(57)【要約】本発明は、先には知られていなかったＡβ分泌の修飾因子を記載する。これらのタンパク質は、アルツハイマー病を含む、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防しまたは軽減するための新規治療の開発のための適当な標的として同定される。本発明はまた該病理学的状態を処置し、予防しまたは軽減するための方法および、そのための、これらの修飾因子の活性および／または発現に阻害効果を有するモジュレーターを含む、医薬組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防または軽減する方法であり、それを必要とする対象に、有効量の表１に記載のものからなる群から選択される一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを投与することを含む、方法。
【請求項２】
該タンパク質がシクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該モジュレーターが該対象における該タンパク質の活性を阻害する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該モジュレーターが該対象における該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
該モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質であり、該物質が、該タンパク質の遺伝子発現を阻害することが意図されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
該モジュレーターが、該タンパク質に対する一つまたはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントが該タンパク質の活性を阻害できる、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項１または２記載の方法。
【請求項８】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減する方法であり、それを必要とする対象に、それを必要とする対象に、有効量の表１に記載のものからなる群から選択される一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９】
該タンパク質がシクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該モジュレーターが、該対象における該タンパク質の活性を阻害する、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
該モジュレーターが、該対象における該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項８または９記載の方法。
【請求項１２】
該モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、該タンパク質の遺伝子発現を阻害することが意図されている、請求項８または９記載の方法。
【請求項１３】
該モジュレーターが、該タンパク質に対する一つまたはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントが該タンパク質の活性を阻害できる、請求項８または９記載の方法。
【請求項１４】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項８または９記載の方法。
【請求項１５】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減するのに有用なモジュレーターの同定法であり、候補モジュレーターが、表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質を阻害する能力をアッセイすることを含む、方法。
【請求項１６】
該タンパク質が、シクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該方法が、さらに、同定した阻害性モジュレーターが、該病理学的状態の何れか一つまたはそれ以上の動物モデルにおいて観察される病理学的影響を改善する能力をアッセイすることを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
該方法が、さらに、同定した阻害性モジュレーターが、該病理学的状態の対象での臨床試験において観察される病理学的影響を改善する能力をアッセイすることを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２０】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減するのに有用なモジュレーターの同定法であり、候補モジュレーターが、表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質の遺伝子発現を阻害する能力をアッセイすることを含む、方法。
【請求項２１】
該タンパク質が、シクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該方法が、さらに、同定した阻害性モジュレーターが、該病理学的状態の何れか一つまたはそれ以上の動物モデルにおいて観察される病理学的影響を改善する能力をアッセイすることを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
該方法が、さらに、同定した阻害性モジュレーターが、該病理学的状態の対象での臨床試験において観察される病理学的影響を改善する能力をアッセイすることを含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
該病理学的状態がアルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２５】
表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを、それを必要とする対象におけるＡβ分泌が関連する病理学的状態を処置または改善するための有効量を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
該タンパク質がシクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項２５記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項２５または２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該モジュレーターが該タンパク質の活性を阻害する、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項２９】
該モジュレーターが該タンパク質の遺伝子発現を阻害する、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３０】
該モジュレーターが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、該タンパク質の遺伝子発現を阻害することが意図されている、請求項２５または２６記載の医薬組成物。
【請求項３１】
該モジュレーターが、該タンパク質に対する一つまたはそれ以上の抗体、またはそのフラグメントを含み、該抗体またはそのフラグメントが該タンパク質の活性を阻害できる、請求項２５または２６記載の方法。
【請求項３２】
表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターでの処置の候補者である可能性があるＡβ分泌が関連する病理学的状態を有する対象を診断する方法であり、該対象からの生物学的サンプルにおける該タンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイすることを含み、ｍＲＮＡレベルがコントロールと比較して上昇した対象をモジュレーター処置の候補者であるとする、方法。
【請求項３３】
該タンパク質が、シクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防または軽減する方法であり、
(ａ)対象を、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質のｍＲＮＡレベルについてアッセイし；そして
(ｂ)ｍＲＮＡレベルがコントロールと比較して上昇した対象に、何れか一つまたはそれ以上の該タンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを、該病理学的状態を処置または軽減するのに十分な量で投与する
ことを含む、方法。
【請求項３５】
該タンパク質がシクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項３３または３４記載の方法。
【請求項３７】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減する方法であり：
(ａ)対象を、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質のタンパク質レベルについてアッセイし；そして
(ｂ)タンパク質レベルがコントロールと比較して上昇した対象に、何れか一つまたはそれ以上の該タンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを、該病理学的状態を処置または軽減するのに十分な量で投与する。
【請求項３８】
該タンパク質が、シクロフィリンＦ、カルボキシペプチダーゼＺ、カルモジュリン２、ＴＯＢ３、ＴＬＬ２、プロテアーゼＥ、キモトリプシノーゲンＢ１、骨形成タンパク質ＢＭＰ４５(ＢＭＰ４５)、ＡＮＧ２遺伝子、タイプ１腫瘍壊死因子レセプター剥離アミノペプチダーゼ・レギュレーター(ＡＲＴＳ−１)、Ｆａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)−結合死ドメイン(ＦＡＤＤ)、マイトージェン活性化タンパク質キナーゼ４(ＭＡＰＫ４)、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ(酸セラミダーゼ)およびトリプターゼ・ベータからなる群から選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該病理学的状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患からなる群から選択される、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
生物学的サンプルにおける表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルを検出するためのキットであり：
(ａ)該タンパク質またはそのフラグメントのポリヌクレオチド；
(ｂ)(ａ)と相補的なヌクレオチド配列；
(ｃ)(ａ)と相補的なＲＮＡｉ配列；
(ｄ)該タンパク質、またはそのフラグメント；または
(ｅ)該タンパク質に対する抗体
を含み、成分(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)または(ｅ)が、実質的構成要素を構成し得る、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病を含むが、これに限定されないＡβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防または軽減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(ＡＤ)は４０または４２アミノ酸Ａβペプチドから成る、アミロイドプラークの、脳における細胞外蓄積により特徴付けられる。Ａβ４２ペプチドのこの細胞外蓄積は、疾患状態の証明となる病理であり、したがって、ＡＤの原因における最も重要なプレイヤーと考えられている。ＡＤ脳の他の共通の病巣は、微小管結合タンパク質である異常にリン酸化されたタウで構成される神経原繊維のもつれの存在であるが、現在、多くの証拠が、Ａβがこの疾患の中心的役割を演じることを示唆する。それにも関わらず、ＡＤの病因はほとんど理解されていない。
【０００３】
分子遺伝学における近年の進歩が、アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)、プレセニリン１タンパク質、α−２マクログロブリン(Ａ２Ｍ)、ニカストリン、およびＡＰＯＥε４における変異を含む、ＡＤとの関連遺伝子を示唆している。晩発型アルツハイマー病(発症が＞６５歳、ＬＯＡＤ)の染色体“ホットスポット”は、１０ｑに位置づけられている。対照的に、家族性早期発症アルツハイマー病(発症が＜６５歳、ＥＯＡＤ)の遺伝子座は、γ−セクレターゼ部位のＡＰＰ変異またはγ−セクレターゼ活性に影響することが知られているプレセニリン１遺伝子の変異に特異的に位置づけられている。ＬＯＡＤとＥＯＡＤに関連する遺伝子を区別することが重要である。プレセニリン、ニカストリンまたはＡＰＰγ−開裂部位に見られる全てでなくてもほとんどのＥＯＡＤ変異は、γ−セクレターゼ開裂と関連している。他方、ＬＯＡＤと関連する遺伝子は、脳における細胞からのＡβ分泌または排泄を変える能力以外、ＡＤと一般的な関連はない。したがって、ＥＯＡＤはγ−セクレターゼ活性における特異的欠損により引き起こされることが明らかであるが、一方ＬＯＡＤにおける特異的欠損(複数もある)はまだ明らかではないように見える。
【０００４】
Ａβペプチドは、大きなタイプＩ経膜タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)のエンドプロテアーゼ開裂により産生される。アミロゲン経路(amylogenic pathway)においてＡＰＰを開裂する二つの酵素は、β−およびγ−セクレターゼと呼ばれ、これらはＡＰＰを各々Ｎ−およびＣ−末端から開裂する。この経路において、β−セクレターゼ(ＢＡＣＥ)はＡＰＰの開裂の律速酵素であり、細胞から分泌されるｓＡＰＰ−βフラグメントおよび膜に残るＣ９９フラグメントを産生する。Ｃ９９フラグメントはγ−セクレターゼ(ＧＡＣＥ)の基質であり、これはＣ９９を開裂してＡβと、ＮＦκ−Ｂ経路においてＩＬ−１β、ＫＡＩ１(テトラスパニン細胞表面分子)を介して遺伝子を抑制するＴｉｐ６０とＦｅ６５との複合体において機能するように見えるＣ９９“スタブ”を産生する。ＡＤの遺伝学的、生化学的、および分子学的証拠が、ＬＯＡＤが多遺伝子性であり、家族性および／または自然発生的な一つまたはそれ以上の遺伝的欠失を含むようであることを示唆する。
【０００５】
ＡＰＰプロセッシングは異なるセクレターゼ酵素が関連する：ＢＡＣＥ開裂はｓＡＰＰβおよびＣ９９(またはＣ８９)フラグメントを産生する。ｓＡＰＰβフラグメントは細胞外に分泌され、Ｃ９９はγ−セクレターゼの基質である。γ−セクレターゼは次いでＣ９９をアミロイド生成性ペプチドＡβ４０またはＡβ４２に開裂する。α−セクレターゼ開裂は、ｓＡＰＰαおよびＣ８３を産生する。ｓＡＰＰαは細胞外に分泌され、Ｃ８３フラグメントはγ−セクレターゼにより開裂され、非アミロイド生成性Ｐ３ペプチドとなる。
【０００６】
我々は、驚くべきことに、Ａβ分泌のこれまで同定されていなかった修飾因子を発見した；これらの遺伝子の過剰発現がＡβ４０およびＡβ４２発現を増加させ、データは、それらがγ−セクレターゼ開裂に直接作用し、Ａβの産生を増加させることを示唆する。このように、これらの遺伝子は、アルツハイマー病(ＡＤ)を含むが、これに限定されない、Ａβ分泌が関連する病理学的状態に使用し得る治療上の標的である可能性がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、Ａβ分泌のこれまで知られていなかった修飾因子の発見と、該修飾因子を、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防しまたは軽減するための新規治療剤の開発の標的として使用することに関連する。このように、一つの態様において、本発明は、該状態を処置、予防または軽減するのに有用なモジュレーターの同定法であり：ａ)候補モジュレーターが、インビトロまたはインビボで、表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質の活性を阻害するおよび／または表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する能力をアッセイすることを含み、さらに、ｂ)同定した阻害性モジュレーターが、該状態の動物モデルにおいておよび／または該状態の何れか一つまたはそれ以上の対象での臨床試験において観察される病理学的影響を改善する能力をアッセイすることを含み得る、方法に関する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防または軽減する方法であり、それを必要とする対象に、有効量の表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを投与することを含み、該モジュレーターが、例えば、該対象における該タンパク質の活性を阻害するかまたは該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する、方法に関する。さらなる実施態様において、モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の遺伝子発現を阻害することが意図されている。さらなる実施態様において、モジュレーターは、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質に対する抗体、またはそのフラグメントを含み、該抗体が、例えば、酵素活性または他のタンパク質活性を阻害できる。本明細書では、一つまたはそれ以上の該タンパク質の一つまたはそれ以上の一つまたはそれ以上のモジュレーターが投与可能であることを意図する。
【０００９】
他の態様において、本発明は、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防または軽減する方法であり、それを必要とする対象に、有効量の表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを含む医薬組成物を投与し、該モジュレーターが、例えば、該対象における該タンパク質の活性を阻害し、または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する方法に関する。さらなる実施態様において、モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の遺伝子発現を阻害することが意図されている。さらなる実施態様において、モジュレーターは、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質に対する抗体またはそのフラグメントを含み、該抗体は、例えば、酵素活性または他のタンパク質活性を阻害できる。本明細書では、該タンパク質の一つまたはそれ以上の一つまたはそれ以上のモジュレーターが投与可能であることを意図する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを、それを必要とする対象においてＡβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減する量で含み、該モジュレーターが、例えば、何れかの該タンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害できおよび／または何れかの該タンパク質の一つまたはそれ以上の遺伝子発現を阻害できる、医薬組成物に関する。さらなる実施態様において、モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の遺伝子発現を阻害することが意図されている。さらなる実施態様において、モジュレーターは、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質に対する抗体、またはそのフラグメントを含み、該抗体は、例えば、酵素活性または他のタンパク質活性を阻害できる。
【００１１】
他の態様において、本発明は、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターでの処置に適した候補者対象の可能性がある、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を有する対象の診断法であり、該対象における生物学的サンプルから該タンパク質のレベルをアッセイし、そのレベルがコントロールと比較して上昇した対象をモジュレーター処置の候補者であるとする、方法に関する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターでの処置に適した候補者対象の可能性がある、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を有する対象の診断法であり、該対象からの生物学的サンプルにおける該タンパク質のｍＲＮＡレベルをアッセイし、ｍＲＮＡレベルがコントロールと比較して上昇した対象をモジュレーター処置の候補者であるとする、方法に関する。
【００１３】
さらに別の態様において、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減する方法であり：(ａ)対象を、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルについてアッセイし；そして(ｂ)ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルがコントロールと比較して上昇した対象に、何れか一つまたはそれ以上の該タンパク質の一つまたはそれ以上のモジュレーターを、該病理学的状態を処置または軽減するのに十分な量で投与することを含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらに別の態様において、患者からの体組織サンプルにおける、表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現または該タンパク質もしくはそのフラグメントの何れか一つまたはそれ以上のレベルを検出するために必要な成分を含む、アッセイ法およびキットを提供し、このようなキットは、例えば、該タンパク質の何れか一つまたはそれ以上に、またはそのフラグメントに結合する抗体、または、該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む。好ましい実施態様において、このようなキットはまたキット成分を使用すべき方法の詳細を詳述した指示書を含む。
【００１５】
本発明はまた表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質のモジュレーターの、Ａβ分泌が関連する病理学的状態の処置、予防または軽減のための医薬の製造における使用に関する。一つの実施態様において、該モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、何れかの該タンパク質の一つまたはそれ以上の遺伝子発現を阻害することが意図されている。さらに別の実施態様において、該モジュレーターは、該タンパク質、またはそのフラグメントの何れか一つまたはそれ以上に対する、一つまたはそれ以上の抗体を含み、該抗体またはそのフラグメントが、例えば、該タンパク質の酵素活性または他の活性を阻害できる。
【００１６】
本発明はまた、医薬として使用するための表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質のモジュレーターに関する。一つの実施態様において、該モジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上の物質を含み、該物質が、何れかの該タンパク質の一つまたはそれ以上の遺伝子発現を阻害することが意図されている。さらに別の実施態様において、該モジュレーターは、該タンパク質、またはそのフラグメントの何れか一つまたはそれ以上に対する一つまたはそれ以上の抗体を含み、該抗体またはそのフラグメントは、例えば、酵素活性または他のタンパク質活性を阻害できる。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明の実施に際して、分子生物学における多くの慣用法を使用する。これらの技術は既知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997(F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985(D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984(M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984(Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986(R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986(IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987(J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory); およびMethods in Enzymology Vol. 154およびVol. 155(各々Wu and GrossmanおよびWu編)に説明されている。
【００１８】
本明細書および特許請求の範囲で使用されている単数形は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、複数形を含む。このように、例えば、“抗体”という記載は、当業者に既知の一つまたはそれ以上の抗体およびその均等物を意味するなどである。
【００１９】
本明細書で使用する“Ａβ分泌が関連する病理学的状態”は、不溶性アミロイド沈着物(老人斑)(その主要成分は、アミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)のタンパク質分解産物、４０−４２アミノ酸アミロイドベータ(Ａβ)ペプチドである)の形成により特徴付けられ得る、修飾されたＡＰＰ代謝またはＡＰＰ経路に関与する成分のプロセッシング、例えば、異常α−、β−、またはγ−セクレターゼ活性、および／またはＡβ分泌を含むが、これらに限定されないＡＰＰ経路における異常と関連する状態を含むが、これらに限定されない。このような状態は、アルツハイマー病ならびに記憶、認知および行動を制御する脳の細胞集団におけるニューロンの退化および最終的には死により特徴付けられるその他の状態を含む。このような状態はまた、パーキンソン病、タウパシー、プリオン病、前頭側頭型痴呆、線条体黒質変性症、レヴィー小体痴呆、ハンチントン病、ピック病、アミロイド症、および過剰なＡβ産生が関連する他の神経退行性疾患を含むが、これらに限定されない状態を含み得る。
【００２０】
本明細書で使用する“核酸配列”は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびフラグメントまたはその一部、およびゲノムまたは合成起源の、一本鎖または二本鎖であってよく、かつセンスまたはアンチセンス鎖を意味するＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００２１】
本明細書で使用する“アンチセンス”は、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を意味する。用語“アンチセンス鎖”は、“センス”鎖に相補的な核酸鎖に対して使用する。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモーターに、逆配向で目的の遺伝子をライゲーションすることを含む、任意の方法で製造し得る。細胞内に挿入されたら、この転写鎖と細胞により産生された天然配列を組み合わせて、二本鎖を形成する。次いでこれらの二本鎖のさらなる転写または翻訳をブロックする。 “ネガティブ”という表示は、時に、アンチセンス鎖に対して使用し、そして“ポジティブ”は、時に、センス鎖に対して使用する。
【００２２】
“ｃＤＮＡ”は、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)配列の一部と相補的であり、一般にｍＲＮＡ調製物から、逆転写酵素を使用して合成されるＤＮＡを意味する。
【００２３】
本明細書で意図している、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、リボザイム、ｓｉＲＮＡおよび二本鎖または一本鎖ＲＮＡは、選択したヌクレオチド配列が、遺伝子発現の遺伝子−特異的阻害をするような、核酸配列を対象とする。例えば、ヌクレオチド配列の知識を使用して、ｍＲＮＡと最も強くハイブリダイゼーションするアンチセンス分子を設計し得る。同様に、遺伝子の特異的ヌクレオチド配列を認識し、開裂するようにリボザイムを合成できる(Cech. J. Amer. Med Assn. 260: 3030(1988))。遺伝子発現の標的阻害に使用するためのこのような分子を設計するための技術は、当業者に既知である。
【００２４】
本明細書に記載の個々のタンパク質／ポリペプチドは、ヒトまたは他の種由来の、部分形、アイソフォーム、変異体、前駆体形、完全長タンパク質、上記の何れかの配列またはフラグメントを含む縮合タンパク質を含むが、これらに限定されない、これらのタンパク質の何れかおよび全ての形を含む。当業者には明らかであるタンパク質ホモログまたはオーソロガスは、この定義に包含される。タンパク質なる用語は、ゲノムのＤＮＡライブラリーのような何れかの種の天然に存在する起源ならびに、発現系を含む遺伝子操作した宿主細胞から単離した、または、例えば、自動化ペプチド合成装置を使用して化学合成によりまたはこのような方法の組み合わせにより産生されたタンパク質を意味することを意図されている。このようなポリペプチドを単離し、調製する手段は当分野で既知である。
【００２５】
本明細書で使用する“サンプル”なる用語は、その最も広い意味で使用する。対象からの生物学的サンプルは、血液、尿、脳組織、一次細胞系、不死化細胞系または、タンパク質活性もしくは遺伝子発現アッセイし得る他の生物学的材料を含み得る。生物学的サンプルは、例えば、血液、腫瘍または、例えば、Affymetrixチップ、ＲＴ−ＰＣＲまたは他の慣用法のような慣用のガラス・チップ・マイクロアレイ技術を使用して、そこから遺伝子発現プロファイリングのために総ＲＮＡを精製し得るような他の試料を含み得る。
【００２６】
本明細書で使用する“抗体”なる用語は、完全な分子ならびに、エピトープ性決定基を結合できる、Ｆａ、Ｆ(ａｂ')２、およびＦｖのようなそのフラグメントを意味する。特異的ポリペプチドを結合できる抗体は、免疫化抗原として、目的の小ペプチドを含む、完全なポリペプチドまたはフラグメントを使用して調製できる。動物の免疫化に使用するポリペプチドまたはペプチドは、ＲＮＡの翻訳由来であるかまたは化学的合成物であってよく、かつ担体タンパク質と接合し得る。ペプチドと化学的に結合する、一般的に使用される担体は、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリンを含む。結合したペプチドを次いで動物(例えば、マウス、ヤギ、ニワトリ、ラットまたはウサギ)の免疫化に使用する。
【００２７】
本明細書で使用する“ヒト化抗体”は、ヒト抗体をより厳密に模倣するために、非抗原結合領域のアミノ酸が置換されているが、まだ本来の結合能を維持している、抗体分子を意味する。
【００２８】
“治療的有効量”は、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防または軽減するのに十分な薬剤の量である。
“対象”は、任意のヒトまたは非ヒト生物を意味する。
【００２９】
このように、一つの態様において本発明は、アルツハイマー病を含むが、これに限定されない、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減するのに有用なモジュレーターの同定法であり：ａ)候補モジュレーターが、表１に記載のものからなる群から選択される何れか一つまたはそれ以上のタンパク質の活性を阻害するおよび／または該タンパク質の何れか一つまたはそれ以上をコードする遺伝子の発現をインビトロまたはインビボで阻害する能力をアッセイすることを含み、さらに、ｂ)同定した阻害性モジュレーターが、該状態の動物モデルにおいておよび／または該状態の何れか一つまたはそれ以上の対象での臨床試験において観察される病理学的影響を改善する能力をアッセイすることを含み得る、方法に関する。
【００３０】
慣用のスクリーニングアッセイ(インビトロおよびインビボの両方)を、タンパク質活性を阻害するおよび／または遺伝子発現を阻害するモジュレーターの同定に使用し得る。タンパク質活性レベル、例えば、酵素活性レベルは、対象において、対象からの生物学的サンプルを使用して、慣用の酵素活性アッセイを用いてアッセイできる。遺伝子発現(例えばｍＲＮＡレベル)はまた、例えば、慣用のノーザン分析または市販のマイクロアレイを含む、当業者が熟知する方法を使用して測定し得る。さらに、試験化合物がタンパク質レベルを阻害する効果は、ＥＬＩＳＡ抗体ベースのアッセイまたは蛍光標識反応アッセイで検出できる。これらの技術はハイスループットスクリーニングのために容易に利用でき、当業者は熟知している。
【００３１】
これらの試験から集められたデータを使用して、これらのモジュレーターの、本明細書に記載の病理学的状態の処置への有用性を同定する。阻害性物質を、当業者が熟知の慣用の生存動物モデルでおよび／または慣用法にしたがったヒトでの臨床試験でさらにアッセイし、該化合物が、該状態の何れか一つまたはそれ以上をインビボで処置、予防または軽減する能力を評価する。
【００３２】
本明細書に記載の方法による分析のための候補モジュレーターは、本明細書で修飾因子として同定されたタンパク質を阻害することが既知の化学化合物ならびに、何れかのレベルでのこれらのタンパク質に対する効果が、まだ特徴付けられていない化合物を含む。阻害活性を有することが既知の化合物を、直接、上記のような動物モデルでまたは臨床試験でアッセイし得る。
【００３３】
他の態様において、本発明は、アルツハイマー病を含むが、これに限定されない、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置し、予防し、または軽減する方法であり、それを必要とする対象に、有効量の表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質の何れか一つまたはそれ以上のモジュレーターを含む、医薬組成物を投与することを含む方法に関する。このようなモジュレーターは、該タンパク質またはそのフラグメントに対する抗体を含む。ある特定の好ましい実施態様において、医薬組成物は、該タンパク質またはその一部のヒト形に高度に選択的である抗体を含む。該タンパク質に対する抗体は、対象におけるタンパク質の凝集をもたらすことができ、したがって、タンパク質活性、例えば酵素活性を阻害し、または減少させ得る。このような抗体は、また、例えば、活性部位との直接相互作用により、または基質の活性部位への接近を遮断することにより、タンパク質活性を阻害または減少し得る。抗体はまた、タンパク質の制御に関与し得る、例えば、酵素活性に必要なタンパク質−タンパク質相互作用の阻止により、タンパク質活性を阻害するために使用する。本明細書に記載のような阻害活性を有する抗体は、製造可能であり、当業者が熟知した標準アッセイにより同定できる。
【００３４】
本明細書に記載の修飾因子に対する抗体はまた診断的に使用し得る。例えば、これらの抗体を慣用法にしたがって使用し、対象中の修飾因子のレベルを定量し得る；適当なコントロールと比較した異常レベルは、本明細書に記載の何れか一つまたはそれ以上の病理学的状態の種々の臨床形または重症度の指標であり得る。このような情報は、何れか一つまたはそれ以上の該状態の患者を、該修飾因子に対する阻害剤での処置に応答し得るまたは応答し得ない小集団に同定するためにも有用であろう。同様に、本明細書で意図されているのは、対象における本明細書に記載の修飾因子のメッセージレベルの定量が、診断および適当な治療の決定に有用であることである；適当なコントロール個体と比較して、これらのタンパク質の何れか一つまたはそれ以上のｍＲＮＡレベルが上昇した対象は、本明細書に記載のようなモジュレーターでの処置に適した候補者と考えられる。
【００３５】
このように、他の態様において、本発明は：
(ａ)表１に記載のものからなる群から選択されるタンパク質またはそのフラグメントのポリヌクレオチド；
(ｂ)(ａ)と相補的なヌクレオチド配列；
(ｃ)(ａ)と相補的なＲＮＡｉ配列；
(ｄ)表１に記載のものからなる群から選択されるポリペプチドまたはそのフラグメント；または
(ｅ)表１に記載のものからなる群から選択されるポリペプチドに対する抗体、またはそのフラグメント
を含む、診断用キットに関する。
【００３６】
任意のこのようなキットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、(ｄ)または(ｅ)が実質的構成要素を構成し得ることが理解されるであろう。
【００３７】
同様に、本明細書で意図されているのは、対象における、本明細書に記載の何れか一つまたはそれ以上の修飾因子のレベルまたは活性をモニタリングしおよび／または遺伝子発現(ｍＲＮＡレベル)を検出することが、例えば、ある処置レジメンの効果を測定するための、臨床試験法の一部として使用し得ることである。例えば、試験物質を投与している患者を臨床的に評価し、所望(すなわち、コントロール患者におけるレベルよりも高い、または、該状態の何れか一つまたはそれ以上が、臨床的介入により十分に軽減した患者におけるレベルよりも高いレベル)より高い修飾因子レベル、活性および／または遺伝子発現レベルの患者を同定する。これらのデータに基づき、医師は次いで処方する投与量、投与レジメン、または、治療物質のタイプを調節する。
【００３８】
患者に対する治療を最適化するために考慮する因子は、特に、処置する状態、処置する特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定のタイプ、投与方法、投与のスケジュールおよび、医師が既知の他の因子を含む。投与すべき活性化合物の治療的有効量は、このような考慮により決定され、本明細書に記載のＡβ分泌または修飾されたＡＰＰ代謝が関連する病理学的状態の処置、予防または軽減に必要な最小量である。
【００３９】
本明細書に記載のタンパク質に対する適当な抗体は、市販の商品から得ることができるか、慣用法により製造できる。例えば、本明細書に記載されているのは、一つまたはそれ以上の異なって発現される遺伝子エピトープを特異的に認識する抗体の製造法である。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーから産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Ｉｄ)抗体、および上記の何れかのエピトープ−結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書に記載のポリペプチドに対する抗体の製造のために、種々の宿主動物を、ポリペプチド、またはその一部の注射により免疫化し得る。このような宿主動物は、ウサギ、マウス、ヤギ、ニワトリ、およびラットを含むが、これらに限定されない。フロインド(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ(カルメット−ゲラン菌)およびコリネバクテリウム・パルヴムのようなおそらく有用であるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない種々のアジュバントを、宿主の種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用し得る。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物、またはその抗原機能的誘導体のような抗原で免疫化した動物の血清由来の抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、上記のような宿主動物に、また上記のようにアジュバントを添加されたポリペプチド、またはその一部を注射することにより免疫化し得る。
【００４２】
特定の抗原に対する抗体の同種集団であるモノクローナル抗体は、培養における継続的細胞系による、抗体分子の産生のために提供される何れかの技術により得られ得る。これらは、KohlerおよびMilstein(1975, Nature 256: 495-497; および米国特許４,３７６,１１０)のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA80: 2026-2030)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., 1985, Monoclonal antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)を含むが、これらに限定されない。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＹおよびそれらの何れかのサブクラスを含む、何れかの免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養し得る。インビボでのｍＡｂの高力価での産生から、現在それが好ましい製造法である。
【００４３】
加えて、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子と共に適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる、“キメラ抗体”の産生のために開発された技術(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454)を使用できる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変性または超可変性領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が、異なる動物種に由来する、分子である。
【００４４】
あるいは、一本鎖抗体の製造に関して記載の方法(米国特許４,９４６,７７８；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85: 5879-5883; およびWard et al., 1989, Nature 334: 544-546)は、異なって発現される遺伝子−一本鎖抗体の産生に適合できる。一本鎖抗体を、Ｆｖ領域の重および軽鎖フラグメントの、一本鎖ポリペプチドをもたらすアミノ酸架橋を介した架橋により、形成する。
【００４５】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の産生に有用な技術を、本明細書に記載のポリペプチドに対する抗体、フラグメント、誘導体、および機能的均等物の産生に適合できる。このような技術は、米国特許５,９３２、４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,９１０,７７１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,５４５,５８０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に記載され、これら全ての記載を、出典明示によりその全体を本明細書に包含させる。
【００４６】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の方法により製造し得る。例えば、このようなフラグメントは、以下のものを含むが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド結合の還元により産生できるＦａｂフラグメント。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し(Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281)、所望の特性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速で容易な同定を可能にし得る。
【００４７】
本明細書に記載の抗体の検出は、標準ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ分析、およびインビトロまたはインビボで使用される標準イメージング技術を使用して、達成し得る。検出は、抗体の、検出可能な物質への結合(すなわち、物理的連結)により容易にできる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、配合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質を含む。適当な酵素の例は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、３−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な配合団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリスリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、そして、適当な放射活性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含む。
【００４８】
検出の容易さのために特に好ましいのはサンドイッチアッセイであり、それには多くの変法が存在し、その全てを本発明に包含することを意図する。例えば、典型的な前向きアッセイにおいて、非標識抗を固体支持体上に固定化し、試験すべきサンプルをその結合分子と接触させる。抗体−抗原二元複合体の形成を可能にするのに十分な時間である、適当なインキュベーション時間の後、検出可能なシグナルを誘発できるレポーター分子で標識した第２の抗体を添加し、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体の形成を可能にするのに十分な時間インキュベートする。全ての未反応物質を洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により測定するか、既知の量の抗原を含むコントロールサンプルとの比較により定量し得る。前向きアッセイの変法は、サンプルと抗体の両方を同時に結合抗体に添加する、同時アッセイを含み、または、標識抗体と検出するサンプルを最初に結合させ、インキュベートし、非標識表面結合抗体に添加する、逆向きアッセイを含む。これらの技術は当業者に既知であり、わずかな改変の可能性は容易に明らかとなるであろう。本明細書で使用する“サンドイッチアッセイ”は、基本的な二面技術における全ての改変を含むことを意図する。本発明の免疫アッセイに関して、唯一の限定因子は、標識抗体が、修飾因子ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的な抗体であることである。
【００４９】
最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア−または放射性ヌクレオチド含有分子の何れかである。酵素免疫アッセイの場合、酵素は、通常、グルタールアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩の手段により、第２抗体と接合する。容易に認識されるように、しかしながら、当業者に既知の広範囲の異なるライゲーション技術が存在する。一般的に使用される酵素は、とりわけ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。特異的酵素と共に使用すべき基質は、一般に、対応する酵素による加水分解で、検出可能な色の変化を起こすように選択する。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリホスファターゼ接合体との使用に好ましく；ペルオキシダーゼ接合体のためには、１,２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般に使用される。上記のような発色性基質よりむしろ蛍光産物を産生する、色素蛍光発生基質を用いることも可能である。適当な基質を含む溶液を、次いで、三元複合体に添加する。第２抗体と結合した酵素と反応する基質が、定質的可視シグナルをもたらし、それをさらに、通常、分光光度法により定量し、血清サンプルに存在する目的のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントの量を評価し得る。
【００５０】
あるいは、フルオレッセインおよびローダミンのような蛍光化合物を、抗体と、その結合能を変えることなく化学結合し得る。特定の波長の光の照射により活性化したとき、蛍光色素−標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の興奮性状態を誘発し、続いて、特徴的な長さの波長の光を放出する。放出は、光学顕微鏡で可視的に検出可能な特徴的色素として見られる。免疫蛍光法およびＥＩＡ技術は両方とも十分に確立されたアッセイであり、本方法に特に好ましい。しかしながら、放射性同位体、化学発光または生物発光分子のような他のレポーター分子も使用し得る。当業者には、必要な使用に適合させるために、方法をどのように改変するか、容易に明らかとなろう。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、核酸レベルで記載の修飾因子の発現を阻害する物質も含み得る。このような分子は、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡおよび／または修飾因子をコードする核酸の適当なヌクレオチド配列を指向する二本鎖または一本鎖ＲＮＡを含む。これらの阻害性分子は、当業者に慣用の方法を使用して、不当な実験的負担を必要とせずに製造し得る。例えば、遺伝子発現の修飾(例えば阻害)は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、すなわちプロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対する、アンチセンス分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを設計することにより、得ることができる。例えば、転写開始部位由来のオリゴヌクレオチド、例えば、開始部位から−１０ないし＋１０の間の位置を使用し得る。それにも関わらず、遺伝子の全ての領域を、ｍＲＮＡと最も強くハイブリダイズするアンチセンス分子の設計に使用し得、このような適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、製造され、当業者が熟知した標準アッセイ法により同定し得る。
【００５２】
同様に、遺伝子発現の発現阻害は、“三重らせん”塩基対形成方法論を使用して、達成し得る。三重らせん対形成は、二本鎖がポリメラーゼ、転写因子、または抑制分子が結合するのに十分に開く能力を阻害するため、有用である。三重鎖ＤＮＡを記載した近年の治療的進歩は、文献に記載されている(Gee, J.E. et al. (1994)In: Huber, B.E. and B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.)。これらの分子はまた転写物がリボゾームと結合するのを防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を遮断することが意図される。
【００５３】
酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムを使用し、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することにより、遺伝子発現を阻害することがまた可能である。リボザイム作用の機構は、リボザイム分子の相補的標的ＲＮＡへの配列−特異的ハイブリダイゼーション、続くヌクレオチド鎖切断的開裂を含む。使用し得る例は、遺伝子配列のヌクレオチド鎖切断的開裂を特異的にかつ効率的に触媒することを意図し得る、加工された“ハンマーヘッド”または“ヘアピン”モチーフリボザイム分子である。何れか可能性のあるＲＮＡ標的中の特異的リボザイム開裂部位を、最初に、標的分子を以下の配列を含むリボザイム開裂部位に関して走査することにより同定する：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ。同定されたら、開裂部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、１５から２０リボヌクレオチドの間の短ＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを操作不可能にする可能性がある二次構造に関して評価し得る。候補標的の適合性は、また、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用した、相補的オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションの到達性の試験により評価し得る。
【００５４】
リボザイム法は、細胞をリボザイムに暴露するか、または細胞中でこのような小ＲＮＡリボザイム分子の発現を誘導することを含む(Grassi and Marini, 1996, Annals of Medicine 28: 499-510; Gibson, 1996, Cancer and Metastasis Reviews 15: 287-299)。本明細書に記載の遺伝子の少なくとも一つに対応するｍＲＮＡを標的とする、ハンマーヘッドおよびヘアピンリボザイムの細胞内発現は、遺伝子によりコードされるタンパク質の阻害に利用できる。
【００５５】
リボザイムは、リボザイム配列内に挿入されＲＮＡオリゴヌクレオチドの形で細胞に直接送達されるか、または、所望のリボザイム分をコードする発現ベクターとして細胞内に挿入される。リボザイムは、ｍＲＮＡを開裂するのに触媒的に有効であり、それにより、細胞中のｍＲＮＡ存在量を修飾する、十分な数インビボで慣用的に発現できる(Cotten et al., 1989 EMBO J. 8: 3861-3866)。特に、慣用の、既知の規則にしたがい設計され、例えば、標準ホスホラミダイト化学により合成された、リボザイムをコードするＤＮＡ配列を、ｔＲＮＡをコードする遺伝子のアンチコドン幹およびループにおける制限酵素部位にライゲートでき、それを次いで当分野で慣用の方法により細胞内に形質転換し、発現できる。好ましくは、誘導性プロモーター(例えば、グルココルチコイドまたはテトラサイクリン反応エレメント)もこの構築物に挿入し、リボザイム発現を選択的に制御できるようにする。飽和使用のために、高度にかつ構造的に活性のプロモーターを使用できる。ｔＤＮＡ遺伝子(すなわち、ｔＲＮＡをコードする遺伝子)が、その小さいサイズ、高い割合の転写および異なる種類の組織中の遍在的発現のために、この適用で有用である。
【００５６】
したがって、リボザイムを、実質的に何れかのｍＲＮＡ配列を開裂するために慣用的に設計でき、細胞を、リボザイムの制御可能で触媒的有効量が発現されるように、このようなリボザイム配列をコードするＤＮＡで慣用的に形質転換できる。したがって、細胞中の実質的に何れかのＲＮＡ種の存在量を、修飾でき、または混乱させ得る。
【００５７】
リボザイム配列は、アンチセンスヌクレオチドに関して記載したのと実質的に同じ方法で修飾でき、例えば、リボザイム配列は、修飾塩基部分を含み得る。
【００５８】
ＲＮＡアプタマーも細胞中に挿入でき、または発現でき、ＲＮＡ存在量または活性を修飾する。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質、例えばＴａｔおよびＲｅｖ  ＲＮＡ(Good et al., 1997, Gene Therapy 4: 45-54)に対する、その翻訳を特異的に阻害できる、特異的ＲＮＡリガンドである。
【００５９】
遺伝子発現の遺伝子特異的阻害はまた慣用の二本鎖または一本鎖ＲＮＡ技術を使用して達成し得る。このような技術の記載は、出典明示によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ９９／３２６１９に見ることができる。加えて、ｓｉＲＮＡ技術が、遺伝子発現を阻害するための手段として有用であることが証明されている(Cullen, BR Nat. Immunol. 2002 Jul; 3(7): 597-9; Martinez, J. et al. Cell 2002 Sept.6; 110(5): 563)。
【００６０】
本発明のアンチセンス分子、三重らせんＤＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、核酸分子の合成に関する当分野で既知の何れかの方法により製造し得る。これらの方法は、固相ホスホラミダイト化学合成のような、オリゴヌクレオチドの化学合成の技術を含む。あるいは、ＲＮＡ分子を、本明細書に記載のポリペプチドの遺伝子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写により産生し得る。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼにより、広範囲のベクターに挿入し得る。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構造的にまたは誘導性に合成するｃＤＮＡ構築物を、細胞系、細胞、または組織に挿入できる。
【００６１】
ベクターを、細胞または組織中に、多くの利用可能な手段により挿入し得、インビボ、インビトロまたはエキソビボで使用し得る。エキソビボ治療のために、ベクターを患者から採った幹細胞に挿入し、クローン増幅し、同じ患者に自己移植して戻す。トランスフェクションおよびリポソーム注入による送達は、当分野で既知の方法を使用して達成し得る。
【００６２】
加えて、本明細書で同定した修飾因子のｃＤＮＡおよび／またはタンパク質を、これらの修飾因子によりインビボで修飾される他のタンパク質、例えばレセプターの同定に使用できる。このようにして同定したタンパク質を、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置するための薬剤スクリーニングに使用できる。修飾因子の下流のものを含むこれらの遺伝子を同定するために、例えば、該病理学的状態の一つまたはそれ以上の慣用のインビボモデルの動物を、修飾因子の特異的阻害剤で処置し、動物を殺し、組織サンプルを摘出し、組織から総ＲＮＡを単離し、かつ、コントロール動物(阻害剤を投与されていない動物)と比較して変化しているメッセージレベルを同定するための標準マイクロアレイアッセイ技術を用いる、慣用法を使用することを意図する。
【００６３】
慣用のインビトロまたはインビボアッセイを、本明細書で同定した修飾因子の過剰発現をもたらす可能性のある遺伝子の同定に使用し得る。このようにして同定された遺伝子を使用して、Ａβ分泌が関連する病理学的状態の処置のための強力な治療剤かもしれない薬剤をスクリーニングするために使用できる。例えば、慣用のレポーター遺伝子アッセイを使用し、その中で、修飾因子遺伝子のプロモーター領域を、レポーター遺伝子の上流に配置し、構築物を適当な細胞(例えば、ＨｅＬａ、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３のような腫瘍細胞系またはヒトヒト2倍体線維芽細胞、内皮または軟骨細胞のような一次細胞)にトランスフェクトし、細胞を、慣用の技術を使用して、レポーター遺伝子の発現の検出により、修飾因子プロモーターの活性化をもたらす上流遺伝子に関してアッセイする。
【００６４】
本明細書に記載の病理学的状態を処置する方法として、慣用法による、例えば、これらのタンパク質に対する抗体の設計によりおよび／またはこのようなタンパク質の遺伝子を標的とした阻害性アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーの設計より、本明細書で同定した修飾因子による遺伝子またはタンパク質の機能および／または発現の阻害ができることを意図する。本明細書に記載の病理学的状態を処置するためのこのような阻害性物質を含む医薬組成物も意図される。
【００６５】
Ａβ分泌が関連する病理学的状態の処置、予防および／または軽減に有用な、本明細書に記載の医薬組成物は患者に治療的有効量で投与すべきである。治療的有効量は、該状態の何れか一つの処置、予防、または軽減をするのに十分な化合物の量を意味し、医師またはこの分野の通常の技術を有する他の者により決定できる。
【００６６】
本発明の阻害性物質は、医薬組成物として投与できる。本発明にしたがい使用するためのこのような医薬組成物は、慣用の方法で、一つまたはそれ以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、製剤し得る。
【００６７】
このように、化合物およびその生理学的に許容される塩および溶媒和物を、吸入または吹き込み(口または鼻の何れかを介して)、または、局所、経口、口腔、非経腸または直腸投与により投与し得る。
【００６８】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、ゼラチン化前のメイズ澱粉、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム)；滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉またはグリコール酸ナトリウム澱粉)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)のような薬学的に許容される賦形剤と共に慣用の手段で製造される、錠剤またはカプセルの形をとり得る。錠剤は、当分野で既知の方法によりコーティングし得る。経口投与のための液体製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形をとり得、または、使用前に水または他の適当な媒体で構築するための乾燥製品として存在し得る。このような液体製剤は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油)；および防腐剤(例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)のような薬学的に許容されると共に、慣用の手段で製剤し得る。製剤はまた緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤を、適当な場合、含み得る。
【００６９】
経口投与用製剤は、活性化合物の制御された放出を提供するために、適当に製剤し得る。
口腔投与のために、組成物は慣用法で製剤した錠剤またはロゼンジの形を取り得る。
【００７０】
吸入による投与のために、本発明にしたがい使用するための化合物は、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用した、加圧包装またはネブライザーからのエアロゾルスプレー形で噴霧する。加圧式エアロゾルの場合、投与単位は、定量を送達するためのバルブを提供することにより、決定し得る。例えば、吸入器または吹き入れ器で使用するための、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物と、ラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤を含んで製剤し得る。
【００７１】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または連続輸液による非経腸投与のために製剤し得る。注射用製剤は、単位投与形、例えば、アンプル中、または、複数回用量コンテナ中に、適当な防腐剤と共に存在し得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤補助剤(formulatory agent)を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に、適当な媒体、例えば、滅菌無発熱源水で構築するための、粉末形であり得る。
【００７２】
化合物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドのような慣用の坐薬基剤を含む、坐薬または留置エネマ(retention enemas)に製剤し得る。
【００７３】
化合物はまたデポ剤として製剤し得る。このような長期に作用する製剤は、インプラント(例えば皮下または筋肉内)により、または、筋肉内注射により投与し得る。このように、例えば、化合物は、適当な重合性または疎水性物質(例えば許容される油中のエマルジョンとして)またはイオン交換樹脂と、または、やや溶けにくい誘導体として、例えば、やや溶けにくい塩として製剤し得る。
【００７４】
組成物は、望ましい場合、活性成分を含む１回またはそれ以上の投与形を含み得る、パックまたはディスペンサー装置中に存在し得る。パックは、例えば、ブリスターパックのような、金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与指示書を伴い得る。
【００７５】
本発明における使用に適した医薬組成物は、活性成分が、意図する目的を達成するための十分量で包含させる、組成物を含む。有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００７６】
すべての化合物に関して、治療的有効量を、最初に、例えば、新生物細胞の細胞培養アッセイにおいて、または、動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタにおいて概算できる。動物モデルはまた適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用し得る。投与量は、動物モデルで、ＩＣ５０(すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように製剤し得る。このような情報を、次いで、ヒトにおける有用な投与量および投与経路を決定するために使用できる。
【００７７】
治療的有効量は、Ａβ分泌が関連する病理学的状態を処置、予防および／または軽減するのに有用な、活性成分、例えば、阻害性化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせんＤＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡまたは、修飾因子をコードする遺伝子の発現の阻害を意図した二本鎖または一本鎖ＲＮＡ、該修飾因子に対する抗体またはそのフラグメントの量である。治療効力および毒性、例えば、ＥＤ５０(集団の５０％に治療的に有効な量)およびＬＤ５０(集団の５０％に致死的な量)は、細胞培養または実験動物における標準医薬品法により決定し得る。毒性および治療的効果の間の用量比率は治療計数であり、これは、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。大きな治療計数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒト使用のための投与量の範囲の処方に使用する。このような組成物に含まれる投与量は、好ましくは、わずかな毒性でまたは毒性なしでＥＣ５０を含む、循環濃度の範囲内である。投与量は、この範囲内で用いる投与形、患者の感受性および投与経路に依存して変化する。
【００７８】
正確な投与量は、医師が、処置を必要とする患者に関連する因子に照らして、決定する。投与量および投与は、活性成分の十分なレベルを提供するために、または、所望の効果を維持するために、調節する。考慮すべき可能性のある因子は、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時間および頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性および治療に対する耐容性／応答を含む。長期に作用する医薬組成物は、特定の製剤の半減期および排泄速度に依存して、３〜４日毎、毎週、２週間に１回投与し得る。
【００７９】
通常の投与量は、投与経路に依存して、０.１から１００,０００μgまで、総投与量約１ｇまで変化し得る。特定の投与量および送達法に関するガイダンスは、文献中に提供され、当分野の医師には一般に利用可能である。当業者は、ヌクレオチドに関して、タンパク質またはその阻害剤と異なる製剤を用い得る。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。タンパク質の経口投与に適した医薬製剤は、例えば、米国特許５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１に記載されている。
【００８０】
本明細書に記載の発明は、それらが変化し得るため、記載の特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを意図する。本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを記載する目的であり、いかなる方法でも本発明を限定することは意図しない。
【００８１】
特記しない限り、本明細書に記載の技術用語および専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類したまたは同等な何れかの方法および物質を本発明の実施または試験において使用できるが、好ましい方法、デバイスおよび材料をここに記載する。本明細書に記載の全ての刊行物は、本発明と関連して使用すべき、刊行物に報告された材料および方法を記載する目的で、出典明示により本明細書に包含させる。当業者は、慣用の実験を超えることがない実験を使用して、本明細書に記載の本発明の具体的態様に対する多くの相当物を認識し、または、確認できるであろう。このような相当物は特許請求の範囲に包含することを意図する。
【実施例】
【００８２】
以下の方法を、下記の実施例を実施するために行う：
４７９遺伝子再配置の構築
私有の(proprietary)完全長ｃＤＮＡクローンコレクション中の約２０,０００クローンを、その染色体位置および推定される機能に基づいてコンピューター内分析する；コレクション由来の４７９遺伝子は、染色体１０ｑ晩発型アルツハイマー病“ホットスポット”に、あるレベルのアノテーションと共に位置づけられることが判明する。
【００８３】
これらの遺伝子を、機能レベルでさらにアノテーションするために、４７９タンパク質配列を、別々の検索アルゴリズムの３つの異なる配列分析プログラムにかける：ＮＣＢＩで４７９クローンを、非冗長(ｎｒ)タンパク質データベースに対してスクリーニングした、InterProScan、Celera/Pantherタンパク質ファミリー分類データベースおよびベーシック・ロジカル・アラインメント・サーチ・ツール(ブラスト)と呼ばれる私有のプログラム(Altschul, S.F. et al. , (1990)J. Mol. Biol. 215: 403-410)。全３つの方法から得たデータは重複し、データベースに集められた各遺伝子の完全なアノテーションである。
【００８４】
４７９の１０ｑ遺伝子のためのＤＮＡを、約２０,７２８私有遺伝子セット由来の細菌大腸菌株ＤＨ５α(Invitrogen, Carlsbad, CA)グリセロールストックから再配置する。セットは、６０μlの細菌グリセロールストック(８％グリセロール中、ルリア・ブロス(ＬＢ))を含む、３８４ウェルGenetixプレート(Genetix USA Inc., St. James, NY)を含む。目的の各ウェルの２μlアリコートを、１００μlのＬＢ／８％グリセロールを含む、一つのGreiner  ３８４ディープ・ウェル・プレート(Greiner BioONE Inc., Longwood, FL)を接種するのに使用する。プレートをエアポア・シート(Qiagen, Valencia, CA)で密封し、サランラップで包み、３７℃で２２時間、振盪せずにインキュベートする。この培養物の５μlアリコートを、１００μg／μlアンピシリン(エアポア・シートで覆われた５つのQiagenディープ９６ウェルプレートに配置)を含む、１mlのテリフィック・ブロス(ＴＢ)に接種し、２２時間、３７℃で２５０rpmで振盪しながら増殖させる。培養の密度を改善するために、１００μlの接種物を、新鮮な１×ＴＢ  １００μg／μlアンピシリンを含む、別のQiagenディープ９６ウェルプレートに再接種し、一晩増殖させる。細胞を４０００rpmで１５分、遠沈させ、上清を除去する。細胞ペレットを、Qiagen BioRobot 8000に移し、そこでＤＮＡミニプレップを、QIAprep Turbo96 PB(１−４プレート)プロトコールを使用して調製する。プロトコールは、ＤＮＡ溶出のために、Corning９６ウェルＵＶ−プレート(Corning Inc. Life Sciences, Acton, MA)を、Qiagen９６ウェルプレートの代わりに使用する。ＤＮＡ濃度を、慣用法にしたがい、SPECTRAmax 190(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)で計算するＡ２６０／２８０比率を使用して決定する。
【００８５】
９６ウェル形式のプレートをトランスフェクトするのに必要なＤＮＡの量を決定するために、各プレートの平均ＤＮＡ濃度を計算する。“母プレート”の平均ＤＮＡ濃度を、１８０μlの容量に各ウェルを再懸濁するのに使用し、２５ng／μlの平均ＤＮＡ値に到達するようにする。各ウェルからの６μl容量を、３０の新鮮な９６ウェルＰＣＲプレート(Corning Inc. Life Sciences, Acton, MA)に入れる。これらのトランスフェクションの各々は、準備ができた“母プレート”のコピーである“娘プレート”であり、ヒートシールし、−２０℃に凍結する。
【００８６】
２２６８遺伝子再配置の構築
Ａ２２６８遺伝子再配置を、２０,７２０遺伝子を、アノテーションに基づいて、最良の可能性がある薬剤標的と考えられる遺伝子の小サブセットまで濃縮するために産生する。この機能に基づく再配置は、キーワード“キナーゼ”、“ホスファターゼ”、“プロテアーゼ”、“アポトーシス”、“エイコサノイド代謝”、“スフィンゴ脂質代謝”、“ポリアミン代謝”、“ホスホリパーゼ”または“ケモカイン”と一致する遺伝子アノテーションの同定により作る。これらの検索から、全ての冗長クローンを除去し、得られた遺伝子のセットを、再配置中に残す。
【００８７】
再配置中の他の遺伝子のセットは、いわゆるＣＧＵＦ、または未知機能の(シー・エレガンス、およびキイロショウジョウバエに対する)保存遺伝子である。この遺伝子のリストは、割り当てられた機能を有しない、ハエおよび虫(worms)とオーソロジーな、６１３の予期されたヒト遺伝子のCeleraデータベースに由来する。オーソロジーの定義は、二つの配列が、互いにブラスト検索で最高のヒット(１ｅ−１０のＰ値)である場合である。６１３のCelera遺伝子を、次いで、Blastn(Altschul, SF et al. Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402)を使用して、クローンコレクションに対してブラスト検索する。クローンを、LifeSeqGold(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)を比較し、これは、実験に由来する転写物およびスプライス変異体を代表し得る集合ＥＳＴ配列を含む。元の６１３のうち５２９が、我々の私有のクローンコレクションで発見され、各５２９遺伝子の２から３遺伝子が、完全コード領域を得る機会を増やすための２２６８再配置に集められる。キナーゼを、さらに、ＲＥＦＳｅｑデータベース(NCBI, Bethesda, MD)に対して、コード領域の５'末端が、ＲＥＦＳｅｑエントリーと、５０塩基対にわたり９５％の同一性であるという要求で、キーワード検索によりフィルターをかける。Ｅ２を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに対するクローンのtBlastnを使用してフィルターをかける。＜１ｅ−１０のスコアのヒットを、再配置に加える。この再配置を、一つのではなく６つの３８４ウェルプレートを使用して、ＤＮＡミニプレップを調製するために細菌を増殖させる以外、４７９再配置と同じ形式で調製する。
【００８８】
トランスフェクション
ＣＨＯ  Ｋ１細胞(ATCC, Manassas, VA)を、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ、および２２mgのＬ−プロリン(Sigma Chemical, St. Louis, MO)と共に、滅菌し、カバーした、９６ウェル皿(Corning Inc. Life Sciences, Acton, MA)に、１０,０００細胞／７５μl／ウェルで、Multidropディスペンサーを製造者(Thermo Labsystems, Franklin, MA)のプロトコールにしたがい使用して入れる。プレートを一晩３７℃で、水を引き上げた(water jacked)ＣＯ２細胞培養チャンバー中でインキュベートする。４７９遺伝子アレイに関して、９６ウェルプレートのウェルあたり、トランスフェクション混合物を〜２００ngのｃＤＮＡ、１０μlのＯｐｔｉＭＥＭ、および１μlのFUGENE 6で調製する(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)。慣用法にしたがい、目的のｃＤＮＡを、完全長ＡＰＰと、１：１５比率(ｃＤＮＡ：ＡＰＰｗｔ(６９５))でコ−トランスフェクトする。
【００８９】
ＨＥＫ  ２９３細胞(ATCC, Manassas, VA)トランスフェクションに関して、Qiagen(登録商標)SuperFect試薬を、製造者の指示にしたがい使用する。６ウェル皿に、５×１０５細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、５％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)と共に入れ、２４時間増殖させる。SuperFect混合物を、１００μlの無血清培地(ＤＭＥＭ)、３μgの総ＤＮＡ、および２０μlのSuperFectで作る。培地を細胞から除き、１mLの新鮮培地を添加する。全てのSuperFect混合物を培地に添加し、３７℃で２時間インキュベートする。次いで、混合物を除去し、細胞を一度３mLのＰＢＳで洗浄する。新たな培地を再び細胞に添加し、それらを２４時間または４８時間インキュベートする。
【００９０】
２２６８遺伝子アレイに関して、トランスフェクション効率を、トランスフェクション混合物に２７ng／ウェルの最終濃度で含まれるｐＧＬ３−コントロールベクター(Promega Madison, Wisconsin cat#E1741)に対して標準化する。合計２５プレートまたは２４００ウェルが、２２６８遺伝子のトランスフェクションに必要である。この反応のマスター混合物を調製するために、３５mlのＯｐｔｉＭＥＭ、３７５μlのＡＰＰｗｔ  ＤＮＡ(１μg／μl)、９４μlのｐＧＬ３−コントロールベクター(１μg／μl)を、５０mlFalcon試験管(Fisher Scientific, St. Louis, MO)中に混合する。８mlを混合物から取り、８００μlのFUGENE 6に添加し、７５μlのその新しい混合物を、４つの９６ウェルＰＣＲプレートに入れる。このプレートを、BioMekFX(Coulter, Fullerton, CA)上で使用し、そこで１０μl／ウェルを、１５０ng／ウェル(６μlの“母プレート”)の平均ＤＮＡ濃度のトランスフェクションの準備ができたＤＮＡ“娘プレート”と混合する。ｃＤＮＡサンプルに添加したFUGENEと培地の混合物を７回ピペッティングすることにより混合する。混合物を、２０分、室温でインキュベートし、全容量を培養した細胞に添加し、十分に混合する。細胞およびトランスフェクション混合物を、そのプレート中、３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間の時点は、慣用のウェスタン・ブロット分析により、ＣＨＯ  Ｋ１細胞からのＢＡＣＥ過剰発現およびＡβ分泌が最大となる時点であると予め決定された(データは示していない)。
【００９１】
ルシフェラーゼアッセイ
２４時間後、細胞上清をプレートから取り出し、慣用的にプレコートしたＥＬＩＳＡプレートに移す。同時に、１００μlの新鮮完全ＤＭＥＭ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)を、再び細胞に添加する。BRIGHTGLOルシフェラーゼアッセイシステム(Promega Madison, Wisconsin)からの標準プロトコールを使用し、９０μlの新鮮ルシフェラーゼ試薬を各ウェルに添加し、混合する。２分、室温でインキュベート後、各プレートをLUMINOSKAN ASCENT(Thermo Labsystems, Fullerton, CA)照度計で、５００ms集積時間を使用して読む。標準化法は、ＥＬＩＳＡ読出しを、ルシフェラーゼ読出しで割り、アッセイの誘発倍数を決定することを含む。この方法で、全てのトランスフェクション事象をトランスフェクション効率に対して標準化する。標準化法は、また、細胞生存能の水準点として働く。
【００９２】
ヒット確認
このアッセイで“ヒット”(標準化データセットでＡβ分泌を＞５倍および生データセットで＞１.５倍増加させる全ての遺伝子)と採点されたクローンを、“母プレート”グリセロールストックから回収する。各ストックを１×ＬＢ寒天／１００μg／mlアンピシリンプレートに線状に撒き、一晩、３７℃で増殖させる。三つの別々のコロニーを採り、５ml培養として、１５ml  Falcon試験管で一晩３７℃で増殖させる。これらの培養から、ＤＮＡを、HighSpeed Maxi Kit(Qiagen cat#12663)を使用して、製造者のプロトコールにしたがい調製し、ＤＮＡ濃度を、慣用法でSpectramax 190(Molecular Devices)で決定する。全ての“ヒット”を次いで配列決定し(Solvias, Basel, Switzerland)、遺伝子の５'および３'配列を確認する。配列が正しい遺伝子と対応する場合は、これらのＤＮＡを使用してフォローアップ確認のための全アッセイを繰り返す。これらの実験において、Ａβ４０およびＡβ４２ペプチドの両方を、ＥＬＩＳＡを用いてアッセイし、総Ａβレベルを慣用法にしたがいウェスタン・ブロット分析により試験する。
【００９３】
ＳＥＡＰアッセイ
細胞培養中でＡβペプチドを測定する一つの可能性のある注意点は、遺伝子の過剰発現がより多くのＡβ放出の原因となる分泌の全体的増加をもたらす可能性があることである。分泌におけるこれらの非特異的影響を制御するために、ＳＥＡＰ(Great EscAPe SEAP kit, Clontech Cat#PT3057-2)アッセイを使用して、トランスフェクトした細胞の総分泌を測定する。製造者の指示にしたがい、細胞を目的の各ｃＤＮＡで、ＳＥＡＰ(１００ng／ウェル)と共にトランスフェクトする。４８時間インキュベーション後、１００μlのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、続いて、１００μlの化学発光基質およびサンプルを１０分インキュベートする。アルカリホスファターゼ酵素のコントロール曲線を、アッセイの検出の直線範囲を決定するために１１倍希釈にわたり測定する。プレートをLUMINOSKAN ASCENT(Thermo Labsystems)照度計で、５００ms積分時間を使用して読む。
【００９４】
ＥＬＩＳＡ抗体
市販のＡβペプチドのＮＨ２末端に対するマウスモノクローナル抗体を、予めコートした９６ウェルプレート(Ａβ４０に関してはBiosource Cat#KBH3481/PPO81およびＡβ４２に関してはCat#KBH3441/PPO81)における捕獲抗体として使用する。ポリクローナル検出抗体をBiosource(anti-hAβ40 Cat#44-348およびanti-hAβ42 Cat#44-344)から得、１５mMナトリウムアジド中で１／２２０に希釈する。二次抗体(Ａβ４０に関してはBiosource Cat#KBH3481およびＡβ４２に関してはCat#KBH3441)は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識抗−ウサギＩｇＧである。二次抗体を、３.３mM  チモール中、１／１００に希釈する。
【００９５】
間接的２サンドイッチＥＬＩＳＡ
抗体−コーティングしたプレートを、使用前にマイクロプレート洗浄機(Bioteck Instruments, Inc, Winooski, VT)で、ＰＢＳ−ＴＥ(１mM  ＥＤＴＡおよび０.０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、洗浄緩衝液)で４回洗浄する。１００μlのトランスフェクトした細胞の条件培地を取り、１mM  ＡＥＢＳＦ(Biosource, Camarillo, CA)を含むサンプル希釈剤で１：２に希釈する。１００μlのこの混合物を洗浄した、抗体コートした９６ウェルプレートに添加し、テープで覆い、４℃で一晩インキュベートする。サンプルを取り、プレートを洗浄緩衝液で４回洗浄する。検出抗体溶液を、１００μl／ウェルで添加し、プレートを室温で２時間、振盪しながらインキュベートする。プレートを再び洗浄緩衝液で４回洗浄し、二次抗体溶液を１００μl／ウェルで添加し、２時間、振盪しながらインキュベートする。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ペーパータオル上に軽くたたきつけて乾かす。１００μlの安定化クロモゲン(テトラメチルベンジジン)を各ウェルに添加し、プレートを３０分、暗所でインキュベートする。１００μlの停止溶液(１Ｎ  Ｈ２Ｓ)をプレートに添加して反応を停止させる。プレートをマイクロプレートリーダーで４５０nM(Molecular Devices)で１時間読む。
【００９６】
ロボット化プロトコール
全てのトランスフェクションおよびＥＬＩＳＡを、Beckman Coulter Biomek FXロボット上で行う。プロトコールは、Visual Basic(Microsoft, Redmond, WA)で書き、Biomek FX 2.1aソフトウェアで作動させる。基本的なトランスフェクション法は、２回のピペッティング段階を含む。最初に、１５μlの９６ウェルの再配置したｃＤＮＡプレートを、１１μlの無血清培地(ＤＭＥＭ)、完全長ＡＰＰ、およびFUGENE 6を含む新たな９６ウェルプレートに移す。２番目に、FUGENE混合物を２０分、室温でインキュベートした後、全混合物(２５μl)を７５μl細胞溶液に移す。プレートを次いで２４時間、３７℃でインキュベートする。
【００９７】
ノーザン・ブロット分析
シクロフィリンＦ  ｃＤＮＡ(市販品)を、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ  Ｉで３時間、３７℃で二箇所消化する。消化物を、１×ＴＡＥゲル(BioRad Cat#161-3044)上で分離し、断片を慣用法にしたがい剃刀で削り取る。ｃＤＮＡを、スピンカラム(Sigma Cat#S-6501, St. Louis, MO)を使用してゲル断片から抽出する。ｃＤＮＡを新鮮な(＜２週間)Ｐ３２(Amersham Cat# REDIV/03, Piscataway, NJ)で、REDIPRIME IIキット(Amersham Cat #RPN1634)を使用し、製造者の指示にしたがい標識する。
【００９８】
脳の８つの異なる部位(小脳、大脳皮質、髄質、脊髄、後頭極、前頭葉、側頭葉、および被殻)を含む脳特異的標準化多組織ノーザン・ブロット(MTN, Clontech Cat#7755-1, Palo Alto, CA)を、Ｐ３２標識シクロフィリンＦ  ｃＤＮＡでプローブする。全てのインキュベーションおよび洗浄段階は、ＭＴＮ使用説明書にしたがう。ブロットをＸ線フィルム(Amersham Cat# RPN 3114k)に−７０℃で２４、４８および２時間暴露し、その後発色させる。ブロットを製造者の指示にしたがい切片にして、サランラップ中で−２０℃で貯蔵する。
【００９９】
さらに、ヒト多組織発現アレイ(MTE, Clontech Cat#7776-1 Palo Alto, CA)もＰ３２標識シクロフィリンＦ  ｃＤＮＡでプローブする。このアレイは、脳の２０の異なる領域を含む、７３組織を含む。ブロットを、製造者の指示にしたがいプローブし、洗浄し、切片にする。
【０１００】
プラスミド
ＡＰＰ野生型およびＡＰＰスウェーディッシュ変異体のｃＤＮＡを、先に記載のように、ｐＲＫプラスミド発現ベクターに、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に挿入する(Promega, Madison, WI)(Bodendorf, U., Fischer, F., Bodian, D., Multhaup, G., Paganetti, P. 2001 J. Biol. Chem. 276: 12019 12023)。
【０１０１】
完全長ＢＡＣＥ  ｃＤＮＡは、以前ヒト脳ライブラリーから単離され、ｐＲＫ発現ベクターにクローン化されている(Fischer, F., Paganetti, P. Brain Res. 1996. 716: 91-100)。Ｃ９９過剰発現構築物を慣用法にしたがい作った(Invitrogen PAN neuronal library)。
【０１０２】
ウェスタン・ブロット抗体
“ヒット”のＥＬＩＳＡ表現型を確認するために、各ヒット由来の１０μlの上清を１８％Tris−ＨＣｌクライテリオン・ゲル(BioRad, Hercules, CA)上で流し、半乾燥装置(BioRad)を使用してＰＶＤＦ膜(Millipore Immobilon P cat#1PVH0010, Bedford, MA)上に移し、膜を６Ｅ１０抗体(Signet, Dedham, MA)の１／２０００希釈およびＨＲＰ(Pierce, Rockford, IL)に結合した抗−マウスＩｇＧの１／２０００希釈でプローブする。完全長ＡＰＰの検出を、ローディングコントロールとして使用する。
【０１０３】
慣用法を使用して、ウサギポリクローナル抗血清８１８を、β−セクレターゼであるＢＡＣＥ５０１のペプチド４８４−５０１に対して惹起させる。抗血清８１８を、対応する共有結合ペプチドを有する市販の試薬を使用して精製する(Bodendorf, U., Fischer, F., Bodian, D., Multhaup, G., Paganetti, P. 2001 J. Biol. Chem. 276: 12019 12023)。全ての抗血清は、ＢＡＣＥ５０１に対して等しく十分に反応する。モノクローナル抗体β１を以前に記載のように惹起し(Fischer, F., Paganetti, P. Brain Res. 1996. 716: 91-100.))、そしてＡβのＮ−末端(残基１−１６)と反応させる。マウスモノクローナル抗体６Ｅ１０をSignet, Dedham, MAから得、Ａβのアミノ末端における１から１６残基の間に位置するエピトープと反応させる。ＡＰＰＣ８抗体を、ＡＰＰのＣ−末端(アミノ酸６７６−６９５)に対して惹起し、それはＡＰＰおよびそのＣ−末端フラグメントの全てを認識する(Fischer, F., Paganetti, P. Brain Res. 1996. 716: 91-100.)。野生型ｓＡＰＰβ(抗血清８７９)のカルボキシ−末端に特異的なネオペプチド・ウサギ抗血清を、合成ペプチド(Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ)に対して惹起する(Bodendord, U., et al. 2002. J Neurochem. 80(5): 799-806)。
【０１０４】
細胞抽出法およびウェスタン・ブロット分析
培養したＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクション後２４時間または４８時間に、プロテアーゼ阻害剤(Complete(登録商標)Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)を含むＲＩＰＡ緩衝液(１０mM  Tris、ｐＨ  ７.５、１５０mM  塩化ナトリウム、１mM  ＥＤＴＡ、１％Nonidet P-40、０.５％ナトリウム−デオキシコレート、１％ＳＤＳ)中、抽出し、４℃で１０分、１０,０００×ｇで遠心する。上清を回収し、ペレットを廃棄する。続いて、細胞抽出物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ(登録商標)膜(Millipore, Bedford, MA)に移し、一次抗体でプローブする。上清を１６％Tricineゲル(Invitrogen Novex, Carlsbad, CA)上でも分離し、代謝物ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを試験する。慣用法を使用して、細胞抽出物をまた１６％Tricineゲル(Invitrogen Novex, Carlsbad, CA)上で分離し、カルボキシ−末端代謝物Ｃ９９、Ｃ８９、Ｃ８３、ＡＰＰ、およびＢＡＣＥを試験する。Ａβを、細胞上清中で、１８％Tris−Tricineゲル(BioRad Criterion, Hercules, CA)上、慣用法にしたがい検出する。膜を５％(ｗ／ｖ)低脂肪乳粉末のリン酸緩衝化生理食塩水、０.０５％Ｔｗｅｅｎ−２０(ＰＢＳＴ)の溶液でブロックし、一晩４℃で一次抗体希釈剤と共にインキュベートする。結合抗体を、ＰＢＳＴで希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼに接合したヤギ抗−マウスまたは抗−ウサギＩｇＧ(Chemicon, Temecula, CA)で検出する。免疫学的検出をＥＣＬ検出系(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)で、先に記載のように行う(Manni, M., et al., 1998. FEBS. 427: 367-370)。
【０１０５】
［実施例１］
染色体１０ｑスクリーニング
我々の分析における第一段階は、最も可能性のあるＡＤ標的を表すクローンの二つの再配置したセットを定義することであった。約２０,７２０遺伝子の最初の私有のコレクションから、２,２６８再配置を、ＣＧＵＦ、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、およびアポトーシス関連遺伝子を富ませることにより産生した。ＣＧＵＦのものは、表現型の詳細な生化学的および分子学的分析を行うことができるモデル微生物に対してホモロジーを有する、遺伝子の同定において重要である。キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、アポトーシス関連遺伝子、およびその他は、それらが推定薬剤標的であるために、選択した。この原理に基づき、Ａβ分泌を修飾するこの再配置由来の遺伝子は、化合物ライブラリーに対して直接スクリーニングできるようである。
【０１０６】
機能的／薬物使用(druggable)再配置と対照的に、我々はまた染色体１０ｑにみられるＬＯＡＤに位置することが知られている全ての可能性のあるクローンを単離することを望んだ(Taner, N.E., et al. 2000. Science. 290: 2303-2304. Bertram, L., et al., Science. 2000. 290: 2302-2303. Myers, A. et al., Science. 2000. 290: 23042305.)。第一に、染色体１０の連鎖解析に使用したマーカーと隣接したＳＴＳマーカーを、Blastn配列により配列決定されたCeleraゲノムに位置づけた。この地図を、“ホットスポット”である染色体１０の長腕のみを含むと定義した。この領域由来のＤＮＡおよびタンパク質配列セットの両方を、各々慣用のtBlastnおよびBlastp検索を使用して我々の私有のクローンコレクションと比較した。基準を満たす全てのクローンを、データベースに編集し４７９クローンの小サブセットに再配置した。
【０１０７】
この領域中の４７９クローンをさらに特徴付けするために、これらの遺伝子の機能的アノテーション分析を、“重複クラスター”アプローチを使用し、異なるデータベースにアクセスし、各プログラムの情報を重複させる３つの異なる配列分析プログラムを採用することにより行った。この方法で、最も完全かつ正確なアノテーションが素早く達成される。我々は、最初にInterProScanプログラムを実行し、InterProデータベース(HMMPfam, HMMTigr, HMMSmart, BlastProDom, FingerPRINTScan, & ProfileScan)中のドメインに対するタンパク質のホモロジーを試験した。次に、我々はInterProの結果を私有のCeleraデータベース由来の予めアノテーションしたタンパク質と重ねた。最後に、我々は、これらの二つの分析を、非冗長公開データベースに対するBlastp検索と比較した。この実験から、我々は、６２５遺伝子、すなわち、１０ｑ領域の１１０１の予定された転写物の５６.８％を機能的にアノテーションできた。１１０１の可能性のある転写物のうち４７９完全長クローンのみが試験に利用可能である。４７９のうち、３５４を完全にアノテーションしたが(７４％)、残りは未知の機能である(データは示していない)。
【０１０８】
我々は、染色体１０ｑからの４７９遺伝子セットを、最初にＡＤに対する連鎖解析に基づきスクリーニングした。FUGENE 6(Roche Biochemicals, Indianapolis, IN)トランスフェクション試薬を使用して、対数相ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、〜２００ngの各ｃＤＮＡと共に９６ウェルプレートにトランスフェクトする。我々は、すでに２４時間が、ＥＬＩＳＡによるＡβレベルの測定に最適な時点であることを決定していた(データは示していない)。簡単に言うと、ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、製造者のプロトコールを使用してトランスフェクトし、Ａβレベルを経時的に上清から測定した；２４時間、４８時間、および７２時間。検出の直線範囲は、２４時間であることが判明した。トランスフェクション２４時間後、我々は細胞から上清を回収し、その媒体を抗体でコートしたＥＬＩＳＡプレートに撒いた。ＢＡＣＥ酵素のトランスフェクションをポジティブコントロールとして使用し、ベクター単独をネガティブコントロールとして使用する。Ａβ４０およびＡβ４２に関するＥＬＩＳＡ読出しを繰り返し、Ａβ４０および４２レベルがＢＡＣＥトランスフェクト細胞よりも各々４倍および２倍高いことが示唆された。我々は、変異状態よりむしろ野生型状態におけるこれらの遺伝子を観察することを望んでいたため、ＡＰＰｓｗｅ変異体よりむしろＡＰＰｗｔを使用した。我々は、ＡβをＡＰＰｗｔにおいて増加させる遺伝子が、家族性疾患症例の小集団でのみ現れるＡＰＰｓｗｅよりもＡＤの発症に病理学的に関連していると予測する。
【０１０９】
Ａβ４０スクリーニングは、Ａβ４０レベルの上昇をもたらす単一遺伝子をもたらしたが(ヒット率０.００２１％)、Ａβ４２分泌に影響する遺伝子はもたらさなかった。この影響を続くＥＬＩＳＡアッセイで繰り返し、この影響が再現性があることを示唆した。このクローンを配列決定し、シクロフィリンＦ遺伝子であることが確認された。シクロフィリンＦは、ペプチジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ(PPIase)のシクロフィリン(イムノフィリンのクラス)遺伝子ファミリーであり、PPIaseは薬剤シクロスポリンＡ(ＣｓＡ)を結合することが既知である(Schreiber, S.L. (1991). Science. 251: 283. Bergsma, D. et al. (1991)J. Biol. Chem. 266: 23204-23214.)。ＣｓＡへの結合以外に、これらのタンパク質は、タンパク質折りたたみおよび／または細胞内タンパク質輸送に関与すると考えられている。ＣｓＡは、移植中の移植片対宿主病を予防するために使用されている免疫抑制剤である(Schreiber, S.L. and Crabtree, G.R. (1992). Immunol. Today. 13: 136.)。ＣｓＡはその細胞内標的であるシクロフィリンＡ(ＣＰＡ)(およびおそらく他のイムノフィリン)と結合し、それが細胞内シグナル伝達に関与するエフェクター分子を阻害する(Schreiber, S.L. and Crabtree, G.R. (1992). Immunol. Today. 13: 136.)。ＣｓＡ／ＣｐＡ複合体は、セリン−スレオニンホスファターゼカルシニューリンと選択的に結合し、阻害し、初期Ｔ細胞特異的遺伝子の転写を遮断する。この阻害がＴ細胞活性化の遮断およびＩＬ−２のような増殖因子の産生をもたらす。
【０１１０】
シクロフィリンＦの可能性のある機能を評価するために、我々は、ＣｐＡ、Ｂ、Ｃ、およびＦの一次アミノ酸配列をアラインした(データは示していない)。アラインメントから、シクロフィリンＦがこのイムノフィリンファミリーであることが明らかである。ＣｓＡ(結晶構造に基づく)と結合することが既知の残基は、これらのタンパク質で１００％保存されている。これにより、ＣｐＦが、PPIaseおよびＣｓＡ結合タンパク質に含まれる。
【０１１１】
シクロフィリンＦは、その染色体１０ｑにおける物理的位置のために、我々のスクリーニングで発見された。我々は、１０ｑにおけるホットスポット座位に対する正確な位置を位置づけた。それは、動原体のすぐ遠位で、マーカーＤ１０Ｓ１２２０およびＤ１０５１６７０の間の最高ピークの右側に位置した(データは示していない)。
【０１１２】
［実施例３］
シクロフィリンＦ確認
ウェスタン・ブロットアッセイを使用し、ＥＬＩＳＡでのシクロフィリンＦの結果を確認した。ＣＨＯ  Ｋ１細胞を、Ａβレベルに影響する遺伝子の用量を測定するために、一連のシクロフィリンＦ濃度でトランスフェクトした。シクロフィリンＦがＣＭＶプロモーター(Invitrogen, Gateway(登録商標), Carlsbad, CA)から過発現されるため、トランスフェクション中のより多いＤＮＡがインビボでより大きな発現をもたらすと仮定できる。我々の結果は、シクロフィリンＦの遺伝子用量と、細胞外Ａβのレベルの間に直接的相関関係が存在することを示唆する(データは示していない)。これは、より多くのシクロフィリンＦが発現されると、より多くのＡβが分泌されることを示唆するため、非常に興味深い発見である。
【０１１３】
脳の２０の異なる領域を含む脳特異的多組織ノーザンブロット(ＭＴＮ)のブロット(Clontech, Palo Alto, CA))およびＭＴＥブロット(Clontech)を、この臓器におけるシクロフィリンＦ発現を試験するために使用した。この分析の結果は、シクロフィリンＦが、脳内で、より具体的に、小脳、髄質および脊髄で発現されることを示唆する(シクロフィリンＦの予測される転写物は〜０.６２４kbである)(データは示していない)。より少ない程度で、大脳皮質、側頭葉、および被殻(基底核)におけるシクロフィリンＦ発現が、より長い暴露において存在する。より長いｍＲＮＡ種が、３.５kbで検出されるようである。これは、おそらくスプライス変異体または、シクロフィリンＦと相同性を有する他のシクロフィリンメッセージであろう。
【０１１４】
ＭＴＥブロットも、体中ならびにＭＴＮブロットで示されていない脳の領域のどこでシクロフィリンＦが発現されているかを決定するために試験した。７２時間暴露からのデータは、シクロフィリンＦが側頭葉、小脳、被殻および脊髄で発現することを示す(データは示していない)。ＭＴＮブロットで示されていないいくつかの別の組織：中心傍回、橋、脳梁、扁桃、尾状核、海馬、および視床もシクロフィリンＦ  ｍＲＮＡを含むことが判明した。脳ではないが、全ブロットで最高の発現をすると考えられた組織は、甲状腺であった。これらの結果は、シクロフィリンＦが、ＡＤにより影響を受けることが知られている脳の領域：側頭葉、海馬、および扁桃で発現されることを示唆するため、興味をそそる(Citron, M., Diehl, T.S., Capell, A., Haass, C., Teplow, D.B., Selkoe, D. Neuron. 1996. 17: 171-179.)。脳のこれらの領域におけるシクロフィリンＦの過剰発現が、増加したＡβレベルによるＡＤの誘発に何らかの方法で関与している可能性は、十分にある。シクロフィリンＧがこれらの領域で過剰発現されるならば、アミロイドプラーク形成の増加をもたらすＡβ産生が増加することはありそうである。
【０１１５】
［実施例４］
２２６８機能的遺伝子スクリーニング
２２６８遺伝子スクリーニングを、内部トランスフェクションコントロールをデータの標準化に使用する点で、４７９の１０ｑスクリーニングとわずかに異なる方法で行う。１０ｑスクリーニングにおいて、結果は生データとして提供するが、そのため、細胞死および発現レベルは、技術的に不可能なため制御されていない。しかし、より大規模なスクリーニングにおいて、より多くのデータ点が、正常に分散したデータを作るためのトランスフェクション効率を制御することを必要とする。ＥＬＩＳＡ実験は細胞の上清のみを使用するため、細胞をルシフェラーゼ値の読み取りに使用し、ルシフェラーゼシグナルに基づくトランスフェクション効率の決定をする。ルシフェラーゼプラスミドは元々のトランスフェクション混合物に包含され、トランスフェクション２４時間後に読み取る。Ａβ４０およびＡβ４２  ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を、ＥＬＩＳＡ光単位／ルシフェラーゼ光単位の比率として解釈し、高いシグナルは、より大きなＥＬＩＳＡシグナル／ルシフェラーゼシグナル比率を示し、Ａβ４０またはＡβ４２のインデューサーとして解釈する。
【０１１６】
Ａβ４０およびＡβ４２  ＥＬＩＳＡスクリーニングの結果を分析用の私有のデータベースに挿入する；そうすることで、結果を質問でき、多様な形式で提示できる。表２は、Ａβ４０およびＡβ４２アッセイにおいて５倍以上増加した遺伝子を示す。表を一目見て、残りから突出する遺伝子の特異的なタイプはない。まるで、遺伝子の多くのタイプが、ベクターコントロールと比較してＡβ４０およびＡβ４２分泌を増加できるようである。
【０１１７】
Ａβ４２レベルに影響することなくＡβ４０分泌を特異的に１.５倍以上増加させる遺伝子を表３に示す。この遺伝子のセットをルシフェラーゼコントロールに対して標準化せず、“生”データと名付けた。これらの遺伝子のいずれも標準化した遺伝子のセットと重複しなかった。我々は、全ての可能性のあるＡβ修飾因子を、修飾因子がどのようにして発見されたかにかかわらず、追跡することが重要であるため、“生”データヒットを追跡した。
【０１１８】
二つの遺伝子のみがＡβ４２レベルを“生”データセットで特異的に増加することが判明した(表４参照)。これらの遺伝子も標準化データセットには見られなかった。したがって我々は、Ａβ４０およびＡβ４２  ＥＬＩＳＡからトップの１４ヒットを選択し、追跡確認実験を行った。このスクリーニングからの全ての遺伝子は、Ａβ４０またはＡβ４２分泌に作用するという独特な性質のため、興味深いＡＤ標的であるようである。
【０１１９】
各スクリーニングからの生データ分析し、標準化データセットと比較する。この内部比較により、Ａβ修飾因子を発見するためのこのスクリーニングアプローチの正当性を決定する。生データと標準化データセットの間にわずかな重複しかないため、我々は追跡アッセイを、生データのみを読み取るよりも標準化データが良いアプローチであるか否かを経験的に決定するために使用できる。このように、我々の前のＥＬＩＳＡスクリーニングを、クローン回復および確認で追跡し、元の“ヒット”が本当であることを確認する。
【０１２０】
［実施例５］
クローン回復および確認
これらのアッセイからのトップの１７ヒットをその各々の“母プレート”から選択し、新たにＤＮＡ単離する。各クローンを５'配列決定し、アノテーションは、配列結果にしたがい確認または変化した。続いて、各クローンを形質転換し、ＥＬＩＳＡ実験を、Ａβ４０およびＡβ４２の両方について繰り返した。これらの結果を表１０に要約する。試験した１７ヒット中３つのみが繰り返されなかったが(１８％)、他の１４遺伝子はそれらの活性が確認された。
【０１２１】
Ａβレベルにおけるヒットの影響を確認するために、ウェスタン・ブロットを行う。試験した１４遺伝子において、全てＡβレベルの増加における影響が確認された(データは示していない)。この結果はＥＬＩＳＡ結果を確認し、これらのヒットが、Ａβ分泌を増加できるため、ＡＰＰ経路における新しい候補遺伝子であるという最初の証拠を提供する。
【０１２２】
この点で、ＡＰＰ代謝実験のために、ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＨＯ  Ｋ１細胞の代わりに使用する(ＡＰＰ開裂産物のウェスタン・ブロット)。ＣＨＯ  Ｋ１細胞が、内因性Ａβの低いレベルのためにＥＬＩＳＡスクリーニングに使用するために良い細胞系であるため、ＨＥＫ２９３細胞における内因性ＡＰＰプロセッシング活性は相当高く、これらの細胞におけるＡＰＰ開裂産物の測定に簡便である。Ａβの測定に加えて、ウェスタン・ブロットをまたＡＰＰ、ＡＰＰ代謝産物Ｃ９９、Ｃ８９、Ｃ８３、ｓＡＰＰα、およびｓＡＰＰβの試験に使用する(データは示していない)。ＥＬＩＳＡにおいて見られるＡβレベルの増加がＢＡＣＥ活性の増加のためであるようであるため、開裂産物における変化をアッセイした。ＢＡＣＥ開裂の下流生成物の測定を、活性の変化の試験に使用できる。ｓＡＰＰαフラグメントをまた測定して、ヒットがα−セクレターゼ活性に影響を有するかどうかを決定した。
【０１２３】
ＡＰＰおよびＣＴＦ(Ｃ９９、Ｃ８９およびＣ８３)レベルにおける数個の“ヒット”の効果を試験した。ＡＰＰＣ８抗体を使用して、我々は同じゲル上でＡＰＰおよびＣＴＦｓを検出できた。ＲＩＰＡ細胞抽出物を１６％Tricineゲルに流し、分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、ＡＰＰＣ８でプローブした。ＢＡＣＥとＡＰＰｗｔおよびＡＰＰｓｗｅのコトランスフェクションはこのアッセイでポジティブコントロールとして働いた。ＢＡＣＥ過剰発現は、ＡＰＰｗｔおよびＡＰＰｓｗｅ基質での総ＡＰＰレベルの減少をもたらした。さらに、ベクターでトランスフェクトしたまたはＡＰＰでトランスフェクトした細胞コントロールと比較して、Ｃ８３フラグメントのレベルは減少したが、Ｃ８９およびＣ９９フラグメントのレベルは増加した。トランスフェクトしたＨＥＫ細胞は、細胞単独よりも約５倍多いＡＰＰおよびＡＰＰ開裂産物を産生した(データは示していない)。これは、ＡＰＰプラスミド過剰発現の典型である。
【０１２４】
ＡＰＰおよびＣＴＦ代謝を変えると思われる数個のヒット：カルボキシペプチダーゼＺ(ＣＰＺ)、プロテアーゼＥ、ＣＰＢＰ、ＴＯＢ３(８Ｉ２１)および未知(１０Ｍ１３)があり、ＡＰＰｗｔとコトランスフェクトした場合、全てＡＰＰおよび総ＣＴＦレベルを低下させる。ＴＯＢ３、カルモジュリン２、カルボキシペプチダーゼＺ、シクロフィリンＦ、およびＴＮＦＲアミノペプチダーゼ(８Ｃ８)は、ＡＰＰｓｗｅとコトランスフェクトした場合、ＡＰＰおよびＣＴＦレベルの両方を低下させる。遺伝子ＣＴＲＢ１、ＡＮＧ２およびＴＮＦＲは、ＡＰＰｗｔとコトランスフェクトした場合、ＡＰＰまたはＣＴＦレベルに影響しない。この広範囲の効果にもかかわらず、ＡＰＰおよびＣＴＦレベルのモジュレーションは、これらの遺伝子の過剰発現が、Ａβ分泌を増加させるＡＰＰの開裂に直接影響することを明らかに示す。
【０１２５】
ｓＡＰＰαプロセッシングもＡＰＰｗｔまたはＡＰＰｓｗｅとｃＤＮＡのコトランスフェクション、続く上清のウェスタン・ブロットにより調べた。データは、ＢＡＣＥをトランスフェクトした細胞において、ｓＡＰＰαレベルはＡＰＰｗｔサンプルで非常に低く、ＡＰＰｓｗｅサンプルでは存在しないことを示唆する。これは、ＢＡＣＥの過剰発現がＡＰＰ基質をα−セクレターゼ酵素から奪い取るであろうためと、予測される。ＨＥＫ２９３細胞単独中のｓＡＰＰαのレベルは検出限界以下であったが、ベクター／ＡＰＰで形質転換した細胞は、かなりのレベルのｓＡＰＰαを示す(データは示していない)。これは、内因性α−セクレターゼが過剰発現したＡＰＰの存在下で活性であることを示唆する。ＡＰＰｗｔ条件下、カルボキシペプチダーゼＺ(ＣＰＺ)のみがｓＡＰＰαレベルをベクターコントロールと比較して減少させる。ＡＰＰｓｗｅとコトランスフェクトした場合、トリプターゼ・ベータ(１０Ｍ１１)、ＴＯＢ３(８Ｉ２１)、カルボキシペプチダーゼＺ(ＣＰＺ)、カルモジュリン２(Ｃａｌ２)、シクロフィリンＦおよびＴＮＦＲアミノペプチダーゼ(８Ｃ８)が、ｓＡＰＰαをＢＡＣＥトランスフェクションと同程度まで減少させる。これらの結果は、ヒットが、Ａβ分泌を増加させ、ｓＡＰＰα分泌を減少させることによりＢＡＣＥ様活性を模倣できることを示唆する。これは、遺伝子がＡＰＰのアミロイド生成性β−部位開裂を刺激でき、非アミロイド生成性α−部位開裂を減少できることを示唆する。
【０１２６】
ウェスタン・ブロットの結果の我々のコレクションは、ヒットがＢＡＣＥおよび／または活性の増加を介して、ＡＰＰの開裂に特異的に影響することを示唆する。したがって、我々は、ヒットに対してＡＰＰｗｔ基質よりむしろＣ９９基質を提供することを決めた。この方法で、我々は、Ｃ９９のＡβ４０および／またはＡβ４２への開裂を直接アッセイし、このヒットがＧＡＣＥ活性を特異的に増加させるか否か決定した。ＥＬＩＳＡヒットで１：３比率でコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＣ９９の２４時間一過性トランスフェクションからのデータは、Ｃ９９がヒットにより処理され、Ｃ９９のレベルの変化がもたらされることを示唆する。トリプターゼ・ベータ、ＴＯＢ３、プロテアーゼＥ、ＣＰＢＰ、ＢＭＰ、ＡＮＧ２、ＴＮＦＲ、ＣＴＲＢ１、およびＴＬＬ２クローンは、Ｃ９９レベルをＣ９９コントロールと比較して低下させた。加えて、上清をＡβ４０ＥＬＩＳＡでアッセイした。ウェスタン・ブロットで示されたＣ９９フラグメントの増加したプロセッシングと一致して、Ａβ４０レベルは、アミノヒドロラーゼおよびＣＰＢＰ遺伝子以外の全てのヒットで増加する。これらの結果は、ヒットがＣ９９のＡβへの開裂を刺激でき、これらのヒットが直接γ−セクレターゼ活性または新規なγ−セクレターゼ活性それ自体に影響することを証明する。
【国際調査報告】
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