(57)【要約】ヒトＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１ポリペプチド、およびこうしたポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を開示する。開示するポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する、改変された抗体と天然の抗体の両方を産生するのに特に有用である。また、本発明の抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含む薬剤組成物およびワクチンを開示する。また、前記ポリペプチドに対するリガンド、アンタゴニスト、およびアゴニストを同定するための、こうしたポリペプチドを利用する方法を開示する。最後に、腫瘍性疾患の治療、診断、および／または予後のための、上述の組成物を含む方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のどちらかと結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号２に示す通りのアミノ酸２１から７１８の間、配列番号８に示す通りのアミノ酸２１から７３４の間、配列番号２２〜２７に示す通りのアミノ酸配列のＩＧＳＦ９と結合するか、または配列番号２９に示す通りの、アミノ酸２８から３１７、３７３から４１７、６７４から６７８または７４２から７４９間でＬＩＶ−１と結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体または抗原結合フラグメントはドメイン欠損抗体を含む、請求項２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項３に記載のドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記細胞傷害性薬剤は、放射性核種である、請求項４に記載のドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体は、ヒト化されている、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体は、霊長類化されている、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで該抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する、１つまたは複数の機能を妨げる、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項１０】
１種または複数の二官能性キレート剤に共有結合的に連結させたドメイン欠損抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、腫瘍性疾患の治療のための組成物。
【請求項１１】
前記二官能性キレート剤は、ＭＸ−ＤＴＰＡおよびＣＨＸ−ＤＴＰＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する治療上有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを投与するステップを包含する、腫瘍性疾患を呈している哺乳類を治療する方法。
【請求項１３】
前記哺乳類に治療上有効量の少なくとも１種の化学療法剤を投与するステップをさらに包含し、ここで該化学療法剤および前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意の順序で、あるいは並行して投与できる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体あるいはその抗原結合フラグメントは、ドメイン欠損抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＨ２ドメインを欠いている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬剤と結合されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記化学療法剤の２週間以内に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドあるいはそのフラグメントおよび生理的に許容される担体を含む、癌を治療するためのワクチン。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、配列番号２に示す通りのＩＧＳＦ９のアミノ酸１から１１６３もしくはアミノ酸２１から７１８、または配列番号２９に示す通りのＬＩＶ−１のアミノ酸１から７４９、アミノ酸２８から３１７、もしくはアミノ酸３７３から４１７を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記生理的に許容される担体は、アジュバントまたは免疫賦活剤を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記アジュバントはＰＲＯＶＡＸ（商標）である、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ポリペプチドは、ヘルパーＴペプチドに融合される、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記患者に請求項１９に記載のワクチンを投与することを包含する、癌の治療または予防を必要とする患者において、免疫応答を誘発する方法。
【請求項２５】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの過剰発現を検出することによって癌を診断する方法であって、
ｅ．癌の診断を必要とする個体からサンプルを得ること；
ｆ．該サンプルにおいて、ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること；
ｇ．正常な個体からの対照サンプルまたは診断される個体からの正常組織に由来するＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること；および
ｈ．ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１の発現レベルを、対照サンプルにおいて得られるものと比較し、その比較の結果が癌の診断となること、
を含む方法。
【請求項２６】
前記ＩＧＳＦ９フラグメントは、エキソン５〜１０を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記過剰発現は、核酸増幅またはハイブリダイゼーションにより検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記過剰発現が、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する抗体、あるいはその抗原結合フラグメントを使用して検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
癌治療を受けている個体の予後を判定する方法であって、
ｅ．癌治療の予後を必要とする該個体からサンプルを得ること；
ｆ．該サンプルにおけるＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１、あるいはそのフラグメントの発現を検出すること；
ｇ．正常な個体からの対照サンプルまたは診断される個体からの正常組織に由来するＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１、あるいはそのフラグメントの発現を検出すること、および；
ｈ．ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１の発現レベルを、対照サンプルにおいて得られるものと比較し、その比較の結果が癌の予後となること、
を含む方法。
【請求項３０】
前記ＩＧＳＦ９フラグメントは、エキソン５〜１０を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
免疫学的にＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１抗原あるいはそのフラグメントに似ている抗イディオタイプ抗体を活性成分として含む、ワクチン。
【請求項３２】
癌を治療または発見するのに使用するための、請求項９に記載の組成物を説明書と共に含む、キット。
【請求項３３】
腫瘍細胞がＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１抗原を発現している哺乳類において、腫瘍性疾患を治療する方法であって、薬学的に有効な量のＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を前記哺乳類に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
薬学的に許容される担体と、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を含む、抗腫瘍免疫応答を誘発するのに有効な量の免疫原性調製物とを含むワクチンであって、該免疫原性調製物は抗腫瘍免疫応答を誘発可能である、ワクチン。
【請求項３５】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の少なくとも８ヌクレオチドの部分を含む、長さが最高５０ヌクレオチド長までの、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現を妨げる、アンチセンス核酸。
【請求項３６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変されたインターヌクレオチド結合を含む請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
細胞または組織において、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現を妨げる方法であって、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現が妨げられるように、請求項３４に記載の核酸と、該細胞または組織を接触させることを包含する、方法。
【請求項３８】
配列番号３；
配列番号５；
配列番号１２；
配列番号１３；
配列番号１４；
配列番号１５；
配列番号１６；
配列番号１７；
配列番号１８；
配列番号１９；
配列番号２０；および
配列番号２１
からなる群から選択される、単離された核酸。
【請求項３９】
請求項３８の核酸を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項３８の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項４１】
配列番号４；
配列番号６；
配列番号２２；
配列番号２３；
配列番号２４；
配列番号２５；
配列番号２６；および
配列番号２７
からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４３】
請求項４１に記載のポリペプチドと生理的に許容される担体とを含む、癌を治療するためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の技術分野）
本発明は、ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１の組成物、特に抗体および抗原結合フラグメントに関し、また、腫瘍疾患の発見および治療のために前記組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
癌は、米国における２番目に大きな死因であり、全死亡者数の５分の１以上を占める。癌細胞は、２つの遺伝的特性により定義される：癌細胞およびその後代細胞は、（１）通常の抑制を無視して複製する、かつ（２）他の細胞のために通常確保される領域に侵入してコロニーを作る。癌細胞の無統制な増殖により、腫瘍または新生物が生じる。
【０００３】
癌細胞によって通常の細胞産物のうちの独特の成分が発現されることは、腫瘍免疫学の根拠となる基本的な仮定である。悪性形質転換が、哺乳類の細胞表面上の抗原性の変化に関連するという概念をはっきりと支持する、重要かつ説得力のある徴候が、現在存在する（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．，  Ａｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０：３２３−３７７（１９８７）。ヒト腫瘍細胞上で少なくとも発現の増大を示すと思われる大きい群の細胞表面抗原を定義するために、様々な血清学的戦略が利用されている（Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４１：３６１−３７５（１９８１）；  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｓ  Ａ（ｅｄ．）Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９８０）。こうした２つの抗原は、ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１である。
【０００４】
免疫グロブリン様ドメインの存在によって特徴づけられる免疫グロブリンタンパク質スーパーファミリーのメンバーは、同種親和性結合と異好性結合の両方を仲介する。（Ｄｏｕｄｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７９：６６３−６７０（２００２））。免疫グロブリンタンパク質は、細胞外のリガンドと細胞内のセカンドメッセンジャーカスケードとの間の信号伝達をしばしば仲介する。このように、多くの免疫グロブリンタンパク質は、細胞内の環境と相互作用する膜貫通領域および細胞質のカルボキシ末端配列を有する。例えば、細胞質受容体チロシンキナーゼまたはホスファターゼドメインをもつ免疫グロブリンタンパク質は、その酵素活性によって直接、その細胞内シグナリング効果を発揮するが、他のものは、細胞内のキナーゼと結合し、これを活性化することによって、作用する。免疫グロブリンリガンド結合によるｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼの活性化は、細胞の細胞骨格の動力学に対する影響をもたらし、胚発生の形態形成運動に関連する細胞接着と細胞形状変化との間の重要な関連を提供する。
【０００５】
ＩＧＳＦ９（免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー９）は、マウスＬｐ遺伝子を単離するためのポジショナルクローニング作業中に同定された、免疫グロブリンスーパーファミリーのＮＣＡＭサブクラスの新規のメンバーである。（Ｄｏｕｄｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７９：６６３−６７０（２００２））。ＩＧＳＦ９の相同体は、神経の発達に関与する、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）からのタンパク質Ｔｕｒｔｌｅである。さらに、ＩＧＳＦ９は、ヒト腫瘍の形成および侵襲性に関与するものの重要な候補に相当する可能性がある。染色体１ｑ２２〜ｑ２３領域の重複を伴う腫瘍は、しばしば観察され、さらに、免疫グロブリンタンパク質の発現の上方制御は、ヒト腫瘍内の一般的な所見であり、細胞機能の調節不全および新生物の侵襲性に寄与する可能性がある。
【０００６】
ＬＩＶ−１は、転移性乳癌に関連するエストロゲン調節性遺伝子である。ＬＩＶ−１構造の研究では、これが、Ｚｎ２＋イオンを結合および／または輸送する潜在能力をもつヒスチジンリッチプロテインであることが明らかになっている。Ｚｎ２＋は、細胞に必須でありかつ細胞に対して有毒であるので、生体膜全体に能動輸送され、その取り込みおよび排出はしっかりと調節される。（Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  ４９：２４９−２５３（２０００））。
【０００７】
ＬＩＶ−１は、唯一の既知のホルモン調節性Ｚｎ２＋結合タンパク質である。他のＺｎ２＋結合タンパク質が、転移性癌において役割を持つかどうかということは、まだ明らかにされていない。しかし、組織アレイにおけるある種のＺｎ２＋結合タンパク質は、細胞死およびニューロン性疾患と関連があった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は一般に、特に、癌の発見および治療に使用できる組成物に関し、また、癌の発見および治療のための方法を提供する。
【０００９】
下で提供される実験結果は、ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１が、様々な腫瘍細胞内で差別的に発現されることを証明する。この差別的な発現により、ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１が、乳、大腸、卵巣、肺および前立腺癌を含めた様々な新生物の発見および治療のための標的として作用することが可能になる。
【００１０】
本発明は、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１または前記タンパク質のフラグメントのいずれかと結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。より詳細には、その単離された抗体または抗原結合フラグメントは、図１Ｂ（配列番号２）に示す通りのアミノ酸２１〜７１８の間、配列番号８のアミノ酸２１〜７３４の間、配列番号２２〜２７に示す通りのアミノ酸で、ＩＧＳＦ９と、あるいは、図２２Ｂ（配列番号２９）に示す通りのアミノ酸２８〜３１７、３７３〜４１７、６７４〜６７８、または７４２〜７４９間で、ＬＩＶ−１と結合することができる。
【００１１】
本発明はまた、単離された抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体または抗原結合フラグメント（ただし、前記抗体または抗原結合フラグメントは、ドメイン欠損抗体を含む）を対象とする。ドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞毒性の薬剤をさらに含むことができる。好ましい実施形態では、細胞毒性の薬剤は、放射性核種である。
【００１２】
本発明の抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体あるいは抗原結合フラグメントはまた、ヒト化あるいは霊長類化させることができる。
【００１３】
本発明はまた、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する抗体あるいはその抗原フラグメント（ただし前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に関連する１つまたは複数の機能を阻害する）を対象とする。
【００１４】
本発明はさらに、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する抗体あるいはその抗原結合フラグメントを含む組成物に関する。
【００１５】
好ましい実施形態では、腫瘍性疾患を治療する方法は、１種または複数の二官能性キレート剤に共有結合的に連結する、ドメイン欠損抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体あるいはその抗原結合フラグメントを含む。二官能性キレート剤は、ＭＸ−ＤＴＰＡおよびＣＨＸ−ＤＴＰＡからなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、腫瘍性疾患を呈している哺乳類を治療する方法であって、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する治療上有効量の抗体あるいはその抗原結合フラグメントを投与するステップを含む方法を対象とする。前記方法は、前記哺乳類に治療上有効量の少なくとも１種の化学療法剤を投与することをさらに含むことができる。ただし、前記化学療法剤および前記抗体あるいはその抗原結合フラグメントは、任意の順序で投与することもできるし、同時に投与することもできる。好ましい実施形態では、抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体あるいは抗原結合フラグメントが、治療を必要とする哺乳類に投与される。抗ＩＧＳＦ９および抗ＬＩＶ−１抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＨ２ドメインを欠くように改変できる、かつ／またはヒト化させる、かつ、細胞毒性の薬剤をさらに含むことができる。
【００１７】
本発明はさらに、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドあるいはそのフラグメントおよび生理的に許容される担体を含む、癌を治療するためのワクチンに関する。好ましい実施形態では、抗癌ワクチンは、図１Ｂ（配列番号２）に示す通りの、ＩＧＳＦ９のアミノ酸１〜１１６３またはアミノ酸２１〜７１８、あるいは図２２Ｂ（配列番号２９）に示す通りの、ＬＩＶ−１のアミノ酸１〜７４９、アミノ酸２８〜３１７、またはアミノ酸３７３〜４１７を含む。ワクチンは、ヘルパーＴペプチドと融合させたＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ペプチドをさらに含むことができる。さらに、ワクチンは、アジュバントまたは免疫賦活剤などの生理的に許容される担体をさらに含むことができる。より好ましい実施形態では、ワクチンは、アジュバントＰＲＯＶＡＸ（商標）をさらに含む。本発明はさらに、前記ワクチンを使用して、癌の治療または予防を必要とする患者において免疫応答を誘発する方法に関する。
【００１８】
本発明はまた、以下を含む、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの過剰発現を検出する方法を対象とする：
ａ．癌の診断が必要な人からサンプルを得ること、
ｂ．前記サンプル内のＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること、
ｃ．健康な人からの対照サンプル、または診断される人からの正常組織内の、ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること、および
ｄ．ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１の発現レベルを、対照サンプルにおいて得られるものと比較すること（ただし、前記比較は、結果的に癌の診断となる）。
【００１９】
本発明の一実施形態では、過剰発現は、核酸増幅、ハイブリダイゼーションによって、あるいはＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはその抗原結合フラグメントに対する抗体を使用することによって検出される。別の実施形態では、ＩＧＳＦ９フラグメントは、エキソン５〜１０を含む。
【００２０】
本発明はまた、以下を含む、癌治療を受けている人の予後を判定するための方法に関する：
ａ．癌治療の予後が必要な前記の人からサンプルを得ること、
ｂ．前記サンプル内のＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること、
ｃ．健康な人からの対照サンプル、または診断される人からの正常組織内の、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１またはそのフラグメントの発現を検出すること、および
ｄ．ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１の発現レベルを、対照サンプルにおいて得られるものと比較すること（ただし、前記比較は、結果的に癌の予後となる）。
【００２１】
一実施形態では、ＩＧＳＦ９フラグメントは、エキソン５〜１０を含む。
【００２２】
本発明はまた、活性成分として、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１抗原あるいはそのフラグメントに、免疫学的に似ている抗イディオタイプ抗体を含むワクチンに関する。
【００２３】
本発明はまた、癌を治療または発見するのに使用するための、本明細書に記載される様々なポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、および抗原結合フラグメントを、説明書と共に含むキットに関する。
【００２４】
本発明はまた、腫瘍細胞がＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１抗原を発現している哺乳類において、腫瘍性疾患を治療する方法であって、前記哺乳類に、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはその抗原結合フラグメントに対する薬学的に有効な量の抗体を含む組成物を投与することを含む方法にも関する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される担体と、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を含む、抗腫瘍免疫応答を誘発する有効な量の免疫原性の調製物とを含むワクチンが、抗腫瘍免疫応答を誘発するために使用される。
【００２５】
本発明はまた、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現を阻害する、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の少なくとも８ヌクレオチド部分を含む、最高５０ヌクレオチドの長さのアンチセンス核酸に関する。本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも１種の改変されたインターヌクレオチド結合を含むことができる。さらに、本発明は、細胞または組織におけるＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現を阻害する方法であって、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現が阻害されるように、前記アンチセンス核酸と前記細胞または組織を接触させることを含む方法に関する。
【００２６】
本発明はさらに、様々な形のＩＧＳＦ９（配列番号１、７、および１２〜２１）を含む、単離された核酸に関する。本発明はまた、配列番号１、７、および１２〜１５を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、配列番号２、８、および２２〜２７を含む単離されたポリペプチドおよび組成物に関する。本発明は、上で述べた通りの配列番号２、８、および２２〜２７のポリペプチドと、生理的に許容される担体とを含むワクチンにも関する。
【００２７】
本発明はさらに、ショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇ（配列番号３）を含む単離された核酸に関する。本発明はまた、配列番号３を含むベクターおよび宿主細胞に関する。本発明はさらに、配列番号４のポリペプチドを含む、単離されたポリペプチドおよび組成物に関する。本発明はさらに、上で述べた通りの、配列番号４のポリペプチドと、生理的に許容される担体とを含む、癌を治療するためのワクチンに関する。
【００２８】
本発明はさらに、ロングフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇ（配列番号５）を含む単離された核酸に関する。本発明はまた、配列番号５を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
本発明はさらに、配列番号６のポリペプチドを含む組成物に関する。本発明はさらに、上で述べた通りの、配列番号６のポリペプチドと、生理的に許容される担体とを含む、癌を治療するためのワクチンに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１遺伝子が腫瘍細胞、特に乳房、卵巣、大腸、肺、および前立腺の新生物と、正常細胞との間で差別的に発現されることは、本発明の発見である。これらの遺伝子の過剰発現は、癌のマーカーとして使用できる。この知識を利用して、遺伝子とそれらの発現産物の両方に対して特異的な診断および治療用試薬、特に抗体およびその抗原結合フラグメントを作ることができる。この知識はまた、癌患者、特に乳房、卵巣、大腸、肺、または前立腺癌を患う患者のための適当な治療レジメンの提供に役立つこととなる診断および治療方法に使用することもできる。
【００３０】
（本発明の抗体）
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１から得られるペプチドは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を増加させるために使用できる。本発明は、腫瘍細胞に関連する抗原と免疫反応性である抗体または抗原結合フラグメントが、癌患者に対する治療プロトコルに使用される場合に、これを改変または変更して、生化学特性を強化し、有効性を改善することができるという事実に、少なくともある程度基づいている。望ましくは、改変された抗体は、放射性核種または抗悪性腫瘍薬などの細胞傷害性薬剤と結合されることとなる。
【００３１】
用語「抗体」は、本明細書では、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分を指す。こうした抗体には、ポリクローナルの、モノクローナルの、キメラの、単鎖の、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦａｂ’２フラグメント、ＦｖおよびＦａｂ発現ライブラリが含まれるが、これに限定されるものではない。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤ（これらは、その分子に存在する重鎖の性質によって、互いに異なる）のいずれかに関係がある。ある種のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびその他などのサブクラスも有する。さらに、ヒトでは、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に関するここでの参考文献には、こうしたすべてのクラス、サブクラス、およびタイプの抗体種に関する参考文献が含まれる。
【００３２】
抗体のフラグメントが、抗原と結合する機能を果たすことができることが示されている。本明細書では「抗原結合フラグメント」には、以下が含まれるが、これに限定されるものではない：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡＢフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ｖｉｉ）単鎖のＦｖ分子（ｓｃＦｖ）（ただし、ＶＨドメインとＶＬドメインは、抗原結合部位を形成するために２つのドメインを結びつけることを可能にするペプチドリンカーにより連結されている）（Ｂｉｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８），  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、（ｖｉｉｉ）二重特異性の単鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された二重特異性抗体、多価または多重特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４；  Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））。
【００３３】
本発明の単離されたポリペプチドは、抗原、あるいはその一部分またはフラグメントとして働くことを意図することができ、さらに、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製ための標準の技術を用いて、免疫特異的に抗原と結合する抗体を生成するために使用することができる。全長タンパク質を使用することができる。あるいは、本発明は免疫原として使用するためのＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、図１Ｂ、９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、２１Ｂ、または２２Ｂ（配列番号２、４、６、８、２２〜２７、または２９）に示されるアミノ酸配列など、全長ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６つのアミノ酸残基を含み、このペプチドに対して増加された抗体が、全長タンパク質との、あるいはそのエピトープを含有する任意のフラグメントとの特異的な免疫複合体を形成するように、そのエピトープを含む。望ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０のアミノ酸残基、または少なくとも１５のアミノ酸残基、または少なくとも２０のアミノ酸残基、または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。
【００３４】
本発明のある種の実施形態では、抗原性ペプチドに包含される少なくとも１種のエピトープは、タンパク質（例えば親水性領域）の表面に位置するＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の領域である。ヒトＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１タンパク質配列（図１Ｂおよび２２Ｂ）の疎水度分析により、これらのタンパク質のどの領域が特に親水性であるかが示され、それによって、標的抗体産生のための有用な表層残基をコード化できる可能性がある（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２（１９８２））。したがって、抗原ペプチドに包含される好ましいエピトープは、その表面に位置するＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１の領域、例えば、ＩＧＳＦ９の約２１アミノ酸から約７１８アミノ酸まで（図１Ｂ）、ＩＧＳＦ９の約２１アミノ酸から約７３４アミノ酸まで（図９Ｆ）、図２１Ｂに示す通りのアミノ酸配列、あるいは、ＬＩＶ−１の、約２８アミノ酸から約３１７アミノ酸まで、約３７３アミノ酸から約４１７アミノ酸まで、約６７４アミノ酸から約６７８アミノ酸まで、または約７４２アミノ酸から約７４９アミノ酸まで（図２２Ｂ）（配列番号２、４、６、８、２２〜２７、または２９）などである。
【００３５】
ポリクローナル抗体の産生ために、様々な適切な宿主動物（例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類）を、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ペプチド、合成の変異体、誘導体、またはそれらのフラグメントを用いる１回または複数回の注射によって免疫することができる。適当な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質に相当する化学的に合成されたポリペプチド、または免疫原性タンパク質の組換えにより発現されたポリペプチド、あるいはそれらのフラグメントを含有できる。さらに、このタンパク質は、免疫されている哺乳類において免疫原性であることが分かっている第２のタンパク質に結合させることができる。こうした免疫原性タンパク質の例には、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが含まれるが、これに限定されるものではない。この調製物は、アジュバントをさらに含むことができる。免疫応答を増大するために使用される様々なアジュバントには、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば水酸化アルミニウム）、ＭＰＬ−ＴＤＭ（モノホスホリルリピドＡ−合成トレハロースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））、およびＰＲＯＶＡＸ（商標）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を対象とするポリクローナル抗体は、免疫された哺乳類から単離し、さらに、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの当分野でよく知られた技術を使用して精製することができる。
【００３７】
得られた抗体を、哺乳類の血清から採取して、ポリクローナル調製物を提供できるが、脾臓、リンパ節、または末梢血からそれぞれのリンパ球を単離して、モノクローナル抗体の同種の調製物を提供することが、しばしば望ましい。望ましくは、リンパ球は、脾臓から得られる。
【００３８】
「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）は、本明細書では、独特の軽鎖遺伝子産物および独特の重鎖遺伝子産物からなる１つの分子種のみの抗体分子を含有する抗体分子の集団を指す。特に、ＭＡｂの相補性決定領域は、集団のすべての分子において、同一である。したがって、ＭＡｂは、それに対する独特の結合能によって特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を含有する。
【００３９】
このよく知られたプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）では、抗原を注入されていた哺乳類から得られる比較的に短命な、あるいは失活した（ｍｏｒｔａｌ）リンパ球を、不滅の腫瘍株（例えば骨髄腫細胞系）と融合させることによって、不滅であり、かつＢ細胞の遺伝的にコード化された抗体をもたらす能力がある、ハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」がもたらされる。得られたハイブリッドを、単一の抗体の形成ための特異的な遺伝子を含む個々の株を用いて、選択、希釈、および再増殖によって、単一の遺伝子の株に分離する。
【００４０】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、融合されていない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１種または複数の物質を好ましくは含有する適切な培地に接種し、増殖させる。当分野の技術者であれば、ハイブリドーマの形成、選択、および増殖ための試薬、細胞系、および培地が、多くの供給者から市販品として入手できること、また、標準化されたプロトコルが確立されていることを理解するであろう。通常、ハイブリドーマ細胞が増殖している培地は、所望の抗原に対するＭＡｂの産生のためにアッセイされる。望ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析により決定される。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを、限界希釈手順によって、サブクローニングし、標準の方法によって、増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  ｐｐ  ５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６））。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体を、例えばプロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の精製手順によって、培地、腹水液、または血清から分離できることがさらに理解されるであろう。
【００４１】
本明細書では、用語「改変された抗体」は、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のいずれかと免疫反応性である任意の抗体または抗原結合フラグメントあるいはそれらの組換え体を意味するものとする。ただし、ほぼ同じ結合特異性の完全な、変更されていない抗体と比較した場合の腫瘍局在の増大または血清半減期の低下などの所望の生化学特性を提供するために、１つまたは複数の定常領域ドメインの少なくとも一部分は、欠損している、あるいは変更されている。好ましい実施形態では、本発明の改変された抗体は、定常ドメインのうちの一つの少なくとも一部分が欠損されている。この開示の目的では、こうした構築物を、「ドメイン欠損」と称するものとする。好ましくは、改変された抗体の定常領域のあるドメイン全体が欠損させられ、さらに好ましくは、ＣＨ２ドメイン全体が欠損させられる。さらに詳細に後述する通り、各々の所望の変異体は、よく知られた技術を使用して、完全な前駆体または親抗体から容易に作成または建築できる。
【００４２】
当分野の技術者であれば、本発明の化合物、組成物、および方法が、本発明のポリペプチドを呈するいかなる腫瘍性疾患、腫瘍、または悪性腫瘍を治療するのにも有用であることを理解するであろう。上で示した通り、本発明の改変された抗体は、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のどちらかと免疫反応性である。すなわち、開示する改変された抗体の抗原結合部分（すなわち可変領域または免疫反応性フラグメントあるいはそれらの組換え体）は、悪性腫瘍の部位でＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のどちらかに結合する。さらに一般的にいえば、本発明に有用な改変された抗体は、（文献内の先に報告されたものを含めて）ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と反応する任意の抗体から得るまたは誘導することができる。さらに、開示する改変された抗体を産生するために使用される親抗体または前駆抗体あるいはそれらのフラグメントは、ネズミのもの、ヒトのもの、キメラ、ヒト化されたもの、ヒト以外の霊長類のもの、または霊長類化されたものである。他の好ましい実施形態では、本発明の改変された抗体は、本明細書に記述する通りの変更された定常ドメインを持つ単鎖の抗体構築物（参照により本明細書に組み込む米国特許第５，８９２，０１９号に開示されるものなど）を含むことができる。したがって、本明細書の教示に従って改変されるこうしたタイプのいずれの抗体も、本発明に適合する。
【００４３】
本発明の改変された抗体は、好ましくは、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結びつき、結合する。したがって、以下で若干詳細に述べる通り本発明の改変された抗体は、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と反応する多くの抗体のいずれからでも誘導する、産生する、あるいは作ることができる。好ましい実施形態では、改変された抗体は、一般的な遺伝子工学技術（それによって、１種または複数の定常領域ドメインの少なくとも一部分が、欠損または変更され、血清半減期の減少などの所望の生化学特性が提供される）を使用して誘導されることとなる。より詳細には、以下で例示する通り、当分野の技術者は、被検者の抗体の可変領域および／または定常領域に相当する遺伝子配列を容易に単離し、適切なヌクレオチドを欠損または変更させて、本発明の改変された抗体を提供できる。改変された抗体を、確立したプロトコルを使用して、臨床または商業的スケールで発現および産生させることができることをさらに理解できるであろう。
【００４４】
選択される実施形態では、本発明に有用な改変された抗体は、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する既知の抗体から誘導されることとなる。これは、親抗体のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかを得ること、および本明細書に述べる通りの改変を設計することによって、容易に達成できる。他の実施形態については、既知の抗体の抗原結合領域（例えば可変領域または相補性決定領域）のみを使用し、改変された定常領域とそれらを組み合わせて、所望の改変された抗体を産生することが望ましい可能性がある。適合する単鎖の構築物も、同様の方式で産生できる。いずれにせよ、従来技術において一般的であるように、本発明の抗体はまた、親和性を改良するあるいは免疫原性を低下させるために設計できることは言うまでもない。例えば、本発明の改変された抗体は、ヒト化またはキメラ化させた抗体から誘導するあるいは作ることができる。したがって、本発明と合致する改変された抗体は、天然に存在するネズミ、（ヒトを含めて）霊長類、または他の哺乳類のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、二重特異性抗体、あるいは単鎖抗体構築物、ならびに各タイプの免疫反応性フラグメントから誘導できるかつ／またはこれらを含むことができる。
【００４５】
上で述べた抗体に加えて、上で述べた一般的な免疫学的な技術と組み合わされる免疫化を使用して産生される新規の抗体の抗原結合領域から誘導される、あるいはこれらを含む、改変された抗体を提供することが望ましい可能性がある。
【００４６】
他の適合する実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、容易に単離することができ、従来の手順を使用して配列決定できる（例えば、ネズミの抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合する能力があるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、次いでこれを、原核生物または真核生物の宿主細胞（大腸菌細胞、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンを他に産生しない骨髄腫細胞など）に形質移入させる。より詳細には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記述する通りに改変することが可能）は、Ｎｅｗｍａｎ他、米国特許第５，６５８，５７０号（参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの抗体を産生するための定常領域および可変領域配列をクローニングするために使用されることができる。本質的に、これは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの転換、および免疫グロブリン特異的なプライマーを使用するＰＣＲによるそれらの増幅を伴う。以下にさらに詳細に述べる通り、所望の抗体を発現する形質転換細胞を比較的に大量に増殖させて、免疫グロブリンを臨床的および商業的に供給できる。
【００４７】
当分野の技術者であれば、抗体または抗体フラグメントをコードしているＤＮＡがまた、例えば、ＥＰ  ３６８  ６８４  Ｂ１および米国特許第５，９６９，１０８号（それぞれ参照により本明細書に組み込む）に記載される通りの抗体ファージライブラリからも誘導されることも理解するであろう。いくつかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））は、チェインシャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）、ならびに、大きなファージライブラリを作成するための戦略としての組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えによる、高親和性ヒト抗体の産生を記載している。こうした手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングための従来のハイブリドーマ技術に対する実行可能な代案を提供し、したがって、明らかに本発明の範囲内である。
【００４８】
本発明のさらに他の実施形態は、内因性免疫グロブリン産生ができないトランスジェニック動物（例えばマウス）における、実質的にヒトの抗体の産生を含む（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号、および第５，５８９，３６９号を参照）。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ領域の同型接合的欠損が、内因性抗体産生の完全な抑制になることを記載している。こうした生殖系列変異マウスにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を移入することにより、抗原投与後にヒト抗体が産生されることとなる。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を産生する好ましい別の手段は、参照により本明細書に組み込まれる自己の（ｃｏｍｍｏｎｌｙ−ｏｗｎｅｄ）米国特許第５，８１１，５２４号に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質はまた、本明細書に記述する通りに単離および操作できることは言うまでもない。
【００４９】
組換え抗体を産生するためのさらに別の非常に効率的な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）によって開示されている。具体的には、この技術は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体の産生をもたらす。この参考文献は、本明細書にその内容全体を引用するものとする。さらに、この技術はまた、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、本発明の譲受人に譲渡された米国特許番号５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号、および第５，７５６，０９６号に記載されている。
【００５０】
本発明の範囲が、本明細書に記載されるＤＮＡの塩基配列のすべてのアレル、変異体、および突然変異体を包含することが、さらに理解されよう。
【００５１】
周知のように、ＲＮＡは、イソチアン酸グアニジニウム抽出および沈殿、それに続く遠心分離またはクロマトグラフィーなどの標準の技術によって、元々のハイブリドーマ細胞から、あるいは他の形質転換細胞から単離できる。所望であれば、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーのような標準技術によって、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離できる。これらの目的に適した技術は、従来技術では普通であり、前述の参考文献に記載されている。
【００５２】
よく知られた方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用し、抗体の軽鎖および重鎖をコードしているｃＤＮＡを、同時にまたは別々に作ることができる。これは、コンセンサス定常領域プライマーによって、あるいは公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づく、より特異的なプライマーによって、開始できる。上記の通り、ＰＣＲを使用して、抗体の軽鎖および重鎖をコードしているＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同的プローブ（マウス定常領域プローブなど）によって、スクリーニングすることができる。
【００５３】
ＤＮＡ、通常プラスミドＤＮＡは、本明細書に記述する通りの細胞から単離することができ、組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献に詳細に記載されている標準のよく知られた技術に従って、制限酵素地図が作製され、配列決定することができる。当然、ＤＮＡは、単離プロセスまたはその後の分析中いつでも、本発明に従って改変できる。
【００５４】
本発明に従って、本発明のポリペプチドに特異的な単鎖抗体の産生に、技術を適合させることができる（米国特許第４，９４６，７７８を参照）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリ（Ｈｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））の作成に、方法を適合させて、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ１に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントまたは誘導体、あるいはそれらのフラグメント、類似体、または相同体の迅速かつ有効な識別を可能にすることができる。本発明のポリペプチドに対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントは、それだけには限らないが以下を含めた従来技術によって産生できる：（ａ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることにより産生されるＦａｂフラグメント、（ｃ）パパインおよび還元剤を用いる抗体分子の処理により産生されるＦａｂフラグメント、および（ｄ）Ｆｖフラグメント。
【００５５】
二重特異性抗体もまた、本発明の範囲内である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性をもつ、モノクローナルの、好ましくはヒトの、またはヒト化させた抗体である。この場合、結合特異性のうちの１つが、本発明の抗原性ポリペプチド（ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはそれらのフラグメント）に対するものであるのに対して、第２の結合標的は、任意の他の抗原であり、好都合には、細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【００５６】
二重特異性抗体を作るための方法は、当技術分野で知られている。従来、二重特異性抗体の組換え体産生は、２つの重鎖が異なる特異性をもつ２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づくものである（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は潜在的に１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、これらのうち１つだけは適切な二重特異性構造を持つ。この適切な分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより達成される。
【００５７】
所望の結合特異性をもつ抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。この融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であることが好ましい。融合物のうちの少なくとも１つに、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体の産生は、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６）に、さらに詳細に出ている。
【００５８】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製できる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生するための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製できる。さらに、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するために完全な抗体をタンパク質分解的に切断する手順を記載している。
【００５９】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、大腸菌から直接回収することができ、化学的に連結させて二重特異性抗体を形成できる（Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。これらの方法は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生に使用できる。
【００６０】
結合価が２より大きい抗体も考えられる。例えば、三重特異性（ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を、調製することができる（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【００６１】
典型的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも１つは、本発明のポリペプチドに由来する。あるいは、特定の抗原を発現する細胞に、細胞の防衛機制を集中させるために、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームを、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）などの白血球上の引き金分子あるいはＩｇＧに対するＦｃ受容体に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を向けるために使用できる。これらの抗体は、抗原結合アーム、ならびに細胞傷害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、またはＴＥＴＡなどの放射線核種（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ）キレート剤と結合するアームを備える。
【００６２】
ヘテロ結合抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合的に連結された抗体からなる。こうした抗体は、例えば、望ましくない細胞を免疫細胞の標的とするために提案された（米国特許第４，６７６，９８０号）。これらの抗体は、架橋剤を必要とするものを含めた合成タンパク質化学における既知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製できると考えられる。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用して、あるいはチオエーテル結合を形成することによって構築できる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが含まれる。
【００６３】
本発明の目的では、改変された抗体が、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のポリペプチドと抗体との結合をもたらすいずれのタイプの可変領域も含むことができることが理解されよう。その際、可変領域は、液性反応を開始して、所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンを産生するように誘導することができる哺乳類のいずれのタイプも含むことができる、あるいはこれらから誘導することができる。したがって、改変された抗体の可変領域は、例えば、ヒト、ネズミ、ヒト以外の霊長類（例えばカニクイザル、マカクなど）、あるいはルピナス由来であり得る。特に好ましい実施形態では、改変された免疫グロブリンの可変領域および定常領域は、ヒトのものである。他の選択された実施形態では、適合する抗体（通常、ヒト以外の供給源から誘導される）の可変領域は、結合特性を改良するあるいは分子の免疫原性を減少させるように設計または特異的に調整することができる。この点については、本発明における有用な可変領域は、ヒト化させることもできるし、そうでなければ移入されたアミノ酸配列の包含を介して変更することもできる。
【００６４】
「ヒト化抗体」は、親抗体の抗原−結合特性を保持するあるいは実質的に保持するが、人間においてはそれほど免疫原性ではない、ヒト以外の供給源、通常ネズミの抗体から誘導される抗体を意味する。これは、以下を含めた様々な方法によって、提供することができる。（ａ）ヒト定常領域上に完全なヒト以外の可変ドメインをグラフトしてキメラ抗体を産生すること、（ｂ）重要なフレームワーク残基の保持の有無にかかわらず、ヒトのフレームワークおよび定常領域に、１つまたは複数のヒト以外の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をグラフトすること、または（ｃ）ヒト以外の可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によって、ヒト様部分を用いてこれらを「覆い隠す」こと。こうした方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、および第５，６９３，７６２号（これらはすべて、その内容全体を本明細書に引用する）に開示されている。
【００６５】
ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を持つマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、相当するヒト以外の残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲやフレームワーク配列にも見られない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１種、通常２つの可変ドメインのすべてを実質的に含むこととなる。ただし、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト以外の免疫グロブリンのそれに相当し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。
【００６６】
ヒト以外の抗体をヒト化させるための方法は、当分野でよく知られている。通常、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１種または複数のアミノ酸残基を持つ。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、「移入」残基としばしば称され、これは、「移入」可変ドメインから通常取り出される。ヒト化は、基本的にＷｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］ヒト抗体の対応配列をげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置換することによって実施することができる。したがって、こうした「ヒト化」抗体は、実質的に全長に満たないヒト可変ドメインが、ヒト以外の種からの対応配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、通常、いくつかのＣＤＲ残基およびひょっとするといくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における類似の部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００６７】
抗体が、ヒト治療用途のためのものである場合、ヒト化抗体を作るために使用されるヒト可変ドメイン（軽と重の両方）の選択は、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を低下させるために、非常に重要である。げっ歯類抗体の可変ドメインの配列は、いわゆる「最も適当な」方法に従って、既知のヒト可変ドメイン配列の完全なライブラリに対してスクリーニングされる。げっ歯類のものに最も近いヒトＶドメイン配列が同定され、その中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）が、ヒト化抗体に受容される（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔｌ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、すべてのヒト抗体の特定のサブグループの軽鎖または重鎖の共通配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用するものである。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体ために使用できる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３））。
【００６８】
抗原に対する高い結合親和性および他の有利な生物学的性質を保持しながら、抗体をヒト化させることが、さらに重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、親の配列およびヒト化された配列の三次元模型を使用して、親の配列および様々な概念的なヒト化産物の分析のプロセスによって、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルが、一般に利用可能であり、当分野の技術者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の、有望な三次元高次構造を例示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイを見ることによって、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の、ありそうな役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に、影響を与える残基の分析が可能になる。このように、所望の抗体の特徴（例えば、１つまたは複数の標的抗原に対する親和性の増大）が達成されるように、レシピエントの配列および移入配列から、ＦＲ残基を選択して組み合わせることができる。一般に、高頻度可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も強く関与する。
【００６９】
様々な形のヒト化抗体が想定される。例えば、ヒト化抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントであり得、これは、任意選択で１種または複数の細胞傷害性薬剤と結合させて、免疫複合体を産生する。あるいは、ヒト化抗体は、完全なＩｇＧ１抗体などの完全な抗体であり得る。
【００７０】
ヒト化の代替例として、ヒト抗体を産生することができる。例えば、免疫化後に、内因性免疫グロブリンが産生されなくても、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を生じることが、現在可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖Ｊ領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合的欠損が、結果的に内因性抗体産生を完全に抑制することが記載されている。こうした生殖系列変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の移入により、抗原投与後にヒト抗体が産生されることとなる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｎｕｎｏ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９号（すべてＧｅｎＰｈａｒｍのもの）、第５，５４５，８０７号；およびＷＯ  ９７／１７８５２を参照のこと。
【００７１】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、免疫されていない提供者からの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントを産生できる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄなどの、糸状バクテリオファージの主要または主要でないコートタンパク質遺伝子にインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）クローン化させ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体フラグメントとして呈示させる。糸状の粒子がファージゲノムの一重鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能特性に基づく選抜はまた、結果的に、それらの特性を呈する抗体をコードしている遺伝子の選抜となる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかに似ている。ファージディスプレイは、例えばＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１  （１９９３）に概説されている様々な形式で実施できる。Ｖ遺伝子部分のいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫マウスの脾臓から誘導されるＶ遺伝子の、小さいランダムな組合せのライブラリから、様々な配列の抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫されていないヒト供与者からのＶ遺伝子のレパートリーを作成することができ、（自己抗原を含めて）様々な配列の抗原に対する抗体を、基本的に、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されている技術に従って単離できる。また、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号を参照のこと。
【００７２】
上で示した通り、ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって産生することもできる（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照）。
【００７３】
当分野の技術者であれば、ヒト定常領域上にヒト以外の可変ドメイン全体をグラフトすることにより、「古典的な」キメラ抗体が産生されることを理解するであろう。本出願においては、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が、第１の種から得られ、あるいは誘導され、定常領域（これは、本発明に従って、完全であってもよいし、部分的であってもよいし、改変されていてもよい）が、第２の種から得られる任意の抗体を意味するものとする。好ましい実施形態では、抗原結合領域または部位は、ヒト以外の供給源（例えばマウス）からのものであり、定常領域は、ヒト由来である。可変領域の免疫原特異性は、一般にその供給源によって、影響を受けないが、ヒト定常領域は、ヒト以外の供給源からの定常領域ほど、ヒト被験者からの免疫応答を誘発させないと思われる。
【００７４】
好ましくは、重鎖と軽鎖の両方における可変ドメインは、１つまたは複数のＣＤＲの少なくとも一部分の置換によって、必要に応じて、部分的なフレームワーク領域置換および配列変化によって変更される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が誘導される抗体と同じクラスまたはサブクラスの抗体から誘導できるが、ＣＤＲが、異なるクラスの抗体から、好ましくは異なる種由来の抗体から誘導されることも想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別のものに移入するために、ＣＤＲの全てを、供与者の可変領域からの完全なＣＤＲで置き換える必要はない可能性があることを強調しなければならない。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要なそれらの残基を移入することが必要であるに過ぎない可能性がある。米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、および第５，６９３，７６２号に記載される説明を考慮すると、ルーチン試験を実施することによって、あるいは試行錯誤による試験によって、免疫原性が低下された機能的な抗体を得ることは、十分に当分野の技術者の能力内であるだろう。
【００７５】
可変領域への変更にかかわらず、当分野の技術者であれば、所望の生化学特性（天然のあるいは変更されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較して、増大された腫瘍局在、あるいは減少された血清半減期など）を提供するために、本発明の改変された抗体が、１つまたは複数の定常領域ドメインの少なくとも一部分が欠損または変更された抗体またはそれらの免疫反応性フラグメントを含むことを理解するであろう。好ましい実施形態では、改変された抗体の定常領域は、ヒト定常領域を含む。本発明に適合する定常領域への改変は、１つまたは複数のドメインにおける１つまたは複数のアミノ酸の添加、欠損、または置換を含む。すなわち、本明細書に開示される改変された抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）のうちの１種または複数への変更または改変を含むことができる。以下にさらに詳細に述べる、また、実施例で示す通り、本発明の好ましい実施形態は、１つまたは複数のドメインが部分的にまたは完全に欠損させられた改変された定常領域を含む。特に好ましい実施形態では、改変された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されたドメイン欠損構築物または変異体を含む（ΔＣＨ２構築物）。さらに他の好ましい実施形態では、省略された定常領域ドメインが、通常、定常領域の欠損によって与えられる分子屈曲性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば１０残基）によって置き換えられることとなる。
【００７６】
定常領域が、その構造の他に、いくつかのエフェクター機能を仲介することは、当技術分野で知られている。例えば、抗体への補体のＣ１成分の結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏症に関与する可能性がある。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合する（抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する）。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）およびＩｇＭ（μ受容体）を含めて、多くの異なるクラスの抗体に特異的なＦｃ受容体が存在する。細胞表面上のＦｃ受容体への抗体の結合により、抗体でコートされた粒子の包み込みおよび滅失、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞（抗体依存性細胞障害またはＡＤＣＣと呼ばれる）による抗体でコートされた標的細胞の溶解、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含めた多くの重要かつ様々な生物反応が引き起こされる。様々なＦｃ受容体およびレセプター部位がある程度研究されているが、依然として、その場所、構造、および機能化について知られていないことが多数存在する。
【００７７】
本発明の範囲を限定する訳ではないが、本明細書に記述する通りに改変された定常領域を含む抗体が、エフェクター機能の変更を提供し、その結果、投与された抗体の生物学的プロフィールに影響が及ぼされると考えられている。例えば、（点突然変異または他の手段を介する）定常領域ドメインの欠損または失活は、循環する改変された抗体のＦｃ受容体結合を減少させ、それによって、腫瘍局在を増大させることができる。他の場合には、本発明に合致する定常領域改変により補体結合が緩和され、したがって、結合された細胞毒の血清半減期および非特異的結合が減少される可能性がある。定常領域のさらに他の改変を使用して、抗原特異性または抗体自由度（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）の増大により、局在の増強を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を排除することができる。より一般的に言えば、当分野の技術者であれば、本明細書に記述する通りに改変された抗体が、認識できるあるいはできない多くの微妙な効果を発揮する可能性があることを理解するであろう。同様に、本発明に従う定常領域への改変は、十分に当分野の技術者の視野内の、よく知られた生化学または分子工学技術を使用して、容易に行うことができる。
【００７８】
改変された抗体を、それぞれの改変された抗体のヒンジ領域に直接ＣＨ３ドメインが融合されるように設計できることに留意されたい。他の構築物では、ヒンジ領域および改変されたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン間のペプチドスペーサーを提供することが望ましい可能性がある。例えば、ＣＨ２ドメインが欠損され、残留するＣＨ３ドメイン（改変されている、あるいはされていない）が、５〜２０アミノ酸スペーサーを用いてヒンジ領域に連結される、適合する構築物を、発現させることができるだろう。この点については、ある好ましいスペーサーは、アミノ酸配列ＩＧＫＴＩＳＫＫＡＫ（配列番号４４）を持つ。こうしたスペーサーは、例えば、定常ドメインの調節エレメントが、フリーでありかつ利用可能なままであること、あるいはヒンジ領域が、自由（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）のままであることを確実にするために、加えることができる。しかし、アミノ酸スペーサーが、場合によっては、免疫原性であると判明する可能性があり、構築物に対して不必要な免疫応答を誘発する可能性がある点に留意するべきである。したがって、構築物に加えられる任意のスペーサーは、比較的に非免疫原性であることが好ましく、改変された抗体の所望の生化学特性を維持できる場合は、全く省略されることがさらに好ましい。
【００７９】
完全な定常領域ドメインの欠損の他に、本発明の抗体を、少数のまたは単一のアミノ酸の部分的な欠損または置換によって、提供できることは言うまでもない。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域における単一のアミノ酸の突然変異は、実質的にＦｃ結合を減少させ、それによって、腫瘍局在を増大させるのに十分である可能性がある。同様に、調整されるべきエフェクター機能（例えば補体ＣＬＱ結合）を制御する１種または複数の定常領域ドメインのその部分を単に欠損させることが望ましい可能性がある。定常領域のこうした部分的な欠損は、被検者の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を完全なままにしながら、抗体の選択された特性（血清半減期）を改善できる。さらに、上に言及した通り、開示された抗体の定常領域を、得られる構築物のプロフィールを向上させる１種または複数のアミノ酸の突然変異または置換を介して改変できる。この点については、改変された抗体の構造および免疫原性プロフィールを実質的に維持しながら、保存された結合部（例えばＦｃ結合）により提供される活性を乱すことが可能である可能性がある。さらに他の好ましい実施形態は、エフェクター機能などの望ましい特性を増強するための、あるいはより多くの細胞毒または炭水化物付着を提供するための、定常領域への１種または複数のアミノ酸の添加を含むことができる。こうした実施形態では、選択された定常領域ドメインから誘導される特異的な配列を挿入または複製することが望ましい可能性がある。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、クローン化された可変領域遺伝子が、上で示した通りに改変された重鎖および軽鎖定常域遺伝子（好ましくはヒトのもの）と共に、発現ベクターに挿入される。好ましくは、これは、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＩＤＥＣ社の自社開発の発現ベクターを使用して実施される。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター（ｍａｊｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４０複製開始点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１およびエキソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、およびリーダー配列を含有する。下記の実施例に示すように、このベクターが、可変領域および定常領域遺伝子の編入、ＣＨＯ細胞における形質移入、それに続くＧ４１８を含有培地における選抜、およびメトトレキセート増幅後に、抗体の非常に高レベルの発現をもたらすことが分かっている。このベクター系は、本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号に実質的に開示されており、それぞれ本明細書にその内容全体を引用するものとする。この系は、高い発現量、すなわち＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。
【００８１】
他の好ましい実施形態では、本発明の改変された抗体は、２００１年１１月１６日に出願され、本明細書にその内容全体を組み込まれる米国仮出願第６０／３３１，４８１に開示されるものなどの多シストロン性構築物を使用して発現させることができる。これらの新規の発現系では、抗体の重鎖および軽鎖などの関連する複数の遺伝子産物は、単一の多シストロン性構築物から産生できる。これらのシステムは、真核生物の宿主細胞における比較的に高レベルの改変された抗体を提供するために、好都合には内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。適合するＩＲＥＳ配列は、本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている。当分野の技術者であれば、こうした発現系を使用して、本出願に開示されるあらゆる改変された抗体を効率的に産生できることを認識するであろう。
【００８２】
より一般的には、いったん本発明のポリペプチド（例えば改変された抗体など）を含有するベクターまたはＤＮＡの塩基配列が調製されたならば、発現ベクターは適切な宿主細胞に導入できる。すなわち、宿主細胞を、形質転換することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当分野の技術者によく知られた様々な技術によって達成できる。これには、（電気泳動および電気穿孔法を含めて）形質移入、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡ（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ＤＮＡ）を用いる細胞融合、マイクロインジェクション、および完全なウイルスを用いる感染を含むが、これに限定されるものではない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．  “Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，  ｐｐ．  ４７０−４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。最も好ましくは、宿主へのプラスミド導入は、電気穿孔法を介する。形質転換細胞を、軽鎖および重鎖の産生に適した条件下で増殖させ、重鎖および／または軽鎖タンパク質合成のために分析する。典型的な分析技術には、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または蛍光標示式細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。
【００８３】
本明細書では、用語、「形質転換」は、遺伝子型を変化させ、その結果として受容細胞の変化をもたらす、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡのいかなる導入も指すために、広義に使用されるものとする。
【００８４】
同じ方針で、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を使用して作成される、少なくとも１種の異種遺伝子を含有するベクターを用いて形質転換される細胞を指す。本明細書で定義する通り、宿主細胞により産生される抗体またはその改変物は、この形質転換によるものである。組換え型宿主からの抗体の単離ためのプロセスの説明では、別段の明確な指定がない限り、用語「細胞」および「細胞培養物」は抗体の供給源を表すために同義的に使用される。言い換えれば、「細胞」から抗体の回収は、遠心沈殿された完全な細胞からの回収、あるいは培地と浮遊細胞の両方を含有する細胞培養物からの回収のいずれかを意味する可能性がある。
【００８５】
タンパク質発現のために使用される宿主細胞系は、最も好ましくは哺乳類起源であり、当分野の技術者であれば、そこで発現されるべき所望の遺伝子産物に最適な特定の宿主細胞系を選択的に決定する能力を有すると考えられる。典型的な宿主細胞系には、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ  １１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を用いたＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３×６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これに限定されるものではない。ＣＨＯ細胞が、特に好ましい。宿主細胞系は通常、商業サービス、すなわちＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または掲載された文献から入手可能である。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生により、大量の所望の抗体を与えるためのスケールアップが可能になる。組織培養条件下での哺乳類の細胞培養のための技術は、当技術分野で知られており、例えばエアリフト反応器内、または連続撹拌反応器内の均質な浮遊培養、あるいは、例えばホローファイバー内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上、またはセラミックカートリッジ上の固定されたあるいは封入された（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）細胞培養が含まれる。改変された抗体の単離ために、例えば硫酸アンモニウムを用いる沈殿、ＰＥＧなどの吸湿性の材料に対する透析、選択的な膜を介する濾過などによって、培養上清中の免疫グロブリンを、第一に濃縮する。必要に応じてかつ／または所望により、濃縮された抗体を、慣習的なクロマトグラフィー法（例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセルロースでのクロマトグラフィーまたは（イムノ）アフィニティークロマトグラフィー）によって精製する。
【００８７】
本発明の改変された免疫グロブリン遺伝子および／またはポリペプチドはまた、バクテリアや酵母などの非哺乳類細胞において発現させることができる。この点に関しては、バクテリアなどの様々な単細胞非哺乳類微生物、すなわち、培養または発酵で増殖させることができるものを形質転換させることもできることは言うまでもない。形質転換を受けやすいバクテリアには、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の株などの腸内細菌科；サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；肺炎双球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバーが含まれる。バクテリア中で発現される場合、免疫グロブリン重鎖および軽鎖が通常、封入体の部分になることをさらに理解されたい。これらの鎖を、その後単離し、精製し、その後機能的な免疫グロブリン分子に組み立てる必要がある。
【００８８】
原核生物に加えて、真核生物の微生物も使用できる。多くの他の株が一般に入手可能であるが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは一般的なパン酵母が、真核微生物の中で最も一般的に用いられる。
【００８９】
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現のためには、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）；  Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が、一般的に用いられる。このプラスミドは、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１など、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の突然変異株のための選択マーカーを提供するｔｒｐｌ遺伝子を既に含有する（Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、その後、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。
【００９０】
臨床的に有用な量がどのように得られるかに関係なく、本発明の改変された抗体は、多くの結合形（すなわち免疫複合体）または非結合形のどの形でも使用できる。特に、本発明の抗体は、ラジオアイソトープ、治療薬、細胞増殖抑制性の薬剤、生物毒素、またはプロドラッグなどの細胞毒に結合することができる。あるいは、本発明の改変された抗体は、非結合型で、あるいは、悪性細胞を排除する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含めて被検者の生来の防衛機構を利用するために、「ありのままの」形で使用できる。特に好ましい実施形態では、改変された抗体は、多くのよく知られたキレート剤または直接標識のいずれかを使用して、ラジオアイソトープ（９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、および１８８Ｒｅなど）に結合させることができる。他の実施形態では、開示された組成物は、メトトレキセート、アドリアマイシン、およびリンフォカイン（インターフェロンなど）などの薬物、プロドラッグまたは生体応答調節剤に連結される改変された抗体を含むことができる。本発明のさらに他の実施形態は、リシンまたはジフテリア毒素などの特異的な生体毒素に結合させた改変された抗体の使用を含む。さらに他の実施形態では、改変された抗体は、得られる分子が腫瘍細胞およびＴ細胞などのエフェクター細胞に結合するような、他の免疫学的に活性なリガンド（例えば抗体またはそのフラグメント）と、複合体を形成させることができる。どの複合または非複合改変された抗体を使用するべきかという選択は、癌のタイプおよび段階、補助治療（例えば化学療法または外部放射線）の使用、および患者の状態に依存することとなる。当分野の技術者が、本明細書の教示を考慮して、こうした選択を容易に行うことができるであろうことは言うまでもない。
【００９１】
本明細書では「細胞毒性または細胞傷害性薬剤」は、成長および細胞増殖に有害であり、それに暴露された場合、悪性腫瘍を減少させる、阻害する、あるいは殺すことができるいかなる薬剤も意味する。典型的な細胞毒には、放射性核種、生体毒素、細胞増殖抑制性または細胞毒性の治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、および生体応答調節剤（サイトカインなど）が含まれるが、これに限定されるものではない。以下にさらに詳細に述べる通り、放射性核種細胞毒が、本発明のために特に好ましい。しかし、悪性細胞の増殖を減速または遅延させるために、あるいは悪性細胞を排除するために作用し、本明細書に開示される改変された抗体に関連する可能性があるいかなる細胞毒も、本発明の範囲内である。
【００９２】
言うまでもなく、以前の研究では、アイソトープを用いて標識される抗腫瘍抗体をうまく利用して、動物モデルにおいて、ある種の場合では人間において、固形腫瘍ならびにリンパ腫／白血病における細胞を殺していた。放射性核種は核ＤＮＡ中で複数の鎖切断を引き起こすイオン化放射線を生じることによって作用し、細胞死をもたらす。治療用結合体を生じるために使用されるアイソトープは通常、治療上有効な光路長（ｐａｔｈ  ｌｅｎｇｔｈ）を持つ高エネルギーα−、γ−またはβ−粒子を生じる。こうした放射性核種は、例えば結合体が付着または侵入した腫瘍細胞など、それに近接する細胞を殺す。これらは通常、非局在化細胞上ではほとんどまたは全く効果を持たない。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。
【００９３】
本発明と関連する放射標識された結合体の使用に関して、改変された抗体は、（例えばヨウ素化を介して）直接標識することもできるし、キレート剤の使用を介して間接的に標識することもできる。本明細書では、語句「間接標識」および「間接標識法」は、キレート剤が抗体に共有結合的に付着されることと、少なくとも１種の放射性核種がキレート剤に結びつくことの両方を意味する。こうしたキレート剤は、ポリペプチドとラジオアイソトープの両方と結合するので、二官能性キレート剤と通常称される。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオサイクマトベンジル（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｃｍａｔｏｂｅｎｚｙｌ）−３−メチルジオセレン（ｍｅｔｈｙｌｄｉｏｔｈｅｌｅｎｅ）トリアミン五酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡおよびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識のための特に好ましい放射性核種には、１１１Ｉｎおよび９０Ｙが含まれる。
【００９４】
本明細書では、語句「直接標識」および「直接標識法」は両方とも、放射性核種が（通常アミノ酸残基を介して）直接抗体に共有結合的に付着されることを意味する。より詳しくは、これらの連結技術には、ランダム標識および部位特異的標識が含まれる。後者の場合、標識は、結合体のＦｃ部分のみに存在するＮ結合型糖残基などの二量体または四量体上の特定の部位が対象とされる。さらに、様々な直接標識技術およびプロトコルが、本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９ｍ標識抗体は、配位子交換プロセスによって、スズイオン溶液を用いて過テクネチウム酸（ＴｃＯ４−）を還元し、セファデックスカラム上へ還元されたテクネチウムをキレート化し、このカラムに抗体を適用することによって、あるいはバッチ標識技術によって、例えば、過テクネチウム酸、ＳｎＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液などの緩衝液、および抗体をインキュベートすることによって調製されることができる。いずれにせよ、抗体を直接標識するための好ましい放射性核種は、当分野でよく知られており、直接標識のための特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合的に付着される１３１Ｉである。改変された抗体は、例えば、放射性ナトリウムまたはヨウ化カリウムおよび化学的酸化剤（次亜塩素酸ソーダ、クロラミンＴなど）、あるいは酵素的酸化剤（ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびグルコースなど）を用いて、本発明に従って誘導できる。ただし、本発明のためには、間接標識方法が、特に好ましい。
【００９５】
キレート剤およびキレート剤結合体に関する特許は、当技術分野で知られている。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、ポリ置換されたジエチレントリアミンペンタ酢酸キレートおよびこれを含有するタンパク質結合体、ならびにそれらの調製のための方法を対象としている。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、第５，２４６，６９２号、第５，２８６，８５０号、第５，４３４，２８７号、および第５，１２４，４７１号はまた、ポリ置換されたＤＴＰＡキレートにも関する。これらの特許は、その内容全体を本明細書に組み込むものとする。適合する金属キレート剤の他の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡが、特に好ましく、以下で何度も例示される。さらに発見されるべきものを含めて、さらに他の適合するキレート剤は、当分野の技術者によって、容易に認識されることができ、明らかに本発明の範囲内である。
【００９６】
同時係属中の特許出願第０８／４７５８１３号、第０８／４７５８１５号、および第０８／４７８９６７号中でキレート化を容易にするために使用される特異的な二官能性キレート剤を含めて、適合するキレート剤は、三価金属に対する高親和性を提供し、腫瘍対非腫瘍比の増大および骨取り込みの減少、ならびに標的部位、すなわちＢ細胞リンパ腫腫瘍部位での放射性核種のより大きいｉｎ  ｖｉｖｏ保持を呈するように選択されることが好ましい。しかし、他の二官能性キレート剤（これらの特性の全てを備えていてもいなくてもよい）は、当技術分野で知られており、腫瘍治療において、有益である可能性がある。
【００９７】
本明細書の教示に従って、改変された抗体を、診断および治療目的の異なる放射標識に結合できることも理解されよう。この目的のために、上述の同時係属中の出願（その内容全体を本明細書に引用するものとする）は、治療用抗体の投与の前の腫瘍の診断用「イメージング」のための放射標識された治療用結合体を開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」結合体は、ヒトＣＤ２０抗原に特異的な、すなわち、二官能性キレート剤（すなわち、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルＤＴＰＡと１−メチル３−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡの１：１混合物を含むＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸））を介して１１１Ｉｎに付着される、ネズミのモノクローナル抗体（２Ｂ８）を含む。約１から約１０ｍＣｉは、検出可能な毒性無しで安全に投与できるので、１１１Ｉｎは、診断用放射性核種として特に好ましく、イメージングデータは通常、その後の９０Ｙ標識された抗体分布を予示する。その線量が安全であり、より低線量と比較してイメージング効率が増すので、大抵のイメージング研究は、５ｍＣｉ  １１１Ｉｎ標識された抗体を利用し、最適なイメージングは、抗体投与の３〜６日後にもたらされる。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，  Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）を参照のこと。
【００９８】
上で示した通り、様々な放射性核種を、本発明に適用でき、当分野の技術者は、様々な状況下でどの放射性核種が最も適切かということを容易に決定する能力をもつと考えられる。例えば、１３１Ｉは、標的免疫療法に使用されるよく知られた放射性核種である。しかし、１３１Ｉの臨床有用性は、以下を含めたいくつかの因子によって制限される可能性がある：８日の物理的半減期；血液中と腫瘍部位の両方でのヨウ化抗体の脱ハロゲン；および放射特性（例えば大きなγ成分）（腫瘍中の局所化された線量蓄積（ｄｏｓｅ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）に対して最適以下の可能性がある）。優れたキレート剤が出現したことに伴って、タンパク質に金属キレート基を付着する好機が現れ、１１１Ｉｎおよび９０Ｙなどの他の放射性核種を利用する機会が増した。９０Ｙは、放射免疫療法的な用途で利用するためのいくつかの利益を提供する。９０Ｙの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体蓄積を可能にするのに十分長く、例えば１３１Ｉとは異なり、９０Ｙは、１００〜１，０００のセル直径の組織の範囲で、その減衰中にγ照射を伴うことのない高エネルギーの純粋なβ放射体である。さらに、最小限の量の透過放射線は、９０Ｙ標識された抗体の外来患者への投与を可能にする。さらに、標識された抗体の内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、細胞殺滅に必要ではなく、電離放射線の局所放射が、標的抗原を欠いている隣接した腫瘍細胞に対して致死的でなければならない。
【００９９】
９０Ｙ標識された改変された抗体の、有効な単回治療線量（すなわち治療上有効な量）は、約５ｍＣｉと約７５ｍＣｉの間、好ましくは、約１０ｍＣｉと約４０ｍＣｉの間である。１３１Ｉ標識された抗体の、骨髄非切除の有効な単回治療線量は、約５ｍＣｉと約７０ｍＣｉの間、好ましくは約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉの間である。１３１Ｉ標識された抗体の、骨髄切除の（すなわち自家骨髄移植が必要な可能性がある）有効な単回治療線量は、約３０ｍＣｉと約６００ｍＣｉの間、好ましくは、約５０ｍＣｉと約５００ｍＣｉとの間である。キメラ抗体に関しては、ネズミの抗体と比較してより長い循環半減期が原因で、ヨウ素１３１標識キメラ抗体の、骨髄非切除の有効な単回治療線量は、約５ｍＣｉと約４０ｍＣｉの間、好ましくは、約３０ｍＣｉより少ない範囲である。例えば１１１Ｉｎ標識のためのイメージング基準は、通常約５ｍＣｉ未満である。
【０１００】
１３１Ｉおよび９０Ｙを用いて多くの臨床的経験が積まれる一方、他の放射標識も、当技術分野で知られており、同様の目的で使用されている。さらに他のラジオアイソトープも、イメージングのために使用される。例えば、本発明の範囲に適合するさらなるラジオアイソトープには、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、および２１３Ｂｉが含まれるが、これに限定されるものではない。この点については、α、γ、およびβ放射体がすべて、本発明に適合する。さらに、本開示に照らせば、当分野の技術者であれば、過度の実験を行わなくとも、治療の選択された方針に、どの放射性核種が適合するかということを容易に決定できると思われる。この目的で、臨床的診断において既に使用されているさらなる放射性核種には、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、ならびに１１１Ｉｎが含まれる。抗体は、また、標的免疫療法に使用できる可能性のある様々な放射性核種を用いて標識されてきている。Ｐｅｉｒｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７）。これらの放射性核種には、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅ、ならびに程度はより低いものの１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが含まれる。米国特許第５，４６０，７８５号は、こうしたラジオアイソトープに関するさらなるデータを提供しており、これを、参照により本明細書に組み込む。
【０１０１】
放射性核種に加えて、本発明の改変された抗体は、多くの生体応答調節剤、医薬品、毒素、または免疫学的に活性なリガンドのどれとも結合させるあるいは結びつけることができる。当分野の技術者であれば、これらの非放射性結合体を、選択される細胞毒に応じて様々な技術を使用して構築することができることを理解するであろう。例えばビオチンとの結合体は、例えば、改変された抗体を、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのビオチンの活性化エステルと反応させることによって調製される。同様に、蛍光マーカーとの結合体は、カップリング剤、例えば上で列挙したものの存在下で、あるいはイソチオシアネート、好ましくはイソチオシアン酸フルオレセインとの反応によって調製できる。本発明のキメラ抗体の、細胞増殖抑制性／細胞毒性物質および金属キレートとの結合体も、類似の方式で調製される。
【０１０２】
本発明に用いられる好ましい薬剤は、細胞毒、特に癌治療のために使用されるものである。こうした薬物には、一般に、細胞増殖抑制性薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖薬、チューブリン結合剤（ｔｕｂｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ホルモン、およびホルモン拮抗物質などが含まれる。本発明に適合する典型的な細胞増殖抑止剤には、アルキル化物質（メクロレタミンなど）、トリエチレンホスホルアミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロランブシル、ブスルファン、メルファラン、またはトリアジクオン、さらにニトロソウレア化合物（例えばカルムスチン、ロムスチン、またはセムスチン）が含まれる。他の好ましいクラスの細胞傷害性薬剤には、例えば、アンスラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬物、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性のヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ダイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）、およびポドフィリンが含まれる。これらのクラスの特に有用なメンバーには、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ポルフィロマイシン、５‐フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６‐メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、あるいはポドフィロトキシン誘導体（エトポシドまたはリン酸エトポシドなど）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシンなどが含まれる。本明細書の教示に適合するさらに他の細胞毒には、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）ジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が含まれる。コルチコステロイド（例えばプレドニソン）、プロゲスチン（例えばヒドロキシプロゲステロンまたはｍｅｄｒｏｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール）、抗エストロゲン（例えばタモキシフェン）、アンドロゲン（例えばテストステロン）、およびアロマターゼ阻害薬（例えばアミノグルセタマイド）などのホルモンおよびホルモン拮抗物質もまた、本明細書の教示に適合する。前述の通り、当分野の技術者は、化合物の反応を、本発明の結合体を調製するのにより都合よいものにするために、化学修飾を行って所望の化合物にすることができる。
【０１０３】
特に好ましい細胞毒の一例は、カリケアマイシン、エスペラミシン、またはダイネミシンを含めた、エンジインファミリーの制癌抗生物質のメンバーまたは誘導体を含む。これらの毒素は極めて強力であり、核ＤＮＡを切断することによって作用して、細胞死をもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて、不活性であるが免疫原性の多くのポリペプチドフラグメントを与えることができるタンパク質毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラミシン、および他のエンジインなどの毒素は、本質的に非免疫原性の小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体および他の分子を標識するために従来使用されている技術によって、二量体または四量体に化学的に連結させる。これらの連結技術は、結合体のＦｃ部分のみに存在するＮ結合型糖残基を介する部位特異的な連結を含む。こうした部位特異的連結法は、連結の、結合体の結合特性に対する起こりうる影響を、減少させる効果がある。
【０１０４】
上で言及した通り、適合する細胞毒は、プロドラッグを含むことができる。本明細書では、用語「プロドラッグ」は、腫瘍細胞に対して親薬物と比較してそれほど細胞毒性でなく、酵素によって、活性化されるあるいはより活性な親薬物の形に変わることが可能な、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形を指す。本発明に適合するプロドラッグには、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意選択で置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意選択で置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性な細胞毒性のない薬物に転換できる５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これに限定されるものではない。さらに、本発明に用いられるプロドラッグ形に誘導体化できる細胞毒性の薬物の例には、上記のそれらの化学療法剤が含まれる。
【０１０５】
他の細胞毒の中では、抗体を、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンギノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎ）、サキシトキシン、志賀毒素（ｓｈｉｇａｔｏｘｉｎ）、破傷風菌、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲン（ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｇｅｎ）、または有毒な酵素などの生体毒素にも結びつけることができることはいうまでもない。好ましくは、こうした構築物は、抗体−毒素構築物の直接的発現を可能にする遺伝子工学技術を用いて作られる。本発明の改変された抗体に結びつけることができる他の生体応答調節剤は、サイトカイン（リンフォカインおよびインターフェロンなど）を含む。さらに、上で示した通り、同様の構築物を使用して、免疫学的に活性なリガンド（例えば抗体またはそのフラグメント）を、本発明の改変された抗体と結合させることができる。好ましくは、これらの免疫学的に活性なリガンドは、免疫活性のあるエフェクター細胞の表面上の抗原に向けられることとなる。これらの場合、構築物を使用して、エフェクター細胞（Ｔ細胞やＮＫ細胞など）を、腫瘍関連抗原を持つ腫瘍細胞の近くに持ってくることによって、所望の免疫応答を引き起こすこととなる。本開示に照らせば、当分野の技術者は、従来の技術を使用してこうした構築物を容易に形成できると思われる。
【０１０６】
開示する改変された抗体と共に使用できる別のクラスの適合する細胞毒は、効率的に腫瘍細胞に向けることができる放射線増感薬物である。こうした薬物は、電離放射線に対する感受性を増強し、それによって、放射線療法の効率を増大させる。腫瘍細胞によって内部に取り入れられた抗体複合体は、放射線増感作用が最大となるであろう核のより近くに、放射線増感剤を送達することとなる。結合されていない放射線増感剤を連結された改変された抗体は、血液から急速に取り除かれ、標的腫瘍中に残留する放射線増感作用薬は局所化され、正常組織中の取り込みは最小限にされることとなる。血液からの急速クリアランスの後、補助放射線療法は、次の３つの方法のうちの１つで施されることとなる：１．）腫瘍に特異的に向けられる外照射、２．）腫瘍に直接埋め込まれる放射能、または３．）同じ標的抗体を用いる全身放射線免疫治療。潜在的に関心が持たれるこの方法の変形形態は、放射線増感させられた免疫複合体への治療用ラジオアイソトープの付着（それによって、患者に単一の薬物を投与するという便宜がもたらされる）であろう。
【０１０７】
本発明の主な利点は、開示する抗体が結合形で使用されても、非結合形で使用されても、骨髄抑制が起こっている患者、特に、補助治療（放射線療法や化学療法など）を受けている、あるいは受けていた患者において、これらの抗体を使用できることであることはいうまでもない。すなわち、改変された抗体の有益な送達プロフィール（すなわち比較的に短い血清滞留時間および増強された局在）は、赤色骨髄の蓄えが減少し、骨髄毒性に影響されやすい患者を治療するために特に有用となる。この点に関しては、改変された抗体の特有の送達プロフィールは、骨髄抑制が起こっている癌患者への放射標識された結合体投与のために非常に有効となる。したがって、改変された抗体は、以前に補助治療（例えば外照射または化学療法）を受けたことのある患者において、結合形または非結合形  で有用である。他の好ましい実施形態では、改変された抗体は（ここでも複合形または非複合形で）、化学療法剤を用いる組み合わせられた治療レジメンで使用されることができる。当分野の技術者であれば、こうした治療レジメンが、開示する抗体と１種または複数の化学療法剤の、逐次的な、同時の、並行した（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、または同範囲的な（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）投与を含むことができることを理解するであろう。本発明の本態様の特に好ましい実施形態は、放射標識された抗体の投与を含むこととなる。
【０１０８】
すぐ上に述べた通り、改変された抗体を投与できる一方、他の実施形態では、結合された改変された抗体および結合されていない改変された抗体を、一次治療薬として、他の点は健康な癌患者に投与できることを強調しなければならない。こうした実施形態では、改変された抗体を、新生物を患う患者に、かつ／または新生物を患っておらず、補助治療（例えば外照射や化学療法など）を過去にも現在も受けていない患者に投与できる。
【０１０９】
（本発明のポリペプチド）
本発明はさらに、図１Ｂ、９Ｆ、２１Ｂまたは２２Ｂ（配列番号２、４、６、８、２２〜２７、または２９）におけるアミノ酸配列を持つ単離されたＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチド、あるいは上記のポリペプチドの一部を含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、（一般に認識されている通り）同義であると考えられ、文脈が、ペプチド結合によって結合された少なくとも２アミノ酸の鎖を示す必要があるとき、各用語は同義的に使用されることができる。単語「ポリペプチド」は、本明細書では、１０を超えるアミノ酸残基を含有する鎖に対して使用される。オリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列はすべて、本明細書では、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれる。
【０１１０】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能のへの有意な影響無しで変化させることができることが、当分野において認識されるであろう。配列中でこうした違いが想定される場合、活性を決定するタンパク質上の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。一般に、同様の機能を果たす残基が使用されるという条件で、三次構造を形成する残基を置き換えることができる。他の例では、変更がタンパク質の重要でない領域で起こる場合、残基のタイプは全く重要でない可能性がある。
【０１１１】
したがって、本発明は、後述するタンパク質部分などのＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質の領域を含めたＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドの変形をさらに含む。こうした変異体は、欠損、挿入、逆位、繰り返し、およびタイプの置換（例えば、親水性残基を別のものに、概して、強力でない親水性を疎水性に置換する）を含む。小さい変化またはこうした「ニュートラルな」アミノ酸置換は通常、活性に対してほとんど影響を持たない。
【０１１２】
一般的に、保存的置換と考えられるものは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間での、あるものの別のものへの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの交換、酸性の残基ＡｓｐとＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇの交換、および芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１１３】
上で詳細に示したように、どのアミノ酸変化が、表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意な有害作用を持ちそうでないか）ということに関するさらなる手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に出ている。
【０１１４】
したがって、図１Ｂ、９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、２１Ｂ、または２２Ｂ（配列番号２、４、６、８、２２〜２７、または２９）のポリペプチドのフラグメント、誘導体、または類似体は、（ｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、保存されるまたは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されるアミノ酸残基）で置換され、こうした置換されたアミノ酸残基が、遺伝暗号によってコードされるものであってもなくてもよいもの、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基が、置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟したポリペプチドが、ポリペプチド（例えばポリエチレングリコール）の半減期を増大する化合物などの、別の化合物と融合されるもの、または（ｉｖ）付加アミノ酸が、ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチドあるいはリーダーまたは分泌配列などの成熟ポリペプチド、あるいは成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列に融合されるものであり得る。こうしたフラグメント、誘導体、および類似体は、本明細書の教示から、当分野の技術者の範囲内であると考えられる。
【０１１５】
機能にとって不可欠な、本発明のＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質中のアミノ酸は部位特異的突然変異誘発またはアラニン−スキャニング突然変異誘発などの当技術分野で知られた方法によって同定できる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子中のあらゆる残基に単一のアラニン突然変異を導入するものである。得られた変異体分子を、その後、生物活性について試験する。リガンド−受容体結合にとって重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識などの構造分析によって決定できる（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０１１６】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形で提供される。「単離されたポリペプチド」は、その本来の環境から取り出されたポリペプチドを指す。したがって、生成されるかつ／または組換え型宿主細胞内に含有されるポリペプチドは、本発明の目的を達成するために単離されるものと考えられる。また、組換え型宿主細胞から部分的にまたは実質的に精製されたポリペプチドは、「単離されたポリペプチド」と意図される。
【０１１７】
当技術分野で知られた様々な方法論を利用して、本発明のどの単離されたポリペプチドも得ることができる。最も簡単には、アミノ酸配列は、市販品として入手できるペプチド合成機を使用して合成されることができる。合成的に構築されるタンパク質配列は、一次、二次、または三次構造および／または立体配置特性を共有することによって、タンパク質活性を含めた、共通する生物学的性質を有することができる。この技術は、特により大きなポリペプチドの、小ペプチドおよびフラグメントを生じるのに有用である。フラグメントは、例えば、天然のポリペプチドに対する抗体を産生するのに有用である。したがって、これらは、治療用化合物のスクリーニングにおいて、また、抗体の開発のための免疫学的プロセスにおいて、天然の精製されたタンパク質に対する生物学的に活性なまたは免疫学的な代替物として使用できる。
【０１１８】
あるいは、本発明のポリペプチドは、所望のポリペプチドを発現するために変更された細胞から精製されることができる。本明細書では、細胞が、その細胞が通常生じないあるいは通常低レベルで生じるポリペプチドを生じるために遺伝子操作を介して作られる場合、その細胞は、所望のポリペプチドの発現のために変更されると言われる。当分野の技術者は、本発明のポリペプチドの１つを生じる細胞を産生するために、真核生物または原核生物の細胞に、組換え型配列または合成配列のいずれかを導入し、発現させるように、手順を容易に適合させることができる。これらには、とりわけ、上で述べたプラスミドおよび宿主細胞が含まれる。例えば、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドの組換えにより生じられた変形版（ｖｅｒｓｉｏｎ）は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０（１９８８）に記載されている一段階法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ）によって、実質的に精製されることができる。
【０１１９】
本発明のＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドには、リーダーを含むポリペプチド、リーダーを除いた成熟ポリペプチド（すなわち成熟タンパク質）；図１Ｂ（配列番号２）における約２１から約７１８までのアミノ酸を含むポリペプチド；図９Ｆ（配列番号８）における約１から約１１７９までのアミノ酸を含むポリペプチド；図９Ｆ（配列番号８）における約２１から約１１７９までのアミノ酸を含むポリペプチド；配列番号４、６、２２〜２７で示される配列を含むポリペプチド；図２２Ｂ（配列番号２９）における約２８から約３１７までのアミノ酸を含むポリペプチド；図２２Ｂ（配列番号２９）における約３７３から約４１７までのアミノ酸を含むポリペプチド；図２２Ｂ（配列番号２９）における約６７４から約６７８までのアミノ酸を含むポリペプチド；図２２Ｂ（配列番号２９）における約７４２から約７４９までのアミノ酸を含むポリペプチド、ならびに、上記のポリペプチドと、少なくとも８０％同一、好ましくは、少なくとも９０％または９５％同一、さらに好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドが含まれ、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸を有するこうしたポリペプチドの一部もさらに含まれる。
【０１２０】
２つのポリペプチドについての「類似性（％）」は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）および類似性を決定するための初期設定を使用して、２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによってもたらされる類似性スコアを指す。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列の類似性が最も高いセグメントを見つけるために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９，  １９８１）を使用する。
【０１２１】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドの基準アミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、ポリペプチド配列が、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドの基準アミノ酸の各１００個のアミノ酸あたり最高５個までのアミノ酸の変異を含む可能性があること以外は、そのポリペプチドのアミノ酸配列が基準配列と同一であることを意味する。言い換えれば、基準アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、基準配列中のアミノ酸残基の最高５％は、欠損させることができる、あるいは別のアミノ酸で置換できる、あるいは、基準配列中の全アミノ酸残基の５％までのいくつかのアミノ酸を、基準配列に挿入させることができる。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、あるいは（基準配列中の残基の中に個々に、あるいは基準配列内の１つまたは複数の隣接する群中に点在する）それらの末端位置の間のどこにでも存在することができる。
【０１２２】
実際には、例えば、任意の特定のポリペプチドが図１Ｂおよび２２Ｂ（配列番号２および２９）に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１などの既知のコンピュータプログラムを使用して、通常決定できる。特定の配列が、例えば、本発明による基準配列と９５％同一であるか決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは当然、同一性の割合が、基準アミノ酸配列の完全長にわたって算出され、基準配列中のアミノ酸残基の総数の最高５％までの相同性のギャップが可能であるようにセットされる。
【０１２３】
本発明のポリペプチドは、当分野の技術者によく知られた方法を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上あるいは分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして有用である。
【０１２４】
精製されたポリペプチドを、当分野でよく知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合アッセイで使用して、ポリペプチドに結合する分子を同定できる。これらの分子には、例えば、小分子、コンビナトリアルライブラリからの分子、抗体、または他のタンパク質が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１２５】
さらに、本発明のペプチド、またはペプチドに結合可能な分子は、毒素（例えばリシンまたはコレラ）と、あるいは細胞に対して有毒な他の化合物と複合体を形成できる。毒素−結合分子複合体は、その後、図１Ｂ、９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、２１Ｂ、または２２Ｂ（配列番号２、４、６、８、２２〜２７、または２９）のポリペプチドに対する結合分子の特異性によって、腫瘍または他の細胞を標的にする。
【０１２６】
上で詳細に記述した通り、本発明のポリペプチドは、後述するようにＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質発現を検出するための診断検査法において有用な、あるいはＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質機能を増強または抑制可能なアゴニストおよびアンタゴニストとして有用な、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を増加させるために使用できる。さらに、こうしたポリペプチドは、本発明によるアゴニストおよびアンタゴニスト候補でもあるＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質結合タンパク質を「捕獲する」ために、酵母２ハイブリッドシステム（ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ）で使用できる。酵母２ハイブリッドシステムは、Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０１２７】
（本発明のポリヌクレオチド）
本発明はまた、上記のＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子も提供する。
【０１２８】
別段の指示がない限り、本明細書に記述される各「ヌクレオチド配列」は、一連のデオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴと省略）として示される。しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチド、一連のデオキシリボヌクレオチドを指し、また、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチド、すなわち、特定のデオキシヌクレオチド配列内の各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）が、リボヌクレオチドウリジン（Ｕ）により置き換えられたリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）の対応配列を指す。例えば、デオキシリボヌクレオチド省略形を使用して記述した配列番号１の配列を有するＲＮＡ分子への言及（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、Ｇ、またはＣにより置き換えられ、各デオキシヌクレオチドＴが、リボヌクレオチドＵにより置き換えられた配列を有するＲＮＡ分子を示すためのものである。
【０１２９】
図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、および２２Ａにおけるヌクレオチド配列などの本明細書に提供される情報を用いて、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドをコードしている本発明の核酸分子は、出発原料としてｍＲＮＡを使用する、ｃＤＮＡをクローン化するためのものなど、標準のクローニングおよびスクリーニング法を使用して得ることができる。単離された核酸はまた、ベクター中でクローン化させることができ、上記の通りの当分野でよく知られた宿主細胞中で増殖させることができる。
【０１３０】
図１ＡにおけるＩＧＳＦ９の決定されたヌクレオチド配列は、図１Ａ〜１Ｂ（配列番号１〜２）に示されるヌクレオチド配列の位置１の開始コドンを伴う約１１６３アミノ酸残基のタンパク質をコードしているオープンリーディングフレーム、および約２０アミノ酸残基の予測されるリーダー配列を含有する。図１Ｂに示す通り、予測されるＩＧＳＦ９タンパク質のアミノ酸配列は、約２１アミノ酸から約７１８アミノ酸までの細胞外ドメインをさらに含有する。
【０１３１】
図８ＡにおけるＬＩＶ−１の決定されたヌクレオチド配列は、図２２Ａ〜２２Ｂ（配列番号２８〜２９）に示されるヌクレオチド配列の位置１の開始コドンを伴う約７４９アミノ酸残基のタンパク質をコードしているオープンリーディングフレーム、および約２７アミノ酸残基の予測されるリーダー配列を含有する。図２２Ｂに示す通り、予測されるＬＩＶ−１タンパク質のアミノ酸配列は、約２８アミノ酸から約３１７アミノ酸まで、約３７３アミノ酸から約４１７アミノ酸まで、約６７４アミノ酸から約６７８アミノ酸まで、および約７４２アミノ酸から約７４９アミノ酸までの細胞外ドメインをさらに含有する。
【０１３２】
上記の通り、本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形で、あるいは（例えばクローニングによって得られる、あるいは合成的に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含めて）ＤＮＡの形であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（別名センス鎖）であってもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖とも称する）であってもよい。
【０１３３】
「単離された」核酸分子（１種または複数）は、その本来の環境から取り出された核酸分子すなわちＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含有される組換え型ＤＮＡ分子は、本発明のために単離されるものとみなされる。さらに、単離されたＤＮＡ分子の例には、異種宿主細胞中で維持された組換え型ＤＮＡ分子、または、溶液中で（部分的にまたは実質的に）精製されたＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離された核酸分子は、合成的に生成されるこうした分子をさらに含む。
【０１３４】
本発明の単離された核酸分子には、図１Ａおよび２２Ａ（配列番号１および２８）に示されるヌクレオチド配列の位置１の開始コドンを伴うオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子；図１Ａおよび２２Ａ（配列番号１および２８）に示される成熟したＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１タンパク質に対するコード配列を含むＤＮＡ分子；図９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、および２１Ａ（配列番号３、５、７、および１２〜２１）に示されるコード配列を含むＤＮＡ分子；および上記のものとは実質的に異なる配列を含むが、遺伝暗号の縮重により、やはりＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質をコードしているＤＮＡ分子が含まれる。当然、遺伝暗号は、当分野でよく知られている。したがって、当分野の技術者が上記の縮重する変異体を産生することは、慣例であろう。
【０１３５】
本発明はさらに、本明細書に記載される単離された核酸分子のフラグメントを対象とする。図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）に示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントは、本明細書に述べる通りの診断用プローブおよびプライマーとして有用な、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは最低約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも３０ｎｔ、さらに好ましくは、少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントを意味する。図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）に示されるヌクレオチド配列の、全てではないにしても大抵のものに相当するフラグメントがそうであるように、当然、長さ５０〜５００ｎｔのより大きなフラグメントも、本発明では有用である。長さが少なくとも２０ｎｔのフラグメントは、例えば、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）に示されるヌクレオチド配列からの、２０以上の連続した塩基を含むフラグメントを意味する。本発明の好ましい核酸フラグメントには、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質の、エピトープをもつ部分をコードしている核酸分子が含まれる。こうした単離された分子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成による遺伝子マッピングのための、また、例えばノーザンブロット分析による、ヒト組織中でのＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。後でさらに詳細に述べるように、ある種の組織または体液中でＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１遺伝子発現の変化が検出されることは、ある種の腫瘍性疾患の指標である。
【０１３６】
別の態様では、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、上記の本発明の核酸分子中のポリヌクレオチドの一部とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドを含む本発明のポリペプチドをコードしている単離された核酸分子が提供される。「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５Ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および変性した剪断された２０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベートし、それに続いて、約６５℃の０．１Ｘ  ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを意味する：ポリヌクレオチドの「一部」とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドとは、少なくとも約１５ｎｔ、好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらに好ましくは少なくとも３０ｎｔ、さらに好ましくは約３０〜７０ｎｔの基準ポリヌクレオチドとハイブリッドを形成するポリヌクレオチド（ＤＮＡもまたはＲＮＡのいずれか）を意味する。これらは、上で、また下でさらに詳細に述べるように、診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
【０１３７】
当然、基準ポリヌクレオチドのより大きな部分（例えば長さ５０〜７５０ｎｔの部分）と、あるいは基準ポリヌクレオチドの全長と、ハイブリッドを形成するポリヌクレオチドもまた、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）に示されるヌクレオチド配列の、全てではないにしても大抵のものに相当するポリヌクレオチドがそうであるように、本発明ではプローブとして有用である。「長さが少なくとも２０ｎｔ」のポリヌクレオチドの一部分とは、例えば、基準ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの、２０以上の隣接するヌクレオチドを意味する。上記のように、こうした部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ．  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（その開示全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている通り、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技法によるプローブとして、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による標的配列の増幅のためのプライマーとして診断上有用である。
【０１３８】
ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１ヌクレオチド配列が、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）において提供されるので、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１分子の一部分とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドを産生することは、当分野の技術者にとっては慣例であろう。例えば、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１分子の音波処理による制限エンドヌクレアーゼ切断または剪断は、全長ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１分子の一部とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドである様々なサイズのＤＮＡ部分を産生するために、容易に使用することができるであろう。あるいは、本発明のハイブリッド形成ポリヌクレオチドは、既知の技術に従って合成的に産生されることができるであろう。こうしたポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）またはその補体を含有するいかなる核酸分子ともハイブリッドを形成するので、当然、ポリＡ配列（ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリヌクレオチドの３’末端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ）など）のみと、あるいはＴ（またはＵ）残基の相補的なストレッチのみとハイブリッドを形成するポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分とハイブリッドを形成するために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれないこととなる。
【０１３９】
上記のように、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドをコードしている本発明の核酸分子は、単独で成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているもの；成熟ポリペプチドおよびさらなる配列に対するコード配列、すなわち、約２０アミノ酸のリーダーまたは分泌配列をコードしているもの（プレまたはプロまたはプレプロタンパク質配列など）など；例えば、それだけには限らないが、転写、ｍＲＮＡプロセッシング−−例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含めて−−、リボソーム結合、およびｍＲＮＡの安定性において役割を果たす、転写されるが翻訳されない配列などの、イントロンおよび非コード５’および３’配列を含めて、さらなる非コード配列を伴い、上述のさらなるコード配列を伴うあるいは伴わない成熟ポリペプチドのコード配列；付加アミノ酸（さらなる機能性を提供するものなど）をコードしているさらなるコード配列を含むことができるが、これに限定されるものではない。したがって、ポリペプチドをコードしている核酸配列は、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードしている配列などのマーカー配列に融合できる。本発明のこの態様の好ましい具体例としては、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ社）中で提供されるタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くは、市販品として入手できる。例えばＧｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載される通り、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパクの好都合な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに相当する精製に有用なさらなるペプチドであり、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）に記載されている。他のこうした融合タンパクには、アミノ−またはカルボキシ末端でＩｇＧ  Ｆｃに融合するＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドが含まれる。
【０１４０】
本発明はさらに、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質の部分、類似体、または誘導体をコードしている、本発明の核酸分子の変異体に関する。天然の対立遺伝子変異体など、変異体は、天然に存在する可能性もある。「対立遺伝子変異体」とは、微生物の染色体上の所与の場所を占める遺伝子のいくつかの代替形のうちの１つを意味する。Ｇｅｎｅｓ  ＩＩ，  Ｌｅｗｉｎ，  ｅｄ．。天然に存在しない変異体は、当分野で知られた突然変異誘発技術を使用して産生することができる。
【０１４１】
こうした変異体には、ヌクレオチド置換、欠損、または付加により生成されるものが含まれる。置換、欠損、または付加は、１つまたは複数のヌクレオチドに関する可能性がある。変異体は、コードまたは非コード領域内で、あるいはこれらの両方内で変更することができる。コード領域内での変更は、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠損、または付加を生じる可能性がある。これらの中で特に好ましいものは、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質またはその一部分の特性および活性を変えないサイレントな置換、付加、および欠損である。また、この点に関して特に好ましいものは、保存的置換である。最も好ましいものは、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、および２２Ａ（配列番号１、３、５、７、および２８）に示されるアミノ酸配列を有する成熟したＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質をコードしている核酸分子である。
【０１４２】
本発明のさらなる実施形態は、（ａ）図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）における配列を有するＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；（ｂ）図１Ｂ（配列番号２）中の約２１から約７１８までの位置、図２２Ｂ（配列番号２９）中の約２８から約３１７までの位置、図２２Ｂ（配列番号２９）中の約３７３から約４１７までの位置、図２２Ｂ（配列番号２９）中の約６７４から約６７８までの位置、または図２２Ｂ（配列番号２９）中の約７４２から約７４９までの位置のアミノ酸配列を有する成熟したＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列；および（ｃ）上の（ａ）または（ｂ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
【０１４３】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドをコードしている基準ヌクレオチド配列に、少なくとも、例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドをコードしている基準ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり、最高５つまでの点突然変異を含む可能性があることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、基準配列と同一であることを意味する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、基準配列中のヌクレオチドの最高５％は、欠損させることができる、あるいは、別のヌクレオチドで置換できる、あるいは、基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのいくつかのヌクレオチドを、基準配列に挿入させることができる。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、あるいは（基準配列中のヌクレオチドの中に個々に、あるいは基準配列内の１つまたは複数の隣接する群中に点在する）それらの末端位置の間のどこにでも存在することができる。
【０１４４】
実際には、例えば、任意の特定の核酸分子が図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１などの既知のコンピュータプログラムを使用して、通常決定できる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の相同性が最も高いセグメントを見つけるために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９，  １９８１）を使用する。特定の配列が、例えば、本発明による基準配列と９５％同一であるか決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを使用する場合、パラメータは当然、同一性の割合が、基準ヌクレオチド配列の完全長にわたって算出され、基準配列中のヌクレオチドの総数の最高５％までの相同性のギャップが可能であるようにセットされる。
【０１４５】
当然、当分野の技術者であれは、遺伝暗号の縮重により、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）に示される核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を有する多数の核酸分子が、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質活性を持つポリペプチドをコードしていることを直ちに認識するであろう。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重する変異体はすべて、同じポリペプチドをコードしているので、これは、上記の比較分析を実施しなくても、当分野の技術者に明白である。縮重する変異体でないこうした核酸分子についても、相当な数がまた、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１タンパク質活性を持つポリペプチドをコードしていることが、当分野においてさらに認識されるであろう。これは、当分野の技術者が、タンパク質機能を有意には遂行しそうでない、あるいはほとんどしそうでないアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置き換えること）を完全に知っているという理由である。
【０１４６】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換体を作る方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）中に提供されており、その中で、著者は、変化に対するアミノ酸配列の耐性を研究するために、２つの主な方法が存在することを示している。第１の方法は、進化のプロセスに依存する（ただし、突然変異は、自然淘汰によって、受け入れられる、あるいは拒絶される）。第２の方法は、クローン化された遺伝子の特定の位置のアミノ酸変化、および選択またはスクリーンを導入して、機能性を維持する配列を同定するために、遺伝子工学を使用する。この著者が述べている通り、これらの研究では、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど耐性があることが認められた。この著者はさらに、どのアミノ酸変化が、タンパク質のある位置で許容的でありそうかを示している。例えば、大抵の埋め込まれた（ｂｕｒｉｅｄ）アミノ酸残基は、無極性の側鎖を必要とするのに対し、表面側鎖の少数の特徴は通常、保存される。他のこうした表現型的にサイレントな置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，およびその中の引用文献中に記載されている。
【０１４７】
（癌の診断および治療）
本発明のポリペプチドは、癌細胞産生、増殖、または転移に関与する可能性がある。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在または量の検出は、１つまたは複数のタイプの癌の診断および／または予後に有用である可能性がある。例えば、本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの存在または発現増加は、癌の遺伝的リスク、前癌状態または進行中の悪性腫瘍を示唆する可能性がある。逆にいえば、遺伝子の欠損またはポリペプチドの欠如が、癌状態に関連する可能性がある。癌に関連する単一ヌクレオチド多型または癌の素因の識別はまた、診断または予後に有用である可能性がある。
【０１４８】
癌治療は、腫瘍細胞増殖を抑制する、血管形成（腫瘍成長を支持するのに必要である新規の血管の増殖）を抑制する、かつ／または、腫瘍細胞の運動性または侵襲性を低下させることにより転移を妨げることによって腫瘍退縮を促進する。本発明の治療用組成物は、固形段階の腫瘍／悪性腫瘍を含めて成人および小児腫瘍、小細胞癌および非小細胞癌を含めた肺癌、小細胞癌および腺管癌を含めた乳癌、食道癌を含めた消化管癌、胃癌、大腸癌、結腸直腸癌および結腸直腸新生物に関連するポリープ、膀胱癌および前立腺癌を含めた泌尿器癌、ならびに卵巣悪性腫瘍、（子宮内膜を含めて）子宮癌、および卵胞中の固形腫瘍を含めた女性生殖器の悪性腫瘍に有効であり得る。
【０１４９】
（本発明のポリペプチドの生物活性の阻害剤および刺激因子を含めて）本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体（またはその抗原結合フラグメント）、またはポリペプチドのモジュレーターは、癌を治療するために投与できる。治療用組成物は、単独で、あるいは癌の補助療法（手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、およびレーザ療法など）と組み合わせて、治療上有効な投薬量で投与することができ、有益効果（例えば、腫瘍サイズを低下させること、腫瘍増殖の速度を遅らせること、転移を抑制すること、あるいは、必ずしも癌を根絶せずに全体的な臨床状態を改良することなど）を提供できる。
【０１５０】
組成物はまた、抗癌カクテルの一部として、治療有効量で投与することもできる。抗癌カクテルは、送達のために薬学的に許容される担体に加えて、１種または複数の抗癌剤と、本発明のポリペプチドまたはモジュレーターとを含む混合物である。癌治療薬としての抗癌カクテルの使用は、慣例である。当分野でよく知られており、本発明のポリペプチドまたはモジュレーターと組み合わせて治療薬として使うことができる抗癌剤には、以下が含まれる：アクチノマイシンＤ、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、カロラムブシル（Ｃｈａｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、シスプラチン（シスＤＤＰ）、シクロホスファミド、シタラビンＨＣｌ（シトシンアラビノシド）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンＨＣｌ、リン酸エストラムチンナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロクスウリジン、５‐フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、フルタミド、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類似体）、ロムスチン、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、マイトマイシン、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、クエン酸タモキシフェン、チオグアニン、チオテパ、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、アムサクリン、アザシチジン、ヘキサメチルメラミン、インターロイキン２、ミトグアゾン、ペントスタチン、セムスチン、テニポシド、および硫酸ビンデシン。
【０１５１】
さらに、本発明の治療用組成物は、癌の予防療法のために用いることができる。個体が癌を発症する素因となる、当技術分野で知られた遺伝的条件および／または環境的状況（例えば発癌物質への暴露）が存在する。これらの状況下では、癌を発症する危険を低下させるために、治療上有効な用量の本発明のポリペプチドを用いてこれらの個体を治療することが有益であるだろう。
【０１５２】
潜在的な癌治療薬としての本発明のポリペプチドの有効量を決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いることができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルには、培養腫瘍細胞の増殖アッセイ；軟寒天中での培養腫瘍細胞の増殖（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｗｉｌｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  Ｃｈ１８  ａｎｄ  Ｃｈ２１を参照）；Ｇｉｏｖａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ  Ｉｎｓｔ．５２：９２１−３０（１９７４）に記載されている通りのヌードマウスにおける腫瘍系；Ｐｉｌｋｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：４１０７−９（１９９７）に記載される通りのボイデンチャンバーアッセイにおける腫瘍細胞の可動性および浸潤可能性；ならびに、それぞれＲｉｂａｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｌ．Ｊ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４０：１１８９−９７（１９９９）、およびＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １７：４２３−９（１９９９）に記載される通りの鶏卵（ｃｈｉｃｋ）漿尿膜の血管系の誘導または血管内皮細胞移動の誘導などの血管形成アッセイが含まれる。例えば、適切な腫瘍細胞系統は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログから入手可能である。
【０１５３】
しかし、上で示した通り、本発明の選択された実施形態は、癌患者への改変された抗体の投与、あるいは放射線療法または化学療法などの１種または複数の補助治療と組み合わせたあるいは連携した投与（すなわち組み合わされた治療レジメン）を含む。本明細書では、補助治療と連携したあるいは組み合わせた、改変された抗体の投与は、治療および開示された抗体の逐次的な、同時の、同範囲的な（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）、並行した（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）、共働の、または同時性の（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）投与または適用を意味する。当分野の技術者であれば、組み合わされた治療レジメンの様々な成分の投与または適用がおそらく、治療の全体的な効果を増強するために時間調節されるであろうことを理解するであろう。例えば、化学療法剤を、治療の標準のよく知られた過程で投与し、２、３週以内に本発明の放射性免疫結合（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）がそれに続くであろう。逆に、細胞毒と結合された改変された抗体を、静脈内に投与し、腫瘍局所的な外照射がそれに続くであろう。さらに他の実施形態では、改変された抗体は、一回の外来診療で、１種または複数の選択された化学療法剤と同時に投与できる。当分野の技術者（例えば経験豊かな腫瘍学者）であれば、この明細書の選択された補助治療および教示に基づいて、過度の実験を行わなくとも有効な組み合わされた治療レジメンを容易に見つけることができるだろう。
【０１５４】
この点に関しては、改変された抗体（細胞毒を伴うまたは伴わない）と化学療法剤の組み合わせは、患者に治療的利益を提供する任意の期間内に、どんな順序でも投与できることはいうまでもない。すなわち、化学療法剤と改変された抗体は、任意の順序で、あるいは同時に投与できる。選択された実施形態では、本発明の改変された抗体は、以前に化学療法を受けている患者に投与される。さらに他の実施形態では、改変された抗体と化学療法治療薬は、実質的に同時にまたは並行して投与される。例えば、患者は、化学療法の過程を受けながら、改変された抗体を投与されることができる。好ましい実施形態では、改変された抗体は、任意の化学療法剤または治療の１年以内に投与されることとなる。他の好ましい実施形態では、改変された抗体は、任意の化学療法剤または治療の１０、８、６、４、または２ヵ月以内に投与されることとなる。さらに他の好ましい実施形態では、改変された抗体は、任意の化学療法剤または治療の４、３、２、または１週以内に投与されることとなる。さらに他の実施形態では、改変された抗体は、選択された化学療法剤または治療の５、４、３、２、または１日以内に投与されることとなる。２つの薬剤または治療を、数時間または数分内に（すなわち実質的に同時に）患者に投与できることがさらに理解されよう。
【０１５５】
この点に関しては、本発明の改変された抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖を排除する、低下させる、抑制する、あるいは制御する（例えば、組み合わされた治療レジメンを提供するための）任意の化学療法剤または薬剤またはレジメンと連携してあるいは組み合わせて使用できることがさらに理解されよう。先に述べた通り、こうした薬剤はしばしば、赤色骨髄の蓄え（ｒｅｓｅｒｖｅ）の減少をもたらす。この減少は、こうした患者における新生物の積極的な治療を好都合にも可能にする本発明の化合物の減弱された骨髄毒性によって、全体的にあるいは部分的に相殺できる。他の好ましい実施形態中では、本明細書に開示される放射標識された免疫複合体を、放射性核種に対する腫瘍細胞の感受性を増大させる放射線増感剤と共に、効率的に使用できる。例えば、放射標識された改変された抗体が大部分は血流から取り除かれたが、依然として１つまたは複数の腫瘍の部位には治療上有効なレベルで残留させた後に、放射線増感化合物を投与できる。
【０１５６】
これらの本発明の態様に関して、本発明と適合する典型的な化学療法剤には、アルキル化剤、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキセートおよびプレドニソンが含まれる。４種複合製剤ＭＯＰＰ（メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジン、およびプレドニソン）は、様々な形のリンパ腫を治療するのに非常に有効であり、本発明の好ましい実施形態を含む。ＭＯＰＰ耐性の患者では、ＡＢＶＤ（例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロランブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニソン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ＋ＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびビンブラスチン）、またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニソン）合剤を使用できる。ＨＡＲＲＩＳＯＮ’Ｓ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ  １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １３ｔｈ  ｅｄ．１９９４）内の、Ａｒｎｏｌｄ  Ｓ．  Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ｍ．  Ｎａｄｌｅｒ，  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、ならびにＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）、ならびに標準の投薬およびスケジューリングについてその中に引用されている参考文献。これらの治療法は、元のままで使用してもよいし、本明細書に記述する通りの１種または複数の改変された抗体と組み合わせて、特定の患者に対して必要に応じて変更することもできる。
【０１５７】
本発明にとって有用なさらなるレジメンには、シクロホスファミドまたはクロランブシルなどの単一のアルキル化剤、あるいは、以下の合剤の使用が含まれる：ＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニソン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、およびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰ＋プロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰ＋メトトレキセート、ブレオマイシン、およびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニソン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、およびロイコボリン＋標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニソン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキセート、およびロイコボリン）、ならびにＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、一定用量のプレドニソン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）など。当分野の技術者であれば、これらのレジメン各々に対する標準の投薬量およびスケジューリングを決定することが直ちに可能であるだろう。ＣＨＯＰはまた、ブレオマイシン、メトトレキセート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド、およびエトポシドと組み合わされている。他の適合する化学療法剤には、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコホルマイシン、およびフルダラビンが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１５８】
本発明の改変された抗体と組み合わせて使用される化学療法剤の量は、被検者によって変化させることもできるし、当技術分野で知られているものに従って投与してもよい。例えば、ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  １２３３−１２８７（（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ９ｔｈ  ｅｄ．１９９６）内の、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓを参照のこと。
【０１５９】
前述の通り、本発明の改変された抗体、免疫反応性フラグメント、またはその組換え体は、哺乳類の悪性腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ治療に対して薬学的に有効な量で投与できる。この点に関しては、開示する抗体が、投与を容易にし、かつ活性剤の安定性を増進するように処方されることはいうまでもない。好ましくは、本発明の薬剤組成物は、生理食塩水、非毒性の緩衝液、防腐剤などの、薬学的に許容される非毒性で無菌の担体を含む。本出願の目的では、治療薬に結合された、あるいは結合されていない改変された抗体、免疫反応性フラグメント、またはそれらの組換え体の薬学的に有効な量は、腫瘍細胞上の選択された免疫反応性抗原との有効な結合を達成し、これらの細胞の死を増加させるのに十分な量を意味するものとする。当然、本発明の薬剤組成物は、薬学的に有効な量の改変された抗体を提供するために、単回投与または複数回投与で投与できる。
【０１６０】
より詳細には、開示する抗体および方法は、腫瘍サイズを低下させる、腫瘍成長を抑制する、かつ／または、担癌動物の生残時間を延長するのに有用でなければならない。したがって、本発明はまた、こうしたヒトまたは動物に、有効な、非毒性の量の改変された抗体を投与することによって、ヒトまたは他の動物における腫瘍を治療する方法にも関する。当分野の技術者は、悪性腫瘍を治療するための、改変された抗体の有効な非毒性の量を、ルーチン試験によって、決定することが可能であろう。例えば、改変された抗体の治療的に活性な量は、疾患の段階（例えば、ステージＩに対するステージＩＶ）、年齢、性別、内科的合併症（例えば免疫抑制性状態または疾患）および被検者の体重、ならびに抗体の被検者中で所望の応答を誘発する能力などの因子によって変わり得る。投与計画は、最善の治療効果を提供するように調整できる。例えば、毎日、数回に分けて投与することもできるし、治療状態の緊急性により示されるように、用量を比例的に減少させることもできる。しかし通常、有効な投薬量は、１日あたり体重１キログラムにつき約０．０５から１００ミリグラム、好ましくは１日あたり体重１キログラムにつき約０．５から１０ミリグラムの範囲であると予測される。
【０１６１】
本開示の範囲に合わせて、本発明の改変された抗体は、治療または予防程度の影響を生じるのに十分な量で、上述の治療方法に従って、ヒトまたは他の動物に投与できる。本発明の抗体は、既知の技術に従って、本発明の抗体を、通常の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより調製される通常の剤形で、こうしたヒトまたは他の動物に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形および特徴が、それと組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数により決定されることが、当分野の技術者には認識されるであろう。当分野の技術者であれば、本発明によるモノクローナル抗体の１種または複数の種を含むカクテルが特に有効であると判明する可能性があることをさらに理解するであろう。
【０１６２】
抗体、免疫反応性フラグメント、またはそれらの組換え体の結合体、および治療薬を調製して投与する方法は、当分野の技術者によってよく知られている、あるいは容易に決定される。本発明の抗体（またはそのフラグメント）の投与経路は、経口、非経口、吸入、または局所であり得る。本明細書では、用語「非経口」には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣投与が含まれる。静脈内、動脈内、皮下、および筋肉内の形の非経口投与が、通常好ましい。これらの形の投与はすべて、明らかに本発明の範囲内であるものと考えられるが、好ましい投与の形は、注射用の、特に、静脈内または動脈内注射または点滴用の溶液であるだろう。通常、注射に適した薬剤組成物は、緩衝液（例えば酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意選択で安定剤（例えばヒトアルブミン）などを含むことができる。しかし、本明細書の教示と適合する他の方法では、改変された抗体を、悪性腫瘍部位の部位に直接送達し、それによって、腫瘍性組織の治療薬への暴露を増大させることができる。
【０１６３】
非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、食塩水および緩衝培地を含めて、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。主題発明では、薬学的に許容される担体には、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％食塩水が含まれるが、これに限定されるものではない。他の一般的な非経口賦形剤には、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が含まれる。静脈内の賦形剤には、流体および栄養補充薬、電解質補充薬、リンゲルのブドウ糖を主成分とするものなどが含まれる。抗菌物質、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、防腐剤および他の添加物も、存在可能である。
【０１６４】
より詳細には、注射可能な用途に適した薬剤組成物には、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌粉末が含まれる。こうした場合では、組成物は無菌であり、かつ簡単な注射性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して維持されることが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は必要な粒度の維持によって、また、界面活性剤の使用によって維持できる。
【０１６５】
微生物の作用の予防は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって成し遂げることができる。多くの場合、組成物中に、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続性の吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１６６】
いずれにせよ、無菌の注射可能な溶液は、本明細書に列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に、必要な量の活性な化合物（例えば、単独または他の活性剤と組み合わせた改変された抗体）を適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、濾過滅菌を続けることによって調製できる。通常、分散液は、活性な化合物を、無菌の賦形剤に組み込むことにより調製され、これは、基本的な分散媒および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調整法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、そのあらかじめ滅菌フィルター処理した溶液から、活性成分プラスいずれかのさらなる所望の成分の粉末がもたらされる。注射用の調製物は、当技術分野で知られた方法に従って、無菌条件下で製造され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、またはバイアルなどの容器に充填され、密封される。さらに、調製物は、梱包し、同時係属中のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９３３７およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９３３８（それぞれ参照により本明細書に組み込む）に記載されているものなどのキットの形で販売できる。こうした製品は、付随する組成物が、癌、悪性腫瘍、または腫瘍性疾患を患うあるいはこれらの素因がある被検者を治療するのに有用であることを示すラベルまたは添付文書を備えていることが好ましい。
【０１６７】
上で詳細に述べた通り、本発明は、その治療を必要とする哺乳類の被検者における腫瘍性疾患の治療のための化合物、組成物、キット、および方法を提供する。被検者は、ヒトであることが好ましい。腫瘍性疾患（例えば癌および悪性腫瘍）は、黒色腫、神経膠腫、肉腫、および癌腫などの固形腫瘍、ならびにリンパ腫および白血病などの骨髄性または血液学的な悪性腫瘍を含む可能性がある。一般に、癌細胞を標的にすることを可能にする抗原性マーカーとしてＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を含有するいずれの新生物も、開示する本発明を使用して、改変された抗体によって予防的または治療的に処置できる。治療できる典型的な癌には、前立腺、大腸、乳房、卵巣、および肺癌が含まれるが、これに限定されるものではない。上述の腫瘍性疾患に加えて、開示する本発明を好都合に用いて、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１をもつさらなる悪性腫瘍を治療することもできることは言うまでもない。
【０１６８】
（受容体／リガンド活性）
本発明のポリペプチドは、また、受容体、受容体リガンド、または阻害剤、あるいは受容体／リガンド相互作用のアゴニストとしての活性を示すことができる。本発明のポリヌクレオチドは、こうした特性を示すポリペプチドをコードすることができる。こうした受容体およびリガンドの例には、これに限定されるものではないが、サイトカイン受容体およびそのリガンド、受容体キナーゼおよびそのリガンド（これに限定されるものではないが、例えばセレクチン、インテグリンなどの細胞接着分子、およびそのリガンドを含めて）、ならびに、抗原提示、抗原認識、および細胞性および液性免疫応答の発現に関与する受容体／リガンド対が含まれる。受容体およびリガンドはまた、関連する受容体／リガンド相互作用の潜在的ペプチドまたは小分子阻害剤のスクリーニングにも有用である。本発明のポリペプチド（受容体およびリガンドのフラグメントを含むが、これに限定されるものではない）は、受容体／リガンド相互作用の阻害剤としてそれ自体で有用であり得る。
【０１６９】
本発明のポリペプチドの受容体−リガンド活性を決定するための適切なアッセイには、以下に記載されるものが含まれるが、これに限定されるものではない：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ，Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｈａｐｔｅｒ  ７．２８、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ７．２８．１〜７．２８．２２）、Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６８６４−６８６８，  １９８７；Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５−１１５６，  １９８８；  Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９−１６０  １９８９；  Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５６−９８，  １９９４；  Ｓｔｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０，  １９９５。
【０１７０】
例えば、本発明のポリペプチドを、リガンド（１つまたは複数）に対する受容体として使用し、それによって、そのリガンド（１つまたは複数）の生物活性を伝えることができる。リガンドは、結合アッセイ、アフィニティークロマトグラフィー、二遺伝子雑種スクリーニングアッセイ、ＢｌＡｃｏｒｅアッセイ、ゲルオーバーレイアッセイ、または当技術分野で知られた他の方法を介して同定できる。
【０１７１】
アゴニストまたはアンタゴニストまたは部分アゴニストまたは部分的アンタゴニストとしての薬物またはタンパク質を特徴づける研究には、競合するリガンドとしての他のタンパク質の使用が必要である。本発明のポリペプチドまたはそのリガンドは、従来方法によって、ラジオアイソトープ、比色定量分子、または毒素分子に連結させることによって標識できる。（”Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｍｕｒｒａｙ  Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（ｅｄ）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １８２（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。ラジオアイソトープの例には、トリチウムおよび炭素１４が含まれるが、これに限定されるものではない。比色定量分子の例には、フルオレサミンなどの蛍光分子、またはローダミンあるいは他の比色定量分子が含まれるが、これに限定されるものではない。毒素の例には、リシンが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１７２】
（受容体活性ためのアッセイ）
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えばリガンドまたは受容体）の特異的な結合を検出するための方法を提供する。この技術は、本発明の受容体ポリペプチドに対するこれまでに知られていない結合パートナーを同定するのに特に有用な多数のアッセイを提供する。例えば、哺乳類または細菌の細胞を使用する発現クローニングまたは二遺伝子雑種スクリーニングアッセイを用いて、結合パートナーをコードしているポリヌクレオチドを同定できる。もう一つの例として、本発明の適切な固定されたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを用いて、本発明のポリペプチドを認識して結合するポリペプチドを単離できる。本発明のポリペプチドの生物活性を調整する（すなわち、増大させるあるいは減少させる）化合物、特に小分子を同定するために使用される多くの異なるライブラリが存在する。本発明の受容体ポリペプチドに対するリガンドはまた、本発明の受容体の発現を除いて遺伝的に同一である２つの細胞集団（片方の細胞集団は、本発明の受容体を発現するのに対し、もう片方は発現しない）に、外因性リガンドまたはリガンドのカクテルを加えることによって同定できる。リガンドの追加に対する２つの細胞集団の反応を、その後比較する。あるいは、発現ライブラリは、細胞中で本発明のポリペプチドと同時発現させることができ、潜在的なリガンド（１つまたは複数）を同定するために、自己分泌反応について検定することができる。さらに別の例として、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、ゲルオーバーレイアッセイ、または当技術分野で知られた他の方法を用いて、以下を含めた結合パートナーポリペプチドを同定できる：（１）有機および無機の化学ライブラリ、（２）天然物ライブラリ、および（３）ランダムペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子からなるコンビナトリアルライブラリ。
【０１７３】
本発明のポリペプチドのシグナル伝達カスケードにおける下流の細胞内シグナル伝達分子の役割を決定することができる。例えば、そのリガンドが同定されている、本発明のポリペプチドの細胞質ドメインがタンパク質の細胞外部分に融合されたキメラタンパク質は、宿主細胞中で産生される。その後この細胞を、キメラタンパク質の細胞外部分に特異的なリガンドと共にインキュベートし、それによって、キメラ受容体を活性化させる。細胞内シグナル伝達に関与する既知の下流タンパク質を、予測される修飾、すなわちリン酸化について、その後検定することができる。当分野の技術者に知られている他の方法を用いて、受容体活性に関与するシグナル伝達分子を同定することもできる。
【０１７４】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
本発明の別の態様は、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはフラグメント、類似体、あるいはそれらの誘導体とハイブリッド形成可能な、あるいはこれらと相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。アンチセンス核酸は、タンパク質をコードしているセンス核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドあるいはコード鎖全体に対して、あるいはその一部のみに対して相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が提供される。図１Ｂ、９Ｂ、９Ｄ、９Ｆ、２１Ｂ、または２２Ｂ（配列番号２、４、６、８、２２〜２７、または２９）のタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体、および類似体をコードしている核酸分子、あるいは、図１Ａ、９Ａ、９Ｃ、９Ｅ、９Ｈ、２１Ａ、または２２Ａ（配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）の核酸配列に対して相補的なアンチセンス核酸が、さらに提供される。
【０１７５】
一実施形態では、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖のコード領域に対するアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。別の実施形態では、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域の側面に位置する５’および３’配列を指す（すなわち５’および３’非翻訳領域とも称される）。
【０１７６】
この開示では、用語「アンチセンス核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド構造などの天然に見られるタイプのオリゴマー核酸部分と、天然に見られる核酸に結合可能な人工類似体との両方を包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって、あるいはメチルホスホネート、ホスホロチオネート、または他の結合により連結される類似体によって連結されるリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーに基づくことができる。これらはまた、基本構造が変更されている、あるいは他の改変を受けているが、依然として、天然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡ構造に結合する能力を保持するモノマー部分を含むことができる。
【０１７７】
本明細書に開示する核酸をコードしているコード鎖配列（例えば配列番号１、３、５、７、１２〜２１、または２８）を考慮して、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎとＣｒｉｃｋの法則またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対に従って設計できる。アンチセンス分子は、ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であってもよいが、好ましくは、ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲のコードまたは非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のヌクレオチド長であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さを選択するためには、最も有利な特性を得るようにバランスを保たれなければならない。１０〜１５塩基のより短い長さのオリゴヌクレオチドは、容易に細胞に入るが、遺伝子特異性が低い。対照的に、２０〜３０塩基のより長いオリゴヌクレオチドは、優れた遺伝子特異性を与えるが、細胞への取り込みの速度の低下が示される。”Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−−Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  Ｃｏｈｅｎ，  Ｅｄ．ＭｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ（１９８８）内、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＨＯＳＰＨＯＲＯＴＨＩＯＡＴＥ  ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳを参照のこと。
【０１７８】
本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で知られた手順を使用している化学合成または酵素による結合反応を使用して構築できる。例えば、アンチセンス核酸は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは、分子の生物学的安定性を増大するように、あるいはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大するように設計された様々に改変されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成できる（例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用できる。
【０１７９】
アンチセンス核酸を生成するために用いることができる改変されたヌクレオチドの例には、以下が含まれる：５‐フルオロウラシル、５‐ブロムウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンタニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２、２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、疑似ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、その中で核酸が、アンチセンス方向にサブクローニングされる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下のサブセクションでさらに記述される、当該の標的核酸に対してアンチセンス方向のものとなるであろう）発現ベクターを使用して、生物学的に生成できる。
【０１８０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、一般的に、被検者に投与される、あるいは、本発明によるタンパク質をコードしている細胞のｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッドを形成する、あるいはこれらと結合し、それによって、（例えば転写および／または翻訳を抑制することによって）タンパク質の発現を抑制するように、ｉｎ  ｓｉｔｕ生成される。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によるもの、あるいは、例えば、ＤＮＡ二重らせんに結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特定の相互作用を介するものであり得る。アンチセンス核酸分子の投与経路の例は、選択された細胞を標的にするために改変することができ、その後全身的に投与することができる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面の受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、それが、選択された細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するように改変できる。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書に記載されるベクターを使用して、細胞に送達できる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるようなベクター構築物が好ましい。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的なＲＮＡと、特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは、通常のβ−単位に反して、鎖は、互いと平行になる（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６６２５−６６４１（１９８７））。アンチセンス核酸分子は、また、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１５：３２７−３３０（１９８７））を含むことができる。
【０１８２】
（腫瘍ワクチン）
本発明のペプチドまたはその類似体は、腫瘍性疾患を治療または予防するために、ワクチンの組成物の形で用いることができる。免疫刺激活性を持つ本発明のペプチドまたはその類似体は、改良された血清半減期以外の所望の特性を提供するために改変できる。例えば、ＣＴＬ活性を誘発するペプチドの能力を、ヘルパーＴ細胞応答を誘発することが可能な少なくとも１種のエピトープを含有する配列への結合によって増強することができる。特に好ましい免疫原性ペプチド／ヘルパーＴ結合体は、スペーサー分子により連結される。スペーサーは一般的に、アミノ酸または疑似アミノ酸などの、比較的に小さい中性の分子からなるが、これらは、生理学的条件下では実質的に荷電しておらず、また、線状または枝分かれした側鎖を持つ可能性がある。スペーサーは、例えば、無極性のアミノ酸のＡｌａ、Ｇｌｙ、または他の中性のスペーサー、あるいは中性の極性アミノ酸から一般的に選択される。スペーサーは任意選択で存在し、同じ残基からなる必要はなく、ヘテロまたはホモオリゴマーであり得ることが理解されよう。存在する場合、スペーサーは通常、少なくとも１または２残基、より一般には３から６残基である。あるいは、ＣＴＬペプチドは、スペーサー無しでヘルパーＴペプチドに連結できる。
【０１８３】
免疫原性ペプチドは、直接、あるいはＣＴＬペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のスペーサーを介して、ヘルパーＴペプチドに連結できる。免疫原性ペプチドまたはヘルパーＴペプチドのアミノ末端は、アシル化することができる。典型的なヘルパーＴペプチドには、破傷風トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリアスポロゾイト周囲３８２〜３９８および３７８〜３８９が含まれる。
【０１８４】
ある実施形態では、本発明のワクチンの組成物中に、少なくとも１種の免疫賦活性の成分を含むことが、望ましい可能性がある。したがって、本発明はまた、いくつかの態様において、非核酸アジュバントの使用を含む。ある実施形態では、非核酸アジュバントは、デポ効果をもたらすアジュバント、免疫刺激的なアジュバント、またはデポ効果をもたらし、かつ免疫系を刺激するアジュバントである。好ましくは、デポ効果を引き起こすアジュバントは、鉱油、非鉱油、油中水型または水中油型エマルジョンを含めたミョウバン（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルジョンベースの調合物（Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントなど）；ＭＦ−５９；およびＰＲＯＶＡＸ（商標）からなる群から選択される。より好ましい実施態様では、免疫賦活剤は、ＰＲＯＶＡＸ（商標）である。
【０１８５】
ある実施形態では、免疫刺激アジュバントは、Ｑ．サボンソウの木の樹皮から精製されるサポニン（ＱＳ２１など）；リポポリサッカリド（モノホスホリル脂質（ＭＰＬ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、およびスレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）など）のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体；ＯＭ−１７４；およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ延長因子からなる群から選択される。一実施形態では、デポ効果をもたらし、免疫系を刺激するアジュバントは、ＩＳＣＯＭＳ；ＳＢ−ＡＳ２；ＳＢ−ＡＳ４；ミセルを形成する非イオン性のブロックコポリマー（ＣＲＬ  １００５など）；およびシンテックスアジュバント調合物（Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）からなる群から選択される。
【０１８６】
免疫原性ペプチドは、合成的に、あるいは組換えＤＮＡ技術によって調製することもできるし、完全なウイルスまたは腫瘍などの天然の供給源から単離することもできる。ペプチドは、好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそのフラグメント実質的に含まないこととなるが、ある実施形態では、ペプチドを、天然のフラグメントまたは粒子に合成的に接合することができる。これらのポリペプチドまたはペプチドは、様々な長さであり得、その中性の（荷電していない）形でも、塩の形でもよく、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの改変がなくても、改変（その改変によって、本明細書に記載される通りのポリペプチドの生物活性が破壊されないような条件に従うもの）が含まれてもよい。
【０１８７】
あるいは、組換えＤＮＡ技術を使用することができ、そこでは、当該の免疫原性ペプチドをコードしているヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換または形質移入され、発現に適した条件下で培養される。これらの手順は、一般に、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）に記載されているように、通常、当技術分野で知られている。したがって、本発明の１種または複数のペプチド配列を含む融合タンパク質は、適切なＴ細胞エピトープを提示するために用いることができる。
【０１８８】
本発明のペプチドおよびその薬剤およびワクチン組成物は、新生物を治療するために、哺乳類、特にヒトに投与するのに有用である。本発明の免疫原性ペプチドを使用して治療できる腫瘍疾患の例には、肺、卵巣、乳房、および前立腺癌が含まれる。
【０１８９】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、抗原に対する免疫応答を誘発し、それによって、患者の自身の免疫応答能力を増強するために、ウイルス感染または癌に罹りやすいあるいはそのリスクがある患者に投与される。こうした量は、「免疫原的に有効な量」と定義される。この使用では、厳密な量はここでも、患者の健康状態および体重、投与様式、調合物の性質などに依存するが、一般に７０キログラムの患者につき約１．０μｇから約５０００μｇの範囲、より一般には体重７０ｋｇあたり約１０μｇから約５００μｇ  ｍｇの範囲である。
【０１９０】
治療または免疫化目的のために、本発明のペプチドはまた、弱毒化されたウイルスの宿主（例えば牛痘または鶏痘）によって発現させることもできる。この方法は、本発明のペプチドをコードしているヌクレオチド配列を発現するために、ベクターとしての牛痘ウイルスの使用を伴う。急性または慢性的に感染している宿主への導入、または感染していない宿主への導入の後、組換え型牛痘ウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主のＣＴＬ応答を誘発する。例えば、免疫化プロトコルに有用な牛痘ベクターおよび方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。もう一つのベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、参照により本明細書に組み込まれる（Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化に有用な非常に様々な他のベクター、例えばチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクターなどは、本明細書の記述から、当分野の技術者には明らかとなるであろう。
【０１９１】
同様に、抗原ペプチドは、生体外でＣＴＬを誘発するために用いることができる。得られるＣＴＬを用いて、治療法の他の通常の形に応答しない、あるいは治療のペプチドワクチン方法に応答しない患者において、慢性の（ウイルスまたは細菌の）感染症または腫瘍を治療できる。特定の病原体（感染因子または腫瘍抗原）に対する生体外ＣＴＬ応答は、抗原提供細胞（ＡＰＣ）の供給源および適切な免疫原性ペプチドと共に、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を組織培地でインキュベートすることによって誘発される。適切なインキュベーション時間（一般的に１〜４週）（ＣＴＬｐは、活性化され、成熟し、エフェクターＣＴＬに発達する）の後、細胞は、患者に戻され、その特定の標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破壊することとなる。
【０１９２】
ペプチドにはまた、診断用薬としての用途を見いだすこともできる。例えば、本発明のペプチドを用いて、ペプチドまたは関連するペプチドを使用する治療レジメンに対する特定の個体の感受性を決定することができ、したがって、これは、既存の治療プロトコルの改変に、あるいは罹患者の予後の決定に有用であり得る。さらに、このペプチドはまた、どの人が、慢性の感染症を発症する実質的なリスクをもつかについて予測するために用いることができる。
【０１９３】
（抗イディオタイプ抗体）
本発明はまた、腫瘍免疫療法および免疫予防ための抗イディオタイプ抗体を利用する方法を対象とする。本発明は、治療的利点のための免疫系のイディオタイプネットワークの操作に関する。抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を用いる免疫化は、抗−抗イディオタイプの免疫グロブリンの形成を誘導でき、そのうちのいくつかは、抗イディオタイプを誘導するために使用する抗体（Ａｂ１）と同じ抗原特異性を持つ。これは、免疫系における抗原特異的な認識物を産生および増幅するための機構を提供することによって、免疫応答の操作ための強力な方法をもたらす。腫瘍に対する免疫応答は、腫瘍抗原のイディオタイプ特異的な認識物が関与すると思われるので、本発明は、治療的利益の達成に向けてこの認識物を操作するための戦略に関する。本発明の特定の実施形態は、腫瘍に対する免疫化のための、養子免疫療法に使用されるリンパ球の活性化のための、また、腫瘍抗原の方向を目指すイディオトープを発現するサプレッサーＴ細胞またはサプレッサー因子により仲介される免疫抑制の抑制ための、抗イディオタイプ抗体の使用を含む。抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントはまた、抗腫瘍抗体の投与によって腫瘍抗原に対する受動免疫を受けている患者における抗−抗体誘導をモニターするために使用されることができる。
【０１９４】
特定の実施形態では、抗腫瘍イディオトープを呈する抗腫瘍抗体あるいは免疫細胞または免疫因子の投与による、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗イディオタイプ抗体の誘導が、治療的価値がある可能性がある。
【０１９５】
本発明はまた、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の方向を目指すイディオタイプを認識する、抗イディオタイプのＭＡｂ分子、または抗イディオタイプのＭＡｂ分子のフラグメント、またはその改変形態を対象とする。
【０１９６】
本発明のＭＡｂ分子は、ＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する特異性をもつ別の抗体分子のイディオタイプに結合する抗原結合部位を含有する、完全なモノクローナル抗体分子およびフラグメント、またはこれらの分子のいずれかの化学修飾物を含む。ＭＡｂ分子のイディオタイプを含有するモノクローナル抗体フラグメントは、様々な技術によって、産生できるであろう。これらには、以下が含まれるが、これに限定されるものではない：ペプシンを用いて抗体分子を処理することによって産生できるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって産生できるＦａｂ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理してジスルフィド架橋を減少させることによって産生できる２ＦａｂまたはＦａｂフラグメント。
【０１９７】
その意図される使用に応じて、本発明の抗イディオタイプ抗体は、当技術分野で知られた結合技術を使用して、様々な化合物のいずれかを付着させることによって、化学的に改変することができる。これには、酵素的手段、酸化的置換、キレート化など（例えば、イムノアッセイ目的のためのラジオアイソトープの付着において使用されるものなど）が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１９８】
分子への化合物の化学結合または結合は、イディオタイプ結合に関与しない部位（例えば分子のＦｃドメイン）を対象とすることができる。これは、共役反応が行われる前に分子の結合部を防護することによって達成できる。例えば、分子を、共役反応の前に、それが認識するイディオタイプに結合させることができる。結合完了後、分子の結合部に対する影響を最小限にして改変された分子を生成するために、複合体を崩壊させることができる。
【０１９９】
抗イディオタイプ抗体または本発明の抗体分子のフラグメントを免疫原として使用して、特異的な細胞性腫瘍免疫を誘発、改変、または調節できる。これには、同系腫瘍に対する免疫化におけるこれらの分子の使用が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０２００】
（キット）
本発明はさらに、適切な標識と任意選択で結合されたあるいは結びつけられた本発明の核酸プローブまたは抗体を使用して、試験サンプルにおいて、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドあるいはそれらの相同体のうちの１つの存在または発現を同定するための方法を提供する。
【０２０１】
一般に、本発明のポリヌクレオチドを検出するための方法は、以下を含むことができる：該ポリヌクレオチドと結合して複合体を形成する化合物と、サンプルを、複合体を形成するのに十分な時間接触させることと、複合体を検出すること（複合体が検出されるならば、本発明のポリヌクレオチドがサンプル中で検出されたこととなる）。こうした方法はまた、以下も含むことができる：厳密なハイブリダイゼーション条件下で、こうした条件下で本発明のポリヌクレオチドとアニールする核酸プライマーと、サンプルを接触させることと、アニールされたポリヌクレオチドを増幅すること（ポリヌクレオチドが増幅されるならば、本発明のポリヌクレオチドがサンプル中で検出されたこととなる）。
【０２０２】
一般に、本発明のポリペプチドを検出するための方法は、以下を含むことができる：該ポリヌクレオチドと結合して複合体を形成する化合物とサンプルを、複合体を形成するのに十分な時間、接触させることと、複合体を検出すること（複合体が検出されるならば、本発明のポリヌクレオチドがサンプル中で検出されたこととなる）。
【０２０３】
詳細には、こうした方法は、以下を含む：１種または複数の抗体あるいは１種または複数の本発明の核酸プローブと共に試験サンプルをインキュベートすることと、試験サンプル内の成分への核酸プローブまたは抗体の結合について検定すること。
【０２０４】
試験サンプルと共に核酸プローブまたは抗体をインキュベートするための条件は、変化する。インキュベーションの条件は、アッセイに使用される形式、使用される検出方法、およびアッセイにおいて使用される核酸プローブまたは抗体のタイプおよび性質に依存する。当分野の技術者であれば、一般に利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、または免疫学的なアッセイ形式のいずれも、本発明の核酸プローブまたは抗体を使用するために容易に適合させることができることを認識するであろう。こうしたアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，  Ｔ．，  Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ  Ｖｏｌ．  １（１９８２），  Ｖｏｌ．  ２（１９８３），  Ｖｏｌ．  ３（１９８５）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）に出ている。本発明の試験サンプルは、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、あるいは体液（痰、血液、血清、血漿、または尿など）を含む。上記の方法において使用される試験サンプルは、アッセイ形式、検査法の性質、および検定されるサンプルとして使用される組織、細胞、または抽出物に基づいて変わることとなる。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製するための方法は、当分野でよく知られており、利用されるシステムに適合するサンプルを得るために、容易に適合させることができる。
【０２０５】
本発明の別の実施形態では、本発明のアッセイを実施するために必要な試薬を含有するキットが提供される。具体的には、本発明は、以下を含む１つまたは複数の容器を、しっかり密閉して収納するためのコンパートメントキットを提供する：（ａ）本発明のプローブまたは抗体の１つを含む第１の容器；および（ｂ）以下のうちの１種または複数を含む、１つまたは複数の他の容器：洗浄試薬、結合したプローブまたは抗体の存在を検出することが可能な試薬。
【０２０６】
詳細には、コンパートメントキットには、試薬が別々の容器に含有されているいずれのキットも含まれる。こうした容器としては、小さいガラス容器、プラスチック容器、またはプラスチックまたは紙の袋が挙げられる。こうした容器は、あるコンパートメントから別のコンパートメントへの試薬の効率的な移動を可能にし、その結果サンプルおよび試薬が相互汚染されないようになる。また、各容器の薬剤または溶液は、あるコンパートメントから別のコンパートメントに、定量的に加えることができる。こうした容器には、試験サンプルを受容することとなる容器、アッセイに使用される抗体またはプローブを含有する容器、洗浄試薬（リン酸緩衝食塩水、トリス緩衝液など）を含有する容器、および結合された抗体またはプローブを検出するために使用される試薬を含有する容器が含まれることとなる。検出試薬のタイプには、標識された核酸プローブ、標識された二次抗体、あるいは代替形態では、一次抗体が標識されている場合、標識された抗体との反応が可能な、酵素的な、あるいは抗体に結合する試薬が含まれる。当分野の技術者であれば、本発明の開示するプローブおよび抗体を、当分野でよく知られている確立されたキット形式の１つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０２０７】
（実施例１：ＩＧＳＦ９発現）
ＩＧＳＦ９遺伝子発現を、様々な正常な組織および腫瘍性の組織において試験した。図２は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｄａｔａｓｕｉｔｅを使用して決定される通りの、この遺伝子の遺伝子発現プロフィールを表す「ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ」である。ｙ軸上の値は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｕｎｉｔでの発現強度に相当する。図上のそれぞれの青い円は、個々の患者のサンプルに相当する。図の左の棒グラフは、遺伝子フラグメントを発現することが判明した各組織タイプの割合を表す。それぞれの組織タイプのサンプルの総数は、以下の通りである：悪性の乳房（６０）；悪性の大腸（９１）；悪性の肺（４０）；悪性の卵巣（３７）；悪性の前立腺（２６）；正常な乳房（３０）；正常な大腸（３０）；正常な食道（１７）；正常な腎臓（２７）；正常な肝臓（１９）；正常な肺（３４）；正常なリンパ節（９）；正常な卵巣（２２）；正常な膵臓（１８）；正常な前立腺（２１）；正常な直腸（２２）；正常な脾臓（９）；正常な胃（２１）。
【０２０８】
さらに、正常および悪性のヒト組織におけるＩＧＳＦ９の発現を、市販品として入手できるヒトｃＤＮＡパネルと、ヒト組織および細胞系から社内で調製されるｃＤＮＡサンプルを使用するＰＣＲ実験によって、さらに調査した。これらの実験の結果を、下の図３〜７に示す。以下のＰＣＲプライマーを合成し、すべての実験で使用した。
【０２０９】
【化１】
2006520194.tif 000002
これらのプライマーの配列は、ＩＭＡＧＥクローン＃２０１３０９６／ＡＴＣＣカタログ＃３０６８４９６内に存在するＩＧＳＦ９の一部に含まれており、そこから得られたプラスミドＤＮＡを、各実験において、陽性対照として使用した。これらのプライマーによって、ＩＧＳＦ９遺伝子を含有する任意のｃＤＮＡ鋳型から、３８７ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現は、ｃＤＮＡの完全性についての対照として、すべての実験において測定される。ＧＡＰＤＨは、すべてのヒト組織において、多量に発現されるハウスキーピング遺伝子である。ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に使用されるプライマーは、以下の通りである：
【０２１０】
【化２】
2006520194.tif 000003
これらのプライマーによって、ＧＡＰＤＨ遺伝子をコードしている任意のｃＤＮＡ鋳型から、４８２ｂｐ産物が増幅される。すべての実施例において、陽性および陰性対照も含まれる。陽性対照は、ＩＭＡＧＥクローン４７６２１４３のプラスミドＤＮＡであり、陰性対照は、水（鋳型無し）である。
【０２１１】
図３は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡパネルを使用して決定される通りの、正常組織における、ＩＧＳＦ９の発現を示す（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃Ｋ１４２０−１およびＫ１４２１−１）。上のパネルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のパネルはＧＡＰＤＨの発現を示す。各レーンに存在するｃＤＮＡサンプルは、以下の通りである：（１）脳、（２）胎盤、（３）肺、（４）肝臓、（５）骨格筋、（６）腎臓、（７）膵臓、（８）脾臓、（９）胸腺、（１０）前立腺、（１１）精巣、（１２）卵巣、（１３）小腸、（１４）大腸、（１５）末梢血白血球、（１６）陽性対照、および（１７）陰性対照。図の右側の矢印は、ＩＧＳＦ９  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。この図におけるデータでは、ＩＧＳＦ９が、正常な肝臓、膵臓、前立腺、精巣および大腸では弱く発現され、他の全ての正常組織には無いことが示される。
【０２１２】
図４は、ヒト卵巣腫瘍サンプルおよび２つの卵巣腫瘍細胞系のパネルにおけるＩＧＳＦ９発現を示す。卵巣腫瘍サンプルは、Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）から入手し、細胞系Ｏｖｃａｒ−３およびＰＡ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ）から入手した。ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキット（カタログ＃７５１６２）を使用して、各サンプルおよび細胞系から単離した。ｃＤＮＡは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｃＤＮＡ合成システム（カタログ＃１１９０４〜０１８）を使用して、全ＲＮＡから調製した。上のパネルは、ＩＧＳＦ９の発現を示し、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。各レーンの上の数字は、以下の通りの卵巣腫瘍サンプルに相当する：（１）中程度分化型の嚢胞腺癌、（２）低分化型の乳頭状漿液性腺癌、（３）低分化型の乳頭状漿液性腺癌、（４）低分化型の類子宮内膜腺癌、（５）乳頭状漿液性腺癌、（６）類子宮内膜腺癌、（７）低分化型腺癌、（８）低分化型の乳頭状漿液性腺癌、（９）Ｏｖｃａｒ−３細胞系、（１０）ＰＡ−１細胞系、（１１）陽性対照、および（１２）陰性対照。図の右側の矢印は、ＩＧＳＦ９  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。このパネルにおけるデータからは、ＩＧＳＦ９が、８腫瘍サンプル中の７つで発現され、これらのうちの５つは強く発現されることが示される。これはまた、卵巣腫瘍細胞系の両方において発現される。
【０２１３】
図５は、正常な乳房サンプルと適合させた、乳腺腫瘍サンプルにおけるＩＧＳＦ９の発現を示す。胸部組織における発現は、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＨｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  ｐａｉｒ  ｐａｎｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃  Ｋ１４３２−１、第一の５サンプルセット）およびＧｒｏｓｓｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｌａ  Ｍｅｓａ  ＣＡから入手した５つの社内で適合されるサンプルを使用して決定された。ＲＮＡは、ＴＲｌｚｏｌ試薬を使用して、各サンプルから単離した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃  １５５９６０２６）。ｃＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ｃＤＮＡ合成システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１８２６７−０２１）を使用して、全ＲＮＡから調製した。上のゲルは、ＩＧＳＦ９の発現を示し、下のゲルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。（Ｎ）正常組織、（Ｔ）腫瘍組織。腫瘍サンプルは、以下の通りである：（患者Ａ）浸潤性腺管癌；（患者Ｂ）浸潤性腺管癌；（患者Ｃ）管状腺癌；（患者Ｄ）浸潤性腺管癌；（患者Ｅ）浸潤性腺管癌；（患者Ｔ）高悪性度ｉｎ  ｓｉｔｕかつ浸潤性の腺管癌；（患者Ｘ）管腺癌；（患者Ｗ）混合性の腺管癌および小葉癌；（患者ＧＨ１９）高悪性度浸潤性腺管癌；（患者ＧＨ１７）低悪性度分泌管内癌。図の右側の矢印は、ＩＧＳＦ９  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。ここで示されるデータは、ＩＧＳＦ９が、乳腺腫瘍１０サンプルのうち８サンプルで発現されるが、正常サンプル１０サンプルのうち４サンプルでしか発現されないことを示す。
【０２１４】
肺腫瘍におけるＩＧＳＦ９の発現を、図６に示す。発現は、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＨｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃Ｋ１４３４−１）を使用して決定された。上のパネルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。（Ｎ）正常なサンプル、（Ｔ）腫瘍サンプル。分析された腫瘍サンプルは、以下の通りであった：（患者Ａ）浸潤性腺管癌；（患者Ｂ）扁平上皮細胞角化癌；（患者Ｃ）腺扁平上皮癌；（患者Ｄ）角化扁平上皮癌；（患者Ｅ）扁平上皮癌。図の右側の矢印は、ＩＧＳＦ９  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。ここで示されるデータは、ＩＧＳＦ９が、肺腫瘍５サンプル中のすべてに存在するが、正常なサンプル５サンプルのうち２サンプルにしか存在しないことを示す。
【０２１５】
結腸腫瘍におけるＩＧＳＦ９発現を、図７に示す。結腸腫瘍サンプルは、Ｌａ  Ｍｅｓａ，ＣＡのＧｒｏｓｓｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキット（カタログ＃  ７５１６２）を使用して、各サンプルおよび細胞系から単離した。ｃＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ｃＤＮＡ合成システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１８２６７〜０２１）を使用して、全ＲＮＡから調製した。上のパネルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。サンプルは、以下の通りである：（１）グレード３の腺癌、（２）グレード２の腺癌、（３）グレード１の腺癌、（４）グレード２の腺癌、（５）結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６。図の右側の矢印は、ＩＧＳＦ９  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。この図におけるデータは、ＩＧＳＦ９が、結腸腫瘍細胞系ＨＴＣ１１６において発現されること、また、４つの腫瘍サンプルの少なくとも１つにおいて、弱く発現される可能性があることを示す。
【０２１６】
まとめると、ここで示されるデータは、ＩＧＳＦ９が、複数の卵巣、乳房、肺、および結腸の腫瘍サンプルにおいて、有意水準で発現されることを示す。したがって、ＩＧＳＦ９は、上述した適応症のいずれかにおける腫瘍治療のための全腫瘍（ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原および適切な標的に相当し得る。
【０２１７】
（実施例２：ＲＴ−ＰＣＲにより決定される、ヒト腫瘍細胞におけるＩＧＳＦ９の発現）
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）およびＡｒｉｚｏｎａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）から入手される一連のヒト腫瘍株におけるＩＧＳＦ９の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。この実験の結果を、図８に表すが、これは、ＩＧＳＦ９が多くの異なる腫瘍株において発現されることを示す。
【０２１８】
以下の腫瘍株を使用した：
膵臓：ＰＡＮＣ−１。
乳房：ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、ＭＡＤ−ＭＢ２３１、ＭＥ−１８０、ＵＡＣＣ８１２。
卵巣：ＵＡＣＣ３２６。
肺：Ａ５４９（ＮＳＣＬＣ）、ＮＣＩ−Ｈ６９（小細胞）、ＮＣＩ−Ｈ１２９９（ＮＳＣＬＣ）、ＮＣＩ−Ｈ２１２６（ＮＳＣＬＣ）。
大腸：ＨＴ  ２９、ＬｏＶｏ、ＳＷ  ６２０、Ｃｏｌｏ２０１、Ｃｏｌｏ２０５、Ｃｏ１ｏ３２０。
【０２１９】
ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して各細胞系から単離し、ｃＤＮＡは、その後、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｃＤＮＡ合成システムを使用して、全ＲＮＡから調製した。ＰＣＲ実験の結果は、図８に説明され、この図では、各サンプルにおけるＩＧＳＦ９の相対的な発現は、内部対照グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の強度に対するＩＧＳＦ９の強度の比として示される。
【０２２０】
以下のＰＣＲプライマーを合成し、すべての実験で使用した。
【０２２１】
【化３】
2006520194.tif 000004
これらのプライマーによって、ＩＧＳＦ９遺伝子を含有する任意のｃＤＮＡ鋳型から、３８７ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。ＧＡＰＤＨの発現は、ｃＤＮＡ完全性についての対照として、すべての実験で測定された。ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に使用されるプライマーは、以下の通りであった：
【０２２２】
【化４】
2006520194.tif 000005
これらのプライマーによって、ＧＡＰＤＨ遺伝子をコードしている任意のｃＤＮＡ鋳型から、４８２ｂｐの産物が増幅される。
【０２２３】
（実施例３：ＩＧＳＦ９構築物を発現する安定な哺乳類細胞系の産生）
ＩＧＳＦ９の２つの代替の形が、公開のデータベースにおいて同定された（本明細書では「ショートフォーム」および「ロングフォーム」ＩＧＳＦ９と称する）。ロングフォームのＩＧＳＦ９は、２つのＩｇドメイン間に位置する細胞外ドメイン内に１７アミノ酸挿入物を含有する、選択的スプライシングされた変異体である。ＩＧＳＦ９ショートフォームのヌクレオチドおよびタンパク質配列を、図１Ａおよび１Ｂに示す。図９Ｅと９Ｆはそれぞれ、ロングフォームのＩＧＳＦ９のヌクレオチドとタンパク質配列を表す。
【０２２４】
ショートフォームとロングフォーム両方のＩＧＳＦ９をコードしている完全長のｃＤＮＡは、標準の分子クローニング技術および合成のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、市販品として入手できるＥＳＴプラスミドから構築した。次いで、完全長クローンを、自社開発の哺乳動物発現ベクター（米国特許第５，６４８，２６７号、第５，７３３，７７９号、第６，０１７，７３３号、および第６，１５９，７３０号に記載されているが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手できるｐＩＮＤ／ｈｙｇｒｏなどの市販品として入手できるベクター；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；およびＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬなどを使用できるだろう）に挿入した。可溶性の形のショートフォームＩＧＳＦ９とロングフォームＩＧＳＦ９の両方はまた、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（イムノアドヘシン）をコードしているｃＤＮＡに、これらの分子の細胞外ドメインをコードしているｃＤＮＡを遺伝的に融合させることによって構築した。ショートおよびロングフォームＩＧＳＦ９の細胞外ドメインは、鋳型として完全長遺伝子を使用するＰＣＲ手順によって生成した。その後、これらの構築物を、ＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子配列を含有する自社開発の哺乳類発現ベクターに挿入した。クローニングによって、ＩｇＧ１  ＦｃのＮ末端を伴うＩＧＳＦ９細胞外ドメインのインフレーム融合がもたらされた（全配列については図９を参照）。
【０２２５】
上記の構築物の全てをその後使用して、安定に形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を産生する。短時間で、発現構築物を、電気穿孔法によって、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５．  Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．，  １２：５５５−５６６）に形質移入させた。細胞を、洗浄し、計数し、氷冷したＳＢＳ緩衝液（７ｍＭ  ＮａＰＯ４、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２７２ｍＭスクロース、ｐＨ  ７．４）に再懸濁した。プラスミドＤＮＡは、ＰａｃＩ制限消化によって、線状化し、１または０．５ｕｇ／ｍｌ  ＤＮＡを４×１０６  ＤＧ４４細胞と混合し、電気穿孔した。細胞を、９６穴マイクロタイター培養プレートに接種し、細胞系を、ヒポキサンチン＋チミジン（ＨＴ，Ｇｉｂｃｏ）を補足したＣＨＯ  Ｓ  ＳＦＭ  ＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）において、Ｇ４１８耐性について選別した。プレートからの細胞を、最低濃度のＤＮＡで形質移入し、強力な細胞増殖を示すものを、ＥＬＩＳＡによる代用マーカー発現についてスクリーニングした（完全長構築物の場合Ｂ７Ｉｇ、イムノアドヘシン構築物についてＣＴＬＡ４Ｉｇ）。イムノアドヘシン細胞系を最も多く産生するものを、撹拌培養に展開し、イムノアドヘシン分子を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、培養上清から精製し、その後、ネズミのモノクローナル抗体産生ための免疫原として使用した（実施例４を参照）。
【０２２６】
図１０は、精製されたイムノアドヘシンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。材料は、１０リットルの培養上清から精製された。タンパク質は、クマシーブルー染色によって視覚化された。予測される分子量の強力なバンドは、ロングフォームのＩＧＳＦ９にのみ見られる（レーン２）。ショートフォーム（レーン１）は、複数の分解産物を生じる。図１０におけるデータは、組換え型ＩＧＳＦ９分子が、哺乳動物細胞中で高レベルで上手く発現できることを示す。
【０２２７】
最も高いレベルの完全長ＩＧＳＦ９構築物を発現する細胞系を、５ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）、その後５０ｎＭ  ＭＴＸ中で増幅させた。簡単に言うと、細胞は、１．５細胞／プレートから３０００細胞／プレートまでの範囲の密度で（２倍ずつ増やしながら）接種し、２週間、５ｎＭ  ＭＴＸまたは５０ｎＭ  ＭＴＸを含有する培地で培養した。生存している細胞を、ＥＬＩＳＡによって、代用マーカー発現についてスクリーニングし、最も多くクローンを産生するものを、撹拌培養に展開した。生じた細胞系におけるＩＧＳＦ９伝達（ｍｅｓｓａｇｅ）の発現は、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロッティングによって確認した。代表的なノーザンブロットを、図１１に示す。ノーザン分析については、全ＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉキットを使用して、１×１０８細胞から抽出した。ｍＲＮＡは、推奨されるバッチプロトコルを使用して、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）  ｍＲＮＡ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｉｄｉ／Ｍａｘｉキットを使用して単離した。３μｇのｍＲＮＡを、３％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲル上で分離し、標準的方法に従ってブロットした。ＧＡＰＤＨ対照プローブと共に、ＩＧＳＦ９の細胞外領域に特異的なヌクレオチドプローブを、製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従って、ＤＩＧ−標識ヌクレオチドミックスを使用するＰＣＲによって、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識した。このブロットを、合計５０ｎｇ／ｍｌに等しい濃度のＩＧＳＦ９プローブおよび１５ｎｇ／ｍｌのＧＡＰＤＨプローブを使用して、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ）中で、５０℃でハイブリッド形成させた。ブロットを、製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従って、ＤＩＧ洗浄液で洗浄し、ブロック検出システムを使用して検出した。その後、ブロットを、約１６時間フィルムに露光させた。図に示されるように、予測されるサイズの、ある主な産物は、図１１のレーン２〜５に見られる。第２の、より大きな転写産物が見られるのは、おそらく次行に続く転写によるものである。この図に示されるデータにより、組換え型ＩＧＳＦ９分子が、哺乳動物細胞において、検出可能なレベルで発現されることが確認される。
【０２２８】
（実施例４：抗ＩＧＳＦ９モノクローナル抗体８Ｆ３の産生）
モノクローナル抗体は、まず最初に、遺伝子銃を使用して、可溶性のショートフォームＩＧＳＦ９−ＩｇをコードしているｃＤＮＡ構築物を、５回、６〜８週間目の雄のＢＡＬＢ／ｃマウスに注射することによって産生した。その後、マウスを、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、安定に発現するＣＨＯ細胞系の上清から精製されたショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇ融合タンパク質（前述の実施例を参照）で追加免疫した。マウスに、１１日間かけて、１２本の注射５セットからなる急速免疫化技術で、精製されたタンパク質を注入した。マウスは、１２日目に採血し、ＩＧＳＦ９特異抗体の抗体価を、精製されたショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇでコートされた９６穴プレート上で、ＥＬＩＳＡによって決定した。１３日目に、最も高い力価を呈しているマウスから、脾臓を摘出し、標準の免疫学的技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．１９７５．  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ｐ４９５）に従って、マウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞に融合させた。図１２は、上で述べた通りに免疫された２匹のマウスからの、血清の連続希釈物におけるＩＧＳＦ９反応性を測定する代表的なＥＬＩＳＡを表す。
【０２２９】
ハイブリドーマはすべて、まず最初に、ＥＬＩＳＡによって、ショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇに対する反応性についてスクリーニングし、次いで、交差反応を起こし得るいかなる抗体も除外するために、陽性のものをすべて、関連性のないＩｇ融合タンパク質に対してスクリーニングした。クローンを最も多く産生するものを、限界希釈によってサブクローニングし、最終的にスピナーフラスコに展開した。１０〜１２日後に、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、抗体を培養上清から精製し、メーカーの説明書に従って、マウス免疫グロブリンＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、アイソタイプの決定を行った。８Ｆ３と称される１つのモノクローナル抗体を、その高力価およびＩＧＳＦ９に対する結合特異性に基づくさらなる研究ために選別した。実施例５および６は、様々な関連する組織におけるＩＧＳＦ９の発現を試験するための、この抗体を使用した実験を記載する。
【０２３０】
（実施例５：モノクローナル抗−ＩＧＳＦ９抗体を使用して検出される安定な細胞系および腫瘍株上のＩＧＳＦ９発現）
フローサイトメトリーにより測定される通りの、安定に形質移入されたＣＨＯ細胞におけるＩＧＳＦ９表面発現
安定に形質移入されたＣＨＯ細胞の表面上での組換え型ＩＧＳＦ９分子の発現を、ビオチン化された抗ＩＧＳＦ９モノクローナル抗体８Ｆ３を使用して、フローサイトメトリーによって確認した。抗体は、メーカーの説明書（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に従って、ＥＣＬタンパク質ビオチン化モジュールを使用してビオチン化した。
【０２３１】
フローサイトメトリーについては、細胞を採取し、ＰＢＳで二回洗浄した。その後、３〜５×１０５細胞を、９６穴丸底プレートに分注し、ＦＡＣＳ緩衝液（１０％正常ヤギ血清、０．２％  ＢＳＡ、および０．１％  ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞ペレットを、１０μｇ／ｍｌの一次抗体（ビオチン化された８Ｆ３またはアイソタイプ対照）１００μｌと共に、１００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、１時間氷上でインキュベートした。次いで、プレートを遠心分離機にかけ、上清を針吸引した。次いで、細胞ペレットを、上で述べた通りのＦＡＣＳ緩衝液で、さらに２回洗浄した。その後、細胞を、１：５００希釈のストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、氷上でさらに１時間インキュベートし、その後、細胞を前記の通りに洗浄し、次いで、５μｌヨウ化プロピジウムを含有する５００μｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、死細胞から生細胞を分離した。蛍光強度は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒサイトメーターを使用して測定し、ＨＬＡ−ＡＰＣ陽性かつヨウ化プロピジウム陰性の細胞集団をゲート制御した。
【０２３２】
図１３および１４は、安定なＣＨＯ形質移入体におけるショートおよびロングフォームＩＧＳＦ９発現のフローサイトメトリー分析を表す。これらの図中のデータは、両方のフォームが、形質移入細胞の表面上で発現され、ショートフォーム形質移入体のＭＴＸ増幅の増大が、この分子の表面発現の増大をもたらすことを示す。
【０２３３】
フローサイトメトリーにより測定される通りの腫瘍株上のＩＧＳＦ９表面発現
ヒト肺腫瘍細胞系ＮＣＩ−Ｈ６９におけるＩＧＳＦ９の内因性表面発現を、複数の濃度の一次抗体８Ｆ３が試験されること以外は本質的に上で述べた通りのフローサイトメトリーによって測定した。この実験の結果を、図１５に示す。この実験は、内因的に発現されるＩＧＳＦ９が、ヒト腫瘍株の表面上で発見されることを証明する。
【０２３４】
ウェスタンブロッティングにより測定される通りの腫瘍株におけるＩＧＳＦ９発現
抗ＩＧＳＦ９モノクローナル抗体８Ｆ３を用いて探索される、ヒト腫瘍株からのタンパク質溶解物を使用するイムノブロッティング実験では、ＩＧＳＦ９タンパク質が、多くのヒト腫瘍株において、検出可能なレベルで発現されることが確認される。このデータを、図１６に表す。タンパク質溶解物は全て、ＳＤＳゲルサンプルバッファー中での直接的な溶菌によって調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解させた。溶解物のタンパク質濃度を、メーカーの説明書に従って、ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して決定した。細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６％アクリルアミドゲル）によって分解させ、ＰＶＤＦ膜に移し、精製された抗ＩＧＳＦ９  ｍＡｂ（８Ｆ３、１０mｇ／ｍｌ）を使用して、４℃で一晩免疫ブロットし、それに続いて、１：１，０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合−抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＢｉｏＲａｄ）をと共にインキュベーションした。免疫ブロットは、メーカーの説明書に従って、ＥＣＬ試薬を使用して（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）展開した。
【０２３５】
蛍光顕微鏡法により測定される通りの、腫瘍細胞の表面上のＩＧＳＦ９の発現
ポリＬ−リシンでコートされたカバーグラス上で増殖させたＺＲ−７５−１乳腺腫瘍細胞を、抗ＩＧＳＦ９モノクローナル抗体８Ｆ３（１０μｇ／ｍｌ）と共に、１６時間インキュベートした。この細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、氷冷メタノールを使用して固定した。固定化された細胞を、ブロッキング緩衝液（３％ヤギ血清、０．５％  ＢＳＡ（ＰＢＳ中））において、ブロッキングし、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ）および１：２０００の希釈のＡｌｅｘａ４８８−ヤギ抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に、室温で４５分インキュベートした。この細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ａｎｔｉｆａｄｅキット（分子プローブ）を使用して、ガラススライド上に載せ、ＢｉｏＲａｄ  Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２１００共焦点顕微鏡システム（対物レンズ６０ｘ）を使用して調べた。この実験の結果を、図１７に表す。この図は、乳腺腫瘍細胞の表面染色を示す。
【０２３６】
まとめると、図１３〜１７に示されるデータは、モノクローナル抗体８Ｆ３が、ＩＧＳＦ９に対して反応性を持つことを証明し、ＩＧＳＦ９が細胞表面タンパク質であることを確認する役割を果たす。これらのデータによって、ＩＧＳＦ９が、ヒト腫瘍株の表面上で有意水準で発現することが判明したので、ＩＧＳＦ９が、ヒト腫瘍に対する適切な免疫療法標的であるという仮定も裏づけられる。
【０２３７】
（実施例６：ネズミの腫瘍異種移植片におけるＩＧＳＦ９発現）
ネズミの腫瘍異種移植片は、以下の通りに産生された：腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ６９（肺）およびＺＲ−７５−１（乳房）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されたＬＳ１７４Ｔ（大腸）およびＯｖｃａｒ−３（卵巣）を採取し、２２ゲージ注射針を用いて、シリンジを介して細胞懸濁液を通過させることによって、細胞集塊を分離した。細胞を、洗浄し、計数し、ＰＢＳに再懸濁させた。
【０２３８】
２〜１０×１０６細胞／１００μＬを、ヌードマウスの右側腹部上に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘤は、４〜８週増殖させた後に切除した。ｉｎ  ｖｉｖｏの再継代については、２ｍｍの腫瘍部を、ヌードマウスのわき腹にｓ．ｃ．で再導入し、４〜８週増殖させた。
【０２３９】
抗ＩＧＳＦ９モノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定される通りの、ネズミの腫瘍異種移植片および細胞系上でのＩＧＳＦ９表面発現
フローサイトメトリー分析については、新しい腫瘍サンプルを、細かく切り刻み、５％  ＢＳＡおよび０．０５％  ＮａＮ３を含有するコラゲナーゼ溶液と共に、３７℃で１時間消化させた。生細胞を、密度勾配遠心分離によって、死細胞および他の細片から分離した。
ついで、細胞を、９６穴丸底プレートに蒔き、実施例５に記載される通りのフローサイトメトリーのために処理した。培養で増殖させた細胞を、非酵素的な緩衝液を使用して分離し、洗浄し、９６穴プレートに蒔き、上で記載された通りに処理した。
【０２４０】
図１８は、ＮＣＩ−Ｈ６９およびＯｖｃａｒ−３のネズミ腫瘍異種移植片および培養細胞におけるＩＧＳＦ９発現を測定する典型的なＦＡＣＳ実験を示す。図１８のデータは、ＩＧＳＦ９が、培養で増殖された細胞と、ネズミの異種移植片から誘導されたｉｎ  ｖｉｖｏ継代培養された細胞の両方の表面上で発現されることを示す。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させたヒト腫瘍細胞の表面上でのＩＧＳＦ９の発現は、ＩＧＳＦ９が適切な治療標的であるという認識を裏づける。
【０２４１】
ネズミの腫瘍異種移植片におけるＩＧＳＦ９伝達は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される
腫瘍異種移植片サンプルにおけるＩＧＳＦ９の発現は、ヒトＩＧＳＦ９に特異的なＧＡＰＤＨコントロールプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって測定された。異種移植片サンプルは、上で記載される通りに産生し、切除した。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを使用して０．２５ｇの組織サンプルから単離し、ＤＮＡ分解酵素で処理し、Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを使用して精製した。ｃＤＮＡは、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムを使用して合成した。ＰＣＲは、標準の条件下で実施した。ＩＧＳＦ９を増幅するために使用されるＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
【０２４２】
【化５】
2006520194.tif 000006
典型的なＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を、図１９に示す。ＩＧＳＦ９伝達は、ＬＳ１７４ＴおよびＮＣＩ−Ｈ６９腫瘍株の２つのｉｎ  ｖｉｖｏ継代培養株（Ｐ０およびＰ１）で、また、ネズミの異種移植片からの誘導されたＯｖｃａｒ−３細胞の少なくとも１種の継代培養株（Ｐ０）で検出された。
【０２４３】
ＩＧＳＦ９の選択的スプライシング形は、ネズミの異種移植片腫瘍で発現される
ネズミの異種移植片サンプルから得られたＰＣＲ産物の配列分析では、ＩＧＳＦ９の複数のアイソフォームが、腫瘍から得られた細胞に発現されることが示された。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＩＧＳＦ９の領域の側面（以前に記述したショートおよびロングアイソフォームが、配列中（エキソン９内）で分岐する場所）に位置するように設計されたプライマーを使用して、上で述べた通りに実施した。ＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
【０２４４】
【化６】
2006520194.tif 000007
ＰＣＲ産物を、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してショットガンクローニングし、挿入断片は、ＡＢＩ自動ＤＮＡ解析装置を使用して配列決定した。ＮＣＩ−Ｈ６９異種移植片から誘導されたクローン中で、２つの新規のアイソフォームを同定し、Ｏｖｃａｒ−３異種移植片から誘導されたクローン中で、さらなる別の新規のアイソフォームを同定した。
【０２４５】
新規のアイソフォームはすべて、ＡＧ／ＧＴスプライシング法則に従い、これは、それらが本物のスプライスバリアントであることを示唆する（Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ，  １９７８．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５；４８５３−７．）。典型的なＰＣＲゲルを、選択的スプライシングによって影響を受けるＩＧＳＦ９のエキソンの概略図と共に、図２０に表す。得られた各ヌクレオチド配列のインフレーム翻訳物からは、新規の配列はすべて、膜貫通領域を欠く短縮されたタンパク質を産生するであろうことが予測される。得られた実際のヌクレオチド配列のアラインメントを、それらに対応する予測されたタンパク質配列と共に、図２１に示す。部分ヌクレオチド配列を、ＩＧＳＦ９ロングフォームのエキソン５〜１０と整列配置させた。
【０２４６】
ここで示されるシークエンシングデータにより、ＩＧＳＦ９の複数のアイソフォームが、ヒト腫瘍に存在する可能性があること、また、多くのアイソフォームが、免疫療法の潜在的な標的に相当する可能性があることが示される。
【０２４７】
（実施例７：ＬＩＶ−１発現）
図２２は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｄａｔａｓｕｉｔｅを使用して決定される通りの、この遺伝子の遺伝子発現プロフィールを表す「ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ」である。ｙ軸上の値は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｕｎｉｔでの発現強度に相当する。図上のそれぞれの青い円は、個々の患者のサンプルに相当する。図の左の棒グラフは、遺伝子フラグメントを発現することが判明した各組織タイプの割合を表す。それぞれの組織タイプのサンプルの総数は、以下の通りである：悪性の乳房（６０）；悪性の大腸（９１）；悪性の肺（４０）；悪性の卵巣（３７）；悪性の前立腺（２６）；正常な乳房（３０）；正常な大腸（３０）；正常な食道（１７）；正常な腎臓（２７）；正常な肝臓（１９）；正常な肺（３４）；正常なリンパ節（９）；正常な卵巣（２２）；正常な膵臓（１８）；正常な前立腺（２１）；正常な直腸（２２）；正常な脾臓（９）；正常な胃（２１）。
【０２４８】
先の実施例に記載される通り、正常および悪性のヒト組織におけるＬＩＶ−１の発現を、市販品として入手できるヒトｃＤＮＡパネルと、ヒト組織および細胞系から社内で調製されるｃＤＮＡサンプルを使用するＰＣＲ実験によって、さらに調査した。これらの実験の結果を、図２３〜２５に示す。以下のＰＣＲプライマーを合成し、すべての実験で使用した：
【０２４９】
【化７】
2006520194.tif 000008
これらのプライマーの配列は、ＩＭＡＧＥクローン＃４６９７８７８／ＡＴＣＣカタログ＃６６４５７２９内に存在するＬＩＶ−１の一部に含まれており、そこから得られたプラスミドＤＮＡを、各実験において、陽性対照として使用した。これらのプライマーによって、ＬＩＶ−１遺伝子を含有する任意のｃＤＮＡ鋳型から、３６０ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。先の実施例に記載される通り、ＧＡＰＤＨの発現は、ｃＤＮＡの完全性についての対照として、すべての実験において測定される。
【０２５０】
ＬＩＶ−１プライマーによって、ＧＡＰＤＨ遺伝子をコードしている任意のｃＤＮＡ鋳型から、４８２ｂｐ産物が増幅される。すべての実施例において、陽性および陰性対照もまた含まれる。陽性対照は、ＩＭＡＧＥクローン４６９７８７８のプラスミドＤＮＡであり、陰性対照は、水（鋳型無し）である。
【０２５１】
図２３は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ’ｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌを使用して決定される通りの、正常組織におけるＬＩＶ−１の発現を示す（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃Ｋ１４２０−１およびＫ１４２１−１）。上のパネルが、ＬＩＶ−１の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。各レーンに存在するｃＤＮＡサンプルは、以下の通りである：（１）心臓、（２）脳、（３）胎盤、（４）肺、（５）肝臓、（６）骨格筋、（７）腎臓、（８）膵臓、（９）陰性対照、および（１０）陽性対照。図の右側の矢印は、ＬＩＶ−１  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。ここで示されるデータは、ＬＩＶ−１が正常な脳、胎盤、肺、肝臓および腎臓では弱く発現され、正常な膵臓ではそれよりわずかに大きな程度で発現されることを示す。
【０２５２】
図２４は、正常な乳房サンプルと適合させた、乳腺腫瘍サンプルにおけるＬＩＶ−１の発現を示す。胸部組織における発現は、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＨｕｍａｎ  Ｍａｔｃｈｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｐａｉｒ  Ｐａｎｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃  Ｋ１４３２−１、左のパネル）およびＧｒｏｓｓｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｌａ  Ｍｅｓａ  ＣＡから入手した５つの社内で適合されるサンプル（右のパネル）を使用して決定された。ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃１５５９６０２６）を使用して、各サンプルから単離した。ｃＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ｃＤＮＡ合成システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１８２６７〜０２１）を使用して、全ＲＮＡから調製した。上のゲルは、ＬＩＶ−１の発現を示し、下のゲルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。図の右側の矢印は、ＬＩＶ−１  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。腫瘍サンプルは、以下の通りである：（１−患者Ａ）浸潤性腺管癌、（２−患者Ｂ）浸潤性腺管癌、（３−患者Ｃ）管状腺癌、（４−患者Ｄ）浸潤性腺管癌、（５−患者Ｅ）浸潤性腺管癌、（６−患者Ａ）正常、（７−患者Ｂ）正常、（８−患者Ｃ）正常、（９−患者Ｄ）正常、（１０−患者Ｅ）正常、（１１）陰性対照、（１２）陽性対照、（１３−患者Ｇ１９）高悪性度浸潤性腺管癌、（１４−患者Ｇ１７）低悪性度分泌管内癌、（１５−患者Ｘ）管腺癌、（１６−患者Ｗ）混合性の腺管癌および小葉癌、（１７−患者Ｔ）高悪性度ｉｎ  ｓｉｔｕかつ浸潤性の腺管癌、（１８−患者Ｇ１９）正常、（１９−患者Ｇ１７）正常、（２０−患者Ｘ）正常、（２１−患者Ｗ）正常、（２２−患者Ｔ）正常、（２３）陰性対照、および（２４の）陽性対照。この図に示されるデータは、ＬＩＶ−１が、分析された乳癌サンプルの１０本すべてにおいて発現されることを示す。１０本のサンプルのうち４本については、腫瘍組織における発現が、対応する適合させた正常なサンプルによりも有意に高い。
【０２５３】
結腸腫瘍におけるＬＩＶ−１の発現を、図２５に示す。結腸腫瘍サンプルは、Ｌａ  Ｍｅｓａ，ＣＡのＧｒｏｓｓｍｏｎｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。大腸腺癌細胞系ＨＣＴ１１６は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキット（カタログ＃  ７５１６２）を使用して、各サンプルおよび細胞系から単離した。ｃＤＮＡは、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  ｃＤＮＡ合成システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃１８２６７〜０２１）を使用して、全ＲＮＡから調製した。上のパネルが、ＬＩＶ−１の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。サンプルは、以下の通りである：（１）グレード３の腺癌、（２）グレード２の腺癌、（３）グレード１の腺癌、（４）グレード２の腺癌、（５）結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ  １１６、（６）陽性対照、および（７）陰性対照。ここで示されるデータは、ＬＩＶ−１が、試験された４本の結腸腫瘍サンプルのすべてにおいて発現されることを示す。
【０２５４】
まとめると、ここで示されるデータは、ＬＩＶ−１が、複数の乳房および結腸腫瘍サンプルにおいて、有意水準で発現されることを示す。Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃデータは、これがまた、前立腺腫瘍サンプルにおいて、過剰発現することを示す。したがって、ＬＩＶ−１は、上述した適応症のいずれかにおける腫瘍治療のための全腫瘍抗原および適切な標的に相当し得る。
【０２５５】
（実施例８：癌を治療する方法）
癌を患う、あるいは癌の疑いがある患者からの組織サンプルを入手する。サンプルは、生検サンプル、腫瘍を組織から摘出した後の病理学サンプルであってもよいし、以前に患者から得られた保管されているサンプルであってもよい。サンプルは、実施例１〜７と同様に分析する。
【０２５６】
腫瘍サンプルにおけるＩＧＳＦ９および／またはＬＩＶ−１のレベルの分析に基づいて、治療レジメンは、当分野の技術者に知られている治療の許容される変形形態を使用して決定される。これらには、本明細書に記載される方法、診察（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）、手術の様式、放射線などの非アジュバント治療、およびタモキシフェンまたは細胞毒の薬物療法などの補助療法が含まれるが、これに限定されるものではない。
【０２５７】
本発明は、過剰発現ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１が、多くの新生物に関連することを立証した。したがって、本発明が、ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１の発現レベルが、様々な癌についての有益な予後マーカーとなることを証明することは、重要な意味を持つ。ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現レベルは、本発明の抗体、抗原結合フラグメント、またはポリヌクレオチドを使用して決定できる。したがって、診断および外科的除去時の、原発腫瘍におけるＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１発現レベルを知ることは、補助ホルモンおよび化学療法（ならびに補助放射線療法）に関する治療決定に直接影響を与えることができる。
【０２５８】
現在利用できる癌治療の選択および利用に影響を及ぼすことに加えて、ＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１発現レベルを知ることは、新規の癌治療の適用にも有用であり得る。正常レベルのＩＧＳＦ９およびＬＩＶ−１発現を復活させる治療には、上記のものが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０２５９】
（実施例９：化合物をスクリーニングする方法）
医薬品業界は、細胞表面の受容体アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する薬学的に有用な化合物を評価することに関心を持っている。１年につき何万もの化合物が、エントリーレベルで、あるいは「ハイフラックス（ｈｉｇｈ  ｆｌｕｘ）」スクリーニングプロトコルで試験される必要がある。エントリーレベルアッセイでは、精査される数千の化合物から、１または２の化合物が、何らかの活性を示すこととなる。その後、これらの化合物は、さらなる開発および試験のために選別される。理想的には、スクリーニングプロトコルは、一度に多くのサンプルを扱うために自動化され、安全性または処理の問題をもたらすラジオアイソトープや他の化学物質を使用しない。細胞表面受容体活性の所望または所望でない薬剤規制を評価する、抗体に基づく方法は、これらの利点を提供し、かつ高い選択性というそれ以上の利点を提供するであろう。
【０２６０】
特に、様々なスクリーニングプロトコルでは、薬物をスクリーニングするために、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を認識する抗体を使用できる。通常、２つの方法が使用される。細胞または組織に基づく方法は、試験対照となる化合物に暴露される指標細胞系または組織を使用する。細胞が使用される場合、この方法は、溶解性または膜透過性の問題を持つ薬物を直ちに排除できると考えられる。タンパク質または酵素に基づくスクリーニングは、精製されたタンパク質を使用することができ、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と反応して細胞内シグナル伝達に影響を及ぼす薬物を同定できる。
【０２６１】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１発現を調節する（例えば、刺激する、ブロックする、妨げる、あるいは抑制する）薬物を同定するための細胞または組織に基づくスクリーニングのために、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１発現の免疫組織化学または細胞化学を使用して、個々の薬剤の効果を測定できる。
【０２６２】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のレベルを正確に検出する免疫組織化学に基づく方法は、固形腫瘍組織片培養および細胞小器官の培養と共に使用できるという利点を有するので、他の方法により使用されるものよりも生理的に適切な設定での、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を調節する薬物の正確な検出を可能にする。さらに、提案される方法はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究動物およびヒトの組織および細胞におけるＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する薬物の効果のスクリーニングおよびモニタリングに適用できることとなる。研究動物の場合、サンプルは、生検（例えば細針穿刺吸引、切開）によって、あるいは組織採取によって入手することができ、その後、本発明の方法に従う。
【０２６３】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１発現レベルは、原則として、単一の細胞においてモニターすることができるので、提案された方法は、非常に感度が高い。実用のために、より多くの細胞が必要である可能性があるが、わずか２０〜１００細胞を用いれば、優れた分析的評価を確実に得ることができる。
【０２６４】
特定実施例および実施例を含めて、前述の明細事項は、本発明を例示するためのものであり、限定するためのものではない。本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、多数の他の変形および改変を実施できる。本明細書に引用される刊行物、特許、および特許出願はすべて、その内容全体を、参照により本開示に組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂはそれぞれ、ヒトＩＧＳＦ９のヌクレオチド（配列番号１）およびタンパク質（配列番号２）配列である。図１Ｂは、予測されるシグナル配列を太字で示し、予測される細胞外ドメインに下線を引き、予測される膜貫通領域を太字かつイタリック体にしている。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂはそれぞれ、ヒトＩＧＳＦ９のヌクレオチド（配列番号１）およびタンパク質（配列番号２）配列である。図１Ｂは、予測されるシグナル配列を太字で示し、予測される細胞外ドメインに下線を引き、予測される膜貫通領域を太字かつイタリック体にしている。
【図２】図２は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｄａｔａｓｕｉｔｅを使用して決定される通りの、ＩＧＳＦ９の遺伝子発現プロフィールを示すｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロフィールを示す。
【図３】図３は、正常組織におけるＩＧＳＦ９の発現を示す。上のパネルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のパネルは、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を示す。各レーンに存在するｃＤＮＡサンプルは、以下の通りである：（１）脳、（２）胎盤、（３）肺、（４）肝臓、（５）骨格筋、（６）腎臓、（７）膵臓、（８）脾臓、（９）胸腺、（１０）前立腺、（１１）精巣、（１２）卵巣、（１３）小腸、（１４）大腸、（１５）末梢血白血球、（１６）陽性対照、および（１７）陰性対照。
【図４】図４は、ヒト卵巣腫瘍サンプルおよび細胞系のパネルにおけるＩＧＳＦ９の発現を示す。上のパネルは、ＩＧＳＦ９の発現を示し、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。各レーンの上の数字は、以下の通りの卵巣腫瘍サンプルに相当する：（１）中程度分化型の嚢胞腺癌、（２）低分化型の乳頭状漿液性腺癌、（３）低分化型の乳頭状漿液性腺癌、（４）低分化型の類子宮内膜腺癌、（５）乳頭状漿液性腺癌、（６）類子宮内膜腺癌、（７）低分化型腺癌、（８）低分化型の乳頭状漿液性腺癌、（９）Ｏｖｃａｒ−３細胞系、（１０）ＰＡ−１細胞系、（１１）陽性対照、および（１２）陰性対照。
【図５】図５は、乳腺腫瘍サンプルにおけるＩＧＳＦ９発現を示し、正常な乳房サンプルに適合させたものである。上のゲルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のゲルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。（Ｎ）正常組織、（Ｔ）腫瘍組織。腫瘍サンプルは、以下の通りである：（患者Ａ）浸潤性腺管癌、（患者Ｂ）浸潤性腺管癌、（患者Ｃ）管状腺癌、（患者Ｄ）浸潤性腺管癌、（患者Ｅ）浸潤性腺管癌、（患者Ｔ）高悪性度ｉｎ  ｓｉｔｕかつ浸潤性の腺管癌、（患者Ｘ）管腺癌、（患者Ｗ）混合性の腺管癌および小葉癌、（患者ＧＨ１９）高悪性度浸潤性腺管癌、（患者ＧＨ１７）低悪性度分泌管内癌。
【図６】図６は、肺腫瘍におけるＩＧＳＦ９の発現を示す。上のパネルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。（Ｎ）正常なサンプル、（Ｔ）腫瘍サンプル。分析された腫瘍サンプルは、以下の通りであった：（患者Ａ）浸潤性腺管癌、（患者Ｂ）扁平上皮細胞角化癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｋｅｒａｔｉｎｉｚｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、（患者Ｃ）腺扁平上皮癌、（患者Ｄ）角化扁平上皮癌、（患者Ｅ）扁平上皮癌。
【図７】図７は、結腸腫瘍におけるＩＧＳＦ９の発現を示す。上のパネルが、ＩＧＳＦ９の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。サンプルは、以下の通りである：（１）グレード３の腺癌、（２）グレード２の腺癌、（３）グレード１の腺癌、（４）グレード２の腺癌、（５）結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６。
【図８】図８は、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるヒト腫瘍株におけるＩＧＳＦ９発現を示す。相対的なＩＧＳＦ９発現は、膵臓（小斑点）、卵巣（垂直線）、乳房（斜めの下り線）、肺（塗りつぶされた、小斑点）および大腸（斜めの上り線）細胞系において測定された。
【図９Ａ】図９は、様々なＩＧＳＦ９構築物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。図９Ａと９Ｂはそれぞれ、ショートフォーム可溶性ＩＧＳＦ９−Ｉｇのヌクレオチド（配列番号３）とアミノ酸（配列番号４）配列を示す。
【図９Ｂ】図９Ａと９Ｂはそれぞれ、ショートフォーム可溶性ＩＧＳＦ９−Ｉｇのヌクレオチド（配列番号３）とアミノ酸（配列番号４）配列を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃと９Ｄはそれぞれ、ロングフォーム可溶性ＩＧＳＦ９−Ｉｇのヌクレオチド（配列番号５）とアミノ酸（配列番号６）配列を示す。
【図９Ｄ】図９Ｃと９Ｄはそれぞれ、ロングフォーム可溶性ＩＧＳＦ９−Ｉｇのヌクレオチド（配列番号５）とアミノ酸（配列番号６）配列を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅと９Ｆはそれぞれ、ロングフォーム全長ＩＧＳＦ９のヌクレオチド（配列番号７）とアミノ酸（配列番号８）配列を示す。
【図９Ｆ】図９Ｅと９Ｆはそれぞれ、ロングフォーム全長ＩＧＳＦ９のヌクレオチド（配列番号７）とアミノ酸（配列番号８）配列を示す。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ロングフォームとショートフォームＩＧＳＦ９（配列番号９〜１１）のタンパク質配列比較である。
【図９Ｈ−１】図９Ｈは、腫瘍異種移植サンプル（配列番号１２〜１５）からのエキソン５〜１１の領域におけるＩＧＳＦ９の選択的スプライシング形のヌクレオチド配列である。
【図９Ｈ−２】図９Ｈは、腫瘍異種移植サンプル（配列番号１２〜１５）からのエキソン５〜１１の領域におけるＩＧＳＦ９の選択的スプライシング形のヌクレオチド配列である。
【図１０】図１０は、組換えにより発現され、かつ精製されたＩＧＳＦ９ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１と２はそれぞれ、可溶性のＩＧＳＦ９−Ｉｇのショートフォームとロングフォームを表す。
【図１１】図１１は、安定に形質移入されたＣＨＯ細胞系におけるＩＧＳＦ９のノーザンブロット分析を示す。各レーンのサンプルは、以下の通りである：（１）形質移入されていない野生型ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞、（２）全長ショートフォームＩＧＳＦ９を発現している安定なＣＨＯ  ５ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）増幅株、（３）可溶性のショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇを発現している安定なＣＨＯ  ５ｎＭ  ＭＴＸ増幅株、（４）可溶性のショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇを発現している安定なＣＨＯ  ５０ｎＭ  ＭＴＸ増幅株、（５）可溶性のロングフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇを発現している安定なＣＨＯ  Ｇ４１８クローン。
【図１２】図１２は、精製されたショートフォームＩＧＳＦ９−Ｉｇに対する、ＥＬＩＳＡによって測定されたマウス血清からの抗ＩＧＳＦ９抗体価を示す。
【図１３】図１３は、ショートフォームＩＧＳＦ９を安定に発現している形質移入されたＧ４１８耐性でありかつＭＴＸ増幅されたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系上の、ショートフォームＩＧＳＦ９表面発現のＦＡＣＳ分析を示す。ＩＧＳＦ９表面発現は、形質移入されていないＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（ＤＧ４４）、Ｇ４１８耐性細胞（Ｇ４１８）、５ｎＭ  ＭＴＸ増幅株（５ｎＭ）、および５０ｎＭ  ＭＴＸ増幅株（５０ｎＭ）において示される。
【図１４】図１４は、ＩＧＳＦ９のロングフォームを安定に発現している形質移入されたＧ４１８耐性でありかつＭＴＸ増幅されたＣＨＯ  ＤＧ４４細胞系上の、ロングフォームＩＧＳＦ９表面発現のＦＡＣＳ分析を示す。ＩＧＳＦ９表面発現は、形質移入されていないＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（ＣＨＯ）、およびＧ４１８耐性細胞（Ｇ４１８）において示される。
【図１５】図１５は、ＮＣＩ−Ｈ６９腫瘍細胞における内因性ＩＧＳＦ９表面発現のＦＡＣＳ分析を示す。２ｏ対照細胞、アイソタイプ適合（ｍａｔｃｈｅｄ）対照抗体（２Ｂ８）、および複数の濃度の一次検出抗体８Ｆ３を試験した。
【図１６】図１６は、ヒト腫瘍株におけるＩＧＳＦ９発現のウエスタンブロット分析を示す。２つの異なる暴露時間が示される：３０分（左パネル）および５秒（右パネル、レーン２と３のみを示す）。各レーンにおいて、使用される細胞系は、以下の通りである：（１）疑似形質移入されたＣＯＳ−７細胞（５μｇ）、（２）全長ＩＧＳＦ９を一時的に形質移入されたＣＯＳ−７細胞（５μｇ）、（３）全長ＩＧＳＦ９を発現している安定なＣＨＯ  Ｇ４１８クローン（５０μｇ）、（４）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞系（５０μｇ）、（５）ＺＲ−７５−１乳癌細胞系（５０μｇ）、（６）ＮＣＩ−Ｈ６９小細胞肺癌細胞系（５０μｇ）、（７）Ｏｖｃａｒ−３卵巣癌細胞系（５０μｇ）、（８）ＰＡ−１卵巣癌細胞系（５０μｇ）。
【図１７】図１７は、免疫蛍光顕微鏡法によって視覚化される通りの、乳腺腫瘍細胞系ＺＲ−７５における細胞表面ＩＧＳＦ９発現を示す。
【図１８】図１８は、Ｏｖｃａｒ−３およびＮＣＩ−Ｈ６９ネズミ腫瘍異種移植片および培養細胞における細胞表面ＩＧＳＦ９発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図１９】図１９は、ＬＳ１７４ＴおよびＮＣＩ−Ｈ６９腫瘍株、ならびにネズミの異種移植片から得られるＯｖｃａｒ−３細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ２代継代培養物（Ｐ０およびＰ１）における、ＩＧＳＦ９発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２０】図２０は、ＩＧＳＦ９の選択的スプライシング形が、ネズミの異種移植腫瘍によって発現されることを示す。図２０Ａは、以下から得られるＰＣＲ産物を示す：（１）ＮＣＩ−Ｈ６９腫瘍株、（２）Ｏｖｃａｒ−３腫瘍株、（３）ＮＣＩ−Ｈ６９マウス異種移植片、（４）Ｏｖｃａｒ−３マウス異種移植片、および（５）陰性対照。図２０Ｂは、Ｏｖｃａｒ−３およびＮＣＩ−Ｈ６９腫瘍異種移植片において見られる新規のスプライスバリアントのアラインメントを示す概略図を示す。上の図は、既知のＩＧＳＦ９変異体（ショートフォームおよびロングフォーム）のエキソン５〜１０を示す。下の図は、新規のＩＧＳＦ９アイソフォームのエキソン５〜１１を示す。
【図２１Ａ】図２１は、ネズミの異種移植組織から得られる新規のＩＧＳＦ９アイソフォームのＩＧＳＦ９配列アラインメントを示す。図２１Ａは、Ｏｖｃａｒ−３およびＮＣＩ−Ｈ６９異種移植腫瘍において、発現される独特のスプライスバリアントからの相当する部分鎖と整列配置させたエキソン８〜１０を含有するオープンリーディングフレームの、ヌクレオチド１１３８〜１１５５の部分的なロングフォームヌクレオチド配列のアラインメントを示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、Ｏｖｃａｒ−３およびＮＣＩ−Ｈ６９異種移植腫瘍において、発現される独特のスプライスバリアントからの相当する部分鎖と整列配置させたエキソン８〜１１に含まれるアミノ酸２８５〜４２６の、翻訳されたアミノ酸配列のアラインメントを示す。アラインメントに相当する配列は、以下の通りである：（１）ロングフォームＩＧＳＦ９（配列番号１６および２２）、（２）Ｏｖｃａｒ−３異種移植片、クローン２から得られる配列（配列番号１７および２３）、（３）Ｏｖｃａｒ−３異種移植片、クローン１から得られる配列（配列番号１８および２４）、（４）ＮＣＩ−Ｈ６９異種移植片クローン１から得られる配列（配列番号１９および２５）、（５）ＮＣＩ−Ｈ６９異種移植片クローン２から得られる配列（配列番号２０および２６）、および（６）コンセンサス配列（配列番号２１および２７）。
【図２２Ａ】図２２Ａと２２Ｂはそれぞれ、ヒトＬＩＶ−１のヌクレオチド（配列番号２８）配列とタンパク質（配列番号２９）配列である。図２２Ｂは、予測されるシグナル配列を太字で示し、予測される細胞外ドメインには、下線を引き、予測される膜貫通領域は、太字かつイタリック体にしている。
【図２２Ｂ】図２２Ａと２２Ｂはそれぞれ、ヒトＬＩＶ−１のヌクレオチド（配列番号２８）配列とタンパク質（配列番号２９）配列である。図２２Ｂは、予測されるシグナル配列を太字で示し、予測される細胞外ドメインには、下線を引き、予測される膜貫通領域は、太字かつイタリック体にしている。
【図２３】図２３は、Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ  ｄａｔａｓｕｉｔｅを使用する、ＬＩＶ−１の遺伝子発現プロフィールを示すｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎプロフィールを示す。
【図２４】図２４は、正常組織におけるＬＩＶ−１発現を示す。上のパネルが、ＬＩＶ−１の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。各レーンに存在するｃＤＮＡサンプルは、以下の通りである：（１）心臓、（２）脳、（３）胎盤、（４）肺、（５）肝臓、（６）骨格筋、（７）腎臓、（８）膵臓、（９）陰性対照、および（１０）陽性対照。
【図２５】図２５は、乳腺腫瘍サンプルにおけるＬＩＶ−１発現を示し、正常な乳房サンプルと適合させたものである。上のゲルが、ＬＩＶ−１の発現を示すのに対して、下のゲルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。図の右側の矢印は、ＬＩＶ−１  ＰＣＲ産物の予想されるサイズを表す。腫瘍サンプルは、以下の通りである：（１−患者Ａ）浸潤性腺管癌、（２−患者Ｂ）浸潤性腺管癌、（３−患者Ｃ）管状腺癌、（４−患者Ｄ）浸潤性腺管癌、（５−患者Ｅ）浸潤性腺管癌、（６−患者Ａ）正常、（７−患者Ｂ）正常、（８−患者Ｃ）正常、（９−患者Ｄ）正常、（１０−患者Ｅ）正常、（１１）陰性対照、（１２）陽性対照、（１３−患者Ｇ１９）高悪性度浸潤性腺管癌、（１４−患者Ｇ１７）低悪性度分泌管内癌、（１５−患者Ｘ）管腺癌、（１６−患者Ｗ）混合性の腺管癌および小葉癌、（１７−患者Ｔ）高悪性度ｉｎ  ｓｉｔｕかつ浸潤性の腺管癌、（１８−患者Ｇ１９）正常、（１９−患者Ｇ１７）正常、（２０−患者Ｘ）正常、（２１−患者Ｗ）正常、（２２−患者Ｔ）正常、（２３）陰性対照、および（２４）陽性対照。
【図２６】図２６は、結腸腫瘍におけるＬＩＶ−１発現を示す。上のパネルが、ＬＩＶ−１の発現を示すのに対して、下のパネルは、ＧＡＰＤＨの発現を示す。サンプルは、以下の通りである：（１）グレード３の腺癌、（２）グレード２の腺癌、（３）グレード１の腺癌、（４）グレード２の腺癌、（５）結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ  １１６、（６）陽性対照、および（７）陰性対照。
【図１Ａ】
2006520194.tif 000009
【図１Ｂ】
2006520194.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2006520194.tif 000015
【図７】
2006520194.tif 000016
【図８】
2006520194.tif 000017
【図９Ａ】
2006520194.tif 000018
【図９Ｂ】
2006520194.tif 000019
【図９Ｃ】
2006520194.tif 000020
【図９Ｄ】
2006520194.tif 000021
【図９Ｅ】
2006520194.tif 000022
【図９Ｆ】
2006520194.tif 000023
【図９Ｇ】
2006520194.tif 000024
【図９Ｈ−１】
2006520194.tif 000025
【図９Ｈ−２】
2006520194.tif 000026
【図１０】
2006520194.tif 000027
【図１１】
2006520194.tif 000028
【図１２】
2006520194.tif 000029
【図１３】
2006520194.tif 000030
【図１４】
2006520194.tif 000031
【図１５】
2006520194.tif 000032
【図１６】
2006520194.tif 000033
【図１７】
2006520194.tif 000034
【図１８】
2006520194.tif 000035
【図１９】
2006520194.tif 000036
【図２０】
2006520194.tif 000037
【図２１Ａ】
2006520194.tif 000038
【図２１Ｂ】
2006520194.tif 000039
【図２２Ａ】
2006520194.tif 000040
【図２２Ｂ】
2006520194.tif 000041
【図２３】
2006520194.tif 000042
【図２４】
2006520194.tif 000043
【図２５】
2006520194.tif 000044
【図２６】
2006520194.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月20日(2005.10.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１のどちらかと結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号２に示す通りのアミノ酸２１から７１８の間、配列番号８に示す通りのアミノ酸２１から７３４の間、配列番号２２〜２７に示す通りのアミノ酸配列のＩＧＳＦ９と結合するか、または配列番号２９に示す通りの、アミノ酸２８から３１７、３７３から４１７、６７４から６７８または７４２から７４９間でＬＩＶ−１と結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体または抗原結合フラグメントはドメイン欠損抗体を含む、請求項２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４】
細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項３に記載のドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記細胞傷害性薬剤は、放射性核種である、請求項４に記載のドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体は、ヒト化されている、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体は、霊長類化されている、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ここで該抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する、１つまたは複数の機能を妨げる、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項１０】
１種または複数の二官能性キレート剤に共有結合的に連結させたドメイン欠損抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、腫瘍性疾患の治療のための組成物。
【請求項１１】
前記二官能性キレート剤は、ＭＸ−ＤＴＰＡおよびＣＨＸ−ＤＴＰＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１と結合する治療上有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、腫瘍性疾患を呈している哺乳類を治療するための薬学的組成物。
【請求項１３】
治療上有効量の少なくとも１種の化学療法剤をさらに含み、ここで該化学療法剤および前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意の順序で、あるいは並行して投与できる、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記抗ＩＧＳＦ９または抗ＬＩＶ−１抗体あるいはその抗原結合フラグメントは、ドメイン欠損抗体である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ドメイン欠損抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＨ２ドメインを欠いている、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞傷害性薬剤と結合されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、前記化学療法剤の２週間以内の投与のために処方されている、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１ポリペプチドあるいはそのフラグメントおよび生理的に許容される担体を含む、癌を治療するためのワクチン。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、配列番号２に示す通りのＩＧＳＦ９のアミノ酸１から１１６３もしくはアミノ酸２１から７１８、または配列番号２９に示す通りのＬＩＶ−１のアミノ酸１から７４９、アミノ酸２８から３１７、もしくはアミノ酸３７３から４１７を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記生理的に許容される担体は、アジュバントまたは免疫賦活剤を含む、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記アジュバントはＰＲＯＶＡＸ（商標）である、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ポリペプチドは、ヘルパーＴペプチドに融合される、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２４】
請求項１９に記載のワクチンを含む、癌の治療または予防を必要とする患者において、免疫応答を誘発するための薬学的組成物。
【請求項２５】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの過剰発現を検出する方法であって、
ｆ．個体から得られたサンプルにおいて、ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること；
ｇ．正常な個体から得られた対照サンプルまたは該サンプルを提供した個体からの正常組織に由来するＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１あるいはそのフラグメントの発現を検出すること；および
ｈ．ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１の発現レベルを、該対照サンプルにおいて検出されるものと比較すること、
を含む方法。
【請求項２６】
前記ＩＧＳＦ９フラグメントは、エキソン５〜１０を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記過剰発現は、核酸増幅またはハイブリダイゼーションにより検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記過剰発現が、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する抗体、あるいはその抗原結合フラグメントを使用して検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
癌治療を受けている個体からＩＧＳＦ９もしくはＬＩＶ−１、またはこれらのフラグメントを検出する方法であって、
ｆ．該個体から得られたサンプルにおけるＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１、あるいはそのフラグメントの発現を検出すること；
ｇ．正常な個体から得られた対照サンプルまたは該サンプルを提供した癌治療を受けている個体から得られた正常組織に由来するＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１、あるいはそのフラグメントの発現を検出すること、および；
ｈ．ＩＧＳＦ−９またはＬＩＶ−１の発現レベルを、対照サンプルにおいて検出されるものと比較すること、
を含む方法。
【請求項３０】
前記ＩＧＳＦ９フラグメントは、エキソン５〜１０を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
免疫学的にＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１抗原あるいはそのフラグメントに似ている抗イディオタイプ抗体を活性成分として含む、ワクチン。
【請求項３２】
癌を治療または発見するのに使用するための、請求項９に記載の組成物を説明書と共に含む、キット。
【請求項３３】
腫瘍細胞がＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１抗原を発現している哺乳類において、腫瘍性疾患を治療するための薬学的組成物であって、薬学的に有効な量のＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１に対する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
薬学的に許容される担体と、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１を含む、抗腫瘍免疫応答を誘発するのに有効な量の免疫原性調製物とを含むワクチンであって、該免疫原性調製物は抗腫瘍免疫応答を誘発可能である、ワクチン。
【請求項３５】
ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の少なくとも８ヌクレオチドの部分を含む、長さが最高５０ヌクレオチド長までの、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現を妨げる、アンチセンス核酸。
【請求項３６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの改変されたインターヌクレオチド結合を含む請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
細胞または組織において、ＩＧＳＦ９またはＬＩＶ−１の発現を妨げるための薬学的組成物であって、請求項３４に記載の核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項３８】
配列番号３；
配列番号５；
配列番号１２；
配列番号１３；
配列番号１４；
配列番号１５；
配列番号１６；
配列番号１７；
配列番号１８；
配列番号１９；
配列番号２０；および
配列番号２１
からなる群から選択される、単離された核酸。
【請求項３９】
請求項３８の核酸を含む、ベクター。
【請求項４０】
請求項３８の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項４１】
配列番号４；
配列番号６；
配列番号２２；
配列番号２３；
配列番号２４；
配列番号２５；
配列番号２６；および
配列番号２７
からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４３】
請求項４１に記載のポリペプチドと生理的に許容される担体とを含む、癌を治療するためのワクチン。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006520194000001.app
【国際調査報告】
2006520194.tif 000046