(57)【要約】本発明は、分子生物学、ワクチン学、免疫学および医薬の分野に関する。本発明は、免疫刺激性物質、特に、非メチル化 C および G (CpGs) を含有する DNA オリゴヌクレオチド、およびそれに結合するメランA から誘導される特定のペプチドで保持され得る VLP を含む修飾ウイルス様粒子 (VLP) を提供する。かかる CpG-VLP は、その CpG-のないものよりも劇的に高い免疫原性を持ち、高いバンド T 細胞応答を誘導する。VLP に選択的に共役、融合あるいは接着されたメランA ペプチドアナログに対する免疫応答が、VLP 自体に対する免疫応答と同様に高められる。さらに、メランA ペプチドアナログに対する T 細胞応答が基本的に Th1 タイプに向けられる。従って、CpG-保持 VLP に接着された抗原は、アレルギー、腫瘍および自己分子または慢性ウイルス疾患に対する予防的または治療的ワクチン接種のための理想的なワクチンとなり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記：
(a)  ウイルス様粒子、
(b)  少なくとも１の免疫刺激性物質、および
(c)  少なくとも１の抗原または抗原決定因子、
なお、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合しており、および該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる、
を含む組成物。
【請求項２】
該少なくとも１の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に、少なくとも１の共有結合により結合しており、および好ましくは該共有結合が非ペプチド結合である、請求項１の組成物。
【請求項３】
該少なくとも１の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に融合している、請求項１の組成物。
【請求項４】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが MHC 分子との効率的な結合を可能にし得る、請求項１−３のいずれかの組成物。
【請求項５】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが対応する正常メランA ペプチドに比して、２の、好ましくは１のアミノ酸置換を特徴とする、請求項１−４のいずれかの組成物。
【請求項６】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログがプロテアーゼまたはペプチダーゼ仲介の減成から保護されている、請求項１−４のいずれかの組成物。
【請求項７】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが下記：
(a)  LAGIGILTV (配列番号: 84)、
(b)  MAGIGILTV (配列番号: 85)、
(c)  EAMGIGILTV (配列番号: 86)、
(d)  ELAGIGILTV (配列番号: 50)、
(e)  EMAGIGILTV (配列番号: 87)、
(f)  YAAGIGILTV (配列番号: 88)、および
(g)  FAAGIGILTV (配列番号: 89)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１−４のいずれかの組成物。
【請求項８】
該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項１−４のいずれかの組成物。
【請求項９】
該ウイルス様粒子が少なくとも１の第１接着部位を含み、および該抗原または抗原決定因子が下記：
(a)  該抗原または抗原決定因子で自然界に存在しない接着部位および
(b)  該抗原または抗原決定因子で自然界に存在する接着部位、
よりなる群から選ばれる少なくとも１の第２接着部位をさらに含み、
なお、該ウイルス様粒子への該抗原または抗原決定因子の該結合は該第１接着部位と該第２接着部位との連関を介して作用され、および好ましくは該連関は少なくとも１の非ペプチド結合により介される、請求項１−８のいずれかの組成物。
【請求項１０】
該抗原または抗原決定因子と該ウイルス様粒子が該連関を介して相互作用して、規則正しい反復した抗原アレイを形成する、請求項９の組成物。
【請求項１１】
該第１接着部位がアミノ基またはリシン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項９または１０の組成物。
【請求項１２】
該第２接着部位がスルフヒドリル基またはシステイン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項９−１１のいずれかの組成物。
【請求項１３】
該第１接着部位がリシン残基であり、および該第２接着部位がシステイン残基である、請求項９−１２のいずれかの組成物。
【請求項１４】
該第１接着部位がアミノ基であり、および該第２接着部位がスルフヒドリル基である、請求項９−１３のいずれかの組成物。
【請求項１５】
該第２接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが下記：
(a)  CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55)、
(b)  CGGELAGIGILTV (配列番号: 57)、
(c)  CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL (配列番号: 58)、
(d)  CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59)、
(e)  ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60)、
(f)  CSPKSLELAGIGILTV (配列番号: 92) および
(g)  ELAGIGILTVILGVLGGC (配列番号: 93)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項９−１４のいずれかの組成物。
【請求項１６】
該第２接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログがアミノ酸配列 CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55) を有する、請求項９−１４のいずれかの組成物。
【請求項１７】
該ウイルス様粒子がリポタンパク質含有の包膜を欠く、請求項１−１６のいずれかの組成物。
【請求項１８】
該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子であり、および好ましくは該ウイルス様粒子が下記：
(a)  肝炎 B ウイルスの組換えタンパク質、
(b)  麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
(c)  シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
(d)  ロタウイルスの組換えタンパク質、
(e)  口蹄病ウイルスの組換えタンパク質、
(f)  レトロウイルスの組換えタンパク質、
(g)  ノルウォークウイルスの組換えタンパク質、
(h)  ヒト・パピローマウイルスの組換えタンパク質、
(i)  BK ウイルスの組換えタンパク質、
(j)  バクテリオファージの組換えタンパク質、
(k)  RNA-ファージの組換えタンパク質、
(l)  Ty の組換えタンパク質および
(m)  (a) 〜 (l) のいずれかの組換えタンパク質のフラグメント、
よりなる群から選ばれる、請求項１−１７のいずれかの組成物。
【請求項１９】
該ウイルス様粒子が肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質である、請求項１−１８のいずれかの組成物。
【請求項２０】
該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質のＣ末端に、好ましくは連鎖配列でもって融合している、請求項１９の組成物。
【請求項２１】
該ウイルス様粒子が RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなり、なお、好ましくは該 RNA-ファージは下記：
(a)  バクテリオファージ Qβ、
(b)  バクテリオファージ R17、
(c)  バクテリオファージ fr、
(d)  バクテリオファージ GA、
(e)  バクテリオファージ SP、
(f)  バクテリオファージ MS2、
(g)  バクテリオファージ M11、
(h)  バクテリオファージ MX1、
(i)  バクテリオファージ NL95、 
(j)  バクテリオファージ f2、
(k)  バクテリオファージ PP7 、および
(l)  バクテリオファージ AP205、
よりなる群から選ばれる、請求項１−２０のいずれかの組成物。
【請求項２２】
該ウイルス様粒子がバクテリオファージ Qβまたはバクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる、請求項１−２１のいずれかの組成物。
【請求項２３】
該免疫刺激性物質がトル様受容体活性化物質またはサイトカイン分泌誘発物質であり、および好ましくは該トル様受容体活性化物質が下記：
(a)  免疫刺激性核酸、
(b)  ペプチドグリカン、
(c)  リポポリサッカライド、
(d)  リポテイコ酸、
(e)  イミダゾキノリン化合物、
(f)  フラジェリン、
(g)  リポタンパク質、
(h)  免疫刺激性有機分子、
(i)  非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および
(j)  (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h) および／または (i) の少なくとも１の物質の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項１−２２のいずれかの組成物。
【請求項２４】
該免疫刺激性核酸が下記：
(a)  リボ核酸、 
(b)  デオキシリボ核酸、
(c)  キメラ核酸、および
(d)  (a)、(b) および／または (c) の少なくとも１の核酸の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
該リボ核酸がポリ-(I:C) またはその誘導体である、請求項２４の組成物。
【請求項２６】
該デオキシリボ核酸が下記：
(a)  非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドおよび
(b)  非メチル化 CpG モチーフのないオリゴヌクレオチド、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項２４の組成物。
【請求項２７】
該免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである、請求項１−２４または請求項２６のいずれかの組成物。
【請求項２８】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列:
5' X1X2CGX3X4 3'、うち、X1、X2、X3 および X4 はヌクレオチドである、
を含む、請求項２７の組成物。
【請求項２９】
少なくとも１の該ヌクレオチド X1、X2、X3 および X4 がホスフェート骨格修飾を有する、請求項２８の組成物。
【請求項３０】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが回交構造配列を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項１−２９のいずれかの組成物。
【請求項３１】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記：
(a)  TCCATGACGTTCCTGAATAAT (配列番号: 35)、
(b)  TCCATGACGTTCCTGACGTT (配列番号: 37)、
(c)  GGGGTCAACGTTGAGGGGG (配列番号: 39)、
(d)  GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、および
(e)  表 2 に記載の “dsCyCpG-253” (配列番号: 49)、
を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなり、
および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の１以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項２７の組成物。
【請求項３２】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項２７の組成物。
【請求項３３】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の１以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項１−３２のいずれかの組成物。
【請求項３４】
該免疫刺激性物質が該ウイルス様粒子に非共有結合している、請求項１−３３のいずれかの組成物。
【請求項３５】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが該ウイルス様粒子に非共有結合している、請求項１−３４のいずれかの組成物。
【請求項３６】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 500 ヌクレオチド、およびさらにいっそう好ましくは約 20 〜 約 100 ヌクレオチドを含む、請求項１−３５のいずれかの組成物。
【請求項３７】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが下記：
(a)  組換えオリゴヌクレオチド、
(b)  ゲノムオリゴヌクレオチド、
(c)  合成オリゴヌクレオチド、
(d)  プラスミド誘導オリゴヌクレオチド、
(e)  一本鎖オリゴヌクレオチド、および
(f)  二本鎖オリゴヌクレオチド
から選ばれる、請求項１−３６のいずれかの組成物。
【請求項３８】
該回交構造配列が GACGATCGTC (配列番号: 1) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項３０の組成物。
【請求項３９】
該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 3 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項３８の組成物。
【請求項４０】
該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 4 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項３８の組成物。
【請求項４１】
該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 5 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項３８の組成物。
【請求項４２】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記：
(a)  GGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 2)、
(b)  GGGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 3)、
(c)  GGGGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 4)、
(d)  GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 5)、
(e)  GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG （配列番号:6)、
(f)  GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG （配列番号: 7)、
(g)  GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG （配列番号: 8)、
(h)  GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG （配列番号: 9)、および
(i)  GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、
から選ばれる核酸配列を有する、請求項３８の組成物。
【請求項４３】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列番号: 7 または配列番号: 41 の核酸配列を有する、請求項２７または３８の組成物。
【請求項４４】
該抗原が細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたは少なくとも２の該エピトープの組合せを含み、該少なくとも２のエピトープが直接もしくは連鎖配列により結合しており、および好ましくは該細胞毒性 T 細胞エピトープがウイルスもしくは腫瘍の細胞毒性 T 細胞エピトープである、請求項１−４３のいずれかの組成物。
【請求項４５】
該抗原が少なくとも１の細胞毒性 T 細胞エピトープと少なくとも１の Th 細胞エピトープとの組合せを含み、および該組合せがメランA 1-118 A/L (配列番号: 94) である、請求項４４の組成物。
【請求項４６】
動物における免疫応答を高めるための方法であって、下記：
(a)  ウイルス様粒子、
(b)  少なくとも１の免疫刺激性物質、および
(c)  少なくとも１の抗原または抗原決定因子、
なお、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合しており、および該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる、
を含む組成物を該動物に導入することを含む方法。
【請求項４７】
該少なくとも１の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に、少なくとも１の共有結合により結合しており、および該共有結合が非ペプチド結合である、請求項４６の方法。
【請求項４８】
該少なくとも１の抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に融合している、請求項４６の方法。
【請求項４９】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが MHC 分子との効率的な結合を可能にし得る、請求項４６−４８のいずれかの方法。
【請求項５０】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが対応する正常メランA ペプチドに比して、２の、好ましくは１のアミノ酸置換を特徴とする、請求項４６−４９のいずれかの方法。
【請求項５１】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログがプロテアーゼまたはペプチダーゼ仲介の減成から保護されている、請求項４６−５０のいずれかの方法。
【請求項５２】
該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが下記：
(a)  LAGIGILTV (配列番号: 84)、
(b)  MAGIGILTV (配列番号: 85)、
(c)  EAMGIGILTV (配列番号: 86)、
(d)  ELAGIGILTV (配列番号: 50)、
(e)  EMAGIGILTV (配列番号: 87)、
(f)  YAAGIGILTV (配列番号: 88)、および
(g)  FAAGIGILTV (配列番号: 89)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項４６−５１のいずれかの方法。
【請求項５３】
該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項４６−５１のいずれかの方法。
【請求項５４】
該ウイルス様粒子が少なくとも１の第１接着部位を含み、および該抗原または抗原決定因子が下記：
(a)  該抗原または抗原決定因子で自然界に存在しない接着部位および
(b)  該抗原または抗原決定因子で自然界に存在する接着部位、
よりなる群から選ばれる少なくとも１の第２接着部位をさらに含み、
なお、該ウイルス様粒子への該抗原または抗原決定因子の該結合は該第１接着部位と該第２接着部位との連関を介して作用され、および好ましくは該連関は少なくとも１の非ペプチド結合により介される、請求項４６−５３のいずれかの方法。
【請求項５５】
該抗原または抗原決定因子と該ウイルス様粒子が該連関を介して相互作用して、規則正しい反復した抗原アレイを形成する、請求項５４の方法。
【請求項５６】
該第１接着部位がアミノ基またはリシン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項５４または５５の方法。
【請求項５７】
該第２接着部位がスルフヒドリル基またはシステイン残基を含むか、または好ましくはそれからなる、請求項５４−５６のいずれかの方法。
【請求項５８】
該第１接着部位がリシン残基であり、および該第２接着部位がシステイン残基である、請求項５４−５７のいずれかの方法。
【請求項５９】
該第１接着部位がアミノ基であり、および該第２接着部位がスルフヒドリル基である、請求項５４−５８のいずれかの方法。
【請求項６０】
該第２接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが下記：
(a)  CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55)、
(b)  CGGELAGIGILTV (配列番号: 57)、
(c)  CSYTTAEELAGIGILTV ILGVL (配列番号: 58)、
(d)  CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59)、
(e)  ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60)、
(f)  CSPKSLELAGIGILTV (配列番号: 92) および
(g)  ELAGIGILTVILGVLGGC (配列番号: 93)、
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項５４−５９のいずれかの方法。
【請求項６１】
該第２接着部位をもつ該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログがアミノ酸配列 CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55) を有する、請求項５４−５９のいずれかの方法。
【請求項６２】
該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子であり、および好ましくは該ウイルス様粒子が下記：
(a)  肝炎 B ウイルスの組換えタンパク質、
(b)  麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
(c)  シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
(d)  ロタウイルスの組換えタンパク質、
(e)  口蹄病ウイルスの組換えタンパク質、
(f)  レトロウイルスの組換えタンパク質、
(g)  ノルウォークウイルスの組換えタンパク質、
(h)  ヒト・パピローマウイルスの組換えタンパク質、
(i)  BK ウイルスの組換えタンパク質、
(j)  バクテリオファージの組換えタンパク質、
(k)  RNA-ファージの組換えタンパク質、
(l)  Ty の組換えタンパク質および
(m)  (a) 〜 (l) のいずれかの組換えタンパク質のフラグメント、
よりなる群から選ばれる、請求項４６−６１のいずれかの方法。
【請求項６３】
該ウイルス様粒子が肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質である、請求項４６−６２のいずれかの方法。
【請求項６４】
該ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログが肝炎 B ウイルス・コアタンパク質または BK ウイルス VP1 タンパク質のＣ末端に、好ましくは連鎖配列でもって融合している、請求項６３の方法。
【請求項６５】
該ウイルス様粒子が RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなり、なお、好ましくは該 RNA-ファージは下記：
(a)  バクテリオファージ Qβ、
(b)  バクテリオファージ R17、
(c)  バクテリオファージ fr、
(d)  バクテリオファージ GA、
(e)  バクテリオファージ SP、
(f)  バクテリオファージ MS2、
(g)  バクテリオファージ M11、
(h)  バクテリオファージ MX1、
(i)  バクテリオファージ NL95、 
(j)  バクテリオファージ f2、
(k)  バクテリオファージ PP7 、および
(l)  バクテリオファージ AP205、
よりなる群から選ばれる、請求項４６−６４のいずれかの方法。
【請求項６６】
該ウイルス様粒子がバクテリオファージ Qβまたはバクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる、請求項４６−６５のいずれかの方法。
【請求項６７】
該免疫刺激性物質がトル様受容体活性化物質またはサイトカイン分泌誘発物質であり、および好ましくは該トル様受容体活性化物質が下記：
(a)  免疫刺激性核酸、
(b)  ペプチドグリカン、
(c)  リポポリサッカライド、
(d)  リポテイコ酸、
(e)  イミダゾキノリン化合物、
(f)  フラジェリン、
(g)  リポタンパク質、
(h)  免疫刺激性有機分子、
(i)  非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および
(j)  (a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h) および／または (i) の少なくとも１の物質の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項４６−６６のいずれかの方法。
【請求項６８】
該免疫刺激性核酸が下記：
(a)  リボ核酸、 
(b)  デオキシリボ核酸、
(c)  キメラ核酸、および
(d)  (a)、(b) および／または (c) の少なくとも１の核酸の混合物、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項６７の方法。
【請求項６９】
該リボ核酸がポリ-(I:C) またはその誘導体である、請求項６８の方法。
【請求項７０】
該デオキシリボ核酸が下記：
(a)  非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドおよび
(b)  非メチル化 CpG モチーフのないオリゴヌクレオチド、
よりなる、あるいは基本的になる群から選ばれる、請求項６８の方法。
【請求項７１】
該免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである、請求項４６−６８または請求項７０のいずれかの方法。
【請求項７２】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列:
5' X1X2CGX3X4 3'、うち、X1、X2、X3 および X4 はヌクレオチドである、
を含む、請求項７１の方法。
【請求項７３】
少なくとも１の該ヌクレオチド X1、X2、X3 および X4 がホスフェート骨格修飾を有する、請求項７２の方法。
【請求項７４】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが回交構造配列を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項４６−７３のいずれかの方法。
【請求項７５】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記：
(a)  TCCATGACGTTCCTGAATAAT (配列番号: 35)、
(b)  TCCATGACGTTCCTGACGTT (配列番号: 37)、
(c)  GGGGTCAACGTTGAGGGGG (配列番号: 39)、
(d)  GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、および
(e)  表 2 に記載の “dsCyCpG-253” (配列番号: 49)、
を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなり、
および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の１以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項７１の方法。
【請求項７６】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが回交構造であり、および好ましくは該回交構造の非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項７１の方法。
【請求項７７】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドがホスフェート骨格の１以上のホスホロチオエート修飾を含有し、または該オリゴヌクレオチドの該ホスフェート骨格の各ホスフェート部分がホスホロチオエート修飾である、請求項４６−７６のいずれかの方法。
【請求項７８】
該免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが該ウイルス様粒子に非共有結合している、請求項４６−７７のいずれかの方法。
【請求項７９】
該免疫刺激性物質および好ましくは該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが該ウイルス様粒子に充填され、好ましくは封入されている、請求項４６−７８のいずれかの方法。
【請求項８０】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 500 ヌクレオチド、およびさらにいっそう好ましくは約 20 〜 約 100 ヌクレオチドを含む、請求項４６−７９のいずれかの方法。
【請求項８１】
該少なくとも１の免疫刺激性物質および好ましくは該免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは該非メチル化 CpG-含有オリゴヌクレオチドが下記：
(a)  組換えオリゴヌクレオチド、
(b)  ゲノムオリゴヌクレオチド、
(c)  合成オリゴヌクレオチド、
(d)  プラスミド誘導オリゴヌクレオチド、
(e)  一本鎖オリゴヌクレオチド、および
(f)  二本鎖オリゴヌクレオチド
から選ばれる、請求項４６−８０のいずれかの方法。
【請求項８２】
該回交構造配列が GACGATCGTC (配列番号: 1) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる、請求項７４の方法。
【請求項８３】
該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 3 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項８２の方法。
【請求項８４】
該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 4 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項８２の方法。
【請求項８５】
該回交構造配列がその 5'-末端で少なくとも 5 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有し、および該回交構造配列がその 3'-末端で少なくとも 6 そして最大 10 のグアノシン実在物を側有する、請求項８２の方法。
【請求項８６】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが下記：
(a)  GGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 2)、
(b)  GGGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 3)、
(c)  GGGGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 4)、
(d)  GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG （配列番号: 5)、
(e)  GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG （配列番号:6)、
(f)  GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG （配列番号: 7)、
(g)  GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG （配列番号: 8)、
(h)  GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG （配列番号: 9)、および
(i)  GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号: 41)、
から選ばれる核酸配列を有する、請求項８２の方法。
【請求項８７】
該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが配列番号: 7 または配列番号: 41 の核酸配列を有する、請求項７１または８２の方法。
【請求項８８】
該抗原が細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたは少なくとも２の該エピトープの組合せを含み、該少なくとも２のエピトープが直接もしくは連鎖配列により結合しており、および好ましくは該細胞毒性 T 細胞エピトープがウイルスもしくは腫瘍の細胞毒性 T 細胞エピトープである、請求項４６−８７のいずれかの方法。
【請求項８９】
該免疫応答が高められた B 細胞応答または高められた T 細胞応答であり、好ましくは該 T 細胞応答が CTL 応答または Th 細胞応答であり、およびさらに好ましくは該 Th 細胞応答が Th1 細胞応答である、請求項４６−８７のいずれかの方法。
【請求項９０】
該動物が哺乳類であり、および好ましくは該哺乳類がヒトである、請求項４６−８９のいずれかの方法。
【請求項９１】
該組成物が該動物に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、鼻孔内にまたは直接的にリンパ節へ投与される、請求項４６−９０のいずれかの方法。
【請求項９２】
免疫学的有効量の請求項１−４５のいずれかの組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むワクチンであって、好ましくはアジュバントをさらに含むワクチン。
【請求項９３】
動物を免疫付加または処置する方法であって、該動物に免疫学的有効量の請求項９２のワクチンを投与することを含む方法。
【請求項９４】
該動物が哺乳類であり、および好ましくは該哺乳類がヒトである、請求項９３の方法。
【請求項９５】
動物を免疫付加または処置する方法であって、該動物に免疫学的有効量の請求項９２のワクチンを投与することにより T 細胞応答を免疫起動することを含む方法。
【請求項９６】
該動物における免疫応答を追加刺激する工程をさらに含み、好ましくは該追加刺激が免疫学的有効量の請求項９２のワクチンまたは免疫学的 有効量の非定型ワクチンを投与することにより作用され、さらに好ましくは該非定型ワクチンが DNA ワクチンである、請求項９５の方法。
【請求項９７】
動物を免疫付加または処置する方法であって、該動物において T 細胞応答を免疫起動し、そして該動物において T 細胞応答を追加刺激する工程を含み、該追加刺激が免疫学的有効量の請求項９２のワクチンを投与することにより作用される方法。
【請求項９８】
該免疫駆動が免疫学的有効量の請求項９２のワクチンまたは免疫学的有効量の非定型ワクチンを投与することにより作用され、および好ましくは該非定型ワクチンが DNA ワクチンである、請求項９７の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願との相互引用
本発明は、２００３年３月２６日に出願された米国特許仮出願 No. 60/457,348（出典明示により本明細書の一部とする）の利益を享受する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ワクチン学、免疫学および医薬の分野に関する。本発明は、ウイルス様粒子 (VLP) に共役され、融合され、または接着されているメランA ペプチドアナログに対する免疫学的応答を高めるための組成物および方法を提供する。好ましくは、免疫刺激性物質、特に免疫刺激性核酸、さらに特に少なくとも１の非メチル化 CpG 配列を含有するオリゴヌクレオチドを VLP に結合、好ましくは充填することによる。本発明は、特に腫瘍の処置に有用である強力な持続性 T 細胞応答を誘発するのに使用できる。
【０００３】
関連の技術
免疫系の本質は２つの別個の主要な形成でつくられる：ひとつは比較的遅い応答速度と記憶能を特徴とする特異的かつ適応性の免疫であり、いまひとつは速い応答速度を発揮するが記憶を欠く非特異的または先天的免疫である。
【０００４】
精製タンパク質の投与のみでは強力な免疫応答を誘出するのに通常不十分であること、および単離されたは抗原はアジュバンといわれるヘルパー物質とともに与えねばならないことはよく知られている。これらのアジュバント内において、投与された抗原が迅速な減成から保護され、アジュバントが低レベルの抗原の伸張の放出を提供する。
【０００５】
単離されたタンパク質と異なり、ウイルスは迅速で効率的な免疫応答をなんらのアジュバントなしに T-細胞の助けの有および無の両方で誘導する (Bachmann & Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997))。多くのウイルスは、エピトープ特異的免疫グロブリンを B 細胞で効率的に橋かけリンカーするエピトープの規則的なアレイを表す半結晶性表面を提示する (Bachmann & Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996))。ウイルス構造は自己免疫疾患におけるアンチ抗体の生成に関連し、病原体に対する自然応答の一部分である (参照、Fehr, T., et al., J. Exp. Med. 185:1785-1792 (1997))。このように、規則正しい反復したアレイにおいて構成されるウイルス粒子は高度に免疫原性である。なぜなら、B 細胞を直接活性化でき、免疫系の別の重要な武器である細胞毒性 T 細胞応答を誘導できるからである。
【０００６】
抗原としてのウイルス粒子はその単離された成分に勝る２つの利点を提示する：(1) 高度に反復された表面構造によって、このウイルス粒子は、B 細胞を直接活性化でき、高い抗体力価および長く続く B 細胞メモリーをもたらす; (2) ウイルス粒子は、溶性タンパク質でなく、ウイルスが非感染性であり、アジュバントが不存在でも、細胞毒性 T 細胞応答を誘導する能力を有する。
【０００７】
さらに、細菌および大部分の非脊椎動物に存在する非メチル化 CG モチーフ(CpG) に富む DNA は強い刺激活性を B 細胞、樹枝状細胞および他の APC で、インビトロおよびインビボで提示する。細菌性 DNA は多くの脊椎動物種において免疫刺激性であるが、個々の CpG モチーフは異なることがある。実際、マウス免疫細胞を刺激する CpG モチーフは必ずしもヒト免疫細胞を刺激し得ない。逆もそうである。さらに、免疫刺激性 CpG-オリゴデオキシヌクレオチドは、マウスにおいて脾腫およびリンパ節腫を伴う骨髄外造血を起こすことによる強い副作用を誘導する(Sparwasser et al., J. Immunol. (1999), 162:2368-74 および実施例 18)。
【０００８】
近年、ワクチン接種の戦略に非常な進歩があるが、その戦略を改善する必要性が存在している。特に、強力な CTL 免疫応答および抗病原性保護を、できるだけ効率的な自然の病原体として、APC などの細胞の一般的活性化なしに、促進する新規の改善されたワクチンを開発することが必要である。
【０００９】
黒色腫は、メラノサイトまたはメラノサイト関連神経細胞から由来する攻撃性でしばしば転移性の腫瘍である。黒色腫はすべての皮膚癌の約３％を占め、その世界的な増加は女性乳癌を除くと他のいずれの腫瘍よりも大きい。黒色腫は皮膚に局在するようなときでも、３０％以上の患者で全身的に転移し、大部分の者が死に至る。最近１０年間、免疫療法および遺伝子療法が黒色腫の処置に新しい有望な方法をもたらしている。例えば、アジュバント有または無でのメラン A/MART-1 ペプチドによる黒色腫患者の処置である。これらの処置は通常限られた成功しかおさめていない。さらに、大部分の研究において、生体外 CTL 応答を MHC クラス I マルチマーで直接測定しないで、むしろ CTL 培養を用い、数週間それを促進してから、メランA 特異的 CTL 応答を測定できている。一般的に、ペプチドはそれ自体が免疫原性でなく、非常に短い半減期をもつ。
【００１０】
免疫療法の別の方法は、樹枝状細胞にメランA/MART-1 ペプチドを充填するか、樹枝状をメランA/MART-1-RNA でトランスフェクトして、患者に再注入することである。この方法の欠点は、個々の患者に由来する自己樹枝状細胞を数日間サイトカインとともにインビトロで精製およびインキュベートすることである。これは非常に微妙で難しい。というのは、樹枝状細胞が、T 細胞が腫瘍にもはや応答しないようになる、免疫原性であって、寛容原性ないために、十分な成熟状態にあらねばならないからである。
【００１１】
Dudley, M.E. (Science. 2002 Oct 25;298(5594):850-4) による別の方法は、メランA-特異的 T 細胞を患者の自己腫瘍材料から単離し、インビトロ培養および増殖し、ドナーに再注入する。上記の方法のためには、特異的ワクチンを個々の患者について別個につくる必要があり、従って、最も効率的な療法ではない。
【００１２】
従って、強い黒色腫ワクチンの特徴解明が癌、特に黒色腫の免疫療法についての新しい戦略の開発に重要である。
【００１３】
発明の要旨
本発明は、特定のヒトメランA ペプチドアナログが、本来の反復した組織を有する構造をもつコア粒子に、特に DNA オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性物質 (ISS) が充填されているウイルス様粒子 (VLP) または VLP のサブユニットに結合しているときに、特異的抗体の誘発のための強い免疫原を提示するという知見に基づいている。本発明はさらに、より免疫原性を付与する VLP 中に DNA オリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性物質を充填できるという知見に基づいている。予想外にも、VLP に存在する核酸またはオリゴヌクレオチドは、CpG モチーフを各々含有する免疫刺激性物質および DNA-オリゴヌクレオチドで具体的に置換し得る。驚くべきことに、これらの充填された免疫刺激性物質、特に、非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性核酸が先天性免疫系の活性化拡大なしに免疫刺激性能を保持した。VLP および本発明の免疫刺激性物質を含む組成物、特に CpG-VLP はその CpG のない対照物に比して劇的に免疫原性であり、高められた B および T 細胞応答を誘導する。さらに、VLP およびメランA ペプチドアナログの両方に対する T 細胞応答が基本的に Th1 タイプに向けられる。従って、CpG-保持 VLP に接着されたヒト・メランA ペプチドアナログは腫瘍に対する予防的または治療的なワクチン形成のための理想的なワクチンであり得る。
【００１４】
第１実施態様において、本発明は、典型的におよび好ましくは、動物における免疫応答を高めるために、ウイルス様粒子、免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を提供する。なお、免疫刺激性物質、核酸またはオリゴヌクレオチドは、ウイルス様粒子に共役され、融合され、あるいは接着され、または封入されている。そして、該抗原または抗原決定因子が該ウイルス様粒子に結合しており、該抗原がヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸、特に非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドをホスフェート骨格のホスホロチオエート修飾により安定にする。別の好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸、特に非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドを VLP 中に、VLP 内の RNA 消化によりおよび選択された CpG を含有する DNA オリゴヌクレオチドの同時付加により、充填する。同じく好ましい実施態様において、VLP を解合し、ついで CpG の存在で再集合する。
【００１６】
さらなる好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸は、CpG モチーフを含有しないにもかかわらず、免疫刺激活性を提示する。かかる核酸は、WO 01/22972 に記載されている。そこに記載のすべての配列を、出典明示により本明細書の一部とする。
【００１７】
さらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。また、ウイルス様粒子はリポタンパク質包膜がないのが好ましい。好ましくは, 組換えウイルス様粒子は、肝炎 B ウイルス、BK ウイルスなどのヒトポリオーマウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄病ウイルス、レトロウイルス、ノルウォークウイルスまたはヒトパピローマウイルス、RNA-ファージ、Qβ-ファージ、GA-ファージ、fr-ファージおよび Ty の組換えタンパク質を含むか、あるいはそのタンパク質からなる。具体的な実施態様において、ウイルス様粒子は、１以上の異なる肝炎 B ウイルス・コア (キャプシド) タンパク質 (HBcAg) を含むか、あるいはそのタンパク質からなる。さらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントである。好ましい RNA-ファージは Qβ-ファージ、AP 205-ファージ、GA-ファージ、fr-ファージである。
【００１８】
特定の実施態様において、抗原は細胞毒性 T 細胞エピトープを含むか、あるいはそのエピトープからなる。関連する実施態様において、ウイルス様粒子は肝炎 B ウイルス・コアタンパク質を含み、細胞毒性 T 細胞エピトープは該肝炎 B ウイルス・コアタンパク質の C-末端に融合される。ひとつの実施態様において、これらはロイシン連鎖配列により融合される。特に好ましい実施態様において、抗原は癌細胞に対する免疫応答を誘導するのに適したポリペプチドである。
【００１９】
本発明の別の態様において、ヒトまたは他の動物における免疫応答を高める方法を提供する。この方法は、動物に、ウイルス様粒子、免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を導入することを含む。なお、免疫刺激性物質、好ましくは核酸、およびさらに好ましくはオリゴヌクレオチドはウイルス様粒子に結合 (すなわち、共役、接着または封入) されている。また、該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはそのアナログから基本的になり、あるいはそのアナログからなり、そして該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログは該ウイルス様粒子に結合している。
【００２０】
本発明のさらに別の実施態様において、組成物を動物に、その皮下に、筋肉内に、鼻孔内に、皮膚内に、静脈内に、またはリンパ節に直接的に導入する。同様に好ましい実施態様において、免疫を高める組成物を、腫瘍の近辺またはワクチン化しようとする局所ウイルス保有宿主に局所的に適用する。
【００２１】
本発明の好ましい態様において、免疫応答は T 細胞応答であり、抗原に対する T 細胞応答が高められる。具体的な実施態様において、T 細胞応答は細胞毒性 T 細胞応答であり、メランA ペプチドに対する細胞毒性 T 細胞応答が高められる。
【００２２】
本発明はまた、免疫学的に有効量の本発明の免疫を高める組成物を薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むワクチンに関する。好ましい実施態様において、ワクチンは少なくとも１のアジュバントをさらに含む。本発明はまた、動物を免疫または処置する方法を提供し、その方法は、動物に免疫学的に有効量の本開示ワクチンを投与することを含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様において、免疫刺激性物質含有の VLP、好ましくは免疫刺激性核酸含有の VLP、さらに好ましくは非メチル化 CpG 含有のオリゴヌクレオチド VLP を黒色腫またはメランA ペプチドに対する動物、典型的および好ましくはヒトのワクチン接種に使用する。典型的および好ましくは、修飾された VLP を用いて、腫瘍に対してワクチン接種する。ワクチン接種は予防的または治療的あるいは両方の目的のためである。
【００２４】
注入経路は、皮下または筋肉内が好ましいが、CpG-含有の VLP を皮膚内に、鼻孔内に、静脈内に、またはリンパ節に直接に適用できる。同様に好ましい実施態様において、CpG-含有のメランA ペプチドアナログ-共役のまたは遊離の VLP を、腫瘍の近辺に、またはワクチン接種をしようとする局所ウイルス保有宿主に局所的に適用する。
【００２５】
上記の一般的記述および下記の詳細な記述は、例示的かつ説明的であり、請求項の本発明のさらなる説明を提供するものである。
【００２６】
発明の詳細な記述
特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等のすべての方法および材料は本発明の実施および試行に使用できるが、好ましい方法および材料を下記に述べる。
【００２７】
1. 定義
アミノ酸リンカー：本明細書で使用される用語 “アミノ酸リンカー” あるいは単に “リンカー” は、第２接着部位を有する抗原または抗原決定因子に連関するのが好ましく、第２接着部位を、典型的には、しかし必然でないが、１アミノ酸残基、好ましくはシステイン残基として含む、または含有するのがさらに好ましい。しかし、本明細書で使用される用語 “アミノ酸リンカー” は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好まし実施態様であっても、アミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみであるとのことを意味しない。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、当技術分野で知られる自然界に存在するアミノ酸または非天然のアミノ酸、all-L または all-D またはその混合物で構成されるのが好ましい。しかし、スルフヒドリル基またはシステイン残基を有する分子を含むアミノ酸リンカーも本発明に含まれる。かかる分子は、好ましくは C1-C6 アルキル-、シクロアルキル (C5,C6)、アリールまたはヘテロアリール部分である。しかし、アミノ酸リンカーに加えて、C1-C6 アルキル-、シクロアルキル- (C5,C6)、アリール- またはヘテロアリール- 部分を好ましくは含み、いずれのアミノ酸をも欠くリンカーも本発明の範囲に含まれる。抗原または抗原決定因子または選択的に第２接着部位とアミノ酸リンカーとの連関は、好ましくは少なくとも１の共有結合により、さらに好ましくは少なくとも１のペプチド結合による。
【００２８】
動物：本明細書で使用される用語 “動物” は、例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ネズミ、マウス、他の哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、昆虫および節足動物を含むことを意味する。
【００２９】
抗体：本明細書で使用される用語 “抗体” は、エピトープすなわち抗原決定因子に結合し得る分子を意味する。この用語は、すべての抗体および１本鎖抗体を含むその抗原結合フラグメントを含むことを意味する。最も好ましくは、抗体は、ヒト抗原結合の抗体フラグメンであり、限定でないが、Fab、Fab' および F(ab')2、Fd、１本鎖 Fvs (scFv)、１本鎖抗体、ジスルフィド結合の Fvs (sdFv)、および VL または VH ドメインを含むフラグメントを含む。抗体は、鳥類および哺乳類を含むいかなる動物源にも由来し得る。抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリが好ましい。本明細書で使用される用語 “ヒト” 抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体、またはヒト免疫グロブリン・ライブラリーもしくは１以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換え動物から単離され、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。これらは、例えば、Kucherlapati et al の米国特許 No. 5,939,598 に記載されている。
【００３０】
抗原：本明細書で使用される用語 “抗原” は、抗体により結合され得る分子または MHC 分子により提示されていると T 細胞受容体 (TCR) を意味する。本明細書で使用される用語 “抗原” は T-細胞エピトープも含む。抗原は、追加的に免疫系により認識され得るか、および／または B- および／または T-リンパ球の活性化をもたらす液素性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導し得るしかし、少なくともある場合においては、抗原が T ヘルパー細胞エピトープ (Th 細胞エピトープ) を含有するか、これと結合され、そしてアジュバント中にあることが必要かもしれない。抗原は１以上のエピトープ (B- および T- エピトープ) を有し得る。上記した特異的反応は、抗原が、典型的には高度の選択的な様相で、その対応する抗体または TCR と好ましくは反応し、他の抗原により誘発され得る他の抗体または TCR の大部分と反応しないことを意味する。本明細書で使用される抗原は、いくつかの個々の抗原の混合物であり得る。
【００３１】
本明細書で使用される “腫瘍抗原” は、腫瘍または癌に連関し、免疫応答を誘発し得るペプチドなどの化合物である。特に、化合物は、MHC 分子の状態で提示されるときに免疫応答を誘発し得る。腫瘍抗原は癌細胞から、例えば、Cohen, et al., Cancer Research, 54:1055 (1994) に記載のような癌の粗抽出物を調製することにより、抗原を部分的に精製することにより、組換え技術により、または既知の抗原の新規合成によりつくり得る。腫瘍抗原は、腫瘍もしくは癌ポリペプチドの全体または抗原性部分である抗原を含む。かかる抗原は、組換え的にまたは当技術分野で既知の他の手段で単離または調製し得る。癌または腫瘍は、限定でないが、胆管癌、脳腫瘍、乳癌、胸部癌、頚部癌、絨毛癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、上皮癌、リンパ腫、肝癌、肺癌 (例えば、小細胞および非小細胞)、黒色腫、神経芽細胞腫、口内癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、肉腫、皮膚癌、睾丸癌、甲状腺癌、腎癌、さらに他の癌腫および肉腫を含む。
【００３２】
抗原決定因子：本明細書で使用される用語 “抗原決定因子” は、B-または T-リンパ球により特異的に認識される抗原の部分を意味する。B-リンパ球は、外部の抗原決定因子に抗体の産生を介して応答する。そこでは、T-リンパ球が細胞性免疫のメディエーターである。このように、抗原決定因子またはエピトープは、抗体により、または MHC の状態では T-細胞受容体により認識される抗原の部分である。
【００３３】
抗原提示細胞：本明細書で使用される用語 “抗原提示細胞” は、免疫刺激能を有する細胞から誘導される白血球または骨髄の異種集団を意味する。例えば、これらの細胞は、T 細胞により認識され得る MHC 分子に結合するペプチドをつくり得る。この用語は、用語 “アクセサリ細胞” と同義であり、例えば、ランゲルハンス細胞、指間細胞、B 細胞、マクロファージおよび樹枝状細胞を含む。ある状態において、上皮細胞、内皮細胞および他の非骨髄誘導細胞も抗原提示細胞として働き得る。
【００３４】
連関：本明細書で使用される用語 “連関” は、第１および第２接着部位に適用されて、第１および第２接着部位の結合、好ましくは、少なくとも１の非ペプチド結合を意味する。連関の本質は、共有結合、イオン結合、疎水性結合、極性結合またはこれらの組合せである。好ましくは、連関の本質は共有結合であり、さらに好ましくは、連関は少なくとも１，好ましくは１の非ペプチド結合を介する。本明細書で使用される用語 “連関” は、第１および第２接着部位に適用されて、本発明の組成物を形成する第１および第２接着部位の直接的連関または結合を包含するのみでなく、あるいは、本発明の組成物をもたらす第１および第２接着部位の間接的連関または結合も包含し、そして典型的におよび好ましくは異種２機能性橋かけリンカーにより結合する。
【００３５】
第１接着部位：本明細書で使用される用語 “第１接着部位” は、典型的におよび好ましくはウイルス様粒子により含まれる非天然または天然の源のエレメントを意味し、これに本発明のメランA ペプチドアナログに含まれる第２接着部位が連関できる。第１接着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然もしくは合成のポリマー、二次的代謝体または化合物 (ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、またはその組合せ、またはその化学的活性基であり得る。第１接着部位は、典型的におよび好ましくはウイルス様粒子の表面に位置する。多数の第１接着部位は、ウイルス様粒子の表面で典型的には反復した立体配置で存在する。好ましくは、第１接着部位はアミノ酸またはその化学的活性基である。
【００３６】
第２接着部位：本明細書で使用される用語 “第２接着部位” は、本発明のメランA ペプチドアナログと連関する、典型的におよび好ましくはそれに含まれるエレメントを意味し、それにウイルス様粒子の表面に位置する第１接着部位が連関できる。本発明のメランA ペプチドアナログの第２接着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然もしくは合成のポリマー、二次的代謝体または化合物 (ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、またはその組合せ、またはその化学的活性基であり得る。少なくとも１の第２接着部位が本発明のメランA ペプチドアナログ上に存在する。用語 “少なくとも１の第２接着部位を持つメランA ペプチドアナログ” は、従って、少なくとも本発明のメランA ペプチドアナログおよび第２接着部位を含む抗原または抗原構造体を意味する。しかし、特に、本発明のメランA ペプチドアナログ中の非天然すなわち自然界に存在しない源に由来する第２接着部位について、これらの抗原または抗原構造体は “アミノ酸リンカー” を含む。
【００３７】
結合：本明細書で使用される用語 “結合” は、共有結合、例えば化学的共役、非共有結合、例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであり得る結合を意味する。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素-硫黄結合、炭素-リン結合などである。用語 “結合” は、“共役”、“融合”、“連関” および “接着” などよりも広く、これらを含む。さらに、ウイルス様粒子に結合している免疫刺激性物質について、用語 “結合” は、免疫刺激性物質の封入または部分的封入を含む。従って、免疫刺激性物質について、用語 “結合” は、“共役”、“融合”、“連関” および “接着” などよりも広く、これらを含む。例えば、非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性物質は、実際の結合なしに、共有結合または非共有結合的でなく、VLP により封入され得る。
【００３８】
コート・タンパク質：本明細書で使用される用語 “コート・タンパク質” は、バクテリオファージまたは RNA-ファージのキャプシド集合体中に組み込まれ得るバクテリオファージまたは RNA-ファージのタンパク質を意味する。しかし、RNA-ファージのコート・タンパク質遺伝子の具体的な遺伝子産物をいうとき、用語 “CP” を用いる。例えば、RNA-ファージ Qβのコート・タンパク質遺伝子の具体的な遺伝子産物を “Qβ CP” といい、ここでは、バクテリオファージ Qβ が “Qβ CP” および A1 タンパク質を含む。バクテリオファージ Qβ のキャプシドは、A1 タンパク質のマイナー分とともに Qβ CP で主に構成される。同様に、VLP Qβ コート・タンパク質は、A1 タンパク質のマイナー分とともに Qβ CP を主に含有する。
【００３９】
共役：本明細書で使用される用語 “共役” は、共有結合または非共有結合の相互作用による接着を意味する。抗原のウイルス様粒子への共役に関して、用語 “共役” は、好ましくは共有結合による接着を意味する。さらに、抗原のウイルス様粒子への共役に関して、用語 “共役” は、好ましくは少なくとも１の非ペプチド結合による連関または接着を意味する。生物活性物質の共役について当業者が通常用いる方法を本発明において使用できる。
【００４０】
融合: 本明細書で使用される用語 “融合” は、１ポリペプチド鎖における異なる源のアミノ酸配列を、そのコード・ヌクレオチド配列のフレーム内の組合せにより組み合わすことを意味する。用語 “融合” は、その末端への融合に加えて、内部融合、すなわちポリペプチド鎖内の異なる源の配列の挿入を意味する。
【００４１】
CpG: 本明細書で使用される用語 “CpG” は、少なくとも１の非メチル化シトシン、グアニン・ジヌクレオチド配列 (例えば、“CpG DNA” すなわちシトシンに続くグアノシンを含有し、ホスフェート結合により連結されている DNA) を意味し、分裂原性作用を刺激/活性化し、例えば分裂原性作用を有し、脊椎動物細胞によるサイトカイン発現を誘導または増加する。例えば、CpG は、B 細胞、NK 細胞、単球などの抗原提示細胞、樹枝状細胞、マクロファージおよび T 細胞を活性化する。CpG は、ホスホロチオエステル結合を含有するアナログなどのヌクレオチドアナログを含み、二本鎖または一本鎖であり得る。一般的に、二本鎖分子がインビボでより安定であり、一本鎖分子は免疫活性の増加を有する。
【００４２】
エピトープ：本明細書で使用される用語 “エピトープ” は、動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有するポリペプチドの部分を意味する。本明細書で使用される “免疫原性エピトープ” は、動物において抗体応答を誘出するか、T-細胞応答を誘導するポリペプチドの部分であると定義する。これは当技術分野で既知のいずれの方法により決定される (参照、例えば、Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998 4002 (1983))。本明細書で使用される用語 “抗原性エピトープ” は、抗体がその抗原を免疫特異的に結合するタンパク質の部分であると定義する。これは当技術分野で既知のいずれの方法により決定する。免疫特異的な結合は、非特異的結合を除くが、他の抗原との交叉活性を必然的に排除するものではない。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープは、T-細胞エピトープが T-細胞受容体により MHC 分子の状態で免疫特異的に結合され得る T-細胞エピトープでも有り得る。
【００４３】
エピトープは、そのエピトープに独特の立体配置において３アミノ酸を含むことができる。一般的に、エピトープは、少なくとも約５の該アミノ酸からなり、さらに通常少なくとも約８−１０の該アミノ酸からなる。エピトープが有機分子であると、小さいニトロフェニルであり得る。好ましいエピトープは、本発明のメランA-ペプチドアナログである。
【００４４】
免疫応答: 本明細書で使用される用語 “免疫応答” は、B- および／または T-リンパ球をもたらす液素性免疫応答および／または細胞性免疫応答を意味する。しかし、ある場合、免疫応答が低いことがあり、本発明の少なくとも１の物質を使用したときのみ検出可能となる。“免疫原性” は、生体の免疫系を刺激する物質に関し、免疫系の１以上の機能が増加されて、免疫原性物質となる。“免疫原性ポリペプチド” は、細胞性および／または液素性の免疫応答を誘出するポリペプチドであって、それは、単独であるか、またはアジュバント存在または不存在で担体に結合している。
【００４５】
免疫化：本明細書で使用される用語 “免疫する” または “免疫化” あるいは関連用語は、標的の抗原またはエピトープに対する実質的な免疫応答 (抗体またはエフェクターなどの細胞性免疫 CTL を含む) を高める能力を付与することを意味する。これらの用語において、完全な免疫が形成されることを要しないで、むしろ出発時よりも実質的に大きい免疫応答がつくられることである。例えば、標的抗原に対する細胞性および／または液素性の免疫応答が本発明方法の適用後に起きると、標的抗原に対して哺乳動物が免疫されたと考え得る。
【００４６】
免疫刺激性核酸：本明細書で使用される用語、免疫刺激性核酸は、免疫応答を誘導するかおよび／または高め得る核酸を意味する。本明細書で使用するように、免疫刺激性核酸は、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含む。好ましくは、免疫刺激性核酸は、少なくとも１の CpG モチーフ、例えば、C が非メチル化である CG ジヌクレオチドを含有する。CG ジヌクレオチドは、回交構造配列の部分であり得、または非回交構造配列に包含されていることがある。上記の CpG モチーフを含有しない免疫刺激性核酸は、例えば、CpG ジヌクレオチドを欠く核酸およびメチル化 CG ジヌクレオチドをもつ CG モチーフを含有する核酸を含む。本明細書で使用される用語 “免疫刺激性核酸” は、4-ブロモシトシンなどの修飾された塩基を含有する核酸も意味する。
【００４７】
免疫刺激性物質: 本明細書で使用される用語 “免疫刺激性物質” は、免疫応答を誘導しおよび／または高め得る物質を意味する。免疫刺激性物質は、本明細書で使用するように、限定でないが、トル様受容体活性化物質およびサイトカイン分泌を誘発する物質を含む。トル様受容体活性化物質は、限定でないが、免疫刺激性核酸、ペプチドグリカン、リポポリサッカライド、リポテイコ酸、 イミダゾキノリン化合物、フラゲリン、リポタンパク質、およびタキソールなどの免疫刺激性有機化合物を含む。
【００４８】
本明細書で使用される用語 “天然のヒト・メラン A ペプチド” または “正常のヒト・メラン A ペプチド” は、正常のヒト・メラン A タンパク質配列のアミノ酸部位 26-35 を提示するアミノ酸配列 EAAGIGILTV (配列番号: 78) または正常のヒト・メラン A タンパク質配列のアミノ酸部位 27-35 を提示するアミノ酸配列 AAGIGILTV (配列番号: 79) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなるペプチドを意味する。
【００４９】
本明細書で使用される用語 “メランA ペプチドアナログ” または “ヒト・メランA ペプチドアナログ” または “ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ” は、対応の正常メランA ペプチドが少なくとも１のアミノ酸またはアミノ酸誘導体により変更されているペプチドであると定義する。この変更は、アミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入またはこれらの組合せを含み得る。本発明の好ましい実施態様において、本明細書で使用される用語 “メランA ペプチドアナログ” は、対応の正常メランA ペプチドのアミノ酸配列 (配列番号: 91) が３、好ましくは２、さらに好ましくは１のアミノ酸またはアミノ酸誘導体により変更されているペプチドであると定義する。この変更は、アミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入またはこれらの組合せを含み得る。
【００５０】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、本明細書で使用される用語 “メランA ペプチドアナログ” は、対応の正常メランA ペプチドのアミノ酸配列 (配列番号: 91) が３、好ましくは２、さらに好ましくは１のアミノ酸またはアミノ酸誘導体により変更されているペプチドであると定義する。この変更は、アミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入またはこれらの組合せを含み得、正常ヒト・メランA タンパク質配列 (配列番号: 91) の部位 26、27、28 および／または 35 にあり、該変更は好ましくはアミノ酸置換である。用語 “メランA ペプチドアナログ”、“ヒト・メランA ペプチドアナログ”、“ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ” および “ヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログ” は互換的に使用する。
【００５１】
天然源：本明細書で使用される用語 “天然源” は、その全体または部分が合成されないで、天然に存在するかまたは生成されることを意味する。
非天然：本明細書で使用されるこの用語は、一般的に天然由来でなく、さらに具体的には人工に由来することを意味する。
非天然源：本明細書で使用される用語 “非天然源” は、一般的に合成を意味し、天然由来でなく、さらに具体的には人工に由来することを意味する。
【００５２】
規則正しいおよび反復した抗原または抗原決定因子のアレイ：本明細書で使用される用語 “規則正しいおよび反復した抗原または抗原決定因子のアレイ” は、一般的に抗原または抗原決定因子の反復パターンを意味し、典型的におよび好ましくは、コア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれにつき抗原または抗原決定因子の独特の空間配置を特徴とする。ある実施態様において、反復パターンは幾何的パターンであり得る。適当な規則正しいおよび反復した抗原または抗原決定子のアレイについての典型的かつ好ましい例は、抗原または抗原決定因子の厳密な反復の半結晶性を有するものであって、好ましくは 0.5 〜 30 ナノメーター、より好ましくは 3 〜 15 ナノメーター、さらに 好ましくは 3 〜 8 ナノメーターの空間を持つ。
【００５３】
オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される用語 “オリゴヌクレオチド” または “オリゴマー” は、２以上のヌクレオチドを含む核酸配列を意味する。一般的に、少なくとも 約 6 ヌクレオチド 〜 約 100,000 ヌクレオチドであり、好ましくは約 6 〜 約 2000 ヌクレオチド、より好ましくは約 6 〜 約 300 ヌクレオチド、さらに好ましくは 約 20 〜 約 300 ヌクレオチド、いっそう好ましくは約 20 〜 約 100 ヌクレオチドである。用語 “オリゴヌクレオチド” または “オリゴマー” は、100 以上〜 約 2000 ヌクレオチドを含む核酸配列も意味し、好ましくは 100 以上〜 約 1000 ヌクレオチド、より好ましくは 100 以上〜 約 500 ヌクレオチドである。“オリゴヌクレオチド” はまた、一般的に非修飾の RNA もしくは DNA または修飾の RNA または DNA であり得るポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドを意味する。“オリゴヌクレオチド” は、限定でないが、一本鎖および 二本鎖 DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物である DNA、一本鎖および二本鎖 RNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物である RNA、一本鎖または典型的には二本鎖であるか、一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る DNA および RNA を含むハイブリド分子を含む。さらに、 “オリゴヌクレオチド” は、RNA または DNA または RNA と DNA の両者を含む３本鎖領域を意味する。さらに、オリゴヌクレオチドは、合成の、ゲノムの、または組換えの、例えば、λ-DNA、コスミド DNA、人工的細菌染色体、イースト人工的染色体、および M13 などのフィラメントファージである。本発明の非常に好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは合成オリゴヌクレオチドである。
【００５４】
用語 “オリゴヌクレオチド” はまた、１以上の修飾基を含有する DNA または RNA および安定性などの理由のために修飾された骨格をもつ DNA または RNA を含む。例えば、適当なヌクレオチド修飾/アナログは、ペプチド核酸、イノシン、トリチル化基、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエート、5-ニトロインドールデオキシリボフラノシル、5-メチルデオキシシトシンおよび 5,6-ジヒドロ-5,6-ジヒドロオキシデオキシチミジンを含む。種々の修飾が DNA および RNA についてなされる。すなわち、“オリゴヌクレオチド” は、天然に典型的に存在するようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に改変された形態、およびウイルスや細胞に特徴的な DNA および RNA の化学的形態を含む。他のアナログ/修飾は、当業者に均等とされよう。
【００５５】
充填：本明細書で使用される用語 “充填され” は、VLP.に関し免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸の状態を意味する。本明細書で使用される用語 “充填され” は、化学的共役などの共有結合、またはイオン性相互作用や疎水性相互作用、水素結合などの非共有結合であり得る結合である。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、チオエーテル結合などの炭素-硫黄結合、炭素-リン結合などである。本用語はまた、物質の封入または部分的封入を含む。用語 “充填され” は、“共役され”、“封入され”、“接着され”を含む。例えば、非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドなどの免疫刺激性物質は、共有結合または非共有結合のいずれの結合の存在なしに VLP に封入され得る。好ましい実施態様において、特に、免疫刺激性核酸が免疫刺激性物質であると、用語 “充填され” は、充填された状態の免疫刺激性核酸が DNAse または RNAse 加水分解を受けないことを示す。好ましい実施態様において、免疫刺激性核酸は VLP キャプシド中に充填され、最も好ましくは、非共有結合による。
【００５６】
本発明の組成物は、選択的に、薬学的に許容される担体と組合せ得る。本明細書で使用される用語 “薬学的に許容される担体” は、１以上の和合性の固体または液体の充填剤、希釈剤またはヒトなどの動物の投与に適した封入の物質である。用語 “担体” は、天然または合成の有機または無機の成分であって、それと活性成分が組み合わされて、投与が容易になる。
【００５７】
ペプチド：本明細書で使用される用語 “ペプチド”は、特にヒト黒色腫メランA ペプチドまたは正常ヒト・メラン A ペプチドについて、モノマー (アミノ酸) から形成される分子化合物を意味し、アミド結合（ペプチド結合とも知られる）により典型的におよび好ましくは直線状に連結している。これは、アミノ酸の分子鎖を示し、産物の具体的な長さを意味しない。 
【００５８】
有機分子：本明細書で使用される用語 “有機分子” は、天然または合成源の化学的実在物を意味する。特に、用語 “有機分子” は、例えば、ヌクレオチド、リピド、炭水化物、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、ステロイド、アルカロイド、テルペンおよび脂肪酸の群のメンバーである天然または合成源のすべての分子を含む。特に、用語 “有機分子” は、ニコチン、コカイン、ヘロインなどの耽溺性薬物に含有される薬理学的に活性の分子を含む。一般的に、有機分子は、本発明のウイルス様粒子に共役、結合あるいは接着するのを可能にする化学的官能基を含有するか、含有するように修飾する。
【００５９】
ポリペプチド：本明細書で使用される用語 “ポリペプチド” は、アミド結合 (ペプチド結合とも知られる) により直線状に連結しているモノマー (アミノ酸) から編成される分子を意味する。これは、アミノ酸の分子鎖を示し、産物の具体的な長さを意味しない。すなわち、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾、例えば、糖化、アセチル化、リン酸化などを意味すること意図する。組換えおよび誘導のポリペプチドは所定の核酸配列から必ずしも翻訳されない。これは、化学合成を含むいかなる方法でもつくり得る。
【００６０】
免疫応答を “高める” 物質は、その物質の添加により、添加しない場合に測定される同種の免疫応答に比して、免疫応答が大きいか、強化されているか、逸脱されている物質を意味する。
【００６１】
好ましくは、免疫応答を “高める” 物質は、(i) メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の頻度が、その物質の添加なしに測定されたメランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の頻度に比して増加している物質、または (ii) メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の機能が、その物質の添加なしに測定されたメランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の機能に比して逸脱、好ましくは改善している物質、または (iii) メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞が、その物質の添加なしに測定されたメランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の増殖、アポトーシスまたは腫瘍組織に対する回帰に比して、増殖を増加し、アポトーシスを減少し、または腫瘍組織に対するより効率的な回帰をなし得るような T 細胞となる物質を意味する。
【００６２】
メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の頻度は、MHC-クラス I /ペプチド複合体、例えばテトラマーまたはマルチマー染色、好ましくはテトラマー染色により測定する。この方法は Speiser, DE. et al. Eur J Immunol. 2002, Vol. 32, 731-741 に記載されている。メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の機能は、サイトカイン放出、例えば細胞性染色、サイトカイン捕捉アッセイ、エリスポット、ELISA、好ましくはエリスポットにより測定する。この方法は、Speiser, DE. et al. Eur J Immunol. 2002, Vol. 32, 731-741 に記載されている。さらに、メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の機能は、メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的、細胞分解的 CD8+ T 細胞応答を、クロニウムまたはユーロピウム放出アッセイでも測定できる。この方法は Valmori, D. et al. J. Immunol. 1998, 161, 6956-6962 に記載されている。メランA-特異的、好ましくは天然のヒト・メランA ペプチド-特異的またはヒト黒色腫メランA ペプチドアナログ-特異的 T 細胞の表現型は、細胞表面または細胞内タンパク質を用いて、例えば、細胞活性化マーカー、細胞識別マーカー、回帰マーカー、ケモカインおよびサイトカイン受容体、共刺激性受容体、死受容体、キラー活性化または阻害性受容体、インテグリン、アンチアポトーシスタンパク質の発現、老化マーカーの欠如、好ましくは、細胞活性化マーカーにより測定する。この方法は、Speiser, DE. et al. Eur J Immunol. 2002, Vol. 32, 731-741 に記載されている。
【００６３】
有効量：本明細書で使用される用語 “有効量” は、所望の生物学的作用を達成するのに必要または十分な量を意味する。組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であり、かかる量は当業者による日常的事項として決定し得る。免疫系欠損を処置するための有効量は、免疫系を活性化し、抗原の暴露に対する抗原特異的免疫応答をもたらすのに必要な量である。この用語はまた、“十分な量” と同義である。
【００６４】
特定の適用についての有効量は、処置しようとする疾患または状態、投与される組成物、対象の大きさおよび／または疾患または状態の重篤度などの因子に依存して変わり得る。当業者は、本発明の組成物の有効量を不当な実験をなすことなしに決定し得るであろう。
【００６５】
自己抗原：本明細書で使用される用語 “自己抗原” は、宿主のゲノムまたは DNA によりコードされるタンパク質を意味し、宿主のゲノムまたは DNA によりコードされるタンパク質または RNA でつくられる産物自体であると定義する。好ましくは、本明細書で使用される用語 “自己抗原” は、ヒトのゲノムまたは DNA によりコードされるタンパク質を意味し、ヒトのゲノムまたは DNA によりコードされるタンパク質または RNA でつくられる産物自体であると定義する。自己抗原を含む本発明の組成物、医薬組成物およびワクチンは、宿主に使用されたときに、自己抗原に対する寛容性を特に破壊し得る。この内容において、“自己抗原に対する寛容性を破壊する” は、本明細書で定義される免疫応答を高めること、好ましくは、自己抗原を含む本発明の組成物、医薬組成物およびワクチンを宿主に適用したときに、自己抗原に特異的な B または T 細胞応答を高めることを意味する。さらに、２またはいくつかの自己分子に由来するタンパク質、自己分子機能を提示するタンパク質、および上記のような高い相同性 (>95%、好ましくは >97%、より好ましくは >99%) の自己分子をもつタンパク質も自己抗原と考え得る。
【００６６】
処置：本明細書で使用される用語 “処置”、“処置する”、“処置される” または “処置されている” は、予防および／または治療を意味する。感染性疾患に用いられたとき、例えば、この用語は、病原体の感染に対する対象の抵抗性を増加する予防的処置、または換言すると、対象が病原体に感染しまたは感染による病状を示すのを減少する処置、ならびに対象が感染した後に、感染と戦うために、すなわち感染を減少または消失せしめるか、または悪化するのを防ぐ処置を意味する。
【００６７】
ワクチン：本明細書で使用される用語 “ワクチン” は、本発明の組成物を含有し、動物に投与し得る形態にある製剤を意味する。典型的には、ワクチンは、本発明の組成物が懸濁または溶解されている通常の塩類溶液または緩衝液を含む。この形態において、本発明の組成物を通常的に用いて、状態を予防、改善あるいは処置できる。宿主への導入において、ワクチンは、限定でないが、抗体、サイトカインの産生および／または細胞毒性 T 細胞、抗原提示細胞、ヘルパー T 細胞、樹枝状細胞の活性化および／または他の細胞性応答を含む免疫応答を誘発することができる。
【００６８】
選択的に、本発明のワクチンは、本発明の化合物に比して大きいまたは小さい割合で存在し得るアジュバントを追加的に含む。本明細書で使用される用語 “アジュバント” は、免疫応答の非特異的刺激剤または宿主におけるデポの生成を可能にする物質である。このデポは、本発明のワクチンと組み合わされたときに、さらに高い免疫応答を提供する。種々のアジュバントを使用できる。その例には、不完全 Freund's アジュバント、水酸化アルミニウムおよび修飾ムラミルジペプチドがある。本明細書で使用される用語 “アジュバント” はまた、本発明のワクチンと組み合わされたときに、さらに高いかつ典型的に特異的な免疫応答を提供する免疫応答の典型的に特異的な刺激剤を意味する。例には、限定でないが、GM-CSF、IL-2、IL-12、IFNαがある。さらなる例は、当業者に知られている。
【００６９】
ウイルス様粒子：本明細書で使用される用語 “ウイルス様粒子” は、ウイルス粒子に類似するが、病原性を発揮していない構造を意味する。典型的には、本発明のウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝的情報を保持していない。一般的に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠くので非感染性である。また、ウイルス様粒子を非定型発現によりつくり得ることが少なくなく、容易に精製できる。いくつかのウイルス様粒子は、そのゲノムと異なる核酸を含有していることがある。上記のように、本発明でのウイルス様粒子は、ウイルスゲノムのすべてまたは部分、特にウイルスゲノムの複製性および感染性成分を欠いているので、非複製性かつ非感染性である。本発明でのウイルス様粒子は、そのゲノムと異なる核酸を含有していることがある。
【００７０】
本発明でのウイルス様粒子についての典型的かつ好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージまたは RNA-ファージのウイルスキャプシドなどのウイルスキャプシドである。用語 “ウイルス キャプシド” または “キャプシド” は、本明細書において相互変換的に使用し、ウイルスタンパク質のサブユニットからなる巨大分子の集合体を意味する。典型的かつ好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットが、本来の反復した組織構造を有するウイルスキャプシドまたはキャプシド中に集合する。この構造は典型的に球状または管状である。例えば、RNA-ファージまたは HBcAg のキャプシドは２０面対称の球状形態を有する。本明細書で使用される用語 “キャプシド様構造” は、上記の意味でキャプシド形態に類似するが典型的な対称集合体と異なるウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を意味し、十分な程度と反復性を保持する。
【００７１】
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用される用語 “バクテリオファージのウイルス様粒子” は、バクテリオファージの構造に類似し、非複製性かつ非感染性で、バクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子を少なくとも欠き、典型的には、宿主に入るためのウイルス接着を起こすタンパク質をコードする遺伝子も欠くウイルス様粒子を意味する。しかし、この定義はまた、上記の遺伝子が、存在はするが、不活性であるために、非複製性かつ非感染性のバクテリオファージのウイルス様粒子をもたらすバクテリオファージのウイルス様粒子を包含する。
【００７２】
RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP：RNA ファージ・コート・タンパク質の VLPの 180 サブユニットの自己集合体から形成され、選択的に宿主 RNA を含有するキャプシド構造を “RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP” と言う。具体的な例は、Qβ コート・タンパク質の VLP である。この場合、Qβ コート・タンパク質の VLP は、長い A1 タンパク質の発現を抑圧で妨げる TAA などの停止コドンを含有する Qβ CP 遺伝子の発現により生成される Qβ CP サブユニット (配列番号 10) からもっぱら集合し得るか（参照、Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996))、または、キャプシド集合体中に A1 タンパク質サブユニット (配列番号 11) を追加的に含有する。読み終えプロセスは、効率が低く、VLP 中で非常に低い量の A1 タンパク質しかもたらさない。非常に多数の例を、充填された ISS と共役された抗原との種々の組合せについて実施した。共役効率および充填の相違を、Qβ CP サブユニットからもっぱら集合された Qβ コート・タンパク質の VLP またはキャプシド中に A1 タンパク質サブユニットを追加的に含有する Qβ コート・タンパク質の VLP を用いたときに観察した。さらに、これらの Qβ VLP 間で免疫応答の差異を認めなかった。従って、明確性のために、用語 “Qβ VLPP” を、Qβ CP サブユニットからもっぱら集合された Qβ コート・タンパク質の VLP、またはキャプシド中に A1 タンパク質サブユニットを追加的に含有する Qβ コート・タンパク質の VLP の両方の例についての記述に用いる。
【００７３】
本明細書で使用される用語 “ウイルス粒子” は、ウイルスの形態学的形を意味する。いくつかのウイルスタイプにおいて、これは、タンパク質キャプシドにより囲まれたゲノムを含み、他のものは追加的構造 (例えば、包膜、テイルなど)を有する。
【００７４】
非包膜のウイルス粒子は、ウイルスゲノムを囲みかつ保護するタンパク様キャプシドからつくる。包膜されたウイルスも、ウイルスの遺伝子材料を囲むキャプシド構造を有するが、追加して、キャプシドを囲むリピド二層包膜を有する。本発明の好ましい実施態様において、VLP はリポタンパク質の包膜すなわちリポタンパク質を含有する包膜がない。さらに好ましい実施態様において、VLP は包膜が全くない。
【００７５】
１または冠詞の a もしくは an：用語 “１”、“a” または “an” は、本明細書で使用するとき、他に明示されていない限り “少なくとも１” すなわち “１以上” を意味する。
【００７６】
当業者には明らかなように、本発明の特定の実施態様は、クローニング、ホリメラーゼ連鎖反応、DNA および RNA の精製、真核細胞および原核細胞における組換えタンパク質の発現などの組換え核酸技法を含む。かかる技法は当業者に周知であり、刊行されている実験法マニュアルで普通見ることができる (例えば、Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997))。組織培養細胞系についての基礎的実験法 (Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition, (1998)) および抗体に基づく技法 (Harlow, E. and Lane, D., “Antibodies: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., “Guide to Protein Purification,” Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R.K., “Protein Purification Principles and Practice,” 3rd ed., Springer-Verlag, New York (1994)) も適格に文献に記載されている（出典明示により本明細書の一部とする)。
【００７７】
2. 免疫応答を高めるための組成物および方法
開示された発明は、動物における１以上の抗体に対する免疫応答を高めるための組成物および方法を提供する。本発明の組成物は、ウイルス様粒子、少なくとも１の免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸、さらに好ましくは非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド、および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む。なお、免疫刺激性物質、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドはウイルス様粒子に結合しており、該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該抗原は ヒト 黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。さらに、本発明は、例えば、癌の予防および／または治療を含む治療および予防の目的のために、実施者がかかる組成物をつくるのを可能にする。
【００７８】
本願の内容におけるウイルス様粒子は、ウイルス粒子に類似するが、病原体でない構造を意味する。一般的に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠くので非感染性である。また、ウイルス様粒子は非定型発現により大量につくることができ、容易に精製できる。
【００７９】
好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は組換えウイルス様粒子である。当業者は、容易に利用可能な組換え DNA 技法およびウイルスをコードする配列を用いて、VLP をつくり得る。例えば、ウイルス包膜またはコア・タンパク質のコード配列は、バキュロウイルス発現ベクターにおける発現のために、市販のバキュロウイルス・ベクターをウイルス・プロモーターの調節的制御の下に、コード配列を調節配列に機能的に連結せしめる配列の適当な修飾とともに、用いてつくることができる。ウイルス包膜またはコア・タンパク質のコード配列は、例えば、細菌発現ベクターにおける発現のためにつくり得る。
【００８０】
VLP の例は、限定でないが、肝炎 B ウイルスのキャプシドタンパク質、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄病ウイルス、ノルウォークウイルス、レトロウイルス GAG タンパク質、レトロトランスポソン Ty タンパク質 p1、肝炎 B ウイルスの表面タンパク質、ヒト・パピローマウイルス、ヒト・ポリオーマウイルス、BK ウイルス (BKV)、RNA ファージ、Ty、fr-ファージ、GA-ファージ、AP 205-ファージおよび特に Qβ-ファージを含む。
【００８１】
当業者には容易に明白なように、本発明の VLP はいずれの特殊な形態に限定されない。この粒子は、化学的に、あるいは天然または非天然の生物学的プロセスにより合成できる。例えば、このタイプの実施態様はウイルス様粒子またはその組換え形を含む。
【００８２】
さらに具体的な実施態様において、VLP は、ロタウイルスの組換えポリペプチド、ノルウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファウイルスの組換えポリペプチド、細菌性 pili または pilus 様構造を形成する組換えタンパク質、口蹄病ウイルスの組換えポリペプチド、麻疹ウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、肝炎 B ウイルス (例えば HBcAg) の組換えポリペプチド、タバコモザイクウイルスの組換えポリペプチド、Flock House ウイルスの組換えポリペプチド、ヒト・パピローマウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、および特に、ヒト・ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、および特に BK ウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、RNA ファージの組換えポリペプチド、Ty の組換えポリペプチド、fr-ファージの組換えポリペプチド、GA-ファージの組換えポリペプチド、AP 205-ファージの組換えポリペプチド、および特に、Qβ-ファージの組換えポリペプチドを含み得るか、あるいはこれらからなり得る。このウイルス様粒子は、かかるポリペプチドの１以上のフラグメント、およびかかるポリペプチド変種を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。ポリペプチドの変種は、その野生タイプの相当物とアミノ酸レベルで、少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 同一性をもつ。
【００８３】
好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。好ましくは、RNA-ファージは下記よりなる群から選ぶ：a) バクテリオファージ Qβ、b) バクテリオファージ R17、c) バクテリオファージ fr、d) バクテリオファージ GA、e) バクテリオファージ SP、f) バクテリオファージ MS2、g) バクテリオファージ M11、h) バクテリオファージ MX1、i) バクテリオファージ NL95、k) バクテリオファージ f2、l) バクテリオファージ PP7、m) バクテリオファージ AP205。
【００８４】
本発明の別の好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-バクテリオファージ Qβまたは RNA-バクテリオファージ fr または RNA-バクテリオファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこのこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。
【００８５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、組換えタンパク質は、RNA ファージのコートタンパク質を含むか、あるいはこのタンパク質から基本的になるか、あるいはこのタンパク質からなる。
【００８６】
キャプシドもしくは VLP を形成する RNA-ファージコート・タンパク質またはキャプシドもしくは VLP 中への自己集合に和合し得るバクテリオファージコート・タンパク質のフラグメントは、従って、本発明のさらなる好ましい実施態様である。バクテリオファージ Qβ コート・タンパク質は、例えば、大腸菌中で組換え的に発現せしめ得る。さらに、かかる発現において、これらのタンパク質はキャプシドを自発的に形成する。さらに、これらのキャプシドは、本来の反復した組織をもつ構造を形成する。
【００８７】
本発明の組成物を調製するのに使用できるバクテリオファージコート・タンパク質の具体的な好ましい例は、バクテリオファージ Qβ (配列番号:10; PIR Database アクセス番号 VCBPQβ、Qβ CP について、および配列番号: 11; アクセス番号 AAA16663、Qβ A1 タンパク質について)、バクテリオファージ R17 (PIR アクセス番号 VCBPR7)、バクテリオファージ fr (配列番号:13; PIR アクセス番号 VCBPFR)、バクテリオファージ GA (配列番号:14; GenBank アクセス番号 NP-040754)、バクテリオファージ SP (GenBank アクセス番号 CAA30374、SP CP について、およびアクセス番号 NP_695026、SP A1 タンパク質について)、バクテリオファージ MS2 (PIR アクセス番号 VCBPM2)、バクテリオファージ M11 (GenBank アクセス番号 AAC06250)、バクテリオファージ MX1 (GenBank アクセス番号 AAC14699)、バクテリオファージ NL95 (GenBank アクセス番号 AAC14704)、バクテリオファージ f2 (GenBank アクセス番号 P03611)、バクテリオファージ PP7 (配列番号: 19) および バクテリオファージ AP205 (配列番号: 31) などの RNA バクテリオファージのコート・タンパク質を含む。さらに、バクテリオファージ Qβ の A1 タンパク質またはそのＣ末端から 100、150 または 180 アミノ酸を欠くＣ末端切除型は、Qβ コート・タンパク質のキャプシド集合体中に組み込み得る。一般的に、キャプシド集合体中の Qβ A1 タンパク質の Qβ CP に比しての％は、キャプシド形成を確保するために限定される。バクテリオファージコート・タンパク質のさらなる具体的な例は、WO 02/056905 の 45 および 46 頁に記載されている（出典明示により本明細書の一部とする）。本発明における RNA-ファージ、特に Qβの好ましいウイルス様粒子は、WO 02/056905 に開示されている（全体を出典明示により本明細書の一部とする）。
【００８８】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。ここで、組換えタンパク質は、RNA ファージの変異コート・タンパク質、好ましくは、上記した RNA ファージの変異コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。別の好ましい実施態様において、RNA ファージの変異コート・タンパク質を、置換で少なくとも１リシン残基の除去により、または置換で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。あるいは、RNA ファージの変異コート・タンパク質を、少なくとも１リシン残基の除去により、または挿入で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。少なくとも１リシン残基の除去、置換または付加は、共役の程度を変えて、すなわち、RNA-ファージの VLP のサブユニット当たりのヒト黒色腫メランA ペプチドアナログの量をワクチンの必要なものに適合し仕上げる。本発明の好ましい実施態様において、平均でサブユニット当たり少なくとも 1.0 のヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが RNA-ファージの VLP に連結する。この値は、RNA-ファージの VLP の全サブユニットまたはモノマーについての平均として計算する。本発明のさらなる好ましい実施態様において、少なくとも 1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9 または少なくとも 2.0 のヒト黒色腫メランA ペプチドアナログが、RNA-ファージの VLP の全サブユニットまたはモノマーについての共役平均として計算される RNA-ファージの VLP に連結している。
【００８９】
別の好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-バクテリオファージ Qβ の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。ここで、組換えタンパク質は、配列番号:10 のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質または配列番号:10 および配列番号: 11 のアミノ酸配列を有するコート・タンパク質の混合物、および配列番号: 11 の変異体を含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなり、Ｎ末端のメチオニンが好ましくは切除されている。
【００９０】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、Qβの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。ここで、組換えタンパク質は、Qβ の変異コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。別の好ましい実施態様において、これらの変異コート・タンパク質を、置換で少なくとも１リシン残基の除去により、または置換で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。あるいは、Qβ の変異コート・タンパク質を、少なくとも１リシン残基の除去により、または挿入で少なくとも１リシン残基の付加により修飾した。
【００９１】
４リシン残基を Qβ コート・タンパク質のキャプシド表面に暴露する。暴露されたリシン残基がアルギニンで置換された Qβ 変異体も本発明で使用できる。下記の Qβ コート・タンパク質変異体および変異 Qβ VLP を本発明の実施に使用できる：“Qβ-240” (Lys13-Arg; 配列番号:20)、“Qβ-243” (Asn 10-Lys; 配列番号:21)、“Qβ-250” (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; 配列番号:22)、“Qβ-251” (配列番号:23) および “Qβ-259” (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; 配列番号:24)。すなわち、本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、a) 配列番号: 20 のアミノ酸配列、b) 配列番号:21 のアミノ酸配列、c) 配列番号: 22 のアミノ酸配列、d) 配列番号:23 のアミノ酸配列および e) 配列番号: 24 のアミノ酸配列よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む変異 Qβ コート・タンパク質の組換えタンパク質を含むか、あるいはこのタンパク質から基本的になるか、あるいはこのタンパク質からなる。上記の Qβ コート・タンパク質、変異 Qβ コート・タンパク質 VLP および キャプシドの構築、発現および精製は、それぞれ WO02/056905 に開示されている。特にこの出願の実施例 18 を引用する。
【００９２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、Qβ 組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。この組換えタンパク質は、Qβ 変異体および対応する A1 タンパク質のいずれか１の混合物を含むか、あるいはこの混合物から基本的になるか、あるいはこの混合物からなる。
【００９３】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。
【００９４】
AP205 ゲノムは、成熟タンパク質、コート・タンパク質、レプリカーぜおよびファージに存在しない２オープンリーディングフレーム；溶解遺伝子および成熟遺伝子の翻訳に役割を演じる１オープンリーディングフレーム (Klovins,J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)) からなる。AP205 コート・タンパク質は、プラスミド pAP283-58 (配列番号: 30) から発現できる。このプラスミドは、pQb10 (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137:133-37 (1993)) の誘導体であり、AP205 リボソーム結合部位を含有する。あるいは、AP205 コート・タンパク質は、pQb185、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流中にクローン化できる。両方法とも WO 04/007538（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のタンパク質の発現およびキャプシドの形成をもたらす。ベクター pQb10 および pQb185 は pGEM ベクターから誘導されるベクターであり、これらのベクター中のクローン遺伝子の発現は trp プロモーター (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137:133-37 (1993)) により制御される。プラスミド pAP283-58 (配列番号:30) は、下記の配列中に想定の AP205 リボソーム結合部位を含む。この配列は、AP205 コート・タンパク質の XbaI 部位の下流であり、ATG 開始コドンのすぐ上流である：tctagaATTTTCTGCGCACCCAT CCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg (配列番号: 30 の塩基 77-133)。ベクター pQb185 は、XbaI 部位からの下流および開始コドンの上流に Shine Delagarno 配列を含む (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg (配列番号: 61)、Shine Delagarno 配列に下線)。
【００９５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えコート・タンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれなる。
【００９６】
すなわち、本発明のこの実施態様は、キャプシドを形成する AP205 コート・タンパク質を含む。かかるタンパク質は、組換えで発現させるか、天然源から調製する。細菌でつくられた AP205 コート・タンパク質は自発的にキャプシドを形成し、これは電子顕微鏡 (EM) および免疫拡散で確認できる。AP205 コート・タンパク質 (配列番号: 31) により形成されるキャプシドと AP205 RNA ファージのコート・タンパク質により形成されるキャプシドの構造的特性は、EM で観察するとき、ほとんど区別できない。AP205 VLP は高度に免疫原性であり、抗原および／または抗原決定因子に連結できて、反復状に方向つけられた抗原および／または抗原決定因子を表示するワクチン構造をつくる。高い力価で、結合の抗原および／または抗原決定因子が抗体分子との相互作用にアクセス可能で免疫原性であることを示す表示の抗原に対して誘発される。
【００９７】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換え変異コート・タンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。
【００９８】
AP205 VLP の集合競合変異形態は、アミノ酸 5 でのプロリンのトレオニンへの置換を有する AP205 コート・タンパク質 (配列番号: 32) を含み、本発明の実施に使用し、本発明のさらなる好ましい実施態様となる。これらの VLP、天然源から誘導された AP205 VLP または AP205 ウイルス粒子は、抗原に結合して、本発明における抗原の規則正しい反復したアレイをつくり得る。
【００９９】
AP205 P5-T 変異コート・タンパク質をプラスミド pAP281-32 (配列番号: 33) から発現でき、このプラスミドは pQb185 から直接誘導され、Qβ コート・タンパク質遺伝子の代わりに変異 AP205 コート・タンパク質遺伝子を含有する。AP205 コート・タンパク質の発現のためのベクターは、AP205 コート・タンパク質の発現のために E. coli 中にトランスフェクトする。
【０１００】
コート・タンパク質および変異コート・タンパク質のそれぞれを発現し、VLP 中の自己集合体に導く方法は、WO 04/007538（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。適当な E. coli 株には、限定でないが、E. coli K802、JM 109、RR1 がある。適当なベクターおよび株およびそれらの組合せは、コート・タンパク質および変異コート・タンパク質それぞれの発現を SDS-PAGE により、キャプシド形成および集合をゲルろ過でのキャプシドを選択的に最初に精製することにより試験し、ついでそれらを免疫拡散アッセイ (Ouchterlony 試験) または電子顕微鏡で試験すること (Kozlovska, T. M. ET AL., Gene 137:133-37 (1993)) でもって同定できる。
【０１０１】
ベクター pAP283-58 および pAP281-32 から発現された AP205 コート・タンパク質は、最初のメチオニンアミノ酸を E. coli の細胞質のために欠くことがある。AP205 VLP の解裂もしくは非解裂型またはその混合物は本発明のさらなる好ましい実施態様である。
【０１０２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えコート・タンパク質またはそのフラグメントと、RNA-ファージ AP205 の組換え変異コート・タンパク質またはそのフラグメントとの混合物を含むか、あるいはこの混合物から基本的になるか、あるいはこの混合物からなる。
【０１０３】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ AP205 の組換えコート・タンパク質または組換え変異コート・タンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。
【０１０４】
VLP およびキャプシドのそれぞれに集合し得る組換え AP205 コート・タンパク質フラグメントも本発明の実施に有用である。これらのフラグメントは、コート・タンパク質および変異コート・タンパク質の内部または末端での欠失によりつくり得る。、コート・タンパク質および変異コート・タンパク質配列での挿入、抗原配列のコート・タンパク質および変異コート・タンパク質配列への融合、および集合の VLP への和合は、本発明のさらなる実施態様であって、キメラ AP205 コート・タンパク質および粒子それぞれに導く。コート・タンパク質配列への挿入、欠失および融合、並びにそれが VLP への集合に和合性かどうかは電子顕微鏡により決定できる。
【０１０５】
上記の AP205 コート・タンパク質、コート・タンパク質フラグメントおよびキメラコート・タンパク質は、沈降による分別工程と、WO 04/007538（出典明示により本明細書の一部とする）に記載のような、Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B カラムおよびこれらの組合せなどを用いるゲル分別による精製工程との組合で、純形態に単離できる。ウイルス様粒子を単離する他の方法は、当技術分野で知られており、バクテリオファージ AP205.の ウイルス様粒子 (VLP) を単離するのに使用し得る。例えば、イースト・レトロトランスポロン Ty の VLP を単離するための超遠心分離の使用が米国特許 4,918,166 （出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。
【０１０６】
いくつかの RNA バクテリオファージの結晶構造が決定されている (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996))。その情報を用いて、当業者は、表面暴露の残基を容易に同定し、１以上の活性アミノ酸残基が挿入されるように、バクテリオファージ コート・タンパク質を修飾できる。このように、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変種 (例えば、バクテリオファージ Qβ、バクテリオファージ R17、バクテリオファージ fr、バクテリオファージ GA、バクテリオファージ SP および バクテリオファージ MS2 のコート・タンパク質) も本発明の組成物およびワクチン組成物に使用できる。修飾 RNA バクテリオファージおよびタンパク質の変種およびキャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の N- および C 末端切除変異、ならびに本発明での使用に適した組成物およびワクチンそれぞれを調製する方法は、WO 02/056905 の 50 頁、33 行〜 52 頁、29 行に記載されている。
【０１０７】
すなわち、本発明は、キャプシドまたは VLP を形成するタンパク質から調製される組成物およびワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニットおよび VLP またはキャプシドからこれらの組成物を調製する方法、これらの個々のタンパク質サブユニット、これらのサブユニットをコードする核酸分子を調製する方法、ならびに本発明のこれらの組成物を用いる個体においてワクチン接種しおよび免疫学的応答を誘発する方法を含む。
【０１０８】
本発明の別の好ましい実施態様において、VLP は、リポタンパク質包膜またはリポタンパク質を含有する包膜がない。さらに好ましい方法において、VLP は包膜がまったくない。
【０１０９】
リポタンパク質包膜またはリポタンパク質を含有する包膜を欠くこと、特に包膜を完全に欠くことは、構造および組成において輪郭の明確なウイルス様粒子をもたらす。従って、かかる明確なウイルス様粒子は副作用を減じる。さらに、リポタンパク質を含有する包膜を欠くこと、特に包膜を完全に欠くことは、ウイルス様粒子内に強い毒性分子および発熱物質が導入されるのを少なくする。
【０１１０】
ひとつの実施態様において、本発明は、ウイルス様粒子を含む本発明のワクチン組成物を提供する。好ましくは、該ウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子である。好ましくは、ウイルス様粒子は、RNA-ファージの、好ましくは RNA ファージのコート・タンパク質の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。あるいは、本発明のワクチン組成物のウイルス様粒子の組換えタンパク質は、RNA ファージの変異コート・タンパク質を含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。RNA-ファージは下記よりなる群から選択する：(a) バクテリオファージ Q(、(b) バクテリオファージ R17、(c) バクテリオファージ fr、(d) バクテリオファージ GA、(e) バクテリオファージ SP、(f) バクテリオファージ MS2、(g) バクテリオファージ M11、(h) バクテリオファージ MX1、(i) バクテリオファージ NL95、(k) バクテリオファージ f2、(l) バクテリオファージ PP7、(m) バクテリオファージ AP205。
【０１１１】
好ましい実施態様において、RNA ファージ の変異コート・タンパク質を、少なくとも１のリシン残基の置換による除去または付加により修飾した。別の好ましい実施態様において、RNA ファージ の変異コート・タンパク質を、少なくとも１のリシン残基の欠如、または少なくとも１のリシン残基の挿入による付加により修飾した。好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、RNA-ファージ Qβ、RNA-ファージ fr または RNA-ファージ AP205 の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含む。
【０１１２】
上述のように、本発明は、ウイルス様粒子またはその組換え型を含む。当業者は、かかる粒子をつくり、それに抗原を接着するための知識を有する。本発明のさらなる好ましい実施態様は、実施例で開示する。
【０１１３】
ひとつの実施態様において、ウイルス様粒子は、BK ウイルス (BKV) の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、あるいはこれから基本的になるか、あるいはこれからなる。この組換えタンパク質は、配列番号:12 のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、あるいはこのタンパク質から基本的になるか、あるいはこのタンパク質からなる。BK ウイルス (BKV) は、papovaviridae のポリオーマウイルス・サブファミリーに属する非包膜の二本鎖 DNA ウイルスである。VP1 は、BKV の主要キャプシドタンパク質である。VP1 は 362 アミノ酸 (配列番号: 12, Gene Bank entry: AAA46882) を有し、大きさが 42 kDa である。E. coli 中でつくられるとき、挿入細胞またはイースト VP1 は自発的にキャプシド構造を形成する (Salunke D.M et al., Cell 46(6):895-904 (1986); Sasnauskas, K., et al., Biol. Chem. 380(3):381-6 (1999); Sasnauskas, K., et al., 3rd International Workshop “Virus like particles as vaccines” Berlin, September 26-29 (2001); Touze, A., et al., J Gen Virol. 82(Pt 12):3005-9 (2001)。キャプシドは、２０面体を形成する 72 VP1 ペンターマー中に編成される。このキャプシドは直径が約 45 nm である。
【０１１４】
ひとつの実施態様において、本発明の組成物に使用される粒子は、肝炎 B キャプシド (コア) タンパク質 (HBcAg) または遊離システイン残基をなくするか減らすように修飾された HBcAg のフラグメントから構成される。Zhou et al. (J. Virol. 66:5393 5398 (1992)) によると、天然に存するシステイン残基を除去するように修飾された HBcAg はマルチマー構造に関連し、それを形成する能力を保持する。このように、本発明の組成物における使用に適したコア粒子は、修飾 HBcAg またはそのフラグメントを含む粒子を含む。そこでは、１以上の天然に存するシステイン残基を切除されているか、別のアミノ酸残基 (例えば、セリン残基) で置換されている。
【０１１５】
HBcAg は、肝炎 B コア抗原前駆タンパク質のプロセシングによりつくられるタンパク質である。多くのイソタイプの HBcAg が同定されており、そのアミノ酸配列が当業者に利用可能である。例えば、配列番号: 16 に示されるアミノ酸配列を持つ HBcAg タンパク質は、長さが 185 アミノ酸であり、212 アミノ酸の肝炎 B コア抗原前駆タンパク質のプロセシングによりつくる。プロセシングが、肝炎 B コア抗原前駆タンパク質のＮ末端からの 29 アミノ酸の除去をもたらす。同様に、長さが 185 アミノ酸である HBcAg タンパク質は 214 アミノ酸肝炎 B コア 抗原前駆タンパク質のプロセシングでつくる。
【０１１６】
好ましい実施態様において、本発明のワクチン組成物を、HBcAg のプロセス型（すなわち、肝炎 B コア抗原前駆タンパク質のＮ末端リーダー配列が除去された HBcAg）を用いて調製する。
【０１１７】
さらに、HBcAg をプロセシングが起きない条件でつくると、一般的に HBcAg は “プロセス” 形態で発現される。例えば、E. coli などの細菌系は、一般的にリーダー配列を除去せず、真核細胞で通常発現されるタンパク質の “単一ペプチド” とも言う。すなわち、タンパク質の発現を細胞質に指示する E. coli 発現系を用いて、本発明の HBcAg をつくるとき、これらのタンパク質は一般的に、肝炎 B コア抗原前駆タンパク質のＮ末端リーダー配列が存在しないように発現される。
【０１１８】
本発明で使用できる肝炎 B ウイルス様粒子の調製は、例えば、WO 00/32227、特に実施例 17 〜 19 および 21 〜 24、WO 01/85208、特に実施例 17 〜 19、21 〜 24、31 および 41 ならびに WO 02/056905 に開示されている。後者の出願について、特に実施例 23、24、31 および 51 を引用する。全３文献を出典明示により本明細書の一部とする。
【０１１９】
本発明はまた、修飾されて、１以上の追加のシステイン残基を欠くか、置換されている HBcAg 変種を含む。すなわち、本発明のワクチン組成物は、配列番号: 16 で示されるアミノ酸配列中に存在しないシステイン残基が欠失された HBcAg を含有する組成物を含む。
【０１２０】
遊離の残基が化学的副反応に関与することがあるのは、当技術分野で周知である。この副反応には、ジスルフィド交換、例えば他の物質との組合せ治療で注射され形成される化学的物質または代謝体との反応、または UV 光への暴露におけるヌクレオチドとの直接酸化および反応がある。特に、HBcAg が核酸を結合する強力な傾向をもつことを考慮して、毒性アダクツをつくることができる。毒性アダクツは、このように多数の種に分布するが、個々には低いレベルであり、一緒になって毒性レベルに達する。
【０１２１】
以上の観点から、天然に存するシステインを除去するように修飾されたワクチン組成物における HBcAg の使用の利点のひとつは、抗原または抗原決定因子が接着されたときに、毒性種が結合し得る部位が数を減じるか、全く消失することである。
【０１２２】
本発明の実施における使用に適した多数の自然界に存在する HBcAg 変種が同定されている。例えば、Yuan et al., (J. Virol. 73:10122 10128 (1999)) は、配列番号:25 での部位 97 に対応する部位におけるイソロイシン残基がロイシン残基またはフェニルアラニン残基で置換されている変種を記載している。
【０１２３】
多くの HBcAg 変種およびいくつかの肝炎 B コア抗原前駆体変種は、GenBank レポート AAF121240、AF121239、X85297、X02496、X85305、X85303、AF151735、X85259、X85286、X85260、X85317、X85298、AF043593、M20706、X85295、X80925、X85284、X85275、X72702、X85291、X65258、X85302、M32138、X85293、X85315、U95551、X85256、X85316、X85296、AB033559、X59795、X85299、X85307、X65257、X85311、X85301 (配列番号:26)、X85314、X85287、X85272、X85319、AB010289、X85285、AB010289、AF121242、M90520 (配列番号:27)、P03153、AF110999, および M95589 に開示されている（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１２４】
上記の肝炎 B コア抗原前駆体変種の配列は、WO 01/85208 にさらに開示され、出願 WO 01/85208 の配列番号: 89-138 である。これらの HBcAg 変種は、多くの部位でアミノ酸配列が異なり、下記の部位に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む：配列番号:28 における部位 12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182 および 183。本発明の組成物における使用に適し、本明細書の開示によりさらに修飾し得るさらなる HBcAg 変種は、WO 01/98333、WO 00/177158 および WO 00/214478 に記載されている。
【０１２５】
本発明における使用に適した HBcAgs は、非メチル化 CpG-含有の オリゴヌクレオチドに封入、共役あるいは接着され得て、特に充填され得て、免疫応答を誘発する限り、いかなる生物体からも誘導し得る。
【０１２６】
上記のように、一般的にプロセスされた HBcAgs (すなわち、リーダー配列を欠くもの) を本発明のワクチン組成物で使用する。本発明は、ワクチン組成物、および上記の変種 HBcAgs を用いる、これらの組成物を使用する方法を含む。
【０１２７】
本発明の範囲にさらに含まれるものは、ダイマーまたはマルチマー構造を形成するために結合し得る追加の HBcAg 変種である。すなわち、本発明は、HBcAg ポリペプチドを含むワクチンを含む。このポリペプチドは、野生型アミノ酸配列に少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 類似のアミノ酸配列を含むか、あるいはこの配列からなり、N 末端リーダー配列を除去するようにプロセスされたそれらのタンパク質を形成する。
【０１２８】
ポリペプチドのアミノ酸配列が野生型アミノ酸配列またはそのサブ部分に少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 類似のアミノ酸配列であるかどうかは、Bestfit プログラムなどの既知のコンピュータープログラムを通常的に用いて決定できる。特定の配列が参照のアミノ酸配列に例えば 95% 類似であるかを決定するために Bestfit などの配列整列プログラムを用いるとき、同定％が参照アミノ酸配列の完全長について計算されるように、そして参照アミノ酸残基の全数の 5% までの相同性のギャップを許容するように、パラメーターを設定する。
【０１２９】
上記の HBcAg 変種および前駆体のアミノ酸配列は互いに比較的類似している。配列番号:28 の特定の部位に対応する部位に位置する HBcAg 変種のアミノ酸残基についての言及は、配列番号:28 に示されるアミノ酸配列でのその部位に存在するアミノ酸残基を意味する。これらの HBcAg 変種の間における相同性は、大部分、哺乳類に感染する肝炎 B ウイルスで十分高く、当業者が、配列番号:28 に示されるアミノ酸配列と特定の HBcAg 変種で “対応する” アミノ酸残基を同定するものとの両方を再検討するのにほとんど難しくないであろう。さらに、配列番号:27 に示される HBcAg アミノ酸配列は、ウッドチャックを感染するウイルスから誘導される HBcAg のアミノ酸配列であって、配列番号:28 に示されるアミノ酸配列を有する HBcAg に十分な相同性を持ち、３アミノ酸残基の挿入が配列番号:28 のアミノ酸残基 155 と 156 の間に配列番号:27 において存在することが容易に明らかである。
【０１３０】
本発明はまた、鳥に感染する肝炎 B ウイルスの HBcAg 変種を含むワクチン組成物、およびこれらの HBcAg 変種のフラグメントを含むワクチン組成物を含む。当業者が認識するように、これらのポリペプチドに天然に存在する１、２、３またはそれ以上のシステイン残基は、本発明のワクチンに挿入する前に、他のアミノ酸残基で置換するか、または除去できる。
【０１３１】
上記のように、遊離システイン残基の消失は、毒性成分が HBcAg に結合し得る部位の数を減じ、そしてまた、同じか隣接する HBcAg 分子のリシンとシステイン残基との橋かけリンカーが生じ得る部位をなくする。従って、本発明の別の実施態様において、肝炎 B ウイルスキャプシド・タンパク質の１以上のシステイン残基を除去または他のアミノ酸残基で置換する。HBcAg-Lys 変種の発現および精製は、WO 02/056905 の実施例 24 に記載され、遊離のシステイン残基がなく、挿入されたリシン残基を含有する HBcAg の構築は、WO 02/056905 の実施例 31 に記載されている。
【０１３２】
他の実施態様において、本発明の組成物およびワクチン組成物はそれぞれ、Ｃ末端領域 (すなわち、配列番号: 28 のアミノ酸残基 145 185 または 150 185) が除去されている HBcAg を含有する。すなわち、本発明の実施での使用に適する追加の修飾 HBcAg は C 末端切除変異体を含む。適当な切除変異体には、1、5、10、15、20、25、30、34、35 アミノ酸が C 末端から除去されている修飾 HBcAg がある。
【０１３３】
本発明の実施における使用に適する HBcAg はまた、N 末端切除変異体を含む。適当な切除変異体には、1、2、5、7、9、10、12、14、15 または 17 アミノ酸が N 末端から除去されている修飾 HBcAg がある。
【０１３４】
本発明の実施における使用に適するさらなる HBcAg は、ＮおよびＣ末端切除変異体を含む。適当な切除変異体には、1、2、5、7、9、10、12、14、15 または 17 アミノ酸が N 末端から除去され、かつ、1、5、10、15、20、25、30、34、35 アミノ酸が C 末端から除去されている修飾 HBcAg がある。
【０１３５】
本発明はさらに、上記の切除変異体に少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 類似のアミノ酸配列を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列 HBcAg ポリペプチドをそれぞれ含む組成物およびワクチン組成物を含む。
【０１３６】
本発明の特定の実施態様において、リシン残基を HBcAg ポリペプチドに導入して、本発明のメランA ペプチドアナログと HBcAg の VLP との結合を仲介せしめる。好ましい実施態様において、本発明の組成物を、HBcAg を用いて調製する。この HBcAg は、配列番号:28 のアミノ酸 1-144、または 1-149、1-185 を含むか、あるいはこれらのアミノ酸からなる。これらのアミノ酸を、部位 79 および 80 に対応するアミノ酸が、アミノ酸配列 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (配列番号:18) を有し、配列番号:29 で示される配列をもつ HBcAg ポリペプチドとなるペプチドで置換されるように修飾する。この組成物は、抗原決定因子が HBcAg の VLP に共役されている実施態様において特に有用である。さらなる好ましい実施態様において、配列番号:28 の部位 48 および 107 のシステイン残基をセリンに変える。
【０１３７】
本発明は、上記のアミノ酸変更をもつ上記の肝炎 B コア抗原前駆体変種のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する対応のポリペプチドをさらに含む。本発明の範囲にさらに含まれるものは、キャプシドまたは VLP を形成するように結合でき、上記のアミノ酸変更をもつ追加の HBcAg 変種である。すなわち、本発明は、HBcAg ポリペプチドを含む組成物およびワクチン組成物それぞれを含む。このポリペプチドは、野生型アミノ酸配列に少なくとも 80%、85%、90%、95%、97% または 99% 類似のアミノ酸配列を含むか、あるいはこの配列からなり、N 末端リーダー配列を除去するようにプロセスされ、上記の変更で修飾されたそれらのタンパク質を形成する。
【０１３８】
本発明の組成物またはワクチン組成物は異なる HBcAgs の混合物を含む。すなわち、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なる HBcAg から構成され得る。例えば、ワクチン組成物を、“野生タイプ” HBcAg と１以上のアミノ酸残基が変更（例えば、除去、挿入または置換）されている修飾 HBcAg を含んで、調製する。さらに。本発明の好ましいワクチン組成物は、抗原がヒト黒色腫メランA ペプチドアナログである高度に規則正しい反復した抗原アレイを表すものである。
【０１３９】
上記の開示のように、本発明は、免疫刺激性物質、好ましくは免疫刺激性核酸およびさらに好ましくは DNA オリゴヌクレオチドあるいはポリ (I:C) を VLP 中に充填し得るとの驚くべき発見に部分的に基づく。予想外にも、VLP 中に存在する核酸を、免疫刺激性物質により、好ましくは免疫刺激性核酸により、さらに好ましくは DNA-オリゴヌクレオチド含有の CpG モチーフまたはポリ (I:C) により特異的に置換できる。例えば、CpG-VLP は、より免疫原性であり、その CpG-のないものよりも特異的な作用を誘発し、高められた B および T 細胞応答を誘導する。VLP に共役され、融合されあるいは接着された抗原に対する免疫応答は、VLP 自体に対する免疫応答と同様に高められる。さらに、VLP と抗原の両者に対する T 細胞応答が Th1 タイプに特異的に向けられる。さらに、充填された核酸および CpG はそれぞれ、減成から保護される、すなわちより安定である。さらに、先天性免疫系からの細胞の非特異的活性化が劇的に減じる。
【０１４０】
先天性免疫系は細菌病原体がもつ非変種分子パターンを認識する能力を有する。最近の研究によると、この認識は有効な免疫応答を誘導するのに重要な工程である。細菌産物が免疫応答を増加する主なメカニズムは、APC、特に樹枝状細胞を刺激して、炎症性サイトカインをつくり、T 細胞についての共刺激性分子を高レベルで発現することである。これらの樹枝状細胞が、ついで主要な T 細胞応答を開始し、T 細胞仲介のエフェクター機能のタイプを指示する。
【０１４１】
２クラスの核酸、すなわち、1) 免疫刺激性配列、特に特殊なフランクリング塩基内に非メチル化 CpG ジヌクレオチド (CpG モチーフと言う) を含有する細菌性 DNA、および 2) 種々のタイプのウイルスにより合成された二本鎖 RNA が、免疫応答を高める細菌成分の重要なメンバーを提示する。ポリイノシン-ポリシチジル酸 (ポリ I:C) などの合成二本鎖 (ds) RNA は、樹枝状細胞を誘導することができ、炎症性サイトカインをつくり、高レベルの共刺激性分子を発現する。
【０１４２】
トクナガおよびヤマモトの一連の研究によると、細菌性 DNA または合成オリゴデオキシヌクレオチドがヒト PBMC およびマウス脾臓細胞を誘導し、タイプ I インタフェロン (IFN) をつくる（Yamamoto et al., Springer Semin Immunopathol. 22:11-19)。ポリ (I:C) は元々タイプ I IFN の強いインデューサーとして合成されたが、IL-12 などの他のサイトカインも誘導する。
【０１４３】
好ましいリボ核酸は、ポリイノシン-ポリシチジル酸二本鎖 RNA (ポリ I:C) を含む。リボ核酸およびその修飾体ならびにそれらの産生の方法は、Levy, H.B (Methods Enzymol. 1981, 78:242-251)、DeClercq, E (Methods Enzymol. 1981,78:227-236)、Torrence, P.F. (Methods Enzymol 1981;78:326-331) 本明細書の参照に記載されている。さらなる好ましいリボ核酸は、二本鎖が二本鎖 RNA を形成するポリ (IC) などの、イノシン酸とシチジル酸のポリヌクレオチドを含む。リボ核酸は有機体から単離できる。リボ核酸はまた、合成のリボ核酸、特に、ホスホジエステル骨格の修飾、特にホスホロチオエート修飾によりヌクレアーゼ抵抗性が減じられている合成ポリ (I:C) オリゴヌクレオチドを包含する。さらなる実施態様において、ポリ (I:C) のリボース骨格をデオキシリボースにより置き換える。どのように合成オリゴヌクレオチドをつくるかは、当業者のよく知るところである。
【０１４４】
本発明の別の好ましい実施態様において、活性トル様受容体 (TLR) が封入されている分子である。１０のヒト・トル様受容体が現在までに知られている。これらは種々のリガンドにより活性化される。TLR2 は、ペプチドグリカン、リポタンパク質、リポポリサッカライド、リポテイコ酸およびジモサン、およびマクロファージ活性化リポペプチド MALP-2 により活性化され；TLR3 は、ポリ (I:C) などの二本鎖 RNA により活性化され；TLR4 は、リポポリサッカライド、リポテイコ酸およびタキソール、および熱ショックタンパク質 HSP-60 および Gp96 などの熱ショックタンパク質により活性化され；TLR5 は、細菌性鞭毛、特にフラジェリン・タンパク質により活性化され；TLR6 は、ペプチドグリカンにより活性化され；TLR7 は、イミキモイドおよびイミダゾキノリン化合物、例えば R-848、ロキソリビンおよびブロピリミンにより活性化され；TLR9 は、細菌性 DNA、特に CpG DNA により活性化される。TLR1、TLR8 および TLR10 についてのリガンドは現在のところ知られていない。しかし、最近の報告によると、同じ受容体が異なるリガンドと反応でき、さらなる受容体が存在する。上記リストのリガンドは限定的でなく、さらなるリガンドが当業者に知られている。
【０１４５】
好ましくは、非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは下記の配列を含む。
5' X1X2CGX3X4 3'
うち、X1、X2、X3 および X4 はなんらかのヌクレオチドである。さらに、このオリゴヌクレオチドは、約 6 〜 約 100,000 ヌクレオチド、好ましくは約 6 〜 約 2000 ヌクレオチド、より好ましくは約 20 〜 約 2000 ヌクレオチド、さらに好ましくは約 20 〜 約 300 ヌクレオチドを含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、100 以上〜 約 2000 ヌクレオチド、好ましくは 100 以上〜 約 1000 ヌクレオチド、より好ましくは 100 以上〜 約 500 ヌクレオチドを含み得る。
【０１４６】
好ましい実施態様において、CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、ホスフェート骨格の１以上のホスホロチオエート修飾を含有する。例えば、１以上のホスフェート骨格修飾を有するか、修飾されたすべてのホスフェート骨格を有する CpG-含有のオリゴヌクレオチド、およびヌクレオチドホスフェート骨格修飾の１、いくつかまたはすべてがホスホロチオエート修飾である CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、本発明の範囲に含まれる。すなわち、好ましい実施態様において、ヌクレオチド X1、X2、X3 および X4 の少なくとも１がホスフェート骨格修飾を有する。
【０１４７】
本発明のさらなる非常に好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、下記よりなる群から選ばれる核酸配列を有する：
【０１４８】
(a) GGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 2); G3-6 と典型的には本明細書で略称する)、(b) GGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 3); G4-6 と典型的には本明細書で略称する)、(c) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 4); G5-6 と典型的には本明細書で略称する)、(d) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 5); G6-6 と典型的には本明細書で略称する)、(e) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ((配列番号: 6); G7-6 と典型的には本明細書で略称する)、
【０１４９】
(f) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ((配列番号: 7); G8-8 と典型的には本明細書で略称する)、(g) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG ((配列番号: 8); G9-9 と典型的には本明細書で略称する)、(h) GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG ((配列番号: 9); G6 と典型的には本明細書で略称する)、(i) tccatgacgttcctgaataat ((配列番号: 34); CyCpGpt と典型的には本明細書で略称する)、(j) TCCATGACGTTCCTGAATAAT ((配列番号: 35); CyCpG と典型的には本明細書で略称する)、
【０１５０】
(k) tccatgacgttcctgacgtt ((配列番号: 36); B-CpGpt と典型的には本明細書で略称する)、(l) TCCATGACGTTCCTGACGTT ((配列番号: 37); B-CpG と典型的には本明細書で略称する)、(m) ggggtcaacgttgaggggg ((配列番号: 38); NKCpGpt と典型的には本明細書で略称する)、(n) GGGGTCAACGTTGA GGGGG ((配列番号: 39); NKCpG と典型的には本明細書で略称する)、(o) attattcaggaacgtcatgga ((配列番号: 40); CyCpG-rev-pt と典型的には本明細書で略称する)、
【０１５１】
(p) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG ((配列番号: 41); g10gacga-PO (G10-PO) と典型的には本明細書で略称する)、(q) gggggggggggacgatcgtcgggggggggg ((配列番号: 42); g10gacga-PS(G10-PS) と典型的には本明細書で略称する)、(r) CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT ((配列番号: 43); (CpG)20OpA と典型的には本明細書で略称する)、(s) TCCATGACGTTCCTGAATAATCGC GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCG ((配列番号: 44); Cy(CpG)20 と典型的には本明細書で略称する)、(t) TCCATGACGTTCCTGAATAATCG CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAAATGCATGTCAAAGACAGCAT ((配列番号: 45); Cy(CpG)20-OpA と典型的には本明細書で略称する)、
【０１５２】
(u) TCCATGACGTTCCTGAATAATAAATGCATGTCAAAGACAGCAT ((配列番号: 46); CyOpA と典型的には本明細書で略称する)、(v) TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAAT ((配列番号: 47); CyCyCy と典型的には本明細書で略称する)、(w) TCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTGGATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCC ((配列番号: 48); Cy150-1 と典型的には本明細書で略称する)、および (x) CTAGAACTAGTGGATC CCCCGGGCTGCAGGAATTCGATTCATGACTTCCTGAATAATTCCATGACGTTGGTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAATAATTCCATGACGTTCCTGAAAATTCCAATCAAGCTTATCGATACCGTCGACC (配列番号: 49); dsCyCpG-253 と典型的には本明細書で略称する (相補的鎖を示さない))。
【０１５３】
上記の配列番号: 34 〜 配列番号: 49 の配列において、小文字はホスホロチオエート結合を介して結合されるデオキシヌクレオチドを示し、大文字はホスホジエステル結合を介して結合されるデオキシヌクレオチドを示す。
【０１５４】
本発明の別の非常に好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、核酸配列 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG ((配列番号: 41); g10gacga-PO または G10-PO と典型的には本明細書で略称する) を有する。
【０１５５】
CpG-含有のオリゴヌクレオチドはまた、組換え、ゲノム、合成、cDNA、プラスミド誘導で一本鎖または二本鎖であり得る。本発明における使用のために、この核酸は、既知の多くの方法のいずれかを用いて合成できる。例えば、β-シアノエチルホスホラミディット法 (Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859 (1981); ヌクレオシド H-ホスホネート法 (Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054 (1986); Froehler et al., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407 (1986); Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058 (1986), Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622 (1988)) がある。これらの化学的方法は、種々の市販されている自動オリゴヌクレオチド・シンセサイザーにより実施できる。あるいは、CpGs は大量にプラスミド (参照、Sambrook, T., et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989) でつくり得る。このプラスミドは、対象に投与された後、オリゴヌクレオチドとなる。オリゴヌクレオチドは、存在する核酸配列 (例えば、ゲノム または cDNA) から、既知の方法、例えば、制限酵素、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いる方法でつくり得る。
【０１５６】
免疫刺激性物質、免疫刺激性核酸および非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、VLP に、その組成物が動物における免疫応答を高める限り、既知のいかなる方法でも結合せしめ得る。例えば、オリゴヌクレオチドは共有結合または非共有結合のいずれでも結合できる。さらに、VLP は免疫刺激性物質、免疫刺激性核酸および非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドを完全にまたは部分的に封入し得る。好ましくは、免疫刺激性核酸および非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド結合部位 (自然界に存在する、または存在しない)、DNA 結合部位または RNA 結合部位などの VLP 部位に結合する。他の実施態様において、VLP 部位はアルギニンに富む反復体またはリシンに富む反復体である。
【０１５７】
本発明の組成物のひとつの具体的な使用は、抗原に対する特異的な免疫応答を高める目的のために樹枝状細胞を活性化することである。免疫応答は、生体外またはインビボ法を用いて高め得る。生体外法は自己または非定型細胞で使用できるが、自己細胞が好ましい。好ましい実施態様において、樹枝状細胞は、末梢血または骨髄から単離するが、樹枝状細胞のいかなる源から単離できる。癌免疫治療の目的のための樹枝状細胞の生体外操作法は、当技術分野のいくつかの文献に記載されている。例えば、Engleman, E. G., Cytotechnology 25:1 (1997); Van Schooten, W., et al., Molecular Medicine Today, June, 255 (1997); Steinman, R. M., Experimental Hematology 24:849 (1996); and Gluckman, J. C., Cytokaines, Cellar and Molecular Therapy 3:187 (1997) がある。
【０１５８】
樹枝状細胞はまた、本発明の組成物とインビボ法を用いて接触せしめることができる。これを達成するためには、CpGs を、抗原に選択的に共役、融合あるいは接着された VLP と組み合わせて、免疫治療を必要とする対象に直接的に投与する。いくつかの実施態様において、VLP/CpG を腫瘍の局所領域に投与するのが好ましい。このことは、既知の方法のいずれか、例えば腫瘍への直接投与で達成できる。
【０１５９】
本発明の好ましい実施態様は、動物における免疫応答を高めるために、(a) ウイルス様粒子、(b) 少なくとも１の免疫刺激性物質および (c) 少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を提供することである。ここで、該抗原または該抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合している。該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合している。該免疫刺激性物質は非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) である。該回交構造配列は、その 3'-末端およびその 5'-末端で、２を超え１１より少ないグアノシン実在物または好ましくは 8-10 グアノシン実在物または最も好ましくは 10 グアノシン実在物を側有する。
【０１６０】
非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分であり、回交構造配列が GACGATCGTC (配列番号: 1) であり、回交構造配列が、その 3'-末端およびその 5'-末端で、２を超え１１より少ないグアノシン実在物または好ましくは 8-10 グアノシン実在物または最も好ましくは 10 グアノシン実在物を側有する、本発明の免疫刺激性物質すなわち非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドが、特に、免疫細胞をインビトロで刺激するのに有効であることを見出した。
【０１６１】
本発明の好ましい実施態様において、回交構造配列は、GACGATCGTC (配列番号: 1) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる。該回交構造配列は、その 5'-末端で少なくとも 3、最大 10 グアノシン実在物を側有し、該回交構造配列は、その 3'-末端で少なくとも 6、最大 10 グアノシン実在物を側有する。別の実施態様において、回交構造配列は、その 5'-末端で少なくとも 3、最大 10 グアノシン実在物を側有し、該回交構造配列は、その 3'-末端で少なくとも 6、最大 10 グアノシン実在物を側有する。
【０１６２】
本発明のさらなる非常に好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分であり、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは、下記より選択される核酸配列を有する： (a) GGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 2); G3-6 と典型的には本明細書で略称する)、(b) GGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 3); G4-6 と典型的には本明細書で略称する)、(c) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 4); G5-6 と典型的には本明細書で略称する)、(d) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 5); G6-6 と典型的には本明細書で略称する)、(e) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ((配列番号: 6); G7-7 と典型的には本明細書で略称する)、(f) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ((配列番号: 7); G8-8 と典型的には本明細書で略称する)、(g) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG ((配列番号: 8); G9-9 と典型的には本明細書で略称する)、(h) GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG ((配列番号: 9); G6 と典型的には本明細書で略称する) および (i) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG ((配列番号: 41); G10-PO と典型的には本明細書で略称する)。
【０１６３】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列である。該回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) である。該回交構造配列は、その 5'-末端で少なくとも 4、最大 10 グアノシン実在物を側有し、該回交構造配列は、その 3'-末端で少なくとも 6、最大 10 グアノシン実在物を側有する。
【０１６４】
本発明の別の好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは下記から選択される核酸配列を有する： (a) GGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 3); G4-6 と典型的には本明細書で略称する)、(b) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 4); G5-6 と典型的には本明細書で略称する)、(c) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 5); G6-6 と典型的には本明細書で略称する)、(d) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ((配列番号: 6); G7-7と典型的には本明細書で略称する)、(e) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ((配列番号: 7); G8-8 と典型的には本明細書で略称する)、(f) GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG ((配列番号: 8); G9-9 と典型的には本明細書で略称する) および (g) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG ((配列番号: 41); G10-PO と典型的には本明細書で略称する)。
【０１６５】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) である。該回交構造配列は、その 5'-末端に少なくとも 5、最大 8 グアノシン実在物を側有し、該回交構造配列は、その 3'-末端に少なくとも 6、最大 10 グアノシン実在物を側有する。
【０１６６】
実験データによると、好ましい本発明の免疫刺激性物質、すなわちグアノシン側有の、回交構造の非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチド（なお、回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) であり、回交構造配列はその 3'-末端および 5'-末端で 11 未満または 10 未満のグアノシン実在物より測有される）を VLP へ充填することの容易性は、少数のグアノシン実在物で回交構造配列が側有されていると、増加する。しかし、回交構造配列を挟むグアノシン実在物の数の減少は、血液細胞のインビトロでの刺激を減少することをもたらす。すなわち、充填能は、表示の本発明の免疫刺激性物質の生物学的活性の低下でまかなわれる。このように、好ましい本実施態様は、充填能と生物学的活性との妥協である。
【０１６７】
本発明の別の好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドは下記から選択される核酸配列を有する： (a) GGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 4); G5-6 と典型的には本明細書で略称する)、(b) GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG ((配列番号: 5); G6-6 と典型的には本明細書で略称する)、(c) GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG ((配列番号: 6); G7-7 と典型的には本明細書で略称する)、(d) GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG ((配列番号: 7); G8-8 と典型的には本明細書で略称する) および (e) GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG ((配列番号: 41); G10-PO と典型的には本明細書で略称する)。
【０１６８】
本発明の別の好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該非メチル化は配列番号: 7 の核酸配列を有し、すなわち免疫刺激性物質は G8-8 または配列番号: 41 すなわち G10-PO である。
【０１６９】
本発明の非常に好ましい実施態様において、免疫刺激性物質が非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。ここにおいて、該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該非メチル化は配列番号: 41 の核酸配列を有し、すなわち免疫刺激性物質は G10-PO である。このように、非常に好ましい実施態様において、本発明は、動物における免疫応答を高めるために、(a) ウイルス様粒子、(b) 少なくとも１の免疫刺激性物質および (c) 少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物を提供する。ここで、該抗原または該抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合している。該抗原はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合している。該免疫刺激性物質は非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドである。該非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドの CpG モチーフは回交構造配列の部分である。該回交構造配列は GACGATCGTC (配列番号: 1) である。該回交構造配列は、その 3'-末端およびその 5'-末端で、10 グアノシン実在物を側有する。
【０１７０】
上記のように、VLP への充填に使用される最適の配列は、充填能と生物学的活性化との妥協にある。このことを考慮すると、本発明において G8-8免疫刺激性物質が好ましい実施態様であり、G10-PO 免疫刺激性物質が非常に好ましい実施態様である。なぜなら、これらは生物学的に高度に活性であり、そしてなお十分充填され得るからである。
【０１７１】
本発明の組成物は、ウイルス様粒子に結合された本発明のヒト黒色腫 メランA ペプチドアナログをさらに含む。
【０１７２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、少なくとも１のメランA ペプチドアナログをウイルス様粒子に融合せしめる。すでに概記したように、VLP は、VLP 中に集合する少なくとも１のサブユニットから構成される。すなわち、本発明のさらなる好ましい実施態様において、キメラ VLP-サブユニット-抗原融合を生成する VLP 中に組み込まれ得るウイルス様粒子またはタンパク質の少なくとも１のサブユニットにメランA ペプチドアナログを融合せしめる。
【０１７３】
メランA ペプチドアナログの融合は、VLP サブユニット配列中への挿入により、または, VLP 中に組み込まれ得るウイルス様粒子またはタンパク質のサブユニットの N- または C-末端への融合により行い得る。以後、VLP サブユニットへのペプチドの融合タンパク質について言及したとき、サブユニット配列のいずれかの末端への融合またはサブユニット内でのペプチドの内的挿入が含まれる。
【０１７４】
融合はまた、メランA ペプチドアナログ配列を VLP サブユニット変種中に挿入することにより行い得る。この変種では、サブユニット配列の部分が欠如されており、これを切除変異という。切除変異は、VLP サブユニット配列の部分の N- もしくは C-末端または内的な欠如を有する。例えば、アミノ酸残基 79 〜 81 の欠如をもつ具体的な VLP HBcAg は内的欠如をもつ切除変異である。抗原または抗原決定因子の、切除変異 VLP-サブユニットの N- または C-末端への融合も、本発明の実施態様となる。同様に、エピトープの VLP サブユニット配列への融合も置換により行い得る。ここでは、例えば、具体的な VLP HBcAg について、アミノ酸 79-81 が外的エピトープで置き換えられる。このように、融合は、以後言及するように、メランA ペプチドアナログ配列の VLP サブユニット配列への挿入により、VLP サブユニット配列の部分のメランA ペプチドアナログでの置換により、または欠如、置換もしくは挿入の組合せにより実施できる。
【０１７５】
キメラ・メランA ペプチドアナログ-VLP サブユニットは、一般的に VLP に自己集合し得る。VLP サブユニットに融合された VLP 表示エピトープも本明細書ではキメラ VLP という。示すように、ウイルス様粒子は、少なくとも１の VLP サブユニットを含むか、あるいはこのサブユニットから構成される。本発明のさらなる実施態様において、ウイルス様粒子は、キメラ VLP サブユニットと非キメラ VLP サブユニット、すなわち融合されている抗原を有しない VLP サブユニットとの混合物を含むか、あるいはこの混合物から構成される。これは、いわゆるモザイク状粒子となっている。これは VLP への集合の形成を確認するのに好都合である。これらの実施態様において、キメラ VLP-サブユニットの割合は、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95% またはそれ以上であり得る。
【０１７６】
フランキング（側有の）アミノ酸残基は、VLP のサブユニット配列のいずれかの末端に融合されるペプチドまたはエピトープ配列のいずれかの末端に、またはかかるペプチド配列の VLP のサブユニット配列への内的挿入のために付加できる。グリシンおよびセリン残基は、融合されるべきペプチドに付加される測有の配列で用いられるのに特に優れたアミノ酸である。グリシン残基は追加の柔軟性を付与する。これは、外的配列を VLP サブユニット配列に融合することに対する強い不安定な作用を減じ得る。
【０１７７】
本発明の特殊な実施態様において、VLP は肝炎 B コア抗原 VLP である。タンパク質の、HBcAg の N-末端への融合 (Neyrinck, S. et al., 天然 Med. 5:1157-1163 (1999)) またはいわゆる主要免疫支配領域 (MIR) への挿入は、記述されており (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)), WO 01/98333)、そして本発明の好ましい実施態様である。MIR 中に欠失をもつ HBcAg の自然界に存在する変種も記述されており (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)（出典明示により本明細書の一部とする)、wt HBcAg に比して、N- または C-末端への融合および欠失部位に対応する MIR 部位での挿入は、本発明のさらなる実施態様である。C-末端への融合も記述されている (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001))。当業者は、通常の分子生物学の技法を用いて、融合タンパク質をいかに構築するかについての指針を容易に見出すであろう (Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ho et al., Gene 77:51 (1989))。HBcAg および HBcAg 融合タンパク質をコードし、HBcAg および HBcAg 融合タンパク質の発現に有用なベクターおよびプラスミドは、記述されており (Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 (1999))、本発明の実施において使用できる。
【０１７８】
HBcAg の MIR に挿入されるエピトープの自己集合およびディスプレイの効率を最適にするための重要な因子は、挿入部位の選択および MIR 中で HBcAg 配列から挿入時に欠失されるアミノ酸の数 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001); EP 421 635; U.S. 6,231,864) であり、または換言すると、HBcAg からどのアミノ酸が新しいエピトープで置き換われるかである。例えば、HBcAg アミノ酸 76-80、79-81、79-80、75-85 または 80-81 の外的エピトープでの置換は記述されている (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001); EP 421 635; US 6,231,864)。HBcAg は長いアルギニン・テイルを含有し (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001))、これはキャプシド集合も不可欠であり、核酸を結合し得る (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001))。このアルギニン・テイルを含有または欠く両方の HBcAg が本発明の実施態様である。
【０１７９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、VLP は RNA ファージの VLP である。RNA ファージの主要コート・タンパク質は、細菌、特に E. coli における発現時に VLP 中に自発的に集合する。本発明の組成物を調製するのに使用できるバクテリオファージコート・タンパク質の具体的な例は、バクテリオファージ Qβ (配列番号:10; PIR Database, アクセス番号. VCBP Qβ、Qβ CP という、および 配列番号: 11; アクセス番号. AAA16663、 Qβ A1 タンパク質という) およびバクテリオファージ fr (配列番号: 13; PIR アクセス番号. VCBPFR) などの RNA バクテリオファージのコート・タンパク質を含む。
【０１８０】
他の好ましい実施態様において、少なくとも１のメランA ペプチドアナログを Qβ コート・タンパク質に融合する。エピトープが Qβ の A1 タンパク質の切断形の C-末端に融合されるか、A1 タンパク質中に挿入される融合タンパク質構築体は記述されている (Kozlovska, T. M. ET AL., Intervirology, 39:9-15 (1996))。A1 タンパク質は、N-末端メチオニンの解裂を考慮すると、UGA 停止コドンの阻止でつくられ、長さ 329 aa または 328 aa をもつ。アラニン (Qβ CP 遺伝子によりコードされる第２アミノ酸) の前で N-末端メチオニンの解裂が通常 E. coli でおこり、これは Qβ コート・タンパク質の場合である。A1 遺伝子の部分、3' の UGA アンバー・コドンが CP 伸張をコードする。この伸張は長さ 195 アミノ酸をもつ。CP 伸張の部位 72 と 73 との間への少なくとも１のメランA ペプチド アナログの挿入は、本発明のさらなる実施態様をもたらす (Kozlovska, T. M. ET AL., Intervirology 39:9-15 (1996))。C-末端切除 Qβ A1 タンパク質のＣ末端でのメランA ペプチド アナログの融合は、本発明のさらなる好ましい実施態様をもたらす。例えば、Kozlovska et al., (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) は、エピトープが部位 19 で切断された Qβ CP 伸張の C-末端で融合される Qβ A1 タンパク質融合について記述している。
【０１８１】
Kozlovska et al. (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) に記述されているように、融合されたエピトープをディスプレイする粒子の集合は、A1 タンパク質-メランA-ペプチド-アナログ融合と wt CP の両方の存在を必要とし、モザイク粒子を形成する。しかし、ウイルス様粒子および特に RNA ファージ Qβ コート・タンパク質の VLP は、それに融合される少なくとも１のメランA ペプチドアナログを有する VLP サブユニットから専ら構成され、これらを含む実施態様は、本発明の範囲内にある。
【０１８２】
モザイク粒子の産生は多くの方法で実施できる。Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996) は３方法を記述しており、これらのすべてを本発明の実施で用い得る。第１の方法において、VLP 上の融合エピトープの効率的なディスプレイは、E. coli 株における CP と CP 伸張の間に UGA 停止コドンを有する Qβ A1 タンパク質融合をコードするプラスミドの発現により仲介される。この株は、UGA コドンの Trp への翻訳を導くクローン化 UGA 阻止 tRNA をコードするプラスミド (pISM3001 プラスミド (Smiley B.K., et al., Gene 134:33-40 (1993)) を保持するものである。別の方法において、CP 遺伝子停止コドンが UAA 中に修飾され、A1 タンパク質-抗原融合を発現する第２プラスミドが共形質転換される。第２プラスミドが異なる抗生物質耐性をコードし、複製源が第１プラスミドに和合性である (Kozlovska, T. M. ET AL., Intervirology 39:9-15 (1996))。第３の方法において、CP および A1 タンパク質-抗原融合は、bicistronic 的にコードされ、Trp プロモーターなどのプロモーターに作動的に連結される。このプロモーターは Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996) の図１に記載されている。
【０１８３】
さらなる実施態様において、メランA ペプチド アナログを fr CP のアミノ酸 2 と 3 (解裂 CP、すなわち解裂される N-末端メチオニンについての番号付け) の間に挿入し、メランA ペプチド アナログ-fr CP 融合タンパク質に導く。VLP に自己集合する fr CP 融合タンパク質の構築および発現のためのベクターおよび発現系は、本発明の実施に有用であり、記述されている (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993))。具体的な実施態様において、メランA ペプチド アナログ配列を、fr CP の 残基 3 および 4 が欠失されている アミノ酸 2 の後に fr CP の欠失変種を挿入する。
【０１８４】
RNA ファージ MS-2 のコート・タンパク質の N-末端突起 β-ヘアピンにおけるエピトープの融合および続く RNA ファージ MS-2 の自己集合 VLP 上の融合エピトープの提示も記述されており (WO 92/13081)、RNA ファージ MS-2 のコート・タンパク質中への挿入または置換による本発明のメランA ペプチドアナログの融合も本発明の範囲内にある。
【０１８５】
本発明の他の実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログをパピローマウイルスのキャプシドタンパク質に融合する。より具体的な実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログをウシ・パピローマウイルス タイプ 1 (BPV-1) の主要キャプシドタンパク質 L1 に融合する。バキュロウイルス/挿入細胞系における BPV-1 融合タンパク質の構築および発現のためのベクターおよび発現系は記述されている (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955)。BPV-1 L1 のアミノ酸 130-136 の、本発明のメランA ペプチド アナログによる置換は、BPV-1 L1-メランA-ペプチド-アナログ融合タンパク質をもたらす。これは、本発明の好ましい実施態様である。バキュロウイルス・ベクターのクローニングおよびバキュロウイルス感染 Sf9 細胞の発現は、記述されており (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955)、本発明の実施に用い得る。本発明の融合されたメランA ペプチドアナログをディスプレイする集合粒子の精製は多くの方法で実施できる。例えば、ゲルろ過やスクロース勾配超遠心分離がある (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955)。
【０１８６】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログを Ty VLP 中に組み込まれ得る Ty タンパク質に融合する。より具体的な実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログを TYA 遺伝子によりコードされる p1 またはキャプシドタンパク質 (Roth, J.F., Yeast 16:785-795 (2000)) に融合する。イースト・レトロトランスポソン Ty 1、2、3 および 4 は Saccharomyces Serevisiae から単離されており、一方、レトロトランスポソン Tf1 は Schizosaccharomyces Pombae から単離されている (Boeke, J.D. and Sandmeyer, S.B., “Yeast Transposable elements,” in The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, p. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991))。レトロトランスポソン Ty1 および 2 は動植物エレメントの copia クラスに関係し、一方、Ty3 は動植物のレトロウイルスに関係するレトロトランスポソンのジプシーファミリー属する。Ty1 レトロトランスポソンにおいて、p1 タンパク質は、Gag またはキャプシドタンパク質も意味し、長さ 440 アミノ酸をもつ。P1 は VLP の成熟時に部位 408 で解裂されて、p2 タンパク質、VLP の基本的成分となる。
【０１８７】
イーストにおける融合タンパク質の発現のための p1 およびベクターに対する融合タンパク質は記述されている (Adams, S.E., et al., 天然 329:68-70 (1987))。このように、例えば、本発明のメランA ペプチド アナログを、pMA5620 プラスミドの BamH1 部位中にメランA ペプチド アナログをコードする配列を挿入することにより p1 に融合し得る。外的エピトープをコードする配列の pMA5620 ベクターへのクローニングは、外的エピトープの N-末端にC-末端融合された Ty1-15 の pl のアミノ酸 1-381 を含む融合タンパク質の発現をもたらす。同様に、本発明のメランA ペプチドアナログの N-末端融合、p1 配列への内的挿入、 p1 配列の部分の置換も本発明の範囲内にある。特に、本発明のメランA ペプチドアナログの、Ty タンパク質 p1 (EP0677111) のアミノ酸 30-31、67-68、113-114 および 132-133 間の Ty 配列 への挿入は、本発明の好ましい実施態様である。
【０１８８】
本発明のメランA またはメランA ペプチドアナログの融合に適したさらなる VLP は、例えば、レトロウイルス様粒子 (WO9630523)、HIV2 Gag (Kang, Y.C., et al, Biol. Chem. 380:353-364 (1999))、Cowpea Mosaic ウイルス (Taylor, K. M. et al., Biol. Chem. 380:387-392 (1999))、parvoウイルス VP2 VLP (Rueda, P. et al., Virology 263:89-99 (1999)), HBsAg (US 4,722,840, EP0201416B1) である。
【０１８９】
本発明の実施に適したキメラ VLP の例は、Intervirology 39:1 (1996) に記載されているものでもある。本発明に使用する VLP のさらなる例は、HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、タバコモザイクウイルスである。SV-40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルスおよびノルウォークウイルスのウイルス様粒子もつくられており、これらの VLP のキメラ VLP も本発明の範囲内にある。
【０１９０】
示すように、モノマーを形成するウイルス様粒子の配列中に挿入によりウイルス様粒子に融合された抗原を含む実施態様も本発明の範囲内にある。ある場合において、欠失を含有するモノマーを形成するウイルス様粒子の形態で抗原を挿入できる。これらの場合、モノマーを形成するウイルス様粒子は、挿入される抗原の不存在でウイルス様構造を形成し得ないことがある。
【０１９１】
いくつかの例において、組換え DNA 技法を、非定型タンパク質を VLP タンパク質に融合せしめるのに利用する (Kratz, P.A., et al., Acad. Sci. USA 96:1915 (1999))。例えば、本発明は、本発明の抗原 (またはその部分、好ましくは、少なくとも 10、20 または 50 アミノ酸) に組換え的に融合または化学的にコンジュゲート (共有結合および非共有結合的にコンジュゲートを含む) された VLP を包含する。融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こり得る。さらに一般的に、ウイルス様粒子に融合され、コンジュゲートされ、あるいは接着されたエピトープを本発明に適合する抗原として使用する場合、スペーサーまたはリンカー配列をエピトープの一端または両端に典型的に加える。かかるリンカー配列は、好ましくはプロテアソーム、エンドソームのプロテアーゼまたは細胞の別の小胞分画により認識される配列を含む。
【０１９２】
共役のひとつはペプチド結合であり、そこではコンジュゲートが隣接ポリペプチド、すなわち融合タンパク質であり得る。本発明の融合タンパク質において、異なるペプチドまたはポリペプチドがフレーム中で互いに連結して、隣接のポリペプチドを形成する。すなわち、融合タンパク質の第１部分が抗原または免疫原を含み、融合タンパク質の第２部分が第１部分の N-末端または C-末端で VLP を含む。あるいは、VLP 中への内部挿入も、抗原の両端で選択的な連鎖配列をもって、本発明で使用できる。
【０１９３】
HBcAg を VLP として使用するとき、抗原が HBcAg 粒子 のＣ末端に連結しているのが好ましい。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) 糖タンパク質から誘導される MHC クラス I 制限ペプチド p33 のＣ末端融合を提示する肝炎 B コア抗原 (HBcAg) をモデル抗原 (HBcAg-p33) として使用できる。185 アミノ酸の長さの野生タイプ HBc タンパク質は、180 サブユニット集合の二十面体からなる高度の構造粒子中に集合する。外的配列の比較的大きい挿入を異なる部位で、構造キャプシドを形成する能力を保持しながら受け容れるという HBcAg および他の VLP の柔軟性は、文献に十分発表されている。このことは、HBc VLP を非複製ワクチンの設計のための有望な候補とする。
【０１９４】
柔軟なリンカー配列 (例えば、ポリグリシン/ポリセリン含有の配列、[Gly4 Ser]2 など(Huston et al., Meth. Enzymol 203:46-88 (1991)) を抗原とリガンドとの間の融合タンパク質中に挿入できる。また、融合タンパク質を “エピトープ・タグ” を含有するように構築できる。これは、例えば、標識化または精製の目的のために、融合タンパク質が抗体 (例えばモノクローナル抗体) を結合するのを可能にする。エピトープ・タグの例はモノクローナル抗体 YL1/2 により認識される Glu-Glu-Phe トリペプチドである。
【０１９５】
本発明はまた、VLP をコードする配列を含有するキメラ DNA およびメランA ペプチドアナログをコードする配列に関する。この DNA をイーストまたは細菌中で、例えばバキュロウイルスで形質転換された昆虫細胞中で発現できる。発現系には制限がなく、それについて日常的な使用で大きい選択が可能である。好ましくは、大量でタンパク質を可能にする系を使用する。一般的に、細菌性発現がその効率からして好ましい。本発明の範囲内での使用に適する発現系は Clarke et al., J. Gen. Virol. 71: 1109-1117 (1990); Borisova et al., J. Virol. 67: 3696-3701 (1993); and Studier et al., Methods Enzymol. 185:60-89 (1990) に記載されている。適当なイースト発現系の例は Emr, Methods Enzymol. 185:231-3 (1990) に記載されている。キャプシドタンパク質の調製に上記で使用したバキュロウイルス系も適している。構成的または誘導的発現系も使用できる。利用可能な発現系の選択および修飾により、タンパク質が得られる形態を制御できる。
【０１９６】
本発明の具体的な実施態様において、高められた免疫応答が望まれる抗原は、フレーム中で肝炎 B ウイルスキャプシド (コア) タンパク質 (HBcAg) に共役され、融合され、あるいは接着されている。しかし、当業者には、他のウイルス様粒子を本発明の融合タンパク質構築体に使用できることは明らかであろう。
【０１９７】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、少なくとも１のメランA ペプチドアナログがウイルス様粒子に、少なくとも１の共有結合により結合する。好ましくは、少なくとも１のメランA ペプチドアナログがウイルス様粒子に少なくとも１の共有結合により結合する。該共有結合は、規則正しいかつ反復したアレイおよびメランA ペプチドアナログ-VLP コンジュゲートをそれぞれ導く非ペプチド結合である。このメランA ペプチドアナログのアレイおよびコンジュゲートはそれぞれ典型的に好ましくは、反復しかつ規則正しい構造を有する。少なくとも１のメランA ペプチドアナログが望むように VLP に結合する。好ましくは、120 以上、より好ましくは 180 以上、さらに好ましくは 270、いっそう好ましくは 360 以上の本発明のメランA-ペプチドが VLP に結合する。反復しかつ規則正しいメランA ペプチドアナログ-VLP アレイおよびコンジュゲートはそれぞれ、VLP に対する少なくとも１のメランA ペプチドアナログの、方向つけされ、指示され定義され明確にされた結合および接着により、確実にされる。これは下記で明白になる。さらに、VLP の典型的な本来の高度に反復の組織的な構造は、高度に規則正しい反復の様相でメランA ペプチドアナログのディスプレイに都合よく貢献し、高度に組織されたメランA ペプチド-VLP アレイおよびコンジュゲートに導く。
【０１９８】
従って、本発明のコンジュゲートおよびアレイはそれぞれ、先行技術と、その高度に組織化された構造、大きさ、およびアレイの表面上の抗原の反復性において異なる。さらに、本発明の好ましい実施態様は、VLP のフォルディングおよび集合を保証しながら発現宿主における粒子の発現を可能にする。ついで抗原すなわち本発明の少なくとも１のメランA ペプチドアナログを VLP にさらに共役せしめる。
【０１９９】
本発明は、本発明のメランA ペプチドアナログの VLP との結合および連関をなす方法を開示する。示すように、本発明のひとつの態様において、本発明の少なくとも１のメランA ペプチドアナログが VLP に、化学的橋かけリンカーにより、典型的および好ましくは、ヘテロ２機能的橋かけリンカーにより結合する。いくつかのヘテロ２機能的橋かけリンカーが公知である。好ましい実施態様において、ヘテロ２機能的橋かけリンカーは、好ましい第１接着部位、すなわち VLP のリシン残基の側鎖アミノ基、少なくとも１の VLP サブユニットと反応できる官能基、ならびに好ましい第２接着部位、すなわち、本発明のメランA ペプチドアナログと融合されているシステイン残基と反応できるさらなる官能基を含有し、還元により反応に利用可能でもある。 
【０２００】
この方法の第１工程は、典型的には誘導化といい、VLP と橋かけリンカーとの反応である。この反応の産物は活性化 VLP であり、活性化担体ともいう。第２工程において、未反応の橋かけリンカーを、ゲルろ過や透析などの通常の方法で除去する。第３工程において、本発明のメランA ペプチドアナログを活性化 VLP と反応せしめる。この工程は典型的に共役工程という。未反応のメランA ペプチドアナログを第４工程で、例えば透析で選択的に除去できる。いくつかのヘテロ２機能的橋かけリンカーが公知である。これは、好ましい橋かけリンカー、 SMPH (Pierce)、スルホ-MBS、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMPB、スルホ-SMCC、SVSB、SIA および他の橋かけリンカー、例えば Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA) から市販のものを含み、アミノ基に反応性の１官能基とシステイン残基に反応性の１官能基とを有する。上記の橋かけリンカーのすべてがチオエーテル結合を形成する。
【０２０１】
本発明の実施に適用可能の別のクラスの橋かけリンカーは、共役でメランA ペプチドアナログ と VLP とのジスルフィド結合の導入を特徴とする。このクラスに属する好ましい橋かけリンカーは、例えば SPDP および スルホ-LC-SPDP (Pierce) である。VLP の橋かけリンカーでの誘導化の進行は、実験条件を変えることで影響を与え得る。例えば、各反応物の濃度、ひとつの反応物の他方に対する過剰、pH、温度、イオン強度などである。共役の程度、すなわち VLP のサブユニット当たりの抗原または抗原決定因子の量を、上記の実験条件を変えて調整し、ワクチンの要件に適合できる。
【０２０２】
抗原または抗原決定因子の VLP に対する結合についての特に好ましい方法は、VLP 表面上のリシン残基と本発明のメランA ペプチドアナログ上のシステイン 残基との結合である。いくつかの実施態様において、第２接着部位またはその部分てしてシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーと VLP に共役するための本発明のメランA ペプチドアナログとの融合、共役、接着または結合を必要とすることがある。該アミノ酸リンカーを含むかかる構築体も公知の簡単なペプチド合成で得ることができる。
【０２０３】
従って、本発明のさらなる好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はさらにアミノ酸リンカーを含み、好ましくは、該アミノ酸リンカーは第２接着部位を含むか、あるいはそれからなる。
【０２０４】
一般的に、柔軟なアミノ酸リンカーが望ましい。アミノ酸リンカーの例は、下記よりなる群から選ぶ：(a) CGG; (b) N-末端ガンマー 1-リンカー; (c) N-末端ガンマー 3-リンカー; (d) Ig ヒンジ領域; (e) N-末端グリシンリンカー; (f) (G)kC(G)n、n=0-12 および k=0-5; (g) N-末端グリシン-セリンリンカー; (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n、n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2 (配列番号: 62); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (l) C-末端 ガンマー 1-リンカー; (m) C-末端 ガンマー 3-リンカー; (n) C-末端グリシンリンカー; (o) (G)nC(G)k、n=0-12、k=0-5; (p) C-末端グリシン-セリンリンカー; (q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k、n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2、o=0-8 (配列番号: 63)。
【０２０５】
アミノ酸リンカーのさらなる例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシン・セリンリンカー (GGGGS)n (配列番号: 64) およびシステイン残基を第２接着部位としておよび選択的にさらなるグリシン残基をすべてさらに含有するグリシンリンカー (G)n である。該アミノ酸リンカーの典型的な好ましい例は、N-末端ガンマー 1: CGDKTHTSPP (配列番号: 65); C-末端ガンマー 1: DKTHTSPPCG (配列番号: 66); N-末端ガンマー 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP (配列番号: 67); C-末端ガンマー 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (配列番号: 68); N-末端グリシンリンカー: GCGGGG (配列番号: 69); C-末端グリシンリンカー: GGGGCG (配列番号: 70); C-末端グリシン-リシンリンカー: GGKKGC (配列番号: 71); N-末端グリシン-リシンリンカー: CGKKGG (配列番号: 72) である。
【０２０６】
本発明の実施に特に適する他のアミノ酸リンカーは、疎水性の抗原または抗原決定因子が VLP に結合しているとき、N-末端リンカーについて CGKKGG (配列番号: 73) または CGDEGG (配列番号: 74) であり、C-末端リンカーについて GGKKGC (配列番号: 75) または GGEDGC (配列番号: 76) である。C-末端リンカーについて、末端システインが選択的に C-末端でアミデートとなっている。
【０２０７】
本発明に有用なさらなるリンカーは、VLP からの抗原ペプチド、すなわちヒト黒色腫メランA ペプチドアナログの放出を可能にするアミノ酸配列である。これらのリンカーの例は、Toes RE et al. J Exp Med. 2001 Jul 2;194(1):1-12 に記載されている。さらに、プロテアソーム解裂についての PAProC- 予測アルゴリスムを使用し得るであろう (Nussbaum AK, et. al. immunogenetics. 2001 Mar;53(2):87-94)。VLP からの抗原ペプチド、すなわちヒト黒色腫メランA ペプチドアナログの放出を可能にする上記のアミノ酸配列についての予測である。
【０２０８】
本発明の好ましい実施態様において、ペプチドの C-末端 での GGCG (配列番号: 77)、GGC または GGC-NH2 (アミド化のための “NH2” スタンド) リンカー、またはその N-末端 での CGG がアミノ酸リンカーとして好ましい。一般的に、グリシン残基を、かさの大きいアミノ酸と、第２接着部位として用いられるシステインの間に挿入して、共役反応におけるかさの大きいアミノ酸の可能性ある妨害を避ける。本発明の最も好ましい実施態様において、アミノ酸リンカー GGC-NH2 が本発明のメランA ペプチドアナログの C-末端に融合している。
【０２０９】
本発明のメランA ペプチドアナログに付加されたシステイン残基は、活性化 VLP 上でヘテロ２機能的橋かけリンカーと反応するために、その還元状態にあらねばならない。遊離のシステインまたは遊離のスルフヒドリル基をもつシステイン残基が利用可能でなければならない。結合部位として機能するシステイン残基が酸化形態にある場合、例えば、それがジスルフィド橋を形成していると、例えば、DTT、TCEP またはβ-メルカプトエタノールによるジスルフィドの還元を必要とする。還元剤の低濃度が WO 02/05690 に記載のように共役に和合し、高濃度が共役反応を阻害する。このことは当業者に知られているように、例えば、透析、ゲルろ過または逆相 HPLC により還元物を取り除かねばならないし、またはその濃度を共役の前に下げねばならない。
【０２１０】
上記の好ましい方法に従うヘテロ２機能的結合橋かけリンカーを用いる、本発明のメランA ペプチドアナログの VLP への結合は、指向の形でメランA ペプチドアナログの VLP への共役を可能にする。本発明のメランA ペプチドアナログ を VLP に結合する別の方法は、カルボジイミド EDC および NHS を用いて、本発明のメランA ペプチドアナログを VLP に橋かけ結合する方法を含む。さらなる方法において、グルタルアルデヒド、DSG、BM[PEO]4、BS3 などのホモ２機能性橋かけリンカー (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA) または VLP のアミノ基またはカルボキシ基に対し反応性の官能基をもつ他の既知のホモ２機能性橋かけリンカーを用いて、本発明のメランA ペプチドアナログを VLP に接着する。
【０２１１】
本発明のメランA ペプチドアナログを VLP に結合する別の方法は、VLP がビオチン化され、そして本発明のメランA ペプチドアナログがストレプタビジン-融合タンパク質として発現される方法、または本発明のメランA ペプチドアナログと VLP の両方が例えば WO 00/23955 に記載のようにビオチン化される方法を含む。この場合、本発明のメランA ペプチドアナログはストレプタビジンに最初に結合し得る。これは、本発明のメランA ペプチドアナログのストレプタビジンに対する比率を、遊離の結合部位が次の工程で加えられる VLP の結合になお利用できるように調整することによる。あるいは、全成分を “ワンポット” 反応で混合し得る。受容体およびリガンドの可溶形態が利用可能であり、VLP または本発明のメランA ペプチド アナログに橋かけ結合され得る、他のリガンド-受容体の対は、本発明のメランA ペプチドアナログを VLP に結合するための結合剤として使用できる。あるいは、リガンドまたは受容体のいずれかを本発明のメランA ペプチドアナログに融合でき、受容体またはリガンドのそれぞれに化学的に結合または融合された VLP への結合を仲介せしめ得る。融合は、挿入または置換でも行い得る。
【０２１２】
すでに示したように、本発明の好ましい実施態様において、VLP は RNA ファージの VLP であり、さらに好ましい実施態様において、VLP は RNA ファージ Qβ コート・タンパク質の VLP である。
【０２１３】
１またはいくつかの抗原分子、すなわち１またはいくつかの抗原または抗原決定因子を RNA ファージ・コート・タンパク質のキャプシドまたは VLP に、好ましくは、立体的に可能であれば RNA ファージの暴露リシン残基を介して、接着できる。RNA ファージのコート・タンパク質の VLP、特に Qβ コート・タンパク質 VLP の具体的な特性は、サブユニットごとのいくつかの抗原に結合する可能性である。これは密なる抗原アレイの産生をもたらす。
【０２１４】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の少なくとも１のメランA ペプチドアナログのウイルス様粒子への接着または結合はそれぞれ、ウイルス様粒子の少なくとも１の第１接着部位と本発明のメランA ペプチドアナログとの相互作用および連関それぞれによる。
【０２１５】
Qβ コート・タンパク質の VLP またはキャプシドは、その表面に定まった数のリシン残基をディスプレイする。これは、キャプシドの内部に向かい RNA と相互作用する３リシン残基およびキャプシドの外部に暴露された別の４リシン残基をもつトポロジイを有する。これらの定まった特性は、リシン残基が RNA と相互作用する粒子の内部よりも、抗原が粒子の外部に接着するのに好都合である。他の RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP もその表面に定まった数のリシン残基およびそれらのリシン残基の定まったトポロジイを有する。
【０２１６】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、第１接着部位はリシン残基であり、および／または第２接着はスルフヒドリル基またはシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施態様において、第１接着部位はリシン残基であり、第２接着はシステイン残基である。
【０２１７】
本発明の非常に好ましい実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログは、システイン残基を介して、RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP のリシン残基、特に Qβ コート・タンパク質の VLP に結合している。
RNA ファージから誘導された VLP についての別の利点は、材料の多量の産生を合理的な費用で可能にする細胞中での高い発現量である。
【０２１８】
示したように、本発明のコンジュゲートおよびアレイはそれぞれ、先行技術のコンジュゲートと、高度に組織化された構造、大きさ、アレイ表面上の抗原の反復性において異なる。さらに、担体としての VLP の使用は、種々の抗原密度でもって頑強な抗原アレイおよびコンジュゲートの形成を可能にする。特に、RNA ファージの VLP の使用および特に RNA ファージ Qβ コート・タンパク質の VLP の使用は、非常に高いエピトープ密度を達成し得る。特に、サブユニット当たり 1.5 以上のエピトープ密度がペプチドを Qβ コート・タンパク質の VLP に共役することにより達成されている (例えば、ヒト A β 1-6 ペプチド、WO 2004/016282)。高いエピトープ密度をもつ RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP の組成物は、本願の教示を用いて調製し得る。本発明の好ましい実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログが VLP の Qβ コート・タンパク質に共役されるとき、サブユニット当たりの本発明のメランA ペプチドアナログの平均数は 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9 以上が好ましい。
【０２１９】
本明細書で定義される第２接着部位は、本発明のメランA ペプチドアナログとともに天然および非天然的に存在し得る。本発明のメランA ペプチドアナログ上に自然界に存在する第２接着部位を欠いているとき、非天然の第２接着を抗原に組み込み得る。
【０２２０】
上記のように、４リシン残基が Qβ コート・タンパク質の VLP 表面で暴露されている。典型的には、これらの残基は橋かけリンカー分子との反応で誘導される。暴露リシン残基のすべてを抗原に共役し得ない場合、橋かけリンカーと反応したリシン残基が、ε-アミノ基に接着された橋かけリンカーとともに誘導化後残る。 このことは１またはいくつかの正電荷の消失をもたらす。正電荷は VLP の安定性および溶解性を阻害するものである。下記する開示の Qβコート・タンパク質変異におけるように、いくつかのリシン残基をアルギニンで置き換えて、正電荷の過剰な消失を防止する。アルギニン残基が橋かけリンカーと反応しないからである。さらに、リシン残基のアルギニンによる置換は、さらに定まった抗原アレイに導き得る。少数の部位が抗原との反応に利用され得るからである。
【０２２１】
従って、暴露残基のアルギニンによる置換を、本願に開示される、下記の Qβ コート・タンパク質変異体および変異の Qβ VLP において行った：Qβ -240 (Lys13-Arg; 配列番号:20)、Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; 配列番号: 22) および Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; 配列番号:24)。構築体をクローン化し、タンパク質を発現し、VLP を精製し、本発明のメランA ペプチドアナログとの共役に用いた。Qβ-251 ; (配列番号: 23) も構築した。Qβ-251 コート・タンパク質の VLP をどのように発現、精製、共役するかについての指針は本願全体で見られる。
【０２２２】
さらなる実施態様において、追加の１のリシン残基をもつ Qβ 変異コート・タンパク質を開示する。これは抗原の高い密度アレイを得るのに適している。この変異 Qβ コート・タンパク質、Qβ-243 (Asn 10-Lys; 配列番号: 21) をクローン化し、タンパク質を発現させ、キャプシドまたは VLP を単離し、精製すると、追加のリシン残基の導入がサブユニットのキャプシドまたは VLP との自己集合体と和合性であることがわかる。このように、メランA ペプチドアナログ・アレイおよびコンジュゲートはそれぞれ、Qβ コート・タンパク質・変異体の VLP を用いて調製できる。抗原の VLP への接着、特に RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP への接着についての好ましい方法は、RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP 表面に存在するリシン残基の、抗原に加えられたシステイン残基との結合である。システイン残基が第２接着部位として効果的であるために、スルフヒドリル基が共役に利用され得なければならない。このように、システイン残基が還元状態にあらねばならない。すなわち、遊離のシステインまたは遊離のスルフヒドリル基をもつシステイン残基が利用可能であらねばならない。
【０２２３】
第２接着部位として機能するシステイン残基が酸化状態にある場合、例えば、それがジスルフィド橋を形成していると、例えば、DTT、TCEP または β-メルカプトエタノールによるジスルフィド橋の還元が必要である。還元物の濃度および抗原に対する還元物のモル過剰を各抗原について調整すべきである。滴定範囲は還元物濃度が低い 10 μM 以下から 10 〜 20 mM 以上までで始め、抗原の担体に対する共役を調べる。還元物の低濃度は WO 02/056905 に記載のように共役反応に和合するが、高濃度は共役反応を阻害する。当業者によく知られるように、還元物を取り出すか、その濃度を透析、ゲルろ過、または逆相 HPLC で低下せしめねばならない。好都合には、透析または平衡緩衝液の pH が 7 以下、好ましくは 6 である。低 pH 緩衝液の抗原活性および安定性との和合性を試験しなければならない。
【０２２４】
RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP 上のエピトープ密度は橋かけリンカーおよび他の反応条件の選択で調整できる、例えば、橋かけリンカー、スルホ-GMBS および SMPH は典型的に高いエピトープ密度をもたらす。誘導化は反応体の高濃度によりポジティブに影響を受け、反応条件の処理を用いて、RNA ファージ・コート・タンパク質の VLP、特にQβ コート・タンパク質の VLP に共役される抗原の数を制御できる。
【０２２５】
非天然の第２接着部位の設計に先立ち、それが融合、挿入、または一般的に処理されるべき部位を選ばねばならない。第２接着部位の選択は、例えば、抗原の結晶構造に基づき得る。抗原のかかる結晶構造が分子の C- または N-末端の利用性 (例えば、溶媒に対するそのアクセス性から決定される)、または、第２接着部位としての利用のためのシステイン残基などの適当な残基の溶媒に対する暴露についての情報を提供し得る。暴露されたジスルフィド橋は、Fab フラグメントの場合、第２接着部位の源でもあり得る。これは一般的に単一のシステイン残基に、2-メルカプトエチルアミン、TCEP、β-メルカプトエタノール または DTT などによる還元で転換され得るからである。抗原の免疫原性に影響を与えない緩和な還元条件を選ぶ。一般的に、自己抗原での免疫がこの天然リガンドとこの自己抗原の相互作用を阻害することを目的とする場合、第２接着部位が天然リガンドとの相互作用の部位に対する抗体の産生が可能になるように、第２接着部位を付加する。すなわち、第２接着部位の位置を、第２接着部位またはそれを含有するアミノ酸リンカーからの立体阻害を回避するように選択する。さらなる実施態様において、天然リガンドと自己抗原の相互作用部位と相違する部位に対する抗体応答が望ましい。かかる実施態様において、第２接着部位は、それが天然リガンドと自己抗原の相互作用部位に対する抗体の産生を防止するように、選択し得る。
【０２２６】
第２接着部位の位置を選択する他の評価基準は、抗原のオリゴマー化、オリゴマー化の部位、共因子の存在、および抗原構造および配列における部位を開示する実験的証拠の利用性を含む。ここでは、抗原の修飾が自己抗原の機能または自己抗原を認識する抗体の産生と和合するものである。
【０２２７】
非常に好ましい実施態様において、本発明のメランA ペプチドアナログは、コア粒子、VLP または VLP サブユニット上で第１接着部位に連関し得る、加えられた単一の第２接着部位または単一の反応性接着部位を含む。これは、少なくとも１だが、典型的には１以上、好ましくは 10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450 以上の本発明のメランA ペプチドアナログのコア粒子および VLP のそれぞれに対する定まった単形態の結合および連関のそれぞれを保証する。抗原上の単一の第２接着部位または単一の接着部位の提供は、非常に高度に規則正しいかつ反復したアレイに導く単一かつ単一形態の結合および連関のそれぞれを保証する。例えば、結合および連関のそれぞれがリシン- (第１接着部位として) とシステイン- (第２接着部位として) との相互作用により効果的となると、本発明のこの好ましい実施態様において、抗原当たりわずか１のシステイン残基が、このシステイン残基が天然的にまたは非天然的に存在することとは無関係に、VLP およびコア粒子の第１接着部位のそれぞれと結合または連関し得る。
【０２２８】
ある実施態様において、第２接着部位の、本発明のメランA ペプチドアナログへの処理には、本発明の開示による第２接着部位として適切なアミノ酸を含有するアミノ酸リンカーの融合を必要とする。従って、本発明の好ましい実施態様において、アミノ酸リンカーが本発明のメランA ペプチドアナログに、少なくとも１の共有結合により結合している。好ましくは、アミノ酸リンカーは第２接着部位を含むか、あるいはこの部位からなる。さらなる好ましい実施態様において、アミノ酸リンカーはスルフヒドリル基またはシステイン残基である。別の好ましい実施態様において、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカーの選択についての評価基準および本発明のアミノ酸リンカーの好ましい実施態様について、すでに上記した。
【０２２９】
本発明の別の具体的な実施態様において、接着部位として、フレーム内で HBcAg に融合されたリシンまたはシステイン残基を選択する。好ましい実施態様において、抗原は HBcAg の C-末端に３ロイシンリンカーを介して融合している。
【０２３０】
抗原または抗原決定因子が VLP にリシン残基を介して結合されるとき、１以上の天然のリシン残基および HBcAg 変種中に存在する他のリシン残基を置換するか削除するのが好都合であり得る。
【０２３１】
多くの場合、自然界に存在するリシン残基が削除されているとき、他のリシンを HBcAg 中に抗原または抗原決定因子についての接着部位として導入する。かかるリシン残基を挿入する方法は当技術分野で既知である。リシン残基はまた、存在するリシン残基を除去することなしに加え得る。
【０２３２】
HBcAg の C 末端 は、このタンパク質の核局在化を指示することが明らかにされている (Eckhardt et al., J. Virol. 65:575 582 (1991))。さらに、タンパク質のこの領域は、HBcAg の核酸に結合する能力を付与するとも思われる。
【０２３３】
示すように、本発明の実施における使用に適する HBcAg はまた、N 末端切除変異体を含む。適当な切除変異体は、1、2、5、7、9、10、12、14、15 または 17 アミノ酸が N 末端から除去されている修飾 HBcAg を含む。しかし、ウイルス様粒子を構成するサブユニットの配列中に内部欠失を含有するウイルス様粒子の変異体も、ウイルス様粒子の規則正しいまたは特定の構造と和合性である限り、本発明に適している。例えば、HBcAg 配列中の内部欠失は適切である (Preikschat, P., et al., J. Gen. Virol. 80:1777-1788 (1999))。
【０２３４】
本発明の実施における使用に適するさらなる HBcAg は、N および C 末端切除変異体を含む。適当な切除変異体は、1、2、5、7、9、10、12、14、15 または 17 アミノ酸が N 末端から除去され、1、5、10、15、20、25、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42 または 48 アミノ酸が C 末端から除去されている修飾 HBcAg を含む。
【０２３５】
本発明のワクチン組成物は、異なる HBcAg の混合物を含み得る。すなわち、このワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なる HBcAg から構成され得る。例えば、ワクチン組成物は、“野生タイプ” HBcAg と、１以上のアミノ酸残基が変更（例えば、欠失、挿入または置換）された修飾 HBcAg とを含み、調製できる。しかし、多くの適用において、１タイプのみの HBcAg を使用する。
【０２３６】
好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は少なくとも１の第１接着部位を含み、抗原または抗原決定因子は少なくとも１の第２接着部位を含む。好ましくは、第１接着部位は１のアミノ基または１のリシン残基を含み、好ましくはそれからなる。第２接着部位は、(a) 該抗原または抗原決定因子との自然界に存在する接着部位; および (b) 該抗原または抗原決定因子との自然界に存在しない接着部位よりなる群から好ましくは選択する。さらに好ましくは、第２接着部位はスルフヒドリル基またはシステイン残基を含み、好ましくはこれからなる。好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子のウイルス様粒子との結合は、第１接着部位と第２接着部位との連関を介して作用し、好ましくは、連関は少なくとも１の非ペプチド結合を介し、そして好ましくは、抗原または抗原決定因子とウイルス様粒子とは、該連関を介して相互作用して、規則正しいかつ反復した抗原アレイを形成する。ひとつの実施態様において、第１接着部位はリシン残基であり、第２接着部位はシステイン残基である。別の実施態様において、第１接着部位はアミノ基であり、第２接着部位はスルフヒドリル基である。
【０２３７】
本発明の具体的な実施態様において、抗原、ここで特に、黒色腫メランA ペプチドアナログは１以上の細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたはこの２エピトープの組合せを含む。すなわち、ひとつの実施態様において、抗原または抗原決定因子は、１、２またはそれ以上の細胞毒性 T 細胞エピトープを含む。他の実施態様において、抗原または抗原決定因子は、１、２またはそれ以上の Th 細胞エピトープを含む。さらに他の実施態様において、抗原または抗原決定因子は、１、２またはそれ以上の細胞毒性 T 細胞エピトープおよび１、２またはそれ以上の Th 細胞エピトープを含む。
【０２３８】
天然のメランA/Mart-1 エピトープ、例えば、メランA/Mart-1 26-35 エピトープは低い親和性でヒト HLA-2 のみと結合する。すなわち、天然のメランA エピトープおよびペプチドのワクチン接種に対するインビボ提示は、それぞれ限られた因子であり得る。このことは、VLP に結合、共役または融合されるメラン A エピトープおよびペプチドそれぞれをワクチン接種に用いるときに特に重要である。この条件で、メランA ペプチドが HLA 分子を橋かけ提示で保持するからである。しかし、橋かけ提示のプロセスは、抗原提示の通常の経路ほど効率的でなく、HLA についてのメランA ペプチドの親和性がさらにより重要である。このように、VLP-に基づくワクチン接種について、HLA に比較的高い親和性をもって結合するメランA ペプチドアナログを用いることが非常に好ましい。同様に、宿主の天然 T 細胞レパートリーにより高い親和性でもって認識されるメランA ペプチドアナログを使用することも利点がある。一般的に、メランA エピトープおよびペプチドアナログはそれぞれ、MHC 分子への効率的な結合を可能にするのに適当な位置にアンカー残基を含有することが好ましい。
【０２３９】
従って、本発明のさらなる態様および本発明の非常に好ましい実施態様は、(a) ウイルス様粒子および (b) 免疫刺激性物質を含み、動物における免疫応答を高めるための組成物を提供する。該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合する。該組成物は少なくとも１の抗原または抗原決定因子をさらに含む。該抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に結合する。該少なくとも１の抗原または抗原決定因子はヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。該ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログは該ウイルス様粒子に結合する。
【０２４０】
本発明の好ましい実施態様において、メラン A ペプチドアナログは MHC 分子との効率的な結合を可能にし得る。すなわち、メランA ペプチドアナログの使用は、特に、MHC 分子との改善された結合をもたらすかかるアンカー残基の導入を可能にする。MHC 分子との改善された結合をもたらすかかるアンカー残基の導入は、天然または正常のメランA ペプチドが、かかるアンカー残基を含有していないとき、または天然または正常のアンカー残基に置き換わる新たに導入されたアンカー残基に劣るアンカー残基のみを含有するとき、特に利点がある。
【０２４１】
メランA ペプチドアナログを導く正常のヒト・メランA ペプチドの修飾、好ましくは、これらのアンカー残基の導入は下記のいずれかで実施する： (i) 変異の誘導 (例えば、化学的誘発、刺激または他の当業者に既知の方法) および次の MHC との改善された結合をもつ修飾ペプチドの選択、または (ii)タンパク質合成のいかなるレベルでも起きる天然変異から生じる、MHC との改善された結合をもつ修飾ペプチドの選択、なお、DNA、複製、RNA もしくはタンパク質発現の翻訳から生じる変異を含み、またこれに限定されない、または (iii) 当業者に既知の通常のペプチド合成による系統的もしくはランダムなアミノ酸交換、欠失、置換もしくは挿入による。かかるアンカー残基の同定は、典型的におよび好ましくは、Rammensee et al. in Geneetics 50:213-219 (1999) に記載の SYFPEITHI database を用いて行う。SYFPEITHI database は、選択のペプチドについて HLA 結合の効率を計算でき、このプログラムを用いて HLA 結合の効率に関するペプチドを最適にすることが可能である。好ましいペプチドアナログの同定は、MHC-ペプチド結合アッセイにより行い得る。このアッセイは、変異細胞系における T 細胞活性化、認識もしくは MHC 上方調節についての全細胞アッセイ、MHC-テトラマー-ペプチド結合アッセイ、標識ペプチドとの競合結合アッセイ、表面プラズマ共鳴アッセイまたは当業者に既知のアッセイを含むが、これらに限定されない。
【０２４２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、メランA ペプチドアナログは、対応する正常のメランA ペプチドに対して２以上、好ましくは１のアミノ酸の置換を特徴とする。
【０２４３】
本発明の別の好ましい実施態様において、メランA ペプチドアナログは、プロテアーゼまたはペプチダーゼが仲介する減成から保護されている。プロテアーゼまたはペプチダーゼ減成から保護されているメランA ペプチドアナログの使用は、ペプチドを対象に適用した後にインビボでペプチドの安定性を増加するか、および／またはプロテアーゼまたはペプチダーゼの存在でペプチドを保存するときに安定性を増加する。この増加された安定性の結果、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログの MHC に対するより効率的な長い提示となり、特異的な T 細胞応答の促進が高まる。
【０２４４】
好ましくは、ヒト・メランA ペプチドアナログを、Blanchet et al, J. Immunol. 167:5852-5861 (2001) などの引用文献に例示される非天然のアミノ酸による天然のヒト・メランA ペプチドの選択アミノ酸残基の置換でもって保護する。これは、化学的に修飾されたメランA ペプチドおよびメランA ペプチドアナログそれぞれが天然または正常のメランA ペプチドに比して等しくよく T 細胞に認識されないかもしれないとの事実から典型的におきる制限を克服する。
【０２４５】
他の好ましい実施態様において、抗原は、下記よりなる群から限定なしに選ばれるアミノ酸配列を有するヒト・黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる： (a) LAGIGILTV (配列番号: 84)、(b) MAGIGILTV (配列番号: 85)、(c) EAMGIGILTV (配列番号: 86)、(d) ELAGIGILTV (配列番号: 50、(e) EMAGIGILTV (配列番号: 87)、(f) YAAGIGILTV (配列番号: 88)、(g) FAAGIGILTV (配列番号: 89)、(h) GHGHSYTTAE ELAGIGILTV (配列番号: 51)、(i) SYTTAEELAGIGILTVILGVL (配列番号: 52) および (j) ELAGIGILTVILGVL (配列番号: 53)。
【０２４６】
非常に好ましい実施態様において、抗原は、下記よりなる群から限定なしに選ばれるアミノ酸配列を有するヒト・黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる：(a) LAGIGILTV (配列番号: 84)、(b) MAGIGILTV (配列番号: 85)、(c) EAMGIGILTV (配列番号: 86)、(d) ELAGIGILTV (配列番号: 50)、(e) EMAGIGILTV (配列番号: 87)、(f) YAAGIGILTV (配列番号: 88) および (g) FAAGIGILTV (配列番号: 89)。これらのペプチドアナログおよびその合成は、Valmori at al., J. Immunol. 160: 1750-1758 (1998) に記載されている。これらのペプチドアナログは、天然の黒色腫ペプチドに対する５種の細胞毒性 T 細胞クローンによる相対的な認識および標的細胞分解を増加する。
【０２４７】
本発明の非常に好ましい実施態様において、ヒト・黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログは、配列 ELAGIGILTV (配列番号: 50) を含むか、あるいはこの配列から基本的になるか、あるいはこの配列からなる。実施例を通して示すように、この非常に好ましい実施態様は、HLA-A2 形質転換マウスにおける機能的メランA-特異的 CD8+T 細胞の拡大を誘導し、HLA-結合と TCR-認識の優れた妥協を提示する (参考、Valmori at al., J. Immunol. 160: 1750-1758 (1998))。
【０２４８】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、第２接着部位をもつヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログは、下記よりなる群から制限なしに選ばれるアミノ酸配列を有する：(a) CGHGHSYTTAE EAAGIGILTV (配列番号: 54); 16-35 と典型的には本明細書で略称する、(b) CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55); メランA 16-35 A/L と典型的には本明細書で略称する、(c) CGGEAAGIGILTV (配列番号: 56); メランA 26-35 と典型的には本明細書で略称する、(d) CGGELAGIGILTV (配列番号: 57); メランA 26-35 A/L と典型的には本明細書で略称する、(e) CSYTTAEELAGIGILTVILGVL (配列番号: 58); メランA 20-40 A/L と典型的には本明細書で略称する、(f) CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59); メランA 26-40 A/L と典型的には本明細書で略称する、(g) ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60); メランA 26-35-C A/L と典型的には本明細書で略称する、(h) CSPKSLELAGIGILTV (配列番号: 92), CSPKSL-メランA 26-35 A/L と典型的には本明細書で略称する、および (i) ELAGIGILTVILGVLGGC (配列番号: 93) メランA 26-40-C A/L と典型的には本明細書で略称する。
【０２４９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、第２接着部位をもつヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログは、下記よりなる群から制限なしに選ばれるアミノ酸配列を有する：(a) CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55); メランA 16-35 A/L) と典型的には本明細書で略称する、(b) CGGELAGIGILTV (配列番号: 57); メランA 26-35 A/L と典型的には本明細書で略称する、(c) CSYTTAEELAGIGILTVILGVL (配列番号: 58); メランA 20-40 A/L と典型的には本明細書で略称する、(d) CGGELAGIGILTVILGVL (配列番号: 59); メランA 26-40 A/L と典型的には本明細書で略称する、(e) ELAGIGILTVGGC (配列番号: 60); メランA 26-35-C A/L と典型的には本明細書で略称する。
【０２５０】
本発明の別の非常に好ましい実施態様において、第２接着をもつヒト黒色腫メランA/MART-1 ペプチドアナログはアミノ酸配列 CGHGHSYTTAEELAGIGILTV (配列番号: 55) (メランA 16-35 A/L) を有する。実施例 21 に示すように、この非常に好ましい実施態様を含むワクチン組成物、すなわち QβメランA 16-35 A/L ワクチンは、樹枝状細胞によりプロセシングされる。
【０２５１】
本発明の別の実施態様において、ウイルス様粒子に共役、融合あるいは接着される本発明のメランA ペプチドアナログは、T 細胞エピトープ、細胞毒性または Th 細胞エピトープである。さらなる好ましい実施態様において、抗原は、少なくとも２の類似または相違の、好ましくは相違のエピトープの組合せであり、少なくとも２のエピトープが直接にまたは連鎖配列で結合している。これらのエピトープは、黒色腫について記載される細胞毒性および Th 細胞エピトープよりなる群から選択する (gp100、チロシナーゼ、MAGE-ファミリーまたは NY-ESO-1)。
【０２５２】
このように、本発明のさらなる好ましい実施態様において、該抗原は、細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたは該エピトープの少なくとも２の組合せを含む、またはさらに含む。該少なくとも２エピトープは直接にまたは連鎖配列で結合しており、好ましくは、該細胞毒性 T 細胞エピトープはウイルスまたは腫瘍細胞毒性 T 細胞エピトープである。
【０２５３】
好ましい細胞毒性 T 細胞エピトープは、メランA エピトープ: (16-36 A/L) (25-36 A/L); チロシナーゼ・エピトープ:  (1-9) および (368-376) (Panelli, M.C. et.al., J. Immunol., 2000, 164, 495-504); Gp100 エピトープ: (154-162), (209-217 (T210M)), (280-288) および (280-288 (A288V)) および (457-466) (Nielsen,M.B. et. al., 2000. J Immunol., 164 (4)., 2287-96 and Linette, G.P. et. al. J Immunol, 2000, 164, 3402-3412 and Skipper, J.C., Int. J. Cancer, 1999, 82, 669-677 and Pass, H.A., et. al., Cancer J Sci Am., 1998, 4, 316-323); TRP2 エピトープ:  (180-188) (288-296) (455-463) (Sun, Y. et.al., Int. J Cancer, 2000, 87 (3), 399-404 and Parkhurst, M.R. et.al., Cancer Res., 1998, 58, 4895-8901 and Harada, M., et al., Cancer Res., 2001, 61, 1089-1094)); NY-ESO-1 エピトープ: 157-165 (Chen, J.L., et. al., J. Immunol, 2000, 165, 948-955); and MAGE-A エピトープ: (248V9) (Graff-Dubois, S., et.al., 2002, J. Immunol, 169, 575-580) である。
【０２５４】
細胞毒性 T 細胞エピトープの好ましい組合せは、メランA (25-36 A/L)、チロシナーゼ (368-376)、Gp100 (209-217 (T210M)) および (457-466)、および NY-ESO-1 (157-165) の組合せである。
【０２５５】
好ましい Th 細胞エピトープは、Mage-3 エピトープ: (281-295)、(141-155) および (146-160) (Kobayashi, H., et.al., Cabcer Res., 2001, 61, 4773-4778); チロシナーゼ・エピトープ: (188-208)、(193-203) (Kobayashi H., et.al., Immunogenetics,1998, 47, 398-403); GP100 エピトープ: (44-59); NY-ESO-1 エピトープ: (115132)、(121138)、(139156)、(119-143) および (134-148) である (Zarour, H. M. et al., Cancer Res., 2002, 62, 213-218)。
【０２５６】
細胞毒性および Th 細胞エピトープの好ましい組合せは、メランA エピトープ (1-118 A/L) (配列番号: 94); NY-ESO-1 エピトープ 115-165; またはメランA (25-36 A7L)、gp100 (209-217 (T210M)、Mage-3(146-160) および gp100 (44-59) の組合せである。
【０２５７】
次のことも理解されるべきである。モザイク・ウイルス様粒子、すなわちそれぞれ異なる抗原およびエピトープに接着されたサブユニットから構成されるウイルス様粒子は、本発明の範囲内である。本発明のかかる組成物は、例えば、それぞれ異なる抗原およびエピトープに融合されたウイルス様粒子を構成するサブユニットをコードする２和合性プラスミドでもって E.coli を形質転換して、得ることができる。この場合、モザイクウイルス様粒子が直接的に細胞内にまたは細胞分解後に集合される。さらに、かかる本発明の組成物はまた、それぞれ異なる抗原およびエピトープを単離されたウイルス様粒子に接着させて、得ることができる。
【０２５８】
本発明のメランA ペプチドアナログおよび特に表示されているエピトープは、合成でき、組換え的に発現でき、そして組換え DNA 技法でウイルス様粒子に共役または融合せしめ得る。抗原のウイルス様粒子への接着についての例示的な方法は WO 00/32227、WO 01/85208、WO 02/056905（出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
【０２５９】
本発明はまた、VLP および免疫刺激性物質、好ましくは VLP に結合する非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドを含み、動物における免疫応答を高めるための組成物をつくる方法を提供する。これは、VLP を免疫刺激性物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれとインキュベートし、RNase を加え、該組成物を精製することを含む。好ましくは、この方法は抗原または抗原決定因子を該ウイルス様粒子に結合する工程を含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。
【０２６０】
好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を免疫刺激性物質とインキュベートする前に、結合している。他の好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、組成物を精製した後に、結合する。同じく好ましい実施態様において、方法は、VLP を RNase とインキュベートし、それぞれ免疫刺激性物質およびオリゴヌクレオチドを加え、組成物を精製する。好ましくは、この方法は抗原または抗原決定因子を該ウイルス様粒子に結合する工程をさらに含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を RNase とともにインキュベートする前に結合している。別の好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、組成物を精製した後に結合する。ひとつの実施態様において、VLP を細菌性発現系でつくる。他の実施態様において、RNase は RNase A である。
【０２６１】
本発明はさらに、免疫刺激性物質、好ましくは 非メチル化 CpG-含有のオリゴヌクレオチドに結合する VLP を含み、動物における免疫応答を高める組成物をつくるための方法を提供する。これは、VLP を解集合し、免疫刺激性物質およびオリゴヌクレオチドそれぞれを加え、VLP を再集合することを含む。この方法は、解集合された VLP の核酸を除去すること、および／または再集合の後に組成物を精製することを含む。好ましくは、この方法はさらに、抗原または抗原決定因子をウイルス様粒子に結合する工程を含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を解集合する前に結合している。別の好ましい実施態様において、抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に、ウイルス様粒子を再集合した後、そして好ましくは組成物を精製した後に結合する。
【０２６２】
本発明はまた、疾患または病態を予防および／または軽減するのに使用できるワクチン組成物を提供する。本発明のワクチン組成物は、免疫学的有効量の本発明の免疫を高める組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むか、あるいはこれらから基本的になるか、あるいはこれらからなる。このワクチンはアジュバントも選択的に含み得る。
【０２６３】
すなわち、好ましい実施態様において、本発明は, 免疫学的有効量の本発明の免疫を高める組成物を、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とともに含むか、あるいはこれらから基本的になるか、あるいはこれらからなるワクチンを提供する。この組成物は、(a) ウイルス様粒子; (b) 少なくとも１の免疫刺激性物質; および (c) 少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含み; 抗原または抗原決定因子はウイルス様粒子に結合しており、そして免疫刺激性物質はウイルス様粒子に結合しており、そして抗原はヒト黒色腫 メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。好ましくは、ワクチンはアジュバントをさらに含む。
【０２６４】
本発明は、動物における疾患または病態を予防および／または軽減するためのワクチン接種を提供する。ひとつの実施態様において、本発明は、広範な種類、特に哺乳類、例えば、ヒト、サル、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタなど、好ましくはヒトにおける癌を予防するためのワクチンを提供する。ワクチンは、すべてのタイプの癌、好ましくは黒色腫を処置できるように設計できる。
【０２６５】
周知のように、タンパク質またはウイルスでの同族の初回強化ワクチン接種はしばしば成功しない。前に存在する抗体が、抗原に再会したとき、メモリー応答の誘発を阻害すると考えられている。驚くべきことに、RNA-ファージ誘導 VLP、特に Qβから誘導された VLP は、メモリー CD8+ T 細胞応答を同族の初回強化ワクチン接種シームにおいて非常に効率的に誘導する。一方、実施例 26 に記載のように、生ワクシニアウイルスの免疫は最初の CD8+ T 細胞応答の誘発について非常に非効率的である。ワクシニアでの同族の追加刺激は、メモリー CD8+ T 細胞の拡張をほとんどもたらさない。
【０２６６】
従って、さらなる態様において、本発明は、免疫学的有効量の本発明ワクチンを投与することにより動物おいて T 細胞応答の免疫起動を誘発することを含み、動物を免疫または処置する方法を提供する。好ましくは、この方法は、動物における免疫応答を追加刺激する工程をさらに含む。好ましくは、追加刺激は、免疫学的有効量の本発明ワクチンまたは免疫学的有効量の非定型ワクチンを投与することにより行う。さらに好ましくは、非定型ワクチンは DNA ワクチン、ペプチドワクチン、組換えウイルスまたは樹枝状細胞ワクチンである。
【０２６７】
さらに、別の態様において、動物における T 細胞応答を免疫起動する工程および動物における T 細胞応答を追加刺激する工程を含む、動物を免疫または処置する方法をさらに提供する。追加刺激は、免疫学的有効量の本発明ワクチンを投与することにより行う。好ましくは、免疫起動は免疫学的有効量の本発明ワクチンまたは免疫学的有効量の非定型ワクチンを投与することで行う。さらに好ましくは、該非定型ワクチンは DNA ワクチン、ペプチド ワクチン、組換えウイルスまたは樹枝状細胞ワクチンである。
【０２６８】
さらに、別の態様において、本発明は、ウイルス様粒子、少なくとも１の免疫刺激性物質および少なくとも１の抗原または抗原決定因子を含む組成物をさらに提供する。該抗原または抗原決定因子は該ウイルス様粒子に結合しており、該免疫刺激性物質は該ウイルス様粒子に結合しており、該抗原は細胞毒性 T 細胞エピトープ、Th 細胞エピトープまたは少なくとも２の該エピトープの組合せを含む。該少なくとも２エピトープは直接的にまたは連鎖配列で結合しており、好ましくは、該細胞毒性 T 細胞エピトープはウイルスまたは腫瘍細胞毒性 T 細胞エピトープである。
【０２６９】
さらなる態様において、本発明は、典型的におよび好ましくは、動物における免疫応答を高めるための組成物を提供する。これは、(a) ウイルス様粒子、(b) 免疫刺激性物質; 該免疫刺激性物質 (b) は該ウイルス様粒子 (a) に結合している、(c) 抗原；該抗原は該ウイルス様粒子 (a) を混合している、を含む。該抗原は、ヒト黒色腫メランA ペプチドアナログを含むか、あるいはこのアナログから基本的になるか、あるいはこのアナログからなる。本明細書で使用される用語 “混合” は、ともに加えられる２以上の物質、成分またはエレメントの組合せ物が互いに化学的に結合しないで、分離され得ることを意味する。抗原をウイルス様粒子と混合する方法は WO 04/000351 に記載されている（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０２７０】
当業者に理解されるように、本発明の組成物が動物に投与されるとき、それは、塩、緩衝液、アジュバント、または組成物の効率を改善するのに望ましい他の物質を含有する組成物であり得る。医薬組成物を調製するのに用い得る物質の例は、多くの文献に記載されており、例えば REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))がある。
【０２７１】
種々のアジュバントを、免疫学的応答を高めるために、宿主の種類に応じて使用できる。それには、限定でないが、Freund's (完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの表面活性物質、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および強く有用のヒトアジュバント、例えば BCG (bacille Calmette Guerin) および Corynebacterium parvum がある。かかるアジュバントも当技術分野で周知である。本発明の組成物とともに投与できるさらなるアジュバントは、限定でないが、モノホスホリル・リピド免疫モデュレーター、AdjuVax 100a、QS 21、QS 18、CRL1005、アルミニウム塩、MF 59、および Virosomal アジュバントがある。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含み得る。
【０２７２】
本発明の組成物は、その投与が個々のレシピエントにに耐容され得るとき、“薬理学的に許容される” という。さらに、本発明の組成物は、“医療的有効量” (すなわち、所望の生理的効果を起こす量) で投与する。
【０２７３】
本発明の組成物は、当技術分野で知られている種々の方法で投与できる。選ばれる特定の形態は、もちろん選択される特定の組成物、処置されるべき状態の重篤度、医療効果に必要な用量に依存する。本発明の方法は、一般的に言って、医学的に許容されるいかなる形態、臨床的に許容されない害作用を起こさないで有効レベルの活性化合物を生じるいかなる形態を用いて、実施できる。かかる投与形態には、経口、経直腸、非経口、糟内、膣内、腹腔内、局所 (粉末、軟膏、液剤、経皮パッチなどによる)、バッカル、口内または鼻腔内スプレーがある。本明細書で使用される用語 “非経口” は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、動脈内の注射および注入を含む投与の形態を意味する。本発明の組成物は直接的にリンパ節に注射できる。 
【０２７４】
投与のための組成物の成分には、無菌の水性 (例えば、生理的塩液) または非水性溶液および懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチレンオレエートなどの注射用有機エステルである。担体または閉塞性ドレッシングを用いて、皮膚の透過性を増加し、抗原の吸収を高め得る。
【０２７５】
組合せ物を、例えば混合物として合わせて、あるいは別個に、同時または別時に投与できる。これは、組合された物質を医療混合物として一緒に投与すること、また、組合された物質を別個であるが同時に投与、例えば、同じ個体に別個の静脈系に投与することを含む。“組合せ” ての投与は、１の化合物または物質を別個に投与すること、第１投与ついで第２投与とすることを含む。
【０２７６】
用量レベルは、投与の形態、対象の性質および担体/アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、対象あたり 約 0.1 μg 〜 約 20 mg の範囲にある。好ましい量は、対象あたり少なくとも約 1 μg 〜 約 1 mg、より好ましくは少なくとも約 10 〜 約 400 μg である。対象を免疫するために複数回の投与が好ましく、プロトコールは問題の対象に適用される当技術分野の標準的なものである。
【０２７７】
組成物は、単位用量形態で都合よく提示でき、薬学の当技術分野で周知の方法で調製できる。方法は組成物を、１以上の補助的成分を構成する担体と関連する工程を含む。一般的に、組成物は、液体担体、細粉砕固体担体またはその両者中に本発明の組成物を均一的にまたは密接に入れ、必要なら産物をつくって、調製する。
【０２７８】
経口投与に適する組成物は、個別的な単位として、例えば、カプセル、錠剤、ロゼンジで提示できる。各々が本発明の組成物につき予め定めた量を含有する。他の組成物に、水性液体または非水性液体中の懸濁液、例えば、シロップ、エリキシルまたはエムルションがある。
【０２７９】
他のデリバリー系に、時間放出、遅延放出または持続性放出デリバリー系がある。かかる系は、上記の本発明組成物の反復投与をなくすことができ、対象および医師の便利性を増加する。多くのタイプの放出デリバリー系が利用可能であり当業者に既知である。
【０２８０】
本発明の別の実施態様は、本発明の組成物を調製する方法、および該組成物を用いて癌およびアレルギーについて医学的処置を行う方法を含む。
【０２８１】
本発明のさらなる態様および実施態様は、下記の実施例および請求項で明らかとなる。
下記の実施例は、例示的なものであり、請求項により定められる本発明の範囲を限定するものではない。当業者に明らかなように、種々の修飾および改変を、本発明の精神および範囲を逸脱することなしになし得る。すなわち、本発明の修飾および改変を、添付の請求項およびその均等の範囲にある限り、包含する。
本明細書で引用されたすべての特許および公表文献を、出典明示により本明細書の一部とする。
【０２８２】
実施例１
p33-HBcAg VLP の生成
LCMV 由来のペプチド p33 を含有する HBcAg の DNA 配列を配列番号: 15 に示す。p33-HBcAg VLP を下記のように生成せしめた。肝炎 B ウイルスの完全ウイルスゲノムを含有する肝炎 B クローン pEco63 を ATCC から入手した。HBcAg をコードする遺伝子を、発現ベクター pkk223.3 (Pharmacia) の EcoRI/HindIII 制限部位に強力な tac プロモーターの制御下に導入した。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) から誘導された p33 ペプチド (KAVYNFATM) (配列番号: 80) を HBcAg (1-185) の C-末端に、３ロイシン-リンカーを介して標準 PCR 法で融合した。優れた発現について選択された E. coli K802 のクローンをプラスミドでトランスフェクトし、細胞を生育し、5 ml 分解緩衝液 (10 mM Na2HPO4, 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.25 % Tween-20, pH 7.0) 中に再懸濁した。 200 μの リゾチーム 溶液 (20 mg/ml) を加えた。音波破壊の後に, 4 μl ベンゾナーゼおよび 10 mM MgCl2 を加え、懸濁液を 30 分間 RT でインキュベートし、15 分間 15,000 rpm で 4℃ で遠心分離し、上澄みを保持した。
【０２８３】
次に、20 % (w/v) (0.2 g/ml 溶解質) 硫酸アンモニウムを上澄みに加えた。30 分間氷上でのインキュベーション後および 15 分間 20,000 rpm、4℃での遠心分離後に、上澄みを捨て、ペレットを 2-3 ml PBS に再懸濁した。20 ml の PBS-溶液を Sephacryl S-400 ゲルろ過カラム (Amersham Pharmacia Biotechnology AG) 上に保持した。フラクションを SDS-Page ゲル上に置き、精製 p33-VLP キャプシドをもつフラクションを集めた。集めたフラクションを Hydroxyapatite カラムに保持した。フロースロー (精製 p33-VLP キャプシドを含有する) を収集し、還元 SDS-PAGE ゲル上にモノマー分子量の分析のために保持した。電子顕微鏡で標準プロトコールに従い調べた。
【０２８４】
すなわち、p33-VLP の構造を電子顕微鏡および SDS PAGE で検査した。組換え的につくられた HBcAg 野生タイプ VLP (HBcAg [aa 1-185] モノマーから構成される) および p33-VLP を精製のために Sephacryl S-400 ゲルろ過カラム (Amersham Pharmacia Biotechnology AG) 上に保持した。集めたフラクションを Hydroxyapatite カラム上に保持した。フロースロー (精製 p33-VLP を含有) を集め、還元 SDS-PAGE ゲル上にモノマー分子量分析のために保持した。
記述を通じて用語 p33-HBcAg VLP、HBcAg-p33 VLP、p33-VLP および HBc33 は互換的に使用する。
【０２８５】
実施例２
GA VLP のクローニング、発現および精製
GA ファージ・コート・タンパク質の cDNA を GA ファージから、逆転写ついで PCR 増幅工程により、RevertAid 第１鎖 cDNA 合成キット (Fermentas) を用いて増幅した。cDNA を酵素 NcoI および HindIII で切断し、同じ酵素で予め切断したベクター pQβ185 中にクローン化し、GA cDNA をもつプラスミド 355.24 に導いた。挿入された cDNA の配列を DNA シーケンシングで調べた。
【０２８６】
プラスミド 355.24 を E. coli JM109 中に形質転換した。発現を基本的に、QβVLP について記載されているように行った。単一のコロニーを、20 mg/L アンピシリンを含有する LB 培地に一夜振盪せずに接種した。この接種物に次の日に、1% カサミノ酸、0.2% グルコースおよび 20 mg/L アンピシリンを補充した M9 培地を含有する大きいフラスコ中に移し、14-20 時間振盪しながらインキュベートした。
【０２８７】
GA VLP を基本的に、QβVLP について記載のように単離した。細胞を分解し、澄んだ溶解質を Sepharose CL-4B カラム (Amersham Pharmacia) に入れた。溶出液を硫酸アンモニウム沈澱で濃縮し、Sepharose CL-6B カラム (Amersham Pharmacia) で再クロマトグラフィーにかけた。最終工程をスクロース勾配 (20-50% w/v) または CsCl の超遠心分離で行った。単離された VLP をついで 20 mM Tris、150 mM NaCl、pH 8.0 で透析した。
【０２８８】
実施例３
フルオレセイン標識の CpG-含有オリゴヌクレオチドは BKV、HBcAg および Qβ-VLP 中に充填できる
イースト中につくられた VLP は、VLP を RNase A で容易に消化され、消失され得る少量の RNA を含有する。高度に活性の RNase A 酵素は、分子量約 14 kDa を持ち、VLP に入るのに十分小さく、望ましくないリボ核酸を消失せしめる。組換え的につくられた BKV VLP (配列番号: 12) を 1 mg/ml に PBS 緩衝液、pH7.2 で濃縮し、RNase A (200μg/ml、Roche Diagnostics Ltd, Switzerland) の存在または不存在で 3 時間37℃でインキュベートした。RNase A 消化後、BKV VLP に 75 nmol/ml 5'-フルオレセイン標識ホスホロチオエート CpG-FAM オリゴヌクレオチド (配列番号: 34 からのオリゴヌクレアーゼ) を補充し、3 時間 37℃でインキュベートした。ついで、BKV VLP を DNaseI 消化 に 3 時間 37℃ (40 u/ml AMPD1, Sigma, Division of Fluka AG, Switzerland) かけるか、DNaseI 消化なしで保持した。サンプルに 6-倍濃縮 DNA-保持緩衝液 (10 mM Tris pH 7.5、10% v/v グリセロール、0.4% オレンジ G) を補い、1 時間 65 ボルトで 0.8% 天然トリス-アセテート pH 7.5 アガロースゲルにかける。エチジウムブロマイドでの染色で、核酸を検出し、一方、エチジウムブロマイドなしで、UV 刺激で CpG-FAM におけるフルオレセイン標識の蛍光となる。
【０２８９】
BKV VLP (15 μg) を天然 0.8% アガロースゲル電気泳動により、コントロール・インキュベーションの後に、または RNase A での消化および続く二本鎖 (ds) DNA (246 bp) (配列番号: 17) とのインキュベーション後に、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーでの染色で、分析した。下記のサンプルをゲル上に保持した: 1: BKV VLP 非処置; 2: BKV VLP RNase A 処置; 3: BKV VLP RNase A での処置、dsDNA とのインキュベーション; レーン M: Gene Ruler 1 kb DNA ラダー (MBI Fermentas GmbH, Heidelberg, Germany)。
【０２９０】
BKV VLP (15 μg) を天然 0.8% アガロースゲル電気泳動により、コントロール・インキュベーションの後に、または RNase A での消化および続く CpG-オリゴヌクレオチド (ホスフェート- またはホスホロチオエート (pt) 骨格を持つ) とのインキュベーション後に、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーの染色で分析した。下記のサンプルをゲル上に保持した: 1: BKV VLP ストック (PBS/50% グリセロ−ル); 2: 非処置 BKV VLP (PBS 緩衝液); 3: RNase A 処置 BKV VLP; 4: RNase A での処置 BKV VLP、透析後; 5: VLP RNase A および CpG-オリゴヌクレオチドと処置 BKV VLP; 6: RNase A および CpG(pt)-オリゴマー処置 BKV VLP; 7: RNase および CpG(pt)-オリゴマー処置 BKV VLP; レーン M: Gene Ruler 1 kb DNA ラダー (MBI Fermentas GmbH, Heidelberg, Germany)。
【０２９１】
RNase A は VLP の移動を変化する。これはクーマシー染色のアガロースゲル上で可視であり、おそらく RNA からの負電荷の欠失による。CpG-オリゴヌクレオチドの付加は BKV VLP の移動を回復し、非処置 VLP に存在する RNA バンドと同じ移動をもつ蛍光バンドをもたらす。このことは、CpG-FAM オリゴヌクレオチドが VLP 中に充填されたことを明示している。
【０２９２】
実施例４
大きい二本鎖オリゴヌクレオチドを BKV VLP 中に充填できる
二本鎖 (ds) ヌクレオチド配列を導入するために、RNase A 処置の組換え BKV VLP (実施例 3) に 50μg/ml (ds) DNA フラグメント (246 bp 長、dsDNA、配列番号: 17) を補充し、3 時間37℃でインキュベートした。サンプルに 6-倍濃縮 DNA-保持緩衝液 (10 mM Tris pH 7.5、10% v/v グリセロール、0.4% オレンジ G) を補い、1 時間 65 ボルトで 0.8% 天然トリス-アセテート pH 8.0 アガロースゲルにかける。BKV VLP (15 μg) を天然 0.8% アガロースゲル電気泳動により、コントロール・インキュベーションの後に、または RNase A での消化および続く (ds) DNA とのインキュベーション後に、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーでの染色で、RNA/DNA またはタンパク質の存在を調べるために分析した。充填された DNA 分子は、エチジウムブロマイドの存在で、クーマシーブルーで可視化される VLP バンドと同じ移動を持つバンドして見うる。
【０２９３】
(ds) DNA の付加は BKV VLP の移動を回復し、クーマシーブルー染色の VLP と同じ移動をもつ DNA バンドをもたらす。このことは、(ds) DNA が BKV VLP 中に充填されたことを明示している。
【０２９４】
実施例５
CpG-含有のオリゴヌクレオチドを BKV VLP 中に充填できる
免疫刺激性 CpG-オリゴヌクレオチドを導入するために、RNase A 処置組換え BKV VLP (実施例 3) に 150 nmol/ml の CpG-オリゴヌクレオチド、ホスホジエステル骨格を持つ CyCpG またはホスホロチオエート骨格をもつ CyCpGpt を補い、3 時間 37℃でインキュベートした。マウス免疫のための VLP 調製物を 24 時間 PBS に対し、pH7.2 で 300 kDa MWCO 透析膜 (Spectrum Medical industries Inc., Houston, USA) で強く透析し (10,000-倍希釈)、RNase A および過剰の CpG-オリゴヌクレオチドをなくした。サンプルに 6-倍濃縮 DNA-保持緩衝液 (10 mM Tris pH 7.5、10% v/v グリセロール、0.4% オレンジ G) を補い、1 時間 65 ボルトで 0.8% 天然トリス-アセテート pH 8.0 アガロースゲルにかける。BKV VLP (15 μg) を天然 0.8% アガロースゲル電気泳動により、コントロール・インキュベーションの後に、または RNase A での消化および続く CpG-オリゴヌクレオチド (ホスホジエステル-またはホスホロチオエート骨格をもつ) とのインキュベーション後に、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーでの染色で、RNA/DNA またはタンパク質の存在および非結合 CpG-オリゴヌクレオチドの還元を調べるために分析した。非結合 CpG-オリゴヌクレオチドは低分子量エチジウムブロマイド染色のバンドとして可視である。CpG-オリゴヌクレオチドは BKV VLP の移動を回復し、クーマシーブルー染色の VLP と同じ移動をもつ DNA バンドとなる。これは、CpG-オリゴヌクレオチドが BKV VLP 中に充填されたことを明示する。
【０２９５】
実施例６
VLP に含有の CpG-オリゴヌクレオチド (ホスフェート骨格のホスホロチオエート修飾をもつ) は高められた Th1 指向の免疫応答を誘発する
雌 BALB/c マウス (１群３匹) の皮下に 10μg BKV VLP に含有のホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチド CyCpGpt (配列番号: 34) を注射した。対照として、マウスは、皮下に 10μg の RNase 処置 BKV VLP 単独、または 0.3 nmol もしくは 20 nmol ホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチドの 200μl PBS pH7.2 との混合された BKV VLP を注射するか、あるいは処置しなかった。BKV VLP を実施例 5 に記載のように調製し、免疫の前に非結合 CpG-オリゴヌクレオチドから透析で精製した。免疫 14 後に血液を採取し、BKV VLP に対する IgG1 および IgG2a 抗体応答を調べた (参照、表 1)。
【０２９６】
【表１】
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表 1: BKV VLP に対するマウス IgG1 および IgG2a OD50% 抗体力価、BKV VLP およびホスホロチオエート (pt) CpG-オリゴヌクレオチドでの免疫 14 日後
【０２９７】
RNase A 処置の BKV VLP に含有のホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチド CyCpGpt での免疫は、同じ量 (0.3 nmol) の、BKV VLP と混合された CpG-オリゴヌクレオチドまたは BKV VLP 単独による免疫に比して、低下した IgG1 および増加したアンチ-BKV VLP IgG2a 力価をもたらす。20 nmol ホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチド CyCpGpt と混合された BKV VLP により免疫されたマウスは、非常に低い IgG1 および高い IgG2a 力価を示す。対照に比しての IgG1 力価の低下および IgG2a 力価の増加は、BKV VLP 中に充填されたホスホロチオエート CpG-オリゴヌクレオチドにより誘導された Th1 細胞指向の免疫応答を表す。表 1 は、CpG-オリゴヌクレオチドと単に混合された BKV VLP に比して、BKV VLP に含有の CpG-オリゴヌクレオチドのより高い能力を明らかに表す。
【０２９８】
実施例７
免疫刺激性核酸を、抗原との融合タンパク質を含む HBcAg VLP 中に充填できる
HBcAg VLP は、E. coli 中で、肝炎 B コア抗原融合タンパク質 p33-HBcAg (HBc33) (参照、実施例 1) またはペプチド P1A に対する融合タンパク質 (HBcP1A) の発現によりつくられたときに、VLP を RNase A とインキュベートすることにより消化され、消失され得る RNA を含有する。
【０２９９】
遺伝子 P1A は、肥満細胞腫・腫瘍細胞系 P815 により発現されるタンパク質をコードする。P1A ペプチドという優性 CTL エピトープが MHC クラス I (Ld) に結合し、複合体が特殊な CTL クローンにより認識される (Braendle et al., 1998, Eur. J. Immunol. 28: 4010-4019)。ペプチド P1A-1 (LPYLGWLVF) ((配列番号: 90) の HBcAg C-末端 (aa 185、参照、実施例 1) の融合を、標準の分子生物学的技法を用いて、適当なプライマーを使用する PCR で実施した。３ロイシン リンカーを HBcAg とペプチド配列との間にクローニングした。発現を実施例 1 に記載のように行った。HBcP1A と名付ける HBcAg と P1A との融合タンパク質が、E. coli 中で発現されたときに、キャプシドを形成した。実施例１に記載の方法と同様に精製できる。
【０３００】
酵素的 RNA 加水分解: 組換え的につくられた HBcAg-p33 (HBc33) および HBcAg-P1A (HBcP1A) VLP を 濃度 1.0 mg/ml、1 x PBS 緩衝液 (KCl 0.2g/L、KH2PO4 0.2g/L、NaCl 8 g/L、Na2HPO4 1.15 g/L) 中、pH 7.4 で、300 μg/ml RNase A (Qiagen AG, Switzerland) の存在下、3 時間、37℃で、テルモミキサー中 650 rpm で、インキュベートした。
【０３０１】
免疫刺激性核酸の充填: RNAse A での RNA 消化後、HBcAg-p33 VLP に 130 nmol/ml CpG-オリゴヌクレオチド B-CpG、NKCpG、G10-PO を補った (表 2)。同様に、150 マー一本鎖 Cy150-1 および 253 マー二本鎖 dsCyCpG-253 を、両者は複数コピーの CpG モチーフを含有する、それぞれ 130 nmol/ml または 1.2 nmol/ml で加え、テルモミキサー中、3 時間37℃でインキュベートした。二本鎖 CyCpG-253 DNA を、CyCpG の二本鎖マルチマーを pBluescript KS-の EcoRV 部位中にクローニングすることでつくった。E. coli XL1-blue でつくられ、Qiagen Endofree プラスミド Giga Kit で単離されたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ XhoI および XbaI で消化し、得られる制限産物をアガロース電気泳動で分離した。253 bp 挿入物を電気溶出およびエタノール沈降により単離した。配列を両鎖のシ−クエンシングにより確認した。
【０３０２】
表 2: 実施例において使用される用語および免疫刺激性核酸の配列
小文字はホスホロチオエート結合を介して結合されるデオキシヌクレオチドを示し、大文字はホスホジエステル結合を介して結合されるデオキシヌクレオチドを示す。
【表２】
2006523189.tif 000003
【０３０３】
DNAse I 処置: 充填された HBcAg-p33 VLP をついで DNaseI 消化 (5 U/ml) に 3 時間 37℃でかけ (DNaseI, RNase free Fluka AG, Switzerland)、広く (2 x 200-倍量に対し) 24 時間 PBS に対し pH 7.4、300 kDa MWCO 透析膜 (Spectrum Medical industries Inc., Houston, USA) でもって透析し、RNAse A および過剰の CpG-オリゴヌクレオチドを除去した。
【０３０４】
ベンゾナーゼ処置: いくつかの一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは部分的に DNaseI 処置に抵抗性であり、ベンゾナーゼ処置を用いて、調製物から遊離のオリゴヌクレオチドを消失せしめる。100-120 U/ml ベンゾナーゼ (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) および 5 mM MgCl2 を加え、3 時間 37℃でインキュベートしてから透析した。
【０３０５】
透析: マウスの免疫実験に使用される免疫刺激性核酸が充填された VLP 調製物を広く (2 x 200-倍量に対し) 24 時間 PBS に対し pH 7.4、300 kDa MWCO 透析膜 (Spectrum Medical industries Inc., Houston, USA) でもって透析し、加えられた酵素および遊離の核酸を除去した。
【０３０６】
充填の分析: 充填された免疫刺激性核酸の放出: 50μl キャプシド 溶液に、1μl の プロテアーゼ K (600 U/ml, Roche, Mannheim, Germany)、3μl 10% SDS-溶液 and 6μl 10 倍プロテアーゼ緩衝液 (0.5 M NaCl、50 mM EDTA、0.1 M Tris pH 7.4) を加え、ついで一夜 37℃でインキュベートした。VLP をこれらの条件で完全に加水分解した。プロテアーゼ K の不活性化を 20 分間 65℃の加熱で行った。1μl RNAse A (Qiagen, 100 μg/ml, 250 倍希釈) を 25μl のキャプシドに加えた。2-30μg のキャプシドを 1 容量の 2x 保持緩衝液 (1xTBE、42% w/v 尿素、12% w/v Ficoll、0.01 % ブロモフェノールブルー) と混合し、3 分間 95℃で加熱し、10% (約 20 nt 長のオリゴヌクレオチドにつき) または 15% (40 マーを超える核酸につき) TBE/尿素ポリアクリルアミドゲル (Invitrogen) 上に保持した。あるいは、サンプルを、6x 保持色素をもつ 1% アガロースゲル (10 mM Tris pH 7.5、50 mM EDTA、10% v/v グリセロ−ル、0.4 % オレンジ G) 上で保持した。TBE/尿素ゲルを SYBRGold で染色し、アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。
【０３０７】
オリゴヌクレオチド B-CpG、NKCpG および G10-PO を HBc33 中に充填した。HBc33 VLP 中に充填された B-CpG の分析をエチジウムブロマイドおよび クーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲルで行った。50μg の下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 非処置 HBc33 VLP; 2. RNase A で処置された HBc33 VLP; 3. RNase A で処置され、B-CpG で充填された HBc33 VLP; 4. RNase A で処置され、B-CpG で充填され、DNaseI で処置された HBc33 VLP; 5. RNase A で処置され、B-CpG で充填され、DNaseI で処置され、透析された HBc33 VLP HBc33 VLP; 6. 1 kb MBI Fermentas DNA ラダー。VLP から抽出された充填 B-CpG の量を、エチジウムブロマイドで染色された 1.5% アガロースゲル上で分析した。下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 0.5 nmol B-CpG 対照; 2. 0.5 nmol B-CpG 対照; 3. B-CpG オリゴ内容 HBc33、フェノール / クロロホルム抽出後; 4. B-CpG オリゴ内容 HBc33、フェノール / クロロホルム抽出および RNase A 処置後; 5. B-CpG オリゴ内容 HBc33、フェノール / クロロホルム抽出および RNase I 処置後; 6. 空; 7. MBI Fermentas 100 bp DNA ラダー。
【０３０８】
HBc33 VLP 中に充填された NKCpG の分析をエチジウムブロマイドおよび クーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲルで行った。15μg の下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 非処置 HBc33 VLP; 2. RNase A で処置された HBc33 VLP; 3. RNase A で処置され、NKCpG で充填された HBc33 VLP; 4. RNase A で処置され、NKCpG で充填され、DNaseI で処置され、透析された HBc33 VLP; 5.  1 kb MBI Fermentas DNA ラダー。VLP から抽出された充填 NKCpG の量を、SYBR Gold で染色された 15% TBE/尿素ゲル上で分析した。下記サンプルをゲル上に保持した: 1. NKCpG オリゴ内容 HBc33、プロテアーゼ K 消化および RNase A 処置後; 2. 20 pmol NKCpG 対照; 3. 10 pmol NKCpG 対照; 4. 40 pmol NKCpG 対照。
【０３０９】
HBc33 VLP 中に充填された g10gacga-PO の分析を、エチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲルで行った。15μg の下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 1 kb MBI Fermentas DNA ラダー; 2. 非処置 HBc33 VLP; 3. RNase A で処置された HBc33 VLP; 4. RNase A で処置され、th g10gacga-PO で充填された HBc33 VLP; 5. RNase A で処置され、th g10gacga-PO で充填され、ベンゾナーゼで処置され、透析された HBc33 VLP。
【０３１０】
VLP 中の RNA 内容物を RNaseA 処置後に強く還元し、一方、大部分のキャプシドが遅移動の塗抹として、おそらく負電荷の RNA の除去により移動した。過剰のオリゴヌクレオチドとのインキュベーションの後に、キャプシドが、RNAseA 処置キャプシドよりも高い量の核酸を含有し、もって非処置キャプシドと類似の速度で移動した。DNAse I またはベンゾナーゼによる追加の処置が遊離のオリゴヌクレオチドを分解し、一方、キャプシド中に充填されたオリゴヌクレオチドが分解しないで、オリゴヌクレオチドの充填を明らかに示した。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの充填を DNAseI/ベンゾナーゼ処置および透析の後にプロテアーゼ K 消化により確認した。上記の方法でキャプシドから放出されたオリゴヌクレオチドが充填に使用されたオリゴヌクレオチドも同じ大きさであるとの事実は、オリゴヌクレオチドの充填を明らかに表す。
【０３１１】
大きい一本鎖オリゴヌクレオチド Cy150-1 を HBc33 中に充填した。Cy150-1 は、CyCpG の 7.5 反復体を含有し、標準的オリゴヌクレオチド合成法 (IBA, Gottingen, Germany) により合成した。HBc33 VLP 中に充填された Cy150-1 を、エチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲルで分析した。15μg の下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 1 kb MBI Fermentas DNA ラダー; 2. 非処置 HBc33 VLP; 3. RNase A で処置された HBc33 VLP; 4. RNase A で処置され、Cy150-1 で充填された HBc33 VLP; 5. RNase A で処置され、Cy150-1 で充填され、DNaseI で処置され、透析された HBc33 VLP; 6. RNase A で処置され、Cy150-1 で充填され、DNaseI で処置され、透析された HBc33 VLP。VLP から抽出された充填 Cy150-1 の量を、SYBR Gold で染色された 10 % TBE/尿素ゲル上で分析した。下記のサンプルをゲル上に保持した: 1. 20 pmol Cy150-1 対照; 2. 10 pmol Cy150-1 対照; 3. 4 pmol Cy150-1 対照; 4. Cy150-1 オリゴ内容の 4μg HBc33、3 分間 95℃で 1 容量 TBE/尿素サンプル緩衝液ととも。
【０３１２】
キャプシド中の RNA 内容物が RNaseA 処置後に強く還元され、一方、大部分のキャプシドが遅移動の塗抹として移動した。キャプシドを 4 容量の水で希釈し、1 mg/ml に濃縮した。過剰の Cy150-1 とのインキュベーション後に、キャプシドがより大量の核酸を含有し、非処置のキャプシドと類似の速度で移動した。DNAseI での追加の処置が遊離で充填されないオリゴヌクレオチドを分解し、一方、キャプシド中のオリゴヌクレオチドは分解されなかった。充填 VLP からの DNAseI-抵抗性核酸の放出は、3 分間 95℃、TBE/尿素保持緩衝液中での加熱により、150 マーの存在を示した。
【０３１３】
オリゴヌクレオチド NKCpGpt も HBcP1A 中に充填した。HBcP1A VLP 中に充填された NKCpGpt の分析を、エチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲル上で行った。15μg の下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 1 kb MBI Fermentas DNA ラダー; 2. 非処置 HBcP1A VLP; 3. RNase A で処置された HBcP1A VLP; 4. RNase A で処置され、NKCpGpt で充填された HBcP1A VLP。RNAse での処置は核酸内容物を還元し、キャプシドの移動を遅らせる。NKCpGpt の追加は、キャプシドの核酸および速い移動を回復した。
【０３１４】
実施例８
免疫刺激性核酸は、抗原と共役された HBcAg-wt 中に充填できる
組換え的につくられた HBcAg-wt VLP を、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス (LCMV) から誘導されるペプチド p33 (CGG-KAVYNFATM) (配列番号: 81) との共役後に充填した。共役のために、HBcAg-wt VLP (2 mg/ml) を 25x モル過剰の SMPH (スクシニミジル-6-[(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート]、Pierce) で 1 時間 25℃、テルモミキサー中で誘導した。誘導された VLP を Mes 緩衝液 (2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸) pH 7.4 で 2 x 2 時間、MWCO 10.000 kD 透析膜を 4℃で用いて、透析した。VLP (50μM) を p33 ペプチド (250μM) の N-末端システインに 2 時間インキュベーションでテルモミキサー中 25℃で共役した。サンプルを (MWCO 300.000) 強く 1x PBS pH 7.4 で透析し、望ましくない遊離のペプチドを消失せしめた。
【０３１５】
HBcAg-wt VLP の SMPH による誘導および p33 ペプチドとの共役を SDS-PAGE 上で分析した。サンプルを 16% SDS PAGE で分析し、クーマシーブルーで染色した。下記サンプルをゲル上に保持した: 1.NEB 予染色のタンパク質マーカー、広範囲 (# 7708S)、10μl; 2. p33 ペプチド; 3. SMPH で誘導された HBcAg-wt VLP、透析前; 4. SMPH で誘導された HBcAg-wt VLP、透析後; 5. p33 と共役された HBcAg-wt VLP、上澄み; 6. p33 と共役された HBcAg-wt VLP、ペレット。HBcAg-wt は 21 kD タンパク質バンドとして可視であった。SMPH の低分子量のために、誘導された産物のみが僅かに大きく、SDS-PAGE で識別できなかった。ペプチドのみが 3 kD バンドとして可視であり、共役された産物である HBx33 が強力な第２バンドを約 24 kD で 50% 以上の全 HBcAg-wtについて示した。
【０３１６】
酵素的 RNA 加水分解: HBx33 VLP (0.5-1.0 mg/ml、1xPBS 緩衝液 pH7.4) を RNase A (300 μg/ml, Qiagen AG, Switzerland) の存在下に 4 容量 H2O で希釈し、塩濃度を最終 0.2xPBS 濃度にまで下げ、3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm でインキュベートした。
【０３１７】
免疫刺激性核酸の充填: RNase A 消化後に HBx33 VLP を Millipore Microcon または Centriplus 濃縮器で濃縮し、ついで 130 nmol/ml CpG-オリゴヌクレオチド B-CpGpt を補い、テルモミキサー中 3 時間 37℃、0.2xPBS pH 7.4 でインキュベートした。次に、反応混合物を DNaseI 消化 (5 U/ml)に 3 時間 37℃ (DNaseI, RNase free Fluka AG, Switzerland) かけた。マウス免疫のための VLP 調製物を強く (2x 200-倍量に対し) 24 時間、PBS に対しpH 7.4 で 300 kDa MWCO 透析膜 (Spectrum Medical industries Inc., Houston, USA) で透析し、RNase A および過剰の CpG-オリゴヌクレオチドを消失せしめた。HBx33 VLP 中に充填された B-CpGpt の分析を、エチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲル上で行った。50μg の下記サンプルをゲル上に保持した: 1. 非処置 HBx33 VLP; 2. RNase A で処置された HBx33 VLP; 3. RNase A で処置され、B-CpGpt で充填された HBx33 VLP; 4. RNase A で処置され、B-CpGpt で充填され、DNaseI で処置された HBx33 VLP; 5. RNase A で処置され、B-CpGpt で充填され、DNaseI で処置され、透析された HBx33 VLP; 6. 1 kb MBI Fermentas DNA ラダー。RNAse 処置がキャプシドの核酸内容物を還元し、その移動を遅らすことを示し得る。B-CpGpt の追加が核酸内容物およびキャプシドの速い移動を回復した。DNAse I のみが遊離のオリゴヌクレオチドを消化し、一方、充填されたオリゴヌクレオチドが透析後も VLP 中に残存した。
【０３１８】
実施例９
免疫刺激性核酸を抗原と共役された Qβ VLP 中に充填し得る
p33 ペプチドの Qβ VLP との共役
組換え的につくられたhe RNA-バクテリオファージ Qb のウイルス様粒子 (Qβ VLP) を、未処置で、または N-末端 CGG および／または C-末端 GGC 伸張を含有する p33 ペプチド (CGG-KAVYNFATM (配列番号: 81) および KAVYNFATM-GGC (配列番号: 82)) との共役後に使用した。組換え的につくられた Qβ VLP を 10 モル過剰の SMPH (Pierce) で 0.5 時間 25℃で誘導し、ついで 20 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.2、4℃で透析し、未反応の SMPH を除去した。ペプチドを 5 倍モル過剰で加え、2 時間テルモミキサー中 25℃で、30% アセトニトリルの存在下に反応せしめた。Qb VLP に共役された p33 の分析を SDS-PAGE でクーマシーブルー染色後に行った。下記のサンプルを保持した: (A) 1. NEB 予染色のタンパク質マーカー、広範囲 (# 7708S)、10μl; 2. Qb VLP、14μg; 3. SMPH で誘導された Qb VLP、透析後; 4. CGG-p33 で共役された Qb VLP、上澄み、(B) 1. NEB 予染色のタンパク質マーカー、広範囲 (# 7708S)、10μl; 2. Qb VLP、10μg; 3. CGG-p33 で共役された Qb VLP、上澄み。SDS-PAGE 分析は、Qβ モノマーに共役された１，２または３のペプチドからなる複数の共役バンドを示した。簡便のために、ペプチドの共役を、実施例においては特に、Qbx33 とする。
【０３１９】
Qβ VLP は、E. coli においてバクテリオファージ Qβ キャプシドタンパク質の発現によりつくられたときに、VLP を RNase A とともにインキュベートすることにより消化され、もって消失される RNA を含有する。
【０３２０】
低いイオン強度および低い Qβ 濃度が RNAse A による Qβ VLP の RNA 加水分解を可能にする
Qβ VLP を濃度 1.0 mg/ml、20mM Hepes/150mM NaCl 緩衝液 (HBS) 中、pH 7.4 で、RNase A (300μg/ml, Qiagen AG, Switzerland) の添加により直接消化せしめるか、または 4 容量 H2O で最終 0.2 x HBS 濃度に希釈し、ついで RNase A (60μg/ml, Qiagen AG, Switzerland) とともにインキュベートした。インキュベーションは 3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm で行った。低または高イオン強度での Qb VLP からの RNase A による RNA 加水分解を、エチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 1% アガロースゲル上で行った。下記のサンプルをゲル上に保持した: (A, B) 1. MBI Fermentas 1kb DNA ラダー; 2. 非処置 Qb VLP; 3. RNase A で処置された Qb VLP、1x HBS 緩衝液中 pH7.2、(C, D) 1. MBI Fermentas 1kb DNA ラダー; 2. 非処置 Qb VLP; 3. RNase A で処置された Qb VLP、0.2 x HBS 緩衝液 pH7.2。1xHBS においてのみ RNA 内容物の非常に弱い還元があり、一方、0.2x HBS において RNA の大部分が加水分解されたことが分かった。同様に、キャプシド移動が 1x HBS での RNAse A 付加で変わらず、一方、0.2 x HBS での RNAse の付加で移動が遅くなる。
【０３２１】
低イオン強度が Qβ VLP における核酸充填を増加する
0.2 x HBS における RNase A 消化後に Qβ VLP を 1 mg/ml に、Millipore Microcon または Centriplus 濃縮器で濃縮し、アリコートを 1x HBS または 0.2 x HBS に対し透析した。Qβ VLP に 130 nmol/ml CpG-オリゴヌクレオチド B-CpG を補い、テルモミキサー中 3 時間 37℃ でインキュベートした。ついで、Qβ VLP をベンゾナーゼ消化 (100 U/ml) に 3 時間 37℃でかけた。サンプルを、1% アガロースゲル上、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーの染色後に分析した。下記のサンプルをゲル上に保持した: 1. 非処置 Qb VLP; 2. RNase A で処置された Qb VLP; 3. RNase A で処置され、B-CpG 0.2x HBS 緩衝液 pH7.2 で充填され、ベンゾナーゼで処置された Qb VLP; 4. RNase A で処置され、B-CpG 0.2x HBS 緩衝液 pH7.2 で充填され、ベンゾナーゼで処置された HBx33 VLP (参照、実施例 12)。1x HBS においてのみ非常に低量のオリゴヌクレオチドを充填でき、一方、0.2 x HBS において強力なエチジウムブロマイド染色のバンドが検出可能であった。これはキャプシドのクーマシーブルー染色で発色している。
【０３２２】
異なる免疫刺激性核酸を Qβ および Qbx33 VLP 中に充填できる
0.2 x HBS における RNase A 消化後に Qβ VLP または Qbx33 VLP を 1 mg/ml に、Millipore Microcon または Centriplus 濃縮器で濃縮し、130 nmol/ml CpG-オリゴヌクレオチド B-CpG、g10gacga および 253 マー dsCyCpG-253 (表 2) を補い、テルモミキサー中 3 時間 37℃ でインキュベートした。ついで、Qβ VLP または Qbx33 VLP を DNAse I 消化 (5 U/ml) またはベンゾナーゼ消化 (100 U/ml) に 3 時間 37℃でかけた。サンプルを、1% アガロースゲル上、エチジウムブロマイドまたはクーマシーブルーの染色後に分析した。
【０３２３】
50μg の下記のサンプルをゲル上に保持した: 1. 非処置 Qbx33 VLP; 2. RNase A で処置された Qbx33 VLP; 3. RNase A で処置され、B-CpGpt で充填された Qbx33 VLP; 4. RNase A で処置され、B-CpGpt で充填され、DNaseI で処置され、透析された Qbx33 VLP; 5. 1 kb MBI Fermentas DNA ラダー。(C) VLP から抽出された充填オリゴの量を SYBR Gold で染色された 15% TBE/尿素上で分析する。下記のサンプルをゲル上に保持する: 1. 2μg Qbx33 VLP の BCpGpt オリゴ内容物、プロテアーゼ K 消化および RNase A 処置後; 2. 20 pmol B-CpGpt 対照; 3. 10 pmol B-CpGpt 対照; 4. 5 pmol B-CpGpt 対照。
【０３２４】
15μg の下記のサンプルを別のゲル上に保持した: 1. MBI Fermentas 1 kb DNA ラダー; 2. 非処置 Qbx33 VLP; 3. RNase A で処置された Qbx33 VLP; 4. RNase A で処置され、g10gacga-PO で処置された Qbx33 VLP; 5. RNase A で処置され、g10gacga-PO で充填され、ベンゾナーゼで処理され、透析された Qbx33 VLP。
【０３２５】
15μg の下記のサンプルを第３ゲル上に保持した: 1. MBI Fermentas 1 kb DNA ラダー; 2. 非処置 Qbx33 VLP; 3. RNase A で処置された Qbx33 VLP; 4. RNase A で処置され、dsCyCpG-253 で充填され、DNaseI で処置された Qbx33 VLP; 5. RNase A で処置され、dsCyCpG-253 で充填され、DNaseI で処置され、透析された Qbx33 VLP。
【０３２６】
異なる核酸 B-CpGpt、g10gacga および 253マー dsDNA を Qbx33 中に充填できる。充填された核酸は DNAse I 消化に対し抵抗性であり、透析の間、充填のまま残る。B-CpGpt の充填をプロテアーゼ K 消化による核酸の放出で、ついでアガロース電気泳動およびエチジウムブロマイド染色で確認した。
【０３２７】
実施例１０
AP205 解集合-精製-再集合、および免疫刺激性核酸の充填
A. オリゴヌクレオチドの付加なしに再集合できる材料からの AP205 VLP の解集合および再集合
解集合: 40 mg の凍結乾燥の精製 AP205 VLP (配列番号: 80 または 81) を 4 ml 6 M GuHCl に再溶解し、一夜 4℃でインキュベートした。解集合混合物を 8000 rpm で遠心分離した (Eppendorf 5810 R、固定角回転翼 F34-6-38、下記工程のすべてで使用)。ペレットを 7 M 尿素に再溶解し、一方、上澄みを 3 日間 NET 緩衝液 (20 mM Tris-HCl、pH 7.8、5mM EDTA および 150 mM NaCl で) 緩衝液を３回変えて透析した。あるいは、透析を 4 日間連続的に行った。透析溶液を 8000 rpm で 20 分間遠心分離し、ペレットを 7 M 尿素に再溶解し、一方、上澄みを硫酸アンモニウム (60% 飽和) でペレット状にし、ペレットを、10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液で再溶解した。7 M 尿素に再溶解されたすべての前のペレットを合わせ、硫酸アンモニウム (60% 飽和) で沈澱にし、10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液で再溶解した。10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液に再溶解された材料を合わせ、平衡 Sephadex G75 カラムに保持し、10 mM DTT を含有する 7 M 尿素緩衝液で 2ml/h で溶出した。カラムから溶出の１ピーク。フラクション 3 ml を収集した。          AP205 コート・タンパク質を含有するピーク・フラクションを集め、硫酸アンモニウム (60% 飽和) で沈澱せしめた。
【０３２８】
ペレットを遠心分離 8000 rpm、20 分間で単離した。これを 7 M 尿素、10 mM DTT に再溶解し、短 Sepharose 4B カラム (1.5 X 27 cm Sepharose 4B、2 ml/h、7 M 尿素、10 mM DTT、溶出緩衝液として) に保持した。主に１ピークがカラムから溶出された小さいショルダーをもつ。AP205 コート・タンパク質を含有するフラクションを SDS-PAGE により同定し、ショルダーを除外して集めた。サンプル 10.3 ml を得た。タンパク質濃度を分光測光で、測定のために 25-倍に希釈されたタンパク質のアリコートを測定して調べた。それには下記式を用いた: (1.55 x OD280  0.76 x OD260) x 容量。平均濃度は 1 nmol/ml VLP (2.6 mg/ml) であった。280 nm vs. 260 nm での吸収比は 0.12/0.105 であった。
【０３２９】
再集合: 1.1 ml β-メルカプトエタノールをサンプルに加え、下記の再集合反応を設定した。
1 ml の AP205 コート・タンパク質、核酸なし
1 ml の AP205 コート・タンパク質、rRNA (約 200 OD260 単位、 10 nmol)
9 ml の AP205 コート タンパク質、CyCpG (370 ul の 225 pmol/μl 溶液、すなわち 83 nmol).
【０３３０】
これらの混合物を、10% β-メルカプトエタノールを含有する 30 ml の NET 緩衝液に対し１時間透析した。核酸を含有しない混合物を別に透析した。透析を継続的に行い、1 l の NET 緩衝液を 3 日間で交換した。反応混合物をついで水 (緩衝液を 5 変換) に対し広く透析し、凍結乾燥した。水に再溶解し、電子顕微鏡 (EM) で調べた。すべての混合物がキャプシドを含有し、AP205 VLP 再集合体が検出可能な核酸の存在に独立的であることを示した。これは、エチジウムブロマイド染色を用いるアガロースゲル電気泳動で測定した。EM 方法は下記のとおり: タンパク質の懸濁液を炭素-formvar コート・グリッドに吸収せしめ、2% ホスホタングステン酸 (pH 6,8) で染色した。グリッドを JEM 100C (JEOL,Japan) 電子顕微鏡により増幅ボルト 80 kV で調べた。ホトグラフ記録 (ネガティイブ) を Kodak 電子イメージフィルムで行い、電子ミクログラフを Kodak ポリマックス紙でのネガティイブのプリントにより得た。CyCpG の存在で再集合された VLP を Sepharose 4B カラム (1 X 50 cm) で精製し、NET 緩衝液 (1 ml/h) で溶出した。フラクションを Ouchterlony アッセイで分析し、VLP を含有するフラクションを集めた。これはサンプル 8 ml となり、透析で水から塩を除き、乾燥した。キャプシドの収量は 10 mg であった。
【０３３１】
エチジウムブロマイドで染色された 0.6% アガロースゲル中の再溶解材料の分析によると、キャプシドに核酸がなかった。再集合工程の後および拡大透析の前に取得した CyCpG 含有の再集合反応サンプルをエチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーで染色された 0.6% アガロースゲル上で分析した。無傷 AP205 VLP と同じ高さで移動するバンドおよびそのエチジウムブロマイドおよびクーマシーブルーでの染色を得ることができ、これはオリゴデオキシヌクレオチドを含有する AP205 VLP が再集合されたことを示す。 再集合に続く拡大透析が VLP 外側でのオリゴデオキシヌクレオチドの分散を導いたようである。有意に、AP205 VLP は検出可能なオリゴデオキシヌクレオチドの不存在で再集合され得る。これはアガロースゲル電気泳動によりエチジウムブロマイド染色を用いて測定できる。オリゴデオキシヌクレオチドは AP205 VLP に、VLP の最初の解集合、核酸からの解集合コート・タンパク質の精製、続くオリゴデオキシヌクレオチドの存在での VLP の後に、うまく結合された。
【０３３２】
B. 付加オリゴヌクレオチドの不存在で再集合しない解集合材料を用いる AP205 VLP の再集合
解集合: 100 mg の精製かつ乾燥の組換え AP205 VLP を上記のように解集合について使用した。すべての工程をパート A に記載のように基本的に行ったが、硫酸アンモニウムのペレットの溶解のために 8 M 尿素を使用し、再集合の前の CL-4B カラムを用いるゲルろ過工程を省略した。Sephadex G-75 カラムの集めたフラクションは 21 mg のタンパク質を含有した。これは分光法によりパート A に記載の式を用いて決定した。サンプルの 280 nm での吸収の 260 nm での吸収に対する比は 0.16 対 0.125 であった。サンプルは測定のために 50 倍に希釈した。
【０３３３】
再集合: Sephadex G-75 ゲルろ過精製工程から得られるタンパク質調製物を硫酸アンモニウム、60% 飽和で沈澱せしめ、得られたペレットを 2 ml 7 M 尿素、10 mM DTT に溶解した。サンプルを 8 ml の 10% 2-メルカプトエタノールの NET 緩衝液で希釈し、1 時間、40 ml の 10% 2-メルカプトエタノールの NET 緩衝液に対し透析した。再集合を、0.4 ml の CyCpG 溶液 (109 nmol/ml) をタンパク質サンプルに透析バッグ中で加えることで始めた。継続的な透析を設定し、NET 緩衝液を溶出緩衝液として使用した。透析を２日間行い、この透析の完了後に EM 解析のためにサンプルを採取した。透析再集合溶液をついで 50% v/v グリセロ−ルの NET 緩衝液に対し透析し、濃縮を完了した。１日の透析後に緩衝液の１変換を行った。透析を全３日間行った。
【０３３４】
透析および濃縮された再集合溶液をゲルろ過により Sepharose 4-B カラム (1X60 cm) 流速 1 ml/時間で NET 緩衝液中で行った。フラクションを Ouchterlony アッセイで試験し、キャプシドを含有するフラクションを乾燥し、水に再懸濁し、平衡 4-B カラム、20 mM Hepes pH 7.6 で再クロマトグラフィーにかけた。下記の３式の各々を用い： 
1. (183 * OD230 nm  75.8 * OD260 nm) * 容量 (ml)-、2. ((OD235 nm  OD280 nm)/2.51) x 容量、3. ((OD228.5 nm  OD234.5 nm) * 0.37) x 容量、
再集合 VLP のタンパク質の量 6  26 mg を決定した。
【０３３５】
再集合 AP205 VLP を、上記の EM、アガロースゲル電気泳動および非還元条件での SDS-PAGE により解析した。
解集合材料の EM 解析によると、AP205 VLP の塩化グアニジニウムでの処置が VLP のキャプシド集合を基本的に混乱させた。この解集合材料のオリゴヌクレオチドでの再集合はキャプシドをもたらす。これを精製し、さらにゲルろ過で富化した。２サイズの粒子を得た。約 25 nm 直径の粒子と、より小さい粒子が電子ミクログラフで見える。再集合がオリゴヌクレオチドの不存在でなかった。再集合粒子のアガロース電気泳動上の保持によると、再集合粒子が核酸を含有した。核酸のフェノールによる抽出および続くエチジウムブロマイド染色アガロースゲル上の保持によると、粒子が再集合に使用されたオリゴヌクレオチドを含有した。充填されたオリゴヌクレオチドの同一性を、このオリゴヌクレオチドのサンプルを粒子から抽出された核酸材料の端から端に保持することにより調整した。再集合 AP205 VLP が保持され、前にエチジウムブロマイドで染色されているアガロースゲルを、ついでクーマシーブルーで染色して、オリゴヌクレオチド内容物と粒子のタンパク質内容物との共移動を表し、オリゴヌクレオチドが粒子中に充填されていることを示す。ゲル上に保持されるのは、非処置 AP205 VLP、h CyCpG で再集合された AP205 VLP の異なる量をもつ 3 サンプル、および非処置 Qβ VLP であった。
【０３３６】
再集合 AP205 VLP の SDS-PAGE ゲル上での保持は、還元剤の不存在で進行し、非処置 AP205 VLP の場合のように、再集合された粒子がジスルフィド橋を形成することを表す。さらに、ジスルフィド橋パターンは非処置粒子と同じである。SDS ゲル上に保持されるサンプルは: タンパク質マーカー、非処置 wt Qβ、再集合d wt Qβ、非処置 AP205 VLP、再集合 AP205 VLP であった。AP205 VLP サブユニットの分子量は 14.0 kDa であり、Qβサブユニットの分子量は 14.3 kDa である (両分子量は N-末端メチオニンを入れて計算)。
【０３３７】
C. p33 エピトープ (配列: H2N-KAVYNFATMGGC-COOH、遊離 N- および C-末端をもつ (配列番号: 82)）の、CyCpG で再集合された AP205 VLP との共役
パートＢで記載のように 20 mM Hepes、150 mM NaCl、pH 7.4 で得られた再集合d AP205 VLP を濃度 1.4 mg/ml で、5-倍過剰の橋かけリンカー SMPH と DMSO 中 50 mM ストックから希釈し、30 分間 15 ℃で反応せしめた。得られたいわゆる誘導 AP205 VLP を 2 X 2 時間、少なくとも 1000-倍量の 20 mM Hepes、150 mM NaCl、pH 7.4 緩衝液に対し透析した。誘導された AP205 を濃度 1 mg/ml で 2.5-倍または 5-倍過剰のペプチドと、DMSO 中 20 mM ストックから希釈し、2 時間 15 ℃で反応せしめた。ついでサンプルを貯蔵のために液体窒素で急に凍結した。
【０３３８】
共役反応を SDS-PAGE 上で解析した。下記のサンプルがゲル上に保持された: タンパク質マーカー; 誘導された AP205 VLP (d); 2.5-倍過剰のペプチドで共役された AP205 VLP、上澄み (s); 2.5-倍過剰のペプチドで共役された AP205 VLP、ペレット (p); 5-倍過剰のペプチドで共役された AP205 VLP、上澄み (s); 5-倍過剰のペプチドで共役された AP205 VLP、ペレット (p)。共役反応の結果は、高い程度の共役が、共役反応において 2.5-倍過剰のペプチドよりも 5 倍過剰のペプチドで達成できたことを示した。
【０３３９】
実施例１１
VLP の RNA 内容物の非酵素的加水分解および免疫刺激性核酸の充填
VLP の 核酸内容物の ZnSO4 依存性減成：20 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl 中の 5 mg Qβ VLP (Bradford 分析で測定) を、2000 ml の 50 mM TrisHCl pH 8.0、50 mM NaCl、5% グリセロ−ル、10 mM MgCl2 か、2000 ml の 4 mM HEPES、pH 7.4、30 mM NaCl に対し、2 時間 4℃で、SnakeSkin（商標）プリーツ透析チュービング (Pierce, Cat. No. 68035).において透析した、各透析緩衝液を一回交換し、さらに 16 時間 4℃で透析を続けた。透析溶液を 10 分間 14 000 rpm (Eppendorf 5417 R、固定角回転翼 F45-30-11、下記の全工程で使用) で澄明にし、タンパク質濃度を Bradford 分析で再度測定した。50 mM TrisHCl pH 8.0、50 mM NaCl、5% グリセロ−ル、10 mM MgCl2 中の Qβ VLP を対応する緩衝液で最終タンパク質濃度 1 mg/ml に希釈し、4 mM HEPES pH 7.4、30 mM NaCl 中の Qβ VLP を対応する緩衝液で最終タンパク質濃度 0.5 mg/ml に希釈した。このキャプシド含有溶液を再度 10 分間 14 000 rpm 4℃で遠心分離した。上澄みを、最終濃度 2.5 mM に加えられた ZnSO4 とともに 24 時間 60℃で Eppendorf テルモミキサー中 550 rpm でインキュベートした。24 時間後、溶液を 10 分間 14000 rpm で澄明にし、沈澱物を捨てた。
【０３４０】
核酸の ZnSO4-依存性減成についての効率をアガロースゲル電気泳動で確認した。上澄みを 5000 ml の 4 mM HEPES pH 7.4、30 mM NaCl に対し 2 時間 4℃で透析した。5000 ml 緩衝液を一回交換し、透析を一夜 4℃で続けた。透析溶液を 10 分間 14 000 rpm 4℃で澄明にし、僅かの沈澱を捨て、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。類似の結果をキャプシドの塩化銅 / フェナントロリン / 過酸化水素の処置で得た。当業者は加水分解または RNA について別の非酵素的方法を知っているであろう。
【０３４１】
ZnSO4-処置 Qβ VLP をアガロースゲル電気泳動で解析した: E.coli から精製され、緩衝液 1 (50 mM TrisHCl pH 8.0、50 mM NaCl、5% グリセロ−ル、10 mM MgCl2) または緩衝液 2 (4 mM HEPES、pH 7.4、30 mM NaCl) に対して透析された Qβ VLP を、2.5 mM 硫酸亜鉛 (ZnSO4) の存在または不存在で 24 時間 60℃でインキュベートした。この処置の後に、等量の表示サンプル (5 μg タンパク質) を保持染料と混合し、0.8% アガロースゲル上に保持した。ついでゲルをエチジウムブロマイドで染色した。VLP の ZnSO4 での処置が核酸内容物を減成し、一方、模倣の処置対照は影響されなかった。
【０３４２】
オリゴデオキシヌクレオチドの ZnSO4-処置 VLP への充填：タンパク質濃度 (Bradford 分析により測定) 0.4 mg/ml 〜 0.9 mg/ml (キャプシド濃度 159 nM および 357.5 nM にそれぞれ対応) をもつ ZnSO4-処置および透析 Qβ キャプシドを、オリゴデオキシヌクレオチドの充填に使用した。オリゴデオキシヌクレオチドを、300-倍モル過剰で Qβ-VLP キャプシドに加え、3 時間 37℃で Eppendorf テルモミキサー中、550 rpm でインキュベートした。3 時間後、反応物を 10 分間 14 000 rpm 4℃で遠心分離した。上澄みを Spectra/Por（登録商標）CE DispoDialyzer、MWCO 300`000 (Spectrum, Cat. No. 135 526) で 5000 ml の 20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl で 8 時間 4℃で透析した。5000 ml 緩衝液を一回交換し、透析を一夜 4℃で続けた。透析されたタンパク質のタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。Qβ キャプシドおよびその核酸内容物のタンパク質濃度を実施例 7 および 9 に記載のように分析した。
【０３４３】
オリゴデオキシヌクレオチドの ZnSO4-処置 VLP への充填をアガロースゲル電気泳動により分析した。2.5 mM 硫酸亜鉛 (+ ZnSO4) で処置された Qβ VLP を 4 mM HEPES、pH 7.4、30 mM NaCl に対し透析し、3 時間 37℃ で過剰のオリゴデオキシヌクレオチドとともにインキュベートした (透析によって、ZnSO4 の濃度が程度 106 に減少し、それでカッコ内にのみ表示した)。オリゴデオキシヌクレオチドの存在でのインキュベーション後に、等量の表示サンプル (5 μg タンパク質) を保持染料と混合し、0.8% アガロースゲルに保持した。ついでゲルをエチジウムブロマイドで染色した。オリゴデオキシヌクレオチドの ZnSO4-処置 Qβ VLP への付加が処置キャプシドの電気泳動挙動を、E.coli から精製された非処置 Qβ キャプシドに比して、回復できた。
【０３４４】
ZnSO4-およびオリゴデオキシヌクレオチド処置の Qβ VLP の核酸内容物をベンゾナーゼおよびプロテアーゼ K 消化ならびにポリアクリル TBE/尿素ゲル電気泳動により分析した。オリゴデオキシヌクレオチドを ZnSO4-処置 Qβ VLP 中に、上記のように分析した。25 μg のこれらの VLP を 25 μl ベンゾナーゼ (Merck, Cat. No. 1.01694.0001) で製造業者の説明書にしたがい充填した。ヌクレアーゼの熱不活化 (30 分間 80℃) の後に、VLP を プロテアーゼ K (最終酵素 濃度 0.5 mg/ml) で製造業者の説明書のように処置した。3 時間後にベンゾナーゼおよびプロテアーゼ K で処置された等量の 2 μg Qβ VLP を TBE-尿素サンプル緩衝液と混合し、15% ポリアクリルアミド TBE-尿素ゲル (Novex（登録商標）、Invitrogen Cat. No. EC6885) に保持した。 
【０３４５】
レーン 2 に保持されるキャプシドを 2.5 mM ZnSO4 で緩衝液 1 (上記参照) で処置し、一方、レーン 3 に保持されるキャプシドを 2.5 mM ZnSO4 で緩衝液 2 (上記参照) で処置した。量および質の標準として、集合反応に使用した 1 pmol、5 pmol および 10 pmol のオリゴデオキシヌクレオチドを同じゲル (レーン 4  6) に保持した。対照として、E.coli から精製された Qβ キャプシドを全く同様に処置し、同じポリアクリルアミド TBE-尿素 ゲル (レーン 1) 上で分析した。その終了後に、ゲルを固定し、中性 pH とし、SYBR-Gold (Molecular Probes Cat. No. S-11494) で染色した。無傷の Qβ VLP (E.coli から精製) は ZnSO4-およびオリゴデオキシヌクレオチド処置 Qβ キャプシドから抽出されたものと同じサイズの核酸を含有していなかった。さらに、後者の VLP から単離された核酸は、集合反応に使用されたオリゴデオキシヌクレオチドと共移動した。この結果は、使用されたオリゴデオキシヌクレオチドが ZnSO4-処置 Qβ キャプシドに充填されたことを確認する。
【０３４６】
実施例１２
免疫刺激性核酸の VLP への充填後の抗原ペプチドの共役
VLP の核酸内容物の RNaseA および ZnSO4 仲介による減成
Qβ VLP を RNaseA で実施例 9 に記載のように、低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 処置した。同様に、実施例 2、3、7 および 10 に記載の他の VLP、すなわち GA、BKV、HBcAg および AP205 を処置した。あるいは、Qβ VLP および AP205 VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 実施例 11 に記載のように処置した。AP205 VLP (1 mg/ml) を 20 mM Hepes pH 7.4 または 20 mM Hepes、1 mM Tris、pH 7.4 で、48 時間 2.5 mM ZnSO4 50℃で Eppendorf テルモミキサー中 550 rpm で処置した。Qβ および AP205 VLP サンプルを実施例 Example 11 に記載のように澄明にし、上澄みを 10.000 MWCO Spectra/Por（商標）透析チュービング (Spectrum, Cat. nr. 128 118) で第１ 2 の l 20 mM Hepes、pH 7.4 で 2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜透析した。サンプルを透析後、実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
【０３４７】
ISS の RnaseA および ZnSO4 処置 VLP への充填 
RNA 加水分解および透析の後に Qβ および AP205 VLP (1-1.5 mg/ml) を ml の VLP につき 130 μl の CpG オリゴヌクレオチド (NKCpG、G10-PO につき参照、表 2; G3-6、G8-8 につき 表 3; 1 mM オリゴヌクレオチド・ストック、10 mM Tris pH 8) と混合した。サンプルを 3 時間 37℃で熱攪拌機中 650 rpm でインキュベートした。ついで、サンプルを 125 U ベンゾナーゼ/ml VLP (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) で 2 mM MgCl2 の存在下で処置し、3 時間 37℃で透析の前にインキュベートした。サンプルを 300.000 MWCO Spectra/Por（登録商標）透析チュービング (Spectrum, Cat. nr. 131 447) 20 mM Hepes、pH 7.4 で 2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載ように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
【０３４８】
免疫原性ペプチドの ISS 充填 VLP との共役
ISS 充填の Qβ VLP を、C-末端 GGC 伸張 (KAVYNFATM-GGC) (配列番号: 82) を含有する p33 ペプチドと共役して、Qb VLP 中に名称 Qb-ISS-33 VLP を得た。充填 Qβ VLP を 20 mM Hepes、pH 7.4 で、10-倍モル過剰の SMPH (Pierce) で 0.5 時間 25℃で誘導化し、２透析工程各 2 時間 20 mM HEPES pH 7.4、4℃ で透析し、非処置の SMPH を除去した。ペプチドを 5-倍モル過剰の誘導混合物に加え、2 時間テルモミキサー中 25℃で反応せしめた。サンプルを 300.000 MWCO Spectra/Por（登録商標）透析チュービング中 20 mM Hepes pH 7.4、2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。ペプチド p33 の Qβとの共役を SDS-PAGE で、16% PAGE Tris-グリシンゲル (Novex（登録商標）、Invitrogen、Cat. No. EC64952) で分析した。これには 2% SDS および β-メルカプトエタノール または DTT を含有するサンプル緩衝液を用いた。充填を 1% アガロースゲル上で、およびプロテアーゼ K 消化後に、実施例７に記載のように TBE/尿素ゲル上で分析した。
【０３４９】
上記のように G8-8 オリゴヌクレオチドで充填された AP205 VLP (1.24 mg/ml) を誘導し、N-末端 C 伸張 (c GHGHSYTTAE ELAGIGILTV) (配列番号: 55) を含有するメランA 16-35 A/L に共役し、AP205-G8-8-メランA VLP を得た。AP205 VLP (G8-8 で充填)を、20 mM Hepes pH 7.4 中で、20-倍モル過剰の SMPH で 0.5 時間 25℃で、誘導し、ついで２回 20 mM HEPES、pH 7.4 で 4℃で、透析して、未反応の SMPH を除去した。ペプチドを透析誘導混合物に 10-倍モル過剰で加え、2 時間テルモミキサー中 25℃で反応せしめた。サンプルを 10.000 MWCO 透析チュウビング中で、20 mM Hepes pH 7.4 に対し 2 時間 4℃で透析し、緩衝液交換の後、一夜同じ緩衝液で透析した。透析後サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。ペプチド・メランA 16-35 A/L の AP205 に対する共役効率を SDS-PAGE により 16% PAGE Tris-グリシンゲル上で解析した。AP205 中に充填の G8-8 オリゴヌクレオチド 1% アガロースゲル上で解析し、プロテアーゼ K 消化後に、AP205-G8-8-メランA 16-35 A/L 中の G8-8 オリゴヌクレオチド量を TBE/尿素ゲルで実施例７に記載のように解析した。
【０３５０】
RNAseA および ZnSO4-処置 Qβ VLP の NKCpG 充填を、p33 ペプチドとの共役の前および後に、アガロースゲル電気泳動で解析した。NKCpG オリゴヌクレオチドを含有し、そして後に p33 ペプチドに共役された Qβ VLP を Qb-NKCpG-33 VLP とよぶ。1 % アガロースゲル上で、エチジウムブロマイド染色ゲル上で可視の蛍光バンドが、充填を表すクーマシーブルー染色ゲル上で可視のタンパク質バンドとともに共移動する。すなわち、充填に際し、両 RNaseA および ZnSO4 処置 Qβ VLP が NKCpG オリゴヌクレオチドを、p33 ペプチドとの共役の前および後に含有する。p33 ペプチドの共役効率が、16 % PAGE Tris-グリシンゲルに対する SDS-PAGE 解析後に可視の複数の共役産物から、ペプチドと反応しなかった残りの Qβ VLP サブユニット・モノマーよりも遅いバンド移動として判定できるように、維持された。充填効率は、TBE/尿素ゲルの解析から、充填 Qb-NKCpG-33 レーンに由来のオリゴヌクレオチドのシグナルを同じゲル上で保持されるオリゴヌクレオチド標準のシグナルと比較することにより評定できる。NKCPG の充填量は 1 〜 4 nmol/100 μg Qb-NKCpG-33 VLP であった。
【０３５１】
G8-8 オリゴヌクレオチドの Qβ VLP への充填およびつづく p33 ペプチドとの共役をアガロースゲル電気泳動で解析した。G8-8 オリゴヌクレオチドを含有し、ついで p33 ペプチドに共役された Qβ VLP を Qb-G8-8-33 VLP とよぶ。G8-8 充填の Qβ VLP のエチジウムブロマイド染色を、エチジウムブロマイドで染色された 1 % アガロースゲル上で見ることができる。エチジウムブロマイド蛍光バンドの、クーマシーブルーでついで染色された同じゲル上で可視の Qβ VLP タンパク質バンドとの共移動が充填を表す。共役効率は、30% であると、SDS-PAGE 分析により 16 % PAGE Tris-グリシンゲル上で判定できた。Qb-G8-8-33 VLP の G8-8 内容物の解析を 1% アガロースゲルでおこなった。充填されたオリゴヌクレオチド量は約 1 nmol/100 μg Qb-G8-8-33 VLP であった。
【０３５２】
G8-8 オリゴヌクレオチドの AP205 VLP への充填をアガロースゲル電気泳動で解析した。G8-8 充填の AP205 VLP の染色を、エチジウムブロマイドで染色された 1 % アガロースゲルでみることができる。ついでクーマシーブルー染色された同じゲル上の AP205 VLP タンパク質バンドの共移動が充填を表した。メランA 16-35 A/L ペプチドとの共役効率を SDS-PAGE 分析により 16 % PAGE Tris-グリシンゲルで評定した。そこでは、ペプチドと反応せずに残る AP205 VLP モノマー・サブユニットよりも遅い移動の複数の共役バンドを見ることができる。共役効率を Qb-G8-8-33 VLP について得られた共役効率と比較する。メランA 16-35 A/L との共役後の AP205 VLP の G8-8 オリゴヌクレオチド内容物についての解析を TBE/尿素ゲル電気泳動で見ることができる。.
【０３５３】
実施例１３
免疫刺激性グアノシン側有オリゴヌクレオチドの VLP への充填
Qbx33 VLP (ペプチド p33 に共役された Qβ VLP、参照、実施例 9) を RNaseA で低イオン条件で (20 mM Hepes pH 7.4)、実施例 9 に記載のように処置し、Qbx33 VLP の RNA 内容物を加水分解した。20 mM Hepes pH 7.4 での透析後、Qbx33 VLP をグアノシン側有オリゴヌクレオチド (表 2: G10-PO、表 3: G3-6、G7-7、G8-8、G9-9 または G6、10 mM Tris pH 8 中の 1 mM オリゴヌクレオチド・ストック由来) と混合し、実施例 12 に記載のようにインキュベートした。ついで、Qbx33 VLP をベンゾナーゼで処置し、300.000 MWCO チュービング中で透析した。オリゴ G7-7、G8-8 および G9-9 をもつサンプルを、3 日間 4 緩衝液交換して強く透析し遊離のオリゴを除去した。充填を、1% アガロースゲル上で、そしてプロテアーゼ K 消化後に TBE/尿素ゲル上で実施例 7 記載のように分析した。
【０３５４】
表 3. 実施例において使用された免疫刺激性核酸の配列
【表３】
2006523189.tif 000004
【０３５５】
RNaseA 処置 Qbx33 VLP 中の G3-6、G6、G8-8 オリゴヌクレオチドの充填をアガロースゲル電気泳動で解析した。オリゴヌクレオチド充填において、参照の非処置 Qβ VLP よりもわずかに遅い蛍光バンド移動が、オリゴヌクレオチドの存在を示すエチジウムブロマイドで染色された 1 % アガロースゲル上で可視となる。シグナルはベンゾナーゼ処置後に保持され、オリゴヌクレオチドの Qbx33 VLP 中の充填を示す。充填効率は TBE/尿素ゲル電気泳動から評定できる。充填された G3-6 オリゴヌクレオチドの量 (約 4 nmol/100 μg Qbx33 VLP) は、充填された G8-8 オリゴヌクレオチドの量 (約 1 nmol/100 μg Qbx33 VLP) よりも非常に高い。このことは、CpG モチーフを挟むグアノシンヌクレオチド・テイルの長さに対する充填能の依存性を示す。
【０３５６】
実施例１４
リボ核酸の VLP への充填
VLP の核酸内容物の ZnSO4 依存性減成
Qβ VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件 (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) で、実施例 11 に記載のように処置した。AP205 VLP (1 mg/ml) を 20 mM Hepes pH 7.4 または 20 mM Hepes、1 mM Tris、pH 7.4 で 48 時間 2.5 mM ZnSO4 で 50℃、Eppendorf テルモミキサー中 550 rpm で処置した。Qβ および AP205 VLP サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、20 mM Hepes、pH 7.4 で実施例 12 のように透析した。
【０３５７】
ポリ (I:C) の ZnSO4-処置 VLP への充填
免疫刺激性リボ核酸ポリ (I:C) (Cat. nr. 27-4732-01、ポリ(I)ポリ(C)、Pharmacia Biotech) を PBS (Invitrogen cat. nr. 14040) または水に濃度 4 mg/ml (9μM) まで溶解した。ポリ (I:C) を 10 分間 60℃でインキュベートし、ついで 37℃に冷やした。インキュベート・ポリ (I:C) を 10-倍モル過剰で ZnSO4-処置 Qβまたは AP205 VLP (1-1.5 mg/ml) に加え、混合物を 3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm でインキュベートした。ついで、過剰の遊離ポリ (I:C) を、VLP 混合物 ml 当たり 125 U ベンゾナーゼで、2 mM MgCl2 の存在下、 3 時間 37℃でテルモミキサー中 300 rpm でインキュベートして酵素的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解で、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みを 300.000 MWCO Spectra/Por（登録商標）透析チュービング (Spectrum, Cat. nr. 131 447) で 2 l 20 mM Hepes、pH 7.4 で 2 時間 4℃で透析し、さらに緩衝液交換後、同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
【０３５８】
免疫原性ペプチドのポリ (I:C) 充填 VLP との共役
ポリ (I:C) で充填された Qβ VLP (1 mg/ml) を誘導し、実施例１２記載の p33 ペプチド (KAVYNFATM-GGC) (配列番号: 82) またはメランA ペプチド (メランA 16-35A/L CGHGHSYTTAEELAGIGILTV) (配列番号: 55) と共役した。これらはそれぞれ Qb-pIC-33 および Qb-pIC-メランA VLP となる。メランA ペプチドとの共役のために、充填される Qβ VLP を 2.1-倍モル過剰の SMPH (Pierce) で 0.5 時間 25℃で誘導し、ついで 20 mM HEPES、pH 7.4、4℃で透析を行って、未反応 SMPH を除いた。ペプチドを 2.1-倍モル過剰で加え、1.5 時間テルモミキサー中 25℃で反応せしめた。サンプルを 300.000 MWCO Spectra/Por（登録商標）CE Dispo Dialyzer により 20 mM Hepes、pH 7.2、3 時間 4℃で透析し、緩衝液を交換後一夜、同じ緩衝液に対して透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。ペプチド p33 およびペプチド・メランA の Qβとの共役を SDS-PAGE により 16% PAGE Tris-グリシンゲルで分析した。充填を、1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後、TBE/尿素ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
【０３５９】
ポリ (I:C) の ZnSO4 処置 Qβ VLP への充填および メランA ペプチドとの共役で得られる Qb-pIC-メランA VLP をアガロースゲル電気泳動で解析した。エチジウムブロマイド染色の 1 % アガロースゲル上で可視である蛍光シグナルは、核酸の存在を示し、充填を表すクーマシーブルー染色のゲル上で可視となるタンパク質バンドと共移動する。メランA ペプチドの共役効率を SDS-PAGE 分析により 16 % PAGE Tris-グリシンゲルで評定した。複数の共役産物が、ペプチドと反応しなかった Qβ VLP モノマー・サブユニットよりも遅く移動するバンドとして、可視であった。メランA の共役効率は、Qb-G8-8-33 VLP (実施例 12) について得られた共役効率に概して匹敵した。しかしやや遅い。Qb-pIC-メランA への充填効率を TBE/尿素ゲルから評定できた。ポリ (I:C) の Qβ 中への充填量は約 25 pmol であり、メランA 共役と同じに留まった。
【０３６０】
ポリ (I:C) で充填された AP205 VLP (1 mg/ml) を誘導し、N-末端 C 伸張 (cGHGHSYTTAE ELAGIGILTV) (配列番号: 55) を含有するメランA 16-35 A/L と共役し、AP205-G8-8-メランA VLP を得た。AP205 VLP を 20 mM Hepes、pH 7.4 中で、20-倍モル過剰の SMPH で 0.5 時間 25℃で誘導し、ついで２回 20 mM HEPES pH 7.4、4℃ で透析して、未反応の SMPH を除去した。ペプチドを透析誘導混合物に 10-倍モル過剰で加え、2 時間テルモミキサー中 25℃で反応せしめた。サンプルを 10.000 MWCO 透析チュービング中 20 mM Hepes pH 7.4、2 時間 4℃で透析し、緩衝液の交換後、一夜同じ緩衝液に対し透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。ペプチド・メランA 16-35 A/L の AP205 との共役効率を SDS-PAGE により 16% PAGE Tris-グリシンゲルで解析した。ポリ (I:C) 充填を 1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後 TBE ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
【０３６１】
ポリ (I:C) の ZnSO4 処置 AP205 VLP への充填およびメランA との共役後の共役産物 AP205-pIC-メランA をアガロースゲル電気泳動で解析した。メランA ペプチドの共役効率を、ペプチドと反応しない AP205 VLP サブユニット・モノマーよりも遅く移動するバンドとして、可視の複数の共役産物の出現から、SDS-PAGE 分析により 16 % PAGE Tris-グリシンゲル電気泳動で評定した。充填効率は TBE ゲルから評定できる。
【０３６２】
実施例１５
免疫刺激性グアノシン側有のオリゴヌクレオチドの HBcAg VLP への充填
HBcAg VLP を RNaseA で低イオン強度条件 (20 mM Hepes pH 7.4) で実施例 9 に記載のように処置し、VLP の RNA 内容物を加水分解した。20 mM Hepes、pH 7.4 での透析後、VLP をグアノシン側有のオリゴヌクレオチド (表 3; G3-6、G7-7、G8-8、G9-9、G10-PO または G6、10 mM Tris pH 8 中の 1 mM ストックより) と混合し、実施例 12 に記載のようにインキュベートした。ついで、VLP をベンゾナーゼで処置し、300.000 MWCO チュービング中で透析した。充填を、1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後、TBE/尿素ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
【０３６３】
実施例１６
免疫刺激性グアノシン側有のオリゴヌクレオチドの GA VLP への充填
GA VLP を RNaseA で低イオン条件 (20 mM Hepes pH 7.4) で実施例 9 に記載のように処置し、VLP の RNA 内容物を加水分解した。20 mM Hepes pH 7.4 での透析後、VLP をグアノシン側有のオリゴヌクレオチド (表 3; G3-6、G7-7、G8-8、G9-9、G10-PO または G6、10 mM Tris pH8 中 1 mM ストックから)と混合し、実施例 12 に記載のようにインキュベートした。ついで、VLP をベンゾナーゼで処置し、300.000 MWCO チュービング中で透析した。充填を 1% アガロースゲル上で、プロテアーゼ K 消化後、TBE/尿素ゲル上で、実施例 7 に記載のように解析した。
【０３６４】
実施例１７
リボ核酸の HBcAg VLP への充填
HBcAg VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 実施例 11 に記載のように処置し、20 mM Hepes pH 7.4 で実施例 12 のように透析した。ポリ (I:C) を 10-倍モル過剰で HBcAg VLP (1-1.5 mg/ml) に加え、3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm で実施例 14 に記載のようにインキュベートした。ついで、過剰の遊離ポリ (I:C) を、ml VLP 混合物あたり 125 U ベンゾナーゼとのインキュベーションにより 2 mM MgCl2 の存在下、3 時間 37℃でテルモミキサー中 300 rpm で酵素的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、実施例 14 のように透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析により測定した。ポリ (I:C) で充填された HBcAg VLP (1 mg/ml) を誘導し、メランA に共役し、実施例 14 のように透析した。
【０３６５】
実施例１８
リボ核酸の GA VLP への充填
GA VLP を ZnSO4 で低イオン強度条件で (20 mM Hepes pH 7.4 または 4 mM Hepes、30 mM NaCl、pH 7.4) 実施例 11 に記載のように処置し、20 mM Hepes pH 7.4 で実施例 12 のように透析した。ポリ (I:C) を 10-倍モル過剰で GA VLP  (1-1.5 mg/ml) に加え、3 時間 37℃でテルモミキサー中 650 rpm で実施例 14 に記載のようにインキュベートした。ついで、過剰の遊離ポリ (I:C) を、ml VLP 混合物あたり 125 U ベンゾナーゼとのインキュベーションにより 2 mM MgCl2 の存在下、3 時間 37℃でテルモミキサー中 300 rpm で酵素的に加水分解した。ベンゾナーゼ加水分解後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、実施例 14 のように透析した。透析後、サンプルを実施例 11 に記載のように澄明にし、上澄みのタンパク質濃度を Bradford 分析により測定した。ポリ (I:C) で充填された GA VLP  (1 mg/ml) を誘導し、メランA に共役し、実施例 14 のように透析した。
【０３６６】
実施例１９
オリゴデオキシヌクレオチドの Qβ 解集合、再集合および充填
Qβ VLP の解集合および再集合
解集合: 45 mg Qβ VLP (2.5 mg/ml、Bradford 分析により測定) を PBS (20 mM ホスフェート、150 mM NaCl、pH 7.5) 中で、10 mM DTT で 15 分間室温、攪拌条件で還元した。塩化マグネシウムの添加後、最終濃度 700 mM で、第２インキュベーションを 15 分間室温、攪拌条件で行い、被膜に囲まれた宿主細胞 RNA および VLP の付随的非組み込みの沈降を導く。沈降した RNA を溶液から除くために、溶液を 10 分間 4000 rpm、4 ℃ (Eppendorf 5810 R、固定角回転翼 A-4-62、下記の全工程で使用) で遠心分離した。放出ダイマー Qβ コート・タンパク質を含有する上澄みを、クロマトグラフィー精製工程に使用した。
【０３６７】
Qβ VLP についての２工程精製法
カチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによる Qβ コート・タンパク質：ダイマー・コート・タンパク質、宿主細胞タンパク質および残渣の宿主細胞 RNA を含有する解集合反応の上澄みを SP-Sepharose FF カラム (xk16/20、6 ml、Amersham Bioscience) にかけた。室温で流速 5 ml/min での操作中、吸収 260 nm および 280 nm をモニターした。カラムを 20 mM リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7 で平衡にし、コート・タンパク質のカラムへの適当な結合を達成するために、サンプルを 1:15 水中で伝導性 10 mS/cm 以下に調整した。結合コート・タンパク質の溶出を 20 mM リン酸ナトリウム / 500 mM 塩化ナトリウムの傾斜工程で行い、タンパク質をフラクション量で約 25 ml 収集した。カラムを 0.5 M NaOH で再生成した。
【０３６８】
第２工程において、単離された Qβ コート・タンパク質ダイマー (カチオン交換カラムからの溶出フラクション) を (２回)、20 mM リン酸ナトリウム / 250 mM 塩化ナトリウム; pH 6.5 で平衡にされた Sephacryl S-100 HR カラム (xk26/60、320 ml、Amersham Bioscience) にかけた。クロマトグラフィーを室温で流速 2.5 ml/min で行った。吸収を 260 nm および 280 nm でモニターした。フラクション 5 ml を収集した。カラムを 0.5 M NaOH で再生成した。
【０３６９】
透析による再集合：精製 Qβ コート・タンパク質ダイマーのストック溶液、濃度 2 mg/ml を、Qβ VLP の再集合のためにオリゴデオキシヌクレオチド G8-8 または G10-PO の存在で使用した。再集合混合物中のオリゴデオキシヌクレオチド濃度は 10 μM であった。再集合混合物中のコート・タンパク質ダイマー濃度は 40 μM (約 1.13 mg/ml) であった。この溶液に尿素および DTT のストック溶液を加えて、各々最終濃度 1 M 尿素および 5 mM DTT を得た。オリゴデオキシヌクレオチドを最終成分として H2O とともに加え、再集合反応の最終量 3 ml を得た。この溶液を、4 ℃ 72 時間で、20 mM TrisHCl、150 mM NaCl 含有の 1500 ml 緩衝液に対し pH 8.0 で透析した。透析された再集合混合物を 14 000 rpm で 10 分間 4 ℃で遠心分離した。わずかな沈降物を捨て、一方、上澄みが、再集合されかつ充填された VLP を含有していた。再集合されかつ充填された VLP を遠心フィルター器 (Millipore, UFV4BCC25, 5K NMWL) で最終タンパク質濃度 3 mg/ml に濃縮した。タンパク質濃度を Bradford 分析で測定した。
【０３７０】
サイズ排除クロマトグラフィーによる、集合されかつ充填された VLP の精製：10 mg までの全タンパク質を、20 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4 で平衡にされた Sepharose（商標）CL-4B カラム (xk16/70、Amersham Biosciences) に保持した。クロマトグラフィーを室温、流速 0.4 ml/min で行った。吸収を 260 nm および 280 nm でモニターした。２ピークを観測し、フラクション 0.5 ml サイズを収集し、SDS-PAGE で分析した。再集合および精製 Qβ キャプシド中のジスルフィド結合パターンを非還元 SDS-PAGE で分析した。5 μg の表示キャプシドを、還元剤を含まないで、16% Tris-グリシンに保持されたサンプル緩衝液 (SDS を含有) と混合した。操作後に、ゲルをクーマシーブルーで染色した。E.coli から精製された “無傷” キャプシドに比べると、再集合 Qβ VLP は、Qβ コート・タンパク質のダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーおよびヘキサマーに対応するバンドで同じジスルフィド結合パターンを表した。E. coli からの無傷および高度精製 Qβキャプシドでのカラムの校正は、主要な第１ピークの現出分子量が Qβ キャプシドと一致することを示した。
【０３７１】
透析ろ過による再集合 (最適化方法): 20 ml の精製コート・タンパク質のストック溶液 (1.5 mg/ml) を尿素、DTT、オリゴデオキシヌクレオチド G10-PO および水のストック溶液と混合した。オリゴデオキシヌクレオチドを最終成分として加えた。混合物の量は 30 ml であり、成分の最終濃度は、35 μM ダイマー・コート・タンパク質 (反射 1 mg/ml)、35 μM オリゴデオキシヌクレオチド、1 M 尿素および 2.5 mM DTT であった。混合物を 300 ml の 20 mM リン酸ナトリウム / 250 mM 塩化ナトリウム、pH 7.2 で接線流ろ過器中、室温で、Pellicon XL 膜カートリッジ (Biomax 5K, Millipore) を用いて、透析ろ過した。全流速を 10 ml/min に設定し、恒常流速を 2.5 ml/min に設定した。透析ろ過工程が完了した後、H2O2 を溶液に最終濃度 7 mM にまで加え、溶液をさらに室温で 60 分間インキュベートし、形成された VLP における構造的ジスルフィド結合の形成を加速した。組み込まれていないオリゴデオキシヌクレオチドおよびコート・タンパク質の除去を第２透析ろ過により 600 ml の 20 mM リン酸ナトリウム / 250 mM 塩化ナトリウム、pH 7.2 で、Pellicon XL 膜カートリッジ (PLCMK 300K, Millipore) を用いて行った。
【０３７２】
オリゴデオキシヌクレオチドの存在で再集合された Qβ VLP の解析：
A)  再集合キャプシドの水力学サイズ：オリゴデオキシヌクレオチド G8-8 の存在で再集合された Qβ キャプシドを動的光拡散法 (DLS) により解析し、E.coli から精製された無傷の Qβ VLP と比較した。再集合キャプシドは、無傷 Qβ VLP と同じ水力学サイズ (質量および配座の両方に依存) を示した。
【０３７３】
B)  再集合キャプシドにおけるジスルフィド結合の形成：再集合 Qβ VLP を非還元 SDS-PAGE で解析し、、E.coli から精製された無傷の Qβ VLP と比較した。再集合キャプシドは、コート・タンパク質のジスルフィド結合のペンタマーおよびヘキサマー形態の存在をもって、無傷 Qβ VLP (上記) に類似のバンド・パターンを表す。
【０３７４】
C)  オリゴデオキシヌクレオチドの存在で再集合された Qβ VLP の核酸内容物についての、変性ポリアクリルアミド TBE-尿素ゲル電気泳動による解析：G8-8 オリゴデオキシヌクレオチドを含有する再集合 Qβ VLP (0.4 mg/ml) を 2 時間 37℃で、ml Qβ VLP あたり 125 U ベンゾナーゼとともに 2 mM MgCl2 の存在下インキュベートした。ついで、ベンゾナーゼ処置 Qβ VLP をプロテアーゼ K (PCR-grade, Roche Molecular Biochemicals, Cat. No. 1964364) で実施例 7 のように処置した。反応物をついで TBE-尿素サンプル緩衝液と混合し、15 % ポリアクリルアミド TBE-尿素ゲル (Novex（登録商標)、Invitrogen Cat. No. EC6885) 上に保持した。定性および定量標準として、再集合反応に使用した 1 pmol、5 pmol および 10 pmol のオリゴデオキシヌクレオチドを同じゲル上に保持した。このゲルを SYBR（登録商標)-Gold (Molecular Probes Cat. No. S-11494) で染色した。SYBR（登録商標)-Gold 染色は、再集合 Qβ キャプシドが、再集合反応に用いたオリゴデオキシヌクレオチドと共移動する核酸を含有することを示した。オリゴデオキシヌクレオチドの存在で再集合された Qβ VLP の核酸内容物のベンゾナーゼ消化に対する抵抗性およびプロテアーゼ K 消化による精製粒子からのオリゴデオキシヌクレオチドの単離が、相まってオリゴデオキシヌクレオチドの充填を表す。
【０３７５】
実施例２０
メランA 黒色腫抗原から誘導されたペプチドの Qb との共役
表 4. 下記のメランA ペプチド部分を化学的に合成した：
【表４】
2006523189.tif 000005
* A/L は、元の野生型メランA ペプチドに比してアラニンからリシンへの交換を表す。
** リンカー配列からのアミノ酸を小文字で表す。
【０３７６】
下記の方法をメランA ペプチド部分の Qb VLP との化学的共役のために使用した。ペプチド・メランA 16-35、メランA 16-35 A/L および メランA 26-35-C A/L について：2 ml の 3.06 mg/ml Qb VLP の 20 mM Hepes、pH 7.2 の溶液を 30 分間、18.4 μl の 50 mM SMPH (サクシニミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアヘキサノエート、Pierce) DMSO 溶液と 25℃で揺動シェーカーで反応せしめた。反応溶液をついで２回 2 時間 2 L の 20 mM Hepes、pH 7.2、4℃で透析した。ついで、2 ml の透析された反応混合物を 18.4 μl の 50 mM ペプチド・ストック溶液 (DMSO 中) ２時間 25 ℃で揺動シェーカーで反応せしめた。ついで、反応混合物を 2x 2 時間 2 リットルの 20 mM Hepes、pH 7.2 で 4℃で透析した。共役された産物を Qb-メランA 16-35 (配列番号: 54)、Qb-メランA 16-35 A/L (配列番号: 55) および Qb-メランA 26-35-C A/L (配列番号: 60) と名付けた。
【０３７７】
メランA 26-35 について： 2 ml の 3.06 mg/ml Qb キャプシド タンパク質 の 20 mM Hepes、pH 7.2 の溶液を 30 分間、75.3 μl の 50 mM SMPH の DMSO 溶液と 25℃で揺動シェーカーで反応せしめた。反応溶液をついで２回 2 時間 2 L の 20 mM Hepes、pH 7.2、4℃で透析した。ついで、2 ml の透析された反応混合物を 37.7 μl の 50 mM ペプチド・ストック溶液 (DMSO 中) ４時間 25 ℃で揺動シェーカーで反応せしめた。ついで、反応混合物を 2x 2 時間 2 リットルの 20 mM Hepes、pH 7.2 で 4℃で透析した。共役された産物を Qb-メランA 26-35 と名付けた。
【０３７８】
メランA 26-35 A/L (配列番号: 57) について：2 ml の 3.06 mg/ml Qb VLP の 20 mM Hepes、pH 7.2 の溶液を 30 分間、37.7 μl の 50 mM SMPH の DMSO 溶液と 25℃で揺動シェーカーで反応せしめた。反応溶液をついで２回 2 時間 2 L の 20 mM Hepes、pH 7.2、4℃で透析した。ついで、2 ml の透析された反応混合物を 18.4 μl の 50 mM ペプチド・ストック溶液 (DMSO 中) ４時間 25 ℃で揺動シェーカーで反応せしめた。ついで、反応混合物を 2x 2 時間 2 リットルの 20 mM Hepes、pH 7.2 で 4℃で透析した。共役された産物を Qb-メランA 26-35 A/L と名付けた。
【０３７９】
メランA 20-40 A/L (配列番号: 58) について：2 ml の 3.06 mg/ml Qb VLP の 20 mM Hepes、pH 7.2 の溶液を 30 分間、18.4 μl の 50 mM SMPH の DMSO 溶液と 25℃で揺動シェーカーで反応せしめた。反応溶液をついで２回 2 時間 2 L の 20 mM Hepes、pH 7.2、4℃で透析した。ついで、2 ml の透析された反応混合物を 184 μl の 5 mM ペプチド・ストック溶液 (DMSO 中) ４時間 25 ℃で揺動シェーカーで反応せしめた。ついで、反応混合物を 2x 2 時間 2 リットルの 20 mM Hepes、pH 7.2 で 4℃で透析した。共役された産物を Qb-メランA 20-40 A/L と名付けた。
【０３８０】
メランA 26-40 A/L (配列番号: 59) について：2 ml の 3.06 mg/ml Qb VLP の 20 mM Hepes、pH 7.2 の溶液を 30 分間、37.7 μl の 50 mM SMPH の DMSO 溶液と 25℃で揺動シェーカーで反応せしめた。反応溶液をついで２回 2 時間 2 L の 20 mM Hepes、pH 7.2、4℃で透析した。ついで、2 ml の透析された反応混合物を 184 μl の 5 mM ペプチド・ストック溶液 (DMSO 中) ４時間 25 ℃で揺動シェーカーで反応せしめた。ついで、反応混合物を 2x 2 時間 2 リットルの 20 mM Hepes、pH 7.2 で 4℃で透析した。共役された産物を Qb-メランA 26-40 A/L と名付けた。
【０３８１】
共役効率を SDS-PAGE 分析で調べた。図 1 は、Qb-メランA VLP の SDS-PAGE 分析を示す。メランA-ペプチドが Qb VLP と共役された。最終産物をサンプル緩衝液と混合し、還元条件で 16 % Novex（登録商標）Tris-グリシンゲルで 1.5 時間 125 V で分離した。分離されたタンパク質をクーマシーブルー溶液中攪拌しながら染色した。背景の染色を 50 % メタノール、8% 酢酸中でのゲル洗浄で除去した。分子量マーカー (P 77085, New England BioLabs, Beverly, USA) を Qb-メランA 移動速度の参考として用いた (レーン 1)。14 μg の Qb 単独 (レーン 2) または SMPH で誘導された Qb (レーン 3) を、8 μg の下記の各産物との比較のために保持した：Qb-メランA 16-35 (レーン 4)、Qb-メランA 16-35 A/L (レーン 5)、Qb-メランA 26-35 (レーン 6) および Qb- メランA 26-35 A/L (レーン7)。
【０３８２】
メランA 16-35 A/L ペプチドが細胞毒性 T リンパ球 (CTL) エピトープ・メランA 26-35 を含有し、Qb-メランA 16-35 A/L を、その免疫原性についてインビトロおよびインビボでさらに試験した。
【０３８３】
実施例２１
Qβ メランA 16-35 A/L VLP を樹枝状細胞でプロセスし、それらをインビトロで T 細胞に提示する
インビトロでのメランA-特異的 T 細胞の生成
Qb-メランA 16-35 A/L ワクチンの免疫原性を調べるために、メランA-特異的 T 細胞をインビトロで生成せしめた。HLA-A2 健常ボランティアからの未熟単球-誘導の樹枝状細胞 (DC) を上記 (Salusto, F. et al. 1994, J.Exp. Med.179:1109) のように生成せしめた。DC (0.5x106/ウエル) を擬製かまたは 40 μg/ml Qb-メランA 16-35 A/L とともに 2 時間 37℃でパルスした。メランA-特異的 CTL 前駆体の頻度を増すために、自己 CD8 T 細胞を PBMC から磁気ソーティング (Miltenyi Biotech)により単離した。1x106/ウエル CD8 T 細胞を抗原パルス DC に加えた。IL-2 を細胞培養に日 3、濃度 10 U/ml で補充し、50 U/ml に日 12 までに増加した。
【０３８４】
細胞系におけるメランA-特異的 CD8 T 細胞の広がりを、メランA 26-35 ペプチド (HLA-A2-メランA-PE) と保持された HLA-A2 からつくられたフィコエリトリン (PE)-標識テトラマーでの染色により、前に発表されている (Romero, P. et all, 1998, J.Exp. Med. 1998, 188:1641) のように調べた。細胞を 1 時間、室温で HLA-A2-メランA 26-35-PE で標識し、アンチ-CD8-FITC 抗体 (BD PharMingen, San Jose, USA) を 30 分間氷上で加えた。洗浄後、細胞を Cell Quest ソフトウエアーを用いる FACS Calibur で解析した。細胞に前面拡散および側面拡散を要しリンパ球をゲートした。このリンパ球集団から CD8 ポジティブ T 細胞のみをさらなる解析のために選択した。メランA-特異的 CD8+ T 細胞の量を、 HLA-A2-メランA ポジティブ細胞の CD8+ リンパ球に対する％として計算した。Qb-メランA 16-35 A/L ワクチンがメランA 26-35 A/L-特異的 CTL の増殖を誘発し(9.7% の CD8 T 細胞)、ワクチンが効率的に取り上げられ、CTL エピトープ (メランA 26-35 A/L) にプロセスされ、ヒト DC により T 細胞に提示されたことを示した。
【０３８５】
メランA CTL を、FACS ソーティング (FACSVantage, Becton Dickenson) により富化し、以前の報告のように (Knuth, A. 1989, PNAS, 86:2804) 制限的希釈でクローン化した。CTL クローンを HLA-A2-メランA-PE テトラマーのポジティブ染色について選択した。CTL をフィトヘマグルチン活性化非定型刺激 PBMC で周期的に再刺激した。
【０３８６】
CTL クローンによる抗原再認識の検定
51Cr 放出 アッセイを行って、メランA CTL クローンの機能的活性を解析した。APC を 1.5 時間、10-6M メランA 26-35 A/L ペプチドまたはネガティブ対照としての 10-6M インフルエンザ M1 ペプチドとインキュベートした。APC を Cr51 とインキュベートして、放射ヌクレオチドの非特異的摂取をペプチド・パルス時に測定した。残存の抗原および放射活性を除くために強く洗った後、104/ウエル APC を種々のメンバーのメランA-特異的 T 細胞と 5 時間インキュベートした。上澄みを集め、メランA-特異的 T 細胞によるメランA-提示 APC の特異的分解を下記の式で計算した：
% 特異的分解 = ((cpm 実験値 - cpm 自発値) / (cpm 最大値  cpm 自発値)) x100 
式中、実験値は、実験サンプル中で測定された放射活性カウントであり、cpm 自発値は、T 細胞の付加なしに 51Cr でパルスされた APC から得られたカウントであり、cpm 最大値は、1% NP-40 で分解された 51Cr-パルス APC から得られたカウントである。
【０３８７】
メランA 26-35 A/L 保持であるが、無関係の M1 ペプチドを保持しない APC を効率的に CTL で分解した (70-85% 特異的分解)。これは CTL クローンの抗原特異性を確認できる。
【０３８８】
実施例２２
ヒト細胞をインビトロで活性化する免疫刺激性配列 (ISS) の能力
Qb-メランA ワクチン中に保持される最適の ISS を選択するために、異なるメンバーのフランキング Gs または 二本鎖 RNA、例えば ポリ (I:C) をもつ CpG を、ヒト CD8 T 細胞に対する CD69 を上方調整する能力およびヒト PBMC において IFN α の分泌を誘導する能力について試験した。
【０３８９】
ヒト PBMC をバッフィーコートから単離し、表示の ISS で、10% FCS を含有する RPMI 培地において 18 時間処置した。上澄み中の IFN αを ELISA により、PBL Biomedical Laboratories より提供された抗体セットを用いて、測定した。PBMC をマウス・アンチ-ヒト CD8-FITC、マウス・アンチ-ヒト CD19-PE および アンチ-ヒト CD69-APC で染し、フローサイトメトリーで分析した。G10-PO が IFN α分泌を誘導するのに最も活性の ISS であった (図 2A)。G9-9 および G8-8 は G10-PO よりもやや活性が劣ったが、これらは高レベルの IFN α分泌を誘導した。他のオリゴヌクレオチドにおいてフランキング Gs の数を減らすと、IFN α分泌が低くなった。ポリ (I:C)-処置 PBMC はいかなる IFN αも放出しなかったが、PBMC からのポリ (I:C)-処置 T および B 細胞は CD69 を上方調節した (図 2B)。ポリ (I:C) も IL-12 分泌を PBMC および単球-誘導 DC から誘導した。
【０３９０】
PBMC の G10-PO、G9-9 および G8-8 による処置は、CD8 T 細胞の細胞膜上の CD69 をほぼ同じ程度に上方調節した。他のオリゴヌクレオチドにおけるフランキング Gs の数を減らすと (7 以下)、IFN αの分泌を誘導する能力 (図 2 A) および T 細胞上の CD69 を上方調節する能力 (図 2B) を減じた。これらのデータによると、G10-PO、G9-9 および G8-8 はヒト細胞に対し匹敵する高い活性を有し、従って、Qb-メランA ワクチンにおいて ISS として用い得る。
【０３９１】
実施例２３
メランA-特異的 T 細胞のインビトロ拡大を G10-PO により増加する
メランA 特異的 CTL のインビトロ増殖を誘導する Qb-メランA VLP の能力を G10-PO の存在および不存在で試験した。未熟ヒト単球-誘導 DC (0.5x106/ウエル) を Qb-メランA 16-35 A/L または メランA 26-35 A/L ペプチド または実施例 21 のような擬製でパルスした。ヒト単球-誘導 DC はトル様受容体-9 (TLR-9)-ネガティブであり、従って CpG B 細胞に応答しない、そしてヒト PBMC に存在するプラズマ細胞性 DC は TLR-9 ポジティブであり、CpG 処置 にサイトカインの産生をもって (IFN α、IL-12) 応答する。単球-誘導 DC の抗原提示能に対する G10-PO の役割を調べるために、抗原-パルス DC を洗い、1x106 自己 PBMC と 2 μM G10-PO の存在または不存在で 2 時間インキュベートした。磁気ソーティングにより単離された自己 CD8 T 細胞 (1x106) を APC に加え、12 日間、実施例１２に記載のように細胞培養条件を用いてインキュベートした。メランA-特異的 CTL を HLA-A2-メランA-PE テトラマー染色およびフローサイトメトリーで検出した。G10-PO を Qb-メランA-パルス DC に加えると、特異的 CTL の頻度が増加する (10% から 14% に)。これは、CpG 刺激によりつくられたサイトカイン環境が CTL インビトロ拡大に好都合であることを示す。. 
【０３９２】
実施例２４
G3-6、G6、G10-PO または ポリ (I:C) で保持された Qbx33 VLP は p33-組換えワクシニアウイルス・チャレンジに対する保護を誘導する
B6 マウスの皮下に Qbx33 単独、または G3-6 もしくは G6 もしくは ポリ (I:C) で保持されたに Qbx33 を免疫した (参照、実施例 12 および 14)。８日後マウスを 1.5 x 106 pfu の組換えワクシニアウイルスでチャレンジし、LCMV-p33 抗原を発現する。4 日後、マウスを殺し、卵巣中のウイルス力価を、前に発表されているように (Bachmann et al, Eur. J. Imunol. 1994, 24:2228) 測定した。図 3 に示すように、G3-6 または G6 または ポリ (I:C) で保持される Qbx33 ワクチンを受けたすべてのマウスがウイルス・チャレンジから保護された。これに対し、未処置のマウスおよび Qbx33 単独で免疫されたマウスはウイルスを卵巣から消失せしめなかった。これらのデータからして、VLP 単独は、保護的 CTL 免疫応答を誘導するのに十分でなく、一方、CpG or ポリ (I:C) で保持された VLP はナイーブ CTL を免疫起動するのに非常に効果的である。
【０３９３】
同様に、G10-PO で保持された Qbx33 でのマウスの免疫化は p33-特異的 CTL を免疫起動し (6.2% +/- 1.4% vs 0.2% +/-0.1%、ナイーブマウス中)、そして組換えワクシニアウイルス・チャレンジからの保護を誘導した。
【０３９４】
実施例２５
Qβ メランA 16-35 A/L VLP をプロセスし、ヒト MHC クラス I アレル HLA-A0201 により提示せしめ、機能性メランA-特異的 CD8+T 細胞の拡大を HLA-A2 形質転換マウスにおいて誘導する
HHD マウスを、キメラ１鎖クラス I 分子を、Db α3 ドメインと融合された A2 α1 および α2 ドメインの N-末端に共有結合されたヒトβ2-マイクログロブリンをもって (Firat, H. et al 1999, Eur.J.Immunol., 29:3112) 発現する。このマウスにおける HLA-A2 形質転換発現で、プロセスされ、CTL エピトープ・メランA 26-35 として提示され、そして CTL をインビボで免疫駆動する QβメランA 16-35 A/L VLP の能力を調べ得る。さらに、ISS としてのアジュバントの作用をインビボで試験できる。
【０３９５】
HHD マウスを、未処置のままか、または 100 μg Qb-メランA 16-35 A/L または Qb-pIC-メランA 16-35 A/L の皮下注射で免疫した。８日後、脾臓細胞を単離し、FACS 緩衝液 (PBS、2% FCS、5mM EDTA、pH 8.2) に再懸濁し、HLA-A2-メランA-PE 標識のテトラマーで 30 分間、室温で染色した。第２工程において、ラットのアンチ-マウス CD8-APC (BD PharMingen, San Jose, USA) およびアンチ マウス Mel14-FITC (BD PharMingen, San Jose, USA) を 30 分間 4℃で加えた。赤血球を BD-分解溶液 (BD Biosciences, San Jose, USA) で 10 分間、室温で分解した。最後に、脾臓細胞を、細胞Quest ソフトウエアーを用いる FACS Calibur で解析した。最初に、細胞を正面拡散および側面拡散で得て、リンパ球をゲートした。このリンパ球集団について、CD8 ポジティブ T 細胞のみをさらなる分析のために選択した。The HLA-A2-メランA-PE および Mel14FITC 標識細胞を FL2 および FL1 検出器でそれぞれ測定した。メランA-特異的活性化 CD8+ T 細胞の量を全 CD8+ リンパ球に対する HLA-A2-メランA ポジティブ、Mel14 ネガティブ細胞％として計算した。
【０３９６】
フローサイトメトリー分析によると、Qb-pIC-メランA 16-35 A/L が驚くべき高い拡大のメランA-特異的活性化 CD8+Mel14- T 細胞を誘導した (2.43% および 0.73%)。これは未処置動物 (0.22% および 0.37%) に比して高い。注記すべきは、ワクチン能が、Qb-メランA がポリ (I:C) で保持されたときにのみ、増加したことである。
【０３９７】
上記で使用のヒト HLA-A2-メランA テトラマーは、タンパク質がキメラなので、非常に効率的にはマウス・メランA-特異的 T 細胞に結合しない。従って、これらのマウスにおいて抗原特異的 T 細胞がより高い程度にあると推定できる。
【０３９８】
同様の実験において、CpG および IFA と混合されたペプチドをもつワクチン接種で CTL をインビボ駆動する HLA-A2-メランA ポジティブ、Mel14 ネガティブ細胞の効率を解析した。 HHD マウスを、20 nmol CpG および不完全 Freud's アジュバント (IFA) と混合された 200 μg Qβ-G10-メランA 16-35 A/L または 50 μg メランA 16-35 A/L で免疫するか、未処置のままとした。８日後、生リンパ球を脾臓から単離し、メランA-特異的 CD8+ T 細胞について染色した。染色は、FACS 緩衝液中 1.5 時間 37℃で、メランA 26-35 ペプチドで保持されるキメラ HLA-A2α1α2Kbα3 MHC クラス I 分子に特異的な PE-標識テトラマーで行った。第２工程において、ラットのアンチ-マウス CD8-APC (BD PharMingen, San Jose, USA) および アンチ・マウス Mel14-FITC (BD PharMingen, San Jose, USA) を 30 分間 4℃で加えた。最後に、脾臓細胞を、細胞Quest ソフトウエアーを用いる FACS Calibur で分析した。
【０３９９】
フローサイトメトリー分析によると、Qβ-G10-メランA 16-35 A/L が メランA-特異的活性化 CD8+Mel14- T 細胞の拡大を誘導する (18.2 %)。これは、未処置動物 (2 %) または 20 nmol CpG および IFA と混合された等量のメランA A/L 16-35 を摂取した動物 (2.0 %) よりも高い。注記すべきは、ワクチン能が、Qb-メランA が G10-PO で保持されたときにのみ、増加したことである。
【０４００】
同様の実験において、HHD マウスの、G8-8 または G10 PO で保持される Qb-メランA 16-35 A/L または Qb-メランA 26-35 A/L での免疫は、HLA-A2-メランA ポジティブおよび Mel14 ネガティブ CD8 T 細胞の拡大を誘導した。
合わせて、これらの知見は、ISS 保持 Qb-ペプチドワクチンの、外来および自己抗原に対する CTL を非常に効率的に駆動する能力を表す。
【０４０１】
実施例２６
CpG で保持される Qbx33 を、長く持続するメモリー CD8+ T 細胞応答の誘発についての同族および非定型の駆動強化領域に使用できる
マウスを 150 μg Qbx33/NKCpG で免疫して、8 日後に、p33-特異的 T 細胞がナイーブマウスにおける 0.4 % +/- 0.2 % から免疫動物における 7.5% +/- 2.2% に、抗原特異的 MHC/ペプチド・テトラマーの測定で、増加した。20 日後に、ペプチド特異的 CD8+ T 集団が 1.6% +/-0.7% に低下した。これらのマウスを第１免疫 30 日後、150 μg Qbx33/NKPS で免疫すると、メモリー T 細胞応答が 8.4% +/-1.9% 特異的 T 細胞まで強化された。この応答は、徐々に低下するが、第１強化 4 か月、150 μg Qbx33/NKPS で T 細胞レベル 23.8% +/-5.2 % となった。
【０４０２】
3 マウスを、20 nmol NKPS および IFA と混合された 50 μg p33 ペプチドで駆動すると、わずか 0.6 % +/-0.4% 特異的 CD8+ T 細胞が、免疫 8 日後まで誘導された。しかし、この低い応答を 7 週後、Qbx33/NKPS で 28.5% +/-9.8% のレベルまで強化できた。
【０４０３】
p33-ペプチドを発現する組換えワクシニアウイルス単位を形成する 1x10exp6 プラークでの免疫は、いかなる T 細胞応答をほとんど誘導しないが (1.1% +/-0.5%)、非常に効率的に 6 月後に、150 μg Qbx33/NKPS による強化で T 細胞レベル 28.1+/- 4.2% まで強化できた。
【０４０４】
これらの結果は、CpG 保持の Qb が、非定型および同族の駆動強化領域において前存在の T 細胞応答を非常に効率的に強化することを示す。注目すべきは、Qb/NKPS が、ペプチドまたは組換えウイルスで効率的な駆動 T 細胞応答をも非常に強化し得ることである。さらに、強力な T 細胞応答が Qbx33/NKPS で確立されたとき、免疫学的に有効量の非定型ワクチン、例えば p33 ペプチド単独、p33 を発現する組換えウイルスまたは VLP に融合もしくは共役された p33 を用いて、この応答を強化できた。後者において、用いられた VLP は、RNA ファージ Qb から誘導された VLP でなく、例えば、AP205 から誘導された HBcAg または VLP である。
【図面の簡単な説明】
【０４０５】
【図１】図１は、Qb-メランA VLP についての SDS-PAGE 分析を示す。Qb-メランA VLP を Qb VLP に実施例２０に記載のように共役した。最終産物をサンプル緩衝液と混合し、還元条件で 16 % Novex（登録商標）Tris-グリシン ゲル上、1.5 時間 125 V で分離した。ゲルをクーマシーブルー溶液に浸すことにより、分離されたタンパク質を染色した。ゲルを 50 % メタノール、8% 酢酸で洗い、染色液を除去した。分子量マーカー (P 77085, New England BioLabs, Beverly, USA) を Qb-メランA 移動速度の参照として使用した (レーン 1)。14 μg の Qb 単独 (レーン 2) または SMPH で誘導された Qb (レーン 3) を、8 μg の各最終産物: Qb-メランA 16-35 (レーン 4)、Qb-メランA 16-35 A/L (レーン 5)、Qb- メランA 26-35 (レーン 6) および Qb- メランA 26-35 A/L (レーン7) との比較のために保存した。
【０４０６】
【図２Ａ】図２Ａは、ISS-処理ヒト PBMC の上澄み中に放出された IFN α を示す。PBMC をバッフィーコートから得て、５倍希釈の表示 ISS とともに 18 時間インキュベートした。用語 G10 を オリゴヌクレオチド G10-PO に使用し、用語 G3 をオリゴヌクレオチド G3-6) に使用する。上澄みを集め、PBL Biomedical Laboratories から提供された抗体セットを用いて、IFN αを ELISA で測定した。
【０４０７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ISS で処置されたヒト CD8+ PBMC に対する CD69 の上方制御を示す。PBMC をバッフィーコートから得て、５倍希釈の表示 ISS とともに 18 時間インキュベートした。細胞を洗い、アンチ-CD8-FITC、アンチ-CD19-PE およびアンチ-CD69-APC (すべて BD PharMingen より)で 20 分間、氷浴上でインキュベートした。洗った後、細胞を、細胞Quest ソフトウエアーを用いる FACS Calibur で分析した。
【０４０８】
【図３】図３は、ポリ (I:C)、G3-6 または G6 で充填される Qbx33 でマウスを免疫した後のウイルス力価を示す。C57Bl6 マウスに 100 μg Qbx33、ポリ (I:C) が充填されるか、p33 に共役された 100 μg Qb VLP (Qb-pIC-33、QbxZnxポリICxp33GGC とも言う)、G3-6 で充填された 90 μg Qbx33 (Qbx33/G3-6) または G6 で充填された 90 μg Qbx33 (Qbx33/G6) を注射して免疫した。８日後に、マウスに、LCMV-p33 エピトープ保有の単位ワクシニアウイルスを形成する 1.5 x 106 プラークを接種した。５日後に、マウスを殺し、卵巣を集めた。卵巣からの単一細胞懸濁液をつくり、BCS40 細胞に順次希釈で加えた。１日後に、細胞層を、50% エタノール、2% ホルムアルデヒド、0.8% NaCl および 0.5% クリスタルバイオレットを含有する溶液で染色し、ウイルスプラークを数えた。
【配列表】
2006523189.tif 000006
2006523189.tif 000007
2006523189.tif 000008
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2006523189.tif 000037
2006523189.tif 000038
【図１】
2006523189.tif 000039
【図２Ａ】
2006523189.tif 000040
【図２Ｂ】
2006523189.tif 000041
【図３】
2006523189.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月21日(2005.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006523189000001.app
【国際調査報告】
2006523189.tif 000043
2006523189.tif 000044
2006523189.tif 000045
2006523189.tif 000046