(57)【要約】活性剤を搬送する固定された−乾燥血液細胞と、これを作製する方法と、これを使用する方法と、これを含有する組成物を記載する。血液細胞は赤血球細胞または血小板であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定された乾燥赤血球細胞、固定された乾燥血小板およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、活性剤を搬送する固定された乾燥血液細胞。
【請求項２】
前記固定された乾燥血液細胞が哺乳類の固定された乾燥血液細胞を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項３】
前記固定された乾燥血液細胞がヒトの固定された乾燥血液細胞を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項４】
前記活性剤が、前記細胞の内部または表面に共有結合または非共有結合で結合されている、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項５】
前記活性剤が前記細胞に含有されている、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項６】
前記固定された乾燥血液細胞がアルデヒド固定された血小板を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項７】
前記固定された乾燥血液細胞が、再構成の結果、
血栓形成面に接着する、
血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、
血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および
顆粒状内容物を放出する、
固定された乾燥血小板である、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項８】
前記固定された乾燥細胞が固定された乾燥赤血球細胞である、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項９】
前記活性剤が抗ウイルス剤を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項１０】
前記活性剤が血液凝固タンパク質を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項１１】
前記活性剤が血液抗−凝固タンパク質を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項１２】
前記活性剤が核酸を含む、請求項１に記載の固定された乾燥血液細胞。
【請求項１３】
製薬学的に許容されうる担体；および
活性剤を搬送し、前記製薬学的に許容されうる担体中で再水和され、固定された乾燥赤血球細胞、固定された乾燥血小板およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固定された乾燥血液細胞
を含む製薬学的組成物。
【請求項１４】
前記担体が滅菌した担体である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１５】
前記担体が固体担体である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１６】
前記担体が液体担体である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１７】
前記担体が水性担体である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１８】
前記固定された乾燥血液細胞が哺乳類の固定された乾燥血液細胞を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項１９】
前記固定された乾燥血液細胞がヒト固定された乾燥血液細胞を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２０】
前記活性剤が前記固定された乾燥血液細胞に結合されている、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２１】
前記活性剤が、前記固定された乾燥血液細胞内に含有される、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２２】
前記固定された乾燥血液細胞がアルデヒド−固定された細胞を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２３】
前記固定された乾燥血液細胞が、再構成の結果、
血栓形成面に接着する、
血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、
血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および
顆粒状内容物を放出する、
固定された乾燥血小板である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２４】
前記固定された乾燥血液細胞が固定された赤血球細胞である、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２５】
前記活性剤が抗ウイルス剤を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２６】
前記活性剤が血液凝固タンパク質を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２７】
前記活性剤が血液抗凝固タンパク質を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２８】
前記活性剤が核酸を含む、請求項１３に記載の製薬学的組成物。
【請求項２９】
活性剤を搬送する固定された乾燥血液細胞を作製する方法であって、
固定された赤血球細胞、固定された血小板およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固定された血液細胞を提供するステップと、
前記固定された血液細胞に前記活性剤を結合するステップと、および
前記固定された血液細胞を乾燥させて、前記活性剤を搬送する固定された乾燥血液細胞を作製するステップと、
を含む方法。
【請求項３０】
前記活性剤を搬送する前記固定された乾燥血液細胞が、製薬学的に許容されうる担体で再水和されて、前記活性剤を搬送する再水和固定された乾燥血液細胞を含む製薬学的に許容されうる組成物を提供する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記固定された血液細胞が固定された哺乳類血液細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記固定された血液細胞が固定されたヒト血液細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合するステップが、前記活性剤を前記固定された血液細胞に共有結合または非共有結合によって結合することによって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合するステップが、前記固定された血液細胞内に前記活性剤を導入することによって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記血液細胞がアルデヒド固定された血液細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記再水和され固定された乾燥血液細胞が、再構成の結果、
血栓形成面に接着する、
血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、
血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および
顆粒状内容物を放出する、
再水和され固定された乾燥血小板を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記固定された血液細胞が固定された赤血球細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
関心対象の化合物をＲＥＳの血栓形成面またはマクロファージに送達する方法であって、
関心対象の前記化合物を搬送する固定された乾燥赤血球細胞、固定された乾燥血小板およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固定された乾燥血液細胞を提供するステップと、
製薬学的に許容されうる担体で再水和されて、前記活性剤を搬送する再水和固定された乾燥血液細胞を含む製薬学的に許容されうる組成物を提供するステップと、および
関心対象の前記化合物の有効量がＲＥＳの前記血栓形成面またはマクロファージに送達されるように前記製薬学的組成物を投与するステップと、
を含む方法。
【請求項３９】
前記固定された乾燥血液細胞が哺乳類固定された乾燥血液細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固定された乾燥血液細胞がヒト固定された乾燥血液細胞を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記血栓形成表面が被験者内に存在し、前記被験者が哺乳類被験者である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記血栓形成面が被験者内に存在し、前記被験者がヒト被験者である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
関心対象の前記化合物が前記細胞に共有結合または非共有結合により結合されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
関心対象の前記化合物が前記細胞内に含有される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記固定された乾燥血液細胞がアルデヒド固定細胞を含み、前記血栓形成面が血管損傷に苦しむ被験者内に存在する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記再水和された固定された乾燥血液細胞が、
血栓形成面に接着する、
血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、
血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および
顆粒状内容物を放出する、
再水和された固定された乾燥血小板である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記固定された乾燥血液細胞が固定された乾燥赤血球細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
関心対象の前記化合物が診断剤または治療剤である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
関心対象の部位に活性剤を送達する方法であって、
前記活性剤を搬送する固定された乾燥赤血球細胞、固定された乾燥血小板およびそれらの組み合わせからなる群から選択される固定された乾燥血液細胞を提供するステップと、
製薬学的に許容されうる担体で前記固定された乾燥血液細胞を再水和して、前記活性剤を搬送する再水和され固定された乾燥血液細胞を含む製薬学的に許容されうる組成物を提供するステップと、および、次いで
前記活性剤の有効量が関心対象の前記部位に送達されるように前記製薬学的組成物を被験者に投与するステップと、
を含む方法。
【請求項５０】
前記固定された乾燥血液細胞が哺乳類の固定された乾燥血液細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記固定された乾燥血液細胞がヒトの固定された乾燥血液細胞を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験者が哺乳類被験者である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記被験者がヒト被験者である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記活性剤が前記固定された乾燥血液細胞に結合されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記活性剤が前記固定された乾燥血液細胞内に含有される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記固定された乾燥血液細胞がアルデヒド固定された乾燥血液細胞を含み、関心対象の前記部位が血管損傷部位である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記再水和され固定された乾燥血液細胞が、
血栓形成面に接着する、
血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、
血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および
顆粒状内容物を放出する
再水和された固定された乾燥血小板である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記固定された乾燥血液細胞が固定された乾燥赤血球細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記活性剤が抗ウイルス剤を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
前記活性剤が血液凝固タンパク質を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６１】
前記活性剤が血液抗凝固タンパク質を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記活性剤が核酸を含む、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援に関する陳述
本発明は、付与番号１−Ｐ２０−ＤＥ１２３４７４、１−Ｐ６０−ＤＥ  １３０７８９および１  Ｒ２１  ＥＢ００２８６３で米国防省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ）および米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの政府支援により実施された。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本願は、開示内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる、２００３年１２月２９日提出の米国仮特許出願番号第６０／５３３，０５９号および２００３年５月１６日提出の米国仮特許出願番号第６０／４７１，００５号の恩典を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、必要としている被験者に活性剤を送達するための方法および組成物に関し、さらに特に活性剤を搬送し、関心対象の部位に活性剤を送達するのに有用である固定された乾燥血液細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
血小板は、血管損傷部位に治療薬を搬送する有望なツールとして数十年間認識されている。しかし、血小板は単離直後に、治療薬で改変し、短い時間帯で注入しなければならないので、治療薬送達ビークルとしての血小板の実用性は限界があった。凍結保存した血小板および通常どおり液体保存した血小板の治療薬送達の利用性は保存損傷による限界があり、凍結血小板の場合には、凍結保存剤を除去する必要性がある。このように、凍結保存した血小板および保存された血液細胞の実用化は一般に制限されている。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の第一の態様は、関心対象の異種化合物、活性剤または化合物を搬送する固定された乾燥血小板、赤血球細胞（ＲＢＣ）またはそれらの組み合わせと、これを含む、これからなるまたは本質的にこれからなる組成物である。このような血小板、ＲＢＣまたはそれらの組み合わせは、好ましくは、ヒト血小板およびＲＢＣなどの哺乳類血液細胞である。化合物または活性剤は、カップリングまたは血小板および／またはＲＢＣ内に含有されるなどの任意の方法で血小板および／またはＲＢＣに結合することができる。血小板および／またはＲＢＣはアルデヒド固定されてもよく、一実施態様において、血小板は、血栓形成表面に接着し、血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および顆粒状内容物を放出するという点において特徴づけられる。送達される活性剤または化合物は、ヌクレオシド類似体抗ウイルス剤などの抗ウイルス剤（例えば、リバビリン）、第ＶＩＩ因子などの血液凝固タンパク質、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、検出可能なタンパク質またはペプチドなどの検出可能な化合物等であってもよい。
【０００６】
本発明の第２の態様は、例えば、約０．０１または０．１〜９９．９または９９．９９重量パーセントの製薬学的に許容されうる担体（例えば、水性または非水性担体；固体、液体またはゲル担体等）および例えば、０．０１または０．１〜９９．９または９９．９９重量パーセントの、必要に応じて製薬学的に許容されうる担体で再水和されており、本明細書に記載する活性剤を搬送する固定された乾燥血液細胞を含む、それらからなるまたは本質的にそれらからなる製薬学的組成物である。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は、固定された血液細胞（典型的には、哺乳類細胞および好ましくは、ヒト細胞、特にＲＢＣ、血小板およびそれらの組み合わせ）を提供するステップと；活性剤を固定された血液細胞に結合させるステップと；および固定された血液細胞を（例えば、フリーズ−ドライまたは凍結乾燥によって）乾燥して、作用化合物を搬送する固定された乾燥血液細胞を作製するステップを含む、必要としている被験者に関心対象の化合物または活性剤を送達するための固定された乾燥血液細胞を作製する方法である。本発明の方法は、固定された乾燥血液細胞を製薬学的に許容されうる担体で再水和して、活性剤を搬送する再水和された固定された乾燥血液細胞を含む製薬学的に許容されうる組成物を提供するステップをさらに含んでもよい。結合するステップは、活性剤を細胞にカップリングするまたは活性剤を細胞に導入することによるなどの任意の好適な手段によって実施することができる。細胞はアルデヒド固定されていてもよく、一実施態様において、細胞は、再構成の結果、血栓形成面に接着する、血栓形成面への接着の結果、形状変化を受ける、血栓形成面への接着の結果、止血血栓を形成する、および顆粒状内容物を放出するという点において特徴付けられる血小板である。
【０００８】
本発明のさらに別の態様は、血栓形成面（例えば、被験者または診断もしくは化合物の試験目的のためにインビトロにおける組織）に関心対象の化合物を送達する方法であって：本明細書に記載する関心対象の化合物を搬送する固定された乾燥赤血球細胞を提供するステップと、製薬学的に許容されうる担体（例えば、製薬学的または生理学的に許容されうる担体）で固定された乾燥血液細胞を再水和して、活性剤を搬送する再水和され固定された乾燥血液細胞を含む組成物を提供するステップと、および、次いで関心対象の化合物の有効量が血栓形成面に送達されるように製薬学的組成物を（例えば被験者、インビトロにおける組織に）投与するステップを含む方法である。被験者は、典型的には、ヒト被験者などの哺乳類被験者であり、関心対象の化合物は診断薬または治療薬であってもよい。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、被験者のＲＥＳのマクロファージに関心対象の化合物を送達する方法である。被験者は、典型的には、ヒト被験者などの哺乳類被験者であり、関心対象の化合物は診断薬または治療薬であってもよい。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、関心対象の部位（例えば、被験者またはインビトロにおける組織）に活性剤を送達する方法であって、本明細書に記載する活性剤を搬送する固定された乾燥赤血球細胞を提供するステップと、製薬学的に許容されうる担体で固定された乾燥血液細胞を再水和して、活性剤を搬送する再水和され固定された乾燥血液細胞を含む製薬学的に許容されうる組成物を提供するステップと、および、次いで活性剤の有効量が関心対象の部位に送達されるように製薬学的組成物を関心対象の部位（例えば、被験者またはインビトロにおける組織）に投与するステップを含む方法である。活性剤の有効量は、内因性血小板等価物の１５％（１５パーセント）未満であってもよい。被験者は、典型的には、ヒト被験者などの哺乳類被験者であり、活性剤は診断薬または治療薬であってもよい。細胞はアルデヒドで固定された細胞であってもよく、被験者は例えば血管損傷で苦しんでいる患者であってもよい。
【００１１】
本発明の上記および他の目的および態様は以下にさらに詳細に説明されている。
【００１２】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は以下にさらに詳細に説明されている。本明細書の説明は、本発明を実施することができる全ての異なる方法または本発明に加えることができる全ての特徴の詳細な一覧表であることが意図されているわけではない。例えば、一実施態様に関して例示する特徴は他の実施態様に組み入れてもよく、特定の実施態様に関して例示される特徴はその実施態様から削除されてもよい。本明細書に示唆されている種々の実施態様の、本発明から逸脱しない数多くの変更および追加は、本発明の開示を鑑みて当業者に明らかである。従って、以下の明細書は、本発明のいくつかの特定の実施態様を例示することが意図されており、全ての置換、組み合わせおよび変化を余すところなく特定することを意図していない。
【００１３】
本発明の方法および組成物で治療される被験者には、ヒト被験者および獣医学的および薬物開発目的のための動物被験体が含まれる。動物被験体は、一般に、ブタ、ヒツジ、メウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウスおよびラット被験体を含むが、これらに限定されない哺乳類被験体である。
【００１４】
本明細書において使用する「血栓形成面」は、創傷組織、アテローム斑などの血管プラーク、局所または全身炎症による活性化内皮、抗癌剤、抗腫瘍薬または抗増殖薬の投与による毒性の副作用として被験者において血栓形成性となる血管、表面または組織、ステント、カテーテル、ペースメーカーおよびリードなどの生物医学インプラント、人工関節などの整形外科インプラント等に見られるような金属、ポリマー等を含む被験者の異物または植え込まれた物品の表面を含むが、これらに限定されない任意の天然または人工的な血栓形成面をいう。化合物は、治療目的または診断目的（例えば、放射性イメージング、組織生検、インプラント除去および送達された化合物がインプラント表面に見られるかどうかの判定等）のためなどの任意の目的のために血栓形成面に投与することができる。
【００１５】
本発明を実施する際に使用する「血小板」は、一般に、動物起源のものであり、好ましくは、哺乳類起源（例えば、ブタ、ヒツジ、メウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒト等）のものである。血小板は、血小板を導入する同一種由来であっても、または血小板を導入する種と異なる種由来であってもよい。一実施態様において、血小板を被験者から回収し、本明細書に記載する活性剤を作製するために使用し、このように作製後、後に、血小板を回収した同一被験者に投与する。
【００１６】
本明細書において使用する「赤血球細胞」は、哺乳類起源（例えば、ブタ、ヒツジ、メウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ヒト等）の任意の赤血球を含む。赤血球細胞は、赤血球細胞を導入する同一種由来であっても、または赤血球を導入する種と異なる種由来であってもよい。一実施態様において、赤血球細胞を被験者から回収し、本明細書に記載する活性剤を作製するために使用し、このように作製後、後に、赤血球細胞を回収した同一被験者に投与する。
【００１７】
本明細書の「固定された血液細胞」は、細胞を構造的に安定にするおよび／または細胞の保存寿命を延長するために細胞の少なくとも一部に組み込まれる少なくとも１種の化合物で化学的に処理された血小板、赤血球細胞またはそれらの混合物であってもよい血液細胞をいう。
【００１８】
本明細書の「固定された乾燥血液細胞」は、固定されており、構造的にさらに安定にするためおよび／または保存寿命を延長するために、乾燥、脱水、凍結乾燥またはフリーズ−ドライ等などの任意の好適な技法によって離脱された血小板、赤血球細胞またはそれらの混合物であってもよい血液細胞をいう。
【００１９】
「再水和され、固定された乾燥血液細胞」は、水が細胞内空間に取り込まれるように、水溶液に接触しているまたは混合されている血小板、赤血球細胞またはそれらの混合物であってもよい固定された乾燥血液細胞をいう。
【００２０】
本明細書において使用する「血液凝固タンパク質」は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子を含むが、これらに限定されない任意の好適な血液凝固タンパク質ならびに第ＸＩＩ因子もしくは第ＸＩＩａ因子、または第Ｘ因子もしくは第Ｘａ因子、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロトロンビンなどの第ＶＩＩ因子もしくは第ＦＶＩＩａ因子を産生する凝固タンパク質を含む。このようなタンパク質は天然または合成であってもよく、天然型タンパク質のわずかな改変を含むタンパク質（すなわち、類似体）を含んでもよい。天然型の場合は、タンパク質は任意の種起源、好ましくは本明細書に記載する哺乳類またはヒト起源であってもよく、一実施態様において、投与する被験者と同じ種起源である。
【００２１】
本明細書において使用する「血液抗−凝固タンパク質」は、活性化プロテインＣ、プロテインＳ、ヘパリンおよびヘパリノイドを含むが、これらに限定されない任意の好適な血液抗−凝固タンパク質を含む。このようなタンパク質は天然または合成であってもよく、天然型タンパク質のわずかな改変を含むタンパク質（すなわち、類似体）を含んでもよい。天然型の場合は、タンパク質は任意の種起源、好ましくは本明細書に記載する哺乳類またはヒト起源であってもよく、一実施態様において、投与する被験者と同じ種起源である。
【００２２】
本明細書において使用する「ＡＡＶ」は、「アデノ随伴ウイルス」をいう。
【００２３】
本明細書において使用する「治療する」という用語は、患者の状態（例えば１つ以上の症状）の改善、疾患進行の遅延等を含む、疾患に苦しむ患者のためになる任意の種類の治療をいう。
【００２４】
本明細書において使用する「製薬学的に許容されうる」という用語は、化合物または組成物が、疾患の重症度および治療の必要性に関して不要に重篤な副作用を生じないで、本明細書に記載する治療を達成するために患者に投与することが好適であることを意味する。
【００２５】
出願人らは、本明細書に引用する全ての米国特許の開示内容は全体の内容が参照により本明細書に組み入れられることを具体的に意図している。
【００２６】
１．血小板
血小板は、米国特許第４，２８７，０８７号；同第５，６５１，９６６号；同第５，９０２，６０８号；同第５，８９１，３９３号および同第５，９９３，０８４号に記載されているものなどの既知の技法により固定することができる。一般に、このような方法は、血小板（例えば、ヒト、哺乳類）を提供するステップ、血小板を固定するのに十分な時間にわたってヒト血小板を固定剤（例えば、アルデヒド）に接触させるステップ；血小板から固定剤を除去するステップ、次いで血小板を乾燥して固定された乾燥血小板を作製するステップに関係する。好ましい実施態様において、接触させるステップは、微生物を死滅させるのに十分な時間にわたって実施される。好ましい実施態様において、接触させるステップは、再構成の結果、（ｉ）血栓形成面に接着する、（ｉｉ）非−血栓形成面に接着しない、（ｉｉｉ）血栓形成面への接着の結果、形状変化（拡散）を受ける、（ｉｖ）血栓形成面への接着の結果、互いに接着して止血血栓を形成する、および（ｖ）顆粒状内容物を放出する能力を失わせる程度の時間にわたって実施される。
【００２７】
さらに特に、本発明に使用する固定された乾燥血小板は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群から選択される化合物で固定することができ、現在ではパラホルムアルデヒドが好ましい。一般に、洗浄した血小板を、典型的には、１．８％以下ののアルデヒド溶液中で最長６０分室温においてインキュベーションすることによって固定することができる。別の技法は、血小板を過マンガン酸塩溶液（例えば、過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム）中でインキュベーションすることによって血小板を固定することである。一般に、洗浄した血小板は、０．００１〜１ｇ／ｄＬのＫＭｎＯ4またはＮａＭｎＯ4溶液中で５〜２０分間インキュベーションすることによって、さらに好ましくは、０．００５〜０．５ｇ／ｄＬのＫＭｎＯ4またはＮａＭｎＯ4溶液中で５〜１５分インキュベーションすることによってこの技法により作製することができる。
【００２８】
製薬学的組成物を作製する際に使用する血小板製剤は、外来物質、特に製剤を投与する患者に遊離の血栓形成物質を提供すると思われる溶解した血小板を本質的に含まないことが必要である。従って、過剰な溶解が乾燥段階中に生じるので、乾燥前に（好ましくは、上記に記載する特徴によって示されるように、生存度を破壊しないで）血小板を十分に固定するために注意を払う必要がある。例えば、ヒト製薬学的組成物を作製する際に使用するのに好適な血小板製剤は、好ましくは、１ミリリットルの溶液において１０9の血小板を再構成する際、微粒子（溶解した血小板の断片化した残存物）は１０×１０6未満であり、好ましくは、再懸濁およびペレット形成後の上清中の乳酸脱水素酵素が１リットル当たり１５０国際単位（ＩＵ）未満である（ここで、１リットル当たり２２００ＩＵは１ミリリットルにおける総溶解数が１０9細胞であることを示す）。
【００２９】
固定後の血小板の乾燥は任意の好適な手段によって実施することができるが、好ましくは、凍結乾燥によって実施される。許容されないレベルの血小板溶解が生じることがあるので、乾燥前に血小板製剤を安定化する注意を払うべきである。安定化は、アルブミンまたはトレハロースなどの好適な水代替分子（または「安定剤」）を含有する溶液に血小板を懸濁させ、次いで溶液を乾燥することによって実施することができる。一実施態様において、０．１〜２０重量パーセントのアルブミンを使用し、さらに好ましくは、１〜１０重量パーセントのアルブミンを使用し、最も好ましくは、５〜１０重量パーセントのアルブミンを使用する。被験者に投与するためには、製剤中のアルブミンは、被験者と同じ種のものでなければならない（例えばヒトアルブミン）。または、製剤を異なる種のアルブミンと共に乾燥し、再構成時にアルブミンを血小板から分離し、被験者に投与するために同一種のアルブミンを再構成後の製剤に添加してもよいが、種非特異的アルブミンは治療対象の被験者において抗原性となることがあるので、全ての種非特異的アルブミンを除去する注意を払う必要がある。乾燥したら、血小板を送達予定の化合物とカップリングまたは結合して、以下にさらに記載する本発明の「活性剤」を作製することができる。
【００３０】
２．凍結乾燥したＲＢＣ．
本発明の架橋し、凍結乾燥したＲＢＣは、以下の反応性部分とホモまたはヘテロマーである二官能性架橋試薬を用いて作製することができる：アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ピリジル−ジスルフィド、イソシアネート、ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、ニトロベンゼン、イミドエステル、光で活性化されうるアジドフェニルおよびアジドポリアロマティクスおよびゼロスペーサーカルボジイミド触媒。２つ以上の架橋剤の組み合わせと同様に、多（ポリ）官能性試薬も考慮され、ＲＢＣと連続的に反応するかまたはＲＢＣと共に反応する。
【００３１】
ＲＢＣは、承認されているＩＡＣＣＯＣプロトコールにより標準的な瀉血、成分採血または全採血方法を用いて哺乳類の血液から得られる。ＲＢＣは、分画遠心法によって（ｍｙ）血漿血小板、白血球および血漿タンパク質から遊離され、次いで化学的架橋剤で処理される。ＲＢＣと架橋剤の反応は、一般に、規定された時間にわたって、２０℃〜３７℃の温度において所定の濃度のＲＢＣで実施される。以下にさらに詳細に考察するように、血小板を十分に固定するように注意を払う必要があり、または凍結乾燥した製品の再水和時に過度の溶解を測定する。架橋段階は抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーの存在下において実施することができ、架橋反応は、一級アミンを含有する化合物を添加することによって停止することができる。架橋後、分画遠心法、クロマトグラフィーおよび／または透析を用いてＲＢＣを架橋剤および反応生成物から除去する。
【００３２】
架橋後のＲＢＣの凍結は、周囲圧力または高圧において広範囲の冷却速度で実施することができる。ＲＢＣ（架橋剤の濃度がゼロまたは低い場合）が高圧相状態の氷（例えば、氷ＩＩ／ＩＩＩ）で凍結される場合には、試料は、好ましくは、等温において加圧され、次いで等圧において、氷ＩＩ／ＩＩＩが準安定であるポイントの−１２０℃より低い温度に冷却されるＲＢＣは、氷結晶基質中で水と置換する「安定剤」小分子（例えば、グリセロール）、タンパク質（例えば、アルブミン）およびポリマー（例えば、ＰＥＧ）の存在下において凍結されうる。好ましい「安定剤」は、最終濃度１％（ｗ．ｖ）のＰＥＧ８，０００である。「安定剤」の種類およびレベルは、再水和されるとき不溶性でなければならない。凍結乾燥は、０℃未満の温度で実施され、好ましくは、ＲＢＣが氷Ｉの周囲圧力において凍結される場合には４０℃および氷ＩＩ／ＩＩＩ相状態からの分子蒸留では−１２０℃付近またはそれ未満において実施される。
【００３３】
架橋剤によるＲＢＣメンバーの化学的修飾は、細網内皮系による認識に関して細胞に「異物」性を与え、血小板の接触活性に関して血栓形成性を与える。表面膜は、細胞膜を立体的に被覆するポリマーを共有結合により結合することによって閉塞される。本発明を実施するために使用することができるポリマー、特に水溶性ポリマーは、一般に、多糖などの天然型ポリマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシエチルメタクリレートなどのポリアクリレート、ポリビニルアルコールおよびポリウレタンなどのポリアルキレンオキシドなどの合成ポリマーである。ポリマーは直鎖状、分岐鎖状または樹状であってもよく、置換されていてもよい。ポリマーは、上記に記載するように、親水性、親油性または親水性および親油性の両方であってもよい。ポリマーは、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ピリジル−ジスルフィド、イソシアネート、ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、ニトロベンゼン、イミドエステル、光で活性化されうるアジドフェニルおよびアジドポリアロマティクスおよびゼロスペーサーカルボジイミド触媒を含むが、これらに限定されない反応性化学的官能基で膜に共有結合により結合される。好ましいポリマーは、シッフ塩基形成により表面リジンに共有結合するための末端アルデヒドを有するＰＥＧ  ５，０００である。大規模赤血球細胞作製のための洗浄および固定段階のほとんどは、有利なことに、元来、輸血前にジメチルスルホキシドまたはグリセロールのような抗凍結剤を除去するために、凍結された赤血球細胞単位の洗浄を容易にするために血液銀行用に設計されたＩＢＭ  ２９９１  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈｅｒと呼ばれる装置を使用することによる閉鎖系において実施することができることを本発明者らは見出した。フリーズ−ドライした赤血球細胞を作製する際に本発明者らの目的のためにこの装置を使用する利点は、オープン容器での赤血球の取り扱いを必要とすると思われる多数の段階の洗浄および固定に無菌環境を提供することであり、Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈｅｒは、手動による再懸濁方法で経験されると思われるものより、各段階後に充填された赤血球細胞を再懸濁する剪断応力が小さい。一例として、本発明者らは、Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈｅｒ処理バッグに３〜４×１０9／ｍＬの細胞数の１５０〜２００ｍＬ容量の白血球を除去した赤血球細胞の懸濁液を導入し、操作説明書に記載されているようにチューブハーネスを取り付ける。次いで、本発明者らは、０．１％ＢＳＡを含有する２００〜２５０ｍＬの容量のリン酸洗浄緩衝液をチューブハーネスを介して滅菌的に導入し、洗浄サイクル＃１を実施する。２９９１にプログラムされている撹拌および遠心分離期間の終了時に、上清の洗浄液を自動的に急送して破棄し、新鮮な緩衝液をハーネスを介して導入し、合計３回洗浄する。３回目の洗浄の遠心分離段階後に、ハンクス緩衝塩溶液［ＨＢＳＳ］に０．０５％グルタルアルデヒドを含有する固定液を室温において２０分の指定のインキュベーション中に導入してから遠心分離し、次いでリン酸緩衝液を用いてさらに３回の洗浄段階を実施する。この時点において、固定され、洗浄された赤血球細胞懸濁液を２９９１処理バッグから取り出し、バルキングおよびブリーズドライ段階のためのバイアルおよびボトル中で取り扱った。
【００３４】
３．被送達化合物．
血小板にカップリングして本発明の活性剤を作製することができる化合物の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸、タンパク質またはペプチド（酵素、抗体等）、ウイルス、細菌、小型有機化合物（例えば、モノマー）、合成および半合成ポリマー、ナノ粒子、キレート金属およびイオン等が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物は、抗微生物、抗細菌または抗ウイルス活性、血液凝固または抗凝固活性、リポーターまたは検出可能な活性等を含むが、これらに限定されない特定の治療目的または方法の目的に応じて、任意の好適な機能または活性を有することができる。血小板にカップリングして本発明の活性剤を作製することができる化合物の追加の例には、血管作用性、抗酸化性、抗血栓性、抗腫瘍形成性、アテローム産生抑制性、抗有糸分裂性、抗血管新生性および抗増殖性化合物が挙げられるが、これらに限定されない。当然のことながら、このような化合物は全て、血小板に結合するまたはカップリングする小胞、ミセルまたは他の粒子内に含有されうる。
【００３５】
抗ウイルス化合物．本発明の一実施態様において、血小板によって搬送される化合物は抗ウイルス化合物である。シアル酸類似体、アマンタジン、リマンタジン、ジドブジン、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、フォスカーネット等を含むが、これらに限定されない任意の好適な抗ウイルス化合物を使用することができる。一実施態様において、抗ウイルス化合物はプリンヌクレオシド類似体であり、その例には、アシクロビル、ジダノシン、リバビリン、ガンシクロビルおよびビダラビンならびにアンチセンスヌクレオシド、ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の一実施態様において、抗ウイルス化合物を搬送する血小板は、ウイルス感染症を治療するのに十分な量が、ウイルス感染症に苦しむ患者に投与される。一実施態様において、患者は、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）またはフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）などの出血熱ウイルスに感染している。
【００３７】
血液凝固および抗凝固タンパク質．送達される化合物は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロトロンビン、活性化プロテインＣ、プロテインＳ、ヘパリンおよびヘパリノイドなどの抗凝固タンパク質ならびに爬虫類および昆虫起源の前凝固タンパク質または抗凝固タンパク質等などの薬物凝固タンパク質であってもよい。
【００３８】
このような化合物は既知である。本発明を実施する際に使用することができる第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子（この用語は、第ＶＩＩ因子の血液凝固活性を保持する改変型第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子または第ＶＩＩ因子類似体を含む）は、特に、米国特許第６，４６１，６１０号；同第６，１３２，７３０号同第６，３２９，１７６号；同第６，１８３，７４３号；同第６，１８６，７８９号；同第５，９９７，８６４号；同第５，８６１，３７４号；同第５，８２４，６３９号；同第５，８１７，７８８号；同第５，７８８，９６５号；同第５，７００，９１４号；同第５，３４４，９１８号および同第５，１９０，９１９号に記載されている。一実施態様において、組み換えヒト第ＶＩＩａ因子が好ましい。
【００３９】
本発明の一実施態様において、創傷部位の血液凝固および／または創傷の治癒を促進するのに有効な量の血液凝固タンパク質を搬送する血小板を、創傷に苦しむ被験者に投与する。
【００４０】
核酸．本発明の血小板によって搬送される核酸は、ＬａｃＺ、β−グルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質等などの検出可能なタンパク質またはペプチドをコードすることができる。
【００４１】
本発明の一実施態様において、血管のアテローム硬化組織またはアテローム斑において検出可能なタンパク質を発現し、それによって改善されたアテローム性動脈硬化症の動物モデルを作製するのに有効な量の検出可能なタンパク質をコードする核酸を搬送する血小板を被験者に投与する。このような動物（好ましくは、餌および／または育種によって、アテローム性動脈硬化症に罹患しやすい動物である）に抗アテローム生成性であると推定される化合物および／または抗アテローム生成性であると推定される餌を投与し、次いで抗アテローム生成性であると推定される化合物および／または抗アテローム生成性であると推定される餌を投与していない対照動物と比較し、検出可能なタンパク質の発現によりプラークを可視化することによって、実験動物対対照動物のアテローム生成によるプラーク形成の程度を比較することができる。
【００４２】
本発明の他の実施態様において、核酸は治療用タンパク質またはペプチドをコードすることができる。例として、（例えば、増殖を阻害するための）ｒａｓエフェクタータンパク質ＲＧＬ2のｒａｓ結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードするＤＮＡなどの抗−アテローム生成タンパク質またはペプチドをコードする核酸、（例えば、血小板機能を阻害するための）内皮一酸化窒素合成酵素変種（ｖａｒｉｅｎａｔｓ）をコードするＤＮＡ、（例えば、炎症過程を阻害するための）ＮＦ−κＢスーパー−レプレッサーをコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
４．化合物と血小板の結合．
送達される化合物は、（１）血小板表面膜に送達される化合物を直接化学的に結合する、（２）血小板の内部膜にカップリングされるポリマーに送達される化合物を結合する、（３）血小板に取り込まれる単層または多層リン脂質小胞に送達される化合物を組み入れる、（４）血小板に取り込まれるナノ粒子、例えばバックミンスターフラーレンに送達される化合物を吸収させるまたは取り込ませる、（５）血小板のα顆粒に送達するために取り込まれるタンパク質に送達される化合物をカップリングする、（６）血小板に貪食されるタンパク質（または他の高分子）または粒子に送達される化合物をカップリングする、（７）送達される化合物を疎水敵に膜に分配する、（８）エレクトロポレーション、補体処理、溶菌タンパク質暴露等で形成される孔を解して血小板細胞内空間に送達される化合物を物理的に取り込ませる、（９）血小板に取り込まれる細胞の外側表面に、非共有結合的に物理的または化学的吸着によって化合物を吸着させることを含むが、これらに限定されない任意の好適な技法によって血小板に結合することができる。
【００４４】
化合物−血小板結合体を作製するための架橋化学．血小板がタンパク質、抗ウイルス化合物等に結合している化合物−血小板結合物は、以下の反応性部分を含んでもよいが、これらに限定されないホモ−二官能性架橋試薬またはヘテロ−二官能性架橋試薬で作製することができる：アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、マレイミド、イミドエステル、活性ハロゲン、ピリジル−ジスルフィド、イソシアネート、ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、ニトロベンゼン、イミドエステル、光で活性化されうるアジドフェニルおよびアジドポリアロマティクスおよびゼロ−スペーサーカルボジイミド触媒。これらの部分の１つ以上を有する多（ポリ）官能性試薬も、逐次的または協力して反応する２つ以上の架橋剤の組み合わせと同じく、考慮される。架橋段階は抗酸化剤およびフリーラジカルスカベンジャーの存在下において実施することができ、架橋反応は、一級アミンを含有する化合物を添加することによって停止することができる。架橋後、分画遠心法、クロマトグラフィーおよび／または透析を含むが、これらに限定されない方法を用いて過剰の試薬を架橋剤および反応性生物から除去する。
【００４５】
ウイルスキャプシド形成．送達される核酸の場合には、核酸は、ウイルスキャプシドまたは粒子内にキャプシド形成または封入することができ、ウイルスキャプシドまたは粒子を血小板に結合またはカップリングすることができる。核酸をキャプシド形成することができる好適なウイルスはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶウイルスは既知であり、送達される関心対象の核酸は、既知の技法によりキャプシド形成またはパッケージングすることができる。例えば、米国特許第６，５４８，２８６号；同第６，４９１，９０７号；同第６，４８９，１６２号；同第６，４５８，５８７号；同第６，４１０，３００号；同第６，２６８，２１３号；同第６，２０４，０５９号；同第６，０９３，５７０号；同第６，０５７，１５２号；同第６，０４０，１８３号；同第５，８６９，３０５号；同第５，８６３，５４１号；同第５，７７３，２８９号；同第５，７５３，５００号；同第５，４７８，７４５号；同第５，４３６，１４６号および同第５，１３９，９４１号参照。ＡＡＶ以外に、当然のことながら、アデノウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスなどを含むが、これらに限定されない他のウイルスを、本発明を実施するための血小板に結合するために核酸をキャプシド形成するために使用することもできる。
【００４６】
関心対象の核酸がウイルス粒子にキャプシド形成またはパッケージングされたら、既知の技法によりウイルス粒子を血小板に結合またはカップリングすることができる。
【００４７】
一般に、送達される化合物は、各血小板が少なくとも１，０００、さらに好ましくは少なくとも１０，０００の送達される化合物分子を搬送するまたは結合するように、血小板にカップリングまたは結合される。
【００４８】
一旦作製されたら、送達される化合物が結合している血小板は、その後の再構成および使用のために（必要な保存寿命に応じて）凍結した形態、冷蔵または室温において保存することができる「活性剤」を含む。
【００４９】
５．活性剤の再構成および投与．
本発明の製剤は、滅菌した無菌パッケージに発熱物質を含まず、滅菌した活性剤を搬送する乾燥した（好ましくは、凍結乾燥した）血液細胞を単に含むことができる。上記のように、アルブミンを含んでもよい。製剤はまた、製薬学的に許容されうる担体で再構成された本発明の血小板製剤を含んでもよい。緩衝液、保存剤および治療的に作用のある他の薬剤などの追加の薬剤を再構成後の製剤に含んでもよい。例えば、米国特許第４，９９４，３６７号（開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）参照。血液細胞および製薬学的担体の量は重要ではなく、血液細胞の特定の適用、それらが再水和されているかどうか等に依存するが、一般に１または１０重量パーセントの血液細胞から９０または９９または場合によって９９．９重量パーセントの血液細胞の範囲であり、０．０１、１または１０重量パーセントの製薬学的に許容されうる担体から９０または場合によっては９９重量パーセントの製薬学的に許容されうる担体の範囲である。再水和されていない固定された乾燥血液細胞のいくつかの実施態様では、組成物は、任意の特定の担体を含まず、本質的に固定された乾燥血液細胞からなってもよくまたは完全に固定された乾燥血液細胞からなってもよい。
【００５０】
上記の固定された乾燥血液細胞は、既知の技法により製薬学的担体に加えて投与するために製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第９版．１９９５年）参照。本発明による製剤を製造する際には、固定された乾燥血液細胞を、とりわけ、許容されうる担体と混合することができる。当然のことながら、担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味において許容されうるべきであり、患者に有害であってはならない。担体は固体（粉末を含む）であってもよく、好ましくは、血液細胞と共に製剤化され、単位投与製剤、例えば、水溶液を添加することによって再構成することができる凍結乾燥した粉末のボトルとしてパッケージングされる。
【００５１】
血液細胞を再水和するためには、上記に列挙する特徴を有し、静脈内注射に好適であるように血小板を再水和する任意の水性担体を使用することができる（例えば、滅菌し、発熱物質を含まない生理食塩液）。例えば、水性担体は、凍結乾燥した粉末形態の本発明の製剤を含有するボトルで注射することができ、適宜内容物を撹拌し、次いで再水和した固定された乾燥血液細胞の水性懸濁液の形態の製剤をボトルから抜き取り、患者に注射で投与することができる。
【００５２】
本発明の化合物は、好ましくは、従来の製薬学的組成物の形態で、例えば、水、ゼラチン、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物オイル、ゴム、アルコール、ワセリン等などの有機および／または無機不活性担体を含有する製薬学的に許容されうる経腸的または非経口的賦形剤に加えて、内部的に、例えば、経口または静脈投与される。製薬学的組成物は、従来の固形剤、例えば錠剤、糖衣錠、坐剤、カプセル等または懸濁剤、エマルジョン等などの従来の液剤であってもよい。望ましい場合には、それらは滅菌されてもおよび／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液または浸透圧を調節するための塩などの従来の製薬学的補助剤を含有してもよい。製薬学的組成物はまた、治療的に活性な他の物質を含有してもよい。本発明の製薬学的組成物は、製薬学的製造に関して当技術分野において既知の従来の方法を使用して作製することができる。
【００５３】
本発明の再構成された製剤は、典型的には、非経口投与（例えば、静脈内注射、動脈内注射）によってヒト患者に投与される。投与される製剤の量は患者の体重および状態に応じて変わるが、典型的には、容量で２０〜３５０ミリリットルの範囲であり、濃度で１ミリリットルあたり１×１０9〜３×１０9個の血小板（さらに好ましくは、１ミリリットルあたり２×１０9〜３×１０9個の血小板）の範囲である。製剤は、単位用量としてこれらの容量および用量を提供するために滅菌し、発熱物質を含まない容器にパッケージングされてもよい。特定の投与経路が重大ではなく、治療する状態に依存し、穿通創部位への局所投与または適用もこのような損傷およびそれらの対応する治療に使用される。
【００５４】
創傷部位画像形成、凝固因子送達および抗ウイルス剤の送達に関係する３つの適用は、以下の考察において考慮されているものである。
【００５５】
ａ）磁気共鳴画像形成による創傷局在化のためのＲＬ血小板
再水和された細胞が血管損傷部位に局在化するとき、ＭＲＩ造影剤として機能することができる常磁性ナノ粒子をＲＬ血小板に負荷することができる。最近の２つの進歩が、ＲＬ血小板−ＭＲＩ造影剤製剤を作製するためのツールを提供している。第一に、注入可能なガドリニウム（Ｇｄ）−キレートはＦＤＡによって承認されており（例えば、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（商標））、血管病変の評価のために緩和造影剤として有用であることが証明されている（例えば、ＲｏｆｓｋｙおよびＡｄｅｌｍａｎ，２０００）。高分子の一級アミンに結合するためのＧｄ−キレート剤の多種多様の化学的活性化型が利用可能であり、特定の血管造影画像形成適用のための調査プローブの開発に至っている（総説はＡｒｔｅｍｏｖ，２００３参照）。例えば、フィブリン塊は、脆弱なプラークを検出するためのＧｄ−抗フィブリン抗体プローブで局在化されている（Ｆｌａｃｋｅら、２００１）。
【００５６】
第二に、磁気ナノ粒子の作製に多大な進歩が見られている（総説はＰａｎｋｈｕｒｓｔら、２００３参照）。サイズ分布が小さい酸化鉄（磁赤鉄鉱および磁鉄鉱）ナノ粒子の合成は特に重要である（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２００３）。さらに、高分子を結合するために酸化鉄粒子をポリマーで修飾する方法が開発されており（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２００３）、磁場中で血液細胞を単離するために使用されている（Ｃｈｅｎら、２０００）。ＲＬ血小板は、酸化鉄ナノプローブ製造および血管損傷部位へのＧｄ−キレートの標的化のための独自の基盤となる。
【００５７】
ｂ）凝固障害状態における止血のためのＲＬ血小板−凝固因子結合体
ＲＬ血小板表面への凝固因子（ＦＶＩＩａなど）の固定および／または凝固因子（血餅安定化はＦＶＩＩＩａ、光活性化はケージドトロンビン（Ａｒｒｏｙｏら、１９９７））によるα−顆粒の負荷は、標準的な補充治療に対する循環抗体阻害物質を有する血友病患者（難治性血友病患者）ならびに他の種類の凝固障害患者の血管創傷部位に補充因子を送達するための論理的な方法である。組み換えＦＶＩＩａは、血小板表面に作用する２つの機序により止血をすると仮定されている。第一に、組み換え第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）が血友病患者において止血をする能力（ＨｅｄｎｅｒおよびＧｌａｚｅｒ，１９９２）は、血小板表面の第Ｘａ因子の直接的な活性化に関係し、それによって第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子の必要性を「迂回する」と理論づけられている（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら、１９９７および２０００参照）。ｒｅｃＦＶＩＩａのこの「迂回」作用は、Ａ型およびＢ型血友病の止血剤としてＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ製品を使用する機能的な基礎となると思われる。第二に、正常レベルの凝固因子の存在下では、ｒＦＶＩＩａは、血小板表面の第ＩＸ因子を活性化することによって止血機序を増加する可能性がある。従って、血小板表面のトロンビン作製のｒＦＶＩＩａ媒介は、血小板減少症における血小板の欠損または血小板無力症における適切な血小板機能の欠損を代償する可能性がある。ｒＦＶＩＩａが血小板機能の「代償的」役割を果たす可能性があるという仮説は、ｒＦＶＩＩａは、血小板減少症（例えば、Ｐｏｏｎら、２０００、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９６）、血小板無力症（ｔｈｒｏｍｂｏａｓｔｈｅｎｉｃ）（例えば、Ａ１  Ｄｏｕｒｉら、２０００）または外傷など両方の血小板欠損症に罹患している患者（例えば、Ｄｕｔｔｏｎら、２００３）の止血を改善するという臨床観察によって裏付けられている。しかし、おそらく、血小板表面に対する凝固因子の親和性の低さ（Ｋｄ〜９０ｎＭ）により、止血には高用量のｒＦＶＩＩａが必要とされることが多い（Ｍｏｎｒｏｅら、１９９７）。従って、本発明者らは、血小板表面へのｒＦＶＩＩａの直接的な化学的固定は、活発な出血を停止する止血剤としての組み換えタンパク質の治療的有効性（指数）を改善すると仮定する。
【００５８】
ｃ）凍結乾燥した血小板による抗ウイルス剤の送達
ＲＬ血小板およびＲＬ  ＲＢＣは、出血熱および肝炎を生じる１本鎖ＲＮＡウイルスに感染しているマクロファージに抗ウイルス治療薬を送達する有望性を有する。細網内皮系（ＲＥＳ）のマクロファージはウイルス感染の初期段階に関与し、血管損傷部位のマクロファージは感染の急性出血期後期に関与するので、これは重要である。アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス（例えば、ラッサ熱ウイルス）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス（例えば、エボラウイルスおよびマールブルグウイルス）、ブンヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス（例えば、リフトバレーウイルス）およびフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス（例えば、黄熱病ウイルス）は、出血を生じるウイルス性の細胞損傷を血管組織に生じる。同様に、Ｃ型肝炎ウイルス（フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）メンバー）伝播は、出血集中強化肝臓手術に関連することが多い。リバビリンは、広域スペクトルの抗ウイルスＲＮＡ変異誘発物質として、これらの出血関連ウイルスの治療の有望性を有する。しかし、有害な毒性が、このリボヌクレオシドの抗ウイルス化学療法剤としての臨床使用を制限している。本発明者らは、ＲＬ血小板を使用してリボヌクレオシドを送達することによってリバビリンの治療的有効性を増加しようとしている。従って、ＲＬ血小板の本質的な止血機能は、化学療法の有効性を増加するためにウイルスの微小環境において、ＲＥＳおよび血管創傷部位マクロファージにおいてリバビリンを濃縮する。
【００５９】
本発明は以下の限定するものではない実施例においてさらに詳細に記載される。
【００６０】
実施例１〜５
血小板へのリバビリンの結合
これらの実施例は、リバビリンおよびｒＦＶＩＩａがカップリングしている再構成された血小板を作製および特徴づける方法を記載する。
【実施例１】
【００６１】
リバビリン−ポリリジンポリマーの合成
リバビリンは、Ｙｏｓｈｉｋａｗａら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ５０，  ５０６５−５０６８（１９６７）によって詳細に記載されているように、化学的にリン酸化してリバビリン一リン酸（ＲＭＰ）を得る。Ｄｉ  ＳｔｅｆａｎｏおよびＦｉｕｍｅ（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ．  ５０，  ４６１−４７２（１９９７））の手法によりｐＨ−感受性ホスホルアミドを介してリバビリン一リン酸（ＲＭＰ）をポリリジンにカップリングするかまたは単純化した手法は、イミダゾール−リバビリン付加物の形成に基づいている（Ｃｈｕ  ら．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  １１，  ６５１３−６５２９（１９８３）参照）。リボヌクレオシドポリマー合成の結合化学は、リバビリンではなくウラシルを用いて試験した。ウラシルとリバビリンの間の含窒素塩基構造の差が合成に大きな影響を与えることを本発明者らは予期していない。
【００６２】
ポリリジン（〜１，４００残基リジン／分子は＜ｍｗ＞＝２０５ｋＤａ）にＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）およびＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート）を反応させて、それぞれ、最終生成物を血小板に共有結合するための蛍光標識および光活性化部分を提供した。最初にＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を触媒として用いてＵＭＰをイミダゾールで活性化することによって、ウラシルをリジンサイド−アームにカップリングした。次いで、活性化ＵＭＰ〜イミダゾール複合体をＦＩＴＣ／ＳＡＮＰＡＨ−修飾リジン鎖に付加して、ホスホアミド結合を形成した。プロトンＮＭＲ分析のピークサイズに基づいて（α−炭素プロトン対含窒素塩基プロトン、図１参照、「ヌクレオシドコポリマーのプロトンＮＭＲスペクトル」、リジン残基の１２％がＵＭＰにカップリングした。１４００残基コポリマーの最終的な平均組成は、１６８、２０および４リジンサイド−アームがそれぞれウラシル、ＳＡＮＰＡＨおよびＦＩＴＣで修飾されており、〜１２００リジン残基が未修飾であった。
【００６３】
別のシリーズの反応において、ポリリジン（シグマ−アルドリッチ，＜ＭＷ＞＝２００，０００ｋＤａ）のεアミノ基をＦＩＴＣで修飾して、フルオロフォア標識を提供し、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＡＮＰＡＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）で標識して、次の段階（ｂ）で血小板に光化学的結合するための部分を提供する。ＦＩＴＣおよびＳＡＮＰＡＨは、ＦＩＴＣ  １分子／〜３００リジン残基およびＳＡＮＰＡＨ  １分子／〜３０リジン残基でポリリジンに結合する。Ｃｈｕら（上記）に詳細に記載されているように、ＲＭＰをイミダゾール化し、次いでＦＩＴＣ、ＳＡＮＰＡＨポリリジンにカップリングして、リバビリンコポリマーのためのホスホルアミド結合を形成する。目標はリジン残基をＲＭＰ残基で飽和することである。プロトンおよび13Ｃ  ＮＭＲを実施して、ポリマー修飾の程度を特徴づける。
【００６４】
ホスホルアミド結合のｐＨ感受性（Ｆｕｍｅら，  Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ．Ｈｅｌｖ．  １３７−１３９（１９８８））は、２．４〜７．４の間で変化するｐＨの緩衝液中で１時間リバビリンコポリマーをインキュベーションすることによって実証する。インキュベーション後、ｐＨを中性に調節して、ＰＢＳで透析して、遊離のＲＭＰを除去する。試料をプロトンＮＭＲで調査して、加水分解の程度を求める。加水分解速度は、ｐＨが中性から低くなるにつれて増加するはずである。
【００６５】
イラクにおける軍事活動の直前および最中に抗ウイルス剤が一時的に入手不可能であったので、本発明者らはリバビリンではなくウラシルを用いるリボヌクレオシドポリマー合成の結合化学を試験することを選択した。本発明者らは、ウラシルとリバビリンの間の含窒素塩基構造の差が合成に大きな影響を与えることを予期していない。
【実施例２】
【００６６】
リバビリン−負荷した凍結乾燥血小板のためのリバビリン−ポリリジンポリマーの結合
凍結乾燥した血小板を作製するための手法は４段階に関係する：過剰な血漿タンパク質から血小板を除去する、パラホルムアルデヒドで軽度に架橋して細胞構造を安定化する、未反応の架橋剤から血小板を除去するおよび凍結乾燥する（Ｒｅａｄら、米国特許第５，６５１，９６６号）。過剰なパラホルムアルデヒドの除去後、血小板を種々の濃度のリバビリンポリマーと混合し、可視光線に暴露して、血小板表面との共有結合の形成のためにＳＡＮＰＡＨ部分を活性化する。次いで、血小板を標準的な手法で凍結乾燥する。カップリング段階において、リバビリンコポリマーの濃度を変化させることによって種々の量のリバビリンを用いて血小板を調製する。リボヌクレオシドコポリマーがＲＬ血小板に共有結合する能力は、共有結合するためのＳＡＮＰＡＨ部分を光活性化する可視スペクトル光線中で細胞を送達ポリマーと共にインキュベーションすることによって検討した。未反応のコポリマーを遠心洗浄で除去し、次いで血小板を蛍光顕微鏡で調査した。図２、「ポリマー修飾ＲＬ血小板の蛍光顕微鏡」、は、蛍光−標識したリボヌクレオシドコポリマーが細胞に結合したことを証明している。血小板の平均蛍光強度に基づいて、各細胞に２４，８００コポリマーが共有結合により標識した。
【実施例３】
【００６７】
リバビリン−血小板の特徴
上記の実施例２により作製したリバビリン−血小板を通常の生理食塩液で再水和し、次いでコポリマー結合の化学的性質、血小板の機能およびリバビリン−血小板がリボヌクレオシドを放出する能力を実証する分析を実施する。
【００６８】
リバビリン−ポリリジンポリマーの表面密度および細胞分布．リバビリン−負荷した血小板に液体シンチレーション計測を実施し、次いで血小板あたり結合した［3Ｈ］リバビリン−コポリマーの量を放射性標識の比活性から算出する。フローサイトメトリーを実施して、蛍光強度と血小板あたりのコポリマーの数の関係も評価することができる。［3Ｈ］リバビリン−コポリマーの細胞局在化は、ＦＩＴＣ部分の共焦点顕微鏡で確認することができる。
【００６９】
リバビリン単位の化学的完全性は、リバビリン−血小板を低ｐＨ緩衝液中に置いてヌクレオシドを加水分解することによって証明する。次いで、試料にＴＬＣ分析を実施し（Ｆｉｓｈｅｒ  ら，  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｈａｅｍ．  １１１，  １６７−１７５（２０００）に詳細に記載されている）、［3Ｈ］加水分解性生物が［3Ｈ］リバビリン一リン酸標品と同時溶出するかどうかを判定する。
【００７０】
リバビリン−血小板の活性化応答．［3Ｈ］リバビリン−コポリマーの量を増加して負荷した血小板に、輸血目的のために調製した再構成した凍結乾燥血小板を特徴づけるために使用したものと同じ種類の分析を実施する。簡単に説明すると、活性化および未活性化リバビリン−血小板の形態を走査型および透過型電子顕微鏡で調査する。ｖＷｆ−媒介性接着をリストセチン凝集を用いて検討することができる。ホスファチジルセリン、ｐ−セレクチン、活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびフィブリノーゲンの表面密度をフローサイトメトリーで解明することができる。これらの手法を使用して、止血機能に過度に有害に影響しないで得ることができるコポリマー修飾の最大程度を確認することができ、任意の特定の調製プロトコールを最適化することができる。
【００７１】
薬物放出および抗ウイルス活性のためのマクロファージによるリバビリン−血小板のエンドサイトーシス．この分析は、別の箇所（Ｆｉｓｈｅｒら，  Ａｒｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓ．  Ｉｍｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２９，  ４３９−４５１（２００１））に詳細に記載されている組織培養に基づいた脾臓マクロファージ貪食作用系を使用する。プンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルスのアダムス（Ａｄａｍｅｓ）株はレベル２バイオセーフティ条件で取り扱うことができ、げっ歯類マクロファージに感染することが既知であり、感染マウスに致死的な肝壊死を生じ、インビボおよびインビトロにおいてリバビリンの抗ウイルス作用に感受性であるので、プンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルスのアダムス（Ａｄａｍｅｓ）株でラット脾臓マクロファージを感染させることによってリバビリン−ＲＬ血小板の抗ウイルス活性を評価することができる。または、これらの検討は、必要に応じて、プンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルス複製に許容性が大きいことが既知であるマウスマクロファージ培養物に適合することができる。
【００７２】
［3Ｈ］リバビリン−コポリマーＲＬ血小板を、３７℃においてゆっくり振とうしながらマクロファージと共にインキュベーションする。試料を時間の関数として取り出し、２種類の分析を実施し、それぞれ、ａ）ウイルス不活性化のための血小板の取り込みおよびｂ）リバビリン代謝を追跡する。
【００７３】
血小板貪食作用およびウイルス不活性化．これらの検討は、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリー分析を使用して、マクロファージ（抗マクロファージ−ＰＥのＰＥ蛍光）およびリバビリン−ＲＬ血小板貪食作用（［3Ｈ］リバビリン−コポリマーＦＩＴＣ蛍光）を同定する。細胞混合物を抗マクロファージ−ＰＥ結合体（ＭＣＡ−３４２、Ｓｅｒｏｔｅｃ）と共にインキュベーションしてマクロファージを標識し、次いでフローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡を実施して、取り込みおよび貪食過程を追跡する。フローサイトメトリーを使用して定量データを提供することができ、共焦点顕微鏡を実施して、マクロファージによってドッキングおよび／または取り込まれるリバビリン−血小板の分布を調査することができる。
【００７４】
リバビリン−ＲＬ血小板または対照血小板で処理したマクロファージサブセットを、感染多重度１０で３７℃において１時間プンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルスをトリプリケートで感染することができる。この時点において、細胞を室温において増殖培地で３回洗浄し、３７度において増殖培地で維持する。洗浄を終了したら、増殖培地の試料を各ウェルから取り出し、プラークアッセイによるウイルスレベルの分析を実施する。追加の試料を４時間間隔で取り出して、上清中のウイルスレベルを求める。ウイルス価は、プンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルス感染に許容性であり、プラークアッセイによってプンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルスレベルを求めるために以前に使用されているＶｅｒｏ細胞のプラークアッセイによって評価される。または、細胞にプンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルスを感染させてから、リバビリン−ＲＬまたは対照血小板で治療する。これは、リバビリン−ＲＬ血小板が、以前に確立されている感染症を制御することができるかどうかを評価する。これらの検討の陽性対照として、マクロファージ群にプンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルスをトリプリケートで感染させる。次いで、これらの培養物を、インビトロにおいてプンタトロ（Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏ）ウイルス複製を阻害することが以前に示されている濃度範囲である１ｍｌあたり４〜１０マイクログラムの範囲の濃度のリバビリン（血小板に負荷していない）で治療する。リバビリン−ＲＬ血小板は、それらが、従来のリバビリン治療で観察されるものに匹敵するレベルまで治療後のマクロファージ培養物のウイルス価を低下する場合には、抗ウイルス作用を示すと考えられる。
【００７５】
リバビリン代謝．［3Ｈ］リバビリン−一リン酸放出および代謝の時間経過を、細胞混合物をＴＸ−１００で溶菌し、次いでＴＬＣ分析で遊離のヌクレオシドを分離することによって調査する（Ｆｉｓｈｅｒら，２０００、上記）。この情報を使用して、コポリマーからの［3Ｈ］リバビリン−一リン酸の放出ならびに3Ｈ］リバビリン−二リン酸および三リン酸への変換を実証する。
【実施例４】
【００７６】
血小板の特徴
好ましくは、リストセチン凝集分析において９０％の効率で機能する、細胞あたり少なくとも１００，０００リバビリンコポリマーを有する血小板は上記の手法（または当業者に容易に明らかであるそれらの変法）によって得られる。この基準は２つの理由で選択される。第一に、インビトロにおけるリストセチン止血パラメーターの１０％の低下は、血小板減少症ウサギの出血を制御する能力によって判定するとき、ＲＬ血小板のインビボにおける止血機能に有意な影響を与えない。第二に、１つの血小板への１００，０００のリバビリン−コポリマー分子の送達は〜３×１０8リバビリン部分（または〜５×１０-16モルのリバビリン）を示す。１つのマクロファージ（細胞内容量〜１０3ｕｍ3を有する）が１つのリバビリン−血小板を取り込む場合には、リバビリン機能の細胞内濃度は〜５×１０-19モル／ｕｍ3または〜５×１０-4モル／リットル（５００  ｕＭ）である。これは、組織培養において抗ウイルス活性を示すリバビリン範囲（１０〜１０ｕＭ）を十分に上回る濃度である（例えば、Ｃｒｏｔｔｙら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ８０，  ８６−９５（２００２）参照）。
【００７７】
ＲＬ血小板のインビボにおける止血効果にもっとも関連するインビボにおける評価指標は、ＧＰＩｂ−フォン・フィルブランド因子媒介性接着に関連する。従って、本発明者らは、リボヌクレオシド標識したＲＬ血小板の予備的な機能特徴づけにリストセチン−媒介性凝集を使用した。図３、「対照およびポリマー修飾ＲＬ血小板のリストセチン凝集」は、再水和後、凝集曲線の最初の傾斜および程度で判定するとき、標識細胞は〜７０％の機能を保持したことを実証している。
【実施例５】
【００７８】
血小板へのリバビリンの取り込み
上記の別の実施態様において、リバビリンは血小板取り込みのために修飾される。例えば、これは、α顆粒取り込みのためにＩｇＧまたはフィブリノーゲンに短鎖リバビリンポリリジンコポリマーをカップリングすることによって実施される。または、血小板エンドサイトーシスのためにラテックスにリバビリンを負荷し、次いで細胞を凍結乾燥のために処理する。
【００７９】
実施例６〜８
核酸送達のための凍結乾燥した血小板
これらの実施例は、薬物開発、診断または治療目的のために再水和可能な凍結乾燥（ＲＬ）血小板を使用して血管損傷部位に核酸を送達する方法を記載する。核酸は、診断または薬物スクリーニング目的に使用するためのレポータータンパク質またはペプチドなどの、関心対象の任意のタンパク質またはペプチドをコードすることができる。
【００８０】
ＲＬ血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合物は、本明細書において図４、「血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺレポーター結合体の作製」に図示するように作製した。この手法は、Ｒｅａｄら、米国特許第５，６５１，９６６号に記載する手法の変形である。
【実施例６】
【００８１】
血小板への抗−ＡＡＶ抗体の結合
抗体結合のための血小板の作製．既知の技法（Ｒｅａｄら，１Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  ３９７−４０１（１９９５））により、分画遠心法（高血小板−血漿を得るため）およびセファロースＣＬ２Ｂクロマトグラフィー（血漿タンパク質から血小板を遊離するため）により新鮮なブタ血小板を単離する。次いで、細胞をパラホルムアルデヒドで安定化し、遠心分離により洗浄して未反応の架橋剤を除去する。これらの段階は、別の箇所（Ｒｅａｄら．，上記）に詳細に記載されている既知のプロトコールを使用する。
【００８２】
抗−ＡＡＶ抗体の修飾および血小板への結合．既知の技法（Ｃａｒｌｓｓｏｎら．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊ．  １７３，  ７２３−７３７（１９７８）参照）により、抗−ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１ポリクローナル抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，  Ｐｌｅａｓａｎｔ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，  ＡＬＳ２４１０７）ポリクローナル抗体（キャプシドタンパク質の２７８〜２８９残基に対する）にＮ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）を反応させて、架橋剤と抗体の間にリジン−イミド結合を形成する。過剰な架橋剤をサイジングクロマトグラフィーで除去し、次いでスルフヒドリル部分を介して血小板表面に抗体を結合するために上記のように作製したアルデヒド安定化した血小板と共にチオール−活性化抗体を２時間インキュベーションする。反応量論は、血小板あたり１０，０００の抗−キャプシド抗体である。未結合の抗体を２回の遠心分離により洗浄して除去する。
【００８３】
凍結乾燥した血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体のためのＡＡＶ〜ＬａｃＺの血小板への結合．２９３細胞に３つのプラスミド：ＬａｃＺを有するｐＡＡＶ、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を有する第２のプラスミド、ならびに「レスキュー」段階を媒介するアデノウイルスタンパク質をコードする第３のプラスミドを同時形質移入する「トリプル−プラスミド」形質移入方法でＡＡＶ〜ＬａｃＺを作製する（ＭｏｎａｈａｎおよびＳａｍｕｌｓｋｉ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１，  ３０９６−３９５０（２０００）参照）。この方法では、２９３細胞は、組み換えＡＡＶ粒子を「レスキューする」ためにアデノウイルスを感染させる必要がなく、従って最終的なＡＡＶ製剤のアデノウイルス汚染を回避する。既知の技法により、硫酸アンモニウム沈降法および密度勾配精製を用いてＡＡＶ〜ＬａｃＺを２９３細胞組織培養から単離する。
【００８４】
血小板表面にＡＡＶ〜ＬａｃＺを結合するために、血小板を、上記のように作製した血小板〜抗−キャプシドＩｇＧ結合体と共に３時間インキュベーションする。２回の遠心洗浄で過剰のＡＡＶ〜ＬａｃＺを除去する。次いで、血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体を凍結し、凍結乾燥して、−２０℃で保存する。再水和の結果、血小板およびＡＡＶ〜ＬａｃＺ濃度が、それぞれ、１×１０8血小板／ｍｌおよび１×１０12ＡＡＶ〜ＬａｃＺベクター／ｍｌであるように、フリーズ−ドライした血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体を作製する。
【実施例７】
【００８５】
血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体の特徴
血小板のＡＡＶ〜ＬａｃＺの表面密度．血小板表面に結合している抗−キャプシドタンパク質抗体およびＡＡＶ〜ＬａｃＺの量は、試料にＳＤＳ−ＰＡＧ電気泳動およびウェスタン分析を実施することによって定量される。抗−ウサギＩｇＧを使用して抗−ＡＡＶを検出し、抗−キャプシドＶＰ１を使用してＡＡＶタンパク質をプロービングする。目的は、各血小板に約１００，０００のＡＡＶ〜ＬａｃＺベクターを結合することである。任意の特定の手法によって低い化学量論が得られる場合には、抗体の濃度を上方に調節しても、および／またはＡＡＶ〜ＬａｃＺとの血小板反応のインキュベーション時間を延長してもよい。
【００８６】
血小板機能に対するＬａｃＺ結合の影響．ＡＡＶ〜ＬａｃＺによる血小板表面修飾がＲＬ血小板機能に対して与える影響は、既知の技法（Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ  ら．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １１，  １８１２（１９９７）；Ｂｏｄｅ  ら．  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １３３，  ２２０−２１１（１９９９））により、凝集アッセイおよびＢａｕｍｇａｒｄｎｅｒ分析を実施することにより確認することができる。
【００８７】
ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合の形質移入効率への影響．表面結合のＡＡＶ〜ＬａｃＺ形質移入効率に対する影響は、ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体をブタ脾臓マクロファージと共にインキュベーションし、次いでＸ−ｇａｌで染色して遺伝子導入についてプロービングすることによって推定される。血小板と共に送達されるウイルス粒子の数に等価な力価のＡＡＶ〜ＬａｃＺを用いて対照実験を実施することができる。
【００８８】
遺伝子治療ツールとしてＡＡＶを開発する際の重要な問題は、高力価製剤を入手する困難さである（例えば、ＭｏｎａｈａｎおよびＳａｍｕｌｓｋｉ、上記参照）。血小板の表面にＡＡＶ〜ＬａｃＺを免疫−吸収することによって、非常に高い局所濃度のプローブが作製される。
【００８９】
血小板へのＡＡＶのカップリングは、ウイルスおよび血小板系の両方の機能に影響することができる。Ｂａｕｍｇａｒｄｎｅｒおよび凝集アッセイにおける血小板の性能がプローブ結合によって測定可能であるほどに影響される場合には、ＡＡＶ〜ＬａｃＺの表面密度を低下してもよい。血小板−結合ＡＡＶが、劇的に低い効率で脾臓マクロファージを形質移入することが見出される場合には、ウイルスベクターの表面密度を増加してもよい。
【実施例８】
【００９０】
血管損傷部位へのレポーター遺伝子送達
ＲＬ血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体が血管損傷部位にＬａｃＺ遺伝子を形質移入する能力を検討する。この実施例では、アテローム生成餌で飼育中のブタのアテローム性動脈硬化血管を損傷し、ＲＬ血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ結合体を注入し、動物をアテローム生成餌を継続して（ｃｏｎｔｉｎｊｕｅｄ）、損傷部位の追加のプラーク形成を生じた。このデザインは、内皮がアテローム性動脈硬化斑破裂および／または血管形成によって乱されることにより、血管がアテローム性動脈硬化斑で再閉塞される場合に生じる一連の事象をモデル化している。実験の詳細な説明は以下のようである。このシステムは、被験者のアテローム性動脈硬化症を治療または軽減する際の活性についてスタチン等などの薬物または餌的介入を試験する際に有用である。
【００９１】
アテローム性動脈硬化症の誘導．４匹のＬｐｂ1/1遺伝子型の３０〜４０ｋｇ（若い成獣）の雄ブタを使用する。Ｌｐｂ1/1（Ｌｐｇ＝Ｌ（リポタンパク質）、ｂ（アポＢ１００）、ｐ（ブタ））は、ＵＮＣ−Ｃｈａｐｅｌ  ＨｉｌｌのＦｒａｎｃｉｓ  Ｏｗｅｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいてクローズドコロニーにおいて繁殖させた多形遺伝子型である。Ｌｐｂ1/1動物は、常染色体共優性様式で遺伝されるので、アテローム生成餌で安定な程度の高コレステロール血症を発症し、餌コレステロールレベルに密接に関連する中程度に重症のアテローム性動脈硬化症を常に発症する（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ら．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４０，４０３−４１５（１９９２））。２匹のブタは高コレステロール餌で飼育し、２匹は標準的な低コレステロール餌で飼育する。
【００９２】
血管損傷およびＲＬ血小板ＬａｃＺ構築物による治療．対照またはアテローム生成餌で２ヶ月飼育した後、動物を麻酔し、右大腿動脈部分を外科的に単離する。血管損傷部位は、２ｃｍ間隔でＧｏｌｄｂａｔｔクランプで動脈を押しつぶすことによって形成する。１０ｃｍの長さの血管にわたって５つの創傷を確立する。創傷確立直後に、１０9のＡＡＶ〜ＬａｃＺ修飾血小板を１０ｍｌの滅菌生理食塩液で再水和し、末梢耳静脈に注入する。外科的切開部位を修復し、次いで動物を対照または高−コレステロール餌でさらに２ヶ月一実施態様においてする。
【００９３】
組織の死後分析．対照または高コレステロール餌で手術後２ヶ月飼育後、動物を安楽死させる。大腿動脈の損傷部分および反対側の血管の同様の部分をＸ−ｇａｌ染色で組織化学的に調査し、ＬａｃＺ遺伝子産物ガラクトシダーゼの発現についてプロービングする。脾臓、肺、心臓および肝組織も導入遺伝子の発現について分析することができる。
【実施例９】
【００９４】
凝固タンパク質結合および血管創傷部位への送達
凝固タンパク質−血小板結合体の作製は、共有結合のための一級アミン反応性および光活性化されうる部分を有するＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−スクシンイミジル６−［４’’−アジド−２’’−ニトロフェニルアミノ］ｈｅｋｉｓａｎｏｅ−ｔｏ）などのヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。ｒｅｃＦＶＩＩａ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ製品）、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａおよび種々の発現系の関連する突然変異体、ならびにＦＸＩＩａまたはＦＸａなどの、ＦＶＩＩａを産生する凝固タンパク質を含む種々の凝固タンパク質を使用することができる。ＲＬ血小板−ｒｅｄＦＶＩＩａ結合体を作製するためには、１００ｍＭのＳＡＮＰＡＨストック溶液を無水ジメチルスルホキシド中で作製し、次いでリン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）で１／１００希釈して１ｍｇ／ｍｌ  ｒｅｃＦＶＩＩａ（例えば、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ社製）にし、暗所で１時間インキュベーションさせる。混合物をＰＢＳに対して一晩透析するかまたはセファロースＣＬ４Ｂでゲルろ過することによって未反応のＳＡＮＰＡＨを除去する。
【００９５】
血小板をアルデヒド安定化し、次いで米国特許第５，６５１，９６６号に詳細に記載されているように過剰のパラホルムアルデヒドから遊離し、次いでＳＡＮＰＡＨ−ｒｅｃＦＶＩＩａを細胞に結合する。次いで、ＳＡＮＰＡＨ−ｒｅｃＦＶＩＩａおよび固定された血小板をＰＢＳ中で１００，０００血小板／ｕｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ＳＡＮＰＡＨ−タンパク質結合体で混合し、次いで標準的な蛍光光源からの可視範囲の光線に暴露して、血小板表面へのＳＡＮＰＡＨ−ｒｅｃＦＶＩＩａ結合体のフォトカップリングを実施する。次いで、セファロースＣＬ−２Ｂのクロマトグラフィーで未反応のタンパク質を血小板から分離し、次いで米国特許第５，６５１，９６６号に詳細に記載されているように、ｒｅｃＦＶＩＩａ−血小板結合体を凍結乾燥する。
【実施例１０】
【００９６】
天然の結合部位による凍結乾燥した血小板表面への組み換え第ＶＩＩａ因子のカップリング
フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した組み換え第ＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）因子の作製。４．８ｍｇのｒＦＶＩＩａ（ＮｏｖａＮｏｒｄｉｓｋ、注入用）を、［ｒＦＶＩＩａ］＝２０ｕＭあたり４．８ｍｌの蒸留水で再水和した。ｒＦＶＩＩａをリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に対して一晩透析し、次いで室温において４０ｕＭのＦＩＴＣと共に３０分間インキュベーションした。反応混合物をＰＢＳに対して一晩透析し、次いでクエン酸添加生理食塩液に対して一晩透析して、ｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣを得た。
【００９７】
再水和した凍結乾燥血小板へのｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣの表面結合−凍結乾燥した血小板を、１．８９×１０9細胞／ｍｌあたりの蒸留水で水和した。血小板およびｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣを混合し、０〜１０ｕＭまでの濃度範囲のｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣおよび０〜１．８９×１０9細胞／ｍｌで室温において３０分インキュベーションした。血小板を生理食塩水で１回遠心洗浄し、次いでＰＢＳ＋２％パラホルムアルデヒドで希釈して、フローサイトメトリー分析を実施した。
【００９８】
ｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣは、対称的なフローサイトメトリーヒストグラムに基づいて均一に凍結乾燥した血小板に結合した（図５、「ＲＬ血小板に結合するｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣのフローサイトメトリー分析」参照）。
【００９９】
凍結乾燥した血小板へのｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣの結合の程度は、総ｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣ濃度の増加関数であった（図６、「ＲＬ：血小板へのｒＦＶＩＩａ結合は濃度依存的である」参照）。
【０１００】
かなりの量のｒＦＶＩＩａが、超生理的濃度の単純な同時インキュベーションによって凍結乾燥した血小板に結合することができることをこれらの結果は示している。
【０１０１】
凍結乾燥した血小板に表面結合するｒＦＶＩＩａの作用は、プロトロンビンからトロンビンへの変換を触媒するこれらの製剤の能力を測定することによって分析した。ＲＬ血小板−ｒＦＶＩＩａは、１０ｍＭのＣａＣｌ2を添加したクエン酸添加生理食塩液中でｒＦＶＩＩａ（１０ｕＭ、３ｕＭ、１ｕＭ、０．３または０ｕＭ）をＲＬ血小板（１×１０5／ｕｌ）と共に１時間インキュベーションすることによって作製した。ＲＬ血小板−ｒＦＶＩＩａ粒子は１回遠心洗浄して、未結合のｒＦＶＩＩ１を除去し、次いで製剤（ならびに対照緩衝液またはほぼ同じ濃度のｒＦＶＩＩａ単独）を、蛍光分析によるトロンビン基質Ｄ−ｐｈｅ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ＡＮＳＮＨを含有する正常または第ＩＸ因子欠損血漿で１０倍希釈した。トロンビン基質産生の開始時間および最大速度を測定した。図７の結果は、ＲＬ血小板−結合ｒＦＶＩＩａはモルベースで少なくとも遊離のｒＦＶＩＩａと同じくらいの活性があることを示している（図７、「ＲＬ血小板−ｒＦＶＩＩａおよび遊離のｒＦＶＩＩａは同様の方法でＩＩａ産生を触媒する」参照）。
【０１０２】
参照文献
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【０１０３】
上記は本発明を例示しており、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲およびそこに含まれる特許請求の範囲の等価物によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ヌクレオシドコポリマーのプロトンＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】ポリマー修飾ＲＬ血小板の蛍光顕微鏡検査を示す。
【図３】対照およびポリマー修飾ＲＬ血小板のリストセチン凝集を示す。
【図４】血小板／ＡＡＶ〜ＬａｃＺ受容体結合体の作製を略図で例示する。
【図５】ＲＬ血小板に結合したｒＦＶＩＩａ−ＦＩＴＣのフローサイトメトリー分析を示す。
【図６】ＲＬ血小板に結合するｒＦＶＩＩａが濃度依存的であることを示す。
【図７】ｒＦＶＩＩａがＲＬ血小板の表面において活性であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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