(57)【要約】本開示は、血管新生に影響を及ぼすためのペプチドおよび薬学的組成物などの組成物の使用に関する。特定の方法は血管新生の促進に有用であり、別のものは血管新生の阻害に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織において血管新生を誘導する方法であって、配列番号:4に示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の有効量を組織へ導入し、これにより組織における血管新生を誘導する段階を含む方法。
【請求項２】
変種または断片が、配列番号:4と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ペプチドが配列番号:4に示されたペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
組織が、移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
移植片が、皮膚または臓器の移植片を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
導入が局所投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
局所投与が、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
導入が全身投与を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
血管新生の誘導が新血管形成の誘導を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
血管新生が望ましい対象の標的領域において血管新生を促進する方法であって、配列番号:4に示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の治療有効量を標的領域へ導入し、これにより対象の標的領域における血管新生を促進する段階を含む方法。
【請求項１１】
変種または断片が、配列番号:4と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドが配列番号:4である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
組織が、移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
移植片が、皮膚または臓器の移植片を含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
導入が局所投与を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
局所投与が、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
導入が全身投与を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
血管新生の誘導が新血管形成の誘導を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１９】
対象が、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳虚血、または創傷を有するか、または発症のリスクがある、請求項10記載の方法。
【請求項２０】
標的領域が、血流が制限された血管を含む、請求項10記載の方法。
【請求項２１】
血管新生を誘導するための薬学的組成物における使用のための、配列番号:4のペプチド、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片。
【請求項２２】
ペプチドが配列番号:4である、請求項21記載の使用。
【請求項２３】
冠動脈疾患、末梢血管疾患、または創傷を治療するための、請求項21記載の使用。
【請求項２４】
対象の組織において血管新生を誘導するためのキットであって、容器と、ある量の配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片とを備えるキット。
【請求項２５】
第二の血管新生物質を含む容器を更に備える、請求項24記載のキット。
【請求項２６】
第二の血管新生物質が、血管内皮細胞増殖因子または塩基性線維芽細胞増殖因子である、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
ペプチドを対象に投与するための使用説明書を更に備える、請求項25記載のキット。
【請求項２８】
新規血管の形成が望ましくない組織において血管新生を阻害する方法であって、有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターを組織へ導入し、これにより組織における血管新生を阻害する段階を含む方法。
【請求項２９】
インヒビターが、抗体、小分子インヒビター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
インヒビターがプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
組織が新生物または網膜を含む、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
血管新生の阻害が望ましい対象の標的領域において血管新生を阻害する方法であって、治療有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)インヒビターを標的領域へ導入し、これにより対象の標的領域における血管新生を阻害する段階を含む方法。
【請求項３３】
インヒビターが、抗体、小分子インヒビター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
インヒビターがプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
標的領域が、皮膚、腫瘍、網膜、関節、または子宮内膜組織である、請求項32記載の方法。
【請求項３６】
対象が、腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を有するか、または発症のリスクがある、請求項32記載の方法。
【請求項３７】
導入が局所投与を含む、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
局所投与が、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
導入が全身投与を含む、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
血管新生を阻害するための薬学的組成物における使用のための、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)。
【請求項４１】
腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を治療するための、請求項40記載の使用。
【請求項４２】
容器と、ある量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)とを備える、対象の組織における血管新生を阻害するためのキット。
【請求項４３】
別の抗血管新生物質を含む容器を更に備える、請求項42記載のキット。
【請求項４４】
抗血管新生物質が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のインヒビターまたは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のインヒビターである、請求項43記載のキット。
【請求項４５】
対象へペプチドを投与するための使用説明書を更に備える、請求項42記載のキット。
【請求項４６】
プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターをスクリーニングする方法であって、PAMPへの抗PAMP抗体の結合の破壊について小分子ライブラリーをスクリーニングする段階と、PAMPへの抗PAMP抗体の結合を破壊することが同定された分子を、血管新生バイオアッセイにおいて抗血管新生活性についてスクリーニングする段階とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2002年11月7日に出願された米国特許仮出願第60/425,018号の利益を請求するものであり、この出願はその全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【０００２】
分野
本開示は、血管新生に影響を及ぼすペプチドおよび薬学的組成物などの組成物の使用に関する。特定の方法は血管新生を促進するために有用であるが、他のものは特に血管新生を阻害するために有用である。
【背景技術】
【０００３】
背景
血管新生は、既存の血管から血液血管系ネットワークを発達させるプロセスであるが、これは固形腫瘍の成長に必須であり、通常の創傷治癒および成長プロセスの構成要素である。これは、アテローム発生、関節炎、乾癬、角膜の新血管形成、および糖尿病性網膜症を含む、多くの疾患および状態の病態生理にも関与している。
【０００４】
血管新生のプロセスに寄与する分子メッセンジャーが長い間探し求められている。例えば、様々な可溶性メディエーターが新血管形成の誘導に関与している。これらは、プロスタグランジン(Auerbach, 「Lymphokines」、Pick and Landy, eds., 69-88, Academic Press, New York, 1981)、ヒトウロキナーゼ(Berman et al., Invest. Opthalm. Vis. Sci., 22:191-199,1982)、銅(Raju et al., J. Natl. Cancer Inst. 69:1183-1188,1982)、および様々な「血管新生因子」(例えば、米国特許第4,916,073号参照)を含む。最も頻繁に言及される血管新生増殖因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)である。
【０００５】
血管新生因子は、創傷治癒(Rettura et al., FASEB Abstract #4309, 61st Annual Meeting, Chicago, 1977)および悪性疾患の発症(Klagsburn et al., Cancer Res., 36:110-114,1976；および、Brem et al., Science, 195:880-881,1977)において重要な役割を果たすことから、新規血管形成物質および抗血管新生物質を同定することは有用であろう。
【発明の開示】
【０００６】
開示の概要
本開示は、プレプロアドレノメジュリンの翻訳後プロセッシングにより生じる20個のアミノ酸分子であるプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)が、その低血圧性および血管拡張性の作用に加え、強力な血管新生因子として機能するという発見を利用している。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のような他の公知の血管新生因子と比較して、PAMPはモルベースで100万倍強力であると推定される。
【０００７】
本明細書において、組織における血管新生を誘導する方法を説明する。本方法は、配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の有効量を組織へ導入し、これにより組織における血管新生を誘導する段階を含む。
【０００８】
血管新生が望ましい対象の標的領域において血管新生を促進する方法も説明される。本方法は、配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の治療有効量を標的領域へ導入し、これにより対象の標的領域における血管新生を促進する段階を含む。
【０００９】
更なる態様は、血管新生を誘導するための薬学的組成物における使用のため、冠動脈疾患の治療における使用のため、末梢血管疾患の治療における使用のため、および創傷治療における使用のための、配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片である。
【００１０】
なお更なる態様は、対象の組織における血管新生を誘導するためのキットである。本キットは、容器と、ある量の配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片とを備える。
【００１１】
有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターを組織へ導入し、これにより組織における血管新生を阻害する段階を含む、新規血管の形成が望ましくないような組織中の血管新生を阻害する方法も、本明細書において説明される。 
【００１２】
血管新生の阻害が望ましい対象の標的領域における血管新生を阻害する方法も説明される。本方法は、標的領域へ治療有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)インヒビターを導入し、これにより対象における血管新生を阻害する段階を含む。
【００１３】
更なる態様は、血管新生を阻害するための薬学的組成物における使用のため、腫瘍の治療における使用のため、網膜症の治療における使用のため、網膜症の治療における使用のため、子宮内膜症の治療における使用のため、関節炎の治療における使用のため、および乾癬の治療における使用のための、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)の調製物である。
【００１４】
対象の組織における血管新生を阻害するためのキットも本明細書において説明される。一部の態様において、このキットは、容器と、ある量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)とを備える。
【００１５】
なお更なる態様は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターをスクリーニングする方法である。本方法は、PAMPへの抗PAMP抗体の結合の破壊について小分子のライブラリーをスクリーニングする段階と、PAMPへの抗PAMP抗体の結合を破壊することが同定された分子を、血管新生バイオアッセイにおいて抗血管新生活性についてスクリーニングする段階とを含む。
【００１６】
前述およびその他の特徴および利点は、添付の図面を参照しながら進められる下記のいくつかの態様の詳細な説明から更に明らかになるであろう。
【００１７】
詳細な説明
I.略号
aFGF：酸性線維芽細胞増殖因子
bFGF：塩基性線維芽細胞増殖因子
CABG：冠動脈バイパス移植手術
GLP-1：グルカゴン様ペプチド-1
IL-8：インターロイキン-8
KLH：キーホールリンペットヘモシアニン
MMP2：メタロプロテイナーゼ2
MMP9：メタロプロテイナーゼ9
PAMP：プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド
PBS：リン酸緩衝生理食塩水
PTCA：経皮経管冠動脈形成術
PVD：末梢血管疾患
VEGF：血管内皮細胞増殖因子
【００１８】
II.用語
特に指定しない限り、技術用語は通常使用されるように使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、Benjamin Lewin、「Genes V」Oxford University Press、1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.)、「The Encyclopedia of Molecular Biology」、Blackwell Science Ltd.、1994(ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (ed.), 「Molecular Biology and Biotechnology : a Comprehensive Desk Reference」、VCH Publishers, Inc.、1995(ISBN 1-56081-569-8)に認めることができる。
【００１９】
本開示の様々な態様の検証を促進するために、以下に具体的用語を説明する。
【００２０】
動物：生きている多細胞脊椎生物、例えば哺乳類および鳥類を含むカテゴリー。哺乳類という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳類の両方を含む。同様に用語「対象」は、ヒトおよび獣医学的対象の両方、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む。
【００２１】
血管新生：既存の血管からの出芽または成長を介した、新規血管形成につながる生物学的プロセス。このプロセスは、既存の血管から内皮細胞が遊走し増殖することを含む。血管新生は、出生前の発生、出生後の発育、および成人の期間中に生じる。成人において、血管新生は、女性の生殖システムの正常な周期、創傷治癒時、および癌のような病理進行時に生じる(総説については、Battegay, J. Molec. Med., 73(7):333-346,1995参照のこと)。
【００２２】
血管新生活性：血管新生の促進。血管新生活性は、血管新生アッセイにおいて測定することができる。いくつかの血管新生アッセイに関する考察は、下記VII項を参照のこと。
【００２３】
血管新生因子：血管新生を促進する分子。多くの実験が、組織は、正常および病的な血管新生プロセス時の血液供給不良の条件下で、血管新生を促進する因子を分泌することを示唆している。血管新生分子は、低酸素状態およびその他の現時点ではよく定義されていない刺激に反応して、腫瘍、炎症、および結合組織細胞において生じる。血管新生因子の非限定的な例としては、bFGF、VEGF、およびPAMP(本明細書において示されている)が挙げられる。
【００２４】
拡散しうる血管新生物質の存在の第一の指標は濾過実験から調べられており、細胞を通さないフィルターにより下層組織から分離された腫瘍細胞はこれらの組織における血管成長を支援することは決してできないことを明らかにしている。血管の形成は、腫瘍細胞自身または付属細胞のいずれかにより分泌された様々な因子により開始および維持される。多くの様々な増殖因子およびサイトカインが、内皮細胞、平滑筋細胞、および線維芽細胞に対して化学走化性、有糸分裂促進性、修飾、または阻害活性を発揮することが示されており、このことから、血管新生プロセスへ何らかの形で関与することが予想できる。例えば、血管内皮細胞の成長、化学走化性の挙動、および／または機能的活性を修飾する因子としては、aFGF、bFGF、アンギオゲニン、アンギオトロピン、上皮増殖因子、IL-8、および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)が特に挙げられる。
【００２５】
多くの血管新生因子は、内皮細胞に関して有糸分裂促進性および化学走化性であるので、それらの生物学的活性(血管新生活性)は、内皮細胞の遊走誘導またはこれらの因子の内皮細胞増殖に対する作用を測定することによって、インビトロで決定することができる。あるいは、バイオアッセイを利用して血管新生活性を直接決定することができる。このようなバイオアッセイは、血管新生の繰返される長期にわたる定量に加え、血管新生性の血管の生理的特徴決定を可能にする。多くのこのようなアッセイが当該技術分野において公知である。
【００２６】
あるアッセイは、無血管化されたマウスの眼(例えば、Kenyon et al., Invest Opthalmol Vis. Sci., 37:1625,1996；下記実施例も参照されたい)またはウサギの眼(例えば、Gaudric et al. Ophthal. Res., 24:181,1992参照)の使用を採用しており、角膜ポケットアッセイと称される。このアッセイは、新規血管が容易に検出され、血管は本質的に必ず、通常は無血管の角膜内に新たに形成されるという利点を有する。
【００２７】
別のアッセイは、鶏絨毛尿膜の使用に関する(CAMアッセイ；Wilting et al., Anat. Embryol., 183:259,1991参照)。ラットにおける他のアッセイ、例えばラット大動脈リングモデルは、血管新生のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために利用されることが多い再現可能なアッセイを提供する(例えば、Lichtenberg et al., Pharmacol Toxicol., 84:34,1999参照)。
【００２８】
第三の種類の血管新生アッセイは、定方向(Directed)インビボ血管新生アッセイ(DIVAA；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002；実施例1参照)と称される。
【００２９】
鶏胚大動脈リングアッセイと称される第四のアッセイは、コラーゲン中に包埋された鶏の大動脈組織を使用する。血管の伸長が顕微鏡によりモニタリングされる。例えば、Isaacs, et al., J. Biol. Chem., 16;277(33):29936-44,2002；およびMartinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002参照のこと。
【００３０】
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされた1種または複数種のポリペプチドを含む蛋白質(または蛋白質複合体)。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子に加え、種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは次に各々免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。
【００３１】
基本的免疫グロブリン(抗体)構造単位は一般に四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の2個の同一対で構成されており、各対は、1個の「軽」鎖(約25kD)および1個の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100から110個またはそれよりも多いアミノ酸の可変領域を規定する。用語「可変軽鎖」(VL)および「可変重鎖」(VH)は各々、これらの軽鎖および重鎖を意味する。
【００３２】
本明細書において使用される抗体という用語は、完全な免疫グロブリンに加え、様々なペプチダーゼによる消化によって作成された多くの良く特徴決定された断片、または遺伝子操作された「人工」抗体を含む。このように、例えばペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド連結の下側で抗体を消化し、それ自身ジスルフィド連結によりVH-CH1に連結した軽鎖であるFabの二量体F(ab)'2を形成する。F(ab)'2は、穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド連結を破壊し、これによりF(ab)'2二量体はFab'単量体へ転換されることがある。Fab'単量体は本質的に、ヒンジ領域の部分を伴うFabである(Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed. , Raven Press, NY, 1993参照)。様々な抗体断片は、完全な抗体の消化に関して定義される一方で、Fab'断片は、化学的にまたは組換えDNA法を利用することのいずれかにより新規合成できることが理解されるであろう。従って本明細書において使用される抗体という用語はまた、抗体全体の修飾により作成されるか、または組換えDNA法を用いて新規合成されるかのいずれかの抗体断片を含む。
【００３３】
本開示の方法および装置において使用するための抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができる。単なる例として、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinの古典的方法(Nature, 256:495-497,1975)またはそれらの派生法に従って、マウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体産生の詳細な手法は、HarlowおよびLane(Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)に説明されている。
【００３４】
(PAMPまたはPAMPインヒビターの)投与：PAMPまたはPAMPインヒビターは、当業者に公知のいずれかの経路で投与することができる。投与は、局所的または全身的であることができる。局所投与の例としては、外用投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入投与による鼻粘膜もしくは肺への投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに局所投与には、典型的には全身投与のために使用される投与経路、例えば特定の臓器または腫瘍に対する動脈による供給のために血管内投与を行うことが含まれる。従って特定の態様において、局所投与は、特定の臓器または腫瘍へ供給を行う血管構造に標的化される場合、動脈内投与および静脈内投与を含む。
【００３５】
全身投与は、PAMPまたはPAMPインヒビターを循環系により体全体に広く分布させるようにデザインされたいずれかの投与経路を含む。従って全身投与は、動脈内および静脈内投与を含むが、これらに限定されるものではない。全身投与は、循環系による体全体への吸収および分布に向けられる場合、外用投与、皮下投与、筋肉内投与、または吸入による投与も含むが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
抗原：動物へ注射または吸収される組成物を含む、動物における抗体産生またはT細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原により誘導されたものを含む、特異的体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。ひとつの態様において、抗原はPAMP抗原である。
【００３７】
アンチセンス、センス、およびアンチジーン：二重鎖DNA(dsDNA)は、プラス鎖と称される5'→3'鎖、およびマイナス鎖と称される3'→5'鎖(逆相補体)の2本の鎖を有する。RNAポリメラーゼは5'→3'方向に核酸を追加するので、DNAのマイナス鎖は、転写時にRNAの鋳型となる。従って、形成されるRNAは、マイナス鎖に相補的な、プラス鎖と同一の配列を有する(TがUに置換されていることを除く)。
【００３８】
アンチセンス分子は、RNAまたはプラス鎖DNAのいずれかと特異的にハイブリダイズ可能な、または特異的に相補的な分子である。センス分子は、DNAのマイナス鎖と特異的にハイブリダイズ可能な、または特異的に相補的な分子である。アンチジーン分子は、標的dsDNAに相補的なアンチセンス分子またはセンス分子のいずれかである。ひとつの態様において、アンチセンス分子は、標的mRNAに特異的にハイブリダイズし、標的mRNAの転写を阻害する。 
【００３９】
関節炎：関節炎は、体の1個または複数個の関節の滑膜に影響を及ぼす炎症疾患である。これは、関節疾患の最も一般的なものであり、関節の炎症を特徴とする。この疾患は通常、複数関節性(2、3の関節に影響を及ぼす)であるが、全身化することもある。関与することが多い関節としては、股関節部、膝、下部腰椎および頸椎、近位および遠位指節間関節、第一手根中手関節、ならびに第一足根中足関節が挙げられる。
【００４０】
関節炎のひとつの型として反応性関節炎があり、これは、トラコーマ・クラミジア、エルシニア、サルモネラ、シゲラ、およびカンピロバクターを含む様々な微生物による尿管または胃腸管感染症に付随する急性の非化膿性の関節炎である。罹患した関節に微生物成分が認められる。関節炎は、突発的に出現し、膝および足首に関係する傾向があるが、場合によっては手首、指、および／または足指が関係することもある。治療しない場合、関節炎はほぼ一年続き、その後概して和らぎ、強直性脊椎炎を伴なうことは稀である。疾患が細菌感染により引き起こされるという証拠があるにもかかわらず、罹患した関節に生存細菌が存在することは稀であり、抗生物質療法が緩和を提供することはほとんどない。
【００４１】
別の型の関節炎は、関節リウマチである。関節リウマチは、体の複数の関節の滑膜に影響を及ぼす慢性的全身性炎症疾患である。この疾患は全身性であるので、更に多くの関節外の疾患の特徴がある。例えば、ニューロパシー、強膜炎、リンパ節症、心膜炎、巨脾腫、動脈炎、およびリウマチ小結節が、本疾患の頻出要素である。関節リウマチのほとんどの症例において、対象は症状の寛解と増悪を経験する。関節リウマチは後天性の自己免疫疾患と考えられており、遺伝的因子が役割を果たしているようである。
【００４２】
血管新生因子の阻害、例えばPAMPの阻害は、関節炎の治療に使用できる可能性がある。
【００４３】
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)：多くの組織型に広範に分布する強力なマイトジェン。塩基性FGFは増殖因子であり、細胞外マトリックス成分、特にヘパリンに結合し、そこから損傷後放出される。塩基性FGFは強力な血管新生因子であり、最初は「血管新生増殖因子」として説明されたこの因子は、後にbFGFとされた。
【００４４】
脳虚血または虚血性卒中：脳への動脈が部分的または完全にブロックされ、組織の酸素需要が供給酸素よりも多い場合に生じる状態。虚血性卒中後の酸素および他の栄養素の剥奪で、脳は卒中の結果として損傷を受ける。
【００４５】
虚血性卒中は、いくつかの異なる種類の疾患により引き起こされうる。最も一般的な問題は、首または頭の動脈の狭窄である。これはアテローム性動脈硬化症、または徐々に沈着したコレステロールにより引き起こされることが最も多い。動脈が余りにも狭くなると、血液細胞がその中に集まり、凝血塊(血栓)を形成する。これらの凝血塊は、それらが形成された場所の動脈をブロックする(血栓症)か、または移動して脳により近い動脈で留まりうる(塞栓症)。
【００４６】
卒中の別の原因として心臓内の凝血塊があり、これは不規則な心拍(例えば、心房細動)、心臓発作、または心弁の異常の結果生じうる。これらは虚血性卒中の最も一般的な原因であるが、他にも多くの可能性のある原因がある。例としては、ドラッグ(street drug)の使用、首の血管に対する外傷性損傷、または凝血障害が挙げられる。
【００４７】
虚血性卒中は、全卒中の約80％を占める、群を抜いて最も一般的な種類の卒中である。卒中は、小児を含むあらゆる年齢の人々が罹患しうる。虚血性卒中を患う人々の多くは高齢者(60歳以上)であり、卒中のリスクは加齢と共に高まる。各年齢で、卒中は女性よりも男性においてより一般的であり、白人系アメリカ人よりもアフリカ系アメリカ人の方がより一般的である。卒中を患う人々の多くは、高い血圧(高血圧症)、心臓疾患、喫煙、または糖尿病などの卒中のリスクをより高める他の問題または状態も有する。脳虚血を患う対象は、血管新生療法の恩恵を受けうる。
【００４８】
冠動脈疾患：冠動脈疾患においては、動脈壁内または上への脂肪(コレステロール)のゆるやかな蓄積により冠動脈が狭くなるか(狭窄)、またはブロックされ(閉塞)、心筋への血流が減少する。この蓄積は、「アテローム硬化性プラーク」または単に「プラーク」と称される。
【００４９】
プラークが動脈の管腔または流路を狭めると、心筋への適量の血液の流れが困難になることがある。蓄積が流れをほんの少し減少させる場合は、安静時には目立った症状はないかもしれないが、活動またはストレスが増大すると胸部圧迫感のような症状が生じることがある。他の症状としては、胸焼け、悪心、嘔吐、息切れ、およびひどい発汗が挙げられる。
【００５０】
流れが著しく低下して心筋がその必要量に見合うだけの十分な血流を受けられない場合(心虚血)は、胸部の痛み(狭心症)、心臓発作(心筋梗塞)、または律動障害(不整脈)などの重度の症状が生じうる。心臓発作は通常、動脈が完全にブロックされた結果であり、心筋に損傷を与えうる。
【００５１】
アテローム性動脈硬化症を治療するには、3種の常法がある：投薬、手術、ならびにステント移植、経皮経管冠動脈形成術(PTCA)、血管内放射線療法、粥腫切除術、およびエキシマレーザーなどの低侵襲性介入手技。これらの治療の目的は、症状を排除または軽減し、冠動脈疾患の症例において心臓発作のリスクを低下することである。
【００５２】
冠動脈疾患の症例において、時に「バイパス手術」と称される冠動脈バイパス移植手術(CABG)は、冠動脈のブロックされた領域の周囲に血液を運搬するための新たな流路を形成する方法である。また、経心筋血管再生と称される外科的介入は、心筋内の一連の流路を切断するレーザーを利用して血流を増加させる。
【００５３】
別の型の治療は、新規血管成長を誘導するために心臓へ血管新生因子を注射することに関する(Henry et al., JACC 33 (2:supp A):384A, 1999)。血管新生因子(例えばbFGF、VEGF、および本明細書に説明されるPAMP)は、動脈内注射、冠動脈内注射、または心膜内注射により注射される。
【００５４】
子宮内膜症：子宮内膜のような組織が、子宮の外側、体の別の領域において認められる、妊娠可能期の女性が罹患する疾患。子宮の外側のこれらの位置で、子宮内膜組織は、結節、病巣、移植片、または増殖物と称されるものへ発達する。これらの増殖物は、疼痛、不妊、および他の問題点を引き起こしうる。
【００５５】
子宮内膜増殖物の最も一般的な位置は腹部であり、子宮を支える靱帯、膣と直腸の間の領域、子宮の外面、および骨盤腔の内層が挙げられる。時には増殖物は、腹部の手術痕に、腸もしくは直腸に、または膀胱、膣、頚部、もしくは外陰部(外性器)にも認められる。子宮内膜増殖物は、腹部の外側、肺、腕、大腿、および他の位置にも認められることがあるが、これらは一般的ではない。
【００５６】
子宮内膜増殖物は、一般に悪性または癌性ではないが、その数十年の間に子宮内膜症に関連して悪性疾患が発生または認められる頻度が増大する。子宮の内層のように、子宮内膜増殖物は通常月経周期のホルモンに反応する。これらは毎月組織を蓄積し、崩壊して出血を生じる。しかし子宮の内層とは異なり、子宮外の子宮内膜組織は、体から離れるすべがない。その結果、内出血、増殖物から溢れた血液および組織の変性、周辺領域の炎症、および瘢痕組織の形成が生じる。増殖物の位置に応じて、増殖物の破裂(これにより子宮内膜症が新たな領域へ広がる)、癒着の形成、腸内出血または閉塞(増殖物が腸内または近傍の場合)、膀胱機能の障害(増殖物が膀胱上または中にある場合)、および他の問題などの他の合併症が起こりうる。症状は時間がたつにつれて悪化するようであるが、一部症例では寛解および再発のサイクルが定型である。
【００５７】
最も一般的な子宮内膜症の症状は、月経前または月経中の疼痛、性的活動時または後の疼痛、不妊、および激しいまたは不規則な出血である。他の症状としては、疲労、月経期間中の腸運動の痛み、月経時の腰の痛み、下痢、ならびに便秘および他の腸の不調が挙げられるであろう。子宮内膜症の女性の一部は、無症状である。不妊は、子宮内膜症の女性の約30〜40％に影響し、本疾患の進行の一般的結果である。
【００５８】
本明細書に説明されるように、血管新生因子の阻害、例えばPAMPの阻害は、子宮内膜症の治療に使用することができる。
【００５９】
エピトープ：抗原決定基。これらは、例えば特異的免疫応答を誘起する抗原性の分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、抗体および合致するまたはコグネイトのエピトープの3D構造を基に、特定の抗原性エピトープに結合する。
【００６０】
機能的に同等の配列変種：本明細書に説明したものと同じ結果を生じる、例えばPAMPまたはPAMPのペプチドインヒビター内の配列の変更物。このような配列変更物は、欠失、塩基修飾、突然変異、標識、および挿入を含みうるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
機能をブロックするまたは機能を中和する抗体：PAMPの血管新生活性を何らかの測定可能な程度に阻害することが可能な抗体。
【００６２】
融合蛋白質：自然には連結して認められない2種のアミノ酸配列を含む蛋白質。PAMP融合蛋白質は具体的には、少なくとも(1)配列番号:4に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4と90％または95％の配列同一性を共有する配列、および(2)配列番号:4に示されたアミノ酸配列または配列番号:4と90％または95％の配列同一性を共有する配列の末端または内部のいずれかに配置されたペプチド部分を含む。このようなPAMP融合蛋白質は加えて、他の蛋白質エレメント、例えばそのようなペプチド部分の間にリンカーを含みうる。
【００６３】
移植片：損傷を受けた部分を交換または欠損を補うために、体の一部に手術により結合または挿入される物質、特に生組織または臓器。移植片の具体例としては、臓器移植片および皮膚移植片が挙げられる。
【００６４】
インヒビター(例えばPAMP血管新生活性の)：特異的分子の活性(例えば生物学的活性)を、何らかの測定可能な程度に阻害することが可能である物質。
【００６５】
特に説明された態様において、インヒビターは、PAMPの血管新生活性のインヒビターである。一部の態様において、インヒビターは、蛋白質、ペプチド、またはそれらの断片、擬態物、アナログ、もしくは誘導体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子阻害性RNA、または小分子インヒビターである。別の態様において、インヒビターは抗体である。例えば、ひとつの態様において、PAMPインヒビターは、機能を中和するポリクローナル(またはモノクローナル)PAMP抗体である。別の態様において、PAMPインヒビターは、PAMPのアミノ酸12-20のみを含むペプチドPAMP(12-20)である。
【００６６】
PAMPインヒビターは、PAMPの血管新生活性のある部分をブロックすることが可能である物質である。しかしある種の態様において、インヒビターは、PAMP血管新生活性の少なくとも約20％をブロックすることができる。別の態様において、インヒビターは、 PAMP血管新生活性の少なくとも約30％、約50％、約60％、約70％、または約80％をブロックすることができる。状況によっては、インヒビターは、PAMPの血管新生活性をさらに大きい割合で阻害することもでき、PAMPの血管新生活性を少なくとも約90％、95％、または98％も、もしくは100％を阻害することもできる。しかしこのような特に高いレベルの結合阻害は、あらゆる状況において求められるものではない。
【００６７】
PAMP血管新生活性の阻害は、当業者に公知のアッセイを用いて測定することができる。あるアッセイは、無血管化されたマウスの眼(例えば、Kenyon et al., Invest Opthalmol Vis. Sci. 37:1625,1996参照；下記実施例も参照されたい)またはウサギの眼(例えば、Gaudric et al. Ophthal. Res. 24:181,1992参照)の使用を採用しており、角膜ポケットアッセイと称される。このアッセイは、新規血管が容易に検出され、血管は本質的に必ず、通常は無血管の角膜内に新たに形成されるという利点を有する。
【００６８】
別のアッセイは、鶏絨毛尿膜の使用に関する(CAMアッセイ；Wilting et al., Anat. Embryol., 183:259,1991参照)。ラット大動脈リングモデルなどのラットにおける他のアッセイは、血管新生アゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用されることが多い再現性のあるアッセイを提供する(例えば、Lichtenberg et al., Pharmacol Toxicol., 84:34,1999参照)。
【００６９】
第三の型の血管新生アッセイは、定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002；実施例1参照)と称される。
【００７０】
第四のアッセイは、鶏胚大動脈リングアッセイと称され、コラーゲン中に包埋された鶏から得た大動脈組織を使用する。血管の外方成長が顕微鏡によりモニタリングされる(例えば、Isaacs, et al., J. Biol. Chem., 16;277(33):29936-44,2002；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst, 21;94(16):1226-37,2002参照)。
【００７１】
単離された：「単離された」生物学的成分(例えば、核酸、ペプチド、または蛋白質)は、その成分が天然に生じる生物の細胞中の他の生物学的成分、例えば、他の染色体および染色体外DNAおよびRNA、ならびに蛋白質から、実質的に分離されるか、別に生成されるか、または精製される。従って「単離されている」核酸、ペプチド、および蛋白質は、標準的精製法により精製された核酸および蛋白質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸、ペプチド、および蛋白質に加え、化学的に合成された核酸も包含している。用語「単離された」または「精製された」は、100％の（absolute）純度を必要とせず、むしろ相対的な用語として意図されている。従って、例えば単離されたペプチド調製物は、ペプチドまたは蛋白質が、細胞内の天然の環境中におけるペプチドまたは蛋白質よりも濃厚化されているものである。好ましくは、調製物は、その蛋白質またはペプチドが調製物の総ペプチドまたは蛋白質含量の少なくとも50％を占めるように精製される。
【００７２】
哺乳類：この用語は、ヒトおよび非ヒトの両方の哺乳類を含む。同様に用語「対象」は、ヒト対象および獣医学的対象の両方、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む。
【００７３】
新生物または腫瘍：任意の新規かつ異常な増殖、特に増殖が制御できない進行性である組織の新規増殖。新生物または腫瘍は有用な機能を提供せず、健常な生物を犠牲にして増殖する。
【００７４】
一般に腫瘍は、細胞増殖の異常な調節により引き起こされるように見える。典型的には、体内における細胞の増殖は厳密に制御されており、新規細胞は、より古い細胞を置き換えるために、または新たな機能を発揮するために作成される。細胞増殖と死滅のバランスが乱された場合、腫瘍が形成されうる。通常は異常な増殖を検出しブロックする免疫系の異常も腫瘍につながりうる。他の原因としては、放射線照射、遺伝子異常、ある種のウイルス、太陽光、タバコ、ベンゼン、ある種の毒キノコ、およびアフラトキシンが挙げられる。
【００７５】
腫瘍は、良性型(緩徐に増殖し、位置にもよるが通常は無害)、悪性型(迅速に増殖し、他の臓器または全身へ広がって損傷させる可能性が高い)、または中間型(良性細胞および悪性細胞の混合)のいずれかに分類される。一部の腫瘍は、男性または女性においてより一般的であり、一部は小児または高齢者においてより一般的であり、および一部は食事、環境、および遺伝的リスク因子により変動する。
【００７６】
新生物の症状は、腫瘍の種類および位置に左右される。例えば、肺腫瘍は、咳、息切れ、または胸部痛を生じるが、結腸の腫瘍は、体重減少、下痢、便秘、および便の潜血を生じうる。一部の腫瘍は無症状であるが、腫瘍に付随することが多い症状としては、発熱、悪寒、寝汗、体重減少、食欲喪失、疲労、および倦怠感が挙げられる。
【００７７】
血管は、腫瘍へ栄養物および酸素を供給する。腫瘍増殖は、増殖腫瘍に必要なものを維持することができる新規血管の生成に依存し、多くの腫瘍は、新規血管の増殖(血管新生)を誘導することができる物質(血管新生因子)を分泌する。本明細書に説明されるように、これらの血管新生因子の阻害、例えばPAMPの阻害は、血管新生を低下し、腫瘍増殖を遅延または停止することができる。
【００７８】
新血管形成：新規血管の増殖。新血管形成は、通常はそれらを含まない組織における血管の増殖、または虚血性、さもなければ損傷を受けた組織における血管の増殖でありうる。新血管形成は、例えば網膜または角膜において生じる場合のように、病的であることがある。
【００７９】
核酸：一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーであり、特に限定されない限りは、天然のヌクレオチドに類似した方法で核酸にハイブリダイズする、天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含している。
【００８０】
オリゴヌクレオチドまたは「オリゴ」：複数のヌクレオチド（例えば、リン酸基および交換可能な有機塩基に連結された糖(例えば、リボースまたはデオキシリボース)を含む分子、これは置換ピリミジン(Py)(例えば、シトシン(C)、チミン(T)、またはウラシル(U))、または置換プリン(Pu)(例えば、アデニン(A)またはグアニン(G)）。本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴリボヌクレオチド(ORN)およびオリゴデオキシリボヌクレオチド(ODN)の両方を意味する。用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオシド(例えば、オリゴヌクレオチドからリン酸を除く)および任意の他の有機塩基ポリマーも含む。オリゴヌクレオチドは、存在する核酸給源(例えば、ゲノムまたはcDNA)から得ることができるが、合成することもできる(例えば、実験室またはインビトロオリゴヌクレオチド合成により生成される)。
【００８１】
PAMP：プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド参照。
【００８２】
末梢血管疾患(PVD)：血液を腕または足へ運搬する動脈が狭窄または閉塞した状態。これは正常な血流を妨害し、時には疼痛を引き起こすが、容易に検出可能な症状を全く生じないことも多い。
【００８３】
もっとも一般的なPVDの原因はアテローム性動脈硬化症であり、これはコレステロールおよび瘢痕組織が蓄積し、血管を閉塞するプラークを形成する段階的プロセスである。一部の症例において、PVDは、動脈で詰まり血流を制限する凝血塊により引き起こされることがある。
【００８４】
PVDは、50歳を超える人20名中の約1名、米国において800万人が罹患している。PVD患者の半数以上が、脚の痛み、しびれ、または他の症状を経験するが、多くの人々がこれらの徴候を「正常な加齢の一部」として片付けてしまい、医学的援助を求めることはない。
【００８５】
最も一般的なPVDの症状は、特に歩行時の、脚または股関節部の痛みを伴う痙攣である。この症状は「跛行」としても知られており、運動時に脚の筋肉への血流が不充分な場合に生じ、虚血が起こる。疼痛は、典型的には筋肉を休めると消散する。
【００８６】
他の症状としては、脚のしびれ、うずき、または脱力が挙げられるであろう。重症の症例においては、PVD患者は、休息時にも脚または足先などの末端部に灼熱痛またはうずくような痛みを経験するか、または脚もしくは足に治らないただれを生じることがある。PVD患者は、脚もしくは足の皮膚の冷えまたは変色、または脚の脱毛を経験することもある。極端な症例においては、未治療のPVDは、脚、足、または足先の切断を必要とすることがある重篤な状態である壊疽を引き起こすことがある。PVD患者は、心臓疾患および卒中のリスクも高い。
【００８７】
本明細書に説明されるように、PVD患者は、PAMPなどの血管新生物質による治療から恩恵を受けうる。
【００８８】
薬学的物質または薬物：対象へ適切に投与された場合に望ましい治療的または予防的作用を誘導することが可能な化合物または組成物。薬学的物質としては、血管新生因子、例えばPAMP、bFGF、およびVEGF、ならびに抗血管新生因子、例えばPAMP、bFGF、またはVEGFのインヒビターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、適当な抗血管新生因子としては、特異的VEGF-RアンタゴニストであるSU5416、ならびにVEGF、bFGF、およびPDGFの受容体をブロックするSU6668が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、Liu et al., Seminars in Oncology, 29(Suppl 11):96-103,2002；Shepherd et al., Lung Cancer, 34:S81-S89, 2001参照。
【００８９】
薬学的に許容できる担体：本開示において有用である薬学的に許容できる担体は従来のものである。「Remington's Pharmaceutical Sciences」(E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975))が、本明細書に開示されたペプチドの薬学的送達に適した組成物および製剤を説明している。
【００９０】
一般に担体の性質は、使用される投与の具体的様式に応じて決まる。例えば、非経口製剤は通常、溶剤として、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容できる液体を含有する注射可能な液体を含む。固形組成物(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態)について、従来的な無毒の固形担体としては、例えば、医療グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加え、少量の無毒の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
【００９１】
疾患の予防または治療：疾患の「予防」は、疾患の完全な発達の阻害、例えば冠動脈疾患を有する患者における心筋梗塞の発症を阻害すること、または新生物を有する対象における腫瘍の進行もしくは転移を阻害することを意味する。「治療」は、疾患の徴候もしくは症状、または疾患が発症し始めた後の病態を改善する治療的介入を意味する。
【００９２】
プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)：プレプロアドレノメジュリンの翻訳後プロセッシングから生じる20アミノ酸の分子(例えば、Ishimitsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203,631-639,1994参照)。本明細書に説明するように、用語PAMPは、配列番号:4に示されたPAMPアミノ酸配列、 配列番号:4と90％または95％の配列同一性を共有し血管新生活性を保持する変種PAMPアミノ酸配列、血管新生活性を保持するPAMP断片、および血管新生活性を保持するPAMP融合蛋白質を含む。血管新生活性は、本明細書に説明される血管新生アッセイのいずれかを用いて評価することができる。本明細書に定義されるように、変種PAMP配列、PAMP断片、またはPAMP融合蛋白質は、血管新生アッセイ、例えば本明細書に説明されるDIVAAアッセイにより測定して、PAMPの血管新生活性の少なくとも一部、例えばPAMPの血管新生活性の25％、50％、75％、90％、または95％を保持する場合に、血管新生活性を保持する。
【００９３】
PAMPは、脳、下垂体、および副腎を含むいくつかの異なる哺乳類組織において検出されており、強力な低血圧性および血管拡張性物質である(例えば、Kitamura et al., FEBS Lett., 351,35-37, 1994；Saita et al., Regul. Pept., 77(1-3):147-153,1998参照)。多くの活性がPAMPに起因しており、ほとんどが液体および電解質の恒常性の生理的制御に関係している。例えば、PAMPは、副腎に直接作用することによりアルドステロン分泌を阻害する。下垂体において、このペプチドは、基礎的(basal)副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)分泌を阻害する。一般にPAMPは、脳および下垂体において、血管におけるその血管拡張作用を補足する作用である血漿容量の喪失を促進するように作用するようである。
【００９４】
本明細書に説明されるように、PAMPは、その低血圧性および血管拡張性作用に加え、強力な血管新生因子として作用する。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの他の周知の血管新生因子と比較した場合、PAMPは、鶏胚大動脈リングアッセイ、および定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA)における試験を基にして、およそ100万倍強力である。
【００９５】
乾癬：鱗化および炎症を特徴とする慢性皮膚疾患。鱗化は、皮膚の外層細胞が通常よりも迅速に再生して皮膚の表面上に集積する場合に生じる。
【００９６】
乾癬は、米国人口の1〜2％、または約550万人が罹患している。本疾患は全ての年齢群において男女間でほぼ等しく生じるが、主に成人が罹患する。乾癬患者は、疼痛およびかゆみを含む不快感、関節の制限された運動性、ならびに感情的苦痛に悩まされることがある。
【００９７】
その最も典型的な形態において、乾癬は、銀色の鱗屑により覆われた厚い赤色皮膚の斑点(patch)を生じる。これらの斑点は、時には斑と称され、通常かゆく、灼熱感を生じることがある。関節の皮膚は、ひびが入ることがある。乾癬は、肘、膝、頭皮、腰、顔面、掌、および足の裏に最も頻繁に生じるが、あらゆる皮膚部位に影響を与えうる。本疾患は、指爪、足爪、ならびに口内および性器の軟組織にも影響を与えうる。
【００９８】
電子顕微鏡を含む組織学的試験は、皮膚の血管形成の変化が乾癬の顕著な特徴であることを明確に立証した。従って本明細書に説明されるように、乾癬を患う対象は、PAMPインヒビターによる治療などの抗血管新生療法から恩恵を受けうる。
【００９９】
網膜症：網膜症は、例えば糖尿病患者における、網膜の血管に影響を与える眼疾患である。時間とともに糖尿病は網膜の循環系に影響を与える。本疾患の最初期相は、背景糖尿病性網膜症として知られている。この相において、網膜の動脈は脆弱化して漏出し、小さい点様の出血を形成する。これらの漏出血管は、網膜の膨潤または浮腫および視力低下につながることが多い。
【０１００】
次の段階は、増殖性糖尿病性網膜症として知られている。この段階において、循環障害が網膜の領域を酸素枯渇または虚血状態とする。循環系が網膜内の適当な酸素レベルを維持しようとして、新たに脆い血管が発生する。これは新血管形成と称される。残念なことに、これらの繊細な血管は容易に出血する。血液は、網膜および硝子体に漏出し、視力の低下と共にスポットまたは浮遊物を生じうる。
【０１０１】
本疾患の後期相において、継続的な異常血管増殖および瘢痕組織が、網膜剥離および緑内障のような重大な問題を引き起こしうる。
【０１０２】
本明細書に説明されるように、網膜症を患う対象は、PAMPインヒビターによる治療などの抗血管新生療法の恩恵を受けうる。
【０１０３】
配列同一性：2つの核酸配列、または2つのアミノ酸配列の間の類似性は、配列間の類似性に関して表され、配列同一性とも称される。配列同一性は、％同一性(または類似性もしくはホモロジー)に関して測定されることが多く、割合(％)が高いほど、2つの配列はより類似している。
【０１０４】
比較のための配列アラインメント法は、当該技術分野において周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが以下のものに説明されている：Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482,1981)；Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443,1970)；Pearson and Lipman (PNAS. USA, 85:2444,1988)；Higgins and Sharp(Gene, 73:237-244,1988)；Higgins and Sharp(CABIOS, 5:151-153,1989)；Corpet et al.(Nuc. Acids Res., 16:10881-10890,1988)；Huang et al. (Comp. Appls Biosci., 8:155-165,1992)；およびPearson et al(Meth. Mol. Biol., 24:307-31,1994)。Altschul et al.(Nature Genet., 6:119-129,1994)は、配列アラインメント法およびホモロジー計算の詳細な考察を示している。
【０１０５】
アラインメントツールALIGN(Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17,1989)またはLFASTA(Pearson and Lipman, 1988)を用いて、配列比較を行うことができる(Internet Program(著作権)1996, W. R. PearsonおよびUniversity of Virginia,「fasta20u63」ver.2.0u63、リリース日1996年12月)。ALIGNは全体の配列を互いに比較するのに対し、LFASTAは局所的に類似した領域を比較する。これらのアラインメントツールおよびそれらの各々のチュートリアルは、インターネット上、NCSAウェブサイトで入手可能である。あるいは、約30個のアミノ酸を超えるアミノ酸配列を比較するためには、「Blast 2 sequences」関数を、デフォルトパラメータ(gap existence cost 11、およびa per residue gap cost 1)に対してデフォルトのBLOSUM62行列セットを用いて、利用することができる。短いペプチド(約30個のアミノ酸よりも少ない)のアラインメントを行う場合、アラインメントは、デフォルトパラメータ(open gap 9、extension gap 1 penalties)についてPAM30行列セットを利用して、「Blast 2 sequences」関数を用いて行われる。BLAST配列比較システムは、例えばNCBIウェブサイトから入手可能である。Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410,1990；Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272,1993；Madden et al., Meth. Enzymol., 266:131-141,1996；Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402,1997；およびZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656,1997も参照されたい。
【０１０６】
蛋白質のオルソログは典型的には、デフォルトのパラメータについてALIGNセットを用いて特異的蛋白質のアミノ酸配列との全長アラインメントにわたりカウントして、75％よりも大きい配列同一性を有することにより特徴付けられる。参照配列に対し更に大きい類似性を有する蛋白質は、この方法で評価した場合に、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、または少なくとも98％の配列同一性のような、増加した割合(％)の同一性を示すであろう。加えて、配列同一性は、開示されるペプチドの一方または両方の結合ドメインの全長にわたって比較することができる。
【０１０７】
全体の配列よりも著しく少ないものが配列同一性について比較される場合、相同配列は典型的には、10〜20個のアミノ酸の短いウインドウにわたって少なくとも80％の配列同一性を有し、参照配列に対するそれらの類似性に応じて、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の配列同一性を有しうる。このような短いウインドウにわたる配列同一性は、LFASTAを用いて決定することができ、方法はNCSAウェブサイトに説明されている。当業者は、これらの配列同一性の範囲が単にガイダンスのために提供されることを理解するであろう。提供された範囲外の非常に重要なホモログを得ることは、全くもって可能である。
【０１０８】
2つの核酸分子が密接に関係していることの別の指標は、これら2つの分子が互いにストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることである。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる環境パラメータ下で異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、指定されたイオン強度およびpHでの特異的配列についての融解点(Tm)よりも約5℃〜20℃低く選択される。Tmは、標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度(指定されたイオン強度およびpHの下で)である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およびストリンジェンシーの計算は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)、およびTijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Part I, Ch.2, Elsevier, New York, 1993)に見ることができる。開示されたペプチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子は典型的には、全ペプチドコード配列、全結合ドメイン、またはコード配列の他の選択された部分のいずれかを基にしたプローブと、0.2xSSC、0.1％SDS、65℃の洗浄条件下でハイブリダイズするであろう。
【０１０９】
高い同一性を示さない核酸配列は、それにも関わらず、遺伝暗号の縮重のために類似のアミノ酸配列をコードすることがある。核酸配列内の変化は、この縮重を利用して、それぞれが実質的に同じ蛋白質をコードする複数の核酸配列を生じるように作成することができることが理解される。
【０１１０】
小分子インヒビター(例えば、PAMPの血管新生活性の)：典型的には分子量1000ダルトン未満、または一部の態様においては、約500ダルトン未満の分子であり、この分子は、何らかの標的分子の活性を何らかの測定可能な程度に阻害することが可能である。特定の態様において、小分子インヒビターはPAMPの血管新生活性のインヒビターである。
【０１１１】
治療有効量：疾患の進行を防止するか、もしくは寛解を引き起こすのに十分であるか、またはアンギナもしくは四肢疼痛のような本疾患により引き起こされる症状の緩和が可能な投与量。例えば、PAMPまたはPAMPインヒビターの治療有効量は、約0.1nM/kg体重〜約1μM/kg体重、例えば約1nM〜約500nM/kg体重、または約5nM〜約50nM/kg体重を変動しうる。正確な投与量は、具体的化合物の強度、対象の年齢、体重、性別、および生理的状態を基に当業者により容易に決定される。
【０１１２】
プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)の変種または断片：配列番号:4と少なくとも90％配列同一性を共有し、血管新生活性、例えば、25％、50％、75％、もしくは100％のPAMP血管新生活性を保持するペプチド。変種および断片の更なる考察については、下記第VI項を参照のこと。血管新生活性を測定するために使用することができる様々なアッセイの考察については、下記第VII項を参照のこと。
【０１１３】
血管内皮細胞増殖因子(VEGF)：VEGFは、46〜48kDa(24kDaサブユニット)の、ホモ二量体の重度にグリコシル化された蛋白質である。しかしグリコシル化は、生物学的活性のためには必要ではない。これらのサブユニットは、ジスルフィド結合により連結されている。
【０１１４】
VEGFは、血管内皮細胞の高度に特異的な分裂促進因子である。インビトロにおいて、VEGFの2つの短い形態は、大血管内皮細胞の増殖を刺激する。VEGFは、他の細胞型の増殖は増強しないようである。VEGFは、血管透過性に有意に影響し、いくつかのバイオアッセイにおける強力な血管新生蛋白質である。VEGFは恐らく、生理的条件下での新血管形成においても役割を果たすであろう。血管新生の誘導におけるVEGFとbFGFの間の強力な相乗作用が認められている。平滑筋細胞およびマクロファージから放出されたVEGFが動脈硬化性疾患の発症に役割を果たすことが示唆されている。
【０１１５】
特に記さない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。単数の用語「1つ（a、an、the）」は、文脈が明らかに示していない限りは複数の意味も有する。同様に用語「または（or）」は、文脈が明らかに示していない限りは「および（and）」を含むことが意図されている。更に、核酸またはポリペプチドについて示された全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量は概数であり、説明目的で提供されることが理解されるべきである。本明細書に説明されたものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実践または試験に使用することができ、適当な方法および材料が以下に説明される。用語「備える（comprise）」は、「含む（include）」を意味する。本明細書において言及する全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が本明細書に参照として組入れられる。矛盾する場合、用語の説明を含み、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例であり、限定を意図するものではない。
【０１１６】
III. いくつかの態様の説明
第一の態様は、組織における血管新生を誘導する方法である。この方法は、配列番号:4で示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の有効量を組織へ導入し、これにより組織における血管新生を誘導する段階を含む。この方法の一部の例において、変種または断片は、配列番号:4と少なくとも95％の配列同一性を有するのに対し、他の例においては、ペプチドは配列番号:4に示されたペプチドである。この方法の一部の例において、組織は、移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈である。具体例において、移植片は皮膚または臓器移植片である。
【０１１７】
本方法の一部の例において、導入は、患部への局所投与、例えば、外用投与、動脈内投与、または標的を還流する末梢血管への静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による鼻粘膜もしくは肺への投与を含む。別の例において、導入は、体全体にわたる全身系分布のための、例えば、動脈内、静脈内、または他の非経口経路による全身投与を含む。具体例において、血管新生の誘導は、新血管形成の誘導を含む。
【０１１８】
別の態様は、血管新生が望ましい対象の標的領域における血管新生を促進する方法である。この方法は、配列番号:4で示されたペプチド、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片の治療有効量を標的領域へ導入し、これにより対象の標的領域における血管新生を促進する段階を含む。この方法の一部の例において、変種または断片は配列番号:4と少なくとも95％の配列同一性を有するのに対し、他の例においては、ペプチドは配列番号:4に示されたペプチドである。この方法の一部の例において、組織は、組織移植片、心臓組織、血管、創傷、または冠動脈である。具体例において、移植片は、皮膚もしくは臓器移植片、または指、手、または腕などの四肢の外科的再付着物である。
【０１１９】
ある例において、対象は、冠動脈疾患、末梢血管疾患、脳虚血、または創傷を有するか、または発症のリスクがある。この方法の具体例において、領域は、血流が制限された血管であり、および／または通常還流する組織を虚血性とする。
【０１２０】
更なる態様は、血管新生を誘導するための薬学的組成物において使用するための配列番号:4のペプチド、または配列番号:4と少なくとも90％または95％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片ペプチドである。一部の態様において、ペプチドは配列番号:4であり、別の態様において、使用は、血管再生を促進するためであり、冠動脈疾患、末梢血管疾患を治療し、または血管再生および創傷治癒を促進する。血管再生の助長は、治癒が遅いまたは治癒しない創傷、例えば末梢血管疾患の対象の皮膚病巣、または寝たきりの対象における褥瘡に関して特に重要である。
【０１２１】
容器と、ある量の配列番号:4、または配列番号:4と少なくとも90％の配列同一性を有し血管新生活性を保持するその変種もしくは断片とを備える、対象の組織において血管新生を誘導するキットも開示する。一部の例において、キットは、第二の血管新生物質を含む容器を備える。ある例において、第二の血管新生物質は、血管内皮細胞増殖因子または塩基性線維芽細胞増殖因子であり、具体例においてこのキットは、ペプチドを対象に投与するための使用説明書も備える。
【０１２２】
新規血管の形成が望ましくない組織中の血管新生を阻害し、これにより病的な新血管形成を阻害する方法も本明細書に開示される。この方法は、有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターを組織へ導入し、これにより組織における血管新生を阻害する段階を含む。一部の例において、インヒビターは、抗体、小分子インヒビター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある例において、インヒビターは、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である。本方法の一部の例において、組織は、新生物、網膜、または角膜を含む。
【０１２３】
更なる態様は、血管新生の阻害が望ましい対象の標的領域における血管新生を阻害する方法である。この方法は、治療有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)インヒビターを標的領域へ導入し、これにより対象の血管新生を阻害する段階を含む。一部の例において、インヒビターは、抗体、小分子インヒビター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある例において、インヒビターは、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である。
【０１２４】
本方法の一部の態様において、組織は、皮膚、腫瘍、網膜、関節、または子宮内膜組織を含む。具体例において、対象は、腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を有するかまたは発症のリスクがある。本方法の一部の例において、導入は、局所投与、例えば、外用投与、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与、心膜内投与、眼球内投与、点眼投与、または吸入による投与を含む。 別の例において、導入は全身投与を含む。
【０１２５】
更なる態様は、血管新生を阻害するために薬学的組成物において使用するためのプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)である。具体例において、使用は、腫瘍、網膜症、子宮内膜症、関節炎、または乾癬を治療するためである。
【０１２６】
対象の組織における血管新生を阻害するためのキットも本明細書に開示される。このキットは、容器と、ある量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)とを備える。一部の例において、容器は、更なる抗血管新生物質、例えば血管内皮細胞増殖因子(VEGF)のインヒビターまたは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)のインヒビターを備える。ある例において、キットは、対象へペプチドを投与するための使用説明書も備える。
【０１２７】
より更なる態様は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)のインヒビターをスクリーニングする方法である。この方法は、PAMPへの抗PAMP抗体の結合を破壊するための小分子のライブラリーをスクリーニングする段階と、血管新生バイオアッセイにおいて抗血管新生活性についてPAMPへの抗PAMP抗体の結合を破壊することが同定された分子をスクリーニングする段階とを含む。
【０１２８】
IV.PAMPおよびPAMPインヒビター
プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)は、プレプロアドレノメジュリンの翻訳後プロセッシングから生じる20アミノ酸のペプチド分子である(例えば、Ishimitsu et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 203,631-639,1994参照)。PAMPは、脳、下垂体、および副腎を含む多種多様な哺乳類の組織において検出されている。
【０１２９】
PAMPは、その強力な低血圧性および血管拡張性作用が知られている(例えば、Kitamura et al., FEBS Lett., 351,35-37, 1994；Saita et al., Regul. Pept., 77 (1-3): 147-153,1998参照)。多くの活性がPAMPに起因しており、ほとんどが液体および電解質の恒常性の生理的制御に関係している。例えば、PAMPは副腎に直接作用することにより、アルドステロン分泌を阻害する。下垂体において、このペプチドは、基礎的副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)分泌を阻害する。一般に、PAMPは、脳および下垂体において、血管におけるその血管拡張作用を補足する作用である血漿容量の喪失を促進するように作用するようである。
【０１３０】
その低血圧性および血管拡張性作用に加え、ここで本明細書において、PAMPは強力な血管新生因子として機能することが示された。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの他の周知の血管新生因子と比較して、PAMPはおよそ100万倍強力である。
【０１３１】
PAMPは、例えば、冠動脈疾患、末梢血管疾患、または脳虚血を有する対象において血管新生を促進するために使用することができる。
【０１３２】
PAMPのインヒビターもまた、血管新生をインビボにおいて阻害するために有用である。例えば、PAMPインヒビターを用い、腫瘍増殖を阻害することができる。腫瘍増殖は、腫瘍の成長必要物を維持する新規血管の生成に依存する。従って、これらの腫瘍のPAMPインヒビターによる処置は、腫瘍への血液供給を断ち切り、それらを効果的に飢餓状態とし、腫瘍増殖を阻害する。PAMPインヒビターは、過剰な血管新生を特徴とする他の疾患、例えば乾癬、糖尿病性網膜症、および子宮内膜症の治療にも使用される。
【０１３３】
V.PAMP抗体の産生
最適には、PAMPに対する抗体は、そのペプチドを特異的に検出するか、またはPAMPの血管新生活性を阻害するであろう。PAMPを特異的に検出する抗体は、PAMPペプチドを認識して結合し、生物学的試料中の他の蛋白質またはペプチドは実質的には認識または結合しないであろう。抗体がその標的蛋白質を特異的に検出することの決定は、多くの標準イムノアッセイ法のいずれかにより行われる。例えば、ウェスタンブロット法(Sambrook et al., In Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)。
【０１３４】
ウェスタンブロット法により所定の抗体調製物(例えばマウスまたはウサギにおいて調製されたもの)が特異的に標的ペプチドを検出することを決定するためには、関心対象のペプチドを合成し、ウェスタンブロットにより膜(例えばニトロセルロース)に移し、被験抗体調製物をこの膜と共にインキュベーションする。膜を洗浄して非特異的に結合した抗体を除去した後、特異的に結合した抗体の存在を、アルカリホスファターゼなどの酵素と複合した抗マウスまたは抗ウサギ抗体を使用して検出する。
【０１３５】
アルカリホスファターゼ基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸/ニトロブルーテトラゾリウムを適用すると、免疫局在化されたアルカリホスファターゼによって濃い青色化合物が生じる。標的PAMPペプチドを特異的に検出する抗体は、この技術により、標的PAMPペプチドバンド(これはその分子量により決定されたゲル上の所定の位置に局在化するであろう)への結合が示される。抗体の他の蛋白質への非特異的結合が生じ、ウェスタンブロット上で弱いシグナルとして検出されることもある。特異的抗体-PAMPペプチド結合から生じた強力な主要シグナルと比べ、ウェスタンブロット上に得られた弱いシグナルにより、当業者はこの結合の非特異的性質を認識するであろう。
【０１３６】
抗体がPAMPの血管新生活性を阻害することの決定は、例えば本明細書に説明される血管新生アッセイのいずれかなどの、血管新生アッセイを用いて行うことができる(下記VII項参照)。例えば、抗体がPAMPの血管新生活性を阻害することの決定は、DIVAAアッセイを用いて、PAMP単独の血管新生活性をPAMP抗体の存在下でのPAMPの血管新生活性と比較することにより行うことができる。PAMPの血管新生活性を阻害する抗体は、DIVAAアッセイにおいてPAMPの血管新生活性を、ある一定量、例えば、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％さえも低下するであろう。
【０１３７】
A.ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
PAMPペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilsteinの古典的方法(Nature, 256:495,1975)またはその派生法に従って、マウスのハイブリドーマから調製することができる。簡単に述べると、選択された蛋白質の数μgを数週間の間マウスに反復接種する。その後このマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞を、ポリエチレングリコールによりマウス骨髄細胞と融合し、過剰な非融合細胞を、アミノプテリンを含有する選択培地(HAT培地)上でこのシステムを増殖させることにより破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、希釈物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに配置し、培養物の増殖を継続する。抗体産生クローンを、Engvallにより最初に説明されたような(Enzymol., 70:419,1980)ELISAおよびその派生法などのイムノアッセイ手法により、ウェル内の上清液中の抗体の検出により同定する。選択された陽性クローンを増殖し、それらのモノクローナル抗体産物を収集して使用することができる。モノクローナル抗体産生に関する詳細な手法は、HarlowおよびLane(Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)に説明されている。
【０１３８】
B.免疫処置によるポリクローナル抗体の産生
単一蛋白質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、未修飾でも、免疫原性を増強するように修飾されていてもよい発現蛋白質で適当な動物を免疫処置することにより調製することができる。効果的なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関連した多くの因子により影響を受ける。例えば、小分子は他のものよりも免疫原性が少ない傾向があり、担体およびアジュバントの使用を必要かもしれない。また、宿主動物の接種部位および投与量に対する応答は変動し、抗原の量が不十分であるか過剰であるかのいずれかにより低力価の抗血清を生じる。複数の皮内部位への抗原の少量投与(ngレベル)が最も信頼できるようである。ウサギに有効な免疫処置プロトコールは、Vaitukaitisら(J. Clin. Endocrinol. Metab., 33:988-991,1971)に見ることができる。
【０１３９】
ブースター注射を規則的な間隔で施すことができ、例えば既知濃度の抗原に対し寒天内の二重免疫拡散により半定量的に決定して、抗体力価が低下し始めた時点で抗血清を収集する。例えばOuchterlonyら(In Handbook of Experimental Immunology, Wier, D.(ed.)、第19章. Blackwell, 1973)を参照されたい。抗体のプラトー濃度は通常、約0.1〜0.2mg/ml血清(約12μM)の範囲である。抗血清の抗原に対する親和性は、例えばFisher(Manual of Clinical Immunology, 第42章,1980)に説明されるように、競合的結合曲線を作成することにより決定される。
【０１４０】
C.合成ペプチドに対する抗体
PAMPペプチドに対して抗体を作製する第三のアプローチは、PAMPのアミノ酸配列を基にして市販のペプチド合成装置上で合成された合成ペプチドの使用である。
単なる例として、PAMPペプチドに対するポリクローナル抗体を、化学的に合成されたペプチドをウサギに注射することによって周知の技術により作成することができる。
【０１４１】
D. PAMPペプチドをコードする配列の注射により作製された抗体
PAMPペプチドを発現するDNAベクターをマウスなどの実験動物へ皮下注射することにより、PAMPペプチドに対する抗体を作製してもよい。組換えベクターの動物への送達は、Tangら(Nature, 356:152-154,1992)に説明されたように携帯型Biolisticシステム(Sanford et al., Particulate Sci. Technol, 5:27-37,1987)を用いて行うことができる。この目的に適した発現ベクターとしては、ヒトβ-アクチンプロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターのいずれかの転写制御下でPAMPペプチドをコードする配列を発現するものを挙げることができる。
【０１４２】
VI.PAMPペプチドおよびPAMPインヒビターペプチドのバリエーション
A.配列変種
本明細書に開示されるペプチドの血管新生または抗血管新生特性は、正確なアミノ酸配列にあるわけではなく、DNA配列によりコードされたアミノ酸配列に固有の三次元構造による。正確なアミノ酸配列を再現することは必要ではなく、三次元構造を再現することにより、これらペプチドの任意の結合特性、例えばPAMPの結合特性を再現することが可能である。これは、三次元構造をコードしているが、例えば遺伝暗号の縮重のために異なる核酸配列をデザインすることにより実現することができる。同様にDNA配列も変動しうるが、機能的血管新生または抗血管新生ペプチドを生じうる。
【０１４３】
変種の血管新生または抗血管新生ペプチドには、開示配列とはアミノ酸配列が異なるが、提供されたペプチドのいずれかと構造的に重要な配列相同性を共有するペプチドが含まれる。このような変種は、部位特異的突然変異誘発またはPCRを含む標準的手法を使用して、コード配列のヌクレオチド配列を操作することにより作成することができる。最も単純な修飾は、1個または複数個のアミノ酸の、同様の生化学特性を有するアミノ酸との置換を含む。これらのいわゆる保存的置換は、特にこのペプチドの結合部位の外側で行われる場合に、得られるペプチドの活性に対し影響が最低限に抑えられる可能性が高い。表1は、ペプチド中の元のアミノ酸と置換することができる保存的置換となるアミノ酸を示している。
【０１４４】
【表１】
2006516537.tif 000002
【０１４５】
ペプチド構造のより実質的な変更は、表1に列記されたものよりも保存度の少ないアミノ酸置換を選択することにより得ることができる。このような変更としては、置換近傍のポリペプチド骨格構造(例えば、シートまたはヘリックスコンホメーション)、標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または特異的側鎖の嵩を維持することに対する作用がより顕著に異なる残基の変更が挙げられる。下記の置換は一般に、蛋白質特性の最大の変化を生じると予想される：(a)親水性残基(例えば、セリルまたはトレオニル)で（またはこれを）疎水性残基(例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルを(またはこれで)置換する；(b)システインまたはプロリンで（またはこれを）いずれか他の残基を(またはこれで)置換する；(c)正帯電した側鎖を有する残基(例えば、リシル、アルギニル、またはヒスタジル)で（またはこれを）負帯電した残基(例えば、グルタミルまたはアスパルチル)を(またはこれで)置換する；または、(d)嵩高な側鎖を有する残基(例えば、フェニルアラニン)で（またはこれを）側鎖を欠くもの(例えば、グリシン)を(またはこれで)置換する。
【０１４６】
変種の血管新生または抗血管新生コード配列は、標準的DNA突然変異誘発技術、例えばM13プライマー突然変異誘発により作成することができる。これらの技術の詳細は、Sambrook(In Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989)の第15章に記載されている。このような技術を使用することにより、開示の血管新生および抗血管新生コード配列とはわずかに異なる変種を作成することができる。本明細書に具体的に開示されるものの誘導体であり、ヌクレオチドの欠失、付加、もしくは置換により開示されるものとは異なるが、依然として血管新生を促進もしくは阻害するペプチドをコードするDNA分子およびヌクレオチド配列は、本開示に含まれる。それらの最も単純な形態において、このような変種は、分子が導入される特定生物のコドン使用頻度のバイアスに合わせるためためのコード領域の変更により、開示配列とは異なりうる。
【０１４７】
あるいは、コード領域は遺伝暗号の縮重を利用することにより変更することができ、ヌクレオチド配列が実質的に変更されるが、なお開示のペプチド配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有するペプチドをコードするようにコード配列を変更しうる。例えば、PAMPの第一のアミノ酸残基はアラニンである。ヌクレオチドコドントリプレットGCTがこのアラニン残基をコードしている。遺伝暗号の縮重のために、3種の別のヌクレオチドコドントリプレット−(GCG、GCC、およびGCA)−もアラニンをコードする。従って、コードされるペプチドのアミノ酸組成または特性に影響を及ぼすことなく、PAMPをコードする配列のヌクレオチド配列をこの位置でこれら3つの代替コドンのいずれかに変更することができる。遺伝暗号の縮重を基に、変種DNA分子は、先に説明された標準的DNA突然変異誘発技術を用いて、またはDNA配列の合成により、本明細書に開示されるcDNAおよび遺伝子配列から誘導してもよい。従って本開示は、PAMPをコードしているが、遺伝暗号の縮重により開示の核酸配列とは異なる核酸配列も包含する。
【０１４８】
B.ペプチド修飾
本開示は、本開示のPAMPおよびPAMPインヒビターペプチドの作用を模倣する生物学的活性分子を含む。本開示のペプチドは、本明細書に説明される天然のペプチドの合成態様に加え、PAMP受容体に特異的に結合するこれらのペプチドのアナログ(非ペプチド有機分子)、誘導体(開示ペプチド配列から出発して得られた化学的に機能化された蛋白質分子)、および変種(ホモログ)を含む。本開示の各ペプチドはアミノ酸配列により構成され、天然およびそうではないL-および／またはD-アミノ酸のいずれかでありうる。
【０１４９】
ペプチドは、様々な化学技術により修飾してもよく、未修飾のペプチドと本質的に同じ活性を有し、任意に他の望ましい特性を有する誘導体を生成しうる。例えば、カルボキシル末端であるか側鎖であるかに関わらず、ペプチドのカルボン酸基は、薬学的に許容できるカチオンの塩の形態で提供されるか、またはエステル化されC1-C16エステルを形成するか、もしくはNR1R2形のアミド(ここでR1およびR2は各々独立してHまたはC1-C16アルキルである)に転換されるか、または一緒にヘテロ環式環、例えば5または6員環を形成してもよい。アミノ末端であるか側鎖であるかに関わらず、ペプチドのアミノ基は、HCl、HBr、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸の塩、および他の有機塩などの薬学的に許容できる酸付加塩の形態であるか、またはC1-C16アルキルもしくはジアルキルアミノに修飾されるか、もしくはアミドに転換されてもよい。
【０１５０】
ペプチド側鎖のヒドロキシル基は、周知の技術を用いてC1-C16アルコキシまたはC1-C16エステルに転換されてもよい。ペプチド側鎖のフェニルおよびフェノール環は、1個または複数個のハロゲン原子、例えばフッ素、塩素、臭素、もしくはヨウ素で、またはC1-C16アルキル、C1-C16アルコキシ、カルボン酸、およびそれらのエステル、またはそのようなカルボン酸のアミドにより置換されてもよい。ペプチド側鎖のメチレン基は、同族のC2-C4アルキレンに拡張することができる。チオールは、多くの周知の保護基のいずれかひとつ、例えばアセトアミド基により保護することができる。当業者はまた、安定性を増強する構造へのコンホメーションの拘束を選択および提供するために、本開示のペプチドに環構造を導入するための方法を認識する。
【０１５１】
ペプチド擬態物および有機擬態物の態様も本開示の範囲内であり、そのようなペプチド擬態物および有機擬態物の化学的構成の三次元配置はPAMPまたはPAMPインヒビターペプチドのペプチド骨格および構成要素アミノ酸側鎖の三次元配置を模倣し、測定可能なまたは増強された血管新生または抗血管新生活性を持つ本開示のペプチドのペプチド擬態物および有機擬態物を生じる。コンピュータモデリングの適用については、ファルマコフォアが、生物学的活性のための構造上の必要要件の理想化された三次元定義である。ペプチド擬態物および有機擬態物は、最新のコンピュータモデリングソフトウェア(コンピュータ支援薬物設計またはCADDを使用して)で各ファルマコフォアに合致するようにデザインすることができる。CADDに使用される技術の説明については、Waltersの「Computer-Assisted Modeling of Drugs」、Klegerman & Groves, eds., 1993, 「Pharmaceutical Biotechnology」、Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, pp.165-174、および「Principles of Pharmacology」、Munson(ed.),1995, Ch.102を参照のこと。血管新生または抗血管新生ペプチドを生成する技術を用いて調製された擬態物も、本開示の範囲内に含まれる。
【０１５２】
C.融合蛋白質
本開示は、PAMPおよびPAMPインヒビターの融合蛋白質を含む。融合蛋白質は、天然には一緒に結合しては認められない2種のアミノ酸配列を含む蛋白質である。PAMP融合蛋白質は具体的には少なくとも(1)配列番号:4に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4と90％または95％の配列同一性を共有する配列と(2)配列番号:4に示されたアミノ酸配列、または配列番号:4と90％または95％の配列同一性を共有する配列の末端または内部のいずれかに配置されたペプチド部分とを含む。このようなPAMP融合蛋白質は加えて、このようなペプチド部分間にリンカーなどの他の蛋白質エレメントを含むことができる。
【０１５３】
融合蛋白質は例えば、関心対象の蛋白質が非常に少量で存在する場合、および蛋白質量が、その蛋白質の特徴決定、この蛋白質に対する抗体産生、または治療目的のこの蛋白質の利用に不充分である場合に使用される。公知の蛋白質またはペプチドDNA配列を関心対象の蛋白質のDNAと融合することにより、融合蛋白質(公知の蛋白質またはペプチドでタグを付けられた関心対象の蛋白質の組合せ)を大量に培養物中で産生することができる。
【０１５４】
ある例において、関心対象の蛋白質を生成しようと試みる場合、関心対象の蛋白質をコードしているDNA配列は、別の蛋白質(例えば、MBPもしくはGFP)の配列または同定可能なペプチド(例えば、HAもしくはc-Myc)をコードしている配列でタグ付けまたは融合される。その後この組換えDNAは微生物に導入され、これにより関心対象の蛋白質に加え、タグ蛋白質またはペプチドが発現される。関心対象の蛋白質を単離または局在化するために、この蛋白質の一部であるタグを単離または局在化する。
【０１５５】
例えば、融合蛋白質は適当なアガロースに結合した抗体スピンカラムに結合することができ、培養物上清または細胞溶解液中の他の蛋白質全てから分離することができる。特定の例において、ビオチン化された抗MBP、抗GFP、抗HA、および抗c-Mycを使用して融合蛋白質の生成を辿るか、またはウェスタンブロット様式で融合蛋白質を同定する。融合蛋白質が組織において発現される場合、ビオチン化された抗体を用いて組織切片内で関心対象の蛋白質を局在化することができる。
【０１５６】
説明されたGFPおよびMBPと同様に、ペプチドをコードしているDNA配列は、関心対象の蛋白質のDNA配列に導入することもできる。この融合蛋白質が発現されると、ペプチドアミノ酸配列により規定されたタグのエピトープを含む。ある態様において、アガロースに結合した抗HAまたは抗c-Mycを用いて、培養物上清または細胞溶解液から融合蛋白質を単離する。ビオチン化された抗体を用いて、ウェスタンブロットにおいて関心対象の蛋白質を同定するか、または場合によっては組織内において融合蛋白質を局在化する。融合蛋白質を作成および検出するこれらおよび他の方法は当業者に公知である。
【０１５７】
VII.血管新生アッセイ
以下の説明は、例えばPAMP、PAMPの誘導体およびアナログ、ならびにその血管新生活性のインヒビターもしくはインヒビターと推定されるものの存在下でのPAMPの血管新生活性を測定するのに有用であるであろう血管新生アッセイの例を提供する。当業者は、他の血管新生アッセイも使用することができることを認めるであろう。
【０１５８】
A.角膜ポケットアッセイ
これは、通常は無血管の角膜の新血管形成を促進する定義された物質の作用を辿るための「最も基準になる」方法である。血管新生または抗血管新生活について試験される物質は、およそ1〜2μl容量の不活性ハイドロンペレット中に徐放形態で固定される。このペレットは、麻酔をかけたC57BLマウス(またはウサギ)の角膜上皮の、微小切開により形成されたポケット中に移植される。5〜7日間にわたって、血管新生因子は、隣接する血管を有する角膜縁の血管の内方成長を刺激する。写真記録はスリットランプ写真により作成される。これらの血管の外観、密度、および広がりが評価され、スコア化される。場合によっては、進行の時間経過を、麻酔をかけた動物において辿り、その後屠殺する。血管は、長さ、密度、およびそれらが出現する縁の放射状表面(時計の文字盤の時刻として表される)について評価される。
【０１５９】
B.皮内スポンジ血管新生アッセイ
規定量の被験試薬を含浸した不活性バイオポリマースポンジが、皮下組織中に作成されたポケットに経皮切開により皮下移植される。その後5〜15日間の範囲の所定の期間経過後にスポンジは取り除かれ、新規血管形成が多くの生化学的および組織形態測定学的パラメータにより定量化される。スポンジの一部は、VEカドヘリン、FLK-1受容体などの内皮細胞に制限された遺伝子産物のウェスタンブロットにより抽出および分析されうる。同じ試料の凍結切片の一部は、同様の抗原について免疫組織化学により評価され、発現レベルはスポンジを侵襲した新規血管内に含まれる内皮細胞蛋白質を反映していることが確認される。マウス角膜ポケットアッセイと共に、腹腔内または静脈内経路による推定血管新生インヒビターの全身投与は、様々な微小血管床における血管新生刺激に対するこれらのインヒビターの局所作用の評価および比較を可能にする。
【０１６０】
C.鶏絨毛尿膜(CAM)アッセイ
CAMアッセイは、鶏胚絨毛尿膜(CAM)中で血管新生および抗血管新生の定量を可能にする。簡単に述べると、鶏卵は、インキュベーションの2または3日目に窓が開けられ、この窓は、テープ、ワックス、ガラススライド、またはパラフィルムで封をされる。インキュベーション8日目に、この窓が開けられ、小さいスポンジまたはゼラチン片が、成長しているCAMの上に置かれる。
【０１６１】
移植後、これらのスポンジは、血管形成の刺激物(例えば、PAMP)またはインヒビター(例えば、PAMP機能をブロックする抗体)により処理される。スポンジへ垂直におよびスポンジと周囲のCAM間葉細胞の間の境界で成長している血管が、12日目に形態測定法により計測される。スポンジへと成長する血管の数を増加する因子は血管新生性とみなされるのに対し、スポンジへの血管成長を阻害する因子は抗血管新生性とみなされる。新規血管数の定量は血管新生性の尺度を提供する。従ってこの技術は、血管新生のアゴニストまたはアンタゴニストの特徴決定を促進する。(より詳細には、Ribatti et al., J. Vasc. Res., 34:455-463,1997参照)。
【０１６２】
D.定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA)
シリコーンチューブ(外径0.15mm、New Age Industries, Southampton, PA)は、長さ1cmに切断され、各チューブの片端は液体シリコンで封止され、24時間乾燥され、その後オートクレーブにかけられる。被験物質の希釈液が、滅菌した冷エッペンドルフチューブ内のマトリゲル中に調製される。チューブはHamiltonシリンジで満たされる。ヌードマウスに麻酔をかけ、ポケットが各動物の背側皮膚内に形成される。その後チューブが、開放端を先にして移植され、その後創傷が閉じられる。
【０１６３】
9〜11日後、血管を可視化するために尾静脈にFITC-デキストランを注射し、この色素を約20分間、血管系を通じて分布させる。次にマウスをCO2で安楽死させ、皮膚ポケットを除去する。
【０１６４】
次に、チューブ口の近傍の血管を維持しつつ皮膚を切開する。その後マトリゲルをチューブから取り外し、ディスパーゼの存在下37℃でインキュベーションして激しく攪拌、遠心し、マトリゲルアリコートを蛍光放出のために96ウェルプレートに移す。蛍光は蛍光光度計により測定される。
【０１６５】
VIII.薬学的組成物
本明細書に説明される血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターは、治療または予防される疾患の位置および種類に応じて様々な方法で製剤化されうる。このように、患部または患部近傍での局所使用のため、および全身使用のため(物質は心臓血管系により広範に散在される方法で投与される)の両方のための薬学的組成物が提供される。本開示はその範囲内に、ヒトまたは獣医学的医薬に使用するために製剤化された少なくとも1種の血管新生ペプチド(例えば、PAMP)もしくは抗血管新生ペプチド、またはPAMPインヒビターを含む薬学的組成物を含む。血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターは典型的にはヒト対象を治療するために使用されるが、これらは、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの他の脊椎動物における同様のまたは同一の疾患を治療するために使用することもできる。
【０１６６】
活性成分として本明細書に説明されるような少なくとも1種の血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターを含む、または活性成分として血管新生ペプチドおよび追加の血管新生物質の両方を含む、または抗血管新生ペプチドもしくはPAMPインヒビターおよび追加の抗血管新生物質の両方を含む薬学的組成物は、選択された投与の具体的様式に応じて適当な固形または液体の担体と共に製剤化することができる。追加の活性成分としては、例えば、bFGFおよびVEGFのような血管新生物質、またはbFGFもしくはVEGFのインヒビターのような抗血管新生物質、またはメタロプロテイナーゼ2(MMP2)インヒビターもしくはメタロプロテイナーゼ9(MMP9)インヒビターのようなプロテアーゼインヒビターが挙げられる。MMP-2インヒビターの例としては、British BiotechnologyのMarimastat(BB-2516)およびBatimastat(BB-94)、AguronのPrinomastat(AG3340)、BayerのTanomastat(BAY 12-9566)、ならびにBMS-275291(Bristol Meyers/Squibb)が挙げられる。特に想定される天然のMMP-2インヒビターは、TIMP-2(メタロプロテイナーゼ2の組織インヒビター)であり、これはMMP-2に特異的であることがわかっている。
【０１６７】
適当な投与様式は、医療実務者が各対象について個別に最もうまく決定することができるであろう。様々な薬学的に許容できる担体およびそれらの製剤は、標準的製剤の専門書、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」、E. W. Martin著に記されている。Wang and Hanson, J. Parenteral Sci. Technol.、Technical Report No. 10, Supp.42:2S, 1988も参照のこと。
【０１６８】
薬学的組成物の剤形は、選択された投与様式により決定される。例えば、注射用液剤に加え、吸入、外用、点眼、腹膜、および経口用の製剤を利用することができる。吸入用調製物は、エアゾール、微粒子などを含みうる。一般的に、吸入用粒子サイズの目標は、吸収のために肺胞領域に医薬品を到達させるために約1μm以下である。経口製剤は、液体(例えばシロップ剤、液剤、または懸濁剤)、または固形(例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤)であってよい。固形組成物に関して、従来の無毒の固形担体としては、薬学的グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、または明らかである。
【０１６９】
組成物または薬学的組成物は、非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、または関節内注射もしくは注入、または舌下、経口、外用、鼻腔内、眼、または経粘膜投与、または肺の吸入を含む任意の経路により投与することができる。血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターが非経口組成物、例えば注射または注入用として提供される場合は、これらは一般に、水性担体、例えばpH約3.0〜約8.0、好ましくはpH約3.5〜約7.4、3.5〜6.0、または3.5〜約5.0の等張緩衝液中に懸濁される。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム-クエン酸およびリン酸ナトリウム-リン酸、ならびに酢酸ナトリウム/酢酸の緩衝液が挙げられる。治療有効量の調製物を経皮注射または送達の後に長時間または何日間にもわたって血流へと送達するために、貯蔵剤(repository)の形態または「デポ剤」の徐放式調製物が使用されうる。
【０１７０】
血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターは、持続放出システムによっても適切に投与される。持続放出製剤の好適な例としては、適当なポリマー材料(例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような成型品の形状の半透性ポリマーマトリックスなど)、適当な疎水性材料(例えば許容できる油中の乳剤として)またはイオン交換樹脂、およびわずかに可溶性の誘導体(例えばわずかに可溶性の塩など)が挙げられる。持続放出型血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターは、血管内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、心膜内、または冠動脈内注射により投与されうる。投与はまた、経口、経直腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、外用(散剤、軟膏剤、ゲル剤、液滴、または経皮貼付剤による)、口腔内、または経口もしくは点鼻スプレー剤でありうる。
【０１７１】
投与のための調製物は、血管新生および抗血管新生ペプチドならびにPAMPインヒビターの制御された放出を生じるように適宜製剤化することができる。例えば薬学的組成物は、生分解性ポリマーおよび／または多糖ゲル化(jellifying)および／または生体接着性のポリマー、両親媒性ポリマー、粒子の境界特性を修飾する物質、および薬学的活性物質を含有する粒子の形態であることができる。これらの組成物は、活性物質の制御された放出を可能にするある種の生体適合性を示す。例えば、米国特許第5,700,486号を参照のこと。
【０１７２】
一部の態様において、血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターは、ポンプによるか(Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201,1987；Buchwald et al., Surgery, 88:507,1980；Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321:574,1989参照)、または例えばミニポンプを用いる連続皮下注入により送達される。静脈内バッグ溶液も利用することができる。適当な投与量を選択する上で重要な因子は、血管新生の増加または減少により、または疾患の制御もしくは予防の測定のための他の判定基準により測定されるような得られる結果、実務者に適当と見なされるようなものである。他の制御された放出システムは、Langerの概説に考察されている(Science, 249:1527-1533,1990)。
【０１７３】
本開示の別の局面において、血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターは、例えば、米国特許第6,436,091号；第5,939,380号；および第5,993,414号に開示されたような移植ポンプにより送達される。移植可能な薬物注入装置を使用し、薬物またはいずれか他の治療的物質の一定の長期間の用量または注入を対象へ提供することができる。本質的にこのような装置は、能動型または受動型に分類することができる。
【０１７４】
能動型薬物またはプログラム可能な注入装置は、患者のシステムへ薬物を送達するためのポンプまたは計量システムを特徴としている。現在入手可能なこのような能動型薬物注入装置の例は、Medtronic SynchroMed(商標)プログラム可能ポンプである。このようなポンプは典型的には、薬物貯蔵庫、薬物を貯蔵庫からポンプ送出するための蠕動ポンプ、および貯蔵庫から送出された薬物をポンプにより患者の解剖学的構造へ輸送するためのカテーテル孔を備えている。このような装置は典型的には、ポンプへ電力を供給するバッテリーに加え、ポンプの流量を制御する電子モジュールも備える。Medtronic SynchroMed(商標)ポンプは更に、ポンプの遠隔プログラミングを可能にするためのアンテナを備える。
【０１７５】
対照的に、受動型薬物注入装置は、ポンプを特徴とせず、薬物を送達するために加圧された薬物貯蔵庫に頼っている。従って、このような装置は能動型装置と比べ、より小型であることに加え、安価であることの両方の傾向がある。このような装置の例としては、Medtronic IsoMed(商標)が挙げられる。この装置は、フローコントロールユニットを介して加えられた加圧された貯蔵庫によりもたらされる力により患者へ薬物を送達する。
【０１７６】
移植型ポンプは、対象の皮膚の下に完全に移植することができ、これにより経皮カテーテルの必要がない。これらの移植型ポンプは、血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターを一定のまたはプログラムされた送達速度で提患者へ供給することができる。一定の速度またはプログラムされた速度のポンプは、相変化または蠕動技術のいずれかに基づいている。一定で、不変の送達速度が必要である場合、定速ポンプが長期間の移植薬物送達に良く適している。注入速度の変更が期待される場合は、プログラム型ポンプを定速ポンプシステムの代わりに使用することができる。浸透圧ポンプは、注入速度が非常に遅いことがありうるので、他の定速ポンプまたはプログラム型ポンプよりもはるかに小型でありうる。このようなポンプの例は、米国特許第5,728,396号に開示されている。
【０１７７】
経口投与に関して、薬学的組成物は、結合剤(例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、乳糖、微晶質セルロース、またはリン酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容できる賦形剤と共に常法により調製された、例えば錠剤またはカプセル剤の形状をとりうる。錠剤は、当該技術分野において周知の方法によりコートすることができる。経口投与のための液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤、または懸濁剤の形をとることができるか、またはこれらは水または他の適当な溶剤により再構成して使用するための乾燥製品として提供される。このような液体調製物は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性溶剤(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、または精留された植物油)；および保存剤(例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸)などの薬学的に許容できる添加剤と共に常法により調製することができる。これらの調製物は適宜、緩衝用塩、矯味矯臭剤、着色剤、および甘味剤も含有することができる。
【０１７８】
吸入投与に関して、本開示に従って使用する化合物は簡便に、加圧容器またはネブライザーからのエアゾールスプレーの提供形態で、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体などの適当な噴射剤を用いて送達される。加圧したエアゾールの場合、単位用量は、計測された量を送達するためのバルブを提供することにより決定できる。吸入器または注入器に使用するためのカプセルおよびカートリッジは、この化合物と乳糖もしくはデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
【０１７９】
外用投与に関して、使用するための化合物は、例えば、エタノール、メタノール、プロピレングリコール、またはジメチルスルホキシドと混合され、これらは創傷または褥瘡潰瘍のような対象の体の標的領域への化合物の均一な分布を促進するための溶剤となる。
【０１８０】
活性成分として本明細書に説明した血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターを含有する薬学的組成物は通常、選択された投与の具体的様式に応じて、適当な固形または液体担体と共に製剤される。本開示において有用な薬学的に許容できる担体および賦形剤は従来のものである。例えば、非経口製剤は通常、薬学的および生理的に許容できる液体溶剤、例えば水、生理食塩水、他の平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどである注射可能な液体を含む。含有することができる賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物などの蛋白質である。望ましいならば、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤などの少量の無毒の補助物質、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートも含有してもよい。このような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるか、もしくは明らかであろう。
【０１８１】
例えば非経口投与に関して、血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターは一般に、注射可能な単位剤形(液剤、懸濁剤、または乳剤)中に望ましい純度で、薬学的に許容できる担体、例えば、使用される用量および濃度でレシピエントに対し無毒であり、製剤の他の成分と適合性のあるものと共に混合することにより製剤化することができる。薬学的に許容できる担体は、無毒の固形、半固形、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル封入材、またはあらゆる種類の製剤補助剤である。
【０１８２】
一般に、これらの製剤は、血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターを、液体担体もしくは細分された固形担体または両方と、各々均一かつ密接に接触させることにより調製される。その後必要であれば、この製品を所望の製剤に成形する。任意に、担体は非経口担体であり、一部の態様において、これはレシピエントの血液と等張な溶液である。このような担体溶剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非水性の溶剤、例えば不揮発性油およびオレイン酸エチルも、更にはリポソームも、本明細書において有用である。
【０１８３】
血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターを含む薬学的組成物は、一部の態様において、正確な用量の個別の投与に適している単位剤形で製剤化される。投与される活性化合物の量は、治療される対象、苦痛の重症度、および投与様式に左右され、処方する医師の判断に委ねるのが良い。これらの範囲内において、投与される製剤は、治療される対象において所望の作用を実現するのに有効量の活性成分の量を含有する。
【０１８４】
血管新生もしくは抗血管新生ペプチドまたはPAMPインヒビターの治療有効量は、利用されるペプチドまたはインヒビター、治療される対象、苦痛の重症度および種類、ならびに投与様式により左右される。PAMPは、bFGFおよびVEGFなどの他の公知の血管新生因子よりも100万倍強力であるので、その投与される量は、一部の態様においては、他の血管新生因子について必要とされる量よりもかなり少ない。例えば、PAMPまたはPAMPインヒビターの治療有効量は、約0.1nM/kg体重〜約1μM/kg体重、例えば約1nM〜約500nM/kg体重、または約5nM〜約50nM/kg体重まで変わりうる。正確な投与量は、具体的な化合物の効力、対象の年齢、体重、性別、および生理的状態を基に、当業者によって容易に決定される。
【０１８５】
本開示のペプチド(例えば、PAMPおよびPAMPインヒビター)は、このペプチドをコードしている裸のDNAとして投与することもできる。ペプチドをコードしている核酸の操作および取り扱いを簡単にするために、核酸は一般にカセットに挿入され、プロモーターに機能的に連結される。好ましくは、プロモーターは、所望の標的組織の細胞において蛋白質の発現を駆動することが可能である。適当なプロモーターの選択は、容易に実現することができる。好ましくは、プロモーターは、高発現プロモーター、例えば763塩基対サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター(Davis, et al., Hum. Gene. Ther., 4:151,1993)、またはMMTプロモーターである。
【０１８６】
エンハンサーなどの発現を増強する他のエレメント、またはtat遺伝子もしくはtarエレメントなどの高レベルの発現を生じるシステムも含むことができる。このカセットは、ベクター、例えばpUC118、pBR322などのプラスミドベクター、または例えば大腸菌の複製起点を含む他の公知のプラスミドベクターに挿入される。Sambrookら「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)を参照のこと。プラスミドベクターは、マーカーポリペプチドが、治療される生物の代謝に有害に作用しないならば、アンピシリン耐性に関するβ-ラクタマーゼ遺伝子などの選択マーカーを含むこともできる。このカセットは、国際公開公報第95/22618号に開示されたシステムなどの合成送達システム中の核酸結合部分に結合することもできる。
【０１８７】
任意にDNAは、カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなどの微量送達ビヒクルと共に使用されても良い。(リポソーム調製法、内容物の標的化および送達法の概説については、Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682,1988；Feigner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21,1989；およびMaurer, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25,1989を参照のこと)。複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技術に従って作成することができる。(Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584,1992；Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest, 90:626-630,1992；およびRosenfeld, et al., Cell, 68:143-155,1992参照のこと)。
【０１８８】
核酸の有効量は、特定の発現された蛋白質、標的組織、対象、および対象の臨床状態の関数であろう。DNAの有効量は、約1〜4000μg、または約1000〜2000、または約2000〜4000の間である。ある状況においては、治療結果を最適なものにするために、2種以上の異なる蛋白質をコードする核酸を使用することが望ましい。例えば、PAMPペプチドおよび他の血管新生蛋白質、例えばVEGFまたはbFGFをコードしているDNAを使用することができる。あるいは、標的化された細胞の活性を増強し同時に血管新生を誘導するために、PAMPをコードしているDNAを他の遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子産物と組合わせることができ、これは例えば、一酸化窒素合成酵素、L-アルギニン、フィブロネクチン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲンアクチベーター、およびヘパリンを含む。
【０１８９】
注射を容易にするために、核酸は、薬学的に許容できる担体と共に製剤化される。適当な担体の例としては、生理食塩水、アルブミン、デキストロース、および滅菌水が挙げられる。核酸は、標準的注射技術を用いて、例えば、皮下針、例えばNo.29〜No.16の間の皮下針サイズを用いて虚血組織に注射される。核酸は、アレルギー試験のための抗原注射に使用されるもののような外部適用される局所用注射装置、または皮下筋肉に送達することが可能である経皮「パッチ」により注射することもできる。核酸はひとつの部位、または虚血組織全体の複数の部位に注射される。
【０１９０】
一旦注射されると、所望の血管新生蛋白質を発現することが可能である核酸は、組織の細胞に取込まれて発現される。関心対象の核酸を含有するベクターは通常細胞ゲノムには組込まれないので、関心対象の蛋白質の発現は、限られた期間のみ生じる。典型的には、血管新生蛋白質は、約2日から数週間、好ましくは約1〜2週間、治療的レベルで発現されるのみである。DNAの再注射を利用し、追加の期間の血管新生蛋白質の発現を提供することができる。所望であれば、レトロウイルスベクターを使用して異種DNAを細胞ゲノムへ組込むことにより、治療的ポリペプチドが発現される期間の長さが数週間から無限に延長される。
【０１９１】
血管新生蛋白質の発現およびその組織細胞からの分泌は、血管新生を誘導し、虚血の治療を可能にし、その結果、末梢血管疾患、脳虚血、または冠動脈疾患などの疾患の治療が可能となる。
【０１９２】
IX. 治療的使用
A. PAMPによる疾患または状態の治療法
冠動脈疾患、脳虚血、創傷、または末梢血管疾患を有するまたは発症のリスクのある対象における領域内の血管新生を促進する方法が、本明細書に開示される。本方法は、治療領域へ治療有効量のプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)を導入し、これによって対象における血管新生を促進する段階を含む。一部の態様において、PAMPは、例えば虚血性組織へVEGFを送達するために使用されるプロトコールを使用して、そのペプチドをコードしている裸のDNAとして投与される(例えば、Isner, et al., J. Vasc. Surg., 28:964-975,1998；Losardo et al., Circulation, 98:2800-2804,1998参照)。
【０１９３】
一部の態様において、PAMPペプチドまたはペプチドをコードするDNAは、例えば新血管形成が望ましい創傷もしくは他の病巣への直接の外用投与により患部へ局所的に投与されるか、または虚血状態の四肢などの患部へ非経口的に方向付けられる。末梢血管疾患を患う対象に関して、投与は、例えば、創傷への直接外用投与によるか、または罹患した四肢への動脈内、静脈内、皮下、もしくは筋肉内注射による。治療効力は、例えば、症状の後退、例えば脚または腕の痙攣の減少、もしくは跛行、しびれ、刺痛、脱力、もしくは疼痛の減少、または肢の皮膚潰瘍の治癒により示される。また血管機能の改善は、例えば、皮膚温度の上昇または手足の皮膚の色の変化により示される。
【０１９４】
脳虚血を患う対象に関して、投与は、例えば動脈内もしくは髄腔内注射によるか、または虚血性脳領域の直接注射による。動脈内注射は、例えば後頭皮質へ物質を投与するための脳底動脈への注射によって虚血性領域へ方向付けられる。一部の態様において、投与は、血液脳関門の浸透圧破壊後の静脈内または動脈内注射による(例えば、米国特許第5,124,146号参照)。一部の態様において、投与は、例えば脳底動脈、頸動脈、または脳動脈への注射による。治療効力は、例えば、症状の軽減、例えば、顔面、腕、もしくは脚のしびれまたは脱力の減少、錯乱の低下、発語の改善、視力改善、または歩行、平衡、もしくは共調の改善により示される。
【０１９５】
冠動脈疾患を患う対象に関して、投与は、例えば、動脈内(特に冠動脈内)、または心膜内注射による。一部の態様において、PAMP蛋白質またはペプチドをコードしているDNAは、静脈内注射などにより全身に投与される。治療効力は、例えば胸部圧迫または疼痛などの症状の後退により表される。
【０１９６】
創傷を患う対象に関して、投与は、例えば皮下または静脈内注射により、創傷への直接注射により、または外用塗布による。治療効力は、例えば創傷治癒の改善により決定される。
【０１９７】
対象が、脳虚血、冠動脈疾患、もしくは末梢血管疾患を発症したかまたは発症のリスクがある場合はいつでも、あるいは胸部または四肢の疼痛などの、脳、心臓、もしくは1つまたは複数の四肢への血流低下の症状、または眩暈、錯乱、発語喪失、もしくは動性の低下などの神経症状が存在する場合に投与を開始することができる。
【０１９８】
血管新生因子の組合せも使用される。例えば、PAMPペプチドまたはペプチドをコードしているDNAは、bFGFまたはVEGF蛋白質または蛋白質をコードしているDNAと一緒に投与される。
有効量のPAMPペプチドまたはペプチドをコードしているDNAは、単回投与量、または複数回投与量で、例えば治療期間中に毎時、毎日、または毎週投与することができる。
【０１９９】
B. PAMPインヒビターによる疾患または状態の治療法
本明細書において、腫瘍、網膜症、乾癬、子宮内膜症、もしくは関節炎を有するまたは発症のリスクがある対象の領域において血管新生を阻害する方法が開示される。本方法は、治療有効量のPAMPインヒビターをこの領域に導入し、これにより対象における血管新生を阻害する段階を含む。一部の態様において、PAMPインヒビターは、VEGFを虚血性組織に送達するために使用されるプロトコールを用い、このペプチドインヒビターをコードしている裸のDNAとして投与される(例えば、Isner, et al., J. Vasc. Surg, 28:964-975,1998；Losardo et al., Circulation, 98:2800-2804,1998参照)。
【０２００】
ひとつの態様において、PAMPインヒビターまたはインヒビターペプチドをコードしているDNAは、局所的に投与される。腫瘍を持つ対象に関して、投与は、例えば、腫瘍の動脈供給への動脈内注射によるか、または腫瘍への直接注射による。別の投与経路は腫瘍の位置により決定される。例えば卵巣腫瘍は、このインヒビターによる腹腔内洗浄により治療される。例えば脳腫瘍は、動脈内または髄腔内注射により、鼻腔内投与により、罹患した脳領域への直接注射により、または血液脳関門の浸透圧破壊後の静脈内もしくは動脈内注射により治療される(例えば、米国特許第5,124,146号参照)。例えば肺癌は、腫瘍への直接注射により、吸入、またはは罹患した肺葉の血液循環への注入により治療される。治療効力は、例えば腫瘍組織量のモニタリングにより決定されるか、または例えば疼痛などの症状の低減により示される。
【０２０１】
網膜症を患う対象に関して、投与は、例えば、眼球内注射(例えば、眼の後眼房へ)、または点眼投与による。あるいは、薬剤は、血管内、例えば網膜動脈への血管供給へと投与されてもよい。治療効力は、例えば、視力の改善、視力の安定化、網膜の新規血管形成の欠如、または疾患進行の失敗により決定される。
【０２０２】
乾癬を患う対象に関して、投与は、例えば、皮下もしくは静脈内注射、または外用塗布による。治療効力は、例えば乾癬症状の軽減により決定される。
【０２０３】
関節炎を有する対象に関して、投与は、例えば関節内注射による。治療効力は、例えば、運動性の改善、または関節痛の軽減を検出することによりモニタリングされる。
【０２０４】
子宮内膜症を患う対象に関して、投与は、例えば、子宮内膜性増殖物への直接注射によるか、またはPAMPインヒビターによる腹腔内洗浄による。治療効力は、例えば、運動性の改善、または骨盤痛の軽減により示される。
【０２０５】
インヒビターの投与は、対象が、腫瘍、網膜症、乾癬、または子宮内膜症を発症したか、または発症のリスクがある場合はいつでも、または不適切な新血管形成の症状が存在する場合に、開始することができる。
【０２０６】
PAMPインヒビターと他の抗血管新生因子の組合せも使用される。例えば、PAMPインヒビターまたはインヒビターペプチドをコードしているDNAは、bFGFまたはVEGFインヒビター、例えば特異的VEGF-RアンタゴニストであるSU5416、ならびにVEGF、bFGF、およびPDGFの受容体をブロックするSU6668などと一緒に投与される(例えば、Liu et al., Seminars in Oncology, 29(Suppl 11):96-103,2002；Shepherd et al., Lung Cancer, 34:S81-S89,2001参照)。
【０２０７】
有効量のPAMPインヒビターまたはインヒビターペプチドをコードしているDNAは、単回投与量、または複数回投与量で、例えば治療期間中、毎日、毎週、2週毎、または毎月投与することができる。
本開示は、下記の非限定的な実施例により例証される。
【０２０８】
実施例
実施例1：血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、アドレノメジュリン(AM)、およびプロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)の血管新生能の比較
本実施例は、公知の血管新生因子と比較してPAMPの血管新生能を測定するための、定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 94:1226-1237,2002参照)の使用説明を提供する。
【０２０９】
A.インプラントの調製
インプラントは下記のように調製した：シリコーンチューブ(外径0.15mm、New Age Industries, Southampton, PA)を長さ1cmに切断した。各チューブの片端を液体シリコンで封止し、24時間乾燥してフューム（fume）を発散させた。チューブをオートクレーブにかけた。
【０２１０】
被験物質の希釈液を、滅菌した冷エッペンドルフチューブ内のマトリゲル中で調製した。マトリゲルの過剰な希釈を避けるために、25xストック液を調製した。チューブをHamiltonシリンジで満たした。全ての材料は滅菌し冷却保存した。各チューブは18〜20μlを要した。マトリゲルは37℃で少なくとも30分かけて固化した。
【０２１１】
B.外科的手法
ヌードマウスにケタミンおよびキシラジン(比1:4)を、マウス1匹につき50μlを皮内的に用い、麻酔をかけた。はさみで各動物の背側皮膚にポケットを形成した。チューブを開放端を先にして移植した。その後創傷を手術用クリップで封鎖した。マウスは、意識が回復するまで暖かさを保った。その後マウスを9〜11日間飼育した。
【０２１２】
C.血管新生の定量
マウスを加熱用ランプの下に置き、それらの尾静脈を拡張させた。尾静脈に、FITC-デキストラン(Sigma)25mg/mlを100μl/マウスとなるよう注射した。約20分後、色素が分布した。その後マウスをCO2で安楽死させ、皮膚ポケットを除去し、PBSで湿らせた布の中に保存した。
【０２１３】
その後皮膚を切開し、チューブの口近傍の血管を維持した。チューブは、300μlディスパーゼ(Collaborative Biomedical Products)を含むエッペンドルフチューブに置いた。その後マトリゲルをチューブから取り外し、これらは後に必要となるまで凍結した。
【０２１４】
マトリゲルは、解凍して37℃で1時間インキュベーションし、その後激しく攪拌、遠心し、100μlを蛍光放出(黒色側)のために96ウェルプレートに移した。FITCの励起は485nmであった。発光は535nmであった。蛍光は、蛍光光度計により測定した。
【０２１５】
D.結果
表2、図1、および図2に示したように、PAMPは、VEGFまたはAMのいずれよりも有意により強力な血管新生因子であった。
【０２１６】
【表２】
2006516537.tif 000003
値は、任意の蛍光単位として表された5個のインプラントの平均±標準偏差を表す。
【０２１７】
実施例2：PAMPは強力な血管新生因子であり、その阻害は腫瘍増殖を低下する
本実施例は、PAMPは非常に強力な血管新生因子であり、VEGFおよびAMなどの他の古典的プロ血管新生因子よりも6桁低い濃度で、動物モデルにおいて新血管形成を誘導することができることを明らかにしている。この実施例はまた、ヒト微小血管内皮細胞はPAMPの受容体を有し、マトリゲルアッセイにおいて、それらの遊走および索(cord)形成を増加することにより、これに反応することも明らかにしている。加えて本実施例は、PAMP刺激が内皮細胞における古典的血管新生因子の発現を誘導すること、およびカルボキシ末端ペプチド断片PAMP(12-20)が、PAMPで誘導された血管新生のインヒビターとして作用し、腫瘍進行の異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を遅延することができることも示している。 
【０２１８】
A.実験手法
化学物質
合成ヒトAM、PAMP、およびPAMP(12-20)は、Bachemから購入した。組換えヒトVEGFおよびbFGFは、R&D Systemsから入手した。
【０２１９】
鶏胚大動脈弓アッセイ
鶏胚大動脈弓アッセイは、エクスビボ血管新生アッセイであり、既に説明されているように行った(Isaacs, et al., J. Biol. Chem., 16;277(33):29936-44,2002；Auerbach et al., Clin. Chem., 49,32-40,2003)。簡単に述べると、長さ約0.8mmの大動脈リングを13日齢の鶏胚(Truslow Farms)の五つの大動脈弓から調製し、外膜層の軟結合組織をピンセットで慎重に取り除いた。各大動脈リングを、48ウェルプレートのウェルの中央に配置し、マトリゲル(BD Biosciences)10μlで覆った。マトリゲルが固化した後、適切な濃度の被験物質を含み増殖因子を含まないヒト内皮SFM基本増殖培地(Invitrogene)300μlを、各ウェルに添加した。これらのプレートを、湿潤インキュベーター中に37℃、5％CO2で24〜36時間維持した。各大動脈リングから出芽する微小血管を倒立顕微鏡で写真撮影し、新たに形成された毛細血管で覆われた領域を画像解析により見積もった。
【０２２０】
定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA)
血管新生の分析および定量は、既に説明されているDIVAA(Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst, 21;94(16):1226-37,2002；Guedez et al., Am. J. Pathol., 162,1431-1439,2003)を用いて行った。簡単に述べると、長さ10mmの片端だけが開いている手術用シリコーンチューブ(アンギオリアクター)に、20μlのマトリゲル単独、またはAM、bFGF、VEGF、PAMP、および／もしくはPAMP(12-20)との混合物を指定された濃度で充填した。ヒト肺癌細胞株(下記参照)も、マトリゲル単独またはPAMP(12-20)と一緒に、1個のアンギオリアクターにつき10,000細胞で予め混合した。マトリゲルが固化した後、アンギオリアクターを、麻酔をかけた無胸腺ヌードマウスの背側脇に移植した(NCIコロニー)。11日後、マウスに25mg/ml FITC-デキストラン(100μl/マウス、Sigma)を静脈内注射し、20分後、アンギオリアクターを取り出した。これらのインプラントの写真を、血管新生反応の目視検査のために撮影した。アンギオリアクター内の新血管形成の量は、インプラント中に捕獲された蛍光の量として決定し、HP分光光度計(Perkin Elmer)により測定した。
【０２２１】
使用したヒト癌細胞株A549およびH1299は、American Tissue Culture Collection(ATTC)から入手し、10％ウシ胎仔血清を含有するRPMI1640(Invitrogene)を与えた。動物において使用する前に、両細胞株を、ヒトおよびマウスの病原体パネルについて試験し、病原体が存在しないことを確認した。
【０２２２】
カルシウム測定
ヒト皮膚微小血管内皮細胞をCell Applications, Inc.から入手し、96ウェルプレート中、1.0x105個細胞/ウェルで培養した。細胞に蛍光色素FLIPR(Molecular Devices)を室温で60分間負荷し、その後分析のためにFlexStation II(Molecular Devices)へ移した。被験化合物は、別のプレートにおいて5x濃度で調製し、FlexStation IIのロボットアームにより適当なウェルに添加した。蛍光を、各ウェルにおいて5秒毎に測定し、記録した。1mM ATP(Sigma)を、カルシウムアゴニストとして使用した(Lau et al., Life Sci., 73,2019-2028,2003)。
【０２２３】
増殖アッセイ
同じ微小血管内皮細胞を、96ウェルプレートにおいて、異なる濃度の被験ペプチドを含有する無血清培地中に、密度2.0x105個細胞/ウェルで播種した。3日間培養した後、1個のウェルあたりの生存細胞の数を、既報のMTTアッセイ(Iwai et al., Lung Cancer, 23,209-222,1999)により概算した。結果は、未処理の対照を上回る増殖率(％)として表した。
【０２２４】
遊走アッセイ
細胞運動性は、既報(Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002)のように測定した。被験ペプチドを、様々な濃度でChemoTxチャンバー(NeuroProbe Inc.)の底に配置した。間の膜を、10μg/mlフィブロネクチンでコートし、上側チャンバーに5.0x105個ヒト内皮細胞を添加した。37℃で4時間インキュベーションした後、膜を固定し、染色した(Protocol Hema3, Biochemical Sciences Inc.)。多孔質の膜に捕獲された細胞を、25x顕微鏡対物レンズにより写真撮影し、1写真視野あたりの細胞数をカウントした。
【０２２５】
索形成アッセイ
ヒト内皮細胞を、2.0x105個細胞/ウェルで被験ペプチドの存在または非存在下、24ウェルプレートの底を覆うマトリゲルの固形層の上に説明されたように播種した(Nam et al., Phytother. Res., 17,107-111)。一晩インキュベーションした後、管状構造を写真撮影し(1ウェルにつき3枚の写真)、1写真視野あたりの節(knot)の数を、格子の複雑さ(lattice complexity)の尺度としてカウントした。
【０２２６】
遺伝子発現のリアルタイムPCR定量
ヒト内皮細胞を、T-75フラスコ中、密度2.5x106個細胞/ウェルで培養した。細胞がプレートの底に付着した後、これらを無血清培地中10nM PAMPで24時間処理した。この曝露の終了時に、細胞をPBSで1回洗浄し、プレートから剥ぎ取り、それらの総RNAをQiagenのRNeasy Mini Kitを用い抽出し、SuperScript First-Strand Synthesisシステム(Invitrogen)を用い逆転写した。遺伝子発現の定量は、既報(Martinez et al., J. Endocrinol., 176,95-102,2003)のようにリアルタイムPCRで行った。PCR反応は、Sybr Green PCRマスターミックス(Applied Biosystems)を用い、Opticonサイクラー(MJ Research)上で進行した。サーモサイクリングは、cDNA(1:10希釈)2μlおよびプライマー(下記参照)400nMを含有する最終容量25μlにおいて行った。全ての標的は、ハウスキーピング遺伝子と同じ試行で、下記のサイクル方式を用いて3つ組で増幅した：最初に試料を95℃で2分間変性させた後、95℃で30秒間、60℃で30秒間、および72℃で30秒間を46サイクル行った。
【０２２７】
全ての試料において、蛍光は各サイクルで測定し、mRNAレベルは18S RNA値により標準化した。PCR後に温度を50℃から96℃(増分0.5℃)で上昇することにより融解曲線を実行した。全てのアンプリコンに関して単一のピークが得られ、従ってこの反応の特異性が確認された。
【０２２８】
プライマーは以下のとおり：
2006516537.tif 000004
【０２２９】
異種移植片実験
NIHコロニー(Frederick(MD))から入手した20匹の雌性無胸腺ヌードマウスに、1.0x107個A549細胞/マウスを皮下注射した。2週間後、マウスは全て、皮膚の下に触知可能な腫瘍を発生させ、この時点でマウスを2群に分けた。週3回、個々の腫瘍を各々測定し(長さ、高さ、厚さ)、各マウスに、その群に応じた腫瘍内注射を施した。第1群(対照)には、PBS 100μlを与えた。第2群は、1μM PAMP(12-20)のPBS溶液を100μl与えた。腫瘍組織量を保持しきれなくなった時点で、マウスを屠殺した。
【０２３０】
統計解析
適当な場合、データは、両側スチューデントt検定により比較した。0.05未満のP値は、統計学的に有意であるとみなした。
【０２３１】
B. PAMPのエクスビボおよびインビボアッセイにおける血管新生能
血管新生を試験するには多くの方法があり(Auerbach et al., Clin. Chem., 49,32-40,2003)、本実験は、PAMPの血管新生特性の予備的評価のために、鶏胚大動脈弓アッセイを使用する。AMおよびVEGFのような通常の血管新生分子は、100nMおよびそれよりも高い濃度で、未処理の対照を上回る出芽血管の統計学的に有意な増加を誘導することができた。比較すると、PAMPは、1nMと低い濃度で多くの血管の成長を誘導することができるのに対して、AMおよびVEGFはこの濃度では、対照を上回る有意な増殖を促進することができない(図3A)。この最初の知見は、PAMPは、それまで説明された分子よりもはるかに強力なプロ血管新生因子であることを示している。
【０２３２】
この知見を更に特徴付けるために、下記の血管新生特性のより正確な定量を可能にするインビトロアッセイを用いた：定方向インビトロ血管新生アッセイまたはDIVAA(Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002；Guedez et al., Am. J. Pathol., 162,1431-1439,2003)。このアッセイは、被験物質を保有している小さいシリコーンカプセルをヌードマウスの皮下に移植することを含む。11日後、マウスに特定量のFITC-デキストランを注射し、このインプラントを通って循環している血液の容量を、カプセル中の蛍光を測定することにより定量する。加えて、シリコーンチューブへの新規血管増殖は、透明性のために直接観察することができる(図4A-F)。興味深いことに、PAMPは、1フェムトモル/Lという低い濃度で、血管新生反応を誘起することができた(図4C)。血管新生反応の程度は、この反応を陰性対照と比べた場合に明らかに認めることができる(図4A)。PAMPにより誘起された血管新生反応は、用量依存性であった(図4C-G)。等モル濃度のVEGF反応と比較した場合、明確な差異が認められた。この動物モデルにおいて、AMおよびVEGFは、ナノモル濃度で血管新生を誘導し始めたのに対し、PAMPはフェムトモル範囲で既に活性があった(図4G)。
【０２３３】
C. PAMP受容体が内皮細胞に存在する
AM受容体は分子レベルで良く特徴付けられているが(McLatchie et al., Nature, 393,333-339,1998)、PAMP受容体の構造は未だ入手不可能である。しかしながら、副腎髄質細胞のPAMPへの曝露は、カルバコールが誘導したカルシウム流入の減少をもたらす(Katoh et al., J. Neurochem., 64,459-461,1995)。内皮細胞において類似条件を作出するために、細胞を、周知のこれらの細胞におけるカルシウム流入の一過性アゴニストである1mM ATPで刺激し(Lau et al., Life Sci., 73,2019-2028,2003)、典型的反応を得た(図5、□)。この反応は、培地中の10nM PAMPの存在により大きく低下された(図5、◇)。ペプチド断片PAMP(12-20)は、血圧調節において全長PAMPとは逆の作用を有することが示され(Fry et al., Life Sci., 60,PL161-167,1997)、このことは、そのPAMPアンタゴニストとしての利用可能性を示唆している。阻害特異性を明らかにするために、過剰なPAMPペプチド断片を添加し、初期反応を回復した(図5、○)。まとめると、これらのデータは、内皮細胞の膜に機能性PAMP受容体が存在し、その結果このペプチドは前述のような血管新生反応を直接活性化しうることを示している。
【０２３４】
D. 内皮細胞に対するPAMPの生理作用
血管新生が起こるためには、内皮細胞が増殖して新たな位置へ遊走し、それら自身が最終的には中空の管に発達する固形索へ組織化しなければならない。これらのプロセスは全てプロ血管新生物質により促進され、全てのプロ血管新生分子は、これらの生理学的作用の少なくともひとつを誘起しなければならない。これらの現象のいずれがPAMPにより誘導されるかを調べるために、ヒト微小血管内皮細胞を、漸増濃度のPAMP、AM、およびVEGFに曝露し、それらの増殖(図6A)、遊走(図6B)、および索形成(図6C)に対する作用を比較した。
【０２３５】
内皮細胞増殖の分析は、AMおよびVEGFは濃度10-8Mで、対照を上回る増殖を有意に増加することができることを示した(両方についてp＜0.001)。他方で、PAMPは、試験した濃度では細胞増殖を有意に修飾しなかった(図6A)。
【０２３６】
これらのペプチドを様々な濃度で含有するウェルへの内皮細胞の遊走を試験した場合、これら3種の分子の挙動は、全く違うパターンを有した。この時、AMは、試験した濃度範囲では細胞遊走を有意に修飾しないのに対し、VEGFおよびPAMPは両方とも濃度10-11Mで、遊走の4倍の増加を生じた(両方についてp＜0.001)。VEGFについて先に報告されたように、両分子は遊走刺激のピークを示し、10-11Mより低いまたは高い濃度で効率は下がった。興味深いことに、10-11Mより低い他のVEGF濃度でも細胞遊走の有意な増加を誘導したので(図6B)、このピークはPAMPについてより顕著であった。
【０２３７】
マトリゲルアッセイにおいて、AM、VEGF、およびPAMPの索形成を誘導する能力も試験した。3種の分子は、用量依存的に索形成を誘導することができた。VEGFが最も効率的物質であり、それにAMが続き、PAMPはこのアッセイでは最も少ない作用を有した(図6C)。
【０２３８】
加えて、外部から加えたPAMPが、他のプロ血管新生分子の遺伝子発現に影響を与えるかどうかも調べた(図6D)。リアルタイムPCR実験により、PAMPの大部分は、基本レベルを約50％上回ってそれ自身の遺伝子(AM)の発現を誘導することが示された。PAMPは、VEGF、bFGF、およびPDGF Cの発現を上昇することも可能であった。反対に、PDGF AまたはPDGF Bの発現における有意な修飾は認められなかった(図6D)。10nM AMまたはVEGFの添加が、AM/PAMP遺伝子の発現に対して作用を有するかどうかも調べたが、処理した内皮細胞について得られた値は、未処理の対照と識別不能であった。
【０２３９】
E. PAMPアンタゴニストはインビボ血管新生を阻害する
PAMPは血管新生の強力なプロモーターであることをデータが示しているので、PAMPの阻害は血管新生を低下させることができると考えられ、腫瘍増殖の管理に有益である可能性がある。ペプチド断片PAMP(12-20)は、内皮細胞においてPAMP受容体アンタゴニストとして作用することから、このペプチドの血管新生の阻害能をインビボにおいて試験した。まず、合成全長PAMPの濃度1nMと漸増用量のPAMP(12-20)との間の競合を、DIVAAアッセイを用いて調べた。PAMPにより誘起された血管新生反応の用量依存型阻害が観察された(図7A)。100倍過剰量のペプチド断片(100nM)は、対照から得られる基本レベルにまで血管新生を阻害した(図7Aの第一のバー)。このペプチド断片はそれ自身は、基本的血管新生を修飾しなかった(図7Aの最後のバー)。
【０２４０】
腫瘍細胞は多くの血管新生因子を産生することから(Chlenski et al., Cancer Lett., 197,47-52,2003)、PAMPの血管新生反応全体に対する寄与を調べた。2種のヒト非小細胞肺癌細胞株(A549およびH299)をマトリゲルに添加し、DIVAAアッセイに配置した。両細胞株は、血管新生反応を誘導し(図7B)、これは100nM PAMP(1-20)により完全にブロックされ、このことは、血管新生を開始するためにはPAMPシグナル伝達が何らかの形で必要であることを示している。
【０２４１】
先のデータは、PAMPの阻害が抗腫瘍療法として有用であることを強力に示唆している。これが真実であるかどうかを明らかにするために、異種移植片実験を行った。ヒト細胞株A549を、無胸腺ヌードマウスに皮下注射し、2週間後に、全ての動物が触知可能な腫瘍塊を注射部位に発生した。これらのマウスを、2つの均等な群に分け、各セットは異なる処置を週3回受けた。対照群は、溶剤(PBS)で処置し、マウスが処置開始後18日目に屠殺されるまで腫瘍塊は増大し続けた(図8、□)。対照的に、1mM PAMP(12-20)を受けたマウスは、より遅い速度の腫瘍増殖を示した(図8、◇)。これらの群間の腫瘍サイズは、9日間の処置後、統計学的差異が認められた。
【０２４２】
F.考察
従って、AM遺伝子関連ペプチドPAMPは、AMおよびVEGFのようなこれまでに認められている血管新生分子よりも6桁低い濃度で活性がある強力な血管新生因子である。加えて、PAMPの受容体はヒト内皮細胞に存在し、これらの細胞は、他の血管新生因子の発現が高められる(boost)のと同時に、それらの遊走および索形成能を増大することにより、PAMPの存在と反応する。加えてペプチド断片PAMP(12-20)は、新血管形成が合成PAMPによりまたは腫瘍細胞により誘導されたかどうかにはかかわらず、血管新生アンタゴニストとして作用し、異種移植片モデルにおける結果により示されたように、腫瘍管理の新規治療法を提供する。
【０２４３】
実施例3：機能をブロックする抗PAMP抗体の産生
機能をブロックする(機能を中和する)精製ポリクローナル抗体は、下記の方法で産生される。PAMPペプチドまたはPAMPペプチドの一部1mg、およびキーホールリムペットヘモシアニン(KLH)1mgを、1mlのPBS中で混合する。25％グルタルアルデヒド(Sigma)10μlをこの混合物に添加すると、フロキュラー（flocular）となる。その後、この混合物を完全フロイントアジュバント1mlに添加し、乳化する。
【０２４４】
宿主動物(通常マウスまたはウサギ)にこの混合物100μlを皮下投与する。投与は2週毎に繰返すが、反復投与のための混合物は不完全フロイントアジュバントで作成する。投与は、マウスでは3回繰返し、この時点で動物を屠殺する。ウサギでは、投与は2週毎に、無期限に繰り返す。
【０２４５】
抗体がその標的蛋白質を特異的に検出することの決定は、多くの標準的イムノアッセイ法のいずれかにより行う；例えば、ウェスタンブロット技法(Sambrook et al.、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」、CSHL, New York, 1989)。
【０２４６】
抗体がPAMP血管新生活性を特異的にブロックすることの決定は、 多くの標準的血管新生バイオアッセイのいずれかにより行う；例えば、角膜ポケットアッセイ(例えば、Kenyon et al., Invest Opthalmol. Vis. Sci. 37:1625,1996； Gaudric et al. Ophthal. Res., 24:181,1992)、CAMアッセイ(Wilting et al., Anat. Embryol., 183:259,1991参照)、鶏またはラットの大動脈リングモデル(例えば、Lichtenberg et al., Pharmacol Toxicol., 84:34,1999参照)、定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002；実施例1参照)、または鶏胚大動脈リングアッセイ(例えば、Isaacs, et al., J. Biol Chem., 16;277(33):29936-44,2002；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002参照)。
【０２４７】
PAMPは、アルギニンアミドで修飾されたペプチドである。従って、これはカルボキシペプチダーゼに対し非常に抵抗性であり、このアルギニンアミド修飾は受容体認識を付与する。従って、アミド修飾に対する抗体は、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)などの他のアミド修飾されたペプチドを標的化することができる。従って、処置時の望ましくない副作用を避けるために、GLP-1または他のアミド修飾されたペプチドとは反応しないハイブリドーマを選択すべきである。
【０２４８】
実施例4：PAMPインヒビターの同定
下記実施例は、PAMPの小分子インヒビターを同定するために使用することができる方法を説明している。
【０２４９】
機能をブロックする抗PAMP抗体(実施例3参照)を、PAMPへの結合の特異性についてELISA型アッセイで試験する；これは、PAMPへの特異的結合に関するインビトロ試験のベースラインを提供する。次に、関心対象の可能性のある分子ライブラリー(例えば、小分子化合物、コンビナトリアルライブラリーから生成された化合物、先に同定された薬物候補などのライブラリー)をPAMP-抗体結合の破壊についてインビトロにおいてスクリーニングする。
【０２５０】
次に、PAMPへの特異的抗体結合を破壊する分子を、抗血管新生または超血管新生活性について血管新生バイオアッセイ(インビトロまたはインビボ)においてスクリーニングし、その結果、PAMPの生物学的活性をブロックまたは超アゴナイズする能力をスクリーニングすることができる。血管新生バイオアッセイの例としては、角膜ポケットアッセイ(例えば、Kenyon et al., Invest Opthalmol. Vis. Sci. 37:1625,1996；Gaudric et al. Ophthal. Res., 24:181,1992)、CAMアッセイ(Wilting et al., Anat. Embryol., 183:259,1991参照)、ラットの大動脈リングモデル(例えば、Lichtenberg et al., Pharmacol Toxicol., 84:34,1999参照)、定方向インビボ血管新生アッセイ(DIVAA；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002；実施例1参照)、または鶏胚大動脈リングアッセイ(例えば、Isaacs, et al., J. Biol. Chem., 16;277(33):29936-44,2002；Martinez et al., J. Natl. Cancer Inst., 21;94(16):1226-37,2002参照)が挙げられる。PAMP活性をブロックまたは超アゴナイズすることがわかった分子については、次に、更なる特徴決定が施され、例えばそれらの特異性、効力、および他の関連特徴が決定される。
【０２５１】
説明された方法または組成物の正確な詳細は、説明された開示の精神から逸脱することなく、変更または修飾することができることは明らかであろう。本発明者らは、特許請求の範囲および精神内の、このような修飾および変更を全て請求するものである。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】DIVAAアッセイにおいてPAMPが血管新生を促進することを示すグラフである。
【図２】DIVAAアッセイにおいてPAMPが血管新生を促進することを示すグラフである。
【図３】図3A-Dは、鶏胚大動脈リングアッセイにおける、AM、VEGF、およびPAMPの血管新生能の比較を示すデジタル画像のセットである。大動脈リングは、マトリゲル内に包埋し、陰性対照としてPBS(図3A)、または1nMのペプチドAM(図3B)、VEGF(図3C)、もしくはPAMP(図3D)のいずれかを含有する無血清培地に曝した。PAMPの場合のみ、対照よりも大きい新規血管の出芽の塊(crown of sprouting)が見られた。バー＝0.5mm。
【図４】図4A-Gは、DIVAAアッセイにより比較したAM、VEGF、およびPAMPのインビボ血管新生能を示すデジタル画像のセットおよびグラフである。マトリゲル内に異なる濃度のペプチドを含有するシリコーンカプセルを、ヌードマウスの皮下に11日間移植した。(図4A-F)実験の終了時に依然皮膚に付着しているアンギオリアクターのデジタル画像。新規血管がチューブ開口部から成長している様子が認められる。カプセルは、 陰性対照としてPBS(図4A)、陽性対照として7μM bFGF (図4B)、10-15M PAMP(図4C)、10-13M PAMP(図4D)、10-11M PAMP(図4E)、または10-9M PAMP(図4F)を含む。バー＝2.0mm。マトリゲルプラグをディスパーゼにより消化し、FITC-デキストラン含量を測定して、インプラントを通って循環している血液容積を定量した(図4G)。各バーは、6個の独立した値の平均および標準偏差を表している。同じ濃度のPAMPおよびVEGFで処理したインプラント間の統計学的有意差をアスタリスクで示した。*：p＜0.05；**：0.01＞p＞0.001；***：p＜0.001。
【図５】PAMP受容体がヒト微小血管内皮細胞に存在することを示すグラフである。1mM ATPの添加は内皮細胞におけるカルシウムフラックスの増加を誘導する(□)のに対し、10nM全長PAMPの添加はこの作用を大きく低下させる(◇)。この遮断作用は100nM PAMP(12-20)(○)により逆転された。R.F.U＝相対蛍光単位。
【図６】図6A-Dは、内皮細胞の生理におけるAM、VEGF、およびPAMPの影響を示すグラフのセットである。(図6A)ヒト微小血管内皮細胞は、無血清培地内に漸増濃度の血管新生ペプチドが存在する96ウェルプレートに播種した。3日間培養後、生存細胞の数をMTTアッセイにより概算し、未処理の対照に対する増殖率(％)として表した。各点は、8個の独立した測定値の平均および標準偏差を表している。(図6B)同じ細胞を、フィブロネクチンでコートしたChemoTxマイクロプレートの上側チャンバー内に播種し、異なる濃度のペプチドを下側チャンバーに配置した。各点は、4個の独立した測定値の平均および標準偏差を表している。(図6C)内皮細胞を、異なる濃度の血管新生ペプチドの存在下、固化したマトリゲル層の上に播種した。索ネットワークの複雑性は、顕微鏡1視野あたりの結節の数で概算した。各バーは、3個の独立したウェルの平均および標準偏差を表している。アスタリスクは未処理の細胞に対する統計学的有意差を表している。*：p＜0.05；**：0.01＞p＞0.001；***：p＜0.001。(図6D)同じ細胞を10nM PAMPに一晩曝露し、血管新生分子のmRNA中のそれらの含量をリアルタイムPCRにより測定した。各バーは、処理細胞中の対象遺伝子と未処理細胞中の含量との間の比を表している。水平線は、未処理の条件に対して変化がないことを示している。
【図７】図7A-Bは、PAMPによって誘導された血管新生のインヒビターとしてのPAMP(12-20)の特徴を示すグラフの対である。(図7A)異なる濃度の全長PAMPおよびPAMP(12-20)をアンギオリアクターに添加し、指示されたDIVAAプロトコールに従ってヌードマウスの皮下に挿入した。各バーは、6個の独立した測定値の平均および標準偏差を表している。PAMP単独(第一のバー)との統計学的差を、*(p＜0.05)または(p＜0.01)で表した。(図7B)PAMP(12-20)はまた、マトリゲルカプセルに包埋した2種のヒト肺癌腫瘍細胞により誘導された血管新生を阻害することが可能であった。PAMP(12-20)は100nMで添加した。各バーは、6個の独立した測定値の平均および標準偏差を表している。未処理の細胞との統計学的差は、*(p＜0.05)で表している。
【図８】異種移植モデルにおけるPAMP(12-20)の抗腫瘍作用を示すグラフである。A549腫瘍を有する無胸腺ヌードマウスを、PBS(□)または1mM PAMP(12-20)(◇)のいずれかにより処理した。各点は、10匹のマウスの平均および標準偏差を表している。処置群間の腫瘍体積の統計学的差は、アスタリスクで表した。*：p＜0.05；**：p＜0.01。
【配列表フリーテキスト】
【０２５３】
添付の配列表に列記された核酸およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則(37CFR)1.822に定義されるように、ヌクレオチド塩基については標準的文字略号、およびアミノ酸については三文字表記を用いて示されている。各核酸配列は片方の鎖のみ示したが、相補鎖は示された鎖を参照することにより含まれることが理解される。添付の配列表中、
配列番号:1は、プレプロアドレノメジュリンをコードしているヌクレオチド配列である。
配列番号:2は、プレプロアドレノメジュリンの蛋白質配列である。
配列番号:3は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)をコードしているヌクレオチド配列である。
配列番号:4は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(PAMP)の蛋白質配列である。
配列番号:5は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)をコードしているヌクレオチド配列である。
配列番号:6は、プロアドレノメジュリンN末端20ペプチド(12-20)の蛋白質配列である。
配列番号:7は、AMフォワードプライマーである。
配列番号:8は、AMリバースプライマーである。
配列番号:9は、VEGFフォワードプライマーである。
配列番号:10は、VEGFリバースプライマーである。
配列番号:11は、bFGFフォワードプライマーである。
配列番号:12は、bFGFリバースプライマーである。
配列番号:13は、PGDF Aフォワードプライマーである。
配列番号:14は、PGDF Aリバースプライマーである。
配列番号:15は、PDGF Bフォワードプライマーである。
配列番号:16は、PDGF Bリバースプライマーである。
配列番号:17は、PDGF Cフォワードプライマーである。
配列番号:18は、PDGF Cリバースプライマーである。
配列番号:19は、18S RNAフォワードプライマーである。
配列番号:20は、18S RNAリバースプライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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