(57)【要約】ＨＩＶの耐性株に感染した細胞におけるそのウイルス複製を阻害する方法であって、ｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体のウイルス複製阻害量を感染細胞に投与することを含む方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶの耐性株に感染した細胞中でのウイルス複製を阻害する方法において、式Ｉ
【化１】
2006510610.tif 000023
（上式中、Ｘは電子求引基で、Ｒ２はアミノ酸残基である）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩のウイルス複製阻害量を感染細胞に投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
ＸはＢｒ、Ｃｌ、Ｉ、又はＮＯ２である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＸはＢｒ又はＣｌである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ２は、-ＮＨＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＯＣＨ３である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＨＩＶの耐性株がＡ１７又はＡ１７-Ｖである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
耐性ＨＩＶ株が、少なくとも一の治療過程に応答しないか又は応答しなかった感染個体から得られた臨床分離株である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＨＩＶ株が非Ｂサブタイプである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
感染した細胞への上記投与が、動物への投与を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
動物がヒトである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス複製阻害量が約１〜約５００ｍｇ／ｋｇ動物体重である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス複製阻害量が約１０〜約１００ｍｇ／ｋｇ動物体重である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記分離株が、変異型逆転写酵素を有するＨＩＶ株に感染しており、該変異が、Ｍ４１Ｌ、Ｄ６７Ｎ、Ｋ７０Ｒ、Ｌ７４Ｖ、Ｋ１０３Ｎ、Ｖ１０６Ｎ／Ａ、Ｅ１３８Ｋ、Ｙ１８１Ｃ、Ｙ１８８Ｈ／Ｌ、Ｔ２１５Ｙ／Ｆ／Ｄの一又は複数を含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この出願は２００２年１０月２５日に出願された米国出願第１０／２８１３３３に対して優先権を主張し米国を除く全ての国を指定して２００３年１０月２４日に米国に国籍と住所を有する法人であるパーカー・ヒューズ・インスティテュート名義でＰＣＴ国際特許出願として出願されたものである。
【０００２】
［発明の背景］
最近の推定によれば、世界中で三億六千百万の人々がヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）に感染している（Gottlieb MS, 2001 N Engl J Med 344(23):1788-91及びSepkowitz KA. 2001 N Engl J Med 344(23):1764-72）。現在、臨床用途に利用できる多数の抗レトロウイルス薬があり、それらによってＨＩＶ感染個体の罹患率及び死亡率の有意な減少が達成されている。合衆国におけるＨＩＶ感染患者の現代の治療法は、一般には、３分類の抗レトロウイルス療法、すなわち、ヌクレオシド類似体逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体ＲＴ阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、及びプロテアーゼ阻害剤のうち、少なくとも２種の併用抗レトロウイルス療法である。併用療法での個々の薬剤は薬物耐性株を選択し、それによって将来の治療法選択肢を制約し得る多剤耐性ＨＩＶの蓄積をつくりだしうる。
【０００３】
現在利用できる抗ＨＩＶ剤は、米国や欧州における主なＨＩＶ株であるサブタイプＢのＨＩＶ-１株に対して開発されている。しかし、世界中のＨＩＶ感染個体の大部分は非サブタイプＢ株に感染しており、米国や欧州を含む世界中の新たな感染の大部分は非サブタイプＢ株によって引き起こされている（Hu等, 1996 JAMA 275: 210-6；Richman DD等, Current Protocols in Immunology, Jhon Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, NY, Suppl 8, Unit 12.9, pp. 1-21, 1993）。これらの非サブタイプＢ株は、一般に、普通に使用されている抗ＨＩＶ治療プロトコルによって影響は受けない。
【０００４】
従って、ＨＩＶの既知の薬物耐性株及び非サブタイプＢ株を含む耐性株に対して活性を持つ強力で効果的な抗ＨＩＶ剤を同定する必要性が存在する。
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、ＨＩＶの耐性株に感染した細胞中でのウイルス複製を阻害する方法において、式Ｉ
【化１】
2006510610.tif 000002
（上式中、Ｘは電子求引基で、Ｒ２はアミノ酸残基である）
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩のウイルス複製阻害量を感染細胞に投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明は、また、ＨＩＶの耐性株及び又はＨＩＶの非サブタイプＢ株に感染した患者を治療する方法において、式Ｉの化合物の治療的有効量を患者に投与することを含んでなる方法を提供する。
【０００６】
［発明の詳細な記載］
この出願において使用される全ての科学及び技術用語は特に断らない限り当該分野で一般的に使用されている意味を持つ。この出願において使用する場合、次の用語又は語句は示した意味を有する。
ここで使用される場合、「約」という用語は、その用語が明示的に示されているか否かに拘わらず、あらゆる数値に適用される。「約」という用語は一般に記載された値に均等であると（つまり同じ機能又は結果を有すると）当業者が考える範囲の数を意味する。多くの場合、「約」という用語は最も近い有効数字まで四捨五入した数を含みうる。
【０００７】
ここで用いられる場合、「その薬学的に許容可能な塩」には酸付加塩又は塩基塩が含まれる。
ここで用いられる場合、「薬学的に許容可能な担体」には、本発明の化合物と組み合わされると、化合物が、例えば白血病又は乳腫瘍細胞のアポトーシスの誘導能のような生物学的活性を保持するようにすることができ、かつ患者の免疫系に非反応性であるあらゆる物質が含まれる。例としては、限定されるものではないが、任意の標準的な薬学的担体、例えばリン酸塩緩衝食塩水、水、油／水エマルションのようなエマルション並びに様々なタイプの湿潤剤が含まれる。かかる担体を含有する組成物はよく知られた常法によって製剤される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Capter 43, 14版, Mack Publishing Co., Easton, PA）。
【０００８】
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸の任意のもの並びにその反対のエナンチオマー又は両エナンチオマーのラセミ混合物、合成類似体及びその誘導体を意味する。その用語には、例えばα-、β-、γ-、δ-及びω-アミノ酸が含まれる。好適な天然に生じるアミノ酸には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、スレオニン、セリン、メチオニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、及びヒスチジンが含まれる。合成又は非天然アミノ酸、例えばトリフルオロロイシン、ｐ-フルオロフェニルアラニン及び３-トリエチルアラニンを使用することができる。アミノ酸という用語にはアミノ酸のエステルが含まれる。エステルには、アルキル基が１から７の炭素原子、好ましくは１から４の炭素原子を有するもの、例えばメチル、エチル、プロピル及びブチルである低級アルキルエステルが含まれる。アミノ酸又はそのエステルのアミノ基は式Ｉのホスフェート基に結合する。
【０００９】
「電子求引基」という用語は、ハロ（-Ｂｒ、-Ｃｌ、-Ｉ、-Ｆ）、-ＮＯ２、-ＣＮ、-ＳＯ３Ｈ、-ＣＯＯＨ、-ＣＨＯ、-ＣＯＲ（ここで、Ｒは（Ｃ１からＣ４）アルキルである）等々の基を含む。
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、臭素（Ｂｒ）、塩素（Ｃｌ）、フッ素（Ｆ）及びヨウ素（Ｉ）の群から選択される原子を記述するのに使用される。
【００１０】
本発明の化合物
本発明の化合物には、以下の式Ｉ
【化２】
2006510610.tif 000003
（上式中、Ｘは電子求引基であり、Ｒ２はアミノ酸残基である）の化合物が含まれる。本発明の化合物はまたフェニル環に置換せしめられて、一を越える電子求引基を有しうる。本発明の一実施態様には、ＸがハロであるがＦではない式Ｉの化合物が含まれる。本発明の他の実施態様では、ＸはＢｒ、Ｃｌ、Ｉ及びＮＯ２、好ましくはＢｒ及びＣｌから選択される。本発明の更なる実施態様では、化合物は、２及び５位に２つの電子求引基Ｘを含み、好ましくは２位と５位の双方にＣｌを含む。本発明の更に他の実施態様では、本発明の化合物は４位にＣｌを、又は４位にＢｒを含む。本発明の一実施態様は、Ｒ２が、-ＮＨＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＯＣＨ３である式Ｉの化合物を含む。
【００１１】
本発明の一実施態様では、ｄ４Ｔ誘導体は、例えばハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、Ｉ）又はＮＯ２置換基でのオルト又はパラ置換体のような、電子求引基をアリール基が有するアリール-ホスフェート置換を有する。一例の式ＩＩＩの化合物を以下に示す。ここで、Ｒ２は、エステル化又は置換されうるアミノ酸残基、例えば-ＮＨＣＨ(ＣＨ３)ＣＯＯＣＨ３であり、又はその薬学的に許容可能な塩又はエステルである。
【化３】
2006510610.tif 000004
式ＩＩの化合物をここでは「化合物１１３」と呼ぶ。
【００１２】
本発明の化合物には、以下の実施例において更に十分に検討するように、強力な抗ウイルス活性を有する２'３'-ジデヒドロ-２'３'-ジデオキシチミジンの誘導体（以下、「ｄ４Ｔ」という）が含まれる。好ましいものはハロゲン置換体で、最も好ましくはパラ-ブロモ置換体である。
フェニル部分に単一のパラ-臭素基を有する式ＩＩＩの化合物は、速やかな加水分解を受けて、キーとなる活性代謝産物アラニニル-スタブジン-モノホスフェート（ａｌａ-ＳＴＶ-ＭＰ）を生じるその能力に寄与すると考えられる（Venkatachakam等, 1998, Biorg. Med. Chem. Lett., 8:3121-25）。
【００１３】
ｄ４Ｔ誘導体の合成
ｄ４Ｔ誘導体は、例えば次のように、当業者に知られているようにして調製することができる。ｄ４Ｔは、出典明示により開示がここに取り込まれるMansuri等, 1989, J. Med. Chem. 32:461において検討されている手順によってチミジンから調製することができる。適切に置換されたアリールホスホロクロリデートは、出典明示により開示がここに取り込まれるMcGuigan等, 1992, Antiviral Res., 17:311において検討されている手順によって調製することができる。ホスホロクロリデートは、Ｎ-メチルイミダゾールを含む無水ＴＨＦ中のｄ４Ｔ溶液に添加して所望の生成物を生成する。
【００１４】
ｄ４Ｔ誘導体は、薬学的に許容可能な担体、アジュバント又は希釈剤と共に活性剤としてｄ４Ｔ又はＡＺＴ誘導体を含む適切な組成物の形態で患者に投与される。所望される場合には徐放投薬形態も使用することができる。組成物は、例えばＨＩＶ逆転写酵素を阻害し、及び／又は宿主細胞においてＨＩＶの複製を阻害するのに十分な、適切な抗ウイルス量で抗ウイルス活性を必要とする患者に投与される。投与量は適切な投与計画に従って投与される。
【００１５】
塩
本発明の化合物は薬学的に許容可能な酸付加及び／又は塩基塩の形態とすることもできる。塩基塩は金属又はアミン、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンを用いて形成される。カチオンとして使用される金属の例はナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等々である。また含まれるのは重金属、例えば銀、亜鉛、コバルト及びセリウムである。好適なアミンの例はＮ,Ｎ'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールエミン、エチレンジアミン、Ｎ-メチルグルカミン、及びプロカインである。
【００１６】
薬学的に許容可能な酸付加塩は有機及び無機酸を用いて生成される。塩形成のための好適な酸の例は塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、蓚酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、グルコン酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸等々が含まれる。塩は、十分な量の所望の酸に遊離塩基形態を接触させて通常の形で一又は二塩等の塩をつくることによって調製される。遊離塩基形態は塩形態を塩基で処理することによって再生することができる。例えば水性塩基の希釈溶液を利用することができる。希水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、アンモニア及び炭酸水素ナトリウム溶液がこの目的に適している。遊離塩基形態は例えば極性溶媒中での溶解度のようなある種の物理的性質においてその各塩形態とは些か異なるが、塩はその他の点では本発明の目的に対してはその各遊離の塩基形態と均等である。
【００１７】
本発明の方法
本発明の一側面によれば、本発明の化合物はＨＩＶの耐性株に感染した細胞においてウイルス複製を阻害する方法に使用される。ウイルス複製の阻害には、限定されるものではないが、ウイルスが複製する速度を減少させ、新しい細胞が感染する速度を減少させることが含まれる。
本発明の別の側面によれば、本発明の化合物は、ＨＩＶの耐性株に感染した患者を治療する方法に使用される。ＨＩＶの耐性株に感染した患者の治療には、限定されるものではないが、ＨＩＶの耐性株による感染の進行を遅延させ、ＨＩＶの耐性株による感染に付随する徴候を減少させることが含まれる。
【００１８】
ここで使用される場合、「ＨＩＶの耐性株」は、少なくとも一の治療過程に応答しないか又は応答しなかった感染個体（「非応答者」）からＨＩＶの株を臨床的に単離することによって、一又は複数の抗ＨＩＶ薬に対して耐性であることが知られている株としてその遺伝子構成によって同定できるＨＩＶの株である。ＨＩＶの耐性株は、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）を含む一又は複数のクラスの抗ＨＩＶ薬に対して耐性である場合がある。ＨＩＶの耐性株の例には、限定されるものではないが、Ａ１７（ＮＮＲＴＩ耐性）、Ａ１７変異体（ＮＮＲＴＩ耐性）、及びＲＴ-ＭＤＲ（ＮＲＴＩ耐性及びＮＮＲＴＩ耐性）が含まれる。ＨＩＶの耐性株の例、その分類、及び耐性株の検査方法は、Shafer等 (2001) A guide to HIV-1 reverse transcriptase and protease sequencing for drug resistance studies, Human Retroviruses and AIDS, Theoretical Biology and Biophysics. Kos Alamos National Laboratories及びParkh等 2001 Mutations in Retroviral Genes Associated with Drug Resistance. Human Retroviruses and AIDS, Theoretical Biology and Biophysics. Kos Alamos National Laboratoriesに見出すことができる。
【００１９】
投与方法
本発明の化合物は医薬組成物として製剤化でき、選択された投与経路に適合させられた様々な形態でヒト患者を含む哺乳動物宿主に投与できる。組成物は好ましくは薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与され、ターゲティング抗体又はサイトカインを含む特定の送達剤と組み合わせることができる。
化合物は、一般的な非毒性の薬学的に許容可能な担体、アジュバント又はビヒクルを含む投薬単位製剤として、経口的、非経口的（皮下注射、静脈的、筋肉内、胸骨内又は注入技術を含む）、吸入噴霧、局所的、粘膜を通しての吸収、又は直腸的に投与され得る。本発明の医薬組成物は、経口投与に好適な懸濁液又は錠剤、点鼻薬、クリーム、滅菌注射可能製剤、例えば滅菌性の注射可能な水性又は油脂性懸濁液又は座薬の形態とできる。
【００２０】
懸濁液としての経口投与のためには、組成物は医薬製剤化分野でよく知られた技術に従って調製することができる。組成物は、嵩を賦与するためにマイクロクリスタリンセルロース、懸濁剤としてアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム、粘度増加剤としてメチルセルロース及び甘味料又は香味料を含みうる。即放錠剤としては、組成物は当該分野で既知のマイクロクリスタリンセルロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース又は他の賦形剤、バインダー、増量剤、錠剤分解物質、希釈剤及び潤滑剤を含みうる。
吸入噴霧又はエアロゾルによる投与に対しては、組成物は医薬製剤の分野でよく知られた技術に従って調製することができる。組成物は、生理食塩水の溶液として、ベンジルアルコール又は他の好適な保存料、生物学的利用能を増大させる吸収促進剤、フッ化炭化水素又は当該分野で一般的に知られている他の可溶化又は分散剤を使用して調製することができる。
【００２１】
注射可能な溶液又は懸濁液としての投与に対しては、組成物は、好適な分散又は湿潤及び懸濁剤、例えばオレイン酸を含む脂肪酸及び合成モノ-又はジグリセリドを含む滅菌油を使用して、当該分野においてよく知られた技術に従って製剤化できる。
座薬としての直腸投与に対しては、組成物は、室温で固体であるが直腸腔内で液化又は溶解して薬剤を放出する好適な非刺激性賦形剤、例えばココアバター、合成グリセリドエステル又はポリエチレングリコールと混合して調製することができる。
好適な投与経路には、経口的、非経口的、並びに静脈内、筋肉内又は皮下経路が含まれる。
【００２２】
より好ましくは、本発明の化合物は非経口的に、つまり静脈内又は腹腔内に、注入又は注射によって投与される。本発明の一実施態様では、化合物は腫瘍注射によって腫瘍に直接投与することができる。本発明の他の実施態様では、化合物は静脈内注射による全身送達を用いて投与することができる。
化合物の溶液又は懸濁液は水、等張性生理食塩水（ＰＢＳ）中で調製することができ、場合によっては非毒性界面活性剤と混合することができる。分散液はまた例えばグリセロール、液状ポリエチレン、グリコール、ＤＮＡ、植物油、トリアセチン及びその混合物中で既知の方法によって調製することができる。通常の保存及び使用条件下で、これらの調製物は、例えば微生物の成長を防止するために保存料を含みうる。
【００２３】
注射又は注入に適した医薬投薬形態は、滅菌水溶液又は分散液、滅菌注射可能又は注入可能溶液又は分散液の即時調製に適した活性成分を含有する滅菌パウダー等々を含みうる。最終的な投薬形態は滅菌性、流体で製造及び保存条件下で安定であることが好ましい。液状担体又はビヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、又は液状ポリエチレングリコール等々、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びその好適な混合物を含む溶媒又は液体分散体媒質でありうる。例えば、リポソームの生成、分散液の場合には要求された粒子サイズの維持、又は非毒性の界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等々によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖、緩衝液、又は塩化ナトリウムを含ませるのが望ましい。注射可能組成物の長期にわたる吸収は、組成物中に吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムヒドロゲル及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
【００２４】
滅菌注射用溶液は、上に挙げた様々な他の成分と共に適切な溶媒中に必要な量のコンジュゲートを導入し、必要に応じて濾過殺菌することによって調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌パウダーの場合には、好適な調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥法であり、これは活性成分とそれまでに滅菌濾過された溶液中に存在する任意の付加的な所望成分のパウダーを生じる。
【００２５】
薬物動態学
過去のインビトロ研究は、フェニル基のパラ位の電子求引基が加水分解速度を増加させて、未置換アリールホスフェート誘導体に対して重要な代謝物アラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェート（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ）の産生を増大させる(Venkatachalam等, Bioorg Med. Chef. Lett., 8,3121 (1998); Vig等, Antiviral Chem. Chemnother., 9, 445 (1998);及び米国特許第６０３０９５７号(Uckun等))。
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]はインビボで速やかに代謝されて、図１に示されるように、二種の代謝物：２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（ｄ４Ｔ）とアラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェート（Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ）が生成される。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰはまた更に代謝されてｄ４Ｔを生じる。代謝物ｄ４Ｔは細胞でのインビトロ研究ではこれまでは見出されていなかった。
【００２６】
ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は血漿又は全血中で速やかに代謝されてＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及び少量のｄ４Ｔを生成する。Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰは血漿と全血の双方において安定している。これらの結果は、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ又はｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の何れかの加水分解によってｄ４Ｔを生成させるには他の酵素（例えば肝臓の酵素）が必要とされることを示している。この仮定は肝臓ホモジェネートと共にｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]をインキュベートした後に有意な量のｄ４Ｔが生成されることに符合している。
【００２７】
排出半減期
静脈内投与されたｄ４Ｔの排出半減期は、以下の実施例に示されるように、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの静脈内投与後に生成されるｄ４Ｔの排出半減期にかなり類似している（３０．３分対３４．０分のｔ１／２）。これに対して、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の静脈内投与後に生成されたｄ４Ｔの排出半減期は有意に長くなった（１１４．８のｔ１／２）。同様に、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から生成されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの排出半減期は、静脈内投与されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰに対するｔ１／２より有意に長かった（１２９．２分対２８．５分のｔ１／２）。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の静脈内投与は、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]誘導代謝物の明らかに長い排出半減期のためにＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ又はｄ４Ｔの等モル用量の投与と比較してＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔの双方への長期の全身性暴露をもたらす。
【００２８】
静脈内投与後に、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の排出半減期（ｔ１／２）は３．５分で、１６０．９ｍｌ／分／ｋｇの全身クリアランス（ＣＬ）であった。全身クリアランス（ＣＬ）値の異なった推定値が、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の２種のジアステレオマー（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ａは２０８．２ｍｌ／分／ｋｇでありｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]Ｂは１２３．９ｍｌ／分／ｋｇである）に対して得られたが、双方とも３０分以内に完全に代謝した。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は活性代謝物Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ（２３％）及びｄ４Ｔ（２４％）に転換した。静脈内投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から生成されたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔのｔｍａｘ値はそれぞれ５．９分及び１８．７分であった。
【００２９】
生物学的利用能
経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]はまたＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔを主要代謝物として生成した。親のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は経口投与後の血液中には検出できなかった。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は胃液中で安定で、胃に吸収されうるが、血液中で速やかに加水分解しうる。他方、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は腸液中で即座に分解してＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰを生成する。この代謝物は腸に吸収され得、その後更に代謝されて血液中にｄ４Ｔを生じる。マウスでのｄ４Ｔに対するｔｍａｘ及びｔ１／２値は、経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から誘導された場合、経口投与されたｄ４Ｔからのものより長かった（それぞれ５分及び１８分）。静脈内投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]と比較して経口投与されたｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の場合は、ｔｍａｘ値は高いがｔ１／２値は低い。ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の経口投与後では、Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ及びｄ４Ｔの推定生物学的利用能はそれぞれおよそ１２％及び４８％であった。しかしながら、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]から代謝されたｄ４Ｔの生物学的利用能（４８％）は経口投与されたＤ４Ｔのもの（９８％）よりも低かった。
【００３０】
齧歯類種におけるｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]のインビボでの薬物動態学、代謝、毒性及び抗レトロウイルス活性は研究されている(Uckun等, ArzneimittelforschuraglDrug Research, 2002,(印刷中))。マウス及びラットでは、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]は、５００ｍｇ／ｋｇと高い単一の腹腔内又は経口大量瞬時投与用量レベルで検出可能な急性又は亜急性毒性なしに非常に良好な許容性を示した(Uckun等, 2002,(上掲))。顕著なことに、連続８週間までのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の毎日の腹腔内又は経口投与には、６．４ｇ／ｋｇと高い累積用量レベルでマウス又はラットにおいて如何なる検出可能な毒性も伴っていなかった(Uckun等, 2002, (上掲))。齧歯類種でのその安全性特性に従って、２５ｍｇ／ｋｇ−１００ｍｇ／ｋｇのｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]を含む硬ゼラチンカプセルの毎日２回の投与を含む４週のｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]処置過程は、８．４ｇ／ｋｇと高い累積用量でイヌ及びネコによって非常によく許容された(Uckun等, Antimicrob. Agents Chemother. (2002年提出))。
【００３１】
有用な用量
耐性ＨＩＶ株及び／又は非ＢサブタイプＨＩＶを阻害するためにインビボで使用される場合、投与される用量は、出血熱の一又は複数の徴候を低減し又は除去するのに十分なもののような、所望の効果を持つのに効果的なものである。適切な量は、本明細書と実施例に提供したインビボでの動物モデルデータから、既知の方法及び関係を使用して推定して、当業者により決定されうる。
一般に、生存時間の増加のようなＨＩＶ感染の徴候又は作用の低減を含む治療的処置を達成するのに効果的なｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体の用量は、約１−５００ｍｇ／ｋｇ体重／用量、好ましくは約１０−１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量のおよその範囲、及び週当たりおよそ８００−１０００ｍｇ／ｋｇ体重の累積用量である。
【００３２】
投与される有効用量は各患者に特定の条件によって変わる。一般に、ウイルス負荷、宿主年齢、代謝、疾病、薬物への前の暴露等々のような要因は薬剤の予想された効能に寄与する。当業者であれば、実施例に提供されたデータから推定して、標準的な手順と患者の分析法を使用して適切な用量を計算できる。一般に、約１−１００ｍｇ／ｋｇ体重を送達する用量が効果的であると予想されるが、より多いものも少ないものも有用であろう。
また、本発明の組成物は他の治療法と組み合わせて投与されうる。そのような併用療法では、化合物の投与用量は単一の薬剤療法に対するものよりも少なくてもよい。
【実施例】
【００３３】
本発明は、幾つかの実施態様を例証するためで如何なる場合も発明を限定するものではない次の実施例を参照して更に明らかにすることができる。
実施例１
ｄ４Ｔ誘導体の合成と特徴付け
ｄ４ＴをMansuri等, 1989, J. Med. Chem. 32:461の手順に従ってチミジンから調製した。適切に置換されたフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデートはまたMcGuigan等, 1992 Antiviral Res., 17:311によって報告された方法に従って調製した。化合物２−４は以下のスキーム１に概略を示したようにして合成した。
【化４】
2006510610.tif 000005
【００３４】
フェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデートを無水ＴＨＦ中のｄ４Ｔ及び１-メチルイミダゾールの溶液に添加し、混合物を室温で５−６時間攪拌した。反応混合物をまとめると、必要な誘導体が良好な収量で得られた。カラムクロマトグラフィーにかけて純粋な化合物を得た。
合成された化合物の物理データは、流量１ｍｌ／分で水／アセトニトリル７０：３０で溶出させるＣ１８の４ｘ２５０ｍｍ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラムを使用して実施したＨＰＬＣによって測定した。次の化合物の純度はＨＰＬＣで９６％を越えていた。星印で標識した１３Ｃ ＮＭＲピークはジアステレオマーのために分かれていた。化合物の物理データを以下に記載する。
【００３５】
化合物２：収率：８１％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２２２，２９８５，２９５４，１７４３，１６９３，１５９３，１４９１，１４５６，１２１３，１１５３，１０３９，９３１，７６９ｃｍ−ｌ；ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．３０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３０−７．１０（ｍ，６Ｈ），６．８５−６．８２（ｍ，１Ｈ），６．３６−６．２６（ｍ，１Ｈ），５．９１−５．８５（ｍ，１Ｈ），５．００（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），４．１９−３．６８（ｍ，４Ｈ），３．７２，３．７１（ｓ，３Ｈ），１．８３，１．８０（ｄ，３Ｈ），１．３８−１．２５（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．９，１６３．７，１５０．７，１４９．７，１３５．７＊，１３３．２＊，１２９．６＊，１２７．３＊，１２５．０＊，１２０．０，１１１．１，８９．６＊，８４．５＊，６６．９＊，５２．５＊，５０．０＊，２０．９及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．６６，３．２０；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量ｍ／ｅ ４８７．９（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間：５．５４及び５．８５分。
【００３６】
化合物３：収率：９２％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２２３，３０７２，２９９９，２９５３，２８３７，１７４３，１６９３，１５０６，１４４３，１２０７，１１５３，１１１１，１０３４，９３７，８３７及び７５６ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３０−７．００（ｍ，５Ｈ），６．８３−６．８１（ｍ，１Ｈ），６．３７−６．２７（ｍ，１Ｈ），５．９１−５．８６（ｍ，１Ｈ），５．００（ｂｒ ｍ，１Ｈ），４．４０−４．３０（ｍ，２Ｈ），４．２０−４．１０（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．９３（ｓ，３Ｈ），３．８２−３．８０（ｓ，３Ｈ），１．８５−１．８１（ｓ，３Ｈ）及び１．３９−１．２９（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７４．０，１６３．９，１５６．６，１５０．８，１４３．５，１３５．８＊，１３３．３＊，１２７．４＊，１２１．２＊，１１４．５，１１１．２，８９．７＊，８４．５，６６．９＊，５５．５，５２．５，５０．６＊，２０．９及び１２．３；３ｌＰ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．８２，３．２０；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量ｍ／ｅ ５１８．２（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間：５．８３及び６．２６分。
【００３７】
化合物４：収率：８３％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２０３，３０７０，２９５４，２８８７，２２４８，１７４３，１６９３，１４８５，１２２１，１１５３，１０３８，９１２，８３５，７３３ｃｍ−１；ｌＨ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．６０−９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．０９（ｍ，４Ｈ），６．３７−６．２７（ｍ，１Ｈ），５．９３−５．８８（ｍ，１Ｈ），５．０４−５．０１（ｂｒ ｍ，１Ｈ），４．３５−４．３３（ｍ，２Ｈ），４．２７−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．７０（ｓ，３Ｈ），１．８５−１．８１（ｓ，３Ｈ），１．３７−１．３１（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．７，１６３．８，１５０．８，１４９．７＊，１３５．６＊，１３３．１＊，１２７．４＊，１２１．９＊，１１８．０，１１１．２＊，８９．７＊，８４．４＊，６７．８＊，５２．５，５０．０＊，２０．７，ａｎｄ１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ３．４１，２．７８；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量ｍ／ｅ  ５６７．１（Ｍ＋Ｎａ）；  ＨＰＬＣ保持時間：１２．０４及び１２．７２分。
【００３８】
実施例２
図２Ａ及び２Ｂは代謝物前駆体Ｂ（図１参照）のフェニル環のパラ置換基の電子効果を表す概略図である。加水分解に対する化合物の感受性を評価するために、化合物２−４をメタノールに溶解させた後、０．００２ＮのＮａＯＨで処理した。濃度を一定に維持し、加水分解産物Ａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの生成を、ＨＰＬＣを用いてモニターした。Lichrospherカラム（Ｃ１８）をＨＰＬＣ実験に使用した。溶媒混合物７０：３０の水／アセトニトリルを使用して定組成条件下でカラムを溶出させた。溶出特性は図２Ｃに示す。
化合物の加水分解をブタ肝臓エステラーゼ系で試験した。データを図２Ｃに示す。化合物２及び４（トリスＨＣｌ中１ｍＭ）を３７℃で２時間、トリスＨＣｌバッファー（ｐH７．４）中で１００Ｕのブタ肝臓エステラーゼ（Sigma）と共にインキュベートした。アセトンを添加し反応混合物を冷却して反応を停止させた。１５０００ｘｇでの遠心分離の後、５０ｐｍｏｌの代謝物を検出可能な定量的分析用ＨＰＬＣ法を使用して活性な代謝物Ａ-ｄ４Ｔ-ＭＰが存在するかについて、反応混合物の０．１ｍＬアリコートを調べた。化合物４の反応生成物の０．１ｍＬアリコートは１．４ｎｍｏｌのＡ-ｄ４Ｔ-ＭＰを含む一方、化合物２の反応生成物中に代謝物は検出されなかった。
【００３９】
図２Ａ及び２Ｂに示すように、フェニル部分のパラ位に電子求引基が存在することが、ｄ４Ｔのフェニルホスフェート誘導体の代謝経路のカルボキシエステラーゼ依存性第１工程（図１、ＡないしＢ）によって生成される代謝物前駆体Ｂのフェノキシ基の加水分解速度を増加させるようである（図２Ａ及び２Ｂ）。フェニル環のパラ位の単一のブロモ置換基はカルボキシエステラーゼによるこの化合物の認識と加水分解に緩衝しないであろう（図１の工程ＡないしＢ）。電子求引パラブロモ置換基によって誘導される電子効果はフェノキシ基Ｃの加水分解を促進し、Ｄと続いて重要な代謝物Ａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの前駆体であるＥを生じるであろう。この仮説を試験するために、我々は、アラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェート（Ａ-ｄ４Ｔ-ＭＰ）の生成を測定することによって０．００２ＮのＮａＯＨでの処理後の化学的加水分解の速度について、未置換化合物２、パラ-メトキシ（ＯＣＨ３）置換化合物３、及びパラ-ブロモ置換化合物４（＝ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモ-フェニルメトキシアラニニルホスフェート]、つまりｄ４Ｔ-ｐＢＰＭＡＰ）を比較した。
図２Ｃに示すように、パラ-ブロモ置換を持つ化合物４は未置換化合物２よりも更に速い加水分解速度を示す一方、パラ位に電子求引基-ＯＣＨ３を有する化合物３はこれら二つの化合物の何れよりも遅い加水分解速度を有していた。同様に、リード化合物４は化合物２よりもブタ肝臓エステラーゼによる酵素的加水分解により感受性であった（図２Ｄ）。
【００４０】
実施例３
ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中での化合物２−４の細胞内代謝
ＴＫ欠損細胞中での化合物２−４の細胞内代謝を分析するために、１ｘ１０６のＣＥＭ細胞を化合物２−４（１００μＭ）と共に３時間インキュベートした後、ＨＰＬＣによって部分加水分解したホスフェートジエステル代謝物アラニニル-ｄ４Ｔ-モノホスフェートの生成を調べた。顕著なことに、化合物４で処理したＣＥＭ細胞中のこの代謝物の量は、化合物２又は３で処理したＣＥＭ細胞中よりも相当多かった（６８０ｐｍｏｌ／１０６細胞対＜５０ｐｍｏｌ／１０６細胞；図３）。
ＣＥＭ細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンからなる培地中で培養した。１０６細胞／ｍＬの密度の一千万の細胞を３７℃で３時間、１００μＭのこれらの化合物と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳで二回洗浄し、０．５ｍＬの６０％メタノールを添加して抽出した。細胞可溶化液を一晩−２０℃に維持した後、可溶化液を１５０００ｘｇで１０分間遠心分離して細胞片を除去した。これらの可溶化物の１００μＭのアリコートをＨＰＬＣに直接注入した。ＨＰＬＣシステムはクォータナリポンプ、オートサンプラー、電子デガッサ、ダイオードアレイ及びデータ解析のケムステーションソフトウェアプログラムをインストールしたコンピュータを備えたヒューレットパッカード（ＨＰ）１１００シリーズから構成されたものであった。試料を２５０ｘ４．６ｍｍのＳｕｌｐｅｌｃｏ ＬＣ-ＤＢ Ｃ１８カラムで溶出させた。溶媒勾配を用いて親化合物からの代謝物を溶解させたが、それはメタノールと１０ｍＭのリン酸アンモニウムの混合物（ｐＨ３．７）からなっていた。勾配は、最初の１０分が５から３５％メタノールまで１ｍＬ／分の流量で実施され、５分間３５％メタノールに維持され、次の２０分間が３５〜１００％メタノールの線形勾配で終了した。検出波長は２７０ｎｍに設定された。６８０ｐｍｏｌのＡ-ｄ４Ｔ-ＭＰに対応する８．７分の保持時間の代謝ピークが、化合物４と共にインキュベートしたＣＥＭ細胞可溶化液からのアリコート中にのみ検出された。
【００４１】
実施例４
化合物２−４の抗ＨＩＶ活性
加水分解に対するその高まった感受性のため、他の化合物よりも化合物４をより強力な抗ＨＩＶ薬剤であると推論した。化合物２−４並びに親化合物ｄ４Ｔ（１）について、過去に記載されている手順（Zarling等, 1990, Nature, 347:92；Erice等, 1993, Antimicrob. Agents Chemother., 37:835-838；Uckun等, 1998, Antimicrob. Agents Chemother., 42:383）を使用して末梢血単核細胞及びＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中におけるＨＩＶ複製を阻害するその能力を試験した。ウイルス複製の阻害パーセントを、試験物質で処理した感染細胞からのｐ２４及びＲＴ活性値を未処理の感染細胞からのものと比較することにより計算した。並行して、化合物の細胞障害性を、Zarling、Enrice及びUckunの文献（上掲）に記載されているように、細胞増殖のミクロ培養テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＡ）を使用して調べた。
表１に示すＨＩＶ-１複製の阻害に対するＩＣ５０値の類似性は、ｄ４Ｔ-アリールホスフェート誘導体が、ＨＩＶ-１感染末梢血単核細胞で試験した場合、親化合物ｄ４Ｔほど強力ではないことの証拠を提供している。過去の報告に一致し、ｄ４ＴのＨＩＶ-１複製阻害能はＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中で大きく減少した。ｄ４Ｔによるｐ２４産生阻害に対するＩＣ５０値は末梢血単核細胞において１８ｎＭであったが、ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中では５５６ｎＭであった。同様に、ＲＴ活性の阻害に対するＩＣ５０値は４０ｎＭから２３５５ｎＭまで増加した（表１）。３種全てのアリールホスフェート誘導体はＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中でｄ４Ｔよりもより強力であったが、アリール部分にパラ-ブロモ置換基を有する化合物４（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]）はｄ４Ｔよりもｐ２４の産生阻害が１２．６倍強力（ＩＣ５０値：４４ｎＭ対５５６ｎＭ）であり、ＲＴ活性阻害が４１．３倍強力（ＩＣ５０値：５７ｎＭ対２３５５ｎＭ）であった（表１）。
【表１】
2006510610.tif 000006
【００４２】
試験した化合物の何れも、ＭＴＡで測定して１００００ｎＭと高い濃度でも末梢血単核細胞又はＣＥＭ細胞に対して如何なる検出可能な細胞障害性も示さなかった。興味深いことに、アリール部分にパラ-メトキシ置換基を有する化合物３は、ＨＩＶ感染ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中におけるＲＴ活性阻害において化合物４より５．６倍効果が少なかったが（ＩＣ５０値：３２０ｎＭ対５７ｎＭ）、これら２つの化合物は末梢血単核細胞では類似した活性を示した（ＩＣ５０値：３３ｎＭ対４２ｎＭ）。よって、パラ-置換基の同一性がＴＫ欠損細胞中でのｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体の抗ＨＩＶ活性に影響を及ぼすと思われる。我々の知る限り、これは、ｄ４Ｔ-アリールホスフェート誘導体の効力並びに選択性指数を、アリール部分に単一のパラ-ブロモ置換基を導入することにより大幅に高めることができることの最初の証明である。ｄ４Ｔのホスフェート誘導体のアリール部分によって決定されるこのこれまで知られていない構造-活性関係は潜在的により効力のあるｄ４Ｔ類似体の設計の基礎を提供する。
【００４３】
実施例５
ＭＤＲ細胞中での化合物４及びＡＺＴの活性
ＨＩＶ-ＭＤＲ細胞に対する化合物４（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]）の活性を、ＡＺＴ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]（Ｐ-ＡＺＴ）及びＡＺＴと比較した。用いたインキュベーション及び分析方法は実施例３について上述した通りであった。
表２に示すように、Ｐ-ＡＺＴ及びＡＺＴは、ＩＣ５０値がそれぞれ１．５及び２．０ｎＭと類似の活性を有している。化合物４の活性（０．０２ｎＭ）はＡＺＴ（２．０ｎＭ）よりも１００倍効果的である。
【表２】
2006510610.tif 000007
【００４４】
実施例６
３ｄＴのアリールホスフェート誘導体の合成
更なる比較によって、３'-デオキシチミジン（３ｄＴ）のアリールホスフェート誘導体のアリール基における様々な置換の抗ＨＩＶ活性に対する効果を研究した。スキーム２に示すように、３ｄＴ（５）を、文献の手法（Mansuri等, 1989, J. Med. Chem., 32:461-466）を使用してチミジンから調製したｄ４Ｔ（１）から調製した。１の水素化を、Ｈ２及び触媒量の５％Ｐｄ／Ｃの存在下、エタノール中で実施して、３ｄＴ（５）を８５％の収率で得た。適切に置換されたフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデートをまたMcGuigan等, 1992, Antiviral Res, 17:311-321によって報告された方法に従って調製し、化合物６−１１をスキーム２に概要を示したようにして合成した。
【化５】
2006510610.tif 000008
【００４５】
適切に置換されたフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデートを無水ＴＨＦ中の３ｄＴ及び１-メチルイミダゾールの混合物に添加した。反応混合物を室温で１２時間、撹拌した後、溶媒を除去した。得られたガムをクロロホルムに再溶解し、１ＭのＨＣｌ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（ＮＯ２誘導体の場合を除く）及び次に水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４によって乾燥させ、溶媒を真空で除去した。粗生成物を、クロロホルム中５％のメタノールで溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、良好な収率で純粋な化合物６−１１を得た。
合成した化合物の物理データを測定した。ＨＰＬＣは、流量１ｍｌ／分で水／アセトニトリル７０：３０で溶出させるＣ１８の４ｘ２５０ｍｍ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラムを使用して実施した。次の化合物の純度はＨＰＬＣで９６％を越えていた。星印で標識した１３Ｃ ＮＭＲピークはジアステレオマーのために分かれていた。化合物の物理データを以下に記載する。
【００４６】
化合物５：収率：８５％；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１１．１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），５．９７−５．９４（ｍ，１Ｈ），５．１０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．０５−３．９５（ｍ，１Ｈ），３．７２−３．５２（ｍ，２Ｈ），２．３０−１．８６（ｍ，４Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１６３．９，１５０．４，１３６．４，１０８．７，８４．８，８１．４，６２．２，３１．８，２５．１，及び１２．５。
化合物６：収率：９６％；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２１１，２９５５，２８２１，１６８９，１４９１，１２６５，１２１１，１１５３，１０４３及び９３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０．１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．３２−７．１２（ｍ，５Ｈ），６．１４−６．０８（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．２１（ｍ，４Ｈ），４．０５−４．００（ｍ，１Ｈ），３．７０，３．６９（ｓ，３Ｈ），２．３７−２．３２（ｍ，１Ｈ），２．０５−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３８−１．３５（ｄｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．８，１５０．３，１５０．１＊，１３５．２，１２９．４＊，１２４．７，１１９．８＊，１１０．５＊，８５．７＊，７８．３＊，６７．２＊，５２．３，５０．１＊，３１．６＊，２５．４＊，２０．７＊，及び１２．４＊；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．８２及び３．１１；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：４９０．４（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝６．８６，７．３５分。
【００４７】
化合物７：収率：９６％；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２１７，２９５４，２８２１，１７４３，１６８９，１４８９，１２６５，１２１７，１１５３，１０９２，１０１２，９２６及び８３７ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４３−７．４１（ｍ，１Ｈ），７．３０−７．１４（ｍ，４Ｈ），６．１３−６．０７（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．００（ｍ，５Ｈ），３．７１，３．７０（ｓ，３Ｈ），２．３８−２．３６（ｍ，２Ｈ），２．０９−１．８９（ｍ，５Ｈ），１．３９−１．３６（ｄｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．７，１５０．２，１４８．８＊，１３５．３，１２９．５−１２９．０，１２１．５−１２１．３，１１６．３，１１０．６，８６．０＊，７８．４＊，６７．７＊，５２．６＊，５０．２＊，３１．８＊，２５．４＊，２０．９＊及び１２．５；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．８７＆３．０９；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：５２４．９（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝１４．０５，１４．８９分。
化合物８：粘性のある油、収率：９６％；λｍａｘ：２２３（ε３３３８）及び２６９（ε４６９５）ｎｍ；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２１１，２９５５，１７４３，１６９３，１５００，１５６９，１２６５，１１９７，１１５３，１０４５，９２３及び８４３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４３（ｄ，１Ｈ），７．１９−７．０１（ｍ，４Ｈ），６．１４−６．０６（ｍ，１Ｈ），４．３９−３．９７（ｍ，５Ｈ），３．７１，３．７０（ｓ，３Ｈ），２．３８−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３９−１．３５（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．７，１５０．２，１５０．１＊，１３５．３，１２１．５＊，１１６．３＊，１１０．６＊，８５．９＊，７８．４＊，６７．７＊，５２．６，５０．２＊，３１．８＊，２５．６＊，２０．９＊，及び１２．５；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．１３及び３．３７；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：５０８．２（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝８．３８，８．８０分。
【００４８】
化合物９：収率：８３％；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２１１，２９５４，１７４３，１６８９，１４８５，１２６５，１２１７，１１５３，１０１０，９２３及び８３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．１５−７．１１（ｍ，２Ｈ），６．１４−６．０６（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．００（ｍ，５Ｈ），３．７１，３．７０（ｓ，３Ｈ），２．３８−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３９−１．３５（ｄｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．８，１５０．３，１４８．５＊，１３５．２，１３２．６＊，１２１．８＊，１１７．７，１１０．６＊，８５．９＊，７８．３＊，６７．２＊，５２．５，５０．２＊，３１．６＊，２５．６＊，２０．８＊，及び１２．５；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．８３及び３．０５；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：５７０．０（Ｍ＋２＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝１５．５０，１６．５７分。
化合物１０：収率，８７％；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２０３，２９５５，１７４３，１６８４，１５９３，１５２２，１３４８，１２６５，１１５３，１１０１，９２０及び８６０ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．５１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．２４−８．２１（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３７（ｍ，３Ｈ），６．１３−６．０８（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．０３（ｍ，５Ｈ），３．７２，３．７１（ｓ，３Ｈ），２．３８−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．４１−１．３８（ｄｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．４＊，１６３．７，１５５．２＊，１５０．２，１４４．４，１３５．３，１２５．９−１２５．４，１２０．６＊，１１５．４，１１０．６＊，８６．１＊，７８．４＊，６８．１＊，５２．７，５０．２＊，３１．７＊，２５．８＊，２０．９＊及び１２．５；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．６０及び２．８１；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：５３５．０（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝８．１２，１０．１４分。
【００４９】
化合物１１：収率，１００％；ＩＲ（ｎｅａｔ）：３２０９，２９５４，１７４３，１５０６，１４６８，１２６５，１２０７，１１５３，１０３６，９３７及び８３５ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．８９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４９−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．１１（ｍ，２Ｈ），６．８４−６．８０（ｍ，２Ｈ），６．１５−６．０９（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．０２（ｍ，５Ｈ），３．７７，３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７４，３．７３（ｓ，３Ｈ），２．３８−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３８−１．３３（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．７＊，１６３．９，１５６．３，１５０．３，１４３．７＊，１３５．２，１２０．７＊，１１４．３＊，１１０．５，８５．７＊，７８．４＊，６７．３＊，５５．４，５２．４，５０．１＊，３１．８＊，２５．４＊，２０．８＊及び１２．４＊；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．２７及び３．５２；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：５２１．３（Ｍ＋１＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝７．１５，７．６６分。
【００５０】
実施例７
３ｄＴ化合物６−１１の抗ウイルス活性
化合物６−１１並びに親化合物３ｄＴを、過去に記載された手順（Zarling等, 1990, Nature, 347:92；Erice等, 1993, Antimicrob. Agents Chemother., 37(4):835-838；上掲のUckun等, 1998）を使用して末梢血単核細胞及びＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞におけるそのＨＩＶ-１複製阻害能についてｄ４Ｔと並列比較によって試験した。
３ｄＴ並びにその誘導体は末梢血単核細胞並びにＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞においてｄ４Ｔよりも活性が低かった（表３）。顕著なことには、末梢血単核細胞では、化合物６−１１に対するＩＣ５０［ＲＴ］値は３ｄＴのＩＣ５０［ＲＴ］値よりも大きく（１．２−３．１対０．７，表３）、これらのプロドラッグが十分に安定であり、その代謝、おそらくはその酵素的加水分解におけるＴＫ依存的工程は活性種の生成に対する律速段階である可能性があることを示唆している。これに対して、ｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体はｄ４Ｔよりも効力が強いことが報告されており、ｄ４Ｔ-モノホスフェートのＴＫ依存的生成がその代謝活性化における律速段階であることを示唆している（McGuigan等, 1996, Bioorg. Med. Chem. Lett., 6:1183-1186）。ｄ４Ｔ及びＡＺＴのアリールホスフェート誘導体の生物活性に関する文献において報告された結果によれば、３ｄＴのアリールホスフェート誘導体は、なお高いマイクロモルＩＣ５０［ＲＴ］値ではあるが、ＴＫ欠損細胞中でのＨＩＶ-１複製阻害において親化合物３ｄＴよりも活性であった（表３）。
化合物６−１１は末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）中よりもＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞において活性がより少なかったので、これらプロドラッグから生成する３ｄＴモノホスフェートのその活性なトリホスフェートへの転換がＴＫの不存在下でより遅い速度で生じると仮定された。比較すると、ｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体は正常細胞とＴＫ欠損細胞において類似の活性を示した（McGuigan等, 1996, Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:1183-1186）。
【００５１】
正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）及びＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中での３'-デオキシチミジンのアリールホスフェート誘導体（６−１１）の抗ＨＩＶ活性。  全てのデータはμＭで、ＭＴＡで測定して（ＩＣ５０［ＭＴＡ］）、５０％（ＩＣ５０［ＲＴ］）９又は５０％の細胞障害性濃度で、ウイルス活性を阻害するのに必要とされる濃度を表す（Mansuri等, 1989, J. Med. Chem., 32:461）。
【表３】
2006510610.tif 000009
【００５２】
図５Ａ及び５Ｂに示されるように、フェニル環のパラ置換基の電子効果は図１に示す３ｄＴのアリールホスフェート誘導体の代謝経路におけるＢからＤへの加水分解的転換に影響を及ぼすことになるはずである。フェニル部分のパラ位における電子求引基の存在は、化合物７−１０の置換フェノキシ基の加水分解速度を増加させることが予想された（図２Ａ及び２Ｂ）。しかしながら、これらの化合物はパラ置換のない化合物６又は電子供与パラ置換基を持つ化合物１１ほど活性ではなく、その代謝におけるカルボキシエステラーゼ依存性第１加水分解工程（図１のＡからＢ）が活性な３ｄＴ代謝物の生成の重要な律速的役割を担っているという仮説を促す。従って、化合物７−１０はヌクレオシド類似体のアリールメトキシアラニニルホスフェート誘導体に対して提案された代謝経路に従ってその加水分解の起因となる推定カルボキシエステラーゼのための比較的不十分な基質となりうる（McIntee等, 1997, J. Med. Chem. 40:3323-3331）。
要約すると、３ｄＴのアリールホスフェート誘導体は、非常に類似したヌクレオシド類似体ｄ４Ｔのプロドラッグ形態の代謝及び活性に関する公開文献から予想されるようには挙動しなかった。驚いたことに、３ｄＴのアリールホスフェート誘導体はＨＩＶ-１に感染した正常な末梢血単核細胞又はＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞株において有望な抗ＨＩＶ活性を誘発しなかった。
【００５３】
実施例８
ｄ４Ｔ、ＡＺＴ及び３ｄＴの誘導体の抗ＨＩＶ活性
スキーム３に示すように、ｄ４Ｔ（１）を、文献の手法（上掲のMansuri等, 1989）を使用してチミジンから調製した。１の水素化を、Ｈ２及び触媒量の５％Ｐｄ／Ｃの存在下、エタノール中で実施して、３ｄＴ（３）を８５％の収率で得た（スキーム３）。
ＡＺＴ（２）を文献の方法を使用してチミジンから調製した（Chu等, 米国特許第４８４１０３９号）。そのフェノキシ部分に異なった置換基を有するｄｄＮリン酸化剤５ａ、５ｂ及び５ｃは、二工程手順によって市販のフェノール類から調製したが（スキーム４）（上掲のMcGuigan等, 1992）、化合物４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、７ａ及び７ｂはこれまでに報告されている。化合物４ｃ及び５ｃは新規であり、その合成手順並びに特徴付けデータは以下に報告する。
【００５４】
ｄ４Ｔ（１）、ＡＺＴ（２）又は３ｄＴ（３）のフェニルメトキシアラニニルホスフェート誘導体の合成を、スキーム５に示すように文献（McGuigan等, 1992, Antiviral Res, 17:311-321）の条件に従って実施した。一般的合成手順は次の通りである：適切に置換されたフェニルメトキシアラニニルホスホロクロリデート５を無水ＴＨＦ中の所望のｄｄＮ（１、２又は３）と１-メチルイミダゾールの混合物に添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した後、溶媒を除去した。得られたガムをクロロホルムに再溶解し、１ＭのＨＣｌ、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び次に水で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４によって乾燥させ、溶媒を真空で除去した。粗生成物を、溶出のためにメタノールとクロロホルムの溶媒混合物を用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、良好な収率で所望の純粋化合物を得た。
【化６】
2006510610.tif 000010
【化７】
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【化８】
2006510610.tif 000012
【００５５】
ｐ-ブロモフェニルホスホロジクロリデート４ｃの合成。  上掲のMcGuigan等, 1993によって記載された手順に従って、無水Ｅｔ２Ｏ（１６５ｍＬ）中のｐ-ブロモフェノール（１３．２０ｇ；７６．３０ｍｍｏｌ）と蒸留したトリエチルアミン（１０．６５ｍＬ）の溶液を、窒素雰囲気下で３時間かけて０℃にて無水Ｅｔ２Ｏ（８３ｍＬ）中の塩化ホスホリル（８．５ｍＬ；９１．２ｍｍｏｌ）の激しく撹拌した溶液中に滴下して加えた。ついで、得られた混合物を室温まで徐々に温め、室温で一晩効果的に撹拌した後、加熱して２時間還流させた。反応混合物を室温まで冷却し吸引器圧下で濾過した。沈殿物を無水Ｅｔ２Ｏ（２ｘ５０ｍＬ）で洗浄した。混合したＥｔ２Ｏ層をロータリーエバポレーターで蒸発乾固させて粗生成物４ｃを淡黄色の油として得て、これをついで減圧蒸留して無色の粘性のある油として純粋な４ｃ（１４．０５ｇ；６３．５％収率）を得た（沸点１１０−１１５℃／２ｍｍＨｇ）。ＩＲ（Ｎｅａｔ）３０９５，１４８１，１３０３，１１８７，９４８，８２９ｃｍ−１。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），７．１５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）。ＧＣ／ＭＳ（ｍ／ｅ）２９０（Ｍ＋），２５４（Ｍ＋−Ｃｌ），１７３（Ｍ＋−ＰＯＣｌ２，８１Ｂｒ），１７１（Ｍ＋-ＰＯＣｌ２，７９Ｂｒ），１５６（Ｍ＋−ＰＯ２Ｃｌ２，８１Ｂｒ），１５４（Ｍ＋−ＰＯ２Ｃｌ２，７９Ｂｒ）。
【００５６】
ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスホロジクロリデート５ｃの合成。
（McGuigan等, 1992, Antiviral Res. 17:311-321）に記載された手順に従って、無水ＣＨ２Ｃｌ２（１８０ｍＬ）中の蒸留したトリエチルアミン（８．８０ｍＬ；６３．１４ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で３時間かけて−７０℃にて無水ＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中のｐ-ブロモフェニルホスホロジクロリデート４ｃ（８．６９ｇ；２９．９７ｍｍｏｌ）とＬ-アラニンメチルエステルハイドロクロライド（４．１９ｇ；３０．０２ｍｍｏｌ）の激しく撹拌した溶液中に添加漏斗を介して滴下して加えた。ついで、得られた混合物を室温まで徐々に温め、室温で一晩撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。無水Ｅｔ２Ｏ（３００ｍＬ）を添加して残渣を溶解させた後、吸引器圧で濾過して白色固体を取り除いた。白色固体を無水Ｅｔ２Ｏ（２ｘ６０ｍＬ）で洗い流した。Ｅｔ２Ｏ層を混合し蒸発乾固させて定量収率の５ｃ（１０．７ｇ）を淡紅黄色の粘性のある油として得た。ついで、この生成物を更に精製しないで次の反応工程に使用した。ＩＲ（Ｎｅａｔ）３２１２，２９８９，２９５２，１７４７，１４８３，１２７０，１２０９，１１４７，９２７，８３１，７５７ｃｍ−１。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．７０（１Ｈ，ｂｒ，Ａｌａ-ＮＨ），７．４８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，アリールＨ），７．１６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，アリールＨ），３．７９及び３．７７（３Ｈ，ｓ及びｓ，-ＯＣＨ３），１．５１及び１．４０（３Ｈ，ｄ及びｄ，Ａｌａ-ＣＨ３）。ＭＳ（Ｃｌ，ｍ／ｅ）３５７．９（Ｍ＋，８１Ｂｒ），３５５．９（Ｍ＋，７９Ｂｒ），３２２．０（Ｍ＋-Ｃｌ，８１Ｂｒ），３２０．０（Ｍ＋-Ｃｌ，７９Ｂｒ），２９７．９（Ｍ＋-ＣＯＯＣＨ３，８１Ｂｒ），２９５．９（Ｍ＋-ＣＯＯＣＨ３，７９Ｂｒ），１８４．０（Ｍ＋-ＢｒＣ６Ｈ４Ｏ）。
【００５７】
ＡＺＴ（１）、ｄ４Ｔ（２）及び３ｄＴ（３）のフェニルメトキシアラニニルホスフェート誘導体の特徴付けデータ：ＨＰＬＣは、流量１ｍｌ／分で水／アセトニトリル７０：３０で溶出させるＣ１８の４ｘ２５０ｍｍ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラムを使用して実施した。次の化合物の純度はＨＰＬＣで９６％を越えていた。星印で標識した１３Ｃ ＮＭＲピークはリン立体中心から生じるジアステレオマーのために分かれていた。
化合物６ａの特徴付けデータ：収率：８１％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２２２，２９８５，２９５４，１７４３，１６９３，１５９３，１４９１，１４５６，１２１３，１１５３，１０３９，９３１，７６９ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．３０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３０−７．１０（ｍ，６Ｈ），６．８５−６．８２（ｍ，１Ｈ），６．３６−６．２６（ｍ，１Ｈ），５．９１−５．８５（ｍ，１Ｈ），５．００（ｂｒ ｍ，１Ｈ），４．１９−３．６８（ｍ，４Ｈ），３．７２，３．７１（ｓ，３Ｈ），１．８３，１．８０（ｄ，３Ｈ），１．３８−１．２５（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．９，１６３．７，１５０．７，１４９．７，１３５．７＊，１３３．２＊，１２９．６＊，１２７．３＊，１２５．０＊，１２０．０，１１１．１，８９．６＊，８４．５＊，６６．９＊，５２．５＊，５０．０＊，２０．９及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．６６，３．２０；ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量ｍ／ｅ４８７．９（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間；５．５４及び５．８５分。
【００５８】
化合物６ｂの特徴付けデータ：収率：９２％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２２３，３０７２，２９９９，２９５３，２８３７，１７４３，１６９３，１５０６，１４４３，１２０７，１１５３，１１１１，１０３４，９３７，８３７及び７５６ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．４０（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．３０−７．００（ｍ，５Ｈ），６．８３−６．８１（ｍ，１Ｈ），６．３７−６．２７（ｍ，１Ｈ），５．９１−５．８６（ｍ，１Ｈ），５．００（ｂｒ ｍ，１Ｈ），４．４０−４．３０（ｍ，２Ｈ），４．２０−４．１０（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．９３（ｓ，３Ｈ），３．８２−３．８０（ｓ，３Ｈ），１．８５−１．８１（ｓ，３Ｈ）及び１．３９−１．２９（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７４．０，１６３．９，１５６．６，１５０．８，１４３．５，１３５．８＊，１３３．３＊，１２７．４＊，１２１．２＊，１１４．５，１１１．２，８９．７＊，８４．５，６６．９＊，５５．５，５２．５，５０．６＊，２０．９，及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．８２，３．２０；ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量ｍ／ｅ５１８．２（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間：５．８３及び６．２６分。
化合物６ｃの特徴付けデータ：収率：８３％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２０３，３０７０，２９５４，２８８７，２２４８，１７４３，１６９３，１４８５，１２２１，１１５３，１０３８，９１２，８３５，７３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．６０−９．５８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．３０−７．０９（ｍ，４Ｈ），６．３７−６．２７（ｍ，１Ｈ），５．９３−５．８８（ｍ，１Ｈ），５．０４−５．０１（ｂｒ ｍ，１Ｈ），４．３５−４．３３（ｍ，２Ｈ），４．２７−３．９８（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．７０（ｓ，３Ｈ），１．８５−１．８１（ｓ，３Ｈ），１．３７−１．３１（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．７，１６３．８，１５０．８，１４９．７＊，１３５．６＊，１３３．１＊，１２７．４＊，１２１．９＊，１１８．０，１１１．２＊，８９．７＊，８４．４＊，６７．８＊，５２．５，５０．０＊，２０．７，及び１２．３；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．４１，２．７８；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦｍａｓｓｍ／ｅ５６７．１（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間：１２．０４及び１２．７２分。
【００５９】
化合物７ｃの特徴付けデータ：収率：９５％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）３２０５．７，３０６６．３，２９５４．５．２１０９．８，１７４５．３，１６９１．３，１４８４．９，１２７０．９，１１５３．２，１０１０．５及び９２６．１ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．６９（１Ｈ，ｂｒ，３-ＮＨ），７．４５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，アリールＨ），７．３４及び７．３２（１Ｈ，ｓ及びｓ，ビニルＨ），７．１１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，アリールＨ），６．１８及び６．１３（ｌＨ，ｔ及びｔ，Ｊ＝６．６及び６．６Ｈｚ，Ｃ-１'のＨ），４．４４−３．７７（６Ｈ，ｍ，Ｃ-３'，４'及び５'のＨ，Ａｌａ-ＮＨ及びＡｌａ-ＣＨ），３．７３及び３．７２（３Ｈ，ｓ及びｓ，-ＣＯＯＣＨ３），２．５１−２．２０（２Ｈ，ｍ，ａｔＣ-２'のＨ），２．１８（３Ｈ，ｓ，Ｃ-５の-ＣＨ３），１．３９及び１．３６（３Ｈ，ｄ及びｄ，Ａｌａ-ＣＨ３）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７３．６，１６３．６，１５０．１，１４９．２，１４９．１，１３５．２，１３２．４，１２１．６，１１７．８，１１１．１，８５．０，８４．７，８１．９，８１．８，６５．５，６０．１，５９．９，５２．４，５０．０，４９．９，３６．９，２０．６，２０．５，１２．２．ＭＳ（Ｃｌ，ｍ／ｅ）５８９．１（Ｍ＋，８１Ｂｒ）及び５８７．１（Ｍ＋，７９Ｂｒ）。
化合物８ａの特徴付けデータ：収率：９６％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２１１，２９５５，２８２１，１６８９，１４９１，１２６５，１２１１，１１５３，１０４３及び９３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１０．１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４７（ｓ，１Ｈ），７．３２−７．１２（ｍ，５Ｈ），６．１４−６．０８（ｍ，１Ｈ），４．４１−４．２１（ｍ，４Ｈ），４．０５−４．００（ｍ，１Ｈ），３．７０，３．６９（ｓ，３Ｈ），２．３７−２．３２（ｍ，１Ｈ），２．０５−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３８−１．３５（ｄｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．８，１５０．３，１５０．１＊，１３５．２，１２９．４＊，１２４．７，１１９．８＊，１１０．５＊，８５．７＊，７８．３＊，６７．２＊，５２．３，５０．１＊，３１．６＊，２５．４＊，２０．７＊，及び１２．４＊；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．８２及び３．１１；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：４９０．４（Ｍ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝６．８６，７．３５分。
【００６０】
化合物８ｂの特徴付けデータ：収率，１００％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２０９，２９５４，１７４３，１５０６，１４６８，１２６５，１２０７，１１５３，１０３６，９３７及び８３５ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．８９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４９−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．１１（ｍ，２Ｈ），６．８４−６．８０（ｍ，２Ｈ），６．１５−６．０９（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．０２（ｍ，５Ｈ），３．７７，３．７６（ｓ，３Ｈ），３．７４，３．７３（ｓ，３Ｈ），２．３８−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３８−１．３３（ｔ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．７＊，１６３．９，１５６．３，１５０．３，１４３．７＊，１３５．２，１２０．７＊，１１４．３＊，１１０．５，８５．７＊，７８．４＊，６７．３＊，５５．４，５２．４，５０．１＊，３１．８＊，２５．４＊，２０．８＊及び１２．４＊；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．２７及び３．５２；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：５２１．３（Ｍ＋ｌ＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝７．１５，７．６６分。
化合物８ｃの特徴付けデータ：収率：８３％；ＩＲ（Ｎｅａｔ）：３２１１，２９５４，１７４３，１６８９，１４８５，１２６５，１２１７，１１５３，１０１０，９２３及び８３３ｃｍ−１；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．８２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．４５−７．４１（ｍ，３Ｈ），７．１５−７．１１（ｍ，２Ｈ），６．１４−６．０６（ｍ，１Ｈ），４．３９−４．００（ｍ，５Ｈ），３．７１，３．７０（ｓ，３Ｈ），２．３８−１．８９（ｍ，７Ｈ），１．３９−１．３５（ｄｄ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．８，１５０．３，１４８．５＊，１３５．２，１３２．６＊，１２１．８＊，１１７．７，１１０．６＊，８５．９＊，７８．３＊，６７．２＊，５２．５，５０．２＊，３１．６＊，２５．６＊，２０．８＊，及び１２．５；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．８３及び３．０５；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ）：５７０．０（Ｍ＋２＋Ｎａ）；ＨＰＬＣ保持時間＝１５．５０，１６．５７分。
【００６１】
実施例９
化合物６ａ−８ｃの抗ＨＩＶ活性
抗ＨＩＶ活性及び細胞障害性の細胞アッセイ。  抗ＨＩＶ活性を逆転写酵素活性アッセイに基づいてウイルス複製を５０％阻害するのに必要な化合物濃度（ＩＣ５０[ＲＴ]）を決定することにより、ＡＺＴ感受性ＨＩＶ-１（株：ＨＴＬＶＩＩＩＢ）-、ＡＺＴ及びＮＮＩ耐性ＨＩＶ-１（株：ＲＴＭＤＲ-１）-（ＮＩＨエイズ研究及び標準試薬計画, DIV.AIDS, NIAID, NIHのBrendan Larder博士より提供；カタログ番号２５２９）、又はＨＩＶ-２（株：ＣＢＬ-２０）感染末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）並びにＨＴＬＶＩＩＩＢ感染ＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞において評価した。ウイルス阻害パーセントを、試験物質で処理した感染細胞からのＲＴ活性値を未処理の感染細胞（つまりウイルスコントロール）からのＲＴ値と比較することにより計算した。化合物の５０％細胞障害濃度（ＣＣ５０[ＭＴＡ]）を２,３-ビス(２-メトキシ-４-ニトロ-５-スルホフェニル)-５-[(フェニルアミノ)-カルボニル]-２Ｈ-テトラゾリウム水酸化物（ＸＴＴ）を用いてミクロ培養テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＡ）によって測定した（Zarling等, 1990, Nature, 347:92；Enrice等, 1993, Antimicrob. Agents Chemother., 37:835-838；上掲のUckun等, 1998）。
【００６２】
効力の強い抗ＨＩＶ剤としてのｄ４Ｔ-５'-(パラ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート)及びＡＺＴ-５'-(パラ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート)の同定。  ｄ４Ｔ-フェニルホスフェート誘導体は、ＨＩＶ-１感染ＰＢＭＮＣで試験した場合、親化合物ほど強力ではなかった。ＨＩＶ-１複製を阻害するｄ４Ｔの能力はＴＫ欠損ＣＥＭ細胞において大幅に減少した。ｄ４ＴによるＲＴ活性阻害に対するＩＣ５０値はＰＢＭＮＣにおいて４０ｎＭであったが、ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中では２４００ｎＭであった（表４及び図４Ａ−４Ｆ）。３種全てのフェニルホスフェート誘導体はＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中でｄ４Ｔよりも強力であったが、フェニル部分にパラ-ブロモ置換基を有する化合物６ｃ（ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]）はｄ４ＴよりもＲＴ活性阻害が６０倍強力（ＩＣ５０値：６０ｎＭ対２４００ｎＭ）であった（表４）。
化合物の何れも、ＭＴＡで測定して１００００ｎＭと高い濃度でもＰＢＭＮＣ又はＣＥＭ細胞に対して如何なる検出可能な細胞障害性も示さなかった。興味深いことに、フェニル部分にパラ-メトキシ置換基を有する化合物６ｂは、ＨＩＶ感染ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中におけるＲＴ活性阻害において化合物６ｃより５倍効果が少なかったが（ＩＣ５０値：３００ｎＭ対６０ｎＭ）、これら２つの化合物は末梢血単核細胞では類似した活性を示した（ＩＣ５０値：３０ｎＭ対４０ｎＭ）（表４）。
【００６３】
化合物７ａ、７ｂ、７ｃ及び親化合物ＡＺＴ（２）についてＰＢＭＮＣ及びＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中におけるＨＩＶ複製を阻害するその能力を試験した（表４）。ウイルス複製の阻害パーセントを、試験物質で処理した感染細胞からのＲＴ活性値を未処理の感染細胞からのものと比較することにより計算した。並行して、化合物の細胞障害性を、細胞増殖のミクロ培養テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＡ）を使用して調べた。ＨＩＶ-１複製を阻害するＡＺＴ（２）の能力はＴＫ欠損ＣＥＭ細胞において大幅に減少していた。ＡＺＴによるＲＴ活性阻害に対するＩＣ５０値はＰＢＭＮＣにおいて３ｎＭであったが、ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中では２００ｎＭであった。対応するｄ４Ｔ誘導体とは異なり、ＡＺＴの未置換及びパラ置換フェニルホスフェート誘導体は、ＨＩＶ-１感染ＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞において試験した場合、親化合物ＡＺＴほど強力ではなかった。しかし、ＡＺＴのパラ-ブロモ置換フェニルホスフェート誘導体であるＡＺＴ-５'-(パラ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート)７ｃは、ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞のＨＩＶ複製阻害においてＡＺＴよりも５倍効果的であった（ＩＣ５０[ＲＴ]値：０．０４μＭ対０．２μＭ）。化合物の何れも、ＭＴＡで測定して１００００ｎＭと高い濃度でもＰＢＭＮＣ又はＣＥＭ細胞に対して如何なる検出可能な細胞障害性も示さなかった。
【００６４】
化合物８ａ−ｃ及びその親化合物３ｄＴ（３）についてＰＢＭＮＣ及びＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中におけるＨＩＶ複製を阻害するその能力を、ｄ４Ｔ（１）と並べて比較試験した。３ｄＴ並びにその誘導体は、末梢血単核細胞並びにＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中においてｄ４Ｔよりも活性が低かった（表４）。顕著なことに、末梢血単核細胞において、化合物８ａ−ｃに対するＩＣ５０[ＲＴ]値は３ｄＴのＩＣ５０[ＲＴ]値よりも高く（１．２−３．１対０．７、表４）、これらのプロドラッグが十分に安定であり、その代謝、おそらくはその酵素的加水分解におけるＴＫ依存的工程は活性種の生成に対する律速段階である可能性があることを示唆している。ｄ４Ｔ及びＡＺＴのフェニルホスフェート誘導体の生物活性に関する文献において報告された結果によれば、３ｄＴのフェニルホスフェート誘導体は、なお高いマイクロモルＩＣ５０［ＲＴ］値ではあるが、ＴＫ欠損細胞中でのＨＩＶ-１複製阻害において親化合物３ｄＴよりも活性であった（表４及び図４Ａ−４Ｆ）。化合物８ａ−ｃはＰＢＭＮＣ中におけるよりもＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中で活性が少なかったので、我々は、これらのプロドラッグから生成される３ｄＴモノホスフェートのその活性なトリホスフェートへの転換がＴＫの不在下で更に遅い速度で生じると考える。
【表４】
2006510610.tif 000013
【００６５】
化合物６ａ、６ｂ及び６ｃはＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中では親ｄ４Ｔ（１）よりも全て効力が強いが、これらのｄ４Ｔ-フェニルホスフェート誘導体（６ａ、６ｂ及び６ｃ）はＨＩＶ-１感染ＰＢＭＮＣ中では親ｄ４Ｔ（１）ほど強い効力ではない（表４）。フェニルメトキシアラニニルホスフェート誘導体化ｄ４Ｔの全てを比較すると、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]６ｃがＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中における最も強い抗ＨＩＶ剤である。この知見は、６ｃのフェニル部分のパラ-ブロモ置換基がそのリンの能力を高めてブロモ置換基の電子求引性のために加水分解を受け（図２）、ＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中に大幅に高い量の重要な代謝物ｄ４Ｔモノホスフェートを生じることに起因するものであろう（McIntee等, 1997, J. Med. Chem. 40:3233-3331）。
【００６６】
ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中におけるフェニル、メトキシフェニル及びブロモフェニルホスフェート誘導体の効能はまたｄ４Ｔ誘導体の場合と同じ傾向になる。つまり７ｃ（ブロモフェニル）＞７ａ（フェニル）＞７ｂ（メトキシフェニル）である。しかしながら、ＡＺＴの３種のフェニルメトキシアラニニルホスフェート誘導体（７ａ、７ｂ及び７ｃ）の中で７ｃだけがＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中においてＡＺＴよりも高い効能を示した（ＩＣ５０値：４０ｎＭ対２００ｎＭ）。３ｄＴのフェニルメトキシアラニニルホスフェート誘導体に対しては（表４）、フェニル部分のパラ位における電子求引基の存在は化合物８ｃの置換フェノキシ基の加水分解速度を増大させることが予想された（例えば図２のＢからＣ）。しかしながら、８ｃはパラ置換のない化合物８ａ又は電子供与パラ置換基を持つ化合物８ｂほど活性ではなく、その代謝におけるカルボキシエステラーゼ依存性第１加水分解工程（例えば図２のＡからＢ）が活性な３ｄＴ代謝物の生成の重要な律速的役割を担っているという仮説を促す。我々は、化合物８ａ、８ｂ及び８ｃがヌクレオシド類似体のフェニルメトキシアラニニルホスフェート誘導体に対して提案された代謝経路に従ってその加水分解の起因となる推定カルボキシエステラーゼのための比較的不十分な基質となりうる（図２）と考える。３ｄＴのアリールホスフェート誘導体は非常に類似したヌクレオシド類似体ｄ４Ｔのプロドラッグ形態の代謝及び活性に関する公開文献から予想され得たようには挙動しなかった。更に驚いたことには、３ｄＴのアリールホスフェート誘導体はＨＩＶ-１感染正常末梢血単核細胞又はＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞株中において有望な抗ＨＩＶ活性を誘発しなかった。
【００６７】
要約すると、ｄ４Ｔ-５'-[ｐ-ブロモ-フェニルメトキシアラニニルホスフェート]６ｃ及びＡＺＴ-５'-[ｐ-ブロモ-フェニルメトキシアラニニルホスフェート]７ｃは、何ら検出可能な細胞障害性を示すことのないＴＫ欠損ＣＥＭ Ｔ細胞中におけるＨＩＶ複製を効果的に阻害する活性な抗ＨＩＶ剤として同定された。これらのｄ４Ｔ及びＡＺＴ誘導体に比較して、対応する３ｄＴ誘導体である３ｄＴ-５'-(パラ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート)はＰＢＭＮＣ又はＴＫ欠損 Ｔ細胞中のおいて有意な抗ＨＩＶ活性を示さなかった。我々の知る限り、これは、ｄ４Ｔ及びＡＺＴのフェニルホスフェート誘導体の効力を決定する過去には認められていない構造活性の最初の包括的な報告である。化合物６ｃ及び７ｃの更なる開発はＴＫ欠損細胞におけるＨＩＶ複製を阻害可能な効率的なＨＩＶ治療方策に対する基礎を提供しうる。
【００６８】
実施例１０
異なったＨＩＶ株に対するＤ４-Ｔ誘導体の活性
この実施例では様々なＨＩＶ株に対する１２のｄ４-Ｔ誘導体の活性を比較した。
化学薬品は、社内で合成したｄ４Ｔを除いて全てＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaulee, WI）から購入した。全ての合成は窒素雰囲気下で実施した。１Ｈ、１３Ｃ及び３１Ｐ ＮＭＲはＣＤＣｌ３中、室温にてＶａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ３００機器で得た。ＦＴ-ＩＲスペクトルはＮｉｃｏｌｅｔ Ｐｒｏｔｅｇｅ４６０分光計で記録した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量スペクトルはＦｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ９５システムを使用して得た。ＵＶスペクトルは、１ｃｍのセルパス長を持つＢｅｃｋｍａｎｎ ＵＶ-ＶＩＳ分光光度計（モデル３ＤＵ７４０００）を使用して記録した。ＨＰＬＣ精製は逆相Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒカラム（２５０ｘ４ｍｍ、Hewlett-Packard, RP-18, カタログ番号７９９２５）と水（７０％）とアセトニトリル（３０％）からなるアイソクラティック流（１ｍｌ／分）を使用して達成した。アルカリ化学的加水分解はテフロン張り反応バイアル中に水酸化ナトリウム（０．０５Ｎ、１ｍｌ）と１０ｍｇの基質を含むメタノール溶液３ｍｌを用いて室温で実施した。溶液を磁気攪拌機を使用して攪拌し反応混合物のアリコートをＨＰＬＣに注入した。出発物質の消失を時間の関数としてモニターした。単分子反応の速度を一次反応式を使用して得た。ＨＰＬＣ実験は時間間隔を変えて、経時的に基質ピークの消失を測定して、実施した。
【００６９】
抗ＨＩＶ-１活性のインビトロアッセイ。  ＨＩＶ陰性のドナーからの正常なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、加湿された５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で１時間の吸着時間の間、０．１の感染効率（ＭＯＩ）でＨＩＶ-１に曝す前に、２０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、３％のインターロイキン-２、２ｍＭのＬ-グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、及び４μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニンを補填したＲＰＭＩ１６４０中で７２時間培養した。続いて、細胞を、様々な濃度のｄ４Ｔホスホロアミデートの存在下で９６ウェルマイクロタイタープレート（１００ｍＬ／ウェル、２ｘ１０６細胞／ｍＬ）中で培養し、培養物上清の一定分量を、過去に記載されているようにして（Uckun等, 1998, Antimicrobial Agents and Chem., 42(2):383-388）、ｐ２４抗原アッセイのために感染７日目にウェルから取り除いた。適用したｐ２４酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ社／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社(Westbrooke, ME)から市販されている未修飾動態学アッセイであり、試験培養上清試料中に存在する抗原が結合するマイクロウェルストリップ上にコートされたＨＩＶコアタンパク質に対してマウスｍＡｂを利用する。ウイルス阻害パーセントは未処理の感染細胞（つまりウイルスコントロール）からのｐ２４値と比較することによって計算した。
【００７０】
分配係数。  オクタノール／水分配係数を振盪フラスコ法によって決定した。ホスホロアミデート類似体をガラスバイアルに入れた２ｍｌの水及び２ｍｌのオクタノールに添加した。混合物を室温で４時間振盪した。二相を注意深く分離しミリポアフィルターで濾過しＨＰＬＣで分析した。分配係数を、オクタノール及び水それぞれの曲線下の面積比を使用して計算した。
統計的解析。  線形化した等式の指数形態の非線形回帰モデリングを使用して３通りのウェルの各セットからＩＣ５０値を計算した。平均ＩＣ５０値は各ポンプ内の変動を均一化するためにｌｏｇ１０変換した。異なった化合物群に対する平均ＩＣ５０値間の差異を調べるために不対応ｔ検定を実施した。加水分解速度はアルカリ条件下での化合物の消失に単一指数減衰方程式を適合させることによって決定した。化合物のＩＣ５０値を、線形モデルに適合させることにより(JMP Software, SAS Institute Inc.)、ｌｏｇ変換加水分解速度定数と相関させた。０．０５未満のｐ値は有意であると判断された。
【００７１】
標的とされるスタブジンのホスホロアミデート誘導体はスキーム６に従って合成した。
【化９】
2006510610.tif 000014
合成した化合物の特徴付けデータを以下にまとめる。
【００７２】
５'-[３-ジメチルアミノフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（ＤＤＥ５９９）。収率：０．８３ｇ（１８％）；融点：６１−６２℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．９３（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｂｒ ｍ，１Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９７（ｍ，１Ｈ），６．４４（ｍ，３Ｈ），６．２４（ｍ，１Ｈ），５．８１（ｍ，１Ｈ），４．９４（ｍ，１Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），４．０８（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．６４＊（ｍ，３Ｈ），２．８６（ｓ，６Ｈ），１．７７＊（ｍ，３Ｈ），１．２８＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．７＊，１６３．９＊，１５１．３＊，１５０．８＊，１３５．５＊，１３２．９＊，１２９．５＊，１２６．９＊，１１１．０＊，１０８．８＊，１０７．２＊，１０３．７＊，８９．３＊，８４．４＊，６６．７＊，６６．１＊，５２．３＊，４９．９＊，４０．２，２０．７，１２．２；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．３２，２．７０；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４４８，３０５０，２９５２，１６９１，１５０６，１４５０，１２４７，１１４３，９９９ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２０３，２０６，２１，２５８ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５３１．１６１９（Ｃ２２Ｈ２９Ｎ４Ｏ８Ｐ＋Ｎａ＋）；ＨＰＬＣｔＲ３．３６分。
５'-[２,６-ジメトキシフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'-デオキシチミジン（ＤＤＥ６００）。収率：０．６０ｇ（１３％）；融点：５１−５３℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．７８（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｂｒ ｄ，１Ｈ），６．９５（ｍ，３Ｈ），６．４８（ｍ，３Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），５．８１（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｍ，３Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｍ，６Ｈ），３．６３＊（ｍ，３Ｈ），１．７４＊（ｄ，３Ｈ），１．２９＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．７＊，１６３．９＊，１５１．７＊，１５０．８＊，１３５．７＊，１３３．１＊，１２８．４，１２６．８＊，１２５．０＊，１１０．９＊，１０４．８＊，８９．２，８４．６＊，６６．８，５５．８＊，５２．２＊，４９．７＊，４９．４＊，２１．０＊，１１．８＊，３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ４．９７，４．２８；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４３２，３０７２，２９５０，１６９１，１４８３，１２６１，１１１２，９３１ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２１０，２６７ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５２６．１５７０（Ｃ２２Ｈ２８Ｎ３Ｏ１０Ｐ＋Ｈ＋）；ＨＰＬＣｔＲ６．５５分。
【００７３】
５'[５'-[３-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'デオキシチミジン（ＤＤＥ６０２）。収率：０．６７ｇ（１４％）；融点：４７−４８Ｃ；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．６５（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．１１（ｍ，５Ｈ），６．９７（ｍ，１Ｈ），６．２６（ｍ，１Ｈ），５．８７（ｍ，１Ｈ），４．９８（ｍ，１Ｈ），４．２６（ｍ，３Ｈ），３．９３（ｍ，１Ｈ），３．６７＊（ｍ，３Ｈ），１．７６＊（ｍ，３Ｈ），１．３２＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．５＊，１６３．８＊，１５０．６＊，１３５．４，１３２．８＊，１３０．６，１２８．０，１２７．３＊，１２３．３＊，１２２．３＊，１１８．８＊，１１１．１，８９．５＊，８４．４＊，６７．２，６６．６，５２．６，５０．０＊，２０．７＊，１２．３＊，３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．３６，２．７４；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４３２，３０７０，２９５４，１６８５，１４７３，１２４７，９４１ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２０８，２１３，２６７ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５４４．０４８６（Ｃ２０Ｈ２３ＢｒＮ３Ｏ８Ｐ＋Ｈ＋）；ＨＰＬＣｔＲ１０．３０，１０．６５分。
４-ブロモ-２-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'デオキシチミジン（ＤＤＥ６０３）。収率：０．８９ｇ（１７％）；融点：５１−５２℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．５２（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｍ，２Ｈ），７．２２（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｍ，１Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），５．９０（ｍ，１Ｈ），５．００（ｍ，１Ｈ），４．３３（ｍ，２Ｈ），４．１９（ｍ，１Ｈ），４．０１（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｓ，１Ｈ），１．７９＊（ｍ，３Ｈ），１．３１＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．５＊，１６３．８＊，１５０．８，１４５．５＊，１３５．３，１３２．８＊，１３０．９，１２７．３＊，１２６．２＊，１２２．７＊，１１７．８＊，１１３．３＊，８９．６＊，），８４．３＊，６７．５＊，６７．１，５２．６，５０．１，２０．８＊，１２．３＊；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．１１，２．５４；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４１５，３２２２，３０７２，２９５２，１６９１，１４７５，１２４５，１０８５，１０３５，９２９ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２１５，２６７ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５７８．０１０５（Ｃ２０Ｈ２２ＢｒＣｌＮ３Ｏ８Ｐ＋Ｈ＋）；ＨＰＬＣｔＲ１８．６３，２０．６３分。
【００７４】
５-[２-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'デオキシチミジン（ＤＤＥ６０５）。収率：０．３６ｇ（１９％）；融点：４５−４６℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．５５（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｍ，２Ｈ），７．２４（ｍ，２Ｈ），６．９９（ｍ，２Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），５．８８（ｍ，１Ｈ），５．００（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），１．８０＊（ｍ，３Ｈ），１．３０＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．６＊，１６３．８＊，１５０．８，１４７．３＊，１３５．４＊，１３３．０＊，１２８．５＊，１２７．２＊，１２６．１＊，１２１．３＊，１１４．４＊，１１１．３＊，８９．６＊，８４．３＊，６７．２＊，５２．５，５０．１＊，２９．６，２０．８＊，１２．４；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．９８，２．３７；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４３２，３０７２，２９５４，１６８５，１４７５，１２４５，１０８９，９３３ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２０７，２６７ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５４４．０４６９（Ｃ２０Ｈ２３ＢｒＮ３Ｏ８Ｐ＋Ｈ＋）；ＨＰＬＣｔＲ８．３７，９．２３分。
５'-[２-クロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'デオキシチミジン（ＤＤＥ６０６）。２．１０ｇ（４７％）；融点：４３−４５℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．８０（ｓ，１Ｈ），７．３９（ｍ，１Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１３（ｍ，１Ｈ），７．０１（ｍ，１Ｈ），６．９２（ｍ，１Ｈ），６．２４（ｍ，１Ｈ），５．８１（ｍ，１Ｈ），４．９４（ｍ，１Ｈ），４．２８（ｍ，３Ｈ），３．９６（ｍ，１Ｈ），３．５９＊（ｍ，３Ｈ），１．７２＊（ｍ，３Ｈ），１．２５＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．５＊，１６３．８＊，１５０．８，１４５．９＊，１３５．３＊，１３２．７＊，１３０．０，１２７．５＊，１２７．０＊，１２４．８＊，１２１．２＊，１１１．０＊，８９．３＊，８４．３＊，６６．９，５２．３，４９．８＊，２０．５，１２．１＊，３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．２３，２．６７；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３２０９，３０７０，２９５２，１６９１，１４８１，１２４５，１０３５，９３１ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２１４，２１５，２１９，２６７ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５００．１０２８（Ｃ２０Ｈ２３ＣｌＮ３Ｏ８Ｐ＋Ｈ＋）；ＨＰＬＣｔＲ７．６２，８．３２分。
【００７５】
５'-[２,５-ジクロロフェニルメトキシアラニニルホスフェート]-２',３'-ジデヒドロ-３'デオキシチミジン（ＤＤＥ６０８）。収率：０．６８ｇ（３０％）；融点：４２−４４℃；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ９．４３（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，２Ｈ），７．０４（ｍ，１Ｈ），６．９９（ｍ，１Ｈ），６．３２（ｍ，１Ｈ，５．８８（ｍ，１Ｈ），４．９９（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｍ，３Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），１．７７＊（ｍ，３Ｈ），１．３３＊（ｍ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７３．５＊，１６３．８，１５０．８，１４６．４＊，１３５．３，１３２．７＊，１３０．７，１２７．４，１２５．８，１２３．７＊，１２１．７＊，１１１．２＊，８９．６＊，８４．３＊，６７．１＊，５２．６，５０．１，２９．６，２０．７＊，１２．３＊；３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．２４，２．６０；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４２３，３２０５，３０７２，２９５４，１６９１，１４７５，１２４５，１０９３，９４６ｃｍ−１；ＵＶ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ２１１，２１６，２２０，２６８ｎｍ；ＦＡＢ ＭＳｍ／ｚ５３４．０５８１（Ｃ２０Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ３Ｏ８Ｐ＋Ｈ＋）；ＨＰＬＣｔＲ１３．１８分。
【００７６】
化合物の抗ＨＩＶ活性を、過去に記載されている手順（Uckun等, 1998, Antimicrobial Agents and Chem., 42(2):383-388）を使用して末梢血単核細胞中におけるＨＩＶ複製を阻害するその能力を評価することによって調べた。ウイルス複製の阻害パーセントを、試験物質で処理した感染細胞からのｐ２４抗原レベルを未処理の感染細胞からのものと比較することにより計算した。
４-Ｂｒ置換を持つ過去に記載された化合物１１３、４-Ｆ置換を持つ化合物６０４、及び４-Ｃｌ置換を持つ化合物６０９並びにパラ位に電子求引ＣＮ基が置換された化合物６０１、及び二重のハロ置換を有する化合物６０３及び６０８を含むパラ位にモノ-ハロ置換を持つ全ての化合物（表５を参照）が僅かに１ｎＭのＩＣ５０値を有していた。２-又は３-位にモノ-ハロ置換を持つ化合物は４-位にモノ-ハロ置換を持つ化合物（平均ＩＣ５０＝１．０±０．０ｎＭ、Ｐ＜０．００１）よりも活性が少なかった（平均ＩＣ５０＝２．３±０．３）。化合物５９８、５９９及び６００を含む電子供与基が置換された化合物はまた４-位にモノ-ハロ置換を持つ化合物よりも活性が低いように思われた（平均ＩＣ５０＝１１．７±６．７ｎＭ、Ｐ＝０．０１７）。従って、電子求引基の存在はこの群のヌクレオシド類似体の抗ＨＩＶ活性を高めると思われる。
【００７７】
次に、スタブジンのアリールホスフェート誘導体の抗ＨＩＶ効力がその親油性又は加水分解速度から予想できるかどうかを決定した。Ｓｉｄｄｉｑｕｉ等（Siddiqqui等, 1999, J. of Med. Chem., 42:4122-4128）の仮説と異なり、スタブジンのアリールホスフェート誘導体の親油性はそのＨＩＶ-１に対する生物活性とは相関しなかった（Ｒ２＝０．０６、ｔ＝０．８６，Ｐ＝０．４）。類似の又は同一の分配係数を有する化合物は広範囲のＩＣ５０値を有していた（表１）。例えば、化合物６００及び６０７は化合物５０８と同じ分配係数を有していた。しかし、そのＩＣ５０値は、化合物５９８のＩＣ５０値よりも、それぞれ５０％高く（６ｎＭ対４ｎＭ）、５０％低かった（２ｎＭ対４ｎＭ）。フェニル環における２-Ｂｒ、２-Ｃｌ及びＮ(ＣＨ３)２置換基は２−２．５倍高い分配係数によって反映されるように、親油性を増大させるが、抗ＨＩＶ効力は増大させず、３-Ｎ(ＣＨ３)２置換の場合には＞１０倍の活性損失を生じさせた。
【００７８】
図１はｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体の文献で提案された代謝経路を示す。フェニル部分のパラ位における電子求引基の存在は、これらのアリールホスフェート誘導体の代謝経路のカルボキシエステラーゼ依存性第一工程によって生じる代謝前駆体Ｂのフェノキシ基の加水分解速度を増加させると思われる。我々の先の刊行物（Venkatachalam等, 1998, Bio. Med. Chem. Lett., 8:3121）において、我々は、電子求引基によって誘導される電子効果がフェノキシ基Ｃの加水分解を促進し、重要な代謝物Ａｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの前駆体であるＤ及び続いてＥを生じると考えた。アルカリ条件を使用する化学的加水分解は電子求引基がこれらホスホロアミデート誘導体の構造中に存在している場合にはＡｌａ-ｄ４Ｔ-ＭＰの生成量を増加させた（Venkatachalam等, 1998, Bio. Med. Chem. Lett., 8:3121）。大幅に多量のＡ-ｄ４Ｔ-ＭＰ（活性なｄ４Ｔ-ＭＰ代謝物の重要な前駆体）を生じる加水分解に対する感受性の増加のため、その構造に電子求引基を含む化合物はそのような置換基を持たない化合物よりもより高い効力の抗ＨＩＶ剤であると考えられた。この仮説は表６及び図５にまとめた実験データによって強く裏付けられる。電子求引基の付加は加水分解速度（図５Ａ）及び化合物の効力（図５Ｂ）を増加させた。電子供与基（すなわち、３-Ｎ(ＣＨ３)２、ジ-ＯＭｅ及び４-ＯＭｅ）を持つ三種の化合物は最も低い加水分解速度を有しており、効力が最も低かった。加水分解速度とＩＣ５０値のｌｏｇ１０変換値間には逆線形関係があった（Ｒ２＝０．４２、ｔ＝−２．８，Ｐ＝０．０１７）
【００７９】
【表５】
2006510610.tif 000015
【００８０】
実施例１１
様々なＨＩＶ株に対するＤ４-Ｔ誘導体の活性
この実施例ではＨＩＶ-１のＨＴＬＶＩＩＩＢ、ＲＴＭＤＲ、Ａ１７及びＡ１７Ｖ株に対するスタブジンと１３種のスタブジンのフェニルホスホロ-アミデート誘導体の抗ウイルス活性を調べた（表６）。
【表６】
2006510610.tif 000016
【００８１】
スタブジン（ｄ４Ｔ）は１８ｎＭのＩＣ５０値でＨＴＬＶＩＩＩＢを阻害した。１３種のスタブジン誘導体のうち１２種はスタブジンよりも実質的に更に効力があり、ナノモル濃度でＨＴＬＶＩＩＩＢを阻害した。
同様に、全ての化合物がナノモルＩＣ５０値でＨＩＶ-１のＮＮＲＴＩ耐性Ａ１７及びＡ１７変異体株に対して強い活性を示した。化合物１１３、６０８及び６０９は、２０から６０ｎＭの範囲のＩＣ５０値で、ＮＲＴＩ耐性並びにＮＮＲＴＩ耐性ＨＩＶ-１株ＲＴＭＤＲに対して最も効力が高いことが見出された。
ＨＴＬＶＩＩＩＢ及びＡ１７に対する合成化合物の抗ＨＩＶ活性はアルカリ加水分解に対するその感受性並びにハメットσ値と相関していた（図６）。ＲＴＭＤＲに対する抗ＨＩＶ活性はまたハメットσ値と相関していた（表７）。各株に対するウイルス複製の阻害（ＩＣ５０値）は、ノンパラメトリック回帰解析（スピアマン順位）を使用すると、ハメットσ、加水分解速度の二つの物理化学的パラメータの各々と相関していた。スピアマンＲｈｏ値は順位データで計算して相関の強さを測定した。
【表７】
2006510610.tif 000017
要約すると、我々はスタブジンのアリールホスホロアミデート誘導体を合成し、様々なウイルス株に対してのその活性を調べた。我々のデータは、フェニル環にハロ置換を持つホスホロアミデート誘導体がＨＩＶ-１の耐性株に対して強い抗ウイルス活性を有していることを確証するものである。
【００８２】
実施例１２
様々なＨＩＶ株の臨床分離株に対するＤ４-Ｔ誘導体の活性
本実験の目的は初代臨床ＨＩＶ-１分離株に対するＤ４-Ｔ誘導体の抗レトロウイルス活性を評価することにあった。
抗ＨＩＶ薬。  化合物１１３、つまりＳＴＶ-５'[パラ-ブロモフェニルメトキシアラニニルホスフェート]の調製のための合成手順は過去に記載されている。ジドブジン（ＺＤＶ）／ＡＺＴ（Glaxo Wellcome）、ラミブジン（ＬＭＶ）／３ＴＣ／エピビル（Glaxo Wellcome）、スタブジン（ＳＴＶ）／ｄ４Ｔ／ゼリット（Cristol-Myers Squibb Co）、ネルフィナビル（ＮＬＶ）／ビラセプト（Agouran）及びネビラピン（ＮＶＰ）（Boehringer Ingelheim/Roxane）をパーカー・ヒューズ・インスティテュートの研究医薬部から取得した。
ウイルス。  遺伝子型及び／又は表現型がＮＲＴＩ耐性の２０の初代臨床分離株（D. Richman研究室で単離）と表現型がスタブジン耐性の１０の臨床分離株（ＮＩＡＩＤの エイズ研究標準試薬計画(AIDS Research and Reference Reagent Program)から取得）を現在の実験に使用した。ＨＩＶ-１株ＨＴＬＶＩＩＩＢ（野生型ＲＴ、ＮＲＴＩ感受性、ＮＮＲＴＩ感受性）、Ａ１７（Ｙ１８１Ｃ変異体、ＮＮＲＴＩ耐性）、Ａ１７変異体（Ｙ１８１Ｃ＋Ｋ１０３Ｎ変異体、ＮＮＲＴＩ耐性）及びＲＴ-ＭＤＲ（Ｍ４１Ｌ、Ｖ１０６Ｎ、Ｔ２１５Ｙ；ＮＲＴＩ耐性、ＮＮＲＴＩ耐性）をまたＮＩＡＩＤのエイズ研究標準試薬計画から取得した。
【００８３】
抗ウイルス感受性アッセイ。  ＨＩＶ-１分離株及び株の表現型薬物耐性実験を、過去に記載されているようにして（Uckun, 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37(4): 835-38）、定量的Ｃｏｕｌｔｅｒ ＨＩＶ-１ｐ２４抗原酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びＨＩＶ-１ｐ２４抗原動態学基準(Antigen Kinetic Standard)（Beckman Coulter）を使用し抗ＨＩＶ剤の濃度を増加させた状態で血清陰性の健康な志願者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中でのｐ２４ｇａｇタンパク質の産生を測定することによって実施した。施設内倫理委員会によって承認を受けた同意書を使用して、ＤＨＨＳガイドラインに従って供血者からインフォームドコンセントを得た。簡単に記載すると、ＰＢＭＣを、加湿された５−７％ＣＯ２雰囲気中、３７±１℃で１時間の吸着時間の間、０．００１−０．１の感染効率でＨＩＶに曝す２４−７２時間前に、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活化ウシ胎仔血清、５％のヒトインターロイキン-２（Zeptometrix）、２ｍＭのＬ-グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、及び５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン-Ｐ（ＰＨＡ-Ｐ）（Ｓｉｇｍａ）を補填したＲＰＭＩ１６４０中で７２時間培養した。続いて、細胞を、０．０００１μＭから１００μＭの範囲の６−７通りの異なった濃度の抗ＨＩＶ剤の存在下で９６ウェルマイクロタイタープレート（１００ｍＬ／ウェル；２ｘ１０６細胞／ｍＬ、三組のウェル）中で培養し、培養物上清のアリコート２５μＬを、過去に記載されているようにして（Uckun, 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(4):835-38）、ｐ２４ＥＩＡのために感染６日目にウェルから取り除いた。コントロールには未感染及び未処理細胞（バックグラウンドコントロール）及び感染しているが未処理の（ウイルスコントロール）細胞を含めた。ｐ２４ＥＩＡは、試験培養上清試料中に存在する抗原が結合するマイクロウェルストリップをコートするために使用されるＨＩＶコアタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を利用する。ウイルス阻害パーセントは未処理の感染細胞（つまりウイルスコントロール）からのｐ２４値と試験物質で処理した感染細胞からのｐ２４値を比較することによって計算した。ＩＣ５０値はＳｔａｔｖｉｅｗ統計プログラム(SAS Institute, Inc.)を使用して決定した。並行して、細胞生存度に対する様々な処理の影響をまた過去に記載されているようにして調べた（Uckun, 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42:383-388）。簡単に記載すると、非感染ＰＢＭＣを同一実験条件下で５日間各化合物を用いて処理した。ミクロ培養テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＡ）を実施して細胞増殖を定量した（Uckun, 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42:383-388）。細胞増殖を５０％阻害する細胞障害性濃度（ＣＣ５０値）をＳｔａｔｖｉｅｗ統計プログラム(SAS Institute, Inc.)を使用して決定した。
【００８４】
プラーク形成アッセイ。  合胞体フォーカス（プラーク）アッセイはＨＩＶの感染性の定量化を可能にする。簡単に記載すると、ＣＤ４発現ＨｅＬａ細胞株（ＨＴ４-６Ｃ）（ＮＩＡＩＤの エイズ研究標準試薬計画）を、ウイルス接種菌液（１００プラーク形成単位）及び数種の濃度の抗ウイルス剤の存在下で２．５−３．０ｘ１０４細胞／ｍｌにて２４ウェル組織培養皿中で培養する。抗ウイルス剤の添加前に２時間のインキュベーション時間の間、ウイルスを最初に添加した。細胞を３日培養し、培養物を、１００％メタノール中に１５分間皿を浸漬し、５分間０．３％のクリスタルバイオレットで染色し、倒立顕微鏡を用いて各ウェル中のプラークを計数することによって、合胞体形成についてアッセイした（Uckun, 1998, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(4):835-38）。プラーク形成の阻害パーセントは、試験物質で処置した感染細胞からのプラーク数を、未処置の感染細胞（つまりウイルスコントロール）からのプラーク数と比較することによって計算した。ＩＣ５０値はＳｔａｔｖｉｅｗ統計プログラム(SAS Institute, Inc.)を使用して決定した。
【００８５】
統計的解析。  各薬剤（ＺＤＶ、化合物１１３、ＳＴＶ、３ＴＣ、ネビラピン、ネルフィナビル）を、０．０００１μＭから１００μＭの範囲の６−７通りの異なった濃度で試験した。各アッセイは、三組のウェルで設定し、１−３回繰り返した。ＩＣ５０及びＩＣ９０値は、線形化した等式の指数形態の非線形回帰モデリングを使用して３通りのウェルの各セットから計算した。初代ＨＩＶ-１臨床分離株では、ＳＴＶ耐性及びＺＤＶ耐性分離株に対して別個に阻害データを評価した。阻害定数は、各群内の変動を均一化するためにｌｏｇ１０変換した。化合物１１３及びＳＴＶ又はＺＤＶに対するＩＣ５０／ＩＣ９０値の平均間の差異を調べるために対応ｔ検定を実施した。０．０５未満のＰ値は有意であると判断された（JMP Software, SAS）。
ＨＩＶ-１分離株及び株の表現型薬物感受性実験を、過去に記載されているようにして、定量的Ｃｏｕｌｔｅｒ ＨＩＶ-１ｐ２４抗原酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びＨＩＶ-１ｐ２４抗原動態学基準（Beckman Coulter）を使用し抗ＨＩＶ剤の濃度を増加させた状態で血清陰性の健康な志願者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中でのｐ２４ｇａｇタンパク質の産生を測定することによって実施した。指数等式の線形化形態（ｌｎＹ＝ｌｎｂ０＋ｂ１Ｘ；ここで、Ｙ＝阻害％、Ｘ＝薬剤濃度）を使用して３通りのウェルの各セットからＩＣ５０値を計算するのにＳｔａｔＶｉｅｗを使用した。阻害定数は、各群内の変動を均一化するためにｌｏｇ１０変換した。各ウイルス株にわたって化合物１１３及びＳＴＶ又はＺＤＶに対するＩＣ５０値の平均間の差異を調べるために対応ｔ検定を実施した。０．０５未満のＰ値は有意であると判断された（JMP Software, SAS）。
【００８６】
１０のジドブジン感受性臨床ＨＩＶ-１分離株に対してスタブジン及びジドブジンと並列比較した化合物１１３の抗ＨＩＶ活性を、これらの分離株の一つに感染したヒトＰＢＭＣ中におけるＨＩＶ-１ｐ２４抗原産生に対するその効果を評価することによって調べた。南アメリカ、アジア、サハラ以南のアフリカからの起源のこれら分離株の９種が非Ｂエンベロープサブタイプ（Ａ＝２、Ｃ＝２、Ｆ＝３、Ｇ＝２、表８）を有していた。これらの分離株に対するスタブジンのＩＣ５０及びＩＣ９０はそれぞれ０．１μＭから０．８μＭ（平均±ＳＥ＝０．２４±０．０７μＭ）及び１．０μＭから４０．９μＭ（平均±ＳＥ＝６．３８±３．８９μＭ）の範囲であった。比較すると、これらの分離株に対するジドブジンのＩＣ５０及びＩＣ９０はそれぞれ０．００１μＭから０．０１μＭ（平均±ＳＥ＝０．００４±０．００１μＭ）及び０．０１１μＭから０．０９μＭ（平均±ＳＥ＝０．０５±０．０１μＭ）の範囲であった。これに対して、化合物１１３のＩＣ５０及びＩＣ９０はそれぞれ０．００２±０．００１μＭ及び０．０３±０．０１μＭであった。従って、表８に示すように、化合物１１３はこれらの臨床分離株に対してスタブジン（Ｐ＜０．０００１；対応ｔ検定）又はジドブジン（ＩＣ５０に対してＰ＝０．０４、ＩＣ９０に対してＰ＝０．０３；対応ｔ検定）よりも強い効力であった。顕著なことに、表現型的にスタブジン耐性のＨＩＶ-１分離株、例えばＢＲ／９２／２５及びＢＲ／９３／２９は化合物１１３に対して極めて感受性であった（表８）。
【００８７】
【表８】
2006510610.tif 000018
【００８８】
ＮＩＨ・エイズ研究標準試薬計画を通して実験室株を手に入れた。全ての初代ＨＩＶ-１分離株は、過去に記載された培養技術を用いてＮＲＴＩで処理されたＨＩＶ感染個体の末梢血白血球から回収した。薬物感受性アッセイを、材料と方法に記載されたようにして、ＰＢＭＣ又はＭＴ-２細胞（ＲＴ-ＭＤＲのみ）を使用して実施した。ＣＣ５０値はネビラピンと化合物１１３の双方に対して＞１００μＭであった（データは示さず）。
これらの１７の実験の内、７の実験において、我々はＰＢＭＣに対する化合物１１３の細胞障害性を調べた。７の実験の各々において、ＣＣ５０値は＞１００μＭであった。よって、化合物１１３の選択性指数（ＳＩ＝ＣＣ５０／ＩＣ５０）は＞１０００００であった。同様に、ジドブジンの平均ＣＣ５０値は９５．６±２．９μＭで、対応する選択性指数（ＳＩ＝ＣＣ５０／ＩＣ５０）は３１８６７であった。比較すると、スタブジンの平均ＣＣ５０値は４．５±１．７μＭで、対応するＳＩはほんの１９６であり、ラミブジンの平均ＣＣ５０値は５５±４５μＭで、対応するＳＩはほんの１３７５であった。よって、化合物１１３はジドブジン、スタブジン又はラミブジンよりも良好な選択性指数を有していた。
【００８９】
ついで、ＮＲＴＩ感受性実験室株ＨＴＬＶＩＩＩＢに対する化合物１１３のインビトロ抗ＨＩＶ活性をそれぞれ三組実施した１７の独立した実験において評価した。試験は、８の実験においてスタブジンと、１３の実験においてジドブジンと、３の実験においてラミブジンと、６の実験においてネルフィナビルと、６の実験においてネビラピンと並列比較した（表９）。化合物１１３はナノモルＩＣ９０値の強い抗ＨＩＶ-１分離株活性を示し、ＮＲＴＩジドブジン、スタブジン又はラミブジンよりも一貫して顕著により効果的であった：化合物１１３の平均ＩＣ５０及びＩＣ９０値はそれぞれ０．００１±０．０００μＭ及び０．０５２±０．０２４μＭであった。比較すると、スタブジンの平均ＩＣ５０及びＩＣ９０値はそれぞれ０．０２３±０．００８μＭ及び１．４７０±０．６１４μＭであった（Ｐ＜０．００１、表９）。同様に、ラミブジンの平均ＩＣ５０及びＩＣ９０値は化合物１１３のものよりも相当（Ｐ＜０．００１）高かった（それぞれ０．０４０±０．０２５μＭ及び１．８２４±０．７４７μＭ；表９）。ジドブジンと比較すると化合物１１３はまた良好なＩＣ５０及びＩＣ９０値を有していた（ＩＣ５０：０．００１±０．０００対０．００３±０．００１、Ｐ＜０．００１；ＩＣ９０：０．０４５±０．０２８対０．０９３±０．０３４、Ｐ＜０．０５）。更に、化合物１１３は６の独立した実験の各々においてＮＮＲＴＩネルフィナビル又はネビラピンよりもより効果的であった（表９）。
【００９０】
【表９】
2006510610.tif 000019
【００９１】
次に、我々は、２０の遺伝子型的及び／又は表現型的にジドブジン耐性の初代ＨＩＶ-１臨床分離株に対する抗ＨＩＶ活性を調べた（表１０）。これら２０の分離株の１１に対してのジドブジンのＩＣ５０は＞１μＭであり、残りの９の分離株に対するＩＣ５０値は＞０．１μＭであった（平均±ＳＥ＝１．６±０．５μＭ）。１９の分離株の遺伝子型を解析し、それぞれがＮＲＴＩ耐性に関連する２−５のＴＡＭを有していることが分かった。ジダノシン耐性を付与するＬ７４Ｖ変異が一つの分離株（Ｘ２６７-１）中に見出され、多剤耐性変異Ｆ１１６Ｙが一つの分離株（Ｘ２６７-５）中に見出された。表１０に示すように、化合物１１３は、８．７±２．８ｎＭ（範囲：＜１ｎＭから４２ｎＭ）の平均ＩＣ５０値を持つその表現型又は遺伝子型ジドブジン耐性の程度に関わりなくこれらの分離株の各々に対してナノモル濃度で活性であった。顕著なことに、５のＴＡＭを持つ表現型的に高度にジドブジン耐性のＧ１９０-６及びＧ７０４-２分離株はそれぞれ２．８ｎＭ及び３．２ｎＭのＩＣ５０値で化合物１１３によって阻害された。ジドブジン耐性分離株に対してのジドブジンに対する化合物１１３の優位性は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定；表１０）。よって、表現型又は遺伝子型ジドブジン耐性は化合物１１３耐性には付随していない。
【００９２】
【表１０】
2006510610.tif 000020
【００９３】
顕著なことに、５のＴＡＭを持つ表現型的に高度にジドブジン耐性のＧ１９０-６及びＧ７０４-２分離株（ジドブジンＩＣ５０値＞１０μＭ）はそれぞれ２．８ｎＭ及び３．２ｎＭの平均ＩＣ５０値で化合物１１３によって阻害された。これらの知見は、化合物１１３が、表現型及び／又は遺伝子型ＮＲＴＩ耐性特性を持つ初代ＨＩＶ-１臨床分離株の高度に効力の高い阻害剤であるとの証拠を提供する。遺伝子型及び／又は表現型ＮＲＴＩ耐性初代ＨＩＶ-１臨床分離株並びに齧歯類及び非齧歯類動物において好ましい毒性特性を持つ非Ｂエンベロープサブタイプに対する化合物１１３の文献記載のインビトロ効力及びＨＩＶ感染Ｈｕ-ＰＢＬ ＳＣＩＤマウス並びにＦＩＶ感染ネコにおけるそのインビボ抗レトロウイルス活性この有望な新しいＮＲＴＩ化合物の更なる開発を正当化する。
【００９４】
我々は、ＣＤ４発現ＨｅＬａ細胞株ＨＴ４-６Ｃを使用する同胞体フォーカス（プラーク）形成アッセイにおいて９つの異なるジドブジン耐性初代ＨＩＶ-１臨床分離株に対する化合物１１３の抗ウイルス活性をまた調べた。表１１に示すように、化合物１１３は７９．４±１８．７ｎＭの平均ＩＣ５０値のナノモルＩＣ５０値で濃度依存的な形で各分離株の感染性を阻害したが、そのＩＣ５０値は同じ分離株に対するジドブジンの３．９±１．０μＭのＩＣ５０値よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０００１、ｌｏｇ１０変換値に対する対応ｔ検定）。
【表１１】
2006510610.tif 000021
【００９５】
Ｌ１００１、Ｋ１０３Ｎ、Ｖ１０６Ａ、Ｅ１３８Ｋ、Ｙ１８１Ｃ及びＹ１８８Ｈ／Ｌを含む、何十もの変異体株をＮＮＲＴＩ化合物に耐性があるものと特徴づけた。特に、Ｙ１８１Ｃ及びＫ１０３Ｎ変異体は、調べたＮＮＲＴＩ化合物の殆どに耐性であるので、最も処理が困難である可能性がある。従って、次に、我々は、ヒト末梢血単核細胞中におけるＹ１８１Ｃ、Ｋ１０３Ｎ、Ｖ１０６Ａ又はＹ１８８Ｌ変異を持つＨＩＶ-１株／分離株の複製を阻害する化合物１１３の能力を、ｐ２４ｇａｇタンパク質産生の測定によって、調べた。化合物１１３はヒト末梢血単核細胞中においてナノモルＩＣ５０値で、Ｙ１８１Ｃ変異体ＨＩＶ-１株Ａ１７、Ｙ１８８Ｌ変異体初代ＨＩＶ-１臨床分離株Ｃ４６７-４及びＹ２０７-７、Ｋ１０３Ｎ変異体初代ＨＩＶ-１臨床分離株Ｘ-１６５-９及びＳ-１５９-２、Ｙ１８１Ｃ＋Ｋ１０３Ｎ二重変異体ＨＩＶ-１株Ａ１７変異体、Ｙ１８１Ｃ＋Ｋ１０３Ｎ二重変異体初代ＨＩＶ-１臨床分離株Ｘ-１６５-８の複製を阻害した（表１１）。初代ＨＩＶ-１臨床分離株に対する化合物の平均ＩＣ５０値は１１．２±６．５ｎＭであった。これらの臨床ＨＩＶ-１分離株はまたＮＲＴＩ耐性を付与する更なるＲＴ遺伝子変異を有しており、ジドブジン耐性表現型を提示する（表９及び表１０参照）。同様に、化合物１１３は、ヒトＴ細胞株ＭＴ２中においてナノモル以下のＩＣ５０値で、ＮＲＴＩ耐性関連ＲＴ変異体Ｍ４１Ｌ及びＴ２１５Ｙをまた有する多剤耐性のＶ１０６Ｎ変異体ＨＩＶ-１株ＲＴ-ＭＤＲの複製を、１００μＭ濃度でさえ細胞障害性を何ら示すことなく、阻害した（表１２）。
【００９６】
【表１２】
2006510610.tif 000022
【００９７】
Ｍ４１Ｌ、Ｄ６７Ｎ、Ｋ７０Ｒ及びＭ１８４Ｖのようなジドブジン耐性分離株に観察された多くのＴＡＭはパーム上の触媒部位及び触媒部位の近くのフィンガードメインから１０Åの距離内に残基を含み、阻害剤の結合及び／又は阻害剤取り込みの動的過程を損なうと思われる。顕著なことには、化合物１１３は、変異体の幾つかはスタブジン-トリホスフェート結合部位から３−１０Å以内であるがナノモル濃度でこれらの分離株の各々を阻害することが可能であった。最後に、ヌクレオシド類似体とは異なり、ＮＮＲＴＩは、触媒部位からおよそ１０−２０Å離れているＨＩＶ-１ＲＴのアロステリック部位に結合する。ＮＮＲＴＩ結合は回転異性体のコンホメーション変化をある残基（Ｙ１８１及びＹ１８８）に誘導し、サム領域をより堅牢にする。双方の事象が結果的に基質結合様式を改変し及び／又は二重ストランドの転位置に影響を及ぼすが、これがおそらくはＲＴのポリメラーゼ機能に重要であり、よって酵素の非競合的阻害を生じる。化合物１１３のようなヌクレオシド類似体は理論的にはＮＮＲＴＩ結合ポケットにおける変異に感受性ではないはずである。我々の予想に一致し、化合物１１３はＮＮＲＴＩ結合ポケットの変異を持つＨＩＶ-１分離株をナノモル濃度で阻害した。
【００９８】
ここに記載した全ての刊行物、特許及び特許文献は完全に記載されているかのように出典明示により取り込む。ここに記載した発明は他の実施態様を含むように変更することができる。そのような自明な変更例の全てが、特許請求の範囲に記載される本発明の要旨と範囲内のものである。本発明の詳細な説明を上に記載したが、本発明はそれに限定されるものではない。ここに記載した発明は、当業者には明らかなように、他の実施態様を含むように変更することができる。そのような変更態様も全て添付の特許請求の範囲に記載した発明の要旨と範囲内のものであること考えられなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ｄ４Ｔのアリールホスフェート誘導体に対する先行技術が提案した代謝経路の概略模式図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは置換フェニル環の加水分解を高めるための電子求引仮説を示す図である。図２Ｃは、試験化合物：Ｘ＝Ｈの化合物２（白抜きの四角）；Ｘ＝ＯＣＨ３の化合物３（塗り潰した四角）；及びＸ＝Ｂｒの化合物４（塗り潰した円）の加水分解の結果としてのＡ-ｄ４Ｔの産生を示す溶出特性である。図２Ｄは、ブタ肝臓エステラーゼによる酵素加水分解に対する試験化合物の感受性を示す溶出特性である。
【図３】ＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中での化合物２−４の細胞内加水分解を示す溶出特性である。６８０ｐｍｏｌのＡ-ｄ４Ｔ-ＭＰに対応する代謝ピークが化合物４と共にインキュベートしたＣＥＭ細胞可溶化物のアリコートにのみ検出された。
【図４Ａ】化合物６ｃの化学構造を示す。
【図４Ｂ】化合物７ｃの化学構造を示す。
【図４Ｃ】化合物６ｃに対するＰＢＭＮＣ及びＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中でのＨＴＬＶＩＩＩＢに対する抗ＨＩＶ活性を示す。
【図４Ｄ】化合物７ｃに対するＰＢＭＮＣ及びＴＫ欠損ＣＥＭ細胞中でのＨＴＬＶＩＩＩＢに対する抗ＨＩＶ活性を示す。
【図４Ｅ】化合物６ｃに対するＨＩＶ-１（ＨＴＬＶＩＩＩＢ）、ＨＩＶ-２及びＲＴＭＤＲ-１に対する抗ウイルス活性を示す。抗ウイルス活性は感染細胞におけるＲＴ活性によって測定したＨＩＶ複製の阻害％として表した。
【図４Ｆ】化合物７ｃに対するＨＩＶ-１（ＨＴＬＶＩＩＩＢ）、ＨＩＶ-２及びＲＴＭＤＲ-１に対する抗ウイルス活性を示す。抗ウイルス活性は感染細胞におけるＲＴ活性によって測定したＨＩＶ複製の阻害％として表した。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは化合物の加水分解の速度及び強さに対する電子求引基の効果を例証する。
【図６】Ａ１７複製の阻害に対するＩＣ５０値に対するハメットσ及び加水分解速度値の相関を示す。塗り潰した円は化合物を表す。実線の垂線は平面からのデータポイントの偏差を表す。平面はＡ１７複製の阻害に対するＬｏｇＩＣ５０値に対するハメットσ及び加水分解速度の重回帰相関適合を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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