(57)【要約】【課題】  高い走査速度と改善されたＳ／Ｎ比で検出する走査顕微鏡の提供。【解決手段】  本発明は、対象物（１）を結像するための走査型顕微鏡であって、光源（２）と、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択素子（８）と、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択性検出装置（４）と、光源（２）から対象物（１）まで延在する照明ビーム路（３）と、対象物（１）から検出装置（４）まで延在する検出ビーム路（５）とを有し、スペクトル選択素子（８）により光源の光が対象物照明のために選択可能であり、スペクトル選択素子（８）により、対象物（１）で反射および／または散乱された光源（２）の選択光が検出ビーム路（５）から分離可能であり、検出ビーム路（５）に延在する光の少なくとも１つの波長領域がスペクトル選択性検出装置（４）により検出可能である走査型顕微鏡に関する。そして対象物（１）を高い走査速度と改善されたＳ／Ｎ比の下で検出するために、照明ビーム路（３）と検出ビーム路（５）とは共焦点スリットスキャナのように構成されている。
2006510926.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物（１）を結像するための走査型顕微鏡であって、光源（２）と、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択素子（８）と、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択性検出装置（４）と、光源（２）から対象物（１）まで延在する照明ビーム路（３）と、対象物（１）から検出装置（４）まで延在する検出ビーム路（５）とを有し、
スペクトル選択素子（８）により光源の光が対象物照明のために選択可能であり、
スペクトル選択素子（８）により、対象物（１）で反射および／または散乱された光源（２）の選択光が検出ビーム路（５）から分離可能であり、
検出ビーム路（５）に延在する光の少なくとも１つの波長領域がスペクトル選択性検出装置（４）により検出可能である形式の走査型顕微鏡において、
照明ビーム路（３）と検出ビーム路（５）とは共焦点スリットスキャナのように構成されている、ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
照明ビーム路（３）には照明スリット絞り（１１）が設けられていることを特徴とする請求項１記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
検出ビーム路（５）には検出スリット絞り（１３）が設けられていることを特徴とする請求項１または２記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
照明スリット絞り（１１）および／または検出スリット絞り（１３）のスリット長および／またはスリット幅は可変調整可能であることを特徴とする請求項２または３記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
照明スリット絞り（１１）および／または検出スリット絞り（１３）は可動配置された絞り（１６，１７，１８，１９）を含み、
有利には各絞り（１６，１７，１８，１９）の辺が照明スリット絞り（１１）ないしは検出スリット絞り（１３）のスリットを形成することを特徴とする請求項４記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
照明スリット絞り（１１）および／または検出スリット絞り（１３）にはそれぞれ１つのズーム光学系（２２）が配属されており、該ズーム光学系によって照明スリット絞り（１１）ないしは検出スリット絞り（１３）の有効スリット幅および／または有効スリット長が可変であることを特徴とする請求項４または５記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
スペクトル選択素子（８）は制御可能なアクティブ光学部材を含み、該アクティブ光学部材は有利にはＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）またはＡＯＤ（音響光学デフレクタ）であることを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
スペクトル選択性検出装置（４）は、検出ビーム路（５）に延在する光をスペクトル分解するための、有利にはプリズムの形態の、手段（２３）と、第１検出器（６）によって検出するために第１スペクトル領域（２５）を選択するための手段（２４，４０）と、第２検出器（７）によって検出するために、選択されなかったスペクトル領域の少なくとも一部を反射するための手段（２４，４０）とを有することを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項９】
検出装置（４）は面状またはライン状の検出器（６，７，３２，３４）を有し、該検出器はその面形状またはライン形状に相応する位置分解能を有することを特徴とする請求項１から８までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項１０】
検出器（６，７，３２，３４）はＣＣＤ素子を含み、該ＣＣＤ素子はＣＣＤアレイまたはＣＣＤラインの形態に構成されていることを特徴とする請求項９記載の走査型顕微鏡。
【請求項１１】
検出ビーム路（５）には検出装置（４）の検出器（６，７，３２，３４）の前方に、有利には可変の、適合光学系が配置されており、該適合光学系によって、検出すべきスペクトル領域の光ビームの形状が検出器形状に適合可能であることを特徴とする請求項１０記載の走査型顕微鏡。
【請求項１２】
検出ビーム路（５）には検出装置（４）の検出器（３２，３４）の前方に、光をまとめるための手段（３３）が配置されており、該光をまとめるための手段は実質的にライン状または合焦された光ビームを形成することを特徴とする請求項１０または１１記載の走査型顕微鏡。
【請求項１３】
光をまとめるための手段（３３）は、レンズ、プリズム、グリッドまたはホログラムを有することを特徴とする請求項１２記載の走査型顕微鏡。
【請求項１４】
検出装置（４）の検出器（６，７，３２，３４）は、μｓ領域またはｎｓ領域にある読み出し速度を有し、これにより有利には蛍光寿命実験および／または蛍光試料の減衰特性を時間的に分解することができることを特徴とする請求項１から１３までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項１５】
検出装置（４）の検出器（６，７，３２，３４）は、検出器を時間的に作動および非作動とすることができるアクティベーションユニットを有することを特徴とする請求項１４記載の走査型顕微鏡。
【請求項１６】
対象物または対象物マーキングに用いるマーカーのマルチフォトン励起を特徴とする請求項１から１５までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象物を結像するための走査型顕微鏡に関するものであり、この走査型顕微鏡は光源と、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択素子と、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択性検出装置と、光源から対象物へ延在する照明ビーム路と、対象物から検出装置へ延在する検出ビーム路とを有し、スペクトル選択素子によって光源の光を対象物照明のために選択することができ、スペクトル選択素子によって、対象物で反射および／または散乱された光源の選択光を検出ビーム路から分離（ausblenden）することができ、検出ビーム路に延在する光の少なくとも１つの波長領域をスペクトル選択性検出装置によって検出することができるもの、に関する。
【０００２】
走査型顕微鏡とは本発明の枠内で、結像すべき対象物が照明パターンによって走査される顕微鏡であると理解されたい。この走査過程は通常はメアンダ（ジグザグ）状に行われる。従って対象物はこの照明パターンにより、例えばブラウン管の画面上で電子ビームが偏向されるのと同じように走査される。
【背景技術】
【０００３】
とりわけ生物医学的適用では長い間、走査型顕微鏡、すなわち共焦点走査型顕微鏡が、従来の落射光顕微鏡または透過光顕微鏡と比較して、光軸に沿って良好な解像度が必要な場合に使用されている。共焦点走査型顕微鏡の構成および使用可能性に関しては、例えば刊行物「Handbook of biological confocal microscopy」,J. Pawley編, Plenum Press 1995 を参照されたい。
【０００４】
ドイツ特許出願ＤＥ４３３０３４７Ａ１およびＤＥ１９９０２６２５Ａ１の枠内では、従来の共焦点走査型顕微鏡の検出装置を、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択性検出装置により置換する手段が示されている。このために、従来の共焦点走査型顕微鏡の検出器の前方に配置された非撓性のカラーフィルタまたは干渉フィルタが、光ビームの少なくとも２つのスペクトル領域を選択および検出する相応の装置を使用することにより置換される。ここでは光ビームがまずプリズム、光学的グリッド、またはホログラムによりスペクトル分解される。次に、スペクトル分解された光から第１のスペクトル領域が、可動配置されたミラー絞りによって選択され、第１の検出器によって検出される。ミラー絞りに入射し、選択されなかった光は、第２の検出器による検出のために反射される。この点において、ドイツ特許出願ＤＥ４３３０３４７Ａ１およびＤＥ１９９０２６２５Ａ１に記載された装置によって、検出器に前置されたスペクトル調整手段としての非撓性フィルタを省略することが公知である。
【０００５】
ＤＥ１９９０６７５７Ａ１から、共焦点走査型顕微鏡の二色性ビームスプリッタまたは多色性ビームスプリッタを使用することのできる光学的装置が公知である。ここではほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択素子によって光源の光から対象物照明のために少なくとも１つの波長が選択され、対象物で反射および／または散乱されたレーザ光源の光が検出ビーム路から分離される。スペクトル選択素子として制御可能なアクティブ光学構成部材が使用される。この構成部材は例えばＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）またはＡＯＤ（音響光学デフレクタ）の形態に構成される。
【特許文献１】ＤＥ４３３０３４７Ａ１
【特許文献２】ＤＥ１９９０２６２５Ａ１
【特許文献３】ＤＥ１９９０６７５７Ａ１
【非特許文献１】「Handbook of biological confocal microscopy」,J. Pawley編, Plenum Press 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
とりわけ弱く蛍光発光する試料を観察する共焦点走査型顕微鏡では、対象物照明に用いられる光ビームが走査される対象点当たりで非常に短い滞留時間を有する。従って検出される対象点のＳ／Ｎ比が通常は非常に小さく、使用不可能なこともある。とりわけ生理学的適用では、生体試料を研究することが特に必要である。この場合、当然のことながら高速の運動過程が発生する。この運動過程は、対象物の検出画像を相応に高速に記録できる場合にだけ、意味のあるものとして検出することができる。このような高い検出速度によって通常は同様に、検出画像データに不満足なＳ／Ｎ比が生じる。
【０００７】
本発明の課題は、冒頭に述べた形式の走査型顕微鏡を改善し、対象物を走査速度が高い場合でも改善されたＳ／Ｎ比を以て検出できるように構成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の方法はこの課題を、請求項１の特徴部構成によって解決する。これによれば走査型顕微鏡は、照明ビーム路と検出ビーム路とが共焦点スリットスキャナのように構成されていることを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明によればまず、走査型顕微鏡による走査過程の並列化（Parallelisierung＝平行走査）により、対象物での照明光ビームの滞留時間が比較的に長くなり、これにより各対象点を比較的長い時間にわたり検出することができることを認識する。このことによりさらに、検出装置により検出される、対象物からの光のＳ／Ｎ比も向上する。対象物検出の並列化（ないし平行走査）は、照明ビーム路と検出ビーム路とを共焦点スリットスキャナのように構成することによって行われる。
【００１０】
ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択素子と、同様にほぼ無段階に可変調整可能な検出装置とは、従来の走査型顕微鏡では単にスポットスキャナ（Punktscanner）のように共焦点走査型顕微鏡として使用されている。すなわち、対象物は点状に走査され、スペクトル選択素子とスペクトル選択性検出装置とは点状の光ビームに対し作用する。しかしスペクトル選択素子とスペクトル選択性検出装置とはライン状の光ビームにも同じように作用することができる。従ってこれらの要素によって走査型顕微鏡を、共焦点スリットスキャナの意義（原理・形式）において実現することができる。
【００１１】
共焦点スリットスキャナでは、対象物がライン状の照明パターンにより、走査型顕微鏡の顕微鏡対物レンズの焦点面で照明される。検出ビーム路の特別の構成により、ライン状に照明された対象物領域から発する光だけが、例えば顕微鏡対物レンズの焦点面（合焦面）から発する光だけが検出される。共焦点スリットスキャナはライン状の対象物照明に対して横方向に共焦点を有する。ライン状の対象物照明の方向にはほとんど共焦点が存在しない。しかし対象物をライン状ないし線状に走査することにより、対象物を列ごとに点状走査する場合と比較して、対象点当たりの画像速度（Bildrate）が同じであれば比較的に長い照明時間と検出時間が達成される。このことにより特に有利には、弱く蛍光発光する試料または生体試料でも比較的良好なＳ／Ｎ比を以て検出することができる。
【００１２】
具体的実施形態では、照明ビーム路に照明スリット絞りが設けられている。ここで照明スリット絞りは有利には、顕微鏡対物レンズの焦点面に対応する面に配置されており、これにより照明側の照明スリット絞りが走査型顕微鏡の顕微鏡対物レンズの焦点面に結像される。これによりライン状の照明パターンが対象領域に発生する。対象物を走査するためにこのライン状の照明パターンを、例えば照明ビーム路に配置された旋回可能なミラーによって対象物に対して相対的に運動させることができる。このときミラーはこの照明ビーム路を適切に、顕微鏡対物レンズの入射瞳にある回転点で偏向（角度変更）させる。
【００１３】
共焦点スリットスキャナでの検出は次のようにして達成される。すなわち検出ビーム路に検出スリット絞りを設けるのである。検出スリット絞りは有利には検出ビーム路の、顕微鏡対物レンズの焦点面に対応する面に配置される。言い替えると、顕微鏡対物レンズはその焦点面に配置された対象物を、場合により顕微鏡対物レンズと検出スリット絞りとの間の検出ビーム路に配置された付加的光学系と共に、検出スリット面が配置された面に結像する。検出スリット面は、顕微鏡対物レンズの焦点面に対応する面に次のように配置されている。すなわち、対象物から到来する光だけが検出スリット絞りを通過することができるように配置されている。この光は顕微鏡対物レンズ焦点面のライン状照明領域から到来する。この点において、照明スリット絞りと検出スリット絞りに関しては共焦点構成（ないし関係）が存在する。
【００１４】
適用ごとに応じて照明パターンの形状を変更できるようにすることが必要な場合もある。例えば顕微鏡対物レンズの結像可能な全焦点面の一部だけが、例えば結像関心領域の形態で検出可能なこともあろう。このためにはライン状照明パターンの長さが相応に短縮される。またライン状照明パターンの幅が変化可能であれば、これにより最終的に走査型顕微鏡の結像解像度を、照明パターンの横方向に対して変化することができる。このためには、照明スリット絞りおよび／または検出スリット絞りのスリット長および／またはスリット幅を可変調整できるようにする。ここでスリット長とスリット幅の変化は有利には相互に独立して行う。すなわちスリット長が決まっている場合には、照明スリット絞りおよび／または検出スリット絞りのスリット幅だけが可変調整可能とする。共焦点結像は、照明スリット絞りと検出スリット絞りの両方がスリット長および／またはスリット幅の変化の際に同じように変化する場合に常に保証される。
【００１５】
具体的には照明スリット絞りおよび／または検出スリット絞りは可動に配置された絞りを含むことができる。例えば４つの矩形絞りの構成も考えられる。この４つの矩形絞りは一方の方向に移動ないしスライドすることができ、有利には電動駆動される。それぞれ２つ（一対）の絞りは、絞りのそれぞれ１つの辺ないしエッジを以て面内に相互に平行に配置することができる。このとき絞りの２つの辺ないしエッジの間を照明光ないし検出光が通過することができる。すなわちスリットは一方向に形成されている。他方の２つの絞りは、それぞれ絞りの辺ないしエッジを以て相互に垂直に配向し、実質的に同じ面に配置することができる。これによりこれら他方の２つの絞りはスリットに対して垂直の方向に沿ってスリットを画定する。この４つの絞りの構成によりスリット長を、照明スリット絞りおよび／または検出スリット絞りのスリット幅の変化に依存しないで変化させることができる。
【００１６】
スリット長および／またはスリット幅の変化は、それぞれ照明スリット絞りおよび／または検出スリット絞りに配属されたズームレンズによって行うこともできる。ここでズームレンズは次のように照明ビーム路ないし検出ビーム路に配置することができる。すなわち、相応のスリット絞りの有効スリット幅および／または有効スリット長が可変であるように配置することができる。
【００１７】
具体的には、それぞれの絞りから対象物までの照明ビーム路ないし検出ビーム路の全体倍率を変化させるズームレンズを使用することができる。ズームレンズは場合により、既に設定済みの構成群として相応のビーム路に使用することができ、これにより有利には個々の絞り部材の機械的調整が不要となる。
【００１８】
スペクトル選択素子は制御可能なアクティブ光学部材を含む。このことにより、相応の制御を前提としてスペクトル選択素子をほぼ無段階に調整することができる。基本的にはＤＥ１９９０６７５７Ａ１の実施形態から公知であり、そこに開示されたすべてのスペクトル選択素子を本発明の走査型顕微鏡に使用することができる。従ってＤＥ１９９０６７５７Ａ１の開示内容をここに明示的に引用し、その限りにおいて公知のものであることを前提とする。とりわけ有利にはスペクトル選択素子として２つのＡＯＴＦ結晶板を設け、そのうちの一方はアクティブ光学部材を形成し、このアクティブ光学部材には相応の超音波が印加される。他方のＡＯＴＦ結晶板は光学的に不活性な構成部材として第１のＡＯＴＦ結晶板に、検出ビーム路中で後置される。すなわち他方のＡＯＴＦ結晶板は、蛍光発光対象物から到来する蛍光光をスペクトル分解し、並びに第１のＡＯＴＦ結晶板による種々異なる偏光方向の分割を取り消すように配置される。このために第２のＡＯＴＦ結晶板は第１のＡＯＴＦ結晶板の長手軸を基準にして１８０°回転して配置されている。別の実施形態では、第２のＡＯＴＦ結晶板にも同様に超音波が印加される。この構成でこの結晶板は、第１のＡＯＴＦ結晶板により有効に反射されなかった残留光をさらに抑圧するために用いられる。
【００１９】
スペクトル選択性検出装置は、検出ビーム路に延在する光をスペクトル分解する手段を含む。有利にはこの手段はプリズムの形態に構成されている。或いはグリッドまたはホログラムを設けることもできる。さらにスペクトル選択性検出装置は、第１検出器により検出するために第１スペクトル領域を選択するための手段と、第２検出器により検出するために、選択されなかったスペクトル領域の少なくとも一部を反射するための手段とを有する。従って検出ビーム路に延在する光はまず、例えばプリズムの形態に構成されたスペクトル分解手段を通過してスペクトル分解されるか、ないしは空間的に扇状に広げられ、第１のスペクトル領域を選択するための手段に入射する。そしてスペクトル分解された光のうち、選択されなかったスペクトル領域の少なくとも一部を反射するための手段に入射する光は第２検出器へ反射される。スペクトル選択性検出装置は、ＤＥ４３３０３４７Ａ１およびＤＥ１９９０２６２５Ａ１から公知の実施形態に従って構成することができる。このドイツ特許出願の開示内容を明示的に引用し、その限りにおいて同様に公知のものであることを前提とする。
【００２０】
第１のスペクトル領域を選択するための手段、ないしは選択されなかったスペクトル領域の少なくとも一部を反射するための手段がスライド可能に配置された絞り、スリット絞り、および／またはミラー絞りによって実現されており、スライドないし機械的調整を少なくともほぼ無段階に行うことができる場合、ほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択性検出装置が得られる。
【００２１】
特に有利な実施形態では、検出装置は面状またはライン状の検出器を有する。この検出器はその面形状またはライン形状に相応する位置分解能を有する。このようにして面状またはライン状の検出器によって、検出スリット絞りを通過し、スペクトル分解され、選択された検出光を一度に検出することができる。面状の検出器が使用される場合、検出スリット絞りの長手側に対して平行な方向で、走査された対象物の位置情報が検出される。これに対して垂直方向では、各結像された対象点ごとに検出光のスペクトル成分が検出される。このスペクトル成分はスペクトル分解手段により空間的に扇状に広げられている。
【００２２】
具体的には検出器はＣＣＤ素子を含み、ＣＣＤ素子はＣＣＤアレイないしはＣＣＤチップの形態で、すなわち面状のＣＣＤ素子として、またはラインフォトマルチプライヤまたはＣＣＤラインの形態で、すなわちライン状のＣＣＤ素子として、または画像増幅器と組み合わせたＣＭＯＳ素子として構成することができる。
【００２３】
検出すべきスペクトル領域の光ビームの形状を検出器の形状に適合すべき場合、例えば面形状またはライン形状に適合すべき場合、検出ビーム路中で検出装置の検出器の前方に適合光学系を配置することができる。ここで適合光学系はレンズまたはレンズ構成体とすることができ、拡大、縮小、またはさらなる結像の作用を有する。有利には適合光学系は、例えばズーム光学系の形態で可変に構成されている。このことにより特に有利には、比較的空間寸法の小さい光ビームを面状またはライン状の検出器の全面ないしは全ラインに拡大することができる。
【００２４】
とりわけ検出光の検出のためにライン状の検出器が使用される場合には、検出ビーム路中で検出装置の検出器の前方に光をまとめるための手段を配置すると有利である。この手段は実質的にライン状の光ビームまたは集束された光ビームを形成する。光をまとめるための手段は、スペクトル選択性検出装置のスペクトル分解手段によるスペクトル分解または空間的に扇状の拡張を少なくとも十分に元に戻すか、ないしはスペクトル的に扇状に広げられた光を、ライン状の検出器により検出可能なラインに集束する。
【００２５】
光をまとめるための手段は、レンズ、プリズム、グリッドまたはホログラムを含むことができる。光をまとめる（zusammenfuehren）ための手段が１つのレンズを含んでいれば、空間的に扇状に広げられた光ビームは単に１つのラインだけに集束され、スペクトル分解は１つのレンズだけでは同様に完全には元に戻されない。しかし相応に配置されたプリズム、グリッドまたはホログラムを有する光学構成素子によって、検出装置のスペクトル分解手段によるスペクトル分解をほぼ完全に元に戻すことができる。これによりスペクトル的に扇状に広げられた光ビームは、光をまとめるための手段によってライン状の光ビームに移行し、これをライン状の検出器により検出することができる。
【００２６】
とりわけ蛍光寿命適用または光子計数適用に対しては、検出装置の検出器はμｓ領域またはｎｓ領域の読み出し速度を有することができる。相応の読み出し速度を有するライン状または線状の検出器は従来技術から公知であり、とりわけ蛍光試料の減衰特性を時間的に分解するような上記適用並びに爆発室へのガス注入実験で使用される。
【００２７】
とりわけ検出装置の検出器は、検出器を時間的に作動させ、また非作動とすることのできるアクティベーションユニットを有する。このようなアクティベーションユニットは、ＣＣＤアレイないしＣＣＤアレイないしチップまたはＣＭＯＳ増幅器では、タイムゲート回路によるｎｓ領域の読み出し速度によって実現される。このタイムゲート回路は検出器の検出を所定の時間窓内で可能にする。
【００２８】
特に有利な実施形態では、走査型顕微鏡がマルチフォトン顕微鏡の形態で構成されている。相応にして対象物ないしは対象物マーキングに用いるマーカーをマルチフォトン励起法によって励起し、検出することができる。このために適切な光源を設けるべきであり、例えばパルス状の光をほぼ赤外線領域で放射するレーザ光源を設けることができる。通常はこのためにチタン−サファイアレーザが使用される。さらにスペクトル選択素子並びにスペクトル選択性検出装置は次のように調整すべきである。すなわち２光子蛍光励起が７２０から１０００ｎｍの波長領域の波長の光によって行われ、これにより励起された蛍光光の検出が４００から６００ｎｍの領域で行われるように調整すべきである。チタン−サファイアレーザから放射される光のパルス持続時間は有利にはｐｓ領域にある。２光子蛍光の他に別の非線形作用を試料中に形成し、検出することができる。例えばより高次の高調波を形成することができ、例えば２次高調波または３次高調波を発生することができる。またはＣＡＲＳ（coherent anti-Stokes Raman Scattering、コヒーレント反ストークス・ラマン散乱）を形成することもできる。
【００２９】
本発明の技術思想を発展および改善するには種々の手段がある。これについては一方では請求項１に従属する請求項を、他方では図面に基づく本発明の有利な実施例の説明を参照されたい。図面に基づく本発明の有利な実施例の説明と関連して、一般的に有利な構成および改善形態を説明する。
【実施例】
【００３０】
図１は、対象物１を結像するための走査型顕微鏡を示す。走査型顕微鏡は、対象物１を対象物照明するためのレーザ光源２を有する。照明ビーム路３はレーザ光源２から対象物１へ延在している。走査型顕微鏡はさらにほぼ無段階に可変調整可能なスペクトル選択性検出装置４を有し、この検出装置は検出ビーム路５に延在する光の少なくとも１つの波長領域を検出する。検出ビーム路５は対象物１から検出器６および７へ延在する。スペクトル選択素子８はレーザ光源２の光を対象物照明のために選択する。この選択は所定の波長の光を走査装置９へ反射することにより行われる。レーザ光源２の選択されなかった光、例えば他の波長の光はスペクトル選択素子８を通過し、ビームキャッチャ１０で吸収される。対象物１で反射および／または散乱された、レーザ光源２の選択光も同様にスペクトル選択素子８によって検出ビーム路５から分離（ausblenden）されて、レーザ光源２の方向に偏向される。
【００３１】
本発明によれば照明ビーム路３と検出ビーム路５とは共焦点スリットスキャナを形成する。これは図２の実施例の斜視図に特に明りょうに示されている。
【００３２】
図１では照明ビーム路３に照明スリット絞り１１が設けられている。レーザ光源２から放射された光ビームはレンズ１２によりライン状の光ビームに変換され、この光ビームの少なくとも大部分が照明スリット絞り１１を通過する。図１には単にライン状ビーム路の光軸だけが示されているが、照明ビーム路３と検出ビーム路５はライン状の横断面を有し、この横断面は図平面に対して垂直に配置されている。
【００３３】
検出ビーム路５には検出スリット絞り１３が設けられており、この検出スリット絞りは一方では顕微鏡対物レンズ１５の焦点面１４に対応し、他方では照明スリット絞り１１に対応するように配置されている。
【００３４】
検出スリット絞り１３のスリット長もスリット幅も可変調整可能であり、このことは図２と図３に示されている。ここで検出スリット絞り１３は可動配置された４つの絞り１６〜１９を有する。絞り１６〜１９のそれぞれ１つの辺ないしエッジは検出スリット絞り１３のスリットを形成する。絞り１６と１７は、二重矢印２０により示された方向に沿ってスライド可能である。絞り１８と１９は二重矢印２１により示された方向に沿ってスライド可能である。従って絞り１８と１９により検出スリット絞り１３のスリット幅を変化することができ、絞り１６と１７により検出スリット絞り１３のスリット長を変化することができる。
【００３５】
図１には、照明スリット絞り１１とスペクトル選択素子８との間にズーム光学系２２が配置されていることが示されている。このズーム光学系により照明スリット絞り１１の有効スリット幅と有効スリット長を変化することができる。ズーム光学系２２はズームレンズ構成体の形態に構成されており、照明ビーム路３の全体倍率係数を顕微鏡対物レンズ１５と共に変化し、従って照明スリット絞り１１の比較的に大きな画像または比較的に小さな画像を顕微鏡対物レンズ１５の焦点面１４に形成する。
【００３６】
図１から図４に示されたスペクトル選択性検出装置４は、検出ビーム路５に延在する光をスペクトル分解するための手段２３を含む。この手段２３はプリズムの形態に構成されている。さらに図１と図４に示された検出装置４は、第１スペクトル領域２５を選択するための手段２４と４０を含む。対象物１から到来し、手段２４と４０により選択された第１スペクトル領域２５の光は検出器６により検出される。手段２４はスライド可能に配置された絞りであり、モータ２６によって、手段２４に示された二重矢印の方向に沿って可動である。
【００３７】
手段４０はスライド可能に配置されたミラー絞りであり、このミラー絞りはモータ２７により手段４０に示された二重矢印の方向に沿って可動である。手段４０で反射される光は手段２３によりスペクトル分解された光のスペクトル成分である。この光は、対象物１から到来し、第１検出器６に対して選択されなかった光である。この光の少なくとも大部分は、反射されたスペクトル領域を選択するための手段２８を通過し、検出器７により検出される。図１と図４に示したレンズ２９は手段２３によりスペクトル分解された光を、第１スペクトル領域２５を選択するための手段２４と４０が配置された平面に合焦ないし集束する。
【００３８】
図２と図３では、検出装置４が面状の検出器６を有することが斜視図に示されている。面状の検出器６はその面形状に相応する位置分解能を有する。面状の検出器６はＣＣＤアレイないしＣＣＤチップの形態に構成されている。図３には、検出装置４の一部が拡大して示されている。ここでは方向３０に沿って、対象物１から到来する光の位置情報がライン状の照明パターンに沿って検出可能であることが概略的に示されている。方向３１に沿って、各検出された対象点のスペクトル情報が検出器６に結像される。分かり易くするため、レンズおよび光を案内および整形するために必要な他の光学手段は図では省略されている。
【００３９】
図２と図３にＣＣＤアレイとして構成された検出器６は毎秒１００画像の読み出し速度を有する。対象画像の大きさが５１２×５１２ピクセルの場合、対象画像全体を記録するために検出器６は５１２回読み出される。従って対象画像の全記録時間は約５秒となる。走査装置９の走査速度は検出器６の読み出し速度に同期しているか、ないしはこれに適合されている。従って一度走査された対象物１の対象物代表値として、上記の５１２×５１２ピクセルの画像サイズの場合、各画素ごとに位置情報とスペクトル情報が存在する。
【００４０】
図４には検出装置４の別の実施例が示されている。この検出装置では、第１スペクトル領域２５を選択するための手段２４，４０と検出器３２との間に光をまとめる（ないし集束する：zusammenfuehren）ための手段３３が配置されており、この光をまとめるための手段３３がまとめる光は第１スペクトル領域２５を選択するための手段２４，４０を通過した光である。光をまとめるための手段３３はプリズムの形態に構成されており、ライン状の光ビームを形成する。このライン状の光ビームはＣＣＤラインとして構成された検出器３２により検出される。同じように反射されたスペクトル領域を選択するための手段２８と検出器３４との間には、そこに延在する光をまとめるための手段３３が設けられている。従って光をまとめるための手段３３によって同様にライン状の光ビームが形成され、この光ビームはＣＣＤラインとして構成されたライン状の検出器３４により検出される。
【００４１】
図５と図６はスペクトル選択素子８の詳細を拡大して示す。横断面が点状のレーザ光源２の光ビームはミラー３５に当たり、このミラーは光を第１ＡＯＴＦ結晶板３６へ反射する。ＡＯＴＦ結晶板３６が、レーザ光源２の光を対象物照明のために選択しないように調整されている場合には、この光は第１ＡＯＴＦ結晶板３６を通過し、ビームキャッチャ（光線トラップ）１０により完全に吸収される。第１ＡＯＴＦ結晶板３６が、例えば所定の波長の光を対象物照明のために選択するように調整されていれば、この光は第１ＡＯＴＦ結晶板３６を通過し、偏向され、１次回折される。従ってこの光は照明ビーム路３に入射し、対象物照明に使用される。このことは対象物１への下向き矢印により示されている。対象物１で反射および／または散乱されたレーザ光源２の選択光は第１ＡＯＴＦ結晶板３６を反対方向に通過し、１次回折され、ミラー３５に当たる。ミラー３５は対象物から到来した反射および／または散乱光をレーザ光源２へ反射する。対象物１から到来する蛍光光は第１ＡＯＴＦ結晶板３６を０次で通過し、ミラー３５を第２ＡＯＴＦ結晶板３７へと通過する。ＡＯＴＦ結晶板３７は概略的に示した光軸３８を中心に１８０°回転して配置されている。従って第２ＡＯＴＦ結晶板３７は、蛍光光の第１ＡＯＴＦ結晶板３６によるスペクトル分解並びに偏光分割を元に戻す（復元する）。２つのミラー３９は単に、ＡＯＴＦ結晶板３６，３７を通過する光を再び光軸３８に対して同心にするためにだけ用いられる。
【００４２】
図６は、本発明の共焦点走査型顕微鏡におけるスペクトル選択素子８の作用を概略的に示す。この共焦点走査型顕微鏡は共焦点スリットスキャナのように動作する。この場合、レーザ光源２から横断面がライン状に構成された光ビームが到来する。この光ビームはミラー３５により第１ＡＯＴＦ３６へ反射される。図６に示されたスペクトル選択素子８のさらなる作用は図５に示したスペクトル選択素子８の作用に実質的に相応する。ここで図６に示した照明ビーム路３の部分も、図６に示した検出器ビーム路５の部分も共にライン状の横断面を有する。
【００４３】
最後に、上に説明した実施例は請求される技術思想の説明のために用いるものであり、この実施例に限定されるものではないことを述べておく。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】対象物を結像するための本発明の走査型顕微鏡の第１実施例の概略図。
【図２】本発明の走査型顕微鏡の第２実施例の概略的斜視図。
【図３】図２の実施例の一部を示す概略的斜視図。
【図４】別の実施例の検出装置の一部を示す概略図。
【図５】従来技術から公知のスペクトル選択素子の実施例の概略図。
【図６】本発明のスペクトル選択素子の実施例の概略的斜視図。
【符号の説明】
【００４５】
１    対象物
２    レーザ光源
３    照明ビーム路
４    検出装置
５    検出ビーム路
６、７、３２、３４    検出器
８    スペクトル選択素子
９    走査装置
１０    ビームキャッチャ
１１    照明スリット絞り
１２、２９    レンズ
１３    検出スリット絞り
１４    焦点面
１５    顕微鏡対物レンズ
１６、１７、１８、１９    絞り
２２    ズーム光学系
２３    検出ビーム路に延在する光をスペクトル分解するための手段
２５    第１スペクトル領域
２６、２７    モータ
２８    反射されたスペクトル領域を選択するための手段
３３    光をまとめるための手段
３５、３９    ミラー
３８    光軸
２４，４０    第１スペクトル領域を選択するための手段
３６    第１ＡＯＴＦ結晶板
３７    第２ＡＯＴＦ結晶板
【図１】
2006510926.tif 000003
【図２】
2006510926.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006510926.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月25日(2004.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物（１）を結像するための走査型顕微鏡であって、光源（２）と、調整可能なスペクトル選択素子（８）と、調整可能なスペクトル選択性検出装置（４）と、光源（２）から対象物（１）まで延在する照明ビーム路（３）と、対象物（１）から検出装置（４）まで延在する検出ビーム路（５）とを有し、
スペクトル選択素子（８）により光源の光が対象物照明のために選択可能であり、
スペクトル選択素子（８）により、対象物（１）で反射および／または散乱された光源（２）の選択光が検出ビーム路（５）から分離可能であり、
検出ビーム路（５）に延在する光の少なくとも１つの波長領域がスペクトル選択性検出装置（４）により検出可能である形式の走査型顕微鏡において、
照明ビーム路（３）と検出ビーム路（５）とは共焦点スリットスキャナのように構成されており、
すなわち、ライン状の照明パターンを対象領域に形成するために、照明ビーム路（３）には照明スリット絞り（１１）が設けられており、
焦点面からのライン状の照明領域から到来する光を検出するために、検出ビーム路（５）には検出スリット絞り（１３）が設けられており、
照明スリット絞り（１１）および／または検出スリット絞り（１３）のスリット長および／またはスリット幅は可変調整可能である、ことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
照明スリット絞り（１１）および／または検出スリット絞り（１３）は可動配置された絞り（１６，１７，１８，１９）を含み、
有利には各絞り（１６，１７，１８，１９）の辺が照明スリット絞り（１１）ないしは検出スリット絞り（１３）のスリットを形成することを特徴とする請求項１記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
照明スリット絞り（１１）および／または検出スリット絞り（１３）にはそれぞれ１つのズーム光学系（２２）が配属されており、該ズーム光学系によって照明スリット絞り（１１）ないしは検出スリット絞り（１３）の有効スリット幅および／または有効スリット長が可変であることを特徴とする請求項１または２記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
スペクトル選択素子（８）は制御可能なアクティブ光学部材を含み、該アクティブ光学部材は有利にはＡＯＴＦ（音響光学同調可能フィルタ）またはＡＯＤ（音響光学デフレクタ）であることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
スペクトル選択性検出装置（４）は、検出ビーム路（５）に延在する光をスペクトル分解するための、有利にはプリズムの形態の、手段（２３）と、第１検出器（６）によって検出するために第１スペクトル領域（２５）を選択するための手段（２４，４０）と、第２検出器（７）によって検出するために、選択されなかったスペクトル領域の少なくとも一部を反射するための手段（２４，４０）とを有することを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
検出装置（４）は面状またはライン状の検出器（６，７，３２，３４）を有し、該検出器はその面形状またはライン形状に相応する位置分解能を有することを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
検出器（６，７，３２，３４）はＣＣＤ素子を含み、該ＣＣＤ素子はＣＣＤアレイまたはＣＣＤラインの形態に構成されていることを特徴とする請求項６記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
検出ビーム路（５）には検出装置（４）の検出器（６，７，３２，３４）の前方に、有利には可変の、適合光学系が配置されており、該適合光学系によって、検出すべきスペクトル領域の光ビームの形状が検出器形状に適合可能であることを特徴とする請求項７記載の走査型顕微鏡。
【請求項９】
検出ビーム路（５）には検出装置（４）の検出器（３２，３４）の前方に、光をまとめるための手段（３３）が配置されており、該光をまとめるための手段は実質的にライン状または合焦された光ビームを形成することを特徴とする請求項７または８記載の走査型顕微鏡。
【請求項１０】
光をまとめるための手段（３３）は、レンズ、プリズム、グリッドまたはホログラムを有することを特徴とする請求項９記載の走査型顕微鏡。
【請求項１１】
検出装置（４）の検出器（６，７，３２，３４）は、μｓ領域またはｎｓ領域にある読み出し速度を有し、これにより有利には蛍光寿命実験および／または蛍光試料の減衰特性を時間的に分解することができることを特徴とする請求項１から１０までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【請求項１２】
検出装置（４）の検出器（６，７，３２，３４）は、検出器を時間的に作動および非作動とすることができるアクティベーションユニットを有することを特徴とする請求項１１記載の走査型顕微鏡。
【請求項１３】
対象物または対象物マーキングに用いるマーカーのマルチフォトン励起を特徴とする請求項１から１２までのいずれか１項記載の走査型顕微鏡。
【国際調査報告】
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