(57)【要約】本発明は、生理的条件に近いか、またはそれらを超える温度において分解に逆らって安定化されるポリペプチド材料を含む固体ＰＡＣＡＰ粒子を包含する。それぞれの態様において、本発明のポリペプチド粒子は１以上の安定化条件により分解に逆らって安定化されるポリペプチド材料を含有する。本発明のポリペプチド粒子は２以上の安定化条件の付加的な作用を合わせて配合することができるため、本発明のポリペプチド粒子が安定化糖を含む場合、許容できるポリペプチド安定化を達成するために必要な安定化糖の量は著しく減少する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド；ならびに、金属イオンおよび酸性条件下において生理的条件までまたはそれを超える温度で安定である糖からなる群から選択される安定化物質；を含む安定化されたポリペプチド粒子であって、酸性の再構成ｐＨを示すように配合されているポリペプチド粒子。
【請求項２】
該ポリペプチド粒子が、ポリペプチド、金属イオンおよび、生理的条件まで、およびそれらを超える温度において酸性ｐＨで安定である糖を含む、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項３】
該安定化物質が、生理的条件までおよびそれらを超える温度において酸性条件下で安定である二糖および単糖から選択される、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項４】
該安定化物質が、トレハロースおよびメチル‐マンノピラノシドから選択される、請求項３に記載のポリペプチド粒子。
【請求項５】
該安定化物質が、酸性条件下において生理的条件までおよびそれを超える温度で安定である二糖および単糖から選択される安定化物質を含み、そして安定化物質対ポリペプチドのｗｔ／ｗｔ比、約０．１／１〜約１／１の間の範囲で安定化物質がポリペプチド粒子中に含まれる、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項６】
該安定化物質が、酸性条件下において生理的条件までおよびそれを超える温度で安定である二糖および単糖から選択される安定化物質を含み、そして安定化物質対ポリペプチドのｗｔ／ｗｔ比、約０．１／１〜約０．５／１の間の範囲で安定化物質がポリペプチド粒子中に含まれる、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項７】
該安定化物質が、酸性条件下において生理的条件までおよびそれらを超える温度で安定である二糖および単糖から選択される安定化物質を含み、そして安定化物質対ポリペプチドのｗｔ／ｗｔ比、約０．１／１〜約０．２５／１の間の範囲で安定化物質がポリペプチド粒子中に含まれる、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項８】
該安定化物質が、二価金属イオン塩に由来する金属イオンを含む、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項９】
該安定化物質が、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、およびＺｎＣｌ２からなる群から選択される二価金属イオン塩に由来する金属イオンを含む、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１０】
該安定化物質が金属イオンを含み、ポリペプチド粒子に含有される安定化物質対ポリペプチドのモル比が約１／１〜約１０／１の範囲である、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１１】
該安定化物質が金属イオンを含み、ポリペプチド粒子に含有される安定化物質対ポリペプチドのモル比が約２／１〜約６／１の範囲である、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１２】
該安定化物質が金属イオンを含み、ポリペプチド粒子に含まれる安定化物質対ポリペプチドのモル比が約４／１である、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１３】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド／グルカゴンスーパーファミリーから選択される、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１４】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、成長ホルモン放出因子、血管作用性腸ポリペプチド、ペプチドヒスチジンメチオニン、セクレチン、およびグルコース‐依存的インスリン刺激ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１５】
下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチドならびに、トレハロースおよびメチル‐マンノピラノシドから選択される安定化糖を含む安定化されたポリペプチド粒子であって、該ポリペプチド粒子に含有される安定化糖対下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチドのｗｔ／ｗｔ比が約０．５５／１であり、そしてポリペプチド粒子が酸性の再構成ｐＨを示すように配合される、前記ポリペプチド粒子。
【請求項１６】
下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド、ならびにＣａ２＋、Ｍｇ２＋、およびＺｎ２＋から選択される安定化金属イオンを含む安定化されたポリペプチド粒子であって、該ポリペプチド粒子に含有される金属イオン対下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチドのモル比が約４／１であり、そしてポリペプチド粒子が酸性の再構成ｐＨを示すように配合される、前記ポリペプチド粒子。
【請求項１７】
ポリペプチド；ならびに、金属イオン、界面活性剤、緩衝剤、および生理的条件までおよびそれを超える温度においてほぼ中性のｐＨ環境中で安定である糖からなる群から選択される２以上の安定化物質；を含むポリペプチド粒子であって、ほぼ中性の再構成ｐＨを示すように配合されているポリペプチド粒子。
【請求項１８】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド／グルカゴンスーパーファミリーから選択される、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項１９】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、成長ホルモン放出因子、血管作用性腸ポリペプチド、ペプチドヒスチジンメチオニン、セクレチン、およびグルコース‐依存的インスリン刺激ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２０】
該ポリペプチド粒子が安定化糖ならびにアミノ酸緩衝剤、ペプチド緩衝剤および無機緩衝剤から選択される緩衝剤を含む、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２１】
安定化糖対ポリペプチドのｗｔ／ｗｔ比が約０．２５／１〜約１／１の間の範囲である、請求項２１に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２２】
該ポリペプチド粒子がアミノ酸緩衝剤およびペプチド緩衝剤から選択される緩衝剤ならびに安定化金属イオンを含む、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２３】
金属イオン対ポリペプチドのモル比が約２／１〜約１０／１の間の範囲である、請求項２３に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２４】
該ポリペプチド粒子がアミノ酸緩衝剤およびペプチド緩衝剤から選択される緩衝剤ならびに界面活性剤を含む、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２５】
該界面活性剤がポリペプチド粒子の約０．０２ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％を占める、請求項２５に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２６】
該ポリペプチド粒子がアミノ酸緩衝剤およびペプチド緩衝剤から選択される緩衝剤、界面活性剤、金属イオンならびに安定化糖を含む、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２７】
該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２８】
該界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムを含み、ポリペプチド粒子の約０．０２ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％を占める、請求項２５に記載のポリペプチド粒子。
【請求項２９】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチドであり、そして該ポリペプチド粒子が、アミノ酸緩衝剤およびペプチド緩衝剤から選択される緩衝剤、ならびに約０．２５／１〜約１／１の間の範囲の安定化糖対ポリペプチドのｗｔ／ｗｔ比で含まれる安定化糖、約２／１〜約１０／１の範囲の金属イオン対ポリペプチドのモル比で含有される金属イオン、および、該ポリペプチド粒子の約０．０２ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％を占める界面活性剤からなる群から選択される１以上の付加的な安定化物質を含む、請求項１８に記載のポリペプチド粒子。
【請求項３０】
酸性条件下で安定であるポリペプチドを含む安定化されたポリペプチド粒子であって、酸性の再構成ｐＨを示すように配合される、前記ポリペプチド粒子。
【請求項３１】
安定化されたポリペプチド粒子がｐＨ５許容の再構成ｐＨを示すように配合される、請求項３０に記載の安定化されたポリペプチド粒子。
【請求項３２】
安定化されたポリペプチド粒子が約ｐＨ２〜ｐＨ４の再構成ｐＨを示すように配合される、請求項３０に記載の安定化されたポリペプチド粒子。
【請求項３３】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、成長ホルモン放出因子、血管作用性腸ポリペプチド、ペプチドヒスチジンメチオニン、セクレチン、およびグルコース‐依存的インスリン刺激ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含み、そして該粒子がｐＨ５より低い再構成ｐＨを示すように配合される、請求項３０に記載の安定化されたポリペプチド粒子。
【請求項３４】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、成長ホルモン放出因子、血管作用性腸ポリペプチド、ペプチドヒスチジンメチオニン、セクレチン、およびグルコース‐依存的インスリン刺激ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含み、そして該粒子がｐＨ２〜ｐＨ４の再構成ｐＨを示すように配合される、請求項３０に記載の安定化されたポリペプチド粒子。
【請求項３５】
該ポリペプチドが下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド類似体を含み、そして初期下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド類似体の９０％以上の回収率を可能にし、６０℃で２ヶ月間保存後の二量体形成が２％未満であるように粒子が配合される、請求項３０に記載の安定化されたポリペプチド粒子。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、長期間にわたり高温での分解に対して安定化された固体のポリペプチド配合物に関する。とりわけ、本発明は、ポリペプチドが１以上の安定化条件により安定化される固体ポリペプチド粒子を製造するための配合物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
長期間にわたり、所望する量の活性物質、たとえばポリペプチドを送達することができるインプラント可能な装置は当該技術分野で公知である。たとえば、米国特許第５，７２８，３９６号、第５，９８５，３０５号、第６，１１３，９３８号、第６，１５６，３３１号、第６，３７５，９７８号、および第６，３９５，２９２号は、溶液または懸濁液のような、安定な活性物質配合物を、長期間（すなわち２週間〜数ヶ月以上にわたる期間）にわたり所望する速度で送達することができるインプラント可能な浸透圧装置を教示する。また、インプラント可能な薬物送達系は、デポー型材料、たとえば米国特許第６，４６８，９６１号、第６，３３１，３１１号および第６，１３０，２００号に記載されたものを包含する。デポー材料は一般に生分解性（biodegradable）または生体浸食性（bioerodible）デポー材料内に活性物質を隔離し、その結果活性物質の拡散、またはデポー材料の分解もしくは浸食に基づいて、活性物質が植え込まれたデポー材料から送達される。代表的なデポー材料にはＰＬＧＡを基礎にした系が挙げられ、それらは一般に約２週間〜６ヶ月間に及ぶ期間にわたり活性物質を送達することができる。それらは長期間にわたり治療レベルで所望する活性物質を送達するように設計できるため、インプラント可能な送達系は好都合には、医療機関の頻繁な訪問または反復自己治療を必要とせずに、長期間所望する活性物質の治療的投与を提供することができる。しかし、インプラント可能な薬物送達系を使用して治療用ポリペプチドを長期間にわたり送達することには種々の技術的難問が存在する。
【０００３】
とりわけ、数週間または数ヶ月にわたりポリペプチドを送達するために設計されたインプラント可能な送達系にローディングされた治療用ポリペプチドの安定性を維持することは困難であることが証明されている。長期間にわたり治療量のポリペプチドを送達する適切なサイズのインプラント系を得るためには、一般に送達されることになる高濃度のポリペプチドを含む溶液または懸濁液を系にローディングすることが必要である。しかし、生理的条件に近いか、またはそれを超える温度（たとえば、３７℃に近いか、またはそれを超える温度）にそのような溶液または懸濁液が長期間曝される場合、ポリペプチドが安定化されていなければ、溶液または懸濁液に含有されるポリペプチドは分解することになる。生理的条件に近いか、またはそれを超える温度に曝されたポリペプチドの分解は種々の経路により進行し、ポリペプチドの生理活性を変化させる、減弱させる、または破壊することができる。したがって、長期間にわたり治療用ポリペプチドを首尾よく送達することができるインプラント可能な送達系を得るために、その中にローディングされたポリペプチドは分解に逆らって安定化される必要があり、その結果、インプラント系は系の機能的寿命の間、治療量の生理活性ポリペプチドを送達することができる。
【０００４】
ポリペプチド配合物中に含まれるポリペプチドを長期にわたり分解に逆らって安定化するために糖はそのような配合物に使用されてきた。とりわけ、糖は凍結乾燥工程中の分子アンフォールディングを減らすことによりポリペプチド凝集を阻害するように働く凍結乾燥保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として使用されてきた。また、糖は凍結乾燥工程中、およびその後の分子運動性を限定し、分子間相互作用を最少化することにより長期安定性に貢献する。しかし、糖をポリペプチド安定化に使用する場合、所望する程度の安定化を達成するためにはしばしば大量を使用する必要がある。Ａｎｄｙａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，２６７，９５８号に教示されるように、許容できる安定化作用を実現するためには１００〜５１０モル比もの量の安定化糖が必要である可能性があり、そしてそのような大量の安定化糖を含むポリペプチド配合物はインプラント可能な薬物送達系へのローディングには適切でない。
【０００５】
送達系内に所望する程度のポリペプチド安定化を達成するために高濃度の安定化糖が必要である場合、系内に含まれるポリペプチド配合物の全体的な容積は増大し、一方系にローディングすることができるポリペプチドの最大濃度は減少する。インプラント系にローディングされる配合物中のポリペプチドの濃度が減少するに従って、所望する投与計画を実現するために必要なポリペプチド配合物の量およびインプラント系の最小サイズは増大する。したがって、安定化糖の必要性を減らすか、または完全に除去する、治療用ポリペプチドを安定化するための配合物および方法を提供することは当該技術分野の進歩となるであろう。高濃度でインプラント可能な送達系にローディングされ、そして長期間、生理的条件まで、またはそれを超える温度に曝露後に、依然としてポリペプチドが許容できる安定性および治療活性を示すことができる程度にそのような配合物および方法がポリペプチドを安定化することができる場合、さらに当該技術分野の進歩となるであろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は固体ポリペプチド粒子を包含し、粒子内に含まれるポリペプチドは生理的条件までおよびそれを超える温度における分解に対して安定化される。本明細書で使用する場合、“生理的条件”という用語は約３７℃の温度を有する環境を表し、そして“ポリペプチド”という用語はオリゴペプチドおよび蛋白質を含み、そして１つのアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基が結合した、２以上のアミノ酸を含む任意の天然または合成化合物を包含する。それぞれの態様において、本発明のポリペプチド粒子は、１以上の安定化条件により分解に逆らって安定化されるポリペプチド材料を包含する。とりわけ、本発明のポリペプチド粒子は次の１以上の粒子条件：ｐＨ、糖含量、界面活性剤含量、緩衝剤含量、および金属イオン濃度を制御することにより、その中に含まれるポリペプチドを安定化するように配合される。本発明のポリペプチド粒子は、２以上の安定化条件の付加的な作用を組み合わせるように配合できるため、本発明のポリペプチド粒子が安定化糖を含む場合、許容できるポリペプチド安定性を達成するために必要な安定化糖の量は著しく減少する。好ましい態様において、本発明のポリペプチド粒子は、安定化糖を使用せずにその中に含まれるポリペプチドを安定化するように配合される。
【０００７】
また、本発明は水性安定化溶液を包含する。本発明の固体ポリペプチド粒子を形成するために、安定化されることになるポリペプチドを含む本発明に記載の水性安定化溶液を形成し、そして凍結乾燥または噴霧乾燥工程のような、適切な粒子形成工程に供してよい。したがって、本発明に記載の水性安定化溶液は、水性安定化溶液を粒子形成工程に供することにより、水性安定化溶液が１以上の安定化条件により安定化されたポリペプチド材料を含む固体ポリペプチド粒子を生じるように配合される。本発明に記載の水性安定化溶液のｐＨ、糖含量、界面活性剤含量、緩衝剤含量、金属イオン濃度、またはポリペプチド濃度を制御することにより、広範囲の所望する安定化特性を有する固体ポリペプチド粒子を製造することができる。
【０００８】
本発明はさらに安定化された、固体ポリペプチド粒子を製造するための方法を包含する。本発明の方法は、本発明の水性安定化溶液中に安定化されることになるポリペプチドを溶かし、固体ポリペプチド粒子中にポリペプチドを再構成（reconstituting）することを包含する。本発明の方法により製造される固体ポリペプチド粒子の配合物は、使用される水性安定化溶液に依存することになる。一態様において、本発明の方法は酸性安定化溶液中に安定化されることになるポリペプチドを溶解することを包含する。別の態様において、本発明の方法は、安定化糖、金属イオン、または安定化糖および金属イオンの両方の存在下で、酸性安定化溶液中に安定化されることになるポリペプチドを溶解することを包含する。さらに別の態様において、本発明の方法は界面活性剤、安定化糖、金属イオン、または安定化糖および金属イオンの両方の存在下で、緩衝液を添加した、ほぼ中性の安定化溶液中に安定化されることになるポリペプチドを溶解することを包含する。本発明の方法のそれぞれの態様において、固体ポリペプチド粒子を再構成する工程は、水性安定化溶液を凍結乾燥または噴霧乾燥工程のような適切な粒子形成工程に供することにより実行することができる。本発明の方法は種々の配合物のいずれか１つを有する粒子を得るために変化してもよいが、それぞれの例の場合、ポリペプチドが１以上の安定化条件により安定化される固体ポリペプチド粒子を提供するように本発明の方法を合わせる。
【０００９】
本発明の固体ポリペプチド粒子は優れたポリペプチド安定化を提供し、６０℃で２ヶ月間貯蔵後の安定化されたポリペプチドの回収率は９６％に至る。さらに、本発明の固体ポリペプチド粒子は比較的高濃度（すなわち、２５％以上のポリペプチド粒子）で懸濁配合物に負荷（ローディング）することが可能であり、そのことが比較的高濃度の安定化されたポリペプチドを有する懸濁液の配合物を容易にする。したがって、本発明の固体ポリペプチド粒子は、長期間にわたり安定化された治療用ポリペプチドの治療量の送達を可能にするのに十分に高い濃度の安定化された治療用ポリペプチドでの許容可能なサイズのインプラント可能な送達系のローディングを容易にする。
【発明の詳細な記載】
【００１０】
初めの態様において、本発明の固体ポリペプチド粒子は酸性ｐＨで安定であるポリペプチドを含み、そして酸性の再構成ｐＨ（acidic reconstitution pH）を示すように配合される。粒子形成前の水性安定化溶液のｐＨ（“見かけのｐＨ”）は、続いて形成される粒子によって示されるｐＨ（“再構成ｐＨ”）を制御し、固体ポリペプチド粒子内のポリペプチドのプロトン化状態を説明する。本発明の目的では、酸性の再構成ｐＨを示す粒子は、約ｐＨ５より低い再構成ｐＨを示すポリペプチド粒子を含み、ｐＨ４より低い再構成ｐＨを示す粒子が好ましく、そして約ｐＨ２〜約ｐＨ４までの範囲の再構成ｐＨを示す粒子がとりわけ好ましい。本発明の固体ポリペプチド粒子によって示されるｐＨを制御することにより、固体粒子に含まれるポリペプチドのプロトン化状態を制御し、そして本発明の固体ポリペプチド粒子を酸性ｐＨで配合することが実質的な安定化作用をもたらすことが見出されている。酸性環境はポリペプチドに含まれるアミノ基のプロトン化に好都合であるため、酸性ｐＨで本発明の固体ポリペプチド粒子を配合することがポリペプチドを安定化すると考えられている。ポリペプチド中に含まれるアミノ基はしばしばペプチドの化学的性質を変化させ、そしてポリペプチド分解の重要な経路として機能する分子間‐または分子内反応をする傾向がある反応性中間体の形成に関与する。ポリペプチドに含まれるアミノ基のプロトン化に好都合な環境中にポリペプチドを維持することにより、はじめの態様に記載のポリペプチド粒子が反応性中間体の形成におけるアミノ基の関与を限定し、結果として分子間‐または分子内反応の結果生じるポリペプチドの分解を限定すると考えられている。
【００１１】
初めの態様に記載の固体粒子への金属イオンの付加は付加的なポリペプチド安定化を提供する。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子が金属イオンを含むように配合される場合、金属イオンは好ましくはＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＺｎＣｌ２のような二価金属塩によって提供される。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子中に含まれる金属イオンの正確な量は、安定化されることになる具体的なペプチド、粒子のｐＨ、および安定化糖の存在の有無に依存することになる。しかし、初めの態様に記載の固体ペプチド粒子が金属イオンを含有する場合、粒子は一般に金属イオン対安定化されたポリペプチドのモル比が約１／１〜１０／１の間であるように配合され、モル比が約２／１〜６／１が好ましく、約４／１のモル比がとりわけ好ましい。本発明の固体ポリペプチド粒子への金属イオンの付加は、長期にわたりポリペプチド二量化の量を減らし、それによって付加的にポリペプチドを安定化する。金属イオンはポリペプチド分子とイオン結合または塩橋を形成することによりポリペプチド二量化を減少させるように働き、そのようなイオン結合または塩橋がポリペプチド分子間の相互作用の機会を限定すると考えられている。
【００１２】
また、初めの態様に記載の固体ペプチド粒子への安定化糖の付加は、付加的なポリペプチド安定化を提供する。安定化糖の含有は、ポリペプチド分子運動性を限定し、ポリペプチド分子間の分子間相互作用を減らすことにより付加的にポリペプチドを安定化する。しかし、本発明の固体ポリペプチド粒子は２以上の付加的な安定化条件によりポリペプチドを安定化するように配合できるため、本発明の固体ポリペプチド粒子が安定化糖を含有するように配合される場合、許容できるレベルの安定性を得るために必要な糖の量は著しく減少する。とりわけ、初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子が安定化糖を含有するように配合される場合、一般に糖は安定化されるポリペプチドに関して約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約１／１ｗｔ／ｗｔまでの範囲の量で含有される。好ましい態様において、安定化糖を含有する本発明の固体ポリペプチド粒子は、安定化されるポリペプチドに関して約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約０．５／１ｗｔ／ｗｔまで、または約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約０．２５／１ｗｔ／ｗｔまでの範囲の量で安定化糖を含有することになる。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子が安定化糖および金属イオンの両方を含有するように配合される場合、所望する程度のポリペプチド安定化を達成するために必要な糖および金属イオンの量は、金属イオンなしに安定化糖、または安定化糖なしに金属イオンを含有する配合物に比較して減らすことができる。そのような潜在的な利点は、糖、金属イオン、および酸性環境ｐＨの付加的な安定化作用により得ることができる。
【００１３】
非還元糖は一般に、本発明に記載の固体ポリペプチド粒子における安定化糖として有用であるが、初めの態様に記載のペプチド粒子の安定化にはすべての糖が適切ではないことが見出されている。とりわけ、通常ポリペプチドの安定化に使用される糖であるショ糖は、酸性条件下では使用に適切ではないことが見出されている。実際、そのような条件下でショ糖が使用される場合、不安定化作用を生じることが見出されている。酸性環境ではショ糖自体が化学的に安定ではないために、そのような不安定化作用が生じると考えられている。とりわけ、ショ糖は酸性ｐＨでグルコースおよびフラクトースに加水分解される。しかし、トレハロースはショ糖のように二糖であるが、酸性条件および高温で化学的に安定である。単糖であるメチル‐マンノピラノシド（“メチル‐ＭＰ”）も酸性環境で化学的に安定である。さらに、酸性ｐＨを示すように配合された固体ポリペプチド粒子に含有される場合、トレハロースおよびメチル‐ＭＰは著しい付加的なポリペプチド安定化を提供することが見出されている。したがって、初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子が安定化糖を含有するように配合される場合、配合物に含有される糖は酸性条件下で安定である必要があり、好ましくは生理的条件まで、およびそれを超える温度で安定である。
【００１４】
初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子は水性安定化溶液から製造することができる。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子を配合するために適切な水性安定化溶液を作製するために、安定化されることになるポリペプチドは酸性溶液に溶かす。酸性水性安定化溶液は、所望するｐＨを有する溶液を提供する量の、ＨＣｌのような適切な酸の添加により得ることができる。本発明に記載の水性安定化溶液のｐＨは、水性安定化溶液を使用して製造される固体ポリペプチド粒子内に含有されるポリペプチドの安定化に重要な役割を果たす。初めの態様に記載（すなわち酸性の再構成ｐＨを有する）の固体ポリペプチド粒子を得るために、目標とする再構成ｐＨより著しく低い見かけのｐＨで水性安定化溶液を作製することが必要であってよい。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子を製造するために適した水性安定化溶液はまた、その中に溶けた金属塩または安定化糖を含有してもよい。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子の製造に適した水性安定化溶液に溶けた金属塩または安定化糖の量は変化してよい。しかし、安定化糖を含有する固体ポリペプチド粒子を製造するために水性安定化溶液を使用することになる場合、水性安定化溶液は、好ましくは安定化されることになるポリペプチドに関して約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約１／１ｗｔ／ｗｔまでの範囲の量で所望する安定化糖を含有することになる。さらに、金属イオンを含有する固体ポリペプチド粒子を製造するために水性安定化溶液を使用することになる場合、水性安定化溶液は、好ましくは約１／１〜約１０／１までの範囲のポリペプチドに対する金属イオンのモル比で所望する金属イオンを含有するように製造される。
【００１５】
酸性水性安定化溶液から初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子を形成するために、安定化溶液は公知の粒子形成工程に供する。たとえば、本発明に記載の水性安定化溶液は、固体ポリペプチド粒子を得るための凍結乾燥または噴霧乾燥を使用して処理してよい。具体的な態様において、本発明に記載の固体ポリペプチド粒子は、４℃で３０分間、および−５０℃で３時間（冷却速度２．５℃／分）安定化溶液を凍結することを含む凍結乾燥サイクルを使用して、本発明に記載の水性安定化溶液から製造される。記載されたように水性安定化溶液を凍結した後、チャンバー圧５０ｍＴにおいて、−３０℃で１０分間、続いて０℃で１０時間の最初の乾燥サイクルを実行する、最初の乾燥サイクルに続いて、すべての温度レベル勾配０．５℃／分、チャンバー圧２００ｍＴにおいて、０℃で３時間、続いて２０℃で１２時間、および３０℃で６時間の第２乾燥サイクルを実行する。しかし、本発明は本明細書に記載の正確な凍結乾燥工程により製造される固体ポリペプチド粒子に限定されない。いくつかの適切な凍結乾燥および噴霧乾燥工程は蛋白質粒子形成の技術分野で公知であり、そして本発明に記載の固体ポリペプチド粒子を提供するために適用してよい。
【００１６】
第２の態様において、本発明の固体ポリペプチド粒子はほぼ中性の再構成ｐＨを示すように配合される。本明細書で使用する“ほぼ中性”という用語はｐＨ５〜約ｐＨ８までの範囲のｐＨを表す。好ましくは、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子は、ｐＨ５〜ｐＨ７の再構成ｐＨを示すように配合される。本発明の第２の態様に記載のポリペプチド粒子は緩衝剤を含有し、そしてさらに界面活性剤、安定化糖、金属イオン、または安定化糖および金属イオンの両方を含有する。ほぼ中性の再構成ｐＨを示し、緩衝添加剤を含有するように固体ポリペプチド粒子を配合することは、固体粒子に含有されるポリペプチド材料を著しく安定化させることが見出されている。ほぼ中性のｐＨでは、対イオン効果により緩衝剤は固体粒子中に含有されるポリペプチド安定化に役立つと考えられている。とりわけ、緩衝剤材料は、分子間または分子内で反応する傾向を示すポリペプチド中に含有される１以上の部位と相互作用するか、またはそれらに結合し、そのような部位がもはや反応に役立たないようにできると考えられている。
【００１７】
第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子の配合物への使用に適した緩衝剤は、ほぼ中性のｐＨで緩衝作用をするものである。第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子に使用することができる緩衝剤の具体的な例としては、アミノ酸またはペプチド緩衝剤、たとえばヒスチジン緩衝剤（Ｈｉｓ−６）またはヒスチジン‐グルタミン酸（Ｈｉｓ−Ｇｌｕ）緩衝剤、および無機緩衝剤、たとえばコハク酸およびクエン酸緩衝剤が挙げられる。第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子は一般に重量で約２０％の緩衝剤と共に配合され、約１５％までの緩衝剤を含有するポリペプチド粒子が好ましい。しかし、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子に含有される緩衝剤の正確な量は粒子に含有されるポリペプチドの量および型に従って変化してよい。さらに、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子を配合するために使用される緩衝剤の量および型も、所望する再構成ｐＨを示す固体ポリペプチド粒子を得るために適合させてよい。
【００１８】
第２の態様に記載の固体粒子を安定化糖、金属イオン、または安定化糖および金属イオンの両方を含むように配合することにより、緩衝剤の存在下、ほぼ中性環境中でポリペプチドを単に配合することにより達成される以上に粒子に含有されるポリペプチドの安定化は増大する。固体ポリペプチド粒子が第２の態様に従って配合され、そして安定化糖、金属イオン、または安定化糖および金属イオンの両方を含む場合、粒子中に含有される糖および金属イオンの量は、初めの態様の固体ペプチド粒子に関して詳述された範囲内である。とりわけ、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子が安定化糖を含有するように配合される場合、粒子に含有される安定化糖の量は、好ましくは安定化されることになるポリペプチドに比較して約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約１／１ｗｔ／ｗｔまでの範囲である。さらに、非‐還元糖は一般に、本発明に記載の固体ポリペプチド粒子において安定化糖として有用であるが、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子はほぼ中性のｐＨで配合されるため、それらは酸性環境で安定ではない安定化糖、たとえばショ糖を含有することができる。さらに、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子が金属イオンを含有するように配合される場合、該粒子は好ましくはポリペプチドに対して約１／１〜約１０／１までの所望する金属イオンのモル比で金属イオンを含有するように製造される。第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子が安定化糖および金属イオンの両方を含有するように配合される場合、所望する程度のポリペプチド安定化を達成するために必要な糖および金属イオンの量は、金属イオンなしに安定化糖、または安定化糖なしに金属イオンを含有する配合物に比較して減らすことができる。そのような潜在的利点は糖、金属イオン、およびほぼ中性の緩衝剤条件の付加的な安定化作用により得ることができる。
【００１９】
第２の態様に記載の固体ペプチド粒子が界面活性剤を含有するように配合される場合、使用される界面活性剤は好ましくはアニオン性界面活性剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子に含有される界面活性剤の量は、安定化されることになるポリペプチドの量および型、ならびに粒子に含有される他の添加剤の性質および量に従って変化してよい。それにもかかわらず、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子は、約０．０２ｗｔ％〜約０．２ｗｔ％までの範囲の量で所望する界面活性剤を含む水性安定化溶液から配合される。
【００２０】
第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子は水性安定化溶液から製造することができる。第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子を製造するために適した水性安定化溶液を作製するために、安定化されることになるポリペプチドはほぼ中性の見かけのｐＨを示し、界面活性剤、金属塩、安定化糖、または金属塩および安定化糖の両方を適宜含有する溶液に溶かす。ほぼ中性の安定化溶液は、所望する見かけのｐＨを有する溶液を提供する量の、すでに説明したような適切な緩衝剤の添加により得ることができる。初めの態様に記載の固体ポリペプチド粒子を製造するために使用される水性安定化溶液が当てはまるように、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子を製造するために使用される水性安定化溶液の見かけのｐＨは、水性安定化溶液を使用して製造される固体ポリペプチド粒子の再構成ｐＨを制御する。したがって、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子を製造するための水性安定化溶液に使用される緩衝剤の量および型は、所望する見かけのｐＨ、および所望する再構成ｐＨを得るために変化してよい。さらに、本明細書に記載の範囲内の緩衝剤含有量を特徴とする固体ポリペプチド粒子を製造するために、水性安定化溶液中に含有される緩衝剤の量は、とりわけ、使用される緩衝剤の型、固体粒子中で所望される緩衝剤の正確な量、ならびに固体粒子中に含有されることになるポリペプチドおよび他の添加剤の性質および量に依存して変化することになる。たとえば、以下に詳述する実施例において、１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤により特徴付けられる安定化溶液は１４ｗｔ％緩衝剤材料を含む固体ポリペプチド粒子を提供した。
【００２１】
第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子の製造に適した水性安定化溶液に溶かした金属塩または安定化糖の量も、安定化されることになるポリペプチドの量および性質、ならびに金属塩または安定化糖の性質に依存して変化してよい。しかし、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子の製造のための水性安定化溶液が安定化糖を含有する場合、水性安定化溶液は好ましくは既に記載の範囲内に収まる量（すなわち、安定化されることになるポリペプチドに比較して約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約１／１ｗｔ／ｗｔまでであり、約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約０．５／１ｗｔ／ｗｔまでおよび約０．１／１ｗｔ／ｗｔ〜約０．２５／１ｗｔ／ｗｔまでの範囲が好ましい）で所望する安定化糖を含有することになる。さらに、第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子の製造のための水性安定化溶液が金属イオンを含有する場合、水性安定化溶液は、好ましくはすでに記載の範囲内に収まる金属イオン対ポリペプチドのモル比（すなわち、約１／１〜約１０／１の範囲のポリペプチドに対する金属イオンのモル比であって、約２／１〜約６／１の範囲が好ましく、そして約４／１のモル比がとりわけ好ましい）で所望する金属イオンを含有するように製造される。
【００２２】
ほぼ中性の水性安定化溶液から第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子を形成するために、ほぼ中性の安定化溶液は公知の粒子形成工程に供する。初めの態様に記載の粒子形成に関して記載されるように、第２の態様に記載の固体粒子は、適切に作製された水性安定化溶液から凍結乾燥または噴霧乾燥工程を使用して形成することができる。たとえば、本明細書に記載の凍結乾燥工程は、水性安定化溶液から第２の態様に記載の固体ポリペプチド粒子を提供するために適する。さらに、しかし、本発明は詳述された具体的な凍結乾燥工程の使用に限定されない。凍結乾燥および噴霧乾燥工程による粒子形成は当該技術分野で公知であり、任意の適切な凍結乾燥または噴霧乾燥工程を本発明の水性安定化溶液に適用し、本発明に記載の固体ポリペプチド粒子を提供することができる。
【００２３】
本発明の固体ポリペプチド粒子、水性安定化溶液、および方法は、下垂体アデニル酸シクラーゼポリペプチド（“ＰＡＣＡＰ”）およびグルカゴンを含む、ペプチドスーパーファミリーに属するペプチドの安定化にとりわけよく適する。ヒトでは、ＰＡＣＡＰ／グルカゴンペプチドスーパーファミリーには、少なくとも９種の異なる型の生理活性ペプチド：ＰＡＣＡＰ‐２７；ＰＡＣＡＰ‐３８；グルカゴン；グルカゴン様ペプチド、たとえばＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２；成長ホルモン放出因子（“ＧＲＦ”）；血管作用性腸ポリペプチド（“ＶＩＰ”）；ペプチドヒスチジンメチオニン（“ＰＨＭ”）；セクレチン；およびグルコース‐依存的インスリン刺激ポリペプチド（“ＧＩＰ”）が挙げられる。これらの９種の異なる型の生理活性ペプチドの中の８種は、脳に見出され、神経ペプチドとして分類される。さらに、多くのＰＡＣＡＰ／グルカゴンスーパーファミリーのメンバーが消化器、膵臓、および生殖器官に存在する（Ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＡＣＡＰ）／ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ、Ｅｎｄｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２１（６）：６１９−６７０を参照されたい）。ＰＡＣＡＰ／グルカゴンスーパーファミリーに包含されるペプチドはそれらのＮ−末端アミノ酸構造が関連し、ＰＡＣＡＰ／グルカゴンスーパーファミリーに包含される種々の異なるペプチドの細胞内産生に使用される遺伝子および前駆体分子は構造が類似する。
【００２４】
Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（“Ｂａｙｅｒ”）によって製造される合成ＰＡＣＡＰ‐Ｒ３作動薬類似体（“ＰＡＣＡＰ類似体”）はとりわけ興味深い。この合成ペプチドは、以下の３１アミノ酸配列：
【００２５】
【化１】
2006504772.tif 000002
【００２６】
により定義される。Ｂａｙｅｒは、膵臓のＲ３許容体に対する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）と選択性を有するＰＡＣＡＰ類似体を設計した。ＰＡＣＡＰ類似体の安定性を改善するために、１７位にある本来のメチオニンはバリンに置換し、２４位に本来位置するアスパラギンはグルタミンに置換した。ＰＡＣＡＰ類似体はII型糖尿病の処置に有用であり、少なくとも３ヶ月、そして好ましくは６ヶ月にわたり、対象（ヒト）に治療量においてＰＡＣＡＰ類似体を送達することができるインプラント可能な薬物送達系からＰＡＣＡＰ類似体を送達することが所望される。しかし、それが固体のままであるか、または水性もしくは有機溶媒溶液に溶けているかのいずれにしても、保護されていないＰＡＣＡＰ類似体は生理的条件に近いか、またはそれを超える温度において不安定である。したがって、インプラント可能な、徐放送達系からの送達に適した懸濁液中にＰＡＣＡＰ類似体をローディングするために、固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子は分解に逆らって安定化される必要があり、そうでなければそれらはほぼ生理的条件であるか、またはそれを超える温度に長期間曝された結果、分解するであろう。
【００２７】
固体ＰＡＣＡＰ類似体は生理的条件に近いか、またはそれを超える温度に曝されるため、分解の最も重要な原因は凝集物形成であることが確認されている。とりわけ、ＰＡＣＡＰ類似体を使用して、保護されていない、凍結乾燥したＰＡＣＡＰ類似体の主要な分解産物が共有結合二量体、二量体‐ＯＡｃおよびＰＡＣＡＰ‐ＯＡｃ付加物であることが確認された。現在、ＰＡＣＡＰ類似体からそのような凝集産物への分解は、反応性分子内環状イミド形成、その後のアセテートイオン、別のＰＡＣＡＰ類似体分子、または両方による求核攻撃により進行すると考えられている。これらの提案された分解経路に対して適当な改変部位は、ＰＡＣＡＰ類似体分子のＡｓｐ３Ａｌａ４およびＧｌｎ２４Ｓｅｒ２５アミノ酸である。さらに、Ｎ−末端ペプチド結合開裂が起こり、固体の保護されていないＰＡＣＡＰ類似体を分解することも確認されている。この蛋白質分解は主に、ｐＨ４で見出され、おそらく促進されたＡｓｐ３カルボキシル側鎖の分子内閉環により起こる。しかし、以下の実施例で詳述するように、本発明の固体ポリペプチド粒子の種々の態様は、たとえ粒子が数ヶ月にわたり４０℃および６０℃の温度で維持されていても、分解に逆らってＰＡＣＡＰ類似体を安定化することに有効である。
【００２８】
本発明の固体ポリペプチド粒子の方法のいくつかの異なる態様はＰＡＣＡＰ類似体の効果的な安定化を提供するが、３種の態様は優れた安定化を提供する。一態様において、固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子は見かけのｐＨ２を示す安定化溶液から凍結乾燥される。安定化溶液の溶媒は、希ＨＣｌを使用して所望する値に調節されたｐＨを有するＨ２Ｏを使用して形成される。この態様に記載の固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子は初期ＰＡＣＡＰ類似体の９２％の回収率を示し、６０℃で２ヶ月間貯蔵後でもわずか１．１％しか二量体が形成されない。図９は、２ヶ月間の安定性の結果を提示し、そしてそれは見かけのｐＨ２を有する安定化溶液から製造された固体ＰＡＣＡＰ粒子の著しく改善された安定性を証明する。
【００２９】
第２の態様において、固体ポリペプチド粒子は酸性ｐＨで配合され、０．５５／１ｗ／ｗ比（トレハロース／ＰＡＣＡＰ類似体）でトレハロースとＰＡＣＡＰ類似体を含有する。これらの粒子は初期ＰＡＣＡＰ類似体の９６％の回収率を可能にし、６０℃で２ヶ月間貯蔵後でさえもわずか０．７％しか二量体が形成されない。酸性ｐＨおよび０．５５／１ｗ／ｗ比でトレハロースおよびＰＡＣＡＰ類似体を含有することにより特徴付けられる固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子を配合するために、酸性水性安定化溶液を使用してよい。そのような安定化溶液は希ＨＣｌのような、適切な酸を使用して作製することができる。そのような溶液のｐＨ（見かけのｐＨ）は好ましくは約ｐＨ２に調整され、トレハロースおよびＰＡＣＡＰ類似体は所望する０．５５／１ｗ／ｗ比で溶液に溶かす。作製された溶液はその後凍結乾燥または噴霧乾燥工程に従い、所望する固体ＰＡＣＡＰ類似体を提供することができる。
【００３０】
第３の態様において、固体ポリペプチド粒子はさらに酸性ｐＨで配合され、４／１のモル比（Ｃａ２＋／ＰＡＣＡＰ類似体）でＰＡＣＡＰ類似体およびＣａ２＋イオンを含有する。６０℃で２ヶ月間貯蔵後、この配合に従って形成された粒子は、初期ＰＡＣＡＰ類似体の９５％の回収率を提供し、二量体はわずか０．８％しか形成されない。酸性ｐＨおよび４／１のモル比でＣａ２＋およびＰＡＣＡＰ類似体を含有することにより特徴付けられ、固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子を配合するために、酸性水性安定化溶液を作製してもよい。さらに、そのような溶液は希ＨＣｌのような適切な酸を使用して作製してよく、そして溶液のｐＨは好ましくは約ｐＨ２に調整される。適切な量のＣａ２＋イオンおよびＰＡＣＡＰ類似体は、４／１のモル比のＣａ２＋およびＰＡＣＡＰ類似体を有する溶液を生じる量のＣａＣｌ２およびＰＡＣＡＰを溶かすことにより、溶解して提供することができる。その後、作製された安定化溶液は凍結乾燥または噴霧乾燥工程に供し、所望する固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子を提供することができる。
【００３１】
本明細書に記載の粒子内に含まれるＰＡＣＡＰ類似体の安定性は最長期間の２ヶ月間および最高温度の６０℃で評価されているが、そのような評価により提供された所見および４０℃での分解速度論との比較は、本発明の方法が生理的温度に近い温度（すなわち、４０℃）で２ヶ月間以上、分解に逆らって十分に安定化される固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子の提供に適することを示唆する。とりわけ、粒子内に含有されるＰＡＣＡＰ類似体の総分解速度は、４０℃より６０℃では約５倍高いことが見出されている。さらに、本発明に従って製造された固体ＰＡＣＡＰ粒子内の凝集または二量化速度は、４０℃より６０℃では１０倍速い。したがって、本発明の方法により製造された固体ＰＡＣＡＰ類似体粒子が約３７℃で維持される場合、粒子内に含まれるＰＡＣＡＰ類似体は６ヶ月まで、そしておそらくそれ以上長く、許容できる安定性を示すことになる。
【００３２】
以下の実施例はＰＡＣＡＰ類似体の安定化に関するが、本発明はそのように限定されない。たとえば、本発明の方法を使用して、ＰＡＣＡＰ／グルカゴンスーパーファミリーの他のメンバー、とりわけ、実質的に相同のアミノ酸配列を有するヒトＶＩＰおよび成長ホルモン放出因子のようなファミリーメンバーの安定化された、固体粒子を提供することができる。しかし、本発明の方法はまた、ＰＡＣＡＰ／グルカゴンスーパーファミリーのメンバーの安定化に限定されない。固体ポリペプチド粒子、水性安定化溶液、および本発明の方法は、蛋白質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）による分解または凝集物形成を示すか、またはＰＡＣＡＰに対して観察されたような、分解されやすい一次構造を有するいずれかのポリペプチドの安定化に有用であってよい。
【実施例】
【００３３】
実施例１
インプラント可能な薬物送達系に使用される懸濁ベヒクルの性質のために、懸濁配合物バルクの混合、およびその後のインプラント系への懸濁配合物のローディングはしばしば高温で行われる。高温で種々の懸濁ベヒクル中に懸濁されたＰＡＣＡＰ類似体（または単に“ＰＡＣＡＰ”）の安定性を評価するために、凍結乾燥したＰＡＣＡＰを４種の異なる懸濁ベヒクル（ＬＬ／ＧＭＬ／ＰＶＰ、ＢＡ／ＰＶＰ、ＥＨＬ／ＰＶＰ、およびＰＥＧ／ＰＶＰ）に懸濁した。ＰＡＣＡＰを懸濁ベヒクルに懸濁するために、３．３ｍｇ  ＰＡＣＡＰアセテートを異なる懸濁液のそれぞれに手動で混合し、ＰＡＣＡＰ含量約３％とした。次に、ＰＡＣＡＰ懸濁配合物の安定性を６５℃で４時間インキュベーション後に評価した。製造されたＰＡＣＡＰ懸濁液の安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣにより評価し、テーブル１（図１０）を参照することにより理解できるように、結果は、４時間のインキュベーション期間中ＰＡＣＡＰが安定で、したがって、一般に懸濁配合物製造工程に伴う温度条件に耐えられるはずであることを示した。
【００３４】
次に、ＰＡＣＡＰ懸濁液を３７℃および６５℃でさらに付加的に１７日間インキュベーションした。付加的な１７日間のインキュベーション後、３７℃でインキュベーションした懸濁液中でわずかな安定性の損失が観察された（テーブル２（図１１））が、６５℃では比較的、より活発な分解が観察された（テーブル３（図１２））。結果は、評価したＰＡＣＡＰ懸濁液における主要な分解経路は共有結合による凝集であることを明らかにした。凝集がベヒクルの存在の有無にかかわらず生じたという事実は、結果として生じた自己会合に懸濁ベヒクルが関与しなかったことを示唆する。さらに、他の化学的分解が凍結乾燥したＰＡＣＡＰの損失に関与した。
【００３５】
実施例２
プロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）研究の予備的な所見が、ＰＡＣＡＰ凍結乾燥物および懸濁液に対する糖（ショ糖）および非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０）の安定化作用評価のきっかけとなった。評価を行うために、３種のレベルのＴｗｅｅｎ  ８０（０、０．０５、０．２ｗｔ％）およびショ糖（０、０．５／１、１／１、ｗ／ｗ）において、１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ６．４）中のＰＡＣＡＰにより試料を作製した。１０ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ６．４）およびコハク酸ナトリウム（ｐＨ６．４）中のＰＡＣＡＰ溶液も調製した。ＰＡＣＡＰ溶液のそれぞれを凍結乾燥し、再構成した固体ＰＡＣＡＰ粒子を得て、個々のバイアルにそれぞれの溶液由来の再構成材料３．３ｍｇの試料を入れ、試料は以下のものを含有した：（１）添加剤無し、（２）０．２ｗｔ％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、（３）０．２ｗｔ％  Ｔｗｅｅｎ  ８０＋０．５：１、ｗ／ｗ  ショ糖、および（４）１：１  ｗ／ｗ  ショ糖。種々の３．３ｍｇ  試料をＬＬ／ＧＭＬ／ＰＶＰおよびＢＡ／ＰＶＰと手動で混合し、ＰＡＣＡＰ含量約３％を有する懸濁配合物を提供し、懸濁配合物は６５℃で４時間インキュベーションした。初めのインキュベーション期間後、種々の懸濁配合物を以下に記載のように貯蔵し、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣにより評価した。
【００３６】
【表１】
2006504772.tif 000003
【００３７】
図１は、ショ糖はＰＡＣＡＰ凝集を抑制したが、Ｔｗｅｅｎ  ８０の存在は付加的な効果を示さなかったことを示す。残ったＰＡＣＡＰの割合によって評価した全体的な安定性も適宜増大した。ＰＡＣＡＰ凝集の程度は貯蔵温度の関数であることが示された（図２）。安定化物質を含まずに凍結乾燥したＰＡＣＡＰは少なくとも４℃で３ヶ月間安定であり、４０℃に比較して６０℃では実質的により速やかに凝集した。この研究は、ショ糖が生理的温度（４０℃）および高温（６０℃）の両方において凍結乾燥したＰＡＣＡＰを安定化することを証明した。
【００３８】
図３および４は、種々の異なる添加剤と共に製造された凍結乾燥配合物に対して、それぞれ４０および６０℃において３ヶ月間にわたるＰＡＣＡＰ凝集物形成の線状増加を示す。ヒスチジンおよびコハク酸ナトリウムは酢酸アンモニウムより優れた安定化物質であることが証明された。１：１ｗ／ｗショ糖を含む試料を除いて、６０℃での凝集速度は４０℃で観察された速度に比べ約１０倍速く、総分解速度は４０℃で観察された速度に比べ、６０℃では約４倍速かった（テーブル４）。これらの結果は、高ショ糖含量が全体的な分子運動性および蛋白質‐蛋白質相互作用を減少させることにより熱安定性を増大させることを示唆する。
【００３９】
一方、３ヶ月間にわたる総分解は、低い直線相関であった（図５）。この実験は、等しい量のショ糖（ｗ／ｗ）を含有する凍結乾燥したＰＡＣＡＰ（酢酸アンモニウム中、見かけのｐＨ６．４で製造）は４０℃で、６ヶ月間に推定８．４％の総分解という最も高い安定性（しかし許容できない）を生じることを証明した。
【００４０】
さらに、この実験は、凍結乾燥したＰＡＣＡＰ配合物だけと同様に、ＢＡ／ＰＶＰおよびＬＬ／ＧＭＬ／ＰＶＰ中のＰＡＣＡＰ懸濁液に対して、ショ糖が凝集物形成を抑制する（図６および７）ことを示した。凝集物形成に関するショ糖の安定化作用はＢＡ／ＰＶＰ懸濁液中では低下するようであった。また、ＢＡ／ＰＶＰ中でのＰＡＣＡＰの同様の長期安定性には、より多い量のショ糖が必要であった（図８）。
【００４１】
分解産物の性状を解析し、分解経路を解明するために、再構成した安定化試料（６０℃で２４日間貯蔵した、凍結乾燥したＰＡＣＡＰ）はエレクトロスプレイ飛行時間型質量分析により分析し、分解産物はＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して同定した。
【００４２】
分子量（ＭＷ）３７４３ａｍｕが無傷のＰＡＣＡＰであると帰属された。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析に基づいて、主要な分解産物は共有結合二量体および二量体‐ＯＡｃ付加物であると同定された。意義深いことには、主要ピークの後で、二量体ピークの溶出前に溶出するピーク集団は、すべてＰＡＣＡＰ‐ＯＡｃ付加物の質量（すなわち、３７８５ａｍｕ）と等しい質量を有する。ＲＰ−ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレイ飛行時間型質量分析を合わせた結果は、両分解物は同じ反応中間体（複数の中間体）を経由することを示唆する。この分析に基づいて、可能性のある分解機序を以下のように仮定することができる：
【００４３】
【表２】
2006504772.tif 000004
【００４４】
分解は、速度を限定する環状イミド中間体形成、続いてアセテートイオン、別のＰＡＣＡＰ分子、または両方の求核付加の２段階機序により進行すると仮定することができる。水分含量はすべての試料で低く（＜１％）、水の求核付加の結果としての脱アミドは顕著ではなかった。
【００４５】
実施例３
固体ＰＡＣＡＰ粒子は、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝剤、ｐＨ６で作製された３種の異なるポリペプチド溶液から凍結乾燥工程（ＦＴＳ  Ｄｕｒｏ  ｓｔｏｐ）により製造された。３種の異なる溶液は、それぞれ異なる量のショ糖を含有し、第１はショ糖を含まず、第２はショ糖対ＰＡＣＡＰの重量比０．５／１で含有し、そして第３はショ糖対ＰＡＣＡＰの重量比１／１で含有した。３種の溶液のそれぞれから製造された固体ＰＡＣＡＰ粒子は２℃〜８℃の範囲の制御温度、ほぼ生理的温度（４０℃）、および生理的温度を超える温度（６０℃）で貯蔵した。それぞれの群の固体ＰＡＣＡＰ粒子内に含有されるＰＡＣＡＰの安定性は、２４日間および３ヶ月間において評価された。それぞれの粒子群内のＰＡＣＡＰ安定性を評価するために、粒子は水で再構成し、逆相ＲＰ−ＨＰＬＣ（０．１％  トリフルオロ酢酸を含有する移動相によるアセトニトリルグラジエント溶出、および２１４ｎｍでのＵＶ検出）およびサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ、アイソクラティック溶出、０．１％  トリフルオロ酢酸および２００ｍＭ  塩化ナトリウムを含有する７０％水溶液と混合した３０％  アセトニトリル、２２０ｎｍでのＵＶ検出）により分析した。
【００４６】
凝集速度（ＳＥＣにより評価）は、試験したすべての配合物で、６０℃では４０℃より１０倍高いことが見出された（テーブル５）。ＰＡＣＡＰ対ショ糖の重量比１／１で製造した固体ＰＡＣＡＰ粒子を除いて、種々の固体ＰＡＣＡＰ粒子において観察された総分解速度（ＨＰＬＣにより評価）は、６０℃では４０℃の約５倍速かった。
【００４７】
実施例４
長期にわたるＰＡＣＡＰ分子の安定性に対するｐＨの効果を評価した。そのような評価を行うために、ＰＡＣＡＰ原料は初めに３種の異なる溶液、ｐＨ２を有する第１の溶液、ｐＨ４を有する第２の溶液、そしてｐＨ６を有する第３の溶液において水に溶かした。それぞれの溶液のｐＨは希ＨＣｌを使用して所望する値に調整した。３種の溶液のそれぞれを凍結乾燥バイアルに入れ、固体ＰＡＣＡＰ粒子は本明細書にすでに記載の凍結乾燥工程により、３種の溶液のそれぞれから製造した。次に３種の溶液のそれぞれ由来の粒子を６０℃で２ヶ月間貯蔵し、その後固体粒子に含有されるＰＡＣＡＰの安定性をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣを使用して評価した。図９は２ヶ月間の安定性の結果を示し、そしてそれは酸性ｐＨで製造された固体ＰＡＣＡＰ粒子の著しく改善された安定性を証明する。
【００４８】
実施例５
ある量の潜在的な安定化糖と共に、種々のｐＨで製造された固体ＰＡＣＡＰ粒子に包含されるＰＡＣＡＰの安定性を評価した。それぞれの例において、固体ＰＡＣＡＰ粒子は３種の異なる糖：ショ糖、トレハロース、およびメチルマンノピラノシド（すべてＳｉｇｍａ製）の中の１種の７．３モル当量から構成された。初めの２種の水溶液は、２に調整されたｐＨを有する第１の溶液、および６に調整されたｐＨを有する第２の溶液にＰＡＣＡＰを溶解することにより作製した（先のように、この実施例に記載の種々の溶液のｐＨは希ＨＣｌを使用して調整した）。第３および第４の水溶液は、２に調整されたｐＨを有する溶液、および６に調整されたｐＨを有する溶液にＰＡＣＡＰおよびメチル‐ＭＰを共に溶解することにより作製した。第５および第６の水溶液は、２に調整されたｐＨを有する溶液、および６に調整されたｐＨを有する溶液にＰＡＣＡＰおよびトレハロースを共に溶解することにより作製した。第７および第８の水溶液は、２に調整されたｐＨを有する溶液、および６に調整されたｐＨを有する溶液にＰＡＣＡＰおよびショ糖を共に溶解することにより作製した。
【００４９】
固体ＰＡＣＡＰ粒子は、すでに記載されているように、凍結乾燥により８種の溶液のそれぞれから製造し、そして８種の溶液のそれぞれから製造された固体ＰＡＣＡＰ粒子はその後６０℃で２ヶ月間貯蔵した。種々の固体ＰＡＣＡＰ粒子を６０℃に２ヶ月間曝した後、種々の粒子に含有されるＰＡＣＡＰの安定性をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ工程を使用して評価した。
【００５０】
ＨＰＬＣ分析は、ｐＨ６で製造されたＰＡＣＡＰ粒子に含有される場合、調べた３種の糖はすべて改善された安定性を示すことを示唆した。とりわけ、ｐＨ６では、ショ糖は凝集物形成妨害においておよそ６倍の改善を提供し、トレハロースは同じ基準でおよそ４倍の改善を提供した。さらに、安定化糖を添加せずにｐＨ２で製造されたＰＡＣＡＰ粒子に比べ、トレハロースおよびメチルＭＰは共に、ｐＨ２で製造された粒子に含有されるＰＡＣＡＰに付加的な安定性を提供した（テーブル６）。しかし、ショ糖はｐＨ２で製造されたＰＡＣＡＰ粒子に含有される場合、著しい不安定効果を示した。ｐＨ２で製造されたＰＡＣＡＰに対するショ糖の不安定効果は、酸性ｐＨを有する溶液からＰＡＣＡＰ粒子を製造する工程中のショ糖分解の結果であると考えられた。
【００５１】
実施例６
ヒスチジン緩衝剤（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＡＣＡＰ粒子、ならびに塩化カルシウム（ＣａＣｌ２、ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）、ショ糖およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ｐｉｅｃｅ）と組み合わせたヒスチジン緩衝剤を含有するＰＡＣＡＰ粒子を製造し、そのような粒子によって提供されるＰＡＣＡＰの安定化を評価した。評価するＰＡＣＡＰ粒子を製造するために、６種の異なる水溶液を作製した。それぞれの溶液はその中に溶解した所望する量のＰＡＣＡＰを含有し、６種の溶液それぞれのｐＨは希ＨＣｌの添加により６に調整した。初めの水溶液は添加剤（ヒスチジン緩衝剤、ＣａＣｌ２、ショ糖またはＳＤＳ）なしに作製した。第２の水溶液は１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤と共に作製した。第３の水溶液は１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤および１０ｍＭ濃度のＣａＣｌ２と共に作製した。第４の水溶液は１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤と共に作製し、ＰＡＣＡＰに関して０．５／１重量比（ショ糖／ＰＡＣＡＰ）でショ糖を含有した。第５の水溶液は１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤、１０ｍＭ濃度のＣａＣｌ２、およびＰＡＣＡＰに関して０．５／１重量比（ショ糖／ＰＡＣＡＰ）を提供する量のショ糖と共に作製した。第６の水溶液は、１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤および０．０２ｗｔ％  ＳＤＳと共に作製した。次にすでに本明細書に記載の凍結乾燥工程を使用して、固体ＰＡＣＡＰ粒子を６種の溶液のそれぞれから製造した。その後、それぞれの溶液から製造したＰＡＣＡＰ粒子は６０℃で２ヶ月間貯蔵し、そのような貯蔵後に種々の異なる粒子内に含有されるＰＡＣＡＰの安定性をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣを使用して評価した。テーブル７から分かるように、ヒスチジン緩衝剤の存在はＰＡＣＡＰ凝集物形成を著しく抑制する（凝集物形成はおよそ１／６に減少）。その上、ショ糖、ＣａＣｌ２およびＳＤＳはさらにペプチドを安定化し、凝集物形成をおよそ１／１４〜１／２０に減少させた。
【００５２】
実施例７
酸性およびほぼ中性ｐＨで製造されたＰＡＣＡＰ粒子におけるＣａＣｌ２の安定化作用を評価するために、４種の異なる型の粒子を配合物し、６０℃で２ヶ月間貯蔵し、その後ＰＡＣＡＰ分解を分析した。４種の異なる粒子配合物は４種の異なる水溶液から製造した。４種の溶液のそれぞれはその中に溶解した所望する量のＰＡＣＡＰを含有し、それぞれの溶液のｐＨは希ＨＣｌを使用して所望するレベルに調整した。初めの水溶液は添加剤（ヒスチジンまたはＣａＣｌ２）なしに作製し、初めの溶液のｐＨは２に調整した。第２の水溶液は１０ｍＭ濃度のＣａＣｌ２と共に作製し、第２の溶液のｐＨは２に調整した。第３の水溶液は１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤と共に作製し、第４の水溶液は１０ｍＭ濃度のヒスチジン緩衝剤および１０ｍＭ濃度のＣａＣｌ２と共に作製した。固体ＰＡＣＡＰ粒子は、すでに本明細書に記載の凍結乾燥工程を使用して、４種の水溶液のそれぞれから製造し（異なる粒子のそれぞれの組成はテーブル８に概説する）、それぞれの溶液から製造されたＰＡＣＡＰ粒子は６０℃で２ヶ月間貯蔵した。６０℃で２ヶ月間貯蔵後の粒子に含有されるＰＡＣＡＰの安定性は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣを使用して評価した。テーブル８から分かるように、そのような評価の結果は、ＣａＣｌ２がｐＨ２および６の両方におけるＰＡＣＡＰ粒子の安定性をさらに改善することを証明した（テーブル８）。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】凍結乾燥したＰＡＣＡＰ（酢酸アンモニウム、およそｐＨ６．４）を４０℃で３ヶ月間貯蔵したときの総分解（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および凝集（ＳＥＣ）を説明するグラフを提供する。
【図２】４℃、４０℃および６０℃で３ヶ月間貯蔵した、凍結乾燥したＰＡＣＡＰの安定性を説明するグラフを提供する。
【図３】種々の添加剤を使用してＰＡＣＡＰを固体粒子に配合する場合の、４０℃でのＰＡＣＡＰ凝集物形成の抑制を説明するグラフを提供する。
【図４】種々の添加剤を使用してＰＡＣＡＰを固体粒子に配合する場合の、６０℃でのＰＡＣＡＰ凝集物形成の抑制を説明するグラフを提供する。
【図５】４０℃での総ＰＡＣＡＰ分解に関するヒスチジン、コハク酸塩、およびショ糖の安定化作用を説明するグラフを提供する。
【図６】４０℃でのＢＡ／ＰＶＰ懸濁液中のＰＡＣＡＰ凝集物形成の抑制に関するショ糖の安定化作用を説明するグラフを提供する。
【図７】４０℃でのＬＬ／ＧＭＬ／ＰＶＰ懸濁液中のＰＡＣＡＰ凝集物形成の抑制に関するショ糖の安定化作用を説明するグラフを提供する。
【図８】４０℃で３ヶ月間貯蔵したときの異なる懸濁ベヒクル中におけるＰＡＣＡＰの総分解を説明するグラフを提供する。
【図９】見かけのｐＨ２，見かけのｐＨ４，および見かけのｐＨ６で凍結乾燥した粒子内に含まれるＰＡＣＡＰを６０℃で２ヶ月間貯蔵したときのＲＰ  ＨＰＬＣにより測定した総分解、およびＳＥＣにより測定した凝集を説明する。
【図１０】テーブル１は、ＰＡＣＡＰ懸濁液を６５℃で４ヶ月間インキュベーションしたときの種々の懸濁ベヒクル中に分散したＰＡＣＡＰの安定性を評価するために行われた研究の結果を示す。
【図１１】テーブル２は、３７℃で１７日間にわたりインキュベーションしたＰＡＣＡＰの安定性を評価するために行われた研究の結果を示し、評価されるＰＡＣＡＰは、単独で凍結乾燥したＰＡＣＡＰか、または３種の異なる懸濁ベヒクルのうちの１種内に分散したＰＡＣＡＰであった。
【図１２】テーブル３は、６０℃で１７日間にわたりインキュベーションしたＰＡＣＡＰの安定性を評価するために行われた研究の結果を示し、評価されるＰＡＣＡＰは、単独で凍結乾燥したＰＡＣＡＰか、または３種の異なる懸濁ベヒクルのうちの１種内に分散したＰＡＣＡＰであった。
【図１３】テーブル４は、ＰＡＣＡＰが種々の異なる添加剤を含む固体粒子に含有され、そのような粒子が４０℃および６０℃でインキュベーションされる場合の、ＰＡＣＡＰの推定分解および凝集速度を提供する。
【図１４】テーブル５は、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝剤中、ｐＨ６で作製された、異なる量のショ糖をそれぞれが含む３種の異なる溶液から形成された固体粒子内に含まれるＰＡＣＡＰの推定分解および凝集速度を提供する。
【図１５】テーブル６は、異なるｐＨで、３種の異なる糖の１種と共に固体ＰＡＣＡＰ粒子を配合することにより達成されるＰＡＣＡＰの安定化を評価するために行われた研究の結果を示す。
【図１６】テーブル７は、異なるｐＨで、１以上の異なる添加剤と共に固体ＰＡＣＡＰ粒子を配合することにより達成されるＰＡＣＡＰの付加的な安定化を評価するために行われた研究の結果を示す。
【図１７】テーブル８は、異なるｐＨで、ＣａＣｌ２、ヒスチジン、ならびにＣａＣｌ２およびヒスチジンの両方と共に固体ＰＡＣＡＰ粒子を配合することにより達成されるＰＡＣＡＰの安定性を評価するために行われた研究の結果を示す。
【図１】
2006504772.tif 000005
【図２】
2006504772.tif 000006
【図３】
2006504772.tif 000007
【図４】
2006504772.tif 000008
【図５】
2006504772.tif 000009
【図６】
2006504772.tif 000010
【図７】
2006504772.tif 000011
【図８】
2006504772.tif 000012
【図９】
2006504772.tif 000013
【図１０】
2006504772.tif 000014
【図１１】
2006504772.tif 000015
【図１２】
2006504772.tif 000016
【図１３】
2006504772.tif 000017
【図１４】
2006504772.tif 000018
【図１５】
2006504772.tif 000019
【図１６】
2006504772.tif 000020
【図１７】
2006504772.tif 000021
【国際調査報告】
2006504772.tif 000022
2006504772.tif 000023
2006504772.tif 000024
2006504772.tif 000025
2006504772.tif 000026
2006504772.tif 000027
2006504772.tif 000028