(57)【要約】本発明は、哺乳類の所望器官に細胞を移動させるために複合糖質を使用して哺乳類における標的組織に細胞を送達する方法に関する。本発明による方法は、特別には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）等のリンパ系細胞、または骨髄もしくは臍帯組織に由来する幹細胞等の幹細胞を投与するステップに特に適用可能である。本方法は、さらにまた哺乳類へ目的の遺伝子を含有する細胞を導入するステップと、および複合糖質を投与するステップとによって目的の遺伝子を哺乳類の組織に標的とさせるためにも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類中の標的組織に幹細胞またはリンパ系細胞を送達するための方法であって、
（ａ）哺乳類に複合糖質を投与するステップと、
（ｂ）哺乳類に前記細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２】
細胞が造血幹細胞である、請求項１の方法。
【請求項３】
幹細胞が骨髄、胎盤、筋肉、脂肪または臍帯から入手される、請求項２の方法。
【請求項４】
リンパ系細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項５】
複合糖質が一般式Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ
（式中、Ｐはヒト血清糖タンパク質のペプチド残基であり、Ｓはヒト血清糖タンパク質の糖残基である。ｘは１〜１００の整数であり、そしてＧａｌはガラクトース残基である）によって表される請求項１の方法。
【請求項６】
複合糖質がオロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項７】
標的組織が心臓、肝臓、肺、および腎臓からなる群から選択される器官の組織である、請求項１の方法。
【請求項８】
複合糖質が細胞の前に哺乳類へ投与される、請求項１の方法。
【請求項９】
複合糖質および細胞が哺乳類へ静脈内投与される、請求項１の方法。
【請求項１０】
造血幹細胞に哺乳類の心臓を標的とさせるための方法であって、
（ａ）哺乳類へアシアロオロソムコイドを投与するステップと、
（ｂ）哺乳類へ細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
細胞がアシアロオロソムコイドを投与するステップの後に投与される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
アシアロオロソムコイドが心臓に近位の血管を介して投与される、請求項１０の方法。
【請求項１３】
アシアロオロソムコイドが頸静脈を介して投与される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
哺乳類の心臓がアシアロオロソムコイドを投与するステップの前に虚血性傷害に罹っている、請求項１０の方法。
【請求項１５】
哺乳類の心臓に間葉系幹細胞を標的とさせるための方法であって、
（ａ）哺乳類にオロソムコイドを投与するステップと、
（ｂ）哺乳類に細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項１６】
オロソムコイドが心臓に近位の血管を介して投与される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
オロソムコイドが頸静脈を介して投与される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
哺乳類の心臓がオロソムコイドを投与するステップの前に虚血性傷害に罹っている、請求項１５の方法。
【請求項１９】
細胞がオロソムコイドを投与するステップの後に投与される、請求項１５の方法。
【請求項２０】
哺乳類の肝臓に造血幹細胞を標的とさせるための方法であって、
（ａ）哺乳類にオロソムコイドを投与するステップと、
（ｂ）哺乳類に細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
細胞がオロソムコイドを投与するステップの後に投与される、請求項２０の方法。
【請求項２２】
哺乳類の肝臓に間葉系幹細胞を標的とさせるための方法であって、
（ａ）哺乳類へアシアロオロソムコイドを投与するステップと、
（ｂ）哺乳類へ細胞を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
細胞がオロソムコイドを投与するステップの後に投与される、請求項２２の方法。
【請求項２４】
目的の遺伝子に哺乳類中の組織を標的とさせるための方法であって、前記目的の遺伝子が導入遺伝子を含み、前記方法が、
（１）哺乳類に目的の遺伝子を含む細胞を導入するステップと、
（２）複合糖質を投与するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
細胞が造血幹細胞である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
細胞がリンパ系細胞である、請求項２４の方法。
【請求項２７】
幹細胞が骨髄、末梢循環または臍帯から入手される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
複合糖質がオロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドからなる群から選択される、請求項２４の方法。
【請求項２９】
哺乳類における組織損傷を特徴とする疾患を治療するための方法であって、
（１）哺乳類に幹細胞を投与するステップと、
（２）哺乳類へ複合糖質を投与するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
幹細胞が骨髄、末梢循環または臍帯から入手される、請求項２９の方法。
【請求項３１】
複合糖質がオロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドからなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３２】
疾患が心疾患、肺疾患、肝疾患、神経疾患および腎疾患からなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３３】
疾患が心筋梗塞、肺気腫、嚢胞性線維症、肝炎、脳卒中、腎炎および微量アルブミン尿症からなる群から選択される、請求項２９の方法。
【請求項３４】
リンパ系細胞または幹細胞と複合糖質とを含む医薬組成物。
【請求項３５】
複合糖質がオロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドからなる群から選択される、請求項３４の医薬組成物。
【請求項３６】
細胞が幹細胞である、請求項３４の医薬組成物。
【請求項３７】
細胞がリンパ系細胞である、請求項３４の医薬組成物。
【請求項３８】
包装材料および前記包装材料内に含有された医薬組成物を含む製造品であって、
ここで、医薬組成物が細胞に所望の器官を標的とさせるために治療的に有効である複合糖質を含み、
包装材料が医薬組成物を細胞に所望の器官を標的とさせるために使用できることを表示するラベルを含む製造品。
【請求項３９】
さらに細胞に標的とさせる際に使用するための、哺乳類へ投与すべき細胞懸濁液を作製するための追加の試薬および印刷された取扱説明書を含む、請求項３８の製造品。
【請求項４０】
さらに哺乳類中にそのような細胞に標的とさせるために適切な量の幹細胞を含む、請求項３９の製造品。
【請求項４１】
複合糖質がオロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドからなる群から選択される、請求項３８の製造品。
【請求項４２】
細胞が造血幹細胞である、請求項４０の製造品。
【請求項４３】
リンパ系細胞表面上のシアロ糖タンパク質決定基の修飾を含むリンパ系細胞を使用して、養子免疫療法の効率を改善するための方法。
【請求項４４】
修飾が新規アシアロ糖タンパク質決定基を生成するためのシアル酸の除去を含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
修飾が酵素によるシアル酸の除去を含む、請求項４４の方法。
【請求項４６】
修飾がノイラミニダーゼによるシアル酸の除去を含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】
修飾が酵素によるシアル酸の添加を含む、請求項４３の方法。
【請求項４８】
養子免疫療法が肝転移または原発性肝癌に対する活性化リンパ球の肝臓への局所的投与である、請求項４３の方法。
【請求項４９】
複合糖質が標的組織の位置する器官へ近位の血管を介して投与される、請求項６の方法。
【請求項５０】
器官が肝臓であり、複合糖質が肝動脈または肝門脈静脈または末梢静脈を介して投与される、請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照することにより、本明細書に組み込まれる２００２年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／３６４，４９８号の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、臨床医学および治療の分野にある。本発明は、細胞表面および／または遊離複合糖質上のシアロもしくはアシアロ決定基、特別にはネオアシアロ決定基を使用して、細胞に目的の器官を標的とさせるための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｍｏｒｅｌｌらは、セルロプラスミンのシアリル基がノイラミニダーゼによって除去されると、この血漿タンパク質が血清から急速に消失することを確定した。彼らは、この現象の原因が肝細胞中に存在するアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ）受容体による捕捉にあることを開示した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：１５５（１９６８））。その後、ＡＳＧＰ受容体は肝細胞中にしか存在しないことが報告された（Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４１：９９，（１９７４））。そのような肝細胞による特異的捕捉は、実験的にトリチウムを用いて標識されたアシアロセルロプラスミンまたはアシアロオロソムコイドが生体内に注入されると、アイソトープが選択的に肝細胞でしか検出されないという事実から同定されている。Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｃ．Ｓ．編集，「Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｔｒａｔｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９７９）の中の第２７９〜２８５頁のＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇ  Ｉ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｈｅｐａｔｉｃ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」を参照。さらに、この受容体が末端糖基としてＤ−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを有する糖タンパク質を特異的に認識かつ吸収することも開示された（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５１：５３１，（１９８２））。
【０００４】
肝細胞の細胞膜は、末端にガラクトースを備えるアシアロ糖タンパク質と結合する細胞構造を含む。この細胞構造は、最初は肝結合性タンパク質（ＨＢＰ）と呼ばれたが、現在はアシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ）受容体と呼ばれている。さらに、様々な脱シアル化糖タンパク質の中でも、脱シアル化α（１）−酸糖タンパク質であるアシアロオロソムコイドは注入された後に血清から最も迅速に消失することが観察されている。このため、アシアロ−α（１）−酸糖タンパク質は肝細胞によって特異的にかつ良好に捕捉されることが確定されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５：４３９７（１９７０））。ＡＳＧＰ受容体は、約４０，０００の分子量を有する単一ポリペプチドで構成されており、糖鎖の非還元的末端位置にガラクトース残基を有する糖タンパク質（すなわち、アシアロ糖タンパク質）を認識することができる。
【０００５】
ＡＳＧＰ受容体の生理的機能はまだ解明されていないが、ＡＳＧＰ受容体は糖タンパク質の代謝に関与すると考えられている。実際に、慢性肝炎、肝硬変および肝癌等の肝疾患の症例ではＡＳＧＰの血中レベルの増加が観察されている。さらに、化学物質の投与によって誘発された肝障害の実験モデルではＡＳＧＰ受容体量の減少が観察されている。
【０００６】
これらの現象を考察すると、ＡＳＧＰ様物質、すなわちＡＳＧＰ受容体指向性化合物の使用によって測定されるＡＳＧＰ受容体の量および質の評価を通して肝疾患を診断できる可能性がある。実際に、アシアロ複合糖質は治療および診断目的で、肝臓によって捕捉された化学物質（免疫抑制薬）および生物学的因子（抗体）にターゲットさせるための手段として他の物質へ共有結合させられている（例えば、米国特許第５，３４６，６９６号、第５，６７９，３２３号、および第５，０８９，６０４号を参照されたい）。
【０００７】
養子細胞免疫療法は、一般に免疫媒介反応を達成するために生物試薬を使用する治療法である。現在、大多数の養子免疫療法は、免疫細胞媒介性反応を増強する、または身体内の癌細胞を含む特異的抗原または異物を認識するいずれかのために処理されている、患者の自己免疫細胞を使用する治療に向けられた自己リンパ球療法（ＡＬＴ）である。治療は患者のリンパ球を取り出すステップと、細胞の免疫機能を活性化するためにこれらの細胞をインビトロで生物製剤や薬物へ曝露させるステップと、によって遂行される。自己細胞がいったん活性化されると、エックスビボで活性化されたこれらの細胞は、様々な形態の癌、感染性疾患、自己免疫疾患または免疫不全疾患を治療する目的で免疫機構を増強するために患者に再注入される。
【０００８】
養子免疫療法では、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）を利用できる。ＬＡＫ療法には、高濃度のＩＬ−２中で自己末梢血白血球を培養することによるＬＡＫ細胞のインビトロ生成が含まれる。次にＬＡＫ細胞は、ＩＬ−２の注入も含むことができる治療において癌患者に再注入される。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，「Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：６８１−７０９（１９８６））。ＴＩＬ療法には、外科的切除標本から入手された充実性腫瘍の内部および周囲に存在する炎症性浸潤細胞由来単核球からのＬＡＫ細胞の生成が含まれる。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１３１８−１３２１（１９８６）。近年は、養子免疫療法のさらに多数の変形が開発されてきた。例えば、癌抗原免疫療法の組成物および方法を開示または要求している２００２年６月１８日にＷｏｏｄへ付与された米国特許第６，４０６，６９９号、ならびにその中で開示かつ言及された参考文献に記載の方法を参照されたい。
【０００９】
癌免疫療法に加えて、養子免疫療法はヘルペスウイルス（ＨＳＶ、ＶＺＶ、ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、および乳頭腫ウイルス等のウイルスによる再発性感染症を含む数種の疾患および状態に関連するＴ細胞の不全症または機能障害に対する用途を有する。例えばＳｐｉｅｇｅｌ  Ｒ．Ｊ．，「Ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ」，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １４：１（１９８７）を参照されたい。ＡＬＴもまたＨＩＶ感染患者の治療において評価されている。「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｂｉｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，Ｍ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ編集，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．の第９章、第１８１−２０４頁（１９９３）のＯ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍａｚａ，「ＨＩＶ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ」。
【００１０】
幹細胞は、再生して特殊化細胞タイプを発生させる独特の能力を有する特別な種類の細胞である。心細胞または皮膚細胞等の身体の大多数の細胞は特定機能を実施するように拘束されているが、幹細胞は拘束されておらず、特殊化細胞に発達するシグナルを受けるまでは拘束されないままである。１９９８年には、ヒト初期胚由来の幹細胞が初めて単離され、培養中で増殖させられた。これらの幹細胞は、実際に身体のほとんどすべての特殊化細胞になることができると認識されている。近年、成体に存在する幹細胞もまた心臓、肝臓、膵臓、および神経系等の極めて広範囲の組織および器官のための置換細胞を生成する能力を有することが証明されている。そこで、このクラスのヒト成体幹細胞は、多くの破壊的な疾患および身体障害によって損傷または破壊された細胞または組織を修復または置換できることが期待できる。幹細胞に身体の特定器官を標的とさせることによりそのような治療を実行することは高度に有用である。
【００１１】
先行技術では、リンパ球および幹細胞は一般に組織内への注射または局所循環内への注入のどちらかによって所望の器官へ送り込まれている。しかし、そのような細胞をマウスへ注入すると、正常骨髄幹細胞およびリンパ球が肝臓へ局在することが証明されている。Ｓａｍｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８：３０９−３２２（１９８４）；Ｓａｍｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：２５０８−２５１２（１９８５）。
【００１２】
さらにまた、哺乳類に注入された細胞の大部分は、細胞のタイプあるいは生理的帰巣特性とは無関係に、肺内皮へ付着することも知られている。幹細胞は、それらが投与されると肺内に蓄積することが観察されている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：１２８１−１２８２（１９９６）；Ｍａｒｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１０２３−１０２８（１９９３）；Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４８５７−４８６１（１９９３）；およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６９：１２−２０（２００１）。
【００１３】
オロソムコイド、アシアロオロソムコイドおよびアガラクト／アシアロオロソムコイドは、好中球活性化、スーパーオキシドアニオン生成、および血小板活性化を阻害することが証明されている。Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４６５−４７２（１９８４）；およびＣｏｓｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：６７７−６７８（１９７９）。これらのタンパク質は、さらに一過性免疫抑制を誘導し、ＴＮＦ挑戦投与から保護した。Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７．６１０９−６１１３（１９８０）およびＬｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：１５７１−１５７５（１９９４）。オロソムコイドは肺内皮細胞への特異的結合を示し、これは炭水化物認識部位とは無関係であると思われた。Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６３：Ｈ４８−Ｈ５５（１９９２）。さらに、オロソムコイドは、用量依存性方法で皮膚毛細管内皮細胞へ結合し、それにより対照動物において漏出を誘発した炎症アゴニストに遭遇しても正常毛細管透過性を維持することが証明されている。Ｍｕｃｈｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．３３１：３１３−３２１（１９９６）。同様に、注入されたオロソムコイドは腎臓細管に結合して糸球体濾過の選択透過性を回復した。Ｍｕｃｈｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ  ８１：１９４−１９９（１９９９）。
【００１４】
脾臓または胸腺から単離されたリンパ球が静脈内注射されたマウスにおける、同系ノイラミニダーゼ処理リンパ球による肝細胞に対する自己免疫反応を含む、肝臓におけるノイラミニダーゼ処理リンパ球の捕捉も報告されている。Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：２８３０−２８３４（１９７９）。ノイラミニダーゼ処理ラットリンパ球と培養中の肝細胞との相互作用に関する試験は、細胞間の接着が哺乳類肝膜レクチン（すなわち、ＡＳＧＰ受容体）とシアル酸残基の除去後にリンパ球表面上で曝露させられたガラクトシル残基との間の立体特異的相互作用に起因することを証明した。Ｋｏｌｂ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１１４：２１９−２２２（１９７９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記を考察すると、循環を通してリンパ球および幹細胞を特定器官へ送達するための方法を開発する必要が存在する。そのような方法は、肝臓、心臓、肺および腎臓等の固形器官を非侵襲的に標的とするための手段を提供する。さらに、肺等の注射による投薬に適合しない極めて散在性の組織を標的とすることができよう。そのような方法は、肝臓、心臓、肺および腎臓等の器官を含む養子免疫療法および再生幹細胞療法において有用であろう。
【００１６】
本発明は、これらやその他の必要なものを取り扱う。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、哺乳類へ炭水化物提示分子（例、複合糖質）を投与するステップと、次に哺乳類へ細胞を投与するステップとを含む、哺乳類中の標的組織へ細胞を送達する方法を特徴とする。
【００１８】
本明細書で使用する用語「投与するステップ」は、外部起源からの注入であろうと、または骨髄等の哺乳類の体内でデポー製剤から循環中に細胞を移動させる方法であろうと、哺乳類の循環中における細胞の濃度上昇を誘導するあらゆる方法を意味する。例えばＧＭ−ＣＳＦおよびＧＣＳＦを使用して幹細胞を動員する手段は、当分野においてよく知られている。例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ」，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１２  Ｓｕｐｐｌ  １：１８７−２０１（１９９４）を参照されたい。
【００１９】
本発明による方法は、特別には例えば骨髄、末梢血、臍帯由来または培養中で増殖させた間葉系幹細胞由来等の幹細胞に適合する。本発明の範囲内の幹細胞には、所望の標的組織内へ分化することのできるあらゆる細胞が含まれる。そのような細胞には、多能幹細胞、胚性幹細胞、多分化能成体幹細胞、および始原細胞もしくは前駆細胞が含まれる。
【００２０】
本発明による方法は、さらにまた特別にはインターロイキン−２（ＩＬ−２）を用いて活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞および／または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含むがそれに限定されない活性化リンパ球等の免疫系細胞に適合する。
【００２１】
本発明の方法は、正常幹細胞または免疫細胞等の細胞を、特に心臓、肝臓、腎臓および肺等の標的組織を標的とすることを可能にする。細胞に心臓を標的とさせる一部の実施形態では、本方法はオロソムコイド（Ｏ）またはアシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）を投与するステップと、細胞を哺乳類へ投与するステップとを特徴とする。細胞に肺を標的とさせる実施形態では、本方法は哺乳類へ生理食塩水もしくは血清アルブミン−生理食塩水溶液またはタンパク質／アルブミンを含まない細胞培養培地中の細胞を投与するステップを特徴とする。細胞に肝臓を標的とさせる実施形態では、本方法はオロソムコイドまたはアシアロオロソムコイドを投与するステップと、細胞を哺乳類へ投与するステップとを特徴とする。一部の実施形態では、オロソムコイドは哺乳類へ細胞を投与するステップと同時に、またはそれに先立って投与される。本発明による方法は、さらにまた細胞に標的器官を標的とさせるステップが実施されない場合でさえ、哺乳類の肝臓内への幹細胞または免疫細胞の隔離を阻害または増強するためにも有用である。
【００２２】
本発明の複合糖質は一般に、一般式Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ（式中、Ｐはヒト血清糖タンパク質のペプチド残基であり、Ｓはヒト血清糖タンパク質の糖残基である。ｘは１〜１００の整数であり、そしてＧａｌはガラクトース残基である）で表すことができる。複合糖質は、部分的または完全にアシアル化されてよい。特に有用な複合糖質には、フェチュイン、アシアロフェチュイン、オロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドが含まれる。
【００２３】
複合糖質は、細胞を投与するステップに関連してあらゆる時間枠で哺乳類へ投与することができる。複合糖質は、細胞の投与の前に、後に、または同時に投与することができる。典型的な実施形態では、複合糖質は細胞に先立って投与される。複合糖質および細胞は、あらゆる適切な経路によって投与することができる。好ましい実施形態では、それらは哺乳類へ非経口的に、そしてより好ましくは静脈内投与される。
【００２４】
本発明による方法は、さらにまた目的の遺伝子を天然に含有する細胞、または目的の遺伝子を用いて形質転換された細胞を哺乳類へ導入するステップによって哺乳類中の組織へ目的の遺伝子を標的させるためにも有用である。そのような方法は、遺伝子産物をコードする機能的遺伝子を含む細胞を哺乳類に投与するステップおよび複合糖質を哺乳類へ投与するステップによって、哺乳類における遺伝子産物の欠損を特徴とする疾患を治療するために有用である。これらの方法によると、当該の外生機能的遺伝子を含有する細胞を投与し、欠乏した遺伝子産物を産生させるために機能できる身体内の特定器官へ局在させることができる。
【００２５】
同様に、本発明による方法は、細胞を投与するステップと複合糖質を哺乳類へ投与するステップとによって、哺乳類における組織損傷を特徴とする疾患を治療するためにも有用である。幹細胞は心臓、膵臓、および神経系等の広範囲の組織および器官のための置換細胞を生成する能力を有するので、幹細胞は多くの破壊的な疾患および身体障害によって損傷または破壊された細胞または組織を修復または置換するために、身体内の特定器官を標的とさせることができる。一部の実施形態では、疾患は心疾患、肺疾患、腎疾患または肝疾患、例えば心筋梗塞、肺気腫、嚢胞性線維症、微量アルブミン尿症、腎炎、脳卒中または肝炎であってよい。
【００２６】
本発明による方法は同様に、哺乳類へ複合糖質を投与するステップおよび循環内へ幹細胞を動員する化学物質または生物製剤を投与するステップによって、哺乳類における組織損傷を特徴とする疾患を治療するためにも有用である。一定の器官は幹細胞を隔離し、それによって損傷した器官への有効量の送達を制限するために、動員された幹細胞の循環中濃度が制限される可能性がある。隔離を阻害することによって、本発明の複合糖質は器官での細胞用量を増加させる。それによって置換細胞を生成する能力が上昇する。幹細胞を動員するための物質を含む方法は、さらにまた心臓、膵臓、および神経系等の広範囲の組織および器官のためにも使用できる。動員された幹細胞は、多くの破壊的な疾患および身体障害によって損傷または破壊された細胞または組織を修復または置換するために、身体内の特定器官を標的とさせることができる。幹細胞が動員される一部の実施形態では、疾患は例えば心筋梗塞、肺気腫、嚢胞性線維症、微量アルブミン尿症、腎炎、脳卒中または肝炎等の心疾患、肺疾患、腎疾患、神経疾患または肝疾患であってよい。
【００２７】
他の実施形態では、本発明は細胞および例えば糖タンパク質である複合糖質を含む医薬組成物を提供する。本発明において有用である糖タンパク質には、例えばフェチュイン、オロソムコイド（Ｏ）およびアシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）が含まれる。他の態様では、本発明は包装材料および包装材料内に含有された医薬製剤を含む製造品を特徴とするが、このとき医薬製剤は本発明により、細胞に所望の器官を標的とさせるために治療上有効である本発明の複合糖質を含んでおり、そして包装材料は本発明により、細胞に所望の器官を標的とさせるために医薬製剤を使用できることを示したラベルを含む。一部の実施形態では、本製造品はさらにまた細胞懸濁液を作製するための溶液等の追加の試薬、および／または本発明により細胞に標的とさせるために使用するための印刷された取扱説明書を含む。そのような製品には、例えば組織損傷を治療するため、または哺乳類の組織へ機能的遺伝子もしくは遺伝子産物を送達するための、細胞および糖タンパク質を含むキットが含まれる。本発明の製造品において有用である糖タンパク質には、フェチュイン、アシアロフェチュイン、オロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドが含まれる。
【００２８】
さらにまた別の実施形態では、本発明は肝臓による捕捉を容易にする目的でアシアロ決定基を有する細胞調製物を生成するために幹細胞またはリンパ系細胞集団を誘導体化する方法を提供する。特別には、本発明は、これらの細胞が非経口投与されたときに循環する、結合される、そしてＡＳＧＰ受容体を介して肝臓によって隔離される、または捕捉されるように、酵素的または化学的手段によって生成されているそれらの表面上でアシアロ決定基を有する誘導体化かつ活性化された細胞またはリンパ球を提供する。ノイラミニダーゼ等のシアリダーゼを用いて全生存細胞を処理するための方法は当分野において知られている。例えば、Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｒ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１３２３−１３２９（１９８３）；Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，上記；およびＫｏｌｂ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，上記、を参照されたい。
【００２９】
例えば、本発明は、肝臓の機能および構造を修復するまたは再生させるために肝臓へこれらの細胞を差し向ける目的でそのような細胞の表面上でネオアシアロ決定基を生成するための、または疾患状態を治癒または改善する目的で正常遺伝子または遺伝子組換え細胞を送達するための、幹細胞を誘導体化する工程を提供する。本発明のこの態様の作動要素は、人工的に作製されたネオアシアロ糖決定基を含有する輸注された幹細胞の局在化を指令する能力、レシピエントのマイクロキメラを作製する能力、およびそれによってネオ決定基が肝臓によって特異的に隔離されるメカニズムである。そこで、これらのネオアシアロ糖決定基を含有する細胞の同化は、マイクロキメリズム（誘導体化幹細胞と遺伝的に異常な元の宿主細胞との混合物）を生じさせる。修飾された幹細胞は、疾患表現型を復帰または改善するために必要とされる少なくとも最小必要量の異常もしくは欠失しているタンパク質または調節機能を発現する。修飾された幹細胞は、患者の血液、骨髄または脂肪組織等のその他の幹細胞産生器官から誘導することができよう、またはまた別の個別細胞系もしくは幹細胞系から誘導することができよう。
【００３０】
本発明はさらに、「ネオアシアロ決定基」を生成する酵素を用いて細胞表面を誘導体化することによって、肝臓による非経口投与された活性化リンパ球の隔離を特異的に促進することによりリンパ系細胞溶解細胞のインビボ細胞トラッフィキングパターンを操作する方法を提供する。そこで、活性化リンパ系細胞集団は、ＡＳＧＰ受容体に結合できる細胞表面アシアロ決定基を有しており、そしてこの結合は新規細胞表面アシアロ決定基を生成する酵素処理によりいっそう増強することができる。
【００３１】
これらの方法は、細胞表面アシアロ決定基を生成するために誘導体化されている非経口投与された細胞の肝臓による（ＡＳＧＰ受容体を介した）捕捉を促進することにより、肝転移または原発性肝癌に対する例えば養子免疫療法の効率を改善するために使用できる。様々な癌の肝転移は治療が困難である。例えば、乳癌の肝転移の排除は、移植のための骨髄または自己幹細胞産物を採取する前に達成されなければならない。化学療法単独で完全な応答を達成するためには数ヵ月間を要する可能性がある。これはしばしば骨髄抑制をもたらし、個体からの幹細胞の採取を極めて困難にする。腫瘍が化学療法耐性である場合には、極めて少数の治療選択肢しか残らない。養子免疫療法は、患者自身の細胞が腫瘍を認識するように培養中で「教育」し、次にこれらの細胞が腫瘍を見つけて破壊するように静脈内投与により患者へ送り込むことによって行われる。
【００３２】
腫瘍負荷が肝臓原発性である場合は、肝臓からの腫瘍排除を特異的に目指す数サイクルの治療を行うことが有用なことがある。本発明によると、これはアシアロ決定基に曝露させるために細胞表面グリコシル化部位を修飾するノイラミニダーゼ等のシアリダーゼを含む（がそれに限定されない）酵素または他の処理を用いて（培養中で増殖または「教育」されている）活性化リンパ系細胞集団を処理することによって遂行できる。それによりこれらの決定基の数は極めて顕著に増加するので、修飾された細胞は肝性ＡＳＧＰ受容体へより容易に結合し、「正常」数のアシアロ決定基を有する細胞より解離する頻度が少なくなる。
【００３３】
ネオアシアロ糖決定基を有するリンパ系細胞の同化は、上記で幹細胞について記載したように、遺伝子操作されている、またはされていない注入されたリンパ球とその部位に存在する元の宿主リンパ系細胞との混合物であるマイクロキメリズムを生じさせる。注入されたリンパ系細胞は、分裂して循環内に入り、そして局所免疫応答に関与するために他の細胞集団を補充することによって免疫応答を強化または増強する。肝臓の環境は、洞様血管および血管構造、特別には門脈系には先天性免疫系の細胞およびプロフェッショナル抗原提示細胞が存在するため、免疫応答を発生させるために理想的に適合する。
【００３４】
例えば、数件の研究は、例えば転移性皮膚黒色腫への応答が活性化リンパ球の肝臓への局所投与を使用して達成できることを証明している。例えば、Ｋｅｉｌｈｏｉｚ  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ：１０３−１０５（１９９４）を参照されたい。追加の細胞表面アシアロ決定基を生成するように修飾されている活性化リンパ球を使用する本発明の方法は、これらの細胞を原発性肝腫瘍または非肝腫瘍へ、または原発性肝癌または非肝癌から遠隔の転移性病変へ送達するために、侵襲性手技を使用せずに肝動脈または門脈静脈または末梢静脈を介して局所的に肝臓へ活性化リンパ球を送達することを許容する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
Ａ．はじめに
本発明は、哺乳類における標的組織へ細胞を送達する方法に向けられる。本方法は、同時または連続的のいずれかで、炭水化物提示分子（例、複合糖質）および細胞を哺乳類へ投与するステップを含む。本発明の方法では、複合糖質、特別にはアシアロオロソムコイド（アシアロα−（１）−酸糖タンパク質）等のアシアロ血漿タンパク質を含むアシアロ複合糖質は、肝性ＡＳＧＰ受容体へ一過性で結合し、それによりこれらの受容体からアシアロ決定基を有する細胞の付着を完全に阻害する。理論に結び付けることを望まなくても、低シアル化および脱シアル化タンパク質／複合糖質（アシアロ複合糖質とも呼ばれる）および類似の決定基を有する細胞は、肝性ＡＳＧＰ受容体への結合の結果として肝臓内に結合または「捕捉」されている（図１を参照）。アシアロ複合糖質による受容体の占有は、肝臓内の当該の類似決定基を有する細胞の隔離を阻害する。
【００３６】
さらに、本発明の開示は、注入された細胞が肺胞系内に集中するのを本発明の複合糖質が防止することを証明する。この所見は、細胞の肺隔離は、再灌流症候群に類似する、内皮細胞上の炎症受容体の発現に関連する可能性があることを示唆している（例えばＫｉｌｇｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ２８：４３７−４４４（１９９４）およびＥｒｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２６６−２７５（１９９９）を参照されたい）。これは、上記に記載したようにオロソムコイド、ＡＳＯおよびアガラクト／アシアロオロソムコイドが好中球活性化スーパーオキシドアニオン生成ならびに血小板活性化を阻害するという報告によって支持されている。
【００３７】
本発明はさらに、糖タンパク質を使用すると、投与する特定複合糖質を変えることによって身体の特定器官へ細胞にトラフィッキングまたは標的とさせることができることを証明している。本発明は、骨髄や幹細胞の移植術、組織修復術、遺伝子療法または養子免疫療法を改良するために有用である。
【００３８】
細胞に肺を標的とさせる実施形態では、本方法は哺乳類へ生理食塩水もしくは血清アルブミン−生理食塩水溶液中の細胞を投与するステップを特徴とする。細胞に心臓を標的とさせる一部の実施形態では、本方法は哺乳類へアシアロオロソムコイドを投与するステップと、および細胞を投与するステップと、を特徴とする。間葉系幹細胞に心臓を標的とさせる他の実施形態では、本方法は哺乳類へオロソムコイドを投与するステップと、および細胞を投与するステップと、を特徴とする。造血幹細胞に肝臓を標的とさせる実施形態では、本方法は哺乳類へオロソムコイドを投与するステップと細胞を投与するステップとを特徴とする。間葉系幹細胞に肝臓を標的とさせる他の実施形態では、本方法は哺乳類へアシアロオロソムコイドを投与するステップと細胞を投与するステップとを特徴とする。一部の実施形態では、オロソムコイドまたはアシアロオロソムコイドは哺乳類へ細胞を投与するステップに先行して少なくとも２回の注入で投与される。本発明による方法は、さらにまた細胞に標的器官を標的とさせるステップが実施されない場合でさえ、哺乳類の肝臓内における細胞の隔離を阻害するためにも有用である。
【００３９】
アシアロ複合糖質、例えばアシアロフェチュインおよびその他のアシアロ血漿タンパク質は、肝実質およびクッパー細胞ＡＳＧＰ受容体へ結合することができる。これらの受容体が骨髄細胞等のアシアロ決定基を有する細胞に結合して捕捉を遮断すると、それらの全身性循環が促進されて循環間隔が増加する。骨髄幹細胞の場合には、これらの化合物の投与は骨髄幹細胞の消失および破壊を防止し、移植効率を増加させる。骨髄細胞はＡＳＧＰ受容体へ結合できる細胞表面アシアロ決定基を有しており、そしてこの結合はＡＳＧＰの適用によって阻害できる。
【００４０】
本発明は、ヒト末梢血由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋）または間葉系幹細胞を免疫不全マウスの頸静脈内に注入すると、それらの大部分が肺に局在するという観察所見を利用している。細胞を注入する前にアシアロオロソムコイドを注入すると、造血幹細胞の大部分は心臓内に局在するが、他方間葉系幹細胞は肝臓内に局在する。あるいはまた、細胞を注入する前にオロソムコイド（Ｏ）を注入すると、造血幹細胞は肝臓内に局在するが、他方間葉系幹細胞の大部分は心臓内に局在する。
【００４１】
これらのタンパク質の注入は、それらを実施しない場合に比較して特定器官内への定量的局在化を引き起こす。その上、アシアロオロソムコイドの影響を受けて心臓内へ局在する造血幹細胞は、血管腔を離れて注入１時間後までに心筋細胞間で観察される。さらに、いったん組織内に入るとこれらの細胞はＣＤ３４抗原を消失するが、これはそれらの細胞が心筋細胞または心臓構成要素（例、血管）に分化する過程にあることを示唆している。さらに１時間後には、ＣＤ３４＋細胞は血管構造から肺組織内に移動することが証明されている。オロソムコイド処置マウスでは、幹細胞群は肝実質中で見いだされ、それらのＣＤ３４抗原を消失していることが証明されており、これもまた肝細胞／肝実質への分化を示唆している。
【００４２】
本発明は、高濃度の幹細胞を非外傷性方法で特定器官に向かわせる能力を証明する。これは幹細胞が標的組織内に移動して所望の細胞タイプへ分化する確率および速度を増強する。本発明は、心臓に近位の血管へのオロソムコイドまたはＡＳＯの送達が注入された幹細胞の心臓内での蓄積を引き起こすという観察所見を利用している。理論で結び付けることを望まなくても、この作用は、内皮細胞が幹細胞に結合して内皮を超える組織内への移動を増強することを誘発する注入部位からすぐ下流にある内皮を感作する糖タンパク質注入によって引き起こすことができる。
【００４３】
複合糖質についての本発明の所見は、輸注した幹細胞の大多数を標的器官内に集中させることができ、それによって効果的レジメンの細胞用量を送達するための手段を提供することを指摘している。これは心臓等の固形器官を非侵襲的に標的とさせ、それによって侵襲的な直接注射に匹敵する機会を提供する。おそらくもっと重要なことに、複合糖質は、注射による投与には適合しない肝臓および腎臓等の極めて広汎性の組織を標的とさせる手段を提供する。
【００４４】
骨髄、末梢血または臍帯血から回収された造血幹細胞（ＨＳＣ）、ならびに髄ストローマ細胞、脂肪吸引脂肪由来ストローマ細胞として回収された、または臍帯血枯渇駆遂胎盤内の静止ストローマ前駆細胞から増殖させた間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、それらの分化能力においてほぼ互換的であり、多能性幹細胞として機能すると思われると認識されている。
【００４５】
そのような細胞は、特定の器官および組織中に局在すると機能的細胞へ分化することが証明されている。すなわち、肝臓内の肝細胞および胆管細胞、心臓内の心筋細胞および動脈平滑筋細胞および内皮細胞、肺における肺胞および気管支上皮内のＩ型やＩＩ型肺細胞、軟骨修復のための軟骨細胞、ならびに腸粘膜細胞、心臓の小血管、中血管および大血管等。
【００４６】
Ｂ．幹細胞
幹細胞は、パーキンソン病、糖尿病、急性および慢性心疾患、末期腎疾患、肝機能不全、および癌等の多数の破壊的疾患において消失した細胞に置換するための鍵を握っている可能性がある。多くの疾患にとって効果的治療法はないが、目的は天然プロセスが取り去ったものを補充する方法を見いだすことである。
【００４７】
現在までに、公表された科学論文は、成体幹細胞が脳、骨髄、末梢血、血管、骨格筋、皮膚の上皮、消化器系、角膜、歯髄、網膜、肝臓、および膵臓内で同定されたことを指摘している。したがって、成体幹細胞は全３種の初期胚葉から発達する組織中で見いだされている。
【００４８】
定義によって、当分野では以下の用語は次のように理解されている。
【００４９】
「幹細胞」は、一定の条件下で、長期間に渡り、または成体幹細胞の場合は生体の一生を通して自ら再生する能力を有する胚、胎児、または成体由来の細胞である。幹細胞はさらにまた、身体の組織および器官を作り上げる分化細胞を発生させることができる。
【００５０】
「多分化能幹細胞」は、それから身体のすべての細胞が発生する３種の胚葉（中胚葉、内胚葉および外胚葉）から発達するタイプの細胞を発生させる能力を有する。ヒト多分化能幹細胞について知られている起源は、ヒト初期胚および生殖腺の一部になることが運命付けられた胎児組織から単離かつ培養された多分化能幹細胞だけである。
【００５１】
「胚性幹細胞」は、胚盤胞と呼ばれる初期（４〜５日齢）胚の一部である内部細胞塊と呼ばれる細胞群由来である。胚盤胞からいったん取り出されると、内部細胞塊の細胞は胚性幹細胞へ培養することができる。これらの胚性幹細胞自体は胚ではない。
【００５２】
「成体幹細胞」は、分化（特殊化）組織内で発生する、自ら再生する、そして適切な組織へ移されると配置された組織の特殊化細胞タイプのすべてを産生するように特殊化される非分化（非特殊化）細胞である。成体幹細胞は、その生体の生涯に渡ってそれら自身の同一コピーを作製することができる。この特性は、「自己再生」と呼ばれている。成体幹細胞は、通例は分裂して始原もしくは前駆細胞を生成し、これらの始原もしくは前駆細胞は次に特徴的な形状および例えば筋細胞収縮または神経細胞シグナル伝達等の特殊な機能を有する「成熟」細胞タイプに分化または発達する。成体幹細胞の起源には、骨髄、血液、目の角膜および網膜、脳、骨格筋、歯髄、肝臓、皮膚、消化管の内面および膵臓が含まれる。
【００５３】
骨髄由来の幹細胞は、成体幹細胞のタイプの中でも最も多く試験されている。現在、骨髄由来幹細胞は移植によって骨髄の様々な血液成分および免疫成分を回復させるために臨床使用されている。現在は骨髄中で２つの主要タイプの幹細胞が同定されている。典型的には血液および免疫細胞を形成すると考えられる造血幹細胞（ＨＳＣ、またはＣＤ３４＋細胞）、そして典型的には骨、軟骨、筋肉および脂肪を形成すると考えられる間質性（間葉系）幹細胞（ＭＳＣ）。しかし近年、どちらのタイプの骨髄由来幹細胞も、同一組織を形成する能力において広範な柔軟性および多分化能があることを証明した。
【００５４】
骨の髄腔内に位置する骨髄は、ヒト成体における唯一の造血部位である。骨髄は、１日に体重１ｋｇ当たり約６０億個の細胞を産生する。造血的に活性な（赤色）骨髄は、出生後には青春後期までに退行し、その後は下頭蓋脊椎、肩帯および下肢帯、肋骨、および胸骨に集中している。脂肪細胞は、手、足、脚および腕の骨内で造血細胞に置換する（黄色骨髄）。脂肪は成体における赤色骨髄のスペースの約５０％を占め、さらに脂肪変態は加齢に伴って緩徐に持続する。極めて高齢の個体では、脂肪から粘液物質への膠様形質転換が発生することがある（白色骨髄）。黄色骨髄は、溶血性貧血等の長期にわたる需要が存在する場合は造血的に活性な骨髄へ復帰することができる。したがって造血は、赤色骨髄の容積を増加させ、前駆細胞から成熟細胞への発達（推移）時間を短縮させることによって拡大することができる。
【００５５】
骨髄間質は主として、骨内膜で始まり皮質毛細管から全身性静脈循環内に入る集合血管で終了する洞の網状組織から構成される。三層の洞壁は内皮細胞から構成される。発育不全の薄い基底膜、および脂肪細胞へ形質転換できる線維芽細胞である外膜細網細胞。内皮細胞および細網細胞は造血サイトカインの起源である。造血は洞間間隙で発生し、複雑な広範囲の刺激性および阻害性サイトカインの配列、細胞間接触および細胞外マトリックス成分が近接細胞に及ぼす作用によって調節される。この独特の環境では、リンパ造血幹細胞がすべての血球タイプに分化する。成熟細胞が産生され、定常状態血球レベルを維持するために放出される。この系は、失血、溶血、炎症、免疫血球減少症およびその他の原因の結果としての追加の細胞を必要とする需要増加を満たすことができる。骨髄幹細胞の移植効率は、肝臓による肝性ＡＳＧＰ受容体を介しての捕捉を防止することによって改善できよう。
【００５６】
「始原もしくは前駆」細胞は、胎児または成体組織中で発生し、そして一部は特殊化される。始原もしくは前駆細胞は分裂して分化細胞を発生させる。研究者らは、幹細胞が分裂して生じる２つの新規細胞の１つは自ら再び複製できる幹細胞であることが多いことで、前駆／始原細胞を成体幹細胞からしばしば区別している。これとは対照的に、始原／前駆細胞が分裂すると、その細胞はより多くの始原／前駆細胞を形成できる、または２種の特殊化細胞を形成できる。始原／前駆細胞は損傷または死滅した細胞に置換するので、したがって肝臓または脳等の組織の完全性および機能を維持することができる。
【００５７】
本発明において有用な幹細胞を単離および培養する手段はよく知られている。臍帯血は、造血幹細胞の豊富な起源である。臍帯血から入手された幹細胞および骨髄または末梢血から入手された幹細胞は、移植使用のためには極めて類似していると思われる。胎盤は、間葉系幹細胞を素晴らしく容易に入手できる起源である。さらにその上、間葉系幹細胞は脂肪細胞および骨髄間葉細胞から誘導できることが証明されており、他の組織中にも存在すると推測されている。成体幹細胞を誘導できる器官には極めて顕著な定性的および定量的相違があるが、細胞間の初期の相違は比較的に表在性で、それらは同様の範囲内の柔軟性を示すことで平衡していると思われる。例えば、造血系および間葉系の成体幹細胞はどちらも、適切な条件下では心筋細胞になることができる。成体幹細胞の完全な可能性の描写は始まったばかりである。
【００５８】
幹細胞は、知られている方法を使用して形質導入および分化のために単離することができる。例えば、マウスにおいては、骨髄細胞はマウスを致死させ、そして剪刀を用いて脚の骨を切断することによって単離される。そのような細胞はＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）およびｌａｄ（分化抗原提示細胞）等の望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることによって骨髄細胞から単離することができる。このプロトコールの例については、Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６−１６９３  １７０２（１９９２）を参照されたい。
【００５９】
ヒトにおいては、ＣＤ３４＋造血幹細胞は臍帯、骨髄、および動員末梢血を含む様々な起源から入手できる。ＣＤ３４＋細胞の精製は、抗体アフィニティー法によって遂行できる。ＣＤ３４＋細胞を単離するためのアフィニティーカラム単離法は、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １３（ｓｕｐｐｌ．３１：１００−１０５（１９９５）によって記載されている。さらにまた例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２．７−１７（１９９３）を参照されたい。間葉系幹細胞を単離、精製および培養により拡大するための方法は知られている。ＭＳＣのための特異的抗原もまた知られている（例えば、米国特許第５，４８６，３５９号および第５，８３７，５３９号を参照されたい）。
【００６０】
Ｃ．炭水化物提示分子
本発明において有用な炭水化物提示分子は、標的組織への当該細胞のターゲティングの増強または阻害を引き起こす適切な炭水化物構造を提示できるあらゆる分子でありえる。ターゲティング機能はオリゴ糖、多糖等の炭水化物分子を使用して実施できる、または炭水化物構造を複合糖質として本明細書に挙げた大きな分子または担体へ結合させることができる。典型的には、炭水化物分子を天然型担体（例、糖タンパク質または糖脂質の一部として）に連結させることができる、または担体が合成型（例、遺伝子組換えポリペプチド配列）であってもよい。当業者は、適切な構造を提示するために多数の担体を使用できることを認識するであろう。適切な担体分子の例には、ポリペプチド、脂質等が含まれる。アシアロ炭水化物成分を使用した標的化合物の調製および使用は当分野において記載されている（例えば、米国特許第５，６７９，３２３、第５，０８９，６０４号、第５，０３２，６７８号および第５，２８４，６４６号を参照されたい）。当業者は、そのような化合物をさらにまた本発明において有用な炭水化物提示分子として使用できることを認識するであろう。
【００６１】
複合糖質が糖タンパク質である場合は、一般に一般式Ｐ−（Ｓ）ｘ−Ｇａｌ（式中、Ｐはヒト血清糖タンパク質のペプチド残基であり、Ｓはヒト血清糖タンパク質の糖残基である。ｘは１〜１００の整数であり、そしてＧａｌはガラクトース残基である）で表すことができる。特別に有用な複合糖質には、フェチュインおよびアシアロフェチュイン（図２を参照）、オロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドならびにガラクトース結合ポリリシン、ガラクトース結合ポリグリコサミン等が含まれる。
【００６２】
本発明の方法は、幹細胞等の細胞に特に心臓、肝臓、腎臓および肺等の標的組織を標的とさせることを可能にする。アシアロオロソムコイド等の複合糖質の非経口投与は、肝性ＡＳＧＰ受容体を遮断し、表面アシアロ決定基を有する細胞（例えば、ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）＋細胞）が循環し続けて髄腔へ移動することを許容するために使用できる。アシアロオロソムコイドは、肝性ＡＳＧＰ受容体へ結合することが証明されている、そしてこの受容体を特徴付けるために広範囲で使用されている糖タンパク質の１つである。
【００６３】
異なる化合物は、提示された炭水化物に依存してＡＳＧＰ受容体に対して異なる結合親和性を有する（図３および４を参照）。そこで、当業者は異なる炭水化物構造を提示する化合物を使用することにより細胞ターゲティングを調節することができる。
【００６４】
複合糖質、特別にはアシアロオロソムコイド等のＡＳＧＰの静脈内投与は、肝性ＡＳＧＰ受容体を遮断し、表面アシアロ決定基を有する細胞が循環し続けて髄腔または当該器官へ移動することを許容するために使用できる。複合糖質は、細胞に関連してあらゆる時間枠で哺乳類へ投与することができるが、一部の実施形態では複合糖質は細胞を投与するステップに先行して投与される。アシアロ複合糖質および細胞はあらゆる適切な経路で投与できるが、それらは一部の実施形態では哺乳類へ静脈内投与され、また別の実施形態では非経口投与される。細胞に肺を標的とさせる実施形態では、本方法は生理食塩水もしくは血清アルブミン−生理食塩水溶液中の細胞を哺乳類へ投与するステップを特徴とする。細胞に心臓を標的とさせる一部の実施形態では、本方法は哺乳類へアシアロオロソムコイドを投与するステップと、および細胞を投与するステップとを特徴とする。間葉系幹細胞に心臓を標的とさせる他の実施形態では、本方法は哺乳類へオロソムコイドを投与するステップと、および細胞を投与するステップとを特徴とする。造血幹細胞に肝臓を標的にさせる実施形態では、本方法は哺乳類へオロソムコイドを投与するステップと、および細胞を投与するステップとを特徴とする。間葉系幹細胞に肝臓を標的にさせる他の実施形態では、本方法はアシアロオロソムコイドを投与するステップと細胞を哺乳類へ投与するステップとを特徴とする。一部の実施形態では、オロソムコイドもしくはアシアロオロソムコイドは哺乳類へ細胞を投与するステップに先行して、および後に少なくとも２回の注入で投与される。本発明による方法は、さらにまた細胞に標的器官を標的とさせるステップを実施しない場合でさえ、哺乳類の肝臓内における細胞の隔離を阻害するためにも有用である。
【００６５】
α−（１）−酸糖タンパク質（オロソムコイドもしくはＡＡＧ）は、急性炎症および癌に関連して濃度が５倍の高さに増加する、したがって急性期タンパク質であると認識されるヒト血漿の正常成分（６５０±２１５μｇｍＬ-1）である。オロソムコイドは一本鎖ポリペプチドから構成され、４４，１００の分子量を有し、１２％のシアル酸を含む約４５％の炭水化物を含有する。オロソムコイドは、最も負に荷電している血漿タンパク質である。オロソムコイドの一定の生物学的特性は、そのシアル酸含量に関連している。そこで、オロソムコイドのクリアランスおよび免疫原性は、脱シアル化されると顕著に増加する。オロソムコイドの生物学的機能の大部分は知られていない。オロソムコイドは、コンカナバリンＡ、フィトヘムアグルチニンおよび同種細胞に反応した芽球化を含む一定のリンパ球反応性を阻害する能力を有しており、そしてこれらの阻害作用は脱シアル化に関連して増強される。非生理的に大量（５〜１５ｍｇ／ｍＬ）のオロソムコイドはＡＤＰおよびアドレナリンによって誘発された血小板凝集を阻害し、そしてオロソムコイドのシアル酸欠損種は数種の慢性疾患状態では上昇すると思われる証拠がある。
【００６６】
Ｄ．遺伝子療法
本発明は、さらにまた身体内へ治療用遺伝子を送達するために生体細胞を使用するステップに向けられる。一部の実施形態では、治療用遺伝子は導入遺伝子である。例えば、幹細胞の１つのタイプ、リンパ球、または線維芽細胞である送達細胞が身体から取り出され、直接遺伝子導入法において使用されるビヒクルのような当業者にはよく知られているビヒクルを介して治療用導入遺伝子がそれらの中に導入される。遺伝子組換え細胞は、まだ実験室内にある間に試験され、そして成長かつ増殖させられ、そして最後に注入によって患者へ戻される。あるいはまた、正常な内因性遺伝子を有する同種異系細胞は特定標的組織における欠損症を逆転させることができる。本明細書では、導入遺伝子または正常な内因性遺伝子のどちらかを有する細胞の使用を遺伝子療法と呼ぶ。
【００６７】
遺伝子組換え細胞を使用する遺伝子療法は、身体内への直接的遺伝子導入より優れた幾つかの独特の長所を提供する。第一に、送達細胞への治療用導入遺伝子の添加は患者の体外で行われるので、医師は導入遺伝子を含有して十分な量で治療用物質を産生する細胞を選択し、それらだけを用いて作業することができるので、これにより医師は重要な制御手段を持つことができる。
【００６８】
幹細胞に基づく、治療目的を有していた遺伝子療法試験のうちで、約３分の１は癌（例、卵巣癌、脳腫瘍、乳房骨髄腫、白血病、およびリンパ腫）に、３分の１はヒト免疫不全ウイルス疾患（ＨＩＶ−１）に、そして３分の１はいわゆる単一遺伝子病（例、ゴーシェ病、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ファンコーニ貧血、ファブリー病、および白血球付着不全症）に集中していた。
【００６９】
上記を考慮すると、本発明による方法は、哺乳類へ目的の遺伝子を含む細胞を導入するステップと複合糖質を投与するステップとによって、目的の遺伝子（導入遺伝子または外因性遺伝子のいずれか）に哺乳類の組織を標的とさせるためにも有用である。そのような方法は、哺乳類へ遺伝子産物をコードする機能的遺伝子を含む細胞を投与するステップと哺乳類へ複合糖質を投与するステップとによって、哺乳類における遺伝子産物の欠損を特徴とする疾患を治療するために有用である。幹細胞は、身体内の特定組織へ遺伝子を送達するためのビヒクルとして使用できる。幹細胞に基づく治療は、癌研究における主要な調査対象領域である。
【００７０】
本発明は、機能的遺伝子の欠如によって引き起こされた疾患に苦しんでいる患者へ目的の遺伝子を提供するために、輸注された幹細胞等の細胞の局在化を提供する。遺伝に基づく多数の疾患の例では、その遺伝子産物の産生が低レベルになると疾患が効果的に改善する、または治癒するであろう。欠損している遺伝子を正常ドナー由来幹細胞の輸注により患者の体内に提供することによって、選択した器官または組織へ幹細胞が局在するように指示し、その器官または組織から遺伝子産物を患者に送達できる器官または組織中で当該患者のマイクロキメリズムを誘発することができる。このため本発明は、安定した正常遺伝子を有する同種異系幹細胞等の輸注された細胞の局在化を指示する能力を提供する。そのような輸注された細胞は次にレシピエントの安定性のマイクロキメラを作製する。
【００７１】
当業者は、極めて広範囲の遺伝に基づく疾患の原因が遺伝子欠損症にあることを承知している。治療できる代表的な遺伝子および疾患には、嚢胞性線維症におけるＣＴＦＲタンパク質および肝臓における凝固障害に関連するタンパク質が含まれる。例えば、血友病Ａの治療は、遺伝子療法を使用して遂行できる。そのような実施形態では、臍帯血由来造血幹細胞等の細胞の輸注は無傷正常血液凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子を送達するために投与することができる。あるいはまた、形質転換細胞が正常な野生型血液凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子を含んでいてもよい。機能的血液凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子を有するそのような細胞は、好ましくは幹細胞の注入に先行するオロソムコイドまたはアシアロオロソムコイド潅流によって、肝臓内に局在するように指示することができる。細胞は肝細胞へ形質転換し、血液中へ血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分泌し始める。
【００７２】
本発明による遺伝子療法の他の実施形態には、血友病Ｂ（血液凝固第ＩＸ欠損症）、ならびにアンチトロンビンＩＩＩ、タンパク質Ｃ、およびタンパク質Ｓ欠損症を治療するステップが含まれる。これらの疾患はすべて血液凝固系を含むが、遺伝子療法には筋ジストロフィー症、嚢胞性線維症等の様々な組織を治療する方法を含むことができる。
【００７３】
Ｅ．幹細胞内へ導入遺伝子を導入する
細胞内へ導入遺伝子を導入するための手段はよく知られている。哺乳類細胞内に核酸を送達して発現させるための様々な方法は、当業者には知られている。そのような方法には、例えばウイルスベクター、リポソームに基づく遺伝子送達法（国際特許出願第９３／２４６４０号；Ｍａｎｎｉｎｏ  Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２−６９１（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；国際特許出願第９１／０６３０９号；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１４（１９８７）；およびＢｕｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（６）：７６０−７６４（１９９６））。当業者に知られているその他の方法にはエレクトロポレーション（米国特許第５，５４５，１３０号、第４，９７０，１５４号、第５，０９８，８４３号、および第５，１２８，２５７号）、直接遺伝子導入法、細胞注入法、沈降法、粒子衝撃法、および受容体媒介性取り込み法（米国特許第５，５４７，９３２号、第５，５２５，５０３号、第５，５４７，９３２号、および第５，４６０，８３１号）が含まれる。さらに、米国特許第５，３９９，３４６を参照されたい。
【００７４】
広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、ギボン関連白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、類人猿免疫不全症ウイルス（Ｓｌｙ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる。例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号、およびＲｏｓｅｎｂｕｒｇ  ＆  Ｆａｕｃｉ，ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版（Ｐａｕｌ編集，１９９３）を参照されたい）。
【００７５】
例えば核酸およびポリペプチドのインビトロ産生において、ならびにインビボおよびエックスビボ遺伝子療法手技において、細胞に標的核酸を用いて形質導入するためにはＡＡＶに基づくベクターも使用される。例えば、ＡＡＶベクターの概観については、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許出願第９３／２４６４１号；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ｌｎｖｓｔ．９４．１３５１（１９９４）ならびにＳａｍｕｉｓｋｉ（上記）を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構成についてはＬｅｂｋｏｗｓｋｉ，米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１  ｌ）：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍａｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む多数の出版物に記載されている。
【００７６】
本発明において有用な細胞に対しては、典型的にはレトロウイルスベクターが使用される。そのようなベクターには、例えば典型的にはパッケージング細胞系を使用してＨＩＶ−２粒子にパッケージされたＨＩＶ−２パッケージ可能な核酸を含むことができる。細胞形質導入ベクターには、遺伝子を標的細胞内へ導入する方法として相当に大きな営利的有用性がある。特別には、インビボまたはエックスビボ手技において治療用核酸を用いて標的細胞を形質導入するために本発明の細胞形質導入ベクターが使用される遺伝子療法手技を使用できる。遺伝子療法は、遺伝子欠損症によって誘発された慢性疾患、ＨＩＶ等の感染性疾患、ならびに癌等の非感染性疾患と闘う方法を提供する。
【００７７】
ＣＤ３４＋幹細胞等の幹細胞は、細胞形質導入および遺伝子療法のためのエックスビボ手技に使用できる。本発明は、幹細胞がインビトロで他の細胞タイプに分化する、または哺乳類（細胞のドナー等）に導入されると、そこで分化のために他の器官を標的とさせない限り骨髄内に移植するという特徴を利用する。そこで本発明は、細胞が心筋細胞を再生させるために心臓へ、肺胞を再生させるために肺へ、および組織を再生させるために腎臓へのように組織を再生させるために特定器官へ幹細胞を向かわせることに、ならびに有効量の欠損している遺伝子産物を提供することによって遺伝的異常を改善するためにＣＤ３４＋幹細胞等の細胞を器官へ向かわせることに適用される。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α等のサイトカインを使用してＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞タイプに分化させるための方法は知られている（例えば、Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６，１６９３−１７０２（１９０２）、およびＳｚａｂｏｌｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，１５４：５８５１−５８６１（１９９５）を参照されたい）。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２：６９９−７０３（１９９５）は、レトロウイルスベクターを使用してヒト胎児臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を形質導入する方法を記載している。
【００７８】
Ｆ．医薬組成物
他の実施形態では、本発明は本発明の細胞および複合糖質を含む医薬組成物を提供する。代表的な糖タンパク質にはオロソムコイドおよびアシアロオロソムコイドが含まれる。他の態様では、本発明は、組織損傷を治療するため、または哺乳類における組織へ機能的遺伝子もしくは遺伝子産物を送達するための細胞および糖タンパク質を含むキットを特徴とする。幹細胞は一般に、組織内への注射、局所循環内への注入、または実現可能な場合は動員、すなわち脾臓摘出術の前に幹細胞捕捉器官の事前の除去によって遂行される骨髄由来の自己幹細胞の動員のいずれかによって、所望の器官へ提供される。
【００７９】
複合糖質は、幹細胞の注入に先行して、同時に、または後に投与することができる。一部の実施形態では、静脈内輸液バッグを使用して、生理食塩水またはＲＰＭＩ１６４０もしくはＡＩＭ−Ｖを含むがそれらに限定されないタンパク質または血清無含有培地を含むおよび含まないデキストロース溶液中の複合糖質を投与することができる。そのような実施形態では、複合糖質を同一バッグ内または「ピギーバック」内で細胞と混合できる。複合糖質はさらにまた細胞の投与後に、長期間にわたる全身性循環時間または特定器官蓄積が増加し続けるのを許容することができる。この手技は、治療用量の細胞を標的器官へ送達するための必要に応じて頻回に繰り返すことができる。本調製物は、血液量１ｍＬ当たり複合糖質３〜７ｍｇ（マウス１匹当たり１２ｍｇまで）の用量では副作用を全く示さなかった動物試験からのデータを前提として、ほとんど毒性に関する懸念なく使用できる。
【００８０】
エックスビボで形質導入された細胞の投与は、最終的に血液または組織細胞と接触させるために細胞または分子を導入するのに通常使用されるあらゆる経路によって行うことができる。形質導入された細胞は、いずれか適切な方法で、好ましくは医薬上許容される担体を用いて投与できる。本発明との関連で患者にそのような細胞を投与する適切な方法を利用することができ、そして、特定組成物を投与するために２つ以上の経路を使用できるが、特定経路は他の経路よりしばしば即時の効果的な反応を生じさせることができる。
【００８１】
医薬上許容される担体は、一部には投与される特定組成物によって、ならびに該組成物を投与するために使用される特定方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物には極めて広範囲の適切な調製物がある。
【００８２】
例えば関節内（関節内に）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下経路によるような非経口投与のために適切な調製物には、調製物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質を含むことができる水性および非水性、等張性無菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存料を含んでいてよい水性および非水性無菌懸濁剤が含まれる。非経口投与は、１つの有用な投与方法である。調製物は、アンプルおよびバイアル等の１回用量または複数回用量で密封された容器で提供することができ、そして一部の実施形態では、使用直前に例えば注射用水のような無菌液状担体の添加しか必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存できる。これらの調製物は、所望クラスの成体幹細胞を循環内に動員する因子とともに投与することができる。
【００８３】
即時調合型の注射液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製できる。エックスビボ療法との関連で上記に記載したベクターにより形質導入された細胞もまた、凍結乾燥により細胞が破壊されるので一般に凍結乾燥は適合しないこと以外は、上記に記載したように非経口投与することができる。
【００８４】
本発明の関連において患者に投与される用量は、患者において有益な治療的応答を経時的に引き起こすために十分でなければならない。用量は、使用される特定細胞の有効性および患者の状態、ならびに治療される患者の体重によって決定される。用量のサイズは、さらにまた特定患者における細胞タイプの投与に付随する何らかの有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。疾患の治療または予防療法において投与される細胞の有効量を決定する際には、医師は循環している血漿レベル、そして置換療法の場合は、当該の遺伝子産物の産生を評価しなければならない。
【００８５】
形質導入された細胞は、確立された方法によって注入のために調製される。Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ６−４８−５３（１９９１；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ４：１１３−１１７（１９８８）；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１２：１−７（１９８８）；Ｍｕｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０１：１７１−１  ８１（１９８７）およびＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２７：３６２−３６５（１９８７）を参照されたいされたい。約２〜４週間の培養期間後に、細胞は１×１０6〜１×１０10の数であってよい。この関連で、細胞の増殖特徴は患者毎に、および細胞タイプ毎に変動する。形質導入された細胞を再注入する約７２時間前に、表現型、および治療薬を発現する細胞のパーセンテージを分析するためにアリコートが採取される。
【００８６】
投与のためには、本発明の細胞は細胞タイプのＬＤ５０、質量に当てはめた様々な濃度での細胞タイプの副作用および患者の全体的健康状態によって決定される速度で投与することができる。投与は、単回用量または分割用量により遂行できる。成体幹細胞は、さらにまたそれらの産生を刺激して、骨髄または脂肪組織を含むがそれらに限定されない組織または空間から出て行く、外因性で投与された因子を使用して動員することもできる。代表的な複合糖質は、幹細胞動員と同時に、先行して、および／または引き続いて、または末梢循環中の細胞の量が所望の治療上のエンドポイントにとって最適である時点に投与することができる。
【００８７】
Ｇ．養子免疫療法
静脈内投与されたＬＡＫ細胞の大部分は肺および肝臓内に隔離されること（Ｌｏｔｚｅ  Ｍ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＣＧＦ）−Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：１４８７−１４９３（１９８０）（おそらくＬＡＫ細胞表面上のアシアロ決定基と内皮細胞、クッパー細胞、および肝細胞の表面上のＡＳＧＰ受容体との相互作用に起因して）（Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，上記；Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，上記）、およびこれらの器官内の転移性腫瘍をＬＡＫ療法によって極めて著明に減少させることができること（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７，上記）は既に証明されている。静脈内注射されたマウス骨髄細胞、ノイラミニダーゼ処理リンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）、およびＬＡＫ細胞はすべてがトラフィッキングパターンを共有している（Ｓａｍｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，上記；Ｓａｍｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，上記；Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，上記；Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，上記；Ｒｏｌｓｔａｄ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  Ｖ．Ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌａｒｇｅ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＬＯＬ）」，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：２８００−２８０８（１９８６）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７，上記）。さらにその上、これらすべての細胞は、それらの表面上にアシアロ決定基を有する。Ｋｒａｄｉｎ  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｕｍｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４：７６−８５．（１９８７）は、111Ｉｎ放射標識した腫瘍由来インターロイキン−２依存性リンパ球（肺の転移性腺癌由来）を受容していた患者をガンマカメラによりイメージングした。これらのヒト腫瘍由来の「キラー」Ｔ細胞は肝臓および肺に移動する。ヒトＬＡＫ細胞の肝臓内の優先的局在化およびそれらが肝細胞癌を死滅させる能力に基づいて、Ｈｓｉｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ」，Ｇｕｔ．２８：１１７−１２４（１９８７）は、この腫瘍を治療するための第Ｉ相臨床試験を実施した。さらにまた肝腫瘍を治療するために肝動脈内に挿入されたカテーテルを介したＩＬ−２を含むＬＡＫ細胞の選択的投与は副作用の大きさおよび範囲を低下させる可能性がある有効な手段のはずであることも提言されている（Ｆａｇａｎ  Ｅ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ（ＬＡＫ）ｃｅｌｌｓ」，Ｇｕｔ．２８：１１３−１１６（９８７））。
【００８８】
ヒト、ラット、およびマウスの肝は、高親和性肝性アシアロ糖タンパク質受容体を介してのシアル酸（すなわち、アシアロ糖タンパク質）および加齢脱シアル化赤血球の除去によって末端に作製されたガラクトース残基を認識することによって脱シアル化された血清糖タンパク質（例えば、アシアロトランスフェリン）を特異的に隔離する、捕捉する、または「取り除く」ことが証明されている（Ａｓｈｗｅｌｌ  Ｇ．，「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｍｅｎａ」，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖｏｌ．４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＯＸ（１９７７）；Ａｓｂｗｅｌｌ  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ」，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｒｉｏｃｈｅｍ．５１：５３１−５５４（１９８２）；Ｈａｒｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｔｈｅ  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，第４巻，Ｐａｒｔ  Ｂ（Ｍ．Ｉ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ編集）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）。ヒト、ラットおよびウサギＡＳＧＰ受容体は実質的に同一の特徴を示す：アシアロリガンド受容体の特異性、カチオン要件、ｐＨ最適条件、親和性、サブユニットサイズ、および温度依存性内在化および分解（Ｄｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｉｔｉｂｉｔｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｉｎｏｃｙｔｏｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｐｈａｇｙ  ｏｆ  125Ｉ−ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５  ５９７１−５９７８（１９８０）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＳＧＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｌｉｎｅ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５６：８８  ８−８８８１（１９８１）；Ａｓｈｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，上記；Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：９３２−９４７（１９８６））。５〜２０℃でリガンド受容体錯体は内在化しない。他方、３７℃では、この錯体は内在化して分解し、受容体は損傷していない細胞表面へ再循環させられる（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，上記）。平均すると、２２５，０００個の受容体を含有する細胞は、１分当たり細胞１個当たり約３０，０００個の可溶性リガンド分子を内在化させることができる。各機能的受容体は８分毎に１個のリガンドに結合して内在化させることができる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，上記）。肝細胞は、クッパー細胞、ならび���肝内皮細胞（Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，上記）および肝細胞癌細胞系とアシアロ−もしくはＧａｌＮＡｃ／Ｇａｌ特異的受容体を共有しており、ＨＥＰＧ２はこの受容体に関して良好に特徴付けられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，上記）。ＨＥＰＧ２細胞１個当たり１５０，０００個および正常肝細胞１個当たり５００，０００個の高親和性部位がある。どちらについても約７×１０9ＭのＫdは同一である。そこで、インビボ付着のインビトロ相関物（以下の実施例におけるような）のような明確に特徴付けられたアシアロ糖タンパク質を用いたＨＥＰＧ２等の細胞系への付着を使用することは、インビボ・トラッフィッキング試験において遭遇するパラメーターおよび可能性のある問題を決定するための費用効果的かつ単純なシステムである。
【００８９】
アシアロ糖タンパク質受容体を遮断するためのアシアロ複合糖質（例、アシアロフェチュイン）の非経口投与は、肝性ＡＳＧＰ受容体を遮断することで肝臓によるこれらの細胞の隔離を遮断することにより骨髄移植の効率を５〜１０倍増加させることが証明されている（Ｓａｍｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，上記）。本明細書におけるインビトロ試験によって証明されたように（実施例５〜１６を参照）、ＬＡＫ細胞がそれらの表面上にアシアロ決定基を有することを前提にすると、それらはＡＳＧＰ受容体を介して肝臓内に捕捉される、または隔離される可能性が高い。これは腫瘍の減少または溶解に関与するために利用できるであろうＬＡＫエフェクター細胞の循環数の正味損失を生じさせる。隔離されたＬＡＫ細胞は腫瘍に到達しない可能性がある。本発明によると、肝性ＡＳＧＰ受容体を遮断することによって肝臓による隔離を防止できる。最終的には、ＬＡＫ療法の有効性は、アシアロ複合糖質の静脈内投与によって、またはシアリダーゼもしくはシアリルトランスフェラーゼを用いてのＬＡＫ細胞表面の修飾によって肝臓によるこれらの細胞の隔離を排除することによって改善される。これは、治療中に使用するＬＡＫ細胞をより少数に、またはＬＡＫ療法サイクル数をより少数に、あるいはＩＬ−２さえより少数にすることを可能にし、それによってＬＡＫ療法に結び付いた毒性を低下させる。
【００９０】
ＬＡＫ療法は、理論上では癌の治療において最も安全で最も毒性の低い療法の１つのはずである。しかし、その期待はまだ満たされていない（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７，上記；Ｄｕｒａｎｔ，「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ：Ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ？」，Ｎ．Ｅｎｇｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６：９３９−９４０（１９８７））。ＬＡＫ細胞は、一部の研究者によって正常肝細胞、内皮細胞、および肝細胞を含む修飾されていない正常細胞を死滅させることも証明されているが、他の研究者によっては証明されていない。本発明は、循環「キラー」細胞の数を増加させ、それによってこれらの細胞が主として肝臓内に隔離される代わりに周辺に位置する腫瘍細胞に遭遇する確率を改善することによって、ＬＡＫ療法の効率を改良する。このため肝臓による隔離を排除することは、肝臓以外の器官内に位置する腫瘍に対するＬＡＫ療法の応答率を改善するはずである。肝臓によるＬＡＫ細胞の隔離を防止すると、さらにまたこの療法に結び付いた重篤な毒性および肝損傷も減少させるはずである。さらに、これは捕捉されたリンパ球による肝実質の自己免疫破壊により惹起される永久的損傷の可能性を低下させるであろう（Ｋｏｌｂ−Ｂａｃｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，上記；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ５９：５９８−６１２（１９８８））。
【００９１】
［実施例］
手順
静脈内投与により111Ｉｎ標識肝細胞を効率的に送達できるように、麻酔下のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内へ静脈内カニューレを留置した（所内動物実験委員会プロトコール＃ＡＭ８７０４６−０７）。麻酔から回復した後に、タイレノール・エリキシル剤を経口投与した。手短かには、生理食塩水に入れた１００〜２５０μＬの５％ヒト血漿アルブミン中に放射標識ＣＤ３４＋細胞を取り入れ、カニューレ内に注入し、次に５０μＬのアルブミン−生理食塩水を用いてフラッシュした。マウスを核医学によりイメージングした。
【００９２】
マウス：１〜２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（非肥満性糖尿病性／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バー・ハーバー）から入手した。これらの動物は、特殊隔離室内のマイクロアイソレーターケージ内で飼養した。空気はＨＥＰＡ濾過し、動物は施設内の層流フード内で入れ換えた。すべての飼料、床敷き、および水は滅菌した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、ＮＫ活性が高度に低下していることを含めて免疫無能力であるため、異種移植された腫瘍ならびに造血細胞およびリンパ球についての試験に理想的に適合する。例えば、Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」，３：２３６−２４６（１９９７）；Ｎｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」，２２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ５８−６０（１９９８）を参照されたい。
【００９３】
作用物質または細胞のすべての投与は、静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）のいずれかで実施した。
【００９４】
幹細胞：癌患者由来のアフェレーシス幹細胞採取産物からＣＤ３４＋幹細胞を単離した。それらは、磁気ビーズに結合したＣＤ３４へ結合した抗体を用いて純度９５〜９９％へ精製し（ＭＡＣＳ単離カラム；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、カリフォルニア州オーバーン）、低温保存した。
【００９５】
ＦＤＡ監視有料骨髄ドナープログラムを通して入手されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＡＣｓ；ＰＴ−２５０１）は、Ｐｏｉｅｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社（メリーランド州ウォーカービル）から購入した。細胞は、製造業者の推奨にしたがって間葉系幹細胞用基礎培地（ＭＳＣＢＭ）中で解凍し、再懸濁させ、放射標識した。
【００９６】
投与したタンパク質：オロソムコイド（α−１酸性糖タンパク質）およびアシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）は、０．１６ｍＭのカプリル酸塩、１０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液（ｐＨ７．０）中に入れて投与した。
【００９７】
麻酔および鎮痛：体重２０〜３０ｇのマウス１匹当たり０．０４ｍＬの腹腔内投与（ｉ．ｐ．）用の齧歯類麻酔用カクテル（齧歯類カクテルの処方：１．５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬのケタミン＋１．５ｍＬの２０ｍｇ／ｍＬのキシラジン＋０．５ｍＬの５０ｍｇ／ｍＬのアセプロマジン）を使用した。齧歯類麻酔用カクテルである麻酔剤は以下のように腹腔内投与した：
１）手術のため−体重２０〜３０ｇのマウス１匹当たり０．０４ｍＬ、および
２）イメージングのため−体重２０〜３０ｇのマウス１匹当たり０．０２ｍＬ。
【００９８】
術後鎮痛：麻酔が部分的に切れた後に、タイレノール６０μＬ／２０ｇ（マウス体重）（６．１０ｍｇ）を経口投与した。鎮痛剤としては、手術直後または苦痛の初回徴候が見られたときにマウス体重２０ｇ当たり６０μＬ（６．１０ｍｇ）のタイレノールを経口投与した。麻酔用調製物中に含有されたキシラジンもまた鎮痛剤として作用する可能性がある。
【００９９】
手術手技（標準的なカニューレ留置）：上記に記載したように動物に麻酔をかけた後、クエン酸生理食塩水を満たしたカニューレを縫い付けるための糸を７０％エタノール中に浸けた。麻酔をかけた動物を手術台上で腹側を上に向けて紙テープで固定した。鎖骨のすぐ下から耳にかけた領域を剃毛した。剃毛した領域はベタジンを用いて清浄化し、７０％エタノールを用いてすすぎ洗いした。すぐ下の外頸静脈と一緒に胸鎖乳突筋を露出させるために、胸郭の上部から顎骨にかけての右頸部の皮膚に垂直切開部を作製した。手術野を明確に露出させるために、（小さなおもりに固定した）ワイヤーフックを用いて皮膚を牽引した。牽引は基礎にある組織を歪めてはならないが、視認およびカニューレ挿入のための領域を安定させなければならない。顕微鏡用鉗子を使用して静脈の上にある脂肪および筋膜を取り除いた。上大静脈における循環を切断して４Ｏ番外科用絹縫合糸で一重結びを作製した。糸の一端はクランプ止血鉗子で固定した。糸のもう一端は静脈の底部周囲に巻き付け、きつく引っ張らずに一重結びを作った。このループを使用して、カニューレを外頸静脈内に挿入した後にカニューレを固定した。マイクロ剪刀を用いて静脈の表面を傷つけた。カニューレの斜端側を上に向けて静脈内に挿入した。アンカーが静脈壁と同一の高さになるまでカニューレを対角線方向に滑りおろさせ、下方の結び目を締め付けた。その中に生理食塩水を通してカニューレを試験した。漏れがないことを確認した後に、下方の結び目を完成した。上糸を使用してカニューレの周囲で二重結びを結んだ。カニューレ内の生理食塩水の流れを監視した。上糸を使用してくぐらせ、組織を捕捉し、この糸を用いて再びカニューレの上方で縛った。上糸と下糸の端を使用して二重結びを作製した。これによって偶発的移動を防止するためにカニューレのハブの上方で上糸と下糸とが固定される。カニューレから止血鉗子を外し、シリンジを取り外した。カニューレを頸部の皮膚の下に配置し、動物を回転させながら（背面を上にして）頸部の首筋の後頭部のすぐ下で体外に出した。オートクリップを使用して出口近くの場所でカニューレの熱収縮部分を固定した。カニューレを妥当な長さ（１．５〜２．０インチ）へ切断し、その中にワイヤープラグを挿入した。動物の向きを元の位置に変え、カニューレを穿刺しないように注意を払いながら頸部をオートクリップで閉鎖した。
【０１００】
手術手技（Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｍｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システムによるカニューレ留置）：Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｍｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システム（Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、マサチューセッツ州サウスランカスター）は、開存性を消失させることなくトラッフィッキング実験の２週間前までの植え込みを許容する閉鎖注射経路である。本質的な差は、ポートが以前のように体外に出ていない点である。これにより咬んだり引っ掻いたりすることで引き起こされるカニューレの汚染や損傷についての追加の危険性が排除される。
【０１０１】
切開領域は初回切開前にベタジンを用いて清浄化した。次にマウスを手術台の上に（背側を上にして）テープで固定した。３〜４ｍｍの切開部を作製した。次に、胸部上に４〜５ｍｍの切開部を作製した。背部から胸部へカニューレを送り込むために背部切開部から正面切開部までトンネルを作製した。カニューレにヘパリンを流し入れた。次に止血鉗子を使用してカニューレを引っ張って通過させた。ポートを配置するために、背部上の組織から皮膚をゆるめに引っ張った。ポートを中上頸部領域内の組織へ縫い付けた。ポートは三重結びを使用して２ヵ所に縫い付けた。次に、胸部が上に向くようにマウスを回転させた。カニューレをある角度で切断し、少なくとも１ｍｍおよび多くても２ｍｍのカニューレを頸静脈内に挿入した。一部の脂肪や組織を引っ張って取り除いた後に、頸静脈を胸部から単離した。マウスの上肢は、胸部が前方に押され、さらに頸静脈が露出するように各側にテープで固定した。頸静脈を単離したら、その周囲に２本の縫合糸を配置した。静脈の上部は、血液の流れを緩徐化させるが完全には血流を停止させない程度に十分に締め付けた。下方の結び目は上部から１〜２ｍｍで、これは締め付けなかった。下方の結び目は、後にカニューレを適所に保持して頸静脈からの過剰な出血を停止させるために使用した。次に、カニューレを静脈内に送り込むことができるように２つの結び目の間で頸静脈内に小さな切開部を作製した。カニューレを静脈内に留置したら、下方の結び目を静脈内のカニューレの周囲で締め付けた。次に、カニューレの中にヘパリンを流すことによりカニューレの漏れをチェックした。漏れがないことを確認した後、両方の切開部を閉鎖した。
【０１０２】
111インジウムオキシン放射標識手技：成体ヒトＣＤ３４＋または間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の111インジウムオキシン放射標識は、自己白血球を標識するためのＡｍｅｒｓｈａｍ社のヘルスケア手技を変更して実施した。
【０１０３】
組織病理学検査のための組織採取：組織は麻酔後に採取した。１時間にわたるイメージング後、器官を採取し、器官の半分は１０％中性緩衝ホルマリン液中で固定し、そして残り半分は冷凍切片作製のためにＯＴＣ内で冷凍した。本明細書に示した画像は固定組織からの画像である。
【０１０４】
マウス組織採取のための剖検手技：前頸部領域から恥骨縁までの初期正中線皮膚切開部を作製し、次に尾側肋骨に続く切開により腹壁を側方反転させながら、白線に続いて胸骨から恥骨までの腹部切開部を作製した。胸骨は、必要に応じて横隔膜および心膜を切開しながら、ほぼ肋軟骨接合部の高さで縁を切断することによって前方へ反転させた。前方では、気管を露出させるために腹側頸部筋肉を含むように胸骨の反転を拡大した。中頸領域で切開して気管および食道を尾側へ反転させ、必要に応じて付着器官を切除しながら胸部臓器をそっくり取り出した。胸部臓器を取り出した後に心臓全体を完全に取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン液に浸漬した。浸漬後、固定液を心室内へ流し入れるために鋸歯状組織鉗子を用いて心臓を軽くマッサージした。気管は、それ以上解剖せずに付着している肺と一緒に固定液中に浸漬した。脾臓を視認し、網状付着物を切開して取り除き、その全体をホルマリン固定液中に浸漬した。胃および腸管は、直腸を切開し、必要に応じて付着物を切断しながら内臓を前方に反転させることにより取り出した。肝臓はそっくり取り出し、その全体をホルマリン固定液中に浸漬した。腎臓は、取り出してその全体をホルマリン固定液中に浸漬した。膵臓は、前方十二指腸から切開してホルマリン固定液中に浸漬した。
【０１０５】
パラフィン加工処理および顕微鏡切片作製法のための組織のトリミング：心臓は、右室を上側、左室をトリミング面の隣の下側になるようにトリミング台上に置いた。２つの半分がほぼ等しくなるように、右室および右房ならびに心臓の基底部では大血管を通る心室間隔膜および左心室を通過する上方から下方へ向かう単一の切開を実施した。各半分は固定液を飽和させたフォームパッドを含有して、「第１心臓」および「第２心臓」とラベル表示された個別包埋用カセットに挿入した。左肺および右肺は、その全体を正中線組織から分離し、左肺および右肺とラベル表示したカセット内の固定液を飽和させたフォームパッド上に平らに置いた。肝臓切片は、肝右側葉および肝中葉から切り取り、適切にラベル表示したカセット内に入れた。左側葉および中葉も切片化し、同様の方法で取り扱った。脾臓は、適切にラベル表示した包埋用カセット内に全体として入れ、最初の断面積を増加させるために湾曲を利用して長い縁を下向きに方向付けた。腎臓の１つは、腎臓の中点から全冠状断面を取り出した。残りの腎臓は、長手方向に切片化した。どちらの切片も単一カセット内に入れた。採取した膵臓は適切にラベル表示したカセット内のホルマリン飽和フォームパッド上に置いた。
【０１０６】
イメージング手技：核医学。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、齧歯類麻酔用カクテルを使用して麻酔をかけた。麻酔をかけたら、マウスは発泡製半円筒形マウスポジショニング装置（ＭＰＤ）上に配置し、チューブソックスを用いて被覆した。ＭＰＤを使用すると、フラットな平面上にマウスを配置するのに比べて、肺と肝臓を視覚的により明確に分離できる。その上にマウスが配置されたフォーム、およびチューブソックスによる被覆は、追加の麻酔を行わずともより長時間のイメージングを許容する快適な温度を維持した。ＭＰＤはＳｉｅｍｅｎｓ社製Ｅ．Ｃａｍガンマカメラのデュアルヘッド間の狭い台の上に配置し、２−ＤまたはＳＰＥＣＴで静的または動的にイメージングした。解剖学的位置（鼻、尾、カニューレ等）をマーキングするためには、57Ｃｏ−スポットマーカーを使用した。これらのデータは、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製ＩＣＯＮシステムを用いて対象領域または注射用量の百分率（％）を解析した（例、肝臓、脾臓、心臓）。
【０１０７】
ＣＴイメージング：腫瘍を評価するため、そして１９９８年８月１７〜２１日にハワイ州ホノルルで開かれたＰＡＣＭＥＤ  Ｔｅｃシンポジウムのプロシーディング集の中のＡｒａｔａ  Ｌ．，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ」およびＮｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｄｉｃａ  ６８（２０００）４５−４８によって記載された方法を使用して注入した放射標識幹細胞の正確な位置を決定する目的で核医学画像とＣＴ画像の位置合わせ／アラインメントをできるようにするために、ＣＴスキャンを実施した（Ｇ．Ｅ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社製、Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｓｐｉｒａｌ  Ｔｕｎｎｅｌ）。動物が麻酔下にある核医学イメージングセッション中にＣＴスキャンを実施した。麻酔をかけた動物は、核医学スキャンの直前または直後にいずれかにＣＴへ移送した。通常は、ＣＴを動物１匹当たり１回しか実施しなかった。ＣＴは、ＣＴ画像を核医学ＳＰＥＣＴ画像と融合させることによって放射標識物質を解剖学的に正確に定位するために使用した。
【０１０８】
Ｓｉｅｍｅｎｓ社製Ｅ．Ｃａｍデュアルヘッド・ガンマカメラを使用するガンマカメライメージングによって、以下の実施例に記載したすべてのヒト幹細胞のインビボ・トラフィッキングパターンを監視した。マウスはマウスポジショニング装置（ＭＰＤ）上に配置し、イメージング・プラットフォーム上の検出器間に配置した。
【実施例１】
【０１０９】
静脈内投与されたＡＳＯはヒトＣＤ３４＋を心臓へ向かわせる
アシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）／高用量ＨＳＣ：５．７５×１０6のＨＳＣを注入する前に３．３ｍｇのＡＳＯを注入すると、注入した細胞の７７±１％は注入直後に心臓内で見いだされ、１．５時間後には７５±５％が心臓領域にとどまっていたが、２４時間後には５２±１％へ減少した。
【０１１０】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バー・ハーバー）から入手した２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（非肥満性糖尿病性／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）へ外頸静脈カニューレを介して５．７５×１０6の111Ｉｎ標識ヒトＣＤ３４＋（ｈＣＤ３４＋）末梢血幹細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。放射標識ＣＤ３４＋幹細胞は、マウスを３．３ｍｇのアシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）の静脈内投与により前処置した後に投与した。インビボ・トラッフィッキングパターンは、注入直後から３６時間までのＳｉｅｍｅｎｓ社製Ｅ．Ｃａｍデュアルヘッド・ガンマカメラを使用したガンマカメライメージングによって追跡した。ヒトＣＤ３４＋は、癌患者由来のアフェレーシス幹細胞採取産物から単離した。それらは磁気ビーズに結合したＣＤ３４へ結合した抗体を用いて９５〜９９％へ精製し（ＭＡＣＳ単離カラム；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製、カリフォルニア州オーバーン）、低温保存した。
【０１１１】
ＡＳＯの後に投与した放射標識ＣＤ３４＋幹細胞は、即時に心臓へ移動した。解剖学的定位は、カニューレの高さに配置した57Ｃｏ点光源の使用によって容易になった。１．５時間後には、注入した用量の７９．２％までが心臓内に位置していた。これらの細胞は、注入後フォローアップ画像の初期には肝臓および脾臓へ移動しなかったが、２４時間後には肝臓内で見いだされた。しかし２４時間後には、最初に注入した用量の５１．６〜５３．２％が心臓内にとどまっていた。３６時間後にインビボでカニューレとともに、そしてカニューレを取り外して致死させた動物の隣に配置してイメージングを実施した。これらの画像は、注入された細胞がカニューレ内に捕捉されておらず、実質的に心臓内にあったことを示している。
【実施例２】
【０１１２】
静脈内投与されたオロソムコイドはヒトＣＤ３４＋細胞が心臓ではなく肝臓および脾臓へ移動することを可能にする
オロソムコイド／高用量ＨＳＣ：５．７５×１０6のＨＳＣを投与する前に５．５ｍｇのオロソムコイドを注入すると、注入した細胞の７４±３％は注入直後に肝臓および脾臓内で見いだされ、１．５時間後には細胞の７４±４％が肝臓領域にとどまっていたが、２４時間後には６３±１％へ減少した。
【０１１３】
実施例１に記載した調製法および手技を繰り返した。
【０１１４】
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バー・ハーバー）から入手した２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（非肥満性糖尿病性／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）へ外頸静脈カニューレを介して５．７５×１０6の111Ｉｎ標識ヒトＣＤ３４＋（ｈＣＤ３４＋）末梢血幹細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。放射標識ＣＤ３４＋幹細胞は、マウスを５．５ｍｇのオロソムコイド（Ｏ）の静脈内投与により前処置した後に投与した。
【０１１５】
マウスをイメージングし、放射標識ｈＣＤ３４＋幹細胞の生体内分布を実施例１に記載した通りに監視した。Ｏを投与した後に投与した放射標識ｈＣＤ３４＋は直ちに肝臓／脾臓領域へ移動し、３６時間後までそこにとどまっていた。解剖学的定位は、カニューレの高さに配置した57Ｃｏ点光源の使用によって容易になった。肝臓／脾臓領域への局在範囲は注入直後の７６．３％から２４時間後の６３．６％に及んでいた。心臓領域では111Ｉｎ放射標識細胞は見いだされなかった。
【０１１６】
３６時間後にインビボでカニューレとともに、そしてカニューレを取り外して致死させた動物の隣に配置してイメージングを実施した。これらの画像は、注入された細胞がカニューレ内に捕捉されていないことを示している。放射能は、カニューレ留置の位置またはそれより下、すなわち肝臓／脾臓領域で見いだされた。
【実施例３】
【０１１７】
オロソムコイドはヒトＨｃｄ３４＋細胞が心臓へは有意に移動せずに肝臓／脾臓へ移動することを可能にする
オロソムコイド／低用量ＨＳＣ：０．５×１０6のＨＳＣ（上記の細胞用量の１０分の１）を注入する前に１１ｍｇのオロソムコイドを注入すると、注入した細胞の４３±２％は注入直後に肝臓および脾臓内で見いだされ、そして１時間後には細胞の４０±３％が肝臓領域にとどまっていた。
【０１１８】
実施例１に記載した調製法および手技を繰り返した。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バー・ハーバー）から入手した２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（非肥満性糖尿病性／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）へ外頸静脈カニューレを介して０．５×１０6の111Ｉｎ放射標識ヒトＣＤ３４＋（ｈＣＤ３４＋）末梢血幹細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。放射標識ＣＤ３４＋幹細胞は、マウスを１１．０ｍｇのオロソムコイド（Ｏ）の静脈内投与により前処置した後に投与した。
【０１１９】
マウスをイメージングし、放射標識ｈＣＤ３４＋幹細胞の生体内分布を上記に記載した通りに監視した。注入の約１時間後、マウスを致死させ、器官を採取し、器官の半分は１０％中性緩衝ホルマリン液中で固定した。組織切片は、ヒトＣＤ３４についての免疫組織学的染色およびヒトＤＮＡを視認するためのインサイチューハイブリダイゼーション後に顕微鏡によって検査した。注入の初期１０分後および１時間後についての核医学的監視によって、放射標識ＣＤ３４＋細胞が肝臓／脾臓領域へ局在することが証明された。
【０１２０】
ＣＤ３４についての免疫組織学的染色後の心臓の顕微鏡検査は、心内膜血管内のｈＣＤ３４＋細胞を証明した。肺内では肺胞中隔において少数のｈＣＤ３４＋細胞を所見できた。幹細胞の形態を備える細胞群は肝洞において見ることができた。ヒトＤＮＡについてのインサイチューハイブリダイゼーションは、ｈＣＤ３４＋細胞が心筋細胞または心室間中隔では見いだされないが、肺内には存在することを明確に証明した。
【実施例４】
【０１２１】
ＡＳＯ投与後のオロソムコイドの投与はｈＣＤ３４＋細胞を心臓および肺へ向かわせるが、肝臓／脾臓領域には向かわせない
アシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）＋オロソムコイド／低用量ＨＳＣ：注入したＡＳＯがＨＳＣの心臓内への局在化を引き起こした場合は、心臓内の蓄積が維持されるかどうかを試験するために、ＡＳＯボーラス投与後にオロソムコイドのボーラス投与を実施するようにプロトコールを変更した。３．３ｍｇのＡＳＯ、次に５．５ｍｇのオロソムコイドを投与した後に０．５×１０6のＨＳＣを注入すると、ＨＳＣは同様に心臓内へ集中した。これは注入した細胞の４４±５％が注入直後に心臓内に蓄積することを引き起こした。１時間後には、注入した細胞の３７±３％が心臓内にとどまっていた。心臓内の局在化は細胞からの主要な集中した信号であったが、注入した細胞の％は実施例１で所見された約７５％から減少した。
【０１２２】
実施例１に記載した調製法および手技を繰り返した。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（メイン州バー・ハーバー）から入手した２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（非肥満性糖尿病性／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）へ外頸静脈カニューレを介して０．５×１０6の111Ｉｎ標識ヒトＣＤ３４＋（ｈＣＤ３４＋）末梢血幹細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。放射標識ＣＤ３４＋幹細胞は、マウスを３．３ｍｇのＡＳＯの静脈内投与、その後の５．５ｍｇのＯの静脈内投与により前処置した後に投与した。
【０１２３】
マウスをイメージングし、放射標識ｈＣＤ３４＋幹細胞の生体内分布を実施例１に記載した通りに監視した。注入の初期１０分後および１時間後についての核医学的監視は、放射標識ｈＣＤ３４＋細胞が心臓へ局在することを証明した。
【０１２４】
注入の約１時間後、マウスを致死させ、器官を採取し、器官の半分は１０％中性緩衝ホルマリン液中で固定した。
【０１２５】
ＣＤ３４についての免疫組織学的染色後の心臓の顕微鏡検査により、心室間中隔におけるｈＣＤ３４＋細胞群、および形態学的には染色した細胞に類似するがＣＤ３４陰性であるそれらの群内の細胞が明らかになった。これらの画像は、核医学試験によって描出された生体内分布を反映していた。心臓内のｈＣＤ３４＋細胞の存在は、インサイチューハイブリダイゼーションによって極めて著明に証明された。ＣＤ３４についての免疫組織学的染色およびヒトＤＮＡについてのインサイチューハイブリダイゼーションはどちらも、注入した幹細胞が肺に局在し、肺胞中隔、血管、およびその他の構造において容易に所見されることを証明した。ヒトＤＮＡの検出により、ＣＤ３４染色によって予測されていたより多くの細胞が肺および心臓内に存在することが判明した。ｈＣＤ３４＋細胞または形態学的にｈＣＤ３４＋細胞に似ている細胞は、肝臓、脾臓または腎臓内では全く見いだされなかった。
【実施例５】
【０１２６】
５％ヒト血清アルブミン（オロソムコイドまたはＡＳＯを含有しない）中に入れて投与されたＨＳＣはその大部分が肺へ移動した
血漿アルブミン／高用量ＨＳＣ：事前のタンパク質注入を行わずにカテーテルを通してＨＳＣを投与すると、０時間後には注入した細胞の７８±１３％が肺で見いだされ、１時間後には５４±１０％が、そして１２時間後には５０±１３％が見いだされた。同様に処理されたマウス肺の組織学検査により、注入した細胞が肺胞中隔および血管構造内にあることが証明された。
【０１２７】
２．７×１０6の111Ｉｎ標識ＨＳＣは、５％ヒト血清アルブミンを含有する０．１ｍＬの生理食塩水中に入れて、２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内に差し込んだカニューレを介して静脈内投与（ｉ．ｖ．）投与した。マウスをイメージングし、放射標識ｈＣＤ３４＋幹細胞の生体内分布を実施例１に記載した通りに監視した。
【０１２８】
５％ヒト血清アルブミンを含有する生理食塩水中に入れて投与した放射標識ＨＳＣは、その大部分が肺へ移動した。解剖学的定位は、肩甲骨および鼻の下方のカニューレ出口部位の高さに配置した57Ｃｏ点光源を使用することにより容易になった。さらに、カニューレのポジションマーカーは、ＣＴ全身スキャン、横断面および冠状断面によって横隔膜の高さにあることが確認された。カニューレ出口部位でのクリップが目印として機能した。肺は鼻マーカーの下方およびカニューレマーカーの上方で視認され、肝臓および脾臓はカニューレマーカーの下方で視認された。初回イメージング時に、注入した用量の９５．４％までが肺内に位置していた（表１）。マウス４匹では、肺についての数値範囲は初回イメージング時点の全身取り込み量の５２．６〜９５．４％に及んだ。１時間後には、ＨＳＣの大部分は肺内に位置し、一部は血液循環中で視認された。１時間後にマウス１匹では、カニューレマーカーの下方で一部の局在化が見られ、これは肝臓および脾臓であった可能性がある。しかし、輪郭は不明瞭である。そのマウスでは１２時間後に、放射標識ＣＤ３４＋幹細胞は肝臓／脾臓領域において見いだされた。しかし１２時間後の他の動物の肺内には、最初に注入した用量の３４．７を超える（３４．７〜６８．５％）用量が心臓内にとどまっていた。
【０１２９】
注入直後（初期または０時間後時点）の肺への局在は動物毎に相違していたが、最初の局在に対してその後のスキャン時点に肺にとどまっていた割合（％）はもっと一定であった。１時間後の背側画像を使用すると、肺内に最初に局在した細胞の７２．１〜７５．５％は肺領域にとどまっていた。１２時間後の背側画像を使用すると、イメージングしたマウス３匹では肺内に最初に局在した細胞の７８％、７２．１％および５０．５％が肺領域にとどまっていた。
【実施例６】
【０１３０】
オロソムコイドはＭＳＣを心臓へ向かわせる
オロソムコイド／低用量ＭＳＣ：ＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）（０．５６×１０6ｃｅｌｌｓ）を注入する前に１１ｍｇのオロソムコイドを投与すると、０時間後には注入した細胞の６８±７％が、そして１時間後には６１±３％が心臓で見いだされた。
【０１３１】
ＭＳＣはＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ事業部、低温保存されたＰＴ−２５０１、１アンプル当たり＞７５０，０００ｃｅｌｌｓ）から入手し、上記の実施例と同様に111Ｉｎを用いて放射標識したが、本実施例ではＭＳＣは５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する幹細胞用基礎培地（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社製）中で標識し、洗浄し、注入した。０．５６×１０6の111Ｉｎ標識ＭＳＣは、５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する０．２１ｍＬの幹細胞用基礎培地中に入れて、２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内に差し込んだＤａ  ＶｉｎｃｉＭｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システムカニューレを介して投与した。ＭＳＣの投与直前に、１１．０ｍｇのオロソムコイドを０．２ｍＬで静脈内投与した。
【０１３２】
マウスをイメージングし、放射標識ＭＳＣ細胞の生体内分布を実施例１に記載した通りに監視した。注入の初期（０時間後）および１時間後のガンマカメラによる監視により、放射標識ＭＳＣが心臓領域に局在することが証明された。画像の対象領域解析により、初期には注入した放射能の約６１．７％〜７５．５％が心臓に局在し、１時間後には注入した細胞の約５８〜６４％がこの領域にとどまっていることが明らかになった。カニューレ、横隔膜、心臓、肺、および肝臓の位置はＣＴスキャン（冠状断面）によって確認した。インサイチューハイブリダイゼーションは、ヒト細胞が肝臓ではなく主として心臓内に存在することを証明した。
【実施例７】
【０１３３】
ＡＳＯ注入後のオロソムコイド注入はＭＳＣを肝臓／脾臓へ向かわせる
ＭＳＣはＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ事業部、低温保存ＰＴ−２５０１、１アンプル当たり＞７５０，０００ｃｅｌｌｓ）から入手し、111Ｉｎを用いて放射標識した。実施例６と同様に、ＭＳＣは５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する幹細胞用基礎培地（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ社製）中で放射標識し、洗浄し、そしてそれに入れて注入した。
【０１３４】
アシアロオロソムコイド（ＡＳＯ）＋オロソムコイド／低用量ＭＳＣ：本実施例は、低細胞用量でのＭＳＣのトラフィッキングをＨＳＣ（実施例４）と比較するために設計されたので、実施例４で使用したＡＳＯおよびオロソムコイドの連続的注入を適用した。ヒト間葉系幹細胞（０．５６×１０6ｃｅｌｌｓ）を注入する前に４．３ｍｇのＡＳＯおよび５．５ｍｇのオロソムコイドの注入を実施した。注入０時間後には注入した細胞の６３±５％、１時間後には５７±７％が肝臓および脾臓で見いだされた。
【０１３５】
０．５６×１０6の111Ｉｎ放射標識ＭＳＣは、５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する０．２１ｍＬの幹細胞用基礎培地に入れて静脈内投与した。ＭＳＣを投与する前に、４．３ｍｇのＡＳＯを含有する０．１ｍＬ、次に５．５ｍｇのオロソムコイドを含有する０．１ｍＬを静脈内投与した。ＡＳＯ、オロソムコイドおよびＭＳＣは、２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内へ差し込んだＤａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｍｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システムカニューレを介して投与した。
【０１３６】
マウスをイメージングし、放射標識ＭＳＣの生体内分布を実施例１と同様に監視した。注入の初期および１時間後のガンマカメラによる監視は、放射標識ＭＳＣが心臓領域に局在することを証明した。初期画像の対象領域解析により、注入した放射能の約５９．２％〜６６．７％が肝臓／脾臓に局在し、１時間後には注入した細胞の約５１．９〜６１．１％がこの領域にとどまっていることが明らかなった。
【０１３７】
カニューレ、横隔膜、心臓、肺、および肝臓の位置はＣＴスキャンによって確認した。インサイチューハイブリダイゼーションによりガンマカメラによる生体内分布データが確証された。ヒトＤＮＡを含有する細胞の大部分は肝臓で見いだされた。
【実施例８】
【０１３８】
生理食塩水単独、ＲＰＭＩ−１６４０単独、または５％ヒト血清アルブミンを含有する生理食塩水（オロソムコイドまたはＡＳＯを含まない）中に入れて投与されたＭＳＣは肺および腎臓へ移動する
ＭＳＣはＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｐｏｉｅｔｉｃｓ事業部、低温保存ＰＴ−２５０１、１アンプル当たり＞７５０，０００ｃｅｌｌｓ）から入手し、111Ｉｎを用いて放射標識した。実施例６と同様に、ＭＳＣは生理食塩水単独、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製、ニューヨーク州グランドアイランド）および５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する生理食塩水中で放射標識し、洗浄し、そしてそれらに入れて注入した。
【０１３９】
生理食塩水単独。１．１４×１０6の111Ｉｎ標識ＭＳＣを０．２０ｍＬの生理食塩水単独に入れて静脈内投与した。ＭＳＣは２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内へ差し込んだＤａ  ＶｉｎｃｉＭｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システムカニューレを介して投与した。
【０１４０】
マウスをイメージングし、放射標識ＭＳＣの生体内分布を実施例１と同様に監視した。注入後初期のガンマカメラによる監視は、放射標識ＭＳＣが肺領域に局在することを証明した。初期画像の対象領域解析により、注入した放射能の９５％が肺に局在することが明らかになった。１時間後には各々８７％および４％が肺および腎臓に局在した。２４時間後には各々６１％および１３％が肺および腎臓に局在した。そして４８時間後には各々５９％および１４％が肺および腎臓に局在した。
【０１４１】
カニューレ、横隔膜、心臓、肺、および肝臓の位置はＣＴスキャンによって確認したが、解剖学的位置（鼻、尾、カニューレ等）をマーキングするためには57Ｃｏ−スポットマーカーを使用した。
【０１４２】
ＲＰＭＩ−１６４０単独。１．１４×１０6の111Ｉｎ標識ＭＳＣを０．２０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０単独に入れて静脈内投与した。ＭＳＣは２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内へ差し込んだＤａ  ＶｉｎｃｉＭｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システムカニューレを介して投与した。
【０１４３】
マウスをイメージングし、放射標識ＭＳＣの生体内分布を実施例１と同様に監視した。注入後初期のガンマカメラによる監視は、放射標識ＭＳＣが肺領域に局在することを証明した。初期画像の対象領域解析により、注入した放射能の９５％が肺に局在することが明らかになった。１時間後には各々７４％および７％が肺および腎臓に局在し、そして２４時間後には各々６９％および９％が肺および腎臓に局在した。
【０１４４】
カニューレ、横隔膜、心臓、肺、および肝臓の位置はＣＴスキャンによって確認したが、解剖学的位置（鼻、尾、カニューレ等）をマーキングするためには57Ｃｏ−スポットマーカーを使用した。
【０１４５】
５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有する生理食塩水。１．１４×１０6の111Ｉｎ標識ＭＳＣは、５％ＨＳＡを含有する０．２０ｍＬの生理食塩水単独に入れて静脈内投与した。ＭＳＣは、２月齢の雌性ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの外頸静脈内へ差し込んだＤａ  ＶｉｎｃｉＭｉｃｒｏｐｏｒｔ血管システムカニューレを介して投与した。
【０１４６】
マウスをイメージングし、放射標識ＭＳＣの生体内分布を実施例１と同様に監視した。注入後初期のガンマカメラによる監視は、放射標識ＭＳＣが肺領域に局在することを証明した。初期画像の対象領域解析により、注入した放射能の９４％が肺に局在することが明らかになった。１時間後には各々８７％および２％が肺および腎臓に局在した。２４時間後には各々５９％および１１％が肺および腎臓に局在した。そして４８時間後には各々５７％および１４％が肺および腎臓に局在した。
【０１４７】
［結果］
上記に記載した実験の結果を下記の表１にまとめた。
【表１】
2006501169.tif 000002
【実施例９】
【０１４８】
以下の実験の大まかな目的は、ヒトＬＡＫ細胞集団がＡＳＧＰ受容体を介してヒト肝細胞癌細胞に特異的に結合するかどうかを、そして結合するのであればこの細胞認識系をリンパ球ターゲティングのために操作できるかどうかを決定することであった。一般的実験アプローチは、図５に示したＡＳＧＰ受容体を有する肝細胞との接触を模倣するインビトロ系中の類似のシアロ−アシアロ含有血漿タンパク質を使用する。
【０１４９】
ヒト最小偏異肝細胞癌単層へのＮＫ／ＬＡＫ活性の付着
対照細胞（ＩＬ−２処理なし）またはＬＡＫ細胞（１０ＵのＩＬ−２／ｍＬ中で３日間培養したＩＬ−２処理ヒト末梢血リンパ球）は４℃で２時間かけるとＨＥＰＧ２細胞の単層へ付着した。培地中のアシアロフェチュイン（ＡＳＦ、２００μｇ／ｍＬ）または培地中のフェチュイン（Ｆ、対照、２００μｇ／ｍＬ）のいずれかを用いてこの単層を前処理した。対照細胞またはＬＡＫ細胞を単層上でインキュベートした後、次にこれらの細胞をデカンテーションし、洗浄し、そしてＮＫ−耐性標的のＲａｊｉに対する51Ｃｒ遊離測定法で細胞毒性能力について試験した。Ｅ：Ｔ比は４０：１、２０：１、１０：１、および５：１であった。平均値の標準誤差を表示した。Ｅ：Ｔ比は対数Ｅ：Ｔとしてプロットした。結果は図６にグラフ表示した。
【０１５０】
結論：ＬＡＫ活性は、対照（十分にシアル化された）タンパク質であるフェチュイン（ＡＳＧＰ受容体を遮断しない）を用いて処理されているＨＥＰＧ２単層上でこれらの細胞をインキュベートすることにより約５０％低下した。ＬＡＫ活性は、アシアロフェチュイン（ＡＳＧＰ受容体を遮断するために）を用いて予備加熱されていたＨＥＰＧ２単層上でこれらの細胞をインキュベートすることによっては除去されなかった。４０℃で２時間にわたりフェチュインまたはアシアロフェチュイン（２００μｇ／ｍＬ）のどちらかと一緒にインキュベートされたＬＡＫまたは対照調製物は、未処理ＬＡＫ細胞集団に対して同一の活性を有していた。これらのデータは、ＬＡＫ細胞は肝性ＡＳＧＰ受容体に結合し、この結合はアシアロフェチュインを用いてこの受容体を遮断することによって阻害できるという意見を支持している。この所見を拡大すると、肝臓によるＬＡＫ細胞の隔離の原因の少なくとも一部はＡＳＧＰ受容体にある、そしてアシアロフェチュイン等のアシアロ複合糖質の投与はこの捕捉を防止してＬＡＫ細胞トラフィッキングを変化させることができるという考えに行き着く。
【０１５１】
２３℃でのＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ受容体陽性、「ＡＳＧＰＲ＋」）およびＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰ受容体陰性、「ＡＳＧＰＲ−」）への付着
この実験は、単層への付着を４℃ではなく２３℃で２時間にわたり実施した以外は、上記と同一であった。２つの単層を使用した：ＡＳＧＰＲ＋細胞系であるＨＥＰＧ２、およびＡＳＧＰＲ−細胞系であるＣＡＫＩ−２（ヒト腎細胞癌細胞）。使用したエフェクター細胞集団は：未処理３日齢ＬＡＫ調製物（ＬＡＫ）およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）ノイラミニダーゼを用いて処理された同一集団（ＬＡＫ／ＮＳ）（３０ｍＵ／ｌ×１０7ｃｅｌｌｓ／２００μＬ）であった。ノイラミニダーゼ処理集団は、アシアロ陽性の対照リンパ球であった。全細胞集団が、処理とは無関係に測定時点に９０％以上が生育可能であった。各タイプのエフェクター集団を対照として２００μｇ／ｍＬのＡＳＦまたはＦである培地単独を用いてインキュベートした。全エフェクターをＲＡＪＩ（ＬＡＫ−感受性標的；ＮＫ−非感受性標的）またはＫ５６２（ＮＫ／ＬＡＫ−感受性標的）上で測定した。Ｅ：Ｔ比およびグラフ表示は上記と同一である。
【０１５２】
結果。上記の実験により下記の結果が生じた（図６〜８を参照）。以下の考察では、ＲＡＪＩ上の活性を「ＬＡＫ」活性と呼び、Ｋ５６２上の活性を「ＩＬ−２活性化ＮＫ」活性と呼ぶ。一部の研究者らは、ＮＫおよびＬＡＫが同一ターゲティング構造を使用して標的（新鮮および培養腫瘍細胞）を認識して死滅させるという考えを支持している。
【０１５３】
（１）未処理（ＬＡＫ）または処理（ＬＡＫ／ＮＳ）いずれかのエフェクターのＡＳＦまたはＦを用いたプレインキュベーションは、ＲＡＪＩまたはＫ５６２細胞のどちらかを死滅させるエフェクターの能力に影響を及ぼさない。
【０１５４】
（２）ノイラミニダーゼ処理はＲＡＪＩ上のＬＡＫ活性を増強するが、Ｋ５６２上のＩＬ−２活性化ＮＫは増強しない（図１１および１２も参照されたい）。
【０１５５】
（３）ノイラミニダーゼ処理を実施した、または実施していないＩＬ−２活性化ＮＫへのＨＥＰＧ２の付着は、２３℃ではＡＳＦによって部分的に阻害されるが、Ｆによっては阻害されない（図７および８）。
【０１５６】
（４）ＬＡＫ活性のＨＥＰＧ２への付着は、２３℃ではＡＳＦまたはＦのどちらを用いても阻害できなかった（図９および１０）。
【０１５７】
（５）ノイラミニダーゼ処理集団のＬＡＫ活性のＨＥＰＧ２への付着はＡＳＦによってわずかに阻害できたが、Ｆによっては阻害できなかった（図１０）。
【０１５８】
（６）ＩＬ−２活性化ＮＫまたはＬＡＫ活性のＣＡＫＩ−２への付着は、２３℃ではＡＳＦまたはＦのどちらを用いても阻害できなかった（図７および−１０）。
【０１５９】
結論：ＬＡＫ活性（ＲＡＪＩ標的上で測定）およびＩＬ−２活性化ＮＫ活性（Ｋ５６２標的上で測定）は、ＡＳＧＰＲ＋細胞系であるＨＥＰＧ２に対して相違する付着特徴を示す。２３℃でＡＳＦを使用すると、ＨＥＰＧ２へのＬＡＫ活性の付着を阻害できる。他方、ＩＬ−２活性化ＮＫ付着は部分的に阻害できる。４℃ではＡＳＦによって実質的に全ＬＡＫ活性のＨＥＰＧ２単層への付着を阻害できる。ＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）単層への付着はＡＳＦによって遮断できない。
【０１６０】
これらのデータは、ＨＥＰＧ２単層への付着は一部にはＡＳＧＰ受容体によって媒介されるが、ＣＡＫＩ−２単層への付着にはこの受容体が関与していないことを示唆している。ＬＡＫ／ＮＫ細胞は少なくとも２つの受容体または認識構造：１）ＬＡＫ／ＮＫ集団上でアシアロ決定基へ結合するＡＳＧＰＲ、および２）標的エピトープに対する「ＬＡＫ」または「ＮＫ」認識構造、を介してＨＥＰＧ２へ結合するというのが作業仮説である。第１はＡＳＦによって阻害できるが、第２は阻害できないはずである。ＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）への結合はＡＳＦによって阻害されないが、これは標的エピトープへのＬＡＫまたはＮＫ認識構造結合のためである。この説は、さらにまた２５０μｇ／ウエルのＡＳＦまたはＦを放射標識標的ＣＡＫＩ−２に対するＬＡＫエフェクターについての51Ｃｒ−遊離測定法に添加した実験（以下を参照）から引き出されたデータによって支持することができる。ＡＳＦは、１ｍｇ／ｍＬの濃度でさえＣＡＫＩ−２標的を死滅させるＬＡＫの能力を阻害しなかった。
【０１６１】
Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＳＧＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｌｉｎｅ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２５６：８８  ７８−（１９８１）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ａ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，「Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＳＧＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ」，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．３００：２２９−２３５（１９８２）によると、ＡＳＧＰＲは２３℃では再循環するが、４℃では再循環しない。付着を阻害する能力において見られる相違は、ＡＳＧＰＲ再循環およびおそらくは標的上のＬＡＫ認識構造の温度依存性によって説明することができる。ＡＳＧＰＲおよびＬＡＫ認識構造両方による４℃でのＬＡＫ：標的結合は、２３℃とは相違するリガンドに対する親和性を有する可能性がある、またはおそらくは高温では他の付着分子がエフェクター：標的相互作用を増加させることができる。つまり、４℃ではいずれかの感知できる親和性を備えるＬＡＫに結合するＨＥＰＧ２上の唯一の受容体はＡＳＧＰＲであり、この温度ではこの静的受容体はそのリガンドであるＡＳＦによって容易に阻害できる。２３℃ではＡＳＧＰＲがＬＡＫ細胞を標的へ結合させる以上のことをする。ＡＳＧＰＲはリガンドのＡＳＦの存在下では再循環して、相互作用を「強固に固定」するために少なくとも標的に対するＬＡＫ認識構造および他の第２付着分子を残す。
【０１６２】
これらのデータは、ＬＡＫ（ＲＡＪＩ上で測定）およびＩＬ−２誘導性ＮＫ（Ｋ５６２上で測定）細胞がＨＥＰＧ２への付着について相違する親和性受容体または相違するオン／オフ率を有することを示唆している。
【０１６３】
理論上では、ノイラミニダーゼ処理は、この処理によって生成するアシアロ決定基の数が増加するためにＨＥＰＧ２単層へのＬＡＫ細胞の結合を増加させるはずであるが、実際には増加させなかった。アシアロ決定基の数がＨＥＰＧ２上のＡＳＧＰＲの最高数を占めるために十分である場合は、これらの決定基の数が増加しても最終作用は変化しない。さらにまた結合に関与する特異的アシアロ決定基があるが、多数ではあっても不適切な決定基を生成しても付着が増加しないことも考えられる。これは、ＬＡＫおよびＩＬ−２活性化集団がＨＥＰＧ２へのこの付着に関与するリガンドに関して相違するかも知れないという興味深い可能性を示唆している。
【０１６４】
ＬＡＫ細胞による腫瘍標的の死滅はＡＳＦまたはＦを標的の前処理に含めてもまたは51Ｃｒ−遊離測定法へ添加しても遮断されない
アシアロ決定基はＬＡＫ−標的相互作用ならびにＬＡＫトラフィッキングおよび肝臓付着のどちらにおいても機能を果たす可能性があるので、トラフィッキングパターンを変化させるためのインビボでのアシアロ糖タンパク質物質の使用が細胞毒性活性も阻害し、そのような操作を逆効果にさせるかどうかを決定することが重要である。１ウェル当たり２５０μｇで、測定にアシアロフェチュインまたはフェチュインを添加することによる標的のプレインキュベーションは、ＬＡＫによる腫瘍標的であるＣＡＫＩ−２の死滅を遮断しない。ＬＡＫは標準５日間調製物であった。しかし、これらのデータは３日間ＬＡＫ調製物を用いて反復した（特異的遊離率％は１分当たりの未加工数（ｒａｗ  ｃｏｕｎｔｓ）の相違が１０％未満までである４回の結果から決定した。測定は標準４時間インキュベーションで実施した）。
【０１６５】
【表２】
2006501169.tif 000003
【０１６６】
自然遊離（培地単独）：２１８３ｃｐｍ．
自然遊離（フェチュイン単独）：２２６７ｃｐｍ．
自然遊離（アシアロフェチュイン単独）：２１４７ｐｍ．
全遊離：３０，６００ｃｐｍ．
【０１６７】
ノイラミニダーゼまたは２，３−および２，６−シアリルトランスフェラーゼによる細胞表面修飾後のＮＫ／ＬＡＫ活性の付着
ＡＩＭ−Ｖ（Ｇｉｂｃｏ社製）中で増殖させた５日齢ＬＡＫ調製物（２０Ｕ／ｍＬ；１Ｄｕｐｏｎｔ単位＝４４．５ＢＲＭＰ単位）は、１０7ｃｅｌｌｓ当たり３０ｍＵのコレラ菌ノイラミニダーゼ、０．４８ｍＵの２，３−もしくは１０μの２，６−シリアリルトランスフェラーゼを用いて（Ｂ．１．２．３および１．２．４に記載のプロトコールによって）処理した。一部のエフェクターは、２３℃で２時間、ＲＰＭＪ中に１０％ＰＢＳを含む培地中でインキュベートした。未処理ＬＡＫ、ノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ、２，３または２，６−シリアリルトランスフェラーゼを用いて処理したＬＡＫからの２×１０7のエフェクターを１５ｍＬの培地中に懸濁させ、２３℃で２時間にわたりＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）またはＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）単層上に置いた。これらのフラスコを１５分毎に揺り動かした。これらの単層からの非付着細胞をデカンテーションし、付着していない対照に追加して、Ｋ５６２およびＲＡＪＩに対して測定した。結果は図１１〜１６に表示した。使用したＥ：Ｔ比は、４０：１、２０：１、１０：１、および５：１であった。
【０１６８】
結果。要約については、上記の表２を参照されたい（このデータのグラフ表示は図１１〜１６に示した）。
【０１６９】
（１）ＩＬ−２活性化ＮＫ（Ｋ５６２標的を死滅させる）は、いずれの細胞表面修飾によっても影響を受けない（図１１、１２および１３、上から４本の点線）；他方ＬＡＫ活性（ＲＡＪＩの死滅）は、ノイラミニダーゼ処理によって有意に増強されるが（図１２、１５および１６）、２，３−または２，６−シアリルトランスフェラーゼ処理によっては増強されない（図１５および１６）。
【０１７０】
（２）ＬＡＫ細胞表面の修飾は、未処理ＬＡＫと比較してＣＡＫＩ−２への付着を変化させない（ＲＡＪＩ上で測定）（図１５）。これとは対照的に、ノイラミニダーゼ処理は２，３−シアリルトランスフェラーゼ処理（図１４、ノイラミニダーゼの上方の実線）と同様に、ＩＬ−２活性化ＮＫ活性のＣＡＫＩ−２への付着を促進する（図１４、一番下の実線；Ｋ５６２上で測定）。２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いた処理は、ＬＡＫまたはＩＬ−２のどちらかによって活性化されたＮＫのＣＡＫＩ−２への付着に全く作用を及ぼさない。
【０１７１】
（３）細胞表面の修飾はＨＥＰＧ２へのＬＡＫ活性の付着を極めて顕著には修飾しない（図１５）。しかし２，６−シアリルトランスフェラーゼ処理はＩＬ−２活性化ＮＫの付着を有意に促進する（図１３、一番下の実線）。そしてこれとは逆に、２，３−シアリルトランスフェラーゼ処理はこれらの細胞のＨＥＰＧ２への付着を有意に防止する（図１３、一番上の実線）。
【０１７２】
結論：ＩＬ−２活性化ＮＫの死滅およびＬＡＫはノイラミニダーゼ処理によって相違する影響を受ける。
【０１７３】
両方のＨＥＰＧ２へのＩＬ−２活性化ＮＫの付着は細胞表面修飾によって変化した。ＬＡＫ付着はこれらの修飾による影響を受けなかった。これはおそらく２，３−および２，６−シアリルトランスフェラーゼの用量反応によって決定できるであろうＬＡＫ細胞表面へ添加できるシアル酸の量に起因する。
【０１７４】
２３℃でのＩＬ−２活性化ＮＫのＨＥＰＧ２への付着は、一部にはＡＳＦによって（以前に報告された）、そして２，３−シアリルトランスフェラーゼとともにシアル酸を添加することによって阻害できよう（だが２，６−シアリルトランスフェラーゼ処理は付着を促進した）。
【０１７５】
２３℃で、または３７℃でさえＡＳＧＰＲ再循環を補償する手段としてより高濃度のＡＳＦ（または他のアシアロ化合物、例えばアシアロＧＭＩ−糖）を添加することがＩＬ−２活性化ＮＫまたはＬＡＫの付着を防止できるかどうかを決定することが必要である。同様に、最高量のシアル酸の添加を達成するための２，３−および２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いた用量反応実験を実施すれば、ｓｅｒ／ｔｈｒへ結合したＯ−結合糖への２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびａｓｎへ結合したＮ−結合糖への２，６−シアリルトランスフェラーゼのように各酵素が相違する構造へ付け加わるので、付着機序の分析が可能になる。これらのグリコシルトランスフェラーゼは、ＩＬ−２活性化ＮＫ（Ｋ５６２の死滅）を担う集団とＲＡＪＩ死滅を担う集団であるＬＡＫとを区別する際に同等に重要な可能性がある。
【０１７６】
本明細書で言及したすべての出版物、特許、特許出願、およびその他の文書は本発明が関係する技術分野における当業者の水準の指標である。すべての出版物、特許、特許出願、およびその他の文書は、あたかも各個別出版物、特許、特許出願、およびその他の文書が特別かつ個別にあらゆる目的でその全体が参照して本明細書に組み込まれると指示された場合と同程度にあらゆる目的でその全体が参照して本明細書に組み込まれる。小見出しは単に文書を容易に詳細に検討できるように含まれており、決して文書の内容についての制限であると見なされてはならない。
【０１７７】
上記の発明を明確に理解してもらう目的で例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、添付の請求項の範囲内で一定の変化および修飾を実施できることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】肝臓内での肝臓による骨髄幹細胞およびリンパ球の捕捉を示した略図である。細胞表面上のアシアロ糖決定基は幹細胞表面上のＡＳＧＰ受容体と反応し、結果として肝臓内への骨髄幹細胞およびリンパ球の局在化を生じさせる。アシアロ複合糖質を含む複合糖質は、そのような細胞表面上のアシアロ糖決定基と幹細胞表面上のＡＳＧＰ受容体との相互作用を遮断する。
【図２】本発明の代表的な２つの糖タンパク質上の炭水化物構造を示した図である。
【図３】ＡＳＧＰ受容体に対する様々な炭水化物の相対結合親和性を示した図である。
【図４】ＡＳＧＰ受容体に対する様々な炭水化物の相対結合親和性を示した図である。
【図５】（１）ヒト肝組織内の細胞からの最小偏異を示すアシアロ糖タンパク質受容体陽性（ＡＳＧＰＲ＋）細胞系であるヒト肝細胞癌細胞系（ＨＥＰ２Ｇ）、および（２）ＡＳＧＰＲ−細胞系であるヒト腎細胞癌細胞系（ＣＡＫＩ−２）の単層培養へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着を試験するための実験システムの略図である。
【図６】４℃でのＨＥＰ２Ｇ単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着（ＮＫ／ＬＡＫ活性によって表される）にアシアロフェチュイン（ＡＳＦ）およびフェチュイン（Ｆ）が及ぼす作用を試験した結果のプロット図である。ＬＡＫ活性（５０％）は、十分にシアル化された対照タンパク質であるフェチュイン（Ｆ）の存在下において、４℃でヒト最小偏異肝細胞癌ＨＥＰＧ２へ付着した（ＬＡＫ−ＮＡ／Ｆ）。ＬＡＫ活性はアシアロフェチュイン（ＡＳＦ）の存在下ではＨＥＰＧ２単層へ付着しなかった（ＬＡＫ−ＮＡ／ＡＳＦ）。ＬＡＫ細胞をＡＳＦ単独の存在下でインキュベートした、すなわち単層への付着は実施しなかった（ＬＡＫ／ＡＳＦ）。対照細胞はＲＡＪＩ標的を死滅させなかった（対照）。**これは３人の相違するドナーの代表値である。
【図７】２３℃でのＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２細胞へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着にアシアロフェチュイン（ＡＳＦ）およびフェチュイン（Ｆ）が及ぼす作用を試験した結果を示した図である。エフェクター細胞集団は、未処理３日齢ＬＡＫ調製物（ＬＡＫ）およびコレラ菌ノイラミニダーゼを用いて処理された同一集団（ＬＡＫＮＳ）であった。Ｋ５６２上で測定された、ＡＳＦまたはＦいずれかの存在下でのＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）およびＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）へのＬＡＫの付着。（ＬＡＫ＝３日齢ＬＡＫ；Ｋ５＝Ｋ５６２標的；ＦＥＴ＝フェチュイン；ＡＳＦ＝アシアロフェチュイン；ＬＡＫ／ＣＡＫＩ／ＡＳＦ／Ｋ５＝Ｋ５６２上で測定された、ＡＳＦを用いて前処理されたＣＡＫＩへ付着したＬＡＫ）。
【図８】図７と同様に、２３℃でのＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２細胞へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着にアシアロフェチュイン（ＡＳＦ）およびフェチュイン（Ｆ）が及ぼす作用を試験した追加の結果である。ＡＳＦまたはＦいずれかの存在下での、ＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）およびＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）へのノイラミニダーゼ処理ＬＡＫの付着。（ＬＡＫ／ＮＳ＝ノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ；例−ＬＡＫ／ＣＡＫ／ＮＳ／ＡＳＦ／Ｋ５＝Ｋ５６２上で測定された、ＡＳＦを用いて前処理されたＣＡＫＩへ付着したノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ）。
【図９】図７と同様に、２３℃でのＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２細胞へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着にアシアロフェチュイン（ＡＳＦ）およびフェチュイン（Ｆ）が及ぼす作用を試験した追加の結果である。ＲＡＪＩ上で測定されたＡＳＦまたはＦいずれかの存在下での、ＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）およびＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）へのＬＡＫ付着。（ＬＡＫ＝３日齢ＬＡＫ；Ｒ＝ＲＡＪＩターゲット；ＦＥＴ＝フェチュイン；ＡＳＦ＝アシアロフェチュイン；ＬＡＫ／ＣＡＫＩ／ＡＳＦ／Ｒ＝ＲＡＪＩ上で測定された、ＡＳＦを用いて前処理されたＣＡＫＩへ付着したＬＡＫ）。
【図１０】図７と同様に、２３℃でのＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２細胞へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着にアシアロフェチュイン（ＡＳＦ）およびフェチュイン（Ｆ）が及ぼす作用を試験した追加の結果である。ＡＳＦまたはＦいずれかの存在下でのＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）およびＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ−）へのノイラミニダーゼ処理ＬＡＫの付着。（ＬＡＫ／ＮＳ＝ノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ；例−ＬＡＫ／ＣＡＫ／ＮＳ／ＡＳＦ／Ｒ＝ＲＡＪＩ上で測定された、ＡＳＦを用いて前処理されたＣＡＫＩへ付着したノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ）。
【図１１】ＨＥＰ２Ｇ細胞単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着に細胞表面修飾が及ぼす作用を試験した結果を示した図である。Ｋ５６２上で測定された、５日齢ＬＡＫ、ノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ、対照（ＩＬ−２なし）の細胞毒性活性。
【図１２】図１１に示したように、ＨＥＰ２Ｇ細胞単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着に細胞表面修飾が及ぼす作用を試験した追加の結果を示した図である。ＲＡＪＩ細胞上で測定された、５日齢ＬＡＫ、ノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ、対照（ＩＬ−２なし）の細胞毒性活性。
【図１３】図１１に示したように、ＨＥＰ２Ｇ細胞単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着に細胞表面修飾が及ぼす作用を試験した追加の結果を示した図である。ノイラミニダーゼ、２，３−または２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いての細胞表面修飾後のＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）へのＬＡＫ活性の付着。（例：ＬＡＫ／ＨＥＰ／ＮＡＳＥ／Ｋ５＝Ｋ５６２上で測定された、ＨＥＰＧ２へ付着したノイラミニダーゼ処理ＬＡＫ）。
【図１４】図１１に示したように、ＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２細胞単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着に細胞表面修飾が及ぼす作用を試験した追加の結果を示した図である。ノイラミニダーゼ、２，３−または２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いての細胞表面修飾後のＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ―）へのＬＡＫ活性の付着。（図１３および１４両方での点線は同一対照である。）
【図１５】図１１に示したように、ＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着に細胞表面修飾が及ぼす作用を試験した追加の結果を示した図である。ＲＡＪＩ細胞上で測定された、ノイラミニダーゼ、２，３−または２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いての細胞表面修飾後のＨＥＰＧ２（ＡＳＧＰＲ＋）へのＬＡＫ活性の付着。
【図１６】図１１に示したように、ＨＥＰ２ＧおよびＣＡＫＩ−２単層へのＮＫ／ＬＡＫ細胞の付着に細胞表面修飾が及ぼす作用を試験した追加の結果を示した図である。ＲＡＪＩ細胞上で測定された、ノイラミニダーゼ、２，３−または２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いての細胞表面修飾後のＣＡＫＩ−２（ＡＳＧＰＲ―）へのＬＡＫ活性の付着。
【図１】
2006501169.tif 000004
【図２】
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【図３】
2006501169.tif 000006
【図４】
2006501169.tif 000007
【図５】
2006501169.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2006501169.tif 000018
【図１６】
2006501169.tif 000019
【国際調査報告】
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2006501169.tif 000021
2006501169.tif 000022
2006501169.tif 000023
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