(57)【要約】ＲＮＡ転写の前にサンプルから一本鎖オリゴヌクレオチドを除去し、それにより非鋳型由来のＲＮＡ生成を減らす方法が記述される。一つの態様として、ＲＮＡ転写の前に反応混合物から一本鎖オリゴヌクレオチドを除去するためにＲＮＡ転写の鋳型を含有するサンプルを１つもしくはそれ以上のエキソヌクレアーゼで処理する。別の態様として、ＲＮＡ転写の鋳型を含有するサンプルをサンプルに存在する一本鎖オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ、そして二本鎖オリゴヌクレオチドを形成するようにハイブリダイゼーションさせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルＲＮＡを逆転写酵素およびＲＮＡの５’末端に向かう方向に合成をプライミングするオリゴヌクレオチドプライマーとインキュベーションすることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成すること；
該一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに転化してｃＤＮＡ鋳型を含有する転写サンプルを生成せしめること；
該転写サンプルから一本鎖オリゴヌクレオチドを除去すること；ならびに
ＲＮＡポリメラーゼを用いて該ｃＤＮＡ鋳型をＲＮＡに転写すること
を含んでなるサンプル中のＲＮＡを増幅する方法。
【請求項２】
該除去することが、一本鎖オリゴヌクレオチドを少なくとも１つのエキソヌクレアーゼで消化することを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩ、ＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＴもしくはエキソヌクレアーゼＶＩＩである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩもしくはその組み合わせである請求項２に記載の方法。
【請求項５】
消化後にエキソヌクレアーゼを熱で殺すことをさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該除去することが、一本鎖オリゴヌクレオチドを相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳｐ６  ＲＮＡポリメラーゼである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のＲＮＡが組織サンプル中の複数の異なるＲＮＡ配列である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中のＲＮＡが単一のＲＮＡ配列である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプライマーがＴ７ｄＴ２１プライマー（配列番号：１）である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
転写されたＲＮＡを２回目の増幅に供することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
転写されたＲＮＡを２回目の増幅の前に精製することをさらに含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該除去することが、一本鎖オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼＩ、ＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶＩＩおよびその組み合わせよりなる群から選択される少なくとも１つのエキソヌクレアーゼで消化することを含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該除去することが、一本鎖オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩの水溶液で消化することを含んでなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
サンプルが哺乳類細胞からの全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを含有する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルがレーザー微量組織採取（ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
転写されたＲＮＡを標識で標識することもしくは転写されたＲＮＡから標識されたｃＤＮＡを合成することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
転写されたＲＮＡを蛍光、放射性、酵素、ハプテン、ビオチン、ジゴキシゲニンもしくはアミノアリル標識で標識することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
サンプル中のＲＮＡが真核生物細胞集団から得られるｍＲＮＡである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ転写の前にサンプルから一本鎖オリゴヌクレオチドを除去し、それにより非鋳型由来のＲＮＡ生成を減らすことによってポリヌクレオチド鋳型からのＲＮＡポリメラーゼに基づくＲＮＡ転写を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに基づく増幅系は、適切なプロモーター配列を保有する所定のＤＮＡ鋳型から数個のＲＮＡ分子を転写するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって核酸を増幅する。Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅキットのような高収量転写キットを用いて、１０００より多いＲＮＡコピーを単一の鋳型分子から生成することができる。この高収量は、非常に高濃度のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを有することにより、そして反応物を比較的長期間、すなわち、３〜１２時間インキュベーションすることにより得られる。そのような条件では、副反応が起こり得ることが示されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献４を参照）。これらはＲＮＡが生成される反応であるが、二本鎖ＤＮＡ鋳型の転写によってではない。そのような反応の例は、ＲＮＡ分子の自己プライミングであり、部分的に二本鎖のＲＮＡ分子もしくはキメラ配列および自己複製することができるＲＮＡ分子（すなわち、ＤＮＡ中間体なしにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより複製されるＲＮＡ分子）の生成をもたらす。そのような副反応は多くの理由で望ましくない：副反応は、所望の鋳型からの転写と競合し、従って、増幅効率を下げる可能性があり；キメラ配列は、マイクロアレイ解析のような方法による発現プロファイリングを狂わせる可能性があり；そして副生成物は、最終ＲＮＡ生成物のかなりの量を構成し、従って、特定のＲＮＡ生成物の量の測定を信頼できなくする可能性がある。
【０００３】
Ｔ７  ＲＮＡ増幅は、ＲＮＡからの、機能性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する二本鎖ｃＤＮＡ鋳型の生成、およびその後の転写を含む。一層高い増幅を得るために、投入ＲＮＡとして一回目に生成されるＲＮＡを用いて２回目のＴ７  ＲＮＡ増幅を行うことができる。２回のＴ７  ＲＮＡ増幅は、１回のＴ７  ＲＮＡ増幅よりかなり大いに実験アーチファクトに悩むことが当業者に知られている。これは典型的には、元のサンプルに任意のＲＮＡが存在するかどうかにかかわらず、サンプルに存在するＲＮＡの高分子量スミアーとして見られる。プロトコルに用いる精製方法により、任意の出発物質に関係なく、低分子量ＲＮＡも同様に見られ得る。
【０００４】
我々は、ある一本鎖オリゴヌクレオチドが、Ｔ７  ＲＮＡ転写ミックスに存在する場合に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの生成をもたらすことを見出した。これは、Ｔ７プロモーター配列もしくは二本鎖ＤＮＡを必要としない鋳型非依存性反応である。転写ミックスに存在する１２〜１８個のデオキシチミジン塩基からなるホモポリマーオリゴヌクレオチドはＲＮＡの生成をもたらし、一方、２０個のデオキシアデノシン塩基からなるオリゴヌクレオチドはもたらさない。Ｔ７プロモーター配列を含有しない二本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡの生成をもたらさない。従って、我々は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる一本鎖依存性、配列依存性、非鋳型依存性のＲＮＡ生成を見出した。２回のＴ７増幅において、１回目の転写反応中にこのメカニズムにより生成されるＲＮＡは２回目に増幅され、そして多量のＲＮＡを生成し得る。従って、第一の転写反応における鋳型非依存性のＲＮＡ生成を最小限に抑えることは重要である。
【０００５】
一続きのデオキシチミジン塩基を含有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端にＴ７プロモーター配列を保有するオリゴｄＴプライマーを用いてプライミングされる最初の逆転写反応からのキャリーオーバーの結果として転写反応物に存在し得る。Ｔ７  ＲＮＡ増幅プロトコルでは、最初にｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。次に、第二鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｔ７  ＲＮＡ転写の機能性鋳型を作製する。二本鎖ｃＤＮＡ鋳型を精製し、そして次にＴ７  ＲＮＡ転写ミックスにおいて転写する。ｃＤＮＡ合成をプライミングするのに用いるオリゴヌクレオチドは、通常は２１個の一続きのデオキシチミジン塩基、通常は２３塩基のＴ７コアプロモーター配列、およびプロモーター配列の５’末端をエキソヌクレアーゼ分解消化から保護するための２０〜２５塩基の長さの一続きの無関係な「バッファー」配列を含有する。従って、プライマー（Ｔ７ｄＴ２１）は、通常、６５〜７０塩基の長さである。この長さのオリゴヌクレオチドは、エタノール沈殿、シリカスピンカラムもしくはＹＭ−１００のようなＭｉｃｒｏｃｏｎ遠心分離精製膜のような精製工程により効率的に除かれない。これらは、Ｔ７  ＲＮＡ増幅に用いられる典型的な精製方法である。我々は、Ｔ７  ＲＮＡ転写の前にサンプルから一本鎖オリゴヌクレオチドを除去し、それにより転写反応における好ましくない非鋳型由来のＲＮＡ生成を抑制する方法を開発した。
【非特許文献１】Ａｒｎａｕｄ−Ｂａｒｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９８）２６：３５５０
【非特許文献２】Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｃｅ，Ｅｍｂｏ  Ｊ（１９９６）１５：３４５８
【非特許文献３】Ｃａｚｅｎａｖｅ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９４）９１：６９７２
【非特許文献４】Ｔｒｉａｎａ−Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９５）２７０：６２９８
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、サンプルＲＮＡを逆転写酵素およびＲＮＡの５’末端に向かう方向に合成をプライミングするオリゴヌクレオチドプライマーとインキュベーションすることにより一本鎖ｃＤＮＡを合成すること；該一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに転化してｃＤＮＡ鋳型を含有する転写サンプルを生成せしめること；該転写サンプルから一本鎖オリゴヌクレオチドを除去すること；ならびにＲＮＡポリメラーゼを用いて該ｃＤＮＡ鋳型をＲＮＡに転写することを含んでなるサンプル中のＲＮＡを増幅する方法に関する。ＲＮＡポリメラーゼは、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼもしくはＳｐ６  ＲＮＡポリメラーゼ、より好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである。オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはＴ７ｄＴ２１プライマーである。
【０００７】
一つの好ましい態様として、該除去することは、一本鎖オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼＩ、ＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＴもしくはエキソヌクレアーゼＶＩＩのような少なくとも１つのエキソヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩもしくはその組み合わせ、より好ましくはエキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩの水溶液で消化することを含んでなる。該方法は、消化後にエキソヌクレアーゼを熱で殺すことをさらに含んでなる。
【０００８】
別の好ましい態様として、該除去することは、一本鎖オリゴヌクレオチドを相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることを含んでなる。
【０００９】
好ましい態様として、サンプル中のＲＮＡは、組織サンプル中の複数の異なるＲＮＡ配列である。あるいはまた、サンプル中のＲＮＡは単一のＲＮＡ配列である。別の好ましい態様として、サンプルは哺乳類細胞からの全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを含有する。サンプル中のＲＮＡはまた、真核生物細胞集団から得られるｍＲＮＡであることもできる。特に好ましい態様として、サンプルはレーザー微量組織採取（ＬＣＭ）により得られる。
【００１０】
好ましい態様として、該方法は、好ましくは転写されたＲＮＡを精製した後に、転写されたＲＮＡを２回目の増幅に供することをさらに含んでなる。
【００１１】
ある好ましい態様として、該方法はまた、転写されたＲＮＡを標識、例えば蛍光、放射性、酵素、ハプテン、ビオチン、ジゴキシゲニンもしくはアミノアリル標識で標識することも含んでなる。あるはまた、該方法は、転写されたＲＮＡから標識されたｃＤＮＡを合成することをさらに含んでなる。
［発明の詳細な記述および好ましい態様］
本発明は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼおよびＳｐ６  ＲＮＡポリメラーゼのような、しかしこれらに限定されるものではない酵素を用いるＲＮＡポリメラーゼ転写の鋳型の調製を改善する方法を提供する。通常は二本鎖ＤＮＡである転写鋳型を含有する溶液は、高い頻度で、一本鎖オリゴヌクレオチドにより汚染される。これは、ＲＮＡを出発鋳型として用いた場合にｃＤＮＡ合成プライマーのキャリーオーバーの結果であり得る。
【００１２】
本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適当なサイズのものであることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、それらが所望の反応をなおプライミングすることができる限り、ＤＮＡ、キメラ混合物もしくは誘導体またはその改変バージョンであることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、それが所望の増幅反応をなおプライミングすることができる限り、塩基部分、糖部分もしくはリン酸バックボーンで改変することができ、そして他の付加基もしくは標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、非特異的核酸切断化学物質もしくは酵素または部位特異的制限エンドヌクレアーゼを用いる大きい核酸フラグメントの切断により、あるいは当該技術分野において既知である標準的な方法での合成により、例えば、自動ＤＮＡ合成機（ＢｉｏｓｅａｒｃｈおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているような）および標準的なホスホルアミダイト化学の使用により得ることができる。
【００１３】
一本鎖オリゴヌクレオチドの存在は、特にオリゴヌクレオチドが一続きのチミジン塩基を含有する場合に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ３  ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼによる非鋳型由来のＲＮＡ生成をもたらす。
【００１４】
本発明において、一本鎖オリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる一本鎖ＤＮＡの酵素消化によるかもしくは相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより転写の前にサンプルから除去される。
【００１５】
「エキソヌクレアーゼ」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを３’もしくは５’のいずれかの遊離末端から消化することができる酵素である。本発明において、好ましいエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡを消化することができる一本鎖特異的エキソヌクレアーゼである。適当なエキソヌクレアーゼの例には、エキソヌクレアーゼＩ、ＲｅｃＪｆ、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶＩＩが包含されるが、これらに限定されるものではない。これらの酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＵＳＢ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）のような業者から市販されている。これらの酵素は、単独でもしくは組み合わせて用いることができる。好ましい組み合わせは、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩである。
【００１６】
ＲＮＡポリメラーゼ転写の転写鋳型は、当該技術分野において既知である適当な技術によりＲＮＡから作製することができる。出発物質として用いるＲＮＡは、例えば、組織サンプルにおいて発現される全てのＲＮＡに相当する複雑なものもしくは一つの単一配列を有するＲＮＡのような単純なものであることができる。一例として（しかし、これに限定されるものではない）：逆転写をプライミングするための一続きのデオキシチミジン塩基を３’末端にそしてＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を５’末端に含有するｃＤＮＡ合成オリゴヌクレオチド、逆転写酵素および逆転写を促す条件におけるインキュベーションを用いてＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。次に、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドからの残余ＲＮＡオリゴマーにより、もしくはランダムプライマーのような外因性プライマーによりプライミングして、ＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに転化する。二本鎖ｃＤＮＡ鋳型は、転写の前に精製することができる。
【００１７】
本発明では、ＲＮＡポリメラーゼ転写の前に１つもしくはそれ以上のエキソヌクレアーゼを二本鎖鋳型に加える。エキソヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼＩもしくはエキソヌクレアーゼの組み合わせ、好ましくはエキソヌクレアーゼＩもしくはエキソヌクレアーゼＶＩＩを転写鋳型に加え、そして好ましくは２５〜４０℃の温度でもしくはより好ましくは約３７℃の温度で１〜６０分、好ましくは２〜３５分、もしくはより好ましくは４〜２０分の期間にわたってインキュベーションする。反応の容量は、好ましくは５〜２００μｌである。加えるエキソヌクレアーゼの量は、エキソヌクレアーゼＶＩＩでは、好ましくは、反応当たり０．１〜５０ユニット、より好ましくは０．２〜２０ユニット、もしくはさらにより好ましくは０．５〜１０ユニットであり、そしてエキソヌクレアーゼＩでは、好ましくは、反応当たり０．１〜２００ユニット、より好ましくは０．５〜５０ユニット、もしくはさらにより好ましくは１〜２０ユニットである。インキュベーション後に、エキソヌクレアーゼは、例えば５５〜１００℃、好ましくは６５〜９０℃、もしくはより好ましくは７０〜８０℃で十分な時間、例えば３０秒〜２０分、好ましくは１〜１０分、もしくはより好ましくは２〜５分間熱で殺すことにより不活性化される。あるいはまた、エキソヌクレアーゼは、例として（しかしこれらに限定されるものではない）、ＰＣＲｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）もしくは遠心分離フィルター膜（例えばＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））のような、シリカに基づくＤＮＡ精製スピンカラムを用いる二本鎖ｃＤＮＡの精製により除去することができる。
【００１８】
次に、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写鋳型を転写することができる。当該技術分野において既知である適当な酵素は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼである。Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から市販されているＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅキットのようなキットを用いることができる。典型的な反応物は、リボヌクレオチド（これらのいくつかもしくは全部は、標識（例えば、蛍光、放射性、酵素、ビオチン、もしくは抗体結合用のハプテン、もしくは染色を促進するためのアミノアリル）で改変することができる）、ＲＮＡ転写用の適当なバッファーおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼを含有する。反応物を適当な期間、通常は１〜１２時間インキュベーションする。得られるＲＮＡを１つもしくはそれ以上の適当な精製方法を用いて精製し、そして次に多数の用途に用いることができる。例として（しかし、これらに限定されるものではない）、増幅されたＲＮＡは、マイクロアレイおよびマクロアレイへのハイブリダイゼーション、ライブラリー構築、ライブラリースクリーニング、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ干渉実験、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）もしくはＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのＢｅａｄＡｒｒａｙのような微小球に基づくアレイへのハイブリダイゼーションに、そして卵母細胞注入におけるｍＲＮＡの発現に用いることができる。
【００１９】
別の態様として、一本鎖オリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチドを加えることによりＲＮＡポリメラーゼ転写の前に除去される。加えるオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによりそれを二本鎖にする。第二のオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは、第一のオリゴヌクレオチドの長さと同様であるが、必ずしも同一ではない。第二のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであることができる。それはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）およびロックド（ｌｏｃｋｅｄ）ＤＮＡのような改変されたバックボーンを含有することができる。それはビオチン、ジゴキシゲニンもしくはジニトロフェニルのような改変された塩基を含有することができる。加えるオリゴヌクレオチドの濃度は、第一のオリゴヌクレオチドのものの１〜１０，０００倍、好ましくは１〜１，０００倍、もしくはより好ましくは第一のオリゴヌクレオチドのものの１〜１００倍であることができる。
【００２０】
以下の実施例は、本発明ならびにその態様および利点のいくつかをさらに説明するために提供する。
［実施例］
【実施例１】
【００２１】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有する二本鎖鋳型なしでのＴ７  ＲＮＡ転写反応
全ての転写反応は、Ｔ７プロモーターを含有する二本鎖のＤＮＡ鋳型なしに行った。反応物は、２５μｌの全容量に２μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各１．５μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（全て、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から）ならびに１００ｎｇのポリイノシン酸（Ｓｉｇｍａ）を含有した。反応物を４２℃で３時間インキュベーションした。インキュベーション後に、１μｌのＤＮアーゼＩを各サンプルに加え、それを次に３７℃で１５分間インキュベーションした。１００ｎｇのポリイノシン酸を各反応物に加えた。次に、反応物をＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）で精製した。６μｌ（容量の１／５）のＲＮＡ生成物を１Ｍの尿素を含有する１％アガロースゲル上で泳動し、臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ光下で視覚化した。
【００２２】
異なる反応物において、三重反復で、Ｔ７  ＲＮＡ転写ミックスへの以下の添加を試験した：（１）１μｇのＴ７ｄＴ２１プライマー、すなわち、５’−ＴＣＴＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：１）；（２）オリゴ５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：２）、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：３）、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：４）、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：５）、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：６）、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：７）および５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：８）のミックスである、１μｇのオリゴｄＴ１２〜１８（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；（３）１μｇのＴ７ヘアピンオリゴ、すなわち、Ｔ７プロモーター部位が二本鎖であるがミスマッチしているヘアピンを形成するように５’末端に追加配列を有する、５’−ＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：９）；（４）１μｇのＴ７ｄＴ２１（配列番号：１）に加えて２０ｎｇの１ｋｂ  ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；（５）２０ｎｇの１ｋｂ  ＤＮＡラダー；（６）２回のＴ７  ＲＮＡ増幅に供した陰性コントロールサンプルにおいて生成される２０ｎｇのａＲＮＡ。
【００２３】
Ｔ７ｄＴ２１は、ＲＮＡ転写反応混合物における遊離Ｔ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチドの存在が、鋳型のない場合にＲＮＡの生成をもたらすかどうかを見るために試験した。オリゴｄＴ１２〜１８は、非鋳型由来のＲＮＡ生成が、Ｔ７ｄＴ２１で見られる場合に、機能性Ｔ７  ＲＮＡプロモーター部位の存在に依存するかどうかを見るために試験した。Ｔ７ヘアピンオリゴヌクレオチドは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位の破壊が、非鋳型由来のＲＮＡ生成を抑制するかどうかを見るために試験した。二本鎖ＤＮＡは、Ｔ７ｄＴ２１で見られる場合に、非鋳型由来のＲＮＡ生成を二本鎖ＤＮＡが抑制することができるかどうかを見るためにＴ７ｄＴ２１の存在下で試験した。二本鎖は、それが非鋳型由来のＲＮＡ生成を促進するかどうかを調べるためにそれ自体で試験した。最後に、２サイクルのＴ７  ＲＮＡ増幅後に陰性コントロール反応物において生成されるａＲＮＡは、ＲＮＡの複製型がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されるかどうかを見るために試験した（Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｃｅ，Ｅｍｂｏ  Ｊ（１９９６）１５：３４５８）。
【００２４】
図１は、ＲＮＡ生成物のアガロースゲル像を示す。転写反応ミックスへのＴ７ｄＴ２１の添加は、高分子量から低分子量におよぶスミアーとして明白な、ＲＮＡの生成をもたらした。また、５００ｂｐ未満の別個の低分子量バンドもあった。オリゴｄＴ１２〜１８の添加は同じパターンをもたらしたので、高分子量から低分子量にサイズがおよぶＲＮＡの生成は、機能性Ｔ７  ＲＮＡプロモーター部位に依存しなかった。しかしながら、オリゴｄＴ１２〜１８をＲＮＡ転写反応に加えた場合に低分子量バンドはなかった。ヘアピンＴ７オリゴヌクレオチドは、高分子量から低分子量までの範囲を有するＲＮＡの生成を有意には減少しなかったが、低分子量バンドの形成を減少した。二本鎖ＤＮＡの添加は、Ｔ７ｄＴ２１により促進される鋳型非依存性ＲＮＡの生成を抑制せず、またそれ自体でＲＮＡ生成を促進もしなかった。最後に、前の２回のＴ７  ＲＮＡ増幅反応から陰性コントロールサンプルにおいて生成されるＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡ転写ミックスに入れた場合にＲＮＡの生成を促進せず、これらの条件下でのＴ７  ＲＮＡ転写反応における複製型ＲＮＡの生成と相反した。
【００２５】
この実験は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが機能性鋳型、すなわち、二本鎖のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位を有する鋳型のない場合にＲＮＡを生成できることを示した。該反応は、一本鎖核酸、特に一本鎖オリゴヌクレオチドの存在により促進される。我々は、オリゴｄＴ１２〜１８もしくはＴ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチドに存在するもののような一続きの一本鎖デオキシチミジン塩基がこの反応を促進するのに十分であることを示した。生成されるＲＮＡは、非常に高い、＞２４，０００ヌクレオチドから低い、１０００ヌクレオチド未満までの分子量の範囲を有する。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位がオリゴヌクレオチドに存在する場合、別個の低分子量バンドが生成され、それは、Ｔ７プロモーター部位をミスマッチ二本鎖により破壊した場合に減少した。
【実施例２】
【００２６】
一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドの存在下でのＴ７  ＲＮＡ転写
全ての転写反応は、二本鎖のＴ７プロモーターを含有するＤＮＡ鋳型なしに行った。反応物は、２５μｌの全容量に２μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各１．５μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（全て、Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）から）を含有した。反応物を４２℃で３時間インキュベーションした。インキュベーション後に、０．５μｌのＤＮアーゼＩを各サンプルのアリコート（７μｌ）に加え、それを次に３７℃で１５分間インキュベーションした。次に、全アリコートを１Ｍの尿素を含有する１％アガロースゲル上で泳動し、臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ光下で視覚化した。
【００２７】
三重反復反応において、Ｔ７  ＲＮＡ転写ミックスに以下の添加を行った：（１）スクランブル配列を有する１μｇの２８ｍｅｒオリゴヌクレオチド：５’−ＧＣＴＧＡＣＴＣＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴ−３’（配列番号：１０）；（２）１μｇのｄＡ２０オリゴヌクレオチド（２０個のデオキシアデニン塩基、配列番号：１１）；（３）１μｇのＴ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチド（配列番号：１）；（４）１μｇのＴ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチド（配列番号：１）に加えて１μｇのｄＡ２０オリゴヌクレオチド、すなわち、５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’（配列番号：１１）。
【００２８】
我々は、Ｔ７  ＲＮＡ転写反応において、機能性鋳型のない場合に、ＲＮＡの生成を促進する一本鎖オリゴヌクレオチドの能力が配列依存性であることを示した。スクランブルオリゴはごく少量の生成ＲＮＡをもたらし、そしてｄＡ２０オリゴは検出可能なＲＮＡ生成をもたらさず、一方、Ｔ７ｄＴ２１オリゴは広範囲の長さの有意なＲＮＡ生成をもたらした。この反応は、存在する古典的な鋳型、すなわち、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの二本鎖のプロモーターを有するポリヌクレオチドがないという意味で鋳型非依存性である。しかしながら、これは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡ重合の鋳型としてオリゴヌクレオチドを用いることを除外しない。我々はまた、Ｔ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチドの３’末端の一続きのデオキシチミジン塩基を２０塩基のデオキシアデニンオリゴヌクレオチドヘのハイブリダイゼーションにより二本鎖にすることが、Ｔ７ｄＴ２１によりもたらされるＲＮＡの生成を劇的に減少することも示した。従って、これは鋳型非依存性、配列依存性そして一本鎖依存性の反応である。ｄＡ２０の添加は、この反応を抑制する方法を提供する。
【実施例３】
【００２９】
Ｔ７ｄＴ２１プライマーによりもたらされるＲＮＡ生成を制限するためにエキソヌクレアーゼを用いること
陰性コントロール反応におけるＲＮＡ生成をなくすことを目的として、１回目のＴ７  ＲＮＡ転写の前の一本鎖オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ消化の効能を試験するために２ｎｇの全ＲＮＡおよびブランク陰性コントロールから開始する２回のＴ７  ＲＮＡ増幅を用いた。陰性コントロール反応において生成されるＲＮＡは、本明細書において「バックグラウンドＲＮＡ」と称する。Ｔ７  ＲＮＡ増幅系を改善する過程で、我々は、バックグラウンドＲＮＡの生成が外因性汚染に依存しないようであることを突き止めた。むしろ、それは転写の前にＴ７  ＲＮＡ転写ミックスに存在するＴ７ｄＴ２１プライマーの量に依存するようである。
【００３０】
４つの条件を試験した：エキソヌクレアーゼなし、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩおよび最後にエキソヌクレアーゼＩとＶＩＩの混合物。各条件は、２ｎｇの全ラット脳ＲＮＡである２つの陽性サンプルおよびＲＮＡを含有しない２つの陰性サンプルを含んだ。全てのサンプルはまた、１００ｎｇのポリイノシン酸（Ｓｉｇｍａ）も含有した。
【００３１】
１回目：
第一鎖ｃＤＮＡ合成：各サンプルに、５０ｎｇのＴ７ｄＴ２１プライマー（配列番号：１）を加えた。混合物を７０℃で１０分間加熱し、そして次に氷上に置いた。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、１０μｌの容量で１００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４２℃で２時間行った。反応物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、５００μＭ  ｄＮＴＰおよび２０ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有した。反応は、７０℃で１０分間加熱することにより停止させた。
【００３２】
第二鎖ｃＤＮＡ合成：第二鎖ｃＤＮＡは、４０μｌの全容量で４μｌの１０ｘ  Ｂｓｔポリメラーゼバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１２ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、２．５Ｕの耐熱性ＲＮアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えることにより合成した。混合物を６５℃で１０分間インキュベーションし、続いてＤＮＡ合成を停止させるために８０℃で１０分間加熱した。次に、サンプルを４組の処理に供した：（１）エキソヌクレアーゼを加えない；（２）２０ユニットのエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、そしてミックスを３７℃で１０分間インキュベーションし、続いて８０℃で１０分間加熱した；（３）１０ユニットのエキソヌクレアーゼＶＩＩ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を反応物に加え、３７℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後に８０℃で１０分間加熱した；（４）２０ユニットのエキソヌクレアーゼＩおよび１０ユニットのエキソヌクレアーゼＶＩＩを反応物に加え、３７℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後に８０℃で１０分間加熱した。
【００３３】
全ての反応物に１００ｎｇのポリイノシン酸および２００μｌのＰＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、そしてミックスをＰＣＲｑｕｉｃｋ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で製造業者の使用法に従って精製した。ＤＮＡは、３０μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０において溶出した。
【００３４】
精製された二本鎖ｃＤＮＡをＳｐｅｅｄＶａｃにおいて１６μになるまで乾燥させ、そして次にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写した。４０μｌの全容量で、４μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各３μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、４μｌの０．１Ｍジチオスレイトールならびに４μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた。転写反応における全ての試薬は、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キットからであった。転写反応を４２℃で３時間実施し、そしてその後にＤｎアーゼＩ（２μｌ）処理を３７℃で１５分間続けた。ＱｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙキットでの精製の前にポリイノシン酸（１００ｎｇ）をサンプルに加えた。溶出されたＲＮＡをＳｐｅｅｄＶａｃにおいて８μｌになるまで乾燥させた。
【００３５】
２回目：
各サンプルに、０．５μｇのランダムヘキサマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた。ミックスを７０℃で１０分間変性させ、そして氷上で冷却した。ｃＤＮＡ合成は、インキュベーションを３７℃で１時間行ったことを除いて、上記のように行った。０．５μｌのＲｎアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を第一鎖反応物に加え、そして３７℃で２０分間インキュベーションした。９５℃で２分間加熱することにより反応を停止させ、そして氷上に置いた。次に、２５０ｎｇのＴ７ｄＴ２１プライマーを反応物に加え、７０℃で５分間、次に４２℃で１０分間加熱した。第二鎖ｃＤＮＡは、７５μｌの最終容量で１５μｌの５ｘ第二鎖ｃＤＮＡ合成バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．９、２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．７５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、１．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０Ｕのエシェリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．１ＵのＲｎアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによりエシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成した。混合物を３７℃で１０分間インキュベーションした。次に、５ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを混合物に加え、そして１６℃で１５分間インキュベーションした。１００ｎｇのポリイノシン酸および３７５μｌのＰＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を反応物に加えた。サンプルをＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で製造業者の使用法に従って精製した。ＤＮＡは、３０μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０において溶出した。二本鎖ｃＤＮＡをＳｐｅｅｄＶａｃにおいて８μｌになるまで乾燥させ、そしてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼで転写した。２５μｌ反応の容量で、２μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各１．５μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、２μｌの０．１Ｍジチオスレイトールならびに２μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた。転写反応を４２℃で３時間実施し、そしてその後にＤＮアーゼＩ処理（１μｌ）を３７℃で１５分間続けた。反応物をＱｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙキットを用いて精製した。精製されたＲＮＡ生成物のアリコート（４８μｌのうち２μｌ）を１Ｍの尿素を含有する１％アガロースゲル上で解析した。
【００３６】
図３に提供するゲル像は、２回のＴ７  ＲＮＡ増幅が陰性コントロール反応においてＲＮＡの生成をもたらしたことを示す。このバックグラウンドＲＮＡは、非常に高分子量から数百塩基までの一連の分子量を有した。エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＶＩＩは両方とも、バックグラウンドＲＮＡの量を減らすことに効果的であった。これらのエキソヌクレアーゼの組み合わせは、最も効果的な溶液であるようであった。
【００３７】
該データは、この場合は最初の第一鎖ｃＤＮＡ合成段階からサンプルに残っているＴ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチドと思われる一本鎖オリゴヌクレオチドの消化が、２回のＴ７  ＲＮＡ増幅におけるバックグラウンドＲＮＡの生成を劇的に減少することを示す。この方法におけるバックグラウンドＲＮＡの除去は、増幅サンプルからアーチファクトＲＮＡを除くことにより増幅ＲＮＡの純度を向上する。
【実施例４】
【００３８】
Ｔ７ｄＴ２１プライマーによりもたらされるバックグラウンドＲＮＡを制限するためのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩの滴定
陰性コントロール反応におけるバックグラウンドＲＮＡをなくす目的で１回目のＴ７  ＲＮＡ転写の前に一本鎖オリゴヌクレオチドを消化するのに必要なエキソヌクレアーゼの量を滴定するために２ｎｇの全ＲＮＡおよびブランク陰性コントロールから開始する２回のＴ７  ＲＮＡ増幅を用いた。
【００３９】
３つの濃度のエキソヌクレアーゼ混合物を試験した：（１）反応当たり、それぞれ、２０および１０ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩ；（２）反応当たり、それぞれ、１０および５ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩ；（３）反応当たり、それぞれ、２および１ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩ。各条件は、２ｎｇの全ラット脳ＲＮＡである２つの陽性サンプルおよび水を含有する２つの陰性サンプルを含んだ。全てのサンプルはまた、１００ｎｇのポリイノシン酸（Ｓｉｇｍａ）も含有した。
【００４０】
１回目：
第一鎖ｃＤＮＡ合成：各サンプルに、５０ｎｇのＴ７ｄＴ２１プライマー（５’−ＴＣＴＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’、配列番号：１）を加えた。混合物を７０℃で１０分間加熱し、そして次に氷上に置いた。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、１０μｌの容量で１００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて４２℃で２時間行った。反応物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、５００μＭ  ｄＮＴＰおよび２０ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有した。反応は、７０℃で１０分間加熱することにより停止させた。
【００４１】
第二鎖ｃＤＮＡ合成：第二鎖ｃＤＮＡは、４０μｌの全容量で４μｌの１０ｘ  Ｂｓｔポリメラーゼバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１２ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および２．５Ｕの耐熱性ＲＮアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えることにより合成した。混合物を６５℃で１０分間インキュベーションし、続いてＤＮＡ合成を停止させるために８０℃で１０分間加熱した。次に、サンプルを４組の処理に供した：（１）エキソヌクレアーゼを加えない；（２）反応当たり、それぞれ、２０および１０ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩを加え、そしてミックスを３７℃で１０分間インキュベーションし、続いて８０℃で１０分間加熱した；（３）それぞれ、１０および５ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩを反応物に加え、３７℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後に８０℃で１０分間加熱した；（４）それぞれ、２および１ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩを反応物に加え、３７℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後に８０℃で１０分間加熱した。
【００４２】
全ての反応物に１００ｎｇのポリイノシン酸および２００μｌのＰＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を加え、そしてミックスをＰＣＲｑｕｉｃｋ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で製造業者の使用法に従って精製した。ＤＮＡは、３０μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０において溶出した。
【００４３】
サンプルは、１０μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各７．５μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、１０μｌの０．１Ｍジチオスレイトールならびに６μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌの全容量で転写した。転写反応における全ての試薬は、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キットからであった。転写反応を４２℃で３時間実施し、そしてその後にＤｎアーゼＩ（２μｌ）処理を３７℃で１５分間続けた。ＱｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙキットでの精製の前にポリイノシン酸（１００ｎｇ）をサンプルに加えた。溶出されたＲＮＡをＳｐｅｅｄＶａｃにおいて４．５μｌになるまで乾燥させた。
【００４４】
２回目：
各サンプルに、０．５μｇのランダムヘキサマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた。ミックスを７０℃で１０分間変性させ、そして氷上で冷却した。ｃＤＮＡ合成は、インキュベーションを３７℃で１時間行ったことを除いて、上記のように行った。０．５μｌのＲｎアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を第一鎖反応物に加え、そして３７℃で２０分間インキュベーションした。９５℃で２分間加熱することにより反応を停止させ、そして氷上に置いた。次に、２５０ｎｇのＴ７ｄＴ２１プライマーを反応物に加え、７０℃で５分間、次に４２℃で１０分間加熱した。第二鎖ｃＤＮＡは、７５μｌの最終容量で１５μｌの５ｘ第二鎖ｃＤＮＡ合成バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．９、２３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．７５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４）、１．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０Ｕのエシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．１ＵのＲｎアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることによりエシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成した。混合物を３７℃で１０分間インキュベーションした。次に、５ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを混合物に加え、そして１６℃で１５分間インキュベーションした。１００ｎｇのポリイノシン酸および３７５μｌのＰＢバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を反応物に加えた。サンプルをＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で製造業者の使用法に従って精製した。ＤＮＡは、３０μｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０において溶出した。ＤＮＡを１６μｌまで濃縮し、そして４μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各３μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、４μｌの０．１Ｍジチオスレイトールならびに４μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する４０μｌの全容量で転写した。転写後に、サンプルを１μｌのＤＮアーゼＩと３７℃で１５分間インキュベーションした。得られるＲＮＡをＲｎｅａｓｙキットを用いて精製した。精製されたＲＮＡ生成物のアリコート（４８μｌのうち２μｌ）を１Ｍの尿素を含有する１％アガロースゲル上で解析した。
【００４５】
図４におけるゲル像は、それぞれ、２および１ＵのエキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩが陰性コントロールにおけるバックグラウンドＲＮＡの生成を効果的に減少したことを示す。
【実施例５】
【００４６】
ＬＣＭサンプルの２回のａＲＮＡ増幅
ＬＣＭサンプルからのＲＮＡ抽出：
レーザー微量組織採取（ＬＣＭ）サンプルにより得られるサンプルを２００ｎｇのポリイノシン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する１０μｌのＲＬＴ／β−ＭＥ溶液に入れる。ＲＬＴ／β−ＭＥ溶液は、ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の各ｍｌに１０μｌのβ−ＭＥを加えることにより調製する。サンプルを４２℃で２０分間インキュベーションし、そして氷上で冷却する。エタノール（１００％、１０μｌ）をサンプルに加え、そして短時間混合する。サンプルを氷上に１０分間放置する。Ｚｙｍｏスピンカラム（Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を２ｍｌのコレクションチューブに置き、そしてサンプル混合物をカラムに移す。チューブを有するカラムを微量遠心分離機においてフルスピードで１５秒間回転させる。カラムにＲＰＥ（２００μｌ）を加え、続いてフルスピードで１分間遠心分離機にかけることによりカラムを２回洗浄する。カラムを新しい１．５ｍｌチューブに置き、次に１０μｌの水をＺｙｍｏスピンカラムの膜に直接（加える？）。５分後に、カラムをフルスピードで１分間回転させることによりＲＮＡを溶出する。ＲＮＡ溶出液をスピード真空（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃｕｕｍ）により４μｌに調整する。
【００４７】
１回目のａＲＮＡ増幅：
第一鎖ｃＤＮＡ合成：各サンプルに５０ｎｇのＴ７ｄＴ２１プライマー（５’−ＴＣＴＡＧＴＡＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号：１）、ＰＡＧＥ精製する、Ｑｉａｇｅｎ）を加える。サンプル混合物を６５℃で５分間加熱し、そして次に氷上で冷却する。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、１０μｌの容量で１００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて４２℃で２時間行う。反応物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、５００μＭ  ｄＮＴＰ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）および２０ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含有する。
【００４８】
第二鎖ｃＤＮＡ合成：第二鎖ｃＤＮＡは、２０μｌの全容量で６５℃で１０分間合成する。第一鎖ｃＤＮＡ（１０μｌ）に、１μｌの１０ｘ  ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、８ＵのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および２．５Ｕの耐熱性ＲＮアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加える。混合物を８０℃に３分間インキュベーションし、そして４ユニットのエキソヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および２ユニットのエキソヌクレアーゼＶＩＩ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を反応物に加え、そして３７℃で１０分間インキュベーションする。反応物を８０℃に３分間加熱し、そして氷上で冷却する。次に、この生成物を精製せずに次の転写反応物に加える。
【００４９】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでの転写：１００μｌの全容量で、８μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各６μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、８μｌの０．１Ｍジチオスレイトールならびに８μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる。転写反応における全ての試薬は、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＡｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）から得られる。転写反応を４２℃で３時間実施し、その後にＤｎアーゼＩ（４μｌ）処理を３７℃で１５分間続ける。
【００５０】
ａＲＮＡ精製：
ポリイノシン酸（１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）、ＲＬＴ／β−ＭＥ（３５０μｌ）および１００％  ＥｔＯＨ（２５０μｌ）をサンプルに加える。Ｚｙｍｏスピンカラムをコレクションチューブに置き、そしてサンプル混合物をカラムに移す。カラムをフルスピード（＞１０，０００ｇ）で１０〜１５秒間遠心分離し、そして素通り画分を捨てる。カラムに７００μｌのＲＰＥを加え、続いてフルスピードで１５〜６０秒間回転させることによりカラムを２回洗浄する。１０μｌのＲｎアーゼフリーの水をカラムマトリックスに直接加え、そしてフルスピードで１分間回転させることによりａＲＮＡを溶出する。溶出液を２回目の増幅用に４μｌになるまで乾燥させる。
【００５１】
２回目のａＲＮＡ増幅：
各サンプルに、０．５μｇのランダムヘキサマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を加える。混合物を６５℃で５分間変性させ、そして氷上で冷却する。ｃＤＮＡ合成は、インキュベーションを３７℃で１時間行うことを除いて、上記のように実施する。ＲｎアーゼＨ（０．５μｌ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を第一鎖反応物に３７℃で２０分間加える。９５℃で２分間加熱することにより反応を停止させ、そして次に氷上で冷却する。次に、２５０ｎｇのＴ７ｄＴ２１プライマーを反応物に加え、それを最初に７０℃で５分間加熱し、そして次に４２℃で１０分間インキュベーションする。第二鎖ｃＤＮＡは、４０μｌの最終容量で３μｌの１０ｘ反応バッファー（５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ）、１．５μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２０Ｕのエシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および５ＵのＲｎアーゼＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加えることによりエシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成する。混合物を３７℃で１０分間インキュベーションし、続いて８０℃に３分間加熱する。二本鎖ｃＤＮＡ鋳型は、１００μｌの全容量で８μｌの１０ｘ  Ｔ７転写バッファー、各６μｌのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ、８μｌの０．１Ｍジチオスレイトールならびに８μｌのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加えることにより転写する。転写反応を４２℃で３時間実施し、その後にＤＮアーゼＩ処理（４μｌ）を３７℃で１５分間続ける。ＱｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙキットを用いることにより反応物を精製し、そして精製されたＲＮＡ生成物のアリコート（４８μｌのうち２μｌ）を１Ｍの尿素を含有する１％アガロースゲル上で解析する。
【００５２】
上記の詳細な記述および好ましい態様ならびに実施例は、本発明ならびにその様々な特徴および利点を説明するために提供されているが、本発明は、特許法の原則下で適切に解釈されるように前述のものによってではなく下記の請求項により定義されると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】機能性鋳型のない場合の、そしてレーン１〜３、Ｔ７ｄＴ２１オリゴヌクレオチド；レーン４〜６、オリゴｄＴ１２〜１８；レーン７〜９、ヘアピンＴ７オリゴヌクレオチド；レーン１０〜１２、Ｔ７ｄＴ２１および１ｋｂ  ＤＮＡラダー；レーン１３〜１５、１ｋｂラダー；レーン１６〜１８、２回のＴ７  ＲＮＡ増幅後の陰性コントロール反応からのａＲＮＡの存在下でのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写反応のアガロースゲル像を示す。ゲルの両側のラダーは、５００ｂｐ〜１２，２００ｂｐの間の長さを有する１ｋｂ二本鎖ＤＮＡラダーである。
【図２】機能性二本鎖鋳型のない場合の、そしてレーン１〜３、スクランブルオリゴ；レーン４〜６、ｄＡ２０オリゴ；レーン７〜９、Ｔ７ｄＴ２１オリゴ；レーン１０〜１２、Ｔ７ｄＴ２１に加えてｄＡ２０の存在下でのＴ７  ＲＮＡ転写反応からのＲＮＡ生成物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図３】２回のＴ７  ＲＮＡ増幅からのＲＮＡ生成物のゲル像を示す。レーン：１〜２、エキソヌクレアーゼ処理なしの陰性コントロール；３〜４、エキソヌクレアーゼ処理なしの２ｎｇの全ＲＮＡ；５〜６、エキソヌクレアーゼＩで処理した陰性コントロール；７〜８、エキソヌクレアーゼＩで処理した２ｎｇの全ＲＮＡ；９〜１０、エキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した陰性コントロール；１１〜１２、エキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した２ｎｇの全ＲＮＡ；１３〜１４、エキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩで処理した陰性コントロール；１５〜１６、エキソヌクレアーゼＩおよびＶＩＩで処理した２ｎｇの全ＲＮＡ。
【図４】ＲＮＡ生成物のゲル像を示す。レーン１〜２、エキソヌクレアーゼ処理なしの陰性コントロール；３〜４、エキソヌクレアーゼ処理なしの２ｎｇの全ＲＮＡ；５〜６、２０ＵのエキソヌクレアーゼＩおよび１０ＵのエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した陰性コントロール；７〜８、２０ＵのエキソヌクレアーゼＩおよび１０ＵのエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理し２ｎｇの全ＲＮＡ；９〜１０、１０ＵのエキソヌクレアーゼＩおよび５ＵのエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した陰性コントロール；１１〜１２、１０ＵのエキソヌクレアーゼＩおよび５ＵのエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した２ｎｇの全ＲＮＡ；１３〜１４、２ＵのエキソヌクレアーゼＩおよび１ＵのエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した陰性コントロール；１５〜１６、２ＵのエキソヌクレアーゼＩおよび１ＵのエキソヌクレアーゼＶＩＩで処理した全ＲＮＡ。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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