(57)【要約】本発明は、一段階リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）に関する新規試料調製、プローブ、プライマー対に関し、薬学的試料、化粧品試料、および非臨床試料における生きている細菌および/または真菌-酵母を普遍的に検出するための方法およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドが選択された標的領域を含む、細菌および/または真菌を含むことが疑われる試料において細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）の存在を判定する方法およびキットであって、以下の段階を含む方法およびキット：
（a）メンブレンおよび/またはDEAE樹脂を遠心分離した後DNアーゼと共にインキュベートすることによって、1000 mlまでの試料から細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を抽出する段階；
（b）チューブ1本の反応においてRTとPCRを組み合わせることができるように、細菌または酵母-真菌リボ核酸（RNA）を、Tth DNAポリメラーゼのようなRNA依存的逆転写酵素活性およびDNA依存的ポリメラーゼ活性を有する熱に安定な酵素と、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーと共に、リボヌクレオチド標的領域に対するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびcDNA合成のための該DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性を可能にする条件下でインキュベートする段階：
2006505275.tif 000014
；ならびに
（c）該DNAポリメラーゼと以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブとを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって、検出可能なレベルに生成されたcDNAを増幅する段階：
2006505275.tif 000015
【請求項２】
Tthポリメラーゼ様の酵素の逆転写酵素活性によって合成されたcDNA標的配列が、一段階リアルタイムRT-PCRによって同じチューブにおいてDNAポリメラーゼのDNA依存的ポリメラーゼ活性によって増幅される、請求項1記載の方法およびキット。
【請求項３】
細菌を検出する組成物が、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、請求項1または2記載の方法およびキット：
2006505275.tif 000016
【請求項４】
細菌を検出する組成物が、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、請求項1または2記載の方法およびキット：
2006505275.tif 000017
【請求項５】
細菌を検出する組成物が、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、請求項1または2記載の方法およびキット：
2006505275.tif 000018
【請求項６】
真菌-酵母を検出する組成物が、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、請求項1または2記載の方法およびキット：
2006505275.tif 000019
【請求項７】
真菌-酵母を検出する組成物が、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、請求項1または2記載の方法およびキット：
2006505275.tif 000020
【請求項８】
全ての細菌および/または真菌-酵母を検出するために用いられるプライマーおよびプローブの好ましい組み合わせが、以下の配列を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法およびキット：
2006505275.tif 000021
【請求項９】
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブが、核酸（DNAおよびRNA）にハイブリダイズすることができる天然の核酸またはペプチド核酸（PNA）である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法およびキット。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法およびキット、ならびに例えば大腸菌およびカンジダ種からの定量された外部標準RNAと比較するために定量されたRNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、薬学的試料、化粧品試料、および非臨床試料において認められる細菌および真菌-酵母を検出するための方法および試薬の分野に関する。
【０００２】
より詳しく述べると、本発明は、滅菌または非滅菌工業製品における生きている細菌および真菌-酵母を24時間未満で普遍的に検出するための一段階リアルタイムRT-PCRに関する試料の調製、プライマーの組、プローブの組、および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
混入物質および感染因子を認識するためのプライマーおよび/またはプローブとして、特異的ポリヌクレオチド配列、またはペプチド核酸を用いることは、問題のある増殖を必要とするアッセイ、肉眼的（コロニー）増殖特徴、顕微鏡形態学、染色反応、および生化学特徴に代わる貴重な代用法となりつつある。ほとんどの場合、これらの技術は産業用装置において実際に用いるためには遅すぎる。
【０００４】
例えば、1984年7月19日に公表されたPCT出願国際公開公報第84/02721号は、標的核酸配列を検出するためのハイブリダイゼーション技法において、リボソームRNA、転移RNA、または他のRNAを有する標的化核酸配列と相補的な核酸プローブを用いることを記述している。このアッセイは、既知のDNAハイブリダイゼーションアッセイより大きい感度および特異性を提供する可能性があるが、相補的プローブを用いる必要があるハイブリダイゼーション技法は、一般的に試験生物の培養に依存し、したがって、迅速な分析にとって不適切である。
【０００５】
これらのプローブは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）によって増幅されたRNAとハイブリダイズするために有用である。RT-PCRは、そのインビトロ培養が難しいか冗長である細菌および/または真菌-酵母からの少数のリボヌクレオチド標的を検出するために用いることができる強力なリボ核酸増幅技術である。RT-PCRは、検出するために生きている標本の存在を必要とする。その最も単純な形において、RT PCRは、特異的cDNA配列を酵素的に合成するためのインビトロ法である。RNA鎖とハイブリダイズして、標的cDNAにおいて対象領域に隣接する一つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、いくつかのcDNAを逆転写酵素によって合成する。鋳型の変性、プライマーのアニーリング、およびアニールしたプライマーのDNAポリメラーゼによる伸長を含むサイクルの繰り返しによって、その末端がプライマーの5'末端によって境界が定められる特異的断片が指数的に蓄積される。PCRは、特異的DNA配列を10倍を超えて12倍選択的に濃縮する。PCR法は、Saikiら、1985、Science 230：1350に記述され、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号（これらの参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる）の主題である。この方法は、鎌状赤血球貧血に関連するβ-グロビン遺伝子における異常な配列（Saikiら、1985、上記）およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）RNA（Byrneら、1988、Nuc. Acids. Res. 16：4165）の存在を検出するために用いられている。
【０００６】
滅菌または非滅菌工業製品における細菌または真菌-酵母によって引き起こされる汚染を首尾よく処理するためには、迅速かつ正確な検出が必要である。細菌および真菌-酵母の検出は従来、純粋培養の単離の後に、標本源、増殖の必要条件、視覚的（コロニー）増殖特徴、顕微鏡的形態、染色反応、および生化学特徴に関する知識を利用する同定技法を行うことによって行われてきた。
【０００７】
工業試料において細菌および真菌-酵母を24時間未満で検出するための、培養と同じ感度の迅速な診断法があれば、現在用いられている方法と比較して有意な改善となるであろうことは明らかである。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、滅菌および非滅菌製品における細菌および真菌-酵母を24時間未満で迅速に検出するための方法および試薬に関する。好ましい態様において、RNAの一段階逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応からの標的領域および得られた増幅DNAを、細菌または真菌-酵母の増幅DNAとハイブリダイズすることができるが、他の生物（哺乳類、植物、昆虫）、またはウイルスの増幅DNAとはハイブリダイズすることができないプローブによって処理する。
【０００９】
Tth DNAポリメラーゼは、RNA依存的逆転写酵素活性とDNA依存的ポリメラーゼ活性とを有し、1本の試験管での反応においてRTとPCRを組み合わせて、それによって細菌、真菌-酵母からのRNAの有無に関してさらに分析することができる熱に安定な酵素である。
【００１０】
一段階リアルタイム逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、本発明によって、ユーザーは迅速なRT-PCRを行うことができ、それによってRTとPCRとの間にチューブを開けることによる擬陽性のリスクがあるものの、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応増幅の際の蛍光をモニターすることによって、細菌および/または真菌-酵母からのRNA、および実験室における先の増幅反応により起こりうるPCR産物の環境的混入物からのRNAの存在を同時に検出および定量することが可能である。
【００１１】
発明の詳細な説明
このように、本発明の方法によって、先行技術の検出法を技術より迅速に細菌および/または真菌-酵母の存在を決定することができる。
【００１２】
一段階リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、本発明によって、ユーザーは迅速なRT-PCRを行うことができ、それによってRTとPCRとの間にチューブを開けることによる擬陽性のリスクがあるものの、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応増幅の際の蛍光をモニターすることによって、細菌および/または真菌-酵母からのRNA、および実験室における先の増幅反応により起こりうるPCR産物の環境的混入物からのRNAの存在を同時に検出および定量することが可能である。
【００１３】
試験する必要がある、または特定の対象リボ核酸配列、すなわち「標的配列」を含むことが疑われる試料を提供する。試料に含まれるリボ核酸をまず、cDNA（精製酵素としてTth DNAポリメラーゼのような酵素、オリゴヌクレオチドまたはPNAを用いて）に逆転写してから、当業者に既知の物理的手段を用いて変性させてもよい。鎖を分離するために好ましい物理的手段は、完全に（＞99％）変性されるまで核酸を加熱することを含む。熱安定DNAポリメラーゼを用いてRNA標的を増幅する方法は、1990年12月21日に提出されたPCT/US第90/07641号に記述され、参照として本明細書に組み入れられる。
【００１４】
次に、変性DNA鎖を同じチューブにおいて、プライマーが1本のDNA鎖に結合することができるハイブリダイゼーション条件で、選択されたオリゴヌクレオチドプライマーと共にインキュベートする。当技術分野で既知であるように、プライマーは、二本鎖配列に沿ったそれらの相対的位置が、一つのプライマーから合成された伸長産物がその相補体から分離された場合に、他のプライマーの伸長のための鋳型となって、既定の長さの複製鎖を生じるような位置にあるように選択される。
【００１５】
プライマーは、重合化のための物質の存在下で伸長産物の合成をプライミングするために十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源、および方法の使用を含む多くの要因に依存する。
【００１６】
本発明において用いるために好ましいオリゴヌクレオチドプライマーは、以下からなる群より選択される：
2006505275.tif 000002
一般的コード：Y＝（C/T）、R＝（A/G）、W＝（A/T）
【００１７】
次に、オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存的伸長を、適当な塩、金属陽イオン、およびpH緩衝系を含む反応培地において重合化物質（四つのデオキシリボヌクレオチド三燐酸（dATP、dGTP、dCTP、およびdTTP）の適当量の存在下で）によって触媒する。
【００１８】
合成産物は、標的配列が含まれる、鋳型鎖およびプライマー伸長鎖を有する二本鎖分子である。これらの産物は、次に、次の複製ラウンドの鋳型として作用する。第二ラウンドの複製において、第一のサイクルのプライマー伸長鎖をその相補的プライマーにアニールする；合成によって、プライマー配列またはその相補体が5'-および3'-末端の双方に結合する「短い」産物を生じる。変性、プライマーのアニーリング、および伸長のサイクルを繰り返すことによって、プライマーによって境界が定められる標的領域の指数的蓄積が起こる。核酸の標的領域を含むポリヌクレオチドの所望の量を得るために十分なサイクルを実行する。所望の量は、変化する可能性があり、産物であるポリヌクレオチドが提供する機能によって決定される。
【００１９】
PCR法は、全ての試薬を同時に一段階で加えるように行われる。
【００２０】
好ましい方法において、RT PCR反応は、Tthのような熱安定酵素を利用する自動プロセスとして行われる。
【００２１】
用いられる機器のタイプは、ロシュ・ディアグノスティクス（Roche Diagnostics、LigthCycler）、セフェイド（Cepheid、Smart Cycler、GeneXpert）、バイオラド（Biorad、Icycler）、コルベットリサーチ（Corbett Research、Rotoe-Gene）から市販されており、リアルタイムPCRアッセイおよび商業的用途のために開発された最も適した機器である。
【００２２】
当業者はまた、緩衝液のために用いられる水中に既に存在し、それによって非特異的増幅が起こる細菌からの核酸によるPCRの混入に関する問題を承知していると思われる。これらの問題を減少させる方法は、大きさが100 bpより大きいDNA鎖の断片を回避するために適切な濾過システムを用いることによって提供される。RT PCR反応において用いられる試薬は全て、使用前に処理しなければならない。
【００２３】
PCRによる増幅の間、高ストリンジェンシーから低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で、標的配列と安定なハイブリッドを形成するプローブポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって標的ポリヌクレオチドを直接検出してもよい。
【００２４】
プローブは典型的に、フルオレセインおよび誘導体系のような非放射性標識系によって標識する。
【００２５】
したがって、一つの態様において、本発明は、ポリヌクレオチドが選択された標的領域を含む、該細菌および/または真菌を含むことが疑われる試料における細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）の存在を決定するための方法およびキットであって、以下の段階を含む方法およびキットに関する：
（a）メンブレンおよび/またはDEAE樹脂上での遠心分離後DNアーゼと共にインキュベートすることによって、1000 mlまでの試料から細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を抽出する段階：
（b）細菌または真菌-酵母リボ核酸（RNA）を、1本のチューブの反応においてRTとPCRとを組み合わせることができる、Tth DNAポリメラーゼまたはTth DNAポリメラーゼのような酵素のような、RNA依存的逆転写酵素活性およびDNA依存的ポリメラーゼ活性を有する熱に安定な酵素と、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーと共に、リボヌクレオチド標的領域に対するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、およびcDNAを合成するための該ポリメラーゼまたはTthのような酵素の逆転写酵素活性を可能にする条件下でインキュベートする段階：
2006505275.tif 000003
；ならびに
（c）Tth DNAポリメラーゼのようなポリメラーゼ酵素と、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブとを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって検出可能なレベルで生成されたcDNAを増幅する段階：
2006505275.tif 000004
【００２６】
cDNA標的配列は、TthまたはTthのような酵素の逆転写酵素活性によって合成することができ、一段階リアルタイムRT-PCRによって同じチューブにおいてDNAポリメラーゼのDNA-依存的ポリメラーゼ活性によって増幅する。
【００２７】
より詳しく述べると、細菌を検出するための組成物は、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む：
2006505275.tif 000005
【００２８】
または、細菌を検出するための組成物は、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む：
2006505275.tif 000006
【００２９】
本発明はまた、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、細菌を検出するための組成物によって実践してもよい：
2006505275.tif 000007
【００３０】
本発明はまた、真菌-酵母を検出するための組成物が、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む、上記の方法およびキットにも関する：
2006505275.tif 000008
【００３１】
または、真菌-酵母を検出するための組成物は、以下の配列を有するポリヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む：
2006505275.tif 000009
【００３２】
全ての細菌および/または真菌-酵母を検出するために用いられるプライマーおよびプローブの好ましい組み合わせは、以下の配列を有する：
2006505275.tif 000010
【００３３】
上記のように、ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、核酸（DNAおよびRNA）とハイブリダイズすることができる天然の核酸またはペプチド核酸（PNA）であってもよい。
【００３４】
RNAはまた、定量して、例えば大腸菌およびカンジダ（Candica）種からの定量された外部標準RNAと比較してもよい。
【００３５】
さらなる特異性の例として、以下のプローブヌクレオチド塩基対データを提供する。本発明において用いるために好ましいオリゴヌクレオチドプローブは、以下からなる群より選択される：
2006505275.tif 000011
【００３６】
リバースプローブは、一段階RT PCRにおいて、cDNAが逆転写酵素によって合成される場合には、プローブはRNA配列域とハイブリダイズしないはずであることから用いることができない。
【００３７】
本発明の好ましいオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの配列は、rRNA遺伝子に基づく、様々な微生物からの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドrRNA遺伝子は、科学の文献に記述されている。例えば、万能細菌プローブは、Wilsonら、1990、J. Clinical Microbiology 28：1942〜1946、およびChemら、1989、FEMS Microbiology Letters 57：19〜24に記載されている。
【００３８】
属特異的および種特異的プローブの例は、Barryら、1990、Biotechnology 8：233〜236、Atlas and Bej、「PCR protocols：A guide to method and application」、399〜406頁、およびゲンプローブ国際特許出願国際公開公報第88/03957号（これらの参考文献は参照として本明細書に組み入れられる）において記述されている。本出願において請求される本発明は、検出される標的の範囲（全ての細菌-真菌-酵母）および適用範囲（臨床以外）がこれらの発明とは異なる。
【００３９】
様々な細菌-真菌-酵母感染症に関して、様々な病態、薬物、および抗生物質治療が推奨されていることから、万能細菌プローブ、グラム陽性およびグラム陰性プローブ、ならびに種または科特異的プローブを含む、rRNAプローブのパネルを用いることは、臨床的に有用な情報を提供するが、単一の万能細菌プローブは提供しない。
【００４０】
これらの先行特許において、万能細菌プローブは、陽性対照に限って用いられている。細菌-真菌-酵母に関する万能プライマーは、増幅産物のクローニングおよびシークエンシング、またはDNAチップ上でのハイブリダイゼーション後に同定するために用いられている。滅菌または非滅菌工業製品において生きている細菌および真菌-酵母を検出するための無菌性制御のためにrRNA標的を用いることは、本発明の前まで記述されていなかった。
【００４１】
細菌および真菌-酵母を一段階RT PCRによって検出するための好ましい万能プライマー対は、以下からなる群より選択される探索ヌクレオベース配列を含む：
2006505275.tif 000012
【００４２】
細菌および真菌-酵母を検出するために好ましい万能プローブは、以下からなる群より選択される探索ヌクレオベース配列を含む：
2006505275.tif 000013
【００４３】
本発明のプローブおよびプライマー対、方法およびキットは、試料中の全ての細菌および/または真菌-酵母が生きて検出されて、定量することができる、単純または複雑な一段階RT PCRアッセイにおいて用いるために特に適している。細菌および/または真菌-酵母のコロニー形成単位（CFU）の総数は、直接決定することができる。
【００４４】
以下の実施例は、本発明の様々な方法および化合物を説明すると意図される。
【００４５】
実施例1
単純な濾過によって試料を分析するための好ましい方法（濾過可能な液体）。遠心分離後にDNアーゼとのインキュベーションを行った場合の、1000 mlまでの試料からの細菌または真菌-酵母リボヌクレオチドの抽出の特異性。
【００４６】
1 − 液体試料（1000 mlまで）を、2000 gでの遠心分離（スイングローター）または真空ポンプによって、ポリカーボネートメンブレン（0.45μmまで）、PVDFメンブレン（0.45μmまで）、またはPESメンブレン（0.45μmまで）に通過させる。
【００４７】
酵素的溶解
2 − 酵素溶解緩衝液1 mlまでと共にフィルターを50 ml滅菌チューブに移して、35℃±2℃で1時間までインキュベートする。
3 − 液体（溶解緩衝液）を2000 gで5分間遠心分離する。
または機械的溶解
2 − 培地600μlに細菌および/または真菌-酵母を回収する。37℃±1℃で1時間までインキュベートする。
3 − 酸洗浄ガラスビーズ（直径100〜500μm）x mgおよび溶解緩衝液xμlを加える。ミキサーミルMM 300（Retsch）において細胞を最高速度で最大90分間破壊する。
【００４８】
4 − 溶解物を市販のキットによってRNA精製のために処理する。本発明者らの好ましいRNA抽出キットは、ワークステーションMagNaPure LC（商標）（ロシュディアグノスティクス）での「MagNaPure LC RNA単離キットII」である。溶出容積は最大100μlである。精製の際に、DNアーゼと共にインキュベーションを行う。
【００４９】
5 − 純粋なRNA抽出物2μl（5μlまで）を、Tthのような酵素およびタックマンプローブと共に以下のプログラムを用いて一段階リアルタイムRT-PCR（LightCycler（商標））のために用いる：
I：逆転写                 61℃/20分（20℃/秒）
II：変性                  95℃/30秒（20℃/秒）
III：PCR（35サイクル）    95℃/5秒（20℃/秒）
60℃/30秒（20℃/秒）
放出された蛍光を60秒の終了時に測定する。
【００５０】
6 − 純粋なRNA抽出物2μl（5μlまで）をTthのような酵素およびハイブリダイゼーションプローブと共に以下のプログラムを用いて一段階リアルタイムRT-PCR（LightCycler（商標））のために用いる：
I：逆転写                 61℃/20分（20℃/秒）
II：変性                  95℃/30秒（20℃/秒）
III：PCR（35サイクル）    95℃/2秒（20℃/秒）
58℃/8秒（20℃/秒）
72℃/16秒（20℃/秒）
放出された蛍光を8秒の終了時に測定する。
【００５１】
実施例2
遠心分離によって試料を分析する好ましい方法（濾過不可能な液体）。1000 mlまでの試料からの遠心分離による細菌または真菌-酵母リボヌクレオチドの抽出の特異性。
【００５２】
酵素的溶解
1 − 試料を11000 gで5分間遠心分離して、上清を捨てる。
2 − 溶解緩衝液xμlに沈殿物を再浮遊させる。攪拌して37℃±1℃で1時間までインキュベートする。
3 − 溶解緩衝液xμlを加える。攪拌して50℃±2℃で最大30分間インキュベートする。
または機械的溶解
1 − 試料を11000 gで5分間遠心分離して、上清を捨てる。
2 − 溶解緩衝液xμlに沈殿物を再浮遊させる。
3 − 酸洗浄ガラスビーズ（直径100〜500μm）x mgを加える。ミキサーミルMM 300（レッチュ）において細胞を最高速度で最大90分間破壊する。
【００５３】
4 − 溶解物を市販のキットによってRNA精製のために処理する。本発明者らの好ましいRNA抽出キットは、ワークステーションMagNaPure LC（商標）（ロシュディアグノスティクス）での「MagNaPure LC RNA単離キットII」である。溶出容積は最大100μlである。精製の際にDNアーゼと共にインキュベーションを行う。
【００５４】
5 − 純粋なRNA抽出物2μl（5μlまで）を、Tthのような酵素およびタックマンプローブと共に以下のプログラムを用いて一段階リアルタイムRT-PCR（LightCycler（商標））のために用いる：
I：逆転写                 61℃/20分（20℃/秒）
II：変性                  95℃/30秒（20℃/秒）
III：PCR（35サイクル）    95℃/5秒（20℃/秒）
60℃/30秒（20℃/秒）
放出された蛍光を60秒の終了時に測定する。
【００５５】
6 − 純粋なRNA抽出物2μl（5μlまで）をTthのような酵素およびハイブリダイゼーションプローブと共に以下のプログラムを用いて一段階リアルタイムRT-PCR（LightCycler（商標））のために用いる：
I：逆転写                 61℃/20分（20℃/秒）
II：変性                  95℃/30秒（20℃/秒）
III：PCR（35サイクル）    95℃/2秒（20℃/秒）
58℃/8秒（20℃/秒）
72℃/16秒（20℃/秒）
放出された蛍光を8秒の終了時に測定する。
【００５６】
実施例3
RNAの直接溶解およびジエチルアミノエチルセルロースDEAEメンブレンでの回収による、試料を分析するための好ましい方法（濾過不可能な液体）。DNアーゼとのインキュベーション後に溶解物をDEAEメンブレン上で遠心分離することによって、1000 mlまでの試料からの細菌または真菌-酵母リボヌクレオチドの抽出の特異性。
【００５７】
酵素的溶解
1 − 試料に溶解緩衝液x mlを加える。攪拌して35℃±2℃で1時間までインキュベートする。
2 − 溶解緩衝液x mlを加える。攪拌して50℃±2℃で最大30分間インキュベートする。
または機械的溶解
1 − 酸洗浄ガラスビーズ（直径100〜500μm）x mgおよび溶解緩衝液xμlを加える。
2 − ミキサーミルMM300（Retsch）において最高速度で最大90分間細胞を破壊する。
【００５８】
3 − 完全に溶解した後、大きさが10μmより大きい粒子を保持するためにプレフィルターメンブレン（ポリプロピレン10μm）に溶解物を加える。濾液には核酸が含まれる。
【００５９】
4 − 全ての核酸を保持するために予め洗浄したDEAEメンブレンに溶解物を加える。遠心分離してメンブレンを洗浄する。
【００６０】
5 − 遠心分離または真空ポンプによって塩（1 mlまで）を加えて、無菌的なのきれいなチューブにおいて核酸を回収する。
【００６１】
6 − 市販のキットによってRNA精製のために溶解物を処理する。本発明者らの好ましいRNA抽出キットは、ワークステーションMagNaPure LC（商標）（ロシュディアグノスティクス）での「MagNaPure LC RNA単離キットII」である。溶出容積は100μlまでである。精製の際にDNアーゼと共にインキュベーションを行う。
【００６２】
7 − 純粋なRNA抽出物2μl（5μlまで）を、Tthのような酵素およびタックマンプローブと共に以下のプログラムを用いて一段階リアルタイムRT-PCR（LightCycler（商標））のために用いる：
I：逆転写                 61℃/20分（20℃/秒）
II：変性                  95℃/30秒（20℃/秒）
III：PCR（35サイクル）    95℃/5秒（20℃/秒）
60℃/30秒（20℃/秒）
放出された蛍光を60秒の終了時に測定する。
【００６３】
8 − 純粋なRNA抽出物2μl（5μlまで）をTthのような酵素およびハイブリダイゼーションプローブと共に以下のプログラムを用いて一段階リアルタイムRT-PCR（LightCycler（商標））のために用いる：
I：逆転写                 61℃/20分（20℃/秒）
II：変性                  95℃/30秒（20℃/秒）
III：PCR（35サイクル）    95℃/2秒（20℃/秒）
58℃/8秒（20℃/秒）
72℃/16秒（20℃/秒）
放出された蛍光を8秒の終了時に測定する。
【配列表】
2006505275000001.app
【国際調査報告】
2006505275.tif 000022
2006505275.tif 000023
2006505275.tif 000024
2006505275.tif 000025
2006505275.tif 000026