(57)【要約】ペプチドアミドの固相合成のためのプロセスが提供され、該プロセスは、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸をその側鎖により固体支持体へ付着させ、α−窒素保護基を除去し、該α−窒素上にペプチド鎖を組み立て、そして次に組み立てられたペプチドアミドを固体支持体から切断することを含んでいる。新規アミノ酸類似体、ペプチドアミドおよび固相支持体もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドアミドの固相合成のためのプロセスであって、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸を、その側鎖を経て固体支持体へ付着させ、α−窒素保護基を除去し、そして該α−窒素上にペプチド鎖を組み立てることを含む、前記プロセス。
【請求項２】
ペプチドアミドの固相合成のためのプロセスであって：
（ａ）その側鎖にヘテロ原子を含んでいるα−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸を、該側鎖を経て固体支持体へ付着させ；
（ｂ）付着した第一のアミノ酸が固体支持体に結合されて残るような条件下で、α−窒素保護基を除去することにより、付着した第一のアミノ酸のα−窒素を脱保護し、そして追加のα−窒素保護アミノ酸を、付着したアミノ酸の脱保護α−窒素へカップリングして、保護Ｎ−末端を有する付着したペプチドアミドを得；
（ｃ）付着したペプチドアミドが固体支持体に結合されて残るような条件下で、α−窒素保護基を除去することにより、付着したペプチドアミドのＮ−末端を脱保護し、そして追加のα−窒素保護アミノ酸を、付着したペプチドアミドの脱保護Ｎ−末端へカップリングし、そして固体支持体上に所望のペプチドアミドが組み立てられるまで繰り返し；
（ｄ）該ペプチドアミドのＮ−末端からα−窒素保護基を除去し、そして場合によって非アミノ酸Ｎ−末端残基と反応させ；そして
（ｅ）ペプチドアミドが固体支持体から放出されるように、ペプチドアミドの第一のＣα−カルボキサミドアミノ酸側鎖および固体支持体間の連結を切断し、そして場合によって、任意の側鎖保護基を除去する、工程を含んでいる、前記プロセス。
【請求項３】
α−窒素保護基が塩基に不安定な保護基である、請求項１かまたは請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
α−窒素保護基がＦｍｏｃである、請求項１〜３の何れかに記載のプロセス。
【請求項５】
α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がＦｍｏｃ−システインＣα−カルボキサミドである、請求項１〜４の何れかに記載のプロセス。
【請求項６】
固体支持体が４−メトキシトリチルポリスチレンである、請求項１〜５の何れかに記載のプロセス。
【請求項７】
Ｆｍｏｃ−ＡｒｇおよびＦｍｏｃ−Ｈａｒが側鎖保護基の使用なしでカップリングされる、請求項２から６の何れかに記載のプロセス。
【請求項８】
ペプチドアミドが、単離そして場合によって行う精製に続いて環化される、請求項２から７の何れかに記載のプロセス。
【請求項９】
ペプチドアミドが、ペプチドアミド中の二つの残基間のジスルフィド架橋の形成を経て環化される、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
ＣｙｓおよびＭｐｒ間のジスルフィド架橋を通して環化されたｃ［Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２の固相合成のための、請求項１かまたは請求項２に記載のプロセスであって：
（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２のチオール側鎖を、適した反応性固体支持体へ付着させ；
（ｉｉ）固相ペプチド合成を実行して、直線状ペプチドアミドを形成させ；
（ｉｉｉ）固体支持体から直線状ペプチドアミドを切断して、配列Ｍｐｒ−Ｓ−Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２、ＨＳ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２または−［Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２］２の直線状ペプチドアミドを得；そして
（ｉｖ）ペプチドアミドを環化して生成物を形成する、工程を含んでいる、前記プロセス。
【請求項１１】
ＣｙｓおよびＭｐｒ間のジスルフィド架橋を通して環化されたｃ［Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２の固相合成のための請求項１かまたは請求項２に記載のプロセスであって：
（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２のチオール側鎖を、適した反応性固体支持体へ付着させ；
（ｉｉ）ホモアルギニンの側鎖上の保護基を使用することなく、固相ペプチド合成を実行して、直線状ペプチドアミドを形成させ；
（ｉｉｉ）固体支持体から直線状ペプチドアミドを切断して、配列ＨＳ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２の直線状ペプチドアミドを得；そして
（ｉｖ）ペプチドアミドを環化して生成物を形成する、工程を含んでいる、前記プロセス。
【請求項１２】
その側鎖中にヘテロ原子を含んでいる、Ｆｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸。
【請求項１３】
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ−ＮＨ２から成る群より選択される、請求項１２に記載のＦｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸。
【請求項１４】
Ｈａｒ−Ｇ−Ｄ配置を含んでいる、ペプチドアミドのジスルフィド二量体。
【請求項１５】
【化１】
2006501150.tif 000005
から成る群より選択される、請求項１４に記載のジスルフィド二量体。
【請求項１６】
配列−［Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２］２を有する、請求項１４かまたは１５に記載のジスルフィド二量体。
【請求項１７】
ペプチドアミド中のチオールへのジスルフィド結合により連結された、追加のチオール含有化合物を含んでいる、Ｈａｒ−Ｇ−Ｄ配置を含んでいるペプチドアミド。
【請求項１８】
【化２】
2006501150.tif 000006
から成る群より選択される、請求項１７に記載のペプチドアミド。
【請求項１９】
配列Ｍｐｒ−Ｓ−Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２を有する、請求項１７に記載のペプチドアミド。
【請求項２０】
固相合成のための支持体であって、アミノ酸の側鎖を通して支持体へ付着されたα−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸を含んでいる、前記支持体。
【請求項２１】
α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がその側鎖により付着されている、トリチルリンカーを有する、ポリスチレンまたはポリジメチルアクリルアミド重合体を含む、請求項２０に記載の固相合成のための支持体。
【請求項２２】
Ｆｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がその側鎖により付着されている、トリチルリンカーを有する、ポリスチレンまたはポリジメチルアクリルアミド重合体を含み、ここで、アミノ酸がＣｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｅｎ、ＤｐｒまたはＤａｂから成る群より選択される、請求項２０かまたは２１に記載の固相合成のための支持体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ペプチドアミドの固相合成のためのプロセス、Ｆｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸、新規ペプチドアミド、およびペプチドアミド合成のための新規支持体に関する。
【０００２】
多くのペプチドで治療剤としての有用性が観察されている。特に重要である１つのペプチドは、６つのアミノ酸および１つのメルカプトプロピオニル残基を含んでいる環状ペプチドアミドである、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）である。エプチフィバチドは、血小板レセプター糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａへ結合することにより、そして血小板凝集を阻害することにより作用し、従って凝血塊を防止している。エプチフィバチドは、急性冠動脈症候群を処置している患者および経皮冠動脈介入を受けている患者において使用される、インテグレリン（ｉｎｔｅｇｒｅｌｉｎ、商標）の活性成分である。
【０００３】
エプチフィバチド生産のための固相法は、米国特許第５，３１８，８９９号に記載されている。しかしながら、多くのペプチドと同様に、エプチフィバチドでの主たる努力目標は、受容可能な費用で十分な物質を生産することである。
【０００４】
ペプチドは、アルファ−アミノ保護アミノ酸を使用して、ペプチドのカルボキシ末端から開始する固相合成により、合成することができる。２つの最も広く使用されているプロトコールは、アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）もしくは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を用いている。
【０００５】
Ｆｍｏｃ保護戦略が用いられる場合、好ましい固相支持体は、４−（２’、４’−ジメトキシベンジル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ（Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド）連結剤で誘導体化されたポリジメチルアクリルアミドまたはポリスチレン樹脂である。ペプチド配列の最初の保護アミノ酸は、通常、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）のごとき活性化剤存在下で、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＢｔＯＨ）と反応させることで、そのカルボキシ基を活性エステルへ変換することにより、この樹脂へ付着させる（ａｔｔａｃｈ）ことができる。この穏和な活性化工程は、ＣｙｓおよびＴｒｐ（本明細書を通し、アミノ酸の標準３文字または１文字略号が使用されるであろう）のごとき、感受性残基のラセミ化を最少にする。加えて、このペプチド樹脂の穏和な酸分解は、樹脂からのペプチドの切断、および任意の側鎖保護基の脱保護の両方を起こすことができる。しかしながら、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド連結剤は高価な試薬であり、このことが商業規模でのペプチド合成におけるその使用を制限している。
【０００６】
別の戦略は、４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＨＭＢＡ）連結単位を有する樹脂を使用することである。これらの誘導体化樹脂は、Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）で誘導体化された樹脂よりも安価である。しかしながら、最初のアミノ酸の付着に、偶発的Ｆｍｏｃ除去および感受性アミノ酸のラセミ化の両方を生じる可能性がある、ｐ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）触媒エステル化プロトコールを含んでいる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅら、（１９８１）  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．ｐ３３６）。
【０００７】
ペプチドは通常、樹脂結合ペプチドエステルのアンモニア分解／アミノ分解により、もしくはＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂のごとき、アミンに基づいたリンカーを使用するペプチドアミドの合成により、対応するアミドへ変換される。それ故、それらの生産もまた上に概説した因子により制限されている。
【０００８】
ゆえに、エプチフィバチドのごときペプチドアミドを、大規模に、高純度で、経済的に生産することができるプロセスに対する要求が存在する。
それ故、本発明はペプチドアミドの固相合成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸をその側鎖を経て固体支持体へ付着させ、α−窒素保護基を除去し、そして該窒素上にペプチド鎖を組み立てることを含んでいる。
【０００９】
好ましくは、組み立てられたペプチドアミドは次ぎに固体支持体から切断される。
好ましくは、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸は、その側鎖にＮ、ＯまたはＳのごときヘテロ原子を含んでいる。
【００１０】
ペプチドアミドの固相合成のために好ましいプロセスは、以下の工程を含んでいる：
（ａ）その側鎖にヘテロ原子を含んでいる、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸を、該側鎖を通して固体支持体へ付着させ；
（ｂ）付着した第一のアミノ酸が固体支持体に結合されて残るような条件下で、α−窒素保護基を除去することにより、付着した第一のアミノ酸のα−窒素を脱保護し、そして追加のα−窒素保護アミノ酸を、付着したアミノ酸の脱保護α−窒素へカップリングして、保護Ｎ−末端を有する付着したペプチドアミドを得；
（ｃ）付着されたペプチドアミドが固体支持体に結合されて残るような条件下で、α−窒素保護基を除去することにより、付着されたペプチドアミドのＮ−末端を脱保護し、そして追加のα−窒素保護アミノ酸を、付着されたペプチドアミドの脱保護Ｎ−末端へカップリングし、そして固体支持体上に所望のペプチドアミドが組み立てられるまで繰り返し；
（ｄ）該ペプチドアミドのＮ−末端からα−窒素保護基を除去し、そして場合によって非アミノ酸Ｎ−末端残基と反応させ；そして
（ｅ）ペプチドアミドが固体支持体から放出されように、ペプチドアミドの第一のα−カルボキサミドアミノ酸側鎖および固体支持体間の連結を切断し、そして場合によって、任意の側鎖保護基を除去する。
【００１１】
工程（ｅ）で放出されたペプチドアミドは、好ましくは、単離し、そして精製する。
α−窒素保護基は、好ましくは塩基に不安定な保護基である。より好ましくは、α−窒素保護基はＦｍｏｃである。
【００１２】
α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸は、ヘテロ原子を含んでいる側鎖を有する任意のアミノ酸から誘導することができる。好ましくは、側鎖は、求核性Ｎ、ＯおよびＳ部分のごとき求核性部分を含んでいる。より好ましくは、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸はＣｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｅｎ（ペニシラミン）、Ｄｐｒ（２，３−ジアミノプロピオン酸）およびＤａｂ（２，４−ジアミノ酪酸）から誘導される。α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がＣｙｓから誘導されるのが特に好ましい。
【００１３】
上記の優先度に基づくと、最も好ましいα−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸はＦｍｏｃ−システイン  Ｃα−カルボキサミド（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２）である。
Ｎα−Ｆｍｏｃ  Ｃα−カルボキサミドアミノ酸は、アミノ酸の側鎖と保護基を反応させ、次ぎにＣα−カルボキシルをアミド化することにより製造することができる。アミド化は、好ましくは、アミノ酸α−カルボキシル基を活性エステルへ変換し、続いて臭化アンモニウム／Ｎ−メチルモルホリンのごときアミド化剤との反応により実行される。側鎖保護基が使用される場合、それは好ましくはトリチル部分を含んでいる。アミド化後、トリチル保護基は、例えば、ジクロロメタンのごとき適した溶媒中、トリフルオロ酢酸およびトリイソプロピルシランで処理するような既知の条件を使用して、容易に除去することができる。
【００１４】
工程（ａ）の固体支持体は、固相ペプチド合成に使用するために適した、当該分野で知られている任意の支持体であることができる。そのような支持体は、通常連結基を経て、アミノ酸の側鎖、より好ましくは求核性アミノ酸側鎖と反応することができ、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のアシル化および脱保護サイクルを通じて安定であり、および工程（ｅ）のペプチドアミドの放出を可能にする結合を形成する。
【００１５】
好ましくは、固体支持体はポリスチレンまたはポリジメチルアクリルアミド重合体に基づいている。より好ましくは、支持体は架橋剤として約０．５から２％のジビニルベンゼンを含むスチレンの共重合体、またはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ビスアクリロイルエチレンジアミンおよびアクリロイルサルコシンメチルエステル単量体を含んでいるポリジメチルアクリルアミド重合体である。これらの好ましい支持体および他の適した支持体の詳細は、本明細書において参考文献として援用される、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ“Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、にみることができる。
【００１６】
好ましいリンカー基はトリチル部分、より好ましくは４−メトキシトリチル部分を含んでいる。
上記の優先度に基づくと、特に好ましい固体支持体は４−メトキシトリチルポリスチレンである。
【００１７】
工程（ａ）は、ペプチド固相合成において、固体支持体へのＣα−カルボキシルを通したアミノ酸の連結において通常使用されるものと同一の条件下および同一の溶媒中で実行することができる。これらの方法は当該技術分野では公知であり、本明細書において参考文献として援用される、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ，“固相ペプチド合成−実際的アプローチ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ“Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、のごとき、このことを主題とした多くの標準教科書に記載されている。
【００１８】
樹脂が４−メトキシトリチルポリスチレンであり、およびＦｍｏｃ窒素保護基が使用される場合、工程（ａ）は、典型的には、Ｎα−Ｆｍｏｃ  Ｃα−カルボキサミドアミノ酸を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのごとき適した溶媒に溶解し、次ぎに、撹拌しながらＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えることを含んでいる。次ぎに、このＮα−Ｆｍｏｃ  Ｃα−カルボキサミドアミノ酸溶液を樹脂に加え、樹脂と反応させ、その後、樹脂を集め、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのごとき適した溶媒で洗浄する。
【００１９】
工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のカップリングおよび脱保護サイクルは、当該技術分野では公知であるペプチド固相合成のための標準条件を使用して実行することができる。さらに詳細には、例えば、本明細書において参考文献として援用される、ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｐａｒｄ，“固相ペプチド合成−実際的アプローチ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ“Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、を参照されたい。使用される保護基がＦｍｏｃである場合、Ｆｍｏｃ除去が、ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液、より好ましくは、２０％  ｖ／ｖピペリジンを含むＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液で処理することにより達成されることが、特に有利である。
【００２０】
アミノ酸活性化は、好ましくは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＢｔＯＨ）およびジイソプロピルカルボジイミドの存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中で実行する。
【００２１】
工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）において、さもなければカップリングおよび脱保護サイクル中に修飾されるであろう感受性側鎖を保護するため、側鎖保護基を使用することができる。感受性側鎖を有するアミノ酸の例はＣｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｈａｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｐｅｎ、Ｔｒｐ、ＡｓｎおよびＧｌｎである。若しくは、所望の側鎖を得るため、ペプチドアミドの固相合成後化学修飾を実行することができる。例えば、米国特許第５，３１８，８９９号のプロセスに従い、リジン残基のグアニジン化によりホモアルギニンが製造できる。
【００２２】
本発明に従ったプロセスの特定の態様において、いくつかの側鎖保護基を省略してもよいことが観察されている。それ故、本発明の好ましいプロセスにおいて、Ｆｍｏｃ−ＡｒｇおよびＦｍｏｃ−Ｈａｒは、側鎖保護基を使用することなくカップリングされる。このことは、ＡｒｇまたはＨａｒのカップリング後、これらのアミノ酸残基の側鎖上にあるグアニジノ基がさらなるカップリング反応に先立ってプロトン化されることを確かめることにより達成することができる。このことは、好ましくは、樹脂結合ペプチドアミドを過剰のＢｔＯＨで処理することにより達成される。
【００２３】
工程（ｄ）における場合によって反応させる非アミノ酸Ｎ−末端残基は、樹脂へ付着したペプチドアミドのＮ−末端と反応することができる任意の化合物であることができる。一般に、この化合物は有機酸、好ましくはチオール置換有機酸、およびより好ましくはＳ−保護メルカプトプロピオン酸若しくはメルカプトプロピオン酸ジスルフィドである。
【００２４】
工程（ｅ）において、固体支持体からペプチドアミドを切断するために必要とされる正確な条件は、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸の側鎖、および支持体上のリンカー基の性質で変化し、当該技術分野では既知である。典型的には、Ｃｙｓおよび４−メトキシトリチルポリスチレンの好ましい組合わせでは、ペプチドアミド樹脂を１０％（ｖ／ｖ）エタンジチオール含有トリフルオロ酢酸で処理することにより、ペプチドアミドを放出することができる。
【００２５】
工程（ｅ）において、固体支持体間との連結が切断される前に、若しくは後に任意の側鎖保護基を除去することができる。しかしながら、固体支持体およびペプチドアミド間の連結、および任意の側鎖保護基の除去を、単一プロセスにより実行することが好ましい。工程（ｄ）が非アミノ酸Ｎ−末端残基との反応を含んでいないこともまた好ましい：α−窒素保護基はＮ−末端から除去されており、固体支持体およびペプチドアミド間の連結、および任意の側鎖保護基の除去が単一プロセスにより実行される。
【００２６】
ペプチドアミドの単離および精製は、当業者にはよく知られているであろう、標準的方法および技術を使用して達成することができる。これらの方法は、ジイソプロピルエーテルのごとき、ペプチドアミドの完全性に影響しないであろう溶媒中でのペプチドアミドの沈殿、続いての分取ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィーおよび塩交換を含んでいる。
【００２７】
単離されたペプチドアミドは、精製前若しくは後に、さらなる加工にかけることができる。好ましくは、ペプチドアミドは単離、そして場合によって行う精製に続いて環化される。より好ましくは、ペプチドアミドは、利用可能なチオールを有している、ペプチドアミド中の２つの残基間でのジスルフィド架橋の形成を経て環化される。
【００２８】
ジスルフィド架橋の形成を経てペプチドアミドを環化するために、任意の適した方法を使用することができる。当該技術分野で知られている方法の例は、本明細書において参考文献として援用される、Ａｌｂｅｒｉｃｉｏら、ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ“Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成”中、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００、ページ９１から１１４，により要約されている。そのような方法の例には、空気酸化；ＥＤＴＡおよび酸化型および還元型グルタチオンを含んでいるトリス緩衝液のごとき、酸化還元緩衝液の存在下での酸化；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）仲介酸化；フェリシアン化カリウム仲介酸化；エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）仲介酸化；ヨウ素仲介酸化；トリフルオロ酢酸タリウム（ＩＩＩ）仲介酸化；アルキルトリクロロシラン−スルホキシド仲介酸化；トリフルオロメタンスルホン酸銀−ＤＭＳＯ−水性ＨＣｌ仲介酸化；および２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）、２，２’−ジチオピリジンおよびビス（ｔｅｒｔ−ブチル）アゾカルボキシレートのごとき試薬を使用する直接ジスルフィド形成が含まれる。
【００２９】
好ましくは、利用可能なチオールを有する２つの残基を含むペプチドアミドを水性媒質中、例えば、内部ジスルフィド結合形成を可能にする、リットル当たり１ｇ未満の濃度まで希釈し、そして次ぎに、ｐＨをｐＨ７．５から１０．５、好ましくはｐＨ８から１０、より好ましくはｐＨ８．５から９．５、および特に約ｐＨ９のごときアルカリ性ｐＨへ調整することにより、環化がなし遂げられる。最適ペプチド濃度およびｐＨは、チオールおよびペプチド両方の性質のごとき、多くの因子に依存するであろうことが認められるであろう。
【００３０】
環化はまた以下の工程によっても達成することができる：
（ｉ）ペプチドアミド内のチオール含有残基、好ましくはＮ末端残基へのジスルフィド架橋により繋がれた、追加のチオール含有化合物を有する所望のペプチドアミドの類似体を合成する。この追加のチオール含有化合物は、好ましくは、それが結合されている残基と同一であり、および、好ましくはシステイン、ペニシラミン、またはより好ましくはメルカプトプロピオン酸である。このジスルフィド含有ペプチドアミド類似体は、ペプチドアミド中の別の残基にあるチオールと反応して内部転位を起こすことができ、環状ペプチドアミドを得る；かまたは
（ｉｉ）個々の鎖が一つまたはそれより多くのジスルフィド架橋により連結されている、所望のペプチドアミドの二量体を合成する。これらの二量体は次ぎに、適した条件下、内部転位を起こすことが可能であり、所望の環状ペプチドの１または２当量を得る。
【００３１】
（ｉ）および（ｉｉ）の内部転位は一般に、水性媒質中のペプチドを、例えば、内部ジスルフィド結合形成を可能にする、リットル当たり５から２０ｇの濃度まで希釈し、そして次ぎに、ｐＨをｐＨ７．５から１０．５、好ましくはｐＨ８から１０、より好ましくはｐＨ８．５から９．５、および特に約ｐＨ９のごときアルカリ性ｐＨへ調整することを含んでいる。最適ペプチド濃度およびｐＨは、チオールおよびペプチド両方の性質のごとき、多くの因子に依存するであろうことが認められるであろう。
【００３２】
好ましくは、本プロセスにより生産されるペプチドアミドは、Ｈａｒ−Ｇ−Ｄ配置を含んでいる。より好ましくは、本プロセスにより生産されるペプチドアミドは、ジスルフィド架橋環状化合物を形成することができる。本プロセスにより生産されるペプチドアミドが、
【００３３】
【化１】
2006501150.tif 000002
【００３４】
から成る群より選択されることが特に好ましい。
ジスルフィド架橋により連結された、任意の上記化合物の二量体を含んでいるペプチドアミド、またはペプチドアミド中のチオールへのジスルフィド架橋により連結された、追加のチオール化合物を有するペプチドアミドを生産するプロセスもまた好ましい。
【００３５】
ペプチドアミドが、配列：
ＨＳ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２；
Ｍｐｒ−Ｓ−Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２；または
−［Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２］２
を含むプロセスにより生産されることが特に好ましい。
【００３６】
より特別には、ペプチドアミドが、配列ＨＳ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２を含むプロセスにより生産されることが好ましい。
好ましくは、これらの直線状ペプチドアミドは次ぎに、ＣｙｓおよびＭｐｒ間のジスルフィド架橋により環化され、ｃ［Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２を与える。
【００３７】
本発明の好ましい態様は、ＣｙｓおよびＭｐｒ間のジスルフィド架橋を通して環化されたｃ［Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２の固相合成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは以下の工程を含んでいる：
（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２のチオール側鎖を、適した反応性固体支持体へ付着させ；
（ｉｉ）固相ペプチド合成を実行して、直線状ペプチドアミドを形成させ；
（ｉｉｉ）固体支持体から直線状ペプチドアミドを切断して、配列Ｍｐｒ−Ｓ−Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２、ＨＳ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２または−［Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２］２の直線状ペプチドアミドを得；そして
（ｉｖ）ペプチドアミドを環化して生成物を形成する。
【００３８】
本発明のより好ましい態様は、ＣｙｓおよびＭｐｒ間のジスルフィド架橋を通して環化されたｃ［Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２の固相合成のためのプロセスを提供し、前記プロセスは以下の工程を含んでいる：
（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２のチオール側鎖を、適した反応性固体支持体へ付着させ；
（ｉｉ）ホモアルギニンの側鎖上の保護基を使用することなく、固相ペプチド合成を実行して、直線状ペプチドアミドを形成させ；
（ｉｉｉ）固体支持体から直線状ペプチドアミドを切断して、配列ＨＳ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２の直線状ペプチドアミドを得；そして
（ｉｖ）ペプチドアミドを環化して生成物を形成する。
【００３９】
好ましい固体支持体およびプロセス条件は前に定義したとおりである。
本発明のプロセスは、バッチもしくは連続的流れ合成技術、もしくは製造業者により提供された指導書に従う任意の自動合成機を使用することができる。
【００４０】
本発明の第二の様相に従うと、その側鎖にヘテロ原子を含んでいるＦｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸が提供される。より好ましくは、その側鎖にヘテロ原子を含んでいるＦｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ−ＮＨ２、Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ−ＮＨ２から成る群より選択される。
【００４１】
その側鎖にヘテロ原子を含んでいるＦｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸は、本発明の第一の様相で前に説明したように製造することができる。
本発明の第三の様相は、Ｈａｒ−Ｇ−Ｄ配置を含んでいるペプチドアミドのジスルフィド二量体を提供する。本発明の第三の様相に従った化合物は、
【００４２】
【化２】
2006501150.tif 000003
【００４３】
から成る群より選択されることが好ましい。
本発明の第三の様相に従った、特に好ましい化合物は、配列：
−［Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２］２
を有している。
【００４４】
本発明の第四の様相は、ペプチドアミド中のチオールへのジスルフィド結合により連結された、追加のチオール含有化合物を含んでいる、Ｈａｒ−Ｇ−Ｄ配置を含んでいるペプチドアミドを提供する。追加のチオール含有化合物は、ペプチド中のＮ−末端チオール含有残基へジスルフィド結合により連結されていることが好ましい。また追加のチオール含有化合物は、ジスルフィド結合によりそれが連結されているペプチド残基と同一であることも好ましい。追加のチオール含有化合物がメルカプトプロピオン酸であり、そしてそれがペプチドアミド中のＮ−末端メルカプトプロピオン酸へ連結されていることが特に好ましい。
【００４５】
本発明の第四の様相に従った化合物は、
【００４６】
【化３】
2006501150.tif 000004
【００４７】
から成る群より選択されることが好ましい。
本発明の第四の様相に従った、特に好ましい化合物は、配列Ｍｐｒ−Ｓ−Ｓ−Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ２を有している。
【００４８】
本発明の第五の様相は、固相合成のための支持体を提供し、それはアミノ酸の側鎖を通して該支持体に付着したα−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸を含んでいる。
該支持体は本発明の第一の様相で説明されたものであり、好ましくは、トリチルリンカーを有するポリスチレンまたはポリジメチルアクリルアミド重合体に基づくものである。
【００４９】
好ましくは、付着したα−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸はＣｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｅｎ（ペニシラミン）、Ｄｐｒ（２，３−ジアミノプロピオン酸）およびＤａｂ（２，４−ジアミノ酪酸）から誘導される。α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がＣｙｓから誘導されるのが特に好ましい。
【００５０】
付着したα−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸のα−窒素保護基は、好ましくは塩基に不安定な保護基である。より好ましくは、α−窒素保護基はＦｍｏｃである。
それ故、本発明の第五の様相に従った好ましい支持体は、α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がその側鎖を通して付着されている、トリチルに基づくリンカーを有する、ポリスチレンまたはポリジメチルアクリルアミド重合体を含んでいる。
【００５１】
特に好ましい支持体は、Ｆｍｏｃ−α−窒素−Ｃα−カルボキサミドアミノ酸がその側鎖を通して付着されている、トリチルに基づくリンカーを有する、ポリスチレンまたはポリジメチルアクリルアミド重合体を含んでおり、ここで、アミノ酸はＣｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｅｎ、ＤｐｒまたはＤａｂ、特にＣｙｓ、から成る群より選択される。
【００５２】
本発明はここで以下の実施例により例示されるが、それにより制限されるものではない。
【００５３】
実施例１
エプチフィバチドｃ［Ｍｐｒ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ］−ＮＨ２の合成
略語
ＤＣＭ                  ジクロロメタン
ＤＩＣ                  ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ              Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ                  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＥＤＴ                  １，２−エタンジチオール
Ｆｍｏｃ                ９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｈａｒ                  ホモアルギニン
ＢｔＯＨ                １−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＰＰ                  ジイソプロピルエーテル
Ｍｐｒ                  ３−メルカプトプロピオン酸
［Ｍｐｒ−ＯＨ］２      ３−メルカプトプロピオン酸ジスルフィド
ＮＭＭ                  Ｎ−メチルモルホリン
ＴＩＰＳ                トリイソプロピルシラン
ＴＦＡ                  トリフルオロ酢酸
【００５４】
工程１  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２合成
工程１（ａ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨのアミド化
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５８４．０ｇ）およびＢｔＯＨ．Ｈ２Ｏ（３０６．０ｇ）を別々にデュラン（Ｄｕｒａｎ）フラスコに加え、ＤＭＦ（６リットル）で溶解した。フラスコは次ぎに氷浴に沈めた。溶液が＜５℃に到達したら、ＤＩＣの一回一定分量（１５５．８ｍｌ）を加え、反応混合物を１８分撹拌して、活性エステルを形成させた。次ぎにフラスコを氷浴から取り出し、乾燥し、そして室温まで温めた。
【００５５】
ＮＨ４Ｂｒ（１０７．７ｇ）を秤量して乾燥デュランフラスコに加え、ＤＭＦ（８００ｍｌ）を撹拌しながら加え、透明になるまで撹拌を続けた。次ぎに、ＮＨ４Ｂｒの溶液を撹拌しながら、ＮＭＭの一定分量（１２０．８ｍｌ）を加え、次ぎにそれを活性化Ｆｍｏｃ−アミノ酸溶液へ加えた。混合の最初の１分間に、淡黄色（pale yellow）からあざやかな黄色（bright yellow）への、特有の色の変化があった。反応混合物は次ぎに室温で４．５から１８時間撹拌した。
【００５６】
反応混合物を５リットルの丸底フラスコへ移し、本来の容量の約３分の１まで（２．３リットル）、一部を蒸発させた。淡いオレンジ色の液体を５リットルの反応フラスコに移し、オーバーヘッド攪拌機で激しく撹拌した。未反応の酸性ＢｔＯＨを、５％ｗ／ｖＮａＨＣＯ３（水溶液）（２．０リットル）を注意深く加えることにより中和し、得られた媒体をＨ２Ｏ（４．０リットル）で希釈した。この段階の間、中間体Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（トリチル）−ＮＨ２が軟塊様白色固形物として沈殿した。この固形物を濾過し、水で洗浄し（３ｘ４リットル）、０．５時間風乾した後、デシケーターに移し、“真空下”で１８時間乾燥した。
【００５７】
工程１（ｂ）トリチル保護基の除去
工程１（ａ）の生成物、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ２（５８５．０ｇ）を１０リットルの反応容器へ移し、オーバーヘッド攪拌機を使用して、０．３時間かけてＤＣＭ（６００ｍｌ）に溶解した。反応混合物へＴＩＰＳの一定分量（２００ｍｌ）を加え、ＴＦＡ（５．１リットル）の添加に先立って、氷浴に沈めた。反応混合物を低温で１０分間穏やかに撹拌し、そして次ぎに室温まで戻し、さらに１．５時間撹拌した。反応混合物を蒸発により濃縮すると、油性固形物を得た。この生成物をＤＣＭ（１．０リットル）に再溶解し、生成物からＴＦＡを共沸させて除くためにもう一度蒸発させた。これにより白色固形物が生じ、激しく撹拌しながら酢酸エチル（３．０リットル）へ抽出すると、淡黄色溶液を得た。この溶液を激しく撹拌しながら石油エーテル６０．８０（１９．０リットル）へ加えると、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２が沈殿した。均質な固形物を提供するため、撹拌を３０分続けた。固形物を濾過し、石油エーテル６０／８０で３回洗浄した（一洗浄当たり１．０リットル）。得られた固形物は‘真空下’で１８時間乾燥させた。生成物からいかなるトリチル−ＴＩＰＳ付加物も除去するため、石油エーテルによる沈殿を３回繰り返した。
【００５８】
工程２  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２付着
工程１からのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（７４５．１ｇ）を撹拌しながらＤＭＦ（２６１５ｍｌ）に溶解した。生じたアミノ酸溶液に、ＤＩＰＥＡ（５０６ｇ）を加え、１分間混合した。このＦｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２溶液を４−メトキシトリチルポリスチレン樹脂（７４７ｇ）（ＣＢＬ−Ｐａｔｒｏｓから，ギリシャ）へ加え、混合物を２時間混合し、次ぎに、濾過による溶媒の除去が可能な反応容器へ加えた。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２が付着した樹脂は、９ＬのＤＭＦで７回洗浄した。洗浄した樹脂は次ぎに、１０％ｖ／ｖＤＩＰＥＡを含むメタノール（６．７Ｌ）に５分間懸濁させた後に濾過し、９ＬのＤＭＦで７回連続的に洗浄した。
【００５９】
工程３  Ｆｍｏｃ基除去
工程２からの樹脂を、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ（２ｘ９Ｌ）で２回処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去した。１回目の処理においては、樹脂およびピペリジン／ＤＭＦ混合物を３分間穏やかに撹拌した後、濾過によりピペリジン／ＤＭＦを除去した。２回目の処理においては、樹脂およびピペリジン／ＤＭＦ混合物を７分間穏やかに撹拌した後、濾過によりピペリジン／ＤＭＦを除去した。樹脂は次ぎに、濾過により溶媒を取り除きながら、ＤＭＦで７回（７ｘ９Ｌ）洗浄した。
【００６０】
工程４  アミノ酸活性化および付加
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（６６１ｇ）およびＢｔＯＨ．Ｈ２Ｏ（６００ｇ）をＤＭＦ（１９４９ｍｌ）に溶解し、氷浴中で１０℃より低い温度まで冷却した。反応混合物へＤＩＣを、撹拌しながら１０分以上かけて、４１ｍｌの一定分量を１０回に分けて加えた。反応混合物の温度をＤＩＣの添加の間にモニターし、２０℃より低く保った。反応混合物はさらに６分間撹拌し、次ぎに工程３からの脱保護洗浄樹脂へ加えた。カップリング反応は、室温で６時間進行させた。カップリング効率はカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験により試験した。ペプチドアミド−樹脂は次ぎにＤＭＦ（９Ｌ）で洗浄し、そして保護Ｆｍｏｃ基は工程３のように除去した。
【００６１】
カイザー試験の代わりに、第二アミンのためのクロラニル試験を使用することを除いて、上に記載したプロセスを繰り返し、樹脂結合プロリンへＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ（８３５ｇ）をカップリングさせた。
【００６２】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（８０６ｇ）およびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（５８２ｇ）は、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨのための上記プロトコールを使用してカップリングさせた。
【００６３】
Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ−ＯＨ（８９４ｇ）は、９００ｇのＢｔＯＨ．Ｈ２Ｏを使用したことを除いて、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨと同一のプロトコールを使用してカップリングさせた。Ｈａｒカップリング後、Ｆｍｏｃ基除去およびＤＭＦ洗浄（各々の洗浄容量は１１．２５Ｌへ増量されている）に続いて、ＢｔＯＨ．Ｈ２Ｏ（１１２５ｇ）のＤＭＦ（１１．２５Ｌ）溶液を樹脂に加え、５分間撹拌した後に濾過した。
【００６４】
［Ｍｐｒ−ＯＨ］２（４１２ｇ）は、洗浄に使用したＤＭＦの容量を９Ｌから１１．２５Ｌに増加させたことを除いて、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨと同一のプロトコールを使用してカップリングさせた。
【００６５】
樹脂は、ＤＣＭ（５ｘ７．５０Ｌ）による切断に先立って、崩壊させた。樹脂は次ぎに１時間風乾した。
【００６６】
工程５  ペプチドアミド切断および側鎖保護基除去
１０％（ｖ／ｖ）ＥＤＴ／ＴＦＡ（１５リットル）を工程４からのペプチドアミド樹脂と混合した。撹拌を続けながら、さらにＴＦＡの一定分量（１５リットル）を加えた。最初の添加から３０分後、粗直線状ペプチドアミド溶液を樹脂から濾過して除いた。樹脂はＴＦＡ（３ｘ１５リットル）で３回洗浄した。合併した濾液をプールし、回転蒸発により濃縮して油状物とした（浴温度＜３５℃）。蒸発は、蒸発速度の突然の低下があった時に停止した。生じた油状物は、撹拌されているＩＰＰ（１００リットル）へ徐々に加えた。蒸発フラスコをＴＦＡ（２ｘ２５０ｍｌ）ですすぎ、これらのすすぎ液もまた撹拌を続けているＩＰＰへ加えた。混合物をさらに１０分撹拌し、生じた沈殿ペプチドアミドは、最低でも３０分間、重力下で放置して沈降させた。固形物を濾過し、過剰量の空気が物質を通して引き込まれないように注意しながら、ＩＰＰ（３ｘ２０リットル）で３回洗浄した。粗直線状ペプチドアミドは次ぎに、一定重量になるように、２０℃、“真空下”で、一夜乾燥した。
【００６７】
工程６  ペプチドアミド環化
工程５からのペプチドアミド（２００ｇ）をアセトニトリル（１１５０ｍｌ）に懸濁し、混ぜながら水（１１５０ｍｌ）を加えると、溶液が提供される。この溶液を水（２０．７リットル）へ加えた。アンモニア水溶液（３．５％ｗ／ｖ）をペプチドアミド溶液に加えて、ｐＨを９．０±０．２５に調整した。必要とされたアンモニアの量は、約２．０ｍｌ／ｇ粗ペプチドアミド、であった。もしｐＨが９．２５を超えたら、酢酸を加えてｐＨ値を必要な範囲内へ戻した。生じた溶液は、４時間後、続いて１時間間隔でＨＰＬＣによりモニターしながら、環化が完了するまで撹拌した。反応の終点は、分析用ＨＰＬＣにより評価し、十分に減少した直線状ペプチドアミドの量が２．５％より少なくなった場合とした。
【００６８】
環化をモニターするために使用されたＨＰＬＣ分析法は以下のようである：
緩衝液Ａ            ６ｍＭ  ＨＣｌ／水
緩衝液Ｂ            アセトニトリル
カラム              Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８
３．５μｍ  １００Å  １５０ｘ４．６ｍｍ
濃度勾配            ３０分で緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂが１０から３５％へ
流速                １ｃｍ３／分
波長                ２０４ｎｍ
注入量              １０μｌ
温度                ３０℃
ピーク幅            １．０
ピーク感度          ０．４
【００６９】
工程７  精製
工程７（ａ）  分取ＨＰＬＣ
工程６からの環化ペプチドアミド溶液を、１０％クエン酸水溶液で酸性とし（３４ｍｌ／ｇ粗ペプチドアミド）、溶解するまで撹拌した。生じた溶液を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ８（Ｅｋａ  Ｎｏｂｅｌから）を用いた分取ＨＰＬＣにより精製した。条件は以下のようである：
媒体              Ｋｒｏｍａｓｉｌ  Ｃ８（１０μ、１００Å、３ｋｇ）
カラム寸法        ２５ｘ１５ｃｍ  内径
流速              ３７５ｍｌ／分
検出              ２５４ｎｍ
緩衝液Ａ          １０ｍＭ  ＨＣｌ／水
緩衝液Ｂ          アセトニトリル
濃度勾配          １０分間、緩衝液Ａ中に５％緩衝液Ｂ
７５分で緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂが５−３０％
５分で緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂが３０−７５％
ピーク分画を集め、プールし、および４℃で保存し、そして塩交換、脱塩、蒸発および凍結乾燥によりさらに精製すると、純粋な環化ペプチドアミドが得られた。
【００７０】
実施例２
工程１
工程１は、実施例１、工程１のように実施した。
【００７１】
工程２  Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２付着
工程１からのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２（４１８．５ｇ）を撹拌しながらＤＭＦ（２６９２ｍｌ）に溶解した。この液を回転エバポレーターに移し、２５−５０％のＤＭＦを蒸発させて除去した（浴温度＜３５℃）。残った溶液は、さらなるＤＭＦの添加により３７６６ｍｌとした。次ぎに、得られたアミノ酸溶液へＤＩＰＥＡ（３８１ｇ）を加え、１分間混合した。このＦｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２溶液を、４−メトキシトリチルポリスチレン樹脂（７６９ｇ）（ＣＢＬ−Ｐａｔｒｏｓから，ギリシャ）へ加え、混合物を２時間混合し、次ぎに、濾過による溶媒の除去が可能な反応容器へ加えた。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＮＨ２が付着した樹脂は、９．２３ＬのＤＭＦで７回洗浄した。洗浄した樹脂は次ぎに、１０％ｖ／ｖＤＩＰＥＡを含むメタノール（９．２３Ｌ）に５分間懸濁させた後に濾過し、続いて９．２３ＬのＤＭＦで７回洗浄した。
【００７２】
工程３  Ｆｍｏｃ基除去
工程２からの樹脂を、２０％ピペリジン含有ＤＭＦ（２ｘ９．２３Ｌ）で２回処理することによりＦｍｏｃ保護基を除去した。１回目の処理においては、樹脂およびピペリジン／ＤＭＦ混合物を３分間穏やかに撹拌した後、濾過によりピペリジン／ＤＭＦを除去した。２回目の処理においては、樹脂およびピペリジン／ＤＭＦ混合物を７分間穏やかに撹拌した後、濾過によりピペリジン／ＤＭＦを除去した。樹脂は次ぎに、濾過により溶媒を取り除きながら、ＤＭＦで７回（７ｘ９．２３Ｌ）洗浄した。
【００７３】
工程４  アミノ酸活性化および付加
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（５０６ｇ）およびＢｔＯＨ．Ｈ２Ｏ（４０５．３ｇ）をＤＭＦ（２００７ｍｌ）に溶解し、氷浴中で５℃より低い温度まで冷却した。反応混合物へＤＩＣを、撹拌しながら１０分以上かけて、３１ｍｌの一定分量を１０回に分けて加えた。反応混合物の温度をＤＩＣの添加の間にモニターし、３０℃より低く保った。反応混合物はさらに６分間撹拌し、次ぎに工程３からの脱保護洗浄樹脂へ加えた。カップリング反応は、室温で６時間進行させた。カップリング効率はカイザー試験により試験した。ペプチドアミド−樹脂は次ぎにＤＭＦ（９．２３Ｌ）で洗浄し、そして保護Ｆｍｏｃ基は工程３のように除去した。
【００７４】
カイザー試験の代わりに、第二アミンのためのクロラニル試験を使用することを除いて、上に記載したプロセスを繰り返し、樹脂結合プロリンへＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ（６３９．７ｇ）をカップリングさせた。
【００７５】
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（６１７．１ｇ）およびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（４４５．９ｇ）は、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨのための上記プロトコールを使用してカップリングさせた。
【００７６】
Ｆｍｏｃ−Ｈａｒ・ＨＣｌ−ＯＨ（７４４．９ｇ）は、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨと同一のプロトコールを使用してカップリングさせた。Ｈａｒカップリング後、Ｆｍｏｃ基除去およびＤＭＦ洗浄（各々の洗浄容量は１１．５３Ｌへ増量されている）に続いて、ＢｔＯＨ．Ｈ２Ｏ（１１５４ｇ）のＤＭＦ（１０．３５Ｌ）溶液を樹脂に加え、５分間撹拌した後に濾過した。
【００７７】
Ｔｒｔ−Ｍｐｒ−ＯＨ（５２２．７ｇ）は、洗浄に使用したＤＭＦの容量を９．２３Ｌから１１．５０Ｌに増加させたことを除いて、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨと同一のプロトコールを使用してカップリングさせた。
【００７８】
樹脂は、ＤＣＭ（５ｘ７．６９Ｌ）による切断に先立って、崩壊させた。樹脂は次ぎに１時間風乾した。
【００７９】
工程５  ペプチドアミド切断および側鎖保護基除去
１０％（ｖ／ｖ）ＥＤＴ／ＴＦＡ（１５リットル）を工程４からのペプチドアミド樹脂と混合した。撹拌を続けながら、さらにＴＦＡの一定分量（１５リットル）を加えた。最初の添加から３０分後、粗直線状ペプチドアミド溶液を樹脂から濾過して除いた。樹脂はＴＦＡ（３ｘ５リットル）で３回洗浄した。合併した濾液をプールし、回転蒸発により濃縮した（浴温度＜３５℃）。蒸発は、残りが５リットルになった時に停止した。生じた溶液は、撹拌されているＩＰＰ（１００リットル）へ徐々に加えた。蒸発フラスコをＴＦＡ（２ｘ２５０ｍｌ）ですすぎ、これらのすすぎ液もまた撹拌を続けているＩＰＰへ加えた。混合物をさらに１０分撹拌し、生じた沈殿ペプチドアミドは、最低でも３０分間、重力下で放置して沈降させた。固形物を濾過し、過剰量の空気が物質を通して引き込まれないように注意しながら、ＩＰＰ（３ｘ２０リットル）で３回洗浄した。粗直線状ペプチドアミドは次ぎに、一定重量になるように、２０−２５℃、“真空下”で、一夜乾燥した。
【００８０】
工程６  ペプチドアミド環化
工程５からのペプチドアミド（１８０ｇ）をアセトニトリル（１０．３Ｌ）に懸濁し、混ぜながら水（１０．３Ｌ）を加えると、溶液が提供される。この溶液を水（１８６．２リットル）へ加えた。アンモニア水溶液（３．５％ｗ／ｖ）をペプチドアミド溶液に加えて、ｐＨを９．０±０．２５に調整した。必要とされたアンモニアの量は、約２．０ｍｌ／ｇ粗ペプチドアミド、であった。もしｐＨが９．２５を超えたら、酢酸を加えてｐＨ値を必要な範囲内へ戻した。ＥＤＴのアセトニトリル溶液（１％ｖ／ｖ、２０７ｍｌ）をペプチド溶液へ加えた。生じた溶液は、１−１．５時間間隔でＨＰＬＣによりモニターしながら、環化が完了するまで撹拌した。反応の終点は、分析用ＨＰＬＣにより評価し、十分に減少した直線状ペプチドアミドの量が２．５％より少なくなった場合とした。
【００８１】
環化をモニターするために使用されたＨＰＬＣ分析法は以下のようである：
緩衝液Ａ            ６ｍＭ  ＨＣｌ／水
緩衝液Ｂ            アセトニトリル
カラム              Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ８
３．５μｍ  １００Å  １５０ｘ４．６ｍｍ
濃度勾配            ３０分で緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂが１０から３５％へ
流速                １ｃｍ３／分
波長                ２０４ｎｍ
注入量              １０μｌ
温度                ３０℃
ピーク幅            １．０
ピーク感度          ０．４
【国際調査報告】
2006501150.tif 000007
2006501150.tif 000008
2006501150.tif 000009
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