(57)【要約】コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールと相対しての低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロール、アポリポタンパク質Ｂ、およびトリグリセリドのいずれか１つまたはそれより多くの哺乳類の血清レベルを、β−カゼインＡ２を含有する組成物を摂取することにより低減する方法。β−カゼインをヒトの消費用の食物または飲料に添加することにより形成される栄養補助食品、ここで、β−カゼインＡは少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２、好ましくはβ−カゼインＡ２のみから成る。
2006501299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−カゼインを含有する組成物を摂取することにより、以下の項目：
ａ）コレステロール；
ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールに相対しての低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール：
ｃ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール；
ｄ）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロール；
ｅ）アポリポタンパク質Ｂ；および
ｆ）トリグリセリド
のいずれか１つまたはそれより多くの、哺乳類の血清レベルを低減する方法であって、β−カゼインが少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２から成る前記方法。
【請求項２】
β−カゼインがβ−カゼインＡ２のみから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳類の血清総コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、またはトリグリセリドレベルに関連するあらゆる疾患または障害を、β−カゼインを含有する組成物を摂取することにより治療するための方法であって、β−カゼインが少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２から成る前記方法。
【請求項４】
疾患または障害が、高コレステロール血症、高脂血症、およびアテローム硬化症から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組成物が食物または食品である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
食物または食品が、生乳、または生乳を含有する製品もしくは生乳からの加工品である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組成物が栄養補助食品である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
栄養補助食品が、運動時のパフォーマンス、体重減少、体重増加、筋肉増強、および筋肉修復からなる群のいずれか１つまたはそれより多くを最適化するために摂取する栄養補給食品である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組成物がβ−カゼインを含有する生乳である請求項１から８のいずれか１項に記載の方法であって、β−カゼインが少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２から成る前記方法。
【請求項１０】
β−カゼインがβ−カゼインＡ２のみから成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が、ヒトの血清コレステロールレベルおよび/または血清トリグリセリドレベルを変えるための十分な一定量のカゼインＡ２を添加することにより形成されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
β−カゼインＡ２をウシの生乳から、またはヤク、バッファロー、ヒツジ、もしくはヤギの生乳から得る、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
以下の項目：
ａ）コレステロール；
ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールに相対しての低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール：
ｃ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール；
ｄ）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロール；
ｅ）アポリポタンパク質Ｂ；および
ｆ）トリグリセリド
のいずれか１つまたはそれより多くの、哺乳類の血清レベルを低減するための組成物の製造におけるβ−カゼインＡ２の使用。
【請求項１４】
ヒトの消費用の食物または飲料にβ−カゼインを添加することにより形成される栄養補助食品であって、β−カゼインが少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２から成る前記栄養補助食品。
【請求項１５】
β−カゼインＡがβ−カゼインＡ２のみから成る、請求項１３に記載の栄養補助食品。
【請求項１６】
β−カゼインＡ２をウシの生乳から、またはヤク、バッファロー、ヒツジ、もしくはヤギの生乳から得る、請求項１３に記載の栄養補助食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
ある種の疾患のリスク因子、例えばコレステロールレベル、脂質レベルおよびトリグリセリドレベル、ならびにＬＤＬ：ＨＤＬ比を低減するためのβ−カゼインＡ２の使用に関する。特に本発明は、このようなリスク因子のレベルの上昇に伴う疾患または障害の予防または治療に関する。本発明はさらに、β−カゼインＡ２を含有する栄養補助食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
心血管疾患は、今日西欧諸国において広く高頻度で見られる。この疾患の予防および治療、ならびに同疾患に伴うリスク因子に関する研究が果敢に進められている。
【０００３】
高コレステロール血症は、動脈硬化症、アテローム硬化症および黄色腫症を含む心血管疾患の１つの高リスク因子として関係があるとされる。高コレステロール血症は、食事、遺伝、環境、ライフスタイル、その他の疾患およびストレスにより影響を受け、若年齢での心臓発作および脳卒中をきたす。
【０００４】
高コレステロール血症は、血中総コレステロール、（低密度リポタンパク質）ＬＤＬ−コレステロール、および（超低密度リポタンパク質）ＶＬＤＬ−コレステロールの上昇したレベルを伴う状態である。特に高レベルのＬＤＬおよびＶＬＤＬはポジティブに冠動脈のアテローム硬化症に関与し、一方高レベルのＨＤＬはネガティブなリスク因子である。ＬＤＬ酸化の役割が文献で非常に注目されている。修飾されたＬＤＬ、すなわちより具体的には酸化ＬＤＬは、内皮および平滑筋の細胞壁への結合能力が増加するため、動脈管腔内での持続的な酸化によりさらに傷害を促進させることが、詳細に報告されている。
【０００５】
さらに酸化ＬＤＬは、アテローム硬化症の過程に直接関与する一定範囲の生理学的応答を惹起することが知られている。これらの応答には、内皮下層スペース内の酸化ＬＤＬを認識してこれらを積極的に取り込み、結果的に泡沫細胞に変換するマクロファージの化学的誘引物質である、炎症性応答の仲介物質（例えばインターロイキン−１、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子アルファ、およびマクロファージコロニー刺激因子）の分泌の刺激を含む。その後泡沫細胞は凝集して脂肪線条を形成する。このような脂肪線条が、進行型のアテローム硬化症の最初の同定可能な特徴的病変である。
【０００６】
高脂血症があると、冠動脈心疾患、ならびに癌および肥満にもかかりやすくなる。高脂血症は、これらの生命を脅かす疾患の早期診断における有用な高リスク因子の１つである。
【０００７】
高脂血症は血液の脂質パラメータが上昇した状態である。循環血液中の脂質分画は、総コレステロール、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、およびトリグリセリドである。American Heart Association（米国心臓協会）のガイドラインによるこれらの安全なレベルを以下に示す。レベルが異常な場合には致死リスクを低減するため、食事の調節および薬剤による積極的な治療が必要である。
【０００８】
総コレステロール      （ＴＣ）＞２４０ｍｇ/ｄＬ
ＬＤＬ−コレステロール  ＞１６０ｍｇ/ｄＬ−Ａｐｏ（Ｂ）アテローム発生性因子
ＨＤＬ−コレステロール  ＜３５ｍｇ/ｄＬ  Ｌｐ（ａ）アテローム発生性因子
トリグリセリド        ＞１５０ｍｇ/ｄＬ
【０００９】
高コレステロール血症と同様に、高脂血症も食事、遺伝、ライフスタイル、環境、家族性疾患、またはストレスに起因する。この状態は遺伝性のこともあるし、または別の疾患、例えば全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、甲状腺機能低下症、ネフローゼ症候群、クッシング病、糖尿病、肥満、アルコール依存症、コルチコステロイド治療、またはエストロゲン治療から二次的に発症することもある。
【００１０】
高コレステロール血症および高脂血症はまた、アテローム硬化症の主要な原因である。アテローム硬化症は他のいかなる単一の状態より、米国ではより多くの死亡に関与している。冠動脈を巻き込むアテローム硬化症の心疾患は、死亡の最も一般的な単一原因であり、全死亡の１/３に当たる。アテローム硬化症による脳への血液の供給の妨害（脳卒中の原因となる）は、（癌に次いで）第３位の最も一般的な死亡原因である。アテローム硬化症はまた、その他の主要な動脈、例えば腎臓、脚および腸への動脈の血流を低減させることにより、多数の重篤な病気の原因にもなる。
【００１１】
アテローム硬化症は、動脈壁の狭小化、すなわち狭窄の結果として起こる心血管の状態である。狭小化は動脈の内側におけるプラーク（隆起した小片）または線条の形成による。これらのプラークは、酸化ＬＤＬ、単球、マクロファージ、泡沫細胞、損傷した筋細胞、繊維組織、血小板の凝集塊、コレステロール、および時にはカルシウムからなる。これらは、血流の乱された領域に形成される傾向があり、血流中のコレステロールが高濃度の人に最も高頻度に認められる。プラークの数および厚さは年齢と共に増加し、血管の滑らかな内側を損なう原因となり、血栓（血塊）の形成を加速することになる。血栓の破片がはがれて塞栓を形成する、すなわち血栓の破片が血流を通して運ばれてより小さな血管（例えば冠動脈）を遮断し、組織の虚血性損傷または虚血性心疾患をきたすことは、稀ではない。
【００１２】
薬物療法は虚血性心疾患の満足できる治療とはいえない、というのは動脈壁への多量の損傷が既に起こってしまっているからである。抗凝固薬は第二の血塊および塞栓の形成を最小限とする試みのために使用されているが、これらは疾患の進行にはほとんどまたは全く効果はない。血管拡張薬は、症状の緩解を提供するために使用されるが、治癒力としての価値はない。
【００１３】
外科的治療は、ある種の高リスクの状態に利用することができる。バルーンによる血管形成術は狭くなった血管を押し広げ、滞った血液の供給を促進することができる。冠動脈の遮断または損傷後の心筋への血液の供給はまた、血管バイパス移植術により回復させることができる。大きなアテロームおよび固まった動脈の障害物は動脈内膜切除により摘出し、傷害された末梢血管の断片全体をプラスチックで織ったチューブの移植片で置き換えることができる。
【００１４】
一部の場合には高コレステロール血症の軽減は、食事の調節および/または薬剤の使用により達成することができ、それにより疾患に由来する致死リスクを最小限にすることができる。食事中の植物繊維および食物のその他の有効成分を消費することにより、ヒトにおける血清コレステロールの低減が達成されてきた。しかし上記の状態に関する安全で有効な治療は依然として必要とされている。
【００１５】
上記のその他のリスク因子に加えて、生乳、特にBos Taurus メスウシ（家畜用メスウシ）の生乳の消費と、疾患、例えば糖尿病、アテローム硬化症および冠動脈心疾患とを関連付けるかなりの証拠が現在挙げられている。
【００１６】
このため世界中のウシの群れから得た生乳のカゼインの組成が、ある程度詳細に、特に異なるカゼインと疾患、例えば糖尿病および冠動脈心疾患間の原因となる特定の関連付けについて研究が行われてきた。ウシの生乳に見出されるβ−カゼイン群が注目されている。
【００１７】
β−カゼインタンパク質の８つの変異型が知られている。これらはβ−カゼインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦとして同定される。世界のウシの母集団の生乳中の主な変異型はβ−カゼインＡ１およびβ−カゼインＡ２である。１次構造、すなわちアミノ酸配列のレベルでのこれらの識別は、β−カゼインＡ１が６７番の位置にアミノ酸のヒスチジンを有するのに対して、β−カゼインＡ２は６７番の位置にアミノ酸のプロリンを有することによる。他のβ−カゼイン変異型はこれ以外のアミノ酸の位置に差異があるかもしれないが、これらの変異型をまた、６７番の位置がヒスチジンかまたはプロリンかに基づいて区別することができる。例えばβ−カゼインＢ、ＣおよびＦは６７番の位置にヒスチジンを有し、β−カゼインＡ３、ＤおよびＥは６７番の位置にプロリンを有する。
【００１８】
疫学的証拠は、食事中のβ−カゼインＡ１がヒトの健康に有害であることを強く示唆する。例えばＷＯ  ９６/１４５７７は、Ｉ型糖尿病におけるβ−カゼインＡ１の強い影響について記載している。疫学的証拠は、β−カゼインＡ１がヒトにおける糖尿病誘発性の活性を刺激すると示唆する。さらにＷＯ  ９６/１４５７７は、非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウスモデルにおけるβ−カゼインＡ１の消費による自己免疫性糖尿病、すなわちＩ型糖尿病の誘導について記載している。同発明は、Ｉ型糖尿病にかかりやすい個体の生乳または乳製品の摂取を、糖尿病非誘導性のβ−カゼイン変異型のみを含有する生乳に制限することにより、同個体のＩ型糖尿病になるリスクを低減することに焦点を当てて記載している。
【００１９】
ＷＯ  ９６/３６２３９は、ヒトの食事におけるβ−カゼインＡ１の回避を主張している。疫学的証拠は、多様な母集団におけるβ−カゼインＡ１の消費と、冠動脈心疾患の発症との間の相関を確証している。同文献に記載された発明は、様々なβ−カゼインをコードするＤＮＡについて遺伝子材料を検査して乳牛を選別することによる、β−カゼインＡ１の回避に焦点を当てている。
【００２０】
このようにβ−カゼインＡ１および糖尿病の間の関連付け、ならびにβ−カゼインＡ１および冠動脈心疾患の間の関連付けの双方について、詳細に報告されている。加えてβ−カゼインＡ１の有害な影響が今度は神経学的障害にまで拡大したことが、最近示された。ＷＯ  ０２/１９８３２は、いかなる“ヒスチジン変異型”も含有しない生乳を提供することによる、神経学的障害または精神的障害の誘発または悪化の回避について記載している。ヒスチジン変異型は、同文献では６７番の位置にヒスチジンを有するβ−カゼイン変異型として定義されている。β−カゼインＡ１はこのようなヒスチジン変異型である。
【００２１】
最近の文献は、β−カゼインＡ１が健康に有害であり、したがってβ−カゼインＡ１はヒトの母集団の食事から排除すべきである、という所見に焦点を当てている。メスウシのほとんどの集団は、主としてβ−カゼインＡ１およびβ−カゼインＡ２を含有し、他のβ−カゼイン変異型は（存在するとしても）わずかしか含有しない生乳を産生する。したがってある母集団の食事の摂取からβ−カゼインＡ１を排除するという所望は、起こり得るβ−カゼイン変異型のうちのβ−カゼインＡ２のみを含有するヒトの消費用の生乳を提供することにより、達成することが可能となる。換言すればβ−カゼインＡ２のみを含有する生乳（およびその生乳から加工された食品）への推進力は、β−カゼインＡ１の回避、およびその結果として糖尿病、冠動脈心疾患、および神経学的障害に伴うリスクを最小限とするという趣旨に動機づけられたものであった。
【００２２】
ＷＯ  ０１/０００４７は、β−カゼインの主としてＡ２変異型を含有する乳製品を含んでなり、さらにヒトの血漿ホモシステイン（ホモシスチン）レベルを低下させる１つ（または複数）の化合物で強化した栄養補助食品を開示している。このような化合物として、ベタイン、コバラミン、葉酸、またはピリドキシンを含んでよい。これについて２つの可能な利点が記載されている。第１にサプリメント中のβ−カゼインＡ１をβ−カゼインＡ２で置き換えることで、糖尿病のリスクを低下させることになる。第２にホモシステイン（ホモシスチン）レベルは冠動脈心疾患に非常に相関しており、ホモシステイン（ホモシスチン）はまたアテローム硬化症の１つのリスク因子と認識されていることから、ホモシステイン（ホモシスチン）レベルを低下させることは望ましい。したがって糖尿病の治療戦略と併せてホモシステイン（ホモシスチン）の治療戦略を用いる、血管の疾患をコントロールするための併用アプローチがある。
【００２３】
ＷＯ  ０１/０００４７はさらに、β−カゼインＡ２の推定消化産生物であるβ−カソモルフィン−９が、糖尿病に対する免疫を提供する可能性があることを開示している。実験結果は、β−カゼインＡ２を与えたラットはコントロールの動物より糖尿病の発症率が低いことを示した。β−カソモルフィン−９は免疫機能の調節因子、したがって糖尿病の進行を減弱する可能性のある物質として記載されている。
【００２４】
しかし、β−カソモルフィン−９による免疫調節に付随するデータは、糖尿病のＮＯＤマウスモデルにおいて抗原を、腸管への経路ではなく注射して使用した実験に基づいていることに注目しなければならない。さらにβ−カソモルフィン−９がβ−カゼインＡ２の消化により産生される単一の活性化合物であることは、また確証されていない。したがってβ−カソモルフィン−９に基づいたデータを外挿し、β−カゼインＡ２が同じ生物学的活性を有するかどうかを正確に予想することは困難である。
【００２５】
ＷＯ  ０１/０００４７において、糖尿病および冠動脈疾患間に原因となる結びつきがあることに言及している。しかしβ−カソモルフィン−９の糖尿病を減弱する特性が、β−カゼインＡ２が少なくとも間接的には冠動脈心疾患に対して防御的効果を有する可能性があることを意味するという示唆は、全体にあいまいな関連付けに基づいており、実施された実験が与えた驚くべき示唆と考えられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明では今回初めて、β−カゼインＡ２の消費が血清コレステロールレベルを低減し、血中トリグリセリドレベルを低減し、ＬＤＬ濃度したがってＬＤＬ：ＨＤＬ比を低減し、アポリポタンパク質Ｂの血清レベルを低減し、そして抗アテローム作用があることを、驚くべきことに発見した。
【００２７】
したがって本発明の目的は哺乳類の血清コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベル、またはトリグリセリドレベルに伴う様々な疾患を、このような疾患に対する予防効果または治療効果を持つための、または少なくとも有用な代用物を提供するための、十分量のβ−カゼインＡ２を含有する組成物を摂取することにより、予防または治療する方法を提供する。
【００２８】
発明の記述
本発明の第１の側面において、β−カゼインを含有する組成物を摂取することにより、以下の項目：
ａ）コレステロール；
ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールに相対しての低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール：
ｃ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール；
ｄ）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロール；
ｅ）アポリポタンパク質Ｂ；および
ｆ）トリグリセリド
のいずれか１つまたはそれより多くの、哺乳類の血清レベルを低減する方法を提供する、ここで、β−カゼインは少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２から成る。好ましくは、β−カゼインはβ−カゼインＡ２のみから成る。
【００２９】
本発明はまた、哺乳類の血清総コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベル、アポリポタンパク質Ｂレベル、またはトリグリセリドレベルに伴ういずれかの疾患または障害を、β−カゼインを含有する組成物を摂取することにより治療するための方法を提供する、ここで、β−カゼインは少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２から成る。
【００３０】
該疾患または障害として、高コレステロール血症、高脂血症およびアテローム硬化症を含む。
該組成物は食物または食品、例えば生乳、または生乳を含有する製品もしくは生乳からの加工品であることが好ましい。
【００３１】
本発明の好ましい態様において該組成物は、運動時のパフォーマンス、体重減少、体重増加、筋肉増強、および筋肉修復からなる群のいずれか１つまたはそれより多くを最適化するために摂取する、栄養補助食品、好ましくは栄養補給食品である。
【００３２】
該組成物は、ヒトの血清コレステロールレベルおよび/または血清トリグリセリドレベルを変えるための十分な一定量のβ−カゼインＡ２を添加することにより形成されていることがさらに好ましい。
【００３３】
好ましくはβ−カゼインＡ２はウシ(bovine cattle)の生乳から、またはヤク、バッファロー、ヒツジ、もしくはヤギの生乳から得る。
本発明のもう１つの側面において、β−カゼインをヒトの消費用の食物または飲料に添加することにより形成される栄養補助食品を提供する、ここで、β−カゼインは少なくとも９５％のβ−カゼインＡ２、好ましくはβ−カゼインＡ２のみから成る。
【００３４】
本発明のさらなる態様において、以下の項目：
ａ）コレステロール；
ｂ）高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールに相対しての低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール：
ｃ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール；
ｄ）超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロール；
ｅ）アポリポタンパク質Ｂ；および
ｆ）トリグリセリド
のいずれか１つまたはそれより多くの、哺乳類の血清レベルを低減するための組成物の製造におけるβ−カゼインＡ２の使用を提供する。
【００３５】
詳細な説明
本明細書で使用する場合“ＬＤＬ”という用語は低密度リポタンパク質を意味し、“ＨＤＬ”は高密度リポタンパク質を意味し、“ＶＬＤＬ”は超低密度リポタンパク質を意味する。
【００３６】
本明細書で使用する場合“トリグリセリド”という用語は、３個の脂肪酸分子と結合したグリセロールから成る脂質または中性脂肪を意味する。
本明細書で使用する場合“心血管疾患”という用語は、血管内の異常な高濃度の脂質に関連付けられることに起因する、促進される、または示される循環系の血管のあらゆる疾患である。
【００３７】
本明細書で使用する場合“動脈硬化症”という用語は、動脈を狭める泡沫細胞および大動脈の線条の形成による、動脈壁の変性である。これは血液循環を制限し、そして個体を血栓症に罹りやすくする。
【００３８】
本明細書で使用する場合“アテローム硬化症”という用語は、脂肪のプラークが内壁上に発生し、その結果血流の障害を伴う動脈の疾患である。
本明細書で使用する場合“アポリポタンパク質Ｂ”または“アポタンパク質Ｂ”または“ＡｐｏＢ”という用語は、ＬＤＬコレステロール輸送タンパク質のタンパク質成分をいう。新規に（de novo）合成されるコレステロールは、肝臓および腸から末梢組織にリポタンパク質の形で輸送される。アポリポタンパク質Ｂのほとんどは、ＶＬＤＬとして循環系内に分泌される。
【００３９】
本明細書で使用する場合“高コレステロール血症”という用語は、Expert Panel Report of the National Cholesterol Educational Program (NCEP) of Detection, Evaluation of Treatment of High Cholesterol in Adults (Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39) のガイドラインによる、血中総コレステロール、ＬＤＬコレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールの上昇したレベルを意味する。
【００４０】
本明細書で使用する場合“高脂血症(hyperlipidemia またはhyperlipemia)”は、血液脂質パラメータが血液中で上昇している状態である。この状態は脂肪の異常な高濃度を明示する。循環血の脂質分画は、総コレステロール、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、およびトリグリセリドである。
【００４１】
本明細書で使用する場合、例えばＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬにおける“リポタンパク質”という用語は、脂質の輸送に重要な血清、血漿およびリンパ液中に見出されるタンパク質の一群をいう。各リポタンパク質の化学的組成は、ＨＤＬがより高いタンパク質−対−脂質比率を有するのに対して、ＶＬＤＬはより低いタンパク質−対−脂質比率を有するという点で異なる。
【００４２】
本明細書で使用する場合“黄色腫症”という用語は、脂肪の沈着に起因する皮膚の黄みがかった腫脹またはプラークによる疾患の証拠である。黄色腫症の存在は通常、増加した血液コレステロールレベルを伴う。
【００４３】
本明細書で使用する場合“ＧＲＡＳ”という用語は、食品添加物に関して“一般に安全と認められている”ことを意味する。
本発明において、β−カゼインＡ２の消費が以下の項目：
１．血清コレステロールレベルの低下
２．血中トリグリセリドレベルの低減、および
３．ＬＤＬ濃度およびＬＤＬ：ＨＤＬ比の低減
を含むポジティブな有益な効果を有するという興味深いそして驚くべき結果を、初めて示した。
【００４４】
本発明によって観察されたこれらの効果は、以下の：
１．高コレステロール血症、
２．高脂血症、および
３．アテローム硬化症
を含む様々な疾患または障害の予防または治療に、β−カゼインＡ２の消費が有益であることを意味する。
【００４５】
この重要な所見は、単にβ−カゼインＡ１がある種の疾患、例えば糖尿病および冠動脈心疾患に寄与するという理由で、β−カゼインＡ２が有益であるとする現行の考察を変えるものである。本発明の所見は、β−カゼインＡ２はそれ自身でポジティブな有益な効果を有することを意味する。
【００４６】
この所見は、１０群のＮＺシロウサギに自由給餌でコントロールされた餌を与えた実験的試験により支持される。動物を屠殺後、血清コレステロールレベル、ＬＤＬ：ＨＤＬ比およびトリグリセリドレベルを測定した。
【００４７】
第３−８群のウサギにおいて、食餌中のβ−カゼインＡ１およびＡ２の３種類の濃度（５％、１０％および２０％）を、合計２０％の乳タンパク質が各食餌中に存在するように乳清タンパク質を加えて（すなわち各々１５％、１０％、０％の乳清タンパク質を添加して）検査した。コレステロール（０．５％）もまたこれらの食餌に添加し、確実に病変を測定できるようにした。コントロールとして第１群のウサギには２０％の乳清タンパク質を、第２群のウサギには２０％の乳清タンパク質＋０．５％のコレステロールを与えた。第９群および１０群には１０％のβ−カゼインＡ１（またはＡ２）＋１０％の乳清のみを与えた。特別に調製された食餌で飼育されたウサギは、１日当たり平均３０．０５±０．９７グラムしか食べなかった。
【００４８】
驚くことではないもののほとんどすべてのウサギは、６週の実験期間にわたり平均５．６２％の体重減少を伴う、体重の減少を示した。このことはウサギの総合的な健康には影響を与えず、ウサギは機敏、敏感であり、身体的不調の兆候は示さなかった。この結果は、カゼインを含有する半合成の食餌を与えたウサギについて、食餌を容易に受け入れられなかった際に餌の摂取および体重増加が半分にまで低減したがウサギはまだ健康な様子だったことが認められた、早期の試験と一致する。食餌中の高レベルのカゼインで飼育されたウサギ（５０％）は、同試験の経過中には体重増加はなかった。
【００４９】
コレステロール非添加の１０％β−カゼインＡ２（第１０群）は、乳清のみ（第１群）および１０％β−カゼインＡ１（第９群）を含む他のすべての群に比して、ｔ＝６週時に有意に低い血清コレステロールレベルをもたらした。β−カゼインＡ１群は、乳清のみの群より高い血清コレステロールレベルを有していた。この結果はβ−カゼインの混合物よりむしろ特定のβ−カゼインの効果を精査する必要性を強調するものであり、血清コレステロールレベルにおいてβ−カゼイン変異型によって効果が異なることを記載した初めての報告である。
【００５０】
２０％β−カゼインＡ１のみ（第９群）を与えたウサギの平均血清コレステロールレベルは、第１群（乳清のみ）の動物より高かった。したがってβ−カゼインＡ１は乳清タンパク質よりわずかにアテローム発生性であると思われる。すべての食餌への０．５％コレステロールの添加は、少なくとも３倍血清コレステロールレベルを増加させ、この効果は乳清のみと比較したＡ１  β−カゼインの効果よりずっと大きかった。食餌中に添加したコレステロールの存在下において、β−カゼインＡ１またはＡ２を与えたウサギの血清コレステロールレベル間に有意差はなかった。
【００５１】
食餌中のコレステロールを含まない場合では、第１０群（β−カゼインＡ２）の血清ＬＤＬレベルは、第９群（β−カゼインＡ１）または１群（乳清のみ）の値より有意に低かった。第９群のＬＤＬレベルは第１群の値より高かったが、有意ではなかった。食餌中に添加したコレステロールの存在下においては、血清ＬＤＬはすべての群（２−８）で有意に上昇したが、群間での有意差はなかった。血清ＨＤＬにおいても、第１０群が第１群より有意に低くなかったことを除き、同様のパターンが認められた。
【００５２】
β−カゼインＡ２の抗アテローム発生性の潜在性は、ＬＤＬ−対−ＨＤＬ比によりさらに強調された。第９群（β−カゼインＡ１）および第１０群（β−カゼインＡ２）間の血清ＬＤＬレベルは、血清ＨＤＬレベルよりずっと大きな差があった。したがってＬＤＬ−対−ＨＤＬ比は、β−カゼインＡ２を与えた動物ではβ−カゼインＡ１を与えた動物より有意に低かった。実際、第１０群のＬＤＬ−対−ＨＤＬ比は、第１群（２０％乳清のみ）を含む他のすべての群より有意に低かった。トリグリセリドまたはホモシステインに関してはすべての群間に有意差はなかった。
【００５３】
このように食餌中のβ−カゼインＡ２は、コレステロールを強化した食餌の非存在下において、β−カゼインＡ１および乳清の双方より低い血清コレステロールレベル（総コレステロール、ＬＤＬおよびＨＤＬコレステロール）を生じさせる。
【００５４】
β−カゼインＡ１およびＡ２の双方とも、２０％乳清に比して脂肪線条を生じさせたが、β−カゼインＡ２はβ−カゼインＡ１より小さな範囲の病変をもたらすことが発見された。実際、食餌中のコレステロールを含まない１０％β−カゼインＡ１は、食餌中のコレステロールを添加した１０％β−カゼインＡ２と、ほぼ同量の病変をもたらした。β−カゼインＡ２を与えたウサギの大動脈弓における脂肪線条の厚さは、食餌中のコレステロールを含むか含まないかのいずれかの場合、ゼロさもなければ非常にゼロに近い値であった。反対にβ−カゼインＡ１を与えたウサギの大動脈弓の脂肪線条の厚さは、有意により高かった。したがってβ−カゼインＡ１は、乳清およびＡ２カゼイン変異型の双方に比してよりアテローム発生性である。
【００５５】
０．５％食餌中のコレステロールの存在下において、２０％β−カゼインＡ２のみが２０％乳清より小さな表面領域の脂肪線条に覆われた大動脈をもたらした。しかし大動脈弓の脂肪線条の厚さは乳清と比較して、２０％および５％β−カゼインＡ２を与えた動物の双方とも有意に小さく（０．０３±０．０１５）、１０％β−カゼインＡ２を与えた動物では（有意ではないが）低い値を示した（０．０１±０．００８）。
【００５６】
コレステロールを強化した食餌と組み合わせてのバルーンによる動脈の傷害は、進行したヒトのアテロームと酷似する病変をラビットにもたらすことが知られている。
食餌中のコレステロールを含むか含まないかのいずれか場合の、β−カゼインＡ１またはＡ２を与えたウサギのバルーンで傷害した右頸動脈の内膜−対−中膜比には、有意差はなかった。しかし（コレステロール添加および非添加双方の）β−カゼインＡ２を与えた群は、β−カゼインＡ１を与えた対応する群に比して、新生内膜の肥厚がより少なかった。β−カゼインＡ２を与えた動物は一般に、（食餌中のコレステロールを含むおよび含まない双方の場合の）乳清を与えた動物より、わずかに薄い血管内膜を有していた。
【００５７】
これらの結果は、コレステロール非添加の１０％Ａ２は、乳清のみおよび１０％β−カゼインＡ１を含む他のすべての群より、有意により低い血清コレステロールレベルをもたらすという事実と合わせて、β−カゼインＡ２がアテローム防護性（atheroprotective）の効果を有するのに対して、β−カゼインＡ１はアテローム発生性であることを初めて示すものである。
【００５８】
これらの結果は、心血管疾患による致死率およびβ−カゼインＡ１の消費との強い関連性を示唆する疫学試験とも一致する。
本発明の組成物は、１つもしくはそれより多くの物質と混合したβ−カゼインＡ２の形としてよく、水性の溶液もしくは懸濁液もしくはエマルジョンの形としてよく、または固体、例えば顆粒もしくは粉末の形としてもよい。本発明のある種の組成物は、それらの自然のままの形、特に生乳または生乳から誘導された製品もしくは加工品としてよい。本発明の他の組成物はβ−カゼインＡ２の添加により補給された物質としてよいが、その場合β−カゼインＡ２は、生乳もしくは生乳の加工品から精製するもしくは分画として得たものとする、またはβ−カゼインＡ２は生乳中またはその生乳からの加工品中に存在するものとする。
【００５９】
本発明の組成物または食品として、生乳または乳製品、栄養サプリメント  例えば体重増加用製剤、食品添加物、アイスクリームまたはその他の乳製品に基づいた冷凍菓子、発酵乳製品  例えばヨーグルトまたはクオーク(quark)、全脂肪、低脂肪および脱脂肪のプロセスチーズを含むチーズ、乳清、乳製品の添加により強化された食品  例えばスープ、アレルギー性分子を除去した牛乳、菓子  例えばチョコレート、リン酸塩および/またはクエン酸塩を添加した製品を含む炭酸乳製品、全脂肪、低脂肪または脱脂肪の牛乳を含有してよい乳児用製剤、液体または粉末の飲用混合物、バターミルク、ならびにバターミルク粉末を含んでよいがこれに限定されないことは、当業者には明らかであろう。
【００６０】
本発明の組成物を投与する好ましい方法は、経口摂取による。しかし他の手段、例えば静注により本組成物を投与することも適当としてよい。本発明の組成物は、コレステロール、ＬＤＬ、およびトリグリセリドのレベルをコントロールするために適するいかなる投与レベルおよび投与頻度で、摂取またはそれ以外の方法で投与してもよい。典型的には組成物の一定量をヒトが毎日または毎週摂取するものとする。
【００６１】
摂取するまたは他の方法で投与するβ−カゼインＡ２の量は被験者間で多様となることもまた、当業者には明らかであろう。
本発明を以下の実施例を参照としてさらに記載する。しかし、本発明がこれらの実施例に限定されないことは認識されなければならない。
【実施例】
【００６２】
実施例
（材料および方法）
雌雄双方（１６−２４週齢）の６０羽のNew Zealand White/Lop 交配種のウサギを、University of Queensland Central Animal Breeding House より入手した。
【００６３】
（プロトコールの概要）
時間＝０に、すべてのウサギの右頸動脈をバルーンにより内膜除去した。次にウサギを無作為に１０群に分け、６週間特定の食餌を与えた。血液サンプルは血清成分分析用にｔ＝０，３および６週時に採取した。ｔ＝６週時にすべての動物を屠殺し、組織サンプルを採取した。試験のプロトコールの概要を表１に示す。
【００６４】
【表１】
2006501299.tif 000003
【００６５】
（手術）
時間＝０に、６０羽すべてのウサギをケタミン（３０ｍｇ/ｋｇ）およびキシラジン（７ｍｇ/ｋｇ）の混合液にて筋注麻酔し、ハロタン(Laser Animal Health, Qld, Australia)で維持した。皮膚および筋膜に切開を加え、茎突舌骨筋を鈍的に切開し、右総頸動脈の上部を露出させた。左側の傷害されていない総頸動脈は、対側性のコントロールとした。側枝を一時的に５/０絹糸(Davis & Geck, Danbury, CT, USA)で結紮し、２フレンチ（２Ｆ）のFogarty 塞栓摘出カテーテル(Baxter Healthcare Corporation, Irvine, CA, USA)を、外頸動脈の枝である上甲状腺動脈に行った動脈切開から導入した（図２．２）。カテーテルを１０ｃｍ（大動脈弓に向かって）前進させ、バルーンを０．２ｍｌの生理食塩水で膨らませて、動脈の内膜除去を行うためカテーテルを引き抜いた。
【００６６】
傷害処置は、内膜の完全な除去を確実にするため、各動物に付き３回行った。傷害後、カテーテルを取り出し、上甲状腺動脈を５/０絹糸で結紮し、傷口を２/０Dexon 縫合糸(Sherwood Medical, St Louis, MO, USA)を用いて閉じた。５０ｍｇ/ｍｌエンロフロキサシンを含有する広域スペクトルの抗生剤（５ｍｇ/ｋｇ  Baytril, Bayer Australia Ltd, Pymble, Australia）を、処置の完了時に皮下投与した。ウサギは手術後モニターし、完全に意識が回復した後ケージに戻した。術後３日間、各動物には約１７０ｍｇのパラセタモール(SmithKline Beecham International, Ermington, Australia)と共に胃管栄養し、抗生剤の皮下投与を継続した。
【００６７】
（ウサギの食餌）
試験は、その組成を表２に示す１０通りの食餌について行った。本質的に各食餌は合計２０％の総乳タンパク質を含有するが、カゼインタンパク質−対−乳清タンパク質の比率が異なるようにした。第１、９および１０群の食餌はさらなる添加物を含有しなかったが、第２、３、４、５、６、７および８群の食餌は０．５％コレステロールを補給した。各群６羽のウサギとし、この食餌を６週間継続した。
【００６８】
【表２】
2006501299.tif 000004
【００６９】
ウサギの新しい食餌は、ウサギの通常のペレットとは色、におい、舌ざわりおよび重さが異なるため、ウサギが新しい食餌に慣れるのに、数日を要することがわかった。通常のペレットは褐色だが、新しい食餌で与えるペレットは白色だった。このため手術前５日間、通常のウサギ用ペレットに新しいペレットを増加しながら（２５％、５０％、７５％、１００％）混入する（合計２００グラムとする）ことにより、すべてのウサギを各々の食餌に慣れさせた。ｔ＝０時には、新しいペレットのみ（１日当たり２００グラム）を以後６週間与え（例外は下記参照）、水は自由飲水とした。ウサギは１日当たり９０−１３０グラムのペレットを食べることが知られている。しかし動物が餌に届くことができるようにホッパーを満たすために２００グラムが必要であった。２００グラムの新しいペレットを毎日与え、各ウサギが食べずに残したペレットの量を毎日秤量して決定した。
【００７０】
ウサギが新しい食餌を食べるのを促すために、いくつかの方法を用いた。第１にウサギの食欲を刺激するために、餌用ホッパーの後ろに少量のアニス種油を滴下した。第２にウサギがまだ新しい食事を食べないか、または体重減少が始めの体重の約１０％に達した場合には、通常の餌を２５、５０または７５％食餌に混入した。この場合には白色の食餌ペレットを褐色の通常のペレットから注意深く分離し、実験用食餌を実際に消費した量を決定するため毎日秤量した。最後に、体重減少が続く場合には、体重が増加するまで１日当たり２００グラムの通常の餌をウサギに与えた。
【００７１】
（ウサギの体重）
すべてのウサギは体重測定を手術当日に開始し、屠殺する週まで毎週行った。
（血液採取）
血液は、各ウサギから術前、食餌の開始時、ならびにｔ＝３および６週時に採取した。各ウサギをしっかり包み、中心耳動脈を覆う毛を剃った。２４ゲージカテーテル(Becton Diskinson Pty Ltd, NSW, Australia)を挿入し、５ｍＬの血液を無菌試験管に採取した。血液は凝固するまで放置し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心した。血清の上清を抽出し、総血清コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬおよびホモシステインについて分析した。
【００７２】
（ウサギの屠殺）
傷害後６週目に、１ｍｌの生理食塩水中の１０００Ｉ．Ｕ．ヘパリン(David Bull Laboratories, Mulgrave, Victoria)を各ウサギの耳静脈に注入した。５分後ウサギは過剰量のペントバルビトン(３２５ｍｇ/ｍｌ Lethabarb, (Virbac Australia Rty Ltd, Victoria))で安楽死させた。顎から骨盤まで切開を加え、後肢および前肢に切開を延長した。その後腹膜腔を注意深く切開して内部の臓器を露出させ、胸郭を切除して心臓を露出させた。灌流装置に接続したチューブに付けた太いゲージの針で、左心室にカニューレ挿入した。下大静脈の小さな部分を清浄にし切開した。循環系を１リットルのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗い流した後、１リットルのＤＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド(Asia Pacific Speciality Chemicals Ltd, NSW, Australia)で１００ｍｍＨｇにて動脈灌流固定を行った。
【００７３】
（組織の採取）
大動脈全体、すなわち腸骨分岐から大動脈弓までを露出させて切り取った。右側（傷害）および左側（コントロール）の総頸動脈を完全に露出させて切り取った。すべての血管は脂肪および付着する結合組織を除去した後、ＤＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを含む試験管に入れた。
【００７４】
（組織の分析）
（管腔病変に関する開いた形での(en face)Oil-Red-O 染色）
固定および組織学的切片作成用に大動脈弓を切り取った。大動脈の残りの部分（約１６ｃｍ）を縦方向に開き、４つの断片に切断した。各断片を小さな透明プラスティック片上に（管腔側を上にして）縫い付け、確実に平らに維持できるようにした。次にこの断片を脂肪親和性の染色剤、Oil-Red-O の飽和溶液中で開いた形で（en face）染色し、脂肪線条に覆われた管腔表面領域を決定できるようにした。
【００７５】
（脂肪線条で覆われた管腔表面領域の分析）
各大動脈断片の画像はDesk Scan II (version 2.31a, Hewlett-Packard, U.S.A.)を用いてスキャンし、Image J 画像ソフトウェア(version 1.23y、国立衛生研究所、U.S.A.)を用いて病変の総領域を測定した。このプログラムは動脈表面の残りの部分（白色から淡いピンク色）に対して、病変（明るい赤に染色される）の強度を比較する。結果を病変で覆われた表面領域のパーセントで表した。
【００７６】
（大動脈弓）
長さ約３−４ｍｍの３つの断片を各大動脈弓から切断し、ＤＰＢＳに浸漬し３０分ずつ２回洗浄した。次にこの断片をエタノール濃度を増加しながら、すなわち７０％エタノールで３０分間、次に９５％エタノールで３０分間、最後に１００％エタノールで３０分間ずつ３回洗浄して脱水した。その後これらの断片を２つの浸透樹脂溶液(Technovit 7100, Heraeus, Germany)の第一の溶液に浸漬し回転装置上で一晩放置した。その後この断片を第二の樹脂溶液に移し、回転装置上で再度一晩放置した。各断片を包埋型の中に注意深く立てて置き、包埋型の底部に最小量のスーパーグルーでその位置のままとめた。浸透用に用いたものと同じ樹脂混合液を硬化剤と混合し、この溶液を、断片全体が完全にカバーされるまで型にピペットで注入した。合成樹脂がポリマー化するまで室温で２時間放置した後、３７℃のオーブンに一晩入れた。次に合成樹脂のブロックを型からそっと外し、接着剤としてTechnovit 3040 (Heraeus, Germany)を用いてHistoblock 上に乗せた。各ブロックをミクロトーム(LKB Bromma, Germany)にしっかり固定し、各１０μｍの約６０−７０切片を切り取って形を調整した。これらを廃棄し、ミクロトームを５μｍの切片を切断するように設定した。これらの切片は鉗子で集め、室温で保持しておいた蒸留水中で広げた。次にこれらをスライドグラスの上に取り、約１５分間６０℃で乾燥させた。次に切片を１０分間Toluidine Blueで染色した後、水道水で４回洗浄し、空気乾燥させた。
【００７７】
（右側および左側頸動脈）
長さ約３−４ｍｍの４個および５個の各断片を、左側（コントロール）および右側（バルーン処置）の頸動脈から各々切り出した。コントロールおよび実験用の容器中では、異なる数の切片を使用し、包埋および切片作成中に組織間で混同しないようにした。この断片を、大動脈弓断片について先に記載した方法を用いて、脱水、包埋、切片作成および染色を行った。
【００７８】
（内膜−対−中膜比）
バルーン処置およびコントロールの頸動脈および大動脈弓の内膜−対−中膜比（Ｉ：Ｍ）に関するすべての形態計測分析は、Mocha Image Analysis system (version 1.1, Jandel Scientific, Ca., U.S.A.)を用いて行った。測定を行い、各動脈のすべての断片の内膜層および中膜層双方のサイズ（ピクセルにて）を決定した。Excel (Microsoft Corporation, N.Y., U.S.A.)のスプレッドシートを用いて、１羽のウサギ当たり３つの大動脈弓断片、４つのコントロール頸動脈断片、および５つのバルーン処置頸動脈断片の各々について、内膜−対−中膜比を算出し、記録した。
【００７９】
（統計）
すべての統計分析は、SigmaStat (Jandel Scientific, Ca., U.S.A.)統計ソフトウェアパッケージを用いて行った。形態計測分析のデータの比較は、順位検定における“クラスカル・ワリス”分散分析（”Kruskal-Wallis”Analysis of Variance on Ranks test）を用いて一元配置多重比較分散分析（One-Way Multiple ANOVAs）にて行った。極端な外れ値はテューキー棄却検定（Tukey’s Outelier Test）を用いて同定した。すべての統計分析において、０．０５未満のＰ値を有意とみなした。情報を Microsoft Excel (Microsoft Corporation, N.Y., U.S.A.)を用いて図示した。すべてのデータは平均±平均の標準偏差として報告した。
【００８０】
（結果）
(ウサギの食餌)
ウサギはｔ＝０時前の数日間にウサギの各々の新しい食餌に慣らしたが、体重減少が１０％に達した一部の動物には、通常のペレットを補給した食餌を数日間与えた。したがって、重さの分かっている（２００グラム）新しいペレットを毎朝与え、翌朝２００グラムの新しいペレットを与える直前に食べ残した分量を秤量することにより、１日当たりの各動物の食べた新しいペレットの量を測定することを必ず行うこととした。新しいペレット（白色）と通常のペレット（褐色）の混合物を与えた場合は、２種類を分けて秤量した。
【００８１】
各ウサギの食べた白色のペレットの重さはウサギ間でばらつきがあった。群の平均では、消費されたペレットの重さは、６週の実験期間にわたり１日当たり１２ｇまでのばらつきしかなく、１日当たり２３．２グラムから３５．３グラムまでの範囲であった（平均  ３０．４８±０．９７グラム）。いずれの群間においても食べた食餌ペレットの量に有意差はなかった。第２−８群の食餌への０．５％コレステロールの添加は、食べた量にも、カゼインのタイプまたは量にも影響はなかった。このようにウサギの消費した餌の量は相対的に少なく（白色ペレット  １日当たり平均３０．４８グラム、褐色ペレット  １日当たり１０．２２グラム、合計  １日当たり平均４０．７２グラム）、多少の体重減少という結果に至ったが、各群で消費された新しい食餌の量は相対的に一定しており、したがって群間の結果の比較は可能である。
【００８２】
（ウサギの体重）
第９群（１０％Ａ１、コレステロール非添加）のみが平均体重増加  ２．１５±１．２％を記録したにとどまり、ほとんどすべてのウサギは６週にわたり体重が減少した。第１０群のウサギ（１０％Ａ２、コレステロール非添加）は少量の体重減少  −０．９２±０．９７％しか示さなかった。２０％乳清のみ（コレステロール非添加）の第１群のウサギは、６週の試験にわたり始めの体重の４．５±６％減少したが、残りの第２−８群（すべてコレステロール添加）は始めの体重の平均７．５７±４．７２％減少した。
【００８３】
最大の平均体重減少は、第６群によるものであった。しかしこの結果は完全に、開始時３．８１ｋｇと重い体重だった１羽のウサギ（Ｋ６）によるものである。このウサギは１日当たり平均２１．５８グラムのペレットを食べ、すべてのウサギの平均（３０．０５）より１日当たり約９グラム少なかった。Ｋ６は病気の兆候は示しておらず、屠殺時にも正常な色の非常に小さな肝臓だったことを除いて、すべての臓器は正常に見受けられた。この群の残りの５羽のウサギは始めの体重の５％未満の減少だった。体重変化においてカゼインの比率またはタイプ間に明らかな関連性はなかった。
【００８４】
（コレステロールについての食餌の効果）
６週時に、ほぼすべての群のコレステロールレベルは第１群（２０％乳清のみ）と有意に異なっていた。興味深いことに第９群（Ａ１）のコレステロールレベルは第１群より高かったが、この差は有意ではなかった。また第８群（２０％Ａ２、コレステロールを含む）のコレステロールレベルは、コレステロールを添加した２０％乳清（第２群）から得られた値の約１/２であったが、この差も有意ではなかった。第９群の血清コレステロールは、食餌中のコレステロールを与えたすべての群（第２−８群）より有意に低かった。第１０群（Ａ２）の血清コレステロールは第１群より有意に低く、事実、第９群を含むすべての群より有意に低かった。
【００８５】
この結果は、食餌への０．５％のコレステロール添加が、食餌中の乳清の量ならびにカゼインの量およびタイプの双方にかかわりなく、血清コレステロールレベルの増加の原因となったことを示す。また食餌中のコレステロール非存在下において、Ａ２は、Ａ１および乳清の双方より低い血清コレステロールレベルをもたらした。
【００８６】
（トリグリセリドについての食餌の効果）
６週までに、第５群（２０％Ａ１）および９群（１０％Ａ１、コレステロール非添加）のトリグリセリドレベルは０週から増加しており、第４群（１０％Ａ１）および１０群（１０％Ａ２、コレステロール非添加）は変化していなかった。他のすべての群の血清トリグリセリドは、０週時のレベルから減少した。
【００８７】
（ＬＤＬについての食餌の効果）
食餌中のコレステロールを添加したすべての群において、血清ＬＤＬは、食餌中のコレステロールを含まない第１群（乳清のみ）または９群（Ａ１）および１０群（Ａ２）より有意に高かった。第９群（Ａ１、食餌中のコレステロールを含まない）は第１群と有意差はなかったが、第１０群（Ａ２、食餌中のコレステロールを含まない）は有意に低かった。第１０群のＬＤＬレベルはまた、第９群の値より有意に低かった。食餌中のコレステロールを添加したすべての群（第２−８群）は、互いの有意差はなかった。
【００８８】
このように血清ＬＤＬは血清コレステロールと同じパターンをとり、食餌中のコレステロールの添加がすべての相応する群の血清ＬＤＬレベルを増加させ、一方で食餌中のコレステロール非存在下のＡ２カゼイン変異型は、Ａ１または乳清のみのいずれかより低い血清ＬＤＬをもたらすことを示した。
【００８９】
（ＨＤＬについての食餌の効果）
血清ＨＤＬは血清ＬＤＬと同じパターンをとり、食餌中のコレステロールの添加（第２−８群）が、コレステロールを添加しなかった場合（第１、９および１０群）より有意なレベル上昇の原因となった。第９群は第１群と有意差はなかったが、第１０群より有意に高く、第１０群は同様に第１群を除くすべての群より有意に低かった。食餌中のコレステロールを含まないβ−カゼインＡ２は、Ａ１より低い血清ＨＤＬレベルをもたらした。
【００９０】
（ＬＤＬ−対−ＨＤＬ比についての食餌の効果）
ＬＤＬ−対−ＨＤＬ比は、個々のウサギの血清ＬＤＬレベルを同じウサギのＨＤＬレベルで割ることにより決定した。その後各群の平均ＬＤＬ：ＨＤＬを決定した。第１０群（１０％β−カゼインＡ２のみ）のＬＤＬ：ＨＤＬは、乳清のみおよびβ−カゼインＡ１のみを含む他のすべての群より有意に低かった。食餌中のコレステロールを含むすべての群（第２−８群）のＬＤＬ−対−ＨＤＬ比は、互いの有意差はなかった。血清ＬＤＬおよびＨＤＬのレベルの場合と同様に、β−カゼインＡ１の用量が多いほど値が高くなり、β−カゼインＡ２の用量が多いほど値が低くなる傾向があった。
【００９１】
（ホモシステインについての食餌の効果）
６週までに血清ホモシステインレベルは０週時の値からわずかしか変化しておらず、実験群間での有意差は示さなかった。
【００９２】
（アテローム硬化症についての食餌の効果）
２０％乳清を与えた第１群のウサギは、プラークで覆われた大動脈表面領域は０％であった。他のすべての群は第１０群を含めて、多少のプラークを有していたが、これは第１群に比して有意に高くはなかった。第１群および１０群のみが第３群より有意に低く、第３群はまた第２−９群よりかなり高かった。しかしこの群内ではウサギ間のばらつきが大きく、２．８％および１８．４％の間の範囲であった。３羽のウサギは極端な外れ値と思われたため、これらの計算からこの３羽を除外した。
【００９３】
第１群の胸部大動脈は、脂肪線条で覆われた表面領域は０％であった。他のすべての群は、食餌中のコレステロールを含まない第９群（Ａ１）および１０群（Ａ２）を含めて、多少の病変を有していた。第９群および１０群は互いの有意差はなかった。食餌中のコレステロールを含むＡ１およびＡ２の双方とも、カゼイン変異型の濃度の増加に伴って病変の比率が低下する傾向があったが、これは有意ではなかった。第３群は他のすべてよりかなり高かったが、有意差はなかった。この群の６羽のウサギの内、３羽はプラークで覆われた表面領域の高い比率を、そして３羽は低い比率を有していた。
【００９４】
食餌中のコレステロール非存在下でＡ２を与えた動物（第１０群）から単離した腹部大動脈は、プラークで覆われた微小の表面領域のみしか有しておらず、プラークで覆われた領域が０％であった第１群（乳清のみ）と有意差はなかった。第１０群は、第９群（Ａ１、食餌中のコレステロールなし）を含む他のすべての群より有意に低かった。第３群（５％Ａ１、食餌中のコレステロールを含む）は、２０％乳清および食餌中のコレステロールを含む第２群より有意に高かった。
【００９５】
このように食餌中のコレステロールを含まない双方のカゼイン変異型とも、乳清のみより広範囲の脂肪線条をもたらしたが、Ａ２はＡ１よりアテローム発生性が低かった。加えてＡ１は、食餌中のコレステロール存在下においてもＡ２よりアテローム発生性が高かった。
【００９６】
（内膜−対−中膜比）
２０％乳清のみ（第１群）では、大動脈弓の内膜の肥厚は認められなかった。同様に食餌中のコレステロールを含まない１０％Ａ２（第１０群）、または食餌中のコレステロールを含む５％Ａ２または２０％Ａ２（第６群および８群）の存在下においても、内膜−対−中膜比の平均は０であった。第７群（１０％Ａ２、食餌中のコレステロールを含む）は内膜−対−中膜比が０．０１のみに過ぎず、６羽のウサギの内４羽は０％であった。すべてのＡ１群（食餌中のコレステロールを含むおよび含まない双方の場合）は、Ａ２カゼインを与えた群により高い内膜−対−中膜比を有していたが、第２群（２０％乳清、０．５％コレステロールを含む）との内膜−対−中膜比の有意差はなかった。事実、食餌中のコレステロール非存在下の１０％Ａ１は、０．５％食餌中のコレステロールを含む２０％乳清と等しい内膜−対−中膜比をもたらした（０．０３）。
【００９７】
このように大動脈弓の脂肪線条の厚さに関して、Ａ１カゼインは食餌中のコレステロール非存在下でさえも、０．５％コレステロールでもたらされる病変と類似する病変をもたらす。反対にＡ２は食餌中のコレステロールの存在下および非存在下の双方において、高いアテローム防護性があるように見受けられる。
【００９８】
バルーンカテーテルによるｔ＝０時の右頸動脈への傷害は、６週までにすべてのウサギに過形成性新生内膜肥厚を誘発した。内膜−対−中膜比の測定は、第１群（２０％乳清のみ）と比較して、第２群のウサギ（２０％乳清、０．５％コレステロールを含む）の新生内膜肥厚に有意ではないがわずかな増加があることを示した。同様に５、１０および２０％Ａ１プラス０．５％コレステロールを与えた群は、第１群に比してより厚い新生内膜であったが、有意差はなかった。５、１０および２０％Ａ２プラス０．５％コレステロールを与えた群はすべて、それらのＡ１の対応する群より薄い新生内膜を有していたが、やはりこの値も有意ではなかった。同様に食餌中のコレステロール非存在下において、Ａ２を与えた動物（第１０群）の内膜−対−中膜比は、Ａ１を与えた第９群より低かった。
【００９９】
すべてのコントロールの血管には新生内膜の肥厚は観察されなかった。
本発明は実施例により記載したが、変更および修飾は本請求項の範疇から離れずに行ってもよいことは、認識されるべきであろう。さらに、特定の特徴に対する公知の均等物が存在する場合には、このような均等物を本明細書において具体的に参照したものとして援用する。
【０１００】
産業上の利用可能性
β−カゼインＡ２の消費は、血清コレステロールレベル、血中トリグリセリドレベル、ＬＤＬ濃度したがってＬＤＬ：ＨＤＬ比、ならびにアポリポタンパク質Ｂの血清レベルを低減するために有用である。したがって本発明の方法は、哺乳類の血清コレステロールレベル、ＬＤＬコレステロールレベルおよびトリグリセリドレベルに伴う、多様な疾患を予防または治療するために有用である。このような疾患として、高コレステロール血症、高脂血症、およびアテローム硬化症を含む。本発明はまた、β−カゼインＡ２を含有する栄養補助食品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、β−カゼインＡ２、β−カゼインＡ１、および乳清を与えたＮＺシロウサギに関する、大動脈の内膜−対−中膜比（動脈の肥厚を表示する）の平均を示す。
【図２】図２は、内膜除去した右頸動脈の新生内膜肥厚の程度（動脈壁傷害後の動脈の疾患の進行を表示する）を示す。Ａ：第１群の実施例は、新生内膜の肥厚がないことを示す、Ｂ：第２群の実施例は、内膜層の多少の病変の形成を示す、そしてＣ：第５群の実施例は重篤な内膜の肥厚を示す。
【図３】図３は、β−カゼインＡ２を与えた、β−カゼインＡ１を与えた、および乳清を与えたＮＺシロウサギに関する、血清コレステロールレベルを示す。
【図４】図４は、β−カゼインＡ２を与えた、β−カゼインＡ１を与えた、および乳清を与えたＮＺシロウサギに関する、血清ＬＤＬ−対−ＨＤＬ比を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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