(57)【要約】本発明は、遺伝子疾患の検出に有用な方法を提供する。方法は、関心対象座の対立遺伝子の配列を決定する段階、および関心対象座における対立遺伝子比率を定量する段階を含む。この比率は、染色体異常の有無を示す。また、本発明は胎児の染色体異常を検出するための非侵襲的方法を提供する。本発明は、胎児ＤＮＡの配列を決定するための非侵襲的方法として特に有用である。本発明は、試料から遊離のＤＮＡを単離する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０００１〜０．０３％、０．０３〜０．０５％、０．０５〜０．０８％、０．０８〜０．１％、０．１〜０．３％、０．３〜０．５％、０．５〜０．７％、０．７〜０．９％、０．９〜１．２％、１．２〜１．５％、１．５〜２％、および２〜３％からなる群より選択される濃度のホルマリンが添加された核酸含有試料から、遊離の核酸を単離する段階を含む、分析目的で試料を調製するための方法。
【請求項２】
試料を、ヒト、非ヒト、哺乳類、爬虫類、畜牛、ネコ、イヌ、ヤギ、イノシシ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、雄牛、雌牛、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラ、およびサメからなる群より選択される供給源から得る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料をヒト供給源から得る、請求項２記載の方法。
【請求項４】
試料を、細胞、胎児細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、膣分泌物、臍帯血、絨毛膜、羊水、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、糞便、または身体浸出物からなる群より選択される供給源から得る、請求項１記載の方法。
【請求項５】
試料が血液である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
血液が妊娠女性に由来する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
血液を、胎児が０〜４週、４〜８週、８〜１２週、１２〜１６週、１６〜２０週、２０〜２４週、２４〜２８週、２８〜３２週、３２〜３６週、３６〜４０週、４０〜４４週、４４〜４８週、４８〜５２週、および５２週超からなる群より選択される胎齢にあるヒト妊娠女性から得る、請求項６記載の方法。
【請求項８】
試料を、血液由来の血漿から得る、請求項７記載の方法。
【請求項９】
試料中のホルマリン濃度が０．１％である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
核酸の単離が、遠心分離の段階を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
遠心分離の段階を、制動力をゼロに設定した遠心分離器で行う、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
遠心分離の段階を、０〜５０ｒｐｍ、５０〜１００ｒｐｍ、１００〜２００ｒｐｍ、２００〜３００ｒｐｍ、３００〜４００ｒｐｍ、４００〜５００ｒｐｍ、５００〜６００ｒｐｍ、６００〜７００ｒｐｍ、７００〜８００ｒｐｍ、８００〜９００ｒｐｍ、９００〜１０００ｒｐｍ、１０００〜２０００ｒｐｍ、２０００〜３０００ｒｐｍ、３０００〜４０００ｒｐｍ、４０００〜５０００ｒｐｍ、５０００〜６０００ｒｐｍ、６０００〜７０００ｒｐｍ、７０００〜８０００ｒｐｍ、および８０００ｒｐｍ超からなる群より選択される速度で行う、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから、試料における対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、以下を含む段階：
（１）対象遺伝子座の増幅；
（２）増幅された遺伝子座とＧｅｎｅＣＨＩＰアレイのハイブリダイゼーション；
（３）ＧｅｎｅＣＨＩＰアレイの洗浄；
（４）検出用試薬によるＧｅｎｅＣＨＩＰアレイの染色；および
（５）ＧｅｎｅＣＨＩＰアレイのスキャニング。
【請求項１４】
（ａ）（１）の増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自律的配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージによる増幅、鎖置換増幅、ならびにスプライス・オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
増幅法がＰＣＲによるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
染色法が、ストレプトアビジン・フィコエリトリンおよびビオチン化抗ストレプトアビジンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、以下を含む段階：
（１）対象遺伝子座の増幅；
（２）アンプリコンの断片化；
（３）断片化されたアンプリコンとＣｏｄｅＬｉｎｋアレイのハイブリダイゼーション；
（４）ヌクレオチドを取り込ませるための伸長反応；ならびに
（５）取り込まれたヌクレオチドの検出。
【請求項１８】
増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自律的配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージによる増幅、鎖置換増幅、ならびにスプライス・オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
増幅法がＰＣＲによるものである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
アンプリコンの断片化が、エキソヌクレアーゼ消化によるものである、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
取り込まれたヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドである、請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
取り込まれたヌクレオチドを、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、および検出可能な電子スピン共鳴、静電容量、比誘電率、または電気伝導度を有する部分からなる群より選択される分子によって標識する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
標識ヌクレオチドを蛍光分子で標識する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、ビーズアレイ技術の使用を含む段階。
【請求項２５】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、以下を含む段階：
（１）対象遺伝子座の増幅；
（２）（ａ）において使用されなかった試薬の脱リン酸化；
（３）（ｂ）の産物のインビトロ転写反応；
（４）（ｃ）の産物のＲＮａｓｅ  Ａ消化；
（５）（ｄ）の産物とＣｌｅａｎＲｅｓｉｎの混合；
（６）（ｅ）の産物の、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰへのトランスファー；ならびに
（７）ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰの分析。
【請求項２６】
増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自律的配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージによる増幅、鎖置換増幅、ならびにスプライス・オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
増幅法がＰＣＲによるものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
脱リン酸化反応に、シュリンプアルカリホスファターゼを使用する、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、以下を含む段階：
（１）対象遺伝子座の増幅；
（２）（ａ）において使用されなかった試薬の脱リン酸化；
（３）プライマーと対象遺伝子座のハイブリダイゼーション；
（４）ヌクレオチドの取り込み；
（５）（ｄ）の産物とＣｌｅａｎＲｅｓｉｎの混合；
（６）（ｅ）の産物のＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰへのトランスファー；ならびに
（７）ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰの分析。
【請求項３０】
増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自律的配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージによる増幅、鎖置換増幅、ならびにスプライス・オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
増幅法がＰＣＲによるものである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
脱リン酸化反応にシュリンプアルカリホスファターゼを使用する、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
プライマーのハイブリダイゼーションが、対象遺伝子座に隣接したものである、請求項２９記載の方法。
【請求項３４】
取り込まれたヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドである、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
取り込まれたヌクレオチドが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、ならびに検出可能な電子スピン共鳴、静電容量、比誘電率、または電気伝導度を有する部分からなる群より選択される分子によって標識される、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
標識ヌクレオチドが蛍光分子で標識される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、以下を含む段階：
（１）対象遺伝子座の増幅；
（２）（１）の産物のエキソヌクレアーゼ処理；
（３）（２）の１本鎖ＤＮＡの、オリゴヌクレオチドへのアニール；
（４）（３）でアニールした鋳型およびプライマーを用いての、ヌクレオチドの取り込み；
（５）取り込まれたヌクレオチドの検出。
【請求項３８】
増幅法が、ポリメラーゼ連鎖反応、自律的配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージによる増幅、鎖置換増幅、ならびにスプライス・オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
増幅法がＰＣＲによるものである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
プライマーが、対象遺伝子座に隣接したハイブリッドを形成する、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
取り込まれたヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドである、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
取り込み反応が、２種類の終結ヌクレオチド、および２種類の非終結ヌクレオチドを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項４３】
取り込まれたヌクレオチドが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、ならびに検出可能な電子スピン共鳴、静電容量、比誘電率、または電気伝導度を有する部分からなる群より選択される分子によって標識される、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
終結ヌクレオチドが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、ならびに検出可能な電子スピン共鳴、静電容量、比誘電率、または電気伝導度を有する部分からなる群より選択される分子によって標識される、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
標識ヌクレオチドが蛍光分子で標識される、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
終結ヌクレオチドが蛍光分子で標識される、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
以下の段階を含む、試料における染色体異常を検出するための方法：
（ａ）鋳型ＤＮＡから対象遺伝子座の対立遺伝子の配列を決定する、以下を含む段階：
（１）増幅反応が、フォワードプライマー、リバースプライマー、およびアンプリコンの領域内にある対象遺伝子座とアニールするプローブを含む増幅反応であり、さらに、プローブが、プローブの一方の末端にレポーター色素を、プローブのもう一方の末端にクエンチング色素を含むプローブである、対象遺伝子座の増幅；ならびに
（２）そのＰＣＲ産物の量を元に特定の遺伝子配列の有無を判定する、ＰＣＲ産物の検出。
【請求項４８】
増幅がＰＣＲによるものである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
プローブが、レポーター色素を５’末端に、クエンチング色素を３’末端に含む、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
ＰＣＲ産物を、ＡＢＩ  ７７００配列検出システムを用いて検出する、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
細胞溶解阻害剤が試料に添加されている、請求項１３、１７、２４、２５、２９、３７、および４７のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
細胞溶解阻害剤が、０．０００１〜０．０３％、０．０３〜０．０５％、０．０５〜０．０８％、０．０８〜０．１％、０．１〜０．３％、０．３〜０．５％、０．５〜０．７％、０．７〜０．９％、０．９〜１．２％、１．２〜１．５％、１．５〜２％、および２〜３％からなる群より選択されるパーセンテージのホルマリンである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
試料中のホルマリン濃度が０．１％である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
組成物中の全遊離ＤＮＡにおける遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージが、約１５〜１６％の胎児ＤＮＡ、約１６〜１７％の胎児ＤＮＡ、約１７〜１８％の胎児ＤＮＡ、約１８〜１９％の胎児ＤＮＡ、約１９〜２０％の胎児ＤＮＡ、約２０〜２１％の胎児ＤＮＡ、約２１〜２２％の胎児ＤＮＡ、約２２〜２３％の胎児ＤＮＡ、約２３〜２４％の胎児ＤＮＡ、約２４〜２５％の胎児ＤＮＡ、約２５〜３５％の胎児ＤＮＡ、約３５〜４５％の胎児ＤＮＡ、約４５〜５５％の胎児ＤＮＡ、約５５〜６５％の胎児ＤＮＡ、約６５〜７５％の胎児ＤＮＡ、約７５〜８５％の胎児ＤＮＡ、約８５〜９０％の胎児ＤＮＡ、約９０〜９１％の胎児ＤＮＡ、約９１〜９２％の胎児ＤＮＡ、約９２〜９３％の胎児ＤＮＡ、約９３〜９４％の胎児ＤＮＡ、約９４〜９５％の胎児ＤＮＡ、約９５〜９６％の胎児ＤＮＡ、約９６〜９７％の胎児ＤＮＡ、約９７〜９８％の胎児ＤＮＡ、約９８〜９９％の胎児ＤＮＡ、および約９９〜９９．７％の胎児ＤＮＡからなる群より選択される、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含む組成物。
【請求項５５】
組成物中の全遊離ＤＮＡにおける遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージが、約１５〜１６％の胎児ＤＮＡ、約１６〜１７％の胎児ＤＮＡ、約１７〜１８％の胎児ＤＮＡ、約１８〜１９％の胎児ＤＮＡ、約１９〜２０％の胎児ＤＮＡ、約２０〜２１％の胎児ＤＮＡ、約２１〜２２％の胎児ＤＮＡ、約２２〜２３％の胎児ＤＮＡ、約２３〜２４％の胎児ＤＮＡ、約２４〜２５％の胎児ＤＮＡ、約２５〜３５％の胎児ＤＮＡ、約３５〜４５％の胎児ＤＮＡ、約４５〜５５％の胎児ＤＮＡ、約５５〜６５％の胎児ＤＮＡ、約６５〜７５％の胎児ＤＮＡ、約７５〜８５％の胎児ＤＮＡ、約８５〜９０％の胎児ＤＮＡ、約９０〜９１％の胎児ＤＮＡ、約９１〜９２％の胎児ＤＮＡ、約９２〜９３％の胎児ＤＮＡ、約９３〜９４％の胎児ＤＮＡ、および約９４〜９５％の胎児ＤＮＡからなる群より選択される、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含む組成物。
【請求項５６】
組成物中の全遊離ＤＮＡにおける遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージが、約１５〜１６％の胎児ＤＮＡ、約１６〜１７％の胎児ＤＮＡ、約１７〜１８％の胎児ＤＮＡ、約１８〜１９％の胎児ＤＮＡ、約１９〜２０％の胎児ＤＮＡ、約２０〜２１％の胎児ＤＮＡ、約２１〜２２％の胎児ＤＮＡ、約２２〜２３％の胎児ＤＮＡ、約２３〜２４％の胎児ＤＮＡ、約２４〜２５％の胎児ＤＮＡ、約２５〜３５％の胎児ＤＮＡ、約３５〜４５％の胎児ＤＮＡ、約４５〜５５％の胎児ＤＮＡ、約５５〜６５％の胎児ＤＮＡ、約６５〜７５％の胎児ＤＮＡ、約７５〜８５％の胎児ＤＮＡ、約８５〜９０％の胎児ＤＮＡ、約９０〜９１％の胎児ＤＮＡ、約９１〜９２％の胎児ＤＮＡ、約９２〜９３％の胎児ＤＮＡ、約９３〜９４％の胎児ＤＮＡ、および約９４〜９５％の胎児ＤＮＡからなる群より選択される、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含む組成物を分析する段階を含む、出生前診断法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、染色体異常および突然変異を含む遺伝子疾患の検出法に関する。本発明は、胎児のＤＮＡ配列決定のための迅速で非侵襲的な方法を提供する。本法は、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよび他の異数体、欠失、付加、増幅、転座、および再配列を含む胎児における染色体異常の検出に特に有用である。なお、本出願は、２００２年３月１１日に出願された米国特許出願第１０／０９３，６１８号明細書、２００２年３月１日および２００２年３月８日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６０／３６０，２３２号明細書および米国仮特許出願第６０／３７８，３５４号明細書、ならびに２００３年２月２８日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０３／０６１９８号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願内容は参照として本明細書にその全体が組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
染色体異常は、ヒトにおける出生時遺伝子欠損の原因としてかなりの割合を占めている。ヒトの細胞核は、４６個の染色体を含有しているが、これらが遺伝的指令を含み、また細胞の働きを決定している。４６個の染色体のうちの半分は一方の親に由来する。正常な男性では互いに全く異なっている性染色体を除いて、母親からの染色体と父親からの染色体とが対応した組を形成する。これらの対は卵子が精子によって受精した時に組合わされたものである。時には、染色体の形成、または組合わせのいずれかにエラーが生じ、が多すぎるか、または少なすぎる染色体を有するか、あるいは何らかの仕方で混合された染色体を有する受精卵子が形成される。各染色体は、多くの遺伝子を含有しているため、染色体異常は、身体系の多くに影響を与え、しばしば発達障害（例えば、精神遅滞）を含む重大な出生時欠損を生じ易い。
【０００３】
細胞は染色体の切断された両端を誤って再結合することがある。これは自発的に生じる場合もあるし、化学化合物、発癌物質に曝された後、および放射線照射後に生じる場合もある。再結合が染色体内部で生じる場合は、２つの切断箇所の間の染色体部分が逆転し、逆位として分類される。逆位では、遺伝子物質の損失はないが、逆位によって、重要な遺伝子の分裂または、疾病に関連した状態を引き起こす融合遺伝子を作り出すことがある。
【０００４】
相互転座においては、２つの非相同染色体が切断して断片を交換する。この状況では、２つの異常染色体が生じる、すなわち、各々が他の染色体に由来する一部からなり、それ自体の一部を欠いている。転座が平衡型である場合、その個体は異常表現型を表すことはない。しかし、転座を有する個体では胚細胞形成時に、卵子または精子の染色体の適切な分布がなされない場合があり、その結果、流産、奇形または子の精神遅滞を生じる。
【０００５】
ロバートソン転座においては、２つの末端流動体の動原体（非中央位置動原体を有する染色体）染色体が融合して１つの大型の中部動原体を生成する。動原体融合を有する個体の核型は、染色体の正常な二倍体数よりも１つ少ない数を有する。
【０００６】
多すぎるまたは少なすぎる染色体を生成するエラーも疾病表現型を導くことがある。例えば、染色体Ｘを失ったコピー（モノソミーＸ）はターナー症候群を生じ、一方、染色体２１の過剰コピーはダウン症候群を生じる。エドワード症候群およびパトー症候群などの他の疾病は、それぞれ染色体１８および染色体１３の過剰コピーによって生じる。
【０００７】
最も一般的な染色体異常の１つは、ダウン症候群として知られている。ダウン症候群の推定発生率は、出生１，０００人のうちの１人から１，１００人のうち１人の間である。米国では毎年、この染色体を有する子供が約３、０００人から５，０００人生まれている。ダウン症候群の子供の大多数（約９５％）は１個余分な染色体２１を有している。ほとんどの場合、この余分な染色体は母親由来である。しかし、ダウン症候群を有する人の約３〜４パーセントでは、染色体２１と染色体１４または２２との間の転座が遺伝子異常の原因となっている。ダウン症候群を有する個体の最後の約１パーセントにモザイク現象と呼ばれるもう１つの染色体異常があることがわかっている。この場合幾つかの細胞は、４７個の染色体を有し、他の細胞は４６個の染色体を有する。モザイク現象は、受胎直後の細胞分裂におけるエラーの結果であると考えられている。
【０００８】
染色体異常は、コンジェンシャルであり、したがって、出生前胎児の健康および病態を判断するために出生前診断を用いることができる。出生前診断による知見が得られないと、胎児または母親または双方にとって不都合な結果となる可能性がある。先天性異常は周産期死亡の２０％から２５％を占めている。特に出生前診断は、残りの妊娠期の管理、出生過程に伴って生じ得る合併症に対する計画、新生児に生じ得る問題に対する準備、および将来の妊娠に影響し得る病態の発見にとって有益である。
【０００９】
超音波検査、羊水穿刺、絨毛膜絨毛試料採取（ＣＶＳ）、母体血液内の胎児血液細胞、母体血清のアルファ−フェトプロテイン、母体血清ベータ−ＨＣＧ，および母体血清エストリオールなどの出生前診断に利用できる種々の非侵襲的および侵襲的方法がある。しかし、非侵襲的な方法は特異性が低く、特異性が高くて感受性の高い方法は、侵襲性が高い。さらに、多くの方法では、最も有用性を高めるために、適用できるのは妊娠中のある特定の期間だけである。
【００１０】
超音波検査
これは、無害な非侵襲的方法である。高周波音波は、羊膜腔内の胎児を含む種々の組織および器官によって生じたエコーのパターンから可視画像を生成させるために用いられる。発達しつつある胎芽は懐胎約６週目に視覚化できる。懐胎約１６週目から２０週目に主な内部器官および四肢を評価して異常がないかどうかを判断できる。
【００１１】
超音波検査は、胎児の大きさおよび位置、羊水量および胎児の解剖学的構造の外観を判断するためには有用であり得るが、この方法には限界がある。ダウン症候群のように形態学的異常がしばしば目立たず微妙な識別しにくい異常は全く検出されないことがあり得る。
【００１２】
羊水穿刺
これは、針を母体の下腹部から子宮内部の羊膜腔内へ通す侵襲性の高い方法である。この方法は、懐胎約１４週目に実施できる。出生前診断のためには、たいていの羊水穿刺は懐胎１４週から２０週の間に実施される。しかし、羊水穿刺前には超音波検査を実施し、懐胎令、胎児および胎盤の位置、および十分な羊水が存在しているかどうかの判断する。羊水中に存在する胎児細胞（大部分は胎児の皮膚に由来）を染色体の生化学的分析および分子生物学的分析用に培養液中で増殖させることができる。
【００１３】
染色体または染色体断片の過多または欠失などの大きな染色体異常は、細胞の４６個の全染色体の同定と分析に関与し、それらの染色体を大きさと構造の微妙な違いに基づいて、対応した組に配列する核型決定によって検出できる。このように系統的に並べると、染色体の数と構造の異常は明白である。この方法では完了までに典型的には、７日〜１０日かかる。
【００１４】
羊水穿刺は、直接的な遺伝情報の提供に使用できるが、この操作には、胎児損傷および母体のＲｈ感作などの危険が伴う。羊水穿刺後の胎児死亡の危険性は通常のそれよりも約０．５％上昇する。Ｒｈ陰性の母親は、ＲｈｏＧａｍによって治療を受けることができる。
【００１５】
絨毛膜絨毛試料採取（ＣＶＳ）
この方法では、超音波誘導装置を有するカテーテルを、膣を経てその頚部を通り、子宮内へと発達中の胎盤まで通す。カテーテルの導入によって胎盤の絨毛膜絨毛の細胞を得ることができ、染色体分析などの種々の方法で分析して胎児の核型を決定できる。また、これらの細胞は培養して、生化学的分析または分子生物学的分析をすることができる。ＣＶＳは、典型的に懐胎９．５週から１２．５週の間に実施される。
【００１６】
ＣＶＳは、侵襲的方法であるという不利な点を有し、胎児の疾病率は低いとあいえ、深刻である。すなわち、これらの損傷率は、羊水穿刺を受けている女性よりも約０．５％から１％高い。稀にＣＶＳは胎児の四肢欠損を伴うことがある。また、母体のＲｈ感作の可能性も存在する。さらにまた、胎児細胞の替わりに、発達中の胎盤内の母体血液細胞が試料採取される可能性も存在する。
【００１７】
母体血清のアルファ−フェトプロテイン（ＭＳＡＦＰ）
発達中の胎児は、主要な２つの血液蛋白質−アルブミンおよびアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を有する。母体は、通常その血液にアルブミンのみを有するので、胎児のＡＦＰ濃度を測定するためにＭＳＡＦＰ試験が利用できる。通常は、羊水に出て胎盤を通り母体の血液に到達できるＡＦＰはほんの少量である。しかし、胎児が神経管欠陥を有すると、羊水中に漏れ出るＡＦＰが増す。神経管欠陥としては、無脳症（神経管の頭端における閉鎖不全）および二分脊椎（神経管の尾端における閉鎖不全）が挙げられる。このような欠陥の発生率は、米国では出生１，０００件につき約１件から２件である。また、胎児の腹壁に欠陥があると、母体の血液内の胎児ＡＦＰはより多量となる。
【００１８】
ＭＳＡＦＰの量は妊娠令とともに増加する。したがって、ＭＳＡＦＰ試験から正確な結果を得るためには、妊娠令を正確に知る必要がある。また、母親の人種および妊娠糖尿病の存在が、正常であると考えられるはずのＭＳＡＦＰの濃度に影響を及ぼすことがある。ＭＳＡＦＰは、典型的には平均値の倍数（ＭｏＭ）として報告される。ＭｏＭが大きくなるほど、欠陥が存在する可能性も大きくなる。ＭＳＡＦＰ試験は、妊娠１６週から１８週の間に最も高い感受性を有しているが、妊娠１５週から２２週の間に利用できる。ダウン症候群または他の染色体異常が存在する場合、ＭＳＡＦＰはより低くなる傾向がある。
【００１９】
ＭＳＡＦＰ試験は非侵襲性的ではあるが、１００％特異的ではない。ＭＳＡＦＰは、胎児の神経管または腹壁の欠陥に関連していない種々の理由で上昇することがある。ＭＳＡＦＰ上昇の最も一般的な原因は、胎児の妊娠令に対する誤った判断である。したがって、ＭＳＡＦＰ試験の結果は、決定的および結論的に考えられることはない。
【００２０】
母体血清のベータ−ＨＣＧ
受胎および発達中の胎芽の子宮への着床後、約１週目から栄養膜は、妊娠診断に利用できる検出可能なベータ−ＨＣＧ（ヒト絨性ゴナドトロピン）を産生し始める。ベータ−ＨＣＧは、母体血清においても定量でき、流産の恐れがある場合、または異所性妊娠が疑われる場合、ベータ−ＨＣＧ量が正常よりも低くなるため、この定量は妊娠初期に有用であり得る。
【００２１】
第２トリメスターの中期から後期に、染色体異常、特にダウン症候群をスクリーンするために、ベータ−ＨＣＧはＭＳＡＦＰと組合わせて利用できる。ベータ−ＨＣＧの上昇とＭＳＡＦＰの低下とが共に存在する場合は、ダウン症候群が示唆される。高濃度のＨＣＧにより栄養膜疾患（奇胎妊娠）が示唆される。超音波検査で胎児が存在せず、それにＨＣＧの上昇を伴うと胞状奇胎が示唆される。
【００２２】
母体血清のエストリオール
母体血清中のエストリオール量は、胎児が生存可能かどうか、胎盤が正しく機能しているか、また母体が健康状態にあるかどうかによって変わってくる。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、胎児の副腎によって作られ、胎盤内でエストリオールへと代謝される。エストリオールは母体の循環に入り、母体の腎臓によって尿中へ、または母体の肝臓によって胆汁中へ排泄される。第３トリメスターに測定された正常濃度のエストリオールは、胎児の一般的健康状態の目安となる。エストリオールの濃度が低下する場合は、胎児は危険な状態にあり、即時分娩が必要であると考えられる。ダウン症候群が存在する場合、また、無脳症を伴う副腎形成不全が存在する場合、エストリオールは低下する傾向がある。
【００２３】
三重スクリーン試験
三重スクリーン試験は、母体血清アルファ−フェトプロテイン（ＭＳＡＦＰ）、ヒト絨性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および未抱合型エストリオール（ｕＥ３）の分析を含んでなる。血液試験は通常、最後の月経期の１６〜１８週後に実施される。この三重スクリーン試験は、非侵襲的ではあるが、試験の異常結果が出生時欠陥を示しているわけではなく、この試験は、危険性が高いことを示し、さらなる試験が必要であることを示唆するだけである。例えば、１，０００人の女性のうち１００人がこの三重スクリーン試験から異常結果を得る。しかし、出生時欠陥を持つ胎児を有するのは１００人の女性のうちわずか２〜３人である。誤陽性の発生率がこのように高いため、妊婦に非常に大きなストレスと不必要な心配を与える。
【００２４】
母体血液から単離された胎児細胞
母体血液内には胎児有核細胞が存在するため、これらの細胞を非侵襲的な出生前診断に利用することができる（ウォークノースカら（Ｗａｌｋｎｏｗｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）１：ｐ．１１１９−１１２２、１９６９年；ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２：ｐ．１３６３−６５、１９８９年；ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８８：ｐ．４３９０−９５、１９９６年）。特定のＤＮＡ配列を探すために、胎児細胞を種々の方法によって分類し、分析することができる（ビアンチら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６１：ｐ．８２２−２９、（１９９７）；ビアンチら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）９３：ｐ．７０５−０８、（１９９６））。蛍光インシトウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、母体血液から回収された胎児細胞の特定の染色体を同定し、トリソミーＸおよびモノソミーＸなどの異数体の病態を診断するために適用できる。
【００２５】
ＦＩＳＨ法は、顕微鏡下で特定の染色体または遺伝子の検出を可能にする有色蛍光タグで標識化したＤＮＡプローブを用いる。ＦＩＳＨを用いれば、標準的な核型決定によっては検出できない微妙な遺伝子異常が容易に同定できる。この方法は完了するのに典型的には２４〜２８時間かかる。また、多色ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブのパネルを用いて、異常染色体のコピー数を見ることができる。
【００２６】
胎児細胞の単離および濃縮に関して改善がなされているが、多くの胎児細胞を得ることは依然として困難である。胎児の核型異常の信頼できる判断または他の異常のアッセイには十分とは言えない。さらに、たいていの方法は、時間がかかり、大きな労働量の投入を要し、ハイスループットで実施することは困難である。
【００２７】
母体血液からの胎児ＤＮＡ
母体の血漿および血清において、胎児ＤＮＡが検出され、定量されてきた（ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３５０：ｐ．４８５−４８７（１９９７）；ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６２：ｐ．７６８−７７５（１９９８））。胎児顆粒球、リンパ球、有核赤血球および栄養芽層細胞などの複数の胎児細胞型が母体循環内に存在する（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、産科学および婦人科学（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。胎児ＤＮＡは、懐胎７週目に血清中で検出でき、妊娠期間の増加とともに上昇する。母体の血清と血漿中に存在する胎児ＤＮＡは、胎児細胞単離プロトコルから得られたＤＮＡ濃度に相当する。
【００２８】
循環胎児ＤＮＡは、胎児の性別を決定するために利用されてきた（ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６２：ｐ．７６８−７７５（１９９８））。また、アカゲザル胎児Ｄ遺伝子型が胎児ＤＮＡを用いて検出されていた。しかしながら、循環胎児ＤＮＡの診断的臨床的適用は、母体ではなく胎児に存在する遺伝子に限られている（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、産科学および婦人科学（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。このように、胎児ＤＮＡ配列を決定することができ、胎児の染色体異常の決定的診断を提供することのできる非侵襲的方法に対する必要性は依然として存在している。
【発明の開示】
【００２９】
発明の簡単な概要
本発明は、突然変異および染色体異常などの遺伝子疾患の検出方法に関する。好ましい態様において、本発明は、限定はしないが、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよび他の異数体、欠失、付加、増幅、断片、転座、および再配列などの変異および染色体異常を検出するために用いられる。多くの異常を同時に検出することができる。また、本発明は妊娠女性の試料から胎児のＤＮＡ配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。本発明は、限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化など、野生型配列に較べた場合の遺伝子配列における何らかの変化を検出するために利用できる。本発明はまた、核酸を含む試料から遊離の核酸を単離するための方法も提供する。
【００３０】
一態様において、本発明は、染色体異常を検出する方法に関しており、前記方法は、（ａ）鋳型ＤＮＡ上、関心対象座の対立遺伝子の配列決定、および（ｂ）（ａ）の関心対象座から同定された関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子比率の定量を含んでなり、前記比率が染色体異常の有無を示す。
【００３１】
他の態様において、本発明は、胎児ＤＮＡ上、関心対象座の配列決定に関する非侵襲的方法を提供し、前記方法は、（ａ）妊娠女性からの試料の獲得；（ｂ）（ａ）の試料に対する細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加；（ｃ）（ｂ）の試料から胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡを含んでなる鋳型ＤＮＡの獲得；（ｄ）鋳型ＤＮＡ上の関心対象座の配列決定を含んでなる。
【００３２】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、汗、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚芽組織、胚芽、２細胞胚芽、４細胞胚芽、８細胞胚芽、１６細胞胚芽、３２細胞胚芽、６４細胞胚芽、１２８細胞胚芽、２５６細胞胚芽、５１２細胞胚芽、１０２４細胞胚芽、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質または身体滲出液などの試料から得られる。
【００３３】
一実施態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の試料から得られる。好ましい一態様において、鋳型ＤＮＡはヒトの妊娠女性から得られる。
【００３４】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは胎芽から得られる。好ましい一態様において、鋳型ＤＮＡは、胎芽の単細胞から得られる。
【００３５】
他の態様において、限定はしないが、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル添加物またはジスルフィド還元物、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、開裂性架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載の化合物などの細胞溶解阻害剤を試料に添加する。好ましい態様では、ホルマリンは試料中に、０．０００１〜０．０３％、０．０３〜０．０５％、０．０５〜０．０８％、０．０８〜０．１％、０．１〜０．３％、０．３〜０．５％、０．５〜０．７％、０．７〜０．９％、０．９〜１．２％、１．２〜１．５％、１．５〜２％、２〜３％、３〜５％、および５％超を含むがこれらに限定されないパーセンテージで存在する。
【００３６】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパン（ｈｏｐａｎｅ）テトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン（ｚｏｎｅｇｒａｎ）、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール（ｔｅｇｒｅｔｏｌ）、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール（ｍｅｘｉｔｉｌ）、ジランチン（ｄｉｌａｎｔｉｎ）、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【００３７】
他の態様において、限定はしないが、デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、グアニジン−ＨＣｌ、イソチオシアン酸グアニジン、Ｎ−ラウロイルサルコシンおよびドデシル硫酸ナトリウムなどのＤＮＡの破壊を防ぐ試剤を試料に添加する。
【００３８】
好ましい一態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血漿から得られる。他の態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血清から得られる。
【００３９】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含んでなる。
【００４０】
他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、母体の関心対象のホモ接合座から選択される。他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、母体の関心対象のヘテロ接合座から選択される。
【００４１】
他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、父親の関心対象のホモ接合座から選択される。他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、父親の関心対象のヘテロ接合座から選択される。
【００４２】
一態様において、１つの染色体上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列が決定される。好ましい一態様において、複数の染色体上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列が決定される。
【００４３】
他の態様において、関心対象座の対立遺伝子配列決定は、限定はしないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、質量分析、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光分極、蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、塩基配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアレイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、ＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析などの方法を含んでなる。
【００４４】
好ましい態様において、関心対象座の対立遺伝子配列決定は、（ａ）第１のプライマーおよび関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素に対する認識部位を含有する第２のプライマーを用いて関心対象座を増幅すること；（ｂ）第２のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素によって増幅されたＤＮＡを消化すること；（ｃ）鋳型として関心対象座を含有する５’オーバーハングを用いて（ｂ）の消化されたＤＮＡ内へ、ヌクレオチドを組み込むこと；（ｄ）（ｃ）のＤＮＡ配列を決定することによって、関心対象座の配列を決定することを含んでなる。
【００４５】
一態様において、前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでなり得る。さらなる態様において、ＰＣＲのサイクル１のアニーリング温度は、第２のプライマーのアニーリング長の略融解温度であり得る。他の実施態様において、ＰＣＲのサイクル２のアニーリング温度は、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡをアニールする３’領域の略融解温度であり得る。他の態様において、残りのサイクルのアニーリング温度は、第２のプライマーの全配列の略融解温度であり得る。
【００４６】
他の態様において、第２のプライマー上の認識部位は、制限酵素の結合部位から離れて切断し、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素のための認識部位である。好ましい態様において、第２のプライマー上の認識部位は、ＩＩＳ型の制限酵素のためのものである。ＩＩＳ型の制限酵素としては、限定はしないが、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、Ｂｓｔ７ｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥａｒＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳＳｆａＮＩ、およびＳｔｈｉ３２Ｉ、より好ましくはＢｃｅＡＩおよびＢｓｍＦＩが挙げられる。
【００４７】
一態様において、第２のプライマーの３’末端は関心対象座に隣接している。
【００４８】
他の態様において、第２のプライマーのアニーリング長は、３５〜３０、３０〜２５、２５〜２０、２０〜１５、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９．８、７、６、５および４未満の塩基からなる群より選択される。
【００４９】
他の態様において、関心対象座の増幅は、第１のプライマー、および制限酵素認識部位の部分を含有する第２のプライマーを用いることを含んでなり、前記認識部位は、少なくとも１個の可変ヌクレオチドを含有し、増幅後に制限酵素認識部位全体が生成し、前記プライマーの３’領域が鋳型ＤＮＡとの誤対合を含有し、前記制限酵素による消化により、関心対象の座を含有する５’オーバーハングが生成する。
【００５０】
好ましい態様において、制限酵素に対する認識部位としては、限定はしないが、ＢｓａＪＩ（５’Ｃ↓ＣＮＮＧＧ３’）、ＢｓｓＫＩ（５’↓ＣＣＮＧＧ３’）、ＤｄｅＩ（５’Ｃ↓ＴＮＡＧ３’）、ＥｃｏＮＩ（５’ＣＣＴＮＮ↓ＮＮＮＡＧＧ３’）、Ｆｎｕ４ＨＩ（５’ＧＣ↓ＮＧＣ３’）、ＨｉｎｆＩ（５’Ｇ↓ＡＮＴＣ３’）、ＰｆＬＦ１（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）、Ｓａｕ９６Ｉ（５’Ｇ↓ＧＮＣＣ３’）、ＳｃｒＦＩ（５’ＣＣ↓ＮＧＧ３’）、Ｔｔｈｌ１１Ｉ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）が挙げられ、より好ましくは、増幅後にＦｎｕ４ＨＩおよびＥｃｏＮＩが生成する。
【００５１】
他の態様において、第１および／または第２のプライマーの５’領域が制限酵素に対する認識部位を含有する。好ましい態様において、前記制限酵素認識部位は、関心対象の座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素認識部位とは異なっている。
【００５２】
さらなる態様において、本発明の方法は、第１および／または第２のプライマーの５’領域における認識部位を認識する制限酵素によって、ＤＮＡを消化することを、さらに含んでなる。
【００５３】
第１および／または第２のプライマーは、５’末端にタグを含有し得る。好ましくは、第１のプライマーが５’末端にタグを含有する。前記タグは、鋳型ＤＮＡから増幅ＤＮＡを分離するために使用することができる。前記タグは、標識ヌクレオチドを含有しない増幅ＤＮＡから標識ヌクレオチドを含有する増幅ＤＮＡを分離するために使用することができる。前記タグは、限定されないが、ラジオアイソトープ、蛍光レポーター分子、化学的ルミネセンスレポーター分子、抗体、抗体断片、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、ホモポリマーのオリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反磁性部分、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分、またはそれらの組合わせを含む、いかなる化学的部分でありうる。好ましくは、前記タグは、ビオチンである。ビオチンタグは、ストレプトアビジンマトリックスを用いて、鋳型ＤＮＡから増幅ＤＮＡを分離するために使用される。ストレプトアビジンマトリックスは、マイクロ滴定プレートのウェルを被覆する。
【００５４】
本発明の方法におけるヌクレオチドの取込みは、限定はしないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスポリメラーゼ類、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ベントポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼなどのＤＮＡポリメラーゼによる。ヌクレオチドの取り込みは、標識ヌクレオチドおよび未標識ヌクレオチドの混合物の使用をさらに含んでなり得る。１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、または５個を超えるヌクレオチドを取り込むことができる。標識ヌクレオチドおよび未標識ヌクレオチドの組合わせを取り込むことができる。標識ヌクレオチドは、三リン酸ジデオキシヌクレオチド（「ジデオキシ」とも称する）および三リン酸デオキシヌクレオチド（「デオキシ」とも称する）からなる群より選択される。未標識ヌクレオチドは、三リン酸ジデオキシヌクレオチドおよび三リン酸デオキシヌクレオチドからなる群より選択される。標識ヌクレオチドは、限定されないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分を含む分子によって標識化する。好ましくは、標識ヌクレオチドは、蛍光分子によって標識化する。蛍光標識ヌクレオチドの取込みは、蛍光ヌクレオチドおよび未標識ヌクレオチドの混合物の使用をさらに含んでなる。
【００５５】
一態様において、関心対象の座の配列決定は、取込みヌクレオチドの検出を含んでなる。一態様において、前記検出は、ゲル電気泳動、毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、蛍光検出、蛍光局在化、ＤＮＡ塩基配列決定、サンガージデオキシ塩基配列決定、ＥＬＩＳＡ、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、扇形磁場質量分析、扇形電場質量分析、蛍光分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリー、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、ＨｕＳＮＰアレイ、ビーズアレイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、ＳＮＰ−ＩＴ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＣｌｅａｖｅ、サザンブロット、スロットブロットおよびドットブロットからなる群より選択される方法による。
【００５６】
一態様において、鋳型ＤＮＡの１つの染色体上の関心対象の座の１個から数十個、数百個、数千個までの対立遺伝子配列が決定される。好ましい一態様において、複数の染色体上の関心対象の座の１個から数十個、数百個、数千個までの対立遺伝子配列が決定される。
【００５７】
好ましい一態様において、関心対象の座は、１個のヌクレオチド多形または突然変異を含有する疑いがある。この方法は、関心対象の複数の座の配列を同時に決定するために利用できる。鋳型ＤＮＡは、１つの染色体の複数の座を含んでなり得る。鋳型ＤＮＡは種々の染色体の複数の座を含んでなり得る。鋳型ＤＮＡ上の関心対象の座は１つの反応において増幅できる。あるいは、鋳型ＤＮＡ上の関心対象の座の各々は別の反応において増幅できる。増幅ＤＮＡは増幅ＤＮＡの消化前に、一緒にプールできる。関心対象の座を含有する標識ＤＮＡの各々は、関心対象の座の配列を決定する前に分離できる。好ましい一態様において、関心対象の座の少なくとも１つは、１個のヌクレオチド多形または突然変異を含有する疑いがある。
【００５８】
他の態様において、一染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を、異なった染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。比較できる染色体については限定されない。任意の染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を、他の任意の染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較することができる。好ましい一態様において、一染色体上の関心対象の複数ヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を合計して、異なった染色体上の関心対象の複数ヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。
【００５９】
他の態様において、一染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を、２個、３個、４個、または４個を超える染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。他の実施態様において、一染色体上の関心対象の複数の座における対立遺伝子の比率を、２個、３個、４個、または４個を超える染色体上の関心対象の複数の座における対立遺伝子の比率と比較する。
【００６０】
他の態様において、一染色体上の関心対象の対立遺伝子の比率を、異なった染色体上の関心対象の対立遺伝子の比率と比較するが、前記比率の違いは、染色体異常の有無を示す。他の態様において、一染色体上の関心対象の複数の対立遺伝子の比率を、異なった染色体上の関心対象の複数の対立遺伝子の比率と比較するが、前記比率の違いは、染色体異常の有無を示す。
【００６１】
他の態様において、妊娠女性の試料から得られた鋳型ＤＮＡ上の１個から数十個、数百個、数千個までの関心対象の座の配列が決定される。一態様において、関心対象の座は、１個の染色体上にある。他の態様において、関心対象の座は、複数の染色体上にある。
【００６２】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、核酸を単離する段階を提供する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）核酸を単離する段階。好ましい態様では、この方法は、遊離の核酸を単離する際に用いられる。最も好ましい態様では、この方法は、遊離の胎児核酸を単離する際に用いられる。
【００６３】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、遊離の胎児核酸を単離する方法を提供する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；（ｃ）血液試料から血漿を単離する段階（血漿は血液試料を遠心分離することで単離する）；ならびに（ｄ）「バフィーコート」の破壊を最小限に抑える手順で上清（血漿を含む）を除去する段階。
【００６４】
別の態様では、核酸を含む試料を、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、乳房分泌液、乳汁、膣分泌物、汗、臍帯血、絨毛膜、羊水、胚組織、胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、３２細胞期胚、６４細胞期胚、１２８細胞期胚、２５６細胞期胚、５１２細胞期胚、１０２４細胞期胚、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、糞便、または身体浸出物を含むがこれらに限定されない、任意の核酸含有供給源から得る。
【００６５】
一つの態様では、核酸を含む試料を妊娠した雌から得る。好ましい態様では、試料を妊娠したヒト女性から得る。好ましい態様では、試料は妊娠女性から得られた血液である。
【００６６】
別の態様では、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を試料に添加する。
【００６７】
アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を試料に添加することができる。
【００６８】
別の態様では、ＤＮａｓｅ阻害剤、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびＮａ−ドデシル硫酸を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの破壊を防ぐ薬剤を試料に添加する。
【００６９】
好ましい態様では、妊娠女性の血液から得られた血漿から核酸を単離する。別の態様では、母親由来の細胞の溶解量を最小とするように設計された手順で得られた血漿から核酸を単離する。別の態様では、妊娠女性の血液を遠心分離し、ブレーキをかけることなく遠心分離を停止させることで、血漿から核酸を単離する。
【００７０】
好ましい態様では、妊娠女性の血液から得られた血漿から、遊離の核酸を単離する。別の態様では、妊娠女性から得られた血液を遠心分離し、ブレーキをかけることなく遠心分離を停止させる（遠心分離は自然減速で停止する）ことで得られた血漿から、遊離の核酸を単離する。別の態様では、妊娠女性の血液を０〜５０ｒｐｍ、５０〜１００ｒｐｍ、１００〜２００ｒｐｍ、２００〜３００ｒｐｍ、３００〜４００ｒｐｍ、４００〜５００ｒｐｍ、５００〜６００ｒｐｍ、６００〜７００ｒｐｍ、７００〜８００ｒｐｍ、８００〜９００ｒｐｍ、９００〜１０００ｒｐｍ、１０００〜２０００ｒｐｍ、２０００〜３０００ｒｐｍ、３０００〜４０００ｒｐｍ、４０００〜５０００ｒｐｍ、５０００〜６０００ｒｐｍ、６０００〜７０００ｒｐｍ、７０００〜８０００ｒｐｍ、および８０００ｒｐｍ超を含むがこれらに限定されない速度で遠心分離する。好ましい態様では、妊娠女性の血液を４０００ｒｐｍ未満の速度で遠心分離する。別の態様では、遠心分離時に加速力を加えない。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、限定はしないが、挿入、欠失、および染色体異常などの遺伝子疾患の検出方法を提供し、特に、胎児の遺伝子疾患の検出に有用である。本法は、転座、付加、増幅、トランスバージョン、逆位、異数性、倍数性、モノソミー、トリソミー、トリソミー２１、トリソミー１３、トリソミー１４、トリソミー１５、トリソミー１６、トリソミー１８、トリソミー２２、三倍体、四倍体、ならびに限定されないが、ＸＯ、ＸＸＹ、ＸＹＹおよびＸＸＸなどの性染色体異常の検出に特に有用である。また本法は、胎児ＤＮＡの配列および胎児ＤＮＡの変異を識別する配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。
【００７２】
本発明は、染色体異常を検出する方法に関しており、前記方法は、（ａ）鋳型ＤＮＡ上、関心対象座の対立遺伝子の配列決定、および（ｂ）（ａ）の関心対象座から同定された関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子比率の定量を含んでなり、前記比率が染色体異常の有無を示す。
【００７３】
他の態様において、本発明は、胎児ＤＮＡ上、関心対象座の配列決定に関して非侵襲的方法を提供し、前記方法は、（ａ）妊娠女性からの試料の獲得；（ｂ）（ａ）の試料に対する細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加；（ｃ）（ｂ）の試料から胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡを含んでなる鋳型ＤＮＡの獲得；（ｄ）鋳型ＤＮＡ上の関心対象座の配列決定を含んでなる。
【００７４】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、ＤＮＡを単離する方法に関する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）ＤＮＡを単離する段階。
【００７５】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、遊離のＤＮＡを単離する方法に関する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）ＤＮＡを単離する段階。
【００７６】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡを単離する段階を含む、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤が添加された核酸含有試料から、遊離のＤＮＡを単離する方法に関する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、遊離の胎児ＤＮＡを単離する方法に関する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）ＤＮＡを単離する段階。別の態様では、塩化セシウム勾配、勾配、ショ糖勾配、グルコース勾配、遠心分離プロトコル、煮沸、Ｑｉａｇｅｎ社の精製システム、ＱＩＡ  ＤＮＡ血液精製キット、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドキット、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＤＮＡ精製システム、ＭａｎｇｅＳｉｌ常磁性粒子をベースとしたシステム、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶテクノロジー、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の精製システム、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ精製キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の精製システム、ＣＯＮＣＥＲＴ社の精製システム、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の精製システム、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＢｌｏｏｄＳｐｉｎキット、およびＵｌｒａＣｌｅａｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡキットを含むがこれらに限定されない、当技術分野に適した任意の手法でＤＮＡを単離する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡを単離する段階を含む、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤が添加された核酸を含む試料から、遊離の胎児ＤＮＡを単離する方法に関する。好ましい態様では、妊娠女性の血液から得られた血漿または血清から、遊離の胎児ＤＮＡを単離する。
【００７９】
別の態様では、試料を遠心分離する段階（遠心分離の制動力はゼロに設定＝遠心分離時にブレーキをかけない）、「バフィーコート」の攪乱を最小限またはゼロに抑えながら上清を新しいチューブに移す段階、ならびに上清の一部のみを新しいチューブに移す段階を含むがこれらに限定されない、試料中の母親由来のＤＮＡの量を実質的に減少させる手法および／またはプロトコルでＤＮＡを単離する。好ましい態様では、遠心分離時の加速力と制動力はいずれもゼロに設定する。
【００８０】
別の態様では、試料を遠心分離する段階（遠心分離の加速力はゼロに設定）、「バフィーコート」の攪乱を最小限またはゼロに抑えながら上清を新しいチューブに移す段階、ならびに上清の一部のみを新しいチューブに移す段階を含むがこれらに限定されない、試料中の母親由来のＤＮＡの量を実質的に減少させる手法および／またはプロトコルでＤＮＡを単離する。
【００８１】
別の態様では、シリンジまたはニードルを用いて「バフィーコート」を除く段階を含むがこれらに限定されない、任意の適用可能な方法で、「バフィーコート」をチューブから除去してから上清を除去する。
【００８２】
別の態様では、遠心分離時の制動力を、最大制動力の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％を含むがこれらに限定されないパーセンテージに設定する。
【００８３】
別の態様では、遠心分離時の加速力を、最大加速力の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％を含むがこれらに限定されないパーセンテージに設定する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約１５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約２０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約３０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約４０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約５０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約６０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約７０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約８０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９１％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９２％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９３％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９４％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９６％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９７％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９８％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９％、および遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９．５％を含むがこれらに限定されない）。
【００８５】
別の態様では、本発明は、出生前診断を目的とした、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物を使用する方法に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約１５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約２０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約３０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約４０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約５０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約６０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約７０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約８０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９１％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９２％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９３％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９４％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９６％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９７％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９８％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９％、および遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９．５％を含むがこれらに限定されない）。
【００８６】
別の態様では、本発明は、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが約１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが約１５〜１６％、遊離の胎児ＤＮＡが約１６〜１７％、遊離の胎児ＤＮＡが約１７〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが約１８〜１９％、遊離の胎児ＤＮＡが約１９〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが約２０〜２１％、遊離の胎児ＤＮＡが約２１〜２２％、遊離の胎児ＤＮＡが約２２〜２３％、遊離の胎児ＤＮＡが約２３〜２４％、遊離の胎児ＤＮＡが約２４〜２５％、遊離の胎児ＤＮＡが約２５〜３５％、遊離の胎児ＤＮＡが約３５〜４５％、遊離の胎児ＤＮＡが約４５〜５５％、遊離の胎児ＤＮＡが約５５〜６５％、遊離の胎児ＤＮＡが約６５〜７５％、遊離の胎児ＤＮＡが約７５〜８５％、遊離の胎児ＤＮＡが約８５〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが約９０〜９１％、遊離の胎児ＤＮＡが約９１〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが約９２〜９３％、遊離の胎児ＤＮＡが約９３〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが約９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが約９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが約９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが約９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが約９８〜９９％、および遊離の胎児ＤＮＡが約９９〜９９．７％を含むがこれらに限定されない）。
【００８７】
別の態様では、本発明は、出生前診断を目的とした、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物を使用する方法に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが約１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが約１５〜１６％、遊離の胎児ＤＮＡが約１６〜１７％、遊離の胎児ＤＮＡが約１７〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが約１８〜１９％、遊離の胎児ＤＮＡが約１９〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが約２０〜２１％、遊離の胎児ＤＮＡが約２１〜２２％、遊離の胎児ＤＮＡが約２２〜２３％、遊離の胎児ＤＮＡが約２３〜２４％、遊離の胎児ＤＮＡが約２４〜２５％、遊離の胎児ＤＮＡが約２５〜３５％、遊離の胎児ＤＮＡが約３５〜４５％、遊離の胎児ＤＮＡが約４５〜５５％、遊離の胎児ＤＮＡが約５５〜６５％、遊離の胎児ＤＮＡが約６５〜７５％、遊離の胎児ＤＮＡが約７５〜８５％、遊離の胎児ＤＮＡが約８５〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが約９０〜９１％、遊離の胎児ＤＮＡが約９１〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが約９２〜９３％、遊離の胎児ＤＮＡが約９３〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが約９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが約９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが約９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが約９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが約９８〜９９％、または遊離の胎児ＤＮＡが約９９〜９９．７％を含むがこれらに限定されない）。
【００８８】
別の態様では、本発明は、遊離の胎児ＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが最大１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１５〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１８〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大２０〜４０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大４０〜５０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大５０〜６０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大６０〜７０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大７０〜８０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大８０〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９０〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９２〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９８〜９９％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９９〜９９．５％、および遊離の胎児ＤＮＡが最大９９．５〜９９．９％を含むがこれらに限定されない）。
【００８９】
別の態様では、本発明は、出生前診断を目的とした、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物を使用する方法に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが最大１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１５〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１８〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大２０〜４０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大４０〜５０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大５０〜６０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大６０〜７０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大７０〜８０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大８０〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９０〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９２〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９８〜９９％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９９〜９９．５％、および遊離の胎児ＤＮＡが最大９９．５〜９９．９％を含むがこれらに限定されない）。
【００９０】
鋳型ＤＮＡ
「関心対象座」とは、核酸の広い領域内に存在する、ある選択された領域を意味する。関心対象座が、限定はしないが、１〜１００、１〜５０、１〜２０個または１〜１０個のヌクレオチドであり、好ましくは、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２個または１個のヌクレオチドである。
【００９１】
本明細書で用いられる「対立遺伝子」とは、染色体上の同じ位置を占めている遺伝子またはＤＮＡの非コード領域を代替的に示す用語の一つである。用語、対立遺伝子は、限定はしないが、細菌、ウィルス、真菌、原生動物、糸状菌、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物および古細菌などのいずれかの生物からのＤＮＡを記述するために使用できる。
【００９２】
例えば、細菌は、典型的には大型の一本鎖ＤＮＡを有する。細菌ＤＮＡに関して、用語、対立遺伝子とは、同じ種の異なった細菌細胞における同一の遺伝子形態と較べた際のある細胞に見られる遺伝子形態を言う。
【００９３】
対立遺伝子は、同一の配列を有することがあるか、または、１個のヌクレオチド、または１個を超えるヌクレオチドが変化していることがある。各染色体が２つのコピーを有する生物に関して、双方の染色体が同一の対立遺伝子を有する場合、この状態はホモ接合と呼ばれる。２本の染色体における対立遺伝子が異なっている場合、この状態は、ヘテロ接合と呼ばれる。例えば、関心対象座が染色体１上のＳＮＰＸである場合、母親の染色体がＳＮＰＸにアデニンを含有し（対立遺伝子Ａ）、父親の染色体がＳＮＰＸにグアニンを含有（対立遺伝子Ｇ）していると、個体はＳＮＰＸにおいてヘテロ接合である。
【００９４】
本明細書で用いられる配列とは、ポリヌクレオチド内の１個のヌクレオチドまたは１個を超える隣接するヌクレオチドの同一性を意味する。単一のヌクレオチド、例えば１個のＳＮＰの場合、「配列」と「同一性」とは、本明細書で交換可能に用いられる。
【００９５】
用語の「染色体異常」とは、患者染色体と正常な相同染色体との間の偏差を言う。用語の「正常」とは、ある特定の種の健康な個体に見られる優位を占める核型または横縞模様を言う。染色体異常は、数に関することもあり、また構造的なこともあり、限定はしないが、異数性、倍数性、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部欠失、付加、染色体の一部付加、挿入、染色体断片、染色体領域、染色体再配列および転座を含む。染色体異常は、病理学的状態の存在に関連して得るか、または病理学的状態へ発展する傾向と関連して得る。本明細書で定義された単一ヌクレオチド多形（「ＳＮＰ」）は、染色体異常ではない。
【００９６】
本明細書で用いられる、ポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みとは、同義的に、伸長反応またははめ込み（Ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応を意味する。
【００９７】
個体に関して本明細書で用いられる「突然変異対立遺伝子」とは、疾病状態を伴う変異体対立遺伝子を言う。
【００９８】
用語の「鋳型」とは、本発明の増幅に使用できる任意の核酸分子を言う。本来は二本鎖ではないＲＮＡまたはＤＮＡを二本鎖ＤＮＡにして、鋳型ＤＮＡとして使用するすることができる。鋳型ＤＮＡに含有する関心対象の１個または複数の座を増幅するために、任意の二本鎖ＤＮＡまたは複数の種々の二本鎖ＤＮＡ分子を含有する調製物を鋳型ＤＮＡとして用いることができる。
【００９９】
鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、ヒト、非ヒト、哺乳動物、爬虫類、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、イノシシ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、雄牛、牝牛、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽類、ネズミ、魚類、イルカ、クジラおよびサメなどの任意の供給源から得ることができる。
【０１００】
鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、腹膜液、腹水、膣分泌液、乳房分泌液、乳汁、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚芽、２細胞胚芽、４細胞胚芽、８細胞胚芽、１６細胞胚芽、３２細胞胚芽、６４細胞胚芽、１２８細胞胚芽、２５６細胞胚芽、５１２細胞胚芽、１０２４細胞胚芽、胚芽組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、または他の身体滲出液、糞便物質、同じ核酸を含有する供給源の個々の細胞または抽出物およびミトコンドリアなどの非細胞構造物の核酸含有試料などの任意の適切な試料からの当業界で十分に確立されたプロトコルを用いたものであり得る。
【０１０１】
一態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の試料から得ることができる。
【０１０２】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、胎芽から得ることができる。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、胎芽の単一細胞から得ることができる。
【０１０３】
一態様において、鋳型ＤＮＡは胎児ＤＮＡである。胎児ＤＮＡは限定はしないが、母体血液、母体血清、母体血漿、胎児細胞、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、尿、唾液、細胞または組織などの供給源から得ることができる。
【０１０４】
他の態様において、限定はしないが、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル添加物またはジスルフィド還元物、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、開裂性架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載の化合物などの細胞溶解阻害剤を試料に添加する。好ましい態様では、ホルマリンは試料中に、０．０００１〜０．０３％、０．０３〜０．０５％、０．０５〜０．０８％、０．０８〜０．１％、０．１〜０．３％、０．３〜０．５％、０．５〜０．７％、０．７〜０．９％、０．９〜１．２％、１．２〜１．５％、１．５〜２％、２〜３％、３〜５％、および５％超を含むがこれらに限定されないパーセンテージで存在する。別の態様では、架橋剤と細胞膜安定化剤、架橋剤と細胞溶解阻害剤、ならびに細胞膜安定化剤と細胞溶解阻害剤を含むがこれらに限定されない、架橋剤、細胞膜安定化剤、または細胞溶解阻害剤の任意の組合わせを試料に添加することができる。複数種の架橋剤を、複数種の細胞膜安定化剤とともに使用することができる。複数種の架橋剤を、複数種の細胞溶解阻害剤とともに使用することができる。複数種の細胞膜安定化剤を、複数種の細胞溶解阻害剤とともに使用することができる。
【０１０５】
別の態様では、溶解を細胞の約１０％未満とするように、細胞溶解阻害剤を試料に添加する。好ましい態様では、溶解を細胞の約５％未満とするように、細胞溶解阻害剤を試料に添加する。最も好ましい態様では、溶解を細胞の約１％未満とするように、細胞溶解阻害剤を試料に添加する。
【０１０６】
別の態様では、溶解を細胞の約１０％未満とするように、細胞膜安定化剤を試料に添加する。好ましい態様では、溶解を細胞の約５％未満とするように、細胞膜安定化剤を試料に添加する。最も好ましい態様では、溶解を細胞の約１％未満とするように、細胞膜安定化剤を試料に添加する。
【０１０７】
別の態様では、溶解を細胞の約１０％未満とするように、架橋剤を試料に添加する。好ましい態様では、溶解を細胞の約５％未満とするように、架橋剤を試料に添加する。最も好ましい態様では、溶解を細胞の約１％未満とするように、架橋剤を試料に添加する。
【０１０８】
別の態様では、細胞溶解阻害剤、架橋剤、または細胞膜安定化剤を、試料の採取後に１〜１０秒間、１０〜３０秒間、３０〜６０秒間、１〜５分間、５〜１０分間、１０〜２０分間、２０〜３０分間、３０〜４０分間、４０〜５０分間、６０〜９０分間、９０〜１８０分間、または１８０分間超を含むがこれらに限定されない適用可能な時間をかけて試料に添加する。別の態様では、細胞溶解阻害剤、架橋剤、または細胞膜安定化剤は、ガラス製チューブ、プラスチック製チューブ、円形容器、エッペンドルフチューブ、ＩＶバッグ、または他の任意の適切な採取用装置を含むがこれらに限定されない、試料採取装置内に存在する。別の態様では、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加後に、試料を、１〜５分間、５〜１０分間、１０〜２０分間、２０〜４０分間、４０〜６０分間、６０〜９０分間、９０〜１２０分間、１２０〜１５０分間、１５０〜１８０分間、１８０〜２４０分間、２４０〜３００分間、または３００分間超を含むがこれらに限定されない、試薬を機能させる期間、ほぼ室温で静置する。
【０１０９】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡの双方を含有する。好ましい態様において鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液から得られる。血液は、限定はしないが、静脈穿刺などの標準的な血液吸引法を用いて採血する。例えば、血液は肘内側の静脈、または手の裏側の静脈から吸引する。血液試料は、妊娠女性から懐胎の間、任意の時に採血できる。例えば、血液試料はヒト女性から、懐胎１〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、２４〜２８、２８〜３２、３２〜３６、３６〜４０、または４０〜４４週目、好ましくは、懐胎８〜２８週目に採血できる。
【０１１０】
血液試料は、母体細胞から血漿を分離するため、遠心分離する。血漿フラクションと母体細胞フラクションとを別々の管に移して再度遠心分離する。血漿フラクションは、細胞を含まない胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含有する。胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを単離するために、限定はしないが、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）から供給されるキアアンプＤＮＡブラッド・ミディ・キット（ＱＩＡａｍｐＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）などの任意の標準的ＤＮＡ単離法を用いることができる。
【０１１１】
好ましい一態様において、限定はしないが、ＥＤＴＡなどのマグネシウムキレート剤を含有する装置内へ血液を採取でき、４℃で貯蔵する。場合によっては、限定はしないが、ＥＧＴＡなどのカルシウムキレート剤を添加できる。
【０１１２】
他の態様において、限定はしないが、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル添加物またはジスルフィド還元物、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、開裂性架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載の化合物などの細胞溶解阻害剤を試料に添加する。
【０１１３】
別の態様では、母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【０１１４】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。母体血漿中胎児ＤＮＡのパーセンテージは、０．３９％から１１．９％の間である（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、産科学および婦人科学（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。血液試料中の大部分のＤＮＡは母体ＤＮＡであるため、胎児の遺伝子型決定のためのＤＮＡ使用は困難である。しかし、母体血漿中の胎児ＤＮＡのパーセンテージを上昇させる方法により、胎児ＤＮＡの配列決定が可能となり、突然変異挿入、欠失および染色体異常などの遺伝子疾患の検出が可能になる。母体血液試料への細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加により、胎児ＤＮＡの相対的比率を上げることができる。母体細胞と胎児細胞の双方の溶解が阻害されるが、大部分の細胞は母体細胞であるため、母体細胞の溶解を阻害することにより、遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージが相対的に増加する。実施例４を参照されたい。
【０１１５】
他の態様において、大型ボア針、短針、テフロン（登録商標）などの層流を増加させる針被覆、層流を増加させるための針斜角の変更、または血流速度を低下させる技術など細胞溶解量を減少させる血液吸引の技術、方法、プロトコルまたは装置を使用することができる。胎児細胞は、母体の免疫系によって母体血液中で破壊され易い。しかし、血液吸引または血液試料の処理の結果、大部分の母体細胞溶解が生じ易い。したがって、細胞溶解を防止または減少させる方法によって、試料内の母体ＤＮＡ量が減少し、遊離の胎児ＤＮＡの相対的パーセンテージが上昇する。
【０１１６】
他の態様において、細胞溶解量を減少させるために、細胞の構造完全性を保存または安定化する試剤を使用することができる。
【０１１７】
別の態様では、母親由来の血液中における遊離の母親由来のＤＮＡの量を減らす任意のプロトコルを、試料を得る前に使用することができる。別の態様では、試料を得る前に、妊娠女性を０〜５分間、５〜１０分間、１０〜１５分間、１５〜２０分間、２０〜２５分間、２５〜３０分間、３０〜３５分間、３５〜４０分間、４０〜４５分間、４５〜５０分間、５０〜５５分間、５５〜６０分間、６０〜１２０分間、１２０〜１８０分間、１８０〜２４０分間、２４０〜３００分間、３００〜３６０分間、３６０〜４２０分間、４２０〜４８０分間、４８０〜５４０分間、５４０〜６００分間、６００〜６６０分間、６６０〜７２０分間、７２０〜７８０分間、７８０〜８４０分間、８４０〜９００分間、９００〜１２００分間、１２００〜１５００分間、１５００〜１８００分間、１８００〜２１００分間、２１００〜２４００分間、２４００〜２７００分間、２７００〜３０００分間、３０００〜３３００分間、３３００〜３６００分間、３６００〜３９００分間、３９００〜４２００分間、４２００〜４５００分間、および４５００分間超を含むがこれらに限定されない期間、運動させることなく休息させる。別の態様では、妊娠女性が身体的にリラックスした状態になってから試料を得る。試料を得る前の休息時間を確保することで、試料中の母親由来の核酸の量が減少する場合がある。別の態様では、試料を午前４〜５時、午前５〜６時、午前６〜７時、午前７〜８時、午前８〜９時、午前９〜１０時、午前１０〜１１時、および午前１１〜１２時を含むがこれらに限定されない、午前中の時間帯に妊娠女性から得る。
【０１１８】
別の態様では、妊娠女性に、０〜１時間、１〜２時間、２〜３時間、３〜４時間、４〜５時間、５〜６時間、６〜７時間、７〜８時間、８〜９時間、９〜１０時間、１０〜１１時間、１１〜１２時間、または１２時間超を含むがこれらに限定されない時間、睡眠をとらせた後に、妊娠女性から試料を得る。
【０１１９】
別の態様では、試料を得る前に、妊娠女性は、一定の時間、運動をした後に休息させる。別の態様では、運動時間は、０〜１５分間、１５〜３０分間、３０〜４５分間、４５〜６０分間、６０〜１２０分間、１２０〜２４０分間、または２４０分間超を含むがこれらに限定されない。
【０１２０】
他の態様において、限定はしないが、デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、グアニジン−ＨＣｌ、イソチオシアン酸グアニジン、Ｎ−ラウロイルサルコシンおよびドデシル酸ナトリウムなどのＤＮＡの破壊を防ぐ試剤を血液試料に添加できる。
【０１２１】
他の態様において、胎児ＤＮＡは胎児細胞から得られ、前記胎児細胞は、限定はしないが、母体血液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎芽組織および母体の子宮頚部または膣から得られた粘液などの供給源から単離できる。
【０１２２】
ある好ましい他の態様において、胎児細胞は母体の末梢血から単離される。母体血清からの胎児細胞を精製するために、胎児細胞に特異的な抗体を使用することができる（ミューラーら（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３３６：ｐ．１９７−２００（１９９０）；ガンシャート−アーラートら（Ｇａｎｓｈｉｒｔ−Ａｈｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、産科学および婦人科学のアメリカ・ジャーナル（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．）１６６：ｐ．１３５０−１３５５（１９９２））。胎児細胞を濃縮するために、フローサイトメトリー法を用いることもできる（ヘルツェンバークら（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）７６：ｐ．１４５３−１４５５（１９７９）；ビアンチら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）８７：ｐ．３２７９−３２８３（１９９０）；ブラッチら（Ｂｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、プレネイタル・ダイアグノーシス（Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）１１：ｐ．７８７−７９８（１９９１））。また、米国特許第５，４３２，０５４号明細書は、広い上部と細い毛細管の底部を有するポリエチレン製の管を用いることにより胎児の有核赤血球細胞を分離する方法を記載している。速度可変プログラムを用いた遠心分離により、赤血球はその分子密度に基づいて毛細管内に重なる。胎児赤血球などの低密度赤血球を含有する密度フラクションを回収して、次に母体赤血球を優先的に破壊するように特異的に溶血する。高浸透圧媒体中の密度勾配を用いて、胎児赤血球の濃くなった赤血球を、リンパ球および破裂した母体細胞から分離する。高浸透圧溶液の使用により赤血球は、収縮し、それらの密度が増加し、より密度の高いリンパ球からの精製が促進される。胎児細胞が単離された後、当業界の標準的方法を用いて胎児ＤＮＡを精製することができる。
【０１２３】
分析された核酸は、独特のＤＮＡ配列を含む任意の核酸、例えば、ゲノム、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、人工すなわち人間の作成したＤＮＡならびにｃＤＮＡなど、ＲＮＡ試料から逆転写されたＤＮＡであり得る。ＲＮＡの配列は、鋳型ＤＮＡとして用いるために二本鎖ＤＮＡの形態にすることができる場合は、本発明により決定することができる。
【０１２４】
鋳型にアニールし、その鋳型のコピー合成をプライムするために使用できるオリゴヌクレオチドの考察に用いられる場合の用語の「プライマー」および「オリゴヌクレオチドプライマー」は交換不能である。
【０１２５】
「増幅」ＤＮＡとは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって、一回、または複数回コピーされたＤＮＡである。十分な数の関心対象座のコピーが、アッセイされる試料中に既に存在しているなど、大量のＤＮＡがアッセイに利用できる場合は、関心対象座のＤＮＡを「増幅」して、より大量の複製コピーにする必要はないと思われる。むしろ、制限酵素認識部位を二本鎖にできるヘアピン構造を含有し得る適切なプラーマーのセットを用いて鋳型ＤＮＡを一回「コピー」するだけで十分であり得る。
【０１２６】
「コピーＤＮＡ」の「コピー」とは、一回コピーされたＤＮＡまたは増幅されて一回よりも多くコピーされたＤＮＡを言う。
【０１２７】
一態様において、核酸は、核酸源を含有する元の試料内で直接増幅される。核酸が抽出、精製、または単離される必要はなく、必要なのは、ただ増幅できる形態で提供されることだけである。増幅前のプライマーによる鋳型核酸のハイブリダイゼーションは必要ない。例えば、増幅は、当業界で周知の標準的プロトコルを用いて細胞溶解液または試料溶解液内で実施することができる。固体支持体上の生物学的固定調製物内の、あるいは、非ＤＮＡ物質を含有する組成物中のＤＮＡであって、固体支持体または固定調製物または組成物中の非ＤＮＡ物質から最初に抽出されることなく増幅できるＤＮＡは、そのＤＮＡが適切なプライマーと共にアニールできる限り、さらに精製することなく直接使用することができ、コピーでき、特に増幅でき、コピー産物または増幅産物は回収して本明細書に記載されたとおり利用できる。
【０１２８】
ある好ましい態様において、核酸は、増幅前に当業界で公知の方法を用いて、元の試料に存在する非核酸物質から抽出、精製、単離される。
【０１２９】
他の態様において、核酸は、核酸源を含有する元の試料から抽出、精製、または単離し、増幅前に、限定はしないが、酵素消化、マニュアルせん断、または音波処理などの当業界に周知の方法を幾つか用いて核酸を断片化する。例えば、ＤＮＡは、関心対象座には存在しない認識部位、特に８塩基対また６塩基対の認識部位を有する１種以上の制限酵素によって消化することができる。典型的には、ＤＮＡは５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００および１００，０００塩基対長などの所望の長さに断片化できる。他の態様において、ＤＮＡは、約１０００から２０００塩基対の平均長に断片化される。しかし、必ずしもＤＮＡを断片化する必要はない。
【０１３０】
増幅前に、断片化したＤＮＡから関心対象座を含有するＤＮＡ断片を精製することができる。関心対象座にアニールする能力に基づいて関心対象座を受けとるホックとして増幅に用いられるプライマー（「プライマー設計」の節を参照）を用いてこのような断片を精製できる。好ましい態様において、例えば、ビオチンプライマーなどのタグ修飾プラーマーが用いられる。
【０１３１】
関心対象座を含有するＤＮＡ断片を精製することによって、増幅反応の特異性を改善することができる。これにより、鋳型ＤＮＡの非特異的領域の増幅が最少化されることになる。また、ＤＮＡ断片を精製することによって、特異性の改善された複合ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または関心対象の複数座の増幅が可能になる。
【０１３２】
配列決定される関心対象座は、配列のみに基づいて選択できる。ヒトでは、１４２万を超える単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）が記載されている（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０９：ｐ．９２８−９３３（２００１））。平均して、１．９ｋｂのヒトゲノムにつき１つのＳＮＰがある。しかし、本発明によって配列決定する関心対象座の選択の際、関心対象座の間の距離は考慮する必要はない。ゲノムＤＮＡ上の１つより多い関心対象座を分析する場合、選択された関心対象座は同一の染色体上にあることもあり、また異なった染色体上にあることもある。
【０１３３】
好ましい態様において、選択された関心対象座は、染色体上の特定の領域に密集して存在し得る。ＤＮＡのいずれの開裂または断片化によっても関心対象の複数座が結合したままであるように、関心対象座をあるＤＮＡ領域内に密集させることができる。例えば、得られたＤＮＡが自然力によって５ｋｂの断片に切断される場合、関心対象の複数座は５ｋｂの領域内で選択できる。このことにより、断片内の関心対象座によって測定された各断片が実験単位として役立ち、複数の染色体上の関心対象座を比較する実験上のノイズの可能性を減らすことができる。
【０１３４】
染色体上の関心対象座は、限定はしないが、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜３５００、３５００〜４０００、４０００〜４５００、４５００〜５０００、５０００〜１００００塩基対および１００００塩基対を超えて互いに隔たっていることがあり得る。
【０１３５】
好ましい態様において、関心対象座が大きさによって分離できるように、増幅される配列の長さは、関心対象の各々の座によって異なっていることが好ましい。
【０１３６】
実際、遺伝子配列全体をコピーするプライマーを利用する必要がないことは、本発明の利点の一つである。コピーされた関心対象座は、むしろ、遺伝子全体のうちのほんの小部分またはＤＮＡの非コード領域の小部分であることが好ましい。遺伝子全体の塩基配列決定はコストを増加させ、結果を遅らせる可能性があるため不利である。所望の塩基または関心対象座のみの塩基配列決定は、時間的に最も速く、また最少のコストで関心対象座の最大数の配列決定を可能にすることから、本法の全体的効率を最も高くする。
【０１３７】
本発明の方法では、多数の配列を一緒に分析できるため、特に関心対象の多数の座の大スケールスクリーニングを受けることができる。
【０１３８】
本発明の方法を用いて、任意の数の関心対象座を特に同時に分析し、処理することができる。同時に関心対象の１個の座または関心対象の複数座の配列を決定するために、試料（単数または複数）を分析することができる。関心対象座は１つの染色体上、または複数の染色体上に存在し得る。
【０１３９】
あるいは、全体的な遺伝子スクリーニングが所望される場合、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜１００、１００〜２５０、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜３，０００、３，０００〜５，０００、５，０００〜１０，０００、１０，０００〜５０，０００または５０，０００超の関心対象座を同時に分析することができる。遺伝子フィンガープリントを提供して個人の同定、またはＳＮＰ遺伝子型を決定するために、本発明の方法を用いる場合に、このような全体的遺伝子スクリーニングが望まれると考えらる。
【０１４０】
コピーしようとする関心対象座は、コード配列内にあってもよいし、コード配列外にあってもよい。コピーしようとする関心対象座の１個以上が１つの遺伝子内にあることが好ましい。好ましい態様において、コピーされる鋳型ＤＮＡは、ゲノムのコード配列、イントロンまたはエクソン内にある関心対象の単数または複数の座である。非常に好ましい態様において、エクソンＤＮＡ配列がコピーされる。関心対象座は、突然変異が疾病の原因となるか、または疾病状態を生じ易くすることが知られている部位であり得る。関心対象座関心対象座は、単一ヌクレオチドの多型部位であり得る。あるいは、コピーしようとする関心対象座は、コード配列の外側、例えば、転写調節領域内、特にプロモーター、エンハンサーまたはリプレッサー配列内にあり得る。
【０１４１】
関心対象座の配列決定法
限定はしないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＳＴ）、蛍光局在化、ＤＮＡ塩基配列決定、サンガージデオキシ塩基配列決定、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、ＤＮＡ自動塩基配列決定装置上での毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、マイクロアレー、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、米国特許第６，２５１，６３９号明細書に記載されている単一プライマー線形ＤＮＡ増幅、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法などの核酸配列についての情報を提供する任意の方法を用いることができる。
【０１４２】
好ましい配列決定法は、本明細書にその全体が組み込まれている、２００２年３月１１日出願の米国特許出願第１０／０９３，６１８号明細書に以前記載されている。
【０１４３】
Ｉ．プライマー設計
鋳型ＤＮＡの増幅に用いられるプライマーを設計または選択するために、コンセンサス配列などの公表された配列を用いることができる。関心対象座の側面に位置するプライマー構築用に用いられる配列の選択は、関心対象座の配列の検査により、または直接それに対してなされる。最近公表されたヒトゲノムの配列は、関心対象の所望のヒト遺伝子座の側面に位置するプラーマーを設計するための有用なコンセンサス配列情報源を提供している。
【０１４４】
関心対象座の「側面に位置する」とは、一方のプライマーの３’領域の少なくとも一部が鋳型ＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的であり、関心対象座の部位より上流であり（フォワードプライマー）、他方のプライマーの３’領域の少なくとも一部が鋳型ＤＮＡのセンス鎖に相補的であり、関心対象座の下流にある（リバースプライマー）であるようなプライマー配列であることを意味する。「プライマー対」とは、フォワードプライマーとリバースプライマーの対を意味する。プライマー対の双方のプライマーとも、プライマーの伸長を可能にし、その伸長によって関心対象座の領域における鋳型ＤＮＡの増幅が生じるような仕方でアニールする。
【０１４５】
当業界に周知の方法を用いて、限定はしないが、適切な配列のクローニングおよび直接的化学合成などの種々の方法により、プライマーを調製することができる（ナラングら（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）６８：ｐ．９０（１９７９）；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．）、メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）６８：ｐ．１０９（１９７９））。また、プライマーは、オペロン・テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ），およびライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販供給元から得ることができる。プライマーは、一定の融点を有し得る。プライマーの長さは５’端または３’端において、伸長または短縮させて、所望の融点を有するプライマーを生成することができる。好ましい態様において、プライマー対のうちの一方のプライマーは他のプライマーよりも長い。好ましい態様において、プライマー対のうちで、プライマーの３’アニーリング長が異なる。また、プライマー対の配列と長さが所望の融解温度を生じさせるように、各プライマー対のアニーリング箇所を設計することができる。２５塩基対より小さなプライマーの融解温度を決定するための最も簡便な等式は、ワラス則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。限定はしないが、アレイ・デザイナー・ソフトウェア（アレイット社（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．））、ゲノム分析用のオリゴヌクレオチドプローブ・シーケンスデザイン・ソフトウェア（オリンパス・オプティカル社（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．））、ネットプライマー（ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ）、およびヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）からのＤＮＡシス（ＤＮＡｓｉｓ）などのコンピュータプログラムがプライマーの設計に使用できる。各プライマーのＴＭ（融解温度またはアニーリング温度）は、ネット・プライマー（２００２年４月１７日におけるインターネットアドレス：http://premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.htmlのフリーウェブに基づくプログラム）などのソフトウェアプログラムを用いて計算される。
【０１４６】
他の態様において、プライマーのアニーリング温度は、限定はしないが、サイクル１、２、３、４、５、サイクル６〜１０、サイクル１０〜１５、サイクル１５〜２０、サイクル２０〜２５、サイクル２５〜３０、サイクル３０〜３５、または３５〜４０などの任意の増幅サイクル後に再計算し、増加させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’ハーフが、関心対象の各座からの産物内へ組み込まれ、したがって、ＴＭは各プライマーの５’ハーフの配列および３’ハーフの配列の双方に基づいて再計算できる。
【０１４７】
例えば、図１Ｂにおいて、増幅の第１サイクルは、第２のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする１３塩基の３’領域（領域「ｃ」）の略融解温度で実施される。第１サイクルの後、アニーリング温度は、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする領域「ｂ」として表されている３’領域の略融解温度であるＴＭ２へと上げることができる。第２のプライマーは元の鋳型ＤＮＡに結合することはできない。なぜならば、第２のプライマーは、元の鋳型ＤＮＡの１３塩基にのみアニールするが、ＴＭ２は第１のプライマーの３’アニーリング領域である略２０塩基の融解温度であるからである（図１Ｃ）。しかし、第１のプライマーは、前記反応の第１サイクルにおいてコピーされたＤＮＡに結合することができる。第３のサイクルにおいて、アニーリング温度は、領域「ｃ」および「ｄ」として表されている第２のプライマー全体の配列の略融解温度であるＴＭ３に上げられる。ＰＣＲの第２サイクルから生成した鋳型ＤＮＡは、領域「ｃ」および「ｄ」の双方を含有し、したがって第２のプライマーはＴＭ３においてアニールし、伸長することができる（図１Ｄ）。残りのサイクルはＴＭ３で実施される。第１のプライマー全体の配列（ａ＋ｂ’）は、ＰＣＲの第３サイクルから鋳型にアニールし、伸長することができる（図１Ｅ）。アニーリング温度を上げることによって、非特異的結合が減り、前記反応の特異性が高まるが、これは、約３×１０９塩基長であるヒトゲノムＤＮＡからの関心対象座を増幅する場合、特に有用である。
【０１４８】
本明細書に用いられている用語のアニーリング温度に関する「約」は、述べられた温度の摂氏１０度以内の温度を包含するために用いられる。
【０１４９】
一態様において、関心対象の各座に対して１つのプライマー対が用いられる。しかし、関心対象の各座に対して複数のプライマー対を用いることができる。
【０１５０】
一態様において、プライマー対の一方または双方のプライマーが１種以上の制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）に対する５’領域内配列を含有するように、プライマーが設計される。
【０１５１】
制限酵素がＤＮＡを消化する位置に関して本明細書に用いられている「センス」鎖とは、制限酵素が切断する方向の５’から３’へ読む鎖である。例えば、ＢｓｍＦＩは、次の配列を認識する。
2006521086.tif 000002
【０１５２】
センス鎖は、制限酵素が切断する方向の５’から３’へ読む際に配列「ＧＧＧＡＣ」を含有する鎖である。
【０１５３】
制限酵素がＤＮＡを消化する位置に関して本明細書に用いられている「アンチセンス」鎖とは、制限酵素が切断する方向の３’から５’へ読む鎖である。
【０１５４】
他の態様において、プライマー対の一方のプライマーは、認識部位から「ｎ」個のヌクレオチドを切断する制限酵素に対する制限酵素認識部位を含有し、３’窪み端および関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように設計される（本明細書では「第２のプライマー」と称す）。「Ｎ」は、認識部位から制限酵素によって切断される部位までの距離である。言い換えれば、プライマー対のうちの第２のプライマーは、ＤＮＡを認識部位では切断せず、認識部位からヌクレオチド「ｎ」個離れて切断する制限酵素に対する認識部位を含有する。例えば、認識配列が制限酵素ＢｃｅＡＩに対するものである場合、前記酵素はセンス鎖上の認識部位からヌクレオチド１０個を切断し、アンチセンス鎖上の認識部位からヌクレオチド１２個を切断する。
【０１５５】
プライマーの３’領域および好ましくは３’ハーフは、関心対象座の側面に位置する配列にアニールするように設計される（図１Ａ）。このプライマー上の制限酵素認識部位を認識する制限酵素による消化によって関心対象座を含有する５’オーバーハングが精製されるという条件で、第２のプライマーは、関心対象からいずれかの距離でアニールできる。５’オーバーハングは限定はしないが、１、２、３、４、５、６、７、８個の塩基、および８個を超える塩基など、任意の大きさであり得る。
【０１５６】
好ましい一態様において、関心対象座の近くにアニールするプライマーの３’端（第２のプライマー）は、関心対象座からまたは関心対象座から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の塩基、または１４個を超える塩基をアニールすることができる。
【０１５７】
好ましい一態様において、第２のプライマーは、プライマー対の他方のプライマー（他方のプライマーは本明細書では「第１のプライマー」と称される）よりも関心対象座のより近くにアニールするよう設計される。第２のプライマーは、フォワードプライマーまたはリバースプライマーであり得、第１のプライマーは、それぞれリバースプライマーまたはフォワードプライマーであり得る。第１のプライマーと第２のプライマーのどちらをフォワードプライマーまたはリバースプライマーにすべきかはどちらのデザインが、より良好な結果を提供するかによって決めることができる。
【０１５８】
例えば、関心対象座の近くにアニールするプライマーは、センス鎖上の認識部位から１０個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断する制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有できる。この場合、制限酵素認識部位が関心対象座から１３塩基、１２塩基、１０塩基または１１塩基であるように、プライマーを設計できる。認識部位が関心対象座から１３塩基である場合、ＢｓｍＦＩによる消化で５’オーバーハング（ＲＸＸＸ）が生成され、関心対象座（Ｒ）はこのオーバーハングにおける１番目のヌクレオチド（３’から５’へ読んで）、Ｘは任意のヌクレオチドである。認識部位が関心対象座から１２塩基である場合、ＢｓｍＦＩによる消化で５’オーバーハング（ＸＲＸＸ）が生成され、関心対象座（Ｒ）はこのオーバーハングにおける２番目のヌクレオチド（３’から５’へ読んで）である。認識部位が関心対象座から１１塩基である場合、ＢｓｍＦＩによる消化で５’オーバーハング（ＸＸＲＸ）が生成され、関心対象座（Ｒ）はこのオーバーハングにおける３番目のヌクレオチド（３’から５’へ読んで）である。制限酵素による消化が関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように制限酵素認識部位から関心対象座の間の距離を設計する。認識部位から関心対象座の間の効果的距離は、制限酵素の選択によって変わる。
【０１５９】
他の態様において、他方のプライマーに比して関心対象座のより近くにアニールするプライマーは、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素が関心対象座部位におけるヌクレオチドとは独立に、切断部位において同一の配列を見るように設計できる。例えば、関心対象座近くにアニールするプライマーを、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位（５’ＧＧＧＡＣ３’）が関心対象座から１３塩基であるように設計される場合、制限酵素は、アンチセンス鎖を関心対象座から１塩基で切断する。関心対象座におけるヌクレオチドは切断部位に隣接しており、ＤＮＡ分子によって変わり得る。切断部位に隣接するヌクレオチドが一定であることが望まれる場合、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位が関心対象座部位から１２塩基離れているように、プライマーを設計する。ＢｓｍＦＩによる消化によって、関心対象座の部位がオーバーハングの２番目の位置（３’から５’へと読んで）にあり、もはや切断部位には隣接していない５’オーバーハングが生成する。制限酵素認識部位が関心対象座の部位から１２塩基にあるようにプライマーを設計することにより、切断部位に隣接するヌクレオチドを、関心対象座におけるヌクレオチドとは独立して同一であるようにできる。また、制限酵素認識部位が関心対象座の部位から１１塩基または１０塩基にあるように設計されたプライマーにより、切断部位に隣接するヌクレオチドを、関心対象座におけるヌクレオチドとは独立して同一であるようにできる。他の制限酵素に関しても、切断部位に隣接するヌクレオチドを、関心対象座におけるヌクレオチドとは独立して同一であるように、プライマー設計の同様な方法を用いることができる。
【０１６０】
第１のプライマー（フォワードあるいはリバースのいずれか）の３’端は、関心対象座から選択された距離でアニールするように設計できる。例えば、この距離は、好ましくは関心対象座から１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００の間および１０００塩基を上回る。各々の連続的な上流プライマーが、各々の下流のプライマーからだんだん遠くに離れているいくように、第１のプライマーのアニーリング部位を選択する。
【０１６１】
例えば、関心対象座１で第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’端がＺ塩基離れている場合、関心対象座２で上流および下流プライマーの３’端はＺ＋Ｋ塩基離れ、ここでＫ＝１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００塩基または１０００塩基を上回る（図２）。第１のプライマーを第２のプライマーからだんだん遠くに離す目的は、関心対象座全てのＰＣＲ産物の大きさが異なるようにして、例えば塩基配列決定ゲル上で分離できるようにすることである。
【０１６２】
一態様において、第１のプライマーまたは第２のプライマーの５’領域は、任意のタイプの制限酵素に対する認識部位を有することができる。好ましい一態様において、第１および／または第２のプライマーの５’領域は、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するために用いられる制限酵素認識部位とは異なる制限酵素認識部位を少なくとも１つ有する。
【０１６３】
一態様において、第１のプライマーの５’領域は、任意のタイプの制限酵素に対する認識部位を有することができる。好ましい一態様において、第１のプライマーは、第２のプライマーにおける制限酵素認識部位とは異なる制限酵素認識部位を少なくとも１つ有する。他の好ましい態様において、第１のプライマーは、第２のプライマーよりも関心対象座からより遠くにアニールする。
【０１６４】
好ましい態様において、第２のプライマーは、限定はしないが、２塩基の５’オーバーハングと４塩基の５’オーバーハングを各々生成するＢｃｅＡＩおよびＢｓｍＦＩなどのＩＩＳ型制限酵素に対する制限酵素認識部位を含有する。ＩＩＳ型制限酵素は、非対称塩基配列を認識する（オーソドックスなＩＩ型酵素のようにパリンドロームではなく）ので好ましい。ＩＩＳ型制限酵素は、認識部位の外側、典型的には、認識部位の外側、２０塩基対までにある特定の箇所のＤＮＡを開裂する。これらの特性により、ＩＩＳ型制限酵素およびその認識部位は、本発明の方法において特に有用である。本法に用いられるＩＩＳ型制限酵素は、５’オーバーハングおよび３’窪みを残す。
【０１６５】
多種多様なＩＩＳ型制限酵素が知られており、このような酵素は、細菌、ファージ、古細菌および真核藻類ウィルスから単離されており、商品として入手できる（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン所在；ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー所在；ダブリュー・スジバルスキーら（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．）、ジーン（Ｇｅｎｅ）１００：ｐ．１３−２６、１９９１年）。本発明の方法に有用であると考えられるＩＩＳ型制限酵素の例としては、限定はしないが、表Ｉに載せたような酵素が挙げられる。
【０１６６】
（表Ｉ）
2006521086.tif 000003
【０１６７】
一態様において、プライマー対は各々のプライマーの５’領域に、１つの制限酵素に独特の制限酵素認識部位を提供する配列を有する。
【０１６８】
他の態様において、プライマー対は各々のプライマーの５’領域に、１つ以上の制限酵素、特に１つ以上のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位を提供する配列を有する。例えば、ある一定のコンセンサス配列は１つ以上の酵素によって認識され得る。例えば、ＢｓｇＩ、Ｅｃｏ５７１およびＢｐｍＩは全てコンセンサス（Ｇ／Ｃ）ＴＧｎＡＧを認識し、アンチセンス鎖上から１６ｂｙを開裂し、センス鎖から１４ｂｙを開裂する。このようなコンセンサス配列を提供するプラーマーは、制限酵素ＢｓｇＩ、Ｅｃｏ５７１およびＢｐｍＩのいずれかによって認識され得る部位を有する産物を生じる。
【０１６９】
認識部位から離れてＤＮＡを切断し、３’窪み端および５’オーバーハングを生成する他の制限酵素としては、ＩＩＩ型制限酵素が挙げられる。
【０１７０】
例えば、制限酵素ＥｃｏＰ１５Ｉは、配列、５’ＣＡＧＣＡＧ３’を認識し、センス鎖下流の２５塩基を開裂し、アンチセンス鎖の２７塩基を開裂する。さらに、新規の制限酵素が続いて発見されており、本発明に利用するために容易に採用し得ることは、通常の当業者に理解されるであろう。
【０１７１】
他の態様において、第２のプライマーは、ある制限酵素に対する認識配列の一部を含有し得るが、ここで制限酵素による消化によって、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように鋳型ＤＮＡ増幅の際に制限酵素に対する認識部位全体が生成される。例えば、ＢｓｍＦＩに対する認識部位は５’ＧＧＧＡＣＮ１０↓３’である。鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域は鋳型ＤＮＡに相補的である必要はないヌクレオチド「ＧＧＧ」で終止できる。３’アニーリング領域が、約１０〜２０塩基である場合、たとえ最後の３個の塩基がアニールしなくてもプライマーは伸長し、ＢｓｍＦＩ部位を生成する。
2006521086.tif 000004
【０１７２】
アデノシンとシトシンがプライマーに取り込まれて、ＢｓｍＦＩ、５’ＧＧＧＡＣＮ１０↓３’に対する認識部位を形成するように鋳型ＤＮＡの次の２個の塩基がチミジンとグアニンである鋳型ＤＮＡにアニールするように第２のプライマーを設計できる。ＢｓｍＦＩによる消化によって、関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するような仕方でアニールするように第２のプライマーを設計できる。
【０１７３】
他の態様において、第２のプライマーは、制限酵素に対する認識部位の全体または認識部位の一部を含有できるが、制限酵素による消化によって認識部位が切断され、関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するように、鋳型ＤＮＡのプライマー依存複製時に認識部位全体が生成される。例えば、制限酵素ＢｓａＪＩは、次の認識部位：５’Ｃ↓ＣＮ１Ｎ２ＧＧ３’と結合する。鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域が「ＣＣ」で終止するように第２のプライマーを設計することができ、関心対象のＳＮＰは「Ｎ１」として表され、ＳＮＰの下流の鋳型配列は「Ｎ２ＧＧ」である。
2006521086.tif 000005
【０１７４】
ＢｓａＪＩによる消化後、以下の配列の５’オーバーハングが生成すると考えられる。
５’Ｃ              ３’
３’ＧＧＮ１Ｎ２ＣＣ  ５’
【０１７５】
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、３’窪み端は、オーバーハング内の１番目のヌクレオチドに相補的である未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを除去した後、関心対象座を表す次のヌクレオチド、Ｎ１をはめ込むために標識ｄｄＮＴＰ類を用いることができる。限定はしないが、
2006521086.tif 000006
などの他の制限酵素を用いることができる。
【０１７６】
鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域は、鋳型ＤＮＡに対し１００％相補的である必要はない。例えば、第２のプライマーの３’端の最後の１、２、または３個のヌクレオチドは鋳型ＤＮＡにミスマッチであってもよい。鋳型ＤＮＡにアニールするプライマーの領域は、そのプライマーを標的化し、プライマーの伸長を可能にする。たとえ最後の２個のヌクレオチドが鋳型ＤＮＡに相補的でなくても、そのプライマーは伸長し、制限酵素認識部位を生成する。例えば、第２のプライマーの最後の２個のヌクレオチドは「ＣＣ」である。第２のプライマーは、鋳型ＤＮＡにアニールし、たとえ「ＣＣ」が鋳型ＤＮＡ上のヌクレオチドＮａおよびＮｂに相補的でなくても伸長できる。
2006521086.tif 000007
【０１７７】
ＢｓａＪＩによる消化後、以下の配列の５’オーバーリングが生成すると考えられる。
2006521086.tif 000008
【０１７８】
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、５’オーバーハングは、未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを濯いで除去し、標識ｄｄＮＴＰ類によってはめ込むことができる。取り込まれた１番目のヌクレオチドが関心対象座に相当する。関心対象座にグアニンが報告されている場合、関心対象座を未標識シトシンによってはめ込むことができ、関心対象座の下流のヌクレオチド１個を検出することができる。例えば、Ｎ２はアデニンと推定される。関心対象座がグアニンである場合、未標識シトシンをはめ込み反応に用いることができる。シトシンを除去した後、標識チミジンによるはめ込み反応を用いることができる。関心対象座がグアニンである場合だけ、標識チミジンが取り込まれることになる。このように、関心対象座の配列は、関心対象座の下流のヌクレオチドを検出することによって決定することができる。
【０１７９】
他の態様において、第１のプライマーおよび第２のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含有するが、制限酵素による消化によって、関心対象座のを含有する５’オーバーハングが生成するように、鋳型ＤＮＡの増幅時に制限酵素に対する認識部位全体が生成される。限定はしないが、制限酵素
2006521086.tif 000009
などの任意の制限酵素に対する、１個または１個を超える可変ヌクレオチドを含有する認識部位を生成させることができる。
【０１８０】
好ましい一態様において、第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’領域は、制限酵素に対する部分的配列を含有するが、ここで部分的配列は鋳型ＤＮＡに対して１、２、３、４個または４個を超えるミスマッチを含有し、これらのミスマッチが制限酵素認識部位を作り出す。３’端に忍容され得るミスマッチの数は、プライマーの長さ次第である。例えば、関心対象座がＮ１によって表されるならば、第１のプライマーは下記の領域「ａ」として表される鋳型ＤＮＡに相補的であるように設計することができる。第１のプライマーの３’領域は、鋳型ＤＮＡに相補的ではない「ＣＣ］で終止する。第２のプライマーは、下記の領域「ｂ’」として表される鋳型ＤＮＡに相補的であるように設計される。第２のプライマーの３’領域は、鋳型ＤＮＡに相補的ではない「ＣＣ」で終止する。
2006521086.tif 000010
【０１８１】
１回の増幅後、以下の産物が生成すると考えられる。
2006521086.tif 000011
【０１８２】
２回めのサイクルで、プライマーは、ＰＣＲの第１サイクルから生成した鋳型にアニールできる。
2006521086.tif 000012
【０１８３】
ＰＣＲの第２サイクル後、以下の産物が生成されると考えられる。
2006521086.tif 000013
【０１８４】
ＢｓａＪＩに対する制限酵素認識部位が生成し、ＢｓａＪＩによる消化後、関心対象座を含有する５’オーバーハングが作り出される。関心対象座は以下に詳述されるとおり検出することができる。
【０１８５】
他の態様において、プライマー対は、各々のプライマーの５’領域に、２つ以上の制限部位を提供する配列を有する。
【０１８６】
最も好ましい態様において、いずれかの所望の配列の開裂に、異なった制限酵素が必要とされるように、プライマー対は５’領域、特に５’端に異なった制限酵素認識部位を有する。例えば、関心対象座「Ａ］に対する第１のプライマーは、任意の型の制限酵素であり得る制限酵素「Ｘ］によって認識される配列を含有し、関心対象座により近くアニールする、関心対象座「Ａ］に関する第２のプライマーは、「ｎ」個のヌクレオチドを切断し、５’オーバーハングおよび３’窪み端を残すＩＩＳ型制限酵素である制限酵素「Ｙ］に対する配列を含有する。５’オーバーハングは関心対象座を含有する。増幅したＤＮＡをストレプトアビジン被覆ウェルに結合した後、酵素「Ｙ］によって消化し、濯いでから標識ヌクレオチドによってはめ込み、濯いでから関心対象座を含有するＤＮＡ断片を固体マトリックスから遊離させる制限酵素「Ｘ］によって消化する。関心対象座は、関心対象座、例えば、ＳＮＰ部位に「はめ込まれた」標識ヌクレオチドを検出することによって分析することができる。
【０１８７】
他の態様において、本発明によって増幅される異なった関心対象座に関する第２のプライマーが同じ制限酵素に対する５’領域に認識配列を含有し、同様に第１のプライマーも全て、第２のプライマーを認識する酵素とは異なった酵素である制限酵素の同じ制限酵素認識部位を含有する。
【０１８８】
他の態様において、本発明によって増幅される複数の関心対象座に関する第２のプライマーが５’領域に異なった制限酵素に対する制限酵素認識配列を含有する。
【０１８９】
他の態様において、本発明によって増幅される複数の関心対象座に関する第１のプライマーが５’領域に異なった制限酵素に対する制限酵素認識配列を含有する。複数の制限酵素配列によって、プールされた関心対象座が固体マトリックスから遊離する順序に影響を与える機会が提供される。例えば、５０の関心対象座が増幅される場合、第１のプライーは、精製を助ける５’最末端におけるタグおよび制限酵素認識部位を有することができ、第２のプライマーはＩＩＳ型制限酵素に対する認識部位を含有できる。例えば、第１のプライマーの幾つかがＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を有し、他の第１のプライマーがＰｓｔＩに対する認識部位を有し、さらに他の第１のプライマーがＢａｍＨＩに対する認識部位を有することができる。増幅後、第１のプライマー上のタグの助けで、関心対象座を固定支持体に結合できる。一度に１個の制限酵素の制限消化を実施することによって増幅された関心対象座を連続的に遊離することができる。第１の消化をＥｃｏＲＩによって実施すると、ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有する第１のプライマーと共に増幅された関心対象座が遊離し、回収されるが、他の関心対象座は固体支持体に結合したままである。一度に１個の制限酵素で消化することにより、増幅関心対象座を選択的に固体支持体を遊離させることができる。第１のプライマーにおいて種々の制限酵素認識部位を使用することにより、１本の反応管内でより多数の関心対象座を増幅することができる。
【０１９０】
好ましい態様において、各プライマーの制限酵素消化部位の任意の５’領域を、断片の操作、加工、同定および／または精製を提供する官能基によって修飾することができる。このような官能基またはタグの例としては、限定はしないが、ビオチン、ビオチン誘導体、炭水化物、ハプテン類、色素、放射性分子、抗体、および抗体断片、ペプチド類および免疫遺伝分子などが挙げられる。
【０１９１】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは１回の複製を超えて増幅されることなく、１回複製することができる。関心対象座の多数のコピーが既に試料中に存在し、それ以上のコピーが必要とされない場合など、分析に利用できるＤＮＡが多量に存在する場合に、これは有用である。この態様では、配列が折り返されて、相補的様式でそれ自身の内部の配列に配列にアニールするように、プライマーは、５’領域に「ヘアピン」構造を含むように設計されることが好ましい。鋳型ＤＮＡが１回だけ複製される場合、認識部位を含んでなるＤＮＡ配列は「ヘアピン」構造がなければ一本鎖になるであろう。しかし、ヘアピン構造の存在下で、その領域は効果的に二本鎖となり、制限酵素による活性に対し、二本鎖基質を提供する。
【０１９２】
反応条件が適合する限り、ＤＮＡの関心対象座分析用プライマー対は全て、本発明の方法に利用するため、共に混合することができる。好ましい一態様において、全プライマー対は、１つの反応器内に鋳型ＤＮＡと共に混合する。このような反応容器は、例えば、反応管、またはマイクロ滴定プレートのウェルであり得る。
【０１９３】
あるいは、ヌクレオチドに関する競合を避けるために、プライマー二量体およびプライマーのアニーリング濃度に伴う困難を最少化するため、各関心対象座または関心対象座の小群を別々の反応管またはウェル内で増幅でき、所望の場合、その産物を後でプールできる。例えば、別々の反応物を１個の反応容器内へプールしてから、関心対象座またはＳＮＰ部位を含有する５’オーバーハングおよび３’窪み端を生成する制限酵素によって消化することができる。各プライマー対のプライマーは、等モル量で提供されることが好ましい。また、種々のプライマー対の各々が、使用される他のプライマー対に対して等モル量で提供されることが特に好ましい。
【０１９４】
他の態様において、プライマーの各々の関心対象座を効率的に増幅できるプライマー対の組合わせを用いることができる（例えば、図２を参照）。本発明の方法における使用前に、このような組合せを決定できる。互いに効率的に作用し合うプライマー対を選択するために、複数ウェルプレートおよびＰＣＲ装置が使用できる。例えば、各プライマー対の最適アニーリング温度を選択するために、エッペンドルフ・マスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標））グラジエントＰＣＲ機器などのグラジエントＰＣＲ機器を使用できる。同様の特性を有するプライマー対を１つの反応管内で一緒に使用できる。
【０１９５】
他の態様において、同一のプライマー対を用いて複数の鋳型ＤＮＡ試料からの単一の関心対象座を、その関心対象座に最適のＰＣＲ条件で増幅するために、限定はしないが、９６ウェル以上のプレートを含む複数の試料容器を用いることができる。あるいは、各関心対象座の増幅のために、別の複数の試料容器を用い、各鋳型ＤＮＡ試料の産物を後でプールすることができる。例えば、マイクロ滴定プレート１において、９６種の異なったＤＮＡ試料からの遺伝子Ａを増幅し、マイクロ滴定プレート２において、９６種の異なったＤＮＡ試料からの遺伝子Ｂを増幅することができ、次に増幅産物をプールすることができる。
【０１９６】
複数の関心対象座増幅結果は、各関心対象座の配列を有する代表的ＰＣＲ産物を含有する調製物である。例えば、鋳型ＤＮＡとして１個体だけのＤＮＡを用い、その鋳型ＤＮＡから数百の疾病関連の関心対象座を増幅した場合、増幅ＤＮＡは、各関心対象座からの小型のＰＣＲ産物の混合物になると考えられる。その場合、このような調製物をさらに分析して、各関心対象座における配列または少数の関心対象座における配列を決定できると考えられる。また、前記調製物を、ＤＮＡを保存する様式で貯蔵でき、後の時点で分析することができると考えられる。増幅ＤＮＡに含まれた情報は、限定はしないが、蛍光検出、塩基配列決定、ゲル電気泳動および質量分析などの任意の好適な方法により明らかにすることができる（下記の「取り込みヌクレオチドの検出」の節を参照）。
【０１９７】
ＩＩ．関心対象座の増幅
限定はしないが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、３ＳＲ（自立配列反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＰＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ端の急速増幅）、ＰＬＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応との組合わせ）、Ｑ−ベータファージ増幅（シャーら（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロジー（Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ．）３３：ｐ．１４３５−４１（１９９５））、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＳＯＥ−ＰＣＲ（スプライス重複伸長ＰＣＲ）などの当業界に知られた任意の好適な方法を用いて、鋳型ＤＮＡを増幅できる。これらの方法は、本出願に明白に記載されている遊離可能なプライマーに媒介されたサイクル増幅反応の変法を設計するために使用できる。最も好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ（ＰＣＲ：実用的アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、インニスら（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９１）；およびＰＣＲテクノロジー：ＤＮＡ増幅の原理と応用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、エイチ・エイ・エーリッヒ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ）、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９８９））を用いて増幅される。ＰＣＲはまた、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８００，１５９号明細書；米国特許第４，９６５，１８８号明細書；米国特許第４，８８９，８１８号明細書；米国特許第５，０７５，２１６号明細書；米国特許第５，０７９，３５２号明細書；米国特許第５，１０４，７９２号明細書；米国特許第５，０２３，１７１号明細書；米国特許第５，０９１，３１０号明細書；および米国特許第５，０６６，５８４号明細書、を含む多数の米国特許に記載されている。
【０１９８】
典型的なＰＣＲ反応の構成要素としては、限定はしないが、鋳型ＤＮＡ、プライマー、反応緩衝剤（ポリメラーゼの選択に依る）、ｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。好適なＰＣＲプライマーは、上記に検討したとおり設計され、調製できる（上記の「プライマー設計」の節を参照）。簡略に述べると、反応液を９５℃に２分間加熱して鋳型ＤＮＡの鎖を分離し、この反応液を適切な温度（設計されたプライマーのアニーリング温度を計算することにより決定）まで冷却して、プライマーを鋳型ＤＮＡにアニールさせ、７２℃に２分間加熱して伸長させる。
【０１９９】
好ましい一態様において、増幅の最初の３サイクルの各サイクルにおいてアニーリング温度を増加させて、非特異的な増幅を減らす。下記の実施例１も参照されたい。ＰＣＲ第１サイクルのＴＭ１は、第２のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である。アニーリング温度は、サイクル２〜１０において、好ましくないサイクル２において、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度であるＴＭ２に増加できる。サイクル２でアニーリング温度を増加させる場合、そのアニーリング温度は、次のアニーリング温度増加までは略同じ温度に留まる。最後に、アニーリング温度をＴＭ２に増加させたサイクルに引き続くいずれかのサイクルで、好ましくはサイクル３で、第２のプライマー全体の略融解温度であるＴＭ３へとアニーリング温度を増加させる。第３サイクル後、残りのサイクルのアニーリング温度は略ＴＭ３であり得るか、またはさらに増加し得る。この例では、アニーリング温度はサイクル２およびサイクル３において増加させている。しかし、アニーリング温度は、サイクル１における低アニーリング温度からサイクル２の高アニーリング温度へと、さらなる温度の増加なしに増加できるか、またはアニーリング温度は、任意の数の増加ステップで、低アニーリング温度から高アニーリング温度へと次第に変化させることができる。例えば、アニーリング温度は、サイクル２、３、４、５、６などにおいて変化させることができる。
【０２００】
アニーリング後、各サイクルの温度を「伸長」温度まで増加させてプライマーを「伸長」させ、伸長後、各サイクルの温度を変性温度へと増加させる。大きさが５００塩基対未満のＰＣＲ産物では、各サイクルにおける伸長ステップを除いて、変性ステップとアニーリングステップだけを有してもよい。典型的なＰＣＲ反応は上記のように、変性、アニーリング、および伸長の２５〜４５サイクルからなる。しかし、前述したとおり、本発明の実施には、１サイクルの増幅（１コピー）で十分なこともある。
【０２０１】
他の態様において、鋳型ＤＮＡを１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０サイクルまたは２０サイクルより多く増幅するために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでなる複数のプライマーセットを用いることができ、次に増幅産物を、１つのプライマーセットまたは複数のプライマーセットのサブセットを用いた反応においてさらに増幅する。好ましい態様において、プライマー二量体の形成を最少化するために低濃度の各プライマーセットを用いる。低濃度の出発ＤＮＡは、複数のプライマーセットを用いて増幅できる。限定はしないが、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０．９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜１０００対、および１０００対を超える任意の数のプライマーセットを第１の増幅反応に用いることができる。他の態様において、増幅産物は、１対のプライマーセットを用いて、第２の反応において、増幅される。他の態様において、増幅産物は、限定はしないが、２〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０．９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０対、および２５０対を超える複数のプライマー対のサブセットを用いてさらに増幅させる。
【０２０２】
最少量の鋳型ＤＮＡが検出できる座数を制限しないように、複数のプライマーセットが関心対象座を増幅する。例えば、鋳型ＤＮＡが１個の細胞から単離されるか、、あたは鋳型ＤＮＡが母体の鋳型ＤＮＡおよび胎児の鋳型ＤＮＡの双方を含んでなる妊娠女性から得られる場合、関心対象座を増幅するための第１の増幅反応において、低濃度の各プライマーセットを用いることができる。低濃度のプライマーによって、プライマー二量体の形成が減少し、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニールしてポリメラーゼにより伸長させる可能性が増大する。複数のプライマーセットを用いて実施されるサイクルの最適回数は、プライマーの濃度によって決定される。第１の増幅反応後に関心対象座をさらに増幅するために、さらにプライマーを加えることができる。各プライマーセットの追加量を加えることができ、１回の反応でさらに増幅される。あるいは、増幅産物は、各反応において１つのプライマーセット；または複数のプライマーセットのサブセットを用いてさらに増幅できる。例えば、第１の増幅反応において、１５０個のプライマーセットを用いた場合、この第１の反応からの産物をさらに増幅するために、１０個のプライマーセットのサブセットを用いることができる。
【０２０３】
限定はしないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ベントＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼなどのプライマー伸長を触媒する任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。熱安定ポリメラーゼを用いることが好ましい。また、ポリメラーゼ添加前に、反応液を９５℃に２分間加熱する「ホットスタート」ＰＣＲを実施することができるか、またはサイクル１の加熱ステップまでポリメラーゼを不活性に保つことができる。「ホットスタート」ＰＣＲは、非特異的増幅を最少化するために使用できる。ＤＮＡを増幅するために、限定はしないが、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５サイクルなど、任意のＰＣＲサイクル数を用いることができる。最も好ましい態様において、実施されるＰＣＲサイクル数は、各関心対象座の等モル量が生成されるような回数である。
【０２０４】
ＩＩＩ．増幅ＤＮＡの精製
本発明の実施にとって、増幅ＤＮＡの精製は、必ずしも必要ではない。しかしながら、一態様において、精製が好ましい場合は、プライマー（第１または第２のプライマー）の５’端を、ＰＣＲ産物の精製を容易にするタグによって修飾できる。好ましい態様においてＰＣＲ産物の精製を容易にするタグによって第１のプライマーを修飾する。修飾は、全プライマーに対して同じであることが好ましいが、ＰＣＲ産物を異なった群に分けることが望まれる場合は、異なった修飾を用いることができる。
【０２０５】
前記タグは、限定されないが、ラジオアイソトープ、蛍光レポーター分子、化学的ルミネセンスレポーター分子、抗体、抗体断片、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、ホモポリマーのオリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反応性部分、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分、およびそれらの組合わせを含む化学的部分であり得る。
【０２０６】
一例として、プライマーの５’端をビオチン化できる（ケンドパルら（Ｋｅｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９−１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１０：３０〜３４（１９９１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３−６１６４（１９９０））。ビオチンは、コピーされたＤＮＡを、ゲノムＤＮＡまたは関心対象ではない任意の他のＤＮＡ分子から精製するために使用できる親和性タグを提供する。限定はしないが、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によるストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）プレート、透過プレート、ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレート（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズに挙げられているカタログ番号１６４５６９２）など、図１Ｆに示されるようなストレプトアビジン被覆マトリックスを用いてビオチン分子を精製できる。
【０２０７】
各関心対象座のＰＣＲ産物を、ストレプトアビジン被覆プレートの別々のウェル内に入れる。あるいは、関心対象座のＰＣＲ産物をプールして、限定はしないが、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によるストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）プレート、透過プレート、ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレート（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズに挙げられているカタログ番号１６４５６９２）など、ストレプトアビジン被覆マトリックス内に入れることができる。
【０２０８】
また、増幅ＤＮＡは、例えば標準プロトコルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって当業界に公知の非親和的方法を用いて鋳型ＤＮＡから分離することもできる。
【０２０９】
ＩＶ．増幅ＤＮＡの消化
当業界に公知の標準的プロトコルを用いて第１のプライマーまたは第２のプライマー上に供給された配列を認識する制限酵素によって、増幅ＤＮＡを消化することができる（図６Ａ〜６Ｄ）。制限酵素消化は、当業界に周知の標準的プロトコルを用いて実施される。使用される酵素は、第１のプライマーまたは第２のプライマーによって生成される制限認識部位に依って決まる。プライマー上に生成した制限認識部位についての詳細に関しては、上記の「プライマー設計」の節を参照されたい。
【０２１０】
ＩＩＳ型制限酵素は、認識部位の外側の略１０〜２０塩基対を切断する点で極めて有用である。用いられるＩＩＳ型制限酵素は、限定はしないが、ＢｃｅＡＩおよびＢｓｍＦＩなどの５’オーバーハングおよび３’窪み端を生成するものであることが好ましい（例えば、表Ｉ参照）。最も好ましい態様において、第２のプライマー（フォワードまたはリバースのいずれか）がＢｓｍＦＩまたはＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識配列を含有する。ＩＩＳ型制限酵素、ＢｓｍＦＩは核酸配列ＧＧＧＡＣを認識し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断し、センス鎖上の認識部位から１０個のヌクレオチドを切断する。ＢｓｍＦＩによる消化によって４塩基の５’オーバーハングが生成される。
【０２１１】
例えば、増幅後に制限酵素認識部位が関心対象座から１３塩基であるように第２のプライマーが設計されると、消化後、関心対象座は、５’オーバーハングにおける第１の塩基（３’から５’へと読んで）であり、３’窪み端は関心対象座から１塩基である。３’窪み端は、関心対象座に相補的なヌクレオチドによって補充できる。オーバーハングの１個の塩基はジデオキシヌクレオチド類を用いて補充できる。しかし、オーバーハングの１、２、３または４個の塩基は、デオキシヌクレオチド類またはジデオキシヌクレオチド類とデオキシヌクレオチド類との混合物を用いてはめ込むことができる。
【０２１２】
制限酵素ＢｓｍＦＩは、センス鎖上の認識部位からＤＮＡの１０個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断する。しかし、配列依存的な仕方で、制限酵素ＢｓｍＦＩは、センス鎖上の認識部位からＤＮＡの１１個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１５個のヌクレオチドを切断する。したがって、消化後、ＤＮＡ分子の２つの集団が存在する。すなわち、１０／１４で切断されたＤＮＡ分子および１１／１５で切断されたＤＮＡ分子である。増幅産物において、ＢｓｍＦＩに対する認識部位が関心対象座から１３塩基であるならば、１１／１５の位置で切断されたＤＮＡ分子は、オーバーハングの２位（３’から５’へと読んで）に関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成することになる。ＤＮＡ分子の３’窪み端は、標識ヌクレオチドによってはめ込まれる。例えば、標識ジデオキシヌクレオチドが用いられた場合、１１／１５で切断された分子の３’窪み端は、関心対象座より上流の塩基に相当する１個の塩基ではめ込まれるであろうし、１０／１４で切断された分子の３’窪み端は、関心対象座からの塩基に相当する１個の塩基で補充されるであろう。１０／１４の位置で切断されたＤＮＡ分子および１１／１５の位置で切断されたＤＮＡ分子は大きさによって分けることができ、取り込まれたヌクレオチドを検出できる。このことにより、関心対象座の前の双方のヌクレオチドの検出、関心対象座の検出が可能となり、また関心対象座の後の３塩基を検出できることもある。
【０２１３】
あるいは、関心対象座より上流の塩基と関心対象座とが異なるヌクレオチドであるとすると、１１／１５で切断された分子の３’窪み端は、上流塩基に相補的なデオキシヌクレオチドではめ込みができる。残りのデオキシヌクレオチドを洗い流し、関心対象座部位は、標識デオキシヌクレオチド、未標識デオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、または未標識ジデオキシヌクレオチドによってはめ込みができる。はめ込み反応後、任意の好適な方法によってヌクレオチドを検出できる。したがって、ｄＮＴＰによる第１のはめ込み反応後、１０／１４および１１／１５で切断された分子の３’窪み端は、関心対象座より上流である。ここで、３’窪み端は関心対象座に相当する１個の塩基、２個の塩基、３個の塩基または４個の塩基ではめ込みできる。
【０２１４】
制限酵素ＢｃｅＡＩは、核酸配列ＡＣＧＧＣを認識し、センス鎖上の認識部位から１２個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断する。第２のプライマー上のＢｃｅＡＩに対する認識部位からの距離を関心対象座から１３塩基となるように設計すると（図４Ａ〜４Ｄを参照）、ＢｃｅＡＩによる消化で関心対象座を含有する２塩基の５’オーバーハングおよび関心対象座より上流の３’窪み端を生成する。関心対象座は５’オーバーハング内の第１のヌクレオチド（３’から５’へと読んで）である。
【０２１５】
ＢｓｍＦＩで見られるよりは、はるかに低い頻度ではあるが、制限酵素ＢｃｅＡＩの別途切断も見られる。制限酵素ＢｃｅＡＩは、センス鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１５個のヌクレオチドを切断できる。したがって、ＤＮＡ分子の２つの集団が存在する。すなわち、１２／１４で切断されたＤＮＡ分子および１３／１５で切断されたＤＮＡ分子である。増幅産物において、制限酵素認識部位が関心対象座から１３塩基であるならば、１３／１５の位置で切断されたＤＮＡ分子は、オーバーハングの２番目の位置（３’から５’へと読んで）に関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成することになる。前記ＤＮＡ分子の３’窪み端をはめ込むために、標識ジデオキシヌクレオチドが使用できる。１３／１５で切断されたＤＮＡ分子は、はめ込まれた関心対象座より上流の塩基を有することになり、１２／１４で切断されたＤＮＡ分子は、はめ込まれた関心対象座の部位を有することになる。１３／１５で切断されたＤＮＡ分子および１２／１４で切断されたＤＮＡ分子は、大きさによって分けることができ、取り込まれたヌクレオチドを検出できる。このように別途切断を、さらなる配列情報を得るために使用できる。
【０２１６】
あるいは、５’オーバーハングの２塩基が異なっているとすれば、１３／１５で切断されたＤＮＡ分子の３’窪み端は、オーバーハング内の１番目の塩基に相補的なデオキシヌクレオチドではめ込みができ、過剰のデオキシヌクレオチドを洗い流す。はめ込み後、１２／１４で切断されたＤＮＡ分子の３’窪み端および１３／１５で切断されたＤＮＡ分子は、関心対象座より上流である。前記３’窪み端は、標識ジデオキシヌクレオチド類、未標識ジデオキシヌクレオチド類、標識デオキシヌクレオチド類、または未標識デオキシヌクレオチド類のいずれかではめ込みができる。
【０２１７】
プライマーが、コピーされたある一定の関心対象座に対して、異なった制限部位を提供するならば、コピーＤＮＡを同時に消化するために、必要な制限酵素を全て一緒に加えることができる。あるいは、例えば１回につき１種の制限酵素を用いて、異なった制限消化を連続して行うことができ、その制限酵素に対して特異的な産物だけが消化される。
【０２１８】
限定はしないが、酵素濃度、温度、緩衝剤条件、および消化時間などの最適制限酵素消化条件は各制限酵素に対して最適化できる。例えば、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩに見られる別途切断は、所望の場合、限定はしないが、２５〜１６℃、１６〜１２℃、１２〜８℃、８〜４℃、または４〜０℃などの低温での制限酵素消化の実施により減少させることができる。
【０２１９】
Ｖ．標識ヌクレオチド類の取り込み
第２のプライマー上の配列を認識する制限酵素による消化によって、３’窪み端および関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成する（図１Ｇ）。３’窪み端は、５’オーバーハングを鋳型として用い、未標識または標識ヌクレオチド類もしくは未標識および標識ヌクレオチド双方の組合わせの存在下ではめ込みができる。ヌクレオチドは、限定はしないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、および検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分などの検出を可能にする任意のタイプの化学基または化学部分によって標識できる。ヌクレオチドは、１種または１種より多い化学基または化学部分によって標識できる。各ヌクレオチドを同一の化学基または化学部分によって標識できる。あるいは、各々異なったヌクレオチドを異なった化学基または化学部分によって標識できる。標識ヌクレオチドは、ｄＮＴＰ類、ｄｄＮＴＰ類またはｄＮＴＰ類、ｄｄＮＴＰ類双方の混合物で標識できる。
【０２２０】
限定はしないが、未標識デオキシヌクレオチド、標識デオキシヌクレオチド、未標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、標識および未標識デオキシヌクレオチドとの混合物、標識および未標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、標識デオキシヌクレオチドと標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、標識デオキシヌクレオチドと未標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、未標識デオキシヌクレオチドと未標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、未標識デオキシヌクレオチドと標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、ジデオキシヌクレオチド類似体、デオキシヌクレオチド類似体、ジデオキシヌクレオチド類似体とデオキシヌクレオチド類似体との混合物、リン酸化ヌクレオシド類似体、２’−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸エステルおよび修飾２’−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸エステルなどの任意のヌクレオチドの組合わせをヌクレオチドの取り込みに使用できる。
【０２２１】
例えば、図１Ｈに示されるように、ポリメラーゼの存在下、３’窪み端は、鋳型として５’オーバーハングを用いて蛍光ｄｄＮＴＰではめ込みできる。取り込まれたｄｄＮＴＰは、限定しないが、蛍光検出などの任意の好適な方法を用いて検出できる。
【０２２２】
４個のヌクレオチド全てを異なった蛍光基で標識することができ、このことにより、１つの反応を４種の標識ヌクレオチドの存在下で実施することができる。あるいは、各関心対象座に関して、４つの異なった「はめ込み」反応が実施できる。すなわち、４つの反応の各々が異なった標識ヌクレオチドを含有することになる（例えば、ｄｄＡＴＰ＊、ｄｄＴＴＰ＊、ｄｄＧＴＰ＊、またはｄｄＣＴＰ＊、ここで＊は標識ヌクレオチドを示す）。各ヌクレオチドは異なった化学基、または同一の化学基で標識できる。標識ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであり得る。
【０２２３】
他の態様において、限定しないが、フルオレセイン、ピレン、７−メトキシクマリン、カスケードブルーＴＭ、アレキサフルー（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ）３５０、アレキサフラー４３０、アレキサフラー４８８、アレキサフラー５３２、アレキサフラー５４６、アレキサフラー５６８、アレキサフラー５９４、アレキサフラー６３３、アレキサフラー６４７、アレキサフラー６６０、アレキサフラー６８０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ジアルキルアミノクマリン、パシフィックブルー、マリナブルー、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＩ−Ｘ、ＤＴＡＦ、オレゴングリーン５００、ダンシル−Ｘ、６−ＦＡＭ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、ローダミングリーン−Ｘ、ロドールグリーン、カルセイン、エオシン、臭化エチジウム、ＮＢＤ、ＴＥＴ、２’、４’、５’、７’テトラブロモスルホンフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦｌＢＲ２、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、Ｃｙ３、ローダミンＲｅｄ−ｘ、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、カルボキシＸローダミン、テキサスレッドＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、Ｃｙ５、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン＃１、スペクトラムグリーン＃２、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッドまたはナフトフルオレセインなどの蛍光色素によってヌクレオチドを標識できる。
【０２２４】
他の態様において、ヌクレオチドが異なった蛍光基によって標識される「はめ込み」反応が蛍光標識ｄＮＴＰ類と共に実施できる。取り込まれたヌクレオチドは、限定はしないが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などの好適な方法によって検出できる。
【０２２５】
他の態様において、ＳＮＰまたは関心対象座の３’窪み端のはめ込みに標識ｄｄＮＴＰ類と未標識ｄｄＮＴＰ類双方の混合物が使用できる。５’−オーバーハングは、限定はしないが、２、３、４、５、６塩基または６塩基を超える、２塩基以上からなる。例えば、５’−オーバーハングが配列「ＸＧＡＡ」（ここでＸは関心対象座、例えばＳＮＰ）からなるならば、標識ｄｄＮＴＰ類と未標識ｄｄＮＴＰ類との混合物との混合物によるはめ込みによって、幾つかの異なったＤＮＡ断片が生じることになる。標識ｄｄＮＴＰが「Ｘ」の位置に取り込まれると、反応は終止し、１個の標識塩基が取り込まれることになる。しかし、未標識ｄｄＮＴＰが取り込まれると、ポリメラーゼは標識ｄｄＮＴＰが取り込まれるまで他の塩基を取り込み続ける。取り込まれた最初の２つのヌクレオチドがｄＮＴＰであり、３番目がｄｄＮＴＰであれば、３’窪み端は、３塩基だけ伸長することになる。このＤＮＡ断片を、１、２または４塩基の大きさだけ伸長した他のＤＮＡ断片から分離できる。標識ｄｄＮＴＰ類と未標識ｄｄＮＴＰ類との混合物によって、オーバーハングの全ての塩基が補充され、関心対象座、例えばＳＮＰについてのさらなる配列情報が提供される（図７Ｅおよび９Ｄを参照）。
【０２２６】
標識ヌクレオチドの取り込み後、第１のプライマーによって供給された配列を認識する制限酵素によって、増幅ＤＮＡを消化することができる。例えば、図１１では増幅ＤＮＡが、領域「ａ」に結合する制限酵素によって消化されて、ストレプトアビジンマトリックスから取り込まれたヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を遊離する。
【０２２７】
あるいは、各関心対象座に関する各プライマー対の一方のプライマーを、限定はしないが、マイクロ滴定プレートのウェルなどの固体支持マトリックスに結合させることができる。例えば、一方のプライマーをビオチン化したプライマー対と共に、ストレプトアビジン被覆マイクロ滴定プレートを増幅反応に用いることができる。先ず、ビオチン化プライマーがストレプトアビジン被覆マイクロ滴定プレートに結合する。次に、関心対象座のＰＣＲ増幅のために、これらのプレートを反応容器として利用する。増幅反応が完了したら、余分なプライマー、塩類および鋳型ＤＮＡは洗浄により除去できる。増幅ＤＮＡは、マイクロ滴定プレートに結合したままである。第２のプライマー上の配列を認識し、関心対象を含有する５’−オーバーハングを生成する制限酵素によって増幅ＤＮＡを消化することができる。消化された断片は洗浄によって除去できる。消化後、ＳＮＰ部位、または関心対象座は５’−オーバーハング内に現れる。３’窪みは、ポリメラーゼの存在下、限定はしないが蛍光ｄｄＮＴＰなどの標識ヌクレオチドによってはめ込まれる。第１の５’領域における配列を認識する制限酵素による消化によって標識ＤＮＡは、マイクロ滴定プレート内の上澄み液へ遊離できる。
【０２２８】
他の態様において、遺伝子の複数対立遺伝子配列を決定するために、１種のヌクレオチドを使用できる。遺伝子の複数対立遺伝子配列を決定するために、伸長反応を終結させるヌクレオチドが使用できる。１つの対立遺伝子において、終結ヌクレオチドは、前記対立遺伝子の５’−オーバーハング内の関心対象座に相補的である。前記ヌクレオチドは取り込まれ、反応を終結させる。異なった対立遺伝子では前記終結ヌクレオチドは関心対象座に相補的でないため、異なった対立遺伝子の関心対象座に非終結ヌクレオチドが取り込まれる。しかし、終結ヌクレオチドは、前記異なった対立遺伝子の５’−オーバーハング内の関心対象座から下流のヌクレオチドに相補的である。対立遺伝子の配列は、終結ヌクレオチドの取り込みパターンを分析することによって決定できる。終結ヌクレオチドは、標識化されていることもあり、また、未標識のこともある。
【０２２９】
他の態様において、終結ヌクレオチドは、限定はしないが、ジデオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド誘導体、ジデオキシヌクレオチド類縁体、ジデオキシヌクレオチド同族体、硫黄化学基を有するジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド誘導体、デオキシヌクレオチド類縁体、デオキシヌクレオチド同族体、硫黄化学基を有するデオキシヌクレオチド、三リン酸アラビノシド、三リン酸アラビノシド類縁体、三リン酸アラビノシド同族体または三リン酸アラビノシド誘導体などの伸長反応を終結または阻害するヌクレオチドである。
【０２３０】
他の態様において、限定はしないが、蛍光色素などの１シグナル生成部分タグで標識した終結ヌクレオチドを、関心対象座の対立遺伝子の配列決定に使用できる。１シグナル生成部分タグで標識した単一ヌクレオチドを使用することにより、異なった蛍光部分を使用する場合に生じ得る困難が除去される。また、関心対象座の対立遺伝子の配列決定に１シグナル生成部分タグで標識した単一ヌクレオチドを使用することにより、反応数が減り、ピペット操作のエラーが除去される。
【０２３１】
例えば、第２のプライマーがＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有するならば、消化によって４塩基の５’−オーバーハングが生成する。関心対象座がオーバーハングの１番目に位置するように第２のプライマーを設計できる。代表的なオーバーハングを下記に示すが、ここでＲは関心対象座を表す。
2006521086.tif 000014
【０２３２】
可変部位が、ホモ接合かヘテロ接合かを決定するために、１シグナル生成部分タグを有する１種のヌクレオチドを用いることができる。例えば、可変部位がアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）であれば、関心対象座の対立遺伝子の配列を決定するために、オーバーハングの２、３、または４の位置にアデニンまたはグアニンが存在するという条件でアデニンまたはグアニンを使用できる。
【０２３３】
例えば、オーバーハングの２位のヌクレオチドが、アデニンに相補的であるチミジンであるならば、関心対象座の対立遺伝子の配列を決定するために、標識ｄｄＡＴＰ、未標識ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを使用できる。ｄｄＡＴＰは、限定はしないが、蛍光色素などの任意のシグナル生成部分によって標識できる。鋳型ＤＮＡがアデニンに関してホモ接合であるならば、標識ｄｄＡＴＰ＊は対立遺伝子において、オーバーハングに相補的な１位に取り込まれ、オーバーハングに相補的な２、３、または４位にヌクレオチドは見られないことになる。
2006521086.tif 000015
【０２３４】
オーバーハングに相補的な１位における標識ｄｄＡＴＰの取り込みに相当する１つのシグナルが見られることになるが、これはこの位置におけるアデニンに関し、この固体はホモ接合であることを示す。この標識化法により、異なった量子効率を有する種々の色素を用いることから生じ得る困難が除去される。
【０２３５】
ホモ接合グアニン：
鋳型ＤＮＡがグアニンに関してホモ接合であるならば、オーバーハングに相補的な１位にｄｄＡＴＰが取り込まれることはないが、１番目に利用できる位置、この場合、オーバーリングに相補的な２位に、ｄｄＡＴＰが取り込まれることになる。例えば、オーバーハングにおける２番目の位置がチミジンに相当する場合：
2006521086.tif 000016
【０２３６】
オーバーハングに相補的な２位におけるｄｄＡＴＰの取り込みに対応する１つのシグナルが見られるが、このことは、グアニンに関してその個体がホモ接合であることを示す。オーバーハングに相補的な２位にはめ込まれた分子は、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれる補充される分子とは異なった分子量を有する。
【０２３７】
ヘテロ接合条件：
2006521086.tif 000017
【０２３８】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な２位に補充されたｄｄＡＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、１個の塩基対によって分離でき、このことから、シグナルの容易な検出および定量が可能である。限定はしないが、ゲル電気泳動、毛管ゲル電気泳動、ＤＮＡ塩基配列決定、および質量分析などの分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて、１位にはめ込まれた分子を２位にはめ込まれた分子から識別することができる。ヌクレオチドは化学的部分によって標識される必要はない。すなわち、異なった対立遺伝子に相当するＤＮＡ分子は、分子量に基づいて分離できる。
【０２３９】
オーバーハングの２位がアデニンに相補的でないならば、３位または４位がアデニンに相補的である可能性がある。例えば、オーバーハングの３位がヌクレオチドアデニンに対して相補的であり得るが、その場合は双方の対の配列を決定するために、標識ｄｄＡＴＰが使用できる。
【０２４０】
2006521086.tif 000018
【０２４１】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、２個の塩基対によって分離でき、これは、分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて検出できる。
【０２４２】
あるいは、２位および３位がアデニンに相補的ではない（すなわち、オーバーハングの２位および３位が、グアニン、シトシンまたはアデニンに相当する）が、４の位置がアデニンに相補的であれば、双方の対の配列を決定するために標識ｄｄＡＴＰを使用することができる。
【０２４３】
2006521086.tif 000019
【０２４４】
オーバーハングに相補的な１位におけるｄｄＡＴＰみよってはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られるが、このことは可変部位におけるアデニンに関して、その個体がホモ接合であることを示す。
【０２４５】
2006521086.tif 000020
【０２４６】
オーバーハングに相補的な４位においてはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られるが、このことはその個体がグアニンに関してホモ接合であることを示す。
【０２４７】
2006521086.tif 000021
【０２４８】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な４位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、３個の塩基対によって分離でき、このことから、シグナルの検出および定量が可能である。１位にはめ込まれた分子と４位にはめ込まれた分子とは分子量に基づいて識別することができる。
【０２４９】
上記のように、可変領域がアデニンまたはグアニンを含有しているならば、双方の対立遺伝子配列を決定するために標識アデニンまたは標識グアニンを使用することができる。オーバーハングの２、３、または４位がアデニンに相補的ではないが、１つの位置がグアニンに相補的ならば、鋳型ＤＮＡがアデニンまたはグアニンに関してホモ接合かヘテロ接合かを決定するために標識ｄｄＧＴＰを使用することができる。例えば、オーバーハングの３位がシトシンに相当するならば、鋳型ＤＮＡがグアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合、またはヘテロ結合である場合、以下のシグナルが予想される。
【０２５０】
2006521086.tif 000022
【０２５１】
オーバーハングに相補的な１位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られ、このことによって、その個体がグアニンに関してホモ接合であることが示される。
【０２５２】
2006521086.tif 000023
【０２５３】
オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られ、このことによって、その個体が可変部位のアデニンに関して、ホモ接合であることが示される。
【０２５４】
2006521086.tif 000024
【０２５５】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＧＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれたｄｄＧＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、２個の塩基対によって分離され、このことから、シグナルの容易な検出および定量が可能である。
【０２５６】
別の態様では、対象対立遺伝子の配列の決定に使用される、１つの化学成分で標識されたヌクレオチドを、蛍光検出、ＤＮＡ配列決定用ゲル、自動ＤＮＡ配列決定装置を用いるキャピラリ電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動、および他の配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁場型質量分析、電場型質量分析、赤外分光法、紫外分光法、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリーを含むがこれらに限定されない、さまざまな方法で、または、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ断片は「プローブ」および「標的」の両方として有用なもの）を含むＤＮＡハイブリダイゼーション法、ＥＬＩＳＡ、蛍光定量、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアレイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法で分析することができる。
【０２５７】
幾つかのＩＩＳ型の制限酵素は、上記で検討したように別途の切断も示す。例えば、ＢｓｍＦＩは、認識部位から１０／１４および１１／１５で切断する。この切断パターンは互いに排他的ではない。すなわち、ある特定の配列において、１１／１５の切断パターンが見られるならば、１０／１４の切断もまた見られる。制限酵素ＢｓｍＦＩが認識部位から１０／１４で切断するならば、５’オーバーハングはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４となる。ＢｓｍＦＩが認識部位から１１／１５で切断するならば、５’オーバーハングはＸ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３となる。オーバーハングのＸ０が標識ヌクレオチドに対して相補的であるならば、標識ヌクレオチドはＸ０位に取り込まれ、品質保証のレベルを増加させる。これによりさらなる配列情報が提供される。
【０２５８】
例えば、可変部位がアデニンまたはグアニンであり、オーバーハングの３位がアデニンに相補的であるならば、可変部位の遺伝子型の決定に標識ｄｄＡＴＰを使用することができる。１１／１５オーバーハングの０位がアデニンに相補的なヌクレオチドを含有しているならば、ｄｄＡＴＰがはめ込まれ、追加のシグナルが見られる。
【０２５９】
2006521086.tif 000025
【０２６０】
３つのシグナルが見られる。すなわち、０位に取り込まれたオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰに対応するもの、１位に取り込まれたオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰに対応するもの、および３位に取り込まれたオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰに対応するものである。０位、１位および３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的な分子は分子量が異なり、限定はしないが、ゲル電気泳動および質量分析などの、分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて分離することができる。
【０２６１】
一方の対立遺伝子対他方の対立遺伝子の比率の定量、または野生型ＤＮＡ配列の存在下での変異体ＤＮＡ配列の相対量決定のためには、正確で高感度の検出法を用いなければならない。ＩＩＳ型制限酵素によって示される別途切断は、一方の対立遺伝子対他方の対立遺伝子の比率決定における困難さを大きくするものと思われる。なぜならば、この制限酵素は、別途切断（１１／１５）パターンをこの２つの対立遺伝子上で等しく示すとは思われないからである。例えば、対１は、１０／１４での切断が８０％の頻度であって、１１／１５は２０％の頻度であり得る。しかし、２つの対立遺伝子は配列が異なるため、対立遺伝子２は１０／１４での切断が９０％の頻度で、１１／１５が２０％の頻度であり得る。
【０２６２】
定量化のための、前記の別途切断問題は、オーバーハングの０位のヌクレオチドが、標識ヌクレオチドに相補的でない場合は除去することができる。例えば、可変部位がアデニンまたはグアニンに相当し、オーバーハングの３位がアデニンに相補的（すなわち、オーバーハングの３位にチミジンが位置している）ならば、可変部位の遺伝子型の決定に、標識ｄｄＡＴＰを用いることができる。１１／１５切断特性によって生成したオーバーハングの０位がアデニンに相補的でない（すなわち、オーバーハングの０位がグアニン、シトシンまたはアデニンに相当する）ならば、認識部位から１１／１５に切断された断片から追加のシグナルは見られない。オーバーハングに相補的な０位は、未標識ヌクレオチドではめ込みができ、制限酵素の別途切断パターンによって見られる複雑さが除かれる。この方法は、限定はしないが、突然変異または単一ヌクレオチド多形などの可変部位の比率の定量に対して高精度の方法を提供する。
【０２６３】
例えば、ＳＮＰＸがアデニンまたはグアニンであり得れば、制限酵素が別途切断パターンに関し、対立遺伝子間に相違を示すかどうかを決定せずに、アデニンに相当する対立遺伝子およびグアニンに相当する対立遺伝子を定量化することが、この標識法によって可能となる。
【０２６４】
2006521086.tif 000026
【０２６５】
ＢｓｍＦＩの別途切断特性によって生成したオーバーハングを以下に表す。
2006521086.tif 000027
【０２６６】
標識ｄｄＡＴＰおよび未標識ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによるはめ込み後、以下の分子が生成する。
2006521086.tif 000028
【０２６７】
２つのシグナルが見られる。すなわち、１位においてオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰではめ込まれた分子に対応するもの、および３位においてオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰではめ込まれた分子に対応するものである。１１／１５オーバーハングの０位は未標識ヌクレオチドによってはめ込まれ、そのことにより、対立遺伝子１上の可変部位におけるヌクレオチドと対立遺伝子２上の可変部位におけるヌクレオチドとの定量化における困難が除去される。
【０２６８】
アデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、チミジン同族体、あるいはアデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、またはチミジン同族体、あるいはアデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、チミジン同族体、あるいはアデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、またはチミジン同族体の任意の組合わせなどの任意のヌクレオチドを用いることができる。
【０２６９】
限定はしないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、および検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分などの任意の化学基または化学部分によってヌクレオチドを標識できる。ヌクレオチドは、１種以上の化学基または化学部分によって標識できる。
【０２７０】
他の態様において、標識および未標識ヌクレオチドを使用できる。限定はしないが、標識ジデオキシヌクレオチドと標識デオキシヌクレオチド；標識ジデオキシヌクレオチドと未標識デオキシヌクレオチド；未標識ジデオキシヌクレオチドと未標識デオキシヌクレオチド；および未標識ジデオキシヌクレオチドと標識デオキシヌクレオチドなどのデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドとの任意の組合わせが使用できる。
【０２７１】
他の態様において、化学部分で標識されたヌクレオチドをＰＣＲ反応に使用できる。次に、制限酵素による消化後に生成した５’オーバーハングにはめ込みを行うために未標識ヌクレオチドが使用される。関心対象座の対立遺伝子配列を決定するために未標識末端ヌクレオチドが、未標識ヌクレオチドの存在下で使用できる。
【０２７２】
例えば、ＰＣＲ反応に標識ｄＴＴＰが使用された場合、ＢｓｍＦＩによる消化後、以下の５’オーバーハングが生成する。
2006521086.tif 000029
【０２７３】
５’オーバーハングのはめ込みには、未標識ｄｄＡＴＰ、未標識ｄＣＴＰ、未標識ｄＧＴＰ、および未標識ｄＴＴＰが使用できる。２つのシグナルが生成する。すなわち、第１のシグナルは、１位においてオーバーハングに相補的な未標識ｄｄＡＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応し、第２のシグナルは、３位においてオーバーハングに相補的な未標識ｄｄＡＴＰによってはめ込まれた分子に対応する。前記ＤＮＡを分子量に基づいて分離でき、ＰＣＲ反応時に取り込まれたｄＴＴＰの蛍光によって検出できる。
【０２７４】
標識ＤＮＡ関心対象座は、限定はしないが、蛍光検出、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、自動ＤＮＡ塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリー、またはサザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡ断片を「プローブ」と「標的」の双方として使用できるＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光分析、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法などの種々の方法によって分析できる。
【０２７５】
この標識法は極めて感度が良く、限定はしないが、
2006521086.tif 000030
種々の比率の関心対象座の検出を可能にさせる。
【０２７６】
例えば、ＳＮＰ座における対立遺伝子の配列を決定するため、または通常対立遺伝子の集団の中から突然変異対立遺伝子を検出するため、または抗生物質感受性ウィルスの中から薬剤耐性ウィルスの対立遺伝子を検出するため、または病原性細菌株の対立遺伝子の中から、非病原性細菌株の対立遺伝子を検出するために、１シグナル生成部分によって標識した１種のヌクレオチドを使用することが、この標識法によって可能である。
【０２７７】
上記に示したように、ある特定の関心対象座における対立遺伝子配列を決定するために１種のヌクレオチドが使用できる。個体が特定の突然変異に関して、ホモ接合かヘテロ結合かを決定するために、または特定のＳＮＰ部位における対立遺伝子配列を決定するために、この方法は特に有用である。この標識によって、種々の色素の量子係数によって生じる誤差が除去される。また、この方法により、限定はしないが、マイクロ滴定プレートのウェルまたは１つのエッペンドルフ管などの１個の反応容器内で反応を進行させることができる。
【０２７８】
この標識法は、同一試料内の複数の遺伝子シグナルの検出に特に有用である。例えば、この方法は、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの双方を含有する妊娠女性の血液、血清または血漿中の胎児ＤＮＡの検出に有用である。血液、血清または血漿中に母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡは、９７：３などの比率で存在し得るが、上記の方法を胎児ＤＮＡの検出に用いることができる。この方法は、同一集団中、２種、３種、４種、または４種を超える異なった遺伝子シグナルを検出するために使用できる。
【０２７９】
この標識化法は、野生型対立遺伝子の大集団の中に存在する突然変異対立遺伝子の検出に特に有用である。さらに、この方法により、野生型細胞の大集団の中に存在する１個の突然変異体細胞の検出ができる。例えば、この標識化法は、正常細胞の大集団の中に存在する１個の癌細胞の検出に用いることができる。癌細胞は通常、ＤＮＡ配列に突然変異を有する。背景に大量の野生型ＤＮＡ配列がある場合でも、突然変異ＤＮＡ配列を同定することができる。この標識化法は、限定はしないが、結腸、腎臓、乳房、膀胱、肝臓、腎臓、脳、肺、前立腺などの任意のタイプの癌および白血病などの血液癌のスクリーニング、検出、または診断に利用できる。
【０２８０】
また、この標識化法は、細菌、真菌、ウィルス、原生動物およびマイコバクテリアなどの病原性生物の検出にも利用できる。この方法はまた、限定はしないが、細菌、真菌、ウィルス、原生動物およびマイコバクテリアなどの微生物の病原性株と非病原性株とを識別するためにも利用できる。
【０２８１】
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には幾つかの株が存在するが、その多くは非病原性である。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７などの幾つかの株は病原性である。非病原性Ｅ．ｃｏｌｉと病原性Ｅ．ｃｏｌｉとの間には遺伝子の違いがある。上記の標識法は、時には個体の正常な微生物叢に関連している非病原性生物の大集団の中の病原性微生物を検出するために利用できる。
【０２８２】
ＶＩ．関心対象座の分析
限定はしないが、蛍光検出、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、自動ＤＮＡ塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、（例えば、ＡＢＩプリズム３１００ジェネティック・アナライザー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）または、ＡＢＩプリズム３７００ジェネティック・アナライザー）、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩基配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリー、またはサザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡ断片を「プローブ」と「標的」の双方として使用できるＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光分析、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法などの種々の方法によって関心対象座を分析することができる。
【０２８３】
関心対象座は、ゲル電気泳動を用いて分析でき、続いて取り込まれたヌクレオチドを蛍光検出できる。関心対象座を分析または読み取るための他の方法は、９６ウェルのストレプトアビジン被覆プレートに対して直接蛍光プレート読み取り機または蛍光分析計を使用することである。各関心対象座を読み取るために、蛍光プレート読み取り機または、ファルマシア９２００タイフーン（Ｐｆａｒｍａｃｉａ  ９２００  Ｔｙｐｈｏｏｎ）などのスキャナー上にプレートを載せることができる。
【０２８４】
あるいは、関心対象座のＰＣＲ産物をプールでき、「はめ込み」の後に（図１０）その産物をそれらに適切な任意の方法を用いて大きさによって分離でき、次に、限定はしないが、蛍光検出、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、自動ＤＮＡ塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩基配列決定法、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡマイクロアレイなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリーなどの種々の方法を用いて分析できる。例えば、ＤＮＡを大きさによって分離するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動が利用でき、各バンドの蛍光色を測定するために、前記ゲルを走査できる（例えば、ＡＢＩ３７７ＤＮＡ塩基配列決定装置またはファルマシアタイフーン９２００を用いて）。
【０２８５】
他の態様において、関心対象座の配列は、関心対象座に対して３’であるヌクレオチドの取り込みを検出することによって決定できるが、ここで前記ヌクレオチドは、関心対象座において可能なヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである。この態様は、ＳＮＰの塩基配列決定および検出にとって特に有用である。ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドを取り込む効率と速度は、各ヌクレオチドによって変わる。
【０２８６】
ヒトゲノムプロジェクトのデータによると、ＳＮＰの９９％はバイナリーである。関心対象座ＳＮＰに対して３’であるヌクレオチドを決定するためにヒトゲノムの配列を利用することができる。ＳＮＰ部位に対して３’であるヌクレオチドがＳＮＰ部位における可能なヌクレオチドと異なっている場合、ＳＮＰに対して１個または１個を超える塩基の３’であるヌクレオチドが、ＳＮＰ部位の配列を決定するために使用できる。
【０２８７】
例えば、染色体１３上のＳＮＰＸの配列を決定するとしよう。ヒトゲノムの配列により、ＳＮＰＸは、アデノシンまたはグアニンのいずれかであり得ること、また、関心対象座に対して３’ヌクレオチドはチミジンであることが示されている。ＳＮＰＸを含有するＤＮＡ断片を増幅するために増幅後、関心対象座の１３個の塩基であるように設計されている、制限酵素認識を含有するプライマーを利用する。制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化によって、アデノシンまたはグアニンのいずれかであり得る関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成する。消化産物は、２つの「はめ込み」反応に分けることができ、一方の反応はｄＴＴＰを含有し、他方の反応はｄＣＴＰを含有する。関心対象座が、グアニンに関してホモ接合であるならば、ｄＣＴＰと混合したＤＮＡ分子だけがはめ込まれる。関心対象座が、アデノシンに関してホモ接合であるならば、ｄＴＴＰと混合したＤＮＡ分子だけがはめ込まれる。関心対象座がヘテロ接合であるならば、ｄＣＴＰと混合したＤＮＡ分子ならびにｄＴＴＰと混合したＤＮＡ分子がはめ込まれる。余分のｄＮＴＰを除去するための洗浄後、関心対象座に対して３’であるヌクレオチド（チミジン）に相補的な標識ｄｄＡＴＰによって試料にはめ込みを行う。以前の反応によってはめ込まれたＤＮＡ分子は標識ｄｄＡＴＰによってはめ込まれることになる。固体がアデノシンに関してホモ接合であるならば、ｄＴＴＰと混合したＤＮＡは引き続いて標識ｄｄＡＴＰではめ込まれることになる。しかし、ｄＣＴＰと混合したＤＮＡ分子は、そのヌクレオチドを取り込まず、したがって、ｄｄＡＴＰを取り込むことはできないであろう。ｄＴＴＰと混合した分子においてのみ、標識ｄｄＡＴＰが検出されたことにより、染色体１３上のＳＮＰＸにおけるヌクレオチドはアデノシンであることが示される。
【０２８８】
他の態様において、単一ヌクレオチドの多形または突然変異の有無に関して大規模なスクリーニングを実施することができる。１個の染色体または複数の染色体上の１個から数十、数百、数千の関心対象座を、前述の「プライマー設計」の節のとおり、プライマーと共に増幅することができる。増幅された各関心対象座が異なる大きさであるようにプライマーを設計できる（図２）。複数の関心対象座は、１個の染色体、複数の染色体、複数の遺伝子、１個の遺伝子またはそれら任意の組合わせ上にある複数の関心対象座を示している１個体のＤＮＡ試料のものであり得る。
【０２８９】
ヒトのデータを解析している場合、知られた配列は１個体（例えば、現在そのＤＮＡを分析中の個人など）から決定されている特定の配列のこともあり、または、ヒトゲノムの一部として公表されたコンセンサス配列などのこともある。
【０２９０】
関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率
一態様において、関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を算出することができる。関心対象座におけるヌクレオチドの強度を、限定はしないが、ジーンスキャン（ＧｅｅｎＳｃａｎ）およびイメージクオント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）などの任意の数のコンピュータプログラムを用いて定量化できる。例えば、ヘテロ接合ＳＮＰに関しては、２種のヌクレオチドが存在し、各々が１：１の比率で存在し得る。好ましい態様において、複数のヘテロ接合ＳＮＰの比率を算出することができる。
【０２９１】
一態様において、関心対象のヘテロ接合座で対立遺伝子における可変ヌクレオチドに関する比率を算出できる。関心対象座に存在する各々の可変ヌクレオチドの強度を、限定はしないが、ジーンスキャン（ＧｅｅｎＳｃａｎ）およびイメージクオント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）などの任意の数のコンピュータプログラムを用いて定量化できる。例えば、ヘテロ接合ＳＮＰに関しては、２種のヌクレオチドが存在し、各々が１：１の比率で存在し得る。好ましい態様において、複数のヘテロ接合ＳＮＰの比率を算出することができる。
【０２９２】
他の態様において、一染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を合計し、異なる染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。好ましい態様において、一染色体上の複数の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を合計し、異なる染色体上の複数の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。染色体１上のＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４などから得られた比率を合計できる。次にこの比率を、ＳＮＰＡ、ＳＮＰＢ、ＳＮＰＣ、ＳＮＰＤなどから得られた比率と比較することができる。
【０２９３】
例えば、染色体１上の１００種のＳＮＰを分析することができる。これら１００種のＳＮＰのうち、５０種がヘテロ接合であると仮定しよう。染色体１上のヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子の比率を合計できるが、略５０：５０の比率になるはずである。同様に、染色体２１上の分析されたＳＮＰ１００種のうち、５０種がヘテロ接合であると仮定しよう。染色体２１上のヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子の比率を合計する。染色体が正常な数であれば、この比率は略５０：５０のはずであり、したがって、染色体１と染色体２１から得られた比率の間には違いがないはずである。しかし、染色体２１の追加コピーが存在すれば、追加の対立遺伝子が供給され、前記比率は略６６：３３になるはずである。このように、ヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチド類の比率を、染色体異常の有無を検出するために利用できる。異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部欠失、付加、染色体の一部付加、挿入、染色体の断片、染色体の一領域、染色体再配列および転座などの何らかの染色体異常を検出することができる。本法は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ＸＸＹおよびＸＹＹの検出に特に有用である。
【０２９４】
本発明は、ヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の比率を定量化する方法を提供する。関心対象座としては、限定はしないが、単一ヌクレオチド多型、突然変異が挙げられる。遺伝子の全配列を増幅したり、特定の遺伝子産物を定量化する必要はない。本発明は、定量的ＰＣＲに依存しない。
【０２９５】
胎児染色体異常の検出
上記の標題「鋳型ＤＮＡ」の節で検討したように、鋳型ＤＮＡが母体の鋳型ＤＮＡと胎児鋳型ＤＮＡとを含んでなる妊娠女性の試料から鋳型ＤＮＡを得ることができる。一態様において、鋳型ＤＮＡは妊娠女性の血液から得られる。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。
【０２９６】
一態様において、妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡは母体の鋳型ＤＮＡ、および胎児の鋳型ＤＮＡの双方を含んでなる。他の態様において、母体鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質または身体滲出液などの核酸含有供給源から得て配列決定し、妊娠女性の試料から得られた鋳型ＤＮＡについて分析した関心対象座であるホモ接合またはヘテロ接合の関心対象座を同定する。
【０２９７】
好ましい態様において、ホモ接合の関心対象座を同定するために母体鋳型ＤＮＡ上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列を決定する。他の態様において、ヘテロ接合の関心対象座を同定するために母体鋳型ＤＮＡ上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列を決定する。母体鋳型ＤＮＡ上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列は１つの反応または複数の反応において決定できる。
【０２９８】
例えば、染色体の２１上の母体の関心対象座１００個および染色体１上の母体の関心対象座１００個を分析するとすれば、各染色体の略５０個の関心対象座がホモ接合であり、５０個がヘテロ接合であると予想されるであろう。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡを用いて各染色体上のホモ接合の関心対象座５０個またはヘテロ接合の関心対象座５０個、またはホモ接合の関心対象座５０個とヘテロ接合の関心対象座５０個、またはホモ接合の関心対象座とヘテロ接合の関心対象座との任意の組合わせを分析することができる。
【０２９９】
妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、上述の増幅、単離、消化、はめ込み、および検出方法を用いて分析される。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡをスクリーンするために、母体鋳型ＤＮＡ上の関心対象座を分析するために使用した同一のプライマーが用いられる。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡ上の任意の数の関心対象座を分析することができる。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡにおいて、例えば、１、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０．９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００個、または４０００個を超えるホモ接合の母体関心対象座を分析することができる。好ましい態様において、複数の染色体上の複数の関心対象座が分析される。
【０３００】
ホモ接合の母体関心対象座の集団で、妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡから、ヘテロ接合の関心対象座とホモ接合の関心対象座の双方が存在し、ヘテロ接合の関心対象座をさらに分析することができる。存在する染色体の数を決定するためにヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の比率が利用できる。
【０３０１】
染色体上の染色体異常を通常伴わないヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率を決定することによって、妊娠女性の試料に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージを算出することができる。好ましい一態様において、胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定するために、一染色体上の複数のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率が利用できる。例えば、胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定するためにヒトゲノムにおいて最も大きな染色体１を用いることができる。
【０３０２】
例えば、母体鋳型ＤＮＡ（Ａ／Ａ）において、ＳＮＰＸがホモ接合であると仮定しよう。ＳＮＰＸにおいて、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの双方を含有し得る妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡはヘテロ接合（Ａ／Ｇ）である。ＳＮＰＸにおいて、母体はホモ接合であるため、ヌクレオチドのグアニンは胎児のＤＮＡを表しており、したがって、グアニンは胎児ＤＮＡのものである。ＳＮＰＸにおけるグアニンを用いて、試料中の胎児ＤＮＡパーセンテージを算出できる。
【０３０３】
あるいは、胎児ＤＮＡパーセンテージを決定するために、２本以上の染色体上の複数の関心対象座を調査できる。胎児ＤＮＡパーセンテージを決定するために、例えば、染色体１３および１８上の複数の関心対象座を調べることができる。というのは、染色体１３および１８における染色体異常を有する生物は生存できないからである。
【０３０４】
あるいは、試料中に存在する胎児ＤＮＡの量を決定するために、男性胎児では、Ｙ染色体上のマーカーが使用できる。妊娠女性の試料から単離された鋳型ＤＮＡを用いて１区画の連続希釈を行うことができ、定量的ＰＣＲ分析を実施できる。２つのＰＣＲ反応を実施できる。すなわち、一方はＹ染色体上のマーカー、例えばＳＲＹを増幅するＰＣＲ反応、および他方はいずれかの常染色体上の一領域を増幅するＰＣＲ反応である。以下の式を用いて、胎児ＤＮＡの量が算出できる。
胎児ＤＮＡパーセント：（検出Ｙ染色体最終希釈／検出常染色体最終希釈）＊２＊１００。
【０３０５】
仮に、ＳＮＰ  Ａにおいて、母親がホモ接合のＡ／Ａであって、胎児がヘテロ接合のＡ／Ｇであれば、Ａ：Ｇの比を用いて染色体異常を検出することができる。仮に、胎児由来のＤＮＡが、母親由来の血液中のＤＮＡの５０％であれば、母親由来のヌクレオチドがアデニンで、また他のヌクレオチドがグアニンであるＳＮＰ  Ａとなり、グアニン（胎児の鋳型ＤＮＡに由来する）に対するアデニン（２つのアデニンが母親の鋳型ＤＮＡに由来し、また１つが胎児の鋳型ＤＮＡに由来する）の比は、２５：７５すなわち０．３３と予測される。しかし、仮に、胎児が、特定の染色体のトリソミーであり、追加の染色体が母親からの寄与によるものである場合、つまり追加のアデニンヌクレオチドが存在する場合、同比は０．２５（５０（Ｇ）／（母親由来の２＊５０のＡ＋胎児由来の２＊５０のＡ））と予測することができる。したがって、２コピーで存在する染色体から得られる比と、トリソミー状態で存在する染色体から得られる比の間には８％の差がある。一方で、仮に、追加の染色体が父親からの寄与によるものである場合、つまり追加のグアニンが存在する場合、同比は０．６６となる（胎児由来の２＊５０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊５０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の５０のＡ対立遺伝子）。
【０３０６】
しかし、仮に、胎児由来のＤＮＡが母親由来の血液中のＤＮＡの４０％を占める場合、（トリソミーの場合を除く）予測比率は０．２５である（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊６０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の１＊６０のＡ対立遺伝子））。仮に、胎児がトリソミーの場合、また追加の染色体が母親からもたらされる場合であれば、予測比率は０．２０となる（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊６０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の２＊４０のＡ対立遺伝子）。２コピーで存在する染色体から得られる比、トリソミー状態で存在する染色体から得られる比の差は５％となる。
【０３０７】
他の態様において、複数の染色体上の複数の関心対象座を調査できる。一染色体上の各へテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の比率を合計でき、別の染色体上の各関心対象座における対立遺伝子の比率と比較できる。比較される染色体はヒト起源のものであり得、限定はしないが、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹが挙げられる。複数の染色体から得られた比率を１個の染色体または複数の染色体から得られた比率と比較できる。
【０３０８】
一態様において、比較に用いられる染色体の１つは、染色体１３、１５、１６；１８、２１、２２、ＸまたはＹであり得る。好ましい一態様において、染色体１３、１８および２１についての比率が比較される。
【０３０９】
例えば、妊娠女性に由来する試料中の胎児ＤＮＡが４０％であると仮定すると、第１染色体上のヘテロ接合の対象遺伝子座における対立遺伝子の比は０．２５となる（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊６０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の４０のＡ対立遺伝子）。同様に、第２１染色体上のヘテロ接合の対象遺伝子座における対立遺伝子の比は０．２５となる。しかし、追加の染色体が母親からの寄与によるトリソミー２１の胎児では、第２１染色体上のヘテロ接合の対象遺伝子座におけるヌクレオチドは０．２０の比で存在することになる（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の６０＊２のＡ対立遺伝子＋胎児由来の４０＊２のＡ対立遺伝子）。これとは対照的に、第１染色体に関する比は０．２５で変わらないので、比に見られる５％の差は、追加の染色体の存在を意味する。１〜１０〜１００〜１０００の対象遺伝子座を分析することができる。
【０３１０】
別の態様では、妊娠女性由来の試料に由来する鋳型ＤＮＡ上の対象遺伝子座の遺伝子型を、母親の対象遺伝子座がホモ接合であることを事前に確認することなく決定することができる。母親と胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む鋳型ＤＮＡの分析に先だって、母親の鋳型ＤＮＡの遺伝子型を決定する必要はない。
【０３１１】
染色体異常の有無を決定するために関心対象座における対立遺伝子の比率を利用できる。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡは、母体鋳型ＤＮＡおよび胎児鋳型ＤＮＡの双方を含有している。母体鋳型ＤＮＡまたは胎児鋳型ＤＮＡのいずれかに関する各ＳＮＰにおいて３つの可能性が存在する。すなわち、対立遺伝子１に関してヘテロ接合、ホモ接合または対立遺伝子２に関してホモ接合である。アデニンまたはグアニンのいずれかであるＳＮＰに関するヌクレオチドの可能な比率を表ＩＩに示してある。表ＩＩに示された比率は、妊娠女性の試料中ＤＮＡの５０％が胎児ＤＮＡとして算出してある。
【０３１２】
（表ＩＩ）ヘテロ接合型のＳＮＰに関するヌクレオチドについての比
2006521086.tif 000031
【０３１３】
３つのヌクレオチド比が存在する。すなわち、単一ヌクレオチド１００％、５０：５０または７５：２５である。これらの比率は、妊娠女性の試料中に存在する胎児ＤＮＡ量に依って変わる。しかし、胎児ＤＮＡのパーセンテージは、分析された染色体に係らず一定になるはずである。したがって、染色体が２つのコピーにおいて存在するならば、上記の算出比が見られるであろう。
【０３１４】
一方、これらのパーセンテージは、過剰の染色体が存在すれば変化するであろう。例えば、ＳＮＰＸがアデニンまたはグアニンであり得るとし、妊娠女性の試料中の胎児ＤＮＡのパーセンテージが５０％であると仮定しよう。染色体１上の関心対象座の分析により、上記で検討された比率、すなわち１００：０、５０：５０および７５：２５が与えられるであろう。過剰の染色体を有した場合のＡ／ＧであるＳＮＰに関する可能な比率を表ＩＩＩに示してある。
【０３１５】
（表ＩＩＩ）染色体のさらなるコピーが存在するときの、ＳＮＰにおけるヌクレオチド比
2006521086.tif 000032
【０３１６】
一染色体の追加のコピーを有するヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子に関する可能な比率は、０：１００、４０：６０、および２０：８０である。これらの比率のうちの２つ、４０：６０と２０：８０は、一染色体の２つのコピーを有して得られたヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子の比率とは異なる。上記で検討したように、ヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドに関する比率は、試料中に存在する胎児ＤＮＡ量に依存する。しかし、比率がどうあろうとも、それらは、染色体異常がない限り、染色体全てに亘って一定に保たれるであろう。
【０３１７】
ある染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率を、別の染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率と比較することができる。例えば、染色体１上の複数の関心対象座に関する比率（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４などにおける比率）を、染色体２１上の複数の関心対象座に関する比率（ＳＮＰＡ、ＳＮＰＢ、ＳＮＰＣ、ＳＮＰＤなどにおける比率）と比較できる。任意の染色体を他の任意の染色体と比較できる。比較できる染色体の数に制限はない。
【０３１８】
再び表ＩＩおよび表ＩＩＩのデータを参照すると、２つのコピーで存在した染色体１上のヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの比率は２５：７５および５０：５０であった。一方、３つのコピーで存在する染色体２１上のヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの比率は４０：６０および２０：８０であった。これら２種の比率の間の違いは、染色体異常を示している。これらの比率は、母体血清中に存在する胎児ＤＮＡの変化する度合いの全範囲に対して前計算できる。胎児の染色体異常の存在を検出するために、母体のホモ接合およびヘテロ接合の関心対象座双方が使用できることを表ＩＩおよびＩＩＩは示している。
【０３１９】
追加染色体の存在を検出するために、ヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの比率をどのように利用するかを、上記の例は示している。染色体再配列、転座、微小染色体、染色体領域の重複、モノソミー、染色体領域の欠失、および染色体の断片を検出するために同じタイプの分析を用いることができる。本法は、母親または父親の遺伝子型決定を必要としないが、血漿試料とともに分析する必要のあるＳＮＰの数を減らしてもよい。
【０３２０】
本発明は、胎児の遺伝子産物量を定量しない。また、本発明の利用法は、Ｙ染色体上に見られる遺伝子分析に限定されてはいない。本発明は、単に父親から遺伝された核酸の検出に依存せず、むしろ本発明は、ＳＮＰを含む関心対象座における母親の対立遺伝子対胎児の対立遺伝子の比の算出を可能にする方法を提供する。
【０３２１】
別の態様では、対象遺伝子座における１つの対立遺伝子を使用して染色体異常の有無を判定し、また胎児の遺伝性疾患を検出することができる。好ましい態様では、対象遺伝子座における母親の対立遺伝子を使用して、胎児における染色体異常の有無を判定する。生物学的な母親の遺伝子型を決定して、対象遺伝子座がホモ接合であることを同定することができる。同様に、生物学的な父親の遺伝子型を決定して、対象遺伝子座がホモ接合であることを同定することができる。１つの対立遺伝子に関して母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また他の対立遺伝子に関して父親の鋳型ＤＮＡがホモ接合である対象遺伝子座を、母親と胎児の両方の鋳型ＤＮＡを含む、母親の血漿から得られた鋳型ＤＮＡを用いて分析する。１、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜８０００、８０００〜１６０００、１６０００〜３２０００、または３２０００を超える対象遺伝子座を含むがこれらに限定されない、任意の数の対象遺伝子座を分析することができる。
【０３２２】
好ましい態様では、母親由来のゲノム、および対象遺伝子座における、母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子に由来するシグナルを定量する。例えば、仮に、ＩＩＳ型酵素による切断後に生じる５’オーバーハングが、蛍光標識されたＡヌクレオチドで埋められると、取り込まれた色素の強度を定量することができる。
【０３２３】
母親の鋳型ＤＮＡ−−アデニンに関してホモ接合
2006521086.tif 000033
父親の鋳型ＤＮＡ−−シトシンに関してホモ接合
2006521086.tif 000034
血漿中の鋳型ＤＮＡ−−母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方
母親の鋳型ＤＮＡ−−アデニンに関してホモ接合
2006521086.tif 000035
胎児の鋳型ＤＮＡ−−ヘテロ接合
2006521086.tif 000036
【０３２４】
妊娠女性の血漿から得られた鋳型ＤＮＡが、標識ｄｄＡＴＰ、および非標識のｄｄＣＴＰ（上記のｄｄＣ）、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰで埋められる。血漿ＤＮＡは、母親由来の２本のアデニン対立遺伝子、および胎児由来の１本のアデニン対立遺伝子を含む。標識ｄｄＡＴＰおよび非標識ｄｄＣＴＰによって埋められることで、母親の対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子のみが検出される。父親の対立遺伝子は、このような場合には検出されない。このはめ込み反応は、実施例に記載された手順で実施することができる。
【０３２５】
１つの対象遺伝子座、または複数の対象遺伝子座を分析することができる。複数の対象遺伝子座における、母親由来の対立遺伝子の強度を定量することができる。１つの染色体に関して平均値を算出し、これを、異なる染色体について得られた平均値と比較することができる。例えば、第１染色体に関して、母親由来の対立遺伝子と、母親から受け継いだ胎児由来の対立遺伝子の平均強度を、第１３染色体、第１８染色体、または第２１染色体に関する母親の対立遺伝子と、母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子の平均強度と比較することができる。好ましい態様では、第１３染色体、第１５染色体、第１８染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体（可能な場合）を比較する。
【０３２６】
対象遺伝子座に由来するシグナルは、別の対象遺伝子座より強い場合がある。しかし、１本の染色体上の対象遺伝子座に由来するシグナルが、他の染色体上の対象遺伝子座に由来するシグナルより強くなるという理由はない。さまざまな対象遺伝子座に由来するシグナルが多様性を示す可能性がある一方で、このような多様性は、ゲノム全体にわたってみられるはずである。対象遺伝子座の平均シグナルは、どの染色体を比較しても同じはずである。
【０３２７】
等量のＰＣＲ産物の量が生じるようにＰＣＲ反応条件を最適化することができる。例えば、個々の対象遺伝子座に関して、プライマー濃度、ヌクレオチド濃度、およびサイクル数を最適化することができる。また、特定の対立遺伝子の何らかの増加を検出することが可能な条件ではめ込み反応を実施することができる。はめ込み反応の条件を最適化することで、試薬濃度、はめ込み反応時間、および反応温度を含むがこれらに限定されない、対象対立遺伝子の何らかの増加を検出することができる。
【０３２８】
通常の遺伝子核型の場合、個々の対象遺伝子座におけるシグナルは、母親由来のゲノムに由来するシグナルと、この母親から受け継いだ胎児由来の対立遺伝子に由来するシグナルを含む。試料中の胎児ＤＮＡのパーセントは、分析対象の染色体にかかわらず一定である。例えば、仮に、ＳＮＰ  Ｘにおいて、母親由来のゲノムがＡ／Ａであり、また父親由来のゲノムがＧ／Ｇであれば、胎児のゲノムはＡ／Ｇとなり、また胎児のアデニン対立遺伝子は、アデニン対立遺伝子に由来する特定のパーセンテージのシグナルを含むことになる。仮に、母親の血漿中における胎児ＤＮＡのパーセンテージが２０％であれば、胎児のアデニン対立遺伝子は、アデニン対立遺伝子に関してシグナルの２０％に寄与することになる。母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子の寄与は、分析対象のどの対象遺伝子座に関しても一定となる。
【０３２９】
染色体異常がある場合は、母親由来のゲノム、および対象遺伝子座において、母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子に由来するシグナルは、他の染色体について観察されるシグナルとは異なることになる。例えば、トリソミーの場合であれば、対象遺伝子座におけるシグナルは、母親由来のゲノム、および母親から受け継いだ、胎児の２本の対立遺伝子を含むことになる。３コピーが存在する染色体に関して、対象遺伝子座に由来するシグナルは、このような対象遺伝子座における対立遺伝子のシグナルを変化させることになる、追加の胎児対立遺伝子の寄与を含むことになる。
【０３３０】
別の態様では、１つの対立遺伝子と既知量の標準ＤＮＡを用いて比率を計算することができる。好ましい態様では、母親由来のゲノムの対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子、ならびに標準ＤＮＡを用いて比を計算する。対象遺伝子座がホモ接合であることを同定するためには、生物学的な母親の遺伝子型を決定するとよい。同様に、生物学的な父親の遺伝子型を決定することで、対象遺伝子座がホモ接合であることを同定することができる。１つの対立遺伝子に関して母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また別の対立遺伝子に関して父親の鋳型ＤＮＡがホモ接合である対象遺伝子座を、母親の血漿（母親と胎児の両方の鋳型ＤＮＡを含む）から得られる鋳型ＤＮＡを用いて分析する。
【０３３１】
好ましい態様では、母親由来のゲノム、および対象遺伝子座に関して母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子に由来するシグナルを定量する。例えば、仮に、ＩＩＳ型酵素による切断で生じる５’オーバーハングが、蛍光標識されたＡヌクレオチドで埋められると、取り込まれた色素の強度を定量することができる。
【０３３２】
血漿中の鋳型ＤＮＡ−−母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方
母親の鋳型ＤＮＡ−−アデニンに関してホモ接合
2006521086.tif 000037
胎児の鋳型ＤＮＡ−−ヘテロ接合
2006521086.tif 000038
【０３３３】
妊娠女性の血漿から得られる鋳型ＤＮＡは、標識ｄｄＡＴＰ、および非標識のｄｄＣＴＰ（上記のｄｄＣ）、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰで埋められる。血漿ＤＮＡは、母親由来の２つのアデニン対立遺伝子と、胎児由来の１つのアデニン対立遺伝子を含む。標識ｄｄＡＴＰと非標識ｄｄＣＴＰによって埋められることによって、母親の対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子のみが検出される。
【０３３４】
１つの対象遺伝子座、または複数の対象遺伝子座を分析することができる。個々の対象遺伝子座に関して、対象遺伝子座とほぼ同じ位置に移動するようにＤＮＡ分子を設計する。好ましい態様では、このようなＤＮＡ分子の量は既知である。母親由来のゲノムの対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子、ならびに対象遺伝子座とほぼ同じ位置に移動するように設計されたＤＮＡ分子を用いて比を計算する。例えば、仮に、対象遺伝子座を３０塩基対に移動するように設計する場合、ＤＮＡ分子を、２０〜２５塩基、２５〜３０塩基、３０〜３５塩基、３５〜４５塩基、および４５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、約３０塩基対に移動するように設計することができる。母親由来のゲノムの対立遺伝子、およびその母親に由来する胎児の対立遺伝子、ならびに標準ＤＮＡ分子を、同じ反応で分析することができるほか、個別の反応で分析することができる。母親由来のゲノムの対立遺伝子、およびその母親に由来する胎児の対立遺伝子、ならびに標準ＤＮＡ分子を、１枚のゲルの同じレーンで分析することができるほか、１枚のゲルの別のレーンで分析することができる。対象遺伝子座と同じ位置に移動するように設計された既知量の標準ＤＮＡ分子の使用は、ゲル上の位置に対するバンドの強度を含むがこれらに限定されない、さまざまな因子を矯正することになる。
【０３３５】
染色体上の複数の対象遺伝子座の比を定量し、平均値を算出することができる。こうして得られた平均値を、他の染色体について得られた平均値と比較することができる。こうして得られた比を用いることで染色体異常の有無がわかる。母親由来のゲノムの対立遺伝子および胎児の対立遺伝子の分析により、１つの遺伝子が関与する遺伝性疾患、または複数の遺伝子が関与する遺伝性疾患の検出も可能となる。
【０３３６】
本発明の方法を用いて、任意の生物の任意の染色体を分析できる。例えば、ヒトでは、本発明の方法を用いて、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸまたはＹを分析できる。任意の染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率を、他の任意の染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率と比較することができる。
【０３３７】
このように本発明は、胎児における染色体異常の迅速で精確で決定的な検出のための、胎児細胞の単離に依存しない非侵襲的方法を提供する。また、本発明は、胎児のＤＮＡ配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。本発明は、限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化など、野生型配列に較べた場合の遺伝子配列における何らかの変化を検出するために利用できる。
【０３３８】
短縦列反復を用いた胎児染色体異常の検出
短縦列反復（ＳＴＲ）は、前後様式で多数回反復されている長さが、通常２〜５塩基対の短いＤＮＡ配列である。縦列反復ＤＮＡ配列は、ヒトゲノム全体で広く存在しており、集団内の個体間で十分な変異性を示している。微小付随体は９〜８０塩基対のコア反復を有する。
【０３３９】
他の態様において、胎児の染色体異常を検出するために、短縦列反復を用いることができる。鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質または身体滲出液などの核酸含有試料から得ることができる。他の態様において、核酸含有試料に、細胞溶解阻害剤を加える。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液から得られる。他の態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。
【０３４０】
妊娠女性の血液から得られた鋳型ＤＮＡは、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの双方を含有する。胎児ＤＮＡは母親から、および父親からのＳＴＲ類を含んでなる。染色体異常を検出するために母親と父親の間のＳＴＲ類における変異を利用することができる。
【０３４１】
短縦列反復を増幅するためにプライマーを設計できる。限定はしないが、ポリメラーゼ連鎖反応、自立配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ端の高増幅、ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、鎖置換増幅、およびスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応などの任意の増幅法が使用できる。
【０３４２】
限定はしないが、１〜５、５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００および１０００を超える任意の数の短縦列反復を分析できる。短縦列反復は、１つのＰＣＲ反応において、または複数のＰＣＲ反応において分析できる。好ましい態様において、複数の染色体のＳＴＲ類を分析する。
【０３４３】
増幅後、限定はしないが、ゲル電気泳動および質量分析などの任意の数の方法によってＰＣＲ産物を分析できる。妊娠女性の鋳型ＤＮＡは、母親起源のＳＴＲ類と父親起源のＳＴＲ類を含んでいる。父親起源のＳＴＲ類が胎児ＤＮＡを表す。父親起源のＳＴＲ類と母親起源のＳＴＲ類とは、長さが同一であり得るか、あるいは、父親起源のＳＴＲ類と母親起源のＳＴＲ類とは、長さが異なり得る。
【０３４４】
ヘテロ接合ＳＴＲ類は、母親のものと父親のものとで長さが異なるＳＴＲ類である。各ＰＣＲ産物量を、各ヘテロ接合のＳＴＲ類に関して定量化できる。染色体の数が正常であれば、ＰＣＲ産物量は略等しくなるはずである。しかし余分な染色体があれば、ＳＴＲ  ＰＣＲ産物のうちの１つがより多量に存在することになろう。
【０３４５】
例えば、妊娠女性の血液から得られた鋳型ＤＮＡについて、染色体１以上の複数のＳＴＲ類を分析できる。各ＳＴＲは、母親起源であっても、また父親起源であっても略同僚で存在するはずである。同様に、２つの染色体２１でも、各ＳＴＲは略同僚で存在するはずである。しかし、トリソミー２１では、母親のものと父親のものとで長さが異なれば（ヘテロ接合ＳＴＲ）、ＳＴＲ  ＰＣＲ産物のうちの１つがより多量に存在するはずである。１つの染色体上の各へテロ接合ＳＴＲの比を、別の染色体上の各へテロ接合ＳＴＲの比と比較することができ、ここでの違いが、染色体異常の有無を示す。
【０３４６】
キット
本発明の方法は、本法に用いられる試薬をキットの形態で提供することにより最も利便性よく実施される。キットは１種以上の以下の成分を含有することが好ましい：キットの使用説明書、別々の容器またはパッケージに封鎖した適切な緩衝剤、塩類、ＤＮＡ抽出清浄剤、プライマー、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、５’修飾物質および所望の場合、適切な純度の水、キットの使用者が本発明の方法によって適切な核酸試料を抽出し、それを分析することを可能にするような成分。キットで提供されるプライマーは、キットの目的およびそのキットを用いて試験することが望まれているＤＮＡに依って変わる。
【０３４７】
キットはまた、所望の、または種々の単一ヌクレオチド多形、特に望ましくない病態または疾病を伴う単一ヌクレオチド多型を検出するために設計できる。例えば、あるキットは、他にも成分はあるが、ハンチントン病に関連した１つ以上の関心対象座を増幅するための１セットの、または複数のセットのプライマーを含んでなり得る。他のキットは、他にも成分はあるが、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病を発症する体質に関連した遺伝子に対する１セットの、または複数の組のプライマーを含んでなり得る。さらに他のキットは、他にも成分はあるが、心疾患を発症する体質に関連した遺伝子に対する１セットの、または複数のセットのプライマーを含んでなり得る。このようなキットの利用法に関する詳細は下記の「利用法」の節に提供している。
【０３４８】
利用法
本発明の方法は、個体の遺伝子型を知ることが望まれる場合にはいつでも使用できる。本発明の方法は、遺伝子疾患の検出に特に有用である。本発明の方法は、胎児における遺伝子疾患の検出目的の非侵襲的方法として特に有用である。好ましい態様において、本発明の方法は、単一のヌクレオチド多型の同定法を提供する。
【０３４９】
好ましい態様において、限定はしないが、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、付加、染色体再配列、転座および他の異数体などの染色体異常を検出するために有用である。本法は、胎児における染色体異常を検出するために特に有用である。
【０３５０】
好ましい態様において、本発明の方法は、胎児における疾病の存在、特に、ある遺伝子配列の存在の結果生じる遺伝子疾患、または遺伝子配列を知ることが望まれる個人において、同定が望まれる他の生物学的状態の同定を目的とした方法を提供する。このような遺伝子配列の存在に基づいた胎児におけるこのような配列の同定は、例えば、胎児がキャリアかどうかを決定するために、または胎児がある一定の遺伝子的特徴、病態または疾病を発症させる体質であるかどうかを判断するために使用できる。本発明の方法は、親と子の出生前遺伝子検査において特に有用である。
【０３５１】
本発明により診断し得る疾病の例を表に挙げてある。
【０３５２】
（表ＩＶ）
2006521086.tif 000039
2006521086.tif 000040
2006521086.tif 000041
2006521086.tif 000042
2006521086.tif 000043
【０３５３】
本発明の方法は、遺伝子的特徴または遺伝子疾患を伴う数十、数百、数千の複数の関心対象座において、その特徴または疾病状態を伴う関心対象座、特に、そのような特徴または病態を伴うことが最も多い関心対象座の塩基配列決定によって個人をスクリーニングするために有用である。本発明は、限定はしないが、心疾患、癌、内分泌疾患、免疫障害、神経学的障害、筋骨格障害、眼科学的障害、遺伝子異常、トリソミー、モノソミー、トランスバージョン、転座、皮膚障害および家族性疾患などの特定の疾患集団の分析に有用である。
【０３５４】
また、本発明の方法は、例えば、母親または父親の検査などに使用するため、公知の供給源または配列のＤＮＡに対する、未知の配列ＤＮＡの関係を確証、または同定するために使用できる。
【０３５５】
本発明を全般的に説明したところで次に、ある特定の実施例を参照することにより、本発明の理解はさらに深まるであろう。本明細書に含まれている実施例は例示のみを目的としており、他に特記しない限り、限定を意図するものではない。
【０３５６】
実施例
以下の実施例は、例示のみであり、請求項で規定された本発明の範囲を限定する意図はない。
【０３５７】
実施例１
ＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅したが、非特異的増幅を減少させるために指定温度において、サイクル１を実施してから、サイクル２で温度を上げ、さらにサイクル３で温度を上げた。第２のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の融解温度を算出することによって、ＰＣＲのサイクル１のＴＭ１を決定した。例えば、図１Ｂにおいて、ＴＭ１は領域「ｃ」の略融解温度であり得る。アニーリング温度は、サイクル２において、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度であるＴＭ２へと上昇させた。例えば図１Ｃにおいて、アニーリング温度（ＴＭ２）は、領域「ｂ」の融解温度に相当する。サイクル３において、アニーリング温度は、第２のプライマーの全配列の略融解温度であるＴＭ３へと上昇させた。例えば図１Ｄにおいて、アニーリング温度（ＴＭ３）は、領域「ｃ」＋領域「ｄ」の融解温度に相当する。増幅の残りのサイクルはＴＭ３で実施した。
【０３５８】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した５ｍｌの血液試料から調製した。血液は３６人の志願者から採血した。ＱＩＡＧＥＮより供給されたＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡブラッド・ミディ・キット（Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて、各血液試料から鋳型ＤＮＡを単離した。３６人の志願者各人の鋳型ＤＮＡを、さらなる分析のために単離後プールした。
【０３５９】
プライマー設計
以下の４つの単一ヌクレオチド多型を分析した。すなわち、染色体２１上に位置する、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベースに帰属する同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０（図３、レーン１）；染色体１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図３、レーン２）、染色体１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６（図３、レーン３）、および染色体１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（図３、レーン４）である。ＳＮＰ合弁会社（ＳＮＰ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｌｔｄ．）のデータベースは、２００２年２月１４日時点で有効が確認されたウェブサイトアドレス、http://snp.cshl.org./でアクセスできる。
【０３６０】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000044
第２のプライマー：
2006521086.tif 000045
【０３６１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000046
第２のプライマー：
2006521086.tif 000047
【０３６２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000048
第２のプライマー：
2006521086.tif 000049
【０３６３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000050
第２のプライマー：
2006521086.tif 000051
【０３６４】
全てのプライマーは、その３’領域が各関心対象座にフランキングする上流または下流の配列に相補的であるように、また、５’領域が制限酵素認識部位を含有するように設計された。第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した。
【０３６５】
ＰＣＲ反応
４つの関心対象座全てを、ＰＣＲを用いて鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）。ＰＣＲ反応の構成要素は以下のとおりである：４０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、５μＭの第１のプライマー、５μＭの第２のプライマー、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手された１×ホットスターＴａｑマスター・ミックス（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（カタログ番号２０３４４３）。ホットスターＴａｑマスター・ミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝剤、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有した。
【０３６６】
関心対象座ＳＮＰを含有する各鋳型ＤＮＡの増幅は、本明細書で厳密な低アニーリング温度、厳密な中アニーリング温度、厳密な高アニーリング温度と称される３つの異なる一連のアニーリング温度を用いて実施した。アニーリング温度プロトコルに係りなく、各ＰＣＲ反応は、４０サイクルの増幅からなっていた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスを用いて実施した。製造元による教示のとおり、ＰＣＲの最初のサイクル前に、反応液を９５℃で１５分間温置した。各伸長ステップ後の変性ステップは、９５℃で３０分間行った。温度を上げることなく効率的な伸長が可能な温度でアニーリング反応を実施した。
【０３６７】
厳密な低アニーリング反応は、最初の３つのサイクルの各々における異なるアニーリング温度を含んでなる。すなわち、第１のサイクルのアニーリング温度は３７℃で３０秒；第２のサイクルのアニーリングは５７℃で３０秒；第３のサイクルのアニーリング温度は６４℃で３０秒であった。引き続くサイクルから完了までのアニーリングは６４℃で実施した。
【０３６８】
ゲルの写真（図３Ａ）に示されるように、ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（レーン４）の増幅後に複数のバンドが見られた。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０（レーン１）、ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（レーン２）、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６（レーン３）の増幅では、強度の高い１本のバンドおよび、より高分子量のものである微弱な強度のバンド１本が生成した。低アニーリング温度条件が用いられた場合、正確な大きさの産物が生成したが、これは各反応における主産物であった。
【０３６９】
厳密な中アニーリング反応は、最初の３つのサイクルの各々における異なるアニーリング温度を含んでなる。すなわち、第１のサイクルのアニーリング温度は４０℃で３０秒；第２のサイクルのアニーリングは６０℃で３０秒；第３のサイクルのアニーリング温度は６７℃で３０秒であった。引き続くサイクルから完了までのアニーリングは６７℃で実施した。厳密な低アニーリング条件下で見られたことと同様に、ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（図３Ｂ、レーン４）の厳密な中等度条件下の増幅により、複数のバンドが生成した。他の３種のＳＮＰ（レーン１〜３）の増幅では、１本のバンドが生成した。その結果、１３塩基のアニーリング長を有するプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから関心対象座を間違いなく増幅するために、アニーリング温度を変化させて使用できることがわかった。
【０３７０】
厳密な高アニーリング反応は、最初の３つのサイクルの各々における異なるアニーリング温度を含んでなる。第１のサイクルのアニーリング温度は４６℃で３０秒；第２のサイクルのアニーリングは６５℃で３０秒；第３のサイクルのアニーリング温度は７２℃で３０秒であった。引き続くサイクルから完了までのアニーリングは７２℃で実施した。ゲルの写真（図３Ｃ）に示されるように、厳密な高アニーリング温度を用いたＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（レーン４）の増幅により、正確な分子量の単一バンドが生成した。最初の３つのサイクルの各々に関してアニーリング温度を上げることにより、非特異的増幅が排除された。ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１１２（レーン２）の増幅により１本のバンドが生成した。ＳＮＰのＨＣ２１Ｓ００３４０（レーン１）とＴＳＣ０２１４３６６（レーン３）は、厳密な高アニーリング温度において増幅できなかったが、厳密な中アニーリング温度で、これらのＳＮＰは、１本のバンドとして増幅された。その結果、ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（図３、レーン４）に対して示されているように、非特異的ＰＣＲ産物を減少させるために、アニーリング温度を変化させて使用できることがわかった。
【０３７１】
実施例２
染色体１上のＳＮＰ（ＴＳＣ００９５５１２）、染色体１３上のＳＮＰ（ＴＳＣ０２６４５８０）および染色体２１上のＳＮＰ（ＨＣ２１Ｓ０００２７）を分析した。ＴＳＣ００９５５１２は２つの異なるプライマーセットを用いて分析し、ＨＣ２１Ｓ０００２７はヌクレオチドの取り込みに関して、２種の反応を用いて分析した。
【０３７２】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した５ｍｌの血液試料から調製した。ＱＬＡＧＥＮより供されたＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡブラッド・ミディ・キット（Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて、鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡは、前記キットに含まれる使用説明書に従って単離した。単離後、３６人のヒト志願者の鋳型ＤＮＡを一緒にプールし、制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断した。製造元の使用説明書に従って制限酵素消化を実施した。
【０３７３】
プライマー設計
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000052
第２のプライマー：
2006521086.tif 000053
【０３７４】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した（図４Ａ）。
【０３７５】
また、ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、同一の第１のプライマーおよび以下の配列を有する異なる第２のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
第２のプライマー：
2006521086.tif 000054
【０３７６】
この第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した（図４Ｂ）。
【０３７７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000055
第２のプライマー：
2006521086.tif 000056
【０３７８】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した（図４Ｃ）。
【０３７９】
またＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、同一の第１のプライマーおよび以下の配列を有する第２のプライマーを用いて増幅した：
第２のプライマー：
2006521086.tif 000057
【０３８０】
この第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した（図４Ｄ）。
【０３８１】
染色体１３上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000058
第２のプライマー：
2006521086.tif 000059
【０３８２】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０３８３】
ＰＣＲ反応
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９６号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、４０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０３８４】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０３８５】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２に関するＰＣＲ産物は、図５Ａ〜５Ｄに示してある。
【０３８６】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。各ＰＣＲ産物を、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの４つの別々の反応ウェルに分割した。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０３８７】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素により、精製ＰＣＲ産物を消化した。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図６Ａと６Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図６Ｃと６Ｄ）を、２種の異なる第２プライマーを用いて別々の反応において増幅した。図６Ａ（ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７）および図６Ｃ（ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２）は、制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化後のＰＣＲ産物を表している（ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号Ｒ０５７２Ｓ）。図６Ｂ（ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７）および図６Ｄ（ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２）は、制限酵素ＢｃｅＡＩによる消化後のＰＣＲ産物を表している。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。ＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０は、ＢｓｍＦＩにより消化された。適切な制限酵素による消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０３８８】
標識ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０３８９】
各ＳＮＰに対し、４つの別々のはめ込み反応を行ったが、４つの反応の各々が異なる蛍光標識をしたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ）を含有した。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、蛍光標識したヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ヌクレオチドは、ファーメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、ＳＮＰまたは関心対象座に相当する１塩基だけ伸長した（図７Ａ〜７Ｄ）。
【０３９０】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７に関する「はめ込み」反応には、標識ｄｄＮＴＰと未標識ｄＮＴＰ類との混合物もまた、用いられた。４０μＭの未標識ｄＮＴＰ類、１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＣＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、および１μｌのｄｄＴＴＰを含有する混合物を用いた以外は、上記のとおりの「はめ込み」条件であった。蛍光ｄｄＮＴＰ類はアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５；アマーシャムは蛍光ヌクレオチドの濃度を公表していない）から入手した。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、制限酵素ＢｓｍＦＩによって消化され、４塩基の５’オーバーハングを生成した。図７Ｅで示されるように、取り込まれた最初のヌクレオチドが標識ジデオキシヌクレオチドならば、３’窪み端は１個の塩基によってはめ込まれ、ＳＮＰまたは関心対象座を検出できる。しかし、取り込まれた最初のヌクレオチドがｄＮＴＰならば、ポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰがはめ込まれるまでヌクレオチドの取り込みを続ける。例えば、最初の２つのヌクレオチドがｄＮＴＰ類ではめ込みでき、３番目のヌクレオチドがｄｄＮＴＰではめ込みできると、オーバーハング内の３番目のヌクレオチドを検出できる。このように、５’オーバーハング全体の配列を決定することができ、各ＳＮＰまたは関心対象座から得られる情報が増加する。
【０３９１】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた（図８Ａ〜８Ｄ）。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０３９２】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、１０μｌの試料から２〜３μｌを４８ウェル膜トレイ（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８−０１）内に入れた。トレイ内の試料を４８フロー・メンブレン・コーム（Ｆｌｏｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｂ）（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８）に吸収させ、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル内へ挿入した（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）。
【０３９３】
前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。膜コームを除去し、ＡＢＩ３７７自動塩基配列決定装置上で３時間、ゲルを操作した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０３９４】
図９Ａに示されたように、３６人の個人の試料から、２つのヌクレオチドのうちの１つ、アデノシンか、またはグアニンのいずれかが、ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７として検出された。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７に存在すると報告されているのは、この２つのヌクレオチドである（http://snp.cshl.or/snpsearch.shtml）。
【０３９５】
ＳＮＰ  ＴＳ０００９５５１２には、２つのヌクレオチドのうちの１つ、グアニンまたはシトシンが検出された（図９Ｂ）。関心対象座がＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有する第２のプライマーによって増幅されでもまた、ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有する第２のプライマーによって増幅されても同じ結果が得られた。
【０３９６】
図９Ｃに示すように、ＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０には、２つのヌクレオチドのうちの１つ、アデノシンまたはシトシンのいずれかが検出された。このＳＮＰ部位に存在すると報告されているのは、この２つのヌクレオチドである（http://snp.cshl.or/snpsearch.shtml）。また、関心対象座から１塩基においてチミジンが検出された。配列依存様式でＢｓｍＦＩは１０／１４位で幾つかのＤＮＡ分子を切断し、同じ配列を有する他のＤＮＡ分子を１１／１５位で切断する。制限酵素ＢｓｍＦＩがセンス鎖上の１１個のヌクレオチドを切り取り、アンチセンス鎖上の１５個のヌクレオチドを切り取る場合、３’窪み端はＳＮＰ部位の１個の塩基である。ＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０の配列は、ＳＮＰ部位の直前の塩基がチミジンであることを示した。この位置への標識ｄｄＮＴＰの取り込みにより、１０／１４位で切断された断片より１塩基小さな断片が生成する。したがって、１１／１５位で切断されたＤＮＡ分子は、ＳＮＰ部位直前の塩基についての配列情報を提供し、１０／１４位で切断されたＤＮＡ分子は、ＳＮＰ部位についての配列情報を提供した。
【０３９７】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７を、ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有する第２のプライマーを用いて増幅した。ＢｓｍＦＩによる消化によって生成した５’オーバーハングをはめ込むために標識ｄｄＮＴＰ類および未標識ｄＮＴＰ類の混合物を用いた。ｄＮＴＰが取り込まれたならば、ポリメラーゼはｄｄＮＴＰが取り込まれるまでヌクレオチドの取り込みを続ける。各々が塩基１個だけ異なるＤＮＡ断片の集団が生成し、オーバーハング全体の配列が決定された。
【０３９８】
図９Ｄに見られるように、ＳＮＰまたは関心対象座の直前のヌクレオチド（チミジン）に相補的なアデニンが検出された。このヌクレオチドは上述のＢｓｍＦＩの１１／１５切断特性のため検出された。グアニンおよびアデノシンがＳＮＰ部位において検出されたが、これらは、このＳＮＰ部位に関して報告されている２つのヌクレオチドである（図９Ａ）。２つのヌクレオチドは、色素の分子量が異なるため、ＳＮＰ部位において検出され、これによって２つのヌクレオチドが分離できた。次に検出されたヌクレオチドは、ＳＮＰ部位のすぐ下流のヌクレオチドに相補的であるチミジンであった。その次に検出されたヌクレオチドは、ＳＮＰ部位から２塩基下流のヌクレオチドに相補的であるグアニンであった。最後に、ＳＮＰ部位から下流の３番目のヌクレオチドに相補的であるアデノシンが検出された。ＳＮＰ部位についての情報だけでなく、ＳＮＰ部位直前のヌクレオチドおよび隣接した３つのヌクレオチドについての情報が得られた。
【０３９９】
関心対象座は、突然変異を含有していなかった。しかし、関心対象座のうちの１つが、限定はしないが、点突然変異、挿入、欠失、転座または前記突然変異の任意の組合わせなどの突然変異を有するとしたら、それは、コンセンサス配列または公表配列との比較によって同定できるであろう。各関心対象座に属する配列を、各関心対象における遺伝子本来の、非疾病関連配列と比較することにより、その配列における突然変異の有無が決定される。次に、その配列における突然変異の所見を、その個人における疾病兆候の存在として、またはその疾病を発現する体質として適宜解釈される。被験者が突然変異配列の１つまたは２つの対立遺伝子を有するかどうか、したがって、その被験者がキャリアかどうか、または示された突然変異から生じるのが、優性状態か劣性状態かを決定するために、突然変異配列対正常、すなわち非突然変異配列との相対量を評価することができる。
【０４００】
実施例３
染色体１の４つの関心対象座および染色体２１の２つの関心対象座を別々のＰＣＲ反応にて増幅し、一緒にプールしてから分析した。増幅された関心対象座の各々の大きさが異なるようにプライマーを設計することにより、関心対象座を検出することができた。
【０４０１】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した５ｍｌの血液試料から調製した。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）より供給されたキアアンプＤＮＡブラッド・ミディ・キット（カタログ番号５１１８３）を用いて、各血液試料から鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡをキットに含まれる使用説明書のとおり単離した。３６人のヒト志願者から鋳型ＤＮＡを単離し、さらなる分析のために１つの試料にプールした。
【０４０２】
プライマー設計
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000060
第２のプライマー：
2006521086.tif 000061
【０４０３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000062
第２のプライマー：
2006521086.tif 000063
【０４０４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000064
第２のプライマー：
2006521086.tif 000065
【０４０５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000066
第２のプライマー：
2006521086.tif 000067
【０４０６】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００１３１は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000068
第２のプライマー：
2006521086.tif 000069
【０４０７】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000070
第２のプライマー：
2006521086.tif 000071
【０４０８】
各ＳＮＰに関して、第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、５’末端にビオチンタグを有した。各ＳＮＰの増幅に用いられた第２のプライマーは制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した。
【０４０９】
ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、以下のアニーリング温度を用いた以外は実施例２に記載されたとおりに実施した：ＰＣＲの１番目のサイクルのアニーリング温度は３７℃で３０秒、ＰＣＲの２番目のサイクルのアニーリング温度は５７℃で３０秒、およびＰＣＲの３番目のサイクルのアニーリング温度は６４℃で３０秒であった。引き続く全てのサイクルのアニーリング温度は６４℃で３０秒であった。ＰＣＲは３７サイクル実施した。ＰＣＲ後、反応液から１／４容量を取り、１本の管に合わせた。
【０４１０】
関心対象断片の精製
試料をストレプタウェルマイクロ滴定プレートの単一ウェルに結合させたこと以外、ＰＣＲ産物（合わせて１つの試料となっており、「試料」と称す）は、実施例２に記載されたとおりゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。
【０４１１】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーの認識部位に結合した制限酵素ＢｃｅＡＩによって試料を消化した。制限酵素消化は、酵素と共に供給された使用説明書に従って実施した。制限酵素消化後、ウェルを１×ＰＢＳによって３回洗浄した。
【０４１２】
ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０４１３】
はめ込み反応には、以下の成分を用いた：１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＴＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＣＴＰ、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は４０℃で１０分間実施した。標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット（ＵＳ７９５６５）；キットに備えられているｄｄＮＴＰ類の濃度は所有権があり、アマーシャムによって公表されていない）から入手した。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、ＳＮＰまたは関心対象座に相当する１塩基だけはめ込まれた。
【０４１４】
ヌクレオチドの取り込み後、ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０４１５】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、１０μｌの試料から２〜３μｌを４８ウェル膜トレイ（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８−０１）内に入れた。トレイ内の試料を４８フロー・メンブレン・コーム（Ｆｌｏｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｂ）（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８）に吸収させ、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル内へ挿入した（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）。
【０４１６】
前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。膜コームを除去し、ＡＢＩ３７７自動塩基配列決定装置上で３時間、ゲルを操作した。取り込まれたヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０４１７】
増幅した各関心対象座の大きさが異なるようにプライマーを設計した。図１０に示すように増幅した各関心対象座は、約５〜１０ヌクレオチド異なっていたので、ゲル電気泳動によって関心対象座を互いに分離することができた。ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５に関してグアニンとシトシンの２つのヌクレオチドが検出された。これらはＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５に存在することが報告されている２つのヌクレオチドであった（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含んでなり、グアニンを取り込んだＤＮＡ分子の分子量はシトシンを取り込んだＤＮＡ分子の分子量とは異なっていたため、各ヌクレオチドに関して異なるバンドが見られた。
【０４１８】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７に、グアニンとアデノシンの２つのヌクレオチドが検出された（図１０）。このＳＮＰに関して報告された２つのヌクレオチドは、グアニンとアデノシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。上記に考察したように、この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含んでおり、この試料中に双方のヌクレオチドが示されることが予想される。グアニンを取り込んだＤＮＡ断片の分子量は、アデノシンを取り込んだＤＮＡ断片とは異なっていたため、双方のヌクレオチドを検出できた。
【０４１９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６にヌクレオチド、グアニンが検出された（図１０）。このＳＮＰ位置に存在することが報告されている２つのヌクレオチドはチミジンとシトシンである。
【０４２０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４にヌクレオチド、グアニンが検出された（図１０）。このＳＮＰに関して報告された２つのヌクレオチドはグアニンとシトシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。
【０４２１】
ＳＮＰ  ＴＳ０００９５５１２にヌクレオチド、シトシンが検出された（図１０）。このＳＮＰ部位に関して報告された２つのヌクレオチドはグアニンとシトシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。
【０４２２】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００１３１に検出されたヌクレオチドはグアニンであった。このＳＮＰ部位に関して報告された２つのヌクレオチドはグアニンとアデノシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。
【０４２３】
上記に考察したように、この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含んでおり、ＳＮＰ部位に双方のヌクレオチドが示されることが予想される。ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４、ＴＳＣ００９５５１２、ＴＤＣ０２１４３６６およびＨＣ２１Ｓ００１３１に関しては、２つのヌクレオチドのうちの１つが検出された。これらのＳＮＰ部位に関して報告された双方のヌクレオチドが試料中に存在しているようであるが、一方の蛍光色素が他方より圧倒的に多い。１つのヌクレオチドを取り込んだＤＮＡ分子の分子量により、他のヌクレオチドを取り込んだＤＮＡ分子の効率的な分離ができなかった。しかし、ＳＮＰ類は互いに容易に分離し、各ＳＮＰにとって適切なヌクレオチドが取り込まれた。ＰＣＲ後、単一試料として処理された複数の染色体の複数の関心対象座の配列を決定した。
【０４２４】
蛍光標識ｄｄＮＴＰ類を含有する１つの反応を、複数の関心対象座を含む試料で実施した。あるいは、各反応が１つの蛍光認識ヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＣＴＰ）および未標識ｄｄＮＴＰ類を含有する４つの別々のはめ込み反応を実施できた（実施例２、図７Ａ〜７Ｄおよび図９Ａ〜Ｃを参照）。４つの別々の「はめ込み」反応により、関心対象座に存在する任意のヌクレオチドが検出できる。例えば、１個人の複数の関心対象座を含有する試料を分析するとして、前記個体が、１つ以上の関心対象座においてヘテロ接合であれば、このヘテロ接合の関心対象座におけるヌクレオチドを決定するために、４つの別々の「はめ込み」反応が利用できる。
【０４２５】
また、複数の個人の鋳型を含有する試料を分析する場合、４つの別々の「はめ込み」反応によって関心対象に見られるヌクレオチドの頻度とは独立に、試料中に存在するヌクレオチドが検出できる。例えば、試料が５０人の鋳型ＤＮＡを含有し、そのうち４９人が、関心対象座にチミジンを有し、１人がグアニンを有するとすれば、図９Ａ〜９Ｃにあるように各「はめ込み」反応をゲルの別々のレーンで操作する４つの別々の「はめ込み」反応の実施によってグアニンを検出できる。複数の鋳型ＤＮＡからなる試料を分析する場合、質量の違いにより１個の関心対象座部位における複数のヌクレオチドを識別する必要性が複数の「はめ込み」反応によって緩和される。
【０４２６】
本実施例において、複数の単一ヌクレオチド多形を分析した。限定はしないが、複数の関心対象座の突然変異、トランジション、トランスバージョン、転座、挿入、および欠失などの突然変異の有無を決定することも可能である。複数の関心対象座は、１個の染色体のものであり得るか、または複数の染色体のものであり得る。複数の関心対象座は１個の遺伝子のものであり得るか、または複数の遺伝子のものであり得る。
【０４２７】
疾病の表現型の原因となるか、またはその素因を与える複数の関心対象座の配列が決定できる。例えば、癌または任意の他の疾病に関する１個から数十、数百、数千個の遺伝子を増幅できる。増幅した各関心対象座の大きさが異なるようにプライマーを設計できる。ＰＣＲ後、増幅した関心対象座を合わせて１つの試料として処理できる。あるいは複数の関心対象座を１つのＰＣＲ反応において増幅できるか、または関心対象座の総数、例えば１００個を、ＰＣＲ反応１つにつき例えば、１０個の関心対象座の試料に分割して後でプールすることができる。本明細書で示すように、複数の関心対象座の配列が決定できる。このように、１つの反応において、疾病の表現型の原因となるか、またはその素因を与える１個から１０個、数百個、数千個の遺伝子配列を決定することができる。
【０４２８】
実施例４
妊娠女性の試料における遊離の胎児ＤＮＡを用いて胎児の染色体異常の配列を決定または検出する能力は、胎児ＤＮＡのパーセンテージの低さが障害となっていた。遊離胎児ＤＮＡのパーセンテージを上昇させることによって、突然変異、挿入、欠失、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミー、トリソミー２１、トリソミー１８、トリソミー１３、ＸＸＹ、ＸＸＸ、他の異数性、欠失、付加、増幅、転座および再配列の検出が増強すると考えられる。妊娠女性から得られた血漿中の胎児パーセントを、細胞溶解阻害剤の存在下、非存在下双方において決定した。Ｙ染色体上の遺伝子マーカーを用いて、胎児ＤＮＡのパーセントを算出した。
【０４２９】
鋳型ＤＮＡの調製
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液試料５ｍｌから鋳型ＤＮＡを調製した。血液は２本の管に分割した（フィッサシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌＥＤＴＡバキューム管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）１本の管にホルムアルデヒド（２５μｌ／ｍｌ血液）を加えた。他方の管は、ＥＤＴＡの存在以外は未処理のままであった。２本の管を１０００ｒｐｍにて１０分間回転させた。各試料の上澄み液（血漿）の２ミリリットルを新たな管に移し、３０００ｒｐｍにて１０分間回転させた。各試料の８００μｌをＤＮＡ精製に用いた。血球のＤＮＡ精製用キアゲン・ミディキット（キアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いてＤＮＡを単離した。ＤＮＡを１００μｌの希釈水に溶出させた。２種の鋳型ＤＮＡが得られた。すなわち、ＥＤＴＡで処理した血液試料由来のもの、ならびにＥＤＴＡおよびホルムアルデヒドで処理した血液試料由来のものである。
【０４３０】
プライマー設計
２つの異なったプライマーセットを用いた。すなわち、一方のプラーマーセットは、Ｙ染色体に特異的であり、したがって、胎児ＤＮＡに特異的であり、他方のプライマーセットは、母体の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの双方に存在するのう胞性線維症遺伝子を増幅するように設計された。
【０４３１】
本実施例において、各プライマーの５’全体および３’の配列が鋳型ＤＮＡにアニールするように第１のプライマーおよび第２のプライマーを設計した。本実施例において、胎児はＸＹ遺伝子型を有しているので、胎児ＤＮＡの存在マーカーとして、Ｙ染色体を用いた。Ｙ染色体上のＳＲＹ遺伝子を増殖するために以下のプライマーを設計した。
第１のプライマー：
2006521086.tif 000072
第２のプライマー：
2006521086.tif 000073
【０４３２】
任意の遺伝子、または遺伝子領域、または任意の染色体の任意の部分を増強するために設計されたプライマーを母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを検出するために用いることができた。本実施例では、のう胞性線維症遺伝子を増幅するために、以下のプライマーを設計した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000074
第２のプライマー：
2006521086.tif 000075
【０４３３】
ＰＣＲ反応
ＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子を、ＰＣＲを用いて鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応はキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）より供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。ＳＲＹ遺伝子増幅のために、キアゲン精製カラムから溶出したＤＮＡを連続的に１：２の希釈した。のう胞性線維症遺伝子の増幅のために、キアゲン精製カラムからのＤＮＡを１：４に希釈し、次に連続的に１：２に希釈した。以下の成分を各ＰＣＲ反応に用いた：８μｌの鋳型ＤＮＡ（希釈または未希釈）、１μｌの各プライマー（５μＭ）、１０μｌのホットスターＴａｑ混合物。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分
（２）９４℃で１分
（３）５４℃で１５秒
（４）７２℃で３０秒
（５）ステップ２〜４を４５サイクル反復
（６）７２℃で１０分。
【０４３４】
胎児ＤＮＡの定量化
キアゲンカラムから溶出した鋳型ＤＮＡを、以下の濃度に連続的に希釈した：１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、１：１０２４、１：２０４８、１：４０９６。ＳＲＹ遺伝子の増幅は、未希釈の鋳型を用いて実施した、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２。のう胞性線維症遺伝子の増幅は、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、１：１０２４、１：２０４８、１：４０９６に希釈した鋳型ＤＮＡを用いて実施した。ＥＤＴＡ単独で処理した血漿試料ならびにＥＤＴＡおよびホルムアルデヒドで処理した血漿試料から精製した鋳型ＤＮＡを用いて同じ連続希釈を実施した。
【０４３５】
ＥＤＴＡで処理した血漿試料から単離した鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応の結果を図１１Ａに示してある。ＳＲＹ遺伝子は、未希釈鋳型ＤＮＡから、および１：２に希釈した試料においても増幅した（図１１Ａ）。ＳＲＹ遺伝子は、次の７つの連続希釈液において増幅されなかった。一方、のう胞性線維症遺伝子は、１：２５６まで連続希釈されたもので検出された。のう胞性線維症遺伝子は、血漿中に存在する母体ＤＮＡのパーセンテージが高いため、より多く存在することが予想された。遺伝子産物の増幅に備えた最終希釈試料は、のう胞性線維症遺伝子か、またはＳＲＹ遺伝子の１つのコピーを有すると推測された。
【０４３６】
ホルムアルデヒドとＥＤＴＡで処理された血漿試料から単離された鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応の結果は図１１Ｂに示してある。ＳＲＹ遺伝子は、未希釈鋳型ＤＮＡ、および１：２に希釈された試料において増幅した（図１１Ｂ）。ＳＲＹ遺伝子は、次の６つの連続希釈液において増幅されなかった。しかし、１：２５６希釈液において、ＳＲＹ遺伝子は検出された。１：２５６試料における増幅が真のシグナルを示している可能性は少ない。なぜならば、その前の６つの希釈系がＳＲＹ増幅に関して全て陰性であったからである。この試料におけるＳＲＹ遺伝子の増幅は、用いられたＰＣＲサイクル数の多さにより生じた実験上の人為結果である可能性が高い。したがって、試料中に存在する胎児ＤＮＡ量の算出に１：２５６試料を使用しなかった。
【０４３７】
のう胞性線維症遺伝子の増幅は、１：１６希釈した試料中に検出された（図１１Ｂ）。ホルマリンの存在により、母体細胞の溶解が妨げられ、したがって、試料中母体ＤＮＡのパーセンテージは低い。これは、ＥＤＴＡのみで処理され、１：２５６の希釈液まで増幅が維持された試料とは極めて対照的である。
【０４３８】
母体血漿中に存在する胎児ＤＮＡのパーセントを以下の式を用いて算出した：
％胎児ＤＮＡ＝（ＳＲＹ遺伝子量／のう胞性線維症遺伝子量）＊２＊１００。
ＳＲＹ遺伝子量は、遺伝子が増幅された最高希釈値によって示された。同様に、のう胞性線維症遺伝子量は、それが増幅された最高希釈値によって示された。前記式は、２つの乗法因子を含有しているが、これは、ＳＲＹ遺伝子（Ｙ染色体上に位置）にはただ１つのコピーが存在し、一方、のう胞性線維症遺伝子には２つのコピーが存在する事実に関して標準化するために用いられる。
【０４３９】
上記実施例において、ＥＤＴＡのみで処理された試料に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージは、１．５６％（２／２５６＊２＊１００）であった。血漿中に存在する胎児ＤＮＡの報告されているパーセンテージは、０．３９％から１１．９％の間である（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。ホルマリンとＥＤＴＡとで処理された試料中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージは２５％であった（２／１６＊２＊１００）。この実験は多数回反復され、各回ともホルマリンの存在により胎児ＤＮＡの全体パーセンテージが増大した。
【０４４０】
ホルマリン有無での１８の血液試料からの胎児ＤＮＡパーセントを、１：５の連続希釈を実施した以外は上記のとおり算出した。１：５希釈を実施したため、ＳＲＹ遺伝子またはのう胞性線維症遺伝子のいずれかの検出を可能にした最終連続希釈液は、遺伝子の１つのコピーを有したか、またはその遺伝子の４つのコピーを有したと考えられる。１８の試料のホルマリン有無における結果を表Ｖにまとめてある。低範囲では、最終希釈試料が遺伝子の１つのコピーを有したことが推測され、高範囲では、最終希釈液が遺伝子の４つのコピーを有したことが推測された。
【０４４１】
（表Ｖ）ホルマリン有無における胎児ＤＮＡ平均パーセンテージ
2006521086.tif 000076
【０４４２】
母体細胞溶解の減少、したがって、試料中に存在する母体ＤＮＡ量の減少によって、胎児ＤＮＡの全体的増加が達成された。本実施例では、細胞溶解の防止にホルムアルデヒドを使用したが、細胞溶解を防ぎ、細胞の構造的完全性を増加させる任意の試剤が使用できる。２種以上の細胞溶解剤を使用できる。母体血漿における胎児ＤＮＡの増加により、胎児ＤＮＡの配列決定が可能になり、また限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化、トリソミー、モノソミー、他の異数性、増幅、再配列、転座、トランスバージョン、欠失、付加、増幅、断片、転座、および再配列などのＤＮＡ配列異常または染色体異常の迅速な検出が提供される。
【０４４３】
実施例５
トリソミー２１の遺伝子座を有する個人の鋳型ＤＮＡを分析した。染色体１３上の３つの関心対象座および染色体２１上の２つの関心対象座を分析した。
【０４４４】
鋳型ＤＮＡの調製
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液試料５ｍｌから鋳型ＤＮＡを調製した。前記ヒト志願者は、追加の染色体２１（トリソミー２１）を有することが前もって遺伝子型決定されていた。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）より提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。
【０４４５】
プライマー設計
以下の５種の単一ヌクレオチド多形を分析した：染色体２１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３；染色体２１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０３２０９６１０；染色体１３上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７；および染色体１３上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７。他の個人の鋳型ＤＮＡを内部対照として用いた。グアニンに関してホモ接合であることが前もって同定されたＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７を内部対照として用いた。ＳＮＰ合弁会社のデータベースは、２００２年４月１日現在実効があるhttp://snp.eshl.org/ウェブサイト宛先にてアクセスできる。
【０４４６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３を以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000077
第２のプライマー：
2006521086.tif 000078
【０４４７】
第１のプライマーは、５’端をビオチン化し、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４４８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３０９６１０を以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000079
第２のプライマー：
2006521086.tif 000080
【０４４９】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５０】
ＳＮＰ（ｓｓ）８１３７７３（ＮＣＢＩ寄託ＳＮＰ（ｓｓ）データベースによる帰属登録番号）を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000081
第２のプライマー：
2006521086.tif 000082
【０４５１】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000083
第２のプライマー：
2006521086.tif 000084
【０４５３】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７２７９を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000085
第２のプライマー：
2006521086.tif 000086
【０４５５】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000087
第２のプライマー：
2006521086.tif 000088
【０４５７】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５８】
ＰＣＲ反応
ＰＣＲを用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅された５つ全ての関心対象座を増幅した（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応はキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）より供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。各関心対象座に関して、一反応当たりの鋳型ＤＮＡ量およびプライマー量を最適化できる。本実施例では、４０ｎｇのヒトゲノム鋳型ＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。３８サイクルのＰＣＲを実施した。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３、ＳＮＰ  ＴＳＣ０３０９６１０およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４３７に関して以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）４２℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）６０℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６９℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３７回反復；
（９）７２℃で５分。
【０４５９】
ＳＮＰ  ｓｓ８１３７７３、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７２７９に関して以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３７回反復；
（９）７２℃で５分。
【０４６０】
各ＰＣＲの第１のサイクルにおいて、アニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度であった。ＰＣＲの第２のサイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度であった。ＰＣＲの第３のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの全配列の略融解温度であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を次第に上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度は、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０４６１】
関心対象断片の精製
キアゲン・ミン・エリュート（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ＰＣＲ精製キットを製造元の使用説明書（カタログ番号２８００６）に従って用い、ＰＣＲ反応の成分からＰＣＲ産物を分離した。前記ＰＣＲ産物を２０μｌの希釈水に溶出させた。各増幅ＳＮＰに１ミクロリットルのＰＣＲ産物、１μｌの増幅内部対照ＤＮＡ（ＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７）および８μｌの希釈水を混合した。各試料の５ミクロリットルをピアース・ストレプタウェル・マイクロ滴定プレート（カタログ番号１５５０１）の２つの別々の反応ウェル内に入れた。第１のプライマーは５’ピオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を４５℃、１５０ｒｐｍにて１時間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０４６２】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合した制限酵素により精製ＰＣＲ産物を消化した。精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｅＡＩ（ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号Ｒ０６２３Ｓ）。この消化は、制限酵素と共に供された使用説明書に従ってマイクロ滴定プレートのウェル内で実施した。適切な制限酵素による消化後、前記ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、開裂した断片を除去した。
【０４６３】
標識ヌクレオチドの取り込み
上記制限酵素消化によって、ＳＮＰおよび３’窪み端を含有した、５’オーバーハングを有するＤＮＡが得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０４６４】
各ＳＮＰに対し、２つのはめ込み反応を行ったが、各反応が異なった蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを含有した（特定のＳＮＰに存在することが報告されたヌクレオチドに依って、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ）。例えば、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３にはヌクレオチドのアデニンとチミジンが報告されている。したがって、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３に関する消化ＰＣＲ産物は、蛍光標識ｄｄＡＴＰか、または蛍光標識ｄｄＴＴＰのいずれかと混合した。各反応とも内部参照として蛍光標識ｄｄＧＴＰを含有した。以下の成分を各はめ込み反応に加えた：２μｌのＲＯＸ−共役ジデオキシヌクレオチド（各ＳＮＰに関して報告されたヌクレオチドにより）、２μｌのＲＯＸ−共役ｄｄＧＴＰ（内部対照）、２．５μｌの１０×シーケナーゼ緩衝剤、２μｌのシーケナーゼおよび２５μｌ反応液に必要な水。はめ込み反応は、全て４５℃で４５分間実施した。しかし、より短い時間の取り込みを用いることができる。非蛍光標識ｄｄＮＴＰ類は、ファーメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。ＲＯＸ−共役ｄｄＮＴＰ類は、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）から入手した。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、ＳＮＰまたは関心対象座に相当する１塩基だけ伸長した。
【０４６５】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に「はめ込み」ＤＮＡ断片を、製造元の推奨に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって、ストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間行った。
【０４６６】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離後、１０μｌの試料のうち３μｌを４８ウェル膜トレイ（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８−０１）に入れた。トレイ中の試料を４８フロー膜コーム（ザ・ゲル・カンパニー、カタログ番号ＴＡＭ４８）で吸収させ、３６ｃｍ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオホィッテーカー・モレキュラー・アプリケーションズ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）内に挿入した。
【０４６７】
試料を３０００ボルトで３分間、ゲル中で電気泳動させた。膜コームを取り出し、ゲルをＡＢＩ３７７自動塩基配列決定装置上で３時間操作した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光で検出した。
【０４６８】
図１２に見られるように、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３は、標識ｄｄＴＴＰによって「はめ込み」がなされ（レーン１）、別の反応においては、標識ｄｄＴＴＰによってなされた（レーン３）。生データを用いたヌクレオチド間の計算比は、６６：３４で、これは、トリソミー２１を有する個人における染色体２１上のＳＮＰに関する理論比６６：３３と一致する。色素の取り込み効率における可変性を最少化するために、ｄｄＴＴＰとｄｄＡＴＰの双方とも同じ蛍光色素で標識した。しかし、種々の蛍光標識、または任意の検討可能な標識を付けたヌクレオチドが使用できる。異なった標識を使用する場合は、取り込み率を計算することが好ましい。
【０４６９】
各はめ込み反応を別々のウェルで実施したため、マイクロ滴定プレートのウェル間でＤＮＡ結合が変化する可能性が存在し得た。ストレプトアビジン被覆プレートに対するＤＮＡ結合の変化の可能性を明らかにするために内部対照を用いた。試料を２つの別々のウェルに分割する前に、グアニンに関してホモ接合の内部対照（ＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７）を試料に添加したため、等しい量の内部対照が各ウェルに存在するはずである。２つの反応間の取り込みｄｄＧＴＰ量を決定することができる。各ウェルにおけるＤＮＡ量が等しいならば、取り込みｄｄＧＴＰ量も等しくなるはずである。なぜならば、この反応は飽和条件下で行われており、飽和条件とは、各鋳型分子におけるヌクレオチドの取り込みを維持する条件だからである。内部対照を用いると、ｄｄＡＴＰ対ｄｄＴＴＰの取り込み率は、６３．４：３６．６であった。この率は生データによって得られた比率に極めて類似しており、特定のＤＮＰに関して、２つのはめ込み反応における違いが小さいことを示した。
【０４７０】
（表ＶＩ）トリソミー２１を有する個体由来のＤＮＡ鋳型における複数のＳＮＰでの対立遺伝子の頻度
2006521086.tif 000089
【０４７１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３０９６１０は、ｄｄＴＴＰ（レーン３）またはｄｄＣＴＰ（レーン４）によってはめ込みがなされた（図１２）。生データを用いたヌクレオチドの計算比は６４：３６であった。ｄｄＴＴＰとｄｄＣＴＰの双方とも同じ蛍光色素で標識した。上記で検討したとおり内部対照に対する標準化後、ｄｄＴＴＰ対ｄｄＣＴＰの対立遺伝子計算比は、６６．８：３３．２であった（表ＶＩ）。やはり、生データからの計算比と、内部対照を用いた計算比の双方とも、トリソミーを有する個人における染色体２１上のＳＮＰに関する理論比、６６．６：３３．４に極めて類似している。
【０４７２】
ヘテロ接合ＳＮＰ類におけるヌクレオチドの比、６６：３３が３つのコピーにおいて存在する染色体上の座を表したことを証明するために、染色体１３上のＳＮＰ類を分析した。血液試料を採取した個人は１つの母親染色体１３と１つの父親染色体１３を有することの予め遺伝子型決定がなされていた。
【０４７３】
寄託されたＳＮＰ（ｓｓ）８１３７７３をｄｄＡＴＰによって（レーン５）またはｄｄＣＴＰによって（レーン６）はめ込んだ（図１２）。このヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの計算比は、生データを用いると４６：５４であった。この比は予測比５０：５０の１０％以内にある。染色体の追加コピーが存在する場合に予測される比の６６：３３に近似していないことは重要である。
【０４７４】
内部対照に対する標準化後、計算比は４１：５９であった。予測値に反して、内部対照に対する標準化によって計算比と理論比との間の食い違いが増大した。この結果、ＤＮＡ試料をアリコート化する際に生じた実験的誤差を表していると思われる。
【０４７５】
また、「はめ込み」反応の鋳型として用いられたオーバーハング生成に使用された制限酵素が、一方の鋳型ＤＮＡを、他方の鋳型ＤＮＡより優先的に切断することも可能である。２つの鋳型は、ＳＮＰ部位におけるヌクレオチドに関して異なっており、これが切断に影響を与え得る。切断部位に隣接するヌクレオチドがＳＮＰ部位におけるヌクレオチドとは独立して同一であるように、プライマーを設計することができる（標題「プライマー設計」の節でさらに検討される）。
【０４７６】
染色体１３上のＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７は、一反応においてはｄｄＴＴＰにより（レーン７）、他の反応においてはｄｄＣＴＰにより（レーン８）はめ込みがなされた（図１２）。生データを用いたこのＳＮＰにおけるヌクレオチドの計算比は５５：４５であった。内部対照に対する標準化後、Ｔ：Ｃの対立遺伝子計算比は４９：５１であった。標準化した比率は、染色体１３の２つのコピーを有する個人に関する理論比５０：５０により近かった。
【０４７７】
染色体１３上のＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７２７９は、一反応においてはｄｄＴＴＰにより（レーン９）、他の反応においてはｄｄＣＴＰにより（レーン１０）はめ込みがなされた（図１２）。生データを用いたこのＳＮＰにおけるヌクレオチドの計算比は５３：４７であった。内部対照に対する標準化後、Ｔ：Ｃの対立遺伝子計算比は５０．７：４９．３であった。これは、染色体１３の２つのコピーを有する個人に関する理論比５０：５０と一致している。
【０４７８】
染色体１３上の分析されたＳＮＰ類のうちの２つにおけるヌクレオチドの比は略５０：５０であった。１つのＳＮＰ、ｓｓ８１３７７３は４６：５４の比を示し、内部対照に対して標準化すると、この比は４１：５９であった。これらの比は予測された５０：５０からはずれているが、同時に、これらの比は６６：３３の比で示される余分な染色体を示しているわけでもない。この特定ＳＮＰからのデータは決定的ではないが、偽陽性を示しているわけではない。このＳＮＰのデータについての結論は引き出せない。しかし、他の２つのＳＮＰ類は正常な数の染色体を示した。一染色体上の限定はしないが、１〜５、５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、および３０００を超える複数のＳＮＰを分析することが好ましい。染色体異常の有無を決定するためには、特定の染色体に対する比の平均を用いることが好ましいであろう。しかし、１つの関心対象座を分析することもやはり可能である。決定的でないデータが得られた場合は、他の関心対象座を分析できる。
【０４７９】
鋳型ＤＮＡを採取した個人は、トリソミー２１を有することの予め遺伝子型決定がなされており、染色体２１上のＳＮＰにおける対立遺伝子頻度は追加の染色体２１が存在していることを示している。追加の染色体は、各ＳＮＰに対して追加のヌクレオチドを与え、したがって、ヘテロ接合ＳＮＰにおける伝統的な５０：５０比を変化させる。これらの結果は、複数のＳＮＰで一貫しており、染色体２１上に見られるものに明白である。染色体１３上のＳＮＰの対立遺伝子頻度には、略５０：５０の予測比が得られた。このＳＮＰ検出法は、限定はしないが、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミー２１、トリソミー１８、トリソミー１３および他の異数体、欠失、付加、増幅、転座、および再配列などの染色体異常の検出に使用できることが、これらの結果により証明される。
【０４８０】
実施例６
インフォームドコンセントを得た後、４人からゲノムＤＮＡを採取した。鋳型ＤＮＡを用いて染色体１３上の６種のＳＮＰ（ＴＳＣ０８３７９６９、ＴＳＣ００３４７６７、ＴＳＣ１１３０９０２、ＴＳＣ０５９７８８８、ＴＳＣ０１９５４９２、ＴＳＣ０６０７１８５）を分析した。これらのＳＮＰ類に関する情報は、以下のウェブサイトに見ることができる：www.snp.chsl.org/snpsearch.shtml;ウェブサイトは２００３年２月１１日現在有効である。
【０４８１】
６つの選択されたＳＮＰ部位における個人の遺伝子型を決定するために、１種の蛍光色素で標識された単一ヌクレオチドを用いた。６種のＳＮＰが１つの反応において分析できるようにプライマーを設計した。
【０４８２】
鋳型ＤＮＡの調製
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液試料９ｍｌから鋳型ＤＮＡを調製した。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）より提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡは、キットに含まれる使用説明書に従って単離した。
【０４８３】
プライマー設計
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８３７９６９は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000090
第２のプライマー：
2006521086.tif 000091
【０４８４】
第１のプライマーは、５’端にビオチンタグを有し、また、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から６０塩基をアニールするように設計された。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４８５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００３４７６７は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000092
第２のプライマー：
2006521086.tif 000093
【０４８６】
第１のプライマーは、５’端にビオチンタグを有し、また、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から５０塩基をアニールするように設計された。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４８７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000094
第２のプライマー：
2006521086.tif 000095
【０４８８】
第１のプライマーは、５’端にビオチンタグを有し、また、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から６０塩基をアニールするように設計された。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４８９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５９７８８８は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000096
第２のプライマー：
2006521086.tif 000097
【０４９０】
第１のプライマーは、５’端にビオチンタグを有し、また、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から７０塩基をアニールするように設計された。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４９１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９５４９２は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000098
第２のプライマー：
2006521086.tif 000099
【０４９２】
第１のプライマーは、５’端にビオチンタグを有し、また、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から８０塩基をアニールするように設計された。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４９３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000100
第２のプライマー：
2006521086.tif 000101
【０４９４】
第１のプライマーは、５’端にビオチンタグを有し、また、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から９０塩基をアニールするように設計された。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４９５】
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９６号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。この実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供給されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たり鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、４０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０４９６】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおける３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度は、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０４９７】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。本実施例において、第１のプライマーが関心対象座から様々な距離でアニールするように設計された。当業技術者は、第１のプライマーのアニーリング位置が関心対象座から５〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１０５、１０６〜１１０、１１１〜１１５、１１６〜１２０、１２１〜１２５、１２６〜１３０、１３１〜１４０、１４１０〜１６０、１６１０〜１８０、１８１０〜２００、２０１０〜２２０、２２１０〜２４０、２４１０〜２６０、２６１０〜２８０、２８１０〜３００、３０１０〜３５０、３５１０〜４００、４０１０〜４５０、４５０〜５００塩基または５００塩基を上回ってよいことを解する。
【０４９８】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。ＰＣＲ反応後、１個体の各ＰＣＲ反応液の１／／４容量をロッシュ・ダイアグノシティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨによるストレプタウェル、透明ハイ・バンドプレート（カタログ番号一６４５６９２、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ、２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載）の１つのウェル内に共に混合した。第１のプライマーは５’ピオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０４９９】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩにより、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０５００】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化により、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０５０１】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ８３７９６９に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列全体ではなく、オーバーハング（Ｒは可変部位を示す）を示す部分のみを複写している。
2006521086.tif 000102
【０５０２】
アンチセンス鎖上のオーバーハング内３番目の位置は、グアニンに相補的なシトシンに相当する。この可変部位は、アデニンまたはグアニンであり得るので、双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いた。グアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合またはヘテロ接合の個人に対するはめ込み反応を以下に図式化している。
【０５０３】
ＴＳＣ０８３７９６９におけるグアニンに関しホモ接合：
2006521086.tif 000103
【０５０４】
標識ｄｄＧＴＰは、オーバーハングの１位に取り込まれる。オーバーハングの１位において標識ｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子に対応するただ１つのシグナルが見られる。
【０５０５】
ＴＳＣ０８３７９６９におけるアデニンに関しホモ接合：
2006521086.tif 000104
【０５０６】
未標識ｄＡＴＰは、オーバーハングの１位に取り込まれ、未標識ｄＴＴＰは、オーバーハングの２位に取り込まれる。標識ｄｄＧＴＰは、オーバーハングの３位に取り込まれた。ただ１つのシグナルが見られることになる。すなわち、ｄｄＧＴＰにより、３位にはめ込まれた分子の分子量は、１位にはめ込まれた分子の分子量とは異なるため、アデニンまたはグアニンに関してホモ接合の個人を容易に同定することができる。
【０５０７】
ＴＳＣ０８３７９６９においてヘテロ接合：
2006521086.tif 000105
【０５０８】
２つのシグナルが見られることになる。すなわち、ｄｄＧＴＰにより、１位にはめ込まれたＤＮＡ分子に相当する第１のシグナルおよびオーバーハングの３位にはめ込まれた分子に相当する第２のシグナルである。この２つのシグナルは、限定はしないが、ゲル電気泳動など、分子量に基づいて分離する任意の方法を用いて分離できる。
【０５０９】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ００３４７６７に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列全体ではなく、オーバーハング（Ｒは可変部位を示す）を示す部分のみを複写している。
2006521086.tif 000106
【０５１０】
５’センス鎖（ここでは、上の鎖として示されている）上のＴＳＣ００３４７６７に関して見られたヌクレオチドはシトシンとグアニンである。オーバーハングの２位はチミジンに相補的なアデニンに相当する。オーバーハングの３位は、グアニンに相補的なシトシンに相当する。双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いた。
【０５１１】
この場合、第２のプライマーは、関心対象座の上流にアニールするので、はめ込み反応はアンチセンス鎖（ここでは、下の鎖として示されている）上で生じる。ＩＩＳ型の制限酵素認識部位を含有する第２のプライマーが、関心対象座の上流でアニールするのか、下流でアニールするかに依って、センス鎖かまたはアンチセンス鎖のいずれかをはめ込みできる。
【０５１２】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列全体ではなく、オーバーハング（Ｒは可変部位を示す）を示す部分のみを複写している。
2006521086.tif 000107
【０５１３】
５’センス鎖（ここでは、上の鎖として示されている）上のＴＳＣ１１３０９０２に関して見られたヌクレオチドはアデニンとグアニンである。オーバーハングの２位はチミジンに相当し、オーバーハングの３位は、グアニンに相補的なシトシンに相当する。
【０５１４】
双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いる。
【０５１５】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ０５９７８８８に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列全体ではなく、オーバーハング（Ｒは可変部位を示す）を示す部分のみを複写している。
2006521086.tif 000108
【０５１６】
５’センス鎖（ここでは、上の鎖として示されている）上のＴＳＣ０５９７８８８に関して見られたヌクレオチドはシトシンとグアニンである。オーバーハングの３位はグアニンに相補的なシトシンに相当する双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いる。
【０５１７】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列全体ではなく、オーバーハング（Ｒは可変部位を示す）を示す部分のみを複写している。
2006521086.tif 000109
【０５１８】
５’センス鎖（ここでは、上の鎖として示されている）上のＴＳＣ０６０７１８５に関して見られたヌクレオチドはシトシンとチミジンである。この場合、第２のプライマーは関心対象座からアニールするので、アンチセンス鎖がはめ込みを受ける。アンチセンス鎖は（ここでは、下の鎖として示されている）はグアニンまたはアデニンではめ込まれることになる。
【０５１９】
５’オーバーハングの２位は、アデニンに相補的なチミジンであり、オーバーハングの３位はグアニンに相補的なシトシンに相当する。双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いる。
【０５２０】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ０１９５４９２に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列全体ではなく、オーバーハングを示す部分のみを複写している。
2006521086.tif 000110
【０５２１】
この部位に見られるヌクレオチドはシトシンとグアニンである（ここでは、上の鎖として示されている）。５’オーバーハングの２位は、チミジンに相補的なアデニンであり、オーバーハングの３位はグアニンに相補的なシトシンに相当する。双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いる。
【０５２２】
上記で示したように、６種のＳＮＰ双方の対立遺伝子配列は、未標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの存在下、ｄｄＧＴＰによる標識によって決定できる。各はめ込みには以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、グアニン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼおよび２０μｌの反応液に要する水。前記はめ込み反応は４０℃で１０分実施した。非蛍光標識ｄＮＴＰ類はファーメンタス社（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の全ての標識試剤は、アマーシャム（サーモ・シーケナーゼ・ダイ・ターミネータ・サイクル・シーケンシング・コアキット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０５２３】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に「はめ込み」ＤＮＡ断片は、酵素と共に供された製造元の教示に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって、ストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間行った。
【０５２４】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、試料を３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の一レーンに乗せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。自動塩基配列決定装置ヘーファー（Ｈｏｅｆｅｒ）ＳＱ３シーケンサー上で３時間、ゲルを操作した。ゲルを装置から取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメジャー上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０５２５】
図１１に示されるように、ＳＮＰ  ＴＳＣ８３７９６９に関するレーン１および２における鋳型ＤＮＡはアデニンに関してホモ接合である。個体がアデニンに関してホモ接合ならば、以下のはめ込み反応の発生が予想された。
【０５２６】
ＴＳＣ８３７９６９におけるアデニンに関しホモ接合：
2006521086.tif 000111
【０５２７】
未標識ｄＡＴＰがオーバーハングに相補的な１位に取り込まれた。未標識ｄＴＴＰはオーバーハングに相補的な２位に取り込まれた。標識ｄｄＧＴＰがオーバーハングに相補的な３位に取り込まれた。アクリルアミドゲルの略４６位に移動した１本のバンドのみが見られた。これは、１位にはめ込まれたヌクレオチドがアデニンであることを示した。ヌクレオチド、グアニンがはめ込まれたならば、１本のバンドが４４位に予想されるであろう。
【０５２８】
しかし、ＳＮＰ  ＴＳＣ０８３７９６９に関するレーン３および４の鋳型ＤＮＡはヘテロ結合であった。個体がヘテロ接合であるとすれば、以下のはめ込み反応が予想された。
【０５２９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８３７９６９においてヘテロ接合：
2006521086.tif 000112
【０５３０】
２本の明瞭なバンドが見られた。すなわち、第１のバンドはオーバーハングに相補的１位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子（Ｇ対立遺伝子）に対応し、第２のバンドは、オーバーハングに相補的３位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子（Ａ対立遺伝子）に対応する。２本のバンドを分子量の違いに基づき、電気泳動を用いて分離した。個体がＳＮＰ部位においてヘテロ接合であることを決定するために、１種の蛍光標識ヌクレオチドｄｄＧＴＰを用いた。これは、２つの異なった対立遺伝子の存在を効果的に検出するための初めての単一ヌクレオチド利用法である。
【０５３１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００３４７６７に関しては、２本の明瞭なバンドで実証されるように、レーン１および３の鋳型ＤＮＡは、シトシンとグアニンに関してヘテロ接合である。低い方のバンドは、オーバーハンドに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＧＴＰに対応した。わずかにより高い分子量の第２のバンドは、３位にはめ込まれたｄｄＧＴＰに対応し、オーバーハングの１位が未標識ｄＣＴＰによってはめ込まれ、そのため、ポリメラーゼは、オーバーハングに相補的な３位にｄｄＧＴＰを取り込むまでヌクレオチドの取り込みを続けることが可能であった。ｄｄＧＴＰがオーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたとした場合よりも高い分子量の単一バンドによって実証されるように、レーン２および４における鋳型ＤＮＡはグアニンに関してホモ接合であった。
【０５３２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関しては、ゲル上で略６２位に移動している単一の高分子量バンドによって実証されるように、レーン１、２および４における鋳型ＤＮＡは、可変部位におけるアデニンに関してホモ接合である。レーン３における鋳型ＤＮＡは、２本の明瞭なバンドによって示されるように、可変部位においてヘテロ接合である。低い方のバンドは、オーバーハングに相補的な１位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子（グアニン対立遺伝子）に対応する。高い方の分子量バンドはオーバーハングに相補的な３位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子（アデニン対立遺伝子）に対応する。
【０５３３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５９７８８８に関して、レーン１および４における鋳型ＤＮＡは、可変領域におけるシトシンに関してホモ接合であった。すなわち、レーン２における鋳型ＤＮＡは可変領域においてヘテロ接合であり、レーン３における鋳型ＤＮＡは、グアニンに関してホモ接合であった。予想されるはめ込み反応を以下に図式化してある。
【０５３４】
シトシンに関してホモ接合：
2006521086.tif 000113
【０５３５】
グアニンに関してホモ接合：
2006521086.tif 000114
【０５３６】
グアニン／シトシンに関してヘテロ接合：
2006521086.tif 000115
【０５３７】
可変領域におけるグアニンに関してホモ接合である鋳型ＤＮＡは、１本のバンドを示したが、これはオーバーハングに相補的な１位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応する。これらのＤＮＡ分子は、オーバーハングの３位にｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に比して、より低分子量であった（ＳＮＰ  ＴＳＣ０５９７８８８に関するレーン３を参照）。これらのＤＮＡ分子は分子量が２塩基だけ異なっていた。
【０５３８】
可変領域におけるシトシンに関してホモ接合である鋳型ＤＮＡは、１本のバンドを示したが、これはオーバーハングに相補的な３位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応する。これらのＤＮＡ分子は、１位にｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子よりもより高分子量に移動した（ＳＮＰ  ＴＳＣ０５９７８８８に関するレーン１および４を参照）。
【０５３９】
可変領域においてヘテロ接合である鋳型ＤＮＡは、２本のバンドを示した。すなわち、第１のバンドは、オーバーハングに相補的な１位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応し、より低分子量であった。また、第２のバンドは、オーバーハングに相補的な３位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応し、より高分子量であった（ＳＮＰ  ＴＳＣ０５９７８８８に関するレーン３を参照）。
【０５４０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９５４９２に関して、レーン１および３における鋳型ＤＮＡは、可変領域においてヘテロ接合であり、これは２本の明瞭なバンドの存在によって証明された。レーン２における鋳型ＤＮＡは、可変領域におけるグアニンに関してホモ接合であった。レーン４における鋳型ＤＮＡはシトシンに関してホモ接合であった。このＳＮＰに関しレーン４では、ただ１本のバンドが見られ、これは、オーバーハングに相補的な１位において、ｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子よりも高い分子量を有した（レーン２、３、４を比較）。
【０５４１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５に関して見られる対立遺伝子は、シトシンまたはチミジンであると報告されている。一致のため、ＳＮＰ合弁会社がセンス鎖に現れる際に見られる対立遺伝子を示している（２００３年２月１１日現在、実効のあるウェブサイト；www.snp.cshl.org/shpsearch.shtml）。このＳＮＰに関し、第２のプライマーは関心対象座の上流にアニールしたので、ＢｓｍＦＩにおける消化後、はめ込み反応をアンチセンス上に生じさせた。
【０５４２】
レーン１および３における鋳型ＤＮＡは、鋳型ＤＮＡはヘテロ接合であり、レーン２における鋳型ＤＮＡはチミジンに関してホモ接合であり、レーン４における鋳型ＤＮＡはシトシンに関してホモ接合であった。アンチセンス鎖はｄｄＧＴＰによってはめ込みがなされたので、センス鎖上のヌクレオチドはシトシンに相当した。
【０５４３】
予想されるバンドの位置を同定するために分子量マーカーが使用できる。あるいは、分析された各ＳＮＰに対し、予想された２本のバンドの位置を精確に同定する公知のヘテロ接合試料が使用できる。
【０５４４】
図１１に示されるように、限定はしないが、ＳＮＰおよび単一ヌクレオチド突然変異などの可変領域の同一性決定のために、１種の蛍光色素で標識された１種のヌクレオチドが使用できる。典型的には、ある個体があるＳＮＰ部位においてホモ接合かヘテロ接合かを決定するために、１種の蛍光色素で標識した１種のヌクレオチドおよび第２の色素で標識した第２のヌクレオチドを用いて、複数の反応が実施される。しかし、２種の色素は異なる量子係数を有するため、これが結果を比較する場合に問題を生じさせる。１種の蛍光色素で標識した１種のヌクレオチドを使用することによって、異なる色素の量子係数に由来する誤差が排除される。
【０５４５】
本実施例では、蛍光標識したｄｄＧＴＰを用いた。しかし、本法は、限定はしないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分など、任意のシグナル生成部分でタグを付けたヌクレオチドに適用できる。さらに、標識したｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰを使用できる。
【０５４６】
上記実施例では、オーバーハングに相補的な３位を、第２の対立遺伝子の指標として用いた。しかし、オーバーハングの２位または４位を同様に用いることができる（ヌクレオチドの取り込みの節を参照）。さらにオーバーハングは、ＩＩＳ型酵素ＢｓｍＦＩによって生成したが、限定はしないが結合部位からある距離でＤＮＡを切断する表Ｉに挙げた酵素などの任意の酵素が使用できる。
【０５４７】
また、上記実施例では、ＳＮＰ部位の直前のヌクレオチドは、はめ込まれた鎖上のグアニンではなかった。これにより、ＩＩＳ型酵素の除去すべき別途切断特性の作用が排除された。例えば、ＳＮＰ  ＴＳＣ０８３７９６９において、センス鎖上のＳＮＰ部位のヌクレオチドはアデニンであった。ＢｓｍＦＩが別途切断特性を示したとすれば、アデニン対立遺伝子およびグアニン対立遺伝子に関して、以下のオーバーハングが生成するであろう。
2006521086.tif 000116
【０５４８】
グアニン対立遺伝子では、オーバーハングの１位がｄＡＴＰによってはめ込まれるため、ポリメラーゼは、オーバーハングに相補的な２位にｄｄＧＴＰを取り込むことができると考えられる。
【０５４９】
アデニン対立遺伝子では、オーバーハングに相補的な１位は、ｄＡＴＰによってはめ込まれ、２位はｄＡＴＰによってはめ込まれ、３位はｄＴＴＰによってはめ込まれ、４位はｄＧＴＰによってはめ込まれと考えられる。１０／１４で切断された分子と１１／１５で切断された分子との間に分子量の違いはないと考えられる。ＤＮＡ分子が可変部位にアデニンを含有したか、またはグアニンを含有したかに対応する違いだけであろう。
【０５５０】
図１１に見られるように、第１のプライマーのアニーリング領域の配置によって、ゲルの単一レーンにおける複数のＳＮＰの分析が可能となる。また、同一の色素と共に同一のヌクレオチドを使用することにより、単一のはめ込み反応を実施できる。本実施例においては、１レーンで６つのＳＮＰが分析された。しかし、限定はしないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜４０、４０〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、および２００を超える任意の数のＳＮＰを単一反応において分析できる。
【０５５１】
さらに、標識したヌクレオチドがいずれも可変部位（１１／１５切断の０位におけるヌクレオチドに相補的）の直前に存在しないという条件で、双方の対立遺伝子を検出するために用いられる１つの標識ヌクレオチドを別のＳＮＰセットを検出するために用いられる第２の１つの標識ヌクレオチドと混合することができる。例えば、ＳＮＰ  Ｘが可変部位におけるグアニンまたはチミジンであり得るとすれば、ＢｓｍＦＩによる消化後に生成した、以下の５’オーバーハングを有する。
2006521086.tif 000117
【０５５２】
標識ｄｄＧＴＰ、未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰによるはめ込み反応後、以下の分子が生成すると考えられる。
2006521086.tif 000118
【０５５３】
ＳＮＰ  Ｙが可変部位におけるアデニンまたはチミジンであり得るとすれば、ＢｓｍＦＩによる消化後に生成した、以下の５’オーバーハングを有する。
2006521086.tif 000119
【０５５４】
標識ｄｄＡＴＰ、および未標識ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰによるはめ込み反応後、以下の分子が生成すると考えられる。
2006521086.tif 000120
【０５５５】
本実施例では、ＳＮＰ  Ｘ、ＳＮＰ  Ｙ双方の対立遺伝子各々の同一性決定に標識ｄｄＧＴＰおよび標識ｄｄＡＴＰを用いる。ＳＮＰ  Ｘの直前のヌクレオチド（１１／１５切断由来のオーバーハングの０位に相補的なヌクレオチド）は、はめ込みされている鎖上のグアニンまたはアデニンではない。同様に、ＳＮＰ  Ｙの直前のヌクレオチドははめ込みされている鎖上のグアニンまたはアデニンではない。このことから、双方のＳＮＰのはめ込み反応が、標識ｄｄＧＴＰ、標識ｄｄＡＴＰ、および未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによって、１つの反応において生じ得る。これによって実施に要する反応数が減り、１つの反応において分析できるＳＮＰの数が増える。
【０５５６】
各ＳＮＰに関する第１のプライマーは、関心対象座から異なった距離でアニールし、ＳＮＰ類をゲル上の異なった位置に移動させるように設計できる。例えば、ＳＮＰ  Ｘを増幅させるために用いられる第１のプライマーは、関心対象座から３０塩基にアニールでき、ＳＮＰ  Ｙを増幅させるために用いられる第１のプライマーは、関心対象座から３５塩基にアニールできる。また、重なりのないスペクトルを放射する蛍光色素でヌクレオチドを標識できる。ゲル操作後、そのゲルを１つの色素に特異的な波長でスキャンできる。その色素で標識した分子だけがシグナルを放射する。次にそのゲルを第２の色素に対する波長でスキャンできる。その色素で標識した分子だけがシグナルを放射する。この方法により、１回の反応において分析できるＳＮＰの数を最大限に少なくすることができる。
【０５５７】
本実施例において、はめ込まれる鎖上の可変部位の前にあるヌクレオチドは、アデニンまたはグアニンでなかったので、可変部位の後にあるヌクレオチドは、センス鎖上のアデニンまたはグアニンではあり得ない。本法は、標識ヌクレオチドの任意の組合わせで機能でき、当業技術者は、どの標識反応が混合でき、どれができないかを理解するであろう。例えば、１つのＳＮＰをチミジンで標識し、第２のＳＮＰをシトシンで標識するならば、各可変部位の直前のヌクレオチドがセンス鎖上のチミジンまたはシトシンでなく、可変部位の直後のヌクレオチドがセンス鎖上のチミジンまたはシトシンでない場合、ＳＮＰは１回の反応で標識できる。
【０５５８】
本法によって、別途切断の程度を決定するか、または色素の量子係数を補正する複雑さを加えることなく、１つの対立遺伝子のシグナルを第２の対立遺伝子のシグナルと比較することが可能となる。本法は、１つの対立遺伝子対他の対立遺伝子の比の定量化を試みる場合に特に有用である。例えば、本法は染色体異常の検出に有用である。ヘテロ接合部位における対立遺伝子の比は、約１：１であることが予想される（１個の対立遺伝子Ａ及び１個の対立遺伝子Ｇ）。しかし、余分な染色体が存在する場合、この比は約１：２であると予想される（１個の対立遺伝子Ａと２個の対立遺伝子Ｇ、または２個の対立遺伝子Ａと１個の対立遺伝子Ｇ）。本法は、母体ＤＮＡの存在下で胎児ＤＮＡの検出を試みる場合に特に有用である。
【０５５９】
さらに本法は、１つの試料における２つの遺伝子シグナルの検出に有用である。例えば、本法は野生型細胞の存在下で、突然変異細胞を検出できる（実施例５を参照）。突然変異細胞が、特定の遺伝子のＤＮＡ配列における突然変異を含有するならば、突然変異体シグナルと野生型シグナルの双方を検出するために、本法を使用できる。本法は野生型ＤＮＡ配列の存在下、突然変異ＤＮＡ配列を検出するために使用できる。１シグナル生成部分で標識した単一ヌクレオチドを使用するため、突然変異ＤＮＡ対野生型ＤＮＡの比を定量化できる。
【０５６０】
実施例７
種々のタイプの癌に対する非侵襲的方法は、疾病率およびその疾病による死亡率を減少させる可能性を有する。結腸直腸腫瘍の早期検出のために結腸鏡検査、バリウム注腸およびＳ状結腸鏡検査などの幾つかの方法が開発されているが、これらの方法は侵襲的であり、患者の低コンプライアンス率を生じるために利用法が限られている。非侵襲的な遺伝子試験は、早期段階の結腸直腸腫瘍の同定に有用であり得る。
【０５６１】
結腸直腸腫瘍形成における重要な役割を演じる線維様結腸ポリープ症遺伝子（ＡＰＣ）が、１９９１年に研究者により同定された（キンズラーら（Ｋｉｎｚｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５３：ｐ．６６１−６６５、１９９１年）。ＡＰＣ遺伝子は、染色体５ｑ２１−２２上に存在し、８５２９個のヌクレオチドのＲＮＡ分子に関し、合計１５個のエキソンコードを有し、３００Ｋｄ  ＡＰＣ蛋白質を生産する。この蛋白質は、多数の細胞タイプにおいて発現し、細胞接着にとって必須である。
【０５６２】
ＡＰＣ遺伝子における突然変異は、一般に結腸直腸新形成を開始させる（ジェイ・ツァオら（Ｔｓａｏ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１４５：ｐ．５３１−５３４、１９９４年）。ＡＰＣ遺伝子における突然変異の凡そ９５％はナンセンス／フレームシフト変異を生じる。最もよく見られる突然変異は、コドン１０６／および１３０９で起こり、これらのコドンにおける突然変異は全生殖細胞系突然変異の１／３を占めている。体細胞突然変異に関して、６０％はコドン１２８６〜１５１３内で生じるが、これはコード配列の約１０％である。この領域は、変異密集領域（ＭＣＲ）と称される。ＡＰＣ遺伝子において、ヌクレオチド置換（表ＶＩＩを参照）、スプライシングエラー（表ＶＩＩＩを参照）、小欠失（表ＩＸを参照）、小挿入（表Ｘを参照）、小挿入／欠失（表ＸＩを参照）、大欠失（表ＸＩＩを参照）、大挿入（表ＸＩＩＩを参照）および複合再配列（表ＸＩＶを参照）などの多くのタイプの突然変異が確認されている。
【０５６３】
大便中のＡＰＣ遺伝子における突然変異を有する細胞を確認する試みが研究者によってなされてきた（ジー・トラバーソら（Ｔｒａｖｅｒｓｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．）、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３４６巻：ｐ．３１１−３２０、２００２年）。ＡＰＣ突然変異は、殆ど全ての腫瘍において見られるが、大便試料中２５０個の細胞のうち、約１個がＡＰＣ遺伝子における突然変異を有しており、たいていの細胞は大便中に流入した正常細胞である。さらにヒトＤＮＡは、大便試料中に見られる全ＤＮＡの約１０億分の１であり、大多数のＤＮＡは細菌のものである。トラバーソらの採用した方法によって検出されるのは、切断型蛋白質を生じる突然変異のみである。
【０５６４】
上記で検討したように、ＡＰＣ遺伝子における多数の突然変異は、結腸直腸腫瘍の形成に関係していた。したがって、結腸直腸腫瘍検出のための高感受性で非侵襲的な方法に対する必要性は依然として存在している。下記にＡＰＣ遺伝子における２つの突然変異を検出する方法を記載する。しかし、本明細書に記載された方法を用いて、任意の数の突然変異を分析することができる。
【０５６５】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、大便試料などの結腸細胞を含有する試料から精製する。鋳型ＤＮＡは、アールキストら（Ａｈｌｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）（ガストロエンテロロジー（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、１１９：ｐ．１２１９−１２２７、２０００年）に記載された方法を用いて精製する。大便試料が凍結している場合は、その試料を室温で解凍し、イグザクター・スツール・シェーカー（Ｅｘａｃｔｏｒ  ｓｔｏｏｌ  ｓｈａｋｅｒ）（イグザクト・ラボラトリーズ（Ｅｘａｃｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州メイナード所在）で均一化する。均一化後、各試料の４グラム当量を２５３６ｘｇで５分間遠心分離する。前記試料を２回目は、１６，５００ｘｇで１０分間遠心分離する。上澄み液を２０μｌのＲナーゼ（１ミリリットル当たり０．５ｍｇ）と共に３７℃で１時間温置する。１リットル当たり３モルの酢酸ナトリウム１／１０容量および等容量のイソプロパノールによってＤＮＡを沈殿させる。前記ＤＮＡを５ｍｌのトリス−ＥＤＴＡ（１リットル当たり０．０１モルのトリス（ｐＨ７．４）および１リットル当たり０．００１モルのＥＤＴＡ）に溶解する。
【０５６６】
プライマー設計
突然変異がコドン１３７０に存在するかどうかを決定するために、以下のプライマーを用いる：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000121
第２のプライマー：
2006521086.tif 000122
【０５６７】
第１のプライマーは、５’末端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対するヌクレオチド配列を含有する。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対するヌクレオチド配列を含有する。
【０５６８】
コドン１３０２に小欠失が存在するかどうかを決定するため、以下のプライマーを用いる：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000123
第２のプライマー：
2006521086.tif 000124
【０５６９】
第１のプライマーは、５’末端におけるビオチンタグおよびＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有する。
【０５７０】
ＰＣＲ反応
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９６号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。この実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、例えば、キアゲンから供給されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を使用した「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。一反応当たり鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化されるが、本実施例では、４０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０５７１】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおける３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度は、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０５７２】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化される。
【０５７３】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離する。各ＰＣＲ産物を、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの４つの別々の反応ウェルに分割する。第１のプライマーは５’ピオチンタグを含有するので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しない。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施する。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄する（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０５７４】
あるいは、ＰＣＲ産物をストレプトアビジンプレートの単一ウェル内に入れて、単一ウェル内においてヌクレオチド取り込み反応を実施する。
【０５７５】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩ（ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号Ｒ０５７２Ｓ）により、精製ＰＣＲ産物を消化する。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施する。適切な制限酵素による消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄する。
【０５７６】
標識ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られる。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にする。
【０５７７】
各関心対象座に対し、４つの別々のはめ込み反応を行うが、４つの反応の各々が異なる蛍光標識をしたｄｄＮＴＰ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＣＴＰ）を含有する。各はめ込み反応に以下の成分を加える：１μｌの蛍光標識ｄｄＮＴＰ、蛍光標識したヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドを含有する０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は４０℃で１０分間実施する。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（メリーランド州ハノーバー所在）から購入する。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手する。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、関心対象座に相当する１塩基だけ伸長する。
【０５７８】
「はめ込み」反応には、標識ｄｄＮＴＰと未標識ｄＮＴＰ類との混合物もまた、用いることができる。４０μＭの未標識ｄＮＴＰ類、１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、および１μｌのｄｄＡＴＰを含有する混合物を用いる以外は、上記のとおりの「はめ込み」条件である。蛍光ｄｄＮＴＰ類はアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５；アマーシャムは蛍光ヌクレオチドの濃度を公表していない）から入手する。関心対象座は、制限酵素ＢｓｍＦＩによって消化され、４塩基の５’オーバーハングを生成する。取り込まれる最初のヌクレオチドが標識ｄｄＮＴＰならば、３’窪み端は１個の塩基によってはめ込まれ、関心対象座を検出できる。しかし、取り込まれた最初のヌクレオチドがｄＮＴＰならば、ポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰがはめ込まれるまでヌクレオチドの取り込みを続ける。例えば、最初の２つのヌクレオチドがｄＮＴＰ類ではめ込みでき、３番目のヌクレオチドがｄｄＮＴＰではめ込みできると、オーバーハング内の３番目のヌクレオチドを検出できる。このように、５’オーバーハング全体の配列を決定することができ、各ＳＮＰまたは関心対象座から得られる情報が増加する。このタイプのはめ込み反応は、挿入、欠失、挿入と欠失、再配列および転座の存在を検出する場合に特に有用である。
【０５７９】
あるいは、単一の色素で標識された単一ヌクレオチドが、関心対象座の配列決定に用いられる。実施例６を参照されたい。本法により、異なる量子係数を有する種々の色素を使用する場合に生じ得る誤差が排除される。
【０５８０】
ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯ぐ。次に酵素と共に供される製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させる。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施する。
【０５８１】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、試料を３６ｃｍの５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）に載せる。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させる。自動塩基配列決定装置（ヘーファー（Ｈｏｅｆｅｒ）ＳＱ３シーケンサー）上で３時間ゲルを操作した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出する。
【０５８２】
別々のはめ込み反応を実施した場合、細胞がＡＰＣ遺伝子のコドン１３７０に突然変異を含有しているかどうかを決定するため、ｄｄＡＴＰおよびｄｄＴＴＰに関するはめ込み反応に対応するゲルのレーンを分析する。正常細胞のみが存在すれば、ｄｄＡＴＰによるはめ込み反応に対応するレーンは明瞭なシグナルとなる。ｄｄＴＴＰによる「はめ込み」反応に関しては、シグナルが検出されない。しかし、患者の試料がＡＰＣ遺伝子のコドン１３７０に突然変異を有する細胞を含んでいれば、ｄｄＡＴＰによるはめ込み反応に対応するレーンは明瞭なシグナルとなり、かつ、ｄｄＴＴＰによる「はめ込み」反応に対応するレーンからのシグナルが検出される。ｄｄＴＴＰによる「はめ込み」反応に対応するレーンからのシグナル強度は、試料中の突然変異の細胞数を示す。
【０５８３】
あるいは、ＡＰＣ遺伝子のコドン１３７０における対立遺伝子配列を決定するために、１つの標識ヌクレオチドが用いられる。コドン１３７０において、正常な配列はＡＡＡであり、これはアミノ酸リジンをコードする。しかし、結腸直腸腫瘍に関連しているコドン１３７０は、ヌクレオチドの置換が確認されている。具体的には、コドン１３７０、ＡからＴへの変化（ＡＡＡ−ＴＡＡ）が典型的に見られるが、これは、停止コドンとなる。単一のはめ込み反応を標識ｄｄＡＴＰおよび未標識ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを用いて実施する。コドン１３７０をコードする正常および突然変異双方のＤＮＡ配列の存在を決定するために、１種の蛍光色素で標識した単一ヌクレオチドを用いる。コドン１３７０に相当する配列は、太字にて関連するＤＮＡ配列を下記に表す。
2006521086.tif 000125
【０５８４】
ＢｓｍＦＩによる消化後、以下のオーバーハングが生成する。
2006521086.tif 000126
【０５８５】
患者の試料が、コドン１３７０に突然変異を含む細胞を有さないならば、標識ｄｄＡＴＰの取り込みに対応する１つのシグナルが見られる。
2006521086.tif 000127
【０５８６】
しかし、患者の試料が、ＡＰＣ遺伝子のコドン１３７０に突然変異のある細胞を有していれば、コドン１３７０における正常な配列に対応する１つのシグナルが見られる、かつコドン１３７０における突然変異の配列に対応する第２のシグナルが見られる。これらのシグナルは、分子量が異なっていることが明瞭に確認される。
2006521086.tif 000128
【０５８７】
突然変異対立遺伝子が存在する場合、２つのシグナルが見られる。突然変異ＤＮＡ分子は、野生型ＤＮＡ分子の１塩基後にはめ込まれる。２つのシグナルは、分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて分離される。野生型ＤＮＡ配列と突然変異ＤＮＡ配列双方の存在を検出するために、１種の標識ヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ）が用いられる。この標識法によって、実施に要する反応数が減り、患者の試料における突然変異細胞数の正確な定量化が可能になる。患者の予後、疾病の程度と重症度を決定するために、試料中の多数の突然変異細胞が利用される。この標識法によって、異なる量子係数を有する異なる色素を使用することに伴う複雑さが排除される。また、この標識法により、ピペット反応に伴う誤差が排除される。
【０５８８】
別々のはめ込み反応を実施した場合、細胞がＡＰＣ遺伝子のコドン１３０２に突然変異を含有しているかどうかを決定するため、ｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰに関するはめ込み反応に対応するゲルのレーンを分析する。コドン１３０２をコードする配列は太字にて正常なＤＮＡ配列を下記に表す。
2006521086.tif 000129
【０５８９】
消化後、以下の５’オーバーハングが生成する。
2006521086.tif 000130
【０５９０】
はめ込み反応後、標識ｄｄＴＴＰが取り込まれる。
2006521086.tif 000131
【０５９１】
コドン１３０２を典型的にコードするＡＰＣ配列の１塩基欠失は結腸直腸腫瘍に関連している。関連配列は太字にて正常なＤＮＡ配列を下記に表す。
2006521086.tif 000132
消化後：
2006521086.tif 000133
はめ込み後：
2006521086.tif 000134
【０５９２】
ＡＰＣ遺伝子に突然変異が存在しないならば、ｄｄＣＴＰ＊によるはめ込み反応に関してシグナルは検出されないが、ｄｄＴＴＰ＊によるはめ込み反応に関して明瞭なシグナルが検出される。しかし、患者の試料中にＡＰＣ遺伝子に突然変異を有する細胞が存在するならば、ｄｄＣＴＰ＊およびｄｄＴＴＰ＊によるはめ込み反応に関してシグナルが見られる。
【０５９３】
あるいは、未標識ｄＮＴＰ類、蛍光標識ｄｄＡＴＰ、蛍光標識ｄｄＴＴＰ、蛍光標識ＣＴＰおよび蛍光標識ｄｄＧＴＰを含有する混合物を用いて単一のはめ込み反応を実施する。欠失がなければ、標識ｄｄＴＴＰが取り込まれる。
2006521086.tif 000135
【０５９４】
しかし、Ｔが欠失していれば、標識ｄｄＣＴＰ＊が取り込まれる。
2006521086.tif 000136
【０５９５】
チミジンヌクレオチドの欠失のため、２つのシグナルは分子量によって分離される。突然変異細胞が存在すれば、２つのシグナルが同一レーンにおいて発生するが、一塩基対によって分離される（この原理は図９Ｄに示している）。欠失によって、ＤＮＡ断片の分子量に変化が生じ、正常細胞および突然変異細胞の双方の存在の検出に単独のはめ込み反応が使用できる。
【０５９６】
上記実施例においては、ヌクレオチド置換および小欠失の検出のための、方法を記載している。しかし、本法は、限定はしないが、ヌクレオチド置換（表ＶＩＩを参照）、スプライシングエラー（表ＶＩＩＩを参照）、小欠失（表ＩＸを参照）、小挿入（表Ｘを参照）、小挿入／欠失（表ＸＩを参照）、大欠失（表ＸＩＩを参照）、大挿入（表ＸＩＩＩを参照）および複合再配列（表ＸＩＶを参照）などの任意のタイプの突然変異の検出に使用できる。
【０５９７】
また、上記の方法は、限定はしないが、表ＩＶに挙げられた疾病など、任意のタイプの疾病の検出に用いられる。さらに、本明細書に記載された発明された発明を用いて、限定はしないが、表ＩＶに挙げられた疾病に関連する遺伝子、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＳＨ６、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＲＥＴ、ＰＴＥＮ、ＡＴＭ、Ｈ−ＲＡＳ、ｐ５３、ＥＬＡＣ２、ＣＤＨ１、ＡＰＣ、ＡＲ、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、ＣＹＰ１Ａ１、ＧＳＴＰ１、ＧＳＴＭ１、ＡＸＩＮ２、ＣＹＰ１９、ＭＥＴ、ＮＡＴ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＱ０１、ｔｒｃ８、ＲＡＤ５１、ＰＭＳ１、ＴＧＦＢＲ２、ＶＨＬ、ＭＣ４Ｒ、ＰＯＭＣ、ＮＲＯＢ２、ＵＣＰ２、ＰＣＳＫ１、ＰＰＡＲＧ、ＡＤＲＢ２、ＵＣＰ３、ｇｌｕｒ１、ｃａｒｔ、ＳＯＲＢＳ１、ＬＥＰ、ＬＥＰＲ、ＳＩＭ１、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ１Ａ、ＴＡＰ２、ＴＨＰＯ、ＴＨＲＢ、ＮＢＳ１、ＲＢＭ１５、ＬＩＦ、ＭＰＬ、ＲＵＮＸ１、Ｈｅｒ−２、グルココルチコイド受容体、エストロゲン受容体、チロイド受容体、ｐ２１、ｐ２７、Ｋ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、網膜芽腫蛋白質、ウィスコット−アルドリッチ（ＷＡＳ）遺伝子、Ｖライデン因子、ＩＩ因子（プロトロンビン）、テトラヒドロ葉酸メチレンレダクターゼ、のう胞性線維症、ＬＤＬ受容体、ＨＤＬ受容体、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子、ＳＨＯＸ遺伝子、一酸化窒素調節に関する遺伝子、細胞周期調節に関する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍遺伝子、神経変性に関連する遺伝子、肥満に関連する遺伝子などの任意のタイプの突然変異遺伝子が検出される。略号は、本明細書に参照のため組み込まれているヒト遺伝子突然変異データベースに挙げられている蛋白質に相当する（２００３年２月１２日現在実効のあるウェブサイトアドレス；www.archive.uwcm.ac.uk./uwcm）。
【０５９８】
上記実施例は、大便試料からの突然変異細胞および突然変異対立遺伝子の検出を示している。しかし、本明細書に記載の方法は、限定はしないが、血液試料、血清試料、血漿試料、尿試料、脊髄液、リンパ液、精液、膣分泌液、腹水、唾液、粘膜分泌物、腹膜液、糞便試料、身体滲出液、乳房液、肺吸引液、細胞、組織、上記の核酸を含有する供給源の個体の細胞または抽出物およびミトコンドリアまたは葉緑体などの細胞下構造体など、任意の生物学的試料の突然変異細胞検出に用いられる。さらに、本明細書に記載の方法は、限定はしないが、法医学試料、食品試料、考古学試料、農業試料または無機試料などの任意の数の核酸含有試料の突然変異細胞および突然変異ＤＮＡの検出に用いられる。
【０５９９】
上記実施例は、ＡＰＣ遺伝子の突然変異の検出に関する。しかい、本明細書に記載の発明は、疾病の素因に関連する任意の遺伝子における突然変異の検出に用いられる（表ＸＶを参照）。
【０６００】
例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰ１（ＧＳＴＰ１）プロモーターの過メチル化は、前立腺癌において最もよく見られるＤＮＡ変化である。前記プロモーターのメチル化状態は、重硫酸ナトリウムおよび本明細書に記載の方法を用いて決定される。
【０６０１】
重硫酸ナトリウムによる処理によって、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換され、メチル化シトシンは未変化のままとなる。本明細書に記載の方法を用いて、メチル化されることの多いＧＳＴＰ１プロモーター領域を増幅するように、第１のプライマーおよび第２のプライマーを設計する。重硫酸ナトリウム処理前のＧＳＴＰ１プロモーター領域を下記に示す。
重硫酸ナトリウム処理前：
2006521086.tif 000137
【０６０２】
重硫酸ナトリウム処理、ＰＣＲ増幅、およびＩＩＳ型制限酵素ＢａｍＦＩによる消化後のＧＳＴＰ１プロモーター領域を下記に示す。
2006521086.tif 000138
【０６０３】
５’オーバーハングのはめ込みには、標識ｄｄＡＴＰ、未標識ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを用いる。以下の分子が生成する。
2006521086.tif 000139
【０６０４】
２つのシグナルが見られる。１つは、オーバーハングに相補的な１位においてｄｄＡＴＰによりはめ込まれたＤＮＡ分子（非メチル化）に対応し、他方はオーバーハングに相補的な４位においてｄｄＡＴＰによりはめ込まれたＤＮＡ分子（メチル化）に対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離される。あるいは、１つの反応に標識ｄｄＧＴＰを用い、もう１つの反応に標識ｄｄＡＴＰを用いて、別々の反応においてはめ込み反応を実施する。
【０６０５】
本明細書に記載の方法は、前立腺癌をスクリーンするため、また、この疾患の進行および重症度をモニターするために用いられる。メチル化配列および非メチル化配列双方を検出するために、単一ヌクレオチドを使用することによって正確な定量化が可能となり、またメチル化配列に対する高レベルの感受性が提供されるので、前記疾患の早期検出に有用な手段である。
【０６０６】
表ＶＩＩ〜ＸＩＶに含まれる情報は、ヒト遺伝子突然変異データベースから得た。本明細書に提供された情報を用いて、当業技術者は、任意の遺伝子の対立遺伝子配列の決定に、これらの方法をいかに適用するかを解されるであろう。多数の遺伝子およびそれに関連する突然変異は、以下のウェブサイト：www.archive.uwcm.ac.uk./uwcmに見ることができる。
【０６０７】
（表ＶＩＩ）ヌクレオチド置換
2006521086.tif 000140
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【０６０８】
（表ＶＩＩＩ）ヌクレオチド置換
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2006521086.tif 000147
【０６０９】
（表ＩＸ）ＡＰＣ小欠失
太字は、コドンを示す。アンダーケース文字は欠失を表す。欠失がコード領域を超えて広がる場合は、他の位置情報が与えられる。例えば、略号５’ＵＴＲは、５’未翻訳領域を表し、略号Ｅ６１６は、エキソン６／イントロン６境界を示す。
2006521086.tif 000148
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2006521086.tif 000161
【０６１０】
（表Ｘ）小規模な挿入
2006521086.tif 000162
2006521086.tif 000163
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【０６１１】
（表ＸＩ）小規模な挿入／欠失
2006521086.tif 000165
【０６１２】
（表ＸＩＩ）大規模な欠失
2006521086.tif 000166
【０６１３】
（表ＸＩＩＩ）大規模な挿入および重複
2006521086.tif 000167
【０６１４】
（表ＸＩＶ）大規模な再構成（転位も含む）
2006521086.tif 000168
【０６１５】
（表ＸＶ）診断応用
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【０６１６】
実施例８
単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）は、配列変化のうちで最もよく見られる形態であり、ヒトゲノムには、５％以上の集団頻度で３００万の共有ＳＮＰが存在すると予想されてきた。これらの多形を指標として遺伝子マップが開発されている。
【０６１７】
対立遺伝子頻度はＳＮＰごとに変化する。すなわち、あるＳＮＰに関する対立遺伝子頻度は５０：５０であり得るが、他のＳＮＰに関する対立遺伝子頻度は９０：１０であり得る。対立遺伝子頻度が５０：５０に近づくほど、特定個体はそのＳＮＰにおいてヘテロ接合である可能性が大きくなる。ＳＮＰ合弁会社は、幾つかのＳＮＰに関する頻度情報を提供しているが、その他のものに関しては提供していない。www.snp.chsl.org。特定のＳＮＰに関する対立遺伝子頻度は、実施例５に記載の非侵襲的出生前スクリーニングに関するそのＳＮＰの有用性について貴重な情報を提供する。全てのＳＮＰが使用できるが、対立遺伝子頻度が５０：５０により近いＳＮＰが好ましい。
【０６１８】
簡単に言うと、母体血液は胎児ＤＮＡを含有する。母親がホモ接合であるＳＮＰを検査することによって、母体ＤＮＡを胎児ＤＮＡから識別することができる。例えば、ＳＮＰ  Ｘでは、母体ＤＮＡはグアニンに関してホモ接合であり得る。妊娠女性の血漿から採取した鋳型ＤＮＡが、アデニン対立遺伝子およびグアニン対立遺伝子に対応するシグナルの検出により証明された場合、ヘテロ接合であれば、胎児ＤＮＡの標識としてアデニン対立遺伝子を使用することができる（実施例５を参照）。あるＳＮＰの対立遺伝子頻度が５０：５０に近づくほど、特定のＳＮＰにおいて母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間に違いがある可能性が大きくなる。
【０６１９】
例えば、ＳＮＰ  Ｘにおいて、認められた対立遺伝子がアデニンおよびグアニンであり、ＳＮＰが９０（Ａ）：１０（Ｇ）の対立遺伝子頻度を有しているとすれば、その特定のＳＮＰにおいて、母親のＤＮＡと父親のＤＮＡの双方が、アデニンに関してホモ接合である可能性が大きい。したがって、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの双方が、アデニンに関してホモ接合となり、胎児ＤＮＡに関して異なったシグナルは存在しない。しかし、ＳＮＰ  Ｘにおける対立遺伝子頻度が５０：５０であり、母親がアデニンに関してホモ接合であれば、父親ＤＮＡは、ＳＮＰ  Ｘにグアニン対立遺伝子を含有している可能性が大きい。
【０６２０】
ＳＮＰに関する対立遺伝子頻度を決定する方法を下記に提供する。染色体１３上に位置する７つのＳＮＰを分析した。この方法は、限定はしないが、ヒト染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹ上のＳＮＰなどの任意のＳＮＰに適用可能である。
【０６２１】
鋳型ＤＮＡの調製
特定のＳＮＰの対立遺伝子頻度を決定するために、２５０人からインフォームドコンセントを得てＤＮＡを採取した。各個人から９ｍｌの血液試料を滅菌管（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌ  ＥＤＴＡ減圧管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取した。管を１０００ｒｐｍで１０分間回転させた。各試料の上澄み液（血漿）を取り、一般に「バフィーコート（ｂｕｆｆｙ−ｃｏａｔ）」と称されている残りの血液試料の１ミリリットルを新たな管に移した。各試料に１ミリリットルの１×ＰＢＳを加えた。
【０６２２】
キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡは、キットに含まれている使用説明書に従って単離した。各個体から、０．７６μｇのＤＮＡを一緒にプールし、プールしたＤＮＡを引き続く全ての反応に用いた。
【０６２３】
プライマー設計
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ０９０３４３０を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000173
第２のプライマー：
2006521086.tif 000174
【０６２４】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から８２塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６２５】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ０３３７９６１を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000175
第２のプライマー：
2006521086.tif 000176
【０６２６】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から９２塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６２７】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ０７８６４４１を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000177
第２のプライマー：
2006521086.tif 000178
【０６２８】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から１０４塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６２９】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ１１６８３０３を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000179
第２のプライマー：
2006521086.tif 000180
【０６３０】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から６４塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６３１】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ００５６１８８を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000181
第２のプライマー：
2006521086.tif 000182
【０６３２】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から８２塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６３３】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ０４６６１７７を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000183
第２のプライマー：
2006521086.tif 000184
【０６３４】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から９２塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６３５】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７４２４を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000185
第２のプライマー：
2006521086.tif 000186
【０６３６】
第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から１０４塩基にアニールするように設計した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０６３７】
第１のプライマーは、関心対象座から種々の距離でアニールするように設計した。当業技術者は第１のアニーリング位置が、限定はしないが、関心対象座から５〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１０５、１０６〜１１０、１１１〜１１５、１１６〜１２０、１２１〜１２５、１２６〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、２８１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４５１〜５００、５０１〜１０００、１００１〜２０００、２００１〜３０００または３０００を上回る任意の距離であり得ることを解されるであろう。
【０６３８】
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９６号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、４０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡ（２４５人の鋳型ＤＮＡ混合物）および５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０６３９】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０６４０】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０６４１】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物を、未使用ＰＣＲ剤から単離した。ＰＣＲ反応後、ＳＮＰ  ＴＳＣ０９０３４３０、ＳＮＰ  ＴＳＣ０３３７９６１およびＳＮＰ  ＴＳＣ０７８６４４１に関する反応液の１／２容量を１本の反応管に一緒に混合した。ＳＮＰ  ＴＳＣ１１６８３０３、ＳＮＰ  ＴＳＣ００５６１８８、ＳＮＰ  ＴＳＣ０４６６１７７、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７４２４に関する反応液の１／２容量を１本の反応管に一緒にプールした。未使用のプライマーおよびヌクレオチドを、キアゲン・ミンエリュートＰＣＲ精製キット（キアゲン、カタログ番号２８００４）を用いて反応液から除去した。反応は、カラムと共に供された製造元の使用説明書に従って行った。
【０６４２】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素により、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は制限酵素と共に供された使用説明書に従ってエッペンドルフ管内で実施した。
【０６４３】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化によって、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０６４４】
実施例６で詳細に検討したように、あるＳＮＰの双方の対立遺伝子を、１種の標識ヌクレオチドにより、他の未標識ヌクレオチドの存在下で決定できる。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、グアニン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。本実施例において用いられたシーケナーゼはＤＮＡポリメラーゼであった。しかし、限定はしないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ベントＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９のポリメラーゼ、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼなどの任意のＤＮＡポリメラーゼを、はめ込み反応に用いることができる。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０６４５】
関心対象座の検出
試料を、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の１レーンに載せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置（ホーファーＳＱ３シーケンサー）上で３時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ）上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０６４６】
下記は、ＳＮＰ  ＴＳＣ００５６１８８に関する５’オーバーハングの図式の複写である（ここでＲは可変部位を示す）。配列全体ではなく、オーバーハングの部分のみを示している。
2006521086.tif 000187
【０６４７】
実施例６で詳細に検討したように、関心対象座の対立遺伝子配列を決定するために、１種の化学的部分によって標識した１種のヌクレオチドが使用できる。５’センス鎖（ここでは上の鎖として表される）上のＴＳＣ００５６１８８に関して見られるヌクレオチドは、アデニンとグアニンである。アンチセンス鎖上のオーバーハングにおける３位は、グアニンに相補的なシトシンである。可変部位がアデニンまたはグアニンであり得るので、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いて、双方の対立遺伝子の配列を決定した。下記はグアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合、またはヘテロ接合の個体に対するはめ込み反応の図式である。
ホモ結合アデニン：
2006521086.tif 000188
ホモ結合グアニン：
2006521086.tif 000189
ヘテロ結合：
2006521086.tif 000190
【０６４８】
図１４に見られるように、ＴＳＣ００５６１８８に関して、２本のバンドが検出された。低い方のバンドは、オーバーハングに相補的な１位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応したが、これはグアニン対立遺伝子を表している。低い方のバンドより１塩基だけ離れている高い方のバンドは、オーバーハングに相補的な３位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応した。このバンドは、アデニン対立遺伝子を表している。各バンドの強度は高く、各対立遺伝子が集団内で十分に表れていることを示していた。ＴＳＣ００５６１８８は、対立遺伝子頻度の高いＳＮＰであることが示されている。
【０６４９】
下記は、ＳＮＰ  ＴＳＣ３３７９６１に関し、ＢｓｍＦＩによる消化後に生成した５’オーバーハングの図式の複写である（ここでＲは可変部位を示す）。配列全体ではなく、オーバーハングの部分のみを示している。
2006521086.tif 000191
【０６５０】
５’センス鎖（ここでは上の鎖として表される）上のＳＮＰ  ＴＳＣ３３７９６１に関して見られるヌクレオチドは、アデニンとグアニンである。アンチセンス鎖上のオーバーハングにおける３位は、グアニンに相補的なシトシンである。可変部位がアデニンまたはグアニンであり得るので、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いて、双方の対立遺伝子の配列を決定した。下記はグアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合、またはヘテロ接合の個体に対するはめ込み反応の図式である。
グアニンに関してホモ結合：
2006521086.tif 000192
アデニンに関してホモ結合：
2006521086.tif 000193
【０６５１】
図１４に見られるように、予想された低分子量バンドの位置に移動している１本のバンドが見られた。このバンドは、オーバーハングに相補的な１位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子のものであるが、これは、グアニン対立遺伝子を表している。オーバーハングに相補的な３位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応するバンドは検出されなかった。ＳＮＰ  ＴＳＣ３３７９６１は、集団内でそれほど可変的ではないＳＮＰであることが示されている。
【０６５２】
分析した７種のＳＮＰのうち、４種のＳＮＰ（ＴＳＣ１１６８３０３、ＴＳＣ００５６１８８、ＴＳＣ０４６６１７７、およびＴＳＣ０１９７４２４）は、対立遺伝子頻度が高い。この４種のＳＮＰの各々に関して、強度の高い２本のバンドが見られたことから、双方の対立遺伝子が集団内に十分表れていることが示される。
【０６５３】
しかし、ＳＮＰが有用であるためには、必ずしも５０：５０の対立遺伝子頻度を有する必要がるというわけではない。全てのＳＮＰが、有用な情報を提供する。本明細書に記載した方法は、限定はしないが、点突然変異などのＳＮＰまたは任意の可変部位の対立遺伝子頻度決定のための迅速な技術を提供する。
2006521086.tif 000194
の対立遺伝子頻度が有用であり得る。
【０６５４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０９０３４３０に関して、２本のバンドが見られた。一方の低分子量バンドは、標識ｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子を表した。オーバーハングの相補的な３位において標識ｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子に関するより強度の低いバンドが見られたが、これはシトシン対立遺伝子を表した。ＳＮＰ  ＴＳＣ０９０３４３０は、対立遺伝子変化頻度の低いＳＮＰであることが示されている。集団内では、大多数の個人がグアニン対立遺伝子を担持しているが、シトシン対立遺伝子も存在している。
【０６５５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３３７９６１およびＳＮＰ  ＴＳＣ０７８６４４１に関して、高強度の１本のバンドが見られた。ＳＮＰ  ＴＳＣ０３３７９６１およびＳＮＰ  ＴＳＣ０７８６４４１双方に関して検出されたバンドは、オーバーハングに相補的な１位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応した。オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれたと考えられるＤＮＡ分子で、第２の対立遺伝子を表したと考えられるシグナルは、検出されなかった。ＳＮＰ  ＴＳＣ０３３７９６１およびＳＮＰ  ＴＳＣ０７８６４４１は、集団内で可変性の少ないＳＮＰであることが示されている。
【０６５６】
図１４に示されるように、各関心対象座の増幅に用いられる第１のプライマーは、関心対象座から様々な距離でアニールするように設計できる。これにより、同一の反応において複数のＳＮＰを分析することが可能になる。第１のプライマーを、関心対象座から特定の距離にアニールするように設計することにより、限定はしないが、１〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、４０１〜５００、および５００を上回る任意の数の関心対象座を１つの反応において分析することができる。
【０６５７】
実施例６で検討されたように、幾つかのＩＩＳ型制限酵素は、別途の切断パターンを示す。例えば、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩは、その結合部位から１０／１４を切断するのが典型的だが、この酵素はまた、その結合部位から１１／１５を切断できる。別途切断の作用を排除するため、はめ込み反応に用いられる標識ヌクレオチドは、１１／１５切断によって生じるオーバーハングの０位に相補的でないように選択すべきである（実施例６に詳細に検討されている）。例えば、ｄｄＧＴＰによって、標識する場合、はめ込まれる鎖上の可変部位の前のヌクレオチドはグアニンであってはならない。
【０６５８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００５６１８８に関して、ＢｓｍＦＩによって生成した１１／１５オーバーハングを可変部位は太字にして下記に表している。
ＴＳＣ００５６１８８に関しての１１／１５オーバーハング
2006521086.tif 000195
【０６５９】
標識ｄｄＧＴＰ、未標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰによるはめ込み反応後、以下の分子が生成した。
2006521086.tif 000196
【０６６０】
２つのシグナルが見られた。一方のバンドは、オーバーハングの１位にｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子に対応し、他方のバンドはオーバーハングに相補的な３位にｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子に対応した。これらは、１０／１４オーバーハングのはめ込み反応後、生成した同一のＤＮＡ分子である。したがって、別途切断による不確かさを伴わずに２本のバンドを比較できる、単一ヌクレオチドによるこの標識法により、酵素の別途切断特性から生じる誤差が排除される。
【０６６１】
本明細書に記載の方法は、限定はしないが、ヒト染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹ上のＳＮＰなど、任意のＳＮＰに適用可能である。
【０６６２】
実施例９
ヘテロ接合ＳＮＰは、定義によりヌクレオチド１個だけ異なっている。ヘテロ接合ＳＮＰにおいては、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、１：１の比で存在し得る。しかし、ＤＮＡポリメラーゼが他のヌクレオチドよりも速く１個のヌクレオチドを取り込んで、そのため、ヘテロ接合ＳＮＰの観察された比が理論上予想された１：１の比と異なり得るという可能性がある。
【０６６３】
ヘテロ接合ＳＮＰにおいて、対立遺伝子１対対立遺伝子２の予想比に関する効率的で正確な定量化を可能にする方法を下記に記載する。
【０６６４】
鋳型ＤＮＡの調製
２４人からインフォームドコンセントを得てＤＮＡを採取した。各個人から９ｍｌの血液試料を滅菌管（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌ  ＥＤＴＡ減圧管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取した。管を１０００ｒｐｍで１０分間回転させた。各試料の上澄み液（血漿）を取り、一般に「バフィーコート（ｂｕｆｆｙ−ｃｏａｔ）」と称されている残りの血液試料の１ミリリットルを新たな管に移した。各試料に１ミリリットルの１×ＰＢＳを加えた。
【０６６５】
キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡは、キットに含まれている使用説明書に従って単離した。
【０６６６】
プライマー設計
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000197
第２のプライマー：
2006521086.tif 000198
【０６６７】
以下のプライマーセットを用いてＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000199
第２のプライマー：
2006521086.tif 000200
【０６６８】
第１のプライマーは、５’末端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対するヌクレオチド配列を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対するヌクレオチド配列を含有した。第１のプライマーは、関心対象座から様々な距離でアニールするように設計された。
【０６６９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５に関する第１のプライマーは、関心対象座から９０塩基をアニールするように設計された。ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関する第１のプライマーは、関心対象座から６０塩基をアニールするように設計された。
【０６７０】
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９６号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、４０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０６７１】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０６７２】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０６７３】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。ＰＣＲ反応液の１／２を、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの１つのウェルに移した。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０６７４】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩにより、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０６７５】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化により、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０６７６】
実施例６で詳細に検討したように、あるＳＮＰの双方の対立遺伝子を、１種の標識ヌクレオチドにより、他の未標識ヌクレオチドの存在下で決定できる。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、グアニン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０６７７】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０６７８】
関心対象座の検出
試料を、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の１レーンに載せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置（ホーファーＳＱ３シーケンサー）上で３時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ）上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
【０６７９】
下記は、ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５に関する５’オーバーハングの図式の複写である（ここでＲは可変部位を示す）。配列全体ではなく、オーバーハングの部分のみを示している。
2006521086.tif 000201
【０６８０】
５’センス鎖（ここでは上の鎖として表す）上のＴＳＣ０６０７１８５に関して見られるヌクレオチドは、シトシンとチミジン（ここではＲとして表す）である。この場合、第２のプライマーは、関心対象座からアニールするので、はめ込み反応は、アンチセンス鎖（ここでは下の鎖として表す）上に生じる。アンチセンス鎖はグアニンまたはアデニンによってはめ込まれることになる。
【０６８１】
オーバーハングの２位は、アデニンに相補的なチミジンであり、オーバーハングの３位は、グアニンに相補的なシトシンに相当する。双方の対立遺伝子の配列を決定するために、未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄＧＴＰを用いた。はめ込み反応後、以下のＤＮＡ分子が生成した。
2006521086.tif 000202
【０６８２】
ＴＳＣ０６０７１８５における認識部位から１１／１５で切断するＢｓｍＦＩにより生成したオーバーハングを下記に表す。
2006521086.tif 000203
【０６８３】
標識ｄＧＴＰをはめ込み反応に使用するため、認識部位から１１／１５で切断された分子から新たなシグナルは生じない。オーバーハングに相補的な０位は未標識ｄＡＴＰによってはめ込まれた。標識ｄｄＧＴＰによって１位にはめ込まれたオーバーハングに相補的な分子、または標識ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的な分子から生じたシグナルだけが見られた。
【０６８４】
２４人中、５人がＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５に関してヘテロ接合であった。図１５に示されるように、２本のバンドが検出された。より低分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって１位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応した。より高分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応した。
【０６８５】
５つのヘテロ接合試料の各々に関して、２つの対立遺伝子の比を算出した（表ＸＶＩを参照）。対立遺伝子２対対立遺伝子１の平均比は、１．０００であり、標準偏差は、０．０４４であった。このように、ＴＳＣ０６０７１８５における対立遺伝子の比は一貫性が高い。ある特定のＳＮＰに関する実験上で算出された対立遺伝子比を以後、ＳＮＰの「Ｐ」値と称す。分析されるゲノムの数が、統計上のサンプリングからの誤差が生じない十分な数であるという条件でＴＳＣ０６０７１８５を分析することによって、１：１の対立遺伝子比が一貫して与えられることになる。
【０６８６】
試料が少数のゲノムを含有したとすれば、プライマーは、統計的にある染色体を他の染色体よりもアニールする可能性がある。例えば、試料が対立遺伝子１の合計４０個の染色体および対立遺伝子２の４０個の染色体に相当する４０個のゲノムを含有すれば、プライマーは、対立遺伝子１の４０個の染色体にアニールするが、対立遺伝子２にアニールするのは３５個の染色体だけということもあり得る。これによって対立遺伝子１が対立遺伝子２よりも優先的に増幅され、対立遺伝子１対対立遺伝子２の比を変化させることが考えられる。この問題は、試料中に十分な数のゲノムを有することによって排除される。
【０６８７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５は、可変部位におけるヌクレオチドの違いがＰＣＲ反応または制限酵素による消化、またははめ込み反応に影響を与えないＳＮＰであることが示される。１種の蛍光色素によって標識された１種のヌクレオチドを使用することによって、ある対立遺伝子に関するバンドを、第２の対立遺伝子に関するバンドと正確に比較し得ることが保証される。２つの異なるレーン間の比較、または色素の量子係数の補正を必要とする複雑さが加わらない。さらに、ＩＩＳ型制限酵素の別途切断特性による作用が排除されている。
【０６８８】
（表ＸＶＩ）ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０７１８５およびＴＳＣ１１３０９０２における対立遺伝子１および対立遺伝子２の比
2006521086.tif 000204
【０６８９】
下記に、ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関する５’オーバーハングの図式を示す。配列全体ではなく、オーバーハングを示す部分だけの複写である（ここではＲは可変部位を示す）。
2006521086.tif 000205
【０６９０】
５’センス鎖（ここでは上の鎖として表される）上のＴＳＣ１１３０９０２に関して見られるヌクレオチドはアデニンとグアニンである。オーバーハングの２位はチミジンに相当し、オーバーハングの３位は、グアニンに相補的なシトシンに相当する。未標識ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＡＴＰの存在下、蛍光標識ｄｄＧＴＰを用いて、双方の対立遺伝子の配列を決定した。はめ込み反応後、以下のＤＮＡ分子が生成した。
2006521086.tif 000206
【０６９１】
図１５に示されるように、２本のバンドが検出された。より低分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって１位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子（Ｇ対立遺伝子）に対応し、より高分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子（Ａ対立遺伝子）に対応した。
【０６９２】
２４人中５人がＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関してヘテロ接合であった。図１５に見られるように、対立遺伝子１に対応するバンドは、対立遺伝子２に対応するバンドよりも強度が高い。これは５人の各々に見られた。対立遺伝子１に対応するバンドの実際の強度は、個人によって変化したが、対立遺伝子２に対応するバンドよりも常に高い強度であった。５人に関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１の平均比は、０．７４１１６であり、標準偏差は、０．０１７０１８であった。
【０６９３】
異なる５人から鋳型ＤＮＡを調製した。別々のＰＣＲ反応、別々の制限酵素消化および別々のはめ込み反応を実施した。しかし、各鋳型ＤＮＡに関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１の比は約０．７５であった。このＳＮＰの「ｐ」値は一貫性が高い。
【０６９４】
例えば、ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関して、「ｐ」値は０．７５であった。統計上のサンプリング誤差を除去するため、試料が十分なゲノム数を含有しているという条件で、この値からの偏差は、染色体１３の異常コピー数の存在を示すことになる。対立遺伝子２の追加コピーが存在すれば、「ｐ」値は予想される０．７５よりも高くなる。しかし、対立遺伝子１の追加コピーが存在すれば、「ｐ」値は予想される０．７５よりも低くなる。特定のＳＮＰに関して「ｐ」値を定量化することが、染色体異常の有無を決定するために、ＳＮＰを使用することができる。染色体異常の存在を検出するためには、単一のＳＮＰに関して測定された正確な「ｐ」値で十分である。
【０６９５】
幾つかのＳＮＰにおいて、一対立遺伝子の他の一対立遺伝子に対する比が、理論上予想される１：１の比からなぜ変化するかについては、幾つかの可能な解釈がある。第１に、ＤＮＡポリメラーゼは、あるヌクレオチドを他のヌクレオチドよりも速く取り込む可能性がある。対立遺伝子はＰＣＲによって増幅されているため、あるヌクレオチドが他のヌクレオチドよりもほんのわずか優勢であっても、予想された１：１の比からの変化を生じ得る。はめ込み反応の間は、あるヌクレオチドが他のヌクレオチドよりも優先となる可能性は見られない。なぜならば、１種の色素によって標識した単一ヌクレオチドが使用されるからである。
【０６９６】
ＳＮＰ部位における可変ヌクレオチドが、２つの対立遺伝子の変性速度に影響を与える可能性もある。対立遺伝子１がグアニンを含有し、対立遺伝子２がアデニンを含有すれば、これらのヌクレオチドに関する結合の強さの違いが、ＤＮＡ鎖の分離する速度に影響を与え得る。やはり対立遺伝子はＰＣＲによって増幅されているため、ほんの僅かな違いが、最終結果に大きな影響を与え得ることを特記することは重要である。また、ＳＮＰ部位における可変ヌクレオチドが、２本の鎖の分離後アニールする速度に影響を与えている可能性もある。
【０６９７】
あるいは、ＩＩＳ型制限酵素がある対立遺伝子を他の対立遺伝子よりも優先的に切断する可能性もある。上記で詳細に検討したように、ＩＩＳ型制限酵素は、認識部位から離れて切断する。ＳＮＰ部位における可変ヌクレオチドが制限酵素消化の効率に影響を与えている可能性がある。幾つかのＳＮＰにおいて、制限酵素はある対立遺伝子を１００％の効率で切断し、一方、他の対立遺伝子を９０％の効率で切断する可能性がある。
【０６９８】
しかしながら、対立遺伝子１対対立遺伝子２の比が理論上予想された１：１の比から逸脱する事実が、ＳＮＰの有用性に影響を与えるか、または減少させるわけではない。上記に示されたように、各ＳＮＰに関する「ｐ］値は異なる個人の間で一貫性がある。
【０６９９】
任意のＳＮＰに関する「ｐ」値は、限定はしないが、１〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜２１０、２１１〜２２０、２２１〜２３０、２３１〜２４０、２４１〜２５０、２５１〜２６０、２６１〜２７０、２７１〜２８０、２８１〜２９０、２９１〜３００人、および３００人を上回る任意の数のヘテロ接合の個人の鋳型ＤＮＡを分析することによって算出できる。
【０７００】
本明細書に記載された方法により、任意のＳＮＰに関する「ｐ］値の決定が可能である。幾つかのＳＮＰよりもより一貫した挙動をとる可能性がある。ヒトゲノムには、３００万以上のＳＮＰが存在するため、各々のＳＮＰがどのような挙動をとるかを推測することは不可能である。各ＳＮＰに関する「ｐ」値は、実験的に決定する必要があろう。本明細書に記載された方法は、高い一貫性および再現性のある「ｐ」値を有するＳＮＰの同定を可能にする。
【０７０１】
実施例１０
実施例９で検討したように、特定のＳＮＰにおけるある対立遺伝子対他の対立遺伝子の比は、理論上予想された５０：５０の比から変化し得る。ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の比が、染色体疾患を有する個人において線形を維持するという条件で、追加染色体の存在を検出するためにこれらのＳＮＰを用いることができる。例えば、ＳＮＰＸにおいて、対立遺伝子１対対立遺伝子２のパーセンテージが７５：２５であるとすれば、ダウン症候群を有する個人に関して、対立遺伝子１対対立遺伝子２の予想パーセンテージは、このＳＮＰにおける予想パーセンテージからの変化を反映するように適切に調整されなければ
ならない。
【０７０２】
染色体２１上のＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２に関する対立遺伝子１対対立遺伝子２のパーセンテージは、正常な４人の鋳型ＤＮＡおよびダウン症候群を有する１人の鋳型ＤＮＡを用いて算出された。下記に示すように、ダウン症候群を有する１人において、ある対立遺伝子対他の対立遺伝子は一貫性があり、線形を維持した。
【０７０３】
鋳型ＤＮＡの調製
正常な遺伝子核型を有する４人および染色体２１の１つ余分なコピーを有すること（ダウン症候群）が確認されている１人からＤＮＡを採取した。ダウン症候群を有する個人の親からもインフォームドコンセントを得た。
【０７０４】
各個人から９ｍｌの血液試料を滅菌管（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌ  ＥＤＴＡ減圧管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取した。キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡはキットに含まれている使用説明書に従って単離した。
【０７０５】
プライマー設計
以下のプライマーセットを用いてＴＳＣ０１０８９９２を増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000207
第２のプライマー：
2006521086.tif 000208
【０７０６】
第１のプラーマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７０７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。
【０７０８】
ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、５０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。３８サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３７回反復；
（９）７２℃で５分。
【０７０９】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０７１０】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０７１１】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。各ＰＣＲ産物を２つの試料に分け、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの２つの別々の反応ウェルに移した。各ＰＣＲ反応に関し各々、マイクロ滴定プレートの別々のウェルに２つの複製物が存在した。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０７１２】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩにより、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するため１×ＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０７１３】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化により、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０７１４】
実施例６で詳細に検討したように、ＳＮＰの双方の対立遺伝子の配列は、１種の標識ヌクレオチドを用いて、他の未標識ヌクレオチドの存在下で決定できる。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＴＴＰ、チミジン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０７１５】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０７１６】
関心対象座の検出
試料を、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の１レーンに載せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置（ホーファーＳＱ３シーケンサー）上で３時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ）上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
【０７１７】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２に関する５’オーバーハングの図式を示す。ＤＮＡ配列の全体ではなく、オーバーハングの部分のみを複写している（ここでＲは可変部位を示す）。
2006521086.tif 000209
【０７１８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２に関して認められたヌクレオチドは、センス鎖上（ここでは上の鎖として表す）のアデニンとチミジンである。オーバーハングの３位は、チミジンに相補的なアデニンに相当する。未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰの存在下で標識ｄｄＴＴＰを用いた。標識ｄｄＴＴＰによるはめ込み反応後、以下のＤＮＡ分子が生成した。
2006521086.tif 000210
【０７１９】
対立遺伝子１から得た値と対立遺伝子２から得た値を比較することに困難はなかった。なぜならば、はめ込み反応には１種の標識ヌクレオチドが使用され、双方の対立遺伝子に関するはめ込み反応が、１本の管内で生じたからである。ＢｓｍＦＩの別途切断特性は、この分析に影響を与えないであろう。なぜならば、１１／１５オーバーハングは、１０／１４オーバーハングと全く同様にはめ込みを受けるからである。はめ込みを受けた１１／１５オーバーハングの図式を下記に表す。
2006521086.tif 000211
【０７２０】
図１６に見られるように、鋳型ＤＮＡの各試料に関して２本のバンドが検出された。より低分子量のバンドは、ｄｄＴＴＰによって１位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応し、より高分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応した。
【０７２１】
対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、一貫性が高かった（表ＸＶＩＩを参照）。また、いずれの所与の個人に関しても、ＰＣＲ反応の複製物は、同様の結果を示した（表ＸＶＩＩを参照）。対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、対立遺伝子２の値を、対立遺伝子１および対立遺伝子２の値の合計で割る（対立遺伝子２／（対立遺伝子１＋対立遺伝子２））ことによって算出した。４人の対立遺伝子２対対立遺伝子１の平均パーセンテージは０．４７７３であり、標準偏差は０．００９７であった。ダウン症候群を有する１人から単離した鋳型ＤＮＡ上の対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは０．３０８６であった。
【０７２２】
正常な個人の鋳型ＤＮＡを用いて、対立遺伝子２対対立遺伝子１の理論上予想されたパーセンテージは０．５０である。しかし、実験的に決定されたパーセンテージは０．４７７３であった。染色体２１の余分なコピーを１つ有する１人に関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１の理論上予想されたパーセンテージは０．３３である。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１の実験的に決定されたパーセンテージは０．３０８６であった。
【０７２３】
理論上予想されたパーセンテージからの偏差は一貫性が高く、線形を維持している。染色体２１の余分なコピーを１つ有する１人から採取された鋳型遺伝子上でもＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２における対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは線形を維持することが、以下の式によって証明される。
2006521086.tif 000212
【０７２４】
正常な個人から得た鋳型ＤＮＡを用いて、対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージが０．４７と決定されるならば、ダウン症候群を有する個人の鋳型ＤＮＡを用いた対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは０．３１０２になるはずである。実験的に決定された比は０．３０８６で、標準偏差は０．００１８６であった。ダウン症候群を有する個人の鋳型ＤＮＡ上の対立遺伝子２対対立遺伝子１の予測されたパーセンテージと実験的に決定されたパーセンテージとの間に違いはない。
【０７２５】
特定のＳＮＰにおけるある対立遺伝子対他の対立遺伝子のパーセンテージは一貫性が高く、再現性があり線形である。ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の算出されたパーセンテージに係らず、任意のＳＮＰが、染色体疾患の有無を決定するために使用できることが、このことから証明される。
【０７２６】
（表ＸＶＩＩ）ＴＳＣ０１０８９９２での対立遺伝子１に対する対立遺伝子２の割合
2006521086.tif 000213
【０７２７】
実施例１１
ある特定のＳＮＰに関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、一貫性が高い。実験的に決定された比からの統計上有意な偏差は染色体異常の存在を示す。正常な個人の鋳型ＤＮＡおよびダウン症候群を有する個人の鋳型ＤＮＡを用いて、染色体２１上のＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２における対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージを下記に計算した。
【０７２８】
鋳型ＤＮＡの調製
正常な遺伝子核型を有する個人および染色体２１の１つ余分なコピーを有することが確認されている個人（ダウン症候群）からＤＮＡを採取した。ダウン症候群を有する個人の親からもインフォームドコンセントを得た。
【０７２９】
各個人から９ｍｌの血液試料を滅菌管（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌ  ＥＤＴＡ減圧管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取した。キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡはキットに含まれている使用説明書に従って単離した。
【０７３０】
鋳型ＤＮＡの混合
正常な遺伝子核型を有する個人の鋳型ＤＮＡおよび染色体２１の１つ余分なコピーを有する個人の鋳型ＤＮＡを１０ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。正常な鋳型ＤＮＡおよびダウン症候群の鋳型ＤＮＡの４種の混合物を以下の様式で作成した：
混合物１：  ３２μｌの正常ＤＮＡ＋８μｌのダウン症候群ＤＮＡ
混合物２：  ２８μｌの正常ＤＮＡ＋１２μｌのダウン症候群ＤＮＡ
混合物３：  ２０μｌの正常ＤＮＡ＋２０μｌのダウン症候群ＤＮＡ
混合物４：  １０μｌの正常ＤＮＡ＋３０μｌのダウン症候群ＤＮＡ
【０７３１】
正常な鋳型ＤＮＡおよびダウン症候群を有する個人の鋳型ＤＮＡに関して、３つの別々のＰＣＲ反応を設定した。同様に、各混合物に関して３つの別々のＰＣＲ反応を設定した。
【０７３２】
プライマー設計
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000214
第２のプライマー：
2006521086.tif 000215
【０７３３】
第１のプラーマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７３４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。
【０７３５】
特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、５０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。３８サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３７回反復；
（９）７２℃で５分。
【０７３６】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０７３７】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０７３８】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。各ＰＣＲ産物を２つの試料に分け、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの２つの別々のウェルに移した。各ＰＣＲ反応に関し各々、マイクロ滴定プレートの別々のウェルに２つの複製物が存在した。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０７３９】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩにより、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するため１×ＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０７４０】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化により、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０７４１】
実施例６で詳細に検討したように、ＳＮＰの双方の対立遺伝子の配列は、１種の標識ヌクレオチドを用いて、他の未標識ヌクレオチドの存在下で決定できる。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＴＴＰ、チミジン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０７４２】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０７４３】
関心対象座の検出
試料を、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の１レーンに載せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置（ホーファーＳＱ３シーケンサー）上で３時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ）上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
【０７４４】
図１７Ａ〜Ｆに示されるように、２本のバンドが検出された。より低分子量のバンドは、ｄｄＴＴＰによって１位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応し、より高分子量のバンドは、ｄｄＴＴＰによって３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応した。
【０７４５】
実験は盲検様式で実施した。どの管がどの鋳型ＤＮＡに相当するかが知られないように管を暗号化した。ゲルの分析後、各管を次のカテゴリーに分類した：正常鋳型ＤＮＡ、ダウン症候群鋳型ＤＮＡ、ダウン症候群鋳型ＤＮＡ対正常ＤＮＡの３：１混合物、正常鋳型ＤＮＡ対ダウン症候群鋳型ＤＮＡの１：１混合物、ダウン症候群鋳型ＤＮＡ対正常鋳型ＤＮＡの１：２．３混合物、およびダウン症候群鋳型ＤＮＡ対正常鋳型ＤＮＡの１：４混合物。各ＰＣＲ反応の各複製物は、首尾よく適切なカテゴリーに分類された。このことは、異常ＤＮＡがＤＮＡ全体の少ないパーセンテージでしか存在しなくても、その検出に本法が使用できることを証明している。
【０７４６】
正常鋳型ＤＮＡの３つのＰＣＲ反応の各複製物に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージを表ＸＶＩＩＩに示す（図１７Ａも参照）。対立遺伝子２対対立遺伝子１の平均パーセンテージは、対立遺伝子２の値を、対立遺伝子１および対立遺伝子２の値の合計で割る（対立遺伝子２／（対立遺伝子１＋対立遺伝子２））ことによって算出した結果、平均０．５００２５であり、標準偏差は０．００２８９７であった。このように、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、５０：５０の比率で存在する。あるＰＣＲ反応と他のＰＣＲ反応とで、バンドの強度は変化するが（反応１と反応３とを比較されたい）、１つのＰＣＲ反応内での強度に違いないはない。さらに、ＰＣＲ反応の２種の複製物に関して得られた値は極めて類似していた。変化の多くは、ＰＣＲ反応間にあるもので、ピペット操作誤差に帰せられる可能性が大きい。
【０７４７】
ダウン症候群鋳型ＤＮＡの３つのＰＣＲ反応の各複製物に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージを表ＸＶＩＩＩに示す（図１７Ｂを参照）。対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、対立遺伝子２の値を、対立遺伝子１および対立遺伝子２の値の合計で割る（対立遺伝子２／（対立遺伝子１＋対立遺伝子２））ことによって算出した結果、平均０．３０１３１４であり、標準偏差は０．０１２９１７であった。肉眼によるゲルの分析であっても対立遺伝子１は対立遺伝子２よりも多数のコピーで存在することは明らかである（図１７Ｂを参照）。変化の多くはやはり、ＰＣＲ反応の複製物の間にではなく、ＰＣＲ反応間で生じている。統計上の変化の大部分はピペット操作誤差による可能性が大きい。
【０７４８】
染色体異常の存在を検出するためには、単一ヌクレオチドの分析で十分であった。そのＳＮＰの「ｐ」値が知られており、また、統計上のサンプリング誤差が分析に導入されないように十分な数のゲノムが存在するという条件で、１個のヌクレオチドで十分である。この実験においては、各反応に凡そ５，０００のゲノムが存在した。
【０７４９】
ダウン症候群鋳型ＤＮＡ対正常鋳型ＤＮＡの３：１の比である混合物からなる反応は、正常鋳型ＤＮＡおよび他のＤＮＡ混合物と明らかに識別可能であった（図１７Ｃを参照）。対立遺伝子２対対立遺伝子１の算出パーセンテージは０．３１９０８９であり、標準偏差は０．００４３４６であった（図ＸＶＩＩＩを参照）。同様に、ダウン症候群鋳型ＤＮＡ対正常鋳型ＤＮＡが１：１の比である混合物、ならびに１：２．３の比である混合物からなる反応も識別可能であり（図１７Ｄおよび１７Ｅを参照）、それらの値は全ての反応から統計上有意であった（図ＸＶＩＩＩを参照）。
【０７５０】
正常な鋳型遺伝子量が増加するにつれて、対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージが上昇した。ダウン症候群鋳型ＤＮＡ対正常鋳型ＤＮＡの１：４の比である混合物では、対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、０．３９７６４２であり、標準偏差は０．００１９０３であった（図１７Ｆを参照）。この値と正常鋳型ＤＮＡから得られた値との間の違いは、統計上有意である。このように、試料が異常ＤＮＡの均一試料でなくても、本明細書に記載された方法により、染色体異常の検出が可能である。
【０７５１】
上記のように、正常ＤＮＡが大量に存在する中でも染色体の異常コピー数を有する小フラクションのＤＮＡの存在を検出することができる。正常ＤＮＡ量が増加し、ダウン症候群ＤＮＡ量が減少するにつれて対立遺伝子２対対立遺伝子１に対応するバンドの強度が等しくなることは、肉眼によっても明らかであった。
【０７５２】
上記実施例では、染色体２１上に位置するＳＮＰを分析した。しかし、限定はしないが、ヒト染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹ、ならびに胎児染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹなどの任意の染色体上の任意のＳＮＰが分析できる。さらに、上記の方法を用いて、非ヒト生物の染色体を分析できる。染色体の任意の組合せを分析できる。上記実施例では、一染色体の１つ余分なコピーが検出された。しかし、モノソミーを検出するために同じ方法を用いることができる。
【０７５３】
（表ＸＶＩＩＩ）ＴＳＣ０１０８９９２での対立遺伝子１に対する対立遺伝子２の割合
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【０７５４】
実施例１２
上記実施例９で検討したように、ヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子１対対立遺伝子２の比は一定である。しかし、ヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子１対対立遺伝子２の比に影響を与え得る１つの要因は、ゲノム数の少なさである。例えば、４０個のゲノムがあるとすると、これは、対立遺伝子１の合計４０個の染色体と対立遺伝子２の４０個の染色体があることを意味するが、プライマーが対立遺伝子１を有する４０個の染色体にアニールするが、対立遺伝子２を有する染色体には３０個しかアニールしないということが統計上あり得る。これは、対立遺伝子１対対立遺伝子２の比に影響を与えることになり、ある一定のＳＮＰに関する「ｐ」値に大きな影響を与え得る。
【０７５５】
少量のゲノムＤＮＡ試料を増加させるために、典型的には縮退オリゴヌクレオチドＰＣＲを採用する全ゲノム増幅が用いられる。８、１０、１２または１４塩基のオリゴヌクレオチド類がゲノムの増幅に用いられる。プライマーは、ゲノム全体に亘ってランダムにアニールし、少量のゲノムＤＮＡ試料を、ゲノム分析用に数百倍多いＤＮＡへと増幅する。
【０７５６】
本明細書に記載の方法は、一般にゲノム全体が関心対象座であるわけではないという事実を利用する。１つの染色体、または複数の染色体またはゲノム全体を意味する染色体上に位置する特に関心対象となる坐が分析用に選択される。たとえ、関心対象座がゲノム全体に関する染色体上に位置しているとしても、それらの染色体のうち、関心対象座を含有する領域を増幅することが好ましい。
【０７５７】
妊娠女性の血漿から得られた胎児ＤＮＡによく見られる小数ゲノムの限界を克服するために、複合的方法を用いてゲノム数を増加させることができる。下記の方法により、関心対象座を含有する単数または複数の染色体が優先的に増幅される。
【０７５８】
鋳型ＤＮＡの調製
ヒト志願者からインフォームドコンセントを得た後、９ｍｌの血液試料を滅菌管に採取した（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌ  ＥＤＴＡ減圧管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）。管を１０００ｒｐｍで１０分間回転させた。各試料の上澄み液（血漿）を取り、一般に「バフィーコート（ｂｕｆｆｙ−ｃｏａｔ）」と称されている残りの血液試料の１ミリリットルを新たな管に移した。各試料に１ミリリットルの１×ＰＢＳを加えた。キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。
【０７５９】
複合プライマー設計
プライマーは、染色体２１上に位置する関心対象座のコピー数を増やすために、染色体２１上の様々な領域にアニールするように設計した。プライマーの長さは１２塩基であった。しかし、限定はしないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６〜４５、４６〜５５、５６〜６５、６６〜７５、７６〜８５、８６〜９５、９６〜１０５、１０６〜１１５、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を超える任意の長さのプライマーが使用できる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の双方にアニールするように設計した。
【０７６０】
染色体２１上に位置する９つのＳＮＰを分析した。すなわち、ＴＳＣ０３９７２３５、ＴＳＣ０４７０００３、ＴＳＣ１６４９７２６、ＴＳＣ１２６１０３９、ＴＳＣ０３１０５０７、ＴＳＣ１６５０４３２、ＴＳＣ１３３５００８、ＴＳＣ０１２８３０７、およびＴＳＣ０２５９７５７である。１〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、４０１〜５００、５０１〜６００、６０１〜７００、７０１〜８００、８０１〜９００、９０１〜１０００、１００１〜２０００、２００１〜３０００、３００１〜４０００、４００１〜５０００、５００１〜６０００、６００１〜７０００、７００１〜８０００、８００１〜９０００、９００１〜１０，０００および１０，０００を超える任意の数のＳＮＰを分析することができる。
【０７６１】
９つのＳＮＰの各々に関して、ある１２塩基プライマーは、関心対象座の凡そ１３０塩基上流にアニールするように設計し、ある１２塩基プライマーは、関心対象座の凡そ１３０塩基下流にアニールするように設計した（本明細書では複合プライマーと称される）。限定はしないが、
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任意の距離でアニールするように設計できる。また、１つのＳＮＰに関して、限定はしないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、および５０を上回る１セット以上の複合プライマーが使用できる。
【０７６２】
また、染色体２１の他の領域を増幅するために、合計１００セットのプライマー（反応に２００種のプラーマー）に関して、９１セットのフォワードおよびリバースプライマーを用いた。１つの反応において、多数のプライマーを多数の非特異的結合を生じることなく使用できることを証明するために、これらの９１個のプライマーを使用した。限定はしないが、１〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、４０１〜５００、５０１〜６００、６０１〜７００、７０１〜８００、８０１〜９００、９０１〜１０００、１００１〜２０００、２００１〜３０００、３００１〜４０００、４００１〜５０００、５００１〜６０００、６００１〜７０００、７００１〜８０００、８００１〜９０００、９００１〜１０，０００、１０，００１〜２０，０００、２０，０００〜３０，０００、および３０，０００を超える任意の数のプライマーを反応に用いることができる。
【０７６３】
前記複合プライマーは、プライマーの３’端に同じヌクレオチドを有するように設計された。この場合、複合プライマーは「ＡＡ］（ここでＡはアデニンを示す）で終わる。プライマー−二量体形成を最少化するために、プライマーを、この様式で設計した。しかし、プライマーは、限定はしないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、アデニンとグアニンの任意の組合わせ、アデニンとシトシンの任意の組合わせ、アデニンとチミジンの任意の組合わせ、グアニンとシトシンの任意の組合わせ、グアニンとチミジンの任意の組合わせ、またはシトシンとチミジンの任意の組合わせなどの任意のヌクレオチドで終わることができる。また、複合プライマーは、３’端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０個を超える同じヌクレオチドを有することができる。
【０７６４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３９７２３５に対する複合プライマーは以下であった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【０７６５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４７０００３に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【０７６６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１６４９７２６に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【０７６７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006521086.tif 000227
【０７６８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３１０５０７に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【０７６９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006521086.tif 000231
【０７７０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000232
第２のプライマー：
2006521086.tif 000233
【０７７１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１２８３０７に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000234
第２のプライマー：
2006521086.tif 000235
【０７７２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７に対する複合プライマーは以下のものであった：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
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【０７７３】
染色体２１の種々の領域にアニールする９１セットの追加プライマーを反応に含めた：
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【０７７４】
複合ＰＣＲ
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３９７２３５、ＳＮＰ  ＴＳＣ０４７０００３、ＳＮＰ  ＴＳＣ１６４９７２６、ＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９、ＳＮＰ  ＴＳＣ０３１０５０７、ＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２、ＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１２８３０７、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７を包囲する染色体２１上の領域を、ポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ、本明細書に参照として組み込んでいる米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。このＰＣＲ反応には、関心対象座の上流および下流の凡そ１３０塩基にアニールするプライマーを使用した。ＰＣＲ反応を用いたのは、関心対象座のコピー数を増加させて、ゲノム数の少なさから生じ得る誤差を排除するためである。
【０７７５】
特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、１５ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。
【０７７６】
５ｍＭの濃度のフォワードおよびリバースプライマー各々２マイクロリットルを１本のマイクロ遠心管にプールし混合した。４０μｌのＰＣＲ反応液総量（１．５μｌの鋳型ＤＮＡ、１０．５μｌの滅菌水、８μｌのプライマー混合物、および２０μｌのホットスターＴａｑ（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ））中、８マイクロリットルのプライマー混合物を用いた。２５サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分；
（２）９５℃で３０秒；
（３）４℃で３０秒；
（４）３７℃で３０秒；
（５）ステップ２〜４を２４回反復；
（６）７２℃で１０分。
【０７７７】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０７７８】
別の態様では、６塩基のオリゴヌクレオチド、７塩基のオリゴヌクレオチド、８塩基のオリゴヌクレオチド、９塩基のオリゴヌクレオチド、１０塩基のオリゴヌクレオチド、１１塩基のオリゴヌクレオチド、１２塩基のオリゴヌクレオチド、１３塩基のオリゴヌクレオチド、１４塩基のオリゴヌクレオチド、または１４塩基を超えるオリゴヌクレオチドを用いて対象遺伝子座を増幅する。好ましい態様では、６塩基のオリゴヌクレオチド、７塩基のオリゴヌクレオチド、８塩基のオリゴヌクレオチド、９塩基のオリゴヌクレオチド、１０塩基のオリゴヌクレオチド、１１塩基のオリゴヌクレオチド、または１２塩基のオリゴヌクレオチドを用いて対象遺伝子座を増幅する。別の態様では、１〜５塩基、５〜１０塩基、１０〜１５塩基、１５〜２０塩基、２０〜２５塩基、２５〜３０塩基、３０〜３５塩基、３５〜４０塩基、４０〜４５塩基、４５〜５０塩基、５０〜１００塩基、１００〜５００塩基、５００〜１０００塩基、１０００〜２０００塩基、２０００〜４０００塩基、４０００〜８０００塩基、８０００〜１０，０００塩基、または１０，０００塩基を超える塩基を含むがこれらに限定されない、任意の数のオリゴヌクレオチドを使用することができる。ランダムオリゴの数が少ない場合、オリゴの濃度は、効率的な増幅を可能とするには十分多いが、オリゴの数は、オリゴ間の干渉を引き起こさない程度に十分少ない。このため、ゲノムの効率的な増幅が可能となる。
【０７７９】
別の態様では、対象遺伝子座の上流および下流の配列を分析して、個々の対象遺伝子座の上流または下流の配列中に存在する６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、または１２塩基の配列を同定する（これを後に対象遺伝子座の増幅に使用する）。別の態様では、１〜１０個、１０〜５０個、５０〜１００個、１００〜２００個、２００〜５００個、または５００個超を含むがこれらに限定されない、任意の数の６塩基のオリゴヌクレオチドを使用して、対象遺伝子座を増幅することができる。
【０７８０】
別の態様では、少数のゲノムに由来する対象遺伝子座の数を、一定数の対象遺伝子座を増幅後に、プライマーを除去し、また残りの対象遺伝子座を増幅することで増やすことができる。全ての対象遺伝子座が、１回の反応で多重化される必要はない。１〜５個、５〜１０個、１０〜２５個、２５〜５０個、５０〜１００個、１００〜２００個、２００〜４００個、または４００個超を含むがこれらに限定されない、任意の数の、実験的に決定された対象遺伝子座を１回の反応で多重化することができる。このような対象遺伝子座のコピー数を増やした後に、増幅産物の結合を可能とするカラムに試料を通し、プライマーおよび使用されなかったｄＮＴＰを除去することができる。結合した産物をカラムから溶出後に、異なる対象遺伝子座を１回の反応で増幅することができる。このため、プライマー間の相互作用の量は減じることになる。
【０７８１】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムド（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｄ）ＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【０７８２】
関心対象断片の精製
キアゲン・ミンエリュート（Ｑｕｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ＰＣＲ精製キット（キアゲン、カタログ番号２８００４）を用いて、反応液から余分のプライマーおよびヌクレオチドを除去した。反応は、カラムと共に供された製造元の使用説明書に従って実施した。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中へ溶出した。
【０７８３】
ＰＣＲ反応２
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３９７２３５を以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006521086.tif 000264
【０７８４】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から１０３塩基にアニールするように設計された第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７８５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４７０００３は、以下のプライマーセットを用いて増幅させた：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006521086.tif 000266
【０７８６】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から８０塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７８７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１６４９７２６を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006521086.tif 000268
【０７８８】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から１１３塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７８９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
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第２のプライマー：
2006521086.tif 000270
【０７９０】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から５４塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７９１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３１１０５０７を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000271
第２のプライマー：
2006521086.tif 000272
【０７９２】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から９３塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７９３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000273
第２のプライマー：
2006521086.tif 000274
【０７９４】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から８０塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７９５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000275
第２のプライマー：
2006521086.tif 000276
【０７９６】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から９４塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７９７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１２８３０７を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000277
第２のプライマー：
2006521086.tif 000278
【０７９８】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から５４塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０７９９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７を、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000279
第２のプライマー：
2006521086.tif 000280
【０８００】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、関心対象座から１００塩基にアニールするように設計された。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０８０１】
全ての関心対象座は、ポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ、本明細書に参照として組み込んでいる米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それを単独のＰＣＲ反応において、一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、キアゲンから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。
【０８０２】
複合反応の溶出液（ミンエリュートカラムから溶出したＰＣＲ産物）の１マイクロリットルを、各ＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡとして用いた。複合試料を鋳型として用いた場合、各ＳＮＰは三重増幅した。対照として、各ＳＮＰを１５ｎｇの元の鋳型ＤＮＡ（複合反応を受けなかったＤＮＡ）から増幅した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は、各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０８０３】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０８０４】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０８０５】
アガロースゲル分析
各ＳＮＰに関し、元の鋳型ＤＮＡからのＰＣＲ反応液２０マイクロリットルのうち４マイクロリットルを、アガロースゲル電気泳動によって分析した（図１８Ａを参照）。各ＳＮＰに関し、複合鋳型から増幅したＰＣＲ反応液２０マイクロリットルのうち４マイクロリットルを、アガロースゲル電気泳動によって分析した（図１８Ｂを参照）。
【０８０６】
元の鋳型ＤＮＡから増幅したＳＮＰの８／９に強度の高い単一バンドが見られた（レーン１〜３および５〜９）。８つのＳＮＰの各々に関して、バンドは正しい位置に移動した。元の鋳型からＴＳＣ１２６１０３９を増幅すると、正しい位置に移動した。強度の高い単一バンド、およびより低分子量の微弱なバンドが１本生じた（レーン４）。見られたバンドは２本だけで、それらは分子量に基づいて明瞭に識別できた。本明細書に記載されたＰＣＲ法により、関心対象座の濃縮または濃厚化を伴うことなく、ゲノムＤＮＡから関心対象座を明瞭に増幅することができる。
【０８０７】
図１８Ｂに見られるように、複合鋳型ＤＮＡからＳＮＰ  ＴＳＣ０３９７２３５、ＳＮＰ  ＴＳＣ０４７０００３、ＳＮＰ  ＴＳＣ０３１０５０７、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０１２８３０７を増幅するために用いられたプライマーにより、正しい位置に移動した強度の高い単一バンドが生じた（レーン１、２、５および８）。この複合反応は２００種のプラーマーを含有したにも係らず、追加のバンドは生じなかった。複合プライマーは、１２塩基長であり、染色体２１上に位置する配列以外の配列にもアニールする可能性があるが、その産物は見られなかった。なぜならば、そのバンドは第２のＰＣＲ反応において増幅されなかったからである。第２のＰＣＲ反応には、関心対象座に特異的なプライマーを用い、非対照のオリゴヌクレオチドおよび上昇アニーリング温度を使用したので、ゲノムの特異的増幅が可能となる（実施例１を参照）。
【０８０８】
複合鋳型ＤＮＡからＴＳＣ１６４９７２６を増幅すると、強度の高い１本のバンドと２本の弱いバンドが生じ、これらは分子量に基づいて、明瞭に識別できた（図１８Ｇ、レーン３を参照）。複合鋳型ＤＮＡからＴＳＣ１２６１０３９を増幅すると、正しい分子量の高強度のバンド１本と、より低分子量の微弱なバンドが１本生じた（図１８Ｂ、レーン４を参照）。この低分子量バンドは、元の鋳型ＤＮＡからＴＳＣ１２６１０３９を増幅した際に見られたバンドと同じ大きさであった（図１８Ａ、レーン４と図１８Ｂ、レーン４を比較されたい）。このように複合鋳型ＤＮＡ上でＴＳＣ１２６１０３９を増幅した場合、追加の非特異的バンドは生じなかった。
【０８０９】
複合鋳型ＤＮＡからＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１３３５００８、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７を増幅すると、正しい位置に移動した高強度のバンド１本とより弱いバンドを１本生じた（レーン６、７および９）。ＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７では、より弱いバンドはより低分子量のもので、関心対象のバンドから明瞭に識別された（図１８Ｂ、レーン６および９を参照）。ＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８では、より弱いバンドは僅かに分子量の高いものであった。しかし、元の鋳型ＤＮＡからのＴＳＣ１３３５００８増幅産物と比較することによって、正しいバンドを同定することができる（図１８Ａ，レーン７と図１８Ｂ、レーン７を比較されたい）。ＴＳＣ１３３５００８に関して、ＰＣＲ条件を最適化することもできる。全て９つのＳＮＰは全く同一条件下で増殖し、増幅したＳＮＰでは、明瞭に識別できるバンドが生じた。
【０８１０】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。ＰＣＲ反応液の１／２を、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの１つのウェルに移した。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０８１１】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩにより、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０８１２】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化により、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０８１３】
実施例６で詳細に検討したように、あるＳＮＰの双方の対立遺伝子を、１種の標識ヌクレオチドにより、他の未標識ヌクレオチドの存在下で決定できる。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、グアニン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０８１４】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０８１５】
関心対象座の検出
試料を、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の１レーンに載せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置（ホーファーＳＱ３シーケンサー）上で３時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ）上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。各バンドを枠で囲み、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー・ソフトウェアを用いて、バンドの強度を算出した。
【０８１６】
ＢｓｍＦＩによる消化後のＴＳＣ０４７０００３に関する５’オーバーハングの略図を下記に表す。
2006521086.tif 000281
【０８１７】
ＴＳＣ０４７０００３に関して、センス鎖（ここでは上の鎖として表す）上に見られたヌクレオチドは、アデニンとグアニンである。オーバーハングの３位は、グアニンに相補的なシトシンに相当する。未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの存在下、標識ｄｄＧＴＰを使用した。はめ込み反応後のＤＮＡ分子の略図を下記に表す。
2006521086.tif 000282
２本のバンドが検出された。より低分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって１位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応した。より高分子量のバンドは、標識ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応した（図１９を参照）。
【０８１８】
元の鋳型ＤＮＡおよび複合鋳型ＤＮＡからの増幅後、ＴＳＣ０４７０００３における対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージを算出した。１つの反応において双方の対立遺伝子の検出に１種の蛍光標識ヌクレオチドを使用することにより、ピペット操作反応によって生じるエラーおよび異なった色素の量子係数によって生じるエラーの量が減少する。
【０８１９】
ＴＳＣ０４７０００３に関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、対立遺伝子２の値を、対立遺伝子１および対立遺伝子２の値の合計で割る（対立遺伝子２／（対立遺伝子１＋対立遺伝子２））ことによって算出した。元の鋳型ＤＮＡ上のＴＳＣ０４７０００３に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、０．５３９と算出された（表ＸＩＸを参照）。複合鋳型ＤＮＡ上の各ＳＮＰに関しては３つのＰＣＲ反応を実施した。複合鋳型ＤＮＡ上のＴＳＣ０４７０００３に関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１の平均パーセンテージは、０．４９であり、標準偏差は０．０３１９であった（表ＸＩＸを参照）。元の鋳型ＤＮＡから得られたパーセンテージと複合鋳型ＤＮＡから得られたパーセンテージの間に統計上の有意差はなかった。
【０８２０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９に関しては、元の鋳型ＤＮＡ上のＴＳＣ１２６１０３９に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは、０．４４と算出された（表ＸＩＸを参照）。複合鋳型ＤＮＡ上の各ＳＮＰに関しては３つのＰＣＲ反応を実施した（図１９Ｂを参照）。複合鋳型ＤＮＡ上のＴＳＣ１２６１０３９に関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１の平均パーセンテージは０．４６８であり、標準偏差は０．０５６８３であった（表ＸＩＸを参照）。元の鋳型ＤＮＡから得られた対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージと複合鋳型ＤＮＡから得られたパーセンテージの間に統計上の有意差はなかった。
【０８２１】
複合鋳型ＤＮＡ上のＴＳＣ１２６１０３９に関して、対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージに見られる変化は、ピペット操作反応による可能性が大きい。複製物の数を増やすことによって、この変化を減少させることができる。多数の複製品を用いることによって、最少の統計的変化でパーセンテージを得ることができる。
【０８２２】
同様に、ＳＮＰ  ＴＳＣ０３１０５０７およびＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８に関しても、元の鋳型ＤＮＡから得られた対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージと複合鋳型ＤＮＡから得られたパーセンテージの間に統計上の差はなかった（表ＸＩＸおよび図１９Ｃおよび１９Ｄを参照）。このように、可変部位におけるある対立遺伝子対他の対立遺伝子のパーセンテージに影響を与えることなく、関心対象座を含有する染色体領域の数を増やすために、複合反応を用いることができる。
【０８２３】
（表ＸＩＸ）複合化ありまたはなしで、種々のＳＮＰにおける対立遺伝子１に対する対立遺伝子２のパーセンテージ
2006521086.tif 000283
2006521086.tif 000284
【０８２４】
関心対象座を増幅させるために、本明細書に記載された方法では２つの異なる増幅反応を用いた。別のＰＣＲ反応において、オリゴヌクレオチドが関心対象座の上流および下流にアニールするように設計された。従来のゲノム増幅とは異なり、これらのプライマーは縮重せず、関心対象座から特定の距離でアニールした。しかし、プライマーの長さに依って、ゲノムの他の領域にプライマーがアニールした可能性がある。
【０８２５】
第２のＰＣＲ反応は、実施例１〜６に記載の方法を用いる。関心対象座を増幅するようにプライマーが設計され、関心対象座における配列が決定される。第２のＰＣＲ反応の条件により、複合鋳型ＤＮＡから特異的に関心対象座を増幅できた。たとえ、複合反応からの非特異的産物が存在したとしても、それらは関心対象座の増幅を妨害しなかった。増幅が元の鋳型ＤＮＡ上で行われたか、複合鋳型ＤＮＡ上で行われたかに係らず、４種のＳＮＰにおいて、対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージに統計上の差はなかった。
【０８２６】
本実施例で分析されたＳＮＰは、ヒト染色体２１上に位置した。しかし、本法は非ヒトＤＮＡおよび、限定はしないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹなどのヒトＤＮＡに適用することができる。この複合法は、限定はしないが、ヌクレオチド置換、挿入、欠失および再配列などの遺伝子突然変異の分析にも適用できる。
【０８２７】
上記方法は、出発鋳型ＤＮＡ量が限られている場合はいつでも、遺伝子分析に利用できるＤＮＡ量を増加させるために使用できる。例えば、悪性細胞を有する前悪性および前侵襲性病巣は通常、標本中細胞の小部分を構成しているため、実施し得る遺伝子分析の数が減少する。本明細書に記載された方法は、遺伝子分析に利用できる悪性ＤＮＡ量を増加させるために使用できる。また、母体血液中に存在する胎児ゲノムの数は少ないことが多いが、本明細書に記載された方法は、胎児ＤＮＡ量を増やすために使用できる。
【０８２８】
実施例１３
妊娠女性の血液から分離した血漿は、母体鋳型ＤＮＡと胎児鋳型ＤＮＡの双方を含んでいる。先に検討したように、母体血漿中、胎児ＤＮＡのパーセンテージは、個々の妊娠女性によって変化する。しかし、母体鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、血漿から得られた鋳型ＤＮＡがヘテロ接合パターンを示す場合のＳＮＰを分析することによって胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定できる。
【０８２９】
例えば、ＳＮＰ  Ｘが、アデニンかグアニンのいずれかであり、ＳＮＰ  Ｘに関する母体ＤＮＡが、グアニンに関してホモ接合であると仮定しよう。血漿試料中の鋳型ＤＮＡの配列を決定するために、実施例６に記載した標識化法を用いることができる。血漿試料がＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合である胎児ＤＮＡを含有するならば、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化、および標識ｄｄＧＴＰ、未標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰによるはめ込み反応後、以下のＤＮＡ分子が予想される。
2006521086.tif 000285
【０８３０】
２つのシグナルが見られる。すなわち、１つのシグナルは、ｄｄＧＴＰによって１位にはめ込まれた、オーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応し、第２のシグナルは、ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれた、オーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に対応する。しかし、母体ＤＮＡは、１位にはめ込まれた、オーバーハングに相補的なＤＮＡ分子に相当するグアニンに関してホモ接合である。ｄｄＧＴＰによって３位にはめ込まれた、オーバーハングに相補的なＤＮＡ分子からのシグナルは、胎児ＤＮＡを表すアデニン対立遺伝子に対応する。このシグナルは胎児ＤＮＡの指標となり、血漿試料中に存在する胎児ＤＮＡ量を測定するために使用できる。
【０８３１】
ある染色体と他の染色体の胎児ＤＮＡ量に違いはない。例えば、いずれかの所与の個人における染色体１の胎児ＤＮＡパーセンテージは、染色体２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹの胎児ＤＮＡパーセンテージと同じである。したがって、ある染色体上のＳＮＰに関して算出された対立遺伝子の比を、他の染色体上のＳＮＰに関する対立遺伝子の比と比較することができる。
【０８３２】
例えば、染色体１上のＳＮＰに関する対立遺伝子の比は、染色体２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹ上のＳＮＰに関する対立遺伝子の比と等しいはずである。しかし、胎児が、限定はしないが、トリソミーまたはモノソミーなどの染色体異常を有していれば、異常コピー数で存在する染色体に関する比は、他の染色体に関する比とは異なるであろう。
【０８３３】
妊娠女性の血液は、インフォームドコンセントを得た後に採取された。母体ＤＮＡがホモ接合であり、同じＳＮＰが妊娠女性の血漿から得たＤＮＡのヘテロ接合パターンを示す場合のＳＮＰを分析することにより、母体血漿中の胎児ＤＮＡを検出できることを証明するために前記血液試料が用いられた。
【０８３４】
全血からの血漿調製
各々９ｍｌの血液を含有する４本の管から血漿を分離した（フィッシャー・サイエンティフィック）。血液は、インフォームドコンセントを得た妊娠女性から静脈穿刺により採取した。採血後、ホルムアルデヒド（２５μｌ／ｍｌ血液）を各管に加えた。前記管は発送まで４℃で保存した。前記管は、フェデラルエクスプレス（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）により、アイスパックを含有したフォームコンテナー中で発送した。
【０８３５】
前記血液を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。遠心分離機上のブレーキは用いなかった。この遠心分離を反復した。上済み液を新たな管に移し、３０００ｒｐｍで１０分間回転させた。遠心分離機上のブレーキは用いなかった。４本の管各々の上澄み液をプールし、２本の管へ分割した。前記血漿をＤＮＡが精製されるまで、−８０℃で保存した。
【０８３６】
キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡは、キットに含まれている使用説明書に従って単離した。血漿の鋳型ＤＮＡは、２０マイクロリットルの最終容量へ溶出させた。
【０８３７】
母体ＤＮＡの単離
上記試料から血漿を取り出した後、一般に「バフィコート」と称される残りの血液試料の１ミリリットルを新たな管に移した。１×ＰＢＳの１ミリリットルを前記試料に加えた。キアゲンより提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。
【０８３８】
ホモ接合母体ＳＮＰの同定
実施例８は、集団内で可能性の高いＳＮＰの同定、または所与の個人のヘテロ接合ＳＮＰを同定するための方法を説明している。実施例８に記述された方法を、母体ＤＮＡがホモ接合である染色体１３上のＳＮＰを同定するために母体鋳型ＤＮＡに適用した。任意の数のＳＮＰをスクリーンできる。スクリーンされるＳＮＰの数は、分析が必要とされている胎児ＤＮＡ中のヘテロ接合ＳＮＰの数に比例する。
【０８３９】
実施例６で詳述したように、ある特定のＳＮＰにおける双方の対立遺伝子の配列を決定するために、１種の標識ヌクレオチドが使用できる。未標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの存在下、標識ｄｄＧＴＰによって決定できる配列のＳＮＰが本実験例において選択された。しかし、標識ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰまたはｄｄＴＴＰによって決定できる配列のＳＮＰもまた使用できる。また、分析されるＳＮＰは、全てが同じヌクレオチドで標識されるか、または４種のヌクレオチドの任意の組合せによって標識されるように選択され得る。例えば、４００のＳＮＰをスクリーンしようとする場合、１００は、標識ｄｄＡＴＰによって、１００は標識ｄｄＴＴＰによって、１００は標識ｄｄＧＴＰによって、１００は標識ｄｄＣＴＰによって、または４種の標識ヌクレオチドの任意の組合せによって配列が決定されるように選択され得る。
【０８４０】
母体ＤＮＡが、ホモ接合である２９種のＳＮＰが以下のように同定された：
2006521086.tif 000286
ヘテロ結合ＳＮＰは個体によって変化する。
【０８４１】
複合プライマー設計
母体血漿中、典型的には少数の胎児ゲノムが存在する。染色体１３上に位置する関心対象座のコピー数を増加させるために、各関心対象座の凡そ１３０塩基上流および１３０塩基下流にアニールするように、プライマーを設計した。これは、少数のゲノムの操作時に生じ得て、ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の比に影響を与え得る統計上のサンプリングエラーを減少させるために行われた（実施例１１を参照）。プライマーは１２塩基長であった。しかしながら、限定はしないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６〜４５、４６〜５５、５６〜６５、６６〜７５、７６〜８５、８６〜９５、９６〜１０５、１０６〜１１５、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る任意の長さのプライマーが使用できる。プライマーはセンス鎖とアンチセンス鎖双方にアニールするように設計された。
【０８４２】
プライマーは、プライマー二量体の形成を減少させるため、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’端で終止するように設計した。しかし、プライマーは、４種のヌクレオチドの何れにおいても、また、４種のヌクレオチドの任意の組合わせにおいても終止するように設計できる。
【０８４３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００５２２７７に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000287
リバースプライマー：
2006521086.tif 000288
【０８４４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２２５３９１に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000289
リバースプライマー：
2006521086.tif 000290
【０８４５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２８９０７８に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000291
リバースプライマー：
2006521086.tif 000292
【０８４６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１３４９８０４に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000293
リバースプライマー：
2006521086.tif 000294
【０８４７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８７０２０９に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000295
リバースプライマー：
2006521086.tif 000296
【０８４８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９４９３８に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000297
リバースプライマー：
2006521086.tif 000298
【０８４９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８２０３７３に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000299
リバースプライマー：
2006521086.tif 000300
【０８５０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０９０２８５９に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000301
リバースプライマー：
2006521086.tif 000302
【０８５１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１５１０に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000303
リバースプライマー：
2006521086.tif 000304
【０８５２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２２８２３４に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000305
リバースプライマー：
2006521086.tif 000306
【０８５３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８２９１０に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000307
リバースプライマー：
2006521086.tif 000308
【０８５４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８３８３３５に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000309
リバースプライマー：
2006521086.tif 000310
【０８５５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８１８９８２に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000311
リバースプライマー：
2006521086.tif 000312
【０８５６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４６０２０４に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000313
リバースプライマー：
2006521086.tif 000314
【０８５７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１０８４４５７に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000315
リバースプライマー：
2006521086.tif 000316
【０８５８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４６６１７７に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000317
リバースプライマー：
2006521086.tif 000318
【０８５９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２７０５９８に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000319
リバースプライマー：
2006521086.tif 000320
【０８６０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１００２０１７に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000321
リバースプライマー：
2006521086.tif 000322
【０８６１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１０４２００に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000323
リバースプライマー：
2006521086.tif 000324
【０８６２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１３８９に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000325
リバースプライマー：
2006521086.tif 000326
【０８６３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００３９９６０に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000327
リバースプライマー：
2006521086.tif 000328
【０８６４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１８１３４に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000329
リバースプライマー：
2006521086.tif 000330
【０８６５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０３６８８に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000331
リバースプライマー：
2006521086.tif 000332
【０８６６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１２９１８８に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000333
リバースプライマー：
2006521086.tif 000334
【０８６７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１０３５７０に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000335
リバースプライマー：
2006521086.tif 000336
【０８６８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８１３４４９に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000337
リバースプライマー：
2006521086.tif 000338
【０８６９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０７０１９４０に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000339
リバースプライマー：
2006521086.tif 000340
【０８７０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７９６２に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000341
リバースプライマー：
2006521086.tif 000342
【０８７１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６６０２７４に関する複合プライマーは以下のものであった：
フォワードプライマー：
2006521086.tif 000343
リバースプライマー：
2006521086.tif 000344
【０８７２】
複合ＰＣＲ
上記の２９のＳＮＰを包囲する染色体１３上の領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、本明細書に参照として組み込んでいる米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。このＰＣＲ反応には、関心対象座の上流および下流の凡そ１５０塩基にアニールするプライマーを使用した。５８種のプライマーを一緒に混合し、鋳型ＤＮＡを増幅する単独の反応に用いた。この反応は、関心対象座のコピー数を増加させて、ゲノム数の少なさから生じ得る誤差を排除するために実施された。
【０８７３】
特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。
【０８７４】
５ｍＭの濃度のフォワードおよびリバースプライマー各々２マイクロリットルを１本のマイクロ遠心管にプールし混合した。４０μｌのＰＣＲ反応液総量（２０μｌの鋳型血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマー混合物、および２５μｌのホットスターＴａｑ（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ））中、４マイクロリットルのプライマー混合物を用いた。２５サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分；
（２）９５℃で３０秒；
（３）４℃で３０秒；
（４）３７℃で３０秒；
（５）ステップ２〜４を２４回反復；
（６）７２℃で１０分。
【０８７５】
種々の設定の試み、および最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０８７６】
関心対象座のコピー数を増加させるために、限定はしないが、プライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）（ツアングら（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）、８９：ｐ．５８４７−５１、１９９２年）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（テレニウスら（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｌ  ａｌ．）、ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）１３：ｐ．７１８−２５、１９９２年）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼを用いた、ローリングサークル複製を受ける鎖置換増幅（ディーンら（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ゲノミック・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１１：ｐ．１０９５−９９，２００１年）、複素置換増幅（米国特許第６，１２４，１２０号明細書）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キットおよびタグ化ＰＣＲなどの他のゲノム増幅法もまた使用できる。
【０８７７】
関心対象断片の精製
キアゲン・ミンエリュートＰＣＲ精製キット（キアゲン、カタログ番号２８００４）を用いて、反応液から未使用のプライマーおよびヌクレオチドを除去した。反応は、カラムと共に供された製造元の使用説明書に従って実施した。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中へ溶出した。
【０８７８】
ＰＣＲ反応２
プライマー設計
ＳＮＰ  ＴＳＣ００５２２７７は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000345
第２のプライマー：
2006521086.tif 000346
【０８７９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２２５３９１は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000347
第２のプライマー：
2006521086.tif 000348
【０８８０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２８９０７８は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000349
第２のプライマー：
2006521086.tif 000350
【０８８１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１３４９８０４は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000351
第２のプライマー：
2006521086.tif 000352
【０８８２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８７０２０９は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000353
第２のプライマー：
2006521086.tif 000354
【０８８３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９４９３８は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000355
第２のプライマー：
2006521086.tif 000356
【０８８４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８２０３７３は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000357
第２のプライマー：
2006521086.tif 000358
【０８８５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０９０２８５９は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000359
第２のプライマー：
2006521086.tif 000360
【０８８６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１５１０は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000361
第２のプライマー：
2006521086.tif 000362
【０８８７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２２８２３４は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000363
第２のプライマー：
2006521086.tif 000364
【０８８８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８２９１０は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000365
第２のプライマー：
2006521086.tif 000366
【０８８９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８３８３３５は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000367
第２のプライマー：
2006521086.tif 000368
【０８９０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８１８９８２は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000369
第２のプライマー：
2006521086.tif 000370
【０８９１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４６９２０４は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000371
第２のプライマー：
2006521086.tif 000372
【０８９２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１０８４４５７は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000373
第２のプライマー：
2006521086.tif 000374
【０８９３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４６６１７７は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000375
第２のプライマー：
2006521086.tif 000376
【０８９４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１２７０５９８は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000377
第２のプライマー：
2006521086.tif 000378
【０８９５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１００２０１７は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000379
第２のプライマー：
2006521086.tif 000380
【０８９６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１０４２００は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000381
第２のプライマー：
2006521086.tif 000382
【０８９７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１３８９は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000383
第２のプライマー：
2006521086.tif 000384
【０８９８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００３９９６０は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000385
第２のプライマー：
2006521086.tif 000386
【０８９９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１８１３４は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000387
第２のプライマー：
2006521086.tif 000388
【０９００】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６０３６８８は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000389
第２のプライマー：
2006521086.tif 000390
【０９０１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１２９１８８は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000391
第２のプライマー：
2006521086.tif 000392
【０９０２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１０３５７０は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000393
第２のプライマー：
2006521086.tif 000394
【０９０３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０８１３４４９は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000395
第２のプライマー：
2006521086.tif 000396
【０９０４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０７０１９４０は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000397
第２のプライマー：
2006521086.tif 000398
【０９０５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７９６２は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000399
第２のプライマー：
2006521086.tif 000400
【０９０６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０６６０２７４は、以下のプライマーセットを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000401
第２のプライマー：
2006521086.tif 000402
【０９０７】
第１のプライマーの各々は、５’端におけるビオチンタグおよびＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有し、関心対象座から特定の距離でアニールするように設計した。これにより、各関心対象座が異なる位置に移動するため（第１のアニーリング位置に基づいて）、関心対象座に関する単独反応が可能になる。第２のプライマーはＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０９０８】
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。
【０９０９】
一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できる。各関心対象座に関するＰＣＲ反応において、ミンエリュートカラムから溶出した複合鋳型ＤＮＡの１マイクロリットルを用い、各プライマーは５μＭを用いた。上記の２９種のＳＮＰもまた、母体ＤＮＡから増幅した（１５ｎｇのＤＮＡをＰＣＲ反応に用いた。プライマー濃度は上記のとおり）。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０９１０】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０９１１】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。本実施例では、第１のプライマーを、関心対象座から様々な距離にアニールするように設計した。第１のプライマーのアニーリング位置は、関心対象座から５〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、５６〜６０、６１〜６５、６６〜７０、７１〜７５、７６〜８０、８１〜８５、８６〜９０、９１〜９５、９６〜１００、１０１〜１０５、１０６〜１１０、１１１〜１１５、１１６〜１２０、１２１〜１２５、１２６〜１３０、１３１〜１４０、１４０〜１６０、１６０〜１８０、１８０〜２００、２００〜２２０、２２０〜２４０、２４０〜２６０、２６０〜２８０、２８０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００塩基、または５００塩基を上回ってよいことは、当業技術者に解される。
【０９１２】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。各ＰＣＲ産物を、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの１つのウェルに入れた。あるいは、第１のプライマーは、関心対象座を分子量に基づいて分離可能なように設計したので、ＰＣＲ産物を１つのウェルにプールすることができる。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０９１３】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩにより、精製ＰＣＲ産物を消化した。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０９１４】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩによる制限酵素消化により、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０９１５】
実施例６で示したように、あるＳＮＰの双方の対立遺伝子を、１種の標識ヌクレオチドにより、他の未標識ヌクレオチドの存在下で決定できる。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、グアニン以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ｄｄＮＴＰは、ファーメンタス社（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。
【０９１６】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０９１７】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後、試料を、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）の１レーンに載せた。前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。前記ゲルを塩基配列決定装置（ホーファーＳＱ３シーケンサー）上で３時間操作した。装置から前記ゲルを取り出し、タイフーン９４００バリアブルモード・イメージャー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ）上でスキャンした。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０９１８】
下記にＳＮＰ  ＴＳＣ０８３８３３５に関する５’オーバーハングの略図を表す。配列全体ではなく、オーバーハングの部分のみを模写している（ここでＲは可変部位を示す）。
2006521086.tif 000403
【０９１９】
ＴＳＣ０８３８３５５に関して観察されたヌクレオチドは、５’センス鎖（ここで上の鎖として表している）上のアデニンとグアニンである。オーバーハングの３位にあるヌクレオチドは、グアニンに相補的なシトシンに対応した。標識ｄｄＧＴＰは、未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの存在下、両方の対立遺伝子配列を決定するために使用できる。
【０９２０】
制限酵素ＢｓｍＦＩは、認識部位から１０／１４を典型的に切断して、５’オーバーハングを創製するために用いられた。時には、ＢｓｍＦＩは、認識部位から１１／１５を切断して以下のオーバーハングを生成する。
2006521086.tif 000404
【０９２１】
オーバーハングの０位は、アデニンに相補的なチミジンである。オーバーハングに相補的な０位は、未標識ｄＡＴＰによってはめ込まれ、したがって、はめ込み反応後、酵素が認識部位から１０／１４で切断しても１１／１５で切断しても全く同一の分子が生成した。はめ込み反応後に生成したＤＮＡは下記に表される。
2006521086.tif 000405
【０９２２】
ＴＳＣ０８３８３５５に関して増幅された母体鋳型ＤＮＡは、予想された高分子量バンドの位置に単一バンドを示し、これは「Ａ」対立遺伝子に対応した（図２０、レーン１を参照）。前記母体鋳型ＤＮＡは、ＴＳＣ０８３８３５５におけるアデニンに関してホモ接合であった。
【０９２３】
しかしながら、レーン２において、同じ個体の血漿から単離されたＴＳＣ０８３８３５５に関する複合鋳型ＤＮＡの増幅により２本のバンド、すなわち、「Ｇ」対立遺伝子に対応した低分子量バンド、および「Ａ」対立遺伝子に対応した高分子量バンドを示した。妊娠女性の血漿から単離された鋳型ＤＮＡは、母体鋳型ＤＮＡと胎児鋳型ＤＮＡの双方を含有する。
【０９２４】
図２０、レーン１に見られるように、母体鋳型ＤＮＡは、このＳＮＰにおけるアデニンに関してホモ接合であった（レーン１と２を比較）。「Ｇ」対立遺伝子は、胎児ＤＮＡを表した。母体鋳型ＤＮＡおよび胎児鋳型ＤＮＡのシグナルは、明瞭に区別された。「Ｇ」対立遺伝子は、胎児ＤＮＡの指標となり、試料に存在する胎児ＤＮＡ量を測定するために使用できる。また、一旦、所与の試料に関して母体血漿中の胎児ＤＮＡのパーセンテージが決定されると、このパーセンテージの何らかの偏差が染色体異常を示す。本法により、胎児染色体異常検出のための第１の非侵襲的方法を提供する。
【０９２５】
図２０、レーン３に見られるように、ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１８１３４に関する母体ＤＮＡの分析により、アデニン対立遺伝子に対応した高分子量バンドの予想された位置に移動した単一バンドが生成した。同様に、母体血漿から単離された複合鋳型ＤＮＡの分析により、アデニン対立遺伝子の予想された位置に移動した単一バンドが得られた（図２０、レーン４を参照）。母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの双方は、ＴＳＣ０４１８１３４のアデニンに関してホモ接合である。
【０９２６】
下記にＴＳＣ０１２９１８８に関する５’オーバーハングの略図を示しており、ここでＲは可変部位を示す。
2006521086.tif 000406
【０９２７】
可変部位（Ｒ）の上流のヌクレオチドは、センス鎖上のグアニンに対応しない。したがって、ＢｓｍＦＩの１１／１５切断特性により生成した５’オーバーハングは、１０／１４切断により生成した５’オーバーハングに理想的にはめ込まれる。未標識ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの存在下で標識ｄｄＧＴＰが、はめ込み反応に用いられた。はめ込み反応後に生成したＤＮＡ分子は以下に示される。
2006521086.tif 000407
【０９２８】
ＳＮＰ  ＴＳ０１２９１８８に関する母体ＤＮＡの分析により、「Ｇ」対立遺伝子を表したオーバーハングに相補的な１位でｄｄＧＴＰによりはめ込まれたＤＮＡ分子に対応した単一バンドが得られた（図２０、レーン５を参照）。アデニン対立遺伝子に関するバンドは検出されず、母体ＤＮＡがグアニンに関してホモ接合であることを示した。
【０９２９】
対照的に、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの双方を含有する母体血漿の複合鋳型ＤＮＡの分析により、２本の明瞭なバンドが得られた（図２０、レーン６を参照）。低分子量バンドは、「Ｇ」対立遺伝子に対応したが、一方、高分子量バンドは、「Ａ」対立遺伝子に対応した。前記「Ａ」対立遺伝子は、胎児ＤＮＡを表す。このように、胎児細胞を単離しなければならないという複雑さを加えることなく、母体ＤＮＡシグナルと胎児ＤＮＡシグナルの分離を可能にする方法が開発された。さらに、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間の相違を検出するために父親ＤＮＡの試料は必要とされない。
【０９３０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１３８９に関する母体ＤＮＡの分析により、「Ａ」対立遺伝子に対応した高分子量位置に移動した単一バンドを得た。「Ｇ」対立遺伝子に対応したバンドは検出されなかった。同様に、ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１３８９に関する母体血漿の複合鋳型ＤＮＡの分析により、「Ａ」対立遺伝子に対応した高分子量位置に移動した単一バンドが得られた。母体鋳型ＤＮＡと胎児鋳型ＤＮＡの双方とも、ＳＮＰ  ＴＳＣ０５０１３８９におけるアデニンに関してホモ接合であった。
【０９３１】
血漿からの母体鋳型ＤＮＡと鋳型ＤＮＡは、同じ試料から由来した。非侵襲的方法により得られた１つの試料が、母親および胎児双方の遺伝的指紋を提供した。
【０９３２】
母体鋳型ＤＮＡがホモ接合であった２９のＳＮＰのうち、胎児鋳型ＤＮＡは、２９のＳＮＰのうち２つでヘテロ接合であった。胎児ＤＮＡは、残りの２７ＳＮＰにおいて母体鋳型ＤＮＡと同じ対立遺伝子に関してホモ接合であった（データは示していない）。所与のＳＮＰにおいて、母体鋳型ＤＮＡのホモ接合対立遺伝子と血漿鋳型ＤＮＡとの比較により、さらに品質管理水準を高くできる。母体鋳型ＤＮＡと血漿鋳型ＤＮＡとが、同一ＳＮＰにおける異なる対立遺伝子に関してホモ接合であることはあり得ない。これが見られると、処理中のエラーが発生したことを示していると考えられる。
【０９３３】
本明細書に記載された方法は、母体遺伝子シグナルを分離でき、また母体血漿試料中の胎児遺伝子シグナルと識別できることを証明している。上記の実施例は、染色体１３に位置するＳＮＰを分析したが、ヒト染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹ、胎児染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹを含めていずれの染色体も分析できる。
【０９３４】
さらに、本明細書に記載された方法は、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質、または身体滲出液などの任意の生体試料における胎児ＤＮＡを検出するために使用できる。
【０９３５】
本明細書に記載された方法は、母体ＤＮＡがホモ接合であり、妊娠女性の血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを分析することにより、母体試料中の胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定できることを証明している。胎児ＤＮＡのパーセンテージは、胎児遺伝子型が染色体疾患を有するかどうかを決定するために使用できる。
【０９３６】
例えば、試料中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージが、染色体１の分析により３０％と算出される場合（染色体１に関与する染色体異常は妊娠初期に終了する）、３０％胎児ＤＮＡからの偏差が、染色体異常を示している。例えば、染色体１８上の１つのＳＮＰまたは複数のＳＮＰの分析の際、胎児ＤＮＡのパーセンテージが３０％以上であれば、このことは、染色体１８上に追加のコピーが存在することを示すと考えられる。任意の染色体からの胎児ＤＮＡの算出パーセンテージを、任意の他の染色体と比較できる。特に、染色体１３上の胎児ＤＮＡのパーセンテージを、染色体１８と２１上の胎児ＤＮＡのパーセンテージと比較できる。
【０９３７】
この分析は、各ＳＮＰにおける、ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の予想比の知識により補助される。実施例９で考察されたように、ヘテロ接合のＳＮＰの全てが、５０：５０の比率を示しているとは限らない。ある対立遺伝子対他の対立遺伝子の予想比の知識により、分析しなければならない可変部位の総数が減少する。しかしながら、種々のＳＮＰに係る予想比の知識がなくても、胎児ＤＮＡのパーセンテージは、多数のＳＮＰを分析することにより算出できる。ＳＮＰのサンプリングサイズが十分に大きい場合、予想比の値から生じる統計学的変化は除去される。
【０９３８】
さらに、ヘテロ接合の母体ＳＮＰはまた、貴重な情報を提供する。この分析は、ホモ接合の母体ＳＮＰに限定されない。例えば、母体ＤＮＡ上のヘテロ接合ＳＮＰにおいて、対立遺伝子１対対立遺伝子２の比が１：１である場合、胎児ＤＮＡが染色体異常を担持していない限り、血漿鋳型ＤＮＡにおける比率は、１：１のままであるはずである。
【０９３９】
上記の方法は、限定はしないが、点突然変異、トランジション、トランスバージョン、転座、挿入、欠失、および複製など、胎児ＤＮＡにおける突然変異を検出するために使用することもできる。図２０に見られるように、胎児ＤＮＡは、母体ＤＮＡと容易に識別できる。上記の方法は、任意の遺伝子に関する任意の関心対象座の配列を決定するために使用できる。
【０９４０】
実施例１４
妊娠女性の血液から単離された血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。上述したように、胎児の染色体異常を、母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合パターンを示すＳＮＰを解析することで判定することができる。
【０９４１】
例えば、ＳＮＰ  Ｘがアデニンまたはグアニンのいずれかであり、またＳＮＰ  Ｘにおける母親由来のＤＮＡがグアニンのホモ接合であると想定されたい。実施例６に記載された標識法で、血漿試料中のＤＮＡの配列を決定することができる。仮に、血漿試料が、ＳＮＰ  Ｘがヘテロ接合である胎児ＤＮＡを含む場合、以下のＤＮＡ分子が、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる切断と、標識ｄｄＧＴＰ、非標識のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰによるはめ込み反応後に生じることが予想される。
2006521086.tif 000408
【０９４２】
２つのシグナルが現れる。第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な位置においてｄｄＧＴＰで埋められたＤＮＡ分子に対応し、また第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な３番目の位置においてｄｄＧＴＰで埋められたＤＮＡ分子に対応する。しかし、母親由来のＤＮＡは、グアニンについてホモ接合であり、これは、オーバーハングに相補的な１番目の位置において埋められたＤＮＡ分子に対応する。オーバーハングに相補的な３番目の位置においてｄｄＧＴＰで埋められたＤＮＡ分子に由来するシグナルは、胎児ＤＮＡであることを意味するアデニン対立遺伝子に対応する。このシグナルは、胎児ＤＮＡの指標となり、血漿試料中に存在する胎児ＤＮＡの量を測定するために使用することができる。
【０９４３】
１本の染色体と別の染色体に由来する胎児ＤＮＡの量に差はない。例えば、第１染色体に由来する任意の個人の胎児ＤＮＡのパーセンテージは、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体に由来する胎児ＤＮＡのパーセンテージと同じである。したがって、１本の染色体上のＳＮＰに関して計算された対立遺伝子の比を、別の染色体上におけるＳＮＰに関する対立遺伝子の比と比較することができる。
【０９４４】
例えば、第１染色体上のＳＮＰに関する対立遺伝子の比は、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体上のＳＮＰに関する対立遺伝子の比と等しいはずである。しかし、仮に、胎児にトリソミーまたはモノソミーを含むがこれらに限定されない染色体異常がある場合、異常なコピー数で存在する染色体の比は、他の染色体に関する比と異なることになる。
【０９４５】
妊娠女性の血液のインビボにおける状況を再現するために、母親由来のＤＮＡを、トリソミー２１であると既に診断されている、その子どもから単離されたＤＮＡと、さまざまな比で混合し、胎児ＤＮＡのさまざまなパーセンテージを表した。例えば、母親由来の血液中における胎児ＤＮＡが５０％というインビボにおける状況を再現するために、等量の母親由来のＤＮＡを、ダウン症候群の小児から単離されたＤＮＡと混合した。母親由来のＤＮＡを解析して、ＳＮＰがホモ接合であることを同定し、また次に、これらのＳＮＰを対象に、５０％の母親由来のＤＮＡと５０％のダウン症候群ＤＮＡの混合物を用いて解析を行った。第１３染色体上のヘテロ接合のＳＮＰにおける、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の比を、第２１染色体上のヘテロ接合のＳＮＰにおける、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の比と比較した。
【０９４６】
以下の４種類の異なる試料を解析した：ダウン症候群の小児のＤＮＡが１００％で含まれる試料；ダウン症候群の小児のＤＮＡが７５％と、同小児の母親のＤＮＡが２５％で含まれる試料；ダウン症候群の小児のＤＮＡが５０％と、同小児の母親のＤＮＡが５０％で含まれる試料；ダウン症候群の小児のＤＮＡが４０％と、同小児の母親のＤＮＡが６０％で含まれる試料。母親由来のＤＮＡを解析した結果、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した。ダウン症候群の小児から単離されたＤＮＡの遺伝子型を決定したところ、ＳＮＰがヘテロ接合であることがわかった。次に、ＳＮＰにおいて、同試料の遺伝子型を決定したところ、母親のＤＮＡはホモ接合であり、また子どものＤＮＡはヘテロ接合であった。各試料に関して、これらのＳＮＰを１０回解析した。
【０９４７】
血液試料の採取
施設内倫理審査委員会（ＩＲＢ）によって承認された試験は、ダウン症候群の小児、およびその両親から血液試料を採取することを可能とするように計画した。この試験では、母親、父親、およびダウン症候群の小児から血液を採取した。ダウン症候群の小児からの血液採取に関するインフォームド・コンセントを、本人のほかに両親から得た。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取した。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存した。
【０９４８】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存した。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心した。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心した。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存した。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存した。
【０９４９】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離した。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用した。同じチューブ内の血液から、母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを単離した。
【０９５０】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
母親由来のＤＮＡの遺伝子型を決定した結果、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した。第１３染色体上の７６８のＳＮＰ、および第２１染色体上の７６８のＳＮＰの遺伝子型を、実施例６に記載された方法で決定した。任意の数のＳＮＰを解析することが可能であり、またＳＮＰを、ヒトの第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体上に位置づけることができる。好ましくは、遺伝子型決定対象のＳＮＰの対立遺伝子頻度は、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、または９０：１０である。実施例８に記載さた手順で、任意のＳＮＰの対立遺伝子頻度を決定することができる。
【０９５１】
第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰの詳細は、インターネット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｎｐ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ）経由で閲覧可能なＳＮＰコンソーシアムのデータベースに記録されている。プライマーは、上述の実施例（例えば、実施例１、実施例２、実施例３、実施例５、および実施例６）に記載された手順で設計した。
【０９５２】
第１のプライマーは、ＩＩＳ型酵素で切断後に、実施例６に記載されたように産物が異なる分子量を有するように設計した。こうすることで、増幅産物をプールして、ゲルの１つのレーンに流すことが可能となった。
【０９５３】
例えば、第１のプライマーを、切断後に３０塩基対の産物が生じるように設計することができる。同様に、異なる対象遺伝子座に対する第１のプライマーを、切断後に４０塩基対の産物が生じるように設計することができる。第１のプライマーは、１回の反応で、数多くの遺伝子座がゲルの１つのレーンで解析可能なように設計することができる（３０塩基対、４０塩基対、５０塩基対、６０塩基対、７０塩基対、８０塩基対、９０塩基対、１００塩基対、１１０塩基対、および１２０塩基対の産物を１つのレーンに流すことが可能）。第１のプライマーは、対象遺伝子座から、５〜１０塩基、１０〜２５塩基、２５〜５０塩基、５０〜７５塩基、７５〜１００塩基、１００〜１５０塩基、１５０〜２００塩基、２００〜２５０塩基、２５０〜３００塩基、３００〜３５０塩基、３５０〜４００塩基、４００〜４５０塩基、４５０〜５００塩基、５００〜５５０塩基、５５０〜６００塩基、６００〜６５０塩基、６５０〜７００塩基、７００〜７５０塩基、７５０〜８００塩基、８００〜８５０塩基、８５０〜９００塩基、９００〜９５０塩基、９５０〜１０００塩基、および１０００塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の距離をおいてアニールするように設計することができる。
【０９５４】
対象遺伝子座の増幅
遺伝子型が決定された個々のＳＮＰを対象に、ＰＣＲ反応で対象遺伝子座を増幅した。ＰＣＲ反応は、９６ウェルプレートで行った。個々のＳＮＰに対して、第１および第２のプライマー（１．２５μＭのストック濃度を３μｌ）をマイクロタイタープレートのウェルに添加した。第２１染色体用に８枚の９６ウェルＰＣＲプレートを準備し、また第１３染色体用に８枚の９６ウェルプレートを準備した。マイクロタイタープレートのウェルにプライマーを添加した後に、ゲノムＤＮＡとＨｏｔＳｔａｒ  ＰＣＲ試薬を含む混合物を各ウェルに添加した。各ＰＣＲ反応物は、３μｌの各プライマー、７．５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒミックス、０．５μｌの水、および１μｌのゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ／μｌ）を含むようにした。
【０９５５】
ＰＣＲのサイクル条件を以下に示す：
（１）９５℃で１５分および１５秒間；
（２）３７℃で３０秒間；
（３）９５℃で３０秒間；
（４）５２℃で３０秒間；
（５）９５℃で３０秒間；
（６）５８℃で３０秒間；
（７）９５℃で３０秒間；
（８）工程６および７を３７回繰返す；
（９）７２℃で５分間。
【０９５６】
対象断片の精製
ＰＣＲ反応後に、３０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、４０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、５０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、６０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、７０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、８０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、９０塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物、１００塩基対の産物を生じるように設計された第１のプライマーによって生じた３μｌのＰＣＲ産物を、Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製の、透明なＨｉｇｈ−Ｂｉｎｄプレート）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、２００１  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃａｔａｌｏｇに記載されたカタログ番号１  ６４５  ６９２）のウェルにひとまとめに混合した。第１のプライマーは、ストレプトアビジンでコーティングされたウェルにＰＣＲ産物は結合するがゲノム鋳型ＤＮＡは結合しないようにするために５’ビオチンタグを含むようにした。ストレプトアビジン結合反応は、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて実施した（１０００ｒｐｍ、２０分間、３７℃）。各ウェルの内容物を吸引して非結合材料を除去し、１×ＰＢＳで３回、軽く混合しながら洗浄した（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：１７８９−１７９５  （１９９０）；  Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：３０−３４  （１９９１）；  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６１６３−６１６４  （１９９０））。
【０９５７】
単離された断片の制限酵素による切断
精製後のＰＣＲ産物を、第２のプライマーからＰＣＲ産物中に組み込まれた認識部位に結合する制限酵素ＢｓｍＦＩで切断した。切断はＳｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ中で、制限酵素に添付された指示書に従って行った。切断後にウェルをＰＢＳで３回洗浄し、切断済みの断片を除去した。
【０９５８】
標識ヌクレオチドの取り込み
ＢｓｍＦＩ制限酵素による切断で、ＳＮＰ部位すなわち対象遺伝子座、および３’埋め込み末端を含む、５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が生じた。５’オーバーハングは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、１つのヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの取り込みを可能とする鋳型として機能した。実施例６に詳述されているように、１つの化学成分で標識された１つのヌクレオチドを使用して、ＳＮＰにおける配列を決定することができる。
【０９５９】
増幅された対象遺伝子座を、ストレプトアビジン−ウェルに、大きさごとに、またはめ込み反応に使用されるヌクレオチドごとにプールした。グアニンヌクレオチドを用いて決定されたＳＮＰの配列をひとまとめにプールした。同様に、アデニンヌクレオチドを用いて決定されたＳＮＰの配列をひとまとめにプールし、またチミジンヌクレオチドを用いて決定されたＳＮＰの配列をひとまとめにプールし、ならびにシトシンヌクレオチドを用いて決定されたＳＮＰの配列をひとまとめにプールした。
【０９６０】
したがって、典型的なはめ込み反応物は、産物の大きさが３０〜１２０塩基対の８つの増幅された遺伝子座を含んでおり、８つ全ての配列を、１つの化学成分で標識された１つのヌクレオチドを用いて決定した。任意の数の増幅遺伝子座をひとまとめにプールすることができる。
【０９６１】
以下の成分を、個々のはめ込み反応物に添加した：１μｌの蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド（Ｇはめ込み反応用にｄｄＧＴＰ、Ａはめ込み反応用にｄｄＡＴＰ、チミジンはめ込み反応用にｄｄＴＴＰ；およびシトシンはめ込み反応用にｄｄＣＴＰ）、０．５μｌの非標識ｄＮＴＰ（４０μＭ；標識ヌクレオチドを除く全ヌクレオチドを含む）、２μｌの１０×ｓｅｑｕｅｎａｓｅ緩衝液、０．２５μｌのＳｅｑｕｅｎａｓｅ、および水（２０μｌの反応物調製時に要時）。
【０９６２】
はめ込み反応は４０℃で１０分間行った。非蛍光標識ｄＮＴＰは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社（Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）から購入した。他のラベリング試薬はいずれもＡｍｅｒｓｈａｍ社から入手した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ，ＵＳ  ７９５６５）。
【０９６３】
ラベリング後に、個々のＳｔｒｅｐｔａｗｅｌｌを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回洗浄した。次に、「はめ込まれた」ＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて、製造業者の指示書（酵素に添付）に従って切断することでＳｔｒｅｐｔａｗｅｌｌから遊離させた。切断は、１２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間かけて行った。
【０９６４】
対象遺伝子座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離させた後に、試料を３６ｃｍの５％アクリルアミド（尿素）ゲル（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  ＲｕｎＧｅｌ  Ｐａｃｋｓ、カタログ番号５０６９１）のレーンにロードした。試料をゲル中で電気泳動した（３０００ボルトで３分間）。ゲルの泳動は配列決定装置（Ｈｏｅｆｅｒ  ＳＱ３  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）上で３時間かけて行った。このゲルを装置から外し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４００  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒでスキャンを行った。取り込まれた標識ヌクレオチドが、蛍光を指標として検出された。ＳＮＰがホモ接合であることが判明した。
【０９６５】
トリソミー２１鋳型を用いた、ＳＮＰがヘテロ接合であることの同定
ダウン症候群（上記の、遺伝子型が決定された母親の子ども）の個人から単離されたＤＮＡを解析したところ、ＳＮＰがヘテロ接合であることがわかった。母親のＤＮＡを対象に解析した、第１３染色体上の同じ７６８のＳＮＰと、第２１染色体上の同じ７６８のＳＮＰの遺伝子型を、実施例６に記載された方法で決定した。任意の数のＳＮＰを解析し、ＳＮＰを、ヒトの第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、またはＹ染色体上に位置づけることができる。好ましくは、遺伝子型の決定対象となるＳＮＰの対立遺伝子頻度は、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、または９０：１０である。実施例８に記載されているように、任意のＳＮＰの対立遺伝子頻度を決定することができる。
【０９６６】
ダウン症候群の個人から単離されたＤＮＡを用いてＳＮＰの遺伝子型を決定するプロセスは、母親由来のＤＮＡに関して説明されたプロセスと同じである。ＳＮＰがヘテロ接合であることがわかった。
【０９６７】
母親由来のＤＮＡがホモ接合のＳＮＰ、およびダウン症候群の個人から単離されたＤＮＡがヘテロ接合のＳＮＰを対象に、母親由来のＤＮＡとダウン症候群のＤＮＡの混合物を含む試料を用いて、さらに解析を行った。
【０９６８】
母親由来のＤＮＡおよびダウン症候群のＤＮＡを含む試料の調製
母親由来のＤＮＡ、および自分のダウン症候群の子どもから得られたＤＮＡを分光光度計で定量した。母親のＤＮＡと子どものＤＮＡを、さまざまなパーセンテージで混合し、母親の血液中を循環する胎児ＤＮＡの状況を再現した。以下のパーセンテージについて解析を行った：１００％がダウン症候群のＤＮＡの場合、７５％がダウン症候群のＤＮＡの場合、５０％がダウン症候群のＤＮＡの場合、および４０％がダウン症候群のＤＮＡの場合。
【０９６９】
ヘテロ接合の各ＳＮＰの比を、対立遺伝子１に関して得られた値を、対立遺伝子２に関して得られた値で割ることで算出した。例えば、仮に、ＳＮＰ  Ｘがアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）のいずれかの場合、ＳＮＰ  Ｘにおける比を、アデニンに関して得られた値を、グアニンに関して得られた値で割ることで算出した。
【０９７０】
ダウン症候群のＤＮＡを１００％含む試料を対象に、母親由来のＤＮＡに関してホモ接合で、またダウン症候群の個人から単離されたＤＮＡに関してヘテロ接合である第１３染色体上の６２のＳＮＰを解析した。第２１染色体に関しては、母親由来のＤＮＡに関してホモ接合で、またダウン症候群の個人から単離されたＤＮＡに関してヘテロ接合である６４のＳＮＰを解析した。
【０９７１】
第１３染色体上の６２のＳＮＰ、および第２１染色体上の４９のＳＮＰを個別に１０回解析した。表ＸＸに示すように、１０回の試行のそれぞれに関して、第１３染色体上の対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の比は、予想通り約１．０であった。第１３染色体については、１コピーの対立遺伝子１、および１コピーの対立遺伝子２が存在している。１０回の試行の平均は１．０５１であった（標準偏差＝０．０８５）。
【０９７２】
トリソミー２１の場合、１本の対立遺伝子が２コピー（通常は母親から受け継いだもの）と、別の対立遺伝子が１コピー存在する。予測比率は約０．５となる（１コピーの対立遺伝子１／２コピーの対立遺伝子２）。表ＸＸに示したように、第２１染色体に関する比は、低値は０．４６２から、高値は０．６３４までの範囲を変動する。あらゆる試行において、第２１染色体に関して得られた比は、第１３染色体に関して得られた比と有意に異なっていた。１０回の試行の比の平均は０．５３１であった（標準偏差＝０．０４９）。
【０９７３】
真の統計的尺度が得られるようにするために、この実験を１０回繰返した。仮に、１０種類の異なる遺伝子試料を使用した場合、基準（母親がホモ接合で、ダウン症候群の子どもがヘテロ接合）に適合するＳＮＰは異なることになり、試料間の比較は困難になる。
【０９７４】
統計解析の結果、第１３染色体および第２１染色体に関して得られた比の信頼値９９．９％は、値のランダムな数値的揺らぎではなく、真の差を意味することが判明した。Ｒａｖｇｅｎ法では、染色体異常の存在が同定されている。
【０９７５】
７５％のダウン症候群のＤＮＡと２５％の母親のＤＮＡを含む試料の場合、第１３染色体上の６２のＳＮＰ、および第２１染色体上の５０のＳＮＰを、特に明記しない限り解析した。さまざまな試行に関して、すべてのＳＮＰが定量可能であったわけではない。なぜなら、一部のＳＮＰに対応するバンドは薄かったからである。この結果は、ＰＣＲによる増幅の不良、ストレプトアビジンプレートに対する弱い結合、または弱いはめ込み反応に起因する可能性がある。
【０９７６】
試行３では、第１３染色体上の６１のＳＮＰを解析した。試行４では、第２１染色体上の４９のＳＮＰを解析した。試行５では、第２１染色体上の４７のＳＮＰと、第１３染色体上の６１のＳＮＰを解析した。試行７では、第２１染色体上の４９のＳＮＰと、第１３染色体上の６１のＳＮＰを解析した。試行８では、第２１染色体上の４９の染色体と、第１３染色体上の５９のＳＮＰを解析した。試行９および１０では、第１３染色体上の５９のＳＮＰを解析した。
【０９７７】
ヘテロ接合のＳＮＰに関する、第１３染色体に関する予測比率は０．６である。仮に、母親の両方の染色体がアデニンヌクレオチドを含み、またダウン症候群のゲノムが、アデニンヌクレオチドを有する１本の染色体と、グアニンヌクレオチドを有する１本の染色体を含む場合、Ｇ：Ａの比は、０．７５／（０．７５（ダウン症候群のＡ対立遺伝子）＋０．２５＋０．２５（母親由来のＡ対立遺伝子））（＝０．６）となる。１０回の試行において、第１３染色体に関して得られた比は０．５６７〜０．６４５の範囲を変動した。１０回の試行の平均は０．６０９であった（標準偏差＝０．０３２）（表ＸＸ参照）。
【０９７８】
トリソミー状態の第２１染色体に関する予測比率は０．３７５である。仮に、母親の両方の染色体がアデニンヌクレオチドを含み、またダウン症候群のゲノムが、アデニンヌクレオチドを有する２本の染色体と、グアニンヌクレオチドを有する１本の染色体を含む場合、Ｇ：Ａの比は、０．７５／（０．７５＋０．７５（ダウン症候群のＡ対立遺伝子）＋０．２５＋０．２５（母親由来のＡ対立遺伝子））（＝０．３７５）となる。
【０９７９】
１０回の試行において、第２１染色体に関して得られた比は０．３５０〜０．４１２５の範囲を変動した（平均＝０．３８４、標準偏差＝０．０１７）（表ＸＸ参照）。統計解析の結果、第１３染色体および第２１染色体に関して得られた比である信頼値９９．９％は真の差であり、ランダムな数値的揺らぎではないことが判明した。Ｒａｖｇｅｎ法では、２５％の母親由来のＤＮＡの存在下で、染色体異常の存在が同定されている。
【０９８０】
ダウン症候群のＤＮＡを５０％含む試料に関しては、第１３染色体上の４６のＳＮＰと第２１染色体上の３５のＳＮＰを、特に明記されない限り解析した。試行１では、第１３染色体上の４５のＳＮＰを解析した。試行２では、第１３染色体上の４４のＳＮＰを解析した。試行３では、第１３染色体上の４２のＳＮＰを解析した。試行４では、第１３染色体上の４４のＳＮＰと、第２１染色体上の３４のＳＮＰを解析した。試行５では、第２１染色体上の３４のＳＮＰを解析した。試行７および８では、第１３染色体上のそれぞれ４４および４１のＳＮＰを解析した。試行９では、第１３染色体上の４４のＳＮＰ、および第２１染色体上の３４のＳＮＰを解析した。試行１０では、第１３染色体上の４４のＳＮＰを解析した。
【０９８１】
５０％の試料に関する、第１３染色体上のヘテロ接合のＳＮＰにおける予測比率は０．３３である。仮に、母親の両方の染色体がアデニンヌクレオチドを含み、またダウン症候群のゲノムが、アデニンヌクレオチドを有する１本の染色体と、グアニンヌクレオチドを有する１本の染色体を含む場合、Ｇ：Ａの比は、０．５０／（０．５０（ダウン症候群のＡ対立遺伝子）＋０．５０＋０．５０（母親由来のＡ対立遺伝子））（＝０．３３）となる。１０回の試行において、第１３染色体に関して得られた比は０．３０２〜０．３４７の範囲を変動した。１０回の試行の平均は０．３２４であった（標準偏差＝０．０１３）（表ＸＸ参照）。
【０９８２】
トリソミー状態の第２１染色体に関する予測比率は０．２５である。仮に、母親の両方の染色体がアデニンヌクレオチドを含み、またダウン症候群のゲノムが、アデニンヌクレオチドを有する２本の染色体と、グアニンヌクレオチドを有する１本の染色体を含む場合、Ｇ：Ａの比は、０．５０／（０．５０＋０．５０（ダウン症候群のＡ対立遺伝子）＋０．５０＋０．５０（母親由来のＡ対立遺伝子））（＝０．２５）となる。
【０９８３】
１０回の試行において、第２１染色体に関して得られた比は０．２３０〜０．２７５の範囲を変動した（平均＝０．２４４、標準偏差＝０．０１５）（表ＸＸ参照）。統計解析の結果、第１３染色体および第２１染色体に関して得られた比である信頼値９９．１％は真の差であり、ランダムな数値的揺らぎではないことが判明した。Ｒａｖｇｅｎ法では、５０％の母親由来のＤＮＡ存在下で、染色体異常の存在が同定されている。
【０９８４】
ダウン症候群のＤＮＡを４０％含む試料に関しては、第１３染色体上の６０のＳＮＰと第２１染色体上の４８のＳＮＰを、特に明記されない限り解析した。試行１では、第２１染色体上の４７のＳＮＰを解析した。試行２〜４では、第１３染色体上の５９のＳＮＰ、および第２１染色体上の４７のＳＮＰを解析した。試行５および６では、第２１染色体上の４６のＳＮＰを解析した。試行７では、第１３染色体上の５８のＳＮＰを解析した。試行８では、第２１染色体上の４６のＳＮＰを解析し、また試行９および１０では、第２１染色体上の４７のＳＮＰを解析した。
【０９８５】
ダウン症候群のＤＮＡを４０％含む試料に関しては、第１３染色体上のヘテロ接合のＳＮＰにおける予測比率は０．２５である。仮に、母親の両方の染色体がアデニンヌクレオチドを含み、またダウン症候群のゲノムが、アデニンヌクレオチドを有する１本の染色体と、グアニンヌクレオチドを有する１本の染色体を含む場合、Ｇ：Ａの比は、０．４０／（０．４０（ダウン症候群のＡ対立遺伝子）＋０．６０＋０．６０（母親由来のＡ対立遺伝子））（＝０．２５）となる。１０回の試行において、第１３染色体に関して得られた比は０．２５４〜０．２８５の範囲を変動した。１０回の試行の平均は０．２６９であった（標準偏差＝０．００９）（表ＸＸ参照）。
【０９８６】
トリソミー状態の第２１染色体に関する予測比率は０．２０である。仮に、母親の両方の染色体がアデニンヌクレオチドを含み、またダウン症候群のゲノムが、アデニンヌクレオチドを有する２本の染色体と、グアニンヌクレオチドを有する１本の染色体を含む場合、Ｇ：Ａの比は、０．４０／（０．４０＋０．４０（ダウン症候群のＡ対立遺伝子）＋０．６０＋０．６０（母親由来のＡ対立遺伝子））（＝０．２０）となる。
【０９８７】
１０回の試行において、第２１染色体に関して得られた比は０．２１６〜０．２４９の範囲を変動した（平均＝０．２３、標準偏差＝０．０１１）（表ＸＸ参照）。統計解析の結果、第１３染色体および第２１染色体に関して得られた比である信頼値９４．３％は真の差であり、ランダムな数値的揺らぎではないことが判明した。Ｒａｖｇｅｎ法では、６０％の母親由来のＤＮＡの存在下で、染色体異常の存在が同定されている。
【０９８８】
トリソミー２１状態の存在は、異常なＤＮＡをさまざまなパーセンテージで含む数多くの試料を対象に、Ｒａｖｇｅｎ法で明らかにされている。異常なＤＮＡの個々のパーセンテージを個別に１０回解析し、各回において、異常な状態の存在が判明した。第１３染色体上の複数のヘテロ接合のＳＮＰにおける対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の比を算出し、比の平均を得た。同じ処理を、第２１染色体上に位置するＳＮＰについて行った。第１３染色体上のヘテロ接合のＳＮＰに関して得られた比は、第２１染色体に関して得られた比と統計的に異なっていた。第１３染色体と第２１染色体に関して得られた比はいずれも、数学的に推定された値に近い値であった。
【０９８９】
この実施例では、ダウン症候群のＤＮＡを１００％を含む試料と、ダウン症候群のＤＮＡを７５％含む試料に関する信頼区間は９９．９％であり、またダウン症候群のＤＮＡを５０％含む試料に関する信頼区間は９９．１％であった（この値は、羊水穿刺で報告されている値にほぼ等しい）。ダウン症候群のＤＮＡを４０％含む試料に関する信頼区間は９４．３％であり、これは、出生前診断目的で現在市販されている非侵襲的検査より精度が高い。
【０９９０】
上述したように、第１３染色体上の約６０のＳＮＰ、および第２１染色体上の５０のＳＮＰを解析した。４０％またはこれ未満の胎児ＤＮＡを含む試料に関する信頼区間を大きくするためには、より多数のＳＮＰを解析するとよい。Ｒａｖｇｅｎ法は、高精度で費用効果に優れたＤＮＡ配列決定法であるので、多数のＳＮＰの配列決定は困難ではない。検定の真度は、配列が決定されたＳＮＰの数によって決定される。低いパーセンテージのＤＮＡを含む試料について精度を高くするためには、より多くのＳＮＰを解析するとよい。あるいは、本明細書に記載された方法で、試料が、より高いパーセンテージの胎児ＤＮＡを確実に含むようにすることが可能である。
【０９９１】
この実施例では、母親の血液中に胎児のＤＮＡが存在することを示す、ダウン症候群のＤＮＡを４０％含む試料を解析した。０．０００１〜１％、１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、および９０〜１００％を含むがこれらに限定されない、任意のパーセンテージの胎児ＤＮＡを含む母親由来の血液試料を解析することができる。
【０９９２】
（表ＸＸ）Ｒａｖｇｅｎ法でダウン症候群のＤＮＡを４０％含む試料を対象に染色体異常を同定する
2006521086.tif 000409
【０９９３】
実施例１５
実施例４に記載されているように、母親由来の血液中の胎児ＤＮＡのパーセンテージを高めるために、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋試薬を使用することができる。この実施例では、母親由来の細胞の溶解量を最小とする、遊離の胎児ＤＮＡを単離する方法について説明する。１６州の２７の臨床施設で採取された母親由来の６９の血液試料に対するホルマリンの作用を解析した。妊娠女性から採取した全試料にホルマリンを添加し、胎児ＤＮＡのパーセンテージを、段階希釈解析と、これに続くＰＣＲによって算出した。Ｙ染色体上の遺伝マーカーを用いて、胎児ＤＮＡのパーセントを算出した。
【０９９４】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取した。血液試料は、全米の１６州で医療行為を行っている２７の異なる臨床施設で回収した。血液試料は、男子および女子の胎児を妊娠している女性から採取したが、ここでは発明者らは、男子の胎児を妊娠している女性から得られた結果について報告する。というのは、Ｙ染色体が、胎児ＤＮＡのパーセンテージを定量する際に受け入れられているマーカーだからである。
【０９９５】
血液は、適切な処理後に、結果として得られる血清または血漿中における胎児由来ＤＮＡ／母親由来ＤＮＡの比の実質的な上昇をもたらす、任意の方法またはプロセスで回収する。本明細書で用いる、「胎児由来ＤＮＡ／母親由来ＤＮＡ比の実質的な上昇」は、本明細書に記載された方法で検出することができる。このような方法またはプロセスは、典型的には、標準的な手順で採取される血液試料中に存在する胎児由来ＤＮＡ／母親由来ＤＮＡの比の、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、１００％、またはこれを上回る比の実質的な上昇をもたらす。
【０９９６】
他の態様では、血液を、結果として得られる血清または血漿中に、処理後に回収または検出される全ＤＮＡ量と比較して、遊離の胎児ＤＮＡ量の実質的な上昇をもたらす任意の方法またはプロセスで回収する。このような方法またはプロセスは、典型的には実質的な上昇もたらし、回収または検出される胎児ＤＮＡは、処理後の血漿試料または血清試料中に回収または検出される全ＤＮＡの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、またはこれを上回る。
【０９９７】
全ての臨床施設には、２１ゲージのニードル、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を含むシリンジ、アイスパック、および輸送用容器を含む、静脈穿刺法に使用されるキットが配布された。臨床施設は、血液採取直後にホルムアルデヒドを添加して、チューブを穏やかに逆さにするように指示された。
【０９９８】
血液試料を採取する方法またはプロセスには、細胞溶解の緩和または減少をもたらす他の段階を含めることができる。例えば、血液採取装置を、使用する採取用のニードル、シリンジ、またはチューブ内における剪断力に起因する細胞溶解を抑えるように改変することができる。例えば、大きなゲージのニードルを使用することで細胞の剪断を減らすことができるほか、ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブを改変することで血流速度を低下させることができる。
【０９９９】
血漿の単離
任意の方法で、血液の採取後に血漿を細胞成分から単離することができるが、細胞の溶解が実質的に防止、減少、または阻害される方法が好ましい。血液は、処理を行うまで４℃で保存した。母親由来の細胞の溶解量を少なくするように血漿の単離法を実施した。制動力および加速力をゼロに設定した遠心器で、チューブを１０００ｒｐｍで１０分間遠心することで、細胞の溶解、および／または血液細胞成分の血漿中への混合を実質的に防止、減少、阻害した。チューブの遠心を、制動力をゼロに設定し（遠心を自然減速で停止させる）、また加速力をゼロに設定して１０００ｒｐｍで１０分間、再び行った。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに慎重に移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心した（ブレーキおよび加速力はゼロに設定）。各試料の上清（血漿）を、細胞成分の血漿中への混合を実質的に防ぐ手順で回収されたしフィーコートが乱れないように十分注意した。チューブ内に残存しうる上清のパーセンテージは、０．００１〜１％、１〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％または８０％超を含むがこれらに限定されない。この実施例では、バフィーコートが乱れないようにするために、約０．５ｍｌの上清をチューブ内に残した。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存した。
【１０００】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って血漿試料からＤＮＡを単離した。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出した。しかし、塩化セシウム勾配、ショ糖勾配、グルコース勾配、遠心プロトコル、煮沸、Ｑｉａｇｅｎ社の精製システム、ＱＩＡ  ＤＮＡ血液精製キット、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドキット、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＤＮＡ精製システム、ＭａｎｇｅＳｉｌ常磁性粒子をベースとしたシステム、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶテクノロジー、ＷｉｚａｒｄゲノムＤＮＡ精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の精製システム、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ精製キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の精製システム、ＣＯＮＣＥＲＴ社の精製システム、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の精製システム、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＢｌｏｏｄＳｐｉｎキット、およびＵｌｒａＣｌｅａｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡキットを含む、任意のＤＮＡ単離法を使用することができる。当業者であれば、ＤＮＡの収量を増加させるために、製造業者のプロトコルを変更可能なことを理解できる。例えば、ＤＮＡ精製用のＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットでは、１×ＡＬ緩衝液の使用が推奨されている。しかし、ＤＮＡの収量を増加させる場合には、０．１〜０．５Ｘ  ＡＬ緩衝液、０．５〜１×  ＡＬ緩衝液、１×〜２×  ＡＬ緩衝液、２〜３×  ＡＬ緩衝液、３〜４×  ＡＬ緩衝液、４〜５×  ＡＬ緩衝液、および５×を上回るＡＬ緩衝液を含むがこれらに限定されない、任意の濃度のＡＬ緩衝液を使用することができる。当業者であれば、試薬の変更および操作がＡＬ緩衝液に限定されないことを理解することができる。
【１００１】
胎児ＤＮＡのパーセンテージの定量
母親の血漿試料中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージを、段階希釈解析と、これに続くＰＣＲによって算出した。以下の異なる２種類のプライマー対を使用した：１つのプライマーセットはＹ染色体に特異的なものであり、したがって胎児ＤＮＡに特異的なものであり、またもう１つのプライマーセットは、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方に存在するのう胞性線維症遺伝子を増幅するように設計されたものである。
【１００２】
プライマー設計
Ｙ染色体上のＳＲＹ遺伝子を増幅するために以下のプライマーを設計した：
上流プライマー：
2006521086.tif 000410
下流プライマー：
2006521086.tif 000411
【１００３】
のう胞性線維症遺伝子を増幅するために以下のプライマーを設計した：
上流プライマー：
2006521086.tif 000412
下流プライマー：
2006521086.tif 000413
【１００４】
ＰＣＲ反応
ＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子を、鋳型のゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行った。ＳＲＹ遺伝子の増幅に関しては、Ｑｉａｇｅｎ精製カラムから溶出したＤＮＡを段階的に１：２に希釈した。のう胞性線維症遺伝子の増幅に関しては、Ｑｉａｇｅｎ精製カラムから溶出したＤＮＡを１：４に希釈した後に、段階的に１：２に希釈した。各ＰＣＲ反応には、以下の成分を使用した：８μｌの鋳型ＤＮＡ（希釈済み、または未希釈のもの）、１μｌの各プライマー（５μＭ）、１０μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑミックス。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９４℃で１分間；
（３）５４℃で１５秒間；
（４）７２℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を４５サイクル繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１００５】
ＳＲＹ遺伝子の増幅は、以下の希釈率の鋳型を用いて行った：非希釈、希釈率１：２、希釈率１：４、希釈率１：８、希釈率１：１６、希釈率１：３２、希釈率１：６４、希釈率１：１２８、希釈率１：２５６、および希釈率１：５１２。のう胞性線維症遺伝子の増幅は、以下の希釈率の鋳型を用いて行った：希釈率１：４、希釈率１：８、希釈率１：１６、希釈率１：３２、希釈率１：６４、希釈率１：１２８、希釈率１：２５６、希釈率１：５１２、希釈率１：１０２４、希釈率１：２０４８、および希釈率１：４０９６。
【１００６】
母親の血漿中に存在する胎児ＤＮＡのパーセントを、以下の公式で算出した：
％胎児ＤＮＡ＝（ＳＲＹ遺伝子の量／のう胞性線維症遺伝子の量）＊２＊１００。
ＳＲＹ遺伝子の量は、同遺伝子が増幅された最高希釈値によって代表させた。同様に、のう胞性線維症遺伝子の量は、同遺伝子が増幅された最高希釈値で代表させた。この公式は、ＳＲＹ遺伝子は（Ｙ染色体上に）１コピーしか存在しないが、のう胞性線維症遺伝子は２コピーが存在するという事実を標準化するために使用される増倍係数２を含む。
【１００７】
ワシントン州からマサチューセッツ州に至る１６州の２７の臨床施設で回収された６９の母親血液試料に対するホルマリンの作用を表ＸＸＩに示す。本研究では、妊娠女性から採取された全試料にホルマリンが添加され、胎児ＤＮＡのパーセンテージが、段階希釈解析と、これに続くＰＣＲによって算出された。段階希釈およびＰＣＲによる増幅は、４人の異なる研究者によって５か月間をかけて実施された。妊娠期間が１１週〜２８週の女性から試料が回収された（大半の女性が妊娠１６〜１９週）。要約を表ＸＸＩＩＩに示す。
【１００８】
母親由来の血液中で解析された６９の試料における遊離の胎児ＤＮＡの平均パーセンテージは３３．６％であった。Ｌｏらは、本研究における大半の女性の妊娠期間である、妊娠初期の後期〜妊娠中期の中間の女性では、胎児ＤＮＡの濃度が３．４％であると報告している。したがって、ホルマリンの添加は、胎児ＤＮＡの平均パーセンテージの約１０倍の上昇をもたらしたことになる。
【１００９】
母親由来の血液中の胎児ＤＮＡの、算出されたパーセンテージは印象的な値であったが、本研究で観察された胎児ＤＮＡのパーセンテージの範囲を調べることも重要である。約６パーセントの女性（４／６９）では、母親由来の血液中に３．１２５％の遊離の胎児ＤＮＡが含まれており、これは本研究で認められた胎児ＤＮＡの最低のパーセンテージであった。別の１０．２％の女性では、６．２５％の胎児ＤＮＡが含まれていた。これは、文献に報告された平均値の２倍の増加に相当する。母親由来の血液中に含まれる胎児ＤＮＡが１０％未満の女性の総数は、わずか１６．０％であった。
【１０１０】
本研究では、５８パーセントの女性が含む胎児ＤＮＡのパーセンテージは２５％またはこれを上回った。母親由来の血液中に５０パーセントまたはこれを上回る胎児ＤＮＡを含んでいた女性が２６．０％いたことは重要である。この規模の胎児ＤＮＡのパーセンテージは、これまで報告されていないので、出生前遺伝学領域における新しいツールとなる。
【１０１１】
妊娠期間が１１週の女性から採取された試料は４つあった。母親由来の血液試料中の胎児ＤＮＡのパーセンテージは、２つの試料が１２．５％であり、１つの試料が２５％であり、また１つの試料が５０％以上であった。したがって、胎児ＤＮＡのパーセンテージに対するホルマリンの作用は、妊娠初期ならびに妊娠後期の女性から採取された試料について認められたことになる。
【１０１２】
細胞膜の安定化、および遊離ＤＮＡの放出の減少による作用はホルマリンに限定されなかった。発明者らは、細胞溶解を抑えたり、および／または細胞膜を安定化する、多種多様な薬剤（グルタルアルデヒドなど）、および薬剤群の組合わせを過去に検討しており、このような薬剤も、血液試料中の遊離ＤＮＡの量を減少させることがわかっている（データは提示していない）。
【１０１３】
上記の方法は、実質的に細胞溶解を阻害したり抑えたり、または細胞膜を安定化するために、採取時または採取時の近くに、血液試料に薬剤を添加する段階を含む場合もある。ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞溶解を抑えたり、細胞膜を安定化したり、または細胞膜を架橋したりする任意の数の薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。使用可能な他の架橋剤は、ウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／）に挙げられている。
【１０１４】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１０１５】
細胞膜を安定化したり、細胞溶解を抑えたり、または細胞膜を架橋したりする、任意の濃度の薬剤を添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化したり、細胞溶解を抑えたり、または細胞膜を架橋したりする薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１０１６】
母親由来の血液試料中の遊離の胎児ＤＮＡに関して、注目すべきパーセンテージが報告されたが、ホルマリンの重要性を丁寧に医師に説明することによって、さらに高いパーセンテージが達成可能であると考えられる。ホルマリンの存在に関して、試料を無作為に調べたところ、約１０パーセントの試料についてホルマリンが添加されていないことがわかった。また別の１０パーセントの試料では凝集物が認められ、ホルマリンが、採取された血液と十分混合されていなかった可能性が示唆された。したがって、ホルマリンの添加は顕著な作用をもたらしたものの、対照を設定した条件では、遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージが高くなる可能性がある。
【１０１７】
また発明者らは、静脈穿刺手順時に、また断熱性輸送用容器（検体は、スタイロフォーム（Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ）容器中でアイスパックとともに輸送されるが、試料はさまざまな地域から送られてくるので温度には幅がある）中において溶血を最小化する手順は、遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージの一層の上昇を引き起こす可能性があると考えている。溶血を抑えるように設計されたニードルを、静脈穿刺手順時に使用することができる。
【１０１８】
また発明者らは、血漿を慎重に単離する手順は、母親試料中のＤＮＡを最小限に抑えることを促すと想定している。発明者らは、細胞の溶解を抑えるために、緩やかな遠心パラメータの設定などの上記手順を実施し、外力を加えることなく（ブレーキをかけずに）ローターを停止させた。また発明者らは、血漿ＤＮＡを含む上清を、母親のＤＮＡを含むバフィーコートから丁寧に除去した。細胞の溶解を抑えるために、これらの手順をホルマリンの添加と組合わせることによって、胎児ＤＮＡのパーセンテージが大きく上昇することになった。
【１０１９】
（表ＸＸＩ）ホルマリンは、数多くの臨床施設において、さまざまな妊娠期間の女性から採取された血液試料中に遊離の胎児ＤＮＡが占めるパーセンテージを高める
2006521086.tif 000414
【１０２０】
（表ＸＸＩＩ）ホルマリンは、数多くの臨床施設において、さまざまな妊娠期間の女性から採取された血液試料中の遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージを高める
2006521086.tif 000415
【１０２１】
（表ＸＸＩＩＩ）母親由来の細胞の溶解防止に使用可能な架橋剤の代表的なリスト
2006521086.tif 000416
2006521086.tif 000417
2006521086.tif 000418
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2006521086.tif 000420
2006521086.tif 000421
【１０２２】
実施例１６
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。市販および非市販のアレイを含むがこれらに限定されない、任意のＤＮＡマイクロアレイを使用することができる。
【１０２３】
第１３染色体、第１８染色体、および第２１染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１３染色体および第１８染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１８染色体および第２１染色体に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、第１５染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、Ｙ染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、個々の常染色体上およびいずれかの性染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１３染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１８染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第２１染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１５染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第１７染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、第２２染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、１本の染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイ、および複数の染色体上に位置するＳＮＰを含むＤＮＡマイクロアレイを含むがこれらに限定されない、対象となる染色体または染色体群上に位置するＳＮＰを含むようにＤＮＡマイクロアレイを設計することができる。
【１０２４】
この実施例では、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＨｕＳＮＰアレイによってＳＮＰを解析するが、ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、ＧｅｎＦｌｅｘ  Ｔａｇアレイ、Ｍａｐｐｉｎｇ  １０Ｋアレイ、他のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製アレイ、および他のＤＮＡアレイを含むがこれらに限定されない、任意の数のＤＮＡアレイを使用することができる。
【１０２５】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１０２６】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞溶解を抑えたり、細胞膜を安定化したり、または細胞膜を架橋したりする、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化したり、細胞溶解を抑えたり、細胞膜を架橋したりする薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化したり、細胞溶解を抑えたり、または細胞膜を架橋したりする薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１０２７】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１０２８】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１０２９】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１０３０】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
ＨｕＳＮＰアッセイ法
ＨｕＳＮＰアッセイ法を、Ｋ．Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈらの手順で行う（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８，１００１−１００５）。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ＨｕＳＮＰ（商標）アレイは、ゲノム全体に広がる、ほぼ１，５００のＳＮＰを同時に追跡することによって、ゲノム全体の調査が可能であると考えられている。この実施例では、ＨｕＳＮＰアレイを代表的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイとして使用するが、特定のユーザー要件に適合させるために設計されたＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＣＹＰ４５０、およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘカスタムアレイを含むがこれらに限定されない他のアレイの使用を制限する意図はない。
【１０３１】
ＰＣＲによる増幅
母親由来のＤＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から提供されたＨｕＳＮＰプロトコルに従ってアッセイする。各試料を対象に、２４プールのプライマー対（５０〜１００の遺伝子座／プール、各５０  ｎＭ）を、５ｎｇの母親由来のＤＮＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．２５  ＵのＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および提供された緩衝液と混合する（１プールあたり１２．５μｌ）。試料を、９５℃で５分間かけて変性した後に、９５℃で３０秒間、５２℃＋０．２℃／サイクルで５５秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクル行い、続いて９５℃で３０秒間、５８℃で５５秒間、および７２℃で３０秒間を５サイクル行い、７２℃で７分間の最終伸長を行う。１μｌの増幅産物を９９９μｌのｄｄＨ２Ｏに添加することで、１：１０００倍希釈の各プールを調製する。次に、２．５μｌの１：１０００希釈物を新しいプレートに移し、０．８μＭのビオチン化Ｔ７プライマーおよび０．８μＭのビオチン化Ｔ３プライマー、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５  ＵのＴａｑ、および提供された緩衝液で、２５μｌ中で、９５℃で８分間に続いて、９５℃で３０秒間、５５℃で９０秒間、および７２℃で３０秒間を４０サイクル行い、また７２℃で７分間の最終伸長を行うことで増幅する。次に、各プールの１．５μｌを対象に、増幅されたことを３％アガロースゲル上で検証する。各試料に関して、各２４プールの残分を混合し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１０スピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）にロードする。カラムを室温で１３，０００  ｇで２０分間遠心して試料を濃縮し、カラムを逆さにして３，０００  ｇで３分間遠心する。容量を６０μｌに調整する。
【１０３２】
対象となるＳＮＰのみを用いて、カスタムアレイを設計することができる。例えば、第１染色体、第１３染色体、第２１染色体、第１８染色体、第１５染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体上に位置するＳＮＰを含むカスタムアレイを設計することができる。
【１０３３】
また、第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、またはＹ染色体を含む、任意のヒト染色体に位置するＳＮＰを含む、任意の数のＳＮＰを増幅することができる。第１３染色体上の２つの代表的なＳＮＰ、および第２１染色体上の２つの代表的なＳＮＰを選択する。ＳＮＰのゲノム上の位置および配列は、ＳＮＰコンソーシアム（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ）に記載されている場合がある。仮に、これらのＳＮＰがアレイ上に存在しない場合は、別のＳＮＰを選択することができる。
【１０３４】
第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０４６６９１７（Ｃ／Ｇ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000422
下流プライマー：
2006521086.tif 000423
【１０３５】
第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６（Ｔ／Ａ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000424
下流プライマー：
2006521086.tif 000425
【１０３６】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８（Ａ／Ｇ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000426
下流プライマー：
2006521086.tif 000427
【１０３７】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００６９８０５（Ｃ／Ｔ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000428
下流プライマー：
2006521086.tif 000429
【１０３８】
ＧｅｎｅＣｈｉｐプローブアレイに対するハイブリダイゼーション、洗浄、および染色
５〜３０μｌの試料（チップのロットの強度によって異なる）を、３  Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）、２ｍＭの対照オリゴヌクレオチドＢ１（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社から提供）、５×デンハート液、１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．８、および０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０（総容量１３５μｌ）で希釈し、９５℃で１０分間かけて変性させる。氷上で２分間、静置した後に、試料をＨｕＳＮＰチップにロードし、ハイブリダイズさせる（４４℃、１６時間、４０  ｒ．ｐ．ｍ）。
【１０３９】
各チップを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘフルオディクス上で染色する。チップを、６×ＳＳＰＥＴ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（６×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡナトリウム）＋０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）との２５℃における２回の混合を２サイクルと、４×ＳＳＰＥＴ（４×ＳＳＰＥ＋０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）との３５℃における５回の混合を６サイクル行って洗浄する。チップを、５０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリン、および０．２５ｍｇ／ｍｌのビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（溶媒６×ＳＳＰＥ）、１×デンハート液、および０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（総容量５００μｌ）を用いて、２５℃で３０分間かけて染色する。チップを６×ＳＳＰＥＴに浸した後に、２５℃で６×ＳＳＰＥＴで４回混合して６回洗浄する。
【１０４０】
ハイブリダイゼーション、洗浄、および染色手順の後に、ＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（ＨｕＳＮＰ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐ／Ｎ  ７００３０８）でＨｕＳＮＰプローブアレイをスキャンする。
【１０４１】
スキャニング
ＨｕＳＮＰプローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナーで、ＨｕＳＮＰ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐ／Ｎ  ７００３０８）に従ってスキャンする。ＡｌｐｈａＡｒｒａｙ（商標）Ｒｅａｄｅｒを含むがこれらに限定されない他のスキャナーを使用することができる。遺伝子型の判定は、得られたハイブリダイゼーションシグナルの強度を元に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅバージョン５．０ソフトウェアによって自動的になされる。各対立遺伝子のＳＮＰは、２０−ヌクレオチドのプローブ内におけるＳＮＰ塩基位置の位置が異なる４つまたは５つの相補的なプローブによって表される。各プローブは順に、同じ配列のプローブと対を形成する（ただし、プローブとの非特異的な結合に関する蛍光値の修正することを意図した、ＳＮＰの位置、またはこの近傍における中央部のミスマッチは除く）。
【１０４２】
個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。
【１０４３】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児ゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡにおけるＳＮＰがホモ接合である対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１０４４】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１０４５】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１０４６】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１０４７】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１０４８】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１０４９】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１０５０】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１０５１】
増幅対象領域が、ＨｕＳＮＰアッセイ法で使用されるプライマーに対するアニーリング配列を確実に含むことが重要である。ＨｕＳＮＰアレイの購入時に、各ＳＮＰを増幅するための個々のＳＮＰおよびプライマーを同定することができる。こうして得られた知見を元に、多重プライマーを、ＨｕＳＮＰアレイに使用するプライマーに対するアニーリング領域を含むように設計する。
【１０５２】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。増幅された個々の遺伝子座（各５μｌ）をひとまとめに混合する。
【１０５３】
ＨｕＳＮＰアッセイ法、洗浄、染色、およびスキャニング
プールされたＤＮＡを、ＨｕＳＮＰアレイを用いて、上述の手順でアッセイする。洗浄、染色、およびスキャニングの手順については既に述べた。
【１０５４】
個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１０５５】
定量
ＳＮＰがヘテロ接合である、個々の対立遺伝子のシグナルの強度を定量する。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１０５６】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られる比と同じはずである。
【１０５７】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１０５８】
この実施例では、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨｕＳＮＰアレイの使用について説明したが、アレイの使用を制限する意図はない。表ＸＸＩＶに記載されたＤＮＡアレイ、または表ＸＸＩＶまたは表ＸＸＶに記載された任意の企業から入手可能なＤＮＡアレイを含むがこれらに限定されない、任意のＤＮＡアレイを使用することができる。母親由来の血液中に胎児の染色体異常を検出するために、表ＸＸＩＶ、表ＸＸＶ、表ＸＸＶＩ、および表ＸＸＶＩＩに記載された製品またはサービスを含むがこれらに限定されない、任意の数の製品またはサービスを用いることで、カスタムＤＮＡアレイを作製することができる。
【１０５９】
（表ＸＸＩＶ）一部のハイブリダイゼーション用マイクロアレイフォーマットの特徴
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【１０６０】
（表ＸＸＶ）アレイ、またはアレイ製造関連の装置および機器を製造する企業
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【１０６１】
（表ＸＸＶＩ）アレイデータベースおよびオンラインツール
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【１０６２】
（表ＸＸＶＩＩ）ワールドワイドウェブ上のマイクロアレイデータベース
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【１０６３】
実施例１７
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離された血漿は、母親の鋳型ＤＮＡおよび胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例では、Ｍｏｔｏｒｏｌａ社とＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が共同開発したＣｏｄｅＬｉｎｋ  ＳＮＰ  Ｂｉｏａｒｒａｙ  ＳｙｓｔｅｍでＳＮＰを解析するが、他のマイクロアレイを使用することもできる。Ａｍｅｒｓｈａｍ社は、第６染色体上に位置するＰ４５０のさまざまな領域の遺伝子型決定用に設計されたＣｏｄｅＬｉｎｋ  Ｐ４５０  Ｂｉｏａｒｒａｙを販売している。
【１０６４】
しかし、Ａｍｅｒｓｈａｍ社は、第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、またはＹ染色体を含む、任意の染色体の領域の解析を可能とする、カスタムＣｏｄｅＬｉｎｋアレイを作製する可能性がある。
【１０６５】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１０６６】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えたり、細胞膜を安定化したり、または細胞膜を架橋したりする、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化する薬剤、細胞の溶解を抑える薬剤、または細胞膜を架橋する薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化する薬剤、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１０６７】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１０６８】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１０６９】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１０７０】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
ＣｏｄｅＬｉｎｋ  ＳＮＰ  Ｂｉｏａｒｒａｙ
ＣｏｄｅＬｉｎｋ  ＳＮＰは、広範囲に及ぶ（ｂｒｏａｄ−ｂａｓｅｄ）ＳＮＰの遺伝子型決定のためのバイオアレイシステムソリューションである。ＣｏｄｅＬｉｎｋ  ＳＮＰには、ＰＣＲによる増幅およびアンプリコンの断片化と、これに続く、表面ベースの酵素による対立遺伝子の識別、ならびにアレイベースのラベリングおよび検出を含む多重アッセイ法が含まれる。ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイ用の試薬は、２４回分の反応に十分な試薬を提供するＰ４５０  Ｒｅａｇｅｎｔキットに含まれている。
【１０７１】
ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）プラットフォームは、シラン処理済みで長鎖アルキル基で覆われたガラススライドを含む（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．７，ｅ３０，Ａｐｒｉｌ  １，２００２）。アクリルアミドの活性化エステルを含むプレポリマーはスライドに光結合される。活性化エステルは、Ｃ６−アミノ−オリゴヌクレオチドの結合部位となる。５’アミン終結末端（５’  Ａｍｉｎｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ）のオリゴヌクレオチドを、分注ロボット技術でポリマー上に蓄積させる。オリゴヌクレオチドは、フルオレセイン誘導体色素とともに分注する（これにより、分注後に全スライドのスキャニングが可能となる）。オリゴヌクレオチドの結合を可能とするために、スライドを湿潤チャンバー内に配置する。他の部位をブロックし、スライドを洗浄し、すすいで乾燥させてから、統合型ポリプロピレン製ハイブリダイゼーション用チャンバーに取り付ける。
【１０７２】
カスタムＣｏｄｅＬｉｎｋアレイは、対象染色体上に位置するＳＮＰを含むように合成することができる（どの染色体上に位置するＳＮＰも解析可能）。この実施例では、第２１染色体上に位置する２つのＳＮＰ（ＴＳＣ０２７１６２８、ＴＳＣ００６９８０５）、および第１３染色体上に位置する２つのＳＮＰ（ＴＳＣ０４６６９１７、ＴＳＣ１１７２５７６）を有する代表的なＣｏｄｅＬｉｎｋアレイを使用する。しかし、ＳＮＰに対する、１〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜３００、３０１〜４００、４０１〜５００、５０１〜６００、６０１〜７００、７０１〜８００、８０１〜９００、９０１〜１０００、１００１〜２０００、２００１〜３０００、３００１〜４０００、４００１〜５０００、５００１〜６０００、６００１〜７０００、７００１〜８０００、８００１〜９０００、９００１〜１０，０００、および１０，０００を超えるプローブを含むがこれらに限定されない、任意の数のプローブを有するＣｏｄｅＬｉｎｋアレイを使用することができる。使用されるＳＮＰは、１本の染色体上に、複数の染色体上に、または任意の組合わせの染色体上に位置する場合がある。
【１０７３】
ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイは、表面に結合した１本鎖プローブを含む（詳細なダイアグラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ５．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ＡＰＴＲＩＸ／ｕｐｐ０１０７７．ｎｓｆ／Ｃｏｎｔｅｎｔ／ｃｏｄｅｌｉｎｋ＿ｓｎｐで閲覧可能）。表面から最も遠いヌクレオチドが対象遺伝子座に対応する。
【１０７４】
例えば、第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０９４６６９１７は、シトシンヌクレオチドまたはグアニンヌクレオチドのいずれかの場合がある。２種類のプローブが作製されている（ＴＡＡＡＡＧおよびＴＡＡＡＣ）。これらのプローブは、表面から最も遠いグアニンまたはシトシンと結合する。プローブの配列は、長い場合もあれば短い場合もある。
【１０７５】
第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳ１１７２５７６におけるヌクレオチドは、チミジンまたはアデニンのいずれかの場合がある。２種類のプローブが作製されている：
2006521086.tif 000463
ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイ上のＳＮＰに対するプローブの長さは、同じか、または異なる場合がある。
【１０７６】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８におけるヌクレオチドは、アデニンまたはグアニンのいずれかの場合がある。２種類のプローブが作製されている：
2006521086.tif 000464
ＳＮＰに対するプローブは、ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに対する場合がある。
【１０７７】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５におけるヌクレオチドは、シトシンまたはチミジンのいずれかの場合がある。２種類のプローブが作製されている：
2006521086.tif 000465
【１０７８】
これら４つのＳＮＰに対する代表的なプローブについては上述した。しかし、これらのプローブは、配列の長さが長い場合もあれば短い場合もあり、またＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に対するように作製することができる。また、個々のＳＮＰに対する複数のプローブを使用することができる。配列が異なるか、または配列が同じ複数のプローブを同じＳＮＰに対して使用することができる。例えば、ＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５に対する１つのプローブは長さが１０ヌクレオチドの場合があり、またＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５に対する別のプローブは長さが２０ヌクレオチドの場合がある。あるいは、ＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５に対する１つのプローブはセンス鎖に対する場合があり、またＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５に対する第２のプローブはアンチセンス鎖に対する場合がある。
【１０７９】
ＰＣＲによる増幅
ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイが設計されたら、次の段階は増幅である。任意の増幅法が用いられる（好ましくはＰＣＲ）。第１３染色体上に位置する２つのＳＮＰ、および第２１染色体上に位置する２つのＳＮＰを増幅するためのプライマーを、ＳＮＰコンソーシアム（ｈｔｔｐ：／／ｓｎｐ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ）で提供される情報を元に設計する。当業者であれば、他の任意の対象ＳＮＰに対するプライマーを設計する方法を理解するであろう。
【１０８０】
第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０４６６９１７（Ｃ／Ｇ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000466
下流プライマー：
2006521086.tif 000467
【１０８１】
第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６（Ｔ／Ａ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000468
下流プライマー：
2006521086.tif 000469
【１０８２】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８（Ａ／Ｇ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000470
下流プライマー：
2006521086.tif 000471
【１０８３】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５（Ｃ／Ｔ）を、以下のプライマーを用いて増幅する：
上流プライマー：
2006521086.tif 000472
下流プライマー：
2006521086.tif 000473
【１０８４】
オリゴヌクレオチドプローブの長さは、５〜１０塩基、１１〜１５塩基、１６〜２０塩基、２１〜２５塩基、２６〜２９塩基、３０塩基、３１〜３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、および７５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さをとりうる。
【１０８５】
ＰＣＲ条件は、製造業者の示唆に従って設計すべきである。代表的なＰＣＲ条件を以下に示す。対象遺伝子座は、別個の反応チューブ内で増幅されるが、１回のＰＣＲ反応でまとめて増幅することもできる。特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲを行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化することができるが、この実施例では、４０ｎｇの鋳型のヒトゲノムＤＮＡと５μＭの各プライマーを使用する。４０サイクルのＰＣＲを行う。ＰＣＲ条件を以下に示す：
（１）９５℃で１５分および１５秒間；
（２）９５℃で３０秒間；
（４）５７℃で３０秒間；
（５）７２℃で３０秒間；
（６）工程２〜５を３２回繰返す；
（７）７２℃で５分間。
【１０８６】
ＰＣＲによる精製および断片化
ＰＣＲ産物を、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する手順で精製する。ＰＣＲによる精製の１つの形態を紹介する。Ｑｉａｇｅｎ社のＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８００６）を用いて、製造業者の指示書に従ってＰＣＲ産物を、ＰＣＲ反応の諸成分と分離する。
【１０８７】
精製後のＰＣＲ産物を、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する手順で断片化する。ＰＣＲ産物は、ＤＮａｓｅを含むがこれらに限定されない酵素を用いて、または超音波処理またはニードルによる剪断を含むがこれらに限定されない機械的な力で断片化することができる。
【１０８８】
ハイブリダイゼーション
精製後の断片状ＰＣＲ産物を、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する手順でＣｏｄｅＬｉｎｋアレイにハイブリダイズさせる。典型的なハイブリダイゼーション手順では、穏和な界面活性剤（ＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎ−１００など）、塩類（ＭｇＣｌ２など）、および緩衝液（ＴｒｉｓまたはＰＢＳなど）を含む溶液中で、標的プローブと試料ＤＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション反応は通常、軽く振盪しながら２５〜４４℃で８〜１６時間行う。ハイブリダイゼーション反応は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能なＳｈａｋｅｒキットを使用して実施することができる。
【１０８９】
あるいは、ハイブリダイゼーション用チャンバーを含む、Ｍｏｔｏｒｏｌａ社製の１２−スライドシェイカートレイを使用してハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション用チャンバーのポートは、１ｃｍのシーリングストリップ（Ｍｏｔｏｒｏｌａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で密閉し、またスライドを含むシェイカートレイを、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｉｎｎｏｖａ（商標）４０８０振盪インキュベーター内に装填する（ハイブリダイゼーション用チャンバーが上面を向くようにする）。スライドを、３０００  ｒ．ｐ．ｍ．で振盪しながら３７℃で１８時間インキュベートする。
【１０９０】
ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイを用いたハイブリダイゼーションには、特定の手順および解決法が存在する場合がある。ＣｏｄｅＬｉｎｋの代理人は、アレイの事前購入なしにはプロトコルを提供しないと思われる。
【１０９１】
対立遺伝子特異的な伸長
ハイブリダイゼーション後に、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する手順に従って伸長反応を行う。典型的な伸長反応には、ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、ポリメラーゼ、および塩類を含む緩衝液が必要である。使用するヌクレオチドおよびポリメラーゼの濃度は、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する濃度とすべきである。大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはｓｅｑｕｅｎａｓｅを含むがこれらに限定されない、任意のＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。好ましくは、使用するポリメラーゼは、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨するポリメラーゼである。
【１０９２】
洗浄、標識、および検出
伸長反応後に、好ましくはＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する溶液でアレイを洗浄する。典型的な洗浄液は、緩衝液中に界面活性剤（群）および塩類を含む。例えばアレイをＴＮＴ緩衝液（０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄することができる。アレイを、ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨する、室温、１０〜１６℃、１７〜２４℃、２５℃、２６〜３６℃、３７℃、３８〜４１℃、４２℃、４３〜５４℃、５５℃、または５５℃超を含むがこれらに限定されない温度で洗浄する。
【１０９３】
ＣｏｄｅＬｉｎｋのメーカーが推奨するプロトコルに従って、シグナルを発生させる。代表的なプロトコルを紹介する。ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）の１：５００倍の希釈物を用いて、室温で３０分間かけてシグナルを発生させる。過剰な色素は、ＴＮＴ緩衝液で４回（室温で各５分間）洗浄して除去する。シグナルの強度は、増幅用希釈緩衝液（ＰＥ／ＮＥＮ）に溶解したチラミド−ｃｙ３の１：２００倍の希釈物を用いることで強めることができる。
【１０９４】
スライドを脱イオン水で洗浄し、窒素銃（ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｇｕｎ）で乾燥させる。処理後のスライドを、Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘスキャナー（レーザーは６３５  ｎｍ、光電子増倍管の電圧は６００、スキャン解像度は１０μにそれぞれ設定）でスキャンする。スライドをスキャンし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能なＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）ＳＮＰソフトウェアキットで解析する。
【１０９５】
個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。
【１０９６】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ホモ接合のＳＮＰであることが判明した後に、これらのＳＮＰを、血漿から単離されたＤＮＡを対象に解析する。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰである、対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１０９７】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１０９８】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１０９９】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１１００】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１１０１】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１１０２】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１１０３】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１１０４】
増幅対象領域（胎児由来の対象遺伝子座のコピー数を増やすために実施される）が、ＣｏｄｅＬｉｎｋアッセイ法で使用されるプライマーに対するアニーリング配列を確実に含むことが重要である。ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイの購入時に、各ＳＮＰを増幅するための個々のＳＮＰおよびプライマーを同定することができる。こうして得られた知見を元に、多重プライマーを、ＨｕＳＮＰアレイに使用するプライマーに対するアニーリング領域を含むように設計する。
【１１０５】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。増幅された個々の遺伝子座（各５μｌ）をひとまとめに混合する。
【１１０６】
ＣｏｄｅＬｉｎｋアッセイ法、洗浄、染色、およびスキャニング
プールされたＤＮＡを、ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイを用いて、上述の手順でアッセイする。洗浄、染色、およびスキャニングの手順については既に述べた。
【１１０７】
個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１１０８】
定量
ＳＮＰがヘテロ接合である、個々の対立遺伝子のシグナルの強度を定量する。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１１０９】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られる比と同じはずである。
【１１１０】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１１１１】
この実施例では、ＣｏｄｅＬｉｎｋアレイの使用について説明したが、アレイの使用を制限する意図はない。表ＸＸＩＩＩに記載されたＤＮＡアレイ、または表ＸＸＩＶに記載された任意の企業から入手可能なＤＮＡアレイを含むがこれらに限定されない、任意のＤＮＡアレイを使用することができる。
【１１１２】
実施例１８
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例では、ＳＮＰを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能なＩｌｌｕｍｉｎａ社のＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）プラットフォームを用いて解析する。
【１１１３】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１１１４】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えるか、または細胞膜を安定化する、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１１１５】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１１１６】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１１１７】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１１１８】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）技術は、小型化された、極めて高処理能の遺伝的解析を可能とすると謳われている光ファイバーベースのアレイシステムを含む。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社の９６−バンドルのＳｅｎｔｒｉｘアレイ（商標）は、ほぼ１５０，０００個のＳＮＰの並行処理を可能とすると謳われている。
【１１１９】
ファイバー・バンドルは、ほぼ５０，０００本の個別の光伝達ファイバー鎖を含むように作られている。個々のファイバー・バンドルは、最初にバンドル内の各ファイバー鎖の末端においてマイクロウェルが化学的にエッチング処理され、これが１つのバンドルあたり最大５０，０００個の個別のマイクロウェルを作ることでアレイに変換される。
【１１２０】
別のプロセスでは、特定の種類の分子をビーズに固定することでセンサーを作製する（個々のビーズの直径は約３ミクロン）。ＳＮＰ解析では、１バッチにおいて個々のビーズに特定のＤＮＡ配列を結合させる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社は、同じ種類の数十万個の分子が個々のビーズをコーティングすると述べている。コーティングされたビーズのバッチを混合して、望ましい型のアレイに特異的なプールを形成させる。ＳＮＰ解析では、アレイのプールは、自身と、または既知のゲノムＤＮＡとクロスハイブリダイズしないＤＮＡ配列を使用することになっている。
【１１２１】
次に、自己集合性アレイを作製する。混合済みのビーズプールにバンドルを浸すことで、コーティングされたビーズは、バンドル中の各ファイバーの末端において、１ウェルあたり１個のビーズについて個別に自己集合することでアレイが作られる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＳＮＰ遺伝子型決定アレイでは、ビーズプールは最大１５００の配列を含み、これが５０，０００本のファイバーを含む各バンドル中で自己集合して、約３０倍の冗長度を有するアレイが作られる。
【１１２２】
ＢｅａｄＡｒｒａｙ社製のバンドルは、集合してマトリックス状のデバイスとなる。これは、より大きなアレイの個々のファイバー・バンドルが、標準化されたマイクロタイタープレートの１つのウェルに対応し、Ａｒｒａｙ  ｏｆ  Ａｒｒａｙｓ（商標）プラットフォームと呼ばれる。
【１１２３】
アレイの集合後に、個々のファイバーコア中に存在するビーズの種類を決定するために、デコーディングプロセスが用いられる。ＤＮＡ分子は、Ｏｌｉｇａｔｏｒ（商標）カスタムＤＮＡ合成技術で合成される。
【１１２４】
ＢｅａｄＡｒｒａｙ技術、およびＢｅａｄＡｒｒａｙ技術から生まれた他の技術を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ社のＳＮＰ遺伝子型決定サービスは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社の施設、またはＢｅａｄＡｒｒａｙ技術がライセンス供与された施設において提供される。
【１１２５】
母親由来のＤＮＡ試料を、ＳＮＰに対応するオリゴヌクレオチドプローブを含むＢｅａｄＡｒｒａｙで解析する。このオリゴヌクレオチドプローブは、ヒトの第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体を含む、任意の染色体上に位置するＳＮＰに対応する場合がある。ＢｅａｄＡｒｒａｙを解析して、母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰを同定する。次に、同定されたホモ接合のＳＮＰを、母親由来の血漿から単離されたＤＮＡを用いて解析する。
【１１２６】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡにおけるＳＮＰがホモ接合である対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性のある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１１２７】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１１２８】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１１２９】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１１３０】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１１３１】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１１３２】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１１３３】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１１３４】
増幅対象領域が、ＢｅａｄＡｒｒａｙにおけるオリゴヌクレオチドプローブに対するアニーリング配列を確実に含むことが重要である。ＢｅａｄＡｒｒａｙサービス購入時に、各ＳＮＰおよび各々のＳＮＰ解析に用いられるプライマーを確認する。こうして得られた知見を元に、多重プライマーを、ＢｅａｄＡｒｒａｙにおけるプライマーに対するアニーリング領域を含むように設計する。
【１１３５】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。増幅された個々の遺伝子座（各５μｌ）をひとまとめに混合する。
【１１３６】
ＢｅａｄＡｒｒａｙ技術
プールされたＤＮＡを、ＢｅａｄＡｒｒａｙを用いて、上述の手順でアッセイする。個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１１３７】
定量
ＳＮＰがヘテロ接合である、個々の対立遺伝子のシグナルの強度を定量する。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１１３８】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られる比と同じはずである。
【１１３９】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１１４０】
この実施例では、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＢｅａｄＡｒｒａｙ技術の使用について説明したが、アレイの使用を制限する意図はない。表ＸＸＩＩＩに記載されたＤＮＡアレイ、または表ＸＸＩＶに記載されたいずれかの企業から入手可能なＤＮＡアレイを含むがこれらに限定されない、任意のＤＮＡアレイを使用することができる。
【１１４１】
実施例１９
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例では、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法を用いるＳｅｑｕｅｎｏｍ社のＭａｓｓＡｒｒａｙ（商標）システムを用いてＳＮＰを解析する。
【１１４２】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１１４３】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えるか、または細胞膜を安定化する、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１１４４】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１１４５】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１１４６】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１１４７】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
標的ＳＮＰ同定：ｈＭＣ法
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のｈＭＣ法では、遺伝子型の決定にヌクレオチド塩基に特異的な切断を用いる。切断された断片をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで測定し、任意の特定の配列を対象に、各断片の質量を元に、特徴的なピークシグナルを得る。
【１１４８】
プライマー設計
２つのＰＣＲ反応（フォワード反応とリバース反応）には４種類のプライマーが必要である。ＰＣＲのアンプリコンについて推奨される大きさの範囲は３００〜７００塩基対である。プライマーは、インビトロ転写に適切な産物を得るために、Ｔ−７プロモーターのタグが付いたフォワードまたはリバースのプライマーを含む。不完全な終結を防ぐために８塩基の挿入を含める。Ｔ−７プロモーターを欠くプライマーは、プライマーのバランスをとるために１０−ｍｅｒのタグを含む。
【１１４９】
１つのＳＮＰに対するプライマーを以下に示す。第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６（Ｔ／Ａ）を、フォワード反応について、以下のプライマーを用いて増幅する：
フォワード反応：
上流プライマー：
2006521086.tif 000474
下流プライマー：
2006521086.tif 000475
リバース反応：
上流プライマー：
2006521086.tif 000476
下流プライマー：
2006521086.tif 000477
Ｔ−７プロモーターの配列はイタリックで示し、８塩基の挿入には下線を付し、１０塩基のバランス用配列には二重線を付してあり、また遺伝子特異的な配列には何も印をつけていない。
【１１５０】
ＰＣＲによる増幅
５μｌの容量で、３８４−マイクロリットルフォーマットを用いて５ナノグラムのＤＮＡを増幅する。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９４℃で１５分間；
（２）９４℃で２０秒間；
（３）６２℃で３０秒間；
（４）７２℃で１分間；
（５）工程２〜４を４４回繰返す；ならびに
（６）７２℃で３分間。
【１１５１】
脱リン酸化
シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）（２μｌ）を各５μｌのＰＣＲ反応物に添加し、ＰＣＲ反応に由来する、取り込まれなかったｄＮＴＰを脱リン酸化する。プレートは３７℃で２０分間インキュベートする。次にプレートを８５℃で５分間インキュベートする。
【１１５２】
インビトロ転写
個々の転写反応には、２μｌの転写カクテル、および２μｌのＰＣＲ／ＳＡＰ試料が必要である。２μｌの転写カクテル、および２μｌのＰＣＲ／ＳＡＰ試料を、新しいマイクロタイタープレートに添加する。このプレートを３７℃で２時間インキュベートする。このプロトコルに関する詳細な情報については、全体が参照として本明細書に組み入れられる、「ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ  ＳＮＰ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」の「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」の章を参照されたい。
【１１５３】
ＲＮａｓｅ  Ａによる切断
ＲＮａｓｅ  Ａカクテル（２．５μｌ）を、各反応物（Ｔ切断およびＣ切断）に添加する。プレートを３７℃で１時間インキュベートする。
【１１５４】
ＳＮＰ部位におけるヌクレオチドに応じて、さまざまな重量の多様な断片が生じる。例えば、第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６の周囲のＤＮＡ配列は以下の通りである：
2006521086.tif 000478
2006521086.tif 000479
【１１５５】
ＰＣＲ、インビトロ転写、および塩基特異的な切断後に、各対立遺伝子について、以下の断片が生じる：
2006521086.tif 000480
【１１５６】
ＡＴＣ断片およびＡＡＣ断片に関しては、ＴとＡ間の重量の差を用いて、ＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６における遺伝子型を決定する。同様に、断片ＡＧＴＴＡおよび断片ＡＧＡＴＡにおけるＴとＡ間の重量の差を用いて、ＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６における遺伝子型を決定する。
【１１５７】
試料の条件設定
２回蒸留した水（２０μｌ）を、３８４−ウェルプレートの各試料に添加する。各ウェルにＣｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ（６ｍｇ）を添加する。プレートを１０分間回転後に３２００×ｇで遠心する。水は常にＣｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎの前に添加することが推奨される。
【１１５８】
試料の輸送
ｈＭＣ反応産物（１０〜１５μｌ）を、３８４エレメントのＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）に分注する。詳細な情報については、「ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ  ＳＮＰ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」の「Ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｎｔｏ  ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰｓ」の章を参照されたい。
【１１５９】
試料の解析
４通りの切断反応で生じるスペクトルを、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）システムを用いて得る。詳細な指示については、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰＳ（登録商標）からのスペクトルの測定に関する指示について記載されている「ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＲＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」の「Ａｃｑｕｉｒｉｎｇ  Ｓｐｅｃｔｒａ」の章を参照されたい。
【１１６０】
ＳＮＰの解析
得られた結果をＳＮＰ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで解析する。詳細な指示については、ＳＮＰ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアの使用に関する指示について記載されている「ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＲＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ」の「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＳＮＰｓ」の章を参照されたい。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ手順に有用な成分には、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（品番００４５００）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＲＴ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン１．２、品番１１４３４）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）ＳＮＰ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔａｒｔｅｒキット（品番１００２７）、およびＬｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｅｒ  ＳＮＰ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｓ（品番  １１４３３）が含まれる。
【１１６１】
ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰアレイを使用して、ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰアレイの購入後に入手可能な、以下の製造業者の推奨するプロトコルおよび手順に従い、母親由来のＤＮＡの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰを用いて、母親の血漿から単離されたＤＮＡを解析する。
【１１６２】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡにおけるＳＮＰがホモ接合である対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１１６３】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１１６４】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１１６５】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１１６６】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１１６７】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１１６８】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１１６９】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１１７０】
増幅対象領域が、標的ＳＮＰ同定法であるｈＭＣ法において、ＰＣＲ用プライマーに対するアニーリング配列を確実に含むことが重要である。
【１１７１】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。増幅された個々の遺伝子座（各５μｌ）をひとまとめに混合する。
【１１７２】
標的ＳＮＰ同定：ｈＭＣ法
プールされたＤＮＡを、ｈＭＣ法で上記の手順でアッセイする。個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。しかし、望ましいならば、他の染色体上に位置するＳＮＰを定量することもできる。
【１１７３】
定量
各ピークの強度を定量する（各ピークは、特定の分子量を有するＤＮＡ断片に対応する）。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。
【１１７４】
胎児ゲノム上のＳＮＰ  ＸにおけるＧヌクレオチドの存在のために、分子量が異なるいくつかの断片が存在する。Ａヌクレオチドを有するピークの強度を定量し、またＧヌクレオチドを有する断片に対応するピークの強度を定量する。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１１７５】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られる比と同じはずである。
【１１７６】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１１７７】
この実施例では、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のｈＭＣ法の使用について説明したが、他の質量分析法の使用を制限する意図はない。
【１１７８】
実施例２０
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例では、ＳＮＰを、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のＭａｓｓＡｒｒａｙ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（商標）（ｈＭＥ）アッセイ法で解析する。
【１１７９】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１１８０】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えるか、または細胞膜を安定化する、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１１８１】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１１８２】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１１８３】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１１８４】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（商標）（ｈＭＥ）アッセイ法
Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（商標）（ｈＭＥ）アッセイ法では、ビーズ不使用で標識不要のプライマー伸長法で遺伝子型を決定する。個々のプライマー産物は、関連づけられた遺伝子型の、質量分析による正確な同定を可能とする固有の分子量を有する。
【１１８５】
鋳型の増幅
単離された母親由来のＤＮＡ（２．５ｎｇ）を、３８４−マイクロタイタープレートフォーマットを用いて、５μｌ容量中で増幅する。任意の数のＳＮＰを、１回の反応か、または複数回の反応のいずれかで増幅することができる。第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８（Ａ／Ｇ）の増幅時に使用される、代表的なプライマーを以下に示す：
上流プライマー：
2006521086.tif 000481
下流プライマー：
2006521086.tif 000482
これらのプライマーは、ヌクレオチド配列が長い場合も短い場合もある。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイ法のメーカーが推奨するＰＣＲ条件を以下に示す。代表的なＰＣＲ条件を以下に示す：
（１）９５℃で１５分および１５秒間；
（２）９５℃で３０秒間；
（４）５７℃で３０秒間；
（５）７２℃で３０秒間；
（６）工程２〜５を３２回繰返す；
（７）７２℃で５分間。
【１１８６】
脱リン酸化
北極シュリンプアルカリホスファターゼを試料に添加し、３７℃で２０分間インキュベートする。この段階は、任意の残存ヌクレオチドを脱リン酸化して、同ヌクレオチドの後の取り込み、およびＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイ法との干渉を防ぐために行う。次に試料を８５℃でインキュベートし、熱に不安定なＳＡＰを不活性化する。
【１１８７】
ｈＭＥ反応
ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマーを、多型部位の近傍にアニールするように設計し、また多型部位の両方の対立遺伝子が同定されるように設計する。ＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８の場合、代表的なＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマーは
2006521086.tif 000483
である。
ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマーの長さは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイ法のメーカーが提供する指示書に従って決定する。
【１１８８】
ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）のカクテル混合物を、初期プライマー伸長反応物に添加する。当初のＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマーと比較して、一般に１〜４塩基長い対立遺伝子特異的なプライマー産物が生じる。
【１１８９】
ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤプライマーは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイ法のメーカーが推奨する条件に従って、多型部位の極めて近傍にハイブリダイズする。ヌクレオチド混合物は、可能な全てのＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ産物に関する重量の差が最大とするように選択する。適切なｄＮＴＰは、１つのｄｄＮＴＰが取り込まれて反応が終結するまで取り込まれる。ｈＭＥアッセイ法の全段階について、製造業者のプロトコルに従う。
【１１９０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８に関する、代表的な反応産物を以下に示す：
プライマー伸長前のＡ対立遺伝子
2006521086.tif 000484
ＳＮＰ部位を太字で示す。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰとのインキュベーション後に、以下の産物が生じる：
プライマー伸長後のＡ対立遺伝子
2006521086.tif 000485
ｄｄＡＴＰがプライマーに取り込まれる。標識ｄｄＮＴＰまたは非標識ｄｄＮＴＰのいずれかを使用することができる。黒印は、非標識ｄｄＡＴＰを意味する。取り込み反応の後に、２４−ｍｅｒのプライマーが生じる。
プライマー伸長前のＧ対立遺伝子
2006521086.tif 000486
ＳＮＰ部位を太字で示す。ＤＮＡポリメラーゼ、ｄｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰとのインキュベーション後に、以下の産物が生じる：
Ｇプライマー伸長後の対立遺伝子
2006521086.tif 000487
取り込み反応の後に、２５−ｍｅｒのプライマーが生じる。Ａ対立遺伝子を有する反応産物（２４−ｍｅｒ）と、Ｇ対立遺伝子を有する反応産物（２５−ｍｅｒ）間の分子量の差を、対象遺伝子座の遺伝子型の決定に用いる。
【１１９１】
試料の条件設定
ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ（商標）樹脂を反応物に添加して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析に干渉する外来性の塩を除去する。
【１１９２】
試料の輸送
１５ｎｌの試料を３８４−マイクロタイタープレートから移し、３８４  ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（商標）マイクロアレイのパッドにスポットする。
【１１９３】
試料の解析
ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（商標）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ内に据え、伸長産物の重量を測定する。決定後に、遺伝子型がＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲ（商標）ＲＴソフトウェアでリアルタイムで判定される。母親由来のＤＮＡにおけるＳＮＰがホモ接合であることを同定し、血漿から単離されたＤＮＡを対象に解析を行う。
【１１９４】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰである対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１１９５】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１１９６】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１１９７】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１１９８】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１１９９】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１２００】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１２０１】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１２０２】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。増幅された個々の遺伝子座（各５μｌ）をひとまとめに混合する。
【１２０３】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤアッセイ法
プールされたＤＮＡを、ｈＭＥアッセイ法で、上述の手順でアッセイする。個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１２０４】
定量
各ピークの強度を定量する（各ピークは、特定の分子量を有するＤＮＡ断片に対応する）。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。
【１２０５】
胎児のゲノム上のＳＮＰ  ＸにおけるＧヌクレオチドの存在のために、分子量が異なるいくつかの断片が存在する。Ａヌクレオチドを有するピークの強度を定量し、またＧヌクレオチドを有する断片に対応するピークの強度を定量する。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１２０６】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られる比と同じはずである。
【１２０７】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１２０８】
この実施例では、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社のＭａｓｓＡＲＲＡＹ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（ｈＭＥ）アッセイ法の使用について説明したが、分子量に基づいて分子を区別する手法の使用を制限する意図はない。
【１２０９】
実施例２１
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例ではＳＮＰを、Ｏｒｃｈｉｄ社のＳＮＰ−ＩＴ（商標）アッセイ法で解析する。しかし、プライマー伸長に基づく他のＳＮＰ検出法を使用することもできる。
【１２１０】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１２１１】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えるか、または細胞膜を安定化する、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１２１２】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１２１３】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１２１４】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１２１５】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
ＳＮＰ−ＩＴ（商標）アッセイ法
ＳＮＰ−ＩＴアッセイ法は、１塩基プライマー伸長に基づく。ＳＮＰ−ＩＴアッセイ法に先立ち、対象ＳＮＰを含むＰＣＲ産物を、１つの非修飾プライマーと１つのホスホロチオレート修飾プライマーを用いて調製する。次にＰＣＲ産物をエキソヌクレアーゼで処理して１本鎖とし、この１本鎖ＤＮＡを、９６ウェルマイクロタイタープレートの表面上に固定されたＳＮＰ−ＩＴオリゴヌクレオチドにアニールさせる。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼと標識ターミネーターの添加によって１塩基伸長が生じる。取り込まれた塩基を、標識に特異的な抗体を用いて検出した後に比色検出を行う。データ解析は、視覚的に、または吸光プレートリーダーを使用して行うことができる。
【１２１６】
プライマー設計
個々の対象遺伝子座に関して、ＳＮＰ−ＩＴ（商標）アッセイ法では３種類のプライマーが必要である。プライマーは、１００〜５０塩基対のアンプリコンを生じるように設計する。ＳＮＰ部位のすぐ上流にアニールするように設計されるＳＮＰ−ＩＴプライマーの配列が、上の鎖と下の鎖の間から選べる最良の配列である。ＳＮＰ−ＩＴプライマーの配列は、自己ハイブリダイゼーション、およびアンプリコン中の他の部位とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように設計する。また、ＳＮＰ−ＩＴプライマーには、自己プライミングを防ぐために修飾塩基を含ませる場合がある。プライマーの長さは、ＳＮＰ−ＩＴアッセイ法のメーカーに従って決定する。
【１２１７】
第２１染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５の増幅および遺伝子型決定に用いられる代表的なプライマーを以下に示す：
上流プライマー：
2006521086.tif 000488
下流プライマー：
2006521086.tif 000489
ＳＮＰ−ＩＴプライマー：
2006521086.tif 000490
【１２１８】
上流プライマーは修飾されておらず、また下流プライマーは、ホスホロチオレートで修飾されている。
【１２１９】
ＳＮＰ−ＩＴプレートのコーティング
ＳＮＰ−ＩＴプライマーを、空の９６ウェルプレートのウェルをコーティングするために添加する。この反応物は通常、一晩、製造業者のプロトコルおよび手順に従ってインキュベートする。
【１２２０】
ＰＣＲ
鋳型ＤＮＡ（１５ｎｇ）を、エッペンドルフチューブを含むがこれらに限定されない反応容器中、またはマイクロタイタープレートのウェルのいずれかで増幅する。ＰＣＲ反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２１】
エキソヌクレアーゼ
ＰＣＲ産物をエキソヌクレアーゼで処理して、非修飾鎖を分解する。
【１２２２】
保護されたホスホロチオレート標識鎖をＳＮＰ−ＩＴアッセイ法に使用する。エキソヌクレアーゼ反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２３】
アニーリング
１本鎖ＰＣＲ産物をＳＮＰ−ＩＴ  プレートに移し、ＳＮＰ−ＩＴプライマーとのハイブリッドを形成させる。アニーリング反応は、典型的には１時間かかる。アニーリング反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２４】
ＳＮＰ−ＩＴ反応
ＤＮＡポリメラーゼ、フルオレセインまたはビオチンのいずれかで標識された２種類の終結用ヌクレオチド、および２種類の非標識ターミネーターを含む伸長用試薬を、アニールした鋳型とプライマーの複合体を含むＳＮＰ−ＩＴのウェルに添加する。ＳＮＰ  ＴＳＣ００６９０８５の場合、ｄｄＣＴＰをフルオレセインで標識し、またｄｄＴＴＰをビオチンで標識し、また非標識ターミネーターはｄｄＡＴＰおよびｄｄＧＴＰである。伸長反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２５】
ＳＮＰ−ＩＴプライマーの１塩基伸長によって、ＳＮＰ特異的な塩基が取り込まれる。取り込まれなかった材料を除去するために、マニュアルで、またはプレート洗浄機でプライマーを洗浄する。洗浄反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２６】
検出
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で標識された抗フルオレセインをプレートに添加し、取り込まれた任意のフルオレセイン標識ターミネーターに結合させる。ラベリング反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２７】
プレートを洗浄後に、ｐＮＰＰを検出用基質として用いて発色させる。黄色を呈したｐＮＰＰ基質を検出するために、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取り後に、洗浄段階を行ってｐＮＰＰの検出用試薬を除去する。発色および洗浄段階は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２８】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたストレプトアビジンをプレートに添加し、任意の取り込まれたビオチン標識ターミネーターに結合させる。ラベリング反応は、製造業者のプロトコルおよび手順に従って行う。
【１２２９】
洗浄後に、ＴＭＢを検出用基質として用いて発色させる。青色を呈したＴＭＢ基質を検出するために、６２０ｎｍにおける吸光度を読み取る。
【１２３０】
解析
吸光度をプロットして、遺伝子型の判定元となるスキャッチャードプロットを得る。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰを同定し、母親の血漿から単離されたＤＮＡを対象に解析を行う。
【１２３１】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰである対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１２３２】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１２３３】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１２３４】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１２３５】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１２３６】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１２３７】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１２３８】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１２３９】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。増幅された個々の遺伝子座（各５μｌ）をひとまとめに混合する。
【１２４０】
ＳＮＰ−ＩＴアッセイ法
プールされたＤＮＡを、ＳＮＰ−ＩＴアッセイ法で上述の手順でアッセイする。個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１２４１】
定量
各対立遺伝子の蛍光強度を定量する。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。
【１２４２】
Ａヌクレオチドを有する対立遺伝子の強度を定量し、またＧヌクレオチドを有する対立遺伝子の強度を定量する。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１２４３】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られる比と同じはずである。
【１２４４】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１２４５】
この実施例では、ターミネーターヌクレオチドを、さまざまな化学成分で標識する。しかし、本明細書に記載された方法（実施例６参照）で、１種類の標識ターミネーターを用いて両方の対立遺伝子の検出を可能とするようにＳＮＰ−ＩＴアッセイ法を修飾することができる。
【１２４６】
この実施例では、Ｏｒｃｈｉｄ社のＳＮＰ−ＩＴアッセイ法の使用について説明したが、プライマー伸長に依存する他の手法の使用を制限する意図はない。Ｏｒｃｈｉｄ社のＳＮＰｓｔｒｅａｍ  ２５Ｋ、ならびにＧｅｔＧｅｎｏｓ（商標）、ＱＣｒｅｖｉｅｗ（商標）、およびＶａｌｉｄＧｅｎｏｓ（商標）を含むがこれらに限定されない、付属ソフトウェアも、母親由来の血液中に含まれる染色体異常の存在の検出に使用することができる。これらの製品の追加情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｃｈｉｄｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｓｇ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｎｐｓｔｒｅａｍ．ａｓｐで得られる。
【１２４７】
実施例２２
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例では、ＳＮＰを、ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ法で解析する。しかし、蛍光を発生する５’ヌクレアーゼアッセイ法に依存する他の方法を使用することもできる。
【１２４８】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１２４９】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えるか、または細胞膜を安定化する、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１２５０】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１２５１】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１２５２】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１２５３】
母由来親のＳＮＰがホモ接合であることの同定
ＴａｑＭａｎアッセイ法
ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社は、その配列検出システム製品ラインに、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）７７００配列検出システム、およびＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列検出システムの２つの装置を揃えている。このようなリアルタイムシステムは、ＰＣＲ産物を検出可能であるとされている。というのは、ＰＣＲ中にＰＣＲ産物が蓄積するために、試料中のＤＮＡの定量が可能となるからである。
【１２５４】
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００およびＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００の検出システムに使用可能な１つの化学的手法は、蛍光を発生することで特定のＰＣＲ産物の検出を可能とするプローブを用いる、蛍光発生５’ヌクレアーゼアッセイ法、またはＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ法である。レポーターを５’末端に、またクエンチャーを３’末端に組み入れた、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社が特許を有する蛍光発生性プローブの設計は、ＴａｑＭａｎプローブの設計の一助となった。
【１２５５】
ＡＢＩ  ７７００装置を使用したＰＣＲによる定量の基礎は、２種類の異なる蛍光色素で標識された短い（２０〜２５塩基）のオリゴデオキシヌクレオチドを含むＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブと呼ばれる二重標識蛍光発生性オリゴヌクレオチドプローブを用いてＰＣＲ産物の蓄積を連続的に測定することにある。５’末端にはレポーター色素が位置し、また３’末端にはクエンチング色素が位置する。このオリゴヌクレオチドプローブの配列は、ＰＣＲアンプリコン中に存在する内部配列に相同である。プローブが完全な場合、２つのフルオロフォア間にエネルギー移動が生じ、またレポーターからの発光がクエンチャーによって消失する（Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，４：３５７−３６２，１９９５ａ；  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５３８，８４８；  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７２３，５９１）。
【１２５６】
ＰＣＲの伸長期に、プローブがＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されると、オリゴヌクレオチド−クエンチャーからレポーターが放出され、レポーターの発光強度が上昇する。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００は、９６ウェルのＰＣＲトレイフォーマットで各ウェルにつながる光ファイバーシステムを用いる。レーザー光源が各ウェルを励起し、ＣＣＤカメラが、各ウェルの蛍光のスペクトルおよび強度を測定することで、ＰＣＲによる増幅中にリアルタイムデータが得られる。ＡＢＩ  ７７００  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって、レポーター色素およびクエンチャー色素の蛍光強度が判明し、増幅期間中における、標準化されたレポーター発光強度の上昇が算出される。次に、得られた結果を、サイクル数で代表される時間に対してプロットし、ＰＣＲによる増幅の連続的な尺度を得る。各ＰＣＲ反応において初期標的の正確な定量を行うためには、産物蓄積の初期対数期中のある時点で増幅プロットを調べる。これは、バックグラウンドを上回る蛍光閾値を割り当て、各試料の増幅プロットが閾値に達する時点（閾値サイクル数すなわちＣＴとして定義）を決定することで達成される。閾値サイクル数の差を用いて、既に述べたように、各チューブに含まれるＰＣＲ標的の相対量を定量する。
【１２５７】
ＳＮＰ解析では、ＳＮＰの各対立遺伝子に対するＴａｑＭａｎプローブを設計することができる。ＳＮＰにおける各対立遺伝子の有無の判定には、レポーターの発光を用いる。例えば、アデニンまたはグアニンのいずれかの可能性があるＳＮＰの場合、アデニンに対する相補的ヌクレオチドでＴａｑＭａｎプローブを設計し、またグアニンに対する相補的ヌクレオチドで別のＴａｑＭａｎプローブを設計する。これら２つのＴａｑＭａｎプローブを別個の反応容器で用いることで、アデニン対立遺伝子の量、およびグアニン対立遺伝子の量を計算することができる。
【１２５８】
プライマーおよびプローブ設計
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェアを用いて、プライマーおよびプローブを設計することができる。最初にプローブを設計し、次に、重複することなくプローブに可能な限り近いプライマーを設計する。５０〜１５０塩基対のアンプリコンが強く推奨される。
【１２５９】
プライマーおよびプローブは、製造業者の推奨に従って設計すべきである。プライマーとプローブの双方について、Ｇ／Ｃは２０〜８０％の範囲とする。プライマーおよびプローブは、同一のヌクレオチドの連続を避けるように設計する。これはグアニンについて特にあてはまり、４つまたはこれを上回ってＧが連続することは避けるべきである。
【１２６０】
プローブの場合、ＴＭを約６８〜７０℃とし、また５’末端にグアニンが来ないように設計する。またプローブは、Ｇ塩基よりＣ残基の数が多くなるように設計する。
【１２６１】
プライマーの場合、ＴＭを約５８〜６０℃とし、また３’末端における５個のヌクレオチドの中にＧ塩基および／またはＣ塩基が２個を越えないようにプライマーを設計する。
【１２６２】
例えば、第２１染色体上に存在するＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８（Ａ／Ｇ）に対する代表的なプライマーおよびプローブを以下に示す：
フォワードプライマー（ＴＭ＝６０℃）：
2006521086.tif 000491
リバースプライマー（ＴＭ＝５８℃）：
2006521086.tif 000492
ＴａｑＭａｎプローブＡ対立遺伝子（ＴＭ＝６８℃；太字はＳＮＰにおける可変ヌクレオチドを示す）：
2006521086.tif 000493
ＴａｑＭａｎプローブＧ対立遺伝子（ＴＭ＝７０℃；太字はＳＮＰにおける可変ヌクレオチドを示す）：
2006521086.tif 000494
ＳＮＰの周辺配列に関する情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｎｐ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇで得られる。フォワードおよびリバースのプライマーの濃度を独立に変えることによって、アッセイ法の最適条件をもたらす濃度を決めることができる。５０  ｎＭ〜９００  ｎＭの範囲のプライマー濃度を検討する。
【１２６３】
仮に、母親由来のＤＮＡが１本の対立遺伝子についてホモ接合（例えばアデニン）であるならば、グアニンヌクレオチドに特異的なＴａｑＭａｎプローブを含む試料では、レポーターはクエンチャーと分離しない。なぜなら、ＴａｑＭａｎプローブは鋳型ＤＮＡとアニールしないからである。しかし、仮に、母親由来のＤＮＡがホモ接合であるならば、レポーターはクエンチャーから、グアニン対立遺伝子に特異的なＴａｑＭａｎプローブを含む試料と、アデニン対立遺伝子に特異的なＴａｑＭａｎプローブを含む試料の両方において分離する。
【１２６４】
試薬溶液
ＴａｑＭａｎアッセイ法に推奨されるポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼである。ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼの使用は、非特異的な産物の形成の量を減らすと言われている。ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）Ｕｒａｃｉｌ  ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）およびｄＵＴＰが加えられると、ＰＣＲの持ち越し汚染に対して保護される。ＰＣＲ反応に関しては、ＴａｑＭａｎアッセイ法の最適なパフォーマンスを可能とするように調製された試薬であるＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒミックスが製造業者によって推奨されている。
【１２６５】
ＴａｑＭａｎ反応緩衝液は、５．５ｍＭのＭｇＣｌ２、各２００  ｎＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４００  ｎＭのｄＵＴＰ、０．５  ＵのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および１．２５  ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを含む。
【１２６６】
熱サイクリングのパラメータ
ＰＣＲによる増幅、およびプライマー−プローブの全ての組合わせの検出をＡＢＩ  ７７００配列検出システムで行う。ＴａｑＭａｎアッセイ法に関して推奨されているサイクリングパラメータを以下に示す：
（１）５０℃で２分間；
（２）９５℃で１０分間；
（３）９５℃で１５秒間；
（４）６０℃で１分間；
（５）工程３〜４を４０サイクル繰返す。
【１２６７】
ＴａｑＭａｎによる定量
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８にアデニンヌクレオチドを、またＳＮＰ  ＴＳＣ０２７１６２８にグアニンヌクレオチドを６桁の範囲（５×１００〜５×１０６コピー）で含む既知量のＤＮＡから外部標準が生成する。検出の閾値は、ＰＣＲサイクル３〜１５に関して算出された平均ベースライン発光の標準偏差の１０倍に設定する（Ｓｔｕｌｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６７，Ｎｏ．６，２７８１−２７８９，２００１）。閾値サイクルをＤＮＡ濃度に関連づけた標準曲線を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００ソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可）によって作成する。
【１２６８】
母親由来のＤＮＡのＳＮＰがホモ接合であることを同定し、血漿から単離されたＤＮＡ試料を対象に解析を行う。
【１２６９】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰである、対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１２７０】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１２７１】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１２７２】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１２７３】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１２７４】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１２７５】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１２７６】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１２７７】
増幅対象領域が、ＢｅａｄＡｒｒａｙで使用されるオリゴヌクレオチドプローブに対するアニーリング配列を確実に含むことが重要である。ＢｅａｄＡｒｒａｙサービスの購入時に、各ＳＮＰを解析するための個々のＳＮＰおよびプライマーを同定する。こうして得られた知見を元に、多重プライマーを、ＢｅａｄＡｒｒａｙに使用されるプライマーに対するアニーリング領域を含むように設計する。
【１２７８】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。
【１２７９】
ＴａｑＭａｎアッセイ法
増幅されたＤＮＡをＴａｑＭａｎアッセイ法で、上述の手順でアッセイする。個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１２８０】
定量
ＴａｑＭａｎ対立遺伝子に特異的なプローブの蛍光強度を定量する。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。
【１２８１】
Ａヌクレオチドを有する対立遺伝子の蛍光強度を定量し、またＧヌクレオチドを有する対立遺伝子の強度を定量する。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１２８２】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られた比と同じはずである。
【１２８３】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【１２８４】
この実施例は、ＴａｑＭａｎアッセイ法の使用について説明したが、５’ヌクレアーゼ活性を利用する他の手法の使用を制限する意図はない。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素を、母親および胎児由来のＤＮＡの配列を決定するために、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム、およびＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）５７００配列検出システムで使用することもできる。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素アッセイ法で、母親由来の血液中における胎児の染色体異常の存在を検出することができる。
【１２８５】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素は、ＰＣＲ中における産物の蓄積の検出を可能とする特異性の高い２本鎖ＤＮＡ結合色素である。しかし、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素アッセイ法は、非特異的な反応産物を含む全ての２本鎖ＤＮＡを検出してしまう。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素アッセイ法の利点は、プローブを必要としない点である。
【１２８６】
ＴａｑＭａｎアッセイ法と、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素アッセイ法の両方について、同じプライマー設計パラメータが推奨されている（実施例２１の「プライマー設計」のセクション参照）。ＴａｑＭａｎアッセイ法で推奨されるプライマー最適化パラメータも、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ２本鎖色素アッセイ法に従うべきである。また、鋳型対照を、さまざまな濃度のプライマーとともに流すべきでもない。
【１２８７】
またＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社は、Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（商標）ＳＮＰ遺伝子型決定用製品、およびＡｓｓａｓｙｓ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ（商標）Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＳＮＰ遺伝子型決定用製品を含むがこれらに限定されない、母親および胎児のＤＮＡの配列決定のために使用可能な他の製品を販売している。
【１２８８】
以上、本発明について詳細に説明したが、本発明が、本発明の意図もしくは範囲、または本発明の任意の態様に影響を及ぼすことなく、広範囲かつ同等の範囲の条件やパラメータなどを用いて実施可能であることを、当業者であれば理解するであろう。
【１２８９】
本明細書で引用された全ての文書、例えば科学文献、特許、および特許出願は、個々の文書が具体的および個別的に、全体が参照として本明細書に組み入れられるのと同じように、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。引用された文書は、該当文書の最初のページのみが示されているが、文書全体は、該当文書の残りのページを含むことが意図される。
【１２９０】
実施例２３
母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離された鋳型ＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を判定する。妊娠女性の血液から単離される血漿は、母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む。母親由来のＤＮＡおよび血漿由来のＤＮＡを解析するためには、任意の数のＳＮＰ検出法を使用することができる。この実施例では、ＴｈｉｒｄＷａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の核酸検出用のＩｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ法でＳＮＰを解析する。しかし、正しい配列の存在下で形成される生物学的構造を利用および定量する、他の手法を使用することもできる。
【１２９１】
血液試料の採取
ＩＲＢによって承認された試験に準じて、インフォームド・コンセントを得た後に、妊娠女性から血液試料を採取する。血液を、９ｍｌのＥＤＴＡ  Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）に採取し、ホルムアルデヒド（４％  ｗ／ｖ）を含む０．２２５ｍｌの１０％中性緩衝液を各チューブに添加し、各チューブを穏やかに逆さにする。チューブは、処理の準備が整うまで４℃で保存する。
【１２９２】
ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＢＳＯＣＯＥＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＤＳＴ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞の溶解を抑えるか、または細胞膜を安定化する、任意の数の薬剤をチューブに添加することができる。細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を任意の濃度で添加することができる。好ましい態様では、細胞膜を安定化するか、または細胞の溶解を抑える薬剤を、後の反応を妨げたり阻害したりしない濃度で添加する。
【１２９３】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【１２９４】
血漿由来および母親由来の細胞の単離
血液は、処理を行うまで４℃で保存する。チューブを、制動力をゼロに設定した遠心器で、１０００ｒｐｍで１０分間遠心する。チューブを１０００ｒｐｍで１０分間、再び遠心する。各試料の上清（血漿）を新しいチューブに移し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心する（ブレーキはゼロに設定）。上清を新しいチューブに移し、−８０℃で保存する。母親由来の細胞を含む、約２ミリリットルの「バフィーコート」を別のチューブに移し、−８０℃で保存する。
【１２９５】
ＤＮＡの単離
血液細胞からＤＮＡを精製するためのＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、カタログ番号５１１８３）を用いて、製造業者の指示書に従って、血漿試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡを１００μｌの蒸留水中に溶出する。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉキットは、「バフィーコート」に含まれる母親由来の細胞からＤＮＡを単離する際にも使用される。
【１２９６】
母親由来のＳＮＰがホモ接合であることの同定
ＴｈｉｒｄＷａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ法
Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）社が開発したＩｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ法は、ＤＮＡを検出および定量解析するための等温性の「ＰＣＲ不要」の方法である。Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法は、正しい標的分子の存在下でのみ無関係のシグナルを生じて増幅する。Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ法は、配列ではなく構造に基づいて特定の部位において核酸分子を切断する、構造特異的な古細菌のｆｌａｐエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）ファミリーの熱安定性の酵素の作用に拠っている。既知配列に対する構造形成用プローブとともに使用される場合、同酵素は、構造および標的配列特異的に切断する。Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のアッセイ法に使用されるヌクレアーゼは、「Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）」酵素と呼ばれている。
【１２９７】
Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ法では、Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素によって認識される基質複合体を作るために、２種類の標的特異的なオリゴヌクレオチドを使用する（Ｌ．ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，１２（２１）：１６，１９９８）。この基質複合体は、上流のＩｎｖａｄｅｒオリゴと下流のシグナルプローブが、タンデムに核酸とハイブリダイズすることで形成される。Ｉｎｖａｄｅｒオリゴの３’末端は、シグナルプローブのハイブリダイゼーション部位と、少なくとも１塩基は重複していなければならない（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１３４４−５５，１９９４）。シグナルプローブの５’末端は、５’フラップを形成するための付加的な非対合塩基を有する。Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素は、Ｉｎｖａｄｅｒオリゴと重複する部位でシグナルプローブを切断して５’アームを放出する。反応混合物は、過剰なシグナルプローブを含み、また反応は、プローブの溶解温度付近で進む。標的の各コピーに対して、多くのシグナルプローブが温度サイクリングを行うことなしに切断される場合がある。
【１２９８】
Ｉｎｖａｄｅｒオリゴとシグナルプローブ間の重複が重要である。重複部位に位置するミスマッチは、重複を妨げることで切断をブロックし、この結果、ＳＮＰと変異の区別が可能となる。
【１２９９】
Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法では、２つの連続した切断段階が利用される。第１の反応で放出されるシグナルプローブの５’アームは直接検出されない。むしろ、第２の切断産物が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって検出されるシグナルの実質上の供給源である。第１の反応で放出される５’アームである１次切断産物は、供給されたＦＲＥＴプローブと二次反応でハイブリダイズするＩｎｖａｄｅｒオリゴとして使用される。ＦＲＥＴプローブは、ドナーフルオロフォアとクエンチングアクセプターフルオロフォアの２種類の色素で標識されている。ヌクレアーゼが第２のプローブを切断すると２種類のフルオロフォアが分離し、クエンチングが除去され、ドナー色素に由来する強化された蛍光シグナルが検出される。
【１３００】
プローブ設計
第１３染色体上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６（Ｔ／Ａ）における配列を区別するために、以下のプローブを設計する：
Ｔ対立遺伝子に対するＩｎｖａｄｅｒオリゴ：
2006521086.tif 000495
Ａ対立遺伝子に対するＩｎｖａｄｅｒオリゴ：
2006521086.tif 000496
【１３０１】
Ｉｎｖａｄｅｒオリゴヌクレオチドは、シグナルプローブのすぐ上流の１８〜２２塩基の領域に相補的になるように、またシグナルプローブに対して１塩基ハイブリダイズする領域に「侵入する」３’末端に追加的な１塩基が含まれるように設計する。
Ｔ対立遺伝子用のシグナルプローブ：
2006521086.tif 000497
Ａ対立遺伝子用のシグナルプローブ：
2006521086.tif 000498
【１３０２】
これらのシグナルプローブは、標的分子に相補的な３’領域と、検出目的で用いられる非相補的な５’アーム（上記の下線を付した配列）を含むように設計する。シグナルプローブは、その５’末端において、６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ）、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識する。しかし、５’末端は、放射性同位体、蛍光レポーター分子、化学発光レポーター分子、抗体、抗体断片、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、ホモポリマーオリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性成分、常磁性成分、反磁性成分、リン光成分、発光成分、電気化学発光成分、色成分、検出可能な電子スピン共鳴、静電容量、比誘電率、または電気伝導度を有する成分、ならびに、これらの組合わせを含むがこれらに限定されない、任意の化合物で標識することができる。
【１３０３】
Ｉｎｖａｅｒプローブとシグナルプローブはいずれも、最小数の予測可能な二次構造の形成に応じて、センスまたはアンチセンスの標的ＤＮＡ鎖のいずれかに相補的である。
【１３０４】
ＰＣＲによる増幅
ＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６の周囲のＤＮＡの断片をＰＣＲで増幅する。上流および下流のプライマーの配列を以下に示す：
上流プライマー：
2006521086.tif 000499
下流プライマー：
2006521086.tif 000500
【１３０５】
増幅反応は、２μｌのゲノムＤＮＡ、３５ｐｍｏｌの各プライマー、５０μｍの各デオキシヌクレオチド（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、１×ＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５％  ＮＰ４０）、１  Ｍベタイン、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および２．５  ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む、最終容量１００μｌで行う。ＰＣＲのサイクル条件は、９５℃で５分間の初期変性段階と、９５℃で１分間の変性、６８℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、ならびに７２℃で１分間の最終伸長を含む。
【１３０６】
Ｉｎｖａｄｅｒ反応
各１マイクロリットルのＰＣＲ産物を、０．５ｐｍｏｌの適切なＩｎｖａｄｅｒオリゴヌクレオチド、キャリアとしての１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ  ８．０）に添加する（最終濃度１０ｍＭ、容量７μｌ）。この混合物を９５℃で５分間処理して変性させた後に、反応温度を６０℃に冷却する。Ｉｎｖａｄｅｒ反応は、３０ｎｇのＣｌｅａｖａｓｅ  ＶＩＩＩ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１０ｐｍｏｌの適切なシグナルプローブオリゴヌクレオチドを含む混合物（容量３μｌ）を添加することで開始させる。反応混合物を６０分間インキュベートする。反応は、１０μｌの９５％ホルムアミド−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）−０．０５％クリスタル・バイオレットを添加して終結させる。終結後に、反応物を試薬グレードの水で１：１０に希釈する。自動蛍光配列決定装置（モデル３７７、ＰＥ−ＡＢＩ）上に据えた２４％変性ポリアクリルアミドゲル（１８ｃｍ×２５．５ｃｍ×ｍｍ）に２μｌの試料をロードして電気泳動を行う。フィルターセットＣを用いてデータを収集し、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアで処理する。
【１３０７】
また、５μｌの各試料を、２０％（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）の変性ポリアクリルアミドゲルを用いて２０  Ｗで電気泳動を行う。ゲルカセット（２０ｃｍ×２０ｃｍ×０．５ｍｍ）を、５８５ｎｍのフィルター（ＴＥＴおよびＨＥＸで標識されたプローブ用）、ならびに５０５ｎｍのフィルター（ＦＡＭで標識されたプローブ用）を用いて蛍光スキャナー（ＦＭＢＩＯ−１００；  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，ＣＡ）でスキャンする。
【１３０８】
Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法では、放出されたシグナルプローブの５’アームが別のプローブとハイブリダイズし、また蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって特定の核酸の存在が検出されるように、第２の切断反応を行うことも可能である。ＦＲＥＴプローブを使用する際には、製造業者のプロトコルに従う。
【１３０９】
個々のＳＮＰにおける遺伝子型は、個々の対立遺伝子特異的なシグナルプローブの蛍光強度を解析することで決定する。例えば、ＳＮＰ  ＴＳＣ１１７２５７６の場合、Ｔ対立遺伝子の存在は、Ｔ対立遺伝子のシグナルプローブ（上述）に由来するシグナルプローブを用いて、放出される５’シグナルプローブの量を解析することで判定する。同様に、Ａ対立遺伝子の存在は、Ａ対立遺伝子シグナルプローブから放出される５’シグナルプローブの量を解析することで判定する。この反応は、個別の条件で解析可能な２種類の異なる化合物を用いることで、１つの反応容器内で行うことができるほか、Ａ対立遺伝子およびＴ対立遺伝子の反応を、２つの異なる反応容器内で行うことができる。
【１３１０】
母親由来の血漿から単離されたＤＮＡの解析
母親由来のＤＮＡを解析し、ＳＮＰがホモ接合であることが判明した後に、これらのＳＮＰの解析を、血漿から単離されたＤＮＡを対象に行う。母親の血漿中には、胎児のゲノムは通常、低コピー数でしか存在しない。母親由来のＤＮＡがホモ接合であるＳＮＰである、対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマーを、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および約１３０塩基下流にアニールするように設計する。こうすることで、数の少ないゲノムを扱う際に生じる恐れのある統計的なサンプリングエラー（ある対立遺伝子と別の対立遺伝子の比に影響する可能性がある）は小さくなる（実施例１１参照）。
【１３１１】
多重プライマー設計
プライマーの長さは１２塩基とする。しかし、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、１０塩基、１１塩基、１２塩基、１３塩基、１４塩基、１５塩基、１６塩基、１７塩基、１８塩基、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６〜４５塩基、４６〜５５塩基、５６〜６５塩基、６６〜７５塩基、７６〜８５塩基、８６〜９５塩基、９６〜１０５塩基、１０６〜１１５塩基、１１６〜１２５塩基、および１２５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、任意の長さのプライマーを使用することができる。プライマーは、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にアニールするように設計する。
【１３１２】
母親由来のホモ接合のＳＮＰは、個々の試料によって異なるので、ここでは特定の配列を示すことはしない。プライマーは、母親由来のホモ接合のＳＮＰの約１３０塩基上流および下流にアニールするように設計する。プライマーは、プライマー二量体の形成を抑えるために、ジヌクレオチド「ＡＡ」の３’末端で終結するように設計する。しかし、プライマーは、４種類のヌクレオチドのいずれかにおいて、また４種類のヌクレオチドの任意の組合わせにおいて終結するように設計することができる。
【１３１３】
多重ＰＣＲ
母親由来のホモ接合のＳＮＰの上流および下流の領域を、鋳型ゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅する（参照として本明細書に組み入れられる、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．４，６８３，１９５および４，６８３，２０２）。このＰＣＲ反応では、個々の対象遺伝子座の約１３０塩基上流および下流にアニールするプライマーを使用する。鋳型ＤＮＡを増幅するために、プライマーをひとまとめに混合し、１回の反応で使用する。この反応は、対象遺伝子座のコピー数を増やし、ゲノム数の少なさに起因するエラーを除くために行う。
【１３１４】
特異度を高めるために、「ホットスタート」ＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮ社製のＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて行う。１回の反応あたりの鋳型ＤＮＡおよびプライマーの量を、個々の対象遺伝子座について最適化する。この実施例では、２０μｌの血漿鋳型ＤＮＡを用いる。
【１３１５】
フォワードおよびリバースのプライマー（各２マイクロリットル、濃度５ｍＭ）を、１本の微小遠心チューブにプールして混合する。４マイクロリットルのプライマーミックスを、総ＰＣＲ反応容量５０μｌ（２０μｌの鋳型の血漿ＤＮＡ、１μｌの滅菌水、４μｌのプライマーミックス、および２５μｌのＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ）に使用する。２５サイクルのＰＣＲを行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：
（１）９５℃で１５分間；
（２）９５℃で３０秒間；
（３）４℃で３０秒間；
（４）３７℃で３０秒間；
（５）工程２〜４を２４回繰返す；
（６）７２℃で１０分間。
【１３１６】
変性、アニーリング、および伸長時の温度および時間を、さまざまな設定を検討し、最良の結果が得られたパラメータを用いることで最適化する。
【１３１７】
対象遺伝子座のコピー数を増やすために、プライマー伸長プレ増幅（ＰＥＰ）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，８９：５８４７−５１，１９９２）、縮重オリゴヌクレオチドプライムドＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）（Ｔｅｌｅｎｉｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２）、バクテリオファージ２９のＤＮＡポリメラーゼ（ローリングサークル型複製を行う）を使用する鎖置換増幅（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１０９５−９９，２００１）、多置換増幅（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）、ＲＥＰＬＩ−ｇ（商標）全ゲノム増幅キット、およびＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲを含むがこれらに限定されない、他のゲノム増幅法を使用することもできる。
【１３１８】
増幅対象領域が、ＢｅａｄＡｒｒａｙで使用されるオリゴヌクレオチドプローブに対するアニーリング配列を確実に含むことが重要である。ＢｅａｄＡｒｒａｙサービスの購入時に、各ＳＮＰを解析するための個々のＳＮＰおよびプライマーを同定する。こうして得られた知見を元に、多重プライマーを、ＢｅａｄＡｒｒａｙに使用されるプライマーに対するアニーリング領域を含むように設計する。
【１３１９】
対象断片の精製
使用されなかったプライマーおよびヌクレオチドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）を用いて反応物から除去する。この反応は、カラムに添付された製造業者の指示書に従って行う。ＤＮＡを１００μｌの滅菌水中に溶出する。
【１３２０】
Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法
増幅されたＤＮＡをＩｎｖａｄｅｒアッセイ法で、上述の手順でアッセイする。個々のＳＮＰの遺伝子型を決定する。母親由来のＤＮＡがホモ接合であり、また血漿から単離されたＤＮＡがヘテロ接合である、第１３染色体および第２１染色体上に位置するＳＮＰを定量する。
【１３２１】
定量
対立遺伝子に特異的なシグナルプローブの蛍光強度を定量する。上述したように、対立遺伝子２に対する対立遺伝子１の予測比を元に、染色体異常の有無を判定することができる。仮に、母親由来のゲノムがＳＮＰ  Ｘにおいてホモ接合（Ａ／Ａ）であり、また血漿由来のＤＮＡがＳＮＰ  Ｘにおいてヘテロ接合（Ａ／Ｇ）であれば、Ｇは明瞭な胎児のシグナルとなる。
【１３２２】
Ａヌクレオチドを有する対立遺伝子の蛍光強度を定量し、またＧヌクレオチドを有する対立遺伝子の強度を定量する。Ｇ：Ａの比は、母親由来の血液中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージによって変わる。
【１３２３】
例えば、仮に、試料が胎児ＤＮＡを５０％含む場合、予測比率は０．３３となる（胎児由来の１つのＧ対立遺伝子／（母親由来の２つのＡ対立遺伝子＋胎児由来の１つのＡ対立遺伝子））。この比は、２コピーで存在する全染色体について一定となるはずである。第１３染色体上のＳＮＰについて得られる比は、第２１染色体について得られた比と同じはずである。
【１３２４】
しかし、仮に、胎児のゲノムが第２１染色体の別のコピーを含む場合は、同染色体の比は、予測比から逸脱するであろう。母親由来の血液中に胎児ＤＮＡが５０％含まれるトリソミー状態の場合の予測比率は０．２５である。したがって、母親由来のゲノムがホモ接合であり、また血漿から単離されるＤＮＡがヘテロ接合であるＳＮＰを解析することで、胎児の染色体異常を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【１３２５】
【図１Ａ】二本鎖ＤＮＡ分子を表している略図。１対のプライマーを曲がった矢印として表し、関心対象の座の側面を塩基Ｎ１４における三角形の記号として表している。関心対象の座は、単一ヌクレオチド多形、点突然変異、挿入、欠失、転座などであり得る。各プライマーは、第１のプライマー領域「ａ」として、第２のプライマーでは領域「ｄ」として表されている５’末端から約１０ｂｙに制限酵素認識部位を含有する。制限認識部位［ａ］は、任意のタイプの制限酵素に対するものであり得るが、認識部位「ｄ」は、制限酵素認識部位から「ｎ」ヌクレオシドを切断し、５’オーバーハングおよび３’窪み端を残す制限酵素に対するものである。このような酵素の例としては、限定はしないが、ＢｃｅＡｌおよびＢｓｍＦＩが挙げられる。５’オーバーハングは３’窪み端にヌクレオチドを取り込むための鋳型として働く。第１のプライマーは、精製の助けになるように、５’端をビオチンで修飾して示されている。前記プライマーの３’端配列は、このプライマーが、関心対象の座の上流および下流の所望の間隔でアニールするような配列になっている。第２のプライマーは、関心対象の座に近接してアニールする。すなわち、第２のプライマーの３’端が関心対象の座から１塩基離れてアニールするように、領域「ｃ」として表されているアニーリング部位が設計されている。第２のプライマー上の領域「ｄ」を認識する制限酵素による消化が関心対象の座を含有する５’オーバーリングを生成するという条件で、第２のプライマーは関心対象の座から任意の間隔でアニールできる。第１のプライマーの領域「ｂ」として表されているアニーリング部位は約２０塩基である。
【図１Ｂ】ＰＣＲによる増幅の第１サイクルのアニーリングステップおよび伸長ステップを表している略図。領域「ｃ」として表され、この例では１３塩基対である第２のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度で、増幅の第１サイクルが実施される。この温度で第１のプライマー、第２のプライマーの双方が各々の相補鎖にアニールし、点線で示される伸長を始める。この第１のサイクルにおいて、第２のプライマーは伸長して、第１のプライマーが次のサイクルでアニールできる領域ｂをコピーする。
【図１Ｃ】ＰＣＲ増幅の第２サイクルにおける変性後のアニーリングと伸長ステップを表している略図。第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする領域「ｂ」として表されている３’領域の２０ｂｙの略融解温度であるより高いアニーリング温度（ＴＭ２）において、増幅の第２サイクルが実施される。したがって、ＴＭ２において、領域ｂに相補的な領域ｂ’を含有する第１のプライマーは、前記反応の第１サイクルでコピーされたＤＮＡに結合することができる。しかし、ＴＭ２では、アニーリング温度が高いため、第２のプライマーは元の鋳型ＤＮＡまたは前記反応の第１のサイクルでコピーされたＤＮＡにアニールすることができない。第２のプライマーは元の鋳型ＤＮＡにおける１３塩基にアニールできるが、ＴＭ２は２０塩基の略融解温度に決められている。
【図１Ｄ】増幅第３サイクル時変性後のアニーリングおよび伸長反応を表している略図。このサイクルでは、アニーリング温度ＴＭ３は、領域「ｃ」および「ｄ」を含む第２のプライマー全体の略融解温度である。領域「ｃ」＋「ｄ」の長さは略２７〜３３ｂｙ長であり、したがってＴＭ３は、ＴＭ１およびＴＭ２よりもかなり高い。このより高いＴＭで、領域「ｃ」および「ｄ」を含む第２のプライマーは、サイクル２で生成したコピーＤＮＡにアニールする。
【図１Ｅ】増幅の残りのサイクルに関するアニーリングおよび伸長反応を表している略図。残りのサイクルに関するアニーリング温度は、第２のプライマー全体の略融解温度であるＴＭ３である。ＴＭ３で、第２のプライマーは、領域ｃ’およびｄ’を含む鋳型に結合し、第１のプライマーは、領域ａ’およびｂを含む鋳型に結合する。初めの３つのサイクルの各サイクルにおいて、アニーリング温度をＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３と連続的に上昇させることにより、非特異的増幅はかなり減少する。
【図１Ｆ】固体マトリックスに結合した関心対象の増幅座を表す略図。
【図１Ｇ】制限酵素「ｄ」による消化後の結合増幅ＤＮＡを表す略図。「下流」端は上澄み液に遊離し、任意の緩衝液による洗浄によって除去できる。関心対象の座を含有する上流端は固体マトリックスに結合したままである。
【図１Ｈ】領域ｄｄＮＴＰで「はめ込み」後の結合増幅ＤＮＡを表している略図。関心対象の座（Ｎ１４）に相補的な塩基（Ｎ’１４）を「はめ込む」ためにはＤＮＡポリメラーゼが用いられる。この例では、関心対象の座または関心対象のＳＮＰだけをはめ込むように、ｄｄＮＴＰ類だけがこの反応に存在している。
【図１Ｉ】制限酵素「ａ」による消化後の標識結合ＤＮＡを表している略図。標識ＤＮＡは上澄み液に遊離するが、取り込まれた塩基を同定するためにそれを回収する。
【図２】１つのプライマーが、関心対象座の各座の側面に位置するように特異的にアニールした数ｎの関心対象座および数ｎのプライマー対、ｘ１、ｙ１からｘｎ、ｙｎを有する二本鎖ＤＮＡの鋳型を表している略図。第１のプライマーは、５’端をビオチン化されていて・によって表され、任意のタイプの制限酵素であり得る制限酵素認識部位「ａ」を含有する。第２のプライマーは制限酵素認識部位から「ｎ」ヌクレオチドを切断し、関心対象の座を含有する５’オーバーハングおよび３’窪み端を生成する制限酵素に対する認識部位である制限酵素認識部位「ｄ」を含有する。第２のプライマーは関心対象の各々の座に隣接してアニールする。関心対象座のＰＣＲ産物を制限酵素「ｄ」によって消化することにより関心対象の座を含有する５’オーバーハングおよび３’窪み端が生成されるように、第２のプライマーにおける制限酵素部位「ｄ」の正確な位置が設計される。第１のプライマーのアニーリング部位は、約２０塩基長であり、連続的な第１のプライマーの各々が、第２のプライマーの各々からさらに離れるように選択される。例えば、座１で、第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’端がＺ塩基対離れているならば、座２では第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’端は、Ｚ＋Ｋ塩基対離れており、ここでＫ＝１、２、３、または３より多い塩基である。座Ｎに対するプライマーは、ＺＮ−１＋Ｋ塩基対離れている。連続的な第１のプライマーの各々を第２のプライマーの各々からさらに離す目的は、「はめ込まれた」制限断片（図１Ｂ〜１Ｉに記したように増幅、精製、消化および標識化の後に生成された）の大きさが異なり、例えば、電気泳動により分離でき、関心対象の各個別の座を検出できるようにすることである。
【図３】複数のアニーリング温度を用いるＳＮＰ類のＰＣＲ増幅。３６人のヒト志願者のゲノムＤＮＡ鋳型を含有する試料を次の４種のＳＮＰに関して分析した：染色体２１上に位置し、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベース帰属の同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０（レーン１）；染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（レーン２）；染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６（レーン３）；および染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（レーン４）。各ＳＮＰは、本明細書において、低緊縮アニーリング温度；中等度緊縮アニーリング温度；および高緊縮アニーリング温度と称される３つの異なったアニーリング温度プロトコルを用いてＰＣＲにより増幅した。アニーリング温度プロトコルに係りなく、各ＳＮＰは、ＰＣＲの４０サイクルで増幅した。各ＰＣＲ反応の変性ステップは、９５℃で３０秒間実施された。図３Ａ：低緊縮アニーリング温度プロトコルを用いた４種の異なったＳＮＰのＰＣＲ増幅を証明しているゲルの写真。図３Ｂ：中等度緊縮アニーリング温度プロトコルを用いた４種の異なったＳＮＰのＰＣＲ増幅を証明しているゲルの写真。図３Ｃ：高緊縮アニーリング温度プロトコルを用いた４種の異なったＳＮＰのＰＣＲ増幅を証明しているゲルの写真。
【図４Ａ】染色体２１上に位置し、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベース帰属の同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を含有する。ＳＮＰはＲ（Ａ／Ｇ）およびｒ（Ｔ／Ｃ）（Ｒに対して相補的）によって示されている。
【図４Ｂ】染色体２１上に位置し、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベース帰属の同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を含有する。ＳＮＰはＲ（Ａ／Ｇ）およびｒ（Ｔ／Ｃ）（Ｒに対して相補的）によって示されている。
【図４Ｃ】染色体１のＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＴＳＣ００９５５１２配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を有する。ＳＮＰはＳ（Ｇ／Ｃ）およびＳ（Ｃ／Ｇ）（Ｓに対して相補的）によって示される。
【図４Ｄ】染色体１のＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２のＤＮＡ配列の図。第１のプライマーおよび第２のプライマーは、ＴＳＣ００９５５１２配列の、各々上と下に示されている。第１のプライマーはビオチン化しており、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有する。第２のプライマーは、ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有し、ＤＮＡ配列にアニールする１３塩基を有する。ＳＮＰはＳ（Ｇ／Ｃ）およびＳ（Ｃ／Ｇ）（Ｓに対して相補的）によって示される。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、図４Ａ〜４Ｄに記したプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図５Ａと５Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図５Ｃと５Ｄ）のヌクレオチド配列を表している略図である。プライマー配列における制限部位を太字で示している。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、適切なＩＩＳ型制限酵素による消化後の各増幅ＳＮＰのヌクレオチド配列を表している略図である。図６Ａと６Ｂは、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の断片を表している。図６Ｃと６Ｄは、それぞれＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩおよびＢｃｅＡＩによって消化したＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２の断片を表している。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、消化したＳＮＰ部位の５’オーバーハングを３’窪み端を「はめ込む」ための鋳型として用いる、蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを表す略図である。図７Ａと７Ｂは、取り込まれた標識ｄｄＮＴＰを有する消化ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７座を表す（＊Ｒ−ｄｄ＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。図７Ｃと７Ｄは、取り込まれた標識ｄｄＮＴＰを有する消化ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２座を表す（＊Ｓ−ｄｄ＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。ｄｄＮＹＰ類を使用することにより、関心対象ヌクレオチドまたは５’オーバーハングに存在するＳＮＰ部位に相補的なヌクレオチド１個分だけ、３’窪み端が伸長することが保証される。図７Ｅは、ＳＮＰ部位を含有する５’オーバーハングへのｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰの取り込みを表している略図である。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００００７はＢｓｍＦＩによって消化され、４塩基の５’オーバーハングを生成する。ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰとの混合物の使用により、３’窪み端をヌクレオチド１個分（先ずｄｄＮＴＰが取り込まれる）；ヌクレオチド２個分（ｄｄＮＴＰの後に１個のｄＮＴＰが取り込まれる）；ヌクレオチド３個分（ｄｄＮＴＰの後に２個のｄＮＴＰが取り込まれる）；またはヌクレオチド４個分（ｄｄＮＴＰの後に３個のｄＮＴＰが取り込まれる）伸長させることができる。４種の産物を全て大きさによって分離することができ、また、取り込まれたヌクレオチドを検出することができる（＊Ｒ−ｄｄ＝蛍光ジデオキシヌクレオチド）。ＳＮＰまたは座の部位に対応する第１のヌクレオチドおよび次の３つのヌクレオチドの検出により、さらなる品質保証のレベルが提供される。ＳＮＰは、Ｒ（Ａ／Ｇ）およびｒ（Ｔ／Ｃ）（Ｒに相補的）によって示されている。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、固体支持マトリックス、すなわちストレプトアビジン被覆ウェルからの「はめ込まれた」ＳＮＰの遊離である。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、図８Ａと８Ｂに示されており、一方、ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は図８Ｃと８Ｄに示されている。「はめ込まれた」ＳＮＰは、溶液中で遊離しており、検出することができる。
【図９Ａ】ＢｃｅＡＩによって消化されたＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列分析。４つの「はめ込み」反応が示されており、各反応が１つの蛍光標識ヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ類を含有した。ＢｃｅＡＩによる消化で生成した５’オーバーハングおよびこのＳＮＰ部位において予想されるヌクレオチドが示されている。
【図９Ｂ】ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２ＳＮＰの配列分析。ＴＳＣ００９５５１２は、ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによって、また別の反応では、ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによって増幅された。各ＰＣＲ産物に関して、４つの「はめ込み」反応が示されており、各反応が１つの蛍光標識ヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ類を含有した。ＢｃｅＡＩによる消化で生成した５’オーバーハング、およびＢｓｍＦＩによる消化で生成した５’オーバーハングおよび予想されるヌクレオチドが示されている。
【図９Ｃ】ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＴＳＣ２６４５８０の配列分析。４つの「はめ込み」反応が示されており、各反応が１つの蛍光標識ヌクレオチド、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰおよび未標識ｄｄＮＴＰ類を含有した。２つの異なる５’オーバーハングが表されており、１つは、センス鎖上の１１個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１５個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表し、他方は、センス鎖上の１０個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１４個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表している。また、予想されるヌクレオチドが示されている。
【図９Ｄ】ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した第２のプライマーによる増幅後のＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７の配列分析。ＢｓｍＦＩによる消化で生成した５’オーバーハングのはめ込みには、標識ｄｄＮＴＰ類および未標識ｄＮＴＰ類が用いられた。２つの異なる５’オーバーハングが表されており、１つは、センス鎖上の１１個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１５個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表し、他方は、センス鎖上の１０個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子およびアンチセンス鎖上の１４個のヌクレオチドが切り取られたＤＮＡ分子を表している。ＳＮＰより上流のヌクレオチド、ＳＮＰ部位におけるヌクレオチド（この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含有したので、双方のＤＮＡがこの試料中に存在すると考えられる）およびＳＮＰの下流の３個のヌクレオチドが示されている。
【図１０】複数のＳＮＰの配列分析。染色体２１上に位置しているＳＮＰ類ＨＣ２１Ｓ００１３１およびＨＣ２１Ｓ０００２７ならびに染色体１上に位置しているＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５、ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６、ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２を別々のＰＣＲ反応において、ＢｓｍＦ１に対する認識部位を含有した第２のプライマーによって増幅した。各々増幅された関心対象の座が異なる大きさであるように、プライマーを設計した。増幅後、反応物を１つの試料にプールし、本法の引き続く全てのステップはその試料で行った（図１Ｆ〜１Ｉに対し、説明されたように）。各ＳＮＰおよび各ＳＮＰで見られるヌクレオチドを示している。
【図１１】母体血液中の胎児ＤＮＡパーセンテージの定量。血液はヒト妊娠女性からインフォームドコンセントを得て採取した。ＤＮＡを単離し、連続希釈を行って、試料中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージを測定した。染色体Ｙ上に位置するＳＲＹ遺伝子を胎児ＤＮＡの検出に用いた。染色体７上に位置するのう胞性線維症遺伝子を、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡ双方の検出に用いた。図１１Ａ：ＥＤＴＡで処理した血液試料から単離した鋳型ＤＮＡを用いたＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子の増幅。図１１Ｂ：ホルマリンおよびＥＤＴＡで処理した血液試料から単離した鋳型ＤＮＡを用いたＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子の増幅。
【図１２】前もってトリソミー２１を有する遺伝子型（ダウン症候群）と決定されている個体の遺伝子分析。前もってトリソミー２１を有する遺伝子型と決定されている個体の遺伝子分析から、インフォームドコンセントを得て血液を採取した。ＤＮＡを単離し、染色体２１上の２種のＳＮＰおよび染色体１３上の２種のＳＮＰの遺伝子型を決定した。ゲルの写真に示されるように、染色体２１上のＳＮＰは、２つのヌクレオチドの比率が不釣合いである。ゲルの肉視検査により、染色体２１に関して分析されたＳＮＰ部位における２つのヌクレオチドのうちの１つがより大きな強度を有していることが証明され、それが５０：５０比で存在していないことが示唆される。しかし、染色体１３上の分析されたヘテロ接合ＳＮＰ部位におけるヌクレオチドは、予想された５０：５０比で存在していることが、肉視検査により示唆される。
【図１３】１種の蛍光標識ヌクレオチドを用いたＳＮＰ、ＴＳＣ０８３７９６９、ＴＳＣ００３４７６７、ＴＳＣ１１３０９０２、ＴＳＣ０５９７８８８、ＴＳＣ０１９５４９２、ＴＳＣ０６０７１８５の両対立遺伝子の配列測定。ＢｓｍＦＩによる消化で生成したオーバーハングをはめ込むために未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下で標識ｄｄＧＴＰを使用した。はめ込まれた鎖上の可変部位の先にあるヌクレオチドはグアニンではなく、また、はめ込まれた鎖上の可変部位の後にあるヌクレオチドもグアニンではなかった。はめ込まれた鎖上の可変部位の２塩基後のヌクレオチドはグアニンであった。可変部位にグアニンを含有する対立遺伝子は、標識ｄｄＧＴＰを用いてはめ込みを行った。グアニンを含有しない対立遺伝子は未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによってはめ込まれ、オーバーハングに相補的な３位に標識ｄｄＧＴＰがはめ込まれるまで、ポリメラーゼはヌクレオチドの取り込みを続ける。
【図１４】集団内における可変的な対立遺伝子を有するＳＮＰの同定。染色体１３上に位置する７種のＳＮＰの両対立遺伝子の配列は、２４５個体から得られたＤＮＡからなる鋳型ＤＮＡを用いて決定した。ＢｓｍＦＩによる消化によって生成したオーバーハングにはめ込みを行うために未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの存在下、標識ｓｓＧＴＰを用いた。はめ込まれた鎖上の可変部位の先にあるヌクレオチドはグアニンではなく、また、はめ込まれた鎖上の可変部位の後にあるヌクレオチドもグアニンではなかった。はめ込まれた鎖上の可変部位の２塩基後のヌクレオチドはグアニンであった。可変部位にグアニンを含有する対立遺伝子は、標識ｄｄＧＴＰを用いてはめ込みを行った。グアニンを含有しない対立遺伝子は未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによってはめ込まれ、オーバーハングに相補的な３位に標識ｄｄＧＴＰがはめ込まれるまで、ポリメラーゼはヌクレオチドの取り込みを続ける。
【図１５】ヘテロ接合ＳＮＰにおける１つの対立遺伝子の他の対立遺伝子に対する比率の決定。ＳＮＰＴＳＣ０６０７１８５に関して見られたヌクレオチドは、センス鎖上のシトシン（対立遺伝子１と称す）およびチミジン（対立遺伝子２と称す）である。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、５個体から単離された鋳型ＤＮＡを用いて計算した。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、一定で、１：１であった。ＳＮＰ  ＴＳＣ１１３０９０２に関して見られたヌクレオチドは、センス鎖上のグアニン（対立遺伝子１と称す）およびアデニン（対立遺伝子２と称す）である。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、５個体から単離された鋳型ＤＮＡを用いて計算した。対立遺伝子２対対立遺伝子１の比率は、一定で、７５：２５であった。
【図１６】染色体２１の１つ余分なコピーを含有する鋳型ＤＮＡについて計算すると、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２における対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージは線形を維持する。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、４人からの鋳型ＤＮＡをを用いて増幅され、各ＰＣＲ反応に関して、２つの別々のはめ込み反応（ＡおよびＢとして標識）を実施した（標識１〜４）。正常な個体からの鋳型ＤＮＡ上の対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージ計算値は０．４７であった。理論上の予想パーセンテージ０．５０からの偏差は、ダウン症候群を有する個体から単離された鋳型ＤＮＡについては線形を維持する。
【図１７Ａ】正常な遺伝子核型を有する個体から単離された鋳型ＤＮＡからの、染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本明細書に記載された方法を用いて増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つの試料に分けた。ＳＮＰ部位における対立遺伝子２のパーセンテージ（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．５０の中間値であった。
【図１７Ｂ】トリソミー２１遺伝子核型を有する個体から単離された鋳型ＤＮＡからの、染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本明細書に記載された方法を用いて増幅し、ＩＩＳ型の制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つの試料に分けた。ＳＮＰ部位における対立遺伝子２のパーセンテージ（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３０の中間値であった。
【図１７Ｃ】トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの３：１の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んた。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つの試料に分けた。ＳＮＰ部位における対立遺伝子２のパーセンテージ（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３１９の中間値であった。
【図１７Ｄ】トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの１：１の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つの試料に分けた。ＳＮＰ部位における対立遺伝子２のパーセンテージ（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３５２の中間値であった。
【図１７Ｅ】トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの１：２．３の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つの試料に分けた。ＳＮＰ部位における対立遺伝子２のパーセンテージ（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３８２の中間値であった。
【図１７Ｆ】トリソミー２１を有する個体からの鋳型ＤＮＡおよび正常な遺伝子核型を有する個体からの鋳型ＤＮＡの１：４の比率（トリソミー２１：正常）からなる混合物からの染色体２１上に位置するＳＮＰの分析。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１０８９９２は、本明細書に記載された方法を用いて鋳型混合物から増幅し、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化の後、標識ｄｄＴＴＰならびに未標識ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを用いて５’オーバーハングにはめ込んだ。３つの別々のＰＣＲ反応を実施し、各ＰＣＲ反応物を２つの試料に分けた。ＳＮＰ部位における対立遺伝子２のパーセンテージ（対立遺伝子２／（対立遺伝子２＋対立遺伝子１））を計算した結果、０．３９７の中間値であった。
【図１８Ａ】鋳型ＤＮＡから増幅された９種のＳＮＰのアガロースゲル分析。９種のＳＮＰの各々は、本明細書に記載された方法を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。レーン１はＳＮＰ  ＴＳＣ０３９７２３５に対応し、レーン２はＳＮＰ  ＴＳＣ０４７０００３に対応し、レーン３はＳＮＰ  ＴＳＣ１６４９７２６に対応し、レーン４はＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９に対応し、レーン５はＳＮＰ  ＴＳＣ０３１０５０７に対応し、レーン６はＳＮＰ  ＴＳＣ１６５０４３２に対応し、レーン７はＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８に対応し、レーン８はＳＮＰ  ＴＳＣ０１２８３０７に対応し、およびレーン９はＳＮＰ  ＴＳＣ０２５９７５７に対応する。
【図１８Ｂ】染色体１３上の種々の領域にアニールした１２個の塩基プライマーを用いて、元の鋳型ＤＮＡを増幅した。染色体１３の全体に亘った領域を増加するために、１００種の異なるプライマーセットを用いた。９種のＳＮＰの各々に対し、関心対象の座の略１３０個の塩基、および関心対象の座の下流の１３０個の塩基をアニールするプライマーを用いた。関心対象座を含有する領域を増幅するために、合計１００種類のプライマーセットを含有する増幅反応を用いた。生じたＰＣＲ産物は、引き続くＰＣＲ反応に用いたが、ここで、９種のＳＮＰの各々は、第１のプライマーおよびＩＩｓ型制限酵素ＢｓｍＦＩに対する結合部位を含有した第２のプライマーを用いて、個々に増幅した。ＳＮＰは図１８Ａと同じ順序で入れた。
【図１９Ａ】元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ０４７００３に関する対対立遺伝子２対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。
【図１９Ｂ】元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ１２６１０３９に関する対対立遺伝子２対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。
【図１９Ｃ】元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ３１０５０７に関する対対立遺伝子２対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。
【図１９Ｄ】元の鋳型ＤＮＡ（ＩＡ）および融合鋳型ＤＮＡ（Ｍ１〜Ｍ３）上のＳＮＰ  ＴＳＣ１３３５００８に関する対立遺伝子２対対立遺伝子１のパーセンテージの定量であり、ここでは関心対象座の上流および下流の１５０個の塩基をアニールする１２個の塩基プライマーを用いてＤＮＡを先ず増幅し、次に第１のプライマーおよび第２のプライマーを用いて、複合鋳型ＤＮＡ上で３つの別々のＰＣＲ反応を行った。
【図２０】妊娠女性から単離した血漿ＤＮＡからの胎児ＤＮＡの検出。血漿ＤＮＡ上の母体ＤＮＡが、ホモ接合である４種のＳＮＰを分析した。ＴＳＣ０８３８３５５（レーン１）におけるアデニンに関し、母体ＤＮＡはホモ接合であったが、血漿ＤＮＡはヘテロ接合パターン（レーン２）を示した。グアニン対立遺伝子は母体の信号から明らかに区別される胎児ＤＮＡを表した。ＴＳＣ０４１８１３４（レーン３および４）におけるアデニンに関し、母体ＤＮＡおよび血漿ＤＮＡの双方ともホモ接合であった。ＴＳＣ０１２９１８８（レーン５）におけるグアニンに関し、母体ＤＮＡはホモ接合であったが、血漿ＤＮＡはヘテロ接合パターン（レーン６）を示した。アデニン対立遺伝子は胎児ＤＮＡを表した。ＴＳＣ０５０１３８９（レーン７および８）におけるアデニンに関し、母体ＤＮＡおよび血漿ＤＮＡの双方ともホモ接合であった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2006521086.tif 000539
【図１５】
2006521086.tif 000540
【図１６】
2006521086.tif 000541
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年6月20日(2006.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006521086000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月21日(2006.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、染色体異常および突然変異を含む遺伝子疾患の検出法に関する。本発明は、胎児のＤＮＡ配列決定のための迅速で非侵襲的な方法を提供する。本法は、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよび他の異数体、欠失、付加、増幅、転座、および再配列を含む胎児における染色体異常の検出に特に有用である。なお、本出願は、２００２年３月１１日に出願された米国特許出願第１０／０９３，６１８号明細書、２００２年３月１日および２００２年３月８日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６０／３６０，２３２号明細書および米国仮特許出願第６０／３７８，３５４号明細書、ならびに２００３年２月２８日に出願されたＰＣＴ出願第ＵＳ０３／０６１９８号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願内容は参照として本明細書にその全体が組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
染色体異常は、ヒトにおける出生時遺伝子欠損の原因としてかなりの割合を占めている。ヒトの細胞核は、４６個の染色体を含有しているが、これらが遺伝的指令を含み、また細胞の働きを決定している。４６個の染色体のうちの半分は一方の親に由来する。正常な男性では互いに全く異なっている性染色体を除いて、母親からの染色体と父親からの染色体とが対応した組を形成する。これらの対は卵子が精子によって受精した時に組合わされたものである。時には、染色体の形成、または組合わせのいずれかにエラーが生じ、が多すぎるか、または少なすぎる染色体を有するか、あるいは何らかの仕方で混合された染色体を有する受精卵子が形成される。各染色体は、多くの遺伝子を含有しているため、染色体異常は、身体系の多くに影響を与え、しばしば発達障害（例えば、精神遅滞）を含む重大な出生時欠損を生じ易い。
【０００３】
細胞は染色体の切断された両端を誤って再結合することがある。これは自発的に生じる場合もあるし、化学化合物、発癌物質に曝された後、および放射線照射後に生じる場合もある。再結合が染色体内部で生じる場合は、２つの切断箇所の間の染色体部分が逆転し、逆位として分類される。逆位では、遺伝子物質の損失はないが、逆位によって、重要な遺伝子の分裂または、疾病に関連した状態を引き起こす融合遺伝子を作り出すことがある。
【０００４】
相互転座においては、２つの非相同染色体が切断して断片を交換する。この状況では、２つの異常染色体が生じる、すなわち、各々が他の染色体に由来する一部からなり、それ自体の一部を欠いている。転座が平衡型である場合、その個体は異常表現型を表すことはない。しかし、転座を有する個体では胚細胞形成時に、卵子または精子の染色体の適切な分布がなされない場合があり、その結果、流産、奇形または子の精神遅滞を生じる。
【０００５】
ロバートソン転座においては、２つの末端流動体の動原体（非中央位置動原体を有する染色体）染色体が融合して１つの大型の中部動原体を生成する。動原体融合を有する個体の核型は、染色体の正常な二倍体数よりも１つ少ない数を有する。
【０００６】
多すぎるまたは少なすぎる染色体を生成するエラーも疾病表現型を導くことがある。例えば、染色体Ｘを失ったコピー（モノソミーＸ）はターナー症候群を生じ、一方、染色体２１の過剰コピーはダウン症候群を生じる。エドワード症候群およびパトー症候群などの他の疾病は、それぞれ染色体１８および染色体１３の過剰コピーによって生じる。
【０００７】
最も一般的な染色体異常の１つは、ダウン症候群として知られている。ダウン症候群の推定発生率は、出生１，０００人のうちの１人から１，１００人のうち１人の間である。米国では毎年、この染色体を有する子供が約３、０００人から５，０００人生まれている。ダウン症候群の子供の大多数（約９５％）は１個余分な染色体２１を有している。ほとんどの場合、この余分な染色体は母親由来である。しかし、ダウン症候群を有する人の約３〜４パーセントでは、染色体２１と染色体１４または２２との間の転座が遺伝子異常の原因となっている。ダウン症候群を有する個体の最後の約１パーセントにモザイク現象と呼ばれるもう１つの染色体異常があることがわかっている。この場合幾つかの細胞は、４７個の染色体を有し、他の細胞は４６個の染色体を有する。モザイク現象は、受胎直後の細胞分裂におけるエラーの結果であると考えられている。
【０００８】
染色体異常は、コンジェンシャルであり、したがって、出生前胎児の健康および病態を判断するために出生前診断を用いることができる。出生前診断による知見が得られないと、胎児または母親または双方にとって不都合な結果となる可能性がある。先天性異常は周産期死亡の２０％から２５％を占めている。特に出生前診断は、残りの妊娠期の管理、出生過程に伴って生じ得る合併症に対する計画、新生児に生じ得る問題に対する準備、および将来の妊娠に影響し得る病態の発見にとって有益である。
【０００９】
超音波検査、羊水穿刺、絨毛膜絨毛試料採取（ＣＶＳ）、母体血液内の胎児血液細胞、母体血清のアルファ−フェトプロテイン、母体血清ベータ−ＨＣＧ，および母体血清エストリオールなどの出生前診断に利用できる種々の非侵襲的および侵襲的方法がある。しかし、非侵襲的な方法は特異性が低く、特異性が高くて感受性の高い方法は、侵襲性が高い。さらに、多くの方法では、最も有用性を高めるために、適用できるのは妊娠中のある特定の期間だけである。
【００１０】
超音波検査
これは、無害な非侵襲的方法である。高周波音波は、羊膜腔内の胎児を含む種々の組織および器官によって生じたエコーのパターンから可視画像を生成させるために用いられる。発達しつつある胎芽は懐胎約６週目に視覚化できる。懐胎約１６週目から２０週目に主な内部器官および四肢を評価して異常がないかどうかを判断できる。
【００１１】
超音波検査は、胎児の大きさおよび位置、羊水量および胎児の解剖学的構造の外観を判断するためには有用であり得るが、この方法には限界がある。ダウン症候群のように形態学的異常がしばしば目立たず微妙な識別しにくい異常は全く検出されないことがあり得る。
【００１２】
羊水穿刺
これは、針を母体の下腹部から子宮内部の羊膜腔内へ通す侵襲性の高い方法である。この方法は、懐胎約１４週目に実施できる。出生前診断のためには、たいていの羊水穿刺は懐胎１４週から２０週の間に実施される。しかし、羊水穿刺前には超音波検査を実施し、懐胎令、胎児および胎盤の位置、および十分な羊水が存在しているかどうかの判断する。羊水中に存在する胎児細胞（大部分は胎児の皮膚に由来）を染色体の生化学的分析および分子生物学的分析用に培養液中で増殖させることができる。
【００１３】
染色体または染色体断片の過多または欠失などの大きな染色体異常は、細胞の４６個の全染色体の同定と分析に関与し、それらの染色体を大きさと構造の微妙な違いに基づいて、対応した組に配列する核型決定によって検出できる。このように系統的に並べると、染色体の数と構造の異常は明白である。この方法では完了までに典型的には、７日〜１０日かかる。
【００１４】
羊水穿刺は、直接的な遺伝情報の提供に使用できるが、この操作には、胎児損傷および母体のＲｈ感作などの危険が伴う。羊水穿刺後の胎児死亡の危険性は通常のそれよりも約０．５％上昇する。Ｒｈ陰性の母親は、ＲｈｏＧａｍによって治療を受けることができる。
【００１５】
絨毛膜絨毛試料採取（ＣＶＳ）
この方法では、超音波誘導装置を有するカテーテルを、膣を経てその頚部を通り、子宮内へと発達中の胎盤まで通す。カテーテルの導入によって胎盤の絨毛膜絨毛の細胞を得ることができ、染色体分析などの種々の方法で分析して胎児の核型を決定できる。また、これらの細胞は培養して、生化学的分析または分子生物学的分析をすることができる。ＣＶＳは、典型的に懐胎９．５週から１２．５週の間に実施される。
【００１６】
ＣＶＳは、侵襲的方法であるという不利な点を有し、胎児の疾病率は低いとあいえ、深刻である。すなわち、これらの損傷率は、羊水穿刺を受けている女性よりも約０．５％から１％高い。稀にＣＶＳは胎児の四肢欠損を伴うことがある。また、母体のＲｈ感作の可能性も存在する。さらにまた、胎児細胞の替わりに、発達中の胎盤内の母体血液細胞が試料採取される可能性も存在する。
【００１７】
母体血清のアルファ−フェトプロテイン（ＭＳＡＦＰ）
発達中の胎児は、主要な２つの血液蛋白質−アルブミンおよびアルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）を有する。母体は、通常その血液にアルブミンのみを有するので、胎児のＡＦＰ濃度を測定するためにＭＳＡＦＰ試験が利用できる。通常は、羊水に出て胎盤を通り母体の血液に到達できるＡＦＰはほんの少量である。しかし、胎児が神経管欠陥を有すると、羊水中に漏れ出るＡＦＰが増す。神経管欠陥としては、無脳症（神経管の頭端における閉鎖不全）および二分脊椎（神経管の尾端における閉鎖不全）が挙げられる。このような欠陥の発生率は、米国では出生１，０００件につき約１件から２件である。また、胎児の腹壁に欠陥があると、母体の血液内の胎児ＡＦＰはより多量となる。
【００１８】
ＭＳＡＦＰの量は妊娠令とともに増加する。したがって、ＭＳＡＦＰ試験から正確な結果を得るためには、妊娠令を正確に知る必要がある。また、母親の人種および妊娠糖尿病の存在が、正常であると考えられるはずのＭＳＡＦＰの濃度に影響を及ぼすことがある。ＭＳＡＦＰは、典型的には平均値の倍数（ＭｏＭ）として報告される。ＭｏＭが大きくなるほど、欠陥が存在する可能性も大きくなる。ＭＳＡＦＰ試験は、妊娠１６週から１８週の間に最も高い感受性を有しているが、妊娠１５週から２２週の間に利用できる。ダウン症候群または他の染色体異常が存在する場合、ＭＳＡＦＰはより低くなる傾向がある。
【００１９】
ＭＳＡＦＰ試験は非侵襲性的ではあるが、１００％特異的ではない。ＭＳＡＦＰは、胎児の神経管または腹壁の欠陥に関連していない種々の理由で上昇することがある。ＭＳＡＦＰ上昇の最も一般的な原因は、胎児の妊娠令に対する誤った判断である。したがって、ＭＳＡＦＰ試験の結果は、決定的および結論的に考えられることはない。
【００２０】
母体血清のベータ−ＨＣＧ
受胎および発達中の胎芽の子宮への着床後、約１週目から栄養膜は、妊娠診断に利用できる検出可能なベータ−ＨＣＧ（ヒト絨性ゴナドトロピン）を産生し始める。ベータ−ＨＣＧは、母体血清においても定量でき、流産の恐れがある場合、または異所性妊娠が疑われる場合、ベータ−ＨＣＧ量が正常よりも低くなるため、この定量は妊娠初期に有用であり得る。
【００２１】
第２トリメスターの中期から後期に、染色体異常、特にダウン症候群をスクリーンするために、ベータ−ＨＣＧはＭＳＡＦＰと組合わせて利用できる。ベータ−ＨＣＧの上昇とＭＳＡＦＰの低下とが共に存在する場合は、ダウン症候群が示唆される。高濃度のＨＣＧにより栄養膜疾患（奇胎妊娠）が示唆される。超音波検査で胎児が存在せず、それにＨＣＧの上昇を伴うと胞状奇胎が示唆される。
【００２２】
母体血清のエストリオール
母体血清中のエストリオール量は、胎児が生存可能かどうか、胎盤が正しく機能しているか、また母体が健康状態にあるかどうかによって変わってくる。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、胎児の副腎によって作られ、胎盤内でエストリオールへと代謝される。エストリオールは母体の循環に入り、母体の腎臓によって尿中へ、または母体の肝臓によって胆汁中へ排泄される。第３トリメスターに測定された正常濃度のエストリオールは、胎児の一般的健康状態の目安となる。エストリオールの濃度が低下する場合は、胎児は危険な状態にあり、即時分娩が必要であると考えられる。ダウン症候群が存在する場合、また、無脳症を伴う副腎形成不全が存在する場合、エストリオールは低下する傾向がある。
【００２３】
三重スクリーン試験
三重スクリーン試験は、母体血清アルファ−フェトプロテイン（ＭＳＡＦＰ）、ヒト絨性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および未抱合型エストリオール（ｕＥ３）の分析を含んでなる。血液試験は通常、最後の月経期の１６〜１８週後に実施される。この三重スクリーン試験は、非侵襲的ではあるが、試験の異常結果が出生時欠陥を示しているわけではなく、この試験は、危険性が高いことを示し、さらなる試験が必要であることを示唆するだけである。例えば、１，０００人の女性のうち１００人がこの三重スクリーン試験から異常結果を得る。しかし、出生時欠陥を持つ胎児を有するのは１００人の女性のうちわずか２〜３人である。誤陽性の発生率がこのように高いため、妊婦に非常に大きなストレスと不必要な心配を与える。
【００２４】
母体血液から単離された胎児細胞
母体血液内には胎児有核細胞が存在するため、これらの細胞を非侵襲的な出生前診断に利用することができる（ウォークノースカら（Ｗａｌｋｎｏｗｓｋａ，ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）１：ｐ．１１１９−１１２２、１９６９年；ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２：ｐ．１３６３−６５、１９８９年；ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８８：ｐ．４３９０−９５、１９９６年）。特定のＤＮＡ配列を探すために、胎児細胞を種々の方法によって分類し、分析することができる（ビアンチら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６１：ｐ．８２２−２９、（１９９７）；ビアンチら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）９３：ｐ．７０５−０８、（１９９６））。蛍光インシトウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、母体血液から回収された胎児細胞の特定の染色体を同定し、トリソミーＸおよびモノソミーＸなどの異数体の病態を診断するために適用できる。
【００２５】
ＦＩＳＨ法は、顕微鏡下で特定の染色体または遺伝子の検出を可能にする有色蛍光タグで標識化したＤＮＡプローブを用いる。ＦＩＳＨを用いれば、標準的な核型決定によっては検出できない微妙な遺伝子異常が容易に同定できる。この方法は完了するのに典型的には２４〜２８時間かかる。また、多色ＤＮＡ  ＦＩＳＨプローブのパネルを用いて、異常染色体のコピー数を見ることができる。
【００２６】
胎児細胞の単離および濃縮に関して改善がなされているが、多くの胎児細胞を得ることは依然として困難である。胎児の核型異常の信頼できる判断または他の異常のアッセイには十分とは言えない。さらに、たいていの方法は、時間がかかり、大きな労働量の投入を要し、ハイスループットで実施することは困難である。
【００２７】
母体血液からの胎児ＤＮＡ
母体の血漿および血清において、胎児ＤＮＡが検出され、定量されてきた（ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３５０：ｐ．４８５−４８７（１９９７）；ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６２：ｐ．７６８−７７５（１９９８））。胎児顆粒球、リンパ球、有核赤血球および栄養芽層細胞などの複数の胎児細胞型が母体循環内に存在する（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、産科学および婦人科学（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。胎児ＤＮＡは、懐胎７週目に血清中で検出でき、妊娠期間の増加とともに上昇する。母体の血清と血漿中に存在する胎児ＤＮＡは、胎児細胞単離プロトコルから得られたＤＮＡ濃度に相当する。
【００２８】
循環胎児ＤＮＡは、胎児の性別を決定するために利用されてきた（ローら（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ａｍ．Ｊ．ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．）６２：ｐ．７６８−７７５（１９９８））。また、アカゲザル胎児Ｄ遺伝子型が胎児ＤＮＡを用いて検出されていた。しかしながら、循環胎児ＤＮＡの診断的臨床的適用は、母体ではなく胎児に存在する遺伝子に限られている（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、産科学および婦人科学（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。このように、胎児ＤＮＡ配列を決定することができ、胎児の染色体異常の決定的診断を提供することのできる非侵襲的方法に対する必要性は依然として存在している。
【発明の開示】
【００２９】
発明の簡単な概要
本発明は、突然変異および染色体異常などの遺伝子疾患の検出方法に関する。好ましい態様において、本発明は、限定はしないが、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミーおよび他の異数体、欠失、付加、増幅、断片、転座、および再配列などの変異および染色体異常を検出するために用いられる。多くの異常を同時に検出することができる。また、本発明は妊娠女性の試料から胎児のＤＮＡ配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。本発明は、限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化など、野生型配列に較べた場合の遺伝子配列における何らかの変化を検出するために利用できる。本発明はまた、核酸を含む試料から遊離の核酸を単離するための方法も提供する。
【００３０】
一態様において、本発明は、染色体異常を検出する方法に関しており、前記方法は、（ａ）鋳型ＤＮＡ上、関心対象座の対立遺伝子の配列決定、および（ｂ）（ａ）の関心対象座から同定された関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子比率の定量を含んでなり、前記比率が染色体異常の有無を示す。
【００３１】
他の態様において、本発明は、胎児ＤＮＡ上、関心対象座の配列決定に関する非侵襲的方法を提供し、前記方法は、（ａ）妊娠女性からの試料の獲得；（ｂ）（ａ）の試料に対する細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加；（ｃ）（ｂ）の試料から胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡを含んでなる鋳型ＤＮＡの獲得；（ｄ）鋳型ＤＮＡ上の関心対象座の配列決定を含んでなる。
【００３２】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、汗、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚芽組織、胚芽、２細胞胚芽、４細胞胚芽、８細胞胚芽、１６細胞胚芽、３２細胞胚芽、６４細胞胚芽、１２８細胞胚芽、２５６細胞胚芽、５１２細胞胚芽、１０２４細胞胚芽、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質または身体滲出液などの試料から得られる。
【００３３】
一実施態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の試料から得られる。好ましい一態様において、鋳型ＤＮＡはヒトの妊娠女性から得られる。
【００３４】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは胎芽から得られる。好ましい一態様において、鋳型ＤＮＡは、胎芽の単細胞から得られる。
【００３５】
他の態様において、限定はしないが、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル添加物またはジスルフィド還元物、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、開裂性架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載の化合物などの細胞溶解阻害剤を試料に添加する。好ましい態様では、ホルマリンは試料中に、０．０００１〜０．０３％、０．０３〜０．０５％、０．０５〜０．０８％、０．０８〜０．１％、０．１〜０．３％、０．３〜０．５％、０．５〜０．７％、０．７〜０．９％、０．９〜１．２％、１．２〜１．５％、１．５〜２％、２〜３％、３〜５％、および５％超を含むがこれらに限定されないパーセンテージで存在する。
【００３６】
母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパン（ｈｏｐａｎｅ）テトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン（ｚｏｎｅｇｒａｎ）、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール（ｔｅｇｒｅｔｏｌ）、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール（ｍｅｘｉｔｉｌ）、ジランチン（ｄｉｌａｎｔｉｎ）、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【００３７】
他の態様において、限定はしないが、デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、グアニジン−ＨＣｌ、イソチオシアン酸グアニジン、Ｎ−ラウロイルサルコシンおよびドデシル硫酸ナトリウムなどのＤＮＡの破壊を防ぐ試剤を試料に添加する。
【００３８】
好ましい一態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血漿から得られる。他の態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血清から得られる。
【００３９】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含んでなる。
【００４０】
他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、母体の関心対象のホモ接合座から選択される。他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、母体の関心対象のヘテロ接合座から選択される。
【００４１】
他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、父親の関心対象のホモ接合座から選択される。他の態様において、鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、父親の関心対象のヘテロ接合座から選択される。
【００４２】
一態様において、１つの染色体上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列が決定される。好ましい一態様において、複数の染色体上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列が決定される。
【００４３】
他の態様において、関心対象座の対立遺伝子配列決定は、限定はしないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、質量分析、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光分極、蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、塩基配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアレイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、ＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析などの方法を含んでなる。
【００４４】
好ましい態様において、関心対象座の対立遺伝子配列決定は、（ａ）第１のプライマーおよび関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素に対する認識部位を含有する第２のプライマーを用いて関心対象座を増幅すること；（ｂ）第２のプライマー上の認識部位を認識する制限酵素によって増幅されたＤＮＡを消化すること；（ｃ）鋳型として関心対象座を含有する５’オーバーハングを用いて（ｂ）の消化されたＤＮＡ内へ、ヌクレオチドを組み込むこと；（ｄ）（ｃ）のＤＮＡ配列を決定することによって、関心対象座の配列を決定することを含んでなる。
【００４５】
一態様において、前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでなり得る。さらなる態様において、ＰＣＲのサイクル１のアニーリング温度は、第２のプライマーのアニーリング長の略融解温度であり得る。他の実施態様において、ＰＣＲのサイクル２のアニーリング温度は、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡをアニールする３’領域の略融解温度であり得る。他の態様において、残りのサイクルのアニーリング温度は、第２のプライマーの全配列の略融解温度であり得る。
【００４６】
他の態様において、第２のプライマー上の認識部位は、制限酵素の結合部位から離れて切断し、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素のための認識部位である。好ましい態様において、第２のプライマー上の認識部位は、ＩＩＳ型の制限酵素のためのものである。ＩＩＳ型の制限酵素としては、限定はしないが、ＡｌｗＩ、Ａｌｗ２６Ｉ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、Ｂｓｔ７ｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＥａｒＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、ＳＳｆａＮＩ、およびＳｔｈｉ３２Ｉ、より好ましくはＢｃｅＡＩおよびＢｓｍＦＩが挙げられる。
【００４７】
一態様において、第２のプライマーの３’末端は関心対象座に隣接している。
【００４８】
他の態様において、第２のプライマーのアニーリング長は、３５〜３０、３０〜２５、２５〜２０、２０〜１５、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９．８、７、６、５および４未満の塩基からなる群より選択される。
【００４９】
他の態様において、関心対象座の増幅は、第１のプライマー、および制限酵素認識部位の部分を含有する第２のプライマーを用いることを含んでなり、前記認識部位は、少なくとも１個の可変ヌクレオチドを含有し、増幅後に制限酵素認識部位全体が生成し、前記プライマーの３’領域が鋳型ＤＮＡとの誤対合を含有し、前記制限酵素による消化により、関心対象の座を含有する５’オーバーハングが生成する。
【００５０】
好ましい態様において、制限酵素に対する認識部位としては、限定はしないが、ＢｓａＪＩ（５’Ｃ↓ＣＮＮＧＧ３’）、ＢｓｓＫＩ（５’↓ＣＣＮＧＧ３’）、ＤｄｅＩ（５’Ｃ↓ＴＮＡＧ３’）、ＥｃｏＮＩ（５’ＣＣＴＮＮ↓ＮＮＮＡＧＧ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、Ｆｎｕ４ＨＩ（５’ＧＣ↓ＮＧＣ３’）、ＨｉｎｆＩ（５’Ｇ↓ＡＮＴＣ３’）、ＰｆＬＦ１（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）、Ｓａｕ９６Ｉ（５’Ｇ↓ＧＮＣＣ３’）、ＳｃｒＦＩ（５’ＣＣ↓ＮＧＧ３’）、Ｔｔｈｌ１１Ｉ（５’ＧＡＣＮ↓ＮＮＧＴＣ３’）が挙げられ、より好ましくは、増幅後にＦｎｕ４ＨＩおよびＥｃｏＮＩが生成する。
【００５１】
他の態様において、第１および／または第２のプライマーの５’領域が制限酵素に対する認識部位を含有する。好ましい態様において、前記制限酵素認識部位は、関心対象の座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素認識部位とは異なっている。
【００５２】
さらなる態様において、本発明の方法は、第１および／または第２のプライマーの５’領域における認識部位を認識する制限酵素によって、ＤＮＡを消化することを、さらに含んでなる。
【００５３】
第１および／または第２のプライマーは、５’末端にタグを含有し得る。好ましくは、第１のプライマーが５’末端にタグを含有する。前記タグは、鋳型ＤＮＡから増幅ＤＮＡを分離するために使用することができる。前記タグは、標識ヌクレオチドを含有しない増幅ＤＮＡから標識ヌクレオチドを含有する増幅ＤＮＡを分離するために使用することができる。前記タグは、限定されないが、ラジオアイソトープ、蛍光レポーター分子、化学的ルミネセンスレポーター分子、抗体、抗体断片、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、ホモポリマーのオリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反磁性部分、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分、またはそれらの組合わせを含む、いかなる化学的部分でありうる。好ましくは、前記タグは、ビオチンである。ビオチンタグは、ストレプトアビジンマトリックスを用いて、鋳型ＤＮＡから増幅ＤＮＡを分離するために使用される。ストレプトアビジンマトリックスは、マイクロ滴定プレートのウェルを被覆する。
【００５４】
本発明の方法におけるヌクレオチドの取込みは、限定はしないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスポリメラーゼ類、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ベントポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼなどのＤＮＡポリメラーゼによる。ヌクレオチドの取り込みは、標識ヌクレオチドおよび未標識ヌクレオチドの混合物の使用をさらに含んでなり得る。１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、または５個を超えるヌクレオチドを取り込むことができる。標識ヌクレオチドおよび未標識ヌクレオチドの組合わせを取り込むことができる。標識ヌクレオチドは、三リン酸ジデオキシヌクレオチド（「ジデオキシ」とも称する）および三リン酸デオキシヌクレオチド（「デオキシ」とも称する）からなる群より選択される。未標識ヌクレオチドは、三リン酸ジデオキシヌクレオチドおよび三リン酸デオキシヌクレオチドからなる群より選択される。標識ヌクレオチドは、限定されないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分を含む分子によって標識化する。好ましくは、標識ヌクレオチドは、蛍光分子によって標識化する。蛍光標識ヌクレオチドの取込みは、蛍光ヌクレオチドおよび未標識ヌクレオチドの混合物の使用をさらに含んでなる。
【００５５】
一態様において、関心対象の座の配列決定は、取込みヌクレオチドの検出を含んでなる。一態様において、前記検出は、ゲル電気泳動、毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、蛍光検出、蛍光局在化、ＤＮＡ塩基配列決定、サンガージデオキシ塩基配列決定、ＥＬＩＳＡ、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、扇形磁場質量分析、扇形電場質量分析、蛍光分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリー、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ、ＨｕＳＮＰアレイ、ビーズアレイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、ＳＮＰ−ＩＴ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＣｌｅａｖｅ、サザンブロット、スロットブロットおよびドットブロットからなる群より選択される方法による。
【００５６】
一態様において、鋳型ＤＮＡの１つの染色体上の関心対象の座の１個から数十個、数百個、数千個までの対立遺伝子配列が決定される。好ましい一態様において、複数の染色体上の関心対象の座の１個から数十個、数百個、数千個までの対立遺伝子配列が決定される。
【００５７】
好ましい一態様において、関心対象の座は、１個のヌクレオチド多形または突然変異を含有する疑いがある。この方法は、関心対象の複数の座の配列を同時に決定するために利用できる。鋳型ＤＮＡは、１つの染色体の複数の座を含んでなり得る。鋳型ＤＮＡは種々の染色体の複数の座を含んでなり得る。鋳型ＤＮＡ上の関心対象の座は１つの反応において増幅できる。あるいは、鋳型ＤＮＡ上の関心対象の座の各々は別の反応において増幅できる。増幅ＤＮＡは増幅ＤＮＡの消化前に、一緒にプールできる。関心対象の座を含有する標識ＤＮＡの各々は、関心対象の座の配列を決定する前に分離できる。好ましい一態様において、関心対象の座の少なくとも１つは、１個のヌクレオチド多形または突然変異を含有する疑いがある。
【００５８】
他の態様において、一染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を、異なった染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。比較できる染色体については限定されない。任意の染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を、他の任意の染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較することができる。好ましい一態様において、一染色体上の関心対象の複数ヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を合計して、異なった染色体上の関心対象の複数ヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。
【００５９】
他の態様において、一染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を、２個、３個、４個、または４個を超える染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。他の実施態様において、一染色体上の関心対象の複数の座における対立遺伝子の比率を、２個、３個、４個、または４個を超える染色体上の関心対象の複数の座における対立遺伝子の比率と比較する。
【００６０】
他の態様において、一染色体上の関心対象の対立遺伝子の比率を、異なった染色体上の関心対象の対立遺伝子の比率と比較するが、前記比率の違いは、染色体異常の有無を示す。他の態様において、一染色体上の関心対象の複数の対立遺伝子の比率を、異なった染色体上の関心対象の複数の対立遺伝子の比率と比較するが、前記比率の違いは、染色体異常の有無を示す。
【００６１】
他の態様において、妊娠女性の試料から得られた鋳型ＤＮＡ上の１個から数十個、数百個、数千個までの関心対象の座の配列が決定される。一態様において、関心対象の座は、１個の染色体上にある。他の態様において、関心対象の座は、複数の染色体上にある。
【００６２】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、核酸を単離する段階を提供する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）核酸を単離する段階。好ましい態様では、この方法は、遊離の核酸を単離する際に用いられる。最も好ましい態様では、この方法は、遊離の胎児核酸を単離する際に用いられる。
【００６３】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、遊離の胎児核酸を単離する方法を提供する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；（ｃ）血液試料から血漿を単離する段階（血漿は血液試料を遠心分離することで単離する）；ならびに（ｄ）「バフィーコート」の破壊を最小限に抑える手順で上清（血漿を含む）を除去する段階。
【００６４】
別の態様では、核酸を含む試料を、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、乳房分泌液、乳汁、膣分泌物、汗、臍帯血、絨毛膜、羊水、胚組織、胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、３２細胞期胚、６４細胞期胚、１２８細胞期胚、２５６細胞期胚、５１２細胞期胚、１０２４細胞期胚、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水、糞便、または身体浸出物を含むがこれらに限定されない、任意の核酸含有供給源から得る。
【００６５】
一つの態様では、核酸を含む試料を妊娠した雌から得る。好ましい態様では、試料を妊娠したヒト女性から得る。好ましい態様では、試料は妊娠女性から得られた血液である。
【００６６】
別の態様では、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒド誘導体、架橋剤、一級アミノ基反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加もしくはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、切断可能な架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載された化合物を含むがこれらに限定されない、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を試料に添加する。
【００６７】
アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を試料に添加することができる。
【００６８】
別の態様では、ＤＮａｓｅ阻害剤、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、塩酸グアニジン、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびＮａ−ドデシル硫酸を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡの破壊を防ぐ薬剤を試料に添加する。
【００６９】
好ましい態様では、妊娠女性の血液から得られた血漿から核酸を単離する。別の態様では、母親由来の細胞の溶解量を最小とするように設計された手順で得られた血漿から核酸を単離する。別の態様では、妊娠女性の血液を遠心分離し、ブレーキをかけることなく遠心分離を停止させることで、血漿から核酸を単離する。
【００７０】
好ましい態様では、妊娠女性の血液から得られた血漿から、遊離の核酸を単離する。別の態様では、妊娠女性から得られた血液を遠心分離し、ブレーキをかけることなく遠心分離を停止させる（遠心分離は自然減速で停止する）ことで得られた血漿から、遊離の核酸を単離する。別の態様では、妊娠女性の血液を０〜５０ｒｐｍ、５０〜１００ｒｐｍ、１００〜２００ｒｐｍ、２００〜３００ｒｐｍ、３００〜４００ｒｐｍ、４００〜５００ｒｐｍ、５００〜６００ｒｐｍ、６００〜７００ｒｐｍ、７００〜８００ｒｐｍ、８００〜９００ｒｐｍ、９００〜１０００ｒｐｍ、１０００〜２０００ｒｐｍ、２０００〜３０００ｒｐｍ、３０００〜４０００ｒｐｍ、４０００〜５０００ｒｐｍ、５０００〜６０００ｒｐｍ、６０００〜７０００ｒｐｍ、７０００〜８０００ｒｐｍ、および８０００ｒｐｍ超を含むがこれらに限定されない速度で遠心分離する。好ましい態様では、妊娠女性の血液を４０００ｒｐｍ未満の速度で遠心分離する。別の態様では、遠心分離時に加速力を加えない。
【００７１】
発明の詳細な説明
本発明は、限定はしないが、挿入、欠失、および染色体異常などの遺伝子疾患の検出方法を提供し、特に、胎児の遺伝子疾患の検出に有用である。本法は、転座、付加、増幅、トランスバージョン、逆位、異数性、倍数性、モノソミー、トリソミー、トリソミー２１、トリソミー１３、トリソミー１４、トリソミー１５、トリソミー１６、トリソミー１８、トリソミー２２、三倍体、四倍体、ならびに限定されないが、ＸＯ、ＸＸＹ、ＸＹＹおよびＸＸＸなどの性染色体異常の検出に特に有用である。また本法は、胎児ＤＮＡの配列および胎児ＤＮＡの変異を識別する配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。
【００７２】
本発明は、染色体異常を検出する方法に関しており、前記方法は、（ａ）鋳型ＤＮＡ上、関心対象座の対立遺伝子の配列決定、および（ｂ）（ａ）の関心対象座から同定された関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子比率の定量を含んでなり、前記比率が染色体異常の有無を示す。
【００７３】
他の態様において、本発明は、胎児ＤＮＡ上、関心対象座の配列決定に関して非侵襲的方法を提供し、前記方法は、（ａ）妊娠女性からの試料の獲得；（ｂ）（ａ）の試料に対する細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加；（ｃ）（ｂ）の試料から胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡを含んでなる鋳型ＤＮＡの獲得；（ｄ）鋳型ＤＮＡ上の関心対象座の配列決定を含んでなる。
【００７４】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、ＤＮＡを単離する方法に関する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）ＤＮＡを単離する段階。
【００７５】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、遊離のＤＮＡを単離する方法に関する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）ＤＮＡを単離する段階。
【００７６】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡを単離する段階を含む、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤が添加された核酸含有試料から、遊離のＤＮＡを単離する方法に関する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、遊離の胎児ＤＮＡを単離する方法に関する：（ａ）核酸を含む試料を得る段階；（ｂ）細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤を（ａ）の試料に添加する段階；ならびに（ｃ）ＤＮＡを単離する段階。別の態様では、塩化セシウム勾配、勾配、ショ糖勾配、グルコース勾配、遠心分離プロトコル、煮沸、Ｑｉａｇｅｎ社の精製システム、ＱＩＡ  ＤＮＡ血液精製キット、ＨｉＳｐｅｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドキット、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＤＮＡ精製システム、ＭａｎｇｅＳｉｌ常磁性粒子をベースとしたシステム、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶテクノロジー、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ精製キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ社の精製システム、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ精製キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の精製システム、ＣＯＮＣＥＲＴ社の精製システム、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の精製システム、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  ＢｌｏｏｄＳｐｉｎキット、およびＵｌｒａＣｌｅａｎ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡキットを含むがこれらに限定されない、当技術分野に適した任意の手法でＤＮＡを単離する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、ＤＮＡを単離する段階を含む、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤が添加された核酸を含む試料から、遊離の胎児ＤＮＡを単離する方法に関する。好ましい態様では、妊娠女性の血液から得られた血漿または血清から、遊離の胎児ＤＮＡを単離する。
【００７９】
別の態様では、試料を遠心分離する段階（遠心分離の制動力はゼロに設定＝遠心分離時にブレーキをかけない）、「バフィーコート」の攪乱を最小限またはゼロに抑えながら上清を新しいチューブに移す段階、ならびに上清の一部のみを新しいチューブに移す段階を含むがこれらに限定されない、試料中の母親由来のＤＮＡの量を実質的に減少させる手法および／またはプロトコルでＤＮＡを単離する。好ましい態様では、遠心分離時の加速力と制動力はいずれもゼロに設定する。
【００８０】
別の態様では、試料を遠心分離する段階（遠心分離の加速力はゼロに設定）、「バフィーコート」の攪乱を最小限またはゼロに抑えながら上清を新しいチューブに移す段階、ならびに上清の一部のみを新しいチューブに移す段階を含むがこれらに限定されない、試料中の母親由来のＤＮＡの量を実質的に減少させる手法および／またはプロトコルでＤＮＡを単離する。
【００８１】
別の態様では、シリンジまたはニードルを用いて「バフィーコート」を除く段階を含むがこれらに限定されない、任意の適用可能な方法で、「バフィーコート」をチューブから除去してから上清を除去する。
【００８２】
別の態様では、遠心分離時の制動力を、最大制動力の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％を含むがこれらに限定されないパーセンテージに設定する。
【００８３】
別の態様では、遠心分離時の加速力を、最大加速力の１〜５％、５〜１０％、１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％を含むがこれらに限定されないパーセンテージに設定する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約１５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約２０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約３０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約４０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約５０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約６０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約７０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約８０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９１％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９２％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９３％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９４％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９６％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９７％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９８％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９％、および遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９．５％を含むがこれらに限定されない）。
【００８５】
別の態様では、本発明は、出生前診断を目的とした、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物を使用する方法に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約１５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約２０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約３０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約４０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約５０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約６０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約７０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約８０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９０％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９１％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９２％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９３％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９４％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９５％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９６％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９７％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９８％、遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９％、および遊離の胎児ＤＮＡが少なくとも約９９．５％を含むがこれらに限定されない）。
【００８６】
別の態様では、本発明は、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが約１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが約１５〜１６％、遊離の胎児ＤＮＡが約１６〜１７％、遊離の胎児ＤＮＡが約１７〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが約１８〜１９％、遊離の胎児ＤＮＡが約１９〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが約２０〜２１％、遊離の胎児ＤＮＡが約２１〜２２％、遊離の胎児ＤＮＡが約２２〜２３％、遊離の胎児ＤＮＡが約２３〜２４％、遊離の胎児ＤＮＡが約２４〜２５％、遊離の胎児ＤＮＡが約２５〜３５％、遊離の胎児ＤＮＡが約３５〜４５％、遊離の胎児ＤＮＡが約４５〜５５％、遊離の胎児ＤＮＡが約５５〜６５％、遊離の胎児ＤＮＡが約６５〜７５％、遊離の胎児ＤＮＡが約７５〜８５％、遊離の胎児ＤＮＡが約８５〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが約９０〜９１％、遊離の胎児ＤＮＡが約９１〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが約９２〜９３％、遊離の胎児ＤＮＡが約９３〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが約９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが約９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが約９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが約９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが約９８〜９９％、および遊離の胎児ＤＮＡが約９９〜９９．７％を含むがこれらに限定されない）。
【００８７】
別の態様では、本発明は、出生前診断を目的とした、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物を使用する方法に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが約１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが約１５〜１６％、遊離の胎児ＤＮＡが約１６〜１７％、遊離の胎児ＤＮＡが約１７〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが約１８〜１９％、遊離の胎児ＤＮＡが約１９〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが約２０〜２１％、遊離の胎児ＤＮＡが約２１〜２２％、遊離の胎児ＤＮＡが約２２〜２３％、遊離の胎児ＤＮＡが約２３〜２４％、遊離の胎児ＤＮＡが約２４〜２５％、遊離の胎児ＤＮＡが約２５〜３５％、遊離の胎児ＤＮＡが約３５〜４５％、遊離の胎児ＤＮＡが約４５〜５５％、遊離の胎児ＤＮＡが約５５〜６５％、遊離の胎児ＤＮＡが約６５〜７５％、遊離の胎児ＤＮＡが約７５〜８５％、遊離の胎児ＤＮＡが約８５〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが約９０〜９１％、遊離の胎児ＤＮＡが約９１〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが約９２〜９３％、遊離の胎児ＤＮＡが約９３〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが約９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが約９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが約９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが約９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが約９８〜９９％、または遊離の胎児ＤＮＡが約９９〜９９．７％を含むがこれらに限定されない）。
【００８８】
別の態様では、本発明は、遊離の胎児ＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが最大１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１５〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１８〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大２０〜４０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大４０〜５０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大５０〜６０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大６０〜７０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大７０〜８０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大８０〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９０〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９２〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９８〜９９％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９９〜９９．５％、および遊離の胎児ＤＮＡが最大９９．５〜９９．９％を含むがこれらに限定されない）。
【００８９】
別の態様では、本発明は、出生前診断を目的とした、遊離の胎児由来のＤＮＡおよび遊離の母親由来のＤＮＡを含む組成物を使用する方法に関する（組成物中における遊離の母親由来のＤＮＡに対する遊離の胎児由来のＤＮＡの割合は、遊離の胎児ＤＮＡが最大１３〜１５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１５〜１８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大１８〜２０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大２０〜４０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大４０〜５０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大５０〜６０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大６０〜７０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大７０〜８０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大８０〜９０％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９０〜９２％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９２〜９４％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９４〜９５％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９５〜９６％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９６〜９７％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９７〜９８％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９８〜９９％、遊離の胎児ＤＮＡが最大９９〜９９．５％、および遊離の胎児ＤＮＡが最大９９．５〜９９．９％を含むがこれらに限定されない）。
【００９０】
鋳型ＤＮＡ
「関心対象座」とは、核酸の広い領域内に存在する、ある選択された領域を意味する。関心対象座が、限定はしないが、１〜１００、１〜５０、１〜２０個または１〜１０個のヌクレオチドであり、好ましくは、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２個または１個のヌクレオチドである。
【００９１】
本明細書で用いられる「対立遺伝子」とは、染色体上の同じ位置を占めている遺伝子またはＤＮＡの非コード領域を代替的に示す用語の一つである。用語、対立遺伝子は、限定はしないが、細菌、ウィルス、真菌、原生動物、糸状菌、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物および古細菌などのいずれかの生物からのＤＮＡを記述するために使用できる。
【００９２】
例えば、細菌は、典型的には大型の一本鎖ＤＮＡを有する。細菌ＤＮＡに関して、用語、対立遺伝子とは、同じ種の異なった細菌細胞における同一の遺伝子形態と較べた際のある細胞に見られる遺伝子形態を言う。
【００９３】
対立遺伝子は、同一の配列を有することがあるか、または、１個のヌクレオチド、または１個を超えるヌクレオチドが変化していることがある。各染色体が２つのコピーを有する生物に関して、双方の染色体が同一の対立遺伝子を有する場合、この状態はホモ接合と呼ばれる。２本の染色体における対立遺伝子が異なっている場合、この状態は、ヘテロ接合と呼ばれる。例えば、関心対象座が染色体１上のＳＮＰＸである場合、母親の染色体がＳＮＰＸにアデニンを含有し（対立遺伝子Ａ）、父親の染色体がＳＮＰＸにグアニンを含有（対立遺伝子Ｇ）していると、個体はＳＮＰＸにおいてヘテロ接合である。
【００９４】
本明細書で用いられる配列とは、ポリヌクレオチド内の１個のヌクレオチドまたは１個を超える隣接するヌクレオチドの同一性を意味する。単一のヌクレオチド、例えば１個のＳＮＰの場合、「配列」と「同一性」とは、本明細書で交換可能に用いられる。
【００９５】
用語の「染色体異常」とは、患者染色体と正常な相同染色体との間の偏差を言う。用語の「正常」とは、ある特定の種の健康な個体に見られる優位を占める核型または横縞模様を言う。染色体異常は、数に関することもあり、また構造的なこともあり、限定はしないが、異数性、倍数性、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部欠失、付加、染色体の一部付加、挿入、染色体断片、染色体領域、染色体再配列および転座を含む。染色体異常は、病理学的状態の存在に関連して得るか、または病理学的状態へ発展する傾向と関連して得る。本明細書で定義された単一ヌクレオチド多形（「ＳＮＰ」）は、染色体異常ではない。
【００９６】
本明細書で用いられる、ポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みとは、同義的に、伸長反応またははめ込み（Ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応を意味する。
【００９７】
個体に関して本明細書で用いられる「突然変異対立遺伝子」とは、疾病状態を伴う変異体対立遺伝子を言う。
【００９８】
用語の「鋳型」とは、本発明の増幅に使用できる任意の核酸分子を言う。本来は二本鎖ではないＲＮＡまたはＤＮＡを二本鎖ＤＮＡにして、鋳型ＤＮＡとして使用するすることができる。鋳型ＤＮＡに含有する関心対象の１個または複数の座を増幅するために、任意の二本鎖ＤＮＡまたは複数の種々の二本鎖ＤＮＡ分子を含有する調製物を鋳型ＤＮＡとして用いることができる。
【００９９】
鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、ヒト、非ヒト、哺乳動物、爬虫類、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、イノシシ、ブタ、サル、類人猿、ゴリラ、雄牛、牝牛、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽類、ネズミ、魚類、イルカ、クジラおよびサメなどの任意の供給源から得ることができる。
【０１００】
鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、腹膜液、腹水、膣分泌液、乳房分泌液、乳汁、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚芽、２細胞胚芽、４細胞胚芽、８細胞胚芽、１６細胞胚芽、３２細胞胚芽、６４細胞胚芽、１２８細胞胚芽、２５６細胞胚芽、５１２細胞胚芽、１０２４細胞胚芽、胚芽組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、または他の身体滲出液、糞便物質、同じ核酸を含有する供給源の個々の細胞または抽出物およびミトコンドリアなどの非細胞構造物の核酸含有試料などの任意の適切な試料からの当業界で十分に確立されたプロトコルを用いたものであり得る。
【０１０１】
一態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の試料から得ることができる。
【０１０２】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、胎芽から得ることができる。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、胎芽の単一細胞から得ることができる。
【０１０３】
一態様において、鋳型ＤＮＡは胎児ＤＮＡである。胎児ＤＮＡは限定はしないが、母体血液、母体血清、母体血漿、胎児細胞、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、尿、唾液、細胞または組織などの供給源から得ることができる。
【０１０４】
他の態様において、限定はしないが、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル添加物またはジスルフィド還元物、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、開裂性架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載の化合物などの細胞溶解阻害剤を試料に添加する。好ましい態様では、ホルマリンは試料中に、０．０００１〜０．０３％、０．０３〜０．０５％、０．０５〜０．０８％、０．０８〜０．１％、０．１〜０．３％、０．３〜０．５％、０．５〜０．７％、０．７〜０．９％、０．９〜１．２％、１．２〜１．５％、１．５〜２％、２〜３％、３〜５％、および５％超を含むがこれらに限定されないパーセンテージで存在する。別の態様では、架橋剤と細胞膜安定化剤、架橋剤と細胞溶解阻害剤、ならびに細胞膜安定化剤と細胞溶解阻害剤を含むがこれらに限定されない、架橋剤、細胞膜安定化剤、または細胞溶解阻害剤の任意の組合わせを試料に添加することができる。複数種の架橋剤を、複数種の細胞膜安定化剤とともに使用することができる。複数種の架橋剤を、複数種の細胞溶解阻害剤とともに使用することができる。複数種の細胞膜安定化剤を、複数種の細胞溶解阻害剤とともに使用することができる。
【０１０５】
別の態様では、溶解を細胞の約１０％未満とするように、細胞溶解阻害剤を試料に添加する。好ましい態様では、溶解を細胞の約５％未満とするように、細胞溶解阻害剤を試料に添加する。最も好ましい態様では、溶解を細胞の約１％未満とするように、細胞溶解阻害剤を試料に添加する。
【０１０６】
別の態様では、溶解を細胞の約１０％未満とするように、細胞膜安定化剤を試料に添加する。好ましい態様では、溶解を細胞の約５％未満とするように、細胞膜安定化剤を試料に添加する。最も好ましい態様では、溶解を細胞の約１％未満とするように、細胞膜安定化剤を試料に添加する。
【０１０７】
別の態様では、溶解を細胞の約１０％未満とするように、架橋剤を試料に添加する。好ましい態様では、溶解を細胞の約５％未満とするように、架橋剤を試料に添加する。最も好ましい態様では、溶解を細胞の約１％未満とするように、架橋剤を試料に添加する。
【０１０８】
別の態様では、細胞溶解阻害剤、架橋剤、または細胞膜安定化剤を、試料の採取後に１〜１０秒間、１０〜３０秒間、３０〜６０秒間、１〜５分間、５〜１０分間、１０〜２０分間、２０〜３０分間、３０〜４０分間、４０〜５０分間、６０〜９０分間、９０〜１８０分間、または１８０分間超を含むがこれらに限定されない適用可能な時間をかけて試料に添加する。別の態様では、細胞溶解阻害剤、架橋剤、または細胞膜安定化剤は、ガラス製チューブ、プラスチック製チューブ、円形容器、エッペンドルフチューブ、ＩＶバッグ、または他の任意の適切な採取用装置を含むがこれらに限定されない、試料採取装置内に存在する。別の態様では、細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加後に、試料を、１〜５分間、５〜１０分間、１０〜２０分間、２０〜４０分間、４０〜６０分間、６０〜９０分間、９０〜１２０分間、１２０〜１５０分間、１５０〜１８０分間、１８０〜２４０分間、２４０〜３００分間、または３００分間超を含むがこれらに限定されない、試薬を機能させる期間、ほぼ室温で静置する。
【０１０９】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡの双方を含有する。好ましい態様において鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液から得られる。血液は、限定はしないが、静脈穿刺などの標準的な血液吸引法を用いて採血する。例えば、血液は肘内側の静脈、または手の裏側の静脈から吸引する。血液試料は、妊娠女性から懐胎の間、任意の時に採血できる。例えば、血液試料はヒト女性から、懐胎１〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、２４〜２８、２８〜３２、３２〜３６、３６〜４０、または４０〜４４週目、好ましくは、懐胎８〜２８週目に採血できる。
【０１１０】
血液試料は、母体細胞から血漿を分離するため、遠心分離する。血漿フラクションと母体細胞フラクションとを別々の管に移して再度遠心分離する。血漿フラクションは、細胞を含まない胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含有する。胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを単離するために、限定はしないが、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）から供給されるキアアンプＤＮＡブラッド・ミディ・キット（ＱＩＡａｍｐＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）などの任意の標準的ＤＮＡ単離法を用いることができる。
【０１１１】
好ましい一態様において、限定はしないが、ＥＤＴＡなどのマグネシウムキレート剤を含有する装置内へ血液を採取でき、４℃で貯蔵する。場合によっては、限定はしないが、ＥＧＴＡなどのカルシウムキレート剤を添加できる。
【０１１２】
他の態様において、限定はしないが、ホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質および核酸架橋剤、第一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル添加物またはジスルフィド還元物、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、開裂性架橋剤、ＡＥＤＰ、ＡＰＧ、ＢＡＳＥＤ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、ＢＭ（ＰＥＯ）４、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＳ３、ＢＳＯＣＯＥＳ、ＤＦＤＮＢ、ＤＭＡ、ＤＭＰ、ＤＭＳ、ＤＰＤＰＢ、ＤＳＧ、ＤＳＰ、ＤＳＳ、ＤＳＴ、ＤＴＢＰ、ＤＴＭＥ、ＤＴＳＳＰ、ＥＧＳ、ＨＢＶＳ、スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ、スルホ−ＤＳＴ、スルホ−ＥＧＳ、または表ＸＸＩＩＩに記載の化合物などの細胞溶解阻害剤を試料に添加する。
【０１１３】
別の態様では、母親由来の細胞の溶解を抑えるために、アルデヒド、尿素ホルムアルデヒド、フェノールホルムアルデヒド、ＤＭＡＥ（ジメチルアミノメタノール）、コレステロール、コレステロール誘導体、高濃度マグネシウム、ビタミンＥおよびビタミンＥ誘導体、カルシウム、グルコン酸カルシウム、タウリン、ナイアシン、ヒドロキシルアミン誘導体、ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ、ショ糖、アスタキサンチン、グルコース、アミトリプチリン、異性体Ａホパンテトラフェニル酢酸、異性体Ｂホパンテトラフェニル酢酸、シチコリン、イノシトール、ビタミンＢ、ビタミンＢ複合体、ヘミコハク酸コレステロール、ソルビトール、カルシウム、補酵素Ｑ、ユビキノン、ビタミンＫ、ビタミンＫ複合体、メナキノン、ゾネグラン、亜鉛、イチョウ抽出物、ジフェニルヒダントイン、ｐｅｒｆｔｏｒａｎ、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルセリン、テグレトール、ＰＡＢＡ、クロモグリク酸二ナトリウム、ネドクロミルナトリウム、フェニトイン、クエン酸亜鉛、メキシチール、ジランチン、ヒアルロン酸ナトリウム、またはポロキサマー１８８を含むがこれらに限定されない、細胞膜を安定化する薬剤を、母親由来の血液試料に添加することができる。
【０１１４】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。母体血漿中胎児ＤＮＡのパーセンテージは、０．３９％から１１．９％の間である（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、産科学および婦人科学（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ）９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。血液試料中の大部分のＤＮＡは母体ＤＮＡであるため、胎児の遺伝子型決定のためのＤＮＡ使用は困難である。しかし、母体血漿中の胎児ＤＮＡのパーセンテージを上昇させる方法により、胎児ＤＮＡの配列決定が可能となり、突然変異挿入、欠失および染色体異常などの遺伝子疾患の検出が可能になる。母体血液試料への細胞溶解阻害剤、細胞膜安定化剤、または架橋剤の添加により、胎児ＤＮＡの相対的比率を上げることができる。母体細胞と胎児細胞の双方の溶解が阻害されるが、大部分の細胞は母体細胞であるため、母体細胞の溶解を阻害することにより、遊離の胎児ＤＮＡのパーセンテージが相対的に増加する。実施例４を参照されたい。
【０１１５】
他の態様において、大型ボア針、短針、テフロン（登録商標）などの層流を増加させる針被覆、層流を増加させるための針斜角の変更、または血流速度を低下させる技術など細胞溶解量を減少させる血液吸引の技術、方法、プロトコルまたは装置を使用することができる。胎児細胞は、母体の免疫系によって母体血液中で破壊され易い。しかし、血液吸引または血液試料の処理の結果、大部分の母体細胞溶解が生じ易い。したがって、細胞溶解を防止または減少させる方法によって、試料内の母体ＤＮＡ量が減少し、遊離の胎児ＤＮＡの相対的パーセンテージが上昇する。
【０１１６】
他の態様において、細胞溶解量を減少させるために、細胞の構造完全性を保存または安定化する試剤を使用することができる。
【０１１７】
別の態様では、母親由来の血液中における遊離の母親由来のＤＮＡの量を減らす任意のプロトコルを、試料を得る前に使用することができる。別の態様では、試料を得る前に、妊娠女性を０〜５分間、５〜１０分間、１０〜１５分間、１５〜２０分間、２０〜２５分間、２５〜３０分間、３０〜３５分間、３５〜４０分間、４０〜４５分間、４５〜５０分間、５０〜５５分間、５５〜６０分間、６０〜１２０分間、１２０〜１８０分間、１８０〜２４０分間、２４０〜３００分間、３００〜３６０分間、３６０〜４２０分間、４２０〜４８０分間、４８０〜５４０分間、５４０〜６００分間、６００〜６６０分間、６６０〜７２０分間、７２０〜７８０分間、７８０〜８４０分間、８４０〜９００分間、９００〜１２００分間、１２００〜１５００分間、１５００〜１８００分間、１８００〜２１００分間、２１００〜２４００分間、２４００〜２７００分間、２７００〜３０００分間、３０００〜３３００分間、３３００〜３６００分間、３６００〜３９００分間、３９００〜４２００分間、４２００〜４５００分間、および４５００分間超を含むがこれらに限定されない期間、運動させることなく休息させる。別の態様では、妊娠女性が身体的にリラックスした状態になってから試料を得る。試料を得る前の休息時間を確保することで、試料中の母親由来の核酸の量が減少する場合がある。別の態様では、試料を午前４〜５時、午前５〜６時、午前６〜７時、午前７〜８時、午前８〜９時、午前９〜１０時、午前１０〜１１時、および午前１１〜１２時を含むがこれらに限定されない、午前中の時間帯に妊娠女性から得る。
【０１１８】
別の態様では、妊娠女性に、０〜１時間、１〜２時間、２〜３時間、３〜４時間、４〜５時間、５〜６時間、６〜７時間、７〜８時間、８〜９時間、９〜１０時間、１０〜１１時間、１１〜１２時間、または１２時間超を含むがこれらに限定されない時間、睡眠をとらせた後に、妊娠女性から試料を得る。
【０１１９】
別の態様では、試料を得る前に、妊娠女性は、一定の時間、運動をした後に休息させる。別の態様では、運動時間は、０〜１５分間、１５〜３０分間、３０〜４５分間、４５〜６０分間、６０〜１２０分間、１２０〜２４０分間、または２４０分間超を含むがこれらに限定されない。
【０１２０】
他の態様において、限定はしないが、デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤、塩化亜鉛、エチレンジアミン四酢酸、グアニジン−ＨＣｌ、イソチオシアン酸グアニジン、Ｎ−ラウロイルサルコシンおよびドデシル酸ナトリウムなどのＤＮＡの破壊を防ぐ試剤を血液試料に添加できる。
【０１２１】
他の態様において、胎児ＤＮＡは胎児細胞から得られ、前記胎児細胞は、限定はしないが、母体血液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胎芽組織および母体の子宮頚部または膣から得られた粘液などの供給源から単離できる。
【０１２２】
ある好ましい他の態様において、胎児細胞は母体の末梢血から単離される。母体血清からの胎児細胞を精製するために、胎児細胞に特異的な抗体を使用することができる（ミューラーら（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３３６：ｐ．１９７−２００（１９９０）；ガンシャート−アーラートら（Ｇａｎｓｈｉｒｔ−Ａｈｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、産科学および婦人科学のアメリカ・ジャーナル（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．）１６６：ｐ．１３５０−１３５５（１９９２））。胎児細胞を濃縮するために、フローサイトメトリー法を用いることもできる（ヘルツェンバークら（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）７６：ｐ．１４５３−１４５５（１９７９）；ビアンチら（Ｂｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（ＰＮＡＳ）８７：ｐ．３２７９−３２８３（１９９０）；ブラッチら（Ｂｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、プレネイタル・ダイアグノーシス（Ｐｒｅｎａｔａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）１１：ｐ．７８７−７９８（１９９１））。また、米国特許第５，４３２，０５４号明細書は、広い上部と細い毛細管の底部を有するポリエチレン製の管を用いることにより胎児の有核赤血球細胞を分離する方法を記載している。速度可変プログラムを用いた遠心分離により、赤血球はその分子密度に基づいて毛細管内に重なる。胎児赤血球などの低密度赤血球を含有する密度フラクションを回収して、次に母体赤血球を優先的に破壊するように特異的に溶血する。高浸透圧媒体中の密度勾配を用いて、胎児赤血球の濃くなった赤血球を、リンパ球および破裂した母体細胞から分離する。高浸透圧溶液の使用により赤血球は、収縮し、それらの密度が増加し、より密度の高いリンパ球からの精製が促進される。胎児細胞が単離された後、当業界の標準的方法を用いて胎児ＤＮＡを精製することができる。
【０１２３】
分析された核酸は、独特のＤＮＡ配列を含む任意の核酸、例えば、ゲノム、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、人工すなわち人間の作成したＤＮＡならびにｃＤＮＡなど、ＲＮＡ試料から逆転写されたＤＮＡであり得る。ＲＮＡの配列は、鋳型ＤＮＡとして用いるために二本鎖ＤＮＡの形態にすることができる場合は、本発明により決定することができる。
【０１２４】
鋳型にアニールし、その鋳型のコピー合成をプライムするために使用できるオリゴヌクレオチドの考察に用いられる場合の用語の「プライマー」および「オリゴヌクレオチドプライマー」は交換不能である。
【０１２５】
「増幅」ＤＮＡとは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって、一回、または複数回コピーされたＤＮＡである。十分な数の関心対象座のコピーが、アッセイされる試料中に既に存在しているなど、大量のＤＮＡがアッセイに利用できる場合は、関心対象座のＤＮＡを「増幅」して、より大量の複製コピーにする必要はないと思われる。むしろ、制限酵素認識部位を二本鎖にできるヘアピン構造を含有し得る適切なプラーマーのセットを用いて鋳型ＤＮＡを一回「コピー」するだけで十分であり得る。
【０１２６】
「コピーＤＮＡ」の「コピー」とは、一回コピーされたＤＮＡまたは増幅されて一回よりも多くコピーされたＤＮＡを言う。
【０１２７】
一態様において、核酸は、核酸源を含有する元の試料内で直接増幅される。核酸が抽出、精製、または単離される必要はなく、必要なのは、ただ増幅できる形態で提供されることだけである。増幅前のプライマーによる鋳型核酸のハイブリダイゼーションは必要ない。例えば、増幅は、当業界で周知の標準的プロトコルを用いて細胞溶解液または試料溶解液内で実施することができる。固体支持体上の生物学的固定調製物内の、あるいは、非ＤＮＡ物質を含有する組成物中のＤＮＡであって、固体支持体または固定調製物または組成物中の非ＤＮＡ物質から最初に抽出されることなく増幅できるＤＮＡは、そのＤＮＡが適切なプライマーと共にアニールできる限り、さらに精製することなく直接使用することができ、コピーでき、特に増幅でき、コピー産物または増幅産物は回収して本明細書に記載されたとおり利用できる。
【０１２８】
ある好ましい態様において、核酸は、増幅前に当業界で公知の方法を用いて、元の試料に存在する非核酸物質から抽出、精製、単離される。
【０１２９】
他の態様において、核酸は、核酸源を含有する元の試料から抽出、精製、または単離し、増幅前に、限定はしないが、酵素消化、マニュアルせん断、または音波処理などの当業界に周知の方法を幾つか用いて核酸を断片化する。例えば、ＤＮＡは、関心対象座には存在しない認識部位、特に８塩基対また６塩基対の認識部位を有する１種以上の制限酵素によって消化することができる。典型的には、ＤＮＡは５０、１００、２５０、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００および１００，０００塩基対長などの所望の長さに断片化できる。他の態様において、ＤＮＡは、約１０００から２０００塩基対の平均長に断片化される。しかし、必ずしもＤＮＡを断片化する必要はない。
【０１３０】
増幅前に、断片化したＤＮＡから関心対象座を含有するＤＮＡ断片を精製することができる。関心対象座にアニールする能力に基づいて関心対象座を受けとるホックとして増幅に用いられるプライマー（「プライマー設計」の節を参照）を用いてこのような断片を精製できる。好ましい態様において、例えば、ビオチンプライマーなどのタグ修飾プラーマーが用いられる。
【０１３１】
関心対象座を含有するＤＮＡ断片を精製することによって、増幅反応の特異性を改善することができる。これにより、鋳型ＤＮＡの非特異的領域の増幅が最少化されることになる。また、ＤＮＡ断片を精製することによって、特異性の改善された複合ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または関心対象の複数座の増幅が可能になる。
【０１３２】
配列決定される関心対象座は、配列のみに基づいて選択できる。ヒトでは、１４２万を超える単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）が記載されている（ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０９：ｐ．９２８−９３３（２００１））。平均して、１．９ｋｂのヒトゲノムにつき１つのＳＮＰがある。しかし、本発明によって配列決定する関心対象座の選択の際、関心対象座の間の距離は考慮する必要はない。ゲノムＤＮＡ上の１つより多い関心対象座を分析する場合、選択された関心対象座は同一の染色体上にあることもあり、また異なった染色体上にあることもある。
【０１３３】
好ましい態様において、選択された関心対象座は、染色体上の特定の領域に密集して存在し得る。ＤＮＡのいずれの開裂または断片化によっても関心対象の複数座が結合したままであるように、関心対象座をあるＤＮＡ領域内に密集させることができる。例えば、得られたＤＮＡが自然力によって５ｋｂの断片に切断される場合、関心対象の複数座は５ｋｂの領域内で選択できる。このことにより、断片内の関心対象座によって測定された各断片が実験単位として役立ち、複数の染色体上の関心対象座を比較する実験上のノイズの可能性を減らすことができる。
【０１３４】
染色体上の関心対象座は、限定はしないが、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜５００、５００〜７５０、７５０〜１０００、１０００〜１５００、１５００〜２０００、２０００〜２５００、２５００〜３０００、３０００〜３５００、３５００〜４０００、４０００〜４５００、４５００〜５０００、５０００〜１００００塩基対および１００００塩基対を超えて互いに隔たっていることがあり得る。
【０１３５】
好ましい態様において、関心対象座が大きさによって分離できるように、増幅される配列の長さは、関心対象の各々の座によって異なっていることが好ましい。
【０１３６】
実際、遺伝子配列全体をコピーするプライマーを利用する必要がないことは、本発明の利点の一つである。コピーされた関心対象座は、むしろ、遺伝子全体のうちのほんの小部分またはＤＮＡの非コード領域の小部分であることが好ましい。遺伝子全体の塩基配列決定はコストを増加させ、結果を遅らせる可能性があるため不利である。所望の塩基または関心対象座のみの塩基配列決定は、時間的に最も速く、また最少のコストで関心対象座の最大数の配列決定を可能にすることから、本法の全体的効率を最も高くする。
【０１３７】
本発明の方法では、多数の配列を一緒に分析できるため、特に関心対象の多数の座の大スケールスクリーニングを受けることができる。
【０１３８】
本発明の方法を用いて、任意の数の関心対象座を特に同時に分析し、処理することができる。同時に関心対象の１個の座または関心対象の複数座の配列を決定するために、試料（単数または複数）を分析することができる。関心対象座は１つの染色体上、または複数の染色体上に存在し得る。
【０１３９】
あるいは、全体的な遺伝子スクリーニングが所望される場合、２、３、４、５、６、７、８、９、１０〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜１００、１００〜２５０、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜３，０００、３，０００〜５，０００、５，０００〜１０，０００、１０，０００〜５０，０００または５０，０００超の関心対象座を同時に分析することができる。遺伝子フィンガープリントを提供して個人の同定、またはＳＮＰ遺伝子型を決定するために、本発明の方法を用いる場合に、このような全体的遺伝子スクリーニングが望まれると考えらる。
【０１４０】
コピーしようとする関心対象座は、コード配列内にあってもよいし、コード配列外にあってもよい。コピーしようとする関心対象座の１個以上が１つの遺伝子内にあることが好ましい。好ましい態様において、コピーされる鋳型ＤＮＡは、ゲノムのコード配列、イントロンまたはエクソン内にある関心対象の単数または複数の座である。非常に好ましい態様において、エクソンＤＮＡ配列がコピーされる。関心対象座は、突然変異が疾病の原因となるか、または疾病状態を生じ易くすることが知られている部位であり得る。関心対象座関心対象座は、単一ヌクレオチドの多型部位であり得る。あるいは、コピーしようとする関心対象座は、コード配列の外側、例えば、転写調節領域内、特にプロモーター、エンハンサーまたはリプレッサー配列内にあり得る。
【０１４１】
関心対象座の配列決定法
限定はしないが、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ、ゲル電気泳動、ＥＬＩＳＡ、質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＳＴ）、蛍光局在化、ＤＮＡ塩基配列決定、サンガージデオキシ塩基配列決定、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、ＤＮＡ自動塩基配列決定装置上での毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、マイクロアレー、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、米国特許第６，２５１，６３９号明細書に記載されている単一プライマー線形ＤＮＡ増幅、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法などの核酸配列についての情報を提供する任意の方法を用いることができる。
【０１４２】
好ましい配列決定法は、本明細書にその全体が組み込まれている、２００２年３月１１日出願の米国特許出願第１０／０９３，６１８号明細書に以前記載されている。
【０１４３】
Ｉ．プライマー設計
鋳型ＤＮＡの増幅に用いられるプライマーを設計または選択するために、コンセンサス配列などの公表された配列を用いることができる。関心対象座の側面に位置するプライマー構築用に用いられる配列の選択は、関心対象座の配列の検査により、または直接それに対してなされる。最近公表されたヒトゲノムの配列は、関心対象の所望のヒト遺伝子座の側面に位置するプラーマーを設計するための有用なコンセンサス配列情報源を提供している。
【０１４４】
関心対象座の「側面に位置する」とは、一方のプライマーの３’領域の少なくとも一部が鋳型ＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的であり、関心対象座の部位より上流であり（フォワードプライマー）、他方のプライマーの３’領域の少なくとも一部が鋳型ＤＮＡのセンス鎖に相補的であり、関心対象座の下流にある（リバースプライマー）であるようなプライマー配列であることを意味する。「プライマー対」とは、フォワードプライマーとリバースプライマーの対を意味する。プライマー対の双方のプライマーとも、プライマーの伸長を可能にし、その伸長によって関心対象座の領域における鋳型ＤＮＡの増幅が生じるような仕方でアニールする。
【０１４５】
当業界に周知の方法を用いて、限定はしないが、適切な配列のクローニングおよび直接的化学合成などの種々の方法により、プライマーを調製することができる（ナラングら（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）６８：ｐ．９０（１９７９）；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．）、メソッズ・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）６８：ｐ．１０９（１９７９））。また、プライマーは、オペロン・テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ），およびライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの市販供給元から得ることができる。プライマーは、一定の融点を有し得る。プライマーの長さは５’端または３’端において、伸長または短縮させて、所望の融点を有するプライマーを生成することができる。好ましい態様において、プライマー対のうちの一方のプライマーは他のプライマーよりも長い。好ましい態様において、プライマー対のうちで、プライマーの３’アニーリング長が異なる。また、プライマー対の配列と長さが所望の融解温度を生じさせるように、各プライマー対のアニーリング箇所を設計することができる。２５塩基対より小さなプライマーの融解温度を決定するための最も簡便な等式は、ワラス則（Ｔｄ＝２（Ａ＋Ｔ）＋４（Ｇ＋Ｃ））である。限定はしないが、アレイ・デザイナー・ソフトウェア（アレイット社（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｉｎｃ．））、ゲノム分析用のオリゴヌクレオチドプローブ・シーケンスデザイン・ソフトウェア（オリンパス・オプティカル社（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．））、ネットプライマー（ＮｅｔＰｒｉｍｅｒ）、およびヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）からのＤＮＡシス（ＤＮＡｓｉｓ）などのコンピュータプログラムがプライマーの設計に使用できる。各プライマーのＴＭ（融解温度またはアニーリング温度）は、ネット・プライマー（２００２年４月１７日におけるインターネットアドレス：http://premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.htmlのフリーウェブに基づくプログラム）などのソフトウェアプログラムを用いて計算される。
【０１４６】
他の態様において、プライマーのアニーリング温度は、限定はしないが、サイクル１、２、３、４、５、サイクル６〜１０、サイクル１０〜１５、サイクル１５〜２０、サイクル２０〜２５、サイクル２５〜３０、サイクル３０〜３５、または３５〜４０などの任意の増幅サイクル後に再計算し、増加させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの５’ハーフが、関心対象の各座からの産物内へ組み込まれ、したがって、ＴＭは各プライマーの５’ハーフの配列および３’ハーフの配列の双方に基づいて再計算できる。
【０１４７】
例えば、図１Ｂにおいて、増幅の第１サイクルは、第２のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする１３塩基の３’領域（領域「ｃ」）の略融解温度で実施される。第１サイクルの後、アニーリング温度は、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする領域「ｂ」として表されている３’領域の略融解温度であるＴＭ２へと上げることができる。第２のプライマーは元の鋳型ＤＮＡに結合することはできない。なぜならば、第２のプライマーは、元の鋳型ＤＮＡの１３塩基にのみアニールするが、ＴＭ２は第１のプライマーの３’アニーリング領域である略２０塩基の融解温度であるからである（図１Ｃ）。しかし、第１のプライマーは、前記反応の第１サイクルにおいてコピーされたＤＮＡに結合することができる。第３のサイクルにおいて、アニーリング温度は、領域「ｃ」および「ｄ」として表されている第２のプライマー全体の配列の略融解温度であるＴＭ３に上げられる。ＰＣＲの第２サイクルから生成した鋳型ＤＮＡは、領域「ｃ」および「ｄ」の双方を含有し、したがって第２のプライマーはＴＭ３においてアニールし、伸長することができる（図１Ｄ）。残りのサイクルはＴＭ３で実施される。第１のプライマー全体の配列（ａ＋ｂ’）は、ＰＣＲの第３サイクルから鋳型にアニールし、伸長することができる（図１Ｅ）。アニーリング温度を上げることによって、非特異的結合が減り、前記反応の特異性が高まるが、これは、約３×１０９塩基長であるヒトゲノムＤＮＡからの関心対象座を増幅する場合、特に有用である。
【０１４８】
本明細書に用いられている用語のアニーリング温度に関する「約」は、述べられた温度の摂氏１０度以内の温度を包含するために用いられる。
【０１４９】
一態様において、関心対象の各座に対して１つのプライマー対が用いられる。しかし、関心対象の各座に対して複数のプライマー対を用いることができる。
【０１５０】
一態様において、プライマー対の一方または双方のプライマーが１種以上の制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）に対する５’領域内配列を含有するように、プライマーが設計される。
【０１５１】
制限酵素がＤＮＡを消化する位置に関して本明細書に用いられている「センス」鎖とは、制限酵素が切断する方向の５’から３’へ読む鎖である。例えば、ＢｓｍＦＩは、次の配列を認識する。
2006521086.tif 000546
【０１５２】
センス鎖は、制限酵素が切断する方向の５’から３’へ読む際に配列「ＧＧＧＡＣ」を含有する鎖である。
【０１５３】
制限酵素がＤＮＡを消化する位置に関して本明細書に用いられている「アンチセンス」鎖とは、制限酵素が切断する方向の３’から５’へ読む鎖である。
【０１５４】
他の態様において、プライマー対の一方のプライマーは、認識部位から「ｎ」個のヌクレオチドを切断する制限酵素に対する制限酵素認識部位を含有し、３’窪み端および関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように設計される（本明細書では「第２のプライマー」と称す）。「Ｎ」は、認識部位から制限酵素によって切断される部位までの距離である。言い換えれば、プライマー対のうちの第２のプライマーは、ＤＮＡを認識部位では切断せず、認識部位からヌクレオチド「ｎ」個離れて切断する制限酵素に対する認識部位を含有する。例えば、認識配列が制限酵素ＢｃｅＡＩに対するものである場合、前記酵素はセンス鎖上の認識部位からヌクレオチド１０個を切断し、アンチセンス鎖上の認識部位からヌクレオチド１２個を切断する。
【０１５５】
プライマーの３’領域および好ましくは３’ハーフは、関心対象座の側面に位置する配列にアニールするように設計される（図１Ａ）。このプライマー上の制限酵素認識部位を認識する制限酵素による消化によって関心対象座を含有する５’オーバーハングが精製されるという条件で、第２のプライマーは、関心対象からいずれかの距離でアニールできる。５’オーバーハングは限定はしないが、１、２、３、４、５、６、７、８個の塩基、および８個を超える塩基など、任意の大きさであり得る。
【０１５６】
好ましい一態様において、関心対象座の近くにアニールするプライマーの３’端（第２のプライマー）は、関心対象座からまたは関心対象座から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個の塩基、または１４個を超える塩基をアニールすることができる。
【０１５７】
好ましい一態様において、第２のプライマーは、プライマー対の他方のプライマー（他方のプライマーは本明細書では「第１のプライマー」と称される）よりも関心対象座のより近くにアニールするよう設計される。第２のプライマーは、フォワードプライマーまたはリバースプライマーであり得、第１のプライマーは、それぞれリバースプライマーまたはフォワードプライマーであり得る。第１のプライマーと第２のプライマーのどちらをフォワードプライマーまたはリバースプライマーにすべきかはどちらのデザインが、より良好な結果を提供するかによって決めることができる。
【０１５８】
例えば、関心対象座の近くにアニールするプライマーは、センス鎖上の認識部位から１０個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断する制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有できる。この場合、制限酵素認識部位が関心対象座から１３塩基、１２塩基、１０塩基または１１塩基であるように、プライマーを設計できる。認識部位が関心対象座から１３塩基である場合、ＢｓｍＦＩによる消化で５’オーバーハング（ＲＸＸＸ）が生成され、関心対象座（Ｒ）はこのオーバーハングにおける１番目のヌクレオチド（３’から５’へ読んで）、Ｘは任意のヌクレオチドである。認識部位が関心対象座から１２塩基である場合、ＢｓｍＦＩによる消化で５’オーバーハング（ＸＲＸＸ）が生成され、関心対象座（Ｒ）はこのオーバーハングにおける２番目のヌクレオチド（３’から５’へ読んで）である。認識部位が関心対象座から１１塩基である場合、ＢｓｍＦＩによる消化で５’オーバーハング（ＸＸＲＸ）が生成され、関心対象座（Ｒ）はこのオーバーハングにおける３番目のヌクレオチド（３’から５’へ読んで）である。制限酵素による消化が関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように制限酵素認識部位から関心対象座の間の距離を設計する。認識部位から関心対象座の間の効果的距離は、制限酵素の選択によって変わる。
【０１５９】
他の態様において、他方のプライマーに比して関心対象座のより近くにアニールするプライマーは、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成する制限酵素が関心対象座部位におけるヌクレオチドとは独立に、切断部位において同一の配列を見るように設計できる。例えば、関心対象座近くにアニールするプライマーを、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位（５’ＧＧＧＡＣ３’）が関心対象座から１３塩基であるように設計される場合、制限酵素は、アンチセンス鎖を関心対象座から１塩基で切断する。関心対象座におけるヌクレオチドは切断部位に隣接しており、ＤＮＡ分子によって変わり得る。切断部位に隣接するヌクレオチドが一定であることが望まれる場合、ＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位が関心対象座部位から１２塩基離れているように、プライマーを設計する。ＢｓｍＦＩによる消化によって、関心対象座の部位がオーバーハングの２番目の位置（３’から５’へと読んで）にあり、もはや切断部位には隣接していない５’オーバーハングが生成する。制限酵素認識部位が関心対象座の部位から１２塩基にあるようにプライマーを設計することにより、切断部位に隣接するヌクレオチドを、関心対象座におけるヌクレオチドとは独立して同一であるようにできる。また、制限酵素認識部位が関心対象座の部位から１１塩基または１０塩基にあるように設計されたプライマーにより、切断部位に隣接するヌクレオチドを、関心対象座におけるヌクレオチドとは独立して同一であるようにできる。他の制限酵素に関しても、切断部位に隣接するヌクレオチドを、関心対象座におけるヌクレオチドとは独立して同一であるように、プライマー設計の同様な方法を用いることができる。
【０１６０】
第１のプライマー（フォワードあるいはリバースのいずれか）の３’端は、関心対象座から選択された距離でアニールするように設計できる。例えば、この距離は、好ましくは関心対象座から１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００の間および１０００塩基を上回る。各々の連続的な上流プライマーが、各々の下流のプライマーからだんだん遠くに離れているいくように、第１のプライマーのアニーリング部位を選択する。
【０１６１】
例えば、関心対象座１で第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’端がＺ塩基離れている場合、関心対象座２で上流および下流プライマーの３’端はＺ＋Ｋ塩基離れ、ここでＫ＝１、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００塩基または１０００塩基を上回る（図２）。第１のプライマーを第２のプライマーからだんだん遠くに離す目的は、関心対象座全てのＰＣＲ産物の大きさが異なるようにして、例えば塩基配列決定ゲル上で分離できるようにすることである。
【０１６２】
一態様において、第１のプライマーまたは第２のプライマーの５’領域は、任意のタイプの制限酵素に対する認識部位を有することができる。好ましい一態様において、第１および／または第２のプライマーの５’領域は、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するために用いられる制限酵素認識部位とは異なる制限酵素認識部位を少なくとも１つ有する。
【０１６３】
一態様において、第１のプライマーの５’領域は、任意のタイプの制限酵素に対する認識部位を有することができる。好ましい一態様において、第１のプライマーは、第２のプライマーにおける制限酵素認識部位とは異なる制限酵素認識部位を少なくとも１つ有する。他の好ましい態様において、第１のプライマーは、第２のプライマーよりも関心対象座からより遠くにアニールする。
【０１６４】
好ましい態様において、第２のプライマーは、限定はしないが、２塩基の５’オーバーハングと４塩基の５’オーバーハングを各々生成するＢｃｅＡＩおよびＢｓｍＦＩなどのＩＩＳ型制限酵素に対する制限酵素認識部位を含有する。ＩＩＳ型制限酵素は、非対称塩基配列を認識する（オーソドックスなＩＩ型酵素のようにパリンドロームではなく）ので好ましい。ＩＩＳ型制限酵素は、認識部位の外側、典型的には、認識部位の外側、２０塩基対までにある特定の箇所のＤＮＡを開裂する。これらの特性により、ＩＩＳ型制限酵素およびその認識部位は、本発明の方法において特に有用である。本法に用いられるＩＩＳ型制限酵素は、５’オーバーハングおよび３’窪みを残す。
【０１６５】
多種多様なＩＩＳ型制限酵素が知られており、このような酵素は、細菌、ファージ、古細菌および真核藻類ウィルスから単離されており、商品として入手できる（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マジソン所在；ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリー所在；ダブリュー・スジバルスキーら（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．）、ジーン（Ｇｅｎｅ）１００：ｐ．１３−２６、１９９１年）。本発明の方法に有用であると考えられるＩＩＳ型制限酵素の例としては、限定はしないが、表Ｉに載せたような酵素が挙げられる。
【０１６６】
（表Ｉ）
2006521086.tif 000547
【０１６７】
一態様において、プライマー対は各々のプライマーの５’領域に、１つの制限酵素に独特の制限酵素認識部位を提供する配列を有する。
【０１６８】
他の態様において、プライマー対は各々のプライマーの５’領域に、１つ以上の制限酵素、特に１つ以上のＩＩＳ型制限酵素によって認識される制限部位を提供する配列を有する。例えば、ある一定のコンセンサス配列は１つ以上の酵素によって認識され得る。例えば、ＢｓｇＩ、Ｅｃｏ５７１およびＢｐｍＩは全てコンセンサス（Ｇ／Ｃ）ＴＧｎＡＧを認識し、アンチセンス鎖上から１６ｂｙを開裂し、センス鎖から１４ｂｙを開裂する。このようなコンセンサス配列を提供するプラーマーは、制限酵素ＢｓｇＩ、Ｅｃｏ５７１およびＢｐｍＩのいずれかによって認識され得る部位を有する産物を生じる。
【０１６９】
認識部位から離れてＤＮＡを切断し、３’窪み端および５’オーバーハングを生成する他の制限酵素としては、ＩＩＩ型制限酵素が挙げられる。
【０１７０】
例えば、制限酵素ＥｃｏＰ１５Ｉは、配列、５’ＣＡＧＣＡＧ３’を認識し、センス鎖下流の２５塩基を開裂し、アンチセンス鎖の２７塩基を開裂する。さらに、新規の制限酵素が続いて発見されており、本発明に利用するために容易に採用し得ることは、通常の当業者に理解されるであろう。
【０１７１】
他の態様において、第２のプライマーは、ある制限酵素に対する認識配列の一部を含有し得るが、ここで制限酵素による消化によって、関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成するように鋳型ＤＮＡ増幅の際に制限酵素に対する認識部位全体が生成される。例えば、ＢｓｍＦＩに対する認識部位は５’ＧＧＧＡＣＮ１０↓３’である。鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域は鋳型ＤＮＡに相補的である必要はないヌクレオチド「ＧＧＧ」で終止できる。３’アニーリング領域が、約１０〜２０塩基である場合、たとえ最後の３個の塩基がアニールしなくてもプライマーは伸長し、ＢｓｍＦＩ部位を生成する。
2006521086.tif 000548
【０１７２】
アデノシンとシトシンがプライマーに取り込まれて、ＢｓｍＦＩ、５’ＧＧＧＡＣＮ１０↓３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する認識部位を形成するように鋳型ＤＮＡの次の２個の塩基がチミジンとグアニンである鋳型ＤＮＡにアニールするように第２のプライマーを設計できる。ＢｓｍＦＩによる消化によって、関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するような仕方でアニールするように第２のプライマーを設計できる。
【０１７３】
他の態様において、第２のプライマーは、制限酵素に対する認識部位の全体または認識部位の一部を含有できるが、制限酵素による消化によって認識部位が切断され、関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成するように、鋳型ＤＮＡのプライマー依存複製時に認識部位全体が生成される。例えば、制限酵素ＢｓａＪＩは、次の認識部位：５’Ｃ↓ＣＮ１Ｎ２ＧＧ３’と結合する。鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域が「ＣＣ」で終止するように第２のプライマーを設計することができ、関心対象のＳＮＰは「Ｎ１」として表され、ＳＮＰの下流の鋳型配列は「Ｎ２ＧＧ」である。
2006521086.tif 000549
【０１７４】
ＢｓａＪＩによる消化後、以下の配列の５’オーバーハングが生成すると考えられる。
５’Ｃ              ３’
３’ＧＧＮ１Ｎ２ＣＣ  ５’
【０１７５】
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、３’窪み端は、オーバーハング内の１番目のヌクレオチドに相補的である未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを除去した後、関心対象座を表す次のヌクレオチド、Ｎ１をはめ込むために標識ｄｄＮＴＰ類を用いることができる。限定はしないが、
2006521086.tif 000550
などの他の制限酵素を用いることができる。
【０１７６】
鋳型ＤＮＡにアニールする第２のプライマーの３’領域は、鋳型ＤＮＡに対し１００％相補的である必要はない。例えば、第２のプライマーの３’端の最後の１、２、または３個のヌクレオチドは鋳型ＤＮＡにミスマッチであってもよい。鋳型ＤＮＡにアニールするプライマーの領域は、そのプライマーを標的化し、プライマーの伸長を可能にする。たとえ最後の２個のヌクレオチドが鋳型ＤＮＡに相補的でなくても、そのプライマーは伸長し、制限酵素認識部位を生成する。例えば、第２のプライマーの最後の２個のヌクレオチドは「ＣＣ」である。第２のプライマーは、鋳型ＤＮＡにアニールし、たとえ「ＣＣ」が鋳型ＤＮＡ上のヌクレオチドＮａおよびＮｂに相補的でなくても伸長できる。
2006521086.tif 000551
【０１７７】
ＢｓａＪＩによる消化後、以下の配列の５’オーバーリングが生成すると考えられる。
2006521086.tif 000552
【０１７８】
関心対象座にヌクレオチドのグアニンが報告されていない場合、５’オーバーハングは、未標識シトシンによってはめ込むことができる。過剰のシトシンを濯いで除去し、標識ｄｄＮＴＰ類によってはめ込むことができる。取り込まれた１番目のヌクレオチドが関心対象座に相当する。関心対象座にグアニンが報告されている場合、関心対象座を未標識シトシンによってはめ込むことができ、関心対象座の下流のヌクレオチド１個を検出することができる。例えば、Ｎ２はアデニンと推定される。関心対象座がグアニンである場合、未標識シトシンをはめ込み反応に用いることができる。シトシンを除去した後、標識チミジンによるはめ込み反応を用いることができる。関心対象座がグアニンである場合だけ、標識チミジンが取り込まれることになる。このように、関心対象座の配列は、関心対象座の下流のヌクレオチドを検出することによって決定することができる。
【０１７９】
他の態様において、第１のプライマーおよび第２のプライマーが制限酵素に対する認識部位の一部を含有するが、制限酵素による消化によって、関心対象座のを含有する５’オーバーハングが生成するように、鋳型ＤＮＡの増幅時に制限酵素に対する認識部位全体が生成される。限定はしないが、制限酵素
2006521086.tif 000553
などの任意の制限酵素に対する、１個または１個を超える可変ヌクレオチドを含有する認識部位を生成させることができる。
【０１８０】
好ましい一態様において、第１のプライマーおよび第２のプライマーの３’領域は、制限酵素に対する部分的配列を含有するが、ここで部分的配列は鋳型ＤＮＡに対して１、２、３、４個または４個を超えるミスマッチを含有し、これらのミスマッチが制限酵素認識部位を作り出す。３’端に忍容され得るミスマッチの数は、プライマーの長さ次第である。例えば、関心対象座がＮ１によって表されるならば、第１のプライマーは下記の領域「ａ」として表される鋳型ＤＮＡに相補的であるように設計することができる。第１のプライマーの３’領域は、鋳型ＤＮＡに相補的ではない「ＣＣ］で終止する。第２のプライマーは、下記の領域「ｂ’」として表される鋳型ＤＮＡに相補的であるように設計される。第２のプライマーの３’領域は、鋳型ＤＮＡに相補的ではない「ＣＣ」で終止する。
2006521086.tif 000554
【０１８１】
１回の増幅後、以下の産物が生成すると考えられる。
2006521086.tif 000555
【０１８２】
２回めのサイクルで、プライマーは、ＰＣＲの第１サイクルから生成した鋳型にアニールできる。
2006521086.tif 000556
【０１８３】
ＰＣＲの第２サイクル後、以下の産物が生成されると考えられる。
2006521086.tif 000557
【０１８４】
ＢｓａＪＩに対する制限酵素認識部位が生成し、ＢｓａＪＩによる消化後、関心対象座を含有する５’オーバーハングが作り出される。関心対象座は以下に詳述されるとおり検出することができる。
【０１８５】
他の態様において、プライマー対は、各々のプライマーの５’領域に、２つ以上の制限部位を提供する配列を有する。
【０１８６】
最も好ましい態様において、いずれかの所望の配列の開裂に、異なった制限酵素が必要とされるように、プライマー対は５’領域、特に５’端に異なった制限酵素認識部位を有する。例えば、関心対象座「Ａ］に対する第１のプライマーは、任意の型の制限酵素であり得る制限酵素「Ｘ］によって認識される配列を含有し、関心対象座により近くアニールする、関心対象座「Ａ］に関する第２のプライマーは、「ｎ」個のヌクレオチドを切断し、５’オーバーハングおよび３’窪み端を残すＩＩＳ型制限酵素である制限酵素「Ｙ］に対する配列を含有する。５’オーバーハングは関心対象座を含有する。増幅したＤＮＡをストレプトアビジン被覆ウェルに結合した後、酵素「Ｙ］によって消化し、濯いでから標識ヌクレオチドによってはめ込み、濯いでから関心対象座を含有するＤＮＡ断片を固体マトリックスから遊離させる制限酵素「Ｘ］によって消化する。関心対象座は、関心対象座、例えば、ＳＮＰ部位に「はめ込まれた」標識ヌクレオチドを検出することによって分析することができる。
【０１８７】
他の態様において、本発明によって増幅される異なった関心対象座に関する第２のプライマーが同じ制限酵素に対する５’領域に認識配列を含有し、同様に第１のプライマーも全て、第２のプライマーを認識する酵素とは異なった酵素である制限酵素の同じ制限酵素認識部位を含有する。
【０１８８】
他の態様において、本発明によって増幅される複数の関心対象座に関する第２のプライマーが５’領域に異なった制限酵素に対する制限酵素認識配列を含有する。
【０１８９】
他の態様において、本発明によって増幅される複数の関心対象座に関する第１のプライマーが５’領域に異なった制限酵素に対する制限酵素認識配列を含有する。複数の制限酵素配列によって、プールされた関心対象座が固体マトリックスから遊離する順序に影響を与える機会が提供される。例えば、５０の関心対象座が増幅される場合、第１のプライーは、精製を助ける５’最末端におけるタグおよび制限酵素認識部位を有することができ、第２のプライマーはＩＩＳ型制限酵素に対する認識部位を含有できる。例えば、第１のプライマーの幾つかがＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を有し、他の第１のプライマーがＰｓｔＩに対する認識部位を有し、さらに他の第１のプライマーがＢａｍＨＩに対する認識部位を有することができる。増幅後、第１のプライマー上のタグの助けで、関心対象座を固定支持体に結合できる。一度に１個の制限酵素の制限消化を実施することによって増幅された関心対象座を連続的に遊離することができる。第１の消化をＥｃｏＲＩによって実施すると、ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有する第１のプライマーと共に増幅された関心対象座が遊離し、回収されるが、他の関心対象座は固体支持体に結合したままである。一度に１個の制限酵素で消化することにより、増幅関心対象座を選択的に固体支持体を遊離させることができる。第１のプライマーにおいて種々の制限酵素認識部位を使用することにより、１本の反応管内でより多数の関心対象座を増幅することができる。
【０１９０】
好ましい態様において、各プライマーの制限酵素消化部位の任意の５’領域を、断片の操作、加工、同定および／または精製を提供する官能基によって修飾することができる。このような官能基またはタグの例としては、限定はしないが、ビオチン、ビオチン誘導体、炭水化物、ハプテン類、色素、放射性分子、抗体、および抗体断片、ペプチド類および免疫遺伝分子などが挙げられる。
【０１９１】
他の態様において、鋳型ＤＮＡは１回の複製を超えて増幅されることなく、１回複製することができる。関心対象座の多数のコピーが既に試料中に存在し、それ以上のコピーが必要とされない場合など、分析に利用できるＤＮＡが多量に存在する場合に、これは有用である。この態様では、配列が折り返されて、相補的様式でそれ自身の内部の配列に配列にアニールするように、プライマーは、５’領域に「ヘアピン」構造を含むように設計されることが好ましい。鋳型ＤＮＡが１回だけ複製される場合、認識部位を含んでなるＤＮＡ配列は「ヘアピン」構造がなければ一本鎖になるであろう。しかし、ヘアピン構造の存在下で、その領域は効果的に二本鎖となり、制限酵素による活性に対し、二本鎖基質を提供する。
【０１９２】
反応条件が適合する限り、ＤＮＡの関心対象座分析用プライマー対は全て、本発明の方法に利用するため、共に混合することができる。好ましい一態様において、全プライマー対は、１つの反応器内に鋳型ＤＮＡと共に混合する。このような反応容器は、例えば、反応管、またはマイクロ滴定プレートのウェルであり得る。
【０１９３】
あるいは、ヌクレオチドに関する競合を避けるために、プライマー二量体およびプライマーのアニーリング濃度に伴う困難を最少化するため、各関心対象座または関心対象座の小群を別々の反応管またはウェル内で増幅でき、所望の場合、その産物を後でプールできる。例えば、別々の反応物を１個の反応容器内へプールしてから、関心対象座またはＳＮＰ部位を含有する５’オーバーハングおよび３’窪み端を生成する制限酵素によって消化することができる。各プライマー対のプライマーは、等モル量で提供されることが好ましい。また、種々のプライマー対の各々が、使用される他のプライマー対に対して等モル量で提供されることが特に好ましい。
【０１９４】
他の態様において、プライマーの各々の関心対象座を効率的に増幅できるプライマー対の組合わせを用いることができる（例えば、図２を参照）。本発明の方法における使用前に、このような組合せを決定できる。互いに効率的に作用し合うプライマー対を選択するために、複数ウェルプレートおよびＰＣＲ装置が使用できる。例えば、各プライマー対の最適アニーリング温度を選択するために、エッペンドルフ・マスターサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標））グラジエントＰＣＲ機器などのグラジエントＰＣＲ機器を使用できる。同様の特性を有するプライマー対を１つの反応管内で一緒に使用できる。
【０１９５】
他の態様において、同一のプライマー対を用いて複数の鋳型ＤＮＡ試料からの単一の関心対象座を、その関心対象座に最適のＰＣＲ条件で増幅するために、限定はしないが、９６ウェル以上のプレートを含む複数の試料容器を用いることができる。あるいは、各関心対象座の増幅のために、別の複数の試料容器を用い、各鋳型ＤＮＡ試料の産物を後でプールすることができる。例えば、マイクロ滴定プレート１において、９６種の異なったＤＮＡ試料からの遺伝子Ａを増幅し、マイクロ滴定プレート２において、９６種の異なったＤＮＡ試料からの遺伝子Ｂを増幅することができ、次に増幅産物をプールすることができる。
【０１９６】
複数の関心対象座増幅結果は、各関心対象座の配列を有する代表的ＰＣＲ産物を含有する調製物である。例えば、鋳型ＤＮＡとして１個体だけのＤＮＡを用い、その鋳型ＤＮＡから数百の疾病関連の関心対象座を増幅した場合、増幅ＤＮＡは、各関心対象座からの小型のＰＣＲ産物の混合物になると考えられる。その場合、このような調製物をさらに分析して、各関心対象座における配列または少数の関心対象座における配列を決定できると考えられる。また、前記調製物を、ＤＮＡを保存する様式で貯蔵でき、後の時点で分析することができると考えられる。増幅ＤＮＡに含まれた情報は、限定はしないが、蛍光検出、塩基配列決定、ゲル電気泳動および質量分析などの任意の好適な方法により明らかにすることができる（下記の「取り込みヌクレオチドの検出」の節を参照）。
【０１９７】
ＩＩ．関心対象座の増幅
限定はしないが、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、３ＳＲ（自立配列反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＰＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ端の急速増幅）、ＰＬＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応との組合わせ）、Ｑ−ベータファージ増幅（シャーら（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・メディカル・マイクロジー（Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏ．）３３：ｐ．１４３５−４１（１９９５））、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＳＯＥ−ＰＣＲ（スプライス重複伸長ＰＣＲ）などの当業界に知られた任意の好適な方法を用いて、鋳型ＤＮＡを増幅できる。これらの方法は、本出願に明白に記載されている遊離可能なプライマーに媒介されたサイクル増幅反応の変法を設計するために使用できる。最も好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲ（ＰＣＲ：実用的アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、インニスら（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．）、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９９１）；およびＰＣＲテクノロジー：ＤＮＡ増幅の原理と応用（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、エイチ・エイ・エーリッヒ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ）、ストックトン・プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９８９））を用いて増幅される。ＰＣＲはまた、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８００，１５９号明細書；米国特許第４，９６５，１８８号明細書；米国特許第４，８８９，８１８号明細書；米国特許第５，０７５，２１６号明細書；米国特許第５，０７９，３５２号明細書；米国特許第５，１０４，７９２号明細書；米国特許第５，０２３，１７１号明細書；米国特許第５，０９１，３１０号明細書；および米国特許第５，０６６，５８４号明細書、を含む多数の米国特許に記載されている。
【０１９８】
典型的なＰＣＲ反応の構成要素としては、限定はしないが、鋳型ＤＮＡ、プライマー、反応緩衝剤（ポリメラーゼの選択に依る）、ｄＮＴＰ類（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）およびＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。好適なＰＣＲプライマーは、上記に検討したとおり設計され、調製できる（上記の「プライマー設計」の節を参照）。簡略に述べると、反応液を９５℃に２分間加熱して鋳型ＤＮＡの鎖を分離し、この反応液を適切な温度（設計されたプライマーのアニーリング温度を計算することにより決定）まで冷却して、プライマーを鋳型ＤＮＡにアニールさせ、７２℃に２分間加熱して伸長させる。
【０１９９】
好ましい一態様において、増幅の最初の３サイクルの各サイクルにおいてアニーリング温度を増加させて、非特異的な増幅を減らす。下記の実施例１も参照されたい。ＰＣＲ第１サイクルのＴＭ１は、第２のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である。アニーリング温度は、サイクル２〜１０において、好ましくないサイクル２において、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度であるＴＭ２に増加できる。サイクル２でアニーリング温度を増加させる場合、そのアニーリング温度は、次のアニーリング温度増加までは略同じ温度に留まる。最後に、アニーリング温度をＴＭ２に増加させたサイクルに引き続くいずれかのサイクルで、好ましくはサイクル３で、第２のプライマー全体の略融解温度であるＴＭ３へとアニーリング温度を増加させる。第３サイクル後、残りのサイクルのアニーリング温度は略ＴＭ３であり得るか、またはさらに増加し得る。この例では、アニーリング温度はサイクル２およびサイクル３において増加させている。しかし、アニーリング温度は、サイクル１における低アニーリング温度からサイクル２の高アニーリング温度へと、さらなる温度の増加なしに増加できるか、またはアニーリング温度は、任意の数の増加ステップで、低アニーリング温度から高アニーリング温度へと次第に変化させることができる。例えば、アニーリング温度は、サイクル２、３、４、５、６などにおいて変化させることができる。
【０２００】
アニーリング後、各サイクルの温度を「伸長」温度まで増加させてプライマーを「伸長」させ、伸長後、各サイクルの温度を変性温度へと増加させる。大きさが５００塩基対未満のＰＣＲ産物では、各サイクルにおける伸長ステップを除いて、変性ステップとアニーリングステップだけを有してもよい。典型的なＰＣＲ反応は上記のように、変性、アニーリング、および伸長の２５〜４５サイクルからなる。しかし、前述したとおり、本発明の実施には、１サイクルの増幅（１コピー）で十分なこともある。
【０２０１】
他の態様において、鋳型ＤＮＡを１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０サイクルまたは２０サイクルより多く増幅するために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含んでなる複数のプライマーセットを用いることができ、次に増幅産物を、１つのプライマーセットまたは複数のプライマーセットのサブセットを用いた反応においてさらに増幅する。好ましい態様において、プライマー二量体の形成を最少化するために低濃度の各プライマーセットを用いる。低濃度の出発ＤＮＡは、複数のプライマーセットを用いて増幅できる。限定はしないが、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０．９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜１０００対、および１０００対を超える任意の数のプライマーセットを第１の増幅反応に用いることができる。他の態様において、増幅産物は、１対のプライマーセットを用いて、第２の反応において、増幅される。他の態様において、増幅産物は、限定はしないが、２〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０．９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０対、および２５０対を超える複数のプライマー対のサブセットを用いてさらに増幅させる。
【０２０２】
最少量の鋳型ＤＮＡが検出できる座数を制限しないように、複数のプライマーセットが関心対象座を増幅する。例えば、鋳型ＤＮＡが１個の細胞から単離されるか、、あたは鋳型ＤＮＡが母体の鋳型ＤＮＡおよび胎児の鋳型ＤＮＡの双方を含んでなる妊娠女性から得られる場合、関心対象座を増幅するための第１の増幅反応において、低濃度の各プライマーセットを用いることができる。低濃度のプライマーによって、プライマー二量体の形成が減少し、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニールしてポリメラーゼにより伸長させる可能性が増大する。複数のプライマーセットを用いて実施されるサイクルの最適回数は、プライマーの濃度によって決定される。第１の増幅反応後に関心対象座をさらに増幅するために、さらにプライマーを加えることができる。各プライマーセットの追加量を加えることができ、１回の反応でさらに増幅される。あるいは、増幅産物は、各反応において１つのプライマーセット；または複数のプライマーセットのサブセットを用いてさらに増幅できる。例えば、第１の増幅反応において、１５０個のプライマーセットを用いた場合、この第１の反応からの産物をさらに増幅するために、１０個のプライマーセットのサブセットを用いることができる。
【０２０３】
限定はしないが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ベントＤＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシーケナーゼなどのプライマー伸長を触媒する任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。熱安定ポリメラーゼを用いることが好ましい。また、ポリメラーゼ添加前に、反応液を９５℃に２分間加熱する「ホットスタート」ＰＣＲを実施することができるか、またはサイクル１の加熱ステップまでポリメラーゼを不活性に保つことができる。「ホットスタート」ＰＣＲは、非特異的増幅を最少化するために使用できる。ＤＮＡを増幅するために、限定はしないが、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５サイクルなど、任意のＰＣＲサイクル数を用いることができる。最も好ましい態様において、実施されるＰＣＲサイクル数は、各関心対象座の等モル量が生成されるような回数である。
【０２０４】
ＩＩＩ．増幅ＤＮＡの精製
本発明の実施にとって、増幅ＤＮＡの精製は、必ずしも必要ではない。しかしながら、一態様において、精製が好ましい場合は、プライマー（第１または第２のプライマー）の５’端を、ＰＣＲ産物の精製を容易にするタグによって修飾できる。好ましい態様においてＰＣＲ産物の精製を容易にするタグによって第１のプライマーを修飾する。修飾は、全プライマーに対して同じであることが好ましいが、ＰＣＲ産物を異なった群に分けることが望まれる場合は、異なった修飾を用いることができる。
【０２０５】
前記タグは、限定されないが、ラジオアイソトープ、蛍光レポーター分子、化学的ルミネセンスレポーター分子、抗体、抗体断片、ハプテン、ビオチン、ビオチン誘導体、フォトビオチン、イミノビオチン、ジゴキシゲニン、アビジン、酵素、アクリジニウム、糖、酵素、アポ酵素、ホモポリマーのオリゴヌクレオチド、ホルモン、強磁性部分、常磁性部分、反応性部分、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分、およびそれらの組合わせを含む化学的部分であり得る。
【０２０６】
一例として、プライマーの５’端をビオチン化できる（ケンドパルら（Ｋｅｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９−１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１０：３０〜３４（１９９１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３−６１６４（１９９０））。ビオチンは、コピーされたＤＮＡを、ゲノムＤＮＡまたは関心対象ではない任意の他のＤＮＡ分子から精製するために使用できる親和性タグを提供する。限定はしないが、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によるストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）プレート、透過プレート、ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレート（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズに挙げられているカタログ番号１６４５６９２）など、図１Ｆに示されるようなストレプトアビジン被覆マトリックスを用いてビオチン分子を精製できる。
【０２０７】
各関心対象座のＰＣＲ産物を、ストレプトアビジン被覆プレートの別々のウェル内に入れる。あるいは、関心対象座のＰＣＲ産物をプールして、限定はしないが、ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）によるストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）プレート、透過プレート、ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレート（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズに挙げられているカタログ番号１６４５６９２）など、ストレプトアビジン被覆マトリックス内に入れることができる。
【０２０８】
また、増幅ＤＮＡは、例えば標準プロトコルを用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって当業界に公知の非親和的方法を用いて鋳型ＤＮＡから分離することもできる。
【０２０９】
ＩＶ．増幅ＤＮＡの消化
当業界に公知の標準的プロトコルを用いて第１のプライマーまたは第２のプライマー上に供給された配列を認識する制限酵素によって、増幅ＤＮＡを消化することができる（図６Ａ〜６Ｄ）。制限酵素消化は、当業界に周知の標準的プロトコルを用いて実施される。使用される酵素は、第１のプライマーまたは第２のプライマーによって生成される制限認識部位に依って決まる。プライマー上に生成した制限認識部位についての詳細に関しては、上記の「プライマー設計」の節を参照されたい。
【０２１０】
ＩＩＳ型制限酵素は、認識部位の外側の略１０〜２０塩基対を切断する点で極めて有用である。用いられるＩＩＳ型制限酵素は、限定はしないが、ＢｃｅＡＩおよびＢｓｍＦＩなどの５’オーバーハングおよび３’窪み端を生成するものであることが好ましい（例えば、表Ｉ参照）。最も好ましい態様において、第２のプライマー（フォワードまたはリバースのいずれか）がＢｓｍＦＩまたはＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識配列を含有する。ＩＩＳ型制限酵素、ＢｓｍＦＩは核酸配列ＧＧＧＡＣを認識し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断し、センス鎖上の認識部位から１０個のヌクレオチドを切断する。ＢｓｍＦＩによる消化によって４塩基の５’オーバーハングが生成される。
【０２１１】
例えば、増幅後に制限酵素認識部位が関心対象座から１３塩基であるように第２のプライマーが設計されると、消化後、関心対象座は、５’オーバーハングにおける第１の塩基（３’から５’へと読んで）であり、３’窪み端は関心対象座から１塩基である。３’窪み端は、関心対象座に相補的なヌクレオチドによって補充できる。オーバーハングの１個の塩基はジデオキシヌクレオチド類を用いて補充できる。しかし、オーバーハングの１、２、３または４個の塩基は、デオキシヌクレオチド類またはジデオキシヌクレオチド類とデオキシヌクレオチド類との混合物を用いてはめ込むことができる。
【０２１２】
制限酵素ＢｓｍＦＩは、センス鎖上の認識部位からＤＮＡの１０個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断する。しかし、配列依存的な仕方で、制限酵素ＢｓｍＦＩは、センス鎖上の認識部位からＤＮＡの１１個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１５個のヌクレオチドを切断する。したがって、消化後、ＤＮＡ分子の２つの集団が存在する。すなわち、１０／１４で切断されたＤＮＡ分子および１１／１５で切断されたＤＮＡ分子である。増幅産物において、ＢｓｍＦＩに対する認識部位が関心対象座から１３塩基であるならば、１１／１５の位置で切断されたＤＮＡ分子は、オーバーハングの２位（３’から５’へと読んで）に関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成することになる。ＤＮＡ分子の３’窪み端は、標識ヌクレオチドによってはめ込まれる。例えば、標識ジデオキシヌクレオチドが用いられた場合、１１／１５で切断された分子の３’窪み端は、関心対象座より上流の塩基に相当する１個の塩基ではめ込まれるであろうし、１０／１４で切断された分子の３’窪み端は、関心対象座からの塩基に相当する１個の塩基で補充されるであろう。１０／１４の位置で切断されたＤＮＡ分子および１１／１５の位置で切断されたＤＮＡ分子は大きさによって分けることができ、取り込まれたヌクレオチドを検出できる。このことにより、関心対象座の前の双方のヌクレオチドの検出、関心対象座の検出が可能となり、また関心対象座の後の３塩基を検出できることもある。
【０２１３】
あるいは、関心対象座より上流の塩基と関心対象座とが異なるヌクレオチドであるとすると、１１／１５で切断された分子の３’窪み端は、上流塩基に相補的なデオキシヌクレオチドではめ込みができる。残りのデオキシヌクレオチドを洗い流し、関心対象座部位は、標識デオキシヌクレオチド、未標識デオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、または未標識ジデオキシヌクレオチドによってはめ込みができる。はめ込み反応後、任意の好適な方法によってヌクレオチドを検出できる。したがって、ｄＮＴＰによる第１のはめ込み反応後、１０／１４および１１／１５で切断された分子の３’窪み端は、関心対象座より上流である。ここで、３’窪み端は関心対象座に相当する１個の塩基、２個の塩基、３個の塩基または４個の塩基ではめ込みできる。
【０２１４】
制限酵素ＢｃｅＡＩは、核酸配列ＡＣＧＧＣを認識し、センス鎖上の認識部位から１２個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１４個のヌクレオチドを切断する。第２のプライマー上のＢｃｅＡＩに対する認識部位からの距離を関心対象座から１３塩基となるように設計すると（図４Ａ〜４Ｄを参照）、ＢｃｅＡＩによる消化で関心対象座を含有する２塩基の５’オーバーハングおよび関心対象座より上流の３’窪み端を生成する。関心対象座は５’オーバーハング内の第１のヌクレオチド（３’から５’へと読んで）である。
【０２１５】
ＢｓｍＦＩで見られるよりは、はるかに低い頻度ではあるが、制限酵素ＢｃｅＡＩの別途切断も見られる。制限酵素ＢｃｅＡＩは、センス鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドを切断し、アンチセンス鎖上の認識部位から１５個のヌクレオチドを切断できる。したがって、ＤＮＡ分子の２つの集団が存在する。すなわち、１２／１４で切断されたＤＮＡ分子および１３／１５で切断されたＤＮＡ分子である。増幅産物において、制限酵素認識部位が関心対象座から１３塩基であるならば、１３／１５の位置で切断されたＤＮＡ分子は、オーバーハングの２番目の位置（３’から５’へと読んで）に関心対象座を含有する５’オーバーハングを生成することになる。前記ＤＮＡ分子の３’窪み端をはめ込むために、標識ジデオキシヌクレオチドが使用できる。１３／１５で切断されたＤＮＡ分子は、はめ込まれた関心対象座より上流の塩基を有することになり、１２／１４で切断されたＤＮＡ分子は、はめ込まれた関心対象座の部位を有することになる。１３／１５で切断されたＤＮＡ分子および１２／１４で切断されたＤＮＡ分子は、大きさによって分けることができ、取り込まれたヌクレオチドを検出できる。このように別途切断を、さらなる配列情報を得るために使用できる。
【０２１６】
あるいは、５’オーバーハングの２塩基が異なっているとすれば、１３／１５で切断されたＤＮＡ分子の３’窪み端は、オーバーハング内の１番目の塩基に相補的なデオキシヌクレオチドではめ込みができ、過剰のデオキシヌクレオチドを洗い流す。はめ込み後、１２／１４で切断されたＤＮＡ分子の３’窪み端および１３／１５で切断されたＤＮＡ分子は、関心対象座より上流である。前記３’窪み端は、標識ジデオキシヌクレオチド類、未標識ジデオキシヌクレオチド類、標識デオキシヌクレオチド類、または未標識デオキシヌクレオチド類のいずれかではめ込みができる。
【０２１７】
プライマーが、コピーされたある一定の関心対象座に対して、異なった制限部位を提供するならば、コピーＤＮＡを同時に消化するために、必要な制限酵素を全て一緒に加えることができる。あるいは、例えば１回につき１種の制限酵素を用いて、異なった制限消化を連続して行うことができ、その制限酵素に対して特異的な産物だけが消化される。
【０２１８】
限定はしないが、酵素濃度、温度、緩衝剤条件、および消化時間などの最適制限酵素消化条件は各制限酵素に対して最適化できる。例えば、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓｍＦＩに見られる別途切断は、所望の場合、限定はしないが、２５〜１６℃、１６〜１２℃、１２〜８℃、８〜４℃、または４〜０℃などの低温での制限酵素消化の実施により減少させることができる。
【０２１９】
Ｖ．標識ヌクレオチド類の取り込み
第２のプライマー上の配列を認識する制限酵素による消化によって、３’窪み端および関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成する（図１Ｇ）。３’窪み端は、５’オーバーハングを鋳型として用い、未標識または標識ヌクレオチド類もしくは未標識および標識ヌクレオチド双方の組合わせの存在下ではめ込みができる。ヌクレオチドは、限定はしないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、および検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分などの検出を可能にする任意のタイプの化学基または化学部分によって標識できる。ヌクレオチドは、１種または１種より多い化学基または化学部分によって標識できる。各ヌクレオチドを同一の化学基または化学部分によって標識できる。あるいは、各々異なったヌクレオチドを異なった化学基または化学部分によって標識できる。標識ヌクレオチドは、ｄＮＴＰ類、ｄｄＮＴＰ類またはｄＮＴＰ類、ｄｄＮＴＰ類双方の混合物で標識できる。
【０２２０】
限定はしないが、未標識デオキシヌクレオチド、標識デオキシヌクレオチド、未標識ジデオキシヌクレオチド、標識ジデオキシヌクレオチド、標識および未標識デオキシヌクレオチドとの混合物、標識および未標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、標識デオキシヌクレオチドと標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、標識デオキシヌクレオチドと未標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、未標識デオキシヌクレオチドと未標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、未標識デオキシヌクレオチドと標識ジデオキシヌクレオチドとの混合物、ジデオキシヌクレオチド類似体、デオキシヌクレオチド類似体、ジデオキシヌクレオチド類似体とデオキシヌクレオチド類似体との混合物、リン酸化ヌクレオシド類似体、２’−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸エステルおよび修飾２’−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸エステルなどの任意のヌクレオチドの組合わせをヌクレオチドの取り込みに使用できる。
【０２２１】
例えば、図１Ｈに示されるように、ポリメラーゼの存在下、３’窪み端は、鋳型として５’オーバーハングを用いて蛍光ｄｄＮＴＰではめ込みできる。取り込まれたｄｄＮＴＰは、限定しないが、蛍光検出などの任意の好適な方法を用いて検出できる。
【０２２２】
４個のヌクレオチド全てを異なった蛍光基で標識することができ、このことにより、１つの反応を４種の標識ヌクレオチドの存在下で実施することができる。あるいは、各関心対象座に関して、４つの異なった「はめ込み」反応が実施できる。すなわち、４つの反応の各々が異なった標識ヌクレオチドを含有することになる（例えば、ｄｄＡＴＰ＊、ｄｄＴＴＰ＊、ｄｄＧＴＰ＊、またはｄｄＣＴＰ＊、ここで＊は標識ヌクレオチドを示す）。各ヌクレオチドは異なった化学基、または同一の化学基で標識できる。標識ヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドであり得る。
【０２２３】
他の態様において、限定しないが、フルオレセイン、ピレン、７−メトキシクマリン、カスケードブルーＴＭ、アレキサフルー（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ）３５０、アレキサフラー４３０、アレキサフラー４８８、アレキサフラー５３２、アレキサフラー５４６、アレキサフラー５６８、アレキサフラー５９４、アレキサフラー６３３、アレキサフラー６４７、アレキサフラー６６０、アレキサフラー６８０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ジアルキルアミノクマリン、パシフィックブルー、マリナブルー、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＩ−Ｘ、ＤＴＡＦ、オレゴングリーン５００、ダンシル−Ｘ、６−ＦＡＭ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４、ローダミングリーン−Ｘ、ロドールグリーン、カルセイン、エオシン、臭化エチジウム、ＮＢＤ、ＴＥＴ、２’、４’、５’、７’テトラブロモスルホンフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦｌＢＲ２、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、Ｃｙ３、ローダミンＲｅｄ−ｘ、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、カルボキシＸローダミン、テキサスレッドＸ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ、Ｃｙ５、スペクトラムアクア、スペクトラムグリーン＃１、スペクトラムグリーン＃２、スペクトラムオレンジ、スペクトラムレッドまたはナフトフルオレセインなどの蛍光色素によってヌクレオチドを標識できる。
【０２２４】
他の態様において、ヌクレオチドが異なった蛍光基によって標識される「はめ込み」反応が蛍光標識ｄＮＴＰ類と共に実施できる。取り込まれたヌクレオチドは、限定はしないが、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などの好適な方法によって検出できる。
【０２２５】
他の態様において、ＳＮＰまたは関心対象座の３’窪み端のはめ込みに標識ｄｄＮＴＰ類と未標識ｄｄＮＴＰ類双方の混合物が使用できる。５’−オーバーハングは、限定はしないが、２、３、４、５、６塩基または６塩基を超える、２塩基以上からなる。例えば、５’−オーバーハングが配列「ＸＧＡＡ」（ここでＸは関心対象座、例えばＳＮＰ）からなるならば、標識ｄｄＮＴＰ類と未標識ｄｄＮＴＰ類との混合物との混合物によるはめ込みによって、幾つかの異なったＤＮＡ断片が生じることになる。標識ｄｄＮＴＰが「Ｘ」の位置に取り込まれると、反応は終止し、１個の標識塩基が取り込まれることになる。しかし、未標識ｄｄＮＴＰが取り込まれると、ポリメラーゼは標識ｄｄＮＴＰが取り込まれるまで他の塩基を取り込み続ける。取り込まれた最初の２つのヌクレオチドがｄＮＴＰであり、３番目がｄｄＮＴＰであれば、３’窪み端は、３塩基だけ伸長することになる。このＤＮＡ断片を、１、２または４塩基の大きさだけ伸長した他のＤＮＡ断片から分離できる。標識ｄｄＮＴＰ類と未標識ｄｄＮＴＰ類との混合物によって、オーバーハングの全ての塩基が補充され、関心対象座、例えばＳＮＰについてのさらなる配列情報が提供される（図７Ｅおよび９Ｄを参照）。
【０２２６】
標識ヌクレオチドの取り込み後、第１のプライマーによって供給された配列を認識する制限酵素によって、増幅ＤＮＡを消化することができる。例えば、図１１では増幅ＤＮＡが、領域「ａ」に結合する制限酵素によって消化されて、ストレプトアビジンマトリックスから取り込まれたヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を遊離する。
【０２２７】
あるいは、各関心対象座に関する各プライマー対の一方のプライマーを、限定はしないが、マイクロ滴定プレートのウェルなどの固体支持マトリックスに結合させることができる。例えば、一方のプライマーをビオチン化したプライマー対と共に、ストレプトアビジン被覆マイクロ滴定プレートを増幅反応に用いることができる。先ず、ビオチン化プライマーがストレプトアビジン被覆マイクロ滴定プレートに結合する。次に、関心対象座のＰＣＲ増幅のために、これらのプレートを反応容器として利用する。増幅反応が完了したら、余分なプライマー、塩類および鋳型ＤＮＡは洗浄により除去できる。増幅ＤＮＡは、マイクロ滴定プレートに結合したままである。第２のプライマー上の配列を認識し、関心対象を含有する５’−オーバーハングを生成する制限酵素によって増幅ＤＮＡを消化することができる。消化された断片は洗浄によって除去できる。消化後、ＳＮＰ部位、または関心対象座は５’−オーバーハング内に現れる。３’窪みは、ポリメラーゼの存在下、限定はしないが蛍光ｄｄＮＴＰなどの標識ヌクレオチドによってはめ込まれる。第１の５’領域における配列を認識する制限酵素による消化によって標識ＤＮＡは、マイクロ滴定プレート内の上澄み液へ遊離できる。
【０２２８】
他の態様において、遺伝子の複数対立遺伝子配列を決定するために、１種のヌクレオチドを使用できる。遺伝子の複数対立遺伝子配列を決定するために、伸長反応を終結させるヌクレオチドが使用できる。１つの対立遺伝子において、終結ヌクレオチドは、前記対立遺伝子の５’−オーバーハング内の関心対象座に相補的である。前記ヌクレオチドは取り込まれ、反応を終結させる。異なった対立遺伝子では前記終結ヌクレオチドは関心対象座に相補的でないため、異なった対立遺伝子の関心対象座に非終結ヌクレオチドが取り込まれる。しかし、終結ヌクレオチドは、前記異なった対立遺伝子の５’−オーバーハング内の関心対象座から下流のヌクレオチドに相補的である。対立遺伝子の配列は、終結ヌクレオチドの取り込みパターンを分析することによって決定できる。終結ヌクレオチドは、標識化されていることもあり、また、未標識のこともある。
【０２２９】
他の態様において、終結ヌクレオチドは、限定はしないが、ジデオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド誘導体、ジデオキシヌクレオチド類縁体、ジデオキシヌクレオチド同族体、硫黄化学基を有するジデオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシヌクレオチド誘導体、デオキシヌクレオチド類縁体、デオキシヌクレオチド同族体、硫黄化学基を有するデオキシヌクレオチド、三リン酸アラビノシド、三リン酸アラビノシド類縁体、三リン酸アラビノシド同族体または三リン酸アラビノシド誘導体などの伸長反応を終結または阻害するヌクレオチドである。
【０２３０】
他の態様において、限定はしないが、蛍光色素などの１シグナル生成部分タグで標識した終結ヌクレオチドを、関心対象座の対立遺伝子の配列決定に使用できる。１シグナル生成部分タグで標識した単一ヌクレオチドを使用することにより、異なった蛍光部分を使用する場合に生じ得る困難が除去される。また、関心対象座の対立遺伝子の配列決定に１シグナル生成部分タグで標識した単一ヌクレオチドを使用することにより、反応数が減り、ピペット操作のエラーが除去される。
【０２３１】
例えば、第２のプライマーがＢｓｍＦＩに対する制限酵素認識部位を含有するならば、消化によって４塩基の５’−オーバーハングが生成する。関心対象座がオーバーハングの１番目に位置するように第２のプライマーを設計できる。代表的なオーバーハングを下記に示すが、ここでＲは関心対象座を表す。
2006521086.tif 000558
【０２３２】
可変部位が、ホモ接合かヘテロ接合かを決定するために、１シグナル生成部分タグを有する１種のヌクレオチドを用いることができる。例えば、可変部位がアデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）であれば、関心対象座の対立遺伝子の配列を決定するために、オーバーハングの２、３、または４の位置にアデニンまたはグアニンが存在するという条件でアデニンまたはグアニンを使用できる。
【０２３３】
例えば、オーバーハングの２位のヌクレオチドが、アデニンに相補的であるチミジンであるならば、関心対象座の対立遺伝子の配列を決定するために、標識ｄｄＡＴＰ、未標識ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを使用できる。ｄｄＡＴＰは、限定はしないが、蛍光色素などの任意のシグナル生成部分によって標識できる。鋳型ＤＮＡがアデニンに関してホモ接合であるならば、標識ｄｄＡＴＰ＊は対立遺伝子において、オーバーハングに相補的な１位に取り込まれ、オーバーハングに相補的な２、３、または４位にヌクレオチドは見られないことになる。
2006521086.tif 000559
【０２３４】
オーバーハングに相補的な１位における標識ｄｄＡＴＰの取り込みに相当する１つのシグナルが見られることになるが、これはこの位置におけるアデニンに関し、この固体はホモ接合であることを示す。この標識化法により、異なった量子効率を有する種々の色素を用いることから生じ得る困難が除去される。
【０２３５】
ホモ接合グアニン：
鋳型ＤＮＡがグアニンに関してホモ接合であるならば、オーバーハングに相補的な１位にｄｄＡＴＰが取り込まれることはないが、１番目に利用できる位置、この場合、オーバーリングに相補的な２位に、ｄｄＡＴＰが取り込まれることになる。例えば、オーバーハングにおける２番目の位置がチミジンに相当する場合：
2006521086.tif 000560
【０２３６】
オーバーハングに相補的な２位におけるｄｄＡＴＰの取り込みに対応する１つのシグナルが見られるが、このことは、グアニンに関してその個体がホモ接合であることを示す。オーバーハングに相補的な２位にはめ込まれた分子は、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれる補充される分子とは異なった分子量を有する。
【０２３７】
ヘテロ接合条件：
2006521086.tif 000561
【０２３８】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な２位に補充されたｄｄＡＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、１個の塩基対によって分離でき、このことから、シグナルの容易な検出および定量が可能である。限定はしないが、ゲル電気泳動、毛管ゲル電気泳動、ＤＮＡ塩基配列決定、および質量分析などの分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて、１位にはめ込まれた分子を２位にはめ込まれた分子から識別することができる。ヌクレオチドは化学的部分によって標識される必要はない。すなわち、異なった対立遺伝子に相当するＤＮＡ分子は、分子量に基づいて分離できる。
【０２３９】
オーバーハングの２位がアデニンに相補的でないならば、３位または４位がアデニンに相補的である可能性がある。例えば、オーバーハングの３位がヌクレオチドアデニンに対して相補的であり得るが、その場合は双方の対の配列を決定するために、標識ｄｄＡＴＰが使用できる。
【０２４０】
2006521086.tif 000562
【０２４１】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、２個の塩基対によって分離でき、これは、分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて検出できる。
【０２４２】
あるいは、２位および３位がアデニンに相補的ではない（すなわち、オーバーハングの２位および３位が、グアニン、シトシンまたはアデニンに相当する）が、４の位置がアデニンに相補的であれば、双方の対の配列を決定するために標識ｄｄＡＴＰを使用することができる。
【０２４３】
2006521086.tif 000563
【０２４４】
オーバーハングに相補的な１位におけるｄｄＡＴＰみよってはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られるが、このことは可変部位におけるアデニンに関して、その個体がホモ接合であることを示す。
【０２４５】
2006521086.tif 000564
【０２４６】
オーバーハングに相補的な４位においてはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られるが、このことはその個体がグアニンに関してホモ接合であることを示す。
【０２４７】
2006521086.tif 000565
【０２４８】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な４位にはめ込まれたｄｄＡＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、３個の塩基対によって分離でき、このことから、シグナルの検出および定量が可能である。１位にはめ込まれた分子と４位にはめ込まれた分子とは分子量に基づいて識別することができる。
【０２４９】
上記のように、可変領域がアデニンまたはグアニンを含有しているならば、双方の対立遺伝子配列を決定するために標識アデニンまたは標識グアニンを使用することができる。オーバーハングの２、３、または４位がアデニンに相補的ではないが、１つの位置がグアニンに相補的ならば、鋳型ＤＮＡがアデニンまたはグアニンに関してホモ接合かヘテロ接合かを決定するために標識ｄｄＧＴＰを使用することができる。例えば、オーバーハングの３位がシトシンに相当するならば、鋳型ＤＮＡがグアニンに関してホモ接合、アデニンに関してホモ接合、またはヘテロ結合である場合、以下のシグナルが予想される。
【０２５０】
2006521086.tif 000566
【０２５１】
オーバーハングに相補的な１位においてｄｄＧＴＰによってはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られ、このことによって、その個体がグアニンに関してホモ接合であることが示される。
【０２５２】
2006521086.tif 000567
【０２５３】
オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれた分子の分子量に対応する１つのシグナルが見られ、このことによって、その個体が可変部位のアデニンに関して、ホモ接合であることが示される。
【０２５４】
2006521086.tif 000568
【０２５５】
２つのシグナルが見られる。すなわち、第１のシグナルは、オーバーハングに相補的な１位にはめ込まれたｄｄＧＴＰに対応し、第２のシグナルは、オーバーハングに相補的な３位にはめ込まれたｄｄＧＴＰに対応する。２つのシグナルは、分子量に基づいて分離できる。すなわち、対立遺伝子１と対立遺伝子２とは、２個の塩基対によって分離され、このことから、シグナルの容易な検出および定量が可能である。
【０２５６】
別の態様では、対象対立遺伝子の配列の決定に使用される、１つの化学成分で標識されたヌクレオチドを、蛍光検出、ＤＮＡ配列決定用ゲル、自動ＤＮＡ配列決定装置を用いるキャピラリ電気泳動、マイクロチャンネル電気泳動、および他の配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁場型質量分析、電場型質量分析、赤外分光法、紫外分光法、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリーを含むがこれらに限定されない、さまざまな方法で、または、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロット、およびＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡ断片は「プローブ」および「標的」の両方として有用なもの）を含むＤＮＡハイブリダイゼーション法、ＥＬＩＳＡ、蛍光定量、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアレイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法で分析することができる。
【０２５７】
幾つかのＩＩＳ型の制限酵素は、上記で検討したように別途の切断も示す。例えば、ＢｓｍＦＩは、認識部位から１０／１４および１１／１５で切断する。この切断パターンは互いに排他的ではない。すなわち、ある特定の配列において、１１／１５の切断パターンが見られるならば、１０／１４の切断もまた見られる。制限酵素ＢｓｍＦＩが認識部位から１０／１４で切断するならば、５’オーバーハングはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４となる。ＢｓｍＦＩが認識部位から１１／１５で切断するならば、５’オーバーハングはＸ０Ｘ１Ｘ２Ｘ３となる。オーバーハングのＸ０が標識ヌクレオチドに対して相補的であるならば、標識ヌクレオチドはＸ０位に取り込まれ、品質保証のレベルを増加させる。これによりさらなる配列情報が提供される。
【０２５８】
例えば、可変部位がアデニンまたはグアニンであり、オーバーハングの３位がアデニンに相補的であるならば、可変部位の遺伝子型の決定に標識ｄｄＡＴＰを使用することができる。１１／１５オーバーハングの０位がアデニンに相補的なヌクレオチドを含有しているならば、ｄｄＡＴＰがはめ込まれ、追加のシグナルが見られる。
【０２５９】
2006521086.tif 000569
【０２６０】
３つのシグナルが見られる。すなわち、０位に取り込まれたオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰに対応するもの、１位に取り込まれたオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰに対応するもの、および３位に取り込まれたオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰに対応するものである。０位、１位および３位にはめ込まれたオーバーハングに相補的な分子は分子量が異なり、限定はしないが、ゲル電気泳動および質量分析などの、分子量に基づいて識別する任意の方法を用いて分離することができる。
【０２６１】
一方の対立遺伝子対他方の対立遺伝子の比率の定量、または野生型ＤＮＡ配列の存在下での変異体ＤＮＡ配列の相対量決定のためには、正確で高感度の検出法を用いなければならない。ＩＩＳ型制限酵素によって示される別途切断は、一方の対立遺伝子対他方の対立遺伝子の比率決定における困難さを大きくするものと思われる。なぜならば、この制限酵素は、別途切断（１１／１５）パターンをこの２つの対立遺伝子上で等しく示すとは思われないからである。例えば、対１は、１０／１４での切断が８０％の頻度であって、１１／１５は２０％の頻度であり得る。しかし、２つの対立遺伝子は配列が異なるため、対立遺伝子２は１０／１４での切断が９０％の頻度で、１１／１５が２０％の頻度であり得る。
【０２６２】
定量化のための、前記の別途切断問題は、オーバーハングの０位のヌクレオチドが、標識ヌクレオチドに相補的でない場合は除去することができる。例えば、可変部位がアデニンまたはグアニンに相当し、オーバーハングの３位がアデニンに相補的（すなわち、オーバーハングの３位にチミジンが位置している）ならば、可変部位の遺伝子型の決定に、標識ｄｄＡＴＰを用いることができる。１１／１５切断特性によって生成したオーバーハングの０位がアデニンに相補的でない（すなわち、オーバーハングの０位がグアニン、シトシンまたはアデニンに相当する）ならば、認識部位から１１／１５に切断された断片から追加のシグナルは見られない。オーバーハングに相補的な０位は、未標識ヌクレオチドではめ込みができ、制限酵素の別途切断パターンによって見られる複雑さが除かれる。この方法は、限定はしないが、突然変異または単一ヌクレオチド多形などの可変部位の比率の定量に対して高精度の方法を提供する。
【０２６３】
例えば、ＳＮＰＸがアデニンまたはグアニンであり得れば、制限酵素が別途切断パターンに関し、対立遺伝子間に相違を示すかどうかを決定せずに、アデニンに相当する対立遺伝子およびグアニンに相当する対立遺伝子を定量化することが、この標識法によって可能となる。
【０２６４】
2006521086.tif 000570
【０２６５】
ＢｓｍＦＩの別途切断特性によって生成したオーバーハングを以下に表す。
2006521086.tif 000571
【０２６６】
標識ｄｄＡＴＰおよび未標識ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰによるはめ込み後、以下の分子が生成する。
2006521086.tif 000572
【０２６７】
２つのシグナルが見られる。すなわち、１位においてオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰではめ込まれた分子に対応するもの、および３位においてオーバーハングに相補的なｄｄＡＴＰではめ込まれた分子に対応するものである。１１／１５オーバーハングの０位は未標識ヌクレオチドによってはめ込まれ、そのことにより、対立遺伝子１上の可変部位におけるヌクレオチドと対立遺伝子２上の可変部位におけるヌクレオチドとの定量化における困難が除去される。
【０２６８】
アデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、チミジン同族体、あるいはアデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、またはチミジン同族体、あるいはアデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、チミジン同族体、あるいはアデニン、アデニン誘導体、アデニン同族体、グアニン、グアニン誘導体、グアニン同族体、シトシン、シトシン誘導体、シトシン同族体、チミジン、チミジン誘導体、またはチミジン同族体の任意の組合わせなどの任意のヌクレオチドを用いることができる。
【０２６９】
限定はしないが、放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体断片、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチン誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、色部分、および検出可能な電子スピン共鳴、電気キャパシタンス、誘電率または電気伝導度を有する部分などの任意の化学基または化学部分によってヌクレオチドを標識できる。ヌクレオチドは、１種以上の化学基または化学部分によって標識できる。
【０２７０】
他の態様において、標識および未標識ヌクレオチドを使用できる。限定はしないが、標識ジデオキシヌクレオチドと標識デオキシヌクレオチド；標識ジデオキシヌクレオチドと未標識デオキシヌクレオチド；未標識ジデオキシヌクレオチドと未標識デオキシヌクレオチド；および未標識ジデオキシヌクレオチドと標識デオキシヌクレオチドなどのデオキシヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドとの任意の組合わせが使用できる。
【０２７１】
他の態様において、化学部分で標識されたヌクレオチドをＰＣＲ反応に使用できる。次に、制限酵素による消化後に生成した５’オーバーハングにはめ込みを行うために未標識ヌクレオチドが使用される。関心対象座の対立遺伝子配列を決定するために未標識末端ヌクレオチドが、未標識ヌクレオチドの存在下で使用できる。
【０２７２】
例えば、ＰＣＲ反応に標識ｄＴＴＰが使用された場合、ＢｓｍＦＩによる消化後、以下の５’オーバーハングが生成する。
2006521086.tif 000573
【０２７３】
５’オーバーハングのはめ込みには、未標識ｄｄＡＴＰ、未標識ｄＣＴＰ、未標識ｄＧＴＰ、および未標識ｄＴＴＰが使用できる。２つのシグナルが生成する。すなわち、第１のシグナルは、１位においてオーバーハングに相補的な未標識ｄｄＡＴＰによってはめ込まれたＤＮＡ分子に対応し、第２のシグナルは、３位においてオーバーハングに相補的な未標識ｄｄＡＴＰによってはめ込まれた分子に対応する。前記ＤＮＡを分子量に基づいて分離でき、ＰＣＲ反応時に取り込まれたｄＴＴＰの蛍光によって検出できる。
【０２７４】
標識ＤＮＡ関心対象座は、限定はしないが、蛍光検出、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、自動ＤＮＡ塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリー、またはサザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡ断片を「プローブ」と「標的」の双方として使用できるＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光分析、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法などの種々の方法によって分析できる。
【０２７５】
この標識法は極めて感度が良く、限定はしないが、
2006521086.tif 000574
種々の比率の関心対象座の検出を可能にさせる。
【０２７６】
例えば、ＳＮＰ座における対立遺伝子の配列を決定するため、または通常対立遺伝子の集団の中から突然変異対立遺伝子を検出するため、または抗生物質感受性ウィルスの中から薬剤耐性ウィルスの対立遺伝子を検出するため、または病原性細菌株の対立遺伝子の中から、非病原性細菌株の対立遺伝子を検出するために、１シグナル生成部分によって標識した１種のヌクレオチドを使用することが、この標識法によって可能である。
【０２７７】
上記に示したように、ある特定の関心対象座における対立遺伝子配列を決定するために１種のヌクレオチドが使用できる。個体が特定の突然変異に関して、ホモ接合かヘテロ結合かを決定するために、または特定のＳＮＰ部位における対立遺伝子配列を決定するために、この方法は特に有用である。この標識によって、種々の色素の量子係数によって生じる誤差が除去される。また、この方法により、限定はしないが、マイクロ滴定プレートのウェルまたは１つのエッペンドルフ管などの１個の反応容器内で反応を進行させることができる。
【０２７８】
この標識法は、同一試料内の複数の遺伝子シグナルの検出に特に有用である。例えば、この方法は、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの双方を含有する妊娠女性の血液、血清または血漿中の胎児ＤＮＡの検出に有用である。血液、血清または血漿中に母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡは、９７：３などの比率で存在し得るが、上記の方法を胎児ＤＮＡの検出に用いることができる。この方法は、同一集団中、２種、３種、４種、または４種を超える異なった遺伝子シグナルを検出するために使用できる。
【０２７９】
この標識化法は、野生型対立遺伝子の大集団の中に存在する突然変異対立遺伝子の検出に特に有用である。さらに、この方法により、野生型細胞の大集団の中に存在する１個の突然変異体細胞の検出ができる。例えば、この標識化法は、正常細胞の大集団の中に存在する１個の癌細胞の検出に用いることができる。癌細胞は通常、ＤＮＡ配列に突然変異を有する。背景に大量の野生型ＤＮＡ配列がある場合でも、突然変異ＤＮＡ配列を同定することができる。この標識化法は、限定はしないが、結腸、腎臓、乳房、膀胱、肝臓、腎臓、脳、肺、前立腺などの任意のタイプの癌および白血病などの血液癌のスクリーニング、検出、または診断に利用できる。
【０２８０】
また、この標識化法は、細菌、真菌、ウィルス、原生動物およびマイコバクテリアなどの病原性生物の検出にも利用できる。この方法はまた、限定はしないが、細菌、真菌、ウィルス、原生動物およびマイコバクテリアなどの微生物の病原性株と非病原性株とを識別するためにも利用できる。
【０２８１】
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には幾つかの株が存在するが、その多くは非病原性である。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７などの幾つかの株は病原性である。非病原性Ｅ．ｃｏｌｉと病原性Ｅ．ｃｏｌｉとの間には遺伝子の違いがある。上記の標識法は、時には個体の正常な微生物叢に関連している非病原性生物の大集団の中の病原性微生物を検出するために利用できる。
【０２８２】
ＶＩ．関心対象座の分析
限定はしないが、蛍光検出、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、自動ＤＮＡ塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、（例えば、ＡＢＩプリズム３１００ジェネティック・アナライザー（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）または、ＡＢＩプリズム３７００ジェネティック・アナライザー）、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩基配列決定法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリー、またはサザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡ断片を「プローブ」と「標的」の双方として使用できるＤＮＡマイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光分析、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ＳＮＰ−ＩＴ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ、ＨｕＳＮＰ、ビーズアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＭａｓｓＥｘｔｅｎｄ、またはＭａｓｓＣｌｅａｖｅ（商標）（ｈＭＣ）法などの種々の方法によって関心対象座を分析することができる。
【０２８３】
関心対象座は、ゲル電気泳動を用いて分析でき、続いて取り込まれたヌクレオチドを蛍光検出できる。関心対象座を分析または読み取るための他の方法は、９６ウェルのストレプトアビジン被覆プレートに対して直接蛍光プレート読み取り機または蛍光分析計を使用することである。各関心対象座を読み取るために、蛍光プレート読み取り機または、ファルマシア９２００タイフーン（Ｐｆａｒｍａｃｉａ  ９２００  Ｔｙｐｈｏｏｎ）などのスキャナー上にプレートを載せることができる。
【０２８４】
あるいは、関心対象座のＰＣＲ産物をプールでき、「はめ込み」の後に（図１０）その産物をそれらに適切な任意の方法を用いて大きさによって分離でき、次に、限定はしないが、蛍光検出、ＤＮＡ塩基配列決定ゲル、自動ＤＮＡ塩基配列決定装置上の毛管電気泳動、マイクロチャネル電気泳動、および他の塩基配列決定法、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩基配列決定法、サザンブロット、スロットブロット、ドットブロットなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、およびＤＮＡマイクロアレイなどのＤＮＡハイブリダイゼーション法、質量分析、飛行時間型質量分析、四重極質量分析、磁気偏向型質量分析、電気偏向型質量分析、赤外分光、紫外分光、パレンチオスタティック（ｐａｌｅｎｔｉｏｓｔａｔｉｃ）アンペロメトリーなどの種々の方法を用いて分析できる。例えば、ＤＮＡを大きさによって分離するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動が利用でき、各バンドの蛍光色を測定するために、前記ゲルを走査できる（例えば、ＡＢＩ３７７ＤＮＡ塩基配列決定装置またはファルマシアタイフーン９２００を用いて）。
【０２８５】
他の態様において、関心対象座の配列は、関心対象座に対して３’であるヌクレオチドの取り込みを検出することによって決定できるが、ここで前記ヌクレオチドは、関心対象座において可能なヌクレオチドとは異なるヌクレオチドである。この態様は、ＳＮＰの塩基配列決定および検出にとって特に有用である。ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドを取り込む効率と速度は、各ヌクレオチドによって変わる。
【０２８６】
ヒトゲノムプロジェクトのデータによると、ＳＮＰの９９％はバイナリーである。関心対象座ＳＮＰに対して３’であるヌクレオチドを決定するためにヒトゲノムの配列を利用することができる。ＳＮＰ部位に対して３’であるヌクレオチドがＳＮＰ部位における可能なヌクレオチドと異なっている場合、ＳＮＰに対して１個または１個を超える塩基の３’であるヌクレオチドが、ＳＮＰ部位の配列を決定するために使用できる。
【０２８７】
例えば、染色体１３上のＳＮＰＸの配列を決定するとしよう。ヒトゲノムの配列により、ＳＮＰＸは、アデノシンまたはグアニンのいずれかであり得ること、また、関心対象座に対して３’ヌクレオチドはチミジンであることが示されている。ＳＮＰＸを含有するＤＮＡ断片を増幅するために増幅後、関心対象座の１３個の塩基であるように設計されている、制限酵素認識を含有するプライマーを利用する。制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化によって、アデノシンまたはグアニンのいずれかであり得る関心対象座を含有する５’オーバーハングが生成する。消化産物は、２つの「はめ込み」反応に分けることができ、一方の反応はｄＴＴＰを含有し、他方の反応はｄＣＴＰを含有する。関心対象座が、グアニンに関してホモ接合であるならば、ｄＣＴＰと混合したＤＮＡ分子だけがはめ込まれる。関心対象座が、アデノシンに関してホモ接合であるならば、ｄＴＴＰと混合したＤＮＡ分子だけがはめ込まれる。関心対象座がヘテロ接合であるならば、ｄＣＴＰと混合したＤＮＡ分子ならびにｄＴＴＰと混合したＤＮＡ分子がはめ込まれる。余分のｄＮＴＰを除去するための洗浄後、関心対象座に対して３’であるヌクレオチド（チミジン）に相補的な標識ｄｄＡＴＰによって試料にはめ込みを行う。以前の反応によってはめ込まれたＤＮＡ分子は標識ｄｄＡＴＰによってはめ込まれることになる。固体がアデノシンに関してホモ接合であるならば、ｄＴＴＰと混合したＤＮＡは引き続いて標識ｄｄＡＴＰではめ込まれることになる。しかし、ｄＣＴＰと混合したＤＮＡ分子は、そのヌクレオチドを取り込まず、したがって、ｄｄＡＴＰを取り込むことはできないであろう。ｄＴＴＰと混合した分子においてのみ、標識ｄｄＡＴＰが検出されたことにより、染色体１３上のＳＮＰＸにおけるヌクレオチドはアデノシンであることが示される。
【０２８８】
他の態様において、単一ヌクレオチドの多形または突然変異の有無に関して大規模なスクリーニングを実施することができる。１個の染色体または複数の染色体上の１個から数十、数百、数千の関心対象座を、前述の「プライマー設計」の節のとおり、プライマーと共に増幅することができる。増幅された各関心対象座が異なる大きさであるようにプライマーを設計できる（図２）。複数の関心対象座は、１個の染色体、複数の染色体、複数の遺伝子、１個の遺伝子またはそれら任意の組合わせ上にある複数の関心対象座を示している１個体のＤＮＡ試料のものであり得る。
【０２８９】
ヒトのデータを解析している場合、知られた配列は１個体（例えば、現在そのＤＮＡを分析中の個人など）から決定されている特定の配列のこともあり、または、ヒトゲノムの一部として公表されたコンセンサス配列などのこともある。
【０２９０】
関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率
一態様において、関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を算出することができる。関心対象座におけるヌクレオチドの強度を、限定はしないが、ジーンスキャン（ＧｅｅｎＳｃａｎ）およびイメージクオント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）などの任意の数のコンピュータプログラムを用いて定量化できる。例えば、ヘテロ接合ＳＮＰに関しては、２種のヌクレオチドが存在し、各々が１：１の比率で存在し得る。好ましい態様において、複数のヘテロ接合ＳＮＰの比率を算出することができる。
【０２９１】
一態様において、関心対象のヘテロ接合座で対立遺伝子における可変ヌクレオチドに関する比率を算出できる。関心対象座に存在する各々の可変ヌクレオチドの強度を、限定はしないが、ジーンスキャン（ＧｅｅｎＳｃａｎ）およびイメージクオント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）などの任意の数のコンピュータプログラムを用いて定量化できる。例えば、ヘテロ接合ＳＮＰに関しては、２種のヌクレオチドが存在し、各々が１：１の比率で存在し得る。好ましい態様において、複数のヘテロ接合ＳＮＰの比率を算出することができる。
【０２９２】
他の態様において、一染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を合計し、異なる染色体上の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。好ましい態様において、一染色体上の複数の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率を合計し、異なる染色体上の複数の関心対象のヘテロ接合座における対立遺伝子の比率と比較する。染色体１上のＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４などから得られた比率を合計できる。次にこの比率を、ＳＮＰＡ、ＳＮＰＢ、ＳＮＰＣ、ＳＮＰＤなどから得られた比率と比較することができる。
【０２９３】
例えば、染色体１上の１００種のＳＮＰを分析することができる。これら１００種のＳＮＰのうち、５０種がヘテロ接合であると仮定しよう。染色体１上のヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子の比率を合計できるが、略５０：５０の比率になるはずである。同様に、染色体２１上の分析されたＳＮＰ１００種のうち、５０種がヘテロ接合であると仮定しよう。染色体２１上のヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子の比率を合計する。染色体が正常な数であれば、この比率は略５０：５０のはずであり、したがって、染色体１と染色体２１から得られた比率の間には違いがないはずである。しかし、染色体２１の追加コピーが存在すれば、追加の対立遺伝子が供給され、前記比率は略６６：３３になるはずである。このように、ヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチド類の比率を、染色体異常の有無を検出するために利用できる。異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部欠失、付加、染色体の一部付加、挿入、染色体の断片、染色体の一領域、染色体再配列および転座などの何らかの染色体異常を検出することができる。本法は、トリソミー１３、トリソミー１８、トリソミー２１、ＸＸＹおよびＸＹＹの検出に特に有用である。
【０２９４】
本発明は、ヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の比率を定量化する方法を提供する。関心対象座としては、限定はしないが、単一ヌクレオチド多型、突然変異が挙げられる。遺伝子の全配列を増幅したり、特定の遺伝子産物を定量化する必要はない。本発明は、定量的ＰＣＲに依存しない。
【０２９５】
胎児染色体異常の検出
上記の標題「鋳型ＤＮＡ」の節で検討したように、鋳型ＤＮＡが母体の鋳型ＤＮＡと胎児鋳型ＤＮＡとを含んでなる妊娠女性の試料から鋳型ＤＮＡを得ることができる。一態様において、鋳型ＤＮＡは妊娠女性の血液から得られる。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。
【０２９６】
一態様において、妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡは母体の鋳型ＤＮＡ、および胎児の鋳型ＤＮＡの双方を含んでなる。他の態様において、母体鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質または身体滲出液などの核酸含有供給源から得て配列決定し、妊娠女性の試料から得られた鋳型ＤＮＡについて分析した関心対象座であるホモ接合またはヘテロ接合の関心対象座を同定する。
【０２９７】
好ましい態様において、ホモ接合の関心対象座を同定するために母体鋳型ＤＮＡ上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列を決定する。他の態様において、ヘテロ接合の関心対象座を同定するために母体鋳型ＤＮＡ上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列を決定する。母体鋳型ＤＮＡ上の複数の関心対象座の対立遺伝子配列は１つの反応または複数の反応において決定できる。
【０２９８】
例えば、染色体の２１上の母体の関心対象座１００個および染色体１上の母体の関心対象座１００個を分析するとすれば、各染色体の略５０個の関心対象座がホモ接合であり、５０個がヘテロ接合であると予想されるであろう。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡを用いて各染色体上のホモ接合の関心対象座５０個またはヘテロ接合の関心対象座５０個、またはホモ接合の関心対象座５０個とヘテロ接合の関心対象座５０個、またはホモ接合の関心対象座とヘテロ接合の関心対象座との任意の組合わせを分析することができる。
【０２９９】
妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡ上の関心対象座は、上述の増幅、単離、消化、はめ込み、および検出方法を用いて分析される。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡをスクリーンするために、母体鋳型ＤＮＡ上の関心対象座を分析するために使用した同一のプライマーが用いられる。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡ上の任意の数の関心対象座を分析することができる。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡにおいて、例えば、１、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０．９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００個、または４０００個を超えるホモ接合の母体関心対象座を分析することができる。好ましい態様において、複数の染色体上の複数の関心対象座が分析される。
【０３００】
ホモ接合の母体関心対象座の集団で、妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡから、ヘテロ接合の関心対象座とホモ接合の関心対象座の双方が存在し、ヘテロ接合の関心対象座をさらに分析することができる。存在する染色体の数を決定するためにヘテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の比率が利用できる。
【０３０１】
染色体上の染色体異常を通常伴わないヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率を決定することによって、妊娠女性の試料に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージを算出することができる。好ましい一態様において、胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定するために、一染色体上の複数のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率が利用できる。例えば、胎児ＤＮＡのパーセンテージを決定するためにヒトゲノムにおいて最も大きな染色体１を用いることができる。
【０３０２】
例えば、母体鋳型ＤＮＡ（Ａ／Ａ）において、ＳＮＰＸがホモ接合であると仮定しよう。ＳＮＰＸにおいて、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの双方を含有し得る妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡはヘテロ接合（Ａ／Ｇ）である。ＳＮＰＸにおいて、母体はホモ接合であるため、ヌクレオチドのグアニンは胎児のＤＮＡを表しており、したがって、グアニンは胎児ＤＮＡのものである。ＳＮＰＸにおけるグアニンを用いて、試料中の胎児ＤＮＡパーセンテージを算出できる。
【０３０３】
あるいは、胎児ＤＮＡパーセンテージを決定するために、２本以上の染色体上の複数の関心対象座を調査できる。胎児ＤＮＡパーセンテージを決定するために、例えば、染色体１３および１８上の複数の関心対象座を調べることができる。というのは、染色体１３および１８における染色体異常を有する生物は生存できないからである。
【０３０４】
あるいは、試料中に存在する胎児ＤＮＡの量を決定するために、男性胎児では、Ｙ染色体上のマーカーが使用できる。妊娠女性の試料から単離された鋳型ＤＮＡを用いて１区画の連続希釈を行うことができ、定量的ＰＣＲ分析を実施できる。２つのＰＣＲ反応を実施できる。すなわち、一方はＹ染色体上のマーカー、例えばＳＲＹを増幅するＰＣＲ反応、および他方はいずれかの常染色体上の一領域を増幅するＰＣＲ反応である。以下の式を用いて、胎児ＤＮＡの量が算出できる。
胎児ＤＮＡパーセント：（検出Ｙ染色体最終希釈／検出常染色体最終希釈）＊２＊１００。
【０３０５】
仮に、ＳＮＰ  Ａにおいて、母親がホモ接合のＡ／Ａであって、胎児がヘテロ接合のＡ／Ｇであれば、Ａ：Ｇの比を用いて染色体異常を検出することができる。仮に、胎児由来のＤＮＡが、母親由来の血液中のＤＮＡの５０％であれば、母親由来のヌクレオチドがアデニンで、また他のヌクレオチドがグアニンであるＳＮＰ  Ａとなり、グアニン（胎児の鋳型ＤＮＡに由来する）に対するアデニン（２つのアデニンが母親の鋳型ＤＮＡに由来し、また１つが胎児の鋳型ＤＮＡに由来する）の比は、２５：７５すなわち０．３３と予測される。しかし、仮に、胎児が、特定の染色体のトリソミーであり、追加の染色体が母親からの寄与によるものである場合、つまり追加のアデニンヌクレオチドが存在する場合、同比は０．２５（５０（Ｇ）／（母親由来の２＊５０のＡ＋胎児由来の２＊５０のＡ））と予測することができる。したがって、２コピーで存在する染色体から得られる比と、トリソミー状態で存在する染色体から得られる比の間には８％の差がある。一方で、仮に、追加の染色体が父親からの寄与によるものである場合、つまり追加のグアニンが存在する場合、同比は０．６６となる（胎児由来の２＊５０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊５０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の５０のＡ対立遺伝子）。
【０３０６】
しかし、仮に、胎児由来のＤＮＡが母親由来の血液中のＤＮＡの４０％を占める場合、（トリソミーの場合を除く）予測比率は０．２５である（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊６０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の１＊６０のＡ対立遺伝子））。仮に、胎児がトリソミーの場合、また追加の染色体が母親からもたらされる場合であれば、予測比率は０．２０となる（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊６０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の２＊４０のＡ対立遺伝子）。２コピーで存在する染色体から得られる比、トリソミー状態で存在する染色体から得られる比の差は５％となる。
【０３０７】
他の態様において、複数の染色体上の複数の関心対象座を調査できる。一染色体上の各へテロ接合の関心対象座における対立遺伝子の比率を合計でき、別の染色体上の各関心対象座における対立遺伝子の比率と比較できる。比較される染色体はヒト起源のものであり得、限定はしないが、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸおよびＹが挙げられる。複数の染色体から得られた比率を１個の染色体または複数の染色体から得られた比率と比較できる。
【０３０８】
一態様において、比較に用いられる染色体の１つは、染色体１３、１５、１６；１８、２１、２２、ＸまたはＹであり得る。好ましい一態様において、染色体１３、１８および２１についての比率が比較される。
【０３０９】
例えば、妊娠女性に由来する試料中の胎児ＤＮＡが４０％であると仮定すると、第１染色体上のヘテロ接合の対象遺伝子座における対立遺伝子の比は０．２５となる（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の２＊６０のＡ対立遺伝子＋胎児由来の４０のＡ対立遺伝子）。同様に、第２１染色体上のヘテロ接合の対象遺伝子座における対立遺伝子の比は０．２５となる。しかし、追加の染色体が母親からの寄与によるトリソミー２１の胎児では、第２１染色体上のヘテロ接合の対象遺伝子座におけるヌクレオチドは０．２０の比で存在することになる（胎児由来の４０のＧ対立遺伝子／（母親由来の６０＊２のＡ対立遺伝子＋胎児由来の４０＊２のＡ対立遺伝子）。これとは対照的に、第１染色体に関する比は０．２５で変わらないので、比に見られる５％の差は、追加の染色体の存在を意味する。１〜１０〜１００〜１０００の対象遺伝子座を分析することができる。
【０３１０】
別の態様では、妊娠女性由来の試料に由来する鋳型ＤＮＡ上の対象遺伝子座の遺伝子型を、母親の対象遺伝子座がホモ接合であることを事前に確認することなく決定することができる。母親と胎児の鋳型ＤＮＡの両方を含む鋳型ＤＮＡの分析に先だって、母親の鋳型ＤＮＡの遺伝子型を決定する必要はない。
【０３１１】
染色体異常の有無を決定するために関心対象座における対立遺伝子の比率を利用できる。妊娠女性の試料由来の鋳型ＤＮＡは、母体鋳型ＤＮＡおよび胎児鋳型ＤＮＡの双方を含有している。母体鋳型ＤＮＡまたは胎児鋳型ＤＮＡのいずれかに関する各ＳＮＰにおいて３つの可能性が存在する。すなわち、対立遺伝子１に関してヘテロ接合、ホモ接合または対立遺伝子２に関してホモ接合である。アデニンまたはグアニンのいずれかであるＳＮＰに関するヌクレオチドの可能な比率を表ＩＩに示してある。表ＩＩに示された比率は、妊娠女性の試料中ＤＮＡの５０％が胎児ＤＮＡとして算出してある。
【０３１２】
（表ＩＩ）ヘテロ接合型のＳＮＰに関するヌクレオチドについての比
2006521086.tif 000575
【０３１３】
３つのヌクレオチド比が存在する。すなわち、単一ヌクレオチド１００％、５０：５０または７５：２５である。これらの比率は、妊娠女性の試料中に存在する胎児ＤＮＡ量に依って変わる。しかし、胎児ＤＮＡのパーセンテージは、分析された染色体に係らず一定になるはずである。したがって、染色体が２つのコピーにおいて存在するならば、上記の算出比が見られるであろう。
【０３１４】
一方、これらのパーセンテージは、過剰の染色体が存在すれば変化するであろう。例えば、ＳＮＰＸがアデニンまたはグアニンであり得るとし、妊娠女性の試料中の胎児ＤＮＡのパーセンテージが５０％であると仮定しよう。染色体１上の関心対象座の分析により、上記で検討された比率、すなわち１００：０、５０：５０および７５：２５が与えられるであろう。過剰の染色体を有した場合のＡ／ＧであるＳＮＰに関する可能な比率を表ＩＩＩに示してある。
【０３１５】
（表ＩＩＩ）染色体のさらなるコピーが存在するときの、ＳＮＰにおけるヌクレオチド比
2006521086.tif 000576
【０３１６】
一染色体の追加のコピーを有するヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子に関する可能な比率は、０：１００、４０：６０、および２０：８０である。これらの比率のうちの２つ、４０：６０と２０：８０は、一染色体の２つのコピーを有して得られたヘテロ接合ＳＮＰにおける対立遺伝子の比率とは異なる。上記で検討したように、ヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドに関する比率は、試料中に存在する胎児ＤＮＡ量に依存する。しかし、比率がどうあろうとも、それらは、染色体異常がない限り、染色体全てに亘って一定に保たれるであろう。
【０３１７】
ある染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率を、別の染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率と比較することができる。例えば、染色体１上の複数の関心対象座に関する比率（ＳＮＰ１、ＳＮＰ２、ＳＮＰ３、ＳＮＰ４などにおける比率）を、染色体２１上の複数の関心対象座に関する比率（ＳＮＰＡ、ＳＮＰＢ、ＳＮＰＣ、ＳＮＰＤなどにおける比率）と比較できる。任意の染色体を他の任意の染色体と比較できる。比較できる染色体の数に制限はない。
【０３１８】
再び表ＩＩおよび表ＩＩＩのデータを参照すると、２つのコピーで存在した染色体１上のヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの比率は２５：７５および５０：５０であった。一方、３つのコピーで存在する染色体２１上のヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの比率は４０：６０および２０：８０であった。これら２種の比率の間の違いは、染色体異常を示している。これらの比率は、母体血清中に存在する胎児ＤＮＡの変化する度合いの全範囲に対して前計算できる。胎児の染色体異常の存在を検出するために、母体のホモ接合およびヘテロ接合の関心対象座双方が使用できることを表ＩＩおよびＩＩＩは示している。
【０３１９】
追加染色体の存在を検出するために、ヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの比率をどのように利用するかを、上記の例は示している。染色体再配列、転座、微小染色体、染色体領域の重複、モノソミー、染色体領域の欠失、および染色体の断片を検出するために同じタイプの分析を用いることができる。本法は、母親または父親の遺伝子型決定を必要としないが、血漿試料とともに分析する必要のあるＳＮＰの数を減らしてもよい。
【０３２０】
本発明は、胎児の遺伝子産物量を定量しない。また、本発明の利用法は、Ｙ染色体上に見られる遺伝子分析に限定されてはいない。本発明は、単に父親から遺伝された核酸の検出に依存せず、むしろ本発明は、ＳＮＰを含む関心対象座における母親の対立遺伝子対胎児の対立遺伝子の比の算出を可能にする方法を提供する。
【０３２１】
別の態様では、対象遺伝子座における１つの対立遺伝子を使用して染色体異常の有無を判定し、また胎児の遺伝性疾患を検出することができる。好ましい態様では、対象遺伝子座における母親の対立遺伝子を使用して、胎児における染色体異常の有無を判定する。生物学的な母親の遺伝子型を決定して、対象遺伝子座がホモ接合であることを同定することができる。同様に、生物学的な父親の遺伝子型を決定して、対象遺伝子座がホモ接合であることを同定することができる。１つの対立遺伝子に関して母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また他の対立遺伝子に関して父親の鋳型ＤＮＡがホモ接合である対象遺伝子座を、母親と胎児の両方の鋳型ＤＮＡを含む、母親の血漿から得られた鋳型ＤＮＡを用いて分析する。１、１〜５、５〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜５００、５００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜８０００、８０００〜１６０００、１６０００〜３２０００、または３２０００を超える対象遺伝子座を含むがこれらに限定されない、任意の数の対象遺伝子座を分析することができる。
【０３２２】
好ましい態様では、母親由来のゲノム、および対象遺伝子座における、母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子に由来するシグナルを定量する。例えば、仮に、ＩＩＳ型酵素による切断後に生じる５’オーバーハングが、蛍光標識されたＡヌクレオチドで埋められると、取り込まれた色素の強度を定量することができる。
【０３２３】
母親の鋳型ＤＮＡ−−アデニンに関してホモ接合
2006521086.tif 000577
父親の鋳型ＤＮＡ−−シトシンに関してホモ接合
2006521086.tif 000578
血漿中の鋳型ＤＮＡ−−母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方
母親の鋳型ＤＮＡ−−アデニンに関してホモ接合
2006521086.tif 000579
胎児の鋳型ＤＮＡ−−ヘテロ接合
2006521086.tif 000580
【０３２４】
妊娠女性の血漿から得られた鋳型ＤＮＡが、標識ｄｄＡＴＰ、および非標識のｄｄＣＴＰ（上記のｄｄＣ）、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰで埋められる。血漿ＤＮＡは、母親由来の２本のアデニン対立遺伝子、および胎児由来の１本のアデニン対立遺伝子を含む。標識ｄｄＡＴＰおよび非標識ｄｄＣＴＰによって埋められることで、母親の対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子のみが検出される。父親の対立遺伝子は、このような場合には検出されない。このはめ込み反応は、実施例に記載された手順で実施することができる。
【０３２５】
１つの対象遺伝子座、または複数の対象遺伝子座を分析することができる。複数の対象遺伝子座における、母親由来の対立遺伝子の強度を定量することができる。１つの染色体に関して平均値を算出し、これを、異なる染色体について得られた平均値と比較することができる。例えば、第１染色体に関して、母親由来の対立遺伝子と、母親から受け継いだ胎児由来の対立遺伝子の平均強度を、第１３染色体、第１８染色体、または第２１染色体に関する母親の対立遺伝子と、母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子の平均強度と比較することができる。好ましい態様では、第１３染色体、第１５染色体、第１８染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体（可能な場合）を比較する。
【０３２６】
対象遺伝子座に由来するシグナルは、別の対象遺伝子座より強い場合がある。しかし、１本の染色体上の対象遺伝子座に由来するシグナルが、他の染色体上の対象遺伝子座に由来するシグナルより強くなるという理由はない。さまざまな対象遺伝子座に由来するシグナルが多様性を示す可能性がある一方で、このような多様性は、ゲノム全体にわたってみられるはずである。対象遺伝子座の平均シグナルは、どの染色体を比較しても同じはずである。
【０３２７】
等量のＰＣＲ産物の量が生じるようにＰＣＲ反応条件を最適化することができる。例えば、個々の対象遺伝子座に関して、プライマー濃度、ヌクレオチド濃度、およびサイクル数を最適化することができる。また、特定の対立遺伝子の何らかの増加を検出することが可能な条件ではめ込み反応を実施することができる。はめ込み反応の条件を最適化することで、試薬濃度、はめ込み反応時間、および反応温度を含むがこれらに限定されない、対象対立遺伝子の何らかの増加を検出することができる。
【０３２８】
通常の遺伝子核型の場合、個々の対象遺伝子座におけるシグナルは、母親由来のゲノムに由来するシグナルと、この母親から受け継いだ胎児由来の対立遺伝子に由来するシグナルを含む。試料中の胎児ＤＮＡのパーセントは、分析対象の染色体にかかわらず一定である。例えば、仮に、ＳＮＰ  Ｘにおいて、母親由来のゲノムがＡ／Ａであり、また父親由来のゲノムがＧ／Ｇであれば、胎児のゲノムはＡ／Ｇとなり、また胎児のアデニン対立遺伝子は、アデニン対立遺伝子に由来する特定のパーセンテージのシグナルを含むことになる。仮に、母親の血漿中における胎児ＤＮＡのパーセンテージが２０％であれば、胎児のアデニン対立遺伝子は、アデニン対立遺伝子に関してシグナルの２０％に寄与することになる。母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子の寄与は、分析対象のどの対象遺伝子座に関しても一定となる。
【０３２９】
染色体異常がある場合は、母親由来のゲノム、および対象遺伝子座において、母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子に由来するシグナルは、他の染色体について観察されるシグナルとは異なることになる。例えば、トリソミーの場合であれば、対象遺伝子座におけるシグナルは、母親由来のゲノム、および母親から受け継いだ、胎児の２本の対立遺伝子を含むことになる。３コピーが存在する染色体に関して、対象遺伝子座に由来するシグナルは、このような対象遺伝子座における対立遺伝子のシグナルを変化させることになる、追加の胎児対立遺伝子の寄与を含むことになる。
【０３３０】
別の態様では、１つの対立遺伝子と既知量の標準ＤＮＡを用いて比率を計算することができる。好ましい態様では、母親由来のゲノムの対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子、ならびに標準ＤＮＡを用いて比を計算する。対象遺伝子座がホモ接合であることを同定するためには、生物学的な母親の遺伝子型を決定するとよい。同様に、生物学的な父親の遺伝子型を決定することで、対象遺伝子座がホモ接合であることを同定することができる。１つの対立遺伝子に関して母親の鋳型ＤＮＡがホモ接合であり、また別の対立遺伝子に関して父親の鋳型ＤＮＡがホモ接合である対象遺伝子座を、母親の血漿（母親と胎児の両方の鋳型ＤＮＡを含む）から得られる鋳型ＤＮＡを用いて分析する。
【０３３１】
好ましい態様では、母親由来のゲノム、および対象遺伝子座に関して母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子に由来するシグナルを定量する。例えば、仮に、ＩＩＳ型酵素による切断で生じる５’オーバーハングが、蛍光標識されたＡヌクレオチドで埋められると、取り込まれた色素の強度を定量することができる。
【０３３２】
血漿中の鋳型ＤＮＡ−−母親の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの両方
母親の鋳型ＤＮＡ−−アデニンに関してホモ接合
2006521086.tif 000581
胎児の鋳型ＤＮＡ−−ヘテロ接合
2006521086.tif 000582
【０３３３】
妊娠女性の血漿から得られる鋳型ＤＮＡは、標識ｄｄＡＴＰ、および非標識のｄｄＣＴＰ（上記のｄｄＣ）、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰで埋められる。血漿ＤＮＡは、母親由来の２つのアデニン対立遺伝子と、胎児由来の１つのアデニン対立遺伝子を含む。標識ｄｄＡＴＰと非標識ｄｄＣＴＰによって埋められることによって、母親の対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子のみが検出される。
【０３３４】
１つの対象遺伝子座、または複数の対象遺伝子座を分析することができる。個々の対象遺伝子座に関して、対象遺伝子座とほぼ同じ位置に移動するようにＤＮＡ分子を設計する。好ましい態様では、このようなＤＮＡ分子の量は既知である。母親由来のゲノムの対立遺伝子、および母親から受け継いだ胎児の対立遺伝子、ならびに対象遺伝子座とほぼ同じ位置に移動するように設計されたＤＮＡ分子を用いて比を計算する。例えば、仮に、対象遺伝子座を３０塩基対に移動するように設計する場合、ＤＮＡ分子を、２０〜２５塩基、２５〜３０塩基、３０〜３５塩基、３５〜４５塩基、および４５塩基を上回る塩基を含むがこれらに限定されない、約３０塩基対に移動するように設計することができる。母親由来のゲノムの対立遺伝子、およびその母親に由来する胎児の対立遺伝子、ならびに標準ＤＮＡ分子を、同じ反応で分析することができるほか、個別の反応で分析することができる。母親由来のゲノムの対立遺伝子、およびその母親に由来する胎児の対立遺伝子、ならびに標準ＤＮＡ分子を、１枚のゲルの同じレーンで分析することができるほか、１枚のゲルの別のレーンで分析することができる。対象遺伝子座と同じ位置に移動するように設計された既知量の標準ＤＮＡ分子の使用は、ゲル上の位置に対するバンドの強度を含むがこれらに限定されない、さまざまな因子を矯正することになる。
【０３３５】
染色体上の複数の対象遺伝子座の比を定量し、平均値を算出することができる。こうして得られた平均値を、他の染色体について得られた平均値と比較することができる。こうして得られた比を用いることで染色体異常の有無がわかる。母親由来のゲノムの対立遺伝子および胎児の対立遺伝子の分析により、１つの遺伝子が関与する遺伝性疾患、または複数の遺伝子が関与する遺伝性疾患の検出も可能となる。
【０３３６】
本発明の方法を用いて、任意の生物の任意の染色体を分析できる。例えば、ヒトでは、本発明の方法を用いて、染色体１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、ＸまたはＹを分析できる。任意の染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率を、他の任意の染色体上のヘテロ接合関心対象座における対立遺伝子の比率と比較することができる。
【０３３７】
このように本発明は、胎児における染色体異常の迅速で精確で決定的な検出のための、胎児細胞の単離に依存しない非侵襲的方法を提供する。また、本発明は、胎児のＤＮＡ配列を決定するための非侵襲的方法を提供する。本発明は、限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化など、野生型配列に較べた場合の遺伝子配列における何らかの変化を検出するために利用できる。
【０３３８】
短縦列反復を用いた胎児染色体異常の検出
短縦列反復（ＳＴＲ）は、前後様式で多数回反復されている長さが、通常２〜５塩基対の短いＤＮＡ配列である。縦列反復ＤＮＡ配列は、ヒトゲノム全体で広く存在しており、集団内の個体間で十分な変異性を示している。微小付随体は９〜８０塩基対のコア反復を有する。
【０３３９】
他の態様において、胎児の染色体異常を検出するために、短縦列反復を用いることができる。鋳型ＤＮＡは、限定はしないが、細胞、組織、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹膜液、腹水、糞便物質または身体滲出液などの核酸含有試料から得ることができる。他の態様において、核酸含有試料に、細胞溶解阻害剤を加える。好ましい態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液から得られる。他の態様において、鋳型ＤＮＡは、妊娠女性の血液の血漿または血清から得られる。
【０３４０】
妊娠女性の血液から得られた鋳型ＤＮＡは、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡの双方を含有する。胎児ＤＮＡは母親から、および父親からのＳＴＲ類を含んでなる。染色体異常を検出するために母親と父親の間のＳＴＲ類における変異を利用することができる。
【０３４１】
短縦列反復を増幅するためにプライマーを設計できる。限定はしないが、ポリメラーゼ連鎖反応、自立配列反応、リガーゼ連鎖反応、ｃＤＮＡ端の高増幅、ポリメラーゼ連鎖反応とリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、鎖置換増幅、およびスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応などの任意の増幅法が使用できる。
【０３４２】
限定はしないが、１〜５、５〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１０００および１０００を超える任意の数の短縦列反復を分析できる。短縦列反復は、１つのＰＣＲ反応において、または複数のＰＣＲ反応において分析できる。好ましい態様において、複数の染色体のＳＴＲ類を分析する。
【０３４３】
増幅後、限定はしないが、ゲル電気泳動および質量分析などの任意の数の方法によってＰＣＲ産物を分析できる。妊娠女性の鋳型ＤＮＡは、母親起源のＳＴＲ類と父親起源のＳＴＲ類を含んでいる。父親起源のＳＴＲ類が胎児ＤＮＡを表す。父親起源のＳＴＲ類と母親起源のＳＴＲ類とは、長さが同一であり得るか、あるいは、父親起源のＳＴＲ類と母親起源のＳＴＲ類とは、長さが異なり得る。
【０３４４】
ヘテロ接合ＳＴＲ類は、母親のものと父親のものとで長さが異なるＳＴＲ類である。各ＰＣＲ産物量を、各ヘテロ接合のＳＴＲ類に関して定量化できる。染色体の数が正常であれば、ＰＣＲ産物量は略等しくなるはずである。しかし余分な染色体があれば、ＳＴＲ  ＰＣＲ産物のうちの１つがより多量に存在することになろう。
【０３４５】
例えば、妊娠女性の血液から得られた鋳型ＤＮＡについて、染色体１以上の複数のＳＴＲ類を分析できる。各ＳＴＲは、母親起源であっても、また父親起源であっても略同僚で存在するはずである。同様に、２つの染色体２１でも、各ＳＴＲは略同僚で存在するはずである。しかし、トリソミー２１では、母親のものと父親のものとで長さが異なれば（ヘテロ接合ＳＴＲ）、ＳＴＲ  ＰＣＲ産物のうちの１つがより多量に存在するはずである。１つの染色体上の各へテロ接合ＳＴＲの比を、別の染色体上の各へテロ接合ＳＴＲの比と比較することができ、ここでの違いが、染色体異常の有無を示す。
【０３４６】
キット
本発明の方法は、本法に用いられる試薬をキットの形態で提供することにより最も利便性よく実施される。キットは１種以上の以下の成分を含有することが好ましい：キットの使用説明書、別々の容器またはパッケージに封鎖した適切な緩衝剤、塩類、ＤＮＡ抽出清浄剤、プライマー、ヌクレオチド、標識ヌクレオチド、５’修飾物質および所望の場合、適切な純度の水、キットの使用者が本発明の方法によって適切な核酸試料を抽出し、それを分析することを可能にするような成分。キットで提供されるプライマーは、キットの目的およびそのキットを用いて試験することが望まれているＤＮＡに依って変わる。
【０３４７】
キットはまた、所望の、または種々の単一ヌクレオチド多形、特に望ましくない病態または疾病を伴う単一ヌクレオチド多型を検出するために設計できる。例えば、あるキットは、他にも成分はあるが、ハンチントン病に関連した１つ以上の関心対象座を増幅するための１セットの、または複数のセットのプライマーを含んでなり得る。他のキットは、他にも成分はあるが、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病を発症する体質に関連した遺伝子に対する１セットの、または複数の組のプライマーを含んでなり得る。さらに他のキットは、他にも成分はあるが、心疾患を発症する体質に関連した遺伝子に対する１セットの、または複数のセットのプライマーを含んでなり得る。このようなキットの利用法に関する詳細は下記の「利用法」の節に提供している。
【０３４８】
利用法
本発明の方法は、個体の遺伝子型を知ることが望まれる場合にはいつでも使用できる。本発明の方法は、遺伝子疾患の検出に特に有用である。本発明の方法は、胎児における遺伝子疾患の検出目的の非侵襲的方法として特に有用である。好ましい態様において、本発明の方法は、単一のヌクレオチド多型の同定法を提供する。
【０３４９】
好ましい態様において、限定はしないが、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、付加、染色体再配列、転座および他の異数体などの染色体異常を検出するために有用である。本法は、胎児における染色体異常を検出するために特に有用である。
【０３５０】
好ましい態様において、本発明の方法は、胎児における疾病の存在、特に、ある遺伝子配列の存在の結果生じる遺伝子疾患、または遺伝子配列を知ることが望まれる個人において、同定が望まれる他の生物学的状態の同定を目的とした方法を提供する。このような遺伝子配列の存在に基づいた胎児におけるこのような配列の同定は、例えば、胎児がキャリアかどうかを決定するために、または胎児がある一定の遺伝子的特徴、病態または疾病を発症させる体質であるかどうかを判断するために使用できる。本発明の方法は、親と子の出生前遺伝子検査において特に有用である。
【０３５１】
本発明により診断し得る疾病の例を表に挙げてある。
【０３５２】
（表ＩＶ）
2006521086.tif 000583
2006521086.tif 000584
2006521086.tif 000585
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2006521086.tif 000587
【０３５３】
本発明の方法は、遺伝子的特徴または遺伝子疾患を伴う数十、数百、数千の複数の関心対象座において、その特徴または疾病状態を伴う関心対象座、特に、そのような特徴または病態を伴うことが最も多い関心対象座の塩基配列決定によって個人をスクリーニングするために有用である。本発明は、限定はしないが、心疾患、癌、内分泌疾患、免疫障害、神経学的障害、筋骨格障害、眼科学的障害、遺伝子異常、トリソミー、モノソミー、トランスバージョン、転座、皮膚障害および家族性疾患などの特定の疾患集団の分析に有用である。
【０３５４】
また、本発明の方法は、例えば、母親または父親の検査などに使用するため、公知の供給源または配列のＤＮＡに対する、未知の配列ＤＮＡの関係を確証、または同定するために使用できる。
【０３５５】
本発明を全般的に説明したところで次に、ある特定の実施例を参照することにより、本発明の理解はさらに深まるであろう。本明細書に含まれている実施例は例示のみを目的としており、他に特記しない限り、限定を意図するものではない。
【０３５６】
実施例
以下の実施例は、例示のみであり、請求項で規定された本発明の範囲を限定する意図はない。
【０３５７】
実施例１
ＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅したが、非特異的増幅を減少させるために指定温度において、サイクル１を実施してから、サイクル２で温度を上げ、さらにサイクル３で温度を上げた。第２のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の融解温度を算出することによって、ＰＣＲのサイクル１のＴＭ１を決定した。例えば、図１Ｂにおいて、ＴＭ１は領域「ｃ」の略融解温度であり得る。アニーリング温度は、サイクル２において、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度であるＴＭ２へと上昇させた。例えば図１Ｃにおいて、アニーリング温度（ＴＭ２）は、領域「ｂ」の融解温度に相当する。サイクル３において、アニーリング温度は、第２のプライマーの全配列の略融解温度であるＴＭ３へと上昇させた。例えば図１Ｄにおいて、アニーリング温度（ＴＭ３）は、領域「ｃ」＋領域「ｄ」の融解温度に相当する。増幅の残りのサイクルはＴＭ３で実施した。
【０３５８】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した５ｍｌの血液試料から調製した。血液は３６人の志願者から採血した。ＱＩＡＧＥＮより供給されたＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡブラッド・ミディ・キット（Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて、各血液試料から鋳型ＤＮＡを単離した。３６人の志願者各人の鋳型ＤＮＡを、さらなる分析のために単離後プールした。
【０３５９】
プライマー設計
以下の４つの単一ヌクレオチド多型を分析した。すなわち、染色体２１上に位置する、ヒト染色体２１ｃＳＮＰデータベースに帰属する同定番号ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０（図３、レーン１）；染色体１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図３、レーン２）、染色体１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６（図３、レーン３）、および染色体１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（図３、レーン４）である。ＳＮＰ合弁会社（ＳＮＰ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  Ｌｔｄ．）のデータベースは、２００２年２月１４日時点で有効が確認されたウェブサイトアドレス、http://snp.cshl.org./でアクセスできる。
【０３６０】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000588
第２のプライマー：
2006521086.tif 000589
【０３６１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000590
第２のプライマー：
2006521086.tif 000591
【０３６２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000592
第２のプライマー：
2006521086.tif 000593
【０３６３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000594
第２のプライマー：
2006521086.tif 000595
【０３６４】
全てのプライマーは、その３’領域が各関心対象座にフランキングする上流または下流の配列に相補的であるように、また、５’領域が制限酵素認識部位を含有するように設計された。第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した。
【０３６５】
ＰＣＲ反応
４つの関心対象座全てを、ＰＣＲを用いて鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）。ＰＣＲ反応の構成要素は以下のとおりである：４０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、５μＭの第１のプライマー、５μＭの第２のプライマー、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手された１×ホットスターＴａｑマスター・ミックス（ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）（カタログ番号２０３４４３）。ホットスターＴａｑマスター・ミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝剤、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有した。
【０３６６】
関心対象座ＳＮＰを含有する各鋳型ＤＮＡの増幅は、本明細書で厳密な低アニーリング温度、厳密な中アニーリング温度、厳密な高アニーリング温度と称される３つの異なる一連のアニーリング温度を用いて実施した。アニーリング温度プロトコルに係りなく、各ＰＣＲ反応は、４０サイクルの増幅からなっていた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスを用いて実施した。製造元による教示のとおり、ＰＣＲの最初のサイクル前に、反応液を９５℃で１５分間温置した。各伸長ステップ後の変性ステップは、９５℃で３０分間行った。温度を上げることなく効率的な伸長が可能な温度でアニーリング反応を実施した。
【０３６７】
厳密な低アニーリング反応は、最初の３つのサイクルの各々における異なるアニーリング温度を含んでなる。すなわち、第１のサイクルのアニーリング温度は３７℃で３０秒；第２のサイクルのアニーリングは５７℃で３０秒；第３のサイクルのアニーリング温度は６４℃で３０秒であった。引き続くサイクルから完了までのアニーリングは６４℃で実施した。
【０３６８】
ゲルの写真（図３Ａ）に示されるように、ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（レーン４）の増幅後に複数のバンドが見られた。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００３４０（レーン１）、ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（レーン２）、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６（レーン３）の増幅では、強度の高い１本のバンドおよび、より高分子量のものである微弱な強度のバンド１本が生成した。低アニーリング温度条件が用いられた場合、正確な大きさの産物が生成したが、これは各反応における主産物であった。
【０３６９】
厳密な中アニーリング反応は、最初の３つのサイクルの各々における異なるアニーリング温度を含んでなる。すなわち、第１のサイクルのアニーリング温度は４０℃で３０秒；第２のサイクルのアニーリングは６０℃で３０秒；第３のサイクルのアニーリング温度は６７℃で３０秒であった。引き続くサイクルから完了までのアニーリングは６７℃で実施した。厳密な低アニーリング条件下で見られたことと同様に、ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（図３Ｂ、レーン４）の厳密な中等度条件下の増幅により、複数のバンドが生成した。他の３種のＳＮＰ（レーン１〜３）の増幅では、１本のバンドが生成した。その結果、１３塩基のアニーリング長を有するプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡから関心対象座を間違いなく増幅するために、アニーリング温度を変化させて使用できることがわかった。
【０３７０】
厳密な高アニーリング反応は、最初の３つのサイクルの各々における異なるアニーリング温度を含んでなる。第１のサイクルのアニーリング温度は４６℃で３０秒；第２のサイクルのアニーリングは６５℃で３０秒；第３のサイクルのアニーリング温度は７２℃で３０秒であった。引き続くサイクルから完了までのアニーリングは７２℃で実施した。ゲルの写真（図３Ｃ）に示されるように、厳密な高アニーリング温度を用いたＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（レーン４）の増幅により、正確な分子量の単一バンドが生成した。最初の３つのサイクルの各々に関してアニーリング温度を上げることにより、非特異的増幅が排除された。ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１１２（レーン２）の増幅により１本のバンドが生成した。ＳＮＰのＨＣ２１Ｓ００３４０（レーン１）とＴＳＣ０２１４３６６（レーン３）は、厳密な高アニーリング温度において増幅できなかったが、厳密な中アニーリング温度で、これらのＳＮＰは、１本のバンドとして増幅された。その結果、ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５（図３、レーン４）に対して示されているように、非特異的ＰＣＲ産物を減少させるために、アニーリング温度を変化させて使用できることがわかった。
【０３７１】
実施例２
染色体１上のＳＮＰ（ＴＳＣ００９５５１２）、染色体１３上のＳＮＰ（ＴＳＣ０２６４５８０）および染色体２１上のＳＮＰ（ＨＣ２１Ｓ０００２７）を分析した。ＴＳＣ００９５５１２は２つの異なるプライマーセットを用いて分析し、ＨＣ２１Ｓ０００２７はヌクレオチドの取り込みに関して、２種の反応を用いて分析した。
【０３７２】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した５ｍｌの血液試料から調製した。ＱＬＡＧＥＮより供されたＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡブラッド・ミディ・キット（Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて、鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡは、前記キットに含まれる使用説明書に従って単離した。単離後、３６人のヒト志願者の鋳型ＤＮＡを一緒にプールし、制限酵素ＥｃｏＲＩによって切断した。製造元の使用説明書に従って制限酵素消化を実施した。
【０３７３】
プライマー設計
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000596
第２のプライマー：
2006521086.tif 000597
【０３７４】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した（図４Ａ）。
【０３７５】
また、ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、同一の第１のプライマーおよび以下の配列を有する異なる第２のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
第２のプライマー：
2006521086.tif 000598
【０３７６】
この第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した（図４Ｂ）。
【０３７７】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000599
第２のプライマー：
2006521086.tif 000600
【０３７８】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した（図４Ｃ）。
【０３７９】
またＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、同一の第１のプライマーおよび以下の配列を有する第２のプライマーを用いて増幅した：
第２のプライマー：
2006521086.tif 000601
【０３８０】
この第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した（図４Ｄ）。
【０３８１】
染色体１３上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000602
第２のプライマー：
2006521086.tif 000603
【０３８２】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチンタグおよび制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有した。
【０３８３】
ＰＣＲ反応
関心対象座は全てポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、参照のため本明細書に組み込まれている米国特許第４，６８３，１９６号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）を用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した。本実施例では、関心対象座を別々の反応管で増幅したが、それらを１つのＰＣＲ反応において一緒に増幅することもできる。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応は、ＱＩＡＧＥＮから供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。一反応当たりの鋳型ＤＮＡおよびプライマー量は各関心対象座に関して最適化できるが、本実施例では、４０ｎｇの鋳型ヒトゲノムＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。４０サイクルのＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３９回反復；
（９）７２℃で５分。
【０３８４】
ＰＣＲの最初のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度である３７℃であった。ＰＣＲの第２サイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの、鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度である５７℃であった。ＰＣＲの第３サイクルにおけるアニーリング温度は、第２の配列全体の略融解温度である６４℃であった。残りのサイクルのアニーリング温度は６４℃であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度が、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。
【０３８５】
種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２に関するＰＣＲ産物は、図５Ａ〜５Ｄに示してある。
【０３８６】
関心対象断片の精製
ＰＣＲ産物をゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。各ＰＣＲ産物を、ロッシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ＧｍｂＨ（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の２００１年バイオケミカルズ・カタログに掲載のカタログ番号１  ６４５  ６９２）からのストレプタウェル（Ｓｔｒｅｐｔａｗｅｌｌ）の透明ハイ・バインド（Ｈｉｇｈ−Ｂｉｎｄ）プレートの４つの別々の反応ウェルに分割した。第１のプライマーは５’ビオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を３７℃、１０００ｒｐｍにて２０分間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０３８７】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合する制限酵素により、精製ＰＣＲ産物を消化した。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７（図６Ａと６Ｂ）およびＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２（図６Ｃと６Ｄ）を、２種の異なる第２プライマーを用いて別々の反応において増幅した。図６Ａ（ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７）および図６Ｃ（ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２）は、制限酵素ＢｓｍＦＩによる消化後のＰＣＲ産物を表している（ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号Ｒ０５７２Ｓ）。図６Ｂ（ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７）および図６Ｄ（ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２）は、制限酵素ＢｃｅＡＩによる消化後のＰＣＲ産物を表している。消化は前記制限酵素と共に供された使用説明書に従ってストレプタウェルにおいて実施した。ＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０は、ＢｓｍＦＩにより消化された。適切な制限酵素による消化後、開裂した断片を除去するためＰＢＳでウェルを３回洗浄した。
【０３８８】
標識ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０３８９】
各ＳＮＰに対し、４つの別々のはめ込み反応を行ったが、４つの反応の各々が異なる蛍光標識をしたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ）を含有した。各はめ込み反応に以下の成分を加えた：１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、蛍光標識したヌクレオチド以外の全てのヌクレオチドを含有した０．５μｌの未標識ｄｄＮＴＰ類（４０μＭ）、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は全て４０℃で１０分間実施した。非蛍光標識ヌクレオチドは、ファーメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。他の標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５）から入手した。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、ＳＮＰまたは関心対象座に相当する１塩基だけ伸長した（図７Ａ〜７Ｄ）。
【０３９０】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７に関する「はめ込み」反応には、標識ｄｄＮＴＰと未標識ｄＮＴＰ類との混合物もまた、用いられた。４０μＭの未標識ｄＮＴＰ類、１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＣＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、および１μｌのｄｄＴＴＰを含有する混合物を用いた以外は、上記のとおりの「はめ込み」条件であった。蛍光ｄｄＮＴＰ類はアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット、ＵＳ７９５６５；アマーシャムは蛍光ヌクレオチドの濃度を公表していない）から入手した。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、制限酵素ＢｓｍＦＩによって消化され、４塩基の５’オーバーハングを生成した。図７Ｅで示されるように、取り込まれた最初のヌクレオチドが標識ジデオキシヌクレオチドならば、３’窪み端は１個の塩基によってはめ込まれ、ＳＮＰまたは関心対象座を検出できる。しかし、取り込まれた最初のヌクレオチドがｄＮＴＰならば、ポリメラーゼは、ｄｄＮＴＰがはめ込まれるまでヌクレオチドの取り込みを続ける。例えば、最初の２つのヌクレオチドがｄＮＴＰ類ではめ込みでき、３番目のヌクレオチドがｄｄＮＴＰではめ込みできると、オーバーハング内の３番目のヌクレオチドを検出できる。このように、５’オーバーハング全体の配列を決定することができ、各ＳＮＰまたは関心対象座から得られる情報が増加する。
【０３９１】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に酵素と共に供された製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた（図８Ａ〜８Ｄ）。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０３９２】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、１０μｌの試料から２〜３μｌを４８ウェル膜トレイ（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８−０１）内に入れた。トレイ内の試料を４８フロー・メンブレン・コーム（Ｆｌｏｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｂ）（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８）に吸収させ、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル内へ挿入した（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）。
【０３９３】
前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。膜コームを除去し、ＡＢＩ３７７自動塩基配列決定装置上で３時間、ゲルを操作した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０３９４】
図９Ａに示されたように、３６人の個人の試料から、２つのヌクレオチドのうちの１つ、アデノシンか、またはグアニンのいずれかが、ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７として検出された。ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７に存在すると報告されているのは、この２つのヌクレオチドである（http://snp.cshl.or/snpsearch.shtml）。
【０３９５】
ＳＮＰ  ＴＳ０００９５５１２には、２つのヌクレオチドのうちの１つ、グアニンまたはシトシンが検出された（図９Ｂ）。関心対象座がＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有する第２のプライマーによって増幅されでもまた、ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有する第２のプライマーによって増幅されても同じ結果が得られた。
【０３９６】
図９Ｃに示すように、ＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０には、２つのヌクレオチドのうちの１つ、アデノシンまたはシトシンのいずれかが検出された。このＳＮＰ部位に存在すると報告されているのは、この２つのヌクレオチドである（http://snp.cshl.or/snpsearch.shtml）。また、関心対象座から１塩基においてチミジンが検出された。配列依存様式でＢｓｍＦＩは１０／１４位で幾つかのＤＮＡ分子を切断し、同じ配列を有する他のＤＮＡ分子を１１／１５位で切断する。制限酵素ＢｓｍＦＩがセンス鎖上の１１個のヌクレオチドを切り取り、アンチセンス鎖上の１５個のヌクレオチドを切り取る場合、３’窪み端はＳＮＰ部位の１個の塩基である。ＳＮＰ  ＴＳＣ０２６４５８０の配列は、ＳＮＰ部位の直前の塩基がチミジンであることを示した。この位置への標識ｄｄＮＴＰの取り込みにより、１０／１４位で切断された断片より１塩基小さな断片が生成する。したがって、１１／１５位で切断されたＤＮＡ分子は、ＳＮＰ部位直前の塩基についての配列情報を提供し、１０／１４位で切断されたＤＮＡ分子は、ＳＮＰ部位についての配列情報を提供した。
【０３９７】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７を、ＢｓｍＦＩに対する認識部位を含有する第２のプライマーを用いて増幅した。ＢｓｍＦＩによる消化によって生成した５’オーバーハングをはめ込むために標識ｄｄＮＴＰ類および未標識ｄＮＴＰ類の混合物を用いた。ｄＮＴＰが取り込まれたならば、ポリメラーゼはｄｄＮＴＰが取り込まれるまでヌクレオチドの取り込みを続ける。各々が塩基１個だけ異なるＤＮＡ断片の集団が生成し、オーバーハング全体の配列が決定された。
【０３９８】
図９Ｄに見られるように、ＳＮＰまたは関心対象座の直前のヌクレオチド（チミジン）に相補的なアデニンが検出された。このヌクレオチドは上述のＢｓｍＦＩの１１／１５切断特性のため検出された。グアニンおよびアデノシンがＳＮＰ部位において検出されたが、これらは、このＳＮＰ部位に関して報告されている２つのヌクレオチドである（図９Ａ）。２つのヌクレオチドは、色素の分子量が異なるため、ＳＮＰ部位において検出され、これによって２つのヌクレオチドが分離できた。次に検出されたヌクレオチドは、ＳＮＰ部位のすぐ下流のヌクレオチドに相補的であるチミジンであった。その次に検出されたヌクレオチドは、ＳＮＰ部位から２塩基下流のヌクレオチドに相補的であるグアニンであった。最後に、ＳＮＰ部位から下流の３番目のヌクレオチドに相補的であるアデノシンが検出された。ＳＮＰ部位についての情報だけでなく、ＳＮＰ部位直前のヌクレオチドおよび隣接した３つのヌクレオチドについての情報が得られた。
【０３９９】
関心対象座は、突然変異を含有していなかった。しかし、関心対象座のうちの１つが、限定はしないが、点突然変異、挿入、欠失、転座または前記突然変異の任意の組合わせなどの突然変異を有するとしたら、それは、コンセンサス配列または公表配列との比較によって同定できるであろう。各関心対象座に属する配列を、各関心対象における遺伝子本来の、非疾病関連配列と比較することにより、その配列における突然変異の有無が決定される。次に、その配列における突然変異の所見を、その個人における疾病兆候の存在として、またはその疾病を発現する体質として適宜解釈される。被験者が突然変異配列の１つまたは２つの対立遺伝子を有するかどうか、したがって、その被験者がキャリアかどうか、または示された突然変異から生じるのが、優性状態か劣性状態かを決定するために、突然変異配列対正常、すなわち非突然変異配列との相対量を評価することができる。
【０４００】
実施例３
染色体１の４つの関心対象座および染色体２１の２つの関心対象座を別々のＰＣＲ反応にて増幅し、一緒にプールしてから分析した。増幅された関心対象座の各々の大きさが異なるようにプライマーを設計することにより、関心対象座を検出することができた。
【０４０１】
鋳型ＤＮＡの調製
鋳型ＤＮＡは、インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血した５ｍｌの血液試料から調製した。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）より供給されたキアアンプＤＮＡブラッド・ミディ・キット（カタログ番号５１１８３）を用いて、各血液試料から鋳型ＤＮＡを単離した。鋳型ＤＮＡをキットに含まれる使用説明書のとおり単離した。３６人のヒト志願者から鋳型ＤＮＡを単離し、さらなる分析のために１つの試料にプールした。
【０４０２】
プライマー設計
ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000604
第２のプライマー：
2006521086.tif 000605
【０４０３】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000606
第２のプライマー：
2006521086.tif 000607
【０４０４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000608
第２のプライマー：
2006521086.tif 000609
【０４０５】
ＳＮＰ  ＴＳＣ００９５５１２は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000610
第２のプライマー：
2006521086.tif 000611
【０４０６】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００１３１は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000612
第２のプライマー：
2006521086.tif 000613
【０４０７】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７は、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000614
第２のプライマー：
2006521086.tif 000615
【０４０８】
各ＳＮＰに関して、第１のプライマーは、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する認識部位を含有し、５’末端にビオチンタグを有した。各ＳＮＰの増幅に用いられた第２のプライマーは制限酵素ＢｃｅＡＩに対する認識部位を含有した。
【０４０９】
ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、以下のアニーリング温度を用いた以外は実施例２に記載されたとおりに実施した：ＰＣＲの１番目のサイクルのアニーリング温度は３７℃で３０秒、ＰＣＲの２番目のサイクルのアニーリング温度は５７℃で３０秒、およびＰＣＲの３番目のサイクルのアニーリング温度は６４℃で３０秒であった。引き続く全てのサイクルのアニーリング温度は６４℃で３０秒であった。ＰＣＲは３７サイクル実施した。ＰＣＲ後、反応液から１／４容量を取り、１本の管に合わせた。
【０４１０】
関心対象断片の精製
試料をストレプタウェルマイクロ滴定プレートの単一ウェルに結合させたこと以外、ＰＣＲ産物（合わせて１つの試料となっており、「試料」と称す）は、実施例２に記載されたとおりゲノム鋳型ＤＮＡから分離した。
【０４１１】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーの認識部位に結合した制限酵素ＢｃｅＡＩによって試料を消化した。制限酵素消化は、酵素と共に供給された使用説明書に従って実施した。制限酵素消化後、ウェルを１×ＰＢＳによって３回洗浄した。
【０４１２】
ヌクレオチドの取り込み
上記の制限酵素による消化によって、ＳＮＰ部位または関心対象座および３’窪み端を含有した５’オーバーハングを有するＤＮＡ断片が得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、ヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０４１３】
はめ込み反応には、以下の成分を用いた：１μｌの蛍光標識ｄｄＡＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＴＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＧＴＰ、１μｌの蛍光標識ｄｄＣＴＰ、２μｌの１０×配列緩衝剤、０．２５μｌのシーケナーゼ、および２０μｌの反応液に必要な水。はめ込み反応は４０℃で１０分間実施した。標識化剤は全てアマーシャム（サーモシーケナーゼ・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・コア・キット（ＵＳ７９５６５）；キットに備えられているｄｄＮＴＰ類の濃度は所有権があり、アマーシャムによって公表されていない）から入手した。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、ＳＮＰまたは関心対象座に相当する１塩基だけはめ込まれた。
【０４１４】
ヌクレオチドの取り込み後、ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に製造元の使用説明書にしたがって、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって「はめ込み」ＤＮＡ断片をストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間実施した。
【０４１５】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスからの遊離後、１０μｌの試料から２〜３μｌを４８ウェル膜トレイ（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８−０１）内に入れた。トレイ内の試料を４８フロー・メンブレン・コーム（Ｆｌｏｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃｏｍｂ）（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８）に吸収させ、３６ｃｍ  ５％アクリルアミド（尿素）ゲル内へ挿入した（バイオ・ホイッテーカー・モレキュラー・アプリケーションンズ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）。
【０４１６】
前記試料を３０００ボルトで３分ゲル内に電気泳動させた。膜コームを除去し、ＡＢＩ３７７自動塩基配列決定装置上で３時間、ゲルを操作した。取り込まれたヌクレオチドを蛍光により検出した。
【０４１７】
増幅した各関心対象座の大きさが異なるようにプライマーを設計した。図１０に示すように増幅した各関心対象座は、約５〜１０ヌクレオチド異なっていたので、ゲル電気泳動によって関心対象座を互いに分離することができた。ＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５に関してグアニンとシトシンの２つのヌクレオチドが検出された。これらはＳＮＰ  ＴＳＣ００８７３１５に存在することが報告されている２つのヌクレオチドであった（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含んでなり、グアニンを取り込んだＤＮＡ分子の分子量はシトシンを取り込んだＤＮＡ分子の分子量とは異なっていたため、各ヌクレオチドに関して異なるバンドが見られた。
【０４１８】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ０００２７に、グアニンとアデノシンの２つのヌクレオチドが検出された（図１０）。このＳＮＰに関して報告された２つのヌクレオチドは、グアニンとアデノシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。上記に考察したように、この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含んでおり、この試料中に双方のヌクレオチドが示されることが予想される。グアニンを取り込んだＤＮＡ断片の分子量は、アデノシンを取り込んだＤＮＡ断片とは異なっていたため、双方のヌクレオチドを検出できた。
【０４１９】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２１４３６６にヌクレオチド、グアニンが検出された（図１０）。このＳＮＰ位置に存在することが報告されている２つのヌクレオチドはチミジンとシトシンである。
【０４２０】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４にヌクレオチド、グアニンが検出された（図１０）。このＳＮＰに関して報告された２つのヌクレオチドはグアニンとシトシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。
【０４２１】
ＳＮＰ  ＴＳ０００９５５１２にヌクレオチド、シトシンが検出された（図１０）。このＳＮＰ部位に関して報告された２つのヌクレオチドはグアニンとシトシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。
【０４２２】
ＳＮＰ  ＨＣ２１Ｓ００１３１に検出されたヌクレオチドはグアニンであった。このＳＮＰ部位に関して報告された２つのヌクレオチドはグアニンとアデノシンである（http://snp.cshl.org/snpsearch.shtml）。
【０４２３】
上記に考察したように、この試料は、３６人の鋳型ＤＮＡを含んでおり、ＳＮＰ部位に双方のヌクレオチドが示されることが予想される。ＳＮＰ  ＴＳＣ０４１３９４４、ＴＳＣ００９５５１２、ＴＤＣ０２１４３６６およびＨＣ２１Ｓ００１３１に関しては、２つのヌクレオチドのうちの１つが検出された。これらのＳＮＰ部位に関して報告された双方のヌクレオチドが試料中に存在しているようであるが、一方の蛍光色素が他方より圧倒的に多い。１つのヌクレオチドを取り込んだＤＮＡ分子の分子量により、他のヌクレオチドを取り込んだＤＮＡ分子の効率的な分離ができなかった。しかし、ＳＮＰ類は互いに容易に分離し、各ＳＮＰにとって適切なヌクレオチドが取り込まれた。ＰＣＲ後、単一試料として処理された複数の染色体の複数の関心対象座の配列を決定した。
【０４２４】
蛍光標識ｄｄＮＴＰ類を含有する１つの反応を、複数の関心対象座を含む試料で実施した。あるいは、各反応が１つの蛍光認識ヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＣＴＰ）および未標識ｄｄＮＴＰ類を含有する４つの別々のはめ込み反応を実施できた（実施例２、図７Ａ〜７Ｄおよび図９Ａ〜Ｃを参照）。４つの別々の「はめ込み」反応により、関心対象座に存在する任意のヌクレオチドが検出できる。例えば、１個人の複数の関心対象座を含有する試料を分析するとして、前記個体が、１つ以上の関心対象座においてヘテロ接合であれば、このヘテロ接合の関心対象座におけるヌクレオチドを決定するために、４つの別々の「はめ込み」反応が利用できる。
【０４２５】
また、複数の個人の鋳型を含有する試料を分析する場合、４つの別々の「はめ込み」反応によって関心対象に見られるヌクレオチドの頻度とは独立に、試料中に存在するヌクレオチドが検出できる。例えば、試料が５０人の鋳型ＤＮＡを含有し、そのうち４９人が、関心対象座にチミジンを有し、１人がグアニンを有するとすれば、図９Ａ〜９Ｃにあるように各「はめ込み」反応をゲルの別々のレーンで操作する４つの別々の「はめ込み」反応の実施によってグアニンを検出できる。複数の鋳型ＤＮＡからなる試料を分析する場合、質量の違いにより１個の関心対象座部位における複数のヌクレオチドを識別する必要性が複数の「はめ込み」反応によって緩和される。
【０４２６】
本実施例において、複数の単一ヌクレオチド多形を分析した。限定はしないが、複数の関心対象座の突然変異、トランジション、トランスバージョン、転座、挿入、および欠失などの突然変異の有無を決定することも可能である。複数の関心対象座は、１個の染色体のものであり得るか、または複数の染色体のものであり得る。複数の関心対象座は１個の遺伝子のものであり得るか、または複数の遺伝子のものであり得る。
【０４２７】
疾病の表現型の原因となるか、またはその素因を与える複数の関心対象座の配列が決定できる。例えば、癌または任意の他の疾病に関する１個から数十、数百、数千個の遺伝子を増幅できる。増幅した各関心対象座の大きさが異なるようにプライマーを設計できる。ＰＣＲ後、増幅した関心対象座を合わせて１つの試料として処理できる。あるいは複数の関心対象座を１つのＰＣＲ反応において増幅できるか、または関心対象座の総数、例えば１００個を、ＰＣＲ反応１つにつき例えば、１０個の関心対象座の試料に分割して後でプールすることができる。本明細書で示すように、複数の関心対象座の配列が決定できる。このように、１つの反応において、疾病の表現型の原因となるか、またはその素因を与える１個から１０個、数百個、数千個の遺伝子配列を決定することができる。
【０４２８】
実施例４
妊娠女性の試料における遊離の胎児ＤＮＡを用いて胎児の染色体異常の配列を決定または検出する能力は、胎児ＤＮＡのパーセンテージの低さが障害となっていた。遊離胎児ＤＮＡのパーセンテージを上昇させることによって、突然変異、挿入、欠失、転座、トランスバージョン、モノソミー、トリソミー、トリソミー２１、トリソミー１８、トリソミー１３、ＸＸＹ、ＸＸＸ、他の異数性、欠失、付加、増幅、転座および再配列の検出が増強すると考えられる。妊娠女性から得られた血漿中の胎児パーセントを、細胞溶解阻害剤の存在下、非存在下双方において決定した。Ｙ染色体上の遺伝子マーカーを用いて、胎児ＤＮＡのパーセントを算出した。
【０４２９】
鋳型ＤＮＡの調製
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液試料５ｍｌから鋳型ＤＮＡを調製した。血液は２本の管に分割した（フィッサシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、９ｍｌＥＤＴＡバキューム管、カタログ番号ＮＣ９８９７２８４）１本の管にホルムアルデヒド（２５μｌ／ｍｌ血液）を加えた。他方の管は、ＥＤＴＡの存在以外は未処理のままであった。２本の管を１０００ｒｐｍにて１０分間回転させた。各試料の上澄み液（血漿）の２ミリリットルを新たな管に移し、３０００ｒｐｍにて１０分間回転させた。各試料の８００μｌをＤＮＡ精製に用いた。血球のＤＮＡ精製用キアゲン・ミディキット（キアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いてＤＮＡを単離した。ＤＮＡを１００μｌの希釈水に溶出させた。２種の鋳型ＤＮＡが得られた。すなわち、ＥＤＴＡで処理した血液試料由来のもの、ならびにＥＤＴＡおよびホルムアルデヒドで処理した血液試料由来のものである。
【０４３０】
プライマー設計
２つの異なったプライマーセットを用いた。すなわち、一方のプラーマーセットは、Ｙ染色体に特異的であり、したがって、胎児ＤＮＡに特異的であり、他方のプライマーセットは、母体の鋳型ＤＮＡと胎児の鋳型ＤＮＡの双方に存在するのう胞性線維症遺伝子を増幅するように設計された。
【０４３１】
本実施例において、各プライマーの５’全体および３’の配列が鋳型ＤＮＡにアニールするように第１のプライマーおよび第２のプライマーを設計した。本実施例において、胎児はＸＹ遺伝子型を有しているので、胎児ＤＮＡの存在マーカーとして、Ｙ染色体を用いた。Ｙ染色体上のＳＲＹ遺伝子を増殖するために以下のプライマーを設計した。
第１のプライマー：
2006521086.tif 000616
第２のプライマー：
2006521086.tif 000617
【０４３２】
任意の遺伝子、または遺伝子領域、または任意の染色体の任意の部分を増強するために設計されたプライマーを母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを検出するために用いることができた。本実施例では、のう胞性線維症遺伝子を増幅するために、以下のプライマーを設計した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000618
第２のプライマー：
2006521086.tif 000619
【０４３３】
ＰＣＲ反応
ＳＲＹ遺伝子およびのう胞性線維症遺伝子を、ＰＣＲを用いて鋳型ゲノムＤＮＡから増幅した（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応はキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）より供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。ＳＲＹ遺伝子増幅のために、キアゲン精製カラムから溶出したＤＮＡを連続的に１：２の希釈した。のう胞性線維症遺伝子の増幅のために、キアゲン精製カラムからのＤＮＡを１：４に希釈し、次に連続的に１：２に希釈した。以下の成分を各ＰＣＲ反応に用いた：８μｌの鋳型ＤＮＡ（希釈または未希釈）、１μｌの各プライマー（５μＭ）、１０μｌのホットスターＴａｑ混合物。以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分
（２）９４℃で１分
（３）５４℃で１５秒
（４）７２℃で３０秒
（５）ステップ２〜４を４５サイクル反復
（６）７２℃で１０分。
【０４３４】
胎児ＤＮＡの定量化
キアゲンカラムから溶出した鋳型ＤＮＡを、以下の濃度に連続的に希釈した：１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、１：１０２４、１：２０４８、１：４０９６。ＳＲＹ遺伝子の増幅は、未希釈の鋳型を用いて実施した、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２。のう胞性線維症遺伝子の増幅は、１：４、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、１：１０２４、１：２０４８、１：４０９６に希釈した鋳型ＤＮＡを用いて実施した。ＥＤＴＡ単独で処理した血漿試料ならびにＥＤＴＡおよびホルムアルデヒドで処理した血漿試料から精製した鋳型ＤＮＡを用いて同じ連続希釈を実施した。
【０４３５】
ＥＤＴＡで処理した血漿試料から単離した鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応の結果を図１１Ａに示してある。ＳＲＹ遺伝子は、未希釈鋳型ＤＮＡから、および１：２に希釈した試料においても増幅した（図１１Ａ）。ＳＲＹ遺伝子は、次の７つの連続希釈液において増幅されなかった。一方、のう胞性線維症遺伝子は、１：２５６まで連続希釈されたもので検出された。のう胞性線維症遺伝子は、血漿中に存在する母体ＤＮＡのパーセンテージが高いため、より多く存在することが予想された。遺伝子産物の増幅に備えた最終希釈試料は、のう胞性線維症遺伝子か、またはＳＲＹ遺伝子の１つのコピーを有すると推測された。
【０４３６】
ホルムアルデヒドとＥＤＴＡで処理された血漿試料から単離された鋳型ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応の結果は図１１Ｂに示してある。ＳＲＹ遺伝子は、未希釈鋳型ＤＮＡ、および１：２に希釈された試料において増幅した（図１１Ｂ）。ＳＲＹ遺伝子は、次の６つの連続希釈液において増幅されなかった。しかし、１：２５６希釈液において、ＳＲＹ遺伝子は検出された。１：２５６試料における増幅が真のシグナルを示している可能性は少ない。なぜならば、その前の６つの希釈系がＳＲＹ増幅に関して全て陰性であったからである。この試料におけるＳＲＹ遺伝子の増幅は、用いられたＰＣＲサイクル数の多さにより生じた実験上の人為結果である可能性が高い。したがって、試料中に存在する胎児ＤＮＡ量の算出に１：２５６試料を使用しなかった。
【０４３７】
のう胞性線維症遺伝子の増幅は、１：１６希釈した試料中に検出された（図１１Ｂ）。ホルマリンの存在により、母体細胞の溶解が妨げられ、したがって、試料中母体ＤＮＡのパーセンテージは低い。これは、ＥＤＴＡのみで処理され、１：２５６の希釈液まで増幅が維持された試料とは極めて対照的である。
【０４３８】
母体血漿中に存在する胎児ＤＮＡのパーセントを以下の式を用いて算出した：
％胎児ＤＮＡ＝（ＳＲＹ遺伝子量／のう胞性線維症遺伝子量）＊２＊１００。
ＳＲＹ遺伝子量は、遺伝子が増幅された最高希釈値によって示された。同様に、のう胞性線維症遺伝子量は、それが増幅された最高希釈値によって示された。前記式は、２つの乗法因子を含有しているが、これは、ＳＲＹ遺伝子（Ｙ染色体上に位置）にはただ１つのコピーが存在し、一方、のう胞性線維症遺伝子には２つのコピーが存在する事実に関して標準化するために用いられる。
【０４３９】
上記実施例において、ＥＤＴＡのみで処理された試料に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージは、１．５６％（２／２５６＊２＊１００）であった。血漿中に存在する胎児ＤＮＡの報告されているパーセンテージは、０．３９％から１１．９％の間である（パートルおよびビアンチ（Ｐｅｒｔｌ，ａｎｄ  Ｂｉａｎｃｈｉ）、Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ９８：ｐ．４８３−４９０（２００１））。ホルマリンとＥＤＴＡとで処理された試料中に存在する胎児ＤＮＡのパーセンテージは２５％であった（２／１６＊２＊１００）。この実験は多数回反復され、各回ともホルマリンの存在により胎児ＤＮＡの全体パーセンテージが増大した。
【０４４０】
ホルマリン有無での１８の血液試料からの胎児ＤＮＡパーセントを、１：５の連続希釈を実施した以外は上記のとおり算出した。１：５希釈を実施したため、ＳＲＹ遺伝子またはのう胞性線維症遺伝子のいずれかの検出を可能にした最終連続希釈液は、遺伝子の１つのコピーを有したか、またはその遺伝子の４つのコピーを有したと考えられる。１８の試料のホルマリン有無における結果を表Ｖにまとめてある。低範囲では、最終希釈試料が遺伝子の１つのコピーを有したことが推測され、高範囲では、最終希釈液が遺伝子の４つのコピーを有したことが推測された。
【０４４１】
（表Ｖ）ホルマリン有無における胎児ＤＮＡ平均パーセンテージ
2006521086.tif 000620
【０４４２】
母体細胞溶解の減少、したがって、試料中に存在する母体ＤＮＡ量の減少によって、胎児ＤＮＡの全体的増加が達成された。本実施例では、細胞溶解の防止にホルムアルデヒドを使用したが、細胞溶解を防ぎ、細胞の構造的完全性を増加させる任意の試剤が使用できる。２種以上の細胞溶解剤を使用できる。母体血漿における胎児ＤＮＡの増加により、胎児ＤＮＡの配列決定が可能になり、また限定はしないが、点突然変異、読み枠シフト、トランジョン、トランスバージョン、付加、挿入、欠失、付加−欠失、フレームシフト、ミスセンス、復帰突然変異、および微小付随体変化、トリソミー、モノソミー、他の異数性、増幅、再配列、転座、トランスバージョン、欠失、付加、増幅、断片、転座、および再配列などのＤＮＡ配列異常または染色体異常の迅速な検出が提供される。
【０４４３】
実施例５
トリソミー２１の遺伝子座を有する個人の鋳型ＤＮＡを分析した。染色体１３上の３つの関心対象座および染色体２１上の２つの関心対象座を分析した。
【０４４４】
鋳型ＤＮＡの調製
インフォームドコンセントを得たヒト志願者から静脈穿刺により採血された血液試料５ｍｌから鋳型ＤＮＡを調製した。前記ヒト志願者は、追加の染色体２１（トリソミー２１）を有することが前もって遺伝子型決定されていた。キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）より提供されたキアンプＤＮＡブラッド・ミディキット（ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ）（カタログ番号５１１８３）を用いて鋳型ＤＮＡを単離した。
【０４４５】
プライマー設計
以下の５種の単一ヌクレオチド多形を分析した：染色体２１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３；染色体２１上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０３２０９６１０；染色体１３上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７；および染色体１３上に位置するＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７。他の個人の鋳型ＤＮＡを内部対照として用いた。グアニンに関してホモ接合であることが前もって同定されたＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７を内部対照として用いた。ＳＮＰ合弁会社のデータベースは、２００２年４月１日現在実効があるhttp://snp.eshl.org/ウェブサイト宛先にてアクセスできる。
【０４４６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３を以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000621
第２のプライマー：
2006521086.tif 000622
【０４４７】
第１のプライマーは、５’端をビオチン化し、ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４４８】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３０９６１０を以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000623
第２のプライマー：
2006521086.tif 000624
【０４４９】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５０】
ＳＮＰ（ｓｓ）８１３７７３（ＮＣＢＩ寄託ＳＮＰ（ｓｓ）データベースによる帰属登録番号）を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000625
第２のプライマー：
2006521086.tif 000626
【０４５１】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５２】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000627
第２のプライマー：
2006521086.tif 000628
【０４５３】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５４】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７２７９を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000629
第２のプライマー：
2006521086.tif 000630
【０４５５】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５６】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７を、以下のプライマーを用いて増幅した：
第１のプライマー：
2006521086.tif 000631
第２のプライマー：
2006521086.tif 000632
【０４５７】
第１のプライマーは、５’端におけるビオチン基を含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を含有した。第２のプライマーは、制限酵素ＢｃｅＡＩに対する制限酵素認識部位を含有した。
【０４５８】
ＰＣＲ反応
ＰＣＲを用いて、鋳型ゲノムＤＮＡから増幅された５つ全ての関心対象座を増幅した（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，６８３，２０２号明細書）。特異性を増大させるため、「ホットスタート」ＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応はキアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）より供されたホットスターＴａｑマスター・ミックスキット（カタログ番号２０３４４３）を用いて実施した。各関心対象座に関して、一反応当たりの鋳型ＤＮＡ量およびプライマー量を最適化できる。本実施例では、４０ｎｇのヒトゲノム鋳型ＤＮＡおよび５μＭの各プライマーを用いた。３８サイクルのＰＣＲを実施した。ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３、ＳＮＰ  ＴＳＣ０３０９６１０およびＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４３７に関して以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）４２℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）６０℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６９℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３７回反復；
（９）７２℃で５分。
【０４５９】
ＳＮＰ  ｓｓ８１３７７３、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７、およびＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７２７９に関して以下のＰＣＲ条件を用いた：
（１）９５℃で１５分１５秒；
（２）３７℃で３０秒；
（３）９５℃で３０秒；
（４）５７℃で３０秒；
（５）９５℃で３０秒；
（６）６４℃で３０秒；
（７）９５℃で３０秒；
（８）ステップ６と７とを３７回反復；
（９）７２℃で５分。
【０４６０】
各ＰＣＲの第１のサイクルにおいて、アニーリング温度は、第２のプライマーの３’アニーリング領域の略融解温度であった。ＰＣＲの第２のサイクルにおけるアニーリング温度は、第１のプライマーの鋳型ＤＮＡにアニールする３’領域の略融解温度であった。ＰＣＲの第３のサイクルにおけるアニーリング温度は、第２のプライマーの全配列の略融解温度であった。ＰＣＲの最初の３つのサイクルにおいてＴＭ１からＴＭ２，そしてＴＭ３へとアニーリング温度を次第に上昇させることにより、特異性は大きく向上する。これらのアニーリング温度は、典型的なものであり、当業技術者は、各サイクルのアニーリング温度は、使用される特定のプライマーに依存することを解されるであろう。種々の設定の試みおよび最良の結果をもたらすパラメータの使用によって、変性、アニーリングおよび伸長のための温度および時間を最適化できる。
【０４６１】
関心対象断片の精製
キアゲン・ミン・エリュート（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ）ＰＣＲ精製キットを製造元の使用説明書（カタログ番号２８００６）に従って用い、ＰＣＲ反応の成分からＰＣＲ産物を分離した。前記ＰＣＲ産物を２０μｌの希釈水に溶出させた。各増幅ＳＮＰに１ミクロリットルのＰＣＲ産物、１μｌの増幅内部対照ＤＮＡ（ＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７）および８μｌの希釈水を混合した。各試料の５ミクロリットルをピアース・ストレプタウェル・マイクロ滴定プレート（カタログ番号１５５０１）の２つの別々の反応ウェル内に入れた。第１のプライマーは５’ピオチンタグを含有したので、ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジン被覆ウェルに結合し、一方、ゲノム鋳型ＤＮＡは結合しなかった。ストレプトアビジン結合反応は、サーモミキサー（Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）（エッペンドルフ）を４５℃、１５０ｒｐｍにて１時間用いて実施した。各ウェルを吸引して未結合物質を除去し、静かに混合しながら１×ＰＢＳで３回洗浄した（カンドパルら（Ｋａｎｄｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．１７８９〜１７９５（１９９０）；カネオカら（Ｋａｎｅｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１０：ｐ．３０〜３４（１００１）；グリーンら（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１８：ｐ．６１６３〜６１６４（１９９０））。
【０４６２】
単離断片の制限酵素消化
第２のプライマーからＰＣＲ産物に取り込まれた認識部位に結合した制限酵素により精製ＰＣＲ産物を消化した。精製ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｃｅＡＩ（ニューイングランド・バイオラブス、カタログ番号Ｒ０６２３Ｓ）。この消化は、制限酵素と共に供された使用説明書に従ってマイクロ滴定プレートのウェル内で実施した。適切な制限酵素による消化後、前記ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、開裂した断片を除去した。
【０４６３】
標識ヌクレオチドの取り込み
上記制限酵素消化によって、ＳＮＰおよび３’窪み端を含有した、５’オーバーハングを有するＤＮＡが得られた。５’オーバーハングは鋳型として働き、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、単数または複数のヌクレオチドの取り込みを可能にした。
【０４６４】
各ＳＮＰに対し、２つのはめ込み反応を行ったが、各反応が異なった蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを含有した（特定のＳＮＰに存在することが報告されたヌクレオチドに依って、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ）。例えば、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３にはヌクレオチドのアデニンとチミジンが報告されている。したがって、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３に関する消化ＰＣＲ産物は、蛍光標識ｄｄＡＴＰか、または蛍光標識ｄｄＴＴＰのいずれかと混合した。各反応とも内部参照として蛍光標識ｄｄＧＴＰを含有した。以下の成分を各はめ込み反応に加えた：２μｌのＲＯＸ−共役ジデオキシヌクレオチド（各ＳＮＰに関して報告されたヌクレオチドにより）、２μｌのＲＯＸ−共役ｄｄＧＴＰ（内部対照）、２．５μｌの１０×シーケナーゼ緩衝剤、２μｌのシーケナーゼおよび２５μｌ反応液に必要な水。はめ込み反応は、全て４５℃で４５分間実施した。しかし、より短い時間の取り込みを用いることができる。非蛍光標識ｄｄＮＴＰ類は、ファーメンタス社（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．）（メリーランド州ハノーバー所在）から購入した。ＲＯＸ−共役ｄｄＮＴＰ類は、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）から入手した。蛍光標識ｄｄＮＴＰ類の存在下、３’窪み端は、ＳＮＰまたは関心対象座に相当する１塩基だけ伸長した。
【０４６５】
標識後、各ストレプタウェルを１×ＰＢＳ（１００μｌ）で３回濯いだ。次に「はめ込み」ＤＮＡ断片を、製造元の推奨に従い、制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化によって、ストレプタウェルから遊離させた。消化は１２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間行った。
【０４６６】
関心対象座の検出
ストレプトアビジンマトリックスから遊離後、１０μｌの試料のうち３μｌを４８ウェル膜トレイ（ザ・ゲル・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、カタログ番号ＴＡＭ４８−０１）に入れた。トレイ中の試料を４８フロー膜コーム（ザ・ゲル・カンパニー、カタログ番号ＴＡＭ４８）で吸収させ、３６ｃｍ５％アクリルアミド（尿素）ゲル（バイオホィッテーカー・モレキュラー・アプリケーションズ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ロングレンジャー・ラン・ゲル・パックス（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｎ  Ｇｅｌ  Ｐａｃｋｓ）、カタログ番号５０６９１）内に挿入した。
【０４６７】
試料を３０００ボルトで３分間、ゲル中で電気泳動させた。膜コームを取り出し、ゲルをＡＢＩ３７７自動塩基配列決定装置上で３時間操作した。取り込まれた標識ヌクレオチドを蛍光で検出した。
【０４６８】
図１２に見られるように、ＳＮＰ  ＴＳＣ０１１５６０３は、標識ｄｄＴＴＰによって「はめ込み」がなされ（レーン１）、別の反応においては、標識ｄｄＴＴＰによってなされた（レーン３）。生データを用いたヌクレオチド間の計算比は、６６：３４で、これは、トリソミー２１を有する個人における染色体２１上のＳＮＰに関する理論比６６：３３と一致する。色素の取り込み効率における可変性を最少化するために、ｄｄＴＴＰとｄｄＡＴＰの双方とも同じ蛍光色素で標識した。しかし、種々の蛍光標識、または任意の検討可能な標識を付けたヌクレオチドが使用できる。異なった標識を使用する場合は、取り込み率を計算することが好ましい。
【０４６９】
各はめ込み反応を別々のウェルで実施したため、マイクロ滴定プレートのウェル間でＤＮＡ結合が変化する可能性が存在し得た。ストレプトアビジン被覆プレートに対するＤＮＡ結合の変化の可能性を明らかにするために内部対照を用いた。試料を２つの別々のウェルに分割する前に、グアニンに関してホモ接合の内部対照（ＳＮＰ  ＴＳＣ０２００３４７）を試料に添加したため、等しい量の内部対照が各ウェルに存在するはずである。２つの反応間の取り込みｄｄＧＴＰ量を決定することができる。各ウェルにおけるＤＮＡ量が等しいならば、取り込みｄｄＧＴＰ量も等しくなるはずである。なぜならば、この反応は飽和条件下で行われており、飽和条件とは、各鋳型分子におけるヌクレオチドの取り込みを維持する条件だからである。内部対照を用いると、ｄｄＡＴＰ対ｄｄＴＴＰの取り込み率は、６３．４：３６．６であった。この率は生データによって得られた比率に極めて類似しており、特定のＤＮＰに関して、２つのはめ込み反応における違いが小さいことを示した。
【０４７０】
（表ＶＩ）トリソミー２１を有する個体由来のＤＮＡ鋳型における複数のＳＮＰでの対立遺伝子の頻度
2006521086.tif 000633
【０４７１】
ＳＮＰ  ＴＳＣ０３０９６１０は、ｄｄＴＴＰ（レーン３）またはｄｄＣＴＰ（レーン４）によってはめ込みがなされた（図１２）。生データを用いたヌクレオチドの計算比は６４：３６であった。ｄｄＴＴＰとｄｄＣＴＰの双方とも同じ蛍光色素で標識した。上記で検討したとおり内部対照に対する標準化後、ｄｄＴＴＰ対ｄｄＣＴＰの対立遺伝子計算比は、６６．８：３３．２であった（表ＶＩ）。やはり、生データからの計算比と、内部対照を用いた計算比の双方とも、トリソミーを有する個人における染色体２１上のＳＮＰに関する理論比、６６．６：３３．４に極めて類似している。
【０４７２】
ヘテロ接合ＳＮＰ類におけるヌクレオチドの比、６６：３３が３つのコピーにおいて存在する染色体上の座を表したことを証明するために、染色体１３上のＳＮＰ類を分析した。血液試料を採取した個人は１つの母親染色体１３と１つの父親染色体１３を有することの予め遺伝子型決定がなされていた。
【０４７３】
寄託されたＳＮＰ（ｓｓ）８１３７７３をｄｄＡＴＰによって（レーン５）またはｄｄＣＴＰによって（レーン６）はめ込んだ（図１２）。このヘテロ接合ＳＮＰにおけるヌクレオチドの計算比は、生データを用いると４６：５４であった。この比は予測比５０：５０の１０％以内にある。染色体の追加コピーが存在する場合に予測される比の６６：３３に近似していないことは重要である。
【０４７４】
内部対照に対する標準化後、計算比は４１：５９であった。予測値に反して、内部対照に対する標準化によって計算比と理論比との間の食い違いが増大した。この結果、ＤＮＡ試料をアリコート化する際に生じた実験的誤差を表していると思われる。
【０４７５】
また、「はめ込み」反応の鋳型として用いられたオーバーハング生成に使用された制限酵素が、一方の鋳型ＤＮＡを、他方の鋳型ＤＮＡより優先的に切断することも可能である。２つの鋳型は、ＳＮＰ部位におけるヌクレオチドに関して異なっており、これが切断に影響を与え得る。切断部位に隣接するヌクレオチドがＳＮＰ部位におけるヌクレオチドとは独立して同一であるように、プライマーを設計することができる（標題「プライマー設計」の節でさらに検討される）。
【０４７６】
染色体１３上のＳＮＰ  ＴＳＣ０１９８５５７は、一反応においてはｄｄＴＴＰにより（レーン７）、他の反応においてはｄｄＣＴＰにより（レーン８）はめ込みがなされた（図１２）。生データを用いたこのＳＮＰにおけるヌクレオチドの計算比は５５：４５であった。内部対照に対する標準化後、Ｔ：Ｃの対立遺伝子計算比は４９：５１であった。標準化した比率は、染色体１３の２つのコピーを有する個人に関する理論比５０：５０により近かった。
【０４７７】
染色体１３上のＳＮＰ  ＴＳＣ０１９７２７９は、一反応においてはｄｄＴＴＰにより（レーン９）、他の反応においてはｄｄＣＴＰにより（レーン１０）はめ込みがなされた（図１２）。生データを用いたこのＳＮＰにおけるヌクレオチドの計算比は５３：４７であった。内部対照に対する標準化後、Ｔ：Ｃの対立遺伝子計算比は５０．７：４９．３であった。これは、染色体１３の２つのコピーを有する個人に関する理論比５０：５０と一致している。
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染色体１３上の分析されたＳＮＰ類のうちの２つにおけるヌクレオチドの比は略５０：５０であった。１つのＳＮＰ、ｓｓ８１３７７３は４６：５４の比苣몤臣膀蛥ꢃ꿥ꞅ臣뺯臣ꚁ꣦隺賥馁苣ꢁ胣鎁臣钯臣钼볯骼볯馼臣芁臣龁胣鎁苣覂臣钯臣袺룦閁苣龁볯邼볯閼볯讁苣꾁臣貂臣蒁苣貁胣貐駦ꮁ胣鎁苣覂臣钯臣隼볯骼볯鎼臣钯臣몤臣貂苣馽裥ꪁ鿦늉뷤銂ꓧ鞁臣蒁苣辂臣ꞁ苣ꪁ臣芀臣꺁觧骮볯꺼볯讁苣꺁菣벃苣꾁뇦骮髧ꞁ臣ꪁ臣貁胣북駩Ꞁ苣몤臣ꚁ臣讂苣醁臣꾁臣蒁胣鎁臣뎼볯낼臣螃菣뾂臣ꒁ臣ꚁ臣邵ꯨ꾁볥趁蟥鮁臣蒁胣鞁臣鞁胣隻臣銼臣꺁볯꺼볯麡臣ꎭ룥ꪁ闦꺁鿦늉뷤銂ꓧ鞁臣芀룤鎟觨鎽룤꺁駩骮臣鞁臣蒁臣膀볯鲀볯膀볯鲀볯邼胣醼볯鲀볯邼胣閼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯膀볯邼볯鲀볯邼볯邼胣醼볯邼볯鲀볯邼볯邼胣銼볯邼볯鲀볯邼볯邼胣誁苣뎁볯邼볯邼苣薶臣讂ꓨ낕臣뎼볯낼苣蚈黦馁苣鎁臣貁ꗥ뺁臣蒁胣鎟觨鎽闧뢸臣覜蓧銂뇦骮臣讂臣膂臣꾁胣릉껥꺁鿦늉뷤ꮁ꿥馁苣钯臣뎹鷥銂铧蒁苣鎁臣貁ꗥ뺁臣蒁臣芁苣蚁胣鞁臣鞁胣醼臣꺁雩莿꿥ꆱ뫥銂裥邞臣讂臣ꢁ苣蒂臣誂迥붃臣芁苣芀뇦骮髧ꞁ臣蒁菣벃苣貁뻥覂苣龁ꃥ袐臣膀믤꺁雩莿꿥ꆱ뫥銂裥邞臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 뎋黥꒼볯ꆼ苣ꆎ迥鞁臣讀뫤꾁胣袃菣붂菣벃볯醼苣覜臣讂臣ꢁ臣袺苣몁볤邭黥몱껥貁臣閁苣ꚁ臣誂胣鎟觨鎽볯醼룤꺁볯꺼볯ꮁ臣醁苣뺯ꯧ몁볤邭ꃩꚺ臣붿諥꺁鿦늉뷤銼볯貁귥ꢜ臣ꚁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣붿諥꺁鿦늉뷤꾁胣蒐볯꺼볯ꮁ꿥鞁臣붿諥꺁菣꾂菣ꪂ菣覃苣躸臣膀臣龁臣ꎁ臣膀菣蚃菣ꖎ郥뎼볯낼臣誁臣讂볤놵髧ꪁ볯邼볯閼볯钯苣覤賥閁臣讂胣鎁苣覂臣邵黦꾁胣螤闦꺁볯꺼볯ꞁ룤ꮲ臣ꚁ臣誂胣鎟觨鎽볯醼룤ꮁꛨ覂苣讂苣꺁臣躘駧ꞁ臣讂胣鎟觨鎽볯鎼룤꺁볯꺼볯꺁꿥讫臩鶼귥뮠뫥ꮁ臣膀闧閼볯骼볯邼臣袺룦钯臣鞾苣貂臣芀臣꺁볯꺼볯鲤蟥閳臣膀駩骮臣鞁臣蒁臣膀믨Ꞻ胣袃菣뎃苣邃菣뢂菣뎃胣ꊃ菣붂菣벃胣袃菣붂菣벃볯醼胣袃菣붂菣벃볯颼胣袃菣붂菣벃볯鎼臣袂臣隻臣낕闦鎽胣ꂬꓥ膀믤ꂊ胣鞢맥膀믨Ꞻ胣誁苣뎁蛥超裥ꪁ臣꺁鿦늉뷤낕룥꺁ꓦ몇臣뾽铧ꞁ臣讂臣ꢁ臣膀臣貂苣꺁뗧鲞臣袂苣벨飦閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤隼戼㹲 ꒂ菣閃苣벃菣覃苣뎃苣뎃菣銂뻥龁뻥膀볯몺臣覂苣躃菣꒼볯ꆼ苣ꆎ迥鞁臣芀诩讞볯꺼볯銂铧蒁臣鎟觨鎽볯鎼룤꺁볯꺨臣뎼볯낼볯뒼볯ꎼ볯颼볯鞼볯隼볯膀볯뎼볯邼볯鎼볯鞼볯鞼胣뒼볯ꎼ볯醼볯邼볯邼볯膀볯뎼볯邼볯馼볯颼볯颼胣뒼볯ꎼ볯醼볯閼볯馼볯膀볯뎼볯邼볯邼볯醼볯閼볯銂裥邞臣龁胣鎁苣覂臣뎼볯낼ꇩꮁ雩馁苣薃ꃥ꾁胣ꖻ룤꺁苣Ꞃ菣떂苣袃臣讦苣鎁臣貁臣趁苣骼睷⹷湳⹰档汳漮杲猯灮敳牡档献瑨汭Ꚃ苣隃苣ꒂ菣꾁볯邼볯鎼맥銼鳦醼볯ꖗ迧ꢜ鳦릊臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 隼臣꺁臩麊臣貂臣뎼볯낼菩趽臣誁臣讂胥몺臣몁볤邭黥銂뇦骮臣讂臣膂臣膀볯꺨臣趛藥늉듧ꞁ꣦颭臣貂臣颍룤貃苣것苣膃菣銂铧蒁臣芀볯꺨臣뎼볯낼臣醼臣꺁迥鲿臣誁臣ꚁ裥邞臣趁苣袂臣ꮁ菣ꦃ苣麃菣銂꣨袨臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ诩讞볯꺼볯꺁ꫨ붣戼㹲 ꒂ菣閃苣벃菣覃苣뎃苣뎃菣銂뻥龁菣袃뿥颡胨讁苣馝蓨뾩裥ꮁ苣誂軦股臣貂臣股뛦ꚩ雦馼뷯貽臣覂诩讞볯꺼볯銂ꫨ붣臣龁胣궂苣늂菣袼볯ꦼ볯Ꞽ볯꺼볯袂苣邏뻤閁苣龁苣ꊂ菣鞃볯꺼볯隃菣莃菣뮃菣螃苣궂菣袃볯놼볯ꆼ뷯邽†볯꺼볯₡ꊼ뷯辽뷯蒽†볯覽뷯覽†볯覽뷯覼볯ꮂ苣궃苣ꪕ迥閼볯醼볯鎼볯銂铧蒁臣뎋黥꒼볯ꆼ苣颍鯩鞁臣芀诩讞볯꺼볯꾁胣궂菣袃臣ꮐ臣貂苣뾽铧겪飦뢛臣鎾臣ꚁ跥ꊛ臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ菣ꦃ苣麃菣궨꣨㲈牢ਾ†볯꺼볯₰뒼볯ꎼ볯颼볯鞼볯隼볯꾁胣ꖻ룤꺁菣ꦃ苣麃菣뮂菣袃苣ꢔ臣ꚁꋥ薹臣龁볯㲚牢ਾ곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㘰㈵〱㘸琮晩㸢〲㘰㈵〱㘸琮晩ꃂ〰㘰㐳⼼㹡⼼䥄㹖견볯꺁菣ꦃ苣麃菣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔶ㄲ㠰⸶楴≦㈾〰㔶ㄲ㠰⸶楴쉦゠〰㌶㰵愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀볯馀ꯧꮁ菣ꪂ菣뎃苣낂苣覜臣膀臣龁胣ꖼ뷯辽볯ꦼ臣뺯臣讂裥邙藩ꂴꫨ颭菩趽苣ꮐ鳦鞁臣芀곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀雩莿꿥ꆱ뫥讁苣隼볯ꦡ鿥銂苣讃菣ꮃ臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣龁胣견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣ꊼ뷯趽볯ꦼ臣뺯臣讂裥邙藩ꂴꫨ颭菩趽苣ꮐ鳦鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 뎼볯낼†볯뎼볯邼볯鎼볯鞼볯鞼臣膀믤许臣鞃菣ꒂ菣벃苣莃菣銂铧蒁臣鞢맥鞁臣骼戼㹲견볯꺁菣ꦃ苣麃菣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔶ㄲ㠰⸶楴≦㈾〰㔶ㄲ㠰⸶楴쉦゠〰㌶㰶愯㰾䐯噉ਾ곧銼臣鞃菣ꒂ菣벃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㘰㈵〱㘸琮晩㸢〲㘰㈵〱㘸琮晩ꃂ〰㘰㜳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣閼胢꾫臣鎃苣膃菣뾂苣銂鳦鞁胣뺁臣膀볯莽뷯늼볯ꮁ꿥馁苣뚈駩떅듧趪귨ꢃ뷤銂郥覜臣龁胣견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣ꊖ뿥뺯뇨Ꞻ臣覂볯邼ꇥ몟苣ꊂ菣벃菣馁苣袂臣ꮁ꣨袨臣貂臣芀곧銼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀볯鎽뷯ꚼ볯ꮁ꿥馁苣뚈駩떅듧趪귨ꢃ뷤銂郥覜臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†볯꺼볯₰뒼볯ꎼ볯醼볯邼볯邼볯꾁胣ꖻ룤꺁菣ꦃ苣麃菣뮂菣袃苣ꢔ臣ꚁꋥ薹臣龁볯㲚牢ਾ곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㘰㈵〱㘸琮晩㸢〲㘰㈵〱㘸琮晩ꃂ〰㘰㠳⼼㹡⼼䥄㹖견볯꺁菣ꦃ苣麃菣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔶ㄲ㠰⸶楴≦㈾〰㔶ㄲ㠰⸶楴쉦゠〰㌶㰹愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀볯馀ꯧꮁ菣ꪂ菣뎃苣낂苣覜臣膀臣龁胣ꖼ뷯辽볯ꦼ臣뺯臣讂裥邙藩ꂴꫨ颭菩趽苣ꮐ鳦鞁臣芀곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀雩莿꿥ꆱ뫥讁苣隼볯ꦡ鿥銂苣讃菣ꮃ臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣龁胣견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣ꊼ뷯趽볯ꦼ臣뺯臣讂裥邙藩ꂴꫨ颭菩趽苣ꮐ鳦鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖 뎼볯낼†볯뎼볯邼볯馼볯颼볯颼臣膀믤许臣鞃菣ꒂ菣벃苣莃菣銂铧蒁臣鞢맥鞁臣骼戼㹲견볯꺁菣ꦃ苣麃菣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔶ㄲ㠰⸶楴≦㈾〰㔶ㄲ㠰⸶楴쉦゠〰㐶㰰愯㰾䐯噉ਾ곧銼臣鞃菣ꒂ菣벃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㘰㈵〱㘸琮晩㸢〲㘰㈵〱㘸琮晩ꃂ〰㘰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣閼胢꾫臣鎃苣膃菣뾂苣銂鳦鞁胣뺁臣膀볯莽뷯늼볯ꮁ꿥馁苣뚈駩떅듧趪귨ꢃ뷤銂郥覜臣龁胣견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣ꊖ뿥뺯뇨Ꞻ臣覂볯邼ꇥ몟苣ꊂ菣벃菣馁苣袂臣ꮁ꣨袨臣貂臣芀곧銼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀볯鎽뷯ꚼ볯ꮁ꿥馁苣뚈駩떅듧趪귨ꢃ뷤銂郥覜臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†볯꺼볯₰뒼볯ꎼ볯醼볯閼볯馼볯꾁胣ꖻ룤꺁菣ꦃ苣麃菣뮂菣袃苣ꢔ臣ꚁꋥ薹臣龁볯㲚牢ਾ곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㘰㈵〱㘸琮晩㸢〲㘰㈵〱㘸琮晩ꃂ〰㘰㈴⼼㹡⼼䥄㹖견볯꺁菣ꦃ苣麃菣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔶ㄲ㠰⸶楴≦㈾〰㔶ㄲ㠰⸶楴쉦゠〰㐶㰳愯㰾䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀볯馀ꯧꮁ菣ꪂ菣뎃苣낂苣覜臣膀臣龁胣ꖼ뷯辽볯ꦼ臣뺯臣讂裥邙藩ꂴꫨ颭菩趽苣ꮐ鳦鞁臣芀곧醼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀雩莿꿥ꆱ뫥讁苣颼볯ꦡ鿥銂苣讃菣ꮃ臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣龁胣견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣ꊼ뷯趽볯ꦼ臣뺯臣讂裥邙藩ꂴꫨ颭菩趽苣ꮐ鳦鞁臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 뎼볯낼†볯뎼볯邼볯邼볯醼볯閼臣膀믤许臣鞃菣ꒂ菣벃苣莃菣銂铧蒁臣鞢맥鞁臣骼戼㹲견볯꺁菣ꦃ苣麃菣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔶ㄲ㠰⸶楴≦㈾〰㔶ㄲ㠰⸶楴쉦゠〰㐶㰴愯㰾䐯噉ਾ곧銼臣鞃菣ꒂ菣벃볯㲚牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㘰㈵〱㘸琮晩㸢〲㘰㈵〱㘸琮晩ꃂ〰㘰㔴⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣邼볯馼볯醀⼼䥄㹖 견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣閼胢꾫臣鎃苣膃菣뾂苣銂鳦鞁胣뺁臣膀볯莽뷯늼볯ꮁ꿥馁苣뚈駩떅듧趪귨ꢃ뷤銂郥覜臣龁胣견볯꺁菣ꦃ苣麃菣꾁胣ꊖ뿥뺯뇨Ꞻ臣覂볯邼ꇥ몟苣ꊂ菣벃菣馁苣袂臣ꮁ꣨袨臣貂臣芀곧銼臣鞃菣ꒂ菣벃臣膀볯鎽뷯ꚼ볯ꮁ꿥馁苣뚈駩떅듧趪귨ꢃ뷤銂郥覜臣龁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†雩莿꿥ꆱ뫥꾁藥ꚁ菣ꪃ菣ꦃ菣벂胩階迥鲿볯낼볯늼胣芏藧꺁臣膂鳦躘듧뢛臣蒵臣벾臣貂臣蒁苣뎱鯥릉꣨견볯貼볯颼볯貼볯馼볯랏飦내鯦誁苣뎁뇧붛觧놨곧钼볯隼볯鎼볯銼볯銼迥躘듧뢛볯銂铧蒁臣膀诩讞苣躃菣꒼볯ꆼ臣覂ꋥ薹臣龁胣鎁臣龮雦设臣꾁胣ꊖ뿥뺯뇨Ꞻ苣ꖈ胣꺁迥鲿껧ꞁꋥ薹臣龁臣膀臣貂苣銂볯ꒁ臣낼볯늼迥鲿臣誁臣ꚁ룤銷臣鞢맥馁苣鎁臣节臣趁苣芀觧낕胦銂ꋥꞤ臣鮁苣龁苣膀胣鮃菣袃苣뾂菣袃胣낼볯늼苣ꢔ臣龁胣낼볯늼迥鲿臣膀볯ꦼ볯Ꞽ볯꺼臣覂뻤ꚵ臣貂臣鮃菣袃苣뾂菣뒼뷯醽菣릂苣벃菣龃菣꾂苣궂菣袃볯ꮂ苣궃苣ꪕ迥銼볯鎼볯钼볯覼苣ꢔ臣ꚁ껥붖臣龁胣肸迥鲿뷥龁苣뎋黥꒼볯ꆼ臣袂臣鞃菣ꒂ菣벃蟩꾁郥ꊖ뿥뺯뇨Ꞻ臣ꊖ臣ꚁ鳦ꦁ賥ꞁ臣讂臣膀鳦龮雦设臣꾁胣钼볯躽뷯꺁诩讞菣袃苣躃菣꒼볯ꆼ臣袂臣閼볎볯꺁郥鞃菣ꒂ菣벃苣ꢔ臣龁胣钼볯떂苣꾂菣꺁볯ꎼ볯銂껥붖臣龁胣ꖻ룤꺁볯ꎼ볯ꆝ믤銂铧蒁臣骼戼㹲 袼볯覼볯閼蓢ꞁ볯閼裥醼볯銧볯㲛牢ਾ†볯銼볯鎼볯莄臣鎼볯銧볯㲛牢ਾ†볯鎼볯馼볯莄臣鎼볯銧볯㲛牢ਾ†볯钼볯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