(57)【要約】磁性ナノ粒子組成物の製造方法である。この方法は、タンパク質鋳型内で磁性ナノ粒子を各々形成する工程を含み、上記磁性ナノ粒子の形成前に、上記タンパク質鋳型の液体組成物又はそのサブユニットが、微孔性膜濾過工程で処理されることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性ナノ粒子組成物の製造方法であって、タンパク質鋳型内に各々の前記磁性ナノ粒子を形成する工程を含み、前記磁性ナノ粒子の形成前に、前記タンパク質鋳型又はそのサブユニットの液体組成物が、微孔性膜濾過工程で処理されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記タンパク質鋳型が、鞭毛L-P環、微小管、バクテリオファージ、シャペロニン、ウィルスカプシド及びフェリチンファミリーのメンバーから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質鋳型が、フェリチンファミリーのメンバーから成る請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記フェリチンファミリーのメンバーが、DPS及びアポフェリチンから選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記フェリチンファミリーのメンバーが、アポフェリチンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記磁性ナノ粒子が、フェリ-又はフェロ-磁性金属、金属合金、M-型フェライト又はスピネルフェライトから成る請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記フェリ-又はフェロ-磁性金属が、コバルト、鉄及びニッケルから成る群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記金属又は金属合金が、アルミニウム、バリウム、ビスマス、セリウム、クロム、コバルト、銅、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ホルミウム、鉄、ランタン、ルテチウム、マンガン、モリブデン、ネオジム、ニッケル、ニオブ、パラジウム、白金、プラセオジム、プロメチウム、サマリウム、ストロンチウム、テルビウム、ツリウム、チタン、バナジウム、イッテルビウム、イットリウム及びその混合物から成る群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記合金が、二元合金又は三元合金である請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記二元合金が、コバルト-ニッケル、鉄-白金、コバルト-パラジウム、鉄-パラジウム、及びサマリウム-コバルトから成る群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記三元合金が、ジスプロシウム-鉄-ターバイド、ネオジム-鉄-ホウ化物、鉄-コバルト-白金、コバルト-ニッケル-白金、及びコバルト-ニッケル-クロムから成る群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、コバルト又は白金又はその合金から成る請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、コバルト及び白金の合金から成る請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体組成物が、水溶液である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
膜フィルターの孔径が、約0.02〜10μmの範囲である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記膜フィルターの孔径が、約1μm未満である請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記膜フィルターの孔径が、約0.5μm未満である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記膜フィルターの孔径が、約0.2μm未満である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜フィルターの孔径が、約0.1μmである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記膜フィルターが、ディスクフィルターである請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記膜フィルターが、高分子材料、金属、セラミックス、ガラス及び炭素から成る群から選択される材料から作られる請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記材料が、ポリマーから成る請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリマーが、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリアクリレート、ポリビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、セルロース、セルロースエステル及びそのコポリマーから成る群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリマーが、ポリエーテルスルホン又はポリビニリデンである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質が、約10-50mg/mlの範囲の濃度の前記液体組成物中に存在する請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記液体組成物のpHが、約5.0〜7.0の範囲である請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記液体組成物が、濾過工程の間、負荷陽圧に付される請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記磁性粒子が、約100nm以下の直径（又は非回転楕円面粒子の場合の最大直径）を有する請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記磁性ナノ粒子が、約50nm以下の直径を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記磁性ナノ粒子が、約20nm以下の直径を有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約20%以下でしか変化しない請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約10%以下でしか変化しない請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約5%以下でしか変化しない請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記磁性ナノ粒子の形成工程が、前記磁性ナノ粒子を含み又は構成するために、金属イオン源又は金属源の追加的付加を含む請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記カチオン源及びアニオン源が、一反復当たり封入粒子当たり1-200原子のカチオン及びアニオンを提供するのに十分な量添加される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記カチオン源及びアニオン源が、一反復当たり封入粒子当たり20-100原子のカチオン及びアニオンを提供するのに十分な量添加される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記カチオン源及びアニオン源が、一反復当たり封入粒子当たり約50原子のカチオン及びアニオンを提供するのに十分な量添加される請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記金属イオン源が、金属塩又は金属である請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記塩が、テトラクロロアンモニウムプラチネートである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記磁性ナノ粒子の形成が、不活性雰囲気下に生じる請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記磁性ナノ粒子の形成が、少なくとも約24℃の温度で生じる請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記磁性ナノ粒子の形成が、約25℃〜約60℃の範囲の温度で生じる請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記磁性ナノ粒子の形成が、約35℃〜約50℃の範囲の温度で生じる請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が、磁性分別工程をさらに含む請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記磁性分別工程が、前記液体組成物を、約0.2-10ml/分の範囲の流速で、磁性粉末を含むカラムに通過させる工程を含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
封入シェルが、ビオチン、アビジン、抗体又はその誘導体、レセプター分子、オプソニン、及び金属結合リガンドから成る群から選択されるリガンドによって官能化される請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記封入シェルが、除去され又は処理されている請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記封入シェルが、酵素分解又はpH変性によって除去されている請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記タンパク質を除去するために使用される前記酵素が、プロテアーゼである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記pH変性が、前記組成物のpHを約4.0以下又は約9.0以上の値に調整することによってもたらされる請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記封入セルが、炭化されている請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
巨大分子鋳型内で各々形成される磁性ナノ粒子の液体組成物の処理方法であって、前記方法は、前記組成物が微孔性膜濾過工程に施される工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５３】
前記巨大分子鋳型が、有機又は無機材料から成る請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記無機材料が、シロキサン、シラン及びその誘導体から成る群から選択される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記有機材料が、有機巨大分子である請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記有機巨大分子が、界面活性剤、ポリマー及びタンパク質から成る群から選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記タンパク質が、鞭毛L-P環、微小管、バクテリオファージ、シャペロニン、ウィルスカプシド及びフェリチンファミリーのメンバーから成る群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質鋳型が、フェリチンファミリーのメンバーから成る請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記フェリチンファミリーのメンバーが、DPS及びアポフェリチンから成る群から選択される請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記フェリチンファミリーのメンバーが、アポフェリチンである請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記磁性ナノ粒子が、フェリ-又はフェロ-磁性金属、金属合金、M-型又はスピネルフェライトから成る請求項５２〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記フェリ-又はフェロ-磁性金属が、コバルト、鉄及びニッケルから成る群から選択される請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記金属又は金属合金が、アルミニウム、バリウム、ビスマス、セリウム、クロム、コバルト、銅、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ホルミウム、鉄、ランタン、ルテチウム、マンガン、モリブデン、ネオジム、ニッケル、ニオブ、パラジウム、白金、プラセオジム、プロメチウム、サマリウム、ストロンチウム、テルビウム、ツリウム、チタン、バナジウム、イッテルビウム、イットリウム及びその混合物から成る群から選択される請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記合金が、二元合金又は三元合金である請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記二元合金が、コバルト-ニッケル、鉄-白金、コバルト-パラジウム、鉄-パラジウム、及びサマリウム-コバルトから成る群から選択される請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記三元合金が、ジスプロシウム-鉄-ターバイド又はネオジム-鉄-ホウ化物、鉄-コバルト-白金、コバルト-ニッケル-白金、及びコバルト-ニッケル-クロムから成る群から選択される請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ナノ粒子が、コバルト又は白金又はその合金から成る請求項５２〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ナノ粒子が、コバルト及び白金の合金から成る請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記液体組成物が、水溶液である請求項５２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記膜フィルターの孔径が、約0.02-10μmの範囲である請求項５２〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記膜フィルターの孔径が、約1μm未満である請求項５２〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記膜フィルターの孔径が、約0.5μm未満である請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記膜フィルターの孔径が、約0.2μm未満である請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記膜フィルターの孔径が、約0.1μmである請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記膜フィルターが、ディスクフィルターである請求項５２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記膜フィルターが、ポリマー材料、金属、セラミックス、ガラス及び炭素から成る群から選択される材料から作られる請求項５２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記材料が、ポリマーから成る請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリマーが、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリアクリレート、ポリビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、セルロース、セルロースエステル及びそのコポリマーから成る群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項７９】
前記ポリマーが、ポリエーテルスルホン又はポリビニリデンである請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記タンパク質が、約0.1-20mg/mlの範囲の濃度で前記組成物中に存在する請求項５６〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物のpHが、7-8.5の範囲である請求項５２〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記組成物が、濾過工程の間、負荷陽圧に付される請求項５２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記磁性ナノ粒子が、約100nm以下の直径（又は非回転楕円面粒子の場合の最大直径）を有する請求項５２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記磁性ナノ粒子が、約50nm以下の直径（又は非回転楕円面粒子の場合の最大直径）を有する請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記磁性ナノ粒子が、約20nm以下の直径（又は非回転楕円面粒子の場合の最大直径）を有する請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約20%以下でしか変化しない請求項５０〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約10%以下でしか変化しない請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約5%以下でしか変化しない請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法が、磁性分別工程をさらに含む請求項５０〜８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記磁性分別工程が、前記組成物が、約0.2-10ml/分の範囲の流速で、磁性粉末を含むカラムを通過する工程を含む請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記磁性分別工程が、膜濾過工程の前に実施される請求項８９又は９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記封入シェルが、ビオチン、アビジン、抗体又はその誘導体、レセプター分子、オプソニン、及び金属結合リガンドから成る群から選択されるリガンドによって官能化される請求項５０〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記封入シェルが、除去又は処理される請求項５０〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記封入シェルが、酵素分解又はpH変性によって除去されている請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記封入シェルを除去するために使用される前記酵素が、プロテアーゼである請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記pH変性が、前記組成物のpHを約4.0以下又は約9.0以上の値に調整することによってもたらされる請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記封入シェルが、炭化されている請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
磁性ナノ粒子の安定な組成物であって、各ナノ粒子が、封入材料によって封入され、少なくとも70質量%の前記ナノ粒子が、凝集形態でなく、かつ前記組成物が、上記組成物の封入材料の全質量に基づいて30%以下の遊離した封入材料を含むことを特徴とする組成物。
【請求項９９】
少なくとも80質量%の前記ナノ粒子が、凝集していない請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
少なくとも90質量%の前記ナノ粒子が、凝集していない請求項９８に記載の組成物。
【請求項１０１】
前記封入材料が、有機材料又は無機材料を含む請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記無機材料が、シロキサン、シラン及びその誘導体から成る群から選択される請求項１０１に記載の組成物。
【請求項１０３】
前記有機材料が、有機巨大分子から成る請求項１０２に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記有機巨大分子が、界面活性剤、ポリマー及びタンパク質から成る群から選択される請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記タンパク質が、鞭毛L-P環、微小管、バクテリオファージ、シャペロニン、ウィルスカプシド及びフェリチンファミリーのメンバーから成る群から選択される請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記タンパク質封入材料が、前記フェリチンファミリーのメンバーから成る請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記フェリチンファミリーのメンバーが、DPS又はアポフェリチンである請求項１０６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記フェリチンファミリーのメンバーが、アポフェリチンである請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記磁性ナノ粒子が、フェリ-又はフェロ-磁性金属、金属合金、M-型フェライト又はスピネルフェライトを含む請求項９８〜１０８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記フェリ-又はフェロ-磁性金属が、コバルト、鉄及びニッケルから成る群から選択される請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記金属又は金属合金が、アルミニウム、バリウム、ビスマス、セリウム、クロム、コバルト、銅、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ホルミウム、鉄、ランタン、ルテチウム、マンガン、モリブデン、ネオジム、ニッケル、ニオブ、パラジウム、白金、プラセオジム、プロメチウム、サマリウム、ストロンチウム、テルビウム、ツリウム、チタン、バナジウム、イッテルビウム、イットリウム及びその混合物から成る群から選択される請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記合金が、二元合金又は三元合金である請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記二元合金が、コバルト-ニッケル、鉄-白金、コバルト-パラジウム、鉄-パラジウム、及びサマリウム-コバルトから成る群から選択される請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記三元合金が、ジスプロシウム-鉄-ターバイド又はネオジム-鉄-ホウ化物、鉄-コバルト-白金、コバルト-ニッケル-白金、及びコバルト-ニッケル-クロムから成る群から選択される請求項１１２に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記ナノ粒子が、コバルト又は白金又はその合金から成る請求項９８〜１１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記ナノ粒子が、コバルト及び白金の合金から成る請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記組成物が、液体組成物である請求項９８〜１１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記液体組成物が、水溶液である請求項１１７に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記組成物のpHが、約5.0-7.0の範囲である請求項１１７又は１１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２０】
前記磁性ナノ粒子が、約100nm以下の直径（又は非回転楕円面粒子の場合の最大直径）を有する請求項９８〜１１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記磁性ナノ粒子が、約50nm以下の直径を有する請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記磁性ナノ粒子が、約20nm以下の直径を有する請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約20%以下でしか変化しない請求項９８〜１２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約10%以下でしか変化しない請求項１２３に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記磁性ナノ粒子が、その最大寸法が約5%以下でしか変化しない請求項１２４に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記封入シェルが、ビオチン、アビジン、抗体及びその誘導体、レセプター分子、オプソニン及び金属結合リガンドから成る群から選択されるリガンドによって機能される請求項９８〜１２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記封入シェルが、除去又は処理されている請求項９８〜１２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記封入シェルが、酵素分解又はpH変性によって除去されている請求項１２７に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記タンパク質を除去するために使用される前記酵素が、プロテアーゼである請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記pH変性が、前記組成物のpHを約4.0以下又は約9.0以上の値に調整することによってもたらされる請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記封入シェルが、炭化されている請求項１３０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、液体中の安定な磁性ナノ粒子の調製方法及びそのような組成物の製造方法に関する。本発明の組成物は、種々の最終用途を有するが、特に磁気録音媒体の生産に有用である。
（本発明の背景）
ナノ粒子材料は、技術の多くの領域、例えばデータ記憶媒体(W098/22942)、診断学及び治療学のような生物医学的適用(US5491219)、生物探知システム、細胞磁性測定、熱伝達媒体、封止剤、ダンピング剤、インク、形質導入及び圧センサー(WO01/39217)で広く適用されてきている。そのようなナノ粒子は少なくともその合成中に封入され得る。この封入材料は、ナノ粒子の合成完成時に、保持又は除去され得る。
磁性粒子製造の技術分野で遭遇する共通の問題は、粒子の凝集傾向であり、それによってこれらの適用を厄介にする(Kumar K 1997, J. Liq. Chromat. & Related Tech. 20 (20) pages 3351-3364)。理想的には、一度製造されると、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の低度の凝集と高度の安定性とを有するべきである。
磁性特性を利用することによって、濃縮された磁性ナノ粒子組成物を得ることは期待される一方で、一度磁性ナノ粒子が、磁性分別(magnetic fractionation)に付されると、不可逆的に凝集されることが一般的に知られている。
種々のやり方、例えば、超音波処理、分散剤及び表面電荷の改良を使用して、磁性ナノ粒子の凝集問題を克服しようと試みられている(Rittner M, Business Communications Co. Inc. GB-201A-C Dec. 2001 Opportunities in Nanostructured Materials)が、しばしば成功が制限されている。
【０００２】
フェリチンで封入されたナノ粒子の凝集の阻止を検討する先の研究は、凝集を克服する手段として、サイズ-排除クロマトグラフィー及びゲル濾過(Kumar K 1997 ibid; Hainfeld JF, 1992 PNAS 89 pages 11064-11068)に着目した。これらの報告に記載された方法論の結果は、凝集の低い傾向を有する粒子を回収する点で、望ましくなかった。
我々は、安定な磁性ナノ粒子の組成物の改良された製造方法を発明した。本発明に従って、封入された磁性ナノ粒子を含む液体組成物（又は封入材料が、磁性ナノ粒子の形成を企図しているタンパク質鋳型である場合には、封入材料の液体組成物）は、膜濾過工程に施される。これは、得られる磁性ナノ粒子の安定性、特に凝集抵抗を改良する。さらに、磁性分別と磁性ナノ粒子の濾過との組み合わせによって、長期間凝集しない、より高度に占有され、封入された磁性ナノ粒子を得ることが可能になる。高度に占有された磁性ナノ粒子の組成物は、例えば、封入粒子の大部分が、少なくとも小磁性ナノ粒子を中に含む組成物でもよい。さらに、そのような組成物の中に、わずかな封入粒子は実質的に磁性粒子によって充填さてもよい。上記とは別に、それは、僅かな封入粒子が、より大きな磁性ナノ粒子によって中に実質的に充填される組成物でもよい。
【０００３】
（本発明の概要）
本発明の第一の方法の特徴に従えば、磁性ナノ粒子の組成物の製造方法であって、各々タンパク質鋳型内での上記磁性ナノ粒子の形成工程を含み、上記タンパク質鋳型又はそのサブユニットの液体組成物が磁性ナノ粒子の形成の前に、微孔性膜濾過工程(microporous membrane filtration step)によって処理されることを特徴とする方法を提供する。
本発明の第二の方法の特徴に従えば、磁性ナノ粒子の液体組成物の処理方法であって、各々が、巨大分子鋳型内で形成され、上記方法が、前記組成物を微孔性膜濾過工程に付す工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
本発明の第一及び第二の特徴に従う方法が、高度な凝集抵抗を有する封入磁性ナノ粒子の高度に安定な組成物を提供することが分かった。本発明の一つの態様において、我々は、少なくとも６ヶ月は凝集の兆候を示さない磁性ナノ粒子の組成物を生じさせることができた。
【０００４】
本発明の第三の特徴に従って、磁性ナノ粒子の安定な組成物を提供し、このナノ粒子は、封入材料によって封入され、ナノ粒子の少なくとも70質量%は、凝集形態でなく、この組成物は、この組成物の封入材料全質量に基づき、30%以下の遊離した封入材料を含む。本発明の第三の好ましい態様において、この組成物は、組成物中の封入材料の全質量に基づき10%以下の遊離した封入材料を含む。そのような組成物は、本発明の方法の特徴に従って得られる。本発明のこの特徴において、80質量%を超える粒子が凝集しないことが好ましく、少なくとも90質量%の粒子が凝集しないことが更に好ましい。この粒子が凝集する程度は、透過型電子顕微鏡(TEM) (Jeol 2010; http://www. jeoleuro. com) 又は原子間力顕微鏡("Dimension", Digital Instruments ; www. di. com)を使用して評価され得る。
「凝集形態」の用語は、粒子の集団で存在する封入粒子を意味し、組成物中互いに空間的に分離したばらばらの粒子を意味しない。
「遊離した封入材料」の用語は、コア磁性ナノ粒子を含まないか、又は実質的に非鉱化(unmineralised)されているとみなすことのできる封入材料を意味する。
【０００５】
（本発明の詳細な説明）
本発明の第一の二つの方法の特徴のそれぞれにおいて、磁性ナノ粒子及び封入粒子は、液体組成物の一部を成す。この液体組成物は、その成分が溶解していると一般的にみなされるという意味で「溶液」としてみなされ得るが、そのような溶液は、コロイド懸濁液としてもみなされ得る。この液体組成物の主成分は、好ましくは水であるが、１種以上の水混和性溶媒、例えばテトラヒドロフラン又はエタノールも存在してよい。例えば、テトラヒドロフラン又は他の水混和性溶媒が、50質量%までの総量で存在し得る。液体組成物の水-混和性溶媒の割合は、好ましくは25質量%未満、更に好ましくは10質量%未満である。
本発明の二つの方法特徴のそれぞれにおいて、この液体組成物が、膜濾過方法に付される。膜フィルターは、周知な構造であり、上記構造は、膜が、モノリス構造を有し、すなわち、固体構造が、永続的に結合されて連続的な固相を形成するという事実によって非膜フィルターと区別される。これとは対照的に、非膜フィルターは、機械的な絡み合い又は他の表面力によって定位置に保持される繊維から形成される。膜フィルターは、必要であれば非常に細かい孔を有する狭い孔径分布で作られ得る。本発明に使用される微孔性膜は、約0.02-10μm、好ましくは1μm未満、最も好ましくは0.5μm未満の孔を有し、本発明に使用され得る孔径の具体例は、0.2μmの孔及び0.1μmの孔である。本発明に使用される微孔性フィルターは、ポリマー、金属、セラミックス、ガラス及び炭素を含む種々の材料から作られ得る。典型的に、この膜は、膜濾過で使用される技術分野で既知のポリマー材料で形成されるだろう。これは、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリアクリレート、ポリビニリデン、例えばフッ化ポリビニリデン(PVDF)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、セルロース、セルロースエステル及びそのコポリマーである。好ましくは、封入材料がタンパク質である場合には、この膜は、低いタンパク質結合性の材料、例えばポリエーテルスルホン又はポリビニリデンを含むように選択されるだろう。そのような微孔性フィルターは、ミリポア株式会社(ベッドフォード、マサチューセッツ州)から入手可能である。
【０００６】
この膜フィルターは、膜ディスクでもよいが、膜フィルターの他の形態が使用可能である。
重要なことは、安定な磁性ナノ粒子組成物の製造を達成するために、フィルター孔径を、ナノ粒子材料の孔径より大きい数倍(several order of magunitude)とできることを見出したことである。例えば、本発明の好ましい態様において、封入材料である、アポフェリチンは、約12nmの直径を有する。凝集しにくいフェリチン封入された磁性ナノ粒子の安定な調製物は、0.2μm及び0.1μmを使用して達成され得る。
通常、本発明の磁性ナノ粒子は、ナノサイズの範囲で全ての大きさ又は寸法、典型的には少なくとも1nm及び100nm以下、好ましくは50nm以下及び更に好ましくは20nm以下を有するだろう。本発明の好ましい磁性ナノ粒子は、実質的には1-100nmの範囲の直径を有する回転楕円面である。しかし、本発明は、さらにナノサイズの範囲内でない一つの大きさを有する磁性粒子、例えばαβ-チューブリンから形成された尿細管性蛋白である微小管を使用して形成された粒子まで拡張し、これは、外径約25nmで数μmの長さを有する。
【０００７】
本発明の第一の方法の特徴において、タンパク質鋳型又はサブユニットの液体組成物が、上記磁性ナノ粒子の形成の前に、微孔性膜濾過工程に付される。従って、この態様において、このタンパク質鋳型の液体組成物が、まず調製され、通常、水溶液であり、その後微孔性膜濾過工程に付される。この工程において、この組成物を、フィルターの一面に投入し、膜で濾過する。この態様において、組成物中のタンパク質は、10-50mg/mlの範囲の濃度で好ましく存在する。ある態様において、組成物のpHは、好ましくは5-7の範囲である。好ましくは、この組成物は、濾過工程の間、負荷陽圧に付される。例えば、負荷陽圧は、6894Pa(1psi)より大きく、例えば34.5kPa(5psi)より大きくてよい。本来、この圧は、137.9kPa(20psi)未満、例えば103.4kPa(15psi)未満である。タンパク質鋳型（又はそのサブユニット）の組成物を含む濾液は、次いでそれ自体既知(WO98/22942を参照されたい。)の方法で磁性ナノ粒子の封入に使用するため回収される。
本発明の第二の方法の特徴において、巨大分子鋳型内で各々形成された磁性ナノ粒子の液体組成物を微孔性膜濾過工程に付する。本発明のこの方法の特徴において、磁性ナノ粒子は、まずそれ自体既知(WO98/22942を参照されたい。)の方法で巨大分子鋳型内で形成される。この特徴において、好ましい巨大分子鋳型は、タンパク質鋳型であるが、これは必須ではなく、他の巨大分子材料が、磁性ナノ粒子の形成に使用され得る。磁性ナノ粒子の組成物、好ましくは水溶液は、他の溶媒、例えばアルコール又はアルカンがいくつかの態様で使用され得るが、その後微孔性膜濾過工程で処理される。この濾過工程において、本発明の第一の方法の特徴と同様に、この組成物は、フィルターの一面に投入され、膜で濾過される。本発明の態様において、磁性ナノ粒子は、0.1-20mg/mlの範囲の濃度で組成物中に好ましく存在する。ある態様において、組成物のpHは、好ましくは7-8.5の範囲である。好ましくは、この組成物は、濾過工程の間、負荷陽圧に付される。例えば、負荷陽圧は、6894Pa(1psi)より大きく、例えば34.5kPa(5psi)より大きくてよい。本来、137.9kPa(20psi)未満、例えば103.4kPa(15psi)未満である。封入された磁性ナノ粒子の組成物を含む濾液がその後回収される。
【０００８】
本発明の第二の方法の特徴において使用され、かつ本発明の第三の（生成物の）特徴における磁性ナノ粒子を封入する封入材料は、磁性ナノ粒子を受け入れ、少なくとも部分的に受け入れることができ、従って粒子を含むことができる好適なキャビティーを含むことのできるるもので、例えばそのようなキャビティーは、封入材料内に十分に封入されよう。これとは別に、封入材料は、十分には囲まれないが、それでもなお磁性粒子を受け取り、また支持できる好適な開口部を含み得、例えば、この開口部は、巨大分子の環(annulus)によって形成されるものでよい。
封入シェルは、有機材料又は無機材料、例えば、シロキサン、シラン又はその誘導体を含んでよい。封入材料は、単一粒子を含むか又はコア磁性ナノ粒子とするために一緒に作用するいくつかの粒子を含むでもよい。
好ましい態様において、封入材料は、分子又は分子集合を意味する有機巨大分子でよく、また1500kDまで、典型的には500kD未満の分子量を有してよい。そのような有機巨大分子は、界面活性剤、ポリマー又はタンパク質でよい。好適なタンパク質は、鞭毛L-P環、αβ-チューブリンから形成される尿細管性蛋白、約25nmの外径及び数μmの長さを有する微小管、バクテリオファージ、シャペロニン、例えば細菌性GroEL及びGroES、DPS及びウィルスカプシドを含む。例えば、DPSは、フェリチン同族体、三倍軸(three-fold axis)内の中空コア及び細孔を含む十二量体DNA保護タンパク質である。鞭毛LP環は、数μmに亘り、約13nmの厚さの、約13nmの内側直径及び約20nmの外側直径を有する環型構造である。それらは、非常に整然とした配列にパックしてもよい。より希釈された濃度では、ダイマーは、26nm厚さのものを形成し得る。
【０００９】
非常に好ましい態様において、封入材料は、フェリチンファミリーのメンバーである。本発明は、最も好ましくは、その内部キャビティーがナノスケールの磁性粒子を作るために使用される鉄貯蔵タンパク質である、フェリチンを利用する。フェリチンは、450kDの分子量を有する。フェリチンは、生物種全体にわたって鉄代謝において利用され、その構造は、それに共通して非常に維持される。フェリチンは、自己集合して外部直径に12nmの中空シェルを提供する24サブユニットからなる。フェリチンは、本来、常磁性フェリハイドライト(ferrihydrite)の形態で4500鉄(III)を貯蔵する8nm直径のキャビティーを有する。しかし、このフェリハイドライトは、除去され得（フェリハイドライトを欠いているフェリチンは「アポフェリチン」を意味する。）、他の材料が配合されてもよい。フェリチン内のサブユニットは、密にパックするが、キャビティーへのチャンネルは3倍軸及び4倍軸で存在する。本発明に使用される現に好ましい巨大分子は、8nm程度の直径のキャビティーを有するアポフェリンタンパク質である。このタンパク質内に受け入れられる磁性ナノ粒子は、タンパク質が、伸びて直径8nmより大きい粒子を受け入れ得る約15nmまでの直径を有する。
フェリチンは、脊椎動物、無脊椎動物、植物、菌類、酵母、バクテリアに天然に見出される。組換え技術によって合成され得る。そのような合成型は、天然型に一致し得るが、内部キャビティー内に粒子を受け入れることができる必須の特性を保持する突然変異体を合成することも可能である。フェリチンのそのような天然の及び合成型の使用は、本発明の範囲内に企図される。
フェリチンは、窒素流下、緩衝酢酸ナトリウム溶液に対して透析によってアポフェリチンに変換される。例えば、チオグリコール酸を使用する還元的キレート化は、フェリハイドライトコアを除去するために使用され得る。この後に、塩化ナトリウム溶液に対して繰り返し透析をして溶液から還元されたフェリハイドライトコアを除去する。
【００１０】
封入材料がタンパク質（又はそのサブユニット）である態様に関連がある前節での説明は、本発明の第一方法の特徴に関する。従って、本発明の第一の特徴において使用される好適なタンパク質は、鞭毛L-P環、管形タンパク質であり、αβ-チューブリンから形成されかつ約25nm外径及び数μmの長さを有する微小管、バクテリオファージ、シャペロニン、GroELのようなDPS及びウィルスカプシドを含む。好ましいタンパク質鋳型材料は、ナノスケールの磁性粒子を生産するために使用される内部キャビティーを有するフェリチンファミリーのメンバーである。
本発明の磁性ナノ粒子において、先述のように、100nm以下の直径（非回転楕円面粒子の場合の最大直径）を有する。好ましくは、この直径は、50nm以下、より好ましくは、20nm以下である。この寸法は、少なくとも部分的に封入材料の大きさによって決定される。封入材料が、緩和状態で約8nmのキャビティーを有するポリフェリンの場合、コア磁性ナノ粒子（すなわち、封入材料を除外するコア材料）は、タンパク質は直径8nmより大きい粒子を受け入れるように伸び得るので、約15nmまでの直径を有し得る。
【００１１】
磁性コア粒子は、フェリ-又はフェロ磁性金属、例えばコバルト、鉄、又はニッケル、金属合金、希土類元素と遷移金属の合金、M-型フェライト又はスピネルフェライトであってもよい。金属又は金属合金は、１種以上の以下、アルミニウム、バリウム、ビスマス、セリウム、クロム、コバルト、銅、ジスプロシウム、エルビウム、ユーロピウム、ガドリニウム、ホルミウム、鉄、ランタン、ルテチウム、マンガン、モリブデン、ネオジム、ニッケル、ニオブ、パラジウム、白金、プラセオジム、プロメチウム、サマリウム、ストロンチウム、テルビウム、ツリウム、チタン、バナジウム、イッテルビウム、イットリウム又はその混合物を含んでよい。
好ましくは、このナノ粒子は、二元合金又は三元合金、例えば、コバルト-ニッケル、鉄-白金、コバルト-パラジウム、鉄-パラジウム、サマリウム-コバルト、ジスプロシウム-鉄-ターバイド又はネオジム-鉄-ホウ化物、鉄-コバルト-白金、コバルト-ニッケル-白金、又はコバルト-ニッケル-クロムを含む。好ましくは、上記ナノ粒子は、コバルト又は白金又はその合金を含む。さらに好ましくは、上記ナノ粒子は、コバルト及び白金の合金を含む。
【００１２】
磁性ナノ粒子は、有機巨大分子のような封入材料の典型的に水溶性媒体中における溶液を、コア磁性ナノ粒子を構成し得る適切な金属イオン源又は金属源と組み合わせる方法によって調製される。本発明の方法において、金属イオン源が封入材料に徐々に添加されることは好ましい。例えば、カチオン源及びアニオン源が、一反復(iteration)当たり封入粒子当たりのカチオン源及びアニオン源の１原子より多くを、より好ましくは一反復当たり封入粒子当たりのカチオン源及びアニオン源の２０原子より多くを提供するに十分な量で添加され得る。カチオン及びアニオン源が、一反復あたり封入粒子当たりカチオン源及びアニオン源の200原子未満を、好ましくは一反復あたり封入粒子当たりカチオン源及びアニオン源の100原子未満提供するに十分な量で添加され得る。本発明の好ましい態様において、カチオン源及びアニオン源は、一反復あたり封入粒子当たりカチオン源及びアニオン源の約50原子を提供するに十分な量添加され得る。これらの低濃度は、カチオン源及びアニオン源を含む溶液の連続希釈によって達成され得る。
本発明の一つの態様において、金属イオン源が、磁性ナノ粒子を含む金属塩又は金属、例えばテトラクロロアンモニウムプラチネートであることが好ましい。
上記とは別に、現在はあまり好ましくはないが、金属イオン源は、有機巨大分子源が添加される組成物中に存在してもよい。
有機巨大分子及び金属イオンの混合物は、均質化を確実にするために攪拌してもよい。ナノ粒子が、元素金属を含む場合、組成物に対して還元を行い、それによって、ナノスケールの金属粒子が有機巨大分子キャビティー内に形成するようにする。この還元は、好ましくは、不活性雰囲気下で行い、酸化から金属粒子を保護し、これによって磁性粒子を還元する。還元/酸化工程は、金属イオンの添加の間で繰り返し、（各々のサイクルで同一でも異なっていてもよい。）、ナノ粒子を形成することができる。
【００１３】
反応混合物は、磁性ナノ粒子が形成され得る好ましい温度以下の温度で形成され、次いでその温度まで上げる。上記とは別に、金属イオン源が添加される封入材料源は、少なくとも24℃の温度で維持し、それにさらに金属イオン源を添加する。
タンパク質は、その３次元構造を失うまで、70℃までの温度に耐えられ得る。従って、封入材料がタンパク質である態様においては、反応温度は約70℃までにわた得る。これらの態様において、反応温度は、好ましくは約25℃〜約60℃、更に好ましくは35℃〜50℃の範囲に維持される。上記とは別に、反応温度は、約50℃〜約60℃の範囲で、例えば約55℃で維持され得る。別の態様において、反応温度は、約60℃〜約70℃の範囲で、例えば約65℃で維持され得る。
本発明の一つの態様において、水性媒体は、巨大分子鋳型内での磁性コア粒子の形成の間、アルカリ性pHで維持される。このpHは、好ましくは7.5-8.5の範囲で維持される。これは、緩衝液の使用で達成され得る。好適な溶液は、使用される封入材料に依存して変わり得る。
本発明の方法の特徴の一つの態様において、この方法は、封入された磁性ナノ粒子の磁性分別工程をさらに含む。これは、重力下、又は陽圧の負荷によって、この組成物を遅延媒体に通過させる工程を含み、磁場に付すと、組成物内の粒子がその磁性特性に従って空間的に分離され、よって類似の磁性の粒子の濃縮された組成物を得る。磁性ナノ粒子の磁性は、封入されていようといまいと、コア磁性ナノ粒子のサイズによって決定され、この方法は、コア粒子が、高度の単分散度を有し、即ち、本発明の組成物の中で個々の磁性ナノ粒子の粒径が変化する度合いが少ない組成物を得る手段を更に提供する。最大のナノサイズの寸法で測定されるこの変化は、通常20%未満、好ましくは10%未満及び最も好ましくは5%未満であるべきである。平均サイズが、相対的に大きく、例えば約50nmの組成物に対して、この変化は、上記範囲の下端に位置することが好ましく、一方相対的に小さい粒子、例えば約10nmに対しては、この変化は、上記範囲の上端に位置するのがよい。本発明に従う粒径は、例えば透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して測定され得る。
【００１４】
遅延媒体は、IV型20L等の鋼、又は粉末、ビーズ又は当業界で既知の他の形態の別の好適な軟-磁性材料を含み得る。遅延媒体は、磁性ナノ粒子組成物と化学的に反応しない材料を、その構造を損傷又は変化させないように含むが、磁性ナノ粒子は分別装置を通過する間、何らかの形態の吸引相互作用を有し得ることが好ましい。
当業者であれば磁性分別のための多くの手段が、例えば磁性ワイヤー、磁性粉末クロマトグラフィー及びフィールドフロー(field-frow)分別技術が利用可能であることを理解できるだろう。本発明の好ましい態様において、組成物は、磁性粉末を含むカラムを0.2-10ml/分の範囲の流速で通過する。磁性分別は、ナノ粒子が懸濁されている液状媒体が交換可能にされる優位性を提供する。
形成された封入された磁性ナノ粒子が膜濾過工程に付されるという本発明の第二の方法の特徴の場合、磁性分別工程の後、この濾過工程が好ましく生じる。
本発明の一つの態様において、封入シェルは、例えばビオチン/アビジンで官能化させられ得る表面を提供し、抗体のような生物リガンド又はそのフラグメントの結合を促進する。種々のリガンド、例えば抗体又はその誘導体、レセプター分子、オプソニンは、タンパク質カプセルの表面に結合し得る。さらに、種々のプロトコルは、タンパク質表面への結合部分の結合に有用である(Wong S. S. 1993 "Chemistry of protein conjugation and cross-linking"CRC Press) and, in particular, biotinylation and avidinylation of ferritin have been described (Li M. et.al. 1999 Chem. Mater. , 11 pages 23-26; Bayer E. A. et.al. 1976 J. Histochem. & Cytochem., 24 (8) pages 933-939を参照されたい)。
【００１５】
本発明の別の態様において、シェルの外側の特徴は、廃棄物のような材料から金属混入物を除去するために、例えば金属結合リガンドによって官能化され得、それによってこの媒体は処理に使用されることが可能になる。
いくつかの態様において、封入シェルを、除去して、被覆していない磁性ナノ粒子を残し得る。例えば、上記被膜がタンパク質である場合、例えば酵素分解又はpH変性により変性され得る。特に、タンパク質は、プロテアーゼを使用して消化され又は組成物のpHを、タンパク質が安定な範囲外、例えば約pH4.0以下又は約pH9.0以上の値に調整することによって変性され得る。変性されたタンパク質材料は、例えば透析又は遠心沈殿法によって除去され得る。好ましい態様において、このタンパク質は、組成物のpHを約4.0以下に調整することによって変性される。
他の態様において、シェルが処理され、ナノ粒子コアの周囲の残基を除去し、例えば巨大分子シェルを、所望のキャリアー液体に再懸濁させる前に、封入粒子を単離することにより、及び300℃の程度の高温に付すことにより炭化され得る。上記とは別に、組成物中でこの粒子を炭化するのが望ましい場合、レーザー熱分解が使用され得る。
本発明は以下の非制限的な例を参照して説明される。
【実施例１】
【００１６】
アポフェリンの生成
この例は、ウマ脾臓フェリチンからのアポフェリンの調製を説明する。アポフェリンは、窒素流下、pH5.5で緩衝化された酢酸ナトリウム溶液(0.2M)で透析（分子量カットオフは10-14kDである。）することにより、トリグリコール酸を使用するフェリハイドライトコアを除去するための還元的キレート化により、カドミウムなしの天然ウマ脾臓フェリチンから調製した。次いで、塩化ナトリウム溶液(0.15M)で透析を繰り返すことによって、溶液から還元されたフェリハイドライトコアを完全に除去した。
【実施例２】
【００１７】
アポフェリン内のコバルト/白金ナノ粒子の合成
アポフェリンを、pH7.5-8.5に緩衝化された0.05Mの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタン-スルホン酸(HEPES)緩衝液か、又はpH7.5-8.5に緩衝化された0.25MのAMPSOのいずれかに分散した。次いで、0.1Mコバルト(II)酢酸溶液及び0.1Mアンモニウムテトラクロロプラチネート(II)溶液のアリコートを添加し、この混合物を35℃〜50℃の間の温度で攪拌した。次いで、水素化ホウ素ナトリウムを使用して還元を行った。いくつかの金属塩添加及び十分な還元を行い、コアがCo/Pt結晶によって実質的に占められているアポフェリンを得た。
【実施例３】
【００１８】
アポフェリチン内での磁鉄鋼粒子の合成
アポフェリンを、緩衝化されpH8.5に調整され、かつ40-70℃に維持された温度で、50mMの3- ( [1, 1-ジメチル-2-ヒドロキシエチル] アミノ) -2- ヒドロキシプロパンスルホン酸 (AMPSO)中に分散した。アンモニウム鉄(II) サルフェート(25mM)及びトリメチルアミン-N-オキシド(25mM)のアリコートをアポ-フェリン溶液に徐々に増大しながら添加した。添加した鉄(II)のアリコートは、アポフェリン１分子当たり100原子と等価であった。アリコートの添加の増加間隔は、約15分であった。アポフェリンコアが磁性コアによって実質的に占有されるまで、添加を行った。次いで、得られた溶液を水で透析し、0.2nmフィルターで濾過して、濃縮し、又は調製されたままで使用した。
【実施例４】
【００１９】
磁性粒子の磁性分別
磁性分別を鋼粉末カラムを含むガラスカラムを使用して実施した。ネオジム鉄ホウ化物を含む二種の永久磁石をカラムの部分の片側に置き、磁性ナノ粒子物質、例えば実施例２で説明したコバルト白金-アポフェリン粒子をカラムに通した。続いて、カラムを、0.25%(w/v)ヒドラジン(pH8.0)の脱気溶液で洗浄した。次いで、磁石を取り出し、カラムから分離された材料を集めた。図１は、磁性分別前(a)及び後(b)両方のアポフェリチン内のコバルト-白金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真(JEOL 2010)を示す。
【実施例５】
【００２０】
実施例１で調製した材料のようなアポフェリンの懸濁液、又は実施例２で調製した材料のような磁性ナノ粒子を、0.2um〜0.1umの範囲の孔径を有するミリポア（登録商標）ポリスルホンフィルターを使用して膜濾過工程で処理した。溶出液を集め、透過型電子顕微鏡により分析した。顕微鏡写真は、組成物内の粒子の70%より多くを分離した単一の粒子として示した。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】磁性分別(a)前及び(b)後の両方の、アポフェリチン内のコバルト-白金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真(JEOL2010)を示す。
【図１】
2006501662.tif 000002
【国際調査報告】
2006501662.tif 000003
2006501662.tif 000004
2006501662.tif 000005
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