(57)【要約】本発明は、（i）汚染を除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品を１種以上のプロテアーゼと接触させること、及び任意に（iii）この物品をオートクレーブ処理することを含む、プリオン汚染除去方法に関する。    本発明はさらに、洗浄剤及びプロテアーゼを含有するプリオン汚染除去用キット、並びに洗浄剤及びプロテアーゼを含有するプリオン汚染除去用組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）物品を洗浄剤と接触させること、（ii）該物品をプロテアーゼと接触させること、及び任意に（iii）該物品をオートクレーブ処理することを含む、物品のプリオン汚染除去方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼが、国際生化学・分子生物学連合命名規約委員会が定義するＥ．Ｃ．３．４．分類に属するプロテアーゼ及びペプチダーゼ酵素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼがプロナーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤に接触させること、（ii）該物品を第一のプロテアーゼと接触させること、（iii）該物品を第二のプロテアーゼと接触させること、及び任意に（iv）該物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法。
【請求項７】
前記第一のプロテアーゼ及び第二のプロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のプロテアーゼがプロナーゼであり、かつ前記第二のプロテアーゼがパパインである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のプロテアーゼがプロテイナーゼＫであり、かつ前記第二のプロテアーゼがプロナーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のプロテアーゼがプロナーゼであり、かつ前記第二のプロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記洗浄剤がイオン性洗浄剤である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記洗浄剤がアニオン性洗浄剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記物品が表面を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記表面が医療機器の表面である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面が金属である、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記金属が鋼鉄である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
洗浄剤並びにプロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択されるプロテアーゼを含有するキット。
【請求項１９】
前記プロテアーゼを２種類以上含有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
イオン性洗浄剤並びにプロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される１種類以上のプロテアーゼを含有する組成物。
【請求項２２】
前記プロテアーゼを２種類以上含有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記洗浄剤がＳＤＳである、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオン汚染除去に使用される方法及び試薬に関する。本発明は特に外科用器具のプリオン汚染除去に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｖＣＪＤを引き起こすプリオン病原体の遺残及び耐性によって、外科手術後の医原性感染の可能性が懸念されている。
【０００３】
プリオン病には、ヒツジのスクレイピー及びウシのＢＳＥ並びにヒトのＣＪＤがある。これらは新規な感染性致死性神経変性疾患群である。このプリオンと呼ばれる感染性病原体は、正常な細胞性ＰｒＰ蛋白質の立体配座異性体から主に或いは単独で構成されている。ＰｒＰＳｃと示されるこの配座異性体には、蛋白分解に耐性である、洗浄剤（detergent）に不溶性である、熱安定性が高いなど、異常な特性が幾つかある。プリオンの感染性が従来のオートクレーブ処理耐性であるということは公知であるので、これらの物性は、ＰｒＰＳｃが外科用鋼鉄に強く付着するという最近の知見と共に、外科用器具の洗浄及び消毒における問題を提起している。
【０００４】
ｖＣＪＤには症状発現前の診断検査法がないので、患者の術前検査は不可能である。ＣＪＤが疑われている又は確認されている少数の症例では使用済み器具の検疫又は破壊が可能であるが、大半の手順については新たな汚染除去方法が必要である。英国保健省は現在、医原性ＣＪＤ感染の問題に取り組むために複数の研究プロジェクトを実施中である。
【０００５】
標準的オートクレーブ処理法、及び一部の場合では１３４℃まで昇温する高温オートクレーブ処理が、プリオン汚染除去のために病院で使用される標準法である。しかし、従来の研究で、オートクレーブ処理条件下でプリオンは破壊されないことがわかっている。明らかに、オートクレーブ処理条件下でプリオンは徐々に蓄積する。さらに、熱処理を行っても死滅しないプリオンは、その汚染除去耐性を強めることができるため、そのような高耐性プリオンが、オートクレーブ処理に繰り返しかけられてもプリオンが破壊されない外科用器具上に蓄積する可能性がある。また、効果の最も高いオートクレーブでも、処理中の物品を熱と蒸気が貫通する程度まで消毒できるだけである。多数の複雑な器具からなる外科セットを扱う際には、熱と蒸気の貫通は簡単ではない。
【０００６】
プリオン汚染除去方法に関するＷＨＯガイドラインは、１Ｍ  ＮａＯＨ中に浸漬しながら行うオートクレーブ処理を推奨している。これは極めて危険な方法である。さらに、安全面に加えて、この濃度の苛性アルカリの腐食作用は、オートクレーブ処理で使用される温度及び圧力と組み合わさると、精巧な外科用器具を壊す、或いは少なくとも重大な損傷を与える恐れがある。
【０００７】
オートクレーブ処理前の外科用器具洗浄に現在使用されている市販試薬にはＰｒＰＳｃ汚染に対する作用はほとんどないか全くない。
【０００８】
ＬｐＨ、ＬｐＨｓｅ、及びEndozyme Plusを含む方法など、既存の汚染除去方法は、感染性の破壊には限定的にしか使用されていない。
【０００９】
Taylor 1999（Taylor D. M.、Inactivation of prions by physical and chemical means. 1999、J. Hosp. Infect. 43、69-76.）は、プリオン不活化における次亜塩素酸ナトリウム溶液及び２Ｍ水酸化ナトリウムの使用を開示している。しかし、この方法には、不活化が完全でないなどの問題がある。さらに、プリオンのオートクレーブ処理耐性が報告されている。
【００１０】
本発明は、従来の技術に関連する問題を克服することを目的とする。
【非特許文献１】Taylor D. M.、Inactivation of prions by physical and chemical means. 1999、J. Hosp. Infect. 43、69-76.
【発明の開示】
【００１１】
本発明者らは、プリオン感染価を下げる洗浄剤及び蛋白分解酵素併用処理を開発した。幾つかの実施態様では、約１００万分の１に感染価を低減できる。使用される試薬は水溶性で安定かつ低毒性である。これらの使用プロトコールは、オートクレーブ処理に先立つ医療機器の予備洗浄に用いられる機械などの既存のハードウェアに適合する。従って、本発明により、医療機器などの物品のプリオン感染性汚染を除去できる方法及び試薬が得られる。
【００１２】
本発明の方法、特に併用法は、ｖＣＪＤプリオン不活化などのプリオン不活化に有効である。本方法は、特に金属表面などの表面に用途がある。
【００１３】
本発明の方法及び病院用器具洗浄機への添加用試薬などの組成物は、世界中の病院業務又は滅菌業務提供者に用途があり、医原性ＣＪＤをもたらすようなプリオン汚染の可能性を低減する。
【００１４】
本発明の方法は、オートクレーブ処理に加えて及び好ましくはオートクレーブ処理に先立って有利に使用される。
【００１５】
驚くべきことに、ｖＣＪＤプリオンが他のプリオンに比べて比較的熱不安定性であることが本明細書中で示される。この驚くべき知見により、以下に記載する本発明の方法の増強が可能となる。
【００１６】
理論に拘束されることは望まないが、本発明は、ＰｒＰＳｃの化学の具体的な知識を利用している。本発明者らは、ＳＤＳなどの洗浄剤で処理（例えば煮沸）することによりＰｒＰＳｃのプロテアーゼ感受性を高められるはずであるという論拠を立てた。次いで、多数のプロテアーゼ及び条件を検討し、本発明の方法を発明するに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
一態様においては、本発明により、オートクレーブ処理の破壊作用を増強することによりプリオン汚染除去方法が提供される。この態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品をＳＤＳなどの洗浄剤と接触させること、及び（ii）この物品をオートクレーブ処理することを含む方法が提供される。
【００１８】
別の態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品をプロテアーゼと接触させること、及び任意に（iii）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００１９】
別の態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品を第一のプロテアーゼと接触させること、（iii）この物品を第二のプロテアーゼと接触させること、及び任意に（iv）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００２０】
好ましくは、上記第一及び第二のプロテアーゼは異なる。物品は、第一及び第二のプロテアーゼに同時に又は順次接触させてよい。好ましくは、物品を第一及び第二のプロテアーゼに順次接触させる。
【００２１】
任意に、さらなるプロテアーゼ処理工程を本発明の方法に組み込んでもよい。従って、他の態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品を第一のプロテアーゼと接触させること、（iii）この物品を第二のプロテアーゼと接触させること、（iv）この物品をさらに１種類以上のプロテアーゼに接触させること、及び任意に（v）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００２２】
プロテアーゼ
温度/プロテアーゼ濃度の最適条件
当業者には明らかであるが、プロテアーゼ（１種以上）の濃度が高いほど、破壊度と破壊速度は高くなる。プロテアーゼ濃度と時間の組み合わせは必要に応じて選択できる。これらは通常の試行錯誤によって最適化できる。
【００２３】
本明細書中に提示する実施例には自動洗浄装置での使用に最適な条件が包含されている。さらに、選択された条件は有利なことに低コストである。
【００２４】
プロテアーゼのインキュベーション温度は、使用するプロテアーゼにより異なる。一般に、室温（例えば２０℃）から６０℃までの温度であればいかなる温度も許容できる。パパインの好適温度は３０℃であり、プロテイナーゼＫの好適温度は５５℃であり、プロナーゼの好適温度は４５℃であり、ブロメラインの好適温度は４０℃である。温度がある特定のプロテアーゼの最適値から離れるにつれて不活化時間は長くなる。明らかに、このことは、インキュベーション時間を伸ばすかプロテアーゼ濃度を高くすることによって補償できる。温度が６０℃を超えると、活性が低下する可能性があり、酵素の不活化が可能となるが、明らかに個々のプロテアーゼ調製物の不活化温度は個々に異なるので、可能であれば常に製造者の使用説明に従うべきである。
【００２５】
プロテアーゼは、洗浄剤が過剰に存在すると悪影響を受ける恐れがある（例えば活性低下又は活性喪失が起こる）。個々のプロテアーゼの特性は個々に異なり、洗浄剤の作用による活性喪失を避けることは当業者の能力の範囲内にある。可能であれば常に製造者の使用説明に従うべきである。プロテアーゼとの接触前及び接触時にプロテアーゼ活性が大きく低下しないように有利に洗浄剤濃度を下げられる。
【００２６】
上記プロテアーゼは、好ましくは、国際生化学・分子生物学連合命名規約委員会（http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/）によって定義されるＥ．Ｃ．３．４．分類に属するプロテアーゼ及びペプチダーゼ酵素からなる群より選択される。
【００２７】
上記プロテアーゼは、プロテアーゼの混合物でもよい。しかし、数種のプロテアーゼに一度に接触させる場合には、個々の活性の低下が起こることがあり、例えば接触時間を長くすることにより活性低下を補償する必要が出る可能性があることに留意すべきである。このことについて以下詳細に考察する。
【００２８】
好ましくは、上記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、パパイン、又はブロメラインの１種又はそれ以上からなる。
【００２９】
上記プロテアーゼがブロメラインである場合には、好ましくはプロテアーゼ処理工程に洗浄剤は実質的に存在しない。
【００３０】
プロテアーゼ処理工程が２工程以上用いられる場合には、好ましくはこのプロテアーゼの少なくとも１種はプロテイナーゼＫである。
【００３１】
プロテアーゼ処理工程が１工程しか用いられない場合には、好ましくは上記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、又はパパインであり、より好ましくはプロテイナーゼＫ又はプロナーゼ、さらに好ましくはプロテイナーゼＫである。
【００３２】
好ましくは少なくとも２工程のプロテアーゼ処理工程が用いられる。
【００３３】
好ましくは少なくとも１工程の洗浄剤処理工程及び少なくとも２工程のプロテアーゼ処理工程が用いられる。
【００３４】
プロテアーゼは、遺伝子レベル及び／又はペプチドレベル又は化学レベルの操作或いは改変を受けやすい。酵素のペプチダーゼ活性がそのような操作によっても保持されていれば、プロテアーゼの切断、変異、又は適応（例えば上記プロテアーゼ自体をよりプロテアーゼ耐性にすること）が本発明を妨げるものでないことは当業者には明らかである。実際に、プロナーゼは組み換え精製酵素よりも分画プロテアーゼ調製物に似ていることは一般に認められており、プロナーゼの部分分画製品の使用又はプロナーゼからなるペプチダーゼ（１種以上）のクローニング及び組み換え精製画分の使用は本発明に包含される。熱安定プロテアーゼは、既存のプロテアーゼの改変によって得られたものでも好熱生物由来のプロテアーゼのクローニングによって得られたものでも、特に好ましい。
【００３５】
一態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品をプロナーゼと接触させること、及び任意に（iii）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００３６】
好ましい態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品をプロテイナーゼＫと接触させること、及び任意に（iii）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００３７】
好ましい態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品をプロナーゼと接触させること、（iii）この物品をパパインと接触させること、及び任意に（iv）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００３８】
好ましい態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品をプロテイナーゼＫと接触させること、（iii）この物品をプロナーゼと接触させること、及び任意に（iv）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００３９】
好ましい態様においては、本発明により、（i）汚染除去すべき物品を洗浄剤と接触させること、（ii）この物品をプロナーゼと接触させること、（iii）この物品をプロテイナーゼＫと接触させること、及び任意に（iv）この物品をオートクレーブ処理することを含むプリオン汚染除去方法が提供される。
【００４０】
順次/同時接触
２種以上のプロテアーゼを使用する場合には、それらのプロテアーゼを単一工程にまとめてもよい。しかし、そのような態様においては、各プロテアーゼが他のプロテアーゼを消化するために、プロテアーゼ活性が低下することがある。従って、最大効果を得るには、本発明の方法における各工程を順次実施すると有利である。また、第二のプロテアーゼ又はそれ以降のプロテアーゼに物品を接触させる前に、第一のプロテアーゼの少なくとも一部は有利に除去される。より好ましくは、第二のプロテアーゼ又はそれ以降のプロテアーゼに物品を接触させる前に、第一のプロテアーゼは実質的にすべて除去される。このことは、複数工程シーケンスにおける各プロテアーゼ処理工程に一様にあてはまる。
【００４１】
洗浄剤がプロテアーゼ（１種以上）を不活化する恐れがあるので、有利性の点では、洗浄剤処理工程（１工程以上）及びプロテアーゼ処理工程（１工程以上）は、一緒にすべきでない。従って、プロテアーゼ活性を最大にするために、物品をプロテアーゼに接触させる前に洗浄剤の少なくとも一部を除去（又は希釈）すると、有利である。好ましくは、洗浄剤処理工程（１工程又はそれ以上）はプロテアーゼ処理工程（１工程又はそれ以上）に先行する。
【００４２】
洗浄剤
上記洗浄剤は、好ましくはイオン性洗浄剤、好ましくはアニオン性洗浄剤、好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物、１−オクタンスルホン酸ナトリウム１水和物、ドデシル硫酸リチウム又はＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩のうちの１種又はそれ以上である。好ましくは、上記洗浄剤はＳＤＳである。
【００４３】
洗浄剤は、有効な濃度であればいかなる濃度でも使用できる。有効濃度は、試行錯誤によって簡単に決定及び／又は最適化できる。洗浄剤がＳＤＳである場合には、洗浄剤処理工程による接触に関する洗浄剤の最終濃度は、好ましくは約２％から約６％、好ましくは約３％から約５％、好ましくは約４％、好ましくは４％である。
【００４４】
物品は好適温度であればいかなる温度においても上記洗浄剤と接触可能である。洗浄剤処理工程の最適温度は自由に変更でき、好ましくは７０℃以上、好ましくは８０℃以上、好ましくは９０℃以上、好ましくは１００℃以上である。上記温度は、物品の性質により制約を受ける可能性がある。例えば内視鏡などの一部の医療機器は、オートクレーブ処理で使用されるような高温には耐えられない。このような状況では、本発明の方法は有利なことにオートクレーブ条件を必要とせず、温度選択は、汚染除去対象物品の耐性を顧慮して実施者が行うべきである。オートクレーブ条件を使用しない本発明による方法の例は、実施例の項のプロトコールＢに見出すことができる。実施例の項のプロトコールＢに見出される方法などの本発明による方法は有利なことに、ＬｐＨ、ＬｐＨｓｅ、及びEndozyme Plus処理などの従来技術による従来処理を代替することができる。
【００４５】
洗浄剤処理工程のインキュベーション時間は自由に変更でき、好ましくは２分以上である。数時間又は数日或いはそれ以上など、洗浄剤処理工程においてインキュベーション時間の延長は有利なことがある。
【００４６】
オートクレーブ処理
オートクレーブ処理は、適切なオートクレーブサイクルであればいかなるサイクルによっても実施できる。代表的なサイクルとしては、１２１℃で１８分間、又は好ましくは１３４℃で１８分間がある。実施者が自らの特別なニーズに合わせて他のサイクルを選択することもできる。オートクレーブサイクルを有利に延長することもできる。
【００４７】
オートクレーブ処理工程は、本発明の方法の最終工程として有利に実施される。本発明の方法をオートクレーブ処理工程と組み合わせることには、外科用器具などの汚染除去対象物品経由の感染拡大を最小限に抑えるというさらなる利点がある。さらに、このようにオートクレーブ処理と組み合わせることにより有利に有効性が乗算的に高まる。即ち、各方法が感染価を対数で５だけ低減できる場合、これらを組み合わせると感染価は対数で１０など、さらに低下し得る。
【００４８】
汚染除去すべき物品
汚染除去すべき物品は、プリオンの不活化又は除去が望ましい物理的アイテムであればどんなものでもよい。この用語には、溶液（１液以上）及び装置又は医療機器（外科用器具を含む）などの物体、特に金属製の物体又はそれらの部品（１つ以上）が包含される。不活化又は除去されるプリオンは、物品中（例えば溶液中又は懸濁物中）に存在していてもよく、或いは物品上に存在（例えば物品表面に結合、付着、又はそれ以外の結びつきを）していてもよい。従って、上記物品は表面を有していてもよい。この表面は、医療機器の表面であってもよい。この表面は、金属を含んでいてもよい。この金属は、外科用鋼鉄などの鋼鉄であってもよい。
【００４９】
汚染除去
汚染除去とは、特定の検体又は環境におけるプリオン価の低減を指す。汚染除去とは、このプリオンが不活化されているかどうかに関わらず表面からのプリオンの除去を指す場合がある。従って、汚染除去には不活化が包含され、また、プリオンが破壊／不活化されるかどうかとは無関係にプリオンを除去することが包含される。汚染除去を行う場合、汚染除去対象表面又は溶液からプリオン感染性が取り除かれることが重要である。このことは、破壊（不活化）又は単純な分離によって行える。重要な点は、汚染除去対象表面又は溶液にプリオン（即ちＰｒＰＳｃ）がもはや結びついていないこと、或いは数及び／又は感染価が低下していることである。明らかに、非感染性のプリオン断片が汚染除去後に依然として表面に付着していたとしても、汚染除去つまりこの表面の汚染除去が成功したという事実には実質的影響はないであろう。
【００５０】
汚染除去は、好適なアッセイであればいかなるアッセイによっても評価できる。好ましくは、このアッセイはウェスタンブロット法又はバイオアッセイである。明らかに、バイオアッセイ及び／又はウェスタンブロット法などのアッセイは感度に限界がある。プリオン価（プリオン数／感染性）が低減されている限り、プリオン汚染除去が起こったと見なされる。
【００５１】
好ましくは、プリオン汚染除去は、１００分の１、好ましくは１０００分の１、好ましくは１０，０００分の１、好ましくは１００，０００分の１、好ましくは１，０００，０００分の１、又はそれ以上である。好ましくは、プリオンは完全に除去又は不活化される。
【００５２】
アッセイ方法
本発明の方法により達成されるプリオン低減は、好適な手段であれば当業者に公知のいかなる手段によってもモニターできる。プリオン低減の評価を示すため、本明細書中に好適なアッセイ手法の具体例を提示する。
【００５３】
明らかに、ある特定の状況には他の方法よりもある特定の方法が適することがある。例えば、プリオン汚染除去が溶液中で起こっている場合には、ウェスタンブロット法が最も好適であろう。プリオン汚染除去が表面上で起こっている場合には、表面の直接視覚化が最も好適であろう。或いは、表面上で起こっているプリオン汚染除去については、バイオアッセイが最も好適であろう。個々の状況に対し個々のアッセイ法をどう選択するかは、裕に当業者の能力の範囲内のことである。当然のことながら、多くの状況において最も重要な指標は、感染性の喪失／低下である。現在、プリオン感染性はバイオアッセイによって評価されるのが最も普通である。しかし、感染性配座異性体であるＰｒＰＳｃの生化学アッセイは同様に適切である。
【００５４】
好適なモニタリング方法の一例として、イムノブロットアッセイがある。有利なことにこのイムノブロットアッセイは、Wadsworth et al 2001 Lancet vol 358 pp 171-180に記載のアッセイであるか、或いはこれに基づく。
【００５５】
好適なモニタリング方法の一例として、バイオアッセイがある。バイオアッセイ法は一般に、アッセイ対象である個々のプリオン種に適合するように調整されている。好適なバイオアッセイ法の選択は有利なことに、アッセイ対象であるプリオン種に基づく。
【００５６】
キット
本発明はまた、汚染除去に使用するキットに関する。従って、本発明により、洗浄剤並びにプロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択されるプロテアーゼを含むキットが提供される。好ましくは、このキットは、２種類以上のプロテアーゼを含む。好ましくは、このキット中の洗浄剤はＳＤＳである。
【００５７】
組成物
本発明はまた、汚染除去に使用するための組成物に関する。一態様においては、本発明により、イオン性洗浄剤並びにプロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼ、及びブロメラインからなる群より選択される１種以上のプロテアーゼを含む組成物が提供される。好ましい態様においては、この組成物はこのようなプロテアーゼを２種以上含む。より好ましい態様においては、この組成物の洗浄剤はＳＤＳである。
【００５８】
[実施例]
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はこれらには限定されない。実施例においては以下の図を参照する。
【実施例１】
【００５９】
洗浄剤及びプロテアーゼ併用処理
プリオン感染価を１００万分の１に低減させる洗浄剤及び蛋白分解酵素併用処理について説明する。
【００６０】
この推定値は、使用される特殊なウェスタンブロットプロトコール（Wadsworth et al Lancet 2001）(これは好ましいアッセイ法である）に関して過去に定量されている検出限界に基づいている。
【００６１】
このアッセイ法を用いて、ＰＫ消化後の５ｎｌの１０％（ｗ／ｖ）脳ホモジネートの検出が可能であることが確認された。図1において、３レーンは各々、１０ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）脳ホモジネートから得たリンタングステン酸ナトリウム沈殿ペレットである。プロトコールＡによる処置後このＰｒＰ即ち約５ｎｌ当量がやっと目に見えることがわかる。このホモジネートは最初１０，０００，０００ｎｌ当量を含有していたので、破壊度は約１００万分の１である。
【００６２】
使用試薬は水溶性で安定かつ低毒性である。試薬使用プロトコールは、例えば病院の汚染除去部門で器具の予備洗浄及びオートクレーブ処理のために使用されるような既存のハードウェアに適合している。従って、本発明により、外科用器具のプリオン感染性汚染除去が可能である。本発明の方法は、既存の機械類を用いて有利に実施できる。
【実施例２】
【００６３】
水性検体中のＰｒＰＳｃの破壊
この実施例では、洗浄剤の存在下で物品を２種類の蛋白分解酵素（プロテイナーゼＫ及びプロナーゼ、又はプロナーゼ及びパパイン）に順次曝露することにより感染性物質であるＰｒＰＳｃを水性懸濁物中で不活化できる方法について説明する（この実施例では、この物品とは被感染脳組織である）。
【００６４】
不活化度（この実施例では不活化は破壊と相関する）は、ウェスタンブロットの免疫検出結果から推定できる。
【００６５】
組織検体の調製
脳組織を１８ゲージ、２１ゲージ、及び２３ゲージの注射針に通すことにより、ｖＣＪＤに感染したヒト前頭皮質の脳をＰＢＳ−ダルベッコ培地（GIBCO-BRL 14190-094）中にホモジナイズして２０％（ｗ／ｖ）にした。ホモジネートをＰＢＳで希釈して１５％（ｗ／ｖ）にし、少量のアリコートとして−７０℃で冷凍保存した。
【００６６】
プロトコールＡ：プロテイナーゼＫ及びプロナーゼを用いる、ｖＣＪＤ脳ホモジネート由来ＰｒＰＳｃの３段階破壊
（ａ）洗浄剤による処理:ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。１５％ホモジネートのアリコート２０μｌを、スクリューキャップ付きエッペンドルフ試験管に量り取り、５μｌの２０％ ＳＤＳを加えて最終濃度を４％  ＳＤＳとした。この混合物を１５分、９９−１００℃で加熱した後、室温まで冷却した。４０℃までの冷却であれば同様に許容されるであろう。
（ｂ）第一のプロテアーゼによる処理:プロテイナーゼＫ（ＰＫ）。４０μｇ／ｍｌのＰＫ溶液を二回蒸留水で調製した。この酵素溶液のアリコート５μｌを、上記手順（ａ）で作製した洗浄剤処理したホモジネート溶液２５μｌ溶液に加えた。即ち、プロテイナーゼＫの最終濃度は６．６ｕｇ／ｍｌである。この混合物を４０℃で３０分間インキュベートした。
（ｃ）第二のプロテアーゼによる処理:プロナーゼ。２ｍｇ／ｍｌプロナーゼの０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．５溶液を調製した。この酵素溶液のアリコート０．５μｌを、順次上記手順（ａ）及び（ｂ）を用いて作製した、ＳＤＳ処理及びPK処理したホモジネートの３０μｌ溶液に加えた。即ち、プロナーゼの最終濃度は３３ｕｇ／ｍｌである。この混合物を４０℃で３０分間インキュベートした。
【００６７】
プロトコールＢ：プロナーゼ及びパパインを用いるｖＣＪＤ脳ホモジネート由来のＰｒＰＳｃの３段階破壊
（ａ）洗浄剤による処理:ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）。１５％ホモジネートのアリコート２０μｌをスクリューキャップ付きエッペンドルフ試験管に量り取り、５μｌの２０％ ＳＤＳを加えて最終濃度を４％ ＳＤＳにした。この混合物を１５分間９９−１００℃で加熱した。次いで室温と４０℃の間の温度まで冷却した後に次の工程に進んだ。
（ｂ）第一のプロテアーゼによる処理:プロナーゼ。０．５ｍｇ／ｍｌプロナーゼの０．１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．５溶液を調製した。この酵素溶液のアリコート５μｌを、上記手順（ａ）によって作製した洗浄剤処理したホモジネートの溶液２５μｌに加えた。即ち、プロナーゼの最終濃度は８３ｕｇ／ｍｌである。この混合物を４０℃で３０分間インキュベートした。
（ｃ）第二のプロテアーゼによる処理:パパイン。０．４ｍｇ／ｍｌパパインの０．１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ６．０溶液を調製した。この酵素溶液のアリコート０．５ｕｌを、順次上記手順（ａ）及び（ｂ）により調製したＳＤＳ処置及びプロナーゼ処理したホモジネートの３０μｌ溶液に加えた。パパインの最終濃度は６．５ｕｇ／ｍｌである。この混合物を４０℃で３０分間インキュベートした。
【００６８】
ウェスタンブロットによるＰｒＰＳｃの検出
上記ＳＤＳ／ＰＫ／プロナーゼ（プロトコールＡ）及びＳＤＳ／プロナーゼ／パパイン（プロトコールＢ）処理から得た材料をウェスタンブロット分析に出した（図２を参照）。検体中の残存ＰｒＰＳｃをすべて検出するため、ＩＣＳＭ１８抗体及びＩＣＳＭ３５抗体を用いてブロットを視覚化した。どちらの抗体を用いてもＰｒＰＳｃは検出できなかった。
【００６９】
上記の各種酵素処理を行った後、検体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロット法及びＩＣＳＭ３５抗体による検出を行って視覚化した。第一レーン（レーン1−未処理物質）は未処理物質のコントロール検体である。
【００７０】
第二レーンは、１００℃で１５分間、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳのみで処理されている（レーン２−４％  ＳＤＳ、１００℃、１５分間）。
【００７１】
第三レーンは、ＳＤＳ及びパパイン処理、（レーン３−４％ＳＤＳ ＆ パパイン：プロトコールＢの工程１及び工程３に相当する２工程）である。
【００７２】
第四レーンは、ＳＤＳ、プロナーゼの後パパインという組み合わせである（レーン４−プロトコールＢ即ち３工程）。
【００７３】
第五レーンは、ＳＤＳの後ＰＫのみである（レーン５−時間、濃度、及び温度は、プロトコールＡの工程１及び２と同様である）。
【００７４】
第六レーンは、ＳＤＳ及び順次ＰＫの後プロナーゼである（レーン６−プロトコールＡ）。
【００７５】
第七レーンは、ＳＤＳ及び順次プロナーゼ後ＰＫである（レーン７−プロトコールＡであるが、工程２及び３が逆）。
【００７６】
最後の第八レーンは、ＳＤＳ及びプロナーゼのみである（レーン８−プロトコールＢの工程１及び２のみ）。
【００７７】
ＩＣＳＭ１８をウェスタンブロットの視覚化に用いても、同様の結果が観察される。
【００７８】
図２の説明に関する注：バンドはすべてＰｒＰである。コントロールレーンには総ＰｒＰ、即ちＰｒＰＣ及びＰｒＰＳｃの両方が含まれている。これらは機能によって定義されるので、どれがＰｒＰＳｃであるのか帰納的に定義することはできない。しかし、いかなるＰｒＰも存在しない場合、本発明者らは、ＰｒＰＳｃは存在しないと言える。図２を調べると、本発明の方法が有意なプリオン汚染除去をもたらすことは明らかである。例えば、プロトコールＢ（レーン４）では、免疫反応性バンドが一部残っている。これらはＰｒＰ（ＰｒＰＳｃである可能性が最も高い）である。しかし、その濃度が出発原料から激減しているので、本発明によるプリオン汚染除去が有意であることを示していることは明白である。
【実施例３】
【００７９】
外科用鋼鉄上におけるプリオン感染性の無効化
この実施例は、表面上におけるプリオン感染性の無効化への本発明の方法の応用（この実施例では、表面とは外科用鋼鉄である）であり、従って外科用器具の汚染除去への適用可能性について示すものである。依然として、本発明の方法は、病院の汚染除去部門で行われる予備洗浄手順において有利に実施可能である。残存感染性のバイオアッセイを行うために、この外科用鋼鉄の小型試料をトランスジェニックマウスに移植する。
【００８０】
この実験は、酵素処理によって得られる消毒の有効性を既存の処理方法と比較して示すことを目的としていた。５ｍｍ×０．１５ｍｍの鋼鉄製ワイヤを３０分間、Rocky Mountain Laboratories（ＲＭＬ）スクレイピーの末期症状状態であるＣＤ１マウスの脳から調製した２０％ホモジネートと共にインキュベートした。次いでこれらのワイヤを洗浄せずに乾燥し、Ｔｇ２０／ＺＨ１トランスジェニックマウス（正常プリオン蛋白ＰｒＰｃを過剰発現するよう予め交配しておいた）の脳に挿入した。
【００８１】
挿入前にワイヤを、無消毒（ポジティブコントロール群）、９０分間室温で既存の消毒用化合物（ＬｐＨ、ＬｐＨｓｅ、Endozyme Plus）と共にインキュベート、オートクレーブ処理、或いは酵素処理（オートクレーブ処理有り又は無し）のいずれかで処理した。
【００８２】
上記酵素処理は、９９−１００℃にて４％ＳＤＳ中で１５分間加熱後、４０℃まで冷却し、次いでプロナーゼ添加後パパインを添加する工程を含んでいた。
【００８３】
各酵素インキュベーションは、４０℃で３０分間行った。（即ちプロトコールＢ）。（プロトコールＡ（ＳＤＳ、ＰＫ、プロナーゼ）も外科用器具の汚染除去に好適である−実施例４（‘汚染除去２'）を参照。）
【００８４】
次いで上記ワイヤをＰＢＳで短時間洗浄した。ネガティブコントロール群は、ＲＭＬホモジネートと共にインキュベートしていないワイヤを挿入することに  より作製した。
【００８５】
ワイヤをインキュベートしたＲＭＬホモジネートの感染性（即ち臨床的疾患誘発能）を確認するため、１％希釈物を含む各種希釈物を各々３０μｌずつさらなるマウス群の脳内に接種した。これにより、使用したホモジネートが感染性であることが確認された。これら各種希釈物を比較することにより、必要に応じてホモジネートの感染価を定量できる。
【００８６】
正常脳（２０％ホモジネートの対照である）に鋼鉄を曝露することの影響を検定するため、１群のマウスに、末期症状ＣＤ１マウスの脳に３０分間浸漬しておいたワイヤを挿入した。これらのワイヤをリン酸緩衝生理食塩水−ダルベッコ培地（ＰＢＳ）で短時間すすいでから乾燥させた後、挿入した。
【００８７】
詳細な実験手順
材料
プロナーゼ（SIGMA CODE P5147;１．１６ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．５溶液）
パパイン（SIGMA CODE P3375;０．２１ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ６．０溶液）
【００８８】
非感染ワイヤの移植
Ｇ２６注射針をガイドとして用いて、Ｔｇ２０マウスの脳内に未処理のワイヤ小片を１本ずつ手で移植した。
（Ａ群）
【００８９】
浸漬及び浸漬したワイヤの移植
ワイヤ小片（５ｍｍ）１０本をＲＭＬ感染ＣＤ１マウスの脳内（ブレグマの右側）に３０分間一時的に挿入した。容量５０ｍｌのＦＡＬＣＯＮ試験管を用いて５０ｍｌのＰＢＳダルベッコ培地（GIBCO-BRL 14190-094）中で“浸漬”ワイヤ小片を短時間すすぎ、ペトリ皿上で室温で３０分間乾燥させた。Ｇ２６注射針をガイドとして用いて、マウス６匹の各脳に小片を１本ずつ手で移植した。残りのワイヤ小片４本はこの実施例ではそれ以上使用しなかった。
（Ｂ群）
【００９０】
２０％（ｗ／ｖ）ＲＭＬ脳ホモジネートの調製
ＰＢＳダルベッコ培地（GIBCO-BRL 14190-094）中の脳ホモジネート（２０％（ｗ／ｖ））を、１８ゲージ、２１ゲージ及び２３ゲージ注射針に通すことにより調製した。浸漬に用いたＲＭＬ感染ＣＤ１マウスの脳（湿重量:４００ｍｇ）を１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。ＰＢＳで検体の最終容量を２ｍｌにした。このホモジネート全体を ２０％（ｗ／ｖ）（遠心分離工程無し）と呼び、直ちに次の工程に使用した。アリコートを−２０℃で冷凍した。
【００９１】
ワイヤの２０％（ｗ／ｖ）ＲＭＬ脳ホモジネートへの曝露
各々２０本のワイヤ小片からなる各群を、調製したての２０％（ｗ／ｖ）ＲＭＬ脳ホモジネート（０．１ｍｌ）に１．５ｍｌセーフロック付きエッペンドルフ試験管中で曝露し、撹拌しながら３０分間２２℃でインキュベートした。インキュベート後、脳ホモジネートをピペットで採取し、曝露済みワイヤをペトリ皿にそのまま移した。室温で３０分間ワイヤを乾燥させた。Ｇ２６注射針をガイドとして用いることにより、各マウスの脳に小片を１本ずつ手で移植した。
（Ｃ群）
【００９２】
汚染除去のための処理
ＬｐＨ、ＬｐＨｓｅ及びEndozyme Plusによる処理
ＬＰＨ/ＬＰＨｓｅ（英国、RG22 4AX、ハンツ、ベージングストーク、バイアブルズ、ジェイズクロース、ステリスハウス、ステリス社製）、Endozyme Plus（米国、NY 11501、ミネオラ：サガモアアベニュー393、ルホフコーポレーション社製）。ＬＰＨ及びＬＰＨｓｅは、汚染に曝される恐れのある作業台及び同様の表面の消毒用として設計された自社開発化合物である。Endozyme Plusは、医療機器の消毒用として市販されている。
【００９３】
脳ホモジネートに（上記の通り）曝露したワイヤ小片２０本から各々なる３群を、０．２ｍｌの溶液（ＬｐＨ、ＬｐＨｓｅ、又はEndozyme Plus;各々、濃度は二回蒸留水中１０％（ｖ／ｖ））を入れたエッペンドルフ試験管に移した。これらを室温で９０分間インキュベートした。（各溶液は、二回蒸留水１．３５ｍｌに対して原液０．１５ｍｌを加えることにより、使用前に調製した。）ワイヤを５０ｍｌ及び２５ｍｌのＰＢＳを用いて短時間すすいだ。ＬｐＨ（Ｄ群）。
ＬｐＨｓｅ（Ｅ群）。
Endozyme Plus（Ｆ群）。
【００９４】
オートクレーブ処理
脳ホモジネートに曝露したワイヤ小片２０本（３を参照）を、密封したオートクレーブ処理袋に入れて蓋無しオートクレーブトレイ上にて１２１℃で２０分間、及び１３４℃で３０分間それぞれオートクレーブ処理した。オートクレーブ処理済みワイヤ小片をＴｇ２０マウスの脳内に移植した（各マウス１本ずつ）。
１２１℃（Ｇ群）。
１３４℃（Ｈ群）。
【００９５】
酵素処理のみ又は酵素処理後オートクレーブ処理
脳ホモジネートに曝露したワイヤ小片２０本（３を参照）を、４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む二回蒸留水溶液を入れたエッペンドルフ試験管に移し、１００℃で１５分間煮沸した。エッペンドルフ試験管を４％のＳＤＳ存在下で４０℃まで冷却し、ピペットで液体を除去した。プロナーゼ溶液（１．１６ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを同じエッペンドルフ試験管に加え、４０℃で３０分間インキュベートした。溶液を除去し、パパイン溶液（０．２１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを同じエッペンドルフ試験管に加え、さらに４０℃で３０分間インキュベートした。５０ｍｌ及び２５ｍｌのＰＢＳでワイヤを短時間すすいだ。１群の処理ワイヤを、Ｔｇ２０マウスの脳に１片ずつ永久移植して感染性を分析した。
（Ｉ群）
【００９６】
２群の上記処理ワイヤを、４．１．に記載した通りに、検体と平行してオートクレーブ処理にかけ、その後各Ｔｇ２０トランスジェニックマウスの脳内に１片ずつ移植した。
酵素処理及び１２１℃２０分（Ｊ群）。
酵素処理及び１３４℃２０分（Ｋ群）。
【００９７】
表１に結果を示す（図3を参照:‘汚染除去１'）。図７で結果の経時変化を見ることができる（‘汚染除去１'）。
【００９８】
以上により、本発明の方法が有意なプリオン汚染除去をもたらすことが示される。
【実施例４】
【００９９】
外科用鋼鉄上におけるプリオン感染性の無効化
この実施例は、表面上におけるプリオン感染性の無効化への本発明の方法の応用である（この実施例では、表面は外科用鋼鉄である）ので、外科用器具の汚染除去への応用性を示すものである。この場合もまた、本発明の方法は病院の汚染除去部門で行われる予備洗浄手順において有利に実施可能である。残存感染性のバイオアッセイを行うために、この外科用鋼鉄の小試料をトランスジェニックマウスに移植する。
【０１００】
この実験は、酵素処理による消毒の有効性を既存の処理方法と比較して示すことを目的としていた。５ｍｍ×０．１５ｍｍの鋼鉄製ワイヤを３０分間、Rocky Mountain Laboratories（ＲＭＬ）スクレイピーの末期症状状態であるＣＤ１マウスの脳から調製した１０％ホモジネートと共にインキュベートした。次いでゆるく付着している組織片を除去するために上記ワイヤをボルテックスミキサー上で５００ｕｌのＰＢＳ中にて短時間洗浄してから乾燥させ、Ｔｇ２０／ＺＨ１トランスジェニックマウス（正常プリオン蛋白ＰｒＰＣを過剰発現するように予め交配しておいた）の脳内に挿入した。
【０１０１】
挿入前にワイヤを、無消毒（ポジティブコントロール群‘被感染ワイヤ、滅菌無し'）、１３４℃でオートクレーブ処理、又は本実施例に記載の本発明に従う酵素処理のいずれかで処理した。個々の処理を図５に示す（表２）。
【０１０２】
酵素処理は、実施例２のプロトコールＡ（ＳＤＳ、ＰＫ、プロナーゼ）により行った；ワイヤを９９−１００℃で４％のＳＤＳ中にて１５分間インキュベートし、４０℃まで冷却後、プロテイナーゼＫを添加し、次いでプロナーゼを添加した。各酵素インキュベートは４０℃で３０分間行った。
【０１０３】
次いでワイヤを乾燥させた。ネガティブコントロール群は、ＲＭＬホモジネートと共にインキュベートしなかったワイヤを挿入することにより作製した。
【０１０４】
ワイヤを入れてインキュベートしたＲＭＬホモジネートの感染性を測定するために、さらなるマウス群に３０ｕｌの１％希釈物を脳内接種した。これにより、使用したホモジネートが感染性であることが確認された。
【０１０５】
詳細な実験手順
材料
プロテイナーゼＫ（MERCK CODE 390973P; ０．００６２５ｍｇ／ｍｌ  ０．１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ７．６溶液）。
プロナーゼ（SIGMA CODE P5147; ０．０３３６ｍｇ／ｍｌ  ０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ ｐＨ７．６溶液）
【０１０６】
ワイヤの移植
Ｇ２６注射針をガイドとして用いてＴｇ２０マウスの脳に被処理/未処理のワイヤ小片を1本ずつ手で移植した。
【０１０７】
１０％（ｗ／ｖ）ＲＭＬ脳ホモジネートの調製
脳ホモジネート（１０％（ｗ／ｖ））を基本的に上記の通り調製した。即ち、順次孔径の小さい注射針（１８ゲージ、２１ゲージ、及び２３ゲージ注射針）に脳を通すことによりＰＢＳ中で調製した。アリコートを−７０℃で冷凍した。
【０１０８】
他の手順は上記の通りであった。
【０１０９】
各群の被処理ワイヤをそれぞれ指標マウスの脳に移植し、匹数を数えた。結果を図５（表２）に示す。
【０１１０】
このアッセイの経時変化を図６のグラフに示す（‘汚染除去２'）。
【０１１１】
見てわかる通り、非感染ワイヤからの発病はなかった。脳内感染物質からは１００％発病し、未処理の被感染ワイヤ小片も同様であった。
【０１１２】
病院における標準的プリオン汚染除去処理である高温オートクレーブ処理も１００％発病するに至った。
【０１１３】
最後に、本発明による処理では、１８匹のうち１匹のみ発病するに至った。このレベルでは、この群のこの発病マウスは単回感染用量に曝露したにすぎないと考えられた。
【０１１４】
従って、本発明に従って実施される物品のプリオン汚染除去が感染性を極めて効果的に低減するに至ることがわかる。この低減は、プリオンがないと実質的に見なせる程度までの低減である。
【０１１５】
上記詳細な説明の中で言及した全刊行物を本明細書中に参考として援用する。本発明の範囲及び精神から逸脱せずに上記本発明の方法及び組成物の様々な改変及び変更が行えることは当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい実施態様と共に記載されているが、請求項に記載された本発明は、このような特定の実施態様に不当に限定されるべきでないことが理解されるべきである。それどころか、生化学及びバイオテクノロジー又は関連分野の当業者にとって自明な、本発明を実施するための上記態様の様々な変更は以下の請求項の範囲内であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図1はウェスタンブロットの結果である。
【図２】図２はウェスタンブロットの結果である。
【図３】図３は表である。
【図４】図４は実験計画表である。
【図５】図５は表である。
【図６】図６はグラフである。
【図７】図７はグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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