(57)【要約】本発明は、１型糖尿病に対して応答性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の優性リガンドの同定に基づいている。そのリガンドは、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク（ＩＧＲＰ）である。ＩＧＲＰから、幾つかのＣＤ８＋Ｔ細胞結合ペプチドが同定され、これは、ＩＧＲＰの配列の２０６〜２１４番アミノ酸を含むペプチドを包含し、自己免疫糖尿病での病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞の最も罹患性のＴ細胞受容体に対する高い抗体結合力を持っている。本発明はこれにより、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰを含むオリゴペプチド組成物およびポリペプチド組成物を提供する。また、８〜１０アミノ酸長の、哺乳類ＩＧＲＰと完全に相同なオリゴペプチド組成物も提供され、ここで該オリゴペプチドは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合できる。加えて、上記した組成物を使用して哺乳類を処理する種々の方法が提供され、ここで該哺乳類は、１型糖尿病の危険性に晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている。また、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞が、哺乳類のβ細胞を破壊するのを防ぐ方法も提供され、ここで本方法も、上記した組成物を使用する。更に、哺乳類が１型糖尿病の危険性に晒されているかもしくは１型糖尿病を持っているかを決定する方法が提供され、ここで本方法は、上記した組成物を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む、３５５アミノ酸未満の単離精製オリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同な、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項３】
１００以下のアミノ酸を含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項４】
２５以下のアミノ酸を含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項５】
１３〜２５アミノ酸を含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項６】
８〜１０アミノ酸を含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項７】
ＶＹＬＫＴＮＶＦＬを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項８】
ＴＹＬＫＴＮＬＦＬを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項９】
ＦＬＷＳＶＦＷＬＩを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１０】
ＴＹＹＧＦＬＮＦＭを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１１】
ＡＹＹＴＦＬＮＦＭを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１２】
ＬＲＬＦＧＩＤＬＬを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１３】
ＬＲＶＬＮＩＤＬＬを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１４】
ＳＦＣＫＳＡＳＩＰを含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１５】
抗原性担体を更に含む、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項１６】
検出可能な標識を更に含む、請求項６に記載のオリゴペプチド。
【請求項１７】
検出可能な前記標識が蛍光分子である、請求項１６に記載のオリゴペプチド。
【請求項１８】
検出可能な前記標識が放射性分子である、請求項１６に記載のオリゴペプチド。
【請求項１９】
検出可能な前記標識が酵素である、請求項１６に記載のオリゴペプチド。
【請求項２０】
前記オリゴペプチドに結合可能であるＭＨＣクラスＩ分子を更に含む、請求項１６に記載のオリゴペプチド。
【請求項２１】
前記オリゴペプチドに結合可能であるＭＨＣクラスＩ分子を更に含む、請求項６に記載のオリゴペプチド。
【請求項２２】
前記ＭＨＣクラスＩ分子がマウスＨ−２Ｋｄである、請求項２１に記載のオリゴペプチド。
【請求項２３】
細胞毒性分子を更に含む、請求項２１に記載のオリゴペプチド。
【請求項２４】
前記細胞毒性分子が放射性である、請求項２３に記載のオリゴペプチド。
【請求項２５】
前記オリゴペプチドに結合可能であるＭＨＣクラスＩＩ分子を更に含む、請求項５に記載のオリゴペプチド。
【請求項２６】
細胞毒性分子を更に含む、請求項２５に記載のオリゴペプチド。
【請求項２７】
無菌医薬調製物中の、請求項１に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項２８】
ＹＬＫＴＮＶＦＬ、ＴＹＬＫＴＮＬＦＬ、ＴＹＹＧＦＬＮＦＭ、ＡＹＹＴＦＬＮＦＭ、ＬＲＬＦＧＩＤＬＬ、ＬＲＶＬＮＩＤＬＬ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＫＷＣＡＮＰＤＷＩからなる群から選択される配列を含む、請求項２７に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項２９】
前記オリゴペプチドもしくはポリペプチドが、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ哺乳類ＩＧＲＰポリペプチドである、請求項２８に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項３０】
前記哺乳類ＩＧＲＰが、マウスＩＧＲＰもしくはヒトＩＧＲＰである、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
哺乳類を免疫寛容し、ＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制できる、請求項２８に記載のオリゴペプチドもしくはポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同な、８〜１０アミノ酸長の単離精製オリゴペプチドであって、該哺乳類のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるオリゴペプチド。
【請求項３３】
ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む、請求項３２に記載の単離精製オリゴペプチド。
【請求項３４】
検出可能な標識を更に含む、請求項２５に記載のオリゴペプチド。
【請求項３５】
検出可能な前記標識が蛍光分子である、請求項３４に記載のオリゴペプチド。
【請求項３６】
検出可能な前記標識が放射性分子である、請求項３４に記載のオリゴペプチド。
【請求項３７】
検出可能な前記標識が酵素である、請求項３４に記載のオリゴペプチド。
【請求項３８】
前記オリゴペプチドに結合可能であるＭＨＣクラスＩ分子を更に含む、請求項３４に記載のオリゴペプチド。
【請求項３９】
前記オリゴペプチドに結合可能であるＭＨＣクラスＩ分子を更に含む、請求項３２に記載のオリゴペプチド。
【請求項４０】
細胞毒性分子を更に含む、請求項３９に記載のオリゴペプチド。
【請求項４１】
前記細胞毒性分子が放射性である、請求項４０に記載のオリゴペプチド。
【請求項４２】
哺乳類ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの少なくとも１部分に相補的なアンチセンス分子であって、ここで該哺乳類ＩＧＲＰが配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同である、該哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害できるアンチセンス分子。
【請求項４３】
哺乳類ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの１部分に特異的なリボザイムであって、ここで該哺乳類ＩＧＲＰが配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同である、該哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害するリボザイム。
【請求項４４】
哺乳類ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの１部分に相同なＲＮＡｉ分子であって、ここで該哺乳類ＩＧＲＰが配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同である、該哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害できるＲＮＡｉ分子。
【請求項４５】
１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、ＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するのに充分、該哺乳類へとオリゴペプチドを投与することを含み、ここで該オリゴペプチドが８〜１０アミノ酸長であり、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む方法。
【請求項４６】
前記オリゴペプチドが細胞毒性分子を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳類を、８〜１０アミノ酸長の第２オリゴペプチドを用いて処理することを更に含み、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、ＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するのに充分、該哺乳類へと請求項３２に記載のオリゴペプチドを投与することを含む方法。
【請求項４９】
前記オリゴペプチドが細胞毒性分子を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記哺乳類へと、請求項３２に記載の第２オリゴペプチドを投与することを更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、該哺乳類へと８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドを投与することを含み、該オリゴペプチドが、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、中もしくは低親和性リガンドである、方法。
【請求項５２】
前記オリゴペプチドが、ＫＹＮＩＡＮＷＦＬもしくはＫＹＮＫＡＮＡＦＬである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞がβ細胞を破壊するのを防ぐ方法であって、該β細胞を、請求項３２に記載のオリゴペプチドに特異的に結合できる化合物を用いて処理することを含む方法。
【請求項５４】
オリゴペプチドに結合する前記化合物が、抗体もしくはアプタマーである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴペプチドが、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＹＮＩＡＮＷＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記膵島β細胞が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類の膵臓の１部である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳類がマウスである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記哺乳類がヒトである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記β細胞を、前記オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を用いて処理することを更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記オリゴペプチドが、細胞毒性分子を更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記膵島β細胞が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類の膵臓の１部である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記哺乳類がマウスである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記哺乳類がヒトである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞が哺乳類β細胞を破壊するのを防ぐ方法であって、ＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するのに充分、該ＣＤ８＋Ｔ細胞を、８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドを用いて処理することを含み、該オリゴペプチドが、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む方法。
【請求項６５】
前記オリゴペプチドが、細胞毒性分子を更に含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を、請求項３９に記載の第２オリゴペプチドを用いて処理することを更に含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記膵島β細胞が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類の膵臓の１部である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、該哺乳類へと、請求項４２に記載のアンチセンス分子を投与することを含み、この核酸が、該哺乳類におけるＩＧＲＰ発現を減少させるのに充分投与される方法。
【請求項６９】
１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、該哺乳類へと、請求項４３に記載のリボザイムを投与することを含み、この核酸が、該哺乳類におけるＩＧＲＰ発現を減少させるのに充分投与される方法。
【請求項７０】
１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、該哺乳類へと、請求項４４に記載のＲＮＡｉ分子を投与することを含み、この核酸が、該哺乳類におけるＩＧＲＰ発現を減少させるのに充分投与される方法。
【請求項７１】
１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法であって、該哺乳類の膵臓中へと膵島β細胞を移植することを含み、該β細胞が、該哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を特異的に阻害できるアンチセンス分子、リボザイム、もしくはＲＮＡｉ分子を発現させるベクターを用いてトランスフェクションされる方法。
【請求項７２】
哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っているかを決定する方法であって：
ａ．該哺乳類から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球サンプルを得ること；
ｂ．該リンパ球を、オリゴペプチドおよび該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子と組み合わせること（該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣ分子は検出可能な標識を更に含み、該オリゴペプチドは８〜１０アミノ酸長であり、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む）；ならびに
ｃ．いずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に、該オリゴペプチドに結合するかを決定すること（該オリゴペプチドに結合するＣＤ８＋Ｔ細胞は、該哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っていることを指し示す）
により、該哺乳類におけるＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定することを含む方法。
【請求項７３】
前記決定するステップが、細胞選別機もしくは標識細胞カウンターを用いて、標識ＣＤ８＋Ｔ細胞を数えることにより実施される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記決定するステップが、前記標識が観察され得る条件下、前記リンパ球の顕微鏡観察により実施される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記決定するステップが、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を測定することにより実施される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化が、インターフェロンγ産生を測定することにより測定される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
インターフェロンγ産生が、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して測定される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っているかを決定する方法であって：
ａ．該哺乳類から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球サンプルを得ること；
ｂ．該リンパ球を、オリゴペプチドおよび該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子と組み合わせること（該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣ分子は検出可能な標識を更に含み、該オリゴペプチドは８〜１０アミノ酸であり、哺乳類ＩＧＲＰと完全に相同である）；ならびに
ｃ．いずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に、該オリゴペプチドに結合するかを決定すること（該オリゴペプチドに結合するＣＤ８＋Ｔ細胞は、該哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っていることを指し示す）
により、該哺乳類におけるＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年５月２０日出願の米国仮出願第６０／４７１，８６８号の利益を請求する。
【０００２】
連邦協賛研究開発についての陳述
米国政府は本発明において、支払い済みのライセンスを持っており、限られた条件下、ＮＩＨにより承認された第Ｐ０１ＤＫ５２９５６号の支払いにより準備されるような合理的な状況において、本特許権者が他者にライセンスを付与することを要求する権利を持っている。
【０００３】
（１）本発明分野
本発明は一般的に、１型糖尿病の診断および治療に関する。より具体的には、本発明は、病原性Ｔ細胞により標的とされる膵島β細胞抗原の同定に基づき、１型糖尿病の診断、予防、および治療方法を与える。
【背景技術】
【０００４】
（２）関連技術の記載
参照文献
Aichele, P., D. Kyburz, P. Ohashi, B. Odermatt, R. Zinkernagel, H. Hengartner, and H. Pircher. 1994. Peptide-induced T-cell tolerance to prevent autoimmune diabetes in a transgenic mouse model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 444-448.
Alexander-Miller, M., G. Leggatt, and J. Berzofsky. 1996. Selective expansion of high- or low-avidity cytotoxic T-lymphocytes and efficacy for adoptive immunotherapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 4102-4107.
J. D. Altman et al., Science 274, 94 (1996).
A. Amrani et al., Nature 406, 739 (2000).
A. Amrani et al., J. Immunol. 167, 655 (2001).
B. Anderson, B. J. Park, J. Verdaguer, A. Amrani, P. Santamaria, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9311 (1999).
Anderton, S., and D. Wraith. 1998. Hierarchy in the ability of T cell epitopes to induce peripheral tolerance to antigens from myelin. Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261.
Arden, S., T. Zhan, S. Steegers, S. Webb, B. Bergman, R. O'Brien, and J. Hutton. 1999. Molecular cloning of a pancreatic islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein. Diabetes. 48: 531-540.
Arif, S., T. I. Tree, T. P. Astill, J. M. Tremble, A. J. Bishop, C. M. Dayan, B. O. Roep, and M. Peakman. 2004. Autoreactive T cell responses show proinflammatory polarization in diabetes but a regulatory phenotype in health. J Clin Invest. 113: 451-463.
S. Baekkeskov et al., Nature 347,151 (1990).
Bielekova, B., B. Goodwin, N. Richert, I. Cortese, T. Kondo, G. Afshar, B. Gran, J. Eaton, J. Antel, J. Frank, H. McFarland, and R. Martin. 2000. Encephalitogenic potential of the myelin basic protein peptide (amino acids 83-99) in multiple sclerosis: results of a phase II clinical trial with an altered peptide ligand. Nat. Med. 6: 1167-1175.
Burke, D. H., L. Scates, K. Andrews, and L. Gold., J. Mol. Biol. 264, 650 (1996).
Cocca, B. A., A. M. Cline, and M. Z. Radic. 2002. Blebs and apoptotic bodies are B cell autoantigens. J Immunol. 169: 159-166.
L. Cox, E. L. Huczko, V. H. Engelhard, J. Shabanowitz, D. F. Hunt, in MHC: A Practical Approach, N. Femandez, G. Butcher, Eds. (Oxford Univ. Press, New York, 1997), vol.1, pp.141.
T. P. DiLorenzo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12538 (1998).
T. P. DiLorenzo et al., Clin. Immunol. 105, 332 (2002).
Ellington, A. D., and J. W. Szostak, Nature 346, 818 (1990).
Gammon et al., Nature (London) 319, 413 (1986).
Gross, D. A., S. Graff-Dubois, P. Opolon, S. Cornet, P. Alves, A. Bennaceur-Griscelli, O. Faure, P. Guillaume, H. Firat, S. Chouaib, F. A. Lemonnier, J. Davoust, I. Miconnet, R. H. Vonderheide and K. Kosmatopoulos. 2004. High vaccination efficiency of low-affinity epitopes in antitumor immunotherapy. J. Clin. Invest. 113: 425-433.
Group, D. P. T.-T. D. S. 2002. Effects of insulin in relatives of patients with type 1 diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 346: 1685-1691.
K. Hamaguchi, H. R. Gaskins, E. H. Leiter, Diabetes 40, 842 (1991).
A. H. Hartemann et al., Clin. Exper. Immunol. 116, 225 (1999).
Hirao, I., M. Spingola, D. Peabody, and A. D. Ellington, Mol Divers. 4, 75 (1998).
Jaeger, J., T. Restle, and T. A. Steitz, The EMBO Journal 17, 4535 (1998).
Kappos, L., G. Comi, H. Panitch, J. Oger, J. Antel, P. Conlon, L. Steinman, and T. A. P. L. i. R. M. S. Group. 2000. Induction of a non-encephalitogenic type 2 T helper-cell autoimmune response in multiple sclerosis after administration of an altered peptide ligand in a placebo-controlled, randomized phase II trial. Nat. Med. 6: 1176-1182.
Karin, N., D. Mitchell, S. Brocke, N. Ling, and L. Steinman. 1994. Reversal of experimental autoimmune encephalomyelitis by a soluble peptide variant of a myelin basic protein epitope: T cell receptor antagonism and reduction of interferon γ and tumor necrosis factor a production. J. Exp. Med. 180: 2227-2237.
J. Karttunen, S. Sanderson, N. Shastri, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 6020 (1992).
Kensch, O., B. A. Connolly, H. J. Steinhoff, A. McGregor, R. S. Goody, and T. Restle, J Biol Chem. 275, 18271 (2000).
R. S. Liblau, F. S. Wong, L. T. Mars, P. Santamaria, Immunity 17, 1 (2002).
Lieberman, S., and T. DiLorenzo. 2003. A comprehensive guide to antibody and T-cell responses in type 1 diabetes. Tissue Antigens. 62: 359.
Lieberman, S., A. Evans, B. Han, T. Takaki, Y. Vinnitskaya, J. Caldwell, D. Serreze, J. Shabanowitz, D. Hunt, S. Nathenson, P. Santamaria, and T. DiLorenzo. 2003. Identity of the beta cell antigen targeted by a prevalent population of pathogenic CD8+ T cells in autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100: 8384-8388.
Liu, G., and D. Wraith. 1995. Affinity for class II MHC determines the extent to which soluble peptides tolerize autoreactive T cells in naive and primed adult mice--implications for autoimmunity. Int. Immunol. 7: 1255-1263.
S. E. Martin, J. Shabanowitz, D. F. Hunt, J. A. Marto, Anal. Chem. 72, 4266 (2000).
C. C. Martin et al., J. Biol. Chem. 276, 25197(2001).
McKown, K. et al., 1999. Lack of efficacy of oral bovine type II collagen added to existing therapy in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 42: 1204-1208.
Metzler, B., and D. Wraith. 1993. Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis by inhalation but not oral administration of the encephalitogenic peptide: influence of MHC binding affinity. Int. Immunol. 5: 1159-1165.
Metzler, B., S. Anderton, S. Manickasingham, and D. Wraith. 2000. Kinetics of peptide uptake and tissue distribution following a single intranasal dose of peptide. Immunol. Invest. 29: 61-70.
M. Nagata, P. Santamaria, T. Kawamura, T. Utsugi, J. W. Yoon, J. Immunol. 152, 2042 (1994).
Nicholson, L. B., J. M. Greer, R. A. Sobel, M. B. Lees, and V. K. Kuchroo. 1995. An altered peptide ligand mediates immune deviation and prevents autoimmune encephalomyelitis. Immunity. 3: 397-405.
J. P. Palmer et al., Science 222, 1337 (1983).
K. C. Parker, M. A. Bednarek, J. E. Coligan, J. Immunol. 152, 163 (1994).
Perez-Diez, A., P. Spiess, N. Restifo, P. Matzinger, and F. Marincola. 2002. Intensity of the vaccine-elicited immune response determines tumor clearance. J. Immunol. 168: 338-347.
R. A. Pierce et al., J. Immunol. 163, 6360 (1999).
M. J. Pittet et al., Trends. Immunol. 23, 325 (2002).
F. Pociot, M. F. McDermott, Genes Immun. 3, 235 (2002).
Pozzilli, P. et al., 2000. No effect of oral iinsulin on residual beta-cell function in recent-onset type 1 diabetes (the IMDIAB VII). IMDIAB Group. Diabetologia. 43: 1000-1004.
Princiotta, M. F., D. Finzi, S. B. Qian, J. Gibbs, S. Schuchmann, F. Buttgereit, J. R.
Bennink, and J. W. Yewdell. 2003. Quantitating protein synthesis, degradation, and endogenous antigen processing. Immunity. 18: 343-354.
D. U. Rabin, S. M. Pleasic, R. Palmer-Crocker, J. A. Shapiro, Diabetes 41, 183 (1992).
H. Rammensee, J. Bachmann, N. P. Emmerich, O. A. Bachor, S. Stevanovic, Immunogenetics 50,213 (1999).
P. A. Reche, J. P. Glutting, E. L. Reinherz, Hum. Immunol. 63, 701 (2002).
Santamaria, P. 2001. Effector lymphocytes in autoimmunity. Curr. Opin Immunol. 13: 663- 669.
P. Santamaria et al., J. Immunol. 154, 2494 (1995).
Sauter, B., M. L. Albert, L. Francisco, M. Larsson, S. Somersan, and N. Bhardwaj. 2000. Consequences of cell death. Exposure To necrotic tumor cells, but not primary tissue cells or apoptotic cells, induces the maturation of immunostimulatory dendritic cells. J Exp Med. 191: 423-434.
Schneider, D. J., J. Feigon, Z. Hostomsky, and L. Gold, Biochemistry 34, 9599 (1995).
D. V. Serreze, E. H. Leiter, Curr. Dir. Autoimmun. 4, 31(2001).
D. V. Serreze et al., Diabetes 50, 1992 (2001).
M. Terajima et al., J. Exp. Med. 197, 927 (2003).
R. Tisch, H. McDevitt, Cell 85, 291 (1996).
Toes, R., R. Offringa, R. Blom, C. Melief, and W. Kast. 1996. Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specificT-cell tolerance induction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 7855-7860.
Trentham, D. et al., 1993. Effects of oral administration of type II collagen on rheumatoid arthritis. Science. 261: 1727-1730.
J. D. Trudeau et al., J. Clin. Invest. 111, 217 (2003).
Tuerk, C., and L. Gold, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6988 (1992).
Tuerk, C., and L. Gold, Science 249: 505 (1990).
F. S. Wong et al., Nat. Med. 9, 1026 (1999).
F. S. Wong, A. K. Moustakas, L. Wen, G. K. Papadopoulos, C. A. Janeway, Jr. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99,5551 (2002).
Verdaguer, J., J.-W. Yoon, B. Anderson, N. Averill, T. Utsugi, B. Park, and P. Santamaria. 1996. Acceleration of spontaneous diabetes in TCR-p-transgenic nonobese diabetic mice by β-cell cytotoxic CD8+ T cells expressing identical endogenous TCR-α chains. J. Immunol. 157: 4726-4735.
J. Verdaguer et al., J. Exp. Med. 186, 1663 (1997).
Weiner, H. 1993. Double-blind pilot trial of oral tolerization with myelin antigens in multiple sclerosis. Science. 259: 1321-1324.
Wraith, D. C., D. E. Smilek, D. J. Mitchell, L. Steinman, and H. O. McDevitt. 1989. Antigen recognition in autoimmune encephalomyelitis and the potential for peptide-mediated immunotherapy. Cell 59: 247-255.
Zeh, H., D. Perry-Lalley, M. Dudley, S. Rosenberg, and J. Yang. 1999. High avidity CTLS for two self-antigens demonstrate superior in vitro and in vivo anti-tumor efficacy. J. Immunol. 162: 989-994.
Zhang, Y., B. O'Brien, J. Trudeau, R. Tan, P. Santamaria, and J. P. Dutz. 2002. In situ β-cell death promotes priming of diabetogenic CD8 T lymphocytes. J. Immunol. 168: 1466-1472.
米国特許第5,472,841号明細書.
米国特許第5,496,938号明細書.
米国特許第5,503,978号明細書.
米国特許第5,567,588号明細書.
米国特許第5,580,737号明細書.
米国特許第5,582,981号明細書.
米国特許第5,637,459号明細書.
米国特許第5,654,151号明細書.
米国特許第5,683,867号明細書.
米国特許第5,705,337号明細書.
米国特許第5,712,375号明細書.
米国特許第5,726,017号明細書.
米国特許第5,773,598号明細書.
米国特許第5,786,462号明細書.
米国特許第6,028,186号明細書.
米国特許第6,083,696号明細書.
米国特許第6,110,900号明細書.
米国特許第6,124,449号明細書.
米国特許第6,127,119号明細書.
米国特許第6,140,490号明細書.
米国特許第6,147,204号明細書.
米国特許第6,168,778号明細書.
米国特許第6,171,795号明細書.
【０００５】
ＮＯＤマウスは、膵島炎症（インスリン炎）、次いで、インシュリン産生β細胞のＴ細胞媒介による破壊により特徴付けられる自己免疫疾患であるヒト１型糖尿病の、広く研究されたモデルである（ＳｅｒｒｅｚｅおよびＬｅｉｔｅｒ、２００１年）。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方が、この病理プロセスに関しては必要とされる（ＳｅｒｒｅｚｅおよびＬｅｉｔｅｒ、２００１年）。しかしながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、初期のβ細胞傷害に対して応答性であるように見える（ＳｅｒｒｅｚｅおよびＬｅｉｔｅｒ、２００１年；ＴｉｓｃｈおよびＭｃＤｅｖｉｔｔ、１９９６年；ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年）。Ｂ細胞および自己抗体の病原性はより明らかではないが、ＮＯＤマウスおよびヒトにおける自己免疫糖尿病の病因へと寄与すると現在のところ信じられている自己抗体は全て、Ｔ細胞による認識によるよりもむしろ特異的自己抗体の存在に基づいて、本来同定されたものである（Ｐａｌｍｅｒら、１９８３年；Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖら、１９９０年；Ｒａｂｉｎら、１９９２年）。病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞により標的とされるβ細胞抗原については、僅かしか知られていない。１研究が、ＮＯＤマウスにおける大多数の膵島浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原標的としてインシュリンペプチドを同定したが（Ｗｏｎｇら、１９９９年）、これらインシュリン反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の罹患性は、その後の研究において確かめられなかった（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）。ＮＯＤの膵島から単離された、実質的な割合のβ細胞自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の分断されたα鎖（Ｖα１７−Ｊα４２）を発現し、共通のβ細胞ペプチドの認識を示唆する（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年；Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、１９９５年）。これらのＴ細胞は、上述した抗原性インシュリンペプチドを認識しない（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ｓｅｒｒｅｚｅら、２００１年）。この罹患性Ｔ細胞集団の病原性は、８．３Ｔ細胞クローン（Ｖα１７−Ｊα４２発現Ｔ細胞集団の、代表的Ｔ細胞クローン）の研究を通して、良く確立されている（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ｎａｇａｔａら、１９９４年；Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年）。８．３似のＴ細胞は、ＮＯＤマウスの最も初期の膵島浸潤物中に存在し（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年）、膵島炎症の、顕在化した疾患への進展に連れ、抗体結合力の成熟が進行する（Ａｍｒａｎｉら、２０００年）。与えられた如何なる時間においても、８．３似のＴ細胞は、膵島に関わるＣＤ８＋Ｔ細胞の３０〜４０％までをも構成し得る（Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）。加えて、末梢血中の８．３似のＴ細胞の定量は、今日までに同定された如何なる他の単一の免疫指標とは異なり、個々のＮＯＤマウスにおける糖尿病の進行を予見する（Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）。８．３似のＴ細胞の罹患性および病原性は明確に確立されているが、それらのリガンドの同定は流動的なままに留まっている。８．３Ｔ細胞クローンは、クラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子Ｈ−２Ｋｄ（Ｎａｇａｔａら、１９９４年）へと拘束される。人工オリゴ���プチドＮＲＰ−Ｖ７およびＮＲＰ−Ａ７は以前に、Ｈ−２Ｋｄ分子に関連して、８．３似のＴ細胞に結合すると示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ａｍｒａｎｉら、２００１年）。しかしながら、それらの研究は、１型糖尿病の自己免疫に応答性の８．３似のＴ細胞の天然リガンドの同定を示唆するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
その疾患の診断、予防、および治療のための新たな選択肢を打ち立てるであろうから、１型糖尿病に関連する他のＴ細胞リガンド同様、８．３似のＴ細胞の前記リガンドの決定は、これゆえ望ましいものである。１型糖尿病の病因におけるこれらリガンドの精確な役割の特徴付けも、必要とされている。この発明は、これらの必要性を満たすものである。
【０００７】
従って、本発明者らは、１型糖尿病に対して応答性であるβ細胞上に存在する前記した８．３似のＴ細胞のリガンドを同定することに成功している。そのリガンドは、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク（ＩＧＲＰ）であり、そのＣＤ８＋Ｔ細胞結合ペプチドは、ＩＧＲＰ配列の２０６〜２１４番アミノ酸を含む（マウスに関して配列番号１；ヒトに関して配列番号２）。本発明者らはまた、特にＩＧＲＰ２０６〜２１４に対して反応するＴ細胞が、高親和性リガンド、例えばＩＧＲＰ２０６〜２１４と共に排除される場合（１型糖尿病に関与しない場合）、１型糖尿病に寄与するＩＧＲＰから他の幾つかのＣＤ８＋Ｔ細胞リガンドを同定してきている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
これゆえ、幾つかの実施形態において、本発明は、３５５アミノ酸未満の単離精製オリゴペプチドもしくはポリペプチドに関し、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む。
【０００９】
他の実施形態では、本発明は、無菌医薬調製品中に上記配列の少なくとも１つを含む単離精製オリゴペプチドもしくはポリペプチドに関する。
【００１０】
加えて、本発明は、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ哺乳類ＩＧＲＰと完全に相同な、８〜１０アミノ酸長の単離精製オリゴペプチドに関し、ここで該オリゴペプチドは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合できるものである。
【００１１】
本発明はまた、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同な哺乳類ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの少なくとも１部分に相補的な、アンチセンス分子に関する。これらの実施形態では、該アンチセンス分子は、哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害できるものである。
【００１２】
関連した実施形態では、本発明は、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同な哺乳類ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの１部分に特異的な、リボザイムに関する。これらの実施形態のリボザイムは、哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害する。
【００１３】
他の関連した実施形態では、本発明は、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同な哺乳類ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの１部分に相同な、ＲＮＡｉ分子に関する。これらの実施形態では、該ＲＮＡｉ分子は、哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害できる。
【００１４】
本発明はまた、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法にも関する。該方法は、該哺乳類へと、ＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するのに充分、オリゴペプチドを投与することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドは８〜１０アミノ酸長であり、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む。
【００１５】
更なる実施形態では、本発明は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する他の方法にも関する。これらの更なる方法は、該哺乳類へと、ＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するのに充分、オリゴペプチドを投与することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドは８〜１０アミノ酸長であり、哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同であり、当該哺乳類のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるものである。
【００１６】
本発明は更に、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する更なる方法に関する。該方法は、該哺乳類へと、８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドを投与することを含み、ここで該オリゴペプチドは、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する、中もしくは低親和性リガンドである。
【００１７】
加えて、本発明は、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞がβ細胞を破壊するのを防ぐ方法に関する。該方法は、該β細胞を、８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドに特異的に結合でき、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同な化合物を用いて処理することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドは、該哺乳類のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるものである。
【００１８】
本発明はまた、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞がβ細胞を破壊するのを防ぐ他の方法にも関する。該方法は、該ＣＤ８＋Ｔ細胞を、８〜１０アミノ酸長の、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含むオリゴペプチド、ならびに、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を用いて処理することを含む。
【００１９】
関連した実施形態では、本発明は、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞がβ細胞を破壊するのを防ぐ更なる方法に関する。該方法は、該ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＩＧＲＰへの該ＣＤ８＋Ｔ細胞の結合を防ぐのに充分、オリゴペプチドを用いて処理することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドは８〜１０アミノ酸長であり、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む。
【００２０】
更なる実施形態では、本発明は、１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処理する他の方法に関する。該方法は、該哺乳類へと、アンチセンス分子、リボザイム、またはＲＮＡｉ分子を投与することを含む。これらの実施形態では、該アンチセンス分子、該リボザイム、および該ＲＮＡｉ分子は、哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を、特異的に阻害できる。
【００２１】
本発明はまた、１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する更なる方法にも関する。該方法は、該哺乳類の膵臓中へと、膵島β細胞を移植することを含む。これらの実施形態では、該β細胞は、哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を特異的に阻害できるアンチセンス分子、リボザイム、もしくはＲＮＡｉ分子を発現するベクターを用いて、トランスフェクションされる。
【００２２】
本発明はまた、哺乳類が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っているかを決定する方法にも関する。該方法は、該哺乳類から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球サンプルを得、該リンパ球をオリゴペプチドと組み合わせ、いずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に、該オリゴペプチドに結合するかを決定することにより、該哺乳類におけるＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドは８〜１０アミノ酸長であり、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む。加えて、該オリゴペプチドもしくは前記ＭＨＣ分子は、検出可能な標識を更に含む。これらの方法では、該オリゴペプチドに結合するＣＤ８＋Ｔ細胞は、当該哺乳類が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っていることを指し示す。
【００２３】
関連した実施形態では、本発明は、哺乳類が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っているかを決定する他の方法に関する。該方法は、該哺乳類からＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球サンプルを得、該リンパ球を、哺乳類ＩＧＲＰと完全に相同である８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドおよび該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子と組み合わせ、ここで、該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣ分子が検出可能な標識を更に含み、いずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に、該オリゴペプチドに結合するかを決定することにより、該哺乳類におけるＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドに結合するＣＤ８＋Ｔ細胞は、当該哺乳類が、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っていることを指し示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、β細胞上に存在する、１型糖尿病に対して応答性である前記した８．３似のＴ細胞のリガンドの同定に基づいている。実施例１記載の研究（実験）により確立されたように、該リガンドは膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク（ＩＧＲＰ）であり、その優性ＣＤ８＋Ｔ細胞結合ペプチドは、ＩＧＲＰ配列の２０６〜２１４番アミノ酸を含み、マウスにおいては、共通に受け入れられているアミノ酸１文字略号を使用すれば、配列ＶＹＬＫＴＮＶＦＬを持っている。１型糖尿病の病原に含まれているＣＤ８＋Ｔ細胞に結合できる他のマウスＩＧＲＰペプチドは、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ（１５２〜１６０番アミノ酸）；ＴＹＹＧＦＬＮＦＭ（２１〜２９番アミノ酸）；ＬＲＬＦＧＩＤＬＬ（２２５〜２３３番アミノ酸）；ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ（２４１〜２４９番アミノ酸）；およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰ（３２４〜３３２番アミノ酸）である。実施例３および４参照。
【００２５】
本明細書において使用される場合、ＩＧＲＰアミノ酸配列は膵島特異的であり、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋＮＰ０６７３０６からのマウスＩＧＲＰ）もしくは配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋＮＰ０６６９９９からのヒトＩＧＲＰ）に少なくとも９０％同一である如何なる哺乳類天然起源アミノ酸配列をも包含する。マウスおよびヒトのＩＧＲＰアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１および配列番号２に限定されるものではないが、マウスもしくはヒトに天然に存在する如何なる変異体をも包含する。全ての哺乳類ＩＧＲＰアミノ酸配列の同定は容易に、過度の実験を伴わずに、例えば、膵島細胞に限定され、マウスもしくはヒトＩＧＲＰの既に同定されたｍＲＮＡ配列（例えばそれぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ目録ＮＰ０２１３３１およびＮＰ０２１１７６に見出されるような）に高度に（つまり＞９０％）相同的であるｍＲＮＡ配列を同定し、その発現タンパクのアミノ酸配列を求めることにより、なされ得る。
【００２６】
実施例１に更に議論されるように、マウスＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチドは、配列ＶＹＬＫＴＮＶＦＬを持つ。ＧｅｎＢａｎｋＮＰ０６６９９９からの、ヒトでの類似配列は、ＴＹＬＫＴＮＬＦＬである。これゆえ、マウスおよびヒトの該配列は、第１（ＶとＴ）および第７（ＶとＬ）の位置において相違する。オリゴペプチド配列ＫＹＮＫＡＮＶＦＬ（ＮＲＰ−Ｖ７）およびＫＹＮＫＡＮＡＦＬ（ＮＲＰ−Ａ７）が、８．３似のＴ細胞の更なるリガンドであることも知られている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ａｍｒａｎｉら、２００１年）。これらは、マウスおよびヒトの天然起源の配列とは、第１、第３、第５、および第７の位置において相違する。Ｖ（Ｖａｌ）が非極性であり、Ｔ（Ｔｈｒ）が極性であり、Ｋ（Ｌｙｓ）がプラス（＋）に荷電していることから、これらの配列間での第１の位置における相違は、保存されるものではない。このことは、これらのペプチドの第１の位置が、８．３Ｔ細胞への結合に寄与しないことを指し示す。しかしながら、第７の位置における異なるこれら３アミノ酸、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、およびＡ（Ａｌａ）は全て非極性であり、非極性残基が８．３Ｔ細胞への結合を保持するのに、その位置に関して必要とされることを指し示している。これゆえ、天然に保存されている配列ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬを持つオリゴペプチドは、８．３Ｔ細胞のリガンドであると結論できる。本明細書において使用される場合、（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）は、その位置のアミノ酸が、非極性アミノ酸Ａ、Ｉ、Ｌ、もしくはＶのいずれでもあり得ることを象徴する。マウスＨ−２ＫｄクラスＩ分子が少なくともノナマー（ノナペプチド）を必要とすることが知られているので、マウスＭＨＣ分子およびＴ細胞が利用される場合、少なくとも９アミノ酸が好ましい。一気呵成の研究が、ＩＧＲＰを除くオクタマー（オクタペプチド）のいずれもが、如何なる既知のアミノ酸配列中にも存在しないことを明らかにした。
【００２７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合可能であるとして同定された他のＩＧＲＰペプチドに関しては、ヒトおよびマウスにおいて、１５２〜１６０番ペプチド（ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ）、２４１〜２４９番ペプチド（ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ）、および３２４〜３３２番ペプチド（ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ）が同一である。しかしながら、マウスおよびヒトにおいて、２１〜２９番ペプチドおよび２２５〜２３３番ペプチドが異なっている。２１〜２９番ペプチドは、マウスにおいてはＴＹＹＧＦＫＮＦＭであり、ヒトにおいてはＡＹＹＴＦＬＮＦＭであり、２２５〜２３１番ペプチドは、マウスにおいてはＬＲＬＦＧＩＤＬＬであり、ヒトにおいてはＬＲＶＬＮＩＤＬＬである。ヒトのこれらのペプチドも、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合可能であると予測される。
【００２８】
これゆえ、幾つかの実施形態では、本発明は、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む、３５５アミノ酸未満の単離精製オリゴペプチドもしくはポリペプチドに関する。これらのオリゴペプチドおよびポリペプチドは、１型糖尿病に含まれているペプチド配列を含むＣＤ８＋Ｔ細胞リガンドであることにおいても有用であり、これゆえ、診断もしくは治療といった適用に有用である。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「単離精製」とは、天然に見出されると考えられるよりも高濃度で存在することを意味する。好ましくは、単離精製オリゴペプチドもしくはポリペプチドは、本調製品の少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２５％、更により好ましくは少なくとも約５０％、尚更により好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の本ペプチド成分である。
【００３０】
好ましい実施形態では、これらのオリゴペプチドもしくはポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持っている、哺乳類（例えば、マウスおよびヒト）ＩＧＲＰに完全に相同である。他の好ましい実施形態では、該オリゴペプチドもしくはポリペプチドは、１００アミノ酸以下、より好ましくは２５アミノ酸以下、更により好ましくは１３〜２５アミノ酸、最も好ましくは８〜１０アミノ酸を含むが、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が一般的に、８〜１０アミノ酸のオリゴペプチドにしか結合しないからである。
【００３１】
これらの実施形態では、好ましいポリペプチドもしくはオリゴペプチドは、配列ＶＹＬＫＴＮＶＦＬもしくはＴＹＬＫＴＮＬＦＬを持つ上記ペプチドを含むが、これは、それらの配列がそれぞれマウスおよびヒトからの天然起源ＩＧＲＰ中に存在しているからである。
【００３２】
これらの実施形態の更なる態様では、該オリゴペプチドもしくはポリペプチドはまた、免疫化プロトコールにおいて該ペプチドをより効果的に使用するために、抗原性担体を含み、ＩＧＲＰに対して哺乳類を寛容し、実施例２に記載の実験において達成されたように、１型糖尿病の進展を防ぐ。抗原性担体の非限定例は、不完全フロイントアジュバント（Freund's adjuvant）である。Ｇａｍｍｏｎら、１９８６年も参照。
【００３３】
他の態様では、該オリゴペプチドもしくはポリペプチドは更に、検出可能な標識を含む。このように標識されたペプチドは、診断プロトコールにおいて、例えば８．３似のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定し、１型糖尿病を持っているかもしくはこれのリスクに晒されている哺乳類を同定するのに有用である。本発明は、如何なる特定の検出可能な標識にも限定されず、当業者は過度の実験をすることなく、如何なる特定の適用に関しても、最適な標識を選択できる。例は、蛍光部分、放射性分子、およびアッセイ可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼもしくはストレプタビジン）を包含する。これらの検出可能な部分のいずれかを用いてペプチドを標識する方法は、よく知られている。
【００３４】
更なる態様では、８〜１０アミノ酸の、同定された上記オリゴペプチドは、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子、例えば、ＩＧＲＰ２０６〜２１４に結合するマウスＨ−２Ｋｄ分子と便利に組み合わされ得る。他のペプチドのいずれかに対するＭＨＣクラスＩ分子が、当業界において既知の方法を使用して、同定され得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を介してのみ抗原に結合するので、該オリゴペプチド−ＭＨＣクラスＩ混合物は、Ｔ細胞リガンドを創出するのに有用である。該ＭＨＣクラスＩ分子は、好ましくはテトラマーの形態で、用いられる。例えば、Ａｌｔｍａｎら、１９９６年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年を参照。幾つかの適用、例えば診断では、該オリゴペプチド−ＭＨＣクラスＩ混合物のオリゴペプチドは更に、以前に論じたもののような、つまり、該オリゴペプチドに共役した、検出可能な標識を含む。あるいは、もしくは、更に、該ＭＨＣクラスＩ分子は、検出可能な標識を用い得るであろう。
【００３５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞を排除する方向の幾つかの処理方法では、該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣクラスＩ分子はまた、細胞毒性分子をも包含し得る。これらの方法では、該細胞毒性オリゴペプチド−ＭＨＣクラスＩ混合物は、前記した８．３似のＴ細胞に結合し、ここで、該細胞毒性分子が、該Ｔ細胞を殺傷する。
【００３６】
本発明は、該オリゴペプチドもしくはＭＨＣクラスＩ分子に結合する如何なる特定の細胞毒性分子にも、狭く限定されない。当業者であれば、これらの態様において有用な種々の細胞毒性分子を同定し得、過度の実験をすることなく、如何なる特定の適用に関してもふさわしい細胞毒性分子を選択し得るであろう。潜在的に有用な細胞毒性分子の例は、放射性分子（例えば、１３１Ｉ、９０Ｙ）、および、毒性化学物質もしくはタンパク（例えば、５−フルオロウリジンもしくはリシン）を包含する。
【００３７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、１型糖尿病の病理プロセスに含まれているので、そして、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１３〜２５アミノ酸であるオリゴペプチドに結合するので、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される場合のみ、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのオリゴペプチドの混合物もまた、本発明の範囲内に入る。これらの実施形態では、該オリゴペプチドは１３〜２５アミノ酸であり、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む。前記したオリゴペプチド−ＭＨＣクラスＩ混合物に似て、該オリゴペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ混合物の該オリゴペプチドもしくはＭＨＣクラスＩＩ分子も、検出可能な標識もしくは細胞毒性分子を便利に含み得る。
【００３８】
上記したオリゴペプチドもしくはポリペプチドのいずれもが、特に該オリゴペプチドもしくはポリペプチドが治療処理用に無菌化されるべき場合、無菌医薬調製品において有用に与えられることも見込まれる。これゆえ、幾つかの実施形態では、無菌医薬調製品中の該オリゴペプチドもしくはポリペプチドは、哺乳類を寛容し、ＩＧＲＰに反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制することができる。哺乳類ＩＧＲＰタンパク自体、つまり、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つものも、無菌医薬調製品において有用なものとして包含される。好ましくは、この哺乳類ＩＧＲＰは、マウスＩＧＲＰもしくはヒトＩＧＲＰである。
【００３９】
実施例２および３に指し示されるように、ＩＧＲＰ自体の一般的な特徴がそれを、１型糖尿病に含まれているＴ細胞のリガンドであるペプチドに非常に寄与できるようにするように見える。
【００４０】
これゆえ、本発明はまた、８〜１０アミノ酸長の、哺乳類（例えば、マウスおよびヒト）ＩＧＲＰと完全に相同な単離精製オリゴペプチドにも関し、ここで、該オリゴペプチドは、当該哺乳類のＭＨＣクラスＩ分子に結合できる。好ましくは、該オリゴペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ。好ましい実施形態では、該単離精製オリゴペプチドは、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む。幾つかの好ましい実施形態では、特に該ペプチドが診断に使用されるべき場合、該オリゴペプチドは更に、前記したような検出可能な標識、例えば、蛍光分子、放射性分子、もしくは酵素を含む。他の好ましい実施形態では、該ペプチドは更に、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を含む。これらのオリゴペプチドも、検出可能な該標識があってもなくても、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を含み得る。以前に論じた実施形態の時のように、該オリゴペプチド−ＭＨＣクラスＩ混合物もまた、該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣクラスＩ分子に共役した細胞毒性分子を含み得る。
【００４１】
ＩＧＲＰに関する機能を同定しようとする努力にも関わらず、何も見出されていない。これゆえ、膵島細胞上でのＩＧＲＰの発現を抑制もしくは排除しようとする治療は、１型糖尿病における病原性膵島細胞の破壊を抑制もしくは排除することにおいて有益なようであるが、これは、このような治療が、１型糖尿病へと至る自己免疫反応に関する標的リガンドを排除すると思われるからである。ＩＧＲＰ発現の抑制もしくは排除は、ＩＧＲＰのｍＲＮＡを標的とするアンチセンス分子、リボザイム、もしくはＲＮＡｉ分子を用いた処理により、達成され得る。これらの実施形態では、該アンチセンス分子、リボザイム、もしくはＲＮＡｉ分子は、当業界において既知であるような核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）または核酸模倣物質（例えば、ホスホロチオネート模倣物質）から構成され得る。
【００４２】
これゆえ、加えて本発明は、哺乳類（例えば、マウスおよびヒト）ＩＧＲＰをコード化するｍＲＮＡの少なくとも１部分に対して相補的なアンチセンス分子に関する。これらの実施形態では、該アンチセンス分子は、哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害できる。好ましくは、該哺乳類ＩＧＲＰが、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同である。全ての哺乳類ＩＧＲＰについてのアンチセンス分子が、例えばＧｅｎＢａｎｋ目録ＮＭ０２１３３１（マウス）およびＮＭ０２１１７６（ヒト）において与えられるような既知のＩＧＲＰ配列情報を使用して、過度な実験なしに、デザインされ得る。
【００４３】
関連した実施形態では、本発明は、哺乳類（例えば、マウスもしくはヒト）ＩＧＲＰをコード化しているｍＲＮＡを特異的に開裂させ、こうして当該哺乳類ＩＧＲＰの翻訳を阻害するリボザイムに関する。好ましくは、該哺乳類ＩＧＲＰが、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同である。リボザイム技術は良く確立されたものなので、当業者であれば、過度な実験をすることなく、前記したように、リボザイムをデザインできる。
【００４４】
関連した更なる実施形態では、本発明は、哺乳類ＩＧＲＰをコード化しているｍＲＮＡの１部分に相同であり、これゆえ哺乳類（例えば、マウスもしくはヒト）ＩＧＲＰの翻訳を阻害できるＲＮＡｉ分子に関する。よく知られているように、ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡを包含する）分子は、相同遺伝子の転写もしくは翻訳に干渉する短い２本鎖（ダブルストランド）核酸である。以前の実施形態の時のように、該哺乳類ＩＧＲＰは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％相同である。ＲＮＡｉ技術は良く確立されたものなので、当業者であれば、過度な実験をすることなく、前記したように、ＲＮＡｉ分子をデザインできる。
【００４５】
前記した組成物の多くが、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類（マウスのような齧歯類およびヒトを包含するが、これらに限定されない）を処理する方法において有用である。このように、前記した組成物は、ヒトを包含する哺乳類への投与用に、過度な実験をすることなく、この特定の適用にふさわしいものとして、処方され得る。加えて、適切な用量の該組成物が、標準的な用量−応答プロトコールを使用して、過度な実験をすることなく、求められ得る。
【００４６】
従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔下投与用にデザインされた本組成物が、過度な実験をすることなく、当業界においてよく知られている手段により、例えば不活性稀釈剤もしくは浸食性担体を用いて、製造され得る。本組成物は、ゼラチンカプセル中に封入されるか、または、錠剤（タブレット）中へと圧縮されてもよい。経口投与による治療の目的では、本発明の医薬組成物は賦形剤と共に取り込まれてもよく、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（elixir）、懸濁、シロップ、ウェハウス、チューイング・ガム、および同様なものの形態で使用されてもよい。
【００４７】
錠剤、小丸薬（ピル）、カプセル、トローチ、および同様なものは、バインダー、レシピエント、崩壊剤、滑剤、甘味料、および香料も含有してよい。バインダーの幾つかの例は、微結晶セルロース、ガム、トラガカント、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例は、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤の幾つかの例は、アルギン酸、コーン・スターチ、および同様なものを包含する。滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。滑り剤（glidant）の１例は、コロイド二酸化ケイ素である。甘味料の幾つかの例は、スクロース、サッカリン、および同様なものを包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様なものを包含する。これらの種々の組成物を調製するのに使用される材料は医薬的に純粋であり、使用量において毒性がないべきである。
【００４８】
本発明の組成物は容易に、例えば、静注、筋肉内、くも膜下、もしくは皮下注射によるように、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を溶液もしくは懸濁中へと取り込むことにより、達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してよい。非経口処方は、例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびにＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩のような緩衝剤、および、塩化ナトリウム（食塩）もしくはデキストロースのような等張性調整剤も加えられてよい。本非経口調製品は、ガラスもしくはプラスチックでできたアンプル、使い捨てシリンジ、もしくは多ドーズ・バイアル中に封じ込められ得る。
【００４９】
直腸投与は、本医薬組成物を、直腸もしくはより大きな腸管中へと投与することを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用してなされ得る。坐薬処方は容易に、当業界において既知の方法により、製造され得る。例えば、坐薬処方は、グリセリンを約１２０℃へと熱し、本組成物を該グリセリン中に溶かし、熱せられた該グリセリンを混合し（この後精製水が加えられてもよく）、そしてこの熱い混合物を坐薬の型中へと注ぐことにより、調製され得る。
【００５０】
経皮投与は、皮膚を通した本組成物の経皮吸収を包含する。経皮（投与用）処方は、パッチ（よく知られたニコチンパッチのような）、外用剤、クリーム、ゲル、軟膏、および類似のものを包含する。
【００５１】
本発明は、哺乳類へ、治療に有効な量の本組成物を、鼻から投与することを包含する。本明細書において使用される場合、「鼻から投与する」もしくは「鼻からの投与」は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜へと投与することを包含する。本明細書において使用される場合、組成物の鼻からの投与用の医薬組成物は、よく知られた方法、例えば鼻での噴霧、鼻用ドロップ、懸濁、ゲル、外用剤、クリーム、もしくは粉末により調製された、治療に有効な量の投与されるべき本組成物を包含する。本組成物の投与は、鼻用タンポンもしくは鼻用スポンジを使用して行われてもよい。
【００５２】
従って、幾つかの実施形態では、本発明は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する方法に関する。本方法は、ＩＧＲＰに反応性のＴ細胞を抑制するのに充分、該哺乳類へと無菌医薬調製物中のオリゴペプチドを投与することを含む。これらの実施形態では、該オリゴペプチドは、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む。最後の配列は、ペプチドＮＲＰ−Ｉ４配列であり、これは８．３似のＴ細胞に対して反応することが分かっているペプチドであり、実施例３において、１型糖尿病に有効な処理であることが示される。これらの方法により抑制されるＴ細胞はＣＤ４＋、もしくは好ましくは、ＣＤ８＋であり得る。これらの方法では、該オリゴペプチドもしくはポリペプチドによる処理は、当該哺乳類が、該Ｔ細胞を排除するように寛容化する。該Ｔ細胞がＣＤ８＋である場合、これらの方法はβ細胞において、ＩＧＲＰに対して反応性のＴ細胞を抑制するかもしくは排除すると思われる。実施例２〜４参照。これらの実施形態の該オリゴペプチドもしくはポリペプチドは、前記されたものである。それらは、寛容化プロトコールとして適切なものとして、当業者により適切と考えられる如何なるサイズでもあり得、８〜１０量体、１３〜２５量体、もしくは２５未満、もしくは５０未満、もしくは１００未満、もしくは３００未満のものを包含し、もしくは更により大きく、ＩＧＲＰタンパク全体、不活性キャリアもしくは免疫原性キャリアに共役されたペプチドの幾つかを、包含する。Ｔ細胞活性に対して哺乳類を寛容化するプロトコールは、よく知られている。例えば、Ｇａｍｍｏｎら、１９８６年を参照。
【００５３】
これらの方法は、他の反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を排除するために、上に同定した１種より多いオリゴペプチドが、本処理において使用される実施形態を包含する。
【００５４】
他の実施形態では、本発明は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する更なる方法に関する。これらの方法は、該哺乳類へと、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、ＳＦＣＫＳＡＳＩＰ、およびＹＮＩＡＮＷＦＬからなる群から選択される配列を含む、８〜１０アミノ酸のオリゴペプチドを投与することを含む。これらの方法では、該オリゴペプチドに結合可能なクラスＩのＭＨＣ分子も、オリゴペプチド−ＭＨＣ結合を生成させるように、該オリゴペプチドと共に包含される。これらの実施形態における該オリゴペプチドおよび／または該ＭＨＣクラスＩ分子は更に、前記したような細胞毒性分子を含む。該オリゴペプチド−細胞毒性分子は、ＩＧＲＰに対して反応性のＴ細胞を抑制するのに充分、該哺乳類へと投与される。該ペプチド−ＭＨＣ分子−細胞毒性分子が８．３似のＴ細胞に結合する時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制が達成され、これは、該細胞毒性分子により殺傷される。前記した実施形態では、１種より多いオリゴペプチドが投与され得る。
【００５５】
これらの実施形態では、該ＭＨＣクラスＩ分子は、好ましくは４量体（テトラマー）形態で用いられる。例えば、Ａｌｔｍａｎら、１９９６年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年を参照。しかしながら、該ＭＨＣクラスＩ分子もまた、抗原提示細胞の１部として存在し得る。このような組成物は特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのサイトカイン（特に、インターフェロンγ）産生を測定するのに有用である。例えば、実施例２およびＴｅｒａｊｉｍａら、２００３年を参照。
【００５６】
関連した実施形態では、本発明は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する更なる方法に関する。これらの方法は、該哺乳類へと、８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドを投与することを含み、これは哺乳類ＩＧＲＰと完全に相同であり、前記したように、哺乳類ＭＨＣクラスＩ分子に結合できる。該オリゴペプチドは好ましくは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持っている哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同である。これらの方法では、該オリゴペプチドに結合可能なＭＨＣクラスＩ分子も、オリゴペプチド−ＭＨＣ結合を生成させるように、該オリゴペプチドと共に包含される。これらの実施形態では、該オリゴペプチドおよび／または該ＭＨＣクラスＩ分子は更に、前記したような細胞毒性分子を含む。該オリゴペプチド−細胞毒性分子は、ＩＧＲＰに対して反応性のＴ細胞を抑制するのに充分、該哺乳類へと投与される。該ペプチド−ＭＨＣ分子−細胞毒性分子がＩＧＲＰに対して反応性のＴ細胞に結合する時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制が達成され、これは、該細胞毒性分子により殺傷される。これらの実施形態では、１種より多いオリゴペプチドが投与され得る。
【００５７】
実施例３に示されるように、特に有効な１型糖尿病の処理は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する中〜低親和性結合を持つオリゴペプチドを用いるものである。これゆえ、本発明はまた、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する更なる方法にも関する。本方法は、該哺乳類へと、８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドを投与することを含み、ここで該オリゴペプチドが、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する中〜低親和性リガンドである。これらの方法に関して有用なオリゴヌクレオチドの好ましい例は、実施例３において利用されるとおり、ＫＹＮＩＡＮＷＦＬおよびＫＹＮＫＡＮＡＦＬである。
【００５８】
更なる実施形態では、本発明は、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞がβ細胞を破壊するのを防ぐ方法に関する。これらの方法は、該β細胞を、オリゴペプチドに結合可能な化合物を用いて処理することを含み、ここで該オリゴペプチドが８〜１０アミノ酸長であり、前記したように、哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同である。β細胞ＩＧＲＰ上の結合ドメインによるＩＧＲＰとのＣＤ８＋Ｔ細胞の反応は、該β細胞の破壊へと至り得るのであるが、防がれ得る。該オリゴペプチドは好ましくは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持っている哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同である。これらの実施形態では、該オリゴペプチドに結合する化合物は、該ＭＨＣへの該オリゴペプチドの結合を防ぐか、または、ＣＤ８＋Ｔ細胞への該オリゴペプチド−ＭＨＣ複合体の結合を防ぐ。
【００５９】
好ましい実施形態では、該化合物は、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含むオリゴペプチドもしくはポリペプチドに結合し得る。
【００６０】
これらの実施形態では、該オリゴペプチドに結合可能な該化合物は、オリゴペプチド−ＭＨＣ結合数を抑制することによって、または、該オリゴペプチド−ＭＨＣ複合体に結合するＴ細胞への物理的干渉を惹起することによって、β細胞に結合するＣＤ８＋と干渉することが可能な、如何なる化合物でもあり得る。好ましい実施形態では、該化合物は抗体もしくはアプタマーである。
【００６１】
オリゴペプチドに対する抗体を調製する方法は定法であり、当業者であれば、このような抗体であれば、過度の実験を行うことなく、如何なるＩＧＲＰオリゴペプチドに対しても調製され得ると予期すると思われる。該抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、もしくは組み換え供給源からのものであり得る。本明細書において使用される場合、「抗体」は、典型的な免疫グロブリン抗原結合部位（例えば、ＦａｂもしくはＦａｂ２）を含む抗体全体の断片をも包含する。本抗体もまた、如何なる脊椎動物（例えば、マウス、ニワトリ、ウサギ、ヤギ、もしくはヒト）または組み合わされた脊椎動物（例えば、ヒト化マウス）のものでもあり得る。
【００６２】
アプタマーは、タンパクもしくは小分子（例えば、ステロイド、薬剤等）のような、特定の標的分子に結合する１本鎖オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド類似体である。これゆえ、アプタマーは、抗体に類似したオリゴヌクレオチドである。しかしながら、アプタマーは抗体よりも小さく、一般的に５０〜１００ｎｔの範囲中にある。それらの結合は、該アプタマーオリゴヌクレオチドにより形成される２次構造に高度に依存している。ＲＮＡアプタマーおよび１本鎖ＤＮＡ（もしくは類似体）アプタマー両方が知られている。例えば、Ｂｕｒｋｅら、１９９６年；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０年；Ｈｉｒａｏら、１９９８年；Ｊａｅｇｅｒら、１９９８年；Ｋｅｎｓｃｈら、２０００年；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９５年；ならびに、米国特許第５，７７３，５９８号明細書、米国特許第５，４９６，９３８号明細書、米国特許第５，５８０，７３７号明細書、米国特許第５，６５４，１５１号明細書、米国特許第５，７２６，０１７号明細書、米国特許第５，７８６，４６２号明細書、米国特許第５，５０３，９７８号明細書、米国特許第６，０２８，１８６号明細書、米国特許第６，１１０，９００号明細書、米国特許第６，１２４，４４９号明細書、米国特許第６，１２７，１１９号明細書、米国特許第６，１４０，４９０号明細書、米国特許第６，１４７，２０４号明細書、米国特許第６，１６８，７７８号明細書、および米国特許第６，１７１，７９５号明細書を参照。
【００６３】
仮想的にどの特定の標的にも結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸと呼ばれる反復プロセスを使用することにより選択され得、これはＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを表す（Ｂｕｒｋｅら、１９９６年；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０年；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９５年；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９２年；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０年）。ＳＥＬＥＸの幾つかのバリエーションが開発されており、該プロセスを向上させ、特定環境下でのその使用を可能にする。例えば、米国特許第５，４７２，８４１号明細書、米国特許第５，５０３，９７８号明細書、米国特許第５，５６７，５８８号明細書、米国特許第５，５８２，９８１号明細書、米国特許第５，６３７，４５９号明細書、米国特許第５，６８３，８６７号明細書、米国特許第５，７０５，３３７号明細書、米国特許第５，７１２，３７５号明細書、および米国特許第６，０８３，６９６号明細書を参照。これゆえ、ＩＧＲＰオリゴペプチドを包含する如何なる特定のオリゴペプチドに対するアプタマー産生も、過度の実験を必要としない。
【００６４】
加えて、これらの方法における膵島β細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処理され得る（例えば、１型糖尿病を持っている患者体内への移植用の膵島β細胞に関して）。好ましい実施形態では、該膵島β細胞は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類の膵臓の一部である。本方法は如何なる特定の哺乳類を用いる使用にも限定されないが、マウスもしくはヒトが好ましい。
【００６５】
本発明はまた、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞が、β細胞を破壊するのを防ぐ方法にも関する。本方法は、該ＣＤ８＋Ｔ細胞を、８〜１０アミノ酸のオリゴペプチドを用いて処理することを含み、これは前記したように、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含み、前記したように、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を伴う。これらの実施形態における該ＭＨＣクラスＩ分子は、好ましくは、前記したようにテトラマー形態である。これらの実施形態では、該ＣＤ８＋Ｔ細胞は、該オリゴペプチド−ＭＨＣ複合体に結合し、該Ｔ細胞が該β細胞上の該オリゴペプチド−ＭＨＣに結合するのを防ぐ。
【００６６】
これらの方法の幾つかの実施形態では、該オリゴペプチドもしくはＭＨＣ分子が更に、前記したように細胞毒性分子を含み、このため該Ｔ細胞が該オリゴペプチド−ＭＨＣ−細胞毒性分子複合体に結合すると、殺傷される。
【００６７】
これらの方法における膵島β細胞も、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処理され得る（例えば、１型糖尿病を持っている患者体内への移植用の膵島β細胞に関して）。好ましい実施形態では、該膵島β細胞は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類の膵臓の一部である。本方法は如何なる特定の哺乳類を用いる使用にも限定されないが、マウスもしくはヒトが好ましい。
【００６８】
関連した実施形態では、本発明は、膵島β細胞に対して細胞毒性であるＣＤ８＋Ｔ細胞が、β細胞を破壊するのを防ぐ他の方法に関する。本方法は、該ＣＤ８＋Ｔ細胞を、前記したように、哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同な８〜１０アミノ酸のオリゴペプチドを用いて処理することを含み、前記したように、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を伴う。これらの実施形態における該オリゴペプチドは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合可能である。好ましくは、該オリゴペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持っている。
【００６９】
これらの実施形態における該ＭＨＣクラスＩ分子は、好ましくは、前記したようにテトラマー形態である。これらの実施形態では、該ＣＤ８＋Ｔ細胞は、該オリゴペプチド−ＭＨＣ複合体に結合し、該Ｔ細胞が該β細胞上の該オリゴペプチド−ＭＨＣに結合するのを防ぐ。
【００７０】
これらの方法の幾つかの実施形態では、該オリゴペプチドもしくはＭＨＣ分子が更に、前記したように細胞毒性分子を含み、このため該Ｔ細胞が該オリゴペプチド−ＭＨＣ−細胞毒性分子複合体に結合すると、殺傷される。
【００７１】
これらの方法における膵島β細胞も、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて処理され得る（例えば、１型糖尿病を持っている患者体内への移植用の膵島β細胞に関して）。好ましい実施形態では、該膵島β細胞は、１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っている哺乳類の膵臓の一部である。本方法は如何なる特定の哺乳類を用いる使用にも限定されないが、マウスもしくはヒトが好ましい。
【００７２】
加えて、本発明は、１型糖尿病のリスクに晒されている哺乳類を処理する方法に関する。これらの実施形態の方法は、該哺乳類におけるＩＧＲＰ発現を特異的に減少させることができる化合物を、該哺乳類へと投与することを含む。これらの実施形態では、該化合物は、前記したアンチセンス分子、リボザイム、およびＲＮＡｉ分子からなる群から選択され、ここで該化合物は、該哺乳類におけるＩＧＲＰ発現を減少させるのに充分、投与される。本方法は如何なる特定の哺乳類を用いる使用にも限定されないが、マウスもしくはヒトが好ましい。
【００７３】
１型糖尿病を持っている哺乳類（ヒトを包含する）の処理の既知の方法は、当該哺乳類の膵臓中へ、膵島β細胞を移植することである。しかしながら、β細胞に自己反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞は一般的に、移植後存在するので、移植されたβ細胞もしばしば破壊される。本発明は、移植されたβ細胞のこの破壊を抑制するかもしくは排除する方法を提供する。本方法は、該β細胞におけるＩＧＲＰ発現を抑えるかもしくは排除する核酸を発現するベクターを用いて、該β細胞をトランスフェクションすることを含んでいる。トランスフェクションされた細胞は、殆どもしくは全くＩＧＲＰを発現しておらず、その後、当該哺乳類体内へと移植される。それらの細胞は殆どもしくは全く、ＩＧＲＰを発現しないので、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、該β細胞に結合して破壊することができない。
【００７４】
これゆえ、これらの実施形態では、本発明は、１型糖尿病を持っている哺乳類を処理する更なる方法に関する。本方法は、哺乳類の膵臓中へ、膵島β細胞を移植することを含み、ここで該β細胞は、核酸を発現するベクターを用いてトランスフェクションされる。該核酸は、前記したアンチセンス分子、前記したリボザイム、および前記したＲＮＡｉ分子からなる群から選択される。これらの実施形態では、該核酸は、該β細胞におけるＩＧＲＰ発現を減少させるのに充分、発現される。
【００７５】
これらの実施形態は、如何なる特定タイプのベクターにも限定されない。当業界においてよく知られているように、適切なベクターの例は、ＤＮＡそのままのベクターおよびウィルスベクター、例えば、アデノウィルスもしくレンチウィルスのものを包含する。当業者は、過度の実験をすることなく、適切なベクターを選択して合成できる。
【００７６】
他の実施形態に関して、本方法は、如何なる特定哺乳類を用いての使用にも限定されない。好ましい実施形態では。該哺乳類はマウスもしくはヒトである。
【００７７】
１型糖尿病におけるＩＧＲＰの役割の発見は、幾つかの診断方法を示唆する。
【００７８】
従って、幾つかの実施形態では、本発明は、哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているか１型糖尿病を持っているかを決定する方法に関する。本方法は：
ａ．標準的な方法（例えば、静脈穿刺）により、該哺乳類から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球サンプルを得；
ｂ．該リンパ球を、前記した、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含む８〜１０アミノ酸のオリゴペプチドと組み合わせ、前記したような、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を伴い、ここで該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣクラスＩ分子が更に、前記したような検出可能な標識を含み；
ｃ．該オリゴペプチドに特異的に、いずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞が結合するかどうかを決定する
ことにより、該哺乳類におけるＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定することを含む。これらの実施形態では、該オリゴペプチドに結合するＣＤ８＋Ｔ細胞は、該哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っていることを指し示す。
【００７９】
これらの方法は、如何なる哺乳類を用いても実施され得るが、該哺乳類は、好ましくはマウスもしくはヒトである。
【００８０】
決定するステップ（ｃ．）は、如何なる既知の手段にもより得る。幾つかの好ましい実施形態では、該決定ステップは、細胞選別機（例えば、蛍光活性化細胞選別機）もしくは標識細胞計数機（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター）を使用して、標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞を計数することにより、実施される。他の好ましい実施形態では、該決定ステップは、該標識が観測され得る条件下、例えば、蛍光標識を使用する場合蛍光顕微鏡を用いて、もしくは、酵素標識および着色された酵素基質を使用して結合したＴ細胞を見えるようにする場合光学顕微鏡を用いて、該リンパ球の顕微鏡観察により、実施される。更なる好ましい実施形態では、該決定ステップは、該ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を測定することにより、好ましくは、既知の方法によりインターフェロンγ産生を測定することにより、例えばＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（例えば、Ｈａｒｔｅｍａｎｎら、１９９９年参照）を使用して、実施される。
【００８１】
本発明は、哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているか１型糖尿病を持っているかを決定する他の方法にも関する。本方法は：
ａ．標準的な方法（例えば、静脈穿刺）により、該哺乳類から、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球サンプルを得；
ｂ．該リンパ球を、哺乳類ＩＧＲＰに完全に相同な、８〜１０アミノ酸長のオリゴペプチドと組み合わせ、ここで、該オリゴペプチドが、前記したように、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に結合でき、前記したように、該オリゴペプチドに結合できるＭＨＣクラスＩ分子を伴い、ここで、該オリゴペプチドもしくは該ＭＨＣクラスＩ分子が更に、前記したような検出可能な標識を含み；
ｃ．該オリゴペプチドに特異的に、いずれかのＣＤ８＋Ｔ細胞が結合するかどうかを決定する
ことにより、該哺乳類におけるＩＧＲＰに対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を決定することを含む。これらの実施形態では、該オリゴペプチドに結合するＣＤ８＋Ｔ細胞は、該哺乳類が１型糖尿病のリスクに晒されているかもしくは１型糖尿病を持っていることを指し示す。
【００８２】
好ましい実施形態では、これらの方法において使用されるオリゴペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２に少なくとも９０％の相同性を持つ。上記の他の診断方法に関して、該決定ステップは、好ましくは、細胞選別機もしくは標識細胞計数機を使用して、標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞を計数することにより、または、該標識が観測され得る条件下での顕微鏡観察により、または、該ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を測定することにより、例えばＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用してインターフェロンγ産生を測定することにより、実施される。
【００８３】
上記の全ての処理もしくは診断方法は、哺乳類を処理するための医薬品製造のための、無菌医薬調製品における２次的な医療的使用の実施形態、例えば、ＹＬＫＴＮ（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）ＦＬ、ＦＬＷＳＶＦＷＬＩ、（Ｔ／Ａ）ＹＹ（Ｇ／Ｔ）ＦＬＮＦＭ、ＬＲ（Ｌ／Ｖ）（Ｆ／Ｌ）（Ｇ／Ｎ）ＩＤＬＬ、ＫＷＣＡＮＰＤＷＩ、およびＳＦＣＫＳＡＳＩＰからなる群から選択される配列を含むオリゴペプチドもしくはポリペプチドの使用を示唆するものであり（ここで、該哺乳類は、１型糖尿病のリスクに晒されているか１型糖尿病を持っており、該哺乳類に、該オリゴペプチドもしくはポリペプチドを、ＩＧＲＰに対して反応性のＴ細胞を抑制するのに充分、投与することによる）、本願請求項により示唆されるこのような２次的な医療的使用の実施形態全てが、本明細書において特定され目論まれる。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態が、以下の実施例に記載される。本願請求項の範囲内の他の実施形態は、本明細書に開示されるような本発明の明細書もしくは実施例の参酌から、当業者に明らかとなる。本願実施例と共に、本願明細書は例示的であるとのみ考えられるよう意図されており、本発明の範囲および思想は、本願請求項により指し示される。
【実施例】
【００８５】
実施例１．糖尿病における罹患性病原性Ｔ細胞により標的とされた抗原の同定
本実施例の要約
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、自己免疫（１型）糖尿病において、インシュリン産生膵臓β細胞の破壊には必須である。未だ、それらの抗原標的はかなり未知である。ここに我々は、ＮＯＤマウスにおける罹患集団の病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞のβ細胞標的が、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク（ＩＧＲＰ）であることを明らかにする。ヒトＩＧＲＰ遺伝子は、糖尿病感受性遺伝子座に位置し、このことは、ＩＧＲＰが、ヒト１型糖尿病における病原性Ｔ細胞に関する抗原でもあり、これゆえ、診断および治療アプローチに関する新たな標的であることを指し示す。
【００８６】
材料および方法
マウス
ＮＯＤ／Ｌｔマウスが、同胞交配により維持された。８．３−ＴＣＲαβ−遺伝子導入ＮＯＤマウス（８．３−ＮＯＤ）が、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年に記載されている。全てのマウスがＳＰＦ条件下に維持され、動物愛護に関するホスピタリティガイドラインに従って使用された。
【００８７】
ＭＨＣクラスＩ関連ペプチド
Ｈ−２Ｋｄ分子が、モノクローナル抗体ＳＦ１−１．１および以前に報告された（Ｃｏｘら、１９９７年）ように抽出されたそれらの関連ペプチドを使用して、１．４Ｘ１０１０インターフェロンγ処理ＮＩＴ−１膵臓β細胞（Ｈａｍａｇｕｃｈｉら、１９９１年）から、免疫親和性を用いて精製（イムノアフィニティ精製）された。ペプチド抽出物は、報告されているように（Ｐｉｅｒｃｅら、１９９９年）逆相ＨＰＬＣを２巡行うことにより、分画された。
【００８８】
エピトープ再構築アッセイ
８．３ＣＴＬが、報告されているように（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、２００２年）ＮＲＰ−Ａ７ペプチドのパルスを受けたマイトマイシンＣ処理ＮＯＤ脾臓細胞を有する８．３−ＮＯＤマウスからの脾臓細胞を培養することにより、生成された。ＣＴＬは、１６時間の５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイにおいて使用され、ペプチドのパルスを受けたＲＭＡ−Ｓ／Ｋｄ標的細胞（Ｍ．Ｂｅｖａｎ、ワシントン州立大、シアトル、ＷＡ、ＵＳＡにより提供）の認識に関して、報告されたような（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、２００２年）エフェクター：標的比＝４０：１において、テストされた。合成ペプチドが、図面に指し示された濃度において使用され、７×１０８、６×１０８、および２×１０９ＮＩＴ−１−細胞当量のペプチドがそれぞれ、１次元、２次元、および３次元ＨＰＬＣ分画アッセイに使用された。
【００８９】
ペプチド解析
活性な２次元分画６６が、逆相ミクロキャピラリーカラムにロードされ、自家組み立てＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ  搭載のミクロＥＳＩにより分析され、これには、ナノ流体液体クロマトグラフィーおよびオンライン・溶出液分割機が備え付けられていた（Ｃｏｘら、１９９７年；Ｐｉｅｒｃｅら、１９９９年）。簡潔には、該ミクロキャピラリーＨＰＬＣカラムからの溶出液は、１／１９がＥＳＩ  ＭＳ  分析のためにＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ  中へと向かい、残りの１８／１９がエピトープ再構築アッセイ用に９６穴（ウェル）プレートのウェル中へと直接投入されるよう分割された。このようにして、各ウェルは、該質量（ＭＳ）スペクトルデータ中での１セットのスキャンに相関させることができた。ＣＴＬ活性であった領域において溶出し、その活性−溶菌プロファイルに類似した溶出プロファイルを持っていたペプチドの質量（ＭＳ）が、抗原候補としてマークされた。良い候補は、８００〜１，６００ダルトン（Ｄａ）のデコンボリューション質量（Ｍ＋Ｈ）＋を持っていたが、この質量範囲が、ＭＨＣクラスＩ分子から溶出したペプチドの特徴であった。
【００９０】
配列解析および抗原候補合成
ＣＡＤ質量（ＭＳ、マス）スペクトルが、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎイオントラップ（捕捉）質量分析計（ＬＣＱ）を使用して、選択されたペプチド候補に関して記録された。候補の質量は、クロマトグラフィーの進行が終わるまで、標的とされた。候補ペプチド（ＶＹＬＫＴＮＶＦＬおよびＩＹＱＫＡＦＤＬＩ）が、Ｇｉｌｓｏｎペプチド合成機（ＡＭＳ４２２モデル）を使用して、標準的なＦｍｏｃの化学により合成され、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％まで精製された。候補抗原配列は、ＣＡＤスペクトルを合成ペプチドのものと比較することにより確かめられた。更なる配列の確認と、１細胞当たりのコピー数の推測は、該活性分画を分取し、抗原イオンの潤沢さを、既知濃度においてスパイクされた合成抗原を用いた同一の分取物と比較することにより、決定された。合成および天然に作られたペプチドの共溶出は更に、該抗体の同一性を確認した。
【００９１】
合成ペプチド
ＮＲＰ−Ａ７（ＫＹＮＫＡＮＡＦＬ）、ＮＲＰ−Ｖ７（ＫＹＮＫＡＮＶＦＬ）、ＩＮＳＢ１５〜２３（ＬＹＬＶＣＧＥＲＧ）、ＩＮＳ−Ｉ９（ＬＹＬＶＣＧＥＲＩ）、ＴＵＭ（ＫＹＱＡＶＴＴＴＬ）、およびＧ６Ｐアーゼ（ＫＹＣＬＩＴＩＦＬ）ペプチドが、オートメーション化（自動化）されたペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ４３３Ａ）において、Ｆｍｏｃの化学を利用する標準的な固相法により合成され、それらの同一性が、質量分析（ＭＳ）により確認された。
【００９２】
一過性トランスフェクション
ＣＯＳ−７細胞が、Ｋａｒｔｔｕｎｅｎらにより１９９２年に報告されたようなＤＥＡＥ−デキストランプロトコールを利用して、トランスフェクションされた。前記ＭＨＣクラスＩ分子（Ｈ−２ＫｄもしくはＨ−２Ｄｂ）発現構築体用に１０ｎｇ／ｍＬのＤＮＡが、濃縮されたＩＧＲＰ発現構築体と共にもしくは図面中指し示されたようにベクター単独で使用された。別々の培養が、Ｈ−２Ｋｄ単独でトランスフェクションされ、ＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチド濃度を変動させながら、パルス処理された。８．３ＣＴＬとの共培養後、Ｔ細胞応答が、ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮ−γの放出として測定された。
【００９３】
Ｔ細胞受容体のトランスフェクション体
以前に単離されたＮＯＤ由来β細胞自己反応性ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞クローンＡＩ４、ＡＩ１２．Ｂ１．１、ＡＩ１２．Ｂ１．２、ＡＩ１２．Ｂ１．３、ＡＩ１５．Ａ１０、ＡＩ１５．Ｆ５（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年）ならびに８．３（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年）からのＴ細胞受容体が、Ｓｅｒｒｅｚｅらにより２００１年に記載されたように、ＴＣＲ−Ｔ細胞ハイブリドーマ５８α−β−（ＴＣＲのζ鎖およびＣＤ８αβを発現するよう操作され、Ｈ．−Ｃ．Ｃｈａｎｇ，Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡにより提供）において発現された。ＴＣＲ発現が、ＣＤ３ε（１４５−２Ｃ１１）に対する抗体を使用した、成長しつつあるクローンのフロー・サイトメトリー分析により証明された。２８℃において終夜インキュベートされたＲＭＡ−Ｓ／Ｋｄ細胞が、図面中に指し示された通りの濃度において、外から加えられた合成ペプチドを提示するのに使用された。このＴＣＲトランスフフェクション体によるペプチド認識が、以前に記載されたように（Ｓｅｒｒｅｚｅら、２００１年）ＩＬ−２産生により測定された。
【００９４】
Ｈ−２Ｋｄ安定化アッセイ
ＲＭＡ−Ｓ／Ｋｄ細胞が２８℃において終夜培養され、２８℃において１時間、完全ＤＭＥＭにおいてペプチドのパルスを受け、３７℃において３時間、インキュベートされ、洗浄され、抗Ｈ−２Ｋｄモノクローナル抗体ＳＦ１−１．１を用いて染色され、ＦＩＴＣ共役ポリクローナルヤギ抗マウス抗体を用いて逆染色され、フロー・サイトメトリーにより分析された。ペプチドのパルスを受けなかった細胞におけるＨ−２Ｋｄの平均蛍光強度を、ペプチドのパルスを受けた細胞のものから引き算することにより、データが算出された。
【００９５】
テトラマー染色およびフロー・サイトメトリー（フロー細胞計算）
膵島関連および末梢血由来ＣＤ８＋Ｔ細胞が、以前に記載されたように（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）ＮＯＤマウスから単離された。テトラマーが、以前に記載されたように（Ａｍｒａｎｉら、２０００年）調製され使用された。
【００９６】
結果および議論
糖尿病原性で８．３似のＣＤ８＋Ｔ細胞集団により天然に認識される膵臓β細胞抗原を同定するために、我々は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、ＮＯＤ由来膵臓β細胞株ＮＩＴ−１から、Ｈ−２ＫｄＭＨＣクラスＩ分子を精製した。ペプチドはＨ−２Ｋｄ分子から溶出し、逆相液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分画された。フラクション（分画、複数）はそれらの、ペプチドのパルスを受けた標的細胞の８．３細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）媒介溶血を惹起する能力について、テストされた（図１Ａ）。その活性ピークを構成するフラクション（複数）が貯えられ、異なる条件下のもう１つ別の回のＨＰＬＣに付された。活性な単一ピークが観察された（図１Ｂ）。２次元フラクション６６が再度クロマトグラフィーに付され、その溶出液の一部分が、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびオンライン・溶出液分割器を備えたフーリエ変換イオン・サイクロトロン共鳴質量分光器（ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ）における電気噴霧イオン化法（ＥＳＩ）により、分析された。この分割実験に関しては、溶出液の一部分が、エピトープ再構築活性の決定用に９６穴プレート中に入れられ、残りが該質量分光器へと向けられた。８．３ＣＴＬによる認識に関するペプチド・フラクション・テストは、単一の活性ピークを与えた（図１Ｃ）。該エピトープ再構築アッセイからの溶血プロファイルを有する追加された活性フラクションにおいて観察されたイオンの潤沢さを比較することにより、候補ペプチドが同定された（図１Ｄ）。１００を超えるペプチド候補が、そのスキャン・ウィンドウ中に存在していた。これらのうち約３５が、該ウィンドウ（範囲）内に完全に溶出した。候補が、それらのイオンの潤沢さの曲線とその溶血プロファイルとの間の整合性の拡張に基づいて、ランク付けされた。最良の候補および非常に潤沢に後から溶出した１つのペプチドについての潤沢さの曲線だけが、図１Ｄに示される。ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳのミリマスレベルの精確さの能力が、＜０．１の質量単位異なる共溶出ペプチドが容易に区別されるようにし、該機器の検出限界（２〜１０原子モル）が、１細胞につき僅か数個存在しているペプチド候補を検出することを可能にした（Ｍａｒｔｉｎら、２０００年）。
【００９７】
潤沢さの曲線と溶血プロファイルとの間の整合性に基づけば、最良のペプチド候補は、最多ではないが、２つ荷電した１同位体の５４８．８４５ｍ／ｚを持つものであった（図１Ｄ）。配列解析はＶＹＸＫＴＮＶＦＸ（図１Ｅ）を与え、ここでＸはＩもしくはＬを表し、同一質量のアミノ酸は、この機器では差をつけられない。同様に、潤沢に後から溶出したペプチド（５５５．８３５＋２ｍ／ｚ）の配列が、ＸＹＱＫＡＦＤＸＸであると決定された（Ｓ．Ｍ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、データ示さず）。タンパクデータベース検索は、ＶＹＸＫＴＮＶＦＸおよびＸＹＱＫＡＦＤＸＸ各々についての完全な１つの適合物を与えた（それぞれ、ＶＹＬＫＴＮＶＦＬおよびＩＹＱＫＡＦＤＬＩ）。これらのペプチドが合成され、エピトープ再構築アッセイにおいてテストされた。図１Ｆは、ＶＹＬＫＴＮＶＦＬが８．３により認識される天然β細胞ペプチドであること、ならびに、それに対して活性化された８．３ＣＴＬが、前記した合成アゴニストＮＲＰ−Ａ７およびスーパーアゴニストＮＲＰ−Ｖ７について（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ａｍｒａｎｉら、２００１年）等価用量依存的に応答し、最大値の半分の活性が約５０ｐＭのペプチド濃度において観察されたことを、明らかにするものである。約１００コピーのＶＹＬＫＴＮＶＦＬ／Ｈ−２Ｋｄが、１つのインターフェロン（ＩＦＮ）−γ−処理ＮＩＴ−１細胞につき存在している。
【００９８】
完全ＮＣＢＩ非多重複タンパクデータベースのＢＬＡＳＴサーチが結果的に、マウス膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク（ＩＧＲＰ）の２０６〜２１４番残基に対応するＶＹＬＫＴＮＶＦＬについての唯一の精確なヒットを与えた（Ａｒｄｅｎら、１９９９年）。この抗原ペプチド源が本当にＩＧＲＰであることを確かめるために、我々は、ＩＧＲＰに関する種々の濃度の発現構築物、もしくはベクターのみ、Ｈ−２Ｋｄ発現構築物と一緒に用いて、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションさせ、８．３ＣＴＬによる認識についてテストした。ベクターのみではなくＩＧＲＰを用いてトランスフェクションされた細胞は８．３ＣＴＬを刺激し、共培養時、用量依存的にＩＦＮγを放出した（図１Ｇ）。この応答は、Ｈ−２Ｋｄの発現を必要とした。Ｈ−２Ｄｂ発現構築物を用いたＩＧＲＰ構築物のトランスフェクションが結果的に、ベクターのみのものと同様のＴ細胞応答プロファイルを与えた（Ｓ．Ｍ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、データ示さず）。我々の知識では、ＩＧＲＰは以前には、ＮＯＤマウスもしくは１型糖尿病患者におけるＴ細胞もしくはＢ細胞抗原としては示されていなかった。これゆえ、ＩＧＲＰはＮＯＤマウスにおいて、罹患性で病原性の８．３似のＴ細胞集団の天然の標的であり、新たなβ細胞自己抗原を提示する。
【００９９】
我々は以前に、若いＮＯＤマウスの早期インシュリン炎病巣から、一連の６種の、未知の抗原特異的β細胞自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを単離した（ＡＩ４、ＡＩ１２．Ｂ１．１、ＡＩ１２．Ｂ１．２、ＡＩ１２．Ｂ１．３、ＡＩ１５．Ａ１０、およびＡＩ１５．Ｆ５と命名、ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年）。我々はもっと早くに、ＡＩ１２．Ｂ１．３が、８．３のものとほぼ同一のＶα１７−Ｊα４２ＴＣＲのα鎖を発現し、ＮＲＰ−Ａ７を認識することを報告していた（Ｓｅｒｒｅｚｅら、２００１年）。これゆえ、我々は、それがＩＧＲＰ２０６〜２１４をも認識するであろうと仮定した。我々のパネル中のこのおよび他の全てのクローンがＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性であるかどうかをテストするために、我々は、それらのＩＧＲＰ２０６〜２１４を認識する能力をアッセイした。ＡＩ１２．Ｂ１．３は、ＮＲＰ−Ｖ７およびＮＲＰ−Ａ７同様、ＩＧＲＰ２０６〜２１４を認識したが、以前に同定された抗原性インシュリンペプチド（ＩＮＳ  Ｂ１５〜２３）もしくはそのＩ９変異体（ＩＮＳ−Ｉ９）を認識しなかった（Ｗｏｎｇら、１９９９年；Ｗｏｎｇら、２００２年。図２）。それで、８．３クローンタイプが唯一のものではない。罹患性Ｖα１７−Ｊα４２ＴＣＲのα鎖を分け合う他のβ細胞自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞も、ＩＧＲＰ２０６〜２１４を認識する。重要なことに、ＡＩ１５．Ｆ５はＶα１７−Ｊα５ＴＣＲのα鎖および８．３に類似のＴＣＲのβ鎖を発現するものであり、これもまたＩＧＲＰ２０６〜２１４およびＮＲＰ−Ｖ７に応答したが、それはＮＲＰ−Ａ７を認識しなかった（図２）。このことは、ＩＧＲＰ２０６〜２１４に対する反応性が、Ｖα１７−Ｊα４２ＴＣＲのα鎖を発現するＴ細胞に厳しく限定されないことを実証する。更に、ＮＲＰ−Ｖ７を認識し、ＮＲＰ−Ａ７を認識しないＡＩ１５．Ｆ５の能力は、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｈ−２Ｋｄテトラマーが、ＮＲＰ−Ａ７テトラマーが行うよりも大きな集団の膵島Ｔ細胞を染色するとの最近の観察（Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）と一致している。これゆえ、ＮＲＰ−Ａ７の反応性の以前の測定値（Ａｍｒａｎｉら、２０００年）は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性Ｔ細胞集団の罹病性を低く推定している。
【０１００】
ＮＯＤ由来糖尿病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンに対する唯一他の既知天然リガンドは、Ｈ−２Ｋｄにより提示されるＩＮＳ  Ｂ１５〜２３である（Ｗｏｎｇら、１９９９年）。このインシュリンペプチドは、Ｈ−２Ｋｄへの非常に乏しい結合しか呈さず、このことは結果的に、胸腺におけるＴ細胞のネガティブ・セレクションに関してペプチドの不充分な提示を与えることが、示唆されている（Ｗｏｎｇら、２００２年）。乏しいＭＨＣ結合が一般的に、自己抗原ペプチドの１特徴であるかどうかを決定するために、我々は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４のＨ−２Ｋｄに結合する能力をテストした。Ｈ−２Ｋｄ安定化アッセイにおいて、ＩＧＲＰ２０６〜２１４は良好なＭＨＣ結合を実証し、合成リガンドＮＲＰ−Ｖ７およびＮＲＰ−Ａ７のそれに匹敵し、テストされた最高ペプチド濃度においてさえ殆ど検出できなかったＩＮＳ  Ｂ１５〜２３のそれより顕著に良好であった（図３）。ＮＲＰ−Ｖ７およびＮＲＰ−Ａ７のように、ＩＧＲＰ２０６〜２１４は予期されたＨ−２Ｋｄアンカー残基、つまり２番目の位置のＹおよび９番目の位置のＬを含有する一方、ＩＮＳ  Ｂ１５〜２３は９番目の位置においてＧを持っており、これはＨ−２Ｋｄへのその結合を好ましくないものにする。９番目の位置のＧがＩにより置き換えられると、その結果のＩＮＳ−Ｉ９ペプチドは、Ｈ−２Ｋｄへの改善された結合を示す（図３、Ｗｏｎｇら、２００２年）。更に、マウスＩＧＲＰのタンパク配列が、良好なＭＨＣ結合ペプチドをするようデザインされた幾つかの異なるアルゴリズム（ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、１９９９年）、ＢＩＭＡＳ（Ｐａｒｋｅｒら、１９９４年）、もしくはＲＡＮＫＰＥＰ（Ｒｅｃｈｅら、２００２年））により解析されると、ＩＧＲＰ２０６〜２１４は一貫して、最良のＨ−２Ｋｄ結合物の間にランクする（それぞれ３番目、１番目、もしくは２番目）。併せると、これらの観察は、乏しいＭＨＣクラスＩ結合が、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される自家ペプチドの要件であることを指し示す。
【０１０１】
最近の研究が、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｈ−２Ｋｄテトラマーがｅｘ  ｖｉｖｏにおいて直接、膵島および末梢血由来ＮＲＰ−Ｖ７反応性ＣＴＬを検出し定量するのに使用され得ることを実証した（Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）。しかしながら、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて直接の、自己反応性Ｔ細胞を同定するテトラマー研究における天然の自己ペプチドの使用は、メラノサイト抗原特異的Ｔ細胞に関してのみ報告されている（Ｐｅｔｔｅｔら、２００２年）。３残基だけ８．３スーパーアゴニストＮＲＰ−Ｖ７（ＫＹＮＫＡＮＶＦＬ）とは異なる天然ＩＧＲＰペプチドが同様に、罹患性β細胞自己反応性Ｔ細胞集団を定量するのに使用され得るかどうかを評価するために、我々は、９および２０週齢の非糖尿病ＮＯＤマウスの膵島および末梢血両方からＴ細胞を単離し、それらをＩＧＲＰ２０６〜２１４、ＮＲＰ−Ｖ７、もしくはネガティブ・コントロール・ペプチド（ＴＵＭ）テトラマーを用いて染色した。９および２０週齢のマウスからのかなりの割合の膵島Ｔ細胞がＩＧＲＰ反応性であり、ＩＧＲＰ反応性細胞集団が末梢血中、はっきりと測定された（図４）。重要なことに、９および２０週齢のマウスの膵島および末梢血両方のサンプルについて、テトラマーにより染色されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団の規模は、検出にＩＧＲＰ２０６〜２１４が使用されてもＮＲＰ−Ｖ７テトラマーが使用されても、同様であった。これゆえ、該天然ペプチドは、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて直接、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性膵島および末梢血Ｔ細胞を検出し定量するのに使用され得る。
【０１０２】
１型糖尿病のような自己免疫疾患におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の役割が、より広く認識されてきている（Ｌｉｂｌａｕら、２００２年）。しかしながら、自然に起こる自己免疫疾患におけるこれら病原性Ｔ細胞の天然リガンドについての知識は、極めて限られている。ここに我々は、ＩＧＲＰを、ＮＯＤマウスにおける病原性ＣＤ８＋Ｔ細胞の罹患性集団により認識される天然ペプチド源として同定した。ＩＧＲＰは、膵臓β細胞において発現される（α細胞においてはより低い度合い）膵島特異的タンパクであり、約５０％の同一性を、肝臓のグルコース−６−ホスファターゼ酵素（Ｇ６Ｐａｓｅ）の触媒サブユニットと分け合う（Ｍａｒｔｉｎら、２００１年）。重要なことに、ＩＧＲＰ２０６〜２１４は、９つの位置のうちの６つにおいて、マウスＧ６Ｐａｓｅの相同的な残基（ＫＹＣＬＩＴＩＦＬ）とは異なる。従って、この肝臓Ｇ６Ｐａｓｅペプチドは、８．３ＣＴＬにより認識されない（Ｓ．Ｍ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、データ示さず）。Ｇ６Ｐａｓｅに関するその相同性にも関わらず、ＩＧＲＰに関しての触媒活性は実証されておらず、その機能は未知である（Ａｒｄｉｎら、１９９９年；Ｍａｒｔｉｎら、２００１年）。その配列から、それは膜９回貫通ＥＲ−ｒｅｓｉｄｅｎｔタンパクであると予見される（Ａｒｄｅｎら、１９９９年）。そのＲＮＡの潤沢さは、ＩＧＲＰを、中〜高濃度において発現されるβ細胞遺伝子の間とするものであり（Ｉｄ．）、このタンパクは容易に免疫組織化学により、膵島において検出され得る（Ｍａｒｔｉｎら、２００１年）。興味をかき立てられることに、ヒトＩＧＲＰ遺伝子は、染色体２ｑ２８〜３２にマッピングされ（２６）、糖尿病罹病性遺伝子座ＩＤＤＭ７（２ｑ３１）をオーバーラップするが（ＰｏｃｉｏｔおよびＭｃＤｅｒｍｏｔｔ、２００２年）、これに応答性の遺伝子は未知である。
【０１０３】
ＩＧＲＰ反応性Ｔ細胞集団は、最も早期のＮＯＤ膵島浸潤物であっても、これの実質的な成分を構成し（図２）（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年）、その病原性が明確に確立されている（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ｎａｇａｔａら、１９９４年；Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年）。これゆえ、ＩＧＲＰに対する応答は、自己免疫糖尿病において、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるβ細胞破壊に至る最初の現象の１つであるように見える。今、８．３似のＴ細胞により標的とされる天然β細胞抗原としてのＩＧＲＰの同定に伴って、それらの進展、活性化、および拡大の臨床的な側面を、更に調べることができる。既に、この知識は、ＮＯＤマウスにおけるこの病原性Ｔ細胞集団の抗体結合力の突然変異に応答するメカニズムの解明を可能にしている（Ｈａｎら、投稿中）。加えて今や、同様な罹患性ＩＧＲＰ反応性Ｔ細胞集団が、ヒト１型糖尿病の病理に関わっていることを確かめることが、可能となる。ＮＯＤマウスにおける幾つかのβ細胞自己抗体が、患者において同定されたものをオーバーラップし（ＴｉｓｃｈおよびＭｃＤｅｖｉｔｔ、１９９６年）、ヒトＩＧＲＰ遺伝子は糖尿病罹病性遺伝子座へとマッピングされるので、ＩＧＲＰがヒトでの疾患の進行における有意な重要性を実証するものと思われる。
【０１０４】
実施例２．ＩＧＲＰ２０６〜２１４を使用した、１型糖尿病からのＮＯＤマウスの保護
該ＮＯＤ雌マウスが３．５週齢から、１００μｇのＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチド（リン酸緩衝化生理食塩水中）を腹腔内経由で用いて処理された。４０匹のマウスが、コントロールとして使用された。各コントロールマウスは、ＴＵＭペプチド（ＫＹＱＡＶＴＴＴＬ）を用いて処理された。該マウスは、最初の３回の注射については２週毎にペプチドの注射を１回受け、次いでその後、３週毎に注射を１回受けた。２６匹のコントロールマウス（約６５％）に対して、約２５週齢において、該ＩＧＲＰ２０６〜２１４マウスの２匹（２０％）が糖尿病を進展させた。糖尿病を進展させている２匹の該マウスは、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄテトラマーを用いたＴ細胞染色により求めたところ、膵島中にＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性Ｔ細胞を持たなかった。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＧＲＰ２０６〜２１４およびＮＲＰ−Ｖ７を用いた刺激時に、これらのマウスからの膵島由来Ｔ細胞がインターフェロンγを産生するかどうかを求めることによっても確認された。（インターフェロンγ産生）対（ネガティブコントロールペプチドであるＴＵＭを用いて刺激された細胞）において、有意な差はなかった。これら２匹のマウスの１匹において、その膵島が、ＩＧＲＰ２０６〜２１４以外の２つのＩＧＲＰペプチドに応答するＴ細胞を含有した。これらの結果は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４に対する寛容が１型糖尿病の進展に対して保護し、他のＩＧＲＰペプチドが１型糖尿病の進展に寄与し得ることを指し示す。
【０１０５】
他のＩＧＲＰペプチドが１型糖尿病の進展に寄与し得るという主張を更に裏付けることに、本発明者らは、マウスＩＧＲＰの２９６〜３０４番アミノ酸残基において存在するペプチドＣＡＬＴＳＬＴＴＭが、ＭＨＣクラスＩ分子Ｈ−２Ｄｂにより提示されることをも発見している。
【０１０６】
実施例３．抗ＩＧＲＰ自己免疫操作による糖尿病予防：低親和性に変えられたペプチドリガンドの高い効率
本実施例の要約
抗原療法は、臓器特異的自己免疫の予防に関して、大いなる確約を保っている。しかしながら、ヒトでの限られた臨床試験がほぼ必ずや頓挫してしまっており、これは恐らく、処理の選択をガイドする原則が、よく定まっていないままだからである。ここに我々は、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク（ＩＧＲＰ２０６〜２１４）からのエピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞、すなわち、マウス自己免疫糖尿病における自己反応性Ｔ細胞の罹患性集団の野生型または改変ペプチドリガンドの抗糖尿病特性を検証した。我々は、肥満でない糖尿病マウスにおける膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＧＲＰの幾つかの更なるエピトープを認識すること、ならびに、これらの細胞が、ＩＧＲＰ２０６〜２１４特異的寛容を誘導するよう計画されたペプチド処理プロトコール結果における役割を演じることを示す。ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的とする改変ペプチドリガンドは有効に糖尿病の進行を抑えられたが、低抗体結合力ＩＧＲＰ２０６〜２１４特異的クローンタイプを割愛した用量においてのみであった。対照的に、比較的高用量のこれらのリガンドにより、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性Ｔ細胞のプールの完全に近い欠損が結果的に、次に優性なＩＧＲＰエピトープ反応性Ｔ細胞特性体の促進された動員をもたらし、糖尿病の進行を有意に阻害しなかった。これらの結果は、臓器特異的自己免疫におけるペプチド療法が、非病原性低抗体結合力クローンタイプによる標的臓器リンパ球のニッチの占有を促す条件下では、最も有効であることを示唆する。
【０１０７】
はじめに
溶液での自己抗原性タンパクもしくはペプチド投与は、自己免疫疾患実験モデルにおいて、自己免疫の開始および／または進展を鈍化させ得る（Ｗｒａｉｔｈら、１９８９年；ＭｅｔｚｌｅｒおよびＷｒａｉｔｈ、１９９３年；ＬｉｕおよびＷｒａｉｔｈ、１９９５年；ＡｎｄｅｒｔｏｎおよびＷｒａｉｔｈ、１９９８年；Ｋａｒｉｎら、１９９４年）。しかしながら、同様な戦略を用いたヒトでの限られた臨床試験が、ほぼ必ずや頓挫してしまっている（Ｗｅｉｎｅｒ、１９９３年；Ｔｒｅｎｔｈａｍら、１９９３年；ＭｃＫｏｗｎら、１９９９年；Ｐｏｚｚａｌｌｉら、２０００年；Ｄ．Ｐ．Ｔ．−Ｔ．Ｄ．Ｓ．グループ、２００２年；Ｋａｐｐｏｓら、２０００年；Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら、２０００年）。このことは、処理の選択および条件をガイドする原則がよく定まっておらず、結果として、ヒトでの適用には不適切であることを示唆するものである。
【０１０８】
それらの実験のもう片方（counterpart）とは異なり、自然な臓器特異的自己免疫疾患は結果的に、多数の抗原中の数多くのエピトープに対する複雑な応答からもたらされ、これは自然に、確率的でしばしば予見不可能な流れの中にあるものである。この複雑さは、同一エピトープを認識するリンパ球クローンが、広い範囲内の抗体結合力で抗原／ＭＨＣと結びつき、その強度が病原性の潜在性と相関するとの事実により、複雑化されたものである（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、２００１年；Ｌｉｂｌａｕら、２００２年）。従って、自己免疫の予防のための如何なる免疫における戦略の結果も、自己抗体（単数もしくは複数）、用量、処理周期、ならびに投与経路および投与形態により、影響を受け易い。不運なことに、処理結果に対するこれら変動の個々の寄与についての我々の現時点での見解は、極めて限られている。
【０１０９】
ヒトおよび肥満でない糖尿病（ＮＯＤ）マウス両方における１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、Ｔリンパ球による膵臓β細胞の選択的破壊から結果的にもたらされる自己免疫疾患である。ヒトおよびマウスのＴ１Ｄは、増加するリストに挙げられた抗原に対する複雑なＢ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含んでいる（ＬｉｅｂｅｒｍａｎおよびＤｉＬｏｒｅｎｚｏ、２００３年）。Ｔ１Ｄの開始ははっきりと、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の動員を必要とするが、Ｔ１Ｄの開始および進展はＣＤ８＋Ｔ細胞依存性であるとの動かし難い証拠がある（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、２００１年；Ｌｉｂｌａｕら、２００２年）。他の人達および我々は、ＮＯＤマウスにおける全ての膵島関連ＣＤ８＋細胞の大きな分画が、高度に相同的なＴＣＲα鎖（Ｖα１７−Ｊα４２）を使用するものであることを示しており（Ｓａｎｔａｍａｒｉａら、１９９５年；Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９６年；Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年；ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年）、同一のミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ、ＮＲＰ−Ａ７）を認識するものである（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年）。これらのＴ細胞は既に、ＮＯＤ膵島ＣＤ８＋の最も早期の浸潤物の重要成分であり（ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら、１９９８年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年；Ａｍｒａｎｉら、２００１年）、糖尿病原性であり（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９６年；Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパクからのペプチド（ＩＧＲＰ２０６〜２１４）を標的とし（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、２００３年）、珍しく末梢に多い（循環ＣＤ８＋細胞の約１／２００、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、２００３年；Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）。特記すべきことに、ＮＯＤマウスにおけるインシュリン炎の糖尿病への進行は、循環ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールの巡繰りの拡大を、および、その膵島関連対応部（counterpart）の抗体結合力の成熟を、必ずや伴う（Ａｍｒａｎｉら、２０００年）。併せて考えると、これらのデータは強力であり、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が、マウスのＴ１Ｄの開始および／または進行において、鍵となる役割を演じるとの考えを裏付ける。興味をかき立てられることに、ヒトｉｇｒｐ遺伝子は、染色体２ｑ２８〜３２にマッピングされるが（Ｍａｒｔｉｎら、２００１年）、Ｔ１Ｄ罹患性遺伝子座たるＩＤＤＭ７（２ｑ３１）（ＰｏｃｉｏｔおよびＭｃＤｅｒｍｏｔｔ、２００２年）をオーバーラップし、ＩＧＲＰもヒト糖尿病原性応答の標的であるかも知れないとの可能性を引き起こす。
【０１１０】
可溶性ペプチド（アジュバントなし）の投与は、抗体特異的Ｔ細胞寛容を誘導する有効な方法である（Ａｉｃｈｅｌｅら、１９９４年；Ｔｏｅｓら、１９９６年）。以前我々は、可溶性ＮＲＰ−Ａ７ペプチドを用いた糖尿病発症前ＮＯＤマウスの繰り返し処理が、ペプチド／ＭＨＣに関して最高の親和性を有するＴＣＲを発現するクローンタイプを選択的に欠損させることにより、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの抗体結合力の突然変異を鈍化させることを示した（Ａｍｒａｎｉら、２０００年）。これらの観察は、病原性Ｔ細胞集団の抗体結合力の突然変異が、自己免疫における疾患を顕在化させる良性の炎症の進行において鍵となる現象であることを示唆した。しかしながら、それらはまた、ＮＲＰ−Ａ７の抗糖尿病原としての活性が、「高抗体結合力のニッチのクローンタイプ」（ＮＲＰ−Ａ７処理により消失される）の「低抗体結合力（および潜在的に抗糖尿病原性の）クローンタイプ」による占有により媒介された可能性をも引き起こす。この仮説をテスト（検証）するために、我々はここに、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に関して、部分的なアゴニスト活性、完全なアゴニスト活性、もしくはスーパー（本来のものを凌駕する）アゴニスト活性を有するＡＰＬを同定し、それらの抗糖尿病原活性を、広範な用量に亘りｉｎ  ｖｉｖｏにおいて比較した。
【０１１１】
我々のデータは、野生型のＮＯＤマウスが自然に、数多くのＩＧＲＰエピトープに対する高度に罹患性のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を蓄積すること、ならびに、ＩＧＲＰ２０６〜２１４応答性ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを選択的に標的とすることを狙いとしたペプチド治療が、もしそれが非糖尿病原性低抗体結合力クローンタイプを欠損しない場合有効であることを示す。高用量のＩＧＲＰ２０６〜２１４もしくは高親和性ＡＰＬを用いた、ニッチの罹患性ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性Ｔ細胞の完全な欠損は、次に優性なエピトープ特異的ＩＧＲＰ反応性Ｔ細胞特性体の促進された動員と関連し、糖尿病の進行を鈍化させなかった。これらのデータは、自己免疫における抗原特異的免疫療法の計画のための重要な思索を喚起する。
【０１１２】
材料および方法
マウス、細胞株、および抗体
ＮＲＰＡ７／ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性、Ｈ−２Ｋｄ制限β細胞反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＮＹ８．３のＴＣＲαβ再配列体を発現した８．３ＮＯＤマウスが、記載されている（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら、１９９７年）。ＮＯＤマウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入された。抗Ｌｙｔ−２（ＣＤ８α）（５３−６．７）、抗Ｌ３Ｔ４（ＩＭ７）、抗Ｖβ８．１／８．２（ＭＲ５−２）、抗Ｈ−２Ｋｄ（ＳＦ１−１．１）、および抗Ｈ−２Ｄｂ（ＫＨ９５）ｍＡｂｓが、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入された。
【０１１３】
ペプチドおよびペプチドライブラリー
本研究用にＡＰＬを同定するのに使用されたペプチドライブラリーは、多数回合成技術および標準ＦＭＯＣ化学（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ａｍｒａｎｉら、２００１年）を利用して、調製された。第１回のスクリーニングは、ＮＲＰ主体のジペプチドライブラリーを使用して行われた。応答を惹起できたライブラリーは、ＮＲＰの単一アミノ酸変異体を探すことにより、解析された。部分的なアゴニスト活性、完全なアゴニスト活性、もしくはスーパーアゴニスト活性を表した代表的なＡＰＬ（図１）が、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用に選ばれた。あつらえられた特定の単一ペプチドが、ｒｐＨＰＬＣにより＞８０％純度まで精製され、イオン噴射質量分析（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により、配列決定された。ペプチドはｐＨ７．４において、４０％アセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）中、０．１ＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中１０ｍｇ／ｍＬとして再懸濁され、−８０℃において分取され、使用前にＰＢＳ中に更に再懸濁された。この再懸濁「戦略」は、Ａｍｒａｎｉら、２０００年において使用されたものとは異なり、ＰＢＳ中での再懸濁およびマウス中への注射直前に、真空遠心分離により、ペプチド稀釈ストックの濃縮を避けるものである。後者の「戦略」は結果的に、乾燥させたペプチドの再溶解における難しさのために、材料の損失を招く。Ｈ−２ＫｄもしくはＨ−２Ｄｂに結合するＩＧＲＰペプチドライブラリーは、Ｒａｎｋｐｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｆ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｒａｎｋｐｅｐ．ｃｇｉ）およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ）を用いてＩＧＲＰアミノ酸配列をスクリーニングすることにより、計画された。＞３９のスコア（ｒａｎｋｐｅｐ）もしくは＞２５のスコア（ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ）を有すると予測されたＭＨＣ結合物から構成されたペプチドセット（ｐｅｐｓｅｔ）が、上記のように合成、再懸濁され、１０μＭにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに使用された。
【０１１４】
ＮＯＤ膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞株の生成
ペプチド処理ＮＯＤマウスもしくは無操作ＮＯＤマウスからの膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞が、０．５Ｕ／ｍＬのタケダｒｈＩＬ−２（２４穴プレートにおいて１０〜５０膵島／穴）を含有する完全培地（ＣＭ：１０％胎児牛血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地）において膵島を培養することにより、生成された。膵島から該培地中へと移動したｉｎ  ｖｉｖｏ活性化ＩＬ−２Ｒ＋リンパ球が、膵島分離の６〜９日以内に、機能に関するアッセイにおいて使用された（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年）。
【０１１５】
増殖アッセイ
８．３ＮＯＤマウスからの内因性もしくはＮＲＰ−Ａ７分化（下記参照）脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０４／穴）が５％ＣＯ２において、３７℃３日間、ペプチドのパルスを受け（０．０１、０．１、および１μＭ）γ（線）照射（３，０００ｒａｄ）されたＮＯＤ脾臓細胞（１０５／穴）と共に、２通りインキュベートされた。培養は、培養および回収の最後の１８時間の間、１μＣｉの（３Ｈ）−チミジンのパルスを受けた。
【０１１６】
サイトカイン分泌
８．３ＮＯＤマウスからの内因性脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０４／穴）が、３７℃４８時間、９６穴プレートにおいてペプチドのパルスを受け（０．００１、０．０１、０．１、１および／または１０μＭ）γ（線）照射されたＮＯＤ脾臓細胞（１０５／穴）と共に、インキュベートされた。ペプチド処理ＮＯＤマウスもしくは無操作ＮＯＤマウスからの膵島由来Ｔ細胞短期細胞株（２×１０４ＣＤ８＋Ｔ細胞／穴に調整）が同様にテストされたが、１０μＭのペプチドを使用した。その上清（１００μＬ／穴）が、市販キット（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用したＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２、ＩＬ−４、および／またはＩＦＮ−γ含量について、２通りアッセイされた。
【０１１７】
テトラマーの染色
テトラマーが、Ａｍｒａｎｉら、２０００年に記載されたように調製され、使用された。個々のマウスから手で拾い集められた膵島が、０．５Ｕ／ｍＬのタケダｒｈＩＬ−２を補った完全培地中、７〜９日間培養された。Ｔ細胞（２０μＬにつき１０６個）が次いで、抗ＣＤ８ＦＩＴＣ（クローンＹＴＳ１６９．４；０．５μｇ）およびテトラマー（８５．５ｎＭ）を含有する洗浄媒体２０μＬ（ＲＰＭＩ−１６４０中、０．２％重炭酸ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、および２％ＦＢＳ）中、氷上（氷浴中）４５分間染色された。洗浄後、これらの細胞は、洗浄媒体中再懸濁され、フロー・サイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析された。平衡におけるテトラマー染色分析については、Ｔ細胞が、抗ＣＤ８αＦＩＴＣ（クローンＹＴＳ１６９．４；０．５μｇ）および異なる濃度のテトラマー（８．５５、１７．１、４２．７５、および８５．５ｎＭ）を含有する洗浄媒体２０μＬ（ＲＰＭＩ−１６４０中、０．２％重炭酸ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウム、および２％ＦＢＳ）を用いて、室温において２時間染色された。洗浄後、細胞は、１００μＬの洗浄媒体中に再懸濁され、０．４％パラホルムアルデヒド中で固定され、フロー・サイトメータを用いて分析された。その見かけのＫｄ値は、蛍光単位のスキャッチャード・プロットに適合された線の傾きの反対の符号（負）の逆をプロットすることにより（ＣＤ８＋集団のテトラマーの染色のメディアン（ｎＭ）対蛍光単位）求められた。
【０１１８】
Ｈ−２Ｋｄ安定化アッセイ
２６℃において終夜培養されたＲＭＡ−ＳＫｄ細胞が４通り、９６穴プレートにおいて１０４細胞／穴にて播種され、２６℃１時間、ＲＰＭＩ−１６４０、０．２５％ＢＳＡにおいてペプチドのパルスを受け、３７℃３時間インキュベートされ、洗浄され、抗−Ｈ−２Ｋｄ−ＦＩＴＣもしくは抗−Ｈ−２Ｄｂ−ＦＩＴＣを用いて染色され、ＭＨＣクラスＩ発現についての平均蛍光強度（ｍｆｉ）が、フロー・サイトメトリーにより分析された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９９年）。使用されたコントロールは、ＴＵＭ（Ｈ−２Ｋｄに結合するもの）、ＬＣＭＶ−ＧＰ３３（Ｈ−２Ｄｂに結合するもの）を包含し、ペプチドを包含しなかった。その解離定数（Ｋｄ）が、異なる濃度のペプチド（１０、１、０．１、０．０１、０．００１μＭ）を使用することを除き、上記した実験を繰り返すことにより測定された。該Ｋｄ値は、ＲＭＡ−ＳＫｄ細胞において、Ｈ−２Ｋｄ分子の５０％を救い出すのに必要とされるペプチド濃度として計算された（１０μＭにおいて１００％）。
【０１１９】
ペプチド処理
３〜４週齢の同齢雌ＮＯＤマウスが、ＰＢＳ中１〜１００μｇのペプチドを用いて腹腔内注射された。これが、７〜８週まで２週間毎、その後３週毎、繰り返された。マウスは少なくとも２８週齢まで、高血糖の進行についてモニターされた。ＡＰＬの８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞寛容原活性が、８〜１５週齢の８．３ＮＯＤマウスを、１００μｇのペプチドの１回のｉ．ｐ．注射により処理することによって求められた。より高齢のマウス（２８〜３０週齢）およびＮＲＰ−Ａ７を用いたペプチド処理実験は、より若いマウスにおいて見られたものに統計的に類似した結果を与え、ペプチド処理からもたらされる遺伝子導入Ｔ細胞数の減少がマウスの齢に依存しなかったことを指し示した。マウスは処理１週後に屠られ、それらの脾臓がフロー・サイトメトリーにより、８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在について分析された。
【０１２０】
統計分析
データは、１次回帰および分散分析であるＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵテストもしくはχ２（χ２検定）を利用して、比較された。
【０１２１】
結果
ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＰＬ
我々は第１に、ＮＲＰ−Ａ７に比較して異なる親和性をもって８．３−ＴＣＲと結合できるＮＲＰＡＰＬを求めて探索した。この作業は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４の発見前に首尾良く開始されたが、ＮＲＰの数多くの単一アミノ酸変異体を生成させ、それらの８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起する能力をテストすることを含むものであった（Ａｍｒａｎｉら、２００１年）。ＮＲＰ−Ｉ４が潜在的な「低抗体結合力」ＡＰＬ候補として選ばれたが、これは、それが部分的アゴニストとして振る舞ったからである。それは、内因性の８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の引き金を引くことにおいては極めて効率良かったが、他の応答を誘導することにおいてはＮＲＰ−Ａ７より有意に効率良くはなかった（図５）。ＮＲＰ−Ｖ７が潜在的な「非常に高い抗体結合力」ＡＰＬとして選ばれたが、これは、それが８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＮＲＰ−Ａ７（アゴニスト）より優れたアゴニスト活性を持っていたからである（図５）。これらのペプチドが事実、８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞により、異なる抗体結合力でもって認識された（それらは全て、ＲＭＡ−ＳＫｄ安定化アッセイにより求められた場合、同様な抗体結合力でもってＫｄに結合した。データ示さず）ことを確かめるべく、我々は、内因性８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞を染色する対応ペプチド／ＭＨＣテトラマーの能力をテストした。図６Ａに示されるとおり、該テトラマーの染色強度は、異なるペプチドのまともに機能する抗体結合力と一致していた（図５）。これらのペプチドのまともに機能する抗体結合力も、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの寛容原としての活性と良く相関した。中〜高抗体結合力でもってＮＲＰ−Ｖ７を認識するＴＣＲを発現する（我々の未公表データ）８．３ＮＯＤマウスの、ＮＲＰ−Ｖ７の単回注射（ＰＢＳ中１００μｇ）を用いての処理は、ＮＲＰ−Ａ７もしくはＮＲＰ−Ｉ４を用いて処理された８．３ＮＯＤマウスより少ない８．３ＣＤ８＋脾臓細胞を含有した（図６Ｂ）。
【０１２２】
野生型ＮＯＤマウス膵島由来ＣＤ８＋細胞を用いた実験は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるこれらペプチド／Ｋｄ複合体の各々の差のある結合が、８．３−ＴＣＲ発現細胞の特性ではないことを指し示した。ＮＲＰ−Ｉ４テトラマーが、フロー・サイトメトリーによる検出について、その閾値を上回って、２０週齢の野生型ＮＯＤマウスの膵島由来のＴ細胞を染色できなかった（データ示さず）一方、ＮＲＰ−Ｖ７テトラマーは一般的に、ＮＲＰ−Ａ７テトラマー（図６Ｃ）より高い蛍光強度で染色した。抗体結合力の定量的測定が、これらの結果を確認した。ＮＲＰ−Ｖ７テトラマーが、ＮＲＰ−Ａ７（図６Ｄ）より有意に低いＫｄ（より高い抗体結合力）で、９週齢のＮＯＤマウスの膵島由来のＣＤ８＋細胞に結合した。全体としてこれらのデータは、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方において、増加した親和性で、ＮＲＰ−Ｉ４、ＮＲＰ−Ａ７、およびＮＲＰ−Ｖ７を認識することを実証する。
【０１２３】
ＩＧＲＰ２０６〜２１４ＡＰＬは、ＮＯＤマウスにおいてＴ１Ｄの進行を押し留め得るが、狭い範囲内の用量および親和性でしかない。
我々は次に、特異的ＴＣＲに対しての個々のペプチド／ＭＨＣ複合体の親和性によってだけでなく、認識に利用可能であるペプチド／ＭＨＣ複合体の絶対数（つまり、ペプチドの用量）によって定義される場合、上記ＡＬＰの抗糖尿病活性が「抗体結合力」の関数であるかどうかを調べた。これは、同齢の雌ＮＯＤマウスを、広範な用量に亘って、ＴＵＭ（ネガティブコントロール）、ＮＲＰ−Ｉ４、ＮＲＰ−Ａ７、およびＮＲＰ−Ｖ７（ＰＢＳ中）の繰り返し注射を用いて処理することによって、そして該マウスを糖尿病の進行について追跡することによって、行われた（図７Ａ上図）。３〜４週齢においてスタートして、マウスは処理開始後、２週毎（最初の３用量）もしくは３週毎、１回のペプチド注射をｉ．ｐ．により受けた。マウスは、糖尿病の発症もしくはフォロー・アップ期間（２８〜３２週）の終わりに屠られ、膵島関連ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞下位集団の大きさおよびテトラマー結合抗体結合力についての処理効果を調べた（図７Ａ下図）。
【０１２４】
ＮＲＰ−Ｉ４は、用量依存的に抗糖尿病性であった。それは、＜２０μｇ／単回注射にて与えられた場合、全く保護的ではなかったが、１００μｇ／単回注射にて与えられた場合、高度に抗糖尿病性であった（図７Ａ上図）。衝撃的なことに、ＮＲＰ−Ｉ４の保護効果は、１００μｇ／単回注射において、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞サブセットの大量の欠損とよりも、むしろ膵島中への低抗体結合力ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞と関連していた。これゆえ、これらのマウスの膵島中に含有されるＮＲＰ−Ｖ７反応性ＣＤ８＋細胞の％（図７Ａ下図、右ｙ軸）および絶対数（図７Ｂ）は、ＴＵＭ処理されたコントロールにおいて見られたものに類似していた。更に、ＮＲＰ−Ｉ４処理マウスの膵島関連ＣＤ８＋細胞は、ＴＵＭ処理マウスの膵島由来のもの（左ｙ軸）より有意に低い抗体結合力でもって、ＮＲＰ−Ｖ７テトラマーに結合した（その値は図７Ａに示され、これら２群のマウス間の違いを反映する）。これらの結果の最も論理的な解釈は、高用量ＮＲＰ−Ｉ４処理の保護効果は、高抗体結合力ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞の選択的欠損に由来したということである。この見方に一致して、ＮＲＰ−Ａ７、つまりＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞のより高親和性のリガンドは、ＮＲＰ−Ｉ４（５０μｇ／単回注射）より低い用量においてマウスを糖尿病から保護し、これもまた、膵島内の低抗体結合力ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞の蓄積と共に起こった（図７Ａ下図）。これらのマウスの膵島中のＮＲＰ−Ｖ７反応性Ｔ細胞の絶対数は抑えられたが、ＴＵＭ処理マウスに比較して、有意にではなかった（それぞれ、０．６×１０５±０．３対１×１０５±０．３）。
【０１２５】
しかしながら、高用量のＮＲＰ−Ｉ４および中用量のＮＲＰ−Ａ７による保護が高抗体結合力クローンタイプの欠損のみによるとのこの解釈は、２つの予期せぬ観察のため、奇妙であった。第１に、高用量のＮＲＰ−Ａ７（１００μｇ／単回注射）が無効であった。ここに我々は、稀釈されたストックから乾燥された材料を溶解させることによる（Amraniら、２０００年）のとは反対に、ビヒクルを用いてペプチドの濃縮ストックを稀釈することにより接種体を調製したことが、記されるべきである。後者の戦略は結果的にペプチドの損失を与えるので（我々の観察）、以前のとある研究において（Amraniら、２０００年）「１００μｇ」用量で与えられた場合、ＮＲＰ−Ａ７が保護的であったということは、驚くべきことであるはずはない。第２の予期せぬ観察は、ＮＲＰ−Ｖ７（ＮＲＰ−Ａ７より更に高い親和性の、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のリガンド）が如何なる用量においても、有意には保護的でないということであった（図７Ａ、最上）。このことが悩ましかったのは、ＮＲＰ−Ａ７（１００μｇ／用量）およびＮＲＰ−Ｖ７（ある範囲の用量に亘って）処理マウスの膵島がそれぞれ、有意に抑えられた数のＮＲＰ−Ｖ７反応性ＣＤ８＋細胞を含有したか、または、殆ど完全にこれらのＴ細胞を欠いたからである（図７Ａ、最上、および７Ｂ）。これゆえ、ＮＲＰ−Ｉ４（１００μｇにおいて）およびＮＲＰ−Ａ７（５０μｇにおいて）の抗糖尿病活性は、（高抗体結合力）ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞単独の欠損の原因には帰され得なかった。むしろ、このデータは、膵島への低抗体結合力ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋細胞の動員を、（糖尿病からの）保護が必要とすることを示唆した。恐らく、これらの低抗体結合力細胞が、慢性ではあるが尚非病原性である炎症状態を促進するであろう。
【０１２６】
野生型ＮＯＤマウスは自然に、数多くのＩＧＲＰエピトープに対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を積み重ねる
高用量の（７５〜１００μｇ／単回注射）ＩＧＲＰ２０６〜２１４を用いたＮＯＤマウス処理は、ＮＲＰ−Ｖ７処理マウスにおいて得られたものに非常に似た結果を与えた。このペプチドは、糖尿病発症時の齢を遅らせるが、その発症を有意には抑制しなかった（図８Ａ）。特記すべきことに、ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理の無効性は、血流計算（フロー・サイトメトリー、図８ＢおよびＣ、左パネル）および膵島由来Ｔ細胞を用いた機能に関するアッセイ（図８ＢおよびＣ、右パネル）により求められた両方の場合、膵島内部ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞下位集団の完全に近い欠損とも関連していた。
【０１２７】
これらの結果は我々を、（ＮＲＰ−Ｖ７もしくはＩＧＲＰ２０６〜２１４処理による）ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋サブセットの完全に近い欠損が、膵島における次に優性な自己反応性Ｔ細胞特性体ための「ニッチ」の創出をやや補助したのかも知れないとの可能性を考えるようにさせた。思い至るに、これらのクローンタイプの動員および／または蓄積は、優性なＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性のプールの欠損により与えられた如何なる保護にも逆に作用し得たのかも知れない。高抗体結合力インシュリン１５〜２３／Ｋｄ（ＩｎｓＬ）テトラマーを用いた、ＴＵＭ対ＮＲＰ−Ｖ７もしくはＩＧＲＰ２０６〜２１４処理マウスの膵島由来Ｔ細胞（β細胞自己反応性ＣＤ８＋細胞の他の唯一の既知の標的（Ｗｏｎｇら、１９９９年））染色が有意な違いを明らかにしなかったので（データ示さず）、我々は、糖尿病における抗ＩＧＲＰ−ＣＤ８＋細胞応答が多数のエピトープを巻き込んでいるのかどうか訝った。このことを調査するために、我々は、７６種のＭＨＣクラスＩ結合ノナマー（９量体、３３Ｋｄおよび４３Ｄｂの結合、表Ｉ、ＩＧＲＰ中でのそれらの位置に基づき、アミノ末端からカルボキシ末端へと並べられている）から構成される、ＩＧＲＰ主体のペプチドライブラリーを計画した。これらのペプチドのただ１種（ＩＧＲＰ２０７〜２１５；ペプチド「６」）が、８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起するその能力により求められる場合、ＩＧＲＰ２０６〜２１４（ペプチド「ＩＧ」）と交差反応性であった（データ示さず）。我々は次いで、糖尿病発症前（２１±１週）もしくは急性糖尿病（１８＋１週）ＮＯＤマウスの膵島からプロパガンダされたＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γ分泌を惹起する、これらＩＧＲＰペプチド各々の能力を、ＮＲＰ−Ｖ７およびＴＵＭ（１０μＭ）同様、テストした（表ＩＩおよび図９Ａ）。大部分のマウスは、糖尿病であるにも関わらず、膵島中にＩＧＲＰ２０６〜２１４（およびＩＧＲＰ２０７〜２１５）反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有したが（それぞれペプチド「ＩＧ」および「６」、表ＩＩおよび図９Ａ、左パネル）、該糖尿病マウス由来の細胞は、糖尿病でない動物（マウス）由来の細胞よりも、これら２種のエピトープに対するより激しい応答を積み重ねた（図９Ａ、右パネル、応答しなかったマウスを除く（＜５０ｐｇ／ｍＬ））。ＩＧＲＰ２０６〜２１４テトラマーを用いた実験は、膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の規模と、テトラマー陽性（＋）細胞のパーセンテージ（％）との間の相関の存在を確認し（ｐ＜０．００１）、ＩＦＮ−γ分泌の上記の違いが細胞数の違いを反映することを示唆した（データ示さず）。興味あることに、顕著な数のマウスもまた、他のＩＧＲＰエピトープ、特にペプチド７２、７、８、および３９に対する応答を積み重ねた。テトラマーを用いた限られた研究が、少なくとも何匹かの動物において、ペプチド７２およびペプチド３９に対して反応性のＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を確認した（図９Ｂ）。抗ＩＧＲＰ全応答の規模の比較が更に、ＩＧＲＰ２０６〜２１４に対する応答が糖尿病の動物（マウス）において有意に、糖尿病でないもの（マウス）より高い一方、他のＩＧＲＰエピトープ（ＩＧＲＰ２０６〜２１４を除く）に対する組み合わされた応答はそうではないことを指し示した（図９Ｃ）。このことは、糖尿病を顕在化させる進展が、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性クローンタイプの動員を含んでいるとの仮説に一致しており、我々が以前に提案してあった通りである（Ａｍｒａｎｉら、２０００年；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、２００３年）。
【０１２８】
【表１】
2006525813.tif 000002
【０１２９】
表ＩＩが以下の２ページに示されるが、ＩＧＲＰのアミノ末端からカルボキシ末端への順に、ペプチドを例示する。少なくとも１匹のマウスにおいて応答を起こしたペプチドのみ、示される。
記号：
Ｍ＃＝マウス数；
ＩＵ＝ペプチド無処理の糖尿病マウス；
Ｎ＝ペプチド無処理の糖尿病でないマウス；
ＩＴ＝ＴＵＭペプチド処理された糖尿病マウス；
Ｔ＝ＴＵＭペプチド処理された糖尿病でないマウス；
IIＧ＝ＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチド処理された糖尿病マウス；
ＩＧ＝ＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチド処理された糖尿病でないマウス；
ｎｄ＝求められておらず
有意な応答には、影を付けている。
【０１３０】
【表２】
2006525813.tif 000003
【０１３１】
【表３】
2006525813.tif 000004
【０１３２】
ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を減少されたマウスでの、次に優性なＩＧＲＰエピトープに対する、Ｔ細胞の促進された応答
我々は次に、ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理によるＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋サブセットの完全に近い欠損が、糖尿病からマウスを保護するのに失敗したかどうかを調査したが、これはそれが、膵島中の次に優性なＩＧＲＰエピトープを認識するＴ細胞クローンのための「ニッチ」の創出を補助したからである。その終わりに、我々は、無処理、ＴＵＭ処理、およびＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウスにおいて、抗ＩＧＲＰ−ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を評価した（表ＩＩ、図１０Ａ）。ＴＵＭ処理は、抗ＩＧＲＰ応答の頻度もしくは規模を、有意には増加させなかった。対照的に、ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理が該ＩＧＲＰ２０６〜２１４応答の該頻度および該規模の両方を抑制した一方、他のＩＧＲＰエピトープに対するＴ細胞応答の頻度および規模を増加させた（表ＩＩ、図１０Ａ）。結果として、ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウスにおける内部膵島抗ＩＧＲＰ全応答の規模は、無処理もしくはＴＵＭ処理動物（マウス）について計算されたものに似ていた（図１０Ｂ）。重要なことに、ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウス膵島における次に優性な抗ＩＧＲＰ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の存在は、糖尿病へと進行してしまったマウスにおいて、最も明白であった（図６ＣおよびＤ）。併せると、これらの観察は、Ｔ１Ｄ予防のためのＩＧＲＰ２０６〜２１４（およびＮＲＰ−Ｖ７）ペプチド処理の逆説的な無効性についての説明を与える。
【０１３３】
議論
近年（Ｌｉｂｌａｕら、２００２年）、臓器特異的自己免疫における組織損傷の主要なエフェクターとして、ＣＤ８＋細胞の緊急性が証言されてきた。我々は以前に、膵島特異的タンパクＩＧＲＰ（ＩＧＲＰ２０６〜２１４）からのペプチドを、ＮＯＤマウスにおける有意な分画の膵島関連ＣＤ８＋細胞が認識することを示している（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、２００３年）。我々はまた、このＴ細胞サブセットが、抗体結合力の成熟プロセスを受けることも示しており、これは、非糖尿病原性で低抗体結合力のもののより大きなプール（ストック）の消費において、高抗体結合力のクローンタイプの小さなプール（ストック）の競合的な外殖（outgrowth）に由来する（Ａｍｒａｎｉら、２０００年）。本作業は、ＡＰＬを伴って、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールの操作が治療における有意性を持つ条件を調査するために開始された。我々のデータは、中用量の中親和性のＡＰＬ（ＮＲＰ−Ａ７）もしくは高用量の低親和性のＡＰＬ（ＮＲＰ−Ｉ４）を用いたマウスの長期の処理が、糖尿病からの完全に近い保護を与えたことを示す。疾患からの保護は、非糖尿病原性で低抗体結合力のＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の、それらの高抗体結合力対応体（counterpart）の消費下での、局在した蓄積と関連しており、これらが欠損された。予期せず、低もしくは高用量の非常に高親和性のＡＰＬ（ＮＲＰ−Ｖ７）または高用量の天然ペプチドリガンド（ＩＧＲＰ２０６〜２１４）を用いたマウスの繰り返し処理が、疾患からの限界の（最低限の）保護のみを与えた。衝撃的なことに、これらのマウスの膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞についての我々の詳細な系統的な解析が、これらのマウスの膵島が、非常に僅かなＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞しか含有しなかったことを明らかにしたが、増加した数のＣＤ８＋Ｔ細胞が、数多くの他のＩＧＲＰエピトープを認識した。これらの結果は強力に、罹患性下位集団の自己反応性Ｔリンパ球の排除を介した臓器特異的自己免疫の予防について、高抗体結合力ＡＰＬによる治療の有用性に反論するものである。
【０１３４】
この作業から発生している重要な新たな観察は、ＮＯＤ膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＧＲＰ２０６〜２１４に加えて、ＩＧＲＰの数多くのエピトープに対する応答を積み重ねるということである。我々が、異なるＩＧＲＰエピトープに対して応答する膵島由来Ｔ細胞により分泌されるＩＦＮ−γの規模が反応性クローンタイプ数に相関すると仮定すると（ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性細胞について正しい状況）、全ＮＯＤ膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞の約４０％に相当することになる。これらのＴ細胞の約半分しかＩＧＲＰ２０６〜２１４を認識しないので、これらの観察は、糖尿病における抗ＩＧＲＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の高い罹患性が単に、糖尿病発症前の動物における末梢での高頻度のＶα１７−Ｊα４２＋、ＩＧＲＰ２０６〜２１４特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるのではない（Ｔｒｕｄｅａｕら、２００３年）ことを示唆する。むしろ、これらの新たなデータは、ＩＧＲＰについて何か独特なものの存在を指摘し、これはそれを、糖尿病発症における自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の好ましい標的とする。ＩＧＲＰは、自己免疫攻撃の標的でない他のβ細胞タンパクのものと比較し得るレベルにおいて、β細胞において発現されるので（Ｍａｒｔｉｎら、２００１年；Ａｒｄｅｎら、１９９９年）、その免疫原性が、その分子の性質および／または予見された細胞内部のトポロジー（形状。つまり、小胞体膜）に関連していると推測することが試みられている。最近、細胞における大きな分画のＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体が、リボゾーム欠陥産物（ＤＲｉＰｓ）から生じていることが示され、これは合成後、当該プロテアーゼにより急速に分解される（Ｐｒｉｎｃｉｏｔｔａら、２００３年）。ＩＧＲＰの疎水性および通常ではない膜貫通構造が、β細胞および／または樹状細胞において、高速度のＤＲｉＰ形成を促進することがある。あるいは、前記小胞体膜におけるＩＧＲＰの位置は、β細胞のアポトーシス小体、核の材料を包んで含有する膜結合粒子において、その蓄積を補助することがある（Ｃｏｃｃａら、２００２年）。該核の膜はＥＲ径の一部なので、ＩＧＲＰは核の断片と共にアポトーシス小体中へと隔離することがあると思われ、これは容易に、未成熟なＤＣにより、食作用を受ける（Ｓａｕｔｅｒら、２０００年）。この仮説は思索的なものではあるが、２つの線からの証拠が間接的に、それを裏付ける。第１に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの樹状細胞によるアポトーシスＮＩＴ−１（ＩＧＲＰ＋）およびＩＧＲＰによりトランスフェクションされたＰ８１５細胞の捕捉は結果的に、８．３Ｔ細胞の活性化となる（我々の未発表の観察）。第２に、ｉｎ  ｖｉｖｏでのβ細胞のアポトーシス誘導は、ＰＬＮにおける８．３Ｔ細胞への、ＩＧＲＰ２０６〜２１４の交差提示を促進する（Ｚｈａｎｇら、２００２年）。
【０１３５】
可溶性ペプチドは通常、２日以内にクリアランスされるので（Ｍｅｔｚｌｅｒら、２０００年）、それらは、同時刺激シグナル（アジュバントにより樹状細胞において誘導されるもののような）の非存在下に、抗原反応不顕性および欠損に至る弱くて短命の活性化状態を誘導する（Ａｉｃｈｅｌｅら、１９９４年；Ｔｏｅｓら、１９９６年）。この寛容原刺激はＴＣＲ占有に関する未画定閾値に達しなければならないので、寛容の誘導についての可溶性ペプチドの有効性は、ＴＣＲおよびＭＨＣに対しての親和性同様、用量の関数であるはずである、従って、ＭＲＰ−Ｉ４およびＮＲＰ−Ａ７による治療の有効性が用量と共に上昇したという観察は予期されたものではなく、ＮＲＰ−Ａ７がＮＲＰ−Ｉ４よりも低用量において最大保護活性に到達したという事実も予期されたものではない（ＮＲＰ−Ｉ４より遙かに高抗体結合力を有するＮＲＰ−Ａ７が、認められる）。特記すべきは、保護用量のＮＲＰ−Ａ７およびＮＲＰ−Ｉ４を用いて処理されたマウスの膵島は、通常もしくは僅かに抑制された数のＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有し、これらの細胞は、ＴＵＭ処理のコントロールから単離されたものより低抗体結合力を有するＮＲＰ−Ｖ７テトラマーに結合した。これらの観察は、保護用量のＮＲＰ−Ａ７およびＮＲＰ−Ｉ４が選択的に、病原性高抗体結合力クローンタイプを欠損させ、それらの低抗体結合力対応体（counterpart）を割愛することを示唆する。
【０１３６】
抗腫瘍免疫の誘導のためのワクチン化プロトコールの効率は高抗体結合力ＣＴＬの動員を必要とするので（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒら、１９９６年；Ｐｅｒｅｘ−Ｄｉａｚら、２００２年；Ｚｅｈら、１９９９年）、ＮＲＰ−Ｉ４およびＮＲＰ−Ａ７による罹患性高抗体結合力クローンタイプの欠損が、Ｔ１Ｄからマウスを保護すると仮定するのは安全である。しかしながら、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性Ｔ細胞の全プール（ストック）の有意な欠損にもかかわらず、増加した用量のペプチドを用いたＮＲＰ−Ａ７の抗糖尿病原性ポテンシャルの損失は、保護が高抗体結合力クローンタイプの欠損だけによるものではないことを示唆した。この驚くべき結果は明らかに、ＮＲＰ−Ａ７の特性ではなかったが、これは、天然リガンド（ＩＧＲＰ２０６〜２１４）もしくはＮＲＰ−Ｖ７（ＮＲＰ−Ａ７よりも高親和性なＡＰＬ）を用いて処理されたマウスが、それらの膵島が殆どＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有したという事実にも関わらず、疾患から僅かしか保護されなかったからである。これゆえ、ＮＲＰ−Ｉ４およびＮＲＰ−Ａ７の保護効果は、低結合力クローンタイプの動員をも必要としたに違いない。この概念は、無処理およびＡＰＬ処理マウスにおいて（Ａ．Ｆ．Ｍ．Ｍａｒｅｅ、Ｐ．Ｓａｎｔａｍａｒｉａ、およびＬ．Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ−Ｋｅｓｈｅｔ、投稿中）、Ｔ細胞の抗体結合力の成熟の数学的モデル化により、裏付けられる。この作業は、ＡＰＬにより誘導される、糖尿病からの保護が、非病原性低抗体結合力クローンタイプによる、膵島中でのＴリンパ球のニッチの占有を必要とすると予測する。これらの細胞が糖尿病からの保護を、該当部位への他の自己反応性特異的因子のアクセスを拒否することによるのか、もしくは、免疫制御因子を分泌することにより与えるのかが、探求され続けている。免疫制御特性を有する自己反応性Ｔ細胞が、通常の個々の文献（Ａｒｉｆら、２００４年）において見出されており、ＡＰＬは、特異的免疫制御Ｔ細胞を誘導することができる（Ｋａｐｐｏｓら、２０００年；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９５年）。
【０１３７】
本研究の基本的な考察は、特に糖尿病となってしまっていたマウスでは、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの完全に近い欠損が、次に優性なＩＧＲＰエピトープに対する膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞の上昇した応答に関連していたということである。このことは、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の消去が、次に優性な糖尿病原性エピトープ特異的クローンタイプの拡大をやや促進するニッチ「真空」を創出したことを示唆する。次に優性なこれらのエピトープ特異的な（および潜在的に高抗体結合力の）ＣＴＬは、それらの細胞標的を破壊することにおいて高度に効果的であることがあるが、これは、それらが容易に、最近提案されたように（Ｇｒｏｓｓら、２００４年）、寛容メカニズムをかわすからである。思い至ることに、これら２つの反対の現象（優性エピトープ特異的Ｔ細胞および次に優性なエピトープ特異的Ｔ細胞の動員）は、全長タンパク自己抗体を使用した、ヒトでの治験の無効性を斟酌したものかも知れない（Ｗｅｉｎｅｒ，１９９３年；Ｔｒｅｎｔｈａｍら，１９９３年；ＭｃＫｏｗｎら，１９９９年；Ｐｏｚｚａｌｌｉら，２０００年；Ｇｒｏｕｐ  Ｄ．Ｐ．Ｔ．−Ｔ．Ｄ．Ｓ．，２００２年；Ｋａｐｐｏｓら，２０００年；Ｂｉｅｌｅｋｏｖａら，２０００年）。
【０１３８】
併せれば、我々の知見は、高用量の高親和性ＡＰＬを使用することによる優性Ｔ細胞の下位集団の完全な排除が、細胞複合体の進展、つまりポリクローナル自己免疫応答を止めるには非効率的な方法であることを示唆する。むしろ、我々は、ＡＰＬを用いたこのような疾患の効果的な予防が、高抗体結合力タイプクローンの選択的排除およびそれらの低抗体結合力非病原性タイプ（counterpart）の逆らわない動員を必要とすることを議論するものである。この現象が狭い範囲内のみの用量およびまともに機能する抗体結合力において起きるという事実は、自己免疫における「寛容原」として、ＡＰＬもしくは自己抗体主体のワクチンのデザイン（設計）における支援になることがあるという重要な教訓を有する。ＭＨＣおよびＴＣＲに対するペプチドの親和性ならびに用量の慎重な検討がこれゆえ、臨床試験計画において割愛される。
【０１３９】
実施例４．更なるＴ細胞反応性ＩＧＲＰペプチド
実施例１に記載された手順を用いて、我々は、１２週齢の雌ＮＯＤマウスの膵島からのＴ細胞を培養している。Ｔ細胞は、インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔにより、幾つかの異なるＩＧＲＰペプチドの認識に関してアッセイされた。反応性は、マウスＩＧＲＰ（配列ＦＬＷＳＶＦＷＬＩを持つ）の１５２〜１６０番ペプチドに対して見出された。
【０１４０】
上記に鑑みれば、本発明の幾つかの利点が達成され、他の利点が得られたことが分かる。
【０１４１】
本発明の範囲から逸脱することなく、上記方法および組成物において種々の変更がなされ得るので、上記記載に含有され、添付の図面に示される全事項は例示として解釈され、限定的な意味で解釈されないようにされるものと意図される。
【０１４２】
本明細書において引用される全リファレンスが、本明細書において援用される。本明細書におけるこれらリファレンスについての議論は、本著者らによりなされる主張を要約するものとのみ意図され、如何なるリファレンスも、先行技術を構成するものとは認められない。出願人は、引用された該リファレンスの精確さおよび適切さに挑む権利を留保する。
【０１４３】
付録：マウスおよびヒトのＩＧＲＰアミノ酸配列
配列番号１：ＮＰ０６７３０６からのマウスＩＧＲＰ。８．３似のＴ細胞に反応性のペプチドが太字とされかつ下線を施され、本明細書において同定される他のペプチドが下線（のみ）を施される。
1 mdflhrsgvl iihhlqedyr tyygflnfms nvgdprnifs iyfplwfqln qnvgtkmiwv
61 avigdwfnli fkwilfghrp ywwiqeteiy pnhsspcleq fpttcetgpg spsghamgss
121 cvwyvmvtaa lsytisrmee ssvtlhrltw sflwsvfwli qisvcisrvf iathfphqvi
181 lgviggmlva eafehtpgvh maslsvylkt nvflflfalg fylllrlfgi dllwsvpiak
241 kwcanpdwih idstpfaglv rnlgvlfglg fainsemflr scqgengtkp sfrllcalts
301 lttmqlyrfi kipthaeplf yllsfcksas iplmvvalip ycvhmlmrpg dkktk
配列番号２：ＮＰ０６６９９９からのヒトＩＧＲＰ。８．３似のＴ細胞に反応性のペプチドが太字とされ、下線を施される。
1 mdflhrngvl iiqhlqkdyr ayytflnfms nvgdprniff iyfplcfqfn qtvgtkmiwv
61 avigdwlnli fkwilfghrp ywwvqetqiy pnhsspcleq fpttcetgpg spsghamgas
121 cvwyvmvtaa Ishtvcgmdk fsitlhrltw sflwsvfwli qisvcisrvf iathfphqvi
181 lgviggmlva eafehtpgiq taslgtylkt nlflflfavg fylllrvlni dllwsvpiak
241 kwcanpdwih idttpfaglv rnlgvlfglg fainsemfll scrggnnytl sfrllcalts
301 Itilqlyhfl qiptheehlf yvlsfcksas ipltvvafip ysvhmlmkqs gkksq
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、病原性Ｔ細胞クローン８．３により認識される天然β細胞ペプチドとして、ＩＧＲＰ２０６〜２１４の同定を確立させる実験データのグラフである。    パネルＡ〜Ｃ：Ｈ−２Ｋｄ溶出ＮＩＴ−１ペプチドの、１次元（Ａ）、２次元（Ｂ）、および３次元（Ｃ）ＨＰＬＣ分画のエピトープ再構築活性である。ＲＭＡＳ／Ｋｄ細胞は、ペプチド分画のパルスを与えられ、エフェクターとして８．３ＣＴＬを用いた５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、標的として使用された（１５）。    パネルＤ：３次元ＨＰＬＣ分画のエピトープ再構築活性（右および上の軸上にプロットされた）との、イオン量曲線（左および下の軸上にプロットされた）の相関による、候補ペプチドの決定。ペプチドのｍ／ｚ値は、注釈中に指し示される。    パネルＥ：１同位体の５４８．８４５ｍ／ｚを有する候補ペプチドイオン（Ｍ＋２Ｈ）＋２のＣＡＤ質量スペクトル。ＸはＩもしくはＬを表す。該スペクトルにおいて観測されたイオンには、下線が施されている。ｂイオンは該ペプチドＮ末から発し、ｙイオンはＣ末から発する。    パネルＦ：８．３ＣＴＬによるＶＹＬＫＴＮＶＦＬ（ＩＧＲＰ２０６〜２１４）の認識。ＲＭＡ−Ｓ／Ｋｄ細胞が、指し示されたペプチドのパルスを与えられ、エフェクターとして８．３ＣＴＬを用いた５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、標的として使用された。    パネルＧ：８．３ＣＴＬにより認識される天然抗原ペプチド源としての、ＩＧＲＰの証明。ＣＯＳ−７細胞が、種々の濃度のＩＧＲＰ２０６〜２１４発現構築物もしくはベクターのみを用いて、１０ｎｇ／ｍＬのＨ−２Ｋｄ発現構築物と一緒にトランスフェクションされた（実線）。別個の培養が、Ｈ−２Ｋｄ構築物のみを用いてトランスフェクションされ、種々の濃度のＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチドのパルスを与えられた（破線）。８．３ＣＴＬを用いた共培養後、Ｔ細胞応答が、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ放出として測定され、４０５ｎｍでの吸光度として表示される（Ａ４０５）。
【図２】図２は、多数の早期インシュリン炎Ｔ細胞クローンが、ＩＧＲＰ２０６〜２１４を認識することを確立させる実験結果のグラフである。指し示されたＴＣＲを発現した５８α−β−トランスフェクション体が、指し示されたペプチドのパルスを与えられたＲＭＡ−Ｓ／Ｋｄ細胞と共に培養され、ＩＬ−２の放出（平均±ＳＤ）が、ＥＬＩＳＡにより測定された。８．３ならびに早期インシュリン炎Ｔ細胞クローンＡＩ１２．Ｂ１．３およびＡＩ１５．Ｆ５についてのＴＣＲのα鎖およびβ鎖の一部の配列が、以前に報告された（DiLorenzo ら、１９９８年；Santamaria ら、１９９５年；Nagata ら、１９９４年）。ＡＩ４、ＡＩ１２．Ｂ１．１、ＡＩ１２．Ｂ１．２、ＡＩ１５．Ａ１０株は全て、非Ｖα１７ＴＣＲα鎖を発現するが、血小板結合抗ＣＤ３εに対する応答におけるＩＬ−２の放出により証明されたとおり、トランスフェクションされた該ＴＣＲを介してシグナル伝達できたにもかかわらず、テストされたペプチドのいずれにも応答しなかった（S. M. Lieberman ら、データ示さず）。ＩＧＲＰはＩＧＲＰ２０６〜２１４；ＩＮＳはＩＮＳ  Ｂ１５〜２３；ＦＷはフレームワーク残基；ＣＤＲは相補性決定領域。
【図３】図３は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４が、Ｈ−２Ｋｄに上手く結合しないペプチドを実証しないことを確立させる実験結果のグラフである。ＲＭＡ−Ｓ／Ｋｄ細胞が、指し示されたペプチドのパルスを与えられ、抗Ｈ−２Ｋｄ抗体を用いて染色され、フロー・サイトメトリーにより分析された。ＩＧＲＰはＩＧＲＰ２０６〜２１４；ＩＮＳはＩＮＳ  Ｂ１５〜２３；ＭＦＩは平均蛍光強度。
【図４】図４は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性Ｔ細胞が容易に、ex vivo において直接、ＮＯＤマウスの膵島および末梢血中検出されることを確立させる実験結果のグラフである。９および２０週齢の非糖尿病ＮＯＤマウスの膵島もしくは末梢血からの細胞が、抗ＣＤ８および指し示されたペプチド／Ｈ−２Ｋｄテトラマーを用いて染色された。  左のパネルは、ＣＤ８＋集団上ゲート化された（gated）２０週齢マウスからのサンプルの、代表的なテトラマー染色パターンを示す。数字は、該ＣＤ８＋集団内の、テトラマー＋（陽性）細胞のパーセンテージを指し示す。  右のパネルは、１老齢群につき５匹ずつのマウスについての、該ＣＤ８＋集団内の、テトラマー＋（陽性）細胞のパーセンテージ（平均±ＳＤ）を指し示す。ＴＵＭ／Ｈ−２Ｋｄテトラマーは各群において、０％の細胞を染色した。ＩＧＲＰはＩＧＲＰ２０６〜２１４。
【図５】図５は、８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞のＡＰＬのアゴニスト活性を示す実験結果のグラフである。内因性膵臓８．３ＣＤ８＋細胞（２×１０４）が２通り、２もしくは３日間（それぞれ、サイトカイン分泌および増殖アッセイ）ペプチドのパルス（０．０１〜１μＭ）およびγ照射ＮＯＤ膵臓細胞（１０５）と共にインキュベートされ、１μＣｉの（３Ｈ）−チミジンのパルスを与えられ、回収され、数えられた（増殖アッセイに関して）。この２日間培養したものの上清（１００μＬ）がＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２、ＩＬ−４、および／またはＩＦＮ−γについて、アッセイされた。これらライブラリーのいずれも、ＩＬ−４分泌を誘導しなかった（データ示さず）。データは平均±ＳＥであり、２回もしくは３回の異なる実験の代表である。
【図６Ａ】図６は、ＡＰＬの機能する抗体結合力の違いが、ペプチド／ＭＨＣ結合抗体結合力および寛容原活性の違いと相関することを示す実験結果のグラフである。図６Ａは、テトラマー染色の蛍光強度を示す。内因性膵臓８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞が、異なるＡＰＬ／Ｋｄ−ＰＥテトラマーおよびＣＤ８−ＦＩＴＣｍＡｂを用いて染色された。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＰＬの寛容原活性を示す。本グラフは、無処理（１０±１週齢；ｎ＝９）もしくはＡＰＬ処理８．３ＮＯＤマウス中の全ＣＤ８＋膵臓細胞の合計数を比較する。マウスは、分析前の７日間、ＰＢＳ中１００μｇのペプチドのｉ．ｐ．注射を１回受けた。実験されたマウスの齢および数は、以下のとおりである。    ＴＵＭ処理（１１±１週齢；ｎ＝５）    ＮＲＰ−Ｉ４処理（９±１週齢；ｎ＝３）    ＮＲＰ−Ａ７処理（１１±１週齢；ｎ＝７）    ＮＲＰ−Ｖ７処理（１４±２週齢；ｎ＝３）
【図６Ｃ】図６Ｃは、２０週齢非遺伝子導入ＮＯＤマウスからの膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞のテトラマー結合能を示す。縦に並んだパネルは、３匹の個々のマウスに対応する。各パネルの右上〜中の数字は、テトラマー陽性ＣＤ８＋細胞のパーセンテージに対応する。ＮＲＰ−Ｖ７が、ＮＲＰ−Ａ７より高い蛍光強度で、これらの細胞を染色することに注目。
【図６Ｄ】図６Ｄは、９週齢の雌ＮＯＤマウスの膵島から増殖されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＮＲＰＡ７／Ｋｄ（ｎ＝６マウス）より高い抗体結合力（より低いＫｄ）で、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄテトラマー（ｎ＝６マウス）に結合することを示す。
【図７Ａ】図７は、野生型ＮＯＤマウスにおけるＡＰＬの抗糖尿病原活性を示す実験結果のグラフである。図７Ａ（上のグラフ）は、ＴＵＭ対ＡＰＬ処理雌ＮＯＤマウスにおける糖尿病発症を示す。Ｎ値は、次のとおりであった。    ＴＵＭ：≦２５μｇ（ｎ＝２９）、５０μｇ（ｎ＝１０）、１００μｇ（ｎ＝６９）    ＮＲＰ−Ｉ４：≦２５μｇ（ｎ＝３０）、３５μｇ（ｎ＝１０）、５０μｇ（ｎ＝１０）、１００μｇ（ｎ＝１０）    ＮＲＰ−Ａ７：≦２５μｇ（ｎ＝２９）、３５μｇ（ｎ＝１０）、５０μｇ（ｎ＝１０）、７５μｇ（ｎ＝１０）、１００μｇ（ｎ＝５０）    ＮＲＰ−Ｖ７：≦２５μｇ（ｎ＝３０）、３５μｇ（ｎ＝１０）、５０μｇ（ｎ＝１０）、１００μｇ（ｎ＝５９）  図７Ａ（下のグラフ）は、膵島由来ＣＤ８＋細胞内での、ＡＰＬ対ＴＵＭ処理のそのパーセンテージでの効果、ならびに、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄテトラマー結合細胞の抗体結合力を示す。マウスは、糖尿病発症時もしくは本研究の終わり（３２週目）に屠られ、膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。データは、ＡＰＬ対ＴＵＭ処理マウスにおいて得られた値（ｘ±ＳＥ）の差として、表示される。０を上回るかもしくは下回る値は、ＡＰＬ処理がそれぞれ結果的に、低もしくは高抗体結合力Ｔ細胞の動員、および／または、より低いかもしくは高いパーセンテージのテトラマー反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の動員をもたらしたことを指し示す。Ｎ値は、次のとおりであった。    ＮＲＰ−Ｉ４：≦２５μｇ（ｎ＝１５、７Ｔ１Ｄ）、３５μｇ（ｎ＝４、３Ｔ１Ｄ）、５０μｇ（ｎ＝３、１Ｔ１Ｄ）、１００μｇ（ｎ＝７、０Ｔ１Ｄ）    ＮＲＰ−Ａ７：≦２５μｇ（ｎ＝９、５Ｔ１Ｄ）、３５μｇ（ｎ＝４、４Ｔ１Ｄ）、５０μｇ（ｎ＝５、１Ｔ１Ｄ）、７５μｇ（ｎ＝３、０Ｔ１Ｄ）、１００μｇ（ｎ＝１０）    ＮＲＰ−Ｖ７：≦２５μｇ（ｎ＝１０、７Ｔ１Ｄ）、３５μｇ（ｎ＝６、３Ｔ１Ｄ）、５０μｇ（ｎ＝１０、５Ｔ１Ｄ）、１００μｇ（ｎ＝４７、３１Ｔ１Ｄ）  抗体結合力の測定は、膵島中にテトラマー陽性細胞を含有するマウスにおいてのみ可能であった。そのｎ値は、次のとおりであった。    ＮＲＰ−Ｉ４：≦２５μｇ（ｎ＝１５）、３５μｇ（ｎ＝４）、５０μｇ（ｎ＝２）、１００μｇ（ｎ＝７）    ＮＲＰ−Ａ７：≦２５μｇ（ｎ＝６）、３５μｇ（ｎ＝４）、５０μｇ（ｎ＝５）、７５μｇ（ｎ＝２）、１００μｇ（ｎ＝１０）    ＮＲＰ−Ｖ７：≦２５μｇ（ｎ＝７）、５０μｇ（ｎ＝２）
【図７Ｂ】図７Ｂは、１００μｇ／単回注射での異なるペプチドを用いて処理されたマウスにおける、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄテトラマー結合ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を示す。
【図８Ａ】図８は、ＮＲＰ−Ｖ７およびＩＧＲＰ２０６〜２１４が、ＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のプールを欠損させたにもかかわらず、糖尿病の進行を鈍化させ得ないことを実証する実験結果のグラフである。図８Ａは、ＴＵＭ（ｎ＝６９）、ＮＲＰ−Ｖ７（ｎ＝５９）、およびＩＧＲＰ２０６〜２１４（ｎ＝１９）処理ＮＯＤマウスにおけるＴ１Ｄの累積した発症を示す。全てのマウスが、ペプチド１００μｇ（ＴＵＭ、ＮＲＰ−Ｖ７、およびＩＧＲＰ２０６〜２１４）もしくは７５μｇ（ＩＧＲＰ２０６〜２１４；ｎ＝９）／単回注射を受けた。７５μｇもしくは１００μｇのＩＧＲＰ２０６〜２１４を受けたマウスにおいて特記される差はなく、このため、これらのデータはプールされた。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄテトラマー反応性細胞のパーセンテージ（左）、ならびに、無処理、ＴＵＭ、およびＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウスからの膵島関連ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（右）を示す。個々の処理群内において、糖尿病マウスと非糖尿病マウスとの間において特記される有意差はなかった。テトラマー染色についてのｎ値は：    無処理群：ｎ＝１１（糖尿病２匹）    ＴＵＭ処理群：ｎ＝２０（糖尿病９匹）    ＮＲＰ−Ｖ７処理群：ｎ＝５２（糖尿病３２匹）    ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理群：ｎ＝１７（糖尿病８匹）であった。ＩＮＦ−γ分泌についてのｎ値は：    無処理群：ｎ＝２８（糖尿病１９匹）    ＴＵＭ処理群：ｎ＝１１（糖尿病７匹）    ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理群：ｎ＝１２（糖尿病６匹）であった。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ｂと同じだが、ＩＧＲＰ２０６〜２１４／ＫｄテトラマーもしくはＩＧＲＰ２０６〜２１４ペプチドを用いた。テトラマー染色についてのｎ値は：    無処理群：ｎ＝２８（糖尿病１９匹）    ＴＵＭ処理群：ｎ＝３（糖尿病０匹）    ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理群：ｎ＝１４（糖尿病６匹）であった。ＩＮＦ−γ分泌についてのｎ値は：    無処理群：ｎ＝２９（糖尿病９匹）    ＴＵＭ処理群：ｎ＝７（糖尿病４匹）    ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理群：ｎ＝１１（糖尿病５匹）であった。
【図９Ａ】図９は、多数のＩＧＲＰエピトープに対する膵島内ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＮＯＤマウスが自然に蓄積することを示す実験結果のグラフである。  図９Ａ（左）は、ＩＧＲＰエピトープを認識する膵島内ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する糖尿病および非糖尿病（ＮＯＤ）マウスのパーセンテージ（％）を示す。  図９Ａ（右）は、対応するペプチドに対して応答するマウスからの膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞（応答しなかったマウスを除く）により分泌されたＩＦＮ−γの平均量を示す。データは表ＩＩからのものである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、テトラマーを用いて求められた場合の、ＩＧＲＰ３２４〜３３２もしくはＩＧＲＰ２１〜２９反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を膵島内に含有するマウスの例を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＩＧＲＰペプチドに対する応答における、膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞により分泌されたＩＦＮ−γの累積量を示す。
【図１０Ａ】図１０は、ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理がＩＧＲＰ２０６〜２１４反応性を抑制するものの、特に顕在化した糖尿病へと進行しているマウスにおいて、他のＩＧＲＰエピトープに対する応答を増加させることを示す実験結果のグラフである。図１０Ａ（上のグラフ）は、ＩＧＲＰエピトープを認識する膵島内ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する無処理およびＴＵＭもしくはＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウスのパーセンテージを示す。  図１０Ａ（下のグラフ）は、対応するペプチドに対して応答するマウスからの膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞により分泌されたＩＦＮ−γの平均量を示す。データは表ＩＩからのものである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＩＧＲＰペプチドに対する応答における膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞により分泌されたＩＦＮ−γの累積量を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、糖尿病を進行させたＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウス対糖尿病を進行させなかったマウスの比較を行うこと以外、図１０Ｂにおけるものと同じである。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＩＧＲＰペプチドに対する応答における、糖尿病および非糖尿病ＩＧＲＰ２０６〜２１４処理ＮＯＤマウスの膵島由来ＣＤ８＋Ｔ細胞により分泌されたＩＦＮ−γの累積量を示す。
【図１】
2006525813.tif 000005
【図２】
2006525813.tif 000006
【図３】
2006525813.tif 000007
【図４】
2006525813.tif 000008
【図５】
2006525813.tif 000009
【図６Ａ】
2006525813.tif 000010
【図６Ｂ】
2006525813.tif 000011
【図６Ｃ】
2006525813.tif 000012
【図６Ｄ】
2006525813.tif 000013
【図７Ａ】
2006525813.tif 000014
【図７Ｂ】
2006525813.tif 000015
【図８Ａ】
2006525813.tif 000016
【図８Ｂ】
2006525813.tif 000017
【図８Ｃ】
2006525813.tif 000018
【図９Ａ】
2006525813.tif 000019
【図９Ｂ】
2006525813.tif 000020
【図９Ｃ】
2006525813.tif 000021
【図１０Ａ】
2006525813.tif 000022
【図１０Ｂ】
2006525813.tif 000023
【図１０Ｃ】
2006525813.tif 000024
【図１０Ｄ】
2006525813.tif 000025
【国際調査報告】
2006525813.tif 000026