(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルス（ヒト乳頭腫ウイルス）によって引き起こされるか又はヒトパピローマウイルスに関連する癌腫又はその前段階を、人体サンプルを用いて診断する方法に関する。この方法はヒトパピローマウイルスタンパク質が発現しているかどうかを判定することを含む。そのウイルスタンパクはキャプシドタンパク質, 特に主要キャプシドタンパク質 L1である。本発明はまたこの方法を実施するための検査キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ヒト乳頭腫ウイルス: human papilloma virus）によって引き起こされるか又はヒトパピローマウイルスに関連する癌腫又はその前段階を、人体サンプルを用いて診断する方法において、ヒトパピローマウイルス (HPV)のキャプシドタンパク質が発現しているかどうかを調べることを特徴とする、上記方法。 
【請求項２】
キャプシドタンパク質がキャプシドタンパク質 L1 又はL2である、請求項1記載の方法。 
【請求項３】
癌腫が肛門性器癌である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
肛門性器癌が子宮頚癌である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
人体サンプルがスミア又はバイオプシーサンプルである、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
発現が核酸レベルで判定される、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【請求項７】
ヒトパピローマウイルスキャプシドタンパク質をコードするmRNA又はキャプシドタンパク質に特異的である別の複製因子が存在するかどうかを判定する、請求項6記載の方法。 
【請求項８】
キャプシド抗原に対する血清反応及び(又は)免疫反応があるかどうかを判定する、請求項6記載の方法。
【請求項９】
発現の判定がタンパク質レベルで行われる、請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
発現の判定が核酸レベルで及びタンパク質レベルで行われる、請求項1〜9のいずれか1つに記載の方法。 
【請求項１１】
エンベロープタンパク質の発現の判定が、キャプシドタンパク質に向けられる抗体を用いて行われる、請求項9又は10記載の方法。  
【請求項１２】
ヒトパピローマウイルスによって引き起こされるか又はヒトパピローマウイルス(HPV)が関与する癌腫又はその前段階の、人体サンプルによる検査キットにおいて、当該検査キットが、HPV キャプシドタンパク質が発現しているかどうかを調べることができる試薬を含むことを特徴とする、上記検査キット。
【請求項１３】
試薬がHPV キャプシドタンパク質に, 特にキャプシドタンパク質 L1又はL2に向かうモノクロナール抗体を含む、請求項12記載の検査キット。
【請求項１４】
抗体を固体担体上に固定する、請求項13記載の検査キット。
【請求項１５】
検査試薬として, 抗-マウス免疫グロブリンを酵素、好ましくはペルオキシダーゼと組み合わせて含む、請求項12記載の検査キット。
【請求項１６】
ELISA テストを行うのに適する、請求項12記載の検査キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ヒト乳頭腫ウイルス：human papilloma viruses）によって引き起こされるか又はヒトパピローマウイルスに関連する癌腫又はその前段階の早期診断法に関する。本発明はまた当該方法を実施するための検査キットに関する。
【０００２】
1960年代の終わりから、種々の癌腫のためのスクリーニングプログラムが、ドイツで市販されてきた。子宮頚癌の場合, このプログラムは子宮頚から採取された細胞スミアに、いわゆるパップテストと呼ばれるG. パパニコロー（パパニコロー）法にしたがう細胞形態学的検査を行うことに基づいている。 この検査の場合, 細胞検体を所定の婦人科診察の検診過程内で一定の間隔で女性から採取し、そしてガラススライドに塗沫して、染色する。このスミアを細胞の形態に基づいて分類し、そして病理変化のないスミア, 炎症性変化, 軽度の異形成, 中等度の異形成, 重症の異形成, 上皮内癌又はPap I 〜V に対応する癌種(非特許文献1参照)と呼ぶ。パップテストの結果が病理変化を示す場合, バイオプシーを採取し、組織病理学検査を行う。この検査は異形成の性質及び程度を確かめ、それを子宮頚部上皮内腫瘍(CIN I 〜III)として類別する。この30年にわたるパップテストの使用から、一様に重症の悪性変性を患うグループ内で, 異形成の重症度が増加するにつれて回復を導く寛解の見込みが減少することが分かった。
【０００３】
これまでのところ、個々の調製物において寛解又は進行挙動に関して何らの予測もできなかった。 
【０００４】
パピローマウイルスは約8000の塩基対のゲノムを有する小さい二本鎖DNAウイルスである。今のところ, ヒトに病原性である150より多くの種々のウイルス型が知られている。その上皮向性にしたがって、パピローマウイルスを皮膚と粘膜のグループ (イボ形成、皮膚新生組織形成)又は肛門性器グループ (コンジローム、肛門及び子宮頚癌)にあてはめることができる。
【０００５】
ほとんどの場合, HPVによる感染は無症候性である。それゆえに, 潜在ウイルス感染は顕微鏡的に (“臨床補助的に（subclinically）”) 又は臨床的に識別することができる組織病変を伴うウイルス性疾患と区別されなければならない。
【０００６】
パピローマウイルスのうちのいくつかの型は発癌性であって, すなわちこれらのウイルス型 (たとえばHPV 16及び18)は、上皮細胞の形質転換に決定的に寄与することができる。これらのウイルスは高危険型グループとして表わされる。これとは対照的に、全く発癌性でないか又は極めて僅かにしか発癌性でない低危険型グループのウイルス型(たとえば6 及び11) がある。
【０００７】
HPV 感染は、ヒトに最も頻繁に起こる性的な伝染性感染である。有病率のデータは著しく異なり、検査されるべき最初の相談者に依存する。最初の性的接触があった後, 感染の比率は先ず当然のことながら急激に増加する。北アメリカ及びヨーロッパの一部で, 15 〜25才の女性グループでヒトパピローマウイルスの接触伝染の度合いは50 %より大きい。検出された感染の比率は年齢の増加と共に連続的に降下する。50才後、5 %より少ない。
【０００８】
子宮頚部細胞の採取し、ついでこの細胞のパパニコロー染色を、女性が健康診断を行う時にスクリーニング法として行う。この方法によって、子宮頚癌の進行の間に生じる細胞形態(癌の前段階)の変化を早期発見することができる。この定期的に行う検査は、子宮頚癌の発生を連続的に低下させることに貢献した。にもかかわらず, ドイツで毎年、約6000人の女性が種々の原因から子宮頚癌になっている。
【０００９】
ヒトパピローマウイルスは子宮頚癌の進行で決定的な役割を果たす。 したがって, 補助診断法はウイルスによる感染を発見することに向けられる。分子生物学方法、たとえばPCR又は核酸ハイブリダリゼーションをウイルス性核酸の検出に使用した場合,これらの方法の極めて高い検出感度の故に、大多数の潜伏感染は検出される。したがってHPV 感染で常に陽性であるDNAの検出は、ウイルスの増殖段階の過程に関係しておらず、予後診断を行うことができない。感染の過程に対するウイルスタンパク合成の重要性及びこれに由来する予後診断の重要性は、今まで研究されていない。
【００１０】
次のタンパク質がウイルスライフサイクルにしたがって生成されることは知られている: 初期タンパク質(E)1, E2, E4, E5, E6 及びE7, 及び後期タンパク質(L)1 及びL2 (非特許文献2)。
【００１１】
キャプシドタンパク質 L1 は宿主細胞の細胞質中で合成され、ついでその細胞の核中に輸送される。その核中で, キャプシドタンパク質はウイルスのDNA と情報をやりとりして、成熟ウイルスを産生する。したがってキャプシドタンパク質L1の検出は、ウイルスが増殖段階を通過していると判断させることを可能にする。成熟, 感染性ウイルスは感染した細胞から放出される。ある具体的な実施態様において, この方法は特異的にパピローマウイルスのキャプシドタンパク質 L1を認識するモノクロナール抗体に基づく。適当なモノクロナール抗体は特許文献1に開示されている。スクリーニングテストは今日まで公知であるすべてのパピローマウイルスを認識し、そしてしたがってキャプシド抗原が産生されたかどうか及びHPV 感染がその増殖段階にあるかどうかを判定するのに適する。高危険型検査は、選択的にHPV risk types 16, 18, 33, 35, 39, 45, 51, 56 及び 58を識別する(たとえば非特許文献3参照)。
【００１２】
更に, L1-特異抗体は、個々のHPVタイプ, たとえばHPV 16を判定するのに使用することができる。
【特許文献１】ドイツ特許公開第43 32 596号明細書（ A1）
【非特許文献１】H.J. Soost, The Munich nomenclature, Recent Results Cancer Res. 133 [1993] pp. 105-111
【非特許文献２】H.R. McMurray, D. Nguyen, T.F. Westbrook, D.J. Mc Cance, Biology of human papilllomaviruses, in Int. J. Exp. Pathol.82 [2001] 15 - 33
【非特許文献３】M. Sapp, U. Kraus, C. Volpers, P.J.F. Snij-ders, J.M.M. Walboomers, J.E. Streeck, Analysis of type-restricted and cross-reactive epitopes on virus-like particles of human papilloma virus type 33 and in infected tissue using monoclonal antibodies to the major capsid protein, in J. Gen. Virol. 75 [1994] 3375 - 3383
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、高危険HPV DNA-陽性である、軽度〜中等度の異形成の場合, ヒトパピローマウイルスキャプシド抗原L1の産生が悪性変性の回帰に関連し、一方HPVエンベロープタンパク質の不在が疾患の進行と相互に関連するという観察結果に基づいている。それ故、本発明は悪性変性が進行するかどうかについて相対的に安全な予後診断を行うことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の対象は、ヒトパピローマウイルス（ヒト乳頭腫ウイルス: human papilloma virus）によって引き起こされるか又はヒトパピローマウイルスに関連する癌腫又はその前段階を、人体サンプルを用いて診断する方法において、ヒトパピローマウイルス (HPV)のキャプシドタンパク質が発現しているかどうか調べることを特徴とする、上記方法である。 
【００１５】
“癌腫及びその前段階”なる表現は、ヒトパピローマウイルスに関連するあらゆる種類及び起源の癌腫並びにその前段階を含む。たとえば、この癌腫は肛門性器路の癌腫, 特に子宮頚癌であることができる。 前段階, たとえば軽度〜中等度の異形成 (子宮頚部上皮内腫瘍 (CIN I - III), 等もまた特に言及される。
【００１６】
“ヒトパピローマウイルスのキャプシドタンパク質” なる表現は、すべてのHPV 型のキャプシドタンパク質, とくにウイルスの(主要) キャプシドタンパク質 L1 及び (マイナー) キャプシドタンパク質 L2を意味する。
【００１７】
“人体サンプル”なる表現は、キャプシドタンパク質を検出することができるあらゆる人体サンプルを含む。このような人体サンプルの例はスミア, バイオプシー, 臓器穿刺液, 血液, 唾液、尿、便, 脳脊髄液, リンパ液等である。子宮頚癌の検査が重要ならば、とくにスミア及びバイオプシーを意味する。
【００１８】
“キャプシド形成の判定”なる表現は、キャプシド抗原, そのmRNA, その中間体又はその前駆体の形成を判定するのに適する全ての方法を含む。この表現はキャプシドタンパク質の形成に影響を与えるか及び(又は)調節する複製因子、しかもまたキャプシド抗原に起因するはずである血清反応及び(又は) 免疫反応を明らかに意味する。
【００１９】
キャプシドタンパク質の発現は、核酸レベル 及び(又は)タンパク質レベルで判定することができる。 
【００２０】
免疫組織化学的又は免疫細胞化学的染色法, 及びまたウエスタンブロッティング, ELISA又は免疫沈降法は、たとえばタンパク質レベルでの検出に使用することができる。キャプシド抗原に向かう抗体を使用することもできる。抗体が固形担体、たとえばマイクロタイタープレート、 テストストリップ又はラテックス粒子に固定されている場合が有利である。
【００２１】
本発明の方法は、癌腫疾患の過程を早期に、すなわちその前段階で診断することができる。 
【００２２】
本発明のもう一つ対象は、癌腫又はその前段階を検出するための検査キットであって、このキットがHPV キャプシドタンパク質が発現しているかどうかを調べる試薬を含む。
【００２３】
この際キャプシドタンパク質は一般に抗原として作用する。検査キット は検査試薬として抗-マウス免疫グロブリンを酵素、好ましくはペルオキサダーゼと組み合わせて含むのが好ましい。更に、検査キットは調製物を染色するための物質、有利には色原体溶液を含み、そしてこれに加えて通常の成分、たとえば緩衝液, 担体及び(又は)マーカーを含有することができる。
【００２４】
本発明によって、癌腫を早期に診断することができる。特に, 癌腫の前段階は早期段階で調べることができ、そして疾患の過程を判定することができる。 
【００２５】
本発明の方法によって得られる結果は主観的に判断されないことも特徴である。本発明は迅速かつ容易な操作の点で優れている。それによってこの方法は大規模なスクリーニング法に、特に第三世界の国々に適する。したがって本発明はHPV-関連癌疾患の現在の診断に重要な貢献を示す。
【実施例】
【００２６】
本発明を次の例によって説明する。
【００２７】
86個の細胞スミアのグループ（これらのすべてが軽度〜中等度の異形成を示し、 そしてこれらのすべてが高危険HPV DNA-陽性である）を、 L1-特異抗体を用いてキャプシド抗原 L1 の形成について検査する。この検査を、キャプシドタンパク質 L1に向かう抗体を含むViroactiv kit（登録商標） (Virofem Diagnostik und Forschungs [diagnosis and research] GmbHから得られる)を用いて行う。調製物を煮沸し、ついで抗原の添加後に室温で30分間インキュベートする。検査試薬 (ヤギ抗-マウス免疫グロブリン) 及び色原体(AEC)溶液の連続添加によって、陽性細胞核を染色する。 
【００２８】
スミアは、試料の細胞の少なくとも１個が核の特異的赤色染色を示す場合、陽性であると判定される。 
【００２９】
この尺度で, 29個の試料は陽性であった。これは33.7 %に相当する。  寛解頻度は、キャプシド抗原が形成された25才以上の女性で77.3 % であった。一方30才以上の女性で82.4 %ほどであった。組織学的に確認された重症の異形成 又は上皮内癌に進行する可能性は、それぞれほんの22.7 % 及び17.6 %にすぎなかった。
【００３０】
57個の試料はキャプシド抗原の形成に陰性であった。これは 66.2 %に相当する。キャプシド抗原が検出されなかった25才以上の女性の場合、寛解は25 %にしか見られないが、75 %が進行を示した。一方、30才以上の女性の場合、寛解頻度は22.2 %であった。77.8 %が進行の判定を示した。
【国際調査報告】
2006521104.tif 000002
2006521104.tif 000003
2006521104.tif 000004
2006521104.tif 000005
2006521104.tif 000006
2006521104.tif 000007