(57)【要約】本発明は、生体細胞、特に胚盤胞由来幹細胞（ＢＳ細胞）のガラス化方法の改良に関する。本方法は解凍された後でも生存維持可能であるように細胞に対して非常に低刺激性である。本方法は、ｉ）細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し、ｉｉ）任意的に第１溶液の細胞を培養し、ｉｉｉ）工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し、ｉｖ）任意的に第２溶液の細胞を培養し、ｖ）工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた細胞を、少なくとも２０μｌの容量を収容可能な大きさの一つ以上の閉塞ストローに移し、ｖｉ）一つ以上の閉塞ストローをシールし、さらにｖｉｉ）一つ以上の閉塞ストローをガラス化する工程から構成される。本発明の非常に重要な特徴として、閉塞ストローを使用することと、大容量で効率的にガラス化及び続いて解凍が可能なことである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し、
ｉｉ）任意的に第１溶液の細胞を培養し、
ｉｉｉ）工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し、
ｉｖ）任意的に第２溶液の細胞を培養し、
ｖ）工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた細胞を、少なくとも２０μｌの容量を収容可能な大きさの一つ以上の閉塞ストローに移し、
ｖｉ）一つ以上の閉塞ストローをシールし、さらに
ｖｉｉ）一つ以上の閉塞ストローをガラス化する工程から構成されることを特徴とする細胞のガラス化法。
【請求項２】
閉塞ストローは約２０μｌ〜約２５０μｌの容量を収容可能な大きさであり、例えば、約２０μｌ〜約２２５μｌ、約２５μｌ〜約２００μｌ、約２５μｌ〜約１７５μｌ、約２５μｌ〜約１５０μｌ、約３０μｌ〜約１２５μｌ、約３０μｌ〜約１００μｌ、約３５μｌ〜約７５μｌ、約４０μｌ〜約５０μｌの容量であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞はＢＳ細胞あるいはＢＳ細胞系であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞はｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞系であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第１及び第２溶液の内の少なくとも一つは一つ以上の抗凍結剤からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、プロパンジオール、及びまたはそれらの混合物からなるグループから選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
第１及び第２溶液は同一あるいは異なる一つ以上の抗凍結剤を含有することを特徴とする請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
第１及び第２溶液中の一つ以上の抗凍結剤の濃度は同一または異なることを特徴とする請求項５乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
第２溶液の抗凍結剤の全濃度（％ｖ/ｖ、％ｗ/ｗ、あるいはＭで計測される）は第１溶液の抗凍結剤の全濃度よりも高いことを特徴とする請求項５乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
抗凍結剤はトレハロースであることを特徴とする請求項５乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
トレハロースの濃度は約０．０２Ｍ〜約１Ｍであり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
抗凍結剤はスクロースであることを特徴とする請求項５乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
スクロースの濃度は約０．０２Ｍ〜約１Ｍであり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍであることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
第１及び第２溶液の少なくとも一つは粘度調整剤からなることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
粘度調整剤はフィコール、パーコール、ヒアルロン酸、アルブミン、ポリビニルピロリドン、アルギニン酸、ゼラチンおよびグリセロールからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
粘度調整剤はフィコールであることを特徴とする請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
フィコールの濃度は、最大で約１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば最大で１００ｍｇ／ｍｌ、最大で５０ｍｇ／ｍｌ、最大で２５ｍｇ／ｍｌ、最大で１５ｍｇ／ｍｌ、あるいは最大で１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
第１及び第２溶液は同一か異なる少なくとも一つ以上の粘度調整剤を含むことを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第１及び第２溶液における一つ以上の粘度調整剤の濃度は同一か異なることを特徴とする請求項１４乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
第１及び第２溶液の少なくとも一つは水溶液であることを特徴とする請求項１乃至１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
工程ｉｉ）が含まれることを特徴とする請求項１乃至２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
培養は約３７℃で一定期間の５秒間から約２０分間、例えば約１０秒〜約１５分間、約１５秒〜約１０分間、約２０秒〜約７．５分間、約３０秒〜約５分間、約４０秒〜約４分間、約５０秒〜約３分間、約３０秒〜約２分間、約４５秒〜約１．５分間あるいは約１分間で実施されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
工程ｉｖ）が含まれることを特徴とする請求項１乃至２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
培養は約３７℃で一定期間の５秒間から約１０分間、例えば、約１０秒〜約７．５分間、約１０秒〜約５分間、約１５秒〜約４分間、約１５秒〜約３分間、約１５秒〜約２分間、約２０秒〜約１分間、約５秒〜約１分間、約５秒〜約３０秒間あるいは約１０秒〜約３０秒間で実施されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
培養は約３７℃で約３０秒間あるいはそれ未満で実施されることを特徴とする請求項２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
約５０％あるいはそれ以上、例えば約５５％あるいはそれ以上、約６０％あるいはそれ以上、約６５％あるいはそれ以上、約７０％あるいはそれ以上、約７５％あるいはそれ以上、約８０％あるいはそれ以上、約８５％あるいはそれ以上、約９０％あるいはそれ以上、あるいは約９５％あるいはそれ以上の細胞が失透後に生存可能であり適切な培地で培養されることを特徴とする請求項１乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法によりガラス化が施された細胞。
【請求項２８】
更に、
ｖｉｉｉ）一つ以上のガラス化された閉塞ストローを室温から約４０℃までの温度を有する環境に、閉塞ストローの内容物が解凍されるまでの一定期間おかれ、
ｉｘ）一つ以上の閉塞ストローを開口し、
ｘ）一つ以上の開口された閉塞ストローに含有される細胞を第３溶液（溶液Ｃ）を使用する洗浄処理を行い、
ｘｉ）任意的に、工程ｘ）から得られた洗浄された細胞を第４溶液（溶液Ｄ）に移し、更に
ｘｉｉ）任意的に、第４溶液中で細胞を培養し、
ｘｉｉｉ）任意的に、工程ｘｉｉ）の細胞を第４溶液中から移し更に支持細胞上に細胞を播種し、更に
ｘｉｖ）任意的に、更に細胞を培養する
ことから構成される方法により失透化される請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
工程ｘｉ），ｘｉｉｉ）及びｘｉｖ）が含まれることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
更に、工程ｘｉｉ）が含まれることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
第３及び／または第４溶液（関連する場合）は一つ以上の抗凍結剤を含有することを特徴とする請求項２８乃至３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、プロパンジオール、及びまたはそれらの混合物からなるグループから選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、またはそれらの混合物であることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
抗凍結剤の濃度は約０．０２Ｍ〜約１Ｍの範囲内であり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
第３溶液中の抗凍結剤の濃度は関連する場合第４溶液中の抗凍結剤の濃度より高いことを特徴とする請求項２８乃至３４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体細胞、特に胚盤胞由来幹細胞（ＢＳ細胞）のガラス化方法の改良に関する。本方法は非常に低刺激性であり解凍された後でも細胞は生存維持可能である。
【０００２】
発明の背景
幹細胞はそれ自体が再生し、且つ特殊化あるいは分化細胞を発生させる特異な能力を備える細胞型である。心臓細胞あるいは皮膚細胞のような、体の細胞のほとんどは特定の機能を実施するようになっているが、幹細胞は特殊化した細胞型に進化させる信号を受信するまで機能しない。幹細胞が特異な点はその増殖能であり、その能力と併せて特殊化される。長年、研究者達は幹細胞を利用して損傷したあるいは病変した細胞あるいは組織を代替する方法を発見することに注目してきた。これまでのところ、ほとんどの研究は２つの型の幹細胞、胚性幹細胞及び体細胞性幹細胞に注目してきた。胚性幹細胞は着床前受精卵母細胞、すなわち胚盤胞由来であり、一方体細胞性幹細胞は成体、例えば骨髄、表皮及び腸内に存在する。ヨーロッパ及び他国における多くの法律に関して、受精卵母細胞は子宮内に着床前、すなわち受精後１０〜１４日では胎児として認めていないため、本発明においては、胚盤胞由来幹細胞あるいはｈＢＳ細胞として記載する。多分化能試験は胚性由来あるいは胚盤胞由来幹細胞は生殖細胞を含む、生体の全ての細胞を発生させることができるのに対して、体細胞性幹細胞は衰えつつある細胞型におけるより限定された能力を備える。
【０００３】
１９９８年において、例えば米国特許第５８４３７８０号明細書及び米国特許第６２００８０６号明細書に参照されるように、研究者達は初めてヒト受精卵母細胞由来の胚性幹細胞を分離し、それらを培養液中で成長させることを可能にした。
【０００４】
幹細胞技術における研究の増加及び発展により細胞及び細胞系の適切な保存方法が利用できることが必要となる。細胞はガラス化あるいは凍結保存される。従来手法を利用した低温保存は細胞外氷形成により破壊的影響を有するため、複雑且つ敏感な生物材料に適用することは非常に困難である。ガラス化方法により、細胞を含有する試料は非常に低い温度まで急速に冷却され、次に水分量が結晶化されないガラス様状態を形成する。すなわち、ガラス化は氷結晶の形成されない状態で液状媒体を急速に冷却することである。非晶質ガラスは急速に冷却しながら液体窒素中に直接細胞含有ストローを供給することにより形成される。このガラスは液体の正規分布を維持する一方で過冷却形状のままである。このガラスは氷結晶を有しておらず、更に細胞は細胞破壊を受けておらず、これは氷結晶の形成と関連する。従って、ガラス化は氷核形成及び成長を未然に防ぐ非晶質ガラス状態における固化として定義される。
【０００５】
ヒト胚性幹細胞の低温保存は研究され、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ他は開口引出型ストローガラス化方法を利用したこれらの細胞の低温保存法について記載した（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００１，１６，２１８７−２１９４）。この方法の欠点はストローの開口端部を液体窒素に接触させるため、ガラス化される生物材料の汚染の原因となり得ることである。その上、引出されるストローの大きさに基づき、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ他による方法でガラス化される容量はおよそ１μｌであった。
【０００６】
窒素と直接接触することを防ぐガラス化方法はＬｏｐｅｚ−Ｂｅｊａｒ他によるウサギ胚（Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００２，５８：１５４１−５２）及びＣｈｅｎ他によるマウス卵母細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００１，１６（１１）：２３５０−５６）に関して記載されている。これらの方法は公知の開口引出型ストローと同じ方法で引出す閉塞ストローを利用しているためＲｅｕｂｉｎｏｆｆ他により使用されたストローと同じ大きさを有する。従って、これら両方法において約１〜２μｌの容量が各ストローでガラス化される。
【０００７】
低速度凍結及び急速解凍方法は細胞系の低温保存用に使用されてきた。これらの方法は例えばマウスの胚性幹細胞の低温保存への使用に適切であるが、未分化ヒト胚幹細胞の生存率は非常に乏しく、更に細胞のほとんどが分化するか死ぬ。通常は、このような低速度凍結方法でガラス化される細胞の容量が多いほど低い再生率となる（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ他）。
【０００８】
こうして、できるだけ操作性が良く且つできるだけ少ない工程で実施される一方、同時に処理中に細胞に対する不要な汚染の危険性を防ぐあるいは少なくとも減少させる効果的なガラス化方法を研究することが必要である。特に、ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞系のような、より多量な容量の細胞あるいは細胞系の効果的なガラス化方法を研究する必要性がある。
【０００９】
発明の説明
上述のように、効率的な低温保存方法は胚盤胞由来幹細胞系の進歩した広範囲な利用において必要とされ、これによりヒト胚盤胞幹細胞銀行が確立される。効率的な冷凍及び解凍技術は細胞及び細胞系の保存を効率的にする。いくつかの目的で各ストローにおいて大容量がガラス化されることが望ましい。このことは多量な細胞が所定の手順（あるいは応用）に必要とされる場合、あるいは細胞がガラス化されている状態で郵便にて発送される場合に当てはまる。
【００１０】
本発明は細胞のガラス化法に関し、
ｉ）細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し、
ｉｉ）任意的に第１溶液の細胞を培養し、
ｉｉｉ）前記工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し、
ｉｖ）任意的に第２溶液の細胞を培養し、
ｖ）前記工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた細胞を、少なくとも２０μｌの容量が含有可能な大きさを備える、一つ以上の閉塞ストローに移し、
ｖｉ）一つ以上の閉塞ストローをシールし、さらに
ｖｉｉ）一つ以上の閉塞ストローをガラス化する工程から構成される。
【００１１】
上述の方法の非常に重要な特徴として、各ストローでガラス化できる容量が非常に多いことである。本発明は閉塞ストロー中で細胞をガラス化させる方法に関し、このストローの大きさは約２０μｌ〜約２５０μｌの容量が可能であり、例えば、約２０μｌ〜約２２５μｌ、約２５μｌ〜約２００μｌ、約２５μｌ〜約１７５μｌ、約２５μｌ〜約１５０μｌ、約３０μｌ〜約１２５μｌ、約３０μｌ〜約１００μｌ、約３５μｌ〜約７５μｌ、約４０μｌ〜約５０μｌが含有可能である。本発明の実施例で使用されるストローはおよそ長さ１３ｃｍ、直径およそ２ｍｍ、及び非常に薄いプラスチック壁の厚みおよそ０．１ｍｍである（閉塞ストロー、フレンチミニ−ストロー、２５０μｌ、Ｌ’Ａｉｇｌｅ，ＩＭＶ  ＺＡ４７５°，１３３ｍｍ，Ｓｖｅｎｓｋ  Ｍｊｏｅｌｋ）。しかしながら、ストローの直径と厚みがここで使用されるストローについて同じであるものを使用し、ストローの長さがより長いストローを使用することにより、液体窒素を有する容器の大きさが窒素で覆われるストローの長さ全体を被覆可能である場合に限りよりたくさんの量が十分にガラス化できると予想される。
【００１２】
上述の方法における別の非常に重要な工程としていわゆる閉塞ストローを使用することである。本発明の文脈では「閉塞ストロー」なる用語は、充填位置に開口端部を有し生物材料（例えば細胞あるいは細胞系）を例えば適当な培地にて充填可能である一方、この端部は充填後周囲から細胞に対する不要な汚染を避けるために且つ細胞から周囲に対する不要な汚染の危険性を避けるために充填後直ぐにしっかりと閉じられるようなストローを意味する。ストローの両端部における密閉シールは試料及び環境の両方を汚染から防ぐために重要である。適切な装置としてはＣｒｙｏ  Ｂｉｏ  ＳｙｓｔｅｍによるＣＢＳ  ＳＹＭＳと呼ばれるマニュアルシーリングユニットがある。
【００１３】
ストローは片方の側面は開口し、もう一方の側面はストッパーを備えることが重要である。このストッパーは液体でストロー内を満たすために、空気をシリンジで吸い上げることができるが、液体と直接接触するとすぐに重合し、この端部において毛細管をシールすることができる。この端部をシールする別の適切な方法も利用可能である。もう一方の端部は次にシーリング（溶着、接着など）を使用して閉じられる。重要なことはストローの内容物が迅速に冷却可能であるように壁面が薄く、且つ小さい直径を有することである。ストローの長さはそこまで重要ではないが、実用的な理由から、液体窒素タンク中の標準的なホルダーに密着できるような標準的な長さを備えることが望ましい。ストローはプラスチック製であるがガラスを含有する適切な材料（より破壊されやすくなるが）で製造可能である。重要なことはその材料が安全であり且ついかなる物質も吸収あるいは放出することがなく、すなわち通気性がなく、無毒であり、生体適合性があることである。
【００１４】
本願において、「低温保存」なる用語は極端に低温度で生物材料を保存することを意味する。
【００１５】
本発明の文脈で使用される「直接接触」あるいは「直接暴露」なる用語は生物材料あるいは培地の表面、材料が存在する溶液あるいは材料が凍結材料と接触することが可能である場合に、例えば凍結材料に生物材料が「直接接触」あるいは「直接暴露」することを意味する。
【００１６】
本発明の文脈で使用される「凍結材料」は生物材料のガラス化を生じさせる材料を意味する。試料が直接的に接触しないため、理論上十分に冷却されたいずれの凍結媒体も使用可能である。適切な材料として、液体窒素、液体プロパン、液体ヘリウム、エタン等の液体ガスが含まれるが、これに限定はされない。
【００１７】
ここで使用される「生存可能」は生物材料が一定期間正常に生存、発達、及び増殖可能であることを意味する。
【００１８】
本発明に関し、少なくとも２０μｌ容量の生物材料（例えば、ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞系）は閉塞ストロー内に設置される。閉塞ストローは次に凍結材料（適切には液体窒素）に暴露される。凍結材料に暴露された上で、細胞はガラス化され、次に一定期間保存され更に後日解凍される。解凍された生物材料は生存したままである。上述から明らかなように、細胞と凍結材料は直接接触あるいは直接暴露されない。従って、細胞の(外界からの)汚染と同様に細胞による環境の汚染の危険性は避けられる。
【００１９】
本発明の生物材料は生細胞あるいは生細胞系、特にＢＳ細胞、ＢＳ細胞系、ＢＳ細胞由来細胞である。この細胞は成長のいずれかの段階にある。好適には細胞はヒトに限らず、猿のような非ヒト霊長類、ラット、マウス、及びハムスターのような実験動物、豚、羊、牛、山羊、及び馬のような農業用家畜を含む哺乳類性からなる動物性由来である。本発明の特に興味深い実施態様として、細胞がヒトＢＳ細胞を含むヒト幹細胞であることである。
【００２０】
本発明の方法に使用される適切な細胞として、ＢＳ細胞あるいはＢＳ細胞系、特にｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞系である。この細胞あるいは細胞系はここに記載される手順を利用して得られる。
【００２１】
ガラス化溶液（第１溶液、第２溶液）のうちの少なくとも一つは１つ以上の抗凍結剤、あるいは抗凍結剤混合物を含有する。無毒性抗凍結剤は当然好適である。抗凍結剤は非凍結水中に残存する別の溶質のモル比率が減少することによる目減りを最小限にする。それらは氷結晶の形成を阻害し、更にこうして水の凝固点を押し下げる。これらは結合水と結合する水素によるタンパク質変性を防ぐことも可能である。細胞が冷却されると、溶媒水は細胞外氷に変質し、非透過性電解質あるいは非電解質の細胞外濃度が増加することにより細胞に損傷を与える。抗凍結剤で処理すると、細胞はかなり低い温度に達するまで未処理細胞の塩濃度に達しない。化学反応はかなり低い温度で非常にゆっくりと進み、結果的に細胞の損傷は最小限となる。通常、異なる型の間には差異があるため抗凍結剤を組合わせて使用する方がよい。この抗凍結剤は浸透活性剤としても機能する。適切な抗凍結剤はエチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、プロパンジオール、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトースを含む糖類、及びメチルペンタンジオールからなるグループから選択される。第１及び第２溶液中に含有されるそれぞれの剤の濃度は通常５〜５０％ｖ/ｖの範囲であり、例えば、約５％〜約４０％ｖ/ｖ、約５％〜約２５％ｖ/ｖ（第１溶液）、および約５％〜約３０％ｖ/ｖ（第２溶液）の範囲である。通常第２溶液の抗凍結剤の全濃度（すなわちｖ/ｖ、ｗ/ｖ、あるいはＭとして換算される）は第１溶液のものよりも高い。この第１、第２溶液は同じあるいは異なる一つ以上の抗凍結剤を含有する。第１及び第２溶液中の一つ以上の抗凍結剤の濃度は同じかあるいは異なり、更に通常第２溶液中の抗凍結剤の全体濃度は第１溶液のものよりも高い。
【００２２】
本発明の特別な実施態様において、抗凍結剤はトレハロースである。第１及び／または第２溶液に含有されるトレハロースの濃度は通常約０．０２Ｍ〜約１Ｍの範囲内であり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍの範囲内である。通常、スクロースは同様な使用量で使用される。トレハロースは唯一の天然二糖類であり、たくさんの植物及び動物に存在する。トレハロースは重要なエネルギー源であり、凍結期間中生物の安定化の主な要因となっている。トレハロースは膜の相転移温度を抑制することが可能なため乾燥時さえ液晶状態に維持することができる。何れの理論と組合わせなくてもこのことは再水和間膜の漏出を防ぎこれにより細胞の生存を維持することが推定される。タンパク質に関して、トレハロースは細胞が水和状態の際、タンパク表面から水を排除することによりタンパク質変性を阻害する。
【００２３】
本発明の別の実施態様において、抗凍結剤はスクロースである。第１及び／または第２溶液に含有するスクロース濃度は通常約０．０２Ｍ〜約１Ｍの範囲内であり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍの範囲内である。
【００２４】
本発明のさらに別の実施態様において、第１及び第２溶液のうちの少なくとも一つは抗凍結剤である。
【００２５】
第１及び第２溶液の内の少なくとも一つは粘度調整剤を含む。本発明に使用される適切な粘度調整剤はフィコール、パーコール、ヒアルロン酸、アルブミン、ポリビニルピロリドン、アルギニン酸、ゼラチンおよびグリセロールからなるグループから選択される。第１及び第２溶液は同一かあるいは異なる一つ以上の粘度調整剤を含む。第１及び第２溶液中の一つ以上の粘度調整剤の濃度は同一か異なっている。
【００２６】
本発明の特定の実施態様において、粘度調整剤はフィコールである。第１及び／または第２溶液に含まれるフィコール濃度は最大でおおよそ１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば最大でおおよそ１００ｍｇ／ｍｌ、最大でおおよそ５０ｍｇ／ｍｌ、最大でおおよそ２５ｍｇ／ｍｌ、最大でおおよそ１５ｍｇ／ｍｌ、あるいは最大でおおよそ１０ｍｇ／ｍｌである。
【００２７】
本発明のある実施態様において、第１及び第２溶液の少なくとも一つは水溶液である。
【００２８】
本発明の特定の実施態様において、上述の方法の工程ｉｉ）が含まれる。
【００２９】
この工程を備える利点は溶液との平衡を促進し、抗凍結剤が十分に浸透することを確実にするが、ＤＭＳＯが存在する場合には細胞はいくらか毒性のＤＭＳＯに対して余り長く暴露しないようにするために、可能なタイムスパンは１０秒〜２０分である。
【００３０】
培養は通常約３７℃で一定期間の５秒間から約２０分間、例えば約１０秒〜約１５分間、約１５秒〜約１０分間、約２０秒〜約７．５分間、約３０秒〜約５分間、約４０秒〜約４分間、約５０秒〜約３分間、約３０秒〜約２分間、約４５秒〜約１．５分間あるいは１分間で実施される。
【００３１】
更なる実施態様において、工程ｉｖ）もまた含み、更に培養は通常約３７℃で一定期間の５秒間から約１０分間、例えば、約１０秒〜約７．５分間、約１０秒〜約５分間、約１５秒〜約４分間、約１５秒〜約３分間、約１５秒〜約２分間、約２０秒〜約１分間、約５秒〜約１分間、約５秒〜約３０秒間あるいは約１０秒〜約３０秒間で実施される。
【００３２】
特定の実施態様において、工程ｉｖ）が含まれ、更に培養は３７℃で約３０秒間かそれ未満で実施される。
【００３３】
ガラス化方法は細胞に対して非常に効果的であり低刺激性である。通常約５０％あるいはそれ以上、例えば約５５％あるいはそれ以上、約６０％あるいはそれ以上、約６５％あるいはそれ以上、約７０％あるいはそれ以上、約７５％あるいはそれ以上、約８０％あるいはそれ以上、約８５％あるいはそれ以上、約９０％あるいはそれ以上、あるいは約９５％あるいはそれ以上の細胞が失透した後にも生存可能であり適切な培地で培養される。適切な失透方法を以下に示す。
【００３４】
他の側面において、本発明は、本発明に関する方法によりガラス化が施された、細胞にも関連する。
【００３５】
更なる実施態様あるいは本発明の別の側面において、本発明は失透方法に関連する。
【００３６】
失透方法は、
ｖｉｉｉ）一つ以上のガラス化された閉塞ストローを室温から約４０℃までの温度を有する環境に、閉塞ストローの内容物が解凍されるまでの一定期間おかれ、
ｉｘ）一つ以上の閉塞ストローを開口し、
ｘ）一つ以上の開口された閉塞ストローに含有される細胞を第３溶液（溶液Ｃ）を使用する洗浄処理を行い、
ｘｉ）任意的に、工程ｘ）から得られた洗浄された細胞を第４溶液（溶液Ｄ）に移し、更に
ｘｉｉ）任意的に、第４溶液中で細胞を培養し、
ｘｉｉｉ）任意的に、工程ｘｉｉ）由来細胞を第４溶液から移し且つ支持細胞上にそれら細胞を播種し、更に
ｘｉｖ）任意的に、更に細胞を培養することから構成される。
【００３７】
工程ｘ）以降に得られた細胞は要求されるいかなる目的においても利用可能であり、任意的な工程は細胞を更に、例えば生存能力を研究するために適用される。
【００３８】
工程ｖｉｉｉ）は細胞の解凍に関する。ここでの重要な点は、ストローの内容物を単に解凍し且つストローの外観検査の間にこれを実施すべきであり、従ってタイミングは余り重要ではない。温度は４０℃より高くするべきではなく、室温から４０℃の間に設定可能である。それより高い温度にすると細胞の解凍時、解凍後水槽からゆっくり取出される場合でも熱衝撃を引き起こす可能性がある。
【００３９】
従って、上記方法は、また、必須工程として、工程ｘｉ）、ｘｉｉｉ）、及びｘｉｖ）を含み；更に、工程ｘｉｉ）を含む。
【００４０】
失透溶液は抗凍結剤を含有し、この抗凍結剤は例えば、低毒性の浸透活性剤など浸透活性を有し、通常例えばＤＭＳＯを回避し、更に選択的にトレハロース、スクロースを単独あるいは組合わせて使用する。この溶液における高含有率の二糖類により、ＤＭＳＯ以外の溶液との突然接触により生じる細胞破壊を防ぐ。細胞外の二糖類の存在により自然浸透力が作用することを防ぎ、且つ細胞内に存在するＤＭＳＯ（あるいは類似物）が排出されるのに十分な時間を有し、且つそれが水に徐々に置換される。
【００４１】
しかしながら、第３及び／または第４溶液（関連する場合）は通常一つ以上の抗凍結剤を有する。
【００４２】
特定の実施態様において、一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、プロパンジオール、及びまたはそれらの混合物からなるグループから選択され、特にグリセロール、トレハロース、スクロース、あるいはそれらの混合物が好適に使用される。
【００４３】
第３及び／または第４溶液に含まれる抗凍結剤の濃度は通常約０．０２Ｍ〜約１Ｍの範囲内であり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍの範囲内であり、更に関連する場合、第３溶液中の抗凍結剤の濃度は第４溶液中の浸透活性剤の濃度より高い。通常、関連する場合、第３溶液中の抗凍結剤の濃度は第４溶液中の抗凍結剤の濃度よりも高い。
【００４４】
下記には本発明の方法の概要を記載する。
【００４５】
ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞コロニーは切片に切断される（０．１〜０．４ｍｍ×０．１〜０．４ｍｍ）。４０〜５０μｌ容量中に細胞切片を２０まで（好適には約１０）、閉塞ストロー内で凍結される。閉塞ストローは片方端部にストッパーを有し、もう片方は開口する。細胞切片が凍結のためストロー内に吸引された後、プラグ（ストッパー）を備える端部は冷凍ＰＢＳを使用してシールされ、一方開口端部はボンド(溶接)及びヒートシール装置（Ｄｅｍｔｅｋ，Ａ／Ｓ）を使用してシールされる。大量の細胞が凍結される前に、試験的な冷凍及び解凍期間を実施する。解凍後、細胞切片はマウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）を有する培養皿に播種される。ヒトＢＳ細胞は一代継代培養され次に評価される。
【００４６】
記載される百分率は全てｖ／ｖで示す。
【００４７】
以下の記載は適切な手順、溶液、期間等を記載する。しかしながら、ここに記載される概要及び指針に基づき、当業者により本発明の範囲内において異なる要素に変更可能である。
【００４８】
ガラス化手順−  概要
処理：
１．Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ  ＡＢ、イェーテボリ、スウェーデン製冷凍ＰＢＳに０．６Ｍトレハロースを含有する原液が調製される。
２．溶液Ａ：  １０％エチレングリコールは冷凍ＰＢＳで生成され除菌される。
無菌ＤＭＳＯは終末濃度１０％まで追加される。
３．溶液Ｂ：  ０．３Ｍトレハロース及び２０％エチレングリコールからなる溶液は冷凍ＰＢＳで生成され除菌される。
無菌ＤＭＳＯは終末濃度２０％まで追加される。
４．１ｍｌ溶液Ａ及び溶液Ｂはそれぞれ、４−ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ，ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）内に２つのウェルに分けて配置される。このプレートは３７℃下に設置される。
５．適切な形態を示す、ヒト胚盤胞由来幹細胞のコロニーを選択し、これらは加熱滅菌した延伸ガラス毛細管（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）（あるいはＳｗｅｍｅｄ製の幹細胞切断ツール）を利用して継代用に細胞を切断する際の方法と同様な方法で切断される。Ｓｗｅｍｅｄ製切断ツールは先細の無菌ガラス毛細管であり、２５°の角度を有し、且つ２００あるいは３００マイクロメータのルーメンを有し、ｈＢＳコロニーあるいはｈＢＳコロニー部分の切断、処置、及び移送用に設計される。これはＳｗｅｍｅｄ  Ｌａｂ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｂｉｌｌｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ製である。
６．必要な数のストロー（閉塞ストロー、フレンチミニストロー、可動範囲２５０μｌ、Ｌ’Ａｉｇｌｅ，ＩＭＶ  ＺＡ４７５°，１３３ｍｍ，Ｓｖｅｎｓｋ  Ｍｊｏｅｌｋ）はｈＢＳ−数でラベルされ更に可視チューブは凍結コード（すなわち細胞系／日付／用法表示）でラベルされる。
【００４９】
凍結手順：
１．ストロー中で凍結された細胞はガラス毛細管（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）あるいは延伸ガラスピペット（Ｐａｓｔｅｕｒ，ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、溶液Ａに移される。
２．細胞は溶液Ａにおいて１分間培養される。
３．細胞は次に溶液Ｂの一滴（２５μｌ）に移され、更に２５秒以内に細胞は別の新鮮な溶液Ｂの一滴（２５μｌ）に移される。
４．細胞は２５秒間（最大）溶液Ｂ中で培養される。上記３及び４の工程の時間はできるだけ短くすることが好ましい。
５．１〜１．５ｃｍのシリコンチューブ（滅菌済）は１ｍｌのシリンジ（ツベルクリンシリンジ、使い捨て、Ｃｏｄａｎ  Ｔｒｉｐｌｕｓ  ＡＢ）と結合され、これは順にコットンストッパー（プラグ端）を備える端部でストローと接続される。このシリコンチューブはストローとシリンジ間にシールとして作用する。最初に、冷凍ＰＢＳはおよそ２〜３ｃｍカラムのストローで吸引される。次に、およそ、１〜２ｃｍ空気が吸引される（図１参照）。
６．細胞は次に２ｃｍカラムで立体顕微鏡下で溶液Ｂからストロー内に吸引される。
７．およそ１〜２ｃｍの空気が吸引された後に冷凍ＰＢＳ（これは端部において予備ストッパーとして作用する）が０．５〜１ｃｍ吸引される。
８．ストローの内容物はシリンジで吸引されるため冷凍ＰＢＳはコットンストッパーと接触し、ストッパーを膨らませる。
９．ストローは一組のピンセットを使用してシリンジから取り除き、次にヒートシール装置を使用する溶接にてシールされる。
１０．ストローは可視チューブ内に配置され、順番に液体窒素を含有するタンク内に長期間配置される。
【００５０】
失透手順−  概要
処理：
１．冷凍ＰＢＳに０．２Ｍトレハロースを含有する原液を調製する。
２．溶液Ｃ：冷凍ＰＢＳの０．２Ｍトレハロースを除菌する。
３．溶液Ｄ：冷凍ＰＢＳの０．１Ｍトレハロースを調製し除菌する。
４．１ｍｌの溶液Ｃ、溶液Ｄ及びｈＢＳ培地(以下参照)は４ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ，ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のウェルに別々に配置し、そのプレートは３７℃で培養される。[ｈＢＳ培地はＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ改良イーグル培地を含み、これは２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ置換及び以下の成分：１００ユニット／ｍｌのペニシリン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）で各終末濃度まで追加される]。
【００５１】
ガラス化溶液で使用された、ＤＭＳＯから解凍された細胞をすばやく洗浄することが重要である。低毒性トレハロースの存在により、ガラス化溶液から細胞播種用の培地へゆっくりとした段階的な変化を生じさせる。この濃度は変化させて（５〜５０％ｖ／ｖ，ｗ／ｗ，あるいはｗ／ｖ）異なる効果をもたらすことができる。また、低毒性を有する別の抗凍結剤を使用することも可能である。
【００５２】
解凍法：
１．ガラス化されたヒトＢＳ細胞を含有する閉塞ストローは液体窒素を含有する貯蔵タンクから収集され液体窒素を含有するバイアルに配置される。
２．閉塞ストローは室温で１０秒間空気中にさらされ、次に４０℃の水槽内におよそ２秒間配置される。ストローは加熱滅菌された「汎用布」（ａｌｌｄｕｋ）を使用して乾燥される。
３．加熱滅菌された一組のはさみを使用してストローのプラグされた端部はシールしただけで切開される。このストローはシーリングとして一つのシリコンチューブを使用してシリンジに接続される。このストローは次にボンド（溶接）で切開される。シリンジ内の空気はｈＢＳ細胞を溶液Ｃに押し出すのに使用される。同一のウェルで洗浄される細胞の量は一つのストロー内に含まれる量を超えないようにする。
４．ｈＢＳ細胞コロニーは溶液Ｃで１分間培養される。通常約１分間〜約２０分間である。
５．立体顕微鏡下で、ｈＢＳ細胞コロニーはガラス毛細管（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）あるいは延伸ガラスピペット（Ｐａｔｅｕｒ，ＶＷＲ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用する溶液Ｄに移される。
６．ｈＢＳ細胞コロニーは溶液Ｄで５分間培養される。通常は約５分間〜約３０分間である。
７．立体顕微鏡下で、ｈＢＳ細胞コロニーはガラス毛細管（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）あるいは延伸ガラスピペット（Ｐａｓｔｅｕｒ，ＶＷＲ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してｈＢＳ培地に移される。
８．コロニーは数秒内（５秒未満）にガラス毛細管（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）あるいは延伸ガラスピペット（Ｐａｓｔｅｕｒ，ＶＷＲ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用してｈＢＳ培地から移され、培養皿におけるマウス胚性支持細胞（ＭＥＦ）の上面に播種される。
９．培養皿は更なる培養のためにインキュベータ内に配置される。
【００５３】
本発明は以下の実施例にて更に説明されるが、本発明はいずれの方法にも限定されない。
【００５４】
実施例１
ｈＢＳ細胞のガラス化
２つの溶液Ａ及びＢが調製される（溶液Ａ：除菌された１０％エチレングリコール、１０％ＤＭＳＯ含有冷凍ＰＢＳ；溶液Ｂ：除菌された０．３Ｍトレハロース、２０％エチレングリコール、１０％ＤＭＳＯ含有冷凍ＰＢＳ）。適切な形態を示す、ヒト胚盤胞由来幹細胞のコロニーを選択し、幹細胞切断ツール（Ｓｗｅｍｅｄ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｉｌｌｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）を利用して標準継代用に細胞を切断する際の方法と同様な方法で切断される。これらの細胞切片はおよそ０．１〜０．４ｍｍ×０．１〜０．４ｍｍの大きさである。これらの細胞切片は最初に５００μｌの予熱された（３７℃）溶液Ａにおいて１分間培養され、次に２５μｌの溶液Ｂに移され３０秒間培養され、次に新鮮な一滴の溶液Ｂに再び移され、３０秒間培養される。この容量はおよそ４０〜５０μｌである。およそ１０この細胞切片はガラス化用に調製されたストロー内に吸引され次にストローはボンドで閉塞される。このストローは液体窒素中に投入される。
【００５５】
実施例２
ガラス化ヒトＢＳ細胞の解凍
２つの溶液Ｃ及びＤが調製される（溶液Ｃ：除菌された０．２Ｍトレハロース含有冷凍ＰＢＳ；溶液Ｄ：除菌された０．１Ｍトレハロース含有冷凍ＰＢＳ）。溶液Ｃ及びＤ及びｈＢＳ培地は３７℃にて予熱される。ガラス化されたｈＢＳ細胞（およそ１０この細胞切片）を含有する閉塞ストローは液体窒素タンクから除去される。このストローは室温で１０秒間保存され次に４０℃の水槽で迅速に解凍される（数秒間）。このストローは加熱滅菌されたはさみを使用してプラグ端部において切開され更にシリンジを使用して内容物をストローから溶液Ｃ中に押出される。このｈＢＳ細胞は１分間５００μｌ溶液Ｃにおいて培養され更に５００μｌの溶液Ｄに移され更に５分間培養される。立体顕微鏡下においてｈＢＳ細胞切片は迅速にｈＢＳ培地ですすがれ、次にｈＢＳ培地中のマウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に播種される。これらの細胞は次に培養され（３７℃で培養され）更に定着した新しいコロニーの数は計測され更に継代されてガラス化後のｈＢＳ細胞の生存率を評価する。このガラス化及び解凍処理後の細胞の生存回復率は通常７０〜１００％の範囲である。
【００５６】
実施例３
閉塞ストローを使用するヒトＢＳ細胞のガラス化及び解凍法
ヒトＢＳ細胞（ＳＡ００２、ＳＡ１２１、及びＳＡ１８１細胞系）は実施例１及び２に記載される手順に従ってガラス化され解凍された。マウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に播種し４８時間後にｈＢＳ細胞コロニーは評価され計測された。これら細胞切片それぞれは一つのコロニーを発生させるため、この解凍による回復率は解凍コロニー（適切なｈＢＳ細胞形態を示す）の生菌数と最初にガラス化されたｈＢＳ細胞切片数との比率として計測された。３つのストローが１つの細胞系に対して調製され且つ評価され、これらの結果は、それぞれの別個のストローに対して以下に示され、回復率は４０〜１００％の間であることが示される。
【００５７】
【表１】
2006525006.tif 000002
【００５８】
実施例４
閉塞ストローと開口引出しストローとの直接比較
ヒトＢＳ細胞（ＡＳ０３４細胞系）は開口引出しストローを閉塞ストローと並列して使用する以外は実施例１及び２に記載される方法に従ってガラス化及び解凍処理を行った。特に、注目すべきは、およそ４つのＢＳ細胞切片だけが各開口引出しストロー内でガラス化されることである。マウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に播種し４８時間後にｈＢＳ細胞コロニーは評価され計測された。この解凍回復率は（適切なｈＢＳ細胞形態を示す）解凍コロニーの生菌数と最初にガラス化されたｈＢＳ細胞切片数との比率として計測される。３つのストローが１つの細胞系ごとに調製され且つ評価され、これらの結果は、それぞれの別個のストローごとに以下に示され、結果として、各閉塞ストロー由来の生菌数（絶対数）がより多くえられる一方で許容回復率を維持できることが示された。
【００５９】
【表２】
2006525006.tif 000003
【００６０】
実施例５
ガラス化培地にトレハロース及びスクロースを使用した際の比較
ヒトＢＳ細胞（細胞系ＳＡ１２１）は実施例１及び２に記載される方法に従って、あるいはガラス化及び失透化培地に使用されたトレハロースをトレハロースで使用されたモル濃度と同一濃度のスクロースで置換されること以外は実施例１及び２に記載される方法に従ってガラス化及び解凍処理を行った。マウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に播種し４８時間後にｈＢＳ細胞コロニーは評価され計測された。この解凍回復率は（適切なｈＢＳ細胞形態を示す）解凍コロニーの生菌数と最初にガラス化されたｈＢＳ細胞切片数との比率として計測された。３つのストローが１つの細胞系ごとに調製され且つ評価され、これらの結果は、それぞれの別個のストローごとに以下に示され、トレハロースとスクロースを使用した場合における有意な差異はみられなかった。
【００６１】
【表３】
2006525006.tif 000004
【００６２】
実施例６
ガラス化培地にフィコールを使用するヒトＢＳ細胞のガラス化及び解凍法
ヒトＢＳ細胞（細胞系ＳＡ１２１）はフィコールをガラス化培地に使用する（０ｍｇ／ｍｌ，１０ｍｇ／ｍｌ及び１００ｍｇ／ｍｌ）以外は実施例１及び２に記載される方法に従ってガラス化及び解凍処理を行った。マウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に播種し４８時間後にｈＢＳ細胞コロニーは評価され計測された。この解凍回復率は（適切なｈＢＳ細胞形態を示す）解凍コロニーの生菌数と最初にガラス化されたｈＢＳ細胞切片数との比率として計測される。３つのストローは１つの細胞系ごとに調製され且つ評価され、これらの結果は、それぞれのストローごとに以下に示される。
【００６３】
【表４】
2006525006.tif 000005
【００６４】
実施例７
ガラス化培地に異なるトレハロース濃度を使用する場合の比較
ヒトＢＳ細胞（細胞系ＳＡ１２１）は第２ガラス化溶液（溶液Ｂ）中に２種類の異なるトレハロースの濃度（０．３Ｍ、０．５Ｍ）を使用する以外は実施例１及び２に記載される方法に従ってガラス化及び解凍処理を行った。０．３Ｍトレハロースを溶液Ｂに使用する場合には、溶液Ｃは０．２Ｍトレハロース溶液を含有し、溶液Ｄは０．１Ｍトレハロース溶液を含有した。０．５Ｍトレハロースを溶液Ｂに使用する場合には、溶液Ｃは０．４Ｍトレハロース溶液を含有し、溶液Ｄは０．２Ｍトレハロース溶液を含有した。マウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に播種し４８時間後にｈＢＳ細胞コロニーは評価され計測された。この解凍回復率は（適切なｈＢＳ細胞形態を示す）解凍コロニーの生菌数と最初にガラス化されたｈＢＳ細胞切片数との比率として計測された。異なる２種類のヒトＢＳ細胞系を使用して別々に２つの実験を実施した。３つのストローは１つの細胞系ごとに調製され且つ評価され、これらの結果は、それぞれのストローごとに以下に示される。結果として、実験したトレハロースの状態は両方とも良好であるが、０．５Ｍトレハロース含有溶液Ｂのほうが、０．３Ｍトレハロース含有溶液Ｂよりも効率的である。
【００６５】
【表５】
2006525006.tif 000006
【００６６】
実施例８
閉塞ストローを使用するガラス化及び失透化法の拡大評価
ガラス化方法の質を評価するために大量のヒトＢＳ細胞を３種類の異なるヒトＢＳ細胞系（ＳＡ００１，ＳＡ００２，およびＡＳ０３４）を使用する３種類の異なる場合について（上述の実施例１で示したように）ガラス化した。各場合ごとに１００以上のストローが各細胞系からガラス化された。これらの大量のバッチの中からそれぞれ８〜１０のストローが無作為に選択され、失透化され（上述の実施例２に記載されるように）、マウス胚性支持細胞が表面にある培養皿に別々に播種された。播種され且つ付着し、増殖し、更に適切な形態を示したｈＢＳ細胞集塊の数は各皿毎に判定された。結果は図１、２及び３に示し、ストロー毎に生存ｈＢＳ細胞コロニーが発生するとその後標準手順及に従って継代され特性付けられることを示す。
【００６７】
実施例９
ガラス化及び解凍前後のヒトＢＳ細胞の典型的な形態
ガラス化前のヒトＢＳコロニー（細胞系ＳＡ００１）の典型的な形態は図４に示される。失透及び播種後における、生存コロニーは増殖しさらに、未分化ヒトＢＳ細胞に特有な形態を示した（図５）。次に、これらの細胞は成長し更に標準手順に従って継代されて、ヒトＢＳ細胞コロニーの代表図を図６に示した。同様な結果はヒトＢＳ細胞系ＳＡ００２及びＡＳ０３４に関しても得られた（データは示さない）。
【００６８】
実施例１０
閉塞ストローにおけるガラス化及び失透化を実施した後のヒトＢＳ細胞の特性付け
ガラス化及び失透化工程後においてヒトＢＳ細胞が完全に再生し且つ適切な特性を示すことを実証するために、ヒトＢＳ細胞は広範な特性付けを実施した。これは表面抗原発現の分析、染色体分析、及び生体外及び生体内における多分化能試験を含む。以下のこれらの結果はヒトＢＳ細胞系ＳＡ００１を使用して得られ、更に同様な結果はヒトＢＳ細胞系ＳＡ００２及びＡＳ０３４を使用しても得られた（データは示さない）。
【００６９】
未分化ｈＢＳ細胞の免疫組織化学的染色
マウス胚性支持（ＭＥＦ）細胞で培養された失透化ヒトＢＳ細胞（細胞系ＳＡ００１）はＰＦＡで凝固され、次にトリトンＸ−１００を使用して膜透過された。連続した洗浄及びブロッキング工程後に、細胞を一次抗体で培養した（示されるように）。共役二次抗体が次に検出用に使用された。この核はＤＡＰＩ染色により視覚化された。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は製造業社（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）により示された指示書に従って市販のキットを使用して決定された。各分析が実施される時点の継代数を図７の説明文において括弧内に示される。図７に示されるように、ヒトＢＳ細胞はＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４及びＡＬＰに関してはポジティブな染色を示し、更に未分化ヒトＢＳ細胞を表すＳＳＥＡ−１に関してはネガティブな結果が示された。
【００７０】
染色体分析
ＭＥＦ上で培養された失透化ヒトＢＳ細胞（系ＳＡ００１）はカリクリン（Ｃａｌｙｃｕｌｉｎ）Ａの存在下において培養され、次に細胞培養液で洗浄された。これらの細胞は遠心法により収集され更にエタノール及び氷酢酸を使用して凝固された。この染色体はトリプシン−ギームザ染色法を使用して視覚化された。図８に示されるように、ガラス化及び失透化手順後の細胞において染色体異常は発見されなかった。
【００７１】
テロメラーゼ活性
テロメラーゼ活性を分析するために、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧＧ  テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ，バーゼル，スイス）を製造者の指示書に従って使用した。このアッセイはテロメラーゼ内部活性を利用し、ＰＣＲ法により生成物を増幅させ且つ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用してそれを検出する。ヒトＢＳ細胞系ＳＡ００１は失透化させマウス胚性支持細胞上に培養された後に分析され更に高いテロメラーゼ活性を示した。ｈＢＳ細胞における高テロメラーゼ活性は培地において無制限に分裂する細胞自身の能力と相関する。
【００７２】
生体外分化
失透化ヒトＢＳ細胞の多分化能を研究するために、細胞系ＳＡ００１由来の未分化コロニーを幹細胞切断ツール（Ｓｗｅｍｅｄ  Ｌａｂ，イェーテボリ，スウェーデン）を使用して浮遊培養に移し胚様体（ＥＢｓ）を形成させた。次に、ＥＢｓは組織培養プレート上に配置され更に自然発生的に分化した細胞をβ−III−チューブリン（外胚葉）、デスミン（ｄｅｓｍｉｎ）（中胚葉）、α−フェトプロテイン及びＨＮＦ−３β（内胚葉）に対する抗体を使用して免疫組織化学的評価を実施した。心筋細胞と類似した自発性収縮細胞が更に観察された（図示しない）。総合すると、これらの結果からガラス化及び失透化処理を実施したヒトＢＳ細胞はそれ自身の能力を保持し生体外において３つの異なる胚葉を示す細胞に分化される（すなわち、それらは多能性を保持する）。これらの結果を図９に示す。
【００７３】
生体内分化
失透化ヒトＢＳ細胞の多分化能を研究するために、手術により未分化細胞（細胞系ＳＡ００１）を重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの腎臓被膜下に移殖した。これらマウスは８週間後に解剖され、腫瘍を切開しＰＦＡ中に凝固された。ヘマトキシリン−エオジン染色されたパラフィン切片の組織学的評価を実施し全て３つ胚葉全てから生成される組織があるかどうかを判定した。図１０に示すように、ガラス化及び失透化処理を実施したヒトＢＳ細胞はそれ自身の能力を保持し生体内において３つの異なる胚葉を示す細胞に分化された（すなわち、それらは多能性を保持する）。
【００７４】
ガラス化法に使用可能な細胞の確立の一般法
本発明の方法への使用に適切なｈＢＳ細胞の確立法
２００３年７月１０日付け国際公開第０３／０５５９９２号パンフレット（同一出願人）にて公開された（すなわち本願の優先日より後）ＰＣＴ出願において、適切なｈＢＳ細胞の確立法が記載される。本願のある態様において、使用される細胞は国際公開第０３／０５５９９２号パンフレットに開示される方法により得られ、これはここで参考に取り入れる。
【００７５】
受精卵母細胞由来の多能性ヒト胚盤胞由来幹細胞あるいは細胞系の確立法は、
ｉ）グレードＡあるいはＢを任意に有する、１つの胚盤胞を得るために、グレード１あるいは２を有する、受精卵母細胞を任意に使用して、
ｉｉ）支持細胞と共に胚盤胞を共培養し、一つ以上の内細胞塊細胞コロニーを確立し、
ｉｉｉ）機械的切開により内細胞塊細胞を単離し、
ｉｖ）支持細胞と共に内細胞塊細胞を共培養し胚盤胞由来幹細胞系を得て、
ｖ）任意に、胚盤胞由来幹細胞系を増殖させる、
工程から構成される。
【００７６】
上記方法の出発原料として受精卵母細胞が使用される。受精卵母細胞の質は結果として得られる胚盤胞の質に対して重要である。上記方法の工程ｉ）のヒト胚盤胞は凍結あるいは新鮮な生体外ヒト受精卵母細胞から生成される。以下に、国際公開第０３／０５５９９２号パンフレットに関する方法を使用した適切な卵母細胞を選択する方法について記載する。本発明の方法の重要な成功するための基準は適切な卵母細胞を選択することであることが分かった。すなわち、グレード３の卵母細胞を使用する場合のみ、通常の要求（以下に記載される）を満たすｈＢＳ細胞系を得る可能性が低い。
【００７７】
提供された新鮮受精卵母細胞：０日目に、卵母細胞をＡｓｐ−１００（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）に吸引し、更にＩＶＦ−５０（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）において１日目に受精させる。受精した卵母細胞は３日目に形態及び細胞分裂に基づき評価する。以下のスケールが受精卵母細胞の評価に使用される：
【００７８】
グレード１の受精卵母細胞：ちょうど１割球、断片なし
グレード２の受精卵母細胞：２０％以下の断片
グレード３の受精卵母細胞：２０％以上の断片
【００７９】
第３日目に評価を行った後、グレード１及び２の受精卵母細胞は着床されるか貯蔵用に冷凍される。グレード３の受精卵母細胞はＩＣＭ−２（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）に移される。受精卵母細胞は更に３−５日間（すなわち、受精後５−７日）培養される。この胚盤胞は以下のスケールで評価される。
【００８０】
グレードＡの胚盤胞：６日目に明確な内細胞塊（ＩＣＭ）に拡大される
グレードＢの胚盤胞：拡大はしないがそれ以外はグレードＡと類似
グレードＣの胚盤胞：ＩＣＭは見られない
【００８１】
提供された冷凍受精卵母細胞：２日目（受精後）に、受精卵母細胞をＦｒｅｅｚｅ−Ｋｉｔ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を使用して第４−細胞期で冷凍される。冷凍受精卵母細胞は液体窒素で貯蔵される。第５年の期限が過ぎる前にインフォームドコンセントが提供者から得られる。受精卵母細胞はＴｈａｗ−Ｋｉｔ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を使用して解凍され、更に上述の手順が第２日目から行われる。
【００８２】
上述のように、新鮮な受精卵母細胞はグレード３から生成され、更に冷凍受精卵母細胞はグレード１及び２から生成される。確立方法により得られたデータによると、胚盤胞に発達する新鮮な受精卵母細胞の割合は１９％であり、一方５０％の冷凍受精卵母細胞が胚盤胞に発達される。このことは冷凍受精卵母細胞の方が非常に多くの胚盤胞が得られ、これは恐らく受精卵母細胞の質がより高いためである。新鮮受精卵母細胞由来の胚盤胞の１１％が幹細胞系に発達されるが、一方冷凍受精卵母細胞由来の胚盤胞の１５％が幹細胞に発達される。総合すると、培養された新鮮受精卵母細胞の２％が幹細胞系に発達され、更に培養された冷凍受精卵母細胞の７％が幹細胞系に発達された。
【００８３】
胚盤胞−段階への受精卵母細胞の培養は、従来より公知の手順後に実施される。胚盤胞を生成する手順はガードナー他による、胚培養システムに記載される。Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，Ａ．Ｏ．，及びガードナー，Ｄ．Ｋ．（ｅｄｓ）による、生体外受精ハンドブック、第２版に記載される。ＣＲＣプレス，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２６４；ガードナー他，Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ，７４，Ｓｕｐｐｌ３，Ｏ−０８６；ガードナー他，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ，１３，３４３４，３４４０；ガードナー他，Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ；及びＨｏｐｐｅｒ他，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ，６２，Ｓｕｐｐｌ  １，２４９に記載される。
【００８４】
グレード１あるいは２を有する受精卵母細胞から任意に生成される工程ｉ）における胚盤胞の確立後、グレードＡ及びＢを備える胚盤胞は支持細胞と共に共培養され一つ以上の内細胞塊細胞コロニーを確立する。支持細胞上にプレートされた後、それらの成長は監視され更にコロニーが手動で継代するのに十分大きくなると（プレーティングからおよそ１〜２週間後）、細胞は別の細胞型に切開され更に新規の支持細胞上で成長することにより拡大される。内細胞塊細胞の単離は機械的切開により実施され、これは切断ツールとしてガラス毛細管を使用して実施される。内細胞塊細胞の検出は顕微鏡法により目視にて容易に実施され、更にこれにより、酵素および／または抗体を使用して卵母細胞に対してなんらかの処置を行い栄養外胚葉を損傷あるいは除去する必要がない。
【００８５】
すなわち、国際公開第０３／０５５９９２号パンフレットに記載の方法は免疫手術の必要性を軽減する。免疫手術を使用する方法と栄養外胚葉を無傷のままにする本発明の方法との成功率を比較することにより、免疫手術を避ける非外傷方法の方が、非常に単純、迅速及び外傷のない方法であり免疫手術よりも効果的であることが分かった。これらの方法は幹細胞系の生成、及びこれら細胞系の分化を商業的に実行可能にする。全体として１２２の胚盤胞から、１９の細胞系が確立された（１５．５％）。４２の胚盤胞が免疫手術により処置されその結果これらの内の６つが成功した細胞系として確立された（１４％）。８０の胚盤胞が本発明により処置され更に１３の細胞系が確立された（１６％）。
【００８６】
内細胞塊の分裂に続いて、内細胞塊細胞は支持細胞と共に共培養されて胚盤胞由来幹（ＢＳ）細胞系を得る。ｈＢＳ細胞系を得た後、細胞系は任意に増殖し細胞量を増加させる。すなわち、胚盤胞由来幹細胞系は例えば、４〜５日毎に幹細胞系を継代することにより、増殖される。幹細胞系が継代前に４〜５日以上長く培養されると、細胞が不要に分化する可能性が増加する。
【００８７】
支持培養システムにおける細胞の特別な継代方法は以下の確立実施例５に記載される。
【００８８】
ヒトＢＳ細胞系は自然孵化胚盤胞、あるいは無傷透明帯を備える拡大胚盤胞のいずれかから単離される。上述の方法において、工程ｉ）における胚盤胞は自然孵化胚盤胞である。孵化胚盤胞に関し栄養外胚葉は無傷なままである。孵化胚盤胞、あるいは除去されたまたは部分的に除去された透明帯を備える胚盤胞は不活化支持細胞に接触される。
【００８９】
胚盤胞の透明帯は工程ｉｉ）の前に、例えばＺＤＴＭ−１０（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，イェーテボリ，スウェーデン）などの一つ以上の酸性試薬、プロナーゼなどの一つ以上の酵素あるいは酵素混合物により処置することにより、少なくとも部分的に消化あるいは化学的にひだをつける。
【００９０】
無傷透明帯を備える胚盤胞の簡単なプロナーゼ（シグマ）処理により帯を除去する。プロナーゼと同様のあるいは類似のプロテアーゼ活性を備える別の型のプロテアーゼも使用可能である。この胚盤胞は前記不活化支持細胞上に配置され次にプロナーゼ処理を行う。
【００９１】
本発明のある態様において、工程ｉｉ）および／または工程ｉｖ）は胚盤胞および／または関連すれば内細胞塊細胞を支持細胞に接着させることを促進する試薬により実施される。この目的に使用される適切な物質はヒアルロン酸である。
【００９２】
支持細胞上に胚盤胞をプレートする適切な培地はヒアルロン酸を補充するｈＢＳ−培地でありこれは支持細胞上に胚盤胞が接着し更に内細胞塊が成長することを促進するものである。ヒアルロン酸（ＨＡ）は接合における細胞外マトリックスの重要なグリコサミノグリカン成分である。これは少なくとも二つの細胞表面レセプター：ＣＤ４４及びＨＡ−媒介運動性（ＲＨＡＭＭ）用レセプターと、及び細胞外マトリックスのタンパク質に対して結合相互作用を介して生物学的効果を発揮する。ｈＢＳ細胞を確立する間ＨＡの効能は細胞膜中のリン脂質の界面活性剤極性頭部との相互作用を介して発揮され、これにより界面活性剤層を安定化させることによって、内細胞塊あるいは胚盤細胞の表面張力を低下させて、支持細胞に対する結合効果を増大させることになる。あるいは、ＨＡは内細胞塊あるいは胚盤胞のレセプターおよび／または支持細胞に対して結合し更に内細胞塊の接着及び成長を増進させる生物活性を発揮させる。これにより、液体の表面張力を変化させる、あるいは別の方法で胚盤胞と支持細胞との相互作用に影響させる別の試薬がヒアルロン酸の代わりに使用可能である。
【００９３】
上述の方法において、支持細胞の培養はｈＢＳ細胞系の確立に重要である。胚盤胞由来幹細胞系の増殖は最大３世代、例えば最大２世代における支持細胞の継代からなる。
【００９４】
本発明の方法に使用される適切な支持細胞は胚性あるいは成体由来の繊維芽細胞である。本発明の方法において、工程ｉｉ）及びｉｖ）に使用される支持細胞は同一か異なっており更に例えばヒト、マウス，ラット、猿、ハムスター、カエル、ウサギ等を含む哺乳類などの動物性由来である。ヒトあるいはマウス種由来の支持細胞が好ましい。
【００９５】
一般的要求事項を満たすｈＢＳ細胞系を得るための別の重要な基準は胚盤胞が培養される条件である。胚盤胞由来幹細胞系は幹細胞をおよそ１ｃｍ２当り６０，０００細胞未満、例えばおよそ１ｃｍ２当り５５，０００細胞未満、あるいは１ｃｍ２当りおよそ５０，０００細胞未満の密度を有する支持細胞と共に培養されることにより増殖される。特定の実施態様において、胚盤胞由来幹細胞系は幹細胞を１ｃｍ２当りおよそ４５，０００細胞の密度を有する支持細胞と共に培養されることにより増殖する。これらの値はマウス支持細胞が使用され更に適切な密度が別の型の支持細胞に対しても同様に達成できる場合に適用される。本発明者の発見に基づき、当業者は適切な密度を得ることができる。これらの支持細胞は支持細胞の不要な成長を避けるために分裂期に不活化される。
【００９６】
上述の確立方法により得られた胚盤胞由来幹細胞系は適切な周期において自己再生及び多分化能を維持し、従って適切な周期において安定する。この場合、「安定」とは分裂期に不活化された胚性支持細胞の成長の際に２１か月以上の未分化状態における増殖能を意味する。
【００９７】
上述の確立方法により得られた幹細胞系は一般要求事項を満足させる。すなわち、この細胞系は、
ｉ）分裂期不活化胚性支持細胞で成長する場合に、２１か月以上の未分化状態における増殖能を示し、
ｉｉ）正常正倍数性染色体核型を示し、更に
ｉｉｉ）生体外及び生体内の両方において全ての型の胚葉の誘導体に進化する可能性を保持し、更に
ｉｖ）以下の分子マーカー、ＯＣＴ−４、アルカリホスファターゼ、炭水化物エピトープＳＳＥＡ−３，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１及びモノクロナ−ル抗体ＧＣＴＭ−２により認識された硫酸ケラチン／硫酸コンドロイチン細胞周囲マトリックスプロテイングリカンのタンパクコアの内の少なくとも二つを示し、更に
ｖ）分子マーカーＳＳＥＡ−１あるいは別の分化マーカーは示さず、更に
ｖｉ）その多分化能を維持し更に免疫不全マウスに投与される際に生体内に奇形腫を形成し、更に
ｖｉｉ）分化可能である。
【００９８】
上述の方法により得られた未分化ｈＢＳ細胞は以下の基準により規定され；それらはヒトの着床前受精卵母細胞、すなわち胚盤胞から単離され、更に分裂期不活化支持細胞上で成長する際に未分化状態において増殖能を示し；それらは正常染色体核型を示し；それらは未分化ｈＢＳ細胞に対して典型的なマーカー、例えば、ＯＣＴ−４，アルカリホスファターゼ、炭水化物エピトープＳＳＥＡ−３，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１及びモノクロナ−ル抗体ＧＣＴＭ−２により認識された硫酸ケラチン／硫酸コンドロイチン細胞周囲マトリックスプロテイングリカンのタンパクコアを示し、更に炭水化物エピトープＳＳＥＡ−１あるいは別の分化マーカーの発現は示さないとする基準である。その上、生体外あるいは生体内（奇形腫）における多分化能テストは全ての胚葉誘導体への分化を実証する。
【００９９】
上述により、本方法は多分化能ヒトＢＳ細胞のほぼ純粋な生成を確実にし、これはｉ）分裂期不活化胚性支持細胞で成長する場合に、２１か月以上の未分化状態における増殖能を示し；ｉｉ）正常正倍数性染色体核型を示し；ｉｉｉ）生体外及び生体内の両方において全ての型の胚葉の誘導体への進化の可能性を保持し；ｉｖ）以下の分子マーカー、ＯＣＴ−４，アルカリホスファターゼ、炭水化物エピトープＳＳＥＡ−３，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１及びモノクロナ−ル抗体ＧＣＴＭ−２により認識された硫酸ケラチン／硫酸コンドロイチン細胞周囲マトリックスプロテイングリカンのタンパクコアの内の少なくとも二つを示し、ｖ）分子マーカーＳＳＥＡ−１あるいは別の分化マーカーは示さず、更にｖｉ）その多分化能を維持し更に免疫不全マウスに投与される際に生体内に奇形腫を形成し、更にｖｉｉ）分化可能である。
【０１００】
細胞マーカーの検出用方法はＧａｇｅ，Ｆ．Ｈ．，サイエンス，２８７：１４３３−１４３８（２０００）に記載される。これらの方法は、当業者にとって公知であり、更にＲＴ−ＰＣＲ法あるいはその細胞マーカーに対する抗体を使用する免疫アッセイ法などを含む。以下に、細胞マーカー検出法、ハイブリッド形成法、染色体分析、テロメラーゼ活性測定法及び奇形腫形成について記載する。これらの方法は上記確立方法に従って得られたｈＢＳ細胞が上述の基準を満たすかどうか調べるために使用可能である。
【０１０１】
免疫組織化学
培地中に生存するｈＢＳ幹細胞はその分化の状態を定期的に観察される。未分化ｈＢＳ細胞を観察するための細胞表面マーカーはＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１である。ヒトＢＳ幹細胞は４％ＰＦＡ中で凝固され、次に０．５％トリトンＸ−１００を使用して膜透過される。洗浄し及び１０％粉乳でブロッキングを行った後、細胞は一次抗体と共に培養される。大量に洗浄した後細胞は二次抗体と共に培養され更に核はＤＡＰＩ染色により視覚化される。
【０１０２】
アルカリホスファターゼ
アルカリホスファターゼ活性は製品指示書（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に従い市販キットを使用して決定される。
【０１０３】
Ｏｃｔ−４  ＲＴ−ＰＣＲ
転写因子Ｏｃｔ−４に対するｍＲＮＡレベルはＲＴ−ＰＣＲ法及び遺伝子特異的プライマーセット（５’−ＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧ，５’−ＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＣ）およびハウスキーピング遺伝子（５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ，５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ）などのＧＡＰＤＨを使用して測定される。
【０１０４】
蛍光インシトゥハイブリデーション法（ＦＩＳＨ）
ＦＩＳＨ一ラウンドにつき、一つ以上の染色体が染色体特異的プローブで選択される。この技術は存在する遺伝的な数的異常を検出可能である。この分析に関して、ＣＴＳは第１３，１８及び２１染色体及び性染色体（Ｘ及びＹ）用のプローブからなる市販キット（Ｖｙｓｉｓ．Ｉｎｃ，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用する。各細胞系に対して少なくとも２００の核が分析される。これらの細胞はカルノイ固定液により再懸濁し、更に正電荷ガラススライド上に滴下される。プローブＬＳＩ  １３／２１はＬＳＩハイブリッド形成バッファと混合され、更にスライドに添加されカバースリップにより被覆される。プローブＣＥＰ  Ｘ／Ｙ／１８はＣＥＰハイブリッド形成バッファと混合され、更に別のスライドに同様な方法で添加される。５分間７０℃で変性された後１４−２０時間湿室において３７℃でハイブリッド形成される。３ステップ洗浄を行った後、核はＤＡＰＩ  ＩＩにより染色され、更にスライドは適切なフィルター及びソフトウェアを使用するインバータ顕微鏡（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ）で分析される。
【０１０５】
染色体分析
染色体分析は全ての染色体に対して直接的な方法で研究可能であり、更に非常に有益であり、数的及び大きな構造的異常が検出可能である。モザイクを検出するために、少なくとも３０の染色体が必要である。しかしながら、この技術は大変な時間の浪費と技術的複雑さの両方を備える。このアッセイに対する条件を改善するために、コルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄ）、コルヒチンに対する合成類似化合物及び微小管不安定化剤により細胞を中期において停止させる方法による分裂指数が導入可能であるが、多量な細胞を供給する必要がある（６×１０６細胞数／分析）。細胞は１〜２時間、０．１μｇ／ｍｌのコルセミド存在下で培養され、次にＰＢＳで洗浄され更にトリプシン処理される。細胞は１０分間１５００ｒｐｍで遠心分離により収集される。細胞はエタノール及び氷酢酸を使用して凝固され、更に染色体は改良されたＷｒｉｇｈｔｓ染色法を使用して視覚化される。
【０１０６】
比較ゲノムハイブリダイゼーション
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）は染色体分析に対して補完するものである。ＣＧＨは染色体についてより高度に分析し且つ技術的能力がさほど必要ではない。単離ＤＮＡはＤＮＡ、Ａ４、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ−ｄＵＴＰ／ＦＩＴＣ  １２−ｄＵＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼＩの混合物においてニックトランスレーションされる。アガロースゲル電気泳動法は得られるＤＮＡフラグメント（６００−２０００ｂｐ）の大きさを制御するのに使用される。テスト及び対照ＤＮＡはホルムアミド、硫酸デキストラン及びＳＳＣ含有ハイブリダイゼーション混合液中に沈殿され更に再懸濁される。ハイブリダイゼーションは湿室において３７℃３日間メタファーゼによる変性ガラススライド上で実施される。大量洗浄後、アンチフェード（ａｎｔｉｆａｄｅ）封入混合物（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ，０．１μｇ／ｍｌＤＡＰＩ  ＩＩ）が１滴添加され、更にそのスライドをカバースリップで被覆される。スライドは次に顕微鏡下で映像分析システムを利用して評価される。
【０１０７】
テロメラーゼ活性
高活性はｈＢＳ細胞６に対する基準として規定されてきたため、テロメラーゼ活性はｈＢＳ細胞系で測定される。細胞がより分化した状態になると、テロメラーゼ活性は続いて減少することが知られる。従って、活性を量子化することによってより早い継代及び比較参照データが得られ、更に分化を検出するための手段として利用可能である。テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡキット（ロシュ）をテロメラーゼ内活性に使用する、この方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成物を増幅し更にそれを酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で検出する。このアッセイは製品指示書に従って実施される。このアッセイの結果はｈＢＳ細胞に対して典型的に高いテロメラーゼ活性（＞１）を示す。
【０１０８】
細胞系はそれ自体多分化能を維持し免疫不全マウスに投与すると生体内で奇形腫を形成する。更に、生体外においてこれらの細胞はｈＢＳ細胞誘導体を形成する。これらのモデル両方において、全ての胚葉における細胞特性が見られる。
【０１０９】
免疫不全マウスの奇形腫形成
ヒトＢＳ細胞系が多能性を維持したかどうかを分析する一つの方法は腫瘍、奇形腫を得るために免疫不全マウスに対してその細胞を異種移殖することである。腫瘍に見られる多様な種類の組織は３つの胚葉全てを示す。報告書において、異種移殖された免疫不全マウス由来の腫瘍において、多様な組織、例えば横紋筋、軟骨及び骨（中胚葉）、内臓（内胚葉）及び神経ロゼット（外胚葉）が見られた。更に、大部分の腫瘍は無秩序な組織からなる。
【０１１０】
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）−マウス、Ｂ−及びＴ−リンパ球欠損種が奇形腫の分析に使用される。ヒトＢＳ細胞は睾丸あるいは腎臓被膜下のどちらかに手術的に移殖される。睾丸あるいは腎臓において、ｈＢＳ細胞は１００００〜１０００００細胞数の範囲で移殖される。理想的には、一回で、５〜６匹のマウスが各細胞系に使用される。予備段階における結果は雌のマウスが雄のマウスよりもより術後安定性がよく、且つ腎臓への異種移殖は睾丸に対してと同様に奇形腫の生成において効果的であることが示される。すなわち、雌ＳＣＩＤ−マウスの奇形腫モデルは好適である。腫瘍は通常およそ１ヶ月後には触診可能となる。マウスは１〜４ヶ月後に犠牲になり、更にパラフィン−切片法あるいは凍結−切片法のいずれかにより解剖され凝固される。腫瘍組織は次に免疫組織化学的方法により分析される。３つの胚葉全てに対しての特異的マーカーが使用される。現在使用されるマーカーは：マウス組織とヒト腫瘍組織との区別のためのヒトＥ−カドヘリン、α−平滑筋アクチン（中胚葉）、α−フェトプロテイン（内胚葉）、及びβ−ＩＩＩ−チューブリン（外胚葉）がある。更にヘマトキシリンエオジン染色法が一般的な形態用に実施される。
【０１１１】
この確立方法は「確立実施例」として以下に記載する。これらの実施例は例示を目的としてのみここに記載され、いかなる方法においても本発明の範囲は限定されない。ここに記載される一般的な方法は当業者にとって公知であり更に全ての試薬及びバッファは利用し易く、市販あるいは当業者の手により既知のプロトコールに従って容易に生成し易いものである。全ての培養はＣＯ２雰囲気下において、３７℃で実施される。
【０１１２】
使用される適切な培地の一つは「ＢＳ−細胞培地」あるいは「ＢＳ−培地」とし、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ改良イーグル培地に、２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ代替物及びそれぞれの終末濃度における成分：５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が追加されたものから構成される。
【０１１３】
別の適切な培地として、「ＢＳ細胞体培地」があり、これは以下の；ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ改良イーグル培地に、２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ代替物及びそれぞれの終末濃度における成分：５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノールから構成される。
【０１１４】
本発明の記載において、「安定」とは分裂期不活化胚性支持細胞上で成長する際に２１ヶ月以上もの未分化状態において増殖能を示すことを意味する。
【０１１５】
確立実施例
確立実施例１
自然孵化された胚盤胞由来の未分化幹細胞の原則的に純粋な生成の確立
ヒト胚盤胞は凍結あるいは新鮮なヒト生体外受精卵胚由来であった。自然孵化胚盤胞はｈＢＳ細胞培地（ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ改良イーグル培地に２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ代替物及びそれぞれの終末濃度における成分：５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）に０．１２５ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸が追加されたものが追加される）における支持細胞（ＥＦ）上に直接接触させた。ＥＦ細胞上に胚盤胞をプレーティング後、成長は観察され、プレーティング後（およそ１〜２週間）手動で継代するのに充分コロニーが大きくなると、内細胞塊細胞は別の細胞型から切開され更に新しいＥＦ細胞上で成長し拡大される。
【０１１６】
確立実施例２
無傷透明帯を備える胚盤胞由来の未分化幹細胞のほぼ純粋な生成方法の確立
無傷透明帯を備える胚盤胞に対して、ｒＳ２（ＩＣＭ−２）培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，イェーテボリ，スウェーデン）における短時間プロナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ，シグマ）培養を行い透明帯を消化し、その後胚盤胞はヒアルロン酸（０．１２５ｍｇ／ｍｌ）が添加されたｈＢＳ培地におけるＥＦ細胞層上に直接接触された。
【０１１７】
確立実施例３
アルカリホスファターゼ用組織化学的染色法
細胞はＲＴ−ＰＣＲ、組織化学的（アルカリホスファターゼ）及び免疫細胞化学的分析（以下参照）により採取された。ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ。細胞性ＲＮＡは全てメーカーからの推奨事項に従って、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して生成された。ｃＤＮＡ合成はＲＴ−ＰＣＲ（ロシュ）用ＡＭＶファーストストランドｃＤＮＡ合成キット及びプラチナＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＰＣＲで実施された。アルカリホスファターゼ用組織化学的染色法はメーカーからの推奨事項に従って市販キット（シグマ）を使用して実施された。
【０１１８】
確立実施例４
ｈＢＳ細胞系の生成及び培養
マウスの胚性線維芽細胞支持細胞はＥＭＦＩ−培地：ＤＭＥＭ（ダルベッコ改良イーグル培地）に１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、０．１μＭのβ−メルカプトエタノール、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）が追加される：を含有する組織培養皿上で培養された。支持細胞はマイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ、３時間）で分裂期に不活化された。ヒトＢＳ細胞コロニーは不活化されたマウス胚性繊維芽細胞支持細胞上に手動による切開によって拡大された。
【０１１９】
ヒトＢＳ細胞はｈＢＳ−細胞培地：（ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ改良イーグル培地に２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ代替物及びそれぞれの終末濃度における以下の成分：５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのβ−メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍｌのヒト組み換えｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が追加される：を有する組織培養皿内の分裂期に不活化されたマウス胚性繊維芽細胞支持細胞上で培養された。継代後７日間でコロニーは充分成長しＢＳ細胞体が生成可能となった。
【０１２０】
ＢＳ細胞コロニーはガラス毛細管により０．４×０．４ｍｍ切片に切断され更にＢＳ細胞体培地：ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）ダルベッコ改良イーグル培地に２０％ＫＮＯＣＫＯＵＴ（登録商標）Ｓｅｒｕｍ代替物及びそれぞれの終末濃度における以下の成分：５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１００μＭのβ−メルカプトエタノール：を含む非接着性細菌培養皿上に配置された。嚢胞性ｈＢＳ細胞体を含む、ＢＳ細胞体は７〜９日周期で形成された。
【０１２１】
確立実施例５
ｈＢＳ細胞の継代
継代前に、ｈＢＳ細胞はニコンエクリプスＴＥ２０００−Ｕインバータ顕微鏡（１０×物体）及びＤＸＭ１２００デジタルカメラを使用して撮影される。コロニーは４〜５日周期ごとに継代される。コロニーは充分に大きくなるよう継代され、切片（０．１〜０．３×０．１〜０．３ｍｍ）に切断可能となる。細胞が継代される第１回目には、細胞は１〜２週間成長し、さらにおよそ４切片に切断される。
【０１２２】
コロニーが立体顕微鏡でひとつずつ焦点を合わせられ、更に上述のサイズに従って市松模様に切断される。内部の均質構造のみが継代される。コロニーの各角はナイフで除去され、毛細管に吸引され、新規の支持細胞（最高年齢４日）に接触される。１０〜１６の角は新規のＩＶＦ−皿ごとに隅々まで均一に配置される。これらの皿は５〜１０分間放置されることにより、細胞が新規の支持細胞に接着でき、次にインキュベータ内に設置される。ｈＢＳ培地は１週間に３回交換される。コロニーが継代される場合培地はその週のみに限り２回交換される。通常「半分交換」が実施され、これは培地の半分が吸引され且つ同量の新規で強化された培地に置換されることを意味する。必要であれば、培地全体が交換される。
【０１２３】
確立実施例６
ｈＢＳ細胞のガラス化
前記細胞系由来の適切な未分化形態を有するコロニーは継代用として切除される。１００〜２００ｍｌの液体窒素は十分な容量の冷凍管内に除菌処理される。２つの溶液Ａ及びＢが調製され（Ａ：１Ｍトレハロース、１００μｌエチレングリコール、及び１００μｌＤＭＳＯ含有８００μｌの冷凍ＰＢＳ、Ｂ：１Ｍトレハロース、２００μｌエチレングリコール及び２００μｌＤＭＳＯ含有６００μｌ冷凍ＰＢＳ）更にコロニーはＡ液中に１分間、Ｂ液中に２５秒間配置される。閉塞ストローが凍結コロニーを貯蔵するために使用される。コロニーがストロー内に移された後、それを除菌された窒素を有する冷凍管内に迅速に配置される。
【０１２４】
確立実施例７
胚性マウス支持（ＥＭＦｉ）細胞の播種
細胞はマイトマイシンＣを含有するＥＭＦｉ培地で３７℃で３時間培養されることにより不活化される。ＩＶＦ−皿はゼラチンで被覆される。その培地は吸引され更に細胞はＰＢＳで洗浄される。ＰＢＳはトリプシンで置換され細胞を分離する。培養後、トリプシン活性はＥＭＦｉ培地で遮断される。細胞は次に遠心分離により収集され、ＥＭＦｉ培地において１：５に希釈され、さらにＢｕｒｋｅｒチャンバ内で計測される。細胞は終末濃度が１７０Ｋ細胞／ｍｌのＥＭＦｉ培地に希釈される。ＩＶＦ−皿中のゼラチンは１ｍｌの細胞懸濁液で置換され、更にインキュベータ内に配置される。ＥＭＦｉ培地は播種後のその日に交換される。
【０１２５】
支持細胞に支持された細胞培養系あるいは支持細胞欠如細胞培養系由来のｈＢＳ細胞における効果的な移送方法、及び支持細胞欠如条件下のｈＢＳ細胞の長期的増殖
本発明に使用されるｈＢＳ細胞は支持細胞欠如培養系において培養され、この方法は従来の公知の方法と比較して移送された細胞が少なくとも１０継代以上の間安定する利点がある。リチャード他による研究はｈＢＳ細胞系はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含む、無細胞マトリックスにおいて６継代以上は未分化状態では増殖できないことを示した。しかしながら、ｈＢＳ細胞はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上で３５継代以上も安定し、凍結／解凍の１サイクル処理後でさえ未分化ｈＢＳ細胞用マーカーを依然として発現し更に大まかに比較可能な増殖速度でさえ保持された。更に機械的解離は酵素的解離と比較すると、非常に増加した数の生存コロニーがプレーティング後の２日間で観察された。重要な工程は、ｈＢＳ細胞を支持細胞欠如培養系に移送する最初の工程にあると思われる。従って以下にｈＢＳ細胞を支持細胞欠如培養系に移送する方法において、ｈＢＳ細胞を支持細胞から機械的に切断する方法を記載する。ここで支持細胞欠如実施例においては、各コロニーの中心部分のみが使用され、一方ではＸｕ他による先行研究に従って、コロニー全体を支持細胞を有する培地の汚染の危険性を有する酵素処理により切り離された。更に、支持細胞に培養されたｈＢＳ細胞を支持細胞欠如表面上に移す非常に繊細な工程において酵素を使用することは細胞接着及び成長に関与する重要な表面分子の不活性化を生じさせる。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ内の主要な成分はコラーゲン型ＩＶ及びラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質である。細胞外マトリックスタンパク質に結合される細胞表面インテグリンの活性化は細胞接着、生存及び増殖の調節に対して重要な工程となる。例えば、インテグリンα１はコラーゲンマトリックスにおける生体外及び生体内の細胞増殖の両方を調節するコラーゲンレセプター間の独創的な役割を有する。ラミニン−特異性レセプターは、ｈＢＳ細胞により高度に発現されるインテグリンα６及びβ１により形成され、ｈＢＳ細胞のマトリックス表面への接着に主要な役割をも果たす。すなわち、接着あるいは生存用のいくつかの重要な表面レセプターは細胞が新規の表面に適合する前における大まかな最初のコラゲナーゼＩＶ処理にはほとんど影響されない可能性がある。ここでの実施例において、細胞接着、生存率及び増殖に関して、ｈＢＳ細胞を支持細胞欠如環境へ移すための、機械的あるいは酵素的解離による異なる技術を研究した。その上、未分化ｈＢＳ細胞の均質集団における長期間の増殖及び大規模な生産を促進するために、その方法を改良した。ｈＢＳ細胞の凍結／解凍における従来の冷凍保存技術を利用したものも実験した。
【０１２６】
ｈＢＳ細胞の支持細胞欠如増殖への移送
内細胞塊を切開後、内細胞塊細胞は支持細胞で共培養され胚盤胞由来幹（ＢＳ）細胞系を得る。ｈＢＳ細胞系を得た後、その細胞系は細胞量を増大させるために任意的に増殖される。
【０１２７】
支持細胞欠如システムにおいてｈＢＳ細胞系を増殖させる前にｈＢＳは支持細胞欠如システムに移送される。
【０１２８】
上述のように、また支持細胞欠如実施例において実験されるように、ｈＢＳ細胞系の増殖において成功する重要な因子はｈＢＳ細胞が支持細胞培地系から支持細胞欠如培地系に移される方法にある。従って、ｈＢＳ細胞は、切断ツールとしてガラス毛細管を使用して行われる、機械的解離により支持細胞欠如培地系に移さなければならない。ここでの実施例に示すように、機械的解離を実施したものは、酵素処理した培地と比較すると、細胞のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭへの接着が非常に効率的であり、より迅速な増殖率を有し、更に細胞が継代の間非常に高い安定性を有する結果が得られた。従って、本発明に関するＨＳ細胞を移送方法は酵素処理をほとんど必要としない。ここに示す実施例から、支持細胞欠如条件下で培養され且つ増殖された細胞は支持細胞のある条件下で成長した細胞のものと同様な分裂指数を有する。
【０１２９】
胚盤胞由来幹細胞系の増殖は支持細胞欠如成長条件下で幹細胞を培養することからなり、支持細胞欠如状態でｈＢＳ細胞を培養することは非常に多くの利点があり、例えば、支持細胞の継続的な生産の必要性がなくなり、ｈＢＳ細胞の生産は量産まで規模拡大し易くなり、更に支持細胞からのＤＮＡ転移の危険性あるいは別の感染の危険性がなくなる。
【０１３０】
すなわち、支持細胞欠如条件下での移送及び増殖工程は以下の工程からなり、
ａ）胚盤胞由来幹細胞を機械的処理により支持細胞から支持細胞欠如培地へ移送し、
ｂ）任意的に、適切な成長培地および／または適切な支持基質における支持細胞欠如成長条件下で胚盤胞由来幹細胞を培養し、
ｃ）任意的に、胚盤胞由来幹細胞系を酵素および／または機械的処理により３〜１０日ごとに継代する工程から構成される。
【０１３１】
通常は、ｉ）−ｉｉｉ）の工程は全て含まれる。
【０１３２】
支持細胞培養系から支持細胞欠如培養系へのｈＢＳ細胞の移送
移送工程は上述のように非常に重要な工程であることが分かった。従って、移送は機械的解離あるいは支持細胞培養系における細胞の機械的切開により行われる。この機械的処理は先細端部を有し切断に適切な大きさを有するツールとしての適切な切断ツールにより実施される。このツールはプラスチックあるいはガラス製などの適切な材料で製作され、更に適切なツールの例として、除菌された先細ガラス毛細管であり、これは２５°の角度で２００あるいは３００マイクロメータのルーメンを備え、ｈＢＳコロニーあるいはｈＢＳコロニーの部分を切断、操作及び移送するために設計される。これはＳｗｅｍｅｄ  Ｌａｂ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｂｉｌｌｄａｌ，スウェーデン製である。
【０１３３】
移送されるｈＢＳ細胞はｈＢＳ細胞コロニーであり更に切片はコロニーの中心部から切除され更に細胞集合体として適切な培地中に懸濁される。細胞集合体は機械的に１回以上、例えば細胞集合体が元のコロニーの大きさの少なくとも５０％、例えば最大およそ４０％、最大およそ３０％、最大およそ２０％、最大およそ１０％あるいは最大およそ５％の大きさを有するまで解離される。その大きさは例えば、集合体あるいはコロニーの直径でそれぞれ決定される。
【０１３４】
この支持細胞欠如実施例において、移送方法に関する適切な条件を示す。これらの条件は適切な範囲内で変化可能であり、これは当業者の公知の範囲内である。
【０１３５】
支持細胞欠如実施例１
支持細胞欠如培地用に調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地（ｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地）の生成
ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地を調節するためのｍＥＦ細胞を生成する際、ｍＥＦ細胞（継代２回）の融合性単層はマイトマイシンＣ処理を行い、更にダルベッコ改良イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）に１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＳＴ；１００００Ｕ／ｍｌ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２ｍＭのＧＬＵＴＡＭＡＸＴＭ−Ｉ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２００ｍＭ）；これらは全てＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ製、を追加したものが含まれる、ゼラチン（０．１％；シグマ）で被覆した培養瓶において、５９０００細胞／ｃｍ２の濃度で播種された。２４時間の培養周期及び１回ＰＢＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）洗浄後、培地は廃棄され、更にＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地（０．２８ｍｌ／ｃｍ２）に２４時間の調整期間で置換された。この調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地（ｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地）は同一のｍＥＦ培地（継代２回目）から３回まで毎日収集され、更に０．２μｍの低タンパク質結合フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｌａｎｄｓｋｒｏｎａ，スウェーデン）を使用して除菌された。このｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地はそのままかあるいは−２０℃で凍結して使用され且つ４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（ＧＩｂｃｏＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で懸濁された後に使用された。このｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地は＋４℃で貯蔵されている場合には１週間まで使用可能である。−２０℃で２ヶ月まで貯蔵される場合、使用において生物反応度の減少は全く見られない。
【０１３６】
支持細胞欠如実施例２
ｈＢＳ細胞系の支持細胞欠如増殖条件への移行
最初のｈＢＳ細胞系は１０〜５０継代したマイトマイシンＣ処理マウス支持細胞に保持され、ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ−培地に４ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を追加して培養された。
【０１３７】
ｈＢＳ細胞は支持細胞存在培地からＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ被覆プレートに移行する際、２つの異なる技術、１つは機械的解離、もう一つはコラゲナーゼ処理により実施されて評価された。ｈＢＳ細胞は幹細胞切断ツール（Ｓｗｅｍｅｄ  Ｌａｂ  ＡＢ，Ｂｉｌｌｄａｌ，スウェーデン）を使用して、コロニーの中央部が示される、方形切片で切断され、更に注意深く切り離され、更にその細胞をＨＢＳＳ溶液に移された。幹細胞ツールは除菌された先細のガラス毛細管であり、２５°の角度及び２００あるいは３００のマイクロメータルーメンを有し、ｈＢＳコロニーあるいはｈＢＳコロニーの部分を切断、操作及び移送用に設計される。これはＳｗｅｍｅｄ  Ｌａｂ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ，Ｂｉｌｌｄａｌ，スウェーデンにより製造される。
【０１３８】
コラゲナーゼによる酵素処理（比較用）
ＨＢＳＳで洗浄後、細胞集合体は酵素的解離のためコラゲナーゼＩＶ溶液（２００Ｕ／ｍｌ；シグマ）に移された。これら細胞は３０分間、３７℃で５％ＣＯ２において培養された。培養期間の間、ピペットで機械的解離を繰り返し、更に解離工程はインバータ顕微鏡で観察された。培養周期後、細胞懸濁液は沈殿され（４００Ｇで５分間）、更にＫｎｏｃｋＯＵＴＴＭＤ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回洗浄された後ｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳ培地に再懸濁された。
【０１３９】
本発明における機械的解離
ＨＢＳＳで洗浄後、細胞集合は注意深く１−ｍｌ自動ピペットを使用して機械的に解離した。この解離工程は細胞集合体の大きさが上述したコラゲナーゼＩＶ処理により生成された細胞集合体の大きさに相当する、元のコロニー（平均２００００細胞／元のコロニー）の大きさのおよそ１／１０−１／２０を示す時に終了した。ＨＢＳＳで洗浄後、コロニーはコラゲナーゼＩＶ溶液中（２００Ｕ／ｍｌ）に移送され酵素解離を開始させた。２つの異なる技術に対し、細胞は４ウェル毎に播種され更に３７℃で５％ＣＯ２において培養された。各実験は４回繰り返され、毎回同量の細胞が播種された。２日及び６日後にコロニーの大きさ及び数が計測された。
【０１４０】
支持細胞欠如実施例１及び２の結果
支持細胞存在下条件から支持細胞欠如条件下へのｈＢＳ細胞の移送を最適化するために、２つの異なる技術；１つは機械的解離でもう１つは酵素解離が評価された。機械的解離は、酵素処理培地と比較して、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭへの細胞接着がより効果的であり、且つより迅速な増殖を示した。機械的解離と酵素解離とを比較すると、非常に多量な数の生存コロニーがプレーティング後２日目で観察された（図５）。２つの異なる技術でそれぞれ解離後、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上で生成された全てのコロニーの総面積をそれぞれ比較した（Ｐ＜０．００１）。更に、機械的解離された培地におけるコロニー総面積はプレーティング後６日目で、酵素解離された培地と比較して有意に増加した（Ｐ＝０．０３６）。
【０１４１】
支持細胞欠如実施例３
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上に培養されたｈＢＳ細胞の培地及び継代
４つの異なる細胞系ＳＡ００２，ＡＳ０３８，ＳＡ１２１及びＳＡ１６７は全ての実験に使用された。これら細胞系はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上で３５継代まで増殖され更に凍結／解凍の１サイクル後でさえ、形態的外観及び保持された別のｈＢＳ特性に関して変化がなかった。全ての培地は分化の形態的兆候のない、ｈＢＳ細胞の明瞭なコロニーから構成された。約３〜５日後、培地を取り除くことにより継代され、１ｍｌのコラゲナーゼＩＶ溶液（２００Ｕ／ｍｌ）が各ウェルに追加され、１５〜２０分間培養された。表面から細胞の分離を促進するために、機械的解離を実施した後、更に１５分間培養された。その細胞は次に洗浄した後、ｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地で再懸濁され、更にＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上に１：２から１：６の分割比で播種された。ｈＢＳ培地は５〜６日毎に継代され、更に培地は２日から３日目毎に交換された。
【０１４２】
支持培地欠如実施例３の結果
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上に確立されたｈＢＳ細胞の継代の間、コラゲナーゼＩＶによる酵素処理は表面からコロニーを分離するために必要であることが分かった。継代の間の酵素処理は更に機械的解離と比較して、播種後増殖率を増加させることが分かった。
【０１４３】
支持細胞欠如実施例４
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上に培養されたｈＢＳ細胞の冷凍保存及び解凍法
４つの異なる細胞系、ＳＡ００２、ＡＳ０３８、ＳＡ１２１及びＳＡ１６７は２０〜３０分間コラゲナーゼＩＶにより処理され細胞を互いに分離した後に冷凍された。遠心分離後細胞は冷凍培地に移送され、これは１ｍｌ冷凍培地当り１００万個の細胞の濃度を有する、１０％ＤＭＳＯ、３０％血清代替物及び４ｎｇ／ｍｌｂＦｇＦを含有するｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地からなる。最終的な細胞懸濁液は単一細胞及び細胞集合体の混合物であった。この冷凍管（０．５〜１．０ｍｌの細胞懸濁液）はＮａｌｇｅｎｅ冷凍コンテナに迅速に移され、８０℃で一晩あるいは少なくとも２時間貯蔵され、その後液体窒素中に長期間保存された。
【０１４４】
ｈＢＳ細胞の解凍
ｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地は調整され更に予備加熱された後、全ての細胞懸濁液が解凍されるまでその冷凍管を３７℃の水槽中に配置することによりその細胞は解凍された。この細胞懸濁液は予備加熱された培地に移され５分間後に、遠心分離された（４００Ｇ、５分間）。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの薄層被覆された（ＢＤ）ウェルは、１ｍｌのｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地をウェルに加えることにより水分補給され、更に３７℃で３０分間培養された。細胞ペレットはｋ−ＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ培地において再懸濁され更に２４−ウェルあるいは６−ウェルＭａｔｒｉｇｅｌＴＭプレートに移された。
【０１４５】
支持細胞欠如実施例５
支持細胞欠如状態で培養されたｈＢＳ細胞の特性決定
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培地で確立後且つ冷凍／解凍の１サイクル後に全ての特性決定実験が実施された。
【０１４６】
免疫細胞化学：培地は上述のように継代され、６−ウェルあるいは２４−ウェルＭａｔｒｉｇｅｌＴＭプレートに播種され更に６日間培養した後免疫染色を実施した。この培地はＰＢＳで洗浄され、４％のホルムアルデヒド（ＨｉｓｔｏＬａｂ，イェーテボリ，スウェーデン）で室温にて１５分間で固定され、次にＰＢＳで再び３回洗浄された。モノクロナール一次抗体はＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、及びＳＳＥＡ−４（１：２００；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏｗａ，ｌｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１（１：２００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、及び多クローン性ウサギ抗−Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３（１：１５０；ＫｅＬａｂ，Ｕｐｓｔａｔｅ）に対して直接的に使用された。この一次抗体は４℃で一晩培養された後およそＣｙ３−あるいはＦＩＴＣ−共役二次抗体（１：３００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して視覚化された。培地はまた４’−６’Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  スウェーデンＡＢ，ストックホルム，スウェーデン）で室温で５分間０．５μｇ／ｍＬの終末濃度で室温にて培養され全ての細胞核を視覚化された。染色された培地はＤＡＫＯ蛍光封入剤（Ｄａｋｏｐａｔｔｓ  ＡＢ，Ａｌｖｓｊｏ，スウェーデン）を使用してすすがれ且つ封入され更にインバータ蛍光顕微鏡（ニコンエクリプスＴＥ２０００−Ｕ）で視覚化された。市販キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して製品指示書に従って、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培養ｈＢＳ細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色を実施した。
【０１４７】
テロメラーゼ活性：ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培養ｈＢＳ細胞は集菌され、溶解され、更にテロメラーゼ活性を製品指示書に従って、ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，マンハイム，ドイツ）により分析された。
【０１４８】
染色体分析及びＦＩＳＨ：染色体分析用のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ増殖ｈＢＳ細胞はコルセミド（ｃｏｌｃｅｍｉｄ）（０．１μｇ／ｍｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で１〜３時間培養され、分離され、固定され、ガラススライド上に載せられ、更に改良Ｗｒｉｇｈｔｓ染色法（＃ＷＳ−３２，Ｓｉｇｍａ）を使用して染色体が視覚化された。中期板の生成は前述したように実施された。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析に関して、第１３，１８，２１染色体及び性染色体（Ｘ及びＹ）用プローブとを含有する市販キット（ＭｕｌｔｉＶｙｓｉｏｎＴＭＰＢ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｕｒ  Ｐｒｏｂｅ  Ｐａｎｅｌ；Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を製品指示書に従って使用した。スライドは適切なフィルター及びソフトウェア（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）が装備されるインバータ顕微鏡を使用して分析された。
【０１４９】
奇形腫：奇形腫形成実験に関して、免疫不全ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ｌｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄＢＲ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ドイツ）を使用した。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ増殖ｈＢＳ細胞コロニーはコラゲナーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）を使用して表面から酵素的に切り離され、小細胞集合体に機械的に分離され更におよそ５００００〜１０００００細胞／器官は腎臓被膜下に注射された。対照動物が冷凍ＰＢＳ注射あるいは同腹子由来原発性脳細胞で処理された。これらの動物は注射後８週間して解剖され更にその腫瘍を４％パラホルムアルデヒド溶液に迅速に固定され更にパラフィン包埋された。組織学的分析に対して、奇形腫は８μｍに切断され、更にＡｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ／Ｖａｎ  Ｇｉｅｓｓｏｎで染色された。
【０１５０】
Ｏｃｔ−４発現のＲＴ−ＰＣＲ分析：全てのＲＮＡは製品指示書に従いＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して４つ全てのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培養ｈＢＳ細胞系から単離された。そのｃＤＮＡはＡＭＶファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ロシュ）を使用して全ＲＮＡのうち１μｇから合成され、更にＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応が実施された。ＰＣＲ反応は４つの初期ステップ−ダウンサイクルが含まれ、アニール温度ごとにサイクルを二回繰り返し、９４℃で１５秒間変性され、６６〜６０℃で１５秒間アニ−ル温度で処理され、更に７２℃で３０秒間延長された。下記のサイクルは５８℃のアニール温度で３５回繰り返された。Ｏｃｔ−４の前方向及び逆方向へのプライマー配列は前述した。β−アクチンプライマーは内部制御として使用された（センス，５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣ−３’；アンチセンス、５’−ＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣ−ＡＣＧＣ−３’；４００ｂｐ製品）。このＰＣＲ生成物は１．５％アガロースゲルを使用してゲル電気泳動によりサイズ分画された。ヒトの肝臓はＰＣＲ反応に関して、正の制御として利用され、水は負の制御として利用された。
【０１５１】
支持細胞欠如実施例４及び５の結果
細胞系ＳＡ００２、ＡＳ０３８，ＳＡ１２１及びＳＡ１６７は冷凍保存技術を利用して冷凍及び解凍され、特性に関する変化が見られるかどうかにつき調べた。解凍後全ての４つの細胞系は生存し、更にＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ被覆プレート上で同様な形態で成長を開始した。
【０１５２】
支持細胞欠如条件において４つの異なるｈＢＳ細胞系の多能性及び保守性につき実験し、更に各細胞系を支持細胞培養した前述の結果と比較した。これらの特性決定は、形態、未分化マーカーの発現、テロメラーゼ活性、核型、及び生体内の分化を調べることにより実施された。
【０１５３】
免疫細胞化学：ＳＳＥＡ−１発現は、支持細胞欠如条件で培養されたｈＢＳ細胞系全てにおいて陰性であったのに対し、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ１−８０に対する抗体で染色するとｈＢＳ細胞の多能性を示す明らかな陽性免疫反応を示した。更に、それらの細胞は４つ全てのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ増殖細胞系において高いレベルのＡＰ反応性を示した。
【０１５４】
テロメラーゼ活性：３つのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培養ｈＢＳ細胞系（ＡＳ０３８，ＳＡ１２１、及びＳＡ１６７）により分析された。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭで培養されたｈＢＳ細胞は高いレベルのテロメラーゼ活性を有することが分かった。
【０１５５】
染色体分析及びＦＩＳＨ：染色体分析は２つのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培養ｈＢＳ細胞系、ＡＳ０３８及びＳＡ１２１で実施された。細胞系ＡＳ０３８由来の３つの細胞の内の３つ及び細胞系ＳＡ１２１由来の１２の細胞の内の１０が正常なヒトの４６，ＸＹ核型を有することが分かった（図１０）。ＳＡ１２１細胞系由来の残りの２つの細胞は４５，ＸＹ及び４２，ＸＹの異常な核型を発現した。しかしながら、核型変化は支持細胞存在培地及び支持細胞欠如培地の両方において長期培養後には通常生じる事象である。本実験において支持細胞存在培養されたｈＢＳ細胞の核型分析はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ増殖後の結果と比較され、これはｈＢＳ細胞の核型がこれらの支持細胞欠如条件下で正常性及び安定性を維持していることを示した。ＦＩＳＨ分析は２つのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ増殖された細胞系（ＳＡ１２１（ＸＹ）及びＳＡ１６７（ＸＸ））で実施された。Ｘ、Ｙ、第１８，１３及び２１染色体に対して分析された。試験された両方の細胞系に対して、少なくとも９３％は正常であった。ＦＩＳＨ分析による結果は支持細胞培養されたｈＢＳ細胞系の結果と比較された。
【０１５６】
奇形腫形成：奇形腫形成は２つのＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ培養ｈＢＳ細胞系、ＳＡ１６７及びＳＡ００２に対して実施され、その結果、奇形腫は３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）全てを表す分化した細胞及び組織から形成され、このことはＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ増殖ｈＢＳ培地がそれ自体の多能性を維持した証拠を示した。
【０１５７】
Ｏｃｔ−４発現：Ｏｃｔ−４発現はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ上に培養された４つ全ての細胞系において高かった。
【０１５８】
支持細胞欠如実施例６
胚性マウス支持細胞上に培養されたｈＢＳ細胞に対するＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ被覆プレート上での支持細胞欠如条件下で培養されたｈＢＳ
【０１５９】
細胞の分裂指数の比較
細胞系ＳＡ１２１はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ被覆プレート上での支持細胞欠如条件下及び胚性マウス支持細胞上で３日間並行して培養された。次に有糸分裂時の細胞数はリン酸化ヒストンＨ３に対する核免疫反応により定量化された。両方の培地におけるこの分裂指数は計測され、支持細胞欠如条件で培養されたｈＢＳ細胞及び支持細胞存在下で培養されたｈＢＳ細胞の増殖率を比較した。
【０１６０】
実施例６の結果
分裂指数は支持細胞存在条件下に対する支持細胞欠如（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ）条件下にて成長させた培地間では類似していた。支持細胞欠如培地における倍増時間は支持細胞存在下増殖ｈＢＳ細胞における倍増時間とおよそ同じ（約３５時間）であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ヒトＢＳ細胞系ＳＡ００１におけるガラス化及び失透後の解凍回復を示す。
【図２】ヒトＢＳ細胞系ＳＡ００２におけるガラス化及び失透後の解凍回復を示す。
【図３】ヒトＢＳ細胞系ＳＡ０３４におけるガラス化及び失透後の解凍回復を示す。
【図４】（Ａ）−（Ｃ）は、ガラス化直前のマウス胚性支持細胞上に培養されたヒトＢＳ細胞系ＳＡ００１の典型的形態を示す。
【図５】（Ａ）−（Ｃ）は、失透後第一継代におけるマウス胚性支持細胞上に培養されたヒトＢＳ細胞系ＳＡ００１の典型的形態を示す。
【図６】第１８継代（Ａ）、第２３継代（Ｂ）、第２９継代（Ｃ）及び第３５（Ｄ）継代における、マウス胚性支持細胞上に培養された失透後のヒトＢＳ細胞系ＳＡ００１の典型的形態を示す。
【図７】（Ａ）ヒトＢＳ細胞コロニー[ｐ１９]、（Ｂ）ＳＳＥＡ−１［ｐ３１］、（Ｃ）ＳＳＥＡ−３［ｐ３１］、（Ｄ）ＳＳＥＡ−４［ｐ３１］、（Ｅ）ＴＲＡ−１−６０［ｐ３１］、（Ｆ）ＴＲＡ−１−８１［ｐ３１］、（Ｇ）Ｏｃｔ−４［ｐ３１］、（Ｈ）ＡＬＰ［ｐ３１］を示す。
【図８】ガラス化後の細胞系ＳＡ００１における核型を示す。
【図９】（Ａ）β−ＩＩＩ−チューブリン、（Ｂ）デスミン、（Ｃ）α−フェトプロテイン、（Ｄ）ＨＮＦ−３βで失透された第２９継代のヒトＢＳ細胞（ＳＡ００１）の生体外分化を示す。
【図１０】（Ａ）内胚葉（腺上皮）、（Ｂ）中胚葉（軟骨組織）、（Ｃ）外胚葉（神経外胚葉）における、第１９継代ヒトＢＳ細胞（ＳＡ００１）の生体内分化を示す。
【図１１】凍結用に調整された閉塞ストロー付属シリンジを示す。
【図１】
2006525006.tif 000007
【図２】
2006525006.tif 000008
【図３】
2006525006.tif 000009
【図４】
2006525006.tif 000010
【図５】
2006525006.tif 000011
【図６】
2006525006.tif 000012
【図７】
2006525006.tif 000013
【図８】
2006525006.tif 000014
【図９】
2006525006.tif 000015
【図１０】
2006525006.tif 000016
【図１１】
2006525006.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月24日(2005.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞を第１溶液（溶液Ａ）に移し、
ｉｉ）任意的に第１溶液の細胞を培養し、
ｉｉｉ）工程ｉ）あるいはｉｉ）で得られた細胞を第２溶液（溶液Ｂ）に移し、
ｉｖ）任意的に第２溶液の細胞を培養し、
ｖ）工程ｉｉｉ）あるいはｉｖ）で得られた少なくとも２０μｌの細胞を一つ以上の閉塞ストローに移し、
ｖｉ）一つ以上の閉塞ストローをシールし、さらに
ｖｉｉ）一つ以上の閉塞ストローをガラス化する工程から構成されることを特徴とするｈＢＳ細胞あるいはｈＢＳ細胞由来細胞のガラス化法。
【請求項２】
工程ｖ）において移された細胞の容量は約２０μｌ〜約２５０μｌ、例えば、約２０μｌ〜約２２５μｌ、約２５μｌ〜約２００μｌ、約２５μｌ〜約１７５μｌ、約２５μｌ〜約１５０μｌ、約３０μｌ〜約１２５μｌ、約３０μｌ〜約１００μｌ、約３５μｌ〜約７５μｌ、約４０μｌ〜約５０μｌであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｈＢＳ細胞はｈＢＳ細胞系であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
第１及び第２溶液の内の少なくとも一つは一つ以上の抗凍結剤からなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、プロパンジオール、及びまたはそれらの混合物からなるグループから選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
第１及び第２溶液は同一あるいは異なる一つ以上の抗凍結剤を含有することを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
第１及び第２溶液の一つ以上の抗凍結剤の濃度は同一または異なることを特徴とする請求項４乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第２溶液中の抗凍結剤の全濃度（％ｖ/ｖ、％ｗ/ｗ、あるいはＭで計測される）は第１溶液中の抗凍結剤の全濃度よりも高いことを特徴とする請求項４乃至７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
抗凍結剤はトレハロースであることを特徴とする請求項４乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
トレハロースの濃度は約０．０２Ｍ〜約１Ｍであり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
抗凍結剤はスクロースであることを特徴とする請求項４乃至８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
スクロースの濃度は約０．０２Ｍ〜約１Ｍであり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．３Ｍ〜約０．６５Ｍ、約０．４Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．４５Ｍ〜約０．５５Ｍであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第１及び第２溶液の少なくとも一つは粘度調整剤からなることを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
粘度調整剤はフィコール、パーコール、ヒアルロン酸、アルブミン、ポリビニルピロリドン、アルギニン酸、ゼラチンおよびグリセロールからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
粘度調整剤はフィコールであることを特徴とする請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
フィコールの濃度は、最大で約１５０ｍｇ／ｍｌ、例えば最大で１００ｍｇ／ｍｌ、最大で５０ｍｇ／ｍｌ、最大で２５ｍｇ／ｍｌ、最大で１５ｍｇ／ｍｌ、あるいは最大で１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
第１及び第２溶液は同一か異なる一つ以上の粘度調整剤を含むことを特徴とする請求項１３乃至１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
第１及び第２溶液中の一つ以上の粘度調整剤の濃度は同一か異なることを特徴とする請求項１３乃至１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
第１及び第２溶液の少なくとも一つは水溶液であることを特徴とする請求項１乃至１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程ｉｉ）が含まれることを特徴とする請求項１乃至１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
培養は約３７℃で一定期間の５秒から約２０分間、例えば約１０秒〜約１５分間、約１５秒〜約１０分間、約２０秒〜約７．５分間、約３０秒〜約５分間、約４０秒〜約４分間、約５０秒〜約３分間、約３０秒〜約２分間、約４５秒〜約１．５分間あるいは約１分間で実施されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
工程ｉｖ）が含まれることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
培養は約３７℃で一定期間の５秒から約１０分間、例えば、約１０秒〜約７．５分間、約１０秒〜約５分間、約１５秒〜約４分間、約１５秒〜約３分間、約１５秒〜約２分間、約２０秒〜約１分間、約５秒〜約１分間、約５秒〜約３０秒間あるいは約１０秒〜約３０秒間で実施されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
培養は約３７℃で約３０秒間あるいはそれ未満で実施されることを特徴とする請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
約５０％あるいはそれ以上、例えば約５５％あるいはそれ以上、約６０％あるいはそれ以上、約６５％あるいはそれ以上、約７０％あるいはそれ以上、約７５％あるいはそれ以上、約８０％あるいはそれ以上、約８５％あるいはそれ以上、約９０％あるいはそれ以上、あるいは約９５％あるいはそれ以上の細胞が失透後に生存可能であり適切な培地で培養されることを特徴とする請求項１乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１乃至２５のいずれかに記載の方法によりガラス化が施された細胞。
【請求項２７】
更に、
ｖｉｉｉ）一つ以上のガラス化された閉塞ストローを室温から約４０℃までの温度を有する環境に、閉塞ストローの内容物が解凍されるまでの一定期間おかれ、
ｉｘ）一つ以上の閉塞ストローを開口し、
ｘ）一つ以上の開口された閉塞ストローに含有される細胞を第３溶液（溶液Ｃ）を使用する洗浄処理を行い、
ｘｉ）任意的に、工程ｘ）から得られた洗浄された細胞を第４溶液（溶液Ｄ）に移し、更に
ｘｉｉ）任意的に、第４溶液中の細胞を培養し、
ｘｉｉｉ）任意的に、工程ｘｉｉ）の細胞を第４溶液から移し更に支持細胞上にこれらの細胞を播種し、更に
ｘｉｖ）任意的に、更に細胞を培養する
ことから構成される方法により失透化される請求項１乃至２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
工程ｘｉ），ｘｉｉｉ）及びｘｉｖ）が含まれることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
更に工程ｘｉｉ）が含まれることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
第３及び／または第４溶液（関連する場合）は一つ以上の抗凍結剤を有することを特徴とする請求項２７乃至２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、プロパンジオール、及びまたはそれらの混合物からなるグループから選択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
一つ以上の抗凍結剤はグリセロール、トレハロース、スクロース、またはそれらの混合物からなるグループから選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
抗凍結剤の濃度は約０．０２Ｍ〜約１Ｍであり、例えば約０．０５Ｍ〜約０．９Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．８Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．７Ｍ、約０．１Ｍ〜約０．６Ｍ、約０．１５Ｍ〜約０．５Ｍ、約０．２Ｍ〜約０．４Ｍであることを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
第３溶液中の抗凍結剤の濃度は関連する場合、第４溶液中の抗凍結剤の濃度より高いことを特徴とする請求項２７乃至３３のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2006525006.tif 000018
2006525006.tif 000019
2006525006.tif 000020
2006525006.tif 000021