(57)【要約】本発明は、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)類似体に関する。さらに具体的には、本発明は、29個以上のアミノ酸を有し、ヒト天然GHRH(1-29)NH2と比べて向上したタンパク質分解耐性と、in vitro試験におけるヒトGHRH受容体への高い結合親和性とを同時に呈するGHRH類似体に関する。さらに本発明は、前記GHRH類似体のいずれか一を含む薬剤組成物、ならびに、in vivo GH放出の刺激およびGH欠乏関連病態を処置する薬物の調製のための前記類似体の使用に関する。さらに本発明は、哺乳類においてGHRH誘導性生物作用を惹起する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GHRH類似体、該類似体の機能性誘導体、または薬剤として許容されるこれらの塩であって、式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-A9-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A9はSerまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A21はLys またはD-Lysであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつ
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）
の構造を含み、
前記類似体、前記類似体の機能性誘導体またはこれらの塩が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも実質的に高いin vitro効力指数を有するGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体、または薬剤として許容されるこれらの塩。
【請求項２】
前記類似体が、式中
-A2がD-Ala, A8がAla, A15がAla, A22がLysであり、A9, A10, A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるもの;
-A2がD-Ala, A10がD-Tyr,かつA22がLysであり、A8, A9, A15, A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるもの;ならびに
-A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-Ala,かつA22がLysであり、A8, A9, A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるもの、
からなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項３】
前記類似体が、式中A2がD-Ala,A8がAla,A15がAla,A22がLysであり; A9,A10,A21 およびA30が請求項１に規定のとおりであるものからなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項４】
前記類似体が、式中A2がD-Ala,A10がD-TyrおよびA22がLysであり; A8,A9,A15,A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるものからなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項５】
前記類似体が、式中A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-AlaおよびA22がLysであり; A8,A9,A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるものからなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項６】
前記in vitro効力指数が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも少なくとも500倍高い請求項１ないし５のいずれか一項に記載のGHRH類似体。
【請求項７】
前記in vitro効力指数が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも少なくとも1500倍高い請求項６に記載のGHRH類似体。
【請求項８】
前記in vitro効力指数が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも少なくとも2500倍高い請求項７に記載のGHRH類似体。
【請求項９】
有効量の、請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩;および
薬剤として許容される担体
を含有する薬剤組成物。
【請求項１０】
in vivo GH放出の特異的な刺激のための、請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは請求項９に規定の薬剤組成物の有効量の使用。
【請求項１１】
GH欠乏関連病態を処置する薬物を調製するための、請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは請求項９に規定の薬剤組成物の有効量の使用。
【請求項１２】
前記病態が、視床下部下垂体性小人症、熱傷、骨粗しょう症、腎不全、偽関節性骨折、急性／慢性の消耗性疾患または感染、創傷治癒、術後問題発生の低減、泌乳不全、女性の不妊症、ガン患者におけるカヘキシー、同化および／または異化の問題、T細胞免疫不全、神経変性病態、GHRH受容体依存性腫瘍、老化、睡眠障害、筋減少患者・虚弱老年者・HIV患者・放射線療法および化学療法関連の副作用を呈しているガン患者におけるような筋衰弱性疾患からなる群より選択される請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記筋衰弱性疾患が、筋減少、老年性虚弱、HIVおよびガンからなる群より選択される請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは請求項９に規定の薬剤組成物の有効量を当該哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類におけるGHRH誘導性生物作用の惹起方法。
【請求項１５】
前記GHRH誘導性生物作用が、睡眠障害の制御、食物摂取障害の制御およびタンパク質合成の増進を含む群より選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質合成の増進の結果、筋量が増加または乳生成が増加する請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)類似体(analogues)の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、29個以上のアミノ酸を有し、ヒト天然GHRH(1-29)NH2と比べて、向上したタンパク質分解耐性を示し、in vitro試験でヒトGHRH受容体への相対的に高い結合親和性を有するGHRH類似体に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン(GH)は、タンパク質合成・生長や脂肪分解の刺激などの同化作用発揮、および成長の制御を担う下垂体前葉ソマトトロピンホルモンである。1980年代半ばまでは、死後に採集された下垂体が唯一のヒトGH(hGH)供給源であった。今日、hGHは遺伝子操作によって大量に入手可能である。
【０００３】
GHは小児の発育および成人の代謝において重要な役割を果たす。それぞれ、小児におけるGH欠乏は発育遅滞または不全に関連し、一方GH過剰は巨人症または末端肥大症を引き起こす。
【０００４】
GHは、哺乳類の下垂体前葉における成長ホルモン産生細胞で産生され、生涯を通じて分泌される。これは、主に脳内で2種類の視床下部ホルモンにより制御されている。その分泌および合成を刺激するGHRHと、これらを阻害するソマトスタチンである。何種類かの末梢因子がGH分泌を制御する。これらのうち、インスリン様成長因子-1(IGF-1)は重要なものであり、これはGHに応答して肝臓内で産生され、視床下部に作用してGH分泌に対する負のフィードバックを起こさせるためである。
【０００５】
GHを主たる標的とする薬剤には、GH放出を刺激する合成GHRH；GH放出を阻害するソマトスタチン類似体のオクトレオチド;欠乏状態においてGHの代替に用いられるリコンビナントヒトGH(ソマトトロピン、ソマトレム);およびGH非感受性(Laron型小人症)の治療に用いられるリコンビナントIGF-1、などがある。
【０００６】
GHはこれまでに試験されている動物種の全てにおいて、加齢とともに減少する。ヒトにおいて、21から31歳から後に、GH量は10年当たり約14%ずつ減少して、60歳までに、GHの24時間の全産生率が半分に減少する。よってヒトは、20歳で毎日約500μg、40歳で200μg、80歳で25μgのGHを産生する。
【０００７】
米国では1985年以来、処方調剤用の生合成GHが入手可能となったので、成長ホルモン欠乏の症例において、GH代替療法が選択可能な治療となった。米国では、GH治療適格の小児数は、GH欠乏の厳密な診断基準を適用した場合の11000人から、値が3分の1より低い者全員を候補とした場合の1.3万人に渡る。GH治療の各コストは、1年当たり15500万ドルから、より緩やかな診断基準をケアの基準とすれば20億ドルに跳ね上がるであろう (Cuttler L. et al., 1996)。20000人の小児しかGH治療を受けていない(Finkelstein, B. S. et al., 1998)ことから、これまで、米国の小児科医らは立証済みでない適応症に対するGHの処方を十分に控えてきている。
【０００８】
別の問題は、従来の生合成GHは注射しなければならないために患者が受け付けにくいことである。GH(191アミノ酸)のアミノ酸複合構造は、消化管内で完全に破壊されてしまう。
【０００９】
全般的に、GHは、活動状態の悪性疾患、良性の脳内高血圧、および増殖性もしくは前増殖性糖尿病網膜症を有する患者において禁忌とされている。
【００１０】
成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)は44アミノ酸のペプチドである。ある著者らにより、GHRH(1-44)NH2のN末端の29アミノ酸断片であるGHRH(1-29)NH2が、GHRH(1-44)NH2の完全な生物活性を示すことが報告されている。 
【００１１】
GHRHはまず膵腫瘍から、続いて様々な哺乳類の視床下部から単離された。GHRHは、視床弓状核に加えて、視交差上核など他の視床下部内側核、および、辺縁系など脳のその他の領域内に存在する。GHRH様免疫反応性および／またはGHRHメッセンジャーリボ核酸(mRNA)もまた、胎盤、消化管、卵巣、精巣、胸腺、脾臓および腎髄質中に見出されている。
【００１２】
正常および腫瘍性の下垂体から、ならびに正常視床下部、精巣、卵巣および腎髄質由来の様々な組織調製物および細胞培養物において、GHRH結合性部位が局在決定され特徴付けられている。薬理学的研究により、下垂体および卵巣に2群のGHRH結合性部位が存在することが明らかにされている。すなわち、生理学的に関連する形態の受容体に対応している高親和性かつ低結合容量の結合性部位、および、低親和性かつ高結合容量の結合性部位である。
【００１３】
加齢に伴ってラット下垂体GHRH結合性部位パラメータの変化が起こり、高親和性の結合性部位が失われる結果となる。
【００１４】
GHRHはin vivoで速やかに分解することが知られている。血清および血漿、肝臓、ならびに、下垂体および視床下部などの標的組織において、GHRHの分解パターンが解明されている。これまでに同定されている脆弱性のペプチドとしては、R2-R3,R10-R11,R11-R12,R14-R15,R18-R19,R20-R21,R21-R22(Boulanger et al. Brain Res 1993; Boulanger et al. Peptides 1992)がある。さらに、これらのアミノ酸残基を改変することにより、GHRHおよびその類似体のタンパク分解を阻止または減少させるとともに、結果的に作用持続時間をより長くすることが可能であることも知られている(Girard P. et al. Eur J Clin Pharmacol 1987,32 : 507-513)。
【００１５】
天然に存在するGHRHにおけるこれらの阻害要因および制限の結果として、米国特許第5,584,216号に記載のように、ラット下垂体GHRH受容体への5から13倍向上した親和性を示す新規クラスの14多置換(polysubstituted)合成GHRHスーパーアゴニストが発見された。このような発明は、GHRH受容体について、高感度かつ高度に選択的な非毒性のマーカーペプチド、およびマーカーポリクローナル抗体を提供した。
【００１６】
さらに、これまで学術組織または製薬／バイオテクノロジー会社のいずれによって設計されたGHRH類似体も、バイオアッセイまたは動物でのin vivo試験における半減期の改良のみを目的とした、これら類似体の構造変更を基本としていた。
【００１７】
これまでに、単純なアミノ酸多置換によって、下垂体GHRH受容体に対する親和性およびin vivo半減期が向上するように改良できるGHRH類似体が必要とされている。さらには、そのGHRH類似体が動物におけるGH分泌を刺激する能力を有すること、および、天然GHRH(1-44)NH2よりも効力が高いことが、in vivoで立証される必要がある。この点について、米国特許第5,584,216号に記載のGHRH類似体群における選択に際し、予想外の利点が確認された。
【特許文献１】米国特許第5,584,216号
【非特許文献１】Cuttler L. et al., 1996
【非特許文献２】Finkelstein, B. S. et al., 1998
【非特許文献３】Boulanger et al. Brain Res 1993
【非特許文献４】Boulanger et al. Peptides 1992
【非特許文献５】Girard P. et al. Eur J Clin Pharmacol 1987,32 : 507-513
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、上述の要求を満足するGHRH類似体を提供することである。かくして、本発明は、GHRH類似体とその使用、およびGHRH誘導性生物作用を惹起する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
第一の態様によれば、本発明は、式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-A9-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;A9はSerまたはAlaであり;A10はTyrまたはD-Tyrであり;A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;A21はLys またはD-Lysであり;A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつA30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）の構造を含み、前記類似体、前記類似体の機能性誘導体またはこれらの塩が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも実質的に高いin vitro効力指数を有するGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体、または薬剤として許容されるこれらの塩に向けられている。
【００２０】
別の態様によれば、本発明は、上述のGHRH類似体、誘導体またはこれらの塩と、薬剤として許容される担体とを含有する薬剤組成物に向けられている。
【００２１】
さらに別の態様によれば、本発明は、in vivo GH放出の特異的な刺激のための前記類似体の使用に向けられている。
【００２２】
さらに別の態様によれば、本発明は、GH欠乏関連病態を処置する薬物を調製するための前記類似体の使用に向けられている。
【００２３】
さらに別の態様によれば、本発明は、GHRH誘導性生物作用を惹起する方法に向けられている。
【００２４】
本発明およびその利点は、その好ましい実施形態に関する以下の非限定的な説明を、本願添付の図面を参照して読むことで、よりよく理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の創意は、ヒト天然GHRH(1-29)NH2と比べて、向上したタンパク質分解耐性を示し、in vitro試験でヒトGHRH受容体への相対的に高い結合親和性を有するGHRH類似体に向けられている。本発明者らは、このようなGHRH類似体に普遍的なアミノ酸配列を特定した。「GHRH類似体」という用語は、GHRHアゴニスト、さらに具体的には、GHRH受容体に対して高親和性に結合し、下垂体前葉腺の成長ホルモン細胞を刺激して成長ホルモンを放出させることで、血漿の成長ホルモン(GH)濃度を増大させるような合成ペプチドを意味すると解される。
【００２６】
本発明はさらに、ここで規定されているGHRH類似体を含む組成物、ならびにこのようなGHRH類似体および／または組成物を使用する方法に関する。
【００２７】
・GHRH 類似体、その誘導体または塩
第一の態様によれば、本発明は、GHRH 類似体、該類似体の機能性誘導体、または薬剤として許容されるこれらの塩に関する。さらに具体的には、本発明のGHRH類似体は、次式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-A9-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;A9はSerまたはAlaであり;A10はTyrまたはD-Tyrであり;A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;A21はLys またはD-Lysであり;かつA22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつA30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）の構造を含むアミノ酸配列を有する。「残基」という用語は、アミノ酸に関して使用される場合、対応するアミノ酸からカルボキシル基の水酸基とアミノ基の水素原子一個との除去により誘導されている基を意味する。
【００２８】
さらには、本発明のGHRH類似体は、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数(in vitro potency index)よりも実質的に高いin vitro効力指数を有する。「天然に存在するGHRH」という表記は、hGHRH (1-29)NH2(天然GHRHペプチドの機能部位)およびhGHRH(1-44)NH2(天然GHRHペプチド全体)の双方を包含すると解される。
【００２９】
ここで用いられる「in vitro効力指数」という表記は、i)hGHRH受容体を発現しているBHK細胞中での、天然hGHRH(1-29)NH2と比したGHRH類似体の相対的な結合親和性と、ii)ヒト血漿またはヒト血清中での好ましくは60または180分インキュベーション後における、hGHRH(1-29)NH2と比した化合物の相対的なin vitroタンパク質分解耐性とを掛け合わせることで得られる比較手段を表す。
【００３０】
ここで用いられる「相対的に高い結合親和性」という用語は、ヒトGHRH受容体に対する本発明のGHRH類似体の結合親和性が、天然GHRHの結合親和性よりも少なくとも約100倍高いことを意味する。
【００３１】
ここで用いられる「向上したタンパク質分解耐性」という用語は、ヒト血漿または血清中でのin vitroインキュベーションにおいて、本発明のGHRH類似体の平均残留率が、天然GHRHより実質的に高い(substantially higher)、例えば少なくとも50%の割合であることを意味する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態によれば、「実質的に高い」という表記は、本発明のGHRH類似体、その誘導体またはその塩のin vitro効力指数を特徴付けるために使用されるとき、in vitro効力指数が、天然hGHRH (1-29)NH2のin vitro効力指数よりも、好ましくは少なくとも500倍、より好ましくは1500倍、そしてさらに好ましくは2500倍大きいことを示す。
【００３３】
ここで用いられる「機能性誘導体」という用語は、一般的に解釈されるとおり、本発明のGHRH類似体の生物活性と実質的に同一の、機能的な生物活性を有するタンパク質／ペプチド配列を示す。本発明のGHRH類似体の機能性誘導体は、特定の機能の達成にそのような修飾が必要なければ、共有結合した炭水化物などの転写後修飾を含んでも含まなくてもよい。「機能性誘導体」という用語は、本発明で企図されるGHRH類似体の「断片(fragments)」、「領域(segments)」、「変異体(variants)」、あるいは「化学的誘導体」を包含する。
【００３４】
認識されるであろうとおり、式Xはアミノ酸(A)配列である。全般に、アミノ酸を指定するためにここで使用している省略形は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature の推奨 (Biochemistry, 1972,11 : 1726-1732) に基づいている。さらに具体的には、「アミノ酸」という用語は、ペプチド化学の一般的な教科書に記載されており (Kipple, K. D, "Peptides and Amino Acids", W. A. Benjamin, Inc., New York, 1966;"The Peptides", E. D. Gross E. and Meienhofer J., vol. 1, Academic press, New York, 1979)、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、ピログルタミン酸、 サルコシン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンを包含する。
【００３５】
ここで記載されている本発明におけるGHRHペプチドは、好ましくは、Atherton E.L. Sheppard R.C.によって記述されている固相ペプチド化学t-Boc-酸不安定性保護スキーム("Solid-phase peptide synthesis: a practical approach", IRL press, Oxford University press, Oxford, England, 1989, 1-203ページ)を用いて合成されている。本発明のGHRH類似体が、当業者に知られている他のいかなる手法によって提供されてもよいことは理解されるであろう。
【００３６】
本発明によれば、天然型GHRHに対する様々な組み合わせでの多置換が好ましい。かくして、このような組み合わせの一つにおいて、好ましいGHRH類似体は、A2がD-Alaに、A8がAlaに、A15がAlaに、A22がLysに置換された上述の式Xの構造を含む。A9、A10、A21およびA30は以上で規定されているとおりである。
【００３７】
本発明の別の好ましい類似体は、式中A2がD-Ala、A10がD-Tyr、およびA22がLysである上述の式Xの構造を含む。A8,A9,A15,A21およびA30は以上で規定されているとおりである。
【００３８】
本発明のさらに別の好ましい類似体において、この類似体は、式中A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-AlaおよびA22がLysである上述の式Xの構造を含む。A8,A9,A21およびA30は以上で規定されているとおりである。
【００３９】
・薬剤組成物
別の態様において、本発明は、以上で規定されているGHRH類似体、その機能性誘導体、または塩の薬用有効量と、薬剤として許容される担体とを含む薬剤組成物に関する。
【００４０】
ここで用いられる「組成物」という用語は、本発明のGHRH類似体を所望の濃度で含む製品を包含するよう意図される。「薬剤として許容される」とは、担体、希釈剤または賦形剤が、処方されるGHRH類似体の作用を妨げず、かつ、有害な影響なしに被験者に投与可能でなければならないことを意味する。当業界で知られている、薬剤として許容される担体には、滅菌水、食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝溶液が包含されるが、これらに限定されない。担体には補助剤が含まれていてもよく、希釈剤、安定化剤(例えば糖類およびアミノ酸)、保存料、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤、増粘添加剤、ラクトース、着色剤などが挙げられ、ただしこれらに限定されない。薬剤として許容される、本発明の企図において好ましい担体は、塩化ナトリウムなどの塩類の溶液（好ましくは0.9%にて用いられる）、または吸入用の粉末製剤の調製に利用されるラクトースである。
【００４１】
・使用方法
本発明の他の態様において、本発明は、in vivo GH放出の特異的な刺激のための、およびGH欠乏関連病態を処置する薬物を調製するための、本発明のGHRH類似体またはこれを含む薬剤組成物の使用に関する。「処置」は、治療的処置および予防・防止的処置の双方を意味する。処置を必要とする者には、このような障害もしくはGH欠乏を既に呈している者も、障害もしくはGH欠乏を起こしやすい者も、また、障害もしくはGH欠乏を予防しようとする者も包含される。
【００４２】
本発明によれば、「in vivo GH放出の特異的な刺激」という表記は、複数種混在の受容体を含有する試料中で、GHRH受容体に直接結合することでGHの放出を活性化するが他の受容体分子への直接結合によるGH放出活性化をしないような、本発明のGHRH類似体の作用を表す。
【００４３】
本発明におけるGH欠乏関連病態は、視床下部下垂体性小人症、熱傷、骨粗しょう症、腎不全、偽関節性骨折、急性／慢性の消耗性疾患または感染、創傷治癒、術後問題、泌乳不全、女性の不妊症、ガン患者におけるカヘキシー、同化および／または異化の問題、T細胞免疫不全、神経変性病態、GHRH受容体依存性腫瘍、老化、睡眠障害、筋衰弱性疾患を包含するが、これらに限定はされない。ここで用いられる筋衰弱性疾患とは、筋減少、老年性虚弱、HIVおよびガンのいずれであってもよい。さらに具体的には、本発明の薬剤組成物の使用は、化学療法および放射線療法関連性の副作用を呈しているガン患者を対象とし得る。
【００４４】
さらに別の態様において、本発明は、哺乳類においてGHRH誘導性生物作用を惹起する方法を提供する。この方法は、上記哺乳類に、ここで規定されているGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは以上で規定されている薬剤組成物の有効量を投与する工程を含む。
【００４５】
ここで使われる「GHRH誘導性生物作用」という表記は、睡眠障害の制御、食物摂取の制御およびタンパク質合成の増進を包含するが、これらに限定はされない。本発明において、GHRH類似体投与の後に観察されるタンパク質合成の増進は、Lapierre H. et al. (1995). J. Dairy Sci. 78: 804-815; Dubreuil, P. et al. (1996) Can J. Vet. Res. 60 (1) : 7-13; Lapierre H. et al. (1992) J. Anim. Sci. 70 (3): 764-772;およびFarmer C. et al. (1992) Biol. Neonate 61 (2): 110-117、に記載されているように、特に筋量の増加または乳生成の増加につながり得る。
【００４６】
ここで用いられる「哺乳類」という用語は、哺乳類に分類され、GHRH受容体活性の調節が望まれるあらゆる動物を表し、ヒト、家畜および牧畜、ならびに動物園、スポーツまたは愛玩動物を包含し、例えば、犬、馬、猫、牛、豚などが挙げられる。ここで用いられる「調節」とは、アゴニズムおよび／または部分アゴニズムを包含するよう意図している。
【００４７】
「有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師または他の臨床家が探求しようとする組織、動物またはヒトの生物学的もしくは臨床的応答を誘発するGHRH類似体分量を意味する。言い換えれば、特定の疾病を処置するためのある化合物の、このような有効量とは、その疾病に伴う症状を改善する、または幾分か軽減するのに十分な分量である。このような分量は、一まとめの投与量で投与されても、有効となるような管理計画に従って投与されてもよい。この分量により、疾病を治癒させることもできるが、典型的には、疾病の症状を改善するために投与される。化合物「の投与」および「を投与すること」という用語は、本発明のGHRH類似体または本発明の組成物を、処置を必要とする個体に投与することを意味すると解されるべきである。
【００４８】
本発明のGHRH類似体および組成物は、哺乳類に対して様々な投与経路で与えられ得る。例えば、上記組成物を、水性または油性滅菌注射製剤などの滅菌注射製剤の形態で投与することができる。これらの懸濁剤は、適当な分散剤や湿潤剤と懸濁剤とを用い、当業界で知られている技術によって製剤され得る。また、滅菌注射製剤は、滅菌注射溶液であっても、または非経口摂取可能な賦形薬もしくは溶剤であってもよい。これらを非経口的に、例えば、静脈内または筋肉内の注射または輸液によって投与することができる。また、本発明のGHRH類似体および組成物は、局所投与用にクリーム、軟膏、ローション、ゲル、ドロップ、坐剤、噴霧剤、液剤または粉剤としても製剤され得る。また、これらは加圧エアロゾルディスペンサー、鼻用噴霧器、ネブライザー、計量吸入器、粉末吸入器、またはカプセルという手段で、被験者の気道にも投与され得る。適当な投与量は、組成物中の各成分の分量、期待する効果(即効性か長期性か)、処置しようとする疾病・障害、投与経路、生物学的利用能、ならびに処置される哺乳類の齢および体重などの要因に応じて異なるであろう。とにかく、本発明のGHRH類似体および組成物を投与するために、当業界でよく知られている方法を用いることができる。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明の可能な適用形態を具体的に説明するものであり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の改良例および変形例を得ることができる。本発明の試行実施においては、ここで記載されているのと同様または同等ないかなる手法および材料も利用可能であるが、好ましい手法および材料を説明する。
【００５０】
・実施例1
GHRH受容体結合活性のin vitro データに基づいたGHRH類似体の初期選択
米国特許第5,854, 216号に記載されている元の14置換GHRH類似体からの、候補物質の初期選択を、2ヶ月齢オスSprague Dawleyラット下垂体前葉製剤における受容体親和性のin vitroデータに基づいて行った。今回の新規発明は、選択されたGHRH類似体の、ヒト(human)GHRH受容体(hGHRH-R) を軽質移入されたハムスター新生児腎臓(BHK)細胞におけるhGHRH-Rに対する親和性と、ラット血清、ヒト血漿またはヒト血清に対する耐性とに基づいている。さらに詳しく言うと、hGHRH(1-29)-NH2と比較して、i)ラット下垂体前葉におけるhGHRH(1-44)-NH2結合性部位に対するin vitro結合親和性およびBHK発現細胞中hGHRH-Rに対するin vitro結合親和性の相対的な向上;ならびにii) hGHRH (1-29) NH2と比した化合物の相対的in vitroタンパク質分解耐性に関して、好ましい候補薬物を選択した。
【００５１】
下記の表１から示されるように、合成ペプチドのラットGHRH受容体に対する相対結合親和性は、ヒトの受容体に対する相対結合親和性を予知するものではなかった。以下に示されているように、表１に示される各GHRH類似体をGHRH類似体#1から5と称する。
【００５２】
表１．ラット下垂体前葉膜調製物中およびラット血清中それぞれにおける、GHRH類似体の全般的な生物活性に関するタンパク質分解in vitro耐性ならびに受容体親和性と、BHK細胞膜調製物中での受容体親和性との組み合わせで理論上予測される効果に基づき優先的に選択された物質群。 
【００５３】
【表１】
2006504694.tif 000002
【００５４】
・実施例２
天然GHRHおよび本発明のGHRH類似体の分析-試験アッセイ
1-競合的結合アッセイ
放射性リガンドとして[125I-Tyr10]hGHRH(1-44)NH2を用い、以前から記載されているように(Boulanger L, et al. (1999) Neuroendocrinology 70: 117-127)、125I-GHRH結合アッセイを実施した。5 mM MgCl2, 5 mM EDTAおよび0.42% BSA含有の50 mM トリス-酢酸 緩衝液(pH 7.4)全容積300 μl中の低から高濃度に渡る(0-1000 nM)ヒト(h)GHRH(1-29)NH2、hGHRH(1-44)NH2またはGHRH類似体を含むBHK(ハムスター新生児腎臓)570細胞膜調製物(25μgタンパク質/アッセイ用チューブ)中で、競合試験を行った。非特異的な結合を、1 μM hGHRH(1-29)NH2存在下で測定した。平衡状態(23℃, 60分)でインキュベーションを行い、遠心処理(12,000 g, 5分, 4℃)によって停止した。ペレット中の放射線量を、ガンマ線計数によって測定した。アッセイの妥当性を評価し、類似体の相対的親和性を決定するために、各試行においてhGHRH(1-29)NH2の親和性を試験した。表２および３に示したGHRH類似体の競合曲線の解析およびIC50の決定には、Ligandコンピュータプログラムを用いた (Gaudreau P. et al. (1992) J Med Chem, 35: 1864-1869)。
【００５５】
2-血清中および血漿中in vitroタンパク質分解アッセイ
hGHRH(1-29)NH2またはGHRH類似体の300μM溶液10μlをジメチルスルフォキシド(DMSO)に可溶化し、下記の条件の一つにおいてインキュベートした。a-2ヶ月齢オスSprague Dawleyラット由来の血清(「picopure」水中1/100希釈液)190μl、37℃で0,8,15,30または60分間、ポリプロピレンチューブ内;b-ヒト健常提供者の血漿(「Human Whole Blood Na EDTA」由来、男性、薬物無し(Algorithme Pharma Inc.);プロジェクト:MTL-P2-155;ロット:MTLP2155-01,LAB Dev Intにより提供)190μl;およびc-ヒト健常提供者のプール血清,ロット:X409(LAB Dev Intにより提供)、37℃で0,60,120,180または420分間、ポリプロピレンチューブ内。氷冷したストップバッファー(リン酸カリウム緩衝液、トリフルオロ酢酸 (TFA)にてpH 0.8まで酸性化されたもの)800μlの添加、および（ラット血清の場合のみ）煮沸5分により、タンパク質分解を停止した。遠心処理(12000g, 5分, 4℃)（ラット血清の場合のみ）の後、血清-ペプチド混合物を条件設定済みSep-Pak C-18カートリッジに通して、血清タンパク質から天然GHRHまたはGHRH類似体の残留濃縮物を抽出した。上記天然GHRHまたは上記類似体を、2 mlの50%アセトニトリル-0.01%TFA/50% 0.01%TFA水溶液中で溶離した。抽出されたペプチド200μl（0時点におけるGHRHまたは類似体は1μgであった）を、分析用HPLCにて、1個のp-Bondapak C18カラム(粒子サイズ10μm, 0.39×15 cm)(ラット血清の場合)または2個直列のC18カラム(ヒト血清および血漿の場合)と、NaClO4 0.01 M, pH 2.5およびアセトニトリルからなる複合溶媒系とを用いて定量した。45分に渡ってアセトニトリルが30から60%(ラット血清の場合)または30から50%(ヒト血清および血漿の場合)という線形濃度勾配を用いた。完全ペプチドの溶出を214nmにてモニターし、ピーク領域面積によって残留濃度を求めた(Boulanger L, et al. (1993) Brain Res 616: 39-47; Boulanger L, et al. (1992) Peptides 13: 681- 689)。
【００５６】
3-天然GHRHまたはGHRH類似体のin vivo投与
ヒトGHRH類似体#5(ヒト[D-Ala2, D-Tyr10, Ala15, Lys22]GHRH (1-29)NH2アナログ)がGH分泌を刺激する能力を、雌ラット成体(処置開始時26-34週齢)および雄ビーグル犬において検証した。
i-ラットへのin vivo投与
USP注射用0.9%塩化ナトリウム中ヒトGHRH類似体#5を、雌ラットに静脈内(IV)または皮下(SC)注射で1回投与した後、表２に示されるように、14日間の観察を行った。投与の前に、全ての投与用製剤を0.22μmフィルターでろ過して確実に無菌状態とした。当該個体の直近の体重に基づいて、実際に投与するGHRH類似体#5の量を計算および調整した。投与は各日おおよそ同じ時刻に開始し、午前9:00±30分に始めた。
【００５７】
【表２】
2006504694.tif 000003
【００５８】
薬力学的調査のために、投与前、投与後4,10,15,45分および5時間の各時点に、1時点につき1群あたり2匹から(1個体あたり最多で3回)、頚静脈穿刺で血液試料(約1.3 ml)を採集した。全ての血液試料はカリウムEDTAチューブ中に採集され、冷却下で遠心処理された (2から8℃, 1500 gで10分間)。
【００５９】
ii-ラット成長ホルモンの測定
血漿中GHは、Linco Diagnostic Servicesによって、彼ら独自のキットを用いて測定された。
Lincoによるラット成長ホルモンラジオイムノアッセイキット(RIA)(RGH-45HK)は、血清、血漿および組織培養培地中のラット成長ホルモンの定量測定に意図されている。抗体がリコンビナントラット成長ホルモンに対して樹立され、そして、トレーサーおよび標準物質の双方が同一のリコンビナントラット成長ホルモンで調製されているので、これは完全同種アッセイである。このキットには、RIAを完遂するために必要な標準物質、抗体、トレーサー、品質管理物、沈降試薬および緩衝剤が含まれる。アッセイは、次の条件：一晩;室温にて平衡状態インキュベーション;試料体積は100μl血清、血漿または組織培養培地、において実施された。標識として125I-ラット成長ホルモン(20,000 CPM/チューブ)を用いた。
【００６０】
アッセイのパフォーマンスは次の通りであった。
ED80=1.0±0.1 ng/ml
ED50=4.7±0.2 ng/ml
ED20=23.1±0.7 ng/ml
最終的に、アッセイの特異性は次の通りであった。
ラット成長ホルモン100%;
ラットプロラクチン<0.1%;
ブタ成長ホルモン<0.5%;
ヒト成長ホルモン<0.1%。
【００６１】
iii-雄ビーグル犬へのin vivo投与
USP注射用0.9%塩化ナトリウム中ヒトGHRH類似体#5を、表３に示されるように3,5および8日目に、それぞれ投与量レベル0.01、0.1、および1 mg/kg体重で、皮下(SC)注射にて約8ヶ月齢の雄犬に投与した。1日目は、この犬に対照物質(賦形剤)を与え、11日目には陽性対照のhGHRH(1-44)NH2を投与量レベル0.01 mg/kgで与えた。投与の前に、全ての投与用製剤を0.22μmフィルターでろ過して確実に無菌状態とした。当該個体の直近の体重に基づいて、実際に投与するGHRH類似体#5の量を計算および調整した。投与は各日程においておおよそ同じ時刻に開始し、午前9:00±30分に始めた。
【００６２】
【表３】
2006504694.tif 000004
【００６３】
薬力学的調査のために、各処置日において、投与前、投与後7,15,22,30,45,および60分の各時点に、上記犬から頚静脈穿刺で血液試料(約1.0 ml)を採集した。全ての血液試料はカリウムEDTAチューブ中に採集され、冷却下で遠心処理された (2から8℃, 1500 gで10分間)。
【００６４】
iv-イヌ成長ホルモンの測定
血漿中GHは、Linco Diagnostic Servicesによって、彼ら独自のキットを用いて測定された。Lincoによるブタ／イヌ成長ホルモンラジオイムノアッセイキット(RIA)(PGH-46HK)は、血清、血漿および組織培養培地中の成長ホルモンを定量するために開発されたものである。抗体がリコンビナントブタ成長ホルモンに対して樹立され、そして、標準物質およびトレーサーの双方が同一のリコンビナントブタ成長ホルモンで調製されているので、これは完全同種アッセイである。ブタ成長ホルモンとイヌ成長ホルモンとはアミノ酸配列が同一であるから、ブタ成長ホルモン用に開発されたこのアッセイによって、イヌ成長ホルモンのレベルが同様に十分に測定される。RIAを完遂するために必要な全内容（標準物質、抗体、トレーサー、品質管理物、沈降試薬および緩衝剤）が含まれている。アッセイは、次の条件：一晩;室温にて平衡状態インキュベーション;試料体積は100μl血清、血漿または細胞培養培地、において実施された。標識として125I-ブタ／イヌ成長ホルモン(18,000 CPM/チューブ)を用いた。
【００６５】
アッセイのパフォーマンスは次の通りであった。
ED80=2.3±0.2 ng/ml
ED50=9.8±0.5 ng/ml 
ED20=41.8±1.4 ng/ml 
最終的に、アッセイの特異性は次の通りであった。
ブタ成長ホルモン 100%;
ブタプロラクチン <0.1%;
イヌ成長ホルモン100%;
ヒト成長ホルモン <0.5%。
【００６６】
・実施例３
ラット血清中における、hGHRH(1-29)NH2と比較した類似体の相対的in vitroタンパク質分解耐性
表４に示されるように、60分間のインキュベーション後には、全てのGHRH類似体が、hGHRH(1-29)NH2と比べて有意に高い残留濃度を示した。さらには、GHRH類似体#5の残留濃度が、GHRH類似体1,2あるいは3のいずれよりも有意に高かった。従ってこれらの結果は、GHRH類似体#4を除いては、上述のアッセイを用いた際にGHRH類似体#5が最良のin vitroタンパク質分解耐性を呈することを示す。
【００６７】
【表４】
2006504694.tif 000005
【００６８】
・実施例４
ヒト血漿および血清中での、hGHRH(1-29)NH2と比した類似体の相対的in vitroタンパク質分解耐性
ここで表５および６を参照すると、hGHRH(1-44)NH2、hGHRH(1-29)NH2、および3種のGHRH類似体の各in vitroタンパク質分解耐性値を見ることができる。この耐性は、ヒト血漿(表5)およびヒト血清(表6)中で0から420分に渡る各種インキュベーション時間での、各ペプチドの平均残留量（パーセンテージ）で表されている。さらに詳細には、上記値は3から7回試行の平均値、標準偏差および平均値からの標準誤差である。
【００６９】
表５で特に認識されるように、天然型GHRHに関しては、180から420分に渡る各種インキュベーション時間は、当該ペプチドの平均残留量の顕著な減少につながった。一方、全3種類の類似体はすべて、180分のインキュベーション後、依然として比較的高い平均残留量を示していた(68から81%)。さらには、GHRH類似体#5は、420分インキュベーション後ですら、依然として75%の平均残留量を示した。、統計的有意性をP<0,05と設定し、Welchの修正あり、両側、群間対応なし(unpaired)のステューデントのt検定を用いたところ、残留量について上記類似体群のヒトGHRH(1-29)NH2に対する有意な差が確認された。さらなる統計分析により、ヒト血漿中でのhGHRH(1-29)NH2の残留量が、GHRH類似体#1,3および5いずれのそれよりも有意に小さい(P<0,01)ことも確認された。しかしながら、これら類似体どうしは、平均残留量において有意差がなかった。
【００７０】
ここで表６を参照すると、420分インキュベーションにおいて、hGHRH(1-29)NH2が完全に消失したのに対して、GHRH類似体#5は初期濃度の50%量を維持していたことが認められる。
【００７１】
従って、ヒト血漿およびヒト血清中でのインキュベーション双方において、天然型GHRHの残留量はその類似体群の残留量よりも有意に小さかった。 
【００７２】
【表５】
2006504694.tif 000006
【００７３】
【表６】
2006504694.tif 000007
【００７４】
・実施例５
天然型および類似体GHRHの、hGHRH受容体に対する結合親和性
表７に示されるように、ヒトGHRH(1-44)NH2のIC50と、GHRH類似体#5のそれとの間で有意な差は確認されず(両側、群間対応なしステューデントのt検定、Welchの修正、有意性をP<0,05に設定)、このGHRH類似体がヒトGHRH受容体に対して少なくとも天然ヒトGHRH(1-44)NH2と同程度の親和性を有することが示された。
【００７５】
各値は、類似体については3連で実施した試行の平均値±SEMを、hGHRH(1-44)NH2については2連で実施した試行の平均値±SEMを表す。IC50は、競合曲線解析用LIGANDプログラムで求められた、125I-GHRHの特異的結合の50%を阻害するペプチド濃度である。
【００７６】
【表７】
2006504694.tif 000008
【００７７】
・実施例６
ヒトGHRH受容体を発現したBHK細胞膜調製物中でのhGHRH(1-29)-NH2類似体およびhGHRH(1-29)-NH2の結合親和性、および上記類似体のin vitroタンパク質分解耐性
表8から11に示される結合アッセイ結果について、値は類似体については3連で行った互いに独立の8回試行の平均値±SEMを、hGHRH(1-29)NH2については3連で行った互いに独立の4回試行の平均値±SEMを表す。IC50は、競合曲線解析用LIGANDプログラムで求められた、125I-GHRHの特異的結合の50%を阻害するペプチド濃度である。hGHRH(1-29)-NH2のIC50/類似体のIC50という比を求めることで、相対的親和性が得られた。
【００７８】
表9から11に示されるタンパク質分解アッセイ結果について、値は3から5回独立試行の平均値±SEMを表す。
【００７９】
次の表８に示されるように、GHRH類似体#1,2,3および5は、受容体に対するhGHRH(1-29)NH2の結合親和性よりも有意に高い結合親和性を呈した。さらには、ヒトGHRH受容体に対するGHRH各類似体#1および#5の相対的結合親和性は互いに有意差なしであったが、GHRH類似体#5の上記親和性は#3のそれよりも有意に高かった。
【００８０】
【表８】
2006504694.tif 000009
【００８１】
【表９】
2006504694.tif 000010
【００８２】
表９から明らかなように、GHRH類似体#1,3および5のin vitro効力指数はそれぞれ758、404および1671に達している。言い換えれば、これら3種の類似体は、ヒト血漿中60分in vitroインキュベーションにおいて、天然hGHRH(1-29)NH2と比べて有意に高いその受容体への結合親和性と、有意に良好なタンパク質分解耐性とを同時に有している。さらには、以下の表10から明らかなように、各GHRH類似体のin vitro効力指数は、ヒト血漿中180分インキュベーションにおいてさらに高くなっている。
【００８３】
【表１０】
2006504694.tif 000011
【００８４】
次のステップとして、ヒト血清中でのインキュベーション後にも同様の観察がやはり正しいのかを試験した。GHRH類似体#5についての結果を表11で見ることができる。ヒト血清中で60または180分間のインキュベーションにおいて、この場合もやはり、GHRH類似体#5は天然hGHRH(1-29)NH2と比べて有意に高いin vitro効力指数を示した。
【００８５】
【表１１】
2006504694.tif 000012
【００８６】
・実施例７
in vivo GH放出を特異的に刺激するための、GHRH類似体の使用
本発明は、in vivo GH放出の特異的な刺激のための、上記GHRH類似体の使用に向けられる。このような使用は、下記の背景に基づいている。
【００８７】
GH合成および分泌に影響する全ての要因が統合されることで、パルス状の放出パターンが引き起こされる。よって、血漿GHレベルの測定は、それだけでは解釈することが難しい。血液中のGHの基底濃度は非常に小さい。小児および青年において、成長ホルモンの放出が最も高まる時間は、深睡眠の開始直後である。GHの分泌パターンは間欠的で、1日当たり6から8回のパルスとパルス間の非常に低いレベルとを呈し、睡眠サイクルの段階3および4と関連付けられているが、この関連性は年齢が上がるほど明確でなくなってゆく。これらのパルスの一部は食事、ストレス、運動、または徐波睡眠と関連付けられている。
【００８８】
男性よりも女性の方が、GHパルスがより頻繁に発生し、血漿GH基底濃度が高い。男性の方がGHパルスの頻度は少ないが、振幅はより大きい。ヒトにおいては、典型的には、24時間の昼-夜期間中に高い分泌パルス1回と低いパルス数回とがある。睡眠相の後退、前進、または中断により、これに応じてメインのGH分泌パルスが変動し得る。少なくともヒトにおいては、GH分泌は、体内概日周期によっても制御されている。睡眠周期が通常時から変動しても、体内時計に従って、幾分かのGHは依然として夜早くに分泌される。GH分泌は、成長期および成人初期に最も高い。ヒトにおいて、その分泌速度は40歳代に減少し始める。加齢に伴って、まず日中の分泌パルスが減少するが、睡眠時GHパルスは存続する。
【００８９】
多数の動物種が、典型的には24時間の昼-夜期間の中で長さの変動する数種の睡眠相を有するので、動物においては、GH分泌と睡眠との相互関係を明らかにすることがより困難である。しかしながら、数種の哺乳類において、睡眠中の血漿GHレベル向上が明らかにされている (Van Cauter, E.らによる概説、Sleep, 1998,21 : 553-566)。神経科学において広く利用されるモデル動物であるラットでは、GH分泌は、約3.3時間周期のパルス状である。この周期は、同様の周期長である睡眠-覚醒の縮日周期と、GHパルスが睡眠の極大状態よりも約24分前に起こるように関連している(Mitsugi, N.およびKimura, F. Neuroendocrinol., 1985,41 : 125-130)。明期中に短周期(3時間)という全体的な睡眠不足状態にすると、この不足状態の間にラットのGH分泌が減少する結果となる(Kimura, F.およびTsai, C.-W. J. Physio. (Lond.), 1984,353 : 305-315)。
【００９０】
GHRH類似体のこのような使用について評価する目的で、下記の実験を行った。さらに特別には、雌Sprague-Dawleyラットに皮下または静脈内注射した後に14日間観察した場合のGHRH類似体#5の薬力学的および薬物動態学的プロファイルならびに急性毒性と、上記GHRH類似体を雄ビーグル犬に、皮下注射にて、少なくとも2日のウォッシュアウト期間を設けつつ投与濃度を順次上げて同一個体に投与した場合の、当該犬における薬力学的プロファイルとを評価することが目的であった。上述のGHRH類似体は、天然に存在するヒト成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)のアミノ末端領域に対応し、2,10,15,および22位の4アミノ酸が置換された29アミノ酸アミド化合成ペプチドの、合成酢酸塩型変異体である。
【００９１】
・試験結果
i.ラットでの検証
各試料がブラインド、2連にて試験され、結果は二つの数理平均値である。血漿および試料の由来は、分析者には知られていなかった。
【００９２】
以下の表12に、ラットGHに関するラット血漿試験の結果が示されている。表12中の各値は、2個体の数理平均値を表す。そして、同様のデータを時間に対してプロットすることで、図１で静脈内注射投与、図２で皮下注射投与についての薬力学曲線が示されている。
【００９３】
表13に、各種継続時間に対する成長ホルモン曲線下領域面積(AUC)が示されている。
【００９４】
データから、GHRH類似体#5の静脈内投与および皮下投与の両方が、投与量依存的な応答すなわち末梢血液中へのGH分泌を誘発したことが示される。動物間でGHレベルの有意な変動が観察された。このことにより、その他の観察事項が確証される。
【００９５】
大部分の個体が、投与前に上昇した循環成長ホルモン濃度を呈した。全ラット群において、GH濃度が、GHRHまたはNaCl注射の約300分(5時間)後に再び上昇する傾向があった。
【００９６】
【表１２】
2006504694.tif 000013
【００９７】
表12に示したラット成長ホルモン(ng/mL) は2連で測定された。値は、1時点当たり2匹での平均値を表す。「経路」は、皮下(SC)または静脈内(IV)であった投与経路を表す。
【００９８】
【表１３】
2006504694.tif 000014
【００９９】
表13に示した「経路」は、皮下(SC)または静脈内(IV)のいずれかである投与経路を表す。さらに、「GH AUC」はGHRH投与の45、120または300分後に測定された。
【０１００】
i.イヌでの検証
各試料がブラインド、2連にて試験され、結果は二つの数理平均値である。血漿および試料の由来は、分析者には知られていなかった。
【０１０１】
以下の表14に、イヌGHに関するイヌ血漿試験の結果が示されている。同様のデータを時間に対してプロットし、図３で皮下注射投与についての薬力学曲線が示されている。
【０１０２】
データから、GHRH類似体#5の皮下投与が、投与量依存的な応答すなわち末梢血液中へのGH分泌を誘発したことが示される。
【０１０３】
GH濃度は、GHRH注射の約30または50分後に再び、注射された投与量に依存して上昇する傾向があった。
【０１０４】
ラットおよびイヌいずれへのGHRH類似体投与の後も、処置に関連した臨床的徴候は観察されなかった。
【０１０５】
【表１４】
2006504694.tif 000015
【０１０６】
・データ解釈
以上で示されているデータは、合成GHRH類似体#5が、ラットおよびイヌ双方の下垂体でGHRH受容体を認識してGH応答および循環中への分泌を誘発することを、明白に実証している。ラットにおいて、上記応答は、ピーク振幅の高さの点でも、ピーク時間に対応するAUCの点でも投与量依存性である。分泌ピークは1回皮下注射後10から15分、静脈内注射後4から10分の間である。GHRH類似体#5に応答したGH分泌は、天然hGHRH(1-44)NH2に応答した分泌よりも、ピーク振幅およびのAUCの双方について2倍大きい。最大GHRH類似体#5の1回IV投与により、成長ホルモンの一過性の脱感作が誘導された。
【０１０７】
イヌにおいて、ラットと同様に、GHRH類似体#5に応答したGH分泌は投与量依存性である。1回皮下注射後の分泌ピークは5から15分の間であり、さらに、明らかに食塩水または天然GHRHへの応答では確認されないような2番目のGHピークが存在し、上記類似体はイヌ血漿中でより長時間安定であることを示している。GHRH類似体#5に似対するGH応答は、天然hGHRH(1-44)NH2に応答したGH分泌よりも有意に大きい(AUCは未測定)。
【０１０８】
・結論
In vivo実証実験で確証が成された。H-Tyr D-Ala2 Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser D-Tyr10 Arg Lys Val Leu D-Ala15 Gln Leu Ser Ala Arg Lys Lys22 Leu Gin Asp Ile Met Ser Arg-NH2においてAla2,Tyr10,Gly15,およびLeu22がD-Ala2,D-Tyr10,D-Ala15,およびLys22で置換されたアミノ酸配列を有するGHRH(1-29)NH2合成類似体は、ラットおよびイヌ下垂体中の成長ホルモン分泌細胞のGHRH受容体に結合し、成長ホルモンの分泌および遊離を投与量依存的に刺激する。
【０１０９】
GHRH類似体#5は、天然の44アミノ酸GHRHよりin vivoで少なくとも2倍強力である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ヒト天然GRF(1-44)NH2ペプチドと、一方で低から高投与量に渡る本発明の好ましい実施形態に係るGHRH類似体を、１回静脈内注射した後の、ラット成長ホルモンの分泌プロファイルを示すグラフである。
【図２】本発明の好ましい実施形態に係るGHRH類似体を低から高投与量にて各１回皮下注射した後の、ラット成長ホルモンの分泌プロファイルを示すグラフである。
【図３】本発明の好ましい実施形態に係るGHRH類似体を低から高投与量にて多数回皮下注射した後の、イヌ成長ホルモンの分泌プロファイルを示すグラフである。
【図１】
2006504694.tif 000016
【図２】
2006504694.tif 000017
【図３】
2006504694.tif 000018
【配列表】
2006504694000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月27日(2004.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GHRH類似体、該類似体の機能性誘導体、または薬剤として許容されるこれらの塩であって、式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-A9-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-A21-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A9はSerまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A21はLys またはD-Lysであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつ
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）
の構造を含み、
前記類似体、前記類似体の機能性誘導体またはこれらの塩が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも実質的に高いin vitro効力指数を有するGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体、または薬剤として許容されるこれらの塩。
【請求項２】
前記類似体が、式中
-A2がD-Ala, A8がAla, A15がAla, A22がLysであり、A9, A10, A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるもの;
-A2がD-Ala, A10がD-Tyr,かつA22がLysであり、A8, A9, A15, A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるもの;ならびに
-A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-Ala,かつA22がLysであり、A8, A9, A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるもの、
からなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項３】
前記類似体が、式中A2がD-Ala,A8がAla,A15がAla,A22がLysであり; A9,A10,A21 およびA30が請求項１に規定のとおりであるものからなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項４】
前記類似体が、式中A2がD-Ala,A10がD-TyrおよびA22がLysであり; A8,A9,A15,A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるものからなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項５】
前記類似体が、式中A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-AlaおよびA22がLysであり; A8,A9,A21およびA30が請求項１に規定のとおりであるものからなる群より選択される請求項１に記載のGHRH類似体、その機能性誘導体またはこれらの塩。
【請求項６】
前記in vitro効力指数が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも少なくとも500倍高い請求項１ないし５のいずれか一項に記載のGHRH類似体。
【請求項７】
前記in vitro効力指数が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも少なくとも1500倍高い請求項６に記載のGHRH類似体。
【請求項８】
前記in vitro効力指数が、天然に存在するGHRHのin vitro効力指数よりも少なくとも2500倍高い請求項７に記載のGHRH類似体。
【請求項９】
有効量の、請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩;および
薬剤として許容される担体
を含有する薬剤組成物。
【請求項１０】
in vivo GH放出の特異的な刺激のための、請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは請求項９に規定の薬剤組成物の有効量の使用。
【請求項１１】
GH欠乏関連病態を処置する薬物を調製するための、請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは請求項９に規定の薬剤組成物の有効量の使用。
【請求項１２】
前記病態が、視床下部下垂体性小人症、熱傷、骨粗しょう症、腎不全、偽関節性骨折、急性／慢性の消耗性疾患または感染、創傷治癒、術後問題発生の低減、泌乳不全、女性の不妊症、ガン患者におけるカヘキシー、同化および／または異化の問題、T細胞免疫不全、神経変性病態、GHRH受容体依存性腫瘍、老化、睡眠障害、筋減少患者・虚弱老年者・HIV患者・放射線療法および化学療法関連の副作用を呈しているガン患者におけるような筋衰弱性疾患からなる群より選択される請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記筋衰弱性疾患が、筋減少、老年性虚弱、HIVおよびガンからなる群より選択される請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１ないし８のいずれか一項に規定のGHRH類似体、該類似体の機能性誘導体または薬剤として許容されるこれらの塩あるいは請求項９に規定の薬剤組成物の有効量を当該哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類におけるGHRH誘導性生物作用の惹起方法。
【請求項１５】
前記GHRH誘導性生物作用が、睡眠障害の制御、食物摂取障害の制御およびタンパク質合成の増進を含む群より選択される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質合成の増進の結果、筋量が増加または乳生成が増加する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳類において成長ホルモンの合成または分泌を刺激することができ、天然hGHRH1-29のin vitro効力指数よりも実質的に高いin vitro効力指数を有し、式Tyr-D-Ala2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Lys22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2（式中、A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）の構造を有するGHRH類似体または薬剤として許容されるその塩。
【請求項１８】
前記in vitro効力指数が、天然hGHRH1-29のin vitro効力指数よりも少なくとも500倍高い請求項１７に記載のGHRH類似体。
【請求項１９】
前記in vitro効力指数が、天然hGHRH1-29のin vitro効力指数よりも少なくとも1500倍高い請求項１８に記載のGHRH類似体。
【請求項２０】
前記in vitro効力指数が、天然hGHRH1-29のin vitro効力指数よりも少なくとも2500倍高い請求項１９に記載のGHRH類似体。
【請求項２１】
式Tyr-D-Ala2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-D-Tyr10-Arg-Lys-Val-Leu-D-Ala15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Lys22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-NH2の構造を有する請求項１７に記載のGHRH類似体。
【請求項２２】
a)式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）
の構造を含み、天然型hGHRH1-29に対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含むGHRH類似体または薬剤として許容されるその塩の有効量；および
b)薬剤として許容される担体
を含む薬剤組成物。
【請求項２３】
前記GHRH類似体またはその塩が、式中
-A2がD-Ala, A8がAla, A15がAla, A22がLysであるもの;
-A2がD-Ala, A10がD-Tyr,かつA22がLysであるもの;ならびに
-A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-Ala,かつA22がLysであるもの、
からなる群より選択される請求項２２に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
A2がD-Ala, A8がAsn, A10がD-Tyr, A15がD-Ala, A22がLys, A30が結合である請求項２３に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
a)式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）の構造の、天然型hGHRH1-29に対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含むGHRH類似体または薬剤として許容されるその塩の有効量；および
b)薬剤として許容される担体
を含む薬剤組成物。
【請求項２６】
前記GHRH類似体またはその塩が、式中
-A2がD-Ala, A8がAla, A15がAla, A22がLysであるもの;
-A2がD-Ala, A10がD-Tyr,かつA22がLysであるもの;ならびに
-A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-Ala,かつA22がLysであるもの、
からなる群より選択される請求項２５に記載の薬剤組成物。
【請求項２７】
A2がD-Ala, A8がAsn, A10がD-Tyr, A15がD-Ala, A22がLys, A30が結合である請求項２６に記載の薬剤組成物。
【請求項２８】
a)式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつ
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）の構造を含み、天然型hGHRH1-29に対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含むGHRH類似体または薬剤として許容されるその塩の有効量；および
b)薬剤として許容される担体
を含み、成長ホルモンの合成または分泌を、これを必要とする哺乳類において刺激するための薬剤組成物。
【請求項２９】
前記GHRH類似体またはその塩が、式中
-A2がD-Ala, A8がAla, A15がAla, A22がLysであるもの;
-A2がD-Ala, A10がD-Tyr,かつA22がLysであるもの;ならびに
-A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-Ala,かつA22がLysであるもの、
からなる群より選択される請求項２８に記載の薬剤組成物。
【請求項３０】
A2がD-Ala, A8がAsn, A10がD-Tyr, A15がD-Ala, A22がLys, A30が結合である請求項２９に記載の薬剤組成物。
【請求項３１】
成長ホルモンの合成または分泌を、必要とする哺乳類において刺激するための薬剤組成物の調製における、GHRH類似体または薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記GHRH類似体または薬剤として許容されるその塩が、式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつ
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）
の構造を含み、天然型hGHRH1-29に対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含む使用。
【請求項３２】
前記GHRH類似体またはその塩が、式中
-A2がD-Ala, A8がAla, A15がAla, A22がLysであるもの;
-A2がD-Ala, A10がD-Tyr,かつA22がLysであるもの;ならびに
-A2がD-Ala,A10がD-Tyr,A15がD-Ala,かつA22がLysであるもの、
からなる群より選択される請求項３１に規定の使用。
【請求項３３】
A2がD-Ala, A8がAsn, A10がD-Tyr, A15がD-Ala, A22がLys, A30が結合である請求項３２に規定の使用。
【請求項３４】
前記哺乳類が、視床下部下垂体性小人症、熱傷、骨粗しょう症、腎不全、偽関節性骨折、急性／慢性の消耗性疾患または感染、創傷治癒、術後問題発生の低減、泌乳不全、女性の不妊症、ガン患者におけるカヘキシー、同化および／または異化の問題、T細胞免疫不全、神経変性病態、GHRH受容体依存性腫瘍、老化、睡眠障害、筋減少患者・虚弱老年者・HIV患者・放射線療法および化学療法の副作用を呈しているガン患者におけるような筋衰弱性疾患からなる群より選択される障害を有する請求項３１に記載の使用。
【請求項３５】
前記筋衰弱性疾患が、筋減少、老年性虚弱、HIVおよびガンからなる群より選択される請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
成長ホルモンの合成または分泌を必要とする哺乳類において刺激するための、GHRH類似体または薬剤として許容されるその塩の使用であって、前記GHRH類似体または薬剤として許容されるその塩が、式X:Tyr-A2-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-A8-Ser-A10-Arg-Lys-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-A22-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-A30-NH2
（式中、A2はAlaまたはD-Alaであり;
A8はAsn, D-AsnまたはAlaであり;
A10はTyrまたはD-Tyrであり;
A15はGly, AlaまたはD-Alaであり;
A22はLeu, D-Leu, LysまたはAlaであり;かつ
A30は結合または1から15残基の任意のアミノ酸配列である）
の構造を含み、天然型hGHRH1-29に対して少なくとも一つのアミノ酸置換を含む使用。
【請求項３７】
前記哺乳類が、視床下部下垂体性小人症、熱傷、骨粗しょう症、腎不全、偽関節性骨折、急性／慢性の消耗性疾患または感染、創傷治癒、術後問題発生の低減、泌乳不全、女性の不妊症、ガン患者におけるカヘキシー、同化および／または異化の問題、T細胞免疫不全、神経変性病態、GHRH受容体依存性腫瘍、老化、睡眠障害、筋減少患者・虚弱老年者・HIV患者・放射線療法および化学療法の副作用を呈しているガン患者におけるような筋衰弱性疾患からなる群より選択される障害を有する請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記筋衰弱性疾患が、筋減少、老年性虚弱、HIVおよびガンからなる群より選択される請求項３７に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
【表１】
2006504694.tif 000019
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
3-天然GHRHまたはGHRH類似体のin vivo投与
ヒトGHRH類似体#5(ヒト[D-Ala2, D-Tyr10, D-Ala15, Lys22]GHRH (1-29)NH2アナログ)がGH分泌を刺激する能力を、雌ラット成体(処置開始時26-34週齢)および雄ビーグル犬において検証した。
i-ラットへのin vivo投与
USP注射用0.9%塩化ナトリウム中ヒトGHRH類似体#5を、雌ラットに静脈内(IV)または皮下(SC)注射で1回投与した後、表２に示されるように、14日間の観察を行った。投与の前に、全ての投与用製剤を0.22μmフィルターでろ過して確実に無菌状態とした。当該個体の直近の体重に基づいて、実際に投与するGHRH類似体#5の量を計算および調整した。投与は各日おおよそ同じ時刻に開始し、午前9:00±30分に始めた。


【国際調査報告】
2006504694.tif 000020
2006504694.tif 000021
2006504694.tif 000022