(57)【要約】本発明は、プリオンタンパク質活性が１以上の遺伝子操作突然変異により低減されたクローン化トランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）を提供する。望ましくは、これらのトランスジェニックウシはまた、異種（例えばヒト）抗体を発現するように遺伝的に操作されている。かかるウシは、プリオン関連疾患、例えばウシ海綿状脳症（狂牛病としても知られる）に対して抵抗性を示すため、これらは医薬品用のヒト抗体の安全な供給源、及び農業製品の安全な供与源となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然の突然変異を含むウシ。
【請求項２】
突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を低減するものである、請求項１記載のウシ。
【請求項３】
突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を実質的に排除するものである、請求項２記載のウシ。
【請求項４】
突然変異がヘミ接合性である、請求項１記載のウシ。
【請求項５】
突然変異がホモ接合性である、請求項１記載のウシ。
【請求項６】
突然変異がプリオン核酸へのポジティブセレクションマーカーの挿入を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項７】
ポジティブセレクションマーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項６記載のウシ。
【請求項８】
ポジティブセレクションマーカーが異種プロモーターと機能的に連結されている、請求項６記載のウシ。
【請求項９】
各アレルが同じ抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項５記載のウシ。
【請求項１０】
各アレルが異なる抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項５記載のウシ。
【請求項１１】
突然変異がプリオン核酸へのＳＴＯＰコドンの挿入を含む、請求項５記載のウシ。
【請求項１２】
ＳＴＯＰコドンがプリオン核酸のエキソン３における最初のＡＴＣコドンの下流に挿入される、請求項１１記載のウシ。
【請求項１３】
ＳＴＯＰコドンが前記ＳＴＯＰコドンの１０ヌクレオチド以内に挿入される、請求項１０記載のウシ。
【請求項１４】
突然変異がプリオン核酸における１以上のヌクレオチドの欠失を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項１５】
突然変異がプリオン核酸における１以上のヌクレオチドの欠失を含まない、請求項１記載のウシ。
【請求項１６】
１以上のトランスジーンを含有し、該トランスジーンによりコードされるｍＲＮＡ又はタンパク質を発現する１以上の核酸を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項１７】
再配列を経て１を超える異種免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現する異種Ｉｇ遺伝子の全体又は一部を含有する１以上の核酸を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項１８】
異種抗体をコードする１以上の核酸を含む、請求項１６又は１７記載のウシ。
【請求項１９】
タンパク質又は異種抗体が別の属からの抗体である、請求項１８記載のウシ。
【請求項２０】
異種抗体がヒト抗体である、請求項１９記載のウシ。
【請求項２１】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項１８記載のウシ。
【請求項２２】
抗体が血清及び／又は乳汁中に発現される、請求項１８記載のウシ。
【請求項２３】
核酸が染色体断片内に含まれる、請求項１６又は１７記載のウシ。
【請求項２４】
染色体断片がΔＨＡＣである、請求項２３記載のウシ。
【請求項２５】
染色体断片がΔΔＨＡＣである、請求項２３記載のウシ。
【請求項２６】
核酸が宿主染色体から独立して維持される、請求項１６又は１７記載のウシ。
【請求項２７】
核酸が、Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、再配列されていない抗体軽鎖核酸セグメントを含む、請求項１７記載のウシ。
【請求項２８】
核酸が、（ｉ）Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＤ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、及び／又は（ｉｉ）Ｄ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、再配列されていない抗体重鎖核酸セグメントを含む、請求項１７記載のウシ。
【請求項２９】
内因性抗体の発現を低減する突然変異を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項３０】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を低減するものである、請求項２９記載のウシ。
【請求項３１】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を実質的に排除するものである、請求項３０記載のウシ。
【請求項３２】
突然変異が機能性Ｉｇ軽鎖の発現を低減するものである、請求項２９記載のウシ。
【請求項３３】
突然変異が機能性Ｉｇ軽鎖の発現を実質的に排除するものである、請求項３２記載のウシ。
【請求項３４】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖及び機能性Ｉｇ軽鎖の発現を低減するものである、請求項２９記載のウシ。
【請求項３５】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖及び機能性Ｉｇ軽鎖の発現を実質的に排除するものである、請求項３４記載のウシ。
【請求項３６】
α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項３７】
Ｊ鎖をコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項３８】
異種Ｊ鎖をコードする核酸を含む、請求項１記載のウシ。
【請求項３９】
Ｊ鎖がヒトＪ鎖である、請求項３８記載のウシ。
【請求項４０】
内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然の突然変異を含むウシ細胞。
【請求項４１】
突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を低減するものである、請求項４０記載の細胞。
【請求項４２】
突然変異が機能性プリオンタンパク質の発現を実質的に排除するものである、請求項４１記載の細胞。
【請求項４３】
突然変異がヘミ接合性である、請求項４０記載の細胞。
【請求項４４】
突然変異がホモ接合性である、請求項４０記載の細胞。
【請求項４５】
突然変異がプリオン核酸へのポジティブセレクションマーカーの挿入を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項４６】
ポジティブセレクションマーカーが抗生物質耐性遺伝子である、請求項４５記載の細胞。
【請求項４７】
ポジティブセレクションマーカーが異種プロモーターと機能的に連結されている、請求項４５記載の細胞。
【請求項４８】
各アレルが同じ抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項４４記載の細胞。
【請求項４９】
各アレルが異なる抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項４４記載の細胞。
【請求項５０】
突然変異がプリオン核酸へのＳＴＯＰコドンの挿入を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項５１】
ＳＴＯＰコドンがプリオン核酸のエキソン３における最初のＡＴＧコドンの下流に挿入される、請求項５０記載の細胞。
【請求項５２】
ＳＴＯＰコドンが前記ＳＴＯＰコドンの１０ヌクレオチド以内に挿入される、請求項５１記載の細胞。
【請求項５３】
突然変異がプリオン核酸における１以上のヌクレオチドの欠失を含まない、請求項４０記載の細胞。
【請求項５４】
突然変異がプリオン核酸における１以上のヌクレオチドの欠失を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項５５】
１以上のトランスジーンを含有し、該トランスジーンにより発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質を発現する１以上の核酸を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項５６】
Ｂ細胞において再配列を経て１を超える異種免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現可能な異種Ｉｇ遺伝子の全体又は一部を含有する１以上の核酸を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項５７】
異種抗体をコードする１以上の核酸を含む、請求項５５又は５６記載の細胞。
【請求項５８】
タンパク質又は異種抗体が別の属からの抗体である、請求項５７記載の細胞。
【請求項５９】
異種抗体がヒト抗体である、請求項５８記載の細胞。
【請求項６０】
抗体がポリクローナル抗体である、請求項５７記載の細胞。
【請求項６１】
抗体が血清及び／又は乳汁中に発現される、請求項５７記載の細胞。
【請求項６２】
核酸が染色体断片内に含まれる、請求項５５又は５６記載の細胞。
【請求項６３】
染色体断片がΔＨＡＣである、請求項６２記載の細胞。
【請求項６４】
染色体断片がΔΔＨＡＣである、請求項６２記載の細胞。
【請求項６５】
核酸が宿主染色体から独立して維持される、請求項５５又は５６記載の細胞。
【請求項６６】
核酸が、Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、再配列されていない抗体軽鎖核酸セグメントを含む、請求項５６記載の細胞。
【請求項６７】
核酸が、（ｉ）Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＤ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、及び／又は（ｉｉ）Ｄ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、再配列されていない抗体重鎖核酸セグメントを含む、請求項５６記載の細胞。
【請求項６８】
内因性抗体の発現を低減する突然変異を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項６９】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を低減するものである、請求項６８記載の細胞。
【請求項７０】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖の発現を実質的に排除するものである、請求項６９記載の細胞。
【請求項７１】
突然変異が機能性Ｉｇ軽鎖の発現を低減するものである、請求項６８記載の細胞。
【請求項７２】
突然変異が機能性Ｉｇ軽鎖の発現を実質的に排除するものである、請求項７１記載の細胞。
【請求項７３】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖及び機能性Ｉｇ軽鎖の発現を低減するものである、請求項６８記載の細胞。
【請求項７４】
突然変異が機能性ＩｇＭ重鎖及び機能性Ｉｇ軽鎖の発現を実質的に排除するものである、請求項７３記載の細胞。
【請求項７５】
α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項７６】
Ｊ鎖をコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項７７】
異種Ｊ鎖をコードする核酸を含む、請求項４０記載の細胞。
【請求項７８】
Ｊ鎖がヒトＪ鎖である、請求項７７記載の細胞。
【請求項７９】
核酸がウシ細胞において宿主染色体とは独立して維持される、請求項５５又は５６記載の細胞。
【請求項８０】
体細胞である、請求項４０記載の細胞。
【請求項８１】
胎仔線維芽細胞である、請求項８０記載の細胞。
【請求項８２】
Ｂ細胞である、請求項４０記載の細胞。
【請求項８３】
請求項８２記載の細胞とミエローマ細胞との融合により形成されるハイブリドーマ。
【請求項８４】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシ細胞の作製方法であって、第１プリオン遺伝子ターゲティングベクターを、ウシ細胞において第１ベクターと内因性プリオン核酸の第１アレルとの間で相同組換えが起こる条件下で、該ウシ細胞に導入し、それにより該細胞にヘミ接合性突然変異を導入することを含む、上記方法。
【請求項８５】
第１ベクターを、該細胞において第１ベクターと内因性プリオン核酸の第２アレルとの間で相同組換えが起こる条件下で、該細胞に導入し、それにより該細胞にホモ接合性突然変異を導入することをさらに含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
第１ベクターとは異なる抗生物質耐性遺伝子を有する第２プリオン遺伝子ターゲティングベクターを、該細胞において第２ベクターと内因性プリオン核酸の第２アレルとの間で相同組換えが起こる条件下で、該細胞に導入し、それにより該細胞にホモ接合性突然変異を導入することをさらに含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
細胞がウシ線維芽細胞である、請求項８４〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
細胞がウシ胎仔線維芽細胞である、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）細胞、細胞由来のクロマチン塊、又は細胞由来の核を卵母細胞に挿入するステップであって、該細胞が内因性プリオン核酸に第１突然変異を含む、上記ステップ、
（ｂ）該卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、宿主ウシの子宮に、該卵母細胞又は該胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ
を含む、上記方法。
【請求項９０】
胎仔が生存子孫に発育する、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
上記細胞が、選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつプリオン核酸と実質的な配列同一性を有する１以上の核酸と機能的に連結されたプロモーターを含むカセットを含有する核酸を該細胞に挿入し、それにより該カセットがプリオン核酸の一方の内因性アレルに組み込まれることを含む方法により調製されたものである、請求項８９記載の方法。
【請求項９２】
上記細胞が、以下のステップ：
（ａ）第１選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ該プリオン核酸と実質的な配列同一性を有する第１核酸と機能的に連結された第１プロモーターを含む第１カセットを含有する核酸を、該細胞に挿入し、それにより第１カセットが、該プリオン核酸を産生する第１トランスジェニック細胞の第１内因性アレルに組み込まれるステップ、及び
（ｂ）第２選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ該プリオン核酸と実質的な配列同一性を有する第２核酸と機能的に連結された第２プロモーターを含む第２カセットを含有する核酸を、第１トランスジェニック細胞に挿入するステップであって、第２選択マーカーは第１選択マーカーとは異なるものであり、それにより第２カセットが、該プリオン核酸を産生する第２トランスジェニック細胞の第２内因性アレルに組み込まれる上記ステップ、
を含む方法により作製される、請求項８９記載の方法。
【請求項９３】
以下のステップ：
（ｃ）上記胚、上記胎仔又は上記胎仔から生じる子孫から細胞を単離するステップ；
（ｄ）該細胞における内因性プリオン核酸に第２突然変異を導入するステップ；
（ｅ）該細胞、該細胞由来のクロマチン塊、又は該細胞由来の核を、卵母細胞に挿入するステップ；及び
（ｆ）該卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、宿主ウシの子宮に、該卵母細胞又は該胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
をさらに含む、請求項８９記載の方法。
【請求項９４】
上記細胞が、Ｂ細胞において再配列を経て１以上の異種Ｉｇ分子を発現可能な異種Ｉｇ遺伝子の全体又は一部を含有する１以上の核酸を含む、請求項８９記載の方法。
【請求項９５】
上記核酸が異種抗体をコードする、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
異種抗体がウシの血液又は乳汁中に発現される、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項４０記載の透過性化細胞を、再プログラム培地中で、該透過性化細胞の核、クロマチン塊若しくは染色体からの因子の除去又は再プログラム培地から核、クロマチン塊若しくは染色体への因子の付加が可能な条件下にてインキュベートし、それにより再プログラム化細胞を形成するステップ、
（ｂ）前記再プログラム化細胞を有核又は脱核卵母細胞に挿入し、それにより核移植卵母細胞を形成するステップ、並びに
（ｃ）前記核移植卵母細胞又は該核移植卵母細胞から形成される胚を、宿主ウシの子宮に、該核移植卵母細胞又は胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項９８】
再プログラム培地が細胞抽出物である、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
透過性化細胞の核が膜に結合したままであり、核におけるクロマチンは再プログラム培地でのインキュベーション過程で凝縮しないものである、請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
クロマチン塊が再プログラム培地での透過性化細胞のインキュベーションにより形成される、請求項９７記載の方法。
【請求項１０１】
再プログラム化細胞が再プログラム化細胞の膜が再封入される条件下にてインキュベートされる、請求項９７記載の方法。
【請求項１０２】
再プログラム化細胞が核移植卵母細胞への挿入前に再プログラム培地から精製される、請求項９７記載の方法。
【請求項１０３】
胎仔が生存子孫に発育する、請求項９７記載の方法。
【請求項１０４】
２つの子孫を交配しプリオン核酸の両方のアレルに突然変異を有するトランスジェニックウシを作出することをさらに含む、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
ステップ（ｂ）からの核移植卵母細胞を細胞分裂が可能な条件下にて培養し、得られる細胞の１つが１回以上再クローン化される、請求項９７記載の方法。
【請求項１０６】
透過性化細胞及び核移植卵母細胞が同種由来である、請求項９７記載の方法。
【請求項１０７】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項４０記載の細胞由来のドナー核と再プログラム培地とを、ＤＮＡ複製を生じることなくクロマチン塊の形成が可能な条件下にて接触させるステップ、
（ｂ）前記クロマチン塊を卵母細胞に挿入し、それにより核移植卵母細胞を形成するステップ、並びに
（ｃ）前記核移植卵母細胞又は該核移植卵母細胞から形成される胚を、宿主ウシの子宮に、該核移植卵母細胞又は胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１０８】
再プログラム培地が、有糸分裂抽出物、界面活性剤及び塩溶液、界面活性剤溶液、塩溶液、又はプロテインキナーゼ溶液である、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
ステップ（ａ）からのクロマチン塊が、前記核移植卵母細胞への挿入前に前記抽出物から精製されたものである、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１０】
胎仔が生存子孫に発育する、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１１】
ステップ（ｂ）からの核移植卵母細胞を細胞分裂が可能な条件下にて培養し、得られる細胞の１つを１回以上再クローン化する、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１２】
ドナー核及び核移植卵母細胞が同種由来である、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１３】
ドナー核が二倍体である、請求項１０７記載の方法。
【請求項１１４】
ドナー核が、線維芽細胞、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、血液細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞、筋細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、胎仔細胞、胎盤細胞、雌性生殖系由来の細胞又は胚性細胞に由来するものである、請求項８４、８９、９７又は１０６記載の方法。
【請求項１１５】
細胞が胎仔線維芽細胞である、請求項８４、８９、９７又は１０６記載の方法。
【請求項１１６】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項４０記載の細胞、該細胞由来の核又は該細胞由来のクロマチン塊を卵母細胞に挿入し、それにより第１胚を形成するステップ、
（ｂ）第１胚由来の１以上の細胞と第２胚由来の１以上の細胞とを接触させ、それにより第３胚を形成するステップであって、第２胚がｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚又は単為生殖活性化胚であり、第１胚及び第２胚の少なくとも１つが緊密化胚である、上記ステップ、並びに
（ｃ）第３胚を、宿主ウシの子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１１７】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項４０記載の細胞、該細胞由来の核又は該細胞由来のクロマチン塊を卵母細胞に挿入し、それにより第１胚を形成するステップ、
（ｂ）第１胚由来の１以上の細胞と第２胚由来の１以上の細胞とを接触させ、それにより第３胚を形成するステップであって、第２胚がｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚又は単為生殖活性化胚であり、第１胚及び第２胚が異なる細胞期にあるものである、上記ステップ、並びに
（ｃ）第３胚を、宿主ウシの子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１１８】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項４０記載の細胞由来のドナー核と再プログラム培地とを、クロマチン塊の形成が可能な条件下にて接触させるステップ、
（ｂ）前記クロマチン塊を卵母細胞に挿入し、それにより第１胚を形成するステップ、
（ｃ）第１胚由来の１以上の細胞と第２胚由来の１以上の細胞とを接触させ、それにより第３胚を形成するステップであって、第２胚がｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚又は単為生殖活性化胚である、上記ステップ、並びに
（ｄ）第３胚を、宿主ウシの子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１１９】
ステップ（ａ）が、４対未満の相同染色体を有するドナー核と再プログラム培地とを、ＤＮＡ複製を生じることなくクロマチン塊の形成が可能な条件下にて接触させることを含むものである、請求項１１８記載の方法。
【請求項１２０】
機能性プリオンタンパク質の発現が低減されたトランスジェニックウシの作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）請求項４０記載の透過性化細胞を、再プログラム培地中で、該透過性化細胞の核、クロマチン塊若しくは染色体からの因子の除去又は再プログラム培地から核、クロマチン塊若しくは染色体への因子の付加が可能な条件下にてインキュベートし、それにより再プログラム化細胞を形成するステップ、
（ｂ）前記再プログラム化細胞を卵母細胞に挿入し、それにより第１胚を形成するステップ、
（ｃ）第１胚由来の１以上の細胞と第２胚由来の１以上の細胞とを接触させ、それにより第３胚を形成するステップであって、第２胚がｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚又は単為生殖活性化胚である、上記ステップ、並びに
（ｄ）第３胚を、宿主ウシの子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１２１】
再プログラム化細胞が該再プログラム化細胞の膜が再封入される条件下にてインキュベートされないものである、請求項１２０記載の方法。
【請求項１２２】
胎仔が生存子孫に発育する、請求項１１６〜１１８及び１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
胎仔の胎盤における少なくとも１０％の細胞が第２胚に由来する、請求項１１６〜１１８及び１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
抗体の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）異種抗体の遺伝子座をコードする核酸を含む請求項１７記載のウシに目的の１以上の抗原を投与するステップであって、該遺伝子座における核酸セグメントは再配列を経て該抗原に特異的な抗体を産生するものである、上記ステップ、並びに
（ｂ）上記ウシから上記抗体を回収するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項１２５】
抗体がモノクローナルである、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
抗体がポリクローナルである、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２７】
抗体がウシの血清又は乳汁から回収される、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２８】
抗体の製造方法であって、異種抗体の遺伝子座をコードする核酸を含む請求項１７記載のウシから異種抗体を回収するステップを含み、該遺伝子座における核酸セグメントは再配列を経て異種抗体を産生するものである、上記方法。
【請求項１２９】
抗体がモノクローナルである、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３０】
抗体がポリクローナルである、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３１】
抗体が該ウシの血清又は乳汁から回収される、請求項１２８記載の方法。
【請求項１３２】
Ｉｇが所望の抗原に対するものである、請求項１２４又は１２８記載の方法。.
【請求項１３３】
５’から３’の順に、ウシ細胞の内因性プリオン核酸の第１領域と実質的な配列同一性を有する第１相同性領域、ポジティブセレクションマーカー、及び該プリオン核酸の第２領域と実質的な配列同一性を有する第２相同性領域を含むカセットを含有する核酸であって、第１相同性領域が第２相同性領域よりも長く、該カセットが該細胞の内因性プリオン核酸に組み込まれるものである、上記核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）活性が１以上の遺伝子操作突然変異により低減されたクローン化トランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）に関する。かかるプリオンタンパク質活性が低減したトランスジェニックウシは、プリオン関連疾患、例えばウシ海綿状脳症（ＢＳＥ、狂牛病としても知られる）に対して抵抗性を示すと考えられるので、これらは農業製品及び医薬品（ヒト治療用抗体など）の安全で好ましい供与源となる。
【背景技術】
【０００２】
１９８６年に英国で最初のＢＳＥ症例が発見されてから、この感染性疾患は世界の他の領域（日本など）に拡散している。この疾患の脅威は、農業及び医薬品業界に多大な影響を与え、これらの産業ではウシの用途が制限されている。数十年の研究に基づいて、この疾患の実質的な要因としてプリオンタンパク質が同定された。プリオンタンパク質活性が低減している動物は、プリオンタンパク質に関連する感染に対する抵抗性を有すると予測されるため、望まれている。
【０００３】
現在までに、相同組換え法を使用したネズミ胚性幹（ＥＳ）細胞における慣用の遺伝子ターゲティング手法を用いてプリオンタンパク質活性が低減されたトランスジェニックマウスが作出されている。しかしながら、ウシなどの有蹄動物からＥＳ細胞を単離し、培養し、遺伝的に改変することは困難である。
【０００４】
プリオンノックアウトヒツジの作出においては、胎仔線維芽細胞をプロモーターを含まないノックアウト（ＫＯ）ベクターでトランスフェクトしているが、これは、プリオンタンパク質遺伝子が胎仔線維芽細胞において非常に高活性に発現されるためである（Denning et al., Nature Biotech., 19:559-562, 2001）。この種のノックアウトベクターを用いることにより、相同的にターゲティングされたクローンを適当な薬剤（Ｇ４１８又はピューロマイシンなど）を用いて選抜することができる。なぜなら、ノックアウトベクター中のプロモーターを含まない薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン又はピューロマイシン耐性遺伝子）は、それが高活性に発現される遺伝子座に組み込まれた場合にしか発現されないためである。しかしながら、これらのヘミ接合性ターゲティングヒツジ線維芽細胞の核移植によっては１頭の生存仔ヒツジのみが作出されているにすぎず、この仔ヒツジは誕生後約１２日で死亡した。寿命が制限されないネズミＥＳ細胞とは異なり、体細胞である線維芽細胞は寿命が限られる。そのため、所望のノックアウト細胞を選択するために厳格な薬剤選択下で細胞を培養するのに必要な時間の長さのために、体細胞遺伝子ターゲティングは困難である。さらに、一般的には、体細胞である線維芽細胞における相同組換えの頻度はネズミＥＳ細胞よりも約１０〜１００分の一低い。伝統的な核移植法の成功率が低いことに加えて、体細胞線維芽細胞に関するこれらの制限のために、所望の部位特異的突然変異を有する生存家畜を作出することは困難である。
【０００５】
遺伝子ターゲティングによるプリオンタンパク質活性の低減がウシにおいて試みられている。本発明者の知識では、プリオン遺伝子座に突然変異を有するトランスジェニックウシの作出の成功については報告されていない。これはおそらく、適当なノックアウトベクター及び／又は核移植法がないことによると考えられる。従って、有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）においてプリオン遺伝子座を突然変異させるための改良されたノックアウトベクターが必要とされている。さらに、これらの遺伝子改変ドナー細胞からトランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）を作出する改善された方法が望まれている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ドナー細胞（体細胞性胎仔線維芽細胞）において有蹄動物（例えばウシ）のプリオン遺伝子座におけるヘミ接合性及びホモ接合性ターゲティング組込み（いわゆる相同組換え）の頻度が非常に高いノックアウトベクターの設計に関する。本発明はまた、本明細書に記載のいずれかの核移植法において遺伝子操作されたドナー細胞を用いてプリオン遺伝子座にヘミ接合性又はホモ接合性突然変異を有する生存仔ウシを作製する方法に関する。これらのウシは、ヒトの用途のための治療用ヒト抗体などの医薬品及び農業製品を製造するために有用である。
【０００７】
本発明の方法は、いくつかの技術、例えば、（ｉ）本明細書に記載するプリオン遺伝子ノックアウト細胞、（ｉｉ）ＰＣＴ公報ＷＯ０２／０５１９９７号に記載されている核移植法又はクロマチン移植法などの哺乳動物クローン化法、及び（ｉｉｉ）ヒト人工染色体（ＨＡＣ）（例えばΔＨＡＣ）の有蹄動物への導入（ＰＣＴ公報ＷＯ０２／７０６４８；Kuroiwa et al., Nature Biotechnol. 20:889-894, 2002）により達成される。プリオンノックアウト有蹄動物細胞を哺乳動物クローン化法のドナー遺伝物質の供与源として用いて、プリオンノックアウト（ヘミ又はホモ）子孫を得る。
【０００８】
プリオンノックアウト有蹄動物はまた、他の有用な性質、例えばヒト抗体の産生を有していてもよい。かかる有蹄動物は、上記技術を組み合わせて用いて作出することができる。例えば、プリオンノックアウト及びヒト抗体産生ウシは、ＰＣＴ公報ＷＯ０２／７０６４８号に記載のようにプリオンノックアウト有蹄動物とヒト抗体産生有蹄動物を交雑することにより作出することができる。胎仔線維芽細胞の連続操作を用いることにより、有蹄動物の交雑を行って又は行わないでかかる有蹄動物を作出することも可能である。ウシ胎仔線維芽細胞の連続操作は、以下のステップを反復して行うことを含む：（ｉ）有蹄動物（例えばウシ）線維芽細胞の遺伝子操作、（ｉｉ）この細胞を用いた哺乳動物のクローン化、（ｉｉｉ）胎仔の作出、（ｉｖ）遺伝子操作胎仔線維芽細胞の単離。例えば、プリオンノックアウト線維芽細胞を連続的に操作して、ＨＡＣを保持させ、内因性Ｉｇ遺伝子を不活化しうる。
【０００９】
得られるモノクローナル又はポリクローナル異種抗体は種々の用途を有する。例えば、これらは細菌又はウイルスなどの病原性微生物の感染症のための予防又は治療用組成物における有効成分として用いられ得る。
【００１０】
トランスジェニック有蹄動物及び有蹄動物細胞
一態様において、本発明は、内因性プリオン核酸の一方又は両方のアレルに非天然突然変異（例えば、最初のＡＴＣコドンの後の突然変異、このコドンの１０、２０、５０又は１００塩基内の突然変異など）を有する有蹄動物（例えばウシ）又は有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）を提供する。好ましくは、この突然変異は、機能性プリオンタンパク質の発現を低減する又は実質的に排除する。好ましい実施形態において、機能性又は総プリオンタンパク質の発現は、少なくとも１０、２０、４０、６０、８０、９０、９５又は１００％低減する。突然変異は、ヘミ接合性又はホモ接合性でありうる。いくつかの実施形態において、突然変異には、ポジティブセレクションマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）のプリオン核酸への挿入が含まれる。好ましくは、ポジティブセレクションマーカーは、異種プロモーターに機能的に連結される。プリオン核酸の両方のアレルに抗生物質耐性遺伝子が挿入された有蹄動物又は有蹄動物細胞に関して、各アレルは、同じ又は異なる抗生物質耐性遺伝子を含有しうる。好ましい実施形態において、ネガティブセレクションマーカー（例えばＤＴ−Ａ又はＴｋ）が異種プロモーターと機能的に連結され、内因性プリオンアレルに突然変異を生じさせるために使用されるベクター中に存在する。突然変異は、プリオン核酸中に１以上のヌクレオチド（例えば連続するヌクレオチド）の欠失を含んでもよいし、又は含まなくてもよい。
【００１１】
上記態様の好ましい実施形態において、有蹄動物（例えばウシ）又は有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）は、１以上のトランスジーンを有し、該トランスジーンによりコードされるｍＲＮＡ又はタンパク質（例えば抗体）を発現する。好ましい有蹄動物は、天然に配列されたヒト染色体のセグメント（例えばヒト染色体断片）又は人工的に操作されたヒト染色体断片を含む人工染色体（すなわち、この断片はヒトゲノムに関して再配列されうる）を含有する。いくつかの実施形態において、異種核酸は、染色体断片内に含まれる。核酸は、有蹄動物の染色体に組み込まれているか、又は宿主の染色体とは独立して有蹄動物細胞内に保持される。種々の実施形態において、核酸は、染色体断片（ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣなど）に含まれる。他の実施形態において、異種抗体は、別の属に由来する抗体、例えばヒト抗体である。
【００１２】
好ましい有蹄動物及び有蹄動物細胞は、異種抗体遺伝子座を有する１以上の核酸（たとえば、１以上のＢ細胞において再配列を経て少なくとも１つの異種免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現する異種Ｉｇ遺伝子の全体又はその一部をコードする核酸）を有する。好ましくは、核酸は、Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、未再配列抗体軽鎖核酸セグメントを有する。他の好ましい核酸は、（ｉ）Ｖ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＤ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、及び／又は（ｉｉ）Ｄ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体がＪ遺伝子セグメントをコードする核酸セグメントの全体と１以上のヌクレオチドにより分離されている、未再配列抗体重鎖核酸セグメントを有する。他の好ましい有蹄動物は、少なくとも１つの異種免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を発現する、再配列された異種Ｉｇ遺伝子の全体又は一部をコードする１以上の核酸を有する。
【００１３】
他の好ましい実施形態において、異種抗体の軽鎖及び／又は重鎖は、ヒト核酸によりコードされる。好ましい実施形態において、重鎖は、重鎖の任意のクラス、例えばμ、γ、δ、ε又はαなどであり、軽鎖はλ又はκ軽鎖である。他の好ましい実施形態において、異種免疫グロブリン鎖又は抗体をコードする核酸は、その未再配列形態である。他の好ましい実施形態において、異種抗体の１を超えるクラスが上記有蹄動物により産生される。種々の実施形態において、１を超える異なる異種Ｉｇ又は抗体が上記有蹄動物により産生される。異種抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。
【００１４】
上記態様の種々の実施形態において、有蹄動物（例えばウシ）又は有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）は、内因性抗体の発現を低減する突然変異を有する。好ましくは、突然変異は、機能性ＩｇＭ重鎖の発現を低減するか、又は機能性ＩｇＭ重鎖の発現を実質的に排除する。他の好ましい実施形態において、突然変異は、機能性Ｉｇ軽鎖の発現を低減するか、又は機能性Ｉｇ軽鎖の発現を実質的に排除する。また他の好ましい実施形態において、突然変異は、機能性ＩｇＭ重鎖及び機能性Ｉｇ軽鎖の発現を低減するか、又は機能性ＩｇＭ重鎖及び機能性Ｉｇ軽鎖の発現を実質的に排除する。好ましくは、有蹄動物はまた、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はＪ鎖をコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を有する。他の好ましい実施形態において、有蹄動物は、外因性Ｊ鎖（例えばヒトＪ鎖など）をコードする核酸を有する。好ましくは、突然変異は、内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素、ガラクトシルα（１，３）ガラクトースエピトープ、及び／又はＪ鎖の発現を低減又は排除するものである。好ましくは、有蹄動物はヒトＪ鎖を含有するヒトＩｇＡ又はＩｇＭ分子を産生する。好ましい有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）には、体細胞、例えば胎仔線維芽細胞又はＢ細胞が含まれる。
【００１５】
本発明はまた、異種（例えばヒト）抗体を産生するハイブリドーマに関する。一態様において、本発明は、本発明のＢ細胞とミエローマ細胞との融合により形成されるハイブリドーマを提供する。好ましくは、抗体は目的の抗原と反応するものである。
【００１６】
トランスジェニック有蹄動物細胞の作製方法
本発明はまた、プリオン核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を有する有蹄動物細胞（例えばウシ細胞）の作製方法に関する。これらの細胞は、トランスジェニック有蹄動物（例えばウシプリオンノックアウト有蹄動物）の作出のためのドナー細胞として用いることができる。好ましくは、上記突然変異により、機能性プリオンタンパク質の量が低減する、及び／又はプリオン関連感染症若しくは疾患（例えばＢＳＥ）の発生が低減する。
【００１７】
従って、そのような一態様において、本発明は、トランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）の作製方法に関する。この方法は、第１プリオン遺伝子ターゲティングベクターを、第１ベクターと有蹄動物細胞における内因性プリオン核酸の第１アレルとの間で相同組換えが起こるような条件下で有蹄動物細胞に導入し、それにより該細胞にヘミ接合性突然変異を導入する。好ましくは、第１ベクターは、細胞の内因性プリオン核酸の第１領域と実質的な配列同一性を有する第１相同性領域、ポジティブセレクションマーカー、及びプリオン核酸の第２領域と実質的な配列同一性を有する第２相同性領域を含む。好ましい実施形態において、一方の相同性領域は、他方の相同性領域よりも少なくとも１、２、３、４、５、６又は８キロベース長い。好ましくは、本方法はまた、第１ベクターを、第１ベクターと該細胞における内因性プリオン核酸の第２アレルとの間の相同組換えが可能な条件下で、該細胞に再導入し、それにより該細胞にホモ接合性突然変異を導入することを含む。他の実施形態において、本方法はまた、第１ベクターとは異なる抗生物質耐性遺伝子を有する第２プリオン遺伝子ターゲティングベクターを、第２ベクターと該細胞における内因性プリオン核酸の第２アレルとの間で相同組換えが起こるような条件下で、該細胞に導入し、それにより該細胞にホモ接合性突然変異を導入することを含む。好ましくは、第１及び／又は第２ベクターは、１ｍＭスペルミジンの存在下で細胞に導入する。好ましい細胞には、ウシ胎仔線維芽細胞が含まれる。
【００１８】
本発明の種々の実施形態において、内因性プリオン核酸を突然変異させるために使用する核酸（例えば、選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつプリオン核酸と実質的な配列同一性を有する核酸と機能的に連結されたプロモーターを含むノックアウトカセット）は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどには含まれない。例えば、核酸は、細胞のウイルス感染を伴わない標準的な方法（トランスフェクション又はリポフェクションなど）を用いて有蹄動物細胞に挿入されるプラスミド又は人工染色体中に含有させうる。また別の実施形態において、内因性プリオン核酸を突然変異させるために使用する核酸（例えば、選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつプリオン核酸と実質的な配列同一性を有する核酸と機能的に連結されたプロモーターを含むノックアウトカセット）は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどの中に含有される。この実施形態によると、ウイルスベクターを含むウイルスを用いて有蹄動物細胞に感染させ、その結果ウイルスベクターの一部又は全体が有蹄動物細胞中に挿入される。
【００１９】
トランスジェニック有蹄動物の作製方法
本発明はまた、内因性プリオン核酸に１以上の突然変異を有するトランスジェニック有蹄動物を作製する方法を提供する。１つのかかる方法は、本発明の上記態様のいずれかの細胞、該細胞由来のクロマチン塊、又は該細胞由来の核を卵母細胞に挿入することを含む。細胞は、内因性プリオン核酸に第１突然変異を有する。卵母細胞又は該卵母細胞から形成される胚を、該卵母細胞又は胚が胎仔に発育可能な条件下で宿主有蹄動物の子宮に導入する。好ましくは、胎仔は生存子孫にまで発育する。
【００２０】
好ましい実施形態において、第１突然変異は、選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ場合により内因性プリオン核酸と実質的な配列同一性を有する１以上の核酸と機能的に連結されていてもよいプロモーターを含むカセットを含有する核酸を挿入することにより細胞に導入し、それにより該カセットがプリオン核酸の一方の内因性アレルに組み込まれるようにする。他の好ましい実施形態において、突然変異は、第１選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ場合により内因性プリオン核酸と実質的な配列同一性を有する第１核酸と機能的に連結されていてもよい第１プロモーターを含む第１カセットを含有する核酸を細胞に挿入することにより細胞に導入し、それにより第１カセットがプリオン核酸を産生する第１トランスジェニック細胞の第１内因性アレルに組み込まれる。第１トランスジェニック細胞には、第２選択マーカーをコードする核酸と機能的に連結され、かつ場合によりプリオン核酸と実質的な配列同一性を有する第２核酸と機能的に連結されていてもよい第２プロモーターを含む第２カセットを含有する核酸を挿入する。第２選択マーカーは第１選択マーカーとは異なるものであり、第２カセットはプリオン核酸を産生する第２トランスジェニック細胞の第２内因性アレルに組み込まれる。
【００２１】
また他の好ましい実施形態において、細胞は、胚、胎仔又は胎仔から生じる子孫から単離されたものであり、別の突然変異が該細胞のプリオン核酸又は他の核酸（例えば、抗体重鎖若しくは軽鎖核酸）に導入されている。その後、得られた細胞、該細胞からのクロマチン塊、又は該細胞からの核を用いて第２ラウンドの核移植を行い、２以上の突然変異を有するトランスジェニック有蹄動物を作出する。複数の突然変異は、遺伝子の同じ若しくは異なるアレルにあってもよいし、異なる遺伝子にあってもよい。第１ラウンド又は任意により第２ラウンドの核移植において使用する細胞は異種抗体をコードする。特定の実施形態において、細胞は、Ｂ細胞において再配列を経て１以上の異種Ｉｇ分子を発現可能な異種Ｉｇ遺伝子の全部又は一部をコードする１以上の核酸を含む。好ましい実施形態において、突然変異させる細胞は、線維芽細胞（例えば胎仔線維芽細胞）である。好ましくは、突然変異させる内因性遺伝子は、線維芽細胞において活性を有しない内因性プロモーターと機能的に連結される。他の好ましい実施形態において、突然変異させる内因性遺伝子と機能的に連結される内因性プロモーターは、内因性ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨなど）と機能的に連結される内因性プロモーターの活性の８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満の活性である。プロモーター活性は、任意の標準的なアッセイ、例えば遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを測定するアッセイを用いて測定しうる（例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley & Sons, 1995参照）。トランスジェニック有蹄動物を作出するこの方法は、ドナー細胞（すなわち、核移植に用いる遺伝物質の供与源となる細胞）において発現されない遺伝子を突然変異させることができるという利点を有する。
【００２２】
好ましくは、トランスジェニック有蹄動物の作出に使用する細胞は、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び／又はＪ鎖をコードする内因性核酸の一方又は両方のアレルに突然変異を有する。他の好ましい実施形態において、細胞は、外因性Ｊ鎖、例えばヒトＪ鎖をコードする核酸、又は異種抗体をコードする核酸を有する。好ましくは、異種核酸は、異種Ｉｇ遺伝子の全体又は一部をコードし、該遺伝子がＢ細胞において再配列を経て１を超える異種Ｉｇ分子を発現可能なものである。他の好ましい実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。また別の好ましい実施形態において、免疫グロブリン鎖又は抗体は、血清及び／又は乳汁中に発現される。
【００２３】
本発明者は、プリオン核酸に１以上の突然変異を有する哺乳動物をクローン化するために用いることができる、哺乳動物（例えばウシなどの有蹄動物）のクローン化の種々の改善方法を以前に開示している（米国特許公開２００２−００４６７２２Ａ１、及びＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０５１９９７号）。これらのいくつかの方法においては、透過性化細胞を再プログラム培地（例えば細胞抽出物）を用いてインキュベートし、細胞からの因子の付加又は除去を可能にし、その後透過性化細胞の形質膜を再度封入して所望の因子を取り囲み、細胞の膜の完全性を回復する。またこれらのいくつかの方法は、核移植胚の生存子孫への発育に望ましくない遺伝子の転写を促進する可能性のある核成分（例えば転写因子）の放出を可能にする、ドナー核（例えば、単離された核又はドナー細胞内の核）のクロマチン塊への凝縮を含む。所望であれば、これらの方法のいずれかのステップを、１回以上反復して行ってもよいし、又は異なる再プログラム方法を連続して実施して、再プログラムの程度を増大し、クローン化胎仔の生存率を高めてもよい。
【００２４】
トランスジェニック有蹄動物（例えば、ウシ）を作出する１つの方法は、本発明の上記態様のいずれかの透過性化細胞（例えば、内因性プリオン核酸に１以上の突然変異を有する細胞）を再プログラム培地（例えば細胞抽出物）を用いて、該透過性化細胞の核、クロマチン塊又は染色体からの因子（例えば、転写因子などの核若しくは細胞質成分）の除去、あるいは核、クロマチン塊又は染色体への因子の付加が可能な条件下にて、インキュベートし、それにより再プログラム化細胞を形成させることを含む。再プログラム化細胞は、脱核卵母細胞に挿入し、得られる卵母細胞又は該卵母細胞により形成される胚は、宿主有蹄動物の子宮に、該卵母細胞又は胚が胎仔に発育可能な条件下にて、導入される。好ましい実施形態において、透過性化細胞は、クロマチン塊の形成が可能な以下の条件の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在下若しくは不在下における有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／又は塩溶液、あるいはプロテインキナーゼ溶液。さらに別の好ましい実施形態において、透過性化細胞は、間期再プログラム培地（例えば、間期細胞抽出物）と共にインキュベートする。また別の好ましい実施形態において、透過性化細胞における核は膜に結合した状態であり、核中の染色体はこの間期再プログラム培地とのインキュベーションの過程で凝縮しない。特定の実施形態において、再プログラム培地中での透過性化細胞のインキュベーションは、ＤＮＡの複製を生じないか、又は細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％未満においてＤＮＡ複製が生じるにすぎない。他の実施形態において、再プログラム培地中での透過性化細胞のインキュベーションは、細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％においてＤＮＡ複製を生じる。種々の実施形態において、透過性化細胞は、無傷細胞を、プロテアーゼ（トリプシンなど）、界面活性剤（ジギトニンなど）又は細菌性トキシン（ストレプトリシンＯなど）と共にインキュベートすることにより形成される。好ましい実施形態において、再プログラム化細胞は、再プログラム化細胞の膜が卵母細胞への挿入前に再度封入されるような条件下でインキュベートするものではない。また別の好ましい実施形態において、再プログラム化細胞は、再プログラム化細胞の膜が卵母細胞への挿入前に再度封入されるような条件下でインキュベートする。他の好ましい実施形態において、再構成された卵母細胞又は得られる胚は、同じ細胞数で同じ種に由来する対照卵母細胞又は対照胚により発現される対応のレベルよりも５倍未満ではあるが高いレベルでラミンＡ、ラミンＣ、又はＮｕＭＡタンパク質を発現する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、トランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）の別の作製方法を提供する。この方法は、（ａ）本発明の細胞からのドナー核（例えば内因性プリオン核酸に１以上の突然変異を有する核）を、ＤＮＡ複製を生じることなくクロマチン塊の形成が可能な条件下にてインキュベートするステップ、（ｂ）該クロマチン塊を脱核卵母細胞に挿入し、それにより核移植卵母細胞を形成させるステップ、並びに（ｃ）核移植卵母細胞又は核移植卵母細胞から形成される胚を、該核移植卵母細胞又は胚が胎仔に発育可能な条件下にて、宿主有蹄動物の子宮に導入するステップ、を含む。好ましい実施形態において、ドナー核は、核又は細胞質成分（例えば転写因子、リプレッサータンパク質又はクロマチン再構築タンパク質）が核又は得られるクロマチン塊に付加されるようなあるいは核又はクロマチン塊から除去されるような条件下で、再プログラム培地（例えば細胞抽出物）でインキュベートする。好ましくは、ドナー核は、クロマチン塊の形成が可能な以下の条件の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在下若しくは不在下における有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／又は塩溶液、あるいはプロテインキナーゼ溶液。他の好ましい実施形態において、再構成された卵母細胞又は得られる胚は、同じ細胞数で同じ種に由来する対照卵母細胞又は対照胚により発現される対応のレベルよりも５倍未満ではあるが高いレベルでラミンＡ、ラミンＣ、又はＮｕＭＡタンパク質を発現する。好ましくは、核は、４対よりも少ない相同染色体を有する（すなわち、２対よりも少ない完全染色分体を有する）。
【００２６】
キメラ有蹄動物の好ましい作出方法
他の好ましい有蹄動物は、２以上の胚に由来する細胞を用いて作出されるキメラ有蹄動物である。例えば、核移植胚（例えば、細胞、核又はクロマチン塊を脱核卵母細胞に挿入することにより形成される胚）に由来する細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（体外受精）胚、天然胚又は単為生殖活性化胚に由来する細胞と混合しうる。好ましくは、細胞及び該核移植胚からの子（progeny）の大部分は得られるキメラ胚の胎仔組織中に組み込まれる。細胞及び第２胚からの子の少なくとも一部は、胎盤組織に組み込まれ、得られるキメラ胚の生存率を促進することが好ましい。好ましい実施形態において、核移植胚は内因性プリオン核酸に突然変異を有し、かつ異種抗体をコードする核酸を有する。
【００２７】
従って、１つのそのような態様において、本発明は、細胞、核又はクロマチン塊（例えば、内因性プリオン核酸に突然変異を有し、かつ場合により異種抗体をコードする１以上の核酸を有していてもよい細胞、核又はクロマチン塊）を卵母細胞に挿入し、それにより第１胚を形成させることによりトランスジェニック有蹄動物を作出する方法を提供する。第１胚からの１以上の細胞を、第２胚からの１以上の細胞と接触させ、それにより第３胚を形成させる。第２胚は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（体外）受精胚、天然の胚、又は単為生殖的に活性化された胚である。第３胚は、宿主有蹄動物の子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入される。
【００２８】
別の関連する態様において、本発明は、トランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）を作製するためのまた別の方法を提供する。この方法は、本発明の透過性化細胞（例えば、内因性プリオン核酸に突然変異を有し、また場合により異種抗体をコードする核酸を有していてもよい細胞）を再プログラム培地（例えば細胞抽出物）中で、該透過性化細胞の核、クロマチン塊又は染色体からの因子の除去、あるいは再プログラム培地から核、クロマチン塊又は染色体への因子の付加が可能な条件下にて、インキュベートし、それにより再プログラム化細胞を形成させることを含む。再プログラム化細胞は、脱核卵母細胞に挿入し、それにより第１胚を形成させる。第１胚からの１以上の細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（体外）受精第２胚、天然の第２胚、又は単為生殖的に活性化された第２胚からの１以上の細胞と接触させ、第３胚を形成させる。この第３胚は、宿主有蹄動物の子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入される。
【００２９】
好ましい実施形態において、透過性化細胞は、核又は細胞質成分（例えば転写因子）が、核又は得られるクロマチン塊に付加される又はそれから除去されるのが可能な条件下にて、再プログラム培地（例えば細胞抽出物）と共にインキュベートする。他の好ましい実施形態において、透過性化細胞は、クロマチン塊の形成が可能な以下の条件の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在下若しくは不在下における有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／又は塩溶液、あるいはプロテインキナーゼ溶液。さらに別の好ましい実施形態において、透過性化細胞は、間期再プログラム培地（例えば、間期細胞抽出物）と共にインキュベートする。また別の好ましい実施形態において、透過性化細胞における核は膜に結合した状態であり、核中の染色体はこの間期再プログラム培地とのインキュベーションの過程で凝縮しない。いくつかの実施形態において、再プログラム培地中での透過性化細胞のインキュベーションは、ＤＮＡの複製を生じないか、又は細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％又は５％未満においてＤＮＡ複製が生じるにすぎない。他の実施形態において、再プログラム培地中での透過性化細胞のインキュベーションは、細胞の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％においてＤＮＡ複製を生じる。種々の実施形態において、透過性化細胞は、無傷細胞を、プロテアーゼ（トリプシンなど）、界面活性剤（ジギトニンなど）又は細菌性トキシン（ストレプトリシンＯなど）と共にインキュベートすることにより形成される。好ましい実施形態において、再プログラム化細胞は、再プログラム化細胞の膜が卵母細胞への挿入前に再度封入されるような条件下でインキュベートしない。また別の好ましい実施形態において、再プログラム化細胞は、再プログラム化細胞の膜が卵母細胞への挿入前に再度封入されるような条件下でインキュベートする。
【００３０】
また別の実施形態において、有蹄動物は、本発明の細胞からのドナー核（例えば、内因性プリオン核酸に突然変異を有し、また場合により異種抗体をコードする核酸を有していてもよい核）を再プログラム培地（例えば細胞抽出物）中で、クロマチン塊の形成が可能な条件下にて接触させ、クロマチン塊を脱核卵母細胞の挿入し、それにより第１胚を形成させることにより作製される。第１胚に由来する１以上の細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精（体外受精）させた第２胚、天然の第２胚又は単為生殖的に活性化された第２胚に由来する１以上の細胞と接触させ、それにより第３胚を形成させる。この第３胚は、宿主有蹄動物の子宮に、第３胚が胎仔に発育可能な条件下にて導入される。好ましい実施形態において、クロマチン塊は、４対未満の相同染色体を有するドナー核と再プログラム培地を、ＤＮＡ複製を生じることなくクロマチン塊が形成可能な条件下にて接触させることにより形成される。好ましくは、ドナー核は、クロマチン塊の形成が可能な以下の条件の１以上と接触させる：抗ＮｕＭＡ抗体の存在下若しくは不在下における有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／又は塩溶液、あるいはプロテインキナーゼ溶液。
【００３１】
２つの胚に由来する細胞を用いて作製される有蹄動物に関する上記態様のいずれかの好ましい実施形態において、第１胚及び第２胚の少なくとも１つは緊密化胚である。別の実施形態において、第１胚及び第２胚は異なる細胞期にあるものである。第１胚、及び第２胚を作製するために使用されるドナー細胞は、同種に由来するものであってもよいし、又は異なる属若しくは種に由来するものであってもよい。好ましくは、胎仔の栄養外胚葉又は胎盤組織における少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の細胞が第２胚に由来するか、あるいは胎仔の内部細胞塊又は胎仔組織における少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の細胞が第１胚に由来するものである。他の好ましい実施形態において、第１胚又は第３胚は、同じ細胞数で同じ種に由来する対照胚により発現される対応のレベルよりも５倍未満ではあるが高いレベルでラミンＡ、ラミンＣ、又はＮｕＭＡタンパク質を発現する。
【００３２】
２つの胚に由来する細胞を用いて作出される有蹄動物に関する上記態様の他の好ましい実施形態において、第１胚又は第２胚の透明帯の一部又は全部は、各胚に由来する細胞を接触させる前に取り除く。一実施形態において、第１胚及び第２胚からの細胞は、溶液中又は固相支持体上で互いに隣接して配置させることにより接触させる。別の実施形態において、標準的な方法を用いて、第１胚からの細胞を第２胚に注入する。細胞は、第２胚のいずれの領域（例えば、透明帯と胚の間の胚の周囲、及び胚そのものなど）に注入することができる。天然の胚の例としては、標準的な方法を用いて妊娠有蹄動物（例えばウシ）から外科的に又は非外科的に取り出した胚である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（体外受精）胚の例としては、標準的な方法を用いて作製した細胞質内精子注入胚がある。また、２を超える胚に由来する細胞（例えば、３、４、５、６又はそれ以上の胚からの細胞）を組み合わせて、クローン化有蹄動物の作出のためのキメラ胚を形成することも可能である。
【００３３】
有蹄動物を作出するための好ましい実施形態
上記態様のいずれかの好ましい実施形態において、再プログラム培地（例えば細胞抽出物）は、因子、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター又はリプレッサーなどの濃縮又は枯渇により変更が加えられる。他の好ましい実施形態において、卵母細胞又はキメラ胚におけるＮｕＭＡ又はＡＫＡＰ９５タンパク質の発現レベルは、細胞質におけるレベルよりも核におけるレベルの方が少なくとも２倍、５倍、１０倍又は２０倍高い。また他の実施形態において、卵母細胞又はキメラ胚におけるＡＫＡＰ９５タンパク質の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％は、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ、及び１００ｍＭ又は３００ｍＭ  ＮａＣｌの溶液を用いて抽出される。好ましくは、クロマチン塊は、脱核卵母細胞に挿入する前に再プログラム培地（例えば抽出物）から精製される。別の好ましい実施形態において、クロマチン塊の脱核卵母細胞への挿入は、クロマチン塊及び卵母細胞と、融合性化合物（fusigenic compound）とを、クロマチン塊が卵母細胞に侵入可能な条件下にて接触させることを含む。また別の好ましい実施形態において、胎仔は生存子孫に発育する。好ましくは、核移植卵母細胞又は胚の少なくとも１、３、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％が生存子孫に発育する。この方法においては、クロマチン塊を含む卵母細胞又は再プログラム化細胞は、細胞分裂が可能な条件下で培養することができ、得られる細胞の１つは、１回以上再クローン化しうる。本方法において用いるドナー核、ドナークロマチン塊又はドナー細胞、及び卵母細胞は、同種に由来するものであってもよいし、又は異なる種若しくは属に由来するものであってもよい。望ましくは、ドナー細胞又は得られるトランスジェニック有蹄動物は、対応する天然細胞又は有蹄動物よりも少なくとも１０、２０、４０、６０、８０、９０、９５又は１００％少ない機能性又は総タンパク質を発現する。卵母細胞は受精されていても未受精であってもよい。好ましくは、ドナー核、クロマチン塊又は透過性化細胞はＧ１期又はＧ０期細胞からのものである。さらに、クローン化胚、胎仔又は有蹄動物のゲノムＤＮＡは、ドナー細胞のものと実質的に同一であることが好ましい。また、クロマチン塊又は再プログラム化細胞は、胚において該クロマチン塊又は再プログラム化細胞と実質的に同一のＤＮＡを有する細胞と天然細胞と実質的に同一のＤＮＡを有する細胞との混合物を含有する、キメラ胚、胎仔又は有蹄動物の作出のために胚に挿入しうることも意図される。また、脱核卵母細胞を本発明の方法に使用しうることも意図される。
【００３４】
本発明の任意の態様において用いる再プログラム培地は、異種ヌクレオチドを含んでもよいし又は含まなくてもよい。他の好ましい実施形態において、再プログラム培地中の又は透過性化細胞において形成されるクロマチン塊は、目的遺伝子をコードする核酸を有するベクターと、ベクター中の核酸とクロマチン塊のゲノム中の対応する核酸との間でランダム組み込み又は相同組換えが起こる条件下で接触させ、クロマチン塊のゲノムを改変させる。完全な形質膜が存在せず、また核膜が存在しないため、透過性化細胞中又は溶液中のクロマチン塊は、天然細胞よりも遺伝的に改変されやすくなりうる。再プログラム抽出物を調製するために使用し得る細胞の例としては、胚性幹細胞、及び脳、血液、骨髄、膵臓、肝臓、皮膚又は他の任意の器官若しくは組織からの成体幹細胞が含まれる。他の再プログラム細胞抽出物の例としては、卵母細胞抽出物（例えば、ウシ又はウニの卵母細胞抽出物）、及び雄性生殖細胞抽出物（例えば、脊椎動物、非脊椎動物、又は哺乳動物（ウシなど）からの精原細胞、精母細胞、精子細胞又は精子の抽出物）が挙げられる。ドナー細胞又は透過性化細胞は、不死化されていないものであってもよいし、又は天然に、自発的に若しくは遺伝学的に不死化されたものであってもよい。ドナー細胞、透過性化細胞、レシピエント細胞又はサイトプラストは、任意の年齢の供給源、例えば胚、胎仔、若年又は成体の哺乳動物（例えば有蹄動物）に由来するものであり得る。より若年の供給源に由来する細胞は、自発的突然変異の獲得がより少ない可能性があり、また卵母細胞への挿入後の寿命がより長い可能性がある。
【００３５】
有蹄動物の育種方法
有蹄動物又は有蹄動物細胞の作製のための上記方法のいずれかの好ましい実施形態において、本発明の有蹄動物を別の有蹄動物（例えば、抗体重鎖若しくは軽鎖核酸に突然変異を有する有蹄動物、又は異種抗体をコードする核酸を有する有蹄動物）と交配させて、２以上の遺伝子改変を有する胎仔又は生存子孫を作出する。好ましくは、１以上の細胞を胎仔又は子孫から単離し、１以上のさらなる遺伝子改変を単離細胞に導入する。
【００３６】
抗体の製造方法
本発明はまた、異種抗体（例えばヒト抗体）を発現する本発明の有蹄動物を用いた抗体の製造方法を提供する。このような方法のひとつでは、１以上の目的の抗原を、異種抗体遺伝子座をコードする核酸を有する本発明の有蹄動物に投与する。遺伝子座中の核酸セグメントは、再配列を経て、抗原に特異的な抗体を生成する。その抗体を有蹄動物から回収する。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、目的の抗原と反応することが好ましい。好ましくは、抗体は有蹄動物の血清又は乳汁から回収される。
【００３７】
関連する態様において、本発明は、別の抗体製造方法を提供し、該方法では、異種抗体遺伝子座をコードする核酸を有する本発明の有蹄動物から異種抗体を回収する。遺伝子座中の核酸セグメントは、再配列を経て、異種抗体を産生する。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、目的の抗原と反応することが好ましい。好ましくは、抗体は有蹄動物の血清又は乳汁から回収される。
【００３８】
核酸
本発明はまた、有蹄動物（例えばウシ）においてプリオン遺伝子を突然変異させるために有用な核酸（例えばベクター）を提供する。かかる核酸の１つは、５’から３’の順に、有蹄動物細胞の内因性プリオン核酸の第１領域と実質的な配列同一性を有する第１相同性領域、ポジディブセレクションマーカー、及びプリオン核酸の第２領域と実質的な配列同一性を有する第２相同性領域を含むカセットを有する。一実施形態において、第１相同性領域（例えば、３、２、１．５、又は１ｋｂ未満の領域）は、第２相同性領域（例えば、少なくとも７、８、９、又は１０ｋｂの領域）よりも短く、カセットは、細胞の内因性プリオン核酸中に組み込まれることができる。別の実施形態において、第１相同性領域は、第２相同性領域よりも長い。好ましくは、第１及び／又は第２相同性領域は、突然変異対象の細胞における内因性プリオン核酸の対応領域に対して同系である。
【００３９】
関連する態様において、本発明は、有蹄動物細胞の内因性プリオン核酸の第１領域と実質的な配列同一性を有する第１相同性領域、ポジディブセレクションマーカー、プリオン核酸の第２領域と実質的な配列同一性を有する第２相同性領域、及びポジティブセレクションマーカーとは逆の配向のネガティブセレクションマーカー（例えば、ＤＴ−Ａ又はＴｋ）（例えば、短い相同性領域の末端にプロモーターを連結するためのネガティブセレクションマーカー）を含むカセットを有する核酸を提供する。カセットは、細胞の内因性プリオン核酸中に組み込まれることができる。望ましくは、相同性領域の一方は、長さが少なくとも７、８、９、又は１０ｋｂであり、他方の相同性領域は、長さが３、２、１．５、又は１ｋｂ未満である。いくつかの実施形態において、ネガティブセレクションマーカーの一部又は全体は、短い相同性領域内に存在する。好ましくは、第１及び／又は第２相同性領域は、突然変異対象の細胞における内因性プリオン核酸の対応領域に対して同系である。
【００４０】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸及びスペルミジン（例えば、０．１〜１０ｍＭスペルミジン）を含む組成物を提供する。
【００４１】
上記態様の好ましい実施形態
好ましくは、有蹄動物の抗血清又は乳汁はポリクローナルヒト免疫グロブリンを有する。好ましくは、抗血清又は乳汁はウシ、ヒツジ、ブタ又はヤギからのものである。別の好ましい実施形態において、Ｉｇは所望の抗原に対して生じたものである。好ましい実施形態において、抗血清は、ヒトにおける疾患の治療又は予防のための静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）として用い得る。別の好ましい実施形態において、目的の抗原を有蹄動物に投与し、該抗原に対して生じるＩｇを有蹄動物により産生させる。好ましくは、異種免疫グロブリン遺伝子座における核酸セグメントが再配列し、目的の抗原と反応する異種抗体が産生される。好ましくは、抗血清及び／又は乳汁は、内因性抗体よりも少なくとも２、５、１０、２０又は５０倍以上の異種抗体を含み、あるいは内因性抗体を全く含まない。所望であれば、ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体を、上記トランスジェニック有蹄動物（例えばトランスジェニックウシ）に由来する異種Ｂ細胞を用いて調製しうる。また、有蹄動物から単離される異種抗体（例えばヒト抗体）を化学的に修飾して、それらが、トキシン、治療上有効な化合物、酵素、サイトカイン、放射性標識、蛍光標識又はアフィニティタグと共有結合するように修飾してもよいことが意図される。所望であれば、蛍光又は放射性標識を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の画像化に用いてもよい。
【００４２】
好ましくは、プリオン核酸における突然変異は、プリオンタンパク質の感染性形態の生成を低減する。好ましい実施形態において、有蹄動物により産生されるプリオンタンパク質の感染性形態の量は、突然変異を有しない対照の有蹄動物により産生されるものと比べて８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０又は５％未満である。好ましくは、感染性のプリオンタンパク質が産生されない。
【００４３】
好ましい実施形態において、突然変異は、別の動物（例えば異なる有蹄動物種又は品種）に由来するプリオン核酸の一部又は全体（例えばコード領域）の挿入である。好ましくはこの異種プリオン核酸は、内因性プリオン核酸の一部又は全体と置換されている。好ましい実施形態において、異種プリオン核酸は、プリオン感染症に対する抵抗性が高い種又は品種（例えばスクレイピーに抵抗性を示すヒツジ）に由来する。好ましくは、プリオン感染症に罹患した突然変異を有する有蹄動物の割合は、プリオン感染症に罹患した突然変異を有しない対照の有蹄動物の割合の８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０又は５％未満である。
【００４４】
好ましい有蹄動物及びドナー細胞
有蹄動物の例として、ウマ目（奇蹄類Ｐｅｒｉｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）及びウシ目（偶蹄類Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）のメンバー（ウシ（Ｂｏｓ）属のあらゆるメンバー等）が挙げられる。他の好適な有蹄動物としては、ヒツジ、オオツノヒツジ、ヤギ、野牛、カモシカ、雄牛、ウマ、ロバ、ラバ、シカ、ヘラジカ、アメリカトナカイ、水牛、ラクダ、ラマ、アルパカ、ブタ及びゾウが挙げられる。
【００４５】
好ましいドナー細胞の例としては、分化細胞、例えば、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、血液細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞、及び筋細胞、並びに未分化細胞、例えば胚性細胞（幹細胞、胚性生殖細胞など）が含まれる。別の好ましい実施形態において、細胞は、雌性生殖系、例えば乳腺、卵丘、顆粒球又は卵管細胞に由来するものである。他の好ましい細胞には、胎児細胞及び胎盤細胞が含まれる。また好ましい細胞には、任意の器官、例えば膀胱、脳、食道、ファローピウス管、心臓、腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、尿管、尿道及び子宮に由来するものがある。好ましくは、ドナー細胞、ドナー核、ドナークロマチン塊、又は再構成された卵母細胞は４倍体ではない。
【００４６】
また別の好ましい実施形態において、核、透過性化細胞又は染色体は、トランスジェニック細胞又は有蹄動物に由来するものであるか、あるいは、ドナー細胞に見出されない又は天然細胞には見出されない突然変異を含有する。好ましいトランスジェニックドナー核及びドナー細胞は、クローン化有蹄動物における疾患又は寄生虫に対する改善された抵抗性を付与するタンパク質をコードする。あるいは、ドナー核又はドナー細胞は、クローン化有蹄動物が組換え産物を産生するように、例えばウシの尿、血液又は乳汁中にヒトタンパク質を産生するように操作してもよい。例えば、タンパク質は、ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をウロプラキン（uroplakin）プロモーターの制御下に挿入することによりウシの尿中に発現させうる。クローン化ウシの乳汁中で産生しうる治療用タンパク質の例としては、ヒト凝固因子、例えば第Ｉ〜ＸＩＩＩ因子のいずれかが含まれる（Voet and Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1990）。これらの異種タンパク質は、プロラクチンプロモーター、又はウシの乳汁中での発現に適した他の任意のプロモーターの制御下にて発現させうる。これらの又は他の組織又は液体から、標準的な精製方法（例えばAusubelら、前掲参照）を用いて組換えタンパク質を精製しうる。
【００４７】
定義
本明細書で使用する「人工染色体」とは、選択マーカーの挿入、クローニング部位の挿入、１以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換等の人工的な改変を有する哺乳動物染色体又はその断片を意味する。「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」とは、１以上のヒト染色体から作製した人工染色体を意味する。人工染色体は、宿主細胞中で宿主細胞の内因性染色体とは独立に維持することができる。この場合、ＨＡＣは内因性染色体と共に安定して複製し、かつ分離されている。あるいはまた、宿主細胞の内因性染色体に転座していてもよいし、又は挿入されてもよい。２つ以上の人工染色体を、宿主細胞に同時又は逐次的に導入することができる。例えば、ヒト１４番染色体（Ｉｇ重鎖遺伝子を含む）、ヒト２番染色体（Ｉｇκ鎖遺伝子を含む）及びヒト２２番染色体（Ｉｇλ鎖遺伝子を含む）から誘導される人工染色体を導入することができる。あるいはまた、異種Ｉｇ重鎖遺伝子及びＩｇ軽鎖遺伝子の両方を含む人工染色体（ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣ等）を導入してもよい。重鎖遺伝子座と軽鎖遺伝子座は、異なる染色体腕上（セントロメアの異なる側）にあるのが好ましい。さらに別の好適な実施形態では、ＨＡＣの全体の大きさは、約１０、９、８又は７メガベース以下である。
【００４８】
「配列前又は未再配列形態の核酸」とは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを経ていない核酸を意味する。好適な実施形態では、抗体軽鎖のＶ遺伝子セグメントをコードする全ての核酸セグメントが、１以上のヌクレオチドにより、Ｊ遺伝子セグメントをコードする全ての核酸セグメントから分離されている。抗体重鎖のＶ遺伝子セグメントをコードする全ての核酸セグメントは、１以上のヌクレオチドにより、Ｄ遺伝子セグメントをコードする全ての核酸セグメントから分離されていること、及び／又は抗体重鎖のＤ遺伝子セグメントをコードする全ての核酸セグメントは、１以上のヌクレオチドにより、Ｊ遺伝子セグメントをコードする全ての核酸セグメントから分離されていることが好ましい。未再配列形態の核酸は、実質的にヒトのものであることが好ましい。他の好適な実施形態では、核酸は、ヒト由来の天然型核酸の対応する領域と、少なくとも７０、８０、９０、９５又は９９％同一である。
【００４９】
「内因性抗体の量及び／又は活性を低減する」とは、例えば２００３年５月１９日出願のＵＳＳＮ １０／４４１，５０３に記載されているようにＢ細胞により産生される内因性の機能性抗体の量又はＢ細胞の集団の量を低減することを意味する。内因性抗体の量のこの低減は、Ｂ細胞により産生される内因性抗体の量の減少、機能性の内因性Ｂ細胞の数の減少、又はその組み合わせに起因するものでありうる。好ましくは、Ｂ細胞により分泌されるか、又は内因性抗体を発現若しくは分泌するＢ細胞の表面上で発現される内因性抗体の量は、少なくとも２５、５０、７５、９０又は９５％低減する。別の好ましい実施形態において、レシピエント哺乳動物に由来するサンプル、例えば血液サンプル中の内因性Ｂ細胞の数は、少なくとも２５、５０、７５、９０又は９５％低減する。
【００５０】
「二機能性抗体」とは、異なる抗体又は抗体の異なるフラグメントに共有結合した抗体又は抗体のフラグメントを包含する。一つの好ましい実施形態において、抗体又はフラグメントの両方は、同じ抗原で発現される異なるエピトープに結合する。他の好ましい二機能性抗体は、２つの異なる抗原、例えば抗体軽鎖及び抗体重鎖の両方に結合する。標準的な分子生物学的技術、例えば本明細書に記載したものを用いて、融合核酸が二機能性抗体をコードするように、２つの核酸を機能的に結合することができる。
【００５１】
「フラグメント」とは、本発明の抗体の対応領域と同一であるが、完全長配列よりも短い、連続するアミノ酸の領域を有するポリペプチドを意味する。フラグメントは、標準的アッセイ、例えば本明細書に記載したものに基づいて、対応する抗体と同じ抗原と結合する能力を有する。好ましくは、抗原へのフラグメントの結合は、対応する抗体の結合の少なくとも２０、４０、６０、８０又は９０％である。
【００５２】
「精製された」とは、自然に付随する他の成分から分離されたことを意味する。典型的には、自然に会合するタンパク質、抗体及び天然有機化合物が少なくとも５０重量％除去されている場合には、因子は実質的に純粋である。好ましくは、因子は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、天然源からの因子の分離、又は自然に因子を産生しない組換え宿主細胞での因子の産生によって得ることができる。当業者は、タンパク質、小胞及び細胞小器官を、標準的技術、例えばAusubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2000）により記載された技術を用いて精製することができる。因子は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学濃度、ＨＰＬＣ分析又はウェスタン分析（Ausubelら、上記）を用いて測定して、出発材料の少なくとも２、５又は１０倍純粋であることが好ましい。好ましい精製方法は、免疫沈降、カラムクロマトグラフィー、例えばイムノアフィニティクロマトグラフィー、磁性ビーズイムノアフィニティ精製及びプレート結合抗体によるパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を包含する。
【００５３】
「クロマチン塊」とは、膜で囲まれていない２以上の染色体を意味する。好ましくは、クロマチン塊は細胞の全ての染色体を含む。凝縮した染色体を含む人工誘導クロマチン塊は、本明細書に記載したように、核を有糸分裂再プログラム培地（例えば、有糸分裂抽出物）に曝露することにより形成することができる。あるいは、凝縮した又は部分凝縮した染色体を含む人工誘導クロマチン塊は、本明細書に記載したように、以下の１つに曝露することにより作製することができる：すなわち、抗ＮｕＭＡ抗体を含む有糸分裂抽出物、界面活性剤及び／若しくは塩溶液、又はプロテインキナーゼ溶液。クロマチン塊は、互いに物理的に接触していない別個の染色体を含んでもよいし、又は物理的に接触している２以上の染色体を含むものであってもよい。
【００５４】
所望により、染色体凝縮のレベルは、標準的方法を用いて、ＤＮＡ染色素であるＤＡＰＩによる染色の強度を測定することによって決定することができる。染色体が凝縮すると、この染色強度は増大する。従って、染色体の染色強度は、分裂間期における脱凝縮した染色体の染色強度（０％凝縮と呼ばれる）及び有糸分裂における最大に凝縮した染色体の染色強度（１００％凝縮と呼ばれる）と比較することができる。この比較に基づいて、最大凝縮のパーセントを決定することができる。好ましい凝縮したクロマチン塊は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００％凝縮している。好ましい脱凝縮又は部分凝縮したクロマチン塊は、５０、４０、３０、２０又は１０％未満が凝縮しているものである。
【００５５】
「核」とは、細胞のＤＮＡの大部分又は全部を含む膜結合した細胞小器官を意味する。ＤＮＡは染色体に凝縮した形で詰め込まれている。好ましくは、ＤＮＡを被包する膜は、１又は２の脂質二重層を含むか、又はヌクレオポリンを有する。
【００５６】
「４対より少ない相同染色体を有する核」とは、４ｎより少ないＤＮＡ含有量を有する核を意味し、ここで、「ｎ」は特定の属又は種の哺乳動物の正常一倍体染色体対に存在する染色体の数である。このような核は４コピーの各遺伝子又は遺伝子座を持たない。好ましくは、核は二倍体であり、従って２対の相同染色体を有するが、２より少ない完全対の染色分体を有する。
【００５７】
「前核」とは、減数分裂に起因する一倍体核又は核移植前核を意味する。雌性前核は、雄性前核と融合する前の卵母細胞又は卵の核である。雄性前核は、受精時に卵母細胞又は卵に入った後であるが、雌性前核と融合する前の精子核である。核移植前核は、ドナー細胞、核又はクロマチン塊が卵母細胞に導入された後に形成する前核（例えば、二倍体前核）である。核移植前核は４対より少ない相同染色体を有する。
【００５８】
「ドナー細胞」とは、核又はクロマチン塊が誘導される細胞、又は透過性化細胞（permeabilized cell）を意味する。
【００５９】
「透過性化」とは、形質膜における孔の形成、又は形質膜の部分的若しくは完全な除去を意味する。
【００６０】
「再プログラム培地」とは、細胞、核、クロマチン塊若しくは染色体からの因子の除去、又は細胞、核、クロマチン塊若しくは染色体への因子の付加を許容する溶液を意味する。好ましくは、因子の付加又は除去により、ドナー細胞、クロマチン塊若しくは核中での、又は再プログラムされたクロマチン塊若しくは核を含む細胞中でのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが増加又は減少する。別の実施形態において、再プログラム培地における透過性化細胞、クロマチン塊又は核のインキュベーションにより、透過性化細胞又は再プログラムされたクロマチン塊若しくは核を含む細胞の表現型は、ドナー細胞の表現型に対して変化する。また別の実施形態において、透過性化細胞、クロマチン塊又は核の再プログラム培地におけるインキュベーションにより、透過性化細胞又は再プログラムされたクロマチン塊若しくは核を含む細胞が、ドナー細胞に対する活性を獲得又は損失する。
【００６１】
具体例としての再プログラム培地は、生物学的分子、例えばタンパク質又は核酸を含まない溶液（例えば緩衝液）を包含する。このような溶液は、核、クロマチン塊又は染色体から１以上の因子を除去するのに有用である。他の好ましい再プログラム培地は、抽出物、例えば細胞核又は細胞質からの細胞抽出物、又はその組み合わせである。具体例としての細胞抽出物は、卵母細胞（例えば、哺乳動物、脊椎動物又は無脊椎動物の卵母細胞）、雌生殖細胞（例えば、哺乳動物、脊椎動物又は無脊椎動物の生殖細胞、例えば精祖細胞、精母細胞、精子細胞又は精子）、及び幹細胞（例えば、成体又は胚性幹細胞）からの抽出物を包含する。また他の再プログラム培地は、１以上の天然又は組換え因子（例えば、核酸又はタンパク質、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチン再構築タンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン又は他のホルモン）が添加されている溶液若しくは抽出物、又は１以上の因子が除去されている抽出物である。さらに他の再プログラム培地としては、界面活性剤（例えば、０．０１％〜０．１％、０．１％〜０．５％又は０．５％〜２％のイオン又は非イオン界面活性剤、例えば１以上の次の界面活性剤：ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸Ｎａ、ｎ−オクチルグルコシド、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＩＧＥＰＡＬ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０又はＴｗｅｅｎ８０）、塩（例えば、約０．１、０．１５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５又は２Ｍ  ＮａＣｌ又はＫＣｌ）、ポリアミン（例えば、約１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ又は１０ｍＭのスペルミン、スペルミジン、プロタミン又はポリ−Ｌ−リジン）、プロテインキナーゼ（例えば、サイクリン依存性キナーゼ１、プロテインキナーゼＣ、プロテインキナーゼＡ、ＭＡＰキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ、ＣＫ１カゼインキナーゼ又はＣＫ２カゼインキナーゼ）、及び／又はホスファターゼ阻害剤（例えば、約１０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭの１以上の次の阻害剤：オルトバナジン酸Ｎａ、ピロリン酸Ｎａ、フッ化Ｎａ、ＮＩＰＰ１、インヒビター２、ＰＮＵＴＳ、ＳＤＳ２２、ＡＫＡＰ１４９又はオカダ酸）の溶液が挙げられる。いくつかの実施形態において、再プログラム培地は抗ＮｕＭＡ抗体を含む。所望により、複数の再プログラム培地を同時又は順次に用いて、ドナー細胞、核又はクロマチン塊を再プログラムすることができる。
【００６２】
「間期再プログラム培地」とは、クロマチンの脱凝縮及び核膜の形成を誘導する培地（例えば、間期細胞抽出物）を意味する。
【００６３】
「有糸分裂再プログラム培地」とは、クロマチンの凝縮及び核膜の分解を誘導する培地（例えば、有糸分裂細胞抽出物）を意味する。
【００６４】
「再プログラム化細胞」とは、再プログラム培地に曝露された細胞を意味する。好ましくは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又はそれより多いｍＲＮＡ又はタンパク質分子が、ドナー細胞又は透過性化細胞中で発現されない再プログラム化細胞中で、発現される。別の好ましい実施形態において、再プログラム化細胞中で発現されるが、ドナー細胞又は透過性化細胞中では発現されないｍＲＮＡ又はタンパク質分子の数は、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００又は２００〜３００（両端を含む）である。好ましくは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００又はそれより多いｍＲＮＡ又はタンパク質分子が、再プログラム化細胞中で発現されないドナー細胞又は透過性化細胞中で、発現される。また別の好ましい実施形態において、ドナー細胞又は透過性化細胞中で発現されるが、再プログラム化細胞中では発現されないｍＲＮＡ又はタンパク質分子の数は、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００又は２００〜３００（両端を含む）である。さらに別の好ましい実施形態において、これらのｍＲＮＡ又はタンパク質分子は、ドナー細胞（すなわち、ドナー細胞又は透過性化された出発細胞）及び再プログラム化細胞の両者で発現されるが、これらの細胞における発現レベルは、標準的アッセイ（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，前掲）を用いて測定して、少なくとも２、５、１０及び２０倍異なる。
【００６５】
「因子の付加」とは、クロマチン、染色体又は核膜の成分、例えば核膜又は核マトリックスへの因子の結合を意味する。あるいは、因子は核中に移入され、従って該因子は核膜により結合又は被包される。好ましくは、染色体に結合しているか又は核内に存在する因子の量は、少なくとも２５、５０、７５、１００、２００又は５００％増加する。
【００６６】
「因子の除去」とは、クロマチン、染色体又は核膜の成分、例えば核膜又は核マトリックスからの因子の解離を意味する。あるいは、因子は核から移出され、従って該因子は、もはや核膜により結合又は被包されていない。好ましくは、染色体に結合しているか又は核内に位置する因子の量は、少なくとも２５、５０、７５、１００、２００又は５００％減少する。
【００６７】
「因子の濃縮又は枯渇」とは、天然又は組換え因子が、再プログラム培地（例えば、細胞抽出物）中に元から存在する因子の数の少なくとも２０、４０、６０、８０又は１００％付加又は除去することを意味する。あるいは、再プログラム培地中に自然に存在しない天然又は組換え因子を添加することができる。好ましい因子は、タンパク質、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター及びリプレッサー；膜小胞及び細胞小器官を包含する。一つの好ましい実施形態において、因子は、以下に記載するように、再プログラム培地に添加される前に精製される。あるいは、以下に記載する精製方法の１つを用いて、望ましくない因子を再プログラム培地から除去することができる。
【００６８】
「再クローン化」とは、クローン化の第二ラウンドに用いることを意味する。特に、本発明の方法から作製した胚、胎仔又は成体に由来する細胞を、有糸分裂再プログラム培地（例えば、有糸分裂細胞抽出物）中でインキュベートして、上記のように脱核卵母細胞に挿入するためのクロマチン塊を形成することができる。あるいは、細胞を透過性化し、再プログラム培地中でインキュベートし、そして上記のように脱核卵母細胞に挿入することができる。クローン化の２以上のラウンドを行うと、ドナークロマチン塊又はドナー細胞のさらなる再プログラムを生じることができ、これによってクローン化の最終ラウンド後に生存子孫が得られる確率が増大する。
【００６９】
「生存子孫」とは、子宮外で生存する哺乳動物を意味する。好ましくは、哺乳動物は、それが母性宿主を出た時点から少なくとも１秒、１分、１時間、１日、１週間、１ヵ月、６ヵ月又は１年間生存する。哺乳動物は、生存するために子宮外環境の循環系を必要としない。
【００７０】
「核移植（nuclear transfer）卵母細胞」又は「核移植（nuclear transplant）卵母細胞」とは、ドナー細胞、核又はクロマチン塊が挿入又は融合された卵母細胞を意味する。卵母細胞から形成される胚は、「核移植」又は「核移植」胚と呼ばれる。
【００７１】
「胚」又は「胚性」とは、母性宿主の子宮膜に移植（implant）されていない、発育している細胞塊を意味する。従って、「胚」という用語は、受精した卵母細胞；ドナークロマチン塊、核又は再プログラム化細胞を含む卵母細胞；前胚盤胞期の発育している細胞塊；又は母性宿主の子宮膜への移植前、及び生殖隆起の形成前の発育期にある他の任意の発育している細胞塊を指すことができる。胚は、細胞発育の複数の段階を表すことができる。例えば、ある胚は接合体と呼ばれることがあり；分割した胚に起因する細胞の固体球状塊は桑実胚と呼ばれることがあり、そして割腔を有する胚は胚盤胞と呼ばれることがある。「胚性細胞」は、胚から単離されたか又はそれに含まれる細胞である。
【００７２】
「胚由来の細胞」とは、胚における細胞の細胞分裂に起因する細胞を意味する。
【００７３】
「キメラ胚」とは、２以上の胚に由来する細胞から形成された胚を意味する。生じる胎仔又は子孫は、初期胚の１つのみから誘導される細胞、又は、初期胚の２以上から誘導される細胞を有することができる。所望により、胎盤組織及び胎仔組織に取込まれる、各胚に由来する細胞のパーセンテージは、標準的なＦＩＳＨ分析又は１つの胚に加えた膜色素の分析を用いて測定することができる。
【００７４】
「キメラ有蹄動物」とは、２以上の胚に由来する細胞から形成された有蹄動物を意味する。有蹄動物は、初期胚の１つのみに由来する細胞、又は、初期胚の２以上に由来する細胞を有することができる。所望により、胎盤組織及び胎児組織に取込まれる、各胚に由来する細胞のパーセンテージは、標準的ＦＩＳＨ分析又は１つの胚に加えた膜色素の分析を用いて測定することができる。
【００７５】
「緊密化前胚」とは、緊密化する前の胚を意味する。緊密化前胚は、その割球の表面でＥ−カドヘリンを本質的に発現しない。好ましい緊密化前胚は、同じ種の完全に緊密化した胚よりも、少なくとも３、５、１０、２０、３０又は４０倍少ない（３、５、１０、２０、３０又は４０分の１の）Ｅ−カドヘリンを発現する。
【００７６】
「緊密化胚」とは、緊密化を受けている胚又は緊密化後の胚を意味する。緊密化胚の割球は、それらの表面でＥ−カドヘリンを発現する。このＥ−カドヘリン発現は、抗Ｅ−カドヘリン抗体を用いる標準的方法を用いて測定することができる。Ｅ−カドヘリンは割球間の接着性を増大する。好ましい緊密化胚は、緊密化過程が完了している胚を包含する。他の好ましい緊密化胚は、同じ種の緊密化前胚よりも、少なくとも３、５、１０、２０、３０又は４０倍多いＥ−カドヘリンを発現する。
【００７７】
「胎仔」とは、母性宿主の子宮膜内に移植された、発育している細胞塊を意味する。胎仔は、当業者により容易に確認される生殖隆起のような明確な特徴を有することがある。「胎仔細胞」は、胎仔から単離されるか又はそれに含まれる任意の細胞である。
【００７８】
「単為生殖」又は「単為生殖活性化」とは、卵母細胞又は卵が、その核と雄性前核とが融合することなく発育することを意味する。例えば、卵母細胞が受精することなく分裂するように誘導することができる。
【００７９】
「透明体」とは、多くの哺乳動物の卵母細胞又は卵を取囲む半透明の柔軟な非細胞性層を意味する。
【００８０】
「栄養外胚葉」とは、哺乳動物胚性発育の胚盤胞期中の胞胚腔を取囲む細胞の最外層を意味する。栄養外胚葉は、さらに発育すると胎盤組織の大部分又は全部を生じる。
【００８１】
「内部細胞塊」とは、栄養外胚葉により取囲まれた細胞を意味する。内部細胞膜は、さらに発育すると胎仔組織の大部分を生じる。
【００８２】
「ある細胞型に特異的なｍＲＮＡ又はタンパク質」とは、ある細胞型において、他の全ての細胞型における発現レベルよりも、少なくとも１０、２０、５０、７５又は１００倍大きいレベルで発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質を意味する。好ましくは、ｍＲＮＡ又はタンパク質は、ある細胞型においてのみ発現される。
【００８３】
「突然変異」とは、天然又は参照核酸配列の変化、例えば挿入、欠失、フレームシフト、サイレント変異、ナンセンス変異又はミスセンス変異を意味する。好ましくは、核酸配列によりコードされるアミノ酸配列は、天然配列から少なくとも１つのアミノ酸の変化を有する。細胞、胚、胎仔又は哺乳動物の遺伝子配列を改変するための組換えＤＮＡ技術の例は、ゲノムへの別の生物（例えば、ヒト）に由来するＤＮＡ配列の挿入、１以上のＤＮＡ配列の欠失、及び標的ＤＮＡ配列への１以上の塩基変異（例えば、部位特異的又はランダム変異）の導入を包含する。これらの改変をもたらす方法の例は、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターを用いるランダム挿入、相同組換え、遺伝子ターゲティング、トランスポゾン要素、及び外来ＤＮＡを導入するための任意の他の方法を包含する。これらの技術の全ては分子生物学の当業者に周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，上記参照）。改変ＤＮＡ又はドナートランスジェニック細胞を含むトランスジェニック細胞に由来するクロマチン塊、染色体及び核は、本発明の方法に使用することができる。
【００８４】
「不死化」とは、不死化細胞と同じ細胞型、属及び種の天然対照細胞よりも、又は不死化細胞を誘導したドナー細胞よりも、少なくとも２５、５０、７５、９０又は９５％多い細胞分裂を行う能力を有することを意味する。好ましくは、不死化細胞は、対照細胞よりも少なくとも２、５、１０又は２０倍多い細胞分裂を行うことができる。より好ましくは、不死化細胞は、無限数の細胞分裂を行うことができる。不死化細胞の例は、該細胞の正常な増殖調節過程を変更するｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの変異を自然に獲得する細胞を包含する。さらに他の好ましい不死化細胞は、癌遺伝子、例えばｒａｓ、ｍｙｃ、ａｂｌ、ｂｃｌ２若しくはｎｅｕを発現するように遺伝的に改変された細胞、又は形質転換ＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス若しくはＳＶ４０ウイルスに感染させた細胞を包含する（Kumarら、Immunol. Lett. 65:153-159, 1999；Knightら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1988；Shammahら、J. Immunol. Methods 160-19-25, 1993；Gustafsson及びHinkula、Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994；Kataokaら、Differentiation 62:201-211, 1997；Chatelutら、J. Immunol. 48:659-666, 1998）。また、細胞は、テロメラーゼ遺伝子を発現するように遺伝的に改変されていてもよい（Roquesら，Cancer Res. 61:8405-8507, 2001)。
【００８５】
「非不死化」とは、上記のように不死化されていないことを意味する。
【００８６】
「融合性化合物（fusigenic compound）」とは、クロマチン塊又は核が、レシピエント細胞に隣接して存在するときに、該細胞に挿入される確率を増大する化合物を意味する。例えば、融合性化合物は、細胞の形質膜に対するクロマチン塊又は核のアフィニティを増大する。また、融合性化合物は、細胞の形質膜との核の核膜の結合を促進することができる。
【００８７】
「実質的に同一」とは、別の配列に対して少なくとも６０、７０、８０、９０又は１００％の同一性を有する配列を有することを意味する。配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを用い、そこで規定されたデフォルトパラメータにより測定される（例えば、配列解析ソフトウエアパッケージ（Sequence Analysis Spftware Package）；Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）。このソフトウェアのプログラムは、種々の置換、欠失及び他の改変との相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列と一致させるものである。
【００８８】
利点
本発明により、プリオン遺伝子の一方又は両方のアレルに突然変異を有するトランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）の作製に関して多数の利点が提供される。例えば、本明細書に記載するプリオンノックアウトベクター、細胞培養法及びトランスフェクション法によって、驚くべき高頻度でウシ細胞におけるプリオン遺伝子を不活化された。本発明の改善された核移植方法（例えば、クロマチン移植及びＳＬＯＴ）と組み合わせて多数の正確にターゲティングされたドナー細胞を用いることにより、プリオンタンパク質の発現が低減された又は全くないクローン化トランスジェニック有蹄動物（例えばウシ）の作製が多大に促進される。これらの得られるトランスジェニック有蹄動物は、農業製品（例えば肉類）及び医薬品（例えば、トランスジェニック有蹄動物において１以上の異種核酸によりコードされるヒト治療用抗体）の望ましい供与源である。
【００８９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記載及び請求項から明らかであろう。
【００９０】
図面の簡単な説明
本願の書類は、着色した図面（図３１、３４Ａ−３４Ｃ、３６Ａ、３６Ｂ、４２Ａ−４２Ｄ、４５Ａ、４６Ｄ、４７Ａ、４７Ｃ、４８、４９Ｂ、５０Ａ−５０Ｄ及び５１Ｃ−５１Ｅ）を含む。着色した図面を含む本特許又は特許出願の複写は、請求及び必要な費用の支払いにより特許庁より提供されうる。
【００９１】
図１Ａは、Ｉｇノックアウト及びヒト人工染色体を含むウシを作製するのに使用する手順の概要である。図１Ａ中の時系列は、Ｉｇノックアウトベクターを調製しノックアウト細胞を生成するのに予測される１８ヶ月、ノックアウト細胞から胎仔を生成する２ヶ月、その後のノックアウトを行うための９ヶ月、仔ウシが産まれるまでの９ヶ月の妊娠期、仔ウシから胚が生成するまでの１２ヶ月、及びＨＡＣ導入を行うための６ヶ月に基づく。
【００９２】
図１Ｂは、内因性Ｉｇ遺伝子中に突然変異を含み、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣを含むウシを作製するのに使用する方法の概要である。図１Ｂ中の時系列に関して、雄性及び雌性ノックアウト細胞を単離するのに、１週に２５０のコロニー、３ヶ月間に合計３，０００のコロニーがスクリーニングされると考えられる。１，５００コロニー当たり１つ以上のノックアウトコロニーが生成すると仮定する。ホモ接合ノックアウト有蹄動物は、（１）核移植の前に第２のＩｇ突然変異を単離ノックアウト細胞に導入するか、（２）第２のＩｇ突然変異を、第１ラウンドの核移植から生成した胚、胎仔（例えば、妊娠約６０日目の胎仔）若しくは子孫から得た細胞に導入し、得られたホモ接合細胞を第２ラウンドの核移植のドナー細胞として使用するか、又は（３）ヘミ接合有蹄動物を交配させること、により作製し得る。図１Ａ及び図１Ｂ中、「Ｈｏｍｏ」はホモ接合を示し、「Ｈｅｍｉ」はヘミ接合を示し、「Ｈ」は重鎖を示し、「Ｌ」は軽鎖を示し、「ＨＡＣ」はヒト人工染色体を示し、「ＨＡＣ１」はいずれかのＨＡＣを示し、「ＨＡＣ２」は第２のＨＡＣを示す。
【００９３】
図２Ａは、本発明によるμ（ＩｇＭ重鎖）ノックアウト構築物を示す。図２Ｂは、ホルスタイン牛由来の免疫グロブリン遺伝子座の制限マップである。
【００９４】
図３Ａ及び３Ｂは、構築物ｐＳＴｎｅｏＢとｐＬｏｘＰ−ＳｔｎｅｏＢの概略図である。それぞれ、μノックアウトＤＮＡ構築物を作製するために使用した。
【００９５】
図３Ｃは、μノックアウトＤＮＡ構築物を示す。
【００９６】
図３Ｄは、μノックアウト構築物中の第１の相同性領域として使用したゲノムウシμ重鎖遺伝子座の１．５ｋｂ領域のポリヌクレオチド配列である（配列番号４７）。
【００９７】
図３Ｅは、μノックアウト構築物中の第２の相同性領域として使用したゲノムウシμ重鎖遺伝子座の３．１ｋｂ領域のポリヌクレオチド配列である（配列番号４８）。この配列において、「ｎ」はそれぞれ任意のヌクレオチドを示すか、ヌクレオチドが無いことを示す。連続する「ｎ」ヌクレオチドの領域は、ポリヌクレオチド配列が決定されていない約０．９〜１．０ｋｂの領域を表す。
【００９８】
図３Ｆは、ピューロマイシン耐性ウシμ重鎖ノックアウト構築物を示す。
【００９９】
図３Ｇは、ウシκ軽鎖ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である（配列番号６０）。この配列の全体又は一部は、κ軽鎖ノックアウト構築物に使用し得る。さらに、このκ軽鎖は、κ軽鎖ノックアウト構築物に使用されるゲノムκ軽鎖配列を単離するのに使用し得る。
【０１００】
図４は、ΔＨＡＣ及びΔΔＨＡＣの構築の概略図である。
【０１０１】
図５は、ΔＨＡＣ胎仔中のヒト重鎖及び軽鎖をコードするゲノムＤＮＡの存在を示すアガロースゲルの写真である。
【０１０２】
図６は、妊娠７７日目のΔＨＡＣ胎仔（胎仔＃５９９６）中のヒトＣμエキソン３及び４の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１０３】
図７は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中の内因性ウシ重鎖の再配列を示すアガロースゲルの写真である。
【０１０４】
図８は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中の再配列ヒト重鎖の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１０５】
図９は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中のヒト重鎖遺伝子座由来のスプライシングされた定常領域の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１０６】
図１０は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中の再配列ヒト重鎖の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１０７】
図１１Ａは、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６由来の再配列ヒト重鎖転写産物のポリヌクレオチド配列である（配列番号４９）。
【０１０８】
図１１Ｂは、この配列（「Ｑｕｅｒｙ（問合せ）」）のある領域と、ヒト抗肺炎球菌抗体（「Ｓｂｊｃｔ（対象）」）との配列アライメントである（それぞれ配列番号５０及び５１）。ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６由来の問合せ配列については、ヒト抗肺炎球菌抗体配列の対応するヌクレオチドと異なるヌクレオチドのみを示してある。
【０１０９】
図１２Ａ〜１２Ｂは、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６由来の再配列ヒト重鎖転写産物の追加のポリヌクレオチド配列（配列番号５２及び５４）、及びその推定アミノ酸配列（配列番号５３及び５５）である。
【０１１０】
図１３は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５５８０が、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の両方を含むことを実証するアガロースゲルの写真である。
【０１１１】
図１４は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂが、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の両方を含むことを実証するアガロースゲルの写真である。
【０１１２】
図１５は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５５４２Ａ中のヒト重鎖遺伝子座に由来するスプライスμ定常領域の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１１３】
図１６は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａ中のヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１１４】
図１７は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂ中のヒトＩｇλ遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１１５】
図１８は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ中のヒトＩｇλ遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１１６】
図１９は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａ中のヒトＩｇλ遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【０１１７】
図２０は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ由来の再配列ヒト軽鎖転写産物のポリヌクレオチド配列、及び対応する推定アミノ酸配列である（それぞれ、配列番号５６及び５７）。
【０１１８】
図２１は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ由来の再配列ヒト軽鎖転写産物の別のポリヌクレオチド配列、及び対応する推定アミノ酸配列である（それぞれ、配列番号５８及び５９）。
【０１１９】
図２２Ａ〜２２Ｈは、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ（図２２Ａ〜図２２Ｄ）及び５４４２Ｂ（図２２Ｅ〜図２２Ｈ）によるヒトλ軽鎖及びウシ重鎖タンパク質の発現のＦＡＣＳ分析のグラフである。これらの胎仔の脾臓由来のリンパ球を、フィコエリトリン標識化抗ヒトλ抗体と（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）、ＦＩＴＣ標識化抗ウシＩｇＭ抗体と（図２２Ｄ及び２２Ｈ）、又は抗体無しで（図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｅ及び図２２Ｆ）反応させ、ＦＡＳＣａｌｉｂｕｒ細胞ソーター上で分析した。抗体の１つで標識化された細胞のパーセンテージは、各ヒストグラムの下に表示している。
【０１２０】
図２３は、ピューロマイシン耐性遺伝子及び転写終結配列を、ウシ細胞中の内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に挿入するために使用する、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトベクターの概略図である。
【０１２１】
図２４は、ＡＡＶターゲッティングベクターの骨格として使用された、エキソン２、３及び４を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片の概略図である。ネオマイシン耐性マーカーを、エキソン４に挿入して、遺伝子座の挿入突然変異に使用した。その後適切なターゲッティングの確認のために使用したＰＣＲプライマーのアニーリング部位の位置を示してある。
【０１２２】
図２５は、内因性ウシＩｇＨ配列を除去するために設計されたアデノ随伴ウイルス構築物の構造の概略図である。
【０１２３】
図２６は、適切なターゲッティング事象のために個々に形質導入されたクローンのＰＣＲ分析を示すアガロースゲルの写真である。この実験において使用したベクターは、図２５に示す。適切なターゲッティングを示すＰＣＲ生成物は、＊印を付けた。
【０１２４】
図２７は、ＨＡＣ担持胚について妊娠率をまとめて示す表である。
【０１２５】
図２８Ａ〜２８Ｊは、Ｂ細胞の発育を抑制するために抗ウシＩｇＭ抗体（ｄａｓ６）を注射した実験胎仔又は対照胎仔のいずれかからの末梢血リンパ球のＦＡＣＳ解析の写真である。図２８Ａ〜２８Ｅは、Ｂ細胞の表面上で発現されるＩｇＭ分子を検出するために抗ウシＩｇＭ抗体を用いて行ったＦＡＣＳ解析の写真である。図２８Ａ及び２８Ｂに示すように、対照胎仔からの約１９．８２〜２６．６１％の末梢血リンパ球がＩｇＭを発現した。一方、抗ウシＩｇＭ抗体を注射した３頭の胎仔からの末梢血リンパ球の７．７８％、１１．８０％又は３．９５％がＩｇＭを発現した（それぞれ図２８Ｃ〜２８Ｅ）。図２８Ｆ〜２８Ｊは、Ｂ細胞の表面上で発現される抗体軽鎖分子を検出するために抗ウシ軽鎖抗体（ｄａｓ１０）を用いて行ったＦＡＣＳ解析の写真である。図２８Ｆ及び図２８Ｇに示されるように、対照胎仔からの末梢血リンパ球の約１２．４３〜２９．４７％が抗体軽鎖分子を発現した。一方、抗ウシＩｇＭ抗体を注射した３頭の胎仔からの末梢血リンパ球の２．５４％、１３．７７％又は３．９９％が抗体軽鎖分子を発現した（それぞれ図２８Ｈ〜２８Ｊ）。
【０１２６】
図２９Ａ〜２９Ｂは、ウシ移植前胚における核膜及び核マトリックスタンパク質の免疫検出を示す。図２９Ａは、同じ抗体を用いて試験した前核期及び８細胞期におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚の写真である。図２９Ａにおける矢印は、前核期胚の雌性前核における抗ＮｕＭＡ及び抗ＡＫＡＰ９５標識を指す。図２９Ａにおける差込図は、０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で標識したＤＮＡの写真である（バー、２０μｍ）。図２９Ｂは、ウシ線維芽細胞（上段）及び前核期胚（下段）のイムノブロッティング分析である。分子量マーカーは図２９Ｂの右側にｋＤａで示している。
【０１２７】
図３０は、ウシドナー線維芽細胞（ドナー細胞）、未成熟クロマチン凝縮期の核移植胚（融合の３時間後）、前核期の核移植胚（融合の１９時間後）、及び本明細書に記載のように活性化した単為生殖前核期胚の写真である。ドナー核の分解（disassembly）及び新たな前核の形成（assembly）は、抗ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５抗体を用いて、注射の３時間後「ｈｐｉ」の未成熟クロマチン凝縮期（ＰＣＣ）及び注射の７時間後の未成熟クロマチン凝縮期（ＮＴ  ＰＮ）でモニターした。１０ｍＭ  ＳｒＣｌ２でのＭＩＩ卵母細胞の単為生殖活性化後に形成された雌性前核はまた、活性化処理の開始から５時間後に分析した（Ｐａｒｔｈ．ＰＮ）。ラミンＡ／Ｃはウシ前核期の核移植胚の前核において生成された。ＤＮＡは、０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で対比染色した。ＴＲＩＴＣとは、ＴＲＩＴＣ結合二次抗体での標識を意味する（バー、２０μｍ）。
【０１２８】
図３１は、ＡＫＡＰ９５が、単為生殖胚と比較して、核移植胚の前核においてより強力に固定（存在）することを示すグラフである。このグラフは、３％パラホルムアルデヒドでの固定前に、室温にて３０分かけて０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩと、１００又は３００ｍＭ ＮａＣｌを用いたｉｎ ｓｉｔｕ抽出後の、単為生殖胚及び核移植胚の前核、並びに体細胞ドナー核における未抽出ラミンＢ、ＡＫＡＰ９５及びＤＮＡ標識の相対割合（％）を示す。Ｂ型ラミン（赤）及びＡＫＡＰ９５（緑）の局在を、二重免疫蛍光により調べた。各波長における蛍光標識強度、すなわち赤（ラミンＢ）、青（ＤＮＡ）及び緑（ＡＫＡＰ９５）を定量した。基準値（１００％未抽出）は、胚、又は固定化前にのみ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて透過性化した細胞におけるＢ型ラミン、ＤＮＡ及びＡＫＡＰ９５染色の相対量を表す。約３０個の胚を各群で試験した。
【０１２９】
図３２は、線維芽細胞融合と、５μＭイオノマイシンで４分間の後、１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド／２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤで４時間（ｂ’、−）、（ｂ’）のようにイオノマイシン／シクロヘキシミド／サイトカラシンＤの後、さらに１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドでの９時間の培養（ｂ’’、ＣＨＸ）、又は活性化処理期間全体において（ｂ’）と同様にまた１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤと共にインキュベートする（ｂ’’’）、のいずれかによる卵母細胞活性化によって作製されたウシ前核核移植胚の写真である。抗ラミンＢ抗体（ウサギポリクローナル）及び抗ラミンＡ／Ｃ抗体（ｍＡｂ）を同じ調製物に対して使用した。差込図は、０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２を用いたＤＮＡ標識の写真である（バー、２０μｍ）。
【０１３０】
図３３は、有糸分裂細胞質抽出物（Ｍ−Ｓ１５）、有糸分裂サイトゾル抽出物（Ｍ−Ｓ２００）、及び卵母細胞抽出物（ＭＩＩ−Ｓ１５）における染色体凝縮及び核膜の分解のグラフである（ｎ＝３００〜４００核、３〜５回の反復実験で試験した）。
【０１３１】
図３４Ａ〜３４Ｃは、精製した導入ウシ線維芽細胞核（図３４Ａ）、及び有糸分裂サイトゾル抽出物で生成された凝縮クロマチン（図３４Ｂ）、及び卵母細胞抽出物（図３４Ｃ）の免疫蛍光分析の写真のセットである。表示する核マーカーを試験した。ＤＮＡはヨードプロピジウム（赤）で対比染色した（バー、１０μｍ）。
【０１３２】
図３５は、慣用の核移植法（ＮＴ）又は核注入法（ＮＩ）の後、及び本発明の方法を用いたクロマチン塊の卵母細胞への注入（ＣＴ）後に卵母細胞で得られる凝縮クロマチンの免疫蛍光分析の写真のセットである。検出可能なラミンＢ及びＡ／Ｃの両方が可溶化する（バー、１０μｍ）。
【０１３３】
図３６Ａ〜３６Ｂは、クロマチン移植、核移植、又は核注入から得られる前核の免疫蛍光分析の写真のセットである。胚は、核移植、核注入又はクロマチン移植の１９時間後に固定し、標識した。対照の単為生殖前核（Ｐａｒｔ．）も試験した。図３６Ａは、ラミンＡ／Ｃ及びＢの分析を示す。図３６Ｂは、ＡＫＡＰ９５及びＮｕＭＡの分析を示す。ラミンＡ／Ｃ（緑色標識）のみが、核移植及び核注入前核においてみとめられた（バー、３０μｍ）。
【０１３４】
図３７は、クローン化Ｔｃ仔ウシの作出手順の図解である。ＨＡＣの構築は、Ｉｇλ及びＩｇＨ遺伝子を含むｈＣｈｒ２２及びｈＣｈｒ１４領域、並びにｎｅｏ選択マーカーの位置を用いて示す。ＣＨＯクローンから、ＭＭＣＴ技術を用いてＨＡＣをウシ胎仔線維芽細胞に移入した。Ｔｃ線維芽細胞を核移植のために脱核卵母細胞と融合した。再構成されたＴｃ胚を胚盤胞期までｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、その後レシピエントウシに移植した。約６０日間の妊娠期間のＴｃ胎仔を回収し、線維芽細胞系を再度確立し、評価し、さらなる核移植に使用した。再クローン化Ｔｃ胚はレシピエントに導入して、Ｔｃ仔ウシを作出させた。
【０１３５】
図３８Ａ〜３８Ｄは、Ｔｃ胎仔の分析を説明する。再生したＴｃ線維芽細胞系及び対照非トランスジェニック線維芽細胞のＧ４１８選択（図３８Ａ）。Ｔｃ胎仔及び対照におけるＩｇＨ及びＩｇｌ遺伝子座のゲノムＰＣＲ。３頭の胎仔、すなわち＃５９６８（レーン１）、＃６０３２（レーン２）及び＃６０４５（レーン３）はΔＨＡＣ線維芽細胞に由来し、胎仔＃５５８０（レーン４）はΔΔＨＡＣ線維芽細胞に由来する。対照として、非トランスジェニック胎仔（レーンＮ）を回収し、評価した（図３８Ｂ）。全てのＴｃ胎仔及び陽性対照ヒト脾臓ＤＮＡサンプル（レーンＰ）において、ヒトＩｇＨ及びＩｇｌ遺伝子座の両方がＰＣＲにより検出されたが、陰性対照には検出されなかった（レーンＮ）。再配列され発現されたヒトＩｇμ及びＩｇλの転写産物が、陰性対照非トランスジェニックウシの脾臓（レーンＮ）、クローン化Ｔｃ胎仔の脳（レーン１）、肝臓（レーン２）及び脾臓（レーン３）、並びに陽性対照ヒト脾臓（レーンＰ）から、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅された（図３８Ｃ）。９１日目に回収されたクローン化Ｔｃ胎仔からＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたヒトＩｇμ及びＩｇλ転写産物の代表的なヌクレオチオド配列及び推定アミノ酸配列（図３８Ｄ）。ＲＴ−ＰＣＲは記載のように実施した（Kuroiwaら, Nature Biotech 18:1086-1090, 2000）。ヒトＩｇμ転写産物については、ＶＨ１／５  ＢＡＣＫ、ＶＨ３  ＢＡＣＫ、及びＶＨ４ＢＡＣＫを５’プライマーとして用い、Ｃμ−２を３’プライマーとして用いた。ヒトＩｇλ転写産物については、Ｖλ１ＬＥＡ１、Ｖλ２ＭＩＸ及びＶλ３ＭＩＸを５’プライマーとして用い、ＣλＭＩＸを３’プライマーとして用いた。増幅されたｃＤＮＡは、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてサブクローニングし、ＤＮＡ自動シーケンサー（ABI3700 system）を用いて配列決定した。
【０１３６】
図３９Ａ〜３９Ｃは、クローン化Ｔｃ仔ウシの分析を示す写真である。４頭のクローン化Ｔｃ仔ウシ、すなわち細胞系＃６０４５からの雄仔ウシ（＃５０）、及び細胞系＃５９６８からのメス仔ウシ（＃１０６４、＃１０６５、＃１０６６）（図３９Ａ）。クローン化Ｔｃ仔ウシ及び対照からのＰＢＬ由来のＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子座のゲノムＰＣＲ；仔ウシ＃１０６４（レーン１）、＃１０６５（レーン２）、＃１０６６（レーン３）、＃５０（レーン４）、＃１０６７（レーン５）及び＃１０６８（レーン６）（図３９Ｂ）。全てのＴｃ仔ウシ及び陽性対照ヒト肝臓ＤＮＡ（レーンＰ）において、ＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子座の両方がゲノムＰＣＲにより検出されたが、陰性対照の非トランスジェニック仔ウシにおいては検出されなかった（レーンＮ）。間期染色体におけるＦＩＳＨ分析は単一シグナルを示す細胞及び二重シグナルを示す細胞に分布する（図３９Ｃ）。矢印は、周囲のウシ染色体におけるＨＡＣの位置を示す。ＨＡＣの染色は、ジゴキシゲニン標識ヒトＣＯＴ−１  ＤＮＡをプローブとして用いて行い、抗ジゴキシゲニン−ローダミンを用いて検出した。
【０１３７】
図４０Ａ〜４０Ｂは、ウシ胎仔線維芽細胞（図４０Ａ）、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した前核及び８〜１６細胞期ウシ胚（図４０Ｂ）における、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５の免疫蛍光分布を示す。矢印は、雌性前核（両方の前核のうち最小のもの）におけるＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５蛍光標識を示す。差込図は、０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で標識したＤＮＡである。
【０１３８】
図４０Ｃは、ウシ線維芽細胞（Ｆｉｂ）及び前核胚（ＰＮ）における、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５のイムノブロッティング分析を示す。バー：１０μｍ（図４０Ａ）、５０μｍ（図４０Ｂ）。
【０１３９】
図４１Ａ〜４１Ｄは、ウシＮＴ胚における核エンベロープ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５の動態を示す。ドナー線維芽細胞核の分解（disassembly）及び新しい前核の形成（assembly）を、所定の抗体（ＴＲＩＴＣ）を用いてＰＣＣ期及びＰＮ期に免疫蛍光によりモニターした（図４１Ａ）。同様の活性化手順後の単為発生前核もまた試験した（Ｐａｒｔ．ＰＮ）。各抗体により標識された胚のパーセント（±ＳＤ）を示す（ｎ〜２０個の胚／群、３回試験）。レシピエント卵母細胞は、５μＭイオノマイシンで４分間の後１０μｇ／ｍｌ ＣＨＸ／２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤで４時間の処理（ｂ）、（ｂ）のようにイオノマイシン／ＣＨＸ／サイトカラシンＤの後、１０μｇ／ｍｌ ＣＨＸで９時間の処理（ｂ’）、又は、（ｂ）のように活性化処理の間に５μｇ／ｍｌ ＡｃｔＤと共に処理（ｂ’’）のいずれかで活性化した（図４１Ｂ）。ＤＮＡ（Ｂの挿入図）は、ヘキスト３３３４２で標識した。バー＝１０μｍ。図４１Ｃは、未処理（−）ＮＴ胚（１００％蛍光）と比較した、ＣＨＸ及びＡｃｔＤ処理ＮＴ胚におけるラミンＡ／Ｃ、ラミンＢ及びＮｕＭＡの免疫蛍光強度の平均±ＳＤの棒グラフである（ｎ＝３０胚／群、３回試験）。図４１Ｄは、ＮＴ胚の前核におけるＡＫＡＰ９５の核内固定（intranuclear association）の棒グラフである。ＰＮ期の単為生殖胚（Ｐａｒｔ．）及びＮＴ胚（ＮＴ）、並びにドナー線維芽細胞（Ｆｉｂ）を、固定前に０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍｇ ＤＮＡｓｅＩ／３００ｍＭ ＮａＣｌで抽出した。ラミンＢ及びＡＫＡＰ９５は免疫蛍光により試験し、ＤＮＡをヘキスト３３３４２で染色した。データは、非抽出単為生殖胚若しくはＮＴ胚、又は体細胞における蛍光（１００％蛍光）と比較した、ラミンＢ、ＤＮＡ、及びＡＫＡＰ９５の免疫標識強度の平均±ＳＤとして示す（ｎ〜３０個の胚／群、３回試験）。バー＝１０μｍ。
【０１４０】
図４２Ａ〜４２Ｄは、ＣＴが、ラミンＡ／Ｃ及びＮｕＭＡを欠損する胚をもたらすことを示す。ラミンＡ／Ｃ及びＢ、ＮｕＭＡ並びにＡＫＡＰ９５の再分布は、有糸分裂ウシ線維芽細胞からの抽出物中でインキュベートしたウシ線維芽細胞の核における免疫蛍光によりモニターした（Chaudhary et al., J. Cell Biol. 122:295-306, 1993）（図４２Ａ）。ＤＮＡを０．１μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで標識した。所定のマーカーの分解（標識の消失）を示す核の割合（％）を示す（ｎ＞２００核／マーカー、３回の試験）。ＰＮ胚は、ＣＴ、ＮＴ、ＮＩ又は単為生殖により生じ、ラミンＡ／Ｃ及びＢ、ＮｕＭＡ並びにＡＫＡＰ９５の分布は活性化の開始の１４時間後における免疫蛍光により調べた（Poccia et al., Trends Biochem. Sci. 17:223-227, 1992；及びChaudhary et al., J. Cell Biol. 122:295-306, 1993）（図４２Ｂ）。ＤＮＡをヘキスト３３３４２で標識した。ＰＮ期ＮＴ胚における免疫光度と比較したＣＴ、ＮＩ又は単為生殖胚における所定のマーカーの免疫蛍光強度の平均±ＳＤを示す（ＮＴ＝１００％蛍光；ｎ＝１５〜２０個の胚／マーカー、３回試験）（図４２Ｃ）。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＤＮＡｓｅＩ／ＮａＣｌで抽出した後のＰＮ期ＮＴ胚及びＣＴ胚におけるラミンＢ、ＤＮＡ及びＡＫＡＰ９５の免疫標識強度を示す（図４２Ｄ）。値をそれぞれ非抽出の前核ＮＴおよびＣＴ胚と比較した蛍光強度の平均±ＳＤとして表す（ｎ＝約１５個の胚／マーカー／処理、３回試験）。バー＝１０μｍ（図４２Ａ）、２０μｍ（図４２Ｂ）。
【０１４１】
図４３Ａ〜４３Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドナー核の分解とＣＴによる再構成された前核におけるＴＢＰの局在の改変を示す。ＮＴ及びＣＴの過程のＴＢＰの動態は、ドナー線維芽細胞（Ｆｉｂ）、ＰＣＣ期の凝縮クロマチン（ＮＴ ＰＣＣ）、有糸分裂抽出物中で凝縮したドナー染色体（ＭＳ１５ ＣＣ）、ＮＴ前核（ＮＴ ＰＮ）、及びＣＴ前核（ＣＴ ＰＮ）の免疫蛍光分析を図４３Ｂにおいて比較する。ＤＮＡをヘキスト３３３４２で標識した。バー＝２０μｍ。各期におけるＴＢＰ／ＡＫＡＰ９５及びＴＢＰ／ＤＮＡ蛍光強度の比を図４３Ａに、単為生殖前核（Ｐａｒｔ．ＰＮ）における蛍光強度の比を図４３Ｂに示す。群当たり１０〜１３個の胚における蛍光強度の平均±ＳＤを示す。
【０１４２】
図４４Ａは、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明のプリオンタンパク質ノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｎｅｏベクター）の概略図である。この概略は、正確にターゲティングされたクローンを同定する手法について説明する。
【０１４３】
図４４Ｂは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む、本発明のプリオンタンパク質ノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏベクター）の概略図、及び正確にターゲティングされたクローンを同定する手法を示す。
【０１４４】
図４４Ｃは、種々のウシ線維芽細胞系における本発明のプリオンタンパク質ノックアウトベクターを用いたプリオンタンパク質遺伝子座での相同組換えの頻度を示す表である。
【０１４５】
図４５Ａは、ＮＴ及びＳＬＯＴ胚からの前核におけるラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ、ＡＫＡＰ９５、及びＤＮＡのレベルを示す写真である。
【０１４６】
図４５Ｂは、図４５Ａからの蛍光強度のグラフである。
【０１４７】
図４６Ａ〜４６Ｄは、ＮＴ後の線維芽細胞核の動態を示す。図４６Ａは、ウシ線維芽細胞、並びにＩＶＰ前核（ＰＮ）及び８〜１６細胞期のウシ胚におけるラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、及びＴＢＰの免疫蛍光分布を示す。挿入図は、ヘキスト３３３４２で標識したＤＮＡである。バー＝１０μｍ（左）、５０μｍ（右）。図４６Ｂは、胎仔線維芽細胞及び前核胚におけるラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、及びＴＢＰのイムノブロットの写真である。図４６Ｃは、ＮＴ胚におけるＰＣＣ及び前核（ＮＴ−ＰＮ）期でのラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、及びＴＢＰの免疫蛍光分析の写真である。バー＝１０μｍ。図４６Ｄは、ＩＶＰ胚の雄性（ＭＰＮ）及び雌性（ＦＰＮ）、並びにＮＴ胚の前核（ＮＴ−ＰＮ）における所定のタンパク質の免疫標識強度の棒グラフである。ヘキスト３３３４２（ＤＮＡ）蛍光において抗体蛍光の比の平均±ＳＤとして表す。Ａ、Ｃ、Ｄにおいては、マーカー当たり２０個以上の胚を３〜５回の試験で分析した。
【０１４８】
図４７Ａ〜４７Ｃは、ＮＴ胚における前核の特性決定を示す。図４７Ａは、前核ＩＶＰ及びＮＴ胚、並びに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩ／３００ｍＭ ＮａＣｌでのｉｎ ｓｉｔｕ抽出後の線維芽細胞における、ＴＢＰ及びＤＮＡ（ヘキスト３３３４２）の免疫標識強度（平均±ＳＤ）の棒グラフである。標識強度は、非抽出胚の強度と相対的に表す（ｎ＝３０個の胚又は細胞／群）。図４７Ｂは、本明細書に記載の（ｂ）のように、又は１０μｇ／ｍｌ ＣＨＸの存在下で（ｂ’）のように、又は５μｇ／ｍｌ ＡｃｔＤの存在下で（ｂ’’）のように活性化したＮＴ胚におけるマーカーの発現を示す写真である（ｎ＝３０個の胚／群、２〜３回試験）。挿入図はＤＮＡである。バー＝１０μｍ。図４７Ｃは、図４７Ｂのように活性化した胚における、ヘキスト３３３４２（ＤＮＡ）蛍光において所定のタンパク質の免疫標識強度の比（平均±ＳＤ）の棒グラフである（ｎ＝１５〜２０個の胚／処理／マーカー）。
【０１４９】
図４８は、ＳＬＯＴ手順を示す。ステップ１において、ドナー線維芽細胞を５００ｎｇ／ｍｌのＳＬＯを用いて３０分かけて可逆的に透過性化する。ステップ２において、透過性化細胞を洗浄し、ＡＴＰ再生系を含む有糸分裂抽出物中でインキュベートして、染色体凝縮を誘発し、核成分の除去を促進する（矢印）。ステップ３において、抽出物を取り出し、細胞を任意により２ｍＭ  ＣａＣｌ２と共に２時間培養して再封入してもよい。ステップ４において、細胞を脱核レシピエント卵母細胞と融合し、ステップ５において、卵母細胞をＮＴと同様に活性化して、前核形成及び発育を誘導する。
【０１５０】
図４９Ａ〜４９Ｃは、有糸分裂抽出物における体細胞核分解の誘導を示す。図４９Ａは、有糸分裂抽出物がアポトーシスを誘導しないことを示す。完全ウシ線維芽細胞（レーン１）、５μｇ／ｍｌノコダゾールで２０時間かけてアポトーシスを誘導した線維芽細胞（レーン２）、又は有糸分裂抽出物（レーン３）若しくは間期抽出物（レーン４）に１時間曝露したＳＬＯ透過性化線維芽細胞を、抗ＰＡＲＰ抗体（上部パネル）を用いてイムノブロットした。ＤＮＡの分解は、０．８％アガロースでのゲル電気泳動及び臭化エチジウムでの染色により評価した（下部パネル）。図４９Ｂは、ＡＴＰ再生系を含む（＋ＡＴＰ）又は含まない（−ＡＴＰ）有糸分裂抽出物における透過性化線維芽細胞の４５分間インキュベーション後のラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＴＢＰ及びＡＫＡＰ９５の免疫蛍光分析の写真である。バー＝１０μｍ。４回試験で分析した１０００個以上の細胞が、示すような一貫性のある標識を示した。図４９Ｃは、間期線維芽細胞（レーン１）、１μｇ／ｍｌノコダゾールで有糸分裂期に同調化した線維芽細胞（レーン２）、ＡＴＰ再生系を含む若しくは含まない有糸分裂抽出物に（レーン３、４）又は間期抽出物に（レーン５）曝露した透過性化線維芽細胞から単離されたクロマチン、有糸分裂抽出物に曝露した透過性化線維芽細胞全体（レーン６）の免疫ブロッティング分析の写真である。ブロットは、所定のタンパク質に対する抗体を用いて検出した。ヒストンＨ４はゲルにおいてタンパク質導入対照として用いた。
【０１５１】
図５０Ａ〜５０Ｄは、ＳＬＯＴ胚の核の特性決定を示す。図５０Ａは、表示のようにＳＬＯＴ又はＮＴによる卵母細胞への導入の３０分以内におけるクロマチンの形態（矢印）を示す。破線は卵母細胞の細胞質を示す。右側のパネルは、ＳＬＯＴ及びＮＴ胚におけるドナークロマチンの拡大図を示す。バー＝２０μｍ。図５０Ｂは、ＮＴ又はＳＬＯＴにより作製された前核期胚（上部の２つのパネル）及び８〜１６細胞期胚（下の２つのパネル）における、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、及びＴＢＰの分布を示す。バー＝２０μｍ（ｎ＝２０〜３０個の胚／マーカー、３回試験）。図５０Ｃは、ＮＴ又はＳＬＯＴ胚の前核における表示のタンパク質についてのヘキスト３３３４２（ＤＮＡ）蛍光強度における免疫標識強度の比（平均±ＳＤ）の棒グラフである（ｎ＝約２０個の胚／マーカー、３回試験）。図５０Ｄは、非抽出胚の場合と比較した、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩ／３００ｍＭ ＮａＣｌで抽出した後の前核ＮＴ及びＳＬＯＴ胚におけるＴＢＰ及びＤＮＡ（ヘキスト３３３４２）の免疫標識強度（平均±ＳＤ）の棒グラフである（ｎ＝１５個の胚／群、２回試験）。
【０１５２】
図５１Ａ〜５１Ｅは、ＳＬＯＴ及びＮＴクローンの発育及び形態の評価を示す。図５１Ａは、ＮＴ及びＳＬＯＴクローンのｉｎ ｖｉｖｏでの発育の割合の棒グラフである。妊娠率は、表示の妊娠日数における超音波検査により評価した。生まれた仔ウシの割合及び出生２４時間後における生存仔ウシの割合もまた示す。８週間にわたって、それぞれ移植した５９個及び２１１個の胚から１２頭のＳＬＯＴ仔ウシ及び２３頭のＮＴ仔ウシが生まれた。ｐ値はフィッシャーの直接確率検定により求めた。図５１Ｂは、５〜６週齢におけるＳＬＯＴクローン（Simintal×Angusの交配同一雌）の写真である。図５１Ｃは、個々のＳＬＯＴ及びＮＴ仔ウシ、並びに出生の２４時間以内の胎盤のスコアのグラフである。図５１Ｄは、個々のＳＬＯＴ及びＮＴクローンの出生時体重のグラフである。図５１Ｃ及び５１Ｄにおいては、ＳＬＯＴ（丸）又はＮＴ（四角）クローン内で、一色が、同じ個体についての仔ウシスコア、胎盤スコア、及び出生時体重を表す。図５１Ｅは、ＳＬＯＴ及びＮＴクローンの仔ウシスコア、胎盤スコア、及び出生時体重のボックスプロット分析である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５３】
詳細な説明
本発明は、部分的には、驚くべき結果である、本明細書に記載の方法を用いたウシプリオン遺伝子座の高頻度な不活化に基づいている。多数の正確にターゲティングされたプリオンノックアウト細胞は、プリオンノックアウト有蹄動物（例えばウシ）の作製を多大に促進するものである。さらに、本発明は、プリオンノックアウト有蹄動物の作製をさらに簡便化するための核移植の効率を高めるための改良方法を提供する。これらの得られるトランスジェニック有蹄動物は、農業製品（例えば肉）、及び医薬品（例えば、トランスジェニック有蹄動物における１以上の異種核酸によりコードされるヒト治療用抗体）の望ましい供与源となる。
【０１５４】
ドナーウシ細胞におけるプリオン遺伝子座を不活化するために用いるノックアウトベクターは、部分的には、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されているウシプリオンタンパク質遺伝子座の配列（ＡＪ２９８８７８）に基づくものである。ノックアウトベクターの構築に使用するプリオンタンパク質遺伝子のゲノム配列の供与源は、遺伝子改変した線維芽細胞の系統のものと一致する。特に、プリオンタンパク質遺伝子のホルスタインゲノム配列は、ホルスタイン由来の線維芽細胞における効率的なターゲティングのためのノックアウトベクターの構築に使用した。ノックアウトベクターは、プリオン遺伝子座に隣接するプリオン遺伝子座に対し相同性を有する２つの領域を含有し、転写終結（ＳＴＯＰ）配列を、２つのｌｏｘＰ部位によりはさまれた薬剤耐性遺伝子と共にプリオン遺伝子座に挿入するように設計した。別の手法では、ノックアウトベクターにおいて２つの連続しない相同性領域を用いて、２つの相同性領域の間にある内因性プリオンタンパク質遺伝子の領域を削除する。プリオンタンパク質の活性を低減するために、ＳＴＯＰ配列をエキソン３における最初のＡＴＧコドンのすぐ後に挿入した。遺伝子座における効率的な相同組換えのために、相同性領域の一方は他の相同性領域よりも長くした。特に、３’領域の長さを８．３ｋｂとし、これは５’相同性領域の１．１ｋｂよりもはるかに長いものであった。相同組換え体を濃縮するため、ネガティブセレクションマーカー（例えばＤＴ−Ａ遺伝子）を、プリオンタンパク質遺伝子に対して反対の配向で短い５’相同性領域に付加した。ノックアウトベクターはトランスフェクション前に適当な制限酵素で線状化し、基本のプラスミドベクター（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのｐＵＣ）がネガティブセレクションマーカーの末端に付加されるようにした。さらに、相同組換えを増強するために、線状化ノックアウトベクターを、線維芽細胞への添加前に、１ｍＭスペルミジンを含有するＨＢＳ（ヘルペス緩衝化生理食塩水）で処理した。
【０１５５】
ポリアミン及び任意の他の化合物をターゲティングベクターに添加して、相同組換えの効率を高めることができる。好ましいポリアミンの濃度は、０．１〜１０ｍＭ、最も好ましくは濃度は１ｍＭである。ポリアミンは、例えば、スペルミジン、スペルミン、カダベリン、及びプトレッシンから選択されうる。好ましいポリアミンはスペルミジンである。他の化合物は、ＤＮＡのリン酸残基とイオン結合を形成しうる化合物（ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｌ−アルギニンなど）から選択されうる。
【０１５６】
さらに、ネガティブセレクションマーカーを、ターゲティングベクターが線状化された際にベクターの端部に露出しないように配置することによって、相同組換えの効率を上げることができる。好ましくは、ネガティブセレクションマーカーとして機能する単位の５’端および３’端が、線状化ターゲティングベクターのそれぞれ５’および３’端から少なくとも１Ｋｂ、好ましくは２Ｋｂ以上離れるよう配置する。通常、ネガティブセレクションマーカーの５’側または３’側の一方には、相同ゲノム配列が位置するため、線状化ターゲティングベクターの端からのネガティブセレクションマーカーの距離は十分なものとなる。線状化ターゲティングベクターにおいて、ネガティブセレクションマーカーのもう一方の端は、少なくとも１ｋｂ、好ましくは少なくとも２Ｋｂの追加配列を保持するように設計しうる。例えば、ターゲティングベクターにおけるｐＵＣベクターの配列をこの追加配列として用い得る。
【０１５７】
１つの特定の方法において、ホルスタイン由来のノックアウトベクターを、ホルスタイン胎仔線維芽細胞にエレクトロポレーションにより導入したところ、驚くべきことにヘミ接合性ターゲティングクローンを５０％を超える高効率で得た。多数の正確にターゲティングされたクローンは、健常な胎仔及び仔ウシを効率的に作製するのに十分である。ホモ接合性ターゲティング胎仔及び仔ウシを作製するため、ヘミ接合性ターゲティング胎仔から単離されたヘミ接合性ノックアウト線維芽細胞を、同じノックアウトベクター又は異なる抗生物質耐性遺伝子を有するノックアウトベクターを用いてエレクトロポレーションを行い、プリオン遺伝子座の残りのアレルを突然変異させる。あるいは、ホモ接合性ノックアウト仔ウシは、雄性及び雌性ヘミ接合性ノックアウトウシを交配することにより作出しうる。
【０１５８】
異種抗体を発現する有蹄動物の作製方法
ヒト抗体を産生するホモ接合性プリオンタンパク質ノックアウトウシ（プリオンタンパク質ＫＯ／ｈＡｂウシ）は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、ホモ接合性プリオンタンパク質ノックアウト遺伝子型を有するウシ線維芽細胞（例えば、ＷＯ０２／７０６４８号、Kuroiwa et al. Nature Biotechnol. 20;889-894, 2002に記載のもの）に導入することにより作製することができる。好適な手法には、例えば、有蹄動物への重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子の両方を含むヒト人工染色体（ＨＡＣ）の挿入、又は胎仔の時期若しくはその出生後における有蹄動物へのヒトＢ細胞若しくはＢ細胞前駆体の挿入が含まれる（例えば、免疫欠陥又は免疫抑制有蹄動物）（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３５７３５号及びＷＯ０２／０７４９３８号参照）。
【０１５９】
標準的な方法を使用して、異種抗体を発現するトランスジェニック有蹄動物の作出に使用するために、特定の種（例えばヒト）の抗体を生成する遺伝子（好ましくは遺伝子座全体）を含む所望の核酸をドナー細胞に導入しうる。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／０７６７１号及びＷＯ００／１０３８３号に開示されているようなヒト人工染色体を使用することが好ましい。これらのヒト人工染色体は、日本国特許第３０３０００９２号にも記載されている。これらの公報はいずれも、参照により全体的に本明細書に援用される。また、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有し発現する人工ヒト染色体又はトランスジーンの構築は、Shenら, Hum. Mol. Genet. 6:1375-1382 (1997)；Kuroiwaら, Nature Biotechnol. 18:1086-1090 (2000)；及びLoupertら, Chromosome 107:255-259 (1998)；ＷＯ００／１０３８３号；ＷＯ９８／２４８９３号；ＷＯ９６／３３７３５号；ＷＯ９７／１３８５２号；ＷＯ９８／２４８８４号；ＷＯ９７／０７６７１号；米国特許第５，８７７，３９７号；米国特許第５，８７４，２９９号；米国特許第５，８１４，３１８号；米国特許第５，７８９，６５０号；米国特許第５，７７０，４２９号；米国特許第５，６６１，０１６号；米国特許第５，６３３，４２５号；米国特許第５，６２５，１２６号；米国特許第５，５６９，８２５号；及び米国特許第５，５４５，８０６号に開示されている（全て参照により全体的に本明細書に援用される）。ヒト人工染色体はまた、異種抗体遺伝子を野生型動物細胞に導入するためにも利用され得る。これは、上記方法を用いて達成できる。人工染色体を動物細胞（特に、胎仔線維芽細胞）に導入することは、本明細書に記載するように、ミクロセル融合により行うことができる。
【０１６０】
ヒト人工染色体を使用する代わりに、免疫グロブリン遺伝子をコードする核酸を、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター又はコスミドベクターを用いて染色体に組み込んでもよい。異種Ｉｇ遺伝子を含むベクター（ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９６／３３７３５号、ＷＯ９７／１３８５２号、ＷＯ９８／２４８８４号、米国特許第５，８４９，９９２号、米国特許第５，８２７，６９０号）は、エレクトロポレーション、リポフェクション、ＹＡＣベクターを含む酵母スフェロプラストとの融合等の公知方法を用いて、胎仔線維芽細胞に導入することができる。さらに、異種Ｉｇ遺伝子を含むベクターを、胎仔線維芽細胞の内因性Ｉｇ遺伝子座にターゲッティングさせて、異種Ｉｇ遺伝子の導入及び内因性Ｉｇ遺伝子の破壊を同時に行うことができる。
【０１６１】
異種免疫グロブリン遺伝子をコードする核酸の組込みは、Lonbergらによる特許（前掲）に記載されているように行うこともできる。異種免疫グロブリン遺伝子を宿主有蹄動物の染色体に挿入するために使用する「ノックイン」構築物では、１つ以上の免疫グロブリン遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子が、構築物でトランスフェクトされる細胞型において活性なプロモーターと機能的に連結され得る。例えば、構成的に活性な、誘導可能な、又は組織特異的なプロモーターを使用して、組み込まれた抗生物質耐性遺伝子の転写を活性化して、トランスフェクトされた細胞をその獲得した抗生物質耐性に基づいて選択することができる。あるいはまた、Ｉｇ遺伝子及び抗生物質耐性遺伝子を含むノックインカセットがプロモーターに機能的に連結していないノックイン構築物を使用してもよい。この場合、ノックインカセットが内因性プロモーターの下流に組み込まれた細胞は、内因性プロモーターの制御下で生じる抗生物質耐性マーカーの発現に基づいて選択することができる。これらの選択された細胞を、本明細書に記載の核移植法に使用して、異種免疫グロブリン遺伝子が宿主染色体に組み込まれたトランスジェニック有蹄動物を作製することができる。
【０１６２】
同様の方法論を使用して、異なる種（他の種の中でも特にイヌ、ネコ、他の有蹄動物、非ヒト霊長類等）のＩｇの発現のための遺伝子を含む人工染色体を作製し挿入することが可能である。上述したように、また当該技術分野で公知なように、異なる種の免疫グロブリン遺伝子は、異なる種にわたり実質的な配列相同性を示すことが周知である。
【０１６３】
挿入された人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）が細胞系（例えば、ウシ胎仔線維芽細胞）に安定して導入されたと判断したら、それを核移植のドナーとして利用する。この決定はＰＣＲ法により行い得る。得られるトランスジェニック仔ウシは、安定に導入された核酸（ヒト人工染色体等）を含む。核酸（例えば、ヒト人工染色体）が安定して組み込まれた仔ウシを得た後、それらの動物を試験して、それらが免疫感作及び親和性成熟に応答してヒトＩｇ遺伝子を発現するか否かを決定する。
【０１６４】
異種抗体をも発現する有蹄動物における内因性抗体の産生を低減する方法
上記手順全体の改変も行うことができる。例えば、得られるトランスジェニック有蹄動物により発現される内因性抗体の量を低減するために、異種核酸を挿入する前又は後にドナー細胞において１以上の内因性Ｉｇ遺伝子を不活性化してもよい。さらに、異種Ｉｇ遺伝子を保持する動物を、内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化された動物と交配してもよい。ドナー細胞（例えばウシ線維芽細胞）の連続的操作の概要の例は以下で説明する。
【０１６５】
最初に、ホモ接合性プリオンタンパク質ノックアウト線維芽細胞を作製する。続いて、ヘミ接合性ウシ免疫グロブリン重鎖（ＢＩｇＨ）ノックアウト線維芽細胞を遺伝子ターゲティングにより作製し、胎仔を核移植（例えばＳＬＯＴ又はクロマチン移植）を用いて作製する。ホモ接合性ＢＩｇＨノックアウト線維芽細胞は、第２の遺伝子ターゲティングにより作製し、続いて胎仔を核移植を用いて作製する。ヘミ接合性ウシ免疫グロブリン軽鎖（ＢＩｇＬ）ノックアウト線維芽細胞を遺伝子ターゲティングにより作製し、その後、核移植により胎仔を作製する。ホモ接合性ＢＩｇＬノックアウト線維芽細胞は、第２の遺伝子ターゲティングにより作製し、胎仔を核移植により作製する。続いて、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、ホモ接合性プリオンタンパク質／ＢＩｇＨ／ＢＩｇＬノックアウト遺伝子型を有する上記の一連のノックアウト線維芽細胞に導入し、胎仔及び仔ウシを核移植を用いて作製する。
【０１６６】
本発明の有蹄動物の作製方法の例
内因性プリオン核酸に突然変異を有し、また場合により異種抗体をコードする１以上の核酸を有していてもよい有蹄動物を作製するための好ましい方法は、ドナー遺伝物質を、再構築した後に、レシピエント卵母細胞に挿入してトランスジェニック有蹄動物を形成させることを含む。再構築（remodeling）とは、細胞全体又は無傷の核をレシピエント卵母細胞に移植することにより得られるものよりも、得られる核移植卵母細胞の発育を改善するあらゆる形態的変化を意味する。再プログラムは、内因性プリオン核酸に突然変異を有し、場合により異種抗体をコードする１以上の核酸を有していてもよいドナー核を再プログラム培地（例えば、有糸分裂抽出物、界面活性剤、及び／若しくは塩溶液、又はプロテインキナーゼ溶液）中でインキュベートし、それにより核膜の分解及び可能であればクロマチン凝縮を生じることにより行う。この核膜の分解及びクロマチン凝縮によって、染色体に結合し、卵母細胞、胚又は胎仔の発育に望ましくない遺伝子の転写を促進する転写調節タンパク質が放出される。別の調節タンパク質は、クロマチン塊をレシピエント卵母細胞に移植する前にクロマチン塊を精製することにより除去しうる。あるいは、染色体から放出される特異的調節タンパク質は、免疫低下（immunodeplete）される、又は再プログラム培地（例えば細胞抽出物）から除去され、それらが染色体と再結合するのを防止する。核移植後、卵母細胞の細胞質からの新しいタンパク質は、クロマチンの脱凝縮及び卵母細胞における核膜形成過程で染色体に結合する可能性がある。これらのタンパク質は、卵母細胞の生存子孫への発育を可能にする遺伝子の転写を促進する。
【０１６７】
トランスジェニック有蹄動物を作出するために使用しうる別のクローン化方法は、細胞からの因子の付加又は除去を可能にする再プログラム培地（例えば細胞抽出物）中で透過性化細胞（すなわち、内因性プリオン核酸に突然変異を有し、場合により異種抗体をコードする１以上の核酸を有していてもよい細胞）をインキュベートすることによる、透過性化細胞の再プログラム化を含む。透過性化細胞の形質膜は、好ましくは再度封入され、所望の因子を取り囲み、細胞の膜の完全性を回復させる。その後、再プログラム化細胞はクローン化哺乳動物の作出のためのレシピエント卵母細胞に導入される。このクローン化方法は、６０日後に生存している異種免疫グロブリン核酸を有しない胎仔を作出するために用いられた。予備試験の結果は、第４０日から第６０日の間に生存する胎仔は、従来の核移植胎仔（８／１６、５０％）よりも本方法を用いて形成された胎仔（７／１０、７０％）の方が高いことを示している。内因性プリオン核酸に突然変異を有し及び／又は異種抗体をコードする１以上の核酸を有する胎仔についても類似の結果が予想される。
【０１６８】
別の方法においては、胎盤組織の大部分が１つの遺伝子供与源に由来し、胎仔組織の大部分が別の遺伝子供与源に由来するキメラ胚を作出しうる。これらのキメラ胚は、胎盤の異常が少ない可能性があり、それゆえ生存率が高くなりうる。一つのかかる方法において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚又は天然胚に由来する細胞を、内因性プリオン核酸に突然変異を有し、場合により異種抗体をコードする１以上の核酸を有していてもよく、かつ典型的な核移植法又は本明細書に記載する任意のほかのクローン化方法を用いて作出された胚に由来する細胞と接触させる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚に由来する細胞を、核移植胚の周囲（例えば、透明帯と胚との間）に注入しうる。この方法を用いて、対照の核移植胚の生存率２５％と比較して、第４０日における生存率が６７％の異種抗体遺伝子を有しないキメラ胚が作出されている。内因性プリオン核酸に突然変異を有する及び／又は異種抗体をコードする１以上の核酸を有する核移植胚に由来する細胞を用いた場合にも類似の結果が予想される。他の方法において、緊密化前胚、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚又は天然胚に由来する細胞を、緊密化前の核移植胚に由来する細胞と共に、各胚に由来する細胞が再構成されて単一のキメラ胚を形成する条件下にてインキュベートする（Wells and Powell, Cloning 2:9-22, 2000）。両方の方法において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚又は天然胚に由来する細胞は胎盤に選択的に組み込まれ、核移植法による細胞は胎仔組織に選択的に組み込まれる。
【０１６９】
本発明に対する先行技術の説明
ヒトＩｇはマウスにおいて発現されてはいたが、ヒトＩｇがウシ又は他の有蹄動物において機能的に再配列されて発現されるかどうかは予測することはできなかった。その理由は、抗体遺伝子構造、抗体産生メカニズム、及びＢ細胞の機能の相違のためである。特に、マウスとは異なり、ウシ及びヒツジは、免疫生理学的にヒトと異なる（Lucierら, J. Immunol. 161: 5438, 1998；Parngら, J. Immunol. 157:5478, 1996；及びButler, Rev. Sci. Tech. 17:43, 2000）。例えば、ウシ及びヒツジにおける抗体遺伝子の多様化は、ヒト及びマウスにおける遺伝子再構成よりもはるかに遺伝子変換（gene conversion）に頼るものである。また、ヒト及びマウスにおけるＢ細胞の主要な位置は骨髄であるのに対し、ウシ及びヒツジではＢ細胞は小腸パイエル板に存在する。その結果、本発明の前には、免疫グロブリンの再配列及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の多様化がウシ（又は他の有蹄動物）Ｂ細胞系列内で起こるかどうかを予測することは不可能ではないにしろ困難であった。さらに、内因性Ｉｇが存在せず又はヒト抗体からの干渉を受けて、ウシが生存可能、すなわち正常な免疫機能を示すかどうかも予測することができなかった。例えば、ヒトＩｇを発現するウシＢ細胞がウシにおいて小腸パイエル板に正確に移動するかどうかも確かではなかった。なぜならこれはヒトにおいて起こらないものであるためである。また、ヒトＦｃレセプター機能（補体の活性化、サイトカインの誘導、及び抗原の除去を媒介する）がウシの系において正常であるかどうかも不明であった。ヒトＩｇが機能的に発現されるか又は適度な免疫応答をもたらすのに十分な量で発現されるかどうかが不明であるため、かかる有蹄動物が生存するかどうかは予測できなかった。また、ヒト染色体がトランスジェニック有蹄動物において安定に維持されるかどうかも不明であった。
【０１７０】
本発明において用いる手法を上述したが、利用される技術を以下にさらに詳細に説明する。これらの例は例示目的で提供するものであり、限定目的と解釈されるべきではない。特に、これらの例はトランスジェニックウシを重点的に記載しているが、記載の方法は、任意のトランスジェニック有蹄動物の作出及び試験のために用いることができる。
【実施例１】
【０１７１】
プリオンタンパク質活性が低減したトランスジェニック有蹄動物
ＰｒＰ遺伝子座の両方のアレルが突然変異したウシ線維芽細胞クローンを、連続的相同組換えにより作製した。ＰｒＰホモ接合性ノックアウト細胞を作製するためのＤＮＡ構築物を使用して、ネオマイシン又はピューロマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ又はｐｕｒｏ、実施例３に記載）及び転写終結カセット（ＳＴＯＰ）をエキソン３の開始ＡＴＧコドンのすぐ後に挿入することにより、機能性完全長ＰｒＰ ｍＲＮＡの転写を防止した。従って、得られる未成熟ＰｒＰ転写産物は機能性コードドメインを欠く。ｎｅｏ遺伝子を含むＤＮＡ構築物（すなわち、ＰｒＰＫＯｎｅｏベクター）を、最初にウシ線維芽細胞系にエレクトロポレーションし、次いで、ネオマイシン耐性コロニーを単離した。ＰＣＲ分析によれば、いくつかのコロニーでエキソン３において相同組換えが生じた。こうして、ＰｒＰ遺伝子座の一方のアレルが突然変異されたウシ線維芽細胞系を生成した。ヘミ接合性の突然変異（ｈｅｍｉ−ＰｒＰＫＯ）線維芽細胞から、ＰｒＰ遺伝子座の一方のアレルが突然変異された３頭の仔ウシを作出し、ｈｅｍｉ−ＰｒＰＫＯ線維芽細胞系を再確立した。その後、ｐｕｒｏ遺伝子を含む別のＤＮＡ構築物（すなわち、ＰｒＰＫＯｐｕｒｏベクター）を、ｈｅｍｉ−ＰｒＰＫＯ線維芽細胞にエレクトロポレーションし、次いで、ピューロマイシン耐性コロニーを単離した。ＰＣＲ分析によれば、約５％の頻度でいくつかのコロニーで残りのアレルのエキソン３において相同組換えが生じた。こうして、ＰｒＰ遺伝子座の両方のアレルが突然変異されたウシ線維芽細胞クローン（ｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ）が生成した。
【０１７２】
ホモ接合性の突然変異（ｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ）線維芽細胞から、ＰｒＰ遺伝子座の両方のアレルが突然変異された１０頭の胎仔を作出し、ｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ線維芽細胞を再確立した。これらのｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ線維芽細胞においては、ＰｒＰ発現の完全な欠損がＲＴ−ＰＣＲ分析により確認された。ｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ線維芽細胞は、同じノックアウトベクターとホモ接合性ノックアウト細胞を選択するためのより高濃度の抗生物質を組み合わせることにより作出することができる。核移植を用いることにより、ｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ仔ウシはｈｏｍｏ−ＰｒＰＫＯ線維芽細胞から作出しうる。
【０１７３】
これらの方法は、さらに以下に記載する。
【０１７４】
プリオンタンパク質ノックアウトベクターの構築
プリオンタンパク質ノックアウトベクターを以下のように作製した（図４４Ａ）。プリオンタンパク質遺伝子のエキソン３周辺のゲノムＤＮＡを単離するために、以下のプライマー対5’-CCA CAT AGG CAG TTG GAT CC-3’（配列番号６９）及び5’-ATA AGA GGC CTG CTC ATG GC-3’（配列番号７０）を用いてＤＮＡプローブをＰＣＲにより増幅した。このプローブを用いて、ウシ（ホルスタイン）ゲノムλファージライブラリーをスクリーニングし、４つの陽性λファージクローンを同定した。この４つのクローンのうち１つのクローンを、制限マッピングによりさらに分析した。エキソン３を含む８．３ｋｂのＢａｍＨＩゲノム断片（３’相同腕）及び１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）にサブクローニングし、ｎｅｏ及びＳＴＯＰカセットを、開始コドンのすぐ後にあるＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＢｇｌＩＩ部位は平滑末端とし、ＮｏｔＩリンカーをこの部位に挿入した。次にジフテリアトキシン遺伝子（ＤＴ−Ａ，Ｇｉｂｃｏ）を新たに作製したＮｏｔＩ部位に付加した。ＤＴ−Ａは、ターゲティングカセットにおけるネオマイシン耐性遺伝子に対して逆（リバース）配向で挿入し、ターゲッティングカセットがゲノム中にランダムに組み込まれた細胞を死滅させた（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｎｅｏベクター）。同様に、ｐｕｒｏ遺伝子を含む類似のノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏベクター、図４４Ｂ）を構築した。これらのプリオンタンパク質ノックアウトベクターは、ＳｒｆＩ制限酵素（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて線状化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）がＤＴ−Ａ遺伝子に結合できるようにした。
【０１７５】
トランスフェクション／ノックアウト手順
標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用いて、以下のように雄胎仔線維芽細胞系（ホルスタイン）をトランスフェクトした。ウシ胎仔線維芽細胞を培養するために使用した培地は、５００ｍｌαＭＥＭ（Gibco, 12561-049）、５０ｍｌウシ胎仔血清（Hy-Clone＃ABL13080）、５ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）、及び１ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（Gibco/BRL #21985-023）を含んでいた。トランスフェクション前日、顕微鏡検査で判断する目標集密度を８０〜１００％として、細胞をＴ１７５組織培養フラスコに播種した。トランスフェクション当日、約１０７個のウシ線維芽細胞をトリプシン処理し、αＭＥＭ培地で１回洗浄した。細胞を８００μｌのα−ＭＥＭに再懸濁した後、１ｍＭスペルミジンを含有するＨｅｐｅｓ緩衝食塩水（ＨＢＳ）に溶解した３０μｇのｐＢｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈ）ＫＯｎｅｏベクターを細胞懸濁液に添加し、ピペッティングによりよく混ぜた。細胞−ＤＮＡ懸濁液を、エレクトロポレーションキュベットに移し、５５０Ｖ及び５０μＦにてエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を、血清を添加したα−ＭＥＭ培地と共に、６０の２４ウェルプレート上に植え付けた。４８時間の培養後、培地を、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と置き換え、細胞を２〜３週間培養してネオマイシン耐性細胞を選択した。選択後、１００％に近い集密度に達した全てのコロニーを取り、レプリカプレート（２４ウェルプレート）に分けた。１つのプレートの細胞はゲノムＤＮＡ抽出用であり、もう１つのプレートの細胞は核移植用である。ゲノムＤＮＡをコロニーから抽出して、ＰＣＲにより所望の相同組換え事象についてスクリーニングした。典型的には、約１００個のＧ４１８コロニーを分析した。
【０１７６】
ターゲッティング組込みについてのスクリーニング
上述したように、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra SYSTEMS）を製造元のプロトコールに従って使用して、ゲノムＤＮＡを各２４ウェルから個別に抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを、２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。以下のプライマー対Ｆ７（5’-TGT CAA AGA GAC ACT CCT CAT TTG TCT TCC-3’；配列番号７１）及びＲ７（5’-TCA TAG CCG AAT AGC CTC TCC ACC C-3’；配列番号７２）を使用して、ＰＣＲによるスクリーニングを行った。一方のプライマーの配列は、ノックアウトベクター中に位置し、他方のプライマーの配列はターゲッティング内因性遺伝子座中の組込まれたベクターのすぐ外側に位置する（図４４Ａ）。従って、予想されるＰＣＲ生成物は、ノックアウトベクターが相同組換えにより標的遺伝子座に組み込まれた場合にのみ検出されるはずである。ＰＣＲ反応混合液は、１７．９μｌの水、３μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ２＋添加）、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＬＡ  Ｔａｑを含んでいた。以下の条件下で反応混合液をインキュベートすることにより、３０サイクルのＰＣＲを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、及び６８℃にて５分間であった。ＰＣＲ後、反応混合液を電気泳動により分析した。９４個のスクリーニングしたネオマイシン耐性クローンの約５０％から予想されたサイズのＰＣＲ産物が生成された（図４４Ｂ）。これらの陽性クローンは、別のプライマー対：Ｆ１０（5’-TGA AGA TGT CCC AGT GCT GGG GAT-3’、配列番号７３）及びＲ１０（5’-GAG TTA GGG GCG GGA CTA TGG TTG C-3’、配列番号７４）を用いてＰＣＲ増幅により確認し、予想サイズである２．７ｋｂのＰＣＲ産物を得た。５０％を超える高頻度の相同組換えが別の線維芽細胞系である雌性Ｆ１（ホルスタイン×ジャージー）細胞系においても再現された（図４４Ｃ）。従って、使用した最初の細胞系に関係なくプリオン遺伝子座の一方のアレルがノックアウトベクターにより突然変異したウシ線維芽細胞系の作製に成功した。
【０１７７】
クロマチン移植
ヘミ接合性プリオンノックアウト細胞又はこれらの細胞からの核を本明細書に記載の核移植法のいずれかで用いて、ヘミ接合性プリオンノックアウト有蹄動物（例えばノックアウト仔ウシ）を作出することができる。所望であれば、ノックアウト仔ウシ又は生存有蹄動物からの細胞を以下に記載のように用いて、ホモ接合性プリオンノックアウト細胞を作製することも可能である。１つの特定の方法においては、線維芽細胞（例えばウシ一次胎仔線維芽細胞）を有糸分裂期に１μｇ／ｍｌノコダゾールで１８時間かけて同調化させ、有糸分裂シェイクオフ（mitotic shake-off）により回収し、リン酸緩衝化生理食塩水で２回、細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及びプロテアーゼインヒビター）で１回洗浄した。沈降した細胞を１容量の氷冷細胞溶解緩衝液中に再懸濁し、氷上で１時間かけて膨張させ、ぴったりのガラス製乳棒を用いてダウンスホモジネートした。溶解物を１５，０００×ｇで４℃で１５分間遠心し、上清（有糸分裂抽出物）をアリコートに分け、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。新鮮な抽出物又は凍結した抽出物を使用した。
【０１７８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞を２０ｈｐｍで脱核させた。選択したコロニーからのトランスフェクトウシ線維芽細胞をＣａ２＋／Ｍｇ２＋非含有ハンクスの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、約３７℃の水浴において、１００μｌ ＨＢＳＳ中３１．２ＵのストレプトリシンＯ（SLO; Sigma）を含む懸濁液において３０分間インキュベートすることにより透過性化した。一過性の膜ＤＮＡ色素であるヨウ化プロピジウム（０．１μｇ／ｍｌ）の取込みにより透過性化を評価した。透過性化線維芽細胞を沈降させ、洗浄し、約３７℃において、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭリン酸クレアチン、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含有する４０μｌの有糸分裂抽出物中で３０〜４５分間インキュベートした。アリコートを０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で染色し、クロマチン凝縮をモニターした。インキュベーションの最後に、反応混合物を５００μｌのαＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で希釈した。これらの細胞を脱核卵母細胞と融合した。卵母細胞は、２８ｈｐｍで活性化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚盤胞期にまで胚を培養した。レシピエント雌１頭当たり２つの胚を導入した。超音波により妊娠をモニターし、Ｃ切片（C-section）をレシピエントで実施して、細胞系の生成のための胎仔を回収した。
【０１７９】
２回目のトランスフェクション／ノックアウト手順
以下のようにして、第１ＫＯベクターが既に「アレルＡ」に組み込まれているｈｅｍｉ−ＰｒＰＫＯ胎仔線維芽細胞系にトランスフェクトした。ウシ胎仔線維芽細胞を培養するために使用した培地は、５００ｍｌαＭＥＭ（Gibco, 12561-049）、５０ｍｌウシ胎仔血清（Hy-Clone＃ABL13080）、５ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）、及び１ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（Gibco/BRL #21985-023）を含んでいた。トランスフェクション前日、顕微鏡検査で判断する目標集密度を８０〜１００％として、細胞をＴ１７５組織培養フラスコに播種した。トランスフェクション当日、約１０７個のウシ線維芽細胞をトリプシン処理し、αＭＥＭ培地で１回洗浄した。細胞を８００μｌのα−ＭＥＭに再懸濁した後、１ｍＭスペルミジンを含有するＨＢＳ（Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水）に予め溶解した３０μｇのＫＯベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏベクター）を細胞懸濁液に添加し、ピペッティングによりよく混ぜた。細胞−ＤＮＡ懸濁液を、エレクトロポレーションキュベットに移し、５５０Ｖ及び５０μＦにてエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を、血清を添加したα−ＭＥＭ培地と共に、３０の４８ウェルプレート上に植え付けた。４８時間の培養後、培地を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地と置き換え、細胞を２〜３週間培養してピューロマイシン耐性細胞を選択した。選択後、１００％に近い集密度に達した全てのコロニーを取り上げ、レプリカプレート（２４ウェル及び４８ウェルプレート）に分けた。１つのプレートはゲノムＤＮＡ抽出用であり、もう１つのプレートは核移植用である。ゲノムＤＮＡをコロニーから抽出して、ＰＣＲにより所望の相同組換え事象についてスクリーニングした。
【０１８０】
ホモ接合性ターゲッティング組込みについてのスクリーニング
上述したように、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra SYSTEMS）を製造元のプロトコールに従って使用して、ゲノムＤＮＡを各２４ウェルから個別に抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを、２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。以下のプライマー対「Ｆ１４」（5’- TTG CTC CAC CTT CCG TCT TCT GTC-3’；配列番号３）及び「Ｒ１４」（5’- GTT GGC GCC TAC CGG TGG ATG TG-3’；配列番号４）を使用して、ＰＣＲによるスクリーニングを行った。一方のプライマーの配列は、ＫＯベクター中に位置し、他方のプライマーの配列はターゲッティング内因性遺伝子座中の組込まれたベクターのすぐ外側に位置する（図１）。従って、予想されるＰＣＲ生成物は、ＫＯベクターが相同組換えにより標的遺伝子座に組み込まれた場合にのみ検出されるはずである。ＰＣＲ反応混合液は、１７．９μｌの水、３μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ２＋添加）、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＬＡ  Ｔａｑを含んでいた。以下の条件下で反応混合液をインキュベートすることにより、３０サイクルのＰＣＲを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、及び６８℃にて５分間であった。ＰＣＲ後、反応混合液を電気泳動により分析した。クローン３３２個をスクリーニングした結果、１５つのクローン（＃２６、８６、１１３、１１６、１１８、１７３、１７７、２１３、２３５、２５０、２５１、２６６、２８５、３１８及び３３０）が予想した大きさのＰＣＲ産物を生じ、これを配列決定により確認した。多型配列に基づいて、ＫＯベクターは、全てのクローンにおけるＰｒＰ遺伝子座のエキソン３の「アレルＢ」に組み込まれた。８個のクローンを核移植に供し、それにより胎仔が得られたが、＃２８５からの３頭の胎仔（＃１３９５、１４６８、１４７６）、及び＃１１３からの７頭の胎仔（＃１４３９−１、１４３９−２、１４８７、３５８３、３６３２、３６８２−１、３６８３−２、４９６１）は、ｐｕｒｏＫＯベクター及びｎｅｏＫＯベクターがそれぞれ「アレルＢ」及び「アレルＡ」に組み込まれたホモ接合性ＰｒＰＫＯであることが証明された。従って、ＰｒＰ遺伝子座の両方のアレルがＫＯベクターにより突然変異された１０のウシ線維芽細胞系を作製することに成功した。
【０１８１】
表１は、ヘミ接合性ＰｒＰＫＯ細胞系に由来するホモ接合性ＰｒＰＫＯクローンを用いたクロマチン移植後の妊娠に関するデータをまとめるものである。
【表１】
2006505291.tif 000002
【０１８２】
ホモＰｒＰ胎仔におけるＰｒＰ発現の欠損の検証
いくつかの胎仔から、線維芽細胞を確立し、総ＲＮＡをRNeasy Miniキット（QIAGEN）を用いて抽出した。１μｌの総ＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡ合成（ＲＴ−ＰＣＲ用のSuperScript First-Strand Synthesis System；Invitrogen）に供し、続いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは以下のように行った。使用したプライマーは、5’-AAG AAG CGA CCA AAA CCT GG-3'及び5’-GTA ACG GTG CAT GTT TTC ACG-3’である。ＰＣＲ反応混合物には、３２．５μｌの水、５μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファー（TAKARA）、８μｌのｄＮＴＰ混合物、１０ｐｍｏｌフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌリバースプライマー、２μｌの第一鎖ｃＤＮＡ、及び０．５μｌのＥｘ  Ｔａｑ（TAKARA）が含まれた。以下の条件で反応混合物をインキュベートすることにより、３５サイクルのＰＣＲを行った：すなわち、８５℃で３分、９４℃で１分、９８℃で１０秒、６２℃で３０秒、及び７２℃で１分。ＰＣＲ後、反応混合物を電気泳動により分析した。明瞭なＰＣＲ産物が野生型及びヘミＰｒＰ ＫＯ細胞の両方において検出されたが、ホモＰｒＰ ＫＯ細胞系の１０個には陽性ＰＣＲ産物はなかった。この結果は、ホモＰｒＰ ＫＯ細胞系におけるＰｒＰ発現の完全な不在を確証している。
【実施例２】
【０１８３】
ＨＡＣの導入及び再配列
ＨＡＣの挿入のための手順の概要
プリオン遺伝子の一方又は両方に突然変異を有し、異種抗体を発現する有蹄動物（例えばウシ）を作出するために、標準的な方法を使用して、異種抗体をコードする核酸（例えばＨＡＣ）を細胞に挿入しうる。例えば、ＨＡＣを、プリオン遺伝子の一方又は両方のアレルを不活性化する前又は後に挿入しうる。所望であれば、１以上の内因性抗体遺伝子を細胞において突然変異させてもよい。その後、以下により詳細に記載するように、細胞を標準的な核移植手順において使用して、所望のトランスジェニック有蹄動物を作出する。
【０１８４】
原則的に、ヒト人工染色体配列（＃１４ｆｇ．、＃２ｆｇ．及び＃２２ｆｇ．）を含む雄性及び雌性ウシ胎仔線維芽細胞系を入手し、選択し、使用して、これらの系統からクローン化仔ウシを作製する。
【０１８５】
例えば、ヒト１４番染色体から誘導したＨＡＣ（Ｉｇ重鎖遺伝子を含む「＃１４ｆｇ」）、ヒト２番染色体から誘導したＨＡＣ（Ｉｇκ鎖遺伝子を含む「＃２ｆｇ」）、及びヒト２２番染色体（Ｉｇλ鎖遺伝子を含む「＃２２ｆｇ」）から誘導したＨＡＣを、同時に又は逐次的に導入することができる。
【０１８６】
＃１４ｆｇ．雄動物と＃２ｆｇ及び＃２２ｆｇ．雌動物とを交配させ、子孫を評価することで、これらの染色体断片の伝達を試験する。伝達が成功したら、２つの系統を交配させて、３つ全ての染色体断片を含む系統を作製する。
【０１８７】
また、＃１４ｆｇ．、＃２ｆｇ．及び＃２２ｆｇ．染色体断片を、胎仔細胞（例えばトランスジェニックＨｏｍｏ  Ｈ／Ｌ胎仔細胞）に挿入して、クローン化仔ウシ又は他のトランスジェニック仔ウシとの交雑トランスジェニックＨＡＣ仔ウシ（例えばＨｏｍｏ  Ｈ／Ｌ仔ウシ）を作製するために使用してもよい。あるいはまた、他のＨＡＣ（ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣ等）を、以下に記載のように導入するか、又は任意の他の染色体移入方法を用いて導入してもよい。
【０１８８】
論理的根拠
ＨＡＣの生殖細胞系伝達は、ＨＡＣを動物（例えばＩｇノックアウト動物）に導入するため、及び動物を生成集団として増殖させるために有用であろう。生殖細胞系を介したＨＡＣの増殖で懸念されるのは、減数分裂の間の染色体物質の不完全な対合である。しかし、生殖細胞系伝達は、Tomizukaら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722, 2000）が示したように、マウスにおいて成功している。
【０１８９】
図１Ａにまとめた方法は、＃１４ｆｇ．を雄性細胞系統に挿入し、＃２ｆｇ．及び＃２２ｆｇ．をそれぞれ雌性細胞系に挿入することから構成される。ＨＡＣを保持する仔ウシを作製し、メス及びオスの両方を介して生殖細胞系伝達を試験することができる。得られる子孫の一部（約２５％）は、重鎖及び軽鎖ＨＡＣの両方を含むであろう。さらに交雑させることにより、３つの染色体断片全てを含む仔ウシ系統が得られるであろう。任意によりこれらの動物を、先に記載したように胎仔細胞から生成したトランスジェニック動物（例えばＨｏｍｏ  Ｈ／Ｌ動物）との交雑に使用してもよい。
【０１９０】
実験設計
細胞系の最初のスクリーニングから細胞を得る。これらは、ホルスタインであっても、又は上で使用したものと異なった系統であってもよい。これにより、集団中で可能な限りの遺伝多様性を維持しながらの交雑が可能になる。次いで、ＨＡＣを細胞系に導入し、陽性細胞系の選択を行う。選択された細胞系を核移植に使用して、仔ウシを作製する。１２月齢から始めて、精液及び卵子を回収し、受精させ、レシピエント動物に導入する。ＤＮＡマーカー分析及び核型分析のために細胞サンプルを取る。出生時から始めて、血液サンプルを取り、ヒトＩｇタンパク質の存在について分析する。
【０１９１】
上記したように、上記実験において開発された手順を用いて、ＨＡＣはＨｏｍｏ  Ｈ／Ｌ細胞系にも導入される。
【０１９２】
さらに以下の実施例を、本発明の別の例示として提供する。
【０１９３】
ＨＡＣの挿入のための手順例
追加の実験を行い、異種（例えばヒト）免疫グロブリン重鎖（μ）及びλ軽鎖が、単独又は組み合わせられて、ウシ宿主により産生され得ることを実証した。さらに、これらの実験は、ヒト免疫グロブリン鎖が再配列し、ポリクローナル血清が得られたことを実証した。これらの手順において、免疫グロブリン発現遺伝子を、ヒト人工染色体を用いて、ウシ線維芽細胞に導入した。次いで、線維芽細胞を核移植のために利用し、胎仔を得て、抗体産生について分析した。これらの手順及び結果は以下により詳細に記載する。プリオン遺伝子の一方又は両方のアレルに突然変異を有する胎仔から単離され、またＨＡＣの導入のために以下に記載する方法において用いる線維芽細胞から同様の結果が予想される。あるいは、ＨＡＣを細胞に導入してもよく、続いて突然変異を、（ｉ）ＨＡＣを有する細胞のプリオン遺伝子に、又は（ｉｉ）ＨＡＣを有する細胞を用いて作出されたクローン化胎仔に由来する細胞のプリオン遺伝子に、導入しうる。
【０１９４】
ＨＡＣ構築物
先に記載された染色体クローニング系（Kuroiwaら, Nature Biotech. 18:1086-1090, 2000）を用いてヒト人工染色体（ＨＡＣ）を構築した。簡単に説明すると、ΔＨＡＣを構築するために、ｌｏｘＰ配列がＨＣＦ２遺伝子座に組み込まれた、先に報告したヒト２２番染色体断片（ｈＣｈｒ２２）を、テロメア配列挿入による染色体トランケーション（Kuroiwaら, Nucleic Acids Res., 26: 3447-3448, 1998）によりＡＰ０００３４４遺伝子座でトランケートした。次に、ＡＰ０００３４４遺伝子座でトランケートされた上記ｈＣｈｒ２２断片（ｈＣＦ２２）を含むＤＴ４０細胞クローンを、安定かつ生殖細胞系伝達性のヒトミニクロモソームＳＣ２０ベクターを含むＤＴ４０細胞クローン（「Ｒクローン」と称する）と融合させることにより、細胞ハイブリッドを形成した。ＳＣ２０ベクターは、ｌｏｘＰ配列を、Ｓ２０断片のＲＮＲ２遺伝子座に挿入することにより作製された。ＳＣ２０断片は、ヒトＩｇ重鎖遺伝子の領域全体を含むヒト１４番染色体から誘導される天然の断片である（Tomizukaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722, 2000）。得られたＤＴ４０細胞ハイブリッドは、両方のｈＣｈｒ断片を含んでいた。ＤＴ４０ハイブリッドを、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターでトランスフェクトして、ｈＣＦ２２とＳＣ２０ベクター間のＣｒｅ／ｌｏｘＰ仲介型染色体転座を誘導した。ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを用いて安定トランスフェクタントを分析して、ＨＣＦ２及びＡＰ０００３４４遺伝子座により規定される２．５メガベースのｈＣｈｒ２２領域の、ＳＣ２０ベクターのｌｏｘＰクローニング部位へのクローニングを確認した。次いで、ΔＨＡＣを含むと予想されるＰＣＲ陽性細胞を、コードされる緑色蛍光タンパク質の蛍光に基づくＦＡＣＳソーティングにより単離した。ソートされた細胞を、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析にもかけて、２．５メガベースのｈＣｈｒ２２インサートを含むΔＨＡＣの存在を確認した。
【０１９５】
同様に、この染色体クローニング系を用いてΔΔＨＡＣも構築した。ｈＣｈｒ２２断片を、ＡＰ０００３４４遺伝子座でトランケートし、次に、ＤＴ４０細胞中での相同組換えにより、ｌｏｘＰ配列をＡＰ０００５５３遺伝子座に組み込んだ。次いで、得られた細胞を、ＳＣ２０ミニクロモソームベクターを含むＲクローンと融合させた。細胞ハイブリッドを、Ｃｒｅ発現ベクターでトランスフェクトして、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ仲介型染色体転座を生じさせた。ＡＰ０００５５３及びＡＰ０００３４４遺伝子座により規定される、１．５メガベースのｈＣｈｒ２２インサートを含むΔΔＨＡＣの生成を、ＰＣＲ及びＦＩＳＨ分析により確認した。
【０１９６】
ΔＨＡＣ及びΔΔＨＡＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能性を、これらのＨＡＣを含むキメラマウスの作製により評価した。これらのＨＡＣをマウス胚性幹（ＥＳ）細胞に個々に導入し、次いでこれを、標準的な手順（特開２００１−１４２３７１号；２０００年５月１１日出願）を用いたキメラマウスの作製に使用する。得られたマウスは、高度なキメラ率（８５〜１００％の毛色）を有しており、これらのＨＡＣを含むＥＳ細胞の高レベルな多分化能、及びこれらのＨＡＣのｉｎ  ｖｉｖｏでの分裂安定性を示した。さらに、ΔＨＡＣは、ΔＨＡＣキメラマウスの生殖細胞系を介して次の仔に伝達され、このＨＡＣの減数分裂安定性が実証された。
【０１９７】
これらのＨＡＣを保持するニワトリＤＴ４０細胞は、ブタペスト条約に基づき、２００１年５月９日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１−１−１中央第６、日本）に寄託した。寄託番号は以下の通りである。ΔＨＡＣ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８２）、ΔΔＨＡＣ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８１）、及びＳＣ２０断片（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７５８３）。これらのＨＡＣを保持するニワトリＤＴ４０細胞はまた、台湾のＦｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）にも寄託した。寄託番号及び日付は以下の通りである。すなわち、ΔＨＡＣ（ＣＣＲＣ  ９６０１４４；２００１年１１月９日）、ΔΔＨＡＣ（ＣＣＲＣ  ９６０１４５；２００１年１１月９日）、及びＳＣ２０断片（細胞系をＳＣ２０（Ｄ）の名称で寄託；ＣＣＲＣ  ９６００９９；１９９９年８月１８日）。
【０１９８】
ΔＨＡＣ中の２．５メガベース（Ｍｂ）ｈＣｈｒ２２インサートは、以下のＧｅｎｂａｎｋ受託番号で示すＢＡＣコンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）から構成されている。すなわち、ＡＣ００２４７０、ＡＣ００２４７２、ＡＰ０００５５０、ＡＰ０００５５１、ＡＰ０００５５２、ＡＰ０００５５６、ＡＰ０００５５７、ＡＰ０００５５８、ＡＰ０００５５３、ＡＰ０００５５４  ＡＰ０００５５５、Ｄ８６９９５、Ｄ８７０１９、Ｄ８７０１２、Ｄ８８２６８、Ｄ８６９９３、Ｄ８７００４、Ｄ８７０２２、Ｄ８８２７１、Ｄ８８２６９、Ｄ８７０００、Ｄ８６９９６、Ｄ８６９８９、Ｄ８８２７０、Ｄ８７００３、Ｄ８７０１８、Ｄ８７０１６、Ｄ８６９９９、Ｄ８７０１０、Ｄ８７００９、Ｄ８７０１１、Ｄ８７０１３、Ｄ８７０１４、Ｄ８６９９１、Ｄ８７００２、Ｄ８７００６、Ｄ８６９９４、Ｄ８７００７、Ｄ８７０１５、Ｄ８６９９８、Ｄ８７０２１、Ｄ８７０２４、Ｄ８７０２０、Ｄ８７０２３、Ｄ８７０１７、ＡＰ０００３６０、ＡＰ００３６１、ＡＰ０００３６２、ＡＣ００００２９、ＡＣ０００１０２、Ｕ０７０００、ＡＰ０００３４３、及びＡＰ０００３４４。ΔΔＨＡＣ中の１．５Ｍｂ  ｈＣｈｒ２２インサートは、以下のＢＡＣコンティグから構成される。すなわち、ＡＰ０００５５３、ＡＰ０００５５４、ＡＰ０００５５５、Ｄ８６９９５、Ｄ８７０１９、Ｄ８７０１２、Ｄ８８２６８、Ｄ８６９９３、Ｄ８７００４、Ｄ８７０２２、Ｄ８８２７１、Ｄ８８２６９、Ｄ８７０００、Ｄ８６９９６、Ｄ８６９８９、Ｄ８８２７０、Ｄ８７００３、Ｄ８７０１８、Ｄ８７０１６、Ｄ８６９９９、Ｄ８７０１０、Ｄ８７００９、Ｄ８７０１１、Ｄ８７０１３、Ｄ８７０１４、Ｄ８６９９１、Ｄ８７００２、Ｄ８７００６、Ｄ８６９９４、Ｄ８７００７、Ｄ８７０１５、Ｄ８６９９８、Ｄ８７０２１、Ｄ８７０２４、Ｄ８７０２０、Ｄ８７０２３、Ｄ８７０１７、ＡＰ０００３６０、ＡＰ００３６１、ＡＰ０００３６２、ＡＣ００００２９、ＡＣ０００１０２、Ｕ０７０００、ＡＰ０００３４３、及びＡＰ０００３４４（Dunhamら, Nature 402:489-499, 1999）。
【０１９９】
ウシ胎仔線維芽細胞の作製
ウシ胎仔線維芽細胞を作製するために、４５〜６０日齢の胎仔を、オス及びメス両親の系図が連続する３世代について記録された、Trans Ova（Iowa）で飼育された疾患試験済みホルスタイン牛又はジャージー牛から回収した。回収した胎仔は、一次胎仔線維芽細胞の作製のために、HematechのWorcester分子生物学部門まで、保冷剤（wet ice）に載せて輸送した。到着後、胎仔を、組織培養フード内の非組織培養グレードの１００ｍｍプラスチック製ペトリ皿に移した。滅菌ピンセット及びハサミを用いて、胚外膜及び臍帯を胎仔から取り除いた。胎仔を、新しいプラスチック製ペトリ皿に移した後、頭部、四肢及び内臓を取り除いた。除臓した胎仔を、以下からなる約１０ｍｌの胎仔濯ぎ溶液を含む第３のペトリ皿に移した。すなわち、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含む１２５ｍｌの１×ダルベッコ−ＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、カタログ番号１４０４０）、０．５ｍｌ酒石酸チロシン（８ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−３３９７）、２ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−３５３９）、及び１ｍｌのファンギゾン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、カタログ番号１５２９５−０１７）（混合し、０．２μｍナイロンフィルターユニット［Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号１５０−００２０］を通して濾過した）であった。
【０２００】
それぞれの胎仔を、胎仔濯ぎ溶液でさらに３回洗浄し、微量の血液を除去し、５０ｍｌ組織培養円錐管に移し、滅菌メスで小片に細かく刻んだ。組織切片を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、カタログ番号１４１９０）で１回洗浄した。組織切片が試験管の底に沈んだ後、上清を除去し、約３０ｍｌの細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、カタログ番号１３１５１−０１４）と置き換えた。試験管を何回か反転させて混合し、組織培養インキュベーター中で３８．５℃／５％ＣＯ２にて２０分間インキュベートした。組織が試験管の底に沈んだ後、上清を除去し、等容量の新しい細胞解離緩衝液と置き換えた。組織及び細胞解離緩衝液の混合液を、２４ｍｍ先を丸めたスピン棒（spin bar）を含む滅菌７５ｍｌトリプシン処理用ガラスフラスコ（Wheaton Science Products、カタログ番号355393）に移した。フラスコを３８．５℃／５％ＣＯ２組織培養インキュベーターに移し、磁気攪拌プレート上に置き、約２０分間の効率的な混合を可能にするのに十分な速度で攪拌した。フラスコを、組織培養フードに移し、組織切片を沈めた後、上清を除去し、１，２００ｒｐｍにて５分間の遠心分離により解離細胞を回収した。細胞ペレットを、以下から構成される小容量の完全線維芽細胞培養培地中に再懸濁した。すなわち、４４０ｍｌαＭＥＭ（BioWhittaker、カタログ番号12-169F）、５０ｍｌ照射ウシ胎仔血清、５ｍｌ  ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ補助物質（supplement）（Gibco-BRL、カタログ番号25050-061）、５ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma、カタログ番号P-3539）、１．４ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（Gibco-BRL、カタログ番号21985-023）（ウシ胎仔血清を除く全ての成分を混合し、０．２μｍナイロンフィルターユニット［Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号１５１−４０２０］を通して濾過した）であった。そして、氷上で保存した。解離プロセスをさらに３回、各ステップの間に３０ｍｌの細胞解離溶液を添加して、繰り返した。細胞をプールし、完全線維芽細胞培地中で洗浄し、２３及び２６ゲージ針、そして最後に７０μｍ細胞濾過器（B-D Falcon、カタログ番号352350）に順番に通して、１つの細胞懸濁液を生成した。トリパンブルー（０．４％溶液、Sigma、カタログ番号T-8154）の存在下で血球計において数えることにより、細胞密度及び生存率を決定した。
【０２０１】
一次線維芽細胞を、３８．５℃／５％ＣＯ２にて、完全線維芽細胞培地中で、Ｔ７５  ｃｍ２組織培養フラスコ当たり１×１０６生存細胞の細胞密度で増殖させた。３日間の培養後又は細胞が集密状態に達する前に、フラスコを１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない）で一度濯ぎ、１０ｍｌの細胞解離緩衝液と５〜１０分間室温にてインキュベートすることにより線維芽細胞を回収した。細胞の剥離は、倒立顕微鏡を使用して目でモニターした。このステップにおいて、磨砕することにより細胞塊が確実にバラバラになるように注意した。洗浄及び定量後、遺伝子ターゲッティング実験で使用するための解離した線維芽細胞が用意できた。これらの細胞は、長期保存のために凍結保存することもできた。
【０２０２】
ＨＡＣのウシ胎仔線維芽細胞への導入
ミクロセル媒介型染色体移入（ＭＭＣＴ）（Kuroiwaら Nature Biotech. 18:1086-1090, 2000）を使用して、ΔＨＡＣ及びΔΔＨＡＣを、ＤＴ４０細胞ハイブリッドからチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に移した。ΔＨＡＣを含むＣＨＯクローン（「Ｄ１５クローン」）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８及び０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加したＦ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地中で、３７℃及び５％ＣＯ２にて、培養した。Ｄ１５クローンを、１２のＴ２５フラスコにおいて増殖させた。集密度が８０〜９０％に到達したとき、コルセミド（Ｓｉｇｍａ）を、最終濃度を０．１μｇ／ｍｌとして培地に添加した。３日後、培地を、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と交換した。フラスコを、６０分間、８，０００ｒｐｍにて遠心分離にかけて、ミクロセルを回収した。ミクロセルを、８μｍ、５μｍ及び３μｍフィルター（Ｃｏｓｔａｒ）に通して精製し、その後ＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。これらのミクロセルを、以下に記載するように、ウシ線維芽細胞との融合のために使用した。
【０２０３】
ウシ胎仔線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地中で、３７℃及び５％ＣＯ２にて培養した。線維芽細胞を、Ｔ１７５フラスコ中で増殖させた。集密度が７０〜８０％に達したとき、０．０５％トリプシンで、細胞をフラスコから剥離した。線維芽細胞を、ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、その後ミクロセル懸濁液上にかぶせた。ミクロセル−線維芽細胞懸濁液を、５分間、１，５００ｒｐｍにて遠心分離した後、ＰＥＧ１５００（Ｒｏｃｈｅ）を製造元のプロトコールに従ってこのペレットに添加して、ミクロセルをウシ線維芽細胞と融合させた。融合後、融合細胞を、６つの２４ウェルプレートに播き、１０％ＦＢＳを補足したα−ＭＥＭ培地中で、２４時間培養した。次いで、培地を、０．７ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換した。Ｇ４１８抗生物質の存在下での約２週間の培養後、Ｇ４１８耐性の融合細胞を選択した。これらのＧ４１８耐性クローンを、以下に記載する核移植に使用した。
【０２０４】
同様に、ＣＨＯクローンＣ１３由来のΔΔＨＡＣを、ＭＭＣＴにより、ウシ胎仔線維芽細胞に移入した。選択したＧ４１８耐性クローンを、核移植のために使用した。
【０２０５】
核移植、活性化及び胚培養
核移植手順は、本質的に既に記載されているようにして実施した（Cibelliら, Science 1998: 280:1256-1258）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞を、成熟後（ｈｐｍ）１８〜２０時間で除核し、紫外光（ＵＶ）下でのビスベンズイミド（Hoechst 33342, Sigma）標識化により、染色体の除去を確認した。これらの細胞質体−ドナー細胞対（couplet）を、２．４ｋＶ／ｃｍの単一の電気パルスを２０μ秒間用いて（Electrocell manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA）、融合させた。３〜４時間後、合計移植対（couplet）の２５％をランダムなサブセットとして取り、移植された核のビスベンズイミド標識化により融合を確認した。３０ｈｐｍにて、再構成された卵母細胞及び対照を、カルシウムイオノホア（５μＭ）で４分間（Cal Biochem, San Diego, CA）、そしてＡＣＭ培養培地に入った１０μｇシクロへキシミド及び２．５μｇサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）で６時間、先に記載されているように（Linら, Mol. Reprod. Dev. 1998:49:298-307；Presicceら, Mol. Reprod. Dev. 1994:38:380-385）活性化した。活性化の後、卵子を、ＨＥＰＥＳ緩衝化ハムスター胚培養培地（ＨＥＣＭ−Ｈｅｐｅｓ）中で５回洗浄し、０．２ｍｌの胚試験鉱油（Ｓｉｇｍａ）で覆われた、照射マウス胎仔線維芽細胞及び０．５ｍｌの胚培養培地を含む４ウェル組織培養プレートに入れて培養した。２５〜５０の胚を各ウェルに入れ、３８．５℃にて、周囲雰囲気中５％ＣＯ２下で、インキュベートした。４日目に、１０％ＦＣＳを、培養培地に添加した。
【０２０６】
胚移植
７及び８日目に核移植胚盤胞を、６及び７日目に同期化した未出産メスレシピエントにそれぞれ移植した。ルタリス（Lutalyse）（Pharmacia and Upjohn, Kalamazoo, MI）を１回注射した後、発情期を検出することで、レシピエント動物を同期化した。胚移植の３０日後及び６０日後に、レシピエントを、超音波検査により受胎産物の存在について検査し、その後３０日ごとに、直腸触診により２７０日目まで検査した。これらのウシ胎仔におけるＨＡＣの保持は、表２にまとめてあり、以下の節においてより詳細に記載する。
【表２】
2006505291.tif 000003
【０２０７】
１４番染色体の断片を含むＨＡＣの導入
ＳＣ２０断片、すなわちヒト１４番染色体断片（Ｉｇ重鎖遺伝子を含む「ｈｃｈｒ．１４ｆｇ」）を、上述したのと実質的に同じようにして、胎仔線維芽細胞に導入した。任意の他の標準的な染色体移入方法を使用して、このＨＡＣ、又はヒトＩｇ遺伝子を含む別のＨＡＣを、ドナー細胞に挿入してもよい。得られるドナー細胞を、上述したような技術等の標準的な核移植技術において用いて、ＨＡＣを有するトランスジェニック有蹄動物を作製することができる。
【０２０８】
ｈｃｈｒ．１４ｆｇを含む細胞からクローン胚を移植した２８匹のレシピエントの妊娠状況を、超音波検査により調べた。結果を表３にまとめた。
【０２０９】
所望であれば、得られたＨＡＣ胎仔又はＨＡＣ子孫由来の細胞を用いて、第２ラウンドの核移植を行い、さらにクローン化した子孫を作出することも可能である。最初のＨＡＣ胎仔又はＨＡＣ子孫由来の細胞はまた、凍結して細胞系統とし、それを別のＨＡＣ有蹄動物の作出のためのドナー細胞の供与源として使用しうる。
【表３】
2006505291.tif 000004
【０２１０】
妊娠率は、予想よりも低かった。これは、胚移植中の極端で異常に暑い気候に起因すると考えられる。
【０２１１】
図２７に示すように、ＨＡＣを担持する胚の妊娠率は、非トランスジェニッククローン妊娠体と等しいようである。ΔΔＨＡＣ仔ウシを担持する１匹のレシピエントは、最近、生存した健康な仔ウシを産んだ。他は数ヶ月先に産まれる。
【０２１２】
ΔＨＡＣウシ胎仔におけるヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現の実証
クローン化ΔＨＡＣ−トランスジェニックウシ胎仔を、様々な妊娠日数において取り出し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の存在、再配列及び発現について分析した。これらの胎仔の１匹の脾臓並びに非リンパ系組織（肝臓及び脳）からＲＴ−ＰＣＲにより得られたゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの分析は、ΔＨＡＣの存在、再配列及び発現を示していた。
【０２１３】
ΔＨＡＣ胎仔中のヒト重鎖及び／又は軽鎖の存在
ヒト重鎖及び軽鎖がΔＨＡＣ胎仔に保持されているか否かを決定するため、肝臓ＤＮＡをΔＨＡＣ胎仔から単離し、ＰＣＲにより、ヒト重鎖及び軽鎖をコードするゲノムＤＮＡの存在について分析した。
【０２１４】
ゲノム重鎖ＤＮＡを検出するために、以下のプライマーを使用した。すなわち、ＶＨ３−Ｆ 5'-AGT GAG ATA AGC AGT GGA TG-3'（配列番号１）及びＶＨ３−Ｒ 5'-CTT GTG CTA CTC CCA TCA CT-3'（配列番号２）であった。λ軽鎖ＤＮＡの検出のために使用したプライマーは、ＩｇＬ−Ｆ 5'-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAA A-3' （配列番号３）及びＩｇＬ−Ｒ 5'-GAG AGT TGC AGA AGG GGT YGA CT-3'（配列番号４）であった。ＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌフォワードプライマー及び１０ｐｍｏｌリバースプライマー、１μｌのゲノムＤＮＡ、並びに０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。反応混合液を以下の条件下でインキュベートすることにより、３８サイクルのＰＣＲを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、５６℃にて３０秒間、及び７２℃にて３０秒間である。
【０２１５】
図５に示すように、胎仔＃５９６８、６０３２及び６０４５はそれぞれ、ヒト重鎖（μ）及び軽鎖（λ）遺伝子座の両方を含んでいた。胎仔＃５９９６は、ヒト重鎖遺伝子座のみを含んでいた。胎仔＃５９８３は、ヒト重鎖を含んでおらず、ヒト軽鎖を含んでいなかった可能性がある。胎仔＃５８４６は、いずれのヒト配列も含んでいなかった。従って、胎仔＃５９８３及び５８４６は、ＨＡＣを保持していなかった可能性がある。これらの結果は、ΔＨＡＣが、ウシにおいて妊娠５８日目まで安定して保持され得ることを示唆している。
【０２１６】
ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６におけるヒトＣμエキソンの存在
Ｃμ３及びＣμ４の部分を含むｍＲＮＡ転写産物に特異的なプライマーを使用して、ΔＨＡＣが存在し、胎仔＃５９９６のヒトμ遺伝子座の定常領域をコードする転写産物を発現しているか否かを決定した。
【０２１７】
このヒトμ重鎖のゲノム定常領域のＲＴ−ＰＣＲ分析のために、プライマー「ＣＨ３−Ｆ１」（5'-acc acc tat gac agc gtg ac-3'、配列番号５）及び「ＣＨ４−Ｒ２」（5'-gtg gca gca agt aga cat cg-3'、配列番号６）を用いて、３５０塩基対のＲＴ−ＰＣＲ生成物を得た。このＰＣＲ増幅は、９５℃にて５分間の開始変性インキュベーションにより行った。次いで、９５℃にて１分間、５９℃にて１分間及び７２℃にて２分間のインキュベーションにより、変性、アニーリング及び増幅を３５サイクル行った。次いで、反応混合液を、７２℃にて１０分間インキュベートした。以下に記載するように（図７）、プライマーＩ７Ｌ及びＰ９を用いて、再配列ウシ重鎖を検出した。内部対照として、プライマー「ＧＡＰＤＨフォワード」（5'-gtc atc atc tct gcc cct tct g-3'、配列番号７）及び「ＧＡＰＤＨリバース」（5'-aac aac ttc ttg atg tca tca t-3'、配列番号８）を用いて、ＧＡＰＤＨ  ＲＮＡのレベルを検出した。このＧＡＰＤＨ  ＲＮＡの増幅のために、サンプルを、９５℃にて５分間インキュベートし、その後、９５℃にて１分間、５５℃にて１分間及び７２℃にて２分間のインキュベーションを３５サイクル行った。ついで、混合液を、７２℃にて７分間インキュベートした。
【０２１８】
この分析は、胎仔＃５９９６の脾臓のＲＴ−ＰＣＲ分析によって、対照ヒト脾臓ｃＤＮＡ（レーン４）及びΔＨＡＣキメラマウスから得たｃＤＮＡ（レーン５）を用いて生成した増幅産物に合致するバンド（レーン３）が生成したことを示した（図６）。非リンパ系組織（ウシ肝臓（レーン１）又はウシ脳（レーン２））においては、このようなバンドは検出されなかった。これらの組織が、ＲＴ−ＰＣＲを支援する能力を有することは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨの増幅が、肝臓（図６のレーン１０）及び脳（図７のレーン６）の両方において上手くいったことから示された。
【０２１９】
妊娠７７日目までのウシ重鎖遺伝子座の再配列
ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６を試験して、免疫グロブリン重鎖遺伝子座再配列に必要な組換え系の発現及び活性化に必要な発達プロセスを経たか否かを決定した。この分析のために、標準ＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、μ−ＶＨ再配列体をコードするｍＲＮＡ転写産物の存在を検出した。胎仔＃５９９６の脾臓、肝臓及び脳から単離したＲＮＡを、プライマー「１７Ｌ」（5'-ccc tcc tct ttg tgc tgt ca-3'、配列番号９）及び「Ｐ９」（5'-cac cgt gct ctc atc gga tg-3'、配列番号１０）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＰＣＲ反応混合液を、９５℃にて３分間インキュベートし、その後、以下の条件を使用して、変性、アニーリング及び増幅を３５サイクル行った。すなわち、９５℃にて１分間、５８℃にて１分間及び７２℃にて２分間である。次いで、反応混合液を７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０２２０】
図７のレーン５は、再配列ウシ重鎖の増幅について予測される大きさ（４５０塩基対）の生成物が得られたことを示す。この生成物は、再配列ウシ重鎖転写産物に対応する配列を含むことが知られている対照ウシＣμ重鎖ｃＤＮＡ（レーン７）の位置と同じ位置に移動した。予測どおり、再配列重鎖は、現発達時点では、脾臓（レーン５）において発現したが、脳（レーン２）及び肝臓（レーン３）では不在であった。
【０２２１】
ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中のヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現
ヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現は、Ｃμ及びＶＨ領域の部分を含むＤＮＡのセグメントが増幅することにより実証された。Ｃμ（Ｃμ１）及びＶＨ（ＶＨ３−３０）の部分を含むＲＮＡ転写産物に特異的なプライマーを用いて、再配列ヒトＣμ−ＶＤＪ配列を含むＲＮＡ転写産物が存在するか否かを決定した（図８）。
【０２２２】
このＲＴ−ＰＣＲ分析のために、プライマー「Ｃμ１」（5'-cag gtg cag ctg gtg gag tct gg-3'、配列番号１１）及び「ＶＨ３−３０」（5'-cag gag aaa gtg atg gag tc-3'、配列番号１２）を用いて、４５０塩基対のＲＴ−ＰＣＲ生成物を得た。このＲＴ−ＰＣＲは、反応混合液を、９５℃にて３分間インキュベートし、その後、９５℃にて３０分間、６９℃にて３０分間及び７２℃にて４５分間でのインキュベーションを４０サイクル、並びに７２℃にて１０分間のインキュベーションを１サイクル行うことにより、行った。次いで、同じプライマーで、９５℃にて３分間のインキュベーションを１サイクル、９５℃にて１分間、５９℃にて１分間、７２℃にて１分間のインキュベーションを４０サイクル、そして、７２℃にて１０分間のインキュベーションを１サイクル行うことにより、このＲＴ−ＰＣＲ生成物を再増幅した。内部対照として、上述したようにＧＡＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。
【０２２３】
図８中のゲルは、胎仔＃５９９６由来の脾臓のＲＴ−ＰＣＲ分析により、ヒト脾臓ｃＤＮＡ（レーン４）又はΔＨＡＣキメラマウス脾臓ｃＤＮＡ（レーン１）を用いて生成した増幅産物と一致するバンド（レーン５）が生成したことを示す。ウシ肝臓（レーン２）又はウシ脳（レーン３）においては、このようなバンドは検出されなかった。陽性対照として、ＧＡＤＰＨ  ＲＮＡ（レーン８及び９）の増幅は、これらの組織がＲＴ−ＰＣＲを実施する能力を有することを示した。
【０２２４】
胎仔＃５９９６におけるヒト重鎖領域の再配列及び発現は、プライマーＣＨ３−Ｆ３（5'-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAA A-3'、配列番号１３）及びＣＨ４−Ｒ２（5'-GTG GCA GCA AGT AGA CAT CG-3'、配列番号１４）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析によっても実証された。これらのＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、１μｌのｃＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。以下の条件下で反応混合液をインキュベートすることにより４０サイクルのＰＣＲを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて３０秒間である。
【０２２５】
図９のレーン６及び７に示すように、胎仔＃５９９６の脾臓由来の増幅配列は、２つの陽性対照（ヒト脾臓（レーン８）及びΔＨＡＣキメラマウス脾臓（レーン９）に由来するサンプル）に由来するスプライシングされた定常領域断片と同じ大きさであった。予測したように、正常マウス脾臓及びウシ脾臓に由来する陰性対照は、増幅配列を含まなかった（レーン１及び２）。胎仔＃５９９６の肝臓及び脳由来のサンプルは、スプライシングされたヒトμ重鎖定常領域断片と同じ大きさのスプライシングされ増幅された配列を含まなかったが、ＲＮＡサンプルを汚染するゲノムＤＮＡから誘導されたスプライシングされていないゲノム断片の増幅配列は含んでいた（レーン３、４及び５）。
【０２２６】
ΔＨＡＣ胎仔におけるヒト重鎖遺伝子座のＶＤＪ再配列
ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６における重鎖遺伝子座中でのＶＤＪ再配列をさらに実証するためにも行った。第１の反応のためにプライマーＣμ−１（5'-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3'、配列番号１５）、第２の反応のためにプライマーＣμ−２（5'-AGG CAG CCA ACG GCC ACG CT-3'、配列番号１６）、そして両方の反応のためにプライマーＶＨ３−３０．３（5'-CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG-3'、配列番号１７）を用いて、ｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、１μｌのｃＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。ＲＴ−ＰＣＲは、第１の反応について以下の条件下で３８サイクル行うことにより行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６５℃にて３０秒間、及び７２℃にて３０秒間であった。第２の反応については、３８サイクルを以下の条件下で行った。すなわち、プライマーＶＨ３−３０．３及びＣμ−２（5’-AGG CAG CCA ACG GCC ACG CT-3'、配列番号１６）を用いて、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６５℃にて３０秒間、及び７２℃にて３０秒間であった。
【０２２７】
図１０のレーン６及び７に示すように、胎仔＃５９９６の脾臓のＲＴ−ＰＣＲ分析は、レーン８及び９の陽性対照と同じ大きさの重鎖バンドを生成した。胎仔＃５９９６の肝臓及び脳由来のサンプルは、いくらかの汚染再配列ＤＮＡを含んでいた（レーン３及び５）。レーン１及び２の陰性対照は、正しくない大きさのバンドを生成した。
【０２２８】
配列決定によるΔＨＡＣ再配列の確認
ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６の脾臓由来のＲＮＡの逆転写により得たｃＤＮＡを、再配列ヒトμに特異的なプライマーで増幅し、アガロースゲル上を移動させた。Ｃμ１−ＶＨ３−３０プライマー対での増幅により生成したバンドをゲルから切り出した。増幅したｃＤＮＡをバンドから回収し、クローニングした。再配列ヒトμについてＰＣＲ陽性である得られたクローンから得たＤＮＡを、精製及び配列決定した（図１１Ａ）。
【０２２９】
このΔＨＡＣ胎仔由来の配列は、２０を超える既知のヒト重鎖配列に対して９５％を上回る相同性を有する。例えば、ヒト抗肺炎球菌抗体のμ鎖は、この配列の領域に９７％の相同性を有する（図１１Ｂ）。
【０２３０】
再配列ヒト重鎖由来の追加の配列も、プライマーＣμ−１及びＶＨ３−３０．３を用いた胎仔＃５９９６の脾臓のＲＴ−ＰＣＲ分析、その後のプライマーＣμ−２及びＶＨ３−３０．３を用いた再増幅により得た。ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮカラム（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）を用いてＲＴ−ＰＣＲ生成物を精製し、ｐＣＲ２．１  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造元のプロトコールに従ってクローニングした。Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定反応（ＡＢＩ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ反応混合液（３μｌ）、鋳型プラスミド（２００ｎｇ）、及びＣμ−２プライマー（１．６  ｐｍｏｌ）からなる１０μｌ容量の反応混合液中で行った。配列決定反応を、ＡＢＩ３７００シーケンサーを使用して行った。この分析のために、以下の条件下で２５サイクルを行った。すなわち、９６℃にて１分間、９６℃にて１０秒間、５５℃にて５秒間、及び６０℃にて４分間であった。
【０２３１】
少なくとも２つの再配列ヒト重鎖転写産物（ＶＨ３−１１／Ｄ７−２７／ＪＨ３／Ｃμ及びＶＨ３−３３／Ｄ６−１９／ＪＨ２／Ｃμ（図１２Ａ及び図１２Ｂ））が同定された。これらの結果は、ヒトμ重鎖遺伝子座のＶＤＪ再配列が、胎仔＃５９９６の脾臓中のΔＨＡＣにおいて生じることを立証している。同じ胎仔に由来する２以上の再配列重鎖配列の同定も、ΔＨＡＣ胎仔が多様なヒト免疫グロブリン配列を産生する能力を有することを実証する。
【０２３２】
ΔΔＨＡＣ胎仔におけるヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の再配列及び発現
ΔΔＨＡＣが染色体移入（transchromosomal）されたウシ胎仔線維芽細胞から誘導されたクローン胎仔を、様々な妊娠日数にあるレシピエントウシから取り出した。ＨＡＣ担持ヒト免疫グロブリン重鎖及びλ軽鎖遺伝子座の存在及び再配列について、胎仔を分析した。これらの組織に由来するゲノムＤＮＡの調査から、一部の胎仔におけるヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の存在が示された。これらの胎仔の脾臓から誘導されたｃＤＮＡの調査から、これらの胎仔の一部における免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の再配列及び発現が示された。ＦＡＣＳ分析も、２匹の胎仔における脾臓リンパ球の表面上のヒトλ軽鎖タンパク質の発現を実証した。
【０２３３】
ΔΔＨＡＣ胎仔におけるヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の存在
ΔΔＨＡＣ胎仔が、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座を保持しているか否かを判断するために、５８日齢胎仔＃５５８０、５７日齢胎仔＃５８４８、並びに９１日齢胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂの肝臓由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行った。重鎖遺伝子座を検出するために使用したＰＣＲプライマーは、ＶＨ３−Ｆ（5'-AGT GAG ATA AGC AGT GGA TG-3'、配列番号１８）及びＶＨ３−Ｒ（5'-CTT GTG CTA CTC CCA TCA CT-3'、配列番号１９）、そして軽鎖を検出するために使用したプライマーは、ＩｇＬ−Ｆ（5'-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAA A-3'、配列番号２０）及びＩｇＬ−Ｒ（5'-GAG AGT TGC AGA AGG GGT YGA CT-3'、配列番号２１）であった。ＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、１μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。以下の通り３８サイクルのＰＣＲを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、５６℃にて３０秒間、及び７２℃にて３０秒間であった（図１３及び図１４）。
【０２３４】
図１３及び図１４に示すように、陽性対照の５８日齢胎仔＃５５８０は、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の両方を含んでいた。さらに、９１日齢胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂも、重鎖及び軽鎖遺伝子座の両方を含んでいた（図１４）。対照的に、胎仔＃５８４８は、いずれのヒト遺伝子座も含んでおらず、ΔΔＨＡＣを含んでいなかった可能性がある。これらの結果は、ΔΔＨＡＣが、ウシにおいて妊娠９１日目まで安定して保持され得ることを示唆した。
【０２３５】
ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａにおけるヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現
ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５５４２Ａにおける再配列ヒト重鎖ＲＮＡ転写産物の発現を検出した。使用したＲＴ−ＰＣＲプライマーは、ＣＨ３−Ｆ３（5'-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAA A-3'、配列番号２２）及びＣＨ４−Ｒ２（5'-GAG AGT TGC AGA AGG GGT GAC T-3'、配列番号２３）であった。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、１μｌのｃＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。以下の通り、４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲサイクルを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて３０秒間であった。
【０２３６】
図１５のレーン４及び５は、陽性対照サンプルと大きさが近い、胎仔＃５４４２Ａの脾臓由来のスプライシングされ増幅されたμ重鎖定常領域配列を含んでいた。これらの結果は、胎仔＃５４４２Ａが、その脾臓において、再配列μ重鎖転写産物を発現したことを示す。ＲＮＡサンプル中で汚染されたゲノムＤＮＡから増幅されたスプライシングされていないゲノム配列の領域においては曖昧なバンドも見られた。胎仔＃５４４２Ａの肝臓及び脳由来の対照サンプルは、増幅再配列重鎖配列について予想していた大きさのバンドを生成しなかった。
【０２３７】
ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａにおけるヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現
ＲＴ−ＰＣＲを行って、妊娠１１９日目のΔΔＨＡＣ胎仔（胎仔＃５８６８Ａ）の脾臓における再配列ヒト重鎖ＲＮＡ転写産物の発現を検出した。この分析のために使用したプライマーは、ＶＨ３０−３（5'-cag gtg cag ctg gtg gag tct gg-3'、配列番号２４）及びＣＭ−１（5'-cag gag aaa gtg atg gag tc-3'、配列番号２５）であった。さらに、プライマー「ＧＡＰＤＨ  ｕｐ」（5'-gtc atc atc tct gcc cct tct g-3'、配列番号２６）及び「ＧＡＰＤＨ  ｄｏｗｎ」（5'-aac aac ttc ttg atg tca tca t-3'、配列番号２７）を用いて、ＧＡＰＤＨ対照転写産物を増幅した。このＰＣＲ分析のために、反応混合液を、９５℃にて５分間インキュベートし、その後、９５℃にて１分間、５８℃にて１分間及び７２℃にて２分間インキュベートすることで変性、アニーリング及び増幅を複数サイクル行った。次いで、混合液を７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０２３８】
図１６のレーン３は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａのこの分析で生成したＲＴ−ＰＣＲ生成物を含む。このＲＴ−ＰＣＲ生成物は、再配列ヒト重鎖（４７０塩基対）の増幅について予測していた大きさで、ゲルにおいて、再配列ヒト重鎖転写産物に対応する配列を含むことが知られている対照ｃＤＮＡと同じ位置に移動した。対照として、ΔΔＨＡＣ胎仔５８６８Ａ胎仔脾臓ｃＤＮＡ及び正常ウシｃＤＮＡサンプルの両方が、ＧＡＰＤＨプライマーで増幅された場合に生成物を生成し、ｃＤＮＡが増幅を実施する能力を有することを実証した（レーン７及び８）。
【０２３９】
ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂにおけるヒトλ遺伝子座の再配列及び発現
ヒトλの部分を含む転写産物の増幅に特異的なプライマーを用いて、再配列ヒトλ軽鎖遺伝子座由来のＲＮＡ転写産物を検出した。
【０２４０】
図１７に示すＲＴ−ＰＣＲについては、プライマーＣλ１（5'-GGG AAT TCG GGT AGA AGT TCA CTG ATC AG -3'、配列番号２８）、Ｃλ２−３（5'-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA TGA G -3'、配列番号２９）及びＣλ７（5'-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA CGA G -3'、配列番号３０）の等モル混合液を、プライマーＶλ１  ＬＥＡ１（5'-CCC AAG CTT RCC KGS TYY CCT CTC CTC -3'、配列番号３１）と共に使用した。ＲＴ−ＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、１μｌのｃＤＮＡ、及び０．３μｌのＥｘ  Ｔａｑを含んでいた。ＲＴ−ＰＣＲ条件は以下の通りであった。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、６０℃にて３０秒間、及び７２℃にて１分間を４０サイクルであった。
【０２４１】
図１８に示すように、このＲＴ−ＰＣＲ分析は、プライマーＶλ３ＬＥＡ１（5'-CCC CCA AGC TTG CCT GGA CCC CTC TCT GG-3'、配列番号３２）、Ｖλ３ＪＬＥＡＤ（5'- ATC GGC AAA GCT TGG ACC CCT CTC TGG CTC AC-3'、配列番号３３）、ＶλＢＡＣＫ４（5'-CCC CCA AGC TTC TCG GCG TCC TTG CTT AC-3'、配列番号３４）の等モル混合液、並びにプライマーＣλ１（5’-GGG AAT TCG GGT AGA AGT TCA CTG ATC AG-3’、配列番号３５）、Ｃλ２−３（5’-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA TGA G-3’、配列番号３６）及びＣλ７（5’-GGG AAT TCG GGT AGA AGT CAC TTA CGA G-3’、配列番号３７）の等モル混合液を用いても行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応条件は、図７について上述したものと同じであった。
【０２４２】
図１７のレーン６及び７、並びに図１８のレーン４及び５は、陽性対照バンドと大きさが似ている胎仔＃５４４２Ａの脾臓由来のＲＴ−ＰＣＲ生成物を含んでおり、この胎仔における再配列軽鎖ＲＮＡ転写産物の存在を示した。胎仔＃５４４２Ｂ由来の脾臓サンプルは、写真では目に見えない適切な大きさの非常に弱いバンドを生成した。このＲＴ−ＰＣＲ生成物は、胎仔＃５４４２Ｂも、その脾臓において再配列軽鎖免疫グロブリン転写産物を発現したことを示す。予想通り、胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂの脳由来のサンプルは、ヒト再配列λ軽鎖転写産物を発現しなかった。
【０２４３】
ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａにおけるヒトλ遺伝子座の再配列及び発現
再配列ヒトλ軽鎖遺伝子座由来のＲＮＡ転写産物を、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａにおいても検出した。この分析のために、ヒトλの部分を含む転写産物の増幅に特異的なプライマーを用いて、再配列ヒトλ遺伝子座の部分をコードする転写産物のΔΔＨＡＣコード発現を検出した。プライマーＶＬ１  ＬＥＡＩ（5'-ccc cca agc ttR ccK gSt Yyc ctc tcc tc-3'、配列番号３８）、並びにプライマーＣＬ１（5'-ggg aat tcg ggt aga agt cac tga tca g-3'、配列番号３９）、ＣＬ２−３（5'-ggg aat tcg ggt aga agt cac tta tga g-3'、配列番号４０）及びＣＬ７（5'-ggg aat tcg ggt aga agt cac tta cga g-3'、配列番号４１）の等モル混合液をこの分析のために使用した。このＲＴ−ＰＣＲ反応のために、反応混合液を、９５℃にて５分間インキュベートし、次いで、９５℃にて１分間、６０℃にて１分間及び７２℃にて２分間インキュベートすることで変性、アニーリング及び増幅を複数サイクル行った。次いで、混合液を７２℃にて１０分間インキュベートした。
【０２４４】
この分析は、ΔΔＨＡＣ＃５８６８Ａ（図１９のレーン４）由来の脾臓ｃＤＮＡが、ＴＣマウス脾臓ｃＤＮＡ（レーン６）陽性対照と同じ大きさのＲＴ−ＰＣＲ生成物を生成したことを実証した。ΔΔＨＡＣ＃５８６８Ａ由来の脳又は肝臓ｃＤＮＡ（それぞれレーン２及び３）のいずれを使用しても、このようなＲＴ−ＰＣＲ生成物は検出されなかった。プライマー「ＧＡＰＤＨ  ｕｐ」及び「ＧＡＰＤＨ  ｄｏｗｎ」を用いたハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの増幅が上手くいったことで（レーン８及び１０）、これらの組織がそれぞれＲＴ−ＰＣＲを支援する能力を有することが示された。
【０２４５】
配列決定によるΔΔＨＡＣ再配列の確認
胎仔＃５４４２Ａ由来の脾臓サンプルに対して、プライマーＣλ１、Ｃλ２−３及びＣλ７の等モル混合液をプライマーＶλ１ＬＥＡ１と共に、又はプライマーＶλ３ＬＥＡ１、Ｖλ３ＪＬＥＡＤ及びＶλＢＡＣＫ４の等モル混合液、並びにプライマーＣλ１、Ｃλ２−３及びＣλ７の等モル混合液を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。ＰＣＲ生成物を、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて精製し、ｐＣＲ２．１  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に製造元のプロトコールに従ってクローニングした。Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列決定反応（ABI Applied System）を、等モル混合液中のＣλ１、Ｃλ２−３及びＣλ７プライマーを用いて実施した。９６℃にて１分間、９６℃にて１０秒間、５５℃にて５秒間及び６０℃にて４分間を２５サイクル行った。１０μｌ反応混合液は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ反応混合液（３μｌ）、鋳型プラスミド（２００ｎｇ）、並びにＣλ１、Ｃλ２−３及びＣλ７プライマー（１．６ｐｍｏｌ）を含んでいた。反応混合液は、ＡＢＩ  ３７００シーケンサーを用いて分析した。
【０２４６】
少なくとも２つの再配列ヒトλ軽鎖転写産物が同定された（Ｖ１−１７／ＪＬ３／Ｃλ及びＶ２−１３／ＪＬ２／Ｃλ）。これらの結果は、ヒトλ軽鎖遺伝子のＶＪ再配列が胎仔＃５４４２Ａの脾臓中のΔΔＨＡＣにおいて生じることを実証している（図２０及び２１）。
【０２４７】
ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂにおけるヒトλ軽鎖及びウシ重鎖の発現のＦＡＣＳ分析
ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂ由来の脾臓リンパ球を、ヒトλ軽鎖及びウシ重鎖タンパク質の発現について分析した。これらの細胞を、フィコエリトリン標識化抗ヒトλ抗体と（図２２Ｃ及び図２２Ｄ）、ＦＩＴＣ標識化抗ウシＩｇＭ抗体と（図２２Ｄ及び２２Ｈ）、又は抗体無しで（図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｅ及び図２２Ｆ）、４℃にて２０分間反応させた。その後、細胞を、２％ＦＣＳを加えたＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＳＣａｌｉｂｕｒセルソーター上で分析した。電子的にゲートを設定するために、非抗体対照を用いて、抗体と反応した細胞のパーセンテージを計算した。これらのパーセンテージは、各ヒストグラムの下に表示している。胎仔＃５４４２Ａ（図２２Ａ〜２２Ｄ）及び胎仔＃５４４２Ｂ（図２２Ｅ−２２Ｈ）は、ヒトλ軽鎖タンパク質及びウシ重鎖タンパク質の両方を発現した。
【０２４８】
ＨＡＣ仔ウシにおけるヒト抗体タンパク質の発現
上記のように、トランスクロモゾーム（Ｔｃ）仔ウシを作出するための新規な操作法を開発した（図３７）。この方法は、一次ウシ線維芽細胞にとっては細胞倍加が約３５のみという限られた寿命、及びドナー細胞に導入されて維持されるべき大きなＤＮＡ挿入体（insert）のための必要条件による制限を克服する。特に、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）ベクターを用いて、再配列していない全体のヒトＩｇ重鎖（ＩｇＨ）及びラムダ軽鎖（Ｉｇλ）遺伝子座の両方をウシ一次線維芽細胞に導入した。選択した線維芽細胞クローンを、クローン化胎仔を産生することにより再び幼若化し、増殖させた。クローン化胎仔細胞を選択し、再クローン化して４頭の健康なＴｃ仔ウシを産生したところ、これらは重鎖及び軽鎖ヒトＩｇ遺伝子座の両方を機能的に再配列し、かつヒトポリクローナル抗体を産生した。これらの結果は、トランスジェニック家畜の作出のためのＨＡＣベクターの使用可能性を実証する。より重要なことには、ヒトＩｇ遺伝子を含むＴｃウシを用いて、抗生物質耐性感染症の予防からバイオテロリズムの撲滅に至る用途を有する新規なヒトポリクローナル治療剤を製造することができる。以下に、この方法をより詳細に記載する。
【０２４９】
ＨＡＣをＣＨＯクローンに由来するウシ胎仔線維芽細胞に、本明細書に記載したＭＭＣＴ技術を用いて導入した。コロニーが出現し始めるまで、線維芽細胞をＧ４１８（７００μｇ／ｍｌ）を用いてＨＡＣベクター上のｎｅｏ遺伝子マーカーについて選択した。このステップで、完全な抗生物質選択及びＤＮＡに基づくスクリーニングを回避し、核移植前の細胞分裂を最小限にした。コロニーを増殖及び形態に基づいて選択し、核移植を上記のように行った（Ｌｕｃｉｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：５４３８−５４４４，１９９８）。細胞は数日間だけ核移植に有用なので、最終選択は、再幼若化し、かつクローン化胎仔の作出により細胞を増殖させた後に行った。
【０２５０】
胚盤胞期への発育は１７〜２１％の範囲にあり、４０日目の妊娠は２２〜５０％の範囲にあり、細胞系の間で相違がなかった。５６〜５８日に、４頭のΔＨＡＣ胎仔及び２頭のΔΔＨＡＣ胎仔を回収し、線維芽細胞系を再生し、さらに分析及び核移植のために凍結保存した。５６〜５８日に集めた胎仔、及び７７〜１１９日に集めた追加の７頭の胎仔から誘導された線維芽細胞系中のＨＡＣの保持を、Ｇ４１８耐性（図３８Ａ）及びＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子座のゲノムＰＣＲ（図３８Ｂ）により評価した。１３頭の胎仔の９頭はＧ４１８に耐性であり、それらの８頭はヒトＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子座の両方の存在を示した。３頭のΔＨＡＣ（＃５９６８、＃６０３２及び＃６０４５）及び１頭のΔΔＨＡＣ（＃５５８０）陽性５６〜５８日胎仔を、再クローン化及び子孫の産生のために使用した。５頭の陽性７７〜１１９日胎仔を、ＲＴ−ＰＣＲ分析、続いて増幅産物の配列決定によりヒトＩｇ遺伝子座の発現及び再配列について評価した。ヒトＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子は全ての胎仔で発現され（図３８Ｃ）、適切なＶ（Ｄ）Ｊ組換えの証拠を示した（図３８Ｄ）。
【０２５１】
再クローン化ΔＨＡＣ細胞系は、３７頭のレシピエントから１頭の雄（細胞系＃６０４５由来）及び５頭の雌（＃５９６８及び＃６０３２由来）仔ウシを産生した（１６％、図３９Ａ）。細胞系＃６０３２から誘導された２頭の仔ウシは生後４８時間以内に死亡した。１頭の仔ウシは非再生ΔΔＨＡＣ細胞から生まれた。５頭の生存仔ウシ全ては健康であり、かつ表現型が正常であった。ＨＡＣの保持は、Ｇ４１８選択、ゲノムＰＣＲ及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析により、全ての仔ウシで確認された（図３９Ｂ及び３９Ｃ）。ＦＩＳＨ分析の結果は、ＨＡＣが独立した染色体として保持されたこと、及びＨＡＣを保持する細胞の割合が７８〜１００％であったことを示した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ、９１％）と線維芽細胞（８７％）との間には保持率に明らかな相違が観察されなかった。ドナー細胞系＃６０４５は、ドナー細胞系＃５９６８（それぞれ９７％及び８６％）よりも高い保持率を有する可能性がある。興味深いことに、Ｔｃウシにおける保持率は、本発明者が以前にマウスで観察したものよりも高いことがある。ヒトＩｇ遺伝子座が仔ウシ並びに胎仔において再配列され、かつ発現されたかどうかを判定するために、本発明者はＰＢＬにおいてＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。本発明者は、ＰＢＬにおけるヒトＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子の両方の発現を観察し、多様なヒトＩｇＨ及びＩｇλレパートリーが配列分析により測定された（表４）。配列の代表的セットは、遺伝子座にわたって分布するＶＨ／Ｖλ、ＤＨ及びＪＨ／Ｊλセグメントの広い利用を示した。Ｉｇλ転写産物において、ＶＨ１及びＶＨ３に由来するＶセグメントの高頻度の利用が観察された。これは、ヒトにおけるＶＨセグメントの利用と同様である。非生殖細胞系列のヌクレオチドの付加（Ｎ−付加）並びにヌクレオチド欠失も、ＩｇＨ及びＩｇλ転写産物の両方で観察された。これは、重鎖及び軽鎖の両方の第三相補性決定領域（ＣＤＲ３）において高度の多様性を生じた。さらに、ヒトＩｇタンパク質は、７頭の仔ウシのうち５頭で、初乳を与える前に採取した血液サンプル中に、固相ＥＬＩＳＡにより測定して、１３〜２５８ｎｇ／ｍｌの範囲のレベル（Ｉｇ発現は新生仔ウシにおいて典型的に非常に低い〜検出不可能である）で検出された。これらのデータは、ＨＡＣ移入が、一次細胞において再クローン化手法用いて効率的に行いうること、及びＨＡＣにより担われるヒトＩｇ遺伝子が、Ｔｃ仔ウシにおいて高度の多様性で適切にプロセシング及び発現されうることを示す。
【０２５２】
この研究の結果は、染色体クローン化、染色体移入及び体細胞再クローン化技術の組み合わせを用いて、Ｍｂサイズのゲノムトランスジーンを担持するＨＡＣベクターを保持する健康な仔ウシを産生しうることを実証する。さらに、これらの技術を用いて、仔ウシにおいてヒトＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子の両方の遺伝子座全体の移入及び保持を実証した。興味深いことに、両方の遺伝子座は、ヒト又はマウスのどれとも実質的に異なる免疫生理学を有する種において、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン遺伝子の適切なプロセシングを経てそれを発現したことが実証された。このＨＡＣ系は、医薬用途のための種々の複合ヒトタンパク質（例えば、ヘモグロビン）又はタンパク質の大きな集合体を発現させるために使用することができる。例えば、ヒトＩｇＨ及びＩｇλ遺伝子座の両方を保持している、この研究で作出したＴｃ仔ウシは、ヒトポリクローナル抗体の製造に有用である。ヒトポリクローナル抗体は、現在、ヒト血液又は血漿ドナーからしか入手できない。従って、ヒトポリクローナル産物の供給及び応用には制限がある。Ｔｃウシを超免疫して、多種多様なヒト疾患を処置するための新規ポリクローナル治療剤を大量生産することができる。
【０２５３】
表４．クローン化Ｔｃ仔ウシにおけるヒト免疫グロブリン重鎖及びλ鎖の転写産物のレパートリー分析
ヒトμ及びλ−特異的ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、クローン化し、配列決定した。１０の独立したμ及びλクローンのそれぞれのＶ（Ｄ）Ｊ結合部のヌクレオチド配列は、公開された生殖細胞系列配列（Ｉｇ−ＢＬＡＳＴ）との相同性により決定して、ＶＨ／Ｖλ、ＤＨ、ＪＨ／Ｊλ及びＮセグメントに分類して示されている。
【表４】
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2006505291.tif 000006
【実施例３】
【０２５４】
１以上の内因性抗体に突然変異を有する、異種抗体を産生するトランスジェニック有蹄動物
実施例２に記載したように異種抗体を発現しかつプリオン遺伝子に突然変異を有する有蹄動物において、内因性抗体の発現は、任意により１以上の内因性抗体遺伝子を突然変異させて低減させてもよい。機能性内因性重鎖又は軽鎖遺伝子の数に対する、機能性異種免疫グロブリン重鎖又は軽鎖遺伝子の数を増やすことで、所望の異種抗体（例えばヒト治療用抗体）を発現するＢ細胞の割合（％）が高まるはずである。
【０２５５】
これらのトランスジェニック有蹄動物を作製するために、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣトランスジェニック有蹄動物を、内因性免疫グロブリン鎖（例えば、μ重鎖又はλ若しくはκ軽鎖）の一方又は両方のアレルに突然変異を含むトランスジェニック有蹄動物と交配してもよい。所望であれば、得られたトランスジェニック有蹄動物を、（ｉ）内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、プリオン、及び／若しくはＪ鎖核酸の一方又は両方のアレル中に突然変異を含むトランスジェニック有蹄動物、又は（ｉｉ）外因性Ｊ鎖核酸（例えば、ヒトＪ鎖）を含むトランスジェニック有蹄動物、と交配してもよい。あるいはまた、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣトランスジェニック胎仔由来の細胞（例えば、胎仔線維芽細胞）を、１つ以上の内因性免疫グロブリン遺伝子の突然変異により遺伝子改変してもよい。別の可能性のある方法では、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣを、内因性免疫グロブリン（μ重鎖及び／又はλ軽鎖）がヘミ接合的又はホモ接合的に不活性化されている細胞（例えば、胎仔線維芽細胞）に導入する。上記方法のいずれにおいても、細胞は、（ｉ）突然変異（好ましくはノックアウト突然変異）を、内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、プリオン及び／若しくはＪ鎖核酸の一方又は両方のアレルに導入すること、又は（ｉｉ）外因性Ｊ鎖核酸を導入すること、によっても遺伝子改変され得る。得られたトランスジェニック細胞を、核移植手順に使用して、所望のトランスジェニック有蹄動物を生成してもよい。例示の方法を以下に記載する。
【０２５６】
ＤＮＡ構築物
上記したμ重鎖（図２Ａ）、λ軽鎖、κ軽鎖、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、プリオン及び／又はＪ鎖ノックアウト構築物を使用してもよい。あるいはまた、以下に記載するピューロマイシン耐性μ重鎖構築物を使用してもよい（図３Ｆ）。このノックアウト構築物は、ウシμ重鎖遺伝子座の４つの主要コードエキソンを除去するが、膜貫通ドメインは無傷のまま残して、μ重鎖遺伝子座の不活性化を生じるように設計した。
【０２５７】
ピューロマイシン耐性構築物は、以下のように組み立てた。コードエキソン１にすぐに近接する領域を含む４．４キロ塩基ＸｈｏＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＸｈｏＩ部位に挿入した。ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＰＧＫＰｕｒｏを、Ｐｅｔｅｒ  Ｗ．Ｌａｉｒｄ博士（Whitehead Institute, USA）から入手した。ピューロマイシン耐性遺伝子を含む１．７ＫｂのＸｈｏＩ断片を、４．４  Ｋｂ断片の隣かつ下流において、ポリリンカー領域に存在するＳａｌＩ部位にサブクローニングした。この１．７Ｋｂピューロマイシンマーカーは、ウシ免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコードエキソンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４と置き換わる。野生型ゲノム配列においてこれらの４つのエキソンの下流にあるμ遺伝子座の４．６Ｋｂ領域を含むＸｂａＩ断片を、この構築物に付加して、第２の相同性領域として使用した。
【０２５８】
最終的なターゲッティング構築物を作製するために、３つの組み立てた断片をＮｏｔＩ及びＭｌｕＩで切断することにより、この構築物のサブクローンを作製した。ＭｌｕＩ制限消化は、４．６Ｋｂ断片を１．４Ｋｂまでトランケートする。ＮｏｔＩ部位は、ポリリンカーに存在し、サブクローン化ＤＮＡ自体は切断しない。ＭｌｕＩ部位をクレノウ断片で充填して平滑末端を生成させ、ＮｏｔＩ／充填ＭｌｕＩ断片を、新しいｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に存在するＮｏｔＩ及びＳｍａＩ部位を用いてサブクローニングした。遺伝子ターゲッティングのために、この最終ベクターをＮｏｔＩで直線化した。
【０２５９】
エレクトロポレーションによる遺伝子ターゲッティング、及びトランスフェクト線維芽細胞の薬剤選択
エレクトロポレーションのために、限られた数の集団倍加を経た１×１０７ウシ胎仔線維芽細胞（例えば、実施例２に記載のように、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣトランスジェニック胎仔から得た線維芽細胞）の単一細胞懸濁液を、１２００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、０．８ｍｌの無血清α−ＭＥＭ培地に再懸濁させた。再懸濁細胞を、０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベット（Invitrogen、カタログ番号P460-50）に移した。次に、制限酵素で線状化した遺伝子ターゲッティングベクターＤＮＡを３０μｇ加え、１ｍｌピペットを用いてキュベットの中身を混合し、その後室温にて２分間インキュベーションステップを行った。キュベットを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩエレクトロポレーションシステム（Ｂｉｏｒａｄ）のショックチャンバーに入れ、１０００ボルト及び５０μＦにてエレクトロポレーションした。キュベットを、組織培養フードに素早く移し、エレクトロポレーションした細胞を、約３０ｍｌの完全線維芽細胞培地にピペットで入れた。細胞を、３０の１００ｍｍ組織培養皿（Corning、カタログ番号431079）に等しく分配し、緩やかに回して細胞を均一に行き渡らせ、３８．５℃／５％ＣＯ２にて１６〜２４時間インキュベートした。吸引により培地を除去し、選択した選択薬剤を含む完全線維芽細胞培地で置き換えた。培地は２日ごとに替え、合計７〜１４日間の間続けた。薬剤選択プロセスの間、相当するプレートを目でモニターして、細胞死及びコロニー形成を調べた。遺伝子ターゲッティングベクターの不在下でエレクトロポレーションした線維芽細胞を含み、薬剤選択プロセスの間にコロニーを生成しないはずの陰性対照プレートを用意した。
【０２６０】
薬剤耐性線維芽細胞コロニーの採取及び細胞の増殖
薬剤耐性コロニーは、薬剤選択ステップ（通常、７〜１４日間）の終了後、肉眼で目に見え、すぐにも増殖用の４８ウェル組織培養プレートに移せる状態である。この移すプロセスを助けるために、個々のコロニーについて、組織培養プレートの底に色ペン（Sharpie）で丸をつけた。コロニーを含む組織培養プレートを、１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない）で２回洗浄し、次いで、１プレートにつき細胞解離緩衝液の１：５希釈液を５ｍｌ添加した。室温にて３〜５分間のインキュベーションステップの後、個々のコロニーが組織培養皿の底から剥がれ始める。コロニーが剥離する前に、Ｐ２００ピペットメン（pipetmen）及びエアロゾルバリアーピペットチップ（２００又は２５０μｌ）を用いて、４８ウェル組織培養プレートの単一のウェルに個々に移した。移した後、上下にピペッティングすることによりコロニーを完全に解離させ、１ｍｌの完全線維芽細胞培地を添加した。細胞が確実に薬剤耐性となるように、４８ウェルステージにわたり薬剤選択を続けた。移したコロニーを、３８．５℃／５％ＣＯ２にて培養し、倒立顕微鏡を用いて目でモニターした。２〜７日後、集密状態に達したウェルを、１×Ｄ−ＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まない）で２回洗浄し、０．２ｍｌの細胞解離緩衝液を添加することでウェルの底から剥がし、その後室温にて５分間インキュベーションステップを行った。剥離後、Ｐ１０００ピペットメン及びエアロゾルピペットチップ（１０００μｌ）を用いて、上下にピペッティングすることにより細胞をさらに解離させる。解離した線維芽細胞の約７５％を、２４ウェル組織培養プレートの個々のウェルに移し、後続するＰＣＲ分析のためにさらに増殖させ、残りの２５％は、第２の２４ウェルプレートの単一のウェルに移して増殖させ、最終的に体細胞核移植実験に使用する。元の細胞の７５％を含むプレート中の細胞が集密状態近くまで増殖したら、そのクローンからＤＮＡを単離して遺伝子分析する。
【０２６１】
ＤＮＡ調製
遺伝子分析のためにＤＮＡを単離するのに使用する手順は、Lairdら, Nucleic Acids Research, 1991, Volume 19, No. 15を応用する。具体的には、２４ウェルプレートの１つのウェルにおいて特定のクローンがほぼ集密状態になったら、そのウェルから培養培地を吸引し、付着細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＰＢＳを吸引除去し、０．２ｍｌ緩衝液と置き換えて、細胞を溶解し、単離しようとするＤＮＡ由来の余分なタンパク質を消化する。この緩衝液は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫからなる。２４ウェルプレートを組織培養インキュベーターに、最低３時間戻して、ＤＮＡを放出させ、タンパク質を消化させる。この手順の粘性産物を、１．５ｍｌ微量遠心管に移し、０．２ｍｌのイソプロパノールを添加して、ＤＮＡを沈降させる。遠心分離により沈降物を回収し、７０％エタノールでＤＮＡペレットを濯ぎ、通気乾燥後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５〜５０μｌの緩衝液にペレットを再懸濁させる。このＤＮＡを、クローンのＰＣＲ分析に使用する。
【０２６２】
クローンのスクリーニング
２つの異なる手法（両方ともポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を採用する）を用いてクローンをスクリーニングする。本節において記載する全ての手法が、任意の他の遺伝子をターゲッティングするために応用でき、唯一の違いは遺伝子分析に使用するプライマーの配列である。
【０２６３】
第１の手法によれば、２つの別々のプライマー対を使用して、安定したトランスフェクション生成物を個々に増幅する。一方のプライマー対は、組込み部位に関係なく、クローンのゲノム中にターゲッティングベクターが存在するのを検出するために使用する。プライマーは、両方ともターゲッティングベクター中に存在するＤＮＡ配列にアニールするように設計する。このＰＣＲ反応由来のＰＣＲ生成物の強度は、ゲノムに組み込まれたターゲッティングベクターのコピー数と相関させ得る。従って、１コピーのターゲッティングベクターしか含まない細胞は、ＰＣＲ反応により低い強度のバンドしか得られない。他方のプライマー対は、所望の遺伝子座に組み込まれたベクターのコピーのみを検出するように設計する。この場合、一方のプライマーは、ターゲッティングベクター内でアニールするように設計し、他方のプライマーは、ターゲッティングベクターに存在しない、標的遺伝子座に特異的な配列にアニールするように設計する。この場合、ターゲッティングベクター中に存在しない部位のすぐ隣にターゲッティングベクターが組み込まれている場合のみに、ＰＣＲ生成物が検出されることにより、所望のターゲッティング事象を示す。生成物が検出された場合には、そのクローンを核移植に使用する。
【０２６４】
ネオマイシン耐性重鎖ノックアウト構築物のために、プライマーＮｅｏ１（5'-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3'、配列番号４２）、及びＩＮ２５２１（5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3'、配列番号４３）を用いて、組込み位置に関係なく、細胞におけるターゲッティングベクターの存在を検出する。プライマーＮｅｏ１及びＯＵＴ３５７０（5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGT C-3'、配列番号４４）を用いて、μ重鎖遺伝子座に組み込まれたターゲッティング構築物のコピーのみを特異的に増幅する。
【０２６５】
ネオマイシン耐性重鎖ノックアウト構築物の組込みを分析するこれらのＰＣＲ反応のために、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲキットを使用する。ＰＣＲ反応混合液は、１ｐｍｏｌｅの各プライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１０μｌのＱ溶液、５μｌのＤＮＡ及び１μｌのｄＮＴＰ溶液を含む。反応混合液を、Ｈ２Ｏで合計容量５０μｌにする。このＰＣＲ増幅は、９４℃にて２分間の開始変性インキュベーションにより行う。次いで、９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間及び７２℃にて２分間のインキュベーションにより、変性、アニーリング及び増幅を３０サイクル行う。次いで、反応混合液を、７２℃にて５分間、そして混合液がＰＣＲ装置から除去されるまで４℃にてインキュベートする。
【０２６６】
別の手法では、単一のプライマーセットを使用して、標的遺伝子座を増幅し、ＰＣＲ生成物の大きさを正しいターゲッティングの診断に用いる。一方のプライマーは、ターゲッティングベクターに存在しない遺伝子座の領域にアニールするように設計され、他方のプライマーは、ターゲッティングベクターに存在するが野生型遺伝子座にも存在する部位にアニールするように設計する。この場合、ゲノム中の所望でない部位に組み込まれたターゲッティングベクターは検出されない。ターゲッティングベクターにより欠失される領域は、その場所に挿入される薬剤選択マーカーとは大きさが異なるため、生成物の大きさは、増幅する遺伝子座が野生型遺伝子型のものか又は標的遺伝子型のものかに左右された。ターゲッティングベクターの正しくない挿入を含むか、又は全く挿入を含まないクローンからのＤＮＡの増幅は、野生型遺伝子座について予測される大きさを有する単一のＰＣＲ生成物を生じる。正しくターゲッティング（「ノックアウト」）されたアレルを含むクローンからのＤＮＡの増幅は、２つのＰＣＲ生成物を生じる（１つは、野生型アレルの増幅を示し、もう１つは、野生型アレル中の一部の配列が、（置換する配列と長さが異なる）薬剤耐性マーカーに置き換わったために予測可能な大きさに変わったものを示す）。
【０２６７】
ピューロマイシン耐性重鎖ノックアウト構築物のために、プライマーＳｈｏｒｔｅｎｄ（5'-CTG AGC CAA GCA GTG GCC CCG AG-3'、配列番号４５）、及びＬｏｎｇｅｎｄ（5'-GGG CTG AGA CTG GGT GAA CAG AAG GG-3'、配列番号４６）を使用した。このプライマー対は、野生型重鎖遺伝子座、及びピューロマイシン構築物により適切にターゲッティングされた遺伝子座の両方を増幅する。２つのバンドの大きさの差は約０．７Ｋｂである。短いバンドの存在は、適切なターゲッティングを示す。
【０２６８】
ピューロマイシン耐性重鎖ノックアウト構築物の組込みを分析するこのＰＣＲ反応のために、Promega Master Mixキットを使用する。ＰＣＲ反応混合液は、１ｐｍｏｌｅの各プライマー、２．５μｌのＤＮＡ及び２５μｌの２×Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを含む。反応混合液を、Ｈ２Ｏで合計容量５０μｌにする。このＰＣＲ増幅は、９４℃にて２分間の開始変性インキュベーションにより行う。次いで、９４℃にて４５秒間、６０℃にて４５秒間及び７２℃にて２分間のインキュベーションにより、変性、アニーリング及び増幅を３０サイクル行う。次いで、反応混合液を、７２℃にて５分間、そして混合液がＰＣＲ装置から除去されるまで４℃にてインキュベートする。
【０２６９】
第１ラウンドの核移植
免疫グロブリン遺伝子が不活性化されている選択した線維芽細胞を、実施例２に記載したように核移植に用いて、内因性免疫グロブリン遺伝子に突然変異を含み、異種免疫グロブリン遺伝子をコードするＨＡＣを含むトランスジェニック有蹄動物を作製することができる。あるいはまた、標準的な方法を用いて核移植を行い、選択したトランスジェニック線維芽細胞から得た核又はクロマチン塊（すなわち、膜に覆われていない１つ以上の染色体）を、除核した卵母細胞（例えば、米国特許出願第６０／２５８，１５１号；２０００年１２月２２日出願に記載されている）に挿入してもよい。これらの方法は、内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、プリオン及び／又はＪ鎖核酸が突然変異された細胞にも使用できる。
【０２７０】
第２ラウンドの突然変異誘発及び核移植
所望であれば、細胞（例えば、胎仔線維芽細胞）を、第１ラウンドの核移植で生成したトランスジェニック有蹄動物から得てもよい。さらなるラウンドの遺伝子ターゲッティングを上述のように行って、第１のラウンドのターゲッティングで不活性化された遺伝子の第２のアレルを不活性化することができる。あるいはまた、別の免疫グロブリン（例えば、μ重鎖、λ軽鎖、κ軽鎖若しくはＪ鎖）、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ、又はプリオン遺伝子を、本ラウンドのターゲッティングで不活性化してもよい。この第２ラウンドのターゲッティングのためには、高濃度の抗生物質を使用するか、又は異なる抗生物質耐性マーカーを有するノックアウト構築物を使用し得る。抗生物質耐性細胞は、上述したように選択できる。選択された細胞を上述したように第２ラウンドの核移植に使用して、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子に２つの突然変異を含み、そして異種免疫グロブリン遺伝子をコードするＨＡＣを含むトランスジェニック有蹄動物を作製することができる。あるいはまた、選択した抗生物質耐性細胞をまず処理して、以下に記載するようにＧ１期細胞を単離して、それを第２ラウンドの核移植に使用してもよい。
【０２７１】
核移植用にＧ１細胞を単離するために、単離の２４時間前に、５．０×１０５細胞を、１０ｍｌのα−ＭＥＭ＋ＦＣＳを含む１００ｍｍ組織培養プレート上に植え付ける。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、単離の１〜２時間前に培養培地を換える。次いで、プレートを、Ｖｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ２（Fisher Scientific, Houston, TX, 中速度）上で３０〜６０秒間振とうして、培地を除去し、１０００Ｇで５分間遠心し、ペレットを２５０μｌのＭＥＭ＋ＦＣＳ中に再懸濁させる。次いで、細胞間橋が付着した新しく分裂した細胞二倍体（cell doublet）を（これらの細胞は初期Ｇ１にあるため）選択する。この単離手順は、「振り払い（shake off）」法と称する。
【実施例４】
【０２７２】
内因性免疫グロブリン遺伝子を突然変異させるための別の方法
本手法のいくつかの実施形態では、プリオン遺伝子に１以上の突然変異を有する有蹄動物における異種免疫グロブリン産生は、本質的に、相同組換え手法、異種Ｉｇ遺伝子座全体を担持する人工染色体の導入、核移植、及び内因性抗体を排除するための抗体の投与を組み合わせて使用することにより達成される。より具体的には、本方法では、ＩｇＭ重鎖遺伝子の一方又は両方のアレル、及び場合によりＩｇ軽鎖遺伝子の一方又は両方のアレルのターゲッティング破壊をするのが好ましい。ただし、異種抗体産生はＩｇ核酸に突然変異を有しない動物によっても実施することができる。遺伝子ノックアウトは、相同組換えを連続して行い、その後の別の交配手順によって起こすことができる。好適な実施形態では、まず、適切な相同組換えベクターを用いて、組織培養で、オス又はメス有蹄動物（例えば、ウシ）胎仔線維芽細胞のＩｇＭ重鎖遺伝子の一方のアレルのターゲッティング破壊を起こす。胎仔線維芽細胞を使用することは、一部の他の体細胞よりも好ましい。なぜなら、これらの細胞は、組織培養で増殖及び遺伝子操作し易いからである。しかし、胎仔線維芽細胞の使用は、本発明において必須ではなく、実際に他の細胞系に置き換えても同等の結果が得られうる。
【０２７３】
当然のことながら、本方法では、ターゲッティングＩｇＭ重鎖アレルと相同な領域を有するＤＮＡ構築物を構築して、この構築物が有蹄動物ゲノム中のＩｇＭ重鎖アレルへ組み込まれた際にその発現を破壊するようにする。このようなＩｇＭアレルのターゲッティング破壊を行うためのベクターの一例は、以下の実施例に記載する。これに関して、ターゲッティング部位において相同組換えをもたらすベクターの構築方法は、当業者に周知である。さらに、この場合、適切なベクターの構築は、特に、他の有蹄動物（以下参照）由来の免疫グロブリン遺伝子の配列と同様に、ウシＩｇＭ重鎖及びＩｇλ軽鎖遺伝子の配列が既知であるということを考慮すると、当該分野の技術レベル内にある。相同組換えを容易にするために、ＩｇＭ遺伝子の相同組換え及び不活性化を生じるのに使用するベクターはそれぞれ、有蹄動物ＩｇＭ重鎖及びＩｇ軽鎖遺伝子と実質的な配列同一性を示すＤＮＡの部分を含む。これらの配列は、相同組換え及びターゲッティング欠失又は不活性化を容易にするために、ターゲッティング遺伝子座と、好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、さらに好ましくは同遺伝子型である。
【０２７４】
通常、構築物は、ＩｇＭ重鎖遺伝子及び／又はＩｇ軽鎖遺伝子が有効に破壊された所望の相同組換体（例えば、線維芽細胞）の選択に役立つマーカー遺伝子を含むことが好ましい。マーカー遺伝子の例としては、数ある中で、抗生物質耐性マーカー、薬剤耐性マーカー及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。好適な構築物を図２Ａに示し、この構築物を作製するのに使用する出発材料を図３Ａ及び図３Ｂに示す。プロモーターに機能的に連結されたポジティブセレクションマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を挟む、内因性免疫グロブリン遺伝子と相同な２つの領域を含む他の構築物は、標準的な分子生物学的技術を用いて作製することができ、本発明の方法において使用できる。
【０２７５】
図２Ａ及び図３Ｃに示すμノックアウト構築物は、「Ｃ−μエキソン１〜４」と称されるウシ免疫グロブリン重鎖定常領域をコードするエキソン、及び「ＴＭエキソン」と称される膜貫通ドメインをコードする２つのエキソンを除去するように設計された。
【０２７６】
このベクターを構築するために、「１」と称した領域、すなわち、ゲノムμ重鎖ウシ配列由来のＸｂａＩ−ＸｈｏＩ断片を、酵素ＸｂａＩ及びＸｈｏＩで予め切断した市販のＤＮＡベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Stratagene, LaJolla, California）にサブクローニングした。この断片をクローン化した後では、約３．５  ＫｂのＮｏｔＩ断片を挿入するのに用いるＮｏｔＩ制限酵素認識配列がＸｂａＩ部位に隣接していた。この断片は、以下にさらに記載するネオマイシン耐性マーカーを含む。所望であれば、他のμノックアウト構築物を、別の有蹄動物品種、種又は属由来のゲノムμ重鎖配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ６３６３７として寄託された、スイス牛／ホルスタイン交雑に由来するμ重鎖配列）を用いて構築できる。
【０２７７】
断片「１」及びネオマイシン耐性マーカーを連結してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに入れた後、ネオマイシン耐性マーカーの隣にＳａｃｌ部位が残存していた。新しい構築物をＳａｃｌで直線化し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｓａｃｌ消化により生じた付着末端を充填することで平滑末端に変換した。
【０２７８】
「２」と称した断片を、ＸｈｏＩ−ＢｓｔＩ１０７１断片として単離し、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｘｈｏｌ及びＢｓｔＩ１０７１酵素により生じた付着末端を充填することで平滑末端断片に変換した。
【０２７９】
終了後、最終的な構築物は、領域２、ネオマイシン耐性マーカー及び領域１をそれぞれ含んでいた。
【０２８０】
ウシ線維芽細胞のトランスフェクションのために、構築物を、制限酵素ＫｐｎＩで消化し（図中２つのＫｐｎＩ部位が示されている）、そのＤＮＡ断片を相同組換えに使用した。
【０２８１】
ネオマイシン耐性構築物は、以下のように組み立てた。「ｐＳＴｎｅｏＢ」と称される構築物（Katohら, Cell Struct. Funct. 12:575, 1987；Japanese Collection of Research Biologicals （JCRB）寄託番号：VE039）は、コード領域の上流にあるＳＶ４０プロモーター及びＴＫエンハンサーの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含むように設計された。コード領域の下流には、ＳＶ４０ターミネーター配列が存在する。ｎｅｏカセットを、ＸｈｏＩ断片として、「ｐＳＴｎｅｏＢ」から切り出した。標準的な分子生物学的技術を用いて断片の端部を平滑末端に変換した後、平滑末端断片を、ベクターｐＢＳ２４６（Gibco/Life Technologies）中のＥｃｏＲＶ部位にクローン化した。この部位は、ｌｏｘＰ部位に挟まれている。「ｐＬｏｘＰ−ＳＴＮｅｏＲ」と称した新しい構築物を、μノックアウトＤＮＡ構築物を作製するために使用した。この構築物の所望の断片は、元々ｐＢＳ２４６クローニングベクター中に存在していたｌｏｘＰ部位及びＮｏｔＩ部位に挟まれている。ｌｏｘＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰを含む所望のＮｏｔＩ断片を、免疫グロブリンμ定常領域エキソンを置き換えるために使用した。ネオマイシン耐性遺伝子に機能的に連結したＳＶ４０プロモーターはネオマイシン耐性遺伝子の転写を活性化し、所望のＮｏｔＩ断片がμ定常領域エキソンと入れ替わった細胞を、それらの獲得した抗生物質耐性に基づいて選択することができる。
【０２８２】
ＩｇＭ重鎖アレルが有効に破壊された細胞系を得た後、これを核移植ドナーとして使用して、クローン化有蹄動物胎仔（例えば、クローン化ウシ胎仔）を作製し、最終的に、一方のＩｇＭ重鎖アレルが破壊された胎仔又は動物を作製する。その後、それから誘導された体細胞（例えば、線維芽細胞）を用いて第２ラウンドの遺伝子ターゲッティング破壊を実施することができ、異なる選択マーカーを含む同様のベクターを用いて、第２のＩｇＭ重鎖アレルが不活性化された細胞を作製する。
【０２８３】
第１のターゲッティング遺伝子破壊と同時に、同様にオス又はメス供給源のものであり得る第２の有蹄動物（例えば、ウシ）体細胞系も遺伝子改変することが好ましい。操作される第１の細胞系がオスの場合、メス細胞系を改変することが好ましい。逆に、操作される第１の細胞系がメスの場合、オス細胞系を選択することが好ましい。この場合も、操作される細胞は有蹄動物（例えば、ウシ）胎仔線維芽細胞を含むことが好ましい。
【０２８４】
好適な実施形態では、メス胎仔線維芽細胞を遺伝子改変して、Ｉｇλ軽鎖遺伝子の一方のアレルのターゲッティング破壊を導入する。本方法は、有蹄動物（例えば、ウシ）Ｉｇλ軽鎖に相同な領域、及び選択マーカーを有するベクターを用いて同様に実施される。この場合のＤＮＡ構築物は、組込み及び内因性Ｉｇ軽鎖との相同組換えの際に、ターゲッティングＩｇλ軽鎖遺伝子の破壊（不活性化）が生じるように設計される。
【０２８５】
所望のターゲッティング破壊を有するメス線維芽細胞系を選択した後、核移植のためのドナー細胞として同様に利用するか、又はこのような細胞系から得たＤＮＡを核移植のドナーとして使用する。
【０２８６】
あるいはまた、この細胞を、第２ラウンドの相同組換えに供して、第１のアレルを破壊するのに使用したものと同様であるが、異なる選択マーカーを含むＤＮＡ構築物を用いて、第２のＩｇλ軽鎖を不活性化してもよい。
【０２８７】
核移植を行う方法、特にクローン化ウシ及びクローン化トランスジェニックウシの作製法は既に報告されており、米国特許第５，９４５，５７７号に記載されている。あるいはまた、ＷＯ９５／１６６７０号；ＷＯ９６／０７７３２号；ＷＯ９７／０７６６９号；又はＷＯ９７／０７６６８号のいずれかに開示される核移植技術（まとめてRoslin法と呼ぶ）を使用してもよい。Roslin法は、増殖期のドナー細胞ではなく静止期の細胞を使用する点で、University of Massachusetts法とは異なる。上記特許は全て、参照により全体的に本明細書に援用される。これらの核移植手順により、クローン化トランスジェニックウシの仔（例えば、Ｉｇ軽鎖遺伝子及び／又はＩｇＭ遺伝子の少なくとも一方のアレルのターゲッティング破壊を含む仔）を作製するのに使用できるトランスジェニッククローン化胎仔が作製される。このような細胞系を作製したら、これらを利用して、オス及びメス重鎖及び軽鎖ヘミ接合ノックアウト（Ｍ及びＦ  Ｈｅｍｉ  Ｈ／Ｌ）胎仔及び仔を作製することができる。さらに、これらの技術は、トランスジェニックウシを作製するための使用のみに限定されない。上記技術は、他の有蹄動物の核移植のためにも使用できる。
【０２８８】
核移植の後、有蹄動物を交配させるか、又は先に記載した相同ターゲッティングベクターを用いた二次遺伝子ターゲッティングにより、所望の動物を作製することができる。
【０２８９】
先に記載したように、本発明のさらなる目的は、オス及びメス重鎖及び軽鎖ヘミ接合ノックアウトを作製することを含んでおり、このようなヘミ接合ノックアウトは既に記載した細胞系を用いて作製される。これは上記方法に従って作製した仔を交配させることによって行うことができるが、この場合は、ＩｇＭ重鎖遺伝子のアレルが破壊された仔を、Ｉｇ軽鎖のアレルが破壊された別の仔と交配させる。あるいはまた、上記手順により作製した仔から得られる細胞を操作することによる二次遺伝子ターゲッティングによって行ってもよい。これは、ＩｇＭ重鎖遺伝子のアレル又はＩｇ軽鎖のアレルの相同組換えターゲッティング破壊により行う。オス及びメス重鎖及び軽鎖ヘミ接合ノックアウト（Ｍ及びＦ  Ｈｅｍｉ  Ｈ／Ｌ）を含む細胞系が生成したら、これを使用して、そのようなノックアウトを含む胎仔又は仔ウシを作製する。上述したように、これは、交配又は二次遺伝子ターゲッティングにより行われる。
【０２９０】
オス及びメス重鎖及び軽鎖ヘミ接合ノックアウトが得られたら、これらの動物に由来する細胞を利用して、ホモ接合ノックアウト（Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｌ）胎仔を作製することができる。この場合も、遺伝子ターゲッティングを繰り返すか又は交配によって行う。本質的に、交配を用いる場合、オス重鎖及び軽鎖ヘミ接合ノックアウトを、メス重鎖及び軽鎖ヘミ接合ノックアウトと交配させ、ホモ接合ノックアウトを含む仔を選択する。あるいはまた、上述したヘミ接合ノックアウト由来の細胞を組織培養で操作して、ＩｇＭ又はＩｇ軽鎖（λ）遺伝子の他方のアレルをノックアウトしてもよい。二次遺伝子ターゲッティングはより迅速に結果が得られるので、特にウシ等の有蹄動物の妊娠期間が比較的長いことを考えると、交配より好ましいかもしれない。
【０２９１】
この連続的なノックアウト及び／又は育種手法の間に、プリオン遺伝子の一方又は両方のアレルが、この方法の過程で作製されたドナー細胞のいずれかに突然変異を受ける（例えば、内因性Ｉｇ核酸に突然変異を有する若しくは有しない、及び外因性Ｉｇ核酸を有する若しくは有しないドナー細胞）。従って本明細書に記載の方法を用いて作出した有蹄動物は、プリオン遺伝子、Ｉｇ重鎖遺伝子、Ｉｇ軽鎖遺伝子、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、及び／又はＪ鎖遺伝子にいくつかの所望の突然変異を有し、また１以上の異種Ｉｇ及び／又はＪ鎖遺伝子を有しうる。
【０２９２】
ヒトＩｇを発現するトランスジェニック有蹄動物を作出するためのノックアウト手順
Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｌ胎仔又は仔ウシを作製するための手法を図１にまとめる。図には３つのスキームの概要を示してある。第１のスキームでは再生胎仔細胞系における連続ノックアウトを利用する。この手法は技術的に最も難しく、リスクレベルが最も高いが、上記したように育種手法よりも結果が速く得られる可能性がある。他の２つのスキームでは動物の育種を利用する。第２のスキームでは、オス及びメス細胞系においてそれぞれ、重鎖及び軽鎖遺伝子の単一ノックアウトのみが必要である。このスキームは細胞系の再生を利用せず、技術的には最も簡単な手法であるが、終了するまでに最も時間がかかる。スキーム３はスキーム１と２の中間にある。全てのスキームにおいて、Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｌノックアウト仔ウシの生存及び維持は困難である可能性があるため、Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｌ胎仔のみを作製する。必要であれば、受動免疫療法を使用してＨｏｍｏ  Ｈ／Ｌノックアウト仔ウシの生存率を高めることもできる。
【０２９３】
実験設計
本発明では、ヘミ接合オス重鎖ノックアウト（Ｍ  Ｈｅｍｉ  Ｈ）及びヘミ接合メス軽鎖ノックアウト（Ｆ  Ｈｅｍｉ  Ｌ）を作製し、これらのターゲッティング欠失体から４０日齢胎仔を作製することが好ましい。胚由来の細胞を回収し、Ｍ  Ｈｅｍｉ  Ｈ細胞において軽鎖遺伝子座の一方のアレルをターゲッティングし、Ｆ  Ｈｅｍｉ  Ｌ細胞において重鎖遺伝子座の一方のアレルをターゲッティングして、Ｈ及びＬ遺伝子座の両方のヘミ接合欠失を有する細胞（Ｈｅｍｉ  Ｈ／Ｌ）を得る。これらの細胞を使用して４０日齢胎仔を誘導し、これから線維芽細胞を単離する。
【０２９４】
Ｍ  Ｈｅｍｉ  Ｈ／Ｌ線維芽細胞を他のＨ鎖アレルでターゲッティングしてＭ  Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｈｅｍｉ  Ｌを作製し、Ｆ  Ｈｅｍｉ  Ｈ／Ｌを他方のＬ鎖アレルでターゲッティングしてＦ  Ｈｏｍｏ  Ｌ／Ｈｅｍｉ  Ｈを作製する。ホモ接合欠失体を作製するためには、より高い薬剤濃度を使用してホモ接合ターゲッティングを促進する。しかし、この手法が上手くいかず、育種が必要となり得る可能性もある。選択カセットのｃｒｅ／ｌｏｘターゲッティングを利用する一例では、同じ選択系を１つを上回るターゲッティング欠失に対して使用することが可能である。これらの線維芽細胞をクローニングし、４０日齢胎仔を回収し、線維芽細胞を単離する。このクローニングで得られた胎仔細胞をターゲッティングして、Ｈ又はＬ遺伝子座のいずれかのホモ接合欠失を生じさせて、Ｍ  Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｌ及びＦ  Ｈｏｍｏ  Ｈ／Ｌ胎仔線維芽細胞を得る。これらの線維芽細胞をクローニングし、４０日齢胎仔を回収し、線維芽細胞を単離する。次いで、これらのＨｏｍｏ  Ｈ／Ｌ胎仔線維芽細胞を、場合によっては育種手順を用いて、ＨＡＣの取り込みに使用する。
【０２９５】
ライブラリー構築
胎仔線維芽細胞を使用してゲノムライブラリーを構築する。ターゲッティング構築物がクローニングに使用する細胞と同遺伝子型であることが重要であることが報告されているが、本発明において必須ではない。例えば、同遺伝子型、実質的に同遺伝子型、又は非同遺伝子型構築物を使用して、内因性免疫グロブリン遺伝子に突然変異を生成することができる。１つの可能性のある方法では、他のウシ品種と比べて近親交配が遺伝的に高レベルなホルスタイン牛を使用する。本発明者らは、異なる動物間で、免疫グロブリン遺伝子中の多形を全く検出していない。これは、配列相同性が高く、非同遺伝子型構築物でのターゲッティングが上手くいくことを示唆している。
【０２９６】
１つのオス細胞系及び１つのメス細胞系から、「クローニング可能性（clonability）」試験を行うと同時にライブラリーを構築する。このプロセスの終了時に、ライブラリーが生成し、多数の異なる胎仔細胞系が試験され、クローニングの目的に最良なものとして１つの細胞系が選択されると想定される。
【０２９７】
ゲノムライブラリーは、胎仔線維芽細胞から単離した高分子量ＤＮＡを用いて構築する。ＤＮＡを大きさで分画し、２０〜２３Ｋｂの高分子量ＤＮＡをλファージベクターλＺａｐ又はλＦｉｘに挿入する。本発明者らは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ調製ライブラリーを用いて素晴らしい成功を収めた。従って、ＤＮＡを単離し、大きさで選択したＤＮＡをライブラリー調製のためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅに送付する。ウシ重鎖及び軽鎖を含むクローンを単離するために、放射性標識ＩｇＭ  ｃＤＮＡ及び放射性標識軽鎖ｃＤＮＡを使用する。さらに、軽鎖遺伝子座を欠失する必要がある場合には軽鎖ゲノムクローンを単離する。胎仔細胞ライブラリーをそれぞれ、ウシ重鎖及び軽鎖を含むクローンについてスクリーニングする。約１０５〜１０６プラークをスクリーニングすることで、重鎖又は軽鎖遺伝子座のいずれかを含むクローンを単離できると見込まれる。単離したら、両方の遺伝子座をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングし、制限マッピングを行う。ホルスタインにおけるこれらの遺伝子座の制限マップを図２Ｂに示す（Knightら, J Immunol 140:3654-3659, 1988）。さらに、得られたクローンのマップを作成し、ターゲッティング構築物を組み立てるために使用する。
【０２９８】
ターゲッティング構築物の作製
重鎖及び軽鎖遺伝子を単離したら、構築物を作製する。ＩｇＭ構築物は、ＩｇＭ定常領域膜ドメインを欠失することにより作製される。Rajewsky及び共同研究者らによりマウスで示されているように、ＩｇＭの膜ドメインの欠失はＢ細胞発生を阻止する。なぜなら、表面ＩｇＭは継続的なＢ細胞発生のために必要なシグナルであるからである（Kitamuraら, Nature 350:423-426）。従って、ホモ接合ＩｇＭウシはＢ細胞を欠く。本方法においては、機能性Ｉｇを欠く動物の生仔出生（live birth）は必要ないため、問題にはならない。しかし、必要であれば、受動免疫療法を使用して、ヒトＩｇ遺伝子座が導入される最後のステップまで動物の生存を改善してもよい。
【０２９９】
ＩｇＭ重鎖アレルのノックアウトをもたらすために使用するターゲッティング構築物の一例を図２Ａに示す。重鎖については、膜ＩｇＭドメインを、ｌｏｘＰ部位に挟まれたネオマイシンカセットと置き換える。付着膜ドメインは、ｎｅｏカセットと共にスプライシングされ、その膜ドメインはｌｏｘＰ部位のすぐ５’側に挿入されたＴＡＧストップコドンを有するようになり、その結果、膜ドメインの不活化を確実にすることができる。これを、約５〜６キロ塩基の３’染色体ＤＮＡを有するターゲッティング構築物の５’端に配置する。
【０３００】
薬剤濃度を高めることで、ＩｇＭ重鎖又は軽鎖のいずれかの第２のアレルの欠失が可能にならない場合は、ｃｒｅ／ｌｏｘ系（Sauer, 1998, Methods 14:381-392に概要が記載されている）を使用して選択マーカーを欠失させる。以下に記載するように、ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、選択マーカーのターゲッティング欠失を可能にする。必要であれば、全ての選択マーカーをｌｏｘＰ配列で挟んで、これらのマーカーを欠失し易くする。
【０３０１】
軽鎖構築物は、ウシλ鎖定常領域（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３９６６９８に見られるλ軽鎖定常領域、又は任意の他の有蹄動物λ軽鎖定常領域）、及びｌｏｘ  Ｐ部位に挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子カセットを含んでおり、ウシ遺伝子をｌｏｘＰ部位に挟まれたピューロマイシンカセットと置き換える。λ定常領域遺伝子の３’側にある約５〜６キロ塩基のＤＮＡが、ピューロマイシン耐性遺伝子の３’側で置き換えられる。必要であれば、ピューロマイシン耐性遺伝子は、５’及び３’端部の両方においてｌｏｘＰ部位を担持して、欠失を可能にする。有蹄動物抗体遺伝子間の高度な相同性により、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３９６６９８中のウシλ軽鎖配列は、様々な有蹄動物に由来するゲノムλ軽鎖配列にハイブリダイズすることが予想され、従って、様々な有蹄動物λ軽鎖ゲノム配列を単離するために標準的な方法で使用できる。これらのゲノム配列を、本明細書に記載する方法等の標準的な方法において使用して、任意の有蹄動物中の内因性λ軽鎖を不活性化するためのノックアウト構築物を作製し得る。
【０３０２】
κ軽鎖ノックアウト構築物は、図３Ｇに示すウシκ軽鎖配列、又は任意の他の有蹄動物κ軽鎖配列を使用して同様に構築し得る。このウシκ軽鎖は、様々な有蹄動物からゲノムκ軽鎖配列を単離するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。これらのゲノム配列を、本明細書に記載する方法等の標準的な方法において使用して、任意の有蹄動物中の内因性κ軽鎖を不活性化するためのノックアウト構築物を作製し得る。
【０３０３】
場合によっては、さらに別の有蹄動物遺伝子を突然変異又は不活性化してもよい。例えば、内因性有蹄動物ＩｇＪ鎖遺伝子をノックアウトして、ヒトに投与する本発明の抗体中の有蹄動物ＩｇＪ鎖遺伝子の潜在的な抗原性を抑制することができる。ターゲッティングベクターの構築のためには、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ０２３０１に見られるウシＩｇＪ鎖領域のｃＤＮＡ配列を使用することができる。このｃＤＮＡ配列をプローブとして用いて、ＲＰＣ１−４２（Oakland, CAのBACPAC）等のＢＡＣライブラリーからウシＩｇＪ鎖のゲノム配列を単離するか、又は任意の他の有蹄動物からＪ鎖のゲノム配列を単離してもよい。さらに、ヒトＪ鎖コード配列を、本発明の有蹄動物に導入して、ヒトＩｇＡ及びＩｇＭ分子を機能性発現させてもよい。ヒトＪ鎖のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨ００２８３６、Ｍ１２７５９及びＭ１２３７８から入手可能である。この配列は、本明細書に記載するような標準的な方法を用いて有蹄動物胎仔線維芽細胞に挿入し得る。例えば、ＨＡＣ、ＹＡＣベクター、ＢＡＣベクター、コスミドベクター又はノックイン構築物中のヒトＪ鎖核酸を、内因性有蹄動物染色体に組み込むか、又は内因性有蹄動物染色体から独立して維持させてもよい。得られたトランスジェニック有蹄動物細胞を、本明細書に記載する核移植法に使用して、機能性有蹄動物Ｊ鎖の発現を低減するか又は排除する突然変異を有し、かつヒトＪ鎖を発現する異種核酸を含む所望の有蹄動物を作製してもよい。
【０３０４】
さらに、有蹄動物α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を突然変異させて、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素によって生成するガラクトシル（α１，３）ガラクトースエピトープの発現を低減又は排除してもよい。本発明の有蹄動物により産生されるヒト抗体がこの糖質エピトープにより改変されると、これらのグリコシル化抗体は、治療薬としてヒトに投与された場合、この糖質エピトープと反応するレシピエント中の抗体により不活性化されるか又は除去され得る。この糖質エピトープに対する可能な免疫応答を排除するためには、ウシα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の配列を用いて、ノックアウト構築物を設計し、有蹄動物中のこの遺伝子を不活性化するとよい（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ０４９８９；Joziasseら, J. Biol. Chem. 264:14290-14297, 1989）。このウシ配列、又は米国特許第６，１５３，４２８号及び同第５，８２１，１１７号に開示されているブタα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ配列を用いて、様々な有蹄動物からゲノムα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ配列を得て、ガラクトシル（α１，３）ガラクトースエピトープの発現が低減するか又は排除される他の有蹄動物を作製してもよい。
【０３０５】
所望であれば、有蹄動物プリオン遺伝子を突然変異させるか、不活性化して、感染リスク（ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）等）の可能性を低くしてもよい。ターゲッティングベクターの構築のためには、実施例１に記載するようにウシプリオン遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を用いるとよい（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２９８８７８）。あるいはまた、このゲノムプリオン配列を用いて、他の有蹄動物からゲノムプリオン配列を単離してもよい。プリオン遺伝子を、本明細書に記載するような方法を使用して、不活性化してもよい。あるいは、ヒツジのα−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子又はプリオン遺伝子を突然変異させる既報の方法（Denningら, Nature Biotech. 19: 559-562, 2001）等）を本明細書に記載する教示に基づいて採用してもよい。例えば、本明細書に記載のドナー細胞（例えば胎仔線維芽細胞）の培養、ノックアウトベクターの作製、ドナー細胞のノックアウトベクターによるトランスフェクション（例えば、スペルミジンの存在下でのトランスフェクション）、及び／又はトランスジェニック有蹄動物の作出のためのノックアウト細胞から卵母細胞への遺伝物質の移植のための改善された方法を使用しうる。
【０３０６】
各遺伝子座の第２のアレルをターゲッティングする際に、第１の選択マーカーが細胞中に残っている場合には、異なる選択マーカーを含む新しいターゲッティング構築物を組み立てる必要があるかもしれない。表５に示すように、様々な選択法が利用可能かつ比較でき、適切な選択系を選ぶことができる。最初は、薬剤濃度を上げて（例えば、薬剤濃度を二倍にして）、第２のアレルをターゲッティングする。これが上手くいかない場合には、新しいターゲッティング構築物を採用し得る。
【表５】
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【０３０７】
様々な方法論を用いて、上記した追加の突然変異又は遺伝子不活性化を本発明の有蹄動物に取り込むことができる。各々所望の突然変異についてトランスジェニック有蹄動物細胞系が生成したら、交雑育種を用いて、これらの追加の突然変異を本発明の有蹄動物に取り込むことができる。あるいはまた、これらの追加の突然変異を有する胎仔線維芽細胞を、内因性Ｉｇ遺伝子をノックアウトするため、及び／又は異種Ｉｇ遺伝子を導入するための出発材料として用いてもよい。また、内因性Ｉｇ遺伝子中にノックアウト突然変異を有する、及び／又は異種Ｉｇ遺伝子を含む胎仔線維芽細胞を、これらの追加の突然変異又は不活性化のための出発材料として使用することができる。
【０３０８】
Ｉｇ遺伝子座のターゲッティング欠失
ターゲッティング構築物を、例えばエレクトロポレーションにより、胚線維芽細胞に導入する。適切な抗生物質を使用して、ターゲッティングベクターを取り込んだ細胞を選択する。使用した薬剤に耐性なクローンを選択して培養する。次いで、これらのクローンを、ガンシクロビルでのネガティブセレクションに供し、適切に組み込まれたクローンを選択する。あるいはまた、薬剤選択で生き残ったクローンをＰＣＲで選択する。適切にターゲッティングされたクローンを見つけるために、少なくとも５００〜１０００のクローンをスクリーニングする必要があると推定される。本発明者らの推測は、ＩｇＭ重鎖定常領域の膜ドメインをターゲッティングすると、３００のｎｅｏ耐性クローンのうち約１つが正確にターゲッティングされるというKitamuraの知見（Kitamuraら, Nature 350:423-426, 1991）に基づいている。従って、クローンを、９６ウェルプレート中で１０クローンずつのグループにプールして、１０クローンのプールを、目的とするターゲッティングクローンについてスクリーニングすることが考えられる。陽性が同定されたら、プールしたクローンから単離した単一のクローンをスクリーニングする。この方法により、ターゲッティングクローンの同定が可能になるはずである。
【０３０９】
線維芽細胞は培養において移動するため、１枚の皿につき約１０を上回るクローンが生成する場合には、個々のクローンを区別するのは難しい。さらに、高効率トランスフェクションを伴うクローン増殖のための方法を開発してもよい。希釈クローニング等のいくつかの適当な方法が使用できる。
【０３１０】
薬剤耐性マーカーのＣｒｅ／Ｌｏｘ切除
上述したように、例示のターゲッティング構築物は、ｃｒｅ／ｌｏｘ系を用いてマーカーを効率的に欠失し易くするために、ｌｏｘＰ部位に挟まれた選択マーカーを含有している。ターゲッティングベクターを担持する胎仔線維芽細胞を、エレクトロポレーションを介してＣｒｅ含有プラスミドでトランスフェクトする。最近発表されたＧＦＰｃｒｅ融合遺伝子を含むＣｒｅプラスミド［Gagneten S.ら, Nucleic Acids Res 25:3326-31 (1997)］を使用してもよい。これにより、Ｃｒｅタンパク質を含む全てのクローンの迅速な選択が可能になる。これらの細胞は、ＦＡＣＳソーティング、又は顕微鏡操作を介した緑色蛍光発光細胞の手操作による回収のいずれかにより、選択される。緑色の細胞は、活発に転写されるＣｒｅリコンビナーゼを担持し、つまり、薬剤耐性マーカーを欠失していると期待される。Ｃｒｅ発現について選択した細胞をクローニングし、ＰＣＲ分析を介して薬剤耐性マーカーの欠失についてクローンを分析する。切除されたと判断された細胞を小さいクローンにまで培養し、２つに分割し、１つのアリコートを選択培地中で試験して、薬剤耐性遺伝子が確実に欠失されたことを確認する。他のアリコートは、次のラウンドのターゲッティング欠失に使用する。
【０３１１】
他の有蹄動物の免疫グロブリン遺伝子の改変へのターゲッティング手法の適用
他の有蹄動物の免疫グロブリン遺伝子を改変するために、３つの主要領域を含むようにターゲッティングベクターを設計した。第１の領域は、ターゲッティングの遺伝子座に相同である。第２の領域は、そのターゲッティング遺伝子座の一部と特異的に置き換わる薬剤選択マーカーである。第３の領域は、第１の領域と同様にターゲッティング遺伝子座に相同であるが、野生型ゲノムにおいて第１の領域と隣接していない。ターゲッティングベクターと所望の野生型遺伝子座との相同組換えにより、ターゲッティングベクター中で相当する２つの相同性領域間の遺伝子座配列が欠失され、該配列が薬剤耐性マーカーで置き換えられる。好適な実施形態では、２つの相同性領域の合計の大きさが約６キロ塩基であり、ターゲッティング遺伝子座の一部と置き換わる第２の領域の大きさは約２キロ塩基である。このターゲッティング法は、原核生物細胞からヒト細胞まで幅広い種に対して概して有用である。使用する各ベクターの特異性は、遺伝子ターゲッティング手順のために選択される遺伝子座、及びこの方法で使用する配列にある。この手法は、全ての有蹄動物（ヤギ（Capra hircus）、ヒツジ（Ovis aries）、ブタ（Sus scrufa）、及びウシ（Bos taurus）が挙げられるがこれらに限定されない）に使用できる。
【０３１２】
有蹄動物の細胞中の特定の遺伝子をターゲッティングするためにエレクトロポレーションを使用することも、有蹄動物において広く使用され得る。本明細書に記載する一般手順は、他の有蹄動物のゲノムにターゲッティング突然変異を導入するために適応できる。エレクトロポレーション条件（電圧及び容量）を変更して、他の有蹄動物から得るトランスフェクタントの数を最適化してもよい。
【０３１３】
さらに、ウシ中の重鎖遺伝子座をターゲッティングするために本発明で使用した方法（すなわち、除去されるエキソンを直に挟む領域に相同な領域を含むベクターを用いて、全てのコードエキソン及び介在配列を除去すること）は、他の有蹄動物においても同等に使用できる。例えば、ヒツジ（Ovis aries）の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に対して広範な分析が行われており、ヒツジ遺伝子座は構造及び配列の両方の点でウシ遺伝子座と極めて類似性が高い（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ７１５７２、Ｚ４９１８０〜Ｚ４９１８８、Ｍ６０４４１、Ｍ６０４４０、ＡＦ１７２６５９〜ＡＦ１７２７０３）。再配列ヒツジ免疫グロブリン鎖について報告された多数のｃＤＮＡ配列に加えて、重鎖５’エンハンサー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ９８２０７）、３’μスイッチ領域（Ｚ９８６８０）及び５’μスイッチ領域（Ｚ９８６８１）を含めて重鎖遺伝子座についてのゲノム配列情報が報告されている。重鎖のヒツジ分泌形態についての完全ｍＲＮＡ配列は、受託番号Ｘ５９９９４として寄託されている。この寄託物は、対応するウシ配列と高い相同性がある４つのコードエキソンの配列全体を含んでいる。
【０３１４】
ヒツジ遺伝子座についての情報をＧｅｎＢａｎｋから入手し、ウシ配列と高い相同性を有する領域を決定するためにＰＣＲ分析用に使用するプライマーを設計するのに使用した。非同質遺伝子型ＤＮＡを用いてウシ細胞をターゲッティングしたため、ヒツジ配列と高い相同性を有する領域の発見を、ウシ品種間で類似の配列保存性が存在する可能性が高いことの指標として用いた。ウシ及びヒツジ免疫グロブリン遺伝子座の配列及び構造が類似していることから、ウシ免疫グロブリン遺伝子座を除去するために使用したターゲッティング法は、ヒツジの系に上手く適用できることが予想され得る。さらに、ブタ（Sus scrofa、受託番号Ｓ４２８８１）及びヤギ（Capra hircus、受託番号ＡＦ１４０６０３）についての既存の情報は、これらの種の両方の免疫グロブリン遺伝子座も、本ターゲッティング法を利用するのに十分な程度のウシ遺伝子座に対する類似性を有することを示す。
【実施例５】
【０３１５】
ウシＩｇＭノックアウト
以下の手順を用いて、免疫グロブリン重鎖（μ）遺伝子座の一方のアレルが相同組換えにより破壊されているウシ線維芽細胞系を作製した。μ遺伝子座（ＩｇＭ重鎖遺伝子に対応）のエキソン１〜４を除去し、ネオマイシン耐性遺伝子のコピーで置き換えることにより、ＩｇＭノックアウトをもたらすためのＤＮＡ構築物を作製した。この構築物を使用して、核移植法で上手く使用されるネオマイシン耐性細胞系を得て、これらの細胞系に由来する胚盤胞をレシピエントウシに移植した。さらに、これらの胚盤胞のいくつかをＰＣＲ法を用いて試験して、μ遺伝子座においてターゲッティング挿入が適切に生じたことを確認した。得られた細胞系の一部から核移植法により得た胚盤胞により、ヘテロ接合ＩｇＭノックアウト胎仔を妊娠していることが示された。さらに、単一のＩｇＭ重鎖（μ）ノックアウトを含む雄及び雌細胞系の両方を作製した。これらの細胞系からクローニングされた動物を交配することにより、μの両方のコピーが不活化された仔が得られることが予測される。本明細書に記載するように、仔は、プリオンノックアウト有蹄動物を交配して、ＩｇＭ及びプリオン遺伝子に突然変異を有する子孫を作出してもよい。あるいは、該仔からの細胞を、実施例１に記載のようにプリオン遺伝子の一方又は両方のアレルを不活化するように遺伝的に改変させうる。以下、これらの手順をより詳細に述べる。
【０３１６】
ＤＮＡ構築物
本明細書中に記載した全てのトランスフェクションに使用したＤＮＡは以下のように作製した。４つの主要エキソン（膜貫通ドメインエキソンを除く）であるＣＨ１〜４は、下流（ＣＨ４）端部のＸｈｏＩ制限部位と、上流（ＣＨ１）端部のＸｂａＩ部位との間に挟まれている。トランスフェクション法に使用した構築物は、ＸｈｏＩ部位の下流にある１．５ｋｂのゲノム配列、及びＸｂａＩ部位の上流にある３．１Ｋｂのゲノム配列から構成した（図３Ｄ及び３Ｅ）。これらの配列を、マサチューセッツの酪農用ホルスタイン牛集団の１匹から、本明細書に記載するようにして単離した。ネオマイシン耐性マーカーを、３．５Ｋｂ断片に載せてこれらの２つの断片の間に挿入し、元のゲノム配列に由来するＣＨ１〜４を元々含む２．４ＫｂのＤＮＡと置き換えた。ベクターの骨格はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）であった。８．１Ｋｂのインサートを精製し、ウシ胎仔線維芽細胞のトランスフェクションに使用した。この構築物を図３Ａ〜３Ｃに示す。他の相同性領域を含む、及び／又は別の抗生物質耐性遺伝子を含む他のμノックアウト構築物を、標準的方法を使用して構築し、内因性μ重鎖遺伝子を突然変異させるのに使用してもよい。
【０３１７】
トランスフェクション／ノックアウト手順
市販の試薬であるＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Qiagen, Valencia, CA, USA）を用いて、胎仔ウシをトランスフェクトした。
【０３１８】
HematechのKansas施設において、疾患試験を受けたオスシャロレイ（Charlais）牛からウシ線維芽細胞を作製し、HematechのWorcester分子生物学研究所に送付して、記載する全ての実験に使用した。任意の他の有蹄動物品種、属又は種も、ドナー細胞（例えば、線維芽細胞等の体細胞）の供給源として使用できる。ドナー細胞を遺伝子改変して、機能性内因性Ｉｇの発現を低減するか又は排除する突然変異を含むようにする。
【０３１９】
ウシ胎仔線維芽細胞の培養のために使用した培地は以下の成分から構成した。すなわち、５００ｍｌαＭＥＭ（Bio-Whittaker #12-169F）、５０ｍｌウシ胎仔血清（Hy-Clone#A-1111-D）、２ｍｌ抗生物質／抗真菌剤（Gibco/BRL#15245-012）、１．４ｍｌ ２−メルカプトエタノール（Gibco/BRL #21985-023）、５．０ｍｌ Ｌ−グルタミン（Sigma Chemical #G-3126）及び０．５ｍｌ酒石酸チロシン（Sigma Chemical #T-6134）であった。
【０３２０】
トランスフェクションの前日、顕微鏡検査で判断される目標集密度を４０〜８０％として、細胞を６０ｍｍ組織培養皿に播種した。
【０３２１】
トランスフェクト当日、無血清／抗生物質不含培地に入れて合計容量を１５０μｌにした５μｇのＤＮＡを、２０μｌのＳｕｐｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬と混合し、室温にて５〜１０分間放置して、ＤＮＡ−Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ複合体を形成した。複合体が形成される間、トランスフェクトするウシ線維芽細胞を含む６０ｍｍ組織培養皿から培地を除去し、４ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を一度濯いだ。１ｍｌの増殖培地を１７０μｌのＤＮＡ／Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合液に添加し、すぐに６０ｍｍ皿に入った細胞に移した。細胞を、３８．５℃、５０％二酸化炭素中で、２．５時間インキュベートした。ＤＮＡ／Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ複合体と共に細胞をインキュベートした後、培地を吸引除去し、細胞を４ｍｌ ＰＢＳで４回洗浄した。５ｍｌの完全培地を添加し、培養液を一晩、３８．５℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、３７℃にて１ｍｌのＰＢＳ中０．３％トリプシンで、顕微鏡観察で判断して細胞がプレートから離れるまでインキュベートした。各６０ｍｍ皿から得た細胞を、２４ウェル組織培養プレート（４１．７μｌ／ウェル）の２４のウェルに分注した。１ｍｌの組織培養培地を各ウェルに添加し、プレートを、３８．５℃にて２４時間、及び５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。
【０３２２】
全てのトランスフェクション手順の間、ＤＮＡを含まないＳｕｐｅｒｆｅｃｔ／ＰＢＳ混合液を用いて偽（sham）トランスフェクションを行った。なぜなら、これらの細胞はいずれもネオマイシン耐性遺伝子を含まず、組織培養培地にＧ４１８を添加した後に全ての細胞が死滅すると思われたからである。これは、ＤＮＡを受容した細胞のポジティブセレクションのための陰性対照の役割を果たした。
【０３２３】
２４時間のインキュベーション後、各ウェルに、４００μｇ  Ｇ４１８を含む１ｍｌの組織培養培地をさらに添加し、最終的なＧ４１８濃度を２００μｇ／ｍｌとした。７日間のＧ４１８選択のために、細胞をインキュベーターに戻した。その間、トランスフェクト及び偽トランスフェクションプレートの両方を、細胞死についてモニターし、７日間にわたり、偽トランスフェクションのウェルの大部分が生存細胞をほとんど又は全く含まず、ＤＮＡを受容した細胞を含むプレートは卓越した細胞増殖を示した。
【０３２４】
７日間の選択期間後、９０〜１００％の集密度にあるウェルから得た細胞を、０．２ｍｌのＰＢＳ中０．３％トリプシンを用いて剥がし、増殖させるために３５ｍｍ組織培養プレートに移して、少なくとも５０％の集密度になるまでインキュベートした。この時点で、細胞を、０．６ｍｌのＰＢＳ中０．３％トリプシンでトリプシン処理した。各３５ｍｍ組織培養プレートから、０．６ｍｌ細胞懸濁液のうちの０．３ｍｌを、さらに増殖させるために、１２．５ｃｍ２組織培養フラスコに移した。残った０．３ｍｌは、３５ｍｍ皿に再播種し、約５０％の最小限の集密度が得られるまでインキュベートした。この時点で、これらのプレートから得た細胞を、ＰＣＲ分析用のＤＮＡ抽出のために処理した。各系統のフラスコは、これらの分析を終えるまでインキュベーターに入れたままにし、所望のＤＮＡ組込みを含まない場合には打ち切るか、又は今後の核移植及び凍結保存のために保存した。
【０３２５】
ターゲッティング組込みのスクリーニング
上述したように、ＤＮＡ構築物を含むトランスフェクタントをスクリーニングするためのＤＮＡ供給源は、分析する一連の細胞の入った３５ｍｍ組織培養皿とした。ＤＮＡを以下のように調製し、Lairdらにより発表された手順を採用した（Lairdら, Nucleic Acids Research, 19:4293）。簡単に説明すると、ＤＮＡを以下のように調製した。以下の成分で、細胞溶解緩衝液を調製した。すなわち、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫであった。
【０３２６】
各３５ｍｍ組織培養皿から培地を吸引し、０．６ｍｌの上記緩衝液と置き換えた。皿を再度インキュベーターに３時間入れたところ、この間に細胞溶解とタンパク質消化が起こった。このインキュベーションの後、溶解産物を、１．５ｍｌ微量遠心管に移し、０．６ｍｌのイソプロパノールを添加して、ＤＮＡを沈降させた。試験管を激しく反転振とうし、室温に３時間放置し、その後、ＤＮＡ沈降物を、微量遠心機中で１３，０００ｒｐｍにて１０分間かけて沈降させた。各試験管の上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで一度濯いだ。７０％エタノールを吸引除去し、ＤＮＡペレットを空気乾燥した。乾燥したら、各ペレットを３０〜５０μｌのＴｒｉｓ（１０ｍＭ）−ＥＤＴＡ（１ｍＭ）緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁させ、一晩水和・可溶化させた。５〜７μｌの各ＤＮＡ溶液を、それぞれのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順に使用した。
【０３２７】
２つの別々のＰＣＲ法を使用して、トランスフェクタントを分析した。第１の手順は、トランスフェクションに使用するＤＮＡ内に位置する部位にアニールすると予測される２つのプライマーを使用した。第１のプライマー配列は、ＤＮＡ構築物のネオマイシン耐性カセットと相同で、第２の配列は約０．５Ｋｂ離れたところに位置し、０．５Ｋｂの短いＰＣＲ生成物を生じた。特に、プライマーＮｅｏ１（5'-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3'、配列番号４２）及びＩＮ２５２１（5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3'、配列番号４３）を使用した。このＰＣＲ反応のために、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲキットを用いた。ＰＣＲ反応混合液は、各プライマーを１ｐｍｏｌｅ、５μｌの１０×反応緩衝液、１０μｌのＱ溶液、５μｌのＤＮＡ、及び１μｌのｄＮＴＰ溶液を含んでいた。Ｈ２Ｏで、反応混合液を合計容量５０μｌにまでした。９４℃にて２分間の開始変性インキュベーションにより、ＰＣＲ増幅を行った。次いで、９４℃にて４５秒、６０℃にて４５秒及び７２℃にて２分間のインキュベーションにより、変性、アニーリング及び増幅を３０サイクル行った。次いで、反応混合液を、７２℃にて５分間、そして混合液がＰＣＲ装置から除かれるまで４℃にて、インキュベートした。あるいはまた、細胞のゲノムに組み込まれるノックアウト構築物の領域に相同な任意の他のプライマーを、標準的ＰＣＲ反応において、適切な反応条件下で使用して、Ｇ４１８選択で生き残る細胞がＤＮＡ構築物の組込みの結果として耐性であったことを確認してもよい。
【０３２８】
少ない割合のトランスフェクタントしか、所望の位置（μ遺伝子座）にＤＮＡ組込みを含まないことが予測されるため、別のプライマー対を用いて、導入されたＤＮＡがトランスフェクタントのゲノムに存在することだけではなく、所望の位置に組み込まれたことを確認した。適切な組込みを検出するためのＰＣＲ手順は、ＤＮＡ構築物のネオマイシン耐性カセット内に位置する１つのプライマー、及び（相同性領域が、トランスフェクションに使用したＤＮＡ構築物に含まれる領域の外側にあるため）ＤＮＡがＩｇＭ遺伝子座の適切な部位に組み込まれた場合にのみ１．８Ｋｂ離れてアニールすると予測される１つのプライマーを用いて行った。このプライマーは、ＤＮＡ構築物が所望の位置に組み込まれた場合に、ＤＮＡ構築物中で相当する配列に直に隣接するＤＮＡ配列にアニールするように設計した（ＤＮＡ構築物内に存在する領域内にあり、かつゲノムにおいて隣接する領域内にある遺伝子座のＤＮＡ配列は予め決定した）。特に、プライマーＮｅｏ１及びＯＵＴ３５７０（5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGT C-3'、配列番号４４）をこの分析に用いた。このＰＣＲ反応を、第１のＰＣＲ反応について上述したようにＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲキットを用いて行って、ターゲッティング構築物の細胞への組み込みを確認した。あるいはまた、このＰＣＲ分析は、任意の適切な反応条件下で、細胞のゲノムに組み込まれるノックアウト構築物の領域と相同な任意の他のプライマー、及び組込み部位の上流又は下流にある細胞のゲノム中の領域に相同な任意の他のプライマーを用いて行ってもよい。
【０３２９】
これらの方法を用いて、１３５の個々の３５ｍｍプレートを、ＤＮＡ構築物の適切な遺伝子座へのターゲッティング組込みについてスクリーニングした。このうち８プレートのＤＮＡが、適切にターゲッティングされたＤＮＡ構築物を含むと判断され、このうち３つを核移植手順において使用するために選択した。これらの細胞系は「８−１Ｃ」、「５−３Ｃ」及び「１０−１Ｃ」と称した。レシピエントウシへの導入に使用しない残った胚盤胞は、追加のＰＣＲ分析に供するＤＮＡを抽出するために使用した。この分析は、トランスフェクトされた系統の初回スクリーニングにも使用したプライマーでのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法を用いて実施した。
【０３３０】
上記したように、μ遺伝子座のエキソン１〜４を除去するように設計された遺伝子ターゲッティング構築物を用いて、３つの細胞系を生成した。これらの系統は全て、ＰＣＲに基く試験により、ターゲッティング挿入について陽性と試験され、核移植に使用した。これらの核移植で残った胚盤胞を、適切にターゲッティングされた構築物を試験するＰＣＲによりスクリーニングした。以下の陽性胚盤胞の頻度が得られた：
細胞系８−１Ｃ：        ６／８
細胞系１０−１Ｃ：      ２／１６
細胞系５−３Ｃ：        ０／１６
【０３３１】
妊娠４０日目において、超音波検査により合計１１の妊娠が検出されたが、６０日目までに７胎仔が死んでいた。残った４胎仔を処理して、新しい胎仔線維芽細胞を再生し、残った器官を使用して、ＰＣＲ分析用の小組織サンプルを作製した。分析の結果は以下の通りである：
系統８−１Ｃ：２胎仔、ＰＣＲにより１胎仔がターゲッティング挿入について陽性
系統１０−１Ｃ：１胎仔、ＰＣＲにより１胎仔がターゲッティング挿入について陽性
系統５−３Ｃ：１胎仔、ＰＣＲにより１胎仔がターゲッティング挿入について陰性
【０３３２】
驚くべきことに、ターゲッティング挿入について陽性と試験された１０−１Ｃ胚盤胞の頻度はたった２／１６だったにも関わらず、この細胞系から得た唯一の生存６０日齢胎仔はＰＣＲで判断したところ陽性であった。８−１Ｃ由来の陽性胎仔も得られた。全ての組織サンプルのＤＮＡのサザンブロット分析を実施して、構築物が、一方の端部においてのみ正確にターゲッティングされているのではなく（これは元の構築物に存在する短い相同性領域のＰＣＲにより判断）、他方の端部においても正確にターゲッティングされていることを確認した。これまでの結果に基づき、２つの独立した組込み事象から、２つの重鎖ノックアウト胎仔が生成したと考えられる。また、これらの胎仔は、２つの異なる系統から誘導されているため、少なくとも一方は、両端部において構築物を正しく組み込んでいる可能性が高い。サザンブロット分析により、ターゲッティング構築物の両端部の適切なターゲッティングを確認した後、さらなる核移植を行って、追加の胎仔を作り、出産させる。
【０３３３】
核移植及び胚導入
Ｋ／Ｏ細胞系（８−１−Ｃ（１８））で核移植を行い、８つの胚を作製した。このバッチから得た合計６つの胚を、Trans Ova Genetics（「TOG」、Iowa）の疾患を患っていない３匹のレシピエントに導入した。
【０３３４】
凍結胚を、疾患を患っていない１０匹のレシピエントに導入して、疾患を患っていないメス線維芽細胞系を得た。３５〜４０日目に妊娠を確認後、胎仔回収を予定した。
【０３３５】
妊娠診断及び胎仔回収
ノックアウト胎仔細胞由来のクローン化胚が導入された１８匹のレシピエントの妊娠状態を、超音波検査により調べた。結果を表６にまとめる。
【表６】
2006505291.tif 000008
【０３３６】
妊娠診断
ノックアウト細胞由来のクローン化胚（８−１Ｃ）を導入した３匹のレシピエントの妊娠状態を調べた。１匹は妊娠しておらず、残りの２匹は１ヵ月後に再確認する必要があった。
【０３３７】
胎仔回収及び細胞系の樹立
４０日目においてＫ／Ｏ胚で１１匹の妊娠体を得た。６０日目で、４匹の生存胎仔を取り出した。４匹全てから細胞系を樹立し、後に使用するために凍結保存した。また、胎仔由来の組織サンプルを回収及び急速冷凍（snap freeze）し、ＰＣＲ／サザンブロット分析のためにＨｅｍａｔｅｃｈ分子生物学研究所に送付した。
【０３３８】
４つの細胞系の全てがオスであった。メス細胞系を確保するために、Trans Ova Geneticsにおいて疾患を患っていないレシピエントで確立された妊娠５５日目の妊娠体から回収した胎仔（６）から細胞系を樹立し、後にＫ／Ｏ細胞を樹立するために凍結保存した。最近、μノックアウトを含むメス細胞系の存在が確認された。このメス細胞系を用いて、オス細胞系から生成する動物と交配され得るクローン化動物を作製して、二重μノックアウトを含むものについて子孫をスクリーニングしてもよい。
【０３３９】
所望であれば、得られたノックアウト胎仔又はノックアウト子孫由来の細胞を使用して第２ラウンドの核移植を行い、さらなるクローン化子孫を作出しうる。最初のノックアウト胎仔又はノックアウト子孫由来の細胞はまた、凍結して細胞系統を確立し、それを別のノックアウト有蹄動物の作出のためのドナー細胞供与源として用いることができる。
【実施例６】
【０３４０】
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性が低減されたトランスジェニック有蹄動物
所望であれば、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを突然変異させたトランスジェニック有蹄動物を作出し、ガラクトースα（１，３）−ガラクトースエピトープによる異種抗体の望ましくない糖鎖付加を防止することができる。α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座の一方のアレルが突然変異したウシ線維芽細胞系を、相同組換えにより作製した。α−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウト細胞を作製するためのＤＮＡ構築物を使用し、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ、本明細書に記載）及び転写終結カセット（ＳＴＯＰ）を、触媒ドメインを含むエキソン９に挿入することにより、機能性完全長α−ガラクトシルトランスフェラーゼｍＲＮＡの転写を防いだ。従って、得られる未成熟α−ガラクトシルトランスフェラーゼ転写産物は触媒ドメインを欠く。ＤＮＡ構築物（すなわち、α−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトベクター）を、３つの独立したウシ線維芽細胞系にエレクトロポレーションし、次いで、ピューロマイシン耐性コロニーを単離した。ＰＣＲ分析によれば、いくつかのコロニーでエキソン９領域において相同組換えが生じた。こうして、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座の一方のアレルが突然変異されたウシ線維芽細胞系が生成した。所望であれば、同じノックアウトベクター及びより高濃度の抗生物質を（ホモ接合ノックアウト細胞を選択するために）用いるか、又は別のノックアウトベクターを異なる抗生物質耐性遺伝子と共に用いて、第２のアレルを突然変異させてもよい。本方法を他の有蹄動物由来の細胞に適用し、本明細書に記載する核移植法に使用するトランスジェニック細胞を作製して、本発明のトランスジェニック有蹄動物を作製してもよい。
【０３４１】
これらの方法は、さらに以下に記載する。
【０３４２】
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトベクターの構築
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトベクターを以下のように作製した（図２３）。α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン９周辺のゲノムＤＮＡを単離するために、以下のプライマー対5'-gat gat gtc tcc agg atg cc-3'（配列番号６１）及び5'-gac aag ctt aat atc cgc agg-3'（配列番号６２）を用いたＰＣＲにより、ＤＮＡプローブを増幅した。このプローブを用いて、ウシゲノムλファージライブラリーをスクリーニングし、７つの陽性λファージクローンを同定した。オスシャロレイ牛線維芽細胞由来のＤＮＡを含む１つのクローンを、制限マッピングによりさらに分析した。エキソン９を含むＮｏｔＩ−ＸｈｏＩゲノム断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）にサブクローニングし、ｐｕｒｏ及びＳＴＯＰカセットの両方を、触媒ドメインの５’側にあるＮｏｔＩ−ＸｈｏＩゲノム断片のＡｖｉＩ部位に挿入した。ジフテリアトキシン遺伝子（ＤＴ−Ａ，Ｇｉｂｃｏ）もベクター構築物に付加し、ターゲッティングカセットが非相同的に組み込まれた細胞を死滅させた。
【０３４３】
トランスフェクション／ノックアウト手順
標準的なエレクトロポレーションプロトコルを用いて、以下のように３つの胎仔線維芽細胞系（２つはオスジャージー牛由来のもの、１つはメスジャージー牛のもの）をトランスフェクトした。ウシ胎仔線維芽細胞を培養するために使用した培地は、５００ｍｌαＭＥＭ（Gibco, 12561-049）、５０ｍｌウシ胎仔血清（Hy-Clone＃ABL13080）、５ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）、及び１ｍｌ  ２−メルカプトエタノール（Gibco/BRL #21985-023）を含んでいた。トランスフェクション前日、顕微鏡検査で判断する目標集密度を８０〜１００％として、細胞をＴ１７５組織培養フラスコに播種した。トランスフェクション当日、約１０７個のウシ線維芽細胞をトリプシン処理し、αＭＥＭ培地で１回洗浄した。細胞を８００μｌのα−ＭＥＭに再懸濁した後、３０μｇのＤＮＡを細胞懸濁液に添加し、ピペッティングによりよく混ぜた。細胞−ＤＮＡ懸濁液を、エレクトロポレーションキュベットに移し、１，０００Ｖ及び５０μＦにてエレクトロポレーションした。その後、エレクトロポレーションした細胞を、血清を添加したα−ＭＥＭ培地と共に、２０の２４ウェルプレート上に植え付けた。４８時間の培養後、培地を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地と置き換え、細胞を２〜３週間培養してピューロマイシン耐性細胞を選択した。選択後、１００％に近い集密度に達した全てのコロニーを選び、ゲノムＤＮＡをコロニーから抽出して、ＰＣＲにより所望の相同組換え事象についてスクリーニングした。
【０３４４】
ターゲッティング組込みについてのスクリーニング
上述したように、ＰＵＲＥＧＥＮＥ  ＤＮＡ単離キット（Gentra Systems）を製造元のプロトコールに従って使用して、ゲノムＤＮＡを各２４ウェルから個別に抽出した。各ゲノムＤＮＡサンプルを、２０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ）に再懸濁した。以下のプライマー対5'-aag aag aga aag gta gaa gac ccc aag gac-3'（配列番号６３）及び5'-cct ggg tat aga cag gtg ggt att gtg c-3'（配列番号６４）を使用して、ＰＣＲによるスクリーニングを行った。一方のプライマーの配列は、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトベクター中に位置し、他方のプライマーの配列はターゲッティング内因性遺伝子座中の組込まれたベクターのすぐ外側に位置する（図２３）。従って、予想されるＰＣＲ生成物は、ノックアウトベクターが相同組換えにより標的遺伝子座に組み込まれた場合にのみ検出されるはずである。
【０３４５】
ＰＣＲ反応混合液は、１８．９μｌの水、３μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ２＋添加）、４．８μｌのｄＮＴＰ混合液、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、１０ｐｍｏｌのリバースプライマー、１μｌのゲノムＤＮＡ、及び０．３μｌのＬＡ  Ｔａｑを含んでいた。以下の条件下で反応混合液をインキュベートすることにより、４０サイクルのＰＣＲを行った。すなわち、８５℃にて３分間、９４℃にて１分間、９８℃にて１０秒間、及び６８℃にて１５分間であった。ＰＣＲ後、反応混合液を電気泳動により分析した。予測した大きさのＰＣＲ生成物を生成したピューロマイシン耐性クローンを選択した（図２３）。こうして、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子座の一方のアレルがノックアウトベクターにより突然変異されているウシ線維芽細胞系がうまく生成した。
【実施例７】
【０３４６】
内因性遺伝子を突然変異させるためにアデノ随伴ウイルスを用いてトランスジェニック有蹄動物を作出する別の方法
細胞のゲノム中に存在する標的配列の特異的な置き換えのためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用することができる（Inoueら, Mol. Ther. 3:526-530, 2001；Hirataら, J. Virol. 74:16536-16542, 2000；Inoueら, J. Virol. 73:7376-7380, 1999；及びRussellら, Nat. Genet. 18:325-330, 1998）。遺伝子ターゲッティング率は、より慣用的な遺伝子ターゲッティング手法と比べて非常に効率的である。ＡＡＶは、幅広い宿主範囲及び組織特異性（ウシ及びヒト皮膚線維芽細胞の両方に対する特異性を含む）を有する。従って、ＡＡＶを用いて、内因性免疫グロブリン（例えば、μ重鎖、λ軽鎖、κ軽鎖若しくはＪ鎖）、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はプリオン遺伝子中に１つ以上の突然変異を含むトランスジェニック有蹄動物細胞を作製することができる。次に、これらのトランスジェニック細胞を、本明細書に記載する核移植方法に用いて、本発明のトランスジェニック有蹄動物を作製することができる。
【０３４７】
ＡＡＶを使用することにより、ウシ免疫グロブリン重鎖遺伝子座の相同組換えが、従来の遺伝子ターゲッティング法（すなわち、エレクトロポレーション及びリポフェクション法）を使用して以前に得られたものよりも高い頻度で生じた。第１ラウンドの遺伝子ターゲッティング実験では、ＡＡＶベクターを介してＤＮＡが導入された７３の安定した形質導入体のうち、適切にターゲッティングされた線維芽細胞クローンが５つ得られた。
【０３４８】
これらの実験は以下の通りに実施した。
【０３４９】
ＡＡＶノックアウトベクター
ＡＡＶ構築物は、外来配列の単純な挿入、又は内因性配列のＡＡＶベクター中に存在する新しい配列による置き換えにより、遺伝子を破壊することができる。図２４は、ウシ免疫グロブリン重鎖μ定常領域の４つのコードエキソンの全てが、２８２２塩基対のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片上に存在するＡＡＶ構築物を示す。市販のベクターｐＭＣ１Ｎｅｏに存在するネオマイシン耐性マーカーを含む１．１６Ｋｂ断片を、ホルスタイン牛由来のμ重鎖遺伝子座のエキソン４に存在するＳａｃＩＩ部位に挿入した。この遺伝子座は、実施例３に記載したノックアウトベクターを作製するために単離されたファージクローンに含まれているものであった。ＡＡＶベクターを作製するために、μ重鎖遺伝子座中のＳａｃＩＩ部位を充填して平滑末端とし、次いでこれを平滑末端ＳａｌＩリンカー（New England Biolabs）にライゲートした。その後、ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＭＣ１ＮｅｏのＸｈｏＩ断片を、ＳａｌＩリンカーを介して、この遺伝子座に付加されたＳａｌＩ部位にライゲートした。このライゲーションは、ＸｈｏＩ及びＳａｌＩ制限部位が互換性のある端部を有するために実施可能である。このノックアウトベクターにより、内因性μ重鎖遺伝子へのネオマイシン耐性遺伝子の破壊的挿入が生じ、μ重鎖遺伝子が不活性化される。この遺伝子不活性化は、内因性μ遺伝子座の領域を欠失させることなく生じる。
【０３５０】
ターゲッティングの間にエキソン３及び４を内因性遺伝子座から除去して、これらの２つのエキソンをネオマイシン耐性遺伝子の機能性コピーで置き換えるように別のベクターを設計した（図２５）。この構築物は、メスジャージー牛由来のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により作製した。具体的には、以下のプライマーを用いて、３’相同性領域を増幅した。すなわち、ＸｂａＩ制限部位を付加する5'-GGG GTC TAG Agc aga cac tac act gat ggg ccc ttg gtc c-3'（配列番号６５）、及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加する5'-GGG GAA GCT Tcg tgt ccc tgg tcc tgt ctg aca cag-3'（配列番号６６）である。５’相同性領域は、ＸｈｏＩ制限部位を付加するプライマー5'-GGG GCT CGA Ggt cgg cga agg atg ggg gga ggt g-3'（配列番号６７）、及びＫｐｎＩ制限部位を付加する5'-GGG GGG TAC Cgc tgg gct gag ctg ggc aga gtg gg-3'（配列番号６８）で増幅した。これらのプライマー配列中の大文字で示すヌクレオチドは、μ重鎖遺伝子座にはアニールしないヌクレオチドであるが、その後のサブクローニングステップを容易にする制限部位を付加するためにプライマーに含まれる。最初の４つのグアニンは、プライマーの最端部から制限部位を分離するために付加されている。なぜなら、制限酵素は、プライマーの最端部にある部位を内部部位と同じようにはうまく切断しないからである。５’相同性領域は１．５Ｋｂの長さであり、エキソン１及び２を含む。５’相同性領域はまた、エキソン３の最初の２５ヌクレオチドを含んでいて、エキソン３のスプライス受容部位を維持する。スプライス受容部位は、エキソン３がスプライシングに使用されるようにして、エキソン１及び２が下流膜貫通ドメインにスプライシングすることで異常な膜結合生成物を形成する可能性を防止する。３’相同性領域は、１．２４Ｋｂの長さで、エキソン４のすぐ下流にある領域を含む。
【０３５１】
図２４に示す構築物については、ターゲッティングカセットを、Ryanら（J. Virol. 70:1542-1553, 1996）が報告したウイルス長末端反復（ＬＴＲ）配列を含むＡＡＶベクターに、標準的な方法により挿入した。ＴｔｅｔＡ２パッケージング細胞系を先に記載されたように用いて（Inoue及びRussell, J. Virol. 72:7024-7031, 1998）、ＡＡＶベクターをキャプシドにパッケージングし、先に記載されたように精製した（Zolotukhinら, Gene Therapy, 6:973-985, 1999）。図２５に示す構築物については、上記方法又は任意の他の標準的な方法を用いて、ターゲッティングカセットを、Ｒｙａｎらが記載したＡＡＶベクター又は任意の他のＡＡＶベクター（Stratagene製の市販ベクター等）に挿入して、ベクターを含むウイルスを作製することができる。
【０３５２】
形質導入手順
メスジャージー牛由来の線維芽細胞を、４８ウェル組織培養プレートの１つのウェルに、１ウェルにつき４０，０００細胞で播種し、完全培地中で３８．５℃及び５％ＣＯ２下にて、細胞がウェルの底表面に付着するまで培養した。細胞が付着したら、培地を除去し、図２４に示すベクターの感染多重度（ＭＯＩ）を５００〜２０，０００粒子／細胞として、ＡＡＶ粒子を含む０．２ｍｌの新しい培地と置き換えた。ＭＯＩは、得られるコロニー数及び薬剤選択期間中のこのコロニーの間隔を判断した試験的な実験に基づき選択した。プレートを一晩インキュベートした。このインキュベーションの後、形質導入ウェルをカルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで濯ぎ、トリプシン又は上記細胞解離緩衝液のいずれかを使用してウェルから剥離した。剥離した細胞をゆるやかにピペッティングすることで均一な細胞懸濁液を得、ウェル中の細胞を１０の１００ｍｍ組織培養皿に再度分配した。皿を完全培地と共に一晩インキュベートした。
【０３５３】
この１００ｍｍ皿のインキュベーションの後、培地を、３５０μｇ／ｍｌの濃度でＧ４１８を含む選択培地と置き換えた。皿表面上でコロニーが肉眼で目に見えるようになるまで、選択培地を２〜３日ごとに取り換えた。この時点で、個々のコロニーを採取し、それぞれの容器に移した。
【０３５４】
コロニーを含む領域には、組織培養皿の外面に印をつけた。全てのコロニーに丸をつけた後、プレートから培地を吸引除去し、プレートをカルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、１×トリプシンの１：２５希釈液でプレートを溢れさせ、コロニーがプレートの表面から目に見えて剥離し始めるまで、室温にて放置した。プレートは静止した状態で保って、剥離したコロニーがプレートの別の場所へ浮遊するのを防いだ。ピペットチップを用いて、細胞凝集体を、５０ｍｌの容量で採取し、ピペットチップの中身を２４ウェル組織培養プレートの１つのウェルに移した。全てのコロニーを移した後、Ｇ４１８を含む完全培地を添加し、単離したクローンを集密状態近くまで増殖させた。
【０３５５】
個々のウェルがほぼ集密状態になったとき、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳで２回洗浄した。０．２ｍｌの細胞解離緩衝液を使用して、細胞を剥離した。この細胞懸濁液のうち、２０μｌを新しい２４ウェルプレートに写し、残った細胞は、２．０ｍｌの完全培地を添加した後に、元の２４ウェルプレートの表面に再付着させた。元のプレートを１００％の集密度までインキュベートした。新しいプレートは、後のウシクローニング手順のために、適切にターゲッティングされた細胞の供給源としての役割を果たす。
【０３５６】
元の２４ウェルプレートのウェルが１００％の集密度に達したとき、培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳを除去し、Lairdら（Nucleic Acids Res. 19:4293, 1991）を応用した細胞溶解緩衝液で置き換えた。簡単に説明すると、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含む０．２ｍｌの溶解緩衝液を、ウェルに添加した。プレートをインキュベーターに３時間から一晩の間戻した。次いで、粘性細胞溶解産物を微量遠心管に移した。等容量のイソプロパノールを添加してＤＮＡを沈降させた。微量遠心機中で１０分間スピンした後、上清を捨て、ペレットを０．５ｍｌの７０％エタノールで１回洗浄した。エタノールを除去した後、ＤＮＡペレットを通気乾燥させ、３５μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁させた。３μｌのアリコートをＰＣＲ分析に使用した。
【０３５７】
ＰＣＲ分析
ＡＡＶ粒子が形質導入された薬剤耐性クローン由来のＤＮＡサンプルを、ＰＣＲ分析を用いて、ベクターの適切なターゲッティングについてスクリーニングした。このスクリーニング法では、薬剤選択マーカーをコードするＤＮＡ内にアニールする一方のプライマー、及び標的遺伝子座内にアニールするが、ＡＡＶターゲッティング粒子に存在する配列の外側にアニールする別のプライマーを使用する。ＰＣＲ生成物は、ＡＡＶターゲッティングＤＮＡが、内因性ゲノムの所望の位置に組み込まれた場合にのみ検出される。
【０３５８】
これらのＡＡＶ粒子を用いた単一のターゲッティング実験から得た結果を、図２６に示す。この分析に基づくと、７３の個別のクローンのうち５つが、適切にターゲッティングされたベクターＤＮＡを含んでいた。
【０３５９】
本方法はまた、図２５に示すＡＡＶベクター、又は任意の他の適切なアデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルスベクターと共に使用され得る。所望であれば、単離したコロニー中で、異なる抗生物質耐性遺伝子（すなわち、ネオマイシン耐性遺伝子以外の遺伝子）を有するＡＡＶベクターを形質導入することで、第２のμ重鎖アレルを突然変異させることができる。その結果生じるホモ接合ノックアウト細胞を選択するために、感染細胞を、対応する抗生物質の存在下で培養する。あるいはまた、単離したコロニーに、ネオマイシン耐性遺伝子を含むＡＡＶベクターを形質導入して、高濃度の抗生物質（すなわち、ヘテロ接合ノックアウト細胞は死滅するが、ホモ接合ノックアウト細胞は死滅しない抗生物質濃度）の存在下で培養できる。
【実施例８】
【０３６０】
典型的なウシ核移植胚における核再プログラム欠陥の証拠
典型的な核移植技術は、低いパーセンテージの生きた出産を一般的に生じる。以下に記載するように、この効率は、少なくとも一部は、卵母細胞の発育に望ましい遺伝子の転写を促進し、かつ発育に望ましくない遺伝子の転写を抑制するために、再構成された卵母細胞がドナー細胞又はドナー核を再プログラムする能力がないためである。実施例１１及び１２は、本発明の方法においてプリオン遺伝子に突然変異を有しまた任意により異種Ｉｇ遺伝子を有していてもよいトランスジェニック有蹄動物を作製するために使用できる改良クローン化方法を説明する。
【０３６１】
ウシの移植前発育中の核膜、核マトリックス及びクロマチン−マトリックス境界成分の分布
移植前の胚における核膜（Ｂ型及びＡ／Ｃ型ラミン）、核マトリックス（ＮｕＭＡ）及びクロマチン−マトリックス境界（ＡＫＡＰ９５）成分の分布を測定するために、ウシ胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（体外受精、ＩＶＦ）により産生し、免疫蛍光分析により試験した。ウシのｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を、以前に記載されたように行った（Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．３４：２１２−２２３，１９９３）。簡単に説明すると、単一の雄ウシに由来する凍結−解凍したウシ精子を、４５〜９０％Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配の上部に積層し、７００×ｇで３０分間遠心した。ペレットの精子濃度を測定し、精子を受精の最終濃度が１０６精子／ｍｌとなるように希釈した。成熟後２２時間で、卵母細胞をＴＬ  ＨＥＰＥＳで３回洗浄し、４８０μｌの受精培地に入れた。２０μｌの精子懸濁液を５０個の卵母細胞について１０６精子／ｍｌで加えた。０．５ｍｌの胚培地中にマウス胎児線維芽細胞の単層を含み、０．３ｍｌの試験済み胚鉱油（Ｓｉｇｍａ）で被覆された４ウェル組織培養プレートの培養液に入れた。各ウェルに２５〜５０の胚を入れ、５％ＣＯ２空気雰囲気中、３８．５℃でインキュベートした。受精率は、前核発育により測定して、９０％を上回った。
【０３６２】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚を免疫蛍光分析するために、抗ヒトラミンＢ抗体を、Ｄｒ．Ｊｅａｎ−Ｃｌａｕｄｅ  Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ，ＣＮＲＳ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅから取得した。抗ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をＳａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、抗ＮｕＭＡ抗体を、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから取得した。抗ラットＡＫＡＰ９５アフィニティー精製したウサギポリクローナル抗体を、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから取得した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚を、ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラスカバースリップ上に沈降させ、３％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１５分間透過性化した（Ｃｏｌｌａｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３５：１７１５−１７２５，１９９６）。タンパク質を、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）中の２％ＢＳＡで１５分間ブロッキングした。一次抗体（抗ＡＫＡＰ９５、抗ラミンＢ、抗ＬＢＲ、抗ＮｕＭＡ及び抗ラミンＡ／Ｃ）及び二次抗体をそれぞれ３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴ−ＢＳＡ中の１：１００希釈で使用した。ＤＮＡを、アンチフェードマウンティング培地に混合した０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で対比染色した。サンプルをスライドに載せ、カバースライドをネイルエナメルで密封した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０エピ蛍光顕微鏡で免疫蛍光観察を行い、ＪＶＣ  ＣＣＤカメラ及びＡｎａｌｙＳＩＳソフトウェアで写真を撮影した。Ａｌｄｕｓ  Ｐｈｏｔｏｓｔｙｌｅｒソフトウェアを用いて映像を処理した。ＡｎａｌｙＳＩＳ定量プログラムを用いて蛍光シグナルの相対定量を行った。データを平均相対蛍光強度で表した。
【０３６３】
ウシ胚の免疫蛍光分析は、Ｂ型ラミンが核の周囲で検出されたことを示した（図２９Ａ）。しかしながら、ラミンＡ／Ｃは前核又は８細胞期では検出されなかった。これらの早い細胞期でラミンＡ／Ｃが検出されなかったことは、分化細胞のマーカーのためと予想される（Ｇｕｉｌｌｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３７９５−３７９９，１９８７）。核マトリックス構造タンパク質であるＮｕＭＡは、試験した全ての段階（期）で検出された（図２９Ａ）。しかしながら、ウシ前核期胚では、ＮｕＭＡ標識は、両方の前核のうち最も小さい雌性前核（ＦＰＮ）に限定された（図２９Ａ、矢印）。最近、早期マウス胚で特性決定され（Ｂｏｍａｒら，提出した２００２原稿）、またアフィニティー精製した抗ラットＡＫＡＰ９５抗体を用いて検出されたＡＫＡＰ９５もまた、雌性前核に限定された（図２９Ａ）。それにもかかわらず、ＡＫＡＰ９５の核内分布は、後続の発育期の全ての線維芽細胞の核において観察された（図２９Ａ）。
【０３６４】
免疫蛍光標識の特異性を、ウシ一次胎仔線維芽細胞及び前核期ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚のウェスタンブロット分析により確認した（図２９Ｂ）。この分析のために、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりゲル当り４０ｍＡでタンパク質を分析した。タンパク質を、泳動緩衝液（２５ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシン，２０％メタノール及び０．１％ＳＤＳ）中で、ニトロセルロース膜上に１００Ｖで１時間かけて電気泳動により泳動させた。膜を、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；すなわち、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ及び２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）で１０分間洗浄し、５％の乳汁を含むＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で１時間ブロッキングし、次の一次抗体：抗ＡＫＡＰ９５（１：２５０希釈）、抗ラミンＢ（１：１０００）、抗ＬＢＲ（１：５００）、抗ＮｕＭＡ（１：５００）及び抗ラミンＡ／Ｃ（１：５００）と共に１．５時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで１０分間２回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合した二次抗体と共に１時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳで１０分間２回洗浄し、増強化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて現像した。
【０３６５】
全てのタンパク質は、それらの予想見掛けＭｒ：６８ｋＤａ（Ｂ型ラミン）、７０及び６０ｋＤａ（それぞれラミンＡ及びＣ）、約１８０ｋＤａ（ＮｕＭＡ）及び９５ｋＤａ（ＡＫＡＰ９５）で検出された。全体的に見て、これらの結果は、移植前ウシ胚が交差反応性抗体で検出できる核構造タンパク質を発現することを示す。特に、ラミンＡ／Ｃは、ウシ移植前胚では免疫学的に検出されない。ラミンＡ／Ｃは体細胞で発現されるので（図２９Ｂ）、それらは、核移植胚における核再プログラムのための分子マーカーを潜在的に構成する。
【０３６６】
核移植ウシ胚における核膜、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５の動態
核膜及び核マトリックス構造の動態を、典型的な核移植手法過程でウシにおいて試験した。これらの構造を、それぞれラミンＡ／Ｃ及びＢに対する抗体、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５を用いて調査した。核再構築過程のこれらの構造の動態を測定するために、以前に記載されたように単離した一次胎仔線維芽細胞をドナー細胞として用いて、ウシ核移植胚を産生した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。簡単に説明すると、ＰＢＳ中の０．０８％トリプシン及び０．０２％ＥＤＴＡ（トリプシン−ＥＤＴＡ）を用いてトリプシン処理することにより、ウシ胎仔から細胞を回収した。細胞をＴ７５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１５ｇ／ｍｌグルタミン（Ｓｉｇｍａ）、０．００３％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）及び抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を添加したα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に播種した。播種後３日目に、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで回収し、α−ＭＥＭ／ＤＭＳＯ中で凍結した。Ｇ１細胞を以前に記載されたように単離した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。簡単に説明すると、単離する２４時間前に、５．０×１０５の細胞を、１０ｍｌのＭＥＭ／ＦＢＳを含むＴ７５フラスコに播いた。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、培地を１〜２時間で交換し、プレートをＶｏｒｔｅｘ上で、中速度で３０〜６０秒間回転した。培地を除去し、５００×ｇで５分間遠心し、ペレットを２５０μｌのＭＥＭ／ＦＢＳに再懸濁させた。細胞質架橋により結合した二重細胞（cell doublet）を、マイクロピペットを用いて選択し、核移植のために使用した。
【０３６７】
ウシ核移植を、以前に記載されたように行った（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した卵母細胞を、成熟の１８〜２０時間後に脱核した。Ｇ１ドナー細胞を卵黄周囲の空間に移入した後、それらを、２．４ｋＶ／ｃｍの単一電気パルスを２０マイクロ秒間使用して融合させた（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ２００，Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）。成熟後２８〜３０時間（すなわち、卵母細胞を、卵巣から採取した後、成熟培地に入れてから２８〜３０時間後、かつドナー細胞と融合して少なくとも２時間後）に、カルシウムイオノフォア（５μＭ）で４分間（Ｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、続いてＡＣＭ培地（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．２７ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ乳酸ナトリウム、０．４ｍＭピルベート、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１％ＢＭＥアミノ酸、及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸）中の１０μｇのシクロヘキシミド及び２．５μｇのサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）で５時間かけて再構成された卵母細胞及び単為発生対照を活性化した（Ｌｕｉら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４９：２９８−３０７，１９９８）。活性化した後、核移植胚又は卵母細胞卵を５回洗浄し、マウス胎児線維芽細胞と共に５％ＣＯ２雰囲気中３８．５℃で一緒にインキュベートした。
【０３６８】
再構成された胚を、標準的方法を用いて活性化し、融合後３時間に、成熟前クロマチン凝縮（ＰＣＣ）期の胚を、パラホルムアルデヒドで固定し、ラミンＡ／Ｃ、ラミンＢ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５に対する抗体を用いた免疫蛍光により分析した（図３０、ＰＣＣ）。さらに、前核（ＰＮ）期（すなわち、融合後１５時間のウシ胚）に進むことが可能であった核移植胚の群を、同様にして分析した（図３０、核移植−ＰＮ）。対照として、本明細書に記載したように活性化した単為生殖卵母細胞も、前核期で試験した（図３０、単為生殖ＰＮ（Ｐａｒｔｈ．ＰＮ））。
【０３６９】
予想したように、ドナー体細胞（ウシ胎仔線維芽細胞、図３０）は、全てのマーカーを文献から予期された分布で発現した。成熟前クロマチン凝縮期において、明確な凝縮した染色体塊は、ヘキスト３３３４２でのＤＮＡ染色により証明された。ラミンＡ／Ｃ及びＢは、おそらくそれらが卵細胞質中に分散した結果として、凝縮した染色体上又はその付近で検出されなかった（図３０、ＰＣＣ）。若干の標識したＮｕＭＡが検出された。このＮｕＭＡはおそらく、凝縮した染色体を維持する紡錘体極と会合していた。これに対し、ＡＫＡＰ９５は凝縮した（ＰＣＣ）染色体と会合していた。この結果は、有糸分裂ヒト細胞におけるＡＫＡＰ９５標識と類似している（reminiscent）（Ｃｏｌｌａｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１１６７−１１８０，１９９９；Ｓｔｅｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５０：１２５１−１２６２，２０００）。前核期において、全てのマーカーが検出された。ラミンＡ／Ｃは前核膜に存在した（図２、核移植−ＰＮ）。これは、上記ラミンが対照の単為生殖前核の膜（図３０）及び受精前核の膜（図２９Ａ）からの不在と対比して顕著だった。ラミンＢは、対照前核のように核移植前核で検出された。同様に、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５は、核小体を除き、核内部に存在した。ＮｕＭＡ標識は、対照の単為生殖前核よりも核移植前核において一貫して鮮明であった（核移植ＰＮと単為生殖ＰＮとの比較、図３０）。まとめると、これらの観察結果は、核移植胚の前核が、体細胞核マーカーのラミンＡ及びＣを再び生成（assemble）し、かつ強いＮｕＭＡ染色を示すことを示す。
【０３７０】
単為生殖胚及び核移植胚の前核におけるＡＫＡＰ９５の示差的固定
Ａ−キナーゼ固定タンパク質ＡＫＡＰ９５は、有糸分裂染色体凝縮に関係した核タンパク質である。核移植後に体細胞核の再プログラムに影響を与える別の分子マーカーとして使用するために、ＡＫＡＰ９５の核内固定性を、胎仔線維芽細胞から形成されたウシ核移植前核期の胚において特性決定した。単為生殖胚に由来する前核、及び体細胞ドナー細胞の核におけるＡＫＡＰ９５の固定も、試験した。
【０３７１】
前核胚中のＡＫＡＰ９５の核内固定を、ｉｎ  ｓｉｔｕで室温で３０分間、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ、及び１００又は３００ｍＭのＮａＣｌを用いた胚の抽出により試験した。上記のように、雄性前核はＡＫＡＰ９５を固定しなかった。これに対し、有意な量のＡＫＡＰ９５及びＤＮＡは、ウシの核移植胚の前核及びドナー核において、ＤＮＡｓｅＩ及び３００ｍＭのＮａＣｌに抵抗性であった（図３１）。Ｂ型ラミンは、単為生殖又は核移植前核において、ＤＮＡｓｅＩ及び３００ｍＭのＮａＣｌにより抽出されなかった（図３１）。これは、ＡＫＡＰ９５及びＤＮＡ分布の変化が核構成の大きな変化に起因しなかったことを示唆する。これらのデータは、体細胞核におけるように、ＡＫＡＰ９５が、ウシの単為生殖前核よりも核移植前核における細胞内構造物に、より強く結合することを示す。この関連がＤＮＡ組織化に制約を課するのか又は核移植胚における変化したゲノム組織化に起因するのかは、まだ決定されていない。ＤＮＡｓｅＩ抵抗性ＤＮＡは転写がサイレントなので、核移植後のＡＫＡＰ９５固定の不完全な再構築が、発育上重要な遺伝子の発現を妨害するようである。
【０３７２】
核移植ウシ胚におけるラミンＡ／Ｃの転写誤調節
著しい観察結果は、ラミンＡ／Ｃがウシ核移植胚における前核の周囲腔で再び生成されるが、この体細胞特異的マーカーが体外受精前核及び単為生殖前核に存在しないことであった。従って、本発明者は、ラミンＡ／Ｃの再生成（reassembly）が、（ｉ）成熟前のクロマチン凝縮期に分解（disassembled）された体細胞ラミンの再ターゲティング（図３０）、（ｉｉ）母性ラミンＡ／Ｃ  ｍＲＮＡのプールからのラミンの翻訳及び再生成、又は（ｉｉｉ）核移植前核の体細胞ラミンＡ（ＬＭＮＡ）遺伝子の新規転写、に起因するかどうかを調査した。
【０３７３】
これらの可能性を区別するために、本明細書に記載した「典型的な」核移植手法によるか、核移植に続いて再構成胚をタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）で活性化することによるか、又は核移植に続いてＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）阻害剤アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在下で活性化して新規転写を阻害することによるか、のいずれかでウシ核移植胚を作製した。ウシ核移植胚をシクロヘキシミド中で培養するために、卵母細胞をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）中で１４時間インキュベートした以外は、上記のように核移植した後、卵母細胞を活性化した。活性化後１４時間に、卵母細胞を５回洗浄し、１５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＭ培地に１時間入れた。インキュベーションの後、前核の発育をエピ蛍光顕微鏡により観察した。次いで、前核胚をＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、スライドに載せた。ウシ核移植卵母細胞をアクチノマイシンＤ中で培養するために、シクロヘキシミドインキュベーションステップに５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）を加えた以外は、上記のように核移植した後、卵母細胞を活性化した。５時間後、卵を５回洗浄し、５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを含むＡＣＭ培地に入れた。活性化後１４時間に、卵を５回洗浄し、１５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＭ培地に１時間入れた。インキュベーションの後、前核の発育をエピ蛍光顕微鏡により観察した。前核期胚をＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、スライドに載せた。
【０３７４】
核移植前核の周囲でのラミンＢの生成は、タンパク質又はＲＮＡ合成阻害剤のいずれによっても影響されなかった。この結果は、ラミンＢが、前に分解した体細胞プール及び／又は卵母細胞形質中のラミンＢの大きなプールいずれかから再生成されたことを示す。核移植前核において検出されたラミンＡ／Ｃ（図３０）は、シクロヘキシミドで活性化した後に再形成された核には存在しなかった。この結果は、ラミンＡ／Ｃの生成には新規タンパク質合成を必要とすること、及び、ドナー核注入又は細胞融合により卵母細胞にもたらされた分解した体細胞プールから再び標的化されないことを示す。さらに、ラミンＡ／Ｃは、胚がアクチノマイシンＤの存在下に活性化される場合には再生成されない。この結果は、核移植前核におけるラミンＡ／Ｃの再生成が、再構成された前核におけるＬＭＮＡの新規転写に起因することを示す。核移植前核において検出されたＮｕＭＡは、シクロヘキシミドで活性化された核移植胚の前核では再生成されないが、アクチノマイシンＤで処理した核移植胚の前核において僅かに検出される。この知見は、核移植前核におけるＮｕＭＡの再生成が、少なくとも部分的に、母性ＮｕＭＡ  ｍＲＮＡのプールから生じる新規翻訳を必要とすることを強く示唆する。抗ＮｕＭＡ標識が、対照の未処理核移植胚と比較して、アクチノマイシンＤで処理した核移植胚の前核では弱いという一貫した観察結果（図３２のｂ’とｂ’’’との比較）は、核移植前核におけるＮｕＭＡの生成の一部が、前核期におけるＮｕＭＡ遺伝子の新規転写に起因することを示唆する。
【０３７５】
まとめると、これらの結果は、ＬＭＮＡ遺伝子が、核移植後の核の再構築時に発現停止（turn off）されないことを示す。同様に、ＮｕＭＡ遺伝子は、前核核移植胚において明らかに活性のままである。これらの遺伝子の一過性の不活化は、クロマチンの高度に凝縮した性質から予期されるように、成熟前のクロマチン凝縮中に行われるようである（図３０）。これらの結果は、本明細書に記載した条件下で産生された核移植胚における不完全な核再プログラムを説明する。ＡＫＡＰ９５について前に論じたように、核移植前核におけるラミンＡ／Ｃの抵抗性が、遺伝子発現、例えば発育上重要な遺伝子の発現に影響を与えることを提案する。以前に報告された、ラミンＡ及びＣと染色タンパク質及びＤＮＡとの相互作用、並びにこれらのラミンと転写因子との関連も、この仮説を支持する。
【実施例９】
【０３７６】
典型的なウシ核移植胚における核再プログラム欠陥の例
また、天然の胚と典型的な核移植胚の相違をの例をいかに記載する。これらの相違には、分化した細胞特異的Ａ型核ラミンの前核の生成の相違、前核ＮｕＭＡ及びＴＡＴＡ結合タンパク質濃度の上昇、並びに界面活性剤、ＤＮＡｓｅ及び塩による抽出に対する核マトリックス−クロマチン境界成分ＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの感受性の増大が含まれる。
【０３７７】
これらの研究のために、ウシ胎仔線維芽細胞の細胞系を以前に記載されたように確立した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７６−１１７８，２００１及びＫａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。Ｇ１期線維芽細胞の倍加物を、以前に記載されたシェイクオフ（振り払い）法（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７６−１１７８，２００１）を用いて、培養物から単離した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を、以前に記載されたように行った（Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３４：２２４−２３１，１９９３）。核移植（ＮＴ）及び卵母細胞の活性化のために、Ｇ１期ドナー細胞を用いる核移植を、成熟後約２０時間（ｈｐｍ）に、以前に記載されたように行った（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７６−１１７８，２００１及びＫａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。再構成された胚を、２８〜３０ｈｐｍ（Ｔ＝０）で、５μＭのカルシウムイオノフォアで４分間、続いて１０μｇ／ｍｌのＣＨＸ及び２．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＤで５時間活性化した。胚を洗浄し、マウス胎児線維芽細胞と共培養した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。再構成された胚をＣＨＸ中で培養した場合には、卵母細胞を上記のように活性化し、２．５μｇ／ｍｌのＣＨＸと共にさらに９時間（ＣＨＸ中で合計１４時間）培養した。胚を十分に洗浄し、上記のように培養した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。再構成された胚をＡｃｔＤに曝露した場合には、５時間のＣＨＸインキュベーションステップに５μｇ／ｍｌのＡｃｔＤを添加した以外は、上記のように卵母細胞を活性化した。
【０３７８】
免疫学的分析のために、細胞、卵母細胞、胚、核（実施例１４）及びクロマチン塊（実施例１４）をポリ−Ｌ−リジン被覆カバースリップ上に存在させ、３％パラホルムアルデヒドで１５分固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間透過性化した。タンパク質を、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ２０を用いてブロッキングした。一次及び二次抗体（１：１００希釈物）を、それぞれ３０分間インキュベートした。特に、ヒトラミンＢのペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を用いた（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２２：２９５−３０６，１９９３）。また、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のヤギ抗ラミンＢポリクローナル抗体、抗ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体及び抗ＴＢＰ抗体を用いた。抗ＮｕＭＡモノクローナル抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のもの、抗ラットＡＫＡＰ９５アフィニティ精製ポリクローナル抗体はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のものであった。ＤＮＡを０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で対比染色した。ＪＶＣ  ＣＣＤカメラで写真を撮影し、ＡｎａｌｙｓＳＩＳソフトウェアを用いて免疫蛍光強度の定量を行った。データは、少なくとも３回反復試験における対照に対する平均±ＳＤ蛍光強度として表した。ｉｎ  ｓｉｔｕ抽出のために、カバースリップ上に配置した胚及び細胞を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）中、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ及び３００ｍＭのＮａＣｌと共に１５分間インキュベートした後、免疫蛍光分析を行った。免疫ブロッティングのために、１００個の胚を２０μｌのＳＤＳサンプル緩衝液に溶解し、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、以下の抗体、すなわち抗ラミンＢ（１：１０００）、抗ラミンＡ／Ｃ（１：２５０）、抗ＮｕＭＡ（１：２５０）、抗ＡＫＡＰ９５（１：２５０）で分析した。
【０３７９】
上記の免疫学的分析に基づいて、Ａ／Ｃ型及びＢ型ラミン、ＮｕＭＡ並びにＡＫＡＰ９５の分布を、ＮＴのために普通に用いられるウシ胎仔線維芽細胞で特性決定した（図４０）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製したウシの移植前胚において、ラミンＢは、前核（ＰＮ）期ほどにも早く核周囲で検出された（図４０）。ラミンＡ／Ｃは、分化細胞のマーカーから予想されたように、存在しなかった。ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５は、前核期で雌性前核に限定されたが、全ての核は後続する期では検出されなかった。免疫蛍光データの特異性は免疫ブロットにおいて確認した（図４０）。
【０３８０】
ラミンＡ／Ｃ、及びＢ、ＮｕＭＡ並びにＡＫＡＰ９５の動態を、ウシ線維芽細胞の脱核卵母細胞への移植に関連する形態学的核再構成中に試験した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。ドナー核は、融合の３時間以内に成熟前クロマチン凝縮（ＰＣＣ）受けた（図４１Ａ）。核ラミン及びＮｕＭＡは、卵母細胞の細胞質中に再分散され、ＰＣＣ染色体では存在しなかった（図４１Ａ）。ＡＫＡＰ９５は、有糸分裂細胞の特性記憶であるＰＣＣ染色体と関連した。レシピエント卵母細胞の活性化処理の開始の１４時間後に、ＮＴ胚は完全に発育した前核を示した（図４１Ａ、ＮＴ  ＰＮ）。しかしながら、単為生殖又は受精胚とは対照的に、本質的に全てのＮＴ前核は、ドナー体細胞の２つの特徴である強いラミンＡ／Ｃ及びＮｕＭＡ免疫反応性を発現した（図４１Ａ）。
【０３８１】
１０μｇ／ｍｌのタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）又は５μｇ／ｍｌのＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）ＩＩ阻害剤アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）（両者は前核形成に適合する）の存在下のレシピエント卵母細胞活性化は、前核ラミンＡ／Ｃの生成を阻害した（図４１Ｂ及び４１Ｃ）。この結果は、これらの体細胞ラミンの生成が、体細胞ラミンＡ（ＬＭＮＡ）遺伝子の転写に起因することを示した。ラミンＢの生成は、ＣＨＸ又はＡｃｔＤにより撹乱されず、それは、Ｂ型ラミンの分解された体細胞プール及び／又は母性プールから再びターゲットされなかったことを示す（図４１Ｂ及び４１Ｃ）。ＣＨＸ曝露後には、ＮｕＭＡは本質的に検出されなかった。しかしながら、ＮＴ前核における４０％のＮｕＭＡ免疫反応性は、ＡｃｔＤ処理後に検出された（図４１Ｂ及び４１Ｃ）。この結果は、ＮｕＭＡの生成が、母性ｍＲＮＡからの翻訳及び新規転写の結果として生成（assemble）することを示唆する。ラミンＡ／Ｃ及びＮｕＭＡはＮＴ前核において異常に転写されるので、これらのタンパク質を、核移植方法の能力を測定するためのマーカーとして用いて、ドナー遺伝物質を再プログラムすることができる。
【０３８２】
実施例８に記載のように、核マトリックス−クロマチン境界の構造多価タンパク質（Ｃｏｌｌａｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１１６７−１１８０，１９９９）であり、かつ過少アセチル化クロマチン中に多量に存在するＡＫＡＰ９５の核内固定特性を、ドナー遺伝物質の再プログラムのためのマーカーとして用いることもできる。ＡＫＡＰ９５は調査した唯一のマーカーであり、これは、ＰＣＣ染色体上の体細胞ドナー核及びＮＴ前核において単為生殖配胚（図４１Ａ）及びＰＮ胚（図４０Ｂ）の前核と同様の標識強度で検出された。ＮＴ前核におけるＡＫＡＰ９５の会合は、タンパク質又はＲＮＡ合成の阻害により維持される。従って、ＮＴ胚中のＰＮ  ＡＫＡＰ９５の大部分は、体細胞起源のものである。ＡＫＡＰ９５の固定を、ＮＴ胚、単為生殖胚及びドナー線維芽細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ及び３００ｍＭのＮａＣｌで抽出することにより試験した。単為生殖胚において、約９０％のＡＫＡＰ９５及びＤＮＡが抽出された。しかしながら、ＮＴ前核においては３５％のＡＫＡＰ９５が抽出されなかった（図４１Ｄ）。ＤＮＡｓｅＩ及びＮａＣｌに対するＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの感受性は、線維芽細胞核の感受性と類似していた（図４１Ｄ）。ラミンＢはこれらの条件下では抽出されず、ＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの抽出可能性の相違が核構成の全体的変化に起因しなかったことを示した。これらの結果は、ＮＴ前核がＡＫＡＰ９５の強い固定及びＤＮＡｓｅＩへの限定されたＤＮＡ接近可能性を特徴とすることを意味する。従って、体細胞ＮＴにより生成された前核は、ドナー核の不完全な形態学的再構築及び／又は体細胞遺伝子の転写誤調節の結果として、構造異常を示すようである。
【実施例１０】
【０３８３】
典型的なウシ核移植胚における核再プログラム欠陥の例
実施例９に記載のように、核移植（ＮＴ）胚における発現パターンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成（ＩＶＰ）移植前胚におけるものと比較した。この比較のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を行い、胚を以前に記載されたように培養した（Ｃｏｌｌａｓら，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３４：２２４−２３１，１９９３及びＫａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。ＮＴを、ドナーウシ胎仔線維芽細胞を脱核卵母細胞に融合させることにより行った（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７６−１１７８，２００１及びＫａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。レシピエント卵母細胞を、成熟後２８〜３０時間（ｈｐｍ）に、５μＭのカルシウムイオノフォアで４分間、続いて１０μｇ／ｍｌのＣＨＸ及び２．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＤで５時間活性化し、洗浄した。胚をマウス胎児線維芽細胞と共培養した（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６４：１４８７−１４９３，２００１）。ＣＨＸ処理のために、卵母細胞を上記のように活性化し、培養前に胚を２．５μｇ／ｍｌのＣＨＸと共にさらに９時間培養した。ＡｃｔＤ処理のために、培養前に５μｇ／ｍｌのＡｃｔＤを５時間のＣＨＸインキュベーションステップに添加し、胚を５μｇ／ｍｌＡｃｔＤ中でさらに９時間維持した以外は、卵母細胞を上記のように活性化した。ＮＴ胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞期まで培養し、レシピエント雌当り２つの胚を移植した。妊娠を超音波検査法によりモニターし、Ｃセクションを行った。仔ウシを出産の２４時間以内に獣医により評価した。
【０３８４】
ＮＴ及びＩＶＰ胚におけるタンパク質レベルを分析するために、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製の抗ラミンＢポリクローナル抗体、抗ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体、及び抗ＴＢＰポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた。抗ＡＫＡＰ９５抗体はＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のものであった。免疫蛍光分析を、記載されたように行った（Ｂｏｍａｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１５：２９３１−２９４０，２００２）。簡単に説明すると、細胞及び胚を、ポリ−Ｌ−リジン被覆ガラスカバースリップ上に配置し、３％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で１５分間透過性化し、タンパク質をＰＢＳ／２％ＢＳＡ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１５分間ブロッキングした。サンプルを一次及び二次抗体（１：１００希釈物）と共にそれぞれ３０分間インキュベートした。ＤＮＡを０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で対比染色した。ＪＶＣ  ＣＣＤカメラで写真を撮影し、ＡｎａｌｙＳＩＳソフトウェアを用いて免疫蛍光強度の定量を行った。指示されたときに、サンプルを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）中の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ及び３００ｍＭのＮａＣｌのカクテルを用いてカバースリップ上で１５分間抽出した後、免疫蛍光分析を行った。免疫ブロッティングのために、タンパク質サンプル（３０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ニトロセルロース上にブロットし、指示された抗体で検出した。
【０３８５】
核移植胚中のドナー核の動態
ウシ核移植（ＮＴ）中に体細胞の核の動態を調査するために、遍在的に発現されるＢ型ラミン（ラミンＢと呼ばれる）及び分化細胞特異的Ａ型ラミン（ラミンＡ／Ｃ）の核膜の２つの構造成分の分布を試験した（Ｇｒｕｅｎｂａｕｍら，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２９：３１３−３２３，２０００）。核ラミンは核膜をクロマチンに固定し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの（前）核再構成後に核膨張を促進することが示唆されている。また、Ｂ型ラミンの生成ができないと細胞死をもたらすので、ラミンは細胞生存にとって不可欠であることが示されている。転写装置のマーカーとして、実際上全ての遺伝子のための転写因子であるＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の動態を分析した。ウシ胎仔線維芽細胞及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成（ＩＶＰ）移植前胚における、ラミンＢの核周囲分布及びＤＮＡと共にＴＢＰの共局在化（colocalization）は、他の種における観察結果と一致した（Ｈｏｙら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８：４６４−４７８，１９９５；Ｈｏｕｌｉｓｔｏｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０２：２７１−２７８，１９８８；及びＷｏｒｒａｄら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：２３４７−２３５７，１９９４）（図４６Ａ）。ラミンＡ／Ｃは、分化した細胞のマーカーから予期されたように、移植前の発育中には検出されなかった（図４６Ａ）。免疫蛍光標識の特異性を免疫ブロット上で検証した（図４６Ｂ）。
【０３８６】
線維芽細胞の核を脱核卵母細胞に移植した後、ラミンＡ／Ｃ及びＢの両者は、成熟前に凝縮した染色体（ＰＣＣ、注入後３時間）から分解しなかったが、ＴＢＰは染色体に会合したままであった（図４６Ｃ、ＰＣＣ）。レシピエント卵母細胞の活性化の開始の１４時間後に、全てのＮＴ胚は核周囲ラミンＢ標識を有する完全に発育した前核を含み、ＴＢＰはＤＮＡと共に局在化した（図１Ｃ、ＮＴ−ＰＮ）。しかしながら、ＩＶＰ胚とは対照的に、９５〜９９％のＮＴ胚は前核期ほどにも早くラミンＡ／Ｃ発現を示し（図４６Ｃ）、発現は早期発育中に持続した（下記参照）。ＮＴ及びＩＶＰ胚の前核中の免疫標識したラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ及びＴＢＰの相対量を、二次抗体の蛍光強度とＤＮＡの蛍光強度（ヘキスト３３３４２）との比を測定して、試験した核中のＤＮＡ含有量（一倍体：二倍体）を計算することにより定量した。ラミンＢの相対量はＮＴ及びＩＶＰ胚の前核において類似したが、ラミンＡ／Ｃ及びＴＢＰの相対量は、ＩＶＰ胚中の雄性前核（ＭＰＮ）又は雌性前核（ＦＰＮ）よりもＮＴ前核において高かった（図４６Ｄ）。
【０３８７】
ＮＴ胚の前核中のＴＢＰ、ＤＮＡ及びＡ型ラミン
ＮＴ前核におけるＴＢＰのより高い含有量は、界面活性剤（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ヌクレアーゼ（１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ）及び塩（０．３ＭのＮａＣｌ）の組み合わせによるｉｎ  ｓｉｔｕ抽出に対して、より大きな抵抗性と関連した。抽出された胚における免疫蛍光標識強度を未抽出対照のものに対して定量すると、約３５％のＴＢＰが、ＩＶＰ胚の雄性（ＮＰＮ）又は雌性（ＦＰＮ）前核においては抽出されないままであった（図４７Ａ）。しかしながら、ＮＴ前核のＴＢＰは、線維芽細胞核におけるように抽出に対して強い抵抗性を示した（図４７Ａ）。同様に、ＮＴ前核のＤＮＡは、ＩＶＰ胚の前核と比較して、これらの条件下における抽出に対して４．５倍増大した抵抗性を示し（図４７Ａ、ＤＮＡ）、より緊密なクロマチンの構成を示唆した。
【０３８８】
ＮＴ胚の前核中のラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ及びＴＢＰの起源を判定するために、レシピエント卵母細胞を本明細書に記載したように、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）ＩＩ阻害剤であるアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ；５μｇ／ｍｌ）の存在下に、又はタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ；１０μｇ／ｍｌ）を用いて活性化した（Ｋｎｏｔｔら，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６６：１０９５−１１０３、２００２）。ラミンＡ／Ｃ、ラミンＢ及びＴＢＰの生成は、免疫蛍光標識した前核胚のデンシトメトリー分析により判定した。両方の阻害剤は前核ラミンＡ／Ｃの生成を阻害し（図４７Ｂ及び４８Ｃ）、ＮＴ胚中のこれらの体細胞ラミンの生成が、前核期におけるラミンＡ遺伝子の転写に起因したことを示唆した。ラミンＢの生成はＣＨＸ又はＡｃｔＤ処理により撹乱されず（図４７Ｂ及び４７Ｃ）、ラミンＢが、ＮＴ後の卵母細胞細胞質に可溶化した体細胞ラミン及び／又はラミンの母性プールから生成されたことを示唆した。ＴＢＰの類似した量は、未処理胚において、又はＲＮＡ若しくはタンパク質合成を阻害した後に検出された（図４７Ｂ及び４７Ｃ）。ＴＢＰはＰＣＣ中の凝縮した染色体に会合するので、また、間期ＩＩ卵母細胞細胞質は検出可能なＴＢＰを欠くので、体細胞起源のＴＢＰは、おそらく、ＮＴ過程でのドナーゲノムと会合したままである。従って、Ａ型ラミンの発現に加えて、ＮＴ胚の前核は、より多量のＴＢＰ及び向上したＴＢＰの核内固定を示す。
【実施例１１】
【０３８９】
哺乳動物をクローン化するための再プログラム化ドナークロマチン塊の使用
実施例８〜１０において実証した典型的な核移植胚における不完全な再プログラム化の問題を克服するために、ドナークロマチンを核移植の前により効率的に再プログラム化するための新しい方法を開発した（２００１年１２月２１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０１／５０４０６号）。これらの方法は、核膜（nuclear envelope）溶解及び場合によりクロマチン凝縮を生じる再プログラム培地（例えば、細胞抽出物）中で、ドナー細胞に由来する核（例えば、異種抗体をコードする核）をインキュベートすることを含む。この核膜崩壊及びクロマチン凝縮により、染色体に結合していた転写調節タンパク質が放出される（さもなければ、卵母細胞、胚、又は胎仔発育に望ましくない遺伝子の転写が促進される）。さらに、再プログラム培地に由来する調節タンパク質は、クロマチン塊に結合して、発育に望ましい遺伝子の転写を促進し得る。
【０３９０】
プリオン遺伝子に突然変異を有し、また任意により異種Ｉｇ遺伝子を発現してもよい有蹄動物を作製するために、ドナー核又はクロマチン塊は、プリオン遺伝子の１以上のアレルの突然変異により、また任意により異種抗体をコードする１以上の核酸を挿入することにより、再プログラム化の前、途中又は後で改変され得る。所望であれば、クローン化胎仔又はクローン化子孫に由来する細胞を、第２ラウンドの核移植に使用して、追加のクローン化子孫を作製し得る。また、最初のクローン化胎仔又はクローン化子孫に由来する細胞を冷凍して、追加のクローン化有蹄動物の作製のためにドナー細胞の供与源として使用される細胞系統を形成してもよい。
【０３９１】
クローン化に使用されるドナー核のバルク調製
数百万もの数の核が、培養中の同調又は非同調細胞集団から単離され得る。細胞集団は、自然に又は化学的に同調され得る。集団中の少なくとも４０、６０、８０、９０又は１００％の細胞がＧ０又はＧ１期で停止（arrest）することが好ましい。これを達成するために、細胞を、例えば、低い血清（５％、２％又は０％血清等）中で、１、２又は３日間以上インキュベートして、Ｇ０期にある細胞の割合（％）を上げてもよい。Ｇ１にある細胞を同調させるために、細胞をコンフルエント状態まで付着細胞として増殖させて、その後０．５〜１μｇ／ｍｌノコダゾール（nocodazole）（Sigma Chemicals, St. Louis, MO）中で、１７〜２０時間、先に記載されているように（例えば、Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999及び該文献中の参考文献を参照）インキュベートしてもよい。片手でフラスコを繰返し叩くことにより、付着細胞が入ったフラスコを強く振とうし、有糸分裂期細胞とＧ１期二倍体（doublet）との離脱を生じさせる。Ｇ１期二倍体とは、分裂プロセスの終了時でも薄い橋により接続したままの対の伸長（elongated）細胞である。離脱Ｇ１期二倍体は、この特徴的な二倍体構造に基づいて、培地から単離され得る。Ｇ１期二倍体は、単離後、付着したままでも、又は２つの別個の細胞に分裂してもよい。
【０３９２】
同調又は非同調細胞を、標準的手順を使用してリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）中で回収し、数回の洗浄ステップを実行して、元の培地から低張緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭダイズトリプシン阻害剤、及び１００μＭ  ＰＭＳＦ）に移す。例えば、細胞は、５０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、５００×ｇ、４℃にて１０分間の遠心分離によりペレット化し得る。ＰＢＳ上清をデキャンタし、ペレット化細胞を５０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、上述したように遠心分離する。この遠心分離の後、ペレット化細胞を２０〜５０容量の氷冷低張緩衝液中に再懸濁し、５００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離する。上清を再度捨て、約２０容量の低張緩衝液を細胞ペレットに添加する。細胞を、この緩衝液に注意深く再懸濁し、氷上で少なくとも１時間インキュベートし、細胞を徐々に膨張させる。
【０３９３】
細胞から核を単離させるために、標準的手順を使用して細胞を溶解させる。例えば、２〜５ｍｌの細胞懸濁液をガラスホモジナイザーに移し、ぴったりと合う乳棒を最初に１０〜２０ストローク使用して加圧（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイズしてもよい。あるいはまた、電動式ミキサー（例えば、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）を使用して、細胞懸濁液をホモジナイズする。所望であれば、位相差顕微鏡を４０倍拡大で使用して細胞溶解をモニターしてもよい。このホモジナイネーションの間、核は無傷のまま、かつ元々付着していた細胞質成分（小胞、細胞小器官及びタンパク質等）のほとんど又は好ましくは全てが核から放出されるべきである。必要であれば、１〜２０μｇ／ｍｌの細胞骨格阻害剤（サイトカラシンＢ又はサイトカラシンＤ）を、上記低張緩衝液に添加してこのプロセスを手助けしてもよい。ホモジナイゼーションは、細胞を溶解し、細胞質成分を核から放出するのに必要なだけ続ける。細胞型によっては、１００、１５０以上の回数ものストロークが必要となりうる。次いで、溶解物を、氷上の１５ｍｌ円錐管に移し、膨張細胞の懸濁液の残りで細胞溶解手順を繰り返す。低張緩衝液中で作った２Ｍストック溶液から得たショ糖を、細胞溶解物に添加し（例えば、１／８容量の２Ｍストック溶液を溶解物に添加し）、最終濃度が２５０ｍＭのショ糖を生じさせる。この溶液を倒置させて混合し、スイングアウトローター中で４００×ｇ、４℃にて、１０〜４０分間の遠心分離により核をペレット化する。次いで、上清を捨て、ペレット化核を、１０〜２０容量の核緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭショ糖、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭダイズトリプシン阻害剤、及び１００μＭＰＭＳＦ）に再懸濁させる。上記記載したように、１〜２容量の核緩衝液中で核を沈殿及び再懸濁させる。新しく単離した核は、以下に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏ再プログラム化及び核移植のために即使用されるか、又はその後使用するために保存され得る。保存のためには、核を、核緩衝液中に約１０６／ｍｌの濃度まで希釈させる。グリセロール（２．４容量の１００％グリセロール）を添加し、緩やかにピペッティングしてよく混ぜる。懸濁液を、氷上の１．５ｍｌ管中１００〜５００μｌ容量に等分し、メタノール−ドライアイス浴中ですぐに冷凍し、−８０℃にて保存する。使用前に、核のアリコートを氷上又は室温にて解凍させる。１容量の氷冷核緩衝液を添加し、スイングアウトローター中で溶液を１，０００×ｇにて１５分間遠心分離させる。ペレット化核を１００〜５００μｌ核緩衝液中に再懸濁し、上述したように遠心分離する。その後、ペレット化核を最小容量の核緩衝液中に再懸濁させ、使用時まで氷上で保存する。
【０３９４】
ドナー遺伝物質の再プログラム化において使用する有糸分裂期抽出物又は培地の調製
有糸分裂期抽出物を調製するために、体細胞系（例えば、線維芽細胞）を、０．５〜１μｇ／ｍｌノコダゾール中での１７〜２０時間のインキュベーションにより有糸分裂期に同調させ（例えば、Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999、及び該文献中の参考文献を参照）、上述したように激しく振とうすることで有糸分裂期細胞を離脱させる。離脱したＧ１期二倍体は、捨てられるか、又は離脱細胞の主要部分（典型的には、少なくとも８０％）を構成する有糸分裂期細胞と共に残されてもよい。回収した離脱細胞を、１０ｍｌ円錐管において５００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離する。いくつかの細胞ペレットをプールし、合計容量５０ｍｌの冷却ＰＢＳ中に再懸濁させ、５００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離させる。このＰＢＳ洗浄ステップを繰り返す。細胞ペレットを、約２０容量の氷冷細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭダイズトリプシン阻害剤、１００μＭ  ＰＭＳＦ、及び任意に２０μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ）中に再懸濁し、８００×ｇで、４℃にて１０分間の遠心分離により細胞を沈殿させる。上清を捨て、わずか１容量の細胞溶解緩衝液中で細胞ペレットを注意深く再懸濁させる。細胞を、氷上で１時間インキュベートさせて、細胞を膨張させる。細胞を、チップ超音波機を使用した超音波処理、又はガラス乳鉢及び乳棒を使用した加圧ホモジナイゼーションのいずれかにより溶解させる。細胞溶解は、少なくとも９０％の細胞及び核が溶解されるまで実施し、これは位相差顕微鏡を使用して評価され得る。少なくとも９０％の細胞及び核を溶解させるために必要な超音波時間は、抽出物を調製するのに使用する細胞型に応じて異なり得る。
【０３９５】
細胞溶解物を１．５ｍｌ遠心分離管に入れ、卓上遠心分離機を使用し、１０，０００〜１５，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離する。管を遠心分離機から取り出し、すぐに氷上に置く。２００μｌピペットチップを使用して上清を注意深く回収し、いくつかの管から得た上清をプールし、氷上に置く。この上清は「有糸分裂期細胞質」又は「ＭＳ１５」抽出物である。この細胞抽出物は、クロマチン塊を生成するために通常の方法又はミクロ法（micromethod）のいずれを使用するかに応じて、氷上の管ごとに５０μｌ又は１０μｌ容量の抽出物に等分され得る。抽出物は、液体窒素上ですぐに瞬間冷凍され、使用時まで−８０℃で保存される。あるいはまた、細胞抽出物を、（例えば、ＳＷ５５  Ｔｉローター；Ｂｅｃｋｍａｎに適合した）氷上の超遠心分離管に入れる。必要であれば、管の上まで鉱油を重ねる。抽出物を、２００，０００×ｇで４℃にて３時間遠心分離して、ＭＳ１５抽出物に含まれる膜小胞を沈殿させる。遠心分離の終了後、油を捨てる。上清を注意深く回収し、必要に応じてプールし、氷上の冷却１．５ｍｌ管に入れる。この上清を「ＭＳ２００」又は「有糸分裂期細胞質内」抽出物と称する。ＭＳ１５抽出物について記載したように、抽出物を等分及び冷凍する。
【０３９６】
所望であれば、追加の核因子で抽出物を富化してもよい。例えば、核は、再プログラム化抽出物を誘導する細胞型の細胞か、又は任意のその他の細胞型の細胞から精製されて、上述したように超音波処理により溶解され得る。核因子は、攪拌されている０．１５〜８００ｍＭの濃度のＮａＣｌ又はＫＣｌを含む核緩衝液中での１０〜６０分間のインキュベーションにより抽出する。溶解物を遠心分離して、抽出不可能な成分を沈殿させる。目的の抽出因子を含む上清を透析して、ＮａＣｌ又はＫＣｌを除去する。透析した核抽出物を等分し、冷凍保存する。この核抽出物を様々な濃度で、再プログラム化のために核を添加する前に上述した全細胞抽出物に添加する。
【０３９７】
有糸分裂期抽出物は、卵母細胞又は雄性生殖細胞等の生殖細胞からも調製され得る。例えば、自然に中期ＩＩ段階で止まった中期ＩＩ卵母細胞を、上述したように回収し、洗浄し、溶解して卵母細胞抽出物を生成する。雄性生殖細胞抽出物を調製するためには、食肉処理場から得た精巣を細分化し、回収した細胞をショ糖又はパーコール勾配上で分画遠心分離することにより、該器官から生殖細胞を単離する。生殖細胞を、体細胞（ライディヒ及びセルトリ細胞）から分離し、懸濁により洗浄し、ＰＢＳ中で沈殿させる。その後、細胞を、上述したように氷冷細胞溶解緩衝液中で一度洗浄し、超音波処理により溶解する。溶解物を、１５，０００×ｇで４℃にて１５分間の遠心分離により除去し、上清（すなわち、生殖細胞抽出物）を等分し、液体窒素中で瞬間冷凍させる。
【０３９８】
細胞抽出物の代替物として、１つ以上の天然型又は組換え因子（例えば、核酸、又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチン再構築タンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン、若しくは他のホルモン等のタンパク質）を、緩衝液等の溶液に添加することによっても、再プログラム培地は形成され得る。１つ以上の因子は、卵母細胞又は幹細胞に特異的であることが好ましい。
【０３９９】
凝縮クロマチン塊の形成
ＭＳ１５若しくはＭＳ２０００抽出物又は有糸分裂培地のアリコートを、氷上で解凍させる。ＡＴＰ生成系（０．６μｌ）を、２０μｌの抽出物又は培地に添加し、攪拌により混合する。ＡＴＰ生成系の調製のために、等量の１００ｍＭ  ＡＴＰストック、１Ｍクレアチンリン酸、及びＨ２Ｏ中で作製した２．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼストック溶液（１００×）を混合し、使用時まで氷上で保存する。ＡＴＰ生成系を抽出物に添加した後、最終濃度は、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭクレアチンリン酸、及び２５μｌ／ｍｌクレアチンキナーゼである。
【０４００】
抽出物又は培地に、核懸濁液を、１０μｌの抽出物又は培地当たり１μｌ核の濃度で添加し、ピペッティングによりよく混合し、３０、３３、３５、３７又は３９℃の水浴中でインキュベートする。混合液を含む管を規則的な間隔で優しく叩いて、染色体が管の底で凝集するのを防ぐ。核膜崩壊及び染色体凝縮を、規則的に（１５分毎等）、顕微鏡下でモニターする。核膜が崩壊し、染色体が凝縮し始めたら、抽出物又は培地からクロマチン塊を回収するための手順を開始する。
【０４０１】
あるいはまた、凝縮していないか又は部分的にしか凝縮していないクロマチン塊は、抗体を単離核に予め挿入（pre-loading）した後に、核マトリックスタンパク質ＮｕＭａに対して上記手順を実施することにより形成され得る（Steenら, J. Cell Biol. 149, 531-536, 2000）。この手順により、ドナー核を囲む核膜の溶解によってクロマチンから核成分が除去される。しかし、抗ＮｕＭＡ抗体の添加により凝縮ステップは阻害される。染色体凝縮を防止することにより、染色体が有糸分裂期抽出物中でインキュベートされている間の染色体破壊又は損失の危険性が低下し得る。
【０４０２】
この手順のために、精製細胞核（２，０００核／μｌ）を、０．７５μｇ／ｍｌリソレシチンを含む５００μｌ核緩衝液中で室温にて１５分間透過性にする。余分なリソレシチンは、核緩衝液中で調製した１ｍｌの３％ＢＳＡを添加し、氷上で５分間インキュベートすることによりクエンチする。次いで、核を、沈殿させ、核緩衝液中で１回洗浄する。核を、抗ＮｕＭＡ抗体を含む１００μｌ核緩衝液（１：４０希釈；Transduction Laboratories）中で、２，０００核／μｌで再懸濁させる。氷上で緩やかに攪拌しながら１時間インキュベーションした後、１Ｍショ糖を用いて５００×ｇで２０分間、核を沈殿させる。次いで、核を核緩衝液中に再懸濁させ、上記節に記載したＡＴＰ再生系を含む有糸分裂期抽出物又は培地に添加する。任意に、抗ＮｕＭａ抗体を抽出物又は培地に添加して、染色体凝縮をさらに防止する。
【０４０３】
凝縮されていないか、又は部分的にしか凝縮されていないクロマチン塊は、界面活性剤又はプロテインキナーゼに暴露することによっても形成され得る。界面活性剤を使用して、核中の染色体に結合していないか又は緩く結合している核成分を可溶化し、核膜を除去し得る。この手順のために、精製細胞核（２，０００〜１０，０００核／μｌ）を、０．１％〜０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はＮＰ−４０等の界面活性剤を添加した核緩衝液中でインキュベートする。核膜を除去し易くするために、ＮａＣｌ等の追加の塩を、約０．１、０．１５、０．２５、０．５、０．７５又は１Ｍの濃度で緩衝液に添加してもよい。緩やかに振とうさせながらの氷上での３０〜６０分間のインキュベーションの後、スイングアウトローター中、１，０００×ｇで、合計容量に応じて１０〜３０分間の遠心分離により核を沈殿させる。ペレット化核を、０．５〜１ｍｌ核核酸中に再懸濁させ、上述したように沈殿させる。この洗浄手順を２回繰り返して、界面活性剤及び余剰塩を確実に完全に除去する。
【０４０４】
あるいはまた、組換え又は天然型プロテインキナーゼを単独で又は併用して使用して、核膜を除去する。プロテインキナーゼは、標準的手順を使用して精製するか、又は商業的供給元から精製形態で得ることが好ましい。これらのキナーゼは、核膜、核マトリックス、又はクロマチンの成分をリン酸化し、核膜を除去してもよい（例えば、Collas及びCourvalin, Trends Cell Biol. 10:5-8, 2000を参照）。好ましいキナーゼとしては、サイクリン依存キナーゼ１（ＣＤＫ１）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＭＡＰキナーゼ、カルシウム／カルモジュリン依存キナーゼ（ＣａｍＫＩＩ）、及びＣＫ１カゼインキナーゼ、又はＣＫ２カゼインキナーゼが挙げられる。この方法のために、約２０，０００の精製核を、１．５ｍｌ遠心分離管に入った２０μｌのリン酸化緩衝液中で室温にてインキュベートする。ＣＤＫ１（Upstate Biotechnology）のための好ましいリン酸化緩衝液は、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２−７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、８０ｍＭ  β−グリセロリン酸、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１００μＭ  ＡＴＰ、及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む。ＰＫＣについては、好ましい緩衝液は、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２−７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００μＭ  ＣａＣｌ２、４０μｇ／ｍｌホスファチジルセリン、２０μＭジアシルグリセロール、１００μＭ  ＡＴＰ、及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む。ＰＫＣ及びＣＤＫ１の両方を同時に使用する場合、４０μｇ／ｍｌホスファチジルセリン及び２０μＭジアシルグリセロールを添加したＣＤＫ１リン酸化緩衝液を使用する。ＰＫＡのための好ましいリン酸化緩衝液は、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１００μＭ  ＡＴＰを含む。ＭＡＰキナーゼのためには、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１ｍＭ  ＤＴＴを補充したＰＫＡリン酸化緩衝液を使用してもよい。ＣａｍＫＩＩについては、１ｍＭ  ＤＴＴを添加したＰＫＡ緩衝液、又はUpstate Biotechnologyから得たＣａｍキナーゼアッセイキット（Venemaら, J. Biol. Chem 272: 28187-90, 1997）のいずれかを使用する。
【０４０５】
プロテインキナーゼを２５〜１００ｎｇの最終量まで添加することにより、リン酸化反応を開始する。反応液を室温にて最大１時間インキュベートする。核膜崩壊は、このインキュベーションの間、例えば１５分間隔で顕微鏡検査によりモニターしてもよい。核膜崩壊の後、上述したように核を３回洗浄して、界面活性液を除去する。
【０４０６】
クロマチン塊の回収
凝縮、部分的に凝縮、又は凝縮していないクロマチン塊を含む抽出物又は溶液を、核緩衝液中で作った等量の１Ｍショ糖溶液の存在下におく。クロマチン塊は、スイングアウトローター中、４℃にて１，０００×ｇで、サンプル容量に応じて１０〜３０分間の遠心分離により沈殿する。上清を捨て、ペレット化クロマチン塊を、０．１〜１．０ｍｌ核緩衝液又は脂肪融合（lipofusion）緩衝液（約ｐＨ７．０若しくはｐＨ７．５の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、又は約ｐＨ６．２の２０ｍＭ  ＭＥＳのいずれかに入った、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭダイズトリプシン阻害剤、及び１００μＭ  ＰＭＳＦ）中にピペッティングにより注意深く再懸濁させ、１，０００×ｇで１０〜３０分間遠心分離する。上清を捨て、ペレット化クロマチン塊を、核緩衝液又は脂肪融合緩衝液に再懸濁させ、使用時まで氷上で保存する。クロマチン塊をそれぞれ、微細操作皿に入った、油の下にある２０μｌ液滴のＨＥＰＥＳ緩衝化培地に移す。以下に記載するように、１つのクロマチン塊を各除核卵母細胞に挿入する。
【０４０７】
クロマチン塊を調製するためのミクロ法
ＡＴＰ生成系、界面活性剤及び／若しくは塩溶液を含むＭＳ１５若しくはＭＳ２００抽出物又は有糸分裂培地、あるいは上記プロテインキナーゼ溶液を、１０〜２０μｌ液滴でペトリ皿に入れる。その後、培養培地に入った５０μｌ液滴の単離Ｇ１期細胞二倍体又はＧ０期細胞、細胞溶解を促すために使用する０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００又はＮＰ−４０を含むＨＥＰＥＳ−又は重炭酸緩衝化培地の別個の５０μｌ「溶解」液滴、及び５０μｌ液滴の卵母細胞注入培地を添加する。これらの液滴はそれぞれ、ＣＯ２平衡鉱油で覆う。５０μｌ「洗浄液滴」の培養培地も、ペトリ皿に添加して、溶解細胞又は核を洗浄するために使用する。
【０４０８】
マイクロピペットを使用して、細胞を溶解液滴に移す。ピペットで緩やかに繰返し吸引することにより細胞膜を溶解させる。細胞が溶解したら、溶解物を洗浄液滴に丁寧に放出し、すぐに核を再吸引して界面活性剤を除去する。任意に、核は、有糸分裂期抽出物又は培地に添加する前に、透過性化し、抗ＮｕＭＡ抗体とインキュベートしてもよい。次いで、核を、ＭＳ１５、ＭＳ２００、培地、界面活性剤及び／若しくは塩溶液、又はプロテインキナーゼ溶液の液滴に放出する。核崩壊及び染色体凝縮を上述したようにモニターする。核膜が破壊され、かつ抗ＮｕＭａ抗体を含まない有糸分裂期抽出物を使用した場合に染色体が凝集し始めた後、以下に記載するように、単一の無傷クロマチン塊がマイクロピペットで単離され、除核レシピエント卵母細胞に移される。
【０４０９】
卵母細胞の除核
レシピエント卵母細胞は、中期ＩＩ段階の卵母細胞であることが好ましい。この段階で、卵母細胞は、精子と受精した場合と同様に導入されたクロマチン塊を処理するように活性化されるか又は既に十分に活性化されている。卵母細胞の除核のために、卵母細胞中のＤＮＡの一部又は好ましくは全体を除去又は不活化させる。レシピエント卵母細胞中のＤＮＡのこの破壊又は除去により、卵母細胞の遺伝物質がクローン化哺乳動物の成長及び発達に寄与しないようにする。卵母細胞の前核を破壊するための１つの方法は、紫外線への暴露である（Gurdon、Methods in Cell Biology, Xenopus Laevis: -Practical Uses in cell and Molecular Biology, Kay及びPeng編, Academic Press, California, volume 36:299-309頁, 1991に掲載）。あるいはまた、卵母細胞前核は、任意の標準的技術により外科的に除去してもよい（例えば、McGrath及びSolter, Science 220:1300-1319, 1983を参照）。１つの可能性のある方法では、針を卵母細胞に刺し、針の内腔に核を吸引する。次いで、形質膜を裂かずに針を卵母細胞から抜く（米国特許第４，９９４，３８４号及び同第５，０５７，４２０号）。
【０４１０】
卵母細胞にクロマチン塊を挿入するための脂肪融合（lipofusion）
クロマチンは、以下に記載するように脂肪融合によって、又は標準的なミクロ注入若しくは電気融合（electrofusion）技術により、レシピエント卵母細胞に導入され得る（例えば、米国特許第４，９９４，３８４号及び同第５，９４５，５７７号を参照）。以下の脂肪融合方法も、染色体をその他のレシピエント細胞に挿入する他の用途において使用され得る。
【０４１１】
クロマチン塊を、遠心分離により、有糸分裂期抽出物、界面活性剤及び／若しくは塩溶液、又はプロテインキナーゼ溶液から単離し、次いで、上述したように脂肪融合緩衝液で洗浄する。クロマチン塊は、使用時まで氷冷脂肪融合緩衝液中で保存され得る。あるいはまた、クロマチン塊を等分し、液体窒素又はメタノール・ドライアイス浴中で冷凍し、−８０℃にて冷凍保存する。脂肪融合溶液は、１つ以上の融合（fusigenic）試薬を、脂肪融合緩衝液と、約５：１〜１：１０にわたる個別の割合で混合することにより調製する。融合試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び脂肪親和性化合物（リポフェクチン（登録商標）、リポフェクタミン（登録商標）、ＤＯＴＡＰ（登録商標）｛Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−メチル硫酸トリメチルアンモニウム；Ｃ４３Ｈ８３ＮＯ８Ｓ｝、ＤＯＳＰＡ（登録商標）｛２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−トリフルオロ酢酸プロパンアミニウム｝、及びＤＯＰＥ（登録商標）（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン））が含まれるがこれらに限定されない。
【０４１２】
その他の好ましい脂質としては、中性及び一価又は多価の陽イオン脂質（第四級アンモニウム基を含むもの等）が挙げられる。別の好ましい脂質は、コレステロール中のヒドロキシル基と脂質中の基との反応から形成される部分等のコレステロール部分を有する。さらに別の好ましい脂質は、好ましくは５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、又は２０〜３０の炭素原子を含む飽和又は不飽和脂肪酸を有する。これらの脂質は、標準的な化学合成技術を使用して合成され得るか、天然由来源から得られるか、又は商業的供給元から購入され得る（Summersら, Biophys J. 71:3199-3206, 1996；Nabekuraら, Pharm Res. 13:1069-1072, 1996；Walterら, Biophys J. 66:366-376, 1994；Yangら, Biosci Rep. 13:143-157, 1993；Walter及びSiegel, Biochemistry. 6:32: 3271-3281, 1993）。その他の好ましい融合化合物は、ウニ卵又は任意の他の由来源に由来する膜小胞画分等のリン脂質である（Collas及びPoccia, J. Cell Science 109: 1275-1283, 1996）。染色体を膜小胞体画分と接触させることにより、染色体が無傷膜で封入されないことが好ましい。
【０４１３】
例えば、ＤＯＴＡＰ（登録商標）等の陽イオン脂質を、脂肪融合緩衝液中約０．１〜３０μｇ／ｍｌの濃度で使用してもよい。あるいはまた、ＤＯＰＥ（登録商標）等の、陽イオン脂質及び中性脂質の混合物からなるリポソーム剤形が使用され得る。
【０４１４】
新しく調製されたか、又は冷凍及び解凍されたクロマチン塊を、脂肪融合溶液と混合して、クロマチン塊を化合物で被覆する。インキュベーションを２０〜３０℃の温度にて約１０〜３０分間実施する。脂肪融合溶液中にクロマチン塊を含む小滴を、ＣＯ２で平衡化された鉱油の存在下に置く。除核したレシピエント卵母細胞を含む液滴も調製する。脂肪融合試薬で被覆したクロマチン塊を、マイクロピペットに吸い上げ、卵母細胞の細胞質と透明帯との間の卵黄周囲腔に挿入する。クロマチン塊は、卵母細胞の細胞膜に隣接させ確実に卵母細胞と接触させる。クロマチン塊−卵母細胞複合体は２０〜３０℃の温度に保ち、顕微鏡下で融合をモニターする。融合が生じた後は、再構成卵母細胞を以下に記載するように活性化する。
【０４１５】
再構成卵母細胞の活性化、培養及び導入
極体押し出し（extrusion）及び染色体欠損を防ぐために、サイトカラシンＢの存在下で卵母細胞を活性化するか、又は活性化の直後にサイトカラシンＢを添加し得る（Wakayamaら, PNAS 96:14984-14989, 1999；Wakayamaら, Nature Genetics 24:108-109, 2000）。電気的手段又は非電気的手段のいずれもが、再構成卵母細胞を活性化するために使用され得る。細胞を活性するための電気的技術は当該分野で周知である（例えば、米国特許第４，９９４，３８４号及び同第５，０５７，４２０号を参照）。細胞を活性化するための非電気的手段は、細胞分裂の確率を上げる当該分野で公知の任意の方法を含み得る。卵母細胞を活性化するための非電気的手段の例としては、エタノール；イノシトール；三リン酸；Ｃａ＋＋イオノフォア及びプロテインキナーゼ阻害剤；タンパク質合成阻害剤；ホルボールエステル；サプシガージン（thapsigargin）、又はあらゆる精子成分の存在下で卵母細胞をインキュベートすることが挙げられる。活性化のための他の非電気的方法としては、卵母細胞を低温衝撃又は機械的応力に供することが挙げられる。あるいはまた、核移植の１〜３時間後に、卵母細胞を、活性化するためのＳｒ２＋、並びに細胞質分裂及び極体押し出しを防止するためのサイトカラシンＢを含む培地中で約６時間インキュベートしてもよい（Wakayamaら, PNAS 96:14984-14989, 1999；Wakayamaら, Nature Genetics 24:108-109, 2000）。クローン化する哺乳動物の種類に応じて、活性化の好ましい長さは異なり得る。例えば、畜牛等の家畜動物では、卵母細胞活性化期間は、一般的に、約１６〜５２時間、又は好ましくは約２８〜４２時間に分布する。
【０４１６】
活性化の後、卵母細胞を、培養培地に適切な時間の間入れて、得られた胚を発育させる。２細胞期以降の細胞期において、胚を代理母レシピエント雌に移し、出産まで発育させる。ウシ種については、胚は、母体宿主に移す前に、典型的に胚盤胞段階まで（例えば、約６〜８日間）培養する。他のクローン化動物については、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に適した長さは当業者に公知であるか、又は常套的な実験により決定され得る。
【０４１７】
哺乳動物の子宮に胚を導入する方法も当該分野において周知である。胚の発育段階は、宿主動物の発情周期と相関させることが好ましい。胚を哺乳動物の子宮に入れた後、胚は出産まで発育し得る。あるいはまた、胚は選択された時点まで子宮内で発育させ、その後、標準的な外科的方法を使用して胚（又は胎仔）を取り出し健康及び生存可能性を判断する。１つの種から得た胚を、別の種から得た動物の子宮環境に入れてもよい。例えば、ウシ胚を、ヒツジの卵管内で発達させることができる（Stice及びKeefer, Biology of Reproduction 48: 715-719, 1993）。胚と子宮とのあらゆる異種間関係が本発明の方法において使用され得る。
【０４１８】
卵母細胞又は他のレシピエント細胞と核との脂肪融合
上述したように、約５：１〜１：１０に分布する個々の割合で、１つ以上の融合試薬を脂肪融合緩衝液と混合することにより脂肪融合溶液を調製する。上述したように、新しく調製されたか、又は冷凍及び解凍された核を、脂肪融合溶液と混合して、核を化合物で被覆する。２０〜３０℃の温度にてインキュベーションを約１０〜３０分間実施する。脂肪融合溶液中に核を含む小滴を、ＣＯ２平衡化鉱油の存在下に置く。レシピエント細胞、好ましくは除核細胞を含む液滴も調製する。除核レシピエント細胞は、上述したように微細操作又は遺伝物質をＵＶ光に暴露して損傷させて染色体又は核を物理的に除去することにより調製する。卵母細胞への挿入のためには、脂肪融合試薬で被覆された核を、マイクロピペット中に吸い上げ、卵母細胞の細胞質と透明帯との間の卵黄周囲腔に挿入する。他のレシピエント細胞への挿入のために、被覆した核を、卵母細胞の細胞膜に隣接させ確実に細胞と接触させることが好ましい。核−細胞複合体は２０〜３０℃の温度に保ち、顕微鏡下で融合をモニターする。融合が生じた後は、再構成卵母細胞を上述したように活性化する。
【実施例１２】
【０４１９】
哺乳動物をクローン化するための再プログラム化透過性化細胞の使用
細胞はまた、核又はクロマチン塊を細胞から単離する必要なく再プログラム化され得る。この方法では、細胞を透過性にしてから、培地（例えば、細胞抽出物）と細胞との間で因子交換可能な条件下で、間期又は有糸分裂期再プログラム培地中でインキュベートする。間期培地を使用する場合、細胞中の核は、膜に結合したままである。有糸分裂培地を使用する場合、核膜崩壊及びクロマチン凝縮が生じ得る。この培地中でのインキュベーションにより核を再プログラム化した後、形質膜を再封入して、培地から得た所望の因子を含む無傷の再プログラム化細胞を培地から形成することが好ましい。所望であれば、培地を、実施例１１に記載の追加の核因子で富化させてもよい。その後、再プログラム化細胞をレシピエント卵母細胞と融合させ、再構成卵母細胞から形成された胚を母体レシピエント哺乳動物に挿入して、クローン化哺乳動物を作製する。
【０４２０】
プリオン遺伝子に突然変異を有しまた任意により異種Ｉｇ遺伝子を有してもよい有蹄動物の作製のためには、プリオン遺伝子の１以上のアレルの突然変異により及び任意により異種抗体をコードする１以上の核酸の挿入により、プログラム化の前、途中又は後にドナー細胞を改変する。所望であれば、クローン化胎仔又はクローン化子孫から得た細胞を、２ラウンド目の核移植に使用して、さらなるクローン化子孫を作製できる。初期クローン化胎仔又はクローン化子孫から得た細胞を冷凍して、追加のクローン化有蹄動物を作製するためのドナー細胞の由来源として使用される細胞系を形成してもよい。
【０４２１】
細胞の透過性化
この手順を使用して再プログラム化され得る細胞としては、非同調細胞、及びＧ０、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、Ｍ期又はこれらの期の組合せと同調した細胞が挙げられ得る。ジギトニン又はストレプトリシンＯでの透過性化等の任意の標準的な手順を使用して細胞を透過性にする。簡単に説明すると、標準的な手順を使用して細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄する。ジギトニン透過性化については、細胞を、約０．００１〜０．１％の濃度でジギトニンを含む培養培地に再懸濁させ、氷上で１０分間インキュベートさせる。ストレプトリシンＯでの透過性化については、細胞をストレプトリシンＯ溶液（例えば、Maghazachiら, FASEB J. 11:765-774, 1997、及び該文献中の参考文献を参照）中で約１５、３０又は６０分間室温にてインキュベートさせる。いずれのインキュベーションの後も、細胞を、４００×ｇにて１０分間の遠心分離により洗浄する。この洗浄ステップは、ＰＢＳ中での再懸濁及び沈殿により２回繰り返す。使用時まで細胞を室温にてＰＢＳ中で保つ。透過性化細胞は、以下に記載するように、再プログラム化のために間期又は有糸分裂期培地にすぐに添加することが好ましい。
【０４２２】
再プログラム培地の調製
間期再プログラム化抽出物を調製するために、標準的方法を使用して間期培養細胞を回収し、１０ｍｌ円錐管中で４℃にて５００×ｇで１０分間の遠心分離により洗浄する。上清を捨て、細胞ペレットを、合計容量５０ｍｌの冷却ＰＢＳ中に再懸濁させる。細胞を、５００×ｇ、４℃にて１０分間遠心分離させる。この洗浄ステップを繰り返し、細胞ペレットを約２０容量の氷冷間期細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．２）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μＭアプロチニン、１０μＭロイペプチン、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭダイズトリプシン阻害剤、１００μＭ  ＰＭＳＦ、及び任意により２０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ）中に再懸濁させる。８００×ｇ、４℃にて１０分間の遠心分離により、細胞を沈殿させる。上清を捨て、細胞ペレットを、わずか１容量の間期細胞溶解緩衝液中に注意深く再懸濁させる。細胞を、氷上で１時間インキュベートして、細胞を膨張させる。チップ超音波機を使用した超音波処理、又はガラス乳鉢及び乳棒を使用した加圧ホモジナイゼーションのいずれかにより細胞を溶解する。細胞溶解は、細胞及び核の少なくとも９０％（これは、位相差顕微鏡を使用して評価され得る）が溶解されるまで実施する。細胞及び核の少なくとも９０％を溶解するのに要する超音波処理時間は、抽出物を調製するのに使用する細胞の種類に応じて異なり得る。
【０４２３】
細胞溶解物を、１．５ｍｌ遠心分離管に入れ、卓上遠心分離機を使用して、１０，０００〜１５，０００×ｇで、４℃にて１５分間遠心分離する。遠心分離機から管を取り出し、すぐに氷上に載せる。２００μｌピペットチップを使用して上清を注意深く回収し、いくつかの管から得た上清をプールし氷上に載せる。この上清は、「間期細胞質」又は「ＩＳ１５」抽出物である。この細胞抽出物は、氷上の管１本当たり２０μｌ容量の抽出物に等分され、すぐに液体窒素上で瞬間冷凍され、使用時まで−８０℃にて保存され得る。あるいはまた、細胞抽出物を、（例えば、ＳＷ５５Ｔｉローター；Ｂｅｃｋｍａｎに適した）氷上の超遠心分離管に入れる。必要であれば、管の上まで鉱油を重ねる。抽出物を、２００，０００×ｇで、４℃にて３時間遠心分離して、ＩＳ１５抽出物に含まれる膜小胞を沈殿させる。遠心分離の終了後、油を捨てる。上清を注意深く回収し、必要であればプールし、氷上の冷却１．５ｍｌ管に入れる。この上清は、「ＩＳ２００」又は「間期細胞質内」抽出物と称する。ＩＳ１５抽出物について記載したように、抽出物を等分し、冷凍する。
【０４２４】
所望であれば、追加の核因子で抽出物を富化してもよい。例えば、再プログラム化抽出物を誘導する元の細胞型の細胞、又はその他の任意の細胞型の細胞から核を精製し、上述したように超音波処理により溶解してもよい。核因子は、０．１５〜８００ｍＭの濃度でＮａＣｌ又はＫＣｌを含む核緩衝液中で攪拌しながらの１０〜６０分間のインキュベーションにより抽出する。溶解物を遠心分離して抽出不可能成分を沈殿させる。目的の抽出因子を含む上清を透析して、ＮａＣｌ又はＫＣｌを無くす。透析した核抽出物を等分し、冷凍保存する。この核抽出物を、様々な濃度で、再プログラム化のために細胞を添加する前に上述した全細胞抽出物に添加する。
【０４２５】
間期抽出物はまた、卵母細胞又は雄性生殖細胞等の生殖細胞からも調製され得る。例えば、卵母細胞は、上述したように活性化し、５時間培養して間期に導入させる。次いで、卵母細胞を、溶解緩衝液からＥＤＴＡを省くこと以外は、中期ＩＩ卵母細胞抽出物について実施例１１に記載したように処置する。雄性生殖細胞抽出物は、実施例１１に記載するように調製され得る。
【０４２６】
細胞抽出物の代替物として、再プログラム培地は、１つ以上の天然型又は組換え因子（例えば、核酸、又はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストン、プロタミン、核ラミン、転写因子、アクチベーター、リプレッサー、クロマチン再構築タンパク質、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン若しくは他のホルモン等のタンパク質）を、緩衝液等の溶液に添加することによっても形成され得る。１つ以上の因子は、卵母細胞又は幹細胞に特異的であることが好ましい。
【０４２７】
培地中での細胞の再プログラム化
透過性化細胞を、上述した間期再プログラム培地、又は実施例１１に記載する有糸分裂期再プログラム培地中に、約１００〜１，０００細胞／μｌの濃度で懸濁させる。上述したようにＡＴＰ生成系及びＧＴＰを抽出物に添加し、反応液を、３０〜３７℃にて最大２時間インキュベートして、抽出物から細胞への因子の転移、及び活性核の取込み又は因子の染色体結合を促進する。再プログラム化細胞を、８００×ｇにて遠心分離し、再懸濁により洗浄し、ＰＢＳ中で４００×ｇにて遠心分離する。所望であれば、細胞を、２０〜３０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培養培地、（Ｈ２Ｏに入った１Ｍストックから添加される）２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＲＰＭＩ１６４０、又は２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むα−ＭＥＭ培地に再懸濁させ、通常の細胞培養インキュベーター中で３７℃にて１〜３時間インキュベートして、細胞膜を再封入させる。次いで、細胞を、通常の温暖培養培地（１０％ＦＣＳ）中で洗浄し、標準的な培養条件をさらに使用して培養する。実施例１７に記載のように、再プログラム化透過性化細胞を使用して、細胞膜を再封入することなく卵母細胞に遺伝子伝達してもよい。
【０４２８】
透過性化細胞を再プログラム化させる代替方法
あるいはまた、細胞を、カバースリップ上において透過性にすることで、細胞の取扱いを最小限にし、細胞の遠心分離を無くして、細胞の生存可能性を最大にしてもよい。細胞（例えば、線維芽細胞）を、１２ウェルプレートに入っている１６ｍｍポリ−Ｌ−リシン被覆カバースリップ上のＲＰＭＩ１６４０中で、５０，０００〜１００，０００細胞／カバースリップまで成長させる。Ｃａ２＋を含まないハンク平衡化食塩水（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に入った２００ｎｇ／ｍｌストレプトリシンＯ中で、５０分間、３７℃の通常雰囲気下で、細胞を透過性にする。所望であれば、これらの条件下で透過性にする細胞のパーセントは、ヨウ化プロピジウム摂取に基づいて測定され得る。ストレプトリシンＯを吸引し、カバースリップを８０〜１００μｌの再プログラム培地で覆い；細胞を３０分間〜１時間３７℃にてＣＯ２雰囲気下でインキュベートする。再プログラム培地は、ＡＴＰ生成系、並びにＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰをそれぞれ１ｍＭずつ含むことが好ましい。任意に形質膜を再封入するために、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むα−ＭＥＭ培地、２０〜３０％ウシ胎仔血清を含む培地、又は２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むＲＰＭＩ１６４０を、ウェルに添加し、細胞を２時間３７℃にてインキュベートする。あるいはまた、形質膜は再封入しない。
【０４２９】
透過性化及び再封入した細胞の割合（％）に対するストレプトリシンＯ処理の影響
透過性化及び再封入した細胞の割合（％）を評価するために、ストレプトリシンＯインキュベーションの量及び時間滴定を実施した（表７）。細胞の透過性は、ストレプトリシンＯ処理の終了時の０．１μｌ／ｍｌのＤＮＡ染色色素であるヨウ化プロピジウムの取込みにより評価した。再封入は、別個の細胞群における再封入処理の終了時に同様に評価した。
【表７】
2006505291.tif 000009
【０４３０】
ストレプトリシンＯ処理により透過性にされ、有糸分裂期抽出物に暴露されたウシ線維芽細胞の生存可能性の評価
ＴＵＮＥＬ分析を実施して、０若しくは５００ｎｇ／ｍｌストレプトリシンＯで透過性にされてから再封入された細胞、又はストレプトリシンＯで透過性にされ、３０〜６０分間有糸分裂期抽出物に暴露され、かつ再封入された細胞におけるアポトーシスを評価した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞はアポトーシス（すなわち、細胞死）の過程にある細胞である。データは、ストレプトリシンＯ自体は、アポトーシスを誘導しないことを示す（表８）。ＴＵＮＥＬ分析に基づけば、ストレプトリシンＯ処理細胞の有糸分裂期抽出物への６０分間の暴露はアポトーシス率を１０％上昇させるが、３０分間の暴露では上昇しない（表８）。これらのデータに基づけば、抽出物中でのドナー細胞の３０分間のインキュベーションの方が、６０分間のインキュベーションよりも好ましい。３０分間のインキュベーションは、細胞の免疫蛍光分析により、検査した核の大部分（約９０％、ｎ＞１００）において核膜崩壊を引き起こすことが示された。
【０４３１】
さらに、クロマチン移植方法について実施例１１に記載するように、抽出物中でインキュベートされ、緩衝液Ｎ又はＴＬ−ＨＥＰＥＳのいずれか、及びショ糖で洗浄される精製核は、アポトーシスの過程を経ない（それぞれ、２／３４及び３／４７ＴＵＮＥＬ陽性）。
【表８】
2006505291.tif 000010
【０４３２】
これらのクローン化方法のために選択した透過性化方法は、５００ｎｇ／ｍｌ  ＳＬＯで、３８℃にて、３０分間であった。再プログラム化細胞を囲む無傷の膜を形成するために選択した再封入方法は、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むα−ＭＥＭ培地にて２時間のインキュベーションであった。
【０４３３】
プロテアーゼを使用した代替的な細胞透過性化方法
プロテアーゼを使用した細胞透過性化方法の一例では、細胞（例えば、線維芽細胞）を３５ｍｍプレート中で一晩コンフルエント状態まで成長させる。５分間の通常のトリプシン−ＥＤＴＡ（０．５％−５．３ｍＭ）手順により線維芽細胞をプレートから取り出す。線維芽細胞をＰＢＳ中で洗浄してから、１ｍｌ  ＴＬ  Ｈｅｐｅｓ中に再懸濁させる。ＴＬ  Ｈｅｐｅｓに入った１ｍｌの３ｍｇ／ｍｌプロテアーゼを、１ｍｌの細胞懸濁液（最終プロテアーゼ濃度は１．５ｍｇ／ｍｌ）に添加し、室温にて１分間インキュベートする。細胞を、１０ｍｌ  ＨＢＳＳ中で洗浄し、１ｍｌ  ＨＢＳＳ中に再懸濁させ、数を数える。最小容量で約１０５の細胞を、有糸分裂期抽出物インキュベーションに使用する。４０μｌのＭＳ−１５有糸分裂期抽出物を、３７℃にて３０分間細胞上に載せる。その後、細胞をＴＬ  Ｈｅｐｅｓ中で洗浄し、本明細書に記載する核移植手順の１つにおいて使用する。
【０４３４】
これらの細胞は、透過性の兆候を示した。なぜなら、有糸分裂期抽出物中でのインキュベーションの後、７０〜８０％の細胞が核膜崩壊及び未成熟染色体凝縮を経て、抽出物からのＭＰＦ（成熟促進因子）又はＭＰＦの何らかの成分が膜を横断したことを示したからである。この細胞透過性化方法は、トリプシン等の様々なプロテアーゼと共に、並びに様々な生殖細胞、体細胞、胚細胞、胎仔細胞、成熟細胞、分化細胞及び未分化細胞と共に使用され得る。
【０４３５】
再構成卵母細胞の形成、活性化、培養、及び導入
再プログラム化細胞を、標準的なミクロ注入又は電気融合技術を使用して、レシピエント卵母細胞に挿入、又は融合させる（例えば、米国特許第４，９９４，３８４号及び５，９４５，５７７号を参照）。例えば、ショ糖（例えば、２．５％ショ糖）の存在下又は不在下にて標準的細胞培地に入った卵母細胞の隣に細胞を置いて、注入ピペットに細胞を吸引してもよい。次いで、ピペットを、数回吸引して、細胞を溶解し、核から細胞質成分を除去して、その後卵母細胞に注入する。次いで、再構成卵母細胞を、実施例１１に記載するクローン化哺乳動物の作製方法等の標準的方法を使用して、活性化し、培養し、母体レシピエント哺乳動物に導入する。
【実施例１３】
【０４３６】
クロマチン移植（ＣＴ）及びストレプトリシンＯ移植（ＳＬＯＴ）を用いるより完全な核再プログラムの実証：
実施例８〜１０において例証したように、従来の核移植前核段階胚では、不完全な核再構築及び再プログラム化が生じる。この発見は、前核移植胚の核膜におけるラミンＡ／Ｃの生成（assembly）、及び過剰なＮｕＭＡ免疫蛍光標識化により実証された。実施例１１に記載するクロマチン塊移植方法、並びに実施例１２に記載する細胞透過性化及び再プログラム化方法（ＳＬＯＴとも称される）を使用して、より完全な核再プログラム化を達成した。
【０４３７】
特に、本発明のクローン化方法により、従来のクローン化方法を使用して作製されるクローン化胚よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚により似ているタンパク質発現パターンを有する胚が作製される。実施例８〜１０において例示するように、クロマチン移植胚は、従来の核移植胚よりも少ないラミンＡ／Ｃタンパク質を発現した。ラミンＡ／Ｃは、分化細胞で自然に発現されるが、胚では発現されない核ラミナの体細胞特異的成分である。ラミンと、転写因子、クロマチンタンパク質及びＤＮＡとの報告されている相互作用から、従来の核移植胚におけるラミンＡ／Ｃの発現は、胚発育に望ましくない体細胞に特異的なタンパク質の発現を促進する可能性が高い。従って、本発明のクロマチン移植胚は、望ましくない体細胞特異的タンパク質を、従来の核移植胚よりも少なく発現し得る。さらに、クロマチン移植胚は、転写調節に関係すると見なされている核マトリックスの主要成分であり、従来の核移植胚よりもｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚に似ているＮｕＭＡについての発現パターンを有した。この結果も、クロマチン移植胚が、従来の核移植胚よりも効率的に再プログラム化されることを示す。
【０４３８】
ウシ線維芽細胞核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ核崩壊の評価
有糸分裂期ウシ線維芽細胞から調製された抽出物は、添加した精製線維芽細胞核の約８０％の崩壊を一貫して支持した（図３３）。中期ＩＩ卵母細胞から得た抽出物（すなわち、受精前に、中期ＩＩで自然に止まった卵母細胞からの抽出物）も、核（３０分以内に７５％の核）崩壊をうまく支持した。
【０４３９】
添加した間期核（図３４Ａ）、ＭＳ１５有糸分裂期抽出物中でインキュベートした核から得たクロマチン塊（図３４Ｂ）、及び卵母細胞抽出物中でインキュベートした核から得たクロマチン塊（図３４Ｃ）を、以下のマーカーの発現について検査した：すなわち、内核膜の内在性タンパク質であるラミンＢ受容体（ＬＢＲ）（膜マーカー）；核ラミナの偏在成分であるラミンＢ；分化細胞のみに存在し、胚では不在の核ラミナの体細胞特異的成分であるラミンＡ／Ｃ；核マトリックスの主要成分であるＮｕＭＡ；核のＰＫＡ接着性タンパク質であるＡＫＡＰ９５；及びＤＮＡ。体細胞質内ＭＳ１５及び卵母細胞ＭＳ１５抽出物の両方が、検査したクロマチンユニットの約１００％において、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＬＢＲ、及びＮｕＭＡの可溶化を誘導した（図３４Ｂ及び３４Ｃ）。予想通り、ＡＫＡＰ９５は、有糸分裂期ヒト細胞において先に観察された通り（Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999）、染色体と会合したままであった。この結果は、実施例８において、未成熟クロマチン凝縮段階にあるウシ核移植胚についても記載している。有糸分裂期抽出物及び卵母細胞抽出物の両方が、使用方法（すなわち、従来の核移植、核注入（ＮＩ）、又はクロマチン移植）に関係なく、核膜可溶化を促進することにおいて、無傷卵母細胞と同等に効率的であると思われた（図３５）。
【０４４０】
クロマチン移植により生成した前核胚と、核移植及び核注入胚から得た前核の比較
クロマチン移植胚を生成するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞を、成熟後約１８〜２０時間で除核した。間期ウシ胎仔線維芽細胞から得た核を、本明細書に記載するようにウシ胎仔細胞から調製したＭＳ１５有糸分裂期抽出物中でインキュベートした。核膜崩壊が生じた後かつクロマチン凝縮が終了する前に、抽出物からクロマチン塊を単離した。特に、間期にある染色体の凝縮レベル（０％凝縮）及び有糸分裂中の染色体の凝縮の最大レベル（１００％凝縮）と比較して、クロマチンが約５０〜６０％凝縮された時にクロマチン塊を単離した。この段階において、クロマチン塊中の個々の染色体は、区別することができず、クロマチン塊の端部は不規則な形をしていた。有糸分裂期抽出物から単離されたクロマチン塊を、１小滴の２．５％ショ糖含有ＴＬ  ＨＥＰＥＳに、除核卵母細胞と共に入れた。ショ糖は、その後の注入手順により卵母細胞が損害されるのを最小限にするために添加した。クロマチン塊を、バーレー・ピエゾドリル（Burleigh Piezo Drill）（Fishers, NY）を使用し、面取りマイクロ注入ピペットを用いて、卵母細胞に注入した（周波数２Ｈｚにて７５マイクロ秒間、７０Ｖの振幅）。典型的に、複数のパルス（２、３、４又は５パルス等）を実施して、注入のために針を卵母細胞に十分に貫通させる。注入後、卵母細胞を、ＴＬ  ＨＥＰＥＳ含有ショ糖の連続希釈で洗浄して、浸透圧衝撃を最小限にした。成熟後２８〜３０時間にて（すなわち、卵母細胞が、卵巣から回収された後（クロマチン塊の注入後少なくとも２時間後）に成熟培地に入れられてから２８〜３０時間）、単為発生のための再構成卵母細胞及び対照を、カルシウムイオノフォア（５μＭ）で４分間（Cal Biochem, San Diego, CA）、並びに１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド及び２．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＭ培養培地［１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．２７ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ乳酸ナトリウム、０．４ｍＭピルビン酸塩、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（脂肪酸を含まない）、１％ＢＭＥアミノ酸、及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ）］中で５時間、先に記載されるように（Liuら, Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998）活性化した。活性化後、卵を５回洗浄し、マウス胎仔線維芽細胞及び０．５ｍｌの胚培養培地を含み、０．３ｍｌの胚テスト鉱油（Ｓｉｇｍａ）で覆われた４ウェル組織培養プレート中で培養する。２５〜５０の胚を各ウェルに入れ、３８．５℃にて、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。所望であれば、カルシウム（例えば、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、３．５、５ｍＭ以上のＣａＣｌ２）を、約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０時間以上培養培地に添加して、注入後の卵母細胞の再封入を促進してもよい。再封入卵母細胞は、本明細書に記載する標準的方法を使用してレシピエント哺乳動物に注入された場合に卵母細胞を囲む無傷の層により高い生存率を有する可能性が高い。
【０４４１】
核注入胚は、クロマチン塊の代わりに、抽出物中でインキュベートされていない間期ウシ胎仔線維芽細胞核を卵母細胞に注入すること以外は、クロマチン移植胚について上述したように形成した。実施例８に記載する従来方法を使用して核移植胚を生成した。
【０４４２】
核移植、核注入、及びクロマチン移植前核は、予想通り、ラミンＢ（図３６Ａ、赤い標識）及びＡＫＡＰ９５（図３６Ｂ、赤い標識）を再生成（reassembly）する。核移植及び核注入前核は、ラミンＡ／Ｃ、体細胞特異的成分（図３６Ａ、緑の標識）も再生成し、これは核移植胚について上記報告された結果と一致する。しかし、クロマチン移植前核及び対照単為発生前核は、ラミンＡ／Ｃを再生成しない（図３６Ａ）。核移植前核は、大部分のクロマチン移植又は単為発生前核（図３６Ｂ、緑の標識）と異なり、ＮｕＭＡ（緑の標識）も含む。単為発生核及びクロマチン移植核は、上記報告されるように低レベルのＮｕＭＡを生成する。
【０４４３】
クロマチン移植の前の核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解（disassembly）は、対照単為発生前核に形態的に似ている前核を生じる。対照的に、核移植及び核注入前核は、体細胞特異的成分（ラミンＡ／Ｃ及び広範囲（extensive）ＮｕＭＡ標識）を有している。この結果は、従来の核移植又は核注入手順後の不完全な核再構築を示す。上述したように、核移植及び核注入前核で検出されたラミンＡ／Ｃは、前核期で新たに転写されたラミンに由来する。核ラミン及び場合によりＮｕＭＡは、転写調節及びヒト疾患に関係するとみなされるため、従来の核移植前核におけるラミンＡ／Ｃの持続性は、不適切な機能性再プログラム化を示し得る。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核分解及びクロマチン移植により、従来の核移植又は核注入よりも正常な前核が生成されると結論付ける。
【０４４４】
再プログラム化クロマチン塊又は透過性化細胞をドナー供与源として使用したクローン化効率
実施例１２に記載するように、一次ウシ胎仔線維芽細胞のストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）−誘導型透過性化、再プログラム培地（例えば、有糸分裂期抽出物）への透過性化細胞の３０分間の暴露、任意により培養による２ｍＭカルシウムでの線維芽細胞の再封入、及び標準的な細胞融合方法を使用した卵母細胞へのクロマチンの移植を含む、「ＳＬＯＴ」と称する新規クローン化手順を開発した。
【０４４５】
このクローン化方法について、１バイアルのストレプトリシンＯ（Sigma S-5265；４℃にて保存粉末形態で保存された２５，０００ユニット）を、４００μｌのＨ２Ｏに溶解し、よく混合する。内容物全てを、１５ｍｌ円錐管に移し、その後、３．６ｍｌのＨ２Ｏを添加し、攪拌により混合した。１０μｌのアリコートを−２０℃にて、０．０６２Ｕ／μｌのストック濃度にて冷凍した。細胞（約１００，０００）を、１００μｌのＨＢＳＳ（Gibco BRL、カタログ番号14170-120）に室温にて懸濁させた。これらの細胞は、コンフルエントな状態で、従って、約８０〜８５％の細胞がＧ１期にあり、その他の細胞の大部分はＳ期にあった。ストレプトリシンＯストック溶液（５μｌ）（すなわち、５００ｎｇ／ｍｌ又は０．３Ｕ／μｌ最終濃度）を添加し、混合液を３８℃にて２５分間、水浴中でインキュベートした。インキュベーションの間、管を２〜３回優しく叩いて、細胞を確実に懸濁させたままにした。室温ＰＢＳ（２００μｌ）を添加し、緩やかなピペッティングによりよく混合させた。細胞を、卓上遠心分離機において、５，０００ｒｐｍで５分間室温にて遠心分離させた。上清を全て捨てた。この段階で、ペレットは小さく、はっきりとは目に見えない可能性がある。ＡＴＰ生成系（４０μｌ、「ＭＳ１５」）を含む有糸分裂期抽出物を添加し、よく混合した。細胞の遠心分離の間に、１バイアルの４０μｌ抽出物を解凍し、１．２μｌのＡＴＰ生成系を添加し、よく混合し、室温にてインキュベートすることにより、抽出物を調製した。この有糸分裂期抽出物は、上記節においてクロマチン塊の生成に使用したのと同じ抽出物であった。混合物を３８℃にて水浴中で３０分間インキュベートし、管を時折叩いた。室温再封入培地（ＲＭ、５００μＬ）（１ＭストックからのＣａＣｌ２を２ｍＭまで添加した完全α−ＭＥＭ［Bio-Whittaker］培地）を添加した。管を開けたままにし、ＣＯ２インキュベーター中で２時間、時折管を叩いて細胞が確実に懸濁した状態でインキュベートした。細胞を、卓上遠心分離機において、５，０００ｒｐｍにて５分間、室温にて遠心分離した。細胞ペレットを、１００μｌの室温ＴＬ  ＨＥＰＥＳ（Bio-Whittaker、カタログ番号04-616F）に再懸濁させ、追加の９００μｌのＴＬ  ＨＥＰＥＳを添加した。標準的な手順を用いて、核移植を実施した。卵母細胞を活性化させ、上記節においてクロマチン移植について記載したようにレシピエント哺乳動物に移した。
【０４４６】
このＳＬＯＴ方法及び本発明のクロマチン移植方法を用いて形成した胚の発育を表７にまとめた。胚盤胞期までの発育は、従来の核移植胚と比べて、ＳＬＯＴ胚の方が僅かに低かった。胚盤胞期におけるＳＬＯＴと核移植発育との差は、核移植のために、細胞周期のＧ１期にある細胞をＳＬＯＴよりもより高いパーセンテージで使用した影響によるものかもしれない。生存率は、クロマチン移植胚の方が低く、これは侵襲手順において予想されるものである。
【０４４７】
妊娠率は、妊娠４０日目において核移植とＳＬＯＴ胚とで同等であった（表９）。妊娠４０日から６０日までの生存率は、従来方法を使用して生成された核移植胚よりもＳＬＯＴ胚についての方が高い傾向にあった。
【表９】
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【０４４８】
上記したように、クロマチン移植胚についての生存率は、再構成卵母細胞をカルシウム中で数時間インキュベートして、卵母細胞が、レシピエント哺乳動物に挿入される前に再封入されることにより高くすることができる。ＳＬＯＴ胚の生存率も、細胞を培養から取り出す際と、卵母細胞と融合させる際との時差を狭めることによって高めることができる。例えば、ストレプトリシンＯ中でのインキュベーション、再プログラム培地中でのインキュベーション、及び／又は再封入培地中でのインキュベーションの時間の長さを短くしてもよい。特に、再封入培地中でのインキュベーションは約１時間未満まで短くしてもよい。この短縮された再封入処置は、上述したように２ｍＭカルシウムか、又はより高い濃度のカルシウム（例えば、約２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０若しくは６．０ｍＭカルシウム）の存在下で実施されて、再封入の率を高めてもよい。卵母細胞と融合する前に細胞が処置される時間の長さを短くすることで、細胞がＳ期に突入し、ＤＮＡ複製を開始して再構成卵母細胞の生存率を低下させる可能性が低くなる。
【実施例１４】
【０４４９】
クロマチン移植（ＣＴ）を用いるより完全な核再プログラムの実証
実施例１１に記載したように、ドナー核の再構築を向上させるため、体細胞遺伝子の抑制を促すため、及び受精卵（fertilized zygote）の前核構造に似た前核構造を有する胚を生成するための手法を開発した。この一般的なクロマチン移植方法の特定の例では、単離した無傷ウシ線維芽細胞核を、核分解を促すのに必要なＡＴＰ生成系の存在下で、有糸分裂期ウシ線維芽細胞の細胞質抽出物中でインキュベートする。
【０４５０】
ドナー核をクロマチン塊に変換するための有糸分裂期再プログラム化抽出物を生成するために、線維芽細胞を、０．５μｇ／ｍｌノコダゾールで約１８時間有糸分裂期に同調させ、有糸分裂振り落し（mitotic shake-off）により回収し、氷冷ＰＢＳ中で２回、及び氷冷細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．２）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤）中で１回洗浄した（Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999）。パッケージ細胞（packed cell）を１容量の細胞溶解緩衝液中に再懸濁させ、氷上で１時間膨張させ、全ての細胞が溶解されるまでぴったりと合う乳棒を用いて氷上でダウンスホモジナイズした。溶解物を、１５，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離し、上清（有糸分裂期抽出物）を回収し、等分し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃にて保存した。
【０４５１】
ドナークロマチンを生成するために、非同調コンフルエント線維芽細胞を回収し、洗浄し、約２０容量の氷冷低張核単離緩衝液（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２ｍｍ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍｍ  ＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤のカクテル）中に再懸濁させた（Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999）。氷上にて１時間後、細胞をぴったりと合う乳棒で加圧ホモジナイズした。２Ｍストックからショ糖を２５０ｍＭの濃度まで添加し、核を４００×ｇで１０分間、４℃にて沈殿させた。核を核単離緩衝液（２５０ｍＭショ糖を含まないこと以外は上記緩衝液と同じ緩衝液）中で洗浄し、新鮮なままで使用するか、核単離緩衝液／７０％グリセロール中で冷凍させた（Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999）。
【０４５２】
再プログラム化のために、単離線維芽細胞核を、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭクレアチンリン酸、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含む４０μｌの有糸分裂期抽出物中、４，０００核／μｌで、３０分間３８℃のＨ２Ｏ浴においてインキュベートした。核膜崩壊及びクロマチン凝縮を位相差顕微鏡法によりモニターした。インキュベーションの終了時、反応混合液を、２．５％ショ糖を含む５００μｌのＴＬ  Ｈｅｐｅｓで希釈し、２，０００×ｇで５分間の沈殿によりクロマチンを回収した。クロマチン塊を、ＴＬ  Ｈｅｐｅｓ／ショ糖中に再懸濁させ、除核卵母細胞と共に、鉱油の下にあるＴＬ  Ｈｅｐｅｓ／ショ糖に移した。個々のクロマチン塊を、バーレー・ピエゾドリル（Fishers, NY）（２Ｈｚ、２μｓ、７０Ｖ）を使用し、面取りマイクロ注入ピペットで２０ｈｐｍにて除核したｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞に注入した。注入後、卵母細胞を、ショ糖含有ＴＬ  Ｈｅｐｅｓの連続希釈液中で洗浄して、浸透圧衝撃を最小限にし、培養した。２８ｈｐｍにて、再構成した卵母細胞及び単為発生対照を、ＮＴについて記載したように活性化し、培養した（Kasinathanら, Nat. Biotechnol. 19:1176-1178, 2001、及びKasinathanら, Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001）。核注入（ＮＩ）のために、精製した線維芽細胞核を、有糸分裂期抽出物の代わりに細胞溶解緩衝液に暴露し、ＣＴについてと同様に除核卵母細胞に注入した。
【０４５３】
再プログラム化の結果、ラミンＡ／Ｃ、ラミンＢ、及びＮｕＭＡは分解し易かった一方で、ＡＫＡＰ９５は凝縮染色体と会合したままであった（図４２Ａ）。ＴＵＮＥＬ分析は、抽出物中でアポトーシスが生じなかったことを示した。ヒトＨｅＬａ核及び有糸分裂期抽出物での同様の核崩壊調査は、凝縮クロマチン塊が核再構築（Steenら, J. Cell Biol. 150:1251-1562, 2000）、及び間期細胞質における転写を支持可能であることを示した。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核分解は、機能的核を再形成可能な凝縮クロマチンを生成する。凝縮線維芽細胞クロマチンを、沈殿により回収し、個々のクロマチン塊を除核レシピエント卵母細胞に注入した。培養による回収後、ＮＴ卵母細胞について実施例９に記載したように、卵母細胞を活性化した。核の取扱いにより生じる人為的結果についての対照として、抽出物緩衝液にのみ暴露した無傷核も注入した。
【０４５４】
ＣＴ及び対照の核注入（ＮＩ）結果を図４２Ａ〜４２Ｄに示す。ＮＩは、ＮＴ前核と同様に、ラミンＡ／Ｃ及びＢ、ＮｕＭＡ、並びにＡＫＡＰ９５を含む前核を生成した（図４２Ｂ及び４２Ｃ）。ＣＴは、注入及び活性化を経て生存した胚（注入した卵母細胞の約５０％、ｎ＞２，０００）の８０％以上においてＰＮ形成を生じた。しかし、ＣＴ前核は、検出可能なラミンＡ／Ｃを示さず、ＮＴ及びＮＩ前核と比べて抗ＮｕＭＡ免疫標識化の１／３の低下を示した（図４２Ｂ及び４２Ｃ）。このパターンは、単為発生前核のパターンと類似していた。上述したＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＤＮａｓｅＩ／ＮａＣｌでのＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの抽出率は、ＮＴ前核と比べて、ＣＴ前核において８倍向上し、前核ＡＫＡＰ９５固定（anchoring）及びＤＮａｓｅＩ利用性（accessibility）に対するＣＴの有益な影響を反映している（図４２Ｄ）。クロマチン結合ＡＫＡＰ９５は、主に転写において抑制された（低アセチル化）クロマチンと同時分画することから、この結果は、ＣＴが、ＰＮ生成の際のユークロマチンの形成を向上することを示唆する。
【０４５５】
ＴＡＴＡ結合タンパク質ＴＢＰの力学を、ＮＴ及びＣＴ手順を並行して実施することにより線維芽細胞ドナー核再構築の間に検査した。ＴＢＰは、本質的に全ての遺伝子についての全般的な転写機構の生成を促進する（Sharpら, Cell 68:819-821, 1992）。ＴＢＰは、ドナー線維芽細胞核において、ＡＫＡＰ９５及びＤＮＡと同時局所化した（図４３Ａ）。ＮＴ後に得たＰＣＣ染色体は、有糸分裂期抽出物中で凝縮される染色体の５倍（ＴＢＰ／ＡＫＡＰ９５及びＴＢＰ／ＤＮＡ蛍光強度比で示される）のＴＢＰを含んでいた（図４３Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで凝縮された染色体のＴＰＢ標識強度は、有糸分裂期線維芽細胞のものに似ていた。ＰＮ段階において、ＴＢＰは、ＣＴ胚ではほとんど検出されなかったが、ＮＴ及びＮＩ胚において強力な免疫反応性を示した（図４３Ａ）。ＮＴ胚中の前核ＴＢＰは、体細胞に由来するものであった。なぜなら、転写又は翻訳の阻害は強力なＴＢＰ標識を維持していたからである。マウス中の前核ＴＢＰ濃度は、間期を経過する間に上昇することが示されている（Worradら, Development 120:2347-2357, 1994）。しかし、再構成されたＮＴ胚とＣＴ胚との間の、ＰＣＣ−又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ−凝縮クロマチンからのＰＮ形成の動態の類似は、ＮＴ前核におけるＴＢＰ濃度の向上が、細胞周期段階のさらなる進行によるものでないことを示した。従って、ドナー核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解は、クロマチンからのＴＢＰの解離を促進し、得られるＣＴ前核が、同じ再構成段階にあるＮＴ前核と比べて約１／１０のＴＢＰを含むようにする。
【０４５６】
従って、ＮＴによる不完全な再プログラム化の５つの構造的及び機能的マーカーは、ラミンＡ／Ｃの前核生成、前核ＮｕＭＡ及びＴＢＰ濃度の増加、並びに界面活性剤、ＤＮａｓｅ及び塩での抽出に対するＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの感受性の上昇が挙げられる。対照的に、適切な核再形成及び細胞生存のために必須なＢ型ラミン（Steenら, J. Cell Biol. 153:621-626, 2001）は、ＮＴ前核において正常に生成すると思われるが、生成されたＢ型ラミンのプールが体細胞のもの（従って、再標的化されたもの）か、又は母体由来源のものかは判断できなかった。ＬＭＮＡ遺伝子は、ＮＴ前核において活性のままであり、分化細胞特異的Ａ型ラミンの生成を生じる。クロマチンとの相互作用及び転写機構を経て、核ラミンは、転写調節に関与することが示唆されている（Cohenら, Trends Biochem. Sci. 26:41-47, 2001）。従って、核ラミンの正しいセットの生成が、ＮＴ胚における適切な前核機能について最も重要であると思われる。
【０４５７】
本方法では、体細胞核成分は抽出物に分散され、典型的に卵母細胞質とは接触しない。これにより、母体ラミンの組成とは異なり得るＢ型ラミン等の発生核に対する体細胞特異的分子の再標的化が妨げられる（Cohenら, Trends Biochem. Sci. 26:41-47, 2001）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロマチン凝縮は、クロマチン再構築酵素等のＤＮＡ結合因子（Sifら, Genes Devel. 12:2842-2851, 1998）及び転写因子の放出も促進して、阻害性の可能性のある体細胞成分のドナーゲノムを「剥ぎ取り（stripping）」得る。特に、ＴＢＰ除去により、再構成ＣＴ前核における体細胞特異的遺伝子の不活性化が生じ、受精後の雄性前核の低い転写活性を重複（duplicate）し得る（Pocciaら, Trends Biochem. Sci. 17:223-227, 1992）。
【０４５８】
ドナー核から因子を除去することから推測されるのは、クロマチンへの母体成分の挿入、及び生理学的前核への再構築が容易になり得るということことである。ＣＴは、ヌクレアーゼ及び塩に対するＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの感受性を上げる。ＤＮａｓｅＩ耐性ＤＮＡは、ほとんど転写的にサイレントである。従って、ＮＴによるＡＫＡＰ９５接着の不完全な再構築は、発育上重要な遺伝子（胎盤の発達、妊娠後期の維持、及びクローン化動物の出生後生存率に関与する遺伝子等）の発現を損ないうる。
【０４５９】
ＣＴ卵母細胞の以下の特徴は、有糸分裂期抽出物中でインキュベートしたクロマチン塊の核移植が、得られる再構成卵母細胞の機能的特徴を有意に改善することを示す。体細胞ドナー細胞ＮｕＭＡにより高レベルで発現される核マトリックスタンパク質は、ＣＴ前核（すなわち、クロマチン塊を卵母細胞に導入した後に形成される前核）において、ＮＴ前核よりも１／３低く発現された。この結果は、ＣＴ卵母細胞のＮｕＭＡのレベルが、ＮＴ卵母細胞よりも天然型卵母細胞中のＮｕＭＡのレベルにより近いことを示す。ＣＴ前核はまた、ＮＴ前核よりも１／１０の低さの全般的転写因子ＴＢＰを発現した。有糸分裂期抽出物におけるインキュベーションによるドナークロマチン塊からＴＢＰのこの除去により、得られるＣＴ卵母細胞における望ましくない体細胞特異的遺伝子を不活性化し得る。分化細胞に特異的で、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精された又は単為発生的に活性化される卵母細胞において検出されない核膜タンパク質であるラミンＡ／Ｃは、ＣＴ前核においても検出されなかったが、ＮＴ前核において検出された。核ラミンは転写を調節し得るため、ＣＴ前核における検出可能ラミンＡ／Ｃの欠如により、ＮＴ卵母細胞よりもＣＴ卵母細胞においてより適切な転写調節をもたらし得る。界面活性剤、ＤＮａｓｅ及び塩での抽出に対する、転写的に抑制（低アセチル化）されたクロマチンで富化された、核マトリックス−クロマチン境界の構造タンパク質であるＡＫＡＰ９５、及びＤＮＡの感受性を、前核において測定し、ＡＫＡＰ９５とＤＮＡとの接着を特徴決定し、及び前核におけるＤＮＡ利用性を特徴決定した。抽出率は、ＮＴ前核と比べてＣＴ前核において８倍増し、ＡＫＡＰ９５接着、及びドナーＤＮＡの形態的再構築に対する、有糸分裂期抽出物中でのドナークロマチン塊のインキュベーションの有益な影響を反映した。ＡＫＡＰ９５及びＤＮａｓｅＩ耐性ＤＮＡは、転写的に抑制されたか又はサイレントのＤＮＡに関連するため、ヌクレアーゼ、塩及び界面活性剤に対するＡＫＡＰ９５及びＤＮＡの感受性の増加は、ＣＴ卵母細胞が発育上重要な遺伝子の発現を高めたかもしれないことを示唆する。
【０４６０】
同様の結果が、プリオン遺伝子において１つ以上の突然変異を有する細胞に由来するドナー核について予測される。
【実施例１５】
【０４６１】
ストレプトリシンＯ移植を用いるより完全な核再プログラムの実証
ＳＬＯＴを使用した、有糸分裂期抽出物中での透過性化細胞のインキュベーションの間のクロマチン塊の再プログラム化も、図４５Ａ及び４５Ｂにおいて実証する。この調査では、体細胞ドナー細胞により高レベルで発現される核マトリックスタンパク質であるＮｕＭＡの発現、及び分化細胞に特異的な核膜タンパク質であるラミンＡ／Ｃの発現を、ＳＬＯＴを使用して生成される卵母細胞について、及び抽出物中でインキュベートされていない核を含む細胞の従来の核移植を使用して生成される卵母細胞（「ＮＴ」）について比較した。活性化の１４時間後、ＳＬＯＴ前核（すなわち、クロマチン塊を含むドナー細胞を卵母細胞へ導入した後に形成される前核）は、ＮＴ前核と比べて僅かに少ないＮｕＭＡ及びラミンＡ／Ｃを発現した（三重試験において、ｎ＝１５−２０胚／マーカー）。これらの結果は、再構成されたＳＬＯＴ卵母細胞が、ＮＴ卵母細胞よりも効率的に再プログラム化され、天然の受精卵母細胞により似ていることを実証する。核ラミンは転写を調節し得るため、ＳＬＯＴ前核中のラミンＡ／Ｃの有意に低いレベルにより、ＮＴ卵母細胞よりもＳＬＯＴ卵母細胞において適切な転写調節がもたらされ得る。
【０４６２】
得られる卵母細胞における望ましくない因子の発現を低くすることに加えて、ＳＬＯＴは、従来の核移植方法と比べて得られる胎仔の生存可能性を高める（表１０）。従って、ＳＬＯＴドナー細胞の多くの構造的及び機能的な違いは、非ヒト胚及び非ヒト哺乳動物を形成するための再構成卵母細胞の能力を実質的に改善する。
【表１０】
2006505291.tif 000012
【実施例１６】
【０４６３】
ストレプトリシンＯ移植（ＳＬＯＴ）を用いるより完全な核再プログラムの実証
実施例１２及び１５に記載したように、新規ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核再構築系を開発した。この系は、ドナー細胞の透過性化、有糸分裂期抽出物におけるクロマチン凝縮の誘導、及びクロマチンが凝縮される間に可溶化される核因子を除去するための透過性化細胞の洗浄を含む。ウシクロマチン移植胚の前核は、体細胞に似る核移植胚とは対照的に、通常の胚のパターンに非常に似ているいくつかのマーカーの発現パターンを示す。このクロマチン移植系を使用して、８匹の健康な仔ウシを作製した。クロマチン移植は、出産までの生存率を高め、大きい仔ウシの発生率を低くし、出産後の生存率を有意に向上させる傾向を示す。この結果は、体細胞ドナー核が移植前にうまく操作されたことを実証する。以下にさらに記載するように、有糸分裂期抽出物における体細胞核の分解、及びその後の卵母細胞への凝縮クロマチンの移植は、核再構築を向上し、クローンの発生及び生存率が改善された形跡を示す。所望であれば、この手順を使用して、核再プログラム化のメカニズムをさらに特徴決定できる。
【０４６４】
クロマチン移植手法
前核ＮＴ胚において同定された不具合を軽減するために、線維芽細胞核を、レシピエント卵母細胞に移植する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作した。このＳＬＯＴ系は、図４８にまとめている。有糸分裂期抽出物の生成のために、線維芽細胞を、１μｇ／ｍｌノコダゾールで１８時間有糸分裂期に同調させ、有糸分裂振り落しにより回収し、リン酸緩衝化食塩水中で２回、及び細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．２）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、及びプロテアーゼ阻害剤）中で１回洗浄した。沈殿した細胞を、１容量の氷冷細胞溶解緩衝液に再懸濁させ、氷上で１時間膨張させ、ぴったりと合う乳棒を用いて氷上で加圧ホモジナイズした。溶解物を、１５，０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離し、上清（有糸分裂期抽出物）を等分し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−８０℃にて保存した。新しいか又は冷凍の抽出物を使用したが、核崩壊の効率について顕著な違いはなかった。
【０４６５】
コンフルエントな培養から得たウシ胎仔線維芽細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないハンク平衡化食塩水（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、３０分間、約３８．５℃のＨ２Ｏ浴にて、３１．２ＵストレプトリシンＯ（ＳＬＯ；Ｓｉｇｍａ）を含む１００μｌのＨＢＳＳに懸濁させた１００，０００細胞のインキュベーションにより、細胞を透過性にした。膜不透過性ＤＮＡ株、ヨウ化プロピジウム（０．１μｇ／ｍｌ）の取込みにより、透過性化を評価した。透過性にされた線維芽細胞を沈殿させ、洗浄し、ＡＴＰ生成系（１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭクレアチンリン酸、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ）を含む４０μｌ有糸分裂期抽出物中で、３０〜４５分間、約３８．５℃にてインキュベートし、核分離及び核成分の除去を促した。アリコートを、０．１μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２で標識化して、クロマチン凝縮をモニターした。インキュベーションの後、沈殿により線維芽細胞を抽出物から回収し、洗浄した。反応混合液を、膜再封入のために２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５００μｌαＭＥＭ／１０％ウシ胎仔血清（Gibco-BRL）で希釈し、細胞を２時間、３８．５℃にて培養した（Hakelienら, Nat. Biotechnol. 20:460-466, 2002）。ヨウ化プロピジウム取込みにより再封入をモニターした。再封入した細胞を、２０ｈｐｍで除核したｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵母細胞と融合させた。卵母細胞を２８ｈｐｍで活性化し、実施例１０でＮＴについて記載したように胚を培養した。
【０４６６】
胚盤胞期までｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＬＯＴ胚を培養し、レシピエント雌１匹につき２つの胚を導入した。超音波検査により妊娠をモニターし、Ｃ切除を行った。獣医により、仔ウシを出産２４時間以内に評価した。
【０４６７】
有糸分裂期抽出物中における線維芽細胞核の崩壊
有糸分裂期抽出物は、有糸分裂期ウシ線維芽細胞の溶解物から得た１５，０００×ｇ上清で構成されており、ＡＴＰ再生系を含んでいた。ポリ（ＡＤＰ）リボシルポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）のタンパク質分解、及びアポトーシス線維芽細胞を特徴とするＤＮＡ分画の不在から判断したところ、抽出物はアポトーシスを含んでいなかった（図４９Ａ）。従って、抽出物は、体細胞核の再構築を促進するのに適していた。
【０４６８】
抽出物は、染色体のＡＴＰ依存性凝縮、クロマチンからのＡ／Ｃ及びＢ型ラミンの分解（これらのラミンの細胞質標識化により判断）、並びにクロマチンからのＴＢＰの除去を導いた（図４９Ｂ）。これらの事象は、有糸分裂期抽出物からの回収後、線維芽細胞から精製した凝縮クロマチンの免疫ブロッティング分析により確認した（図４９Ｃ、レーン１及び３と比較）。この実験では、Ａキナーゼ接着性タンパク質ＡＫＡＰ９５を、有糸分裂期において通常生じる凝縮染色体と会合したままの核成分のマーカーとして使用した（Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999）。ヒストンＨ４を、ゲル中のタンパク質挿入対照として使用した（図４９Ｃ）。有糸分裂期抽出物中のクロマチンからの、核ラミン及びＴＢＰの分解は、ＡＴＰ再生系に依存し（図４９Ｂ及び４９Ｃ、レーン３及び４）、有糸分裂期細胞において生じるものによく似ていた（図４９Ｃ、レーン２）。さらに、有糸分裂期抽出物への暴露後の、（単離クロマチンと対照を成すものとして）透過性化線維芽細胞全体の免疫ブロッティング分析により、可溶化ラミンＡ／Ｃ及び全ての検出可能ＴＢＰの画分が細胞から排除され、及び／又はタンパク質分解されたことが示された（図４９Ｃ、レーン６）。最後に、ＡＴＰ再生系を含む、間期線維芽細胞（図４９Ｃ、レーン５）又は細胞溶解緩衝液のみから得た対照抽出物は、核分解を促進せず、つまり、核崩壊がＡＴＰ依存性であり、有糸分裂期抽出物に特異的であることが示された。有糸分裂期抽出物に暴露され、ＣａＣｌ２で再封入された透過性化線維芽細胞はいくつかの継代にわたり培養されることができ、つまり、膜透過性化、抽出物中での透過性化細胞のインキュベーション、及び膜再封入が、生存に適した手順であることが示された。
【０４６９】
クロマチン移植により生成された胚における核の特徴決定
再封入線維芽細胞とレシピエント卵母細胞との融合は、非透過性化細胞と同等の（７０％を超える）効率で生じた。ドナークロマチンは、卵母細胞への導入時には凝縮形態であった（図５０Ａ、ＳＬＯＴ）。対照的に、ＮＴのために使用した線維芽細胞のクロマチンは、融合の３０分以内に脱凝縮したままであった（図５０Ａ、ＮＴ）。従って、有糸分裂期抽出物で処置した線維芽細胞を、卵母細胞へ導入する前にＣａＣｌ２で再封入することにより、ドナー細胞中での核再形成は促されなかった。この観察結果は、融合直後のＳＬＯＴ胚における凝縮クロマチンの周りの核膜の不在（いくつかのラミナ及び内核膜タンパク質の免疫蛍光分析から判断）により裏付けられた。
【０４７０】
ＳＬＯＴ及びＮＴ胚の核中の核ラミン及びＴＢＰの免疫標識、並びにＤＮＡ蛍光強度に関係するこれらのマーカーの免疫標識強度を図５０Ｂ及び５０Ｃに示す。核周囲ラミンＢ標識強度は、ＳＬＯＴ及びＮＴ前核において類似していた。しかし際立ってＮＴ前核とは対照的に、ＳＬＯＴ胚において、ラミンＡ／Ｃは、前核及び少なくとも８〜１６細胞期で検出されなかった（図５０Ｂ）。ＳＬＯＴ前核はまた、ＮＴ前核と比べて、ＴＢＰ標識の１／４の低下も示した（図５０Ｃ）。マウスにおける前核ＴＢＰ濃度は、間期の経過の間に増加することが示されている（Worradら, Development 120:2347-2357, 1994）。しかし、ＰＣＣ−又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ−凝縮クロマチンからの前核形成の動態学は、ＮＴ及びＳＬＯＴ胚において似ており、ＮＴ前核のＴＢＰ濃度の向上がより進んだ細胞周期段階によるものである可能性は低い（ただし、正式には除外されていない）。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ、及び０．３Ｍ  ＮａＣｌでの抽出に対するＴＢＰの抵抗性は、１／２以下に低下し（図５０Ｄ）、ＴＢＰと核内リガンドとの会合がより弱いことを示した。同様に、ＤＮａｓｅＩに対するＤＮＡの抵抗性は、ＳＬＯＴ前核においてほぼ１／４に低下し、ＳＬＯＴが、前核においてより緩いクロマチン構造の確立を支持することを示唆する（図５０Ｄ）。従って、有糸分裂期抽出物における線維芽細胞核の分解、及びその後の卵母細胞への凝縮クロマチンの移植は、ドナー核の形態学的再構築を向上させ、ＮＴ胚の前核において検出される不具合を軽減した。
【０４７１】
クロマチン移植により健康なクローンが生成される
ＳＬＯＴは、クローン化胚を出産まで発育させた（図５１Ａ及び５１Ｂ）。レシピエント雌への胚盤胞の導入後の妊娠率は、４０日目において、ＮＴ胚よりもＳＬＯＴ胚の方が有意に高く（Ｐ＝０．０２；フィッシャーテスト）、この傾向は発生から出産まで維持された（それぞれ１２／５９及び２３／２１１の仔ウシが産まれた；Ｐ＝０．０５）（図５１Ａ）。さらに、ＳＬＯＴは、分娩後２４時間を超えたクローンの生存率を向上させた（それぞれ１０／５９及び１７／２１１；Ｐ＝０．０４）（図５１Ａ及び５１Ｂ）。
【０４７２】
動物及び胎盤を１（正常）〜５（肉眼的に異常）にスコア付けすることにより、産まれたＮＴ（実施例１０）及びＳＬＯＴクローンの健康状態を評価した。胎盤スコアには、胎盤浮腫、胎盤葉数、大きさ及び形態、羊水の色、子宮の形態、並びに臍等のパラメータが含まれた。動物スコアには、機能的評価、並びに呼吸器、心血管、消化器官、泌尿器、筋肉、骨格及び神経系の全体的な様子が含まれた。個々の仔ウシについてのデータを図５１Ｃに示す。ボックスプロット分析は、ＮＴから得た動物及び胎盤のスコアが、ＳＬＯＴから得られるものよりも分散していることを示している（図５１Ｅ）。ＳＬＯＴ及びＮＴクローンの平均出産時体重には有意な違いはなかった。しかし、出産時において４５ｋｇを超えるＳＬＯＴ仔ウシの割合は、ＮＴ動物の割合よりも低かった（Ｐ＝０．０２；フィッシャー）（図５１Ｄ及び５１Ｅ）。まとめると、これらの結果は、クロマチン移植により、生存子孫が作製されることを示し、発生及び生存可能性の改善の証拠を示す。
【０４７３】
作出されたＳＬＯＴ子孫の数が限定されている（ｎ＝８）にも関わらず、ＮＴ（実施例１０）と比べて、ＳＬＯＴは、４０日目の妊娠率（Ｐ＝０．０２）、及び出産した仔ウシの２４時間を超える生存率（Ｐ＝０．０４）を有意に向上させる。ＳＬＯＴにより作出された動物の健康状態の改善への傾向は、ボックスプロット分析においても反映されていた。さらに、ＳＬＯＴにより作出される大きい（４５ｋｇを超える）仔ウシの発生率の低さは、動物管理にとって実質的かつ経済的な意味合いを有する。
【０４７４】
ラミンＡ／Ｃの生成、前核ＴＢＰ含有量の増加、及びＤＮａｓｅＩに対するＤＮＡの抵抗性の上昇を含むいくつかの核不具合がＮＴ胚において同定されている。これらの不具合は、線維芽細胞核の不完全な再構築、及び／又は分化細胞特異的（例えば、ラミンＡ）遺伝子の発現の誤調節から生じ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの核の再構築、及び卵母細胞への凝縮クロマチンの移植は、これらの不具合を軽減する。
【０４７５】
ＳＬＯＴを介した核の再構築により、ＤＮａｓｅＩに対するＤＮＡ感受性が高まり、転写的に活性（又は潜在的に活性）なクロマチンの形成を促進し得る。この影響により、胎盤発達、妊娠後期の維持、及び出産後生存率に関わる遺伝子等の発育上重要な遺伝子の発現が促進され得る。ＳＬＯＴはまた、クローン化胚におけるラミンＡ遺伝子発現の抑制も誘導する。核ラミナ組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ操作により、正確なセットのラミンを生成するのに失敗すると、必ずアポトーシスが生じることが示されている（Steenら, J. Cell Biol. 153:621-626, 2001）。さらに、ＤＮＡ、クロマチン及び転写機構とラミンとが相互作用する際に、クローン化胚における正常な核機能のために適切なラミナ再形成が必須となる可能性が高い（Gruenbaumら, J. Struct. Biol. 129:313-323, 2000、及びCohenら, Trends Biochem. Sci. 26:41-47, 2001）。
【０４７６】
有糸分裂期におけるか又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのクロマチン凝縮は、クロマチン再構築酵素、転写因子（例えば、ＴＢＰ）、又は他の潜在的に阻害性の体細胞成分等のＤＮＡ結合成分の放出を伴う。ドナー体細胞クロマチンからのＴＢＰの除去は、発達を損ないうる、ＳＬＯＴ胚中の体細胞特異的遺伝子の抑制又は負調節を促し得る。ドナー核から因子を除去するということは、クロマチンへの母体成分の挿入、及びその後の生理学的前核への再構築が容易になるということである。
【０４７７】
最後に、細胞抽出物中の体細胞核を直接再構築し、生存子孫を作製することが可能である。クローン化又は分化転換の目的のための核のｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作（Landsverkら, EMBO Rep. 3:384-389, 2002、及びHakelienら, Nat. Biotechnol. 20:460-466, 2002）は、核再プログラム化のメカニズムのさらなる任意の調査のために有用なツールである。クロマチン移植は、クローンの出産までの発育及び生存可能性の改善の証拠を示す。系のさらなる操作により、哺乳動物クローン化の効率がさらに改善されるかもしれない。
【実施例１７】
【０４７８】
ストレプトリシンＯ移植（ＳＬＯＴ）を用いるより完全な核再プログラム化の別の実証例
実施例１２に記載したＳＬＯＴ方法は、ドナー透過性化細胞が、遺伝的伝達の前に再封入されない場合に改善された結果をもたらした。さらに、コンフルエント細胞の代わりにＧ１期にあるドナー細胞を使用することにより、再構成卵母細胞及び得られる胚の生存可能性が高まり得る。これらの実験を、以下に詳細に記載する。
【０４７９】
緩衝液の調製
１ｍｌのＨ２Ｏをエッペンドルフ管に入れ、１５４ｍｇの冷蔵ＤＴＴを添加し、攪拌によりよく混合することによって、１モルＤＴＴ溶液を調製した。溶液を１０μｌ容量に等分し、−２０℃にて冷凍した。アリコートは、数回、解凍及び再冷凍され得る。核生成／分解アッセイ用の細胞抽出物を調製するための１００ｍｌ容量の細胞溶解緩衝液は、ＮａＣｌ（５０ｍＭ、５Ｍストックの１ｍｌ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ、１Ｍストックの０．５ｍｌ）、Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．２（２０ｍＭ、１Ｍストックの２ｍｌ、ｐＨ８．２）、及びＨ２Ｏ（９６．５ｍｌ）を含んでいた。緩衝液を等分し、４℃にて保存した。溶解物調製の際に、約１ｐＨユニットの液滴を添加した。有糸分裂期抽出物を調製するために、１０ｍＭ  ＥＧＴＡを添加し（１Ｍストックの１ｍｌ）、９６．５ｍｌの代わりに９５．５ｍｌのＨ２Ｏを添加した。使用前に、以下を添加した：すなわち、ＤＴＴ（１μｌ／ｍｌ溶液、−２０℃の１Ｍストック、１ｍＭ最終濃度）、ＰＭＳＦ（１０μｌ／ｍｌ溶液  １００ｍＭストック、１ｍＭ最終濃度）、ＣＡＬ混合液（溶液１ｍｌ当たり−２０℃の１０μｌＣＡＬカクテル、すなわち、キモスタチン、アプロチニン及びロイペプチンがそれぞれ１０μｇ／ｍｌの最終濃度）、ペプスタチンＡ（溶液１ｍｌ当たり−２０℃の１０μｌストック、１０μｇ／ｍｌ最終濃度）、並びにサイトカラシンＤ（−２０℃の１ｍｇ／ｍｌストックから１μｌ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ最終濃度）。ノコダゾール１０００×ストック溶液のために、１ｍｇ／ｍｌのノコダゾール含有ＤＭＳＯを調製し、１６０μｌアリコートで保存した。
【０４８０】
ストレプトリシンＯストック（ＳＬＯ）を調製するために、１バイアルのＳＬＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−５２６５；４℃にて粉末として保存される２５，０００ユニット）を、４００μｌのＨ２Ｏに溶解し、よく混合した。内容物全体を１．５ｍｌ円錐管に移し、１０μｌアリコートに分け、−２０℃にて冷凍した。ストック濃度は「１０×」であった。プロテアーゼ溶液を調製するために、３ｍｌ ＴＬ  Ｈｅｐｅｓ及び９ｍｇプロテアーゼ（Sigma P-8811）を、１５ｍｌ円錐管に添加し、攪拌により混合した。溶液を０．２２μｍシリンジフィルタを通して、ＴＬ  Ｈｅｐｅｓに直接濾過させた。細胞により容量が二倍になったため、最終濃度は１．５ｍｇ／ｍｌであった。ＨＥＣＭ  Ｈｅｐｅｓについては、ＮａＣｌ（１１４ｍＭ、６．６６２ｇ）、ＫＣｌ（３．２ｍＭ、０．２３９ｇ）、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ（２．０ｍＭ、０．２９４ｇ）、ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ（０．５ｍＭ、０．１０２ｇ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（１０ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ３５３９  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ最終濃度）、フェノールレッド（５μｇ／ｍｌ、１ｍｌ）、及びＨ２Ｏ（合計容量を９９０ｍｌまで増加させるのに十分な量）を合わせた。次いで、１００×アミノ酸（１０ｍｌ）、乳酸ナトリウム（１０ｍＭ、１．４４ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（０．１ｍＭ、０．０１１ｇ）、ＮａＨＣＯ３（２ｍＭ、０．１６８ｇ）、及びＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ、２．３８ｇ）を添加した。最終的な溶液は、２６０〜２７０ｍＯｓＭのオスモル濃度を有していた。次いで、３ｇウシ血清アルブミン（画分Ｖ）を添加し、ｐＨを７．４に調節した。０．２２μＭフィルタを介して溶液を濾過し、４℃で保存した。
【０４８１】
ＡＴＰストック溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａ３３７７：１００ｍＭストック、１００×）を調製するために、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）及びＡＴＰ（０．０５５ｇ）を合わせ、１０μｌアリコートを−２０℃にて冷凍した。クレアチンリン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７９３６：１Ｍストック、１００×）を調製するために、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）及びクレアチンリン酸（０．２５５ｇ）を合わせ、１０μｌアリコートを−２０℃にて冷凍した。クレアチンキナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ３７５５：２．５ｍｇ／ｍｌストック、１００×）を調製するために、Ｈ２Ｏ（１ｍｌ）及びクレアチンキナーゼ（０．００２５ｇ）を合わせ、１０μｌアリコートを−２０℃にて冷凍した。ＡＴＰ生成系を調製するために、等しい割合の１００ｍＭ  ＡＴＰストック、１Ｍクレアチンリン酸、及び２．５ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼストック溶液（１００×）を、Ｈ２Ｏを使用して作製し、混合し、冷凍溶液として保存した。ＡＴＰ生成系は、使用時まで氷上で維持した。ＡＴＰ生成系（１．２μｌ）を、抽出物（４０μｌ）に添加し、溶液を攪拌により混合した。抽出物中のＡＴＰ生成系の最終濃度は、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭクレアチンリン酸、及び２５μｇ／ｍｌクレアチンキナーゼであった。
【０４８２】
有糸分裂期抽出物の調製
１バイアルの１５０〜２００万の細胞を解凍した。細胞を２つのＴ７５フラスコに分け、コンフルエントになるまで２日間増殖させた。６〜８のＴ７５フラスコ中で細胞を継代させ、コンフルエント状態まで増殖させた。細胞をトリプシン処理し、血球計算板を使用して数を数え、利用できる細胞数を全て使用して可能な限り多くのＴ１５０フラスコを使用してそれぞれに３百万の細胞を添加した。細胞系（例えば、一次線維芽細胞等の線維芽細胞、上皮細胞、又はＭＤＢＫ細胞等の不死化及び疾患のない細胞）を、７０〜８０％のコンフルエント状態で、標準的な手順を用いて０．５〜１μｇ／ｍｌノコダゾールで１７〜２０時間有糸分裂期に同調させた（例えば、Collasら, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999及び該文献中で引用される参考文献）。同調した細胞を有糸分裂振り落しにより回収した。片手でフラスコを繰返し叩くことにより、細胞を含む各フラスコを激しく振とうさせた。有糸分裂期細胞を分離し、培養培地に浮遊させた。回収した細胞を、５０ｍｌ円錐管中、５００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを、合計５０ｍｌの冷却リン酸緩衝化食塩水／Ｃａ／Ｍｇを含まないＰＢＳに再懸濁させた。所望であれば、いくつかの細胞ペレットを、単一の５０ｍｌ管にプールしてもよい。細胞を、５００×ｇで、１０分間、４℃にて遠心分離し、上記洗浄ステップを繰り返した。細胞ペレットの容量を測定し、細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＤＴＴ及びＰＭＳＦ）を含む約２０容量の氷冷細胞溶解緩衝液に再懸濁させた。
【０４８３】
次いで、５００×ｇで、５分間、４℃にて細胞を沈殿させた。上清を捨て、細胞ペレット容量を測定した。細胞ペレットを、全てのプロテアーゼ阻害剤を含む１容量のみの細胞溶解緩衝液に再懸濁させた。細胞を氷上で１時間インキュベートして、細胞を膨張させた。チップ超音波機を使用して、全ての細胞が破壊されて開くまで、細胞懸濁液を超音波処理した。細胞溶解を位相差顕微鏡の下でモニターした。次のステップに進むまでに、９０％の細胞が溶解していることが望ましい。超音波処理は、必要なだけ延長してよい。超音波処理時間は、抽出物を調製するために使用する細胞型に応じて異なる。あるいはまた、ガラス乳鉢及び乳棒（ホモジナイザー）を使用したダウンスホモジナイゼーションにより、望ましくは細胞の少なくとも９０％が溶解されるまで細胞を溶解させる。細胞溶解物を１．５ｍｌ遠心分離管に入れ、卓上冷蔵遠心分離機を使用し、約１５，０００×ｇで、１５分間、４℃にて遠心分離する。遠心分離機を、冷室又は冷蔵庫に入れて、平衡化させた。管を遠心分離機から取り出し、すぐに氷上に置いた。２００μｌピペットチップを使用して上清を注意深く回収した。この上清が、有糸分離期抽出物である。抽出物を、氷上にある別の管に入れた。いくつかの管から得た上清をプールした。
【０４８４】
この段階で２つの代替例が存在する。細胞抽出物を、氷上の管に、１本の管あたり４１μｌで等分した。抽出物をすぐに液体窒素中で瞬間冷凍させ、使用時まで−８０℃冷凍庫で保存した。１５，０００×ｇ遠心分離により調製したこのような抽出物を、ＭＳ１５（又は有糸分裂期細胞質抽出物）と呼ぶ。あるいはまた、ＭＳ１５抽出物を、（例えば、ＳＷ５５  Ｔｉローター；Ｂｅｃｋｍａｎに適合した）氷上の超遠心分離管に入れる。必要であれば、管の上まで鉱油を重ねて、超遠心分離の際に管が倒れるのを防ぐ。抽出物を、２００，０００×ｇで、３時間、４℃にて遠心分離して、ＭＳ１５に含まれる膜小胞を沈殿させた。遠心分離の終了時に、油を捨てた。上清を注意深く回収し、氷上の冷却１．５ｍｌ管に入れる。必要であれば、いくつかの上清を使用する。この上清をＭＳ２００（又は、有糸分裂期細胞質内抽出物）と称する。ＭＳ１５抽出物について記載したように、ＭＳ２００抽出物を等分及び冷凍する。
【０４８５】
クロマチン移植
クローン化手順の前日に、１００万の線維芽細胞で３５ｍｍ  Ｎｕｎｃを調製するか、又は５００，０００の細胞を含む６つのＴ７５フラスコを振り落しのために用意した。クローン化手順の朝、全てのフラスコに入った１５％ＦＢＳ照射完全培地を含むαＭＥＭを変えて、屑及び死滅細胞を除去した。細胞透過性化及び有糸分裂期抽出物反応を行う前に、ＳＬＯストック溶液の連続希釈（例えば、１×、０．５×、０．３×及び０．１×）、水浴中で約３８．５℃にて３０分間のインキュベート、次いでヨウ化プロピジウムでの染色により、８０〜９０％の細胞を透過性化するのに必要な最低濃度のＳＬＯを決定した。
【０４８６】
トリプシン又は細胞解離緩衝液を使用して、コンフルエント培養物、又は新たにトランスフェクトした細胞培養物から細胞を解離し、１５ｍｌ円錐管に入れ、及びハンク平衡化食塩水（Ｃａ／Ｍｇを含まない）（ＨＢＳＳ）を使用した遠心分離により１回洗浄した。細胞ペレットを１ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁させ、細胞を数えて濃度を測定した。約５０，０００〜１００，０００細胞を、１００μｌのＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、カタログ番号１４１７０−１２０）に室温にて懸濁させた。先に決定した濃度にある５μｌのＳＬＯストック溶液を添加した。混合液を約３８．５℃にて３０分間水浴中でインキュベートした。管を、インキュベーションの間、２〜３回優しく叩いて、確実に細胞を懸濁液中に維持させた。２００μｌ容量の室温ＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇを含まない）を添加し、ゆるやかなピペッティングによりよく混合した。細胞を、卓上遠心分離機中で、５００×ｇ、５分間、室温にて遠心分離した。全ての上清を捨てた。ペレットは小さく、はっきりと目に見えない可能性があった。
【０４８７】
ＡＴＰ生成系を含む４０μｌ容量の有糸分裂期抽出物を添加し、溶液をよく混合した。上記３０分間のインキュベーションの間に抽出物を調製した。１バイアルの４０μｌ抽出物を解凍し、１．２μｌのＡＴＰ生成系に添加した。溶液をよく混合し、室温に保った。混合液を３８．５℃にて水浴中、３０分間インキュベートし、管を時折優しく叩いた。５００μｌ容量の室温完全培地（αＭＥＭ＋１５％ウシ胎仔血清）を添加し、使用時まで蓋を開けたまま約３８．５℃インキュベーター中で保存した。細胞を、卓上遠心分離機において、５００×ｇ、５分間、室温にて遠心分離した。細胞ペレットを、１ｍｌの室温ＴＬ  Ｈｅｐｅｓに再懸濁させ、１５ｍｌ円錐管に移した。１ｍｌ容量の３ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ含有ＴＬ  Ｈｅｐｅｓ（濾過済み）を、細胞上の最終プロテアーゼ濃度である１．５ｍｇ／ｍｌまで添加し、混合液を３０秒間インキュベートした。１５ｍｌ円錐管を満たすようにＴＬ  Ｈｅｐｅｓを添加し、管に蓋をかぶせ、２３００ｒｐｍにて、５分間遠心分離した。ＴＬ  Ｈｅｐｅｓを細胞から除去し、１５０μｌのＴＬ  Ｈｅｐｅｓを細胞に添加した。適切な細胞系について管を標識化し、加温ステージに置いた。
【０４８８】
細胞を調製している時間の間、適切な大きさの細胞導入ピペットを使用する細胞導入のための操作ステーションを用意した。約５０の除核卵母細胞を、１００ｍｍ皿に入った重鉱油の下にある５０ｕｌ液滴のＴＬ  Ｈｅｐｅｓに入れた。洗浄した細胞を、除核卵母細胞と共に液滴に入れた。全ての卵母細胞へ遺伝的伝達するのに十分な細胞を使用した。操作ツールを立体的にブロックするほど多くの細胞を使用しないように注意した。１つの除核卵母細胞をホルダに置き、１つの細胞を帯下の卵黄周囲腔に入れ、細胞を卵母細胞の形質膜に接触させる。融合させ易くするため、細胞を、極体に隣接させるか、又は対向させた。全ての除核卵母細胞に細胞が導入された後、卵母細胞を液滴から取り出し、ＨＥＣＭ  Ｈｅｐｅｓの入った予め加温した３５ｍｍ皿に入れて、融合させた。
【０４８９】
結果
遺伝的伝達の前に膜を再封入していないドナー細胞についての以下の表１２の結果を、遺伝的伝達の前に膜を再封入したドナー細胞についての表１１に示す結果と比較すると、透過性にした細胞膜を再封入しないことによりクローン化効率の上昇が得られうることが示されている。さらに、表１２は、コンフルエント細胞の代わりにＧ１期にあるドナー細胞を使用することが、再構成卵母細胞及び得られる胚の生存可能性を高め得ることを実証する。表１１のデータは、ウシ一次線維芽細胞及びドナーウシ胎仔線維芽細胞から得た抽出物を使用して得た。ＭＤＢＫ細胞も上手く使用されて、再プログラム化抽出物を生成した。
【表１１】
2006505291.tif 000013
【０４９０】
【表１２】
2006505291.tif 000014
【実施例１８】
【０４９１】
キメラ哺乳動物の作出方法
哺乳動物をクローン化するために従来方法を使用して生じる多くの自然流産は、胎仔の問題よりも胎盤異常から生じると考えられている。従って、主に１つの由来源に由来する胎盤組織（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚、又は単為発生的に活性化された胚）と主に別の由来源（例えば、異種抗体をコードする核移植胚）に由来する胎仔組織を有するキメラ胚を作製するための方法を開発した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚、又は単為発生的に活性化された胚から得た細胞に主に由来する胎盤組織を有するキメラ胚は、天然型胎盤組織に似て、高い生存子孫作製率を生じることが好ましくあり得る。子孫の大部分の細胞は、核移植胚から得た細胞に由来し、従って、核移植胚に使用するドナー細胞のものと実質的に同じゲノムを有する。
【０４９２】
このような方法の１つでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚から得た細胞を、従来の核移植方法、又は本明細書に記載する任意の他のクローン化方法のいずれかを使用して作製した異種抗体をコードする緊密化胚の周囲（例えば、透明帯と胚自体との間）に注入する。代替的な方法では、緊密化前、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚から得た細胞を、本発明のクローン化方法の１つを使用して（例えば、再プログラム化クロマチン塊又は透過性化細胞をドナー由来源として使用して）作製した異種抗体をコードする緊密化前胚から得た細胞と、それぞれの胚から得た細胞が再構成されて単一のキメラ胚を生成させるような条件下で、インキュベートさせる（Wells及びPowell, Cloning 2:9-22, 2000）。両方の方法において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚から得た細胞が、胎盤に優先的に取り込まれ、核移植方法から得た細胞は胎仔組織に優先的に取り込まれる。これらの方法は、以下にさらに記載する。これらの結果は、異種抗体遺伝子を含まない核移植胚を使用して得られた。しかし、異種抗体遺伝子を含む及び／又はプリオン遺伝子に突然変異を含む核移植胚について同様の結果が予想される。
【０４９３】
Ｇ１線維芽細胞の単離
核移植胚を作製するためのドナー細胞としてＧ１線維芽細胞を単離するために、先に記載した「振り落し」方法を使用した（Kasinathanら, Nature biotech. 19:1176-1178, 2001）。簡単に説明すると、単離の２４時間前、５．０×１０５細胞を、１０ｍｌのα−ＭＥＭ及びＦＣＳを含む１００ｍｍ組織培養プレート上でプレート化した。翌日、プレートをＰＢＳで洗浄し、単離の１〜２時間前に培養培地を置き換えた。次いで、プレートを、Ｖｏｌｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ２（Fisher Scientific, Houston, TX, 中速）上で３０〜６０秒間振とうさせた。培地を除去し、５００×ｇで、５分間回転させ、ペレットを２５０μｌのＭＥＭ及びＦＣＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液は、細胞質橋により付着した新たに分裂した細胞二倍体、いくつかの単一細胞、及び中期又は後期細胞から構成されていた。細胞質橋により付着した細胞二倍体を、核移植のドナー細胞として使用した。
【０４９４】
核移植、活性化、及び胚培養
単離したＧ１線維芽細胞を使用した核移植手順を、本質的に先に記載されるように行った（Cibelliら, Nature Biotech. 16:642-646, 1998；Kasinathanら, Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2000）。成熟化の約１８〜２０時間後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟卵細胞を除核し、染色体除去を、ＵＶ光下のビスベンズイミド（Hoechst 33342, Sigma）標識化により確認した。２．４ｋＶ／ｃｍの単一の電気パルスを２０マイクロ秒間（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ操作機２００、Genetronics, San Diego, CA）使用して、これらのサイトプラスト−ドナー細胞対（couplet）を融合した。成熟の３０時間後、再構成された卵母細胞及び対照を、カルシウムイオノフォア（５μＭ）で４分間（Cal Biochem, San Diego, CA）、並びに１０μｇシクロヘキシミド及び２．５μｇサイトカラシンＤ（Ｓｉｇｍａ）を含むＡＣＭ培養培地（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、０．２７Ｍｍ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ乳酸ナトリウム、０．４ｍＭピルビン酸塩、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、３ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（脂肪酸を含まない）、１％ＢＭＥアミノ酸、及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸；全てＳｉｇｍａから入手）で６時間、先に記載されるように活性化した（Liuら, Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998；Presicceら, Mol. Reprod. Dev. 38:380-385, 1994）。活性化の後、卵を、ＨＥＰＥＳ緩衝化ハムスター胚培養培地（ＨＥＣＭ−ＨＥＰＥＳ、１１４ｍＭ  ＮａＣｌ、３．２ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ乳酸ナトリウム、０．１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、及び１％ＢＭＥアミノ酸；Ｓｉｇｍａ）で５回洗浄し、０．２ｍｌの胚テスト鉱油（Ｓｉｇｍａ）で覆われた、マウス胎仔線維芽細胞及び０．５ｍｌの胚培養培地を含む４ウェル組織培養プレート中で培養させた。２５〜５０胚を各ウェルに入れ、３８．５℃にて、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。４日目に、１０％ＦＣＳを培養培地に添加した。７及び８日目に、胚盤胞期への発達を記録した。
【０４９５】
ウシｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精
ウシｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚を作製するために先に記載されているように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を行った（Collasら, Mol. Reprod. Dev. 34:224-231, 1993）。４５％及び９０％等張パーコール勾配を、精子ＴＬストックで調製した（Parrishら, Theriogenology 24:537-549, 1985）。単体の雄牛から得た冷凍−解凍したウシ精子を、勾配の上に重ね、３０分間、７００×ｇにて遠心分離した（２０００ｒｐｍ、半径６．３７インチチップを使用）。ペレット中の精子の濃度を測定し、精子を精子ＴＬ（精子ＴＬストック、１ｍＭピルビン酸塩、６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、及び１％ＰＳ）に希釈し、受精時の最終濃度を１０６精子／ｍｌとした。成熟２２時間後、卵母細胞をＴＬ  ＨＥＰＥＳ中で３回洗浄し、６ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．２ｍＭピルビン酸塩、２０μＭペニシラミン、１０μＭ低タウリン（hypotaurine）、１ｍＭエピネフリン（epinepherin）（Leibfriedら, J. Reprod. Fertil. 66:87-93, 1982）及び０．００４μｇ／ｍｌヘパリンを含むＮｕｎｃウェルに入った４８０μｌの受精ＴＬ（Bavisterら, Biol. Reprod. 28:235-247, 1983）中に入れた。２０μｌの精子を５０の卵母細胞に添加して、１０６精子／ｍｌの最終濃度を得た。培養条件は、核移植について上述したものと同じであった。前核発生に基づく受精率は９０％を超えていた。
【０４９６】
キメラ核移植胚
８細胞期にあるｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚（６〜１２分割球）を、緊密化の前に、受精してから約９６時間後に回収した。透明帯をプロテアーゼ（ＴＬ−ＨＥＰＥＳ中３ｍｇ／ｍｌ）で除去した。解剖顕微鏡を使用して、帯溶解を注意深くモニターした。帯が最初に溶解し始めると（約２分）、胚を取り、ＴＬ−ＨＥＰＥＳで洗浄し、ハンク平衡化食塩水を含む３０ｍｍペトリ皿に移し、３７．５℃にて３０分間インキュベートした。これらの緊密化前胚からの分割球を、１００ｍｍペトリ皿に入った鉱油の下にあるＴＬ−ＨＥＰＥＳの小滴（５０μｌ）に移した。４日目の８〜１６細胞期にある核移植胚を選択し、分割球を含む同じ小滴に移した。これらの核移植胚は、緊密化前胚（例えば、８細胞期胚）及び緊密化胚（例えば、１６段階胚）の両方を含んでいた。次いで、標準的な微細操作技術を用いて、面取りマイクロピペット（直径３５μｍ）で、４〜６の分割球を核移植胚に移した。分割球を移した後、核移植胚について記載したように胚を培養した。
【０４９７】
７及び８日目、キメラ胚の胚盤胞への発達を評価した。胚盤胞は、核移植胚に注入する前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚から得た細胞に添加した膜染料ＤｉＩの存在についても分析した。細胞を４日目に標識化し、７日目に観察した。この染料は、元々染色された細胞の子孫におけるいくつかの細胞分割について維持され、いくつかの細胞分割後のキメラ胚の分析が可能であった。この分析に基づき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚から得た細胞をキメラ胚に取り入れた。所望であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚又は核移植胚のいずれかの核酸に特異的なプローブでの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、標準的な方法を使用して行ってもよい（例えば、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, pp. 14.7.1-14.7.12, 1995を参照）。このＦＩＳＨ分析を使用して、キメラ胚のそれぞれの胚から誘導された細胞の分布を決定（例えば、何パーセントの細胞が、内部細胞塊に取り込まれ、何パーセントが栄養外胚葉に取り込まれるのかを決定）できる（これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び胎仔中で培養されるか、胚から生成された子孫である）。あるいはまた、緑色蛍光タンパク質等のリポーター遺伝子を、胚の１つから得た細胞に添加して、胎盤及びキメラ胚の様々な胎仔組織への細胞の取り込みをモニターするのに使用できる。
【０４９８】
胚導入
７及び８日目、核移植胚及びキメラ核移植胚から誘導された第１級及び第２級の核移植胚盤胞を、６及び７日目の同調された出産経験のないレシピエント雌ウシに導入した。ルタライズ（Lutalyse）（Parmacia and Upjohn, Kalamazoo, MI）の一回注射によりレシピエントを同調させ、その後の発情期を検出した。核移植の３０及び６０日後に、レシピエントを、受胎産物の存在について超音波検査により検査し、その後、３０日毎、２４０日目まで直腸検査により検査した。キメラ胚、及びトランスジェニックウシ線維芽細胞と卵母細胞とを融合することにより作製される対照胚について４０日目の妊娠結果を、表１３で比較している。これらの結果は、多数のキメラ胚が４０日目まで生存したことを示す。
【表１３】
2006505291.tif 000015
【０４９９】
キメラ胚を作製するための代替的方法
標準的な方法を使用し、上記方法を改変して、キメラ胚を作製できる。例えば、天然胚を、哺乳動物（例えば、ウシ）から外科的に単離するか、又は標準的技術を使用して卵母細胞を単為発生的に活性化して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚の代わりに使用してもよい。所望であれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚又は単為発生的に活性化させた胚に由来するより少ない数の細胞（例えば、１、２、３、４又は５細胞）を核移植胚に注入して、胎仔組織に取り込まれる注入細胞及びそれらの子孫のパーセントを低くしてもよい。あるいはまた、より多くの細胞（例えば、６、７、８、９、１０、１１以上の細胞）を注入して、胎盤組織に取り込まれる注入細胞及びそれらの子孫のパーセントを上げてもよい。さらに、他の細胞期にある胚から得た細胞を使用できる。例えば、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２又はそれ以降の細胞期にあるｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚、又は単為発生的に活性化された胚を、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２又はそれ以降の細胞期で核移植胚に注入してもよい。注入した細胞及び核移植胚は、同じ細胞期又は異なる細胞期にある。一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚、又は単為発生的に活性化された胚は、核移植胚と比べて倍数性が高く（例えば、４ｎのＤＮＡ内容量）、これは、栄養外胚葉（すなわち、胎盤組織を主に形成する胚の細胞の最も外側にある層）への注入細胞をさらに偏らせる。所望であれば、透明帯の全体又は一部は、注入前に除去されるのではなく、注入細胞を囲んだままにしてもよい。
【０５００】
他の代替的方法では、緊密化前又は緊密化胚、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚、又は単為発生胚から得られた細胞を、緊密化前核移植胚から得た細胞と、それぞれの胚から得た細胞が単一のキメラ胚を生成するように再構成するような条件下で、インキュベートする（Wells及びPowell, Cloning 2:9-22, 2000）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精胚、天然胚、又は単為発生胚から得た細胞は、主に栄養外胚葉に、そして最終的に胎盤組織に寄与すると予想され、核移植胚から得た細胞は、主に内部細胞塊に、そして最終的に胎仔組織に寄与すると予想される。両方の胚から得た細胞は、同じ細胞期にあっても、異なる細胞期にあってもよく、核胚から得た同じか又は異なる数の細胞を合わせて、凝集胚を形成し得る。
【０５０１】
所望であれば、得られるクローン化胎仔又はクローン化子孫から得た細胞を、２ラウンド目の核移植に使用して、さらなるクローン化子孫を作製できる。初期クローン化胎仔又はクローン化子孫から得た細胞は、冷凍されて、さらなるクローン化有蹄動物の作製用のドナー細胞の由来源として使用される細胞系を形成してもよい。
【実施例１９】
【０５０２】
ヒトＩｇ発現の試験
異種抗体をコードするＨＡＣ又は他の核酸を保持する仔ウシの試験は、出生後直ぐに開始し、（１）異種Ｉｇ発現、（２）免疫感作への応答、（３）親和性成熟、及び（４）子孫へのＨＡＣの伝達、について評価することを含む。
【０５０３】
動物から採血し、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲ又はＦＡＣＳ分析によりヒト重鎖及び軽鎖発現の存在についてアッセイすることで、ヒトＩｇ発現をモニターしうる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３５７３５号参照）。動物がヒトＩｇを産生すると判断したら、アジュバントに入った破傷風トキソイドで動物を免疫感作する。免疫感作後、週に１度動物から採血し、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより抗原に対する応答を決定し、免疫感作前に回収した予備採血分と比較する。初回免疫感作の１ヵ月後、動物を水性形態の抗原で二次免疫感作する。二次免疫感作の１週間後、動物から採血し、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより抗原に対する応答を測定し、予備採血分と比較する。ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳアッセイにより、ほとんどの応答力価、及び産生した重鎖アイソタイプの測定が可能になる。このデータにより、抗体力価の増加、及びクラススイッチの発生を判断できる。平均親和性の推定値も測定して、抗原に対する応答の間に親和性成熟が生じるか否かを決定する。
【０５０４】
上述したようにトランスジェニックウシを得た後、それらを利用して、トランスジェニックＩｇを製造する（好ましくはヒトであるが、例えば、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、他の有蹄動物（ヒツジ、ブタ、ヤギ等）、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の他の種のものでもあり得る）。上記したように、Ｉｇ遺伝子は種の間で保存されていることが知られている。
【０５０５】
異種抗体を含有するトランスジェニック抗血清及び乳汁
ウシ（又は他の有蹄動物）は、内因的に曝露されるあらゆる抗原又は外因的に投与される抗原に対するトランスジェニック抗血清を産生する。例えば、抗原を有蹄動物に投与して、該抗原（病原体（例えば、細菌、ウイルス、原生動物、酵母又は菌類）、腫瘍抗原、受容体、酵素、サイトカイン等の抗原が挙げられる）に反応する所望の抗体を産生させることができる。抗体産生のための病原体の例としては、肝炎ウイルス（例えばＣ型肝炎）、免疫不全ウイルス（例えばＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、エンテロウイルス、エボラウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、ストレプトコッカス（例えば、肺炎球菌）、ヘモフィルス（Haemophilus）（例えば、インフルエンザ菌）、ナイセリア（例えば、髄膜炎菌）、ジフテリア菌、ヘモフィルス（例えば、Haemophilus pertussis）、クロストリジウム（例えば、ボツリヌス菌）、スタフィロコッカス、シュードモナス（例えば、緑膿菌）、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０５０６】
１つ以上の病原体を、トランスジェニック有蹄動物に投与して、特定の疾患の予防、安定化又は治療のために有用な超免疫血清を生成させてもよい。例えば、子供の呼吸器感染に関連する病原体を、トランスジェニック有蹄動物に投与して、これらの病原体（例えば、肺炎球菌、インフルエンザ菌、及び／又は髄膜炎菌）と反応する抗血清を生成させることができる。これらの病原体は、有蹄動物に投与する前に、場合により、（例えば、熱、又はホルムアルデヒド等の化学物質に曝すことにより）それらの毒性を低くするように処理してもよい。
【０５０７】
幅広いスペクトルのＩｇを製造するために、様々な病原体（例えば、複数の細菌及び／又はウイルス病原体）をトランスジェニック有蹄動物に投与してもよい。この超免疫血清を用いて、哺乳動物（例えば、ヒト）における感染を予防、安定化又は治療することができ、特に遺伝性又は後天性免疫不全を患う哺乳動物を治療するために有用である。
【０５０８】
さらに、本発明により製造された抗体を用いて、免疫系を抑制（例えば、神経障害を治療するため）、並びに特定のヒト細胞を除去し、また特定の分子をモジュレートしてもよい。例えば、抗イディオタイプ抗体（すなわち、他の抗体を阻害する抗体）、及びＴ細胞、Ｂ細胞又はサイトカインと反応する抗体は、自己免疫疾患又は神経障害（例えば、炎症による神経障害）を治療するのに有用であり得る。これらの抗体は、抗原を投与されていないトランスジェニック有蹄動物から得られるか、又はＢ細胞、Ｔ細胞若しくはサイトカイン（例えば、ＴＮＦα）等の抗原を投与されたトランスジェニック有蹄動物から得られる。
【０５０９】
抗原を投与されていないトランスジェニック有蹄動物が産生するトランスジェニック抗血清を用いて、ヒトポリクローナル抗体（好ましくはヒトＩｇＧ分子）を含む医薬を製造してもよい。これらのヒト抗体は、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）治療薬として、ヒトから単離された抗体の代わりに使用され得る。
【０５１０】
トランスジェニック抗血清は、場合により、１つ以上の目的の抗原と反応する抗体について富化され得る。例えば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley and Sons, 1995）に記載されるような標準的な技術を用いて、抗血清を精製してもよい。好適な精製方法としては、抗原又は抗体で被覆されたビーズを用いた沈降法、アフィニティクロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズアフィニティ精製、及びプレート結合抗原でのパンニング法が挙げられる。さらに、トランスジェニック抗血清を、１つ以上の目的の抗原と接触させて、抗体／抗原複合体の大きさの増大に基づき、抗原と結合する抗体を非結合抗体と分けてもよい。プロテインＡ及び／又はプロテインＧも、ＩｇＧ分子を精製するために使用され得る。内因性抗体の発現が失われていない場合、プロテインＡ及び／又はヒトＩｇ軽鎖λに対する抗体（Pharmingen）を用いて、所望のヒト抗体を、内因性有蹄動物抗体又は有蹄動物／ヒトキメラ抗体と分けてもよい。プロテインＡは、ウシＩｇ重鎖よりもヒトＩｇ重鎖に対してより高い親和性を有し、２つのヒト重鎖を含む所望のＩｇ分子を、１つ又は２つの有蹄動物重鎖を含む他の抗体と分けるために使用できる。ヒトＩｇ軽鎖λに対する抗体を用いて、２つのヒトＩｇλ鎖を有する所望のＩｇ分子を、１つ又は２つの有蹄動物Ｉｇ軽鎖を有するものと分けてもよい。追加的又は代替的に、有蹄動物Ｉｇ重鎖又は軽鎖に特異的な１つ以上の抗体をネガティブ選択ステップで使用して、１つ又は２つの有蹄動物重鎖及び／又は軽鎖を含むＩｇ分子を除去してもよい。
【０５１１】
得られる抗血清自体を、抗原に対する受動免疫法に使用してもよい。あるいはまた、抗血清は、診断的、予防的又は精製的（例えば、抗原の精製を実現する）用途を有する。
【０５１２】
あるいはまた、抗血清投与後、トランスジェニックウシからＢ細胞を単離して、ハイブリドーマ調製に使用してもよい。例えば、標準的技法を用いて、トランスジェニック有蹄動物に由来するＢ細胞を、ミエローマ細胞と融合して、目的のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製することができる（Mocikat, J. Immunol. Methods 225:185-189, 1999；Jonakら, Hum. Antibodies ハイブリドーマ 3:177-185, 1992；Srikumaranら, Science 220:522, 1983）。好ましいハイブリドーマとしては、トランスジェニック有蹄動物と同じ属又は種の哺乳動物に由来するＢ細胞とミエローマ細胞との融合により生成されるものが挙げられる。他の好ましいミエローマ細胞は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス又はヒトに由来するものである。この場合、特定の抗原に対する異種モノクローナル抗体を作るハイブリドーマが得られる。例えば、この技術を用いて、病原体に特異的な、（特定の人工染色体に依存して）ヒト、ネコ、イヌ等のモノクローナル抗体を製造することができる。所望の性質（すなわち、増強した結合親和性、アビディティー）を有する抗体を産生するハイブリドーマの選択方法は、周知である。
【０５１３】
あるいはまた、トランスジェニック有蹄動物由来のＢ細胞を遺伝子改変して、癌遺伝子（ｒａｓ、ｍｙｃ、ａｂｌ、ｂｃｌ２若しくはｎｅｕ等）を発現させてもよいし、又はトランスフォーミングＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルス（エプスタインバーウイルス若しくはＳＶ４０ウイルス等）に感染させてもよい（Kumarら, Immunol. Lett. 65:153-159, 1999；Knightら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1988；Shammahら, J. Immunol. Methods 160-19-25, 1993；Gustafsson及びHinkula, Hum. Antibodies ハイブリドーマ 5:98-104, 1994；Kataokaら, Differentiation 62:201-211, 1997；Chatelutら, Scand. J. Immunol. 48:659-666, 1998）。得られる不死化Ｂ細胞を使用して、理論的には無限の量の抗体を製造することもできる。またＩｇは有蹄動物の乳汁にも分泌されるため、有蹄動物乳汁も異種抗体の供給源として使用できる。
【０５１４】
他の実施形態
以上の説明から、本明細書に記載した本発明を変更及び改変して様々な用途及び状況に応用できることが明らかであろう。例えば、他のインキュベーション時間及び温度（２５、３０、３５、３７、３８，５若しくは４０℃、又はそれ以上若しくはそれ以下の温度など）を、膜の透過性化、ドナー遺伝物質の再プログラム化、膜の再封入、及び／又は遺伝物質の卵母細胞への移植に用いることができる。このような実施形態も本発明の範囲内にある。
【０５１５】
本明細書中で引用した文献はすべて、個々の文献又は特許出願をそれぞれ特定的かつ個別に援用したのと同様に、援用によりその内容が本明細書にふくまれているものとする。
【図面の簡単な説明】
【０５１６】
【図１Ａ−１】図１Ａは、Ｉｇノックアウト及びヒト人工染色体を含むウシを作製するのに使用する手順の概要である。
【図１Ａ−２】図１Ａは、Ｉｇノックアウト及びヒト人工染色体を含むウシを作製するのに使用する手順の概要である。
【図１Ｂ−１】図１Ｂは、内因性Ｉｇ遺伝子中に突然変異を含み、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣを含むウシを作製するのに使用する方法の概要である。
【図１Ｂ−２】図１Ｂは、内因性Ｉｇ遺伝子中に突然変異を含み、ΔＨＡＣ又はΔΔＨＡＣを含むウシを作製するのに使用する方法の概要である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明によるμ（ＩｇＭ重鎖）ノックアウト構築物を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ホルスタイン牛由来の免疫グロブリン遺伝子座の制限マップである。
【図３Ａ】図３Ａは、図３Ｃに示したμノックアウトＤＮＡ構築物を作製するのに使用した構築物「ｐＳＴｎｅｏＢ」の概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ｃに示したμノックアウトＤＮＡ構築物を作製するのに使用した、構築物「ｐＬｏｘＰ−ＳＴｎｅｏＢ」の概略図である。
【図３Ｃ】μノックアウトＤＮＡ構築物を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、μノックアウト構築物中の第１の相同性領域として使用したゲノムウシμ重鎖遺伝子座の１．５ｋｂ領域のポリヌクレオチド配列である（配列番号４７）。
【図３Ｅ】図３Ｅは、μノックアウト構築物中の第２の相同性領域として使用したゲノムウシμ重鎖遺伝子座の３．１ｋｂ領域のポリヌクレオチド配列である（配列番号４８）。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ピューロマイシン耐性ウシμ重鎖ノックアウト構築物の概略図である。
【図３Ｇ】図３Ｇは、ウシκ軽鎖ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列である（配列番号６０）。
【図４】図４は、ΔＨＡＣ及びΔΔＨＡＣの構築の概略図である。
【図５】図５は、ΔＨＡＣ胎仔中のヒト重鎖及び軽鎖をコードするゲノムＤＮＡの存在を示すアガロースゲルの写真である。
【図６】図６は、妊娠７７日目のΔＨＡＣ胎仔（胎仔＃５９９６）中のヒトＣμエキソン３及び４の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図７】図７は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中の内因性ウシ重鎖の再配列を示すアガロースゲルの写真である。
【図８】図８は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中の再配列ヒト重鎖の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図９】図９は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中のヒト重鎖遺伝子座由来のスプライシングされた定常領域の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図１０】図１０は、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６中の再配列ヒト重鎖の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６由来の再配列ヒト重鎖転写産物のポリヌクレオチド配列である（配列番号４９）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、この配列（Ｑｕｅｒｙ（問合せ））のある領域と、ヒト抗肺炎球菌抗体（Ｓｕｂｊｅｃｔ（対象））との配列アライメントである（それぞれ配列番号５０及び５１）。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６由来の再配列ヒト重鎖転写産物の追加のポリヌクレオチド配列（配列番号５２）、及びその推定アミノ酸配列（配列番号５３）である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ΔＨＡＣ胎仔＃５９９６由来の再配列ヒト重鎖転写産物の追加のポリヌクレオチド配列（配列番号５４）、及びその推定アミノ酸配列（配列番号５５）である。
【図１３】図１３は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５５８０が、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の両方を含むことを実証するアガロースゲルの写真である。
【図１４】図１４は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂが、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の両方を含むことを実証するアガロースゲルの写真である。
【図１５】図１５は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ中のヒト重鎖遺伝子座に由来するスプライスμ定常領域の発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図１６】図１６は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａ中のヒト重鎖遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図１７】図１７は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ及び５４４２Ｂ中のヒトＩｇλ遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図１８】図１８は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ中のヒトＩｇλ遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図１９】図１９は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５８６８Ａ中のヒトＩｇλ遺伝子座の再配列及び発現を示すアガロースゲルの写真である。
【図２０】図２０は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ由来の再配列ヒト軽鎖転写産物のポリヌクレオチド配列、及び対応する推定アミノ酸配列である（それぞれ、配列番号５６及び５７）。
【図２１】図２１は、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ由来の再配列ヒト軽鎖転写産物の別のポリヌクレオチド配列、及び対応する推定アミノ酸配列である（それぞれ、配列番号５８及び５９）。
【図２２ａ】図２２Ａ〜Ｈは、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ（図２２Ａ〜図２２Ｄ）及び５４４２Ｂ（図２２Ｅ〜図２２Ｈ）によるヒトλ軽鎖及びウシ重鎖タンパク質の発現のＦＡＣＳ分析のグラフである。
【図２２ｂ】図２２Ａ〜Ｈは、ΔΔＨＡＣ胎仔＃５４４２Ａ（図２２Ａ〜図２２Ｄ）及び５４４２Ｂ（図２２Ｅ〜図２２Ｈ）によるヒトλ軽鎖及びウシ重鎖タンパク質の発現のＦＡＣＳ分析のグラフである。
【図２３】図２３は、ピューロマイシン耐性遺伝子及び転写終結配列を、ウシ細胞中の内因性α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子に挿入するために使用する、α−（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼノックアウトベクターの概略図である。
【図２４】図２４は、ＡＡＶターゲッティングベクターの骨格として使用された、エキソン２、３及び４を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片の概略図である。
【図２５】図２５は、内因性ウシＩｇＨ配列を除去するために設計されたアデノ随伴ウイルス構築物の構造の概略図である。
【図２６】図２６は、適切なターゲッティング事象のために個々に形質導入されたクローンのＰＣＲ分析を示すアガロースゲルの写真である。
【図２７】図２７は、ＨＡＣ担持胚について妊娠率をまとめて示す表である。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｊは、Ｂ細胞の発育を抑制するために抗ウシＩｇＭ抗体（ｄａｓ６）を注射した実験胎仔又は対照胎仔のいずれかからの末梢血リンパ球のＦＡＣＳ解析の写真である。
【図２９Ａ】図２９Ａ及び２９Ｂは、ウシ移植前胚における核膜及び核マトリックスタンパク質の免疫検出を示す。図２９Ａは、同じ抗体を用いて試験した前核期及び８細胞期におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精ウシ胚の写真である。
【図２９Ｂ】図２９Ａ及び２９Ｂは、ウシ移植前胚における核膜及び核マトリックスタンパク質の免疫検出を示す。図２９Ｂは、ウシ線維芽細胞（上段）及び前核期胚（下段）のイムノブロッティング分析である。分子量マーカーは図２９Ｂの右側にｋＤａで示している。
【図３０】図３０は、未成熟クロマチン凝縮及び核移植胚における前核形成の過程における核膜、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５の動態を示す。
【図３１】図３１は、ＡＫＡＰ９５が、単為生殖胚と比較して、核移植胚の前核においてより強力に固定（存在）することを示すグラフである。
【図３２】図３２は、ラミンＡ／Ｃが核移植胚における前核再構成時に新規に転写されることを示している。
【図３３】図３３は、有糸分裂細胞質抽出物（Ｍ−Ｓ１５）、有糸分裂サイトゾル抽出物（Ｍ−Ｓ２００）、及び卵母細胞抽出物（ＭＩＩ−Ｓ１５）における染色体凝縮及び核膜の分解のグラフである（ｎ＝３００〜４００核、２〜５回の反復実験で試験した）。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、精製した導入ウシ線維芽細胞核（図３４Ａ）、及び有糸分裂サイトゾル抽出物で生成された凝縮クロマチン（図３４Ｂ）、及び卵母細胞抽出物（図３４Ｃ）の免疫蛍光分析の写真のセットである。
【図３５】図３５は、慣用の核移植法（ＮＴ）又は核注入法（ＮＩ）の後、及び本発明の方法を用いたクロマチン塊の卵母細胞への注入（ＣＴ）後に卵母細胞で得られる凝縮クロマチンの免疫蛍光分析の写真のセットである。
【図３６】図３６Ａ及び３６Ｂは、クロマチン移植、核移植、又は核注入から得られる前核の免疫蛍光分析の写真のセットである。
【図３７】図３７は、クローン化Ｔｃ仔ウシの作出手順の概要である。ＨＡＣの構築は、Ｉｇλ及びＩｇＨ遺伝子を含むｈＣｈｒ２２及びｈＣｈｒ１４領域、並びにｎｅｏ選択マーカーの位置を用いて示す。
【図３８】図３８Ａ〜３８Ｄは、Ｔｃ胎仔の分析を説明する。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｃは、クローン化Ｔｃ仔ウシの分析を示す写真である。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｂは、ウシ胎仔線維芽細胞（図４０Ａ）、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した前核及び８〜１６細胞期ウシ胚（図４０Ｂ）における、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５の免疫蛍光分布を示す。図４０Ｃは、ウシ線維芽細胞（Ｆｉｂ）及び前核胚（ＰＮ）における、ラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５のイムノブロッティング分析を示す。
【図４１】図４１Ａ〜４１Ｄは、ウシＮＴ胚における核エンベロープ、ＮｕＭＡ及びＡＫＡＰ９５の動態を示す。
【図４２】図４２Ａ〜４２Ｄは、ＣＴが、ラミンＡ／Ｃ及びＮｕＭＡを欠損する胚をもたらすことを示す。
【図４３】図４３Ａ〜４３Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドナー核の分解とＣＴによる再構成された前核におけるＴＢＰの局在の改変を示す。
【図４４Ａ】図４４Ａは、ネオマイシン耐性遺伝子を含む、本発明のプリオンタンパク質ノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｎｅｏベクター）の概略図である。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む、本発明のプリオンタンパク質ノックアウトベクター（ｐＢＰｒＰ（Ｈ）ＫＯｐｕｒｏベクター）の概略図、及び正確にターゲティングされたクローンを同定する手法を示す。
【図４４Ｃ】図４４Ｃは、種々のウシ線維芽細胞系における本発明のプリオンタンパク質ノックアウトベクターを用いたプリオンタンパク質遺伝子座での相同組換えの頻度を示す表である。
【図４５Ａ】図４５Ａは、ＮＴ及びＳＬＯＴ胚からの前核におけるラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＮｕＭＡ、ＡＫＡＰ９５、及びＤＮＡのレベルを示す写真である。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、図４５Ａからの蛍光強度のグラフである。
【図４６】図４６Ａ〜４６Ｄは、ＮＴ後の線維芽細胞核の動態を示す。
【図４７Ａ】図４７Ａ〜４７Ｃは、ＮＴ胚における前核の特性決定を示す。図４７Ａは、前核ＩＶＰ及びＮＴ胚、並びに１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／１ｍｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅＩ／３００ｍＭ ＮａＣｌでのｉｎ ｓｉｔｕ抽出後の線維芽細胞における、ＴＢＰ及びＤＮＡ（ヘキスト３３３４２）の免疫標識強度（平均±ＳＤ）の棒グラフである。
【図４７Ｂ】図４７Ｂは、本明細書に記載の（ｂ）のように、又は１０μｇ／ｍｌ ＣＨＸの存在下で（ｂ’）のように、又は５μｇ／ｍｌ ＡｃｔＤの存在下で（ｂ’’）のように活性化したＮＴ胚におけるマーカーの発現を示す写真である（ｎ＝３０個の胚／群、２〜３回試験）。
【図４７Ｃ】図４７Ｃは、図４７Ｂのように活性化した胚における、ヘキスト３３３４２（ＤＮＡ）蛍光において所定のタンパク質の免疫標識強度の比（平均±ＳＤ）の棒グラフである（ｎ＝１５〜２０個の胚／処理／マーカー）。
【図４８】図４８は、ＳＬＯＴ手順を示す。
【図４９Ａ】図４９Ａ〜４９Ｃは、有糸分裂抽出物における体細胞核分解の誘導を示す。図４９Ａは、有糸分裂抽出物がアポトーシスを誘導しないことを示す。
【図４９Ｂ】図４９Ｂは、ＡＴＰ再生系を含む（＋ＡＴＰ）又は含まない（−ＡＴＰ）有糸分裂抽出物における透過性化線維芽細胞の４５分間インキュベーション後のラミンＢ、ラミンＡ／Ｃ、ＴＢＰ及びＡＫＡＰ９５の免疫蛍光分析の写真である。
【図４９Ｃ】図４９Ｃは、間期線維芽細胞（レーン１）、１μｇ／ｍｌノコダゾールで有糸分裂期に同調化した線維芽細胞（レーン２）、ＡＴＰ再生系を含む若しくは含まない有糸分裂抽出物に（レーン３、４）又は間期抽出物に（レーン５）曝露した透過性化線維芽細胞から単離されたクロマチン、有糸分裂抽出物に曝露した透過性化線維芽細胞全体（レーン６）の免疫ブロッティング分析の写真である。
【図５０】図５０Ａ〜５０Ｄは、ＳＬＯＴ胚の核の特性決定を示す。
【図５１Ａ】図５１Ａ〜５１Ｅは、ＳＬＯＴ及びＮＴクローンの発育及び形態の評価を示す。図５１Ａは、ＮＴ及びＳＬＯＴクローンのｉｎ ｖｉｖｏでの発育の割合の棒グラフである。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、５〜６週齢におけるＳＬＯＴクローン（Simintal×Angusの交配同一雌）の写真である。
【図５１Ｃ】図５１Ｃは、個々のＳＬＯＴ及びＮＴ仔ウシ、並びに出生の２４時間以内の胎盤のスコアのグラフである。
【図５１Ｄ】図５１Ｄは、個々のＳＬＯＴ及びＮＴクローンの出生時体重のグラフである。
【図５１Ｅ】図５１Ｅは、ＳＬＯＴ及びＮＴクローンの仔ウシスコア、胎盤スコア、及び出生時体重のボックスプロット分析である。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５１Ｄ】
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【図５１Ｅ】
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【国際調査報告】
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