(57)【要約】本発明は、ワクチンを調製する方法を提供する。本方法は、（1）特定の病原体の特異的抗原を解析することと；（2）特異的抗原をコードするポリヌクレオチドを得ることと；（3）ポリヌクレオチドとの十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ること；（4）ポリヌクレオチド配列を使用するワクチンを調製すること。また、本発明は、抗腫瘍性のワクチン、特に抗腫瘍性のEGFR分子ワクチンを提供する。抗腫瘍性のEGFR分子ワクチンは、抗原としてEGFR分子を使用することによって構築される種々の新たな生物工学的なワクチンであり、タンパク質ワクチン、遺伝子ワクチン、ウイルス・ワクチン、遺伝子修飾されたワクチン、および安定にトランスフォームされた共生細菌を含む。EGFR分子ワクチンの生物学的機能のうちの1つは、GFR分子を過剰発現する種々の固形腫瘍癌、たとえば、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、胃癌、その他に対して抗癌効果を有し、保護的な抗腫瘍性免疫効果、治療的な抗癌効果、および抑制性の癌転移を含む。EGFR分子ワクチンの抗腫瘍性の作用機序は、EGFR分子が、交差反応性の抗原として自己EGFR分子に対する個体の免疫寛容を破壊し、その結果、個体の自己EGFR分子に対して、活性な免疫応答（細胞性免疫応答および体液性免疫応答）および受動的な免疫応答（養子免疫応答）を含む免疫交差反応を誘導するということである。抗腫瘍性EGFR分子ワクチンは、従来の調製（水性、凍結乾燥された粉末）またはナノ生物工学によって調製されるナノ調製である。EGFR分子ワクチンは、その他の免疫賦活薬の相乗作用によって抗癌効果の増強を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むワクチンを作製するための方法：
1）特定の病原体の特異的抗原を解析することと；
2）前記特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；
3）前記ポリヌクレオチド配列と十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
4）工程3）で得られたポリヌクレオチド配列を使用してワクチンを調製すること。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、前記病原体は、細菌、ウイルス、真菌、および原生動物の群から選択される方法。
【請求項３】
請求項1に記載の方法であって、工程1）のポリヌクレオチド配列と工程3）のポリヌクレオチド配列の間の相同性は、これらによってコードされるポリペプチド配列で比較して、30〜95%である方法。
【請求項４】
請求項1に記載の方法であって、前記ワクチンの形態は、再結合されたタンパク質ワクチン、再結合された遺伝子ワクチン、再結合されたウイルス・ワクチン、遺伝子改変ワクチン、および安定に転化された共生菌からなる群より選択される方法。
【請求項５】
以下の工程を含む癌ワクチンを作製するための方法：
1）動物内の腫瘍細胞の特異的抗原を解析することと；
2）前記特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；
3）前記ポリヌクレオチド配列と十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
4）工程3）で得られたポリヌクレオチド配列を使用してワクチンを調製すること。
【請求項６】
請求項5に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は動物内に生じる方法。
【請求項７】
請求項5に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は動物から生じる方法。
【請求項８】
請求項6または7に記載の方法であって、前記動物はヒトを含む方法。
【請求項９】
請求項5に記載の方法であって、工程1）のポリヌクレオチド配列と工程3）のポリヌクレオチド配列の間の相同性は、これらによってコードされるポリペプチド配列で比較して、30〜95%である方法。
【請求項１０】
請求項5に記載の方法であって、前記ワクチンの形態は、再結合されたタンパク質ワクチン、再結合された遺伝子ワクチン、再結合されたウイルス・ワクチン、遺伝子改変ワクチン、および安定に転化された共生菌からなる群より選択される方法。
【請求項１１】
以下の工程を含むEGFRワクチンを作製するための方法：
1）動物内の腫瘍細胞の特異的抗原を解析することと；
2）前記特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；
3）前記ポリヌクレオチド配列と十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
4）工程3）で得られたポリヌクレオチド配列を使用してワクチンを調製すること。
【請求項１２】
請求項11に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は動物内に生じる方法。
【請求項１３】
請求項11に記載の方法であって、前記腫瘍細胞は動物から生じる方法。
【請求項１４】
請求項11に記載の方法であって、工程1）のポリヌクレオチド配列と工程3）のポリヌクレオチド配列の間の相同性は、これらによってコードされるポリペプチド配列で比較して、30〜95%である方法。
【請求項１５】
請求項11に記載の方法であって、前記ワクチンの形態は、再結合されたタンパク質ワクチン、再結合された遺伝子ワクチン、再結合されたウイルス・ワクチン、遺伝子改変ワクチン、および安定に転化された共生菌からなる群より選択される方法。
【請求項１７】
核酸ワクチンであって、前記ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと病原体の特異的抗原のポリヌクレオチド配列によってコードされる前記ポリペプチドとの間の相同性は、30〜95%である核酸ワクチン。
【請求項１８】
上皮細胞成長因子受容体（EGFR）核酸ワクチンであって、前記ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる上皮細胞成長因子受容体と前記生物体の上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%である核酸ワクチン。
【請求項１９】
上皮細胞成長因子受容体（EGFR）核酸ワクチンであって、前記ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる上皮細胞成長因子受容体と前記ヒトの上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%である核酸ワクチン。
【請求項２０】
以下の工程を含むヒト腫瘍を治療するために使用されるEGFRワクチンを作製するための方法：
1）異種生物体に由来するEGFRをコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
2）工程1）で得られた前記ポリヌクレオチド配列を使用することによってワクチンを調製すること。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法であって、前記異種生物体は、マウス、ラット、ニワトリ、サバ、ショウジョウバエなどのヒト以外のその他の生物体である方法。
【請求項２２】
請求項20に記載の方法であって、前記異種生物体に由来するEGFRをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号24、および配列番号26からなる群より選択される方法。
【請求項２３】
請求項20に記載の方法であって、前記ワクチンの形態は、再結合されたタンパク質ワクチン、再結合された遺伝子ワクチン、再結合されたウイルス・ワクチン、遺伝子改変ワクチン、および安定に転化された共生菌からなる群より選択される方法。
【請求項２４】
請求項20に記載の方法であって、前記ヒト腫瘍は、EGFR分子を過剰発現する、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部扁平上皮癌、および神経膠腫からなる群より選択される方法。
【請求項２５】
以下の工程を含むヒト腫瘍を治療するために使用されるEGFRワクチンを作製するための方法：
1）前記ヒトEGFRのポリヌクレオチド配列を修飾することと；および、
2）前記修飾されたポリヌクレオチド配列を工程1）で得られたポリヌクレオチド配列から選択することによって前記ワクチンを調製すること。
【請求項２６】
請求項25に記載の方法であって、前記ヒトEGFRのポリヌクレオチド配列は、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11からなる群より選択される方法。
【請求項２７】
請求項25に記載の方法であって、前記修飾法は、エラー-プローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリーPCR（assembly PCR）、セクシャルPCR突然変異誘発（sexual PCR mutagenesis）、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発（cassette mutagenesis）、再帰的アンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis）、指数アンサンブル突然変異誘発（exponential ensemble mutagenesis）、部位特異的突然変異、遺伝子再構築（gene reassembly）、GSSM、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される方法。
【請求項２８】
請求項25に記載の方法であって、前記ワクチンの形態は、再結合されたタンパク質ワクチン、再結合された遺伝子ワクチン、再結合されたウイルス・ワクチン、遺伝子改変ワクチン、および安定に転化された共生菌からなる群より選択される方法。
【請求項２９】
請求項25に記載の方法であって、前記ヒト腫瘍は、EGFR分子を過剰発現する、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部扁平上皮癌、および神経膠腫からなる群より選択される方法。
【請求項３０】
上皮細胞成長因子受容体ポリペプチド・ワクチンであって、前記ワクチンに含まれる上皮細胞成長因子受容体ポリペプチドとヒトの上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%であるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジー分野であり、より詳しくは、ワクチンを調製する方法およびその調製されたバイオワクチンに、特に新規の抗EFGR分子ワクチンを含む抗腫瘍ワクチンに関する。分子ワクチンは、新たな生物工学的な薬物の分野であり、PCR分子クローニング、遺伝子発現、現代のワクチン技術、並びに生物工学的な医薬および薬理学などの生物工学の多くの側面を含む。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンは、ウイルス、細菌などの特定の標的物質に対する免疫応答を開始させるために生物体免疫系を刺激することができる物質である。ワクチンの古典的な概念は、主に治療される微生物の病原体（ウイルス、細菌その他など）を使用した感染に対する免疫や、または感染症を防止するために体液性免疫応答が生じるように生物体を免疫するためのその派生に端を発する。たとえば、弱毒ワクチンは、化学反応による感染性病原体の活性成分を不活性化することによって誘導される。弱毒ワクチンは、生きているウイルスまたは細菌を、生物の生物体中でそれ自体を再生することができないように変異することによって産生される。これらのワクチンの2つのクラスは、BおよびT淋疾細胞と反応する表面タンパク質（抗原）を介して免疫化を達成する。ヒトが病原体に感染するときに、BおよびT淋疾細胞は、病原生物体が破壊を生じる前に迅速に反応して、それを根絶することができる。しかし、これらの2つのワクチンは、これらが感染性の病原体によって汚染され得るために、潜在的な危険を有する。たとえば、小児麻痺に対してワクチン接種をしたために小児麻痺に感染する児童の割合が常に存在する。従って、開発方向のうちの1つは、サブユニットワクチン、別名遺伝子工学ワクチンまたはDNA組換えワクチンであり、これらはDNA組換技術によって産生され、表面タンパク質から成るだけであり、免疫応答を開始する。これは、2001年11月によって発表された、Gene Engineering Principle, Edited by Ma Jiangang, published by Xi’an Jiaotong University Press, page 240で見ることができる。上述した病原体自体、その免疫原性を有する成分、および遺伝子発現産物に加えて、「裸の」DNAも、ワクチンの遺伝子ワクチンとして使用するための研究がされている。「裸の」DNAは、病原体から生じる抗原をコードする遺伝子およびそのキャリアとしてのプラスミドDNAから成る。遺伝子ワクチンを注射または微粒子銃または同様の方法を介してヒトに導入した後、遺伝子断片は、抗原タンパク質を合成して免疫応答を開始させることができる。現時点では、発現ライブリー免疫化技術（Expression-Library Immunization technique）は、免疫活性な遺伝子を見いだす最も系統的かつ客観的な手段である。これは、Feng Zhanqi and Yang Tongwei, published by Economic Management Press, pages 169 to 171, 2000に見いだすことができる。
【０００３】
ワクチンの主な機能は、疾患を防止することにある。現在、ワクチンは、疾患を治療するためにも使用される。従って、正常なヒトおよび動物に対するワクチンの機能は、疾患を予防するために疾患予防能力および生物体の抵抗を増強することである。一定の疾患または障害を有するヒトおよび動物に対するワクチンの機能は、病巣を除去し、疾患または障害を治療するために特定の病原性因子を狙った反応を生じるように生物体を誘導することである。ワクチンは、生物体の免疫系に影響を及ぼすことにより、疾患または障害を防止し、または治療し、または防止し、かつ治療することができる物質の一般的な用語であると考えることができる。
【０００４】
動物内で細胞分裂の調整が制御されないことにより生じた不死化細胞は、腫瘍細胞として知られている。転移能力を有する腫瘍は、悪性として知られており、上皮組織の癌は、悪性として知られている。これは、Cell Biology, edited by Zhai Zhonghe, etc., published by Higher Education Press, pages 423 to 427, 2000 （2001 reprint）に見ることができる。腫瘍の発生および宿主の腫瘍に対する応答については、多くの基本的な研究および臨床応用研究があった。発症については、多くの環境要因が動物に対して発癌性および変異原性を有することが示されている。実際に、いくつかの腫瘍は、一定の特異的な物質に対する曝露に関する（たとえば、アスベストおよび造船所労働者の中皮腫）。また、既知のウイルスも、動物腫瘍を誘導することができ、たとえばB型肝炎ウイルスは肝臓癌に関係がある。多くのケースでは、宿主は、腫瘍に抵抗するための免疫応答を生じるが、一部のその他のケースでは、防御されるであろう。
【０００５】
腫瘍細胞および正常細胞は、これらの抗原の質および量の種差に応じて区別することができる。腫瘍細胞の抗原、特に腫瘍細胞に特有の腫瘍特異的抗原は、腫瘍の予防および治療の研究の重点となる。腫瘍治療のための癌ワクチンは、特に重要である。この種の治療ワクチンは、主にすでに癌に罹患している患者を治療するために使用される点で、従来の予防ワクチンとは異なる。癌ワクチンを使用する目的は、最終的に有効な拒絶を達成するために、患者の腫瘍に対する特異的な免疫応答を促進することである。癌ワクチンの研究開発は、近年国際的に腫瘍免疫治療に集中されてきており、これには、主に腫瘍細胞ワクチン、遺伝子修飾ワクチン、ポリペプチド・ワクチン、遺伝子／DNAワクチンなどを含む。
【０００６】
腫瘍細胞ワクチンは、患者または病気の動物の腫瘍細胞を物理的または化学的な方法での処理することによって産生され、処理後にこれらの細胞が治療的または補助的な治療効果を有するような無傷の、死細胞である。腫瘍細胞を治療するために使用される方法は、X線放射または有機溶媒などでの処理を含む。注射またはその他の方法によってこのワクチンを生物体に導入した後に、これは、その腫瘍に対する患者の免疫を促進し、または増強することができる。遺伝子修飾ワクチン、ポリペプチド・ワクチン、および遺伝子／DNAワクチンは、全て腫瘍に対して治療的または補助的な治療効果を有するワクチンであり、腫瘍抗原もしくはその断片または腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドもしくはその断片、およびキャリア、またはこれらの細胞を含むポリヌクレオチドを使用することによって作製される。
【０００７】
上述の通り、ワクチンは、疾患の予防および治療において重要な役割を果たす。環境汚染の悪化につれ、動物体細胞の重篤な異常成長としての腫瘍を生じる頻度を増強する。従って、新たなワクチン、特に癌ワクチンを開発することが必要である。本発明は、ワクチンを作製するための新たな方法、および新たな癌ワクチン−EGFR分子ワクチンを提供し、これは上記の要求を満たす。
【発明の開示】
【０００８】
第１の側面については、本発明は、ワクチンの調製方法を提供する。本方法は：
1）特定の病原体の特異的抗原を解析することと；
2）特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；
3）ポリヌクレオチド配列と十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
4）工程3）で得られたポリヌクレオチド配列を使用してワクチンを調製すること。
【０００９】
第2の側面については、本発明は、癌ワクチンの調製方法に提供する。本方法は：
1）動物内の腫瘍細胞の特異的抗原を解析することと；
2）特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；
3）ポリヌクレオチド配列と十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
4）工程3）で得られたポリヌクレオチド配列を使用してワクチンを調製すること。
【００１０】
第3の側面については、本発明は、EGFRワクチンの調製方法を提供する。本方法は：
1）動物内の腫瘍細胞のEGFR抗原を解析することと；
2）特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列を得ることと；
3）ポリヌクレオチド配列と十分な相違を有するポリヌクレオチド配列を得ることと；および、
4）工程3）で得られたポリヌクレオチド配列を使用してワクチンを調製すること。
【００１１】
第4の側面については、本発明は、核酸ワクチンであって、病原体の1つの特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列と一定の相違を有し、かつその相同性は、一定の値に達することを必要とするポリヌクレオチド配列を含む核酸ワクチンを提供する。ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列と特異的抗原のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドとの間の相同性は、30〜95%である。
【００１２】
第5の側面については、本発明は、核酸ワクチンであって、病原体の2以上の特異的抗原をコードするポリヌクレオチド配列と一定の相違を有し、かつその相同性は、一定の値に達することを必要とする2つ以上のリヌクレオチド配列を含む核酸ワクチンを提供する。ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列と対応する特異的抗原のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリヌクレオチド配列との間の相同性は、30〜95%である。
【００１３】
第6の側面については、本発明は、タンパク質またはポリペプチド・ワクチンであって、病原体の1つの特異的抗原のタンパク質部分のポリヌクレオチド配列と一定の相違を有し、かつその相同性は30〜95%である1つのタンパク質またはポリペプチド分子を含むワクチンを提供する。
【００１４】
第7の側面については、本発明は、タンパク質またはポリペプチド・ワクチンであって、病原体の2つ以上の特異的抗原のタンパク質部分のポリヌクレオチド配列と一定の相違を有し、かつこれらの相同性は30〜95%である2つ以上のタンパク質またはポリペプチド分子を含むワクチンを提供する。
【００１５】
第8の側面については、本発明は、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）核酸ワクチンであって、生物体のEGFR分子遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列と一定の相違を有し、かつその相同性は、一定の値に達することを必要とする1つのポリヌクレオチド配列を含む核酸ワクチンを提供する。ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる上皮細胞成長因子受容体と生物体の上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%である。
【００１６】
第9の側面については、本発明は、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）核酸ワクチンであって、生物体のEGFR分子遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列と一定の相違を有し、かつこれらの相同性は一定の値に達することを必要とする2つ以上のポリヌクレオチド配列を含む核酸ワクチンを提供する。ワクチンに含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされる上皮細胞成長因子受容体と生物体の上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%である。ワクチンに含まれる2つ以上のポリヌクレオチド配列は、異なる供与源を有してもよく、これらは生物体のEGFR分子遺伝子のポリヌクレオチド配列と異なる相同性を有してもよい。
【００１７】
第10の側面については、本発明は、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）タンパク質またはポリペプチド・ワクチンであって、生物体のEGFR分子の1つの変種を含むワクチンを提供する。ワクチンに含まれる上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列と生物体の上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%である。
【００１８】
第10の側面については、本発明は、上皮細胞成長因子受容体（EGFR）タンパク質またはポリペプチド・ワクチンであって、生物体のEGFR分子とは異なる2つ以上の変種を含むワクチンを提供する。ワクチンに含まれる上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列と生物体の上皮細胞成長因子受容体のアミノ酸配列との間の相同性は、30〜95%である。
【００１９】
第11の側面については、本発明は、癌を防止し、治療する際の、上皮細胞成長因子受容体核酸ワクチンおよび上皮細胞成長因子受容体タンパク質またはポリペプチド・ワクチンの使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本明細書で使用されるものとして、「病原体」は、その他の生物体に侵入することができ、一定の疾患または生理学的症状を生じさせることができる細菌、ウイルス、真菌、原生動物、蠕虫などを含む生物体に侵入する外来生物体をいう。
【００２１】
本明細書で使用されるものとして、「癌細胞」は、正常な衰弱および死の経路からはずれて、制御不能に増殖し、分裂する細胞をいう。「癌細胞」集団は、癌組織から成る。本発明において、「癌」の用語は、一般的であり、いずれのタイプの細胞の異常増殖も含み、更に癌組織または癌細胞を含む。増殖を阻害するか、またはこれらの細胞および組織を阻害するか、もしくは除去することが必要とされる。
【００２２】
本明細書で使用されるものとして、「生物体」は、動物、特に「ヒト」をいう。本発明の方法およびワクチンは、免疫系をもつ動物に使用することができる。
【００２３】
本発明のワクチンの標的としての病原体または癌細胞中の特異的抗原を確認するために、当該技術分野の基礎研究結果または周知の方法を使用することができる。特定の病原体内での、またはインビボでの異常な細胞は、これらに特異的な抗原などの特異的なラベル分子を有するので、疾患を予防および治療するための目的を達成するために、これらの分子を標的としてワクチンをデザインして、有害な物質、生物体、または細胞に対する生物体の免疫応答を誘導することができる。GenBankなどの公共データベースまたは多くのウェブサイトによれば、対応する有用な抗原の遺伝子配列またはアミノ酸配列を見つけることができる。また、セントラルドグマに従って、アミノ酸配列または遺伝子配列から推論される配列を本発明に使用することができる。有用なウェブサイトは、
http：//www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes.  
http：//bioweb.pasteur.fr/Genoist/TubercuList.  
を含むがこれらに限定されない。
【００２４】
本発明において、標的抗原に対するものであるポリペプチドの核酸配列またはアミノ酸配列は、標的抗原をコードするタンパク質またはポリペプチド部分の核酸配列またはアミノ酸配列とは異なる。これらの相同性は、コード産物の30〜95%である。
【００２５】
相同性は、通常、配列解析ソフトウェアによって決定される。「相同性」の用語は、2つのポリペプチド配列についての関連においては、比較ウインドウまたは指定された領域にわたって最大の一致について比較し、整列させたときに同じであるか、または指定された割合の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する2つ以上の配列をいう。これは、単に多くの配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアル整列および目視検査によって測定される。
【００２６】
配列比較については、典型的には、1つの配列が参照配列としての役割を果たし、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するときは、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、配列アルゴリズム・プログラム・パラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラム・パラメーターに基づいて、参照配列を基準として試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００２７】
本発明では、抗原中の一定のアミノ酸配列は、参照配列として選択され、ワクチン中のヌクレオチド配列のコード配列またはワクチン中のタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列は、試験配列である。試験配列と参照配列の相同性は、本発明の一態様である。
【００２８】
標的抗原の核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列が「親配列または参照配列」とする場合、本発明に使用する核酸配列またはポリペプチドのアミノ酸配列を「娘配列または派生配列」とすることができる。
【００２９】
「親配列または参照配列」の供与源は、前述のデータベース、ウェブサイト、開示された発明および書類などの従来技術であることができる。また、これらは、インビボの微生物抗原または癌抗原のいずれかの特異的抗原についての研究に由来することもできる。親配列もしくは参照配列またはその配列情報は、ゲノム、染色体、タンパク質またはポリペプチド、mRNA、およびDNA分子を研究し、解析することによって得ることができる。
【００３０】
「娘配列または派生配列」は、「親配列または参照配列」に由来する配列である。これは、「親配列または参照配列」といくらかの相違を有するが、完全に異なるものではない。「娘配列または派生配列」は、「親配列または参照配列」といくつらの構造相関性を有する天然に存在する配列であることができ、または人工の方法によって得られた配列であることもできる。前者のものは、異なる生物体に、または個々の生物体に存在する相同タンパク質をコードする配列をいう。たとえば、ヒト上皮細胞成長因子受容体のコード配列およびマウス上皮細胞成長因子受容体のコード配列は、それぞれ本発明で言及する「親配列」および「娘配列」とするか、またはそれぞれ「参照配列」および「派生配列」とすることができる。これらの命名は、変換することができる。たとえば、マウス上皮細胞成長因子受容体のコード配列を「親配列」とすることができ、一方、ヒト上皮細胞成長因子受容体のコード配列を「娘配列」とすることができ；または、ヒト上皮細胞成長因子受容体のコード配列を「親配列」とすることができ、マウス上皮細胞成長因子受容体のコード配列を「娘配列」とすることができる。「親配列または参照配列」は、「娘配列または派生配列」を突然変異または修飾することによって得ることができる初期物質であることができる。また、「親配列または参照配列」といくらかの相違を有する「娘配列または派生配列」は、人工の合成プロセスによって得ることができる。「娘配列または派生配列」を有する核酸、タンパク質、およびこれらの断片的な物質は、対応するデータベースを検索し、コンピューターで対応するプログラムを実行して「親配列または参照配列」の「娘配列または派生配列」を得て、次いで人工的に合成することによって得られる。また、本発明の「娘配列または派生配列」は、対応する分子ライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。「娘配列または派生配列」を有する核酸、核酸断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、並びに「娘配列または派生配列」を有するおよびタンパク質、ポリペプチド、およびこれらの断片は、本発明の態様に使用することができる。本発明の態様において、「娘配列または派生配列」を有する核酸、核酸断片、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、並びに「娘配列または派生配列」を有するタンパク質、ポリペプチド、およびこれらの断片に対して種々の修飾を行うことができる。また、本発明の目的を達成するために、適切なベクターまたは細胞またはウイルスにこれらを含めることもできる。本発明の態様に使用される上述の種々の物質は、単離して、精製することができ；または、これらは、共に混合することができ、さらにアジュバントなどの一定の物質と混合することもできる。
【００３１】
本明細書に使用されるものとして、「核酸」または「核酸配列」の句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドが、もしくはこれらのいずれかの断片か、ゲノムもしくは合成起源のDNAまたはRNAか、ペプチド核酸（PNA）か、または天然もしくは合成の起源のいずれかのDNA様もしくはRNA様の物質をいう。
【００３２】
特定のポリペプチドまたはタンパク質「のコード配列」または「をコードするヌクレオチド配列」は、適切な制御配列の制御下に配置されたときに、ポリペプチドまたはタンパク質に転写され、翻訳される核酸配列である。
【００３３】
「遺伝子」の用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDNAのセグメントを意味する。これは、コード領域に先行する領域および続く領域（リーダーおよびトレーラ）、並びに適用可能な場合は、個々のコード・セグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００３４】
「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、本明細書に使用されるものとして、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質配列か、またはこれらの任意の断片、部分、もしくはサブユニットで、かつ天然に存在するか、または合成の分子をいう。
【００３５】
「ポリペプチド」の用語は、本明細書に使用されるものとして、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわちペプチド・アイソスタによって互いに連結されたアミノ酸をいい、遺伝子でコードされる20個のアミノ酸以外の修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセシングよって、または当前記技術分野において周知の化学的修飾技術によって修飾されてもよい。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含むポリペプチドのどこにでも行うことができる。同じタイプの修飾が所与のポリペプチドのいくつかの部位で、同程度または様々な程度で存在してもよいことはいうまでもない。また、所与のポリペプチドは、多くの修飾タイプを有していてもよい。修飾は、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋による環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性の架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化（myristolyation）、酸化、パージレーション（pergylation）、タンパク分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、およびアルギニル化（arginylation）などの転移-RNAを媒介したタンパク質に対するアミノ酸の付加を含む（Creighton, T. E., Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York （1993）； Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp. 1-12 （1983）を参照されたい）。
【００３６】
本明細書で使用されるものとして、「単離された」の用語は、材料がその本来の環境（たとえば、これが天然に存在する場合は、天然の環境）から除去されていることを意味する。たとえば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されないが、天然の系に共存する物質のいくつか又は全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であることができ、および／またはこのようなベクターまたは組成物は、組成物の一部であることができ、また、このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドがその天然の環境の一部ではないという点で、さらに単離することができる。
【００３７】
本明細書で使用されるものとして、「精製された」の用語は、絶対純度を必要でなく；むしろ、相対的な定義として企図される。
【００３８】
本明細書で使用されるものとして、「組換え」の用語は、核酸がその天然の環境においては隣接していない「バックボーン」核酸に隣接することを意味する。本発明にしたがったバックボーン分子は、発現ベクター、自己再生する核酸、ウイルス、組み込む核酸などの核酸、および関心対象の核酸挿入物を維持し、もしくは操るために使用されるその他のベクターまたは核酸を含む。
【００３９】
「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えDNA技術によって産生されるポリペプチドまたはタンパク質をいい；すなわち、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外来DNA構築物によって形質転換された細胞から産生される。「合成の」ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成によって調製されるものである。また、固相化学ペプチド合成方法は、本発明のポリペプチドまたは断片を合成するために使用することができる。このような方法は、1960年代初期から当該技術分野において既知であり（Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85： 2149-2154, 1963）（Stewart, J. W. and Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, I11, pp. 11-12も参照されたい）、最近では、商業的に入手可能な研究室ペプチド設計および合成キット（Cambridge Research Biochemicals）に使用されている。このような商業的に入手可能な研究室キットは、一般にH. M. Geysen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81：3998 （1984）の教示を利用しており、その全てが単一のプレートに結合されている多数の「ロッド」または「ピン」の先端でペプチドを合成することができる。このような系を利用するときには、ロッドまたはピンのプレートを逆にして、対応するウェルまたは貯蔵所の第2のプレート（これは、ピンまたはロッドの先端に適切なアミノ酸を付着し、またはアンカーするための溶液を含む）に挿入する。このような生産工程を繰り返すこと、すなわちロッドおよびピンの先端を逆にして、適切な溶液中に挿入することによって、アミノ酸が所望のペプチドに組み込まれる。加えて、多くの入手可能なFMOCペプチド合成系を利用できる。たとえば、ポリペプチドまたは断片の構築は、Applied Biosystems, Inc. Model 431A自動ペプチド合成機を使用して、固体担体上で行うことができる。このような設備は、直接合成によるか、またはその他の既知の技術を使用して結合することができる一
連の断片の合成によるかのいずれかによって、本発明のペプチド類への迅速なアクセスを実現する。
【００４０】
プロモーター配列は、プロモーターで転写を開始するRNAポリメラーゼが、mRNAにコード配列を転写するときには、コード配列に「操作可能な状態で連結」されている。
【００４１】
「プラスミド」は、大文字および／または数の前におよび／または後に、小文字「p」によって示される。出発プラスミドは、本明細書において、非制限の原則で商業的に入手可能で公的に利用できるか、または発表された手順に従って、利用できるプラスミドから構築することができる。加えて、本明細書に記載されているものと同等のプラスミドが当前記技術分野において既知であり、当業者には明らかであろう。本発明において、いくつかの典型的なプラスミドは、図2に示すように構築される。これらのプラスミドは、本発明の態様の1つの形態である。
【００４２】
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成され得る一本鎖のポリデオキシヌクレオチドまたは2つの相補ポリデオキシヌクレオチド鎖をいう。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'ホスフェートを有さず、したがって、キナーゼの存在下においてATPとホスフェートを転化しなくては、別のオリゴヌクレオチドに結合されない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸されていない断片に結合する。
【００４３】
「断片」は、本明細書に使用されるものとして、少なくとも2つの異なる高次構造で存在することができる天然に存在するタンパク質の一部である。断片は、天然に存在するタンパク質と同じか、または実質的に同じアミノ酸配列を有することができる。「実質的に同じ」は、アミノ酸配列が主に、しかし完全にでなく、同じであることを意味する。
【００４４】
「変種」の用語は、（それぞれ）1つまたは複数の塩基対、コドン、イントロン、エキソン、またはアミノ酸残基で修飾された本発明の「親配列または参照配列」をいう。変種は、たとえばエラー-プローンPCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリーPCR（assembly PCR）、セクシャルPCR突然変異誘発（sexual PCR mutagenesis）、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発（cassette mutagenesis）、再帰的アンサンブル突然変異誘発（recursive ensemble mutagenesis）、指数アンサンブル突然変異誘発（exponential ensemble mutagenesis）、部位特異的突然変異、遺伝子再構築（gene reassembly）、GSSM、およびこれらの任意の組み合わせの方法を含む多くの手段のいずれによっても産生することができる。
【００４５】
本発明のもう一つの側面については、前記「娘配列または派生配列」は、「親配列または参照配列」の「変種」とすることができる。なぜなら、これらは、抗原中の「親配列または参照配列」といくらかの構造的な類似点を有するが、いくらかの相違も有する。従って、「娘配列または派生配列」を含む材料は、抗原に対する生物体の免疫応答を誘導してもよく、特に、すでに産生された抗原に対する生物体の寛容を破壊してもよい。実際に、本発明の前記ワクチンに使用される材料は、抗原の構造とのいくつかの類似性を有しているので、生物体によって成し遂げられるであろう本発明のワクチンの材料に対する免疫応答は、抗原に対して交差反応するであろうという事実がある。同時に、本発明のワクチンに使用される材料は、抗原の構造といくらかの相違を有するので、本発明のワクチンは、特に、寛容が生じた抗原に対する生物体の反応を誘導する際に有用である。
【００４６】
本発明の方法は、一例としてEGFR分子ワクチンを用いて記載してある。実際に、本発明は、EGFR分子ワクチンに限定されず、本発明に従って、当業者であれば、本発明の方法を用いてその他のワクチンをうまい具合に調製することができる。本発明のより重要な価値は、これが、ワクチンを産生するための方法、特に生物体の寛容を破壊する方法を開示するということであり；特に、癌の治療に重要な価値を有する。
【００４７】
EGFR分子ワクチンは、ヒトまたはその他の異種起源の生物に由来する相同的なEGFR分子を使用することによって構築される種々の新たな生物工学的ワクチンであり、これらは、最新の生物工学的エンジニアリングによって再構築され、および進化されているか、または、再結合されたタンパク質ワクチン、再結合された遺伝子ワクチン、再結合されたウイルス・ワクチン、遺伝子改変ワクチン、および安定に転化された共生菌含む抗原として生物学的に進化した方法で形成される。これらは、新規の概念を有する癌ワクチンである。
【００４８】
相同的なEGFR分子とは、その他の種起源（マウス、ラット、ニワトリ、サバ、ショウジョウバエ、その他など、配列番号1〜14を参照されたい）に由来するEGDR分子であって、アミノ酸または核酸レベルでヒトEGFR分子といくらかの程度の相同性を有する分子の総称をいう。
【００４９】
ヒト上皮細胞成長因子受容体（EGFR）は、170KDの分子量を有する膜貫通の、単鎖の、グリコシル化されたタンパク質である。これは、1186アミノ酸残基からなり、チロシンタンパク質キナーゼ（PTK）活性を有する。EGFRは、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通疎水性ドメイン、膜近傍ドメイン、PTK活性部位、および受容体C末端ペプチドを含む5つの部分からなる。EGFRは、様々のタイプの転写手段を有し（配列番号1〜5を参照されたい）、種々の変異体を有し、主な変異体はタイプIII EGFRvIIIであり（また、ΔEGFRまたはde2-7EGFRともを呼ばれ、配列番号6を参照されたい）、これは、悪性腫瘍細胞の膜に特異的であり、高い腫瘍特異性を有する。ヒトEGFR分子は、一種の遺伝子ファミリーであり；EGFR（また、c-erbB1/HER1とも呼ばれる）以外のその他のファミリー・メンバーには、c-erbB2/HER2、c-erbB3/HER3、およびc-erbB4/HER4を含み、これらは、それぞれ膜タンパク質p185erbB2、p160erbB3、p180erbB4をコードする。これらのメンバーは、高度に相同的なアミノ酸配列および同様の構造的な特徴を有するが、これらのリガンドは、異なっている。本発明に含まれる癌ワクチンの標的分子はc-erbB2/HER2、c-erbB3/HER3、およびc-erbB4/HER4を除くEGFR（c-erbB1／HER1）である。
【００５０】
EGFR分子のリガンド、EGFまたはTGFは、PTKを活性化することによって自己分泌経路またはパラ分泌経路を介して、および一連のシグナル伝達を介して、EFGRに対して作用して細胞の分裂および増殖を引き起こすことができる。
【００５１】
EFGRは、正常な哺乳類上皮細胞表面の表面上に広く見いだすることができる。平均して、細胞につき約50,000〜100,000の受容分子がある。肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部扁平上皮癌、および神経膠腫などの多くの癌細胞は、全て1〜3×106分子／細胞でEGFRを過剰発現していた。一例として、肺癌の場合、EGFRの過剰発現は癌の浸潤、転移、および予後に密接に関連する。論理上、EGFRは、癌治療の理想的な標的分子のうちの1つと認められた。しかし、これまでに、治療標的としてEGFRを使用する主用途は、モノクローナル抗体および小さな分子合成化合物によるものであった。腫瘍ペプチド・ワクチンおよびアンチセンスRNA遺伝子治療にEGFRvIII分子を使用するような領域で、いくつかのポジティブな開発があった。それにもかかわらず、抗腫瘍分子ワクチンを作製する際の標的分子としてEGFRを使用することに関しては、文献にほとんど報告はなかった。
【００５２】
腫瘍細胞は、その悪性転換、増殖プロセスで1つまたは複数の腫瘍抗原を産生する。しかし、最も多くの状況において、腫瘍細胞の免疫原性は弱く、生物体の活性な免疫応答を誘導することができない。免疫学の視点から、腫瘍細胞は、「正常な」抗原（遺伝子過剰発現）および／または「異常な」抗原（遺伝子修飾、突然変異、または欠失）を持続的に発現することができる宿主内の「自己」組織細胞である。従って、腫瘍抗原は、自己抗原を利用することができる。標準状態下で、生物体は、自己抗原に対する免疫応答を生じず、すなわち免疫寛容を示す。実際に、自己抗原は、最も関連し、かつ大量の抗原であり、宿主の免疫系によって寛容されることを必要とする。自己抗原による寛容の誘導および維持は、種々の機構によって指示されており、これにより正常組織に対する不適当な破壊を防止することができる。しかし、生物の隔絶抗原の放出が生じるか、または生物学的、物理的、または化学的な要因による自己抗原の変化が生じると、自己免疫応答を生じ、標的抗原が位置する細胞、組織、または器官の病理学的損害および機能障害を引き起こす。従って、腫瘍細胞の隔絶自己抗原が放出されるか、またはこれが一定の変化をする場合、腫瘍細胞に対する生物体の特異的な自己免疫応答を誘導することができ；したがって、腫瘍は、減少され、またはさらに絶滅される。上記のとおり、EGFR分子は、種々の腫瘍に過剰発現しており、従ってEGFR分子は、腫瘍抗原および自己抗原として利用することができる。従って、種々のバイオ技術的修飾をヒトEGFR抗原分子（配列番号1〜6を参照されたい）に対して行って、分子ワクチンを産生させて、抗腫瘍免疫応答を誘導し、抗腫瘍形成の目的を達成することができる。
【００５３】
生物進化プロセスにおいて、異なる種の間には、多くの種々の程度の相同分子がある。たとえば、EGFR分子は、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、魚、鳥などの生物に広範に存在し、これらの間には、種々の程度の相同性がある。ヒトEGFR分子と、マウス、ニワトリ、およびショウジョウバエのEGFR分子の相同性は、アミノ酸レベルで、それぞれ、90%、64%、および32%である。抗腫瘍形成の目的を達成するために、進化の過程で異種の相同分子によって形成されるわずかな相違を、免疫寛容を破壊し、免疫原性を増大し、腫瘍細胞の自己免疫応答を誘導するために使用することができる。進化の過程での相同遺伝子の中立変異は、その機能の減少または変化には至らないが、これは、その免疫応答の手段に影響を及ぼすし、または変化させるかもしれない可能性は高い。異種の相同分子を関連する被検者の体に導入し、対応する異種の相同タンパク質を発現させるときに、被検者は、これを外来抗原として認識して、これを除去するための対応する抗体または細胞障害性リンパ球を産生する。同時に、発現された異種の相同タンパク質は、被検者の体の対応するタンパク質分子といくらかの程度の相違を有するので、非特異的な交差反応を生じて、自己免疫応答を誘導し、このタンパク質に対する生物体の免疫寛容を破壊する。
【００５４】
上述の通り、ヒトのEGFRは、マウス、ニワトリ、およびショウジョウバエと種々の相同性を有する。ヒトEGFRは、アミノ酸レベルでBLASTによって解析すると、マウスEGFRと90%、ニワトリEGFRと64%、およびされるミバエEGFRと32%の相同性を有する。本発明者らは、自己腫瘍細胞の寛容を壊すための自己免疫応答を誘発する（illicit）ために、異種間の相同的なEGFR分子によって産生される免疫交差反応を使用する。結果として生じた、EGFRとそのリガンドEGFまたはTGFの結合を競合的に阻害する抗体は、腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。加えて、誘導されたCTLによって、結果を得ることができる。
【００５５】
現代の生物工学の最近の開発により、エラー・プローンPCR技術、DNAシャフリング、ファージ・ディスプレイ技術、その他などの種々の技術をもたらし、遺伝子特異的進化技術によって作製されるEFGR分子ワクチンを支援する。
【００５６】
本発明は、自己EGFRワクチン、異種EGFRワクチン、および誘導された進化EGFRワクチンを含む抗腫瘍性のEGFR分子ワクチンに関する。
【００５７】
本発明は、主に新規の腫瘍ワクチン--抗原としてヒトまたはその他の動物に由来する異種の相同EGFR分子を有するEGFR分子ワクチンに関し、これは、現代の遺伝子工学で作製されるか、または天然の進化過程から誘導される。本発明のワクチンは、タンパク質ワクチン、遺伝子ワクチン、ウイルス・ワクチン、修飾された遺伝子ワクチン、および安定な共生細菌を含む。EGFR分子ワクチンは、EGFRが過剰発現される全ての固形腫瘍に効果を有する。抗癌効果の機構は、EGFR分子が免疫交差反応を起こし得る抗原であり、これが自己EGFR分子に対する体の寛容を弱めて、EGFR分子に対して自己交差反応を起こし得る免疫応答を誘導することができるというものである。また、抗腫瘍性のEGFR分子ワクチンは、微小工学によって作製されるナノ粒子薬剤である。
【００５８】
1.EGFR分子の起源、その選択および改善  
EGFR分子の用語は、本明細書に使用されるものとして、自己EGFR分子、異種EGFR分子、および遺伝子特異的進化EGFR分子を含む。
【００５９】
本発明の重要な特徴は、抗腫瘍免疫療法の分子抗原として、異種の相同的なEGFR分子の使用において証明される。EGFR分子ワクチンは、天然の進化過程によって誘導されるか、または現代の遺伝子工学によって作製される。
【００６０】
EGFRは、事実上広く見いだされる。これは、ヒト、マウスなどの哺乳類から鳥およびニワトリなどのトリの、線虫およびショウジョウバエなどのより下等な生物体の範囲におよぶ種々の生物体に発現する。これらの種々の生物体に由来するEGFR分子は、これらの間で一定の相違を有し、互いの相同性は、30%〜100%である。異種のEGFR分子間の相同性は、本発明にて開示したように、30%〜95%である。例示的な種は、ヒト、マウス、ニワトリ、およびショウジョウバエをいい、アミノ酸レベルで、EGFRの相同性は、マウス、ニワトリ、およびショウジョウバエとヒトの分子は、それぞれ90%、64%、および32%である。ヒトEGFR、マウスEGFR、ニワトリEGFR、およびショウジョウバエEGFR分子は、それぞれ本発明に関連する相同性のモニター点を表す。
【００６１】
EGFR分子は、宿主体による免疫寛容であり、したがって、全てではないが、その免疫原性は非常に弱い。最新の生物工学的操作を使用することにより、自己由来のEGFR分子を遺伝子特異的な進化手順によって修飾することができ、こうして改善されることにより、EGFR抗原の免疫原性を増強する。一般的な技術プロトコルは、自己のEGFR分子の人為的突然変異を生じさせて、遺伝子変異ライブラリーを確立するために、エラー・プローンPCR、ランダム・プライマー伸長技術、およびDNAシャフリング技術を使用する。次いで、選択過程は、ファージ・ディスプレイ技術およびリボソーム・ディスプレイ技術を使用して、より強い免疫原性を有するEGFR分子を得ることによって行われる。
【００６２】
加えて、本発明者らは、細菌、ウイルス、およびその他の生物体の発現修飾系の相違を利用するか、またはタンパク質レベルで自己のEGFR分子をさらに修飾し、改善して自己のEGFRの免疫原性を増大することができる。
【００６３】
2.EGFR組換遺伝子ワクチン  
遺伝子ワクチン（別名DNAワクチン）は、現代の分子技術によって作製される核酸を主成分とした新型のワクチンである。本発明のEGFR分子ワクチンのうちの1つは、DNAワクチンである。
【００６４】
本発明者らは、GenBank（遺伝子配列、cDNA配列、mRNA配列、およびアミノ酸配列を含む）などの公的に利用できるデータバンクに開示されたEGFRの配列を検索する。これらの配列を使用して、およびPCR、RT-PCR、分子ハイブリダイゼーションなどの技術を使用して、本発明者らは、プライマーまたはプローブをデザインした。種々の商業的な遺伝子ライブラリー、cDNAライブラリー、株化細胞、組織培養から、本発明者らは、種々の異なる種に由来するEGFR分子の細胞内ドメインをクローニングし、単離した。本発明者らは、EGFRの細胞外ドメインは、免疫原性を生じる好ましいアクティブ領域であることを見いだした。本発明者らは、より強い免疫原性を有するEGFR分子を選択するために、遺伝子特異的進化技術をさらに使用することができる。シーケンシングを使用してEGFR cDNAの細胞外ドメインの配列を確認した後に、本発明者らは、分子クローニング技術を使用してこれらのEGFRの細胞内ドメインを含む真核生物プラスミド発現系を構築した。次いで、これらの構築物をCHO株化細胞にトランスフェクトして、そのEGFR発現および発現レベルについてこれらを観察し、試験する。これらの真核生物プラスミド発現系の組換えEGFR構築物は、制限酵素消化、SDS-PAGE、およびウエスタンブロットを使用して解析し、確認することができる。本発明者らは、確認された組換えEGFR発現プラスミドを得るために、アルカリ抽出法を使用し、次いで使用する超遠心機、限外濾過法を使用してE.Coli内毒素を除去した。その後、本発明者らは、純粋な組換えプラスミドDNAを得た。プラスミドDNA分子は、免疫化のためのDNAワクチンとして使用することができる。
【００６５】
図2は、EGFR DNA分子ワクチンを作製するために使用したいくつかの代表的なプラスミドを示す。これらのプラスミドを構築する詳細な方法は、以下の通りに簡単に記載してある：ヒト、マウス、ニワトリ（これらは、それぞれ配列番号1〜5、7〜9、19に対応する）のEGFR分子のcDNA配列を得るために、GenBankなどの公共データベースを使用する。本発明者らは、cDNA配列に基づいて以下のプライマーをデザインした：
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACGAATTCTTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACGAATTCTTAATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACGAATTCTTAAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【００６６】
ヒト肺癌株化細胞A431、マウス肺癌株化細胞LL2、およびニワトリ胚からの総RNAをそれぞれRT-PCR増幅を行うために使用して、次いで電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて精製し、PCR産物をサブクローニングする。シーケンシングよってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、NcoIおよびEcoRIを使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集め、これらを精製し、NcoIおよびEcoRIによって消化したpORF-MCSベクター（InvivoGen社から）内に断片を挿入して、組換えプラスミドを選択した。候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認する。これらには、pORF-hEGFR、pORF-mEGFR、およびpORF-chEGFRという名前をつけてある。pcDNA-hEGFR、pcDNA-mEGFR、およびpcDNA-chEGFRの構築のための方法は、上記した方法と同様である。pcDNA3.1（+）ベクターは、InvitroGenによって作製されているが、PCRプライマーの配列は、上記のパラグラフにて説明したように、これらのプライマーとはいくぶん異なっている：これらは、それぞれ以下の通りである：
ヒト・プライマー：5'GAGCTAGCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'CACTCGAGTTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GAGCTAGCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'CACTCGAGTTAATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GAGCTAGCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'CACTCGAGTTAAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【００６７】
ヒトEGFR遺伝子の細胞外ドメインを使用して、ルイス肺癌モデル・マウスの免疫化のためのDNAワクチンを構築し、調製した。免疫化の8週後に、このEGFR DNAワクチンを注射したマウスの生存率は78%であり、マウスEGFR DNAワクチン（25%の生存率を有する）を注射したマウスのものよりも有意に高く、比較実験動物（10〜15%の生存率を有する）よりも非常に高いことを発見した。同時に、本発明者らは、実験モデル・マウスの肺、肝臓、心臓、および腎臓には何らの病理変化も見いださなかった。さらなる研究を行い、マウスで誘導された自己の自己免疫応答は、主にCD4+Tリンパ球に依存的であることを証明した。CTL活性試験では、何らの標的細胞特異的な細胞破壊効果も見いださなかった。免疫組織化学結果は、腫瘍組織での自己抗体などの沈着を示したが、肺、肝臓などの腫瘍組織にこのような沈着は示さなかった。自己抗体は、この場合主にIgGである。
【００６８】
EGFR分子をテンプレートとしてデザインしたアンチセンスRNAおよびRNAi分子は、EGFR組換遺伝子ワクチンの具体例と考えることができる。これは、主にEGFRシグナル経路を遮断する目標を達成するために、EGFR分子の免疫原性を増大して、抗EGFR抗体および特異的なCTL反応を誘導することにより、さらに腫瘍細胞アポトーシスを誘導して、腫瘍細胞の増殖および転移を阻害することによるのではなく、むしろこれは、DNAおよびRNAレベルで直接EGFR分子の発現を制限し、防止する。
【００６９】
3.EGFR組換えタンパク質ワクチン  
タンパク質ワクチンは、比較的伝統的なワクチンであるが、タンパク質は非常に良好な免疫原性を有する。本発明のワクチンのうちの1つは、組換えタンパク質ワクチンであり、E.coli組換え発現ベクター、酵母組換え発現ベクター、バキュロウイルス組換え発現ベクターなどの種々の発現系によって発現される組換えタンパク質によって構築されるものを含む。
【００７０】
PCR、RT-PCR、分子ハイブリダイゼーションなどの分子クローン技術を用いて、本発明者らは、種々の商業的に入手可能な遺伝子ライブラリー、cDNAライブラリー、株化細胞、および組織から、異なる種の多様なEGFR分子の細胞内ドメインをクローニングし、単離し、さらに遺伝子特異的進化技術を使用して、強い免疫原性を有するEGFR分子を選択した。次いで、分子クローン技術を使用して、原核生物プラスミド発現系を構築し、生じる発現系で適切なE.coli宿主を形質転換した。これらのEGFR発現レベルを観察し、調査した。組換えEGFR構築物（プラスミド）は、制限酵素消化、SDS-PAGE、およびウエスタンブロットを使用して解析し、確認した。確認後、組換えEGFR分子を使用してE.coliを形質転換し、組換えタンパク質を産生するために、形質転換されたE.coli細胞を大量に培養した。低温長遠心機を使用して形質転換細胞を集め、次いで細胞をPBS溶液に再懸濁し、超音波技術を使用して溶解した。組換えEGFRタンパク質を単離し、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。単離した組換えEGFRタンパク質は、免疫化のためのタンパク質ワクチンとして使用することができる。
【００７１】
E.coliに発現される組換えEGFRタンパク質ワクチンのための代表的なプラスミドを図2Bに示してある。これらのプラスミドを構築する詳細な方法は、以下に簡単に記載してある：以下のPCRプライマーをGenBankなどの公共データベースにお記載されているヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列に従ってデザインした。それぞれ、配列番号1〜5、7〜9、19に対応する。
【００７２】
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACAGATCTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACAGATCTATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACAGATCTAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【００７３】
それぞれのpORF-hEGFR、pORF-mEGFRおよびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用した。次いで、電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて、精製し、PCR産物をサブクローニングした。PCRサブクローニングの配列を確認したあと、これらをNcoIおよびBglIIを使用して消化し、1.9kbの断片を集めて精製し、次いで、断片を2つの制限酵素NcoIおよびBglIIで消化されたpQE60ベクター（Qiagen社から）に挿入し、組換えプラスミドを選択した。候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、pQE-hEGFR、pQE-mEGFR、およびpQE-chEGFR名づけてある。
【００７４】
組換えEGFRタンパク質は、酵母組換え発現系、バキュロウイルス組換え発現系を使用するなど、上記したE.coli組換え発現系以外の方法によって産生することができる。EGFR組換えタンパク質ワクチンの構築過程のプロトコルについては、図3を参照されたい。
【００７５】
酵母発現系から作製されたEGFR組換えタンパク質ワクチンを発現するプラスミドのための代表的マップを図2Cに示してある。詳細な手順は、以下に記載してある：以下のPCRプライマーをGenBankなどの公共データベースに記載されているヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列に従ってデザインした。それぞれ、配列番号1〜5、7〜9、19に対応する。
【００７６】
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACAGATCTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACAGATCTATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACAGATCTAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【００７７】
それぞれのpORF-hEGFR、pORF-mEGFR、およびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用して、電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて、精製し、PCR産物をサブクローニングした。シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、これらを2つの制限酵素XhoIおよびXbaIを使用して消化し（マウスEGFRを含むプラスミドの場合、XhoIおよびNotI二重酵素消化を使用する）、1.9kbの断片を集めて、精製し、2つの制限酵素XhoIおよびXbaIによって消化された（マウスEGFRを含むプラスミドの場合、XhoIおよびNotI二重酵素消化を使用する）pPICZAベクター（Invitrogen社から）に挿入した。E.coliをこれらのプラスミド標品で形質転換し、組換えプラスミドを選択した。候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、酵母発現プラスミド：pYE-hEGFR、pYE-mEGFR、およびpYE-chEGFRと名づけてある。これらの酵母発現プラスミドをPmeIで消化して、これらを直線化した後に、電気穿孔法を使用して、酵母株化細胞X33またはGS115を形質転換した。安定な形質転換体を選択するために、ゼオシン耐性を使用した。MMH（Minimal Methanol with histidine，MMH）およびMDH（Minimal Dextrose with histidine，MDH）寒天プレートを使用して、Mut+形質転換体を決定して選択した（selecte）。6〜10のMut+形質転換体を小規模の発現について選択し次いで、SDS-PAGE、ウエスタンブロット、ELISA、その他の方法を使用して発現された組換えタンパク質を確認した。酵母発現種子ライブラリーを確立するために、最高の発現効率を有するMut+形質転換体を大規模発現として使用した。大きなフラスコを組換え酵母細胞ラインを培養または発酵させるためにに使用し、酵母ペレットを低温遠心機を使用して集めた。ペレットをPBS溶液に再懸濁したあと、超音波を使用して細胞を破壊した。次いで、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを使用して、組換えEGFRタンパク質を単離し、精製
した。このように誘導される組換えEGFRタンパク質は、被検者の免疫化のためのタンパク質ワクチンとして使用することができる。
【００７８】
同様に、EGFRで作製された酵母組換え発現プラスミドは、その他の酵母発現系によって産生させることができる。
【００７９】
組換えタンパク質ワクチンは、免疫交差反応を誘発する（illicit）能力に関してDNAワクチンよりも強い効果を有する。これは、高力価の抗EGFR抗体および特異的なCTL活性の産生を刺激して、腫瘍細胞の増殖および転移を阻害することができる。
【００８０】
4.EGFR組換えウイルス・ワクチン  
組換えウイルスは、分子ワクチンを産生するための系にも良好な選択肢である。これらの組換えウイルス発現系によって作製される分子ワクチンは、組換えアデノウイルス・ワクチン、レンチウイルス・ワクチン、アデノウイルス随伴ウイルス・ワクチン、レトロウイルスのウイルス・ワクチン、ワクシニアウイルス・ワクチン、および単純疱疹ウイルス・ワクチンを含む。
【００８１】
現在では、アデノウイルス・ベクターが腫瘍遺伝子治療において最も有効なベクターのうちの1つである。これは、高力価で、安全性を有し、分裂細胞または非分裂細胞に感染させることができ、これは宿主の染色体に組み込まれないという利点がある。加えて、アデノウイルスは、比較的強い免疫原性を有し、これはおそらく遺伝子治療のマイナス面であるが、遺伝子免疫療法では大きな利点である。本発明にて開示したように、組換えアデノウイルスで誘導されるEGFR組換えウイルス・ワクチンは、最も重要な態様の1つである。上記の手順に記載されているように、本発明者らは、自己の、異種の、または遺伝子特異的進化EGFR cDNAの種々の種類を最初にクローン化し、次いでこれらのcDNAを使用して、分子生物学的技術によって組換えアデノウイルスの発現ベクターを構築した。次いで、本発明者らは、293細胞にトランスフェクトし、生じる組換えアデノウイルスを収集した。組換えアデノウイルスは、PCR、ウエスタンブロットなどを使用してさらに確認した。本発明者らは、293細胞を使用して大量に作製されたEGFR組換えアデノウイルス・ワクチンを得て、超遠心機および限外濾過法を使用して組換えウイルスを単離し、精製した。上記のように精製したEGFR組換えウイルス・ワクチンは、被験者を免疫するためのワクチンとして使用することができる。EGFR組換えアデノウイルス・ワクチンの構築を示す流れ図については、図4Aを参照されたい。
【００８２】
本発明者らは、GenBankなどの公共データベースに記載されているヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列を得た。それぞれ、配列番号1〜5、7〜9、19に対応する。これらの配列に基づいて、本発明者らは以下のプライマーをデザインした：
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACAGATCTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACAGATCTATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACAGATCTAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【００８３】
それぞれのpORF-hEGFR、pORF-mEGFRおよびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用し、電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて、精製し、PCR産物をサブクローニングした。シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、2つの制限酵素BglIIおよびEcoRVの二重酵素消化を使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集めてこれらを精製し、BglIIおよびEcoRVで予め消化したpShuttle-CMVベクター（Quantum Biotechnologiesによる作製）へ断片を挿入した。本発明者らは、組換えプラスミドを選択した。生じる候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、アデノウイルス・シャトル発現プラスミド：pShuttle-hEGFR、pShuttle-mEGFR、およびpShuttle-chEGFRとなづけた。これらのアデノウイルス・シャトル発現プラスミドのプラスミド・マップについては、図2Dを参照されたい。次いで、本発明者らは、前述のように種々のアデノウイルス・シャトル発現プラスミドを得て、PmeI酵素によってこれらを消化し、アデノウイルス・ゲノムpAdEasy-1またはpAdEast-2を含むバックボーン・ベクターをE.coli BJ5183細胞に同時形質転換した。生じる組換えアデノウイルス・ベクター・プラスミドは、pAd-hEGFR、pAd-mEGFR、およびpAd-chEGFRと名づけてある。これらのアデノウイルス・ベクター・プラスミドをPacI酵素で消化し、リン酸カルシウムDNA共沈法を使用して、これらをアデノウイルス・パッケージング株化細胞の293細胞にトランスフェクトした。生じる組換えアデノウイルスは、Ad-hEGFR、Ad-mEGFR、およびAd-chEGFRと呼ばれている。PCR、ウエスタンブロット、およびその他の方法を使用して、EGFR遺伝子が実際にアデノウイルス・ベクターに組み込まれ、真核生物細胞中に効率的に発現されたことを確認した。
【００８４】
アデノウイルス・ゲノムの相違に応じて、組換えアデノウイルス・ワクチンは、2つの群に分類することができ：第1の群は、世代IのEGFR組換えアデノウイルスと呼ばれ、アデノウイルス・シャトル発現プラスミドpShuttle-EGFRとAdEasy-1組換え体との間の組換えによって生じ、したがって、Ad-hEGFR IAd-mEGFRI、およびAd-chEGFRIと名づけてあり、および第2の群は、世代IIのEGFR組換えアデノウイルスと呼ばれ、アデノウイルス・シャトル発現プラスミドpShuttle-EGFRとAdEasy-2組換え体との間の組換えにより生じ、したがって、Ad-hEGFRII、Ad-mEGFRII、およびAd-chEGFRIIと名づけてある。
【００８５】
加えて、EGFR組換えウイルス・ワクチンは、化合物マンナンによるそのターゲティング能力を増大するように特異的に修飾することができる。
【００８６】
アデノウイルスは、効率的に遺伝子を導入することができるので、アデノウイルスによって作製されたEGFR組換えウイルス・ワクチンにより、被検者の抗腫瘍免疫応答を効率的に誘導し、これによりEGFRを過剰発現した腫瘍の増殖を阻害することができる。
【００８７】
レンチウイルス・ベクターは、新世代の遺伝子治療ベクターである。これは、HIV−１複製欠損を有するレンチウイルスから生じる。これは、モロニー白血病ウイルス（MoMLV）から生じる従来の逆転写酵素ウイルスベクターとは異なる。相違は、レンチウイルス・ベクターは、哺乳動物細胞および非分裂哺乳動物細胞の両者に効率的にトランスフェクトすることができ、良好な生物学的安全性を有することである。加えて、レンチウイルス・ベクターは、レンチウイルス・ベクターを宿主細胞の染色体に組み込むことができ、したがって導入された外来遺伝子の安定にし、長期発現を可能にするという点で、アデノウイルス・ベクターとは異なる。また、組換えレンチウイルスベクター・ワクチンは、EGFR組換えウイルス・ワクチンの重要なバリエーションである。EGFR組換えレンチウイルス・ワクチンを作製する方法は、アデノウイルスに関して記載されているものと同様である。すなわち、本発明者らは、種々の自己の、異種の、または遺伝子特異的進化したEGFR cDNAを最初にクローン化し、次いで分子生物学技術を使用して、本発明者らは、組換えレンチウイルス発現ベクターを構築して、293FT細胞にトランスフェクトし、組換えレンチウイルスを作製した。組換えレンチウイルスをPCR、ウエスタンブロットなどを使用して確認した。さらに、確認後、本発明者らは、293FT細胞を使用して大量のEGFR組換えレンチウイルス・ワクチンを増幅し、超遠心機および限外濾過を使用して、組換えレンチウイルスをさらに単離し、精製した。精製したEGFR組換えレンチウイルスは、ワクチンとして被検者に免役するために使用することができる。組換えレンチウイルス・ワクチンの構築の流れ図については、図4Bを参照されたい。
【００８８】
本発明者らは、Invitrogen社によって作製されたViraPower（商標）レンチウイルス・ゲートウェイ（Lentiviral Gateway：登録商標）発現キットを使用してEGFR組換えレンチウイルスを産生した。詳細な方法は、以下の通りである：本発明者らは、最初にGenBankなどの公共データベースを検索し、ヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列を得た。これらの配列は、それぞれ配列番号1〜5、7〜9、19として一覧を示してある。次いで、本発明者らは、以下のPCRプライマーをデザインした：
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACAGATCTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACAGATCTATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACAGATCTAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【００８９】
本発明者らは、pORF-hEGFR、pORF-mEGFR、およびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用し、次いで電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて、精製し、PCR産物をサブクローニングした。シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、2つの制限酵素NcoIおよびEcoRVの二重酵素消化を使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集めて、これらを精製し、NcoIおよびEcoRVによって予め消化したpENTR11ベクター（Invitrogenによって作製）へ断片を挿入した。本発明者らは、組換えプラスミドを選択した。生じる候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、pENTR-hEGFR、pENTR-mEGFR、およびpENTR-chEGFRと名づけてある。これらのレンチウイルス発現プラスミドのプラスミド・マップについては、図2Eを参照されたい。次いで、本発明者らは、前述のように種々のレンチウイルス発現プラスミドを得て、レンチウイルスゲノムを含むバックボーン・ベクターpLenti6/V5-DESTと共にE.coli DH5細胞に形質転換した。生じる組換えレンチウイルスベクター・プラスミドは、pLenti-hEGFR、pLenti-mEGFR、およびpLenti-chEGFRと名づけてある。また、図2Eを参照されたい。次いで、本発明者らは、これらの組換えレンチウイルスベクター・プラスミドをパッキング混合物（Vira Power（商標）Packaging Mix）と混合し、次いで、リン酸カルシウムDNA共沈法を使用して、組換えレンチウイルスベクター・プラスミドをレンチウイルス・パッキング株化細胞293FT細胞にトランスフェクトした。生じる組換えレンチウイルスは、Lenti-hEGFR、Lenti-mEGFR、およびLenti-chEGFRと呼ばれている。PCR、ウエスタンブロット、およびその他の方法を使用して、EGFR遺伝子が実際にレンチウイルス・ベクターに組み込まれたこと、そのEGFRが真核生物細胞中に正しく、および効率的に発現したことを確認した。
【００９０】
5.EGFR分子ワクチンの修飾および改善  
上記したものは、組換えワクチン（組換遺伝子ワクチン、組換えタンパク質ワクチン、および組換えウイルス・ワクチンを含む）を、好ましい態様において組換えEGFR分子ワクチンを調製する際の基本的手順である。本発明者らは、以下に、EGFR分子ワクチンの効率および特異的を増強することができる修飾並びに改善を含むより多くの態様を記載する。
【００９１】
1）EGFR分子ワクチンのためのアジュバントの選択  
適切なアジュバントは、ワクチンのための良好なキャリアであり、ワクチンの有効な免疫応答を増大することができる。異なるワクチンは、異なるアジュバントを有する。本発明において、本発明者らは、EGFR DNAワクチンのためにフロイントアジュバントおよびリポソームを使用した。EGFR組換えタンパク質ワクチンのために、本発明者らは、主にアルミニウムアジュバントを使用し、EGFR組換えウイルス・ワクチンのためには、通常、アジュバントは、使用しなかった。
【００９２】
2）EGFR遺伝子修飾されたワクチン  
遺伝子修飾されたワクチンは、EGFR分子をトランスフェクトされたヒト、およびその他の異種生物体の株化細胞に由来する細胞ワクチンをいう。これらの細胞ワクチンは、種々の安定に形質転換された腫瘍株、血管内皮細胞、および樹状細胞を使用して作製されるワクチンを含む。また、これらは、組換えウイルスが感染した腫瘍細胞または組織を使用して作製されるワクチンを含む。EGFR遺伝子修飾ワクチンは、EGFR分子ワクチンの具体的な例である。
【００９３】
上記のように、本発明において、EGFRは、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部扁平上皮癌、および神経膠腫などの種々の腫瘍に高度に発現される。しかし、EGFRは、これらの腫瘍の全てにおいて寛容であり、したがって免疫応答を誘発することができない。それにもかかわらず、遺伝子修飾されたワクチンを用いて、本発明者らは、これらの細胞の免疫寛容を破壊して、したがって抗EGFR免疫応答を誘導することができる。本発明者らは、肺癌株A431、乳がん細胞株MCF7その他などのいろいろな腫瘍株、または血管内皮細胞をトランスフェクトするために種々の異なる供与源からの組換えEGFRを含む真核細胞プラスミドを使用した。トランスフェクトした後に、本発明者らは、安定に発現されたEGFR分子を含む安定なトランスフェクタントを選択した。本発明者らは、トランスフェクタントを収集し、パラホルムアルデヒド固定法を使用して細胞ワクチンを作成した。そのほかにも、本発明者らは、異なる供与源からの種々のEGFR組換えウイルス・ワクチンを使用して、腫瘍細胞株、腫瘍組織、および腫瘍血管内皮細胞、その他に感染させることができる。次いで、本発明者らは、同じパラホルムアルデヒド固定法を使用して、細胞ワクチンを作製することができる。
【００９４】
3）共生の細菌の安定なEGFR形質転換体  
また、EGFR分子ワクチンは、共生の細菌の安定なEGFR形質転換体である生ワクチンも含む。
【００９５】
これらの生ワクチンを製造するために、本発明者らは、自己、異種、遺伝子特異的進化EGFRなどの種々の異なる供与源からのEGFRによって構築された原核生物組換え発現プラスミドを使用した。本発明者らは、これらのプラスミドを使用してビフィドバクテリウム属などの腸の共生細菌を形質転換した。次いで、本発明者らは、安定な形質転換体を選択した。共生細菌のこれらの安定なEGFR形質転換体は、外来EGFR分子を持続的に分泌し、これにより体の免疫応答を誘導することができる。従って、これらは、生ワクチンに分類される。これは、EGFR分子ワクチンの具体例である。
【００９６】
4）EGFR分子ワクチンのためのターゲットされたナノ粒子  
純粋な組換えEGFR分子ワクチン（EGFR組換遺伝子ワクチン、組換えタンパク質ワクチン、および組換えウイルス・ワクチンを含む）を、その特異性および免疫原性を増強するためにさらに改善するべきである。本発明は、EGFR分子ワクチンを作製する際にターゲットされたナノ粒子を使用することによって、EGFR分子ワクチンを増強し、修飾するための微小工学の使用を開示する。標的抗原分子としてのEGFR分子のDNAまたはタンパク質形態のいずれか、リポソームなどの生体分子、ナノ材料としてのポリDL-ラクチド-コ-グリコリド重合体（PLGA）などの分解性高分子生物物質、修飾遺伝子としてのMIP-3およびFlt3-L、標的細胞としての樹状細胞を使用して、本発明者らは、新たなタイプのターゲットされたEGFRワクチン・ナノ粒子を構築することができる。
【００９７】
本発明のナノ粒子によってターゲットされたEGFR分子ワクチンは、以下の種々の形態である：（1）マンナン修飾された組換えアデノウイルスのEGFRワクチンおよびタンパク質ワクチン、並びにマンナン修飾されたリポソーム組換えEGFR遺伝子ワクチンおよびタンパク質ワクチンを含むマンナン修飾されたナノ粒子（2）遺伝子ターゲットされたナノリポソーム組換えEGFRワクチン、遺伝子ターゲットされたナノ-PLGA組換えEGFRワクチン、および遺伝子ターゲットされた組換えアデノウイルスのEGFRワクチン（これらは、同時にEGFRおよびMIP-3を発現する）を含む遺伝子ターゲットされたナノ粒子、（3）RGD修飾された組換えアデノウイルスのEGFRワクチンを含む、癌血管内皮細胞をターゲットする組換えアデノウイルスのEGFRワクチン。
【００９８】
本発明に開示したように、ナノ粒子の直径は、通常、500nm未満であり、これらは3つのサイズに分類することができる：200〜500nm、100〜200nm、および50〜100nm。50nm〜100nmの範囲の直径、および80nm程度のナノ・ピーク値を有するナノ粒子を使用することが好ましい。
【００９９】
以下の手順は、マンナン修飾された組換えアデノウイルスEGFRワクチンの調製に適用される：本発明者らは、最初に従来法を使用して、EGFR組換えアデノウイルス（世代IまたはII）を得て、増幅し、クロマトグラフィーまたは超遠心機を使用して組換えアデノウイルスを精製した。次に、本発明者らは、Sigmaからの70mgのマンナンを5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）に、14mg/mlの終濃度に達するように溶解し、45mlの0.01M過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して、混合し、これを4℃で60分間酸化した。その後、本発明者らは、10μlのグリコールを添加し、4℃で30分間インキュベートし、酸化的マンナン（Ox-M）混合物を生じた。次いで、本発明者らは、Ox-M混合物を事前に炭酸水素緩衝液（pH6.0-9.0）で平衡化したセファデックス-G25カラムに充填してクロマトグラフィーを行い、Ox-Mを2mlの大きさの空の容器に溶出させた。その後、本発明者らは、精製したOx-Mを1×1014の組換えアデノウイルス粒子と室温で一晩混合し、必要とされるOx-M-アデノウイルスを得た。次いで、本発明者らは、Ox-M-アデノウイルスに1mg/mlの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、これを3時間室温に放置して、還元的マンナン・アデノウイルス（Red-M-アデノウイルス）を形成させた。Ox-M-アデノウイルスおよびRed-M-アデノウイルスを限外濾過によって脱塩し、濃縮して、細菌を濾過する。次いで、これらを小さな試験管に貯蔵し、-80℃で保存した。マンナン修飾された組換えEGFRアデノウイルスは、被検者を免疫にするためのワクチンとして使用することができる。
【０１００】
アデノウイルスのサイズは、約80nmであるので、これは天然のナノ粒子と考えられる。アデノウイルス粒子は、アデノウイルスのファイバータンパク質がトリペプチド：RGDを発現することができるように修飾することができる。RGDトリペプチドは、標的腫瘍血管内皮細胞に特異的な能力を有する。RGDで修飾された組換えアデノウイルスEGFRワクチンは、天然のターゲットされたEGFR分子ワクチン・ナノ粒子と見なすことができる。
【０１０１】
本発明において、AdEasy系は、RDG修飾されたアデノウイルス組換えEGFRワクチンを構築するために利用される。詳細な方法は、図5に工程毎に示してある。詳細な方法は、以下の通りである：本発明者らは、制限酵素SpeI（Sp）でアデノウイルス・ゲノム・バックボーン・プラスミドpAdEasy-1およびpAdEasy-2を消化し、これらをブラントにするために、T4 DNAポリメラーゼを使用して末端を埋め（filling、f）、次いでPacI（P）で埋めた産物を消化し、電気泳動法を使用して6211bpおよび3579bpの断片を回収して、これらをそれぞれAdFiber I／Sp／f／PおよびAdFiber II／Sp／f／Pと名付けた。これらの断片は、無処理のアデノウイルスファイバータンパク質遺伝子を含む。別に、pSuttleベクターは、最初にこれをBamHIで消化し、次いでT4 DNAポリメラーゼで埋め、PacIで消化することによって調製した。このようなBamHI/filling／PacI-消化処理した後は、ベクターには、AdFiber I／Sp／f／PおよびAdFiber II／Sp／f／P断片を挿入しやすい。生じた組換えプラスミドを、それぞれpSh-AdFiber IおよびpSh-AdFiber IIと名付けた。次いで、本発明者らは、NheI酵素でpSh-AdFiber Iを消化し、T4 DNAポリメラーゼで埋めて、再びKpnI酵素でこれらを消化し（NheI/filling/KpnI）、電気泳動法を用いて、AdFiberI／Nh／f／Kと呼ばれる2090bp断片を回収し；SmaIおよびKpnI二重酵素消化によって事前に消化したpUC18ベクターへこの断片を挿入し、pUC-AdFiberIという名の組換えプラスミドを生じさせた。一方で、pSh-AdFiber IIをAvrII酵素で消化し、次いでT4 DNAポリメラーゼで埋め、次いでHindIIIで消化して（AvrII/filling/HindIII）、電気泳動法を用いて、AdFiber I/A/f/Hを呼ばれる838bpの断片を回収した。この断片を事前にSmaIおよびHindIII二重酵素消化で消化したpUC18ベクターに挿入し、pUC-AdFiberIIと名付けた新たなプラスミドを生じさせた。次いで、本発明者らは、アデノウイルスknob（Ad-knob）遺伝子配列を増幅するためのテンプレートとしてpUC-AdFiberIおよびpUC-AdFiberIIを使用するための一連のPCRプライマーをデザインした。使用するプライマーは、それぞれ以下の通りである：
F1（5'GAAAGCTAGCCCTGCAAACATCA3'）、
R1（5'ACTCCCGGGAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTG3'）、
F2（5'ACTCCCGGGAGTGCATACTCTATGTCA3'）、
R2（5'TATGGTACCGGGAGGTGGTGA3'）、
F3（5'AACCTAGGGAGGTTAACCTAAGCACTG3'）および、
R3（5'CTCAAGCTTTTTGGAATTGTTTGA3'）。
【０１０２】
第1ラウンドのPCRのために、それぞれプライマーF1-R1、F2-R2、F3-R1、およびF2-R3を用いて、本発明者らは、PCR1、PCR2、PCR3、およびPCR4を得た。また、プライマーとしてF1-R2およびF3R3を使用し、テンプレートとして第1ラウンドからの増幅産物PCR1およびPCR2、PCR3、およびPCR4を使用して、本発明者らは、第2ラウンドのPCR増幅を行い、PCR産物PCR1  PCR2（PCRI）、PCR3  PCR4（PCRII）を生じさせた。本発明者らは、第2ラウンドの増幅によるPCRIおよびPCRIIを得て、事前にEcoRV.で切断したpBR322ベクターにこれらを挿入した。生じる組換えプラスミドは、pBR-PCR IおよびpBR-PCR IIと名付けた。RGD-4C二重鎖の配列は、以下の通りである：
5'TGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGC3'  
3'ACACTGACGGCGCCTCTGACAAAGACG5'  
本発明者らは、事前にSmaIによって消化したpBR-PCRIおよびpBR-PCRIIベクターにRGD-4Cを挿入した。生じる組換えプラスミドは、pBR-PCR／RGD IおよびpBR-PCR／RGD IIという名づけてある。組換えプラスミドの配列は、シーケンシングを使用して確認する。pBR-PCR／RGD IをNheI／KpnI二重消化で切断し、電気泳動法を使用してPCR／RGD I断片を回収し、NheI／KpnIを使用して二重消化したpUC-AdFiber Iベクターに断片を挿入した。生じる組換えプラスミドは、pUC-AdFiber-RGD Iと呼ばれる。
【０１０３】
同様に、本発明者らは、AvrII／HindIIIを使用してpBR-PCR／RGD IIを二重消化し、電気泳動法使用して、PCR／RGD  II断片を回収し、事前に二重酵素AvrII／HindIIIによって消化したpUC-AdFiber IIベクターに断片を再び挿入した。生じるプラスミドは、pUC-AdFiber-RGDIIと名づけてある。その後、本発明者らは、SpeI／PacI二重酵素を使用してpUC-AdFiber-RGD IおよびpUC-AdFiber-RGD IIベクターを消化し、電気泳動法を使用してAdFiber-RGD IおよびAdFiber-RGD II断片を回収し、事前にSpeI／PacIで消化したpAdEasy-1、pAdEasy-2ベクターに断片を挿入した。生じる組換えプラスミドは、それぞれpAdEasy-RGD IおよびpAdEasy-RGD IIと呼ばれている。次いで、本発明者らは、最初に上記の通りにアデノウイルス・シャトル発現プラスミドpShuttle-hEGFR、pShuttle-mEGFR、およびpShuttle-chEGFRを得て、PmeIでこれらを直線化した。その後、本発明者らは、それぞれpAdEasy-RGDIおよびpAdEasy-RGDIIと共にこれらのShuttle-EGFRプラスミドでE.coli BJ5183細胞を同時形質転換した。生じる組換えプラスミドは、アデノウイルス・プラスミドpAd-RGD-EGFRIおよびpAd-RGD-EGFRIIと名付けてある。本発明者らは、アデノウイルス・プラスミドpAd-RGD-EGFRIを使用して293細胞にトランスフェクトし、Ad-RGD-EGFR Iという名の組換えアデノウイルスを生じさせた。同様に、本発明者らは、アデノウイルス・プラスミドpAd-RGD-EGFRIIを使用して293E4pIX細胞にトランスフェクトし、Ad-RGD-EGFR IIという名の組換えアデノウイルスを生じさせた。精製後Ad-RGD-EGFRIおよびAd-RGD-EGFRIIは、被験者を免疫するためのワクチンとして使用することができ、さらに重要なことに、これらのワクチンは、腫瘍血管内皮細胞をターゲットする特異性を有する。
【０１０４】
ナノ粒子によってターゲットしたEGFR分子ワクチンは、正常なEGFR分子ワクチンと比較して、非常にEGFRの免疫原性を増大することができ、したがって、EGFRがさらに強力な抗腫瘍免疫応答誘発することができることが、本発明において見いだされる。ナノ粒子によってターゲットしたEGFR分子ワクチンについての作用機序の模型図については、図6を参照されたい。
【０１０５】
5）その他の免疫応答刺激因子とEGFR分子ワクチンの組み合わせ  
EGFR分子ワクチンの抗癌効果は、その他の免疫応答刺激因子の効果と組み合わせることによって増強することができる。これらの因子は、IL-2、TNF、IFN-、およびGM-CDF、その他などのサイトカイン、MIP3、MIP3およびIP10、その他などのケモカイン、CEA、HSP70、HSP90、その他などのストリンジェント・ファクター、およびB7、その他などの種々の免疫共刺激因子を含む。EGFR分子ワクチンとこれらの免疫応答刺激因子の組み合わせの効果は、遺伝子レベルでの遺伝子融合またはタンパク質レベルでの融合タンパク質を介してこれらの効果を理解することができる。また、これらは、細胞レベルで腫瘍細胞、樹状細胞、および脈管内皮細胞を同時にトランスフェクトすることによって作用することができる。
【０１０６】
6.EGFR分子ワクチンの抗癌効果  
上記のように、本発明は、腫瘍関連タンパク質を使用する新型の分子ワクチンを提供する。EGFR分子ワクチンの特定の態様において、ワクチン、遺伝子ワクチン、ウイルス・ワクチン、および遺伝子修飾されたワクチンを含み、これらは全て自己の、異種の、または遺伝子特異的進化EGFR分子タンパク質を使用して作製される。これらの分子ワクチンは、腫瘍形成を防止すること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍に対する抗転移効果、および腫瘍を有するヒトまたは動物の生存率を増大することを含む、有効な抗腫瘍機能を有する。
【０１０７】
EGFR組換えDNAワクチンの抗癌効果を観察するために、マウスをランダムに群に分けて（群につき15匹のマウス）、それぞれの群には、100μgのEGFR組換えDNAワクチン、hEe-p、mEe-p、c-p（対照プラスミド）、または塩類溶液を、それぞれ筋肉内に注射した。注射は、週に一度、4週間連続して行った。4回目の免疫の1週後に、免疫マウスには、それぞれ5×105のLL／2cルイス肺結核患者癌細胞（図7AおよびC）またはMA782／5Sの乳癌細胞（図7BおよびD）をそれぞれ移植した。腫瘍は、mEe-p、c-p、または塩類溶液で免疫したマウスにおいて成長し続けたことを図から理解することができるが、hEe-pで免疫したマウスは、有意な防御免疫を示した。加えて、hEe-pを免疫したマウスの生存率は、mEe-p、c-p、または塩類溶液で免疫したマウスのものより有意に高い。たとえば、hEe-pで免疫したマウスは、5月以上生存した。腫瘍移植の150日間後に、LL／2cルイス肺癌およびMA782／5S乳癌を有するマウスは、それぞれ60%および66%の生存率に達した。また、防御免疫は、用量依存的であるということも発見されている。すなわち、150gの用量で得られる免疫は、100gのEGFR DNAワクチンものと同じであるが、用量を5〜15gまで下げると、ほとんど免疫がない。加えて、H22肝臓癌およびMMT-06052乳癌などのEGFR-陰性腫瘍を有するマウスは、hEe-pで免役したときに、防御免疫を示さなかった。
【０１０８】
防御免疫以外に、EGFR組換えDNAワクチンは、治療的な免疫も有する（図8）。同様に、マウスをランダムに群に分けた（群につき15匹のマウス）。これらには、1×106LL／2cルイス肺癌細胞（図8AおよびC）またはMA782／5S乳癌細胞（図8BおよびD）を1週に一回4週間連続してそれぞれ皮下に注射した。5日後に、これらには、100μgのEGFR組換えDNAワクチン、hEe-p、mEe-p、c-p（対照プラスミド）、または塩類溶液を、それぞれ筋肉内に1週に一回4週間連続して注射した。図から分かるとおり、mEe-p、c-p、または塩類溶液で免疫したマウスの腫瘍は、増殖し続けたが、hEe-pで免疫したマウスの腫瘍は、有意な治療的な効果を示した。加えて、hEe-pで免疫したマウスの生存率は、mEe-p、c-p、または塩類溶液で免疫したものよりも有意に高い。hEe-pで免疫したマウスは、5月以上生存した。腫瘍移植の150日間後に、LL／2cルイス肺癌およびMA782／5S乳癌を有するマウスは、それぞれ40%および53%の生存率を有する。
【０１０９】
EGFR組換えタンパク質ワクチンは、同様の保護的および治療的な免疫を有する。図9を参照されたい。上述の通り、C57BL/6またはBALB／cを有する6〜8週間齢の雌マウスをランダムに群に分け、LL／2cルイス肺癌、MA782／5S乳癌、およびC26腸癌についての腫瘍モデルをこれらのマウスに確立した。腫瘍を有するマウスには、週に一度4週間連続して、5〜50gの量のEGFR組換えタンパク質ワクチン、またはアジュバント・アルミニウム・ヒドロキシル・ゲルおよび塩類溶液100μlを皮下に注射した。組換えchEGFRタンパク質ワクチンで免疫したマウスは、有意な抗腫瘍防御免疫および治療的免疫を示し、LL／2cルイス肺癌およびMA782／5S乳癌の増殖は阻害され、これらの2つの腫瘍を有するマウスの寿命は延長されるが、EGFR天然の腫瘍C26は、有意な影響を受けない。加えて、マウスを組換えmEGFRタンパク質ワクチン、alumアジュバント、または塩類溶液で免疫した場合、腫瘍は、対照群において速いペースで成長し続け、これらのマウスの寿命は、かなり短くなったことが分かる。対照群と比較すると、試験群の腫瘍体積（t検定）および生存機関（ログランク検定）は、有意差（p<0.05）を示した。図9は、MA782／5S乳癌を有するマウスのEGFR組換えタンパク質ワクチンの抗癌効果を示す。
【０１１０】
転移は、腫瘍進行の、および化学療法および放射線療法の失敗の、一般的な原因である。
【０１１１】
血液およびリンパ循環における腫瘍細胞の存在並びに微小移動物（microtransferer）の形成は、転移の鍵である。本発明において、組換えEGFR分子ワクチンは、腫瘍に対して抗転移効果を有することを開示する。図10を参照されたい。尾静脈の注射による動物モデルでのLL／2cルイス肺癌転移の治療研究の間に、chEGFRタンパク質ワクチンで免疫した腫瘍を有するマウスは、対照群と比較してはるかに少ない肺の転移を有するか、または非常に少ない程度であるが、対照群の腫瘍を有するマウスでは、これらを組換えmEGFRタンパク質ワクチン、alumアジュバント、または塩類溶液で免疫した場合に、100%の転移を示し、これらは、無数の移動物を示した。図10は、LL／2cルイス肺癌を有するマウスのEGFR組換えタンパク質ワクチンの抗腫瘍転移効果を示す。図から、LL／2c肺癌の移動物の数およびchEGFRタンパク質ワクチンで免疫したマウスのLL／2c腫瘍転移後の肺湿重量は、対照群と比較して両方とも少ないことが分かる。
【０１１２】
加えて、EGFR分子ワクチンは、インビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害することができ、これらは、インビボで養子性の抗腫瘍免疫を有する。図11を参照されたい。本方法は、以下の通りに記載されている：マウスをEGFR DNAワクチンで免疫して、血清を4回目の免疫の7日後に収集した。血清免疫グロブリン（Ig）をアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。種々の濃度のIg（1〜1000mg/ml）を2×105/ml EGFR陽性の腫瘍細胞（A549、LL／2c、MA782／5S）およびEGFR陰性の腫瘍細胞（H22およびMMT-06052）（いずれの種類の腫瘍細胞も対数増殖基である）に添加した。次いで、細胞およびIgを72時間共培養して、生細胞をトリバンブルー（Tai Pan Blue）法を使用して検査し、増殖阻害の割合を算出した。結果は、ヒトEGFR組換えDNAワクチンhEe-pで免疫したマウスの血清から精製したIgで処理したたEGFR陽性腫瘍細胞は、有意な増殖阻害を示したが、EGFR陰性腫瘍細胞は、影響を受けなかったことを示した。図11Aを参照されたい。対照として、免疫されていない正常なマウスから誘導されるIgは、対応する腫瘍細胞と共培養した。これは、EGFR陽性腫瘍細胞またはEGFR陰性腫瘍細胞のいずれに対しても効果を有さなかった。図11Bを参照されたい。
【０１１３】
また、免疫したマウスから生じたこれらの精製Igは、養子免疫を有する。養子免疫を調査する方法は、以下の通りである：ヌードマウスに1×105〜1×106腫瘍細胞を皮下注射した。1日後、精製したIgを3週間連続して週に2回、10〜300mg/kgの用量で静脈内に注射した。結果は、ヒトEGFR組換えDNAワクチンhEe-pの養子移入が有意な腫瘍抑制効果を有することを示した。比較として、腫瘍細胞をIgに吸着させるために、精製したIgを固定したEGFR陽性腫瘍細胞またはEGFR天然の腫瘍細胞と共に4□で振盪して混合しながら1時間インキュベートした。この過程を4回繰り返した。結果は、ヒトEGFR DNAワクチンhEe-pで免疫したマウスからのIgは、LL／2cおよびMA782／5SなどのEGFR陽性腫瘍細胞によって事前に吸着された、したがって、これらの抗癌効果を失ったが、Igの抗腫瘍効果は、H22などのEGFR陰性腫瘍細胞とインキュベートした後にもまだ残っていた（図11C）。
【０１１４】
上記した肺癌および乳腺癌の他に、影響を受けることができる腫瘍は、肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、頭頸部扁平上皮癌、および神経膠腫を含む、EGFRが過剰発現されたその他の固形腫瘍を含む。EGFR分子ワクチンは、前述の全ての癌に対して信頼できる抗癌効果を有する。
【０１１５】
7.EGFR分子ワクチンの効果の原理および生物学的安全  
抗原または抗原エピトープとその対応する受容体／抗体との間の相互認識が、単に特異的なだけではないことは、現代の免疫学において周知である。実際に、この認識には、一定の可塑性、混乱、および退歩がある。従って、自己抗原に対する免疫寛容を壊すために、分子擬態の機構を介して自己抗原に対する免疫交差反応を誘導することができる。
【０１１６】
上記のように、本発明は、EGFR分子などの腫瘍特異的のタンパク質が免疫交差反応を起こし得る抗原であるという発見を開示する。EGFR分子の一定のバリエーションは、自己EGFR分子に対する体の寛容を弱めることができ、EGFR分子に対して自己交差反応を起こし得る免疫応答を誘導することができる。EGFRに対するこれらの免疫応答は、積極的免疫応答（細胞性免疫応答および体液性免疫応答など）および受動的免疫応答（養子性の免疫応答など）を含む。
【０１１７】
EGFR分子ワクチンの抗腫瘍機能の原理または機構を研究するために、本発明者らは、最初にEGFR免疫マウスからの体液性の液体について免疫試験を行った。使用する試験は、マウスおよびウサギ血清の抗EGFR自己抗体の存在を決定するための、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫沈降を含んだ。本発明者らは、マウス／ウサギの免疫された血清の抗EGFR抗体の力価およびタイプを試験するためにELISAを使用し、本発明者らは、免疫マウスの腫瘍組織の自己抗体を試験するために免疫組織化学を使用した。本発明者らは、自己抗体の機能を調査するために腫瘍細胞凝集試験および血清養子免疫試験を使用した。
【０１１８】
以下の実験プロトコルを試みた。血液をマウス尾静脈からの血液サンプルの抽出を使用して、毎週の免疫化の前後にそれぞれのマウスから得て、またはマウスを屠殺した後に、次の工程に使用するために血清を収集した。ウエスタンブロットでは、組換えEGFR分子ワクチンによって誘導される抗体が、対応する抗原（腫瘍細胞の組換えEGFRタンパク質またはEGFR発現）を特異的に認識することができるが、これらはEGFR-陰性細胞を認識することができなかったことを示した。同時に、抗体の立体表面認識を同定するためにフローサイトメトリーを使用して、本発明者らは、組換えEGFR分子ワクチンが、腫瘍細胞表面上のEGFRを次々に認識することができる特異抗体の産生を刺激することができることを見いだした。ELISAを使用する自己抗体の試験では、マウスが、組換えEGFR分子ワクチンで免役された2週間後に抗マウス自己抗体を産生し始め、1：100〜1：5000の力価に達することを示した。これは、徐々に増大して、4週で1：10000〜1：500000になり、8週で1：500〜1：1000の力価を維持することができる。比較としての、対応する対照群では、検出可能な抗体産生はなかった。生じる抗体のサブタイプについてのさらなる試験では、EGFR分子ワクチンによって産生される抗体が主にIgGであることを示した。図12は、EGFR分子ワクチン（組換えDNAワクチンおよび組換えタンパク質ワクチン）で免疫したマウスによって産生される抗体のタイプを示す。図から、組換えEGFR分子ワクチンは、有意にIgG1、IgG2a、およびIgG2bの産生を増大することができるが、IgMおよびIgAの産生は、増大されないことが分かる。さらに、組換えEGFR分子ワクチンによって刺激される抗体の産生は、抗CD４抗体によって遮断することができるが、抗CD8、抗NK、または対照抗体によっては遮断することができない。比較として、非特異的抗体は、タンパク質ワクチンの対照群、アジュバント、または塩類溶液において検出されなかった。
【０１１９】
また、EGFR分子ワクチンは、細胞性免疫を誘導することができる。EGFR分子ワクチンで免疫したマウスの細胞性免疫を検査するために使用した試験は、以下を含む：CTL活性を測定するために51Cr放出法を使用し；サイトカイン・レベルを（主に、IFN-γおよびIL-4の試験血清中濃度について）試験するためにELISPOTを使用し；T細胞タイプ（CD4+Tリンパ球、CD8+Tリンパ球、またはNK細胞など）を決定するために免疫細胞サブセットの枯渇試験を使用する。
【０１２０】
プロトコルは、以下の通りに行われる：マウスを組換えchEGFRワクチンで免疫し、次いで脾臓モノリンパ球をELISPOT試験のために採取した（これは、モノリンパ球中に大量の抗原特異的なB細胞を示した）。組換えmEGFRで免疫したマウスの試験では、少量の抗原特異的なB細胞の存在を示した。しかし、抗原特異的なB細胞の統計学的に有意な量は、アジュバント群または空ベクター群を含む対照群では見いだされなかった。別の実験では、組換えEGFR分子ワクチンで3週間免疫したマウスから脾臓T細胞を採取した。次いで、本発明者らは、抗原の存在下においてインビトロでT細胞を活性化するための抗原提示細胞として、健康な脾臓からのモノリンパ球を使用した。結果は、組換えchEGFR分子ワクチンで免疫したマウスが比較的大量のIFN-γおよびIL-4産生細胞を含んでいたことを示した。また、組換えchEGFR分子ワクチンを免疫したマウス細胞から誘導される脾臓Tは、mEGFR分子ワクチンによってインビトロで再び刺激された後に、多くのIFN-γおよびIL-4産生細胞を産生した。脾臓T細胞の両群は、インビトロで刺激されなかったT細胞よりも有意に多く産生した。さらにまた、標準的な51Cr試験を使用して、ヒトおよびマウス由来の関連した腫瘍細胞に対する組換えEGFR分子ワクチンで免疫した脾臓T細胞の特異的な細胞破壊効果を決定した。結果は、chEGFR分子ワクチンによって免疫にされたあと、40：1の比率で、マウス脾臓T細胞がEGFR陽性腫瘍細胞に対して特異的な細胞破壊的な活性を示したことを示した。LL／2cおよびMA782／5Sのでは、これらは、それぞれ40.27%、42.83%である。対照的に、mEGFRで免疫したマウス脾臓T細胞は、LL／2cおよびMA782／5Sの腫瘍細胞に対して、およびC26細胞などのEGFR陰性腫瘍細胞に対して細胞破壊効果を示さなかった。同時に、前述の細胞破壊効果は、対応する抗CD8および抗MHC-Iモノクローナル抗体によって遮断することができるが、抗CD４および抗MHC-IIモノクローナル抗体によって遮断されなかった。対照群からの脾臓T細胞は、何ら統計学的に有意な細胞破壊的な活性を示さなかった。図13は、免疫マウスに対するEGFR組換えDNAワクチンのCTL効果を示す。この図から、ヒトEGFR組換えDNAワクチンhEe-pで免疫したマウスからのT細胞が、対照群からのT細胞と比較して、EGFR陽性腫瘍細胞に対してより高い細胞破壊活性を有することを理解することができる。さらに、このインビトロでの細胞破壊活性は、抗CD8または抗-MHC-Iモノクローナル抗体によって遮断することができるが、抗CD4モノクローナル抗体によって遮断することはできず、この細胞破壊活性は、MHC-I依存的なCD8+T細胞に依存的であることを示す。加えて、活性化された脾細胞は、YAC-1標的細胞に対するNK活性の増加を示さなかった。さらに、ヒトEGFR組換えDNAワクチンhEe-pで免疫したマウスから誘導されるCD4枯渇（CD8+）、またはCD8枯渇（CD4+）T細胞の養子移入は、EGFR陽性腫瘍に対して抗癌効果を示した。対照的に、その抗癌効果は、EGFR陰性腫瘍細胞に対しては有意でない。対照群からは、抗癌効果が見られなかった。
【０１２１】
また、本発明者らは、EGFR分子ワクチンで免疫したマウスに対する長期の中毒影響の可能性を観察した。重量減少、皮膚および髪の変質、アペティティ（apetitie）の減少、平均余命の減少などの明らかな中毒性副作用は、観察されなかった。免疫マウスの肝臓、肺、脾臓、および脳の鏡検では、病理変化は発見されなかった。免疫蛍光染色では、マウスの主要器官に自己抗体の堆積は示さなかった。図14を参照されたい。
【０１２２】
本発明の詳細な態様  
以下の実施例は、例示の目的だけのために含まれ、本発明の範囲を制限することは企図されない。
【実施例】
【０１２３】
実施例1：EGFR組換えDNAワクチン  
ヒト、マウス、ニワトリのcDNA配列を得るためにGenBankを検索し、これらは、それぞれ配列番号1〜5、7〜9、19として本明細書に一覧を示してある。本発明者らは、cDNA配列に基づいて以下のPCRプライマーをデザインした。
【０１２４】
pORFに基づいたプラスミドについては、
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACGAATTCTTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACGAATTCTTAATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACGAATTCTTAAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【０１２５】
本発明者らは、ヒト肺癌株化細胞A431、マウス肺癌株化細胞LL2、およびニワトリ胚からの総RNAをそれぞれRT-PCR増幅を行うために使用して、次いで電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて精製し、PCR産物をサブクローニングする。シーケンシングよってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、NcoIおよびEcoRIを使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集め、これらを精製し、NcoIおよびEcoRIによって消化したpORF-MCSベクター（InvivoGen社から）内に断片を挿入する。本発明者らは、組換えプラスミドを選択する。候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認する。これらには、pORF-hEGFR、pORF-mEGFR、およびpORF-chEGFRという名前をつけてある。
【０１２６】
pcDNAに基づいたプラスミドについては：
pcDNA-hEGFR、pcDNA-mEGFR、pcDNA-chEGFRの構築のための方法は、上記した方法と同様である。この場合、pcDNA3.1（+）ベクターは、InvitroGenによって作製されているが、PCRプライマーの配列は、上記のパラグラフにて説明したように、これらのプライマーとはいくぶん異なっている。
【０１２７】
ヒト・プライマー：5'GAGCTAGCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'CACTCGAGTTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GAGCTAGCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'CACTCGAGTTAATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GAGCTAGCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'CACTCGAGTTAAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【０１２８】
本発明者らは、組換え発現プラスミドを選択し、EGFR配列の存在を確認するために制限酵素解析を使用し、次いでCHO、NIH3T3、Velo株化細胞にこれらをそれぞれトランスフェクトした。本発明者らは、SDS-PAGE、ELISA、ウエスタンブロット技術を使用してEGFR発現のレベルをモニターする。本発明者らは、組換えEGFR発現プラスミドを収集するために、アルカリ抽出法を使用した。次いで、本発明者らは、大腸菌毒素混入を除去するために、超遠心機および限外濾過を使用し、こうして純粋なプラスミドDNAを得る。これらのプラスミドDNAは、被験者この場合、マウスを免疫するためのDNAワクチンとして使用することができる。
【０１２９】
上記の方法と同様に、本発明者らは、GenBankなどの公共データベースに集められた配列（配列には、遺伝子配列、cDNA配列、mRNA配列、およびアミノ酸配列を含む）に従って、その他のプライマーまたはプローブをデザインすることができる。これらの配列は、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、サバ、ショウジョウバエなどの種々の種に由来することができ、配列番号1〜14を参照されたい。これらの配列を用いて、本発明者らは、PCR、RT-PCR、分子ハイブリダイゼーションなどの分子クローン技術を用いて、種々の商業的に入手可能な遺伝子ライブラリー、cDNAライブラリー（ClonTech、StrateGeneの遺伝子ライブラリーおよびcDNAライブラリーなど）、株化細胞（ヒト肺癌株化細胞A431、マウス・ルイス肺癌株LL2、その他など）、および組織（肺癌、乳がん組織、ショウジョウバエ組織、およびニワトリ胚、その他など）から、種々の生物源からのEGFR分子の細胞内ドメインをクローニングし、単離する。また、本発明者らは、遺伝子特異的進化技術での選択を使用して、強い免疫原性を有するEGFR分子を得た。シーケンシングを使用してEGFR cDNAの細胞外配列を確認したあと、本発明者らは、pcDNA3.1、pORF-mcs、pBLAST-MCS、pSecTag2などの真核生物発現プラスミドにEGFR細胞外ドメインを挿入した。
【０１３０】
本発明者らは、6〜8週齢のマウスを選択し、ルーチンの技術を使用して種々のマウス腫瘍モデルを確立した。本発明者らは、4週間連続して週に一度、100□gのEGFR組換え発現プラスミドを注射した。本発明者らは、腫瘍を有するマウスの増殖および腫瘍の進行を観察した。8週後に、マウスを屠殺して、免疫マウスの血清および器官は収集した。本発明者らは、体液性免疫応答の試験のためにフローサイトメトリー、ELISA、およびウエスタンブロットを使用した。細胞応答を検査するために、本発明者らは、Cr51、ELISpot法を使用した。実験の毒性および副作用を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用した。次に、本発明者らは、免疫マウスの血清を精製し、ヌードマウスの腫瘍モデルを確立するためにルーチンの方法を使用し、養子免疫治療を行い、腫瘍の増殖をさらに観察した。
【０１３１】
実施例2：EGFR組換えタンパク質ワクチン（大腸菌に発現した）  
実施例1のように、本発明者らは、GenBankなどの公共データベースに記載されているヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列を得た。それぞれ、配列番号1〜5、7〜9、19に対応する。これらの配列に基づいて、本発明者らは以下のプライマーをデザインした：
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACAGATCTAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'、
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACAGATCTATAGATGGTATCTTTGGC3'
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACAGATCTAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【０１３２】
本発明者らは、pORF-hEGFR、pORF-mEGFRおよびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用し、次いで電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて、精製し、次いでPCR産物をサブクローニングした。シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、制限酵素NcoIおよびBglIIを使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集めて精製し、次いで、断片を2つの制限酵素NcoIおよびBglIIで消化されたpQE60ベクター（Qiagen社から）に挿入した。本発明者らは、組換えプラスミドを選択した。生じる候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、pQE-hEGFR、pQE-mEGFR、およびpQE-chEGFR名づけてある。
【０１３３】
同様に、pET32、pLLp、pSE420などの種々の原核生物の発現ベクターに応じて、その他のEGFR組換え原核生物発現プラスミドを構築するために、種々のプライマーをデザインして、使用することができる。
【０１３４】
実施例1と同様に、本発明者らは、種々のEGFR分子の細胞外ドメインをクローン化し、pQE、pET32、pLLpなどの原核生物発現プラスミドに該ドメインを挿入した。組換え発現プラスミドを選択した後に、本発明者らは、制限酵素消化を使用して該ドメインの配列を確認した。次いで、本発明者らは、E.coli TOP10F'、E.coli BL21（DE3）pLys、E.coli M15、その他などのE.coli宿主にこれらの組換えプラスミドを形質転換し、次いでSDS-PAGE、ELISA、ウエスタンブロット、その他などの技術を使用して、EGFR分子の発現レベルを観察し、試験した。これらの試験から、本発明者らは、組換えプラスミドの発現のために最適なE.coli宿主を決定した。次いで、本発明者らは、確認されたEGFR発現プラスミドを使用して、最適なE.coli宿主細胞を形質転換し、次いで安定な形質転換体および各種レベルのシード・バンク・ライブラリーを確立した。本発明者らは、振盪培養器で組換え細菌細胞を培養し、またはあるいは、本発明者らは、標準的な方法を使用して細菌を発酵させた。本発明者らは、低温遠心機を使用して組換え細菌を収集した。次いで、本発明者らは、PBSに細菌を懸濁し、超音波法を使用して細胞を破壊した。本発明者らは、組換えEGFRタンパク質を単離し、精製するために、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを使用した。精製したEGFRタンパク質は、被検マウスを免疫するためのタンパク質ワクチンとして使用することができる。
【０１３５】
実施例1のように、本発明者らは、6〜8週齢のマウスを選択し、ルーチンの技術を使用して種々のマウス腫瘍モデルを確立した。本発明者らは、4週間連続して週に一度、5〜50□gのEGFR組換えタンパク質を注射した。本発明者らは、腫瘍を有するマウスの増殖および腫瘍の進行を観察した。8週後に、マウスを屠殺して、免疫マウスの血清および器官は収集した。本発明者らは、体液性免疫応答の試験のためにフローサイトメトリー、ELISA、およびウエスタンブロットを使用した。細胞応答を検査するために、本発明者らは、Cr51、ELISpot法を使用した。実験の毒性および副作用を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用した。次に、本発明者らは、免疫マウスの血清を精製し、ヌードマウスの腫瘍モデルを確立するためにルーチンの方法を使用し、養子免疫治療を行い、腫瘍の増殖をさらに観察した。
【０１３６】
実施例3：EGFR組換えタンパク質ワクチン（酵母ピチア・パストリス（Pichia pastoris）に発現した）  
また、前の節で説明したように、本発明者らは、GenBankなどの公共データベースに記載されているヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列を得た。それぞれ、配列番号1〜5、7〜9、19に対応する。これらの配列に基づいて、本発明者らは以下のプライマーをデザインした。
【０１３７】
ヒト・プライマー：
5'ATACTCGAGAAAAGAGAGCTGGAGGAAAAGAAAG3'、
5'GCTCTAGAATGGCACAGGTGGCACA3'；
マウス・プライマー：
5'ATGCTCGAGAAAAGAGAGTTGGAGGAAAAGAAAGTC3'、
5'AAGCGGCCGCCATAGATGGTATCTTTG3'；
ニワトリ・プライマー：
5'ATACTCGAGAAAAGAGAGGTGGAGGAGAAGAAAG3'、
5'CGTCTAGAAGATGGAGTTTTGGAG3'。
【０１３８】
本発明者らは、pORF-hEGFR、pORF-mEGFR、およびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用して、電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集め、精製し、PCR産物をサブクローニングした。シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、これらを2つの制限酵素XhoIおよびXbaIを使用して消化し（マウスEGFRを含むプラスミドの場合、本発明者らは、XhoIおよびNotI二重酵素消化を使用する）、1.9kbの断片を集めて、これらを精製し、2つの制限酵素XhoIおよびXbaIによって消化された（マウスEGFRを含むプラスミドの場合、本発明者らは、XhoIおよびNotI二重酵素消化を使用する）pPICZAベクター（Invitrogen社から）に挿入した。本発明者らは、E.coliをこれらのプラスミド標品で形質転換し、組換えプラスミドを選択した。候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、酵母発現プラスミド：pYE-hEGFR、pYE-mEGFR、およびpYE-chEGFRと名づけてある。
【０１３９】
これらの酵母発現プラスミドをPmeIで消化して、これらを直線化した後に、本発明者らは、電気穿孔法を使用して、酵母株化細胞X33またはGS115を形質転換した。本発明者らは、安定な形質転換体を選択するために、ゼオシン耐性を使用した。MMH（Minimal Methanol with histidine，MMH）およびMDH（Minimal Dextrose with histidine，MDH）寒天プレートを使用して、Mut+形質転換体を決定して選択した（selecte）。6〜10のMut+形質転換体を小規模の発現について選択し、次いで、SDS-PAGE、ウエスタンブロット、ELISA、その他の方法を使用して発現された組換えタンパク質を確認した。本発明者らは、酵母発現種子ライブラリーを確立するために、最高の発現効率を有するMut+形質転換体を大規模発現として使用した。本発明者らは、大きなフラスコを組換え酵母細胞株を培養または発酵させるために使用し、酵母ペレットを低温遠心機を使用して集めた。ペレットをPBS溶液に再懸濁したあと、本発明者らは、超音波を使用して細胞を破壊した。次いで、本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを使用して、組換えEGFRタンパク質を単離し、精製した。このように誘導される組換えEGFRタンパク質は、被検者の免疫化のためのタンパク質ワクチンとして使用することができる。同様に、EGFRで作製された酵母組換え発現プラスミドは、その他の酵母発現系によって産生させることができる。
【０１４０】
実施例2のように、本発明者らは、6〜8週齢のマウスを選択し、ルーチンの技術を使用して種々のマウス腫瘍モデルを確立した。本発明者らは、4週間連続して週に一度、5〜50□gのEGFR組換えタンパク質を注射した。本発明者らは、腫瘍を有するマウスの増殖および腫瘍の進行を観察した。8週後に、マウスを屠殺して、免疫マウスの血清および器官は収集した。本発明者らは、体液性免疫応答の試験のためにフローサイトメトリー、ELISA、およびウエスタンブロットを使用した。細胞応答を検査するために、本発明者らは、Cr51、ELISpot法を使用した。実験の毒性および副作用を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用した。次に、本発明者らは、免疫マウスの血清を精製し、ヌードマウスの腫瘍モデルを確立するためにルーチンの方法を使用し、養子免疫治療を行い、腫瘍の増殖をさらに観察した。
【０１４１】
実施例4：EGFR組換えアデノウイルス・ワクチン  
以前の実施例のように、本発明者らは、GenBankなどの公共データベースに記載されているヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列を得た。それぞれ、配列番号1〜5、7〜9、19に対応する。これらの配列に基づいて、本発明者らは以下のプライマーをデザインした：
ヒト・プライマー：
5'GAAGATCTATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACGATATCTTAAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：
5'GAAGATCTATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACGATATCTTAATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：
5'GAAGATCTATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACGATATCTTAAGATGGAGTTTTGGAGCC3'；
本発明者らは、pORF-hEGFR、pORF-mEGFR、およびpORF-chEGFRをPCR増幅のためのテンプレートとして使用し、電気泳動法を使用して増幅されたEGFR断片（平均1.9kbの長さ）を集めて、精製し、PCR産物をサブクローニングした。シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、2つの制限酵素BglIIおよびEcoRVの二重酵素消化を使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集めてこれらを精製し、BglIIおよびEcoRVで予め消化したpShuttle-CMVベクター（Quantum Biotechnologiesによる作製）へ断片を挿入した。本発明者らは、組換えプラスミドを選択した。生じる候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、アデノウイルス・シャトル発現プラスミド：pShuttle-hEGFR、pShuttle-mEGFR、およびpShuttle-chEGFRと名付けた。これらのアデノウイルス・シャトル発現プラスミドのプラスミド・マップについては、図2Dを参照されたい。
【０１４２】
次いで、本発明者らは、前述のように種々のアデノウイルス・シャトル発現プラスミドを得て、PmeI酵素によってこれらを消化し、アデノウイルス・ゲノムpAdEasy-1またはpAdEast-2を含むバックボーン・ベクターをE.coliBJ5183細胞に同時形質転換した。生じる組換えアデノウイルス・ベクター・プラスミドは、pAd-hEGFR、pAd-mEGFR、およびpAd-chEGFRと名づけてある。これらのアデノウイルス・ベクター・プラスミドをPacI酵素で消化し、リン酸カルシウムDNA共沈法を使用して、これらをアデノウイルス・パッケージング株化細胞の293細胞にトランスフェクトした。生じる組換えアデノウイルスは、Ad-hEGFR、Ad-mEGFR、およびAd-chEGFRと呼ばれている。PCR、ウエスタンブロット、およびその他の方法を使用して、EGFR遺伝子が実際にアデノウイルス・ベクターに組み込まれ、真核生物細胞中に効率的に発現されたことを確認した。
【０１４３】
アデノウイルス・ゲノムの相違に応じて、組換えアデノウイルス・ワクチンは、2つの群に分類することができ：第1の群は、世代IのEGFR組換えアデノウイルスと呼ばれ、アデノウイルス・シャトル発現プラスミドpShuttle-EGFRとAdEasy-1組換え体との間の組換えによって生じ、したがって、Ad-hEGFR IAd-mEGFRI、およびAd-chEGFRIと名づけてあり、および第2の群は、世代IIのEGFR組換えアデノウイルスと呼ばれ、アデノウイルス・シャトル発現プラスミドpShuttle-EGFRとAdEasy-2組換え体との間の組換えにより生じ、したがって、Ad-hEGFRII、Ad-mEGFRII、およびAd-chEGFRIIと名づけてある。
【０１４４】
本発明者らは、大量の組換えアデノウイルスAd-EGFRを収集するために、超遠心機を使用し、次いで、上層アガロース方法およびTCID50法を使用して組換えウイルスのそれぞれのバッチの力価（pfu）を試験した。次いで、本発明者らは、確認したEGFRアデノウイルス・ワクチンを大量に産生するために、293細胞を使用した。本発明者らは、さらに、超遠心機および限外濾過を使用して組換えウイルスを単離し、精製した。精製したEGFR組換えアデノウイルスは、被検動物に免役するためのワクチンとして使用することができる。
【０１４５】
以前の実施例に記載されているものと同様に、6〜8週齢のマウスを選択し、ルーチンの技術を使用して種々のマウス腫瘍モデルを確立した。本発明者らは、4週間連続して週に一度、1×109PFUのEGFR組換えアデノウイルスを各マウスに注射した。本発明者らは、腫瘍を有するマウスの増殖および腫瘍の進行を観察した。8週後に、マウスを屠殺して、免疫マウスの血清および器官は収集した。本発明者らは、体液性免疫応答の試験のためにフローサイトメトリー、ELISA、およびウエスタンブロットを使用した。細胞応答を検査するために、本発明者らは、Cr51、ELISpot法を使用した。実験の毒性および副作用を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用した。次に、本発明者らは、免疫マウスの血清を精製し、ヌードマウスの腫瘍モデルを確立するためにルーチンの方法を使用し、養子免疫治療を行い、腫瘍の増殖をさらに観察した。
【０１４６】
実施例5：EGFR組換えレンチウイルス・ワクチン  
EGFR組換えレンチウイルスを作製する方法の例として、本発明者らは、Invitrogen社によって作製されたViraPower（商標）レンチウイルス・ゲートウェイ（Lentiviral Gateway：登録商標）発現キットを使用した。詳細な方法は、以下の通りである：本発明者らは、最初にGenBankなどの公共データベースを検索し、ヒト、マウス、およびニワトリのEGFR分子のcDNA配列を得た。これらの配列は、それぞれ配列番号1〜5、7〜9、19として一覧を示してある。次いで、本発明者らは、以下のPCRプライマーをデザインした：
ヒト・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTTTGC3'、
5'ACGATATCAGGACGGGATCTTAGGCCCA3'；
マウス・プライマー：5'GACCATGGAGGAAAAGAAAGTCTGC3'、
5'ACGATATCATAGATGGTATCTTTGGC3'；
ニワトリ・プライマー：5'GACCATGGAGGAGAAGAAAGTTTGTC3'、
5'ACGATATCAGATGGAGTTTTGGAGCC3'。
【０１４７】
本発明者らは、シーケンシングによってPCRサブクローンの配列を確認した後に、本発明者らは、2つの制限酵素NcoIおよびEcoRVの二重酵素消化を使用してこれらを消化し、1.9kbの断片を集めて、これらを精製し、NcoIおよびEcoRVによって予め消化したpENTR11ベクター（Invitrogenによって作製）へ断片を挿入した。本発明者らは、組換えプラスミドを選択した。生じる候補組換えプラスミドを制限酵素消化解析およびPCR増幅によって確認した。これらは、pENTR-hEGFR、pENTR-mEGFR、およびpENTR-chEGFRと名づけてある。これらのレンチウイルス発現プラスミドのプラスミド・マップについては、図2Eを参照されたい。
【０１４８】
次いで、本発明者らは、前述のように種々のレンチウイルス発現プラスミドを得て、レンチウイルスゲノムを含むバックボーン・ベクターpLenti6/V5-DESTと共にE.coli DH5細胞に形質転換した。生じる組換えレンチウイルスベクター・プラスミドは、pLenti-hEGFR、pLenti-mEGFR、およびpLenti-chEGFRと名づけてある。また、図2Eを参照されたい。次いで、本発明者らは、これらの組換えレンチウイルスベクター・プラスミドをパッキング混合物（Vira Power（商標）Packaging Mix）と混合し、次いで、リン酸カルシウムDNA共沈法を使用して、組換えレンチウイルスベクター・プラスミドをレンチウイルス・パッキング株化細胞293FT細胞にトランスフェクトした。生じる組換えレンチウイルスは、Lenti-hEGFR、Lenti-mEGFR、およびLenti-chEGFRと呼ばれている。PCR、ウエスタンブロット、およびその他の方法を使用して、EGFR遺伝子が実際にレンチウイルス・ベクターに組み込まれたこと、そのEGFRが真核生物細胞中に正しく、および効率的に発現したことを確認した。
【０１４９】
本発明者らは、次いで、上層アガロース方法およびTCID50法を使用して組換えウイルスのそれぞれのバッチの力価（pfu）を試験した。次いで、本発明者らは、確認したEGFRアデノウイルス・ワクチンを大量に産生するために、293細胞を使用した。本発明者らは、さらに、超遠心機および限外濾過を使用して組換えウイルスを単離し、精製した。精製したEGFR組換えアデノウイルスは、被検動物に免役するためのワクチンとして使用することができる。
【０１５０】
以前の実施例に記載されているものと同様に、6〜8週齢のマウスを選択し、ルーチンの技術を使用して種々のマウス腫瘍モデルを確立した。本発明者らは、4週間連続して週に一度、1×109PFUのEGFR組換えレンチウイルスを各マウスに注射した。本発明者らは、腫瘍を有するマウスの増殖および腫瘍の進行を観察した。8週後に、マウスを屠殺して、免疫マウスの血清および器官は収集した。本発明者らは、体液性免疫応答の試験のためにフローサイトメトリー、ELISA、およびウエスタンブロットを使用した。細胞応答を検査するために、本発明者らは、Cr51、ELISpot法を使用した。実験の毒性および副作用を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用した。次に、本発明者らは、免疫マウスの血清を精製し、ヌードマウスの腫瘍モデルを確立するためにルーチンの方法を使用し、養子免疫治療を行い、腫瘍の増殖をさらに観察した。
【０１５１】
実施例6：マンナン修飾された組換えアデノウイルスEGFRワクチン  
以下の手順は、マンナン修飾された組換えアデノウイルスEGFRワクチンの調製に適用される：本発明者らは、最初に従来法を使用して、EGFR組換えアデノウイルス（世代IまたはII）を得て、増幅し、クロマトグラフィーまたは超遠心機を使用して組換えアデノウイルスを精製した。次に、本発明者らは、Sigmaからの70mgのマンナンを5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）に、14mg/mlの終濃度に達するように溶解し、45mlの0.01M過ヨウ素酸ナトリウム溶液を添加して、混合し、これを4℃で60分間酸化した。その後、本発明者らは、10μlのグリコールを添加し、4℃で30分間インキュベートし、酸化的マンナン（Ox-M）混合物を生じた。
【０１５２】
次いで、本発明者らは、Ox-M混合物を事前に炭酸水素緩衝液（pH6.0-9.0）で平衡化したセファデックス-G25カラムに充填してクロマトグラフィーを行い、Ox-Mを2mlの大きさの空の容器に溶出させた。その後、本発明者らは、精製したOx-Mを1×1014の組換えアデノウイルス粒子と室温で一晩混合し、必要とされるOx-M-アデノウイルスを得た。次いで、本発明者らは、Ox-M-アデノウイルスに1mg/mlの水素化ホウ素ナトリウムを添加し、これを3時間室温に放置して、還元的マンナン・アデノウイルス（Red-M-アデノウイルス）を形成させた。Ox-M-アデノウイルスおよびRed-M-アデノウイルスを限外濾過によって脱塩し、濃縮して、細菌を濾過する。次いで、これらを小さな試験管に貯蔵し、-80℃で保存した。マンナン修飾された組換えEGFRアデノウイルスは、被検者を免疫にするためのワクチンとして使用することができる。
【０１５３】
以前の実施例に記載されているものと同様に、本発明者らは、6〜8週齢のマウスを選択し、ルーチンの技術を使用して種々のマウス腫瘍モデルを確立した。本発明者らは、4週間連続して週に一度、1×109PFUのEGFR組換えレンチウイルスを各マウスに注射した。本発明者らは、腫瘍を有するマウスの増殖および腫瘍の進行を観察した。8週後に、マウスを屠殺して、免疫マウスの血清および器官は収集した。本発明者らは、体液性免疫応答の試験のためにフローサイトメトリー、ELISA、およびウエスタンブロットを使用した。細胞応答を検査するために、本発明者らは、Cr51、ELISpot法を使用した。実験の毒性および副作用を決定するために、本発明者らは、免疫組織化学を使用した。次に、本発明者らは、免疫マウスの血清を精製し、ヌードマウスの腫瘍モデルを確立するためのルーチンの方法を使用し、養子免疫治療を行い、腫瘍の増殖をさらに観察した。
【０１５４】
実施例7：RGD修飾された組換えアデノウイルスEGFRワクチン  
本発明において、本発明者らは、RDG修飾されたアデノウイルス組換えEGFRワクチンを構築するためにAdEasy系を利用する。詳細な方法は、図5に工程毎に示してある。
【０１５５】
詳細な方法は、以下の通りである：本発明者らは、制限酵素SpeI（Sp）でアデノウイルス・ゲノム・バックボーン・プラスミドpAdEasy-1およびpAdEasy-2を消化し、これらをブラントにするために、T4 DNAポリメラーゼを使用して末端を埋め（filling、f）、次いでPacI（P）で埋めた産物を消化し、電気泳動法を使用して6211bpおよび3579bpの断片を回収して、これらをそれぞれAdFiber I／Sp／f／PおよびAdFiber II／Sp／f／Pと名付けた。これらの断片は、無処理のアデノウイルスファイバータンパク質遺伝子を含む。別に、pSuttleベクターは、最初にこれをBamHIで消化し、次いでT4 DNAポリメラーゼで埋め、PacIで消化することによって調製した。このようなBamHI/filling／PacI-消化処理した後は、ベクターには、AdFiber I／Sp／f／PおよびAdFiber II／Sp／f／P断片を挿入しやすい。生じた組換えプラスミドを、それぞれpSh-AdFiber IおよびpSh-AdFiber IIと名付けた。
【０１５６】
次いで、本発明者らは、NheI酵素でpSh-AdFiber Iを消化し、T4 DNAポリメラーゼで埋めて、再びKpnI酵素でこれらを消化し（NheI/filling/KpnI）、電気泳動法を用いて、AdFiberI／Nh／f／Kと呼ばれる2090bp断片を回収し；SmaIおよびKpnI二重酵素消化によって事前に消化したpUC18ベクターへこの断片を挿入し、pUC-AdFiberIという名の組換えプラスミドを生じさせた。
【０１５７】
一方で、pSh-AdFiber IIをAvrII酵素で消化し、次いでT4 DNAポリメラーゼで埋め、次いでHindIIIで消化して（AvrII/filling/HindIII）、電気泳動法を用いて、AdFiber I/A/f/Hを呼ばれる838bpの断片を回収した。この断片を事前にSmaIおよびHindIII二重酵素消化で消化したpUC18ベクターに挿入し、pUC-AdFiberIIと名付けた新たなプラスミドを生じさせた。
【０１５８】
次に、本発明者らは、アデノウイルスknob（Ad-knob）遺伝子配列を増幅するためのテンプレートとしてpUC-AdFiberIおよびpUC-AdFiberIIを使用するための一連のPCRプライマーをデザインした。使用するプライマーは、それぞれ以下の通りである：
F1  5'GAAAGCTAGCCCTGCAAACATCA3'）、
R1  5'ACTCCCGGGAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTG3'、
F2  5'ACTCCCGGGAGTGCATACTCTATGTCA3'、
R2  5'TATGGTACCGGGAGGTGGTGA3'、
F3  5'AACCTAGGGAGGTTAACCTAAGCACTG3'および、
R3  5'CTCAAGCTTTTTGGAATTGTTTGA3'。
【０１５９】
第1ラウンドのPCRのために、それぞれプライマーF1-R1、F2-R2、F3-R1、およびF2-R3を用いて、本発明者らは、PCR1、PCR2、PCR3、およびPCR4を得た。また、プライマーとしてF1-R2およびF3R3を使用し、テンプレートとして第1ラウンドからの増幅産物PCR1およびPCR2、PCR3、およびPCR4を使用して、本発明者らは、第2ラウンドのPCR増幅を行い、PCR産物PCR1  PCR2（PCRI）、PCR3  PCR4（PCRII）を生じさせた。本発明者らは、第2ラウンドの増幅によるPCRIおよびPCRIIを得て、事前にEcoRV.で切断したpBR322ベクターにこれらを挿入した。生じる組換えプラスミドは、pBR-PCR IおよびpBR-PCR IIと名付けた。
【０１６０】
RGD-4C二重鎖の配列は、以下の通りである：
5'TGTGACTGCCGCGGAGACTGTTTCTGC3'  
3'ACACTGACGGCGCCTCTGACAAAGACG5'  
本発明者らは、事前にSmaIによって消化したpBR-PCRIおよびpBR-PCRIIベクターにRGD-4Cを挿入した。生じる組換えプラスミドは、pBR-PCR／RGD IおよびpBR-PCR／RGD IIという名づけてある。組換えプラスミドの配列は、シーケンシングを使用して確認する。pBR-PCR／RGD IをNheI／KpnI二重消化で切断し、電気泳動法を使用して、PCR／RGD I断片を回収し、NheI／KpnIを使用して二重消化したpUC-AdFiber Iベクターに断片を挿入した。生じる組換えプラスミドは、pUC-AdFiber-RGD Iを呼ばれる。
【０１６１】
同様に、本発明者らは、AvrII／HindIIIを使用してpBR-PCR／RGD IIを二重消化し、電気泳動法使用して、PCR／RGD II断片を回収し、事前に二重酵素AvrII／HindIIIによって消化したpUC-AdFiber IIベクターに断片を再び挿入した。生じるプラスミドは、pUC-AdFiber-RGDIIと名づけてある。
【０１６２】
その後、本発明者らは、SpeI／PacI二重酵素を使用してpUC-AdFiber-RGD IおよびpUC-AdFiber-RGD IIベクターを消化し、電気泳動法を使用してAdFiber-RGD IおよびAdFiber-RGD II断片を回収し、事前にSpeI／PacIで消化したpAdEasy-1、pAdEasy-2ベクターに断片を挿入した。生じる組換えプラスミドは、それぞれpAdEasy-RGD IおよびpAdEasy-RGD IIと呼ばれている。
【０１６３】
次に、本発明者らは、最初に上記の通りにアデノウイルス・シャトル発現プラスミドpShuttle-hEGFR、pShuttle-mEGFR、およびpShuttle-chEGFRを得て、PmeIでこれらを直線化した。その後、本発明者らは、それぞれpAdEasy-RGDIおよびpAdEasy-RGDIIと共にこれらのShuttle-EGFRプラスミドでE.coli BJ5183細胞を同時形質転換した。生じる組換えプラスミドは、アデノウイルス・プラスミドpAd-RGD-EGFRIおよびpAd-RGD-EGFRIIと名付けてある。
【０１６４】
本発明者らは、アデノウイルス・プラスミドpAd-RGD-EGFRIを使用して293細胞にトランスフェクトし、Ad-RGD-EGFR Iという名の組換えアデノウイルスを生じさせた。同様に、本発明者らは、アデノウイルス・プラスミドpAd-RGD-EGFRIIを使用して293E4pIX細胞にトランスフェクトし、Ad-RGD-EGFR IIという名の組換えアデノウイルスを生じさせた。精製後Ad-RGD-EGFRIおよびAd-RGD-EGFRIIは、被験者を免疫するためのワクチンとして使用することができ、さらに重要なことに、これらのワクチンは、腫瘍血管内皮細胞をターゲットする特異性を有する。
【０１６５】
実施例8：組換えEGFR分子ワクチンの薬理学的研究  
組換えEGFR分子ワクチンの抗癌効果に関する薬理学的研究を得ることは重要である。本発明のこの目的のために行うことができる研究は、以下を含む：通常の腫瘍を有するマウス（防御免疫研究、治療的免疫研究、および転移モデル研究を含む）、ウサギ免疫学的試験、サル免疫学的試験、ヌードマウス養子性免疫学的試験、用量-依存性試験、およびインビトロでの細胞試験、その他。この実施例では、本発明者らは、モデルとして肺癌を使用して、通常の腫瘍有するマウス試験を記載する。その他の試験も同様に行うことができる。
【０１６６】
1.腫瘍を有するマウスの防御免疫：
6〜8週齢のC57BL/6マウスをランダムな群に分ける。これらには、週に一度4週間連続して、両後肢の筋肉内にEGFR分子ワクチンを注射する。5週目に、マウスには、1×106の濃度のLL／2c腫瘍細胞をチャレンジした。最初の免疫処置の0、1、3、5週後に、尾静脈から、または屠殺マウスから血液を採取する。遠心（5000RPMを3分間）後、血清を集め、将来の使用のために-20℃で保存する。
【０１６７】
2.腫瘍を有するマウスの治療的免疫：
6〜8週齢のC57BL/6マウスをランダムな群に分ける。これらには、1×106の濃度で、LL/2癌細胞をチャレンジする。腫瘍を導入して4日後に、これらをランダムな群に分け、週に一度4週間連続して、後肢の筋肉内に注射することによって、EGFR分子ワクチンで免疫した。最初の免疫の0、2、4、および6週後に、尾静脈から、または屠殺マウスから血液を採取する。遠心（5000RPMを3分間）後、血清を集め、将来の使用のために-20℃で保存する。腫瘍重量、体積、および生存曲線を記録する。
【０１６８】
3.腫瘍有するマウスの転移モデル試験：
6〜8週齢のC57BL/6雌のマウスをランダムな群に分ける。これらには、週に一度4週間連続しては、両後肢の筋肉内にEGFR分子ワクチンを注射する。2週後に、対数増殖期のLL/2腫瘍細胞を選択し、マウスにつき2×105の濃度で、マウスの後肢の筋肉内に注射する。上述した注射を続ける（Contiue）。4週後に、マウスを屠殺し、これらの肺の重量を測定する。肺の腫瘍移動物の調査後、肺を10%の中性に緩衝化されたホルムアルデヒドで固定する。
【０１６９】
本明細書に記載されている実施例および態様は、例示の目的であり、これを考慮して種々の修飾または変化が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲、並びに添付の請求の範囲の範囲内に含められる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】相同的な分子ワクチンの作用機序の模式図である。
【図２Ａ１】組換えEGFRプラスミド・マップを示す。2Aは、組換えEGFR成熟核発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ａ２】組換えEGFRプラスミド・マップを示す。2Aは、組換えEGFR成熟核発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ａ３】組換えEGFRプラスミド・マップを示す。2Aは、組換えEGFR成熟核発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ａ４】組換えEGFRプラスミド・マップを示す。2Aは、組換えEGFR成熟核発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ａ５】組換えEGFRプラスミド・マップを示す。2Aは、組換えEGFR成熟核発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ａ６】組換えEGFRプラスミド・マップを示す。2Aは、組換えEGFR成熟核発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ｂ】組換えEGFR原核生物発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ｃ１】組換えEGFR酵母発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ｃ２】組換えEGFR酵母発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ｃ３】組換えEGFR酵母発現プラスミド・マップを示す。
【図２Ｄ１】組換えEGFRアデノウイルスシャトル・プラスミド・マップを示す。
【図２Ｄ２】組換えEGFRアデノウイルスシャトル・プラスミド・マップを示す。
【図２Ｄ３】組換えEGFRアデノウイルスシャトル・プラスミド・マップを示す。
【図２Ｅ−Ｉ】組換えEGFRレンチウイルス前駆体プラスミド・マップを示す。
【図２Ｅ−ＩＩ】組換えEGFRレンチウイルス前駆体プラスミド・マップを示す。
【図３】EGFR組換えタンパク質ワクチンの構築を示す流れ図である。
【図４Ａ】EGFR組換えウイルス・ワクチンの構築を示する流れ図である。図4Aは、EGFR組換えアデノウイルス・ワクチンの構築を示す流れ図である。
【図４Ｂ】EGFR組換えウイルス・ワクチンの構築を示する流れ図である。EGFR組換えレンチウイルス・ワクチンの構築を示す流れ図である。
【図５Ａ】RGD修飾されたEGFR組換えアデノウイルス・ワクチンの構築を示す流れ図である。
【図５Ｂ】RGD修飾されたEGFR組換えアデノウイルス・ワクチンの構築を示す流れ図である。
【図５Ｃ】RGD修飾されたEGFR組換えアデノウイルス・ワクチンの構築を示す流れ図である。
【図６Ａ】図6は、図6A、6B、および6Cを含み、EGFR分子ワクチンがターゲットされたナノ粒子の作用機序を示す模式図である。
【図６Ｂ】図6は、図6A、6B、および6Cを含み、EGFR分子ワクチンがターゲットされたナノ粒子の作用機序を示す模式図である。
【図６Ｃ】図6は、図6A、6B、および6Cを含み、EGFR分子ワクチンがターゲットされたナノ粒子の作用機序を示す模式図である。
【図７】EGFR組換えDNAワクチンの保護抗腫瘍免疫の誘導を示すグラフである。7A。LL／2cルイス肺癌を有する免疫マウスの腫瘍体積の変化。7B。MA782／5S乳癌を有する免疫マウスの腫瘍体積の変化。7C。LL／2cルイス肺癌を有する免疫マウスの生存率。7d。MA782／5S乳癌を有する免疫マウスの生存率。hEe-p、ヒトEGFR細胞外DNAワクチン；mEe-p、マウスEGFR細胞外DNAワクチン；c-p、空プラスミド対照；塩類溶液、塩類溶液対照。
【図８】EGFR組換えDNAワクチンの治療的な抗腫瘍免疫の誘導を示すグラフである。8A。LL／2cルイス肺癌を有するの免疫マウス腫瘍体積の変化。8B。MA782／5S乳癌を有する免疫マウスの腫瘍体積の変化。8C。LL／2cルイス肺癌を有する免疫マウスの生存率。8d。MA782／5S乳癌を有する免疫マウスの生存率、hEe-p、ヒトEGFR細胞外DNAワクチン；mEe-p、マウスEGFR細胞外DNAワクチン；c-p、空プラスミド対照；塩類溶液、塩類溶液対照。
【図９】EGFR組換えタンパク質ワクチンの抗腫瘍免疫の誘導を示す。9A。防御免疫；9B。治療的な免疫；9C。MA782／5S乳癌を有するマウスの生存曲線。edCER、ニワトリEGFR細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ワクチン。edMER：マウスEGFR細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ワクチン。Adj：アジュバント。NS：塩類溶液。
【図１０】EGFR組換えタンパク質ワクチンの抗腫瘍転移効果を示す。10A。LL／2c肺癌の移動物の数。10B。LL／2c腫瘍転移後の肺湿重量。edCER：ニワトリEGFR細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ワクチン。edMER：マウスEGFR細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ワクチン。Adj：アジュバント。NS：塩類溶液。
【図１１】インビトロでのEGFR分子ワクチンの腫瘍細胞増殖の阻害およびその養子性抗腫瘍免疫を示す。11A。EGFR組換えDNAワクチンhEe-pで免疫したマウスから誘導されるIgによるEGFR陽性腫瘍細胞（A549、LL／2c、MA782／5S）およびEGFR陰性腫瘍細胞（H22およびMMT-06052）の増殖の阻害。11B。免疫されていない正常マウスから誘導されるIgによる腫瘍細胞の増殖の阻害。11C。EGFR組換えDNAワクチンhEe-pで免疫にしたマウスから誘導されるIgのインビボでの養子性抗腫瘍免疫。hEe-p、細胞外ヒトEGFRDNAワクチン；mEe-p、マウスEGFR細胞外DNAワクチン；c-p、空のプラスミド対照；塩類溶液、塩類溶液対照。
【図１２】EGFR分子ワクチンによって誘導される抗体のタイプを示す。12A。EGFR組換えDNAワクチンによって誘導される抗体のタイプ。12B。EGFR組換えタンパク質ワクチンによって誘導される抗体のタイプ。hEe-p、ヒトEGFR細胞外DNAワクチン；mEe-p、マウスEGFR細胞外DNAワクチン；c-p、空のプラスミド対照；塩類溶液、塩類溶液対照。edCER：ニワトリEGFR細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ワクチン。edMER：マウスEGFR細胞外ドメインを含む組換えタンパク質ワクチン。Adj：アジュバント。NS：塩類溶液。
【図１３】EGFR DNAワクチンによるインビトロでのCTLを媒介した細胞障害性およびT細胞サブセットの養子移入の誘導を示す。A、標準的な51Cr放出アッセイ法により、hEepで免役したマウスの脾臓から誘導されるT細胞を異なるE：T比でLL／2c細胞に対して試験した。標準的な51Cr放出アッセイ法により、hhEepで免役したマウスの脾臓から誘導されるT細胞は、LL／2c細胞に対してmEe-p（c-p）または免役されていないマウスからのT細胞よりも高い細胞障害性を示した。hEe-pで誘導される腫瘍殺傷活性は、抗CD8または抗MHCクラスI（抗-H-2Kb/H-2Db）mAbによって遮断することができる。BおよびC、hEe-p（白四角）、mEe-p、および免役されていないマウス（黒四角）で免役したC57BL/6マウスの脾臓からT細胞を単離し、CD4+またはCD8+リンパ球を枯渇させた。2×107個のhEe-pで免疫したマウスからのCD４枯渇（CD8+）（B）またはCD8枯渇（CD4+）（C）T細胞の養子移入により、EGFR陽性LL／2cに対する抗腫瘍活性を示した。DおよびE、2×107個のhEe-pで免役したBALB／cマウスからのCD４枯渇（CD8+）（D）またはCD8枯渇（CD4+）（E）T細胞の養子移入によっても、EGFR陽性MA782／5S乳癌モデルにおいて有効であることを見いだした。同系のEGFr陰性腫瘍（B16およびMethA）（B-E）においては、抗腫瘍活性が見いだされなかった。加えて、mEe-pおよび免役されていないマウス（黒四角）で免疫したマウスからのTリンパ球サブセットの転移は、効果を有さなかった（B-E）。データは、腫瘍細胞注射の25日後を表す。
【図１４】蛍光顕微鏡による腫瘍細胞に対する自己抗体の同定を示す。hEepで免役したマウスからのLL／2c腫瘍細胞（A）およびMA782／5S腫瘍細胞（B）に対する自己抗体の沈着があったが、非免疫マウス（CおよびD）からの対応する腫瘍細胞に対してはなかった。CD4+Tリンパ球の枯渇したマウスは、hEe-pで免疫されており、LL／2c腫瘍細胞（E）およびMA782／5Sの腫瘍細胞腫瘍細胞（F）に対して検出可能なIgG特異的な蛍光を発しなかった。対照的に、CD8+リンパ球の枯渇（GおよびH）またはNK細胞では、効果を示さなかった。hEe-pで免疫したマウスの肝臓（I）および腎臓（J）の組織、並びに非免疫マウスからの対応する組織（KおよびL）内には、自己抗体の沈着はなかった。
【図１】
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【図２Ａ１】
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【図２Ａ２】
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【図２Ａ３】
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【図２Ａ４】
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【図２Ａ５】
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【図２Ａ６】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ１】
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【図２Ｃ２】
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【図２Ｃ３】
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【図２Ｄ１】
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【図２Ｄ２】
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【図２Ｄ３】
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【図２Ｅ−Ｉ】
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【図２Ｅ−ＩＩ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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