(57)【要約】生化学系の生物学モデルが生物学データの分析の強力な概念的手段であることが判明した。生物学データはほとんどディファレンシャルディスプレー型式で存在する点で特徴的である。本発明(図1)は人工知能(AI)を用いて生物情報データ(単位操作)を合成することにより生理の基礎となるモデルを構築および分析する(仮想数学モデル)。AI法に加えて、本発明は微分方程式[例えば、ミカエリスメンテン反応速度式、d/dt(基質[t])=-酵素[t]基質[t]/(Km+基質[t])]および線形代数 (即ち、ミカエリスメンテン反応速度式の線形微分方程式およびそのラプラス変換)の該モデルの別の数学ドメインへの再計算での使用を記載する。モデルの検証のためのディファレンシャルディスプレーデータ型式の直接の使用により、生理的およびその他の複雑な系のモデリングに変わるグローバルな解に向けた代替策がより完全となる。
2006501579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法:
a) システムコンポーネントのセットになし得るすべての作用の全部またはサブセットを表す複数の単位操作を提供する工程; 
b)該単位操作のサブセットを含む第一の仮想数学モデルを提供する工程;  
c)第一の人工知能(AI)アルゴリズムを該第一の仮想数学モデルに適用し、第二の仮想数学モデルを作る工程;
d)適合度関数を用いて該第二の仮想モデルにフィルターをかけ少なくとも第三の仮想数学モデルを作成する工程。
【請求項２】
該適合度関数が少なくとも第一のセットの実験データとの適合度比較を含む請求項1の方法。
【請求項３】
該適合度関数が該データの少なくとも第一の調整可能なパラメーターを調整するための少なくとも１つの重み付け因子を含む請求項1または2の方法。
【請求項４】
該方法がさらに工程c) およびd)を反復して行うものである請求項1、2または3の方法。
【請求項５】
該AIアルゴリズムが遺伝的アルゴリズムである請求項1、2、3または4の方法。
【請求項６】
該適合度関数が第一のセットの実験データとの比較を利用する請求項1、2、3、4または5の方法。
【請求項７】
該第一のセットがディファレンシャルディスプレーデータ地点のセットを含む請求項6の方法。
【請求項８】
該ディファレンシャルデータ地点がディファレンシャル遺伝子発現データ地点を含む請求項7の方法。
【請求項９】
該ディファレンシャル遺伝子発現データ地点が正常組織と比較した癌組織から作成される請求項8の方法。
【請求項１０】
該癌組織が乳癌、前立腺癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌および心臓癌からなる癌組織の群から選択される請求項9の方法。
【請求項１１】
該ディファレンシャルディスプレーデータ地点がディファレンシャル気候パターン地点を含む請求項7の方法。
【請求項１２】
該ディファレンシャルディスプレーデータ地点がディファレンシャル交通パターンデータ地点を含む請求項7の方法。
【請求項１３】
該ディファレンシャルディスプレーデータ地点がディファレンシャル金融市場データ地点を含む請求項7の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む生物学的システムの数学モデルを作成する方法:
a)生化学システムパラメーターのセットを規定する複数の一次偽遺伝子単位操作を提供する工程;
b)該偽遺伝子から第一のセットの一次偽染色体を作成する工程;
b)適合度関数を備えた遺伝的アルゴリズムを該一次偽染色体のセットに適用して第二のセットの二次偽染色体を作る工程; 
c)該第二のセットの二次偽染色体を少なくとも第一のセットの実験データと比較する工程;
d)所望により工程b)およびc)を反復して該数学モデルを含むグローバル最適点解を得る工程。
【請求項１５】
該第一のセットの実験データがディファレンシャルデータ地点のセットを含む請求項14の方法。
【請求項１６】
該ディファレンシャルデータ地点がディファレンシャル遺伝子発現データ地点を含む請求項15の方法。
【請求項１７】
該ディファレンシャル遺伝子発現データ地点が正常組織と比較した癌組織から作成される請求項15の方法。
【請求項１８】
以下の工程を含む方法:
a)システムパラメーターのセットを規定する複数の単位操作を提供する工程;
b)該単位操作のサブセットを含む第一の仮想数学モデルを提供する工程; 
c)第一の人工知能(AI)アルゴリズムを該複数に適用して第二の仮想数学モデルを作る工程;
c)該第二の仮想モデルを少なくとも第一のセットの実験データと比較して該第一の仮想モデルと該データの少なくとも第一の差異を明らかにする工程;
d)該第一の差に適応するように該第一のアルゴリズムを変更して第二のAIアルゴリズムを作る工程;
e)該第二のAIアルゴリズムを該第二の仮想モデルに適用して第三の仮想モデルを作る工程;および、
f)該第三の仮想モデルを該第一のセットのデータと比較する工程。
【請求項１９】
以下を含む特定の様式でコンピュータを機能させるコンピュータ読み取り可能メモリ:
a)単位操作を受容および記録し、少なくとも第一の仮想数学モデルを作る単位操作モジュール; 
b)人工知能アルゴリズムに適用する分析モジュール; 
c)仮想モデルを少なくとも第一のセットの実験データと比較する比較モジュール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は35 U. S. C. §119 (e)に基づき、米国出願60/415,481からの優先権を主張し、その全体を引用により本出願に含める。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの全解読が薬剤の発見の展望を劇的に拡大させると予測される。5,000以上の新規薬剤発見の標的が、新規に発見された数千の遺伝子から次なる数年の間に出現するであろうと見積もられる。10年前にはヒト遺伝子の10%未満しか知られておらず、それによって薬剤の発見の可能性がひどく制限されていた。実際、現在入手可能な処方薬は500の標的にしか攻撃しないものであると評価されている。
【０００３】
ところが、ヒトゲノムの大きさは広く予測されていた数（100,000以上と見積もられていた）よりもかなり小さく、30,000 〜40,000遺伝子しかないことが明らかとなった。しかし、これは薬剤の発見の可能性が以前に考えられていたよりも制限されてしまったということを意味するわけではない。ヒトの生物学の複雑さのほとんどはその遺伝子数にあるのではなく、遺伝子産物数に起因することは明らかである。1つの遺伝子は、複数のタンパク質産物を作ることが判明し、これは古典的な生物学的ドグマに反するものである。したがって、30,000の遺伝子から250,000以上のタンパク質が翻訳され、そのほとんどが有用な薬剤の発見の標的である。さらに、タンパク質-タンパク質相互作用はもう１つの可能性のある薬剤の発見の標的のセットを構成する。新規薬剤の発見の標的の可能性のある総数は遺伝子数により制限されるものではなく、実際はその数桁倍である。この可能性のある多数のタンパク質は複雑かつ多次元の代謝およびシグナル伝達系路に編成され、生物学的目的を果たす。
【０００４】
細胞内のシグナル伝達系路はしばしばエフェクター刺激により開始し、細胞生理における表現型的に識別可能な変化をもたらす。細胞内シグナル伝達系路が疾患の病因に重要な役割を果たすにも拘わらず、多くの場合、最初の刺激と最後の細胞の応答以外のシグナル伝達系路についてはあまりわかっていない。代謝経路は典型的には高度に分岐した構造であり、細胞が多くの状況において生存するための基礎的要素およびエネルギーの供給に必要とされる多数の代謝産物の合成または異化を可能にするように進化してきた。これら代謝ネットワークは配電網のように構築されており、１つの経路が阻害されると別の経路が迂回して必要な分子を供給することが出来るようになっている。
【０００５】
歴史的には、シグナル伝達系路および代謝経路は生化学または遺伝学によって解析されてきた。生化学アプローチは経路を「飛び石」のように解析する:経路の一端において作用あるいは関与する分子が見つかるとアッセイできる量を単離し、単離されたものの経路の上流または下流の次の分子の決定に取り組む。
遺伝学アプローチは古典的には「当てずっぽう」である:シグナル伝達系路中に突然変異体を導入または誘導し、遺伝的交差またはcDNAライブラリーを用いた突然変異を補うものの同定によりその座位を位置づける。
生化学アプローチの限界には、試験中の構成成分に関する既存の知識にかなり依存すること、そしてインビトロを超えて解剖実験を行う必要があることが含まれる。純粋に遺伝学的なアプローチの限界には、最初に目的を決め、次に経路を特徴づけてから、遺伝子を同定およびクローニングすることの必要性が含まれる。
【０００６】
伝統的には、生化学的シグナル伝達系路は解明がおそく、順次に行う必要があり、かなりの「ウェット化学」の研究期間を必要とする。代謝経路が全部または文献から部分的に知られることがあるが、これらの経路の数学モデルは通常利用できない。
ハイスループットmRNA、タンパク質および代謝産物プロファイリング方法の出現により、現在ではモデルを適用しうる濃度および流動データの作成が可能である。かかる生物学的モデルはモデルを確認するさらなる実験の予測、いまだ同定されていない生物学成分の必要性の予測または症状を緩和し、結果を予防し、治療に影響を及ぼす医療行為の最善手段の決定に有用である。
Lederberg and McCrayは44種の「オミクス（omics）」技術を2001年のMEDLINEサーチに基づいて報告している(Lederberg et al.、The Scientist 15: 8 (2001)）。Anderson and Sielhammer(Anderson et al.、Electrophoresis 18: 533 (1997) および Gygi et al. (Mol. Cell Biol. 19: 1720 (1999))はmRNAおよびタンパク質レベルが相関しないことを適切に示し;それゆえ、単一の次元の「オミクス」の評価には問題がある(例えば、マイクロアレイデータにおけるmRNA発現)。各機器分析技術は疾患または治療に応答して細胞内で起こる生化学的変化の一面しか提供しない。薬剤の発見および開発は迅速に変数の多い環境になってきている;常に「オミクス」データが増加している:
・ゲノミクス（以下を含む）:
-化学的ゲノミクス、遺伝的変異性およびその効力および毒性に対する効果の分析
-発現ゲノミクス、組織および疾患状態による遺伝子発現のパターンの分析
・プロテオミクス（以下を含む）: 
-発現プロテオミクス、疾患状態の関数としての細胞内の各タンパク質の定量および同定 
-相互作用プロテオミクス、各タンパク質- タンパク質およびタンパク質-リガンド相互作用の同定及び定量
-構造プロテオミクス、すべてのタンパク質の三次元構造の決定(実験的または最初からのモデリングによる)
・メトミクス、組織における低分子の流れの定量（以下を含む）:
-薬物の吸着、代謝、蓄積、および排出(ADME) 
-メタボロミクス、組織および細胞における同化、異化、および代謝産物の輸送の定量
・セロミクス（以下を含む）: 
-目的分子の細胞内分布、細胞内局在の同定
-サイトメトリー、イメージングまたはフロー方法による細胞の型または特性の決定(病理を含む)
【０００７】
生理的またはシステム生物学モデルの開発における２つの難題は、モデル自体の複雑性と、モデルによって説明しなければならない「オミクス」データのすべての不完全性、幅および質である。データの不完全性によって、適合させるために複数のモデルがしばしば必要となる。入手可能な「オミクス」データの幅により、問題の第一の原理またはヒト分析から構築するのが困難な、パラメーターが多く複雑なモデルが導かれてしまう。現在の「オミクス」データの質は低いことが多く(即ち、標準偏差が大きい)またはパラメーター決定に入手可能な質の低いデータの複数のセットにより、互いに矛盾する条件を含むことになる。最後に、ほとんどの「オミクス」データは、レシオメトリックまたは比較的豊富な測定値として存在し、生化学モデルの開発に典型的に必要な必要的絶対的集中データが供給さない。かかるタイプのデータはしばしば「ディファレンシャルディスプレー」と称される。例としては:タンパク質発現解析のための、同位体コード化アフィニティータグ(ICAT（商標）)１および同位体差別化結合エネルギーシフトタグ (IDBEST（商標）)２ならびに核磁気共鳴(NMR)３および質量分析 (MS)４による２つのサンプル間の転写産物相対比の比較のための安定同位体比方法が挙げられる。
1 Aebersold, R. H., et al., WO 00/11208 (Mar. 2,2000). 
2 Schneider, L. V. et al., WO 01/49951 (Aug. 29,2002) ; Hall, M. P. et al., paper presented at the Amer. Soc. Mass Spectro. 50th;Annual Meeting, Orlando, FL (June, 2002). 
3 Gonzalez, B. , Piotto, M. , and G. Huber, WO 02/31523A1 (Apr. 18,2002). 
4 Schneider, L. V. et al., WO 00/63683 (Oct. 26,2000) 
【０００８】
しかし、最近の研究はコンピュータ技術の使用を注目しており、これは、電気工学分野において回路のモデリングに使用されているのと類似であり、これによってシステム生物学の分析を行うものである。以下に詳細に記載するシステム生物学は、増加しつつある生物学的データベースから得られたデータ(例えば、ゲノミクス、プロテオミクス、メトミクス、セロミクスデータ等、ここで「オミクス」データと称する)および実験データを統合することによる生化学的経路の数学モデル化であり、疾患または細胞状態の生化学の基礎となる知識を産むものである。
【０００９】
進化計算技術を用いた様々なタイプのデータの分析に関する様々な方法が記載されている。US 6,282,527 B1; 5,914,891; 6,051,029; 6,078,739; 6,069,629; 5,947,899; WO 99/27443; WO 00/63793; WO 00/65523; WO 01/98935; WO 02/05205; WO 02/44992を参照、これらはすべてその全体を引用により本明細書に含める。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、天然の生化学を基礎づける情報が完全には知られていない、即ち不完全である、システム生物学モデルの発達および進展を可能にする方法の必要性が未だに存在する。生物学的設定に有用なモデルの構築に有用な方法はさらに、その他の複雑かつ変数の多い「システム」においても潜在的に有用である。かかるシステムとしては、例えば、交通パターン、気候パターン、金融および市場分析などが挙げられる。特定のさらなる必要性はディファレンシャルディスプレーデータ型式に適合しうるモデリングアプローチの開発である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は個々の工程が数式に従う複雑なシステムの数学モデルの作成、解明および完成に有用な組成物および方法を提供する。さらに、本発明は差分方程式をモデル化する手段を提供し、これによってモデルパラメーターがディファレンシャルディスプレー「オミクス」データ型に直接適用できるようになる。最後に、本発明はその解決を加速するためのその他の数学ドメインにおける差分方程式モデルの作成手段を提供する。
【００１２】
発明の概要
本明細書に記載の目的に従って、本発明は１セットのシステムコンポーネントに対してなされうるすべての作用の全部またはサブセットを表す複数の単位操作（unit operations）を提供することを含む方法を提供する。該方法は、単位操作のサブセットを含む第一の仮想数学モデルを提供する工程および第一の人工知能(AI)アルゴリズムを第一の仮想数学モデルに適用して第二の仮想数学モデルを作る工程を含む。１つの態様において、適合度関数（fitness function）を用いて第二の仮想モデルにフィルターをかけ少なくとも第三の仮想数学モデルを作る。一般に、適合度関数は実験データに基づく。あるいは、第二のモデルを直接実験データと比較し、データとモデルの差異を明確化する。これら方法は所望により反復してもよい。
【００１３】
別の態様は、１セットの生化学システムコンポーネントになし得るすべての作用の全部またはサブセットを表す複数の一次偽遺伝子単位操作を提供することを含む生物学的システムの数学モデルの作成方法である。該方法は、偽遺伝子から第一のセットの一次偽染色体を作る工程および適合度関数を備えた遺伝的アルゴリズムを該セットの一次偽染色体に適用して第二のセットの二次偽染色体を作る工程、そして所望によりそれを反復することを含む。
【００１４】
さらなる態様において、該方法は、使用するアルゴリズムの調整方法を含む。この態様において、該方法はシステムコンポーネントになし得るすべての作用の全部またはサブセットを表す複数の単位操作を提供する工程、および第一の人工知能(AI)アルゴリズムを該複数に適用して第二の仮想数学モデルを作る工程を含む。第二の仮想モデルは少なくとも第一のセットの実験データと比較して第一の仮想モデルとデータの間の少なくとも第一の差異を明確にし、第一のアルゴリズムを第一の差に適応するよう変化させ、第二のAIアルゴリズムを作る。第二のAIアルゴリズムを第二の仮想モデルに適用して第三の仮想モデルを作り、これを第一のセットのデータと比較する。
【００１５】
別の態様において、本発明はコンピュータを特定方法で機能させるコンピュータ読み取り可能メモリを提供し、これは単位操作を受け取り保存し、少なくとも第一の仮想数学モデルを作る単位操作モジュール、人工知能アルゴリズムを適用する分析モジュールおよび仮想モデルを少なくとも第一のセットの実験データと比較する比較モジュールを含む。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は様々なシステムのための数学モデルを作り、最適化するための進化的コンピュータ技術の使用に関し、これに限定しないが遺伝的アルゴリズム(GA)が含まれる。システムはいずれの科学的システムであってもよく、例えば、生化学的/生理的システム、気候システム、交通システム、経済および金融システム、市場分析システムなどが挙げられる。以下の議論は生理的システムに関する。
【００１７】
システム生物学モデルの構築における困難は基礎にある生化学の複雑性である。生物学ネットワークが大きいほど、モデルを作成するのは困難となり、より複雑で(例えば、多数の調整可能なパラメーター)、より多くのモデルが入手可能なデータへの適合のために提案されうる。また、システム生物学プロセスの制限は人間の精神、即ちその１セットの生物学経路を説明するために可能性のあるモデルの順列をすべて考え得る能力である。
【００１８】
逆に、自然はそのもっとも基本的生化学レベルにおいてそれほど多様ではなく、高度に機能が維持されている。生化学においては多くの普遍的モチーフがあり、例えば、すべての生命は核酸、タンパク質、脂質および炭水化物で構成されている。リボゾームおよび翻訳コードは原核生物および真核生物の世界で高度に保存されている。原核生物および真核生物の両方における一次エネルギー生産工程は細胞膜を横切るプロトン駆動力である。ヌクレオチド三リン酸は異化および同化代謝の間のエネルギー移動としてすべての生物に普遍的に用いられている。すべての既知の好気性生物は解糖 (Embden-Meyerhof)経路とトリカルボン酸回路を含む。細胞膜を横切る分子の輸送は、拡散性、促進性、または能動性のいずれであってもよい。ヒスチジンタンパク質キナーゼシステムは細菌における多くのシグナル伝達プロセスの基礎をなし、例えば、G-タンパク質共役受容体(GPCR)シグナル伝達はほとんどの哺乳類ホルモン及び知覚プロセスに普遍的である。さらなる例とセットを以下に示す。生物システムのモデル化における複雑性、およびその基礎にある生物多様性は、どのように個々の生物がそれら基本的生理的単位をつなぎあわせて細胞機能を達成するかに起因する。
【００１９】
したがって、これら生物経路(本明細書において「代謝経路」または「シグナル伝達経路」と称することもある)は、分類および特徴付け、ならびに時間的に編成されうる一連の異なる生物工程からできている。例えば、特定の経路は特定かつ要求された時間的順序において7つの工程を含み、生物学的目的を達成する。これら7つの工程は、以下に示す基本的生化学レベルを規定する大きいが有限の生理的単位操作のリストから個々に選択されうる。例えば、個々の生理的単位操作は以下を含んでいてもよい：酵素工程(例えば、プロテアーゼ、キナーゼ等についてミカエリスメンテンまたはピンポン動力学)、転写制御(例えば、構成的、抑制的、活性化可能等)、膜輸送(例えば、能動、受動、促進等)、結合平衡(例えば、アフィニティー定数等)、拡散(DNAに対する発現プロモーターまたはRNAに対するリボゾーム作用においては線形;膜タンパク質においては二次元;そして細胞質または細胞外マトリックスの場合には三次元)、酵素制御(アロステリック、共有結合修飾等)、対流性輸送(例えば、血液またはリンパ液循環による組織間輸送、消化管を横切る物質の移動等)。即ち、生理的単位操作はシステムの成分に対してなされる作用である。したがって生理的単位操作は１つの式または式のセットで表しうる１つの数学モデルを共有する一セットの生化学を表す;生理的単位操作は数学モデルである。セットの各メンバーは、そのメンバーが作用するその他の分子の実体(例えば、酵素の基質と生成物)、モデル式の調整可能なパラメーターの値(例えば酵素の速度とミカエリス定数)によってその他のメンバーとは異なる。したがって、いかなる特定の経路またはシステムもかかる生理的単位操作のいずれかの組み合わせを特定の順序で含みうる。例えば、ある経路が5工程経路であると知られており、7種類の可能な生理的単位操作がある場合、75種類の組み合わせが生じうる。しかし、生化学的経路は分岐点に当たる前のいくつかの変換工程に直列的に作動することはない;三次元において、システムは余剰を含めて、同じ5工程の経路について1012を超える可能性のあるモデルを作り、試験する必要がある。
【００２０】
本発明はコンピュータによる方法の使用に関し、これによって生物経路を含む特定のシステムの数学モデルの作成、検証および／または微調整が可能となる;本質的には、本発明は最適化モデル、特にシステム生物学モデルの進化を駆動するエンジンを作り、試験する自動化された仮説である。好適な態様において、これらコンピュータによる方法は以下にさらに説明する進化的なコンピュータによる方法である。この「インシリコ」試験により、多くの可能性のある組み合わせの排除が可能になり、したがって有意に実験データを説明する組み合わせに研究者が集中できるようになる。ある場合には、解が見いだされ(単一の解に収束する)、これは実験的に試験しうる;あるいは、プロセスは収束に至らず、いくつかのモデルが同等にまたは同程度にデータに適合し、これらを試験すればよい;同様に、該プロセスを繰り返し用いて新たな試験モデルを作成することも出来る。
【００２１】
本発明は３つの主要な態様で有用である:好適な態様において、本発明は既存のシステムの数学モデルの確認に有用である。第二に、本発明は実験データに適合するすべての可能な生理的単位操作を見いだすことによって、経路において失われた工程を「埋める」のに有用であり、研究者がそれらに集中することが可能となる。最後に、本発明は１または複数の経路の事実上「新規」な解明により、数学モデルを作成するのに有用であり得る。
【００２２】
本発明はこれら結果を達成するために様々な人工知能(AI)計算技術を利用することが出来る。特に、進化的計算技術、例えば、遺伝的アルゴリズム、進化的プログラミング、進化戦略、分類子システムおよび遺伝的プログラミングのいずれも利用できる。例えば、遺伝的アルゴリズムは好適な態様において使用しうる。GAを以下に説明するが、一般に、生理的単位操作が偽遺伝子となり、これらが編成されて偽染色体となり、データが説明される;例えば、5工程の経路は5つの偽遺伝子偽染色体によって表され、偽遺伝子の順と実体が経路を規定する(図3および4参照)。特定の偽染色体がデータに適合しない場合、それを別の偽染色体と「かけあわせ」、または「組換え」て適合度について評価する。即ち、偽染色体の対が「親」(一般に最高の適合度（例えば、データに適合する能力）の等級であるもの、本明細書において「一次偽染色体」とも称される)として選択され、これら対が様々な技術を用いてかけあわされて「子」または「二次」(またはより高次の)偽染色体が作られる。これら「子」は実験データに対して評価され、プロセスが反復されてよりよい「適合」の偽染色体が作られる。高次染色体を用いて染色体の質よりも染色体の次元が参照される。このプロセスをグローバルに最適化された解である偽染色体が得られるまで繰り返す。これは、特定のセットの特定の(時間的)順の生理的単位操作が見つかったことを表す。あるいは、ある場合には、アルゴリズムは収束しない; 複数の解が見いだされるか、あるいは収束が所望でないためである。かかる場合には、複数の実験を行えばよい。さらなる態様において、その他のAI技術を用いてもよく、以下にさらに説明する。
【００２３】
したがって、このアプローチは以下に記載する生理的単位操作のオブジェクト指向ライブラリーの作成からなり、酵素動力学操作、膜輸送操作、および結合平衡モデル等を含む。これら生理機能単位操作は偽遺伝子となり、これは遺伝的アルゴリズム偽染色体を含む(図3および4)。偽染色体はそれ自体モデルであり、単位操作を並べる最適順序を決定する。図示する模式図において、偽染色体は単位操作の直線上配置を表す。しかし、実際に用いる偽染色体は高次元で生化学ネットワークにおける分岐点を収容するものであってもよい。
【００２４】
したがって、このアプローチは偽染色体のよりよいモデルへの進化を指向する適合度関数を利用する。適合度関数はいくつかの部分からなるものであってよい。第一の部分は文献から得られる確認された経路に基づく厳密な生／死決定であり得る。第二の部分は既に作成されたプロテオミクスおよびメタボロミクスのデータに対する適合度であり得る。最後の部分はユーザーが規定できる限定的仮想からなる。かかる限定的仮想の例はモデルが安定であることの要求である(即ち、与えられたセットの入力に付き単一の定常状態の解を示す)。別の例はより多数の偽遺伝子を含む偽染色体についての適合度関数にペナルティを与えることである。
【００２５】
最適化されたモデルは多くの目的に利用できる。単一のモデルに収束できない場合、１または複数のモデルをインシリコで操作してさらなる実験的検証実験を規定して、複数の最適モデルを識別すればよい。最終的に生き残った１または複数のモデルの感度解析を次に行って最善の診断バイオマーカーおよび治療介入点を決定する。
【００２６】
本発明のある態様において、生理的単位操作は無次元微分方程式のセットからなるものでもよく、各偽染色体モデルの解はタイムドメインにおける数値積分からなる。
【００２７】
本発明の別の態様において、生理的単位操作はモデルのコントロールまたは定常状態形態を差し引くことによって差分方程式に変換できる。本発明のこの態様において、結果的に得られた差分方程式は適合度の試験においてディファレンシャルディスプレーデータ型と共に直接利用することが出来る。
【００２８】
本発明の別の態様において、生理的単位操作は、差分方程式への変換または非線形項のテーラー展開（Taylor series expansion）などの方法により線形化してもよい。その結果得られた線形化された式を次いでその他の数学ドメイン、例えばラプラスドメイン（Laplace domain）(または以下に示すようなその他のドメイン)、に変換し、偽染色体における代数処理によってモデルの解をより速く得る。
【００２９】
これらのモデルは生理的単位操作を表す基本的微分方程式に基づくため、それらはまた予測ツールでもあり、研究者がパラメーターを変更し、「もし〜だったら」というシナリオを演じることが可能となる。実験室データが完全でなく、多数のモデルが同様に良好な適合を与える場合、タンパク質または代謝産物濃度をインシリコで微調整する能力により、研究者が迅速に新規な仮説を立て、最終的な実験を計画して生理的機構の基礎となる真実を識別することが可能となる。いったん生理的モデルが確認されると、それを用いてインシリコでの感度解析により、治療的介入または診断のための最高の標的を選択することができ、したがって治療の最善策または新規薬剤発見のための標的の選択が導かれる。
【００３０】
したがって、本発明はシステムコンポーネントになし得るすべての作用の全部またはサブセットを表す複数の単位操作を提供することを含む方法を提供する。本明細書において「システム」とは数学モデルが望まれるシステムを意味する。当業者に明らかなように、システムは事実上、別個の単位操作を複雑かつ一般に直感的に認識できないパターンにて含むどのようなシステムでもよい。好適なシステムとしては、これらに限定されないが、生物システム、交通システム、気候システム、交通システム、経済および金融システム、市場分析システム等が挙げられる。以下の議論は生物システムに注目するものであるが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
複数の単位操作はシステムコンポーネントのセットの作用を表す。本明細書において「複数」とは少なくとも２つの「単位操作」または「生理的単位操作」(システムが生物学的である場合)が化学工学に共通の定義に一致して規定されていることを意味する[McCabe、W.L. and J.C. Smith、Unit Operations of Chemical Engineering、3rd edition (McGraw-Hill、NY、1976)]。個々のプロセスシステムの数は多いが、それぞれは一連の操作と呼ばれる工程に分けられ、個々の操作は多くのプロセスシステムにおいて現れる。それぞれの個々の操作は共通の技術を有し、同じ科学原理に基づく。これらの原理を定義し、それらを共通の数学的表現に組み入れることにより、個々の操作は単位操作となる。多くの科学原理および技術は単位操作の処理に基本的なものである。なかには基本物理法則および化学原理もあり、例えば質量およびエネルギーの保存、物理および化学平衡、動力学、および特定の物性もある。本明細書において議論するように、生化学的および生理的経路は、個々の要素からなるプロセスシステムであると考えられる。本明細書において議論するように、経路の要素にはこれらに限定されないが、核酸(DNA、RNA (例えば、mRNA、tRNA、snRNA、siRNA等)、タンパク質(例えば、結合性タンパク質、酵素、ペプチド等)、炭水化物、脂質、および代謝産物が挙げられる。一般に以下の議論は、タンパク質要素に関するが、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【００３２】
これらの個々の要素の生化学的性質または特性としてはこれらに限定されないが、酵素動力学式、例えば、ミカエリスメンテン動力学式、膜輸送式、結合平衡式、拡散動力学(例えば、一次元拡散系は、染色体に対するDNA結合タンパク質であり得;二次元分析は細胞膜における受容体であり得;三次元分析は細胞内または細胞間拡散動力学であり得る)、細胞または組織内対流性輸送、または細胞または組織間対流性輸送(例えば、血液、リンパ液または脳脊髄液システムによって輸送される化学物質)、調節機構(例えば、その機能に影響を与える酵素または膜貫通タンパク質のアロステリックまたは共有結合修飾)等が挙げられる。好ましい式としては、これらに限定されないが、単分子化学平衡、二分子平衡、酵素媒介平衡、ミカエリスメンテン動力学、二分子酵素反応、アロステリック上方制御を伴うミカエリスメンテン酵素動力学、およびアロステリック抑制を伴うミカエリスメンテン酵素動力学が実施例に示される。これらの生化学パラメーターから、生理的単位操作が作成される;生理的単位操作は２以上のプロセスシステムに共通の特定の操作に共通する基礎となる科学原理を表す数式である。単位操作は物理的実体、例えば、化学変換、吸着/脱着、拡散、および分子輸送に対してなされる作用を反映する。金融およびマーケティングに関しては、単位操作は、交換、輸送、または他の目的物(例えば外食における換金等)に変換されうる目的物(例えば、物や金)に対してなされる作用を反映する。交通においては、目的物は人および／またはそれらの輸送媒体であって、それに対して交通信号が作用し、収納(駐車場)および流路道)の制限が実行される。
【００３３】
好適な態様において、生理的単位操作はタンパク質を表す;即ち、それらはタンパク質に対してまたはタンパク質によって行なわれ得る生化学作用の一部または全部を表す。本明細書において「タンパク質」とは、ペプチド結合によって少なくとも２つのアミノ酸が結合したものをいう。本明細書において用いる場合、タンパク質には、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。ペプチジル基は天然のアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド疑似構造、即ち「アナログ」、例えば、ペプトイド(Simon et al.、PNAS USA  89(20):9367 (1992)を参照)を含みうる。アミノ酸は用途に応じて天然のものでもそうでなくてもよく、以下により完全に記載する通りである。例えば、候補生理活性(例えば、薬物)薬剤スクリーニングが行われる場合、候補薬剤は合成ペプチドであってもよい。側鎖は(R)配置でも(S)配置でもよい。好適な態様において、アミノ酸は(S)即ちL配置である。
【００３４】
好適な態様において、生理的単位操作は酵素を表す;例えば、単位操作は酵素に対してまたは酵素によってなされうる手順の全部または一部を表す。当業者に明らかであるように、代謝経路には多数の酵素が含まれ、例えば、加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ）;イソメラーゼ（例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼまたはムターゼ）; 転位酵素、キナーゼおよびホスファターゼが挙げられる。好ましい酵素としては以下が挙げられる。基の転移を行うもの、例えばアシル基転移を行うもの、例えば、エンドおよびエキソペプチダーゼ(セリン、システイン、金属および酸プロテアーゼ);アミノ基およびグルタミル転移を行うもの、例えば、グルタミナーゼ、γグルタミルトランスペプチダーゼ、アミド転位酵素等; ホスホリル基転移を行うもの、例えばホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、キナーゼ、およびホスホリラーゼ; ヌクレオチジルおよびピロホスホチル転移、例えば、カルボキシラート、ピロホスホリル転移を行うもの; グリコシル基転移を行うもの;酵素的酸化および還元を行う酵素、例えば、デヒドロゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、オキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、レダクターゼなど;除去、異性化および再編成を触媒する酵素、例えば、以下を用いる水の除去／付加：アコニターゼ、フマラーゼ、エノラーゼ、クロトナーゼ、炭素-窒素リアーゼ等;そして炭素-炭素結合を作るまたは切断する酵素、即ちカルボアニオン反応を行うもの。特定の単位操作は広範な酵素について知られている。特に、プロテアーゼ、例えば、セリン、システイン、アスパルチルおよび金属プロテアーゼ、例えばこれらに限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、およびその他の治療関連セリンプロテアーゼ、例えば、tPAおよびその他の血栓溶解カスケードのプロテアーゼ；以下を含むシステインプロテアーゼ: カテプシン、例えばカテプシンB、L、S、H、J、NおよびO;およびカルパイン;金属プロテイナーゼ、例えばMMP-1〜MMP-10、特に、MMP-1、MMP-2、MMP-7およびMMP-9;およびカスパーゼ、例えば、カスパーゼ-3、-5、-8およびその他のアポトーシス経路のカスパーゼ、およびインターロイキン-変換酵素(ICE)。好適な酵素はSwiss-Prot 酵素データベースに列挙されている。酵素は天然であっても酵素の変異形態であってもよい。例えば、多くの疾患状態は変異酵素に起因する。
【００３５】
好適な態様において、タンパク質は結合性タンパク質であり、生理的単位操作は一般に結合平衡式およびアフィニティー定数を含む。例えば、好ましい多様なシグナル伝達経路に重要な結合性タンパク質は、リガンドと細胞表面受容体の対である(そのなかには酵素、例えばキナーゼも含まれる)。好適なリガンドにはこれらに限定されないが、以下からなる群から選択される細胞表面受容体に結合するリガンドの全部または機能的部分が挙げられる：インスリン受容体(インスリン)、インスリン-様増殖因子受容体(IGF-1とIGF-2を含む)、成長ホルモン受容体、グルコーストランスポーター(特に、GLUT 4 受容体)、トランスフェリン受容体(トランスフェリン)、上皮増殖因子受容体(EGF)、低密度リポタンパク質受容体、高密度リポタンパク質受容体、レプチン受容体、エストロゲン受容体(エストロゲン);インターロイキン受容体、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、およびIL-17 受容体、ヒト成長ホルモン受容体、VEGF受容体(VEGF)、PDGF受容体(PDGF)、トランスフォーミング増殖因子受容体(例えばTGF-αおよびTGF-β)、EPO受容体(EPO)、TPO受容体(TPO)、繊毛様神経栄養因子受容体、プロラクチン受容体、およびT-細胞受容体。特に、ホルモンリガンドが好ましい。ホルモンにはステロイドホルモンとタンパク質性ホルモンの両方が含まれ、例えばこれらに限定されないが、以下が挙げられる：エピネフリン、チロキシン、オキシトシン、インスリン、甲状腺刺激ホルモン、カルシトニン、絨毛性ゴナドトロピン、副腎皮質刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グルカゴン、ロイテイナイズ（leuteinizing）ホルモン、リポトロピン、メラノサイト刺激ホルモン、ノルエピネフリン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、バソプレッシン、エンケファリン、セロトニン、エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾン、およびグルココルチコイドおよび上記のホルモン。受容体リガンドには細胞表面受容体などの受容体に結合するリガンドが含まれ、例えば、ホルモン、脂質、タンパク質、糖タンパク質、シグナル伝達因子、増殖因子、サイトカイン等が挙げられる。
【００３６】
好適な態様において、生理的単位操作は炭水化物を含む。本明細書において「炭水化物」とは、一般式Cx(H2O)yの化合物を意味する。単糖類、二糖類、およびオリゴ-または多糖類がすべてこの定義に含まれ、グリコシド結合で結合した様々な糖分子のポリマーが含まれる。特に好ましい炭水化物はグリコシル化タンパク質の炭水化物要素の全部または一部を含み、以下のもののモノマーおよびオリゴマーが含まれる：ガラクトース、マンノース、フコース、ガラクトサミン、(特にN-アセチルグルコサミン)、グルコサミン、グルコースおよびシアル酸、そして特に、細胞表面受容体などの特定の受容体への結合を可能とするグリコシル化要素である。その他の炭水化物としては以下のもののモノマーおよびポリマーが含まれる：グルコース、リボース、ラクトース、ラフィノース、フルクトース、およびその他の生物学的に重要な炭水化物。
【００３７】
好適な態様において、生理的単位操作は脂質を含む。本明細書において用いる「脂質」には、脂肪、脂肪油、ワックス、リン脂質、糖脂質、テルペン、脂肪酸およびグリセリド、特にトリグリセリドが含まれる。脂質の定義には以下のものも含まれる：エイコサノイド、ステロイドおよびステロール。そのなかには、ホルモンであるものもある。例えば、プロスタグランジン、オピエートおよびコレステロール。例えば、アポトーシスおよび細胞死の際に、細胞膜内の脂質の極性が有意に変化し、健康な細胞状態において存在する二重層の内側と外側の非対称性分布がより対称的となる(例えば、脂質が二重層の平衡にむけて「フリップ」する）。
【００３８】
好ましい生理的単位操作は酵素を表し、以下のミカエリスメンテン式を含む: 
【数１】
2006501579.tif 000003
【００３９】
単位操作は一般にデータベースへと編成される。当業者に明らかなように、これを行うには様々な手段がある。１つの態様において、生理的単位操作はタイムドメインにおける微分方程式のシステムの形態であり、そのまま記録する。しかし、様々な理由でこれは好ましくはない;積分は時間がかかり、計算も大変である。さらに、微分方程式の使用は積分ツールの使用を必要とし、その結果得られるシステムモデルは通常数字的に解決されるに過ぎない。ヒト生理機能に関与する多種多様な時間スケールにより、即ち、癌性の腫瘍は何年もかけて発達する一方、代謝変換は数秒で起こりうることにより、これらのモデルの多くは難しい微分方程式となってしまう。難しい微分方程式のシステムの有効な解を得るには、難しい微分方程式のために設計された予測子-修正子積算器が必要である。いくつかのかかる難解な積算器のためのオープンソースコード(例えば、GEARおよびRODAS)が文献に詳細に説明されている。Rosenbrock法(RODAS)は化学反応式および生化学システムの解を得るのに特に好適であるようであり、Berkeley Madonna パッケージに組み込まれている。これは、前もって作られたいくつかの生化学的経路例を備えている。しかし、微分方程式アプローチは多数の調整可能なパラメーターを作るため、より多くのモデルが特定のデータセットに適合するのを可能にする。最後に、モデル間の識別には、現在の「オミクス」データベースにより入手可能なものと比較して、より正確、定量的、絶対的発現データが必要である。現在「オミクス」データベースにあるデータのほとんどは示差発現型(即ち、GeneChip（商標）、プロテオミクスデータ、ICAT（商標）、およびSIRメタボロミクスデータ)であり、これは絶対的な意味においてわずかなパラメーター、例えば濃度や速度定数、しか知られていないことを意味する。
【００４０】
したがって、好適な態様において、生理的単位操作は別の数学ドメインに変換される。一般に、代数的操作により解決可能なドメインに微分方程式を変換するいずれの線形変換を用いてもよい。当業者に明らかなように、好適な入手可能な変換は多数あり、これらに限定されないが、以下が挙げられる。ラプラス変換、Buschman 変換、フーリエ変換(それには様々な種類がある、例えば、離散時間型フーリエ変換(DTFT)、連続時間フーリエ変換(CTFT)、高速フーリエ変換(FFT)等)、フーリエ-スティールチェス変換、G-変換、H-変換、アダマール変換、ハンケル変換、ハートレイ変換、ハフ変換、Kontorovich-Lebedev変換、Mehler-Fock 変換、Meijer 変換、Narain G- 変換、Operationaal Mathematics、ラドン変換、スティールチェス変換、W-変換、ウェーブレット変換、Z- 変換等。
【００４１】
しかし、微分方程式を代数的操作に変換する際の１つの制限は、これら変換(例えば、ラプラスドメイン)には線形化式の使用が必要であることである。したがって、多くの生理的単位操作は非線形微分方程式として表されており、線形化されなければならない。線形化は当業者に明らかなように様々な手段で行うことができる。好適な態様において、以下により詳細に説明するように、非線形性を無視するために特定の係数の重要性についていかなる数の仮定を作ってもよい。あるいは、線形部分の和を得るような拡張を行ってもよく、そして高次項のいくつかを排除すればよい; 例えば、テーラー級数拡張を行うとよい。
【００４２】
好適な態様において、線形化は一般的な生物学的仮定を用いて行うか、あるいはラプラスドメインの時間のいずれかにおける差分方程式を用いて行う(例えば、単位操作が変換されてコントロールからの偏差を表す場合)。差分方程式の使用には、現在の「オミクス」データへとより直接的にマッピングできるという利点があり、これは典型的には、コントロールのそれからの発現における変化として表される。
【００４３】
ミカエリスメンテン動力学の式を用いてこれらの代替的アプローチを説明することが出来る。微分方程式形態においてはこれは以下の通りである:
【数２】
2006501579.tif 000004
【００４４】
解の形態が知られていない限りは、この式は線形ではないのでこの式のラプラス変換を直接行うことは出来ない。しかし、その二極の１つにおいて式を線形化することはできる。基質[t]>> Kmの場合、線形微分方程式(2)およびそのラプラス変換(3)が得られる:
【数３】
2006501579.tif 000005
【数４】
2006501579.tif 000006
【００４５】
基質濃度が高くない場合どうするべきかという問題が残る。ここで差分方程式の概念は有用である。ある期間にわたる基質(ΔS[t])および酵素 ΔE[t])濃度のコントロール状態(c)からの偏差を定義する場合:
【数５】
2006501579.tif 000007
であり、以下の微分関係が得られる:
【数６】
2006501579.tif 000008
式4、5、および6をミカエリスメンテン式(1)に置換すると以下となる:
【数７】
2006501579.tif 000009
もしΔS[t]が(Km + 基質[c])からわずかしか偏位していないとすると、最初の二項が削除され第一の近似が得られる。もし二次偏差(ΔS[t]ΔE[t])も無視できるとすると、線形化偏差式(8)およびそのラプラス変換(9)が得られ、酵素レベルの変化を基質レベルの変化と関係づけることが可能となり、第一の近似が得られる。
【数８】
2006501579.tif 000010
【００４６】
式9のラプラス逆変換を行うと、定常状態と動的状態の両方の解が得られ、これは酵素レベルの変化と(遺伝子またはタンパク質発現データから決定する)基質レベルの変化を(プロテオミクスまたはメタボロミクスデータから決定する)相関させる。式9における分子は、酵素濃度の上方制御が翻訳されて比例定数(G)のコントロール状態に比べて基質濃度の減少を導くことを示唆する:
【数９】
2006501579.tif 000011
【００４７】
基質濃度が酵素濃度と比べて低い場合、酵素濃度に大きな変化が起きても、基質濃度の変化はほとんどみられない。この状況の例はタンパク質キナーゼ活性であろう。しかし、基質濃度が酵素濃度と比べて高い場合、酵素濃度にわずかな変化が起きると非常に大きな基質濃度の変化が起こる。低分子代謝(例えば、コレステロール分解または糖代謝)はこの例を提供しそうである。さらに、式9の分母は基質がその新しい濃度に以下の時定数（τ）の単純な指数関数的減衰にて近づくことを示唆する;
【数１０】
2006501579.tif 000012
そしてコントロールサンプルにおける基質濃度が高いほど、それはよりゆっくりと新しい値に近づく。しかしこのアプローチの真の力は、ディファレンシャルディスプレーデータ−もっとも一般的な形態の「オミクス」データ−を直接的に扱うことを可能とすることである。というのはそれは、遺伝子、タンパク質、および代謝産物濃度の絶対値の測定の必要性を排除するからである。Gとτはともにディファレンシャルディスプレーデータへの曲線の当てはめによって決定できる。速度(k)とミカエリス(Km)定数の独立の測定ができれば、実際の基質および酵素濃度は式10と11の同時解決によって決定できる。したがって、さらなる絶対値情報が得られるため、より標準的な微分方程式に基づくモデルに直接戻ることも可能である。
【００４８】
好ましい生理的単位操作のさらなる例を実施例にて示す。それらは限定されないが以下を含む：単分子化学平衡、二分子平衡、酵素媒介平衡、ミカエリスメンテン動力学、二分子酵素反応、アロステリック上方制御を伴うミカエリスメンテン酵素動力学およびアロステリック抑制を伴うミカエリスメンテン酵素動力学。
【００４９】
好ましくは代数的な生理的単位操作のデータベースが記憶されると、第一の仮想モデルを生理的単位操作の全部またはセットを用いて作成する。遺伝的アルゴリズムアプローチにおいて、いくつかのさらなる仮想モデルがまた生理的単位操作のランダムまたはセミランダム組み合わせを用いて作られうる。これらのモデルのそれぞれを、既知の「オミクス」データおよびその他のモデルの制約に対する適合度について試験する。最高のモデルはシステムのすべての制約を満たし、「オミクス」データにもっともよく適合するものである。調整可能なモデルパラメーター(以下の定義を参照)を入手可能な「オミクス」データ、類似のシステムにおける類似の単位操作についての文献または直観から収集する。モデルの調整可能なモデルパラメーターの最適値は最小二乗または最小メジアン二乗曲線当てはめにより決定でき、ここで、入手可能な「オミクス」データは過剰に条件を課せられている。あるいは、入手可能なデータがぎりぎり十分であるかまたは不十分である場合、調整可能なモデルパラメーターのいくつかは、研究者の判断により見積もらなければならない。
【００５０】
考慮すべき生理的単位操作の開始セットはしたがって様々な手段から選択できる。上記のように、可能なセットまたはサブセットのいずれを用いてもよい。サブセットは様々な手段で選択できる。ある態様において、特定のシグナル伝達経路は特定の工程を含まないことが知られていることがある;例えば、完全に細胞内の経路は細胞膜輸送工程を含まなくてもよい。したがって生理的単位操作の開始セットでは、操作から特定のこれらの生理的単位操作を除いてもよい。同様に、経路の一部が知られている場合もあり、したがってこれらのパラメーターについての生理的単位操作が特に含まれる。あるいは、特定の経路を考察するために、生理的単位操作のサブセットをランダムに選択するのが望ましい場合もある。
【００５１】
システムモデルに組み込まれる単位操作のセットはまた、可能なモデルパラメーターのセットも規定する。本明細書において「モデルパラメーター」とは、特定のシステムモデルに関与する変数のセットを意味する(例えば、速度定数、アフィニティー定数、輸送係数、相または化学平衡定数等)。好ましくは、すべての可能なモデルパラメーターはシステムについて収集された実験的「オミクス」データから規定または推定される。データが不完全な場合、モデルパラメーターは類似の生化学システムから推定するかまたは研究者の直観となる。
【００５２】
生理的単位操作のこの開始セットを組み合わせてシステムの第一の仮想数学モデルを形成してもよい。当業者に明らかなように、これは、例えば、無作為、直接、または統計的なものを含む計算による様々な手段によって行うことが出来、使用するアルゴリズムに依存するであろう。
【００５３】
ある状況では、例えば遺伝子に基づく人工知能アルゴリズム、例えば、遺伝的アルゴリズムを用いる場合、偽遺伝子を組み合わせて偽染色体とし、これは第一の仮想数学モデルを形成する。当業者に明らかなように、第一の偽染色体の作成には様々な手段がある。１つの態様において、すべての可能な組み合わせを作る;即ち、あらゆる生理的単位操作をあらゆる位置に、あらゆる順序で置き、親偽染色体の開始セットを形成する。これによりすべての可能なモデルの徹底的な研究が可能となるが、これは一般に好ましくない。というにはかかる徹底的な研究を行うには計算時間がかかるためである。ある態様において、偽染色体のいくつかの位置が特定の生理的単位操作として「固定」される。即ち、経路は開始膜輸送パラメーターを含むことが知られていてもよい。同様に経路「分岐」点の場合は、経路におけるいくらかの位置は高次元の可能性を導くことが知られていてもよく(例えば、非線形偽染色体)、したがって分岐点として固定してもよい。ある態様において、既存のモデルを用いて第一のセットの偽染色体を作成する。あるいは、第一の偽染色体は無作為に作成される。
【００５４】
第一の仮想モデルが作成されると、１または複数の人工知能(AI)アルゴリズムをモデルに適用する。当業者に明らかなように、本発明に利用できる多数の好適なアルゴリズムがあり、例えば決定論的および非決定論的方法が含まれる。一般に、決定論的方法がほとんどの場合好ましい。というのは単一の解へのなんらかの収束が望ましいからである。しかし、当業者に明らかなように、以下に説明する技術の多くは非決定論的である。かかる場合において、適合度関数即ち選択圧を用いて解を収束へ導くとよい。さらに以下に説明するように、ある場合には適合度関数を変更し、計算を１または複数回やりなおして可能な解のセットを作るのが望ましい。同様に、極小の同定を可能にする方法もあり、これもまた、単一のグローバルな最適解よりも有用であり得る。
【００５５】
好適な態様において、AIは遺伝的または進化的アルゴリズムである。一般に、進化的アルゴリズム(EA)は自然界にみられる進化の原理を適用して１または複数の解、好ましくは単一の最適解を見いだす。一般に、これらEAは多数のパラメーターに依存する。EAには通常決定論的機能が含まれる。しかし非決定論的要素をEAに組み込むことも可能であり、この場合多数の結果がプールされ平均結果が得られる。１つの態様において、モンテカルロ法を用いて非決定論的モデルからの結果をプールする。別の態様において、EAは以下に説明する適合度関数などの選択圧の非存在下で非決定論的方法として無作為抽出を含む(例えば、異なる実行について異なる解に到達する)。EAは一般に単一解よりも候補解の集団を開始および維持する。これによってより広い研究スペースの抽出が可能となり、EAがグローバル最適点ではなく局地的最適点に「トラップ」されることが避けられる。EAはまた「突然変異」の使用を含んでもよく、ここでEAは定期的に現在の集団に対するランダム変化または突然変異を作る。EAはまたしばしば交差の使用に依存して(特にGA)、既存の解の要素を組み合わせて新規の解を作る。かかる交差は重要となることもあり、より好ましい解の要素が交差における優先性を与えられる。例えば、特定の単位操作が存在するように交差重み付けがなされてもよい(例えば、酵素単位操作)。最後に、EAは解の進化に向けて「選択」または「適合度関数」の使用を組み込む。
【００５６】
本明細書にて説明するように、利用可能な様々な進化的計算技術があり、例えば、遺伝的アルゴリズム、進化的プログラミング、進化戦略、分類子システムおよび遺伝的プログラミングがすべて利用できる。例えば、Genetic Programming III: Darwinian Invention and Problem Solving、John R. Koza et al.、 Morgan Kaufmann Publishers; Genetic Algolithms:Search、Optimization and Machine Learning、Goldberg、1989、Addison-Wesley Publishing Co.; Beset、D. H.、Object-oriented implementation of numerical method: Java and Smalltalkのイントロダクション(Morgan Kaufmann、San Francisco、2001)を参照されたい。これらすべてはその全体を引用により本出願に含める。一般に、AIアルゴリズムの操作は生理機能を真似たものであり、例えば、生殖、交差(有性組換え)、突然変異、および天然の遺伝子複製および遺伝子欠失後にパターン化された構造変化操作が挙げられる。本明細書に説明する「実際の」生物システムと区別するために、これらの機能は、コンピュータ文献ではこの接頭語無しで使用するにも拘わらず、「偽」関数と称する。
【００５７】
遺伝的プログラミングの実行の主な世代のループは、適合度評価、ダーウィン選択、および偽遺伝子操作からなる。集団における各個の仮想数学モデルは、実験データおよびその他の制約と比較してそれがどのような適合であるかを判定するべく評価される。モデルはおそらくは様々な遺伝的操作に参加するその適合度に基づいてモデルの集団から選択され、制限は認容される。モデルがより高い適合度を有していれば、より選択されやすくなるが、適合しないことが知られている個体は所望により数学的原理に基づくなんらかの試験を課される。
【００５８】
好適な態様において、AIアルゴリズムは偽突然変異操作を含む。これは様々な手段で行うことが出来、一般に特定のパラメーター(例えば、偽遺伝子)をランダムに選択し、それを別のものにランダムに変えることによって行われる。一般に、この無性偽突然変異操作は典型的には(各組換え事象において低確率にて）慎重に行われる。突然変異の実際の速度は各適用によって実験的に最適化しなければならないが、一般的には10%未満であり、より典型的には1%未満である。
【００５９】
好適な態様において、AIアルゴリズムは偽交差(例えば、有性組換え)操作を含む。偽交差、即ち、偽有性組換え操作において、両親のモデルはおそらくは適合度に基づいて集団から選択される。偽交差に関わる両親は大きさと形状が同じであっても異なっていてもよい。偽交差点は一方の親から無作為に選択され、かつ偽交差点はもう一方の親から無作為に選択される。偽交差は遺伝的プログラミング(および遺伝的アルゴリズム)研究において卓越した操作であり、高い確率で行われる(即ち、85%〜90%)。
【００６０】
１つの態様において、AIアルゴリズムは偽生殖操作を含み、これは単一の個々のモデルを複製しおそらくは適合度に基づいて選択されて集団の次世代となる。別の態様において、子(交差操作および突然変異の結果得られる偽染色体)は適合度関数におけるそのスコアに基づいて親集団のメンバーに対してランク付けされ、続く交差および突然変異のラウンドにおいてより適合度の低い親集団のメンバーを置換する。
【００６１】
さらに、好適な態様において、１または複数の構造変化操作が用いられる。単一のシグナル伝達経路は単一の線形モデルによって表されうるが、より一般的には、経路はサブ経路、反復、ループ(例えば、フィードバックループ)、分岐点、回帰等を含みうる。ヒトのユーザーが工学問題を解決しようとすると、通常集団におけるすべてのプログラムについての合理的な適合性の構造的編成を単にあらかじめ特定するよう選択するであろう(即ち、各分岐が有する多くの問題の分岐の数と型)。遺伝的プログラミングはしたがって、各分岐における基本的な実行工程の実際の順序を進化させるよう用いられ得る。
【００６２】
しかし解の大きさと形が問題となることがある。この場合においては、遺伝的プログラミングは遺伝的プログラミングの実行の際にダイナミックにすべての構造的決定を行うことが出来る。遺伝的プログラミングは構造変化操作を用いて自然の遺伝子複製と関連する天然の遺伝子欠失操作とを同等にするようにして自動的に数学的構造を決定することが出来る。構造変化操作は遺伝的プログラミングの実行の際に、ダイナミックに個々のモデルに分岐を付加および欠失させる手段を提供する。これら構造変化操作は様々な数の分岐点、反復、ループ、回帰等を有するモデルを含む構造的に異なる集団を迅速に作成し、かかる要素の様々な階層構造の編成を作成する。実験データと適合する構造を有するモデルは競合的偽進化的プロセスにおいて成長し、繁栄する傾向があるが、不適切な構造を有するモデルは、適合度関数の下では好まれない傾向がある。したがって構造変化操作は、ヒトユーザーからプログラム構造をあらかじめ決定する仕事を軽減する。
【００６３】
当該技術分野で知られているように、様々な構造変化操作がある。これらはそれぞれ実行の際に慎重に適用される(例えば、各世代について10%未満、より典型的には1%未満の確率)。
【００６４】
好適な態様において、遺伝的アルゴリズムは本明細書にて説明するように使用される。
【００６５】
好適な態様において、AIアルゴリズムの多くまたは全てによって、適合度関数を用いて解のセットの代替メンバーを選択し、最適解を見つける。適合度関数を用いてモデルを進化させ(例えば、GAを用いる場合偽染色体)、非決定論的方法を収束させる。一般に、適合度関数はいくつかの部分からなるものであってよい。１つの態様において、適合度関数は文献から得られた確認された経路に基づく、厳密な生／死決定を含んでいてもよい。即ち、グローバルな解は特定の生理的単位操作またはパラメーターを含むか回避することが知られていてよく、即ち異なる時間的順序を指令または排除するものでもよい。例えば、膜輸送工程が要求されることが知られているため、この生理的単位操作を含まない可能性のある解は除去される。同様に、特定の酵素工程は特定の順序でなければならない:基質の酵素的変換はその生成の前ではあり得ないなどである。これらの「ルール」は文献または熱力学法則から一般的に導かれる。「制約に基づく」モデリングアプローチ、例えば [Proc. National Acad Sci. (USA) 95:4193-4198、1998; Biotechnology Progress、15:296、1999; J. theor. Biol.、203:229-249、2000]に記載されているものを適合度関数に組み込んでもよい。しかしこれら「本質的」ルールを作りだして、システムを実行し、結果を評価することも可能である。例えば、膜輸送機能が関与しているか知られていない場合、いずれかのルールを用いてシステムを実行し既知の実験データに適合させることにより、モデルの解明が助けられる。別の態様において、適合度関数は実験データに対する適合度の尺度であってもよく、例えば、OMICS発現ゲノミクス、プロテオミクス、およびメタボロミクスのデータが既に作成されている。簡単なレベルにおいて、適合度関数は曲線の当てはめにおける実験データに対する適合度の尺度の統計的優秀性と見なすことも出来る。別の態様において、適合度関数はユーザーが規定できる限定的仮想を含んでいてもよく、例えば、定常状態の多重度についての試験または物理および化学法則の違反が挙げられる(即ち、定数)。多数の定常状態(即ち、生育条件の固定されたセットについて可能性のある２以上の生理的状態)は空転サイクルのように有効でないと考えられ、自然に反して選択されたものであろう。好適な態様において、適合度関数は上記態様の複数または全部を含む。
【００６６】
適合度関数は一般に提案された数の解のセットのそれぞれに適用される。例えばGAにおいて、それは集団における各偽染色体に適用される。適合度関数において数で示される最高のスコアを示す偽染色体は次世代に生き残る。１つの態様において、いずれの子偽染色体であっても親集団の最悪のメンバーよりもよい適合度関数スコアを示すものは、集団における最悪の親偽染色体に取って代わる。別の態様において、限界適合性スコアよりもよいスコアを示すあらゆる偽染色体が集団に加えられ、したがって集団における偽染色体の数は反復回数にともなって増加する。好適な態様において、限界スコアは集団の弱い実効性のメンバーを除去するようある期間にわたって調整される。
【００６７】
いったんAIアルゴリズム(ここでも、好ましくはGA)が選ばれると、それを第一の仮想モデルに対して適用する。例えば、GAの場合、親偽染色体を含む第一のモデルがGAにおいて利用されて「子」偽染色体を作成し、これは第二の仮想モデルを含む。同様に、その他のアルゴリズムの結果、別の第二の仮想モデルが作成される。この第二のモデルは次に実験データに対して比較され、そしてプロセスを反復してグローバルな解を見いだすか、あるいは可能性のある規定されたセットの解に到達する。これはさらに以下に説明する。
【００６８】
したがって、本発明のプロセスを用いて作られた数学モデルは実験データと比較される。当業者に明らかなように、本発明に利用可能な実験データには事実上あらゆる実験的データが含まれる。データは定量的および／または定性的データでよく、「絶対」または「示差」データが含まれる。
【００６９】
好適な態様において、第一のセットの実験データは示差データのセットを含み、例えば、通常多くの「オミクス」評価によって作成されたものが挙げられる。もっとも現代的な生物データ収集方法をとりまく重要事項は、それらがサンプル間の差の尺度しか提供しないことである。例えば、GeneChip（商標）データは逆転写と定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とを使用してコントロールアレイと比較して特定のmRNAの上方制御と下方制御の尺度を提供する。タンパク質発現、例えば、二次元ゲル電気泳動実験は、ゲルにおけるスポットに蓄積した染色の量に基づいて各タンパク質の量の相対的な測定を提供する。質量分析器に基づくディファレンシャルディスプレー技術の最近の発明、例えば、同位体コード化アフィニティータグ(ICAT（商標）)１および同位体差別化結合エネルギーシフトタグ(IDBEST（商標）) ２により、安定な同位体の比に基づいて２以上のサンプル間の相対的タンパク質発現の直接的定量的比較が可能となった。安定同位体比方法は核磁気共鳴(NMR) ３および質量分析(MS) ４による２つのサンプル間の相対代謝産物濃度の定量的比較の提供にも利用されている。これらディファレンシャルディスプレー方法の結果得られるのはレシオメトリック比較であり、化学その他の科学分野で古典的に入手可能であった絶対的比較ではない。これらディファレンシャルディスプレー方法の利点は比較的安価であり、迅速で、正確であることである(<10%標準偏差)。モデリングの観点からの欠点はそれらは絶対的定量的濃度および速度定数情報を提供できないことである。
【００７０】
好適な態様において、様々なタイプの実験データが評価に用いられるが、好ましくはすべての関連性のあるデータを用いる。本明細書にて説明するように、オミクスデータには様々な種類のものがある(Lederberg、前掲を参照)。好適な態様において、入手可能なできるだけ多くのタイプのデータを仮想モデルに対して評価する。一般に、これらの異なるタイプのデータを異なるように「重みづける」ことが有用である。というのは異なるタイプのデータは互いに異なるレベルの相関を有することが知られているからである。例えば、mRNA発現レベルは常にタンパク質発現レベルと相関しているわけではなく、タンパク質発現レベルはおそらく多くの状況においてより生理的に関連している。したがって、発現データよりもタンパク質データに大きく「重み付け」するとよい。好適な態様において、モデルに用いられる生理的単位操作は差分方程式(または差分方程式の数学的変換)である。差分方程式を用いることにより、適合度関数において直接的にディファレンシャルディスプレーデータを使用することが可能となる。
【００７１】
差分方程式を生理的単位操作に使用しないある態様において、絶対値または絶対的実験測定結果の仮定を行わねばならず、それによってディファレンシャルディスプレーデータを適合度関数に使用するための絶対値に変換できる。
【００７２】
これらのプロセスは収束に至るまで反復する。当業者に明らかなように、システムはいずれの桁数において「停止」させてもよい。好適な態様において、使用する適合度関数はグローバルな解への収束を可能とするものである;即ち、１つのモデルを進化させて１または複数のセットの実験データと適合させ、そして以下に説明するように利用する。このグローバルな解により必要により、または所望により以下に説明するようにさらなる局所解の世代が得られる。あるいは、単一解への絶対的な収束は不可能であったり、必要でないこともある。
【００７３】
好適な態様において、システムは単一のグローバルな解へと収束するまで実行し、その後それを以下に説明するように、試験、確認、利用または比較する。
【００７４】
別の態様において、グローバルな解が見いだされ、さらなる競合モデルがグローバルな解の近くに作られる。当業者に明らかなように、これは様々な手段で行うことが出来る。グローバルな解へ収束するとすれば、いずれの数のサンプリング技術を行ってもよい。例えば、モンテカルロサーチを行って解の近くにモデルの順序化されたリストを作ってもよい。この解から開始して、ランダム生理的単位操作変化が作られ、新規な解が計算される。新規なモデルが許容基準を満たせば、さらなるジャンプへの出発点として用いられる。あらかじめ決められた回数のジャンプの後、モデルの順序化されたリストが作られる。モンテカルロサーチはグローバル最小付近の研究スペースを探索し、あるいは研究スペースにおける新規な極小距離を見いだすサンプリング技術である。その他のサンプリング技術も利用でき、例えば、ボルツマンサンプリング、さらなる遺伝的アルゴリズム技術および模擬焼きまなし法（simulated annealing)が挙げられる。さらにすべてのサンプリング技術について、許容されるジャンプの種類は変更されうる(例えば、ランダムジャンプからランダム生理的単位操作、バイアスジャンプ(例えばグローバルな解に向けてまたはそれから離れて)等が挙げられる）。同様に、すべてのサンプリング技術について、サンプリングジャンプが許容されるかどうかの許容基準は変更しうる。
【００７５】
あるいは、単一グローバルモデルに収束しない場合もある。これは様々に起こりうる。例えば、反復は可能な解の有限の特定のサイズセットが存在すれば停止してもよい;例えば、3-100の可能性のある競合解のセットが望ましい。他の例において、解のセット(またはGAにおける偽染色体の親集団)のメンバーは有限の世代数について変化させてはならず(例えば、10〜1000世代)、グローバル最適点セットが収束したことが示唆される。さらに別の例において、解のセットの最良の(適合度関数により測定して)メンバーはアルゴリズムの複数回の反復について変化しない (例えば、10〜10000世代)。同様に、モデルは収束に到達しなくてもよく、可能性のある解のセットにおいて停止させてもよい。さらに、１または複数の異なる計算技術を用いて極小解のセットを作成することが可能である。例えば、GAを用いて１または複数の解を作ることができ、１または複数の異なる計算技術を用いてさらなる可能性のある解のセットを作ることが出来る。これらをともに「プール」して以下に説明するように試験可能なセットを形成すればよい。いったん収束に到達すると、あるいは解のセットが生じると、様々なさらなる工程を所望により実行すればよい。
【００７６】
好適な態様において、１または複数の仮想数学モデル(好ましくは収束におけるかその近くのもの)を１または複数のさらなるセットの実験データと比較する。例えば、乳癌に関与するシグナル伝達経路に対する解を、前立腺癌または肺癌等からのデータに用いればよい。これによって関連するシステムにおけるシグナル伝達経路間の類似と相違の比較および同定が可能となる。したがって、例えば、２種類の癌において２つの経路が同様に作用するか、異なって作用するかという知識は非常に有用である。これによって共通の経路(例えばあらゆる癌経路に「ジェネリック」な薬剤)または特異的経路(例えば肺癌を治療するがその他の組織には有効ではない薬剤)に作用する薬剤の開発が可能となる。同様に、未処理および処理細胞または動物から得たデータとモデルを比較するのも非常に有用である。即ち、未処理サンプルと比較して薬剤または薬剤候補で処理された動物または細胞から得られたデータは多様である。処理または未処理サンプルのいずれかから得られたモデルを互いに比較し、類似または相違を同定することが出来る。
【００７７】
好適な態様において、モデルは実験的に確認する。即ち、グローバルな解または可能性のある解のいずれかとして同定されたモデルはいずれの数の実験技術によって確認してもよい。好適な態様において、１または複数の同じパラメーターを競合モデルにおいて「インシリコ」で、競合モデルにより測定可能な様々な結果が予測されるまで調整する。同じパラメーターをインビボで、例えば遺伝子工学または代謝工学技術で調整することは当該技術分野で一般に知られており、その結果測定された結果を実験データセットに加える。所望により、AIアルゴリズムを新たな「オミクス」データセットに対して再び実行してもよいし、新たな結果にもっとも適合しないモデルを解のセットから除いてもよい。この予測および実験的検証のプロセスを単一のモデルに到達するよう収束するまで反復すればよい。
【００７８】
好適な態様において、本発明のAIアルゴリズムを様々な集積回路に導入してもよく、好ましい態様ではさらなるプロセス速度を得るためにフィールド・プログラマブル・ゲート・アレー(FPGA)または特定用途向け集積回路(ASIC)デバイスを用いる。これらのFPGAまたはASICデバイスをアドレス可能なコプロセシング単位としてコンピュータシステムに組込み、コンピュータシステムへのcpuとメモリ割り当て負荷から解放する。さらに、これらシステムを以下に説明するようにより大きなシステムに組み込んでもよい。
【００７９】
本発明の方法には様々な用途がある。特に、本発明の方法を用いて生理機能、例えば、疾患経路の数学モデルを作成、確認、完了または変化させることが出来る。
【００８０】
好適な態様において、本発明のシステムはあらゆるタイプの原核または真核生物(組織及び細胞を含む)またはウイルスの代謝経路の解明に利用できる。好適な原核細胞としては、これらに限定されないが、細菌、例えば、大腸菌、バシラス種、および極限細菌、例えば好熱菌が挙げられる。好適な真核細胞としては、これらに限定されないが、真菌、例えば、酵母および糸状真菌、（以下の種、Aspergillus、Trichodermaおよび Neurospora）等; 植物細胞、例えば、トウモロコシ、ソルガム、タバコ、アブラナ、ダイズ、ワタ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、ヒマワリ等;および動物細胞、例えば、魚類、鳥類および哺乳類等が挙げられる。好適な魚類細胞としては、これらに限定されないが、以下の種由来のもの、サケ、マス、テラピア、マグロ、コイ、ヒラメ、カレイ、メカジキ、タラおよびゼブラフィッシュ等が挙げられる。好適な鳥類細胞としては、これらに限定されないが、以下由来のもの、ニワトリ、アヒル、ウズラ、キジおよびシチメンチョウ、およびその他の野鶏または狩猟鳥等が挙げられる。好適な哺乳類細胞としては、これらに限定されないが、以下由来の細胞が挙げられる：ウマ、ウシ、バッファロー、シカ、ヒツジ、ウサギ、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミおよびモルモット、ミンク、ヤギ、ブタ、霊長類、有袋類、海生哺乳類、例えば、イルカおよびクジラ。そして以下の株細胞が挙げられる：例えば、あらゆる組織または幹細胞型のヒト株細胞および幹細胞等。好ましいシステムはマウスおよびヒト細胞からのデータを用いる;これにはインビトロおよびインビボで得た、細胞、細胞株、組織または生物体からのデータの使用が含まれる。したがって、実験データはいずれの細胞タイプから得てもよく以下の細胞タイプの、ヒト、霊長類およびげっ歯類細胞が好ましい:あらゆるタイプの腫瘍細胞(特に、メラノーマ、骨髄性白血病、以下の癌：肺癌、乳癌、卵巣癌、大腸癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌および精巣癌)、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球(T-細胞およびB細胞)、肥満細胞、好酸球、脈管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を含む白血球、幹細胞、例えば造血幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、肺幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓幹細胞および筋細胞幹細胞(分化および脱分化因子のスクリーニング用)、破骨細胞、軟骨細胞及びその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞、および脂肪細胞。好適な細胞には既知の研究用細胞も含まれ、例えば、これらに限定されないが、Jurkat T細胞、NIH3T3細胞、CHO細胞、COS細胞等が挙げられる。ATCC細胞株カタログを参照されたい。それを引用により本出願に含める。
【００８１】
当業者に明らかなように、ウイルスおよび感染宿主細胞における代謝経路が注目を集めている;したがって、本発明はウイルス関連経路(則ち、ウイルスまたは感染宿主細胞内)の解明に有用である; 好適なウイルスとしては、これらに限定されないが、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、呼吸器合胞体ウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス)、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス(例えば、風疹ウイルス)、パルボウイルス、ポックスウイルス(例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス)、腸内ウイルス(例えば、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス)、肝炎ウイルス(A、BおよびCを含む)、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメタロウイルス、エプスタインバーウイルス)、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)、レトロウイルス(HIV、HTLV-Iおよび-IIを含む)、パポバウイルス(例えば、パピローマウイルス)、ポリオーマウイルス、およびピコルナウイルス等が挙げられ、そして細菌(様々な病原性および非病原性原核生物を含み、例えば以下が挙げられる：バシラス; ビブリオ、例えば、V. cholerae; エシェリキア、例えば、腸管毒素原性大腸菌、シゲラ、例えば、S. dysenteriae;サルモネラ、例えば、.S. typhi; マイコバクテリウム、例えば、M. tuberculosis、M. leprae;クロストリジウム、例えば、C. botulinum、C. tetani、C. difficile、C.perfringens; コリネバクテリウム、例えば、C. diphtheriae; ストレプトコッカス、S. pyogenes、S. pneumoniae; スタフィロコッカス、例えば、S. aureus; ヘモフィルス、例えば、.H. influenzae; ナイセリア、例えば、N. meningitidis、N. gonorrhoeae; エルシニア、例えば、Y. pestis、シュードモナス、例えば、P. aeruginosa、P. putida;クラミジア、例えば、C. trachomatis; ボルデテラ、例えば、B. pertussis; トレポネーマ、例えば、T.  palladium;G.lamblia等)も利用できる。
【００８２】
好適な態様において、本発明の方法および組成物は標的同定に有用である。疾患状態をモデリングすることにより、薬剤標的および診断バイオマーカーの同定がなされうる。即ち、特定の遺伝子、遺伝子産物または代謝産物が所与の生物プロセスに特異的に関与しているという知識により、治療的介入の可能性のある候補を標的化することが出来る。例えば、かかる遺伝子にコードされるタンパク質は、低分子薬剤の操作の良好な標的となりうる。同様に、薬剤、例えば、アンチセンスおよびsiRNA分子を用いて遺伝子自体の発現を変化(この場合、阻害)させることができる。さらにタンパク質の送達を含む治療を行ってその量を増加させたり、欠失突然変異体を置換することができる。至適モデルの調整可能なパラメーターの感度分析を用いて治療結果に影響を与える経路におけるもっとも応答性の点をみつけることができ、したがって薬剤開発とスクリーニングに対する「最高の」標的を決めることが出来る。
【００８３】
したがって、好適な態様において、本発明の方法および組成物は様々な疾患状態のモデルの解明に有用であり、疾患状態としては、これらに限定されないが、癌(該モデルは癌の浸潤、転移または増殖に向けられ得る);以下に関連する障害:アポトーシス;細胞死;細胞分裂の欠損または細胞増殖の低下;血管新生の調節および調節不全; 多剤耐性; 炎症の調節および調節不全;膜脱分極(例えば、心血管疾患における、発作の催不整脈性能力の低下); 細胞腫大; 特定の細胞内イオンの漏出;イオンチャンネルの調節および調節不全(カリウムおよびクロライドチャンネルを含む);ミオシン重合/脱重合の調節および調節不全(例えば、心血管疾患において); カルシウム再循環;プロトンポンプ機能; プロテアーゼの調節および調節不全; サイトカインの調節および調節不全; 肥満; 糖尿病; 心血管疾患およびプラーク形成; 骨粗鬆症; 骨関節炎; 関節炎、例えば関節リウマチ; 自己免疫疾患(例えば、狼瘡、関節炎、多発性硬化症、糖尿病、乾癬; クローン病; 甲状腺疾患等)。
【００８４】
疾患特異的パラメーター変化を組み込んだ特定の生化学的経路の数学モデルを作成すると、これによって薬剤開発の標的として作用する疾患経路内の特定の分子の同定が可能となる。したがって本発明の方法はいずれのスクリーニング技術と組み合わせてもよく、特に、ハイスループットスクリーニング(HTS)技術と組み合わせることにより、候補生理活性薬のスクリーニングが可能になり、標的モデルパラメーターが健康な生理における値に戻るように作用する薬剤候補を見つけることが出来る。さらに、該モデルはどの要素が薬剤に最良の測定可能な応答をもたらすかという情報を提供する。あるいは、所与の治療法の可能性のある副作用のマーカーを提供する。
【００８５】
好適なスクリーニング標的の選択は当該技術分野で知られている様々な因子に基づく。例えば、細胞外または細胞表面結合分子(例えば、細胞表面受容体)は、低分子または抗体ライブラリーを用いてスクリーニングできる。細胞内分子は低分子ライブラリー、ペプチドおよび核酸等に対してスクリーニングできる。代謝酵素は低分子リガンドによってアロステリック制御を受ける。酵素または受容体タンパク質の突然変異体またはその他の欠損体には、有効なタンパク質自体を治療として注入するか、遺伝子を修正または非突然変異体形態の遺伝子を生物のゲノムに追加する遺伝子療法を行って、有効なコピーを補充しなければならない。
【００８６】
したがって、本発明は標的要素の活性を調節する候補生理活性薬について細胞をスクリーニングする方法を含む。ここで「調節する」とはアゴニスト作用とアンタゴニスト作用の両方を含む(例えば、刺激または阻害)。
【００８７】
本明細書において用いる「候補生理活性薬」または「候補薬剤」の語は、あらゆる分子をいい、例えば、タンパク質、有機低分子、炭水化物(多糖類等)、ポリヌクレオチド、脂質、合成分子または天然代謝産物およびそれらの誘導体などが挙げられる。一般に複数のアッセイ混合物を様々な試薬濃度で並行して試験し、様々な濃度に対する示差的応答を得る。典型的には、かかる濃度の１つをネガティブコントロール、即ち、０濃度または検出レベル未満とする。さらにポジティブコントロールを用いてもよい。
【００８８】
候補薬には多数の化学的分類のものが含まれ、典型的には有機分子、好ましくは分子量100ダルトンを超え約2,500ダルトン未満の有機低分子化合物である。候補薬はタンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候補薬はしばしば１または複数の上記官能基で置換された炭素環（cyclical carbon）または複素環構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含む。候補薬は生体分子からもみられ、例えば、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造アナログまたは組み合わせが挙げられる。
【００８９】
候補薬は様々な起源から得られ、例えば、合成または天然化合物のライブラリーが挙げられる。例えば、様々な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成について多くの手段が入手可能であり、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現が含まれる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが入手可能で容易に生産できる。さらに、天然または合成により生産したライブラリーおよび化合物は常套の化学、物理および生化学手段によって容易に修飾される。既知の薬品を指向性またはランダム化学修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化に供して構造アナログを産生してもよい。
【００９０】
好適な態様において、候補生理活性薬はタンパク質である。本明細書において「タンパク質」とは少なくとも２つの共有結合したアミノ酸をいい、これには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。タンパク質は天然アミノ酸とペプチド結合からなるものでもよいし、合成ペプチド疑似構造のものでもよい。したがって本明細書において用いる「アミノ酸」、または「ペプチド残基」は、天然および合成アミノ酸の両方をいう。例えば、ホモ-フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的ではアミノ酸と考えられる。「アミノ酸」はまたイミノ酸残基、例えば、プロリンおよびヒドロキシプロリンも含む。側鎖は(R)または(S)のいずれの立体配置でもよい。好適な態様において、アミノ酸は(S)即ちL-立体配置である。非-天然側鎖が用いられる場合、非-アミノ酸置換基を用いて、例えば、インビボ分解を防止または遅延させてもよい。化学保護基またはその他の化学置換基を付加してもよい。
【００９１】
好適な態様において、候補生理活性薬は天然タンパク質または天然タンパク質の断片である。したがって、例えば、タンパク質を含む細胞抽出物またはタンパク質性細胞抽出物のランダムまたは指向性消化物を使用することができる。このように、原核および真核タンパク質のライブラリーを本明細書に記載するシステムのスクリーニング用につくればよい。この態様において特に好ましいのは細菌、真菌、ウイルスおよび哺乳類のタンパク質のライブラリーであり、後者が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
【００９２】
好適な態様において、候補生理活性薬は約5〜約30アミノ酸のペプチドであり、約5〜約20アミノ酸が好ましく、約7〜約15が特に好ましい。ペプチドは上記の天然タンパク質の消化産物であってもよいし、ランダムペプチド(「偏った」ランダムペプチドを含む)でもよい。「ランダム」にされたか、または本明細書において文法的にそれと同等の語は、各核酸およびペプチドが実質的にランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からそれぞれなることをいう。一般にかかるランダムペプチド(または以下に記載の核酸)は化学合成されるため、いずれの位置にいずれのヌクレオチドまたはアミノ酸を含むものでもよい。合成プロセスはランダムにされたタンパク質または核酸が生じるように設計すればよく、配列の長さにわたって可能性のある組み合わせのほとんどまたはすべての形成を可能にするものであり、それによってランダムにされた候補生理活性タンパク質性試薬のライブラリーが形成される。
【００９３】
１つの態様において、ライブラリーは完全に確率化されており、何れの位置にも配列の優先傾向または不変を伴わない。好適な態様において、ライブラリーは偏っている。即ち、配列中のいくらかの位置が一定に維持されているか、あるいは制限数の可能性から選択されている。例えば、好適な態様において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基は規定のクラスの中でランダムにされている。かかるクラスとしては、例えば、疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った(小または大)残基、架橋のためのシステインの形成、SH-3 ドメインのためのプロリン、リン酸化部位のためのセリン、スレオニン、チロシンまたはヒスチジン等、またはプリンが挙げられる。
【００９４】
好適な態様において、候補生理活性薬は核酸である。「核酸」または「オリゴヌクレオチド」あるいは本明細書において文法的に同等の語は、少なくとも２つのヌクレオチドが互いに共有結合しているものをいう。本発明の核酸は一般にホスホジエステル結合を含み、あるいはある場合には、以下に示すように、異なる骨格を有する核酸アナログも含まれる。例えば、ホスホルアミド（phosphoramide）(Beaucage、et al.、Tetrahedron、49(10):1925 (1993) およびその参考文献; Letsinger、J. Org. Chem.、35:3800 (1970); Sprinzl、et al.、Eur. J. Biochem.、81:579 (1977); Letsinger、et al.、Nucl. Acids Res.、14:3487 (1986); Sawai、et al.、Chem. Lett.、805 (1984)、Letsinger、et al.、J. Am. Chem. Soc.、110:4470 (1988);およびPauwels、et al.、Chemica Scripta、26:141 (1986))、ホスホロチオエート (Mag、et al.、Nucleic Acids Res.、19:1437 (1991);および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu、et al.、J. Am. Chem. Soc.、111:2321 (1989))、O-メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein、Oligonucleotides and Analogues:  A Practical Approach、Oxford University Pressを参照)、およびペプチド核酸骨格および結合(Egholm、J. Am. Chem. Soc.、114:1895 (1992); Meier、et al.、Chem. Int. Ed. Engl.、31:1008 (1992); Nielsen、Nature、365:566 (1993); Carlsson、et al.、Nature、380:207 (1996)を参照、これらすべては引用により本明細書に含まれる))。その他のアナログ核酸としては、以下を含むものが挙げられる：陽性骨格 (Denpcy、et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、92:6097 (1995));非イオン性骨格(米国特許第5,386,023; 5,637,684; 5,602,240; 5,216,141;および4,469,863号; Kiedrowshi、et al.、Angew. Chem. Intl. Ed. English、30:423 (1991); Letsinger、et al.、J. Am. Chem. Soc.、110:4470 (1988); Letsinger、et al.、Nucleoside & Nucleotide、13:1597 (1994); Chapters 2 and 3、ASC Symposium Series 580、“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”、Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker、et al.、Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.、4:395 (1994); Jeffs、et al.、J. Biomolecular NMR、34:17 (1994); Tetrahedron Lett.、37:743 (1996))および非-リボース骨格、例えば以下に記載のもの、米国特許第5,235,033および5,034,506号、ならびにChapters 6 and 7、ASC Symposium Series 580、“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”、Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook。１または複数の炭素環糖を含む核酸も核酸の定義に含まれる(Jenkins、et al.、Chem. Soc. Rev.、(1995) pp. 169-176参照)。いくつかの核酸アナログは、Rawls、C & E News、June 2、1997、p 35に記載されている。これら文献は全て引用により本明細書に含まれる。かかるリボース-ホスフェート骨格の修飾はさらなる部分の付加を促進するために行われる。さらなる部分としては例えば標識が挙げられる。あるいは、生理的環境におけるかかる分子の安定性と半減期を上昇させるために行われる。さらに、天然核酸とアナログの混合物を作ってもよい。あるいは、異なる核酸アナログの混合物、および天然核酸とアナログの混合物を作ってもよい。核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、二本鎖配列と一本鎖配列の部分を両方含んでいてもよい。核酸はDNA、即ちゲノムDNAおよびcDNAでも、RNAでもよく、あるいはハイブリッドでもよい。ここで核酸はデオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドのいずれの組み合わせを含んでいてもよく、何れの塩基の組み合わせであってもよく、例えば、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン（xathanine）、ヒポキサタニン、イソシトシン、イソグアニン等が��げられる。
【００９５】
タンパク質について先に一般的に記載したように、核酸候補生理活性薬は天然核酸、ランダム核酸または「偏った」ランダム核酸のいずれでもよい。例えば、原核または真核ゲノムの消化産物をタンパク質について説明したように用いることが出来る。
【００９６】
好適な態様において、候補生理活性薬は有機化学部分であり、その様々なものが文献に記載されている。
【００９７】
好適な態様において、異なる候補生理活性薬のライブラリーを用いる。好ましくは、ライブラリーは薬剤の十分に構造的に異なる集団を提供し、特定の標的への結合を可能にするおそらくは十分な範囲の多様性を提供する。したがって、相互作用ライブラリーはその少なくとも１つのメンバーが標的にアフィニティーを与える構造を有するように十分に大きくなければならない。相互作用ライブラリーに要求される絶対的大きさを評価するのは難しいが、免疫応答によりヒントが与えられる: 多用性107-108種類の抗体は生物に向かうほとんどの可能性のある抗原と相互作用するのに十分なアフィニティーを備えた少なくとも１つの組み合わせを提供する。発表されたインビトロ選択技術もまた、ライブラリーサイズとして107-108が、標的に対するアフィニティーを有する構造を見いだすのに十分であることを示している。7〜20アミノ酸長のペプチドのすべての組み合わせのライブラリー、例えば一般にここで提案されているものは、207 (109)〜2020をコードする能力を有する。したがって、107-108種類の分子のライブラリーを用いると本発明の方法により7アミノ酸についての理論的に完全な相互作用ライブラリーのサブセットを「歩く」ことが可能となり、サブセットは2020 ライブラリーを形作る。したがって、好適な態様において、少なくとも106、好ましくは少なくとも107、より好ましくは少なくとも108そしてもっとも好ましくは少なくとも109種類の配列を本発明の方法で同時に分析する。好ましい方法ではライブラリーのサイズと多様性を最大とする。
【００９８】
当業者に明らかなように、インビトロまたはインビボのいずれも(エキソビボ(例えば、細胞)とインビボ(生物体)の両方を含む）スクリーニング技術を利用できる。
【００９９】
好適な態様において、標的分子を単離し、インビトロで試験する。好適な態様において、標的タンパク質を周知技術によって単離し、クローニングし、発現させ、インビトロアッセイ用に単離する。標的タンパク質はサンプルに存在するその他の要素に応じて当業者に知られている様々な方法で単離または精製するとよい。標準的精製方法には、電気泳動、分子、免疫学的およびクロマトグラフィー技術が含まれ、例えばイオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相HPLCクロマトグラフィーおよびクロマトフォーカシングが挙げられる。例えば、標的タンパク質は標準的抗-ライブラリー抗体カラムを用いて精製できる。タンパク質濃縮と組み合わせた限外ろ過およびダイアフィルトレーション技術も有用である。好適な精製技術の一般的教示として、Scopes、R.、Protein Purification、Springer-Verlag、NY (1982)を参照されたい。必要な精製の程度は標的タンパク質の用途に応じて変わる。場合によっては精製は必要ではない。
【０１００】
当業者に明らかなように、様々なインビトロスクリーニングシステムが知られている。例えば、標的タンパク質または候補薬を単離サンプル受容部位(例えば、マイクロタイタープレート、アレイ等)を有する不溶性支持体に非拡散的に結合させる。不溶性支持体は組成物が結合しうるいずれの組成でできていてもよく、可溶性物質から容易に分離でき、そうでないとしてもスクリーニング方法全体において適合性のものである。かかる支持体の表面は固体でも多孔性でもよくどのような形状でもよい。好適な不溶性支持体の例としては、マイクロタイタープレート、アレイ、メンブレンおよびビーズが挙げられる。これらは典型的には、ガラス、プラスチック(例えば、ポリスチレン)、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、テフロン等でできたものである。マイクロタイタープレートおよびアレイは特に便宜である。というのは少量の試薬およびサンプルを用いて多数のアッセイを同時に行うことが出来るからである。ある場合には磁気ビーズ等も含まれる。組成物の結合の特定の様式は、本発明の試薬および方法と適合し、組成物の活性を維持し、非拡散性である限り、重要ではない。好ましい結合方法には抗体の使用(タンパク質が支持体に結合した際に、リガンド結合部位または活性化配列を立体妨害しないもの)、「粘着性」またはイオン性支持体への直接結合、化学的架橋、タンパク質または試薬の表面上での合成等が挙げられる。タンパク質または試薬の結合の後、過剰の非結合物質を洗浄により除く。サンプル受容部位を次いでウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインまたはその他の無毒性タンパク質またはその他の部分とインキュベーションすることによってブロックすればよい。固体支持体が使用されないスクリーニングアッセイも本発明に含まれる;その例を以下に記載する。
【０１０１】
好適な態様において、標的タンパク質は支持体に結合し、候補生理活性薬をアッセイに添加する。あるいは、候補薬を支持体に結合し、標的タンパク質を添加する。新規結合試薬には、特異的抗体、化学ライブラリーのスクリーニングによって同定された非天然結合試薬、ペプチドアナログ等が含まれる。特に注目されるのはヒト細胞への毒性が低い試薬のためのスクリーニングアッセイである。様々なアッセイをこの目的に使用でき、例えば、標識化インビトロタンパク質-タンパク質結合アッセイ、電気泳動度シフトアッセイ、タンパク質結合についてのイムノアッセイ、機能アッセイ(リン酸化アッセイ等)が挙げられる。
【０１０２】
候補生理活性薬の標的タンパク質への結合の測定は様々な方法で行うことができる。好適な態様において、候補生理活性薬を標識し、結合を直接測定する。例えば、これは、標的タンパク質の全部または一部を固体支持体に結合させ、標識化候補薬(例えば、蛍光標識)を添加し、過剰の試薬を洗浄して除き、固体支持体上に標識が存在するかを判定することによって行うことが出来る。様々なブロッキングおよび洗浄工程が当該技術分野で知られているように利用できる。
【０１０３】
好適な態様において、細胞アッセイを行う。この態様において、候補生理活性薬を標的分子(細胞集団中の天然のものでもよいし(例えば、内在性)、組換えによって添加したものでもよい(例えば、細胞に対して外来性)を含む細胞または細胞集団と混合するかそれに添加する。異なる態様のための好適な細胞タイプは上記の通りである。候補生理活性薬と細胞を混合する。当業者に明らかなように、これは様々な方法で達成でき、候補薬を、細胞表面、細胞含有培地、または細胞が増殖しているか接触している表面に添加すること; 例えば試薬を細胞内に導入するベクターの使用により、試薬を細胞内に添加すること(即ち、試薬が核酸またはタンパク質の場合)が挙げられる。
【０１０４】
１つの態様において、候補生理活性薬は、宿主細胞にベクター、例えばウイルスベクターを用いて導入された核酸またはタンパク質(タンパク質はこの場合、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドを含む)である。ベクター、好ましくはウイルスベクターの選択は、細胞のタイプに依存する。細胞が複製している場合、レトロウイルスベクターを使用する。その方法は以下により完全に記載する。細胞が複製していない場合(即ち、細胞周期の相の１つにアレストされている場合)、その他のウイルスベクターを用いるとよく、例えば、レンチウイルスおよびアデノウイルスベクターが挙げられる。
【０１０５】
一般に、候補薬は、試薬-標的相互作用に好ましい反応条件下で細胞に(上記のように細胞外または細胞内に)添加する。一般に、これは生理的条件である。インキュベーションは至適活性がもたらされる温度、典型的には4〜40℃にて行う。インキュベーション時間は至適活性が得られるように選択し、さらに迅速なハイスループットスクリーニングをもたらすように至適化するのがよい。典型的には0.1〜1時間で十分である。過剰の試薬は一般に除去されるか洗浄により除かれる。
【０１０６】
様々なその他の試薬をアッセイに含めてもよい。かかる試薬としては、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤等が挙げられ、これらはタンパク質-タンパク質結合の至適化および／または非特異的またはバックグラウンド相互作用の減少のために利用するとよい。その他のアッセイ効率を向上させる試薬、例えば プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌試薬等を用いてもよい。成分の混合物を検出を可能にする順序で添加するとよい。細胞の洗浄またはすすぎは当業者に明らかなように様々な時点で行うとよく、ろ過および遠心分離を使用してもよい。
【０１０７】
当業者に明らかなように、細胞は様々な基礎に基づいて様々な方法でスクリーニングすることが出来る。一般に、細胞は標的分子の調節に関係する表現型変化についてスクリーニングされる。「表現型変化」または「生理機能変化」あるいは本明細書において用いるその他の文法的同等語は細胞の表現型が何らかの様式で、好ましくはなんらかの検出可能および／または測定可能な様式で変化することを意味する。当業者に明らかなように、本発明の利点は、広範な細胞タイプと可能性のある表現型変化が本発明の方法によって試験できることである。したがって、観察、検出または測定されるあらゆる表現型変化は本発明のスクリーニング方法の基礎となりうる。好適な表現型変化としては、これらに限定されないが以下が挙げられる:全体の物理的変化、例えば、細胞形態、細胞増殖、細胞生存度、基質またはその他の細胞への接着、および細胞密度における変化;１または複数のRNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の発現における変化; １または複数のRNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の平衡状態(即ち半減期)における変化;１または複数のRNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカインまたはその他の分子の局在における変化;１または複数のRNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、受容体またはその他の分子の生理活性または特異的活性の変化;イオン、サイトカイン、ホルモン、増殖因子またはその他の分子の分泌における変化; 細胞膜電位、分極、統合性または輸送における変化; ウイルス性および細菌性病原体の感染性、感受性、潜伏期、接着、および取り込みにおける変化;等。本明細書において「表現型を変化させることが出来る」とは、生理活性試薬がなんらかの検出可能および／または測定可能な様式で細胞の表現型を変化させることが出来ることをいう。
【０１０８】
表現型変化は様々な手段で検出でき、変化すべき表現型に一般に依存及び対応する。一般に、変化した表現型は例えば以下を用いて検出される: 細胞形態の顕微鏡分析; 標準的細胞生存度アッセイ、これは細胞死の増加と細胞生存度の増加の両方を含む、例えば、細胞はウイルス、細菌または細菌または合成毒素による細胞死に対して耐性である;標準的標識化アッセイ、例えば特定の細胞または分子の存在またはレベルについての蛍光定量指示アッセイ、例えばFACSまたはその他の色素染色技術;細胞殺傷後の標的化合物の発現の生化学的検出;質量分析；キャピラリー電気泳動。当業者に明らかなように、スクリーニングはしばしば、スクリーニングシステムにおける標識の取り込みに基づいて行われる。即ち、１つの態様において、アッセイシステムのなんらかの成分が標識される。本明細書において「標識」とは本発明の核酸、タンパク質および抗体が少なくとも1つの本発明の核酸、タンパク質および抗体の検出を可能にする元素、同位体または化学物質を有することをいう。一般に、標識は３つのクラスに分けられる: a) 同位体標識、これは放射性同位体または重同位体; b) 免疫標識、これは抗体または抗原;およびc）着色または蛍光標識、ただしその他の標識、例えば酵素(アルカリホスファターゼおよびHRP)、ビーズ(例えば、磁気ビーズ等)も利用できる。標識は化合物の何れの位置に組み込んでもよい。
【０１０９】
かかる実験的スクリーニングアッセイにおいては、結果は測定されたパラメーターまたは出力に制限される。該スクリーニング方法(前掲)と生理関連モデルとを組み合わせることにより、実際の生化学的経路における相互作用点およびどのモデルパラメーター(例えば、酵素速度定数、ミカエリス定数、平衡定数または競合平衡）が生理活性化合物によって影響を受けているかの解釈が可能となる。このようにして、観察される実験的活性が実質的に同じである化合物の作用機作における相違が認識できる。
【０１１０】
好適な態様において、表現型変化を伴う細胞が検出されると、表現型変化を伴わない複数の細胞からその細胞を単離する。これは、当該技術分野で知られているように様々な方法で行うことが出来、場合によってはアッセイまたはスクリーニングに依存する。好適な単離技術としては、これらに限定されないが以下が挙げられる：FACS、補体を用いた溶解選択、細胞クローニング、傾向撮像装置（Fluorimager）によるスキャニング、「生存」タンパク質の発現、物理的単離のために蛍光またはタグ付加されうる細胞表面タンパク質またはその他の分子の発現誘導;非蛍光分子を蛍光分子に変化させる酵素の発現;無いか遅い増殖のバックグラウンドに対する過剰の増殖;細胞死およびDNA単離またはその他の細胞生存度の指標となる色素など。
【０１１１】
好適な態様において、生理活性試薬は陽性細胞から単離される。これは当該技術分野で知られているように様々な方法で行うことが出来る。単離されると、生理活性試薬および／または生理活性核酸の配列を決定する。この情報は様々に利用することが出来る。好適な態様において、生理活性試薬を再合成し、標的細胞に再導入して、効果を確認する。これは当該技術分野で知られたようにして行うことが出来る。
【０１１２】
好適な態様において、生理活性試薬を用いて標的分子を引き出す。例えば、本明細書にて説明するように、標的分子がタンパク質の場合、エピトープタグまたは精製配列の使用により、生化学的手段(共免疫沈降、アフィニティーカラム等)による一次標的分子の精製が可能となる。あるいは、細菌において発現させ、精製したペプチドは標的細胞型のmRNAからできた細菌cDNA発現ライブラリーに対するプローブとして利用できる。あるいは、ペプチドは酵母または哺乳類のツーまたはスリーハイブリッドシステムにおける「おとり」としても利用できる。かかる相互作用クローニングアプローチはDNA-結合性タンパク質およびその他の相互作用性タンパク質成分の単離に非常に有用である。ペプチドをその他の薬理活性化因子と組み合わせて問題のシグナル伝達経路の上位関係を研究することも出来る。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法は様々な条件下で多数の細胞タイプをスクリーニングするのに有用である。一般に、宿主細胞は疾患状態に関与する細胞であり、細胞に対して望ましくない結果を通常もたらす条件下で試験またはスクリーニングされる。好適な生理活性試薬がみつかると、望ましくない効果は減少または排除されうる。あるいは、疾患状態またはシグナル伝達経路に関連する細胞機構の解明に注目することにより、通常は望ましい結果が減少または排除されることもある。
【０１１４】
本発明のアッセイではロボットシステムを利用してもよい。好適な態様において、本発明のデバイスは液体操作要素を含む。かかる要素には、各ステーションまたはステーションのセットに液体を入れる、または取り出すための要素が含まれる。液体操作システムには、任意の数の要素を含むロボットシステムが含まれる。さらに、本明細書に説明するいずれかまたはすべての工程を自動化することが出来る;したがって、例えば、システムは完全にまたは部分的に自動化してもよい。
【０１１５】
当業者に明らかなように、利用可能な様々な要素があり、例えば、これらに限定されないが、１または複数のロボットアーム; マイクロプレートの位置づけのためのプレート搬送体;カートリッジおよび／またはキャップを備えた容器; 非クロスコンタミネーションプレート上のウェルにふたを取り外しする自動化ふたまたはキャップ搬送体; 使い捨てチップによるサンプル分配のためのチップアセンブリ; サンプル分配のための洗浄可能チップアセンブリ; 96ウェルローディングブロック; (所望により冷却した)冷却試薬ラック; マイクロタイタープレートピペット位置;プレートおよびチップ用積み重ね塔;およびコンピュータシステム。
【０１１６】
完全にロボット的またはマイクロ流体的システムには、自動化液体-、粒子-、細胞- および生物体-操作が含まれ、これにはスクリーニング用途のすべての工程を行うためのハイスループットピペッティングが含まれる。これには液体、粒子、細胞、および生物体の操作が含まれ、例えば吸引、分配、混合、希釈、洗浄、正確な容量輸送;ピペットチップの回収及び廃棄;および一回のサンプル吸引からの多数の送達のための等量のピペッティングの反復が挙げられる。これら操作はクロスコンタミネーションの無い液体、粒子、細胞、および生物体輸送である。この装置はマイクロプレートサンプルのフィルター、メンブレン、および／または娘プレートへの自動化された複製を実行し、高密度輸送、完全プレート段階希釈および高能力の操作を伴う。
【０１１７】
好適な態様において、アッセイ要素に対して特異性を有する、化学的に誘導体化された粒子、プレート、カートリッジ、チューブ、磁気粒子、またはその他の固相マトリックスが用いられる。マイクロプレート、チューブまたは固相マトリックスの結合表面としては、非孔性表面、多孔性表面、共有結合を促進するための修飾されたデキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドを結合させるアフィニティー媒体、表面結合タンパク質、例えば、組換えタンパク質AまたはG、ヌクレオチド樹脂またはコーティング、およびその他のアフィニティーマトリックスが本発明に有用である。
【０１１８】
好適な態様において、マルチウェルプレート、マルチチューブ、容器、カートリッジ、ミニチューブ、深いウェルのプレート、微小遠心管、冷却バイアル（cryovial）、角状ウェルプレート、フィルター、チップ、光ファイバー、ビーズおよびその他の固相マトリックスのための基盤または様々な容量の基盤がアップグレードできるモジュラー基盤上にさらなる能力のために収容される。このモジュラー基盤には、変速回転振盪機、およびソースサンプルおよびサンプルおよび試薬希釈のための多位置作業板、アッセイプレート、サンプルおよび試薬容器、ピペットチップおよび活動性洗浄装置が含まれる。
【０１１９】
好適な態様において、熱サイクラーおよび熱調節システムが熱交換器の温度の安定化のために用いられ、例えば、制御ブロックまたは4BC〜100BCのサンプルのインキュベーションの正確な温度制御を提供する基盤が挙げられ、装置の熱コントローラーに加えて、あるいはその代わりに用いられる。
【０１２０】
好適な態様において、一又は多数の磁気プローブ、アフィニティープローブ、またはピペッターを有する互換性のあるピペットヘッド(単または複-管)がロボット操作により、液体、粒子、細胞、および生物体を操作する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離器または基盤が、単一または多数のサンプル形態において、液体、粒子、細胞、および生物体を操作する。
【０１２１】
これら装置は無菌層流またはドラフトにおいて適合可能であり、マルチウェルプレートまたはチューブにおける細胞培養増殖および形質転換および危険操作のための封入された、自己収容システムである。生細胞は、制御された培養条件、即ち制御された温度、湿度、およびガス条件下で、時系列の生細胞アッセイのために培養される。細胞の自動化形質転換および自動化コロニーピッカーにより所望の細胞の迅速なスクリーニングが可能となる。
【０１２２】
フローサイトメトリーまたはキャピラリー電気泳動型式を用いて、磁気およびその他のビーズ、粒子、細胞、および生物体の個々の捕獲を行うことが出来る。
【０１２３】
フレキシブルなハードウェアおよびソフトウェアにより多数の用途に装置を適用することが可能となる。ソフトウェアプログラムモジュールは方法の作成、改変および実行を可能とする。システム診断モジュールは装置の並び、正確な連結、およびモーター操作を可能とする。特注のツール、実験器具、および液体、粒子、細胞および生物体輸送パターンにより、様々に適用を施すことが可能となる。データベースは方法とパラメーターの記憶を可能とする。ロボットとコンピュータの連携により装置間の連絡が可能となる。
【０１２４】
好適な態様において、ロボット装置はCPUを含み、これはバスを介してメモリと入力/出力デバイス(例えば、キーボード、マウス、モニター、プリンタ等)のセットを連絡する。以下に記載するように、これは本発明の多重デバイスのためのCPUに加えてもよいし、その代わりとしてもよい。CPU、メモリ、入力/出力デバイス、およびバスの一般的な相互作用は当該技術分野で知られている。したがって、実行すべき実験に応じて様々な手順がCPUメモリに記録される。当業者に明らかなように、MathematicaおよびMathCadプログラムおよび匹敵するプログラムを利用することが出来る。
【０１２５】
これらロボット液体操作システムは多数の試薬を利用することが出来、例えば、バッファー、試薬、サンプル、洗浄、アッセイ要素等が挙げられる。
【０１２６】
上記の議論は生物学的用途に関するものであるが、本明細書にて説明するように、その他のシステムも評価でき、数学モデルが作成される。例えば、１つの態様において、単位操作は交通に関連する。モデリングできる効果としては、季節/休日変動、時刻、構造の存在または不在、娯楽、例えばスポーツまたはコンサートなどの存在または不在が挙げられる。単位操作には以下が含まれうる:交通信号、交差点横断歩道または傾斜路、トンネル、橋、幹線道路、道路、駐車構造など。単位操作が作用しうる目的には以下が含まれうる：歩行者、自動車、トラック、列車、自転車など。
【０１２７】
別の態様において、モデルは気候に関連し、季節、温度、風速、降水、地球温暖化または気候変化などのモデルが含まれる。単位操作には以下が含まれうる：大気および水中の熱対流、太陽放射および吸収、蒸発、凝縮、強制対流(大気および水の効果)、熱または冷却の点源(氷山、氷河、火山、人間活動)。
【０１２８】
別の態様において、モデルは金融、経済、または市場の分析に関連し、以下のモデルが含まれる：株価、資本移動、騰貴、財貨サービスの価格と配置、広告効果など。単位操作には以下が含まれうる：銀行、政府財政金融政策、製造作業、輸送、建設、卸売りおよび小売り消費パターンなど。
【０１２９】
以下の実施例は上記の本発明の使用態様をさらに説明するものであり、本発明の様々な態様を実施するために考えられる最良の形態を示すものである。これら実施例は本発明の範囲を限定するものではなく、例示の目的であることを理解されたい。
【０１３０】
以下に列挙のものを含む全ての参考文献は引用によりその全体が本明細書に含まれる。
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【実施例１】
【０１３１】
単分子化学平衡
【数１１】
2006501579.tif 000013
成分Aの濃度の変化速度は下記式で与えられる:
【数１２】
2006501579.tif 000014
(1)
【０１３２】
各成分の濃度はコントロールまたは定常状態からの偏差 (ΔA[t]およびΔB[t])について以下のように表される(AssおよびBss)。
【数１３】
2006501579.tif 000015
(2)
【数１４】
2006501579.tif 000016
(3)
そして、
【数１５】
2006501579.tif 000017
(4)
ただし、
【数１６】
2006501579.tif 000018
(5)
【０１３３】
式 1に代入すると以下となる:
【数１７】
2006501579.tif 000019
(6)
ラプラス変換を行うと以下となる:
【数１８】
2006501579.tif 000020
(7)
ΔA[s]を解き、Keq = kf/kbとすると以下となる：
【数１９】
2006501579.tif 000021
(8)
ここで、システムにおけるゲインを以下とする:
【数２０】
2006501579.tif 000022
(9)
そして一次時定数を以下とする:
【数２１】
2006501579.tif 000023
(10)
【０１３４】
ラプラス逆変換を行い、タイムドメインにおける差分方程式の解として以下を得る：
【数２２】
2006501579.tif 000024
(11)
【実施例２】
【０１３５】
生体分子化学平衡
【数２３】
2006501579.tif 000025
基質濃度(AおよびB)から生成物濃度(C)への変換速度は以下に表される:
【数２４】
2006501579.tif 000026
(2.1)
しかし、各種の濃度における変動はコントロールまたは定常状態[ss]濃度と以下によって関連づけられる:
【数２５】
2006501579.tif 000027
(2.2)
【数２６】
2006501579.tif 000028
(2.3)
【数２７】
2006501579.tif 000029
(2.4)
そして、
【数２８】
2006501579.tif 000030
(2.5)
ただし、
【数２９】
2006501579.tif 000031
(2.5)
【０１３６】
したがって、式 2.1に代入すると以下を得る:
【数３０】
2006501579.tif 000032
(2.6)
しかし第一の近似において、ΔA[t]とΔB[t]が共に小さいとすると、二次項(ΔA[t]ΔB[t])は無視でき、以下の線形近似が得られる:
【数３１】
2006501579.tif 000033
(2.7)
【０１３７】
ラプラス変換を行いΔC[s]を解き、Keq = kf/kbとすると以下が得られる:
【数３２】
2006501579.tif 000034
(2.8)
ここで、
【数３３】
2006501579.tif 000035
(2.9)
【数３４】
2006501579.tif 000036
(2.10)
【数３５】
2006501579.tif 000037
(2.11)
【０１３８】
ラプラス逆変換を行いタイムドメインにおける解を得る:
【数３６】
2006501579.tif 000038
(2.12)
【実施例３】
【０１３９】
酵素-媒介平衡
【数３７】
2006501579.tif 000039
生成物Bの生成速度は下記式により他の成分の濃度と相関する:
【数３８】
2006501579.tif 000040
(3.1)
ここで、酵素複合体の形成についての標準的偽定常状態近似を適用すると:
【数３９】
2006501579.tif 000041
(3.2)
そして、
【数４０】
2006501579.tif 000042
(3.3)
しかし酵素についての物質収支から以下となる:
【数４１】
2006501579.tif 000043
(3.4)
式 3.1に代入すると、
【数４２】
2006501579.tif 000044
(3.5)
しかし、各種の濃度の変動はコントロールまたは定常状態[ss]濃度と以下のように関連づけられる:
【数４３】
2006501579.tif 000045
(3.6)
【数４４】
2006501579.tif 000046
(3.7)
【数４５】
2006501579.tif 000047
(3.8)
そして、
【数４６】
2006501579.tif 000048
(3.9)
ただし、
【数４７】
2006501579.tif 000049
(3.10)
代入してΔB'[t]を解き、二次偏差項を無視すると、以下の差分方程式が得られる:
【数４８】
2006501579.tif 000050
(3.11)
【０１４０】
ラプラス変換を行ってΔB[s]を解くと以下が得られる:
【数４９】
2006501579.tif 000051
(3.12)
ここで、
【数５０】
2006501579.tif 000052
(3.13)
【数５１】
2006501579.tif 000053
(3.14)
そして
【数５２】
2006501579.tif 000054
(3.15)
【０１４１】
ラプラス逆変換を行ってタイムドメインにおける差分方程式に対する解を得る:
【数５３】
2006501579.tif 000055
(3.16)
【実施例４】
【０１４２】
ミカエリスメンテン動力学
【数５４】
2006501579.tif 000056
古典的ミカエリスメンテン式の微分はあらゆる生化学教科書に載っており、以下の生成物(P)生成速度が得られる:
【数５５】
2006501579.tif 000057
(4.1)
コントロールまたは定常状態値からの各濃度の偏差を以下のように規定する:
【数５６】
2006501579.tif 000058
(4.2)
【数５７】
2006501579.tif 000059
(4.3)
【数５８】
2006501579.tif 000060
(4.4)
そして
【数５９】
2006501579.tif 000061
(4.5)
ただし、
【数６０】
2006501579.tif 000062
(4.6)
代入すると、差分方程式を解くことが出来る:
【数６１】
2006501579.tif 000063
(4.7)
分母におけるコントロール基質濃度(Sss)からの小さい偏差を無視すると、式 4.7が以下の近似関係によって線形化できる:
【数６２】
2006501579.tif 000064
(4.8)
最後に、二次偏差 (ΔE[t]ΔS[t])を無視すると以下が得られる:
【数６３】
2006501579.tif 000065
(4.9)
【０１４３】
ラプラス変換を行ってP[s]を解くと、以下が得られる:
【数６４】
2006501579.tif 000066
(4.10)
ここで、
【数６５】
2006501579.tif 000067
(4.11)
そして、
【数６６】
2006501579.tif 000068
(4.12)
【０１４４】
ラプラス逆変換を行って以下のタイムドメインにおける差分方程式に対する解を得る:
【数６７】
2006501579.tif 000069
(4.13)
【実施例５】
【０１４５】
二分子酵素反応
【数６８】
2006501579.tif 000070
生成物(P1またはP2)の生成速度は以下によって与えられる:
【数６９】
2006501579.tif 000071
(5.1)
基質結合速度が律速ではないとすると、中間体(ES1およびES2)の形成は以下の平衡関係によって表される:
【数７０】
2006501579.tif 000072
(5.2)
【数７１】
2006501579.tif 000073
(5.3)
そして酵素総濃度(ET[t])は物質収支から得られる:
【数７２】
2006501579.tif 000074
(5.4)
そして通常の複合体形成(E S1S2[t])についての偽定常状態近似を適用すると以下が得られる:
【数７３】
2006501579.tif 000075
(5.5)
そして代入すると:
【数７４】
2006501579.tif 000076
(5.6)
ここで
【数７５】
2006501579.tif 000077
(5.7)
コントロールまたは定常状態濃度からの偏差としての各変数の変動を以下のように表すことが出来る:
【数７６】
2006501579.tif 000078
(5.8)
【数７７】
2006501579.tif 000079
(5.9)
【数７８】
2006501579.tif 000080
(5.10)
【数７９】
2006501579.tif 000081
(5.11)
そして、
【数８０】
2006501579.tif 000082
(5.12)
ここで、
【数８１】
2006501579.tif 000083
(5.13)
生成物濃度の偏差(ΔP[t])における変化速度を解くと以下が得られる:
【数８２】
2006501579.tif 000084
(5.14)
【０１４６】
ラプラス変換を行い、式 5.14の分母におけるコントロール値からの偏差を無視し二次偏差項を無視すると以下の伝達関数が得られる:
【数８３】
2006501579.tif 000085
(5.15)
ここで
【数８４】
2006501579.tif 000086
(5.16)
【数８５】
2006501579.tif 000087
(5.17)
【数８６】
2006501579.tif 000088
(5.18)
【０１４７】
式 5.15のラプラス逆変換を行うとタイムドメインにおける差分方程式に対する解が得られる：
【数８７】
2006501579.tif 000089
(5.19)
【実施例６】
【０１４８】
アロステリック上方制御を伴うミカエリスメンテン酵素
【数８８】
2006501579.tif 000090
調節性リガンド (L)の結合が活性化された酵素に触媒される反応よりも速いと仮定すると、これは以下の平衡式で表される:
【数８９】
2006501579.tif 000091
(6.1)
さらに、この平衡式におけるEa[t] が実際に活性酵素＋活性酵素-基質複合体の濃度であるとする。
【０１４９】
ミカエリスメンテンから以下が得られる:
【数９０】
2006501579.tif 000092
(6.2)
ただし、活性酵素濃度 (Ea[t])は物質収支から総酵素濃度(E[t])と相関づけられる:
【数９１】
2006501579.tif 000093
(6.3)
したがって、式6.1、6.2、および 6.3を組み合わせると、生成物生成濃度は以下のように表される:
【数９２】
2006501579.tif 000094
(6.4)
各変数における変化はそのコントロールまたは定常状態濃度からの偏差として表される:
【数９３】
2006501579.tif 000095
(6.5)
【数９４】
2006501579.tif 000096
(6.6)
【数９５】
2006501579.tif 000097
(6.7)
【数９６】
2006501579.tif 000098
(6.8)
そして
【数９７】
2006501579.tif 000099
(6.9)
ここで
【数９８】
2006501579.tif 000100
(6.10)
式 6.4に代入し、生成物偏差(ΔP'[t])の変化速度を解くと、以下が得られる:
【数９９】
2006501579.tif 000101
(6.11)
しかし、一次項の分母における定常状態からの偏差は無視でき、第一の近似が導かれる。さらに、二次偏差項も無視すると、式 6.11は以下の近似になる:
【数１００】
2006501579.tif 000102
(6.12)
【０１５０】
ラプラス変換を行い、各偏差変数についての伝達関数が得られる:
【数１０１】
2006501579.tif 000103
(6.13)
ここで
【数１０２】
2006501579.tif 000104
(6.14)
【数１０３】
2006501579.tif 000105
(6.15)
【数１０４】
2006501579.tif 000106
(6.16)
【０１５１】
ラプラス逆変換を行うと、タイムドメインにおける差分方程式に対する解が得られる:
【数１０５】
2006501579.tif 000107
(6.17)
【実施例７】
【０１５２】
アロステリック抑制を伴うミカエリスメンテン酵素
【数１０６】
2006501579.tif 000108
調節性リガンド (L)の結合は活性酵素によって触媒される反応よりも速いと仮定すると、下記平衡式によって表される:
【数１０７】
2006501579.tif 000109
(6.1)
さらに平衡式におけるEa[t]は活性酵素＋活性酵素-基質複合体の実際の濃度であるとする。ミカエリスメンテンから以下が導かれる:
【数１０８】
2006501579.tif 000110
(6.2)
ただし、活性酵素濃度 (Ea[t])は物質収支から総酵素濃度 (E[t])と以下のように相関づけられる:
【数１０９】
2006501579.tif 000111
(6.3)
それゆえ、式6.1、6.2および6.3を組み合わせると、生成物生成速度は以下のように表される:
【数１１０】
2006501579.tif 000112
(6.4)
各変数における変化はコントロールまたは定常状態濃度からの偏差として表される:
【数１１１】
2006501579.tif 000113
(6.5)
【数１１２】
2006501579.tif 000114
(6.6)
【数１１３】
2006501579.tif 000115
(6.7)
【数１１４】
2006501579.tif 000116
(6.8)
そして、
【数１１５】
2006501579.tif 000117
(6.9)
ここで
【数１１６】
2006501579.tif 000118
(6.10)
式 6.4に代入し、生成物偏差の変化速度 (ΔP'[t])を解くと以下が得られる:
【数１１７】
2006501579.tif 000119
(6.11)
しかし、一次項の分母における定常状態からの偏差は無視でき、一次近似が導かれる：
【数１１８】
2006501579.tif 000120
(6.12)
この式を拡張し、二次および三次偏差項を除き、ラプラス変換を行うと、各偏差変数についての伝達関数が得られる:
【数１１９】
2006501579.tif 000121
(6.13)
ここで
【数１２０】
2006501579.tif 000122
(6.14)
【数１２１】
2006501579.tif 000123
(6.15)
【数１２２】
2006501579.tif 000124
(6.16)
【０１５３】
ラプラス逆変換を行うと、タイムドメインにおける差分方程式に対する解が得られる:
【数１２３】
2006501579.tif 000125
(6.17)
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図1は本発明の一般方法の模式図を示す。単位操作を用いて第一の仮想数学モデルを作り、そこでAIアルゴリズムを実行し、第二の数学モデルを作る。一般に適合度関数が(a))に適用され、これはある場合には実験データとの直接比較であり、第三の仮想数学モデルを作る。これをグローバルな解が見つかるまで反復してもよい(本明細書に記載する場合、グローバルな解への収束は必要とされないが)。
【図２】図2は本発明の一般的GA方法の模式図である。偽遺伝子の形態の単位操作を用いて第一の仮想数学モデル(例えば、この場合２つの親偽染色体)を作り、ここで遺伝的アルゴリズムが実行され、第二の数学モデル(例えば、第一世代子染色体)を作る。一般に、適合度関数を(a))に適用し、これはある場合には実験データとの直接比較である。これをグローバルな解が見つかるまで反復してもよい(本明細書に記載する場合、グローバルな解への収束は必要とされないが)。
【図３】図3はシステム生物学モデル作成のための染色体組成および子の世代を示す。Mは生理的単位操作セットを表し、これからモデル染色体が構築され、ここでjはセットからの特定の単位操作要素であり、iはその位置モデル染色体である。これはすべての単位操作が各モデル位置においてランダムに分布しうることを想定するが、アルゴリズムの適用は当業者に明らかであり、各位置に置いて異なるセットが可能であり、かかる変動はBeysianアプローチを表す。全モデル長はnであり、これは実施例において一定であるが、ゼロを単位操作のセットに含めることにより異なる染色体間で変動し得る。この型のアルゴリズムにおいて、子孫の相対適応度を用いてどの子孫が次世代で生まれるかを選択する。子4の位置1に起こるランダム突然変異が示され、これもまた単位操作のセットから得られる。
【図４】図4は本発明の特定のシステムの模式図を示す。図4AはEmbden-Meyhoff システム経路とその要素を示し、図4Bはこのシステムに関連する偽染色体を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−ａ】
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【図４−ｂ】
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【国際調査報告】
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