(57)【要約】本発明は、ペプチドのマッチをスコア付けするためのシステム及び方法に関する。本発明の実施態様は、適切な信号検出ベースのスコア付けシステム及び拡張マッチの新たな概念であると考えられるものを導入することにより、ペプチド及びタンパク質の同定を改善する。第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするために、第一のペプチド、前記第二のペプチド及びそれらの断片に対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成することができる。確率モデルに基づいて、第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率及び第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算することができる。そして、第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて、第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けすることができる。
2006511821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドのマッチをスコア付けする方法であって、
第一のペプチド及び第二のペプチドを提供すること、
第一のペプチドと、第二のペプチドと、第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片と、のそれぞれに対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成すること、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算すること、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算すること、及び
第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けすること
を含む方法。
【請求項２】
第一のペプチドが実験ペプチドであり、
第二のペプチドが候補ペプチドであり、候補ペプチドが、実験ペプチド、理論ペプチド及びペプチドのライブラリからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一のペプチド、第二のペプチド及び第一のペプチド、又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片、に対応する１種以上のマッチ特性が、
質量誤差、
荷電状態、
アミノ酸組成、
ミスした切断、
溶出時間、
タンパク質／ペプチド改変、
質量スペクトルピーク強さ、
質量スペクトルＳＮ比、
質量スペクトル信号質指標、
データベースから導出された統計値、及び
観測可能又は導出可能な特性
の少なくとも一つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１種以上のマッチ特性の確率分布を決定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
既知のペプチドの実験データとペプチドデータベース中のペプチドとの間のマッチに基づいて１種以上のマッチ特性の経験的確率分布を決定することをさらに含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
同定されている複数のペプチドを含む学習データセット又は既知のタンパク質標準のセットに基づいて確率モデル及び確率モデルに対応する複数のパラメータを調節することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
出力を生成することをさらに含み、出力が、
第一の確率と第二の確率との間の比である尤度比、
尤度比の対数である対数尤度、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った尤度比、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った対数尤度、及び
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さの対数で割った対数尤度
の少なくとも一つを含む、第二のペプチドに対応するマッチスコア、
マッチスコアに対応するＺスコア、
マッチスコアに対応するｐ値、
第一のペプチドに対応する生物学的情報、ならびに
第二のペプチドに対応する生物学的情報
の少なくとも一つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第二のペプチドのために理論断片化スペクトルを提供する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
理論断片化スペクトルが、断片同位体に対応する質量を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
第二のペプチドを、
第二のペプチドが属するタンパク質の体系的分類、
第二のペプチドが属するタンパク質の等電点、
第二のペプチドが属するタンパク質の分子量、
非対称質量ウィンドウ、及び
複数の質量インターバルの和でできている可能な質量のセット
の少なくとも一つに基づいてフィルタリングすることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
第一のペプチドの物理的サンプル及び第一のペプチドに対応する生物学的情報を提供すること、及び
第二のペプチドの物理的サンプル及び第二のペプチドに対応する生物学的情報を提供すること
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
２個のペプチドのマッチをスコア付けする方法であって、
実験ペプチドに対応する質量スペクトル情報及び実験ペプチドの少なくとも一つの断片を少なくとも含む、実験ペプチドに対応する情報を提供すること、
候補ペプチドに対応する情報を提供すること、
実験ペプチドに対応する情報及び候補ペプチドに対応する情報に基づいて拡張マッチＥを定義すること、
実験ペプチドに対応する情報及び候補ペプチドに対応する情報に基づいて確率モデルを生成すること、及び
尤度比
【数１】
2006511821.tif 000051
（ここで、Ｄは、実験ペプチド及び候補ペプチドに対応する余分な情報であり、
ｓは、ペプチド配列であり、
Ｈ1は、ペプチド配列ｓが実験ペプチドの正しい配列であるという仮説であり、
Ｈ0は、ペプチド配列ｓが実験ペプチドの誤った配列であるという帰無仮説であり、
確率Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）及びＰ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、確率モデルに基づいて計算される）
に基づいて拡張マッチＥをスコア付けすること
を含む方法。
【請求項１３】
拡張マッチＥが、１個以上の確率変数をさらに含む確率変数であり、１個以上の確率変数が、
実験ペプチド質量ｍと候補ペプチド質量ｍtとの間のマッチを特徴づけるペプチドマッチＰ、
実験ペプチドの断片質量ｆjと候補ペプチドの断片質量ｍt,j（ｊは、実験ペプチドの断片質量の指数である）との間のマッチを特徴づける断片マッチＦ、
実験ペプチドのｍ／ｚ比を候補ペプチドとマッチさせるために使用される電荷ｚ、
実験ペプチドの溶出時間ｔ、
実験ペプチドとマッチする候補ペプチド中のミスした切断の数ｋ、
実験ペプチドとマッチするために候補ペプチドに加えられるタンパク質／ペプチド改変Ｗ、及び
実験ペプチド及び候補ペプチドに対応する情報に基づいて観測可能又は導出可能な確率変数
の少なくとも一つを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
１個以上の確率変数の確率分布を決定することをさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
既知のペプチドの実験データとペプチドデータベース中のペプチドとの間のマッチに基づいて１個以上の確率変数の経験的確率分布を決定することをさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
補題Ｐ（Ａ，Ｂ｜Ｃ）＝Ｐ（Ａ｜Ｂ，Ｃ）Ｐ（Ｂ｜Ｃ）（ここで、Ａ、Ｂ及びＣは確率変数である）に基づいて確率Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）及びＰ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）を推定することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
ベイズスコア
【数２】
2006511821.tif 000052
及びベイズスコア
【数３】
2006511821.tif 000053
（ここで、Ｑは、実験ペプチドの質量スペクトル質に対応する統計値を表す）
の少なくとも一つを計算することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
候補ペプチド質量を実験ペプチド質量と比較すること、及び
候補ペプチド質量と実験ペプチド質量との間の差が所定範囲内であるならば尤度比Ｌに基づいて拡張マッチＥをスコア付けすること
をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
確率モデル及び確率モデルに対応する複数のパラメータを、同定されている複数のペプチドを含む学習データセット又は既知のタンパク質標準のセットに基づいて調節することをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
出力を生成することをさらに含み、出力が、
尤度、
尤度比の対数である対数尤度、
アミノ酸単位で計測された実験ペプチドの長さで割った尤度比、
アミノ酸単位で計測された実験ペプチドの長さで割った対数尤度、及び
アミノ酸単位で計測された実験ペプチドの長さの対数で割った対数尤度
の少なくとも一つを含む、候補ペプチドに対応するマッチスコア、
マッチスコアに対応するＺスコア、
マッチスコアに対応するｐ値、
実験ペプチドに対応する生物学的情報、ならびに
候補ペプチドに対応する生物学的情報
の少なくとも一つを含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
候補ペプチドのために理論断片化スペクトルを提供する、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
理論断片化スペクトルが、断片同位体に対応する質量を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
候補ペプチドを、
候補ペプチドが属するタンパク質の体系的分類、
候補ペプチドが属するタンパク質の等電点、
候補ペプチドが属するタンパク質の分子量、
非対称質量ウィンドウ、及び
複数の質量インターバルの和でできている可能な質量のセット
の少なくとも一つに基づいてフィルタリングすることをさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２４】
実験ペプチドの物理的サンプル及び実験ペプチドに対応する生物学的情報を提供すること、及び
候補ペプチドの物理的サンプル及び候補ペプチドに対応する生物学的情報を提供すること
をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
プロセッサをしてペプチドのマッチをスコア付けさせるためのコードを有する記憶媒体であって、
第一のペプチド及び第二のペプチドに対応する情報を提供するように適合されたコード、
第一のペプチドと、第二のペプチドと、第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片と、に対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成するように適合されたコード、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算するように適合されたコード、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算するように適合されたコード、及び
第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするように適合されたコード
を含む記憶媒体。
【請求項２６】
第一のペプチドが実験ペプチドであり、
第二のペプチドが候補ペプチドであり、候補ペプチドが、実験ペプチド、理論ペプチド及びペプチドのライブラリからなる群より選択される、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項２７】
第一のペプチドと、第二のペプチドと、第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片と、に対応する１種以上のマッチ特性が、
質量誤差、
荷電状態、
アミノ酸組成、
ミスした切断、
溶出時間、
タンパク質／ペプチド改変、
質量スペクトルピーク強さ、
質量スペクトルＳＮ比、
質量スペクトル信号質指標、
データベースから導出された統計値、及び
観測可能又は導出可能な特性
の少なくとも一つを含む、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項２８】
１種以上のマッチ特性の確率分布を決定するように適合されたコードをさらに含む、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項２９】
既知のペプチドの実験データとペプチドデータベース中のペプチドとの間のマッチに基づいて１種以上のマッチ特性の経験的確率分布を決定するように適合されたコードをさらに含む、請求項２８記載の記憶媒体。
【請求項３０】
同定されている複数のペプチドを含む学習データセット又は既知のタンパク質標準のセットに基づいて確率モデル及び確率モデルに対応する複数のパラメータを調節するように適合されたコードをさらに含む、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項３１】
出力を生成するように適合されたコードをさらに含み、出力が、
第一の確率と第二の確率との間の比である尤度比、
尤度比の対数である対数尤度、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った尤度比、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った対数尤度、及び
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さの対数で割った対数尤度
の少なくとも一つを含む、第二のペプチドに対応するマッチスコア、
マッチスコアに対応するＺスコア、
マッチスコアに対応するｐ値、
第一のペプチドに対応する生物学的情報、ならびに
第二のペプチドに対応する生物学的情報
の少なくとも一つを含む、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項３２】
第二のペプチドのために理論断片化スペクトルが提供されている、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項３３】
理論断片化スペクトルが、断片同位体に対応する質量を含む、請求項３２記載の記憶媒体。
【請求項３４】
第二のペプチドを、
第二のペプチドが属するタンパク質の体系的分類、
第二のペプチドが属するタンパク質の等電点、
第二のペプチドが属するタンパク質の分子量、
非対称質量ウィンドウ、及び
複数の質量インターバルの和でできている可能な質量のセット
の少なくとも一つに基づいてフィルタリングするように適合されたコードをさらに含む、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項３５】
第一のペプチドの物理的サンプル及び第一のペプチドに対応する生物学的情報を提供するように適合されたコード、及び
第二のペプチドの物理的サンプル及び第二のペプチドに対応する生物学的情報を提供するように適合されたコード
をさらに含む、請求項２５記載の記憶媒体。
【請求項３６】
第一のペプチドと第二のペプチドと間のマッチをスコア付けするためのシステムであって、
第一のペプチドと、第二のペプチドと、第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片と、に対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成するための手段、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算するための手段、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算するための手段、及び
第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするための手段
を含むシステム。
【請求項３７】
第一のペプチドが実験ペプチドであり、
第二のペプチドが候補ペプチドであり、候補ペプチドが、実験ペプチド、理論ペプチド及びペプチドのライブラリからなる群より選択される、請求項３６記載のシステム。
【請求項３８】
第一のペプチド、第二のペプチド及び第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片に対応する１種以上のマッチ特性が、
質量誤差、
荷電状態、
アミノ酸組成、
ミスした切断、
溶出時間、
タンパク質／ペプチド改変、
質量スペクトルピーク強さ、
質量スペクトルＳＮ比、
質量スペクトル信号質指標、
データベースから導出された統計値、及び
観測可能又は導出可能な特性
の少なくとも一つを含む、請求項３６記載のシステム。
【請求項３９】
１種以上のマッチ特性の確率分布を決定するための手段をさらに含む、請求項３６記載のシステム。
【請求項４０】
既知のペプチドの実験データとペプチドデータベース中のペプチドとの間のマッチに基づいて１種以上のマッチ特性の経験的確率分布を決定するための手段をさらに含む、請求項３９記載のシステム。
【請求項４１】
同定されている複数のペプチドを含む学習データセット又は既知のタンパク質標準のセットに基づいて確率モデル及び確率モデルに対応する複数のパラメータを調節するための手段をさらに含む、請求項３６記載のシステム。
【請求項４２】
出力を生成する手段をさらに含み、出力が、
第一の確率と第二の確率との間の比である尤度比、
尤度比の対数である対数尤度、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った尤度比、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った対数尤度、及び
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さの対数で割った対数尤度
の少なくとも一つを含む、第二のペプチドに対応するマッチスコア、
マッチスコアに対応するＺスコア、
マッチスコアに対応するｐ値、
第一のペプチドと対応する生物学的情報、ならびに
第二のペプチドに対応する生物学的情報
の少なくとも一つを含む、請求項３６記載のシステム。
【請求項４３】
第二のペプチドのために理論断片化スペクトルが提供されている、請求項３６記載のシステム。
【請求項４４】
理論断片化スペクトルが、断片同位体に対応する質量を含む、請求項４３記載のシステム。
【請求項４５】
第二のペプチドを、
第二のペプチドが属するタンパク質の体系的分類、
第二のペプチドが属するタンパク質の等電点、
第二のペプチドが属するタンパク質の分子量、
非対称質量ウィンドウ、及び
複数の質量インターバルの和でできている可能な質量のセット
の少なくとも一つに基づいてフィルタリングするための手段をさらに含む、請求項３６記載のシステム。
【請求項４６】
第一のペプチドの物理的サンプル及び第一のペプチドに対応する生物学的情報を提供するための手段、及び
第二のペプチドの物理的サンプル及び第二のペプチドに対応する生物学的情報を提供するための手段
をさらに含む、請求項３６記載のシステム。
【請求項４７】
第一のペプチドと第二のペプチドと間のマッチをスコア付けするためのシステムであって、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算する第一の計算モジュール、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算する第二の計算モジュール、及び
第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするスコア付けモジュール
を含むシステム。
【請求項４８】
第一のペプチドが実験ペプチドであり、
第二のペプチドが候補ペプチドであり、候補ペプチドが、実験ペプチド、理論ペプチド及びペプチドのライブラリからなる群より選択される、請求項４７記載のシステム。
【請求項４９】
第一のペプチドと、第二のペプチドと、第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片と、に対応する１種以上のマッチ特性が、
質量誤差、
荷電状態、
アミノ酸組成、
ミスした切断、
溶出時間、
タンパク質／ペプチド改変、
質量スペクトルピーク強さ、
質量スペクトルＳＮ比、
質量スペクトル信号質指標、
データベースから導出された統計値、及び
観測可能又は導出可能な特性
の少なくとも一つを含む、請求項４７記載のシステム。
【請求項５０】
１種以上のマッチ特性の確率分布を決定する確率モジュールをさらに含む、請求項４７記載のシステム。
【請求項５１】
既知のペプチドの実験データとペプチドデータベース中のペプチドとの間のマッチに基づいて１種以上のマッチ特性の経験的確率分布を決定する経験モジュールをさらに含む、請求項５０記載のシステム。
【請求項５２】
同定されている複数のペプチドを含む学習データセット又は既知のタンパク質標準のセットに基づいて確率モデル及び確率モデルに対応する複数のパラメータを調節する調節モジュールをさらに含む、請求項４７記載のシステム。
【請求項５３】
出力を生成する出力モジュールをさらに含み、出力が、
第一の確率と第二の確率との間の比である尤度比、
尤度比の対数である対数尤度、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った尤度比、
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さで割った対数尤度、及び
アミノ酸単位で計測された第一のペプチドの長さの対数で割った対数尤度
の少なくとも一つを含む、第二のペプチドに対応するマッチスコア、
マッチスコアに対応するＺスコア、
マッチスコアに対応するｐ値、
第一のペプチドに対応する生物学的情報、ならびに
第二のペプチドに対応する生物学的情報
の少なくとも一つを含む、請求項４７記載のシステム。
【請求項５４】
第二のペプチドのために理論断片化スペクトルが提供されている、請求項４７記載のシステム。
【請求項５５】
理論断片化スペクトルが、断片同位体に対応する質量を含む、請求項５４記載のシステム。
【請求項５６】
第二のペプチドを、
第二のペプチドが属するタンパク質の体系的分類、
第二のペプチドが属するタンパク質の等電点、
第二のペプチドが属するタンパク質の分子量、
非対称質量ウィンドウ、及び
複数の質量インターバルの和でできている可能な質量のセット
の少なくとも一つに基づいてフィルタリングするフィルタモジュールをさらに含む、請求項４７記載のシステム。
【請求項５７】
第一のペプチドの物理的サンプル及び第一のペプチドに対応する生物学的情報を提供する第一のプロバイダモジュール、及び
第二のペプチドの物理的サンプル及び第二のペプチドに対応する生物学的情報を提供する第二のプロバイダモジュール
をさらに含む、請求項４７記載のシステム。
【請求項５８】
疾病を診断するためのペプチドマッチング法であって、
少なくとも一つの疾病に対応する第一のペプチド及び少なくとも一つの疾病に対応しない第二のペプチドを提供すること、
第一のペプチドと、第二のペプチドと、第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片と、に対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成すること、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算すること、
確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない確率を計算すること、
第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けすること、及び
第一のペプチドと第二のペプチドとの間のスコア付けされたマッチに基づいて少なくとも一つの疾病に対応する診断を下すこと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、タンパク質及びペプチド分析に関し、特に、ペプチドどうしのマッチをそれらの断片化又は解離質量スペクトルに基づいてスコア付けするためのシステム及び方法に関する。より具体的には、本発明は、質量スペクトルに記憶された情報を利用することによって高感度で選択性の同定ツールを提供する。これは、適切な信号検出に基づくスコア付けシステム及び拡張マッチの新たな概念であると考えられるものを導入することによって達成される。
【０００２】
発明の背景
データベースサーチと組み合わせた質量分析法（ＭＳ）が、プロテオミックスプロジェクトに関連してタンパク質を同定するための好ましい方法になった（たとえばFenyo Beavis, Proteomics, A Trends Guide, July 2000, 22-26 Elsevierを参照）。典型的なプロテオームプロジェクトでは、対象のタンパク質は、一又は二次元ゲル電気泳動によって分離するか、又は、カラムクロマトグラフィーによって分別された少数のタンパク質の混合物として提供することもできる。そして、酵素、たとえばトリプシンを使用することにより、タンパク質をペプチドに消化する。このようにして得られたペプチドの質量の計測値がペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）を提供する。このようなＰＭＦは、データベースをサーチするために使用することもできるし、別の実験ＰＭＦと比較することもできる（たとえばZhang, W. and Chait, B. T. 2000: ProFound: an expert system for protein indentification using mass spectrometric peptide mapping information, Anal. Chem., 72:2482-2489及びJames, P. ed. 2000: Proteome Research: Mass Spectrometry, Springer, Berlinを参照）。特定の状況で、ＰＦＭは、元のタンパク質に対し、その不明瞭でない同定を可能にするほど十分に特異的とはいえない。このような状況では、第二の手法、たとえば、ペプチドをより小さな分子（その質量が計測される）に分解するペプチド断片化（解離ともいう）を適用することができる（たとえばPapayannopoulos, I. A. 1995: The interpretation of collision-induced dissociation mass spectra of peptides, Mass Spectrometry Review, 14:49-73を参照）。この手法は、タンデム質量分析法、タンデムＭＳ、ＭＳ2又はＭＳ／ＭＳと呼ばれる。断片の質量は、元のペプチドを同定するために使用される非常に特異的なデータセットを構成する。拡張により、タンパク質のいくつかのペプチドのＭＳ／ＭＳデータは、元のタンパク質を同定するために使用される非常に特異的なデータセットを構成する（たとえばHenzel, W. J. et al. 1993: Identifying protein from two-dimensional gels by molecular mass searching of peptide fragments in protein sequence database, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5011-5015, McCormack, A. L. et al. 1997: Direct analysis and identification of proteins in mixture by LC/MS/MS and database searching at the low-femtomole level, Anal. Chem., 69:767-776, James, P. ed. 2000: Proteome Research: Mass Spectrometry, Springer, Berlinを参照）。
【０００３】
本発明の実施態様は、親ペプチド質量の計測及びその断片の質量の計測を含む、ＭＳ／ＭＳデータに基づくペプチドの同定を改善する。
【０００４】
質量分析法（たとえばSnyder, A. P. 2000: Interpreting Protein Mass Spectra, Oxford University Press, Washington DCを参照）データによって生物学的配列のデータベースをサーチする場合に非常に一般的な手法は、実験スペクトルを、データベースに記憶された生物学的配列から生成される理論スペクトルと比較する手法である（たとえばJames, P. ed. 2000: Proteome Research: Mass Spectrometry, Springer, Berlinを参照）。理論データと実験データとの間のマッチングを格付けするためにスコア付けシステムが使用される。通常、最高のスコアのデータベースエントリが実験データの正しい表現とみなされる。理想的には、スコアは、ランダムな偶然のみによって同等以上のスコアを見いだす確率を推定するｐ値によって補足される。ｐ値は、データベース中に見いだされるマッチに多少の信頼性を与えるために使用される。
【０００５】
今日まで、ペプチドのマッチを評価又はスコア付けするための一般的な実践は、訓練を受けた技術者による手作業のスペクトル分析であった。このような方法は、一部の質量分析用途には適しているが、高スループット環境では、手作業の分析は、高スループット設定でデータ品質を定常に維持することができず、マッチをスコア付けするための自動システムに低い精度をこうむらせるため、障害となる。したがって、質量分析データを処理するための高スループットシステムは、高品質のスコア付けシステムを必要とする。
【０００６】
スコア付けシステムはいくつかのゴールを満たさなければならない。たとえば、大きなデータベース、たとえばゲノム全体をサーチし、低存在度タンパク質を検出することに関心をもつ人もいる。大きなデータベースは非常に低い偽陽性率を要する。そうでなければ、誤ったペプチドのマッチがあまりにも膨大になるであろう。これは、非常に選択性のスコア付けシステムの必要性を強調する。低存在度タンパク質の場合、一般に得られるＭＳデータは、高存在度タンパク質の場合に比較して質が低い。これは逆に、非常に高感度のスコア付けシステムの必要性を強調する。
【０００７】
現在利用可能なスコア付けシステムは、質量スペクトルから利用可能な情報の小さな部分しか考慮することができないため、選択性を欠く。たとえば、Bafna及びEdwards（たとえばBafina, V. and Edwards, N. 2001: SCOPE: a probalilistic model for scoring tandem mass spectra against a peptide database, Bioinformatics, 17:S13-S21を参照）は、断片質量だけを考慮し、親ペプチド電荷に依存せず、また、正しいマッチの観測とランダムなマッチの観測との間の尤度比を計算しない。Bafna及びEdwardsは、逐次的な断片マッチのシリーズのような物理的原理から生じる構造的強制に対応する広域的パターンを検出しようとしていない。同じことが、Dancikら（たとえばDancik, V., Addona, T. A., Clauser, K. R., Vath, J. E. and Pevzner, P. A. 1999: De novo peptide sequencing via tandem mass spectrometry: a graph-theoretica approach, J. Comp. Biol., 6:327-342を参照）及びHavilioら（たとえばHavilio, M., Haddad, Y. and Smilansky, Z. 2003: Intensity-based statistical scorer for tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 75:434-444を参照）で提示されているスコア付けシステムならびに欧州特許出願第１０４７１０７号（Micromass社が譲り受け）及びZhangら（たとえばZhang, N., Aebersold, R. and Schwikowski, B. 2002: ProbId: A probabilistic algorithm to identify peptides through sequence database searching using tandem mass spectral data, Proteomics, 2:1406-1412を参照）で開示されているような他のシステムに関しても言える。加えて、Bafna及びEdwardsは、彼らのスコア付けプロセスで最適な統計値を使用していない。
【０００８】
他の利用可能なスコア付けシステムとしては、Mascot（たとえばPappin, D. J. C., Hojrup, P. and Bleasby, A. J. 1993: Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Curr. Biol., 3:327-332を参照）、Sequest（たとえばEng, J. K., McCormack, A. L. and Yates, J. R. III 1994: An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 5:976-989及び米国特許第６，０１７，６９３号を参照）及びＳＯＮＡＲ  ＭＳ／ＭＳ（ProteoMetrics Canadaから市販）がある。後者のシステムは、実験スペクトルと理論ペプチド配列との相関の特別な経験的定義に依存する。
【０００９】
最近、多くの著者、たとえばAndersonら（たとえばAnderson, D. C, Li, W., Payan, D. G. and Noble, W. S. 2003: A new algorithm for the evaluation of shotgun peptide sequencing in proteomics: support vector machine classification of peptide MS/MS spectra and SEQUEST scores, J. Proteome Res., 2:137-146を参照）、Kellerら（たとえばKeller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E. and Aebersold, R. 2002: Emprical statistical model to estimate the accuracy of peptide identification made by MS/MS and database search, Anal. Chem., 74:5385-5392を参照）、Mooreら（たとえばMoore, R. E, Young, M. K. and Lee, T. D. 2002: Qscore: An algorithm for evaluating sequest database search results, J. Am. Soc. Mass Spectrum., 13:378-386を参照）及びSadygovら（たとえばSadygov, R. G., Eng, J., Durr, E., Saraf, A., McDonald, H., MacCoss, M. J. and Yates, J. 2002: Code development to improve the efficiency of automated MS/MS spectra interpretation, J. Proteome Res., 1:211-215を参照）が、Sequest結果を自動的に立証するためのシステムを開発した。Kellerら（上記）はまた、Mascotにも応用している。これらのシステムは、発見的システムの上に開発されたモデルベースのシステム（主に多変量統計値）のハイブリッドカテゴリーを構成する。これらの性能は一般に元来の発見的システムよりも優れているが、最適にはほど遠い。Kellerら（たとえばKeller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E. and Aebersold, R. 2002: Emprical statistical model to estimate the accuracy of peptide identification made by MS/MS and database search, Anal. Chem., 74:5385-5392を参照）と図１０とを比較すること。
【００１０】
発明の概要
本発明にしたがって、ペプチドのマッチをスコア付けする技術が提供される。ある特定の典型的な実施態様では、この技術は、第一のペプチド及び第二のペプチドを提供するステップ、第一のペプチド、第二のペプチド及び第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片それぞれに対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成するステップ、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算するステップ、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算するステップ、及び、第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするステップを含む方法によって実現することができる。
【００１１】
本発明のこの特定の典型的な実施態様のもう一つにしたがって、この技術は、プロセッサをしてペプチドのマッチをスコア付けさせるためのコードを有する記憶媒体であって、第一のペプチド及び第二のペプチドを提供するように適合されたコード、第一のペプチド、第二のペプチド及び第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片に対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成するように適合されたコード、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算するように適合されたコード、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算するように適合されたコード、及び、第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするように適合されたコードを含む記憶媒体によって／として実現することができる。
【００１２】
本発明のこの特定の典型的な実施態様のさらに別のものにしたがって、この技術は、第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするためのシステムであって、第一のペプチド、第二のペプチド及び第一のペプチド又は第二のペプチドの少なくとも１個の断片に対応する１種以上のマッチ特性に基づいて確率モデルを生成するための手段、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算するための手段、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない確率を計算するための手段、及び、第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするための手段を含むシステムによって／として実現することができる。
【００１３】
本発明のこの特定の典型的な実施態様のさらに別のものにしたがって、この技術は、第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするためのシステムであって、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチする第一の確率を計算する第一の計算モジュール、確率モデルに基づいて第一のペプチドが第二のペプチドとマッチしない第二の確率を計算する第二の計算モジュール、及び、第一の確率と第二の確率との間の比に少なくとも部分的に基づいて第一のペプチドと第二のペプチドとの間のマッチをスコア付けするスコア付けモジュールを含むシステムによって／として実現することができる。
【００１４】
以下、本発明を、添付図面に示すその典型的な実施態様を参照しながら詳細に説明する。以下、好ましい実施態様を参照しながら本発明を説明するが、本発明がそれに限定されないということが理解されるべきである。本明細書の教示に通じる当業者は、本明細書で開示され、特許請求される本発明の範囲に入り、本発明が有意な用途を有することができるさらなる具現化、改変及び実施態様ならびに他の使用分野を理解するであろう。
【００１５】
より十分な本発明の理解を容易にするため、ここで添付図面を参照する。これらの図面は、本発明を限定するものと解釈されるべきではなく、典型例を示すことを意図するだけである。
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書に開示されるものは、ペプチドのマッチをスコア付けするように設計された新規なシステム及び方法である。このシステムは、異なる観測、すなわち異なる基本事象の同時観測のタプルとしてマッチを定義する。本発明は、確率モデルを使用して観測された事象を記述することにより、マッチのスコアを生成する。
【００１７】
本発明を詳細に説明する前に、いくつかの用語の定義を以下に述べる。
【００１８】
タンパク質とは、直鎖状で非分岐鎖状のアミノ酸重合体である。本明細書で使用する「タンパク質配列」は、タンパク質を構成するアミノ酸残基のアイデンティティ及び順序を表す。タンパク質配列は、たとえばアミノ酸のリストとして表すことができる。タンパク質配列は通常、Ｎ末端からＣ末端までで順序づけられる。
【００１９】
本明細書で使用する「ペプチド」は、通常は酵素的消化によって得られる、タンパク質の一部である。配列に関して、ペプチド配列は、タンパク質配列全体の部分配列である。ペプチド配列は、ペプチドを構成するアミノ酸残基のアイデンティティ及び順序を表す。文脈に依存して、実験ペプチド、すなわち通常は質量が質量分析法によって物理的に計測されているペプチドと、理論ペプチド、すなわち通常はデータベース中に見られるペプチド配列とを明示的に区別することが重要であることもある。本発明に関連して、「ペプチド」（たとえば実験ペプチド又は候補もしくは理論ペプチド）又はタンパク質は、いかなる適当な方法で表してもよい。たとえば、ペプチドは一般に、物性、たとえば質量スペクトル中で記述されるその質量又は一連の質量によって表される。質量スペクトルはペプチドの物性を記述するため、ペプチドの提供又は取得は通常、たとえば質量スペクトル（たとえば質量のリストとして提供）を提供又は取得することを含む。
【００２０】
本明細書で使用する「親ペプチド」は、タンデム質量分析法で断片化されて複数のペプチド断片又は断片イオンを生じさせるペプチドである。
【００２１】
本明細書で使用する「実験ペプチド」は、同定又はマッチ（たとえばデータとマッチ又は別のペプチドとマッチ）されるペプチドである。実験ペプチドは、未知のペプチドとも呼ばれることもある。実験スペクトルとは、経験的に計測される質量スペクトルである。一般に、実験スペクトルは、計測される質量又は質量電荷比を指す。すなわち、実験信号が処理されて後者の量が抽出されている。
【００２２】
本明細書で使用する「候補ペプチド」は、「理論ペプチド」又は経験的に決定されたペプチドを含むいかなるペプチドであってもよい。通常、「候補ペプチド」は、実験ペプチドとの可能なマッチに関して評価されるペプチドである。「理論ペプチド」は、予測されるが経験的には決定されないペプチド又はランダムに生成されるペプチド又はデータベース中で見いだされるかもしれない既知のタンパク質の一部であるペプチドである。理論スペクトルとは、ペプチド配列から計算された質量及び／又は質量電荷比のリストである。タンパク質改変が考慮されるならば、理論スペクトルは相応に計算されなければならない（表１を参照）。候補ペプチドが経験的に決定されるペプチドである場合、それは既知のペプチドであってもよい。あるいはまた、候補ペプチドは、二つの実験スペクトルのマッチをスコア付けする場合に本発明に関連して使用される未同定のペプチドであってもよい。
【００２３】
表１は、異なる種のいくつかの改変を有する改変ペプチドの例（固定、改変あり及び改変なしで可変性）を示す。改変の各組み合わせが、対応するペプチド総質量及び二行目の可変性改変の場所によって報告されている。
【００２４】
【表１】
2006511821.tif 000003
2006511821.tif 000004
2006511821.tif 000005
【００２５】
本明細書で使用する「タンパク質改変」は、タンパク質の化学構造の改変である。このような改変は、生物学的起源（翻訳後改変）を有してもよいし、たとえば使用される実験プロトコルによる化学的改変又はタンパク質分解から生じるものでもよい。ペプチド質量及びＭＳ／ＭＳスペクトルの両方を改変する（たとえば表２及びTurner, J. P. et al. 1997: Letter code, structure and derivatives of amino acids, Molecular Biotechnology, 8:233-247を参照）。
【００２６】
表２は改変の例を示す。フォーマットは、１改変あたり２行を使用している。一行目：改変番号、ショートネーム、ロングネーム、［前の文字：改変部位の文字：後の文字］。＾（ハット）文字は「not」を意味する。すなわち、＾の後の文字を除くすべての文字を意味する。二行目：Ｎ末端（Ｔ／Ｆ）−−−Ｃ末端（Ｔ／Ｆ）、モノ同位体的アミノ酸質量に対する修正：平均アミノ酸質量に対する修正。
【００２７】
本明細書で使用する可変性改変とは、所与のアミノ酸残基で存在してもよいし存在しなくてもよい改変である。固定改変とは、アミノ酸残基で実質的に常に見られる改変である。
【００２８】
【表２】
2006511821.tif 000006
2006511821.tif 000007
【００２９】
本明細書で使用する「イオンシリーズ」は、ペプチド断片化又は解離のタイプである（たとえば表３及び４、Papayannopoulos, I. A. 1995: The interpretation of collision-induced dissociation mass spectra of peptides, Mass Spectrometry Review, 14:49-73を参照）。
【００３０】
表３は、システイン改変され（Ｃｙｓ＿ＣＡＭ、＋５７ダルトン）、グルタミン（Ｑ）脱アミド化された（＋１ダルトン）ペプチドの断片化スペクトルを示す（質量は端数を捨てて１にした）。イオンシリーズの命名は、星印が後に続くシリーズ名を除き標準的である。後者は「任意数の損失」を意味する。−１に等しい質量は不可能なイオンに相当する。
【００３１】
表４は、ペプチドトリプシンＦＰＮＣＹＱＫＰＣＮＲの理論ＭＳ／ＭＳスペクトルである。二硫黄結合を断つために使用される改変Ｃｙｓ＿ＣＡＭ（ヨードアセトアミド、＋５７Da）は、可変性改変とみなした。規則は、各システイン（Ｃ）を改変することができるということである。ペプチドの総質量は「合計」と記された列にある。１個のシステインだけが改変されている二つのケースは同じ合計質量を共有する。断片質量が必要とされるため、改変の正確な場所が必要である。
【００３２】
ペプチドは、異なる場所で断片化することができる。各総称的な場所が、図２ｂに示すように、いわゆるイオンシリーズに対応する。完全な命名法に関しては、完全な記述のために、Spengler, B. 1997: Post-source decay analysis in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biomolecules. J. Mass Spectrom., 32:1019-1036、Falik et al. 1993, Johnson, R. S. et al. 1988: Collision-induced fragmentation of (M+H)+ ions of peptides. Side chain specific sequence ion. Intl. J. Mass Spectrom. and Ion Processes, 86:137-154、DeGnore, J. P. and Qin, J. 1998: Fragmentation of phoshopeptides in an ion trap mass spectrometer, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 9:1175-1188及びPapayannopoules, I. A. 1995: The interpretation of collision-induced dissociation mass spectra of peptides, Mass Spectrometry Review, 14:49-73を参照すること。特に、二重荷電ｂイオンをｂi++によって指定し、ＮＨ3を失ったｂイオンをｂi*によって指定し、Ｈ2Ｏを失ったｂイオンをｂi○によって指定することが一般的である（シリーズａ、ｃ、ｘ、ｙ、ｚと同じ表記）。各タイプの質量分析計が特異的なイオンシリーズセットを生成する。これはまた、親ペプチドの荷電状態に依存することもできる。
【００３３】
使用される質量分析計器がＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又はＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ計器である場合（たとえばJames, P. ed. 2000: Proteome Research: Mass Spectrometry, Springer, Berlinを参照）、経験的に計測され、断片化される各ペプチドは、「溶出時間」、すなわち質量分析計に取り付けられたクロマトグラフィーシステム中のその滞留時間で得られる（たとえばSakamoto, Y., Kawakami, N. and Sasagawa, T. 1988: Prediction of peptide retention times, J Chromatogr., 442:69-79, Mant, C. T., Zhou, N. E. and Hodges, R. S. 1989: Correlation of protein retention times in reversed-phase chromatography with polypeptide chain length and hydrophobicity, J. Chromatogr., 476:363-75を参照）。
【００３４】
【表３】
2006511821.tif 000008
【００３５】
【表４】
2006511821.tif 000009
【００３６】
タンパク質をペプチドに切断するために使用される酵素が特定の部位を切断する（たとえばThiede, B. et al. 2000: Analysis of missed cleavage sites, tryptophan oxidation and N-terminal pyroglutamylation after in-gel tryptic digestion, Rapid Commun. Mass Spectrum., 14:496-502を参照）。場合によっては、いくつかの部位が酵素によってミスされるかもしれない。切断部位がミスされているような場合、実験ペプチドは「ミスした切断」部位を含む。連続する２個の切断部位がミスされるならば、ペプチドは２個の「ミスした切断部位」を含む、などとなる。一例として表５を参照。
【００３７】
表５は、トリプシン活性をモデル化するためのより進歩した規則の例を示す。より正確な規則を使用することにより、不要な理論ペプチドの数を減らし、ひいてはより特異的な理論スペクトルを得ることができる。
【００３８】
ｐ値は、偶然によって手近に得られるスコアと少なくとも同じくらい良好であるスコアを有するマッチを見いだす確率である。Ｚスコアとは正規化スコアである。すなわち、ランダムなスコア、すなわち誤ったペプチドをマッチすることによって得られるスコアの平均値及びそれらの標準偏差が与えられると、Ｚスコアは、スコア−（マイナス）平均値÷標準偏差である。尤度比とは、あるマッチが正しい確率と、あるマッチが正しくない（ランダムなマッチ）である確率との比である。
【００３９】
ペプチドスコア付けは信号検出に関連して考慮される。検出すべき信号は、誤ったペプチド配列の集合の中の実験ペプチドに対応する正しいペプチド配列である。スコア付けシステムを使用するアルゴリズムが検出を実行する。アルゴリズムによって見いだされた正しいペプチド配列の出現を「真陽性（ＴＰ）」又は「ヒット」と定義し、アルゴリズムによって正しいと同定された誤ったペプチド配列の出現を「偽陽性（ＦＰ）」又は「擬警告」又は「タイプＩエラー」と定義し、アルゴリズムによって拒絶された誤ったペプチド配列の出現を「真陰性（ＴＮ）」又は「正しい拒絶」と定義し、アルゴリズムによって拒絶された正しいペプチド配列の出現を「偽陰性（ＦＮ）」又は「ミス」又は「タイプIIエラー」と定義する。本明細書で使用する実験ペプチド又は実験ペプチド配列は、候補ペプチドが、ペプチド配列を同定するために使用される質量分析計の分解能の範囲で相互に等圧性又は相互に質量あいまいであるアミノ酸の置換の場合のみを除き、実験ペプチド中のアミノ酸残基と同じアイデンティティ及び順序を有する場合、候補ペプチド（たとえばデータベース中のペプチド配列）に「合致」する。
【００４０】
【表５】
2006511821.tif 000010
【００４１】
図１を参照すると、本発明の一つの実施態様にしたがってペプチドのマッチをスコア付けする典型的な方法を示すフローチャートが示されている。
【００４２】
方法はステップ１０２から出発する。ステップ１０４で、実験ペプチド及び候補ペプチドを提供することができる。先に定義したように、実験ペプチド及び候補ペプチドは、多様な出所から得ることができる。多数のペプチド特性に関連するデータを提供することができる。たとえば、とりわけ、実験ペプチド、候補ペプチド及びそれらの断片に関連する質量スペクトル情報を提供することができる。
【００４３】
考慮される実験スペクトルは、スコア付け法が適用される前に前処理されていてもよい。このような前処理は通常、未処理のスペクトルのピークを検出するステップ、関連する同位体的ピークを同定するステップ及び最終的にスペクトルを逆重畳積分する（同じイオンの異なる荷電状態を同定する）ステップを含む。前処理ステップはまた、ＳＮ比及び他のピーク形状特性に基づいてピークを選択することを含む。前処理は、質量リスト又は質量電荷比リストを生成することができる。
【００４４】
本発明の一つの目的は、二つのペプチド断片化又は解離スペクトルの間の相関の指標を推定又は提供することを狙うスコア付け法である。スコア付け法は、二つのＭＳ／ＭＳスペクトルを比較して、それらのスペクトル又はスペクトルが導出される元のペプチドどうしが関連するかどうかを決定する際に使用することができる。本発明の方法はまた、ペプチドの実験ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ペプチド配列から計算された理論ＭＳ／ＭＳスペクトルと比較することを含むことができる。スコア付けシステムはまた、第一の実験ＭＳ／ＭＳスペクトルと第二の実験ＭＳ／ＭＳスペクトルとを比較する際に使用することもできる。
【００４５】
１個の候補ペプチドの代りに、１種以上の候補ペプチド配列を提供してもよい。候補ペプチド配列（たとえば理論ペプチドである候補）は、データベース中に記憶されていてもよい。あるいはまた、計算、たとえばＤＮＡ配列の翻訳の結果であってもよい。あるいはまた、候補ペプチド配列は、手作業で入力してもよい。通常、候補ペプチド配列はデータベース中に記憶されている。記憶されている配列はアミノ酸配列であってもよいが、アミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を記憶することが可能であるようないかなる適当な表現手段を使用してもよく、アミノ酸配列は、実験質量スペクトルを相関させる過程でコンピュータ手段を介して生成される。あるいは、タンパク質配列のライブラリのインシリコ消化からペプチドのライブラリを生じさせることもできる。
【００４６】
一つの実施態様で、スコア付け法は、ペプチド配列ライブラリに照らしてＭＳ／ＭＳランをサーチするために使用される。ＭＳ／ＭＳランとは、通常はタンパク質の混合物から得られる、いくつかのペプチドに関する一連のＭＳ／ＭＳスペクトルであり、１個の実験ペプチドのための同定手法がランのペプチドごとに繰り返し適用される。
【００４７】
図１のステップ１０６で、マッチ特性を選択し、その確率分布を決定することができる。考慮されるマッチ特性としては、親ペプチドにおける質量誤差、断片における質量誤差、親の荷電状態、アミノ酸組成、ミスした切断の存在、溶出時間、タンパク質改変の存在、親のピーク強さ及びＳＮ比、断片のピーク強さ及びＳＮ比、信号質指標ならびに先験的知識から導出される、たとえばタンパク質データベースから得ることができる統計値があるが、これらに限定されない。種々の観測のタプルとしてマッチを考慮すると、利用可能な情報を十分に活用することにより、高スループットデータの可変性質を効率的に扱うことができる。
【００４８】
本発明の実施態様によると、複数のマッチ特性を、それぞれが確率分布を有する確率変数として処理することができる。これらの確率変数の分布を記述する統計値は、たとえば公に利用可能な出所又は計器製造業者をはじめとするいかなる適当な出所によって提供してもよい。統計値はまた、経験的に得ることもできるし、たとえば人工神経回路網又は隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を使用することによって推定することもできる。
【００４９】
ステップ１０８で、複数のマッチ特性を記述する適当な確率モデルを生成することができる。一般に、確率モデルとは、ランダムな（確率）成分又は入力を含む数学モデルである。その結果、指定された入力シナリオでは、対応するモデル出力変数は、確率分布としてのみ知られる。本発明では、ペプチドのマッチは、種々の基本的事象の同時観測によって決定される。本発明は、確率モデルを使用して、観測された事象を確率変数として記述することにより、マッチのスコアを生成することができる。したがって、ユーザは、モデルで考慮すべき１種以上の要因を選択する。モデルは、比較的大きな相対的影響を断片化スペクトルに対して及ぼすマッチ特性だけを考慮することができる比較的簡単なモデルであってもよいし、マッチで観測される、より多くの要因を考慮するより複雑又は完全なモデルであってもよい。
【００５０】
これらの概念を定義し、それらが本発明にどのように関連するかを説明するため、いくつか事象を変数として記述し、次のように導入する。本発明の方法を与えられると、事象のいかなる適当な組み合わせを選択し、モデル化してもよく、本明細書ではリストされないさらなる事象を、単独で又は本明細書に記載された事象と組み合わせてモデルに使用してもよいということが理解されるべきである。特に、他のペプチド同定システムの結果を含めることが可能である。
【００５１】
Ｄpは、親ペプチド質量における質量許容差である。これは、ダルトン又はppm（parts per million）単位で表すことができる。非対称質量ウィンドウを考慮してもよい。その場合、Ｄp（ｍt）を、ペプチド理論質量ｍtに依存して、質量ウィンドウを画定する実数のセットを返す関数として定義することができる。非対称質量ウィンドウは、モノ同位体的ピーク検出における誤差を扱う際に有用であるかもしれない（図２ｂ）。たとえば、第一の同位体が正しい質量に１ダルトンを追加し、計器精度がδであるとすると、Ｄp（ｍt）＝［ｍt−δ、ｍt＋１＋δ］又は、δが１よりもいちじるしく小さい場合、Ｄp（ｍt）＝［ｍt−δ、ｍt＋δ］∪［ｍt＋１−δ、ｍt＋１＋δ］を使用することを望むかもしれない。このような非対称セットはまた、ppm単位での相対質量誤差に関しても定義することができる。
【００５２】
Ｄfは、断片質量における質量許容差である。一般にダルトン又はppm単位で表される。非対称質量ウィンドウを考慮してもよい。その場合、Ｄfは、断片理論質量に依存して、質量ウィンドウを画定する実数のセットを返す関数として定義することができる。非対称セット及び背景の有理数の例に関してはＤpの定義を参照すること。
【００５３】
Ｓは、所与の質量分析計器に関して考慮されるイオンシリーズのセットである。
【００５４】
Ｗは、実験ペプチド質量とマッチするために理論ペプチドに加えられる改変のセットである。Ｗは、各改変及びペプチド配列中のその位置、すなわち改変されるアミノ酸を同定するペアのセットである。
【００５５】
Ｐはペプチドのマッチである。
Ｐ＝（ｍ，ｉｎｔ（ｍ），ｍt）
ここで、ｍは、実験親ペプチド質量であり、ｉｎｔ(ｍ）は、対応する信号強さである。ｍが理論ペプチド質量ｍtに十分に近いならばマッチが発生する。したがって、｜ｍ−ｍt｜≦Ｄpならば、又は、許容差がppmで与えられる場合、１０6｜ｍ−ｍt｜／（０．５（ｍ＋ｍt））≦Ｄpならば、又は、非対称許容差の場合、ｍ∈Ｄp（ｍt）ならば、マッチが発生する。改変（Ｗ）が理論ペプチド質量ｍtを変化させるため、ＰはＷに依存し、Ｐ（Ｗ）と書くことができる。タプルＰに含まれる情報は、実験質量ｍに限定されることもできるし、信号処理ソフトウェア（ピーク検出）によって提供される余分な情報、たとえばピーク幅、ＳＮ比、ペプチド信号理論パターンとのフィットの質などによって補強されることもできる。したがって、より完全なＰのバージョンは以下である。
Ｐ＝（ｍ，ｉｎｔ（ｍ），ｗｉｄｔｈ（ｍ）,ｓｎ（ｍ），ｆｉｔ（ｍ），ｍt）
【００５６】
Ｆは、断片マッチ、すなわち、断片に関するものに限定されているマッチである。通常、ペプチドのマッチが観測される場合、理論ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ペプチド質量とマッチするように可能な改変Ｗが含まれた状態で計算される。理論ＭＳ／ＭＳスペクトル計算に関しては、Baker & Clauser（Baker, P. and Clauser, K. MS-Product, part of the Protein Prospector suite at http://prospector.ucsf.edu/）を参照すること。その場合、断片マッチは、理論断片質量に十分に近い実験断片質量で構成される。
Ｆ＝｛（ｆj，ｉｎｔ（ｆj），ｓｅｒｉｅｓ（ｆj），ｐｏｓ（ｆj），ｍt,j）｝，ｊ∈Ｊ
ここで、Ｊは、理論断片質量に十分に近い実験断片質量ｆjを示すために使用される指数のセットである。ｍt,jが理論断片質量であると仮定すると、｜ｆj−ｍt,j｜≦Ｄfならば、又は、許容差をppmで与える場合、１０6｜ｆj−ｍt,j｜／（０．５（ｆj＋ｍt,j））≦Ｄfならば、又は、非対称許容差の場合、ｆj∈Ｄf（ｍt,j）ならば、実験質量ｆjは理論質量に十分に近い。理論質量ｍt,jは、ペプチド配列及びイオンシリーズｓｅｒｉｅｓ（ｆj）∈Ｓの位置ｐｏｓ（ｆj）のアミノ酸に対応する。実験信号ｆjの強さはｉｎｔ（ｆj）である。例として表３及び４を参照すること。ペプチドの理論ＭＳ／ＭＳスペクトルは、イオンシリーズ（Ｓ）及びペプチド改変（Ｗ）に依存し、その場合、ＦはＦ（Ｄf，Ｓ，Ｗ）と書かれる。タプルＦに含まれる強さに関する情報は除くことができる。個々の断片に関する情報は、信号処理ソフトウェア（ピーク検出）によって提供される余分な情報、たとえばピーク幅、ＳＮ比、ペプチド信号理論パターンとのフィットの質などによって補強することができる。したがって、より完全なＦのバージョンは以下である。
Ｆ＝｛（ｆj，ｉｎｔ（ｆj），ｗｉｄｔｈ（ｆj）,ｓｎ（ｆj），ｆｉｔ（ｆj），ｓｅｒｉｅｓ（ｆj），ｐｏｓ（ｆj），ｍt,j）｝，ｊ∈Ｊ
【００５７】
ｚは、距離Ｄp又はＤp（ｍ）の範囲で実験ペプチドｍ／ｚ比を理論ペプチド質量とマッチさせるために使用される電荷である。
【００５８】
ｔは、実験親ペプチドの溶出時間である。
【００５９】
ｋは、実験データとマッチする理論ペプチドにおけるミスした切断の数である。
【００６０】
ｅは、他のペプチド同定システム、たとえばSequest及びMascotのような市販のプログラムから得られた量のベクトルである。
【００６１】
本発明の実施態様にしたがって、以下に記載する補題１をスコア付け法に使用することができる。
【００６２】
補題１
事象Ｃを与えられた場合に事象Ａ及びＢを同時に観測する条件付き確率は、事象Ｂ及びＣの同時出現を与えられた場合に事象Ａを観測する確率×事象Ｃを与えられた場合に事象Ｂを観測する確率に等しい。すなわち
Ｐ（Ａ，Ｂ｜Ｃ）＝Ｐ（Ａ｜Ｂ，Ｃ）Ｐ（Ｂ｜Ｃ）
【００６３】
証明
Ｐ（Ａ，Ｂ｜Ｃ）＝Ｐ（Ａ，Ｂ，Ｃ）／Ｐ（Ｃ）かつＰ（Ａ｜Ｂ，Ｃ）＝Ｐ（Ａ，Ｂ，Ｃ）／Ｐ（Ｂ，Ｃ）が得られる。これは、Ｐ（Ａ，Ｂ｜Ｃ）＝Ｐ（Ａ｜Ｂ，Ｃ）Ｐ（Ｂ，Ｃ）／Ｐ（Ｃ）を含意する。
【００６４】
このスコア付けシステム又は方法は、いくつかの状況で使用することができる。一例では、実験ＭＳ／ＭＳスペクトル、ペプチド配列ｓ、イオンシリーズセットＳ及び改変Ｗを与えられると、ユーザは、拡張マッチＥ：Ｅ＝（Ｆ，Ｐ，ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ，ｅ）として定義されることができるものをいっしょに構成する確率変数のシリーズの値を計算する。そして、ユーザは、Ｅの中の各変数を確率変数とみなすことにより（したがってＥはそのものが確率変数である）、また、（ｉ）実験スペクトルが得られる元のペプチドがｓに合致する確率Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）及び（ii）実験スペクトルが得られる元のペプチドがｓに合致しない確率Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）を計算することにより、拡張マッチをスコア付けする。Ｄは、利用可能な余分な情報であり、Ｈ1は、配列ｓが実験ペプチドの正しい配列であるという仮説（対立仮説）であり、Ｈ0は、配列ｓが誤りである、すなわちＥがランダムな偶然から生じたものであるという帰無仮説である。
【００６５】
尤度比Ｌを計算するためには、ケースＨ0及びケースＨ1の両方で確率変数Ｅの分布を知ることが必要である。たとえばＤは、理論ペプチド質量の分布（図４）又は経験的に計測された質量の分布を含むことができる。もう一つの可能性は、ペプチド長に対する改変数の分布である。
【００６６】
拡張マッチの概念の利点は、それが、利用可能な情報を正確な数学的フレームワークで活用するのに役立つということである。Ｆは、ＭＳ／ＭＳスペクトルに直接関連するため、Ｅに含まれる。理論ＭＳ／ＭＳスペクトルと実験ＭＳ／ＭＳスペクトルとの間のマッチが類似した質であるならば、Ｐを含めることは、２個の理論ペプチドをそれらの総質量（改変を含む）に基づいて区別する能力を提供する。ミスした切断の数もまた、いくつかの候補マッチを区別するのに役立つ能力を有する。一般に、酵素が切断部位をミスする確率は１よりもきわめて低い。ｋ＞０個のミスした切断を含む理論ペプチドは、正しい確率がより低い。長いペプチドは、正電荷を得る又は負電荷を失う確率がより高いため、荷電状態ｚはペプチド長に強く相関している。したがって、ｚは、候補ペプチドをその長さにしたがって区別するのに不可欠であるかもしれない。また、実験スペクトルで観測されるイオンシリーズは、親ペプチド荷電状態に強く依存する。ペプチドは、それらの疎水性及びサイズに依存して、ＨＰＬＣカラム中の異なる時間で溶出するため、同様な理由によりｔの包含を動機づけられる。最後に、好都合には、ペプチドに加えられる改変Ｗのセットを考慮することができる。簡単な例は、疑わしい数の改変がある（多すぎる）場合である。通常は、ペプチド長に対する改変の数の統計値に依存して、Ｗがもっともらしい確率にアクセスすることができる。
【００６７】
一つの実施態様では、スコア付け法は、ペプチド配列のライブラリをサーチすることによってＭＳ／ＭＳスペクトルが利用可能である実験ペプチドを同定するために使用される。処理は、ライブラリ中の複数の配列に適用され、
１．理論ペプチド質量を実験親ペプチド質量（それぞれｍ及びｍtと呼ぶ）と比較するステップ、及び
２．二つの質量の差の絶対値がＤp以下であるならば、理論断片化スペクトルを計算し、Ｅ及びＬを計算するステップ
を含む。
【００６８】
二つの質量の差の絶対値がＤp以下でないならば、相関とはみなされない。
【００６９】
ステップ２に関して、条件｜ｍ−ｍt｜≦Ｄpを、許容差がppmで与えられている場合には１０6｜ｍ−ｍt｜／（０．５（ｍ＋ｍt））≦Ｄpに換えてもよく、非対称許容差の場合にはｍ∈Ｄp（ｍt）（ｍは、実験ペプチド質量であり、ｍtは、理論ペプチド質量である）に換えてもよい。
【００７０】
もう一つの実施態様では、スコア付け法は、ペプチド配列のライブラリをサーチすることによってＭＳ／ＭＳスペクトルが利用可能である実験ペプチドを同定するために使用される。ペプチドはおそらくは改変されており、いくつかの改変はペプチドライブラリ中で直接は指定されていない。ライブラリ中の各ペプチド配列に適用される処理は以下のステップを含む。
【００７１】
１．可能な改変のセットを与えられると、可能な各理論質量を計算し、実験質量と比較する。改変を計算する典型的な方法は、２００３年４月１６日出願の、改変ペプチドを計算する方法を記載する、開示内容を引用例として本明細書に取り込む国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０３９９８に記載されている。可能な各理論質量は改変のセットＷ（おそらくは空）に対応する。Ｗは、ペプチド配列ライブラリで直接指定されている改変に対してなされたものであり、他の改変は、総質量計算の際に加えられるものである。
【００７２】
２．実験ペプチド質量と理論質量（特定のＷの）との差の絶対値がＤp以下であるならば、理論断片化スペクトルを計算し、Ｗを考慮して、Ｅ及びＬを計算する。そうでなければ、相関とはみなさない。
【００７３】
ステップ２に関して、条件｜ｍ−ｍt｜≦Ｄpを、許容差がppmで与えられている場合には１０6｜ｍ−ｍt｜／（０．５（ｍ＋ｍt））≦Ｄpに換えてもよく、非対称許容差の場合にはｍ∈Ｄp（ｍt）（ｍは、実験ペプチド質量であり、ｍtは、理論ペプチド質量である）に換えてもよい。
【００７４】
したがって、本発明によると、ペプチドのマッチをスコア付けする際にペプチドの１種以上の特性を考慮することができる。本明細書でさらに記載するように、Ｅの種々のバージョンを考慮することができる。マッチをスコア付けする際に考慮することができる変数は、考慮される事象に依存して、マッチ確率に対して有意な影響を及ぼすように選択することができ、その後、補題１を使用し、確率変数依存性推定を簡素化して、Ｌを計算する効果的な方法を得ることができる。
【００７５】
いくつかの典型的なモデルを以下に示す。以下に記載するこれらのモデルは、異なる事象もしくは変数又は事象もしくは変数の組み合わせを考慮する。本発明の方法は以下の例に限定されず、本発明の方法は、変数のいずれか又は変数のいずれかの組み合わせを考慮して実施することができるということが理解されよう。
【００７６】
一つの例（バージョン１）では、スコア付け法は、親ペプチドにおける質量誤差、断片マッチにおける質量誤差、電荷、溶出時間、ミスした切断及びペプチド改変を考慮することができる。この場合、Ｅ＝（Ｆ，Ｐ，ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ）かつＬ＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｅ）｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）である。これは、データベースマッチから抽出することができるいくつかの観測を含む拡張マッチの事例である。妥当な簡素化仮定に基づいて、Ｌにおける確率を推定することが可能である。たとえば、補題１は以下を生じる。
Ｐ（Ｅ）｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）＝Ｐ（Ｆ｜Ｐ，ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ，Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）Ｐ（Ｐ，ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）
ここで、
【００７７】
【数４】
2006511821.tif 000011
【００７８】
と仮定する。すなわち、断片マッチが親マッチＰ、溶出時間ｔ、ミスした切断の数ｋ及び改変Ｗに依存しないと仮定する。この例は、断片マッチが改変に依存しないという簡素化仮定を行うが、特定の改変は断片化パターンを変化させることもあるため、他の例では、断片マッチの改変への依存性を考慮してもよいということが理解されよう（たとえばDeGnore, J. P. and Qin, J. 1998: Fragmentation of phosphopeptides in an ion trap mass spectrometer, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 9:1175-1188を参照）。右項の正しい因子もまた、補題１で簡素化される。
Ｐ（Ｐ，ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）＝Ｐ（Ｐ｜ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ，Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）
×Ｐ（ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）
【００７９】
そして、
【００８０】
【数５】
2006511821.tif 000012
【００８１】
すなわち、ペプチドのマッチが溶出時間、ミスした切断の数及び改変に依存しないと仮定する。ここでもまた、改変への非依存性を論じることができる。計器は、質量を直接計測するのではなく、質量電荷比を計測するものであるため、荷電状態ｚへの依存性は意味がある。したがって、計測誤差は、１よりも大きい荷電状態で増幅される。再び補題１を適用し、
Ｐ（ｚ，ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）＝Ｐ（ｚ｜ｔ，ｋ，Ｗ，Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）Ｐ（ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）
を簡素化する。
【００８２】
【数６】
2006511821.tif 000013
【００８３】
ペプチドはサイズに応じて部分的に溶出し、ペプチドが有することができる電荷の数はそのサイズに部分的に依存するため、溶出時間への依存性は保持される。特定の改変がプロトン化部位を抑制し、ひいてはペプチドが有することができる可能な電荷の数に影響するため、ここでもまた、Ｗを考慮しないことが簡素化目的によって動機づけされる。Ｐ（ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）に補題１を適用すると、以下が得られる。
Ｐ（ｔ，ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）＝Ｐ（ｔ｜ｋ，Ｗ，Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）Ｐ（ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）
【００８４】
【数７】
2006511821.tif 000014
【００８５】
と仮定する。最後に、残りの因子を補題１によって以下に変形する。
Ｐ（ｋ，Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）＝Ｐ（ｋ｜Ｗ，Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）Ｐ（Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1,0）
かつ
【００８６】
【数８】
2006511821.tif 000015
【００８７】
したがって、すべてを合わせると、
【００８８】
【数９】
2006511821.tif 000016
【００８９】
となる。
【００９０】
もう一つの例では、スコア付け法は、親ペプチドにおける質量誤差、断片マッチにおける質量誤差、電荷及びミスした切断を考慮することができる。この実施態様（バージョン２Ａ）では、Ｅ＝（Ｆ，Ｐ，ｚ，ｋ）かつＬ＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）である。先の例と同様に処理を実施すると、以下のようになる。
【００９１】
【数１０】
2006511821.tif 000017
【００９２】
さらなる例では、スコア付け法は、親ペプチドにおける質量誤差、断片マッチにおける質量誤差及び電荷を考慮することができる。この実施態様（バージョン２Ｂ）では、Ｅ＝（Ｆ，Ｐ，ｚ）かつＬ＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）である。先の例と同様に処理を実施すると、以下のようになる。
【００９３】
【数１１】
2006511821.tif 000018
【００９４】
さらなる例では、スコア付け法は、断片マッチにおける質量誤差及び電荷を考慮する簡素化フォーマットで実施することができる。この実施態様（バージョン３Ａ）では、Ｅ＝（Ｆ，ｚ）かつＬ＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）である。先の例と同様に処理を実施すると、以下のようになる。
【００９５】
【数１２】
2006511821.tif 000019
【００９６】
この簡素化バージョンは、拡張マッチタプルＥにペプチドマッチＰをもはや含まない。これは、ペプチド質量が実験ペプチドと理論ペプチドとを比較するためだけに使用され、質量差が許容可能になると直ちに、ペプチド質量精度を使用することなくスコアが計算されることを意味する。このようなスコア付けシステムとMascotソフトウェア（たとえばPerkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M. and Cottrell, J. S. 1999: Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data, Electrophoresis, 20(18):3551-3567を参照）との間の比較に関して図３を参照すること。
【００９７】
さらなる簡素化フォーマットでは、本発明の方法は、断片マッチにおける質量誤差及び親ペプチドにおける質量誤差を考慮することによって実施することができる。この実施態様（バージョン３Ｂ）では、Ｅ＝（Ｆ，Ｐ）かつＬ＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）である。先の例と同様に処理を実施すると、以下のようになる。
【００９８】
【数１３】
2006511821.tif 000020
【００９９】
図１に戻ると、ステップ１１０で、「ヒット」の確率を計算することができる。すなわち、生成した確率モデルに基づいて、実験ペプチドが候補ペプチド配列とマッチする確率（又はその分布）を計算することができる。以下の例では、Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）の計算を例示的に説明する。
【０１００】
一つの実施態様では、確率変数Ｅの分布は、ケースＨ1における既知のデータセット、すなわち、既知のペプチドのスペクトルから学習され、ペプチドライブラリ中の対応するマッチが使用される。種々の経験的分布を計算したのち、使用して、Ｅで考慮される種々の事象に対応する確率を推定することができる。上記第一の例（バージョン１）を参照すると、経験的方法を適用して必要な分布を学習することができる。その場合、スコア付けの事例は以下のとおりである。
【０１０１】
【数１４】
2006511821.tif 000021
【０１０２】
Ｗ（ペプチド改変）
Ｐ（Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、ペプチド１個あたりの可変性改変の総数をペプチド長で割った経験的分布又は潜在的改変の部位の数、すなわち＃Ｗ／ｌｅｎ（ｓ）（ｌｅｎ（ｓ）は、ペプチド配列ｓの長さであり、＃Ｗは、Ｗの濃度である）を計算することによって推定することができる。したがって、以下の近似が得られる。
【０１０３】
【数１５】
2006511821.tif 000022
【０１０４】
より正確な推定は、セットＷに含まれる個々の改変の確率を推定することによって得ることができる。改変は、以下によって指定ことができる。
Ｗ＝｛（ｍｏｄi，ｐｏｓi）｝，ｉ∈Ｉ
ここで、Ｉは、指数のセットであり、ｍｏｄiは、可能な改変のセットから取り出した特定の改変（表１）であり、ｐｏｓiは、ペプチド配列中の対応する位置である。各改変は位置に対応するが、同じ改変がいくつかの位置で見いだされることが可能である。各改変が独立して起こると仮定することができ、ひいては、正しいマッチのデータセットから、ペプチド長又は潜在的な改変部位の数に対する改変ごとの発生数の経験的分布を学習することができる。Ｗ及びｎｕｍ（ｍｏｄ，Ｗ）、ｍｏｄ∈Ｍ（Ｗ）、Ｗにおけるｍｏｄの発生の回数の別個の改変のセットをＭ（Ｗ）によって指定する。後者の表記に関して、よりよい近似を以下のように書くことができる。
【０１０５】
【数１６】
2006511821.tif 000023
【０１０６】
しかし、ペプチド長又は潜在的な改変部位の数に対する経験的統計値を使用せずに済ますことも可能であることが理解されよう。代りに、改変の数の経験的統計値を計算することができる。
【０１０７】
他の例では、各改変を、人工神経回路網又は隠れマルコフモデルによって推定されるその確率によってスコア付けすることが可能である（たとえばBlom, N. et al. 1999: Sequence- and structure-based prediction of eukaryotic phosphorylation sites, J. Mol. Biol., 294:1351-1362及びHansen, J. E. et al. 1998: NetOglyc: prediction of mucine type O-glycosylation sites based on sequence context and surface accessibility, Glycoconjugate Journal, 15:115-130を参照）。そして、独立性を仮定することにより、個々の確率を乗することができる。人工神経回路網又は隠れマルコフモデルパラメータは、既知の例のセットからトレーニングすることができる。
【０１０８】
ミスした切断
Ｐ（ｋ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、ミスした切断（切断されていない切断部位）の経験的確率を単に計算することにより、正しい同定のセットから推定することができる。表５は、ミスした切断の部位を予測するための典型的な規則を提供する。この確率をｐによって指定し、ミスした切断事象の独立性を仮定することにより、二項分布である以下の近似が得られる。
【０１０９】
【数１７】
2006511821.tif 000024
【０１１０】
ここで、ｎは、ペプチド配列中の切断部位の数である。
【０１１１】
溶出時間（ｔ）
Ｐ（ｔ｜Ｗ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、配列から推定されるペプチドの物理化学的性質を既知のペプチドのセットから観測される溶出時間と相関させることによって推定することができる。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロトコルでは、典型的な性質は疎水性及びペプチドサイズである。相関を計測する自然な方法は、疎水性及びサイズに依存する溶出時間の経験的分布を学習する方法である。Ｗは、疎水性及びサイズに影響を及ぼす改変とみなされる。
【０１１２】
何人かの著者が、ペプチド配列に基づいて溶出時間を推定するためのアルゴリズムを記載している（たとえばSakamoto, Y., Kawakami, N. and Sasagawa, T. 1988: Prediction of peptide retention times, J Chromatogr., 442:69-79, Mant, C. T., Zhou, N. E. and Hodges, R. S. 1989: Correlation of protein retention times in reversed-phase chromatography with polypeptide chain length and hydrophobicity, J. Chromatogr., 476:363-75を参照）。そして、実験ペプチドで観測された時間と候補理論ペプチド配列から予測された時間との差に関する統計値を学習することが可能である。この統計値は、たとえば試験データセットを使用して学習したのち、スコア付けされるペプチドのマッチの溶出時間を推定するために使用することができる。したがって、
【０１１３】
【数１８】
2006511821.tif 000025
【０１１４】
電荷（ｚ）
Ｐ（ｚ｜ｔ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、ペプチド長に依存する荷電状態の経験的分布を計算することによって、したがって溶出時間を無視することによって推定することができる。事実、荷電状態は、ペプチド上で電荷を得る又は失うことができる部位の数に強く相関する。この部位の数そのものは、アミノ酸の数と強く相関している。以下が得られる（図７を参照）。
【０１１５】
【数１９】
2006511821.tif 000026
【０１１６】
図７は、ペプチド配列長に対する観測された荷電状態の相対度数の分布及び経験的分布を当てはめる理論モデルを示す。この経験的分布は、Bruker Esquireイオントラップ計器によって分析される３２０個の単電荷ペプチド、２３１０個の二電荷ペプチド及び９６７個の三電荷ペプチドのセットから学習されたものである。分布は、参照ライブラリ（この場合はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）中の所与のサイズのペプチドの度数にしたがって正規化されている。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様では、荷電状態の経験的分布は、溶出時間に依存して計算することができる。理由は、溶出時間がペプチドサイズ及びペプチド長に依存するからである。
【０１１８】
【数２０】
2006511821.tif 000027
【０１１９】
ペプチドのマッチ（Ｐ）
Ｐ（Ｐ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、種々の精度及び高度化の多くの近似によって推定することができる。本発明の一つの態様では、Ｐの計算は、実験質量電荷比だけを考慮することを含む。誤差のガウス（正規）分布を仮定し、Ｄpをダルトン単位で与えると、以下のようになる。
【０１２０】
【数２１】
2006511821.tif 000028
【０１２１】
ここで、ｍtは、理論質量であり、σ（ｚ）は、計器精度をモデル化する標準偏差である。質量許容差がダルトン単位にあるため、ペプチド荷電状態への標準偏差の依存に注目すること。Ｄpがppm単位で与えられる場合、σは、荷電状態から独立していると見なすことができる。
【０１２２】
Ｄpの定義において、モノ同位体的ピーク検出における誤差を扱うために特に設計された可能な非対称ケースを考慮する。特に、ピーク検出ソフトウェアが第一の同位体（Ｃ14ピーク）をモノ同位体的ピーク（Ｃ13ピーク）として選択することが可能である。上記の正規推定をそのような場合に使用することもできるが、本発明はさらに、以下のように計算することができる二峰理論分布を使用することを提供する。
【０１２３】
【数２２】
2006511821.tif 000029
【０１２４】
ここで、ｐは、第一の同位体を誤って選択する確率である。本明細書で開示するように、誤差許容差がppm単位であるならば、σを一定とみなすことができる。
【０１２５】
また、Ｐに含まれるさらなる情報を考慮してもよいことが理解されよう。たとえば、特定のアミノ酸がペプチド検出に好都合であるということが公知である（たとえばPapayannopoulos, I. A. 1995: The interpretation of collision-induced dissociation mass spectra of peptides, Mass Spectrometry Review, 14:49-73, Van Dongen, W. D. et al. 1996: Statistical analysis of mass spectral data obtained from singly protonated peptides under high-energy collision-induced dissociation conditions, J. Mass Spectrom., 31:1156-1162を参照）。したがって、ペプチドを検出する確率は、ペプチド組成に依存して調節することができる。
【０１２６】
【数２３】
2006511821.tif 000030
【０１２７】
ここで、Ｐ（「信号」｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）を計算するための分布は、既知のペプチドのセットから経験的に学習される。
【０１２８】
本発明の他の態様で、確率Ｐ（Ｐ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）推定は、ペプチド理論質量の分布の知識を含むことができる（図４）。この推定の目的は、非常に頻繁な質量（低い質量）を有するペプチドを含むマッチの有意性を減らすことである。高い質量のペプチドはそれほど頻繁ではないため、このようなマッチをより有意とみなすことができる。ペプチド質量分布を含む典型的な推定は以下の形態をとる。
【０１２９】
【数２４】
2006511821.tif 000031
【０１３０】
ここで、Ｐ（「ｍtの有意性」｜Ｄ，Ｈ1）は、図４の分布から経験的に推定される。
【０１３１】
本発明の他の態様で、確率Ｐ（「ｍtの有意性」｜Ｄ，Ｈ1）は、図４の経験的分布に曲線をあてはめることによって推定される。通常、βe-α(mt-m0)のような曲線を使用することができる（ｍ0は、考慮される質量範囲の下限である）。
【０１３２】
本発明の他の態様で、確率Ｐ（Ｐ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、ｉｎｔ（ｍ）と指定する信号の強さ及び／又は質（ＳＮ比ｓｎ（ｍ）、信号あてはめの質（ｍ））を考慮することによって推定することができる。信号の強さは、いくらかの正規化、たとえばその対数をとる、検出されたもっとも強い信号の割合として表現する又はその値のあるベキ（（ｉｎｔr（ｍ）、ｒは実数）をとることを要するかもしれないことが理解されよう。
【０１３３】
本発明の他の態様で、マッチをスコア付けする際に、質量許容差Ｄpが考慮される唯一の規準ではないように補足的規準が考慮される。補足的規準は、たとえば、ＳＮ比、溶出時間、信号の質又は信号の強さであってもよい。
【０１３４】
さらには、他の外部規準を適用してペプチドを選択してもよい。一例では、ペプチドを選択する際に体系的分類を考慮する。本発明のもう一つの態様では、ペプチドは、等電点（ｐＩ）及び／又はペプチドの元のタンパク質の分子量（ＭＷ）に基づいて選択される。他のより一般的な態様で、マッチをスコア付けする際に、タンパク質の性質及び／又はペプチドの性質、たとえば疎水性、電荷などに基づく規準を考慮してもよい。
【０１３５】
断片マッチ（Ｆ）
Ｐ（Ｆ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、本ペプチドスコア付け法で重要な役割を演じる。したがって、本明細書には、その値を推定するために使用することができるいくつかの技術を開示する。第一の簡単な技術は、各イオンシリーズを検出する確率を経験的に学習することである。すなわち、ＭＳ／ＭＳスペクトルが取得されている既知のペプチドのセットに基づき、理論スペクトルを計算し、Ｄfが与えられると、実験断片を検出する。イオンシリーズの独立性及び断片配列への非依存性を仮定することにより、各シリーズの確率を推定することが簡単である。θ∈Ｓの場合、ｑθ（ｚ）によって対応する確率を指定することができる。確率は、親荷電状態に依存して決まるということに留意すること。親荷電状態は、特定のイオンシリーズの生成に強く影響することができる。そのうえ、特定のシリーズは特定の荷電状態では不可能である（単電荷ペプチドの場合の二電荷ｙ＋＋）。そして、各シリーズ中の断片とマッチする確率を、ランダムな偶然により、ＭＳ／ＭＳ理論スペクトルがデータに関連しないランダムなペプチド配列をとることによって決定する。ランダムなマッチの確率をｒθ（ｚ）によって指定する。したがって、その場合、マッチを観測する確率は、ｐθ（ｚ）＝ｑθ（ｚ）＋（１−ｑθ（ｚ））ｒθ（ｚ）である。したがって、
【０１３６】
【数２５】
2006511821.tif 000032
【０１３７】
ここで、Ｉは、各理論断片質量に対応する指数のセットであり、Ｉ−Ｊは、マッチしない理論質量のセットである。マッチしない実験質量をモデル化する試みはないということに留意すること。ノイズは、その出所が複雑多岐であるため、実験データ中で自発的にはモデル化されない。したがって、当業者は、ノイズを考慮してもよいということを理解するであろうが、ノイズの考慮を回避してもよい。
【０１３８】
本発明のもう一つの態様は、断片マッチの確率を正規分布によってモデル化することである。前記モデルは、断片マッチを完全に考慮するか、まったく考慮しないかのいずれかである。すなわち、実験的質量が実験質量に十分に近くなると直ちにそれは考慮される。これは、均一な分布を考慮することに類似している。実験断片質量誤差のプロットが、ベル形状の分布を強く示唆する。これは以下を与える。
【０１３９】
【数２６】
2006511821.tif 000033
【０１４０】
ここで、マッチしない断片を優先しないよう、因子（１−ｐseries(i)（ｚ））を、
【０１４１】
【数２７】
2006511821.tif 000034
【０１４２】
の平均に等しい因子で乗じることができる。
【０１４３】
また、断片マッチ確率を断片のアミノ酸組成に依存させることが可能である。特に、断片の最後のアミノ酸が断片化過程で特別な役割を演じるということが公知である（たとえばTabb, D. L., Smith, L. L., Breci, L. A., Wysocki, W. H., Lin, D. and Yates, J. R. 2003: Statistical characterization of ion trap tandem mass spectra from doubly charged tryptic peptides, Anal. Chem., 75:1155-1163を参照）。したがって、ｐseries(i)（ｚ）に代えてｐseries(i),a(pos(i))（ｚ）を用いることにより、新たなパラメータを導入することが可能である（ここで、ａ（ｐｏｓ（ｉ））は、位置ｐｏｓ（ｉ）のアミノ酸、すなわち断片番号ｉの最後のアミノ酸の位置を返す。
【０１４４】
さらなる態様で、アミノ酸を、断片化過程で類似した役割を持つアミノ酸のクラスによって分類し、したがって、ａ（ｐｏｓ（ｉ））に代えてｃｌａｓｓ（ｐｏｓ（ｉ））を用いることが可能である。これには、モデル中のパラメータの数を減らす利点がある。一例として表６を参照すること。表６は、アミノ酸クラスによる断片マッチ確率、断片強さ及び連続断片マッチを使用する一つのスコア付けシステムのパラメータセットを示す。パラメータは、Esquire 3000+イオントラップ分光計によって分析される６８００個の二電荷及び三電荷ペプチドのデータセットで学習されたものである（代替モデル）。ランダムマッチ確率（ヌルモデル）は、６８００個の参照ペプチドそれぞれごとに１００個のランダムペプチドを生成することによって得た。ランダムペプチドは、正しいペプチドに近い質量を有するが、３次マルコフ連鎖によって生成されるランダム配列を有する。
【０１４５】
【表６】
2006511821.tif 000035
2006511821.tif 000036
【０１４６】
もう一つの態様では、本発明は、連続マッチのシリーズを考慮するためのさらなるモデルを考慮する。正しいマッチの場合、所与のイオンシリーズの中で連続的な断片マッチを観測すると期待される。したがって、実施態様では、スコア付けシステムは、正しいマッチのより高い確率、たとえばより良いスコアをより多数の連続マッチで計算する。一例を、円がペプチド中のアミノ酸を表し、いくつかの連続断片マッチ（塗りつぶした円で示す）が検出されている図１０に示す。この観測を使用して偽陽性を真陽性からより良く区別することができ、ユーザが、各断片マッチが他から独立し、それでもなお精度を保持するというモデル中の他の簡素化仮説を緩和することを可能にする。連続断片マッチが正しくマッチしたスペクトル中で観測される理由は、ひとたび断片がプロトン化部位を含むと、この断片及びより短い断片を含む他のより長い断片が、より長い断片もまたプロトン化部位を含むため、検出されるということである。このようなパターンを同定するための自然なモデルが隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）である（たとえばEwens, W. J. and Grant, G. R. 2001: Statistical Methods in Bioinformatics, Springer, New York, and Durbin, R. et al. 1998: Biological sequence analysis, Cambridge University Press, Cambridgeを参照）。ＨＭＭは、所与のシリーズ中の０、１、２、．．．ｎ個の直前の断片マッチに続く断片マッチに対応するいくつかの状態を有することができる。シリーズの独立性が仮定され、図８のモデルが使用されて、確率Ｐ（θ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）、θ∈Ｓ、すなわち１個のイオンシリーズに限定された確率Ｐ（Ｆ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）が推定される。図８は、本発明の実施態様のイオンシリーズマッチの３次モデルの図である。ａijは遷移確率である。各状態ｋは放出確率ｅkを有している。このモデルは２種のシンボル、マッチ及びミスマッチを放出するだけである。ＨＭＭの図形表現のさらなる詳細に関しては、Durbinら（Durbin, R. et al. 1998: Biological sequence analysis, Cambridge University Press, Cambridge）を参照すること。図８の３次ＨＭＭのパラメータは、従来の手順、たとえば最尤法又は期待値最大化を使用することによって学習することができる（たとえばBaum-Velch Algorithmを参照、Durbin et al. 1998）。すると、以下の近似が得られる。
【０１４７】
【数２８】
2006511821.tif 000037
【０１４８】
最尤、たとえば図８のモデルのためのパラメータセットの一例として、以下を使用することができる。既知のデータセットから、ｋ−１個の直前のマッチの後でマッチを観測する確率Ｐ（１k）を推定する。同様に、ｋ−１個の直前のマッチの後でミスマッチを観測する確率Ｐ（０k）を推定する。また、ランダムペプチド配列を生成することにより、ｋ−１個の直前のマッチの後でマッチを偶然のみによって観測する確率Ｐ（ｒk）を推定することも可能である。そして、ｅk（「マッチ」）＝Ｐ（１k）かつｅk（「ミスマッチ」）＝Ｐ（０k）にしたがって図８のモデルの状態ｋの放出確率をセットする。ａk,k+1＝Ｐ（１k）−Ｐ（ｒk）、ｋ＝１，２、ａ33＝Ｐ（１3）−Ｐ（ｒ3）、ａ11＝１−ａ12、ａ21＝１−ａ23、ａ32＝１−ａ23にしたがって遷移確率をセットする。
【０１４９】
Dancikら（たとえばDancik, V., Addona, T. A., Clauser, K. R., Vath, J. E. and Pevzner, P. A. 1999: De novo peptide sequencing via tandem mass spectrometry, J. Comp. Biol., 6:327-342を参照）及びBafnaら（たとえばBafna, V. and Edwards, N. 2001: SCOPE: a probabilistic model for scoring tandem mass spectra against a peptide database, Bioinformatics, 17:S13-S21を参照）に記載されているような従来モデルは、大まかな近似である、イオンシリーズの独立性を仮定する。簡単なＨＨＭとでとどまることにより、たとえば、汎化されたシリーズを定義し、そのようなシリーズにモデルを適用することが可能である。ある可能なやり方は、シリーズｂ、ｂ＋＋、ｂ−Ｈ２Ｏ、ｂ＋＋−Ｈ２Ｏ、ｂ−ＮＨ３、ｂ＋＋−ＮＨ３でマッチが観測されるとただちにマッチする汎化シリーズＢを定義することである。同様に、シリーズＡ及びＹを定義してもよい。このような汎化シリーズへの射影は、たとえばシリーズｂ及びｂ−ＮＨ３の両方における所与の断片を観測する場合のように事象間の依存性を完全にモデル化するわけではないが、各シリーズ中の各断片が独立していると仮定するよりも正確である。
【０１５０】
もう一つの関連する概念は、図８のＨＭＭのトポロジーを有するモデルを使用し、各状態をして８個の可能なシンボル、すなわち、マッチなし、ｂ又はｂ＋＋のみ、ｂ−Ｈ２Ｏ又はｂ＋＋−Ｈ２Ｏのみ、ｂ−ＮＨ３又はｂ＋＋−ＮＨ３のみ、（ｂ又はｂ＋＋）及び（ｂ−Ｈ２Ｏ又はｂ＋＋−Ｈ２Ｏ）、（ｂ又はｂ＋＋）及び（ｂ−ＮＨ３又はｂ＋＋−ＮＨ３）、（ｂ−ＮＨ３又はｂ＋＋−ＮＨ３）及び（ｂ−Ｈ２Ｏ又はｂ＋＋−Ｈ２Ｏ）、（ｂ又はｂ＋＋）及び（ｂ−ＮＨ３又はｂ＋＋−ＮＨ３）及び（ｂ−Ｈ２Ｏ又はｂ＋＋−Ｈ２Ｏ）を放出させることである。
【０１５１】
多くの他の種の異なるイオンシリーズの組み合わせを使用して、それらどうしの間にあるかもしれない依存をモデル化することもできる。
【０１５２】
本発明の他の態様でＰ（Ｆ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）の推定を改善するために使用することができるさらなる観測が図１０に示されている。図１０は、シリーズｂ及びｂ＋＋シリーズイオンで連続マッチを観測する断片マッチを示す。ペプチドのサイズの増大とともに、イオンがｂシリーズからｂ＋＋シリーズにスイッチして、イオンが荷電する回数の変化を反映するということが見てとれる。同じ観測がｙ、次いでｙ＋＋に関して行われている。点はアミノ酸を表し、塗りつぶされた点は、質量許容範囲に入る観測されたイオンを表す。単電荷イオンシリーズ中で連続断片マッチのシリーズが観測されたのち、対応する二電荷シリーズ中でマッチのシリーズが観測されるということが一般的である。このようなパターンは通常、三電荷親ペプチドに関して起こる。これはまた、二電荷ペプチドに関して観測されることもあるが、三電荷ペプチドに関してほど頻繁ではない。説明は簡単である。断片が長くなると、断片は、第二のプロトン化部位を含み、したがって、単電荷シリーズではもはや検出されず、二電荷シリーズで検出される。
【０１５３】
ＭＳ／ＭＳスペクトルから抽出することができる情報のもう一つの重要な特性又はタイプは、計器に依存して、ペプチド組成に関する部分的指示である。したがって、本発明のさらなる態様は、インモニウムイオンを利用してペプチド組成を推論することである。インモニウムイオンは、１個の残基のみを含むイオンを生じさせる、断片の断片化の産物である。実際、インモニウムイオンは、理論ペプチド組成（配列ｓから得られる）を、インモニウムイオンに対応する実験ピークと相関させるために使用される。先に記載したように、残基ごとのインモニウムイオン検出の経験的確率は、既知のスペクトルのセットから学習することができる。このような経験的研究に関しては、Falick, A. M. et al. 1993: Low-mass ions produced from peptides by high-energy collision-induced dissociation in tandem mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 4:882-893を参照すること。
【０１５４】
本発明の他の態様では、確率Ｐ（Ｆ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ1）は、ｉｎｔ（ｆj）と指定される信号の強さ及び／又は質（ＳＮ比ｓｎ（ｆj）、信号あてはめの質（ｆj））を考慮することによって推定することができる。信号の強さは、いくらかの正規化、たとえばその対数をとる、検出されたもっとも強い信号の割合としてそれを表現する、ピークリスト強さにおけるそのランクをとる又はその値のあるベキ（（ｉｎｔr（ｆj）、ｒは実数）をとることを要するかもしれないことが理解されよう。
【０１５５】
本発明の他の態様では、断片マッチを考慮するために補足的な規準が加えられる。すなわち、質量許容差Ｄfが唯一の規準ではない。補足的な規準は、ＳＮ比、信号の質又は強さであることができる。
【０１５６】
一つの実施態様では、いくつかの実験質量が理論質量のＤf許容差の範囲内にある場合に特定の処理が適用される。本発明の一つの態様は、もっとも近い実験質量だけを考慮することである。本発明のもう一つの態様は、保持された実験質量の平均値をとることである。
【０１５７】
図１に戻ると、ステップ１１２で、「ミス」の確率を計算することができる。すなわち、生成された確率モデルに基づいて、実験ペプチドが候補ペプチドとマッチしない確率（又はその分布）を計算することができる。以下の例では、Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）の計算を例示的に説明する。
【０１５８】
帰無仮説条件Ｈ0の下で上記確率を推定する一つの技術は、既知のペプチドを含まない、したがって可能な正しいマッチを保証しないライブラリをサーチするために既知のペプチドの実験スペクトルを使用することである。このようなサーチは、ヌルモデルに必要な種々のランダムな分布を経験的に学習することを可能にする。
【０１５９】
一つの実施態様では、ペプチドライブラリは、実験質量スペクトルに対応するペプチド配列が取り出される任意のペプチドライブラリである。ライブラリの残りは分布を学習するために使用される。
【０１６０】
一つの実施態様では、ペプチドライブラリは、適切な確率モデルから生成されるランダムなペプチドのライブラリである。確率モデルは、既存のペプチドのライブラリから学習することができる。
【０１６１】
一つの実施態様では、モデル配列長へのエンドステートを含むタンパク質配列をモデル化するために設計されたｎ次マルコフ連鎖（たとえばDurbin et al. 1998を参照）である。ランダムなタンパク質配列は、実験タンパク質消化に使用される酵素にしたがって切断される（表５を参照）。
【０１６２】
Ｐ（Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、経験的分布を学習することによって推定することができる。本発明の一つの態様では、このタスクは、
１．アイデンティティが既知である１種以上のペプチドの実験ＭＳ／ＭＳスペクトルのセットを提供又は取得するステップ、
２．ランダムなペプチドのライブラリを提供又は生成し、さらに、実験セット中のペプチドが偶然にデータベース中に存在ないことを決定するステップ、
３．改変（Ｗ）の存在を考慮しながら各ランダムペプチドを各実験ＭＳ／ＭＳスペクトルと比較し、マッチさせるステップ、及び
４．実験スペクトルごとに最良のマッチを選択し、維持し、含まれる改変の数を計数する、すなわち＃Ｗ／ｌｅｎ（ｓ）を経験的に学習するステップ
にしたがって実施される。
【０１６３】
すると、近似は、
【０１６４】
【数２９】
2006511821.tif 000038
【０１６５】
である。
【０１６６】
そして、仮説Ｈ1に関して上記した同じ方法を使用して別個の改変ごとに別個の分布を学習することができる。
【０１６７】
Ｐ（ｋ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、上記のＰ（Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）を推定するために使用した同じやり方に則して推定することができる。ペプチドのランダムなライブラリからランダムなマッチを取得し、切断部位がミスされている確率を推定する。そして、Ｐ（ｋ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）の場合と同じ二項式を使用することができる。
【０１６８】
Ｐ（ｔ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、ランダムな溶出時間に関して均一な分布、すなわち
【０１６９】
【数３０】
2006511821.tif 000039
【０１７０】
（Ｔは取得ウィンドウ期間である）を仮定することによって推定することができる。
【０１７１】
Ｐ（ｚ｜ｔ，Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、以下にしたがって推定することができる。
【０１７２】
【数３１】
2006511821.tif 000040
【０１７３】
もう一つの可能なやり方は、
【０１７４】
【数３２】
2006511821.tif 000041
【０１７５】
である。
【０１７６】
最後に、上記Ｐ（Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）を推定するために使用したものと同様な方法で処理を進めることも可能である。ペプチドのランダムなライブラリからランダムなマッチを取得し、以下の式を使用する。
【０１７７】
【数３３】
2006511821.tif 000042
【０１７８】
Ｐ（Ｐ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、異なる手法によって推定することができる。スコア付けシステムの一つの実施態様では、Ｄpがダルトン単位で与えられると仮定する。実験ペプチド質量のセットから、理論質量に関して図４に類似した分布を演繹することができる。改変を含めた配列ｓの理論質量をｍtと呼ぶ。そして、ｍtに十分に近い実験質量を見いだす確率は以下である。
【０１７９】
【数３４】
2006511821.tif 000043
【０１８０】
ここで、ｆ（ｍt）は、実験質量分布の密度関数である。質量許容差Ｄpがppm単位で与えられている場合、確率は、以下のように記載することができる。
【０１８１】
【数３５】
2006511821.tif 000044
【０１８２】
ここで、ｆ（ｍt／ｚ）は、実験質量電荷比の密度関数である。許容差が非対称セットＤp（ｍt）であるならば、上記式は、Ｄp（ｍt）を構成する各インターバルの長さを、インターバルの中心の質量を実験的に観測する確率で乗じることによって適合される。当業者は、非対称許容差がppm単位で与えられる場合にこれらの方法を容易に適合することができる。
【０１８３】
本発明のもう一つの態様で、ペプチドマッチの確率は、仮説Ｈ1に関して本明細書で記載したようにペプチド質量の有意性を考慮することによって調節される。たとえば、Ｄpがダルトン単位であるならば、以下が見いだされる。
【０１８４】
【数３６】
2006511821.tif 000045
【０１８５】
Ｐ（Ｆ｜ｚ，Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、上記仮説Ｈ1に関して本明細書で記載した同じ技術を適用することによって推定することができる。まず、以下が見いだされる。
【０１８６】
【数３７】
2006511821.tif 000046
【０１８７】
本発明の他の態様では、上記仮説Ｈ1のＨＭＭ（図８）を使用することができる。そのパラメータは、正しいマッチではなくランダムなマッチから学習される（上記Ｐ（Ｗ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）の場合の手順を参照）。
【０１８８】
本発明の他の態様では、ヌルモデルがＨ1モデルとは異なる構造を有することができる。たとえば、図９のヌルモデルは、以下を計算することを可能にする。
【０１８９】
【数３８】
2006511821.tif 000047
【０１９０】
再び図１を参照すると、ステップ１１４で、上記の確率モデル及び計算に基づいて出力を生成することができる。たとえば、尤度比、すなわち（ｉ）実験ペプチドが候補ペプチドとマッチする確率と（ii）実験ペプチドが候補ペプチドとマッチしない確率との間の比を生成することができる。本発明の実施態様にしたがって、尤度比に代えてその対数を用いてスコアＬ（対数尤度比又は対数オッズ）を定義することができる。他の態様では、本発明は、アミノ酸単位で計測された親ペプチド長で割った尤度比を出力することができる。他の実施態様では、本発明は、アミノ酸単位で計測された親ペプチド長で割った対数尤度を出力することができる。さらに他の実施態様では、本発明は、アミノ酸単位で計測された親ペプチド長の対数で割った対数尤度を出力することができる。
【０１９１】
望むならば、ペプチドのマッチに関して計算されたマッチスコアをｐ値に対応させてもよい。このｐ値は、計算されたスコア以上のスコアをランダムな偶然で得る確率を表す。理論的には、ｐ値とマッチスコアとは、正しいマッチをランダムなマッチから区別することにおいては等価である。しかし、実際には、これは、Ｌを計算する際に導入されることもある簡素化仮定のせいで当てはまらないかもしれない。そのような状況では、ｐ値の推定又はＺスコアの計算は、スコア付けスキームの値をいちじるしく改善することができる。
【０１９２】
ランダムマッチスコア分布がμに等しい期待値及びσに等しい標準偏差を有すると仮定すると、Ｚスコアは、Ｚスコア＝（スコア−μ）／σにしたがって計算することができる。Ｚスコアは、そのようなスコアを得る確率に関して直接的な解釈を有する。
【０１９３】
一つの実施態様では、ｐ値は、トップスコアの経験的分布から推定することができる。たとえば、許容差Ｄp及びＤfならびに可能な改変のセットを与えられるならば、実験データを使用してランダムペプチド配列のライブラリをサーチし、トップスコアの分布を学習する。この分布は、ｐ値の近似値を定義によって直接提供する。
【０１９４】
一つの実施態様では、ｐ値は、１個の実験ペプチドのための１回のサーチで見いだされるトップスコアの理論分布を仮定することによって推定することができる。この分布は、たとえば正規分布又はチェビシェフ分布とみなすことができる（たとえばBafna, V. and Edwards, N. 2001: SCOPE: a probalilistic model for scoring tandem mass spectra against a peptide database, Bioinformatics, 17:S13-S21を参照）。
【０１９５】
一つの実施態様では、密度関数が総称形
【０１９６】
【数３９】
2006511821.tif 000048
【０１９７】
を有する極限値分布が各ペプチドのトップスコアに仮定される。ここで、ｗは、Ｌの適切な正規化から得られる確率変数である（たとえばEwens, W. J. and Grant, G. R. 2001: Statistical Methods in Bioinformatics, Springer, New Yorkを参照）。これはｐ値の推定を考慮している。
【０１９８】
ある実施態様では、ｐ値は、任意のモデル、たとえばマルコフ連鎖にしたがってランダムペプチドを生成したのち、それらをスコア付けすることによって得ることができる。Ｚスコアに正規化（平均を差し引き、標準偏差で割る）したのち、これは、最終的にｐ値を推論するためにガウス型によってあてはめることができるランダムスコアの分布を提供する。ランダムスコア分布は、確率ｐでランダム（正しくない）ペプチドをマッチさせることによってスコアｓを得る確率を与える。データベースサーチ中に実験スペクトルがＮ理論ペプチドに比較されると仮定すると、ｐ値は、１−（１−ｐ）Nによって推定することができる。
【０１９９】
ｐ値を推定するための上記手法は、データベースサーチ中に見いだされたトップスコアが、データベースサーチ中に見いだされたスコアのランダムな選択に対して実施されるブートストラップシミュレーションと組み合わせて使用されないため、Tangらのもの（Tang, C., Zhang, W., Fenyo, D. and Chait, B. T. 2002: Method for evaluating the quality of comparison between experimental and theoretical mass data、米国特許第６，３９３，３６７号）とは異なる。トップスコアがそれだけで使用されるか、ランダムスコアを得るためにランダムなペプチドが生成される上記好ましい実施態様におけるようにトップスコアが全く使用されないかのいずれかである。
【０２００】
出力は、多数のフォーマットでマッチ結果を提示することができる。たとえば、所定のしきい値を超えるスコアを有するペプチド又はマッチを報告してもよいし、ペプチド又はマッチをスコア順に、たとえば昇順又は降順に報告してもよい。他の例では、返される結果はまた、各場合に使用されたタンパク質／ペプチド改変をリストする。
【０２０１】
本発明の実施態様によると、実験ペプチド及び候補ペプチドに関連する生物学的情報を、本発明のスコア付け法によって生成される出力中に提供することもできる。
【０２０２】
再び図１を参照すると、ステップ１１６で、マッチ結果に基づいて、実験ペプチド又は候補ペプチドの物理的サンプルを関連する生物学的情報とともに提供することができる。たとえば、未知のペプチドと既知のペプチドとの間のマッチが信頼未満のスコアを出すならば、タンパク質研究室でのさらなる比較試験のために両ペプチドの物理的サンプルを製造することが望ましいかもしれない。
【０２０３】
方法はステップ１１８で終了する。
【０２０４】
先に論じたように、一つの手法では、スコアＬ＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ0）は、二つの競合する仮説にしたがってＥを観測する確率を考慮する。本発明のスコア付け法を仮説検定のベイズ手法に適合させてもよいことが理解されよう。ベイズ手法を使用して、Ｌ′＝（Ｈ1｜Ｄ，ｓ，Ｅ）／Ｐ（Ｈ0｜Ｄ，ｓ，Ｅ）と定義し、ベイズの定理を適用して、直前の手法に関して使用した同じ利用可能な確率からＬ′を計算する。以下が見いだされる。
Ｐ（Ｈ1｜Ｄ，ｓ，Ｅ）＝Ｐ（Ｅ｜Ｄ，ｓ，Ｈ1）Ｐ（Ｄ，ｓ，Ｈ1）／Ｐ（Ｄ，ｓ，Ｅ）
かつ
Ｐ（Ｄ，ｓ，Ｈ1）＝Ｐ（Ｈ1｜Ｄ，ｓ）Ｐ（Ｄ，ｓ）
帰無仮説の場合の同様な計算を上記等式と組み合わせると、以下が得られる。
Ｌ′＝ＬＰ（Ｈ1｜Ｄ，ｓ）／Ｐ（Ｈ0｜Ｄ，ｓ）
したがって、Ｌと比較した差は、先験的確率Ｐ（Ｈ1｜Ｄ，ｓ）及びＰ（Ｈ0｜Ｄ，ｓ）によるスケーリング因子である。スケーリング因子は、以下の異なる手法によって推定することができる。もっとも簡単な近似は、実験スペクトルに対応するペプチドを同定する際の先験的信頼性であるＰ（Ｈ1）／Ｐ（Ｈ0）である。この値は経験的に学習することができる。また、イオンを検出する偶然はそのアミノ酸組成に依存するため、ｓを利用することが可能である。
【０２０５】
代替の方法は、Ｅ＝（．．．，Ｑ）（Ｑは、スペクトル質に関する統計値を表す）を書くことである。Ｅ（Ｅは、いくつかの確率変数の同時実現を表す）の残り部分とＱを別にしておくことにより、上記のような導出を繰り返してＬ″＝ＬＰ（Ｈ1｜Ｄ，ｓ，Ｑ）／Ｐ（Ｈ0｜Ｄ，ｓ，Ｑ）を得ることが可能である。これは、スペクトル質に関する情報をスコア付けスキームそのものに含めるための代替又は相補的方法である。
【０２０６】
一つの実施態様では、まず、質量許容差Ｄf,1を適用しながら実験断片質量を理論スペクトルとマッチさせ、次に、質量シフトを演繹して、平均質量誤差がゼロに等しくなるようにすることによって実験データを再較正する。その後、許容差Ｄf,2で第二のマッチを計算し、スコアを計算する。このような手法は、ペプチド質量フィンガープリントに関してすでに記載されている（たとえばEgelhofer, V., Bussow, K., Luebbert, C., Lehrach, H. and Nordhoff, E. 2000: Improvements in protein identification by MALDI-TOF-MS peptide mapping, Anal. Chem., 72:2741-2750を参照）。
【０２０７】
一つの実施態様では、上記のデータ再較正は、精度Ｄf,1での初期マッチののち実験データと理論データとの間の多項回帰によって実施される。
【０２０８】
一つの実施態様では、スコア付けシステムは、二つの実験スペクトルを比較するために使用される。一例では、方法は、実験質量の少なくとも一部をイオンシリーズに割り当てる方法を使用して二つの実験スペクトルを比較することを含む。
【０２０９】
他の例では、本発明のスコア付けシステムは、タンパク質を同定するために使用することができる。１種以上のタンパク質で構成されるタンパク質混合物は質量分析法によって分析される。タンパク質同定手法は、以下のようなステップを含むことができる。（１）第一のステップで、一つ以上のペプチドＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。ペプチドＭＳ／ＭＳスペクトルは、問い合わせとして使用され、ペプチド配列ライブラリ中の連続的なペプチドに照らしてサーチされる。ペプチドライブラリは、インシリコ消化によってタンパク質配列ライブラリから得られたものである。本発明のスコア付け法を使用すると、スコアがペプチドのマッチに対応し、実験ペプチドごとにｎ個の最良スコアを有するペプチドが表示され、出力され、記憶される。（２）第二のステップで、共通のタンパク質配列から得られるペプチドを合わせて（合計して）、スコア（たとえば、高ければ高いほど、所与のペプチドマッチを観測するより高い尤度を示す）をタンパク質配列に割り当てる。（３）第三のステップで、タンパク質配列を、たとえばそれらのスコアの順で出力又は表示する。
【０２１０】
一つの実施態様では、タンパク質配列に割り当てられるスコアは、各ペプチドスコアの合計ではない。代りに、いくつかの実験ペプチドが同じペプチド配列に相関している場合には、タンパク質に由来する異なるペプチドごとに最大スコアをだけをとる。そして、異なるペプチド配列それぞれの最大スコアを合計して、タンパク質配列のスコアを提供する。
【０２１１】
本発明のスコア付け法は、いかなる適当なペプチド又はタンパク質同定手法で使用してもよい。本発明のスコア付けシステムを使用してペプチドを同定する典型的な方法では、候補ペプチドが属するタンパク質の体系的分類、候補ペプチドが属するタンパク質の等電点（ｐＩ）又は候補ペプチドが属するタンパク質の分子量（ＭＷ）、非対称質量ウィンドウへの包含、複数の質量インターバルの和集合でできている可能な質量のセットへの包含に基づいて候補ペプチドをフィルタリングすることができる。
【０２１２】
本発明の実施態様によると、スコア付け法は、疾病の診断に適用することができる。たとえば、１種以上の疾病に関連するペプチドを「健全なペプチド」すなわち、いかなる疾病にも関連しないペプチドに対応させることができる。スコア付け法を適用して、対照（健常）者及び罹患者で２種のペプチドの間の濃度の差を識別して、診断ツールを較正することができる。さらには、スコア付け法を適用して、診断結果が未知である患者における２種のペプチドを計測し、参照レベルと比較して診断の回答を出してもよい。１種以上の疾病に関する診断は、マッチするスコア及び／又は識別された差に基づくことができる。
【０２１３】
スコア付け法の他の用途は、サンプル中のペプチド／タンパク質の目録の追加、毒性調査及び化合物の活性の研究を含むことができる。
【０２１４】
図１１を参照すると、本発明の一つの実施態様にしたがってペプチドのマッチをスコア付けするための典型的なコンピュータベースのシステムを例示するブロック図が示されている。システムは、プロセッサ１１０、実験ペプチドデータベース１１２、候補ペプチドデータベース１１４及びユーザインタフェース１１６を含むことができる。本発明の実施態様によると、システムは、コンピュータ又はコンピュータベースのネットワーク上で具現化することができる。プロセッサ１１０は、中央処理装置（ＣＰＵ）であってもよいし、データ操作、論理演算及び数学的計算が可能であるコンピュータであってもよい。本発明の実施態様によると、プロセッサ１１０は、少なくとも入力装置、出力装置、処理装置及び質量分析データを同定するよう要求を受けると、上記本発明の方法のいずれか一つで挙げたステップを実施するように設計されているモジュールを記憶するデータ記憶装置を含む標準的なコンピュータであってもよい。実験ペプチドデータベース１１２は、同定される１種以上のペプチドに関連する実験データを含む１個以上のデータベースであってもよい。候補ペプチドデータベース１１４は、既知のペプチドに関連する情報を含む１個以上のペプチドライブラリ又はデータベースであってもよい。本発明の実施態様によると、データベース１１２及び１１４は、一つのデータベース又は別々のデータベースで具現化することができる。ユーザインタフェース１１６は、システムのユーザから入力を得、システムのユーザに結果を提示する目的を果たすグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）であってもよい。本発明の実施態様によると、ユーザインタフェースモジュールは、表示装置、たとえばＣＲＴ（陰極線管）、ＬＣＤ（液晶表示装置）又はタッチスクリーンモニタであってもよいし、プロセッサ１１０に接続されたコンピュータ端末又はパーソナルコンピュータであってもよい。
【０２１５】
コンピュータベースのシステムは、ペプチド及びタンパク質が同定される広い範囲の用途で使用することができる。本発明のシステムは、ａ）核酸もしくはアミノ酸配列及び／又は質量スペクトル、たとえば実験スペクトルのデータベースにアクセスするステップ、ｂ）それから導出された実験質量スペクトル又は情報を入力し、前記データベースに問い合わせして、実験質量スペクトルが提供されているペプチドと同じタンパク質に関連する又はそれから導出される１種以上の候補ペプチド配列又は質量スペクトルを同定するステップ、及びｃ）前記候補ペプチドに関する情報を出力又は表示するステップを可能にするように設計することができる。それにより、本明細書で開示したように各候補ペプチドをスコアに対応させることができる。たとえば、システムは、ペプチド及び対応するマッチスコアのリスト（同定子又は他の記述、たとえばアミノ酸配列を使用して）を出力することができる。スコアは、候補ペプチドが質量スペクトルに関連する又は関連しない又は対応する及び／又は候補ペプチドが別の候補ペプチドよりも実験ペプチドのほうに対応する確率又は尤度の表示であることができる。
【０２１６】
以下、本発明の二つの実施態様の性能を評価する。以下の実施例は例を示すだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はないということが理解されよう。
【０２１７】
実施例１．Mascotとの性能比較
Mascotとして知られる主要な市販品の一つの性能を本発明のスコア付けシステムと比較した。図３は、開示されたスコア付けシステム（Olav）の、Olav１及びOlav２と呼ばれる二つの設計の性能をMascotに対して示す（たとえばPerkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M. and Cottrell, J. S. 1999: Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data, Electrophoresis, 20(18):3551-3567を参照）。Olav１スコアは、Ｅ＝（Ｆ，ｚ）に基づき、式（Ｆ１）を使用して計算し、Olav２は、Ｅ＝（Ｆ，ｚ，Ｐ，Ｗ）に基づき、図８のＨＭＭを使用することによって計算した。上記分布を計算するために使用したマッチのセットは、質量スペクトルの手作業の分析によって測定して１１，０００個のMascot偽陽性及び２，５００個の真陽性で構成されたものであった。図３は、システムごとに、陽性の同定に対応する連続線及び陰性の同定に対応する破線を示す。真陽性同定と偽陽性同定との交差点が、Mascotを使用した場合によりもOlavを使用した場合のほうが実質的に低いことは明白であり、Olavを使用した場合にあいまいで誤ったマッチがより少ないことを示している。Mascotパラメータは、質量スペクトルの手作業の分析による決定で、可能な最高にセットした。
【０２１８】
実施例２．Dancikらとの性能比較
また、開示したスコア付けシステムの性能を、簡単な決定理論手法に基づくDancikらの方法（Dancik, V., Addona, T. A., Clauser, K. R., Vath, J. E. and Pevzner, P. A. 1999: De novo peptide sequencing via tandem mass spectrometry: a graph-theoretica approach, J. Comp. Biol, 6:327-342）と比較した。図６は、Dancikらのスコア付けシステム、すなわちＥ＝（Ｆ，ｚ）に基づき、式（Ｆ１）を使用して計算したOlav１と、Ｅ＝（Ｆ，ｚ，Ｐ，Ｗ）に基づき、図８のＨＭＭを使用して計算したOlav２との比較を示す。Olav１は、実際には、Dancikらからのスコア付けであり、親ペプチド電荷への依存性を付加したものであることを観測した。図６は、システムごとに、陽性の同定に対応する連続線及び陰性の同定に対応する破線線を示す。性能の差は、Ｆだけ（Olav１及び２）よりも多くの観測をＥに含める利点を示し、また、マッチ（Olav２、連続マッチのシリーズ）の構造を考慮する確率モデルを使用する利点を示す。また、DancikらのシステムがMascotよりも優れていることに注目することは興味深い（図３及び６を比較）。これは、経験的手法の代りにモデルに基づくシステムの利点を示す。
【０２１９】
実施例３．実験スペクトルを用いた性能試験
本発明の一つの実施態様で、液クロマトグラフィー（ＬＣ）イオントラップ及びヒト血漿から得たＱ−ＴＯＦスペクトルにスコア付け法を適用した。ヒト血漿中に存在するタンパク質を多次元ＬＣによって分離して何千ものサンプルを得た。各サンプルをトリプシンによって消化したのち、ＭＳによって分析した。使用したデータが実際のサンプルから得た実際の製造データであったことに注目することが重要である。サンプルの複雑さは０〜２０＋タンパク質の範囲で異なった。取得の際には、４０イオントラップ及び２個のＱ−ＴＯＦ計器を使用した。４個の独立したデータセットを使用して結果を報告し、その結果はすべて手作業でチェックしておいた。セットＡのイオントラップは、２９３３個の正しいペプチドマッチ、３２４個の異なるペプチドで構成されていた。セットＢのＱ−ＴＯＦは、２４１個の正しいペプチドマッチ、１２１個の異なるペプチドで構成されていた。セットＣのイオントラップは、１１，０００個のMascot偽陽性、７５９５個の異なるペプチドで構成されていた。セットＤのイオントラップは、２３６３個の正しいペプチドマッチ、４６８個の異なるペプチドで構成されていた。セットＤを含めた理由は、異なる実験過程のせいでＣのスペクトル質がＡとマッチせず、Ｄとマッチしたからである。
【０２２０】
Olavスコア付けスキームの二つの事例の性能結果を得て、Mascotパラメータを可能な最良になるようにセットした場合のMascot１．７と比較した。Olav代替モデルのパラメータは、最尤推定に基づいてデータセットＡ、Ｂ及び／又はＤから経験的に学習した。ヌルモデルをトレーニングするために使用されたランダムマッチは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ消化ヒトエントリに対してトレーニングした３次マルコフ連鎖によって生成されたランダムペプチド配列から得た。
【０２２１】
性能を推定するために使用した一般的手法は以下のとおりであった。参照セットの２０％を抽出して試験セットを構築した（ランダム選択）。次に、このモデルを残りの８０％に対してトレーニングし、試験セットに対して試験した。この操作を１０回繰り返し、結果を平均した。真陽性及び偽陽性の率を推定するため、スコア又はｐ値にしきい値を設定した。すなわち、正しいマッチセットでは、しきい値によって選択される各マッチは真陽性であり、選択されない各マッチは偽陰性である。ランダムマッチセットでは、選択されるマッチは偽陽性であり、拒絶されるマッチは真陰性である。図１３には、同じセットに対して試験し、学習することによって得られた受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線が示されて、性能推定手順によって得られたＲＯＣ曲線と比較されている。曲線「Olav学習セット」と「Olav15k」とはほぼ同一であり、オーバフィットがないことを意味している。
【０２２２】
イオントラップデータの場合、OlavはＥ＝（Ｐ，Ｆ，ｚ，Ｗ）を使用し、ピーク強さを考慮した。補題１を適用した。確率モデルは、式（Ｆ１）、図８及び９に示すＨＭＭならびに以下のスコア表現に基づくものであった。
【０２２３】
【数４０】
2006511821.tif 000049
【０２２４】
ここで、ペプチド長に対するｚの分布は経験的に学習される。仮定した独立確率の積をＷに使用した。ｂ及びｙ断片のピーク強さを独立観測とみなした。
【０２２５】
Ｑ−ＴＯＦデータの場合、ＨＭＭ及びピーク強さのためのモデルでできた簡素化モデルだけを使用した。
【０２２６】
図１２には、１５，０００種のヒトタンパク質のデータベースに対してサーチすることによる、セットＣ及びＤに対するOlav及びMascotの相対性能が示されている。Mascot真／偽陽性から独立してOlav及びMascotの性能をさらに比較するため、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴヒト配列に対してトレーニングした３次マルコフモデルを使用することにより、１５，０００種のランダムタンパク質配列のデータベースを生成した。また、試験セットＢを同じランダムデータベースに対して使用した。あらゆる比較でOlavがMascotよりも有意に良好に働くということを認めることができる。真陽性率９５％で、偽陽性率は、イオントラップの場合で８．５倍、Ｑ−ＴＯＦの場合で３倍の低下を示した。
【０２２７】
図１３には、より可変性の改変が許される場合又はデータベースがずっと大きい（１００，０００個のエントリがある）場合のイオントラップデータ（セットＡ）に対するOlav性能が示されている。Olav偽陽性率がデータベースサイズの増大よりもゆっくりと増大するということを認めることができ、これは、スコア付けスキームにとって非常に望ましい性質である。
【０２２８】
図１４には、５，０００個のランダムマッチの中の最良値と正しいマッチ（セットＡ及びＢ）とのスコア比の分布が示されている。確率化手順を介するｐ値の計算は、仮定を簡素化する際に失われた尤度比の最適性の一部を回復することができる。図１４は、スコア関数の固有性能を示す。ｐ値は、実際、ペプチドから独立して共通のしきい値をセットするのには、スコアよりも優れているかもしれない。スコアの性能はペプチドごとに別々に計測される。
【０２２９】
実施例４．イオントラップタンデムＭＳの分析
本発明のもう一つの実施態様で、多数のマッチャ特性の重要性を体系的に研究した。多次元液クロマトグラフィーをリットルスケール量のヒト血漿に適用して、約１３，０００個の画分を得て、それらをトリプシンによって消化し、Bruker Daltonics社から市販されている４０個のBruker Esquire 3000計器によって質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ−ＩＴ）によって分析した。使用したイオントラップ質量スペクトルのセットは、１４６，８０８個の正しいマッチからなるものであり、そのうち３３，０００個を手作業で立証しておいた。他のマッチは、固定しきい値に加えて手作業で立証したペプチドに関する生物学的知識及び統計値を含む手法によって自動的に立証した。３，３２９個の単電荷ペプチド（４３６種）、８２，４１５個の二電荷ペプチド（３，０３９種）及び６１，０６４個の三電荷ペプチド（２，９２０種）があった。この例で報告する各性能は、サイズがそれぞれマッチ３，０００個及び５，０００個である、独立したトレーニングセット及び試験セットをランダムに選択することによって得られた。この手順を５回繰り返し、結果を平均した。モデルパラメータ及び性能は両方ともセット間でほとんど変わりなかった。
【０２３０】
この実施態様では、最小スコア関数Ｌ1を定義し、評価した。これは、主要な統計的観測（各イオンタイプθを検出する確率ｐθ（ｚ）は一定ではない）に基づくものであった。ｓ＝ａ1、ａ2．．．ａnをペプチド配列とし、ａiをアミノ酸とした。Ｓ（ｓ，ｉ）⊂Ｓを、ａiとマッチする実験断片質量を有するイオンタイプのセットとした（ａiは、断片の最後のアミノ酸である。質量許容差を付与）。断片マッチの独立を仮定して、以下のように定義した。
【０２３１】
【数４１】
2006511821.tif 000050
【０２３２】
ｐθ（ｚ）、θ∈Ｓは、正しいマッチのセットから学習した。ランダム断片マッチの確率ｒθ（ｚ）は、ランダムペプチドから学習した。Ｓ（ｓ，ｉ）⊂Ｓは、マッチした断片だけによって制限されたわけではなかった。これはまた、特定のイオンが常に可能なわけではない理由で制限された（ニュートラルロス）。ビットＨθ（ｚ）＝ｐθ（ｚ）ｌｏｇ2（ｐθ（ｚ）／ｒθ（ｚ））における相対エントロピーを使用して各イオンタイプの重要性を計測した。基本参照スコア関数を改変して、連続断片マッチ、信号の強さ及びアミノ酸依存の重要性を評価した。信号強さを考慮することにより、基本Ｌ1スコアをいちじるしく改善することができることがわかった。連続断片マッチ及びＬ1のアミノ酸依存バージョンもまた、性能を改善することができた。
【０２３３】
実施例５．Bruker Esquire 3000イオントラップ計器における性能
図１５は、非常に大きなBruker Esquire 3000イオントラップデータのセットに対する、開示されたスコア付けシステムの四つの事例の性能をMascot１．７に比較して示す。セットは、３３２９個の単電荷ペプチド、８２４１５個の二電荷ペプチド及び６１０６４個の三電荷ペプチドを含むものであった。（ａ）断片マッチ確率（式（Ｆ１））、断片の強さ（ピークリスト強さのランクを使用）。（ａ′）アミノ酸クラスによる断片マッチ確率と同じ（詳細な説明を参照）。（ｂ）連続断片マッチ（ＨＭＭ）で（ａ）と同じ。（ｂ′）連続断片マッチ（ＨＭＭ）で（ａ′）と同じ。性能を、ｐ値に種々のしきい値を設定することによって得られる真陽性率対偽陽性率をプロットする受診者動作特性（ＲＯＣ）状の曲線として報告した。真陽性率は、参照データセットのペプチドを含む１５０００種のタンパク質のデータベースに照らしてサーチすることによって推定した。偽陽性率は、１５０００種のランダムなタンパク質のデータベースに照らしてサーチすることによって推定した。ランダムなタンパク質は、第一のタンパク質データベースに対してトレーニングした３次マルコフ連鎖によって生成した。Ｃｙｓ＿ＣＡＭ及び酸化（Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｔｒｙ）を可変性改変として設定した。
【０２３４】
実施例６．Bruker Esquire 3000＋イオントラップ計器における性能
図１６は、Bruker Esquire 3000＋計器で取得された大きなイオントラップデータの集合に対する、開示されたスコア付けシステムの一つの事例の性能を示す。データセットは、６８００個の二電荷及び三電荷ペプチドを含むものであった。スコア付けは、アミノ酸クラスによる断片マッチ確率、断片強さ及び連続断片マッチ（表６で報告したパラメータ）を使用した。性能を、ｐ値に種々のしきい値を設定することによって得られる真陽性率対偽陽性率をプロットする受診者動作特性（ＲＯＣ）状の曲線として報告した。真陽性率は、参照データセットのペプチドを含む１５０００種のタンパク質のデータベースに照らしてサーチすることによって推定した。偽陽性率は、１５０００種のランダムなタンパク質のデータベースに照らしてサーチすることによって推定した。ランダムなタンパク質は、第一のタンパク質データベースに対してトレーニングした３次マルコフ連鎖によって生成した。Ｃｙｓ＿ＣＡＭ及び酸化（Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｔｒｙ）を可変性改変として設定した。
【０２３５】
実施例７．ThermoFinnigan LCQイオントラップ計器における性能
図１７は、Kellerら（たとえばKeller, A., Purvine, S., Nesvizhskii, A. I., Stolyar, S., Goodlett, D. R. and Kolker, E. 2002: Experimental protein mixture for validating tandem mass spectral analysis, OMICS, 6:207-212）から希望により入手可能である２７００個のペプチドのＬＣＱデータセットに対する、開示されたスコア付けシステムの一つの事例の性能を示す。スコア付けは、アミノ酸クラスによる断片マッチ確率、断片強さ及び連続断片マッチを使用した。性能を、ｐ値に種々のしきい値を設定することによって得られる真陽性率対偽陽性率をプロットする受診者動作特性（ＲＯＣ）状の曲線として報告した。真陽性率及び偽陽性率は、同じくKellerらによって提供されたデータベースをサーチすることによって推定した。比較のために、９５％の真陽性率が必要であるならば、Kellerらによって提案されているもの（たとえばKeller, A., Nesvizhskii, A. I., Kolker, E. and Aebersold, R. 2002: Empirical statistical model to estimate the accuracy of peptide identification made by MS/MS and database search, Anal. Chem., 74:5385-5392を参照）に対して１８倍の改善を示す偽陽性率を達成することができた。
【０２３６】
実施例８．Ｑ−ＴＯＦ計器における性能
開示されたスコア付けシステムは、Micromass社から市販されているＱＴＯＦ計器におけるその性能を例示することにより、いかなる質量分析技術にも適用することができる。図１８は、１６９７個の二電荷及び三電荷ペプチドのセットに対する開示されたスコア付けシステムの一つ事例の性能を示す。スコア付けは、断片マッチ確率、断片強さ、インモニウムイオン及び連続断片マッチを使用した。性能を、ｐ値に種々のしきい値を設定することによって得られる真陽性率対偽陽性率をプロットする受診者動作特性（ＲＯＣ）状の曲線として報告した。真陽性率は、参照データセットのペプチドを含む１５０００種のタンパク質のデータベースに照らしてサーチすることによって推定した。偽陽性率は、１５０００種のランダムなタンパク質のデータベースに照らしてサーチすることによって推定した。ランダムなタンパク質は、第一のタンパク質データベースに対してトレーニングした３次マルコフ連鎖によって生成した。Ｃｙｓ＿ＣＡＭ及び酸化（Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｔｒｙ）を可変性改変として設定した。
【０２３７】
実施例９．Esquire 3000＋の場合の一つのスコア付けシステム事例のパラメータセット
表６には、アミノ酸クラスによる断片マッチ確率、断片強さ及び連続断片マッチを使用するスコア付けシステムで使用されるパラメータの値がリストされている。同じく図１６を参照。
【０２３８】
本発明の方法及びシステムは、多数の異なる装置及び質量分析プロトコルとで使用することができることが理解されよう。本発明のスコア付けシステム又はモデルは、対象の実験環境に容易に適合させることができる。たとえば、確率モデルそのもの、たとえば考慮されるマッチ特性及びそれらの他の要因への依存度を適合させることができる。また、スコア全体における種々のマッチ特性の影響を重み付けする際に使用されるパラメータを適合させることもできる。使用されるパラメータ及びモデルを学習する少なくとも二つの方法が可能である。一つは、手作業で立証したデータセット（たとえば実験スペクトル）を提供し、パラメータ及びモデルを調節して、改善されたスコア付け精度を得る方法である。もう一つの方法は、既知のタンパク質標準のセットを提供し、パラメータ及びモデルを調節して、改善されたスコア付け精度を得る方法である。
【０２３９】
また、本発明に記載するようなペプチドのマッチをスコア付けするためのシステム及び方法は、スタンドアロン的に具現化することもできるし、他のハードウェア又はソフトウェアアプリケーションと組み合わせる又はそれに埋め込むこともできる。たとえば、他のソフトウェアプログラムは、本発明の出力を取り出し、本発明の入力を供給することによって動作することができる。このような具現態様は、本発明の範囲に入るものと解釈される。
【０２４０】
この点で、上記本発明のシステム及び方法は通常、ある程度、入力データを処理し、出力データを生成することを含むことに注意しなければならない。この入力データ処理及び出力データ生成は、ハードウェア又はソフトウェアで具現化することができる。たとえば、上記本発明にしたがってペプチドのマッチをスコア付けすることに伴う機能を具現化するため、特定の電子部品をコンピュータ及び通信ネットワーク又は類似もしくは関連の回路に使用してもよい。あるいはまた、記憶された命令にしたがって動作する１個以上のプロセッサが、上記本発明にしたがってペプチドのマッチをスコア付けすることに伴う機能を具現化してもよい。そのような場合、そのような命令を、１個以上のプロセッサ読み取り可能な機器（たとえば磁気ディスク）に記憶する、又は１個以上の信号を介して１個以上のプロセッサに伝送することは本発明の範囲内である。
【０２４１】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様によって範囲を限定されることはない。実際には、前記記載及び添付図面から、本明細書で記載したものに加えて本発明の他の多様な実施態様及び変形が当業者には自明であろう。したがって、そのような他の実施態様及び変形は、請求の範囲に入ると解釈される。さらに、本発明を、特定の目的のための特定の環境における特定の具現態様に関連して本明細書で記載したが、当業者は、その有用性がそれに限定されず、本発明をいかなる数の目的のためのいかなる数の環境ででも有利に具現化することができることを理解するであろう。したがって、請求の範囲は、本明細書で開示した本発明の最大限の範囲及び本質を考慮して解釈されるべきである。さらには、いくつかの参考文献が本開示で引用されている。引用した参考文献それぞれは引用例として本明細書に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】本発明の一つの実施態様にしたがってペプチドのマッチをスコア付けする典型的な方法を示すフローチャートである。
【図２Ａ】質量分析法データを用いて生物学的配列のデータベースをサーチし、実験スペクトルを、データベースに記憶された生物学的配列から生成した理論スペクトルと比較することを含む、タンパク質同定の手法を示す図である。
【図２Ｂ】種々のペプチド断片化イオン及びそれらに付される命名の例を示す図である。
【図３】本発明に一つの実施態様にしたがって、Matrix Science社から入手可能である十分に確立された市販のソルーションであるMascot１．７（たとえばPerkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M. and Cottrell, J. S. 1999: Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data, Electrophoresis, 20(18):3551-3567を参照）に比較した２種の設計のスコア付けシステム（Ｅ＝（Ｆ，ｚ）に基づき、式（Ｆ１）を使用して計算したOlav１及びＥ＝（Ｆ，ｚ，Ｐ，Ｗ）に基づき、図８のＨＭＭを使用して計算したOlav２）の性能を示す図である。
【図４】ペプチドのマッチをスコア付けするために使用することができる、候補ペプチドに関するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベースからの理論トリプシンペプチド質量分布を示す図である（高いペプチド質量は低いペプチド質量に比較して統計的により有意である）。
【図５Ａ】ＭＳスペクトルの例を提供する図であり、図５Ａは、質量スペクトルの例を示す。
【図５Ｂ】ＭＳスペクトルの例を提供する図であり、図５Ｂは、ペプチド理論同位体的分布の例を示す。
【図６】Dancikらのスコア付けシステム、すなわちＥ＝（Ｆ，ｚ）に基づき、式（Ｆ１）を使用して計算したOlav１と、Ｅ＝（Ｆ，ｚ，Ｐ，Ｗ）に基づき、図８のＨＭＭを使用して計算したOlav２との比較を示す図である。
【図７】ペプチド配列長に対する観測された荷電状態の相対度数の分布ならびに経験的分布をあてはめる理論モデルを示す図である。
【図８】本発明の実施態様によるイオンシリーズマッチの３次モデルを示す図である。
【図９】本発明の実施態様によるランダムイオンシリーズマッチ、たとえば帰無仮説のモデルを示す図である。
【図１０】本発明の実施態様による断片マッチを示す図である。
【図１１】本発明の一つの実施態様にしたがってペプチドのマッチをスコア付けするための典型的なコンピュータベースのシステムを示すブロック図である。
【図１２】本発明の一つの典型的な実施態様におけるOlav及びMascotの相対性能を示す図である。
【図１３】本発明の一つの典型的な実施態様におけるイオントラップデータにおけるOlav性能を示す図である。
【図１４】本発明の一つの典型的な実施態様におけるスコア比の分布を示す図である。
【図１５】非常に大きなBruker Esquire 3000イオントラップデータセットに対する開示されたスコア付けシステムの四つ事例の性能をMascot１．７と比較して示す図である。
【図１６】Esquire 3000+で取得されたイオントラップデータの大きな集合に対する開示されたスコア付けシステムの一つ事例の性能を示す図である。
【図１７】Kellerら（たとえばKeller, A., Purvine, S., Nesvizhskii, A. I., Stolyar, S., Goodlett, D. R. and Kolker, E. 2002: Experimental protein mixture for validating tandem mass spectral analysis, OMICS, 6:207-212）から希望により入手可能である２７００個のペプチドのＬＣＱデータセットに対する開示されたスコア付けシステムの一つの事例の性能を示す図である。
【図１８】１６９７個の二電荷及び三電荷ペプチドのセットに対する開示されたスコア付けシステムの一つの事例の性能を示す図である。
【図１】
2006511821.tif 000054
【図２Ａ】
2006511821.tif 000055
2006511821.tif 000056
【図３】
2006511821.tif 000057
【図４】
2006511821.tif 000058
2006511821.tif 000059
2006511821.tif 000060
【図６】
2006511821.tif 000061
【図７】
2006511821.tif 000062
【図８】
2006511821.tif 000063
【図９】
2006511821.tif 000064
【図１０】
2006511821.tif 000065
【図１１】
2006511821.tif 000066
【図１２】
2006511821.tif 000067
【図１３】
2006511821.tif 000068
【図１４】
2006511821.tif 000069
【図１５】
2006511821.tif 000070
【図１６】
2006511821.tif 000071
【図１７】
2006511821.tif 000072
【図１８】
2006511821.tif 000073
【配列表】
2006511821000001.app
【国際調査報告】
2006511821.tif 000074
2006511821.tif 000075
2006511821.tif 000076