になって、ヒト多分化能性幹細胞が、卵母細胞への核移動による体細胞核の再プログラム化によって得られた。治療的クローニングと称されるその技術は、患者由来の多分化能性幹細胞を自家移植療法で用いることを可能にする。同様に、多能性幹細胞は、成体（非胚、非胎児）哺乳動物組織の脱分化によって生じることができる。しかしながら、これまで、このような多能性または多分化能性細胞は、椎間円板を補強するまたは修復するのに用いられたことがなかった。
【０００９】
したがって、多分化能性および／または多能性幹細胞を用いて椎間円板を補強するまたは修復するための技術が、なお必要とされている。本発明は、この必要性に取り組む。
【００１０】
発明の要旨
本発明の一つの側面を簡単に記載すると、椎間円板を補強するおよび／または修復する方法であって、その円板に幹細胞材料を投与することによる方法が提供される。その幹細胞材料は、未分化の細胞由来であってよいし、またはそれは、分化した後、それらの未分化の状態に戻った細胞由来であってよい。植込みを予定した細胞が、円板腔中で使用するための選択の前に分化を開始したか否かにかかわらず、いくつかの態様において、幹細胞材料は、その材料が円板中に植え込まれる前に、ヒト椎間円板細胞（線維芽細胞、軟骨細胞または脊索細胞など）の少なくとも一つの特徴を発現するように誘導された細胞を含む。或いは、その幹細胞材料は、円板腔内で分化して、ヒト椎間円板細胞の少なくとも一つの特徴を発現するので、未分化の幹細胞材料、および幹細胞分化を誘導可能な材料を、円板腔中へ植込みの直前、植込み中または植込み後に一緒にしてよい。
【００１１】
いくつかの態様において、幹細胞材料は、コラーゲンの多い格子（collagen-rich lattice）であってよいコラーゲン基材料（collagen-based material）と一緒にして提供される。このコラーゲン基材料は、脱水した形で提供され、そして投与後に再水和されてよいし、またはそれは、スラリーまたはゲルのような水和した形で提供されてよい。グルタルアルデヒドのような架橋剤は、コラーゲン基材料中に含まれて、コラーゲン架橋を促進することができる。
【００１２】
更に、放射性造影材料は、画像化を増強するために含まれてよい。鎮痛薬および／または抗生物質などの性能増強添加剤は、追加の治療的利点を与えるように含まれてよい。
【００１３】
若干の好ましい態様において、幹細胞材料は、非幹細胞材料を実質的に含まなくてよい幹細胞単離物として提供される。
【００１４】
請求の範囲に記載の本発明の目的および利点は、次の説明から明らかであろう。
【００１５】
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を促す目的のために、ここで、若干の好ましい態様について言及するが、具体的な言葉を用いてそれを記載する。それにもかかわらず、それによって本発明の範囲が制限されるものではなく、好ましい態様におけるこのような変更および追加の修正は、本発明が関する当該技術分野の業者が考えるように解釈されるということは理解されるであろう。
【００１６】
上に示されるように、本発明の一つの側面は、幹細胞材料を用いて椎間円板を補強するまたは修復するための材料および方法に関する。最も好ましい態様において、幹細胞材料は、実質的に堅固な輪の中に入っている円板核に投与される。他の態様において、その材料は、損傷したまたは欠損した輪の中に入っている円板核に投与される。
【００１７】
本発明の一つの側面において、幹細胞材料は、椎間円板に投与され、そして椎間円板細胞に分化するように誘導される。その幹細胞材料は、胚（embroyonic）幹細胞のような、分化したことがない細胞を含んでよいし、またはそれは、分化した後、脱分化して、それらの多能性または多分化能の能力を回復した幹細胞を含んでよい。
【００１８】
どのタイプの幹細胞が用いられるかにかかわらず、それら細胞は、ヒト椎間円板細胞の一つまたはそれを超える特徴を発現するように誘導することができる。一つの態様において、それら細胞は、椎間円板細胞の特徴を示すように誘導された後、円板に（例えば、in vitroで）投与されるが、他の態様において、細胞は、円板に（in vivoで）投与された後に、椎間円板細胞特徴を示すように誘導される。
【００１９】
一つの好ましい態様において、幹細胞材料は、脂肪由来幹細胞材料である。より好ましくは、幹細胞材料は、他の細胞タイプ（例えば、脂肪細胞、赤血球、他の間質細胞等）および細胞外マトリックス材料を実質的に含まない。最も好ましくは、幹細胞材料は、このような他の細胞タイプおよびマトリックス材料を全く含まない。脂肪由来幹細胞材料は、霊長類の脂肪組織に由来してよく、最も好ましくは、脊髄インプラント（implant）を与えられるヒトに由来する。その幹細胞材料は、いずれのタイプの幹細胞由来でもありうるが、望ましくは、その材料は、中胚葉起原のものである。
【００２０】
脂肪由来幹細胞材料を用いる場合、その材料は、いずれか適する方法によって得ることができる。大まかではあるが、その手順は、脂肪組織を起原動物から単離することから始める。生きているドナーからのヒト脂肪間質細胞を用いる場合、外科的または吸引による脂肪除去術などの十分認識されているプロトコールが好適である。
【００２１】
脂肪組織を得た後、好ましくは、幹細胞をその材料の残部から分離するようにそれを処理する。一つの好ましい態様において、その脂肪組織を、生理学的に適合しうる生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄後、激しく撹拌し、沈降させる。その手順は、浮遊物質（例えば、損傷した組織、血液、赤血球等）を脂肪組織から除去する。その洗浄工程および沈降工程は、上澄みから相対的に破片がなくなるまで、繰り返してよい。
【００２２】
残った細胞は、概して、いろいろなサイズの塊で存在するであろうが、それゆえ、その材料を、好ましくは、細胞自体への損傷を最小限にしながら、全体の構造を分解するように処理する。これを達成する一つの方法は、それら洗浄された細胞塊を、細胞間の結合を弱くするまたは破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン等）で処理することである。このような酵素的処理の量および期間は、用いられる条件に依存して異なるであろうが、このような酵素の使用は、概して、当該技術分野において知られている。或いは、または酵素的処理と一緒にして、それら細胞塊を、機械的撹拌、音波エネルギー、熱エネルギー等のような他の処理を用いて分解することができる。
【００２３】
その分解工程は、典型的に、凝集した細胞（概して、リポソーム）と、概してフリーな間質細胞（例えば、赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞および幹細胞）を含有する体液画分のスラリーまたは懸濁液を生じる。分離法における次の工程は、したがって、それら凝集した細胞を間質細胞から分離することである。これは、上澄みによって覆われたペレット中に間質細胞を押し込む遠心分離によって達成することができる。次に、その上澄みを捨て、ペレットを生理学的に適合しうる流体中に懸濁させることができる。
【００２４】
懸濁した細胞には、典型的に、赤血球が含まれ、大部分のプロトコールにおいて、これらを溶解させることが望まれる。赤血球を選択的に溶解させる方法は、当該技術分野において知られており、いずれか適するプロトコールを用いることができる（例えば、高張または低張の基剤中でのインキュベーション）。赤血球が溶解したならば、残った細胞を、その溶解産物から、典型的には、濾過または遠心分離によって分離すべきである。赤血球が溶解しているか否かに関わらず、懸濁した細胞は、より高い純度が得られるように、１回またはそれを超えて連続して、洗浄し、再遠心し、そして再懸濁させることができる。
【００２５】
成体幹細胞は、セルソーターを用いて、または細胞のサイズおよび顆粒度（granularity）の基準で分離することができるが、幹細胞は、比較的小さく且つ無顆粒である。それらは、免疫組織化学的に、例えば、パニングまたは磁気ビーズを用いることによって分離することもできる。それら本発明の細胞を単離する工程および手順はいずれも、所望ならば、手動で行うことができる。或いは、このような細胞を単離する方法は、当該技術分野においてその多くが知られている適する装置によって容易にすることができる。
【００２６】
上に示されたように、いくつかの態様において、幹細胞材料は、分化した後、脱分化して、それらの多能性能力を回復した細胞を含む。それを達成する一つの方法は、それら細胞の培養物を樹立し、そして分化に関連した特異的な後成的染色体変化を逆行させるようにそれら細胞を処理することを含む。
【００２７】
細胞分化中に起こる遺伝子発現の遺伝性変化は、一部分は、染色体コンホメーションの後成的変化のためである。更に、染色体の緩く凝縮した領域（loosely condensed region）は、転写活性な遺伝子を含有し、そして高度に凝縮した染色体領域（highly condensed region）は、転写的にサイレントな遺伝子を含有する。染色体凝縮および転写活性の状態は、一部分は、ＤＮＡメチル化およびヒストンアセチル化によって制御される。ＣｐＧプロモーター内のシトシンのメチル化または過メチル化は、遺伝子サイレンシング（silencing）に関連しているが、未メチル化ＤＮＡは、概して、転写活性である。
【００２８】
分化した成体体細胞は、安定で且つ特異的なメチル化パターンを示すが、原始生殖細胞および着床前胚のような多分化能性細胞は、ゲノム全体の脱メチル化パターンを示す。少数の研究は、これら遺伝性メチル化パターンが逆行しうるということを示した。例えば、ネズミ胸腺リンパ球は、ネズミ胚生殖細胞と融合し、リンパ球細胞核のゲノム全体の脱メチル化を示した。得られた脱メチル化した核は、その後、多分化能を示した。
【００２９】
したがって、本発明の一つの側面において、成体体細胞を、ＤＮＡ脱メチル化を用いて再プログラム化する。脱メチル化は、ＤＮＡを含むヌクレオチドのメチル化の阻害を提供する。本発明により、成体体細胞は、ＤＮＡの脱メチル化を促進するまたは誘導する物質で処理することができる。脱メチル化工程の一つの態様において、成体体細胞を、５−アザ−２’−デオキシシチジンで処理する。一次成体体細胞を、０．１〜１００μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）の存在下の普通増殖培地中で１〜１０日間、好ましくは、５日間培養して、ＤＮＡの脱メチル化を促進するまたは誘導する。他の試薬を、その脱メチル化工程で用いてよく、例えば、メチラーゼ特異的抗体または他のメチラーゼ阻害剤が含まれる。
【００３０】
ＤＮＡメチル化および脱メチル化の特異的パターンに加えて、全体的な転写パターンも、ヒストンアセチラーゼおよびデアセチラーゼなどのクロマチン改造性（remodeling）酵素によって調節される。アセチル化されたヒストンは、脱アセチル化されたヒストンより低い親和性でＤＮＡに結合し、それによって、概して、転写因子がＤＮＡに結合することを可能にする。逆に、脱アセチル化されたヒストンは、一層高い親和性でＤＮＡを結合し、転写活性化因子のＤＮＡへの接近をブロックし、それによって、概して、転写を抑制する。本発明の別の態様において、一次成体体細胞を、ヒストン脱アセチル化の阻害または逆転によって再プログラム化する。一次成体体細胞を、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍｌのトリコスタチンＡ（trichostatin A）（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.）の存在下の普通増殖培地中で少なくとも２４時間培養する。細胞のトリコスタチンＡ処理は、予めサイレントした遺伝子の発現を誘導するまたは可能にすることが分かった。或いは、細胞を酪酸ナトリウムで処理してよいが、それも、ヒストン脱アセチル化を阻害する。ヒストンアセチル化またはＤＮＡメチル化の変化を誘導するまたは容易にする試薬はいずれも、それを達成するのに用いることができる。
【００３１】
また別の態様において、一次成体体細胞を、クロマチン改造性タンパク質で、好ましくは、ヒストンＨ１のヒストンＢ４およびＨＭＧ１との交換を容易にする核シャペロンであるヌクレオプラスミンで処理し、それによって、転写の活性化を容易にする。一つの好ましい態様において、通過ペプチド（transit peptide）（例えば、Ｔａｔ）を、普通培地中の細胞に投与されるヌクレオプラスミンを含むペプチドに融合させる。ヒストン交換を進行させた後、ヌクレオプラスミン処理を停止する。細胞は、当該技術分野において知られている、転写リプレッサーの除去および核改造を容易にするいずれかのクロマチン改造性酵素、試薬、インターカレート剤またはそれらの組合せで処理することができると考えられる。
【００３２】
別の態様において、一次成体体細胞を、脱メチル化剤、脱アセチル化阻害剤またはアセチル化プロモーターおよび／または核シャペロンの組合せで処理して、核の再プログラム化を促進する。本明細書中で用いられる「核シャペロン」という用語は、ヒストンＨ１または他の転写リプレッサーの、ＨＭＧ１、ヒストンＢ４または他の転写活性化因子との交換を容易にするいずれかの試薬を意味する。ヒストンアセチル化またはＤＮＡメチル化の変化を誘導するまたは容易にする試薬はいずれも、本発明の実施において用いることができると考えられる。更に、細胞は、当該技術分野において知られている、転写リプレッサーの除去および核改造を容易にするいずれかのクロマチン改造性酵素、試薬、インターカレート剤またはそれらの組合せで処理することができると考えられる。
【００３３】
更に、熟練者は、それら一次細胞を、それら細胞のゲノムを再プログラム化するために、ＤＮＡメチル化をブロックする、ＤＮＡ脱メチル化を促進する、ヒストン脱アセチル化をブロックする、ヒストンアセチル化を促進するおよび／またはヒストンＨ１のヒストンＢ４またはＨＭＧ１との交換を促進することが当該技術分野において知られている他の試薬で処理することができる。
【００３４】
成体体細胞幹細胞の培養物は、一つかまたはそれを超える次の試薬、すなわち、Ｇ２−Ｍサイクリン、例えば、サイクリンＡまたはサイクリンＢ、ｃ−Ｍｏｓ、コルヒチン、コルセミドまたはいずれか他の可逆性微小管薬で処理して、分裂中期停止を誘導することができる。サイクリンＡ、サイクリンＢまたはｃ−Ｍｏｓなどのポリペプチド試薬は、マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスロケーション、または通過ペプチドに融合しているポリペプチドの直接トランスロケーションが含まれるがこれに制限されるわけではない膜トランスロケーション法によって細胞に投与することができる。或いは、商業的に入手可能なＴｅｔ−オン／Ｔｅｔ−オフシステム（Clontech, Palo Alto Calif）のような、例えば、調節されたプロモーターの制御下の、サイクリンＡ、サイクリンＢまたはｃ−Ｍｏｓをコードしているポリヌクレオチドから構成されるベクターを、カチオン脂質形質導入、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションによって、培養された細胞中にトランスフェクションすることができる。中期停止を細胞中で少なくとも１〜６時間維持した後、その細胞を、ペプチドまたは微小管毒による処理の場合のように培地交換によって、またはポリヌクレオチドベクタートランスフェクションの場合のようにプロモーター抑制によって、中期停止から解放することができる。
【００３５】
容易に入手可能な成体体細胞、最も好ましくは、外毛根鞘（ＯＲＳ）細胞、表皮角化細胞または口腔上皮細胞は、本明細書中に記載のように、対象から入手し且つ培養で増加させることができるということは理解されるはずであり、この場合の対象は、好ましくは、ヒトである。それら細胞を、一定量の脱メチル化剤、好ましくは、約１０μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジンで約５日間処理して、全体的なゲノム脱メチル化を誘導する。これら細胞は、脱アセチル化阻害剤またはアセチル化プロモーター、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌまたは１μＭのトリコスタチンＡで約２４時間処理して、ヒストンアセチル化を促進することもできる。これら細胞は、核シャペロンまたは他のクロマチン改造性酵素（Fry and Peterson, 上記）、好ましくは、ヌクレオプラスミンまたはｔａｔ−ヌクレオプラスミンを含む一定量のポリペプチドで処理して、ＤＮＡからの転写リプレッサーの除去を容易にすることもできる。
【００３６】
前述の一つまたは複数の工程の後に、それら細胞を、中期で細胞を停止する一定量の物質、好ましくは、サイクリンＡまたはサイクリンＢを含むポリペプチドで３０時間処理して、長時間の有糸分裂停止を誘導する。次に、それら細胞を、少なくとも一つ変化した培地中で細胞を洗浄することによって、有糸分裂停止から解放する。
【００３７】
有糸分裂停止工程の後、付着細胞をトリプシン処理し、幹細胞の増殖を支持するように設計された培地中で再プレーティングし且つ培養する。好ましい態様において、改造された細胞を、８０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ．ＲＴＭ．ＤＭＥＭ、２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ．ＲＴＭ．ＳＲ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Bethesda Md.）、１ｍＭグルタミン、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸原液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Bethesda Md.）、４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子および１，０００Ｕ／ｍｌ白血病阻害因子（ＥＳ細胞培地）中のマウス胚線維芽細胞支持細胞の層上に継代する。そのＫＮＯＣＫＯＵＴ．ＲＴＭ．ＤＭＥＭおよびＫＮＯＣＫＯＵＴ．ＲＴＭ．ＳＲは、胚幹細胞の増殖を増強し且つ多分化能性を維持するように設計された特別な製剤である。熟練者は、当該技術分野において知られている他の細胞培地製剤を用いても、多分化能性細胞を増殖させることができる。
【００３８】
それら幹細胞が提供された後、本発明の一つの側面において、それら細胞を、ヒト椎間円板細胞の一つまたはそれを超える特徴を発現するように誘導する。その方法は、下に更に十分に論じられるように、in vitro または in vivo で行うことができる。前述のように、成熟ヒト椎間円板細胞の特徴を発現し始めたこれら細胞もまた、「幹細胞」と称する。実際上、成熟細胞タイプに分化していない細胞はいずれも、本開示の目的のために「幹細胞」と称してよい。
【００３９】
一つの好ましい態様において、改造された細胞を、幹細胞を維持するのに最適ではないがむしろ、改造された細胞を分化させることを可能にする条件下で直接的に培養する。概して、このような培養条件は、血清を欠いてよいし、支持細胞を欠いてよいし、高密度の細胞を含有してよいし、または規定の表現型の成熟細胞を培養するのに用いられる培地、所望のおよび／または規定の表現型の成熟細胞、または例えば、レチノイン酸などの特異的分化因子または神経成長因子のような一つまたはそれを超える種々の形態形成性の増殖因子または分化因子を含有してよい。
【００４０】
処置の一つのタイプは、分化するそれぞれのタイプの成熟細胞（または（pr）それらの前駆細胞）への暴露によって状態調節された培地中で本発明の細胞を培養することである（例えば、筋細胞への暴露によって状態調節された培地は、筋形成分化を誘導しうるし、心臓弁細胞への暴露によって状態調節された培地は、心臓弁組織への分化を誘導しうる等）。
【００４１】
in vitro 由来の成体多分化能性幹細胞の増加した培養物は、増殖因子および／またはモルフォゲンでの in vitro 処理によって分化することができる。当然ながら、分化を誘導するために規定された培地を用いることもできる。軟骨形成性分化は、それら細胞を、約１□Ｍ〜約１０μＭのインスリンおよび約１□Ｍ〜約１０μＭのトランスフェリン、約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β１、および約１０ｎＭ〜約５０ｎＭのアスコルビン酸−２−リン酸（５０ｎＭ）に暴露することによって誘導することができる。軟骨形成性分化について、好ましくは、それら細胞を、高密度で（例えば、約数百万個細胞／ｍｌでまたはマイクロマス（micromass）培養技術を用いて）、そして更には、低量の血清の存在下（例えば、約１％〜約５％）で培養する。骨形成性発育表現型は、それら細胞を、約１０μＭ〜約５０μＭのアスコルビン酸−２−リン酸および約１０ｎＭ〜約５０ｎＭのβ−グリセロリン酸と組み合わせた約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍのデキサメタゾン（例えば、約１μＭ）に暴露することによって誘導することができ、その培地には、血清（例えば、ウシ血清、ウマ血清等）も含まれうる。
【００４２】
それら細胞を、分化誘導性培地中において適する時間（例えば、数日〜１週間またはそれを超えて）培養後、細胞を検定して、実際上、それらが分化して、ある一定の細胞タイプの物理的性質を獲得したか否かを決定することができる。分化それ自体の一つの測定は、テロメア長さであるが、未分化の幹細胞は、分化した細胞より長いテロメアを有するので、それら細胞のテロメラーゼ活性レベルについて検定することができる。或いは、ＲＮＡまたはタンパク質を、それら細胞から抽出し、そして所望の表現型を示すマーカーの存在について（ノーザンハイブリダイゼーション、ｒｔＰＣＲまたはウェスタンブロット分析等によって）検定することができる。当然ながら、それら細胞は、免疫組織化学的に検定することができるし、または組織特異的染色を用いて染色することができる。同様に、骨形成は、それら細胞を骨特異的染料（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、フォンコッサ（von Kossa）等）で染色することによって評価することができるし、または骨特異的マーカー（例えば、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、Ｉ型コラーゲン、骨形成タンパク質、ｃｂｆａ等）の存在について探査することができる。軟骨形成は、軟骨（cartallge）特異的染料（例えば、アルシアンブルー）を用いてそれら細胞を染色することによって、または軟骨特異的分子（例えば、基剤中の硫酸化グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカン（例えば、ケラチン、コンドロイチン等）、ＩＩ型コラーゲン等）の発現／生産についてそれら細胞を探査することによって決定することができる。発育表現型を評価する他の方法は、当該技術分野において知られており、それらのいずれも適当である。例えば、それら細胞は、サイズおよび顆粒度によって選別することができる。更に、それら細胞を用いて、単クローン性抗体を生じることができ、次に、それを用いて、ある一定の細胞タイプにそれらが選択的に結合するか否かを評価することができる。抗原性の相関は、その幹細胞が、ある一定の発育経路に沿って分化したことを確かめることができる。
【００４３】
或いは、幹細胞は、ヒト椎間円板細胞の一つまたはそれを超える特徴を発現するようにin vivoで誘導することができる。それは、椎間円板に外因性幹細胞を、好ましくは、高密度で与えることを含めたいくつかの方法によって達成することができる。幹細胞は、発育を誘導するように選択された物質を伴うかまたは伴うことなく、ヒト椎間円板細胞に加えることができる。
【００４４】
ヒト椎間円板細胞に分化するように幹細胞を誘導することができるそれら因子の中には、幹細胞をin vitroで分化させるのに用いられる因子がある。例えば、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−□、アスコルビン酸−２−リン酸、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、□−グリセロリン酸、インスリン、インスリン様増殖因子、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、および当業者が知ることができるその他を、その目的に用いることができる。
【００４５】
細胞が、上に示唆された一つまたはそれを超える誘導性物質と一緒に与えられているか否かに関わらず、それら細胞を、分化するそれぞれのタイプの成熟細胞（またはそれらの前駆細胞）への暴露によって状態調節された環境中で培養することができるしまたは増殖させることができるということは理解される（例えば、筋細胞への暴露によって状態調節された培地は、筋形成分化を誘導しうるし、心臓弁細胞への暴露によって状態調節された培地は、心臓弁組織への分化を誘導しうる等）。このような処理は、細胞が高密度で与えられている場合に特に有効である。
【００４６】
本発明の他の側面において、脊椎円板を補強するための幹細胞材料の使用を容易にするには、その幹細胞材料を、生物学的に適合しうる格子材料中で提供する。典型的には、その格子は、幹細胞材料を与えたのと同じ脂肪組織からのコラーゲンの多い格子材料を含む。望ましくは、その格子は、時間経過で生物分解性であるので、それは、それが生じる幹細胞材料として体内に吸収されるであろう。その格子には、所望のように、増殖因子、サイトカインおよびモルフォゲン（例えば、レチノイン酸、アラカドン酸（aracadonic acid）等）のようなホルモン類、望まれる細胞外マトリックス分子（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン等）、または他の材料（例えば、ＤＮＡ、ウイルス、他の細胞タイプ等）も含まれうる。
【００４７】
幹細胞／コラーゲンの多い格子材料を形成するには、幹細胞を、格子中に導入して、その中の間隙腔中に透過するようにする。例えば、格子は、細胞を含有する溶液または懸濁液中に浸漬することができるし、またはそれら細胞を、格子中に注入または注射することができる。特に好ましい組成物は、コラーゲンの多い格子材料を、その中に分散した幹細胞材料と一緒に含む懸濁液の架橋によって形成されるヒドロゲルである。この形成方法は、格子のいたるところに細胞を分散させ、細胞を含む格子のなお一層の透過を容易にする。
【００４８】
組成物中への包含させるのに適した格子は、いずれかの適当なソース（例えば、マトリゲル）に由来しうるが、適当な格子についていくつかの商業ソースが存在する（例えば、適するポリグリコール酸は、Purac Biochem.およびBoehringer Ingelheimなどの源から入手することができる）。上に示すように、コラーゲンの多い格子の好ましいソース（供給源）は、幹細胞を与えた脂肪組織の無細胞部分、すなわち、実質的に細胞を欠いている脂肪組織細胞外マトリックス物質である。典型的に、このような脂肪由来格子には、プロテオグリカン、糖タンパク質、ヒアルロニン、フィブロネクチン、コラーゲン（Ｉ型、II型、III型、IV型、Ｖ型、VI型等）等のような、細胞増殖に優れた基質として役立つタンパク質が含まれる。更に、脂肪由来格子には、格子中に播種された細胞の増殖を容易にするためのホルモン類、好ましくは、サイトカインおよび増殖因子が含まれうる。
【００４９】
その脂肪由来格子は、それが無細胞画分に存在するであろうということを除いて、上に記載されたのと同様に、脂肪組織から単離することができる。例えば、脂肪組織またはその誘導体（例えば、上に論じられたような遠心分離後の細胞画分）は、音波または熱エネルギーに供して、および／または酵素的に処理して、格子材料を回収することができる。更に、望ましくは、脂肪組織の細胞画分を、例えば、リパーゼ、洗剤、プロテアーゼでそれを処理することによって、および／または機械的破壊または音波破壊によって（例えば、ホモジナイザーまたは音波処理器を用いて）破壊する。しかしながら、単離されると、その材料は、最初は粘性材料として識別されるが、引き続きそれを、所望の最終用途に依存して、所望のように処理することができる。例えば、未処理の格子材料は、望ましい格子材料を生じるように処理することができる（例えば、透析するまたはプロテアーゼまたは酸で処理する等）。したがって、格子は、水和した形で製造することができるし、またはそれを乾燥させまたは凍結乾燥させて、実質的に無水の形または粉末にすることができる。その後、その粉末は、細胞培養基質として用いるために、例えば、適する細胞培地中にそれを懸濁させることによって再水和させることができる。この点で、脂肪由来格子は、上記のような他の適する格子材料と混合することができる。
【００５０】
いくつかの態様において、幹細胞／コラーゲンの多い格子材料を、脊椎円板を補強するのに用いるための追加のコラーゲン基材料と一緒にする。その追加のコラーゲン基材料は、好ましくは、椎間円板、筋膜、靱帯、腱、無機質脱落骨基質等のような天然のコラーゲンの多い組織に由来する。その材料は、自生、同種または異種であってよいし、またはそれは、ヒトリコンビナント起原のものであってよい。代わりの態様において、コラーゲン基材料は、合成のコラーゲン基材料であってよい。好ましいコラーゲンの多い組織の例には、円板輪、大腿筋膜、足底筋膜（planar fascia）、前または後十字靱帯、膝蓋腱、膝窩腱、四頭腱、アキレス腱、皮膚および他の結合組織が含まれる。
【００５１】
幹細胞／コラーゲンの多い格子材料は、追加のコラーゲン基材料を含んでまたは含むことなく、円板腔中への導入に適当ないずれかの形で提供することができる。例えば、その材料は、固体材料、多孔性材料、織布または不織布であってよい。その材料は、粒子または小片として、または繊維材料として提供することができる。
【００５２】
いくつかの態様において、幹細胞と一緒に与えられるコラーゲン基材料は、脱水状態で与えられ、そして円板中への植込み後に「再水和」される。他の態様において、コラーゲン基材料は、「湿潤」した状態で植え込まれる。その材料が「湿潤」している場合、それは脱水されたことがないので、その方法であってよいし、またはそれを脱水して、再構成していてもよい。再構成する場合、その材料は、生理食塩水または別の水性基剤で再構成されてよいし、またはそれは、エチレングリコールまたは別のアルコールなどの非水性基剤で再構成されてよい。更に、「湿潤」状態で与えられる場合、その材料は、ゲル、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、ペースト等として与えられてよい。最も好ましい態様において、その材料は、円板中への皮下注射針による注射に適する粒状および／または繊維状材料である。
【００５３】
最も好ましい態様において、コラーゲンの多い格子材料および／または追加のコラーゲン基材料を、０．０５ｍｍ〜５ｍｍサイズの粒子として提供する。大腿筋膜または円板輪の粒子のような材料を、追加のコラーゲン基材料として用いる場合、それら粒子は、好ましくは、０．１ｍｍ〜５ｍｍのサイズである。無機質脱落骨基質のような材料を用いる場合、それら粒子は、好ましくは、０．０５ｍｍ〜３ｍｍのサイズである。小プラグの材料を用いる場合、それらプラグは、好ましくは、０．５ｍｍ〜５ｍｍのサイズである。いくつかの態様において、２０ｍｍまでのサイズの小片のような一層大きいサイズの小片を用いることができる。
【００５４】
それら材料は、二つ以上のタイプの組織を用いて処理するまたは加工することができる。例えば、幹細胞／コラーゲンの多い格子材料と、大腿筋膜および／または無機質脱落骨基質（ＤＢＭ）との混合物は、適当な場合、幹細胞／コラーゲンの多い格子材料と、ＤＢＭおよび線維輪材料との混合物の場合のように、好適でありうる。
【００５５】
架橋剤は、それらコラーゲン材料の架橋を促進するように、製剤に加えることができる。例えば、グルタルアルデヒドまたは他のタンパク質架橋剤は、製剤中に含まれてよい。それら架橋剤は、コラーゲン分子間の共有または非共有の架橋結合を促進することができる。同様に、タンパク質変性を阻害する物質も含まれてよい。請求の範囲に記載の本発明において用いるのに適当であると考えられる架橋剤は、当業者に知られており、過度の実験を伴うことなく選択することができる。
【００５６】
材料がスラリーまたはゲルとして用いられる予定の場合、スラリーまたはゲルの形成を促進する添加剤も含まれてよい。これら添加剤は、タンパク質フォールディング、水結合、タンパク質−タンパク質相互作用、および水固定を促進することができる。
【００５７】
更に、硫酸バリウムなどの放射性造影剤、またはＨＹＰＡＱＵＥ（登録商標）などの放射性造影染料は、注射された材料の移動および／または場所を追跡する場合に外科医を助けるように含まれてよい。椎間板造影に用いるのに適当な放射性造影材料は、当業者に知られており、本発明において用いるのに、過度の実験を伴うことなく選択することができる。
【００５８】
最後に、注射された幹細胞／コラーゲン基材料に利点を与える他の添加剤も含まれてよい。このような添加剤には、その手順によって引き起こされる痛みを減少させるための麻酔薬、および細菌感染の可能性を最小限にするための抗生物質が含まれる。
【００５９】
プロテオグリカンおよび／または他の多糖類も、核を水和状態で保持するように水を引きつけるおよび／または結合するために含まれてよい。同様に、円板の治癒、修復、再生および／または回復を促進するための、および／または適正な円板機能を容易にするための増殖因子および／または他の細胞（例えば、椎間円板細胞、幹細胞等）も含まれてよい。請求の範囲に記載の本発明において用いるのに適当な添加剤は、当業者に知られており、過度の実験を伴うことなく選択することができる。
【００６０】
幹細胞／コラーゲン材料は、いろいろな形（例えば、固体、多孔性、織布、不織布、粒状物、ゲル、溶液、懸濁液、ペースト等）に処理した後、円板腔に加えることができるということは理解されるはずである。一つの好ましい態様において、その材料は、円板腔中への注射前に脱水されるが、その場合、それは、円板腔から体液を吸収することによって再水和する。他の態様において、コラーゲン材料は、ゲル、スラリー、または植込み前の他の水和した製剤として与えられる。
【００６１】
幹細胞材料／コラーゲン基材料は、円板腔に「外科的に加え」られる。すなわち、その材料は、身体の自然の成長または再生過程によって「加え」られることとは区別されるように、医療従事者の介入によって加えられる。その外科的手順には、好ましくは、皮下注射針による注射が含まれるが、円板中にコラーゲン基材料を導入する他の外科的方法を用いることができる。例えば、材料は、円板中に、拡張した輪状開口部を介する押出、カテーテルを介する注入、外傷または外科的切開によって生じる開口部を介する挿入、または円板腔中への材料の侵襲性または最小限に侵襲性の他の沈着手段によって導入することができる。
【００６２】
本発明の材料および方法の利点に関して、椎間円板の補強は、その円板の自然の状態および／または性能を回復するまたは改善することができる。更に、補強は、脱水した円板の漸進的変性を遅らせるまたは逆行させることができる。
【００６３】
ここで、上に記載された方法を用いた具体的な実施例に言及する。それら実施例は、好ましい態様を一層完全に記載するために与えられており、それによって本発明の範囲を制限するものではないことを理解すべきである。
【実施例】
【００６４】
実施例１
幹細胞材料の体細胞組織からの取得
脂肪吸引による未処理吸引物は、選択的な外科手術を受けた患者から入手することができる。脂肪吸引法の前に、その患者にエピネフリンを与えて、吸引物の血液混入を最小限にすることができる。次に、吸引物を濾過して、会合した脂肪組織片を、会合した液状廃棄物から分離する。単離された組織を、中性リン酸緩衝化生理食塩水で十分にすすぎ洗浄した後、０．０７５％ｗ／ｖコラゲナーゼで、３７℃において断続的に撹拌しながら約２０分間、酵素的に解離させる。
【００６５】
消化後、コラゲナーゼを中和し、そしてスラリーを約２６０ｇで約１０分間遠心分離する。これは、多層の上澄みおよび細胞ペレットを生じる。次に、その上澄みを取り出し、更なる使用のために保持することができる。ペレットを、赤血球溶解性溶液中に再懸濁させ、そして約２５℃で撹拌することなく約１０分間インキュベートする。インキュベーション後、培地を中和し、そして細胞を再度、約２５０ｇで約１０分間遠心分離する。
【００６６】
２回目の遠心分離後、ペレット中の細胞を懸濁させ、そしてトリパンブルー（tryan blue）排除による生存能力および細胞数について評価する。次に、細胞を、約１０％ウシ胎児血清を補足した培地中において、１ｘ１０６個／１００ｍｍ皿でプレーティングし且つ３７℃、５％ＣＯ２で増殖させる。それら細胞の大部分は、目に見える脂質小滴を含有しない付着性の小さい単核線維芽細胞様細胞である。それら細胞の大部分が、オイルレッド０およびフォンコッサで陰性染色であった。
【００６７】
細胞は、テロメラーゼの発現について（商業的に入手可能なＴＲＡＰ検定キットを用いて）、正の対照として検定に含まれるＨｅＬａ細胞およびＮＨ−１２細胞と一緒に評価することができる。負の対照としてのテロメラーゼ活性を、ヒト包皮線維芽細胞および加熱されたＮＨ−１２細胞抽出物で検定する。テロメラーゼ活性は、１２．５％ポリアクリルアミドセルを用いて分割されたテロメア産物のホスホイメージングによって測定する。テロメラーゼ活性を示すものであり且つ幹細胞の存在と一致するテロメトリックラダー（telometric ladders）は、脂肪組織由来の細胞および正の対照において認められたが、負の対照では認められなかった。これら結果は、それら幹細胞を、脂肪組織からこの技法を用いて単離することができるということを確認する。
【００６８】
実施例２
体細胞の多分化能性幹細胞へのin vitro分化
成人角化細胞を、Clonetics（San Diego, CA）より（form）入手し、そして"Keratinocyte System Instructions" BioWhittaker Catalogue番号ＡＡ−１０００の取扱説明書にしたがって、Keratinocyte Growth Media中において５〜１０％ＣＯ２、３７℃で増殖させる。それら成体角化細胞が、約４０〜８０％密集した時点で、その培養物に、１０〜２５□Ｍ  ５−アザ−２’−デオキシシチジン（Sigma, St Louis, MO）を加える。５−アザ−２’−デオキシシチジンと一緒に４日間インキュベーション後、１００〜２５０ｎｇ／ｍｌのトリコスタチン（Sigma, St Louis, MO）を、培養物に加える。その培養物を、更に１日間インキュベートし、テロメラーゼ活性について試料採取する。
【００６９】
１０〜２５□Ｍ  ５−アザ−２’−デオキシシチジンに５日間および１００〜２５０ｎｇ／ｍｌのトリコスタチンに１日間暴露された角化細胞、およびこれら物質に暴露されなかった細胞を、テロメラーゼの発現について（商業的に入手可能なＴＲＡＰ検定キットを用いて）検定する。これら細胞を、正の対照（ＨｅＬａ細胞およびＮＨ−１２細胞）および負の対照（ヒト包皮線維芽細胞および加熱されたＮＨ−１２細胞抽出物）と一緒に検定する。テロメラーゼ活性は、１２．５％ポリアクリルアミドセル上で分割されたテロメア産物のホスホイメージングによって測定する。テロメラーゼ活性を示し、幹細胞の存在と一致するテロメトリックラダーは、１０〜２５□Ｍ  ５−アザ−２’−デオキシシチジンに５日間および１００〜２５０ｎｇ／ｍｌのトリコスタチンに１日間暴露された角化細胞と、正の対照において認められる。これら結果は、１０〜２５□Ｍ  ５−アザ−２’−デオキシシチジンに５日間および１００〜２５０ｎｇ／ｍｌのトリコスタチンに１日間暴露された角化細胞が、幹細胞様表現型と一致する増加したテロメラーゼ活性を有したことを確認する。
【００７０】
実施例３
幹細胞のin vitro増殖
幹細胞を、１０％ウシ胎児血清を補足されたＤＭＥＭから構成される細胞培地中において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。これら条件下において、細胞は、分化することなく、それらの発育表現型を失うことなく、少なくとも５回継代することができる。
【００７１】
実施例４
多分化能性幹細胞の特定の細胞タイプへの分化
高密度の幹細胞（約７ｘ１０６個細胞／ｍｌ）を、１％ＦＢＳを補足されたＤＭＥＮ、６．２５□Ｍインスリン、６．２５□ｇ／ｍｌのトランスフェリン（transferring）、および１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子□１（ＴＧＦ−□−１）、および５０ｎＭアスコルビン酸２−リン酸１％ＡＢＡＭから構成される培地中で数週間培養する。
【００７２】
数週間後、その組織培養物およびパラフィン切片の組織分析を、Ｈ＆Ｅ、アルシアンブルー（alcain blue）、トルイジンブルー（toludene blue）および Goldner's トリクローム染色で、２日目、７日目および１４日目に行う。試料は、更に、コンドロチン（chondrotin）−４−硫酸およびケラチン硫酸およびII型コラーゲンに対して上昇した抗体への結合について調べる。組織培養物の試料を染色して、組織培養物中に存在するマトリックスの量である定性的推定値を得る。軟骨形成性培地に暴露されていない対照幹細胞は、軟骨形成性細胞への分化の証拠を示さない。軟骨形成性培地に暴露された幹細胞は、軟骨形成性培地への暴露後４８時間程度の初期に、軟骨膜細胞の明確な境界を有する軟骨球状小結節を形成する軟骨形成性細胞への分化の証拠を示す。
【００７３】
実施例５
幹細胞／コラーゲンの多い格子材料の円板腔中への注射
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。その幹細胞／コラーゲン組成物を、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。幹細胞／コラーゲン組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００７４】
実施例６
幹細胞／コラーゲンの多い格子材料の円板腔中への注射
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。次に、組織処理中の分離後に、そのコラーゲンおよび幹細胞を一緒にする。幹細胞／コラーゲン組成物は、更に、生理食塩水またはいずれか他の適当な基剤中に懸濁させることができる。その懸濁液を、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、皮下注射針を用いて注射する。その懸濁液は、注射後、円板腔内に入っている。その後、基剤は円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの補強および回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００７５】
実施例７
幹細胞／コラーゲンの多い格子材料の円板腔中への注射
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。幹細胞をin vitroで増加させた後、コラーゲンと一緒にする。幹細胞／コラーゲン組成物は、更に、生理食塩水またはいずれか他の適当な基剤中に懸濁させることができる。その懸濁液は、注射後、円板腔内に入っている。その後、基剤は円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの補強および回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００７６】
実施例８
放射性造影染料の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。Ｘ線撮影用造影染料を、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。幹細胞／コラーゲン／染料組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、Ｘ線撮影用造影染料を含めた過剰の体液が、円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００７７】
実施例９
鎮痛薬の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。リドカインなどの鎮痛薬を、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。幹細胞／コラーゲン／鎮痛薬組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００７８】
実施例１０
増殖因子の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。一つまたはそれを超える増殖因子を、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。好ましい増殖因子には、円板の治癒および／または再生を促進する表現型への幹細胞の分化を誘導することができるものが含まれる。増殖因子の例には、トランスフォーミング増殖因子β、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子等が含まれる。幹細胞／コラーゲン／増殖因子組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００７９】
実施例１１
追加のコラーゲン基材料の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。一つまたはそれを超えるタイプのコラーゲンを、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。好ましいコラーゲンには、椎間円板、筋膜、靱帯、腱、無機質脱落骨基質等のような、コラーゲンの多い組織または結合組織に由来するものが含まれる。幹細胞／コラーゲン組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞−コラーゲン格子を後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００８０】
実施例１２
多糖類の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。一つまたはそれを超えるタイプの多糖を、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。好ましい多糖類には、ヒアルロン酸、キトサン、キチン、セルロース、寒天等のような、動物または植物に由来するものが含まれる。幹細胞／コラーゲン／多糖組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞／コラーゲン／多糖マトリックスを後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００８１】
実施例１３
追加の生体材料の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。一つまたはそれを超える生体材料を、幹細胞／コラーゲン／組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。好ましい生体材料には、アルブミン、フィブリン、絹、エラスチン、ケラチン、およびポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール等のような他の合成親水性ポリマーまたはヒドロゲルが含まれる。幹細胞／コラーゲン／生体材料組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞／コラーゲン／生体材料マトリックスを後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００８２】
実施例１４
多数の追加の成分の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。Ｘ線撮影用造影染料、鎮痛薬、増殖因子、増量剤および生理食塩水を、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。増量剤は、上述の一つまたはそれを超えるコラーゲン、多糖類または生体材料でありうる。最終組成物は、注射後、円板腔内に入っている。その後、Ｘ線撮影用造影染料および生理食塩水を含めた過剰の体液が、円板腔から拡散し、最終マトリックスを後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００８３】
実施例１５
架橋剤の添加
十分な脂肪組織を、脂肪吸引法によって患者から取り出す。その組織は、脂肪細胞および赤血球を実質的に含まない幹細胞およびコラーゲンの多い格子を、その組織の残余から分離することができるような方法で処理する。グルタルアルデヒドのようなコラーゲン用の架橋剤を、幹細胞／コラーゲン組成物に加えた後、それを、核円板腔中に無傷の輪を介して直接的に、小径皮下注射針を用いて注射する。コラーゲンは、注射後、円板腔中で架橋する。その後、過剰の体液が円板腔から拡散し、幹細胞／架橋したコラーゲンマトリックスを後に残す。１回の注射が望ましいが、しかしながら、適当なレベルの物理的補強および生物学的回復を達成するには、追加の注射が必要なことがありうる。
【００８４】
本発明を、図面および前述の説明で詳細に示し且つ記載してきたが、そのことは、特性を例示するものであって、制限するものではないと解釈されるべきであり、好ましい態様のみが示され且つ記載されたということ、および本発明の精神の範囲内に入る変更および修正は全て、保護されることが望ましいということは理解される。本発明の材料および方法の追加の例は、本明細書中にそのまま記載されているものとされる出願人の同時係属米国特許出願第１０／２４５，９５５号に開示されている。
【国際調査報告】
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