(57)【要約】本発明は，遊離の又は複合体結合の扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ），好ましくはＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体，このようなモノクローナル抗体を認識するハイブリドーマ，ＳＣＣＡを診断する方法，ＳＣＣＡを検出するための診断キットに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離のＳＣＣＡと総ＳＣＣＡを識別することができるモノクローナル抗体。
【請求項２】
遊離のＳＣＣＡ１と総ＳＣＣＡ１を識別することができる請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
該抗体がハイブリドーマによって生産されたものである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１及び３と本質的に同じ結合特異性を有するモノクローナル抗体，抗体フラグメント，組換え抗体，ｓｃＦｖまたはペプチド断片。
【請求項５】
遊離のＳＣＣＡ１の特異的測定のための請求項１〜３記載の抗体または他の結合構造をベースとするイムノアッセー。
【請求項６】
請求項５に記載のイムノアッセーを使用する，癌の診断または癌の再発の検出のための方法。
【請求項７】
遊離のＳＣＣＡ１と，総ＳＣＣＡ１または複合体に結合したＳＣＣＡ１との比率を計算する癌の診断方法。
【請求項８】
遊離のＳＣＣＡ１と総ＳＣＣＡとの比率を計算する癌の診断方法。
【請求項９】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ２を識別することができる請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
該抗体がハイブリドーマによって生産されたものである請求項１０記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項１０及び１１の抗体と本質的に同じ結合特異性を有するモノクローナル抗体，抗体フラグメント，組換え抗体，ｓｃＦｖまたはペプチド断片。
【請求項１２】
遊離のＳＣＣＡ２の特異的測定のための請求項１０〜１２記載の抗体または他の結合構造をベースとするイムノアッセー。
【請求項１３】
請求項１３に記載のイムノアッセーを使用する，癌の診断または癌の再発の検出のための方法。
【請求項１４】
遊離のＳＣＣＡ２と，総ＳＣＣＡとの比率を計算する癌の診断方法。
【請求項１５】
遊離ＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ１，複合体結合ＳＣＣＡ１及び／または遊離ＳＣＣＡ１との比率を計算する扁平上皮癌または癌の再発を診断する方法。
【請求項１６】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮癌を診断する方法。
【請求項１７】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮子宮頸癌を診断する方法。
【請求項１８】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮肺癌を診断する方法。
【請求項１９】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮子宮癌を診断する方法。
【請求項２０】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮食道癌を診断する方法。
【請求項２１】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮頭部及び頸部癌を診断する方法。
【請求項２２】
請求項６〜８及び１４〜１６記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮外陰癌を診断する方法。
【請求項２３】
遊離のＳＣＣＡと総ＳＣＣＡを識別することができるモノクローナル抗体を含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【請求項２４】
遊離のＳＣＣＡ１と総ＳＣＣＡ１を識別することができるモノクローナル抗体を含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【請求項２５】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体を含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【請求項２６】
遊離のＳＣＣＡと総ＳＣＣＡを識別することができるモノクローナル抗体を認識するハイブリドーマを含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【請求項２７】
遊離のＳＣＣＡ１と総ＳＣＣＡ１を識別することができるモノクローナル抗体を認識するハイブリドーマを含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【請求項２８】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体を認識するハイブリドーマを含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＳＣＣＡの異なるアイソフォームの特異的な測定，並びに該異なるアイソフォームの血清学的濃度及びそれらの比率の癌の診断の手段としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）は，子宮，頚部，肺，頭部，頸部，外陰及び食道の扁平上皮癌（ＳＣＣ）のための血清学的マーカーである（１，２）。これは，最初は，７０年代の終わりに，カトウ(Kato)と同僚によって，ヒト頚部の扁平上皮癌からのＴＡ−４複合体から４２〜４８ｋＤａの分子量で精製された（１，３）。ＴＡ−４複合体の電気泳動は１０を超えるフラクションを明らかにした。また，抗原の等電点電気泳動法は２つのサブフラクション，酸性（ｐＩ＜６．２５）及び中性（ｐＩ≧６．２５）アイソフォームを示唆した（４）。
【０００３】
ＳＣＣＡのｃＤＮＡのクローニングは，それがセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）ファミリーに属していることを示す（６）。染色体１８ｑ２１．３上のゲノム領域のさらなるクローニングにより，２つのタンデムに配列した遺伝子が明らかになった（７）。より末端側の，最初のＳＣＣＡをＳＣＣＡ１と命名し，より中心のものをＳＣＣＡ２と命名した（図１）。それらはいずれも８つのエキソンを含んでおり，推定上のイントロンエキソン境界，スプライス部位，開始コドン及び終止コドンは同一である。それらは，ヌクレオチド・レベルで９８％，アミノ酸レベルで９２％の同一性を有する。ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２遺伝生成物の推定されたｐＩ値は，中性のアイソフォームがＳＣＣＡ１によりコードされ，酸性のアイソフォームがＳＣＣＡ２によってコードされることを示す。
【０００４】
ヒトでは，セルピンは二つの染色体クラスターのうちの１つにマッピングされる。ＰＩ６，ＰＩ９及びＥＬＮＡＨ２は６ｐ２５にマッピングされる。しかし，ＰＩ８，ボマピン(Bomapin)，ＰＡＩ２，ＳＣＣＡ１，ＳＣＣＡ２，ヘッドピン(Headpin)及びマスピン(Maspin)は，１８ｑ２１．３にマッピングされる（図１）（７−１２）。これらのクラスターは，２つの独立した染色体間重複及び染色体間重複の数回の繰り返しによって発生したと推定されている（９）。染色体領域１８ｑは，再配列の高頻度の領域としてしばしば報告されてきた（９，１３−１６）。セルピンの標的及び機能は完全には理解されていない。大部分については，主な機能は，凝析，繊維素溶解反応，アポトーシス及び炎症に関連した蛋白質分解を生ずる事象の調整である。しかし，ホルモン輸送及び血圧調整のような別の機能も報告されている（１７−２４）。
【０００５】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２はほとんど同一であるが，それらは反応部位ループが異なる（図２及び図３）。ＳＣＣＡ１はパパイン様のシステイン・プロテイナーゼ・カテプシンＳ，Ｋ及びＬを阻害し（２５，２６），ＳＣＣＡ２はキモトリプシン様のセリン・プロテイナーゼ・カテプシンＧ及び肥満細胞キマーゼを阻害する（２７）。ＳＣＣＡ１の反応部位ループ（ＲＳＬ）に関する研究は，ＲＳＬがシステイン・プロテイナーゼ阻害にとって不可欠なことを示す（２８）。ＲＳＬの可変部分は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２のＲＳＬ交換突然変異体及び単一の突然変異体によって示された標的プロテイナーゼの特異性を規定する（２８，２９）。セリン及びシステイン・プロテイナーゼの両方を阻害するために，セルピンが共通のＲＳＬ依存のメカニズムを利用すると考えられる。
【０００６】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の生物学的役割は完全には理解されない。それらは抑制性セルピンであると考えられる。データは，ＳＣＣＡがアポトーシスに関与し，発現が，アポトーシスの阻害によって癌細胞をいくつかの殺傷メカニズムに対して耐性にすることを示唆する（３０）。
【０００７】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２は，正常な扁平上皮細胞の細胞質で検出される（３１，３３）。患者の血清に現われる抗原が，腫瘍細胞によるＳＣＣＡの生産過剰及びそれらの正常なターンオーバーと相関関係があり得る（３４）。抗体の放射線免疫学分析あるいはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用により，血清中に検出されたＳＣＣＡが，主にＳＣＣＡ２であることが報告されたが（１，３５，３６），ＰＣＲを使用する他の研究は，患者の試料中で両方の抗原が増幅され，検出されることを示す（３７）。
【０００８】
ＳＣＣの患者中の血清濃度は，臨床の段階，及び腫瘍の組織学的分化の程度に関連づけられる（１）。子宮頸癌については，いくつかの研究が，この前処理値と臨床の結果の間の相関を示す（１，３８−４３）。研究はさらに，高いＳＣＣＡレベルと腫瘍の大きさの間の相関を示す。臨床の証拠の数か月前に再発または進行性の疾病を検出することができるかもしれない（３９）。同様の結果は，肺，外陰，頭部及び頸部，及び食道の扁平上皮癌にも見られる（１，２，４４，４５）。これらのすべての研究において，総ＳＣＣＡ値を測定した。
【０００９】
ＳＣＣＡはセルピンファミリーに属し，組織と循環で異なる形態のセルピンが検出されると考えられる。セルピンの一般的な機能は異なる蛋白分解酵素の活性を調節することであり，組織と血清中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２は「遊離」セルピンとして，及びそれらの標的プロテアーゼとの複合体として生じるかもしれないことが推測され得る。これは，血清中で主にセルピンα１−アンチキモトリプシンとの複合体として見出されるセリンプロテアーゼＰＳＡに似ているであろう。ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の特異的な測定，並びにそれぞれ「遊離」及び各セルピンの複合体型も，「総」ＳＣＣＡとの比較で付加的な臨床の情報を提供し得る。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２，並びに各セルピンの「遊離」また「合計の」量を識別することのできるモノクローナル抗体の確立を開示する。さらに，本発明は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２セルピンの「遊離」及び「総」量の測定のためのイムノアッセーの設計のための確立された識別性抗体，並びに癌の診断及び疾病の再発の検出のための該イムノアッセーの使用を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２のエピトープに対するモノクローナル抗体，並びにＳＣＣＡのセリンプロテアーゼ複合体中の露出した及び隠れたＰａｎ  ＳＣＣＡの確立は，ＳＣＣＡのそれぞれの形態を測定するための特定のイムノアッセーを設計することを可能にした。さらに，特定のイムノアッセーを使用する癌の診断方法が本発明に開示されている。
【００１２】
実施例１
組換えＳＣＣＡの生産
１．１  ＳＣＣＡのクローニング
細胞系Ｃａｓｋｉ（頚部），Ｃ−４１（頚部），Ａ５４９（肺）及びＲＰＭＩ２６５０（いん頭）からのｍＲＮＡを，クイックプレップマイクロ(Quick Prep Micro)ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア(Pharmacia)）を使用して調製し，ｃＤＮＡを，ファーストストランド(First Strand)ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア）を使用して調製した。ＳＣＣＡのコード配列をカバーする１２１８ｂｐ  ＤＮＡ断片を，１０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ  ８．８５，２５ｍＭのＫＣｌ，５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｍＭのＭｇＳＯ４（ボエリンガー(Boehringer)），０．２ｍＭのｄＮＴＰ（ファルマシア），１０μＭのＳＣＣＡ  １〜７Ｆ（すべてのプライマーのＤＮＡ配列は表１に示されている），１０μＭのＳＣＣＡ  ３９１〜３９７Ｂ，２μｌのｃＤＮＡ及び２．５ＵのＰｗｏポリメラーゼ（ボエリンガー）を含有する１００μｌの反応液中，ＰＣＲで増幅した。試料を９６℃で５分間変性した後，各々９６℃で１５秒の変性，６０℃で１５秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長からなるサイクル合計３０サイクルを実施した。ＰＣＲ反応は７２℃で１０分間の最終伸長によって終了した。
【００１３】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の検出
ＰＣＲ生成物中のＳＣＣＡ１の存在を，それぞれ２４５及び９７３ｂｐの２個の断片を生じる制限酵素ＳａＣＩＩによる開裂によって，または標準のＰＣＲ反応液（７５ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８．８，２０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．０１％のＴｗｅｅｎ２０，２ｍＭのＭｇＣｌ２，０．２ｍＭのｄＮＴＰ，各プライマー１０μＭ，鋳型，及び０．０２５Ｕ／μｌの反応Ｔａｑポリメラーゼ）中でプライマーＳＣＣＡ１〜７Ｆ及びＳＣＣＡ１  ３２３〜３２９Ｂを用いたＳＣＣＡ１特異的ＰＣＲ（試料を９６℃で５分間変性した後，各々９６℃で１５秒の変性，最適アニーリング温度で１５秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長からなる合計３０のサイクルを実施した。ＰＣＲ反応は７２℃で１０分間の最終伸長によって終了した）により検出した。Ｔａ＝５０℃。９９７ｂｐ断片を得た。ＳＣＣＡ２の存在を，ＳＣＣＡ１〜７Ｆ及びＳＣＣＡ２特異的プライマー（ＳＣＣＡ２  ３５７〜３６３Ｂ）を使用する標準のＰＣＲによって検出した。Ｔａ＝６０℃。１０９０ｂｐ断片が得られた。
【００１４】
クローニング
ＰＣＲ生成物をＰＣＲ−スクリプトＡｍｐクローニング・キット（ストラタジーン(Stratagene)）を使用してクローニングした。コロニースクリーニングは１．２に記載されたようなＰＣＲによって実行した。プラスミドＤＮＡは，ウィザードプラスミニプレップ(Wizard Plus Minipreps)ＤＮＡ精製システム（プロメガ(Promega)）を使用して，ＳＣＣＡ１あるいはＳＣＣＡ２を含む選択されたクローンから調製した。
【００１５】
ＤＮＡシーケンシング
クローンをＡＢＩプリズムビッグダイターミネーターサイクルシーケンシング(Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing) （ピーイー・バイオシステムズ(PE Biosystems))を使用してシーケンシングした。試料をＡＢＩプリズム３１０上で処理した。
【００１６】
再クローニング
選択されたクローンを，発現ベクトルｐＧＥＸ−６Ｐ−３（ファルマシア）に再クローニングした。断片をＰＣＲ−スクリプトＡｍｐベクターからＢａｍＨＩとＸｈｏＩを使用して切り出し，１ｘＯＰＡ，１ｍＭのＡＴＰ，５０ナノグラムの開裂ベクター，モル−エンドベクター：挿入物比１：５〜１：８に相当するＳＣＣＡ挿入物及び７．５〜１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全てファルマシア製）を含有する１０μｌの反応液中で発現ベクトルに結合した。反応管を１０℃で一晩インキュベートし，６５℃で１０分間不活性化した。反応物の２〜４μｌで大腸菌ＪＭ１０９（４６）を形質転換した。その後，選択されたクローンからのプラスミド−ＤＮＡでタンパク質発現用の大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。
【００１７】
クローニングされた遺伝子の維持
１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中のプラスミドＤＮＡ（ＳＣＣＡ１／Ａ２融合遺伝子を含んでいるｐＧＥＸ−６Ｐ−３）を−８０℃で貯蔵する。タンパク質発現の再開のために，サムブルック(Sambrook)等（引用文献４６の１．８２〜１．８４頁）によりコンピテント大腸菌ＢＬ２１をプラスミドＤＮＡで形質転換する。より多くのプラスミドＤＮＡの調製には，大腸菌ＪＭ１０９の形質転換が好ましい。
【００１８】
１．１．２  タンパク質の発現及び精製
タンパク質の発現
発現条件は小規模調製によって決定した。大規模発現については，５００ｍｌの２ｘＹＴ培養液及び１００μｇのアンピシリン／ｍｌに５ｍｌの一晩培養液を接種し，３７℃で培養した。タンパク質発現はＩＰＴＧを加えて０．１ｍＭの最終濃度とすることによりＯＤ６００＝０．５〜１．３で誘導された。
【００１９】
タンパク質の精製
細胞を２０００ｇ，１０分間の遠心分離によって採取し，５０ｍｌのＴＥ，ｐＨ  ８．０で洗浄し，３ｍｌＴＥ／ｇの細菌ペレットに溶解した。リゾチームを最終濃度８００μｇ／ｇペレットで添加し，この混合物を３０〜６０分間氷上でインキュベートし，その後，−７０℃で一晩凍結した。塩化マグネシウム及びデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)を，各々１２ｍＭ及び２０μｇ／ｇペレットの最終濃度で添加した。３０分間の氷上インキュベーションの後，試料を４００００ｇで３０分間遠心分離した。各上清に５０％グルタチオンセファロース（ファルマシア）０．５ｍｌを添加し，穏やかに撹拌しながら室温で３０分間〜２時間インキュベートした。このスラリーを，ｌｘＰＢＳを使用して，５〜７回洗浄した。ＧＳＴ−ＳＣＣＡ融合蛋白質を，０．５〜１ｍｌの還元グルタチオン（ファルマシア）を使用して溶出し，室温で３０〜６０分間，４℃で一晩，穏やかに撹拌しながらインキュベートした。ＳＣＣＡタンパク質は，ＧＳＴとＳＣＣＡの間の開裂によって溶出した。０．４８ｍｌの開裂バッファー（５０ｍＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ  ７．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ）及び２０μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを添加し，試料を４時間または一晩４℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。タンパク質をファスト(Phast)システム（ファルマシア）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【００２０】
実施例２
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の確立
２．１  免疫感作及び抗ＳＣＣＡハイブリドーマの一次選択
ＳＣＣ抗原と反応性のポリクローナル抗血清を，組換えＳＣＣ抗原によるウサギの皮下免疫，及び標準の方法による免疫血清の採取により得た。ポリクローナル抗血清の力価は，抗血清のストレプトアビジンプレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）中に固定したビオチニル化されたＳＣＣＡ２及びＳＣＣＡ１との反応性の測定により試験した。組換えＳＣＣＡ２及びＳＣＣＡ１は，標準の方法によるビオチンＮ−スクシンイミドカプロン酸塩エステルでビオチニル化した。
【００２１】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２と反応性のモノクローナル抗体を，リビ(Ribi)アジュバント中の組換えＳＣＣＡ１０〜５０μｇでＢａｌｂ／ｃマウスを腹腔内免疫感作することにより得た。免疫感作後，６０〜９０日間，２〜４ブースター投与の後，免疫になったマウスからの脾臓細胞を記載したようにＰ３ｘ６３Ａｇ８ミエローマ細胞と融合した。
【００２２】
ＳＣＣＡ１及び／またはＳＣＣＡ２と反応するハイブリドーマ産生抗体を，アフィニティ精製したマウスＩｇＧ＋Ｍ（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリーズ(Jackson Immuno Res Lab)，米国）に対するポリクローナル抗血清をコートしたマイクロタイターウェル中でのハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡスクリーニングによって選択した。その後，ウェルをＳＣＣＡ抗原とインキュベートし，洗浄した後，結合した抗原をポリクローナルウサギ抗ＳＣＣ及びＨＲＰで標識したブタ抗ウサギＩｇ（ダコ  エイエス(Dako AS)，コペンハーゲン，デンマーク）とのインキュベーションによって検出した。
【００２３】
２．２  選択されたハイブリドーマとＳＣＣ抗原との反応性
確立したハイブリドーマの反応性をスクリーニング法と同様のＥＬＩＳＡで試験を行った。簡潔に記載すると，ハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体を，マウスＩｇＧ＋Ｍ（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリーズ，米国）に対するポリクローナル抗血清でコートしたマイクロタイタープレート中に固定した。その後，このウェルをＰＢＳ１％ＢＳＡ中の異なる組換えＳＣＣ抗原（ＳＣＣＡ１，ＳＣＣＡ２，ＳＣＣＡ１／Ａ２及びＳＣＣＡ２／Ａ１融合蛋白質）５０μｌと１時間インキュベートし，洗浄後，プレートをＰＢＳ−１％ＢＳＡで１／５０００に希釈した１００μｌのウサギ抗ＳＣＣとインキュベートした後，さらに１時間インキュベートした。その後，この結合したウサギ抗ＳＣＣを，ＨＲＰ−ブタ抗ウサギＩｇとインキュベートすることにより検出し，ＯＰＤ基質及び４５０ｎｍでのＯＤ測定により視覚化した。
【００２４】
図４に，選択されたハイブリドーマの反応性が示されている。これらは下記の表１からも明白である。
【００２５】
【表１】
2006516114.tif 000003
【００２６】
２．３  遊離の及び複合体結合ＳＣＣＡを識別するモノクローナル抗体の選択
ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体に露出したエピトープと反応するＭａｂ並びにセルピン−プロテアーゼ複合体中に隠れたエピトープと反応するＭａｂを，ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体への及び遊離ＳＣＣＡへの結合の測定により選択した。
【００２７】
２．３．１  ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体の確立
ＳＣＣＡの標的プロテアーゼへの結合を，２μｇのＳＣＣＡ−タンパク質と１ｘＰＢＳ緩衝液中の０．５μｇのカテプシンＧ（バイオデザイン  インターナショナル(Biodesign Int.)）または０．５μｇの０．９μｇカテプシンＬ（カルビオケム(Calbiochem)）（総量４．５μｌ）との混合により行った。試料を３０分間３７°Ｃでインキュベートした。各試料に，０．５μｌの１０ｘ複合体−緩衝液（２０％のＳＤＳ，１４０ｍＭのメルカプトエタノール，ブロモフェノールブルー）を添加した。試料を９５℃で３分間インキュベートし，１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【００２８】
複合体結合の反応性は，下記の表２と図５から明白である。
【００２９】
２．３．２  ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体との反応性
ＳＣＣＡ１とカテプシンＬ，及びＳＣＣＡ２とカテプシンＧの間の複合体形成に影響を与えなかったエピトープを認識したＭＡｂは，それぞれＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のエキソン２〜７内にあるエピトープを認識する抗体のプレインキュベーション，及びその後の上記のようなＥＬＩＳＡアッセーにおける複合体形成の測定により検出された。
【００３０】
ＳＣＣＡ１とカテプシンＬ，そしてＳＣＣＡ２及びカテプシンＧとの複合体形成を阻害する能力に基づいて，多くの抗体がセルピンと標的プロテアーゼの間の複合体形成によって影響を受けないエピトープを認識することが推定された。抗体のセルピン−プロテアーゼとの反応性は，図５及び下記の表２に示される。
【００３１】
【表２】
2006516114.tif 000004
【００３２】
エキソン８に位置するエピトープと反応した２．３．１に記載された抗体は，それぞれのセルピンとそのプロテアーゼの間の複合体形成を阻害した。これらの抗体が「隠れた」エピトープを認識したことが推定され得る。
【００３３】
「遊離」ＳＣＣＡへの複合化は，下記の表３及び図６に示される。
【００３４】
【表３】
2006516114.tif 000005
【００３５】
２．３．３  確立したＭＡｂの反応性のまとめ
異なる形態のＳＣＣＡに対する確立したモノクローナル抗体の反応性を，表４にまとめる。
【００３６】
【表４】
2006516114.tif 000006
グループＡ１ｂ及びＡ３ｂは好ましくは「遊離」ＳＣＣと反応する。グループＣ１ａ及びＣ２ａは「総ＳＣＣＡ２」を認識し，グループＣ１ｂ及びＣ２ｂは，「遊離のＳＣＣＡ２」のみを認識する。
【００３７】
２．４  識別性モノクローナル抗体の生産
ローラーボトルに，ＤＭＥＭ中の１０４細胞／ｍｌ，５％のウシ胎仔血清を接種することによるハイブリドーマ・クローンのインビトロ(in vitro)培養によりモノクローナル抗体を生産し，１０〜１４日間生長させた。その後，モノクローナル抗体を，メーカー推薦によるプロテイン(Protein)Ａ（バイオプロセシング  リミテッド(Bioprocessing Ltd)，ダラム，英国）アフィニティクロマトグラフィーにより培地から精製した。
【００３８】
実施例３
イムノアッセーの確立
確立したモノクローナル抗体及び組換えタンパク質を使用して，総ＳＣＣＡ及び総「遊離」ＳＣＣＡの特異的測定のためのイムノアッセー，総ＳＣＣＡ１及び「遊離」ＳＣＣＡ１に特異的なアッセー，並びに総ＳＣＣＡ２及び「遊離」ＳＣＣＡ２に特異的な測定のためのアッセーを開発することができた。
【００３９】
３．１．  総ＳＣＣＡ測定用イムノアッセー
３．１．１．  総「ＳＣＣＡ」測定用イムノアッセー
ＳＣＣＡ，即ち「遊離」ＳＣＣＡ１，「遊離」ＳＣＣＡ２，複合化ＳＣＣＡ１及び複合化ＳＣＣＡ２の合計に特異的なアッセーを，Ａ１ａの中の抗体（表１）をグループＡ２あるいはＡ３ａからの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。
【００４０】
好ましい構成では，抗体ＳＣＣ１１３を捕獲(catching)抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００４１】
ＳＣＣ１１３  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー(Sigma Chemical Co)，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ(Nakone)法の変形によりＨＲＰと結合した。
【００４２】
ビオチニル化されたＳＣＣ１１３  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，下記のプロトコルによるワンステップＥＩＡに使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣＡ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜５０μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）２５μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣ１１３  ＭＡｂ，１μｇ／ｍｌ及びＨＲＰＳＣＣ１０７，１μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア(Labsystems Oy)，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
４．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー(ELISA Technology)，米国）を添加する。
５．３０分間±５分間インキュベートする。
６．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００４３】
遊離の及び複合体のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２抗原の用量応答曲線は，この分析がＳＣＣＡの全ての形態を認識することを明らかにした。
【００４４】
３．２．  ＳＣＣＡ１の特異的な測定のための分析
３．２．１  総ＳＣＣＡ１の分析
総ＳＣＣＡ１，即ち遊離の及び複合体のＳＣＣＡ１に特異的で，ＳＣＣＡ２との反応性が実質的にない分析を，グループＢ１の抗体をグループＡ１ａ，Ａ２あるいはＡ３ａからの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣ１１０  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００４５】
ＳＣＣ１１１  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。
【００４６】
ビオチニル化されたＳＣＣ１１１  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチンＳＣＣ１１１ＭＡｂ２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴｗｅｅｎ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサテクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００４７】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．２．１による分析が，ＳＣＣＡ１の全ての型をＳＣＣＡ２について５％未満の交差反応性で認識するという結論に達した。
【００４８】
３．２．２「遊離」ＳＣＣＡ１の分析
「遊離」ＳＣＣＡ１に特異的な分析，即ち非複合化ＳＣＣＡ１に特異的で，複合体ＳＣＣＡ１やＳＣＣＡ２との反応性が実質的にない分析を，グループＢ２の抗体をグループＡ１ａの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣＫ１３４  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００４９】
ＳＣＣＫ１３４  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはＨＲＰでナコネ方法の修正によって，ＨＲＰタイプＶ（シグマケミカル  カンパニー，米国）と結合した。
【００５０】
ビオチニル化されたＳＣＣＫ１３４  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１． ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ  ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣＫ１３４ＭＡｂ２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５１】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．２．２による分析が，遊離のＳＣＣＡ１のみを複合体ＳＣＣＡ１あるいはＳＣＣＡ２について５％未満の交差反応性で認識するという結論に達した。
【００５２】
３．３．  ＳＣＣＡ２に特異的な測定のための分析
３．３．１  総ＳＣＣＡ２の測定のための分析
総ＳＣＣＡ２，即ち遊離及び複合体ＳＣＣＡ２に特異的で，ＳＣＣＡ１との反応性が実質的にない分析を，グループＣ１ａまたはＣ２ａの抗体をグループＡ１ａの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣ１０３  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００５３】
ＳＣＣ１０３  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはＨＲＰでナコネ方法の修正によって，ＨＲＰタイプＶ（シグマケミカル  カンパニー，米国）と結合した。
【００５４】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０３  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣ１１３  ＭＡｂ，２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５５】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．３．１による分析が，ＳＣＣＡ２の全ての型をＳＣＣＡ１について５％未満の交差反応性で認識するこという結論に達した。
【００５６】
３．３．２  「遊離」ＳＣＣＡ２のための分析
「遊離」ＳＣＣＡ２，即ち複合体化していないＳＣＣＡ２に特異的で，ＳＣＣＡ２−プロテアーゼ複合体またはＳＣＣＡ１との反応性が実質的にない分析を，グループＣ２ｂの抗体をグループＡ１ａの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣ１０４  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００５７】
ＳＣＣ１０４  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはＨＲＰでナコネ方法の修正によって，ＨＲＰタイプＶ（シグマケミカル  カンパニー，米国）と結合した。
【００５８】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０４  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣ１０４ＭＡｂ２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５９】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．３．２による分析が，遊離のＳＣＣＡ２のみを複合体ＳＣＣＡ２あるいはＳＣＣＡ１について５％未満の交差反応性で認識するという結論に達した。
【００６０】
実施例４
「遊離」ＳＣＣＡを認識するイムノアッセーを使用する癌の診断
健康な個体，及び扁平上皮癌を有する患者におけるＳＣＣＡの異なる形態を測定するために，実施例３によるイムノアッセーを使用した。すべての分析は，予想通りに，健康な個体及び癌患者間の違いを示した。しかしながら，健常者と癌患者の識別比は，ＳＣＣＡ２を測定する分析でより高く，遊離のＳＣＣＡ１と複合体ＳＣＣＡ１間の，及びＳＣＣＡ２とＳＣＣＡ１間の比の測定によりさらに改良された。
【００６１】
正常値の上限を決定するために，ＳＣＣＡアイソフォームを５０人の献血者について，及び５０人の５０〜６５才の健常者において測定した。実施例３による分析において，ＳＣＣＡ  アイソフォームを，子宮頸癌と診察された女性の９４サンプルにおいて，及び扁平上皮肺癌を有する２０の個体において測定した。
【００６２】
実施例４．１
扁平上皮肺癌についての結果を図２に示す。ＳＣＣＡ１は１４人の患者で正常値の上限を超え，ＳＣＣＡ２は１８人の患者で正常値の上限を超えた。ＳＣＣＡ２のレベルは，ＳＣＣＡ１と比較してかなり高く，したがって健常者と悪性の疾病を有する個体の識別性を改善した。
【００６３】
実施例４．２子宮頸癌におけるＳＣＣＡ
子宮頸癌を有する女性からの前治療サンプル中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のレベルを，図７〜１０に示す。ＳＣＣＡ２はほとんどの場合，ＳＣＣＡ１と比べて高かった。これにより，健常者と子宮頸癌の患者との間の識別性は増加する。
【００６４】
実施例４．３子宮頸癌の治療モニタリングにおけるＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２
治療モニタリング中の６人の患者のＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２を，実施例３の分析を使用して測定した。ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のいずれも，疾病の治療過程にならい，４／４人の患者の疾病の臨床的な明示に先立って疾病の再発を検出した。しかしながら，患者においては，ＳＣＣＡ２の相対的増加はＳＣＣＡ１に比べて高く，疾病の再発の早期シグナルを提供する。ＮＥＤの患者では，ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方が治療後に正常になった。
【００６５】
疾病の再発は，治療後１８ヶ月の患者５３において検出された。再発は高いＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２によって示されるが，ＳＣＣＡ２はより早く応答し，ＳＣＣＡ１と比較して，再発の表示としてより高いレベルを示した。
【００６６】
患者２９では，再発が臨床的には治療後１６か月で検出され，治療後８か月にＳＣＣＡ２によって示された。これはＳＣＣＡ１より２〜３か月早い。
【００６７】
患者８３は，最初の治療後７か月に進行性の疾病を示した。ＳＣＣＡ２は正常値にならず，ＳＣＣＡ１は最初の治療後３ヶ月で正常値となり，進行している疾病の臨床診断の時に胃がわずかに上昇した。
【００６８】
１３か月後に患者７０に再発が臨床的に診断された。治療後５〜６か月の間にＳＣＣＡ２の増加が示された。ＳＣＣＡ１は治療後９か月にわずかに上昇し，その後は治療経過にならった。しかしながら，ＳＣＣＡ２は，臨床診断の５〜７か月前に，より明白に疾病の再発を示した。
【００６９】
治療後既に２ヶ月で，患者４８ではＳＣＣＡ２レベルは正常値とはならず，これは再発及び疾病の進行を示唆する。ＳＣＣＡ１は，増加する前，治療後５か月までは正常値の上限であった。
【００７０】
患者４５では治療の効果が得られた。また，疾病を示す証拠は治療後は見られなかった。これは，ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方において値が正常化され，正常範囲に保たれたことによって示された。
【００７１】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方とも，疾病の臨床の経過にならった。しかしながらＳＣＣＡ１と比較して，ＳＣＣＡ２は，疾病の再発に対して，より早期のより明らかな応答を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
図１  ヒトにおいて，２つの染色体クラスターのうちの１つにセルピンがマッピングされる。ＰＩ６，ＰＩ９及びＥＬＮＡＨ２は６ｐ２５にマッピングされ，ＰＩ８，ボマピン，ＰＡＩ２，ＳＣＣＡ１，ＳＣＣＡ２，ヘッドピン及びマスピンは１８ｑ２１．３にマッピングされる。
図２〜３は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の反応部位ループを示す。
図４は，ＳＣＣ  Ｍａｂの相対的反応性を示す。
図５は，複合体結合ＳＣＣ  Ｍａｂの相対的反応性を示す。
図６は，「遊離」ＳＣＣ  Ｍａｂの相対的反応性を示す。
図７は，限定された疾病，扁平上皮肺癌の２０個の試料中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は，各々ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の上限参考値を示す。
図８は，Ｉ期の子宮頸癌中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の上限参考値をそれぞれ示す。
図９は，ＩＩ期の子宮頸癌中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の上限参考値をそれぞれ示す。
図１０は，ＩＩＩ〜ＩＶ期の子宮頸癌中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は正常値の上限を示す。
【図１】
2006516114.tif 000007
【図２】
2006516114.tif 000008
【図３】
2006516114.tif 000009
【図４】
2006516114.tif 000010
【図５】
2006516114.tif 000011
【図６】
2006516114.tif 000012
【図７】
2006516114.tif 000013
【図８】
2006516114.tif 000014
【図９】
2006516114.tif 000015
【図１０】
2006516114.tif 000016
【配列表】
2006516114000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月29日(2004.12.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
総ＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体。
【請求項２】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ２を識別することができる癌の診断または癌の再発の検出のためのモノクローナル抗体。
【請求項３】
該抗体がハイブリドーマによって生産されたものである請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１及び２と本質的に同じ結合特異性を有するモノクローナル抗体，抗体フラグメント，組換え抗体，ｓｃＦｖまたはペプチド断片。
【請求項５】
総ＳＣＣＡ２の特異的測定のための請求項１〜３記載の抗体または他の結合構造をベースとするイムノアッセー。
【請求項６】
遊離ＳＣＣＡ２の特異的測定のための請求項１〜３記載の抗体または他の結合構造をベースとするイムノアッセー。
【請求項７】
請求項５〜６記載のイムノアッセーを使用する，癌の診断または癌の再発の検出のための方法。
【請求項８】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡとの比率を計算する請求項５記載の癌の診断方法。
【請求項９】
遊離ＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ１，複合体結合ＳＣＣＡ１及び／または遊離ＳＣＣＡ１との比率を計算する扁平上皮癌または癌の再発を診断する請求項７〜８記載の方法。
【請求項１０】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮癌を診断する方法。
【請求項１１】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮子宮頸癌を診断する方法。
【請求項１２】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮肺癌を診断する方法。
【請求項１３】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮子宮癌を診断する方法。
【請求項１４】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮食道癌を診断する方法。
【請求項１５】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮頭部及び頸部癌を診断する方法。
【請求項１６】
請求項７〜９記載のいずれかのイムノアッセー及び計算を使用して，扁平上皮外陰癌を診断する方法。
【請求項１７】
総ＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体を含む、癌を診断するか，癌の再発を検出するためのキット。
【請求項１８】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体を含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するための請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
遊離のＳＣＣＡ２と総ＳＣＣＡ２を識別することができるモノクローナル抗体を認識するハイブリドーマを含む，癌を診断するか，癌の再発を検出するための請求項１７〜１８記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＳＣＣＡの異なるアイソフォームの特異的な測定，並びに該異なるアイソフォームの血清学的濃度及びそれらの比率の癌の診断の手段としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）は，子宮，頚部，肺，頭部，頸部，外陰及び食道の扁平上皮癌（ＳＣＣ）のための血清学的マーカーである（１，２）。これは，最初は，７０年代の終わりに，カトウ(Kato)と同僚によって，ヒト頚部の扁平上皮癌からのＴＡ−４複合体から４２〜４８ｋＤａの分子量で精製された（１，３）。ＴＡ−４複合体の電気泳動は１０を超えるフラクションを明らかにした。また，抗原の等電点電気泳動法は２つのサブフラクション，酸性（ｐＩ＜６．２５）及び中性（ｐＩ≧６．２５）アイソフォームを示唆した（４）。
【０００３】
ＳＣＣＡのｃＤＮＡのクローニングは，それがセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）ファミリーに属していることを示す（６）。染色体１８ｑ２１．３上のゲノム領域のさらなるクローニングにより，２つのタンデムに配列した遺伝子が明らかになった（７）。より末端側の，最初のＳＣＣＡをＳＣＣＡ１と命名し，より中心のものをＳＣＣＡ２と命名した（図１）。それらはいずれも８つのエキソンを含んでおり，推定上のイントロンエキソン境界，スプライス部位，開始コドン及び終止コドンは同一である。それらは，ヌクレオチド・レベルで９８％，アミノ酸レベルで９２％の同一性を有する。ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２遺伝生成物の推定されたｐＩ値は，中性のアイソフォームがＳＣＣＡ１によりコードされ，酸性のアイソフォームがＳＣＣＡ２によってコードされることを示す。
【０００４】
ヒトでは，セルピンは二つの染色体クラスターのうちの１つにマッピングされる。ＰＩ６，ＰＩ９及びＥＬＮＡＨ２は６ｐ２５にマッピングされる。しかし，ＰＩ８，ボマピン(Bomapin)，ＰＡＩ２，ＳＣＣＡ１，ＳＣＣＡ２，ヘッドピン(Headpin)及びマスピン(Maspin)は，１８ｑ２１．３にマッピングされる（図１）（７−１２）。これらのクラスターは，２つの独立した染色体間重複及び染色体間重複の数回の繰り返しによって発生したと推定されている（９）。染色体領域１８ｑは，再配列の高頻度の領域としてしばしば報告されてきた（９，１３−１６）。セルピンの標的及び機能は完全には理解されていない。大部分については，主な機能は，凝析，繊維素溶解反応，アポトーシス及び炎症に関連した蛋白質分解を生ずる事象の調整である。しかし，ホルモン輸送及び血圧調整のような別の機能も報告されている（１７−２４）。
【０００５】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２はほとんど同一であるが，それらは反応部位ループが異なる（図２及び図３）。ＳＣＣＡ１はパパイン様のシステイン・プロテイナーゼ・カテプシンＳ，Ｋ及びＬを阻害し（２５，２６），ＳＣＣＡ２はキモトリプシン様のセリン・プロテイナーゼ・カテプシンＧ及び肥満細胞キマーゼを阻害する（２７）。ＳＣＣＡ１の反応部位ループ（ＲＳＬ）に関する研究は，ＲＳＬがシステイン・プロテイナーゼ阻害にとって不可欠なことを示す（２８）。ＲＳＬの可変部分は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２のＲＳＬ交換突然変異体及び単一の突然変異体によって示された標的プロテイナーゼの特異性を規定する（２８，２９）。セリン及びシステイン・プロテイナーゼの両方を阻害するために，セルピンが共通のＲＳＬ依存のメカニズムを利用すると考えられる。
【０００６】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の生物学的役割は完全には理解されない。それらは抑制性セルピンであると考えられる。データは，ＳＣＣＡがアポトーシスに関与し，発現が，アポトーシスの阻害によって癌細胞をいくつかの殺傷メカニズムに対して耐性にすることを示唆する（３０）。
【０００７】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２は，正常な扁平上皮細胞の細胞質で検出される（３１，３３）。患者の血清に現われる抗原が，腫瘍細胞によるＳＣＣＡの生産過剰及びそれらの正常なターンオーバーと相関関係があり得る（３４）。抗体の放射線免疫学分析あるいはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用により，血清中に検出されたＳＣＣＡが，主にＳＣＣＡ２であることが報告されたが（１，３５，３６），ＰＣＲを使用する他の研究は，患者の試料中で両方の抗原が増幅され，検出されることを示す（３７）。
【０００８】
ＳＣＣの患者中の血清濃度は，臨床の段階，及び腫瘍の組織学的分化の程度に関連づけられる（１）。子宮頸癌については，いくつかの研究が，この前処理値と臨床の結果の間の相関を示す（１，３８−４３）。研究はさらに，高いＳＣＣＡレベルと腫瘍の大きさの間の相関を示す。臨床の証拠の数か月前に再発または進行性の疾病を検出することができるかもしれない（３９）。同様の結果は，肺，外陰，頭部及び頸部，及び食道の扁平上皮癌にも見られる（１，２，４４，４５）。これらのすべての研究において，総ＳＣＣＡ値を測定した。
【０００９】
ＳＣＣＡはセルピンファミリーに属し，組織と循環で異なる形態のセルピンが検出されると考えられる。セルピンの一般的な機能は異なる蛋白分解酵素の活性を調節することであり，組織と血清中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２は「遊離」セルピンとして，及びそれらの標的プロテアーゼとの複合体として生じるかもしれないことが推測され得る。これは，血清中で主にセルピンα１−アンチキモトリプシンとの複合体として見出されるセリンプロテアーゼＰＳＡに似ているであろう。ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の特異的な測定，並びにそれぞれ「遊離」及び各セルピンの複合体型も，「総」ＳＣＣＡとの比較で付加的な臨床の情報を提供し得る。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２，並びに各セルピンの「遊離」また「合計の」量を識別することのできるモノクローナル抗体の確立を開示する。さらに，本発明は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２セルピンの「遊離」及び「総」量の測定のためのイムノアッセーの設計のための確立された識別性抗体，並びに癌の診断及び疾病の再発の検出のための該イムノアッセーの使用を記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２のエピトープに対するモノクローナル抗体，並びにＳＣＣＡのセリンプロテアーゼ複合体中の露出した及び隠れたＰａｎ  ＳＣＣＡの確立は，ＳＣＣＡのそれぞれの形態を測定するための特定のイムノアッセーを設計することを可能にした。さらに，特定のイムノアッセーを使用する癌の診断方法が本発明に開示されている。
【００１２】
実施例１
組換えＳＣＣＡの生産
１．１  ＳＣＣＡのクローニング
細胞系Ｃａｓｋｉ（頚部），Ｃ−４１（頚部），Ａ５４９（肺）及びＲＰＭＩ２６５０（いん頭）からのｍＲＮＡを，クイックプレップマイクロ(Quick Prep Micro)ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア(Pharmacia)）を使用して調製し，ｃＤＮＡを，ファーストストランド(First Strand)ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア）を使用して調製した。ＳＣＣＡのコード配列をカバーする１２１８ｂｐ  ＤＮＡ断片を，１０ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ  ８．８５，２５ｍＭのＫＣｌ，５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｍＭのＭｇＳＯ４（ボエリンガー(Boehringer)），０．２ｍＭのｄＮＴＰ（ファルマシア），１０μＭのＳＣＣＡ  １〜７Ｆ（すべてのプライマーのＤＮＡ配列は表１に示されている），１０μＭのＳＣＣＡ  ３９１〜３９７Ｂ，２μｌのｃＤＮＡ及び２．５ＵのＰｗｏポリメラーゼ（ボエリンガー）を含有する１００μｌの反応液中，ＰＣＲで増幅した。試料を９６℃で５分間変性した後，各々９６℃で１５秒の変性，６０℃で１５秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長からなるサイクル合計３０サイクルを実施した。ＰＣＲ反応は７２℃で１０分間の最終伸長によって終了した。
【００１３】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の検出
ＰＣＲ生成物中のＳＣＣＡ１の存在を，それぞれ２４５及び９７３ｂｐの２個の断片を生じる制限酵素ＳａＣＩＩによる開裂によって，または標準のＰＣＲ反応液（７５ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８．８，２０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．０１％のＴｗｅｅｎ２０，２ｍＭのＭｇＣｌ２，０．２ｍＭのｄＮＴＰ，各プライマー１０μＭ，鋳型，及び０．０２５Ｕ／μｌの反応Ｔａｑポリメラーゼ）中でプライマーＳＣＣＡ１〜７Ｆ及びＳＣＣＡ１  ３２３〜３２９Ｂを用いたＳＣＣＡ１特異的ＰＣＲ（試料を９６℃で５分間変性した後，各々９６℃で１５秒の変性，最適アニーリング温度で１５秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長からなる合計３０のサイクルを実施した。ＰＣＲ反応は７２℃で１０分間の最終伸長によって終了した）により検出した。Ｔａ＝５０℃。９９７ｂｐ断片を得た。ＳＣＣＡ２の存在を，ＳＣＣＡ１〜７Ｆ及びＳＣＣＡ２特異的プライマー（ＳＣＣＡ２  ３５７〜３６３Ｂ）を使用する標準のＰＣＲによって検出した。Ｔａ＝６０℃。１０９０ｂｐ断片が得られた。
【００１４】
クローニング
ＰＣＲ生成物をＰＣＲ−スクリプトＡｍｐクローニング・キット（ストラタジーン(Stratagene)）を使用してクローニングした。コロニースクリーニングは１．２に記載されたようなＰＣＲによって実行した。プラスミドＤＮＡは，ウィザードプラスミニプレップ(Wizard Plus Minipreps)ＤＮＡ精製システム（プロメガ(Promega)）を使用して，ＳＣＣＡ１あるいはＳＣＣＡ２を含む選択されたクローンから調製した。
【００１５】
ＤＮＡシーケンシング
クローンをＡＢＩプリズムビッグダイターミネーターサイクルシーケンシング(Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing) （ピーイー・バイオシステムズ(PE Biosystems))を使用してシーケンシングした。試料をＡＢＩプリズム３１０上で処理した。
【００１６】
再クローニング
選択されたクローンを，発現ベクトルｐＧＥＸ−６Ｐ−３（ファルマシア）に再クローニングした。断片をＰＣＲ−スクリプトＡｍｐベクターからＢａｍＨＩとＸｈｏＩを使用して切り出し，１ｘＯＰＡ，１ｍＭのＡＴＰ，５０ナノグラムの開裂ベクター，モル−エンドベクター：挿入物比１：５〜１：８に相当するＳＣＣＡ挿入物及び７．５〜１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（全てファルマシア製）を含有する１０μｌの反応液中で発現ベクトルに結合した。反応管を１０℃で一晩インキュベートし，６５℃で１０分間不活性化した。反応物の２〜４μｌで大腸菌ＪＭ１０９（４６）を形質転換した。その後，選択されたクローンからのプラスミド−ＤＮＡでタンパク質発現用の大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。
【００１７】
クローニングされた遺伝子の維持
１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中のプラスミドＤＮＡ（ＳＣＣＡ１／Ａ２融合遺伝子を含んでいるｐＧＥＸ−６Ｐ−３）を−８０℃で貯蔵する。タンパク質発現の再開のために，サムブルック(Sambrook)等（引用文献４６の１．８２〜１．８４頁）によりコンピテント大腸菌ＢＬ２１をプラスミドＤＮＡで形質転換する。より多くのプラスミドＤＮＡの調製には，大腸菌ＪＭ１０９の形質転換が好ましい。
【００１８】
１．１．２  タンパク質の発現及び精製
タンパク質の発現
発現条件は小規模調製によって決定した。大規模発現については，５００ｍｌの２ｘＹＴ培養液及び１００μｇのアンピシリン／ｍｌに５ｍｌの一晩培養液を接種し，３７℃で培養した。タンパク質発現はＩＰＴＧを加えて０．１ｍＭの最終濃度とすることによりＯＤ６００＝０．５〜１．３で誘導された。
【００１９】
タンパク質の精製
細胞を２０００ｇ，１０分間の遠心分離によって採取し，５０ｍｌのＴＥ，ｐＨ  ８．０で洗浄し，３ｍｌＴＥ／ｇの細菌ペレットに溶解した。リゾチームを最終濃度８００μｇ／ｇペレットで添加し，この混合物を３０〜６０分間氷上でインキュベートし，その後，−７０℃で一晩凍結した。塩化マグネシウム及びデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)を，各々１２ｍＭ及び２０μｇ／ｇペレットの最終濃度で添加した。３０分間の氷上インキュベーションの後，試料を４００００ｇで３０分間遠心分離した。各上清に５０％グルタチオンセファロース（ファルマシア）０．５ｍｌを添加し，穏やかに撹拌しながら室温で３０分間〜２時間インキュベートした。このスラリーを，ｌｘＰＢＳを使用して，５〜７回洗浄した。ＧＳＴ−ＳＣＣＡ融合蛋白質を，０．５〜１ｍｌの還元グルタチオン（ファルマシア）を使用して溶出し，室温で３０〜６０分間，４℃で一晩，穏やかに撹拌しながらインキュベートした。ＳＣＣＡタンパク質は，ＧＳＴとＳＣＣＡの間の開裂によって溶出した。０．４８ｍｌの開裂バッファー（５０ｍＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ  ７．０，１５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ）及び２０μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを添加し，試料を４時間または一晩４℃で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。タンパク質をファスト(Phast)システム（ファルマシア）によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【００２０】
実施例２
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の確立
２．１  免疫感作及び抗ＳＣＣＡハイブリドーマの一次選択
ＳＣＣ抗原と反応性のポリクローナル抗血清を，組換えＳＣＣ抗原によるウサギの皮下免疫，及び標準の方法による免疫血清の採取により得た。ポリクローナル抗血清の力価は，抗血清のストレプトアビジンプレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）中に固定したビオチニル化されたＳＣＣＡ２及びＳＣＣＡ１との反応性の測定により試験した。組換えＳＣＣＡ２及びＳＣＣＡ１は，標準の方法によるビオチンＮ−スクシンイミドカプロン酸塩エステルでビオチニル化した。
【００２１】
ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２と反応性のモノクローナル抗体を，リビ(Ribi)アジュバント中の組換えＳＣＣＡ１０〜５０μｇでＢａｌｂ／ｃマウスを腹腔内免疫感作することにより得た。免疫感作後，６０〜９０日間，２〜４ブースター投与の後，免疫になったマウスからの脾臓細胞を記載したようにＰ３ｘ６３Ａｇ８ミエローマ細胞と融合した。
【００２２】
ＳＣＣＡ１及び／またはＳＣＣＡ２と反応するハイブリドーマ産生抗体を，アフィニティ精製したマウスＩｇＧ＋Ｍ（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリーズ(Jackson Immuno Res Lab)，米国）に対するポリクローナル抗血清をコートしたマイクロタイターウェル中でのハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡスクリーニングによって選択した。その後，ウェルをＳＣＣＡ抗原とインキュベートし，洗浄した後，結合した抗原をポリクローナルウサギ抗ＳＣＣ及びＨＲＰで標識したブタ抗ウサギＩｇ（ダコ  エイエス(Dako AS)，コペンハーゲン，デンマーク）とのインキュベーションによって検出した。
【００２３】
２．２  選択されたハイブリドーマとＳＣＣ抗原との反応性
確立したハイブリドーマの反応性をスクリーニング法と同様のＥＬＩＳＡで試験を行った。簡潔に記載すると，ハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体を，マウスＩｇＧ＋Ｍ（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリーズ，米国）に対するポリクローナル抗血清でコートしたマイクロタイタープレート中に固定した。その後，このウェルをＰＢＳ１％ＢＳＡ中の異なる組換えＳＣＣ抗原（ＳＣＣＡ１，ＳＣＣＡ２，ＳＣＣＡ１／Ａ２及びＳＣＣＡ２／Ａ１融合蛋白質）５０μｌと１時間インキュベートし，洗浄後，プレートをＰＢＳ−１％ＢＳＡで１／５０００に希釈した１００μｌのウサギ抗ＳＣＣとインキュベートした後，さらに１時間インキュベートした。その後，この結合したウサギ抗ＳＣＣを，ＨＲＰ−ブタ抗ウサギＩｇとインキュベートすることにより検出し，ＯＰＤ基質及び４５０ｎｍでのＯＤ測定により視覚化した。
【００２４】
図４に，選択されたハイブリドーマの反応性が示されている。これらは下記の表１からも明白である。
【００２５】
【表１】
2006516114.tif 000017
【００２６】
２．３  遊離の及び複合体結合ＳＣＣＡを識別するモノクローナル抗体の選択
ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体に露出したエピトープと反応するＭａｂ並びにセルピン−プロテアーゼ複合体中に隠れたエピトープと反応するＭａｂを，ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体への及び遊離ＳＣＣＡへの結合の測定により選択した。
【００２７】
２．３．１  ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体の確立
ＳＣＣＡの標的プロテアーゼへの結合を，２μｇのＳＣＣＡ−タンパク質と１ｘＰＢＳ緩衝液中の０．５μｇのカテプシンＧ（バイオデザイン  インターナショナル(Biodesign Int.)）または０．５μｇの０．９μｇカテプシンＬ（カルビオケム(Calbiochem)）（総量４．５μｌ）との混合により行った。試料を３０分間３７°Ｃでインキュベートした。各試料に，０．５μｌの１０ｘ複合体−緩衝液（２０％のＳＤＳ，１４０ｍＭのメルカプトエタノール，ブロモフェノールブルー）を添加した。試料を９５℃で３分間インキュベートし，１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
【００２８】
複合体結合の反応性は，下記の表２と図５から明白である。
【００２９】
２．３．２  ＳＣＣＡ−プロテアーゼ複合体との反応性
ＳＣＣＡ１とカテプシンＬ，及びＳＣＣＡ２とカテプシンＧの間の複合体形成に影響を与えなかったエピトープを認識したＭＡｂは，それぞれＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のエキソン２〜７内にあるエピトープを認識する抗体のプレインキュベーション，及びその後の上記のようなＥＬＩＳＡアッセーにおける複合体形成の測定により検出された。
【００３０】
ＳＣＣＡ１とカテプシンＬ，そしてＳＣＣＡ２及びカテプシンＧとの複合体形成を阻害する能力に基づいて，多くの抗体がセルピンと標的プロテアーゼの間の複合体形成によって影響を受けないエピトープを認識することが推定された。抗体のセルピン−プロテアーゼとの反応性は，図５及び下記の表２に示される。
【００３１】
【表２】
2006516114.tif 000018
【００３２】
エキソン８に位置するエピトープと反応した２．３．１に記載された抗体は，それぞれのセルピンとそのプロテアーゼの間の複合体形成を阻害した。これらの抗体が「隠れた」エピトープを認識したことが推定され得る。
【００３３】
「遊離」ＳＣＣＡへの複合化は，下記の表３及び図６に示される。
【００３４】
【表３】
2006516114.tif 000019
【００３５】
２．３．３  確立したＭＡｂの反応性のまとめ
異なる形態のＳＣＣＡに対する確立したモノクローナル抗体の反応性を，表４にまとめる。
【００３６】
【表４】
2006516114.tif 000020
グループＡ１ｂ及びＡ３ｂは好ましくは「遊離」ＳＣＣと反応する。グループＣ１ａ及びＣ２ａは「総ＳＣＣＡ２」を認識し，グループＣ１ｂ及びＣ２ｂは，「遊離のＳＣＣＡ２」のみを認識する。
【００３７】
２．４  識別性モノクローナル抗体の生産
ローラーボトルに，ＤＭＥＭ中の１０４細胞／ｍｌ，５％のウシ胎仔血清を接種することによるハイブリドーマ・クローンのインビトロ(in vitro)培養によりモノクローナル抗体を生産し，１０〜１４日間生長させた。その後，モノクローナル抗体を，メーカー推薦によるプロテイン(Protein)Ａ（バイオプロセシング  リミテッド(Bioprocessing Ltd)，ダラム，英国）アフィニティクロマトグラフィーにより培地から精製した。
【００３８】
実施例３
イムノアッセーの確立
確立したモノクローナル抗体及び組換えタンパク質を使用して，総ＳＣＣＡ及び総「遊離」ＳＣＣＡの特異的測定のためのイムノアッセー，総ＳＣＣＡ１及び「遊離」ＳＣＣＡ１に特異的なアッセー，並びに総ＳＣＣＡ２及び「遊離」ＳＣＣＡ２に特異的な測定のためのアッセーを開発することができた。
【００３９】
３．１．  総ＳＣＣＡ測定用イムノアッセー
３．１．１．  総「ＳＣＣＡ」測定用イムノアッセー
ＳＣＣＡ，即ち「遊離」ＳＣＣＡ１，「遊離」ＳＣＣＡ２，複合化ＳＣＣＡ１及び複合化ＳＣＣＡ２の合計に特異的なアッセーを，Ａ１ａの中の抗体（表１）をグループＡ２あるいはＡ３ａからの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。
【００４０】
好ましい構成では，抗体ＳＣＣ１１３を捕獲(catching)抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００４１】
ＳＣＣ１１３  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー(Sigma Chemical Co)，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ(Nakone)法の変形によりＨＲＰと結合した。
【００４２】
ビオチニル化されたＳＣＣ１１３  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，下記のプロトコルによるワンステップＥＩＡに使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣＡ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜５０μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）２５μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣ１１３  ＭＡｂ，１μｇ／ｍｌ及びＨＲＰＳＣＣ１０７，１μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア(Labsystems Oy)，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
４．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー(ELISA Technology)，米国）を添加する。
５．３０分間±５分間インキュベートする。
６．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００４３】
遊離の及び複合体のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２抗原の用量応答曲線は，この分析がＳＣＣＡの全ての形態を認識することを明らかにした。
【００４４】
３．２．  ＳＣＣＡ１の特異的な測定のための分析
３．２．１  総ＳＣＣＡ１の分析
総ＳＣＣＡ１，即ち遊離の及び複合体のＳＣＣＡ１に特異的で，ＳＣＣＡ２との反応性が実質的にない分析を，グループＢ１の抗体をグループＡ１ａ，Ａ２あるいはＡ３ａからの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣ１１０  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００４５】
ＳＣＣ１１１  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。
【００４６】
ビオチニル化されたＳＣＣ１１１  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチンＳＣＣ１１１ＭＡｂ２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴｗｅｅｎ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサテクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００４７】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．２．１による分析が，ＳＣＣＡ１の全ての型をＳＣＣＡ２について５％未満の交差反応性で認識するという結論に達した。
【００４８】
３．２．２「遊離」ＳＣＣＡ１の分析
「遊離」ＳＣＣＡ１に特異的な分析，即ち非複合化ＳＣＣＡ１に特異的で，複合体ＳＣＣＡ１やＳＣＣＡ２との反応性が実質的にない分析を，グループＢ２の抗体をグループＡ１ａの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣＫ１３４  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００４９】
ＳＣＣＫ１３４  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはＨＲＰでナコネ方法の修正によって，ＨＲＰタイプＶ（シグマケミカル  カンパニー，米国）と結合した。
【００５０】
ビオチニル化されたＳＣＣＫ１３４  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１． ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ  ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣＫ１３４ＭＡｂ２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５１】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．２．２による分析が，遊離のＳＣＣＡ１のみを複合体ＳＣＣＡ１あるいはＳＣＣＡ２について５％未満の交差反応性で認識するという結論に達した。
【００５２】
３．３．  ＳＣＣＡ２に特異的な測定のための分析
３．３．１  総ＳＣＣＡ２の測定のための分析
総ＳＣＣＡ２，即ち遊離及び複合体ＳＣＣＡ２に特異的で，ＳＣＣＡ１との反応性が実質的にない分析を，グループＣ１ａまたはＣ２ａの抗体をグループＡ１ａの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣ１０３  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００５３】
ＳＣＣ１０３  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはＨＲＰでナコネ方法の修正によって，ＨＲＰタイプＶ（シグマケミカル  カンパニー，米国）と結合した。
【００５４】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０３  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣ１１３  ＭＡｂ，２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５５】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．３．１による分析が，ＳＣＣＡ２の全ての型をＳＣＣＡ１について５％未満の交差反応性で認識するこという結論に達した。
【００５６】
３．３．２  「遊離」ＳＣＣＡ２のための分析
「遊離」ＳＣＣＡ２，即ち複合体化していないＳＣＣＡ２に特異的で，ＳＣＣＡ２−プロテアーゼ複合体またはＳＣＣＡ１との反応性が実質的にない分析を，グループＣ２ｂの抗体をグループＡ１ａの抗体と組み合わせて使用することにより設計した。好ましい構成では，ＳＣＣ１０４  ＭＡｂを捕獲抗体として，ＳＣＣ１０７を検出抗体として使用した。
【００５７】
ＳＣＣ１０４  ＭＡｂを，ビオチンＮＨＲＳカプロン酸塩エステル（シグマケミカル  カンパニー，米国）で標準の方法を使用してビオチニル化し，捕獲抗体として使用した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂは，ナコネ法の変形によりＨＲＰと結合した。ＳＣＣ１０７  ＭＡｂはＨＲＰでナコネ方法の修正によって，ＨＲＰタイプＶ（シグマケミカル  カンパニー，米国）と結合した。
【００５８】
ビオチニル化されたＳＣＣ１０４  ＭＡｂ及びＨＲＰ結合ＳＣＣ１０７ＭＡｂを，下記のプロトコルによって２サイトＥＩＡで使用した。
分析方法：
１．ＳＣＣ組換え抗原（ＰＢＳ中０〜１００μｇ／ｌ，６０ｇ／ｌのＢＳＡ，ｐＨ７．２）５０μｌ＋アッセーバッファー中のビオチン  ＳＣＣ１０４ＭＡｂ２μｇ／ｍｌ１００μｌを，ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート（ラブシステムズ  オサケユキテュア，ヘルシンキ，フィンランド）に入れる。
２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
３．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で３回洗浄する。
４．分析バッファーに，１００μｌのＨＲＰ  ＳＣＣ１０７  ＭＡｂ  ２μｇ／ｍｌを加える。
５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
６．５ｍＭのトリス緩衝液，０．０５％のＴＷＥＥＮ４０，ｐＨ７．７５で６回洗浄する。
７．１００μｌのＴＭＢ（エリサ  テクノロジー，米国）を添加する。
８．３０分間±５分間インキュベートする。
９．ＥＬＩＳＡリーダでＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５９】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のための用量応答曲線に基づき，実施例３．３．２による分析が，遊離のＳＣＣＡ２のみを複合体ＳＣＣＡ２あるいはＳＣＣＡ１について５％未満の交差反応性で認識するという結論に達した。
【００６０】
実施例４
「遊離」ＳＣＣＡを認識するイムノアッセーを使用する癌の診断
健康な個体，及び扁平上皮癌を有する患者におけるＳＣＣＡの異なる形態を測定するために，実施例３によるイムノアッセーを使用した。すべての分析は，予想通りに，健康な個体及び癌患者間の違いを示した。しかしながら，健常者と癌患者の識別比は，ＳＣＣＡ２を測定する分析でより高く，遊離のＳＣＣＡ１と複合体ＳＣＣＡ１間の，及びＳＣＣＡ２とＳＣＣＡ１間の比の測定によりさらに改良された。
【００６１】
正常値の上限を決定するために，ＳＣＣＡアイソフォームを５０人の献血者について，及び５０人の５０〜６５才の健常者において測定した。実施例３による分析において，ＳＣＣＡ  アイソフォームを，子宮頸癌と診察された女性の９４サンプルにおいて，及び扁平上皮肺癌を有する２０の個体において測定した。
【００６２】
実施例４．１
扁平上皮肺癌についての結果を図２に示す。ＳＣＣＡ１は１４人の患者で正常値の上限を超え，ＳＣＣＡ２は１８人の患者で正常値の上限を超えた。ＳＣＣＡ２のレベルは，ＳＣＣＡ１と比較してかなり高く，したがって健常者と悪性の疾病を有する個体の識別性を改善した。
【００６３】
実施例４．２子宮頸癌におけるＳＣＣＡ
子宮頸癌を有する女性からの前治療サンプル中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のレベルを，図７〜１０に示す。ＳＣＣＡ２はほとんどの場合，ＳＣＣＡ１と比べて高かった。これにより，健常者と子宮頸癌の患者との間の識別性は増加する。
【００６４】
実施例４．３子宮頸癌の治療モニタリングにおけるＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２
治療モニタリング中の６人の患者のＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２を，実施例３の分析を使用して測定した。ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２のいずれも，疾病の治療過程にならい，４／４人の患者の疾病の臨床的な明示に先立って疾病の再発を検出した。しかしながら，患者においては，ＳＣＣＡ２の相対的増加はＳＣＣＡ１に比べて高く，疾病の再発の早期シグナルを提供する。ＮＥＤの患者では，ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方が治療後に正常になった。
【００６５】
疾病の再発は，治療後１８ヶ月の患者５３において検出された。再発は高いＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２によって示されるが，ＳＣＣＡ２はより早く応答し，ＳＣＣＡ１と比較して，再発の表示としてより高いレベルを示した。
【００６６】
患者２９では，再発が臨床的には治療後１６か月で検出され，治療後８か月にＳＣＣＡ２によって示された。これはＳＣＣＡ１より２〜３か月早い。
【００６７】
患者８３は，最初の治療後７か月に進行性の疾病を示した。ＳＣＣＡ２は正常値にならず，ＳＣＣＡ１は最初の治療後３ヶ月で正常値となり，進行している疾病の臨床診断の時に胃がわずかに上昇した。
【００６８】
１３か月後に患者７０に再発が臨床的に診断された。治療後５〜６か月の間にＳＣＣＡ２の増加が示された。ＳＣＣＡ１は治療後９か月にわずかに上昇し，その後は治療経過にならった。しかしながら，ＳＣＣＡ２は，臨床診断の５〜７か月前に，より明白に疾病の再発を示した。
【００６９】
治療後既に２ヶ月で，患者４８ではＳＣＣＡ２レベルは正常値とはならず，これは再発及び疾病の進行を示唆する。ＳＣＣＡ１は，増加する前，治療後５か月までは正常値の上限であった。
【００７０】
患者４５では治療の効果が得られた。また，疾病を示す証拠は治療後は見られなかった。これは，ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方において値が正常化され，正常範囲に保たれたことによって示された。
【００７１】
ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方とも，疾病の臨床の経過にならった。しかしながらＳＣＣＡ１と比較して，ＳＣＣＡ２は，疾病の再発に対して，より早期のより明らかな応答を提供した。
【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【図面の簡単な説明】
【００７８】
図１  ヒトにおいて，２つの染色体クラスターのうちの１つにセルピンがマッピングされる。ＰＩ６，ＰＩ９及びＥＬＮＡＨ２は６ｐ２５にマッピングされ，ＰＩ８，ボマピン，ＰＡＩ２，ＳＣＣＡ１，ＳＣＣＡ２，ヘッドピン及びマスピンは１８ｑ２１．３にマッピングされる。
図２〜３は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の反応部位ループを示す。
図４は，ＳＣＣ  Ｍａｂの相対的反応性を示す。
図５は，複合体結合ＳＣＣ  Ｍａｂの相対的反応性を示す。
図６は，「遊離」ＳＣＣ  Ｍａｂの相対的反応性を示す。
図７は，限定された疾病，扁平上皮肺癌の２０個の試料中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は，各々ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の上限参考値を示す。
図８は，Ｉ期の子宮頸癌中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の上限参考値をそれぞれ示す。
図９は，ＩＩ期の子宮頸癌中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は，ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の上限参考値をそれぞれ示す。
図１０は，ＩＩＩ〜ＩＶ期の子宮頸癌中のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２を示す。棒は正常値の上限を示す。
【国際調査報告】
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