(57)【要約】本発明は、変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む変異型タンパク質に関し、ここで、この断片は、非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）および/またはL,N-モノメチルアルギニン（LNMMA）（これはADMAよりも低い血漿レベルで存在する）に対する親和性を有し、かつ、ADMAもしくはLNMMAのシトルリンへの加水分解、シトルリンの放出、またはその両方を欠損している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む単離または精製された変異型タンパク質であって、ここで、該断片が非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）に対する親和性を有し、かつ該変異型タンパク質が該ADMAのシトルリンへの加水分解、および/またはシトルリンの放出、またはその両方を欠損している、変異型タンパク質。
【請求項２】
変異型DDAH酵素が非対称性L,N-モノメチルアルギニン（LNMMA）に対する親和性を有し、かつ該変異型タンパク質が該LNMMAのシトルリンへの加水分解、またはシトルリンの放出のいずれか、またはその両方を欠損している、請求項1に記載の変異型タンパク質。
【請求項３】
断片が野生型DDAHと比較してADMAに対する親和性が増加している、請求項1に記載の変異型タンパク質。
【請求項４】
変異型DDAHが動物細胞からの野生型DDAHに由来する、請求項1に記載の変異型タンパク質。
【請求項５】
動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項4に記載の変異型タンパク質。
【請求項６】
哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項5に記載の変異型タンパク質。
【請求項７】
ADMAに対する親和性が少なくとも約1×107M-1のKA、または10-7以下のKDを有する、請求項1に記載の変異型タンパク質。
【請求項８】
検出可能な標識をさらに含む、請求項1に記載の変異型タンパク質。
【請求項９】
検出可能な標識が光吸収剤、蛍光剤、化学発光剤、酵素、または放射性同位元素である、請求項8に記載の変異型タンパク質。
【請求項１０】
生物学的試料を変異型タンパク質と接触させる工程、および該変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程を包む、生物学的試料中のADMAのレベルを決定するための方法であって、ここで変異型タンパク質が変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む、単離または精製された変異型タンパク質であり、該断片が非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）に対する親和性を有し、かつ該変異型タンパク質が該ADMAのシトルリンへの加水分解、および/またはシトルリンの放出、またはその両方を欠損している、方法。
【請求項１１】
生物学的試料中のADMAが検出可能な標識で標識される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能な標識が光吸収剤、蛍光剤、化学発光剤、酵素、または放射性同位元素である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程が蛍光イムノアッセイ法を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程が酵素イムノアッセイ法を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
変異体タンパク質が検出可能な標識で標識される、請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
検出可能な標識が光吸収剤、蛍光剤、化学発光剤、酵素、または放射性同位元素である、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程が蛍光イムノアッセイ法を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程が酵素イムノアッセイ法を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的試料を請求項7に記載の変異型タンパク質と接触させる工程、および該変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程を包む、生物学的試料中のADMAのレベルを決定するための方法。
【請求項２０】
変異型タンパク質が、蛍光剤および酵素からなる群より選択される検出可能な標識に結合される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
変異型タンパク質に結合する分子が固体表面に結合し、かつ該変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程が該表面に結合する標識の量を検出することを包む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
変異型DDAH酵素が非対称性L,N-モノメチルアルギニン（LNMMA）に対する親和性を有し、かつ該変異型タンパク質がLNMMAのシトルリンへの加水分解、またはシトルリンの放出、またはその両方を欠損している、請求項10に記載の方法。
【請求項２３】
生物学的試料中のADMAの量をアッセイするための、変異型タンパク質および少なくとも1つの試薬を含むキットであって、ここで、該変異型タンパク質が変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む単離または精製された変異型タンパク質であり、該断片が非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）に対する親和性を有し、かつ該変異型タンパク質が該ADMAのシトルリンへの加水分解、および/またはシトルリンの放出、またはその両方を欠損している、キット。
【請求項２４】
抗（変異型タンパク質）抗体をさらに含む、請求項23に記載のキット。
【請求項２５】
検出可能な標識をさらに含む、請求項23に記載のキット。
【請求項２６】
標識が蛍光剤および酵素からなる群より選択される、請求項25に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
政府の権利に関する言及
本発明の開発中に行われた作業の一部は米国政府の助成金を使用した。米国政府は本明細書中に記載される発明に対して一定の権利を有する。
【０００２】
関連特許出願の相互参照
本願は、2003年5月31日に出願された米国仮出願番号60/384,077の恩典を主張する。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は、変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む変異型タンパク質に関し、ここで、上記断片は非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）に対する親和性を有し、かつ上記断片はADMAのシトルリンへの加水分解、および/または遊離シトルリンの放出を欠損している。そのアッセイ法はまた、L,N-モノメチルアルギニン（LNMMA）（これはADMAよりも低い血漿レベルで存在する）を検出するために有用である。
【０００４】
発明の背景
アテローム性動脈硬化症は、米国において、冠状動脈疾患および脳内血管発作に起因する障害の主要な要因でありかつ年間500,000件の死亡の原因である。一酸化窒素（NO）はアテローム性動脈硬化症（単球接着、血小板凝集、血管平滑筋増殖）を促進する鍵となる多くのプロセスに対して阻害効果を有するので、血管NO産生の慢性的な増強はアテローム性動脈硬化症の阻害または予防において有用であることが分かり得る。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症は、高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病、タバコの使用、リポタンパク質（a）（「Lp(a)」）レベルおよびホモシステインレベルの上昇によって加速される。これらの障害のすべては、アテローム性動脈硬化症の任意の臨床的徴候が存在する以前に、ヒトにおいて内皮血管拡張の機能不全によって十分に特徴付けられている（CookeおよびDzau、1997）。これらの条件のすべてにおいて、異常は、一酸化窒素合成（NOS）経路の摂動に大部分起因するようである。これらの条件の大部分において、心臓血管の異常は、NOSが代謝を行ってシトルリンおよびNOを産生する、NO前駆体であるL-アルギニンを投与することによって逆転されるかまたは改善される（CookeおよびDzau、1997）。
【０００６】
ADMA（非対称性ジメチルアルギニン）およびLNMMAはNOSのためのL-アルギニンの内因性競合的アンタゴニストである。LNMMAおよびADMAはNOSの阻害剤として等しい効力を有するようであるが、LNMMAはADMAよりもより低い血漿レベルで存在する。従って、大部分の研究の試みは、ADMAの測定に向けられてきた。上昇したレベルのADMAが、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症を有する患者において見い出されてきた（Bode-Bogerら、1996；YuおよびXiong、1994）；そして血漿ADMAレベルは、尿毒症ラットおよび腎不全を有する患者において、正常値から5〜10倍上昇する（Valianceら、1992a,b）。
【０００７】
アテローム性動脈硬化症の加速に関連する実質的にすべてのリスク要因もまた、ADMAの上昇と関連して、内皮由来のNOの合成および/または活性を弱めることが知られている。ADMAは、内皮血管拡張の機能不全の重要な決定要因であり得、かつ潜在的には、アテローム性動脈硬化症を検出するための重要で新規なリスク要因であり得る。最近、ADMAが心臓血管の死滅の独立した予測指標であることが報告されている。
【０００８】
血液、血漿、および尿のような生理学的液体中でADMAを検出するための現在の方法には、抽出、化学的誘導体化、逆相HPLCによる単離、IC-質量分析法、および蛍光発光が挙げられるが、他の方法もまた利用し得る（Chenら、1997）。しかし、生物学的試料中のADMAおよびLNMMAの測定は、アッセイ法において類似の振る舞いおよび/または交差反応性を示す、2つの密接に関連する化合物、すなわち、アルギニンおよび対称性ジメチルアルギニン（SDMA）の存在によって複雑化されている。ADMAは、1つのグアジニオ窒素上の2つのメチル基のみがアルギニンと異なっている（図1を参照されたい）。さらに、アルギニンの濃度は、正常なヒト血清中のADMAの濃度の約100倍である。SDMAは、アルギニンよりもADMAにより類似しており、1つのメチル基の位置でのみ異なる。正常なヒト血清中では、SDMAの濃度はADMAの濃度と比較され得、約1μMである。
【０００９】
従って、ADMAまたはLNMMAと競合する交差反応性の物質からの干渉を伴わずに、生物学的試料中でADMAおよびLNMMAを正確に測定するアッセイ法を開発する必要性が存在する。循環しているNOシンターゼ阻害剤の正確な測定は、アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管障害の早期検出および処置における価値のあるツールである。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む変異型タンパク質に関し、ここで、この断片は、非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）に対する親和性を有し、かつ、ADMAのシトルリンへの加水分解、および/または遊離シトルリンの放出を欠損している。いくつかの態様において、本発明は、LNMMAに対するその親和性およびその代謝に関して、同じ特性を有する。本発明はまた、生物学的試料中におけるADMAおよびLNMMAを検出する方法、ならびにそれに使用するキットに関する。
【００１１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、変異型ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（DDAH）酵素の少なくとも断片を含む変異型タンパク質を提供し、ここで、この断片は、非対称性N,N-ジメチルアルギニン（ADMA）に対する親和性を有し、かつ、ADMAのシトルリンへの加水分解、および/または遊離シトルリンの放出を欠損している。
【００１２】
DDAH酵素は、ADMAおよび/またはN-モノメチルアルギニン（NMMA）に結合し、かつL-シトルリンに加水分解する亜鉛（II）含有酵素である。従って、この酵素は、ADMAおよびNMMAが一酸化窒素シンターゼに対して有する阻害特性を不活性化する。さらに、野生型DDAH酵素もまた、多くの酵素に共通しているCys-His-Glu触媒三つ組成分を含む。最近、DDAHの特徴付により、それが機能的に独立している触媒部位を有するダイマーであることを明らかになった（Murray-Rust Jら、Nat Struct Biol. 8(8):679-83 (2001)）。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、タンパク質という用語は、成熟した全長タンパク質、プロセシングされていないタンパク質（例えば、シグナル配列を含む）、またはそれらの任意の断片もしくは部分を意味するために使用される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、タンパク質の断片は、全長タンパク質からの任意の部分またはセグメントからの、少なくとも10個の連続するアミノ酸を意味するために使用される。1つの態様において、その断片は少なくとも20個の連続するアミノ酸である。他の態様において、その断片は、少なくとも25、30、40、または50個の連続するアミノ酸である。現在の文脈において予見されるように、その断片は完全長の成熟タンパク質全体からアミノ酸を1つ引いたものであり得る。その断片はまた、別のタンパク質の一部であり得る。これは、別のタンパク質または分子（例えば、アミノ酸、核酸、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、ポリマー、または化学物質）に融合または結合され得る。この断片は融合タンパク質の一部であり得るか、または別のタンパク質に移植され得る。さらに、任意の数のアミノ酸が断片のいずれかの末端に付加され得る。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、変異型タンパク質という語句は、野生型タンパク質のすべての特性を有しないか、または、野生型タンパク質よりもより高いかもしくはより低い程度まで機能するタンパク質を意味する。例えば、その変異体は、野生型と比較して特定の機能を欠損してもよく、またはその変異体は、野生型と比較して、同じ機能を遂行するための、増加または増強された能力または性能を有し得る。野生型DDAHタンパク質または断片における任意の数のアミノ酸の変異事象（例えば、欠失、付加、変化、または置換など）の生成物は、本明細書中に記載されるように、この変異事象がDDAHまたは断片の特性または機能の変化に関連していない限りは、本明細書中において使用される場合のDDAHの変異体として必ずしも適格ではない。この変異型タンパク質または断片は複数の特性または機能についての変異体であり得る。変異体はまた、このタンパク質が、野生型と比較して、付加的または異なる特性を有することを意味し得る。さらに、この変異体は、全長タンパク質である必要はないが、これはまた、例えば、対応する野生型断片のすべての特性を有するわけではないか、または、対応する野生型断片と同じ程度までの機能を実行する断片であり得る。例えば、本発明の変異型DDAH断片は、ADMAの加水分解に寄与するDDAHの対応する野生型断片（触媒部分または触媒部位）と比較して、ADMAのシトルリンへの加水分解を欠損している。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「変異型DDAH」とは、全長変異型DDAHタンパク質または変異型DDAHタンパク質の断片を意味し得る。
【００１７】
変異型DDAH酵素は、ADMAまたはLNMMAの結合および代謝を担うドメインにおいて、野生型酵素の配列の少なくとも80％であるアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも85％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも90％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも95％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも96％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも97％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも98％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の少なくとも99％である。いくつかの態様において、変異型DDAH酵素配列同一性は、野生型酵素の配列の100％である。
【００１８】
配列同一性は任意の方法によって決定され得る。2つのアミノ酸配列間の違いは、参照アミノ酸配列のC末端位置またはN末端位置、または参照配列中もしくは参照配列内の1つまたは複数の隣接するグループ中のアミノ酸間でいずれか個々に分散した、これらの末端位置間の任意の場所に存在し得る。
【００１９】
実際問題として、任意の特定のアミノ酸分子が、少なくとも参照アミノ酸配列と所定の割合で同一であるか否かは、手動または機械によって、標準的なアルゴリズムを使用して2つの分子間で作成される比較を参照する。アルゴリズムは当技術分野において周知であり、BLASTファミリーアルゴリズムのような公的に利用可能なコンピュータアルゴリズムを使用して慣用的に決定され得る（Altschulら、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）。
【００２０】
ポリペプチド配列の類似性はBLASTPアルゴリズムを使用して調べられ得る。BLASTPプログラムは、/blast/executablesの下でNCBIの匿名のFTPサーバー（ftp://ncbi.nlm.nih.gov）上で、および、National Center for Biotechnology Information (NCBI) National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894, USAから利用可能である。BLASTPアルゴリズムは、本発明に従うポリペプチド配列同一性を決定するために使用され得る。BLASTPを含む、BLASTファミリーアルゴリズムは、URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.htmlであるNCBIのインターネットウェブサイトに記載されており、コンピューターアルゴリズムFASTAの公布は、インターネット上のftpサイト、ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta/で、およびDavid Hudson, Assistance Provost for Research, University of Virginia, PO Box 9025, Charlottesville, VAに連絡することによってバージニア大学から利用可能である。バージョン2.0u4［1996年2月］（PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988；ならびにPearson、Methods in Enzymol. 183:63-98, 1990）。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対する特定の割合の同一性を有するのに加えて、改変体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共通した、さらなる構造および/または機能的特徴を有する。本発明のポリペプチドに対する特定の程度の同一性を有するポリペプチドは、それらの一次構造において高い程度の類似性を共有し、かつ実質的に類似の機能的特性を有する。本発明のポリヌクレオチドに対してそれらの一次構造において高い程度の類似性を共有することに加えて、本発明のポリヌクレオチドに対し特定の程度の同一性を有するか、またはそれに対してハイブリダイズし得るポリヌクレオチドは、好ましくは、以下の特徴の少なくとも1つを有する：（i）これらは、翻訳されたときに本発明のポリヌクレオチドと実質的に同じ機能的特性を有するポリペプチドを提供するオープンリーディングフレームまたは部分的オープンリーディングフレームを含む遺伝子によってコードされている；または（ii）これらは共通したドメインを有する。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、ADMAを加水分解するDDAHの能力の欠損は、部分的または完全であり得る。1つの態様において、変異型DDAHは、それが任意の測定可能な程度にまでADMAを加水分解しないようにADMAの加水分解において完全に欠損している。この欠損は、試料がDDAHまたはその断片に曝露される後に、酵素的加水分解のための適切な条件下で、インビトロ、インビボ、またはインサイチューのいずれかで、試料中のシトルリンのレベルまたは濃度を測定することによって（標準的な比色分析アッセイ法を使用して）決定され得る。代替的には、既知量のADMAは変異型DDAHを含む溶液に付加され得、時間に対するADMAの減少がHPLCまたはキャピラリー電気泳動によって測定される。
【００２３】
一般的に、酵素が反応を触媒する能力は、当技術分野において周知の方法によってMichaelis定数（Km）によって判断される。小さなKmは、その酵素が、低い基質濃度において（反応を触媒する）最大反応速度の半分を達成し得ることを意味し、これは、効率的な、または迅速な酵素であることを示す。Kmがより高ければ、より低いKmを有する酵素と比較して、より欠損性である（すなわち、より非効率的）酵素が触媒反応中に存在する。例として、酵素A（1×10-2MのKmを有する）が酵素B（1×10-５MのKmを有する）よりも高いKm値を有するならば、酵素Aは、同じ条件下で（例えば、温度、pHなど）、同じ反応を触媒する際に、酵素Bよりも1000倍より欠損性である。
【００２４】
ADMAセンサーとしてのDDAHの限界は、SDMAに対する結合親和性が低いこと、すなわちKM＞100μMが高いこと、および、分析物の加水分解の生成物が放出されることの2つのみである。しかし、これらの限界の両方は、少なくとも2つのメカニズムのうちの1つによって、単一の工学的段階において緩和され得る。
【００２５】
DDAHを変異誘発させること、ファージ表面上の変異体ライブラリーをディスプレイすること、ならびに可溶性アルギニンおよびSDMAの存在下での固定化ADMAに対するパニングによって、ADMAに対してより高度な特異的親和性を有するDDAH変異体が得られ得る。このような改変体は、ADMAに対する親和性を直接的に増加させる変異、または反応生成物であるシトルリンの放出を妨害する変異によって、より高い親和性を有するはずである。基質親和性を増加させる変異は、典型的には、遷移状態親和性を犠牲にして基質親和性を増加させ、これにより酵素の触媒速度を減少させる。
【００２６】
代替的には、変異は、生成物の解離をブロックし得る。反応中間体は、基質のグアニジノ炭素を介する酵素のCys249上の共有結合チオエーテル付加物であるので、水は、生成物が遊離し得る前にこの付加物を加水分解するために必要であると言われている（Murray-Rustら、2001、Nature Structural Biology 8:679-683）。それゆえに、変異は、活性部位への水の接近をブロックし得るか、または活性部位ポケットからの生成物シトルリンの拡散を立体的にブロックし得るかのいずれかである。たとえ後者の型の変異がそれ自体は必ずしも加水分解を妨害するとは限らないとしても、いずれの方法も分析物が検出のために有用な方法において酵素によって保持される。
【００２７】
遊離のADMAに対する高い親和性を有するが、アルギニンまたはSDMAに対しては低い親和性を有する（または親和性が存在しない）変異型DDAHタンパク質の選択を補助するために、標準的なパニング（強制的進化）ストラテジーを修飾することが一助となり得る。例えば、可溶性アルギニンおよびSDMAが、これらの化合物に対して高い親和性を有する変異型DDAHを固定化ADMAへの結合から阻害するためにファージ懸濁物に付加され得る。
【００２８】
本発明の変異型DDAHは、すべてではないにしても、少なくともいくつかのADMAに対する親和性を有する。本発明の変異型DDAHはまた、野生型DDAHと比較して、ADMAに対する親和性の増加を有し得る。1つの態様において、変異型DDAHは野生型DDAHと同じ、ADMAに対する親和性を保持する。別の態様において、変異型DDAHは、野生型DDAHと比較して、ADMAに対する増加した親和性を有する。
【００２９】
一般的に、酵素（DDAH）のその基質（ADMA）に対する親和性は、その基質に関する酵素のMichaelis定数（KM）を測定することによって決定され得る。KMを測定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、KMは、LehningerまたはAbeles、Frey、およびJencksのような任意の一般的な生化学の教科書において記載されているように、Lineweaver-BurkeプロットまたはHofstee-Eadieプロットから計算され得る。KD、平衡解離定数は、種々の方法、例えば、競合抗体捕捉ELISA（HarlowおよびLane、Antibodies A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor）によって測定され得る。この方法において、例えば、ハプテン化ADMAは、固体支持体上に固定化され、および、標識されたかまたはタグ化された変異型DDAHの懸濁物で平衡化される。結合していない物質は洗い流され、そして結合したDDAHが定量される。この手順が、懸濁物中の競合する増加量のADMAを用いて反復される場合、DDAH結合は、ADMA濃度およびKDに比例する量で減少される。DDAH濃度がKDの10％以下である場合、バックグラウンド補正したシグナルが50％減少する遊離のADMAの濃度がKDに等しい。
【００３０】
KD値と同様に、酵素のその基質に対する親和性は、KM値が減少するにつれて増加する。KM値がより高くなるにつれて、酵素およびその基質の親和性は互いに向かってより低くなる。例として、酵素A（1×10-4MのKMを有する）が酵素B（1×10-７MのKMを有する）よりも高いKM値を有するならば、酵素Bは、同じ基質に対して、酵素Aのそれよりも1000倍高い親和性を有する。いくつかの態様において、変異型DDAHは10-7Mより高くない平衡解離定数（KD）を有する。
【００３１】
KDは、解離速度定数および結合速度定数の比、それぞれkD/kAである。kAは絶対に簡単に104-105M-1秒-1を超えないので、この仮定の下ではkDは高くても10-2-10-3秒-1であるはずである。これは、野生型酵素の推定のkCATよりも104-106倍低い。kCATのこの減少を達成するために、変異がこの量によって加水分解の速度を減少させ得るか、またはこの量によって生成物の解離速度を減少させる得るか、またはその2つの組み合わせのいずれかであり得る。例えば、1つの変異が基質親和性を増加、すなわち、KMを減少させ得、および、これが基質kAに対する変異の効果に逆比例する因子による加水分解速度を減少させる。すなわち、kAが影響されないならば、加水分解速度はKMと同じ量で減少されるが、kAが増加されるならば、加水分解速度は比例的により少ない量で減少される。他の変異は生成物の解離を阻害し得、そしてこの効果はKMを減少させる任意の変異と相加的である。
【００３２】
1つの態様において、変異型DDAHまたはその断片、およびADMAのKDは、少なくとも約1×10-7Mである。別の態様において、変異型DDAHは、野生型DDAHのそれよりもSDMAに対してより低い親和性を有する。
【００３３】
本発明の変異型DDAHは、動物細胞中に見い出される野生型DDAHから誘導され得る。好ましくは、その動物細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、その動物細胞はヒト細胞である。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、誘導されるとは、野生型DDAHアミノ酸配列からの変異型DDAHアミノ酸配列を入手または単離および精製するために使用される任意の技術を意味するために使用される。誘導化の例には、野生型DDAHをコードするDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を介する部位特異的変異誘発、およびDNA複製が起こる間の、既知の化学的突然変異原または放射線を使用することによるランダム変異誘発が含まれるがこれらに限定されない。この誘導化はまた、それらの結合特性を変化させるための、関連するタンパク質の「強制的進化」のような標準的なバクテリオファージディスプレイ技術（ファージディスプレイ）を利用し得る。さらに、誤りがちなPCRが、CadwellおよびJoyce、PCR Primer A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler編、1995、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY、583-590頁によって記載されているように、変異誘発のために使用され得る。ファージディスプレイ技術は、Phase Display of Peptide and Proteins A Laboratory Manual、Kay,Winter,and McCafferty編、1996、Academic Press, San Diegoに記載されている。誘導化は実験的操作の結果である必要はないが、本発明の列挙する特性を有する天然に存在するDDAHの変異体の発見ならびに引き続く単離および精製であってもよい。
【００３５】
単離または精製されるとは、タンパク質または他の分子がその天然の環境から取り除かれていることを意味する。タンパク質または他の分子が操作され（またはその環境が操作され）、その結果それがもはやその天然の環境ではない限り、精製は100％である必要はない。
【００３６】
1つの態様において、本発明の変異型タンパク質は検出可能な標識を含む。別の態様において、変異型タンパク質および標識は、1つまたは複数の結合分子または化合物を介して互いに結合体化される。当技術分野で周知である検出可能な標識の例には、酵素、蛍光剤、化学発光剤、放射性同位元素、および粒子が含まれるがこれらに限定されない。これらは不透明もしくは透明であり得るか、または他の標識と結合体化され得る。
【００３７】
本発明はまた、生物学的試料中のADMAのレベルを決定するための方法を提供し、この方法は、生物学的試料を、変異型DDAHタンパク質またはその断片と接触させる工程、および、この変異型タンパク質に結合するADMAの量をアッセイする工程を包含する。1つの態様において、この生物学的試料は検出可能な標識で標識されている。別の態様において、この変異型タンパク質は検出可能な標識で標識されている。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、生物学的試料は、組織、器官、または体液の全体または一部における、任意の試料を意味し得る。本発明の方法は、インビボ、インビトロ、またはインサイチューの環境で利用され得る。試料の例には、全血もしくはその任意の部分、尿、唾液、胃液、脳脊髄液、胆汁、器官、もしくはそれらの任意の部分、血管もしくはその一部、筋肉組織、神経組織、ならびに悪性および良性の腫瘍組織が含まれるがこれらに限定されない。さらに、その試料はまた、生物学的試料から単離された個々の細胞および細胞培養物を含む。細胞および細胞培養物には、一次細胞培養物、ならびに一次細胞培養物の任意の引き続く継代物が含まれる。
【００３９】
さらに、生物学的試料は、試料の性質およびアッセイ法の性質に依存して、本発明の方法に先立って、処理、保存、濃縮、希釈、操作（例えば、pH調整、バッファー添加）、または変化（例えば、粒子沈殿除去）され得る。例えば、抗凝固因子を全血に付加してもよく、または代替的には、赤血球を除去してもよく、その血液をクエン酸添加またはヘパリン化してもよい。次いで、未処理または処理した試料を、アッセイ法のために適切な他の試薬と合わせるか、または必要に応じてインキュベートしてもよく、次いで、アッセイされる。
【００４０】
変異型DDAHタンパク質に結合したADMAの相対的または絶対的なレベルを正確に測定する任意のアッセイ法が本発明の文脈において使用され得る。これらのアッセイ法はアッセイ法上でモデル化され得、ここで、ADMAまたはDDAHが、それぞれ利用可能な分析物または結合タンパク質で置換される。これらのアッセイ法には、分光光度的検出、蛍光定量的検出、視覚的検出、および放射能の検出が含まれるがこれらに限定されず、市販されている広範な種々の試薬のいずれかを使用し得るか、または文献に記載されている方法論に沿って開発され得る。
【００４１】
種々の試薬を使用して、イムノアッセイ法のための種々のプロトコールが利用され得る。例として、ADMAの模倣物（変異型DDAHタンパク質への結合についてADMAと競合する化合物）と生物学的試料中の任意のADMAとの間の競合、および引き続くADMA模倣物に結合する変異型DDAHタンパク質量の測定が挙げられる。これは、媒体から分離され得る、例えば、容器のウェルまたはマイクロタイタープレートまたは粒子のような固体表面に結合するADMA模倣物を有することによって達成され得る。
【００４２】
チャネリングを使用してもよく、それによって2つの結合タンパク質を一緒に提示し、異なるシグナルを得る。例えば、蛍光エネルギー移動プロトコールはポリエピトープ性試薬を使用し、これは、ADMAと競合性である少なくとも2つのエピトープおよび2つの異なる変異型DDAHタンパク質を有し、1つはドナーとして働く蛍光剤を有し、および1つはレシーバーとして働く蛍光剤を有する。これらの2つの異なる変異型タンパク質がポリエピトープ性試薬に結合する場合、エネルギー移動が起こり、その結果、ドナーを励起させるための励起光を使用することによって測定可能な波長の光が放射される。
【００４３】
変異型タンパク質および結合したADMAによって形成された複合体に対して指向される抗体は、試料中のADMAの検出に対する別のアプローチである。次いで、この抗体は、ELISAまたは逆ELISA技術に共通の標準的な技術を使用して検出され得る。1つの種類または別の種類の酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）は、体液中の分析物の検出および測定のために25年以上の間、広範に使用されてきた（HarlowおよびLane、1988）。それらの原理的な利点は、比類なき親和性および分析物タギングのためのモノクローナル抗体（mAb）の特異性、ならびにシグナル増幅のための酵素の比類なき触媒能力に由来する。より最近、イムノアッセイ法のレパートリーは、改善された反応速度論および感度を有する、ELISAよりもより少ない工程で処理され得る均質な溶液相アッセイ様式の開発によって拡張されてきた（Kopetzkiら、1994；Cotyら、1994；Hendersonら,1986）。
【００４４】
従来的なELISAにおいて、ハプテン化された変異型DDAHがマイクロタイタープレートウェルの表面上に固定化される（HarlowおよびLane、1988）。例えば、ADMAは、固定化されたハプテンへの結合によって溶液から吸着され得、洗浄後、結合したADMAが二次抗体-酵素結合体を結合することによって検出される。この結合体は、発色性基質と反応し、結合したADMAの量に比例するシグナルを産生する。
【００４５】
蛍光偏光イムノアッセイ法（FPIA）は、低分子分析物のための別の均質な溶液相イムノアッセイ法であり、これは、陽性シグナルが競合によって生成されるという独特の利点を有する。FPIAは、直線偏光によって励起されたときの放射光の偏光として、変異型DDAH結合の蛍光標識リガンドと遊離の蛍光標識リガンドとの間の差異を検出する。低分子リガンドは、励起状態の間あまりに速く転落するため放射光がほぼ等方性であるのに対し、より大きな変異型DDAH結合リガンドは励起状態の間ほとんど全く回転せず、それゆえ高度に偏光した、または異方性の光を放射する。分析物は、変異型DDAHへの結合について標識と競合するその能力によって測定され、それにより、放射光の偏光を低くし、入射光に対して特定の角度でその強度を増加する。感度は、変異型DDAH親和性および結合リガンドと遊離リガンドとの間のサイズの違いの関数である。ナノモル濃度親和性および遊離の分析物と変異型DDAH結合分析物との間のより大きなサイズの違いによって、ピコモル濃度以下の濃度が検出可能であり得る。ADMAは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）のような蛍光団の活性化誘導体を用いたADMAの遊離の一級アミノ基の反応によって、フルオロセインのような多くの蛍光団に結合体化され得る。遊離のADMAは、変異型DDAHへの結合について、フルオレセイン-ADMAと競合するその濃度依存的な能力の関数として測定され、それにより偏光放射を減少させる。
【００４６】
本発明者らの変異型DDAHとともに使用され得るさらなるイムノアッセイ形式には、ラジオイムノアッセイ法（RIA；Lauritzenら、1994）、クローン化酵素ドナーイムノアッセイ法（CEDIA；Cotyら、1994）、生体分子相互作用分析（BIA；Fagerstamら、1992）および蛍光共鳴エネルギー移動イムノアッセイ法（FRET；Younら、1995）が含まれるがこれらに限定されない。ELISAと同様に、小さな一価分子のための大部分のイムノアッセイ法は競合阻害アッセイ法であり、そこでは試料分析物が変異型DDAHへの結合について標識したリガンドと競合する。RIAにおいてはリガンドは放射性である。CEDIAにおいては、リガンドはβ-ガラクトシダーゼのα-断片に結合体化され、その結果、変異型DDAH結合が酵素活性を阻害する。従って、試料分析物による変異型DDAH-リガンド相互作用の競合的阻害は、色素原性酵素活性の増加を生じる。FRETイムノアッセイ法においては、リガンドは蛍光団で標識され、この蛍光団は、両方が密接した近接位置にあるときにのみ、変異型DDAHに結合した蛍光団に検出可能にそのエネルギーを移動し得る。BIAは、結合の競合的阻害によってアッセイするのではないが、むしろ、表面プラズモン共鳴と呼ばれる現象を使用して、固定化されたDDAHを用いて試料分析物の相互作用を直接的にモニタリングし、それによって、抗体-結合表面での屈折率が、分析物が変異型DDAHに結合するときに検出可能に変化される。
【００４７】
都合がよければ、このアッセイ法は、蛍光発色セルソーターを使用してもよく、蛍光粒子を使用してもよい。このアッセイ法は、存在するADMAの量と関係する計数された蛍光粒子の量を提供する。例えば、蛍光標識された変異型DDAHに対する、ADMAが結合体化した粒子と試料中のADMAとの間の競合アッセイ法を有することによって、粒子が蛍光変異型DDAHで標識される程度が試料中のADMAの量に比例する。次いで、対照の値と比較して、試料を用いて計数される蛍光粒子の数を比較する。
【００４８】
以下の表は、本発明において使用可能な種々のアッセイ法をまとめたものである。
2006505245.tif 000002
1. 競合物は固定化抗原であり、結合標識は分析物に逆比例する。
2. 蛍光標識の偏光は分析物に逆比例する。
3. ドナーの蛍光は比例的な分析物であり、選択的なアクセプターの蛍光は逆比例的な分析物である。
4. 競合物は酵素-分析物結合体である。遊離の競合物のみが活性であり、分析物に比例する。
5. 分析物保護された酵素イムノアッセイ法；分析物に結合した酵素-抗体融合物のみが活性である。Panorama Research, Inc., Mountain View, CAより入手可能。
6. 生体分子干渉分析。
【００４９】
本発明の方法はまた、変異型DDAHに結合する、抗体のような分子を利用する工程を包含する。DDAH特異的分子が、マイクロタイタープレートのような固体表面に結合され、生物学的試料中のADMAの量をアッセイする工程は、表面結合DDAH特異的分子に結合する標識された変異型DDAHの量を検出することを包含する。
【００５０】
本発明はまた、生物学的試料中のADMAの量をアッセイするためのキットを提供し、これは、変異型DDAHおよび少なくとも1つの試薬を含む。生物学的試料中のADMAの量を検出するために有用な任意の試薬がこのキット中に含まれ得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、試薬はまた、アッセイ法を実行する際に有用なツール（例えば、シリンジ）、補充品（例えば、マイクロタイタープレート）、または装置を含み得る。試薬の例には、抗体、アンタゴニスト（競合的または非競合的）、アゴニスト、結合体、比色分子または溶液、酵素、二次メッセンジャー、放射性同位元素、溶液、シリンジ、マイクロタイタープレート、および凍結乾燥された化合物が含まれるがこれらに限定されない。他の態様において、このキットは、抗（変異型タンパク質）抗体および検出可能な標識を含む。
【００５２】
本発明の方法およびキットにおいて利用される抗体は、任意の便利な供給源（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウマ、齧歯類など）からの抗血清であり得、ここで、その抗血清は、変異型DDAHまたは変異型DDAHおよびADMAによって形成された複合体に強力に結合する抗体を選び出すことによって精製され得る。抗体の産生のための免疫原は、α-アミノ基またはカルボキシル基で変異型DDAHを結合体化することによって調製され得る。特に後者の場合においては、抗原への結合のためのリンカーを使用する。抗血清の代わりに、モノクローナル抗体が、組換え方法を含む公知の方法に従って産生され得る。特に、マウスを使用する場合、そのマウスはDDAH結合体で免疫され得、脾細胞が単離および不死化され、次いで変異型DDAHに対する親和性について、およびおそらく、さらなる特性についてスクリーニングされる。関心対象のクローンは、拡大および増殖され得、または抗DDAH重鎖および抗DDAH軽鎖を発現する遺伝子は、適切な宿主細胞または宿主中での発現について、単離および操作され得る。実際に、以下に記載されるように、その遺伝子はさらに結合親和性を増強するために変異され得る。
【００５３】
実施例
1. ADMAに対して高度な特異的親和性を有するDDAH変異体の単離
変異型DDAHタンパク質または断片のための供給源として、内皮細胞（DDAH2アイソフォーム）または神経細胞（DDAH1アイソフォーム）からクローニングされたDDAHのバクテリオファージディスプレイライブラリーを使用し得る。ヒトDDAH酵素は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって、ヒトDDAHをコードする5'配列および3'配列を含む縮重プライマーを使用して、これらの培養細胞から単離されたRNAから増幅される。次いで、このDDAHコード配列は、ファージのマイナーなコートタンパク質（gIIIp）のアミノ末端に融合したDDAHとしての、大腸菌ヘリプラズム中での発現のためにファージミドベクターにライゲーションされる。次いで、DDAH配列の変異誘発は、CadwellおよびJoyce、PCR Primer A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler編、1995、Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY、583-590頁によって記載されている、誤りがちなPCRによって達成される。この手順は、クローンあたり平均〜1.5変異を産生し得る。変異誘発された配列は、ファージ発現ベクターに再度ライゲーションされ、少なくとも1000万クローンが収集されて、すべての可能な2ヒット変異体がこのライブラリー中で表されることを確証する。
【００５４】
発現産物中でのDDAHとgIIIpとの間で、3つのさらなるエレメントがベクターによってコードされる：（1）抗エピトープ抗体によるELISA検出のための12残基エピトープタグ（c-myc）、（2）アフィニティークロマトグラフィーによる精製のための6-ヒスチジンタグ、および（3）サブクローニングの必要性を伴わない、非抑制性宿主中での遊離のDDAH断片産生のための抑制性終止コドン（アンバー）。ファージライブラリーは、ヘルパーファージを用いて、DDAH-gIIIp融合物を発現する大腸菌株TGI細胞（アンバー抑制性宿主）の定量的感染によって調製される。このヘルパーファージは、本質的に、抗生物質耐性遺伝子を含む野生型ファージである。感染された細胞によって産生されるファージ粒子は、それらの表面上にDDAH変異体を、および内部にDDAH-変異体をコードするファージミドを含む。使用されるライブラリーは、一般的に、〜4×1010の独立したDDAH変異体クローンを表すファージからなる。
【００５５】
ファージは、確立された手順（McCaffertyおよびJohnson、1996；McCafferty、1996）に従って固定化されたADMAに対してパニングされる。ADMAは、スベリン酸リンカーを介して、ウシ血清アルブミン（BSA）上の露出したリジンのα-アミノ基からεアミノ基までを通して結合体化され、この結合体は、ポリスチレン表面上に固定化される。パニング手順において、〜1013ファージ粒子を含む懸濁物が、結合平衡を可能にするために、1〜2時間、固定化されたADMA結合体に曝露される。この懸濁物は、これらのADMAアナログに対して高い親和性を有するDDAH断片の捕捉を阻害するために、約10μMのアルギニンおよび100nMのSDMAを含むべきである。これらの濃度は、所望のKD（例えば、10-8M）を有する変異型DDAH断片またはタンパク質のための区別の所望のレベルに基づいて選択される。結合したファージは洗浄され、トリエチルアミンで溶出される。第1のラウンドから、約6.5×105ファージが回収され得、次いでこれは、大腸菌株TGIに戻されて〜1013まで増幅され、そしてさらに2回のラウンドのパニング（すなわち、結合、洗浄、溶出、および増幅）に供せられる。最終ラウンドのパニングから1.6×1010ファージが回収される。このファージ集団のアリコートを使用して、大腸菌株HB2151に感染させる。この株は、DDAHとgIIIpとの間のアンバー終止コドンを抑制しない。それゆえに、このDDAH変異体は、gIIIpドメインなしで細菌ペリプラズム中で可溶性型で発現される。
【００５６】
クローンからの遊離のDDAH変異体は、固定化されたADMA-スベリン酸-BSA結合体上のELISAによってスクリーニングされる。
【００５７】
さらなる特徴付けおよび臨床的アッセイ法における使用のために、DDAH変異体は、クローンの大規模スケール細菌培養の上清から精製され得る。限外濾過が使用されて濃度を約40倍増加させ、および細菌増殖培地をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で置き換える。次いで、DDAH変異体は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを使用して（IMAC；Janknechtら、1991）、発現ベクターによってコードされる各変異体のカルボキシ末端における6-ヒスチジンタグを使用してアフィニティー精製される。
【００５８】
次いで、精製されたDDAH変異体はELISAの成績について再試験され、および条件が最適化される。マイクロタイターウェルが1μgのADMA-スベリン酸-BSAでコートされる場合、1×10-9M変異型DDAHは、抗-myc-タグマウス抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化（HRP）ウサギ抗マウス抗体、およびABTS（HRPのための色素原性基質）を用いて、十分なシグナル（0.1〜0.2 ODのバックグラウンドを用いて30分以内で1-2 OD 405）を与えるはずである。これらの条件の下では、すなわち、DDAH濃度がKDの10％以下である場合、バックグラウンド補正したシグナルが50％減少する遊離のADMAの濃度はKDに等しい。ADMA濃度の範囲（10-7Mおよび10-8M）が10-9M変異型DDAHを用いてアッセイされる場合、少なくとも50％の阻害が試験された範囲のどこかで実証され得、もともとのKDの見積もりを確証する。競合ELISAは、分析物濃度がKD、すなわち、50％阻害に等しいときに最も高感度であり、このようなADMA濃度は、健常血清の10〜100倍希釈に一致する。
【００５９】
KDのさらなる確証は、吸光度データのScatchard分析によって得られ得る。遊離のADMAの濃度に対する変異型DDAH-ADMA複合体の濃度の比が、複合体の濃度に対してプロットされる場合、KDは傾きから得られ得る（-1/KD）。複合体濃度は、全体の変異型DDAH濃度の倍数 (A-Ab)/(Af-Ab)に等しく、ここで、Aは、その濃度が決定される複合体のA405であり、AfはADMAの非存在下における変異型DDAHのA405であり、そしてAbはADMA過剰での変異型DDAHのA405である。遊離のADMAは全体のADMAから複合体を引いたものに等しい。
【００６０】
2. 競合ELISAにおける変異型DDAH断片を使用する血清ADMAの決定
健常なヒト被験体からの血液試料を利用する。血清からの細胞の除去後、ADMAが標準的な方法によって決定され、この方法には、血清タンパク質の除去、o-フタルアルデヒドを用いる蛍光標識、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、およびポストカラム、インラインフルオロメトリー検出（Chenら、1997）が含まれる。同じ試料が、1×10-9Mの濃度の変異型DDAHを用いる、本質的に実施例1に記載されたような競合ELISAによってアッセイされる。1:10から1:100までの範囲の各試料の一連の希釈が3連でアッセイされ、そしてその結果が、標準的な方法および10-9Mから10-7Mまでの純粋なADMAの標準曲線の結果に対して比較される。標準的なアッセイ法と競合ELISAとの間の優れた一致を観察し得る。
【００６１】
3. 蛍光偏光イムノアッセイ法の最適化
ADMAは、そのα-アミノ基を通してOregon Green（OG）に結合体化され、逆相HPLCによって精製される。遊離の結合体の蛍光偏光は、10-10Mから10-8Mまでの濃度の範囲にわたって、498nm励起最大および524nm放射最大において偏光フルオメーターを用いて決定する。ADMA-OGの偏光は、典型的には、10-９Mにおいて20±5の値を有する全体の範囲にわたって完全に一定であるべきである。10-10MのADMA-OGにおいて、偏光は、10-10Mから10-6Mまでの範囲の変異型DDAHの種々の濃度との平衡の後で決定される。最小値は、遊離の結合体の値と等価であるべきである。（150〜200）の最大値は、10-7Mと10-6Mとの間に到達する。従って、変曲点は10-7Mと10-8Mとの間に存在し得、これはKDの以前の見積もりと一致し、およびこれは、蛍光偏光データのScatchard分析によって確証され得る。この場合、遊離の変異型DDAHに対する変異型DDAH-ADAH-OG複合体の比が複合体に対してプロットされ、そして再度、KDが傾きから導き出される（-1/KD）。この複合体濃度は全体のADMA-OG濃度の倍数(P-Pf)/(Pb-Pf)に等しいはずであり、ここで、Pはその濃度が測定される複合体の偏光であり、Pfは遊離のADMA-OGの偏光であり、およびPbは、過剰の変異型DDAHの存在下でのADMA-OGの偏光である。遊離の変異型DDAHは全体の変異型DDAH−複合体に等しい。偏光はまた、10-7Mの遊離のADMAの存在下で測定され得、これは、ほぼ比例して最大偏光を減少させる、10倍希釈の健常血清に一致する。好ましくは、検出可能な阻害は、100倍高い濃度のアルギニンを用いて、または等価な濃度のSDMAを用いては観察されないはずである。
【００６２】
4. 変異型DDAH断片を使用する、FPIAによる血清ADMAの測定
上記に議論したように、競合的阻害に対する蛍光偏光の最適感度は、抗体濃度がKDに等価であり、かつ蛍光リガンド濃度がKDの約10％である場合に存在する。これらの条件下では、阻害されない偏光はその範囲の中点にあり、かつ約80％阻害が100倍過剰の遊離の分析物を用いて達成され得る。実施例2において分析されたのと同じ試料が、FPIAによって、KDにおける変異型DDAH濃度、および10％KDにおけるADMA-OG濃度を用いて再度分析される。1:2から1:100までの希釈の範囲がアッセイされ、10-6Mから10-8Mまでの範囲の標準曲線と比較される。再度、その結果は、標準的なアッセイ法ならびに競合ELISAと一致し得る。
【００６３】
本明細書中で言及されたすべての刊行物および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照として組み入れられることが示されたのと同じ程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【００６４】
参考文献
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2006505245.tif 000004
2006505245.tif 000005
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2006505245.tif 000008
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2006505245.tif 000010
2006505245.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】アルギニン、非対称性ジメチルアルギニン（ADMA）、および対称性ジメチルアルギニン（SDMA）の分子構造を示す。
【図２】ヒトボランティアにおける血漿ADMAレベルと血管機能（特に内皮依存性血管拡張）との間の関連性を示す。血漿ADMAレベルと上腕動脈の血流依存性血管拡張との間の逆関係に注意されたい。後者の応答は内皮由来の一酸化窒素シンターゼの活性化に依存する。
【図３】ヒト血漿中でのADMAおよびLNMMAのHPLC測定のオリジナルのトレース記録を示す。標準化のためにホモアルギニンを血漿に加えた。アルギニンを、試料を最初にアルギナーゼで処理することによって除去した。通常、アルギニンのピークはホモアルギニンのピークに非常に近接して生じ、かつ、しばしばアルギニンのピークはLNMMA（この図においてMMAとして標識される）、ADMA、およびSDMAのピークにテーリングする。この患者において、ADMAレベルは上昇していることに注意されたい。なぜならば、ADMAピークおよびSDMAピークは同様であるからである。SDMAはこのトレース記録上でADMAから十分に分離しているが、本発明者らのHPLC記録の大部分は、ADMAピークへのSDMAピークのテーリングに起因してさほど明確ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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