(57)【要約】糖尿病性ネフロパシーのラットモデルが開示される。本発明の別の実施態様では、試験化合物の糖尿病性ネフロパシーの効果を評価する方法が開示される。一実施態様では、本発明は、（ａ）請求項１に記載のラットであって、上記試験化合物の非存在下で糖尿病性ネフロパシーを招く進行性タンパク尿及び糸球体硬化症を発症するであろうラットに、上記試験化合物を曝露させる工程、及び（ｂ）上記ラットの糖尿病性ネフロパシーの発症を、上記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程を含む。
2006527999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットが結節形成を伴うII型糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーの症状を発症する、ラット糖尿病モデル。
【請求項２】
前記ラットが、Ｔ２ＤＮミミックMCW株である、請求項１に記載のラット。
【請求項３】
請求項１に記載のラットを少なくとも２匹含むラットの集団。
【請求項４】
前記ラットが、遺伝的に改変された、請求項１に記載のラット。
【請求項５】
前記ラットが、非改変ラットに対してさらなる遺伝物質を有する、請求項４に記載のラット。
【請求項６】
前記ラットが、非改変ラットに対して遺伝物質を欠如する、請求項４に記載のラット。
【請求項７】
請求項１に記載のラットを第２のラットと交配させることにより得られるラット。
【請求項８】
請求項４に記載のラットを第２のラットと交配させることにより得られるラット。
【請求項９】
請求項１に記載のラットに由来する細胞系。
【請求項１０】
請求項４に記載のラットに由来する細胞系。
【請求項１１】
糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーに対する試験化合物の効果を評価する方法であって、下記：
（ａ）請求項１に記載のラットであって、前記試験化合物の非存在下で糖尿病性ネフロパシーを招く進行性タンパク尿及び糸球体硬化症を発症するであろうラットに、前記試験化合物を曝露させる工程、及び
（ｂ）前記ラットの糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーの発症を、前記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程
を含む方法。
【請求項１２】
糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーに対する試験化合物の効果を評価する方法であって、下記：
（ａ）請求項４に記載のラットであって、前記試験化合物の非存在下で糖尿病性ネフロパシーを招く進行性タンパク尿及び糸球体硬化症を発症するであろうラットに、前記試験化合物を曝露させる工程、及び
（ｂ）前記ラットの糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーの発症を、前記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程
を含む方法。
【請求項１３】
II型糖尿病により生じる心臓障害に対する試験化合物の効果を評価する方法であって、下記：
（ａ）請求項１に記載のラットであって、前記試験化合物の非存在下で心臓障害を発症するであろうラットに、前記試験化合物を曝露させる工程、及び
（ｂ）前記ラットの心臓障害の発症を、前記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程
を含む方法。
【請求項１４】
II型糖尿病により生じる血管障害に対する試験化合物の効果を評価する方法であって、下記：
（ａ）請求項１に記載のラットであって、前記試験化合物の非存在下で血管障害を発症するであろうラットに、前記試験化合物を曝露させる工程、及び
（ｂ）前記ラットの血管障害の発症を、前記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程
を含む方法。
【請求項１５】
II型糖尿病により生じる眼障害に対する試験化合物の効果を評価する方法であって、下記：
（ａ）請求項１に記載のラットであって、前記試験化合物の非存在下で眼障害を発症するであろうラットに、前記試験化合物を曝露させる工程、及び
（ｂ）前記ラットの眼障害の発症を、前記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２００２年７月２５日に出願された米国仮出願第６０／３９８，４４６号（本明細書中に参照により援用される）に対する優先権を主張する。
【連邦政府により後援される研究又は開発に関する記述】
【０００２】
−−
【発明の背景】
【０００３】
糖尿病患者に直面する主な罹患率及び死亡率因子の１つは、多くの場合末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に進行する糖尿病性ネフロパシー(腎症)の危険性の増大である（US  Renal  Data  System：Excerpts  from  the  USRDS  2000  Annual  Data  Report：Atlas  of  End-Stage  Renal  Disease  in  the  United  States，Am．J．Kidney  Dis．36:S1-S238，2000；Parving，H.H.，et  al.，「Diabetic  Nephropathy」，In  Brenner  and  Rector's  The  Kidney  6th  Edition，W.B.  Saunders  Company，pp.1731-1773，2000；Viberti，G.，et  al.，Joslin's  Diabetes，pp.691-737，1992）。糖尿病における腎疾患の発症に関する長年の問題は、このプロセスに関与するメカニズムに関係する。糖尿病及びその付随する代謝的な、血行動態的な、糸球体成長及び糸球体細胞障害関連の変更が、糖尿病性ネフロパシーの進行を調節し得ると考え得るメカニズムに関して、多量のデータが作成されている（Viberti，G.，Kidney  Internat．55(6):2526-2527，1999；Sullivan，J.L.，Circulation  100(12):1260-1263，1999；Orloff，L.A.，et  al.，Arch．Surg．134(8):889-897，1999；Lewis，J．and  Lewis，E.J.，Sem．Nephrol．21(2):124-132，2001）。それにもかかわらず、糖尿病患者のおよそ２／３が、腎疾患を発症しないという所見により、高血糖症が、糖尿病性ネフロパシーにおいて許容因子であり、また血漿グルコースレベルの上昇のみでは、十分に腎障害の原因とはならないことが示される（US  Renal  Data  System：Excerpts  from  the  USRDS  2000  Annual  Data  Report：Atlas  of  End-Stage  Renal  Disease  in  the  United  States，Am．J．Kidney  Dis．36:S1-S238，2000）。したがって、遺伝因子は、糖尿病性ネフロパシーに対する感受性において重要な役割を果たすと考えられ、この見解を強力に支持する幾つかの臨床的且つ疫学的研究が存在する（Seaquist，E.R.，et  al.，New  Eng．J．Med．320:1161-1165，1989；Freedman，B.I.，et  al.，Am．J．Kidney  Dis．25(5):710-713，1995）。
【０００４】
腎疾患の進行を決定する際の糖尿病依存性因子と非依存性因子との間の複雑な相互作用は、糖尿病及び、糖尿病性ネフロパシーを伴う患者において見られるものを模倣する腎臓障害を自発的に発症する適正な動物モデルが存在すれば、より研究を行いやすくすることができる。しかしながら、現在まで、糖尿病性ネフロパシーを伴う患者の特徴を示す腎臓における事象の順序及び組織学的変化を完全に反復する糖尿病のげっ歯類モデルは開発されていない。糖尿病性ネフロパシーの適切な小動物モデルの欠如は、糖尿病関連ＥＳＲＤの前兆となる生物学的マーカーを同定するための、及び糖尿病性ネフロパシーの進行を減速させ得る新たな薬物治療の開発における取り組みを大幅に妨げている。
【０００５】
糖尿病を伴う患者の腎臓で見られる変化の幾つかに類似する基底膜の肥厚及び軽い(mild)び慢性巣状糸球体硬化症を示す自発性糖尿病の幾つかのげっ歯類モデル（Ｚｕｃｋｅｒ、ＢＢラット、ＤＢマウス）が存在する（Marliss，E.B.，et  al.，Metabolism  32(Supp.1):1989；Schmitz，P.G.，et  al.，Am．J．Physiol．263(32):F496-F502，1992；Valesquez，M.T.，et  al.，Diabetologia  38:31-38，1995）。しかしながら、これらのモデルは、ヒト糖尿病性ネフロパシーとは異なり、糸球体肥大、まず巣状糸球体硬化症及びタンパク尿を招き、その後に結節形成（キンメルスティール−ウィルソン病変）を伴う重篤な全体的糸球体硬化症及びタンパク尿の発症へ進行する糸球体間質マトリックスの膨張、続く血中尿素窒素レベル及び血漿クレアチニン濃度の上昇を特徴とする末期腎疾患、続く死亡を示さない。
【０００６】
幾つかのマウスモデルにおいて、系統の差異が、糖尿病関連腎障害の重篤性における差異の原因となり得ることが十分認識されている（Zheng，F.，et  al.，Kidney  Inter．54:1999-2007，1998）。したがって、糖尿病を発症しない遺伝的バックグラウンドに存在するために未だ特性化されていない、ラット及びマウスのある特定の系統に糖尿病性ネフロパシーを発症しやすくする因子が存在することが可能である。
【０００７】
腎疾患をかかりやすくする遺伝的因子を保有し得る自発性糖尿病性ラットの１つのかかる系統は、ＧＫラットである。この系統は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の非肥満正常血圧モデルである。ＧＫラットは、２週齢程度と初期にグルコース不耐性（高基底血清インスリンレベル）を示し、また４週齢までにはグルコース負荷の投与後の血漿グルコースレベルの上昇を示す（Portha，B.，et  al.，Diabetes  40:486-491，1991；Ostenson，C.G.，et  al.，Diabetologia  36:3-8，1993；Guenifi，A.，et  al.，Pancreas  10:148-153，1995）。１２週齢までには、ＧＫラットは、空腹時グルコース及びインスリンレベルの上昇及び経口グルコース負荷後の血漿グルコースレベルの長期にわたる上昇を特徴とする明らかなII型糖尿病を示す。数名の研究者等により、ＧＫラットは、糸球体基底膜の肥厚、糸球体間質マトリックスの軽い膨張、糸球体肥大及び軽いび慢性巣状糸球体硬化症を含むほとんどの糖尿病の動物モデルにおいて見られる腎臓における一般的な組織学的変化の幾つかを示すことが報告されている（Yagihashi，S.，et  al.，Diabetologia  15:309-312，1978；Phillips，A.O.，J．Am．Soc．Nephrol．9:639A，1998）。それにもかかわらず、ＧＫラットの広範囲にわたる追跡研究により、老齢のＧＫラットでさえ、重篤な全体的糸球体硬化症及び結節形成、顕著なタンパク尿並びに末期腎疾患（ＢＵＮ及び血漿クレアチニン濃度の上昇）の発症を特徴とする進行性腎疾患を示さないことが示されている（Phillips，A.O.，et  al.，Am．J．Kidney  Dis．37(2):400-410，2001；Riley，S.G.，et  al.，J．Labor．Clin．Med．134(3):304-312，1999）。
【０００８】
糖尿病性ネフロパシーの改良された動物モデルは、糖尿病性ネフロパシーの遺伝的根拠を研究するのに、糖尿病関連障害を発症することに対する感受性に関する新たなバイオマーカー及び診断用試験を同定するのに、並びに糖尿病又は糖尿病性ネフロパシーの進行を変更させ得る新たな薬物及び遺伝子療法（ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ウイルス構築物及び／又は抗体療法）を開発するのに切に必要とされる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者等は、腎疾患を発症するが糖尿病を発症しないＦａｗｎ  Ｈｏｏｄｅｄラットのミトコンドリアゲノム、並びにマーカーＤ２Ｒａｔ１２、Ｄ１１Ｒａｔ９３、Ｄ１６Ｒａｔ１５、Ｄ１９Ｒａｔ５９、ＤＸＭｉｔ４及びＤＸＭｉｔ４２にある２番、１１番、１６番、１９番染色体並びにＸ染色体上の６つの遺伝子座を、II型糖尿病を有するが結節形成を伴う進行性腎疾患を発症しないＧＫラットの遺伝的バックグラウンドへ、戻し交配戦略及び全ゲノム規模の遺伝マーカー利用選抜を使用して導入し、新たなラット系統を創製した。この系統は、II型糖尿病及び末期腎疾患を招く進行性糖尿病性ネフロパシーを発症するII型糖尿病性ネフロパシーミミック（Ｔ２ＤＮミミック）である。
【００１０】
Ｔ２ＤＮミミック及びＧＫFLラットは、これらの２つの系統間で異なるゲノムの領域を確認するために、広範囲に遺伝子型を決定した（ＧＫSwedenラットを使用して、本発明者等の例示的な系統を開発したが、ＧＫFLは、より容易に入手可能であり、またＧＫSwedenラットと本質的に遺伝的に同一であると認められているため、ＧＫSwedenの代わりに比較用に選択した）。この遺伝子型情報は、交配戦略の詳細な説明と一緒に、本発明者等が記載するように、当業者のだれもがＧＫ及びＦＨＨラットからＴ２ＤＮミミック・ラットを完全に反復及び創製するのを可能にする。
【００１１】
本発明者等は、Ｔ２ＤＮミミック対ＧＫFLラットにおける糖尿病の発症、腎臓における組織学的損傷並びにタンパク尿及び糖尿病性ネフロパシーの発症の時間的経過を広範囲にわたって特性化及び比較した。結果により、Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、進行性タンパク尿、糖尿病性ネフロパシー及び腎臓における組織学的損傷（結節性糸球体病変を伴う全体的糸球体硬化症）を発症するのに対して、非許容性遺伝的バックグラウンドにおいて同様の度合いの糖尿病を示すＧＫFLラットは、高齢（２２ヶ月齢、７０歳の人間に等しい）でさえ、糖尿病性ネフロパシーも末期腎疾患も発症しないことが証明される。
【００１２】
本発明の一実施態様は、Ｔ２ＤＮミミック・ラット又は少なくとも２匹のＴ２ＤＮミミック・ラットを含むラットの集団である。本発明はまた、Ｔ２ＤＮミミック・ラットであり、ここで上記ラットは、該ラットが糖尿病であるが、糖尿病性ネフロパシーを発症しないもとのＧＫラット系統からさらなる遺伝物質を有するか、又は遺伝物質を欠如するように改変されている。本発明はまた、Ｔ２ＤＮミミック・ラットを、第２の非糖尿病性ラット系統に交配することにより得られるラットである。本発明はまた、Ｔ２ＤＮミミック・ラット由来の細胞系である。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーに対する試験化合物の効果を評価する方法であって、下記：（ａ）上記試験化合物の非存在下で糖尿病性ネフロパシーを招く進行性タンパク尿及び糸球体硬化症を発症するであろうＴ２ＤＮミミック・ラットに、上記試験化合物を曝露させる工程、及び（ｂ）上記ラットの糖尿病及び糖尿病性ネフロパシーの発症を、上記試験化合物に曝露させていない対照Ｔ２ＤＮミミック・ラットと比較する工程を含む、方法である。
【００１４】
本発明の他の実施態様は、明細書、特許請求の範囲及び図面を参照した後に、当業者に明らかであろう。
【００１５】
本特許又は本願は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を伴う本特許又は本特許出願公開の複写は、要請及び必要な手数料の納付に応じて当局により提供される。
【発明の説明】
【００１６】
概要 
糖尿病性ネフロパシーを自発的に発症する適切な動物モデルの欠如は、糖尿病における進行性腎疾患を防止することができる薬剤、及びこの疾患の基盤となる遺伝子に関する研究を大幅に妨げている。本発明は、II型糖尿病、末期腎疾患及び死亡を招く進行性タンパク尿を自発的に発症する糖尿病性ネフロパシーの動物モデルを供給する。本発明者等が「II型糖尿病性ネフロパシーミミック」に関して「Ｔ２ＤＮミミック」と称したこの動物は、糖尿病性ネフロパシーの研究に、またこの状態を治療及び防止するための薬剤を開発するのに適した動物モデルである。
【００１７】
本発明者等のモデル系を特性化するために、以下の実施例は、II型糖尿病を伴うラットの２つの系統、すなわちＴ２ＤＮミミック及びＧＫFLラット（これらは、ゲノムにわたってアッセイした５４３個のマイクロサテライトマーカーの９７％で同一の対立遺伝子を発現する）における糖尿病及び腎損傷の発症を対比する。インスリン耐性及び糖尿病の時間的経過並びに重篤性は、Ｔ２ＤＮミミック及びＧＫＦＬラットにおいて類似している。しかしながら、Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、６ヶ月齢までに明らかなタンパク尿を発症し、時間とともに進行して、まず糸球体間質マトリックスの膨張及び巣状糸球体硬化症の発症、基底膜の肥厚、血管ヒアリン症(hylanosis)、及び最終的には重篤な全体的結節性糸球体硬化症、並びに末期腎疾患及び死亡を招く。
【００１８】
上述のように、Ｔ２ＤＮミミック・ラットの腎臓の組織学における変化は、糖尿病患者の腎臓で見られるものを密接に模倣する。対比して、糖尿病性ＧＫＦＬラットは、はるかに少ないタンパク尿、基底膜の肥厚、ほんのわずかな度合いの糸球体硬化症を示す。しかしながら、腎疾患及び糸球体硬化症は、２２ヶ月の研究にわたって進行せず、これらのラットは、Ｔ２ＤＮミミック・ラットのような結節性糸球体硬化症及び末期腎疾患を発症しない。この比較により、Ｔ２ＤＮラットは、II型糖尿病性ネフロパシーに適したモデルである一方で、ＧＫFLは、進行性腎疾患を発症しない密接に遺伝的に関連される糖尿病性対照系統として役立ち得ることが示される。この対照系統の有用性により、糖尿病性ネフロパシーの発症における遺伝的感受性に対する糖尿病及び他の代謝因子の効果を分析することが可能である。
【００１９】
Ｔ２ＤＮミミック・ラット 
一実施態様では、本発明は、糖尿病性ネフロパシーを伴う患者にみられるもののような末期腎疾患及び腎キンメルスティール−ウィルソン病変を招く進行性糸球体硬化症及びタンパク尿を発症する糖尿病性ネフロパシーのラットモデルである。本発明者等は、このラットを「Ｔ２ＤＮミミック」ラットと称する。上記ラットはまた、ＧＫSweden遺伝的バックグラウンド上に、Ｆａｗｎ  Ｈｏｏｄｅｄラットのミトコンドリアゲノム、並びにマーカーＤ２Ｒａｔ１２、Ｄ１１Ｒａｔ９３、Ｄ１６Ｒａｔ１５、Ｄ１９Ｒａｔ５９、ＤＸＭｉｔ４及びＤＸＭｉｔ４２にある２番、１１番、１６番、１９番染色体並びにＸ染色体上の６つの遺伝子座を有することを特徴とする。
【００２０】
ラットモデルは、実施例において以下に記載するように、明らかなタンパク尿、巣状糸球体硬化症、糸球体の糸球体間質マトリックスの膨張、腎基底膜の肥厚、血管ヒアリン症及び結節性糸球体硬化症を発症する。
【００２１】
実施例において以下に記載する交配プログラムを行うことにより、Ｔ２ＤＮミミック・ラットが得られ得る。本発明者等は、雄ＧＫSwedenラットと、雌ＦＨＨ／ＥｕｒＭｃｗ（ＦＨＨ）ラットとの異種交配により、Ｔ２ＤＮミミック・ラットを創製する方法を、実施例において以下に記載している。the  Karolinska  Institute（スウェーデン）からＧＫSwedenラットが得られ得る。Charles  River  Laboratories（マサチューセッツ州ウィルミントン）から、Erasmus  University（オランダ、ロッテンダム）から、又はthe  Medical  College  of  Wisconsin（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から、ＦＨＨ／ＥｕｒＭｃｗラットが得られ得る。
【００２２】
本発明者等は、同様に、Charles  River  Laboratoriesで販売されるＧＫFL又はＧＫラットのような他のＧＫ系統を、他のＦＨＨ系統と交配させることにより、Ｔ２ＤＮミミック・ラットを得ることができると信じる。まず、重要なＦＨＨ遺伝子座の対立遺伝子サイズが、本発明者等がＦＨＨ／ＥｕｒＭｃｗラットに関して報告するものと同じであったこと、及び選択したＧＫ系統の遺伝的バックグラウンド及び特徴が、上述のものと類似していたことを確認する必要がある。ＧＫラットは概して、スウェーデンにあるKarolinska  Instituteから得られ得て、ＦＨＨラットは概して、Medical  College  of  Wisconsin、Erasmus  University又はCharles  River  Laboratoriesから得られ得る。
【００２３】
あるいは、少なくとも２０匹の交配対から構成されるＴ２ＤＮミミック・ラットの交配コロニーは、the  Medical  College  of  Wisconsin（ウィスコンシン州ミルウォーキー）で本発明者等により維持されており、最低３０匹の交配対の別個の交配コロニーは、購入可能であり、the  Wood  Memorial  VA  Hospital（ウィスコンシン州ミルウォーキー）においてPhysioGenix  Incによりその動物管理施設で維持されている。最低１５匹の交配対の第３の商業用交配コロニーは、マサチューセッツ州ウィルミントンにおけるCharles  River  Laboratoriesにあるバリアアイソレータ中でPhysioGenicにより維持されている。概して、Ｔ２ＤＮミミック・ラットのこれらのコロニーは、１ヶ月当たり最低１００匹のラットを生み出し、これらは、販売可能であり、３つの交配コロニーを維持するのに利用可能である。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、上記パラグラフで参照したラットに対して遺伝的改変を有するＴ２ＤＮラットである。これらの遺伝的に改変されたＴ２ＤＮミミック・ラットは、遺伝的欠失若しくは付加、又は他の未特性化遺伝的改変を有し得る。Ｔ２ＤＮミミック・ラットに適用される当該技術分野で既知の遺伝的改変プロトコルを使用することにより、かかるラットが得られる。かかる遺伝的に改変されたＴ２ＤＮミミック・ラットを創製する方法の具体例を以下に記載する。
【００２５】
例えば、Ｔ２ＤＮミミックの有用な遺伝的改変は、以下が挙げられる：
【００２６】
１．糖尿病耐性ラット又は糖尿病性ネフロパシー耐性ＧＫFLラットとのＦ２交配でＴ２ＤＮミミック・ラットを使用して、遺伝子マッピング試験を行い、糖尿病、糖尿病性ネフロパシー、糖尿病により誘導される眼疾患（網膜症）、糖尿病性ニューロパシー及び／又は糖尿病に関連した血管及び心臓の末端器官損傷の基盤となる遺伝子を含有するゲノムの領域をポジショナルクローニングすること。
【００２７】
２．６〜１０世代にわたって、量的形質(train)遺伝子座においてクロスオーバーを有するＦ２ラットを、Ｔ２ＤＮミミック・ラットと戻し交配させることにより、Ｆ２集団からＴ２ＤＮミミック・ラットの共通遺伝子系亜系統を創り出して、Ｔ２ＤＮミミック遺伝子的バックグラウンドにおける糖尿病、糖尿病性ネフロパシー並びに眼、心臓及び血管の末端器官損傷を治癒又は増大させるゲノムの小領域を単離すること。Ｔ２ＤＮミミックの共通遺伝子系亜系統を創製する方法の説明は上記に見出される。
【００２８】
一般方法は、Ｔ２ＤＮミミック・ラットを獲得すること、及びそれらを、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（ＢＮ）ラットのような糖尿病耐性系統と交配させることから構成される。Ｆ１ラットを異系交配させて、遺伝子型を決定されるＦ２集団を生じる。以下に記載する遺伝子マッピング研究で同定された糖尿病、糖尿病性ネフロパシー並びに心臓及び血管障害に対する耐性と関連するゲノムの領域においてＢＮ遺伝子を有するラットを、他のＴ２ＤＮミミック・ラットへ戻し交配させる。子ラットの遺伝子型を決定して、所定の(interest)領域に関して依然としてヘテロ接合性であるラットを選択して、別の世代でＴ２ＤＮミミック・ラットと戻し交配させる。所定の領域に関してはヘテロ接合性であるが、ゲノムの全ての他の領域でＴ２ＤＮミミック遺伝子に関してホモ接合性であるラットが獲得されるまで、このプロセスを５〜６世代にわたって繰り返す。この時点で、ラットは交配されて、選択した領域にわたってＢＮ又は他の耐性遺伝子に関してはホモ接合性であり、且つゲノムの残部全体にわたってＴ２ＤＮミミック遺伝子に関してホモ接合性であるラットを生じる。もとのＴ２ＤＮミミック・ラットは、疾患感受性ラットとして役立つ。
【００２９】
ラットは、２４時間の絶食後に血漿グルコースレベルを測定することにより糖尿病に関して、またグルコースの腹腔内投与後にインスリンレベル及び血漿グルコースレベルを測定することによりII型糖尿病に関して表現型決定される。
【００３０】
ラットは、尿を回収すること、並びに様々な時点（１２、１８及び２２ヶ月齢）で、タンパク質の尿排出量及び血漿クレアチニン濃度を測定することにより、糖尿病性ネフロパシーに関して表現型決定される。共通遺伝子系ラットとＴ２ＤＮミミック対照との間に有意な差異が存在した場合、ラットを屠殺して、糸球体疾患及び腎臓損傷の度合いの組織学的評価用に腎臓を調製する。
【００３１】
糖尿病により誘導される血管機能不全は、本発明者等が過去に記載しているように（Yu，et  al.，J．Hypertension  21:1125-1135，2003）、ラットから大動脈を取り出すこと、並びに血管収縮薬であるノルエピネフリン及びバソプレシン(vasospressin)、並びに血管拡張薬であるアセチルコリン及びＤＥＡノノエート（酸化窒素供与体）に対する血管応答を研究することにより評価される。
【００３２】
糖尿病により誘導される心臓機能不全は、心臓を秤量して、心臓肥大の度合いを評価することにより評価される。さらに、心臓を組織学的に調製して、切片を評価して、左心室の壁の面積を測定し、またYu他（２００３年）により過去に記載されるように、心室壁の線維症の度合いを決定する。
【００３３】
これらの共通遺伝子系亜系統は、５０個未満の遺伝子へ所定の遺伝子周辺の領域を狭める。続いて、ほぼ遺伝的に同一である（９９％を上回って類似している）共通遺伝子系（耐性）系統とＴ２ＤＮミミック（感受性）系統との間での差次的に発現される遺伝子を探るｃＤＮＡ及び／又はオリゴヌクレオチド発現アレイを用いて、治療用遺伝子を同定することができる。所定の遺伝子における突然変異は、共通遺伝子系系統及びＴ２ＤＮミミック系統のＤＮＡから単離される遺伝子の直接的なシーケンシングにより確認される。
【００３４】
これらの同定された耐性又は感受性遺伝子は、腎、心臓、血管又は眼の損傷を発症する危険性のある糖尿病患者を特定するための診断試験としてさらに開発することができる。遺伝子はまた、共通遺伝子系系統及びＴ２ＤＮミミック系統から培養される細胞における所定の遺伝子の発現を標準化する化合物（薬剤）を見つけ出すために化学ライブラリーをスクリーニングするための薬剤標的として使用することもできる。これらの化合物は、患者を治療するのに有用である。
【００３５】
治療剤（小分子又は生物製剤）はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉用ＲＮＡ、ウイルス構築物を用いて、共通遺伝子系系統において同定される所定の遺伝子に対して開発することができる（遺伝子治療は、Ｔ２ＤＮミミック系統において標的とされる遺伝子の発現を標準化することを目的とする）。
【００３６】
３．ラットにおいて最近記載されたＥＮＵ突然変異誘発又はジーントラップ戦略で（Zan，et  al.，Nat．Biotechnology  21:645-651，2003）及びマウスにおいて一般的な実施で（Soewato，et  al.，Method  Mol．Biol．209:249-266，2003；Baier，Phys．Genomics  14:111-113，2002；Cox  and  Brown，Curr．Opin．Genet．Dev．13:278-283，2003）Ｔ２ＤＮミミック・ラットを使用して、特定の遺伝子をノックアウトして、糖尿病、糖尿病性ネフロパシー及び／又は糖尿病に関連した心臓、血管、神経及び眼の損傷（糖尿病性ニューロパシー及び網膜症）の発症に耐性である突然変異体を創製すること。あるいは、ＥＮＵ突然変異誘発を用いてＴ２ＤＮミミック系統において遺伝子を無作為にノックアウトすることができ、またＴ２ＤＮミミック・ラットにおいて疾患の臨床的行程を逆転させることができる遺伝子（薬剤標的）における同定された突然変異に対する表現型の変化に関して突然変異体をスクリーニングすることができる。
【００３７】
Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、薬剤若しくは毒素応答又は糖尿病の効果の遺伝的根拠、及び糖尿病性ネフロパシー又は任意の他の所定の表現型（薬剤又は毒素応答、外科的、環境的又は化学的攻撃後の末端器官損傷を発症する心臓、腎臓、血管系又は眼の応答）に対する遺伝的感受性を決定するための組換えパネル（米国特許第１０／３７９，２１７号を参照）において系統の１つとして含ませることができる。
【００３８】
別の実施態様では、本発明は、Ｔ２ＤＮラットを、任意の他のラット系統のラットと交配させて、特有の疾患表現型を有する新たな系統を創製することにより得られるラットである。
【００３９】
例えば、Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、Ｄａｈｌ塩感受性又は自発性高血圧性ラットＳＨＲ（高血圧症）、Ｚｕｃｋｅｒラット（脂質代謝異常(dislipidemia)及び肥満症）、ＢＢラット（Ｉ型糖尿病）のような他の特定疾患形質を有する他の近交系ラット系統、又はMedical  College  of  Wisconsin（pga.mcw.edu）又はCharles  River  Laboratories（マサチューセッツ州ウィルミントン）で入手可能なＤａｈｌ又はＦａｗｎ  Ｈｏｏｄｅｄ  Ｘ  Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙコンソミック系の４４系統（ここで、３００個を超える異なる心臓血管及び代謝形質が特性化されている）と交配させて、シンドロームＸ、高血圧症、肥満症、II型糖尿病、脂質代謝異常及び心臓血管疾患のようなヒト疾患の新たな且つ特有の複雑な動物モデルを創製することができる。
【００４０】
試験化合物の検査 
別の実施態様では、本発明は、糖尿病性ネフロパシーに対する潜在的効果に関して試験化合物を検査する方法である。上記方法は通常、Ｔ２ＤＮミミック・ラットを試験化合物に露出させる工程、及び続いて化合物に露出させていない対照Ｔ２ＤＮラットと比較した場合の糖尿病性ネフロパシーの発症を検査する工程を含む。
【００４１】
この評価に関する典型的なプロトコルは、以下の通りである。
【００４２】
実験は通常、９〜１２ヶ月齢の雄Ｔ２ＤＮミミック・ラットで実施される。糖尿病性ネフロパシーは、雌ラットに対して雄ラットでより大きいため、雄ラットが研究される。ラットは、一側性腎摘出され、６０％ショ糖を含有する精製食事を与えて、糖尿病の度合いを増大させて、一側性腎摘出術とともに、糖尿病により誘導される腎疾患の発症を促進する。
【００４３】
１週間の平衡期間後、血液及び尿サンプルを回収して、ベースライン空腹時グルコース及び脂質レベル、血漿クレアチニン濃度並びにタンパク質及びアルブミン排出量を測定する。
【００４４】
ラット（１群当たり８〜１０匹）を無作為に４つの処理群に割り当てて、低、中若しくは高用量の試験化合物又は賦形剤の強制経口投与(gavage  injection)により経口的に、又は腹腔内若しくは静脈内注射により処理する。薬剤は、薬剤の半減期に依存して１日に１度又は２度投与する。
【００４５】
糖尿病により誘導されるネフロパシーを防止するために試験し得る既知の化合物の典型的な種類としては、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、変換酵素阻害酵素、ＴＧＦβアンタゴニスト及び抗体、成長因子阻害剤、ＰＰａｒ受容体アゴニスト、抗高血圧薬、インスリン感作薬剤等が挙げられる。
【００４６】
中等度範囲用量(mid-range  dose)が、薬物動態的情報及び既知の有効用量（ＥＤ５０）に基づいて選択される。高用量は通常、中等度範囲用量よりも５〜１０倍高く、低用量は通常、中等度範囲用量よりも５倍低い。
【００４７】
ラットは通常、４、８又は１２週間処理される。尿及び血漿サンプルを２週間隔で回収して、血漿クレアチニン濃度（腎機能の指標）、空腹時グルコース及びインスリンレベル（糖尿病の指標）、血漿コレステロール及びトリグリセリドレベル、タンパク質及びアルブミンの尿排出量（腎損傷の指標）を測定する。実験の最後に、ラットをペントバルビタールで屠殺して、血液のサンプルを臨床化学用に回収し、腎臓及び心臓を回収して、秤量し（肥大を測定するため）、ホルマリン中で固定する。サンプルを切片化して、線維性組織（コラーゲン及びフィブロネクチン）を青色に染色するマッソントリクローム染色で染色する。糸球体の直径を測定し、糸球体間質マトリックスでふさがれた糸球体面積のパーセントを、切片１つにつき少なくとも３０個の糸球体に関して、画像解析プログラムを用いてスコア付けする。
【００４８】
また、青色に染色された（間質性線維症）及び赤色に染色された（尿細管におけるタンパク質円柱(cast)）腎面積のパーセントを測定する。タンパク尿、アルブミン尿及び糸球体硬化症の度合い並びに血漿クレアチニン濃度、及び腎線維症及び壊死のパーセントを、薬剤処理群と賦形剤対照群で比較する。処理群間の平均値の差異の有意性は、分散の解析、続くスチューデントニューマンクールズポストホック検定により決定される。糸球体硬化症の進行を低減させるのに有効である薬剤に関して、血漿クレアチニン濃度、尿タンパク質及びアルブミン排出量、並びにマトリックス材料でふさがれた糸球体毛細管面積のパーセントの用量依存的減少を見出すことができる。
【００４９】
本発明の別の実施態様は、II型糖尿病により生じる心臓、血管及び眼の損傷に対する潜在的効果に関して試験化合物を検査する方法である。先の研究者等により、ＧＫラットは、II型糖尿病により生じる心臓、血管及び眼の損傷を決定するための有用なモデルであることが報告されている。Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、ＧＫラットとそのゲノムの９７％を共有し、類似の度合いの糖尿病及びグルコース不耐性を発症するため、試験化合物の、II型糖尿病に関連した血管、心臓及び眼の合併症並びに末端器官損傷を低減させる効果を研究するのに非常に有用なはずである。
【００５０】
典型的な実験では、６週齢のＴ２ＤＮミミック・ラットを、様々な用量の試験化合物又は賦形剤で、１２〜１８週間処理する。試験化合物は、経口的に（強制経口により、若しくは飲料水中で）、又は静脈内若しくは腹腔内注射により、日常的に投与することができる。１２〜１８週の処理の最後に、心臓を秤量し（肥大の度合いを評価するため）、組織学的に切片化して、マッソンのトリクローム染色で染色する。左心室壁の面積を、コンピュータ化された形態測定プログラムを使用して測定して、本発明者等が（Yu，et  al.，J．Hypertension  21:1125-1135，2003）で過去に記載しているように、（コラーゲン及びフィブロネクチンを）青色に染色された組織の面積を測定することにより、左心室壁の線維症及び血管周囲線維症の度合いを評価する。本発明者等は、糖尿病により誘導される心臓損傷を低減させる際に有効な試験化合物が、より軽い心臓(hearth)重量、より薄い心室壁及び左心室のより低度の線維症をもたらすことを見出すことができる。
【００５１】
糖尿病はまた、酸化窒素を放出する内皮依存性血管拡張薬に対して低減された応答を特徴とする内皮機能不全をもたらす。糖尿病により誘導される血管機能不全は、本発明者等が過去に記載しているように（Yu，et  al.，2003）、対照Ｔ２ＤＮミミック及び試験化合物で処理したラットから大動脈を取り出すこと、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでミオグラフにおいて血管輪を載せることにより評価される。血管収縮薬であるノルエピネフリン及びバソプレシン（１０−９〜１０−５Ｍ）並びに血管拡張薬であるアセチルコリン及びＤＥＡノノエート（１０−９〜１０−３Ｍ）に対する大動脈の応答は、本発明者等が過去に記載しているように決定される（上述のYu，et  al.，2003）。不能症、血管不全症（下肢痙攣から壊死及び四肢切断まですべて）を招く糖尿病により誘導される血管機能不全の治療において有効な化合物は、長期にわたる糖尿病を伴うＴ２ＤＮミミック・ラットにおいて、内皮機能不全を改善し、且つアセチルコリン及びブラジキニンに対する血管拡張応答を回復させる。
【００５２】
遺伝的要素の決定 
本発明の別の実施例では、Ｔ２ＤＮミミック・ラット（疾患感受性）のゲノムを、ＧＫＦＬラット（密接に関連のある耐性ラット）又は他の糖尿病耐性系統（例えば、ＢＮラット）と比較して、何の遺伝的要素が、糖尿病性ネフロパシーの発症の原因となり得るかを決定することを望み得る。
【００５３】
例えば、雄Ｔ２ＤＮミミック・ラット（糖尿病性ネフロパシー感受性）を雌Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（糖尿病性ネフロパシー耐性）ラットと交配させて、Ｆ１ハイブリッド集団を創製してもよい。Ｆ１における雄及び雌ラットを交配させて、数百匹（３〜５００）のＦ２子孫を創製する。これらのラットを一側性腎摘出して、６０％ショ糖食事を与える。タンパク尿、アルブミン尿及び血漿クレアチニン濃度の測定用に、尿及び血漿サンプルを６、１２及び１８ヶ月齢で回収する。腎臓を回収して、切片化して、糸球体硬化症の度合いに関してスコア付けする。ゲノム全体にわたって均等に間隔を空けた５００個のマーカーを用いて、ラットの遺伝子型を決定する。腎疾患表現型の連鎖分析を、Ｍａｐｍａｋｅｒプログラムを使用して、ラットすべてに関する遺伝子型を用いて実施する（Lander  and  Kruglyak，Nat，Genet．11:241-247，1995）。
【実施例】
【００５４】
材料及び方法 
Ｔ２ＤＮミミック系統の生成 
Ｔ２ＤＮミミック系統は、腎疾患を発症するが糖尿病を発症しないＦａｗｎ  Ｈｏｏｄｅｄラット（ＦＨＨ／ＥｕｒＭｃｗ）のミトコンドリアゲノム、並びに２番染色体（Ｄ２Ｒａｔ１２）、１１番染色体（Ｄ１１Ｒａｔ９３）、１６番染色体（Ｄ１６Ｒａｔ１５）、１９番染色体（Ｄ１９Ｒａｔ５９）、Ｘ染色体（ＤＸＭｉｔ４）及びＤＸＭｉｔ４２）上の遺伝子座を、II型糖尿病を有するが腎疾患を発症しないＧＫSweden系統のラットの遺伝的バックグラウンドへ導入することにより創製することができる。本発明者等は、the  Karolinska  Institute（スウェーデン）から得られる雄ＧＫSwedenラットを、雌ＦＨＨ／ＥｕｒＭｃｗラット（Medical  College  of  Wisconsin）と交配させて、ＦＨＨラットのすべての常染色体遺伝子及びミトコンドリアゲノムにてＦＨＨの１コピー及びＧＫSwedenの１コピーを有するＦ1世代を生じた。雌Ｆ1ラットを雄ＧＫSwedenラットと戻し交配させて、Ｎ２世代を創製した。ゲノムにわたって最も多くのＧＫSweden対立遺伝子を有し、且つＤ１１Ｒａｔ９３、Ｄ１６Ｒａｔ１５、Ｄ１９Ｒａｔ５９、Ｄ２Ｒａｔ１２、ＤＸＭｉｔ４及びＤＸＭｉｔ４２に関してヘテロ接合性である雌Ｎ２ラットを、全ゲノムマーカー利用選抜戦略を用いて選択して、雄ＧＫSwedenラットと戻し交配させて、Ｎ３世代を創製した。このプロセスをさらに５回戻し交配世代を繰り返した。その後、Ｎ６世代の雄及び雌ラットを異系交配させて、Ｔ２ＤＮミミック系統を創製した。
【００５５】
戻し交配の各世代における遺伝子選択は、雌からＤＮＡを抽出することにより実施され、各ラットは、２０個の常遺伝子及びＸ染色体に沿って、ＧＫSwedenとＦＨＨとの間で多型である１８０個のマイクロサテライトマーカーでＰＣＲにより遺伝子同定された。各ラットにおいて保持されるＧＫSweden対立遺伝子のパーセントが決定され、続いて、最も多くＧＫSweden対立遺伝子（２．Ｓ．Ｄ．）を保有する雌を選択して、雄ＧＫSwedenラットと戻し交配させた。この交配戦略は、第１の異系交配で使用される雌ＦＨＨラットから受け継がれるミトコンドリアＤＮＡを除いて、もとのＧＫSwedenゲノムの大部分の高速固定を可能とし、また上記説明で言及されるＦＨＨからの６つのマーカーを保持した。
【００５６】
本発明の表現型同定研究は、第１のＧＫSweden−ＦＨＨ異系交配後のラットの９〜１２世代で得られるラットに関して実施された。「Ｔ２ＤＮミミック系統」とは、本発明者等は、ＧＫラットの主として固定される遺伝的バックグラウンドにおいて、ＦＨＨのミトコンドリアゲノム及び上記及び下記に記載するさらなる対立遺伝子を有する近交系系統のラットを意味する。本発明者等は、本発明者等の研究室で開発したＴ２ＤＮミミック・ラットの特定の系統をＴ２ＤＮミミックmcwと称する。
【００５７】
Ｔ２ＤＮミミックmcw及びＧＫFLラットの遺伝的比較 
Ｔ２ＤＮミミック・ラットとＧＫFLラット（フロリダ州タンパのthe  VA  Medical  CenterにあるDr．Robert  V．Fareseから購入）との間の遺伝的関連性の度合いを決定するために、及びＴ２ＤＮミミック系統で保持されるＦＨＨゲノムの度合いを評価するために、ゲノムに沿って均等に間隔を空けた５４３個のマイクロサテライトマーカーを用いた全ゲノムスキャンを実施した。選択したマーカーは、ＧＫFLラットとＦＨＨラット間で多型であり、本発明者等の研究で特性化された４７匹のラット系統の間で高度な多型を示し（Steen，et  al.，Genome  Res．9:1-8，1999）、ＧＫ系統間での多型の検出の可能性を最大限にした。
【００５８】
遺伝子型決定 
（１００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ８．５、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０μｇプロテイナーゼＫ）を含有する溶解緩衝液５００μＬ中で５５℃にて一晩インキュベートした尾部の１ｍｍ切片からＤＮＡを抽出し、続いてイソプロパノール沈殿を行い、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で再懸濁させた。ＤＮＡを最終濃度５ｎｇ／μＬに希釈した。ＰＣＲを用いてラットの遺伝子型を決定した。ＰＣＲに先立って、プライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(inase)（NEB，Beverly，MA）を用いて32Ｐ−γ−ＡＴＰで放射標識した。過去に記載されるように（Jacob，H.J.，et  al.，Nat．Gene．9:63-69，1995）、ＰＣＲを実施して、生成物を６％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動的に分離した。
【００５９】
Ｔ２ＤＮミミック糖尿病及びグルコース不耐性の特性化 
雄Ｔ２ＤＮミミックMCW、ＧＫFL及びＢＮラットを、３、６、９及び１２ヶ月齢で腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）に付した。空腹時（１２時間）グルコースレベルの決定後、動物に２．８Ｍ  グルコース溶液１ｇ／Ｋｇを腹腔内注射した。続いて、血液サンプル１０μＬを、グルコース負荷の投与後３０、６０、９０及び１２０分で尾部切開により採血して、血漿グルコースレベルを測定して、グルコースメータ（Bayer  Corp.，Elkhart，IN）で読取った。
【００６０】
タンパク尿 
Ｔ２ＤＮミミックMCW、ＧＫFL及びＢＮラットを、１、３、６、９、１２及び１８ヶ月齢で、代謝ケージに入れ、尿を２４時間回収した。尿中の総タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（BioRad，Hercules  Ca）を用いて比色分析で決定した（Bradford，D.M.，Anal．Biochem．72:248-254，1976）。
【００６１】
脂質プロフィールの決定 
血清コレステロール及びトリグリセリド濃度を、Ｔ２ＤＮミミック及びＧＫFLラットにおいて、３、６、９及び１２ヶ月齢で比較した。この目的で、ラットを一晩絶食させて、血液５００〜７００μＬを尾部静脈から回収した。総コレステロール及びトリグリセリドを、Sigma  Diagnostics，St．Louis，MOからのキットを用いて決定した。
【００６２】
組織学 
腎組織学を、１、６、１２、１８及び２２〜２４ヶ月齢で屠殺したＴ２ＤＮミミックMCW、ＧＫFL及びＢＮラットで評価した。右側の腎臓を取り出して、秤量した後、１０％ホルマリン溶液中で固定し、続いてパラフィン中に包埋した。２つの４μｍ厚の切片を、各腎臓から調製して、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色及び／又はマッソントリクローム染色で染色した。切片は、血管障害の度合い、腎間質性線維症及び糸球体硬化症の度合い並びに糸球体における糸球体間質マトリックスの膨張に関して、光学顕微鏡法により検査した。個々の糸球体における病変を０〜４＋のスケールでスコア付けし、０は、正常な糸球体を表し、１＋以上は、糸球体ふさ状分岐(glomerular  tuft)における毛細血管の２５％損失を表し、２＋は、５０％損失を表し、３＋は、７５％損失を表し、４＋は、硬化した糸球体ふさ状分岐における毛細血管の７５％を超える損失を表した。腎臓１個当たり総計３０〜３５個の糸球体を分析して、平均スコア（硬化症指標）を算出した。糸球体容量も、極大平面面積法(Maximal  Planar  Area  method)の変法を用いて決定した（Pagtalunan，M.E.，et  al.，Kidney  Internat．57:2644-2649，2000）。糸球体周界のデジタル方式迂回のために、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトウェアを適用した。
【００６３】
結果
Ｔ２ＤＮミミック・ラットの遺伝子型
Ｔ２ＤＮミミック・ラット系統は、５４３個のマイクロサテライトマーカーを用いて、広範囲の全ゲノムスキャンで特性化された。遺伝子型は、ＦＨＨ対立遺伝子に関して依然としてヘテロ接合性である２番染色体（Ｄ２Ｒａｔ１２）、１１番染色体（Ｄ１１Ｒａｔ９３）、１６番染色体（Ｄ１６Ｒａｔ１５）、１９番染色体（Ｄ１９Ｒａｔ５９）及びＸ染色体（ＤＸＭｉｔ４及びＤＸＭｉｔ４２）上の６つの遺伝子座を現した。これらマイクロサテライトマーカーと最も近接したマイクロサテライトマーカーとの間のゲノム間隔を仮定して、本発明者等は、ＦＨＨゲノムの最大１％未満が、Ｔ２ＤＮミミック系統における常染色体（１〜２０、＋Ｘ）上に保持されたと推定する。さらに、雌ＦＨＨラットを使用して、この交配でＦ１ラットを生じたため、Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、依然としてＦＨＨラットのミトコンドリアＤＮＡを保有する。この主張は、Ｔ２ＤＮミミックのミトコンドリアゲノムをシーケンシングすること、並びにそれをＧＫ及びＦＨＨラットのミトコンドリアゲノムと比較することにより確認された。
【００６４】
ＧＫFLラット
また、全ゲノムスキャンを行って、糖尿病性ネフロパシー感受性Ｔ２ＤＮミミックと糖尿病性ネフロパシー耐性ＧＫFL系統との間で同じ５４３個の多型マーカーを比較した。結果により、これらの２つの系統間で、試験した５４３個のマーカーにわたって８つの遺伝的差異が存在することが示される。３つの差異は、マーカーＤ３Ｒａｔ５７、１１番（Ｄ１１Ｍｇｈ５）及び１２番（Ｄ１２Ｒａｔ２２）にて存在した。５つのさらなる差異は、１番染色体上で、互いに３０ｃＭ以内のマーカーＤ１Ｒａｔ２９１、Ｄ１Ｍｉｔ１８、Ｄ１Ｍｉｔ３４及びＤｉＭｇｈ１２にて同定された。Ｄ１Ｒａｔ１８５にある５番目の差異は、１番染色体上のテロメアから５７ｃＭでマッピングされた（図１）。これらの５つのマーカーは、試験したゲノムの最大２％を表す。全体的な遺伝子型決定の結果により、糖尿病性ネフロパシー感受性Ｔ２ＤＮミミック及び糖尿病性ネフロパシー耐性ＧＫFL系統は、全ゲノムにわたってすべてのマイクロサテライトレベルで９７％同一であることが示される。
【００６５】
Ｔ２ＤＮミミック系統及びＧＫFLラットにおける糖尿病並びにグルコース不耐性の発症の比較
ベースライン空腹時グルコースレベルは、６ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック系統及びＧＫFLラットの両方において２００ｍｇ／ｄｌを上回って上昇し、ＢＮラットで見られる値を有意に超えた（図２）。しかしながら、研究中のいずれの時点で、ＧＫ及びＴ２ＤＮミミック系統で見られる空腹時グルコースレベルにおいて有意な差異は存在しなかった。ＧＫFL及びＴ２ＤＮミミック系統はともに、グルコース負荷の腹腔内注射後の血漿グルコースクリアランス回復の増加面積に示されるように、グルコース不耐性を示した。グルコース不耐性の度合いは、３ヶ月齢ではＧＫFLラットに対してＴ２ＤＮミミック系統においてわずかに大きかったが、６及び９ヶ月齢のＧＫFL並びにＴ２ＤＮミミック・ラットにおいては、有意な差異は観察されなかった。１２ヶ月齢では、Ｔ２ＤＮミミック・ラットは、ＧＫFLラットで見られるよりも２０〜３０％大きいグルコース不耐性を示した。
【００６６】
Ｔ２ＤＮミミック系統及びＢＫｆ１ラットにおける腎疾患の進行
タンパク尿
Ｔ２ＤＮミミック系統ラットにおけるタンパク尿の長期的なスクリーニング（図３）により、１ヶ月齢では、タンパク尿は、Ｔ２ＤＮミミック・ラット、ＧＫFL及び対照Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラット（ＢＮ）で類似することが示される。タンパク尿は、３ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック及びＧＫFLラットで、有意に上昇するようになった。タンパク尿の度合いは、時間とともに（図３）、またタンパク尿が１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック系統で２９７．４±１７．１ｍｇ／日に達するまで進行する。ＧＫFLラットでは１２ヶ月齢で重篤なタンパク尿を発症しない。タンパク尿はまた、Ｔ２ＤＮミミック系統及びＧＫFLラットの交配から生成されるＦ１子孫の群でも測定した。ＢＮ及びＧＫＦＬラットで観察されたものと同様に、タンパク尿は、Ｆ１ラットが１２ヶ月齢である場合に、ＢＮラットに対してのみ有意に上昇するようになり、この時点で、Ｔ２ＤＮミミック・ラットで見られるものと比較した場合に、依然として非常に低かった。
【００６７】
Ｔ２ＤＮミミック・ラットが、末期腎疾患を招く進行性腎疾患を発症するかどうかを決定するために、本発明者等は、１８ヶ月齢のＢＮ、ＧＫFL及びＴ２ＤＮミミックMCWラットにおいて、タンパク尿及び血漿クレアチニン濃度を測定した。結果を図４に示す。血清クレアチニン濃度は、ＢＮラットに対して、１８又は２２ヶ月齢のＧＫFLラットにおいて増加せず、それらは、ＥＳＲＤを招く進行性腎疾患を示さないことを示した。対比して、１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラット対１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットでは、タンパク尿は、３００〜５００ｍｇ／日を上回って増加し、糖尿病性ＧＫFLラットで見られる値よりも有意に高かった（図４）。さらに、血漿クレアチニンレベルは、１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラット対１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットでは、０．６±０．１〜１．７±０．１ｍｇ／ｄｌへ上昇したが、ＧＫFLラットでは正常な範囲内のままであった。
【００６８】
腎臓における組織学的変化
Ｔ２ＤＮミミック系統の腎臓の組織学的分析は、広範囲の糸球体及び尿細管障害を特徴とする進行性腎疾患の広範囲のパターンを現した。図５Ｅに示されるように、１２ヶ月齢での糸球体損傷の主要形態は、糸球体肥大（図５Ｂ）、巣状分節性糸球体硬化症であり、糸球体間質マトリックスの膨張及び毛細血管の充填に関連したボーマン嚢への糸球体ふさ状分岐の局所的な付着を伴う（図５Ｅ）。１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック系統ラット及び１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック系統ラットの腎臓において、糸球体及び尿細管基底膜の両方の顕著な肥厚が見られる（図５Ｃ及び図５Ｄ）。
【００６９】
１２ヶ月齢では、Ｔ２ＤＮミミック系統における糸球体はまた、糸球体間質マトリックスの膨張及びＰＡＳ陽性物質の出現も示した。この糸球体間質マトリックスの膨張は、Ｔ２ＤＮミミック系統ラットが１８ヶ月齢である場合、Ｔ２ＤＮミミック系統ラットでさらに一層顕著であり、重篤な全体的糸球体硬化症を示すほぼあらゆる糸球体における糸球体毛細血管のほとんど完全な閉塞を伴う（図５Ｆ）。より重要なことに、多くの糸球体で、糸球体において不均整の無細胞結節を見出すことができ（図６及び図７）、これは、ヒトにおける糖尿病性ネフロパシーの特徴であるキンメルスティール−ウィルソン結節に類似する。
【００７０】
対比して、１８ヶ月齢又は２４ヶ月齢でさえも、ＧＫFLラットは、ほんの限られた度合いの糸球体間質マトリックスの膨張及び巣状糸球体硬化症を示した。障害の度合いは、ＢＮラットにおける正常な老齢化に関連した障害の度合いよりも大きくない。ＧＫFLは、糸球体における結節性病変を形成しなかった（図８）。しかしながら、ＧＫFLは、糸球体及び近位の尿細管基底膜の肥厚、並びに糖尿病性ネフロパシーを発症しない糖尿病の多くのモデルで見られる腎臓における一般的な変化である糸球体の肥大を依然として示した。
【００７１】
Ｔ２ＤＮミミック、ＧＫFL及びＢＮラットにおける糸球体肥大の度合いの比較を図９に示す。糸球体の直径は、ＢＮラットに対して、６ヶ月齢及び１２ヶ月齢のＧＫFL並びにＴ２ＤＮミミック・ラットでは有意に大きかった。どの年齢でも、ＧＫFL及びＴ２ＤＮミミック・ラットにおける糸球体の大きさにおいて、有意な差異は見られなかった。
【００７２】
図１０に示すように、６ヶ月齢のＧＫ及びＴ２ＤＮミミック系統は、同様の度合いの糸球体硬化症を示した（それぞれ、０．５１±０．０４及び０．４１±０．０２）。ラットが１２ヶ月齢の時点では、糸球体損傷の度合いは、ＧＫFLラットよりもＴ２ＤＮミミック・ラットにおいて有意に大きい。２２〜２４ヶ月齢では、Ｔ２ＤＮミミックは、３．５±０．２のほぼ１００％の障害スコアを示したのに対して、ＧＫラットは、依然として０．６±０．１を平均とするほんの緩やかな糸球体障害を示し、これはＢＮラットで見られるものと同等である。
【００７３】
脂質代謝異常
１２ヶ月齢の雄Ｔ２ＤＮミミック系統ラットにおける血清コレステロールレベルは、１７０．４±１４．０ｍｇ／ｄＬを平均とし、年齢を適合させた雄ＢＮラットで測定されたレベル４１．７±１．４ｍｇ／ｄＬよりも４倍高い（図１０）。血清トリグリセリド濃度もまた、年齢を適合させた対照ＢＮラットで見られる値（３４．０±５．１ｍｇ／ｄＬ）と比較して、１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック系統ラットで高い（１５７．６±２３．８ｍｇ／ｄＬ）。１２ヶ月齢の雄ＧＫラットでは、血清トリグリセリド（１０８±３ｍｇ／ｄＬ）及びコレステロールレベル（６６±６ｍｇ／ｄＬ）はともに、年齢を適合させたＴ２ＤＮミミック系統ラットで得られた相当する値よりも有意に低い。それにもかかわらず、これらの値は、年齢を適合させた雄ＢＮラットで見られる値に対して依然として高かった（図１０）。タンパク尿及び脂質代謝異常の度合いは、図１１に示すように、Ｔ２ＤＮミミック系統ラットで強力に相関される。
【００７４】
論考
この研究は、同等の度合いのII型糖尿病を発症するＴ２ＤＮミミック及びＧＫFLラットにおける糖尿病性ネフロパシーの発症を特性化した。早期発症の糖尿病後、明らかなタンパク尿が、６ヶ月齢までにＴ２ＤＮミミック系統ラットで発症し（＞５０ｍｇ／日）、ラットがより高齢になるにつれ、タンパク尿の度合いは、徐々により重篤になる。これは、Ｔ２ＤＮミミック・ラットが１８ヶ月齢の時点までに、糸球体の肥大、糸球体及び尿細管の基底膜の肥厚、糸球体間質マトリックスの膨張、並びに巣状糸球体硬化症、続く全体的糸球体硬化症の発症及び多くの糸球体における結節の形成を伴う。対比して、ＧＫFLラットは、糖尿病の重篤性の同様の時間的経過を示すが、この系統は、２２ヶ月齢でさえも、肥大並びに糸球体及び尿細管の基底膜の肥厚を示すが、結節形成を伴う重篤なタンパク尿又は糖尿病性糸球体硬化症を発症しない。
【００７５】
Ｔ２ＤＮミミック系統とＧＫFLラットとの間のタンパク尿の発症及び糸球体疾患の重篤性における差異は、遺伝的バックブラインドにおける小さな差異に起因する可能性が最も高い。これらのラットは、ゲノムにわたって試験した５４３個のマイクロサテライトマーカーの９７％で遺伝的に同一である。Ｔ２ＤＮミミック系統において２〜３個の残存ＦＨＨ対立遺伝子が存在する。これらの対立遺伝子は、系統間の遺伝的差異に約１％起因する。
【００７６】
同様に、糖尿病感受性Ｔ２ＤＮミミックと糖尿病耐性ＧＫFL系統との間で、１番染色体上に差異が存在する。５個の遺伝子マーカーの対立遺伝子サイズにおける５つの差異は、１番染色体上の５７ｃＭゲノム分節周辺に密集していた。他の点では同質遺伝子的バックグラウンドにおけるこの領域で見出される広範囲の多型は、ＧＫFLと、本発明者等がＴ２ＤＮミミック及びＧＫFL系統において現時点で理解している２つのハプロタイプ形態を生じたＧＫSwedenラットとの間に遺伝的差異が存在することを示唆している。この見解は、概して１番染色体のこの領域に位置するＧＫラットにおけるII型糖尿病に関する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）が存在することを明らかにした過去の研究（Galli，J.，et  al.，Nat．Genet．12:31-37，1996；Gauguier，D.，et  al.，Nat．Genet．12:38-43，1996）を考慮して特に重要である。Ｎｉｄｄｍ１と称されるこのＱＴＬは、ＧＫラットにおいて高血糖症を決定する際の主要因子であることが共通遺伝子系統において確認されている（Galli，J.，et  al.，Diabetes  48(12):2463-2470，1999）が、腎疾患又は他の糖尿病に誘導される末端器官損傷の発症を決定する際のその役割は未知である。
【００７７】
本発明者等は、Ｔ２ＤＮミミック系統ラットにおける明らかなタンパク尿の発症に先だって、３ヶ月齢でＴ２ＤＮミミック系統及びＧＫFLラットの両方において、糸球体の有意な拡大を見出している。これらの見解は、糖尿病のほとんどの実験モデルで一般的に報告される糸球体肥大及び基底膜の肥厚を、ＧＫラットが示すという先の報告（Yagihashi，S.，et  al.，Diabetologia  15:309-312，1978；Phillips，A.O.，J．Am．Soc．Neph．9:639A，1998；Riley，S.G.，et  al.，J．Lab．Clin．Med．134(3):304-312，1999）を確証するようである。Ｔ２ＤＮミミック系統ラットにおける腎疾患の自然の成り行きは、ヒト糖尿病性ネフロパシーの自然の成り行きと密接に平行する。糸球体及び尿細管の肥大といった腎構造異常は、初期の年齢ですでに観察され、タンパク尿の発症に先行する。タンパク尿の発症後、糸球体及び尿細管病変は、タンパク尿の進行に平行して発症する。１２ヶ月齢でのＴ２ＤＮミミック系統ラットにおける糸球体損傷の最も一般的な提示は、重篤な巣状分節性糸球体硬化症であり、糸球体間質マトリックスの膨張、開口糸球体毛細血管管腔の閉塞及び幾つかの糸球体における結節性病変の形成を伴う。ラットが１８ヶ月齢の時点までには、ほとんどの糸球体における糸球体間質マトリックスのさらなる膨張（重篤な巣状硬化症(global  sclerosis)）及び多くの糸球体における多くの巨大無細胞結節の形成が見られる。したがって、結節性糸球体硬化症の存在は、長期にわたる（１２ヶ月を超える）糖尿病を伴うＴ２ＤＮミミック系統ラットにおいて明らかに認識され、これは糖尿病を伴う患者におけるこれらの病変の発症と一致するパターンである（Olsen，S.，Nephrol．Dial．Transplant．14:1846-1849，1999；Parving，H.H.，et  al.，「Diabetic  Nephropathy」，In  Brenner  and  Rector's  The  Kidney  6th  Edition，W.B.  Saunders  Company，pp.1731-1773，2000）。ＧＫFLラットは、重篤な生涯にわたる糖尿病に直面していても、２２ヶ月齢でさえ、重篤な糸球体硬化症又は糸球体結節を発症しなかった。したがって、Ｔ２ＤＮミミックは、結節性糸球体硬化症の形成を伴う進行性腎疾患を発症する自発性糖尿病の第１の動物モデルを表す。
【００７８】
Ｔ２ＤＮミミック系統及びＧＫFLラットはともに、１２ヶ月齢のラットにおいて高レベルの血清コレステロール及びトリグリセリドにより反映されるような幾らかの度合いの脂質代謝異常を発症する。Ｔ２ＤＮミミック系統ラットでは、タンパク尿及び脂質代謝異常は、強く相関される。この観察は、脂質代謝異常と糖尿病性ネフロパシーの進行との間で強い相関を実証する糖尿病患者における過去の結果（Krolewski，A.S.，et  al.，Kidney  Intern．45(Suppl.45):S125-S131，1994；Breyer，J.A.，et  al.，Kidney  Intern．50:1651-1658，1996）と一致する。興味深いことに、ＧＫFLラットは、より緩やかな形態の脂質代謝異常を示す。これは、これらのラットで観察されるより緩やかなタンパク尿及び腎疾患の欠如を反映する可能性が高い。それはタンパク質結合の損失に起因する脂質代謝における異常性を誘発する血漿タンパク質の損失であるという概念を、これらのデータは支持するようであり、またこれは、ＥＳＲＤのほとんどの形態におけるタンパク尿と脂質異常性との間の密接な関連性を説明する（Keane，W.F.，et  al.，Kidney  Intern．42(Suppl.38):S134-S138，1992；O'Donnel，M.P.，et  al.，Am．J．Kidney  Dis．22(1):83-89，1993；Shohat，J．and  Boner，G.，Israeli  J．Med．Sci．29:228-239，1993）。
【００７９】
要約すると、本研究は、自発性ＮＩＤＤＭの第１のげっ歯類モデルを特性化した。Ｔ２ＤＮミミック系統は、結節の形成及びＥＳＲＤを招く進行性タンパク尿及び糸球体硬化症を発症する。本研究はまた、糖尿病を発症するが、進行性タンパク尿及び腎疾患の発症に対して耐性である密接に関連する対照系統のＧＫFLラットを同定した。常染色体において別個の遺伝的差異が存在し、ミトコンドリアゲノムは、これらの２つの系統のラット間で完全に異なっている。遺伝的差異は、Ｔ２ＤＮミミック及びＧＫFLラットにおいて、系統が糖尿病性ネフロパシーを発症する感受性における差異を決定する可能性が高い。感受性Ｔ２ＤＮミミックと糖尿病耐性ＧＫFL系統との間の小さな遺伝的差異が、これを糖尿病関連腎疾患の遺伝的分析、並びに糖尿病の持続及び重篤性と腎疾患の遅延発症及び進行との間の関係の分析用の理想的なモデルとする。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、ラット１番染色体の概略図である。領域中に存在するマイクロサテライトマーカーが表示される。Ｔ２ＤＮミミック・ラットとＧＫFLラットとの間で多型であると同定された５つのマイクロサテライトを楕円で強調し、黒矢印は、各マーカーの個々の染色体投射を示す。ＧＫFLラットにおけるインスリン非依存性糖尿病（II型）にこれまで関連されているこのゲノム範囲もまた強調している（Galli，J.，et  al.，Nat．Genet．12:31-37，1996；Gauguier，D.，et  al.，Nat．Genet．12:38-43，1996）。
【図２】図２は、Ｔ２ＤＮミミック・ラット及びＧＫFLラットにおけるII型糖尿病の発症の比較を表す図である。１群当たり総計７匹の動物をあらゆる月齢で試験した。図２Ａ〜Ｄにおいて、腹腔内グルコース負荷（ＩＰＧＴＴ）後の血漿グルコース濃度の変化を示す。図２Ｅにおいて、ＩＰＧＴＴ曲線下の面積の帯列（プログレッション）を示す。*＝月齢を適合させたＧＫＦＬと異なる（ｐ＜０．０５）。
【図３】図３は、Ｔ２ＤＮミミック・ラット、ＧＫFLラット、及びＴ２ＤＮミミック×ＧＫFLのＦ１交配種並びにＢＮ対照ラットにおける進行性タンパク尿の発症を比較する図である。各群において、７匹の動物を試験した。*＝ＢＮラットと異なる、ｔ＝ｐ＜０．０５。Ｔ２ＤＮミミック・ラット対ＧＫFLラット。Ｔ２ＤＮミミック×ＧＫFL  Ｆ1；＃＝ＧＫFLと異なる（ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、１２ヶ月齢及び１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック、ＧＫFL及びＢＮラットにおけるタンパク尿の進行並びに血漿クレアチニン濃度の変化を比較する図である。
【図５】図５は、Ｔ２ＤＮミミック・ラットで発症する腎組織学的病変を示す図である。糸球体の直径は、月齢を適合させた１２ヶ月齢の非糖尿病性ＢＮ対照ラット（図５Ａ）よりもＴ２ＤＮミミック・ラット（図５Ｂ）において著しく大きい。糸球体及び尿細管基底膜の顕著な肥厚が、１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットにおいて光学顕微鏡法で観察される（それぞれ図５Ｃ及び図５Ｄ）。これらの変化は、対照ＢＮラットでは見られない。Ｔ２ＤＮミミック・ラットにおいて６ヶ月齢で観察される最も初期の糸球体病変は、巣状分節性硬化症である（図５Ｅ）。糸球体間質マトリックスの膨張は、ラットが１８ヶ月齢になるまでには腎臓全体にわたってほとんどの糸球体においてほぼすべての毛細血管の閉塞を伴うＴ２ＤＮミミック・ラットが重篤な全体的糸球体硬化症を示すまで進行し続ける（図５Ｆ）。
【図６】図６は、１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットにおける結節性糸球体硬化症の発症を示す図である。糸球体間質マトリックスの広範囲にわたる膨張及び無細胞結節の形成（細い矢印）を示す３つの糸球体を示す（図６Ａ〜Ｃ）。周辺の腎細動脈におけるヒアリン堆積もまたこの月齢で存在する（太い矢印）。
【図７】１８ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットの糸球体におけるキンメルスティール−ウィルソン病変の倍率を高くした図を示す。
【図８】２２ヶ月齢のＧＫFLラットの腎臓における重篤な糸球体硬化症の欠如を示す図である。これらのラットは、基底膜の肥厚及び糸球体肥大を示すが、ほんの軽度の糸球体間質マトリックス膨張及び糸球体硬化症を示す。
【図９】ＧＫFL、Ｔ２ＤＮミミック及びＢＮラットにおける糸球体の直径の比較を示す図である。糸球体の直径は、６ヶ月齢及び１２ヶ月齢で、ＢＮラットよりもＧＫFL及びＴ２ＤＮミミック・ラットにおいて著しく大きい。ＧＫFL及びＴ２ＤＮミミック・ラットの腎臓における糸球体肥大の度合いに差は見られない。
【図１０】Ｔ２ＤＮミミック及びＧＫFLラットにおける糸球体硬化症の度合いの比較を示す図である。スコアは、腎臓１つにつきスコア付けされる３０〜３５個の糸球体における平均損傷スコアを表す（０は、毛細血管に対する損傷なしを示し、２は、毛細血管面積の５０％損失を表し、４は、糸球体毛細血管の完全な損失を表す）。各群において７匹のラットを６ヶ月齢で分析した。１２ヶ月齢では、６匹のＧＫFL及び８匹のＴ２ＤＮミミック・ラットを分析した。１８ヶ月齢では、４匹のＧＫFL及び４匹のＴ２ＤＮミミック・ラットを比較した。*＝６ヶ月齢で適合させた群と異なる。＃＝ＧＫFLと異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１１】Ｔ２ＤＮミミック、ＧＫFL及びＢＮラット間の血清脂質プロフィールの比較を示す図である。１２ヶ月齢のＢＮ（ｎ＝１０）、ＧＫFL（ｎ＝６）及び雄Ｔ２ＤＮミミック（ｎ＝３２）ラットにおける血清コレステロール（Ａ）及びトリグリセリド濃度（Ｂ）を示す。*＝ＢＮと異なる。＃＝ＧＫFLと異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２は、１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットにおけるタンパク尿と脂質代謝異常との間の相関を示す図である。図１１Ａは、タンパク尿及び血清コレステロールレベルの直線回帰を示す（ｎ＝４４）。図１１Ｂは、１２ヶ月齢のＴ２ＤＮミミック・ラットにおけるタンパク尿と脂質代謝異常との間の相関を示す図である。タンパク尿及び血清トリグリセリドレベルの直線回帰を示す（ｎ＝４４）。（ｐ＜０．０５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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