(57)【要約】本発明は、化合物又は分子コンプレックスを含有する化学サンプルを、結合性材料を使用して処理する方法であって、化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスが結合性材料と結合する能力に基づいて、異なる結合特性を有する他の化合物又は分子コンプレックスから分離する方法を含んでなり、前記方法が：（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、(i) 支持体、(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び (iii) 少なくとも１つのリンカーであって、式（Ｉ）：【化１】2006506216.tif 000034［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、Ｘは、Ｏ又はＳであり、ｎは、０〜１０の整数である。］のリンカーを含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合しており；（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分を、該結合性材料に結合するそれらの能力に基づいて分離することを含んでなる、方法に関する。
2006506216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスが結合性材料と結合する能力に基づいて、異なる結合特性を有する他の化合物又は分子コンプレックスから分離する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化１】
2006506216.tif 000027
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合しており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分を、該結合性材料に結合するそれらの能力に基づいて分離すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、該結合性材料が、複数の末端部分を含んでなり、各々の末端部分が少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に連結している方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、前記末端部分の各々が２つのリンカーにより前記支持体に付いている方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.０ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.８ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項６】
請求項２の方法であって、該リンカーが、式：
【化２】
2006506216.tif 000028
［式中、Ｒ1及びＲ2は、請求項１で定義した通りである。］
のリンカーである方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つが、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成している方法。
【請求項８】
請求項２の方法であって、前記末端部分の各々が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から独立に選択される方法。
【請求項９】
請求項２の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される方法。
【請求項１０】
請求項２の方法であって、前記支持体が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ポリマー性樹脂、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項１１】
請求項２の方法であって、前記結合性材料が、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー材料であり、そして、前記接触が、該化合物又は分子コンプレックスを含有する前記サンプルを前記カラム上に充填することを包含する方法。
【請求項１２】
請求項１の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項１３】
請求項１の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項１５】
請求項１の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項１６】
化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプル中の前記化合物又は分子コンプレックスを検出する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させることを含んでなり、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化３】
2006506216.tif 000029
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより該支持体に付いている方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、該結合性材料が、複数の末端部分を含んでなり、各々の末端部分が少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に連結している方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が２つのリンカーにより前記支持体に付いている方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.０ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.８ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項２１】
請求項１７の方法であって、該リンカーが、式：
【化４】
2006506216.tif 000030
［式中、Ｒ1及びＲ2は、請求項１で定義した通りである。］
のリンカーである方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法であって、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つが、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成している方法。
【請求項２３】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から独立に選択される方法。
【請求項２４】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される方法。
【請求項２５】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルコリンからなる群から独立に選択される方法。
【請求項２６】
請求項１７の方法であって、前記支持体が固体支持体のアレイである方法。
【請求項２７】
請求項１６の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項２８】
請求項１６の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項３０】
請求項１６の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項３１】
請求項１６の方法であって、該接触された結合性材料を処理して、該化合物又は分子コンプレックスの存在を測定することを更に含んでなる方法。
【請求項３２】
請求項３１の方法であって、前記処理が、前記化合物又は分子コンプレックスに選択的に結合するタグ付き化合物での処理を含んでなる方法。
【請求項３３】
請求項３２の方法であって、前記結合性材料を前記タグ付き化合物の存在について試験することを更に含んでなり、前記タグ付き化合物の該存在が、前記化合物又は分子コンプレックスの存在の指標となる方法。
【請求項３４】
請求項３２の方法であって、前記タグが、放射性タグ、蛍光性タグ又は化学発光性タグである方法。
【請求項３５】
化合物又は分子コンプレックスの純度を、前記化合物又は分子コンプレックスを含有する純粋でないサンプルから増加させる方法であって：
（ａ）前記サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化５】
2006506216.tif 000031
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該化合物又は分子コンプレックスを、該サンプル中の他の成分の少なくとも一部から分離すること；
（ｃ）該化合物又は分子コンプレックスの少なくとも一部を回収すること
を含んでなる方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法であって、該結合性材料が、複数の末端部分を含んでなり、各々の末端部分が少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に連結している方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法であって、前記末端部分の各々が２つのリンカーにより前記支持体に付いている方法。
【請求項３８】
請求項３６の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.０ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.８ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項４０】
請求項３５の方法であって、該リンカーが、式：
【化６】
2006506216.tif 000032
［式中、Ｒ1及びＲ2は、請求項１で定義した通りである。］
のリンカーである方法。
【請求項４１】
請求項４０の方法であって、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つが、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成している方法。
【請求項４２】
請求項３５の方法であって、前記末端部分の各々が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から独立に選択される方法。
【請求項４３】
請求項３５の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される方法。
【請求項４４】
請求項３５の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルコリンからなる群から独立に選択される方法。
【請求項４５】
請求項３５の方法であって、前記支持体が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ポリマー性樹脂、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項４６】
請求項３５の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項４７】
請求項３５の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項４９】
請求項３５の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項５０】
請求項３５の方法であって、前記結合性材料が、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー材料であり、そして、前記工程（ｂ）が、該カラムを移動相で溶離した後に溶離画分を集めることを含んでなる方法。
【請求項５１】
請求項５０の方法であって、前記溶離が溶剤勾配の使用を包含する方法。
【請求項５２】
請求項５０の方法であって、前記移動相が、水、炭化水素類、エステル類、アルキルエステル類、ニトリル類、アルコール類、酸類、酸類の水溶液、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項５３】
請求項５２の方法であって、前記移動相が、水、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、メタノール、及びトリフルオロ酢酸の水溶液からなる群から選択される方法。
【請求項５４】
請求項５０の方法であって、前記回収が、同じ成分を含有する溶離画分を合せた後に該移動相を除去して精製された該化合物又は分子コンプレックスをもたらすことを含んでなる方法。
【請求項５５】
請求項３５の方法であって、前記工程（ｂ）が、該接触された結合性材料を洗浄して未結合材料を除去することを含んでなる方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法であって、前記工程（ｃ）が、該接触された結合性材料を処理して結合材料を取り外すことを含んでなる方法。
【請求項５７】
請求項３５の方法であって、該方法に付した後に、該回収された化合物又は分子コンプレックスが少なくとも８０％の純度を有する方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法であって、該方法に付した後に、該回収された化合物又は分子コンプレックスが少なくとも９０％の純度を有する方法。
【請求項５９】
請求項３５の方法であって、該化合物又は分子コンプレックスが実質的に純粋な形で回収される方法。
【請求項６０】
複数の化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの分析方法であって：
（ａ）該サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化７】
2006506216.tif 000033
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分の少なくとも一部を分離すること；
（ｃ）該分離された成分を分析すること
を含んでなる方法。
【請求項６１】
請求項６０の方法であって、前記結合性材料が、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー支持体材料であり、そして、前記工程（ｂ）が、該カラムを移動相で溶離することを含んでなる方法。
【請求項６２】
請求項６１の方法であって、前記溶離が溶剤勾配の使用を包含する方法。
【請求項６３】
請求項６１の方法であって、前記移動相が、水、炭化水素類、エステル類、アルキルエステル類、ニトリル類、アルコール類、酸類、酸類の水溶液、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項６４】
請求項６３の方法であって、前記移動相が、水、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、メタノール、及びトリフルオロ酢酸の水溶液からなる群から選択される方法。
【請求項６５】
請求項６１の方法であって、該溶離の画分が集められてから工程（ｃ）で分析される方法。
【請求項６６】
請求項６５の方法であって、前記分析が、分光光度法又は質量スペクトル法を使用して行われる方法。
【請求項６７】
請求項６０の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項６８】
請求項６０の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項６９】
請求項６８の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項７０】
請求項６０の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項７１】
請求項６０の方法であって、前記工程（ｂ）が、該接触された結合性材料を洗浄して未結合材料を除去することを含んでなる方法。
【請求項７２】
請求項７１の方法であって、前記工程（ｃ）が、該接触された結合性材料を処理して該結合材料を取り出し、そうして得られた該材料を分析に付することを含んでなる方法。
【請求項７３】
請求項７２の方法であって、前記取り出された結合材料が、分光光度法又は質量スペクトル法を使用する分析に付される方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの処理において結合性材料を利用する方法に関する。そのような処理は、典型的には、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスに優先的に結合する結合性材料の能力を利用するので、その結合性材料の特性に依拠する。従って、本発明は、アレイ技術を使用する高処理量スクリーニング法におけるような、化合物又は分子コンプレックスの検出などの方法を包含する。本発明は、サンプル中の化合物又は分子コンプレックスの純度を増加させる方法にも関する。好ましい態様においては、化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの、それら構成成分への精製におけるような精製をもたらす。本法は、サンプルの成分を確認するためにそのサンプルを分析することも包含する。現行技術の多くは、あまりに費用が嵩んだり、タンパク質やペプチドが分析されるときなどは分析されるサンプル中の物質の構造的一体性を破壊したりするので、多くの化合物での使用に適さない。今回、本発明者らは、これら応用に、特にサンプルがタンパク質、特に膜タンパク質を含有する場合に、至極適する結合性材料を見出した。
【発明の背景】
【０００２】
ヒト及び他のゲノム配列の決定が最近完了したことに伴い、ゲノムによって提供される知見を利用することを目的として新しい技術の開発に向けられた熱狂的な活動が存在する。この分野における研究の多さのため、タンパク質及びペプチド及びそれらを含有するコンプレックスなどの、大量の化合物又は分子コンプレックスを典型的に含有するサンプルの処理が必要となる。かくして、これらタイプのサンプルの処理を行うための新規で効率的な方法を提供する必要性が増大している。
【０００３】
殆どの場合、複数の化合物を含有するサンプルをスクリーニングするのに使用される処理技術、特にタンパク質単離物をスクリーニングするのに使用される処理技術の多くは、異なる標的分子又は標的分子コンプレックスが結合性物質又は結合性部分に選択的に結合する能力に基づいている。化合物が差別的に結合する能力は、これら技術の多くで基礎とされているところである。例えば、マイクロアレイ技術では、サンプルがそのアレイと接触され、そして、そのサンプル内の一定の化合物又は分子コンプレックスが、典型的には、そのアレイの表面上の結合性部分に結合する。次いで、未結合材料が（典型的には洗浄により）取り除かれ、そしてそのアレイが分析に付される。従って、サンプル内の一定の化合物又は分子コンプレックスがアレイ上の結合性部分に結合する能力がそのアレイの機能を提供する。類似のやり方で、多くの精製及び／又は分析技術は、サンプルをカラム又はカラム様材料に通すことを必要とし、そこでは、カラム内の材料の送出速度は、サンプル内の化合物又は分子コンプレックスの、カラム内の結合性材料との結合性相互作用に依存する。理論ではこれは簡単であるが、タンパク質を、特に膜タンパク質を含有するサンプルでは特に困難に遭遇するものである。
【０００４】
例えば、一般的には化合物又は分子コンプレックスの精製、そして特定的にはタンパク質及びペプチドの精製は、多くのこれら化合物又は分子コンプレックスの製造され方に主に起因して、バイオテクノロジーの分野で大きな興味が持たれている。例えば、興味の対象である多くの化合物又は分子コンプレックスは、細胞培養技術を用いて製造される。これら技術では、典型的には、細胞株が、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスをコードする遺伝子を含有する組換えプラスミドの挿入によってその化合物又は分子コンプレックスを産生するように工学的に処理される。培養中に、細胞株は増殖培地を与えられ、その培地は、一般には特定の細胞株の必要性に合致するように設えられるとはいえ、通常は、多くの糖類、アミノ酸、及び増殖因子、並びに、持続的増殖を支援するために必要であるか又は望まれる他の添加物を含有する。従って、増殖培地は、その細胞株により産生される興味の対象である特定の化合物又は諸化合物とは別の多くの数の化合物を含有する。次いで、増殖段階の終了時に、興味の対象である化合物、タンパク質、ペプチド又は分子コンプレックスを、産生段階中に細胞によって取り込まれた他の化合物の混ぜ物から並びにその細胞の副産物から分離する必要がある。ある場合には、培養プロセス中にやはり細胞によって産生された他の化合物を取り除くことも必要である。
【０００５】
細胞培養が終わったら、精製プロセスにおける第１工程は、典型的には、細胞内成分をその混合物中に放出させる細胞の溶解と、その後の、目的化合物、典型的には、タンパク質、ペプチド又は分子コンプレックスを含有する精製されるべき粗製材料の澄明溶液を生成させるために固体を除去するための遠心分離又は濾過とを包含する。次いで、こうして得られたサンプルは更なる処理に付される。この更なる処理は、サンプルの１又はそれを越える成分の分析、検出又は精製を包含する。
【０００６】
タンパク質単離に関連する最近の研究プロトコルは、典型的には、２Ｄ（２次元）ゲルの使用と、それに先んじる、例えば、３工程洗浄剤抽出操作とを包含する。しかしながら、２Ｄゲル技術の使用に伴う多くの問題が存在する。これらには、操作の費用が嵩むこと、結果の再現性が乏しいこと、この方法が低濃度のタンパク質には不適切であるという事実、サンプルの分離が濃度依存性であるという事実、膜タンパク質に適用するときの能力の欠如、及びＳＤＳの除去が必要になるという事実が含まれる。従って、このタイプの化合物又は分子コンプレックスのための別の精製操作を開発することが望まれる。
【０００７】
使用できる既知の選択肢は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中速液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）、又は他の既知のクロマトグラフィー技術などのクロマトグラフィーである。
【０００８】
典型的に利用されるクロマトグラフィー技術は、分離される成分の電荷、サイズ又は疎水性のいずれか、又はその精製操作に使用される特定のクロマトグラフィー支持体についての分離される成分の親和性に基づいて、そのミックス中の多くの成分を分離することを目的としている。
【０００９】
一般に、クロマトグラフィーに基づく精製技術は、適切なクロマトグラフィー支持体で、混合物中の各成分がそのクロマトグラフィー支持体を異なる速度で通って移動（クロマトグラフィーカラムを降下するなど）させられるという事実に依拠しており、その異なる速度は、用いられる特定の溶剤条件下でのその混合物の諸成分とクロマトグラフィー支持体材料についてのそれらの親和性の差に依存している。カラムクロマトグラフィーが使用されるときは、諸成分が最終的にカラムから溶出し、そして、そのカラム条件が適切なら、適切なやり方で集められた溶出画分が興味の対象である成分を純粋な化合物又は分子コンプレックスの形態で優勢に含有することになる。実際、好ましくは、これは、目的化合物をその成分だけが存在するものとして含有する多くの画分を提供する。最後に、ＨＰＬＣなどの多くのクロマトグラフィー操作では、目的成分がカラムから溶出してきたときに検出するための検出器がクロマトグラフィーカラムの溶出部に連結されていて、必要な画分が効率的に集められるようになっている。
【００１０】
多くの現行の分離技術が不充分であることが分かっているタンパク質の主要なクラスは、特に精製するのが難しい膜タンパク質である。３０〜４０％のＤＮＡが膜タンパク質をコードすると見積もられているので、このクラスのタンパク質は、細胞のタンパク質補足量の有意な割合に相当すると考えられる。不運にも、これまでこれらタンパク質の単離は、それらが構造的に関連する物質から単離されるのを難しくするところの、乏しい溶解性及びコンフォメーション的不安定性を包含する多くの理由のために障害があることが分かっている。タンパク質の分野においてこれらタンパク質により提供される諸機会を十分に利用するために、これら困難が克服される必要がある。
【００１１】
多くのタンパク質又はタンパク質コンプレックスの精製に有用であることが分かっている好ましい技術は、広範囲の化合物の分析及び精製において選り抜きの技術として今日揺るぎなく確立されているＨＰＬＣである。この点に関して、ＨＰＬＣは、ペプチド及びタンパク質及びそれらのコンプレックスの特性決定における中心的技術になっており、最近の生物学及び生物医学における急速な発展の多くのものに決定的であった。
【００１２】
タンパク質精製におけるＨＰＬＣの成功は、結果の再現性、選択の容易さ及び高い回収性などのＨＰＬＣの多くの特徴のお蔭である。ユーザーの視点からみた最も有意な特徴は、非常に密接に関連する分子だけでなく構造的に異なる分子についても、広範囲の条件下で優れた分離能が得られる点である。ＨＰＬＣの特性は、クロマトグラフィーの全ての相互作用的モードが、特定のクロマトグラフィーモードについて特異的である溶離条件を変化させることによって微妙に操作され得る認知力に基づいているという事実に起因している。
【００１３】
ＨＰＬＣを含む全てのクロマトグラフィー技術で得られた結果を向上させる１つの方法は、クロマトグラフィー工程で使用される固体支持体を修飾することである。このやり方では、カラムに導入される材料の結合性についての固相の修飾が、分離効率を向上させるために使用され得る。従って、１つの試みは、ＨＰＬＣで使用できる別の支持体材料と他のクロマトグラフィー精製操作を提供することである。
【００１４】
従って、多くのクロマトグラフィー支持体材料が、一般的なクロマトグラフィー法での使用のために、特にＨＰＬＣでの使用のために開発されてきた。これら材料を調製するに際し、製造されるべき望まれる支持体に依存して多くの操作が採用されてきた。一般に、それら操作は、シリカなどの担体材料の表面上に（興味の対象である成分がそれに親和性を有するか又は有することが期待される）結合性部分を不動化することを包含する。そのような結合性材料を不動化するのに多くの方法が使用されてきたが、典型的には、それは、幾つかのやり方で結合性材料を担体の表面に共有結合させるか又は結合性材料を担体の疎水性表面と疎水性相互作用させることにより行われてきた。幾つかの場合には、これら２つの技術の組合せが、担体の表面上に不動化支持体をもたすために使用される。
【００１５】
各々のシステムに多くの利点と欠点が確認されている。例えば、結合性材料を担体の表面上へ共有結合させることの１つの利点は、このやり方の不動化が担体の表面から結合性部分が漏出するのを少なくするので、クロマトグラフィー材料に長い使用時活性寿命を提供する点である。対照的に、結合性部分の担体への疎水性結合に依拠する材料は、溶剤の選択に依存して短い寿命しか有さないことが分かっている。通常、時間とともに結合性部分又は結合性化合物の担体表面からの漏出が起こり、結合性化合物が漏出すればするほどクロマトグラフィー支持体が非効率になる。ＭＰＬＣにおけるように、クロマトグラフィー支持体材料が日常的に入れ換えられるクロマトグラフィー技術で使用される場合には、そのような問題は該らないが、カラムが特に高額でありかつカラムの入れ換えが望ましくなく実際に不経済であるところのＨＰＬＣに使用するには、明らかに適さない。
【００１６】
しかしながら、疎水性結合の利点は、この技術の使用が、結合性材料が担体の表面に固く結び付いておらずより柔軟であることを意味する点である。従って、このようなやり方での担体と結合性部分との相互作用は、必要な場合には、結合性部分が担体の表面を横方向に大きく動くことを可能にする。このことは、興味の対象である化合物への不動化された材料の潜在的結合性に大きな柔軟性を与えるので、結合性部位の形成により大きな柔軟性を提供する。加えて、膜構造を真似ようとする場合、このことが、生成された不動化支持体が、生体膜において生来的に存在する分子について観察される動きに類似した横方向の動きを有することを意味するので、疎水性相互作用を使用することは望ましい。このことは、結合効率を増加させる傾向があるので、これら材料を使用する精製を理論的には向上させる筈である。
【００１７】
これら競合的問題を克服又は解決するために多くの提案が行われており、更なる研究が必要とされる。かくして、例えば、担体への結合性部分の疎水性結合により製造されたクロマトグラフィー材料の“寿命”を長くするために提案された１つの解決策は、表面に疎水性結合した結合性部分の少なくとも一部を架橋することである。典型的には、架橋は、担体にくっ付いていない結合性部分の末端が最も容易に架橋される（例えば、架橋は、典型的には、結合性部分がカラム上に不動化された後に行われる）ので、そこで起こる。不運にも、これは、クロマトグラフィー材料の寿命を長くするが、形成された全体的“表面”の可動性を有意に低下させるので、その材料の効率を有意に低下させる。従って、サンプルの精製における応用のためだけでなく、サンプルの成分の分離、サンプルの分析、及びサンプル中の成分の検出などの他の処理工程における応用のために、サンプルの処理に使用できる結合性材料を特定する必要性が存在している。
【００１８】
本発明者らは、今回、一定の結合性材料が、これら問題点の多くを克服するために利用できる特性を有することを見出した。これら結合性材料は、微小規模チップに基づく分析及び／又は検出／分析的技術における結合性材料として利用され得るだけでなく、結合性材料がクロマトグラフィー材料として使用されるところの大規模バッチ処理にも適用可能である。これら結合性材料は、化合物及び分子コンプレックスを含有するサンプルの処理に有用であり、多成分混合物からの興味の対象である成分、特にタンパク質含有サンプルからの興味の対象である成分の検出、分析、分離、及び精製に使用されることができる。
【００１９】
かくして、本発明者らは、有用な結合性材料が、その結合性末端部分を固体支持体に連結させる一定の構造的特徴を有する適切な長さのリンカーの取り込みによって製造され得ることを見出した。リンカーを使用する利点は、結合性末端部分が支持体から幾分遠くに追い出されたときでも、その結合性材料が全体としては良好な柔軟性とコンフォメーション自由度を有する点である。結合性部分が天然膜の構成成分の結合性部分に基づく場合には、このことが、その結合性材料が膜様構造として作用することを可能にする。従って、それら支持体は、それらが天然膜の表面を真似るときには、良好な結合特性を提供する十分な柔軟性を有することができる。更には、それらは、共有結合で支持体に結合しているので、漏出に抵抗することができる。加えて、本発明で使用されるリンカーの更なる利点は、支持体の表面近くで架橋されることができるので、柔軟性を損なうことなくその結合性材料に更なる強度を提供できる点である。
【発明の要旨】
【００２０】
１つの側面では、本発明は、化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスが結合性材料と結合する能力に基づいて、異なる結合特性を有する化合物又は分子コンプレックスから分離する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００２１】
【化１】
2006506216.tif 000003
【００２２】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合しており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分を、該結合性材料に結合するそれらの能力に基づいて分離すること、
を含んでなる方法を提供する。
【００２３】
全ての化学材料で言えることだが、リンカー中に見出される全ての置換基にとって好ましい基が存在する。例えば、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、それが別の隣接するリンカーのＲ1又はＲ2と一緒になるとき、式−Ｏ−の基を形成するのが好ましい。Ｒ1とＲ2の両方が隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒に式−Ｏ−の基を形成するのが特に好ましく、その場合、各々のリンカーが２つの他のリンカーに架橋することになる。Ｒ1とＲ2がこのタイプの酸素架橋を形成しない状況では、それらが、Ｈ、ＯＨ、及びアルコキシからなる群から独立に選択されるのが好ましい。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、及びブトキシが含まれ、エトキシが特に好ましく、
ｎは、好ましくは１〜６、より好ましくは２〜５、最も好ましくは３であり、
Ｒ3及びＲ4は、好ましくは、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ４アルキル、及びハロゲンからなる群から選択され、Ｈが特に好ましく、
Ｒ5は、好ましくはＨであり、
Ｒ6は、好ましくはＨ又はＣ1〜Ｃ４アルキルであり、Ｈが特に好ましく、
Ｘは、好ましくはＳである。
【００２４】
この文脈において、成分の分離は、結合性材料に結合する類似の能力を有する成分が、その結合性材料と結合する非類似の能力を有する成分から分離されることを意味する。かくして、例えば、あるサンプルが３成分を有し、そのうちの２成分が結合性材料との類似の結合能力を有し１成分が異なる結合能力を有するなら、この方法は、最初の２成分のそれら３成分からの分離をもたらすことになる。最初の２成分が相互に分離されることを意味することまで意図されていない。
【００２５】
末端部分は多くの形態をとることができ、原則として、末端部分は、他の化合物又は分子コンプレックスについて親和性を有するあらゆる化合物であることができる。末端部分が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から選択されるのが好ましい。特定の好ましい態様においては、末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される。
【００２６】
原則として各々の末端部分は、ただ１つのリンカーを介して結合することができるが、各々の末端部分が２つのリンカーを介して支持体に結合するのが好ましい。これは、何らかの理由で１つの連結が開裂したとしても、末端部分が結合したままで残るので漏出が起こらないという利点を有している。
【００２７】
多くの支持体が利用され得る。しかしながら、支持体は、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ポリマー性樹脂、及びそれらの混合物からなる群から選択されるのが好ましい。
【００２８】
支持体上のリンカーの密度は、１.０ミリモル／ｍ2より大きいのが好ましく、より好ましくは、１.８ミリモル／ｍ2より大きい。
更なる側面では、本発明は、化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプル中の前記化合物又は分子コンプレックスを検出する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させることを含んでなり、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００２９】
【化２】
2006506216.tif 000004
【００３０】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーによって該支持体に付いている方法を提供する。
【００３１】
本発明のこの側面では、結合性材料中のリンカーは、先に記載した通りの同じ好ましい基を有する。この検出方法では、支持体が固体支持体のアレイであることが好ましい。本発明の好ましい態様においては、結合性材料がサンプルと接触させられて、その材料とそのサンプル中の検出されるべき成分との結合が起こる。結合性相互作用が起こるだけの適切な長さの時間が経過すると、化合物又は分子コンプレックスの存在を確認するためにその材料が処理される。その処理の前に、その接触された材料から未結合材料とサンプルを取り除くためにその結合性材料が洗浄されるのが好ましい。本法は、好ましくは、接触させられた結合性材料が、その結合性材料に結合している興味の対象である化合物又は分子コンプレックスに選択的に結合するタグ付き化合物と接触させられる工程を包含する。次いで、この接触工程の後に、典型的には、あらゆる未結合タグ付き化合物を除去するためのその材料の洗浄が行われる。多くのタグがこのタグ付き化合物に使用され得るが、そのタグは、放射性タグ、蛍光性タグ、又は化学発光性タグであるのが好ましい。次いで、この検出は、典型的には、タグの存在について結合性材料を分析することを包含する。分析は、使用されるタグのタイプ及び望まれる結果に依存して、定性的であっても定量的であってもよい。
【００３２】
更なる側面では、本発明は、化合物又は分子コンプレックスの純度を、前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルから増加させる方法であって：
（ａ）前記サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００３３】
【化３】
2006506216.tif 000005
【００３４】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該化合物又は分子コンプレックスを、該サンプル中の他の成分の少なくとも一部から分離すること；
（ｃ）該化合物又は分子コンプレックスの少なくとも一部を回収すること
を含んでなる方法を提供する。
【００３５】
本発明のこの精製方法では、結合性材料は、先に記載した通りの好ましい特徴を有する。
１つの好ましい態様においては、結合性材料は、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー材料であるので、工程（ｂ）は、そのカラムを移動相で溶離した後に、溶離した画分を集めることを含んでなる。移動相が、水、炭化水素類、エステル類、アルコールエステル類、ニトリル類、アルコール類、酸類、酸類の水溶液、及びそれらの混合物からなる群から選択されるのが好ましく、水、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、メタノール、及びトリフルオロ酢酸の水溶液が特に好ましい。
【００３６】
回収工程が、同じ成分を含有する溶離画分を合せた後にその移動相を除去して精製された化合物又は分子コンプレックスをもたらすことを含んでなるのが特に好ましい。この態様では、回収工程は、典型的には、溶出画分を試験してその化合物又は分子コンプレックスを含有する画分を決めることを包含する。
【００３７】
別の態様は、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスが接触工程で結合性材料に結合する、吸着タイプのクロマトグラフィーを利用するものである。この態様では、工程（ｂ）は、好ましくは、あらゆる未結合材料を除去するために接触させられた結合性材料を洗浄することを含んでなる。かくして、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスは、その結合性材料上に残されることによって、サンプル中に存在する他の化合物又は分子コンプレックスが洗浄によって除去されるにつれてその純度が増加される。この態様では、回収工程は、接触させられた結合性材料を、その結合性材料から化合物又は分子コンプレックスを取り外すための物質で処理することを含んでなる。取り外されたら、それは、典型的には、当該技術分野で周知の手段によって単離される。
【００３８】
更なる側面では、本発明は、複数の化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの分析方法であって：
（ａ）該サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は    (i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００３９】
【化４】
2006506216.tif 000006
【００４０】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分の少なくとも一部を分離すること；
（ｃ）該分離された成分を分析すること
を含んでなる方法を提供する。
【００４１】
本発明の分析方法では、結合性材料は、先に記載した通りの好ましい特徴を有する。
本発明の好ましい態様においては、化合物又は分子コンプレックスは、好ましくは、上記の精製の態様について記載したやり方で処理される。
【００４２】
この態様では、工程（ｃ）で利用される分析方法は、分離方法に依存する。従って、例えば、工程（ｂ）がクロマトグラフィー処理を包含する場合には、クロマトグラフィーカラムからの溶出液が、分光光度検出器などの分析検出器又はガスクロマトグラフィー／その溶離化合物に関する質量スペクトルを提供するＭＳ、に直接通されるのが好ましい。
【００４３】
無論、画分が合せられるような別の態様では、成分が単離されてから、当該技術分野で周知の何らかの日常的分析技術に付されて、サンプル中の化合物又は分子コンプレックスの十分な分析が提供されてもよい。
【００４４】
本発明は、結合性材料の使用であって：
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００４５】
【化５】
2006506216.tif 000007
【００４６】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いている結合性材料の、
複数の化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの分析における使用にも関する。
【００４７】
更なる側面では、本発明は、結合性材料の使用であって：
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００４８】
【化６】
2006506216.tif 000008
【００４９】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いている結合性材料の、
化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルから分離する方法、又は、化合物又は分子コンプレックスの純度を、該化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルから増加させる方法における使用に関する。
【００５０】
最後の側面では、本発明は、結合性材料の使用であって：
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００５１】
【化７】
2006506216.tif 000009
【００５２】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いている結合性材料の、
サンプル中の化合物又は分子コンプレックスの検出における使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【００５３】
上記のように、本発明の方法は全て何らかの形態の結合性材料を用いる。異なる化合物又は分子コンプレックスに差別的に結合するこの結合性材料の能力こそが、本法が望ましい効果を達成するのを可能にするのである。
【００５４】
結合性材料
本願の方法において言及されかつ使用される結合性材料は、末端部分と支持体とのリンカーを介する共有結合によってもたらされ、そこでは、そのリンカーは、支持体の表面と末端部分の一部分の両方に共有結合で結合する。一般に、複数のリンカーが支持体の表面に付くと共に、複数の末端部分がそれら複数のリンカーに付いて、膜様構造を形成する。
【００５５】
結合性材料のための基礎として使用される支持体は、当該技術分野で周知の材料である。結合性材料がアレイの形態で使用されると、その支持体は、アレイ支持体として典型的に使用される、ガラス、膜、マイクロタイターウェル、質量スペクトル装置のプレート、ビーズ又は他の粒子などのあらゆる材料であることができるが、ガラス又はポリマー性物品が好ましい。結合性材料がクロマトグラフィー支持体材料として使用されるなら、その支持体は、多孔性でも非多孔性でもよく、好ましくは、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ポリマー性樹脂、又はそれらの混合物から形成されることができる。しかしながら、一般に、単一タイプの支持体が使用されるなら本発明の方法がより効果的であることが分かったので、支持体材料は、（それらが単一材料でできているという点で）“純粋”であるのが好ましい。使用される支持体材料は、ＨＰＬＣ系で典型的に見られる圧力を包含する高圧に十分に耐えられるだけの強度であるのが好ましい。とはいえ、これは、低圧の適用が望まれる場合や結合性材料が検出技術やアレイ技術で使用される場合には必要とされない。使用される支持体のタイプは、ユーザーによって意図される結合性材料についての特定の用途に基づいて当業者により決定され得る。
【００５６】
結合性材料がクロマトグラフィー材料であるとき、その支持体は一般的に粒子状担体材料である。担体材料の粒子サイズは、粒子ごとに大きく変動し得るが、好ましくは約１〜約５００ミクロン、より好ましくは約５〜約１００ミクロン、より好ましくは約５〜約５０ミクロン、最も好ましくは５ミクロンの直径の平均粒子サイズを有する粒子が好ましい。粒子サイズが相対的に均質であることも、本発明の方法でより良好な分解能を提供することが分かったので、好ましいものである。また、粒子は好ましくは多孔性であり、そして好ましくは３００オングストロームのオーダーの気孔サイズを有する。好ましい担体はシリカである。担体として使用するのに特に好ましいシリカは、ＺＯＲＢＡＸTMシリカ、特に Agilent Technologies から入手可能な直径が５μｍで気孔サイズが３００オングストロームのＲx−Ｓｉｌである。
【００５７】
多くの末端部分が、本発明の方法における結合性材料に使用されることができ、特定の末端部分が、本法に付されることが望まれる化合物又は分子コンプレックスに依存して選ばれる。しかしながら、全ての化合物は、少なくとも１つの他の化合物又は分子コンプレックスへの少なくとも幾つかの結合親和性を有しているので、原則として、あらゆる化学部分が末端部分として働くことができる。末端部分の役割は、サンプル中の少なくとも１種の化合物との結合性相互作用を提供することである。従って、大多数の種が結合性部分として使用されることができ、当業者は、概して、望まれる結合性相互作用を達成するのにどのタイプの結合性部分を使用すべきか分かるであろう。単に例として、その適用がアレイであるなら、末端部分が抗体などのリガンド結合性試薬であるのが好ましい。
【００５８】
本法が、結合性材料をクロマトグラフィー材料として使用してサンプル中の化合物又は分子コンプレックスの純度を増加するものであるときは、例えば、その末端部分は、典型的には、興味の対象である化合物との一定の結合親和性であって、純度の一定の増加を提供するのに十分であるが、単離されるべき物質へあまりに強く結合することのない結合親和性を有するように選ばれる。その材料があまりに強く結合すると、化合物又は分子コンプレックスは、そのクロマトグラフィー材料から取り外されることができなくなり、本法をずっと困難なものにする。一般に、当業者は、興味の対象である化合物への末端部分の結合性が一定の精製を提供するのに十分であるか、及び／又はその結合性が強すぎないかを判断するのに殆ど困難を感じないであろう。
【００５９】
しかしながら、本法が検出であるときは、結合性部分が強く（場合によっては不可逆的に）結合することが望ましい。そのような強い結合性は、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスがその結合性材料に結合するようなやり方で、サンプルが結合性材料と接触するのを可能にする。次いで、その結合性材料は、未結合材料を除去するための材料で処理される（典型的には、洗浄など）。従って、結合性材料がこういうやり方で使用されるときは、洗浄が興味の対象である結合した化合物又は分子コンプレックスを除去しないことが重要である。
【００６０】
クロマトグラフィー支持体材料に取り込むのに好ましい末端部分には、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質又はそれらの誘導体が含まれる。これらは、本発明の方法がタンパク質又はペプチド、特に膜タンパク質に応用されるときに特に有用である。これら材料は、細胞膜中に共通に見出されるので、それらは、膜タンパク質に親和性を有し、かくして、膜タンパク質を含有するサンプルがここに記載の方法に付されるときに非常に有用であることが分かった。
【００６１】
これらのうち、末端部分がリン脂質及びそれらの誘導体であるのが特に好ましい。そのリン脂質は、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から選択される。最も好ましくは、末端部分は、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン又はそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００６２】
これら末端結合性部分の多くの一般的構造式は次の通りである。
【００６３】
【化８】
2006506216.tif 000010
【００６４】
【化９】
2006506216.tif 000011
【００６５】
明らかなように、これら材料は２つの脂肪鎖を有する。それらが末端部分として使用されるとき、それらは、典型的には、その少なくとも１つの脂肪鎖の末端炭素を介してリンカーに結合する。好ましくは、各々の末端部分は、その各々の脂肪鎖が１つのリンカーに付くことで、２つのリンカーに結合する。こうすれば、リンカーとの接触が１本の鎖で開裂しても、他の鎖がその末端部分を支持体に結合した状態で保持する。脂肪鎖の長さが変動する天然材料の誘導体も使用され得る。そうする場合、脂肪鎖が同じ数の炭素を含有するのが好ましい。これら変種における脂肪鎖の炭素の数は、１〜２０、より好ましくは１０〜１６、最も好ましくは１１である。加えて、天然材料の誘導体は、炭素主鎖への不飽和要素の導入によっても達成される。炭素鎖への不飽和導入の１つの利点は、その末端部分の更なる精巧さのために追加の官能基を提供できる点である。また、末端部分が結合した後、必要なら、不飽和の存在が膜の更なる架橋を可能にする。
【００６６】
無論、当業者にとって明らかなように、炭素鎖は、あらゆる適する非干渉性置換基で置換されることもできる。非干渉性置換基とは、末端部分とリンカーとの結合に干渉しないあらゆる置換基である。
【００６７】
上記の末端部分は、典型的には、１又はそれを越えるリンカーを介して支持体材料に不動化される。好ましくは、各々の末端部分は、２つのリンカーを介して支持体に付く。この用途に使用される結合性材料に使用されるリンカーは、次の式：
【００６８】
【化１０】
2006506216.tif 000012
【００６９】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
を有する。
【００７０】
Ｒ1及びＲ2の少なくとも１つ、最も好ましくは両方が、別の隣接するリンカー上のＲ1及びＲ2と一緒に−Ｏ−基（酸素架橋）を２つのリンカーの間に形成するのが好ましい。そういうものであるから、各々のリンカーは、少なくとも１つ、最も好ましくは少なくとも２つの他のリンカーに−Ｏ−橋を介して付くのが好ましい。このタイプの酸素架橋の提供は、リンカーの構造的一体性を増加させるのに役立ち、最終的に生成する結合性材料に追加の強度を提供する。実際、これら架橋は、好ましくは、支持体の表面上のリンカーがその酸素架橋によって相互連結している３次元網目様構造を形成する。
【００７１】
全ての化学材料で言えることだが、全ての置換基にとって好ましい基が存在する。例えば、上記のように、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、それが別の隣接するリンカーのＲ1又はＲ2と一緒になるとき、式−Ｏ−の基を形成するのが好ましい。Ｒ1とＲ2の両方が隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒に式−Ｏ−の基を形成するのが特に好ましい。Ｒ1とＲ2がこのタイプの酸素架橋を形成しない状況では、それらが、Ｈ、ＯＨ、及びアルコキシからなる群から独立に選択されるのが好ましい。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、及びブトキシが含まれ、エトキシが特に好ましく、
ｎは、好ましくは１〜６、より好ましくは２〜５、最も好ましくは３であり、
Ｒ3及びＲ4は、好ましくは、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ４アルキル及びハロゲンからなる群から選択され、Ｈが特に好ましく、
Ｒ5は、好ましくはＨであり、
Ｒ6は、好ましくはＨ又はＣ1〜Ｃ４アルキルであり、Ｈが特に好ましく、
Ｘは、好ましくはＳである。
【００７２】
特に好ましいリンカーは、式：
【００７３】
【化１１】
2006506216.tif 000013
【００７４】
のものである。
このリンカーのケイ素末端が支持体材料に付き、その窒素末端が好ましくは末端部分に結合するのが好ましい。
【００７５】
複数のリンカーが支持体材料に付くと共に、複数の末端部分がそれら複数のリンカーに付くのが好ましい。支持体材料上のリンカーの密度は、１.０ミリモル／ｍ2より大きいのが好ましく、好ましくは１.８ミリモル／ｍ2より大きい。
【００７６】
結合性材料の合成は、多くのやり方で行われることができる。しかしながら、リンカー前駆体がまず支持体に付けられてから、適当に活性化された末端部分と、その結合したリンカー前駆体との反応が行われて、結合性材料が仕上げられるのが典型である。ある場合には、いかなる未反応リンカー前駆体も干渉しないようにするために、未反応リンカー前駆体がオクチルアミンなどのブロッキング基と反応させられるエンドキャップ工程が行われる。
【００７７】
この合成の第１工程は、支持体の活性化を包含する。これは、当該技術分野で知られたあらゆるやり方で行われることができ、好ましくは、支持体の表面上にフリーの水酸基を有する活性化支持体をもたらすものである。次いで、その活性化支持体は、式：
【００７８】
【化１２】
2006506216.tif 000014
【００７９】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、ｎ及びＸは、先に記載した通りである。）
のリンカー前駆体と反応させられて、支持体の表面に結合したリンカー前駆体がもたらされる。次いで、これは、アミノ置換（好ましくは、ジアミノ置換）末端部分と反応させられて、結合した末端部分をもたらす。ジアミノ誘導体が使用されるとき、その末端部分は２つのリンカーを介して結合する。
【００８０】
３種の好ましい末端部分の合成及びクロマトグラフィー支持体材料を作るためのそれらと支持体との連結を以下に説明する。
不動化のためのホスファチジルコリン材料の合成
図１に示すホスファチジルコリン修飾シリカ材料が、修飾されたホスファチジルコリン誘導体を修飾されたシリカにカップリングすることにより製造された。その誘導体を修飾されたシリカにカップリングするための合成がスキーム１に示される。第１工程は、商業的に入手可能なＮ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミドと商業的に入手可能な１２−アミノドデカン酸（１）を反応させて、その末端アミノ基を、良好な総収率で得られたｂｏｃ誘導体（２）として保護することを包含する。次いで、ｂｏｃ保護アミノドデカン酸（２）とジシクロヘキシルカルボジアミド（ＤＣＣ）とを反応させて、フリーの酸の縮合から、対応する無水物（３）を生成させた。酸（３）とｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＧＰＧ）の塩化カドミウム錯体とを、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下、水の共沸除去条件下で反応させて、保護されたホスホリルコリン誘導体（４）を生成させた。（４）をパラジウム担持活性炭と水素雰囲気下で反応させてｂｏｃ保護基を円滑に除去してアミン（５）を生成させた。この物質は、これでシリカ上へ容易に不動化できるようになった。リンカーを支持体へ不動化させ、次いで、それらアミンと反応させて目的の結合性材料を生成させた。明らかに、その支持体（シリカ）は、２つのリンカーを介して末端ホスファチジルコリン基に結合されている。
【００８１】
【化１３】
2006506216.tif 000015
【００８２】
ホスファチジル酸誘導体の合成
ホスファチジル酸誘導体の合成がスキーム２に示される。
【００８３】
【化１４】
2006506216.tif 000016
【００８４】
かくして、ｓｎ−グリセロ−３−リン酸ジシクロヘキシルアンモニウム（６）が、そのｓｎ−グリセロ−３−リン酸塩（６）の水溶液をピリジニウムイオン交換樹脂に通すことによって、そのピリジニウム塩に転化されて、ピリジニウム塩（７）を生成した。この物質（７）は単離されずに即座に再懸濁され、３モル当量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及び調製されたばかりのＮ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデセン酸無水物（３）と共に超音波処理されて、１,２−ジ−Ｏ−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデセニル（ＳＮ−グリセロ−３−Ｏ−ホスフェート）（８）を生成した。次いで、これは、パラジウム担持活性炭と窒素雰囲気下で反応させられて、ホスファチジル酸誘導体（９）を生成した。この物質は、これで修飾されたシリカに容易にカップリングできるようになった。
【００８５】
ホスファチジルグリセロール誘導体の合成
ホスファチジルグリセロール誘導体の合成が、スキーム３に示される通りに行われた。かくして、保護されたホスファチジルコリン誘導体（４）が、Ｌ−２,３−Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロールの存在下で、ストレプトミセス種からのホスホリパーゼＤと反応させられて目的の生成物（１０）を生成した。次いで、パラジウム担持活性炭によってｂｏｃ保護基を脱保護して、リンカーへの結合に適するアミノ誘導体（１１）を生成させた。
【００８６】
【化１５】
2006506216.tif 000017
【００８７】
末端基の不動化
シリカから固体支持体を製造するのに必要な連続する一連の工程がスキーム４に概略的に示されている。当業者に明らかなように、シリカの表面は、スキーム４に示す様に、それに付いた多くのヒドロキシ残基を有する。１００ｍｌのイソプロパノール中にシリカの粒子を懸濁させ、その溶液を中和するために２、３滴の塩酸を加え、そして１０分間超音波処理することによりそのシリカを活性化させた。
【００８８】
次いで、こうして形成されたシリカ懸濁液は、中速で２４時間回転混合された。得られた多孔性シリカ懸濁液は、２０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離された。上澄み液をデカンテーションした後、それら粒子は、水とイソプロパノールで洗浄された。次いで、その多孔性シリカ粒子は、１２０℃で２４時間乾燥された。あらゆる残存水が、そのシリカを減圧下で１８０℃で加熱することによってその表面から除去された。スキーム４で（ａ）として描かれている、こうして形成された活性化シリカ粒子は、次いで、触媒量のイミダゾールの存在下で、３−イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＩＴＣＰＳ）で処理された。これは、スキーム４に（ｂ）として示される修飾表面をもたらした。その修飾シリカ粒子と化合物（５）のような不動化されるべき物質との反応が、多数のイソチオ基がホスファチジルコリン誘導体と反応した、スキーム４に（ｃ）として示される表面をもたらす。最後に、その材料は、その表面を後日干渉し得るあらゆる未反応イソチオシアネート基を完全に反応させるために、類似の反応条件下でオクチルアミンと反応させられた。次いで、これは、スキーム４に（ｄ）として概略を示した特徴を有する表面をもたらす。
【００８９】
【化１６】
2006506216.tif 000018
【００９０】
本発明の方法
本発明の方法は、全て、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルで行われる。典型的には、これらサンプルは、複数の化合物、複数の分子コンプレックス又はそれら両方の混合物を含有する。サンプルは、化学合成反応液又は発酵液を含むあらゆる適する供給源からのものであることができる。しかしながら、サンプルは、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導されるのか好ましい。細胞又はウイルスホモジェネートからのサンプルを生成させる操作は、当業者に周知であるのでここでは繰り返さない。このサンプルは、タンパク質、ペプチド又はタンパク質とペプチドの複合体を含有するのが好ましい。タンパク質が膜タンパク質であるのが特に好ましい。
【００９１】
サンプル調製
原則として、本発明の方法に付されるサンプルは、それらが本発明の方法に付されるときあらゆるレベルの純度であることができる。しかしながら、当業者には明らかであろうが、サンプルは、本発明の方法に付される前にあらゆる粒子を除くために濾過されるのが一般である。この工程を省いてもよいが、サンプルが粒状物を含有しているのに濾過されないなら、その粒子が結合性材料を塞いで能力を低下させることが考えられる。結合性材料に不可逆的に結合してその有効寿命を破壊してしまう“ベースライン”物質を除去するために、サンプルがクロマトグラフィー材料の小さな“パッド”で濾過されるのも一般である。このことは、本法がカラムでの精製である場合に特に当てはまる。これら２つの前処理工程は、好ましい工程であるが、本発明の実施に必須という訳ではない。
【００９２】
本法
１つの態様では、本発明は、化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスが結合性材料と結合する能力に基づいて、異なる結合特性を有する他の化合物又は分子コンプレックスから分離する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００９３】
【化１７】
2006506216.tif 000019
【００９４】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合しており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分を、該結合性材料に結合するそれらの能力に基づいて分離すること、
を含んでなる方法を提供する。
【００９５】
更なる態様では、本発明は、化合物又は分子コンプレックスの純度を、前記化合物又は分子コンプレックスを含有する純粋でないサンプルから増加させる方法であって：
（ａ）前記サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【００９６】
【化１８】
2006506216.tif 000020
【００９７】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該化合物又は分子コンプレックスを、該サンプル中の他の成分の少なくとも一部から分離すること；
（ｃ）該化合物又は分子コンプレックスの少なくとも一部を回収すること
を含んでなる方法を提供する。
【００９８】
原則として、これら方法の各々における開始サンプルの純度のレベルは関係がないが、本分離／精製向上操作に付されるサンプル中の化合物又は分子コンプレックスの開始純度が高ければ高いほど、分解能が大きくなって得られる結果が向上するであろうことが一般的に分かる。かくして、目的の化合物又は分子コンプレックスが、本分離／精製向上操作に付される材料の全量の、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、更により好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％を構成するのが好ましい。
【００９９】
本発明の方法は、殆ど全ての化合物又は分子コンプレックスに適用可能である。本発明の操作によって効率的に処理されることができる化合物又は分子コンプレックスは、原則として、好ましくは、選ばれる末端部分について結合親和性を有する化合物又は分子コンプレックスである。その化合物が、有機化合物、特に、ペプチド、タンパク質又は糖タンパク質であるのが特に好ましい。最も好ましくは、タンパク質は、少なくとも１つの疎水性ドメイン又は領域を有する膜タンパク質である。化合物がタンパク質であるなら、好ましくは高分子量タンパク質であるのが好ましい。これらは、あらゆる供給源から得られ得るが、サンプルが細胞又はウイルスホモジェネートから誘導されるのが好ましい。
【０１００】
本発明の純度増加方法では、結合性材料は、好ましくは、当該技術分野で周知のクロマトグラフィーシステムにおいて、クロマトグラフィー支持体材料として利用される。先に説明した結合性材料は、精製のために使用されてきた多くのクロマトグラフィーシステムでの使用に適する。かくして、それらは、混合物がクロマトグラフィー支持体材料の小さなパッドで濾過されるところの簡単な用途からＨＰＬＣなどのより複雑な用途にまで使用されることができる。従って、本結合性材料は、伝統的で周知のクロマトグラフィーの液体／固体用途に、並びに、薄層クロマトグラフィー、ＭＰＬＣ及びＨＰＬＣシステムに使用されることができる。従って、本結合性材料は、当該技術分野で周知のあらゆるクロマトグラフィーシステムに使用されることができる。
【０１０１】
別の態様では、本結合性材料は、平坦な支持体又はプレート上に配置されることができる。これら態様では、サンプルが結合性材料と接触することによって、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスが結合する。次いで、そのプレートは、好ましくは、未結合材料を除去するために洗浄される。洗浄（もし適用可能なら）後、その結合性材料は、その支持体から、化合物又は分子コンプレックス（純度を増加させる場合）又は小さな結合能力を有する化合物又は分子コンプレックス（分離の場合）を取り外すために処理される。
【０１０２】
従って、本来、分離方法の態様であるか純度増加方法の態様であるかに拘らず、サンプルを結合性材料と接触させる工程は、そのサンプルを結合性材料に加えることを含む。結合性材料がクロマトグラフィーカラム内に配置される場合、サンプルをカラムに充填することを包含するのが一般である。結合性材料がマイクロアレイなどのアッセイプレート上にある場合には、接触は、典型的には、サンプルをそのアレイの表面上にピペッティングすることを包含する。
【０１０３】
しかしながら、結合性材料がクロマトグラフィーカラム内のクロマトグラフィー支持体材料である場合に本法が行われるのが好ましい。これらシステムでは、クロマトグラフィー支持体材料は、典型的には、中速液体クロマトグラフィーカラム又は高速液体クロマトグラフィーカラムなどの詰められたカラムの形態で使用される。クロマトグラフィー支持体材料を使用してカラムを詰める方法及びこれらタイプの材料で詰めらることができるカラムは、当該技術分野で周知である。加えて、カラムの形状も周知である。クロマトグラフィーカラム内にカラムが（典型的には空気圧パッキングにより）詰められたら、使用に適する“湿潤”カラムにするために溶剤又は移動相と接触されるのが典型である。カラムを“湿潤”にするために使用される溶媒又は移動相は、生成される化合物のタイプに依存する。典型的には、溶剤又は移動相が使用されるときは、使用される溶剤又は移動相は、精製されるべき化合物がクロマトグラフィー支持体上で非常に低い移動性を有するように選ばれる（溶離が始められる前に充填された物質のカラム内での移動が起こらないようにするため）。
【０１０４】
本法では、処理工程が、接触した物質の移動相での溶離を溶出画分の収集とともに包含するのが好ましい。従って、物質がクロマトグラフィー支持体材料上に充填されたら、接触した物質が移動相で溶離されて、化合物がクロマトグラフィー材料のカラムを移動して最終的にそのカラムから溶出されるのが一般である。このタイプの溶離方法は周知である。
【０１０５】
原則として、あらゆる溶剤又は溶剤混合液が本発明の方法における移動相として使用され得るが、水性及び／又は有機溶剤が特に好ましい。本発明の方法に使用するのに適する溶剤及び／又は溶剤混合液には、炭化水素類、エーテル類、アルキルエステル類、ニトリル類、アルコール類、及び酸類が含まれる。特に好ましい溶剤には、水、メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、及びトリフルオロ酢酸の水溶液が含まれる。混合溶剤系が、単一溶剤系又は溶剤勾配系として使用されるのも典型である。
【０１０６】
本発明の方法は、典型的には、時間の経過とともにカラムの溶離条件を変えることを包含する。かくして、例えば、カラムの初期溶離が一溶剤で始まり、そのカラムに加えられる溶剤混合液中の第２溶剤のパーセンテージが時間の経過とともに徐々に上げられ、かくして溶剤勾配を提供するのが典型である。そのような勾配溶剤技術は、当該技術分野で周知であり、典型的には、溶剤（Ａ）の１００％使用と溶剤（Ｂ）の０％使用で始めて１００％溶剤（Ｂ）と０％溶剤（Ａ）で溶離を終了することを包含する。本発明の精製に使用するのに好ましい第１及び第２溶剤には、トリフルオロ酢酸の水溶液（好ましくは０.１％トリフルオロ酢酸水溶液）及び水／６０％アセトニトリル中の４０％の０.１％ＴＦＡの混合液が含まれる。
【０１０７】
上記のやり方における溶離勾配を変化させる方法は、当該技術分野で周知であり、当業者には明らかであろう。原則として、溶離勾配は、精製されるべき化合物及び存在する時間的制限に基づいて当業者により決定される溶離勾配の開始点及び終点で変動させることができる。しかしながら、原則として、あらゆる溶離勾配が選ばれ得るが、選ばれるべき正確な溶離勾配は、精製されるべき化合物に依存するであろう。次いで、典型的には、好ましくは単離されるべき化合物の純品を含有するカラムからの溶離画分が、小部分で回収される。集められる小部分のサイズは大きく変動し、各々のカラムについて集められる小部分の数も大きく変動する。かくして、例えば、中速液体クロマトグラフィーでは、各々の小部分が１〜５ｍｌからなる多数の分離小部分が集められ得、全部で３０〜１５０の分離画分が単離され得る。次いで、これら画分は、典型的には、目的化合物の存在について試験され、目的化合物を含有する画分が合わされて、その画分から目的化合物又は分子コンプレックスが回収される。
【０１０８】
ある技術では、目的化合物又は分子コンプレックスがカラムから溶出する時を検出するために、クロマトグラフィーカラムの出口に検出器が配置され、このことでより効率的な収集が可能になる。この目的に適する当該技術分野で周知の多くの検出器がある。これら検出器の使用は、興味の対象である化合物で優勢的に構成される画分の収集を可能にするので、複数の画分を集める必要性を回避できる。
【０１０９】
溶離された化合物又は分子コンプレックスを含有する画分からのそれの回収は、当該技術分野で周知の多くのやり方で行い得る。移動相が純粋に有機溶剤である状況では、目的化合物又は分子コンプレックスは、典型的には、慣用的な技術を使用して溶剤を留去することによって回収される。典型的には、そのような工程にロータリーエバポレーターが使用される。
【０１１０】
また、ある溶剤系では、画分を、有機溶剤で、目的化合物をその有機溶剤中に取り込むのに必要な条件下で抽出することが必要であり得る。次いで、上で説明したように、化合物が有機相から回収され得る。目的化合物を画分から結晶化させるなどの他の方法も使用できる。
【０１１１】
興味の対象である化合物又は分子コンプレックスの純度増加及び／又は分離度合いの望まれるレベルを達成するために、本発明の方法を数回繰り返す必要があり得る。これら状況では、目的化合物又は分子コンプレックスを含有する画分が典型的には合わされ、濃縮され、そしてより高い純度の生成物を提供するために再度本発明の方法に付される。
【０１１２】
好ましくは、本発明の方法に付した後、目的化合物は、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有する。本法に付した後、化合物が実質的に純粋な形で回収されるのが特に好ましい。
【０１１３】
別の態様では、結合性材料が、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）で使用されてもよい。これは、ＨＰＬＣとキャピラリー電気泳動（ＣＥ）の間で急速に進歩したハイブリッド技術である。本来、この技術では、ＣＥキャピラリーが、クロマトグラフィー支持体材料（即ち、結合性材料）と一緒に詰められ、電気浸透流（ＥＯＦ）を生み出す詰められたキャピラリーに電圧がかけられる。ＥＯＦは、検出器に向かって毛管現象を起こすキャピラリーに沿って溶質を送り出す。この技術では、結合性材料への溶質の結合に基づく有差分画とその溶質の電気泳動的移動の両方が、検出器に向かう送り出しの間に起こり、それがサンプルの諸構成成分のＣＥＣ分離をもたらす。一般に、この技術の使用で、ＨＰＬＣ又はキャピラリー電気泳動のいずれか単独の場合に比較して、特有の分離選択性が得られる可能性がある。ＥＯＦの流動プロフィールが流動関連バンドの拡幅化を少なくするので、分離／精製効率が概してかなり高くなることが全般的に分かっている。加えて、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶剤を高レベル（典型的には４０〜８０％）で含有する担体電解質がこの技術に用いられる。そうしたものなので、水中の溶解物と中性の溶質の両方の分割が容易に達成される。一般に、先に述べたように、この技術は、キャピラリー電気泳動とＨＰＬＣのハイブリッドである。このことは、キャピラリー電気泳動及びキャピラリー電気クロマトグラフィーでさえ、本法が関与する技術分野の当業者により十分に周知であると考えられるので、この明細書でより詳細に説明されることはない。
【０１１４】
従って、この出願で意図されかつ上で説明した分離及び純度を増加する本法は、多くの種々の類似する工程を含有する。一般に、違いはその方法の目的である。例えば、純度を増加させるとき、その目的は、純粋でないサンプルから純粋な又は比較的純粋な成分を含有する画分を好ましくは提供することである。このことは、その目的が、処理工程（ｂ）が化合物又は分子コンプレックスをサンプルの他の成分（精製されてもされなくてもよい）から純粋な又は比較的純粋な形で好ましくは分離することを確実にするようなものであることを意味する。これの目的は、サンプル中の興味の対象である成分の特性決定を可能にするか又は更なる精巧さのために十分な量の化合物又は分子コンプレックスを提供することである。これは、目的が更なる反応に付せれるだけの量の化合物又は分子コンプレックスを生成させることである方法のためにサンプルが得られる場合に特に当てはまる。
【０１１５】
対照的に、分離では、その目的は、必ずしも化合物又は分子コンプレックスを純粋な形で生成させることでは（純度を増加させることでも）なくて、むしろサンプル中の成分の、一定の結合性材料に結合するそれらの能力に関する情報を得ることである。従って、この方法では、目的は、その結合性材料に結合する類似の能力を有する化合物を特定することである。このタイプのデータの提供は、サンプルの成分がその結合性材料の末端部分に結合する類似の能力を有するかどうかを確認するのを可能にする。この情報は、末端部分が天然の膜を擬似するように設計される場合に非常に有用であり得るので、本明細書に開示された分離は、どの化合物がその膜について類似の結合親和性を有するか及びどの化合物が非類似の結合特性しか有さないかを確認するのを可能にする。
【０１１６】
２種の化合物が一緒に分離する場合、それらはその結合性材料について類似の結合特性を有すると結論付けられる。かくして、このタイプの情報の提供は、膜に結合する物質の種類への洞察力を提供するので、結合相互作用の構造的評価に役立ち得る。
【０１１７】
特に、本分離技術は、特定の化合物又は分子コンプレックスが膜について親和性を有することが分かっている状況で有用であり得る。結合性材料に結合する既知の親和性を有する化合物をサンプルに加えることによって、その分離技術を使用する者は、そのサンプル中のどの成分が、既知の結合親和性を有する化合物又は分子コンプレックスと一緒に分離するか確認することができる。これは、その者に、サンプル中のいずれの成分がその既知化合物と類似の結合特性を有するかに関する情報を提供する。加えて、結合する能力は、概して、カラムの溶離の速度に反比例するから、結合親和性が既知である化合物をサンプルに加えることにより例えば定性的情報を得ることができる。
【０１１８】
従って、本明細書に記載した分離方法は、サンプルの成分と選ばれる特定の結合性部分との相互作用を厳密に調べるのを可能にする。従って、例えば結合性材料が天然の膜を擬似するように結合性部分が選ばれる場合、本分離技術は、サンプルの成分とその膜との相互作用を厳密に調べるのに使用されることができる。加えて、本分離技術は相対的にソフトな技術であってタンパク質／タンパク質相互作用を害さないので、元のサンプル中でのタンパク質／タンパク質相互作用の分析を可能にする。従って、サンプル中にタンパク質／タンパク質相互作用が存在する場合には、本分離技術はこれを同定できなかった（それら２種のタンパク質が一緒に分離するからである）。
【０１１９】
更なる側面では、本発明は、化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプル中の前記化合物又は分子コンプレックスを検出する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させることを含んでなり、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii)少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【０１２０】
【化１９】
2006506216.tif 000021
【０１２１】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより該支持体に付いている方法を提供する。
【０１２２】
混合物中の化合物又は分子コンプレックスの検出は、典型的には、生化学分野で行われるので、当業者は、そのような検出技術に典型的に使用される広範囲の方法に気付くであろう。これら技術の大多数が、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスの結合性材料への結合性を利用したものであったので、ここでこれら技術に言及する。接触工程は多くの形態をとるが、典型的には、サンプルを結合性材料に加えるか又は結合性材料を何らかのやり方でサンプル中に浸漬するかのいずれかである。
【０１２３】
接触工程で物質が結合したら、使用される最終的な検出方法に依存して、多くの工程が行われ得る。接触工程で使用される結合性材料は、結合性材料がアレイの一部を形成する場合など、あらゆる適するタイプのものであり得る。また、結合性材料は、多ウェル分析装置の一部であり得る。そのようなアレイ又はチップ分析技術は概して周知でありかつ当該技術分野でよく理解されている。そのような用途に適する支持体には、ガラススライド、シリコンチップ、マイクロウェル、ＰＶＤＦ膜、並びに磁気マイクロビーズ及び他のマイクロビーズが含まれる。支持体がガラス支持体であるのが特に好ましい。
【０１２４】
これら用途における当業者には明らかであろうが、支持体は、スライドにおけるような平坦な構造を有していても、別の構造を有していてもよい。かくして、例えば、支持体は、その表面上にマイクロチャネルを有するように工作されていても、リンカーが付いている支持体の表面上に小さなマイクロポストが存在してもよい。しかしながら、支持体が実質的に平坦であるのが特に好ましい。
【０１２５】
結合性材料がサンプルと接触したら、結合した材料の存在を検出するためにその接触した材料が処理され得る、当該技術分野で周知の多くの方法がある。これら方法では、あらゆる未結合材料を除去するために、接触した結合性材料が適する移動相で洗浄されるのが好ましい。洗浄に使用される移動相は、結合した材料に依存するとはいえ、典型的には、未結合材料を除去するだけで結合相互作用に害を及ぼさないように選ばれる。典型的な移動相は、水又は等張性生理食塩水である。
【０１２６】
結合性材料の接触工程と洗浄工程（もし適用されるなら）に続いて、結合した材料の存在を検出するために使用され得る多くの技術が存在する。次いで、本法は、好ましくは、化合物又は分子コンプレックスの存在を確認するために、接触した結合性材料を処理することを包含する。しかしながら、その処理は、接触させられた結合性材料を、その結合性材料に既に結合している化合物又は分子コンプレックスに選択的に結合するタグ付き化合物で処理することを包含するのが好ましい。タグ付き化合物の同一性は、スクリーニング又は検出される化合物又は分子コンプレックスに依存するが、一般に、当業者は、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスで使用されるべきタグ付き化合物のタイプが分かるであろう。かくして、標的分子が例えばタンパク質又はペプチドであるなら、タグ付き化合物が、好ましくはそのタンパク質についてのタグ付きリガンド又はレセプターであるべきことは周知である。大多数の化合物で、当業者は、通常、この工程に使用するのに適する分子が分かる。
【０１２７】
このような方法が使用されるとき、結合性材料は、検出されるべき化合物又は分子コンプレックスを介して結合性材料に結合していないあらゆるタグ付き化合物を除去するために、再度洗浄されるのが好ましい。これは、通常、存在する残存タグ付き化合物に起因して、偽“陽性”が記録されることのないようにするために行われる。
【０１２８】
これが行われたら、その結合性材料がタグ付き化合物の存在について試験されるのが好ましい。一般に、タグ付き化合物の存在は、分析されるべき化合物又は分子コンプレックスの存在の指標である。当該技術分野で周知である使用できる多くの適するタグがあるが、タグが、放射性タグ、蛍光性タグ、又は化学発光性タグであるのが好ましい。使用されるタグのタイプは、概して、分析される分子及びタグ付き分子への接近容易性に依存する。
【０１２９】
当業者は、蛍光性、放射性及び化学発光性タグが最も一般的なタグであり、これらタグの存在を試験する方法も当該技術分野で周知であることが分かるであろう。これら方法のいずれも使用できる。ある場合には、これらタイプのタグで、検出される化合物の定性的存在だけでなく存在する化合物の量に関する定量的データに関する情報も提供される。
【０１３０】
更なる側面では、本発明は、複数の化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの分析方法であって：
（ａ）該サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【０１３１】
【化２０】
2006506216.tif 000022
【０１３２】
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分の少なくとも一部を分離すること；
（ｃ）該分離された成分を分析すること
を含んでなる方法を提供する。
【０１３３】
本分析方法は、上で説明したサンプルの純度増加及び／又は分離方法と多くの点で類似しているので、多くの工程は再度説明されることはない。一般に、本法の最初の２工程は同じであるので、工程（ａ）と（ｂ）は好ましくは同じやり方で行われる。
【０１３４】
主要な相違は、（純度を増加させる場合におけるように）溶出した画分を集めるのではなく、サンプルを分析する方法では、そのサンプルの成分の分析を提供するために溶出液が即座に分析されるのが好ましい。これは多くのやり方で行えるが、溶出した物質をカラムの終端から検出装置に向けることを介して行われるのが典型である。検出装置は当該技術分野で周知の多くの形態をとることができるが、典型的には、それは分光光度装置又は質量スペクトル装置である。これら装置は、当該技術分野で周知であり、定量的及び定性的洞察をサンプルの成分に提供することができる。
【０１３５】
また、溶出画分は、興味の対象である化合物又は分子コンプレックスの純粋なサンプルを提供するために合わされてもよく、次いで、それらは、そのサンプルの構成を確認するために分析されることができる。使用される分析技術は、当該技術分野で周知のいかなるものでもよく、例として、赤外、質量スペクトル、又はＮＭＲが含まれる。
【０１３６】
これより、本発明は、以下の実施例により説明される。
【実施例】
【０１３７】
実施例１  ホスファチジルコリン誘導体の合成
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデカン酸（２）：
Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド（３.２４ｇ，１３ｍｍｏｌ）が、１００ｍｌの６０％ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ中の１２−アミノドデカン酸（１）（２.１５ｇ，１０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１.２１ｇ，１２ｍｍｏｌ）の溶液に加えられ、そして、その混合液は、Ｎ2気流下、室温で８時間攪拌された。次いで、その溶液は０℃で１２時間保持され、生成した白色析出物が濾過されて氷冷６０％ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏで洗浄された。その白色残渣はＰ2Ｏ5で減圧乾燥されて、更にニンヒドリン試薬で試験されて、フリーのアミノ基の不存在が確認された。この最終生成物は９３％収率で得られた。ｍ.ｐ.８４〜８５℃；（Ｃ20Ｈ31ＮＯ4Ｎａ)+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝ 372.2151，実測値 372.2136。ＦＴＩＲ（ヌジョール）3346, 2922, 2853, 1692, 1684, 1529, 1472, 1274, 1237, 944, 732, 696ｃｍ-1，1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ，1.31 (s br, 14H, -CH2-(CH2)7-CH2-), 1.49 (qt, 2H, -CH2-CH2- COOH), 1.65 (qt, 2H, -NH-CH2-CH2-), 2.37 (t, 2H, -CH2-COOH), 3.19 (q, 2H, -NH-CH2-CH2-), 4.81 (s br, 1H, -NH-), 5.12 (s, 2H, -CH2-C6H5), 7.37 (s, 5H, -C6H5)。13Ｃ−ＮＭＲδ（ｐｐｍ），178.5, 156.5, 136.8, 128.5, 128.1, 66.6, 45.7, 41.1, 34.1, 33.5, 29.9, 29.4, 29.2, 29.0, 26.7, 24.7, 8.4。
【０１３８】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデカン酸無水物（３）：
１０ｍｌの乾燥ＣＣｌ4中に溶かしたＤＣＣ（０.９１ｇ，４.４ｍｍｏｌ）が１００ｍｌの乾燥ＣＣｌ4と５０ｍｌの無エタノールＣＨＣｌ3中に溶かした（２）（２.８０ｇ，８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加えられた。その溶液は、Ｎ2気流下、室温で６時間攪拌された。ＴＬＣにより試験して反応が完結した後、白色析出物が濾過されて４×２５ｍｌのＣＣｌ4で洗浄された。次いで、その白色残渣は２００ｍｌの無エタノールＣＨＣｌ3に加えられ、氷上で１０分間保持された。そのＣＨＣｌ3溶液が濾過されて、白色析出物が３×２５ｍｌの氷冷無エタノールＣＨＣｌ3で洗浄された。ＣＨＣｌ3濾液が合わされてＣＨＣｌ3溶剤が低圧留去された。その白色残渣が更にＰ2Ｏ5で２４時間減圧乾燥され、８５％収率で得られた。ｍ.ｐ.７２〜７３℃；（Ｃ40Ｈ60Ｎ2Ｏ7Ｎａ)+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝703.4301，実測値 703.4289。ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）3348, 2922, 2853, 1809, 1742, 1686, 1529, 1472, 1267, 1246, 1228, 1073, 734, 696ｃｍ-1。
【０１３９】
１,２−ジ−Ｏ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール−３−Ｏ−ホスホリルコリン（４）：
ｓｎ−グリセロ−３−ホスホリルコリン（ＧＰＣ）が、その塩化カドミウム（ＣｄＣｌ2）複合体（０.４４ｇ，１ｍｍｏｌ）として、減圧下でベンゼンと水の共沸除去を繰り返すことにより乾燥された。その無水ＧＰＣ−ＣｄＣｌ2複合体は、１ｍｌの蒸留されたばかりの無エタノールＣＨＣｌ3中に懸濁され洗浄された。調製されたばかりの（３）（２.０４ｇ，３ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０.２４ｇ，２ｍｍｏｌ）が、定速で攪拌されたＧＰＣ−ＣｄＣｌ2懸濁液に加えられ、そのフラスコにＮ2を溢れさせた後に蓋がなされた。その懸濁液は、遮光して室温で攪拌され、その反応はＴＬＣ（溶離液ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４  Ｐｈｏスプレー又はヨード蒸気での可視化）によって追跡された。３日後、溶媒が減圧留去されて、白色残渣がＣＨＣ１3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：２中に溶解された。次いで、その溶液混合液は、ＣｄＣｌ2を除去するためにＡＧ５０１−Ｘ８樹脂（BloRad）に通され、そしてその樹脂は３床容量の同じ溶媒で更に処理された。溶離液は減圧留去された後、凍結乾燥された。その乾燥生成物はＣＨ3ＯＨ中に溶解され、無勾配溶離液を使用して、溶媒ＣＨ3ＣＮ：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６：３：１でのＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８）により精製され、８５％収率で最終生成物を与えた。ｍ.ｐ.６２〜６３℃；ＴＬＣ：Ｒf＝０.６１（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）；（Ｃ48Ｈ78Ｎ3Ｏ12ＰＮａ）+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝ 942.5224, 実測値 942.5221。ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）：3341, 2922, 2852, 1723, 1684, 1531, 1472, 1268, 1231, 1090, 1061, 970ｃｍ-1。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ，1.25 (s br, 28H, -CH2-(CH2)7-CH2-), 1.48 (qt, 4H, -CH2-CH2-COOH), 1.57 (qt, 4H, -NH-CH2-CH2-), 2.27 (t, 4H, -CH2-COOH), 3.15 (q, 4H, -NH-CH2-CH2-), 3.34 (s br, 9H, -+N(CH3)3), 3.78 (s br, 2H, -CH2-+N(CH3)3), 3.95 (m, 2H, -CH2-CH2-O-P-), 4.13-4.40 (m, 2H, -CH2-CH-), 4.31 (s br, 2H, -P-O-CH2-), 4.88 (s br, 2H, -NH-), 5.08 (s, 4H, -CH2-C6H5), 5.21 (qt, 1H, -CH2-CH-CH2-) 7.34 (s, 10H, -C6H5)。13Ｃ−ＮＭＲδ（ｐｐｍ），173.58, 173.22, 156.46, 136.81, 128.55-128.07, 70.66, 70.59, 66.55, 63.43, 63.02, 59.30, 54.58, 41.17, 34.35, 34.16, 30.98-26.77, 24.96。31Ｐ−ＮＭＲδ（ｐｐｍ） 0.41。
【０１４０】
１,２−ジ−Ｏ−（１２−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロール−３−Ｏ−ホスホリルコリン（５）：
調製されたばかりの（４）（３００ｍｇ，０.３２５ｍｍｏｌ）が１００ｍｌのＣＨ3ＯＨ中に溶解され、これに、３０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃが加えられた。その溶液は、Ｈ2の大気圧下室温で攪拌された。その反応は、ＴＬＣ（溶離液ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）によって追跡された。全ての出発原料が消費されたときに反応が止められた。その混合液は、セライトで濾過されて３×５０ｍｌのＣＨ3ＯＨで洗浄された。合わされたＣＨ3ＯＨ洗浄液が３５℃で減圧濃縮されて、最終生成物がＰ2Ｏ5で１２時間乾燥された。（Ｃ32Ｈ67Ｏ8Ｎ3Ｐ）+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝652.4669，実測値 652.4648。ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）：3365, 2918, 2854, 1745, 1652, 1575, 1244, 1174, 1689, 970, 927, 875, 823, 722, 666ｃｍ-1。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δｐｐｍ，1.30 (s br, 28H, -CH2-(CH2)7-CH2-), 1.59 (qt, 4H, -CH2-CH2-COOH), 1.54 (qt, 4H, -NH-CH2-CH2-), 2.30 (t, 4H, -CH2-COOH), 2.74 (m, 4H, -NH-CH2-CH2-), 3.22 (s br, 9H, -+N(CH3)3), 3.89 (s br, 2H, -CH2-+N(CH3)3), 3.99 (m, 2H, -CH-CH2-O-P-), 4.14-4.41 (m, 2H, -CH2-CH-), 4.28 (s br, 2H, -P-O-CH2-), 5.21 (qt, 1H, -CH2-CH-CH2-), 13Ｃ−ＮＭＲδ（ｐｐｍ），174.95, 174.62, 72.57, 67.95, 64.95, 60.39, 54.73, 41.47, 34.92, 34.82, 31.44-27.46, 25.99。31Ｐ−ＮＭＲδ（ｐｐｍ） 0.97。
【０１４１】
実施例２  ホスファチジン酸誘導体の合成
１,２−ジ−Ｏ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−Ｏ−ホスフェート（８）：
ジシクロヘキシルアンモニウム・ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（３７０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）が１０ｍｌの Milli-Q 中に溶解された。そのジシクロヘキシルアンモニウムは、ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートの水溶液をピリジニウム Dowex-50 イオン交換樹脂に通すことによりピリジニウム塩に転化された。得られたピリジニウム塩の残渣は、加えた無水ピリジン（３×２０ｍｌ）の留去を繰り返すことにより無水にされた。そのｓｎ−グリセロ−３−ホスフェートの乾燥ピリジニウム塩は、１００ｍｌの無水無エタノールＣＨＣｌ3中に再懸濁されて１０分間超音波処理された。３モル当量のＤＭＡＰ（３６６ｍｇ，３ｍｍｏｌ）及び調製されたばかりのＮ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデカン酸無水物［３］（２.０４ｇ，４ｍｍｏｌ）がその懸濁液に加えられた。その混合液は室温で攪拌され、遮光下で７２時間維持された。反応が完結した後、溶媒が３５℃で減圧留去されてから、乾燥した残渣が５０ｍｌのＣＨＣｌ3中に溶解され、脂肪酸誘導体を除去するために、ＣＨＣｌ3でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製され、続いてＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ＝９：１及びＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ＝１：１で溶離された。残渣が更に凍結乾燥されて、最終生成物を７４％収率で与えた。ｍ.ｐ．：７０〜７１℃；ＴＬＣ：Ｒf＝０.８３（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４），０.５４（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ＝１：１）；（Ｃ43Ｈ65Ｎ2Ｏ12Ｐ）+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝832.4278, 実測値 832.4263；ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）：3341, 2922, 2851, 1726, 1684, 1650, 1558, 1531, 1402, 1321, 1268, 1249, 1231, 1175, 1110, 1051, 943 ｃｍ-1。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δｐｐｍ：1.24 [-(CH2)7-; 28H], 1.56 [-CH2-CH2-COO-; 4H], 1.48 [-NH-CH2-CH2; 4H], 2.26 [-CH2-COO-; 4H], 3.17 [-NH-CH2; 4H], 4.03 [-CH-CH2-0-P-, 2H], 4.16-4.36 [CH2-CH-, 2H], 4.89 [-OCO-NH-, 2H], 5.08 [C6H5-CH2-O-, 4H], 5.21 [CH2-CH-CH2-, 1H], 7.34 [C6H5--CH2-, 1OH]。13Ｃ−ＮＭＲδ（ｐｐｍ），173.46, 173,13, 156.76, 136.79, 128.51-128.04, 70.27, 66.52, 63.49, 62.69, 34.24, 34.11, 29.47-26.77, 24.87。31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）2.48。
【０１４２】
１,２−ジ−Ｏ−（１２−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−Ｏ−ホスフェート（９）：
調製されたばかりの化合物（８）（３００ｍｇ，０.３６０ｍｍｏｌ）が２０ｍｌのＣＨＣｌ3及び８０ｍｌのＣＨ3ＯＨの混合液中に溶解され、３０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃがその攪拌溶液に加えられた。その溶液は、室温でＨ2雰囲気下攪拌された。反応は、溶媒ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４を使用するＴＬＣにより追跡された。ＴＬＣプレート上で化合物（１）が消失した後、反応が止められた。その混合液は、セライトの厚い層で満たされた微細焼結ガラスロートを通して濾過されて、３×５０ｍｌのＣＨ3ＯＨで洗浄された。合わされたＣＨ3ＯＨ洗浄液が３５℃で減圧留去されて、最終生成物がＰ2Ｏ5で１２時間減圧乾燥された。ｍ.ｐ.５５〜５６℃；（Ｃ27Ｈ58Ｎ2Ｏ8Ｐ）+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝569.3933, 実測値 569.3917。ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）：3348, 2922, 2852, 1738, 1270, 1250, 1234, 1179, 1122, 1070, 946ｃｍ-1。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.34 [-(CH2)7-; 28H], 1.63 [-CH2-CH2-COO-; 4H], 1.68 [NH-CH2-CH2; 4H], 2.35 [-CH2-COO-; 4H], 2.94 [H2N-CH2; 4H], 4.02 [-CH-CH2-0-P-, 2H], 4.21-4.43 [CH2-CH-, 2H], 5.23 [CH2-CH-CH2-, 1H]。13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ），175.00, 174,67, 72.05, 67.31, 64.61, 63.77, 40.83, 35.09, 34.91, 30.53-28.60, 27.47, 25.96。31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）0.09。
【０１４３】
実施例３  ホスファチジルグリセロールの合成
１,２−ジ−Ｏ−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１２−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−Ｏ−ホスホリル−（−）−２,３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（１０）：
２相反応混合液中での相間ホスファチジル化反応を使用するホスファチジルコリン誘導体［４］からの不動化可能ホスファチジルグリセロール誘導体の合成。Ｌ−２,３−Ｏ−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（３３１.０ｍｇ，２.５ｍｍｏｌ）が、ｐＨを５.６に調節するために使用された酢酸を含有する１０ｍｌの１００ｍＭ ＮａＯＡｃと５０ｍＭ ＣａＣｌ2緩衝液中に溶解された。１０ｍｌのジクロロメタン中に溶解されたホスファチジルコリン誘導体（４）（４６０.０ｍｇ，０.５ｍｍｏｌ）がその緩衝混合液に加えられた。１００ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５.６）でその活性が１ユニット／μｌに調節された、ストレプトミセス種からの1００μｌのホスホリパーゼＤ（Sigma, P-4912）がこの２相混合液に加えられた。この反応液は３５℃で高速攪拌された。相間ホスファチジル化反応の進行が、３０分毎にその混合液の少量を取り出して、溶媒ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：２を使用するＴＬＣにより分析することにより追跡された。反応は５時間後に完結した。その反応混合液は、３０００ｒｐｍ、５℃で１５分間遠心分離することにより、各々の相に分離された。上相の水相を捨てて、有機相が更に２×１０ｍｌの Milli-Q で洗浄された。有機溶媒が３５℃で減圧留去された。次いで、得られた白色固体がシリカゲルクロマトグラフィーにより精製された。カラムをＣＨＣｌ3で洗浄した後、最終生成物（３）がＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ＝２：１を使用して溶離されて、白色固体を収率９３％で与えた。ｍ.ｐ.：６２〜６３℃；ＴＬＣ：Ｒf＝０.６０５（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）；（Ｃ49Ｈ76Ｎ2Ｏ14Ｐ）+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝947.5037，実測値 947.5021。ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）：3337, 2922, 2862, 1732, 1685, 1532, 1268, 1248, 1232, 1172, 1109, 1049, 970ｃｍ-1。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：1.25 [-(CH2)7-; 28H], 1.31 及び 1.37 [CH3-C-CH3; 6H], 1.47 [-CH2-CH2-COO-; 4H], 1.57 [-NH-CH2-CH2-; 4H], 2.27 [-CH2-COO-; 4H], 3.15 [-NH-CH2-; 4H], 3.87 [極性ヘッド -P-O-CH2-CH-, 2H], 3.78-4.00 [極性ヘッド -CH-CH2-; 2H], 3.99 [グリセロール -CH-CH2-O-P-, 2H], 4.16-4.41 [グリセロール -CH2-CH-, 2H], 4.27 [極性ヘッド -CH2-CH-CH2-, 1H], 4.86 [-OCO-NH-, 2H], 5.08 [C6H5-CH2-O-, 4H], 5.28 [グリセロール -CH2-CH-CH2-, 1H], 7.32 [C6H5-CH2-, 10H]。13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）, 173.68 (-COO-), 173.46 (-COO-), 156.45 (-OC-NH-), 136.72 (C6H5-CH2-), 128.51-128.07 (C6H5-), 109.40 (ソルケタール(solketal) ４級 C), 74.74 (極性ヘッド -CH-), 70.66 (グリセロール -CH-), 66.58 及び 66.45 (極性ヘッド -CH2-), 63.95 (グリセロール C3), 62.87 (グリセロール C1), 41.16, 34.26, 34.08, 29.99-29.12, 26.81 (-CBH2-), 26.78 (ソルケタール -CH3), 25.33 (ソルケタール -CH3), 24.84 (ω1 -CH2-)。31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）-2.51。
【０１４４】
１,２−ジ−Ｏ−（１２−アミノドデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−Ｏ−ホスホリル−（−）２,３−イソプロピリデン−ｓｎ−グリセロール（１１）：
調製されたばかりの化合物（１０）（３００ｍｇ，０.３６０ｍｍｏｌ）が５０ｍｌのＣＨ3ＯＨ中に溶解され、３０ｍｇの１０％Ｐｄ／Ｃがその攪拌溶液に加えられ、Ｈ2大気圧下室温で攪拌された。反応は、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＣＨ3ＯＨ：Ｈ2Ｏ＝６５：２５：４）によって追跡され、化合物（３）の消失後に反応が止められた。その混合液は、微細焼結ガラスロートを通して濾過されて、３×５０ｍｌのＣＨ3ＯＨで洗浄された。合わされたＣＨ3ＯＨ洗浄液が３５℃で減圧留去されて、最終生成物がＰ2Ｏ5で１２時間減圧乾燥された。ｍ.ｐ.４７〜４８℃；（Ｃ33Ｈ64Ｎ2Ｏ10Ｐ）+について計算されたＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝679,4301, 実測値 679.4293。ＦＴ−ＩＲ（ヌジョール）：3343, 2922, 2852, 1740, 1269, 1250, 1245, 1175, 1112, 1060, 945 ｃｍ-1。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ）：1.31 [-(CH2)7-; 28H], 1.29 及び 1.38 [CH3-C-CH3; 6H], 1.60 [-CH2-CH2-COO-; 4H], 1.65 [-NH-CH2-CH2-; 4H], 2.31 [-CH2-COO-; 4H], 2.91 [H2N-CH2-;4H], 3.90 [極性ヘッド -P-O-CH2-CH-, 2H], 3.79-4.08 [極性ヘッド -CH-CH2-; 2H], 4.02 [グリセロール -CH-CH2-0-P-, 2H], 4.18-4.39 [グリセロール -CH2-CH-, 2H], 4.28 [極性ヘッド -CH2-CH-CH2-, 1H], 5.21 [グリセロール -CH2-CH-CH2-, 1H]。13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）δ（ｐｐｍ），177.92 (-COO-), 177.58 (-COO-), 110.66 (ソルケタール４級C), 76.10 (極性ヘッド -CH-), 72.32 (グリセロール -CH-), 67.93 及び 67.27 (極性ヘッド -CH2-), 65.09 (グリセロール C3), 63.52 (グリセロール C1), 40.89, 34.95, 30.92-30.06, 28.57 (-CBH2-), 27.17 (ソルケタール -CH3), 25.62 (ソルケタール -CH3), 25.92 (ω1 -CH2-)。31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）0.69。
【０１４５】
実施例４  シリカ粒子の活性化
ZORBAX 300 RX-SIL ５μｍシリカ粒子（２０ｇ）が１００ｍｌのイソプロパノール中に懸濁されて、ＮＨ3を中和するために数滴のＨＣｌが加えられ、そして１０分間超音波処理された。次いで、そのシリカ懸濁液が中速で２４時間回転混合された。次いで、得られた多孔性シリカ懸濁液が２０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心分離された。上澄み液をデカンテーションした後、それら粒子は、２×１００ｍｌのイソプロパノールと２×１００ｍｌの Milli-Q 水で洗浄された。次いで、その多孔性シリカ粒子は、丸底フラスコに入れられ、そして１２０℃で２４時間乾燥された。あらゆる残存水が、高減圧下で１８０℃で加熱することによってそのシリカ粒子の表面から除去された。
【０１４６】
実施例５  ３−イソチオシアナトプロピルトリエトキシシラン（ＩＴＣＰＳ）でのシリカ粒子の修飾
脱水及び活性化されたシリカ粒子（１０.０ｇ）が、蒸留されたばかりの無水トルエン（１５０ｍｌ）中に懸濁され、ＩＴＣＰＳ（１.８７ｇ，８ｍｍｏｌ）がその懸濁液に減圧下で加えられ、その溶媒及びリガンドをその多孔性シリカ粒子の表面構造に浸透させた。１ｇ当たりのシリカ粒子に使用されたＩＴＣＰＳシランの量は、立体的考察に基づいて理論的に不動化され得る量の２倍である、８μｍｏｌ／ｍ2支持体表面のリガンド密度を達成するように計算された。少量のイミダゾール（約１％，ｗ／ｗ）が触媒として加えられ、次いで、その混合液は１０分間超音波処理された。次いで、その反応混合液は、無水条件下で２４時間加熱及び還流された。
【０１４７】
そのシリカ懸濁液が０.２２μｍナイロン膜で濾過されて、３×１００ｍｌのトルエンに続いて２×１００ｍｌのイソプロパノールと２×１００ｍｌの Milli-Q 水で洗浄された。このＩＴＣＰＳ修飾多孔性シリカ粒子は、４５℃で高真空下で２４時間乾燥され、使用まで無水シリカゲルと共に保管された。この修飾多孔性シリカ粒子のリガンド密度は、表１に纏めた、炭素、窒素及び水素の元素分析から計算された。
【０１４８】
【表１】
2006506216.tif 000023
【０１４９】
実施例６  シリカ支持体上へのω−アミノグリセロリン脂質の不動化
不動化可能なＰＡ、ＰＧ及びＰＣ誘導体が、修飾された粒子に、その−ＮＣＳ基を介して、両アシル鎖のω−末端の接近可能なフリーのアミノ基と共有結合された。各々のリン脂質誘導体（２.４ｍｍｏｌ）が、３０ｍｌのメタノール中のＩＴＣＰＳ−修飾シリカ（３.０ｇ）に加えられ、５分間超音波処理された。そのリン脂質−シリカ懸濁液は、室温での逆転振盪によって４８時間穏やかに攪拌された。次いで、そのシリカ粒子は、０.２２μｍのナイロン膜で減圧濾過されて、３×５０ｍｌのＣＨ3ＯＨで洗浄された。次いで、その最終脂質不動化シリカ粒子は、室温で減圧乾燥された。多孔性シリカ支持体上の不動化グリセロリン脂質のリガンド密度は、脂質マトリックスの炭素、水素及び窒素含量の元素分析から決定され、表１に纏められた。シリカ表面上に残存する未反応イソチオシアネート基を遮断するために、そのリン脂質不動化多孔性シリカは、同じ反応条件下でオクチルアミンと更に反応させられ、上記の通りリンス工程に付された。
【０１５０】
次いで、上記の不動化カラムクロマトグラフィー支持体は、多くの精製に使用された。使用された混合物及び使用されたクロマトグラフィー条件は、以下の通りである。
使用された混合液：
混合物１：リボヌクレアーゼＡ＋シトクロムＣ＋テルモリシン
混合物２：メリチン＋２１Ｑメリチン類似体（生物物理学研究のための論文で使用されたもの）
使用されたクロマトグラフィー条件：
緩衝液Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
緩衝液Ｂ：０.１％ＴＦＡ／６０％アセトニトリル
勾配：０〜１００％緩衝液Ｂを３０分間で
流速：１ｍｌ／分
検出：２１４ｎｍ。
【０１５１】
使用されたカラム：
ＰＣ：不動化ホスファチジルコリン
ＰＡ：不動化ホスファチジン酸
ＰＧ：不動化ホスファチジルグリセロール。
【０１５２】
実施例７
この実施例では、実施例１の不動化ホスファチジルコリンから作られたカラムが、リボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ及びテルモリシンの混合物を精製するために使用された。使用されたクロマトグラフィー条件は、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を使用してその混合物をクロマトグラフィー支持体上に充填してから、３０分かけて移動相が０.１％トリフルオロ酢酸から４０％の０.１％トリフルオロ酢酸と６０％のアセトニトリルへ変化するようにして、カラムから混合液を溶離させることであった。溶離速度は一定であった。クロマトグラフィーカラムの流速は１ｍｌ／分であり、使用した検出器は２１４ナノメーターの波長を有した。検出器の出力データを図４に示す。
【０１５３】
実施例８
この実施例では、実施例４の不動化ホスファチジルコリンから作られたカラムが、メリチン及び２１Ｑの混合物を精製するために使用された。これら物質の構造は次の通りである。
【０１５４】
【表２】
2006506216.tif 000024
【０１５５】
使用されたクロマトグラフィー条件は、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を使用してその混合物をクロマトグラフィー支持体上に充填してから、３０分かけて移動相が０.１％トリフルオロ酢酸から４０％の０.１％トリフルオロ酢酸と６０％のアセトニトリルへ変化するようにして、カラムから混合液を溶離させることであった。溶離速度は一定であった。クロマトグラフィーカラムの流速は１ｍｌ／分であり、使用した検出器は２１４ナノメーターの波長を有した。検出器の出力データを図５に示す。
【０１５６】
実施例９
この実施例では、実施例２の不動化ホスファチジン酸から作られたカラムが、リボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ及びテルモリシンの混合物を精製するために使用された。
【０１５７】
使用されたクロマトグラフィー条件は、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を使用してその混合物をクロマトグラフィー支持体上に充填してから、３０分かけて移動相が０.１％トリフルオロ酢酸から４０％の０.１％トリフルオロ酢酸と６０％のアセトニトリルへ変化するようにして、カラムから混合液を溶離させることであった。溶離速度は一定であった。クロマトグラフィーカラムの流速は１ｍｌ／分であり、使用した検出器は２１４ナノメーターの波長を有した。検出器の出力データを図６に示す。
【０１５８】
実施例１０
この実施例では、実施例２の不動化ホスファチジン酸から作られたカラムが、メリチン及び２１Ｑの混合物を精製するために使用された。これら物質の構造は次の通りである。
【０１５９】
【表３】
2006506216.tif 000025
【０１６０】
使用されたクロマトグラフィー条件は、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を使用してその混合物をクロマトグラフィー支持体上に充填してから、３０分かけて移動相が０.１％トリフルオロ酢酸から４０％の０.１％トリフルオロ酢酸と６０％のアセトニトリルへ変化するようにして、カラムから混合液を溶離させることであった。溶離速度は一定であった。クロマトグラフィーカラムの流速は１ｍｌ／分であり、使用した検出器は２１４ナノメーターの波長を有した。検出器の出力データを図７に示す。
【０１６１】
実施例１１
この実施例では、実施例３の不動化ホスファチジルグリセロールから作られたカラムが、リボヌクレアーゼＡ、シトクロムＣ及びテルモリシンの混合物を精製するために使用された。
【０１６２】
使用されたクロマトグラフィー条件は、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を使用してその混合物をクロマトグラフィー支持体上に充填してから、３０分かけて移動相が０.１％トリフルオロ酢酸から４０％の０.１％トリフルオロ酢酸と６０％のアセトニトリルへ変化するようにして、カラムから混合液を溶離させることであった。溶離速度は一定であった。クロマトグラフィーカラムの流速は１ｍｌ／分であり、使用した検出器は２１４ナノメーターの波長を有した。検出器の出力データを図８に示す。
【０１６３】
実施例１２
この実施例では、実施例３の不動化ホスファチジン酸から作られたカラムが、メリチン及び２１Ｑの混合物を精製するために使用された。これら物質の構造は次の通りである。
【０１６４】
【表４】
2006506216.tif 000026
【０１６５】
使用されたクロマトグラフィー条件は、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液を使用してその混合物をクロマトグラフィー支持体上に充填してから、３０分かけて移動相が０.１％トリフルオロ酢酸から４０％の０.１％トリフルオロ酢酸と６０％のアセトニトリルへ変化するようにして、カラムから混合液を溶離させることであった。溶離速度は一定であった。クロマトグラフィーカラムの流速は１ｍｌ／分であり、使用した検出器は２１４ナノメーターの波長を有した。検出器の出力データを図９に示す。
【０１６６】
最後に、本明細書に概略を示した本発明の精神から逸脱することなく、種々の他の修飾及び／又は変更が行われ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】本発明に使用するのに好ましいクロマトグラフィー支持体材料の１つ、即ち、ホスファチジルコリンキャップド支持体材料の構造を示す。
【図２】本発明に使用するのに好ましい第２のクロマトグラフィー支持体材料である、末端部分がホスファチジル酸である支持体の構造を示す。
【図３】本発明に使用するのに好ましいクロマトグラフィー支持体材料の更なるもの、即ち、不動化されたホスファチジルグリセロールを示す。
【図４】実施例７からのＨＰＬＣクロマトグラムの出力である。
【図５】実施例８からのＨＰＬＣクロマトグラムの出力である。
【図６】実施例９からのＨＰＬＣクロマトグラムの出力である。
【図７】実施例１０からのＨＰＬＣクロマトグラムの出力である。
【図８】実施例１１からのＨＰＬＣクロマトグラムの出力である。
【図９】実施例１２からのＨＰＬＣクロマトグラムの出力である。
【図１】
2006506216.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
2006506216.tif 000038
【図５】
2006506216.tif 000039
【図６】
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【図７】
2006506216.tif 000041
【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月25日(2004.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスが結合性材料と結合する能力に基づいて、異なる結合特性を有する他の化合物又は分子コンプレックスから分離する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化１】
2006506216.tif 000044
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合しており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分を、該結合性材料に結合するそれらの能力に基づいて分離すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、該結合性材料が、複数の末端部分を含んでなり、各々の末端部分が少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に連結している方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、前記末端部分の各々が２つのリンカーにより前記支持体に付いている方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.０ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.８ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項６】
請求項２の方法であって、該リンカーが、式：
【化２】
2006506216.tif 000045
［式中、Ｒ1及びＲ2は、請求項１で定義した通りである。］
のリンカーである方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つが、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成している方法。
【請求項８】
請求項２の方法であって、前記末端部分の各々が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から独立に選択される方法。
【請求項９】
請求項２の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される方法。
【請求項１０】
請求項２の方法であって、前記支持体が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ポリマー性樹脂、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項１１】
請求項２の方法であって、前記結合性材料が、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー材料であり、そして、前記接触が、該化合物又は分子コンプレックスを含有する前記サンプルを前記カラム上に充填することを包含する方法。
【請求項１２】
請求項１の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項１３】
請求項１の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項１４】
請求項１３の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項１５】
請求項１の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項１６】
化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプル中の前記化合物又は分子コンプレックスを検出する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させることを含んでなり、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化３】
2006506216.tif 000046
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより該支持体に付いている方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、該結合性材料が、複数の末端部分を含んでなり、各々の末端部分が少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に連結している方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が２つのリンカーにより前記支持体に付いている方法。
【請求項１９】
請求項１７の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.０ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.８ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項２１】
請求項１７の方法であって、該リンカーが、式：
【化４】
2006506216.tif 000047
［式中、Ｒ1及びＲ2は、請求項１で定義した通りである。］
のリンカーである方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法であって、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つが、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成している方法。
【請求項２３】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から独立に選択される方法。
【請求項２４】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される方法。
【請求項２５】
請求項１７の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルコリンからなる群から独立に選択される方法。
【請求項２６】
請求項１７の方法であって、前記支持体が固体支持体のアレイである方法。
【請求項２７】
請求項１６の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項２８】
請求項１６の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項２９】
請求項２８の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項３０】
請求項１６の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項３１】
請求項１６の方法であって、該接触された結合性材料を処理して、該化合物又は分子コンプレックスの存在を測定することを更に含んでなる方法。
【請求項３２】
請求項３１の方法であって、前記処理が、前記化合物又は分子コンプレックスに選択的に結合するタグ付き化合物での処理を含んでなる方法。
【請求項３３】
請求項３２の方法であって、前記結合性材料を前記タグ付き化合物の存在について試験することを更に含んでなり、前記タグ付き化合物の該存在が、前記化合物又は分子コンプレックスの存在の指標となる方法。
【請求項３４】
請求項３２の方法であって、前記タグが、放射性タグ、蛍光性タグ又は化学発光性タグである方法。
【請求項３５】
化合物又は分子コンプレックスの純度を、前記化合物又は分子コンプレックスを含有する純粋でないサンプルから増加させる方法であって：
（ａ）前記サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化５】
2006506216.tif 000048
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該化合物又は分子コンプレックスを、該サンプル中の他の成分の少なくとも一部から分離すること；
（ｃ）該化合物又は分子コンプレックスの少なくとも一部を回収すること
を含んでなる方法。
【請求項３６】
請求項３５の方法であって、該結合性材料が、複数の末端部分を含んでなり、各々の末端部分が少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に連結している方法。
【請求項３７】
請求項３６の方法であって、前記末端部分の各々が２つのリンカーにより前記支持体に付いている方法。
【請求項３８】
請求項３６の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.０ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法であって、前記支持体上の前記リンカーの密度が１.８ミリモル／ｍ2より大きい方法。
【請求項４０】
請求項３５の方法であって、該リンカーが、式：
【化６】
2006506216.tif 000049
［式中、Ｒ1及びＲ2は、請求項１で定義した通りである。］
のリンカーである方法。
【請求項４１】
請求項４０の方法であって、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つが、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成している方法。
【請求項４２】
請求項３５の方法であって、前記末端部分の各々が、レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から独立に選択される方法。
【請求項４３】
請求項３５の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−メチルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジルグリセロール又はそれらの誘導体からなる群から独立に選択される方法。
【請求項４４】
請求項３５の方法であって、前記末端部分の各々が、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジルコリンからなる群から独立に選択される方法。
【請求項４５】
請求項３５の方法であって、前記支持体が、シリカ、アルミナ、チタニア、ジルコニア、ポリマー性樹脂、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項４６】
請求項３５の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項４７】
請求項３５の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項４９】
請求項３５の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項５０】
請求項３５の方法であって、前記結合性材料が、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー材料であり、そして、前記工程（ｂ）が、該カラムを移動相で溶離した後に溶離画分を集めることを含んでなる方法。
【請求項５１】
請求項５０の方法であって、前記溶離が溶剤勾配の使用を包含する方法。
【請求項５２】
請求項５０の方法であって、前記移動相が、水、炭化水素類、エステル類、アルキルエステル類、ニトリル類、アルコール類、酸類、酸類の水溶液、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項５３】
請求項５２の方法であって、前記移動相が、水、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、メタノール、及びトリフルオロ酢酸の水溶液からなる群から選択される方法。
【請求項５４】
請求項５０の方法であって、前記回収が、同じ成分を含有する溶離画分を合せた後に該移動相を除去して精製された該化合物又は分子コンプレックスをもたらすことを含んでなる方法。
【請求項５５】
請求項３５の方法であって、前記工程（ｂ）が、該接触された結合性材料を洗浄して未結合材料を除去することを含んでなる方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法であって、前記工程（ｃ）が、該接触された結合性材料を処理して結合材料を取り外すことを含んでなる方法。
【請求項５７】
請求項３５の方法であって、該方法に付した後に、該回収された化合物又は分子コンプレックスが少なくとも８０％の純度を有する方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法であって、該方法に付した後に、該回収された化合物又は分子コンプレックスが少なくとも９０％の純度を有する方法。
【請求項５９】
請求項３５の方法であって、該化合物又は分子コンプレックスが実質的に純粋な形で回収される方法。
【請求項６０】
複数の化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの分析方法であって：
（ａ）該サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) 少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化７】
2006506216.tif 000050
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分の少なくとも一部を分離すること；
（ｃ）該分離された成分を分析すること
を含んでなる方法。
【請求項６１】
請求項６０の方法であって、前記結合性材料が、クロマトグラフィーカラム内に充填されたクロマトグラフィー支持体材料であり、そして、前記工程（ｂ）が、該カラムを移動相で溶離することを含んでなる方法。
【請求項６２】
請求項６１の方法であって、前記溶離が溶剤勾配の使用を包含する方法。
【請求項６３】
請求項６１の方法であって、前記移動相が、水、炭化水素類、エステル類、アルキルエステル類、ニトリル類、アルコール類、酸類、酸類の水溶液、及びそれらの混合物からなる群から選択される方法。
【請求項６４】
請求項６３の方法であって、前記移動相が、水、酢酸エチル、アセトニトリル、エタノール、メタノール、及びトリフルオロ酢酸の水溶液からなる群から選択される方法。
【請求項６５】
請求項６１の方法であって、該溶離の画分が集められてから工程（ｃ）で分析される方法。
【請求項６６】
請求項６５の方法であって、前記分析が、分光光度法又は質量スペクトル法を使用して行われる方法。
【請求項６７】
請求項６０の方法であって、前記サンプルが、細胞又はウイルスホモジェネートから誘導される方法。
【請求項６８】
請求項６０の方法であって、前記サンプルが、タンパク質、ペプチド、又はそれらのコンプレックスを含有する方法。
【請求項６９】
請求項６８の方法であって、該タンパク質が膜タンパク質である方法。
【請求項７０】
請求項６０の方法であって、前記分子コンプレックスがタンパク質コンプレックスである方法。
【請求項７１】
請求項６０の方法であって、前記工程（ｂ）が、該接触された結合性材料を洗浄して未結合材料を除去することを含んでなる方法。
【請求項７２】
請求項７１の方法であって、前記工程（ｃ）が、該接触された結合性材料を処理して該結合材料を取り出し、そうして得られた該材料を分析に付することを含んでなる方法。
【請求項７３】
請求項７２の方法であって、前記取り出された結合材料が、分光光度法又は質量スペクトル法を使用する分析に付される方法。
【請求項７４】
化合物又は分子コンプレックスを、該化合物又は分子コンプレックスが結合性材料と結合する能力に基づいて、異なる結合特性を有する化合物又は分子コンプレックスから分離する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から選択される少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化８】
2006506216.tif 000051
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合しており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該サンプルの成分を、該結合性材料に結合するそれらの能力に基づいて分離すること、
を含んでなる方法。
【請求項７５】
化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプル中の前記化合物又は分子コンプレックスを検出する方法であって：
（ａ）前記化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルを結合性材料と接触させることを含んでなり、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から選択される少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化９】
2006506216.tif 000052
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2は、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、該末端部分は、少なくとも１つのリンカーを介して該支持体に結合している方法。
【請求項７６】
化合物又は分子コンプレックスの純度を、前記化合物又は分子コンプレックスを含有する純粋でないサンプルから増加させる方法であって：
（ａ）前記サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から選択される少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化１０】
2006506216.tif 000053
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を処理して、該化合物又は分子コンプレックスを、該サンプル中の他の成分の少なくとも一部から分離すること；
（ｃ）該化合物又は分子コンプレックスの少なくとも一部を回収すること
を含んでなる方法。
【請求項７７】
複数の化合物又は分子コンプレックスを含有するサンプルの分析方法であって：
（ａ）該サンプルを結合性材料と接触させること、ここで、該結合性材料は、
(i)  支持体、
(ii) レシチン類、リゾレシチン類、セファリン類、スフィンゴミエリン類、カルジオリピン類、糖脂質、ガングリオシド類、セレブロシド類、及びリン脂質からなる群から選択される少なくとも１つの末端部分、及び
(iii)  少なくとも１つのリンカーであって、式：
【化１１】
2006506216.tif 000054
［式中、Ｒ1及びＲ2は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ6アルケニルオキシ及びアリールオキシからなる群から独立に選択されるか、又は、Ｒ1又はＲ2の少なくとも１つは、別の隣接するリンカー上のＲ1又はＲ2と一緒になって、式−Ｏ−の基を形成し、この際、前記−Ｏ−基は、該リンカーのケイ素原子を該隣接するリンカーのケイ素原子へ繋いでおり、
Ｒ3及びＲ4は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル及びハロゲンからなる群から独立に選択され、
Ｒ5は、Ｈ又はＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ6アルケニル、アリール及びヘテロアリールであり、
Ｘは、Ｏ又はＳであり、
ｎは、０〜１０の整数である。］
のリンカー
を含んでなり、前記末端部分は、少なくとも１つのリンカーにより前記支持体に付いており；
（ｂ）該サンプルの成分を分離すること；
（ｃ）該分離された成分を分析すること
を含んでなる方法。
【国際調査報告】
2006506216.tif 000055
2006506216.tif 000056
2006506216.tif 000057