(57)【要約】本発明は、核酸を真核細胞内に送り込むための医薬調合物であって、該調合物が、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４の範囲内のｐＨ値、および／または５〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内のアニオン濃度を有し、かつ／または１０〜５００μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する非ステロイド系抗炎症薬を提供することを特徴とする、医薬調合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を真核細胞内に送り込むための医薬調合物であって、前記調合物が、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４の範囲内のｐＨ値、および／または５〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内のアニオン濃度、および／または１０〜５００μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する非ステロイド系抗炎症薬を有することを特徴とする医薬調合物。
【請求項２】
前記ｐＨ値が、ｐＨ６．２〜ｐＨ７．０の範囲内である請求項１に記載の調合物。
【請求項３】
前記ｐＨ値が、６．５または７．０である請求項１または２に記載の調合物。
【請求項４】
前記アニオンが、５〜５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する請求項１〜３のいずれかに記載の調合物。
【請求項５】
前記アニオンが、５〜１０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する請求項１〜４のいずれかに記載の調合物。
【請求項６】
前記アニオンが、塩化物イオンである請求項１〜５のいずれかに記載の調合物。
【請求項７】
前記非ステロイド系抗炎症薬が、５０〜２５０μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する請求項１〜６のいずれかに記載の調合物。
【請求項８】
前記非ステロイド系抗炎症薬が、１００μｍｏｌ／ｌの濃度を有する請求項１〜７のいずれかに記載の調合物。
【請求項９】
前記非ステロイド系抗炎症薬が、フルルビプロフェンまたはインドプロフェンである請求項１〜８のいずれかに記載の調合物。
【請求項１０】
核酸、キャリヤー物質および添加物をさらに含む請求項１〜９のいずれかに記載の調合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を真核細胞に送り込むための医薬調合物であって、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４の範囲内のｐＨ値、および／または５〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内のアニオン濃度、および／または１０〜５００μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する非ステロイド系抗炎症薬を有することを特徴とする医薬調合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムを解読する１つの実質的な目的は、（それらの産物の作用様式に基づく）病原性遺伝子を同定すること、および／またはこれらの遺伝子の構造における病原性変化（多型）を同定すること、およびそれらを疾病像(disease profile)に割り当てることである。このような疾病が、余りにも強く、余りにも弱くまたは不正確に発現された所定の数の遺伝子産物に起因することが認められれば、この研究は、複数の疾病の原因治療に近づくであろう。事実、遺伝性疾患（たとえば嚢胞性線維症）の全てについて、一般に、単一の遺伝的欠陥（一遺伝子疾患）が既に判明している。しかし、他の疾患（たとえば高血圧症）では、状況は、はるかに複雑である。これらの疾病は、明らかに単一の遺伝的欠陥ではなく、むしろ多数の遺伝的欠陥（多遺伝子性疾患）の結果であり、冒された人は、ある種の環境因子に暴露した際に発病するように運命づけられる。この制限に関わらず、１つ以上の遺伝子の発現への標的化された介入は、単に症状に関連した治療ではなく、原因に関連した治療の機会を提供する。
【０００３】
科学的知見の現状によれば、このような「遺伝子療法」に、４つの選択肢を利用することができる。たとえば、遺伝子キャリヤー使用して、置換遺伝子を、体細胞内に送り込むこと、および、それを、細胞独自のタンパク質合成機構によって、対応するタンパク質に転写させること（プラスミドのリポソームトランスファー、一時的発現）、および／またはこの遺伝子を、標的細胞のゲノムに組み入れること（ウイルスの遺伝子導入、安定した発現）は、今では容易にできる。しかし、標的細胞を的確に検討する際に、有能性を導入する際に、また必要に応じて、導入された遺伝子のスイッチを入れたり切ったりする際に、今でもまだ重大な困難に直面する。さらに、現在使用されているリポソームトランスファー系およびウイルストランスファー系は、しばしば、細胞傷害作用を有したり、潜在的に劇的な、免疫学的に決定された不耐反応を誘発したりする。
【０００４】
遺伝子導入と対比すると、病原性遺伝子の発現を防止するために、いわゆる、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、対応するタンパク質への翻訳の間に、初めて、これを特異的にブロックすることができる。アンチセンス技術を用いれば、短い、一本鎖ＤＮＡ（概して、１５〜２５ヌクレオチドを含む）が標的細胞に送り込まれ、それらの標的ｍＲＮＡに相補的な塩基配列が提供される。同様に、１本鎖ｍＲＮＡ上に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを置くことにより（ＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリダイゼーション）、翻訳の中断を招く。それに反して、この種の第２選択肢である、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いると、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡのセグメントと同一の配列を有する、厳密に２１塩基対を含むＲＮＡ二本鎖が、細胞に送り込まれる。この後、詳細には未だ分かっていない、タンパク質複合体が標的細胞内で形成され、これが、標的ｍＲＮＡを特異的に分断し、したがって、その翻訳を妨げる。両技術はともに、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡは、それぞれ、自発的に標的細胞内に吸収されないようであるが、はるかに大きいプラスミド（概して数千塩基対長）と同様に、標的細胞内に移入されなければならない、という１つの問題を共有する。この目的のために、それらは、概して、輸送媒体の役割をするリポソーム内にパッケージされる。
【０００５】
遺伝子発現への標的介入のための第３の方法は、短いＤＮＡ二本鎖、いわゆるデコイ・オリゴヌクレオチドを使用する。遺伝子発現の第１段階は、染色体上の、対応するＤＮＡセグメントを、ＲＮＡ１本鎖に転写することである。いわゆる転写因子は、転写の開始に欠くことができない。こうした調節タンパク質は、遺伝子のスターター領域（プロモーター領域）に結合し、ＲＮＡポリメラーゼを介して、遺伝子の転写を開始する。ＤＮＡに結合した転写因子はまた、この転写過程をブロックすることができる。デコイ・オリゴヌクレオチドは、短いＤＮＡ二本鎖（概して、１５〜２５塩基対を含む）であり、その（それらの）標的遺伝子のスターター領域内で標的転写因子が結合する、配列モチーフを擬する。あらゆる転写因子は、その対応する配列モチーフのみを認識する。このように、デコイ・オリゴヌクレオチド手法は特異的である。
【０００６】
細胞質内または細胞核内で、デコイ・オリゴヌクレオチドの結果として無効にされる転写因子の結果は、その（それらの）標的遺伝子の発現を、もはや誘導できない、すなわちブロックするということである。
【発明の開示】
【０００７】
したがって、細胞または生物を圧迫しない、核酸を送り込む簡単な方法が緊急に必要である。
【０００８】
この目的は、請求の範囲で明確に規定される内容によって達成される。
【０００９】
以下の図面を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
プラスミド、アンチセンスおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチドと対照してみると、デコイ・オリゴヌクレオチド（二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド）は、明らかに、助剤（トランスフェクション剤）なしで関連標的細胞に入ることができる。この輸送の根本的な機序は、今まで分かっていない。本発明者は、この度、この機序を説明することに成功した。これに関連して得られた知見に基づいて、真核細胞、特に哺乳動物細胞、特にヒト細胞の中に、核酸を導入するための新しい調合物が提供される。
【００１１】
本書で使用されるとき、用語「調合物(formulation)」または「医薬調合物(pharmaceutical formulation)」は、たとえば、ヒトまたは動物にin vitroで、あるいは器官、組織または細胞にin vitroまたはex vivoで投与される、１つ以上の有効成分および補助的調合剤からなる、薬物もしくは接種媒体(inoculation medium)用の、医薬製剤(pharmaceutical form of preparation)を意味する。本発明による有効成分は、核酸である。
【００１２】
本書で使用されるとき、用語「補助的調合剤」は、有効成分を除く、上述の医薬調合物の全ての成分を意味する。補助的調合剤は、たとえば、生理食塩水または緩衝溶液、水、保存料、イオン類、酸類、塩基類、器官移植用保存液、血液代用液、吸入液、輸液、注射液および医薬品であってもよい。
【００１３】
本発明は、調合物が、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４の範囲内、好ましくは約ｐＨ６.２〜約ｐＨ７．０の範囲内、特に好ましくは約ｐＨ６．５またはｐＨ７．０のｐＨ値、および／または約５〜約１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは約５〜約５０ｍｍｏｌ／ｌ範囲内、特に好ましくは、約５〜約１０ｍｍｏｌ／ｌの、アニオン濃度、好ましくは塩化物イオン濃度、および／または非ステロイド系抗炎症薬、たとえば、約１０〜約５００μｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは約５０〜約２５０μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度、特に好ましくは約１００μｍｏｌ／ｌの濃度を有する、フルルビプロフェンまたはインドプロフェンを有することを特徴とする、核酸を真核細胞に送り込むための新規な調合物に関する。さらに、上述の有効成分および特徴に加えて、該調合物は、１つ以上の適当な緩衝剤も含んでもよい。適当な緩衝剤の１例は、１４５ｍｍｏｌ／ｌのＮａ+、５ｍｍｏｌ／ｌのＫ+、１１ｍｍｏｌ／ｌのＣｌ-、２ｍｍｏｌ／ｌのＣａ2+、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ2+、１０ｍｍｏｌ／ｌのヘペス(Hepes)、１４５ｍｍｏｌ／ｌのイセチオネート、１０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−グルコースを含有し、ｐＨ値が、６.５〜７．０の範囲内、好ましくは約６．５または７．０である、改良リンゲル(modified Ringer's)液である。
【００１４】
最初に、本発明者は、調査したヒト内皮細胞により吸収された蛍光色素標識デコイ・オリゴヌクレオチドの細胞内分布は、不均質であることを確認した。小胞様構造内での蓄積とともに、細胞質および細胞核のより強く分散した標識が示された。特に、核酸が小胞中に蓄積することは、吸収過程が、受容体介在性の、エンドサイトーシス様過程であり得るという仮説の根拠となる。
【００１５】
血管平滑筋細胞または単球と同様に、ヒト内皮細胞は、細胞における核酸吸収の有力候補である、葉酸受容体の一変異または両変異を発現することが、その後分かった。この受容体は、好ましくは、細胞膜におけるいわゆるカベオラに局在している。カベオラの破壊（コレステロールの撤収(withdrawal)またはカベオリン−１の発現阻害による（図２））は、著明なデコイ・オリゴヌクレオチド吸収制限を招く。
【００１６】
反対に、細胞外ｐＨ値を下げることは、受容体介在性の葉酸結合（アフィニティ）に有利であり、このｐＨ依存性はまた、デコイ・オリゴヌクレオチドのヒト内皮細胞内への吸収も示した（図３）。葉酸が該受容体に結合した後、該カベオラは、インターナライズされる（ポトサイトーシス；RGW Anderson(1998)Annu.Rev.Biochem,67,199）。これらの小胞の中に封入された葉酸を該細胞質内に放出するためには、アニオン輸送体（キャリヤー）が必要であり、これは、プロベニシドで阻害することができ（Kamen et al,(1991)J.Clin.Invest.87,1442）、また、後述する還元型の葉酸キャリヤーｈＦＲＣと同一ではない。事実、ヒト内皮細胞におけるデコイ・オリゴヌクレオチドの蓄積は、やはりプロベニシド感受性であった。
【００１７】
したがって、本発明による調合物は、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ７．４の範囲内のｐＨ値を有する調合物に関する。該ｐＨ値は、好ましくは、ｐＨ６.２〜約ｐＨ７．０の範囲内であり、特に好ましくは、約ｐＨ６．５または７．０である。
【００１８】
受容体介在性のポトサイトーシスとともに、葉酸の哺乳動物細胞内への一次輸送ルートは、還元型キャリヤーｈＲＦＣを介した吸収である(LH Matherly(2001)Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.67,131)。葉酸は、ＤＮＡ合成に不可欠なため、原則として、この輸送体は、細胞分裂ができるあらゆる体細胞に利用できる（Whetstine et al、(2002)Biochem.J.7月29日［印刷前の電子ジャーナル発表］も参照されたい）。ヒト内皮細胞は、ｈＦＲＣも発現する。アンチセンスオリゴヌクレオチドに支持された、ｈＦＲＣタンパク質の発現が、これらの細胞の３分の１まで減少すると、デコイ・オリゴヌクレオチド吸収が４５％阻害されることになる（図４）。さらに、この輸送システムの、デコイ・オリゴヌクレオチド吸収への関与に関する表れ（LH Matherly(2001)Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.67,131に記載のｈＦＲＣの特徴を参照されたい）は、葉酸と比較して、葉酸代謝拮抗薬メトトレキサートによる、それらの大幅な阻害増進、および陰イオン交換インヒビターＤＩＤＳ（４，４'−ジイソチオシアノ−２，２'−スチルベン−ジスルホン酸）に対する高い感受性であった。
【００１９】
事実、アニオン系葉酸の、哺乳動物細胞内へのｈＦＲＣ介在性吸収の場合、アニオンが、好ましくは塩化物が、細胞から離れる(antiport)こと、および／またはカチオン、好ましくは、プロトン（Ｈ+）が、細胞内に同時輸送されること(symport)が、対抗手段として、必要である。しかし、該キャリヤーは、擬似生理学的ｐＨ値７．５で、葉酸および／またはメトトレキサートに対して最大アフィニティを有するため、細胞外ｐＨの低下（すなわち、プロトン濃度の上昇）は、この輸送ルートで、核酸吸収を増大するという所望の作用を達成することができない。たとえば、細胞外塩化物濃度（一般に、１２０ｍｍｏｌ／ｌ）を、好ましくは細胞内値（１２ｍｍｏｌ／ｌ）未満に、低下させ、その結果、塩化物の外向き濃度勾配を作ることにより、細胞の中から外への塩化物輸送を促進することは、より有望である。図５に示す通り、細胞外塩化物濃度の低減は、事実、内皮細胞へのデコイ・オリゴヌクレオチド吸収を著明増大に導いた。
【００２０】
要するに、上述の発見から、ｐＨ感受性葉酸受容体介在性のポトサイトーシスと並行して、ヒト細胞内への核酸の吸収が、還元型還元型葉酸キャリヤーを介して行われ、また、細胞外アニオン濃度、特に塩化物濃度を低下させることにより、この輸送ルートの効率を、大幅に上昇できることが確認される。
【００２１】
したがって、本発明による調合物は、約５〜約１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは５〜約５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内、特に好ましくは約５〜約１０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の、アニオン濃度、好ましくは塩化物イオン濃度を含む、調合物に関する。さらに、等モル量のイセチオネートを加えることにより、塩化物イオンの生理学的置換が達成される。
【００２２】
物質の吸収とともに、その排除もまた、その瞬間的濃度および／または細胞における可用性に、重要な役割を果たす。抗炎症薬（非ステロイド系抗炎症薬）、たとえばフルルビプロフェンまたはインドプロフェンで阻害され得る、哺乳動物細胞の中から外への、このような葉酸の輸送ルートは、記述されている(M Saxena,GB Henderson(1996)Biochem.Pharmacol.51,974)。図６に示す通り、デコイ・オリゴヌクレオチドはまた、この輸送ルートで、ヒト細胞から除去される。すなわち、この輸送ルートをブロックすることにより、細胞中の核酸濃度を顕著に上昇させることができる。
【００２３】
したがって、本発明による調合物はまた、約１０〜約５００μｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは約５０〜約２５０μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度で、特に好ましくは約１００μｍｏｌ／ｌの濃度で、非ステロイド系抗炎症薬たとえばフルルビプロフェンまたはインドプロフェンを含む、調合物に関する。
【００２４】
上述の輸送ルートはまた、比較可能な程度まで、またデコイ・オリゴヌクレオチドに加えて、他の核酸、たとえば１本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドによって使用される可能性があり、また内皮細胞に制限されない。たとえば、ＦＩＴＣ標識１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、対応する二本鎖（デコイ）オリゴヌクレオチドと同程度に効果的にヒト内皮細胞内に輸送され、またデコイ・オリゴヌクレオチドの、ヒト内皮内および血管平滑筋細胞内への吸収速度は、概してまったく同じであった。
【００２５】
原則として、たとえば、デコイ・オリゴヌクレオチドが、それらの標的転写因子を効果的に無効にする条件は別として、潜在的に細胞傷害性の助剤がなくても、急速にかつ十分な程度まで、核酸が標的細胞内に吸収されることは、核酸の治療効果に非常に重要である。この程度まで、これらの核酸を適用するための本発明の好ましい方法は：
１．約ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４の範囲内、好ましくは約ｐＨ６．２〜ｐＨ７．０の範囲内、特に好ましくは約ｐＨ６．５または７．０のｐＨ値、および／または
２．約５〜約１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは約５〜約５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内、特に好ましくは約５〜約１０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の細胞外アニオン濃度、好ましくは（たとえばイセチオネートの添加による）塩化物濃度、および／または
３．約１０〜約５００μｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは約５０〜約２５０μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する、特に好ましくは約１００μｍｏｌ／ｌの濃度を有する、非ステロイド系抗炎症薬、好ましくはフルルビプロフェンまたはインドプロフェン
を含む、適切な緩衝液の使用を含む。
【００２６】
さらに、本発明は、上に指名された特徴の２つまたは全てを組み合せることができる、核酸を真核細胞内に送り込むための調合物に関する。図７は、結果として達成された核酸の生物活性増強の例を示す。好ましい一調合物は、本発明によるｐＨ値および塩化物濃度の調節の組合せを含む。
【００２７】
好ましい一実施形態において、標的細胞と接触させる、本発明による調合物は、核酸（０．０１〜１００μｍｏｌ／ｌの濃度）および緩衝溶液のみを含む。１種類以上の適切な緩衝液を使用してもよい。この種の緩衝溶液の一例は、図７に示す実験で使用した通り、１４５ｍｍｏｌ／ｌのＮａ+、５ｍｍｏｌ／ｌのＫ+、１１ｍｍｏｌ／ｌのＣｌ-、２ｍｍｏｌ／ｌのＣａ2+、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ2+、１０ｍｍｏｌ／ｌのヘペス(Hepes)、１４５ｍｍｏｌ／ｌのイセチオネート、１０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−グルコース（ｐＨ６．５またはｐＨ７．０）を含む、改良リンゲル液である。
【００２８】
本発明による方法で使用される調合物は、好ましくは、注射、注入、吸入、または局所利用を可能にする他の適用形態により、局所使用される。本発明の方法内で使用される、該調合物のex vivo使用（血管、組織または細胞のインキュベーション）もまた、局所利用を可能にする。本目的は、核酸含有混合物を、処置すべき細胞のできる限り近くに届けること、および（少なくとも短時間）該核酸の、標的細胞への吸収に最適な細胞外環境を作ることである。
【００２９】
以下の実施例は、単に説明のために提供されるものであり、発明の範囲を制限する意味ではない。
【実施例】
【００３０】
［１．細胞培養］
ヒト内皮細胞は、ヘペス改質(Hepes-modified)タイロード溶液中の１．６Ｕ／ｍｌディスパーゼで、３７℃で３０分間処理することにより、臍静脈から単離し、ゼラチン被覆６ウェル組織培養皿（０．１ＭのＨＣｌ中２ｍｇ／ｍｌのゼラチン、室温で３０分間）上、２０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍｌナイスタチン、５ｍＭヘペス(HEPES)および５ｍＭのＴＥＳ、１μｇ／ｍｌヘパリンおよび４０μｇ／ｍｌ内皮成長因子を含有する、Ｍ１９９培地（ドイツのカルルスルーエにある、ギブコ・ライフ・テクノロジーズ(Gibco Life Technologies,Karlsruhe,Germany)）１．５ｍｌで、培養した。該細胞は、それらの典型的な敷石状形態(pavement morphology)、フォン・ウィレブラント因子（ｖＷＦ）に関して免疫染色陽性およびＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）の蛍光定量的証明（ＦＡＣＳ）、ならびに平滑筋α−アクチンに関して免疫染色陰性（Krzesz et al、(1999)FEBS Lett.453,191）により、同定した。
【００３１】
ヒト血管平滑筋細胞は、切除した胸腺の静脈から単離した。接着性結合組織および脂肪組織の除去後、外科用メスを使用して、該血管を機械的に細分した。この後、該組織を、消化薬溶液（ＤＭＥＭ培地；ギブコ・ライフ・テクノロジーズ(Gibco Life Technologies)中、５％ウシ胎仔血清、５ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、５ｍｍｏｌ／ｌのＴＥＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍｌナイスタチンおよび０．１５％コラゲナーゼ（クロストリジウム・ヒストリチクム(Clostridium histolyticum)、ダイゼンホッフェンにあるシグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich,Deisenhofen)））中、３７℃で、５％ＣＯ2を用いて、１４〜１６時間インキュベートした。該細胞懸濁液を、室温で５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離した後、細胞ペレットを、成長培地（スムーズ・マッスル・セル・グロウス・メディウム(Smooth Muscle Cell Growth Medium)２，ハイデルベルグにあるポモセル有限責任会社(PomoCell GmbH,Heidelberg)）２〜３ｍｌ中に懸濁させ、室温で少なくとも３０分間、ゼラチン（０．１ＮのＨＣｌ  ｍｌ当たり２ｍｇのゼラチン）で予め被覆し、次いで該培地で２回洗浄しておいた組織培養皿に、平らにならした。２日後、無菌条件で、成長培地を取り替え、細胞を培地で簡単に洗浄した。次期以後、４日ごとに培地を交換した。
【００３２】
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１(ATCC TIB 202)は、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０Ｕ／ｍｌナイスタチンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ(Gibco Life Technologies)）で培養した。
【００３３】
［２．デコイ・オリゴヌクレオチド合成］
二本鎖デコイ・オリゴヌクレオチドは、Krzesz et al、(1999)FEBS Lett.453,191に記載の通りに、相補的１本鎖、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識オリゴヌクレオチド（ドイツのケルンにあるユーロジェンテック(Eurogentec,Koeln,Germany)）から製造した。該オリゴヌクレオチドの１本鎖配列は、以下の通りであった（下線を施した文字は、チオリン酸結合塩基を示す）。
【００３４】
AP-1,   5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3' (配列番号:1)
C/EBP,  5'-TGCAGATTGCGCAATCTGCA-3' (配列番号:2)
STAT-1, 5'-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3' (配列番号:3)
【００３５】
［３．アンチセンスオリゴヌクレオチド合成およびインキュベーション］
アンチセンス混合物の場合、３％リポフェクチン（ｖ／ｖ）（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ(Gibco Life Technologies)）を、培地１ｍｌに加え、室温（ＲＴ）で６０分間、インキュベートした。この後、対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチド（ドイツのケルンにあるユーロジェンテック(Eurogentec,Koeln,Germany)）を、０．５μｍｏｌ／ｌの最終濃度で加え、室温でさらに３０分間、インキュベートした。実験開始時に、相当する量のヘパリンおよび内皮成長因子を加え、内皮細胞培養の従来の細胞培地を、アンチセンスリポフェクチン培地に取り替えた。６時間後、アンチセンスリポフェクチン培地を除去し、新鮮な細胞培地に取り替えた。トランスフェクションの２４時間後に、ウエスタン・ブロット分析および／またはデコイ・オリゴヌクレオチド吸収の蛍光顕微鏡分析を実施した。
【００３６】
カベオリン−１に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列（チオリン酸エステル結合を、*で記してある）は、5'-A*T*G*TCCCTCCGAGT*C*T*A-3' (配列番号:4)であった。対照として、アンチセンスオリゴヌクレオチドと同一の塩基組成を持つが、異なる配列(5'-C*T*C*GATCCTGACTA*C*T*G-3')(配列番号:5)を持つスクランブルド・オリゴヌクレオチドを使用した。還元型葉酸キャリヤー（ｈＲＦＣ）に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、5'-C*A*A*A*GG*T*A*GC*A*C*A*CG*A*G-3' (配列番号:6)であった。ここでまた、スクランブルド・オリゴヌクレオチド(5'-A*C*A*T*GG*A*C*A*CG*A*A*GC*A*G-3')(配列番号:7)を、対照として使用した。
【００３７】
［４．ＲＴ−ＰＣＲ分析］
全細胞性ＲＮＡは、キアジェン・ＲＮイージー・キット（Qiagen RNeasy Kit（ドイツのヒルデンにあるキアジェン(Qiagen,Hilden,Germany)）を使用して単離した。この後、製造会社の説明書に従って、最高３μｇのＲＮＡおよび２００Ｕのスーパースクリプト(Superscript)(商標)II逆転写酵素（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ(Gibco Life Technologies)）を全量２０μｌで使用して、ｃＤＮＡ合成を実施した。後のポリメラーゼ連鎖反応では、ｃＤＮＡポリメラーゼ５μｌおよびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１Ｕ（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ(Gibco Life Technologies)）を、全量５０μｌで使用した。ＰＣＲ産物を、０．１％臭化エチジウムを含有する１．５％アガロースゲルで分離し、バンドの強さを、ＣＣＤカメラシステムを用いて濃度測定法で測定し、スキャナリティックス(Scanalytics)（米国マサチュセッツ州のビルリカ(Billerica,MA,USA)）製のワン・ディースキャン(One-Dscan)ゲル分析ソフトウェアで記録した。
【００３８】
全てのＰＣＲ反応は、ティーパーソナル・サイクラー(Tpersonal Cycler)（ドイツ・ゲッティンゲンにあるバイオメトラ(Biometra,Goettingen,Germany)）で、各プライマー対ごとに個々に実施した。
【００３９】
ｈＦＲ１（葉酸受容体α）、産物サイズ１８１ｂｐ、３７サイクル、伸張温度(addition temperature)６０℃、（フォワードプライマー）、5'-CAAGGTCAGCAACTACAGCCGAGGG-3' (配列番号:8)、（リバースプライマー）5'-TGAGCAGCCACAGCAGCATTAGGG-3' (配列番号:9)。
【００４０】
ｈＦＲ２（葉酸受容体ｂ）、産物サイズ３８５ｂｐ、３７サイクル、伸張温度６１℃、（フォワードプライマー）、5'-CTGTGTAGCCACCATGTGCAGTGC-3' (配列番号;10)、（リバースプライマー）5'-TGTGACAATCCTCCCACCAGCG-3')(配列番号:11)。
【００４１】
ｈ１ＦＲＣ、産物サイズ３３３ｂｐ、３７サイクル、伸張温度６０℃、（フォワードプライマー）、5'-CCAAGCGCAGCCTCTTCTTCTTCAACC-3' (配列番号:12)、（リバースプライマー）5'-CCAGCAGCTGGAGGCAGCATCTGCC-3' (配列番号:13)；Sprecher et al、(1998)Arch.Dermatol.Res.290,656）。
【００４２】
ｈ２ＦＲＣ２、産物サイズ１６７ｂｐ、３７サイクル、伸張温度５６℃、（フォワードプライマー）、5'-CCATCGCCACCTTTCAGATTGC-3' (配列番号:14)、（リバースプライマー）5'-CGGAGTATAACTGGAACTGCTTGCG-3'（配列番号：１５）。
【００４３】
全てのＰＣＲ産物の同一性は、後の配列決定で確認した。
【００４４】
［５．ウエスタン・ブロット分析］
ヒト臍静脈内皮細胞は、液体窒素で連続５回凍結し、３７℃で解凍することによって、開いた。タンパク質抽出物は、Heckerら、(1994)Biochem J.299,247に記載の通りに製造した。標準プロトコールに従って、ＳＤＳの存在下、変性条件で、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質２０〜３０μｇを分離し、バイオトレース(BioTrace)(商標)フッ化ポリビニリデントランスファー膜（ドイツロッスドルフにあるポール・コーポレーション(Pall Corporation,Rossdorf,Germany)）にトランスファーした。ドイツのハイデルベルグにあるＢＤ・バイオサイエンシーズ(BD Biosciences,Heidelberg Germany)から入手したポリクローナル一次抗ヒト抗体を、カベオリン−１の免疫学的証明に使用した。ポリクローナル抗ヒト抗体（米国カリフォルニア州ロング・ビーチにあるヴェテランズ・アフェアーズ・メディカル・センターのドクター・ハミッド  Ｍ  セド(Dr.Hamid M.Said,Veterans Affairs Medical Center,Long Beach,California,USA)により惜しみなく提供された）を、ｈＦＲＣタンパク質の証明に使用した。ＣＤ４０タンパク質は、ポリクローナル抗ヒト抗体（米国ニュージャージー州フランダースにあるリサーチ・ダイアグノースティックッス・インク(Research Diagnostics Inc.,Flanders,New Jersey,USA)で検出した。タンパク質バンドは、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧおよび／または抗ウサギＩｇＧ（１：３０００、ドイツのダイゼンホッフェンにあるシグマ(Sigma,Deisenhofen,Germany)）を加えた後、ケミルミネセンス方法（米国イリノイ州ロックフォードにあるピアース・ケミカルのスーパーシグナル・ケミルミネセント・サブストレート(SuperSignal Chemiluminescent Substrate;Pierce Chemical,Rockford,IL,USA)）に続いてオートラジオグラフィー（英国バッキンガムシャーにあるアマシャム・ファルマシア・バイテックのハイパーフィルム（商標）ＭＰ(HyperfilmTM MP,Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,England)を使用して可視化した。トランスファー膜を「ストリップ」（０．２ＮのＮａＯＨで５分、続いて、Ｈ2Ｏで３×１０分洗浄）した後、モノクローナル一次抗体およびペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（両者ともシグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)による、１：３０００希釈）で、β−アクチンの同一タンパク質バンドを証明することにより、同一タンパク質量の使用およびトランスファーを示した。
【００４５】
［６．蛍光顕微鏡法］
実験の開始前に、２４ウェル細胞培養プレートでの内皮細胞培養を、３７℃のリンゲル液（組成：１４５ｍｍｏｌ／ｌのＮａ+、５ｍｍｏｌ／ｌのＫ+、１５６ｍｍｏｌ／ｌのＣｌ-、２ｍｍｏｌ／ｌのＣａ2+、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ2+、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨｅｐｅｓ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−グルコース、ｐＨ７．３５）で１回洗浄した。この後、実験的混合物に応じて、改良リンゲル液または非改良リンゲル液１５０μｌを、３７℃で細胞に使用し、ＦＩＴＣ標識デコイ・オリゴヌクレオチドを、１０μｍｏｌ／ｌの最終濃度で加えた。大気中、３７℃で１８０分までのインキュベーション期間後、温かい非改良リンゲル液１ｍｌで、該細胞を３回洗浄した。蛍光強度は、励起波長４９４ｎｍ、発光波長５１８ｎｍおよび倍率２００×を具備する、アキシオバート(Axiovert)Ｓ  １００  ＴＶ顕微鏡（ドイツのゲッティンゲンにあるツァイス(Zeiss,Goettingen,Germany)）に連結されている、マイクロマックスＣＣＤカメラ(MicroMax CCD-camera)（米国ニュージャージー州トレントンにあるプリンストン・インストゥルメンツ・インク(Princeton Instruments Inc.,Trenton,NJ,USA)）で記録した。蛍光画像（実験混合物の各部につき１画像を撮影した）およびその後の定量化は、メタモーフ(MetaMorph)Ｖ３．０ソフトウェア（米国ペンシルベニア州にあるユニバーサル・イメージング・ウエスト・チェスター(Universal Imaging West Chester,PA,USA)）を使用して実施した。定量化の場合、実験混合物の全蛍光画像を、最初に、同一レベルの輝度およびコントラストに校正した。この後、該ソフトウェアを使用して、各画像の個々のピクセルを積分した総輝度を、蛍光強度の指標として決定し、それによって、デコイ・オリゴヌクレオチドの細胞内濃度を示した。
【００４６】
［７．統計解析］
特に明記されていない限り、図表中の全てのデータは、ｎ回の実験の平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。統計学的評価は、片側分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてダネット事後検定法により実施した。＜０．０５のＰ値を、統計学的に有意な差として考えた。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】例として、細胞培地中でインキュベートしておいたヒト培養内皮細胞における、転写因子Ｃ／ＥＢＰに対するＦＩＴＣ標識デコイ・オリゴヌクレオチドの時間依存的吸収（１０μｍｏｌ／ｌ；図１ａ）および転写因子ＡＰ−１に対するＦＩＴＣ標識デコイ・オリゴヌクレオチドの時間依存的吸収（１０μｍｏｌ／ｌ；図１ｂ）の結果を示す図である。蛍光色素標識核酸の吸収は、蛍光顕微鏡法（倍率４００×）を用いて実証した。
【図２】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）に基づくカベオリン−１のタンパク質発現の減少（対照の３７±１０％、ｎ＝３）が、１時間にわたる、ヒト培養内皮細胞でのＦＩＴＣ標識Ｃ／ＥＢＰデコイ・オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）の吸収に及ぼす作用を、棒グラフの形で示す図である。統計的概要（ｎ＝３〜４、未処理対照細胞におけるデコイ・オリゴヌクレオチドの吸収に対するパーセンテージとして示す。*対照に対してＰ＜０．０５、†ＡＳに対してＰ＜０．０５）。ＳＣＲ（スクランブル）は、同じ塩基組成であるが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとは異なる配列のオリゴヌクレオチドでの、内皮細胞の処理を示す。
【図３】細胞外のｐＨ値の変化が、１時間にわたる、ヒト培養内皮細胞でのＦＩＴＣ標識Ｃ／ＥＢＰデコイ・オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）の吸収に及ぼす作用を、棒グラフの形で示す図である。統計的概要（ｎ＝４〜５、ｐＨ値７．３５における、デコイ・オリゴヌクレオチドの吸収に対するパーセンテージとして示す。*Ｐ＜０．０５）。
【図４】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）に基づく還元型葉酸キャリヤーのタンパク質発現の減少（対照の３３±１０％、ｎ＝５）が、１時間にわたる、ヒト培養内皮細胞でのＦＩＴＣ標識Ｃ／ＥＢＰ−デコイ・オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）の吸収に及ぼす作用を、棒グラフの形で示す図である。統計的概要（ｎ＝３、未処理対照細胞におけるデコイ・オリゴヌクレオチドの吸収に対するパーセンテージとして示す。対照に対して*Ｐ＜０．０５、ＡＳに対して†Ｐ＜０．０５）。ＳＣＲ（スクランブルド）は、不活性なアンチセンスオリゴヌクレオチドによる内皮細胞の処理を示す。
【図５】細胞外塩化物イオン濃度（イセチオネートによる漸次置換）の変化が、ＦＩＴＣ標識Ｃ／ＥＢＰ−デコイ・オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）の吸収に及ぼす作用を、棒グラフ（ａ）の形で示す図である。統計的概要（ｎ＝４、１５６ｍｍｏｌ／ｌＣｌ-の場合の、デコイ・オリゴヌクレオチドの吸収に対するパーセンテージとして示す。*Ｐ＜０．０５）。図５（ｂ）は、例として、１５６から１１ｍｍｏｌ／ｌへの細胞外塩化物濃度の低下が、１時間にわたる、ヒト培養内皮細胞でのＦＩＴＣ標識ＳＴＡＴ−１−デコイ・オリゴヌクレオチドの吸収に及ぼす作用を示す図である（蛍光顕微鏡画像、倍率２００×）。
【図６】フルルビプロフェンまたはインドプロフェン（いずれの場合にも、１００μｍｏｌ／ｌ）との共インキュベーションが、１時間にわたる、ヒト培養内皮細胞での、ＦＩＴＣ標識Ｃ／ＥＢＰ−デコイ・オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）の吸収に及ぼす作用を示す図である。統計的概要（ｎ＝４、未処理対照細胞での、デコイ・オリゴヌクレオチドの吸収に対するパーセンテージとして示す。*Ｐ＜０．０５）。
【図７】インキュベーション媒体としての、（ａ）細胞培地（ｎ＝３）、ならびに（ｂ、ｃ）非改良リンゲル液およびそれぞれに改良した（ｍｏｄ）リンゲル液（１１ｍｍｏｌ／ｌの塩化物イオン、ｐＨ７．０）が、ヒト培養内皮細胞における、サイトカイン刺激（１００Ｕ／ｍｌ腫瘍壊死因子ａ［ＴＮＦａ］プラス１０００Ｕ／ｍｌインターフェロン−γ［ＩＦＮγ］、１０時間）ＣＤ４０タンパク質発現のＳＴＡＴ−１デコイ・オリゴヌクレオチド介在性阻害に及ぼす作用を、棒グラフ（ａ、ｂ）および代表的ウエスタン・ブロット分析（ｃ）で示す図である（サイトカイン刺激細胞中のタンパク質量［Ｔ／Ｉ］に対するパーセンテージとして示す）Ｔ／Ｉに対して*Ｐ＜０．０５；ｂ、統計的概要、ｎ＝６。ｃ、β−アクチンを内部標準として用いた、代表的ウエスタン・ブロット分析。内皮細胞は、サイトカイン類への暴露前に、未標識デコイ・オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）と３０分間、予備インキュベートしておいた。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月6日(2005.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む医薬調合物であって、前記調合物が、ｐＨ６．２〜ｐＨ７．０の範囲内のｐＨ値、および／または５〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の塩化物イオン濃度を有し、かつ／または１０〜５００μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する非ステロイド系抗炎症薬を提供することを特徴とする医薬調合物。
【請求項２】
前記ｐＨ値が、６．５または７．０である請求項１に記載の調合物。
【請求項３】
前記塩化物イオンが、５〜５０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する請求項１に記載の調合物。
【請求項４】
前記塩化物イオンが、５〜１０ｍｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する請求項１〜３のいずれかに記載の調合物。
【請求項５】
前記非ステロイド系抗炎症薬が、５０〜２５０μｍｏｌ／ｌの範囲内の濃度を有する請求項１〜４のいずれかに記載の調合物。
【請求項６】
前記非ステロイド系抗炎症薬が、１００μｍｏｌ／ｌの濃度を有する請求項１〜５のいずれかに記載の調合物。
【請求項７】
前記非ステロイド系抗炎症薬が、フルルビプロフェンまたはインドプロフェンである請求項１〜６のいずれかに記載の調合物。
【請求項８】
キャリヤー物質および添加物をさらに含む請求項１〜７のいずれかに記載の調合物。
【国際調査報告】
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