(57)【要約】本発明は、カチオン性縮合剤、免疫調節化合物および安定剤を含む新しい免疫調節組成物に関する。本発明の組成物は一般に粒子を形成し、本発明の組成物に配合されない免疫調節化合物と比較してより高い免疫調節活性をもつ。該組成物の製造方法および該組成物の治療への使用方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節粒子を含む免疫調節組成物であって、該粒子状組成物はカチオン性縮合剤; ヌクレオチド配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物; およびノニオン性洗剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記免疫調節組成物。
【請求項２】
前記カチオン性縮合剤がポリミキシン、シルクリン、オクタペプチンおよびアムホテリシンからなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン性縮合剤がポリミキシンである、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記カチオン性縮合剤がポリミキシンBである、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記ノニオン性洗剤がポリオキシエチレンソルビタン洗剤である、請求項1に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリオキシエチレンソルビタン洗剤がトリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記粒子状組成物が、さらに脂肪酸と混合することによって調製される、請求項1に記載の組成物。
【請求項８】
前記脂肪酸がオレイン酸の塩である、請求項7に記載の組成物。
【請求項９】
免疫調節粒子の水性懸濁液を含む医薬組成物であって、該粒子はカチオン性縮合剤; 配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物; およびノニオン性洗剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項１０】
前記カチオン性縮合剤がポリミキシン、シルクリン、オクタペプチンおよびアムホテリシンからなる群より選択される、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記カチオン性縮合剤がポリミキシンである、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カチオン性縮合剤がポリミキシンBである、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ノニオン性洗剤がポリオキシエチレンソルビタン洗剤である、請求項9に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリオキシエチレンソルビタン洗剤がトリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
前記粒子状組成物が、さらに脂肪酸と混合することによって調製される、請求項9に記載の組成物。
【請求項１６】
前記脂肪酸がオレイン酸の塩である、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
抗原をさらに含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗原がアレルゲンおよび感染性病原体関連抗原からなる群より選択される、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
(a)配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物(IMC)とノニオン性洗剤とを合わせ、以ってIMC/ノニオン性洗剤混合物を形成するステップ、
(b)カチオン性縮合剤を該IMC/ノニオン性洗剤混合物と合わせるステップ、および
(c)粒子懸濁液を回収するステップ
を含む方法によって調製される粒子懸濁液。
【請求項２０】
個体の免疫反応を調節する方法であって、個体の免疫反応を調節するに足る量の免疫調節組成物を該個体に投与するステップを含み、該組成物は粒子状免疫調節組成物を水性懸濁液中に含み、該粒子状免疫調節組成物はカチオン性縮合剤、ヌクレオチド配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物およびノニオン性洗剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
免疫調節粒子を含む免疫調節組成物であって、該粒子状組成物はポリミキシン、ヌクレオチド配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物(IMC)およびウシ血清タンパク質以外の安定剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記免疫調節組成物。
【請求項２２】
前記安定剤がタンパク質、ノニオン性洗剤、高分子界面活性剤、カチオン性洗剤、アニオン性洗剤および脂肪酸からなる群より選択される、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
前記安定剤がノニオン性洗剤である、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ノニオン性洗剤がポリオキシエチレンソルビタン洗剤である、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリオキシエチレンソルビタン洗剤がトリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである、請求項23に記載の組成物。
【請求項２６】
ポリミキシンがポリミキシンBである、請求項21に記載の組成物。
【請求項２７】
前記粒子状組成物が、さらに脂肪酸と混合して調製される、請求項21に記載の組成物。
【請求項２８】
前記脂肪酸がオレイン酸の塩である、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
前記IMCが、ヌクレオチド配列5’-TCG-3’を含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項３０】
前記IMCが、ヌクレオチド配列5’-プリン,プリン,C,G,ピリミジン,ピリミジン-3’を含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項３１】
前記IMCが、少なくとも14個のヌクレオチドを含む、請求項21に記載の組成物。
【請求項３２】
免疫調節粒子の水性懸濁液を含む医薬組成物であって、該粒子はポリミキシン、ヌクレオチド配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物、およびウシ血清タンパク質以外の安定剤を混合することによって調製される前記医薬組成物。
【請求項３３】
(a)配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物(IMC)と安定剤とを合わせ、以ってIMC/安定剤混合物を形成するステップ、
(b)ポリミキシンを該IMC/安定剤混合物と合わせるステップ、および
(c)粒子懸濁液を回収するステップ
を含む方法によって調製される粒子懸濁液。
【請求項３４】
個体の免疫反応を調節する方法であって、個体の免疫反応を調節するに足る量の免疫調節組成物を該個体に投与するステップを含み、該組成物は粒子状免疫調節組成物を水性懸濁液中に含み、該粒子状免疫調節組成物はポリミキシン、ヌクレオチド配列5’-CG-3’を含む免疫調節化合物および安定剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記方法。
【請求項３５】
免疫調節粒子を含む免疫調節組成物であって、該粒子状組成物はカチオン性縮合剤、配列5’-CG-3’を含む免疫調節ポリヌクレオチド、抗原および安定剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記免疫調節組成物。
【請求項３６】
抗原と免疫調節粒子の水性懸濁液とを含む医薬組成物であって、該粒子はカチオン性縮合剤、配列5’-CG-3’を含む免疫調節ポリヌクレオチドおよび安定剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記医薬組成物。
【請求項３７】
個体の免疫反応を調節する方法であって、個体の免疫反応を調節するに足る量の免疫調節組成物を該個体に投与するステップを含み、該組成物は抗原と粒子状免疫調節組成物とを水性懸濁液中に含み、該粒子状免疫調節組成物はカチオン性縮合剤、ヌクレオチド配列5’-CG-3’を含む免疫調節ポリヌクレオチドおよび安定剤を混合することによって調製されることを特徴とする前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]   本発明は免疫調節製剤、免疫調節製剤の製造方法、およびその使用方法に関する。本発明は特にカチオン性縮合剤と免疫調節化合物(IMC)と安定剤とを含有する免疫調節製剤に関する。本発明はまた、少なくとも1つの免疫反応を調節するための該免疫調節製剤の投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  感染または他の抗原暴露により惹起される免疫反応のタイプは一般に、免疫反応に関与するヘルパーT細胞(Th細胞)のサブセットにより識別することができる。Th1サブセットは古典的な細胞性機能たとえば細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の遅延型過敏反応や活性化などを引き起こし、またTh2サブセットはB細胞活性化のヘルパーとしてより効果的に機能する。ある抗原に対する免疫反応の型は一般に、その抗原に反応する細胞が産生するサイトカイン類による影響を受ける。Th1およびTh2細胞が分泌するサイトカイン類の違いは両サブセットの生物学的機能の違いを反映すると考えられる。たとえばRomagnani (2000), Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18を参照。
【０００３】
[0003]  Th1サブセットは、CTLを活性化するIL-2やIFN-γを分泌するので、ウイルス感染、細胞内病原体および腫瘍細胞への反応に特に適しているであろう。Th2サブセットは自由生活菌や寄生虫への反応により適し、またアレルギー反応を媒介するであろう。というのはIL-4およびIL-5はそれぞれIgEの産生および好酸球の活性化を誘発することが知られているからである。一般にTh1およびTh2細胞はサイトカイン分泌パターンが識別可能なので、ある型の反応で他の型の反応の活性を調節することができる。Th1/Th2バランスのシフトはたとえばアレルギー反応を、あるいは逆にCTL反応の増進を、招く可能性がある。
【０００４】
[0004]  Th2型の反応は結核やマラリアなど数多くの感染症の感染防護にはほとんど役立たない。標的抗原由来の小ペプチドおよび他の既存抗原性物質を使用する提案のワクチン類は感染力を秘めたインタクトなウイルス粒子の使用を避けるものであり、治療効果の実現に必要な免疫反応を必ず誘発するとは限らない。治療効果のあるヒト免疫不全ウイルス(HIV)ワクチンの不在はそうした失敗の不運な例である。タンパク質系ワクチン類は一般に中和抗体の高力価を特徴とするTh2型免疫反応を誘発するが、有効な細胞性免疫をもたらすことはない。
【０００５】
[0005]  さらに、ある型の抗体反応は適応症によっては、特にIgE抗体反応がアナフィラキシー・ショックを招きかねないようなアレルギーには、不向きである。一般にアレルギー反応もまたTh2型の免疫反応を伴う。アレルギー反応はアレルギー性喘息の反応を含めて、アレルゲン暴露の数秒〜数分以内に起こり細胞の脱顆粒現象を伴う早期反応と4〜24時間後に起こりアレルゲン暴露部位への好酸球浸潤を伴う晩期反応とを特徴とする。特に早期アレルギー反応ではアレルゲンが好塩基球上および肥満細胞上のIgE抗体を架橋し、それが引き金となって脱顆粒現象が、それに続いて肥満細胞と好塩基球からのヒスタミンや他の炎症メディエーターの放出が起こる。晩期反応では、好塩基球がアレルゲン暴露部位に浸潤する(そこで組織の損傷と機能障害を招く)。
【０００６】
[0006]  アレルギー疾患の抗原接種療法は少量の、ただし逓増量の、抗原の皮下注射を伴う。そうした免疫処置はIgE仲介アナフィラキシーを誘発する危険があるし、晩期アレルギー反応のサイトカイン仲介イベントに効率的に対処するものではない。これまでのところ、この方法はごく一部で成功しているにすぎない。
【０００７】
[0007]  一般に免疫賦活性配列(ISS)として知られるある種のDNA配列の投与は、Th1関連サイトカインの分泌によって示唆されるようなTh1型の免疫反応を誘発する。免疫調節ポリヌクレオチド+抗原の投与は、投与した抗原に対するTh1型偏向の免疫反応を招く。Roman et al. (1997) Nature Med. 3:849-854. たとえばE. coli βガラクトシダーゼ(β-Gal)/生理食塩水またはアジュバントAlumの皮内注射を受けたマウスは、特異的IgG1、IgE抗体とIL-4、IL-5を分泌するがIFN-γは分泌しないCD4+ T細胞との産生をもって応答し、T細胞がTh2サブセット主体であることを示した。しかしβ-GalをコードしかつISSを含むプラスミドDNA(/生理食塩水)の皮内(または尖叉による)投与を受けたマウスは、IgG2a抗体とIFN-γを分泌するがIL-4、IL-5は分泌しないCD4+ T細胞との産生をもって応答し、T細胞がTh1サブセット主体であることを示した。さらに、プラスミドDNA投与マウスによる特異的IgE産生は66〜75%減少した。Raz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145. 一般に裸DNA接種に対する反応は、抗原刺激を受けたCD4+ T細胞によるIL-2、TNFαおよびIFN-γの産生を特徴とするが、それはTh1型反応であることを示す。これはIgE産生の減少によって示されるように、アレルギーや喘息の治療では特に重要である。Th1型免疫反応を刺激する免疫刺激ポリヌクレオチドの能力は細菌抗原、ウイルス抗原およびアレルゲンで立証されてきた(たとえば国際公開第WO 98/55495号明細書を参照)。興味深いことにISSは細胞表面の受容体(Toll様受容体9またはTLR9)を介して作用する。ただし、最近のある報告ではTLR9の活性化にはISSの内在化が必要であると指摘されている。Chuang et al. (2002), J. Leukoc. Biol. 71(3):538-44; Ahmad-Nejad et al. 2002, Eur. J. Immunol. 2(7): 1958-68.
【０００８】
[0008]  他のDNAベース療法は内在化しなければ作用し得ない。ある種の組織は限定量の核酸を取り込めるものの[Wolff, 1997, Neuromuscul. Disord. 7(5):314-8]、遺伝子療法およびアンチセンスコンストラクトの内在化を改善する製剤が多大の関心を呼ぶに至った。そうした製剤は一般に、DNA縮合用のカチオンと膜融合促進用の(しばしばリポソームの形をとる)1つまたは複数の脂質の使用を伴う。たとえばSemple et al., 2001, Bioch. Biophys. Acta 1510:-152-160; Cappaccioli et al., 1993, Bioch. Biophys Res. Comm. 197 (2):818-25; Maurer et al., 2001, Biophys. J. 80:2310-26; Shi et al., Nucl. Acid Res. 29(10):2079-87; およびMeyer et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 (25):15621-27はいずれも、カチオン性脂質/DNA組成物の血清添加培地へのin vitro使用を開示している。他のカチオン/DNAセットも血清添加培地で試験されている。たとえばDNAと次のカチオン性物質との組合せである: ポリ-L-リシン(Ginobbi et al., 1997, Anticancer Res. 17:29-36; Stewart et al., 199, Mol. Pharmacol. 50:1487-94; およびGonzalez-Ferreiro et al., 2001, J. Controlled Release 73:381-90)、カチオン性ペプチド[Junghans et al., 2000, Nucl. Acid Res. 28(10):e45; Wyman et al., 1997, Biochemistry 36:3008-17]、重合カチオン洗剤[Dauty et al., 2001, J. Am. Chem. Soc. 123(38):9227-34]、ポリアミノ脂質[Guy-Caffey et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(52):31391-96]、カチオン性ブロックコポリマー[Kabanov et al., 1995, Bioconj. Chem. 6(6):639-43] およびカチオン性デンドリマー[Bielinska et al., 1996, Nucl. Acid. Res. 24(11):2176-82; Yoo et al., 1999, Pharmaceut. Res. 16(12):1799-1804]。Legendre et al.[1993, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:893-97]は、遺伝子療法コンストラクトのトランスダクションの改善を目的とした、カチオン性抗生物質のグラミシジンＳやポリミキシンBを含めた数種類のカチオンの使用を開示している。米国特許第5,744,166号明細書は、ポロキサマー407またはゼラチンを随意に含んでもよい、ポリカチオン性高分子とDNAとの製剤組成物を開示している。Chavany et al. [1992, Pharmaceut. Res. 9(4):441049]はアルキルトリメチルアンモニウム塩(CTAB)とDNAとを含む製剤に対するノニオン性洗剤(ポロキサマー188)の効果を開示している。さらに、国際公開第WO 01/15726号明細書は荷電脂質とISSの組合せを開示している。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
[0009]  本発明は個体特に人間個体の免疫反応を調節するための新規の組成物および方法に関する。出願人は、免疫調節活性を著しく高めた新規の免疫調節組成物を見出した。
【００１０】
[0010]  本発明は一態様では、カチオン性縮合剤と免疫調節活化合物(IMC)と安定剤とを含む組成物に関する。本発明は別の態様では、カチオン性縮合剤と免疫調節活化合物(IMC)と安定剤とを含む粒子状組成物に関する。本発明の免疫調節組成物と製薬上許容しうる賦形剤とを含有する製剤組成物もまた、本発明に包含される。実施態様によっては、本発明の組成物は、脂肪酸および/または抗原分子を含む追加成分をさらに含有してもよいし、また随意に除外してもよい。
【００１１】
[0011]  本発明は別の態様では、個体の免疫反応を調節するに足る量の本発明の免疫調節組成物を投与することにより個体の免疫反応を調節する方法に関する。本発明の方法による免疫調節は個体を対象に、たとえばTh2型の免疫反応に関連する疾患(アレルギーまたはアレルギー性喘息など)を患う個体、治療ワクチン(アレルギーエピトープ、マイコバクテリアエピトープまたは腫瘍関連エピトープを含有するワクチンなど)または予防ワクチンなどのワクチン接種を受ける個体、がんを患う個体、感染症を患う個体および病原と接触する危険がある個体を対象に実施してよい。
【００１２】
[0012]  本発明はさらなる態様では、本発明の免疫調節組成物を個体に有効量投与することにより該個体のインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)を増加させる方法に関する。本発明の免疫調節組成物の投与は該個体のIFN-γを増加させる。これらの方法を実施する好適な対象は、突発性肺線維症(IPF)、強皮症、放射線皮膚線維症、住血吸虫性肝線維症を含む肝線維症、腎線維症、およびIFN-γの投与が有効である他疾患の患者である。
【００１３】
[0013]  本発明は別の態様では、本発明の免疫調節組成物を個体に有効量投与することにより該個体のインターフェロン-アルファ(IFN-α)を増加させる方法に関する。本発明の免疫調節組成物の投与は該個体のIFN-αレベルを上昇させる。これらの方法を実施する好適な対象は、IFN-αの投与に反応するウイルス感染症やがんを含む疾患の患者である。
【００１４】
[0014]  本発明は別の態様では、本発明の免疫調節組成物を個体に有効量投与することにより該個体の感染症の1つまたは複数の症状を緩和する方法に関する。本発明の免疫調節組成物の投与は該感染症の1つまたは複数の症状を緩和する。本発明の方法で治療してもよい感染症の例は、細胞性病原体に起因する感染症(マイコバクテリア症、マラリア、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、住血吸虫症または肝吸虫症など)であり、これにウイルス疾患を含めても除外してもよい。
【００１５】
[0015]  本発明はさらに、本発明の方法を実行するためのキットに関する。本発明のキットは一般に、本発明の免疫調節組成物(または本願で開示する本発明の免疫調節組成物を生産するための原料)を入れた容器を含み、また個体がTh2型免疫反応に関連する疾患(たとえばアレルギーまたはアレルギー性喘息)を患う、治療ワクチン(たとえばアレルギーエピトープ、マイコバクテリアエピトープまたは腫瘍関連エピトープを含有するワクチン)または予防ワクチンなどのワクチン接種を受ける、がんを患う、感染症を患う、または病原と接触する危険があるときに、該個体の免疫調節を目的に本発明の免疫調節組成物を使用するための説明書を随意に含んでもよい。
【００１６】
[0016]  本発明はまた、免疫調節化合物(IMC)、安定剤およびカチオン性縮合剤を合わせて混合物とするステップを含む本発明組成物の製造方法を提供する。実施態様によっては、本発明組成物の製造方法は免疫調節化合物(IMC)と安定剤を合わせて初期混合物とするステップと、次いで該初期混合物にカチオン性縮合剤を添加して免疫調節組成物とするステップとを含む。本発明はさらに、これらの方法によって製造した免疫調節組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
[0017]  本発明者は個体特に人間の免疫反応を血溶接するための新規の組成物および方法を見出した。本発明の組成物はカチオン性縮合剤と免疫調節化合物(IMC)と安定剤との粒子状複合体を成分として含む。本発明者は意外にも、IMCはカチオン性縮合剤および安定剤と調合すると、単独で投与するよりも免疫調節活性が著しく高まることを見出した。
【００１８】
一般手法
[0018]  本発明の実施では特に断らない限り、分子生物学(遺伝子組換えを含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学および免疫学の通常の手法、すなわちいずれも技術上周知の手法を使用することになろう。そうした手法は以下の文献で詳しく説明されている: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed., Academia Press, 1996); およびMethods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W.H. Albert and N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags GmbH, 1993).
【００１９】
用語の意味
[0019]  本書で使用する単数形の特定、不特定の名詞は特に断らない限り、または文脈から明らかである場合を除き、複数形を包含する。たとえばIMCは単数又は複数のIMCを包含する。
【００２０】
[0020]  本書で互換的に使用する用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は一本鎖DNA(ssDNA)および二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖RNA(ssRNA)および二本鎖RNA(dsRNA)、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド、またはそれらの組み合わせを包含する。オリゴヌクレオチドは線状または環状構造でもよいし、または線状、環状の両断片を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは一般にホスホジエステル結合を介して連結されたヌクレオシドのポリマーであるが、代替結合たとえばホスホロチオアートエステル結合を介したものでもよい。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン塩基[アデニン、グアニンまたはイノシン、またはそれらの誘導体]またはピリミジン塩基[チミン、シトシンまたはウラシル、またはそれらの誘導体]からなる。DNA中の4つのヌクレオシド単位(または塩基)はデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンという。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００２１】
[0021]  本書ではヌクレオチド配列の塩基を次のように一文字略語で表す: A=アデニン、G=グアニン、C=シトシン、T=チミン、U=ウラシル、I=イノシン、Y=ピリミジン。
【００２２】
[0022]  用語「ISS」は本書では、in vitro、in vivoおよび/またはex vivoで測定して測定可能な免疫反応をもたらすポリヌクレオチド配列をいう。測定可能な免疫反応の非限定的な例は抗原特異的抗体産生、サイトカイン分泌、リンパ球たとえばNK細胞、CD4+ Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、Bリンパ球などの個体群の活性化および拡大である。ISS配列はTh1型反応を選択的に活性化するのが好ましい。本発明に使用するポリヌクレオチドは少なくとも1つのISSを含む。「ISS」は本書では、含ISSポリヌクレオチドの略称でもある。
【００２３】
[0023]  用語「免疫調節(の)」または「免疫反応を調節する」は本書では免疫刺激効果と免疫抑制効果の両方にわたる。免疫調節は量的変化を伴ってもよいが、主に免疫反応全般の質的変化である。本発明に従って免疫調節される免疫反応は一般に「Th2型」免疫反応ではなく「Th1型」寄りの免疫反応である。Th1型反応は一般に、細胞性免疫系(たとえば細胞傷害性リンパ球)の反応と考えられるが、Th2型反応は一般に「体液性」または抗体依存性である。Th1型免疫反応は通常、抗原に対する「遅延型過敏」反応を特徴とし、また生化学レベルで、Th1関連サイトカインたとえばIFN-γ、IL-2、IL-12およびTNF-β、それにIFN-αやIL-6などのレベルの上昇から検出することができる。ただしIL-6はTh2型反応にも関連する可能性がある。Th1型免疫反応は一般に細胞傷害性リンパ球(CTL)産生および低レベルまたは一過性の抗体産生を伴う。Th2型免疫反応は一般にIgE産生を含む抗体産生レベルの上昇、ゼロまたは極小レベルのCTL産生、それにTh2関連サイトカインたとえばIL-4の発現などを伴う。従って、本発明に従う免疫調節は、たとえば本発明の方法による治療を受けた個体における、該治療を欠く場合との比較で見たIFN-γ産生の増大および/またはIgE産生の減少によって認定されよう。
【００２４】
[0024]  用語「免疫調節(の)」は粒子状組成物および/またはオリゴヌクレオチドを形容してもよい。従って、本発明の免疫調節組成物中のポリヌクレオチドが単独では相応の免疫調節活性を示さなくとも、該組成物は免疫調節活性を示すことがある。実施態様によっては、本発明の免疫調節組成物のポリヌクレオチドは単独で存在する場合には「単独免疫調節活性」をもたない、または(粒子状組成物と比較して)「低単独免疫調節活性」をもつ。ポリヌクレオチドの「単独免疫調節活性」は同じ核酸骨格(たとえばホスホロチオアート、ホスホジエステル、キメラ)をもつ単離ポリヌクレオチドの免疫調節活性を測定して求めるが、測定には本書で開示する免疫応答の少なくとも1つの側面を指示するような標準アッセイを使用する。
【００２５】
[0025]  用語「免疫調節化合物」または「IMC」は本書では、免疫調節活性をもち、かつ配列5’-CG-3’を含むヌクレオチド部分を含む分子をいう。IMCは、複数のISSを含む、1つのISSからなる、または単独では免疫調節活性をもたないようなヌクレオチド部分からなってもよい。IMCはポリヌクレオチドからなってもよい(「ポリヌクレオチドIMC」)し、追加部分を含んでもよい。従って、用語「IMC」は、複数のヌクレオチド部分を組み込んでいて、そのうちの少なくとも1つは非核酸スペーサー部分に共有結合した配列5’-CG-3’を含むようなキメラ免疫調節化合物(CIC)を包含する。
【００２６】
[0026]  用語「免疫調節組成物」、「粒子状組成物」および「粒状免疫調節組成物」は本書では、カチオン性縮合剤とIMCと安定剤とを含む組成物をいう。
【００２７】
[0027]  用語「抗原」は抗体またはT細胞抗原受容体が特異的に認識し結合する物質をいう。抗原の例はペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質およびリン脂質; それらの部分および組み合わせなどである。抗原は天然物でも合成物でもよい。本発明組成物に含めるのに適する抗原の例はB細胞またはT細胞の抗原特異的反応を誘発しうる任意の分子などである。抗原は抗原特異的抗体反応を誘発するものが好ましい。ハプテンは「抗原」の範囲に包含される。ハプテンは、それ自体では免疫原性をもたないが、抗原決定基をもつ免疫原分子と結合すると免疫原性をおびる低分子化合物である。低分子は免疫原性をおびさせるにはハプテン化する必要があろう。好ましくは、本発明の抗原はペプチド、脂質(たとえばステロール、脂肪酸、リン脂質など)、インフルエンザワクチンに使用されるような多糖、ガングリオシドおよび糖タンパク質などを包含する。
【００２８】
[0028] 「アジュバント」は、抗原などのような免疫原物質に加えて混合物としたときに、その混合物に暴露した受容宿主の、該抗原に対する免疫反応を非特異的に増進または増強させる物質をいう。
【００２９】
[0029]  用語「ペプチド」は生物学的反応たとえば抗体産生またはサイトカイン活性をもたらすに足る鎖長および組成のポリペプチドであり、ハプテンであるかどうかを問わない。一般に、そうしたペプチドは鎖長が6アミノ酸残基以上である。用語「ペプチド」はさらに(天然物または非天然物の)修飾アミノ酸を包含するが、そうした修飾の非限定的な例はリン酸化、グリコシル化、PEG化、脂質化およびメチル化などである。
【００３０】
[0030]  「抗原ペプチド」の例は、精製した天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗製ペプチド抽出物または半精製または未精製の活性状態のペプチド(弱毒化または不活化したウイルス、細胞、微生物の一部であるペプチドなど)、またはそうしたペプチドの断片である。従って「抗原ペプチド」または「抗原ポリペプチド」は、1つまたは複数の抗原特性を示すポリペプチドの全体または部分を意味する。従ってたとえば「Amb a 1抗原ポリペプチド」または「Amb a 1ポリペプチド抗原」は抗原特性(すなわち抗体またはT細胞受容体に特異的に結合する性質)を示すAmb a 1由来のアミノ酸配列であって、全配列か、該配列の一部か、および/または該配列の修飾体かは問わない。
【００３１】
[0031]  「抗原に対するアレルギー反応」は、好酸球および/または抗原特異的IgEの生成およびそれらの結果としての効果を一般的な特徴とする免疫反応を意味する。技術上周知のように、IgEは肥満細胞および好塩基球上のIgE受容体に結合する。後にIgE認識抗原への暴露が起こると、該抗原は肥満細胞および好塩基球の表面でIgEと架橋結合して、これらの細胞の脱顆粒を、ヒスタミン放出などを非限定的に含めて、引き起こす。言うまでもなく、用語「抗原に対するアレルギー反応」、「アレルギー」および「アレルギー症状」は本発明のいくつかの方法の適用に等しく好適であるし、また本発明の方法はアレルギー反応の予防と現症としてのアレルギー症状の治療に等しく好適である方法を包含する。
[0032]  用語「アレルゲン」は本書では、被験者への暴露に伴いアレルギー反応を誘発するような抗原または分子(通常はタンパク質)の抗原性部分を意味する。一般に該被験者は、たとえば膨疹・紅斑テストや技術上周知の任意の検査法によって示されるように該アレルゲンに対してアレルギー性である。ある分子は、被験者のごく小さな部分集合が該分子への暴露に伴いアレルギー性(たとえばIgE)免疫反応を示すだけで、アレルゲンとされる。多数の単離アレルゲンが周知であり、その非限定的な例を本書の表1に示す。
【００３２】
[0033]  用語「脱感作」は被験者がそれに対してすでに過敏反応を示しているアレルゲンを逓増用量投与することをいう。脱感作に使用するアレルゲン用量の例は技術上周知であり、Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31:111-127などを参照。
【００３３】
[0034]  「抗原特異的免疫療法」は抗原を使用して免疫反応の抗原特異的調節を実現する任意の免疫療法をいう。アレルギーとの関連では抗原特異的免疫療法の非限定的な例は脱感作療法などである。
【００３４】
[0035]  「個体」または「被験者」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物たとえばヒトなどである。哺乳動物の非限定的な例はヒト、ヒト以外の霊長類、家畜、競技・狩猟用動物、げっ歯類動物(マウス、ラットなど)およびペットなどである。脊椎動物はまた、鳥類(すなわち鳥類個体)や爬虫類(すなわち爬虫類個体)を非限定的に含む。
【００３５】
[0036]  物質の「有効量」または「十分量」は臨床結果などを含む有益な、または所期の、結果をもたらすに足る量であり、また従って「有効量」はその適用環境に左右される。抗原に対する免疫反応を調節する組成物の投与との関連では、免疫調節製剤の有効量は、抗原を単独投与した場合の免疫反応との比較でそうした調節を実現するに足る量である。有効量は単回または頻回投与で投与することができる。
【００３６】
[0037]  用語「併用投与」は本書では、免疫反応を調節するに足る短い時間差での2種類以上の物質の投与をいう。好ましくは、併用投与は2種類以上の物質の同時投与をいう。
[0038]  免疫反応たとえばTh1反応の「刺激」は反応の増大を意味し、それは反応の誘発および/または増進に由来しうる。
【００３７】
[0039]  「IgE関連疾患」は、持続的でも非持続的でもよいIgEレベルの上昇などを部分的な特徴とする生理状態である。IgE関連疾患の非限定的な例はアレルギーおよびアレルギー反応、アレルギー関連疾患(後述)、喘息、鼻炎、結膜炎、じん麻疹、ショック、虫(膜翅目)刺されアレルギー、薬物アレルギー、および寄生虫病などである。この用語はこれらの疾患の発現を包含する。一般に、そうした疾患ではIgEは抗原特異的である。
【００３８】
[0040]  「アレルギー関連疾患」は抗原特異的IgE免疫反応の影響に由来する疾患を意味する。そうした影響の非限定的な例は低血圧症およびショックなどである。アナフィラキシーはアレルギー関連疾患の例であり、そこでは血液循環中に放出されるヒスタミンが血管拡張や毛細血管の透過性増大を引き起こし、その結果として顕著な循環血しょう量の低下を招く。アナフィラキシーは関連の影響が全身に及ぶ全身性の場合もあれば、反応が特定の標的組織または器官に限定される局所性の場合もある。
【００３９】
[0041]  用語「ウイルス病」は本書ではウイルスを病因とする疾患をいう。ウイルス病の例はB型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ、後天性免疫不全症候群(AIDS)および帯状疱疹などである。
【００４０】
[0042]  「治療」は本書では、また当業者には自明のように、臨床結果を含む有益なまたは所期の結果を得るための取組みである。本発明では、有益なまたは所期の結果は1つまたは複数の症状の緩和または改善、疾患の程度の逓減、病態の安定化(すなわち非悪化)、疾患の蔓延防止、疾患の進行遅延または減速、および(部分的または完全)寛解を、検出可能か不能かを問わず、非限定的に包含する。「治療」はまた、治療を受けない場合の期待余命との比較で見た延命を意味する。
【００４１】
[0043]  疾病または疾患の「一時的緩和」は、その治療を施さなかった場合と比較して、疾患または病態の程度および/または不都合な臨床的発現が軽減される、および/または進行の時間的経過が遅くなるまたは長くなることを意味する。特にアレルギーとの関連では、当業者には自明のように、一時的緩和はアレルゲンに対する免疫反応の調節により起こるであろう。さらに、一時的緩和は単回投与で起こるとは限らず、しばしば頻回投与によって起こる。従って、反応または疾患の一時的緩和を引き起こすに足る量の投与は単回投与でも頻回投与でもよい。
【００４２】
[0044]  本発明の免疫調節組成物によって「誘発」される「抗体力価」または「抗体量」は該組成物を投与した後の時点での、特定抗原の実測量をいう。
【００４３】
[0045]  「Th1関連抗体」は、その産生および/または増加がTh1免疫反応に関連する抗体をいう。たとえばIgG2aはマウスのTh1関連抗体である。本発明では、Th1関連抗体の測定は1つまたは複数のそうした抗体の測定となる。たとえば人間ではTh1関連抗体の測定はIgG1および/またはIgG3の測定を伴う可能性がある。
【００４４】
[0046]  「Th2関連抗体」は、その産生および/または増加がTh2免疫反応に関連する抗体をいう。たとえばIgG1はマウスのTh2関連抗体である。本発明では、Th2関連抗体の測定は1つまたは複数のそうした抗体の測定となる。たとえばヒトではTh2関連抗体の測定はIgG2および/またはIgG4の測定を伴う可能性がある。
【００４５】
[0047]  ある機能または活性たとえばサイトカイン産生、抗体産生またはヒスタミン放出の「抑制」または「阻害」は、着目している条件またはパラメーターを除いてまったく同じ条件と比較したときの、あるいは別の条件と比較したときの、該機能または活性の一段の低減である。たとえば、本発明の免疫調節組成物とヒスタミン放出を抑制する抗原との同時投与は抗原単独投与の場合と比較してヒスタミン放出を一段と低減する。
【００４６】
[0048]  「血清タンパク質」は、無病哺乳動物とくに無病牛の血清中に通常見られるタンパク質である。最も一般的な血清タンパク質は血清アルブミンである。
【００４７】
[0049]  用語「(を)含む」およびその同族語は本書では包含的な意味で使用する。すなわち用語「(を)包含する」およびその同族語と同等である。
【００４８】
組成物
[0050]  本発明は、個体の免疫反応を調節するための新規組成物を提供する。該組成物はカチオン性縮合剤、IMCおよび安定剤を含む製剤である。実施態様によっては、本発明組成物はさらに抗原および/または脂肪酸を含んでもよい。
【００４９】
[0051]  本発明組成物は一般に粒子状をなす。当業者には自明であろうが、本発明の粒子状組成物は粒径の異なる粒子群からなろう。こうした自然発生的なバラツキのために、本発明組成物中の粒子のサイズは範囲で、または最大係または最小径で、表示する。粒子は少なくとも95(質量)%の粒子が規定寸法を満たす場合には、特定のサイズであるとみなされる(たとえば少なくとも97%の粒子が粒径20μm未満であるとすれば、該組成物は粒径20μm未満の粒子からなるとみなされる)。粒径は技術上周知の任意簡便な方法たとえばろ過法(たとえばカットオフサイズを超える粒子を捕集するための「デプス」フィルターを使用)、動的光散乱法、(特に凍結割断法と組み合せたTEM、SEMを含む)電子顕微鏡法などで測定してよい。
【００５０】
[0052]  本発明組成物は、粒径が約50μm未満の、より好ましくは約20μm未満の粒子を含むのが好ましい。ただし、実施態様によっては、粒径は約3、2または1μm未満であろう。好ましい粒径範囲の例は約0.01μm〜50μm、0.02〜20μm、0.05〜5μmおよび0.05〜3μmなどである。
【００５１】
[0053]  本発明組成物の成分は組成物中に様々な配合比/量で存在してよいが、安定剤や随意成分たとえば脂肪酸、抗原などの量は変動幅が比較的小さく、安定剤なら一般に約0.1%〜0.5%(v/v)に、また脂肪酸なら0〜0.5%に、抗原なら約0.1〜約100 μg/mL好ましくは約1〜約100 μg/mL最も好ましくは約10〜50 μg/mLに、それぞれ留まると考えられる。本発明組成物中のIMCとカチオン性縮合剤の配合量/比は変動幅がもっと大きくなる。IMCの配合量はある程度までIMCの分子量の関数として変動するが、その幅は一般に約50μg/mL〜約2μg/mL好ましくは約100μg/mL〜1μg/mLであろう。カチオン性縮合剤は一般にIMCに対して(質量ベースで)過剰量存在し、(IMC:カチオン性縮合剤で)約1:2〜約1:6、好ましくは約2:5〜約1:5の存在比となる。
【００５２】
[0054]  本発明組成物の粒径は数多くの変数の関数である。本発明者は、組成物中の粒径分布がカチオン性縮合剤/IMC比の加減によって調節しうることを見出した。たとえば例示的な+ISS/0.4% Tween 85/0.4%/オレイン酸/ポリミキシンB組成物中のカチオン性縮合剤/IMC比を加減することにより、平均粒径を約1.5μm(@カチオン性縮合剤/IMC比=1)〜約45μm(@カチオン性縮合剤/IMC比=10)の範囲内で調節することができる。
【００５３】
[0055]  本発明組成物は実施態様次第で、カチオン性縮合剤、IMCおよびノニオン性洗剤である安定剤を含むこともあれば、細胞膜傷害カチオン性リポペプチド[好ましくはポリミキシン、より好ましくはポリミキシンB(PMXB)]、IMCおよび安定剤を含むこともある。実施態様によっては、安定剤は血清タンパク質ではない(特にウシ血清タンパク質ではない)。この実施態様群の例示的な組成物は安定剤としてTween 80またはTween 85などのようなポリオキシエチレンエーテル洗剤を、追加のオレイン酸系安定剤と共に使用する。
【００５４】
[0056]  実施態様によっては、本発明組成物はカチオン性縮合剤、IMCおよびノニオン性洗剤である安定剤を合わせる方法により製造される免疫調節粒子を含むこともあれば、細胞膜傷害カチオン性リポペプチド(好ましくはポリミキシン、より好ましくはPMXB)、IMCおよび安定剤を合わせる方法により製造される免疫調節粒子を含むこともある。実施態様によっては、安定剤は血清タンパク質ではない(特にウシ血清タンパク質ではない)。
【００５５】
[0057]  実施態様によっては、本発明組成物はIMCとノニオン性洗剤である安定剤とを合わせてIMC/安定剤混合物とし、該IMC/安定剤混合物をカチオン性縮合剤とあわせる方法により製造される免疫調節粒子を含むこともあれば、IMCと安定剤とを合わせてIMC/安定剤混合物とし、該IMC/安定剤混合物を細胞膜傷害カチオン性リポペプチド(好ましくはポリミキシン、より好ましくはPMXB)と合わせる方法により製造される免疫調節粒子を含むこともある。実施態様によっては、安定剤は血清タンパク質ではない(特にウシ血清タンパク質ではない)。
【００５６】
[0058]   実施態様によっては、本発明組成物はカチオン性縮合剤、IMCおよびノニオン性洗剤である安定剤を含む免疫調節粒子を含むこともあれば、細胞膜傷害カチオン性リポペプチド(好ましくはポリミキシン、より好ましくはPMXB)、IMCおよび安定剤を含む免疫調節粒子を含むこともある。実施態様によっては、安定剤は血清タンパク質ではない(特にウシ血清タンパク質ではない)。
【００５７】
カチオン性縮合剤
[0059]  本発明の組成物および方法に有用であるカチオン性縮合剤は、生理的pH(すなわちpH 7.0〜7.5程度)で正電荷をもつ分子である。本発明に使用するカチオン性縮合剤は両性イオン性ではなく、ポリカチオン性であるのが、すなわち1分子あたり複数の正電荷をもつのが、好ましい。
【００５８】
[0060]  好ましいカチオン性縮合剤の例: (a)ポリオキシン類[ポリミキシンA、ポリミキシンB(ポリミキシンB1およびポリミキシンB2を含む)、ポリミキシンC、ポリミキシンD、ポリミキシンE(別名コリスチン)、ポリミキシンK、ポリミキシンM、ポリミキシンP、ポリミキシンS、ポリミキシンT]、シルクリン類(シルクリンA、シルクリンB、シルクリンC、シルクリンD、シルクリンE、シルクリンFを含む)、オクタペプチン、アムホテリシン類(アムホテリシンBを含む)、およびアシル化ペプチド類[オクタアシル-KFFKFFKFFおよびアシルKALA(オクタノイル-WEAKLAKALAKHLAKALAKALEACEA)を含む]を非限定的に含む細胞膜傷害カチオン性リポペプチド; (b)ポリミキシンB(PMXB)ノナペプチド、セクロピン類(セクロピンA、セクロピンBおよびセクロピンP1を含む)、KFFKFFKFFおよびKALA(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)を非限定的に含む細胞膜傷害カチオン性リポペプチド類; (c)臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)、臭化ベンジルジメチルアンモニウム(BDAB)、CpyrB(臭化セチルピリジニウム)、CimB(臭化セチルイミダゾリウム)、および[ポリ-L-リシン(PLL)やポリエチレンイミン(PEI)などの]ポリカチオン性高分子を非限定的に含む一本鎖カチオン性界面活性剤。実施態様によっては、カチオン性縮合剤は細胞膜傷害カチオン性リポペプチド、好ましくはポリミキシン、より好ましくはPMXBである。実施態様によっては、カチオン性縮合剤は脂肪酸エステル(すなわち脂質)および二本鎖界面活性剤を排除してもよい。
【００５９】
免疫調節化合物
[0061]  本発明の免疫調節化合物(IMC)は免疫調節活性をもち、かつ配列5’-CG-3’を含むヌクレオチド部分を含む分子である。IMCはポリヌクレオチドでもよいし、また複数のヌクレオチド部分を組み込んでいて、うち少なくとも1つは配列5’-CG-3’を含むような化合物たとえばCICでもよい。IMCがポリヌクレオチドであるときには、該ポリヌクレオチドは少なくとも1つのISSを含んでよいし、また複数のISSsを含んでもよい。ISSsは該ポリヌクレオチド内で隣接させてもよいし、該ポリヌクレオチド内で追加のヌクレオチド塩基により仕切ってもよい。実施態様によっては、IMCはISSからなる。従って、ポリヌクレオチドIMCは本書で開示する任意の1つまたは複数のISSの組合せを含んでもよい。あるいはIMCは、少なくとも2つのヌクレオチド部分を含み、うち少なくとも1つが配列5’-CG-3’をスペーサー部分に共有結合させて含むようなCICでもよい。IMCは本発明の免疫調節組成物の成分として投与したときに、in vitro、in vivoおよび/またはex vivoで測定して測定可能な免疫反応をもたらす。
【００６０】
[0062]  ポリヌクレオチドIMCは6塩基(または塩基対)超の任意の長さでよく、また一般に配列5’-シトシン,グアニン-3’を含むが、長さは好ましくは15塩基または塩基対超であり、より好ましくは20塩基または塩基対超である。技術上周知のように、配列5’-シトシン,グアニン-3’のシトシンは一般に、また特にC-5位では、非メチル化塩基であるが、実施態様によってはシトシンのメチル化がたとえばN-4位で許容されることもある。ポリヌクレオチドIMCはまた配列5’-プリン,プリン,C,G,ピリミジン,ピリミジン,C,G-3’を含んでもよい。ポリヌクレオチドIMCはまた配列5’-プリン,プリン,C,G,ピリミジン,ピリミジン,C,C-3’を含んでもよい。後掲のポリヌクレオチド配列で示唆されるように、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-T,C,G-3’または配列5’-T,C,G,A-3’を(1つまたは複数)含んでもよい。従って、ポリヌクレオチドIMCは5’-CG-3’および/または5’-TCG-3’および/または5’-TCGA-3’を含んでよいし、実施態様によってはウラシル(U)がチミン(T)に置き換わってもよい。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは(5’-CGTTCG-3’などのような)配列5’-C,G,ピリミジン,ピリミジン,C,G-3’を含んでもよい。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-C,G,ピリミジン,ピリミジン,C,G,プリン,プリン-3’を含んでもよい。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは(5’-AACGTT-3’などのような)配列5’-プリン,プリン,C,G,ピリミジン,ピリミジン-3’を含んでもよい。後述のように、ポリヌクレオチドIMCはISSの5’-CG-3’、 5’-TCG-3’、 5’-TCGA-3’、 5’-UCG-3’または5’-UCGA-3’中のCの代りに5-ブロモシトシンを含んでもよい。
【００６１】
[0063]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-プリン,T,C,G,ピリミジン,ピリミジン-3’を含んでもよい。
【００６２】
[0064]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうちの任意の配列を含んでもよい:
GACGCTCC; GACGTCC; GACGTTCC; GACGCCCC; AGCGTTCC; AGCGCTCC; AGCGTCCC; AGCGCCCC; AACGTCCC; AACGCCCC; AACGTTCC; AACGCTCC; GGCGTTCC; GGCGCTCC;GGCGTCCC; CGCGCCCC;GACGCTCG; GACGTCCG;GACGCCCG; GACGTTCG;
AGCGCTCG; AGCGTTCG; AGCGTCCG; AGCGCCCG;AACGTCCG; AACGCCCG; AACGTTCG; AACGCTCG;GGCGTTCG; GGCGCTCG; 
GGCGTCCG; GGCGCCCG.
【００６３】
[0065]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうちの任意の配列を含んでもよい:
GACGCT; GACGTC; GACGTT; GACGCC; GACGCU; GACGUC; GACGUU; GACGUT; GACGTU; AGCGTT; AGCGCT; AGCGTC; AGCGCC; AGCGUU; AGCGCU; AGCGUC; AGCGUT; AGCGTU; AACGTC; AACGCC; AACGTT; AACGCT; AACGUC; AACGUU; AACGCU; AACGUT; AACGTU; CGCGTT; CGCGCT; CGCGTC; CGCGCC; GGCGUU; GGCGCU; GGCGUC; GGCGUT; GGCGTU.
【００６４】
[0066]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうちの任意の配列を含んでもよい(ただしBは5-ブロモシトシンである):
GABGCT; GABGTC; GABGTT; GABGCC; GABGCU; GABGUC; GABGUU; GABGUT; GABGTU; AGBGTT; AGBGCT; AGBGTC; AGBGCC; AGBGUU; AGBGCU; AGBGUC; AGBGUT; AGBGTU; AABGTC; AABGCC; AABGTT; AABGCT; AABGUC; AABGUU; AABGCU; AABGUT; AABGTU; GGBGTT; GGBGCT; GGBGTC; GGBGCC; GGBGUU; GGBGCU; GGBGUC; GGBGUT; GGBGTU.
【００６５】
[0067]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうちの任意の配列を含んでもよい(ただしBは5-ブロモシトシンである):
GABGCTCC; GABGTCCC; GABGTTCC; GABGCCCC; AGBGTTCC; AGBGCTCC; AGBGTCCC; AGBGCCCC; AABGTCCC; AABGCCCC; AABGTTCC; AABGCTCC; GGBGTTCC; GGBGCTCC; GGBGTCCC; GGBGCCCC; GABGCTCG; GABGTCCG; GABGCCCG; GABGTTCG; AGBGTTCG; AGBGCTCG; AGBGTCCG; AGBGCCCG; AABGTCCG; AABGCCCG; AABGTTCG; AABGCTCG; GGBGTTCG; GGBGCTCG; GGBGTCCG; GGBGCCCG; GABGCTBG; GABGTCBG; GABGCCBG; GABGTTBG; AGBGTTBG; AGBGCTBG; AGBGTCBG; AGBGCCBG; AABGTCBG; AABGCCBG; AABGTTBG; AABGCTBG; GGBGTTBG; GGBGCTBG; GGBGTCBG; GGBGCCBG.
【００６６】
[0068]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうちの任意の配列を含んでもよい(ただしBは5-ブロモシトシンである):
GABGCUCC; GABGUCCC; GABGUTCC; GABGTUCC; GABGUUCC; AGBGUUCC; AGBGTUCC; AGBGUTCC; AGBGCUCC; AGBGUCCC; AABGUCCC; AABGUUCC; AABGUTCC; AABGTUCC; AABGCUCC; GGBGUUCC; GGBGUTCC; GGBGTUCC; GGBGCUCC; GGBGUCCC; GABGCUCG; GABGUCCG; GABGUUCG; GABGUTCG; GABGTUCG; AGBGCUCG; AGBGUUCG; AGBGUTCG; AGBGTUCG; AGBGUCCG; AABGUCCG; AABGUUCG; AABGUTCG; AABGTUCG; AABGCUCG; GGBGUUCG; GGBGUTCG; GGBGTUCG; GGBGCUCG; GGBGUCCG; GABGCUBG; GABGUCBG; GABGUUBG; GABGUTBG; GABGTUBG; AGBGCUBG; AGBGUUBG; AGBGUCBG; AGBGUTBG; AGBGTUBG; AABGUCBG; AABGUUBG; AABGUTBG; AABGTUBG; AABGCUBG; GGBGUUBG; GGBGUTBG; GGBGTUBG; GGBGCUBG; GGBGUCBG.
【００６７】
[0069]  実施態様によっては、免疫調節化合物は配列5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:1)を含むこともあれば、また次のうち任意の配列を含むこともある:
5’-TGA CCG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:2);
5’-TCA TCT CGA ACG TTC CAC AGT CA-3’(SEQ ID NO:3);
5’-TGA CTG TGA ACG TTC CAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:4);
5’-TCC ATA ACG TTC GCC TAA CGT TCG TC-3’(SEQ ID NO:5);
5’-TGA CTG TGA ABG TTC CAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:6) (ただしBは5-ブロモシトシンである);
5’-TGA CTG TGA ABG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:7) (ただしBは5-ブロモシトシンである);
5’-TGA CTG TGA ABG TTB GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:8) (ただしBは5-ブロモシトシンである);
5’-GAA ABG UTCG-3’ (SEQ ID NO:9) (ただしBは5-ブロモシトシンである);
5’-BGA ABG UTCG-3’ (SEQ ID NO:10) (ただしBは5-ブロモシトシンである);
5’-TCG AGC GTT CT-3’ (SEQ ID NO:11);
5’-TGA ACG UTC G-3’ (SEQ ID NO:12);
5’-GAA CCG TTC G-3’ (SEQ ID NO:13);
5’-CGA ACG TTC G-3’ (SEQ ID NO:14);
5’-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3’ (SEQ ID NO:15);
5’-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3’ (SEQ ID NO:16);
5’-TCG TCG AAC GTT CGTT-3’ (SEQ ID NO:17);
5’-TCG TCG AAC GTT CG-3’ (SEQ ID NO:18);
5’-TCG TCG AAC GTT-3’ (SEQ ID NO:19);
5’-TCG AAC GTT C-3’ (SEQ ID NO:20)および
5’-TCG TCG AT-3’。
【００６８】
[0070]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは7塩基(または塩基対)以上でもよい。従って実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-TCGX1X2X3X4-3’または5’-UCGX1X2X3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列を含むかまたはそうした配列からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列を含む: 5’-TCGTTTT-3’; 5’-TCGAAAA-3’; 5’-TCGCCCC-3’; 5’-TCGGGGG-3’; 5’-TCGUUUU-3’; 5’-TCGIIII-3’; 5’-UCGTTTT-3’; 5’-UCGAAAA-3’; 5’-UCGCCCC-3’; 5’-UCGGGGG-3’; 5’-UCGUUUU-3’; 5’-UCGIIII-3’。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-X1TCGX2X3X4-3’または5’-X1UCGX2X3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列を含むかまたはそうした配列からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列を含む: 5’-TTCGTTT-3’; 5’-ATCGATT-3’; 5’-TUCGTTT-3’; 5’-AUCGATT-3’。他の実施態様では、ポリヌクレオチドIMCは5’-X1X2TCGX3X4-3’または5’-X1X2UCGX3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列を含むかまたはそうした配列からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列を含む: 5’-TTTCGTT-3’; 5’-AATCGTT-3’; 5’-TTUCGTT-3’; 5’-AAUCGTT-3’。
【００６９】
[0071]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’- X1X2AX3CGX4TCG-3’(SEQ ID NO:21) [式中X1はT、G、CまたはB(B=5-ブロモシトシン)であり、X2はT、G、AまたはUであり、X3はT、AまたはCであり、X4はT、GまたはUである]で示される配列を含む。実施態様によっては、この式に従うポリヌクレオチドIMCは5’-TGA ACG TTC G-3’(SEQ ID NO:22)または5’-GGA ACG TTC G-3’(SEQ ID NO:23)を除外する。
【００７０】
[0072]  他の実施態様では、ポリヌクレオチドIMCは式5’- X1X2AX3BGX4TCG-3’(SEQ ID NO:24) [式中X1はT、G、CまたはB(B=5-ブロモシトシン)であり、X2はT、G、AまたはUであり、X3はT、AまたはCであり、X4はT、GまたはUである]で示される配列を含む。実施態様によっては、この式に従うポリヌクレオチドIMCは5’-TGA ABG TTC G-3’(SEQ ID NO:25) (B=5-ブロモシトシン)を除外する。
[0073]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-TCGTCGX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)を含む。他の実施態様では、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列を含む: 5’-TCGTCGA-3’; 5’-TCGTCGC-3’; 5’-TCGTCGG-3’; 5’-TCGTCGT-3’; 5’-TCGTCGU-3’; 5’-TCGTCGI-3’。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-TCGUCGX1-3’、5’-UCGTCGX1-3’または5’-UCGUCGX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)を含む。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列を含む: 5’-TCGUCGA-3’; 5’-TCGUCGC-3’; 5’-TCGUCGG-3’; 5’-TCGUCGT-3’; 5’-TCGUCGU-3’; 5’-TCGUCGI-3’; 5’-UCGTCGA-3’; 5’-UCGTCGC-3’; 5’-UCGTCGG-3’; 5’-UCGTCGT-3’; 5’-UCGTCGU-3’; 5’-UCGTCGI-3’; 5’-UCGUCGA-3’; 5’-UCGUCGC-3’; 5’-UCGUCGG-3’; 5’-UCGUCGT-3’; 5’-UCGUCGU-3’; 5’-UCGUCGI-3’。
【００７１】
[0074]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-T mC GX1X2X3X4-3’または5’-U mC GX1X2X3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドであり、mCは本書で開示するような修飾シトシンである)で示される配列を含む。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-X1T mC GX2X3X4-3’または5’-X1U mC GX2X3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列を含む。実施態様によっては、該ISSは式5’-X1X2T mC GX3X4-3’または5’-X1X2U mC GX3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列を含む。
【００７２】
[0075]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-T mC GTCGX1-3’、5’-T mC GUCGX1-3’、5’-U mC GTCGX1-3’または5’-U mC GUCGX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)で示される配列を含む。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-TCGT mC GX1-3’、5’-UCGT mC GX1-3’ 、5’-TCGU mC GX1-3’または5’-UCGU mC GX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)で示される配列を含む。他の実施態様では、ポリヌクレオチドIMCは式5’-T mC GT mC GX1-3’、5’-T mC GU mC GX1-3’、5’-U mC GT mC GX1-3’または5’-U mC GU mC GX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)で示される配列を含む。本書で開示するように、修飾シトシン(mC)はシトシンのC-5および/またはC-6位に電子吸引基を付加したものを、たとえば5-ブロモシトシンなどのようなC-5ハロゲン化シトシンを非限定的に包含する。
【００７３】
[0076]  従って実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列を含む(ただしBは5-ブロモシトシンである): 5’-TBGTTTT-3’; 5’-TBGAAAA-3’; 5’-TBGCCCC-3’; 5’-TBGGGGG-3’; 5’-TBGUUUU-3’; 5’-TBGIIII-3’; 5’-TBGTCGA-3’; 5’-TBGTCGC-3’; 5’-TBGTCGG-3’; 5’-TBGTCGT-3’; 5’-TBGTCGU-3’; 5’-TBGTCGI-3’; 5’-TCGTBGA-3’; 5’-TCGTBGC-3’; 5’-TCGTBGG-3’; 5’-TCGTBGT-3’; 5’-TCGTBGU-3’; 5’-TCGTBGI-3’; 5’-TBGTBGA-3’; 5’-TBGTBGC-3’; 5’-TBGTBGG-3’; 5’-TBGTBGT-3’; 5’-TBGTBGU-3’; 5’-TBGTBGI-3’。
【００７４】
[0077]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-TCGTCGX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-TCGTCGA-3’; 5’-TCGTCGC-3’; 5’-TCGTCGG-3’; 5’-TCGTCGT-3’; 5’-TCGTCGU-3’; 5’-TCGTCGI-3’からなる。実施体によっては、ポリヌクレオチドIMCは配列5’-TCGUCGX1-3’、5’-UCGTCGX1-3’または5’-UCG UCG X1-3’(式中X1はヌクレオチドである)からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列からなる: 5’-TCGUCGA-3’; 5’-TCGUCGC-3’; 5’-TCGUCGG-3’; 5’-TCGUCGT-3’; 5’-TCGUCGU-3’; 5’-TCGUCGI-3’; 5’-UCGTCGA-3’; 5’-UCGTCGC-3’; 5’-UCGTCGG-3’; 5’-UCGTCGT-3’; 5’-UCGTCGU-3’; 5’-UCG TCG I-3’; 5’-UCGUCGA-3’; 5’-UCGUCGC-3’; 5’-UCGUCGG-3’; 5’-UCGUCGT-3’; 5’-UCGUCGU-3’; 5’-UCGUCGI-3’。
【００７５】
[0078]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-T mC GX1X2X3X4-3’または5’-U mC GX1X2X3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドであり、mCは本書で開示するような修飾シトシンである)で示される配列からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-X1T mC GX2X3X4-3’または5’-X1U mC GX2X3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-X1X2T mC GX3X4-3’または5’-X1X2U mC GX3X4-3’(式中X1、X2、X3、X4はヌクレオチドである)で示される配列からなる。
【００７６】
[0079]  実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-T mC GTCGX1-3’、5’-T mC GUCGX1-3’、5’-U mC GTCGX1-3’または5’-U mC GUCGX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)で示される配列からなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-TCGT mC GX1-3’、5’-UCGT mC GX1-3’ 、5’-TCGU mC GX1-3’または5’-UCGU mC GX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)で示される配列をからなる。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは式5’-T mC GT mC GX1-3’、5’-T mC GU mC GX1-3’、5’-U mC GT mC GX1-3’または5’-U mC GU mC GX1-3’(式中X1はヌクレオチドである)で示される配列からなる。本書で開示するように、修飾シトシン(mC)はシトシンのC-5および/またはC-6位に電子吸引基を付加したものを、たとえば5-ブロモシトシンなどのようなC-5ハロゲン化シトシンを非限定的に包含する。
【００７７】
[0080]  従って実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のうち任意の配列からなる(ただしBは5-ブロモシトシンである): 5’-TBGTTTT-3’; 5’-TBGAAAA-3’; 5’-TBGCCCC-3’; 5’-TBGGGGG-3’; 5’-TBGUUUU-3’; 5’-TBGIIII-3’; 5’-TBGTCGA-3’; 5’-TBGTCGC-3’; 5’-TBGTCGG-3’; 5’-TBGTCGT-3’; 5’-TBGTCGU-3’; 5’-TBGTCGI-3’; 5’-TCGTBGA-3’; 5’-TCGTBGC-3’; 5’-TCGTBGG-3’; 5’-TCGTBGT-3’; 5’-TCGTBGU-3’; 5’-TCGTBGI-3’; 5’-TBGTBGA-3’; 5’-TBGTBGC-3’; 5’-TBGTBGG-3’; 5’-TBGTBGT-3’; 5’-TBGTBGU-3’; 5’-TBGTBGI-3’。
【００７８】
[0081]  本書で開示するようにポリヌクレオチドIMCは6塩基(または塩基対)超の任意の長さである。従って実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のいずれかの(塩基または塩基対ベースの)おおよその長さを下回る: 10,000; 5,000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; 25; 20; 18; 16:14。実施態様によっては、ポリヌクレオチドIMCは次のいずれかの(塩基または塩基対ベースの)おおよその長さを上回る: 6; 7; 8; 10; 12; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000。あるいは、ポリヌクレオチドIMCは10000; 5000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; 25; 20; 18または16を上限とし、7; 8; 10; 12; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000または7500を下限とする任意の範囲(ただし下限<上限とする)のサイズとしてよい。
【００７９】
[0082]  IMCのポリヌクレオチド部分は技術上周知の修飾を含んでもよい。そうした修飾の非限定的な例は3’OHまたは5’OH基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖部分の修飾およびリン酸基の修飾である。以下、そうした多様な修飾について説明する。
[0083]  IMCのヌクレオチド部分に存在するシトシンはメチル化していないのが好ましいが、実施態様によってはIMCが1つまたは複数のメチル化シトシンを含んでもよい。実施態様によっては、ヌクレオチド部分の5’-CG-3’のシトシンはC-5位でメチル化していないのが好ましい。しかし、メチル化シトシンを含むIMCではN-4位でのメチル化が考えられる。
【００８０】
[0084]  IMCのヌクレオチド部分は一本鎖または二本鎖のDNA、RNAまたは他の修飾ポリヌクレオチドでもよい。IMCのヌクレオチド部分は1つまたは複数のパリンドローム領域を含んでも含まなくてもよいし、該領域は前述のモチーフ中に存在してもよいし、該モチーフを超えて延びてもよいし、また若干例について本書で開示する追加の隣接配列(flanking sequences)を含んでもよい。
【００８１】
[0085]  IMCのヌクレオチド部分は修飾非天然塩基を含んでもよいし、修飾体の糖、リン酸および/または末端を含んでもよい。たとえばリン酸修飾は非限定的な例としてホスホン酸メチル、ホスホロチオアート、ホスホルアミダート(架橋性または非架橋性)、ホスホトリエステルおよびホスホロジチオアートなどがあり、任意の組み合わせで使用してよい。たとえばTable 8に掲載のIMCを参照。他の非リン酸結合もまた使用してよい。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドはホスホロジエステルおよび/またはホスホロチオアート骨格を含む。技術上周知の糖修飾たとえば2’-アルコキシ-RNA類似体、2’-アミノRNA類似体、および2’-アルコキシまたはアミノ-RNA/DNAキメラや本書で開示する他の修飾を行い、任意のリン酸修飾と組み合せてもよい。塩基修飾の非限定的な例は、該ISSのシトシンC-5および/またはC-6への電子吸引基の付加(5-ブロモシトシン、5-クロロシトシン、5-フルオロシトシン、5-ヨードシトシンなど)である。たとえば国際公開第WO 99/62923号明細書を参照。
【００８２】
[0086]  IMCのヌクレオチド部分は、酵素法、化学法、およびより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解などを非限定的に含む技術上周知の手法と核酸合成装置を使用して合成してもよい。たとえばAusubel et al. (1987)およびSambrook et al. (1989)を参照。酵素的に集成するときは、個別ユニットのライゲーションに、たとえばT4 DNAまたはRNAリガーゼなどのリガーゼを使用することができる。米国特許第5,124,246号明細書。オリゴヌクレオチドの分解は、米国特許第4,650,675号明細書で例示されているように、オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼの接触により行うことができる。
【００８３】
[0087]  IMCのヌクレオチド部分は通常のポリヌクレオチド単離法で単離してもよい。そうした方法の非限定的な例は、プローブとゲノムまたはcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションによる共通ヌクレオチド配列の検出、発現ライブラリーの抗体スクリーニングによる共通構造特徴の検出およびPCR法による特定天然配列の合成などである。
【００８４】
[0088]  環状ポリヌクレオチドIMC部分は、単離、組換え法による合成または化学法による合成が可能である。環状ポリヌクレオチドIMC部分は、単離または組換え法で得られる場合には、プラスミドであるのが好ましいであろう。もっと小さい環状オリゴヌクレオチドの化学合成は文献記載の任意の方法で行うことができる。たとえばGao et al. (19959 Nucleic Acids Res. 23:2025-2029およびWang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照。
【００８５】
[0089]  オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドを合成する手法は技術上周知である。ホスホジエステル結合を含む天然DNAまたはRNAは一般に、固相支持体に3’末端を固定した鎖伸長用オリゴヌクレオチドの5’-ヒドロキシル基に適切なヌクレオシドホスホルアミダイトを順次連結させ、次いで中間体の亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルへと酸化させることにより合成する。所期のオリゴヌクレオチド配列が合成されたら、該オリゴヌクレオチドを支持体から分離し、リン酸トリエステル基をリン酸ジエステルへと脱保護し、またアンモニアまたは他塩基の水溶液を使用してヌクレオシド塩基を脱保護する。たとえばBeaucage (1993) “Oligo-deoxyribonucleotide Synthesis” [Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) (Humana Press, Totowa, NJ)所載]; Warner et al. (1984) DNA 3:401および米国特許第4,458,066号明細書を参照。
【００８６】
[0090]  IMCヌクレオチド部分はリン酸修飾ヌクレオチドを含んでもよい。修飾リン酸結合または非リン酸結合を含む核酸の合成も技術上周知である。概論として、Matteucci (1997) “Oligonucleotide Analogs: an Overview”[Oligonucleotide as Therapeutic Agents (D.J. Chadwick and G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY所載]を参照。本発明のオリゴヌクレオチド内の糖または糖類似体部分に結合させうるリン誘導体(または修飾リン酸基)の例は一リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホン酸アルキル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなどである。前記のリン酸類似体の合成、およびヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの組み込みはそれ自体技術上周知であり、本書で詳述するまでもない。Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; およびSchultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973を参照。たとえばホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化ステップを硫化ステップで置き換える点を除けば前記説明の天然オリゴヌクレオチドの合成とほぼ同じである。Zon (1993) “Oligonucleoside Phosphorothioates” [Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190所載]を参照。同様に、他のリン酸類似体たとえばホスホトリエステル[Miller et al. (1971) JACS 93:6657-6665]、非架橋性ホスホルアミダート[Jager et al. (1988) Biochem. 27-7247-7246]、N3’→P5’ホスホルアミダート[Nelson et al. (1997) JOC 62:7278-7287]およびホスホロジチオアート(米国特許第5,453,496号明細書)の合成についてもすでに開示されている。他の非リン系修飾オリゴヌクレオチドもまた使用可能である[Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141]。ホスホロチオアート骨格をもつオリゴヌクレオチドはホスホジエステル骨格のそれよりも免疫原性が強まりうるし、宿主への注射後の耐分解性もより大きいように見受けられる。Braun et al. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; およびLatimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064を参照。
【００８７】
[0091]  本発明の組成物に使用するヌクレオチド部分は(唯一のまたは主要な糖部分としてリボースを含む)リボヌクレオチドおよび/または(主要な糖部分としてデオキシシリボースを含む)デオキシリボヌクレオチドを含む場合があり、あるいはこのヌクレオチド部分に修飾糖または糖類似体を組み込むことができる。従って、糖部分はリボースとデオキシリボースに加えて、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソースおよび糖「類似体」シクロペンチル基でもよい。糖はピラノース型でもフラノース型でもよい。糖部分は好ましくはリボース、デオキシリボース、アラビノースまたは2’-0-アルキルリボースのフラノシドであり、また対応する複素環塩基にαまたはβアノマー配置で結合させることができる。糖修飾の非限定的な例は2’-アルコキシ-RNA類似体、2’-アミノ-RNA類似体、および2’-アルコキシまたはアミノ-RNA/DNAキメラなどである。これらの糖または糖類似体の合成およびそうした糖または類似体が複素環塩基(核酸塩基)と結合した形の対応する「ヌクレオシド」の合成はそれ自体公知であり、そうした合成が特定の実施例に関わる場合以外、本書で立ち入るまでもない。IMCのヌクレオチド部分の合成では糖修飾を行い、任意のリン酸修飾と組み合せてもよい。
【００８８】
[0092]  ヌクレオチド部分に組み込まれる複素環塩基すなわち核酸塩基は天然の主要プリンおよびピリミジン塩基(すなわち前述のウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン)でも、該主要塩基の天然型および合成型修飾体でもよい。
【００８９】
[0093]  多様な複素環塩基と多様な糖部分(および糖類似体)とを含む多数の「合成」非天然ヌクレオシドが技術的に得られること、および本発明の他の要件基準が満たされる限り、IMCのヌクレオチド部分が天然核酸の構成成分たる5つの主要塩基とは異なる複素環塩基を1個または数個含む場合もあることは、当業者には明らかであろう。しかし好ましくは、該ヌクレオチド部分の複素環塩基の非限定的な例はウラシル-5-イル、シトシン-5-イル、アデニン-7-イル、アデニン-8-イル、グアニン-7-イル、グアニン-8-イル、4-アミノピロロ[2.3-d]ピリミジン-5-イル、2-アミノ-4-オキソピロロ[2.3-d]ピリミジン-5-イル、または2-アミノ-4-オキソピロロ[2.3-d]ピリミジン-3-イル基であり、その場合、プリン塩基はISSの糖部分に9位で、ピリミジン塩基は1位で、ピロロピリミジン塩基は7位で、またピラゾロピリミジン塩基は1位で、それぞれ結合する。
【００９０】
[0094]  IMCのヌクレオチド部分は、共有の国際公開第WO 99/62923号明細書で開示のように、少なくとも1つの修飾塩基を含んでもよい。用語「修飾塩基」は本書では「塩基類似体」と同義であり、たとえば「修飾シトシン」は「シトシン類似体」と同義である。同様に「修飾」ヌクレオシドまたはヌクレオチドは本書ではヌクレオシドまたはヌクレオチド「類似体」と同義である。塩基修飾の非限定的な例は、ISSのシトシンのC-5および/またはC-6への電子吸引基の付加などであり、電子吸引基はハロゲンであるのが好ましい。修飾シトシンの非限定的な例はアザシトシン、5-ブロモシトシン、5-クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、5-フルオロシトシン、フルオロピリミジン、5,6-ジヒドロシトシン、5-ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、5-ニトロシトシン、5-ヒドロキシシトシンおよび任意の他ピリミジン類似体または修飾ピリミジンなどである。好ましい修飾ウラシルはC-5および/またはC-6での、好ましくはハロゲン修飾体であり、非限定的な例はブロモウラシル(5-ブロモウラシルなど)、クロロウラシル(5-クロロウラシルなど)、フルオロウラシル(5-フルオロウラシルなど)、ヨードウラシル(5-ヨードウラシル)およびヒドロキシである。Kandimalla et al., 2001, Bioorg. Med. Chem. 9: 807-13を参照。また、国際公開第WO 99/62923号明細書を参照。他の塩基修飾の例は塩基への1つまたは複数のチオール基の付加であり、6-チオ-グアニン、4-チオ-チミンおよび4-チオ-ウラシルなどが非限定的に含まれる。さらに、ヌクレオチド部分は任意のグアノシン残基の代りに7-デアザグアノシンなどのような修飾塩基を、または5’-CG-3’のシトシンを含めた任意のシトシン残基の代りに、N-4-エチルシトシンかN-4-メチルシトシンより選択される修飾シトシンを、含んでもよい。
【００９１】
[0095]  塩基修飾ヌクレオシドの合成、および該塩基修飾ヌクレオチドを前駆体として使用する修飾オリゴヌクレオチドの合成は、たとえば米国特許第4,910,300号、4,948,882号および5,093,232号明細書などですでに開示されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端または内部位置に化学合成によって組み込めるよう設計されている。そうした塩基修飾ヌクレオシドはオリゴヌクレオチドの末端または内部位置に存在すると、ペプチド(または他)抗原の結合部位として役立ちうる。糖修飾ヌクレオシドも(米国特許第4,849,513号、5,015,733号、5,118,800号、5,118,802号明細書などで)すでに開示されており、同様に使用することができる。
【００９２】
[0096]  実施態様によっては、IMCは、参照により本書に全体が組み込まれる共有の米国特許出願第10/176,883号および10/177,826号明細書(2002年6月21出願)で開示しているようなキメラ免疫調節化合物(CIC)である。
【００９３】
[0097]  CICは1つまたは複数の核酸部分と1つまたは複数の非核酸スペーサー部分とを含む。多様な構造のCICが後掲の式Ｉ〜VII で示されるようなコア構造を含めて、IMC用として見込まれる。式Ｉ〜III は「線状CIC」のコア配列を、式IV〜VIは「分岐CIC」のコア配列を、また式VII は「単一スペーサーCIC」のコア構造を示す。
【００９４】
[0098]  本書で示す各式では、Nは核酸部分(向きは5’→3’方向または3’→5’方向)を示し、Sは非核酸スペーサー部分を示す。ダッシュ(-)は核酸部分と非核酸スペーサーの間の共有結合を示す。ダブルダッシュ(--)は非核酸スペーサー部分と2以上の核酸部分の間の共有結合を示す。トリプルダッシュ(---)は非核酸スペーサー部分と多数(3以上)の核酸部分の共有結合を示す。添え字は核酸部分または非核酸スペーサー部分の位置の違いを示すために使用する。しかし、異なる核酸部分の識別を目的とした添え字の使用は、それらの部分が異なる構造をもつことを意味するとは限らない。同様に、異なるスペーサー部分の識別を目的とした添え字の使用は、それらの部分が異なる構造をもつことを意味するとは限らない。たとえば後掲式IIの核酸部分N1およびN2は構造が同じでも異なってもよいし、またスペーサー部分S1およびS2も構造が同じでも異なってもよい。さらに、コア構造の末端部には追加の化学構造部分(たとえばリン酸、モノヌクレオチド、追加の核酸部分、アルキルアミノ、チオまたはジスルフィド基または結合基、および/またはスペーサー部分)が共有結合することも考えられる。
【００９５】
[0099]  線状CICはコア構造中の非核酸スペーサー部分が2個までの核酸部分と共有結合している構造をもつ。例示的な線状CICは次の式に従う:
N1-S1-N2                (Ｉ)
N1-S1-N2-S2-N3          (II)
N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A    (III )
(式中Aは1〜100程度の整数であり、核酸部分に非核酸スペーサー部分を共有結合させて含む単位[Nv-Sv]がA回繰り返されることを示す。添え字のvは、NおよびSが[Nv-Sv]の繰り返しのたびに独立に選択されることを示す。Aはときに1〜10程度であり、ときに1〜3であり、ときには厳密に1、2、3、4または5である。実施態様によっては、Aは下限値を1、2、3、4または5とし上限値を10、20、50または100とする範囲(たとえば3〜10)内の整数である。)
【００９６】
[0100]  例示的な線状CICは次の構造を包含する:
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-OH                           (Ｉa)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-PO4                          (Ｉb)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG                          (Ｉc)
HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG                      (Ｉd)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA                  (Ｉe)
TCGTCGA-HEG-TCGTCGA-(HEG)4-TCGTCGA               (Ｉf)
(TCGTCGA)2-グリセロール-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA      (Ｉg)
PO4-TCGTCGA-HEG-TCGTCGA                          (Ｉh)
TCGTCGA-(HEG)15-T                                (Ｉi)
(TCGTCGA-HEG)2-グリセロール-HEG-TCGTCGA          (Ｉj)
TCGTCGA-HEG-T-HEG-T                              (Ｉk)
【００９７】
[0101]  好ましい線状CICは5’-TCGTCGA-3’-HEG-5’-ACGTTCG-3’-HEG-AGATGAT-3’、5’-TCGTCG-HEG-AACGTT-HEG-AGATGA-3’、および5’-TCGTCGA-C3-ACGTTCG-C3-AGATGAT-3’を包含する。
【００９８】
[0102]  分岐CICは多価スペーサー部分(Sp)を3以上の核酸部分に共有結合させて含む。例示的な分岐CICは次の式で示される:
[Nv]A---Sp                     (IV)
[Sv-Nv]A---Sp                  (Ｖ)
(S1-N1)-Sp--(Nv)A              (VI)
[式中Spは、独立に選択されるA個の核酸部分NvまたはSv-Nv(核酸部分にスペーサー部分を共有結合させて含む単位)に共有結合した多価スペーサー部分である。式IVおよびＶではAは3以上である。様々な実施態様では式IVおよびＶのAは3〜100の整数であるが、Aは下限値を約3、5、10、50または100とし、独立に選択される上限値を約5、7、10、50、100、150、200、250または500とする範囲の整数でもよい。式VIでは、Aは2以上であり、下限値を約2、5、10、50または100とし、独立に選択される上限値を約5、10、50、100、150、200、250、500または500超とする範囲の整数である。]
【００９９】
[0103]  例示的な分岐CICは次の構造を包含する:
(TCGTCGA)2-グリセロール-TCGTCGA                                    (IVa)
(TCGTCGA-HEG)2-グリセロール-TCGTCGA                                (IVb)
(TCGTCGA-HEG-TCGTCGA)2-グリセロール-TCGTCGA                        (IVc)
[(TCGTCGA)2-グリセロール-TCGTCGA]2-グリセロール-TCGTCGA            (IVd)
【０１００】
[0104]  好ましい分岐CICは(5’-TCGACGT-3’-HEG)2-グリセロール-HEG-5’-TCGACGT-3’および(5’-TCGTCGA-3’-HEG)2-グリセロール-HEG-5’-AACGTTC-3’を包含する。
【０１０１】
[0105]  単一スペーサーCICは単一核酸部分を単一スペーサー部分に共有結合させた構造すなわち
N1- S1                 (VII )
を含む。
【０１０２】
[0106]  好ましい実施態様では、S1はたとえば後述のように、一般にエステル(ホスホジエステルまたはホスホロチオアートエステルなど)結合によって結び付いたもっと小さい単位(HEG、TEG、グリセロール、1’,2’-ジデオキシリボース、C2アルキル〜C12アルキルの基本単位など)を含むマルチマー構造をもつ。たとえば後掲の式VII aを参照。該マルチマーはヘテロマーでもホモマーでもよい。一実施態様では、該スペーサーはエステル(ホスホジエステルまたはホスホロチオアートエステルなど)結合によって結び付いたモノマー単位(HEG、TEG、グリセロール、1’,2’-ジデオキシリボース、C2アルキル〜C12アルキルのリンカーなど)のヘテロマーである。たとえば後掲式VII bを参照。
【０１０３】
[0107]  例示的な単一スペーサーCICは次の構造を包含する:
TCGTCGA-(HEG)15                                  (VII a)
TCGTCGA-HEG-プロピル-HEG-プロピル-HEG            (VII b)
【０１０４】
[0108]  実施態様によっては、CICの末端が(たとえば核酸部分-核酸部分; スペーサー部分-スペーサー部分; または核酸部分-スペーサー部分のように)共有結合し、結果的に環状構造となる。
【０１０５】
[0109]  本発明の免疫調節組成物の成分たるIMC用のCICは1つまたは複数の核酸部分を含む。用語「核酸部分」は本書では、ヌクレチオドのモノマー(モノヌクレオチド)またはポリマー(2以上の連続したヌクレオチドを含むポリマー)をいう。ヌクレオチドは本書では、(1)リン酸基にエステル結合している糖に結合したプリンまたはピリミジン塩基、または(2)該塩基および/または糖および/またはリン酸エステルがたとえば後述のような類似体に置き換わった類似体、を含む。2以上の核酸部分を含むCICでは、該核酸部分は同じでも異なってもよい。
【０１０６】
[0110]  免疫調節組成物の成分たるCICに使用される核酸部分は本書で開示の任意のポリヌクレオチドIMC配列を含んでよいし、さらには長さが6塩基対以下の配列でもよい。複数の核酸部分を含むCICでは、該核酸部分は長さが同じでも異なってもよい。長さが6ヌクレオチド以下の核酸は配列5’-CG-3’または随意に5’-TCG-3’または5’-ACG-3’を含むのが好ましいが、CICが複数の核酸部分を含むような実施態様では配列5’-CG-3’を含む必要があるのは1個の核酸部分だけでよい。
【０１０７】
[0111]  複数の核酸部分を含むCICでは、該核酸部分は同じでも異なってもよい。従って種々の実施態様では、免疫調節組成物の成分たるCICは(a)同じ配列の複数個の核酸部分、(b)一核酸部分の複数回の反復、または(c)複数の異なる核酸部分を含むと考えられる。さらに、単一核酸部分は複数のISSを、隣接して、重複して、または該核酸部分内の追加ヌクレオチド塩基によって隔てられて、含んでもよい。一実施態様では、核酸部分は1つまたは複数のパリンドローム領域を含む。一本鎖オリゴヌクレオチドの場合、用語「パリンドローム(の)」は、該オリゴヌクレオチドが相補配列と複合して二本鎖分子を形成するとしたらパリンドロームになると見られる配列を形容する。別の実施態様では、1つの核酸部分がCIC中の第2の核酸部分に対してパリンドロームまたは部分的パリンドロームの関係にある配列を含む。本発明の一実施態様では、CIC中の1つまたは複数の核酸部分の配列はパリンドロームではない。本発明の別の実施態様では、CIC中の1つまたは複数の核酸部分の配列は鎖長が5塩基以上、随意に7塩基以上のパリンドローム配列を含まない。
【０１０８】
[0112]  免疫組成物の成分としてのCICは核酸部分に共有結合した1つまたは複数の非核酸スペーサー部分を含む。非核酸スペーサー部分は本書では便宜上、単に「スペーサー」または「スペーサー部分」と呼ぶことがある。スペーサーは一般に分子量が約50〜約50,000、通常約75〜約5000、ほとんどの場合約75〜約500であり、多様な実施態様では1個、2個、3個の、または4個以上の核酸部分に共有結合している。核酸部分の連結には多様な物質が好適である。たとえば学術文献で「非核酸リンカー」、「非ヌクレオチド・リンカー」または「原子価プラットホーム分子(valency platform molecules)」などと呼ばれている多様な化合物をCICのスペーサーとして使用してもよい。実施態様によっては、スペーサーは複数の共有結合基本単位を含むし、またホモポリマーまたはヘテロポリマー構造をもってもよい。当然ながら、非核酸スペーサーの定義にはモノヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは包含されない。これらを排除しなければ、核酸部分と隣接非核酸スペーサー部分は違いがなくなってしまう。
【０１０９】
[0113]  実施態様によっては、スペーサーは1つまたは複数の塩基欠失ヌクレオチド(すなわちヌクレオチド塩基を欠くが、糖とリン酸部分は残しているヌクレオチド)を含んでもよい。塩基欠失ヌクレオチドの例は1’,2’-ジデオキシリボース、1’-デオキシリボース、1’-デオキシアラビノース、およびそれらのポリマーなどである。
【０１１０】
[0114]  他の好適なスペーサーは随意置換アルキル、随意置換ポリグリコール、随意置換ポリアミン、随意置換ポリアルコール、随意置換ポリアミド、随意置換ポリエーテル、随意置換ポリイミン、随意置換ポリホスホジエステル[たとえばポリ(1-ホスホ-3-プロパノール)]などを含む。随意置換基の例はアルコール、アルコキシ(メトキシ、エトキシ、プロポキシなど)、直鎖または分岐鎖アルキル(C1-C12アルキルなど)、アミン、アミノアルキル(アミノC1-C12アルキルなど)、ホスホルアミダイト、リン酸、チオリン酸、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン(F、Cl、Br、Iなど)、アミド、アルキルアミド(アミドC1-C12アルキルなど)、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、ハロゲン化スルホニル、イミド酸エステル、イソシアン酸、イソチオシアン酸、ハロギ酸、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、ハロアセチル、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、NR1R2[式中R1R2は-C(=O)CH=CHC(=O)である](マレイミド)、チオエーテル、シアノ、糖(マンノース、ガラクトース、グルコースなど)、α,β-不飽和カルボニル、アルキル水銀、α,β-不飽和スルホンなどである。
【０１１１】
[0115]  好適なスペーサーは多環式分子たとえばフェニル環またはシクロヘキシル環を含む分子を含んでもよい。該スペーサーはポリエーテルたとえばポリホスホプロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、二官能性多環式分子たとえば二官能性ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、as-インダセン、s-インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナトリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、チアントレン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチインでも、それらの置換体または修飾体、またはポリエーテルと多環式分子の組合せでもよい。多環式分子はC1-C5アルキル、C6アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロゲンまたはハロアルキル基で置換または多置換してもよい。窒素を含む多複素環分子(インドリジンなど)は一般に好適なスペーサーではない。スペーサーはポリアルコールたとえばグリセロールまたはペンタエリトリトールなどでもよい。一実施態様では、スペーサーは(1-ホスホプロパン)3-リン酸または(1-ホスホプロパン)4-リン酸(それぞれテトラホスホプロパンジオール、ペンタホスホプロパンジオールともいう)を含む。一実施態様では、スペーサーは誘導体化2,2’-エチレンジオキシジエチルアミン(EDDA)を含む。
【０１１２】
[0116]  CICに有用な非核酸スペーサーの例として他に、Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991), 113:6324; Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. (1991), 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Research (1993), 21:2585; Ma et al., Biochemistry (1993), 32:1751; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides (1991), 10:287; Jaschke et al., Tetrahedron Lett. (1993), 34:301; Ono et al., Biochemistry (1991), 30:9914; および国際公開第WO 89/02439号(Arnold et al.)明細書(発明の名称「ヌクレオチド・プローブ用の非核酸連結剤」)で開示の「リンカー類」がある。
【０１１３】
[0117]  好適なスペーサーとしてほかに、Salunkhe et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114:8768; Nelson et al., Biochemistry 35:5339-5344 (1996); Bartley et al., Biochemistry 36:14502-511 (1997); Dagneaux et al., Nucleic Acids Research 24:4506-12 (1996); Durand et al., Nucleic Acids Research 18:6353-59 (1990); Reynolds et al., Nucleic Acids Research, 24:760-65 (1996); Hendry et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1219:405-12 (1994); Altmann et al., Nucleic Acids Research, 23:4827-35 (1995)で開示されているリンカー類がある。さらに、欧州特許第EP0313219B1号明細書(Arnold et al.) (発明の名称「ヌクレオチド・プローブ用の非核酸連結剤」)および米国特許第6,117,657号明細書(Usman et al.)で開示されているリンカー類がある。
【０１１４】
[0118]  非核酸スペーサー部分の例はオリゴエチレングリコール(たとえばトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールの各スペーサー、それに最大約10個、約20個、約40個、約50個、約100個または約200個のエチレングリコール単位を含む他ポリマー); アルキル・スペーサー(たとえばプロピル、ブチル、ヘキシル、および他のC2-C12アルキル・スペーサーたとえば通常はC2-C10アルキル特にC2-C6アルキル); 塩基欠失ヌクレオチドスペーサー; グリセロール、ペンタエリトリトールまたは1,3,5-トリヒドロキシシクロヘキサンから誘導した対称または非対称スペーサー(たとえば本書で開示している対称ダブラーおよびトレブラー・スペーサーなど)である。スペーサーはさらに、前記化合物の(たとえばアミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステル、ホスホロジチオアート、リン酸メチル等の連結剤で結合した)ヘテロ-またはホモ-オリゴマー/ポリマーを含んでもよい。
【０１１５】
[0119]  好適なスペーサー部分はCICに電荷および/または疎水性をもたらし、CICに有利な薬物動態特性(安定性の向上、血中滞留時間の延長など)をもたらし、および/または特定細胞または臓器へのCICの誘導を招くことができる。スペーサー部分を選定または修飾してCICを調製すれば、所期の薬物動態特性または所期の投与形態(たとえば経口投与)への適合を実現することができる。便宜上、スペーサー(またはスペーサー成分)を、該スペーサー成分の由来となっている化合物の化学名(たとえばヘキサエチレングリコール)で呼ぶこともあるが、CICが実際には該化合物と隣接核酸部分または他スペーサー部分成分との複合体を含むことは言うまでもない。
【０１１６】
[0120]  複数のスペーサー部分を含むCICでは、スペーサーは同じでも異なってもよい。たとえば一実施態様では、CIC中のすべての非核酸スペーサー部分が同じ構造をもつ。一実施態様では、CICは2以上、3以上、4以上、5以上または6以上の、またはもっと多くの異なる構造をもつ非核酸スペーサー部分を含む。
【０１１７】
[0121]  見込まれる本発明の実施態様によっては、ある種の構造はCICのスペーサー部分の定義から除外される。たとえば実施態様によっては、スペーサーは塩基欠失ヌクレオチドまたは塩基欠失ヌクレオチドのポリマー以外である。実施態様によっては、スペーサーはオリゴ(エチレングリコール)(HEG、TEGなど)またはポリ(エチレングリコール)以外である。実施態様によっては、スペーサーはC3アルキル以外である。実施態様によっては、スペーサーはアルキルまたは置換アルキル以外である。実施態様によっては、スペーサーはポリペプチド以外である。たとえば実施態様によっては、免疫原分子たとえばタンパク質またはペプチドはスペーサー部分の構成成分として不適当である。しかし後述のように、ある種の実施態様では、CICは「タンパク質性CIC」であり、スペーサー部分にポリペプチド(すなわちアミノ酸のオリゴマーまたはポリマー)を含むものと見込まれる。たとえば実施態様によっては(後述)、ポリペプチド抗原をプラットホーム(多価スペーサー)として使用し、それに複数の核酸部分を結合させることができる。しかし実施態様によっては、スペーサー部分はタンパク質性ではない、および/または抗原ではない(すなわちスペーサー部分はCICから単離された状態では、抗原ではない)。
【０１１８】
[0122]  好適なスペーサー部分はそれを構成成分として含むCICを水溶液(たとえばpH7.0のPBS)中で不溶性にしない。従ってマイクロキャリアーまたはナノキャリアーはスペーサーの定義から除外される。さらに、溶解度が低いスペーサー部分たとえばドデシル・スペーサー(二価アルコール前駆体の1,12-ジヒドロキシドデカンとして測定して溶解度<5mg/ml)は、CICの親水性および活性を低下させかねないので好ましくない。スペーサー部分の溶解度は、たとえば二価アルコールとして測定して5mg/mlを大幅に上回る(たとえば約20mg/ml以上、約50mg/ml以上または約100mg/ml以上である)のが好ましい。
【０１１９】
[0123]  CICに電荷をもたらすものは、核酸部分のリン酸基、チオリン酸基または他の基であり、また非核酸スペーサー部分の基であろう。実施態様によっては、非核酸スペーサー部分は正味の電荷(たとえばpH 7で測定した場合の正味の正電荷または正味の負電荷)をもつ。有用な一実施態様では、CICは正味の負電荷をもつ。実施態様によっては、CIC中のスペーサー部分の負電荷を、本書で開示するスペーサー基本単位を誘導体化しその電荷を増大させることにより増大させる。たとえばグリセロールを2つの核酸部分に共有結合させて、残りのアルコールを活性化ホスホルアミダイトと反応させ、次いで酸化または硫化によりリン酸またはチオリン酸をそれぞれ形成させることができる。実施態様によっては、CIC中の非核酸スペーサー部分に負う負電荷(すなわち複数のスペーサーが存在する場合の電荷の合計)はCIC中の核酸部分に負う負電荷よりも大きい。電荷は分子式を基に計算することが、またはたとえばキャピラリー電気泳動法によって実験的に求めることができる(Li, ed., 1992, Capillary Electrophoresis, Principles, Practice and Application, pp. 202-206, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands)。
【０１２０】
[0124]  前述のように、好適なスペーサーは、一般に非ヌクレオチド「リンカー」と呼ばれる化合物を含めた、それ自体スペーサーとして有用であり本書で開示しているようなより小さな非核酸(たとえば非ヌクレオチド)化合物からなるポリマーでもよい。そうしたポリマー(すなわちマルチユニットスペーサー)はヘテロマーでもホモマーでよいし、またエステル(たとえばホスホジエステルまたはホスホロチオアートエステル)結合で結び付いたモノマー単位(たとえばHEG、TEG、グリセロール、1’,2’-ジデオキシリボースなど)をしばしば含む。たとえば一実施態様では、スペーサーは非ヌクレオチド単位(たとえば2〜約100単位、または2〜約50単位たとえば2〜約5単位、または約5〜約50単位たとえば約5〜約20単位)のポリマー(たとえばヘテロマー)構造を含む。
【０１２１】
[0125]  マルチユニットスペーサーを含むCICにはたとえば
5’-TCGTCG-(C3)15-T
5’-TCGTCG-(グリセロール)15-T
5’-TCGTCG-(TEG)8-T
5’-TCGTCG-(HEG)4-T
があるが、式中(C3)15はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた15個のプロピルリンカーを意味し、(glycerol)15はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた15個のグリセロールリンカーを意味し、(TEG)8はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた8個のトリエチレングリコールリンカーを意味し、また(HEG)4はホスホロチオアートエステルを介して結び付いた4個のヘキサエチレングリコールリンカーを意味する。言うまでもなく、ある種のマルチユニットスペーサーは正味の負電荷をもつが、その負電荷はたとえばエステル結合したモノマー単位の数を増すことによって増大させることができる。
【０１２２】
[0126]  ある種の実施態様では、スペーサー部分は多価非核酸スペーサー部分(すなわち「多価スペーサー」)である。この場合、CICに含まれる多価スペーサーは3以上の核酸部分に結合している。多価スペーサーはときに「プラットホーム」分子とも呼ばれる。多価スペーサーは高分子でも非高分子でもよい。好適な分子の例は、グリセロールまたは置換グリセロール(2-ヒドロキシメチルグリセロール、レブリニルグリセロールなど)、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、1,3,5-トリヒドロキシシクロヘキサン、ペンタエリトリトールおよびペンタエリトリトール誘導体、テトラアミノペンタエリトリトール、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン(Cyclen)、ポリエチレンイミン、1,3-ジアミノ-2-プロパノールおよび置換誘導体、[プロピルオキシメチル]エチル化合物(たとえば「トレブラー」)、ポリエチレングリコール誘導体たとえばいわゆる“Star PEG”および“bPEG”(たとえばGnanou et al., 1988, Makromol. Chem. 189:2885; Rein et al., 1993, Acta Polymer 44:225; Merrill et al.米国特許第5,171,264号明細書; Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL)、およびデンドリマーなどである。
【０１２３】
[0127]  デンドリマーは技術上周知であり、化学的に規定された球状形態の分子であって、一般に分岐構造を得るために多価モノマーの段階的または反復的反応により合成される(たとえばTomalia et al., 1990, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:138-75を参照)。たとえばアミンを末端部に導入したポリアミドアミン、ポリエチレンイミンおよびポリプロピレンイミンのデンドリマーなど、多様なデンドリマーが知られている。本発明に有用なデンドリマーの例は米国特許第4,587,329号、第5,338,532号および第6,177,414号の各明細書で開示されている「高密度星形」高分子または「星形」高分子などであり、いわゆる「ポリ(アミドアミン)(PAMAM)デンドリマー」を含む。本発明の範囲内での使用に適したさらに他のマルチマー型スペーサー分子は米国特許第5,52,391号明細書やPCT出願PCT/US/00/15968号(WO 00/75105号として公開)、PCT/US96/09976号(WO 96/ 40197号として公開)、PCT/US97/10075号(WO 97/46251号として公開)、PCT/US94/10031号(WO 95/07073号として公開)およびPCT/  US99/29339号(WO 00/34231号として公開)の各明細書で開示されているような、化学的に規定された、非高分子原子価プラットホーム分子である。他にも多数の好適な原子価スペーサーが使用可能であり、当業者の知るところとなろう。
【０１２４】
[0128]  プラットホーム分子への核酸部分の結合にはいくつもの方法が可能であり、一般に1つまたは複数の架橋剤および核酸部分上の官能基とプラットホーム分子とが関与する。プラットホームへの結合基の付加には標準化学合成手法を使用する。核酸部分への結合基の付加も標準合成手法で行うことができる。
【０１２５】
[0129]  様々な原子価をもつ多価スペーサーは本発明の実施に有用であり、多様な実施態様ではCICの多価スペーサーを約3〜約400の核酸部分に、ときに3〜100ときに3〜50しばしば3〜10の、またときに401つまたは複数の核酸部分に結合させる。多様な実施態様では多価スペーサーを11以上、26以上、51以上、101以上または501つまたは複数の(同じでも異なってもよい)核酸部分に結合させる。言うまでもなく、CICが多価スペーサーを含むある種の実施態様では、本発明は分子構造がやや異なる一群のCICを提供する。たとえば高原子価のデンドリマー、多糖または他の多価スペーサーを使用してCICを合成すると、多価スペーサー部分に結合した核酸部分の数が(確定可能な範囲内で、またはほぼその範囲内で)異なる、やや不均一な分子混合物が産生される。
【０１２６】
[0130]  核酸部分への結合を可能にするよう誘導体化した多糖はCICに多価スペーサーとして使用することができる。好適な多糖は天然多糖(デキストランなど)でも合成多糖(フィコールなど)でもよい。たとえばアミノエチルカルボキシメチル-フィコール(AECM-Ficoll)はInman, 1975, J. Imm. 114:705-709の方法により調製し、次いでAECM-Ficollをヘテロ二官能性架橋試薬たとえば6-マレイミドカプロン酸アシルN-ヒドロキシスクシンイミド=エステルなどと反応させ、次いでチオール誘導体化核酸部分へと結合することができる (Lee et al., 1980, Mol. Imm. 17:749-56を参照)。他の多糖も同様にして修飾してよい。
【０１２７】
[0131]  当業者は本明細書と技術的な知識を手引きとすれば、通常の方法を用いてCICを合成することが十分に可能である。核酸部分(たとえばオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチド)の合成手法は周知である。核酸部分は酵素合成、化学合成およびそれらの組み合わせなどを非限定的に含む手法により合成することができる。たとえばホスホジエステル結合を含むDNAまたはRNAは、好適なヌクレオシドホスホルアミダイトを、3’-末端で固相支持体に結合させた伸長用オリゴヌクレオチドの5’-OH基に順次結合させた後、中間体の亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルへと酸化させるという方法で化学合成することができる。DNA合成用の有用な固相支持体の例は細孔性ガラスビーズ(CPG) (Applied Biosystems, Foster City, CA)、ポリスチレンビーズ・マトリックスのPrimer Support (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ)およびTentGel(Rapp Polymere GmbH, Tubingen, Germany)などである。所期のオリゴヌクレオチド配列が合成されたら、該オリゴヌクレオチドを支持体から切り離し、リン酸トリエステル基を脱保護してリン酸ジエステルとし、またアンモニアまたは他塩基の水溶液を用いてヌクレオシド塩基を脱保護する。
【０１２８】
[0132]  ホスホジエステル結合を含むDNAまたはRNAポリヌクレオチド(核酸部分)は一般に、たとえば次のステップの繰り返しにより合成する: a) 3’-固相支持体結合ヌクレオシドまたは核酸の5’-ヒドロキシル基からの保護基の除去、b)該5’-ヒドロキシル基への活性化ヌクレオシドホスホルアミダイトの結合、c)亜リン酸トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化、およびd)未反応5’-ヒドロキシル基のキャッピング。ホスホロチオアート結合を含むDNAまたはRNAの合成も前記と同様にして、ただし酸化ステップを硫化ステップへと代えて、合成する。所期のオリゴヌクレオチド配列が合成されたら、該オリゴヌクレオチドを支持体から切り離し、リン酸トリエステル基を脱保護してリン酸ジエステルとし、またアンモニアまたは他塩基の水溶液を用いてヌクレオシド塩基を脱保護する。たとえばBeaucage (1993) “Oligodeoxyribonucleotide Synthesis” [Protocols for Oligonucleotide and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ所載]; Warner et al. (1984) DNA 3:401; Tang et al. (2000) Org. Process Res. Dev. 4:194-198; Wyrzykiewica et al. (1994) Bioorg. & Med. Chem. Lett. 4:1519-1522; Radhakrishna et al. (1989) J. Org. Chem. 55:4693-4699および米国特許第4,458,066号明細書を参照。指定配列の核酸部分を自動的に合成するプログラマブル合成機が種々使用可能である。たとえばExpedite 8909自動DNA合成機(Perseptive Biosystem, Framington, MA); ABI 394 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)およびOligoPilotII(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)などである。
【０１２９】
[0133]  ポリヌクレオチドは、たとえば酸不安定な5’-保護基と3’-ホスホルアミダイトとを含む塩基保護ヌクレオシド(モノマー)を使用して、3’→5’方向へと合成することができる。そうしたモノマーの例は5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-3’-O-(N,N-ジイソプロピルアミノ)2-シアノエチルホスホルアミダイトなどであり、また該保護ヌクレオシドの非限定的な例はN6-ベンゾイルアデノシン、N4-ベンゾイルシチジン、N2-イソブチリルグアノシン、チミジンおよびウリジンなどである。この場合、使用固相支持体は3’-結合した保護ヌクレオシドを含む。あるいは、ポリヌクレオチドは酸不安定な3’-保護基と5’-ホスホルアミダイトとを含む塩基保護ヌクレオシド(モノマー)を使用して、5’→3’方向へと合成することができる。そうしたモノマーの例は3’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-保護ヌクレオシド-5’-O-(N,N-ジイソプロピルアミノ)2-シアノエチルホスホルアミダイトなどであり、また該保護ヌクレオチドの非限定的な例はN6-ベンゾイルアデノシン、N4-ベンゾイルシチジン、N2-イソブチリルグアノシン、チミジンおよびウリジン(Glen Research, Sterling, VA)などである。この場合、使用固相支持体は5’-結合した保護ヌクレオシドを含む。環状の核酸構成成分は単離、組換え手法による合成、または化学合成が可能である。化学合成は文献記載の任意の方法で行なうことができる。たとえばGao et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029およびWang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照。
【０１３０】
[0134]  非核酸部分の付加は常法により行うことができる。特定スペーサー部分の付加方法は技術上周知であり、前掲文献などに記載されている。Durand et al., Nucleic Acids Research 18:6353-59 (1990) などを参照。スペーサー部分と核酸部分の共有結合は数あるうちの任意のタイプたとえばホスホジエステル、ホスホロチオアート、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホルアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオアート、リン酸メチル結合などとしてよい。スペーサー部分と核酸部分の結合には、該核酸部分の合成に使用したのと同じホスホルアミダイト法を使用するのがしばしば好都合であろう。本発明のCICはたとえば自動DNA合成機(たとえばExpedite 8909; Perseptive Biosystems, Framington, MA)によりホスホルアミダイト法(たとえば前掲Beaucage, 1993および前掲Current Protocols in Nucleic Acid Chemistryを参照)を使用して幸便に合成することができる。しかし当業者には自明であろうが、もし望むなら、自動DNA合成機の場合と同じ(または同等の)合成ステップを手作業で行ってもよい。その種の合成では、一般にスペーサー(またはマルチマー・スペーサーの場合にはスペーサー基本単位)の一方の末端は4,4’-ジメトキシトリチル基で保護され、他方の末端はホスホルアミダイト基を含む。
【０１３１】
[0135]  必要な保護基と反応性基とを備えた多様なスペーサーが市販されている。その例は次のとおりである:
トリエチレングリコール・スペーサーまたはTEGスペーサー:  9-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)トリエチレングリコール-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, VA);
ヘキサエチレングリコール・スペーサーまたはHEGスペーサー:  18-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサエチレングリコール-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
【０１３２】
プロピル・スペーサー:  3-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
ブチル・スペーサー:  4-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ブチルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Chem Genes Corporation, Ashland Technology Center, 200 Homer Ave, Ashland, MA);
ヘキシル・スペーサー:  6-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ヘキシルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト];
2-(ヒドロキシメチル)エチル・スペーサーまたはHMEスペーサー: 1-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)-3-(レブリニルオキシ)-プロピルオキシ-2-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト]; 別名「非対称分岐」スペーサー (Chem Genes Corporation, Ashland, MA);
【０１３３】
塩基欠失ヌクレオチド・スペーサーまたは塩基欠失スペーサー: 5-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-1,2-ジデオキシリボース-3-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
対称分岐スペーサーまたはグリセロール・スペーサー: 1,3-O,O-ビス(4,4’-ジメトキシトリチル)グリセロール-2-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Chem Genes, Ashland, MA);
トレブラー・スペーサー: 2,2,2-O,O,O-トリス[3-O-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
対称ダブラー・スペーサー: 1,3-O,O-ビス[5-O-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル-2-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA);
ドデシル・スペーサー: 12-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ドデシルオキシ-1-O-[(2-シアノエチル)N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト] (Glen Research, Sterling, VA)。
【０１３４】
[0136]  これらや、他のきわめて多様な(たとえばDMTおよびホスホルアミダイト基保護基を含む)保護スペーサー部分前駆体は購入することもできるし、本書で開示するCICの合成に向いた通常の方法を用いて合成することもできる。合成機を使用する場合には、メーカーの説明書に従って、ヌクレオチド・モノマーとスペーサーを所期の順序で付加するように合成機をプログラムする。
【０１３５】
[0137]  ホスホルアミダイト法の使用はある種のCICの合成には好都合であるが、言うまでもなく本発明のCICは特定の合成または製造方法によって合成される化合物に限らない。
【０１３６】
[0138]  一実施態様では、2種類以上の核酸部分に結合させた多価スペーサーをもつCICを合成する。たとえば(チオール基を含む多糖に対して反応性の)2個のマレイミド基と(アミノ基を含む核酸に対して反応性の)2個の活性化エステル基とを含むプラットホームがすでに開示されている(国際公開第WO 95/07073号として公開されたPCT/US94/10031号明細書などを参照)。これら2つの活性化基は互いに独立に反応させることができる。この場合は各配列につき2個、合計4個の核酸部分を含むCICが合成されよう。
【０１３７】
[0139]  2種類の核酸配列を含む多価スペーサーを備えたCICは、前述の対称分岐スペーサーと慣用のホスホルアミダイト法により(たとえば手作業式または自動式で)合成することもできる。この対称分岐スペーサーはホスホルアミダイト基と2個の(同じであり、同時に除去される)保護基とを含む。たとえば1つのアプローチでは、第1の核酸を合成し対称分岐スペーサーに結合させ、該スペーサーから保護基を除去する。次いで2個の(同じ配列の)追加核酸を該スペーサー上で(単一核酸の合成に使用した量の2倍量の試薬を各ステップで使用して)合成する。
【０１３８】
[0140]  同様の方法を用いて3種類の核酸部分(以下、核酸Ｉ、II、III と呼ぶ)を多価プラットホーム(非対称分岐スペーサーなど)に結合することもできる。これは自動DNA合成機を使用して行うのが最も好都合である。一実施態様では、非対称分岐スペーサーはホスホルアミダイト基と同時除去が可能な2個の直交保護基とを含む。まず、核酸Ｉを合成し、次いで非対称分岐スペーサーを核酸Ｉに結合し、次いで一方の保護基を選択的に除去した後、核酸IIを付加する。核酸IIを脱保護し、キャップし、次いでスペーサー上の他方の保護基を除去する。最後に核酸III を合成する。
【０１３９】
[0141]  実施態様によっては、核酸部分を合成し、標準合成化学手法を用いて反応性結合基(アミノ、カルボキシラート、チオ、ジスルフィドなど)を付加する。反応性結合基(これは得られるスペーサー部分の一部分をなすと考えられる)は追加の非核酸化合物に結合させてスペーサー部分とする。結合基は核酸に、標準核酸合成法で公知または市販の多様な試薬を用いて、付加する。たとえば、保護アミノ基、カルボキシラート基、チオール基またはジスルフィド基とホスホルアミダイト基とを含む試薬である。これらの化合物は、ひとたび活性化ホスホルアミダイト基を介して核酸に結合され、次いで脱保護を受けると、核酸にアミノ、カルボキシラートまたはチオールの反応性を付与する。
【０１４０】
[0142]  可変長の親水性リンカーはたとえば核酸部分とプラットホーム分子の結合に有用である。種々の好適なリンカーが知られている。好適なリンカーの非限定的な例はエチレングリコールの線状オリゴマーまたはポリマーなどである。その種のリンカーは、式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2 (式中n=0〜200、m=1または2、R1=Hまたは保護基たとえばトリチル、R2=Hまたはアルキルまたはアリールたとえば4-ニトロフェニルエステル)で示されるリンカーを包含する。これらのリンカーは、チオエーテル基を介してチオール反応性基たとえばハロアセイルやマレイミドなどを含む分子を、アミド結合を介してアミノ基を含む第2分子に、結合する際に有用である。この結合順序は変えることができる。すなわちチオエーテル結合の形成はアミド結合の形成の前でも後でもよい。有用なリンカーとしては他にSulfo-SMCC (4-[N-マレイミドメチル]-シクロヘキサン-1-カルボン酸スルホスクシンイミジル)(Pierce Chemical Co. 商品番号22322); Sulfo-EMCS (N-[ε-マレイミドカプロイルオキシ]スルホスクシンイミドエステル)(Pierce Chemical Co. 商品番号22307); Sulfo-GMBS(N-[γ-マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドエステル)(Pierce Chemical Co. 商品番号22324; (Pierce Chemical Company, Rockford, IL)、および一般式をマレイミド-R-C(O)NHSエステル(式中Rはアルキル、環式アルキル、エチレングリコールポリマーなどである)とする類似化合物がある。
【０１４１】
[0143]  核酸部分を多価スペーサーに共有結合させる特に有用な方法は前掲参考文献に記載されている。
【０１４２】
[0144]  実施態様によっては、タンパク質抗原または抗原断片などのポリペプチドを、複数の核酸部分を直接またはリンカーを介して共有結合させるための多価スペーサー部分として使用し、「タンパク質性CIC」を形成する。ポリペプチドはそれに対して適応免疫反応が求められる抗原または免疫原、もしくは担体(アルブミンなど)でもよい。一般にタンパク質性CICは少なくとも1つの、通常は数個または多数の、核酸部分を含むが、該核酸部分は(a)鎖長が2〜7、よりしばしば4〜7ヌクレオチドであり、あるいは2〜6、2〜5、4〜6、または4〜5ヌクレオチドである、および/または(b)低単独免疫調節活性をもつ、または単独免疫調節活性をもたない。タンパク質性CICの合成方法は本発明の開示に触れた当業者には自明であろう。たとえばポリペプチド・スペーサー部分への核酸の共有結合には、技術上周知の方法たとえば核酸部分の3’または5’末端(または核酸部分の内部位置にある好適な修飾塩基)と好適な反応性基(たとえばシトシン残基のN4アミノ基と直接反応することができるN-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を備えたポリペプチドとの間の結合などを用いることができる。別の例として、ポリペプチドは核酸部分の遊離5’末端に、該核酸部分に予め導入しておいたアミン、チオールまたはカルボキシル基を介して結合することができる。あるいは本書で開示している要領でポリペプチドをスペーサー部分に結合してもよい。さらに、保護アミン、チオールまたはカルボキシル基を一端に含み、それに加えたホスホルアミダイト基をも含む結合基を、ポリヌクレオチドのヒドロキシル基に共有結合させ、脱保護後に、該官能基を使用してCICをペプチドに共有結合させることもできる。
【０１４３】
[0145]  配列5’-CG-3’を含むヌクレオチド部分をもつ免疫調節化合物およびCICは公知であり、また共有の米国暫定出願第60/299,883号および第60/373,253号明細書でも開示されている。免疫調節活性をもつ。これらや他のIMCの免疫調節活性は、免疫反応の様々な側面たとえばサイトカイン分泌、抗体産生、NK細胞活性化およびT細胞増殖などを指示する標準検定法を使用して容易に確認することができる。たとえば次の文献を参照: 国際公開WO 97/28259号、WO 98/16247号およびWO 99/11275号の各明細書; Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549; Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-4076; Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-1845; Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158: 3635-3639; Sato et al. (1996) Science 273:352-354; Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423; Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816; Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156: 4570-4575; Roman et al. (1997); およびLipford et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:2340-2344。これらの方法は本発明の免疫調節組成物の免疫調節活性の評価にも同様に用いることができる。
【０１４４】
[0146]  実施態様によっては、IMCは、同じIMCを含む本発明の免疫調節組成物と比較してin vitro、in vivoおよび/またはex vivo測定すると、無活性である(単独免疫調節活性をもたない)か、または低活性である(低単独免疫調節活性をもつ)。当業者には自明であろうが、単独免疫調節活性の測定は濃度に依存するであろうから、特定濃度で「単独免疫調節活性をもたない」との結果が出たIMCでも、もっと高濃度で測定すると、実際に単独免疫調節活性を示すこともある。
【０１４５】
[0147]  IMCは、同じIMCを含む本発明の免疫調節組成物と、同じIMC投与濃度で比較したときに、試験IMCのほうが低活性ならば、「低免疫調節活性」をもつという。好ましくは、試験IMCの単独免疫調節活性は該免疫調節組成物の約50%以下、より好ましくは約20%以下、最も好ましくは約10%以下、また実施態様によってはもっと低水準である。
【０１４６】
[0148]  IMCの「単独免疫調節活性」は所定IMC濃度で単離IMCの免疫調節活性を測定し、本発明の免疫調節組成物の成分として(単離IMCと同じ濃度で)投与したIMCの免疫調節活性を測定し、両者の免疫調節活性値を比較して求める。免疫調節活性を求めるには、本書で述べたような免疫反応の多様な側面を指示する標準検定法を用いる。たとえば本書で開示のヒトPBMC検定法を用いてもよい。ヒトPBMC検定法を用いるときは、両化合物の活性を比較するのが普通であるが、その場合は両化合物を同じ条件下に(たとえば同じ細胞を使用して)、通常は約20μg/mlの濃度で、並行検定する。濃度は一般に260nmでの吸光度を測定し、0.5 OD260/ml= 20μg/mlの換算式を使用して求める。この方法は試験試料中の全核酸の量を標準化する。あるいは、技術上周知の他の方法で濃度または重量を求めてもよい。検定はドナーによるバラツキへの対策として、複数のドナーで行うのが普通である。IMCが「単独免疫調節活性」をもたないのは、IMCに接触させたPBMCのIFN-γ分泌量が試験化合物の不存在下での、または不活性対照化合物[たとえば5’-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’(SEQ ID NO:26)]の存在下でのPBMCによる分泌量を有意に上回らない(たとえば約2倍未満の)場合である。
【０１４７】
安定剤
[0149]  本発明の組成物および方法に有用である安定剤の例は、水中懸濁性であり、かつ水の表面張力を低下させるような物質であるが、水溶性および/または水完全混和性の安定剤が好ましい。本発明の組成物および方法にはタンパク質(好ましくは親水性タンパク質)、ノニオン性洗剤、高分子界面活性剤(ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなど)、カチオン性洗剤、アニオン性洗剤および脂肪酸などを含む多種類の安定剤が有用である。ただし、実施態様によっては、安定化剤の定義から血清タンパク質(特にウシ血清タンパク質)、脂肪酸および/またはイオン性洗剤を除外することもある。
【０１４８】
[0150]  任意のタンパク質が本発明用の安定化剤として使用可能である。実施態様によっては、安定化剤は抗原としての使用を意図していないタンパク質(後述)であり、そうした実施態様では該タンパク質は組成物の所期受容者と同じ種に由来するのが好ましい(たとえば組成物が人間への使用を意図したものなら、安定剤として使用するタンパク質はヒト・タンパク質であるのが好ましい)。血清アルブミンはそうした実施態様で安定剤として有用なタンパク質の例である。他の実施態様では抗原を安定剤として利用するが、その場合には該抗原は所期受容者と同じ種に由来する必要がないし、一般に同じ種に由来しないほうが好ましい。本発明の組成物および方法に有用である抗原について後述する。
【０１４９】
[0151]  本発明の組成物および方法に有用であるノニオン性洗剤の例はグルカミド類たとえばデシルジメチルホスフィン酸化物(APO-10)およびジメチルドデシルホスフィン酸化物(APO-12)、オクタノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-8)、ノナノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-9)およびデカノイル-N-メチルグルカミド(MEGA-10)、ポリオキシエチレンエーテル洗剤たとえばポリオキシエチレン(10)ドデシルエーテル(Genapol C100)、ポリオキシエチレン(4)ラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30]、ポリオキシエチレン(9)ラウリルエーテル[LUBROL(登録商標)PX]、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)35]、ポリオキシエチレン(2)セチルエーテル[BRIJ(登録商標)52]、ポリオキシエチレン(10)セチルエーテル[BRIJ(登録商標)56]、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル[BRIJ(登録商標)58]、ポリオキシエチレン(2)ステアリルエーテル[BRIJ(登録商標)72]、ポリオキシエチレン(10)ステアリルエーテル[BRIJ(登録商標)76]、ポリオキシエチレン(20)ステアリルエーテル[BRIJ(登録商標)78]、ポリオキシエチレン(100)ステアリルエーテル[BRIJ(登録商標)700]、ポリオキシエチレン(2)オレイルエーテル[BRIJ(登録商標)92]、ポリオキシエチレン(10)オレイルエーテル[BRIJ(登録商標)97]、ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル[BRIJ(登録商標)98]、イソトリデシルポリ(エチレングリコールエーテル)8(Genapol 80)、PLURONIC(登録商標)F-68、PLURONIC(登録商標)F-127、ドデシルポリ(エチレングリコールエーテル)9 (Thesit)ポリオキシエチレン(10)イソオクチルフェニルエーテル[TRRITON(登録商標)X-100]、ポリオキシエチレン(8)イソオクチルフェニルエーテル[TRRITON(登録商標)X-114]、モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン[Tween(登録商標) 20]、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン[Tween(登録商標)40]、モノステアリン酸ポリエチグリコールレンソルビタン[Tween(登録商標)60]、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン[Tween(登録商標)65]、モノオレイン酸ポリエチレングリコールソルビタン[Tween(登録商標)80]、トリオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン[Tween(登録商標)85]、ポロキサマー188、およびポリエチレングリコール-p-イソオクチルフェニル=エーテル(Nonidet NP40)、アルキルマルトシド洗剤たとえばシクロヘキシル-n-エチル-β-D-マルトシド、シクロヘキシル-n-ヘキシル-β-D-マルトシドおよびシクロヘキシル-n-メチル-β-D-マルトシド、n-デカノイルスクロース、グルコピラノシド類たとえばメチル 6-O-(N-ヘプチルカルバモイル)-a-D-グルコピラノシド(HECAMEG)およびアルキルグルコピラノシド類たとえばn-デシル-β-D-グルコピラノシド、n-ヘプチル-β-D-グルコピラノシド、n-ドデシル-β-D-グルコピラノシド、n-ノニル-β-D-グルコピラノシド、n-オクチル-α-D-グルコピラノシドおよびn-オクチル-β-D-グルコピラノシド、アルキルチオグルコピラノシド類たとえばn-ヘプチル-β-D-チオグルコピラノシド、アルキルマルトピラノシド類たとえばn-デシル-β-D-マルトピラノシドおよびn-オクチル-β-D-マルトピラノシド、n-デシル-β-D-チオマルトシド、ジギトニン、n-ドデカノイルスクロース、n-ドデシル-β-D-マルトシド、ヘプタン1,2,3-トリオール、n-オクタノイル-α-D-グルコシルアミン(NOGA)、n-オクタノイルスクロース、ポロキサマー類(ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレン・ブロックコポリマー)たとえばポロキサマー188お��びポロキサマー407、スルホベタイン類たとえばSB-10、SB-12およびSB-14、それにn-ウンデシル-β-D-マルトシドである。好ましい安定剤はポリオキシエチレンエーテル洗剤特にモノオレイン酸ポリエチレングリコールソルビタンおよびトリオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタンである。
【０１５０】
[0152]  本発明の組成物および方法に有用であるアニオン性洗剤の例はカプリル酸とその塩、ケノデオキシコール酸とその塩、コール酸とその塩、デカンスルホン酸とその塩、デオキシコール酸とその塩、グリコデオキシコール酸とその塩、ラウロイルサルコシンとその塩、硫酸n-ドデシルとその塩(ナトリウム塩とリチウム塩を含む)、タウロケノデオキシコール酸とその塩、タウロコール酸とその塩、タウロデヒドロコール酸とその塩、タウロデオキシコール酸とその塩、およびタウロウルソデオキシコール酸とその塩である。
【０１５１】
[0153]  カチオン性洗剤の例はセチルピリジニウムとその塩、セチルトリメチルアンモニアとその塩[臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)を含む]、ドデシルトリメチルアンモニアとその塩(臭化ドデシルトリメチルアンモニウムを含む)、アルキルアンモニウムイミダゾリン、4級イミダゾリン、およびテトラデシルトリメチルアンモニアとその塩(臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムを含む)である。
【０１５２】
[0154]  安定剤としての使用を目的に選択される洗剤は水/油乳化洗剤と考えられるものが好ましい。水/油乳化洗剤は技術上周知であり、一般に8〜18程度のHLB(親水性/疎水性バランス)値を特徴とする。粒子状組成物に混合する洗剤はHLB値が好ましくは10〜16程度、より好ましくは11〜15程度である[たとえばモノオレイン酸ポリエチレングリコールソルビタン、HLB=15.4; ポリオキシエチレン(10)イソオクチルフェニルエーテル、HLB=13.5; トリオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、HLB=11]。
【０１５３】
脂肪酸
[0155]  実施態様によっては、本発明の組成物は1つまたは複数の脂肪酸またはその塩を追加成分として含んでもよい。脂肪酸を安定剤として使用し、また脂肪酸を追加成分としても使用する実施態様では、安定剤としての脂肪酸は「追加」成分としての脂肪酸とは異なろう。本発明組成物に有用である脂肪酸はサイズが炭素原子数4〜30の範囲でよいし、また不飽和型(ステアリン酸など)、モノ不飽和型(オレイン酸など)またはポリ不飽和型(リノール酸など)のいずれでもよいが、一般にはモノ不飽和およびポリ不飽和脂肪酸が好ましい。
【０１５４】
[0156]  実施態様によっては、本発明の組成物は炭素原子数が4、5、6、8、10、14、18または20以上、約30、25、20、19、15または10以下の炭素鎖長の脂肪酸を含む。従って、実施態様によっては本発明に使用する脂肪酸は炭素原子数で表した炭素鎖長が約4〜30、5〜25、10〜20または15〜20であろう。
【０１５５】
[0157]  本発明組成物に有用である脂肪酸の非限定的な例はアラキドン酸、デカン酸、ドコサン酸、ドコサヘキサン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ヘプタデカン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ラウリン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、ノナデカン酸、ノナン酸、オクタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペンタデカン酸、ステアリン酸、テトラコサン酸、トリコサン酸、トリデカン酸およびウンデカン酸である。本発明組成物用の好ましい脂肪酸はオレイン酸、パルミトレイン酸およびリノール酸などである。
【０１５６】
抗原
[0158]  実施態様によっては、抗原を免疫調節組成物の成分とするか、または免疫調節組成物と併用投与する。抗原を成分として含む免疫調節組成物は該抗原を粒子状組成物自体に混和してもよいし、粒子状組成物を懸濁させる溶液中に溶解または懸濁させてもよい。任意の抗原を本発明の免疫調節組成物の調製に、または該組成物とのとの併用投与に、使用してよい。
【０１５７】
[0159]  実施態様によっては、抗原はアレルゲンである。表1は組換えアレルゲンの例である。多数のアレルゲンエキスが技術上周知であり、非限定的な例は雑草類(ブタクサ等)花粉アレルゲンAntigen E (Amb a I) [Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:1229-1236); 草本類(イネ科)アレルゲンLol p1 [Tamborini et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249:886-894]; 主要チリダニ・アレルゲンDer pIおよびDer pII[Chua et al. (1998) J. Exp. Med. 167:175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129]; 家ネコ・アレルゲンFel d I [Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30:559-568]; シラカバ花粉Bet v1 [Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8:1935-1938); スギ花粉アレルゲンCry j 1およびCry j 2 [Kingetsu et al. (2000) Immunology 99:625-629]; および他の樹木花粉由来タンパク質抗原[Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31] などの調製品である。前述のように、樹木由来のアレルゲンはシラカバ、セイヨウネズ、スギの花粉を含めて周知である。in vivo投与向けの草本類花粉由来タンパク質抗原のエキスもすでに報告されている。
【０１５８】
[0160]  実施態様によっては、アレルゲンは食物アレルゲンである。その非限定的な例は落花生アレルゲンたとえばAra h 1 [Stanley et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409:213-216]; クルミ・アレルゲンたとえばJug r I [Tueber et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101: 807-814]; ブラジルナッツ・アレルゲンたとえばアルブミン[Pastorello et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102: 1021-1027]; 小エビ・アレルゲンたとえばPen a I [Reese et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:240-242]; 卵アレルゲンたとえばオボムコイド[Crooke et al. (1997) J. Immunol. 159:2026-2032]; 牛乳アレルゲンたとえばウシβ-ラクトグロビン[Selot et al. (1999) Clin. Exp. Allergy 29:1055-1063]; 魚アレルゲンたとえばパルブアルブミン[Van Do et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:619-625; Galland et al. (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706:63-71] などである。実施態様によっては、アレルゲンはラテックス・アレルゲンであり、その非限定的な例はHev b 7 [Sowka et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255:213-219]などである。表1は使用可能アレルゲンの一覧である。
【０１５９】
【表１】
2006505523.tif 000002
【０１６０】
【表２】
2006505523.tif 000003
【０１６１】
【表３】
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【０１６２】
【表４】
2006505523.tif 000005
【０１６３】
[0161]  実施態様によっては、抗原は原虫、細菌、菌類(単細胞性および多細胞性)およびウイルスなどの感染性病原体に由来する。好適なウイルス抗原の例は本書で開示するし、技術上周知でもある。細菌の例はHemophilus Influenza、Mycobacterium tuberculosisおよびBordetella pertussisなどである。感染性病原体原虫の例は、マラリア原虫、Leishmania属、Trypanosoma属およびSchistosoma属などである。菌類の例はCandida albicansなどである。
【０１６４】
[0162]  実施態様によっては、抗原はウイルス抗原である。ウイルス性ポリペプチド抗原の非限定的な例はHIVタンパク質たとえばHIV gagタンパク質[非限定的な例は膜接着性の基質タンパク質(MA)、コアキャプシド(CA)タンパク質、およびヌクレオキャプシド(NC)タンパク質など]、HIVポリメラーゼ、インフルエンザウイルスの基質(M)タンパク質およびヌクレオキャプシド(NC)タンパク質、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎DNAポリメラーゼ、C型肝炎抗原などである。インフルエンザ・ワクチン接種を論じた文献としてはScherle and Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450; Scherle and Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128; Granoff et al. (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71:3391-3396; Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen et al. (1999) Vaccine 17:653-659; Govorkova and Smirnov (1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257; Koide et al. (1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura et al. (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8:595-599などがある。抗原ポリペプチドの例としては他に、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピロマウイルス、RSウイルスおよびポックスウイルスなどを非限定的に含む多数の感染性病原体に関して知られている群-または亜群-特異抗原がある。
【０１６５】
[0163]  多数の抗原ペプチドおよびタンパク質が技術上周知であり、また入手も可能である。常法により同定しうるものもある。腫瘍形成に対する免疫または既存腫瘍の治療に用いる免疫調節ペプチドの例には腫瘍細胞(生細胞または照射細胞)、腫瘍細胞抽出物、または腫瘍抗原[たとえばHer-2/neu、Mart1、がん胎児性抗原(CEA)、ガングリオシド、人乳脂肪球(HMFG)、ムチン(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前立腺特異抗原(PSA)およびチロシナーゼ]のサブユニットを含めることができる。ISSと併用投与される精子タンパク質を含めれば、生殖免疫に基づく避妊ワクチンを形成することができる。Lea et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta. 1307:263。
【０１６６】
[0164]  弱毒化または不活化ウイルスは本発明への抗原としての使用に適する。そうしたウイルスの調製品は技術上周知であり、市販品も多い[たとえばPhysician’s Desk Reference (1998) 52nd edition, Medical Economics Company, Inc.を参照]。たとえばポリオウイルスはIPOL(登録商標; Pasteur Merieux Connaught)およびORIMUNE(登録商標; Lederle Laboratories)として、A型肝炎ウイルスはVAQTA(登録商標; Merck)として、はしかウイルスはATTENUVAX(登録商標; Merck)として、流行性耳下腺炎ウイルスはMUMPSVAX(登録商標; Merck)として、また風疹ウイルスはMERUVA(登録商標; Merck)IIとして、それぞれ市販されている。さらに、HIV-1、HIV-2、単純ヘルペスウイルス、B型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒトおよび非ヒト・パピロマウイルス、およびスロー脳ウイルス(slow brain viruses)などの弱毒化および不活化ウイルスはペプチド抗原をもたらすことができる。
【０１６７】
[0165]  実施態様によっては、抗原はワクシニア、アデノウイルスおよびカナリアポックスなどのウイルスベクターを含む。
【０１６８】
[0166]  抗原は技術上周知の精製手法を用いて単離してもよいし、より好都合には組換え手法を用いて産生させてもよい。
【０１６９】
[0167]  抗原ペプチドの例は精製天然ペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗製ペプチド抽出物、弱毒化または不活化ウイルス、細胞、微生物、またはそれらの断片などである。免疫調節ペプチドは天然物でも、化学または酵素合成物でもよい。技術上周知の任意の化学合成法が好適である。液相ペプチド合成は中サイズのペプチドの合成に用いることができる。ペプチドの化学合成には固相法を用いてもよい。Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833-839. タンパク質分解酵素を用いて、アミノ酸を結合しペプチドとしてもよい。Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. あるいは、細胞の生化学機構を利用して、または生物資源からの単離によって、ペプチドを得ることもできる。組換えDNA手法を用いてペプチドを産生させてもよい。Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press. ペプチドはアフィニティークロマトグラフィーなどの標準手法を用いて単離することもできる。
【０１７０】
[0168]  抗原はペプチド、脂質(たとえばコレステロールを除くステロール類、脂肪酸およびリン脂質など)、H. Influenzaワクチンに使用されるような多糖類、ガングリオシド、リポタンパク質および糖タンパク質などであるのが好ましい。これらは技術上周知の方法、たとえば化学的、酵素的合成および抽出などで得ることができる。多数のステロール、脂肪酸およびリン脂質などのように、分子の抗原部分が市販されていることもある。
【０１７１】
[0169]  本発明の組成物および該組成物を使用する方法に有用なウイルス抗原の非限定的な例はHIV抗原であり、その非限定的な例はHIV外被の糖タンパク質に由来する抗原たとえばgp160、gp120およびgp41などである。HIV遺伝子および抗原に対応する多数の配列が知られている。たとえばロスアラモス国立研究所のHIV Sequence DatabaseはHIV関連のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を収集、管理、ラベル付けしている。このデータベースはインターネットで閲覧することができるし(http://hiv-web.lanl.gov/)、年次刊行物ともなっている。Human Retroviruses and AIDS Compendium (たとえば2000年版)を参照。
【０１７２】
[0170]  感染性病原体に由来する抗原は技術上周知の方法により、たとえば天然ウイルスまたは細菌抽出物から、感染性病原体に感染した細胞から、精製ポリペプチドから、組換え手法で産生させたポリペプチドからおよび/または合成ペプチドから得られる。
【０１７３】
[0171]  実施態様によっては、抗原をIMCに結合する。この結合はIMCの3’または5’末端で、またはIMCの内部位置で好適な修飾塩基に対して、行うことができる。たとえば抗原ペプチドが好適な反応性基(たとえばN-ヒドロキシスクシンイミド=エステル)を含む場合には、シトシン残基のN4アミノ基と直接反応させることができる。IMC中のシトシン残基の数と位置に応じて、1つまたは複数の残基上で特異的標識を実現することができる。
【０１７４】
[0172]  あるいは、修飾オリゴヌクレオチドたとえば技術上周知のものをIMCのいずれかの末端に、または中間位置に組み込むこともできる。これらのオリゴヌクレオチドはブロック官能基を含むことができるが、該官能基はブロックを解除されると、着目する抗原に存在しうるまたは結合させうる多様な官能基に対して反応性になる。
【０１７５】
[0173]  抗原は固相支持体法により、IMCの3’末端に結合させることができる。たとえばがIMCは、予め支持体上で合成しておいたポリペプチド部分に付加することができる。Haralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:493-499; およびHaralambidis et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:501-505. あるいは、3’末端から伸長する切断可能なリンカーを介して固相支持体に結合させるようにIMCを合成することもできる。IMCを支持体から化学的に切断すると、IMCの3’末端に末端チオール基が残るか(Zuckermann et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:5305-5321; Corey et al., 1987, Science 238: 1401-1403)、または末端アミノ基が残る(Nelson et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:1781-94)。ペプチドのアミノ基へのアミノ基修飾IMCの結合はBenoit et al., Neuromethods (1987) 6:43-72に記載の要領で行うことができる。ペプチドのカルボキシル基へのチオール基修飾IMCの結合はSinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Pressに記載の要領で行うことができる。
【０１７６】
[0174]  抗原はIMCの5’末端に、IMCの合成時に予め組み込んでおいたアミン、チオールまたはカルボキシル基を介して付加することができる。IMCを固相支持体に固定した状態で、一端に保護アミン、チオールまたはカルボキシルを、他端にホスホルアミダイトを含む結合基を、5’末端ヒドロキシル基に共有結合させるのが好ましい[Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10283-10299; および米国特許第4,849,513号、5,015,733号、5,118,800号および5,118,802号の各明細書]。該潜在アミン、チオールまたはカルボキシル官能基は脱保護後、ペプチドへのIMCの結合に使用できる[前掲Benoit et al (1987)およびSinah et al. (1991)]。
【０１７７】
[0175]  ペプチド抗原はIMC中の任意の位置の修飾シトシンまたはウラシルに結合させることができる。修飾塩基のC-5位にアミンまたはカルボキシル基などのような潜在官能基をもつ「リンカーアーム」の組込みは、ペプチド結合のための手がかりをもたらす(Ruth, 4th Annual Congress for Recombinant DNA Research, p.123)。
【０１７８】
[0176]  ペプチドへのIMCの結合はビオチン-ストレプトアビジン複合体などのように高アフィニティーの、非共有結合的な相互作用を介して実現することができる。ビオチニル基はたとえばオリゴヌクレオチドの修飾塩基に結合させることができる[Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651]。ストレプトアビジン部分をペプチド部分に組み込むと、ストレプトアビジン結合ペプチドとビオチン化IMCの非共有結合型複合体の形成が可能になる。
【０１７９】
[0177]  脂質へのIMCの結合は標準方法で形成することができる。その非限定的な例はオリゴヌクレオチド-リン脂質複合体 [Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192]、オリゴヌクレオチド-脂肪酸複合体[Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156: 220-222]、およびオリゴヌクレオチド-ステロール複合体[Boujrad et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5728-31]の合成などである。
【０１８０】
[0178]  オリゴ糖へのIMCの結合は周知の標準方法で形成することができる。その非限定的な例はオリゴヌクレオチド-オリゴ糖複合体の合成などであり、該オリゴ糖は免疫グロブリンの一部分である[O’Shannessy et al. J. Applied Biochem. (1985)7:347-55]。
【０１８１】
[0179]  オリゴ糖へのIMCの結合は周知の標準方法で形成することができる。その非限定的な例はオリゴヌクレオチド-オリゴ糖複合体の合成などであり、該オリゴ糖は免疫グロブリンの一部分である[O’Shannessy et al. J. Applied Biochem. (1985)7:347-55]。
【０１８２】
[0180]  IMC/抗原複合体にはアジュバントやサイトカインもまた、遺伝子工学的または化学的に結合させることができる。この種の融合ペプチドは技術上周知であり、またCzerkinsky et al., Infect. Immun., 57:1072-77 (1989); Nashar et al., Vaccine, 11: 235-40 (1993); Dertzbaugh and Elson, Infect. Immun., 61:48-55 (1993)に記載されている。
【０１８３】
[0181]  抗原への環状IMCの結合にはいくつかの方法がある。環状IMCを組換え法または化学法で合成する場合には、IMCに修飾ヌクレオシドを組み込んでもよい[Ruth, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach (1991) IRL Press]。後は標準結合技術により環状IMCを抗原または免疫調節ペプチドに結合することができる(Goodchild, 1990, Bioconjugate Chem. 1:165)。環状IMCを単離するか、または組換え法または化学法で合成する場合には、該結合は、抗原または免疫調節ペプチドに予め組み込んでおいた反応性基(たとえばカルベン、遊離基)を化学的または光学的に活性化することによって形成させることができる。
【０１８４】
[0182]  ペプチドまたは他分子をIMCに結合する方法はC. Kessler, “Nonradioactive labeling methods for nucleic acids” [Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press  (1992)所載]; およびGeoghegan and Stroh, Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992)などでも開示されている。
【０１８５】
[0183]  他の実施態様では、IMCと抗原をプラットホーム分子への結合により近接的に会合させる。該プラットホームはタンパク質性でも非タンパク質性(すなわちポリマーやデンドリマーなどのような有機分子)でもよい。タンパク質性プラットホームの非限定的な例はアルブミン、ガンマグロブリン、免疫グロブリン(IgG)およびオボアルブミンである。Borel et al. (1990) Immunol. Methods 126:159-168; Dumas et al. (1995) Arch. Dematol. Res. 287: 123-128; Borel et al. (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:264-267; Borel et al. (1996) Ann. N.Y. Acad. Sci. 778:80-87. プラットホームはIMCと抗原の両方の結合を許容するための多価分子であり(すなわち複数の結合部位をもち)、また多数の結合部位をもつのが好ましい場合もあろう。他の高分子プラットホームの例はデキストラン、ポリアクリルアミド、フィコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、およびポリ-D-グルタミン酸/D-リシンである。
【０１８６】
[0184]  プラットホーム分子使用の原理は技術上周知である。一般にプラットホームはIMCと抗原を結合させるための然るべき部位を有するか、または有するように誘導体化してある。加えて、または代替的に、IMCおよび/または抗原を誘導体化して然るべき結合基となるようにする。たとえば簡単なプラットホームはペプチドなどのような二官能性の(すなわち2つの結合部位をもつ)リンカーである。
【０１８７】
[0185]  好ましいプラットホーム分子は生物学的に安定であり、すなわち治療効果を及ぼすためのin vivo排出半減期がしばしば数時間、数日、数か月であり、また成分組成の判明している合成一本鎖からなるのが好ましい。該分子は一般に、分子量が約200〜約200,000好ましくは約200〜約50,000(またはもっと小さく、たとえば30,000)である。原子価プラットホーム分子の例は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ-D-リシン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、D-グルタミン酸+D-リシン(存在比3:2)などの高分子であるか、またはそうした高分子からなる。好ましい高分子は分子量約200〜約8,000のPEG系である。使用してもよい他の分子はアルブミンやIgGである。
【０１８８】
[0186]  本発明範囲内の使用に適した他の好ましいプラットホーム分子は、米国特許第5,552,391号明細書で開示されている化学的に規定された、非高分子の原子価プラットホーム分子である。本発明範囲内の使用に適した特に好ましい、均質な化学的に規定された原子価プラットホーム分子は、誘導体化2,2’-エチレンジオキシジエチルアミン(EDDA)およびトリエチレングリコール(TEG)である。追加の好適な原子価プラットホーム分子の非限定的な例はテトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリトリトール、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)、1,4,7,11-テトラアザシクロドデカン(Cyclen)である。
【０１８９】
[0187]  一般に、これらのプラットホームは標準化学合成手法で合成する。PEGは標準手法により誘導体化して多価にしなければならない。複合体の合成に適した物質たとえばPEG、アルブミン、IgGなどには市販品もある。
【０１９０】
[0188]  プラットホーム分子へのIMCと抗原の結合には無数の方法があり、一般には1つまたは複数の架橋剤と抗原およびIMCプラットホーム(プラットホーム分子)上の官能基を使用する。プラットホーム、IMCおよび抗原は適切な結合基をもたなければならない。プラットホームへの結合基の付加は標準化学合成法で行う。ポリペプチド抗原とIMCへの結合基の付加には固相合成法か組換え法を使用する。組換え法では翻訳後修飾によるリンカーの結合が必要となるかもしれないが、そうした方法は技術上周知である。
【０１９１】
[0189]  たとえばアミノ、カルボキシルまたはスルフヒドリル基などの官能基をもつアミノ酸側鎖を含むポリペプチドでは、それらの官能基がポリペプチドをプラットホームに結合するための部位として役立つ。そうした官能基をまだ含んでいないポリペプチドには、そうした官能基をもつ残基を付加すればよい。そうした残基の組み込みには、いずれも技術上周知のペプチド合成法である固相合成法または組換え法を用いればよい。ポリペプチドが糖側鎖をもつときは(または抗原が糖鎖である場合には)、アミノ、スルフヒドリルおよび/またはアルデヒド官能基を慣用の化学反応で該ポリペプチドに組み込めばよい。たとえば第1級アミノ基は水素化シアノホウ素ナトリウム存在下のエチレンジアミンの反応により組み込むことができるし、スルフヒドリル基はシステアミン二塩酸塩の反応に次いで標準ジスルヒド還元剤による還元で導入することができるし、またアルデヒド基は過ヨウ素酸酸化で生成させることができる。同様にして、プラットホーム分子についても然るべき官能基をまだもってない場合に、誘導体化により官能基を導入することができる。
【０１９２】
[0190]  IMCと抗原のプラットホーム分子への結合には可変長の親水性リンカーが有用である。好適なリンカーの例はエチレングリコールの線状オリゴマーまたはポリマーなどである。その種のリンカーは、式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2 (式中n=0〜200、m=1または2、R1=Hまたは保護基たとえばトリチル、R2=Hまたはアルキルまたはアリールたとえば4-ニトロフェニルエステル)で示されるリンカーを包含する。チオエーテル基を介してチオール反応性基たとえばハロアセイルやマレイミドなどを含む分子を、アミド結合を介してアミノ基を含む第2分子に結合するには、これらのリンカーが有用である。これらのリンカーは結合順序が自在であるため、チオエーテル結合の形成はアミド結合の形成の前でも後でもよい。
【０１９３】
組成物の製造方法
[0191]  周知のように、DNAはポリカチオン性分子と複合して、一般に沈殿またはきわめて大きな分子を形成する。本発明者は、組成物の製造方法によって粒径をコントロールし、以って組成物の免疫調節能を左右しうることを見出した。これは粒径約0.1〜0.2μmの粒子が最適の免疫調節活性を示すためである。従って、本発明はまた、本発明組成物の製造方法を、さらには該方法によって製造される組成物を提供する。
【０１９４】
[0192]  周知のように、DNAはポリカチオン性分子と複合して、一般に沈殿またはきわめて大きな分子を形成する。本発明者は、組成物の製造方法によって粒径をコントロールし、以って組成物の免疫調節能を左右しうることを見出した。これは粒径約0.1〜0.2μmの粒子が最適の免疫調節活性を示すためである。従って、本発明はまた、本発明組成物の製造方法を、さらには該方法によって製造される組成物を提供する。
【０１９５】
[0193]  本発明組成物は疎水性成分を含んでもよいが、該組成物は水相で製造するのが好ましい。水相は純水でもよいが、塩、pH緩衝液等(一括して「賦形剤」)でもよい1つの溶質を含む水溶液であるのがこのましい。本発明組成物は一般に製薬への使用を意図しているため、該組成物の製造に使用する賦形剤は製薬上許容しうる賦形剤でもよい。しかし、製薬上許容しえない賦形剤の使用による該組成物の製造も見込まれる。製薬上許容しえない賦形剤を使用して組成物を製造するときは、組成物を(ろ過等の簡便な手法により)処理して製薬上許容し得ない賦形剤を除去または置換するのが好ましい。
【０１９６】
[0194]  本発明組成物の製造方法は、ミキサー、遠心分離機、ポンプおよび他の液体および/またはスラリー処理機などを含む技術上周知の常用加工装置を使用して行ってもよい。本発明組成物は滅菌条件下で製造するか、または製造後に(滅菌ろ過などにより)滅菌するのが好ましい。
【０１９７】
[0195]  一般に、該免疫調節組成物は少なくとも1つのIMC、少なくとも1つの安定剤および少なくとも1つのカチオン性縮合剤を合わせて製造する。IMCを含む水溶液を、1つまたは複数の安定剤(使用安定剤の物性次第で、その水溶液かまたは純粋の安定剤)と、また1つまたは複数のカチオン性縮合剤と合わせるのが好ましい。粒子状組成物を製造するには、組成物成分の混合後の追加処理は一切不要と考えられる。しかし、IMC/安定剤/カチオン性縮合剤を最長48時間、特に約12、18または24時間、静置するのが好ましい。
【０１９８】
[0196]  実施態様によっては、IMCをまず1つまたは複数のカチオン性縮合剤と合わせる。IMCを含む水溶液を1つまたは複数のカチオン性縮合剤(使用カチオン性縮合剤の物性次第で、その水溶液かまたは純粋のカチオン性縮合剤)と合わせるのが好ましい。IMCとカチオン性縮合剤を合わせた後は、インキュベーション時間は一切不要と考えられるが、混合物を前以て調製し、必要となるときまで保存してもよい。
【０１９９】
[0197]  1つまたは複数の安定剤をIMCとカチオン性縮合剤の混合物に加えて、粒子を形成させる。組成物の形成にはさらなる処理は一切不要と考えられる。しかし、IMC/安定剤/カチオン性縮合剤を最長48時間、特に約12、18または24時間、静置するのが好ましい。
【０２００】
[0198]  実施態様によっては、IMCをまず1つまたは複数の安定剤と合わせる。IMCを含む水溶液を1つまたは複数の安定剤(使用安定剤の物性次第で、その水溶液かまたは純粋の安定剤)と合わせるのが好ましい。IMCと安定剤を合わせた後は、インキュベーション時間は一切不要と考えられるが、混合物を前以て調製し、必要となるときまで保存してもよい。
【０２０１】
[0199]  カチオン性縮合剤をIMCと安定剤の混合物に加えて、粒子を形成させる。本発明者は、IMC/安定剤混合物をカチオン性縮合剤と合わせると本発明組成物が自然に形成されることを見出した。従って組成物の形成にはさらなる処理は一切不要と考えられるが、IMC/安定剤/カチオン性縮合剤を最長48時間、特に約12、18または24時間、静置するのが好ましい。
【０２０２】
[0200]  追加成分として脂肪酸を含む組成物の製造では、脂肪酸は含OMC溶液に(単独で、または安定剤と混ぜて)、IMC/安定剤混合物に、またはカチオン性縮合剤の添加と同時に(または安定剤との混合物として)、加えてもよい。
【０２０３】
[0201]  抗原を成分として含む組成物では、該抗原は製造工程のどの段階で加えてもよい。たとえば抗原は初期OMC/安定剤混合物の成分であっても、またはカチオン性縮合剤の前に、それと同時に、または後に加えてもよい。抗原をカチオン性縮合剤の後に加えるときは、該抗原は粒子の精製またはサイズ分画の前後いずれに加えてよい。
【０２０４】
[0202]  IMC/安定剤混合物をカチオン性縮合剤と混合すると通常、ある粒径範囲の粒子(「バルク生成物」)が生産される結果となる。大径粒子は免疫調節用としてはあまり好ましくないし、安定性も劣るので、バルク生成物をさらに処理して所期粒径範囲外の粒子は除去するのが好ましい。このサイズ分画には薄膜ろ過、ゲルろ過、遠心分離、さらには単なる沈降など多様な方法がある。サイズ分画に使用する的確な手法およびパラメーターはバルク生成物の生産に使用する賦形剤、所期粒径範囲、およびユーザーの選好に依存しよう。
【０２０５】
[0203]  前述のように、本発明の方法に使用するための最適粒径は約0.1〜0.2μmである。従って、粒子状組成物のサイズ分画により大きな粒子を除去して好ましい粒子状組成物を回収するのが好ましい。大きな粒子の除去には、重力沈降、遠心分離、ろ過などを含む任意慣用の方法がある。本発明者は、バルク生成物の単なる沈降処理(大きな粒子を重力の働きで沈降させるだけの処理)を15時間行うと粒径2μm未満の粒子状組成物が得られることを見出した。これは、粒径が15時間一定に留まると仮定すると、常用Beckman JA 12 Rotorによる1000 rpmでの10分間の遠心分離にほぼ相当しよう。孔径2.7μmのフィルターによるろ過でも、バルク生成物からの大径粒子の除去という点では満足な結果が得られる。生産工程を滅菌条件下に滅菌資材を使用して行ってこなかった場合には、組成物を生産工程のこの段階で、たとえば滅菌ろ過によって、滅菌するのが好ましい。
【０２０６】
[0204]  粒子状組成物の水性懸濁液はほとんどの適用疾患に好適であると見込まれる(製薬への使用が見込まれる場合は滅菌)。生産工程を製薬上許容しうる滅菌水溶液中で行ってこなかった場合には、この段階で組成物の賦形剤構成を変更して製薬上許容しえない賦形剤は除去するするのが好ましい。許容外の賦形剤は慣用の方法たとえば膜分離精製、ゲル透過クロマトグラフィーによる緩衝液交換などで除去または置換してもよい。サイズ分画法が許容するならば、サイズ分画と緩衝液交換を(たとえばサイズ分画と緩衝液交換が同時に実現されるような条件下でゲル透過クロマトグラフィーを行うことにより)単一プロセスに統合するのが好都合であろう。
【０２０７】
[0205]  本発明組成物はまた、たとえば粒子状組成物の(賦形剤を含むまたは含まない)水性懸濁液を凍結乾燥させることにより、ドライパウダー製剤とするようにしてもよい。好ましくは1つまたは複数の増量剤を組成物に添加および/または溶解し、それを凍結乾燥させてドライパウダー状の組成物とする。許容しうる増量剤の非限定的な例は、糖質たとえば単糖(デキストロース、リボース、フルクトースなど)、アルコール糖(マンニトール、イノシトール、キシリトールなど)、二糖(トレハロース、スクロース、ラクトースなど)、天然高分子[でんぷん、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、タンパク質(ゼラチンや血清アルブミンなど)およびグリコーゲンなど]、それに合成モノマーおよびポリマーである。スクロースは例示的な増量剤であり、一般に5〜15%(v/v)の濃度で使用する。その例示的な使用濃度は10%である。
【０２０８】
[0206]  組成物を水性懸濁液として使用するなら、次に粒子生成物を好ましくは滅菌条件下で包装する。厳密な包装形態は所期の用途や流通経路、それにメーカーおよび/ユーザーの選好に応じて異なろう。注射剤として投与するなら、粒子生成物をバイアル、アンプルまたは該生成物の取出し機構を備えた軟質パックに計量分配する。吸入投与するなら、ネブライザー用のバイアル、アンプル等に計量分配してもよいし、また携帯用吸入療法具たとえばAERx(登録商標)吸入器(Aradigm Corp.)などに使用するための使い捨てパッケージ/ノズルとして包装してもよい。あるいは組成物を経皮または表皮投与器具用の好適なパッケージへと計量分配してもよい。また、組成物を追加の賦形剤または担体たとえば透過性改善化合物、ローション、軟膏などと混合してから包装してもよい。
【０２０９】
治療方法
[0207]  本発明は、個体好ましくは哺乳動物、より好ましくは人間の免疫反応を調節する方法であって、該個体に本発明組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明組成物は免疫反応を調節するに足る量を投与する。本書で開示するように、免疫反応の調節は体液性および/または細胞性であり、また技術上周知の標準手法で、また本書で開示の要領で、測定する。
【０２１０】
[0208]  本発明は、個体好ましくは哺乳動物、より好ましくは人間の免疫反応を調節する方法であって、該個体に本発明組成物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明組成物は免疫反応を調節するに足る量を投与する。本書で開示するように、免疫反応の調節は体液性および/または細胞性であり、また技術上周知の標準手法で、また本書で開示の要領で、測定する。
【０２１１】
[0209]  多数の個体が本発明の免疫調節組成物の受容に適する。個体は人間であるのが好ましいが、そうである必要はない。
【０２１２】
[0210]  実施態様によっては、個体はTh2型免疫反応に関連する疾患たとえばアレルギーまたはアレルギー性喘息の患者である。本発明組成物の投与は免疫調節をもたらし、1つまたは複数のTh1型反応関連サイトカインのレベルを高めるが、それは結果的にアレルゲンに対する個体の反応に関連するTh2型反応機能を低下させる可能性がある。Th2型反応関連疾患をもつ個体の免疫調節は該疾患の1つまたは複数の症状を軽減または改善する結果となる。疾患がアレルギーまたはアレルギー性喘息である場合には、1つまたは複数の症状の改善には次のうち1つまたは複数の軽減が含まれる: 鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgE循環レベル、ヒスタミン循環レベルおよび/または「救急」吸入療法(計量式吸入器またはネブライザーによる吸入アルブテロール剤の投与)の必要性。
【０２１３】
[0211]  さらなる実施態様では、本発明の免疫調節療法が適用される個体はワクチン接種を受ける個体である。ワクチンは予防ワクチンでも治療ワクチンでもよい。予防ワクチンは、個体が危険にさらされている疾患に関連する1つまたは複数のエピトープ(たとえば結核予防ワクチンとしてのM. tuberculosis抗原)を含む。治療ワクチンは個体がかかっている特定疾患に関連する1つまたは複数のエピトープ[たとえば結核患者ではM. tuberculosisまたはM. bovis表面抗原、アレルギー患者ではその患者にとってのアレルギー抗原(すなわち脱感作療法)、がん患者に由来する腫瘍細胞(米国特許第5,484,596号明細書で開示されているものなど)、またはがん患者の腫瘍関連抗原]を含む。後の実施例5で示すように、本発明組成物の肝炎ウイルス抗原、B型肝炎表面抗原(HBsAg)との併用投与はマウスの抗HBsAg抗体力価をHBsAg単独投与の場合と比較して高める結果となった。
【０２１４】
[0212]  本発明組成物はワクチンと共に(たとえば同じ注射で、または同時個別注射で)投与してもよいし、切り離して(たとえばワクチン投与の少なくとも12時間前または後に)投与してもよい。実施態様によっては、ワクチン抗原はIMCとの共有または非共有結合により、または粒子状組成物との混合により、該組成物と一体化している。ワクチン投与を受ける個体に免疫調節組成物を投与すると、該ワクチンに対する免疫反応は、本発明組成物の不存在下にワクチンの投与を受ける個体と比較して、Th1型反応の側にシフトする結果となる。Th1型反応の側へのシフトはワクチンに含まれる抗原に対する遅延型過敏(DTH)反応、IFN-γおよび他のTh1型反応関連サイトカインの増加、ワクチン抗原に対して特異的なCTLの産生、ワクチン抗原に対して特異的なIgEレベルの低さまたは低下、ワクチン抗原に対して特異的なTh2関連抗体の減少、および/またはワクチン抗原に対して特異的なTh1関連抗体の増加などから判定されよう。治療ワクチンの場合には、本発明組成物とワクチンの投与は該ワクチンの適用疾患の1つまたは複数の症状の改善も招く。当業者には自明であろうが、厳密な症状や改善様式は適用疾患によって左右されよう。たとえば治療ワクチンが結核用である場合には、本発明組成物による治療にワクチンを併用することにより咳、胸膜・胸壁痛、発熱、および/または技術上周知の他症状が緩和される結果となる。ワクチンがアレルギー脱感作療法に使用されるアレルゲンである場合には、治療によりアレルギー症状が緩和する(たとえば鼻炎、アレルギー性結膜炎、IgE循環レベルおよび/またはヒスタミン循環レベルが緩和・低下する)結果となる。
【０２１５】
[0213]  本発明の他の実施態様は、がんまたは感染症などの現病をもつ個体の免疫調節療法に関連する。がんは免疫調節のターゲットとして興味をそそる。というのは、ほとんどのがんは体内の他細胞には見られないがん関連および/またはがん特異抗原を発現するからである。がん細胞に対するTh1型反応の刺激は免疫系によるがん細胞の直接および/またはバイスタンダー殺傷という結果を招き、がん細胞の減少や症状の緩和につながる。がん患者への本発明組成物の投与はがん細胞に対するTh1型免疫反応の刺激という結果を招く。そうした免疫反応は細胞性免疫系細胞(たとえばCTL)または体液性免疫系成分の直接作用により、または免疫系の標的となる細胞の近接細胞に対するバイスタンダー効果により、がん細胞を殺傷する可能性がある。たとえばCho et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:509-514を参照。がんとの関連では、本発明組成物の投与は1つまたは複数の追加治療薬たとえば抗腫瘍抗体の投与、化学療法治療計画および/または放射線療法をさらに含んでもよい。抗腫瘍抗体は抗腫瘍抗体の断片および/または誘導体、モノクローナル抗腫瘍抗体、その断片および/または誘導体を含むが、技術上周知であり、そうした抗体試薬たとえばRITUXAN(登録商標)(リツキシマブ)やHERCEPTIN(登録商標)(トラスツズマブ)のがん療法への使用もまた同様である。1つまたは複数の追加治療薬の投与は、粒子状組成物の投与の前、後、および/またはそれと同時の、いずれでもよい。
【０２１６】
[0214]  本発明の免疫調節療法は、感染症特に体液性免疫反応に対して抵抗性である感染症(たとえばマイコバクテリア感染症および細胞内病原体に起因する疾患)を患う個体にも有用である。免疫調節療法は細胞性病原体(細菌、原生生物など)または亜細胞性病原体(ウイルスなど)に起因する感染症の治療に用いてもよい。本発明組成物はマイコバクテリア感染症たとえば結核(M. tuberculosisおよび/またはM. Bovis感染症など)、ハンセン病(すなわちM. leprae感染症)またはM. marinumまたはM. ulcerans感染症などを患う個体に投与してもよい。本発明組成物はウイルス感染症たとえばインフルエンザウイルス、RSウイルス(RSV)、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス特に単純ヘルペスウイルス、およびパピロマウイルスなどの感染症の治療にも有用である。細胞内寄生虫に起因する疾患たとえばマラリア(Plasmodium vivax、P. ovale、P. falciparumおよび/またはP. malariaeなどによる感染症)、リーシュマニア症(Leishmania donovani、L. tropica、L. mexicana、L. braziliensis、L. peruviana、L. infantum、L. chagasiおよび/またはL. aethiopicaなどによる感染症)、およびトキソプラズマ症(すなわちToxoplasmosis gondiiによる感染症)もまた、本発明組成物による免疫調節療法が有用である。該療法は寄生虫病たとえば住血吸虫症(すなわちSchistosoma属住血吸虫たとえばS. haematobium、S. mansoni、S. japonicum、S. mekongiなどによる感染症)および肝吸虫症(すなわちClonorchis sinensisによる感染症)の治療にも有用である。感染症を患う個体への本発明組成物の投与は感染症症状の改善を招く。実施態様によっては、感染症はウイルス感染症ではない。
【０２１７】
[0215]  本発明はさらに、個体の1つ以上のTh1関連サイトカインたとえばIL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ、IFN-αなどを増加させまたは刺激する方法を提供する。実施態様によっては、本発明は個体の、特にIFN-γレベルの増加を必要とする個体の、IFN-γを増加させまたは刺激する方法であって、IFN-γを増加させるに足る有効量の本発明組成物を該個体に投与するステップを含む方法を提供する。IFN-γの増加を必要とする個体とはIFN-γ投与に反応する疾患をもつ個体である。その種の疾患には多数の炎症性疾患たとえば非限定的な例として潰瘍性大腸炎が含まれる。また、その種の疾患には多数の線維症たとえば非限定的な例として突発性肺線維症(IPF)、強皮症、放射線性皮膚線維症、肝線維症(住血吸虫性肝線維症を含む)、腎線維症、並びにIFN-γ投与により改善する可能性のある他の病状も含まれる。本発明に基づく免疫調節組成物の投与はIFN-γレベルの上昇を招き、またIFN-γに反応する疾患の1つまたは複数の症状の改善、1つまたは複数の症状の安定化、または進行の防止(たとえば追加の病変または症状の減少または解消)を招く。
【０２１８】
[0216]  本発明の方法は、該疾患の治療管理基準を構成する他の療法たとえばIPFの全身性コルチコステロイド(たとえばコルチゾン)療法などのような抗炎症薬の投与と組み合せて実行してもよい。
【０２１９】
[0217]  実施態様によっては、本発明は個体の、特にIFN-αレベルの上昇を必要とする個体の、IFN-αを増加させまたは刺激する方法であって、IFN-αを増加させるに足る有効量の免疫調節組成物を該個体に投与するステップを含む方法を提供する。IFN-αの増加を必要とする個体とは組換えIFN-αを含むIFN-αの投与に反応する疾患たとえばウイルス感染症およびがんを患う個体である。実施態様によっては、IMCはIFN-αの産生を誘発する効果がある1つまたは複数の免疫調節ポリヌクレオチドを含むが、該IMCは本書で開示するように、5’-CG-3’に加えて1つまたは複数のTCGおよび/またはT,5-ブロモシトシン,G配列を、特に該免疫調節ポリヌクレオチドの5’末端に含む。この追加のTCGおよび/またはT,5-ブロモシトシン,G配列は5’にすぐ接し、かつCG配列に隣接してもよいし、また5’に接し、かつとTCGおよび/またはT,5-ブロモシトシン,G配列CG配列との間に1つまたは複数の塩基を介してもよい。実施態様によっては、この追加TCGおよび/またはT,5-ブロモシトシン,G配列はCG配列の5’末端にTまたはTCまたはT,5-ブロモシトシンを付加して形成する。免疫調節ポリヌクレオチドの5’末端にTまたはTCまたはT,5-ブロモシトシンを付加して追加TCGおよび/またはT,5-ブロモシトシン,G配列を形成するような実施態様では、該追加配列は該ISSとTCGAまたはT,5-ブロモシトシン,G,A配列を形成してもよい。
[0218]  IFN-αの産生を誘発する効果が特にある免疫調節ポリヌクレオチドの非限定的な例は5’-TCG TCG AAC GTT CGT TAA CGT TCG-3’ (SEQ ID NO:27), 5’-TCG TCG AAC GTT CGT T-3’ (SEQ ID NO:17), 5’-TCG TCG TGA ACG TTC GAG ATG A-3’ (SEQ ID NO:28), 5’-TCG TCG GTA TCG GTC GGT ATG A-3’(SEQ ID NO:29), 5’-TCG TCG GAA CCG TTC GGA ATG A-3’(SEQ ID NO:30), 5’-TCG TCG AAC GTT CGA GAT A-3’(SEQ ID NO:31), 5’-TCG TBG AAC GTT CGA GAT G-3’ (SEQ ID NO:32), 5’-TTC GAA CGT TCG TTA ACG TTC G-3’(SEQ ID NO:33), 5’-TCG TCG GAA ABG UTC GGA ATG A-3’(SEQ ID NO:34), 5’-TCG TBG AAB GUT CGG AAT GA-3’(SEQ ID NO:35)および5’-TCG TBG TGA ACG TTC GAG ATG A-3’(SEQ ID NO:36)である(ただしB = 5-ブロモシトシン)。
【０２２０】
[0219]  当業者には自明であろうが、本発明はまた、個体の免疫反応の調節、Th2型免疫反応に関連する疾患の治療、および少なくとも1つのTh1関連サイトカインの増加または刺激を含む本書で開示の治療方法に使用するための医薬の製造への本発明組成物の使用を提供する。
【０２２１】
[0220]  本発明に基づく免疫調節組成物の投与はIFN-αレベルの上昇を招き、IFN-αに反応する疾患の1つまたは複数の症状の改善、1つまたは複数の症状の安定化、または進行の防止または減速(たとえば追加の病変または症状の減少または解消)を招く。本発明の方法は、該疾患の治療管理基準をなす他の療法たとえばウイルス感染症の場合の抗ウイルス薬の投与などと組み合せて実行してもよい。
【０２２２】
[0221]  IgE関連疾患をもつ個体のIgE(特に血清中)レベルを低下させる方法であって、有効量の粒子状組成物を該個体に投与するステップを含む方法もまた提供される。そうした方法では、該免疫調節組成物は(たとえば抗原を加えずに)単独で投与してもアレルゲンなどの抗原と併用投与してもよい。IgEの減少はIgE関連疾患の1つまたは複数の症状の改善すなわちアレルゲンに対する過敏性の緩和、アレルギーをもつ個体のアレルギー症状の減少、またはアレルギー反応の重篤度の低下などを招く。そうした症状には鼻炎、結膜炎などのアレルギー症状が含まれる。従って本発明はまた、個体のアレルギー疾患を治療する方法を提供する。実施態様によっては、アレルギー疾患を治療する方法は、免疫調節組成物を特定量または用量の抗原と併用投与するステップを含む。何らかの追加抗原投与では、投与する抗原の量または用量は治療過程で同じに維持にしても、減少させても、また(通常の脱感作療法の場合のように)増加させてもよい。
【０２２３】
[0222]  実施態様によっては、本発明は個体の、特にCTLの数および/または活性を増加させる必要のある個体の、CTL産生を刺激する方法であって、CTLの産生を増加させるに足る有効量の免疫調節組成物を該個体に投与するステップを含む方法を提供する。CTL産生を増やす必要のある個体は、一般にCTL活性に反応するような疾患をもつ個体である。本発明に従った粒子状組成物の投与はCTLレベルの上昇を招き、またCTL活性に反応する疾患の1つまたは複数の症状の改善、1つまたは複数の症状の安定化、または進行の防止または減速(たとえば追加の病変または症状の減少または解消)を招く。
【０２２４】
[0223]  本発明の方法は、本書で開示する任意の実施態様を、たとえば粒子状組成物の単独投与または抗原との併用投与などを含む。
【０２２５】
[0224]  当業者には自明であろうが、本発明の方法は粒子状組成物の投与に適した特定の適応症に対する他の療法と組み合せて実行してもよい。免疫調節組成物の投与はたとえば、マラリア患者用の抗マラリア薬たとえばクロロキンの投与と、リーシュマニア患者用の殺リーシュマニア薬たとえばペンタミジンおよび/またはアロプリノールの投与と、またはアトピー性(アレルギー)患者用の脱感作療法と併せて実行してもよい。
【０２２６】
[0225]  本書で開示しているように、免疫調節組成物の投与は、サイトカイン、アジュバントおよび(抗体の断片および/または誘導体、それにモノクローナル抗体、その断片および/または誘導体などを非限定的に含む)抗体を非限定的に含む1つまたは複数の追加の免疫治療薬(すなわち免疫系を介して作用する薬物および/または免疫系に由来する薬物)の投与をさらに含んでもよい。治療用抗体の例はがん療法で使用されるもの(たとえば抗腫瘍抗体)を含む。そうした追加の免疫治療薬の投与は本書で開示の諸々の方法に対応する。
【０２２７】
[0226]  粒子状の免疫調節組成物はアジュバントと共に投与してもよい。抗原を粒子状の免疫調節組成物およびアジュバントと共に投与すると該抗原に対する免疫反応の増強を招き、免疫反応が粒子状組成物と抗原とを含むだけの組成物に由来する免疫反応と比較して強まる可能性がある。アジュバントは技術上周知であり、その非限定的な例は水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ミョウバン(アルミニウム塩)、リポソームおよびマイクロ粒子(ポリスチレン、でんぷん、ポリホスファゼンおよびポリラクチド/ポリグリコシドを非限定的に含む)である。他の好適なアジュバントの非限定的な例はMF59、DETOX(登録商標)(Ribi)、スクアレン混合物(SAF-1)、ムラミルペプチド、サポニン誘導体、マイコバクテリア細胞壁エキス、モノホスホリル脂質A、ミコール酸誘導体、ノニオン性ブロックコポリマー界面活性剤、Quil A、コレラ毒素Bサブユニット、ポリホスファゼンおよび誘導体、それにTakahashi et al. (1990) Nature 344:873-875が開示している免疫刺激複合体(ISCOM)、ならびに脂質系アジュバントや本書で開示しているものなどである。アジュバント類は米国特許第6,406,705号明細書でも開示されている。動物用および動物での抗体産生用としては、フロインド(完全、不完全)アジュバントのマイトジェン成分が使用可能である。
【０２２８】
投与と免疫反応評価
[0227]  免疫調節組成物は本書で開示するように他の医薬および/または免疫原物質および/または免疫刺激物質と組み合せて投与することができるし、また生理的に許容しうるその担体と組み合せることもできる(ので、本発明はこれらの組成物を包含する)。従って、免疫調節組成物はサイトカイン、アジュバントおよび抗体を非限定的に含む他の免疫治療薬と共に投与することができる。
【０２２９】
[0228]  諸々の免疫原性組成物の場合と同様に、特定免疫調節組成物の免疫学的に有効な投与量および投与方法は個体、治療対象の病状、および当業者には自明の他因子に応じて変動しうる。検討対象の因子は併用投与する場合の抗原の抗原性、免疫調節組成物とアジュバントまたは送達分子および/または抗原との併用投与または共有結合の是非、投与経路、および免疫用量の投与回数などである。そうした因子は技術上周知であり、また当業者は過度の実験にまつことなくそうした判断を十分に下すことができる。適切な投与量範囲は免疫反応に所期の調節(たとえばIFN-γおよび/またはIFN-αの刺激など)をもたらすような範囲である。抗原への免疫反応が必要とされるときは、適切な投与量範囲は該抗原に対する免疫反応の所期の調節をもたらすような範囲である。一般に、投与量は粒子状組成物の総投与量ではなく患者へのIMC投与量で決める。IMC送達量で示される有用なおおよその粒子状組成物投与量範囲はたとえば次のうちいずれかにしてもよい: 1〜500μg/kg、100〜400μg/kg、200〜300μg/kg、1〜100μg/kg、100〜200μg/kg、300〜400μg/kg、400〜500μg/kg。各患者に対する絶対投与量は薬理学的特性たとえばバイオアベイラビリティー、排泄速度および投与経路に左右される。
【０２３０】
[0229]  特定粒子状組成物の有効な投与量および投与方法は個別患者、所期の効果および/または疾患の種類、病期および当業者には自明である他因子に応じて変動しうる。用途に応じた有用な投与経路は当業者には自明である。投与経路の非限定的な例は局所、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、注射、胃腸管、鼻咽腔および肺(経気管支および経肺胞を含む)である。適切な投与量範囲は、血中レベルで測定して約1〜10μMの組織濃度を達成するに足る粒子状組成物を供給するような範囲である。各患者に対する絶対投与量は薬理学的特性たとえばバイオアベイラビリティー、排泄速度および投与経路に左右される。
【０２３１】
[0230]  本書で開示するように、APCと高APC濃度組織は粒子状免疫調節組成物のターゲットとして好ましい。従って粒子状組成物は、APCが比較的高濃度で存在する哺乳動物の皮膚および/粘膜に投与するのが好ましい。
【０２３２】
[0231]  本発明は、生理的に許容しうるインプラント、軟膏、クリーム、リンスおよびゲルなどを非限定的に含む局所適用に適した粒状免疫調節組成物製剤を提供する。局所投与は、たとえば送達系を内部に分散させたドレッシング剤または包帯剤により、切創または開放創への送達系の直接投与により、または関心部位を対象にした経皮投与デバイスにより行う。内部にCICを分散させたクリーム、リンス、ゲルまたは軟膏は局所用軟膏または創傷充填薬として好適である。
【０２３３】
[0232]  好ましい皮膚投与経路は侵襲性が最も低い経路である。中でも好ましいのは経皮透過、表皮投与および皮下注射である。中でも好ましいのは皮内組織のAPC濃度がより高くなると期待される表皮投与である。
【０２３４】
[0233]  経皮投与は、粒子状免疫調節組成物を皮膚に浸透させ血流中に入り込ませることができるクリーム、リンス、ゲルなどの塗布という形をとる。ただし、粒径との関係で、経皮投与は皮膚剥離術や皮膚を無傷のままに保つ他の手法と併用するのがよい。経皮投与に適した組成物の非限定的な例は、皮膚に直接塗布するかまたは経皮デバイス(いわゆるパッチ)などの保護担体に含ませるタイプの製薬上許容しうる懸濁液、オイル、クリームおよび軟膏などである。好適なクリーム、軟膏などの例はたとえばPhysician’s Desk Referenceに求めることができる。
【０２３５】
[0234]  この方法に使用するパッチの例はLECTRO PATCH商標の商品(General Medical Company, Los Angeles, CA)である。この商品はリザーバー電極を中性pHに電気的に維持するものであり、薬剤の濃度を加減しながら連続的および/または周期的に投与するよう適合させることができる。該パッチの準備と使用はLECTRO PATCH商品に添付されているメーカー説明書に従って行うのがよい。それらの説明書は参照指示により本明細書に組み込まれる。他の密封パッチシステムもまた好適である。
【０２３６】
[0235]  経皮透過には低周波超音波送達法も好適である。Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853. 低周波超音波(約1MHz)を使用すると、高分子組成物を含めた治療用組成物の一般的な制御放出が可能になる。
【０２３７】
[0236]  表皮投与は基本的に、表皮の最外層を機械的または化学的に刺激して該刺激に対する免疫反応を誘発するものである。特に該刺激は刺激部位にAPCを引き付けるに足ることが望ましい。
【０２３８】
[0237]  機械的刺激手段の一例では複数のごく細く短い尖叉を使用するが、それらの尖叉は皮膚を刺激して刺激部位にAPCを引き付け、尖叉端から移った粒子状組成物を取り込ませるのに役立つ。たとえばPasteur Merieux (Lyon, France)製のMONO-VACC旧ツベルクリン検査キットは含CIC組成物の導入に好適な装置を含む。
【０２３９】
[0238]  該装置(米国の販売元はConnaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA)は一端に注射器内筒を、他端に尖叉円板をそれぞれ備えたプラスチック容器からなる。該尖叉円板は、表皮細胞の最外層をかろうじて引っ掻く程度の長さの、細い複数の尖叉を支持している。MONO-VACCキットの各尖叉は本来旧ツベルクリンで被覆されるが、本発明では粒子状免疫調節組成物製剤で被覆される。該装置の使用はキット添付のメーカー説明書に従うのが好ましい。現在アレルギー検査に使用されている類似の装置もまた、この実施態様に使用することができる。
【０２４０】
[0239]  免疫調節組成物の表皮投与に対する別のアプローチは化学薬品を使用して、表皮の最外層を刺激し、その部位にAPCを引き付けるに足る免疫反応を起こさせるようにするものである。化学薬品の一例は角質分解物質たとえばNoxema Corporationの市販脱毛クリームNAIRに使用されているサリチル酸などである。このアプローチは粘膜上皮投与にも適用できる。化学的刺激は機械的刺激との併用も可能である(たとえばMONO-VACCタイプの尖叉が化学薬品でも被覆されるならば、両方の刺激が実現しよう)。該粒子状組成物は化学薬品を含む担体に懸濁させても、化学薬品と併用投与してもよい。
【０２４１】
[0240]  注射投与経路の非限定的な例は電気的注入(イオントフォレシス)または直接的注入たとえば中心静脈への直接的注入、静脈内、筋内、腹腔内、皮内または皮下注射などである。注射投与に好適な粒子状免疫調節組成物は一般にUSP水または注射用蒸留水で調製するが、pH緩衝液、塩類、増量剤、防腐剤、および他の製薬上許容しうる添加物をさらに含んでもよい。注射用免疫調節組成物の調製には製薬上許容しうる滅菌等張液たとえば注射用の生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を使用してもよい。
【０２４２】
[0241]  胃腸管投与経路の非限定的な例は経口や直腸などである。本発明は胃腸管投与に適した粒子状免疫調節組成物たとえば製薬上許容しうる経口用散剤、錠剤または液剤、および直腸用座剤などを包含する。当業者には自明であろうが、錠剤または座剤は増量剤として製薬上許容しうる固形物たとえばでんぷんをさらに含む。
【０２４３】
[0242]  鼻咽腔および肺投与は吸入投与であり、鼻内、経気管支および経肺胞などの経路を含む。本発明は、エアゾール形成用懸濁液やドライパウダー吸入器用微粉末などを非限定的に含む吸入投与に好適な免疫調節組成物製剤を包含する。吸入投与に好適な器具の非限定的な例は霧化器、気化器、ネブライザー、およびドライパウダー吸入器などである。
【０２４４】
[0243]  技術上周知のように、本書で開示する投与経路に使用する溶液または懸濁液は次のうち任意の1つまたは複数の成分を含んでよい: 滅菌希釈剤たとえば注射用の水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒; 抗菌剤たとえばベンジルアルコールまたはメチルパラベン; 抗酸化剤たとえばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム; キレート剤たとえばエチレンジアミン四酢酸; 緩衝液たとえば酢酸、クエン酸またはリン酸緩衝液; および張性調節剤たとえば塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは酸または塩基たとえば塩酸または水酸化ナトリウムで調整することができる。注射剤はガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【０２４５】
[0244]  技術上周知のように、注射用に適した製剤組成物には滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末などがある。当業者には自明であろうが、滅菌粉末は投与前に好適な担体と混合して還元する。静脈内投与の場合、好適な担体は生理食塩水、静菌性の水、Cremophor EL(登録商標) (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝食塩水などである。いずれの場合にも、製剤組成物は滅菌してある必要があり、また流動的で高い注射適性が存在するのがよいし、製造、貯蔵条件下で安定であるのがよく、また細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護しなければならない。担体は水、エタノール、ポリオール(たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)およびそれら好適な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる。微生物作用の防除には種々の抗菌剤および抗真菌剤たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを使用することができる。該組成物には等張剤たとえば糖、ポリアルコール(マンニトール、ソルビトールなど)、塩化ナトリウムを加えるのが好ましい場合もあろう。該組成物に吸収を遅らせる物質たとえばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを加えることにより、注射適性組成物の長時間吸収を実現することができる。
【０２４６】
[0245]  技術上周知のように、滅菌注射液は所要量の活性化合物を適正な溶媒に、必要に応じて前述の1つまたは複数の成分と共に加え、次いで滅菌ろ過すれば調製することができる。一般に、分散液は基本的な分散媒と前述の所要成分とを含む滅菌基剤に活性化合物を加えて調製する。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は真空乾燥法および凍結乾燥法であり、それにより活性成分と必要な追加成分の滅菌ろ過溶液からそれの成分の粉末が得られる。
【０２４７】
[0246]  投与経路の選択は、誘発される免疫反応の調節に利用することができる。たとえばIgE力価とCTL活性は、インフルエンザウイルスを筋内または表皮経路(遺伝子銃)で投与した場合には同じであったが、粘膜接種は主にIgG2aを、また表皮経路は主にIgG1をそれぞれ産生させた。Pertmer et al. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. 従って、当業者は本発明の免疫調節オリゴヌクレオチドの異なる投与経路が誘発する若干の差を活用することができる。
【０２４８】
[0247]  前述の組成物と投与方法は本発明の免疫調節組成物の製剤の投与方法を説明するものであって、限定するものではない。多様な組成物および装置を製造する方法は当業者には自明であり、本書では立ち入らない。
【０２４９】
[0248]  粒子状組成物に対する免疫反応の(定性および定量)分析には技術上周知の任意の方法を用いることができるが、その非限定的な例は抗原特異抗体の産生量の測定(特異抗体サブクラスの測定を含む)、特定リンパ球群たとえばCD4+T細胞、NK細胞またはCTLの活性化の測定、サイトカインたとえばIFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10またはIL-12の産生量および/またはヒスタミン放出量の測定などである。特異的抗体反応の測定方法は酵素免疫法(ELISA)などであり、技術上周知である。特定タイプのリンパ球たとえばCD4+T細胞の計数には蛍光活性化法(FACS)などがある。細胞傷害性およびCTLの検定はたとえばRaz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523およびCho et al. (2000) などに記載の要領で行うことができる。サイトカイン濃度はたとえばELISA法で測定することができる。免疫原に対する免疫反応を評価する方法は、これらや他の方法を含めて技術上周知である。たとえばSelected Methods in Cellular Immunology (1989) Mishell and Shiigi, eds., W.H. Freeman and Co.を参照。
【０２５０】
[0249]  Th1型反応は、刺激を受ける、すなわち誘発および/または増進されるのが好ましい。本発明では、Th1型免疫反応の刺激は、粒子状免疫調節組成物で処理した細胞からのサイトカイン産生量を無粒子状組成物で処理した対照細胞と比較測定することにより、in vitroまたはex vivoで判定することができる。細胞のサイトカイン産生を判定する方法には本書で開示する方法や技術上周知の任意の方法などがある。粒子状組成物処理に反応して産生されるサイトカインの種類は該細胞による免疫反応がTh1-型偏向かTh2型偏向かを指示する。本書では、用語「Th1型偏向」サイトカイン産生は、刺激物質の存在下でのTh1型免疫反応に関連するサイトカイン産生の、刺激物質の不存在下でのそうしたサイトカイン産生と比較した場合の測定可能な増加をいう。Th1型偏向サイトカインの非限定的な例はIL-2、IL-12、IFN-γおよびIFN-αである。反対に「Th2型偏向サイトカイン」はTh2型免疫反応に関連するサイトカインをいい、その非限定的な例はIL-4、IL-5およびIL-13である。粒子状組成物の活性の判定に有用な細胞は免疫系細胞、宿主および/または細胞株から単離した初代細胞、好ましくはAPCおよびリンパ球、さらに好ましくはマクロファージおよびT細胞などである。
【０２５１】
[0250]  粒子状免疫調節組成物で処理した宿主におけるTh1型免疫反応の刺激は、次のものを非限定的に含む技術上周知の任意の方法で判定することができる: (1)実測IL-4またはIL-5レベルの抗原暴露前後での低下; または粒子状免疫調節組成物で処理した宿主における、抗原-初回免疫したまたは初回免疫+暴露した、無粒子状組成物処理の対照と比較した場合のIL-4またはIL-5レベル低下(場合によっては0)の検出; (2)IL-12、IL-18および/またはIFN(α、β、γ)レベルの抗原暴露前後での上昇; または粒子状免疫調節組成物で処理した宿主における、抗原-初回免疫したまたは初回免疫+暴露した、無粒子状組成物処理の対照と比較した場合のIL-12、IL-18および/またはIFN(α、β、γ)レベルの上昇の検出; (3) 粒子状免疫調節組成物で処理した宿主における無粒子状組成物処理の対照と比較した場合の「Th1型偏向」抗体産生; および/または(4) 抗原暴露前後での抗原特異的IgE実測レベルの低下; または粒子状免疫調節組成物で処理した宿主における、抗原-初回免疫したまたは初回免疫+暴露した、無粒子状組成物処理の対照と比較した場合の抗原特異的IgEレベル低下(場合によっては0)の検出。これらの多様な判定は、APCおよび/またはリンパ球好ましくはマクロファージおよび/またはT細胞が産生するサイトカインを、in vitroまたはex vivoで、本書で開示の(または技術上周知の任意の)方法を用いて測定することにより下すことができる。
【０２５２】
[0251]  粒子状免疫調節組成物での処理に反応して産生される抗原特異的抗体のクラスおよび/またはサブクラスは、細胞による免疫反応がTh1型偏向かTh2型偏向かを指示する。本書では、用語「Th1型偏向」抗体産生はTh1型免疫反応に関連する抗体(すなわちTh1関連抗体)産生の測定可能な増加をいう。1つまたは複数のTh1関連抗体を測定してよい。Th1型偏向抗体の非限定的な例はヒトIgG1および/またはIgG3 [たとえばWidhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581およびde Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164を参照]、それにマウスIgG2aである。反対に「Th2型偏向抗体」はTh2型免疫反応に関連する抗体をいい、その非限定的な例はヒトIgG2、IgG4および/またはIgE [たとえばWidhe et al. (1998)およびde Martino et al. (1999)を参照]、それにマウスIgG1および/またはIgEである。
【０２５３】
[0252]  粒子状免疫調節組成物の投与により誘発されるTh1型偏向サイトカイン産生は細胞性の免疫反応、たとえばNK細胞、細胞傷害性キラー細胞、Th1ヘルパー細胞および記憶細胞による免疫反応を増進する。これらの反応はウイルス、真菌、寄生性原虫、細菌、アレルギー性疾患および喘息、それに腫瘍に対する予防または治療ワクチン接種への使用に特に有益である。
【０２５４】
[0253]  実施態様によってはTh2反応が抑制される(弱められる)。Th2反応の抑制は、たとえばTh2関連サイトカインたとえばIL-4およびIL-5レベルの低下、Th2関連抗体レベルの低下、並びにIgEの減少やアレルゲンへの反応によるヒスタミン放出の減少などによって判定してもよい。
【０２５５】
キット
[0254]  本発明はキットを提供する。実施態様によっては、本発明のキットは本書で開示の任意の粒子状免疫調節組成物を入れた1つまたは複数の容器を含む。あるいは該キットは、本発明組成物の成分を入れた1つまたは複数の容器を含んでもよい。この実施態様の構成には、IMC/安定剤混合物を入れた容器とカチオン性縮合剤を入れた容器とを含むキットや、IMC容器、安定剤容器およびカチオン性縮合剤容器を含むキットが包含される。本発明のキットは、本書で開示の任意の方法(たとえば免疫調節、感染症の1つまたは複数の症状の改善、IFN-γレベル上昇、IFN-αレベル上昇またはIgE関連疾患の改善)に対応する粒子状組成物の用法に関する適当な説明(一般に説明書)セットをさらに含んでもよい。本発明組成物の成分を入れた容器を含む実施態様のキットは一般に、本書で開示の方法による該組成物の調製に関する説明を含むであろう。キットはまた、本発明組成物および/またはその成分に加えて、本書で開示の方法による該組成物の調製に関する説明並びに本書で開示の任意の方法への該組成物の使用に関する説明を含んでもよい。
【０２５６】
[0255]  該キットは任意好適な包装容器にパッケージした粒子状免疫調節組成物を含んでもよい。たとえば粒子状組成物が乾燥製剤(フリーズドライ製剤またはドライパウダーなど)であれば、弾性栓付きバイアルを通常は使用し、弾性栓を貫通して液体を注入するだけで粒子状組成物を懸濁させるようにする。粒子状組成物の液体製剤には、「血液バッグ」に類似した軟質パックをも使用してよいが、除去可能な非弾性隔壁(たとえばシールガラス)または弾性栓を備えたアンプルを使用するのが最も好都合である。特定の器具たとえば吸入器、鼻腔内投与器具(霧化器など)または輸液用器具(ミニポンプなど)との併用パッケージも見込まれる。
【０２５７】
[0256]  粒子状免疫調節組成物の用法に関する説明は一般に所期の方法に対応する用量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。粒子状免疫調節組成物の容器は単回用、バルクパッケージ(たとえば頻回用)または分数回用でもよい。本発明のキットに含める説明は一般にラベルまたは添付紙片(たとえばキットに同梱される紙片)上の書面であるが、機械可読式説明(たとえば磁気または光記憶媒体に収めた説明)でもよい。
【０２５８】
[0257]  実施態様によっては、キットは1つまたは複数の抗原をさらに含むが、該抗原は粒子状免疫調節組成物と同じ容器(製剤)に収めても収めなくてもよい。抗原については本書ですでに開示している。
【０２５９】
[0258]  以下の実施例は本発明の限定ではなく説明が目的である。
【実施例】
【０２６０】
実施例1:  安定剤としてアルブミンを使用する粒子状製剤によるヒト細胞の免疫調節
[0259]  含血清培地(安定剤としてのアルブミンの供給源)中でポリミキシンB (PMXB)、ポリミキシンE (PMXE; 別名コリスチン)およびアムホテリシンB (AMTB)を免疫調節ポリヌクレオチドと合わせて粒子状組成物を調製した。該製剤の免疫調節活性を、ヒト末梢血リンパ球(hPBMC)によるIFN-αおよびIFN-γ産生量測定方法(「hPBMCアセッイ」)で検定した。該IMC(「+ISS」)は配列5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATG A-3’ (SEQ ID NO:1)を有し、陰性対照(「-ISS」)のオリゴヌクレオチドは配列5’-TGA CTG TGA ACC TTA GAG ATG A-3’(SEQ ID NO: 26)を有する。両オリゴヌクレオチドは完全修飾ホスホロチオアート・オリゴデオキシヌクレオチドであった。
【０２６１】
[0260]  末梢血は有志ドナーから、静脈穿刺法によりヘパリン加注射器を使用して採取した。血液をFICOLL(登録商標)(Amersham Pharmacia Biotech)クッション上に重層し、遠心分離した。FICOLL界面に形成されたPBMCのバンドを回収し、冷PBS(リン酸緩衝食塩水)で２回洗浄した。この細胞をRPMI完全培地[RPMI 1640に、10%熱不活化ヒトAB血清、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン、300μg/mLグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1×MEM非必須アミノ酸(NEAA)を添加]に再懸濁させ、12穴または48穴プレートで2×106細胞/mLの密度に培養した。
【０２６２】
[0261]  粒子状組成物は、オリゴヌクレオチド(+ISSまたは-ISS)を20μg/ml、またPMXBを100μg/ml、ウェルに直接添加して調製した。試験サンプルの存在下に細胞を24時間培養し、次いで各ウェルから無細胞培地を回収し、IFN-γおよびIFN-α濃度を検定した。IFN-γおよびIFN-αの検定はCYTOSCREEN(登録商標)ELISAキット(BioSource International, Inc.)を使用して、メーカーの説明書に従って行なった。このhPBMCアッセイでは、IFN-γのバックグラウンドレベルがドナーにより、ときに著しく、異なる場合がある。しかし、IFN-αなどのような他のサイトカインは一般に安定的な活性化パターンを示し、また非刺激条件下では低バックグラウンドレベルをごく普通に示す。
【０２６３】
[0262]  アルブミンの存在下にPMXBとIMCを混合すると、IFN-αとIFN-γの分泌量はIMC単独または-ISSの粒子状製剤の場合と比較して有意に(それぞれp<0.01、p<0.001)増大する結果となった。PMBXは単独では免疫調節活性をもたないので、この結果は特に印象的であった。表2は結果のまとめである。
【０２６４】
【表５】
2006505523.tif 000006
【０２６５】
[0263]  カチオン性縮合剤としてのアムホテリシンBを評価するために追加の実験を行った。培養ウェルを使用して含血清培地(安定剤としてのアルブミンの供給源)中でIMC(+ISS)をPMBXかまたはAMTBと混合し(終濃度はそれぞれ100μg/ml、10μg/ml)、hPBMCアッセイで評価した。AMTBもまたPMXBと同様に単独では活性をもたないが、+ISS単独の場合と比較して免疫調節活性を高める結果となった。表3は結果のまとめである。
【０２６６】
【表６】
2006505523.tif 000007
【０２６７】
[0264]  PMXBの近縁種であるポリミキシンE (PMXE)をカチオン性縮合剤として使用する粒子状組成物もまたhPBMCアッセイで評価した。粒子状製剤は予め、(a) O/S+C: オリゴヌクレオチド(O)を安定剤(S)[ヒト血清アルブミン(HSA)]またはモノオレイン酸ポリエチレングリコールソルビタン[TWEEN(登録商標)80]と混合し、次いでこのオリゴ/HSA混合物をカチオン性縮合剤(C)(PMXEまたはPMXB)と合わせることにより、または(b) O/C+S: オリゴヌクレオチドをカチオン性縮合剤と混合し、次いで安定剤と合わせることにより、調製した。該製剤中の成分の終濃度は1mg/mL IMC、5mg /mL PMX、および20mg/mL HSAまたは0.4%(v/v) TWEEN (登録商標)80であった。該製剤は使用前に室温(約22℃)で1日静置した。容器底の沈殿をボルテックスして再懸濁させてから培養液に添加した。
【０２６８】
[0265]  サンプルを培養液に加え終濃度を20μg/mlオリゴヌクレオチド(ポリミキシン対照の場合は100μg/mlポリミキシン)とした。表4は結果のまとめである。
【０２６９】
【表７】
2006505523.tif 000008
【０２７０】
実施例2: 安定剤としてノニオン性洗剤を使用する粒子状組成物によるヒト細胞の免疫調節
[0266]  ポリオキシエチレン洗剤を安定剤として使用して調製した粒子状組成物をhPBMCアッセイで評価した。加えて、脂肪酸をさらに含む組成物も評価した。
【０２７１】
[0267]  免疫調節オリゴヌクレオチド+ISSをモノオレイン酸ポリエチレングリコールソルビタン[TWEEN(登録商標)80]と混合し、次いでPMXBと混合して、粒子状組成物を形成した。製剤を7日間静置してから、実施例1と同様のhPBMCアッセイに使用した。該製剤中の成分の終濃度は1mg/mL IMC、5mg /mL PMX、および20mg/mL HSAまたは0.1%〜0.4%(v/v) TWEEN (登録商標)80であった。該製剤は使用前に室温(約22℃)で1日静置した。容器底の沈殿をボルテックスして再懸濁させてから培養液に添加した。
【０２７２】
[0268]  サンプルを培養液に加え終濃度を20μg/mlオリゴヌクレオチド(ポリミキシン対照の場合は100μg/mlポリミキシン)とし、実施例1の場合と同様にしてhPBMCアッセイで評価した。粒子状組成物はアッセイ前に7日間静置した組成物を含めていずれも活性であった。表5は結果のまとめである。
【０２７３】
【表８】
2006505523.tif 000009
【０２７４】
[0269]  さらなる実験を行って、安定剤としての別のノニオン性ポリオキシエチレン洗剤[TWEEN (登録商標)85]を評価し、また脂肪酸(オレイン酸)を含む組成物を評価した。加えて、1つのサンプルはアッセイ前に2.7μmフィルターでろ過した。
【０２７５】
[0270]  免疫調節オリゴヌクレオチド+ISSをトリオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン[TWEEN(登録商標)85]と混合し、次いでPMXBと混合して、粒子状組成物を形成した。該製剤中の成分の終濃度は1mg/mL IMC、5mg /mL PMX、および0.4%(v/v) TWEEN (登録商標)85プラス0.4%オレイン酸または20mg/mL HSAであった。該製剤は使用前に室温(約22℃)で1日静置した。該製剤はアッセイ前に最長12日間静置し、使用前に再懸濁させた。
【０２７６】
[0271]  サンプルを培養液に加え終濃度を20μg/mlオリゴヌクレオチド(ポリミキシン対照の場合は100μg/mlポリミキシン)とし、実施例1の場合と同様にしてhPBMCアッセイで評価した。安定剤としてトリオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン[TWEEN(登録商標)85]を含む組成物はオレイン酸の有無に関わらず、2.7μmフィルターでろ過した後でも、活性であった。表6は結果のまとめである。
【０２７７】
【表９】
2006505523.tif 000010
【０２７８】
実施例3:  粒子状組成物の粒径分布
[0272]  オリゴヌクレオチド+ISS(2mg/mL)を、予め調製しておいた0.4%(v/v) トリオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタンと0.4%(v/v)オレイン酸の混合物と混合し、次いでPMXBを5mg/mLとなるよう加えた。この懸濁液を一晩室温で静置した。上清を取り出して直接使用するか(Supe1)、または2.7μmフィルター(Whatman GF/D + GMFプレフィルター)でろ過した(Supe2)。ペレットは等量のPBS中に再懸濁させた。
【０２７９】
[0273]  3つのサンプルそれぞれに由来する一定分量中の粒径をMalvern Mstersizerレーザー光散乱検出器で測定し、また+ISS濃度を0.1N NaOHによる粒子の解離後にサイズ排除クロマトグラフィーで測定した。免疫調節活性は実施例1の要領でhPBMCアッセイにより測定した。
【０２８０】
[0274]  Supe1は粒径約0.1〜10μmの粒子を含み、+ISS中では0.53mg/mLであった。Supe2は粒径約0.1〜1μmの粒子を含み、+ISS中では0.3mg/mLであった。ペレットは粒径約0.1〜90μm(大多数は20〜90μm)の粒子を含み、+ISS中では0.95mg/mLであった。hPBMCアッセイではペレットの活性が最も低かったが、3つのサンプルはどれも活性であった。表7はhPBMCアッセイ結果のまとめである。
【０２８１】
【表１０】
2006505523.tif 000011
【０２８２】
実施例4:  種々の免疫調節ポリヌクレオチドを含む粒子状組成物によるヒト細胞の免疫調節
[0275]  種々のIMCを粒子状組成物に加えて、その免疫調節活性をhPBMCアッセイで評価した。表8は使用IMCのリストである(特に断らない限り、オリゴヌクレオチド骨格はホスホロチオアートである; ホスホジエステル結合で連結された塩基は小文字で示しており、またdsは二本鎖を示す)。
【０２８３】
【表１１】
2006505523.tif 000012
【０２８４】
[0276]  粒子状製剤は、まず1mg/mlオリゴヌクレオチド、0.4% TWEEN(登録商標)85、0.4%オレイン酸の溶液を調製し、次いでその溶液をPMXBで5mg/mlとして調製した。製剤はアッセイ前に室温で24時間静置した。
【０２８５】
[0277]  製剤をボルテックスして、沈殿をすべて再懸濁させ、次いで培養液に加えて終濃度を20μg/mlオリゴヌクレオチド(ポリミキシン対照の場合は100μg/mlポリミキシン)とし、実施例1の要領でhPBMCアッセイを行って評価した。表9は結果のまとめである。
【０２８６】
【表１２】
2006505523.tif 000013
【０２８７】
【表１３】
2006505523.tif 000014
【０２８８】
実施例5:  ポリミキシンのドメインとISS活性の増進
[0278]  PMXBには(1) 5個の正荷電アミノ酸残基を含む環状ペプチドと(2) N末端親油性の脂肪アシル誘導体という2つの主要ドメインがある。IMC活性の増進には一方または両方のドメインが必要なのかを見極めるために、ポリミキシンファミリーの2誘導体のIMC増進能を調べた。試験した誘導体は、ポリカチオン性ドメインを欠くメタンスルホン酸コリスチン(CMS)と親油性ドメインを欠くポリミキシンBノナペプチド(PMXB-9)である。
【０２８９】
[0279]  6人の個別ドナーに由来するPBMCを20μg/ml IMCオリゴヌクレオチド[5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:1)]または20μg/ml -ISSオリゴヌクレオチド[5’-TGC TTG CAA GCT TGC AAG CA-3’ (SEQ ID NO:38)、陰性対照]で、100 μg/mlのPMXB、コリスチン(CLN)、CMSまたはPMXB-9を添加して、または無添加で、24時間刺激した。これらのアッセイでは、ヒト血清アルブミンを含むPBMC細胞培養液にISSとポリミキシンを別々に加えた。結果は表10のとおりである。
【０２９０】
【表１４】
2006505523.tif 000015
【０２９１】
[0280]  表10に示すように、CMSもPMXB-9も共にIMCのIFN-γ/α刺激活性を増進するものの、PMXBまたはCLNと比較するとIFN-γ/α刺激活性の増進幅は著しく小さい。これらのデータはポリミキシンの最適IMC増進活性にはポリミキシンのポリカチオン性ドメインと親油性ドメインが共に必要であることを示す。
【０２９２】
実施例6:  ポリミキシン粒子状製剤およびISS活性
[0281]  ヒトPBMCでは、IMC刺激はサイトカイン、ケモカインおよび抗ウイルス因子などを含む明確で特異的な遺伝子活性化パターンを誘発する。このパターンをPMXBによるIMC活性増進時に調べた。4人のドナーに由来するヒトPMBCをIMCまたはIMC+PMXBで4時間と10時間にわたり刺激した。試験したIMCは次の2種類であった: [5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:1)]および[5’-TCG TCG AAC GTT CGA GAT GAT-3’ (SEQ ID NO:39)]。これらのアッセイではヒト血清アルブミンを含むPBMC細胞培養液にIMCとPMXBを別々に加えた。遺伝子発現の評価では、細胞懸濁液から単離したRNAからcDNAを合成し、またTAQMAN(登録商標)Technologyを使用してRNAを定量した。次の遺伝子の発現を両時点で評価した: IFN-γおよびIFN-α、インターフェロン誘発性タンパク質10(IP-10)、IFN-γ誘導モノカイン(MIG)、2,5-オリゴアデニル酸合成酵素(2,5-OAS)およびインターフェロン刺激遺伝子54K(ISG-54K)。表11はその結果である。
【０２９３】
【表１５】
2006505523.tif 000016
【０２９４】
[0282]  PMXBは10時間の刺激により、IFN-γおよびIFN-α、ケモカイン(IP-10およびMIG)、それに抗ウイルス遺伝子2,5-OASおよびISG-54Kを含む種々の遺伝子に対するIMC SEQ ID NO:1の発現誘発能を明らかに高めた。IMC SEQ ID NO:39はIMC SEQ ID NO:1と比べて遺伝子誘発を加速させるので、PMXBによる増進の評価では早いほうの時点を選んだ。PMXBは4時間でIMC SEQ ID NO:39の転写誘発活性を、10時間でのIMC SEQ ID NO:1並みに、著しく増進した。従って、PMXBは遺伝子活性化のためのIMC伝達シグナルを量的に増大させる模様であるが、それを質的に変化させることはない。
【０２９５】
実施例7:  IMC粒子状製剤は形質細胞様樹状細胞からのIFN-α産生を増進させる
[0283]  ヒトPBMCの形質細胞様樹状細胞(PDC)からのIFN-α産生を調べるために、細胞内染色アッセイとFACS分析を使用した。これらのアッセイには20μg/ml IMCオリゴヌクレオチド[5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:1)または5’-TCG TCG AAC GTT CGA GAT GAT-3’ (SEQ ID NO:39)]または20 mg/ml -ISSオリゴヌクレオチド[5’-TGC TTG CAA GCT TGC AAG CA-3’ (SEQ ID NO:38)、陰性対照]を使用した。これらのアッセイでは、ヒト血清アルブミンを含むPBMC細胞培養液にIMCまたは-ISSとポリミキシンとを別々に加えた。
【０２９６】
[0284]  ヒトPBMCを20μg/mlのIMCまたは-ISSにより、100μg/ml PMXB添加または無添加で6時間刺激したが、うち最後の2件は新合成タンパク質のゴルジ体からの放出を阻む試薬であるブレフェルジンAの存在下でも行った。6時間後、細胞を蛍光標識PDCマーカー、FITC標識抗BCDA-2およびPE標識抗IFN-αで染色した。標識細胞のFACS分析を行った。アッセイは2種類のIMCで行ったが、全PBMCに対する二重染色細胞集団(BCDA-2+、IFN-α+)の百分率を表12に示す。
【０２９７】
【表１６】
2006505523.tif 000017
【０２９８】
[0285]  表12から明らかなように、二重染色細胞の百分率はPBMCをPMXBの存在下に両IMCで処理すると著しく上昇したが、PMXBの存在下に-ISSオリゴヌクレオチドで処理しても上昇しなかった。この結果は、IMC/PMXB製剤の存在下に観測されたPBMCからのIFN-α産生量の増加がPDCに由来することを示唆する。加えて、細胞のBCDA-2-(非PDC)画分では検出可能なIFN-α産生は観測されなかった。
【０２９９】
実施例8:  粒子状組成物によるヒト細胞からのナチュラルキラー細胞活性の誘発
[0286]  ナチュラルキラー(NK)細胞の溶解活性は免疫調節ポリヌクレオチドにより増進される。NK細胞はIMCにより、形質細胞様樹状細胞(PDC)から伝達されるシグナルを通じて間接的に、活性化される。このシグナル伝達ではIFN-αが大きな役割を果たすように見受けられるものの、このシグナルの厳密な性格は未解明である。
【０３００】
[0287]  IMC粒子状製剤のNK細胞刺激活性を評価した。2人のドナーに由来するPBMCを10μg/mlのIMC(+ISS) [5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:1)]により、100μg/ml PMXB添加または無添加で48時間刺激した。次いでPBMCをアッセイにかけ、標的細胞としての51Cr標識K562細胞に対する溶解活性を評価した。対照として、K562細胞を単独で培養し、K562細胞をTritonで溶解し、またK562細胞を非処理PBMCで刺激した。培地中への51Cr放出量から標的細胞の溶解の度合いを測定した。IMC単独での刺激によるNK細胞活性は、PMXBの存在により増進された。表13は結果のまとめである。
【０３０１】
【表１７】
2006505523.tif 000018
【０３０２】
実施例9:  粒子状組成物によるマウスでのin vivo免疫調節
[0288]  B型肝炎表面抗原(HBsAg)とIMC(「+ISS」)粒子状製剤かまたは単純+ISSとの組合せに対する免疫反応をマウスで測定した。IMC(「+ISS」)は配列5’-TGA CTG TGA ACG TTC GAG ATGA-3’ (SEQ ID NO:1)をもち、また完全修飾ホスホロチオアート・オリゴでオキシヌクレオチドであった。
【０３０３】
[0289]  粒子状製剤は、まず1mg/mlオリゴヌクレオチド、0.4% TWEEN(登録商標)85、0.4%オレイン酸の溶液か、または1mg/mlオリゴヌクレオチド、20mg/mL HSA溶液を調製し、次いでその溶液をPMXBで5mg/mlとして調製した。製剤は使用前に室温で24時間静置した。製剤はHBsAgを加えてから注射した。対照としてHBsAg単独とHBsAg/+ISSを使用した。
【０３０４】
[0290]  マウス(Balb/c)を10頭単位で群に分け、0週目と2週目に試験物品(5μgの+ISSと1μgのHBsAg)を筋内注射で投与した。2週目と4週目に血清サンプルを尾静脈採血でとった。6週目に全頭を安楽死させた。
【０３０５】
[0291]  血清サンプルのIgG1およびIgG2a力価をELISA法で評価した。粒子状製剤の投与を受けたマウスはIgG2a力価著しく高まっており、Th1型反応であることを示した。2週目と4週目の抗体力価(カットオフODでのサンプル希釈倍率の逆数)を力価±標準偏差として表14にまとめる。
【０３０６】
【表１８】
2006505523.tif 000019
【０３０７】
[0292]  安楽死させたマウスから摘出した脾臓から脾細胞を単離し、アッセイにかけて個別に抗原刺激によるサイトカイン放出またはペプチド刺激による細胞溶解活性を評価した。
【０３０８】
[0293]  サイトカイン放出は、群あたり10頭のマウスに由来する脾細胞を96穴平底プレートのRPMI 1640培地(10%FCS添加)で5×105細胞/穴に培養して測定した。細胞培養は4日間、5μg/mL HBsAg、媒体単独(陰性対照)またはPMA/イオノマイシン(陽性対照)の存在下に行った。培地を回収してIFN-γおよびIL-5レベルを評価した。どちらかの免疫調節製剤で処理した動物に由来する脾細胞は、IFN-γ放出の増加とIL-5放出の減少を示した。表15は結果のまとめである。
【０３０９】
【表１９】
2006505523.tif 000020
【０３１０】
[0294]  各群5頭に由来する脾細胞をRPMI 1640 + 10%FCS中に3×107細胞/穴、再懸濁させ、B型肝炎ウイルスCTLエピトープであるペプチドIPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO:41) 1μg/mL添加または無添加で4日間インキュベートした。細胞を洗い、4×106細胞/mlに希釈し、抗体コートELISPOTプレートに移し、5〜16時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を脱イオン水で溶解し、抗IL-4抗体または抗IFN-γ抗体と反応させて、陽性細胞のスコア(スポット形成単位、SFU)を出した。粒子状製剤で処理した動物に由来する脾細胞はIFN-γ陽性細胞数を増加させ、IFN-γ:IL-4産生細胞の比を低下させた。表16は(陽性細胞/105細胞として表示した)結果のまとめである。
【０３１１】
【表２０】
2006505523.tif 000021
【０３１２】
[0295]  各群の残りの5頭に由来する脾細胞を15mLのRPMI 1640 + 10%FCS中に再懸濁させた。この懸濁液12mLを12穴プレートの6穴に分配した。残りの細胞懸濁液は1μg/mLのCTLペプチドIPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO:41)と混合し、3倍量の5.33% Rat T-Stimで希釈し、予めプレートしておいた未刺激の細胞へと分配した。培養液を4日間インキュベートし、2% Rat T-Stimで洗い、リプレートし、さらに2日間インキュベートした。この方法によって精製したエフェクター細胞を、Cr51で、またはCr51+ CTLペプチドIPQSLDSWWTSL(SEQ ID NO:41)で標識したMHCマッチ細胞をターゲットにして評価した。+ISS(溶液または粒子状製剤いずれかの形態)プラスHBsAg(HBsAg/+ISS)で処理した動物に由来する細胞は>70%のターゲット細胞を傷害することを示した。表17は結果のまとめである。
【０３１３】
【表２１】
2006505523.tif 000022
【０３１４】
実施例10:  粒子状組成物によるマウス肺細胞の免疫調節
[0296]  免疫調節製剤に応答する種々の遺伝子の調節をマウス肺細胞で測定した。
[0297]  粒子状製剤はまず1mg/ml+ISS、0.4% TWEEN(登録商標) 85、0.4%オレイン酸の溶液か、または20mg/mL HSA溶液を調製し、次いでその溶液をPMXBで5mg/mlとして調製した。該製剤は室温で24時間静置し、次いで10kDa膜を使用して透析した。粒子状製剤と+ISS単独とを点鼻法で軽麻酔ラットに投与した(用量50μL)。投与6時間後に動物を犠牲にし、肺組織を外科的に摘出し、肺組織のホモジナイゼーションにより細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液から単離したRNAからcDNAを合成し、またTAQMAN(登録商標)Technologyを使用してRNAを定量した。粒子状製剤は大多数の試験遺伝子の著増を誘発した。表18は結果のまとめである。
【０３１５】
【表２２】
2006505523.tif 000023
【０３１６】
実施例11:  粒子状製剤と霊長類でのHBsAg抗体反応
[0298]  B型肝炎ウイルスの表面抗原(HBsAg)+粒子状PMXB/+ISS/Tween/オレイン酸(Tween)製剤に対する免疫反応をヒヒで測定した。粒子状製剤はまず1mg/ml+ISS、0.4% TWEEN(登録商標) 85、0.4%オレイン酸の溶液を調製し、次いでその溶液をPMXBで5mg/mlとして調製した。該製剤は投与前に室温で24時間静置した。該製剤には注射前にHBsAg(20μg)を加えた。対照としてHBsAg単独とHBsAg/+ISSとを使用した。
【０３１７】
[0299]  5〜10頭からなる群を0週目と8週目に、HBsAg単独(20μg、n=5)、HBsAg(20μg)+ISS(SEQ ID NO:1)(1000μg、n=5)またはHBsAg(20μg)+Tween製剤 [1000μg+ISS(SEQ ID NO:1)、n=10)の筋内注射で免疫にした。各免疫処置の2週間後、ヒヒから採血により血清サンプルを採取した。
【０３１８】
[0300]  AUSAB酵素免疫アッセイキット(Abbott Laboratories)を使用して該血清サンプルからHBsAg特異的抗体反応を定量した。人間では10mIU/mlの力価が防御的であると考えられる。表19は結果[各群の幾何平均±SE(標準誤差)]のまとめである。
【０３１９】
【表２３】
2006505523.tif 000024
【０３２０】
[0301]  HBsAg+Tween製剤によるヒヒの免疫は第1回、第2回いずれの免疫後もHBsAg単独による免疫と比較して統計的に高いHBsAg特異的抗体反応を誘発した。このデータは、この粒子状Tween製剤が前記のようにマウスの免疫反応を増進するだけでなく霊長類でも免疫反応を増進することを示す。
【０３２１】
実施例12:  免疫調節組成物の凍結乾燥
[0302]  0.4mLの10%オレイン酸(/水)、4mLの1% Tween 85(/水)、1mLの20mg/ml +ISS(SEQ ID NO:1)および3.6mlのダルベッコ改良リン酸緩衝食塩水を混合して1回分10mLの免疫調節組成物を調製した。十分に混合した後、1mLの50mg/mL硫酸PMXBをボルテックス混合しながら徐々に加えた。次いでこの懸濁液8mLに816mgのスクロースを溶解し、一晩静置した。ボルテックスして粒子を再懸濁させ、懸濁液を2mlのアリコートに分割した。2つのアリコートをバイアルごとドライアイス/エタノールに浸して凍結させた。1つのアリコートはLABCONCO Freezone 4.5フリーズドライヤーに入れ〜0.06mBarの圧力下に一晩凍結乾燥させた。サンプルを室温で2週間保存後に脱イオン水に再懸濁させた。この還元組成物を分析すると、懸濁液中の粒径分布は非凍結乾燥タイムゼロ対照サンプルと同等であった。
【０３２２】
実施例13:  凍結乾燥粒子状製剤に対する抗体反応
[0303]  HBsAg+凍結乾燥粒子状Tween(PMX/+ISS/Tween/オレイン酸)製剤に対する免疫反応をマウスで測定した。Balb/cマウス10頭からなる群を、HBsAg単独1μg、HBsAg + 1または5μg +ISS (SEQ ID NO:1)、またはHBsAg+凍結乾燥(lyoTween)製剤[実施例12の要領で調製。ただし1または5μg +ISS (SEQ ID NO:1)を添加]の皮内注射で免疫した。動物は2週間隔で2回の免疫処置を受けた。各免疫の2週間後にマウスから血清サンプルを採取した。
[0304]  血清サンプルのHBsAg特異的IgG1およびIgG2a反応をELISA法で評価した。マウスではTh1型反応によりIgG2aサブクラスが誘発された。抗体力価を各群の平均力価±標準偏差として表20にまとめる。
【０３２３】
【表２４】
2006505523.tif 000025
【０３２４】
[0305]  HBsAg+凍結乾燥Tween製剤の投与を受けたマウスではIgG1および特にIgG2a力価が、第1回、第2回の両免疫後に、HBsAg単独の投与を受けたマウスと比較して劇的に上昇した。これは凍結乾燥Tween製剤が非凍結乾燥Tween製剤と同様の免疫反応増進能をもつことを示す。
【国際調査報告】
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