(57)【要約】本発明は、自然に起こる成長ホルモン突然変異に関し；成長ホルモン機能不全について患者をスクリーニングする際の、又はそのような不規則性を処理するために適している変異体タンパク質を生産するための、成長ホルモン突然変異を検出するための方法及びその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成長ホルモンの核酸分子、ＧＨ１の単離された変異体であって、
次の置換からなることを特徴とする変異体：
＋１４９１  Ｃ→Ｇ、１４９１は１と指定される転写開始部位に対して、ヌクレオチドの位置に関連する。
【請求項２】
成長ホルモンの核酸分子、ＧＨ１の単離された変異体であって、置換Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔを含むタンパク質、すなわちＧＨタンパク質をコード化する核酸分子からなることを特徴とする変異体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載された単離された核酸分子であって、前記分子はｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡのいずれかであることを特徴とする核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２、又は３に記載された核酸分子の転写物。
【請求項５】
請求項１、２、又は３に記載された核酸分子によってコード化された単離されたポリペプチド。
【請求項６】
成長ホルモンタンパク質、ＧＨの変異体であり、置換Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔを含むことを特徴とする単離されたポリペプチド。
【請求項７】
機能不全のＧＨの疑いがある個体をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、このスクリーニング方法は次のステップを含むことを特徴とするスクリーニング方法：
（ａ）  ヒトＧＨ１遺伝子の核酸分子を含むテストサンプルを個体から得て、
（ｂ）  前記分子を配列し、
（ｃ）  ＋１４９１Ｃ→Ｇ置換について前記配列を調査し、そして、
（ｄ）  前記置換がどこに存在するかがＧＨの機能不全があることを結論づける。
【請求項８】
請求項７に記載されたスクリーニング方法において、前記配列ステップはＰＣＲ技術をともなうことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項９】
機能不全のＧＨの疑いがある個体をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、このスクリーニング方法は次のステップを含むことを特徴とするスクリーニング方法：
（ａ）  成長ホルモン、ＧＨ、ポリペプチドを含むテストサンプルを前記個体から得て、
（ｂ）  前記ポリペプチドを配列し、
（ｃ）  Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ置換について前記配列を調査し、そして、
（ｄ）  前記置換がどこに存在するかがＧＨの機能不全があることを結論づける。
【請求項１０】
請求項７、８、又は９に記載されたスクリーニング方法を行うために適したキットであって、このキットは、
（ａ）  ＧＨ１遺伝子の領域＋１４９１に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、この領域は置換＋１４９１Ｃ→Ｇを含み、そして、
（ｂ）  （ａ）で特定した領域の野生型の配列に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、そして、選択的に、
（ｃ）  患者のＤＮＡの所望の領域を増幅するために、ＰＣＲを行うために適した一以上の試薬を含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
請求項７から９のいずれか１項に記載された方法において使用に適し、及び選択的に請求項１０に記載されたキットに提供されることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ置換を含み、さらにレセプターを介した細胞信号伝達経路の特異的な活性化のために与えることを特徴とする単離された成長ホルモンポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質であって、
前記ポリペプチド又はタンパク質はＳＴＡＴ５経路を活性化するが、低下した活性化又はＭＡＰＫ経路を示すことを特徴とするポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質であって、
ＭＡＰＫ経路の活性の前記低下は、野生型ＧＨタンパク質の活性の７０％未満であることを特徴とするポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１５】
前記低下した活性は５０％未満であることを特徴とする請求項１４に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１６】
前記低下した活性は４５％未満であることを特徴とする請求項１３に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１７】
ＭＡＰキナーゼ経路を活性化する低下した能力を所有することを特徴とする単離された成長ホルモンのポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１８】
前記ＭＡＰＫ経路はＥＲＫ経路であることを特徴とする請求項１７に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質。
【請求項１９】
機能不全のＧＨの疑いがある個体をスクリーニングするためのスクリーニング方法であって、次のステップを含むことを特徴とするスクリーニング方法：
（ａ）  個々の内因性の成長ホルモンを含む前記個体からテストサンプルを得て、
（ｂ）  それがレセプターを介したＭＡＰＫ細胞信号伝達経路を活性化するか否か、及びどの程度活性化するかについて決定するために、前記成長ホルモンを調べて、そして、
（ｃ）  野生型ＧＨについて、ＭＡＰＫ細胞信号伝達の低下がどこに存在するかが、ＧＨ機能不全があると結論づける。
【請求項２０】
成長ホルモン機能不全の診断又は適切な治療の発達のための請求項１から３のいずれか１項に記載された単離された核酸分子の使用。
【請求項２１】
成長ホルモン機能不全の診断又は適切な治療の発達のために請求項１２から１８のいずれか１項に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質。
【請求項２２】
請求項１２から１８のいずれか１項に記載された単離された成長ホルモンのポリペプチド又はタンパク質に特有である抗体。
【請求項２３】
薬学的に許容できるキャリアに関連して、請求項１から３のいずれか１項に記載された核酸分子を含む薬学の構成物。
【請求項２４】
薬学的に許容できるキャリアに関連して、請求項１２から１８のいずれか１項に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質を含む薬学の構成物。
【請求項２５】
請求項１から３のいずれか１項に記載された核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載されたベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１２から１８のいずれか１項に記載された単離されたポリペプチド又はタンパク質を準備するためのプロセスであって、
（ａ）  請求項２６に記載された宿主細胞を培養し、そして、
（ｂ）  前記細胞によって生産されたポリペプチド又はタンパク質を培地から取り出すことを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２８】
請求項２７に記載された方法によって生産されたことを特徴とするポリペプチド又はタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然発生の成長ホルモン突然変異、及び、成長ホルモンの不規則性について、又はそのような不規則性を扱うために適当な生成された変異体の治療及び治療学について、患者をスクリーニングするときのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の身長が遺伝的な要因によって影響されることは、１世紀以上前に理解されていた。家族性の低身長は、その通常の劣性遺伝様式とともに、早くも１９１２年には認識されていたが、そのような家族が科学文献に適切に記録されるようになるまで、さらに４半世紀があった。劣性の遺伝的な低身長が単離された成長ホルモン（ＧＨ）の欠乏に一般に関連していたという認識は１９６６年にあっただけである。
【０００３】
ＧＨ欠乏に関連される低身長は、出生の１／４０００と１／１００００の間の発生率で生じると見積もられた。これらのケースのほとんどは散発的であり突発的であるが、５％と３０％との間では、その状態のために遺伝子の原因論と一致する感染した一等親血縁者を有する。ＧＨ欠乏の遺伝子の原因論の確認は、家族性の低身長の分子遺伝学の分析と、感染した個体の脳下垂体に発現する成長ホルモン（ＧＨ）での突然変異の障害の早い証明とから来た。家族性の低身長はまた、多くの他の遺伝子（例えば、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＲＯＰ１及びＧＨＲＨＲ）の突然変異によって生じるかもしれないし、そして、これらの状態の異なる形態を区別することは重要である。
【０００４】
成長ホルモン（ＧＨ）は、様々な効果によって骨格及び軟組織の出生後の成長を促進する多機能ホルモンである。議論はＧＨの直接的及び間接的な作用の相対的寄与率に関して残っている。一方で、ＧＨの直接的な効果はさまざまな組織及び器官に示され、そして、ＧＨレセプターはたくさんの細胞型で記録された。一方で、ＧＨの効果の主要な部分がＧＨ依存のインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−１）の作用で仲介されることを、かなりの量のデータが示す。ＩＧＦ−１は、多くの組織、主として肝臓で生産され、骨、軟骨、及び骨格筋を含む多くの組織の増殖と成熟を高めるためにそれ自体のレセプターを通して作用する。組織の成長を促進することに加え、ＧＨはまた、ナトリウムと水の保持率と同様に、催乳性の、催糖尿病性の、脂肪分解の、及びタンパク同化の効果を含むさまざまな他の生物学的な効果を働かせるために示された。
【０００５】
ＧＨの適当量が、幼年期中に正常な発育を維持するために必要である。ＧＨ欠乏を持っている新生児は、通常、標準の身長と体重がある。あるものは、年齢とともにしだいに遅れてくる低い直線状の出生以後の成長に関連して、小陰茎症又は空腹時低血糖症にかかるかもしれない。成長ホルモン単独欠損症（ＩＧＨＤ）をもつ人々では、骨格の成熟は、通常、彼らの身長の遅延と関連して遅れる。体幹の肥満、彼らの生活年齢のために予測されるより若い容貌及び遅れた第二成歯は、しばしば存在する。早期老化で見られるものと同様の皮膚変化は影響を受けた大人で見られるかもしれない。
【０００６】
家族性のＩＧＨＤは、遺伝の特徴的なモードでいくつかの異なった障害からなる。ＧＨ１遺伝子座における欠陥に関連していることが知られているＩＧＨＤの形態は、今までのところ検出されている異なったタイプの基本的な障害とともに、表１に示される。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
これらの障害の特徴化は、これらのＩＧＨＤの形態の間で、体外から投与されたＧＨに対応して、臨床的な重傷度の違い、遺伝のモード、及び抗体の構成への傾向についての説明を提供することを助けた。ほとんどの場合は散発性であり、視床下部又は脳下垂体に影響する脳水腫、染色体異常、組織球増殖症、感染症、放射、中隔の目の形成不全、トラウマ、又は腫瘍を含む脳欠陥から生じると考えられる。磁気共鳴イメージ試験は、ＩＧＨＤを持つ患者の約１２％で視床下部又は脳下垂体の異常を検出する。
【０００９】
低身長、遅れた「身長増加速度」又は発育速度、及び遅れた骨格の成熟化はＧＨ欠乏で全て見られるが、これらのいずれもこの障害について特定されない；他の全身性疾患がそのような症状をもたらすかもしれない。この明細書中では、「身長増加速度」及び発育速度はともに、１年あたりのセンチメートルで測定されるような、対象又は患者の身長の変化率を意味するものとして解釈される。
【００１０】
ＧＨ欠乏を示す刺激試験は、Ｌ−ドーパ、インスリン誘導の低血糖、アルギニン、インスリン−アルギニン、クロニジン、グルカゴン又はプロプラノロールを用いる。不十分なＧＨピークの応答（通常、＜７〜１０ｎｇ／ｍＬ）はテストによって異なる。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ及びＡＣＴＨの合併の欠乏についてのテストは、脳下垂体の機能不全の範囲を測定して、最適の処理を計画するために実行されるべきである。
【００１１】
組換え型由来のＧＨは、世界中で入手できて、皮下注射によって処方される。最適な結果を得るために、ＩＧＨＤを持つ子供は、通常、彼らの診療が確立されるとすぐに、代償療法を始める。組換え型のＧＨの初期の投与量は体重か表面積に基づくが、使用される正確な量と管理の頻度は異なる手順の間で異なるかもしれない。投与量は思春期の間、増加する体重とともに、最大値まで増加する。その後、個々のＧＨの分泌の容量が再評価されている間、ＧＨ処理は一時中止されるべきである。確認されたＧＨ欠乏を持つ人々は、成年の間、外因性のＧＨの低容量を受ける。
【００１２】
ＧＨで処理される状態は、（１）それが効能を証明したもの、（２）その使用が報告されているが、標準的な実施として受け入れられていないさまざまなものを含む。ＧＨ処理が効能を証明した障害は、単離されたＧＨ欠乏又は複合下垂体ホルモン欠乏症（ＣＰＨＤ）とターナー症候群とに関連したＧＨ欠乏のいずれかを含む。最初の２つの障害とともに、ＧＨ交換療法への個体の臨床的な応答は、以下に応じて変わる：（１）ＧＨ欠乏の重症度と成長へのその悪影響、処理が開始される年齢、出生時の体重、現在の体重、ＧＨの投与量、及び（２）甲状腺ホルモン欠乏症のような関連した欠乏症の処理への認識と応答、及び（３）処理が抗ＧＨ抗体の開発によって複雑であるか否か。ターナー症候群とともに個体についての処理の結果は、彼らの低身長の重症度、彼らの染色体対、及び処理が開始された年齢に従って異なる。
【００１３】
ＧＨの使用が報告された追加の障害は、軟骨形成不全症などのある骨格の形成不全、プラダーウィリ症候群、外因性のステロイドのために２次的に生じたり、又は関節リウマチなどの慢性炎症性の病気と関連する成長抑制、慢性腎不全、極端な突発性の低身長、ラッセルシルバー症候群、及び子宮内発育遅延の治療を含む。
【００１４】
分子遺伝子のレベルにおける家族性ＩＧＨＤの特徴化は、いくつかの理由で重要である。関連している遺伝子座の一致性は、発育遅延の適当な重症度のみならず、さらに重要には、妥当性又は今利用できるさまざまな他の治療を示す。さらに、基本的な遺伝子障害の検出は、その状態の遺伝子の原因論を確認するために役立つ。それはまた、（１）発育遅延の重症度、及び（２）ＧＨ処理に続いて抗ＧＨ抗体の構成の可能性を予測する際に、予測の値を有するかもしれない。ある場合に、病理学的な障害に関する知識はまた、障害の遺伝の異常なモードを説明するために役立つことができ、したがって、影響される家族のカウンセリングのために重要である。最後に、機能不全（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）（非機能（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）とは対照的である）のＧＨ分子を示すＩＧＨＤの状態の原因である突然変異の障害の特徴化は、ＧＨ構造及び機能に新しい洞察をもたらすはずである。
【００１５】
細胞レベルでは、二量体になることを引き起こしながら、単一のＧＨ分子が２個のＧＨレセプター分子（ＧＨＲ）に結合する。２個のＧＨ結合ＧＨＲ分子の二量化は、チロシン・キナーゼＪＡＫ２に関連する信号変換のために必要であると信じられている。細胞内チロシン・キナーゼ、ＪＡＫ２は、ＧＨＲの細胞質尾部に関連している。ＧＨ結合に続いて、２個のＪＡＫ２分子は、ＧＨＲの細胞質尾部で互いの及びチロシン残基の交差しているリン酸化反応をもたらす近い近接性に持って来られる。これらのホスホチロシンは、ＳＴＡＴ５などの細胞信号伝達の仲介物のためにドッキングポイントのように作用する。そして、リン酸化レセプター尾部に結合しているＳＴＡＴ５は、ＪＡＫ２によるそれ自身のリン酸化をもたらすＪＡＫ２への近い近接性に運び込む。リン−ＳＴＡＴ５は２量体になり、それがＧＨの観測された生物学的な効果に通じるＧＨに反応する遺伝子をトランス活性化するところで細胞核に転移する。最近まで、ＧＨの信号伝達がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によって主に仲介されると思われていた。しかしながら、今や、ＧＨはまたホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びｐ４２／４４マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化することが知られている。ＳＴＡＴ５及びＰＩ３Ｋ経路の活性化は、肝臓のＩＧＦ−１の生産を引き起こすことができるが、ＭＡＰＫ経路は、そうするように見えない。
【００１６】
ＪＡＣＫ２とＭＡＰＫの活性化は、ＳＴＡＴ５の活性化に関わるものからのＧＨＲの細胞質ドメインの異なる領域に依存する。ＳＴＡＴ５の活性化は、ＧＨ誘導ＭＡＰＫの活性化のために必要とされないＧＨＲの細胞質ドメインのＣ末端に向かって位置されるチロシン残基５３４、５６６及び６２７のＪＡＫ２仲介のリン酸化を必要とする［Ｈａｎｓｅｎ他，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１  １２６６９−１２６７３  （１９９６）］。対照的に、ＪＡＫ２とＭＡＰＫ経路の活性化は、細胞膜に隣接して位置される高プロリン（箱１）ドメインを含む４６のアミノ酸の伸長に依存する［Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｓ他，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３５  １２９２−１２９８  （１９９４）］。ＧＨＲ活性化に続くＭＡＰＫの活性化は、複数のメカニズムに関わって、複雑であるようにみえる。これらのメカニズムの１つは、ことによるとＩＲＳ−１［Ｌｉａｎｇ他，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４１  ３３２８−３３３６  （２０００）］、Ｇａｂ−１［Ｋｉｍ他，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３  ４８５６−４８６７  （２０００）］及びＥＧＦレセプター［Ｙａｍａｕｃｈｉ他，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０  ９１−９６  （１９９７）］のような複数のドッキングタンパク質に関わって、Ｓｈｃ−Ｇｒｂ２−Ｓｏｓ−Ｒａｓ経路［ＶａｎｄｅｒＫｕｕｒ他，  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０  ７５８７−７５９３  （１９９５）；  ＶａｎｄｅｒＫｕｕｒ他，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８  ４３０１−４３０７  （１９９７）］のＪＡＫ２依存活性化によって仲介される。Ｒａｌ及びホスホリパーゼＤのＳｒｃ依存活性化に対するＭＡＰＫ活性化の代わりのＪＡＫ２非依存メカニズムは最近報告された［Ｚｈｕ他，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７  ４５５９２−４５６０３  （２００２）］。Ｓｒｃ活性化単独で部分的なＭＡＰＫ活性のために十分であるが、ＧＨによる完全なＭＡＰＫ活性化は、ＪＡＫ２及びＳｒｃの両方の活性化を必要とする［Ｚｈｕ他，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７  ４５５９２−４５６０３  （２００２）］。
【００１７】
ＧＨの様々な効果は、異なった組織で異なった細胞質ドメイン又はリン酸化部位を所有するＧＨＲ分子の単独のタイプによって仲介されるかもしれないことが提案された。ＪＡＫ２によって活性化されると、これらの異なった細胞質ドメインは、異なったリン酸経路、成長効果のための一つ、及び異なった代謝の効果のためのその他に通じることができる。
【００１８】
ＧＨは、下垂体前葉のソマトトロピンの細胞によって分泌された２２ｋＤａタンパク質である。Ｘ線による結晶学的研究は、ｕｐ−ｕｐ−ｄｏｗｎ−ｄｏｗｎ流でアレンジされた２組の平行なアルファらせんのコアを包括するためにＧＨを示した。この構造は、２つの分子内ジスルフィド連鎖（Ｃｙｓ５３−Ｃｙｓ１６５とＣｙｓ１８２−Ｃｙｓ  １８９）によって安定させられる。２つの成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）分子は、ＧＨ分子で２つの構造的に異なった部位に結合し、ＧＨＲによって連続的に続行するプロセスが最初にサイト１に、次にサイト２に結合する。ＧＨへのＧＨＲの結合は、ＧＨＲ分子の二量化を可能にする。
【００１９】
部位方向の突然変異誘発が特定の残基の機能を調べることに使用されている間、ＧＨ分子のスキャン突然変異誘発性の研究は、ＧＨとそのレセプターの間の結合相互作用の事実をもたらしている。このように、ＡｒｇによるＧｌｙ１２０（ヒトのＧＨの３番目のアルファらせんにおける）の置換は、ＧＨＲが部位２に結合する損失をもたらし、これによって、ＧＨＲの二量化を妨げる。同様に、ヒトのＧＨタンパク質の残基Ｐｈｅ４４は、プロラクチンレセプターを結合するために重要である。最終的に、残基Ａｓｐ１１５、Ｇｌｙ１１９、Ａｌａ１２２及びＬｅｕ１２３は、マウスＧＨ分子の可能性を高める成長のために重要であるように示された。
【００２０】
細胞内チロシンタンパク質キナーゼＪＡＫ２との二量化したＧＨＲの相互作用は、下流のシグナル形質導入分子のチロシンリン酸化、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの刺激、及び転写の信号変換器及び活性剤（ＳＴＡＴタンパク質）の導入に通じる。このように、ＧＨは、多くの異なったシグナル経路を通る複数の遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。
【００２１】
いくつかの異なったＧＨのイソフォームがＧＨ１遺伝子の発現から発生される（ＧＨ１参照配列は図４に示される）。９％のＧＨ１転写では、エキソン２が、エキソン３への代替のアクセプター接合部位４５ｂｐに接合され、その結果、アミノ酸残基３２から４６を削除し、通常の２２ｋＤａタンパク質に代わり２０ｋＤａイソフォームを生成する。この２０ｋＤａイソフォームは、刺激的な成長と分化ができるようにみえる。代替のアクセプタースプライス部位の選定を決めることに関わる要素は、まだ特徴付けられていないが、複合的な性質であることは明らかである。エキソン３によってコード化されたコドン３２から７１の不在から生じている１７．５ｋＤａイソフォームもまた、脳下垂体の腫瘍組織で微量で検出された。エキソン３及び４、又はエキソン２、３及び４を欠くスプライシング生成物は、脳下垂体の組織で報告されたが、これらは不活性なタンパク質の生成物をコード化するようにみえる。ＧＨの２４ｋＤａグリコシル化した変異体もまた記述されている。主な２２ｋＤａイソフォームのアミノ酸配列を図５に示す。図５では、ＧＨ１遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列、及び２６のアミノ酸リーダー・ペプチドを含むタンパク質のアミノ酸配列を示す。側部の数はアミノ酸残基の数に関する。太字の側面にある垂直の矢印はエキソン境界を指定する。終始コドンはアスタリスクでマークされる。
【００２２】
脳下垂体の成長ホルモン（ＧＨ１）をコード化する遺伝子は、５つの関連する遺伝子（図１）のクラスタ内で染色体１７ｑ２３に位置する。この６６．５ｋｂクラスタは現在、そのまま配列された［Ｃｈｅｎ他．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４  ４７９−４９７  （１９８９）、図４参照］。成長ホルモン遺伝子のクラスタに存在している他の遺伝子座は、２つの絨毛膜の体乳腺発育ホルモン遺伝子（ＣＳＨ１及びＣＳＨ２）、絨毛膜の体乳腺発育ホルモン偽遺伝子（ＣＳＨＰ１）及び成長ホルモン遺伝子（ＧＨ２）である。これらの遺伝子は、長さ６から１３の遺伝子間領域によって切り離され、同じ転写の方向にあり、胎盤的に発現され、下流の組織特有のエンハンサのコントロール下にある。ＧＨ２の遺伝子座は、１３のアミノ酸残基でＧＨ１誘導成長ホルモンと異なっているタンパク質をコード化する。全ての５つの遺伝子は、ＧＨ１の場合で長さ２６０ｂｐ、２０９ｂｐ、９２ｂｐ及び２５３ｂｐの短いイントロンによって同じ位置で中断した５つのエキソンととても似ている構造を共有する。
【００２３】
ＧＨ１の遺伝子のエキソン１は、６０ｂｐの５’の非翻訳配列（代替の転写開始部位は−５４に存在しているが）、コドン−２６から−２４及び２６のアミノ酸リーダー配列の始まりに対応しているコドン−２３の最初のヌクレオチドを含む。エキソン２は、リーダー・ペプチドの残りと成熟したＧＨの最初の３１のアミノ酸をコード化する。エキソン３〜５は、アミノ酸３２〜７１、７２〜１２６及び１２７〜１９１をそれぞれコード化する。エキソン５はまた、ポリアデニル化部位で終わる１１２ｂｐ３’非翻訳の配列をコード化する。Ａｌｕ反復配列要素は、ＧＨ１のポリアデニル化部位への現在の１００ｂｐ３’である。５つの関連した遺伝子は、それらの５’の隣接領域及びコード領域中で非常に相同であるが、それらは自己の３’隣接領域で分岐する。
【００２４】
多くの調査がＧＨ１遺伝子についてなされ、同じものの結果として５つの非翻訳領域のヒトＧＨ１遺伝子プロモーター／５’の知られた多型は特定され、我々の同時継続特許出願ＷＯ０３／０４２２４５に詳細にわたっている。さらに、他の調査は、ＧＨ１遺伝子における全体的な削除、ＧＨ１遺伝子におけるマイクロ的な削除及び単一の塩基対置換を記録した。ＧＨ１遺伝子の全てこれらの変異体は、我々の同時継続特許出願ＷＯ０３／０４２２４５に記録され、したがって、熟練した読者は、存在するＧＨ１変異体の性質に関して基礎的な情報のために、この特許明細書を参照される。
【００２５】
これまで説明された家族性のＧＨ欠乏に関するほとんどのケースは常染色体劣性形質として遺伝されるため、遺伝した欠乏の状態のいくつかの例が、小家族サイズのため認識されてこなかったようである。同様に、ＧＨ１遺伝子のデノボ突然変異体から生じるＧＨ欠乏の場合は散発性として分類することができ、障害のための遺伝的な説明は、検討されることも探し出されることもないだろう。最終的に、欠乏状態を定義するために使用される評価基準に依存すると、ＧＨ欠乏の表現型及び遺伝子型の両方ともの十分な幅は決して臨床的な注意にならないだろう。これらの理由のため、ＧＨ欠乏の有病率の現在の見積もりは、不正確であるかもしれなく、したがって、母集団における本当の有病率をかなり過小評価するかもしれない。
【００２６】
したがって、我々はＧＨ１遺伝子をさらに調査した。我々の調査の結果、我々は、ＧＨの診断と治療に影響がある新しく重要な変異体を特定した。我々の新しい変異体の特定は、ラジオイミュノアッセイベースのＧＨ“機能テスト”への我々の現在の依存度のため、ＧＨ欠乏が診断された状態でいると示すと、我々は考える。さらに、本当の機能的な診断試験の開発の緊急の必要性をそれは示す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
したがって、本発明は、次の置換を含む成長ホルモン核酸分子、ＧＨ１の単離された変異体を提供する：＋１４９１Ｃ→Ｇ、ここで１４９１は１を指定される転写開始部位に対して、ヌクレオチドの位置に関する。
【００２８】
本発明のさらなる構成によれば、置換Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔを有するタンパク質、例えばＧＨタンパク質をコード化する核酸分子を含む成長ホルモン核酸分子、ＧＨ１の単離された変異体を提供する。
【００２９】
特に、本発明は、上述のように定義される核酸配列を提供し、ここで、この配列はｃＤＮＡ又はｍＲＮＡのようなＤＮＡ又はＲＮＡ配列である。
【００３０】
したがって、本発明はまた、前述のＧＨ１の変異体によってコード化されるアミノ酸配列を含むタンパク質（以下“ＧＨ変異体”と称する）のような変異体ＧＨ１の転写物を提供する。
【００３１】
したがって、本発明のさらなる構成によれば、成長ホルモンタンパク質、ＧＨの変異体であり、置換Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔを有する単離されたポリペプチドを提供する。
【００３２】
予想外に、我々の研究は、レセプター仲介の細胞信号伝達経路を独特で特異的に活性化する変異体ＧＨを特定したことを示した。作用薬が前例のないやり方で作用するだけでなく、成長ホルモン欠乏の検出及び処置に関して極めて重要でもある。成長ホルモン欠乏を特定する試験は、とりわけ、循環する（又は内因性の）成長ホルモンが二以上のレセプター仲介の細胞信号伝達経路を活性化する能力に焦点を当てる。この詳細の我々の調査は、循環する成長ホルモンの十分な効能、及びそれに対応して任意の成長ホルモン欠乏の性質又は同定を明らかにする。
【００３３】
上述の変異体の同定、又はレセプター仲介の細胞信号伝達経路の特異的な活性化に焦点を当てない成長ホルモン欠乏の調査は、循環する成長ホルモンの活性の潜在的な欠乏、したがって成長ホルモン欠乏を特定することができないだろう。
【００３４】
したがって、本発明は、機能不全のＧＨの疑いがある個体をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供し、このスクリーニング方法は次のステップを含む：
（ａ）  ヒトＧＨ１遺伝子の核酸分子を含むテストサンプルを個体から得て、
（ｂ）  前記分子を配列し、
（ｃ）  ＋１４９１Ｃ→Ｇ置換について前記配列を調査し、そして、
（ｄ）  前記置換がどこに存在するがＧＨの機能不全があることを結論づける。好ましくは、テストサンプルはゲノムＤＮＡを含み、このゲノムＤＮＡは従来の方法によって抽出されることができる。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法では、シークエンシングステップが従来の方法、例えばＧＨ１遺伝子の適切な領域をシークエンシングするＰＣＲによって実行されてもよい。
【００３６】
したがって、また、本発明は、機能不全のＧＨの疑いがある個体をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供し、このスクリーニング方法は次のステップを含む：
（ａ）  成長ホルモン、ＧＨ、ポリペプチドを含むテストサンプルを前記個体から得て、
（ｂ）  前記ポリペプチドを配列し、
（ｃ）  Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ置換について前記配列を調査し、そして、
（ｄ）  前記置換がどこに存在するかがＧＨの機能不全があることを結論づける。
【００３７】
上述のスクリーニング方法は、診療所で行われる単一の血液検査をともない、機能的なＧＨ欠乏の早期診断に備える。この早期診断は、ＧＨ処置を早期に開始することができ、そして、ＧＨの機能不全のいかなる有害な影響を低下させることができる。
【００３８】
したがって、本発明はさらに、本発明のスクリーニング方法を行うときの使用に適したキットを提供し、このキットは：
（ａ）  ＧＨ１遺伝子の領域＋１４９１に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであり、この領域は置換＋１４９１Ｃ→Ｇを含み、そして、
（ｂ）  （ａ）で特定した領域の野生型の配列に対応する核酸配列を有するオリゴヌクレオチド、そして、選択的に、
（ｃ）  患者のＤＮＡの所望の領域を増幅するために、ＰＣＲを行うために適した一以上の試薬を含む。
【００３９】
このような試薬は、例えば、ヌクレオチド＋１４９１を含むＧＨ１遺伝子のエキソンに対応するＰＣＲプライマー、及び／又は、ここで定義されるプライマー；及び／又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼのようなＰＣＲで使用するための他の試薬を含む。
【００４０】
好ましくは、キットでのプライマー又はオリゴヌクレオチドは、変異体配列での２０塩基対と野生型での２０のように、２５塩基対の範囲で含む。いずれのケースでも、オリゴヌクレオチドは、ゲノムの他の場所に選択された領域及び繰り返されない領域に特有であるように選択されなければならない。
【００４１】
ナノテクノロジーで最初に開発された信号増幅方法（例えばＱ−Ｄｏｔｓなど）のような、他のヌクレオチドの検出方法を使用することができた。また、単一分子検出方法を使用することができた（例えばＳＴＭなど）。このケースでは、この発明に係るキットは、このような代わりの方法での使用のための一以上の試薬を含むこともできる。
【００４２】
代わりに、この発明に係るスクリーニング方法及び対応するキットは、タンパク質／アミノ酸配列、例えばＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体に特有の抗体のような、ＧＨ１の変異体又はＧＨ変異体の存在を指示し、又は相互に関連づける一以上のいわゆる“代理マーカー”に基づくこともできる。このような“代理マーカー”は：
（ａ）  所定の生体分子（これに限定されないが、ヌクレオチド、タンパク質、糖、及び脂質を含む）、
（ｂ）  化合物（これに限定されないが、薬、その代謝産物、及び他の化合物）、及び／又は、
（ｃ）  物理特性を含み、
個体でのこれらの欠乏、存在、又は過多は測定可能であり、本発明に係るＧＨ変異体又はＧＨ１の変異体の存在と相互に関連づけられる。
【００４３】
この発明に係るさらに、適した、代わりのスクリーニング方法は、従来のタンパク質配列方法（質量分析、マイクロアレイ分析、ピロシークエンシングなど）、及び／又は検出の抗体ベース方法（例えばＥＬＩＳＡ）によって特定可能であるＧＨ変異体（例えば、ｈＧＨのＩｌｅ１７９Ｍｅｔを含むタンパク質／ペプチド配列）を含むテストサンプルを得ること、及び一以上のそのようなタンパク質シークエンシング方法を実行することをさらに含むこともできる。
【００４４】
この代わりのケースでは、この発明に係るキットは、このような代わりの方法で使用するための一以上の試薬を含むこともできる。
【００４５】
本発明のさらに別の構成によれば、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ置換を含み、レセプター仲介の細胞信号伝達経路の特異的な活性化のために与える単離された成長ホルモンペプチド又はタンパク質を提供する。
【００４６】
本発明のより好ましい実施の形態では、前記単離されたポリペプチド又はタンパク質変異体は、ＳＴＡＴ５経路を活性化するが、ＭＡＰＫ経路の低下した活性化を示す。
【００４７】
本発明のさらに別のより好ましい実施の形態では、ＭＡＰＫ経路の活性での前述の低下は、野生型ＧＨタンパク質の活性に対して、７０％より低く、さらにより好ましくは５０％より低く、さらに主として４５％以下である。
【００４８】
本発明のさらに別の構成によれば、らせん４のＣ末端部でのアミノ酸置換を持つことで特徴付けられる単離された成長ホルモンタンパク質を提供する。さらに好ましくは、置換はＧＨＲ残基Ｔｒｐ１６９又はＴｒｐ１０４についての結合部位で又はその隣接部で起こる。
【００４９】
本発明のさらなる構成によれば、ＭＡＰＫ経路を活性化する低下した能力を所有することで特徴付けられる単離された成長ホルモンポリペプチド又はタンパク質を提供する。
【００５０】
本発明のより好ましい実施の形態では、前述のＭＡＰＫ経路はＥＲＫ経路である。
【００５１】
本発明のさらなる構成によれば、機能不全のＧＨの疑いがある個体をスクリーニングするためのスクリーニング方法を提供し、このスクリーニング方法は次のステップを含む：
（ａ）  テストサンプルを前述の個体から得て、このサンプルは個々の内因性の成長ホルモンを含み、
（ｂ）  それがレセプターを介したＭＡＰＫ細胞信号伝達経路を活性化するか否か、及びどの程度活性化するかについて決定するために、前述の成長ホルモンを調べて、そして、
（ｃ）  野生型ＧＨについて、ＭＡＰＫ細胞信号伝達の低下がどこに存在するかが、ＧＨの機能不全があることを結論づける。
【００５２】
本発明のさらなる構成によれば、成長ホルモンの機能不全の診断又は適切なＧＨ治療の発達のための前述したようなＧＨ１（核酸）変異体又はＧＨ（ポリペプチド／タンパク質）の変異体の使用を提供する。
【００５３】
本発明のさらに別の構成によれば、本発明の単離された成長ホルモンポリペプチド又はタンパク質に特有の抗体を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、そのために薬学的に受け入れ可能なキャリアと関連して、この発明のＧＨ１又はＧＨ変異体を含む構成物を提供する。
【００５５】
さらに、本発明は：
（ａ）  本発明に係る核酸分子を含むベクター、
（ｂ）  バクテリアの宿主細胞のような、ベクター（ａ）を含む宿主細胞、そして、
（ｃ）  本発明に係るＧＨ変異体を準備するためのプロセス、このプロセスは：
（１）  宿主細胞（ｂ）を培養し、そして、
（２）  培地から、それによって生成されたＧＨ変異体を取り出し、
（ｄ）  培地にあり、上述したように定義される配列、ベクター、又は細胞によってコード化又は発現されたタンパク質又はアミノ酸配列を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は、以下の実施例を参照して説明されるだろう。
【００５７】
（実施例１−患者の選択―アンダルシア／バルセロナの研究）
異なる患者群はスペイン、アンダルシアで成立された。７４人の思春期前の子供が、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ４５のＲａｎｋｅ［（Ｓｕｐｐｌ．２）６４〜６６（１９９６）］によって定義されたように、ＦＳＳ、すなわち、家族性の低身長を示すものとして、分類に基づいて選択された。そのような患者は低身長を示す少なくとも１つの遺伝上の親族がいる。研究における全ての子供の身長の偏差値（ＳＤＳ）は、一般的な母集団の平均より下である−２ＳＤＳであった。全ての対象は、薬理学の刺激テストの後に、正常なＧＨ分泌を示した（ピークＧＨ値≧１０ｎｇ／ｍｌ）。使用された薬理試験はクロニジン（３４ケース）、プロパノロール（２５ケース）及びインシュリン（１５ケース）であった。遺伝学研究についての倫理承認は、それぞれの参加しているセンターと複数の地方の倫理委員会（Ｍｕｌｔｉ−Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）から得た。書面によるインフォームド・コンセントをそれぞれの参加している個人から得た。
【００５８】
標準偏差スコアは、身長、ボディ・マス・インデックス、父方及び母方の身長、中間の親の身長、ＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ−３のレベル、ｎｇ／ｍＬでのピークＧＨ分泌、及びＧＨＢＰ（割合として）について計算された。これらのデータは、新規なＧＨ１遺伝子障害が見つけられた２個体（Ｂ４とＢ４９）について、また、研究された個体の群について群平均として表２に示される。
【００５９】
【表２】
2006523089.tif 000003
【００６０】
（実施例２−ＧＨ１特有断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅）
３．２ｋｂのＧＨ１特有断片のＰＣＲ増幅は実施例１とコントロールに従って選ばれた患者について実行された。ゲノムＤＮＡは標準の手順によって患者のリンパ球から抽出された。
【００６１】
オリゴヌクレオチドプライマーＧＨ１Ｆ（５’  ＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＣ  ３’；  −６１５から−５９９）及びＧＨ１Ｒ（５’  ＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＧＧＧＴＧＣ  ３’；  ＋２５９８から＋２６１６）は、Ｅｘｐａｎｄ（商標）ハイファイシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いてヒトＧＨ１遺伝子を含む３．２ｋｂの単一ゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅するために、ＧＨ１特有配列に対応するようにデザインされた。
【００６２】
２つの別々の薄い壁の０．６５ｍｌのＰＣＲチューブがそれぞれの反応で使用された。最初のチューブは５００ナノグラム（ｎｇ）のそれぞれのプライマー（ＧＨ１ＦとＧＨ１Ｒ）と、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰと、２００ｎｇの患者のゲノムＤＮＡを含み、滅菌水で最終的な体積を２５μｌとなるようにした。第２のチューブは５μｌの１０×の反応バッファを含み、滅菌水で最終的な体積を２４．２５μｌとなるようにした。両方のチューブは氷上に５分間置かれた。この時間後、０．７５μｌのＥｘｐａｎｄ（商標）ポリメラーゼ混合物が第２のチューブに加えられ、含有物が混合され最初のチューブに移された。チューブは３０秒間遠心分離され、反応混合物は３０μｌの軽油（Ｓｉｇｍａ）で覆われた。次に、反応混合物は、４８０又は９７００のＰＣＲのプログラム化できるサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）セット中に９５℃で置かれた。
【００６３】
次に、反応混合物は、次の条件の下で増幅された：９５℃２分、その後に３０サイクルの９５℃３０秒、５８℃３０秒及び６８℃２分が続く。最後の２０サイクルでは、６８℃での伸長ステップはサイクルごとに５秒増加された。これに続いて６８℃７分でのさらなるインキュベーションとなり、次に、反応はさらなる分析前に４℃に冷却された。反応の各セットでブランク（負のコントロール）がまた調整された。ブランクの反応はゲノムＤＮＡを別として全ての試薬を含み、試薬が汚染されていないことを保証することに使用された。
【００６４】
ｎｅｓｔｅｄＰＣＲが実行される前に、ＰＣＲ増幅が成功したか否かを評価するために、１０分の１の体積（５μｌ）が、１．５％のアガロース・ゲルについて分析された。次に、ＰＣＲ増幅が成功したこれらのサンプルは、ｎｅｓｔｅｄＰＣＲのために使用する前に、１００における１に希釈された。
【００６５】
さらに、我々の研究では、反対の方向におけるシークエンシングのために使用される付加的なプライマーはＧＨＢＦＲ（５’  ＴＧＧＧＴＧＣＣＣＴＣＴＧＧＣＣ  ３’；  −２６２から−２７８）、ＧＨＳＥＱ１Ｒ（５’  ＡＧＡＴＴＧＧＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＧ  ３’；  ＋２１５から＋１９８）、ＧＨＳＥＱ２Ｒ（５’  ＧＧＡＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＣ  ３’；  ＋７８５から＋７６７）、ＧＨＳＥＱ３Ｒ（５’  ＴＣＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＣＡＴＴＣ  ３’；  ＋１２８１から＋１２６４）、ＧＨＳＥＱ４（５’  ＣＣＣＧＡＡＴＡＧＡＣＣＣＣＧＣ  ３’；  ＋１７４５から＋１７３０）である（＋１での転写開始部位に相対的に番号付けしている；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０３０７１）。配列変異体を含むサンプルはｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中にクローン化され、続いて、個体ごとに最低４つのクローンをシークエンスする。
【００６６】
（実施例３−ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは、全体のＧＨ１遺伝子をともにスパンする７つの重複したサブ断片を、それぞれのケースで発生させるように、実施例２で生成された断片について実行された。さらに、遺伝子座制御領域が３人の患者を除いた全てでＰＣＲ増幅（実施例５参照）された。
【００６７】
最初の３．２ｋｂのＰＣＲ生成物の７つの重複したサブ断片は、Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＣＲ増幅された。これらの反応のために使用されたオリゴヌクレオチドは、それらの配列位置とともにＧＨ１遺伝子参照配列から決定されるように、表６に掲載される。
【００６８】
希釈された長い（３．２ｋｂ）ＰＣＲ生成物の１μｌのアリコートは薄い壁の０．２ｍｌのＰＣＲチューブ中に又は９６ウェルマイクロタイタープレートの１つのウェル中に置かれた。この中に、最終的な濃度が２００μＭで、５μｌの１０×反応バッファ、５００ｎｇの適切なプライマーペア（例えば、ＧＨ１ＤＦとＧＨ１ＤＲ）、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰが加えられ、滅菌水を４９．８μｌの体積まで、続いて０．２μｌのＴａｇ  Ｇｏｌｄ  ポリメラーゼを加えた。
【００６９】
次に、チューブ又はマイクロタイタープレートは、Ｐｒｉｍｕｓ  ９６  サーマルサイクル（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に置かれ、次のようにサイクルされた：１２分９５℃に続いて３２サイクルの９５℃３０秒、５８℃３０秒及び７２℃２分。これに続いて、７２℃１０分でさらにインキュベーションがあり、次に、反応は更なる分析の前に４℃まで冷却された。
【００７０】
変性高圧液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）がＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡ断片分析システム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ．  Ｃｒｅｗ、チェーシャー州、イギリス）について実行される前に、反応が働いているかを決めるために、反応混合物の１０分の１の体積（５μｌ）は、０．８％のアガロース・ゲルについて分析された。ヘテロ二本鎖構成を高めるために、ＰＣＲ生成物が９５℃５分で、続いて５０℃４５分以上のゆるやかな再アニーリングで、変性された。生成物はＤＮＡｓｅｐのカラム上にロードされ、０．１Ｍトリエチルアミン緩衝酢酸溶液（ＴＥＡＡ  ｐＨ  ７．０）中で、０．９ｍｌ／ｍｉｎの一定の流速で、２％／ｍｉｎの直線的なアセトニトリル（ＢＤＨ  Ｍｅｒｃｋ）の変化度で溶出された。変化度の始点及び終点はＰＣＲ生成物のサイズに応じて調整された。分析は、カラム再生と均衡化に必要である時間を含めて、増幅サンプルにつき６．５〜８．５分かかった。サンプルは、ＤＨＰＬＣＭｅｌｔソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｍｅｌｔ．ｈｔｍｌ）を使用して決定される溶融温度（ＴＭ）で分析され、表３に掲載された。溶出したＤＮＡ断片はＵＶ−Ｃ検出器（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ．）によって検出された。
【００７１】
【表３】
2006523089.tif 000004
【００７２】
上述の実施例１Ａに従って選択された患者から得られたサンプルに関して、次の手順（実施例４と５）が実行された。
【００７３】
（実施例４−ＧＨ１特有長さのＰＣＲ断片のＤＮＡシークエンシング）
ＧＨ１特有長さのＰＣＲ断片を含むクローンは、Ｐｒｉｍｕｓ９６（ＭＷＧ）又は９７００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ＰＣＲサーマルサイクルでの０．２ｍｌのチューブ又は９６ウェルマイクロタイタープレートでＢｉｇＤｙｅ（ＲＴＭ）シークエンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって配列された。シークエンシングのために使用されたオリゴヌクレオチドプライマーは次のものである：
ＧＨ１Ｓ１  （５’  ＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣ  ３’：  −５５６から−５３７）；
ＧＨ３ＤＦ  （５’  ＣＡＴＧＴＡＡＧＣＣＡＡＧＴＡＴＴＴＧＧＣＣ  ３’：  ＋１８９から＋２１０）；
ＧＨ４ＤＦ  （５’  ＧＡＣＴＴＴＣＣＣＣＣＧＣＴＧＴＡＡＡＴＡＡＧ  ３’：  ＋５４１から＋５６０）：及び
ＧＨ６ＤＦ  （５’  ＴＣＣＣＣＡＡＴＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡ  ３’：  ＋１０９９から＋１１２２）。
【００７４】
１μｇのクローン化されたＤＮＡは、３．２ｐｍｏｌの適当なプライマーと４μｌのＢｉｇＤｙｅシークエンシング混合物とで最終的な体積が２０μｌで配列された。次に、チューブ又はマイクロタイタープレートは、サーマルサイクラーに置かれ、次のようにサイクルされた：２分９６℃、続いて３０サイクルの９６℃３０秒、５０℃１５秒及び６０℃４分。次に、反応は、浄化の前に４℃まで冷却された。
【００７５】
浄化は、完成したシークエンシング反応へ、８０μｌの７５％のイソプロパノールを添加することによって実行された。次に、これは混合され、室温で３０分間置いた。次に、反応は、１４，０００ｒｐｍで２０分、室温で遠心分離された。次に、上清が取り除かれ、２５０μｌの７５％イソプロパノールが沈殿に加えられた。サンプルは混合され、５分、１４，０００ｒｐｍ、室温で遠心分離された。上清は取り除かれ、ペレットが７５℃で２分、乾燥された。
【００７６】
次に、サンプルは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７又は３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ＤＮＡシーケンサーで分析された。
【００７７】
（実施例５−ＧＨ１遺伝子突然変異及び多型）
潜在的に病理的な重要性の３つの突然変異はバルセロナ出身の７４人の家族性低身長の患者の配列分析で見つけられた：−３６０Ａ→Ｇ（患者Ｂ４）、＋１０２９でのＧＴＣ→ＡＴＣ（Ｖａｌ  １１０→Ｉｌｅ）（患者Ｂ５３；この変異はまた同時継続特許明細書ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ０１／２１２６に記載されている）及び＋１４９１でのＡＴＣ→ＡＴＧ（Ｉｌｅ１７９→Ｍｅｔ）（患者４９）。表４参照。
【００７８】
４つのＩｌｅ１１０の対立遺伝子がコントロールサンプルで認められたため（０．０２５の頻度）、この変異体は一般的な母集団での多様な頻度で生じる。分子モデリングは、この置換がＧＨの構造に有害な効果を生じさせるかもしれないと示した；進化的に保存されたＶａｌ１１０残基はらせん３のＮ末端に疎水性のコアの一部を形成し、そのより長い側鎖とのＩｌｅによるその置換は、立体障害の原因となると予期されるだろう。この予測と一致すると、Ｉｌｅ１１０変異体は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信号変換経路を活性化するために劇的に減少している能力（正常の４０％）に関連付けられる。したがって、Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ置換はＧＨ活性での減少に関連付けられ、また潜在的に身長に影響する可能性がある機能的な多型を表すようにみえる。この変異は、公平に正常な活性を持つプロモーターハプロタイプ２に関連付けられる。
【００７９】
Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異に関して：Ｉｌｅ１７９はらせん４の中心にｈＧＨタンパク質の表面に置かれる。ｈＧＨｂｐ／ｈＧＨ２：１複合体では、Ｉｌｅ１７９は、部位１、ＴＲＰ１０４及びＴＲＰ１６９の“ｈｏｔ−ｓｐｏｔ”の残基と直接相互作用する。したがって、メチオニン残基とのＩｌｅ１７９の置換は、部位１での正確な立体障害を妨げ、それによって信号変換に影響を及ぼし、その結果ｈＧＨの機能でかなりの変化をもたらすことがありそうである。
【００８０】
（ｃ）コントロールでのＧＨ１コード化配列変異の研究
コーカサス出身の合計８０人の健康なイギリス人のコントロールがまた、実施例２及び３の方法を使用して、ＧＨ１遺伝子のコーディング領域内で、変異体についてスクリーニングされた。単独の個体で見つけられた静的変換の５つの例が認められた［Ａｓｐ２６でのＧＡＣ→ＧＡＴ、Ｓｅｒ８５でのＴＣＧ→ＴＣＣ、Ｓｅｒ８５でのＴＣＧ→ＴＣＡ、Ｔｈｒ１２３でのＡＣＧ→ＡＣＡ及びＡｓｎ１０９でのＡＡＣ→ＡＡＴ］。Ｔｈｒ１２３多型変異体は以前に報告された（Ｃｏｕｎｔｓ他  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｇｅｎｅｔ  ２  ５５〜６０（２００１））。
【００８１】
さらに、３つのミスセンス置換が認められた［ＡＣＣ→ＡＴＣ、Ｔｈｒ２７→Ｉｌｅ；ＡＡＣ→ＧＡＣ、Ａｓｎ４７→Ａｓｐ；ＧＴＣ→ＡＴＣ、Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ、それぞれ１、１及び４つの対立遺伝子／１６０の対立遺伝子］；Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ置換のみが、我々の同時継続特許明細書ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ０１／２１２６（患者６６）に開示された患者研究で見つけられた。分子モデリングは、この置換がＧＨの構造に有害な効果を生じさせるかもしれないと示唆した；Ｖａｌ１１０はらせん３のＮ末端に疎水性のコアの部分を形成し、そのより長い側鎖とのＩｌｅによるその交換が立体障害の原因になるだろう。その結果、Ｖａｌ１１０→Ｉｌｅ置換がコントロールと患者母集団の両方にあるが、それにもかかわらず、それは身長に影響を及ぼすことができるかもしれない。他のコメントは上述の実施例５（ｂ）のように適用される。これにもかかわらず、コントロールの母集団でのミスセンス突然変異の相対的な不足が、患者コーホートで見つけられた障害の病理学的な有意性を支持して議論する。
【００８２】
（実施例６  Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の生物学の活性）
ＨＫ２９３細胞は、実物大のヒトＧＨレセプター（ＧＨＲ）でトランスフェクトされ、また高いＧＨＲ発現に基づいて選択されたもので（ＨＫ２９３Ｈｉ細胞）、ＧＨ変異体の生物学の活性を検査するために使用された［Ｒｏｓｓ他  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １１  ２６５〜７３  （１９９７）；ｖｏｎ  Ｌａｕｅ他  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １６５  ３０１〜３１１（２０００）］。細胞は２４ウェルプレート（ウェルあたり１００，０００細胞）中に２４時間、ＤＭＥＤ内で置かれた：Ｆ−１２（１：１）が１０％ＦＣＳを含む。細胞は、一晩中、脂質ベースのトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、ＳＴＡＴ５−敏感性のルシフェラーゼレポーター遺伝子構成物（Ｒｏｓｓ他、同書、ｖｏｎ  Ｌａｕｅ他、同書）及び構成的に発現されたβ―ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＨ１１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、トランスフェクション効率のために訂正するために、共同してトランスフェクトされた。次に、細胞は、ＧＨＲ二量化、ＳＴＡＴ５活性化及びルシフェラーゼ発現を許容するために、２．５×１０−７Ｍのデキサメサゾンを含んでいる無血清のＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）中で知られた標準の範囲の濃度（０．１〜１０ｎＭ）に希釈された変異体と野生型ＧＨとインキュベートされた。インキュベーションの後、細胞は溶解され、ルシフェラーゼはマイクロプレートルミノメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイシステムを使用して測定された。その結果、ルシフェラーゼ発現はＧＨＲ活性化、したがってＧＨ変異体の生物学の活性の程度の測定を提供した。実験は、４つ一組で実行され、少なくとも３回繰り返された。ルシフェラーゼアッセイデータの統計分析はその後の比較がＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの多重比較試験を使用して分散（ＡＮＯＶＡ）の分析で実行された。
【００８３】
（実施例７−哺乳類の細胞のＧＨ分泌研究）
ラット脳下垂体（ＧＣ）細胞株が、全体の野生型ＧＨ１遺伝子（プロモーターハプロタイプ１の制御下）とそれらの関連付けられたハプロタイプの制御下のミスセンス変異体のための同等の構成物におよぶ３．２ｋｂの断片を含むｐＧＥＭ−Ｔプラスミドでトランスフェクトされた。細胞は、２４ウェルプレート（ウェルあたり２００，０００細胞）の中にプレートされ、一晩中、１５％ウマ血清と２．５％ＦＣＳ（完全な培地）を含むＤＭＥＭ内で培養された。細胞は、５００ｎｇのＧＨ１プラスミドとβ―ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＨ１１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と、脂質ベースのトランスフェクション試薬Ｔｒｆ−２０（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して共同でトランスフェクトされた。トランスフェクションは、ウェルあたり１μｌのＴｆｘ−２０を含む２００μｌの無血清培地中で１時間行われ、その後、０．５ｍｌの完全な培地がそれぞれのウェルに加えられた。細胞は４８時間培養され、培地は採取され、細胞はトランスフェクションの効率の違いを補正するためにβ―ガラクトシダーゼ・アッセイについて溶解した。培地中のＧＨは、ラットＧＨとの交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示さないヒトＧＨ  ＩＲＭＡ（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いていて変異体について定量化された。実験が行われ、データが生物活性アッセイについて説明されているように分析された。
【００８４】
（実施例８―ミスセンス変異体の機能的な特徴）
成熟したタンパク質中のミスセンス突然変異は、ヒトＧＨのエックス線結晶構造の適当なアミノ酸基の単一の交換によってモデル化された。
【００８５】
「分子モデリング」
Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体は、ヒトＧＨのエックス線結晶構造での適切なアミノ酸基の検査によって構造的に分析された（ＰＤＢ：３ＨＨＲ）［１９］。野生型と突然変異体のＧＨ構造は、静電相互作用、水素結合、疎水性相互作用及び表面露出に関して比較された。分子のグラフィックスは、ＩＣＭ分子モデル化ソフトウェア一式（Ｍｏｌｓｏｆｔ  ＬＬＣ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて実行された（図６）。
【００８６】
（実施例９−ＧＨ変異体のタンパク質分解的な消化）
トリプシン、キモトリプシン、またはプロテアーゼＫ（全てＳｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）は、野生型ＧＨまたはＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体（６０ｎＭ）のいずれか一方を発現している昆虫細胞から採取された最終的な濃度が０．１μｇ／ｍｌから１００μｌの培地に加えられ、その後、３７℃、１時間でインキュベートされた。野生型ＧＨについての以前の用量依存性の研究は、０．１μｇ／ｍｌは３つの酵素全てによって分解が開始される濃度であると示した。１時間の処理期間の後に、１０μｌのトリプシンーキモトリプシン抑制剤（５００μｇ／ｍｌ）がプロテイナーゼＫの消化を停止するために加えられた。そして、それぞれの反応は、さらに１５分、３７℃でインキュベートされた。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって１２％ゲルについてミニゲル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて分析された。１時間、３７℃でインキュベートされた消化されていない野生型ＧＨ及びＩｌｅ１７９Ｍｅｔの相当の量がまた、ゲルに続いた。ゲルは、以前の記載［Ｌｅｗｉｓ他  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｒｏｃｉｎｏｌ  １４  ３６１〜３６７  （２００２）］のようにＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロッティングされ、マウスモノクローナル抗ヒトＧＨ抗体（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）と調査され、１：５００に希釈され、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ共役（１：５０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出され、そして、機能強化された化学ルミネセンス（ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって視覚化された。フィルムはＡｌｐｈａ  Ｉｍａｇｅｒ  １２００  ディジタルイメージングシステム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及び、消化されていないＧＨのパーセンテージとして酵素消化に続いて残っているＧＨの量として表された結果を用いて分析された。実験は３回繰り返され、両側ｔ検定によって統計的に評価された。
【００８７】
（実施例１０−ＭＡＰキナーゼ経路の活性化）
Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体が野生型ＧＨと同じ程度へのＭＡＰキナーゼ信号変換経路を活性化する能力は、野生型ＧＨとＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体で３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ前脂肪細胞を刺激することによって調査された。細胞（２５０，０００）は、１０ｃｍの培養皿にプレートされ、実験前に３日間、１０％の子牛血清を含んでいるＤＭＥＭ中で培養された。プレートは、ＰＢＳと洗浄され、細胞は無血清ＤＭＥＭ中で２回の連続した２時間のウォッシュアウト期間でインキュベートした。ＧＨは２回目のウォッシュアウト期間の終わりで無血清ＤＭＥＭ中に直接的にスパイクされ、細胞は適当な時間でインキュベートした。この期間の後、培地は取り除かれ、細胞は、１ｍＭのオルソバナジン酸ナトリウムを含む氷冷したＰＢＳと洗浄され、１ｍＭのオルソバナジン酸塩と１ｍＭのＰＭＳＦを含む０．５ｍｌのＬａｅｍｍｌｉ  バッファ中に溶解され、前述したように１０％のゲルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。ゲルは、ＰＶＤＦ膜上にブロットされ、残基Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にリン酸化されるｐ４２／ｐ４４のＭＡＰキナーゼ、及び残基Ｔｙｒ６９４／Ｔｙｒ６９９（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にリン酸化されるＳＴＡＴ５の活性化した（リン酸化した）形態を検出する抗体を用いて調査された。ブロットは処理され、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて視覚化され、イメージは上述のように分析した。レーン間の等しいタンパク質のローディングを確実にするために、ブロットが剥ぎ取られ、適宜、総ＭＡＰＫまたはＳＴＡＴ５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を認識する抗体で再調査された。リン特有の及び総ＳＴＡＴ５抗体がＳＴＡＴ５ａ及び５ｂと等しく交差反応した。第２の抗体は、使用される第１の抗体に応じて（１：５０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗マウス又は抗ラビットのいずれか一方のＩｇＧ−ＨＲＰ接合であった。フィルムは上述のようにデンシトメトリーをイメージ化することで分析された。リン−ＭＡＰとリン−ＳＴＡＴ５についての結果は、同じサンプルで、総ＭＡＰ又はＳＴＡＴ５に関して正規化された。
【００８８】
初期の研究はまた、我々の実験モデルで野生型ＧＨによるＭＡＰＫとＳＴＡＴ５活性化の経時変化を決めるために実行された。ＧＨによるＳＴＡＴ５活性化は速く、それに従って徐々に下降して５〜１０分でピークであり、一方で、ＭＡＰＫ活性化はさらにより速い下降で１０分でピークとなり、６０分で活性化の基礎レベルに復帰した（図７）。したがって、１０分のＧＨ処理時間は、これは最大ＭＡＰＫ活性化の時間であり、最大ＳＴＡＴ５活性化のプラトー期間にあるため、その後の研究で使用するために選択された。細胞は野生型と変異体ＧＨ（０．５〜２．０ｎＭ）の濃度の範囲で、１０分間で処理され、ＭＡＰＫとＳＴＡＴ５の活性化が分析された（図８）。
【００８９】
（実施例１１−Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の機能的な特徴）
疎水性の残基Ｉｌｅ１７９の進化的な保護は、１９の脊椎動物からのオーソロガスＧＨタンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷ複数配列調整によって調査された［Ｋｒａｗｃｚａｋ他  Ｇｅｎｅ  ２３７  １４３〜１５１  （１９９９）］。
【００９０】
（実施例１２−レセプター結合研究）
レセプター結合研究は、実物大のヒトＧＨＲとトランスフェクトされたＨＫ２９３ｈｉ細胞を用いて実行され、高められたＧＨＲ発現（ＨＫ２９３ｈｉ細胞）の基礎について選択された［Ｒｏｓｓ他  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １１  ２６５〜２７３  （１９９７）；ｖｏｎ  Ｌａｕｅ他  Ｊ．Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ  １６５  ３０１〜３１１  （２０００）］。２μｇのＧＨ（ヒト脳下垂体ヨウ素化グレード，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）は、クロラミンＴ（０．７ｍＭ）を４５秒で用いて、３７ＭＢｑ  ヨウ素―１２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｂｕｃｋｓ，  ＵＫ）と、８７ＭＢｑ／ｎｍｏｌｅの特定の活性にラベル付けされ、そして、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１０カラムを用いて浄化された。細胞は、１２のウェルプレート中にプレートされ（ウェルあたり３００，０００）、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）中で一晩中培養された。培地は無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２中で１回洗浄され、無血清培地で３時間、３７℃でプレインキュベートされ、そして、１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で２回洗浄され、ラベル付けされたＧＨ（２００，０００ｃｐｍ／ｗｅｌｌ）と１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ中で、Ｉｌｅ１７９ＭｅｔＧＨの各野生型の量を変えながら、さらに３時間、室温でインキュベートされた。インキュベーション期間の最後に、細胞はＰＢＳ−ＢＳＡで２回洗浄され、１ＭのＮａＯＨ中で、結合した１２５Ｉ−ＧＨの定量化のために可溶化された。実験（ｎ＝４）は複製のウェル中で実行され、Ｋｄ値はデータのスキャッチャード分析によって計算された。
【００９１】
（結果）
「Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の機能的特徴」
疎水性の残基Ｉｌｅ１７９の進化的な保護は、１９の脊椎動物からのオーソロガスＧＨタンパク質のＣｌｕｓｔａｌＷの複数配列調整によって調査された［Ｋｒａｗｃｚａｋ他  Ｇｅｎｅ  ２３７  １４３〜１５１  （１９９９）］。この残基はタートル以外のすべての脊椎動物中の疎水性のバリンであり、ヒトの家系におけるＩｌｅによる置換が保護されていると示している。ヒトＧＨクラスタのパラロガス遺伝子との比較は、Ｉｌｅ１７９に類似の残基がＣＳＨ１、ＣＳＨ２及びＣＳＨ偽遺伝子（ＣＳＨＰ１）におけるＭｅｔであることを明らかにした。これは、遺伝子変換によってテンプレートされた保護されたＩｌｅ１７９Ｍｅｔ置換と一致する。
【００９２】
そして、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ置換は、ヒトＧＨのエックス線結晶構造での残基の交換によってモデル化された。Ｉｌｅ１７９は、らせん４のＣ−末端部分にあり、これは部位１結合にかかわり、ここで部分的に露光され、“ｈｏｔｓｐｏｔ”ＧＨＲ残基Ｔｒｐ１６９の側鎖と疎水性相互作用を許容する。ＧＨＲとのさらなる相互作用は、Ｉｌｅ１７９の側差及びバックボーン原子と、ＧＨＲ残基Ｌｙｓ１６７及びＧｌｙ１６８のバックボーン原子との間で起こる。Ｉｌｅ１７９側鎖のメチオニンの側鎖との交換は、Ｔｒｐ１６９残基の側鎖との不利なファンデルワールス（例えば立体構造）相互作用を導入し、これらの疎水性の相互作用が置換のうえに保護されるかもしれないと示す。レセプター結合研究は、ＧＨＲのために野生型ＧＨとＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体との親和性を決めるために実行された。メチオニン残基の導入は、レセプター結合を変更しなかった（図９）；野生型とＩｌｅ１７９ＭｅｔＧＨ分子のＫｄ値は、それぞれ１．９９ｎＭと２．０４ｎＭであるとわかった。これは、何か違いが野生型と変異体ＧＨの結合特徴の間に存在するならば、それらは微妙であり、静止系で計測されるようにＫｂを変えないことを示す。アラニンスキャン突然変異誘発は、以前に、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔがレセプター親和性を決定する残基のパッチに起因すると特定された；非保護のアラニン置換は、ＧＨＲ結合（０．３４から０．９２ｎＭへのＫｄ増加）でのマークされた下降の結果になった［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  と  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４  １０８１〜１０８４  （１９８９）］。Ｉｌｅ１７９がレセプター結合の親和性に起因する事実からみて、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体はＧＨＲレセプター結合に微妙な効果を生み出すだろう。
【００９３】
したがって、我々は、Ｉｌｅ１７９ＭｅｔＧＨ変異体とＧＨＲとの間の混乱した相互作用がＳＴＡＴ５とＭＡＰＫ経路の減少した活性化につながることができるかについて調査した。ＳＴＡＴ５活性化は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて非直接的に研究され、ウェスタンブロッティングによって活性化されたリン−ＳＴＡＴ５のレベルを決めることで直接的に研究された。ＭＡＰＫ活性化はウェスタンブロッティングによる活性化されたリン−ＭＡＰＫのレベルを決定することで直接的に研究された。
【００９４】
Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体は、昆虫細胞中に発現され、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイシステム（１１、１２）はその信号変換活性を分析するために使用された。ＧＨが生物学的に活性であるために、それは２つのＧＨＲ分子に結合しなければならず、それによってレセプター２量化を引き起こす。ＧＨＲ２量化は、順番にリン酸化反応によって転写因子ＳＴＡＴ５を活性化する細胞内のチロシン・キナーゼＪＡＫ２を活性化する。リン酸化されたＳＴＡＴ５は２量化し、細胞核に転写し、そして、ＳＴＡＴ５敏感性のプロモーターに結合し、それによって、ＧＨ敏感性の遺伝子の発現に切り替わる。ここで使用されたＧＨ生物活性のアッセイは、この経路のすべてのステージが機能的であることを必要とする。Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体は、１ｎＭ（このアッセイシステムにおけるＧＨのためのおおよそのＥＤ５０値）の濃度での野生型ＧＨと比べる場合では、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ信号変換経路（図１０）を活性化する正常な（９９±４％野生型）能力を現すことがわかった。この変異体は、静的なｉｎ  ｖｉｔｒｏのシステムにおけるその有害な影響を表すことが単純にできなかったが、可能性はまた、ＪＡＫ／ＳＴＡＴの他に、信号変換経路に有害な効果を生み出したかもしれないと考えられた。代わりに、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ置換は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧＨ折り畳み、分泌又は安定性を妥協するか、又は、まだ未定義であるＧＨ軸での悪影響を及ぼすかもしれない。
【００９５】
ＭＡＰＫとＳＴＡＴ５のリン酸化された（活性化された）形態に特有の抗体を使用しているウェスタンブロッティング法実験は、ＭＡＰキナーゼ及びＳＴＡＴ５経路を活性化するＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の能力を評価するために引き受けられた。Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体は研究された濃度範囲中でＭＡＰＫを活性化する減少した能力を示したが、ＳＴＡＴ５活性化中に違いはなかった（新しい図８）。ＧＨの単一の最大限度の投与量（２０ｎＭ）を用いている複数の実験からのデータの分析は、野生型によって提供されるレベルのたった４５％に、ＭＡＰＫを活性化するかなり減少した能力を持つと示した（野生型ＧＨによって提供される活性化の９．７６±２．５２回の基礎レベルに比較して、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体のための活性化の４．３５±０．６６回の基礎レベル；平均±ＳＥＭ、ｎ＝５の別々の実験、ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ−検定、図８）。これは、２０ｎＭの濃度での野生型ＧＨとしての同じレベルにＳＴＡＴ５を活性化する変異体の能力と対比した（野生型での３６．５０回の基礎レベル対Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体での３８．６２回）。ウェスターンブロッティングデータは、野生型ＧＨとＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体両方のために活性の同じようなレベルを示すＳＴＡＴ５敏感性のルシフェラーゼレポーター遺伝子からの結果を確認した。対照的に、ＭＡＰＫの活性化は野生型ＧＨによって引き出された半分のレベルだけで起こった。
【００９６】
さらにこれらの可能性を調査するために、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の分泌がラット脳下垂体ＧＣ細胞において研究された。野生型ＧＨ１遺伝子は、ＧＨ１プロモーターハプロタイプ１のコントロールのもとで、ＧＣ細胞中にトランスフェクトされ、４８時間の期間にわたって６４ｐＭの濃度で、ヒトＧＨ（ヒトＧＨ特有抗体を用いてＥＬＩＳＡによって計測された）の分泌に敏感であるようにみられた。そして、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の分泌レベル（また患者Ｂ４９のｉｎ  ｃｉｓで関連されるＧＨ１プロモーターハプロタイプ１のコントロールのもとで）は、以前記載されたように分析され、計測されたＧＨ分泌レベルは、野生型のパーセンテージとして表現された。分泌が野生型値の９７±４％であるとわかったため、この突然変異はＧＨ分泌について影響をほとんど又はまったく与えそうにないと推論されるだろう。
【００９７】
最終的に、Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体はまた、野生型ＧＨよりもタンパク質分解的切断により感受性があるかを決定するために、トリプシン、キモトリプシン及びプロテイナーゼＫとともにチャレンジされた。しかしながら、ＧＨの２つの形態の間にタンパク質の折り畳みに重要な違いはないということを野生型ＧＨが示したように、１７９Ｍｅｔ変異体は、タンパク質分解的切断に対し同様の耐性を証明した。これは、我々が以前に特定したＧＨ変異体［Ｍｉｌｌａｒ他  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２１  ４２４〜４４０  （２００３）］の約６７％は、野生型ＧＨに比べて、タンパク質分解に対し増加した感受性を示したという状況の中で考えられるべきである。誤った折り畳み（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）の不在と一致して、ラット脳下垂体細胞からのＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体の分泌のレベルは、野生型ＧＨのそれから区別がつかなかった。
【００９８】
我々の知識では、レセプター作用薬による細胞信号伝達経路の特異的な活性化は、全く前例がない。Ｉｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体と対照して、我々の実験室からの研究で以前に特定されたすべてのＧＨ変異体は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路か両方を活性化する減少した分泌か減少した能力かに関連した［Ｍｉｌｌａｒ他  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２１  ４２４〜４４０  （２００３）］。したがって、我々は、Ｉｌｅ１７９ＭｅｔＧＨ変異体によるＧＨＲ活性化は正常にＳｒｃではなくＪＡＫ２、結果として完全なＳＴＡＴ５活性化を活性化するが、ＭＡＰＫの部分的な活性化のみをすることができることを信じる。
【００９９】
ＳＴＡＴ５の正常な活性を表しているが、低身長を示している子供のＭＡＰＫの活性化を減少されたＧＨ変異体の特定は、ＭＡＰＫがＧＨの作用をとりなすときに果すかもしれない役割に関するいくつかの面白い疑問を挙げる。以前の研究は、ＭＡＰＫはＩＧＦ１遺伝子発現のＧＨ導入にかかわらないと示唆した［Ｓｈｏｄａ他  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２  ３９８０〜３９８６  （２００１）；Ｆｒａｇｏ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４３  ４１１３〜４１２２  （２００２）］。しかしながら、他のＧＨ軸タンパク質をコード化する非連鎖の遺伝子座での変異体に合わせて作用している間、それでもなおこの変異体が、発端者によって表される低身長にたぶん起因したかもしれないという可能性は残っている。したがって、ＧＨの効果を促進する成長を規制する際に、今までのところ特定されているよりＭＡＰＫ経路がより大きな役割をはたすかもしれない。
【０１００】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】図１は、４つのパラロガス遺伝子、すなわち、ＣＳＨＰ１、ＣＳＨ１、ＧＨ２及びＣＳＨ２に関して、染色体１７ｑ２３上のＧＨ１遺伝子の位置を示す。
【図２】図２は、イントロン、エキソン非翻訳領域、シグナル・ペプチド、コーディング領域、及びポリＡテールを示すＧＨ１遺伝子の詳細な図である。
【図３】図３は、ＧＨ１のプロモーターとそれに関する配列多型のかなり高いレベルを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＧＨ１遺伝子の参照核酸配列構造を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＧＨ１遺伝子の参照核酸配列構造を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＧＨ１遺伝子の参照核酸配列構造を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＧＨ１遺伝子の参照核酸配列構造を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＧＨ１遺伝子の核酸コード配列と対応するポリペプチド配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＧＨ１遺伝子の核酸コード配列と対応するポリペプチド配列を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＧＨ１遺伝子の核酸コード配列と対応するポリペプチド配列を示す。
【図６】図６は、対応するレセプターと相互作用する場合の成長ホルモンタンパク質の分子モデリングの図である。図は、ＧＨ残基Ｉｌｅ１７９とＧＨＲ残基Ｔｒｐ１６９の側鎖の間の厳しい相互作用を示す。Ｉｌｅ１７９残基は空間充てんモデル（ｓｐａｃｅ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）で表される。Ｔｒｐ１６９はスティックモデル（ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌ）としてあらわされ、一方で、ＧＨＲ残基１６７〜１６９の分子表面は緑で示される。
【図７】図７は、ＥＲＫとＳＴＡＴ５の活性化の時間的経過を示す。示されたデータは、ＥＲＫ（Ａ）とＳＴＡＴ５（Ｂ）の時間依存の活性化を示す、リン特有のＥＲＫとＳＴＡＴ５抗体で調査されたウェスタン・ブロットである。ＥＲＫブロットは、ＥＲＫ１に対応する上側のよりかすかなバンドとＥＲＫ２に対応する下側の暗いバンドを示す。ブロットは、密度計測をイメージ化することで分析され、データ（総合密度値、ＩＤＶ）は、全体のＥＲＫ又はＳＴＡＴ５について正規化され、ＧＨ処理時間（Ｃ）に対してプロットされ、ＧＨ処理に続いてＥＲＫ活性化（斜線の柱）が１０分でピークになり、ＳＴＡＴ５（塗りつぶした柱）が５〜１０分でピークになることを示した。
【図８】図８は、野生型（Ｗｔ、Ａ、ｄ）とＩｌｅ１７９ＭｅｔＧＨ（Ｍｅｔ、Ｂ、Ｅ）によるＥＲＫ（Ａ〜Ｃ）とＳＴＡＴ５（Ｄ〜Ｆ）の容量依存（０．５〜２０ｎＭ）の活性化のウェスタン・ブロット分析を示す。ブロットは、密度計測をイメージ化することで分析され、データ（総合密度値、ＩＤＶ）は全体のＥＲＫとＳＴＡＴ５について正規化され、研究された全ての容量で野生型ＧＨ（塗りつぶされた柱）に比べたＧＨ変異体（斜線の柱）によるＥＲＫ（Ｃ）の減少された活性化を示し、これは変異型（斜線の柱）と野生型ＧＨ（塗りつぶされた柱）の両方による同様の活性化と対比された。
【図９】図９は、野生型（三角形）とＩｌｅ１７９Ｍｅｔ変異体ＧＨのＧＨＲ結合特性を示す。データはラベル付けされていない野生型と変異体ＧＨの０．１〜２０ｎＭの容量範囲を超えて、特有の１２５Ｉ―ラベル付けされたＧＨ結合（％Ｂ／Ｂｏ）の置換として表された。各ポイントは４つの別々の実験±ＳＥＭの平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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