(57)【要約】本発明は、表現型臨床的カットオフにより実施される表現型と遺伝子型のデータ対の包括的解析に基づき抗ウイルス剤の有効性を決定するアルゴリズムを開発する方法を提供する。一態様において、アルゴリズムは、有効な治療を患者に施すことを可能にする。それは、感染個体が抗ウイルス化合物による治療に反応するかを予測するのに役立ち、それにより、患者が無用な副作用を受けることがないように有効な治療法をデザインすることが可能になる。また、効果のない薬剤の投与を回避することにより、時間と資金がかなり節約される。
2006506967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVによりコードされるプロテアーゼが、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該プロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95に呈するか否か否かを検出することを含み、該突然変異の存在により、該HIVが該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆されるが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記方法。
【請求項２】
HIVに感染した個体がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該個体から得たサンプルにおいて、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該HIVのプロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95で検出することを含み、該突然変異の存在により、該個体が該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆されるが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記方法。
【請求項３】
HIVがプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVによりコードされるプロテアーゼが、V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V、およびC95Fよりなる群から選択される突然変異の存在または不存在を呈するか否かを検出することを含み、該突然変異が、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連し、そして該突然変異の存在により、該HIVが該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆される、上記方法。
【請求項４】
HIV中のHIVプロテアーゼの一部分をコードする約10〜約40塩基長の単離されたオリゴヌクレオチドであって、該HIVプロテアーゼが、該ヒト免疫不全ウイルス中の該プロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95に突然変異を含み、該突然変異はプロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連するが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
コドン11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95に突然変異を含むHIVプロテアーゼの一部分をコードする約10〜約40塩基長の単離されたオリゴヌクレオチドであって、該突然変異は該プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連するが、但し、該コドンは位置32にVをコードせず、位置46にIもLもコードせず、位置47にVをコードせず、位置50にVをコードせず、位置54にLもMもコードせず、位置84にVをコードしないものである、上記オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
HIVがプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、
該HIVによりコードされるプロテアーゼが、表1に列挙される1つ以上のHIVプロテアーゼ突然変異の存在または不存在を呈するか否かを検出すること、及び
該突然変異に表4に提供される一連の規則を適用することを含み、
上記一連の規則が満たされた場合、該HIVは該プロテアーゼ阻害剤による治療に対して耐性を示す可能性が高くなっている、上記方法。
【請求項７】
HIVに感染した個体がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、
該個体から得たサンプルにおいて、表1に列挙される1つ以上のHIVプロテアーゼ突然変異の存在または不存在を検出することと、
該突然変異に表4に提供される一連の規則を適用することと、
を含み、
該一連の規則が満たされた場合、該個体は該プロテアーゼ阻害剤による治療に対して耐性を示す可能性が高くなっている、上記方法。
【請求項８】
前記ヒト免疫不全ウイルスがヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)である、請求項１、２、３、６、または７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼが、配列番号1と90%超同一である配列を有する、請求項１、２、３、６、または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロテアーゼ阻害剤がアンプレナビルである、請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記突然変異の前記存在または不存在が、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブと、前記突然変異をコードする前記ヒト免疫不全ウイルスの核酸配列とのハイブリダイゼーションにより検出され、ハイブリダイゼーションの形成により、前記突然変異の前記存在または不存在が示唆される、請求項１、２、３、６、または７に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異の前記存在または不存在が、前記突然変異をコードする核酸配列を決定することにより検出される、請求項１、２、３、６、または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記個体が、抗ウイルス剤による先行治療を受けているかまたは受けたことがある、請求項２または７に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロテアーゼの位置11のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテアーゼの位置11のアミノ酸がIまたはLである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロテアーゼの位置33のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼの位置33のアミノ酸がFである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼの位置34のアミノ酸が、中性、極性、または親水性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロテアーゼの位置34のアミノ酸がQである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロテアーゼの位置43のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロテアーゼの位置43のアミノ酸がTである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロテアーゼの位置48のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロテアーゼの位置48のアミノ酸がMである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸が、中性、疎水性、非極性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸がAである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸が、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸がSまたはTである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロテアーゼの位置58のアミノ酸が、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロテアーゼの位置58のアミノ酸がEである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテアーゼの位置71のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３２】
前記プロテアーゼの位置71のアミノ酸がLである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３３】
前記プロテアーゼの位置76のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロテアーゼの位置76のアミノ酸がVである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸が、中性、疎水性、非極性、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸が、酸性、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３８】
前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸が、Pではない任意のアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３９】
前記プロテアーゼの位置82のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロテアーゼの位置82のアミノ酸がAまたはFである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４１】
前記プロテアーゼの位置83のアミノ酸が、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロテアーゼの位置83のアミノ酸がDである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４３】
前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸が、中性、疎水性、非極性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４４】
前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４５】
前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸がAである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４６】
前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸が、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４７】
前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸がCである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４８】
前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸が、中性、疎水性、非極性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４９】
前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５０】
前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸がAまたはVである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５１】
前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸が、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５２】
前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸がSである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５３】
前記プロテアーゼの位置95のアミノ酸が、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテアーゼの位置95のアミノ酸がFである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５５】
前記プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、前記アミノ酸位置のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19ヶ所で検出することを含む、請求項１、２、３、６、または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、抗ウイルス化合物に対する病原性ウイルスの感受性を決定するための組成物および方法に関する。組成物および方法は、ウイルス感染症の治療に有効な薬剤療法の確認ならびに治療化合物候補の生物学的有効性の確認および決定に有用である。
【背景技術】
【０００２】
2. 発明の背景
1980年代初期以来、6000万人を超える人々が、後天性免疫不全症候群(「AIDS」)の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)に感染している。Lucas, 2002, Lepr Rev. 73 (1):64-71を参照されたい。HIV/AIDSは、現在、サハラ以南のアフリカで第1位の死亡原因であり、世界で第4位の死亡原因である。2001年末には、全世界で推定4000万人の人々がHIVに感染して生存していた。Norris, 2002, Radiol Technol. 73(4):339-363を参照されたい。
【０００３】
現代の抗HIV剤は、HIV生活環のさまざまな時期ならびにHIVの複製および/または生存に不可欠なさまざまな酵素を標的にする。AIDS治療用としてこれまでに承認を受けた薬剤の中には、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、たとえば、AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、アバカビル、ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、たとえば、テノフォビル、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、たとえば、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、ならびにプロテアーゼ阻害剤、たとえば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルがある。
【０００４】
抗ウイルス剤の作用の結果の1つは、薬剤耐性突然変異体を選択するために十分な選択圧をウイルス複製に加えうるということである(Herrmann et al., 1977, Ann NY Acad Sci 284:632-637)。薬剤への暴露が増大するにつれて、複製ウイルス集団に加わる選択圧が増大し、薬剤耐性突然変異体のより急速な出現が促進される。
【０００５】
回避不能な薬剤耐性の出現に伴い、耐性ウイルス集団に対抗して治療を最適化するよう戦略を立てなければならなくなる。薬剤耐性が、薬剤が効かない一因になっているか否かを確認することは困難である。なぜなら、薬剤耐性を生じる可能性のある患者は、予後不良の素因となる他の因子を有する可能性もあるからである(Richman, 1994, AIDS Res Hum Retroviruses 10:901-905)。さらに、各患者は、典型的には、ウイルスの突然変異株と、抗ウイルス剤に対して異なる感受性を有する、異なる突然変異株とのさまざまな混合物を保有する。
【０００６】
抗ウイルス剤耐性の評価に利用可能な伝統的なツールでは不十分である；抗ウイルス剤に対するHIVの耐性を決定する古典的試験は複雑であり、時間がかかり、高価であり、有害な可能性があり、しかも所与の患者の治療に合わせて個別に調整されるものでもない。Barre-Sinoussi et al., 1983, Science 220:868-871; Popovic et al., 1984, Science 224:497-500)およびその変形例(たとえば、Goedert et al., 1987, JAMA 257:331-334; Allain et al., 1987, N. Engl. J. Med. 317:1114-1121; Piatak et al., 1993, Science 259:1749-1754; Urdea, 1993, Clin. Chem. 39:725-726; Kellam and Larder, 1994, Antimicrobial Agents and Chemo. 38:23-30参照)を参照されたい。
【０００７】
2つの一般的な方法が、現在、抗ウイルス剤に対する耐性を測定するために使用されている。表現型試験と呼ばれる第1の方法では、特定の抗ウイルス剤に対する感染者のウイルスから採取されたウイルスの感受性を直接測定する。Petropoulos et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928およびHertogs et al., 1998, Antimicrob Agents CHEMOTHER 42 (2):269-76には、現在広く使用されている表現型アッセイの説明が提供されている。Gunthard et al., 1998, AIDS Res Hum Retroviruses 14:869-76およびSchuurman et al., 1999, J Clin Microbiol. 37:2291-96には、現在普及している遺伝子型アッセイが論述されている。Hirsch et al., 2000, JAMA 283:2417-26には、薬剤感受性を試験するための現在利用可能なアッセイの一般的な解析が提供されている。
【０００８】
遺伝子型試験と呼ばれる第2の方法では、薬剤感受性に影響を及ぼし特異的遺伝子突然変異を薬剤耐性および薬剤無効に関連づけることのできるウイルス中の突然変異を検出する。遺伝子型試験では、患者から採取されたウイルスを検査して、特定の薬剤に対する耐性に関連する特異的遺伝子突然変異が存在するか否かを調べる。遺伝子型試験は、表現型試験よりも優れたいくつかの利点を有する。最も顕著な点は、比較的単純なことと試験を実施しうる速さである。数日間程度の短い期間で試験を終了させることが可能であり、それほど複雑ではないため、安価である。しかしながら、遺伝子型データの解釈は、特異的突然変異と薬剤感受性の変化との関係についての予備知識に依存する。
【０００９】
感受性低下に関連する遺伝子型を用いて抗ウイルス剤(とくに、進化し続けるHIVを標的とした薬剤)の有効性を予測するこれまでの努力は、ひいき目にみても不完全である。所与の抗ウイルス剤または薬剤の組合せが所与の患者を治療するのに有効であるかをより正確に予測することのできるアルゴリズムがあれば、患者に投与する前に見込みのない薬剤を同定することにより、時間と資金が節約されるであろう。より重要な点として、HIV感染症に関して改善が得られない強力な毒素による治療に伴う傷害を取り除くことにより、患者の生活の質が改善されるであろう。したがって、特定の薬剤が特定の患者を治療するのに有効であるかを予測するより正確なアルゴリズムに対する緊急の必要性が存在する。さらに、遺伝子型に基づくアッセイは、表現型アッセイよりも迅速で、費用対効果がありうる。
【発明の開示】
【００１０】
3. 発明の概要
本発明は、抗ウイルス療法または併用療法の有効性を決定するためのアルゴリズムを開発し使用するための方法および組成物を提供する。アルゴリズムは、表現型臨床カットオフ(治療耐性が現れて感受性が失われる点)による制御下で行われる表現型と遺伝子型のデータ対の解析に基づく。アルゴリズムは、所与の抗ウイルス剤が患者を治療するのに有効であるかを正確に予測することにより、患者の生活の質を有意に改善する。それにより、HIV感染症の改善が得られない強力な毒素による治療に伴う傷害が回避される。
【００１１】
一態様において、本発明は、感染個体が抗ウイルス剤または作用剤の組合せによる治療に反応するか否かを予測することにより、有効な治療法を患者に提供できるようにするアルゴリズムを提供する。それにより、患者が無用な副作用を受けることがないように有効な治療法をデザインすることが可能になる。また、効果のない薬剤の投与を回避することにより、時間と資金がかなり節約される。
【００１２】
他の態様において、本発明は、抗ウイルス治療に対するウイルスの感受性を決定する方法を提供する。この方法は、ウイルスゲノムまたはウイルス酵素において、抗ウイルス治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を検出することを含む。
【００１３】
他の態様において、本発明は、ウイルスに感染した個体の抗ウイルス治療の有効性を決定する方法を提供する。この方法は、該個体から得たサンプルにおいて、抗ウイルス治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を検出することを含む。
【００１４】
本発明はまた、同一のまたは異なる抗ウイルス治療の有効性を上述したように決定することにより、抗ウイルス治療を受けている個体におけるウイルス感染の臨床進行をモニターする方法を提供する。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連するヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)のプロテアーゼ中に突然変異を含む核酸およびポリペプチドを提供する。プロテアーゼ阻害剤の例としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
一態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVによりコードされるプロテアーゼが、表1に列挙される1つ以上のHIVプロテアーゼ突然変異の存在または不存在を呈するか否かを検出することと、該突然変異に表4に提供される一連の規則を適用することとを含み、該一連の規則が満たされた場合、該HIVが該プロテアーゼ阻害剤による治療に対して耐性を示す可能性が高くなっているとする、上記方法を提供する。
【００１７】
他の態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に感染した個体がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該個体から得たサンプルにおいて、表1に列挙される1つ以上のHIVプロテアーゼ突然変異の存在または不存在を検出することと、該突然変異に表4に提供される一連の規則を適用することと、を含み、該一連の規則が満たされた場合、該個体が該プロテアーゼ阻害剤による治療に対して耐性を示す可能性が高くなっているとする、上記方法を提供する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、HIVがプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVによりコードされるプロテアーゼが、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該プロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95に呈するか否かを検出することを含み、該突然変異の存在により、該HIVは該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆されるが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記方法を提供する。
【００１９】
他の態様において、本発明は、HIVに感染した個体がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該個体から得たサンプルにおいて、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該HIVのプロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95で検出することを含み、該突然変異の存在により、該個体は該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆されるが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記方法を提供する。
【００２０】
他の態様において、本発明は、HIVがプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVによりコードされるプロテアーゼが、V11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V、およびC95Fよりなる群から選択される突然変異の存在または不存在を呈するか否かを検出することを含み、該突然変異が、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連し、そして該突然変異の存在により、該HIVが該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆される、上記方法を提供する。
【００２１】
好ましい実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。
【００２２】
他の好ましい実施形態では、ヒト免疫不全ウイルスはヒト免疫不全ウイルス1型(「HIV-1」)である。
【００２３】
他の態様において、本発明は、HIVプロテアーゼの一部分をコードする約10〜約40塩基長のオリゴヌクレオチドであって、該HIVプロテアーゼが、該ヒト免疫不全ウイルス中の該プロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95に突然変異を含み、該突然変異はプロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連するが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記オリゴヌクレオチドを提供する。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列の少なくとも10連続残基を含む単離されたポリペプチドであって、先に列挙した本発明の突然変異を少なくとも1つ含み、該突然変異がプロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する、上記ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。
【００２５】
他の実施形態では、前記1つまたは複数の突然変異を含むポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも70%かつ100%未満同一であるか、該ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と80%超同一であるアミノ酸配列を有するか、または該ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と90%超同一であるアミノ酸配列を有し、該突然変異は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、プロテアーゼ中の突然変異の存在または不存在が、配列特異的オリゴヌクレオチドプローブと、前記突然変異をコードするヒト免疫不全ウイルスの核酸配列と、のハイブリダイゼーションにより検出され、ハイブリダイゼーションの形成により、該突然変異の存在または不存在が示唆される、方法を提供する。
【００２７】
他の実施形態では、本発明は、プロテアーゼ中の突然変異の存在または不存在が、前記突然変異をコードする核酸配列を決定することにより検出される、方法を提供する。
【００２８】
他の実施形態では、本発明は、プロテアーゼ中の突然変異の存在または不存在が、たとえばポリメラーゼ連鎖反応により核酸を増幅することにより検出される方法を提供する。
【００２９】
一実施形態では、個体は、抗ウイルス剤による先行治療を受けているかまたは受けたことがある。他の実施形態では、抗ウイルス剤は、上述のまたは別のプロテアーゼ阻害剤である。
【００３０】
一実施形態では、前記プロテアーゼの位置11のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置11のアミノ酸は、IまたはLである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置33のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置33のアミノ酸は、Fである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置34のアミノ酸は、中性、極性、または親水性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置34のアミノ酸は、Qである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置43のアミノ酸は、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置43のアミノ酸は、Tである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置48のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置48のアミノ酸は、Mである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸は、中性、疎水性、非極性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸は、Aである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸は、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置54のアミノ酸は、SまたはTである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置58のアミノ酸は、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置58のアミノ酸は、Eである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置71のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置71のアミノ酸は、Lである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置76のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置76のアミノ酸は、Vである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸は、中性、疎水性、非極性、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸は、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置79のアミノ酸は、Pではないことを前提条件とする任意のアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置82のアミノ酸は、中性、疎水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置82のアミノ酸は、AまたはFである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置83のアミノ酸は、酸性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置83のアミノ酸は、Dである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの���置84のアミノ酸は、中性、疎水性、非極性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸は、Aである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸は、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置84のアミノ酸は、Cである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸は、中性、疎水性、非極性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸は、AまたはVである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸は、中性、親水性、または極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置91のアミノ酸は、Sである。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置95のアミノ酸は、中性、疎水性、または非極性の側鎖を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記プロテアーゼの位置95のアミノ酸は、Fである。
【００３１】
他の態様において、本発明は、前記プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、前記アミノ酸位置のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19ヶ所で検出する方法を提供する。
【００３２】
4. 図の簡単な説明
図1は、HIV-1のゲノム構造の概略図である。  
図2は、詳細に解析した最後の1セットのサンプルに到着するまでのステップを示すフロー図である。  
図3Aは、NL4-3 HIV(GenBank Accession No. P12497)プロテアーゼのアミノ酸配列(配列番号1)を示している。  
図3Bは、NL4-3 HIV(GenBank Accession No. AF324493)プロテアーゼ遺伝子の核酸配列(配列番号2)を示している。  
図4は、2499個のサンプルのCART解析により生成されたツリーを示している。  
図5は、アンプレナビル耐性に関連する突然変異ペアのマトリックスである。  
図6は、2499個のサンプルのCART解析の次のラウンドにより生成されたツリーを示している。  
図7は、N88SによるI50V含有ウイルスのアンプレナビル耐性に対する再感作を示している。プロテアーゼ阻害剤に対するI50V；I50VとN88S；またはI50VとL90Mを含有するクローンの表現型感受性を、クローングループごとに、平均fold change(エラーバーは1標準偏差を表す)で示す；薬剤名称は、次のように略記される：APV, アンプレナビル；IDV, インジナビル；LPV, ロピナビル；NFV, ネルフィナビル；RTV, リトナビル；SQV, サキナビル；ATV, アタザナビル(BMS 232632)。
【００３３】
5. 発明の詳細な説明
本発明は、表現型臨床カットオフにより実施される表現型と遺伝子型のデータ対の包括的解析に基づいて抗ウイルス剤の有効性を決定するアルゴリズムを開発するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、抗ウイルス治療に対するウイルスの感受性を決定する方法、ウイルスに感染した個体の抗ウイルス治療の有効性を決定する方法、および抗ウイルス治療を受けている個体においてウイルス感染の臨床進行をモニターする方法を提供する。他の態様において、本発明はまた、プロテアーゼ阻害剤(たとえば、アンプレナビル)に対する感受性低下に関連するヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)のプロテアーゼ中に突然変異を含む核酸およびポリペプチドを提供する。
【００３４】
5.1 略号
「APV」は、プロテアーゼ阻害剤アンプレナビルに対する略語である。  
「PI」は、プロテアーゼ阻害剤に対する略語である。  
「PT-R」および「PT-S」は、それぞれ、「表現型耐性」および「表現型感受性」に対する略語である。  
「GT-R」および「GT-S」は、それぞれ、「遺伝子型耐性」および「遺伝子型感受性」に対する略語である。  
「PCR」は、「ポリメラーゼ連鎖反応」に対する略語である。  
「FC」は、「fold change」に対する略語である。
【００３５】
遺伝子によりコードされる20種のL-アミノ酸に対して本明細書中で使用されるアミノ酸表記は、従来方式であり、次のとおりである：
アミノ酸          一文字略号          三文字略号
アラニン              A                 Ala
アルギニン            R                 Arg
アスパラギン          N                 Asn
アスパラギン酸        D                 Asp
シスチン              C                 Cys
グルタミン            Q                 Gln
グルタミン酸          E                 Glu
グリシン              G                 Gly
ヒスチジン            H                 His
イソロイシン          I                 Ile
ロイシン              L                 Leu
リシン                K                 Lys
メチオニン            M                 Met
フェニルアラニン      F                 Phe
プロリン              P                 Pro
セリン                S                 Ser
トレオニン            T                 Thr
トリプトファン        W                 Trp
チロシン              Y                 Tyr
バリン                V                 Val
別段の記載がないかぎり、ポリペプチド配列が一連の一文字略号および/または三文字略号として提示される場合、配列は、慣例に従ってN->C方向に提示される。
【００３６】
配列中の個々のアミノ酸は、本明細書中では、ANとして表される。ここで、Aは、配列中のアミノ酸に対する標準的な一文字記号であり、Nは、配列中の位置である。突然変異は、本明細書中では、A1NA2として表される。ここで、A1は、参照タンパク質配列中のアミノ酸に対する標準的な一文字記号であり、A2は、突然変異タンパク質配列中のアミノ酸に対する標準的な一文字記号であり、そしてNは、アミノ酸配列中の位置である。たとえば、G25M突然変異は、アミノ酸位置25におけるグリシンからメチオニンへの変化を表す。突然変異はまた、本明細書中では、NA2として表される場合もある。ここで、Nは、アミノ酸配列中の位置であり、A2は、突然変異タンパク質配列中のアミノ酸に対する標準的な一文字記号である(たとえば、25Mは、アミノ酸位置25における野生型アミノ酸からメチオニンへの変化を表す)。このほか、突然変異はまた、本明細書中ではA1Nとして表される場合もある。ここで、A1は、参照タンパク質配列中のアミノ酸に対する標準的な一文字記号であり、Nは、アミノ酸配列中の位置である(たとえば、G25は、アミノ酸位置25におけるグリシンから任意のアミノ酸への変化を表す)。突然変異タンパク質配列中のアミノ酸が既知でない場合、または突然変異タンパク質配列中のアミノ酸が参照タンパク質配列中に見いだされる以外の任意のアミノ酸であってよい場合、典型的には、この表記が使用される。アミノ酸位置は、突然変異を包含する領域を取り出す元になるタンパク質の全長配列に基づいて番号づけされる。DNA配列中のヌクレオチドおよび点突然変異の表現は、類似している。
【００３７】
特異的核酸塩基配列を含む核酸を参照するために本明細書全体を通して使用される略号は、従来の一文字略号である。したがって、核酸を組み入れる場合、天然に存在するコード核酸塩基は、次のように略記される：アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、およびウラシル(U)。別段の記載がないかぎり、一連の一文字略号として表される一本鎖核酸配列および二本鎖配列のトップ鎖は、5'->3'方向に提示される。
【００３８】
5.2 定義
本明細書中で使用する場合、以下の用語は以下の意味を有するものとする：
別段の記載がないかぎり、「一次突然変異」とは、酵素活性部位に影響を及ぼす突然変異、すなわち、酵素-基質複合体に関与するアミノ酸位置の突然変異、またはウイルスが抗ウイルス剤の選択圧を受けたときに複製の初期ラウンドで再現性よく現れる突然変異、または抗ウイルス剤に対する表現型感受性に大きな影響を及ぼす突然変異を意味する。
【００３９】
「二次突然変異」とは、一次突然変異ではなく、感受性低下に寄与するかまたは一次突然変異により付加される大きな欠損を補償する突然変異を意味する。
【００４０】
「表現型アッセイ」とは、特定の抗ウイルス剤に対するウイルス(たとえば、HIV)の感受性を測定する試験である。
【００４１】
「遺伝子型アッセイ」とは、生物、生物の一部分、遺伝子、または遺伝子の一部分の遺伝子配列を決定する試験である。そのようなアッセイは、薬剤耐性に関連する特定の突然変異が存在するか否かを確定するために、HIVで頻繁に行われる。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「遺伝子型データ」とは、たとえばウイルスの遺伝子型に関するデータである。遺伝子型データの例としては、ウイルス、ウイルスの一部分、ウイルス遺伝子、ウイルス遺伝子の一部分の塩基配列もしくはアミノ酸配列、またはウイルスの核酸中またはタンパク質中の1つ以上のヌクレオチド残基もしくはアミノ酸残基の同一性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
「感受性」とは、特定の薬剤に対するウイルスの反応を意味する。薬剤に対する感受性が軽減または低下しているウイルスは、薬剤に対する耐性が増加しているかまたは感受性が低下している。薬剤に対する感受性が増加または増強または増大されているウイルスは、薬剤に対する感受性が増加しているかまたは耐性が低下している。
【００４４】
所与の薬剤に対するウイルスの表現型感受性は、連続的なものである。それにもかかわらず、特定のfold changeの結果の解釈を単純化すべく1つまたは複数の閾値を定義することが実用上有用である。十分な臨床転帰データが収集されている薬剤では、「臨床カットオフ値」を以下のように定義することが可能である。
【００４５】
「臨床カットオフ値」とは、耐性が現れて感受性が失われる特定のポイントを意味する。それは、患者が特定の薬剤による治療を受けて失敗する確率が有意に増大する薬剤感受性レベルにより定義される。カットオフ値は、臨床試験で決定した場合、抗ウイルス剤ごとに異なる。臨床カットオフ値は、耐性および転帰のデータを評価することにより臨床試験で決定される。薬剤感受性(表現型)は、治療開始時に測定される。治療の全過程にわたりあらかじめ決められた時間点で、ウイルス量の変化のような治療反応をモニターする。薬剤感受性を治療反応と関連づけ、治療失敗に関連する耐性レベルにより臨床カットオフ値を決定する(全試験結果の統計解析)。
【００４６】
「ICn」とは、阻害濃度を意味する。それは、疾患誘発微生物(たとえば、HIV)の複製をn%抑制するのに必要とされる患者の血液中またはin vitroの薬剤の濃度である。したがって、「IC50」とは、薬剤の不存在下で観測されるレベルの50%までウイルス複製を阻害する抗ウイルス剤の濃度を意味する。「患者IC50」とは、患者由来のウイルスの複製を50%阻害するのに必要な薬剤濃度を意味し、「参照IC50」とは、参照ウイルスまたは野生型ウイルスの複製を50%阻害するのに必要な薬剤濃度を意味する。同様に、「IC90」とは、ウイルス複製の90%を阻害する抗ウイルス剤の濃度を意味する。
【００４７】
「fold change」とは、患者ウイルスと薬剤感受性参照ウイルスとの薬剤感受性の数値比較である。それは、患者IC50と薬剤感受性参照IC50との比、すなわち、患者IC50/参照IC50=Fold Change (「FC」)である。1.0のfold changeは、患者ウイルスが薬剤感受性参照ウイルスと同程度の薬剤感受性を呈することを示唆する。1未満のfold changeは、患者ウイルスが薬剤感受性参照ウイルスよりも感受性であることを示唆する。1よりも大きいfold changeは、患者ウイルスが薬剤感受性参照ウイルスほど感受性でないことを示唆する。臨床カットオフ値に等しいかまたはそれよりも大きいfold changeは、患者ウイルスがその薬剤に反応する確率がより低いことを意味する。臨床カットオフ値未満のfold changeは、患者ウイルスがその薬剤に対して感受性であることを意味する。
【００４８】
「アンプレナビル Fold Change」とは、患者血漿サンプルのHIVに対するアンプレナビルのIC50と、NL4-3(GenBank Accession No. AF324493)参照ウイルス株に対するアンプレナビルのIC50との比を意味する。  
2.5未満のAPV fold changeを有する場合、ウイルスは、APVに対して「感受性」である。  
2.5以上のAPV fold changeを有する場合、ウイルスは、APVに対して「耐性」である。
【００４９】
ウイルスが、抗ウイルス治療に対する感受性低下に関連する性質(たとえば、突然変異)を有する場合、ウイルスは、抗ウイルス治療に対して「感受性低下を示す可能性が高くなっている」。この性質を有するウイルスの集団が、平均して、この性質が欠如していること以外は類似しているウイルスの集団よりも抗ウイルス治療に対する感受性が低い場合、ウイルスの性質は感受性低下に関連する。したがって、性質の存在と感受性低下との相関は、絶対的なものである必要はなく、性質が感受性低下を引き起こすための必要条件(すなわち、性質が、感受性低下の原因となる役割を担う条件)も、十分条件(すなわち、性質の存在だけで十分であるという条件)も、存在しない。
【００５０】
「配列相同性%」という用語は、本明細書中では、「相同性%」という用語と同義的に使用される。「配列同一性%」および「同一性%」とは、配列アライメントプログラムを用いてアライメントしたときの2つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列同一性のレベルを意味する。たとえば、本明細書中で使用する場合、80%の相同性は、既定のアルゴリズムにより決定された80%の配列同一性と同じことを意味する。したがって、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さ全体にわたり80%超の配列同一性を有する。配列同一性の例示的レベルとしては、所与の配列に対して60、70、80、85、90、95、98%、またはそれ以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
2つの配列間の同一性を決定するのに使用可能な例示的なコンピュータープログラムとしては、BLASTプログラム一式、たとえば、BLASTN、BLASTX、およびTBLASTX、BLASTP、およびTBLASTN(インターネット上でhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から公的に入手可能)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このほかに、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10(とくに、発表されたデフォルト設定、すなわち、パラメーターw=4、t=17を参照されたい)、およびAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402を参照されたい。GenBank Protein Sequences、および他の公共のデータベース中のアミノ酸配列と対比して所与のアミノ酸配列を評価する場合、典型的には、BLASTPプログラムを用いて配列検索が行われる。BLASTXプログラムは、すべてのリーディングフレーム中の翻訳された核酸配列を、GenBank Protein Sequencesおよび他の公共のデータベース中のアミノ酸配列と対比して検索するのに好適である。BLASTPおよびBLASTXは、両方とも、オープンギャップペナルティー11.0および伸長ギャップペナルティー1.0のデフォルトパラメーターを用いて実行され、BLOSUM-62マトリックスを利用する。Altschul, et al., 1997を参照されたい。
【００５２】
2つ以上の配列間の「同一性%」を決定するための選択された配列の好ましいアライメントは、たとえば、MacVector version 6.5中のCLUSTAL-Wプログラム用いて行われる。このプログラムは、オープンギャップペナルティー10.0、伸長ギャップペナルティー0.1、およびBLOSUM 30類似度行列を含むデフォルトパラメーターを用いて実行される。
【００５３】
「極性アミノ酸」とは、生理学的pHで非荷電である側鎖を有する親水性アミノ酸を意味するが、但し、この側鎖は、2個の原子により共有された電子対が一方の原子の方により近接して保持される少なくとも1つの結合を有する。遺伝子によりコードされる極性アミノ酸としては、Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)、およびThr(T)が挙げられる。
【００５４】
「非極性アミノ酸」とは、生理学的pHで非荷電である側鎖を有する疎水性アミノ酸を意味する。但し、この側鎖は、2個の原子により共有された電子対が一般的には2個の各原子によって等しく保持される結合を有する(すなわち、側鎖は極性ではない)。遺伝子によりコードされる無極性アミノ酸としては、Ala(A)、Gly(G)、Ile(I)、Leu(L)、Met(M)、およびVal(V)が挙げられる。
【００５５】
「親水性アミノ酸」とは、Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142の規格化コンセンサス疎水性スケールに基づいてゼロ未満の疎水性を呈するアミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる親水性アミノ酸としては、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、His(H)、Lys(K)、Ser(S)、およびThr(T)が挙げられる。
【００５６】
「疎水性アミノ酸」とは、Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142の規格化コンセンサス疎水性スケールに基づいてゼロよりも大きい疎水性を呈するアミノ酸を意味する。遺伝子によりコードされる疎水性アミノ酸としては、Ala(a)、Gly(G)、Ile(1)、Leu(L)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Trp(W)、Tyr(Y)、およびVal(V)が挙げられる。
【００５７】
「酸性アミノ酸」とは、7未満の側鎖pK値を有する親水性アミノ酸を意味する。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの消失により生理学的pHで負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によりコードされる酸性アミノ酸としては、Asp(D)およびGlu(E)が挙げられる。
【００５８】
「塩基性アミノ酸」とは、7よりも大きい側鎖pK値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により生理学的pHで正に荷電された側鎖を有する。遺伝子によりコードされる塩基性アミノ酸としては、Arg(R)、His(H)およびLys(K)が挙げられる。
【００５９】
「突然変異」とは、参照の核酸またはポリペプチドに対するアミノ酸配列の変化または対応する核酸配列の変化である。HIVプロテアーゼまたは逆転写酵素を含む本発明の実施形態では、プロテアーゼまたは逆転写酵素をコードする参照核酸は、それぞれ、NL4-3 HIV(GenBank Accession No. AF324493)中に存在するプロテアーゼまたは逆転写酵素のコード配列である。同様に、参照プロテアーゼまたは逆転写酵素ポリペプチドは、NL4-3 HIV配列によりコードされるものである。ペプチドのアミノ酸配列は、たとえば、エドマン分解または質量分析により、直接決定することができるが、より典型的には、ペプチドのアミノ配列は、ペプチドをコードする核酸の塩基配列から推測される。当技術分野で公知の任意の核酸配列決定法を用いることができる。たとえば、Maxam-Gilbert配列決定法(Maxam et al., 1980, Methods in Enzymology 65:499)、ジデオキシ配列決定法(Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad Sci. USA 74:5463)、またはハイブリダイゼーションに基づく方法(たとえば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory 3rd ed., NY;およびAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照されたい)。
【００６０】
ウイルス中の「耐性関連突然変異」(「RAM」)とは、抗ウイルス剤に対するウイルスの感受性低下に関連する突然変異である。RAMは、いくつかのウイルス(たとえば、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」))中に見いだすことができる。そのような突然変異は、1種以上のウイルスタンパク質(たとえば、HIVのプロテアーゼ、インテグラーゼ、エンベロープ、または逆転写酵素)中に見いだすことができる。RAMは、参照株に対比して定義される。HIVプロテアーゼを含む本発明の実施形態では、参照プロテアーゼは、NL4-3 HIV(GenBank Accession No. AF324493)によりコードされるプロテアーゼである。
【００６１】
「突然変異体」とは、参照のウイルス、遺伝子、またはタンパク質に対して1つ以上の変化を有する配列を有するウイルス、遺伝子、またはタンパク質である。
【００６２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、全体を通して同義的に用いられる。
【００６３】
「参照」および「野生型」という用語は、全体を通して同義的に用いられる。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、全体を通して同義的に用いられる。
【００６５】
5.3 耐性関連突然変異
本発明は、HIVのプロテアーゼ中に突然変異を含む核酸およびポリペプチドを提供する。好ましくは、HIVは、ヒト免疫不全ウイルス1型(「HIV-1」)である。一実施形態では、突然変異は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する。他の実施形態では、突然変異は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性の増大に関連する。プロテアーゼ阻害剤は、当業者に公知の任意のプロテアーゼ阻害剤であってよい。プロテアーゼ阻害剤の例としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。
【００６６】
一態様において、本発明は、プロテアーゼ阻害剤(たとえば、アンプレナビル)に対する感受性低下または増大のいずれかに関連するH1Vプロテアーゼ中の突然変異を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を提供する。一実施形態では、本発明は、HIVプロテアーゼに由来し、かつプロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する突然変異を含む、ポリペプチドを提供する。他の実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する2つ以上の突然変異を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性の増大に関連する突然変異を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性の増大に関連する2つ以上の突然変異を含む。本発明のポリペプチドは、これらのポリペプチドから改変または誘導されたペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、翻訳後修飾を含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、1種以上のアミノ酸類似体を含む。
【００６７】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、アンプレナビルに対する感受性低下に関連する1つ以上の突然変異を含む。アンプレナビルに対する感受性低下に関連する突然変異のリストを表1に示す。
【００６８】
他の好ましい実施形態では、本発明は、HIVプロテアーゼに由来し、かつV11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V、およびC95Fよりなる突然変異群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、ポリペプチドを提供する。ここで、突然変異は、アンプレナビルに対する感受性低下に関連する。
【００６９】
他の好ましい実施形態では、前記突然変異を含むポリペプチドは、配列番号1の少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、85、90、または95連続アミノ酸(これらの配列中には、前記の1つまたは複数の突然変異が存在しうる)を含む。
【００７０】
他の実施形態では、前記の1つまたは複数の突然変異を含むポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも70%かつ100%未満同一であるか、該ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と80%超同一であるアミノ酸配列を有するか、または該ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と90%超同一であるアミノ酸配列を有し、該突然変異は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する。
【００７１】
一実施形態では、該ポリペプチドは、天然に存在する。他の実施形態では、該ポリペプチドは、人工的にデザインされる。
【００７２】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適の比較が行われるようにアライメントされている(たとえば、第2のアミノ酸または核酸の配列との最適のアライメントが行われるように、第1のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる)。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列の位置が、第2の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有されていた場合、分子は、その位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一である位置の数の関数である(同一性%=同一の位置の数/位置(たとえば、重なる位置)の合計数×100)。一実施形態では、2つの配列は同一の長さである。
【００７３】
2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。2つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムに、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:5873-5877のような変更が加えられたものであるが、これに限定されるものではない。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTのプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子に相同的な塩基配列を得るために、NBLASTプログラム(スコア=100、ワード長=12)を用いてBLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム(スコア=50、ワード長=3)を用いてBLASTタンパク質検索を行うことができる。比較のためにギャップ付きアライメントが得られるように、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されているGapped BLASTを利用することができる。他の選択肢として、PSI-Blastを用いることにより、分子間の遠隔関係を検出する反復検索を行うことができる。上掲文献参照。BLAST、ギャップ付きBLAST、およびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(たとえば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００７４】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの他の好ましい例は、MYERS and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムであるが、これに限定されるものではない。そのようなアルゴリズムは、CGC配列アライメントソフトウェアパッケージの一部分であるALIGNプログラム(バージョン2.0)中に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのALIGNプログラムを利用する場合、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティー12、およびギャップペナルティー4を使用することができる。配列解析用のこのほかのアルゴリズムは、当技術分野で公知であり、Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci.,10:3-5に記載のADVANCEおよびADAM；ならびにPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されているFASTAが包含される。FASTA内のktupは、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。ktup=2の場合、アライメントされた残基対を調べることにより、比較された2つの配列の類似領域が見いだされ；ktup=1の場合、単一のアライメントされたアミノ酸が調べられる。タンパク質配列を対象にするときは、ktupを2または1に設定することができ、DNA配列を対象とするときは、1〜6に設定することができる。ktupを指定しなかった場合、デフォルトは、タンパク質では2、DNAでは6である。
【００７５】
2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたは許容せずに先に記載のものと類似した方法を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際、典型的には、完全一致の数を求める。
【００７６】
他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードするかまたはそれらに関連するポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸、たとえば、本発明の核酸の同定、分析、突然変異、または増幅を行うためのハイブリダイゼーションプローブ、PCRプライマー、または配列決定用プライマーとして使用するのに十分な核酸分子、を提供する。
【００７７】
一実施形態では、核酸は、プロテアーゼ阻害剤(たとえば、アンプレナビル)に対する感受性低下または増大のいずれかに関連するHIVプロテアーゼ中の突然変異を含むポリペプチドをコードする。一実施形態では、本発明は、HIVプロテアーゼに由来し、かつプロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する1つ以上の突然変異を含むポリペプチド、をコードする核酸を提供する。他の実施形態では、核酸は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性の増大に関連する1つ以上の突然変異を含むポリペプチドをコードする。本発明の核酸は、これらの核酸配列から改変または誘導された核酸、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドを包含する。一実施形態では、核酸は核酸類似体を包含する。一実施形態では、naは天然に存在する。他の実施形態では、該核酸は人工的にデザインされる。
【００７８】
核酸は、任意の長さであってよい。核酸は、たとえば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450、475、または500塩基長でありうる。核酸は、たとえば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、120、125、150、175、200、250、300、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、または10000塩基未満の長さでありうる。好ましい実施形態では、核酸は、たとえばプローブまたはプライマーとして、本明細書に記載の突然変異を検出するのに好適な長さおよび配列を有する。
【００７９】
一実施形態では、核酸は、アンプレナビルに対する感受性低下に関連する1つ以上の突然変異を含むポリペプチドまたはポリペプチドの一部分をコードする。アンプレナビルに対する感受性低下に関連する突然変異のリストを表1に示す。
【００８０】
他の実施形態では、本発明は、HIVプロテアーゼに由来し、かつV11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V、およびC95Fよりなる突然変異群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、ポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを提供する。
【００８１】
他の実施形態では、該突然変異を含む該オリゴヌクレオチドは、配列番号2の15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、180、210、240、255、270、または285連続核酸(この配列内には、前記の1つまたは複数の突然変異が存在しうる)を含む。
【００８２】
他の実施形態では、前記の1つまたは複数の突然変異を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号2の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドと少なくとも60%かつ100%未満同一であるか；該オリゴヌクレオチドは、配列番号2の核酸配列と70%超同一である核酸配列を有するか；該オリゴヌクレオチドは、配列番号2の核酸配列と80%超同一である核酸配列を有するか；または該オリゴヌクレオチドは、配列番号2の核酸配列と90%超同一である核酸配列を有し、該突然変異は、プロテアーゼ阻害剤に対する感受性低下に関連する。2つの核酸配列の同一性パーセントは、上述したように決定することができる。
【００８３】
配列番号2の塩基配列に加えて、アミノ酸配列に変化をもたらすDNA配列多型が集団(たとえば、ヒト集団)内に存在しうることは、当業者であれば理解されよう。そのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子変異により集団内の個体間で存在しうる。天然の対立遺伝子変異は、典型的には、所与の遺伝子の塩基配列に1〜5%の変異をもたらしうる。任意のすべてのそのようなヌクレオチド変異および得られるアミノ酸変異、または天然の対立遺伝子変異の結果でありかつ機能活性を改変しない多型は、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００８４】
他の実施形態では、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部分だけ、たとえば、プローブもしくはプライマーとして使用することができる断片、または本発明のポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードする断片を含みうる。プローブは、それに結合された標識化基、たとえば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、または酵素補因子を含みうる。種々の実施形態では、本発明の核酸分子は、ヌクレオチド部分、糖質部分、またはリン酸バックボーンが修飾されていてもよい。
【００８５】
5.4 薬剤耐性関連ウイルス突然変異の検出
他の態様において、本発明は、ウイルスまたは該ウイルスの派生物において耐性関連突然変異を見いだす方法を提供する。
【００８６】
5.4.1 ウイルスおよびウイルスサンプル
本発明に係る耐性関連突然変異(「RAM」)は、任意のタイプのウイルス(たとえば、動物に見いだされる任意のウイルス)中に存在しうる。本発明の一実施形態では、ウイルスは、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ウシなどの哺乳動物に感染することが知られているウイルスを包含する。好ましい実施形態では、ウイルスは、霊長類に感染することが知られている。さらにより好ましい実施形態では、ウイルスは、ヒトに感染することが知られている。ヒトウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(「HIV」)、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、他のヒトヘルペスウイルス、A型インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、A型、B型、およびC型肝炎ウイルス、ライノウイルス、ならびにヒトパピローマウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態では、ウイルスはHIVである。好ましくは、ウイルスはヒト免疫不全ウイルス1型(「HIV-1」)である。以上は、現在利用可能な抗ウイルス化学療法が存在する特定のウイルスの代表であり、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス(paramxyxovirus)、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ニューモウイルス、およびヘパドナウイルスのウイルス科を代表するものである。本発明は、これらの科に属する他のウイルスに起因する他のウイルス感染症、および現在利用可能な療法が存在するかまたは存在しない他のウイルス科のウイルスが原因で生じるウイルス感染症、に使用することができる。
【００８７】
本発明に係るRAMは、ウイルスサンプルを取得するための当技術分野で公知の任意の手段により取得されるウイルスサンプル中に見いだすことができる。そのような方法としては、ウイルスに感染したヒトもしくは動物からウイルスサンプルを取得する方法またはウイルス培養物からウイルスサンプルを取得する方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、ウイルスサンプルは、ウイルスに感染したヒト個体から取得される。ウイルスサンプルは、感染個体の生体の任意の部分またはウイルスを含有することが予想される任意の分泌物から取得しうる。そのような部分の例としては、血液、血清、血漿、喀痰、リンパ液、精液、膣粘液、および他の体液のサンプルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、サンプルは、血液、血清、または血漿のサンプルである。
【００８８】
他の実施形態では、本発明に係るRAMは、培養物から取得しうるウイルス中に存在する。いくつかの実施形態では、培養物は、実験室から取得可能である。他の実施形態では、培養物は、コレクション(たとえば、American Type Culture Collection)から取得可能である。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明に係るRAMは、ウイルスの派生物中に存在する。一実施形態では、ウイルスの派生物は、それ自体は病原性ではない。他の実施形態では、ウイルスの派生物は、プラスミドまたはプラスミドをトランスフェクトした細胞の複製が、選択圧に対する耐性を増大させる突然変異が選択されるように選択圧の存在または不存在により影響を受ける、プラスミド系である。いくつかの実施形態では、ウイルスの派生物は、対象の核酸またはタンパク質、たとえば、抗ウイルス治療の標的とされる核酸またはタンパク質を含む。一実施形態では、対象の遺伝子をベクター中に組み込むことができる。たとえば、米国特許第5,837,464号および同第6,242,187号ならびにPCT公開WO 99/67427(いずれも、参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。好ましい実施形態では、遺伝子は、プロテアーゼまたは逆転写酵素をコードする遺伝子でありうる。
【００９０】
他の実施形態では、インタクトなウイルスを使用する必要はない。その代わりに、ベクター中に組み込まれたウイルスの一部分を使用することができる。好ましくは、抗ウイルス剤の標的となるウイルスの一部分を使用する。
【００９１】
他の実施形態では、本発明に係るRAMは、遺伝子改変ウイルス中に存在する。ウイルスを遺伝子改変するための当技術分野で公知の任意の方法を用いて、ウイルスを遺伝子改変することができる。たとえば、実験室培養により所望の世代数でウイルスを増殖させることができる。一実施形態では、選択圧を加えない(すなわち、ウイルスは、特定の特性を有するウイルスの複製に有利な処理に付されない)、そして新しい突然変異は、遺伝的浮動を介して蓄積される。他の実施形態では、培養で増殖させるときに選択圧をウイルスに加える(すなわち、1つ以上の特性を有するウイルスの複製に有利な条件下でウイルスを増殖させる)。一実施形態では、選択圧は抗ウイルス治療である。任意の公知の抗ウイルス治療を選択圧として使用することができる。一実施形態では、ウイルスはHIVであり、選択圧はプロテアーゼ阻害剤である。他の実施形態では、ウイルスはHIV-1であり、選択圧はプロテアーゼ阻害剤である。任意のプロテアーゼ阻害剤を用いて、選択圧を加えることができる。プロテアーゼ阻害剤の例としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルよりなる群から選択される。他の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。in vitroで培養されたHIVをプロテアーゼ阻害剤(たとえば、アンプレナビル)で処理することにより、アンプレナビルに対する耐性が増大されたHIVの突然変異株を選択することができる。選択圧のストリンジェンシーを操作することにより、選択特性を有していないウイルスの生存率を増大させたり低下させたりすることができる。
【００９２】
他の態様において、本発明に係るRAMは、ウイルス、ウイルスゲノム、またはウイルスゲノムの一部分を突然変異させることにより生成される。当技術分野で公知の任意の突然変異誘発方法をこの目的のために使用することができる。一実施形態では、突然変異誘発は、本質的にランダムである。他の実施形態では、ウイルス、ウイルスゲノム、またはウイルスゲノムの一部分を突然変異誘発処理に付することにより、本質的にランダムな突然変異誘発を行う。他の実施形態では、抗ウイルス療法の標的であるウイルスタンパク質をコードする遺伝子を突然変異させる。本質的にランダムな突然変異誘発処理の例としては、たとえば、突然変異誘発物質(たとえば、臭化エチジウム、エチルメタンスルホン酸、エチルニトロソウレア(ENU)など)、放射線(たとえば、紫外光)への暴露、転移因子(たとえば、Tn5、Tn10)の挿入および/もしくは除去、または増大された突然変異誘発率を有する細胞、細胞抽出物、もしくはin vitro複製系における複製が挙げられる。たとえば、Russell et al., 1979, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76:5918-5922; Russell, W., 1982, Environmental Mutagens and Carcinogens: Proceedings of the Third International Conference on Environmental Mutagensを参照されたい。これらの突然変異誘発方法はいずれも、本質的にランダムであるが、分子レベルで、それぞれ、それ自体の好ましい標的を有することは、当業者であればわかるであろう。
【００９３】
他の態様において、抗ウイルス療法に対するウイルスの感受性に影響を及ぼしうる突然変異は、部位特異的突然変異誘発を用いて行われる。当技術分野で公知の任意の部位特異的突然変異誘発方法を使用することができる(たとえば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd ed., NY;およびAusubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照されたい)。部位特異的突然変異誘発は、たとえば、特定の遺伝子もしくはゲノム領域、遺伝子もしくはゲノム領域の特定部分、または遺伝子もしくはゲノム領域内の1つもしくはいくつかの特定のヌクレオチドを対象に行うことができる。一実施形態では、部位特異的突然変異誘発は、1つ以上の基準に基づいて、ウイルスのゲノム領域、遺伝子、遺伝子断片、またはヌクレオチドを対象に行われる。一実施形態では、遺伝子または遺伝子の一部分が、部位特異的突然変異誘発に付される。なぜなら、それは、抗ウイルス療法の標的であることが知られているかまたは推測されるタンパク質をコードするからである(たとえば、HIVプロテアーゼをコードする遺伝子)。他の実施形態では、遺伝子の一部分または遺伝子内の1つもしくはいくつかのヌクレオチドが、部位特異的突然変異誘発に付すべく選択される。一実施形態では、突然変異の対象となるヌクレオチドは、抗ウイルス化合物と相互作用することが知られているかまたは推測されるアミノ酸残基をコードする。他の実施形態では、突然変異の対象となるヌクレオチドは、抗ウイルス治療に対する感受性が低下しているウイルス株中で突然変異を起こすことが知られているかまたは推測されるアミノ酸残基をコードする。他の実施形態では、突然変異ヌクレオチドは、抗ウイルス化合物と相互作用することが知られているかもしくは推測されるタンパク質残基または抗ウイルス治療に対する感受性が低下しているウイルス株中で突然変異を起こすことが知られているかもしくは推測されるタンパク質残基の一次配
列中の隣接するまたは近接するアミノ酸残基をコードする。他の実施形態では、突然変異ヌクレオチドは、抗ウイルス化合物と相互作用することが知られているかもしくは推測されるタンパク質残基または抗ウイルス治療に対する感受性が低下しているウイルス株中で突然変異を起こすことが知られているかもしくは推測されるタンパク質残基の二次、三次、または四次構造中の隣接するまたは近接するアミノ酸残基をコードする。他の実施形態では、突然変異ヌクレオチドは、抗ウイルス化合物に結合することが知られているかまたは推測されるタンパク質の活性部位またはその近傍のアミノ酸残基をコードする。たとえば、Sarkar and Sommer, 1990, Biotechniques, 8:404-407を参照されたい。
【００９４】
5.4.2 ウイルス中の突然変異の存在または不存在の検出
ウイルス中の本発明に係るRAMの存在または不存在は、突然変異を検出するための当技術分野で公知の任意の手段により検出することができる。突然変異は、特定のタンパク質をコードするウイルス遺伝子中で、またはタンパク質自体の中で、すなわち、タンパク質のアミノ酸配列中で、検出することができる。
【００９５】
一実施形態では、突然変異は、ウイルスゲノム中に存在する。そのような突然変異は、たとえば、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子中に、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子のシスまたはトランス作用性調節配列、遺伝子間配列、またはイントロン配列の中に存在しうる。突然変異は、抗ウイルス治療に対する感受性を変化させるウイルスの構造、機能、複製、または環境のいずれかの側面に影響を及ぼしうる。一実施形態では、突然変異は、抗ウイルス治療の標的であるウイルスタンパク質をコードする遺伝子中に存在する。
【００９６】
ウイルス遺伝子内の突然変異は、いくつかの方法を利用することにより検出することができる。そのようなアッセイ方法の出発点としてウイルスのDNAまたはRNAを使用することができ、当業者に周知の標準的手順に従って単離することが可能である。
【００９７】
特定の核酸配列中(たとえば、ウイルス遺伝子の特定の領域中)の突然変異の検出は、さまざまな方法により、たとえば、限定されるものではないが、対立遺伝子特異的制限酵素切断に基づく制限断片長多型検出(Kan and Dozy, 1978, Lancet ii: 910-912)、ミスマッチ修復検出(Faham and Cox, 1995, Genome Res 5:474-482)、MutSタンパク質の結合(Wagner et al., 1995, Nucl Acids Res 23:3944-3948)、変性勾配ゲル電気泳動(Fisher et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1579-83)、一本鎖コンフォメーション多型検出(Orita et al., 1983, Genomics 5:874-879)、ミスマッチ塩基対におけるRNAase切断(Myers et al., 1985, Science 230:1242)、ヘテロ二本鎖DNAの化学的(Cotton et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4397-4401)または酵素的(Youil et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 92:87-91)切断、オリゴヌクレオチド特異的プライマー伸長に基づく方法(Syvaenen et al., 1990, Genomics 8:684-692)、遺伝子ビット解析(Nikiforov et al., 1994, Nucl Acids Res 22:4167-4175)、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(Landegren et al., 1988, Science 241:1077)、オリゴヌクレオチド特異的連結連鎖反応(「LCR」)(Barrany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:189-193)、ギャップLCR(Abravaya et al., 1995, Nucl Acids Res 23:675-682)、当技術分野で周知の標準的手順を用いる放射性または蛍光性DNA配列決定、およびペプチド核酸(PNA)アッセイ(Orum et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21:5332-5356; Thiede et al., 1996, Nucl. Acids Res. 24:983-984)により行うことができる。
【００９８】
さらに、ウイルスのDNAまたはRNAは、遺伝子構造が関与する異常、たとえば、点突然変異、挿入、欠失、およびゲノム再配列を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイで使用可能である。そのようなアッセイとしては、限定されるものではないが、サザン分析(Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517)、一本鎖コンフォメーション多型分析(SSCP)(Orita et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770)、およびPCR分析(米国特許第4,683,202号; 同第4,683,195号; 同第4,800,159号; および同第4,965,188号; PCR Strategies, 1995 Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc.)を挙げることができる。
【００９９】
遺伝子特異的突然変異を検出するためのそのような診断方法は、たとえば、ウイルス核酸を、組換えDNA分子、クローン化遺伝子、またはそれらの縮重変異体を含む1種以上の標識化核酸試薬に、これらの試薬がそれらの相補的配列に特異的にアニーリングするのに有利な条件下で、接触させてインキュベートすることを含みうる。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも15〜30塩基である。インキュベーション後、アニーリングされていないすべての核酸を核酸分子ハイブリッドから除去する。次に、ハイブリダイズした核酸の存在を、そのような分子が存在するのであれば、検出する。そのような検出スキームを用いて、ウイルス由来の核酸を、たとえば、固体担体(たとえば、膜またはプラスチック表面、具体的には、マイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズの表面)に固定することができる。この場合、インキュベーション後、アニーリングされていない先に記載したタイプの標識化核酸試薬は、容易に除去される。残留するアニーリングされた標識化核酸試薬の検出は、当業者に周知の標準的方法を用いて行われる。核酸試薬がアニーリングした遺伝子配列を正常な遺伝子配列から予想されるアニーリングパターンと比較することにより、遺伝子突然変異が存在するかを決定することができる。
【０１００】
遺伝子特異的核酸分子を検出するための代替的な診断方法は、それらの増幅を行ってから、たとえば、PCR(米国特許第4,683,202号; 同第4,683,195号; 同第4,800,159号; および同第4,965,188号; PCR Strategies, 1995 Innis et al. (eds.), Academic Press, Inc.)により増幅を行ってから、当業者に周知の方法を用いて、増幅された分子を検出することを含みうる。得られた増幅配列を、増幅核酸がそれぞれの遺伝子の正常コピーだけを含有する場合に予想される配列と比較することにより、遺伝子突然変異が存在するかを決定することができる。
【０１０１】
このほか、当技術分野で公知の任意の配列決定法により、核酸の配列決定を行うことができる。たとえば、Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463のジデオキシ法(これについては、Messing et al., 1981, Nuc. Acids Res. 9:309にさらなる解説がある)により、またはMaxam et al., 1980, Methods in Enzymology 65:499の方法により、ウイルスDNAの配列決定を行うことができる。また、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd ed., NY;およびAusubel et al, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYに記載されている方法をも参照されたい。
【０１０２】
ウイルス遺伝子産物(すなわち、ウイルスタンパク質)またはウイルスペプチド断片に対する抗体も、ウイルスタンパク質中の突然変異を検出するために使用することができる。他の選択肢として、当技術分野で公知の任意の配列決定法を用いて対象のウイルスタンパク質またはペプチド断片の配列決定を行うことにより、対象のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。そのような方法の一例は、小型のタンパク質またはポリペプチドの配列決定に使用可能なエドマン分解法である。より大型のタンパク質の場合には、最初に、当技術分野で公知の化学試薬または酵素試薬(たとえば、ブロモシアン、ヒドロキシルアミン、トリプシン、またはキモトリプシン)により切断し、次に、エドマン分解法により配列決定を行うことができる。
【０１０３】
5.5 突然変異ウイルスの表現型感受性の測定
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、抗ウイルス療法に対する突然変異ウイルスまたはウイルス集団の表現型感受性を決定することができる。たとえば、米国特許第5,837,464号および同第6,242,187号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。いくつかの実施形態では、表現型分析を行う。すなわち、突然変異のない参照ウイルスの感受性と対比して、所与の抗ウイルス剤に対するウイルスの感受性をアッセイする。これは薬剤感受性の直接的定量的測定であり、抗ウイルス剤に対するウイルスの感受性を決定すべく当技術分野で公知の任意の方法により行うことができる。そのような方法の一例としては、参照ウイルスに対するIC50値のfold changeを決定することが挙げられるが、これに限定されるものではない。表現型試験では、特定のウイルス株が薬剤阻害剤の存在下でin vitro増殖する能力を測定する。参照ウイルスを阻害するのに必要な薬剤の量に対して、ウイルス活性を阻害するのにより多くの薬剤が必要とされる場合、ウイルスは、特定の薬剤に対する感受性がより低い。
【０１０４】
一実施形態では、表現型分析を行い、これを用いてウイルス株に対する薬剤のIC50またはIC90を計算する。分析結果はまた、薬剤感受性対照株または同一の患者に由来する先行ウイルス株と比較して、ウイルス株ごとにIC50またはIC90のfold changeとして提示することができる。ウイルスが各利用可能な抗ウイルス薬物療法に直接付されるので、結果を治療反応に直接結びつけることができる。たとえば、患者ウイルスが特定の薬剤に対して耐性を示す場合、その薬剤を回避するかまたは患者の治療法から除外することにより、医師は、より長期間にわたり効果を示す可能性が高くなっている治療計画をデザインすることできる。
【０１０５】
他の実施形態では、組換えウイルスアッセイ(「RVAS」)を用いて表現型分析を行う。RVAでは、ウイルスベクターと、患者ウイルスから増幅させたウイルス遺伝子配列と、の間で相同的組換えを行うことにより生成させたウイルスストックを使用する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはHIVベクターであり、ウイルス遺伝子配列はプロテアーゼ配列および/または逆転写酵素配列である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、PHENOSENSETM(ViroLogic INC., South San Francisco, CA)を用いて表現型分析を行う。Petropoulos et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928；米国特許第5,837,464号および同第6,242,187号を参照されたい。PHENOSENSETMは、表現型試験の利点を活かし以前のアッセイの欠点を克服した表現型アッセイである。アッセイが自動化されているので、PHENOSENSETMでは、制御条件でより高いスループットが得られる。その結果、このアッセイでは、すべての現在利用可能な抗レトロウイルス剤に対する患者のHIV単離物の感受性プロファイルが正確に規定され、サンプルを受け取ってから約10〜約15日以内に結果が医師に直接送付される。PHENOSENSETMは、正確であり、わずか1ラウンドのウイルス複製で結果が得られるので、ウイルスのサブ集団の選択が回避される。結果は定量的であり、さまざまな度合の薬剤感受性の尺度となり、かつ感度が高いので、試験は、約500コピー/mLのウイルス量の血液検体で行うことができ、全ウイルス集団の10%以下の濃度のいくつかの薬剤耐性ウイルスの小集団を検出することができる。さらに、結果は再現性があり、薬剤にもよるが、実施されるアッセイの約95%において、約1.4〜2.5倍未満の変動が達成される。
【０１０７】
PHENOSENSETMは、増幅されたウイルス遺伝子配列に由来する核酸と併用することができる。第5.4.1節に論述されているように、ウイルスを含有するサンプルは、ウイルスに感染したヒトまたは動物に由来するサンプルであってもよいし、ウイルス細胞の培養物に由来するサンプルであってもよい。一実施形態では、ウイルスサンプルは、遺伝子改変実験株を含む。
【０１０８】
次に、遺伝子配列をベクター中に組み込む当技術分野で公知の任意の方法を用いて、増幅されたウイルス遺伝子配列を複製欠損ウイルスベクター中に組み込むことにより、耐性試験ベクター(「RTV」)を構築することができる。一実施形態では、制限酵素および従来のクローニング法を使用する。Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd ed., NY；およびAusubel ET al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照されたい。好ましい実施形態では、ApaIおよびPinAI制限酵素を使用する。好ましくは、複製欠損ウイルスベクターは、インジケーター遺伝子ウイルスベクター(「IGVV」)である。好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、RTVの複製を検出する手段を含有する。好ましくは、ウイルスベクターは、ルシフェラーゼ発現カセットを含有する。
【０１０９】
アッセイは、次のように行うことができる。最初に、RTV DNAと、他のレトロウイルス(たとえば、アンホトロピックマウス白血病ウイルス(MLV))のエンベロープタンパク質を発現するプラスミドとを宿主細胞にコトランスフェクトする。トランスフェクション後、ウイルス粒子を採取し、これを用いて新たな標的細胞に感染させることができる。1ラウンドのウイルス複製の完了は、ベクター中に含まれる複製検出手段により検出することができる。好ましい実施形態では、1ラウンドのウイルス複製の完了により、ルシフェラーゼが産生される。トランスフェクションステップまたは感染ステップのいずれかで、一連の濃度の抗ウイルス剤を添加することができる。
【０１１０】
抗ウイルス剤に対する感受性は、抗ウイルス剤の存在下および不存在下でベクターの複製を比較することにより測定することができる。たとえば、抗ウイルス剤に対する感受性は、抗ウイルス剤の存在下および不存在下でルシフェラーゼ活性を比較することにより測定することができる。感受性ウイルスは、抗ウイルス剤の存在下で低レベルのルシフェラーゼ活性を生じ、一方、感受性の低下したウイルスは、より高レベルのルシフェラーゼ活性を生じるであろう。
【０１１１】
好ましい実施形態では、PHENOSENSETMを用いて、抗ウイルス剤に対するHIV-1の表現型感受性を評価する。好ましくは、抗ウイルス剤はプロテアーゼ阻害剤である。より好ましくは、それはアンプレナビルである。好ましい実施形態では、参照ウイルス株は、HIV株NL4-3またはHXB-2である。
【０１１２】
一実施形態では、ウイルス核酸(たとえば、HIV-1 RNA)を血漿サンプルから抽出し、限定されるものではないが、PCRなどの方法により全ウイルス遺伝子およびその断片を増幅することが可能である。たとえば、Hertogs et al, 1998, Antimicrob Agents Chemother 42 (2):269-76を参照されたい。一例を挙げると、全HIV-1 PRおよびRTコード配列を含有する2.2kbの断片をネステッド逆転写PCRにより増幅する。次に、増幅された核酸(たとえば、PR-RTコード配列)のプールを、ほとんどのPR(コドン10〜99)およびRT(コドン1〜482)配列が欠失したpGEMT3deltaPRTプラスミドと共に、CD4+Tリンパ球(MT4)のような宿主細胞中にコトランスフェクトする。相同的組換えにより、ウイルスコード配列(たとえば、血漿中のHIV-1 RNAに由来するPRおよびRTコード配列)を含有するキメラウイルスを産生させる。トランスフェクトされた遺伝子の産物を標的にするすべての現在利用可能な抗ウイルス剤(たとえば、proRTおよび/またはPR阻害剤)に対するキメラウイルスの感受性は、当技術分野で公知の任意の細胞生存能力アッセイにより決定することができる。たとえば、MT4細胞-3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド系の細胞生存能力アッセイを、高いサンプルスループットを可能にする自動化システムで、使用することができる。RTおよびPR阻害剤のようなすべての抗ウイルス剤に対する耐性のプロファイルを、単一のPR-RT-Antivirogramでグラフ表示することができる。
【０１１３】
当業者に公知の抗ウイルス剤に対するウイルスの表現型感受性を評価するための他のアッセイを使用することができる。たとえば、Shi and Mellors, 1997, Antimicrob Agents Chemother. 41 (12):2781-85; Gervaix et al., 1997, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 94 (9):4653-8; Race et al., 1999, AIDS 13:2061-2068(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１１４】
他の実施形態では、抗ウイルス治療剤による治療に対するウイルスの感受性は、抗ウイルス治療剤の存在下で抗ウイルス治療剤の標的の活性をアッセイすることにより決定される。一実施形態では、ウイルスはHIVであり、抗ウイルス治療剤はプロテアーゼ阻害剤であり、そして抗ウイルス治療剤の標的はHIVプロテアーゼである。たとえば、米国特許第5,436,131号、同第6,103,462号(その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１１５】
5.6 表現型感受性と遺伝子型感受性と関連づけ
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、突然変異が抗ウイルス治療剤に対するウイルスの感受性低下に関連するかつまり本発明に係るRAMであるかを決定することができる。一実施形態では、P値を用いて相関の統計的有意性を決定する。その際、P値が小さいほど、測定が有意であるものとする。好ましくは、P値は0.05未満であろう。より好ましくは、P値は0.01未満であろう。P値は、当業者に公知の任意の手段により算出することができる。一実施形態では、P値は、フィッシャーの直接確率検定を用いて算出される。たとえば、David Freedman, Robert Pisani & Roger Purves, 1980, STATISTICS, W. W. Norton, New Yorkを参照されたい。
【０１１６】
好ましい実施形態では、分析対象の突然変異を有しかつ2.5倍未満または2.5倍超のIC50fold changeを有するサンプルの数を、突然変異のないサンプルの数と比較する。2×2の表を作成し、フィッシャーの直接確率検定を用いてP値を算出することができる(実施例1参照)。0.05または0.01未満のP値は、統計的に有意なものとして分類することができる。
【０１１７】
5.7 抗ウイルス治療剤に対する感受性の決定
他の態様において、本発明は、抗ウイルス治療剤に対するウイルスの感受性を決定する方法を提供する。耐性関連突然変異(RAM)は、先の第5.3〜5.6節に記載されているように同定し抗ウイルス治療剤に関連づけることができる。ウイルス中のRAMの存在は、当技術分野で公知の任意の手段により、たとえば、先の第5.4.2節で論述したように、検出することができる。ウイルス中のRAMの存在により、ウイルスが抗ウイルス治療剤に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることを示唆しうる。一実施形態では、ウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)である。他の実施形態では、ウイルスはヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)である。他の実施形態では、抗ウイルス治療剤はプロテアーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤の例としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルよりなる群から選択される。
【０１１８】
他の実施形態では、本発明は、HIVがプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVのプロテアーゼにおいて、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該プロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95で検出することを含み、該突然変異の存在により、該HIVは該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆されるが、但し、該突然変異は、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記方法を提供する。
【０１１９】
他の実施形態では、本発明は、HIVがプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVのプロテアーゼにおいて、I11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V、およびC95Fよりなる群から選択される突然変異の存在または不存在を検出することを含み、該突然変異が、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連し、そして該突然変異の存在により、該HIVは、該突然変異のないHIV(たとえば、野生型または参照のHIV)と比較して、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆される、上記方法を提供する。
【０１２０】
他の態様において、本発明は、抗ウイルス治療剤に対するウイルスに感染した個体の感受性を決定する方法を提供する。耐性関連突然変異(RAM)は、先の第5.3〜5.6節に記載されているように同定し抗ウイルス治療剤に関連づけることができる。個体由来のサンプル中に存在するウイルス中のRAMの存在は、当技術分野で公知の任意の手段により、たとえば、先の第5.4.2節で論述したように、検出することができる。ウイルス中のRAMの存在により、個体が抗ウイルス治療剤に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることを示唆しうる。一実施形態では、ウイルスはHIVである。他の実施形態では、ウイルスはHIV-1である。他の実施形態では、抗ウイルス治療剤はプロテアーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤の例としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルよりなる群から選択される。他の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。
【０１２１】
他の実施形態では、本発明は、HIVに感染した個体がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該個体から得たサンプルにおいて、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該HIVのプロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95で検出することを含み、該突然変異の存在により、該個体は該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆され、前提条件として、該突然変異が、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記方法を提供する。
【０１２２】
他の実施形態では、本発明は、HIVに感染した個体のプロテアーゼ阻害剤治療の有効性を決定する方法であって、該個体から得たサンプルにおいて、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異の存在または不存在を、該HIVのプロテアーゼのアミノ酸配列のアミノ酸位置11、32、33、34、43、46、47、48、50、54、58、71、76、79、82、83、84、91、または95で検出することを含み、該突然変異の存在により、該個体が該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示すことが示唆され、前提条件として、該突然変異が、V32I、M46I、M46L、I47V、I50V、I54L、I54M、I84Vのいずれでもないものとする、上記を提供する。
【０１２３】
他の実施形態では、本発明は、HIVに感染した個体がプロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっているか否かを決定する方法であって、該HIVのプロテアーゼにおいて、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下に関連するV11I、V11L、L33F、E34Q、K43T、G48M、I54A、I54S、I54T、Q58E、A71L、L76V、P79、V82A、V82F、N83D、I84A、I84C、T91A、T91S、T91V、およびC95Fよりなる群から選択される突然変異の存在または不存在を検出することを含み、該突然変異の存在により、該個体が、該突然変異のないHIV(たとえば、野生型または参照のHIV)に感染した個体と比較して、該プロテアーゼ阻害剤による治療に対する感受性低下を示す可能性が高くなっていることが示唆される、上記方法を提供する。
【０１２４】
5.8 アルゴリズムの構築
一態様において、本発明は、ウイルスに関する遺伝子型データをウイルスに関する表現型データと関連づけるアルゴリズムを構築する方法を提供する。一実施形態では、表現型データを抗ウイルス治療剤に対するウイルスの感受性に関連づける。他の実施形態では、抗ウイルス治療剤は抗ウイルス化合物である。他の実施形態では、抗ウイルス化合物はプロテアーゼ阻害剤である。他の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。
【０１２５】
一実施形態では、アルゴリズムの構築方法は、1セットのウイルスに関する遺伝子型データをその組のウイルスに関する表現型データと関連づける1つまたは複数の規則を作成することを含む。
【０１２６】
一実施形態では、1セットのウイルス中の各ウイルスに関する遺伝子型および表現型のデータを含むデータセットを集成する。当技術分野で公知の任意の方法を用いて、ウイルスに関する遺伝子型データを収集することができる。そのようなデータ収集方法の例は前述した。ウイルスに関する表現型データを収集するために、当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。そのような方法の例は前述した。好ましい実施形態では、データセットは、上述したような1つ以上のRAMを含む。一実施形態では、各遺伝子型データは、そのウイルスセット中のウイルスのウイルスタンパク質の全部または一部分の配列である。他の実施形態では、データセット中の各遺伝子型データは、参照ウイルス中の参照タンパク質に対する、ウイルスによりコードされるタンパク質の単一アミノ酸変化である。他の実施形態では、遺伝子型は、ウイルスタンパク質中に2、3、4、5、6個、またはそれ以上のアミノ酸変化を含む。他の実施形態では、ウイルスはHIVであり、タンパク質はHIVプロテアーゼである。好ましい実施形態では、ウイルスはHIV-1である。他の実施形態では、参照タンパク質はNL4-3 HIV由来のプロテアーゼである。
【０１２７】
一実施形態では、データセット中の各表現型データは、そのウイルスセット中のウイルスの抗ウイルス治療剤に対する感受性である。一実施形態では、抗ウイルス治療剤は抗ウイルス化合物である。他の実施形態では、抗ウイルス化合物はプロテアーゼ阻害剤である。好ましい実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。一実施形態では、感受性は、参照ウイルスに対するウイルスの感受性の変化として測定される。他の実施形態では、感受性は、参照ウイルスに対するウイルスのIC50の変化として測定される。他の実施形態では、IC50の変化は、IC50のfold changeとして表される。特定の実施形態では、ウイルスはHIVである。好ましい実施形態では、ウイルスはHIV-1である。他の好ましい実施形態では、参照HIVは、NL4-3 HIVである。
【０１２８】
データセット中の遺伝子型および表現型のデータは、当技術分野で公知の任意の方法により表現または編成することができる。一実施形態では、グラフの形態でデータを表示する。このタイプの表現では、y軸は、参照ウイルスに対するデータセット中のウイルスのIC50のfold changeを表す。グラフ上の各点は、データセット中の1つのウイルスに対応する。x軸は、データセット中のウイルスが有する突然変異の数を表す。点の位置は、突然変異の数と、ウイルスが有する抗ウイルス療法治療におけるfold changeと、の両方を示し、両方とも参照株に対して測定される。他の実施形態では、データセット中の遺伝子型および表現型のデータは、チャートの形態で表示される。
【０１２９】
一態様において、データセット中の遺伝子型データを表現型データと関連づけるアルゴリズムを定式化する。一実施形態では、表現型カットオフ点を規定する。好ましい実施形態では、表現型は、抗ウイルス治療剤に対する感受性である。他の実施形態では、表現型は、参照ウイルスと対比したときの抗ウイルス治療剤に対する感受性の変化であり、カットオフ点は、ウイルスまたはウイルス集団が抗ウイルス療法に対して表現型耐性(「PT-R」)であると規定される下限かつウイルスまたはウイルス集団が抗ウイルス療法に対して表現型感受性(「PT-S」)であると規定される上限の値である。いくつかの実施形態では、カットオフ点は、参照ウイルスのIC50の2倍、2.5倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、または100倍である。いくつかの実施形態では、表現型カットオフ点は、先に定義したような臨床カットオフ値である。好ましい実施形態では、ウイルスはHIVであり、抗ウイルス療法はプロテアーゼ阻害剤による治療である。好ましい実施形態では、プロテアーゼ阻害剤はアンプレナビルである。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、表現型カットオフ点を用いて遺伝子型カットオフ点を規定する。一実施形態では、これは、データセットのウイルス中の突然変異の数をウイルスの表現型感受性と関連づけることにより行われる。これは、たとえば、先に論述したのと類似したグラフを用いて行うことができる。遺伝子型カットオフ点は、その値よりも大きい突然変異数を有するデータセット中のほとんどのウイルスが表現型耐性(「PT-R」)でありかつその値よりも小さい突然変異数を有するほとんどのウイルスが表現型感受性である(「PT-S」)ように選択される。定義により、遺伝子型カットオフに等しいかまたはそれよりも大きい突然変異数を有するデータセット中のウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性(「GT-R」)であり、突然変異の遺伝子型カットオフ数よりも少ない数を有するデータセット中のウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性(「GT-S」)である。したがって、一実施形態では、表現型耐性かつ遺伝子型耐性(「PT-R、GT-R」)または表現型感受性かつ遺伝子型感受性(「PT-S、GT-S」)のいずれかであるデータセット中のウイルスのパーセントが最大になる遺伝子型カットオフ点を選択する。
【０１３１】
このアルゴリズムはデータセット中の遺伝子型データと表現型データとの関係の有用な近似を提供することができるが、ほとんどの場合、遺伝子型感受性であるが表現型耐性である株(「GT-S、PT-R」)または遺伝子型耐性であるが表現型感受性である株(「GT-R、PT-S」)が、有意な数存在するであろう。したがって、好ましい実施形態では、データセット中の不一致結果のパーセントを減少させるように、アルゴリズムをさらに改良する。これは、たとえば、試験したアルゴリズムで対象とした1つの位置に野生型を含む突然変異の混合を含むウイルス集団に対応する各データ点をデータセットから除去することにより行われる。これは、PT-S, GT-R結果の数を減少させることにより不一致結果の全体的パーセントを減少させる働きがあるので、データセットに対するアルゴリズムの適合性を改善する。
【０１３２】
他の実施形態では、データセットで観測される1つ以上の突然変異に示差的加重値を割り当てる。このステップを含まないアルゴリズムでは、データセット中の各突然変異が抗ウイルス療法に対するウイルスまたはウイルス集団の全体的耐性に等しく寄与することが仮定される。たとえば、データセット中には、抗ウイルス治療剤に対する表現型耐性にほとんどいつも関連する突然変異が存在しうる。すなわち、その突然変異を有するほとんどすべてのウイルスは、全突然変異が1つまたは2つだけの株でさえも、抗ウイルス治療剤に対して表現型耐性である。一実施形態では、そのような突然変異に「加重」を行う。すなわち、増大された突然変異スコアを割り当てる。たとえば、2、3、4、5、6、7、8、またはそれ以上の加重を突然変異に割り当てることができる。たとえば、2の加重が割り当てられた突然変異は、ウイルス中の2つの突然変異としてカウントされるであろう。小数加重値を割り当てることもできる。他の実施形態では、突然変異が抗ウイルス治療剤に対するウイルスの感受性の増大に関連する場合、1未満およびゼロ未満の値を割り当てることができる。
【０１３３】
特定の突然変異に増大された加重を割り当てることに伴うトレードオフが存在することは、当業者であればわかるであろう。突然変異の加重を増大させるにつれて、GT-R, PT-S不一致結果の数が増大する可能性がある。このため、大きすぎる加重を突然変異に割り当てると、アルゴリズムの全体的不一致が増大する可能性がある。したがって、一実施形態では、GT-S, PT-R不一致結果の減少とGT-R, PT-S不一致結果の増大とのバランスをとる加重を突然変異に割り当てる。
【０１３４】
他の実施形態では、データセット中の異なる突然変異間の相互作用も、アルゴリズム中に因子として組み込む。たとえば、2つ以上の突然変異が相乗的に作用することが見いだされる可能性がある。すなわち、ウイルス中の突然変異の同時発生が、各突然変異の作用が互いに独立しているとしたときに予測より有意に多くウイルスの耐性に寄与する可能性がある。他の選択肢として、ウイルス中の2つ以上の突然変異の同時発生が、各突然変異が独立して起こったときの耐性への寄与から予想されるよりも有意に少なくウイルスの耐性に寄与することが見いだされる可能性がある。また、2つ以上の突然変異が独立した突然変異として起こるよりも頻繁に同時発生することが見いだされる可能性がある。したがって、一実施形態では、同時に起こる突然変異に同時に加重を行う。たとえば、GT-R, PT-S不一致結果の数の増大を回避するために、突然変異のうちの1つだけに1以上の加重を割り当て、他の1つまたは複数の突然変異にゼロの加重を割り当てる。
【０１３５】
他の態様において、データセットのウイルス中の突然変異の数および種類をウイルスの表現型感受性に関連づけることにより、表現型カットオフ点を用いて遺伝子型カットオフ点を規定することができる。突然変異の種類の例としては、第一級アミノ酸突然変異、第二級アミノ酸突然変異、ポリペプチド上の実効電荷が保存される突然変異、および特定の位置のアミノ酸の極性、疎水性、または親水性が変化しない突然変異が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の範囲内にある他の突然変異の種類は、本明細書中の教示に基づいて、当業者に自明であろう。
【０１３６】
一実施形態では、突然変異の1つ以上の種類に対する要件を因子として組み込んだアルゴリズムを構築する。他の実施形態では、突然変異の1つ以上の種類の最小数に対する要件をアルゴリズムに因子として組み込む。他の実施形態では、一次または二次突然変異の最小数に対する要件をアルゴリズムに因子として組み込む。他の実施形態では、一次または二次突然変異に対する要件を他の突然変異と組み合わせてアルゴリズムに因子として組み込む。たとえば、突然変異の特定の組合せを有するウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して耐性であるが、その組合せ中の任意の突然変異を単独でまたはその組合せの一部でない他の突然変異と共に有するウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して耐性でないことが見いだされる可能性がある。
【０１３７】
たとえば、先に述べた方法を用いて、任意の所望の結果が得られるように、アルゴリズムをデザインすることができる。一実施形態では、全体的一致(PT-R, GT-R群のパーセントとPT-S, GT-S群のパーセントとの合計、または100 - (PT-S, GT-R群のパーセント + PT-R, GT-S群のパーセント))を最大化するようにアルゴリズムをデザインする。好ましい実施形態では、全体的一致は、約75%、80%、85%、90%、または95%超である。他の実施形態では、PT-R, GT-S結果のパーセントを最小化するようにアルゴリズムをデザインする。他の実施形態では、PT-S, GT-R結果のパーセントを最小化するようにアルゴリズムをデザインする。他の実施形態では、PT-S, GT-S結果のパーセントを最大化するようにアルゴリズムをデザインする。他の実施形態では、PT-R, GT-R結果のパーセントを最大化するようにアルゴリズムをデザインする。
【０１３８】
アルゴリズムの構築時または構築後の任意の時点で、第2のデータセットでさらに試験することができる。一実施形態では、第2のデータセットは、アルゴリズムを構築するのに使用したデータセットに含まれないウイルスよりなる。すなわち、第2のデータセットは、未処理データセットである。他の実施形態では、第2のデータセットは、アルゴリズムを構築するのに使用したデータセット中に存在した1つ以上のウイルスと、そのデータセット中に存在しなかった1つ以上のウイルスと、を含有する。第2のデータセット(とくに、未処理データセット)でアルゴリズムを用いれば、アルゴリズムの予測性能を評価することができる。したがって、一実施形態では、第2のデータセットを用いてアルゴリズムの確度を評価し、上述したようにアルゴリズムの規則に変更を加えて、その確度を改良する。好ましい実施形態では、反復法を用いてアルゴリズムを生成する。その際、アルゴリズムを試験し、次に、所望のレベルの確度が得られるまで、繰返し変更を加える。
【０１３９】
一態様において、アルゴリズムの構築または実施は、いくつかの「出発突然変異」から開始し、特定の突然変異の存在または突然変異の種類を因子として組み込むステップに進めることができる。一実施形態では、I50Vだけまたは任意の1つ以上のV32I、I54LもしくはM、I84AもしくはV + 2つの二次突然変異の存在をアルゴリズムに因子として組み込む。表5に列挙された二次突然変異のいずれかを使用することができる。次に、出発突然変異に加えて他の突然変異をアルゴリズムに因子として組み込む。このほかの突然変異としては、たとえば、82FおよびI84C、ならびに任意の1つ以上の54A、54S、または54Tを挙げることができる。一実施形態では、その後のすべての段階において、二次突然変異の最小数をアルゴリズムに因子として組み込む。より特定的な実施形態では、その後のすべての段階において、少なくとも2つの二次突然変異をアルゴリズムに因子として組み込む。次に、このほかの突然変異(たとえば、33Fと82Aの組合せ)の存在をアルゴリズムに因子として組み込むことができる。2以上突然変異の組合せをアルゴリズムに因子として組み込む場合、一般的には、その両方の突然変異(たとえば、33Fと82A)が同一のウイルス(またはサンプル)中に存在すると解釈される。最後に、このほかの組合せ、たとえば、46Iまたは46Lと、任意の1つ以上の47V、54V、71L、76V、または82Aとの組合せを、アルゴリズムに因子として組み込むことができる。上述したようなアルゴリズムの構築時または実施時、全体的不一致の減少およびアルゴリズムの各ステップで低下したPT-R, GT-S群のデータのパーセントは、表現型耐性を引き起こす突然変異および突然変異の組合せを正確に予測するという点でアルゴリズムがその都度改良されたことを示唆する。
【０１４０】
5.9 ウイルスの感受性を予測するアルゴリズムの使用
他の態様において、本発明はまた、ウイルスの遺伝子型に基づいて抗ウイルス治療剤に対するウイルスまたはウイルス派生物の表現型感受性を予測すべく本発明のアルゴリズムを使用する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ウイルスまたはウイルス派生物において1つ以上のRAMの存在または不存在を検出することと、検出されたRAMにアルゴリズムの規則を適用することを含み、アルゴリズムの規則を満たすウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性であり、アルゴリズムの規則を満たさないウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性である。他の実施形態では、本方法は、ウイルスまたはウイルス派生物において1つ以上のRAMの存在または不存在を検出することと、検出されたRAMにアルゴリズムの規則を適用することを含み、遺伝子型カットオフスコアに等しいかまたはそれ以上であるスコアは、ウイルスが抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性であることを示唆し、遺伝子型カットオフ未満のスコアは、ウイルスが抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性であることを示唆する。
【０１４１】
本発明のアルゴリズムは、先に第5.4.1.節で述べたように、抗ウイルス剤感受性が問題となる任意のウイルス性疾患に使用することができる。特定の実施形態では、本発明のアッセイは、抗ウイルス剤に対するレトロウイルスの感受性を決定するために使用することができる。好ましい実施形態では、レトロウイルスはHIVである。好ましくは、ウイルスはHIV-1である。
【０１４２】
本発明の抗ウイルス剤は、ウイルスに有効な任意の治療剤でありうる。たとえば、本発明の薬剤感受性試験で試験することのできるウイルスの構造、生活環、および遺伝因子を理解することは、本発明を実施するうえで有用である。当業者であれば、これらについて熟知していよう。また、これらは、たとえば、抗ウイルス剤の標的となりうる鍵となる酵素および他の分子を提供するであろう。本発明の抗ウイルス剤の例としては、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、たとえば、AZT、DDI、ddC、d4T、3TC、アバカビル、ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、たとえば、テノフォビル、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、たとえば、ネビラピン、エファビレンツ、デラビルジン、融合阻害剤、たとえば、T-20およびT-1249、ならびにプロテアーゼ阻害剤、たとえば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態では、抗ウイルス剤はレトロウイルスを標的とする。特定の実施形態では、抗ウイルス剤は、プロテアーゼ阻害剤、たとえば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルである。好ましい実施形態では、抗ウイルス剤はアンプレナビルである。
【０１４４】
抗ウイルス剤による治療に対する感受性低下に関連するいくつかの突然変異は、当技術分野で公知である。たとえば、Maguire et al., 2002, Antimicrob Agents Chemother 46:731-738を参照されたい。他のものは、先の第5.4〜5.8節に記載されている方法により決定することができる。たとえば、表1は、アンプレナビルに対する感受性低下に関連する突然変異のリストを提供する。
【０１４５】
5.10 個体に対する抗ウイルス治療剤の有効性を予測するアルゴリズムの使用
他の態様において、本発明はまた、抗ウイルス治療剤に対してウイルスの遺伝子型に基づいてウイルスに感染した個体に対する抗ウイルス治療剤の有効性を予測すべく本発明のアルゴリズムを使用する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ウイルスまたはウイルス派生物において1つ以上のRAMの存在または不存在を検出することと、検出されたRAMにアルゴリズムの規則を適用することを含み、アルゴリズムの規則を満たすウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性であり、アルゴリズムの規則を満たさないウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性である。他の実施形態では、本方法は、ウイルスまたはウイルス派生物において1つ以上のRAMの存在または不存在を検出することと、検出されたRAMにアルゴリズムの規則を適用することを含み、遺伝子型カットオフスコアに等しいかまたはそれ以上であるスコアは、ウイルスが抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性であることを示唆し、遺伝子型カットオフ未満のスコアは、ウイルスが抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性であることを示唆する。
【０１４６】
上記の第5.4.1節に記載されているように、本発明のアルゴリズムは、抗ウイルス剤感受性が問題となる任意のウイルス性疾患に使用することができる。また、本発明の抗ウイルス剤は、ウイルスに有効な任意の治療剤でありうる。特定の実施形態では、本発明のアッセイは、抗ウイルス剤に対するレトロウイルスの感受性を決定するために使用される。好ましい実施形態では、レトロウイルスはHIVである。好ましくは、ウイルスはHIV-1である。本発明のいくつかの実施形態では、抗ウイルス剤はレトロウイルスを標的とする。特定の実施形態では、抗ウイルス剤は、プロテアーゼ阻害剤、たとえば、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルである。好ましい実施形態では、抗ウイルス剤はアンプレナビルである。
【０１４７】
上記の第5.9節に記載されているように、抗ウイルス剤による治療に対する感受性低下に関連する突然変異は、当技術分野で取得可能であるかまたは先に第5.4〜5.8節に記載した方法により決定可能である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルスに感染しかつ同一であるかまたは異なっている抗ウイルス治療剤による先行治療を受けているかまたは受けたことがある個体において抗ウイルス治療剤の有効性をモニターする方法であって、該個体のサンプルにおいて抗ウイルス治療剤の治療に対する感受性低下に関連するアミノ酸残基の存在または不存在を検出することを含み、残基の存在が抗ウイルス治療剤による治療に対応する感受性低下に関連する、上記方法を提供する。
【０１４９】
5.11 一方の抗ウイルス治療剤に対する感受性と他方の抗ウイルス治療剤に対する感受性との相関
他の態様において、本発明は、異なる抗ウイルス治療剤に対するウイルスの遺伝子型感受性に基づいてウイルスに対する抗ウイルス治療剤の有効性を予測すべく本発明のアルゴリズムを使用する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ウイルスまたはウイルス派生物において抗ウイルス治療剤に対する耐性に関連する1つ以上の突然変異の存在または不存在を検出することと、検出された突然変異に本発明のアルゴリズムの規則を適用することを含み、アルゴリズムの規則を満たすウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性であり、アルゴリズムの規則を満たさないウイルスは、抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性である。他の実施形態では、本方法は、ウイルスまたはウイルス派生物において抗ウイルス治療剤に対する耐性に関連する1つ以上の突然変異の存在または不存在を検出することと、検出された突然変異にアルゴリズムの規則を適用することを含み、遺伝子型カットオフスコアに等しいかまたはそれ以上であるスコアは、ウイルスが、異なる抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型耐性であることを示唆し、遺伝子型カットオフ未満のスコアは、ウイルスが、異なる抗ウイルス治療剤に対して遺伝子型感受性であることを示唆する。他の実施形態では、2つの抗ウイルス治療剤は、同一のウイルスタンパク質に影響を及ぼす。他の実施形態では、2つの抗ウイルス治療剤は、両方とも、プロテアーゼ阻害剤である。プロテアーゼ阻害剤の例としては、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、およびロピナビルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、2つの抗ウイルス治療剤の一方は、アンプレナビルである。他の実施形態では、一方のプロテアーゼ阻害剤に対する耐性に関連する突然変異を、他方のプロテアーゼ阻害剤に対する耐性に関連づける。
【実施例】
【０１５０】
6. 実施例
以下の実施例は、本発明の特定の態様を例示するために提供されたものであり、本発明の内容を限定しようとするものではない。
【０１５１】
6.1 実施例1：耐性関連突然変異を同定する患者サンプルの分析
この実施例では、アンプレナビルのようなプロテアーゼ阻害剤に対する感受性の増大または低下に関連する突然変異を同定すべく患者サンプルを分析する方法を示す。HIV-1株のプロテアーゼ配列と、アンプレナビルによる治療に対するその感受性との関係を決定するために、10,513個のサンプルのデータセットを使用した。このデータセットから、すべての「野生型」サンプル、すなわち、すべてのプロテアーゼ阻害剤に対してFC<2を有するサンプルおよび薬剤選択性突然変異を含まないサンプルを除外した。図2は、詳細に解析した最後の1セットのサンプルに到着するまでのステップを記述したフロー図を示している。サンプルを除外する判定基準として使用した薬剤選択性PI突然変異は、HIVプロテアーゼのアミノ酸位置23、24、30、32、33F、46、48、50、53、54、82(82I以外)、84、88、または90で生じた突然変異であった(図2)。次に、同一の遺伝子型を有するサンプルをデータセットから除外した。これにより、データセット中に4414個の患者血漿サンプルが残った。これを遺伝子型および表現型により分析した。
【０１５２】
表現型アッセイは、PHENOSENSETM(Virologic, South San Francisco, CA)HIVアッセイ(Petropoulos et al., 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44:920-928；米国特許第5,837,464号および同第6,242,187号)を用いて行った。アンプレナビルのIC50値は、患者サンプル由来のHIV-1に対して得られたものである。これをNL4-3(GenBank Accession No. AF324493)参照ウイルス株に対して得られたアンプレナビルのIC50と比較した。アンプレナビルの50%阻害濃度(IC50)の「fold change」(またはlog fold change)として表現型データを表した。患者血漿サンプル由来のHIV-1に対して得られたアンプレナビルのIC50をNL4-3(GenBank Accession No. AF324493)参照ウイルス株に対して得られたアンプレナビルのIC50で割ることにより、IC50倍率値を算出した。APVに対する表現型耐性を規定するために使用したカットオフは、2.5倍であった。このカットオフ値は臨床転帰試験から導いたものではないが、2.5倍という閾値には意味がある。その理由は、次のとおりである：アンプレナビルが投与された患者を含むコホートにおいて、このカットオフを用いた表現型結果と臨床反応データとの間に強い相関が存在すること(Haubrich et al, 2001, Antivir Ther 6 (suppl 1): 63; Katzenstein et al., 2002, 9TH CROI, Seattle, WA)；アンプレナビルを用いたとき、最初のPIは軽度であるが(2〜3倍程度の低さ)、ウイルス量のリバウンドを経験した患者ではアンプレナビルに対する感受性低下が観測されたこと(Maguire et al., 2002, Antimicrob Agents Chemother 46:731-738)である；およびPHENOSENSETMアッセイを用いたとき、遺伝子型野生型ウイルスにおけるアンプレナビルFCの分布の99百分位数が、2.1倍であったこと。アンプレナビルFC>2.5を有する突然変異体に対して、%Rおよび%Sの値を、次式に従って算出した：
%R=(PT-Rであった突然変異含有サンプルの数)/(PT-Rサンプルの合計数)
%S=(PT-Sであった突然変異含有サンプルの数)/(PT-Sサンプルの合計数)
アンプレナビルに対する感受性低下に関連する遺伝子型変化を規定するために、患者のサンプルのそれぞれに含まれるHIVプロテアーゼの全アミノ酸配列を分析した。突然変異をNL4-3(GenBank Accession No. AF324493)参照株のプロテアーゼ配列と比較した。4414個のサンプルの少なくとも1%(すなわち、少なくとも44個のサンプル)で突然変異を起こした位置はすべて、詳細に分析した。混合物を突然変異体としてカウントした。いくつかの場合には、同一位置の異なるアミノ酸を一まとめにしたが(たとえば、位置67)、他の位置(たとえば、位置82)の異なる突然変異(たとえば、V82A、F、S、またはT)は、個別にカウントした。
【０１５３】
表現型と遺伝子型との相関の統計的有意性を決定するために、P値を算出した。各突然変異について、APV FC < 2.5またはAPV FC > 2.5を有するデータセット中のサンプルの数を、対象の突然変異を含むサンプルまたは含まないサンプルで比較した。2×2の表を作成し、フィッシャーの直接確率検定を用いてP値を算出した。P < 0.001かつ%R/%S > 3を有する突然変異を、アンプレナビルに対する感受性低下に関連するとみなし；P < 0.001かつ%R/%S < 0.3を有する突然変異を、アンプレナビルに対する感受性の増大に関連するとみなした。本発明の範囲内にあるPの他の値(たとえば、P < 0.05)および%R/%S比の他の値(たとえば、%R/%S > 4または5および%R/%S < 0.25または0.2)は、本明細書中の教示に基づいて当業者には自明であろう。表2は、分析された突然変異の全リストを提供する。また、表1は、アンプレナビルに対する感受性低下または増大のいずれかに関連した突然変異のリストを提供する(すなわち、P < 0.001かつ%R/%S > 3または%R/%S < 0.3を有する突然変異)。
【０１５４】
6.2 実施例2：アンプレナビル感受性とHIVプロテアーゼ中の突然変異との相関
この実施例では、HIVのプロテアーゼ遺伝子中の突然変異を、アンプレナビルに対するその感受性に、関連づけるアルゴリズムの構築について示す。4414個の患者血漿サンプルのデータセットを分析し、アンプレナビルに対する感受性低下に関連する突然変異を実施例1に記載されるように同定した。アンプレナビルに対する表現型感受性(アンプレナビル Fold Change)を、患者の血漿サンプル中に存在するHIVのプロテアーゼ中の突然変異の数の関数として分析した。患者の血漿サンプル由来のHIV-1に対して得られたアンプレナビルのIC50をNL4-3(GenBank Accession No. AF324493)参照ウイルス株に対して得られたアンプレナビルのIC50で割ることにより、サンプルごとにfold changeを算出した。各患者のサンプル中に存在するHIVのプロテアーゼの配列決定を行い、NL4-3(GenBank Accession No. AF324493)HIVの配列と対比して配列変化を決定することにより、遺伝子型データを取得した。NL4-3プロテアーゼのアミノ配列を配列番号1(図3A)で提供し、NL4-3プロテアーゼ遺伝子の核酸配列を配列番号2(図3B)で提供する。
【０１５５】
予備的ラウンドの分析で使用した突然変異は、一次アンプレナビル突然変異I54M、I50V、V32I、I54L、I84V(Maguire et al., 2002, Antimicrob Agents Chemother 46:731-738により同定された)およびI84Aであった。上記の突然変異(V32I、I50V、I54LもしくはM、またはI84AもしくはV)のいずれかが存在する場合、サンプルを遺伝子型耐性(「GT-R」)として規定した。単変量解析(フィッシャーの直接確率検定によりP < 0.001を有意であるとみなした)および回帰ツリー(CART)解析(Statview 5.0 software; SAS, Cary, NC)を用いて、データを解析した。
【０１５６】
この解析の結果を4つの群に分けた。プロテアーゼ中に先に規定した突然変異を含有せず、しかもアンプレナビルに対して表現型感受性かつ遺伝子型感受性(PT-S, GT-S)でいるウイルスは、1635サンプル(すなわち、4414個のサンプルの37%)であった。先に規定した突然変異の少なくとも1つを含有し、しかもアンプレナビルに対して表現型耐性かつ遺伝子型耐性(PT-R, GT-R)であるウイルス(APV FC>2.5；logアンプレナビル Fold Change>0.398)は、1698サンプル(すなわち、サンプルの38.5%)であった。他の2つの群は、「例外」に相当し、ウイルスは、遺伝子型(突然変異の数)に基づいて感受性であると予測されたが、表現型では(logアンプレナビル Fold Changeに基づいて)耐性であったか(PT-R, GT-S)、またはウイルスは、遺伝子型に基づいて耐性であると予測されたが、表現型では(logアンプレナビル Fold Changeに基づいて)感受性であった(PT-S, GT-R)。
【０１５７】
初回の遺伝子型判定では、その約4分の1が、観測された表現型の結果と不一致であった。865個のサンプル(サンプルの19.6%に相当する)は、先に規定した突然変異がすべて欠如していたが、予想とは異なり、アンプレナビルに対して表現型耐性であることが判明した(PT-R, GT-S)。逆に、1つ以上の先に規定した突然変異を有していたいくつかのウイルスは、アンプレナビルに対してWT株よりも大きな耐性を示さなかった(PT-S, GT-R)(216サンプル(4.9%)。
【０１５８】
6.3 実施例3：PT-R, GT-S不一致群の解析
この実施例では、特定の突然変異および突然変異の特定の組合せが他のものよりも大きくアンプレナビル耐性に寄与することを示す。実施例2のPT-R, GT-S群のサンプルは、アンプレナビルに対する感受性低下に関連するHIVプロテアーゼ中の公知の一次突然変異をもたないウイルスに相当する(すなわち、V32I、I50V、I54LもしくはM、またはI84AもしくはVのいずれをも含まない)。これらのウイルスは、表現型耐性であったが(2.5よりも大きいアンプレナビル Fold Changeを有していた)、遺伝子型感受性であると予測された(既知の一次突然変異をまったく有していなかったため)。アンプレナビルに対する不一致の大部分は、PT-R, GT-Sタイプであるので、表現型に関連するが単純に既知の突然変異と共に現れるものではない突然変異に焦点をあてて、アルゴリズムの開発を行った。したがって、既知の突然変異を有するサンプル(GT-R)を除外した。これにより、全体で2499個のサンプルが残った。これらの34%は、APV FC > 2.5を有していた(図4)。
【０１５９】
CART(分類ツリーと回帰ツリー)解析は、APV感受性低下を規定する最も重要な変数の同定を可能にした。図4は、解析により生成されたツリーを示している。アンプレナビルに対する感受性低下に寄与する突然変異として解析により同定されたのは次のとおりであった：V11I, L、V32I、L33F、E34Q、K43T、I47V、G48M、I50V、I54M、I54S、I54A、I54L、I54T、A71L、L76V、V82F、I84V、およびT91。さらに、解析はまた、アンプレナビルに対する感受性低下に独立して関連することはないが他の突然変異と組み合わされてアンプレナビルに対する感受性低下に関連する可能性のあるいくつかの突然変異の同定を可能にした。このリストに含まれたのは、次のとおりであった：L10F、L10I、L24I、E35、M46I、M46L、G48V、F53L、I54V、Q58E、C67、A71V、G73、V82S、V82A、I84A、およびL90M。これらの突然変異のすべての可能なペアを調べて、上述したようにフィッシャーの直接確率検定を行った。結果を表3および図5にまとめる。図5は、アンプレナビルに対する耐性に関連する突然変異ペアのマトリックスである。各セル中の数は、その突然変異ペアに対するオッズ比(%R:%S)であり、括弧中の数は、そのペアを有するサンプルの数を示す。対応するペアがP < 0.001(フィッシャーの直接確率検定により決定される)を有していたセルだけが、セル中に数を有する。
【０１６０】
アンプレナビルに対する感受性低下との強い関連を有する上記の突然変異のペアを、図6に示されるようにCART解析により再び調べた。
【０１６１】
したがって、PT-R, GT-S群は、アンプレナビルに対する感受性低下に独立して関連することはないが他の突然変異と組み合わされてアンプレナビルに対する感受性低下に寄与する突然変異の存在に関連しうることは明らかである。
【０１６２】
6.4 実施例4：アルゴリズムおよびその確度の実証
この実施例では、特定の突然変異、突然変異の種類、および突然変異の組合せを要件に加えることにより、PT-R, GT-S結果の発生率を減少させるアルゴリズムの構築について示す。
【０１６３】
実施例3に記載されているように、4414個のサンプルの出発データセットから、APV GT-Rのサンプルを除外し、2499個のサンプルのデータセットを得た。4414サンプルのデータセットと2499サンプルのデータセットの両方(これらのデータを「トレーニングデータ」と名づけた)で得られた結果に基づいて、最終規則を定式化した。ウイルスの感受性がアルゴリズムのみに基づいて決定されうる確度に基づいて、考案された規則またはアルゴリズムの確度を評価した。予測結果と観測結果との間に矛盾がみられたとき、観測結果との整合性が保たれるようにアルゴリズムに変更を加えた。次に、トレーニングデータから考案された規則を、患者の「バリデーションデータセット」で試験した。バリデーションデータセットは、11,768サンプルのデータセットから開始して取得した。実施例1に記載されているステップに準じて、すべてのプロテアーゼ阻害剤に対してFC < 2を有するサンプルおよび薬剤選択性突然変異を含まないサンプルを、このデータセットから除外した。次に、同一の遺伝子型を有するサンプルを除外した。最後に、トレーニングデータセット中に存在するサンプルを除外した。これにより、1634サンプルのバリデーションデータセットを得た。これを用いて、トレーニングデータセットだけを用いて導いたアルゴリズムの確度を試験した。
【０１６４】
アルゴリズムの開発の各ラウンドまたはバージョンで適用した規則ならびに4414サンプルのトレーニングデータおよび1634サンプルのバリデーションデータで得られた結果を表4にまとめて示す。第1のカラムは、試験の各ラウンドで使用した規則を示している。規則は累積される。すなわち、各ラウンドの規則は、先行するラウンドに追加される。
【０１６５】
次の4つのカラムは、順次、PT-S, GT-S群、PT-R, GT-R群、PT-R, GT-S群、およびPT-S, GT-R群のサンプルの数を示している。PT-S, GT-R列の数は、一次位置または少なくとも2つの二次位置における混合物に関連するPT-S, GT-Rサンプルを除外した数である。混合物を突然変異体としてカウントしたので、たとえば、50%未満の突然変異体を有するサンプルは、たとえその表現型耐性が真の突然変異体ほど高くない可能性があったとしても、遺伝子型を調べる目的では、突然変異体としてカウントされるであろう。このため、規則だけに基づいて予想されるよりも、PT-S, GT-R群に含まれるサンプルの数が多くなる。
【０１６６】
表4の次の3つカラムは、順次、PT-R, GT-S群に含まれるサンプルのパーセントおよびPT-S, GT-R群に含まれるサンプルのパーセントならびに全体的不一致(PT-R, GT-S群のパーセントとPT-S, GT-R群のパーセントとの合計、または100 - (PT-S, GT-S群のパーセント + PT-R, GT-R群のパーセント))を示している。
【０１６７】
アルゴリズムは、I50V単独または任意の1つ以上のV32I、I54LもしくはM、I84AもしくはV + 2つの二次突然変異を意味する「出発突然変異」を要件に加えることから開始した。表5に列挙された二次突然変異のいずれかを使用することができる。次のラウンドで、82FおよびI84C、ならびに任意の1つ以上の54A、54S、または54Tを加えた。このラウンドから、少なくとも2つの二次突然変異(表4の「2mut」)を必要とした。次のラウンドで、33Fと82Aの組合せを加えた。これは、33Fと82Aの両方が同一のウイルス(またはサンプル)中に存在することを必要とした。最後のラウンドで、46Iまたは46Lと、任意の1つ以上の47V、54V、71L、76V、または82Aとの組合せを加えた。
【０１６８】
アルゴリズムの各ラウンドで、全体的不一致およびPT-R, GT-S群のデータのパーセントが減少したことから、表現型耐性を引き起こす突然変異および突然変異の組合せを正確に予測する点で、アルゴリズムが毎回改良されたことが示唆される。トレーニングデータセットでは、全体的不一致は、第1ラウンドの24.5%から最後ラウンドの14.7%まで有意に減少し、PT-R, GT-S群のサンプル数は、それに対応して全サンプルの19.6%から5.9%まで減少した。
【０１６９】
バリデーションデータセットでは、トレーニングデータセットと比較して、開始時の全体的不一致(15.8%)が少なく、しかもPT-R, GT-S群のサンプル(12.8%)が少なかった。理論により拘束されるものではないが、この原因は、バリデーションデータセットに含まれる複雑なウイルスプロテアーゼ遺伝子型を有するサンプルがより少なかったからであると考えられる。トレーニングデータセットのサンプルだけを用いて開発されたアルゴリズムがアンプレナビルに対する任意のウイルスの感受性を正確に予測する確度は、バリデーションデータセットでのその性能により示される。最終的アルゴリズム、すなわち、表4のトレーニングデータセットの最後の行の規則(バリデーションデータセットの項に「最終的アルゴリズム」として示されている)を適用したところ、全体的不一致およびPT-R, GT-S群のデータのパーセントは、それぞれ、15.8%から10.3%まで、12.8%から4.4%まで有意に減少した。
【０１７０】
6.5 実施例5：N88S突然変異の効果
この実施例では、アンプレナビルに対する感受性低下に強く関連する突然変異を含有するウイルスをN88Sにより再感作させることができることを示す。
【０１７１】
N88Sは、プロテアーゼ阻害剤耐性突然変異であり、アタザナビルによりin vitroで選択される(Gong et al, 2000, Antimicrob Agents Chemother 44:2319-26)。それは、インジナビルによる治療の後にもみられる(Condra et al., 1996, J. Virol. 70:8270-8276)。表1および2からわかるように、HIVプロテアーゼ突然変異N88Sは、それが存在するウイルスのアンプレナビルに対する感受性の増大に関連する。一方、I50Vは、反対の作用を有し、感受性低下に関連する。HIV感染患者に由来するサンプルを遺伝子型および表現型に関して分析した。サンプルは、HIVプロテアーゼ中にL10I、I13V、E35D、M36I、R41K、I50V、L63P、A71V、N88N/S(すなわち、位置88におけるNとSの混合物)、およびL90Mの突然変異を含有することが判明した。表現型に関しては、異なるプロテアーゼ阻害剤で次のIC50fold changeが観測された：アンプレナビル：4.1；インジナビル：1.4；ロピナビル：3.3；ネルフィナビル：5.3；リトナビル：11；およびサキナビル：3.6。
【０１７２】
N88S突然変異を含むいくつかのクローンと、それを含まないいくつかのクローンと、を分離するように、集団からクローンを選択した。原血漿サンプルから構築された耐性試験ベクタープール(Petropoulos et al., 2000, Antimicrob Agents Chemother 44:920-8)をE. coliにトランスフォームし、PhenoSense(登録商標)アッセイによりプロテアーゼ遺伝子型に関して個々のコロニーのプラスミドDNAをスクリーニングした。合計21クローンを単離した。3クローンはI50Vだけを含み、15クローンはI50VおよびL90Mを含み、3クローンはI50VおよびN88Sを含んでいた。プール中には、これに加えて、他の突然変異が存在していた。図7は、異なるプロテアーゼ阻害剤に対する表現型感受性をクローングループごとに平均fold change(FC)として示したものである。I50Vのみを含むクローンまたはL90MとI50Vを含むクローンは、アンプレナビル(13〜17 FC)、ロピナビル(7〜9 FC)、ネルフィナビル(7〜10 FC)、およびリトナビル(12〜20 FC)に対して顕著な感受性低下を示した。L90Mの効果は、サキナビル(L90Mを含むときFCが1.8倍に増加)のときを除いて、いずれの場合も小さかった。しかしながら、N88SがI50Vと一緒に存在した場合、アンプレナビル感受性は14.5倍に増加した。図7に示されるように、I50Vを含有しN88Sを含有しないウイルスでは、fold change(APVのバー1)は約17倍である。しかしながら、ウイルスがI50Vに加えてN88Sを含有した場合(APVのバー2)、fold changeは野生型レベル(1.2 FC)まで低下した。ロピナビルおよびリトナビル感受性のレベルも、N88Sの存在下で増大された(それぞれ、IC50が1/1.7および1/1.4に減少した)。逆に、ネルフィナビルおよびアタザナビルに対する感受性は、それぞれ、IC50が2.1倍および2.3倍に増加したことからわかるように、N88Sの存在下で低下した。
【０１７３】
これらの結果から、N88Sは、I50突然変異を含有するHIV-1をアンプレナビルに対して完全に再感作させうることが示唆される。したがって、N88Sを保持することができれば、I50V含有ウイルスを保有する患者のための将来的な治療の選択肢として、おそらく、リトナビルとの併用で、アンプレナビルが含まれうる。図7に示されるように、N88Sはまた、I50Vにより付与されるロピナビルに対する耐性のレベルを低下させた。アンプレナビルおよびロピナビルに及ぼすN88Sの作用の方向が同じであることは、これらの2つのPI間の交差耐性に関する観察結果と一致する。
【０１７４】
本明細書中で引用されたすべての文献は、その全体を参照として組み入れるものとする。
【０１７５】
本明細書に提供されている実施例は、実際のものであっても予測的なものであっても、単に本発明の実施形態にすぎず、なんら本発明を限定しようとするものではない。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図1は、HIV-1のゲノム構造の概略図である。
【図２】図2は、詳細に解析した最後の１セットのサンプルに到着するまでのステップを示すフロー図である。
【図３Ａ】図3Aは、NL4-3 HIV(GenBank Accession No. P12497)プロテアーゼのアミノ酸配列(配列番号1)を示している。
【図３Ｂ】図3Bは、NL4-3 HIV(GenBank Accession No. AF324493)プロテアーゼ遺伝子の核酸配列(配列番号2)を示している。
【図４】図4は、2499個のサンプルのCART解析により生成されたツリーを示している。
【図５】図5は、アンプレナビル耐性に関連する突然変異ペアのマトリックスである。
【図６】図6は、2499個のサンプルのCART解析の次のラウンドにより生成されたツリーを示している。
【図７】図7は、N88SによるI50V含有ウイルスのアンプレナビル耐性に対する再感作を示している。プロテアーゼ阻害剤に対するI50V；I50VとN88S；またはI50VとL90Mを含有するクローンの表現型感受性を、クローングループごとに、平均fold change(エラーバーは1標準偏差を表す)で示す；薬剤名称は、次のように略記される：APV, アンプレナビル；IDV, インジナビル；LPV, ロピナビル；NFV, ネルフィナビル；RTV, リトナビル；SQV, サキナビル；ATV, アタザナビル(BMS 232632)。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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