(57)【要約】ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物。
【請求項２】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体フラグメントはモノクローナル抗体のフラグメントである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体フラグメントはＦａｂまたは単鎖Ｆｖである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗体または抗体フラグメント、あるいは前記抗体または抗体フラグメントの一部分はヒト起源である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗体または抗体フラグメントの前記一部分は、前記抗体または抗体フラグメントの定常領域の一部分、あるいは前記抗体または抗体フラグメントの定常領域である請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗体または抗体フラグメントに結合したトキシンまたは検出可能な成分をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記検出可能な成分は、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、蛍光団、酵素およびポリヒスチジンタグからなる群から選択される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ビオチンタンパク質リガーゼはＢｉｒＡである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記蛍光団はフィコエリトリンである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記トキシンはシュードモナス外毒素Ａまたはその一部分である請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記シュードモナス外毒素Ａの一部分は輸送ドメインおよび／またはＡＤＰリボシル化ドメインである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ヒト抗原提示分子は単鎖抗原提示分子である請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記病原体はウイルス病原体である請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記レトロウイルスはヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドは、ウイルスの癌タンパク質のセグメント、Ｔａｘタンパク質のセグメント、および配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
有効成分としての請求項１に記載の組成物と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。
【請求項２７】
ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む組成物。
【請求項２８】
前記抗体はモノクローナル抗体である請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗体フラグメントはモノクローナル抗体のフラグメントである請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体フラグメントはＦａｂまたは単鎖Ｆｖである請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体または抗体フラグメント、あるいは前記抗体または抗体フラグメントの一部分はヒト起源である請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体または抗体フラグメントの前記一部分は、前記抗体または抗体フラグメントの定常領域の一部分、あるいは前記抗体または抗体フラグメントの定常領域である請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗体または抗体フラグメントに結合したトキシンまたは検出可能な成分をさらに含む請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
前記検出可能な成分は、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、蛍光団、酵素およびポリヒスチジンタグからなる群から選択される請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ビオチンタンパク質リガーゼはＢｉｒＡである請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記蛍光団はフィコエリトリンである請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
前記酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである請求項３６に記載の組成物。
【請求項４０】
前記トキシンはシュードモナス外毒素Ａまたはその一部分である請求項３５に記載の組成物。
【請求項４１】
前記シュードモナス外毒素Ａの一部分は輸送ドメインおよび／またはＡＤＰリボシル化ドメインである請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項２７に記載の組成物。
【請求項４３】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ヒト抗原提示分子は単鎖抗原提示分子である請求項２７に記載の組成物。
【請求項４６】
前記病原体はウイルス病原体である請求項２７に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記レトロウイルスはヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項２７に記載の組成物。
【請求項５０】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項２７に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ポリペプチドは、ウイルスの癌タンパク質のセグメント、Ｔａｘタンパク質のセグメント、および配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
有効成分としての請求項２７に記載の組成物と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物。  
【請求項５３】
ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体フラグメントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５４】
ウイルスのコートタンパク質、検出可能な成分、およびトキシンからなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５５】
ポリペプチドをコードする前記核酸配列は抗体フラグメントをコードする前記核酸配列と翻訳融合される請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記抗体フラグメントはＦａｂまたは単鎖Ｆｖである請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記ウイルスは繊維状ファージであり、前記ウイルスの前記コートタンパク質はｐＩＩＩである請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記検出可能な成分は、ポリヒスチジンタグまたはビオチンタンパク質リガーゼの認識配列である請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記ビオチンタンパク質リガーゼはＢｉｒＡである請求項５８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６０】
前記トキシンはシュードモナス外毒素Ａまたはその一部分である請求項５４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記シュードモナス外毒素Ａの一部分は輸送ドメインおよび／またはＡＤＰリボシル化ドメインである請求項６０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記抗体フラグメント、あるいは前記抗体フラグメントの一部分はヒト起源である請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６４】
前記抗体フラグメントの前記一部分は、前記抗体フラグメントの定常領域の一部分、あるいは前記抗体フラグメントの定常領域である請求項６３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する結合親和性によって特徴づけられる請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６７】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項６６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６８】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項６７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６９】
前記ヒト抗原提示分子は単鎖抗原提示分子である請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記病原体はウイルス病原体である請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７１】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項７０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記レトロウイルスはヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項７１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７３】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７４】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７５】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項７４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７６】
請求項５３に記載の単離されたポリヌクレオチドと、宿主細胞における前記単離されたポリヌクレオチドの転写を行わせるためのプロモーター配列とを含む核酸構築物。
【請求項７７】
前記プロモーター配列はＴ７のプロモーター配列である請求項７６に記載の核酸構築物。
【請求項７８】
前記プロモーター配列は原核生物における前記核酸配列の発現を駆動することができる請求項７６に記載の核酸構築物。
【請求項７９】
前記プロモーター配列は前記核酸配列の誘導可能な発現を駆動することができる請求項７６に記載の核酸構築物。
【請求項８０】
請求項７６に記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項８１】
前記宿主細胞は原核生物細胞である請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
前記原核生物細胞は大腸菌細胞である請求項８１に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
請求項７６に記載の核酸構築物を含む宿主ウイルス。
【請求項８４】
前記宿主ウイルスは繊維状ファージである請求項８３に記載の宿主ウイルス。
【請求項８５】
ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体フラグメントに融合されたコートタンパク質を含むウイルス。
【請求項８６】
前記ウイルスは繊維状ファージであり、前記コートタンパク質はｐＩＩＩである請求項８５に記載のウイルス。
【請求項８７】
前記抗体フラグメントはＦｄフラグメントまたはＦａｂである請求項８５に記載のウイルス。
【請求項８８】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項８５に記載のウイルス。
【請求項８９】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項８５に記載のウイルス。
【請求項９０】
前記抗体フラグメントに結合した検出可能な成分をさらに含む請求項８５に記載のウイルス。
【請求項９１】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項８５に記載のウイルス。
【請求項９２】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項９１に記載のウイルス。
【請求項９３】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項９２に記載のウイルス。
【請求項９４】
前記ヒト抗原提示分子は単鎖抗原提示分子である請求項８５に記載のウイルス。
【請求項９５】
前記病原体はウイルス病原体である請求項８５に記載のウイルス。
【請求項９６】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項９５に記載のウイルス。
【請求項９７】
前記レトロウイルス病原体はヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項９６に記載のウイルス。
【請求項９８】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項８５に記載のウイルス。
【請求項９９】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項８５に記載のウイルス。
【請求項１００】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項９９に記載のウイルス。
【請求項１０１】
ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を検出する方法であって、
（ａ）前記複合体の抗原提示部分を、前記複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体またはフラグメントを含む組成物にさらし、それにより、前記複合体の前記抗原提示部分と前記抗体または抗体フラグメントとのコンジュゲートを得ること；および
（ｂ）前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントを検出し、それにより、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を検出すること
を含む方法。
【請求項１０２】
前記複合体は標的細胞によって呈示または発現され、工程（ａ）が、前記標的細胞を前記組成物にさらすことによって行われる請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
（ｃ）前記標的細胞を個体から得ること
をさらに含む請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記標的細胞を前記組成物にさらすことは、前記組成物を個体に投与することによって行われる請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記標的細胞はＴリンパ球または抗原提示細胞である請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記抗原提示細胞はＢ細胞または樹状細胞である請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記組成物は前記抗体または抗体フラグメントに結合した検出可能な成分をさらに含み、工程（ｂ）は、前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントに結合した前記検出可能な成分を検出することによって行われる請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記検出可能な成分は、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、蛍光団、および酵素からなる群から選択される請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記抗体フラグメントはＦａｂである請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ヒト抗原提示分子は単鎖抗原提示分子である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１６】
前記病原体はウイルス病原体である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記レトロウイルス病原体はヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２０】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項１０１に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
個体における病原体による感染を診断する方法であって、
（ａ）ヒト抗原提示分子と、前記病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物に前記個体の標的細胞をさらし、それにより、前記複合体の前記抗原提示部分と、前記抗体または抗体フラグメントとのコンジュゲートを得ること；および
（ｂ）前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントを検出し、それにより、個体における病原体による感染を診断すること
を含む方法。
【請求項１２３】
（ｃ）前記標的細胞を前記個体から得ること
をさらに含む請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
工程（ａ）は、前記組成物を前記個体に投与することによって行われる請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記標的細胞はＴリンパ球または抗原提示細胞である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
前記抗原提示細胞はＢ細胞または樹状細胞である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２７】
前記組成物は前記抗体または抗体フラグメントに結合した検出可能な成分をさらに含み、工程（ｂ）は、前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントに結合した前記検出可能な成分を検出することによって行われる請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２８】
前記検出可能な成分は、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、蛍光団、および酵素からなる群から選択される請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記抗体フラグメントはＦａｂである請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３０】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３１】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３３】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記病原体はウイルス病原体である請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記レトロウイルス病原体はヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３９】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項１２２に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を発現または呈示する標的細胞を殺すか、または損傷する方法であって、前記複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物に前記標的細胞をさらし、それにより、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を発現または呈示する標的細胞を殺すか、または損傷することを含む方法。
【請求項１４２】
前記組成物は前記抗体または抗体フラグメントに結合されたトキシンをさらに含む請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記トキシンはシュードモナス外毒素Ａまたはその一部分である請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記標的細胞を個体から得る工程をさらに含む請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４５】
前記細胞を前記組成物にさらすことは、前記組成物を個体に投与することによって行われる請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４６】
前記標的細胞は前記病原体に感染している請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４７】
前記標的細胞はＴリンパ球または抗原提示細胞である請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４８】
前記抗原提示細胞はＢ細胞または樹状細胞である請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４９】
前記抗体フラグメントは単鎖Ｆｖである請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５０】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５１】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記病原体はウイルス病原体である請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記レトロウイルス病原体はヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５９】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項１４１に記載の方法。
【請求項１６０】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
個体における病原体に関連する疾患を処置する方法であって、ヒト抗原提示分子と、前記病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物を有効成分として含む医薬組成物の治療効果的な量を前記個体に投与し、それにより、個体における病原体に関連する疾患を処置することを含む方法。
【請求項１６２】
前記組成物は前記抗体または抗体フラグメントに結合されたトキシンをさらに含む請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記トキシンはシュードモナス外毒素Ａまたはその一部分である請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記抗体フラグメントはＦａｂまたは単鎖Ｆｖである請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６５】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６６】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６７】
前記ヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６８】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
前記病原体はウイルス病原体である請求項１６１に記載の方法。
【請求項１７１】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記レトロウイルス病原体はヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
病原体に由来する前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項１６１に記載の方法。
【請求項１７４】
病原体に由来する前記抗原はポリペプチドである請求項１６１に記載の方法。
【請求項１７５】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
抗原提示分子および抗原から構成される複合体の抗原提示部分を生物学的サンプルにおいて検出する方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルを表面に結合すること；
（ｂ）前記生物学的サンプルを、前記複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物にさらし、それにより、前記複合体の前記抗原提示部分と、前記抗体またはフラグメントとのコンジュゲートを得ること；および
（ｃ）前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントを検出し、それにより、抗原提示分子および抗原から構成される複合体の抗原提示部分を生物学的サンプルにおいて検出すること
を含む方法。
【請求項１７７】
（ｄ）前記生物学的サンプルを個体から得ること
をさらに含む請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
工程（ｂ）は、前記組成物を個体に投与することによって行われる請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７９】
前記組成物は前記抗体または抗体フラグメントに結合した検出可能な成分をさらに含み、工程（ｃ）は、前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントに結合した前記検出可能な成分を検出することによって行われる請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８０】
前記検出可能な成分は、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、蛍光団、および酵素からなる群から選択される請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記抗原は病原体に由来する請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８２】
前記生物学的サンプルは病原体に感染している請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記病原体はウイルス病原体である請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記ウイルス病原体はレトロウイルス病原体である請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
前記レトロウイルス病原体はヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
前記生物学的サンプルは細胞サンプルまたは組織サンプルである請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８７】
前記抗体フラグメントは軽鎖、Ｆｄフラグメント、及びＦａｂからなる群から選択される請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１７６に記載の方法。
【請求項１８９】
前記複合体の前記抗原提示部分に対する前記抗体または抗体フラグメントの前記結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９０】
前記抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９１】
前記主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記抗原は前記抗原提示分子によって制限される請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９４】
前記抗原はポリペプチドである請求項１７６に記載の方法。
【請求項１９５】
前記ポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１９４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の抗原提示分子（ＡＰＭ）：抗原複合体と特異的に結合することができる組成物に関連する。より具体的には、本発明は、特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と特異的に結合することができる組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
病原体（例えば、ウイルス、マイコプラズマ、細菌、真菌および原生動物など）によって引き起こされる疾患は、その生涯で数々の場合においてすべてのヒト個体に影響を及ぼす、非常に衰弱性／致死性の高い疾患を含む膨大な数の疾患の原因となっている。例えば、レトロウイルスによって引き起こされる疾患は、様々な免疫学障害、神経学的障害および腫瘍性疾患に関連する。例えば、リンパ親和性レトロウイルスによって引き起こされる疾患、例えば、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、または近縁のヒトＴ細胞リンパ親和性ウイルス（ＨＴＬＶ）（様々な致死性病理の病原因子）によって引き起こされる疾患など（一般的な参照については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＭ．他、２００１、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｐａｔｈｏｌ、８２：１３５〜４７；Ｂａｎｇｈａｍ  ＣＲ．、２０００、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ、５３：５８１〜６を参照のこと）は、ヒトおよび経済に大きな影響を与える致死性疾患の発生の原因である。
【０００３】
しかしながら、多くの種類の病原体関連疾患（例えば、ＨＩＶまたはＨＴＬＶなどのリンパ親和性ウイルスに関連する疾患など）を診断し、特長づけ、また、処置する満足すべき方法を利用することができない。
【０００４】
ＨＴＬＶ−１は、同定された最初のヒトレトロウイルスであった（Ｐｏｉｅｓｚ  Ｂ．Ｊ．他、１９８０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７７：７４１５〜７４１９）。ＨＴＬＶ−１はＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴリンパ球に感染し、成人Ｔリンパ球白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ；Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ．他、１９８２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７９：２０３１〜２０３５）および非腫瘍性の炎症性神経学的症候群（これはＩ型ヒトＴリンパ親和性（ＨＴＬＶ−１）関連ミエロパシー／熱帯ウイルス痙攣性不全対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ；Ｏｓａｍｅ  Ｍ．他、１９８６、Ｌａｎｃｅｔ、１：１０３１〜１０３２；Ｒｉｂａｓ  ＪＧ．およびＭｅｌｏ  ＧＣ．、２００２、Ｒｅｖ  Ｓｏｃ  Ｂｒａｓ  Ｍｅｄ  Ｔｒｏｐ、３５：３７７〜８４；Ｐｌｕｍｅｌｌｅ  Ｙ．、１９９９、Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ、５２：５９５〜６０４において総説される）と呼ばれる）を含む様々な疾患に関連する。血清疫学的研究に基づいてＨＴＬＶ−１感染に結びつけられる他の疾患には、シェーグレン症候群、炎症性関節症、多発性筋症および肺疾患が含まれる（Ｃｏｓｃｏｙ  Ｌ．他、１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４８：３３２〜３４１）。ＨＴＬＶのタンパク質Ｔａｘは、ＨＴＬＶ−１関連疾患の病理発生において主要な役割を果たしているようである。Ｔａｘタンパク質は、ウイルス遺伝子および細胞遺伝子（例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および他のサイトカイン、インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、プロトガン遺伝子、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓ、ならびに主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子など）の転写を刺激することが知られている（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ．、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１：１３１〜１３５）。Ｔａｘの形質転換能が種々の実験系で明らかにされている。Ｔａｘを発現する齧歯類の繊維芽細胞系細胞株は軟寒天においてコロニーを形成し、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成することが示されている（Ｔａｎａｋａ  Ａ．他、１９９０、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７：１０７１〜１０７５）。また、ＴａｘはＲａｓタンパク質と共同して初代繊維芽細胞を形質転換し（Ｐｏｚｚａｔｔｉ  Ｒ．他、１９９０、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１０：４１３〜４１７）、初代Ｔリンパ球をＩＬ−２の存在下で不死化する（Ｇｒａｓｓｍａｎｎ  Ｒ．他、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６：３３５１〜３３５５）。ｔａｘ遺伝子を保有する遺伝子組換えマウスは種々のタイプの腫瘍を発達させる（Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｗ．Ｊ．他、１９９５、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２：１０５７〜１０６１）。ＴａｘはＤＮＡに対して直接的に結合するが、細胞のいくつかの転写因子と共同して作用し、Ｔａｘにより媒介される細胞形質転換におけるこれらの異なる相互作用の役割は依然として不明である（Ｃｏｓｃｏｙ  Ｌ．他、１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４８：３３２〜３４１）。
【０００５】
ＨＡＭ／ＴＳＰは、中枢神経系（ＣＮＳ）および脊髄の白質を冒す進行性の慢性脱髄障害である。この疾患は、男性の約２倍の女性が罹患し、典型的には、疾患発症時期が３０代である。この疾患は数々の非常に衰弱性の高い症状を引き起こし、共通する初期症状および徴候には、歩行障害、ならびに下肢の衰弱およびこわばりが含まれる。この疾患は、下肢の方が上肢よりもはるか大きく冒され、中程度〜重度の痙縮が起こることがあり、また、下部背痛が一般に生じる。疾患の進行には、腸および膀胱の機能不全、ならびに感覚喪失および知覚不全を伴う。磁気共鳴画像法により調べられた患者は、脊髄の萎縮だけでなく、脳における非特異的な病巣を示す場合がある。ＨＡＭ／ＴＳＰに関連する免疫発現には、中枢神経系における主として単球からなる炎症性浸潤物、およびＨＴＬＶ−１Ｔａｘタンパク質のペプチドと主に反応し得る非常に多数のＣＤ８＋  細胞が含まれる。末梢血および脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるそのようなＴ細胞の頻度は、ＨＴＬＶ−１プロウイルスの負荷量およびＨＴＬＶ−１ｔａｘ  ｍＲＮＡの発現レベルに比例することが示されている。ＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子を保有する患者では、免疫応答が、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドを認識するＣＤ８＋  Ｔリンパ球によって支配されることがさらに示されている（Ｂｉｅｇａｎｏｗｓｋａ  Ｋ．他、１９９９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２：１７６５〜１７７１；Ｎａｇａｉ，Ｍ．他、２００１、Ｊ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓ、１８３：１９７〜２０５）。従って、胸腺、脳およびＨＴＬＶ−１が共に有する免疫学的決定因子（例えば、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドおよびその抗原性模倣体など）は、リンパ球の向神経性および神経組織における脱髄を導いていると考えられる。胸部脊髄関与の特異性が、遺伝学的にはＨＡＭ／ＴＳＰ患者に特有である、共有する胸腺および胸部脊髄の決定因子に関係づけられ得ると考えられている。第１段階において、疾患の発症は、そのような決定因子に対して特異的で、ＨＴＬＶ−１感染に応答して再活性化されるＣＤ４＋  Ｔリンパ球に依存している場合があり、また、この段階の期間中におけるそのような脱髄が潜在的には、稀突起膠細胞およびニューロンの接着分子の発現が変化した後におけるミエリン合成における停止の結果として開始され得る。疾患の第２段階は慢性の炎症性の症状発現を伴っており、ウイルス粒子に対して特異的なＣＤ８＋  Ｔリンパ球に依存する場合があるが、ミエリン層のタンパク質分解の結果として生じたペプチドに対して特異的なＣＤ８＋  Ｔリンパ球、および他の中枢神経系タンパク質にも依存する場合がある。
【０００６】
良くても、コルチコステロイドおよびＩＦＮ−γを用いたＨＡＭ／ＴＳＰの治療は、リンパ親和性ウイルスに関連する数々の疾患と同様に、一時的な応答をもたらし得る一方で、現在、ＨＡＭ／ＴＳＰに対する効果的な処置は全くなく、また、最新技術は現在、患者におけるこの疾患の最適な予測、診断、病期分類、モニターリングおよび予後を可能にしていない。
【０００７】
免疫系では、病原体からの抗原特異的な保護を提供するために２つのタイプの免疫応答（すなわち、体液性免疫応答および細胞免疫応答）が用いられており、これらはそれぞれ、抗体およびＴリンパ球による病原体抗原の特異的な認識を伴っている。
【０００８】
Ｔリンパ球は、細胞性免疫の抗原特異的なエフェクターであることによって、そのような病原体が感染した細胞を直接的に細胞溶解することによる、細胞内病原体（例えば、ウイルス、細胞内の細菌、マイコプラズマおよび細胞内の原生動物など）により媒介される疾患からの身体の防御における中心的かつ直接的な役割を果たしている。しかしながら、ヘルパーＴリンパ球もまた、非細胞内病原体に対する体液性免疫応答における非常に重要な役割を、そのような病原体の抗原に対して特異的な抗体の産生を刺激するためにインターロイキン分泌の形態でＢリンパ球にＴ細胞の助けを提供することによって果たしている。
【０００９】
Ｔリンパ球応答の特異性はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によってもたらされ、かつＴ細胞受容体を介して活性化される。Ｔ細胞受容体は、抗体遺伝子レパートリーを生じさせる際に関与する機構と同様な体細胞遺伝子再配置機構によって、抗原特異性を有するそのレパートリーが生じる個々のＴリンパ球にクローン分配される抗原特異的な受容体である。Ｔ細胞受容体は膜貫通分子のヘテロダイマーから構成され、その主要なタイプが、αβダイマーと、γδダイマーのより小さいサブセットとから構成される。Ｔリンパ球受容体サブユニットは、免疫グロブリンと同様に、膜貫通の定常領域と、細胞外ドメインにおける可変領域とを含み、ＴＣＲによって開始されるシグナル伝達が、ＣＤ３／ζ（シグナル伝達サブユニットを含む会合した多サブユニット複合体）を介して間接的に媒介される。
【００１０】
Ｔリンパ球の２つの主要なクラス、すなわち、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、表面マーカーのＣＤ４およびＣＤ８の発現によってそれぞれ区別される。本明細書中上記で記載されたように、ヘルパーＴリンパ球の主要な機能は、ＣＴＬおよびＢリンパ球の活性化および増殖を刺激する、ＩＬ−２などのサイトカインを分泌することであり、ＣＴＬの機能は、免疫原性抗原を呈示する細胞のアポトーシス死を誘導することである。
【００１１】
Ｔリンパ球受容体は、抗体とは異なり、天然の抗原を認識せず、むしろ、ペプチド抗原を提示するための特殊化された抗原提示分子（ＡＰＭ）：主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）との関連でタンパク質抗原または脂質抗原の細胞内プロセシングされたフラグメントを含む、細胞表面に呈示された複合体を認識し、また、脂質抗原、および、より小さい程度ではあるが、ペプチド抗原を提示するためのＣＤ１を認識する。ＭＨＣ分子によって呈示されるペプチド抗原、および、ＣＤ１によって呈示される脂質抗原は、ＭＨＣ制限ペプチドおよびＣＤ１制限脂質としてそれぞれ示される特徴的な化学的構造を有する。主要組織適合性複合体分子は非常に多型であり、それぞれの個々の遺伝子について４０を越える共通する対立遺伝子を含む。「古典的」なＭＨＣ分子は、免疫性において別個の機能を有する２つの主要なタイプ（クラスＩおよびクラスＩＩ）に分けられる。
【００１２】
主要組織適合性複合体クラスＩ分子は、身体における事実上すべての細胞の表面に発現しており、ペプチド抗原と結合する裂溝を含む膜貫通の重鎖と、β２−ミクログロブリンと名付けられたより小さい細胞外の鎖とからなるダイマー分子である。ＭＨＣクラスＩ分子は、プロテアソーム（細胞質における多ユニット構造体）による細胞質ゾルタンパク質の分解に由来する９アミノ酸残基〜１１アミノ酸残基のペプチドを提示する（Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｇ．、２００２、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２６８：９１〜１３６；細菌抗原のプロセシングについては、Ｗｉｃｋ  ＭＪおよびＬｊｕｎｇｇｒｅｎ  ＨＧ．他、１９９９、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１７２：１５３〜６２を参照のこと）。切断されたペプチドはＴＡＰによって小胞体（ＥＲ）の内腔に輸送され、小胞体において、組み立てられたクラスＩ分子の溝に結合し、生じたＭＨＣ：抗原複合体が、Ｔリンパ球に対する抗原提示を可能するために細胞膜に輸送される（Ｙｅｗｄｅｌｌ  ＪＷ．、２００１、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１１：２９４〜７；Ｙｅｗｄｅｌｌ  ＪＷ．およびＢｅｎｎｉｎｋ  ＪＲ．、２００１、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３：１３〜８）。
【００１３】
主要組織適合性複合体クラスＩＩ分子は、Ｔリンパ球の成熟化およびプライミングに関与する特殊化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の限定されたサブセットにおいて発現している。そのようなＡＰＣには特に、樹状細胞およびマクロファージが含まれ、これらは、細胞外の環境からサンプリングされた抗原を内在化し、プロセシングし、かつ呈示する細胞タイプである。ＭＨＣクラスＩ分子とは異なり、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、その抗原結合裂溝が約１０アミノ酸残基〜３０アミノ酸残基またはそれ以上のペプチドを収容することができるαβ膜貫通ダイマーから構成される。
【００１４】
抗原提示分子ＣＤ１（その主要な機能は、本明細書中上記で記載されたように、脂質抗原の提示である）は、ＭＨＣクラスＩ分子と同様に、β２−ミクログロブリンと対形成した膜貫通の重鎖を含むヘテロダイマーであり、そして、ＭＨＣクラスＩＩ分子と同様に、主に専門的ＡＰＣに発現している（Ｓｕｇｉｔａ  Ｍ．およびＢｒｅｎｎｅｒ  ＭＢ．、２０００、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２：５１１）。ＣＤ１：抗原複合体は、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔリンパ球およびＮＫＴリンパ球に発現するＴＣＲによって特異的に認識され、微生物免疫性、腫瘍免疫学および自己免疫性において重要な役割を果たしている。
【００１５】
したがって、身体の細胞が、それらの細胞内タンパク質含有物または脂質含有物について、かかるＡＰＭ：抗原複合体の形態で、免疫監視のときに、またはＴリンパ球の成熟化のときにＴリンパ球によって走査される。
【００１６】
病原体による感染に関連する、ＨＡＭ／ＴＳＰなどの疾患の最適な診断、特長づけおよび処置を可能にするために提案されている１つの方策は、ＡＰＭと、そのような病原体に由来する抗原との特定の組合せから構成されるＡＰＭ：抗原複合体と特異的に結合することができる分子を使用することを伴う。そのような分子は、例えば、検出可能な成分またはトキシンなどの機能的成分にコンジュゲート化することができ、また、得られるコンジュゲートは、そのような複合体、もしくはそのような複合体を呈示する細胞を検出するために、または、そのような複合体を呈示する細胞を殺すために使用することができる。従って、そのようなコンジュゲートは、個体における病原体感染を診断／特長づけおよび処置するためにそれぞれ使用することができる。あるいは、そのような複合体と特異的に結合することができる分子は、細胞表面でそのような複合体と結合し、その結果、そのような複合体に対して特異的なＴＣＲを有するＴリンパ球の活性化を阻止するようにするために使用することができる。そのような分子はさらに、例えば、そのような複合体を単離するために、または、そのような複合体を呈示する細胞、例えば、病原体が感染した細胞、もしくは、病原体由来の抗原にさらされたＡＰＣなどを単離するために使用することができる。
【００１７】
特定のＡＰＭ：抗原複合体と結合することができる分子を伴う先行技術方法がいくつか記載されている。
【００１８】
１つの方法は、特定のＭＨＣ：ペプチド複合体に対して特異的なＴＣＲまたはその誘導体を、そのような複合体と特異的に結合することができる試薬を提供する試みにおいて使用することを伴う。
【００１９】
別の方法は、特定のマウスＭＨＣ：ペプチド複合体に対して特異的な抗体またはその誘導体を、そのような複合体と特異的に結合することができる試薬を提供する試みにおいて使用することを伴う（Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．他、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：１４７〜１５０；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｓ．他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９３：１９２０〜１８２４；Ｄａｄａｇｌｉｏ，Ｇ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７２７〜７３８；Ｄａｙ、Ｐ．Ｍ．他、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：８０６４〜８０６９；Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｍ．他、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１：１３９５〜１４１２；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｂ．他、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：７６５〜７６８；Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７：７１５〜７２６；Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４６３１〜４６３６；Ｚｈｏｎｇ，Ｇ．他、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１３８５６〜１３８６１；Ｚｈｏｎｇ，Ｇ．他、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：６７３〜６８２）。
【００２０】
さらなる方法は、メラノーマ特異的な腫瘍関連抗原のメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）−Ａ１に由来するＨＬＡ−Ａ１制限ペプチドとの複合体におけるヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ１について特異的な抗体またはその誘導体を、そのような複合体と特異的に結合することができる試薬を提供する試みにおいて利用することを伴う（Ｃｈａｍｅｓ，Ｐ．他、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９７：７９６９〜７９７４）。
【００２１】
さらなる方法は、メラノーマ特異的な腫瘍関連抗原ｇｐ１００に由来するＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドとの複合体におけるヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２について特異的な抗体またはその誘導体を、そのような複合体と特異的に結合することができる試薬を提供する試みにおいて用いることを伴う（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：９４２１〜９４２６）。
【００２２】
さらに別の方法は、ヒトテロメラーゼ触媒作用サブユニット（ｈＴＥＲＴ）に由来するＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドとの複合体におけるヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２について特異的な抗体またはその誘導体を、そのような複合体と特異的に結合することができる試薬を提供する試みにおいて使用することを伴う（Ｌｅｖ，Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：３１８４〜３１９４）。
【００２３】
しかしながら、上記の先行技術方法はすべてが下記のような著しい欠点を有する：（ｉ）特定のＭＨＣ：ペプチド複合体と特異的に結合することができる化合物としてのＴＣＲまたはその一部分を使用することを伴う方法は、そのような複合体に対するＴＣＲの固有的な結合親和性が相対的に低いために最適ではない；（ｉｉ）非ヒトＭＨＣを含むＭＨＣ：ペプチド複合体について特異的な抗体またはその一部分を使用することを伴う方法はヒト適用のためには適していない；そして（ｉｉｉ）ＭＨＣ：非病原体由来抗原複合体について特異的な抗体またはその一部分を伴う方法は、病原体由来抗原を含む複合体と特異的に結合させるためには適していない。
【００２４】
従って、先行技術方法はすべて、特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と大きい特異性および親和性で特異的に結合することができる分子を提供するための適切な解決策を提供することに失敗している。
【００２５】
従って、上記制限を有しない分子が必要であることは広く認められており、そのような分子を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２６】
本発明の１つの態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）前記複合体の抗原提示部分を、前記複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体またはフラグメントを含む組成物にさらし、それにより、前記複合体の前記抗原提示部分と前記抗体または抗体フラグメント体とのコンジュゲートを得ること；および（ｂ）前記コンジュゲートの前記抗体または抗体フラグメントを検出し、それにより、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を検出することを含む。
【００２７】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記複合体は標的細胞によって呈示または発現され、かつ、工程（ａ）が、前記標的をこの組成物にさらすことによって行われる。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を検出する方法はさらに、（ｃ）この標的細胞を個体から得ることを含む。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、抗原提示分子および抗原から構成される複合体の抗原提示部分を生物学的サンプルにおいて検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）この生物学的サンプルを表面に結合すること；（ｂ）この生物学的サンプルを、この複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物にさらし、それにより、この複合体のこの抗原提示部分と、この抗体またはフラグメントとのコンジュゲートを得ること；および（ｃ）このコンジュゲートのこの抗体または抗体フラグメントを検出し、それにより、ヒト抗原提示分子および抗原から構成される複合体の抗原提示部分を生物学的サンプルにおいて検出することを含む。
【００３０】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ヒト抗原提示分子および抗原から構成される複合体の抗原提示部分を生物学的サンプルにおいて検出する方法はさらに、（ｄ）この生物学的サンプルを個体から得ることを含む。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、工程（ｂ）は、この組成物を個体に投与することによって行われる。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗原は病原体に由来する。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この生物学的サンプルは病原体が感染している。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この生物学的サンプルは細胞サンプルまたは組織サンプルである。
【００３５】
本発明のなお別の態様によれば、個体における病原体による感染を診断する方法が提供され、この方法は、（ａ）ヒト抗原提示分子と、この病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物にこの個体の標的細胞をさらし、それにより、この複合体のこの抗原提示部分と、この抗体または抗体フラグメントとのコンジュゲートを得ること；および（ｂ）このコンジュゲートのこの抗体または抗体フラグメントを検出し、それにより、個体における病原体による感染を診断することを含む。
【００３６】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、個体における病原体による感染を診断する方法はさらに、（ｃ）この標的細胞をこの個体から得ることを含む。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、工程（ａ）は、この組成物をこの個体に投与することによって行われる。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この組成物はさらに、この抗体または抗体フラグメントに結合した検出可能な成分を含み、かつ、このコンジュゲートのこの抗体または抗体フラグメントを検出することが、このコンジュゲートのこの抗体または抗体フラグメントに結合したこの検出可能な成分を検出することによって行われる。
【００３９】
本発明のさらに別の態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を発現または呈示する標的細胞を殺すか、または損傷する方法が提供され、この方法は、この複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原提示領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物にこの標的細胞をさらし、それにより、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を発現または呈示する標的細胞を殺すか、または損傷することを含む。
【００４０】
下に記載される好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分を発現または呈示する標的細胞を殺すか、または損傷する方法はさらに、この標的細胞を個体から得ることを含む。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この標的細胞をこの組成物にさらすことは、この組成物をこの個体に投与することによって行われる。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この標的細胞はこの病原体が感染している。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この標的細胞はＴリンパ球または抗原提示細胞である。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗原提示細胞はＢ細胞または樹状細胞である。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、個体における病原体に関連する疾患を処置する方法が提供され、この方法は、ヒト抗原提示分子と、この病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物を有効成分として含む医薬組成物の治療効果的な量をこの個体に投与し、それにより、個体における病原体に関連する疾患を処置することを含む。
【００４６】
本発明のなおさらなる態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体フラグメントをコードする第１の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００４７】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、単離されたポリヌクレオチドはさらに、ウイルスのコートタンパク質、検出可能な成分、およびトキシンからなる群から選択されるポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、第２の核酸配列は第１の核酸配列と翻訳融合される。
【００４９】
本発明のさらにさらなる態様によれば、この単離されたポリヌクレオチドと、宿主細胞におけるこの単離されたポリヌクレオチドの転写を行わせるためのプロモーター配列とを含む核酸構築物が提供される。
【００５０】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、このプロモーター配列はＴ７のプロモーター配列である。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このプロモーター配列は原核生物におけるこの核酸配列の発現を駆動することができる。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このプロモーター配列はこの核酸配列の誘導可能な発現を駆動することができる。
【００５３】
本発明のさらなる態様によれば、この核酸構築物を含む宿主細胞が提供される。
【００５４】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この宿主細胞は原核生物細胞である。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この原核生物細胞は大腸菌である。
【００５６】
本発明のなおさらなる態様によれば、この核酸構築物を含むウイルスが提供される。
【００５７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントに融合されたコートタンパク質を含むウイルスが提供される。
【００５８】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、このウイルスは繊維状ファージであり、かつ、このコートタンパク質はｐＩＩＩである。
【００５９】
本発明の別の態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物が提供される。
【００６０】
本発明のなお別の態様によれば、有効成分としてのこの組成物と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む医薬組成物が提供される。
【００６１】
本発明のさらに別の態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む組成物が提供される。
【００６２】
本発明のさらなる態様によれば、ヒト抗原提示分子と、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む組成物を有効成分として、また、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００６３】
下に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この抗体はモノクローナル抗体である。
【００６４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗体フラグメントはモノクローナル抗体のフラグメントである。
【００６５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗体フラグメントは、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂおよび単鎖Ｆｖからなる群から選択される。
【００６６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗原結合領域は、配列番号１４〜９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗体または抗体フラグメント、あるいはこの抗体または抗体フラグメントの一部分はヒト起源である。
【００６８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この抗体または抗体フラグメントのこの一部分は、この抗体または抗体フラグメントの定常領域の一部分、あるいはこの抗体または抗体フラグメントの定常領域である。
【００６９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この複合体のこの抗原提示部分に対するこの抗体または抗体フラグメントの結合は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度からなる範囲から選択される解離定数を有する親和性によって特徴づけられる。
【００７０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この組成物はさらに、この抗体または抗体フラグメントに結合したトキシンまたは検出可能な成分を含む。
【００７１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この検出可能な成分は、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列、ビオチン分子、ストレプトアビジン分子、蛍光団、酵素およびポリヒスチジンタグからなる群から選択される。
【００７２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このビオチンタンパク質リガーゼはＢｉｒＡである。
【００７３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この蛍光団はフィコエリトリンである。
【００７４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００７５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このトキシンはシュードモナス外毒素Ａまたはその一部分である。
【００７６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このシュードモナス外毒素Ａの一部分は輸送ドメインおよび／またはＡＤＰリボシル化ドメインである。
【００７７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このヒト抗原提示分子は主要組織適合性複合体分子である。
【００７８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この主要組織適合性複合体分子は主要組織適合性複合体クラスＩ分子である。
【００７９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、この主要組織適合性複合体クラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である。
【００８０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このヒト抗原提示分子は単鎖抗原提示分子である。
【００８１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、この病原体はウイルス病原体である。
【００８２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このウイルス病原体はレトロウイルスである。
【００８３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このレトロウイルスはヒトＴリンパ親和性ウイルス−１である。
【００８４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、病原体に由来するこの抗原はこの抗原提示分子によって制限される。
【００８５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、病原体に由来するこの抗原はポリペプチドである。
【００８６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、このポリペプチドは、Ｔａｘタンパク質のセグメント、または、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００８７】
本発明は、ヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と最適な特異性／親和性で結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む組成物を提供することによって、現在知られている形態の様々な欠点に対処することに成功している。
【００８８】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。ここで言及する全ての刊行物、特許出願及び他の文献はそれらの全体を参照としてここに組入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定することは意図されない。
【００８９】
図面の簡単な記述
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図１はＥＬＩＳＡによって測定されたときの、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する組換えＦａｂファージクローンの特異的な結合を示すヒストグラムである。ＴＡＸ−ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体、ｇｐ１００−１５４−ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４ペプチド複合体、ＭＵＣ１−Ｄ６−ＨＬＡ−Ａ２：ＭＵＣ１−Ｄ６ペプチド複合体、ＭＡＲＴ２７−ＨＬＡ−Ａ２：ＭＡＲＴ２７ペプチド複合体。
図２ａ〜図２ｃは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する特異的な結合について選択されたＦａｂの発現および精製のウエスタン免疫ブロッティングアッセイを示す写真である。金属アフィニティークロマトグラフィー後の精製Ｆａｂタンパク質、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２軽鎖およびＦｄフラグメントを発現するＢＬ２１培養物から得られた封入体、ならびに、精製されたインビトロ再折り畳み後の非還元（ＮＲ）および還元（Ｒ）のＦａｂ  Ｔ３Ｆ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示される（それぞれ、図２ａ〜図２ｃ）。Ｍ−分子量マーカー。
図３ａ〜図３ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、ＨＬＡ−Ａ２：コントロールペプチド複合体に対してでなく、固定化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する可溶性の精製ＦａｂのＴ３Ｄ４、Ｔ３Ｅ３およびＴ３Ｆ２の特異的な結合をそれぞれ示すヒストグラムである。
図４ａ〜図４ｂは、単鎖ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を結合標的として使用する力価測定ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、Ｆａｂ  Ｔ３Ｅ３およびＦａｂ  Ｔ３Ｆ２の結合特性をそれぞれ示すデータプロットである。図４ｃは、固定化されたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ複合体に対する［１２５］ヨウ素標識Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２の結合を阻害する精製Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２の能力を示す競合的結合分析のデータプロットである。組換えＦａｂの見かけの結合親和性を、［１２５］ヨウ素標識トレーサーの結合の５０パーセント阻害のために要求される競合剤（可溶性の精製Ｆａｂ）の濃度として求めた。
図５ａ〜図５ｆは、ＡＰＣの表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。ＲＭＡＳ−ＨＨＤ細胞、ＪＹ細胞およびヒト樹状細胞（ＤＣ）（それぞれ、図５ａ〜図５ｂ、図５ｃ〜図５ｄおよび図５ａ〜図５ｆ）にＴａｘ１１〜１９ペプチドまたは陰性コントロールのメラノーマｇｐ１００由来ペプチドＧ９〜１５４を実験手順に記載されるように負荷した。その後、ペプチド負荷細胞を可溶性の精製ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に特異的なＦａｂ  Ｔ３Ｅ３（図５ａ、図５ｃおよび図５ｅ）またはＦａｂ  Ｔ３Ｆ２（図５ｂ、図５ｄおよび図５ｆ）とインキュベーションした。陰性コントロールペプチドではなく、Ｔａｘ１１〜１９負荷細胞の特異的な染色に留意すること。コントロールの非負荷細胞が黒色の軌跡で示される。コントロールアッセイを、材料および方法で示される１０個の異なる陰性コントロールＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドを使用して行った。
図６ａ〜図６ｃは、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２テトラマーを使用する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。ＲＭＡＳ−ＨＨＤ細胞、ＪＹ細胞、またはＨＬＡ−Ａ２陽性の成熟した樹状細胞（それぞれ、図６ａ〜図６ｃ）をＴａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理した。その後、ペプチドパルス処理細胞を、示されるように、フィコエリトリンとコンジュゲート化されたＴ３Ｆ２テトラマーまたはＴ３Ｆ２モノマーとインキュベーションした。Ｆａｂモノマーの結合を、フィコエリトリンコンジュゲート化抗ヒトＦａｂ抗体を使用して検出した。Ｔ３Ｆ２テトラマーで染色されたコントロールの非負荷細胞が示される。
図７ａ〜図７ｄは、天然に存在する活性な細胞内プロセシングの後におけるＴ３Ｆ２による細胞表面呈示ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示す。図７ａ〜図７ｂはそれぞれ、ＨＬＡ−Ａ２陰性のＡＰＤ細胞ではなく、ＨＬＡ−Ａ２陽性のＪＹ細胞の表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。細胞を、ｐｃＤＮＡコントロールベクター、または完全な全長のＴａｘ遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ（ｐｃＴＡＸ）でトランスフェクションし、トランスフェクション後の１２時間〜２４時間で、細胞を、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２、または、ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４複合体について特異的な陰性コントロールＦａｂ  Ｇ２Ｄ１２を使用するフローサイトメトリーによって染色した。図７ｃは、ＧＦＰ遺伝子を有するｐｃＤＮＡベクターのトランスフェクションによってモニターされるときの、ＪＹ細胞およびＡＰＤ細胞へのＴａｘ遺伝子形質導入の効率を示す棒グラフである。図７ｄは、示されるように、フィコエリトリンコンジュゲート化Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２テトラマーまたは陰性コントロールＧ２Ｄ１２を用いたＨＬＡ−Ａ２陽性のＲＳＣＤ４細胞およびＨＬＡ−Ａ２陰性のＨＵＴ１０２細胞（これらは、ＨＴＬＶ−１が感染したヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞の系統である）の染色を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
図８ａ〜図８ｂは、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理された細胞の表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の数の定量を示す。ＪＹ  ＡＰＤを様々な濃度のＴａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理し、細胞におけるＨＬＡ−Ａ２−Ｔａｘ１１〜１９ペプチド複合体の表面呈示を、フィコエリトリンコンジュゲート化Ｔ３Ｆ２Ｆａｂを使用するフローサイトメトリーによって分析した。図８ａは、様々な濃度のペプチドを用いた細胞あたりの複合体の計算された数を示す棒グラフである。染色細胞における蛍光強度レベルを、段階的な数のフィコエリトリン分子にコンジュゲート化された校正ビーズ（ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ  ＰＥビーズ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメリーによって定量した。図８ｂは、Ｔａｘ１１〜１９ペプチド濃度の関数として蛍光強度を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。図８ｃ〜図８ｄは、非トランスフェクション細胞集団内において種々の比率で混合された、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされたＪＹ  ＡＰＣの表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の高感度定量検出を示す。混合された集団をＦａｂ  Ｔ３Ｆ２で染色し、検出感度を単色フローサイトメトリーによってモニターした。図８ｃは、示されるように、様々な比率で非トランスフェクション細胞の集団に混合されたトランスフェクション細胞の定量的検出を示す大縮尺（左パネル）または拡大（右パネル）で示される１組の重なったフローサイトメトリーヒストグラムである。図８ｄは、６２．１パーセントのトランスフェクション効率に基づいて非トランスフェクション細胞の集団内において混合されたトランスフェクション細胞の百分率の関数としてＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の検出感度を示すデータ表である。１パーセントもの低い割合で非トランスフェクション細胞の集団に存在するＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体呈示細胞の検出に留意すること。
図９ａ〜図９ｆは、細胞内プロセシング後のＦａｂ  Ｔ３Ｆ２によるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の免疫組織化学的検出を示す光学顕微鏡写真である。図９ａ〜図９ｂは、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２で染色されたＴａｘトランスフェクションＪＹ細胞のｘ６０およびｘ４０の原倍率図をそれぞれ示す。図９ｃは、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２で染色されたコントロールの非トランスフェクションＪＹ細胞を示す。図９ｄは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４複合体について特異的な陰性コントロールＦａｂ  Ｇ２Ｄ１２を用いたＴａｘトランスフェクションＪＹ細胞の染色を示す。図９ｅ〜図９ｆは、Ｔ３Ｆ２で染色された、Ｔａｘの発現のためにトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陰性細胞またはトランスフェクションされていないＨＬＡ−Ａ２陰性細胞を示す。細胞を、トランスフェクション後の１２時間〜２４時間で、ポリ−Ｌ−リジンコーティングのガラス製スリップに吸着させ、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２で染色した。陰性コントロールとしてＦａｂ  Ｇ２Ｄ１２を使用した。
図１０はトキシンにコンジュゲート化された抗特異的ヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体Ｆａｂからなる融合タンパク質による、特異的なヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体を呈示する標的細胞の特異的かつ効率的な殺傷を示すデータプロットである。細胞毒性アッセイを、シュードモナス外毒素ＡのＰＥ３８ＫＤＥＬ短縮化形態に融合された抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体ＦａｂからなるＴ３Ｆ２−ＰＥ３８ＫＤＥＬ融合タンパク質を使用して行った。融合タンパク質による細胞溶解をアッセイするために、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドが負荷されたＪＹ細胞、コントロールのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドが負荷されたＪＹ細胞、またはペプチドが負荷されなかったＪＹ細胞をＴ３Ｆ２−ＰＥ３８ＫＤＥＬとインキュベーションした。コントロールペプチドが負荷されたコントロールのＪＹ細胞、またはペプチドが負荷されなかったＪＹ細胞ではなく、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドが負荷された細胞の特異的かつ効率的なＴ３Ｆ２−ＰＥ３８ＫＤＥＬ媒介の殺傷に留意すること。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
本発明は、特定の抗原提示分子（ＡＰＭ）：抗原複合体と特異的に結合することができる組成物、および、そのような組成物を発現／呈示する細胞／組織を検出、特長づけまたは殺傷／損傷するためにそのような組成物を使用する方法に関する。具体的には、本発明は、特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体を提示／発現するヒト細胞／組織、例えば、病原体に感染した細胞／組織、または、病原体もしくはその抗原にさらされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）などを最適に検出、特長づけまたは殺傷／損傷するために使用することができる。そのため、本発明の組成物は、例えば、ヒトにおける病原体感染を最適に診断し、特長づけ、かつ処置するために使用することができる。
【００９１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、従って、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００９２】
最適な特異性／親和性で特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と結合することができる分子は、ヒトにおける様々な病原体感染の最適な診断、特長づけおよび処置を可能にするので、非常に、他にないほど有用である。
【００９３】
特異的なＡＰＭ：抗原複合体と結合することができる様々な分子が先行技術によって記載されている。
【００９４】
例えば、１つの方法は、マウスＭＨＣ：ペプチド複合体に対して特異的な抗体またはその誘導体を、そのようなマウス複合体と特異的に結合することができる化合物を提供する試みにおいて使用することを伴う。
【００９５】
別の方法は、ヒトＭＨＣ：腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチド複合体に対して特異的な抗体またはその誘導体を、そのようなヒト腫瘍抗原提示複合体と特異的に結合することができる化合物を提供する試みにおいて使用することを伴う。
【００９６】
さらなる方法は、ヒトＭＨＣ：テロメラーゼ由来ペプチド複合体に対して特異的な抗体またはその誘導体を、そのようなヒトテロメラーゼ抗原提示複合体と特異的に結合することができる化合物を提供する試みにおいて使用することを伴う。
【００９７】
しかしながら、そのような先行技術方法はすべてが大きな欠点を有する。非ヒトＡＰＭを含む複合体と特異的に結合することができる分子を伴う先行技術方法はヒト適用のための有用性を有しておらず、また、非病原体由来抗原を含む複合体と特異的に結合することができる組成物を伴う先行技術方法は、病原体由来抗原を含む複合体と特異的に結合することができる分子を要求する適用（例えば、ヒトにおける様々な病原体感染の診断、特長づけおよび処置など）のための有用性を有していない。
【００９８】
このように、先行技術は、最適な特異性および親和性で特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と結合することができる分子を提供することに成功していない。
【００９９】
本発明を実施に移しているとき、最適な特異性および親和性で特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と結合することができる分子が予想外にも発見された。そのような能力は、特定のＡＰＭ：抗原複合体と結合することができるすべての先行技術分子と比較して特異である。
【０１００】
そのような分子を検出可能な成分またはトキシンに結合することが、そのような複合体を呈示する細胞／組織を最適な効率／特異性で検出／特長づけるために、または、そのような複合体を呈示する細胞／組織を最適な効率／特異性で殺傷／損傷するために、それぞれ使用され得ることもまた、予想外ではあったが、発見された。そのような能力もまた、特定のＡＰＭ：抗原複合体と結合することができるすべての先行技術分子と比較して特異である。
【０１０１】
従って、特定のＡＰＭ：抗原複合体と結合することができる先行技術分子とは際だって対照的に、本発明の分子は、病原体に感染しているヒト細胞／組織、または病原体もしくはその抗原にさらされた抗原提示細胞を最適な特異性および感度で検出または特徴づけるために、あるいは、病原体に感染しているヒト細胞／組織、または、原体もしくはその抗原にさらされた抗原提示細胞を最適な効率および特異性で殺すために使用することができる。
【０１０２】
従って、本発明の１つの態様によれば、ＡＰＭと、病原体に由来する抗原とから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗原結合領域を含む抗体または抗体フラグメントを含む組成物が提供される。
【０１０３】
本発明の組成物は、特定のＡＰＭと、そのようなＡＰＭによって制限される病原体に由来する特定の抗原とから構成される複合体（以降、「複合体」として示される）の抗原提示部分と特異的に結合する能力を有する試薬から利益を受ける本質的には任意の適用における使用のために最適である。そのような適用には、特に、（ｉ）複合体の抗原提示部分の特異的な検出を伴う適用、特に、病原体に関連する疾患を診断するためにそのような検出を伴う適用；（ｉｉ）病原体が感染した細胞、または病原体の抗原にさらされたＡＰＣを含めて、複合体の抗原提示部分を呈示／発現する細胞／組織（本明細書中では「標的細胞／組織」として示される）を殺傷／損傷することを伴う適用；および（ｉｉｉ）同系のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する複合体の抗原提示部分の結合を阻止することを伴う適用；および（ｉｖ）複合体、または複合体を呈示／発現する細胞を単離することを伴う適用が含まれる。
【０１０４】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、実質的に完全または無傷の抗体分子を示す。
【０１０５】
本明細書中で使用される表現「抗体フラグメント」は、抗原決定基またはエピトープ（例えば、複合体の抗原提示部分など）と特異的に結合することができる抗体の一部分（１つまたは複数）を含む分子を示す。
【０１０６】
本明細書中で使用される表現「抗体結合領域」は、抗体または抗体フラグメントに関連するとき、特定の抗原決定基またはエピトープ、あるいは抗原決定基またはエピトープの特定の一組と特異的に結合することができる、抗体または抗体フラグメントの一部分（典型的には可変領域）を示す。
【０１０７】
本明細書中で使用される用語「ＡＰＭ」は、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子、ならびにＭＨＣ分子またはＣＤ１分子と構造的および／または機能的に類似する分子などの抗原提示分子を示す。特異的なＡＰＭは、典型的には、ＴＣＲの可変部分が特異的に結合することができる抗原提示複合体を形成するように、異なった抗原の特定の一組のいずれかと結合することができる。本発明の組成物に含まれる抗体または抗体フラグメントが特異的に結合することができる抗原決定基またはエピトープをその抗原提示部分が含む複合体を形成する様々な抗原提示分子が、本明細書中下記においてさらに詳しく記載される。
【０１０８】
本明細書中で使用される用語「抗原」は、ＡＰＭの抗原結合溝と特異的に結合することができる分子またはその一部分（典型的にはペプチドまたは脂質）を示す。そのような抗原は、そのようなＡＰＭによって「制限」されるとこの分野では一般に呼ばれている。典型的な抗原（例えば、病原体由来抗原など）は典型的には、病原体由来のより大きな分子の細胞内プロセシングによって細胞において作製される。そのような細胞には、典型的には、病原体（特に、細胞内病原体）に感染している細胞、または、病原体に由来する抗原にさらされたＡＰＣが含まれる。抗原は一般に、同系ＴＣＲの可変領域と特異的に結合することができる抗原提示部分を有する、それとのＡＰＭ：抗原複合体を形成するように、抗原が特定のＡＰＭの抗原結合溝と特異的に結合することを可能にする特徴的な大きさおよび／または化学的組成（例えば、ペプチド抗原の場合には、それぞれ、特徴的なアミノ酸長さおよび１組のアンカー残基）を有する。
【０１０９】
本明細書中で使用される表現「抗原提示部分」は、複合体に関連するとき、抗体または抗体フラグメントが、（ｉ）複合体の抗原に結合していない複合体のＡＰＭ、（ｉｉ）複合体のＡＰＭと、複合体の抗原とは異なる抗原とから構成されるＡＰＭ：抗原複合体、または（ｉｉｉ）複合体のＡＰＭとは異なるＡＰＭと、そのようなＡＰＭにより制限される任意の抗原（複合体の抗原を含む）とから構成されるＡＰＭ：抗原複合体と特異的に結合することが効果的にできないように、抗体または抗体フラグメントが特異的に結合することができる複合体の任意の部分を示す。
【０１１０】
本明細書中上記で述べられたように、複合体の抗原提示部分は典型的には、同系ＴＣＲの可変領域と特異的に結合することができる複合体の一部分である。本発明の組成物に含まれる抗体または抗体フラグメントが特異的に結合することができる複合体の抗原提示部分が、本明細書中下記においてさらに詳しく記載される。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語ペプチドは、５０アミノ酸残基以下から構成されるポリペプチドを示す。
【０１１２】
適用および目的によって、本発明の組成物は抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０１１３】
好ましくは、組成物は抗体フラグメントを含む。
【０１１４】
抗体フラグメントは、様々なタイプが本明細書中下記においてさらに詳しく記載されるが、一般には抗体よりも小さく、その一方で、抗体フラグメントの免疫グロブリン可変領域を含む完全な抗体の本質的には実質的に同一の結合特異性を保持するという利点を有する。従って、抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、抗体を含む組成物よりも一般には小さく、かつ、それにより、（例えば、インビボで全身的に、または孤立した組織において）後者よりも優れた生体分布および拡散特性を一般に有する。より小さい組成物は、複合体の抗原提示部分に対する、組成物に含まれる抗体または抗体フラグメントの結合を阻害する立体的障害の原因となり得る成分を含む可能性がより少なくなるというさらなる利点を有する。また、Ｆｃ領域などの抗体の定常領域（本明細書中では「定常領域」として示される）の一部またはすべてが、そのようなＦｃ領域を有しない抗体フラグメントを含む本発明の組成物に存在しないことは、そのような定常領域と特異的に結合することができる分子に対する組成物の暴露を伴い、かつ、そのような結合が望ましくない適用のためには好都合である。典型的には、これは、同系のＦｃ受容体にさらされた本発明の組成物に含まれるＦｃ領域の所望されない結合、またはＦｃ結合性の補体成分（例えば、血清に存在する補体成分Ｃ１ｑ）の所望されない結合を伴う場合がある。Ｆｃ受容体は、専門的ＡＰＣ（例えば、樹状細胞など）、Ｂリンパ球および顆粒球（例えば、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージおよびマスト細胞など）を含む数々の免疫細胞タイプの表面に呈示される。特に、機能的な定常領域（例えば、Ｆｃ領域など）が組成物に存在しないことは、その組成物が、定常領域との相互作用を介して所望されない免疫応答（例えば、それぞれ、Ｆｃ受容体媒介による免疫細胞の活性化または補体成分媒介による補体カスケードなど）を活性化することができる定常領域の特異的なリガンド（例えば、同系のＦｃ受容体またはＦｃ結合性の補体成分など）にさらされる適用において特に好都合である。
【０１１５】
様々な状況において、上記のＦｃ受容体呈示細胞タイプは、複合体を呈示／発現するＡＰＣとして機能することが当業者によって理解される。従って、Ｆｃ領域を有しない抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、そのような細胞によって呈示されるＦｃ受容体による抗体または抗体フラグメントの所望されない結合を防止するために、またはそのような細胞のその後の活性化を防止するために好都合であり得る。
【０１１６】
あるいは、そのような機能的な定常領域を含む本発明の抗体または抗体フラグメントは、そのような免疫応答が望まれる適用において好都合であり得る。これは、本明細書中下記においてさらに詳しく記載されるように、標的細胞／組織を殺傷／損傷するために組成物を使用することを伴う適用において特に望ましい。機能的成分に共有結合により結合することができる定常領域（例えば、Ｆｃ領域など）を含む抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物はまた、そのような結合が望ましい適用のために好都合である。
【０１１７】
さらには、抗体フラグメントを含む本発明の組成物の使用は、そのサイズが完全な抗体よりも小さいために、抗体フラグメントは合成がより経済的かつ効率的であるため、抗体または抗体フラグメントを組換え製造することを用いるとき、完全な抗体を用いる使用と比較して好都合である。
【０１１８】
適用および目的によって、組成物は好都合には、様々な構造的および／または機能的な特性のいずれかを有する抗体または抗体フラグメントを含むことができる。具体的には、本発明の教示によれば、組成物は好都合には、（ｉ）モノクローナルまたはポリクローナルな抗体または抗体フラグメント；（ｉｉ）モノマー形態または多量体形態の抗体または抗体フラグメント；（ｉｉｉ）様々な形態またはタイプのいずれかの抗体または抗体フラグメント（例えば、本明細書中下に記載されるもの）；（ｉｖ）様々な哺乳動物種のいずれかに由来する抗体または抗体フラグメントあるいはその一部分；（ｖ）様々な機能的成分のいずれかに結合した抗体または抗体フラグメント；（ｖｉ）様々な特定の複合体のいずれかと特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメント；および／または（ｖｉｉ）所望の親和性で複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０１１９】
本明細書中上記で述べられたように、適用および目的によって、抗体または抗体フラグメントはモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。
【０１２０】
本明細書中で使用されるとき、「ポリクローナル」または「モノクローナル」な抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、抗体または抗体フラグメントのポリクローナルな集団またはモノクローナルな集団をそれぞれ含む組成物の分子の集団である。
【０１２１】
本明細書中で使用されるとき、「ポリクローナル」または「モノクローナル」な抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントあるいはその集団をそれぞれが含む本発明の組成物分子の集団である。
【０１２２】
モノクローナルまたはポリクローナルな抗体または抗体フラグメントを作製する様々な方法が本明細書中下に記載される。
【０１２３】
好ましくは、本発明の教示によれば、抗体または抗体フラグメントはモノクローナルである。
【０１２４】
最適な再現性、標準化または精密さから利益を受ける適用の場合、例えば、本明細書中下記においてさらに詳しく記載されるような分析適用などについては、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントを含む組成物が一般に、同じ複合体の抗原提示部分に向けられたポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントを含む組成物よりも優れている。モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントは、抗体または抗体フラグメントが、複合体の抗原提示部分に対する所望の結合親和性／特異性を有するとして特徴づけられている場合、特に好都合である。従って、そのような抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、一般に当てはまるように、できる限り大きい親和性／特異性で複合体の抗原提示部分と結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む組成物から利益を受ける適用のために最適である。
【０１２５】
下記の実施例の節において記載および明らかにされるように、モノクローナル抗体フラグメントを含む組成物を、複合体の特異的な検出、または標的細胞／組織を殺傷／損傷することを伴う適用を含む本発明の様々な態様を最適に実施するために使用することができる。
【０１２６】
あるいは、広範囲の親和性／特異性で、または様々な異なった親和性／特異性で１つまたは複数の複合体と結合することができる組成物が望ましい適用については、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントを含む本発明の組成物が好都合である。いずれの場合においても、複合体の抗原提示部分に対する所望の結合親和性／特異性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントが利用できない場合、それにもかかわらず、多くの場合、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントを含む組成物が適切である。これは、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体フラグメントの混合物の不均一性により、複合体の抗原提示部分に対する適切な結合親和性／特異性を有する１つまたは複数の抗体または抗体フラグメントが含まれることが多いからである。
【０１２７】
本明細書中上記で述べられたように、適用および目的によって、抗体フラグメントは様々な形態またはタイプのいずれかであり得る。
【０１２８】
好適な抗体フラグメントには、免疫グロブリン軽鎖（本明細書中では「軽鎖」として示される）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（本明細書中では「重鎖」として示される）のＣＤＲ、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄフラグメント、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２が含まれる。
【０１２９】
軽鎖および重鎖の完全な可変領域または本質的に完全な可変領域を含む上記抗体フラグメントのなかの抗体フラグメントは下記のように定義される：（ｉ）Ｆｖ、すなわち、（典型的には免疫グロブリン遺伝子の遺伝子操作によって得られる）２つの鎖として発現される軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）からなる抗体分子のフラグメント；（ｉｉ）単鎖Ｆｖ（これはこの分野では「ｓｃＦｖ」として示される）、すなわち、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を好適なポリペプチドリンカーによって連結されて含む単鎖分子（単鎖Ｆｖは、典型的には、免疫グロブリン遺伝子、およびポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡの遺伝子操作によって得られる）；（ｉｉｉ）Ｆａｂ、すなわち、抗体を酵素パパインで好適に処理して、完全な軽鎖と、重鎖Ｆｄフラグメント（Ｆｄフラグメントは重鎖の可変ドメインおよびＣＨ１ドメインからなる）とを生じさせることによって一般には得られる抗体の一価の抗原結合部分を本質的には含有する抗体分子のフラグメント；（ｉｖ）Ｆａｂ’、すなわち、抗体分子を酵素ペプシンで好適に処理し、その後、得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを還元することによって典型的には得られる抗体の一価の抗原結合部分を含有する抗体分子のフラグメント（２つのＦａｂ’フラグメントが抗体１分子あたり得られる）；および（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、すなわち、抗体分子を酵素ペプシンで好適に処理することによって典型的には得られる抗体の一価の抗原結合部分を含有する抗体分子のフラグメント（すなわち、Ｆ（ａｂ’）２は、１対のジスルフィド結合によってつながれた２つのＦａｂ’からなる）。
【０１３０】
適用および目的によって、抗体フラグメントは好ましくはＦａｂまたは単鎖Ｆｖである。
【０１３１】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、また、下記においてさらに詳しく記載されるように、Ｆａｂを含む本発明の組成物は、複合体の抗原提示部分を検出するために組成物を使用することを伴う本発明の特定の態様において、本発明を効果的に実施するために用いることができる。
【０１３２】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、また、下記においてさらに詳しく記載されるように、単鎖Ｆｖを含む本発明の組成物は、標的細胞／組織を殺傷／損傷するために組成物を利用することを伴う本発明の特定の態様において、本発明を効果的に実施するために利用することができる。
【０１３３】
Ｆａｂ’は構造がＦａｂと本質的に類似するため、Ｆａｂ’を含む本発明の組成物は、Ｆａｂを含む組成物と交換可能に用いることができることが当業者によって理解され、この場合、そのようなＦａｂ’およびＦａｂは、本質的に同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。通常の場合には当てはまるように、できる限り大きい親和性で複合体の抗原提示部分と結合することができる抗体フラグメントを含む本発明の組成物から利益を受ける適用については、Ｆ（ａｂ’）２を含む本発明の組成物は、一価の抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または単鎖Ｆｖなど）を含む組成物よりも都合良く用いことができる。これは、Ｆ（ａｂ’）２の結合が、そのような一価の抗体フラグメントの結合が一価であることと比較して、複合体の抗原提示部分に対して二価であるためである。
【０１３４】
本明細書中上記で述べられたように、適用および目的によって、抗体または抗体フラグメントは様々な哺乳動物種のいずれかに由来し得る。
【０１３５】
好ましくは、抗体または抗体フラグメントはヒト起源である。
【０１３６】
ヒト起源の抗体または抗体フラグメントは、さらには本明細書中下記において記載されるように、または、下記の実施例の節において記載されるように得ることができる。
【０１３７】
ヒト起源の抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は一般に、組成物を個体に投与することを伴う適用のために好ましい。例えば、そのような抗体または抗体フラグメントは一般に、非ヒト起源の抗体または抗体フラグメントよりも良好に免疫学的に寛容される傾向がある。これは、非ヒト抗体の非可変部分が、典型的にはその個体に関して同種であるヒト抗体によって誘発される同種免疫応答よりも強い異種免疫応答を誘発する傾向があるからである。そのような免疫応答は、個体における組成物の半減期、および、従って、個体における組成物の有効性を短くする傾向があるので、そのような免疫応答を最小限にすることが好ましい。そのうえ、そのような免疫応答は、例えば、有害な炎症反応を引き起こすことによって個体に対して病原的である場合がある。
【０１３８】
本明細書中で使用される用語「個体」はヒトを示す。
【０１３９】
あるいは、ヒト起源の抗体または抗体フラグメント、あるいはヒト化抗体はまた、個体における抗体または抗体フラグメントの定常領域によって活性化される機能的な生理学的作用（例えば、標的細胞に対する免疫応答）が所望される適用のためには好都合である。そのような適用には特に、抗体または抗体フラグメントの機能的な部分（例えば、Ｆｃ領域など）と、Ｆｃ受容体またはＦｃ結合性補体成分などの分子との間での機能的な相互作用が、そのような機能的な部分がにヒト起源のＦｃ領域と同様に、ヒト起源であるときには最適である適用が含まれる。
【０１４０】
適用および目的によって、様々なイソ型のいずれかの定常領域またはその一部分を含む抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物を用いることができる。好ましくは、イソ型は、所望の生理学的作用を可能にするか、もしくは阻害するように、または、定常領域もしくはその一部分を介した組成物の望ましくない特定の結合を阻害するように選択される。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するためには、イソ型は好ましくはＩｇＧであり、マスト細胞／好塩基球によるＡＤＣＣを誘導するためには、イソ型は好ましくはＩｇＥであり、そして、好酸球によるＡＤＣＣを誘導するためには、イソ型は好ましくはＩｇＥまたはＩｇＡである。補体カスケードを誘導するためには、組成物は好ましくは、カスケードを開始させることができる定常領域またはその一部分を含む抗体または抗体フラグメントを含む。例えば、抗体または抗体フラグメントは好都合には、Ｃ１ｑ媒介による補体カスケードを誘発するためにＩｇＧのＣｇａｍｍａ２ドメインまたはＩｇＭのＣｍｕ３ドメインを含むことができる。
【０１４１】
逆に、免疫応答（例えば、上記の免疫応答など）を回避するためには、あるいは、定常領域またはその一部分を介した特定の結合を回避するためには、組成物は好ましくは、関連したイソ型の定常領域またはその一部分を含まない。
【０１４２】
本明細書中上記で述べられたように、適用および目的によって、抗体または抗体フラグメントを様々な機能的成分のいずれかに結合することができる。機能的成分に結合した抗体または抗体フラグメント（例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントなど）はこの分野では「免疫コンジュゲート」として示されることがある。
【０１４３】
好ましくは、機能的成分は検出可能な成分またはトキシンである。トキシンに結合した抗体または抗体フラグメントはこの分野では免疫トキシンとして示されることがある。
【０１４４】
本明細書中下記においてさらに詳しく記載および明らかにされるように、検出可能な成分またはトキシンは、複合体の抗原提示部分を検出するために、または標的細胞／組織を殺傷／損傷するために、それぞれ組成物を使用することを伴う本発明の適用において特に都合良く用いることができる。
【０１４５】
組成物は、適用および目的によって、数々のタイプの検出可能な成分のいずれかに結合した抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０１４６】
複合体の抗原提示部分を検出するために組成物を使用することを伴う適用の場合、抗体または抗体フラグメントに結合した検出可能な成分は好ましくは、組成物の抗体または抗体フラグメントが結合する複合体の抗原提示部分の特異的な検出を可能にするレポーター成分である。
【０１４７】
様々なタイプのレポーター成分を、適用および目的によって、複合体の抗原提示部分を検出するために利用することができる一方で、レポーター成分は好ましくは、蛍光団または酵素である。あるいは、レポーター成分は、下記の実施例の節において記載および例示されるように、［１２５］ヨウ素などの放射性同位体であり得る。
【０１４８】
蛍光団を、数々の蛍光検出方法のいずれかによる複合体の抗原提示部分の検出を可能にする検出成分として好都合に用いることができる。適用および目的によって、そのような蛍光検出方法には、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光共焦点顕微鏡観察、蛍光インシチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
様々なタイプの蛍光団を、適用および目的によって、複合体の抗原提示部分を検出するために用いることができる。
【０１５０】
好適な蛍光団の例には、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−クロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッドおよびＰＥ−Ｃｙ５などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
好ましくは、蛍光団はフィコエリトリンである。
【０１５２】
下記の実施例において記載および例示されるように、フィコエリトリンなどの蛍光団に結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、免疫蛍光に基づく様々な検出方法を使用して複合体の抗原提示部分を最適に検出するために使用することができる。
【０１５３】
蛍光団の選択、蛍光団を様々なタイプの分子（例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントなど）に連結する方法、および、そのような免疫コンジュゲートに含まれる抗体または抗体フラグメントが特異的に結合することができる分子を検出するためにそのようなコンジュゲートを使用する方法に関する十分な指針をこの分野の文献において得ることができる［例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９２〜１９９４”、第５版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；米国特許第６０３７１３７号（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎ  Ｉｎｃ．）：Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９５）；Ｋａｙ  Ｍ．他、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：２９３；Ｓｔｕｂｂｓ他、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：９３７；Ｇａｋａｍｓｋｙ  Ｄ．他、「蛍光共鳴エネルギー移動による受容体化学量論の評価」、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ”（第２版）、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｃ．およびＨｏｒｔｏｎ  Ｒ．（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＫ（２００１）：米国特許第６３５０４６６号（Ｔａｒｇｅｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．）を参照のこと］。様々な方法論を、蛍光団を使用して複合体の抗原提示部分を検出するために用いることができる一方で、そのような検出は好ましくは、下記の実施例の節において記載および明らかにされるように行われる。
【０１５４】
あるいは、酵素を、酵素に基づく様々な検出方法のいずれかによる複合体の抗原提示部分の検出を可能にするための検出可能な成分として都合良く利用することができる。そのような方法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ；例えば、溶液において複合体の抗原提示部分を検出するために）、酵素結合化学発光アッセイ（例えば、電気泳動により分離されたタンパク質混合物における複合体を検出するために）、および酵素結合免疫組織化学的アッセイ（例えば、固定処理された組織における複合体を検出するために）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
数々のタイプの酵素を、適用および目的によって、複合体の抗原提示部分を検出するために用いることができる。
【０１５６】
好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５７】
好ましくは、酵素は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【０１５８】
下記の実施例の節において記載されるように、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは酵素免疫組織化学的アッセイなどによって複合体の抗原提示部分を効果的に検出するために使用することができる。
【０１５９】
酵素に基づくそのような検出方法を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｋｈａｔｋｈａｔａｙ  ＭＩ．およびＤｅｓａｉ  Ｍ．、１９９９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、２０：１５１〜８３；Ｗｉｓｄｏｍ  ＧＢ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３２：４３３〜４０；Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ．他、１９８３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４：２０９〜３２７；Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ  Ｍ．、１９８０、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：１９７〜２０８；Ｓｃｈｕｕｒｓ  ＡＨ．およびｖａｎ  Ｗｅｅｍｅｎ  ＢＫ．、１９８０、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１：２２９〜４９を参照のこと）。様々な方法論を、酵素を使用して複合体の抗原提示部分を検出するために用いることができる一方で、そのような検出は好ましくは、下記の実施例の節において記載されるように行われる。
【０１６０】
機能的成分を、状況、適用および目的によって、様々な方法で抗体または抗体フラグメントに結合することができる。
【０１６１】
ポリペプチド性の機能的成分、特にポリペプチド性トキシンを、この分野で広く実施されている標準的な組換え技術によって抗体または抗体フラグメントに都合良く結合することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上掲）および関連する参考文献（下記の実施例の節に示される）を参照のこと）。様々な方法論を用いることができる一方で、ポリペプチド性の機能的成分を抗体または抗体フラグメントに結合することは好ましくは、下記の実施例の節において記載および例示されるように行われる。
【０１６２】
機能的成分はまた、この分野で広範囲に実施されている標準的な化学合成によって抗体または抗体フラグメントに結合することができる［例えば、アメリカ化学会によって（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｏｒｇ／ｐｏｒｔａｌ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて）提供される広範な指針を参照のこと］。化学者などの当業者は、そのような化学合成技術を好適に実施するための要求される専門的知識を有する。
【０１６３】
あるいは、機能的成分は、親和性タグがカップリングされた本発明の抗体または抗体フラグメントを、親和性タグの特異的なリガンドにコンジュゲート化された機能的成分に結合することによって抗体または抗体フラグメントに結合することができる。
【０１６４】
様々なタイプの親和性タグを、抗体または抗体フラグメントを機能的成分に結合するために用いることができる。
【０１６５】
好ましくは、親和性タグはビオチン分子であり、より好ましくはストレプトアビジン分子である。
【０１６６】
ビオチンまたはストレプトアビジンの親和性タグは、ストレプトアビジンおよびビオチンが、人類に知られている最も大きい非共有結合的結合親和力（すなわち、約１０−１４〜１０−１５のＫｄ）で互いに結合することができるために、ストレプトアビジンコンジュゲート化またはビオチンコンジュゲート化された機能的成分を抗体または抗体フラグメントにそれぞれ結合することを最適に可能にするために使用することができる。ビオチン親和性タグは、下記においてさらに詳しく記載されるように、多数のビオチン結合した本発明の抗体または抗体フラグメントをストレプトアビジン分子にコンジュゲート化することによって最適に形成され得る抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む本発明の組成物から、多くの場合には当てはまるように、利益を受ける適用のために非常に好都合であり得る。
【０１６７】
本明細書中で使用される用語「約」は＋１０パーセントまたは−１０パーセントを示す。
【０１６８】
様々な方法がこの分野では広範囲に実施されるが、これらは、ストレプトアビジン分子またはビオチン分子を、抗体または抗体フラグメントなどの分子に、あるいは機能的成分に結合するために用いることができる。
【０１６９】
例えば、ビオチン分子を、ビオチンタンパク質リガーゼの認識配列に結合された本発明の抗体または抗体フラグメントに都合良く結合することができる。そのような認識配列は、ビオチンタンパク質リガーゼ酵素のための特異的なビオチン化基質として役立つ特異的なポリペプチド配列である。ビオチンタンパク質リガーゼの認識質配列（例えば、ビオチンタンパク質リガーゼＢｉｒＡの認識配列など）を使用して抗体フラグメントなどの標的ポリペプチドをビオチン化するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２を参照のこと）。好ましくは、抗体または抗体フラグメントのそのようなビオチン化は、下記の実施例の節において記載および例示されるように行われる。
【０１７０】
あるいは、様々な広範囲に実施されている方法を、ストレプトアビジン分子を単鎖Ｆｖなどの抗体フラグメントに結合するために用いることができる（例えば、Ｃｌｏｕｔｉｅｒ  ＳＭ．他、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３７：１０６７〜１０７７；Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．他、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７８：２０１；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ．他、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ．他、１９９５、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６：９３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ．他、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９：２０３；Ｐｅａｒｃｅ  ＬＡ．他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｌ、４２：１１７９〜１１８８を参照のこと）。
【０１７１】
ストレプトアビジンにコンジュゲート化された機能的成分（例えば、蛍光団など）が免疫蛍光フローサイトメトリー試薬の本質的にはすべての主要な供給者から市販されている（例えば、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。標準的な組換えＤＮＡ化学技術が、好ましくは、ポリペプチド性の機能的成分に融合されたストレプトアビジンを含む融合タンパク質を作製するために用いられる。標準的な化学合成技術もまた、ストレプトアビジン−機能的成分のコンジュゲートを形成するために用いることができる。広範な文献を利用することができ、これらは、ストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン由来分子の発現、精製および使用のための指針（Ｗｕ  ＳＣ．他、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、２４：３４８〜３５６；Ｇａｌｌｉｚｉａ  Ａ．他、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１４：１９２〜１９６）、ストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン由来分子を含む融合タンパク質の発現、精製および使用のための指針（Ｓａｎｏ  Ｔ．およびＣａｎｔｏｒ  ＣＲ．、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２６：３０５〜１１）、ならびに、修飾されたストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン由来分子の発現、精製および使用のための指針（例えば、Ｓａｎｏ  Ｔ．他、１９９３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７０：２８２０４〜２８２０９を参照のこと）を提供しており、これには、その遺伝子配列が大腸菌における発現のために最適化されているストレプトアビジン分子またはストレプトアビジン由来分子についての指針（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＬＤ．およびＷｅｂｅｒ  ＰＣ．、１９９３、Ｇｅｎｅ、１３６：２４３〜６）が含まれる。
【０１７２】
機能的成分に結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物の使用であって、複合体の抗原提示部分の検出以外の様々な目的のための使用、または、標的細胞／組織を殺傷／損傷するための使用もまた本発明によって考えられる。具体的には、親和性タグ、または任意の物質、粒子、そのような組成物を呈示／発現するウイルスもしくは細胞に結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物を、親和性タグの特異的なリガンドを捕獲リガンドとして用いるアフィニティー精製法を使用して都合良く単離または精製することができる。好ましくは、そのような目的のために、親和性タグはポリヒスチジンタグであり、精製法は、ニッケルを親和性タグの特異的なリガンドとして使用して行われる。
【０１７３】
ヒスチジンタグは、典型的には４個〜８個のヒスチジンアミノ酸残基からなるペプチドである。好ましくは、６個のヒスチジン残基から構成されるヒスチジンタグ（これはこの分野では一般にヘキサヒスチジンタグとして示される）が用いられる。そのようなヒスチジンタグはニッケル含有基質と特異的に結合する。ヒスチジンタグの使用に関する十分な指針をこの分野の文献において利用することができる（例えば、Ｓｈｅｉｂａｎｉ  Ｎ．、１９９９、Ｐｒｅｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：７７を参照のこと）。ヒスチジンタグを含む分子の精製は、ニッケルに基づくアフィニティー精製技術を使用して日常的に行われる。ヒスチジンタグのための代わりの好適な捕獲リガンドは抗ヒスチジンタグ単鎖抗体３Ｄ５である（Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｍ．他、２００２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３１８、１３５〜４７）。様々な技術を用いることができる一方で、ヒスチジンタグに結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物を精製することは、好ましくは、下記の実施例の節において記載および例示されるように行われる。
【０１７４】
組成物は、様々な好適な標準的で、広範囲に用いられているアフィニティークロマトグラフィー技術のいずれかを使用して精製することができる。そのような技術を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている［例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ  Ｍ．およびＣｈａｉｋｅｎ  Ｉ．、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１４７、１〜６；Ｊａｃｋ  ＧＷ．、１９９４、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１、５９〜８６；Ｎａｒａｙａｎａｎ  ＳＲ．、１９９４、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ６５８、２３７〜２５８；Ｎｉｓｎｅｖｉｔｃｈ  Ｍ．およびＦｉｒｅｒ  ＭＡ．、２００１、Ｊ  Ｂｏｉｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、４９、４６７〜８０；Ｊａｎｓｏｎ  ＪＣ．およびＫｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｔ．、“Ｐａｃｋｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  Ｐｈａｓｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ｕｎｇｅｒ  ＫＫ．（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７４７頁（１９９０）；Ｃｌｏｎｉｓ  ＹＤ：ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１５７頁（１９８９）；Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ．他、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、１１：１〜１６を参照のこと］。
【０１７５】
本明細書中上記に記載される親和性タグとは異なる様々な親和性タグもまた、機能的成分を抗体または抗体フラグメントに結合するために、あるいは、親和性タグ、または任意の物質、粒子、そのような組成物を呈示／発現するウイルスもしくは細胞に結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物を精製するために用いることができる。
【０１７６】
そのような親和性タグには、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）、エピトープタグ（特異的なモノクローナル抗体が大きい親和性で特異的に結合することができる成分（通常的にはペプチド性））、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、およびキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）タグが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
エピトープタグの例には、１１ｍｅｒの単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄペプチドおよび１１ｍｅｒのＮ末端のバクテリオファージｔ７ペプチド（これらはＨＳＶＴａｇおよびｔ７Ｔａｇ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）としてそれぞれ商業的に知られている）、ならびに、１０アミノ酸または９アミノ酸のｃ−ｍｙｃまたはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）血球凝集素（ＨＡ）ペプチド（これらはモノクローナル抗体の９Ｅ１０および１２Ｃａ５の可変領域によってそれぞれ認識される）が含まれる。
【０１７８】
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇは、ストレプトアビジンと特異的に結合する能力を有するペプチドである。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇの使用に関する十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＴＧＭ．およびＳｋｅｒｒａ，Ａ．、１９９３、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、６：１０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＴＧＭ．他、１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２５５：７５３〜７６６；Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．およびＳｃｈｍｉｄｔ，ＴＧＭ．、１９９９、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６：７９〜８６；Ｓａｎｏ  Ｔ．およびＣａｎｔｏｒ  ＣＲ．、２０００、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、３２６、３０５〜１１；Ｓａｎｏ  Ｔ．他、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、７１５：８５〜９１を参照のこと）。
【０１７９】
好適なマルトース結合ドメインタグは、アミロースを含む基質（例えば、アミロースに基づくアフィニティー精製カラムなど）と特異的に結合する能力を有する、ｍａｌＥによりコードされるマルトース結合タンパク質である。マルトース結合タンパク質の使用に関する十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｇｕａｎ  Ｍ．他、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、２６：２２９〜３４；Ｃａｔｔｏｌｉ  ＦおよびＳａｒｔｉ  ＧＣ、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ、１８：９４〜１００を参照のこと）。
【０１８０】
好適なキチン結合ドメインタグは、キチンと特異的に結合する能力を有する、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓのｃｂｄによりコードされるキチン結合ドメインである。キチン結合タンパク質の使用に関する十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＨＥ他、２００２、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、２６：２４３〜８；Ｃｈｏｎｇ  Ｓ．他、１９９７、Ｇｅｎｅ、１９２：２７１〜８１を参照のこと）。
【０１８１】
従って、機能的成分を、適用および目的によって、上記の様々な親和性タグのいずれかを介して抗体または抗体フラグメントに結合することができる。
【０１８２】
本明細書中上記で述べられたように、抗体または抗体フラグメントに結合した機能的成分はトキシンであり得る。
【０１８３】
標的細胞／組織を殺傷／損傷することを伴う組成物の適用の場合、トキシンは、好ましくは、抗体または抗体フラグメントを複合体の抗原提示部分に特異的に結合することの結果としてコンジュゲート化されたとき、標的細胞／組織を殺傷／損傷することができる。
【０１８４】
様々なトキシンのどれも抗体または抗体フラグメントに結合することができ、それにより、例えば、そのような免疫トキシンを含む組成物を使用して標的細胞／組織を殺傷／損傷するために好適な免疫トキシンを作製することができる。
【０１８５】
好ましくは、トキシンはシュードモナス外毒素Ａであり、より好ましくは、輸送ドメインおよび／またはＡＤＰリボシル化ドメインを含むその一部分である。好ましくは、輸送ドメインおよび／またはＡＤＰリボシル化ドメインを含む部分はトキシンＰＥ３８ＫＤＥＬである。ＰＥ３８ＫＤＥＬをトキシン成分として含む免疫トキシンの作製は、好ましくは、下記の実施例の節において記載および例示されるように行われる。そのような免疫トキシンを作製するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｕ．他、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：８６１６〜２０；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｕ．、２０００、Ｉｎ−ｖｉｖｏ、１４：２１〜７を参照のこと）。
【０１８６】
適用および目的によって、特に、標的細胞／組織を殺傷／損傷するために抗体または抗体フラグメントに結合することができる他のタイプのトキシンには、様々な細菌トキシン、植物トキシン、化学療法剤および放射性同位体がそれぞれ含まれるが、これらに限定されない。免疫トキシンを作製するために一般的に使用されるトキシンの例には、リシンおよびシュードモナス外毒素Ａ由来のＰＥ４０トキシンが含まれる。あるいは、免疫トキシンは、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンまたはコレラトキシンなどのトキシンを用いて作製することができる。
【０１８７】
免疫トキシンの選択、作製および使用のための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｋｎｅｃｈｔｌｅ  ＳＪ、２００１、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ、３５６：６８１〜９；Ｈａｌｌ  ＷＡ．、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６６：１３９〜５４；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｕ．、２０００、Ｉｎ−ｖｉｖｏ、１４：２１〜７；Ｈａｇｇｅｒｔｙ  ＨＧ．他、１９９９、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ、２７：８７〜９４；Ｃｈａｐｌｉｎ  ＪＷ．、１９９９、Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ、５２：１３３〜４６；Ｗｕ  Ｍ．、１９９７、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、７５：１３４７〜５５；Ｈａｌｌ  ＷＡ、１９９６、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ、７：５３７〜４６；Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉ  Ｌ．他、１９９５、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、８０：５４６〜５６；Ｓｉｅｇａｌｌ  ＣＢ．、１９９５、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ、６：２８９〜９５；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ＭＬ．他、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、７６：１０７〜１４；Ｇｈｅｔｉｅ  ＭＡ．およびＶｉｅｔｔａ  ＥＳ．、１９９４、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：７０７〜１４；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ＭＬ．およびＮａｄｌｅｒ  ＬＭ．、１９９４、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３１：８８〜９７；Ｆｒａｎｋｅｌ  ＡＥ．、１９９３、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）、７：６９〜７８；Ｐａｉ  ＬＨ．およびＰａｓｔａｎ  Ｉ．、１９９３、ＪＡＭＡ、２６９：７８〜８１；Ｂｏｏｎ，Ｔ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：７２５〜７２９；Ｒｅｎｋｖｉｓｔ，Ｎ．他、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、５０：３〜１５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．、２３００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：３８０〜３８４；および米国特許第５６７７２７４号を参照のこと）。
【０１８８】
本明細書中上記で述べられたように、適用および目的によって、組成物は、好都合には、抗体または抗体フラグメントのモノマー形態または多量体形態を含むことができる。
【０１８９】
抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む本発明の組成物は一般に、抗体または抗体フラグメントのモノマー形態を含む組成物よりも大きい結合力、および、それにより、抗体または抗体フラグメントのモノマー形態を含む組成物よりも大きい親和性で複合体の抗原提示部分と結合する。従って、抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む本発明の組成物は、できる限り大きい親和性で複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる試薬から、通常の場合には当てはまるように、利益を受ける適用のために好都合であり得る。
【０１９０】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む本発明の組成物は、特に、複合体の抗原提示部分を特異的に検出するために組成物を使用することを伴う適用に関して、本発明の方法を効果的に実施するために都合良く用いることができる。
【０１９１】
様々な方法を、抗体または抗体フラグメントの多量体形態を含む本発明の組成物を作製するために用いることができる。
【０１９２】
好ましくは、抗体または抗体フラグメントの多量体形態は、親和性タグに結合された多数の抗体または抗体フラグメントを、そのような多数の親和性タグと特異的かつ同時に結合することができる多量体化分子に結合することによって作製される。あるいは、抗体または抗体フラグメントの多量体形態は、本発明の多数の抗体または抗体フラグメントを、自己多量体化が可能な成分に結合し、それにより、そのような多数の抗体または抗体フラグメントを多量体化するようにすることによって作製することができる。
【０１９３】
様々なタイプの多量体分子／親和性タグの組合せはどれも、本発明の抗体または抗体フラグメントの多量体形態を作製するために用いることができる。
【０１９４】
好ましくは、そのような組合せは、本明細書中上記で記載されたように、人類に対して知られている最も大きい親和力で互いに結合するビオチン親和性タグおよびストレプトアビジン多量体化分子からなり、従って、本発明の抗体または抗体フラグメントの最適に安定な多量体形態を一般にもたらす。
【０１９５】
特定の適用については、抗体または抗体フラグメントのモノマー形態を含む本発明の組成物が好都合であり得る。そのような組成物は、その比較的小さいサイズのために、最適なその生体分布および／または拡散から利益を受ける、インビボ適用などの適用のために好都合であり得る。
【０１９６】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、本発明の抗体または抗体フラグメントのモノマー形態を含む本発明の組成物は、そのような抗体または抗体フラグメントが、例えば、標的細胞を殺傷／損傷するためにトキシンに結合される適用において、好都合に利用することができる。
【０１９７】
好ましくは、組成物は、ＡＰＭがＭＨＣクラスＩ分子であり、抗原がＭＨＣクラスＩ制限抗原である複合体（本明細書中では「ＭＨＣクラスＩ：抗原複合体」として示される）と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む。
【０１９８】
あるいは、組成物は、ＡＰＭがＭＨＣクラスＩＩ分子であり、抗原がＭＨＣクラスＩＩ制限抗原である複合体（本明細書中では「ＭＨＣクラスＩＩ：抗原複合体」として示される）、または、ＡＰＭがＣＤ１分子であり、抗原がＣＤ１分子であり、抗原がＣＤ１制限抗原である複合体（「ＣＤ１：抗原複合体」）の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。組成物はまた、ＡＰＭ：抗原複合体と構造的および／または機能的に類似する複合体（例えば、上記のＭＨＣ型複合体またはＣＤ１型複合体のいずれかなど）と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０１９９】
組成物は、様々な特定のＭＨＣクラスＩＩ：抗原複合体のいずれかの抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ：抗原複合体の抗原提示部分は、ＡＰＭとして、ＨＬＡ−ＤＰ分子、ＨＬＡ−ＤＱ分子またはＨＬＡ−ＤＲ分子を有する。
【０２００】
本発明の組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と、一般には長さが約１０アミノ酸残基〜３０アミノ酸残基のペプチドである様々なＭＨＣクラスＩＩ制限抗原のいずれかとから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。そのようなペプチドは一般に、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子に対するその特異的な結合を可能にする特定の化学的組成を有する（例えば、Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ  ＰＪ．、１９９８、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ、４：１８２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ．、１９９５、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：８５；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ  Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ  Ｊ．、１９９４、ＡＰＭＩＳ、１０２：２４１；Ｈｏｂｏｈｍ  Ｕ．およびＭｅｙｅｒｈａｎｓ  Ａ．、１９９３、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：１２７１を参照のこと）。
【０２０１】
組成物は、様々な特定のＣＤ１：抗原複合体のいずれかの抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。例えば、ＣＤ１：抗原複合体の抗原提示部分は、ＡＰＭとして、ＣＤ１ａ分子、ＣＤ１ｂ分子またはＣＤ１ｄ分子を有する。
【０２０２】
本発明の組成物は、ＣＤ１分子と、ペプチドまたはより典型的には脂質のいずれかであり得る様々なＣＤ１制限抗原のいずれかとから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。例えば、ＣＤ１ｂ分子およびＣＤ１ｃ分子はともに、ＣＤ１ｂ制限またはＣＤ１ｃ制限のリポアラビノマンナン抗原、ミコール酸抗原またはグルコースモノミコラート抗原と特異的に会合する能力を有し、ＣＤ１ｃはＣＤ１ｃ制限のポリイソプレニル糖脂質抗原と特異的に会合する能力を有し、ＣＤ１ｄはＣＤ１ｄ制限のグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー脂質抗原およびグリコシルセラミド脂質抗原と特異的に会合する能力を有する。
【０２０３】
組成物は、様々な特定のＭＨＣクラスＩ：抗原複合体のいずれか、例えば、ＨＬＡ−Ａ分子、ＨＬＡ−Ｂ分子またはＨＬＡ−Ｃ分子をＭＨＣクラスＩのＡＰＭとして有するＭＨＣクラスＩ：抗原複合体（本明細書中では、「ＨＬＡ−Ａ：抗原複合体」、「ＨＬＡ−Ｂ：抗原複合体」または「ＨＬＡ−Ｃ：抗原複合体」としてそれぞれ示される）の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０２０４】
組成物は、ＡＰＭが様々なＨＬＡ−Ａ分子のいずれかである複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる一方で、組成物は、好ましくは、ＨＬＡ−Ａ分子がＨＬＡ−Ａ２（最も好ましくはＨＬＡ−Ａ２．１（あるいは「ＨＬＡ＊２０１」と称される））である複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる。
【０２０５】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、ＨＬＡ−Ａ２分子をＡＰＭとして有する複合体と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、本発明の様々な実施形態を効果的に実施するために使用することができる。
【０２０６】
本発明の組成物は、ＭＨＣクラスＩ分子と、一般には長さが約９アミノ酸残基〜１１アミノ酸残基のペプチドである様々なＭＨＣクラスＩ制限抗原のいずれかとから構成される複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。そのようなペプチドは一般に、特定のＭＨＣクラスＩ分子に対するその特異的な結合を可能にする特定の化学的組成を有する（例えば、Ｂｉａｎｃｏ  Ａ．他、１９９８、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ、４：４７１；Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ  ＰＪ．、１９９８、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ、４：１８２；Ｆａｌｋ  Ｋ．およびＲｏｔｚｓｃｈｋｅ  Ｏ．、１９９３、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、５：８１；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ．、１９９５、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、７：８５；Ｈｏｂｏｈｍ  Ｕ．およびＭｅｙｅｒｈａｎｓ  Ａ．、１９９３、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３：１２７１を参照のこと）。
【０２０７】
本明細書中上記で記載されたように、本発明の組成物は、ヒトＡＰＭと、病原体に由来する抗原とから構成される特定の複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む。
【０２０８】
組成物は、本質的には任意のタイプの病原体に由来するＡＰＭ制限抗原を含む特定の複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる一方で、病原体は好ましくは、細胞内の病原体である。
【０２０９】
あるいは、病原体は、例えば、細菌、菌類、原生動物、マイコバクテリウムおよび蠕虫などの非細胞内病原体であってもよい。
【０２１０】
組成物は、ウイルス、マイコバクテリウム、細菌（例えば、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）など）および原生動物（例えば、リーシュマニアまたはトリパノソーマなど）を含む様々な細胞内病原体のいずれかに由来するＡＰＭ制限抗原を含む複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０２１１】
好ましくは、抗体または抗体フラグメントは、ウイルス病原体に由来するＡＰＭ制限抗原を含む複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる。
【０２１２】
そのようなウイルス病原体の例には、レトロウイルス、サーコウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、イリドウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、ピコルナウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、アレナウイルスおよびフィロウイルスが含まれる。
【０２１３】
組成物は、様々なレトロウイルスのいずれかに由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる一方で、レトロウイルスは、好ましくは、ヒトＴリンパ親和性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１；これはまたヒトＴ細胞白血病ウイルスとしてこの分野では示される）である。
【０２１４】
あるいは、レトロウイルスは、例えば、ＨＴＬＶ−２、または、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２など）などであり得る。
【０２１５】
組成物は、ＨＴＬＶ−１に由来する様々な抗原のいずれかを含む複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０２１６】
好ましくは、本発明の組成物は、ＨＴＬＶ−１に由来するＡＰＭ制限抗原として、Ｔａｘタンパク質に由来する抗原を含む複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む。
【０２１７】
組成物は、様々なＴａｘタンパク質由来抗原のいずれかをＡＰＭ制限抗原として含み、かつ、様々なアミノ酸配列のいずれかを含む抗原結合領域を有する複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができる。
【０２１８】
好ましくは、抗体または抗体フラグメントは、（ｉ）Ｔａｘタンパク質由来のＡＰＭ制限抗原として、Ｔａｘタンパク質のアミノ酸残基１１〜１９を含むペプチド、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、または好ましくは両者を含む複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメント；（ｉｉ）配列番号１４〜配列番号９７に示されるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列の最大数を含む抗原結合領域を有する抗体または抗体フラグメント；あるいは（ｉｉｉ）好ましくはその両方である抗体または抗体フラグメントを含む。
【０２１９】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、（ｉ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＴａｘタンパク質のアミノ酸残基１１〜１９を含むペプチドをＡＰＭ制限抗原として有する複合体と特異的に結合することができ、かつ（ｉｉ）配列番号１４〜配列番号９７に示されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む抗原結合領域を有する抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、複合体の抗原提示部分を検出するために、または標的細胞／組織を殺すために組成物を使用することを伴う本発明の様々な実施形態を効果的に実施するために使用することができる。
【０２２０】
病原体が感染している細胞、および病原体またはその抗原にさらされたＡＰＣは、異なるＡＰＭおよび／または異なる病原体由来抗原を含む別個の複合体を発現し得ること、および、従って、組成物はそのような細胞タイプの１つまたはそれ以外と選択的に結合するように都合良く選択され得ることが理解される。このことは、本発明の数々の適用において好都合に適用することができ、例えば、本明細書中下に記載されるように組成物を使用して、ＡＰＭと、病原体に由来する抗原との異なる複合体を呈示する良性または有益なＡＰＣを殺傷／損傷することなく、ＡＰＭと、病原体に由来する抗原との１つの特定の複合体を呈示する病原体に感染している細胞を選択的に殺傷／損傷することによって個体において病原体に関連する疾患を処置するときなどにおいて適用することができる。
【０２２１】
本明細書中上記で述べられたように、適用および目的によって、所望の親和性で複合体の抗原提示部分と結合することができる抗体または抗体フラグメントを選択することができる。
【０２２２】
好ましくは、所望の親和性はできる限り大きい。複合体の抗原提示部分についてできる限り大きい結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、一般に、複合体の抗原提示部分に対する機能的成分の最適に安定なコンジュゲート化、および、それにより、最適な感度での複合体の抗原提示部分の検出、または、最適な効率での標的細胞／組織の殺傷／損傷を可能にする。
【０２２３】
好ましくは、親和性は、１ｘ１０−２モル濃度〜５ｘ１０−３モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−３モル濃度〜５ｘ１０−４モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−４モル濃度〜５ｘ１０−５モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−５モル濃度〜５ｘ１０−６モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−６モル濃度〜５ｘ１０−７モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−７モル濃度〜５ｘ１０−８モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−８モル濃度〜５ｘ１０−９モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−９モル濃度〜５ｘ１０−１０モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−１０モル濃度〜５ｘ１０−１１モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−１１モル濃度〜５ｘ１０−１２モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−１２モル濃度〜５ｘ１０−１３モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−１３モル濃度〜５ｘ１０−１４モル濃度、より好ましくは５ｘ１０−１４モル濃度〜５ｘ１０−１５モル濃度、および最も好ましくは５ｘ１０−１５モル濃度〜５ｘ１０−１６モル濃度の範囲から選択される解離定数（Ｋｄ）によって特徴づけられる。
【０２２４】
下記の実施例の節において例示されるように、約１０−９モル濃度の解離定数によって特徴づけられる親和性で複合体の抗原提示部分と結合することができる抗体または抗体フラグメントを、本明細書中に示されるプロトコルを使用して作製することができる。
【０２２５】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、約１０−９モル濃度の解離定数によって特徴づけられる複合体の抗原提示部分に対する結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、複合体の抗原提示部分を検出するために、または標的細胞／組織を殺傷／損傷するために組成物を使用することを伴う実施形態を含めて、本発明の様々な実施形態を効果的に実施するために使用することができる。
【０２２６】
様々な方法を、複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを得るために用いることができる。
【０２２７】
好ましくは、抗体または抗体フラグメントは、基体にコンジュゲート化された複合体の抗原提示部分と所望の親和性で結合することができる抗体または抗体フラグメントを呈示するライブラリーの要素について抗体または抗体フラグメントのコンビナトリアルディスプレーライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。好ましくは、抗体または抗体フラグメントがＦａｂである場合、これは、好ましくは下記の実施例の節において記載されるように、基体に固定化された単鎖ＭＨＣ：ペプチド複合体に関してＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることによって都合良く行うことができる。複合体と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを同定するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、ヒト由来の抗体または抗体フラグメントの作製については、例えば、Ｃｈａｍｅｓ，Ｐ．他、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９７：７９６９〜７９７４；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：９４２１〜９４２６；Ｌｅｖ，Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：３１８４〜３１９４を参照のこと；非ヒト由来の抗体または抗体フラグメントの作製については、例えば、Ａｈａｒｏｎｉ，Ｒ．他、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：１４７〜１５０；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｓ．他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９３：１８２０〜１８２４；Ｄａｄａｇｌｉｏ，Ｇ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７２７〜７３８；Ｄａｙ，Ｐ．Ｍ．他、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：８０６４〜８０６９；Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ，Ｍ．他、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１：１３９５〜１４１２；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ｂ．他、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：７６５〜７６８；Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６；Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４６３１〜４６３６；Ｚｈｏｎｇ，Ｇ．他、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１３８５６〜１３８６１；Ｚｈｏｎｇ，Ｇ．他、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６：６７３〜６８２；Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｄ．Ｒ．他、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６：３８３３〜３８３７を参照のこと；一般的な参考文献については、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．他、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３４９：２９３〜２９９を参照のこと）。
【０２２８】
本発明の組成物に含まれる抗体または抗体フラグメントを作製するためのさらなる指針が本明細書中下記に提供される。
【０２２９】
所望の親和性の抗体または抗体フラグメント（例えば、所望の抗原決定基について１０−１２もの大きい解離定数によって特徴づけられる抗体または抗体フラグメント）を作製することは、この分野での一般的な技術を使用して達成することができることが当業者によって理解される。
【０２３０】
組成物はそれ自体を使用することができ、または、医薬組成物における有効成分として配合することができる。
【０２３１】
従って、本明細書中上記で記載されたように、本発明は、（ｉ）モノクローナルまたはポリクローナルな抗体または抗体フラグメント；（ｉｉ）抗体または抗体フラグメントのモノマー形態または多量体形態；（ｉｉｉ）様々な形態のいずれかによって特徴づけられる抗体または抗体フラグメント；（ｉｖ）様々な哺乳動物種のいずれかに由来する抗体または抗体フラグメントまたはその一部分；（ｖ）様々な特異的なヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体のいずれかの抗原提示部分と特異的に結合する抗体または抗体フラグメント；および／または（ｖｉ）所望の親和性で特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体の抗原提示部分と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む組成物を提供し、また、適用および目的によって、そのような組成物を使用して実施することができる。
【０２３２】
さらに本発明を実施に移しているとき、本発明の抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子配列が単離された。
【０２３３】
従って、本発明の別の態様によれば、本発明の抗体または抗体フラグメントをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【０２３４】
適用および目的によって、単離されたポリヌクレオチドはさらに、ウイルスのコートタンパク質、検出可能な成分およびトキシンをコードする核酸配列を含む。
【０２３５】
好ましくは、ウイルスのコートタンパク質、検出可能な成分またはトキシンに融合された抗体フラグメントを含むキメラなポリペプチドの作製を可能にするために、ポリペプチドをコードする核酸配列は、抗体フラグメントをコードする核酸配列と翻訳融合される。ポリペプチドをコードする核酸配列は、そのような核酸配列の構造配列を、そのような構造配列によってコードされるポリペプチドを含むキメラなポリペプチドの産生を妨げ得る、そのような構造配列の間に存在する転写／翻訳停止コドンまたは任意の他の配列を途中に存在させることなくポリヌクレオチドにおいて互いに読み枠を合わせてクローン化することによってポリヌクレオチドにおいて翻訳融合することができる。
【０２３６】
ウイルスのコートタンパク質に結合された抗体フラグメントは、抗体フラグメントがウイルスのコートタンパク質に融合されているために抗体フラグメントを呈示するウイルスを作製するために使用することができる。そのようなウイルスを作製することは、さらに詳しくは本明細書中下に記載されるように、また、下記の実施例の節において記載されるように行うことができる。
【０２３７】
様々な方法を、単離されたポリヌクレオチドを作製するために使用することができる一方で、単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは、下記の実施例の節において記載されるように作製される。
【０２３８】
下記の実施例の節において記載および例示されるように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本発明の組成物を作製するために好適な抗体フラグメント、あるいは、ウイルスのコートタンパク質、検出可能な成分および／またはトキシンとのそのコンジュゲートを作製するために使用することができる。
【０２３９】
本発明を実施に移しているとき、本発明のポリヌクレオチドを発現することができる核酸構築物が単離または作製された。
【０２４０】
従って、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドと、宿主細胞におけるその転写を行うためのプロモーター配列とを含む核酸構築物を提供する。
【０２４１】
適用および目的によって、様々なタイプの宿主細胞における単離されたポリヌクレオチドの転写を行わせることができる様々なプロモーター配列を用いることができる一方で、プロモーター配列は好ましくは、原核生物におけるその転写を行わせることができる。
【０２４２】
プロモーター配列は、様々な好適な原核生物のいずれかにおけるポリヌクレオチドの転写を行わせる能力を有し得る。
【０２４３】
好ましくは、原核生物は大腸菌である。
【０２４４】
宿主細胞における核酸配列の調節可能な転写を可能にするために、プロモーター配列は好ましくはさらに、宿主細胞における核酸配列の誘導可能な転写を行わせることができる。
【０２４５】
宿主細胞（例えば、好適な大腸菌細胞など）におけるポリヌクレオチドの転写または誘導可能な転写を行わせることができる様々なタイプのプロモーター配列を用いることができる。
【０２４６】
好ましくは、プロモーター配列はＴ７プロモーター配列である。
【０２４７】
ポリヌクレオチドの転写を行わせるためにＴ７プロモーター配列を含む本発明の構築物は、本発明の抗体フラグメント、あるいは、ウイルスのコートタンパク質、検出可能な成分および／またはトキシンとのそのコンジュゲートを好適な大腸菌宿主細胞において効率的に誘導発現するために使用することができることが当業者によって理解される。
【０２４８】
好ましくは、核酸構築物は、下記の実施例の節において記載および明らかにされるように、宿主細胞において本発明の抗体フラグメントを誘導産生させるために単離または組み立てられ、そして使用される。
【０２４９】
本明細書中上記で記載されたように、核酸構築物は様々なタイプの宿主細胞において発現させることができる。例えば、核酸構築物を、哺乳動物細胞または植物細胞などの真核生物宿主細胞において都合良く発現させることができる。
【０２５０】
抗体フラグメントをコードする核酸構築物を真核生物細胞において発現させる様々な方法が当業者によって広範囲に実施されている。
【０２５１】
核酸構築物を発現する植物細胞は、核酸構築物を発現し、それにより、現行の産業基盤を使用して収穫、加工および貯蔵することができる大量の抗体の安価かつ容易な製造を可能にする植物を作製するために使用することができる。
【０２５２】
植物における本発明の核酸構築物の発現は、免疫トキシンなどの免疫複合体を含めて、本発明の組成物の様々な形態を発現する植物を作製するために使用することができる。
【０２５３】
抗体フラグメントをコードする核酸構築物（例えば、免疫トキシンをコードする核酸構築物など）を植物細胞において、そしてそれにより植物において発現させるための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓ  Ｋ．他、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２７５６〜６１；Ｄｅ  Ｊａｅｇｅｒ  Ｇ．他、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、４３：４１９〜２８；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｒ．他、２０００、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ、１４：８３〜９２；Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｒ．他、１９９９、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３０：１０１〜８；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＡ．、１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４０：１１９〜３８を参照のこと）。
【０２５４】
本発明を実施に移しているとき、本発明の核酸構築物と、本発明の抗体フラグメントに融合されたコートタンパク質とを含むウイルスが単離または作製された。
【０２５５】
従って、本発明は、本発明の核酸構築物および／または本発明の抗体フラグメントに融合されたコートタンパク質を含むウイルスを提供する。
【０２５６】
本発明のウイルスは、様々な適用において使用することができ、例えば、複合体の抗原提示部分に対して所望の結合親和性／特異性を有する本発明の抗体フラグメントを選択するためなどに使用することができる。あるいは、そのようなウイルスは、抗体フラグメントまたは核酸構築物を増殖させるために使用することができる。好ましくは、そのような増殖は、宿主細胞に感染させるためにウイルスを使用することによって行われる。
【０２５７】
様々なタイプのコートタンパク質のいずれかに融合された本発明の抗体フラグメントを含む様々なタイプのウイルスはどれも使用することができる。
【０２５８】
好ましくは、ウイルスは繊維状ファージであり、コートタンパク質はｐＩＩＩである。
【０２５９】
様々な方法を、ウイルスを取得および利用するために用いることができる一方で、ウイルスは、好ましくは、下記の実施例の節において記載および明らかにされるように取得および利用される。
【０２６０】
本発明を実施に移しているとき、核酸構築物を含む宿主細胞が作製され、本発明の抗体フラグメントを製造するために使用された。
【０２６１】
従って、本発明は、核酸構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０２６２】
宿主細胞は様々な提供において好都合に使用することができる一方で、宿主細胞は好ましくは、本明細書中上記で述べられたように、抗体フラグメントを製造するために使用される。あるいは、宿主細胞は、核酸構築物を増殖させるために使用することができる。
【０２６３】
様々なタイプの宿主細胞を、適用および目的によって、本発明を実施するために使用することができる。
【０２６４】
好ましくは、宿主細胞は原核生物細胞である。
【０２６５】
あるいは、宿主細胞は哺乳動物細胞であり得る（好適な哺乳動物細胞およびそれらの使用方法の記載については、本明細書中の抗体／抗体フラグメント製造の指針を参照されたい）。
【０２６６】
様々なタイプの原核生物宿主細胞はどれも利用することができる一方で、原核生物細胞は好ましくは大腸菌細胞である。
【０２６７】
様々な方法を、大腸菌宿主細胞を取得および利用するために、例えば、抗体または抗体フラグメントを製造するために用いることができる一方で、大腸菌宿主細胞は、好ましくは、下記の実施例の節において記載および明らかにされるように取得および利用される。
【０２６８】
本発明を実施に移しているとき、特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体の抗原提示部分の特異的な検出を可能にする組成物の能力が明らかにされた。
【０２６９】
従って、本発明の別の態様によれば、複合体の抗原提示部分を検出する方法が提供される。
【０２７０】
この方法は、複合体の抗原提示部分を本発明の組成物にさらし、それにより、複合体の抗原提示部分と、組成物に含まれる抗体または抗体フラグメントとのコンジュゲートを得ることによって行われる。コンジュゲートが形成されると、この方法はさらに、コンジュゲートの抗体または抗体フラグメントを検出し、その結果、それにより複合体の抗原提示部分を検出するようにすることを含む。
【０２７１】
本発明のこの態様による方法は、様々な状況および適用のいずれかにおいて複合体の抗原提示部分を検出するために使用することができる。
【０２７２】
特に、下記において記載されるように、この方法は、個体において病原体による感染を診断するために使用することができる。
【０２７３】
適用および目的によって、様々な方法を、本発明の教示に従って、複合体の抗原提示部分を組成物にさらすために利用することができる。
【０２７４】
標的細胞／組織によって呈示／発現される複合体の抗原提示部分、または、表面に固定化された複合体の抗原提示部分を検出するための方法を使用するとき、複合体の抗原提示部分は、好ましくは、標的細胞／組織、または表面に固定化された複合体の抗原提示部分を組成物にそれぞれさらすことによって組成物にさらされる。
【０２７５】
いくつかの適用については、生物学的サンプルを、組成物を生物学的サンプルと接触させる前に個体から都合良く得ることができる。あるいは、組成物は、組成物を個体に投与することによって生物学的サンプルと接触させることができる。
【０２７６】
本明細書中上記で記載されたように、構成物と、組成物にさらされた複合体の抗原提示部分とがコンジュゲートを形成すると、この方法はさらに、コンジュゲートの抗体または抗体フラグメントを検出し、その結果、複合体の抗原提示部分を検出するようにすることを含む。
【０２７７】
様々な方法を、複合体の抗原提示部分の抗体または抗体フラグメントを検出するために用いることができる一方で、複合体の抗原提示部分は好ましくは、検出可能な成分に結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物を使用し、それに結合している検出可能な成分を検出することにより抗体または抗体フラグメントを検出することによって検出される。
【０２７８】
本明細書中上記で記載されたように、様々な検出可能な成分を、適用および目的によって、様々な検出アッセイの状況において複合体の抗原提示部分を検出するために使用することができる。
【０２７９】
好ましくは、本発明のこの態様による方法は、生物学的サンプルにおいて複合体の抗原提示部分を検出するために使用される。あるいは、この方法は、細胞以外の表面（例えば、ＥＬＩＳＡプレートの表面など）に固定化された複合体の抗原提示部分を検出するために使用することができる。
【０２８０】
この方法は、本質的に任意のタイプの生物学的サンプルにおいて複合体の抗原提示部分を検出するために使用することができる一方で、好ましくは、標的細胞／組織によって呈示／発現される複合体の抗原提示部分を検出するために適用される。
【０２８１】
好ましくは、標的細胞は、複合体を呈示する病原体感染細胞、または、複合体を呈示するＡＰＣ（例えば、専門的ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂリンパ球、顆粒球、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージおよびマスト細胞など）である。
【０２８２】
本明細書中上記で記載されたように、組成物は、本質的には任意の病原体に由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含むことができるので、本発明のこの態様による方法は、本質的には任意の病原体に由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体を検出するために使用することができることが理解される。
【０２８３】
好ましくは、この方法は、ＨＴＬＶ−１由来抗原をＡＰＭ制限抗原として含む特定の複合体を呈示／発現する標的細胞を検出するために使用される。
【０２８４】
好ましくは、本発明のこの態様による方法は、下記の実施例の節において記載されるように行われる。
【０２８５】
下記の実施例の節において明らかにされるように、実施例において示されるプロトコルに従ってこの方法を実施することは、ＨＴＬＶ−１由来抗原をＡＰＭ制限抗原として含む特定の複合体を呈示する細胞、または、細胞以外の表面に固定化されたそのような複合体を最適な特異性および感度で検出するために数々の状況において使用することができる。
【０２８６】
従って、本発明のこの態様による方法は、個体において病原体による感染を効果的かつ強力に診断し、かつ特徴づけるために使用することができる。
【０２８７】
本明細書中上記で記載されたように、本発明の方法のこの態様は、本質的には任意の状況において本質的には任意の複合体を最適な特異性および／または感度で検出するために使用することができるので、本発明のこの態様による方法は、本質的には任意の病原体に関連する本質的には任意の感染を最適に診断し、かつ特徴づけるために使用することができることが理解される。
【０２８８】
例えば、下記の実施例の節において記載されるように、本発明のこの態様による方法は、ＡＰＭ：レトロウイルス由来抗原を最適に検出するために使用することができる。従って、この方法は、レトロウイルスによる感染を個体において最適に検出するために使用することができる。レトロウイルスは、様々な悪性腫瘍、免疫不全症（とりわけ、ＡＩＤＳ）および神経学的障害、ならびに、関節炎、大理石骨病および貧血のような一見したところ多様な症候群を含めて広範囲の様々な疾患に関連する。従って、本発明のこの態様による方法は、例えば、本質的にはすべてのそのような疾患を個体において最適に診断するために使用することができる。
【０２８９】
好ましくは、本発明のこの態様による方法は、下記の実施例の節において記載および明らかにされるように、本発明のこの態様による方法は、ＡＰＭ制限抗原としてＨＴＬＶ−１由来抗原を含む複合体を呈示する標的細胞を最適な感度および特異性で検出するために使用することができるので、ＨＴＬＶ−１感染、またはそのような感染に関連する疾患を個体において診断するために使用される。本発明のこの態様による方法を使用して診断および特長づけされ得るＨＴＬＶ−１感染に関連する疾患には、成人Ｔリンパ球白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ；Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｍ．他、１９８２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７９：２０３１〜２０３５）、シェーグレン症候群、炎症性関節症、多発性筋炎および肺疾患（Ｃｏｓｃｏｙ  Ｌ．他、１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４８：３３２〜３４１）が含まれる。
【０２９０】
最も好ましくは、本発明のこの態様は、下記の実施例の節の実施例２において記載されるように、ＨＴＬＶ−１関連の脊髄障害／熱帯性ウイルス痙性不全対麻痺（ＨＡＭ／ＴＳＰ；Ｏｓａｍｅ  Ｍ．他、１９８６、Ｌａｎｃｅｔ、１：１０３１〜１０３２）の診断および特長づけのために使用することができる。
【０２９１】
本発明を実施に移しているとき、標的細胞／組織の殺傷／損傷を可能にする本発明の組成物の能力が明らかにされた。
【０２９２】
従って、本発明のさらなる態様によれば、標的細胞を殺傷または損傷する方法が提供される。
【０２９３】
本発明の教示によれば、この方法は、標的細胞を本発明の組成物にさらすことによって行われる。
【０２９４】
この方法は、適用および目的によって、様々な様式で様々なタイプの標的細胞を殺すように行うことができる。
【０２９５】
好ましくは、この方法は、トキシンに結合した抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物に標的細胞をさらし、その結果、トキシンによって標的細胞を殺傷／損傷するようにすることによって行われる。
【０２９６】
あるいは、インボ状況またはそのインビトロ同等物において、この方法は、本明細書中上記で記載されたように、そのような抗体または抗体フラグメントが結合する標的細胞に対して向けられた免疫応答（例えば、補体カスケードまたはＡＤＣＣなど）を開始させることができる分子と特異的に結合することができる、Ｆｃ領域またはその一部分を含む抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物に標的細胞をさらすことによって行うことができる。
【０２９７】
本発明のこの態様による方法は、様々な状況および適用のいずれかにおいて標的細胞を殺傷／損傷するために使用することができる一方で、好ましくは、個体において病原体に関連する疾患を処置するように標的細胞を殺傷／損傷するために用いられる。
【０２９８】
この方法はまた、特に、組成物を使用して標的細胞を殺傷／損傷することを試験し、かつ／または最適化するために、標的細胞をインビトロで、または動物におけるインビボで殺傷／損傷するために使用することができることが理解される。組成物を使用する標的細胞の殺傷／損傷のそのような試験および／または最適化は、好都合には、組成物を使用する個体における疾患の処置を最適化するために適用することができる。
【０２９９】
疾患を処置するために標的細胞を殺傷／損傷するための組成物の使用を最適化することについて本発明のこの態様による方法を使用するとき、この方法は、好都合には、標的細胞を個体から得ることによって行うことができる。医師などの当業者は、標的細胞を個体から得るための必要な専門的知識を有する。
【０３００】
様々なタイプの標的細胞を、標的細胞を殺傷／損傷するための組成物の使用を最適化するために個体から得ることができる。好ましくは、そのような標的細胞は、病原体が感染している細胞である。これは、そのような細胞は、病原体が感染している標的細胞を殺すことを最適化するために、そして、従って、個体における疾患の処置を最適化するために特に有用であるからである。
【０３０１】
本明細書中上記で記載されたように、組成物は、本質的には任意の病原体に由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体と最適な特異性および親和性で結合することができる抗体または抗体フラグメントを含むことができるので、本発明のこの態様による方法は、本質的には任意の病原体に由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体を呈示／発現する細胞を最適な効率および特性で殺傷／損傷するために使用することができることが理解される。
【０３０２】
好ましくは、この方法は、ＡＰＭ制限抗原としてＨＴＬＶ−１由来抗原を含む特定の複合体を呈示／発現する標的細胞を殺傷／損傷するために使用される。
【０３０３】
好ましくは、本発明のこの態様による方法は、下記の実施例の節において記載されるように行われる。
【０３０４】
下記の実施例の節において明らかにされるように、この方法を実施例において示されるプロトコルに従って実施することは、ＡＰＭ制限抗原としてＨＴＬＶ−１由来抗原を含む特定の複合体を呈示する細胞を最適な効率および特異性で殺すために使用することができる。
【０３０５】
従って、本発明は、個体において病原体に関連した疾患を処置する方法を提供する。
【０３０６】
この方法は、病原体に由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む本発明の組成物を有効成分として含む医薬組成物の治療効果的な量を個体に投与することによって行われる。
【０３０７】
本明細書中下記において詳しく記載されるように、医薬組成物は様々な方法で投与することができる。
【０３０８】
本明細書中上記で記載されたように、本発明のこの態様による方法は、好ましくは、免疫トキシンを含む組成物を使用して行われる。
【０３０９】
免疫トキシンを使用して疾患を処置するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、一般的な参考文献については、Ｋｎｅｃｈｔｌｅ  ＳＪ、２００１、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ、３５６：６８１〜９３；Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６６：１１１〜２３；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｕ．、２０００、ｉｎ−ｖｉｖｏ、１４：２１〜７；Ｇｈｅｔｉｅ  ＭＡおよびＶｉｔｅｔｔａ  ＥＳ．、１９９４、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：７０７〜１４；Ｗｕ  Ｍ．、１９９７、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、７５：１３４７〜５５；Ｈａｌｌ  ＷＡ、１９９６、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ、７：５３７〜４６；Ｂｏｏｎ，Ｔ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：７２５〜７２９；Ｒｅｎｋｖｉｓｔ，Ｎ．他、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、５０：３〜１５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：３８０〜３８４；および米国特許第５６７７２７４号を参照のこと；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の処置については、例えば、Ｃｈａｐｌｉｎ  ＪＷ．、１９９９、Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ、５２：１３３〜４６を参照のこと；脳腫瘍の処置については、例えば、Ｈａｌｌ  ＷＡ．、２００１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１６６：１３９〜５４を参照のこと；血液学的悪性腫瘍の処置については、例えば、Ｐａｓｑｕａｌｕｃｃｉ  Ｌ．他、１９９５、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、８０：５４６〜５６；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ＭＬ．他、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、７６：１０７〜１４；Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ  ＭＬ．およびＮａｄｌｅｒ  ＬＭ．、１９９４、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３１：８８〜９７を参照のこと；ガン腫の処置については、例えば、Ｓｉｅｇａｌｌ  ＣＢ．、１９９５、Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ、６：２８９〜９５を参照のこと；ガンの処置については、例えば、Ｆｒａｎｋｅｌ  ＡＥ．、１９９３、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）、７：６９〜７８；Ｐａｉ  ＬＨ．およびＰａｓｔａｎ  Ｉ．、１９９３、ＪＡＭＡ、２６９：７８〜８１を参照のこと）。
【０３１０】
この方法は、本発明によって教示される様々な方法論を使用して、病原体に関連する様々なタイプの疾患を処置するために使用することができる。
【０３１１】
好ましくは、この方法は、病原体感染細胞を殺傷／損傷することによって、病原体に関連する疾患を処置するために使用される。これは、好都合には、疾患の病理発生が主に病原体感染細胞に由来する場合に行うことができる。
【０３１２】
あるいは、この方法は、疾患が、病原体に由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体を呈示／発現する病原的ＡＰＣにより活性化された病原的Ｔリンパ球によって病原体感染細胞に対して向けられた病原的な免疫応答を伴う場合、この疾患を処置するために使用することができる。これは、好ましくは、そのような病原的ＡＰＣを殺傷／損傷するために組成物を使用することによって、本明細書中上記に記載されるように行われる。あるいは、そのような病原的ＡＰＣによって媒介される病原的な免疫応答を、病原的な複合体と特異的に結合することができる抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物を使用し、その結果、それにより、複合体によるそのＴＣＲの関与による病原的Ｔリンパ球の活性化を阻止するようにすることによって、本明細書中上記に記載されるように阻害することができる。
【０３１３】
本明細書中上記に記載されるように、本発明の方法のこの態様は、本質的には任意の特定の複合体を呈示／発現する細胞を最適な効率および特異性で殺すために使用することができるので、本発明のこの態様による方法は、本質的には任意の病原体に関連する本質的には任意の感染を個体において最適に処置するために使用することができることが理解される。
【０３１４】
例えば、下記の実施例の節において記載されるように、本発明のこの態様による方法は、レトロウイルスに由来する抗原をＡＰＭ制限抗原として含む複合体を呈示する細胞を最適な効率および特異性で殺傷／損傷するために使用することができる。従って、この方法は、例えば、個体におけるレトロウイルスに関連する感染を最適に処置するために使用することができる。
【０３１５】
従って、本発明のこの態様による方法は、例えば、本明細書中上記に記載されるレトロウイルス感染に関連する広範囲の様々な疾患を最適に処置するために使用することができる。
【０３１６】
好ましくは、本発明のこの態様による方法は、下記の実施例の節において記載および明らかにされるように、本発明のこの態様による方法は、ＡＰＭ制限抗原としてＨＴＬＶ−１由来抗原を含む複合体を呈示する標的細胞を最適な効率および特異性で殺すために使用することができるので、個体におけるＨＴＬＶ−１感染を処置するために使用される。
【０３１７】
本明細書中上記で記載されたように、本発明の抗体または抗体フラグメントは数々の方法で作製することができる。
【０３１８】
本発明のモノクローナルまたはポリクローナルな抗体または抗体フラグメントは、抗体分子または抗体フラグメント分子のインビボ産生の誘導、あるいは、抗体または抗体フラグメントを産生する細胞株の培養を用いる方法によって作製することができる。そのような方法を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている［例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと］。
【０３１９】
抗体を作製する、細胞培養に基づく方法には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術が含まれる（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．他、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７；Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ．他、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８１：３１〜４２；Ｃｏｔｅ  ＲＪ．他、１９８３、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８０：２０２６〜２０３０；Ｃｏｌｅ  ＳＰ．他、１９８４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６２：１０９〜１２０を参照のこと）。
【０３２０】
本発明の抗体または抗体フラグメントをインビボで作製することは、血清中の抗体の産生を高めるスケジュールに従った、アジュバントの存在下での哺乳動物への標的抗原（例えば、複合体の抗原提示部分を含む抗原）の反復した注射によって好都良く行うことができる。標的抗原が非常に小さくて、十分な免疫原応答を誘発することができない場合（これはこの分野では「ハプテン」として示される）、ハプテンを、抗原性的には中性であるキャリアに、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または血清アルブミン［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］のキャリアなどにカップリングすることができる（例えば、米国特許第５１８９１７８号および同第５２３００７８号を参照のこと）。ハプテンをキャリアにカップリングすることは、この分野で広く知られている様々な方法を使用して行うことができる。例えば、アミノ基への直接的なカップリングを行うことができ、そして、必要な場合には、その後、形成されたイミノ連結の還元を行うことができる。あるいは、キャリアを、縮合剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド脱水剤など）を使用してカップリングすることができる。リンカー化合物もまた、そのようなカップリングを行うために使用することができる。ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーの両方をＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手することができる。得られる免疫原性複合体は、その後、好適な哺乳動物被験体（例えば、マウスおよびウサギなど）に注射することができる。抗体のインビボ作製の後、宿主哺乳動物におけるその血清力価を、この分野で広く知られている免疫アッセイ手法を使用して容易に測定することができる。そのようなポリクローナル抗体含有抗血清は、純粋なポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体調製物を得るためのその精製の後、そのようなものとして利用することができる。そのような抗血清または精製された抗体調製物はまた、使用に先立って、適用および目的によって様々な方法で改変することができる。そのような抗血清から単離された抗体をコードする遺伝子配列を、この分野の標準的な技術を使用して決定することができ、そして、抗体またはその改変体（例えば、抗体フラグメントなど）を組換え製造するために使用することができる。
【０３２１】
本発明の抗体フラグメントは、この分野で広く知られている様々な方法を使用して得ることができる。例えば、そのような抗体フラグメントは、元の抗体のタンパク質分解的加水分解によって、または、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞における組換え発現（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現システム）によって調製することができる。
【０３２２】
Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを、元の抗体をペプシンで酵素消化して、５Ｓフラグメントを得ることによって作製することができる。このフラグメントは、３．５Ｓの一価Ｆａｂ’抗体フラグメントを作製するために、チオール還元剤、および、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基を使用してさらに切断することができる。
【０３２３】
ペプシンによる元の抗体の酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよび１つのＦｃフラグメントを直接、作製するために使用することができる。そのような方法を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号；Ｐｏｒｔｅｒ  ＲＲ．、１９５９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、７３：１１９〜１２６を参照のこと）。
【０３２４】
本明細書中上記で記載されたように、Ｆｖは、対形成した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される。この会合は非共有結合性であり得る（例えば、Ｉｎｂａｒ他、１９７２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、６９：２６５９〜６２を参照のこと）。あるいは、本明細書中上記で記載されたように、可変ドメインは、分子間ジスルフィド結合によって単鎖Ｆｖを作製するために連結することができ、または、そのような鎖は、グルタルアルデヒドなどの化学試薬を使用して共有結合的に架橋することができる。単鎖Ｆｖは、ペプチドリンカーをコードするオリゴヌクレオチドによってつながれた、重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列および軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって都合良く調製することができる。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて、発現ベクターは、そのような単鎖Ｆｖをその後で合成する大腸菌などの宿主細胞に導入される。単鎖Ｆｖを作製するそのような方法を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５；Ｂｉｒｄ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６；Ｐａｃｋ他、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号を参照のこと）。
【０３２５】
抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的技術、化学的技術もしくは遺伝子的技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される標的抗原に結合する限り、使用することができる。
【０３２６】
抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ペプチドを含むポリペプチドを、そのようなＣＤＲをコードする遺伝子配列を使用する組換え技術によって、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって得ることができる。そのような方法を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：１０６〜１０を参照のこと）。
【０３２７】
ヒトの治療または診断のためには、ヒト化された抗体または抗体フラグメントが好都合に使用され得ることが理解される。ヒト化された非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト抗体に由来する部分（好ましくは最小限の部分）を有する遺伝子操作されたキメラな抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体には、ヒト抗体（レシピエント抗体）の相補性決定領域が、所望の機能性を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラットまたはウサギなど）の相補性決定領域に由来する残基によって置換されている抗体が含まれる。場合により、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、また、移入された相補性決定領域もしくはフレームワーク配列においても、そのいずれにも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ（典型的には２つ）の可変ドメインの実質的にすべてを含む。この場合、相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体の相補性決定領域に対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、関連したヒトコンセンサス配列のフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体は最適には、典型的にはヒト抗体に由来するＦｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部をも含む（例えば、Ｊｏｎｅｓ他、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９；Ｐｒｅｓｔａ、１９９２、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６を参照のこと）。ヒト以外の抗体または抗体フラグメントをヒト化するための様々な方法がこの分野では広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からヒト化抗体に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、移入された可変ドメインから典型的には選ばれる移入残基として示される。ヒト化は本質的には、ヒトの相補性決定領域を、対応する齧歯類の相補性領域で置換することによって、記載されるように行うことができる（例えば、Ｊｏｎｅｓ他、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６；米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的には全長に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換されているキメラな抗体である。実際、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの相補性決定領域残基、および、おそらくはいくつかのフレームワーク残基が、齧歯類抗体における類似する部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体であり得る。ヒト抗体またはヒト抗体フラグメントはまた、この分野で知られている様々な技術を使用して作製することができ、これらには、ファージディスプレーライブラリーが含まれる［例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ他、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１；Ｃｏｌｅ他、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６〜９５を参照のこと］。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をコードする配列を遺伝子組換え動物（例えば、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、遺伝子再配置、鎖組み立ておよび抗体レパートリーを含めて、すべての点でヒトにおいて見られる抗体産生と非常に類似するヒト抗体の産生がそのような動物において観測される。そのような方法を実施するための十分な指針がこの分野の文献に提供されている（例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号および同第５６６１０１６号；Ｍａｒｋｓ他、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６；ＬｏｎｂｅｒおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３を参照のこと）。
【０３２８】
抗体または抗体フラグメントが得られると、抗体または抗体フラグメントは、さらに詳しくは本明細書中下に記載されるように、また、下記の実施例の節において記載されるように、表面に固定化された標的複合体を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡによって、複合体の抗原提示部分に対する特異的な結合について都合良く試験することができる。複合体の抗原提示部分に対する抗体または抗体フラグメントの特異的な結合を確認した後、様々な方法を用いて、複合体の抗原提示部分に対する所望の結合親和性を呈示するために抗体または抗体フラグメントを改変することができる。そのような方法には、親和性成熟化に基づく方法が含まれる（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．およびＰａｓｔａｎ，Ｉ．、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：５６８〜７２を参照のこと）。
【０３２９】
本明細書中上記で記載されたように、本発明は、本発明の組成物を有効成分として医薬組成物を投与することによって、個体において病原体による感染に関連する疾患を処置するために使用することができる。
【０３３０】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される１つまたは複数の有効成分と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する有効成分の投与を容易にすることである。
【０３３１】
本明細書中において、用語「有効成分」は、生物学的効果を説明することができる組成物を示す。
【０３３２】
以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された有効成分の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントがこれらの表現に包含される。
【０３３３】
本明細書中において、「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０３３４】
薬物の配合および投与のための様々な技術を“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参照として本明細書中に組み込まれる）に見出すことができる。
【０３３５】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達（特に経鼻送達）、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な心室内（脳室内）注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０３３６】
あるいは、医薬組成物は、全身的様式ではなく、局所的様式で投与することができ、例えば、医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することによって投与することができる。
【０３３７】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０３３８】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用され得る調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得るキャリアを使用して従来の様式で配合することできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０３３９】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは、生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的な塩の緩衝液など）において配合することができる。経粘膜投与の場合、透過すべきバリアに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０３４０】
経口投与の場合、医薬組成物は、有効成分をこの分野で広く知られている医薬的に許容され得るキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物を、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして錠剤または糖衣錠コアを得るために、所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤には、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーがある。所望する場合には、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０３４１】
あるいは、経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、本明細書中上記に記載されるような本発明の免疫トキシンを含有する植物の可食部分を含むことができる。従って、個体は、そのような免疫トキシンを、免疫トキシンを内因的に発現する植物食品の形態で摂取することができる。
【０３４２】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または有機溶媒混合物を含有することができる。色素または顔料を、有効成分の用量を明らかにするために、または有効成分の用量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えることができる。
【０３４３】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分を好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。また、安定化剤を加えることができる。経口投与されるすべての配合物は、選ばれた投与経路について好適な投薬量でなければならない。
【０３４４】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０３４５】
鼻吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位を、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジを、有効成分および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合することができる。
【０３４６】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬量形態で提供することができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションであり得るし、また、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０３４７】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態での活性な調製物の水溶液が含まれる。また、有効成分の懸濁物を適切な油系または水系の注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０３４８】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェン非含有水に基づく溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態にすることができる。
【０３４９】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を使用して、坐薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０３５０】
本発明に関連する使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、その意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果的な量は、障害（例えば、虚血）の症状を防止、緩和または改善するために、あるいは処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分（核酸構築物）の量を意味する。
【０３５１】
治療効果的な量の決定は、特に本明細書中に提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０３５２】
本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量を、最初はインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、用量を、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定めることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０３５３】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力を、インビトロ、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路によって変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。
【０３５４】
投薬量および投薬間隔を、所望の治療効果を発揮するために十分である有効成分の血漿中レベルまたは脳レベル（最少有効濃度、ＭＥＣ）をもたらすために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。様々な検出アッセイを、血漿中濃度を測定するために使用することができる。
【０３５５】
処置される状態の重篤度および応答性によって、投薬は単回または複数回の投与が可能であり、この場合、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるか、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０３５６】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、病気の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存する。
【０３５７】
本発明の組成物は、所望される場合には、有効成分を含有する１つ以上の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴うことがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、さらには上記において詳述されているかのように、適応される状態を処置するために、調製され、適切な容器に入れられ、かつ表示され得る。
【０３５８】
本特許の存続期間中に、多くの関連した医学的診断技術が開発されることが予想され、従って、表現「検出する方法」の範囲は、推測されるすべてのそのような新しい技術を包含することが意図される。
【０３５９】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０３６０】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０３６１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ���ｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。
【０３６２】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。
【０３６３】
（実施例１）
ヒトの病原体感染の最適な診断、特長づけおよび処置に対して適用可能な、特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と最適な親和性および特異性で結合することができる試薬の作製
病原体感染（例えば、ウイルス感染など）に関連する疾患には、インフルエンザ、風邪および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む、大きな医学的および経済的な影響を有する数々の衰弱性または致死性の疾患が含まれる。そのような病原体媒介疾患を診断し、特長づけ、かつ処置するために提案されている１つの理論的に効力のある方法は、特異的なヒト抗原提示分子（ＡＰＭ）：病原体由来ペプチド複合体と結合することができる化合物を使用することを伴う。そのような化合物は、病原体感染の細胞／組織、または、ウイルス抗原にさらされたＡＰＣを最適な特異性で同定し、かつ特長づけするために、また、細胞傷害性薬剤を最適な選択性および効率で病原体感染細胞に送達するために、また、ウイルス抗原提示を伴う病原体媒介の病理発生を研究するための他にないほど強力な手段として役立たせるために使用することができる。しかしながら、そのような複合体と特異的に結合することができる化合物を作製するすべての先行技術方法は、ヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と最適な親和性／特異性で結合することができる化合物を提供することに失敗している。本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、予想外にも、下記のように、そのような化合物を発見している。
【０３６４】
材料および方法：
細胞株および抗体：  ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤは、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｄｂ−β２−ミクログロブリン単鎖を発現するＴＡＰ２欠損マウス細胞株である（Ｐａｓｃｏｌｏ，Ｓ．他、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５：２０４３〜２０５１）。ＪＹは、ＴＡＰおよびＨＬＡ−Ａ２が陽性なＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株である。ＡＰＤはＨＬＡ−Ａ２陰性／ＨＬＡ−Ａ１陽性のＢ細胞株である。ＨＵＴ１０２およびＲＳＣＤ４は、それぞれ、ＨＬＡ−Ａ２陰性およびＨＬＡ−Ａ２陽性のＨＴＬＶ−１感染ヒトＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞株である。
【０３６５】
Ｇ２Ｄ１２は、陰性コントロールとして使用された抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４複合体Ｆａｂである（ペプチドＧ９〜１５４はメラノーマ特異的なｇｐ１００タンパク質に由来する）。モノクローナル抗体のｗ６／３２およびＢＢ７．２は、正しく折り畳まれたペプチドと結合したＨＬＡ（汎ＨＬＡ）、およびＨＬＡ−Ａ２と、それぞれ、特異的に結合する。
【０３６６】
ビオチン化された可溶性ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の作製：  可溶性のビオチン化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を以前の記載（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２）のように作製した。簡単に記載すると、構築物を、β２−ミクログロブリンに融合されたＨＬＡ−Ａ２．１（あるいはＨＬＡ−Ａ＊２０１と称される）と、Ｃ末端における部位特異的なビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列と、Ｆｄ鎖のＣＨ１ドメインに融合されたヘキサヒスチジンタグとを含有する単鎖ＭＨＣ融合タンパク質の発現のために組み立てた。この単鎖融合タンパク質において、ＨＬＡ−Ａ２およびβ２−ミクログロブリンは柔軟なペプチドリンカーを介して融合される。この単鎖の発現のために、大腸菌形質転換体を、この構築物を使用して作製し、融合タンパク質を含有する封入体をニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって形質転換体のペリプラズム画分から単離し、そして、封入体から得られた融合タンパク質を、正しく折り畳まれ、かつ組み立てられた可溶性のＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体が得られるように５倍〜１０倍モル過剰のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドの存在下でのインビトロ再折り畳みに供した。正しく折り畳まれたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を、以前の記載（Ａｌｔｍａｎ  Ｊ．Ｄ．他、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９４〜９６）のように、アニオン交換のＱ−セファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、続いてＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）を使用する部位特異的ビオチン化によって単離し、精製した。ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の均一性および純度を、以前の記載（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２）のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を含む様々な生化学的手段によって分析した。
【０３６７】
ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と特異的に結合することができるＦａｂファージの選択：  表面に固定化されたビオチン化ＭＨＣ：ペプチド複合体に対するＦａｂファージ（Ｆａｂファージ）の選択を、以前の記載（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：９４２１〜９４２６；Ｌｅｖ，Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：３１８４〜３１９４）のように行った。簡単に記載すると、３．７ｘ１０１０個の異なるＦａｂクローンを含有する大きなヒトＦａｂライブラリー（ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｈ．Ｊ．他、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１８２１８〜１８２３０）を選択のために使用した。１０１３個のファージを有するアリコートを２００マイクロリットルのストレプトアビジンコーティングされた常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ）とプレインキュベーションして、ストレプトアビジン結合物質をなくした。その後、残ったファージを、減少する量の表面固定化されたビオチン化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を結合標的として使用してパンニングした（初回については５００ナノモル濃度、その後の処理については１００ナノモル濃度）。結合したファージを１００ミリモル濃度のトリエチルアミンで溶出し、溶出液を１モル濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。中和したファージを、その後、３７℃での３０分間のインキュベーションによって大腸菌ＴＧ１細胞（ＯＤ６００＝０．５）に感染させるために使用した。
【０３６８】
選択された抗体の多様性をＤＮＡフィンンガープリンティングによって決定した。異なるクローンのＦａｂ  ＤＮＡを、ｐＵＣ−リバース［５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号１）］およびｆｄ−ｔｅｔ−ｓｅｑ２４［５’−ＴＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴＡＧＴ−３’（配列番号２）］のプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、続いて、ＢｓｔＮＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、米国）を用いた消化を６０℃での２時間のインキュベーションによって行った。反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０３６９】
可溶性の組換えＦａｂの発現および精製：  Ｆａｂを以前の記載（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２）のように発現させ、精製した。簡単に記載すると、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導可能な調節配列の制御下でＦａｂを発現させるための構築物で形質転換されたＴＧ１細胞またはＢＬ２１細胞の培養物をＯＤ６００＝０．８〜１．０に成長させた。培養物を、１ミリモル濃度のＩＰＴＧを添加し、さらに３０℃で３時間〜４時間培養することによって組換えＦａｂを発現させるために誘導した。ペリプラズム内容物を、Ｂ−ＰＥＲ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して放出させ、事前に洗浄されたＴＡＬＯＮカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に加えた。結合したＦａｂを、リン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液に溶解された１００ミリモル濃度の０．５ｍｌのイミダゾールを使用してカラムから溶出し、４℃での一晩のインキュベーションによってリン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液に対して２回透析して、残存イミダゾールを除いた。
【０３７０】
Ｆａｂファージクローンおよび精製ＦａｂのＥＬＩＳＡ：  個々のＦａｂファージクローンおよび可溶性ＦａｂのＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体についての結合特異性を、ビオチン化されたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を結合標的として使用するＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ）をＢＳＡ−ビオチン（１マイクログラム／ウエル）で一晩コーティングした。コーティングされたプレートを洗浄し、ストレプトアビジン（１マイクログラム／ウエル）と室温で１時間インキュベーションした。徹底的な洗浄の後、プレートを０．５マイクログラムのＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と室温で１時間インキュベーションした。プレートを２パーセントのスキムミルク−リン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液と室温で３０分間ブロッキング処理し、続いて、ウエルあたり約１０９個のファージクローンと、または様々な濃度の可溶性の精製Ｆａｂと室温で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄し、そして、可溶性Ｆａｂに対する西洋ワサビペルオキシオダーゼコンジュゲート化抗ヒトＦａｂ抗体、または、Ｆａｂファージに対する西洋ワサビペルオキシオダーゼコンジュゲート化Ｍ１３ファージ抗体とインキュベーションした。検出を、ＴＭＢ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して行った。Ｆａｂファージクローンまたは精製Ｆａｂをスクリーニングするために使用されたＴａｘ１１〜１９標的ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２制限の陰性コントロールペプチドのアミノ酸配列が表１に示される。
【表１】
2006523453.tif 000002
【０３７１】
蛍光性Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２テトラマーの作製：  Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を、クローン化された挿入物のＴ７プロモーター調節の発現のためのｐＥＴ発現ベクターに別々にクローン化した。軽鎖遺伝子を、カルボキシ末端における部位特異的なビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列を含む融合タンパク質（Ｔ３Ｆ２軽鎖−ＢｉｒＡ）として操作した。これらの構築物を大腸菌ＢＬ２１細胞において別々に発現させ、そして、ＩＰＴＧによる誘導のとき、多量の組換えタンパク質を含有する細胞内の封入体が生じた。Ｔ３Ｆ２鎖を含有する封入体を精製し、可溶化し、還元し、そして、０．１モル濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５モル濃度のアルギニンおよび９０マイクロモル濃度の酸化型グルタチオンをｐＨ８．０で含有する酸化還元シャッフリング緩衝液系において１：１の比率でインビボで再折り畳みした。その後、正しく折り畳まれたＦａｂをアニオン交換ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって単離および精製した。Ｆａｂピーク画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して１ミリグラム／ミリリットルに濃縮し、緩衝液を１０ミリモル濃度のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に交換した。ビオチン化を、以前の記載（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２；Ａｌｔｍａｎ  Ｊ．Ｄ．他、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：９４〜９６）のように、ＢｉｒＡ酵素（Ａｖｉｄｉｔｙ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＣＯ）を使用して行った。過剰なビオチンを、Ｇ−２５脱塩カラムを使用してビオチン化Ｆａｂから除いた。フィコエリトリン標識されたストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を１：４のモル比で加えて、ビオチン化Ｆａｂの蛍光性テトラマーを作製した。
【０３７２】
フローサイトメトリー：  ＨＬＡ−Ａ２−β２−ミクログロブリンを発現するＢ細胞株ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ形質転換体、ＥＢＶ形質転換されたＨＬＡ−Ａ２陽性ＪＹ細胞、成熟したヒトＨＬＡ−Ａ２陽性樹状細胞、およびＨＬＡ−Ａ２陰性Ｂ細胞株ＡＰＤ−７０を、細胞表面に発現したＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を用いて組換えＦａｂの反応性を明らかにするために使用した。ペプチドパルス処理を示されたように行った。簡単に記載すると、約１０６個の細胞を血清非含有ＲＰＭＩで２回洗浄し、１マイクロモル濃度〜５０マイクロモル濃度のペプチドを含有する培地において２６℃または３７℃でそれぞれ一晩インキュベーションした。ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞は続いて、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の細胞表面発現を安定化させるために、３７℃で２時間〜３時間インキュベーションされた。
【０３７３】
あるいは、２０ｘ１０６個のＪＹ細胞またはＡＰＤ細胞を、ＴＡＸタンパク質のｃＤＮＡをコードする真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐｃＴＡＸ）の２０マイクログラムでトランスフェクションした。このｃＤＮＡはＭ．Ｙｕｔｓｕｄｏ博士（大阪大学）およびＴ．Ｏｋａ博士（岡山大学）からの譲渡であった。トランスフェクションの１２時間後〜２４時間後に、細胞を１００マイクロリットルの体積において組換えＦａｂ（２０マイクログラム／ミリリットル）と４℃で６０分間〜９０分間インキュベーションした。インキュベーション後、一次標識された細胞を３回洗浄し、１マイクログラムの抗ヒトＦａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベーションした。その後、二次標識された細胞を３回洗浄し、氷冷リン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液に再懸濁した。すべてのその後の洗浄およびインキュベーションは氷冷条件下で行った。細胞を、ＦＡＣＳｔａｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析し、結果を、ＷＩＮＡＮＯＭＯＬＡＲＤＩソフトウエア（Ｔｒｏｔｔｅｒ  Ｊ．、ｈｔｔｐ：／／ｆａｃｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ）を使用して解析した。ペプチド負荷細胞のフローサイトメトリー分析を以前の記載（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：９４２１〜９４２６；Ｌｅｖ，Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：３１８４〜３１９４）のように行った。
【０３７４】
競合結合アッセイ：  以前の記載（Ｌｅｖ，Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：３１８４〜３１９４；Ｃｏｈｅｎ，ＣＪ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：５８３５〜５８４４）のように、柔軟なＥＬＩＳＡプレートをＢＳＡ−ビオチンでコーティングし、１００マイクロリットルの体積において１０マイクログラムのＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を固定化した。可溶性の精製Ｆａｂの結合を、特異的な表面固定化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する［１２５］ヨウ素−Ｆａｂの結合を阻害する精製Ｆａｂの能力が調べられる競合的結合分析によって行った。組換えＦａｂを、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬を使用して［１２５］ヨウ素で放射能標識した。増大する濃度の非標識Ｆａｂを競合剤として存在させて、放射能標識されたＦａｂをトレーサーとしてウエルに加えた（ウエルあたり３ｘ１０５カウント／分〜５ｘ１０５カウント／分）。結合アッセイをリン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液における室温で１時間のインキュベーションによって行った。インキュベーション後、プレートをリン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液で５回洗浄し、結合した放射能を、ガンマカウンターを使用して求めた。Ｆａｂの見かけの親和性を、固定化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する［１２５］ヨウ素標識Ｆａｂの結合の５０パーセント阻害を達成するために必要な競合剤の濃度を外挿することによって求めた。非特異的な結合を、２０倍過剰〜４０倍過剰の非標識Ｆａｂを加えることによって求めた。
【０３７５】
特異的なヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体の酵素結合免疫組織化学的分析：  ＪＹ細胞またはＡＰＤ細胞を上記のようにｐｃＴＡＸベクターでトランスフェクションした。２４時間後、トランスフェクション細胞を、１０パーセントのＦＣＳが補充されたＲＭＰＩにおいて氷上で、２０マイクログラムの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂテトラマーと１時間インキュベーションした。細胞懸濁物を、以前の記載［Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）］のように、０．１パーセントのポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ）で事前にコーティングされたガラス製スライドガラスに載せ、スライドガラスを室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、スライドガラスをリン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液で３回洗浄して、ＤＡＢ＋溶液（Ｄａｋｏ）と１分間インキュベーションし、その後、リン酸塩緩衝化生理的食塩水溶液で洗浄して、過剰な染色試薬を除いた。
【０３７６】
可溶性組換え抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体免疫トキシンの発現および精製：  Ｔ３Ｆ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列を、ＦａｂファージクローンからＰＣＲ増幅によって回収し、そして、Ｔ３Ｆ２−ＰＥ３８（軽鎖可変領域のカルボキシ末端を介してＴ３Ｆ２の単鎖Ｆｖに融合されたトキシンＰＥ３８ＫＤＥＬからなる単鎖免疫トキシン）の発現のために、ＮｃｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントを使用して細菌発現ベクターｐＩＢ−ＮＮにサブクローン化した。トキシンＰＥ３８ＫＤＥＬはシュードモナス外毒素Ａの輸送ドメインおよびＡＤＰ−リボシル化ドメインからなる。ＢＬ２３  ＩＤＥ３細胞における発現、封入体からの再折り畳み、およびＴ３Ｆ２−ＰＥ３８の精製を以前の記載（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８８：８６１２〜２０）のように行った。
【０３７７】
実験結果：
抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体抗体の作製：  ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ２を保有するＨＴＬＶ−１感染患者における免疫応答は主に、ＨＴＬＶ−１反応性のＣＤ８陽性Ｔリンパ球のクローン拡大によって、ＨＬＡ−Ａ２制限のＴａｘタンパク質由来Ｔａｘ１１〜１９ペプチドに対して向けられている。
【０３７８】
組換えＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を、以前に記載された単鎖ＭＨＣ−β２−ミクログロブリン融合タンパク質発現構築物（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２）を使用して作製した。この構築物を使用することにより、ＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインが、柔軟な１５アミノ酸長のペプチドリンカーを使用してβ２−ミクログロブリンに融合される。ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をＴａｘ１１〜１９ペプチドの存在下での封入体のインビトロ再折り畳みによって作製した。折り畳まれたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびサイズ排除クロマトグラフィー分析（データは示されず）によって測定されたとき、非常に純粋で、均一で、かつ単量体であることが見出された。この方法によって得られた組換えＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体は、その生化学的性質、生物物理学的性質および生物学的性質に関して詳しく以前に特徴づけられており、また、正しく折り畳まれ、機能的であることが見出されていた［Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２：Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）］。
【０３７９】
特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体と特異的に結合することができる抗体の選択のために、３．７ｘ１０１０個の組換えヒトＦａｂのレパートリーからなる大きなＦａｂファージライブラリー（ｄｅ  Ｈａａｒｄ，Ｈ．Ｊ．他、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１８２１８〜１８２３０）を使用した。これらのＦａｂは選択時にストレプトアビジンコーティングプレートにさらされるため、ライブラリーは最初にストレプトアビジン結合物質をなくし、続いて、可溶性の組換えＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をパンニングするために使用された。ファージ力価の１３００倍の濃縮が３回のパンニングの後で観測された（表２）。選択されたＦａｂファージの特異性を、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドまたは陰性コントロールのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドのいずれかとの複合体でビオチン化ＨＬＡ−Ａ２とインキュベーションされたストレプトアビジンコーティングウエルを使用する示差的ＥＬＩＳＡによって明らかにした。３回目の選択の後で分析されたファージクローンは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対して２つのタイプの結合パターンを示した。すなわち、一方のクラスの抗体は、様々な特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体を区別することができない汎ＭＨＣ結合物質からなり、第２のタイプは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と特異的に結合した抗体からなった。ＥＬＩＳＡスクリーニングにより、３回目のパンニングからスクリーニングされた無作為に選択されたクローンのうちの８７パーセント（７８／９０）がＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と特異的に結合するようであったことが明らかにされた。
【表２】
2006523453.tif 000003
【０３８０】
しかしながら、Ｆａｂの予想外に大きい割合、すなわち、６２パーセント（５６／９０）が、様々なＨＬＡ−Ａ２：コントロールペプチド複合体を結合標的として使用するＥＬＩＳＡにおいてＦａｂファージとして試験されたとき、結合について完全なＴａｘ１１〜１９ペプチド依存性であり、かつ、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体について特異的であった。表２に示されるように、クローンの６２パーセントがＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体にだけ結合し、他のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドを含有する陰性コントロールの複合体には結合しなかった。従って、そのようなクローンは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と類似するＭＨＣ制限ペプチド特異的な結合を示した。これらの明らかなＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体特異的クローンは、（材料および方法のところで示される）他のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドと複合体化されたＨＬＡ−Ａ２を使用する二次スクリーニングにおいて、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体について特異的であり続けた。図１は、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体とだけ反応し、メラノーマｇｐ１００由来およびＭＡＲＴ−１由来のエピトープ、ならびにＭＵＣ１由来のＤ６エピトープを呈示するＨＬＡ−Ａ２：陰性コントロールペプチド複合体とは反応しなかった４つのＦａｂクローンの代表的な分析を示す。
【０３８１】
ペプチド特異的なクローン（２回目または３回目の処理から得られたクローン）の多様性パターンをＤＮＡフィンガープリント分析によって調べた。２０個の異なる制限パターン（２回目のパンニングから単離されたクローンについては６つ、３回目の選択の後では１４の異なるパターン）が見出された。このことは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と特異的に結合することができる数個の異なるＦａｂの選択に成功したことを示している。ＤＮＡ配列決定分析により、これらの観測結果が確認された。ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体について特異的な１４個のクローンの可変重鎖相補性決定領域および可変軽鎖相補性決定領域の配列が表３に示される。
【表３】
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【０３８２】
抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体Ｆａｂの特異性および親和性：  大腸菌のＢＬ２１細胞またはＴＧ１細胞を使用することにより、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対して最も特異的な結合パターン（上記のように分析、図１）を呈示する３つのファージクローンに由来する可溶性Ｆａｂが得られた。
【０３８３】
大腸菌形質転換体のペリプラズマ画分からニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたＦａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、５０ｋＤａの予想される分子量を有する均一かつ純粋なＦａｂが明らかにされた（図２ａ）。２ミリグラム〜４ミリグラムの量の純粋なＦａｂが１リットルの細菌振とうフラスコ培養から得られた。さらなる操作のために、すなわち、モノマーＦａｂの結合力を増大させるために、Ｆａｂはまた、インビトロ再折り畳みによって作製された。軽鎖およびＦｄフラグメント（可変領域と、定常領域のＣＨ１ドメインとからなる重鎖の短縮化された部分）を、クローン化された挿入物のＴ７プロモーター調節の発現のためにｐＥＴ型発現ベクターにサブクローン化し、そして、ＩＰＴＧによる誘導のとき、多量の組換えタンパク質が細胞内封入体として蓄積した（図２ｂ）。インビトロでの酸化還元シャッフリング再折り畳みのとき、精製されたモノマーＦａｂが大きな収量で得られた（４ミリグラム〜６ミリグラムの精製されたＦａｂが、Ｆａｂ鎖またはＦｄフラグメントをそれぞれが発現する２つの１リットル振とうフラスコ培養物から得られた；図２ｃ）。
【０３８４】
ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する可溶性Ｆａｂの細かい特異性を、ＢＳＡ−ストレプトアビジンコーティングウエルに固定化されたビオチン化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を使用してＥＬＩＳＡによって分析した。ＢＳＡ−ストレプトアビジン−ビオチンスペーサーは複合体の正しい折り畳みを可能にする（複合体は、プラスチックに対する直接的な結合によって変形することがある）。結合した複合体の正しい折り畳み、および結合アッセイ時のその安定性を確認するために、正しく折り畳まれたペプチド複合体化ＨＬＡをもっぱら認識する立体配座特異的なモノクローナル抗体ｗ６／３２と反応する結合した複合体の能力をモニターした。図３ａ〜図３ｃは、ＣＭＶまたはＥＢＶに由来するウイルスエピトープ、および、様々な腫瘍関連エピトープ（例えば、テロメラーゼエピトープ（５４０、８６５）、メラノーマｇｐ１００およびＭＡＲＴ−１に由来するエピトープ（それぞれ、１５４、２０９、２８０、およびＭＡＲＴ）、ならびにＭＵＣ１由来エピトープ（Ａ７およびＤ６）を含有する１０個のコントロールＨＬＡ−Ａ２：ペプチド複合体に対してではなく、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する可溶性ＦａｂのＴ３Ｄ４、Ｔ３Ｅ３およびＴ３Ｆ２の特異的な結合をそれぞれ示す（ペプチドの一覧については実験手法を参照のこと）。従って、これらの抗特異的ＭＨＣ：ペプチド複合体ＦａｂはＴＣＲの結合特性および細かい特異性を示している。コントロール実験において、これらのＦａｂは、プレートに固定化されたとき、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドを単独で認識せず、また、固定化されたストレプトアビジンまたは他のタンパク質抗原（例えば、ＢＳＡ、ＩｇＧ、ＲＮａｓｅまたはキモトリプシンなど）も認識しなかった（データは示されず）。
【０３８５】
可溶性Ｆａｂのうちの２つの結合親和性特性を、ストレプトアビジンコーティングプレートに結合したビオチン化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９への増大する量のＦａｂの添加を使用する飽和ＥＬＩＳＡアッセイを使用して試験した。図４ａ〜図４ｂに示されるように、Ｆａｂ  Ｔ３Ｅ３およびＦａｂ  Ｔ３Ｆ２の結合はそれぞれ用量依存的であり、飽和した。どちらのフラグメントも５０パーセント結合シグナルを外挿することにより、それらの親和性がナノモル濃度の範囲にあることが明らかにされた。
【０３８６】
最後に、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対するＦａｂの見かけの結合親和性を、［１２５］ヨウ素標識されたＦａｂの結合が増大する濃度の非標識Ｆａｂと競合する競合結合アッセイを使用して求めた。これらの結合研究（図４ｃ）では、Ｔ３Ｆ２抗体について約２５ナノモル濃度〜３０ナノモル濃度の見かけの結合親和性が明らかにされた。同様の結果がＴ３Ｅ３抗体について観測された（示されず）。
【０３８７】
ペプチドパルス処理された抗原提示細胞（ＡＰＣ）におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の検出：  単離されたＦａｂが、細胞表面に発現したとき、組換え可溶性形態においてだけでなく、天然型形態においてもまた、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と特異的に結合することができるかどうかを明らかにするために、マウスＴＡＰ２欠損ＲＭＡ−Ｓ細胞を単鎖様式でのヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子でトランスフェクションした（Ｐａｓｃｏｌｏ，Ｓ．他、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５：２０４３〜２０５１）（ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｄｂ−β２−ミクログロブリン単鎖、ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞）。Ｔａｘ１１〜１９ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２制限コントロールペプチドをＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞に負荷し、ペプチド負荷細胞に対する選択されたＦａｂの能力をフローサイトメトリーによってモニターした。ＴＡＰ２変異ＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞のペプチド誘導のＭＨＣ安定化が、モノクローナル抗体のｗ６／３２（ＨＬＡ立体配座依存性）およびＢＢ７．２（ＨＬＡ−Ａ２特異的）の、非負荷細胞ではなく、ペプチド負荷細胞との反応性によって明らかにされた（データは示されず）。Ｆａｂ  Ｔ３Ｅ３およびＦａｂ  Ｔ３Ｆ２は、Ｔａｘ１１〜１９ペプチド負荷のＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ細胞とだけ反応し、ｇｐ１００由来のＧ９〜１５４ペプチドが負荷された細胞とは反応しなかった（それぞれ、図５ａ〜図５ｂ）。同様の結果が、１０個の他のＨＬＡ−Ａ２制限コントロールペプチドを使用するフローサイトメトリー分析を使用して観測された（データは示されず）。
【０３８８】
ＴＡＰ２およびＨＬＡ−Ａ２が陽性であるＥＢＶ形質転換されたＢリンパ芽球細胞株ＪＹの細胞もまたＡＰＣとして使用した。細胞をＴａｘ１１〜１９ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２制限コントロールペプチドとインキュベーションし、インキュベーション後、細胞を洗浄して、Ｆａｂとインキュベーションした。Ｔ３Ｅ３またはＴ３Ｆ２のＦａｂは、これらのＦａｂが選択されたＴａｘ１１〜１９ペプチドとインキュベーションされたＪＹ細胞にだけ結合し、ＨＬＡ−Ａ２制限コントロールペプチドとインキュベーションされたＪＹ細胞には結合しないことが見出された（それぞれ、図５ｃ〜図５ｄ）。コントロールとして、ペプチド負荷されたＨＬＡ−Ａ２陰性／ＨＬＡ−Ａ１陽性のＡＰＤ  Ｂ細胞もまた使用した。これらの細胞に対するＦａｂの結合は観測されなかった（データは示されず）。Ｆａｂ  Ｔ３Ｅ３およびＦａｂ  Ｔ３Ｆ２はまた、パルス処理された成熟型のＨＬＡ−Ａ２陽性樹状細胞に対する結合についても試験された。図５ｅ〜図５ｆにそれぞれ示されるように、Ｔ３Ｅ３およびＴ３Ｆ２のＦａｂは、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理されたＨＬＡ−Ａ２陽性樹状細胞を認識したが、コントロールのｇｐ１００由来ペプチドでパルス処理されたＨＬＡ−Ａ２陽性樹状細胞を認識しなかった。
【０３８９】
Ｆａｂを、細胞の表面におけるＭＨＣ：ペプチド複合体の検出のために改変した。特定の内因性ＨＬＡ：ペプチド複合体の細胞表面での密度は、ペプチドパルス処理されたＡＰＣの密度と比較して低いことが予想されたので、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２の結合力を、蛍光性プローブで直接にタグ標識されたＦａｂテトラマーを作製することによって増大させた。この方法は、ＴＣＲに対するＭＨＣ：ペプチド複合体の結合の結合力を増大させるために、または、組換え抗体分子の感度を増大するために以前に使用されていた（Ｃｌｏｕｔｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．他、２０００、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３７：１０６７〜１０７７）。蛍光標識されたテトラマーを使用することの別の利点は、１回だけの染色工程が必要であるということであり、これに対して、モノマーの非標識Ｆａｂでは、蛍光標識された二次抗体を必要とする。従って、蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて作製されたＦａｂテトラマーが、ペプチドパルス処理されたＡＰＣの表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を測定するために使用された。図６ａ〜図６ｃに示されるように、ペプチドパルス処理されたＲＭＡ−Ｓ−ＨＨＤ（図６ａ）、ＪＹ細胞（図６ｂ）およびヒト樹状細胞（図６ｃ）に関するフローサイトメトリーによって測定されたときの結合の強度は、Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂモノマーに関する染色強度と比較して、対数で２ほど劇的に増大した。
【０３９０】
予想外ではあったが、成熟型のＨＬＡ−Ａ２陽性樹状細胞の染色パターンは、広範囲の様々な蛍光強度にわたって散らばっていることが見出された。このことは、樹状細胞集団が不均一なレベルの特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体を細胞表面において呈示することを初めて示している。従って、そのような結果は、ＡＰＣによる特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体提示の生物学を研究するための本明細書中に記載されるＦａｂなどのＦａｂの効力を示している。
【０３９１】
特に、これらの結果は、細胞表面に呈示されたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を検出するＦａｂの能力を明らかにしている。
【０３９２】
細胞内抗原プロセシングによって形成されるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の細胞表面での検出：  生理学的な抗原プロセシングによってもたらされるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を検出するＦａｂの能力を調べるために、ＨＴＬＶ−１のＴａｘ遺伝子をＨＬＡ−Ａ２陽性およびＨＬＡ−Ａ２陰性のＪＹ細胞またはＡＰＤ細胞にそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞表面に呈示されたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対するＴ３Ｆ２の反応性をフローサイトメトリーによって調べた。分析を、高結合力のテトラマーＦａｂ  Ｔ３Ｆ２を使用して行った。コントロールを越える陽性の染色が、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陰性細胞に関してではなく、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陽性のＪＹ細胞に関してだけ明らかに認められ得る（それぞれ、図７ａ〜図７ｂ）。ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４複合体について特異的な陰性コントロールのＦａｂ  Ｇ２Ｄ１２は、ＴａｘでトランスフェクションされたＪＹ細胞と反応しなかった（図７ａ）。Ｔ３Ｆ２による反応性のＴａｘ１１〜１９ペプチド特異的なＭＨＣ制限パターンは、トランスフェクション効率の差、またはＪＹ細胞およびＡＰＤ細胞のＨＬＡ発現のためではなかった。これらの細胞への緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のトランスフェクションを用いたコントロール実験によって明らかにされるように、Ｆａｂの発現のために使用された同じトランスフェクションプロトコルを使用する両方の細胞株に関するトランスフェクション細胞の割合は類似していた（図７ｃ）。また、ｗ６／３２（汎ＭＨＣモノクローナル抗体）を用いたこれらの細胞の染色強度は類似していた（データは示されず）。これらの結果から、これらのＦａｂは、細胞内抗原プロセシングによって形成されるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を検出することができることが示される。
【０３９３】
ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をウイルス感染細胞で検出するためのＦａｂ  Ｔ３Ｆ２の使用を試みた。この目的のために、ＨＬＡ−Ａ２陰性ＨＵＴ１０２細胞およびＨＬＡ−Ａ２陽性ＲＳＣＤ４細胞（ＨＴＬＶ−１感染のヒトＣＤ４陽性Ｔリンパ球細胞株）を使用した。図７ｄに示されるように、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２による著しい染色が、ＨＵＴ１０２細胞に対してではなく、ＲＳＣＤ４細胞に対して観測された。このことは、このＦａｂはウイルス感染細胞の表面の特異的なＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を検出することができることを示している。予想外ではあったが、染色パターンにより、Ｆａｂとの中程度の反応性または大きい反応性をそれぞれ有する２つの細胞亜集団が明らかにされた。このことは、ＲＳＣＤ４のＨＴＬＶ−１感染細胞の亜集団内におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の発現における変動性を示しているかもしれない。類似する変動性が、抗Ｔａｘタンパク質抗体を用いた染色実験で観測された（データは示されず）。ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４複合体について特異的な陰性コントロールのＦａｂ  Ｇ２Ｄ１２はＲＳＣＤ４細胞を染色しなかった（図７ｄ）。
【０３９４】
これらの結果は、ウイルス感染細胞と同様にＡＰＣにおける抗原提示の研究のための、抗特異的ＭＨＣ：ペプチド複合体Ｆａｂの有用性、特に上記の抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体フラグメントの有用性を強く示している。
【０３９５】
ＡＰＣおよびウイルス感染細胞における表面発現したＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の高感度検出および直接的な定量：  上記に示されるデータは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体特異的Ｆａｂの特異性が大きいこと、ならびに、ＨＬＡ−Ａ２と複合体化された天然にプロセシングされたＴａｘ１１〜１９ペプチドを検出するそれらの能力を明らかにしている。インビトロでのＦａｂによる特異的なＭＨＣ：ペプチド認識の感度を、広範囲のＴａｘ１１〜１９ペプチド濃度にわたって、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２による染色によって調べた。図８ａ〜図８ｂに示されるように、段階的な濃度のＴａｘ１１〜１９ペプチドを使用するペプチドパルス処理されたＪＹ細胞の力価測定は、パルス処理のために使用されたペプチドの濃度に依存する染色強度を明らかにし、また、Ｆａｂは、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドを低いナノモル濃度範囲の濃度で使用したとき、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を検出することができたことを明らかにした。Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂに関して観測されたペプチドパルス処理ＪＹ細胞の染色強度を、段階的な数のフィコエリトリン分子を呈示する校正ビーズとの比較によって推定した。この比較は、様々な濃度のＴａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理された細胞の表面に呈示されるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の数の決定を可能にした（図８ａおよび表２）。細胞あたり１００個もの少ないＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出が達成され（６ナノモル濃度でのＴａｘ１１〜１９ペプチドのパルス処理を使用したとき）、また、その検出は、２５マイクロモル濃度〜５０マイクロモル濃度のＴａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理したとき、細胞あたり約１．１ｘ〜１．２ｘ１０５個の複合体で飽和に達した。
【０３９６】
従って、これらの結果は、Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂによる特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体検出の感度が、Ｔリンパ球ハイブリドーマからの測定可能なサイトカイン分泌（ＩＬ−２またはＩＦＮ−γ）、または、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔリンパ球系統による標的Ｔリンパ球の溶解を誘発するために必要とされる最少ペプチド濃度と同じ範囲にあることを明らかにしている（Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ，Ｃ．およびＧｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８２：８４１〜８５１；Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ，Ｃ．他、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８４：１４９〜１５７）。
【０３９７】
ＭＨＣ依存的な抗原提示の研究を妨げている大きな問題は、細胞内抗原プロセシングによってもたらされる特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体の個々の細胞における表面発現レベルを定量するための適当な方法を利用することができないことである。Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２を使用するＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の細胞表面呈示のフローサイトメトリー分析、および、Ｔ３Ｆ２染色細胞の蛍光強度と、段階的な数のフィコエリトリン部位を呈示する校正ビーズの蛍光強度との比較を使用したとき、細胞表面における特異的なＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の数を定量することが可能であった（表４）。すなわち、１．５マイクロモル濃度のＴａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理されたＪＹ細胞は細胞あたり５ｘ１０３個の複合体をその表面に呈示し、一方、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされたＪＹ細胞は、細胞内抗原プロセシングの後、細胞あたり１ｘ１０４個の複合体をその表面に呈示した。後者の結果は、抗特異的マウスＭＨＣ：ペプチド複合体抗体を使用するインビトロでの細胞の組換えワクシニアウイルス感染の後におけるオボアルブミンペプチドＳＩＮＦＥＫＬに結合したマウスＨ−２ｋｂの最近の定量と完全に一致している（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６）。図７ｄおよび表４に示されるように、ＨＴＬＶ−１感染細胞におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の直接的な検出は、この細胞に呈示された複合体の数の定量を可能にした。校正ビーズを使用したこの分析は、ウイルス感染ＲＳＣＤ４細胞が細胞あたり約３ｘ１０４個のＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をその表面に呈示することを明らかにした。図７ｄに示されるように、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２は、大きい反応性および中程度の反応性で、ＨＴＬＶ−１感染ＲＳＣＤ４細胞の２つの亜集団を認識した。反応性が大きい細胞は３ｘ１０４個のＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をその表面に発現し、一方、低い〜中程度の染色強度を有する細胞集団は数百個のＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を発現する。これらの結果は明らかに、集団内のそれぞれの細胞における特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体発現を定量するそのような抗特異的ＭＨＣ：ペプチド複合体Ｆａｂの能力を明らかにしている。
【表４】
2006523453.tif 000006
＊各実験における染色細胞の蛍光強度を、ビーズあたり既知数のフィコエリトリン（ＰＥ）分子を有する校正ビーズ（ＱｕａｎｔｉＢＲＩＧＨＴ  ＰＥビーズ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の蛍光強度と比較し、各実験について部位の数を求めた。非特異的な部位の平均数を、ＨＬＡ−Ａ２陽性であるが、ＨＴＬＶ−１非感染の細胞、または、ＨＴＬＶ−１感染のＨＬＡ−Ａ２陰性細胞、または、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされていないＡＰＣの染色強度によって求めた。その後、各実験についての特異的な部位の数を各実験について計算した。部位の数の偏差は、それぞれの個々の測定における細胞の検出感度および生理学的状態に依存する。
＊＊部位のバックグラウンド数を、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされていないＳＫ−ＢＲ３（ＨＬＡ−Ａ２陰性／ＨＵＴ１０２）細胞、ＦＭ３Ｄ（ＨＬＡ−Ａ２陽性）細胞およびＪＹ（ＨＬＡ−Ａ２陽性）細胞をコントロールとして使用して記載のように求めた。
【０３９８】
ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を呈示する細胞の不均一細胞集団における検出：  現在、特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体を呈示する個々の細胞を混合細胞集団において検出および表現型決定するために利用可能な試薬は存在しない。そのような試薬は、例えば、腫瘍形成性の細胞を検出または病期分類するために、あるいは、不均一細胞集団内のリンパ系組織における抗原提示を研究するために非常に有用である。上記に記載される抗特異的ＭＨＣ：ペプチド複合体Ｆａｂは理想的には、そのような分析を行うために適している。ほんの小さい割合のみが特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体を発現する細胞の不均一集団をシミュレーションするために、ＴａｘでトランスフェクションされたＪＹ細胞およびコントロールの非トランスフェクションＪＹ細胞を様々な比率で混合し、そのような細胞に対するＴ３Ｆ２  Ｆａｂの反応性をフローサイトメトリーによって分析した。図８ｃに示されるように、Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂを使用する単色フローサイトメトリー分析は、細胞内抗原プロセシングによって生じるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をその表面に発現する混合されたＴａｘトランスフェクションＪＹ細胞の正確な同定を可能にしている。Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂは、０．５パーセントの陽性細胞（これはＪＹ細胞の６１．２パーセントの最大トランスフェクション効率から計算された；図８ｄ）を検出することができることによって明らかにされるように、非トランスフェクション細胞の集団の中において１パーセントもの低い割合でＴａｘトランスフェクションＪＹ細胞を検出することができることが示された（図８ｃ〜図８ｄ）。
【０３９９】
これらの結果は、抗特異的ＭＨＣ：ペプチド複合体Ｆａｂにより、特異的な内因的に生じたＭＨＣ：ペプチド複合体を有する細胞亜集団が解明され得る容易さを明らかにしている。
【０４００】
細胞内抗原プロセシングによって生じたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を呈示する細胞の免疫組織化学的検出：  抗特異的ＭＨＣ：ペプチド複合体抗体についての別の潜在的な使用は、組織における特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体のインシチュウ免疫組織化学的分析である。この潜在的可能性を評価するための最初のステップとして、細胞内抗原プロセシングによってＪＹ細胞に呈示されるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体をインシチュウで検出するＴ３Ｆ２  Ｆａｂの能力を明らかにした。ＴａｘでトランスフェクションされたＪＹ細胞を、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂを使用する単一工程の免疫組織化学的分析に供した。図９ａ〜図９ｆに示されるように、これらの実験では、コントロールの非トランスフェクションＪＹ細胞（図９ｃ）ではなく、ＴａｘでトランスフェクションされたＪＹ細胞（図９ａ〜図９ｂ）を強くかつ特異的に染色するＦａｂの能力が示された。ＨＬＡ−Ａ２：Ｇ９〜１５４複合体について特異的な陰性コントロールのＦａｂ  Ｇ２Ｄ１２は、ＴａｘでトランスフェクションされたＪＹ細胞に対する何らかの有意な免疫反応性を示さなかった（図９ｄ）。これらのインシチュウ免疫組織化学実験におけるＦａｂ  Ｔ３Ｆ２の特異的なＭＨＣ限定反応性に対するさらなる証拠が、ＴａｘでトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陰性／ＨＬＡ−Ａ１陽性ＡＰＤ細胞とのＦａｂの反応性がないこと（図９ｅ）、およびトランスフェクションされていないＨＬＡ−Ａ２陰性／ＨＬＡ−Ａ１陽性ＡＰＤ細胞とのＦａｂの反応性がないこと（図９ｆ）によってもたらされる。これらのデータは、細胞内抗原プロセシングによって生じたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を、細胞の表面および潜在的には組織切片においてインシチュウで特異的に検出するＴ３Ｆ２  Ｆａｂの能力を明らかにしている。本発明者らが知る限りでは、これは、特異的なヒトＭＨＣ：ペプチド複合体のインシチュウ検出を明らかにする最初の実例である。
【０４０１】
ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を呈示する細胞のＴ３Ｆ２−ＰＥ３８免疫トキシンによる特異的な細胞溶解：  そのような複合体を呈示する細胞を細胞溶解する抗特異的ヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体免疫トキシンの能力を、ペプチド負荷されたＡＰＣを殺傷／損傷するＴ３Ｆ２−ＰＥ３８の能力を調べることによって明らかにした。殺傷アッセイを、ＪＹ細胞にＴａｘ１１〜１９ペプチドまたはコントロールのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ｇｐ１００に由来するＧ９〜２０９ペプチドを含む）を負荷することによって行った。図１０に示されるように、Ｔ３Ｆ２−ＰＥ３８はＴａｘ１１〜１９ペプチド負荷のＪＹ細胞を２５００ナノグラム／ミリリットルのＩＣ５０で殺すことができた。コントロールのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドが負荷されたＪＹ細胞、または、ペプチドが負荷されなかった細胞のＴ３Ｆ２−ＰＥ３８媒介の細胞溶解は起こらなかった。
【０４０２】
従って、特異的なヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体を呈示する標的細胞を、そのような複合体に対して特異的な抗体を使用して標的化された細胞傷害性コンジュゲートを使用して特異的かつ効率的に殺傷／損傷する能力が初めて明らかにされた。
【０４０３】
考察：  上記の結果は、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体（例えば、ＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体など）と特異的に結合することができる組換え抗体由来分子（例えば、Ｆａｂなど）の作製、および、そのような複合体を呈示する細胞を特異的に殺傷／損傷するための、そのような分子を含む細胞傷害性コンジュゲートの作製を初めて明らかにした。今日まで、抗特異的ＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体抗体はそのような複合体のマウス形態に対してのみ作製されているだけである（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｐ．Ｓ．他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９３：１８２０〜１８２４；Ｄａｙ，Ｐ．Ｍ．他、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：８０６４〜８０６９；Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６；Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４６３１〜４６３６）。
【０４０４】
これらの新規な分子は、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体に対する大きい親和性で、かつ、大きい特異性の結合を示し、従って、そのような複合体についてＴＣＲ様の特異性を呈示する。しかしながら、ＭＨＣ：ペプチド複合体に対するＴＣＲの固有的に低い親和性とは対照的に、これらの分子は、ＴＣＲの特異性を保持しながら、抗体の大きい親和性の抗原結合特性を示す。そのような特性によって、そのような分子は、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体（例えば、ウイルスペプチドを含む複合体など）を特異的に標識または標的化することができる能力から利益を受ける数々の診断的適用、治療的適用および科学的適用において非常に有望な有用性を有する。
【０４０５】
これらのＦａｂの非常に重要な特徴が、（ａ）懸濁物中、および／または免疫組織化学的技術を使用して固定化された表面において、ペプチド負荷された、ＨＴＬＶ−１などの病原体が感染している細胞によって発現または呈示される特定のヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体（例えば、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体など）と大きい感度および特異性で結合することができる能力、および（ｂ）トキシンなどの分子を、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体（例えば、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体など）を呈示する細胞に送達することができる能力を含めて確認された。
【０４０６】
これらの分子の重要な特徴の１つは、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体を、ＴＣＲを介するシグナル伝達を誘発するために要求される閾値限界に近い表面密度で検出することができるその能力である。オボアルブミンペプチドとの複合体でのマウスＭＨＣクラスＩについて特異的なモノクローナル抗体（Ｈ−２Ｋｂ）を使用する他の研究室からの研究は、フローサイトメトリー検出の感度下限が、単一工程染色技術またはサンドイッチ染色技術を使用したとき、細胞あたり１００個〜５００個の特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体の範囲にあることを示していた（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６）。ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に特異的なＦａｂは、細胞あたり１００個もの少ない複合体を再現可能な様式で検出することができたので、抗特異的ヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチドＦａｂについて本明細書中に示されるデータはこれらの数字と良好に一致している。これらの数字は、Ｔリンパ球からのエフェクター応答（例えば、サイトカイン分泌など）を誘発するために要求されるＡＰＣ上の特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体の閾値数のいくつかの推定値（Ｄｅｍｏｔｚ，Ｓ．他、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１０２８〜１０３０；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．およびＵｎａｎｕｅ，Ｅ．Ｒ．、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：５７４〜５７６）と一致し、また、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介による細胞溶解のために要求され得る数（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｃｋ  ＥＲ．他、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６７〜７０；Ｓｙｋｕｌｅｖ  Ｙ．他、１９９６、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４：５６５〜７１）よりも約１０倍大きい。フローサイトメトリーを使用することにより、抗特異的ヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体Ｆａｂを使用して、Ｔリンパ球ハイブリドーマ株または細胞傷害性Ｔリンパ球株によるサイトカイン分泌を誘発させるために要求されるペプチド濃度に類似し、かつ、ＡＰＣによる短期間アッセイにおける溶解のための標的Ｔリンパ球を感作するために要求される濃度の数倍の範囲にあるペプチド濃度でパルス処理された細胞におけるそのような抗体を検出することが可能であった（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６）。現時点で記載されるデータは、解離細胞集団にフローサイトメトリーを使用して適用されたとき、これらのＦａｂは、Ｔリンパ球を活性化するために要求される密度に近い密度で、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体を検出することができることを示している。従って、これらの分子は、低いが、生理学的に関連したレベルで、特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体の発現を評価するための好適な試薬である。
【０４０７】
この原理は、本発明では、元のＪＹ  ＡＰＣと、そのＴａｘ遺伝子トランスフェクション誘導体との混合物に適用された。後者はＴａｘ抗原を細胞内でプロセシングし、そして、コントロール細胞ではなく、Ｔａｘでトランスフェクションされた細胞が、Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂを使用して陽性に染色されることによって明らかにされるように、関連したＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を細胞表面に呈示する。Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂをフローサイトメトリーのために単一工程染色において使用したときでさえ、非トランスフェクションＪＹ細胞と１パーセントもの低い割合で混合されたＴａｘトランスフェクション細胞を容易に同定することが可能であった。細胞表面に発現した特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体の正確な定量がこの方法を使用して達成され得る極めて大きい容易さはまた、そのことを、抗原プロセシングおよび抗原提示を分析するための貴重な手段にしている。興味深いことに、そのような分析は、抗原の異なった形態の使用、または様々な抗原送達方法の使用、または、抗原プロセシング装置のいくつかの既知の成分もしくは疑われる成分が欠損している細胞の使用からもたらされる抗原呈示における量的な差を明らかにすることに向けられている。現在記載されている抗特異的ヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体Ｆａｂなどの試薬を用いない場合、特異的ヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体の細胞表面レベルの定量は、抗原性ペプチドの生化学的単離に依っている。これは、数々の実験的な人為的影響を受ける、費用および労力を要するプロセスであり、負荷された分子の細胞内プールと、ＴＣＲに接近可能な細胞表面における分子とを区別することができない。
【０４０８】
本明細書に示されるデータにおいて、抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体Ｆａｂは、Ｔａｘ遺伝子でトランスフェクションされた細胞の表面におけるか、またはＨＴＬＶ−１感染細胞における、細胞内抗原プロセシングによって生じたそのような複合体の定量を可能にした。この分析は、Ｔａｘでトランスフェクションされた細胞における細胞内抗原プロセシングが細胞あたり約１０４個の特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体の呈示をもたらしたことを明らかにした。総ＨＬＡ−Ａ２染色との比較では、ＨＬＡ−Ａ２分子のほぼ９０パーセントが１つだけのペプチド種で占有されたことが示された（データは示されず）。これらのデータは、ペプチドをコードする組換えワクシニアウイルスによる感染の後の細胞表面におけるＨ−２Ｋｂ：オボアルブミン由来ペプチド複合体の数が様々な状況で分析された以前の研究（Ｐｏｒｇａｄｏｒ，Ａ．他、１９９７、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６：７１５〜７２６）と一致する。これらのデータはまた、感染細胞により呈示されるウイルスコードのタンパク質に由来するペプチドによるＭＨＣクラスＩ分子の占有を調べた研究から得られた結果（Ａｎｔｏｎ，Ｌ．Ｃ．他、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２５３５〜４２）とも一致する。そのような占有推定値は、新しく合成されたＭＨＣクラスＩ重鎖−β２−ミクログロブリン複合体の安定化の分析によって、または、発現したＭＨＣクラスＩ分子に由来するペプチドの溶出、および、溶出物におけるペプチド濃度を決定するための再構成実験によって得られた。ウイルス感染細胞におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の発現レベルの不均一性を検出するＦａｂ  Ｔ３Ｆ２の能力が示された。そのような新規かつ驚くべきデータは、病原体による感染の診断などの状況において特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体の発現を研究するためのそのような抗体の潜在的有用性を強調している。
【０４０９】
Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂを用いた免疫組織化学的染色は、ＴａｘでトランスフェクションされたＪＹ細胞の表面における、細胞内抗原プロセシングによって生じたＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体のインシチュウ検出を可能にした。このＦａｂを用いたバックグラウンドＨＬＡ呈示レベルの染色は、非トランスフェクション細胞、または、ＴａｘでトランスフェクションされたＨＬＡ−Ａ２陰性細胞のいずれも陽性の染色を示さなかったので、これらの条件のもとでは著しくなかった。そのようなデータは、固定化された生物学的サンプルにおける特異的なヒトＭＨＣ：ペプチド複合体の初めての免疫組織化学的可視化を表している。
【０４１０】
そのような方法は共焦点免疫蛍光観察に適用することができ、これは、抗特異的ヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体抗体を使用したとき、そのような複合体の組立ておよび輸送の細胞内部位の分析を可能にする。特異的ヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体を呈示または発現するＡＰＣのインシチュウ局在化は、抗ウイルスＴリンパ球免疫応答の開始、伝播および維持に関与するＡＰＣおよびＴリンパ球の間での細胞間相互作用を特徴づけることにおいて特に価値がある。多色組織化学を、ウイルスＡＰＣのタイプおよび所在地だけでなく、相互作用する抗ウイルスＴリンパ球（一群の誘発されるサイトカインを含む）の表現型もまた解明するために使用することができる。
【０４１１】
ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に結合するＦａｂの６２パーセントがペプチド特異的であり、かつＭＨＣ制限されていたという事実は予想外であった。これは、これらの抗体が、そのような特異性の方に偏っていないと見なされる非免疫レパートリーから選択されたからである。様々なガン関連ペプチドまたはウイルスＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドを含む非常に様々な特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体と特異的に結合することができる組換えＦａｂを同じファージライブラリーから単離することが可能であったという事実（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：９４２１〜９４２６；Ｌｅｖ，Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６２：３１８４〜３１９４）は、そのようなライブラリーから抗ＭＨＣ：Ｔａｘ１１〜１９複合体抗体を単離することができる能力はＴａｘまたはペプチドに関連していなかったことを示している。１つの特定の抗体ファミリーまたは抗体Ｖ遺伝子セグメントは、ＨＬＡ−Ａ２分子と結合する固有的な性向を有し得ること、および、大きな頻度が、非免疫ライブラリーにおけるそのような抗体の大きな存在量によって説明され得ることが可能である。しかしながら、選択されたクローンの配列は、多くの異なる抗体ファミリーおよび生殖系列セグメントに由来しており、相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれにおいても何らかの偏りが認められない（表３）。本明細書中で単離された抗体のいくつかについての大きい頻度および大きい親和性は、これらの分子が、ファージライブラリーのＢ細胞ドナーに由来する抗体レパートリーにおいて大きい頻度で存在し得ることを示唆している。しかしながら、そのような抗体に対するインビボでの役割は不明のままである。
【０４１２】
特異的なＭＨＣ：ペプチド複合体と結合するＦａｂのこの大きい頻度についての理由が何であろうとも、ファージに基づくこの方法は、非常に様々な特異的なヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体に特異的に結合することができる組換え抗体を同定するために首尾良く適用することができるようである。従って、今回、ＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体に基づくＴＣＲ検出試薬（例えば、テトラマー単鎖ＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体など）を使用してＴリンパ球の観点からだけではなく、本明細書中に記載される新規な抗体タイプを使用して病原体由来ＡＰＣおよび病的細胞の観点からもまた、病原体由来抗原の役割を解明することが可能であり得る。
【０４１３】
抗特異的ヒトＭＨＣ：病原体由来ペプチド複合体抗体についてのさらなる適用は、そのような複合体と、同系ＴＣＲとの間における特異的な相互作用の構造機能研究においてである。ＭＨＣ制限の病原体由来ペプチドにおいて特定の残基を変異させ、Ｆａｂおよびペプチド特異的Ｔリンパ球クローンの結合に対するこれらの変異の影響を調べることによって、そのようなＦａｂと、天然ＴＣＲとの間における構造機能の関係性および認識プロセスの異なる性質に関する重要なデータを得ることが可能であり得る（Ｓｔｒｙｈｎ  Ａ．他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９３：１０３３８〜１０３４２）。
【０４１４】
結論：  特定のヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と最適な親和性および特異性で結合する現時点で記載されているＦａｂの能力によって、そのような試薬は、下記の点について、すべての先行技術化合物と比較して、他にないほど好適であり、かつ最適である：（ａ）そのような複合体を発現または呈示する細胞／組織の同定および特長づけ；（ｂ）以前に記載された方法論（Ｂｏｏｎ，Ｔ．およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｐ．、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：７２５〜７２９；Ｒｅｎｋｖｉｓｔ，Ｎ．他、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５０：３〜１５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．、２００１、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：３８０〜３８４）と同様に、細胞傷害性薬物または放射性核種を病原体感染細胞に標的化することによる、そのような複合体を呈示する細胞の特異的な殺傷；（ｃ）そのような複合体の細胞内での局在化および輸送の共焦点顕微鏡観察による可視化および特長づけ；（ｄ）共焦点顕微鏡観察によるリアルタイムでの、また、インビボにおけるリアルタイムでの、そのような複合体を呈示する細胞の追跡；および（ｅ）本発明者らにより実施される、以前に記載された方法（Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ他、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９９：９４２１〜９４２６；Ｌｅｖ．Ａ．他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：３１８４〜３１９４）と同様に、特異的なヒトＡＰＭ：病原体由来抗原複合体と、同系ＴＣＲとの間における相互作用を阻止することによる免疫応答の調節。例えば、現時点で記載されている試薬は、先行技術の抗ＭＨＣ抗体に関しては当てはまるように、感染者に対する抗原投与の危険性を伴うことなく、また、ＭＨＣ対立遺伝子全体の機能の喪失を伴うことなく、病原的なＴリンパ球媒介の抗病原体免疫応答を制御するために使用することができる。
【０４１５】
従って、現時点で記載されている化合物は、ウイルスなどの病原体によって引き起こされるヒトにおける疾患を診断し、特徴づけ、治療するために、また、抗原提示を伴うそのような疾患の様々な態様を研究するために、他にないほど、かつ最適に好適である。
【０４１６】
（実施例２）
ヒト抗原提示分子および病原体由来抗原の複合体について特異的な検出試薬を使用する病原体関連疾患の最適な予測、診断、病期分類、モニターリングおよび予後
背景：  上記で記載されたように、現在、ヒト患者におけるＨＴＬＶ−１感染に関連する疾患（例えば、ＨＡＭ／ＴＳＰなど）について、満足すべき処置方法は存在せず、また、最新技術は、最適な予測、診断、病期分類、モニターリングおよび予後を可能にしていない。そのような疾患の病理発生は、ＨＴＬＶ−１のＴａｘタンパク質のペプチドに対して主に向けられたＴリンパ球媒介の自己免疫応答に関連している。従って、そのような疾患を有する患者を診断し、病期分類し、かつ特徴づけるための最適な方法は、抗原提示分子（ＡＰＭ）と、ＨＴＬＶ−１感染細胞によって呈示されるＴａｘ由来ペプチド抗原との複合体を特異的に検出することができる検出試薬を取得し、用いることである。そのような試薬によってもたらされ得る、診断、病期分類およびモニターリングの最適な能力は、次に、そのような疾患に対する治療の最適な開発を可能にすることが理解される。特定のＡＰＭ：抗原複合体と結合することができる様々な分子が先行技術において提案されているが、それらはどれも、ヒト抗原提示分子と、病原体由来抗原との複合体を検出することができること、および、従って、病原体により誘導される疾患の特長づけを可能にすることができることを示していない。下に記載されるように、本発明者らは、ヒトにおけるＨＴＬＶ−１関連疾患（例えば、ＨＡＭ／ＴＳＰなど）を最適に特長づけるために、ヒトＡＰＭと、ＨＴＬＶ−１のＴａｘペプチドとの複合体について特異的な検出試薬を利用する方法を先行技術に関連して初めて考案し、それにより先行技術の欠点を克服している。
【０４１７】
材料および方法：
末梢血および脳脊髄液のリンパ球の採取：  ＨＬＡ−Ａ２陽性のＨＡＭ／ＴＳＰ患者から、末梢血を日常的な血液採取によって集め、また、脳脊髄液（ＣＳＦ）を腰椎穿刺によって集める。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌクッションでの遠心分離、その後の低浸透圧での赤血球溶解によって、採取された末梢血から単離する。ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットを、ＭＡＣＳビーズを使用する磁気的細胞分取によって、採取された血液およびＣＳＦから単離する。
【０４１８】
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者から得られた末梢血および脳脊髄液のＴ細胞サブセットにおけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体のフローサイトメトリー分析：  ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、およびＣＤ８＋の単離されたＴ細胞サブセットを、複合体検出試薬としてフィコエリトリンコンジュゲート化Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂテトラマーを使用して、本質的には上記の実施例１に記載されるように行われるフローサイトメトリーによってＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９ペプチド複合体の表面発現について分析する（上記の実施例１を参照のこと）。あるいは、採取された血液および採取されたＣＳＦから得られた、ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットを、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４抗体；ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ８抗体；またはＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＣＤ４抗体およびＰＥ−Ｃｙ５コンジュゲート化抗ヒトＣＤ２５抗体とともに、複合体検出試薬としてフィコエリトリンコンジュゲート化Ｔ３Ｆ２  Ｆａｂテトラマーを使用して、本質的には以前の記載（Ｋｉｖｉｓａｋｋ  Ｐ．他、２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１００：８３８９〜８３９４）のように、多色フローサイトメトリーによってＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９ペプチド複合体の表面発現について分析する。上記の実施例１に記載されるように、Ｔａｘ１１〜１９ペプチド負荷、またはｇｐ１００由来Ｇ９〜１５４ペプチド負荷のＨＬＡ−Ａ２陽性ＲＭＡＳ−ＨＨＤ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の表面発現についての陽性コントロールおよび陰性コントロールとしてそれぞれ用いられる。
【０４１９】
リンパ球におけるＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ負荷量およびＨＴＬＶ−１のｔａｘ  ｍＲＮＡ負荷量の分析：  ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ負荷量の分析を、本質的には以前の記載（Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｓｏｎ  Ｒ．他、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４２：７８０〜９１；Ｃｏｓｔｅ  Ｊ．、２０００、Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ、７Ｓｕｐｐｌ、１：１１ｓ〜１７ｓ；Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｓ．およびＮａｋａｙａｍａ  Ｔ．、１９９７、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、５５：８３３〜８；Ｋａｚａｎｊｉ  Ｍ．他、２０００、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：４８６０〜７）のようにＰＣＲによって行う。ＨＴＬＶ−１のｔａｘ  ｍＲＮＡ負荷量の分析を、本質的には以前の記載（Ｋａｚａｎｊｉ  Ｍ．他、２０００、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、１６：１７４１〜６；Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  Ｙ．他、１９９４、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９６：１９３〜２０１；Ｋａｚａｎｊｉ  Ｍ．他、２０００、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：４８６０〜７）のようにＲＴ−ＰＣＲによって行う。
【０４２０】
ＨＡＭ／ＴＳＰ疾患の重篤度の決定：  ＨＡＭ／ＴＳＰ患者における疾患重篤度を、本質的には以前の記載（ＥＤＳＳ；Ｋｕｒｔｚｋｅ  Ｊ．、１９８３、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３３：１４４４〜１４５２）のように、拡大された障害状態尺度に従って測定する。
【０４２１】
結果：
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者の末梢血およびＣＳＦから単離された、ＣＤ４＋、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋、およびＣＤ８＋のＴ細胞サブセットにおけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の表面発現のプロフィルが、フローサイトメトリーによって高感度で明らかにされる。ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の表面発現を特異的に呈示することが見出される。表面の複合体発現の非常に大きいレベルがＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞において検出され、このことは、そのようなＴ細胞がＨＴＬＶ−１プロウイルスの主要な貯蔵体であることと一致している。様々な相関が、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の発現レベルと、ＨＴＬＶ−１プロウイルスＤＮＡ負荷量、ＨＴＬＶ−１のｔａｘ  ｍＲＮＡ負荷量、および、ＨＴＬＶ−１  Ｔａｘに特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度との間において分析され、明らかにされる。様々な細胞のＴ細胞サブセットにおける複合体の表面発現レベルと、疾患重篤度との相関が分析され、明らかにされる。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔリンパ球におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の表面発現レベルは疾患重篤度と相関することが見出される。
【０４２２】
結論：  本発明の抗ＡＰＭ：抗原複合体抗体は、ＨＴＬＶ−１関連疾患などの病原体関連疾患の最適な予測、診断、病期分類、モニターリングおよび予後を可能にするために使用することができ、それにより、先行技術の数々の欠点を克服している。具体的には、本発明の抗ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体抗体は、ヒトにおけるＨＡＭ／ＴＳＰの最適な予測、診断、病期分類、モニターリングおよび予後を可能にするために使用することができ、それにより、先行技術の数々の欠点を克服している。そのような抗体は、ＨＴＬＶ−１関連疾患の病理発生の最適な解明を可能にし、そのような疾患に対する治療の最適な開発を可能にし、また、現時点で開示されている技術に従ってそのような疾患を処置するための治療剤として用いることができることが理解される。
【０４２３】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０４２４】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許願及び言及されるアクセッション番号によって同定される配列は、あたかも、個々の刊行物、特許、特許願及び言及されるアクセッション番号によって同定される配列各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０４２５】
【図１】ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する組換えＦａｂファージクローンの特異的な結合を示すヒストグラムである。
【図２】図２ａ〜図２ｃは、ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する特異的な結合について選択されたＦａｂの発現および精製のウエスタン免疫ブロッティングアッセイを示す写真である。
【図３】図３ａ〜図３ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、ＨＬＡ−Ａ２：コントロールペプチド複合体に対してでなく、固定化ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体に対する可溶性の精製ＦａｂのＴ３Ｄ４、Ｔ３Ｅ３およびＴ３Ｆ２の特異的な結合をそれぞれ示すヒストグラムである。
【図４】図４ａ〜図４ｂは、単鎖ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体を結合標的として使用する力価測定ＥＬＩＳＡによって測定されたときの、Ｆａｂ  Ｔ３Ｅ３およびＦａｂ  Ｔ３Ｆ２の結合特性をそれぞれ示すデータプロットである。
【図５】図５ａ〜図５ｆは、ＡＰＣの表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図６】図６ａ〜図６ｃは、Ｆａｂ  Ｔ３Ｆ２テトラマーを使用する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図７ａ−ｃ】図７ａ〜図７ｃは、天然に存在する活性な細胞内プロセシングの後におけるＴ３Ｆ２による細胞表面呈示ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示す。
【図７ｄ】図７ｄは、天然に存在する活性な細胞内プロセシングの後におけるＴ３Ｆ２による細胞表面呈示ＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の特異的な検出を示す。
【図８】図８ａ〜図８ｂは、Ｔａｘ１１〜１９ペプチドでパルス処理された細胞の表面におけるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の数の定量を示す。
【図９】図９ａ〜図９ｆは、細胞内プロセシング後のＦａｂ  Ｔ３Ｆ２によるＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体の免疫組織化学的検出を示す光学顕微鏡写真である。
【図１０】トキシンにコンジュゲート化された抗特異的ヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体Ｆａｂからなる融合タンパク質による、特異的なヒトＭＨＣ：ウイルスペプチド複合体を呈示する標的細胞の特異的かつ効率的な殺傷を示すデータプロットである。
【配列表フリーテキスト】
【０４２６】
配列番号１及び２は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３〜１３はＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドの配列である。
配列番号４〜９７はＨＬＡ−Ａ２：Ｔａｘ１１〜１９複合体と特異的に結合するＦａｂの相補性決定領域の配列である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ−ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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