(57)【要約】本発明は、免疫療法の分野に属し、ＣＤ４分子を結合し、かつ重鎖のＶＨ可変ドメインにある位置、及び／又は軽鎖のＶκ可変ドメインにある位置に少なくとも１種の残渣の突然変異を含む１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の突然変異Ｆａｂ断片である、ＣＤ４分子の新規なリガンドに関する。本発明は、ＣＤ４分子が関与する病理の治療用にこれらのリガンドを含む薬剤組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４分子を結合すること、及び重鎖のＶＨ可変ドメインにある位置、及び／又は軽鎖のＶκ可変ドメインにある位置に少なくとも１種の残渣の突然変異を含むことを特徴とする１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の突然変異Ｆａｂ断片。
【請求項２】
重鎖のＶＨドメインの３１−４１、４９−５７、６１−７０又は９０−１０３領域にある位置、及び／又は軽鎖のＶκドメインの１９−２６、３２−４０及び８５−９６領域にある位置に、少なくとも１種の残渣の突然変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の突然変異Ｆａｂ断片。
【請求項３】
Ｃ８８−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｗ３６−Ｈ、Ｃ９２−Ｈ、及びＹ１０２−Ｈ突然変異Ｆａｂを含む群から選択されることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の突然変異Ｆａｂ断片。
【請求項４】
場合により適切な賦形剤の存在下で、有効量の、請求項１から３に記載の突然変異Ｆａｂ断片を有効成分として含む薬剤組成物。
【請求項５】
突然変異Ｆａｂは、治療する患者の体重に対し、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜０．４ｍｇ／ｋｇの濃度で使用されることを特徴とする請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
自己免疫病理の予防又は治療用薬剤を調製するための請求項４又は５のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【請求項７】
自己免疫病理は、リウマチ様多発性関節炎、乾癬又は紅斑性狼瘡から選択されることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
免疫不耐性反応の予防又は治療用薬剤を調製するための請求項４又は５のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【請求項９】
免疫不耐性反応は、移植に続き誘発されることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
宿主への移植組織タイプの反応の予防又は治療用薬剤を調製するための請求項４又は５のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【請求項１１】
ＣＤ４分子を関与させる癌の予防又は治療用薬剤を調製するための請求項４又は５のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【請求項１２】
ＣＤ４分子を関与させる癌は、ＣＤ４＋リンパ腫又はチェザーリ（Ｃｅｓａｒｉ）リンパ腫から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ウイルス感染に関連した免疫不全の予防又は治療用薬剤を調製するための請求項４及び５のいずれかに記載の薬剤組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の分野に属し、１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の突然変異Ｆａｂ断片である、ＣＤ４分子の新規なリガンドに関する。本発明は、ＣＤ４分子が関与する病理の治療用にこれらのリガンドを含む薬剤組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｗ３／２５抗体によるＣＤ４分子の同定及びこの抗体に関する生物学的免疫抑制効果の証明以来、抗ＣＤ４抗体が、高い臨床的有用性を帯びたことが知られている。抗ＣＤ４抗体は、それ以来製薬産業からの多数の注目の的であり、製薬産業にとって数千万人の市場に相当し、自己免疫障害、移植片拒絶及びＨＩＶ感染と同じくらい多様な病理を集めている。出願人は今般、ある種の治療有用性を有するマウス１３Ｂ８．２モノクローナル抗体である、抗ＣＤ４抗体由来の新規リガンドを考案した。
【０００３】
現時点で、大部分が免疫抑制活性を有すると記載される、約１００種の抗ＣＤ４抗体が存在する。しかしながら、これら抗体の大多数は、免疫反応体としてしか使用されていない（ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、診断、等）。１０種に満たない抗体が、治療的使用のために開発されたが、現時点で５種の抗ＣＤ４抗体のみが、実際に臨床試験中である：１）ＯＫＴ４ａ抗体：マウス由来、ＯＫＴ４ａ抗体は、Ｄ１ドメインのＣＤＲ２様領域に重複するエピトープをヒトＣＤ４分子表面で認識する。２）Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ：ＣＤ４のＤ１ドメインのこの抗ＣＤＲ２様抗体は、Ｋｅｌｉｘｉｍａｂの名称で特徴付け及び研究され、かつＮｅｗｍａｎらによって、１０００因子が減少した、Ｆｃレセプタを結合する能力だけでなく、４から９日に改良された半減期を有するために、突然変異によって改良された。３）Ｈｕ５Ａ８抗体：ＣＤＲ移植法によってヒト化されたマウス由来ＣＤ４の抗Ｄ２ドメインＩｇＧ４／κのことである（Ｂｏｏｎら、２００２）。この抗体は、高い抗ＨＩＶ活性を有することが明らかになり（Ｂｕｒｋｌｙら、１９９２；Ｍｏｏｒｅら、１９９２；Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９７）、その非免疫抑制性質、及び循環するＣＤ４＋Ｔリンパ球の比率に対して有害な効果のないこと（Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９７）により、現在提案されている治療に無反応な患者と協働する、又は該患者におけるエイズ治療の枠内で、優良な候補となっている。４）ＭＤＸ−ＣＤ４抗体：ＣＤ４のこの抗Ｄ１ドメイン抗体は、完全にヒト型であり、いかなる工学も必要としなかった（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６）。この抗体は、遺伝子導入マウスの免疫化後のマウスハイブリドーマから切り離して、現在ＣＨＯ細胞で再発現した形状で利用され、このことはその特異性、ＣＤ４分子に対するその親和性、その機能的特性にも少しも影響しない（Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９９）。５）ラットの抗体からＣＤＲ移植法によってヒト化されたＩｇＧ１／κである、ＣＡＭＰＡＴＨ−９Ｈ抗体（Ｇｏｒｍａｎら、１９９１）。ＣＤ４のこの抗Ｄ１ドメイン抗体は、ラットの免疫化によって得られたが、当初、ＣＤ５２分子に向けられる他の抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈによる自己免疫病理の治療の質を改良すると記載された。新規な工学は、ＮＳＯ非分泌性マウス骨髄腫細胞のこの抗体を生成することを可能にし、かつ補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）メカニズムを誘発せず、かつ抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）メカニズムを非常に僅かにのみ誘発する（Ｐｅａｋｍａｎら、１９９４）。
【０００４】
最後に、１３Ｂ８．２モノクローナル抗体（ＩＯＴ４ａ）が、ＨＩＶの繁殖を予防する抗ウイルス剤として１９８０年代末から記載された。これらのデータは、エイズに罹患した７人の患者を対象とする試験において、臨床テストの第一相に直ちに至らせた（Ｄｈｉｖｅｒら、１９８９）。幾つかの他の臨床試験が、この１３Ｂ８．２抗体によって行われた（Ｓｃｈｅｄｅｌら、１９９３；Ｄｅｃｋｅｒｔら、１９９６；Ｓｃｈｅｄｅｌら、１９９９）。これら全ての研究は、病気の進行に対する抗体を投与する臨床的利益を確認した。Ｃ．Ｄｅｖａｕｘのグループによって行われた研究は、１３Ｂ８．２抗体の作用メカニズムを決定することを可能にした（検討には、Ｂｒｉａｎｔ及びＤｅｖａｕｘ、２０００）。
【０００５】
抗ウイルス活性、及び通常ウイルスのゲノム発現の誘発を可能にする細胞内シグナル伝達カスケードの不活性化のために生じた、ＨＩＶの繁殖抑制の間に関連性が存在することが証明された。
【０００６】
この抗ウイルス活性は、ｐ５６ｌｃｋにもＨＩＶコレセプタにも依存しない負のシグナル誘発、又はＣＤ４分子の二量体化／オリゴマー化を関与させる機能的メカニズムの抑制のような幾つもの因子の帰結であり得る。この両方の場合において、１３Ｂ８．２抗体は、ＮＦ−κＢ転写因子の核転座に通常達する経路である、ＭＡＰキナーゼ経路を関与させるシグナル伝達カスケードを抑制する。
【０００７】
この１３Ｂ８．２モノクローナル抗体は、ＣＤ４分子のＤ１ドメインのＣＤＲ３様ループのように導かれると記載された（Ｓａｔｔｅｎｔａｕら、１９８９；Ｃｏｒｂｅａｕら、１９９３；Ｈｏｕｌｇａｔｔｅら、１９９４）。
【０００８】
１３Ｂ８．２抗体により試みた最初の臨床試験は、この分子の治療的可能性を予告していた。しかしながら、製剤対象となる生成物に向けた開発は、抗体の構造及びマウス由来であることに根ざした多数の問題にぶつかった。実際、エイズに罹患した患者を対象とし、かつ元のマウスバージョンにおいて１３Ｂ８．２抗体を含むこれら最初の臨床試験は、比較的低くても、分子の治療効率にやはり干渉する、ＨＡＭＡ応答の誘発を証明した（Ｄｈｉｖｅｒら、１９８９；Ｄｅｃｋｅｒｔら、１９９６；Ｓｃｈｅｄｅｌら、１９９９）。
【０００９】
この分子の免疫原性を限定し、かつ治療対象となる生成物を開発するように、１３Ｂ８．２抗体の組み換えキメラＦａｂ断片が、考案され、かつそれぞれＣＨ１−γ１及びヒトＣκドメインと融合したマウス親抗体の重鎖及び軽鎖のＶドメインを有するために、バキュロウイルス系／昆虫細胞による発現による１３Ｂ８．２抗体のＶドメインの隔離及び配列決定（Ｃｈａｒｄｅｓら、１９９９）後に調製された。
【００１０】
１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の組み換えキメラＦａｂ断片は、親抗体と同じエピトープ特異性でＣＤ４を結合させることが可能であることが証明された。更に、この断片は、（１）抗ウイルス的観点、ＨＩＶプロモーターの活性化及び逆転写酵素活性の抑制、及び（２）免疫抑制的観点、抗原及び混合リンパ球反応の提示に続く細胞活性化抑制から、１３Ｂ８．２抗体の生物学的特性を再生する。
【００１１】
この機能性は、抗体の化学Ｆａｂ断片に関してすでに証明された（Ｂｅｎｋｉｒａｎｅら、１９９５）。従ってキメラ化は、比較的低い効率に注目するとしても、そのウイルス繁殖を抑制する能力に影響しない。
【００１２】
組み換えＦａｂ断片の生物学的特性の評価は、このＦａｂ断片が、ＨＩＶプロモーターの活性化抑制の点でも、抗原提示に応答したＣＤ４＋Ｔリンパ球のＩＬ−２の分泌を抑制する能力においても、親抗体に類似した活性を有することを示している［バキュロウイルス中に発現したキメラマウス−ヒト抗ＣＤ４  Ｆａｂ１３Ｂ８．２は、抗原提示及びＨＩＶ−１プロモーター活性化の両方を抑制する（Ｔｈｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ４  Ｆａｂ  １３Ｂ８．２  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｂｏｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、Ｂｅｓ  Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０（２００１）６７−７６］。
【００１３】
１３Ｂ８．２抗体の組み換えキメラＦａｂ断片は、薬物動態学的定数を改良し、かつある向きで免疫系から逃れることを可能にするであろう、完全な抗体よりも小さいサイズであることと、マウス形状で完全な抗体により行われる予備臨床段階の際に認められるＨＡＭＡタイプの応答がないことを解明するであろう、良好な免疫抑制因子でもあることの二重の利点を有する。
【００１４】
最近の研究の際に、出願人は、ＣＤ４分子への結合に関与する１３Ｂ８．２抗体のパラトープの臨界残渣を同定することができたが、このことは、新世代の抗ＣＤ４分子の設計における進歩を予想させる。実際に、予め特徴付けした、ＣＤ４分子との免疫反応性ペプチドに基づく（Ｂｅｓ  Ｃ．ら、２００１ｂ）。
【００１５】
抗体のパラトープのかかる研究は、マークした抗原とＦａｂ断片の可変領域に重複するペプチドを使用して実行した。
【００１６】
抗体が向けられる抗原を、抗体が認識し得るためには、そのパラトープの三次元構造を保存せねばならないことが一般に認められるので、このアプローチは珍しい。
【００１７】
出願人は今般、このアプローチをキメラ１３Ｂ８．２抗体のＦａｂ断片の可変領域に応用した。
【００１８】
出願人はこのようにして、第二世代１３Ｂ８．２抗体の組み換えキメラＦａｂ断片のリガンド／抗体の相互作用において臨界残渣に影響する又は影響しないが、前記断片の生物学的特性を改良する突然変異を同定できた。
【００１９】
本発明の枠内で行った出願人の研究は、かかるアプローチの予言的結果を確認し、実際、定方向突然変異誘発技術によって得られた実験結果は、１３Ｂ８．２抗体のパラトープに応用された、セルロース担体に対するペプチドの並行多合成のスポット法（Ｆｒａｎｋ  Ｒ、四面体（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、１９９２、４８：９２１７−９２３２）により、前記抗体の生物活性に関与する臨床残渣を同定することが可能になることを証明している。
【００２０】
一方で、より活性の抗体由来分子を得ることは、臨床医にとり、また特に患者にとって、より良い快適さを確実にする投与分量の最小化の点で臨床的有用性を有する。
【００２１】
他方で、これら種々のＦａｂ分子の相補性は、それらの中の一つに対する治療回避の場合に、臨床的有用性を有する。
【００２２】
従って、出願人は、免疫抑制特性を有する、ヒト化したキメラ１３Ｂ８．２モノクローナル抗体由来の新規突然変異Ｆａｂ断片を考案した。
【００２３】
マウス１３Ｂ８．２ハイブリドーマから、１３Ｂ８．２抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子が、免疫グロブリンのシグナル配列においてハイブリダイズされる一組のオリゴヌクレオチドを使用して重合連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅された（Ｃｈａｒｄｅｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５２：３８６−３９４、１９９９）。
【００２４】
ＶＨ２−ＤＱ５２−ＪＨ３及びＶｋ１２／１３−Ｊｋ２遺伝子を使用する、１３Ｂ８．２抗体の可変領域のクローン化は、第一段階で行われ、次に１３Ｂ８．２抗体のＶＨ及びＶｋ領域の完全な配列が、行われた。
【００２５】
ヒト免疫グロブリンの定常領域及びマウス１３Ｂ８．２ハイブリドーマのクローン化された可変領域を有するヒト化された１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体のヒト化されたＦａｂ断片は、次にバキュロウイルス発現系での分子遺伝学によって得られた［Ｃｅｒｕｔｔｉ  Ｍ．ら、タンパク性能（Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、１９９５、仏国特許出願第９５／００１１０号；ＩＮＲＡ／ＣＮＲＳ、１９９７  ＷＯ９５／２０６７２；Ｐｏｕｌ  Ｍ−Ａ．ら、免疫技術（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９５、１：１８９−１９６］。
【００２６】
アラニンアミノ酸によってＣＤ４分子を結合することが可能なペプチド配列中の所定位置でのアミノ酸の置き換えによって得られるスポットＡｌａｓｃａｎデータから、出願人は、ＣＤ４分子への結合に特に重要な寄与を有する１３Ｂ８．２抗体のＦａｂ断片残渣はどれであるか、決定することができた。
【００２７】
Ａｌａｓｃａｎの結果に基づき、ヒト化された１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の一連の１６種の突然変異Ｆａｂが、生成された。このために、１３Ｂ８．２抗体の重鎖の可変領域のＣＤＲ１／ＣＤＲ２／ＣＤＲ３−ＶＨ及び軽鎖の可変領域のＣＤＲ１／ＣＤＲ２−Ｖκ高度可変領域から生じた１６種の残渣は、ＣＤ４分子への結合に関して寄与する残渣の性質を評価するために、アラニンから相次いで変異された。
【００２８】
突然変異Ｆａｂ断片は、バキュロウイルス系／昆虫細胞において生成された（Ｃｅｒｕｔｔｉ  Ｍ．ら、１９９５、特許、タンパク性能（Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）、仏国第９５／００１１０号；ＩＮＲＡ／ＣＮＲＳ、１９９７  ＷＯ９５／２０６７２；Ｐｏｕｌ  Ｍ−Ａ．ら、免疫技術（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９５、１：１８９−１９６）。突然変異体の質は、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットによって評価された。前記突然変異Ｆａｂ断片のＣＤ４分子への結合損失がＥＬＩＳＡ、蛍光による選別（ＦＡＣＳ）又はＢＩＡｃｏｒｅ技術によっても観察されたので、８種の残渣（ＶＨのＨ３５、Ｗ５２、Ｒ５３、Ｆ１００κ、Ｗ１０３、並びにＶκのＹ３２、Ｙ３６及びＨ９１）が、非常に寄与することが発見された。
【００２９】
３種の残渣（ＶＨのＲ３８、ＶκのＷ３５及びＹ９２）が、中位に寄与し、かつ５種のその他の残渣（ＶＨのＦ３２、Ｗ３６、Ｃ９２、Ｙ１０２及びＶκのＣ８８）がＣＤ４分子とのＦａｂ断片の結合に寄与しないことが証明された。
【００３０】
ＣＤ４分子との結合に寄与するように定義されたアミノ酸上に突然変異体を有する突然変異Ｆａｂ断片は、ＨＩＶプロモーター抑制活性、又は抗原提示抑制活性のような、生物学的効率の損失を同様に有する。
【００３１】
１３Ｂ８．２パラトープの分子模型化が行われ、ＣＤ４分子との相互作用に補足的な包括的要素を構成する。
【００３２】
ＶＨの正に帯電したＲ５３残渣、並びに特にＶＨのＨ３５及びＶκのＨ９１の役割は、おそらくＣＤ４分子のＣＤＲ３様の相同領域への結合を可能にし、根本的であるように見え、実際このＣＤ４分子の領域は、Ｅ８７及びＤ８８アミノ酸によって負に帯電している。
【００３３】
この分析は、ヒスチジンアミノ酸の正電荷を５０％から５％に減少させる、６から８のｐＨ勾配が、ＥＬＩＳＡで約２５％の結合減少をもたらすことによって強化される。
【００３４】
結論として、ヒト化された１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の５種の突然変異Ｆａｂが、ＣＤ４分子への結合能力及び１３Ｂ８．２親抗体の免疫抑制特性を保存する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
従って本発明は、ＣＤ４分子を結合し、かつ重鎖のＶＨ可変ドメインにある位置、又は軽鎖のＶκ可変ドメインにある位置に少なくとも１種の残渣の突然変異を含む１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の突然変異Ｆａｂ断片を対象とする。
【００３６】
好ましくは、本発明の１３Ｂ８．２抗体の突然変異Ｆａｂ断片は、野生Ｆａｂに少なくとも等しいＣＤ４分子に対する親和定数を有する。
【００３７】
好ましくは、本発明の１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の突然変異Ｆａｂ断片は、重鎖のＶＨ可変ドメインの３１−４１、４９−５７、６１−７０又は９０−１０３領域にある位置、又は軽鎖のＶκ可変ドメインの１９−２６、３２−４０及び８５−９６領域にある位置に、少なくとも１種の残渣の突然変異を含む。
【００３８】
特には、本発明の突然変異Ｆａｂ断片は、Ｖκ可変領域が、アラニンにより８８位にシステイン残渣の突然変異を有し、かつ添付の配列リスト中の配列番号１６の配列によって同定される、Ｃ８８−Ｌ；ＶＨ可変領域が、アラニン残渣により３２位にフェニルアラニン残渣の突然変異を有し、かつ添付の配列リスト中の配列番号３の配列によって同定される、Ｆ３２−Ｈ；ＶＨ可変領域が、アラニン残渣により３６位にトリプトファン残渣の突然変異を有し、かつ添付の配列リスト中の配列番号５の配列によって同定される、Ｗ３６−Ｈ；ＶＨ可変領域が、アラニン残渣により９２位にシステイン残渣の突然変異を有し、かつ添付の配列リスト中の配列番号９の配列によって同定される、Ｃ９２−Ｈ、及びＶＨ可変領域が、アラニン残渣により１０２位にチロシン残渣の突然変異を有し、かつ添付の配列リスト中の配列番号１１の配列によって同定される、Ｙ１０２−Ｈの突然変異Ｆａｂを含む群から選択される。
【００３９】
本発明は、場合により適切な賦形剤の存在下で、有効量の本発明の突然変異Ｆａｂ断片の少なくとも１種を有効成分として含む薬剤組成物に関する。
【００４０】
本発明の薬剤組成物において、突然変異Ｆａｂは、１〜５０ｍｇ、好ましくは５〜１０ｍｇの濃度で使用され得る。
【００４１】
本発明による薬剤組成物において、突然変異Ｆａｂは、治療する患者の体重に対し、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．４ｍｇ／ｋｇの濃度で使用される。
【００４２】
本発明の薬剤組成物は、自己免疫病理、特にリウマチ様多発性関節炎、かつ乾癬又は紅斑性狼瘡の治療に特に有用である。
【００４３】
特殊な使用態様によれば、本発明の薬剤組成物は、抗ＴＮＦリガンドを含む製剤と組み合わせて使用され得る。
【００４４】
本発明の薬剤組成物は、免疫不耐性反応の治療又は予防に特に有用である。
【００４５】
本発明の薬剤組成物は、移植組織の耐性を改良するために、宿主への移植組織タイプの反応を減少させ、更には除去するために、器官移植後に、患者において開始される反応の治療に同様に有用である。
【００４６】
本発明の薬剤組成物は、ＣＤ４＋リンパ腫又はチェザーリ（Ｃｅｓａｒｉ）リンパ腫のような、ＣＤ４分子を関与させる癌の治療に同様に有用である。
【００４７】
最後に、本発明の薬剤組成物の特別に示す使用は、母子ウイルス伝染の予防のような、更には偶発汚染の際の予防治療の枠内での、エイズ治療の使用である。
【００４８】
キメラ１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体の突然変異Ｆａｂ断片は、免疫抑制治療に特に適し、かつ抗イディオタイプ応答を誘発しないので、治療回避を特に避けることを可能にする。
【００４９】
このように、本発明による薬剤組成物は、ウイルス感染に関連した免疫不全の予防又は治療用薬剤の調製に有用である。
【００５０】
本発明は、１３Ｂ８．２抗体の突然変異Ｆａｂを調製し、精製し、かつ同定し、野生Ｆａｂと比べたそのリガンド、ＣＤ４分子に対する行動を比較し、かつこのようにして最良の生物活性を有するものを選択するために、出願人によって行われた実験作業の記載によって以下に記載される。
【００５１】
本発明は、添付図面によって例証する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
材料及び方法
【００５３】
反応体、細胞系統及びベクター。
【００５４】
ＣＤ４分子のｃＤＮＡ配列全体をコードするｐＭＣ７−Ｔ４プラスミド［Ｍａｄｄｏｎ、１９８７］を使用した。（［Ｂｅｓ、２００１ａ、２００１ｂ］に記載されたように、挿入されるＣＤ４を有するバキュロウイルスが、可溶性ヒト組み換えＣＤ４の生成のために構成され、かつ後で使用された。スポット分析に関して、組み換えヒトＣＤ４（マサチューセッツ州ニーダム、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．）は、市販の反応体（オハイオ州クリーブランド、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造者の指示に従い使用して、ビオチン化した。
【００５５】
１３Ｂ８．２モノクローナル抗体（ＩｇＧ１／κ）を生成するマウスハイブリドーマ系統（Ｄｈｉｖｅｒ、１９８９；Ｃｏｒｂｅａｕ、１９９３）を、Ｄ．Ｏｌｉｖｅ及びＣ．Ｍａｗａｓ（フランス、マルセイユ、ＩＮＳＥＲＭ  Ｕ１１９）から得た。
【００５６】
ＨＬＡ  ＤＲ５、６、ＤＲＢ５２、ＤＱ６、７、及びＡ２分子を発現するＥＢＶ−Ｌｕ  Ｂリンパ芽球腫系統、及びキメラＴＣＲの特異ｐｅｐ２４ペプチド（ＰＡＧＦＡＩＬＫＣＮＮＫＴＦＮＹ）及びヒトＣＤ４を発現するｐｄｂ１０Ｆ  Ｔマウス系統［Ｍａｎｃａ、１９９６］を、Ｐｒ．Ｄｅ  Ｂｅｒａｒｄｉｎｉｓ（イタリア、ナポリ、Ｃｏｎｓｉｇｌｉｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｄｅｌｌｅ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ）から得た。
【００５７】
ＨＩＶ−１のＬＴＲ  βガラクトシダーゼを有するＰ４  ＨｅＬａを指示する細胞系統［Ｂｒｉａｎｔ、１９９８］を、Ｏ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ（フランス、パリ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ）から得た。野生ヒトＣＤ４を発現するＡ２．１／ＣＤ４  Ｔ細胞系統［Ｐｏｕｌｉｎ、１９９１］をＤ．Ｌｉｔｔｍａｎ（ニューヨーク州ニューヨーク）から得た。
【００５８】
ＣＤ４に対する１３Ｂ８．２抗体の免疫反応性配列の寄与残渣を同定するためのスポットａｌａｓｃａｎによる分析。
【００５９】
使用するセルロース膜でのスポットペプチド合成の一般的手順及び記載されたもの［Ｍｏｎｎｅｔ、１９９９；Ｌａｕｎｅ、２００２］。
【００６０】
１３Ｂ８．２抗体の可変領域から導かれるアミノ酸配列に対応する、単一の残渣からフレームが移動する、２０２種の重複ドデカペプチドから、（Ｋａｂａｔ番号付けによる）重鎖の３１−４１、４９−７０及び９０−１０３配列、並びに軽鎖の１９−２６、３２−４０及び８５−９６配列を含むペプチドに関して、抗ＣＤ４免疫反応性を、以前に観察した［Ｂｅｓ、２００１ｂ］。
【００６１】
前記免疫反応性配列をカバーする１７種のヘキサペプチド、及び各ヘキサペプチドの６種の類似体を、スポット法により合成した。
【００６２】
セルロース膜に結合したペプチドの抗原反応性を、［Ｂｅｓ、２００１ｂ］に記載されたことによる反応性スポットに関して青い沈殿物を得させる条件で、ビオチン化ＣＤ４（１μｇ／ｍｌ）によりテストした。スポットの反応性は、膜の走査及びスポットの強度測定から、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅ  １．６１ソフトウェアによって評価した。１３Ｂ８．２抗体のパラトープの寄与残渣のスポット（ＳＣＲ）は、非修飾ペプチド配列のそれと比べた抗原に関する結合能力の５０％以上減少に基づき、同定した。
【００６３】
１３Ｂ８．２抗体の突然変異又は野生Ｆａｂを生成する組み換えバキュロウイルスの構成。
【００６４】
１３Ｂ８．２抗体の可変領域のクローン化及び配列決定に関する一般的な手順は、［Ｃｈａｒｄｅｓ、１９９９；Ｂｅｓ、２００１ａ、２００１ｂ］に記載されたことにより行われた。１３Ｂ８．２抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子の定方向突然変異誘発は、重複ＰＣＲによって行われた［Ｈｏ、１９８９］。アラニン走査によってスポットの寄与残渣（ＳＣＲ）と同定された１６の位置、及び対照として２種の追加残渣（軽鎖のＴ５３及び重鎖のＶ６１）は、アラニンによって突然変異した。
【００６５】
各突然変異体は、配列決定によって確認した。
【００６６】
重鎖の遺伝子調製に関して、ＰｓｔＩ／ＳａｃＩ線形化重鎖の可変領域の断片が、ポリヘドリンプロモーターの制御下で、１３Ｂ８．２抗体の重鎖の挿入及び発現を可能にするＣγ１（Ｆｄγ１）重鎖の第１ドメインを上流にプレインストールされて含む、ｐＢＨｕＦｄγ１転移ベクタープラスミドのカセット中でクローン化された［Ｐｏｕｌ、１９９５；Ｂｅｓ、２００１ａ］。
【００６７】
軽鎖の遺伝子調製に関して、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩ線形化軽鎖の可変領域の断片が、ｐ１０プロモーターの制御下で、１３Ｂ８．２抗体の軽鎖の挿入及び発現を可能にする、遺伝子Ｃκを上流にプレインストールされて含む、ｐＢＨｕＣκ転移ベクタープラスミドのカセット中でクローン化された［Ｐｏｕｌ、１９９５；Ｂｅｓ、２００１ａ］。
【００６８】
２つのステップの組み換え手続き［Ｐｏｕｌ、１９９５；Ｂｅｓ、２００１ａ］が、１３Ｂ８．２抗体の野生かつ突然変異Ｆａｂの２つの重鎖及び軽鎖を発現する組み換えバキュロウイルスを構成するために行われた。非該当の対照Ｆａｂ、１Ｃ１０抗ジゴキシンＦａｂが、バキュロウイルス系／昆虫細胞と類似した方法で発現された。
【００６９】
「１３Ｂ８．２」プライマー
【００７０】
これらのプライマーは、１３Ｂ８．２抗体の突然変異Ｆａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをコードする配列を増幅させるために使用した。これらの配列は、重複ＰＣＲによって得た（図８）。
【００７１】
ｐ１１９Ｆ及びｐ１１９Ｒプライマは、重鎖の増幅の枠内でＥ１及びＥ２プライマーにそれぞれ対応し、ｐ１１６Ｆ及びｐ１１６Ｒプライマーは、軽鎖の増幅の枠内でＥ１及びＥ２プライマーにそれぞれ対応する。
【００７２】
その他のプライマーは、次の用語に従ってＩ１及びＩ２プライマーに対応する：「（Ｈ又はＬ）鎖」「突然変異位置」「１又は２」、例えば、ＶｈＦ３２Ｆ及びＶｈＦ３２Ｒは、重鎖のＦ３２（Ｐｈｅ３２）残渣をアラニンに突然変異させるために使用するＩ１及びＩ２プライマーにそれぞれ対応する。
【００７３】
【表１】
2006513138.tif 000002
2006513138.tif 000003
【００７４】
組み換えＦａｂの生成、精製及び特徴付け。
【００７５】
１３Ｂ８．２抗体の各組み換えＦａｂは、［Ｂｅｓ、２００１ａ］に記載したように、組み換えバキュロウイルスにより感染したＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）の４００ｍｌの上清から、Ｇタンパク上で精製された。
【００７６】
精製したＦａｂは、捕獲反応体としてヒトＦｄγ１断片（英国、バーミンガム、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）に向けられたヒツジの抗血清、及び検出反応体としてペルオキシダーゼ（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ）に共役したκヒト鎖に向けられた抗体を使用してＥＬＩＳＡによって数量化した。抗体の試料は、次に電気泳動分析及びウェスタンブロットによりテストした。
【００７７】
１３Ｂ８．２抗体の野生かつ突然変異ＦａｂによるＣＤ４結合の研究。
【００７８】
ＥＬＩＳＡ法を、可溶性ＣＤ４に結合される能力に関して１３Ｂ８．２抗体のＦａｂを最初にスクリーニングするために利用した。
【００７９】
０．１Ｍの炭酸／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中のバキュロウイルスによって発現するＣＤ４断片の１：５００の希釈が、９６ウェルの酵素免疫分析プレート（英国、ペーズリー、Ｎｕｎｃ）上で４℃で一晩中、インキュベートされた。０．１％のツイーン２０（ＰＢＤ−Ｔ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１６０ｍＭ、ｐＨ７．２による４回の洗浄が、３７℃で１時間、ＰＢＳ−Ｔ中で１％の濃度の脱脂粉乳によるマイクロプレートの飽和の前後に行われた。
【００８０】
次に２．５μｇ／ｍｌの抗体溶液の２つずつの連続した１００％の希釈を、各ウェルに加えた。
【００８１】
２時間インキュベートし、かつＰＢＳ−Ｔ中で洗浄した後、結合抗体は、ペルオキシダーゼ基質の添加を伴う、ヒト−ペルオキシダーゼ抗カッパ共役体（Ｓｉｇｍａ）の１：１０００の溶液１００μｌの添加によって検出される。吸収度は、４９０ｎｍで測定する（Ａ４９０）。
【００８２】
１３Ｂ８．２抗体のＦａｂのパラトープへのＣＤ４の結合の動力学的パラメータは、ＢＩＡｃｏｒｅ分析器（スウェーデン、ウプサラ、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いた表面プラズモン共鳴分析によって決定した。
【００８３】
バキュロウイルス中に発現したＣＤ４は、バイオセンサに対して共有結合的に固定化され、かつＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中の組み換えＦａｂは、５〜２０μｇ／ｍｌの種々の濃度で注入される。
【００８４】
動力学的パラメータは、評価ソフトウェアＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２及び［Ｋａｒｌｓｓｏｎ、１９９４］による全体的方法を使用して計算した。
【００８５】
膜ＣＤ４への野生又は突然変異Ｆａｂの結合は、フローサイトメトリによって評価する。
【００８６】
ＡＮ２．０１／ＣＤ４  Ｔ細胞（１×１０６）が、０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）、又は組み換えＦａｂの各々、又はバキュロウイルス系／昆虫細胞中で発現する非該当の１Ｃ１０抗ジゴキシンＦａｂを補足したＰＢＳ−ＢＳＡによってインキュベートされる（１μｇ／ｍｌ）。
【００８７】
類似した実験が、ＡＮ２．０１  Ｔ細胞（負のＣｄ４  Ｔ細胞系統）で行われた。ＰＢＳ−ＢＳＡによる３回の洗浄後、結合した抗体は、４℃で１時間フルオロセイン（Ｓｉｇｍａ）に共役したヒトカッパ軽鎖に向けられた抗体の５０μｌの１：１０００の溶液によるインキュベーションによって現れる。次のＰＢＳ−ＢＳＡによる３回の洗浄後、蛍光強度を、細胞蛍光光度計ＥＰＩＣＳ（カリフォルニア州フラートン、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）において測定する。
【００８８】
抗原提示に続くＩｌ２の分泌テスト。
【００８９】
［Ｂｅｓ、２００１ａ、２００１ｂ］に記載したように、ｐｅｐ２４刺激ペプチド（１０５細胞／ウェル）により送られるＥＢＶ−Ｌｕ抗原を提示する細胞は、ｐｄｂ  １０Ｆに応答するＴ細胞（２×１０４細胞／ウェル）により共培養した。１３Ｂ８．２抗体の野生又は突然変異Ｆａｂ（２０μｇ／ｍｌ）を、細胞に添加し、かつ抗原提示は、３７℃で２４時間行う。次に１００μｌの上清を回収し、かつＩｌ２分泌に関して市販のＥＬＩＳＡキット（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を使用してテストした。
【００９０】
ＨＩＶ−１プロモーターの活性テスト。
【００９１】
Ｐ４  ＨｅＬａ指示細胞（８×１０４細胞／ｍｌ）を、３日間、Ｆａｂの存在下（２０μｇ／ｍｌ）又は不存在下で、感染性ＨＩＶ−１Ｌａｉウイルスを補足した又は補足しない媒体中で培養し、回収し、かつ溶解させる。βガラクトシダーゼ活性を、４１０ｎｍでの吸収度を測定して、以前に記載したことにより決定した［Ｍｏｎｎｅｔ、１９９９］。
【００９２】
１３Ｂ８．２抗体の可変領域の分子模型化
【００９３】
１３Ｂ８．２抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の三次元模型を、ワークステーションＯ２  Ｒ５０００  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ上でソフトウェアＡｂＭ（英国、アクセルリス、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）［Ｒｅｅｓ、１９９２］を使用して得た。
【００９４】
Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ２−ＣＤＲループを、１類の正準フレーム及びソフトウェアＡｂＭで定義するようなＬ１ループの２類の正準フレームにより構成した。
【００９５】
Ｈ３ループを、データベース／三次元構造のデータベースにおける調査と組み合わされる、ＡｂＭ中で提供される配座調査プログラム、ＣＯＮＧＥＮの組み合わせ調査を使用して構成した。
【００９６】
ソフトウェアＳＹＢＹＬ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ）を使用して、水素が模型に加えられ、かつ模型は、あらゆる小さな血清衝突を除去するために、共役勾配法及びｔｒｉｐｏｓ力場（ｌａ  ｃｈａｍｐ  ｄｅ  ｆｏｒｃｅ  ｔｒｉｐｏｓ）による１００回の反復中に最小にされた。１３Ｂ８．２抗体のアミノ酸の溶剤に到達し得る表面積は、ＳＹＢＹＬ中で提供されるソフトウェアＳＡＬＶＯＬによって三次元模型中で計算した。
【００９７】
ウイルス逆転写酵素活性の測定。
【００９８】
１３Ｂ８．２抗体の組み換えキメラＦａｂ断片の抗ウイルス特性の研究の枠内で使用されるこの方法は、ウイルス逆転写酵素活性をＨＩＶ感染した細胞の培養上清中で決定して、ウイルス繁殖の速度を測定することを可能にする。
【００９９】
第１のステップは、５×１０５のＣＥＭ細胞をテストする試料によって感染させることからなる。このために、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、１００ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１ＬＡＩウイルスの存在下（５×１０５の細胞に対して１００μｌのウイルス）で、４℃で３０分間、細胞をインキュベートする。次にＲＰＭＩ培地での４つの洗浄ステップが、過剰なウイルスを取り除くために行われる。細胞は、ｐ２４プレート中で広げられ、次に１ｍｌの最終体積でテストする試料の存在下、５％のＣＯ２で、３７℃で３日間培養される。ウイルス繁殖を抑制する可能性がある試料を除いて、インヒビターの不存在下、ウイルスの不存在下、及びＡＺＴのような公知のインヒビターの存在下で、幾つかの内部対照を有するように、逆転写酵素活性を同様にテストする。
【０１００】
第２のステップは、ウイルス逆転写酵素の抽出からなる。このステップは、１５〜２０日の期間に対して３日毎に繰り返す。このため、培養プレートは、上清を回収するように、１５００回転／分で、４℃で３分間遠心分離する。感染細胞を、テストする試料の存在下でその濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調整した後に再び培養する。培養上清は、９５０００回転／分で、４℃で５分間遠心分離される。感染細胞によって生成したウイルス粒子を含む、得られた残りかすを、１５μｌの溶解緩衝液（緩衝液調製を参照）の存在下で、４℃で１５分間インキュベートした。このレベルで、ウイルス粒子溶解物は、後で使用するために−８０℃で保存しても良い。
【０１０１】
第３のステップは、逆転写酵素活性の決定からなる。溶解物を、４０μｌの反応混合物（緩衝液調製を参照）の存在下に置き、かつ３７℃で１時間インキュベートする。反応混合物は、ＲＮＡマトリックス（ｐｏｌｙＡＲＮＡ）、プライマー（ｏｌｉｇｏＤＴ）及びデオキシチミジンが３Ｈでマークした４種のヌクレオチドの混合物を含む。従って、このステップは、ウイルス粒子の溶解物中に存在する逆転写酵素によってレトロ転写される（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｔ）ＤＮＡ中に３Ｈ−ｄＴＴＰの取り込みを行うことを可能にする。実際、ＴＣＡ５％への１ｍｌのＰＰＮａ、０．１Ｍ（トリクロロ酢酸へのピロリン酸ナトリウム）の添加による反応停止後、レトロ転写されたＤＮＡは、サケ精液（５００μｇ／ｍｌ）の２００μｌのＤＮＡ溶液及び４ｍｌのＴＣＡ２０％の存在下で４℃で１５分間で沈殿する。この溶液を、ミリポアフィルタ０．４５μ上でろ過される。ＤＮＡを回収したフィルタを、ＴＣＡ５％で２回洗浄し、次にまずエタノール７０％で、次に保温器で、３７℃で１０分間乾燥する。次にフィルタ上に存在する放射能を、５ｍｌの発光液体中にフィルタを組み込んだ後に測定する。
【０１０２】
ｃｐｍ／ｍｌで表現する逆転写酵素活性の測定により、抑制する可能性がある試料の存在下で時間に応じたウイルス繁殖の検査が可能になる。
【０１０３】
混合リンパ球反応
【０１０４】
このアプローチにより、出願人は、異なるドナーの抹消血に由来する２つのリンパ球集団の接触の際に、細胞繁殖を抑制する１３Ｂ８．２抗体の組み換えキメラＦａｂ断片の能力を評価した。
【０１０５】
第１のステップは、混合リンパ球反応を行うことからなる。このため、２人の異なるドナーＡ及びＢから生じたバフィーコート（抹消血のリンパ球製剤）を（１０％のＡＢヒト血清、抗生物質ペニシリン及びストレプトマイシン、並びにＬ−グルタミンを補足した）ＲＰＭＩ培地で洗浄する。次に細胞を、１×１０６細胞／ｍｌの高さで、培地で希釈する。混合リンパ球反応は、２つの計画に従ってｐ９６培養プレート中でなされる。「一方向の」第１の計画は、ドナーＡの５０μｌの細胞懸濁液を、マイトマイシンＣ（２５μｇ／ｍｌの最終濃度）によって、５％のＣＯ２で３７℃で３０分間、予め処理した同じ濃度かつ同じドナーの５０μｌの細胞懸濁液と混合することからなる。この計画により、「異常」細胞に応答した細胞繁殖を評価することが可能になる。「二方向の」第２の計画は、マイトマイシンＣで処理しない、ドナーＡ及びＢに由来する１００μｌの細胞懸濁液を混合することからなる。この計画により、「異質」細胞に応答した細胞繁殖を評価することが可能になる。この第２の計画により、結果の精度を改良することが一般に可能になる。これが、我々が優先的に研究したほうの計画である。両方の場合において、細胞を、テストする試料の５０μｌの溶液の存在下で５〜７日間インキュベートする。
【０１０６】
第２のステップは、細胞繁殖の分量決定からなる。このために細胞を、２０μＭのＢｒＤＵの存在下、５％のＣＯ２で３７℃で１８時間インキュベートする。この分子は、分裂中の細胞のＤＮＡ中に組み込まれる。次に培養プレートは、上清を除去するように、遠心分離し、次に３７℃で１時間乾燥させる。次に細胞を、２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を添加することにより、２５℃で３０分間固定する。過剰の固定溶液の洗浄後、ＢｒＤＵの組み込みは、ペルオキシダーゼでマークした抗ＢｒＤＵ抗体の存在下、３７℃で３時間のインキュベーション及び着色基質の添加後に、ＥＬＩＳＡの原理に従って現れる。吸収度の測定は、４５０ｎｍで行う。
【０１０７】
その場合細胞繁殖は、テストする試料の性質及び濃度に応じて、吸収度の単位で表現される。
【０１０８】
結果
【０１０９】
ＣＤ４結合を有する抗体のパラトープの寄与残渣の同定。
【０１１０】
１３Ｂ８．２抗体の可変領域の予め同定した配列の１７種のヘキサペプチド［Ｂｅｓ、２００１ｂ］、及び一連のアラニン類似体を、ＣＤ４への結合に関与する抗体の臨界残渣を正確に同定するために、スポット法により、細胞膜上で合成した。
【０１１１】
１３Ｂ８．２抗体のＣＤＲ−Ｈ２領域の４９−５７配列の詳細な研究を、添付の図１Ａ及び１Ｂに示す。
【０１１２】
アラニン残渣による（対照ペプチド１として定義する）４９ＧＶＩＷＲＳ５４ペプチドのＴｒｐ５２の置換は、ＣＤ４への結合能力において５０％の減少に至らせ、他方Ａｒｇ５３の変化は、抗原に関する反応性の全損失に至らせる。
【０１１３】
アラニンによる４９ＧＶＩＷＲＳ５４ペプチド残渣の４つのその他の置き換えは、抗原に関連する能力を修飾しない。
【０１１４】
ＣＤ４分子との結合へのＴｒｐ５２及びＡｒｇ５３の寄与は、５２ＷＲＳＧＩＴ５７ペプチドのアラニン走査方法によって確認された（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０１１５】
ＣＤＲ−Ｈ２領域の、６１ＶＰＦＭＳＲ６６、６５ＳＲＬＳＩＴ７０ヘキサペプチド及びその６種のアラニン類似体を使用した、類似した実験により、ＣＤ４分子の結合残渣としてのＡｒｇ６６残渣の同定が可能になる（データは示さない）。
【０１１６】
総合して考察して、Ｈ２領域に関して寄与するモチーフが、５２ＷＲ−−−−−−−−−−−−Ｒ６６（図１Ｃ）であり、２種のＴｒｐ５２及びＡｒｇ５３残渣が、ＣＤＲに属することを決定した。
【０１１７】
同じようにして、寄与モチーフ３２Ｆ−−ＨＷ−Ｒ３８を、１３Ｂ８．２抗体のパラトープのＨ１領域の３種の３１ＴＦＧＶＨＷ３６、３４ＶＨＷＶＲＱ３９及び３６ＷＶＲＱＳＰ４１ヘキサペプチドのａｌａｓｃａｎスポット分析によって決定した；ＩＧＭＴのＫａｂａｔの用語による２種の残渣（Ｐｈｅ３２、Ｈｉｓ３５）の内１種が、ＣＤＲに関与する。
【０１１８】
Ｈ３領域に関して、モチーフは、ＣＤＲのＰｈｅ１００Ｋ及びＴｙｒ１０２残渣を含む９２Ｃ−−−−−−−−Ｆ−ＹＷ１０３ＣＤ４分子に結合され、かつ構造（フレームワーク）の２種の他の残渣は、３種の９０ＹＹＣＡＫＮ９５、９２ＣＡＫＮＤＰ９７及び９９ＴＧＦＡＹＷ１０３ヘキサペプチドから決定された。
【０１１９】
Ｌ１領域の４種の１９ＶＴＦＴＣＲ２４、２１ＦＴＣＲＡＳ２６、３２ＹＬＡＷＹＱ３７及び３５ＷＹＱＱＫＱ４０ヘキサペプチドの研究は、ＣＤ４分子の結合に寄与するものとして、Ａｒｇ２４、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ３５、Ｔｙｒ３６及びＬｙｓ３９残渣を同定した。
【０１２０】
Ｌ２領域には、観察される反応性がなかったので［Ｂｅｓ、２００１ｂ］、いかなる結合モチーフも同定しなかった。
【０１２１】
８８Ｃ−−ＨＹ９２モチーフは、Ｌ３領域の３種の８５ＴＹＹＣＱＨ９１、８８ＣＱＨＨＹＧ９３及び９１ＨＹＧＮＰＰ９６ヘキサペプチドのａｌａｓｃａｎスポットによる分析の結果に応じて、ＣＤ４分子による結合に寄与し、Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９２残渣が、ＣＤＲに属する（図１Ｃ）。
【０１２２】
総合して考察して、１３Ｂ８．２抗体のパラトープの１９種の残渣を、ａｌａｓｃａｎスポット分析によりＣＤ４分子に結合されるＳＣＲ残渣として最初に同定した。
【０１２３】
しかしながら、それらの中で重鎖のＡｒｇ６６残渣及び軽鎖のＡｒｇ２４及びＬｙｓ３９残渣が、抗体の三次元構造において僅かに溶剤に到達し得ると、徹底して思われ、かつ抗原結合中の臨界残渣として以前には決して同定されなかった［ＭｃＣａｌｌｕｎ、１９９６、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｕｂｉｃ．ｒｄｇ．ａｃ．ｕｋ；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ］。
【０１２４】
従って、１３Ｂ８．２抗体のパラトープの１６種のＳＣＲのみを、以下で行う定方向突然変異誘発のために選択した。
【０１２５】
１３Ｂ８．２抗体の唯一のアラニンの突然変異Ｆａｂの特徴付け。
【０１２６】
１３Ｂ８．２抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の遺伝子を、１３Ｂ８．２抗体のＦａｂの全体的状況においてアラニン残渣によって選択したＳＣＲの各々を置き換えるために、重複ＰＣＲによる定方向突然変異誘発用のマトリックスとして使用した。
【０１２７】
適切なｐＢＨｕＦｄ＿１又はｐＢＨｕＣベクター中のクローン化、バキュロウイルス系／昆虫細胞中の発現、Ｇタンパクを用いた精製後、以下で重鎖の可変ドメインで突然変異を有するものに関してＦ３２−Ｈ、Ｈ３５−Ｈ、Ｗ３６−Ｈ、Ｒ３８−Ｈ、Ｗ５２−Ｈ、Ｒ５３−Ｈ、Ｃ９２−Ｈ、Ｆ１００Ｋ−Ｈ、Ｙ１０２−Ｈ及びＷ１０３−Ｈ、並びに軽鎖の可変ドメインで突然変異を有するものに関してＹ３２−Ｌ、Ｗ３５−Ｌ、Ｙ３６−Ｌ、Ｃ８８−Ｌ、Ｈ９１−Ｌ及びＹ９２−Ｌと指し示す、突然変異Ｆａｂの各々を、更に検出し、免疫グロブリン生成物に関してＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットにより数量化した（図２Ａ及び２Ｂ）。
【０１２８】
１３Ｂ８．２抗体の野生Ｆａｂの対応する配列と比べた、突然変異Ｆａｂの各々のＶＨ及びＶＬドメインの領域の配列は、下記の表２（ＶＨドメイン）及び表３（ＶＬドメイン）に示す。
【０１２９】
【表２】
2006513138.tif 000004
2006513138.tif 000005
【０１３０】
【表３】
2006513138.tif 000006
2006513138.tif 000007
【０１３１】
Ｙ３６−Ｌ、Ｃ８８−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｈ３５−Ｈ、Ｗ５２−Ｈ及びＲ５３−Ｈ突然変異体に関して実施例が示すように、重鎖に向けられた捕獲抗体により明らかにされ、かつペルオキシダーゼに共役したカッパ鎖に向けられた抗体によって現れた免疫グロブリンの生成は、精製した各組み換えＦａｂに関して証明された。
【０１３２】
各組み換えＦａｂに関して１μｇの帯電タンパクにより行われるクーマシーブルーの着色による、ＳＤＳ（ＰＡＧＥ−ＳＤＳ）の存在下でのアクリルアミドゲルに対する電気泳動分析は、非還元条件で、正しく組み換えたＦａｂの期待されるサイズに対応する、５０キロダルトンで唯一の帯域を現す（データは示さず）；５０ＫＤでの帯域の同定は、次にヒトカッパ鎖に向けられる抗体を使用して、ウェスタンブロットにより確認した（図２Ｂ）。
【０１３３】
１３Ｂ８．２抗体の突然変異Ｆａｂ対野生ＦａｂによるＣＤ４分子の結合能力。
【０１３４】
可溶性ＣＤ４分子を結合する突然変異Ｆａｂ対野生Ｆａｂの能力は、最初にＥＬＩＳＡ法によって確認し（図３）、かつ次にＢＩＡｃｏｒｅ分析によって数量化する（下記の表４）。
【０１３５】
【表４】
2006513138.tif 000008
【０１３６】
ＥＬＩＳＡで、野生ＦａｂのＣＤ４への結合活性は、１９．５〜１２５０ｎｇ／ｍｌに及ぶ範囲で証明され（図２）、他方で１Ｃ１０抗ジゴキシン組み換えＦａｂではいかなる結合も観察されなかった。
【０１３７】
野生Ｆａｂに関して観察されたものに類似したＣＤ４に関する用量依存的反応性は、対照突然変異Ｆａｂ、Ｔ５３−Ｌ及びＶ６１−Ｈ、並びにスポットで特徴付けした位置での突然変異Ｆａｂ、Ｃ８８−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｗ３６−Ｈ、Ｃ９２−Ｈ及びＹ１０２−Ｈに関して明らかにした。
【０１３８】
他方で、スポットで特徴付けした残渣、ＣＤＲ−Ｌ領域のＴｙｒ３２、Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９２、ＣＤＲ−Ｈ領域のＨｉｓ３５、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３及びＰｈｅ１００Ｋ、軽鎖のＦｗ領域のＴｒｐ３５及びＴｙｒ３６、並びに重鎖のＦｗ領域のＡｒｇ３８及びＴｒｐ１０３のレベルでのアラニンの突然変異は、用量依存的にＣＤ４分子への結合に影響する（図３）。
【０１３９】
Ｙ３２−Ｌ、Ｈ９１−Ｌ、Ｈ３５−Ｈ、Ｒ３８−Ｈ、Ｗ５２−Ｈ、Ｒ５３−Ｈ、Ｆ１００Ｋ−Ｈ及びＷ１０３−ＨのＦａｂのような、ＥＬＩＳＡによってＣＤ４分子への結合能力の損失を有する突然変異Ｆａｂの大部分が、約１００〜１０００倍のＫＤの減少を示し、他方でＥＬＩＳＡでＣＤ４分子への結合能力の維持を示すものは、１３Ｂ８．２抗体の野生Ｆａｂに関して計算されるＫＤ値に類似したＫＤ値を示したので、これらの結果は、ＢＩＡｃｏｒｅ技術を用いて確認された（表１）。最後に、ＥＬＩＳＡでＣＤ４分子への結合能力の減少を有するＷ３５−Ｌ、Ｙ３６−Ｌ及びＹ９２−Ｌ突然変異Ｆａｂは、１３Ｂ８．２抗体の野生ＦａｂのＫＤ値に類似したＫＤ値を示したが、解離速度はより高かった。
【０１４０】
膜ＣＤ４への断片結合を決定するために、ＡＮ２．０１  ＣＤ４＋  Ｔ細胞を間接免疫蛍光マーキング及びフローサイトメトリによって分析した（図４）
【０１４１】
１３Ｂ８．２抗体の野生Ｆａｂにより、Ｔ細胞の濃い着色が用量依存的に得られ、他方でフルオロセインでマークしたカッパ抗鎖抗体又は１Ｃ１０抗ジゴキシンＦａｂによる対照は、前記細胞に結合されない。
【０１４２】
負のＡＮ２．０１  ＣＤ４  Ｔ細胞を使用した類似した実験は、野生Ｆａｂとも、対応する突然変異アラニンを有するＦａｂとも非特異結合がないことを示した。
【０１４３】
他方で、前記細胞のＣＤ４分子への結合における機能低下が、軽鎖のＴｙｒ３２、Ｔｒｐ３５、Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９２、並びに重鎖のＨｉｓ３５、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｐｈｅ１００Ｋ及びＴｒｐ１０３残渣に対してアラニンの置き換えを有する突然変異体に関して観察された。
【０１４４】
ＣＤ４分子が関与する応答における、１３Ｂ８．２抗体の野生Ｆａｂに比べたアラニンで突然変異した残渣を有するＦａｂの生物活性。
【０１４５】
ｐｄｂ１０Ｆ反応性Ｔ細胞により共培養された、Ｐｅｐ２４ペプチドにより刺激したＥＢＶ−Ｌｕ抗原を提示する細胞（ＡＰＣ）は、抗原提示に続き、リンパ球のＩｌ２分泌に至らせる。
【０１４６】
図５に示すように、用量依存的Ｉｌ２分泌抑制が、このＴ細胞活性化模型において、１３Ｂ８．２抗体の野生抗ＣＤ４Ｆａｂのインキュベーションの結果、証明される。
【０１４７】
同じ濃度で、１Ｃ１０Ｆａｂ対照は、いかなる抑制活性も示さない。
【０１４８】
Ｃ８８−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｗ３６−Ｈ及びＣ９２−Ｈのような野生Ｆａｂに類似するＣＤ４分子への結合能力を示す突然変異Ｆａｂは、抗原提示に対する抑制特性も維持する。
【０１４９】
それに反して、ＳＣＲのレベルのその他の突然変異は、突然変異抗ＣＤ４Ｆａｂの抗原提示機能の抑制を全体的又は部分的に取り消す（図５）。
【０１５０】
この結果は、突然変異Ｆａｂ、Ｈ９１−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｈ３５−Ｈ、Ｗ５２−Ｈ及びＲ５３−Ｈ、対ＨＩＶ−１の促進活性における野生Ｆａｂの抑制特性の研究によって得られた結果と相互に関連する（図６）。この場合、ＣＤ４分子の結合能力に機能低下を示す突然変異Ｆａｂ（Ｈ９１−Ｌ、Ｈ３５−Ｈ、Ｗ５３−Ｈ、及びＲ５３−Ｈ）は、ＨＩＶ−１のＬＴＲの制御下でβガラクトシダーゼのレポーター遺伝子の発現を遮断することが可能でなく、他方で野生Ｆａｂのように保護されたＣＤ４分子の結合能力を有するＦ３２突然変異Ｆａｂは、レポーター遺伝子の発現を抑制する。
【０１５１】
総合して考察すると、予めスポットで同定したアラニンの突然変異は、突然変異Ｆａｂの生物活性における欠如と相互に関連するＣＤ４分子への結合の機能低下に至らせる。
【０１５２】
１３Ｂ８．２抗体の可変領域の情報処理模型からのＣＤ４分子への突然変異Ｆａｂの結合の構造分析。
【０１５３】
１３Ｂ８．２抗体のパラトープの三次元模型を、ＡｂＭ中の正準クラスの構造（「フレームワーク」）の定義、及びＣＤＲ  Ｈ３に関してＣＯＮＧＥＮを使用した配座調査技術に従って、ＡｂＭ配列ライブラリーによる１３Ｂ８．２モノクローナル抗体の配列のアミノ酸のアラインメントを行って得た（図７）。
【０１５４】
１ｆｄｌ及び１ｎｌｄ抗体の構造は、それぞれ１３Ｂ８．２抗体の軽鎖及び重鎖のＦＷ領域に関してマトリックスを提供した。
【０１５５】
ＣＤＲ−Ｈ３を除くＣＤＲを、正準クラスに基づき構成した。
【０１５６】
同じ正準クラスのより相同的な配列を有するとして公知であるループを、使用した。
【０１５７】
ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３は、１ｆｄｌ抗体の三次元構造を使用して構成し、かつＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２は、１ｎｌｄ構造を使用して構成した。
【０１５８】
ＣＤＲ−Ｈ３可撓性ループは、正準クラスとして記載されておらず、かつ配座調査と組み合わせたデータベース（ＣＯＮＧＥＮ）における調査を使用して構成された。
【０１５９】
期待されたように構造は、Ｃｙｓ２２及び９２、及び重鎖のベータシート、並びに残渣Ｃｙｓ２３及び軽鎖のベータシートの８８の間に２つのジスルフィド架橋を有する。
【０１６０】
１３Ｂ８．２抗体のアミノ酸の溶剤への到達可能性、及び臨界残渣の側鎖の方向の分析は、定方向突然変異誘発によって確認されたＣＤ４分子を結合する、大部分のＳＣＲ残渣が、ＣＤ４により組み合わせ部位の内部に構造的に方向付けされることを示している。
【０１６１】
他方で、突然変異がＦａｂ全体の状況でＣＤ４への結合を変化させない、Ｐｈｅ３２、Ｔｒｐ３６、Ｃｙｓ９２、Ｔｙｒ１０２及びＣｙｓ８８残渣のレベルの突然変異Ｆａｂは、その側鎖が、溶剤（Ｃｙｓ９２、Ｔｒｐ３６、Ｃｙｓ８８）に到達できないか、Ｐｈｅ３２及びＴｙｒ１０２に関するように、ＣＤ４の結合ポケットの主要な方向のそれを反対方向に向けることを示しており；このようにしてＣＤ４への結合への寄与が、ありそうにないことを構造的に確認している。
【０１６２】
より特異的には、２種のシステインは、溶剤に到達できず、ＣＤ４と相互に作用する確立を減少させる、ジスルフィド架橋に関与している。
【０１６３】
定方向突然変異誘発によって確認された、ＳＣＲ接触残渣の大部分は、芳香性残渣及び／又は帯電残渣である。
【０１６４】
１５０平方オングストロームの面積に対応する抗原による結合部位の入り口で、ＣＤＲ−Ｈ２ループのＴｒｐ５２及びＡｒｇ５３残渣、並びにそれぞれＣＤＲ−Ｌ１及びＣＤＲ−Ｌ３ループのＴｙｒ３２及びＴｙｒ９２残渣は、ＣＤ４との結合に両側で寄与する。ＣＤＲ−Ｌ１ループのＴｙｒ３０残渣も溶剤に露出され、かつＴｙｒ３２及びＴｙｒ９２残渣と疎水性パッチを構成する。
【０１６５】
７５平方オングストロームの面積をカバーする、ＣＤ４への結合部位底部は、それぞれＣＤＲ−Ｈ１ループ及びＣＤＲ−Ｈ３ループのＨｉｓ３５、Ｐｈｅ１００Ｋ残渣、及びＣＤＲ−Ｌ３領域のＨｉｓ９１のように定義される、主に正に帯電した芳香性残渣のクラスターからなる。
【０１６６】
溶剤への僅かな到達可能性を有し、かつ本質的にＦＷに属する４種の追加残渣（重鎖のＡｒｇ３８、Ｔｒｐ１０３及び軽鎖のＴｒｐ３５及びＴｙｒ３６）は、ＣＤ４の結合ポケットに関与する領域のフレームワークの配座をおそらく安定させるか、又は抗体のＨ／Ｌ界面を加工する。
【０１６７】
ＣＤ４結合部位の中央（ＣＤＲ−Ｈ１のＨｉｓ３５及びＣＤＲ−Ｌ３のＨｉｓ９１）及び入り口の下（ＣＤＲ−Ｈ２のＡｒｇ５３）の正に帯電した３種の残渣の存在は、静電相互作用が、ＣＤ４分子上のＣＤＲ３の相同領域上のエピトープ及び１３Ｂ８．２抗体の間に主要な要素の一つを構成し得ることを示唆している。
【０１６８】
ＣＤＲ−Ｌ２領域の分子模型化による分析は、Ｌ２ループが、比較的良好に露出されていることを示しており、ＣＤ４の非結合活性がスポット法によって以前に証明された理由を説明している［Ｂｅｓ、２００１ｂ］。
【０１６９】
考察
【０１７０】
所与の抗体のパラトープの抗原との結合に関与する臨界残渣の定義は、改良された活性での、変異体構成の誘導に必要な条件である。
【０１７１】
定方向突然変異誘発及び／又は分子模型化と時折組み合わされるＸ線結晶構造解析は、抗原／抗体の組み合わせ部位設計のための選択方法である。
【０１７２】
しかしながら（原子座標による）構造パラトープのかかる分析は、大きなサイズのタンパクに関して特に重大である、（大量であることがしばしば要求される）抗原及び抗体の利用可能性、抗原の翻訳後修飾のレベル及び複合体の結晶形成の質により、ある種の複合体に限定される。
【０１７３】
２００２年２月に、異なる約２０種のタンパクのみ抗原／抗体の複合体の原子座標が、タンパクデータバンク銀行に記載された。
【０１７４】
出願人は今般、スポット法が、ペプチド合成と並行して、前述の制限を免除された、抗原との結合に関与する抗体のパラトープの臨界残渣の精細なマッピングのための補足アプローチとなることを証明した。
【０１７５】
このマッピング技術は、大量に利用できないタンパクに対して特別な有用性を有する。かかる実験を成功させるには、抗体の可変領域のアミノ酸配列、微量の抗原及びスポットペプチド合成技術を利用すれば、十分である。
【０１７６】
１３Ｂ８．２抗ＣＤ４抗体から、スポット法により行われた分析に従えば、ＣＤ４分子に結合される、約７０％の残渣が、定方向突然変異誘発によって確認された。これらの結果は、抗トロポニン抗体の体細胞突然変異を経由して選択される数種の残渣が、スポットフォーマットにおいて寄与する残渣であり［Ｌａｕｎｅ、２００２］、かつ抗リゾチーム抗体の同定された、６５％のＳＣＲ残渣［Ｌａｕｎｅ、１９９８］が、リゾチーム／ＨｙＨｅｌ−５の複合体のＸ線結晶構造解析により予め定義される寄与残渣と相互に関連する［Ｓｃｈｅｒｉｆｆ、１９８７；Ｃｏｈｅｎ、１９９６］ことを示す、以前の間接的な論証と相互に関連する。
【０１７７】
更に、ＣＤ４分子への結合に関与する１１種のＳＣＲ残渣の内、１０種（１３Ｂ８．２抗体の軽鎖のＴｙｒ３２、Ｔｒｐ３５、Ｔｙｒ３６、Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９２；１３Ｂ８．２抗体の重鎖のＨｉｓ３５、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｐｈｅ１００Ｋ及びＴｒｐ１０３）が、ＣＤ４分子との接触部位としてすでに同定された位置で局在化され［ＭｃＣａｌｌｕｍ、１９９６；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１］、他方で定方向突然変異誘発によりＣＤ４のパラトープから除外された、５種に対して４種の残渣は、この「接触」のクラスには属さない。
【０１７８】
興味深いことに、１３Ｂ８．２抗体の重鎖の最後の残渣Ｐｈｅ３２は、抗原と接触しているとしてすでに定義された位置で局在化される［ＭｃＣａｌｌｕｍ、１９９６；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１］が、この位置で臨界アミノ酸残渣として目印を付けられたことはなかった［Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１］。
【０１７９】
示唆されたように［Ｌａｕｎｅ、２００２］、スポットでのこれらの偽陽性残渣は、ペプチドフォーマットが、機能パラトープ中で通常隠される抗体の残渣を露出させることで同様に説明され得る。
【０１８０】
このことは、組み合わせ部位の中心と比べた残渣の位置及び方向が、抗原を結合する適性のキーポイントであるという全体的な見通し［ＭｃＣａｌｌｕｍ、１９９６］と一致して、ＣＤ４分子を結合する実際のＳＣＲ残渣のみが、抗原を結合するポケット内部に、構造的に方向付けられる、１３Ｂ８．２抗体の模型化研究によって強調される。
【０１８１】
臨界残渣の中で、２種の残渣が、抗原との組み合わせ部位に到達しにくく、ＣＤ４分子と構造的に相互に作用しないが、ＣＤ４パラトープによって間接的に影響を受けることを示唆している。
【０１８２】
実際、軽鎖のＴｒｐ３５、Ｔｙｒ３６、及び重鎖のＴｒｐ１０３残渣は、ＣＤＲ構造を調整し、かつ抗原への適応を仕上げる残渣を含む、バーニヤゾーン（Ｚｏｎｅ  Ｖｅｒｎｉｅｒ）に属する位置で局在化される［Ｆｏｏｔｅ、１９９２］。
【０１８３】
更に、軽鎖の３６位、及び重鎖の１０３位のアミノ酸は、重鎖及び軽鎖の可変領域の間に二量体界面を形成した後に、側鎖の到達可能性の減少を示し［Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１］、それらが、Ｈ／Ｌ界面のような、抗原への結合ポケットの形状を決定するために重要であることを示唆している。
【０１８４】
他方で、１３Ｂ８．２抗体の重鎖のＨｉｓ３５、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３及びＰｈｅ１００Ｋ、並びに１３Ｂ８．２抗体の軽鎖のＴｙｒ３２、Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９２のような、抗原とおそらく直接相互に作用する、ＣＤ４を結合するＳＣＲ残渣は、溶剤に十分に到達できるとし、かつ抗原との結合後に到達可能な側鎖の表面の大きな減少を有するとして予め同定されたタンパク−抗原の接触のために臨界位置で局在化される［Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１］。
【０１８５】
可変領域の全配列の１％未満が、Ｌ８８又はＨ９２位でシステイン残渣が欠けた配列として記載された。
【０１８６】
それらは、それぞれ軽鎖のＣｙｓ２３残渣及び重鎖のＣｙｓ２２残渣により、抗体の屈曲及び熱力学的安定性を保持するように、ベータシートの間にジスルフィド架橋を形成する。
【０１８７】
システインを欠く細菌中に発現する、大部分の組み換え抗体は、抗原への結合特性において機能低下を示すが、かかる機能抗体全体は、真核細胞において記載された［Ｖｒａｎａ、１９７６］。
【０１８８】
バキュロウイルス系／昆虫細胞において発現する１３Ｂ８．２抗体のＣ８８−Ｌ及びＣ９２Ｈ突然変異Ｆａｂに関する出願人の観察は、ＣＤ４を更に認識し、かつその生物学的特性が、酵母におけるＣｙｓ欠損突然変異リゾチーム発現に関して記載されたもの［Ｔａｎｉｙａｍａ、１９９０］のような、かつシステインを欠く機能タンパクの生成に至らせる、Ｃｙｓ欠損抗体全体の発現に関して示唆される［Ｐｒｏｂａ、１９９７］ように、残留システインのグルタチオンを用いた誘導のような代わりの方法が、真核細胞発現系において生成され得るという仮定を強化することを同様に主張する。
【０１８９】
おそらく、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３領域に本質的に局在化され、かつスポット法によって同定されないその他の残渣は、ＣＤ４分子への結合に寄与し得る。
【０１９０】
１３Ｂ８．２抗体のコンピュータ利用分子模型化によって示唆されるように、重鎖のＡｓｎ９５及びＴｈｒ９９、並びに軽鎖のＡｓｎ９４残渣は、Ｃｄ４との組み換え部位中心に向かうその側鎖の方向を示している（データは示さず）。
【０１９１】
更に、それらは、抗原及びタンパクの接触位置であるとしてすでに定義されたアミノ酸の位置で局在化される［Ｈｏｎｎｅｇｅｒ、２００１］。
【０１９２】
１３Ｂ８．２抗体のＮ９５−Ｈ突然変異体を使用した予備実験は、かかる寄与を支持する論証をしている。
【０１９３】
総合して考察すると、これらの観察は、抗原との結合に関して臨界残渣をより正確に定義するように、所定の抗体の可変領域の分子模型化を、パラトープの６又は１２個のアミノ酸のペプチドのａｌａｓｃａｎスポット分析と組み合わせる必要性を強調している。
【０１９４】
抗体ＣＤ４複合体の結晶化複合体が、記載されていないが、ＣＤ４分子のドメイン１のＣＤＲ２様ドメインの相同ループに結合されるエピトープを認識する、ＯＫＴ４Ａ抗体の分子模型化により、この抗体の組み合わせ部位の研究が可能になった［Ｐｕｌｉｔｏ、１９９６］。興味深いことに、全体的配座における類似した特徴は、１３Ｂ８．２抗体及びＯＫＴ４Ａ抗体の結合ポケットの間で確かめることもできる。
【０１９５】
ＯＫＴ４Ａ抗体の重鎖の２種の帯電残渣（Ｌｙｓ９５及びＡｓｐ１００Ａ）は、１３Ｂ８．２抗体のそれぞれ重鎖及び軽鎖のＨｉｓ３５及びＨｉｓ９１に関するように、結合部位の中心を決定する。
【０１９６】
（ｉ）ＣＤ４への結合が、ｐＨ７．２で７％のみのヒスチジン残渣が正に帯電することに比べて、５０％のヒスチジン残渣が正に帯電するｐＨ６．０で（データは示さず）、１３Ｂ８．２抗体のＦａｂのインキュベーションによって増加され、（ｉｉ）１３Ｂ８．２抗体のＣＤＲ３の相同エピトープが、ＣＤ４分子の負に帯電したＧｌｕ８７及びＡｓｐ８８残渣を関与させるので、１３Ｂ８．２抗体の正に帯電した、かかる残渣の役割を強調することができる。［Ｓａｔｔｅｎｔａｕ、１９８９］は、強い静電相互作用が、１３Ｂ８．２／ＣＤ４の組み合わせ部位で非常に重要であることを示唆している。
【０１９７】
これらの残渣の下で、１３Ｂ８．２抗体に関しても、ＯＫＴ４Ａ抗体に関しても芳香族側鎖を有する残渣のクラスターが、結合に重要であるとして、寄与する。
【０１９８】
ＣＤ４への結合ポケット底部は、組み合わせ部位の適切な配座に対して臨界であり得る、１３Ｂ８．２抗体のＴｒｐ３５、Ｔｙｒ３６、Ａｒｇ３８及びＴｒｐ１０３、並びにＯＫＴ４Ａ抗体に関するＡｌａ３４、Ｌｅｕ８９、Ｓｅｒ３５及びＡｌａ５０ような、フレーム領域（フレームワーク）に本質的に属する、その他の隠された残渣に関与させる［Ｐｕｌｉｔｏ、１９９６］。
【０１９９】
１３Ｂ８．２抗体は、ＨＩＶ転写のエントリー後（ｐｏｓｔ−ｅｎｔｒｅｓ）抑制及びＴ細胞の活性化を示し［全体の検討に関しては、Ｂｒｉａｎｔら、２０００を参照］、かかる生物学的効果は、ＣＤ４分子への結合を乱す突然変異Ｆａｂ断片を使用して取り消される。
【０２００】
換言すると、これらの結果は、少なくとも、１３Ｂ８．２抗体の重鎖のＨｉｓ３５、Ａｒｇ３８、Ｔｒｐ５２、Ａｒｇ５３、Ｐｈｅ１００Ｋ及びＴｒｐ１０３、並びに１３Ｂ８．２抗体の軽鎖のＴｙｒ３２、Ｔｒｐ３５、Ｔｙｒ３６、Ｈｉｓ９１及びＴｙｒ９２残渣が、１３Ｂ８．２抗体の所望の生物学的効果を維持するために、特に臨界であることを示している。
【０２０１】
（参考文献）
2006513138.tif 000009
2006513138.tif 000010
2006513138.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】アラニンスポット走査による１３Ｂ８．２抗体のパラトープのＣＤ４への結合に寄与する残渣の決定を示す。図１Ａは、Ｋａｂａｔ番号付け（ｎｕｍｅｒｏｔａｔｉｏｎ  で  Ｋａｂａｔ）によるＣＤＲ−Ｈ２領域の４９−５７残渣及びそのそれぞれの類似ヘキサペプチドセットをアラニンによってカバーする、ペプチド１  ＧＶＩＷＲＳ及びペプチド２  ＷＲＳＧＩＴに対応する、ＣＤ４プローブによる膜の走査を示す。図１Ｂは、ＣＤＲ−Ｈ２領域の４９−５７残渣をカバーするペプチド１及び２並びにそのそれぞれのアラニン類似体のスポット反応性の定量分析を示す。各棒は、配列が示したアミノ酸の代わりにＡｌａ残渣を含むヘキサペプチドの反応性を示す。図１Ｃは、ＣＤ４分子への結合抑制率（垂直の棒）で測定した、重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲ領域の各々のスポットの寄与する残渣を示す。Ｋａｂａｔ（無地の箱）及びＩＭＧＴ（陰影をつけた箱）により行われたＣＤＲ同定を示す。
【図２】バキュロウイルスの上清からのＧタンパクに対する免疫精製後の、アラニンにより突然変異した残渣を有する組み換えＦａｂの特徴付けを示す。図２Ａは、免疫グロブリンの標準曲線と比べたＹ３６−Ｌ、Ｃ８８−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｈ３５−Ｈ、Ｗ５２−Ｈ、及びＲ５３−Ｈ突然変異のＥＬＩＳＡによる分析を示す。図２Ｂは、ペルオキシダーゼに共役した抗カッパ鎖抗体によって現れた前記Ｆａｂの５０Ｋｄａ帯域のウェスタンブロットによる分析を示す。
【図３】吸収されたＣＤ４分子に対する１３Ｂ８．２抗体の突然変異ＦａｂのＥＬＩＳＡ法により得られた結合曲線を、野生Ｆａｂ及び１Ｃ１０Ｆａｂ対照によって得られたものと比べて示し、各値は、三つ組みによる決定の平均±標準偏差を示し、かつ３つの異なる実験を表す。
【図４】１３Ｂ８．２抗体の組み換えＦａｂ対野生Ｆａｂ及び対照１Ｃ１０Ｆａｂの各々のＡ２．０１／ＣＤ４  Ｔ細胞への結合のフローサイトメトリによる分析を示す。結果は、異なる２つの実験を表す。そこに抗体の濃度を示す。
【図５】ｐｅｐ２４ペプチドにより刺激したＥＢＶ−Ｌｕ抗原を提示する細胞によって感作され、かつ１３Ｂ８．２抗体の組み換えＦａｂによって共培養された、ｐｄｂ  １０ｆ  Ｔ細胞によるＩｌ２の分泌抑制を示す。図５Ａは、１Ｃ１０対照Ｆａｂと比べた野生Ｆａｂの異なる濃度でのＩｌ２の分泌抑制の用量応答率を示す。図５Ｂは、各突然変異組み換えＦａｂに関するＩｌ２の分泌抑制率を示す（ｎｄ＝決定されず）。４５０ｎｍでの吸収度平均は、刺激しないＥＢＶ−Ｌｕを提示する細胞によって共培養されたｐｄｂ  １０Ｆ細胞に関する０．０１５から、ｐｅｐ２４ペプチドにより刺激したＥＢＶ−Ｌｕ抗体を提示する細胞によって共培養されたｐｄｂ  １０Ｆ細胞に関する１．２８まで変化する。ｐｄｂ  １０Ｆ  Ｔ細胞によるマウス抗ＣＤ３抗体（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）のインキュベーションによるＩｌ２の分泌に関する正の対照は、２．３０の吸収度を生じさせる。
【図６】１３Ｂ８．２抗体の突然変異組み換えＦａｂによるインキュベーション後に、ＨＩＶ−１ＬａｉのＬＴＲによって制御されたガラクトシダーゼの遺伝子発現抑制を示す。図６Ａは、様々な濃度の野生組み換えＦａｂの存在下で培養したＨＩＶ−１Ｌａｉウイルスにより感染したＰ４  ＨｅＬａ細胞中のベータガラクトシダーゼの遺伝子発現抑制を示す。図６Ｂは、Ｈ９１−Ｌ、Ｆ３２−Ｈ、Ｈ３５−Ｈ、Ｗ５２−Ｈ、及びＲ５３−Ｈ突然変異組み換えＦａｂの各々に関するベータガラクトシダーゼの遺伝子発現抑制を示す。４１０ｎｍでの吸収度平均は、非感染指示細胞に関する０．０１から、ＨＩＶ−１Ｌａｉウイルスにより感染した指示細胞に関する０．４０まで変化する。
【図７】相同模型化に基づく、ＡｂＭソフトウェアにより生成された１３Ｂ８．２抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の三次元模型を示す（正面図）。情報処理模型は、１３Ｂ８．２抗体のパラトープに関してスポットにより選択された寄与する各残渣に関する側鎖によるＣαトレースとして示す。  定方向突然変異誘発によって確認されるように、ＣＤ４を結合するＳＣＲ残渣は、濃灰色（赤色）で同定され、他方突然変異誘発により定義されるような、ＣＤ４への結合に関与しないものは、淡灰色（青）である。この図は、視覚化ソフトウェアＳｗｉｓｓ  ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒによって得られた。
【図８】１３Ｂ８．２抗体の突然変異Ｆａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをコードする配列を増幅するために使用する方法の概要を示す。これらの配列は、重複ＰＣＲによって得られた。
【配列表】
2006513138.tif 000012
2006513138.tif 000013
2006513138.tif 000014
2006513138.tif 000015
2006513138.tif 000016
2006513138.tif 000017
2006513138.tif 000018
2006513138.tif 000019
2006513138.tif 000020
2006513138.tif 000021
2006513138.tif 000022
2006513138.tif 000023
2006513138.tif 000024
2006513138.tif 000025
2006513138.tif 000026
2006513138.tif 000027
2006513138.tif 000028
2006513138.tif 000029
【図１】
2006513138.tif 000030
【図２】
2006513138.tif 000031
【図３】
2006513138.tif 000032
【図４】
2006513138.tif 000033
【図５】
2006513138.tif 000034
【図６】
2006513138.tif 000035
【図７】
2006513138.tif 000036
【図８】
2006513138.tif 000037
【国際調査報告】
2006513138.tif 000038
2006513138.tif 000039
2006513138.tif 000040
2006513138.tif 000041