(57)【要約】本発明は、食用組成物へのホエータンパク質加水分解物の使用であって、前記ホエータンパク質加水分解物が、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発することができ、および/または標的とする組織におけるグルコース取込みを増大させ、前記ホエータンパク質加水分解物が、血糖値を調節し、または、精神機能の低下を改善もしくは予防し、および/または気力を持続させ、および/または前記組成物を摂取している対象者(物)の食後期間中の充足感を維持もしくは提供することをもたらすかまたはそのために前記ホエータンパク質加水分解物を使用することを特徴とする、ホエータンパク質加水分解物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用組成物へのホエータンパク質加水分解物の使用であって、前記ホエータンパク質加水分解物が、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発することができ、および/または標的とする組織におけるグルコース取込みを増大させ、
前記ホエータンパク質加水分解物が、血糖値を調節し、または、精神機能の低下を改善もしくは予防し、および/または気力を持続させ、および/または前記組成物を摂取している対象者(物)の食後期間中の充足感を維持もしくは提供することをもたらすかまたはそのために前記ホエータンパク質加水分解物が使用されることを特徴とする、ホエータンパク質加水分解物の使用。
【請求項２】
前記ホエータンパク質加水分解物が、β−ラクトグロブリン加水分解物、α−ラクトアルブミン加水分解物、またはこれらの混合物を含む、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記ホエータンパク質加水分解物が1〜20%の範囲の加水分解度を有する、請求項1または2に記載の使用。
【請求項４】
前記ホエータンパク質加水分解物を、前記組成物重量の0.1重量%〜80重量%、好ましくは1〜30重量%の合計量で使用する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記食用組成物が、代替食製品、または代替食ダイエットプランの一部として使用される製品である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記の代替食製品、または代替食ダイエットプランの一部として使用される製品が、調製済み液体、可溶性粉末製品から生成される液体、スープ、デザート、バー、シリアル製品、パスタ製品、麺製品、または可溶性粉末製品である、請求項5に記載の使用。
【請求項７】
前記食用組成物を食事プランまたは体重管理プログラムの一部として使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
血糖値を調節し、精神機能の低下を改善もしくは予防し、気力を持続させ、または食事後期間中の充足感を維持もしくは提供する方法であって、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発し、および/または標的とする組織でのグルコース取込みを増大させることのできる、有効量のホエータンパク質加水分解物を食用組成物によって対象者(物)に経口投与するステップを含む方法。
【請求項９】
前記ホエータンパク質加水分解物を食用組成物によって投与する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記食用組成物が、前記組成物重量の0.1重量%〜80重量%、好ましくは1〜30重量%の前記ホエータンパク質加水分解物合計量を含む、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホエータンパク質加水分解物が、β−ラクトグロブリン加水分解物、α−ラクトアルブミン加水分解物、またはこれらの混合物を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記食用組成物が、酪農製品、大豆製品、パンおよび穀物製品、ケーキ、ビスケット、スプレッド、水中油型エマルション、アイスクリーム、デザート、スープ、濃縮粉末スープ、ソース、濃縮粉末ソース、飲料、スポーツ飲料、健康バー、フルーツジュース、菓子、スナック食品、調理済み料理製品、パック詰め料理製品、および乾燥料理製品から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用または方法。
【請求項１３】
前記組成物が、代替食製品、または代替食ダイエットプランの一部として使用される製品である、請求項12に記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続したエネルギーレベルまたは持続したエネルギー放出を特にもたらすため、ヒトまたは動物の血糖値を調節するための食用組成物の調製における特定のホエータンパク質加水分解物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖値の調節は、糖尿病患者、ならびに患者以外の者にとって重要である。
【０００３】
血中のグルコース濃度は、食物が摂取されてから経過した時間と共に変化し、血糖値のそうした変化が、対象の感じ方に著しい影響を及ぼすことはよく知られている。血糖が正常な空腹時レベルと比べて上昇している場合、対象者は、より気力や活力を感じることができる。しかし、血糖値が空腹時レベルより下に低下している場合、対象者は、より苛立ちや疲れを感じやすく、一般に気力が低下し、および/または精神的に過敏になり、一般に、より生産的でなくなる。この血糖値の低下を低血糖であるという。
【０００４】
したがって、血糖値を常に比較的一定に保つことができ、または少なくとも、それが急激かつ顕著に変化しないならば、対象者にとって有益である。これを、当分野では血糖コントロールの維持ともいう。健康的な食事をとっている正常な対象者では、インスリンが血糖値を正確に調節する。しかし、座ってばかりの生活様式、体重増加、および/または食事要因は、血糖コントロールを乱しかねない。高炭水化物食は、急激なグルコースピークを引き起こしうる。
【０００５】
血糖指数(GI)は、利用可能な炭水化物の量が同じである炭水化物含有食品を分類するための生理学的基準の1つである。血糖指数は、試験食品の50gの炭水化物部分相当の血糖応答曲線の下の面積の増大を、同じ対象者が摂取した標準食品由来の同量の炭水化物に対する応答に対する百分率で示したものであると定義される(1997年のFAO/WHO Expert Consultationによる定義付け)。
【０００６】
GIの値が高いほど、現在のところ、一般に、その炭水化物は血糖値のコントロールに関して「健康的」でないと考えられる。多くの食品は、GI値が高く、そのためグルコースを血中に急速に、かつ概ね顕著に出現させる。食品のGI値は、炭水化物の種類および量によって決まり、一般に加工または精製によって増大する。
【０００７】
たとえば、Current Pharmaceutical Design、2001年、第7巻、1399〜1412ページに発表されているD.Druckerの「The development of glucagonlike-peptide-1 pharmaceuticals as therapeutic agents for the treatment of diabetes」、およびJ Clin Endocrinol Metab、2001年8月、第86巻(8):3853ページに発表されているToft-Nielsenらの「Determinants of the effectiveness of glucagon-like-peptide-1 in type 2 diabetes」によれば、栄養素が摂取された後、腸の内分泌細胞からGLP-1が放出されること、およびGLP-1の外部からの投与によって、正常な対象者および2型糖尿病患者の血糖が低下することが知られている。
【０００８】
The Lancet、第359巻、3月9日、2002年に発表されているZanderらの「Effect of 6-week course of glucagon-like-peptide-1 on glycaemic control, insulin sensitivity and β-cell function in type 2 diabetes」では、そうした患者のGLP-1分泌レベルは正常よりも低いので、GLP-1を患者に直接に投与すると、2型糖尿病を治療できることが報告されている。
【０００９】
WO 01/37850は、糖尿病の治療に使用することのできるグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)の放出を誘発する、カゼイン-グリコマクロペプチドを高濃度にした、部分的に精製した非ホエー乳タンパク質加水分解物を含む組成物を開示している。WO 01/37850では、遠位の回腸および結腸で見られるL細胞によって合成されるプログルカゴンが、翻訳後プロセッシングを受けて、強力なインスリン分泌促進物質であるグルカゴン様ペプチド-I(GLP-1)を含むペプチドになることが知られていることも開示されている。GLP-Iは、グルコースによって誘発されるインスリン分泌を増強することに加え、プロインスリン遺伝子の発現およびプロインスリンの生合成を促進することが知られている。
【００１０】
GLP-1の他の作用には、グルカゴンの分泌および胃の(排出)運動性の抑制が含まれる。GLP-1は、脳のGLP-1R受容体に結合して、満腹感を助長し、食品摂取を抑制することができる。インスリン感受性を増大させることは、2型糖尿病の治療における重要な目標であり、GLP-1の内因性放出の刺激は、静脈内投与に代わる、可能性ある代替手段である。
【００１１】
米国特許第6,207,638号および米国特許公開2002/0019334号は、CCKの放出を刺激する栄養組成物を開示している。この組成物は、a)カゼイン、ホエー、およびダイズから選択されたタンパク質、b)グリコマクロペプチド、c)長鎖脂肪酸、およびd)可溶性および不溶性の繊維（ファイバー）を含む。ホエータンパク質加水分解物は開示されていない。この組成物を使用すると、II型糖尿病患者の血糖コントロールの維持および満腹感の延長を助けることができる。US 2001/0021694では、同じ発明者から、2型糖尿病患者の血糖コントロールの維持を助ける組成物が開示されており、その組成物はカゼイン(グリコ)マクロペプチドまたはその加水分解生成物を含む。
【００１２】
国際公開WO 02/15719号パンフレットは、少なくとも一部分が加水分解されていてよい、ホエータンパク質を含む栄養組成物を開示している。ホエータンパク質加水分解物を含めることは、組成物による満腹効果を低減すると述べられている。この栄養組成物は、食欲減退状態にある者、たとえば、回復期にある者や食欲不振の者など、を対象としている。血糖のコントロールまたは糖尿病に罹患している人の治療については開示されていない。
【００１３】
国際公開WO 01/85984号パンフレット(Davisco Foods International, Inc)は、哺乳動物におけるACE-抑制活性を増大させてあるホエータンパク質加水分解物を開示している。血糖値のコントロールまたは糖尿病に罹患している人の治療については開示されていない。
【００１４】
米国特許出願公開2002/0037830号は、エネルギー補助食品または代謝栄養素として使用するための添加物の調製におけるホエータンパク質加水分解物の使用を開示している。
【００１５】
Aoyamaらは、論文:「Effect of soy and milk whey protein isolates and their hydrolysates on weight reduction in genetically obese mice」、Biosci, Biotechnol, Biochem.、第64巻(12)、2594〜2600ページ、2000年の中で、ミルクホエータンパク質単離物およびその加水分解物が遺伝的に肥満したマウスに及ぼす影響について論じている。この単離物および加水分解物は、大豆タンパク質ほど有効でないことが判明している。
【００１６】
特開平04-149139号公報は、乳タンパク質を酵素で加水分解して得られる、血糖値がコントロールされる糖尿病治療用の血糖降下剤を開示している。
【００１７】
欧州特許出願公開第629 350号公報は、小児の1型糖尿病の予防または治療のための、アレルゲンとなるタンパク質を実質的に含まない牛乳タンパク質加水分解物の使用を開示している。
【００１８】
β‐ラクトグロブリンおよびβ‐ラクトアルブミンを含む飲料製造のための粉末、ならびにそれからできる飲料は、血圧を低下させる用途が知られている。Davisco Foods International(米国ミネソタ州)によって生産されている粉末は、粉末製品30gあたり20gのβ‐ラクトグロブリンおよびα‐ラクトアルブミン、1gの脂質、および6gの炭水化物を含む。この粉末を水または乳と混合して、上記飲料を調製することができる。血糖のコントロールまたは糖尿病への適用における使用は開示されていない。この粉末および飲料は、(水または牛乳で作られたとき)粉末または飲料の総カロリーの55%以上をタンパク質分から提供する。
【００１９】
ホエーを用いたエネルギー飲料も、当業界で知られている。Designer Whey Protein Blast飲料(Next Proteins、米国カリフォルニア州)は、β‐ラクトグロブリンおよびα‐ラクトアルブミンを含んでおり、筋肉量を増大させる栄養補助食品として使用されている。この飲料は、非常に低レベルの炭水化物を含み、かつ脂肪を含まないので、カロリーが主にタンパク質から提供される。20米オンス(約600ml)ボトルの飲料は、脂肪を含まず、1gの炭水化物および17gのタンパク質を含む。
【００２０】
しかし、上述の開発にもかかわらず、依然として、好ましくは食品として経口投与することができ、ヒトまたは動物において血糖値の調節に使用することのできる食用(栄養または治療)組成物が求められている。特に、既知の治療用組成物よりも効能が改善され、または別の供給源から得られる組成物、あるいは対象者（対象物）が摂取するのにより好都合な形態の組成物が求められている。さらに、通常の毎日の食事の一部として使用することのできる組成物が求められている。特に、代替食製品またはスナック食品として使用することのできる組成物が求められている。
【００２１】
また、たとえば甘すぎず、または苦すぎない、許容される味を有し、簡単に食用組成物に配合することができるとともに、上述の効果をもたらす食用組成物を提供することも求められている。
【特許文献１】国際公開01/37850号パンフレット
【特許文献２】米国特許第6207638号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開2002/0019334号公報
【特許文献４】米国特許出願公開2001/0021694号公報
【特許文献５】国際公開02/15719号パンフレット
【特許文献６】国際公開01/85984号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開2002/0037830号公報
【特許文献８】特開平04-149139号公報
【特許文献９】欧州特許出願公開629 350号公報
【特許文献１０】国際公開01/85984号パンフレット
【非特許文献１】Current Pharmaceutical Design、2001年、第7巻、1399〜1412ページに発表されているD.Druckerの「The development of glucagons-like-peptide-1 pharmaceuticals as therapeutic agents for the treatment of diabetes」
【非特許文献２】J Clin Endocrinol Metab、2001年8月、第86巻(8):3853ページに発表されているToft-Nielsenらの「Determinants of the effectiveness of glucagon-like-peptide-l in type 2 diabetes」
【非特許文献３】The Lancet、第359巻、3月9日、2002年に発表されているZanderらの「Effect of 6-week course of glucagon-like-peptide-1 on glycaemic control, insulin sensitivity and β-cell function in type 2 diabetes」
【非特許文献４】Aoyamaら、「Effect of soy and milk whey protein isolates and their hydrolysates on weight reduction in genetically obese mice」、Biosci, Biotechnol, Biochem.、第64巻(12)、2594〜2600ページ、2000年
【非特許文献５】Drucker D.J.ら(1994年)の「Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase A in a novel mouse enteroendocrine cell line」、Mol Endocrinol第8巻:1646〜1655ページ
【非特許文献６】Lee KS、Drescher DG.、「Fluorometric amino-acid analysis with o-phthaldialdehyde (OPA)」、Int. J. Biochem. 1978年、第9巻(7):457〜467ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、上述の問題の1つまたは複数に対処しようと努めるものである。
【００２３】
血糖値の調節に使用される、効率がよく好都合な製品への需要を受けて、これらの用途に有効であり、食用組成物、特に典型的な食生活の中で食されるタイプの食品組成物中に使用することのできる化合物を見出すべく、本発明者らは研究を行った。
【００２４】
詳細には、本発明の目的は、血糖値の調節に使用して、気力、充足感、または気分に有益な効果をもたらすことのできる食用組成物を提供することである。
【００２５】
本発明の目的はまた、血糖値の調節において従来の食用組成物よりも際立った効能を示す食用組成物を提供することである。
【００２６】
本発明の目的はまた、消費者にとって好都合な形態であり、許容される味を有し、通常の毎日の食生活の一部として消費できるものであり、さらに「医薬」の形態でなくても利用可能な組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
驚くべきことに、今回、細胞によるGLP-1およびCCKの放出を刺激し、および/または標的とする組織でのグルコースの取込みを増大させるホエータンパク質加水分解物(WPH)が、血糖値の調節に使用するのに特に適することがわかった。
【００２８】
特定の理論に拘泥するものではないが、WPHは、細胞による1種より多いペプチドの放出を刺激し、そのうちの1種が血糖値のコントロールに関与し(GLP-1)、さらに別のものが消化に関与する(CCK)ので、特に有効であると考えられる。その上、GLP-1およびCCKは両者とも、胃による排出を緩慢にし、血中へのグルコース吸収の「減速」を直接もたらす。
【００２９】
さらに、WPHは、おそらくはインスリン感受性を増大させることによって、筋肉、肝臓、脂肪細胞など、標的とする組織でのグルコースの取込みに直接の刺激作用を及ぼす。詳細には、より良好な血糖コントロールが実現されると、ピーク高血糖応答の縮小、および/またはグルコース応答の変動性の減少、および/または食後グルコースの持続がもたらされることがわかった。換言すれば、血糖応答が延長される。
【００３０】
本発明のWPHは、特定濃度で、誘発される細胞GLP、特にGLP-1の放出が、他の乳タンパク質、乳タンパク質加水分解物、または非加水分解ホエータンパク質よりも高レベルを示すこともわかった。
【００３１】
第一の態様によれば、本発明は、食用組成物へのホエータンパク質加水分解物の使用であって、前記ホエータンパク質加水分解物が、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発することができ、および/または標的とする組織におけるグルコース取込みを増大させ、
前記ホエータンパク質加水分解物が、血糖値を調節し、または、精神機能の低下を改善もしくは予防し、および/または気力を持続させ、および/または前記組成物を摂取している対象者(物)の食後期間中の充足感を維持もしくは提供することをもたらすかまたはそのために前記ホエータンパク質加水分解物が使用されることを特徴とする、ホエータンパク質加水分解物の使用を提供する。
【００３２】
第二の態様によれば、本発明は、血糖値を調節し、精神機能の低下を改善もしくは予防し、気力を持続させ、または食事後期間中の充足感を維持もしくは提供する方法であって、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発し、および/または標的とする組織でのグルコース取込みを増大させることのできる、有効量のホエータンパク質加水分解物を食用組成物によって対象者(物)に経口投与するステップを含む方法、を提供する。
【００３３】
「精神機能の低下を改善もしくは予防する」とは、本明細書では、対象者（物）が、特許請求の範囲にあるホエータンパク質加水分解物を含む組成物を消費した後、食後期間中に精神的課題の実行に対するプラスの効果を実際にもしくは知覚として示し、または経験することを意味する。
【００３４】
「気力の持続」とは、本明細書では、対象者（物）が、特許請求の範囲にあるホエータンパク質加水分解物を含む組成物を消費した後、食後期間中に気力を感じる効果を実際にもしくは知覚として示し、または経験することを意味する。
【００３５】
「充足感」とは、本明細書では、特許請求の範囲にあるホエータンパク質加水分解物を含む組成物を消費した後、食後期間中によい気分になっている感覚を実際にもしくは知覚として示し、または経験することを意味する。
【００３６】
「流動性」製品とは、本明細書では、圧力をかけ、またはかけずに注いだとき、半液体、粉末、または粒状製品で起こりうるように連続した流れでは流出しないまでも、容器外に流出する液体、半液体、粉末、または粒状の製品を意味する。この用語には、容器から流出し得ないような一塊の製品も、アイスクリームなどの、流動しない物理的状態で食される製品も含まない。
【００３７】
本発明の液体または流動性の食用組成物は、血糖値のコントロールに有効であり、(許容可能な味などの)許容可能な官能的性質を有し、さらにホエータンパク質加水分解物の使用濃度と、タンパク質から得られる製品中のカロリー水準とのバランスが良好である。
【００３８】
本発明の両方の態様による好ましいホエータンパク質加水分解物は、β‐ラクトグロブリン加水分解物、α‐ラクトアルブミン加水分解物、またはこれらの混合物を含む。
【００３９】
細胞によるCCKおよびGLPの両方の放出を誘発し、および/または標的とする組織でのグルコース取込みを増大させるWPHを、血糖値の調節に使用される食用組成物を調製する際に使用することは、経口投与することができ、許容可能な味を有し、毎日の食事の一部として好都合に使用することのできる、これらの目的のために有効な組成物を提供するという利点を有する。その上、細胞によるCCKおよびGLPの両方の放出を誘発するWPHでは、CCKまたはGLPのどちらかの放出しか誘発しないWPHを含む製品の消費によって得られる効果と比べて、その効果が有利である。これら2種のペプチドが合わせて(同時または段階的に)放出されると、血糖値がより有効にコントロールされる。さらに、このことは、筋肉、肝臓、脂肪細胞などの標的とする組織でのグルコース取込みに直接の刺激作用をもたらすと考えられる。
【００４０】
特定の理論に拘泥するものでないが、本発明によって実現される血糖値の良好な調節は、以下の1つまたは複数のために生じると考えられる：
-  ホエータンパク質加水分解物は、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの両方の放出を誘発することができる。このことが、胃による排出を緩慢にし、これがさらにグルコースの血流中への吸収を減速させ、それによって、血糖値が長時間にわたって、より一定になるので、より良好な血糖コントロールがもたらされる。あるいは、
-  上記のWPHが、GLP放出を刺激するために、膵臓のβ細胞によるインスリン分泌を刺激し、より良好な血糖コントロールをもたらす。あるいは、
-  WPHは、標的とする組織でのグルコースの取込みを増大させることができ、良好な血糖コントロールをもたらす。
【００４１】
上記の事項は、血糖値をコントロールする必要のある者、たとえば2型糖尿病患者にとって特に有益である。また、グルコース不耐性を有する人の悪化防止に役立ち、したがって2型糖尿病になる危険を減少させる。さらに、食後期間中において、精神機能の向上および/または気力の持続および/または苛立ちやすさの低減を含む他の利点をもたらすことがわかった。
【００４２】
用語「含む(comprising)」とは、その次に記述された構成要素に制限するものではなく、むしろ機能上重要なまたは重要でない、特定されていない構成要素を含む意味である。換言すれば、列挙したステップ、構成要素、または選択肢は、網羅的である必要はない。「含む(including)」または「有する(having)」の語句が使用されるときは常に、これらの用語は、上で規定したような「含む(comprising)」と同等な意味である。
【００４３】
実施例および比較例において、あるいは明確な指示のある場合を除き、この記述の中の、材料の量、または反応、材料の物理的性質、および/もしくは使用の条件を示す数字はすべて、語句「約」によって修飾されるものと理解される。すべての量は、別段の記述がない限り、重量パーセントとしての量である。食用組成物については、別段の記述がない限り、パーセント量はすべて、組成物の総重量に対する重量パーセントである。
【００４４】
（発明の詳細）
[WPHによるペプチドの分泌]
本明細書でいうコレシストキニンまたは「CCK」には、CCK-4、CCK-8、CCK-22、CCK-23、CCK-24、CCH-25、CCK-36、CCK-27、CCK-28、CCK-29、CCK-30、CCK-31、CCK-32、CCK-33、CCK-39、CCK-58を含むCCKファミリーのすべてのペプチドが含まれる。
【００４５】
本明細書では、グルカゴン様ペプチド(GLP)および「GLP」には、GLP-1およびGLP-2を含むGLPファミリーのすべてのペプチドが含まれる。GLP-1は、インスリン分泌に対するその作用のために、特に重要なものであることがわかった。
【００４６】
[細胞による放出]
細胞によるペプチドの放出を誘発するとは、本明細書で述べるところでは、適切な細胞、好ましくは消化管細胞によるその放出を、ホエータンパク質加水分解物(WPH)とこれらの細胞との相互作用の後に誘発することを指す。
【００４７】
細胞によるペプチドの放出の誘発は、本発明によれば、たとえば腸管細胞系を使用して、in vitroで測定することができる。適切な細胞系は、当分野でよく知られている。実施例で使用した細胞は、プログルカゴン-サルウイルス40ラージT抗原遺伝子導入マウスの大腸に発生する腸内分泌腫瘍由来のL細胞系である、GLUTag細胞である。これらの細胞は市販されており、更なる記載は、Drucker D.J.ら(1994年)の「Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase A in a novel mouse enteroendocrine cell line」、Mol Endocrinol第8巻:1646〜1655ページにある。
【００４８】
実施例1および2で、in vitroでの細胞によるCCKおよびGLP-1の放出についてさらに説明している。これらの例の中の情報を、本項に援用する。
【００４９】
対象者（物）(ヒトまたは動物)が特許請求の範囲にあるWPHを、それ自体、または食用組成物の一部として消化するとき、体内の細胞によるCCKおよびGLPの放出が刺激されて、本発明による効果がもたらされる。
【００５０】
この細胞による放出は、たとえば、WPHまたはそれを含む食用組成物を消費した後、その対象者（物）の血中CCKレベルおよびGLPレベルの上昇または様子を測ることによって、in vivoで測定することもできる。血中CCKレベルおよびGLPレベルを測定するのに適する技術は、当分野でよく知られており、ここでこれ以上述べる必要はない。
【００５１】
本発明のWPHは、実施例1および2のin vitro細胞放出試験で、特に少なくとも5mg/mlの濃度で使用したとき、細胞によるCCKおよびGLP-1の放出を示した。
【００５２】
[3T3L1脂肪細胞でのグルコースの取込み]
本明細書に記載されている、脂肪細胞へのグルコースへの取込みを刺激するとは、適切な細胞、好ましくは脂肪細胞、筋細胞、および肝細胞のようなインスリン感受性の標的細胞へのグルコースの取込みを、ホエータンパク質加水分解物とこれらの細胞との相互作用の後に刺激することを指す。
【００５３】
細胞によるグルコースの取込みを刺激することは、本発明によれば、たとえば脂肪細胞を使用して、in vitroで測定することができる。適切な細胞系は、当分野でよく知られている。実施例で使用した細胞は、in vitroで脂肪細胞に分化させてある3T3L1細胞である。これらの細胞は、ATCC(American Tissue Culture Collection)から市販されている。
【００５４】
実施例3および4で、in vitroでの細胞による[3H]グルコースの取込みをさらに説明している。これら実施例の情報を、本項に援用する。
【００５５】
対象者（物）(動物またはヒト)が特許請求の範囲にあるWPHを、それ自体、または食用組成物の一部として消化するとき、本発明によれば、標的とする細胞による血中グルコースの取込みが刺激される。
【００５６】
本発明のWPHは、実施例3のin vitro細胞取込み試験で、少なくとも100μg/mlの濃度でグルコースの取込みを刺激している。実施例3のようにインスリンの存在下では、グルコースの取込みを刺激するWPHの効力が、少なくとも10μg/mlに増大し、WPHが細胞のインスリン感受性を強化することを示唆している。
【００５７】
[ホエータンパク質加水分解物]
本明細書用いられるように、用語「細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発することのできるホエータンパク質加水分解物」および「WPH」は、以下の全てを含む：
細胞による前述のペプチド両方の放出を誘発する単一のホエータンパク質加水分解物;その混合物;成分の少なくとも1種が細胞による一方のみのペプチドの放出を誘発するとしても、混合物が細胞による両方のペプチドの放出を誘発する、2種以上のホエータンパク質加水分解物からなる混合物。標的とする組織でのグルコース取込みが増大することについても、同じ解説が当てはまる。本明細書では、WPHの表示は、上述のようなホエータンパク質加水分解物の単独および複数のどちらを指すのにも使用される。
【００５８】
WPHは、加水分解されており、細胞によるグルカゴン様ペプチドおよびコレシストキニンの放出を誘発し、および/または標的とする組織でのグルコース取込みを増大させることのできるどんなホエータンパク質を含んでもよい。
【００５９】
ホエータンパク質の適切な加水分解方法には、化学的方法(たとえば、酸加水分解による)、酵素(ペプチダーゼ、細菌もしくは植物のプロテアーゼを含む)による方法、または細菌培養液での処理によるものが含まれる。ホエータンパク質の加水分解に使用することのできる適切な酵素の例には、ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンが含まれる。
【００６０】
WPHは、β‐ラクトグロブリン加水分解物またはα‐ラクトアルブミン加水分解物、最も好ましくはこれらの混合物、を含むことが好ましい。混合物中のこれら加水分解物の重量比は、5:1〜1:5の範囲、より好ましくは3.5:1〜1:2のような4:1〜1:4の範囲をとることが好ましい。
【００６１】
本発明に従って使用することのできる１つの特定のWPHは、5〜20重量%のアスパラギン酸、10〜25重量%のロイシン、5〜20重量%のリシン、および10〜32重量%のグルタミン酸を含む。
【００６２】
WPHは、加水分解の程度が、最高で20%、好ましくは1〜15%もしくは20%、より好ましくは2〜10%、たとえば5〜9%の範囲をとることができる。加水分解の程度は、OPA法(Lee KS、Drescher DG.、「Fluorometric amino-acid analysis with o-phthaldialdehyde (OPA)」、Int. J. Biochem. 1978年、第9巻(7):457〜467ページ)によって決定される。
【００６３】
WPHは、約1000ダルトン〜12000ダルトン、好ましくは2000ダルトン〜8000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有することが好ましい。WPHの4〜40重量%、より好ましくは10〜30%が2000〜5000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有し、および/またはWPHの1〜30重量%、より好ましくは2〜20%が5000〜10000ダルトンの範囲の重量平均分子量を有することが好ましい。
【００６４】
WPHは、脱イオン水中の10mg/mlの溶液において、pHが、20℃で6〜9、より好ましくは6.5〜8の範囲を有することが好ましい。
【００６５】
本発明に従って使用することのできるWPHは、当分野で公知であり、市販されている。適切なWPHを得るための一方法の記述が、WO 01/85984 A1に記載されている。市販の適切なWPH供給源は、米国ミネソタ州のDavisco Foods Inc.のBiozate(商標)ホエータンパク質加水分解物製品である。「Biozate(商標)1」と称される製品が特に適することがわかった。
【００６６】
WPHは、食用組成物の調製において使用する。本明細書では、用語「調製」には、食用組成物の適切な製造手法すべて、たとえば、混合、ブレンディング、ホモジナイズ、高圧ホモジナイズ、乳化、分散処理、カプセル封入、が含まれる。WPHは、当分野で公知の適切な任意の方法によって食用組成物中に含めることができ、それらの方法は、食用組成物の種類に応じて決まる。
【００６７】
WPHは、(加水分解物としてまたは親タンパク質として)精密濾過にかけても、またはイオン交換処理してもよい。WPHは、グルタミン、アラニン、シスチン、および分枝アミノ酸で強化してもよい。
【００６８】
[WPHの投与方法]
本発明は、有効量のWPHを経口投与して血糖値を調節する方法を提供する。
【００６９】
この方法によって投与するWPHの合計有効量は、この投与を受ける者の必要に応じて様々でよい。通常、0.1g〜150g、好ましくは1g〜80g、より好ましくは5g〜50gの合計量を投与する。1日有効量を、1日に1回量で投与しても複数回量で投与してもよい。
【００７０】
WPHは、ヒトまたは動物の対象者（物）に、任意の適切な形態、たとえば、カプセル、錠剤、溶液として、または、好ましくは、バー製品、飲料製品、および調製済み飲料製品などの液体製品を含む本明細書に記載したとおりの食用食品組成物として投与することができる。
【００７１】
[食用組成物]
食用組成物は、栄養補助食品(錠剤、粉末、カプセル、もしくは液体製品など)、食品組成物(製品)、飲料、または代替食製品の形であることができる。
【００７２】
栄養補助食品とは、本明細書では、ビタミン、ミネラル、微量元素、WPHなどの少なくとも1種の有益な作用物質を供給し、通常の食事摂取によって得られるそのような作用物質の量を補うことを目的とした組成物または補助食品を指す。これらの組成物または補助食品は、一般に、相当な量のカロリー、タンパク質、炭水化物、または脂肪は含んでいない。これらは、食品として摂取するためのものでなく、毎日の食事の補助として摂取するためのものである。
【００７３】
本発明による食品組成物は、WPHを含む配合を行うことができるどんな食品でもよい。この組成物は、タンパク質、脂肪、および炭水化物のうちの少なくとも1種、またはこれらの混合物を合計で少なくとも5重量%含有し、またはエネルギー量が1食もしくは100gあたり少なくとも10キロカロリー、好ましくは少なくとも20キロカロリーであることが好ましい。食品組成物は、上述のような栄養補助食品を含まない。
【００７４】
本発明の任意の態様による食品組成物は、酪農製品(乳製品や乳飲料など)、大豆製品、パンおよび(パスタおよびシリアルバーを含む)穀物製品、ケーキ、ビスケット、スプレッド、水中油乳濁液(ドレッシング、ケチャップ、マヨネーズなど)、アイスクリーム、デザート、スープ、濃縮粉末スープ、ソース、濃縮粉末ソース、飲料、スポーツ飲料、健康バー、フルーツジュース、菓子、スナック食品、調理済み料理製品、パック詰め料理製品、および乾燥料理製品などから適切に選択することができる。
【００７５】
代替食製品とは、本明細書では、1日あたり1回または複数の通常の食事に替えて使用するための製品を指し、管理されたカロリー含有量のものであり、一般に単一の製品として食される。しかし、この種のいくつかの製品を一緒に食してもよい。代替食製品、および代替食プランの一部として使用される製品の例には、乳飲料や大豆飲料などの(調製済み)液体製品、これら飲料の調製に使用される可溶性粉末およびそれから調製される飲料、バー、スープ、シリアル、麺、もしくはパスタ製品、ライスプディング、カスタード、ポリッジなどのデザートが含まれる。代替食製品は、一般に、カロリー管理食に従っているか、または自身の体重コントロールを望む消費者によって使用される。
【００７６】
本発明によれば、代替食製品、および代替食プランの一部として使用される製品が特に好ましい。これらは、手頃な形態の中に、制限されたカロリー含有量と結合された良好な満腹効果を提供することができるので、特に適切であることがわかった。代替食製品は、調製済み液体、飲料調製に使用される可溶性粉末、それから生成される液体、スープ、デザート、バー、シリアル、パスタ、もしくは麺製品、または可溶性粉末製品であることが特に好ましい。
【００７７】
食用組成物は、たとえば、固体製品、粉末製品、錠剤、カプセル、液体、流動性製品、すくう、注ぐ、もしくは塗るタイプの製品、またはバーなどであることができる。食用組成物は、水やミルクなどの液体と混合されて、代替食製品または代替食プランの一部として使用される製品などの液体製品またはスラリー製品になる粉末であることができる。
【００７８】
食用組成物は、組成物重量の0.1重量%〜80重量%、好ましくは0.5〜40重量%、より好ましくは1〜30重量%、最も好ましくは2もしくは5〜20重量%の合計量のWPHを含むことが好ましい。食用組成物は、β‐ラクトグロブリン加水分解物、α‐ラクトアルブミン加水分解物、またはこれらの混合物を、組成物の重量の0.1〜80重量%、好ましくは1〜50重量%の量で含むことが好ましい。
【００７９】
本発明の一実施形態によれば、食用組成物は、上述の量が用いられようが用いられまいが、1食あたりまたは製品が1食分として使用される場合では製品あたり合計で、20g未満のWPHを含んでよい。
【００８０】
食用組成物が、液体代替食製品やスープなど、液体または易流動性の組成物である場合、WPHの合計量は、組成物の総重量の0.1〜40もしくは50重量%、より好ましくは1〜40重量%、最も好ましくは2〜30重量%の範囲になることが好ましい。これらの組成物は、組成物重量の0.1〜40重量%の合計量のWPHを含み、WPHによって食用組成物の総カロリーの40%以下が供給されることが好ましい。
【００８１】
食用組成物が、バー製品、たとえばバータイプ代替食製品などの固体組成物である場合、WPHの量は通常、組成物の総重量の0.1〜80重量%、好ましくは0.5〜40重量%の範囲になる。バー組成物は、β‐ラクトグロブリン加水分解物、α‐ラクトアルブミン加水分解物、またはこれらの混合物を、組成物重量の0.1〜80重量%、より好ましくは1〜10重量%の合計量で含むことが特に好ましい。
【００８２】
食用組成物は通常、好ましくは食用組成物の0.1〜30もしくは40重量%の量のタンパク質を含む。この組成物は、0.5〜25重量%、好ましくは1〜20重量%のタンパク質を含むことが好ましい。液体または流動性の組成物では、存在するタンパク質が、食用組成物の総カロリーの50%以下、より好ましくは20%〜50%、最も好ましくは25%〜50%を供給する。他の種類の食用組成物については、これらの量が好ましいが必須ではない。
【００８３】
食用組成物は、好ましくは組成物の総重量の最高で60もしくは70重量%の脂肪、より好ましくは0.5〜30もしくは35重量%、最も好ましくは2〜20%の脂肪を含んでよい。適切な任意の脂肪、たとえば、植物脂肪、植物油、堅果油、種油、またはこれらの混合物を使用することができる。飽和または不飽和(一価不飽和および多価不飽和)脂肪を使用することができる。
【００８４】
食用組成物は、組成物の重量の1〜95重量%、より好ましくは5〜70重量%、最も好ましくは10〜60重量%、たとえば15〜50重量%の量の、1種または複数の炭水化物も含むことができる。任意の適切な炭水化物、たとえば、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ、マルトデキストリン、デンプン、化工デンプン、またはこれらの混合物、を使用することができる。
【００８５】
食用組成物は、たとえば、組成物の重量の0.1〜40もしくは50重量%、好ましくは0.5〜20重量%の量の食物繊維も含んでよい。
【００８６】
食用組成物は、乳、ヨーグルト、ケフィア、チーズ、またはクリームなどの酪農製品を、たとえば、組成物の重量の70重量%以下、好ましくは1〜50重量%の量で含むことができる。それに代えて、食用組成物は、同じ量で使用された大豆タンパク質に基づいていることもできる。これらの材料を含めることは、所望する量のタンパク質、脂肪、および炭水化物などが食用組成物中に含まれるように行われる。
【００８７】
食用組成物は、1種または複数の乳化剤を含むことができる。任意の適切な乳化剤、たとえば、レシチン、卵黄、卵由来乳化剤、モノ、ジ、もしくはトリグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、またはモノ、ジ、もしくはトリグリセリドを使用することができる。組成物は、組成物の重量に基づいて0.05〜10重量%、好ましくは0.5%〜5重量%の乳化剤を含むことができる。
【００８８】
食用組成物はまた、安定剤を含むことができる。任意の適切な安定剤、たとえば、デンプン、化工デンプン、ガム、ペクチン、またはゼラチンを使用することができる。組成物は、組成物の重量に基づいて0.01〜10重量%、好ましくは1〜5重量%の安定剤を含むことができる。
【００８９】
食用組成物は、果物もしくは野菜の小片、濃縮物、ジュース、またはピューレを、食用組成物の重量に基づいて60重量%以下含むことができる。組成物は、これらの成分を好ましくは0.1〜40重量%、さらに好ましくは1〜20重量%含む。これら成分の量は、食用組成物の種類に応じて変わり、たとえば、スープは通常、代替食乳飲料よりも多い量の野菜を含む。
【００９０】
食用組成物はまた、組成物の重量に基づいて0.1〜30重量%、好ましくは0.5〜15重量%、より好ましくは3〜8重量%の塩を含むことができる。任意の食用塩、たとえば、塩化ナトリウム、塩化カリウム；クエン酸、乳酸、安息香酸、アスコルビン酸のアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩、またはこれらの混合物を使用することができる。
【００９１】
食用組成物は、慣例に従う量の1種または複数のコレステロール低下剤を含んでよい。任意の適切な公知のコレステロール低下剤、たとえば、イソフラボン、フィトステロール、大豆抽出物、魚油抽出物、茶葉抽出物を使用することができる。
【００９２】
食用組成物は、添加ビタミン、添加ミネラル、ハーブ、スパイス、調味料、香料、酸化防止剤、着色料、保存料、またはこれらの混合物から選択された副成分を、組成物の重量に基づいて10もしくは20重量%以下含むことができる。組成物は、これら成分を好ましくは0.5〜15重量%、より好ましくは2〜10%含む。組成物が添加ビタミンおよびミネラルを含むことは特に好ましい。これらは、ビタミンプレミックス、ミネラルプレミックス、およびこれらの混合物を使用して加えることができる。それに代えて、ビタミンおよび/またはミネラルを個々に加えてもよい。これらの添加ビタミンおよび/またはミネラルは、ビタミンA、B1、B2、B3、B5、B6、B12、C、D、E、H、K、またはミネラルのカルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛、および鉄のうちの少なくとも1種から選択されることが好ましい。
【００９３】
上記食用組成物中のタンパク質、脂肪、炭水化物、および他の成分の量は、組成物の製品形式に応じて、また必要な場合には国または地方の法律に従って変わる。
【００９４】
上記食用組成物が代替食製品である場合、製品のカロリー含有量は、好ましくは50〜600カロリー、より好ましくは100〜500カロリー、最も好ましくは200〜400カロリーの範囲である。
【００９５】
上記組成物は、当分野で公知の任意の適切な方法によって製造することができ、そのような方法は、当業者に周知であり、ここでこれ以上記述する必要はない。
【００９６】
上記食用組成物は、経口摂取を意図しており、以下の任意の１以上との関連において人または動物によって消費されることができる：組成物を消費する対象者（物）の食後期間中の精神機能の維持もしくは改善のため、および/または気力を持続させるため、および/または充足感の維持もしくは提供のため、を含めて血糖値を調節すること。
【００９７】
栄養素とは、本明細書でいうように、食品製品の任意の構成成分であることができ、そこから消費者が生理的な利益を得る。例には、炭水化物、脂肪、タンパク質などの多量養素、またはビタミン、ミネラル、微量元素などの少量養素が含まれる。繊維は、身体によって吸収されないが、本明細書では栄養素として考える。水は、身体に利益をもたらすが、栄養素であるとは考えない。
【００９８】
本発明によるWPHを含む組成物の消費は、医師による助言または消費者の希望に従うプログラムの一部でありえる。上記組成物は、食事プランまたは体重管理プランの一部として使用することが好ましい。後者の場合、消費者は、血糖値の調節に役立ち、かつたとえばエネルギーレベルを保つために多くの人々について一般にその日の間に生じるピークおよびへこみを避けるために役立つ組成物を求めるであろう。食事プランとは、本明細書では、体重コントロールを目的としたプランに従っていない者が従うプランを指す。体重管理プログラムは、体重調整を目的とする人が従うプログラムである。
【００９９】
組成物が、体重コントロールプランの一部としての使用を目的とした代替食組成物である場合、対象者（物）が減量しまたは健康な体重を維持している場合は耐糖能が向上するので、特に有利である。
【０１００】
本発明の別の利点は、医薬として提供する必要があるというより、食用食品組成物をとおして血糖の調節を助けることである。
【０１０１】
以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、実施例は限定するものではないと理解される。当業者には、本発明の範囲内でさらなる例が明らかとなろう。
【０１０２】
〔実施例〕
(実施例1および2：培養GLUTag細胞におけるGLP 1およびCCKの刺激放出)
1.材料
a)ホエータンパク質加水分解物:
使用したホエータンパク質加水分解物は、Davisco Foods International Inc.、米国ミネソタ州Le Sueurから市販されている材料であるBiozate(商標)1であった。Biozate(商標)1は、加水分解されたβ−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミンの混合物を含む。
【０１０３】
Biozate(商標)1の技術仕様を以下に示す。pHは8.0である。以下で述べるOPA法によって測定した加水分解度は、5.5+/-1.5である。分子量プロフィール(ダルトン)は、30〜45%が10,000を超え、7〜12%が5000〜10000の範囲にあり、15〜25%が2000〜5000の範囲にあり、30〜45%が2000未満であり、SEC-HPLCによって測定した。
【０１０４】
b)GLUTag細胞:
GLUTag細胞は、カナダ国トロントのToronto General Hospitalからライセンスを受けて入手した。GLUTag細胞は、プログルカゴン-サルウイルス40ラージT抗原遺伝子導入マウスの大腸に発生する腸内分泌腫瘍由来のL細胞系である。これらの細胞については、Drucker D.J.ら(1994年)の「Activation of proglucagon gene transcription by protein kinase A in a novel mouse enteroendocrine cell line」、Mol Endocrinol第8巻:1646〜1655ページにさらに記載されている。
【０１０５】
c)細胞培養のための材料:
ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FBS)は、Invitrogen Ltd(英国スコットランド、ペーズリー)から入手した。
【０１０６】
2.方法
GLUTag細胞を10%(体積/体積)のFBSを含有するDMEMにおいて37℃でインキュベートする間に増殖させた。細胞が集密になるまで、培地を3〜4日毎に交換した。次いで、細胞をトリプシン処理し、24ウェル培養プレートに播き(0.5×105細胞/ウェル)、さらにプレートを上述のものと同じインキュベート条件下で保管した。3日間保管した後、細胞を0.5%(体積/体積)のFBSを含有するDMEMで2回洗浄し、次いで、3ウェルからなる4本の系列(A〜D)に、以下で詳述するように異なる量のBiozate(商標)1を加えた。すなわち、各系列を3通り調製した。Biozate(商標)1を加えていない対照サンプルも3通りに調製した。
系列A-0.5mg/mlのBiozate(商標)1
系列B-3mg/mlのBiozate(商標)1
系列C-5mg/mlのBiozate(商標)1
系列D-10mg/mlのBiozate(商標)1
【０１０７】
プレートを上で詳述したとおりにインキュベートし、1時間インキュベートした後、各プレートから一定分量を取ってCCK放出を測定した。2時間インキュベートした後に各プレートから別の一定分量を取って、GLP-1放出を測定した。CCKまたはGLP-1の放出を決定するために試験する前に、これら一定分量を以下で詳述するように処理した。
【０１０８】
一定分量を収集し、50μg/mlのフェニルメタンスルホニルフルオライド(PMSF)をそれに加えた。これら一定分量を、CCKおよびGLP-1の分泌を見るその後の分析に向けて-80℃で凍結させた。これら一定分量を解凍し、遠心分離(5000g)にかけて、細胞片を除去した。次いで、GLUTagからのCCKおよびGLP-1の放出を試験した。
【０１０９】
CCKの放出は、非硫酸化および硫酸化型のCCK 26〜33を測定する市販の酵素免疫アッセイキット(Phoenix Pharmaceuticals、米国カリフォルニア州ベルモント)を使用して測定した。試験キットの仕様書によれば、アッセイ内の差異は<5%であり、アッセイ間の差異は<14%である。
【０１１０】
GLP-1の放出は、市販のELISAキット(Linco Research Inc.、米国ミズーリ州セントチャールズ)を使用して測定した。このキットは、生物活性のある形のGLP-1[すなわち、GLP-1(7〜36アミド)およびGLP-1(7〜37)]を測定する。GLP-1の測定前に、一定分量を、0.5%(体積/体積)のFBSを含有するDMEMで1部から10部に希釈して、GLP-1の濃度をこのELISAキットの標準検出範囲内にした。
【０１１１】
図1は、Biozate(商標)1と共に37℃で2時間インキュベートした後にGLUTag細胞から培地に分泌されたGLP-1の濃度を示す。
【０１１２】
図2は、Biozate(商標)1と共に37℃で1時間インキュベートした後にGLUTag細胞から培地に分泌されたCCKの濃度を示す。
【０１１３】
図1および図2のどちらにおいても、x軸は、系列および使用したBiozate(商標)1の濃度を示す。図1および図2のy軸は、インキュベート後にGLUTag細胞から培地に分泌されたGLP-1またはCCKの濃度を示す。図1については、濃度を1リットルあたりのピコモル(10-12M)で示し、図2についてはナノグラム/mlで示す。
【０１１４】
ペプチドの放出が細胞死によるものでなかったことを証明するために、CytoTox 96R非放射性細胞障害性試験(Promega、米国マディソン)を使用して、細胞生存度を確実に決定した。
【０１１５】
図1および図2の結果から、使用したホエータンパク質加水分解物(β−ラクトグロブリンとα−ラクトアルブミン加水分解物の混合物)によって、GLUTag細胞からGLP-1およびCCKの両方が培地に放出されることがわかる。
【０１１６】
（実施例3：0nMおよび1nMのインスリンレベルでの3T3L1脂肪細胞における3H-デオキシ-グルコース取込み）
1.材料
a)ホエータンパク質加水分解物:
使用したホエータンパク質加水分解物は、実施例1および2で詳述したBiozate(商標)1であった。Biozate(商標)1は、血清なしのアッセイ培地に10mg/mlの濃度で溶解させて調製した。このものからさらに6段階の希釈物を調製し、それぞれは前段希釈物の10倍にさらに希釈した。
【０１１７】
b)3T3L1細胞:
マウス胚由来の3T3L1細胞(CL-173、供給元: American Tissue Culture Collection)を使用した。
【０１１８】
c)細胞培養のための材料:
アッセイ培地:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)およびウシ胎児血清(FBS)は、Invitrogen Ltd(英国スコットランド、ペーズリー)から入手した。DMEMには、10%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、1%のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した。
【０１１９】
血清なしのアッセイ培地(SFAM)は、DMEMに2mMのL-グルタミンと1%のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充して調製した。
【０１２０】
分化培地(DM)は、アッセイ培地に250nMのデキサメタゾン、5μg/mlのインスリン、および0.5mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を補充することによって調製した。
【０１２１】
分化後培地(PDM)は、アッセイ培地に5μg/mlのインスリンを補充することによって調製した。
【０１２２】
クレブス-リンガーリン酸緩衝液=13.6mMのNaCl、4.7mMのKCl、1.25mMのCaCl2、1.25mMのMg2SO4、10mMのNa2HPO4。
【０１２３】
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
【０１２４】
2.方法
マウス胚由来3T3L1細胞をAM中で2〜3日毎に培地を交換しながら常法どおりに培養した。培養物が集密過剰にならないように徹底しながら、細胞を95%の集密度まで増殖させた。ほぼ集密になった時点で、実験用のマルチウェルプレートへの継代培養、または継続的な継代のための新たなフラスコでの継代培養向けに細胞の調製を行った。
【０１２５】
継代培養では、フラスコからAMを除去し、廃棄した。細胞を2〜3mlのトリプシン/EDTAで軽くすすいで、血清の痕跡をすべて除去する。次いで、フラスコに5mlのトリプシン/EDTAを加えて、細胞をプラスチックの表面から浮き上がらせた。細胞が分散するまで倒立顕微鏡で観察した(通常は5分以内であるが、必要に応じて、フラスコをさらに数分間37℃のインキュベーターに入れて、分散を促進した)。すべての細胞がフラスコから浮き上がったなら、5mlのトリプシン中和溶液またはAMを加えてトリプシン/EDTA溶液を中和した。次いで、細胞を遠心分離管/万能試験管に移し、2500r.p.m.で3分間の遠心分離にかけ、上清を慎重に吸引し、細胞を再懸濁し、37℃のPBS中で洗浄し、もう一度遠心分離にかけた。PBSを慎重に吸引し、細胞を10mlのAMに再懸濁した。次いで、細胞をカウントし、AMで希釈し、25,000〜30,000細胞/mlの濃度で48ウェルプレートに移した。次いで、細胞を処理しないままマルチウェルプレート中に24時間放置して、細胞がプラスチックに付着させた。
【０１２６】
次いで、細胞をAM中で約2日間増殖させてほぼ集密になるようにした。その後、培地を吸引し、DMと入れ替え、さらに3日間維持した。3日後、培地をさらに2日間PDMに交換した。この段階で、3T3L1細胞は脂肪細胞様の形態に分化し、細胞内に脂質の微小滴が形成されていた。次いで、これらの分化した細胞を以下で詳述する異なる濃度のBiozate(商標)1で3日間かけて処理した。
系列A-100μg/mlのBiozate(商標)1
系列B-10μg/mlのBiozate(商標)1
系列C-1μg/mlのBiozate(商標)1
系列D-100ng/mlのBiozate(商標)1
系列E-10ng/mlのBiozate(商標)1
系列F-1ng/mlのBiozate(商標)1
系列G-100pg/m1のBiozate(商標)1
【０１２７】
3日間の処理の後、細胞をSFAMで3回洗浄し、37℃のインキュベーターに入れた250μ1のクレブス緩衝液中に30分間放置した。細胞に放射標識したグルコース(3H-デオキシグルコース)を加え(2.5μCi/ウェル)、細胞をもう1時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷SFAMで3回洗浄した。次いで、細胞を500μl/ウェルの0.1重量%温Triton X-100で1時間かけて溶解させた。
【０１２８】
各ウェルからの100μlの可溶化液を液体シンチレーション計数によるカウントにかけて、脂肪細胞によって取り込まれた放射標識グルコースの量を評価した。脂肪細胞を溶解させる前に放射標識グルコースの大部分がマルチウェルプレートから除去されたことを保証するために、洗液もカウントにかけた。
【０１２９】
結果は、3H-DPM(1分間の崩壊)の平均値、ならびにこの実験で適用した各実験のサンプル標準偏差を表す。各処理を3通りに試験した。結果を図3および図4に示し、また表1の図によって示す。図3は、インスリン存在下での3T3L1脂肪細胞のグルコース取込みに対するホエータンパク質加水分解物の作用を示し、図4は、インスリンなしでの3T3L1脂肪細胞のグルコース取込みに対する作用を示す。
【０１３０】
結果は、特許請求の範囲にあるホエータンパク質加水分解物が、完全に分化した3T3L1脂肪細胞のグルコースの取込みを改善することを示している。1nMのインスリンを補充したAMに適用した100μg/mlおよび1Oμg/mlの処理での結果は、グルコース取込みが実験対照と比べて22.27%および16.70%増大することを示している。
【０１３１】
インスリンなしのAMに適用した同様の処理では、100μg/mlの濃度のBiozate(商標)1のみが、実験対照と比べてグルコース取込みの増大(31.56%)を示している。上記のことから、WPHとのインキュベートが、T3T脂肪細胞の(3H)グルコース吸収能を強化することを実証している。さらに、インスリン存在下では、WPHがグルコース取込みの刺激に一層有効となり、WPHが、インスリンに対する細胞の感受性を増すことによってグルコース取込みを増強することを示唆している。
【０１３２】
〔食品組成物例〕
実施例4〜6は、本発明に従って使用することのできる異なる食品組成物の例である。
【０１３３】
(実施例4  −  代替食バー製品)
WPHを含む代替食バー製品は、以下の配合に従って調製することができる。
【０１３４】
【表１】
2006510367.tif 000002
【０１３５】
このバーは、ハチミツおよびコーンシロップをピーナッツバターと充分に混合して製造する。チョコレート風味コーティング以外の残りの原材料を加え、混合物をさらに混合し、バー状に成形する。これをコーティングするため、バーを、融解したチョコレート風味コーティングのカーテンに通し、またはそのような融解したコーティングに浸してもよい。バーを冷ましてコーティングを固める。
【０１３６】
(実施例5  −  調製済み液体代替食製品)
WPHを含む代替食調製済み液体は、以下の配合に従って調製することができる。
【０１３７】
【表２】
2006510367.tif 000003
【０１３８】
水に原材料を加え、組成物を均質な製品になるまで混合した。
【０１３９】
(実施例6  −  アイスティー製品)
WPHを含むアイスティー製品は、以下の配合に従って調製することができる。このアイスティーは、原材料をほぼ均質な製品になるまで攪拌しながら混ぜ合わせて製造することができる。製品は、所望により冷やすこともできる。
【０１４０】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図1は、Biozate(商標)1と共に37℃で2時間インキュベートした後、GLUTag細胞から培地に分泌されたGLP-1の濃度を示す。
【図２】図2は、Biozate(商標)1と共に37℃で1時間インキュベートした後、GLUTag細胞から培地に分泌されたCCKの濃度を示す。
【図３】図3は、インスリン存在下での3T3L1脂肪細胞のグルコース取込みに対するホエータンパク質加水分解物の作用を示す。
【図４】図4は、インスリンなしでの3T3L1脂肪細胞のグルコース取込みに対する作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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