(57)【要約】本発明は、メトトレキセート療法を受けているヒトから得た細胞抽出物中で少なくとも1つのポリグルタミン酸メトトレキセート（MTXPG）を分離することによって細胞抽出物中のMTXPGのレベルを決定する工程；および少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程のための方法を提供する。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在する、MTXPG3、MTXPG4もしくはMTXPG5のレベルを決定するため、または各々のポリグルタミン酸メトトレキセート種（MTXPG1〜MTXPG7）のレベルを決定するために有用であり得る。
2006520914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセート（MTXPG）のレベルを決定するための方法であって、
（a）メトトレキセート療法を受けているヒトから得た細胞抽出物中の少なくとも1つのMTXPGを分離(resolve)する工程；および
（b）少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出し、これによって分離されたMTXPGのレベルを決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
MTXPG3、MTXPG4またはMTXPG5のレベルを決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
MTXPG1〜MTXPG7の各々のレベルを決定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
細胞抽出物が赤血球抽出物である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞抽出物が白血球抽出物である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
濃縮(packed)赤血球1リットルあたり、500nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ヒトが自己免疫疾患を有する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
自己免疫疾患が関節炎である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデスおよび乾癬からなる群より選択される、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
ヒトがガンを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
工程（a）がクロマトグラフィーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（HPLC）である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
工程（b）が蛍光定量法を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
工程（b）が分光光度法を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
工程（b）が質量分析法を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセート（MTXPG）のレベルを決定するための方法であって、
（a）該細胞抽出物中の、少なくとも1つのMTXPGを分離する工程であって、MTXPGが天然の量以下の放射性同位体を含む工程；および
（b）少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出し、これによって分離されたMTXPGのレベルを決定する工程であって、分離されたMTXPGの検出が、他のMTXPG種からの該分離されたMTXPGの分画を必要としない工程
を含む、方法。
【請求項１８】
MTXPG3、MTXPG4またはMTXPG5のレベルを決定する工程を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
MTXPG1〜MTXPG7のレベルをそれぞれ決定する工程であって、MTXPG1〜MTXPG7の検出にはMTXPG1〜MTXPG7種のお互いからの分画を必要としない工程を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
細胞抽出物がヒト細胞抽出物である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
細胞抽出物が赤血球抽出物である、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
細胞抽出物が白血球抽出物である、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
濃縮赤血球1リットルあたりの、500nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項17記載の方法。
【請求項２４】
濃縮赤血球1リットルあたりの、50nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項17記載の方法。
【請求項２５】
細胞抽出物が、メトトレキセート療法を受けているヒト由来である、請求項17記載の方法。
【請求項２６】
ヒトが自己免疫疾患を有する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
自己免疫疾患が関節炎である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデスおよび乾癬からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
ヒトがガンを有する、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
工程（a）がクロマトグラフィーを含む、請求項17記載の方法。
【請求項３１】
クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（HPLC）である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
工程（b）が蛍光定量法を含む、請求項17または31記載の方法。
【請求項３３】
工程（b）が分光光度法を含む、請求項17または31記載の方法。
【請求項３４】
工程（b）が質量分析法を含む、請求項17または31記載の方法。
【請求項３５】
細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセート（MTXPG）のレベルを決定するための方法であって、
（a）該細胞抽出物中で、少なくとも1つのMTXPGを分離する工程；
（b）該少なくとも1つのMTXPGを照射し、これによって少なくとも1つの分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を生成する工程；および
（c）該少なくとも1つの分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出して、これによって該MTXPGのレベルを決定する工程
を含む、方法。
【請求項３６】
MTXPG3、MTXPG4またはMTXPG5のレベルを決定する工程を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
MTXPG1〜MTXPG7のレベルをそれぞれ決定する工程を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
工程（b）が、少なくとも1つのMTXPGをUV照射する工程を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
UV照射工程が、225nm〜275nmの範囲の波長を有する放射線を利用する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
UV照射工程が、254nmの波長を有する放射線を利用する、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
工程（a）がクロマトグラフィーを含む、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー（HPLC）である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
工程（b）が0.05％〜1％のH2O2を有する溶媒中で少なくとも1つのMTXPGを照射することによって行なわれる、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
工程（b）が0.1％〜0.3％のH2O2を有する溶媒中で少なくとも1つのMTXPGを照射することによって行なわれる、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
工程（b）が少なくとも1つのMTXPGを0.5秒〜60秒間照射する工程を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４６】
工程（b）が少なくとも1つのMTXPGを0.5秒〜15秒間照射する工程を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
工程（c）が、240nm〜420nmの範囲で励起の際、蛍光を検出する工程を含む、請求項35記載の方法。
【請求項４８】
工程（c）が、240nm〜300nmの範囲で励起の際、蛍光を検出する工程を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
工程（c）が、274nmのUV照射で励起の際、蛍光を検出する工程を含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
工程（c）が、360nm〜410nmの範囲で励起の際、蛍光を検出する工程を含む、請求項47記載の方法。
【請求項５１】
工程（c）が、320nm〜550nmの範囲の発光波長で蛍光を検出する工程を含む、請求項35記載の方法。
【請求項５２】
工程（c）が、440nm〜500nmの範囲の発光波長で蛍光を検出する工程を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
工程（c）が、464nmの発光波長で蛍光を検出する工程を含む、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
工程（c）が、274nmのUV照射励起の際、および464nmの発光波長で蛍光を検出する工程を含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
細胞抽出物がヒト細胞抽出物である、請求項35記載の方法。
【請求項５６】
細胞抽出物が赤血球抽出物である、請求項35記載の方法。
【請求項５７】
細胞抽出物が白血球抽出物である、請求項35記載の方法。
【請求項５８】
濃縮赤血球1リットルあたり、500nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項35記載の方法。
【請求項５９】
濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項35記載の方法。
【請求項６０】
細胞抽出物が、メトトレキセート療法を受けているヒト由来である、請求項35記載の方法。
【請求項６１】
メトトレキセートが低用量療法である、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
ヒトが自己免疫疾患を有する、請求項60記載の方法。
【請求項６３】
自己免疫疾患が関節炎である、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデスおよび乾癬からなる群より選択される、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
ヒトがガンを有する、請求項60記載の方法。
【請求項６６】
ヒトに投与されたメトトレキセート（MTX）療法に関連する治療有効性を最適化するかまたは毒性を軽減する方法であって、
（a）ヒトから得た細胞抽出物中で、少なくとも1つのMTXPGを分離する工程；
（b）少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによって該分離されたMTXPGのレベルを決定する工程；および
（c）該分離されたMTXPGのレベルに基づいて該ヒトに引き続き投与される薬物または投薬量を選択する工程
を含む、方法。
【請求項６７】
MTXPG3、MTXPG4またはMTXPG5のレベルを決定する工程を含む、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
MTXPG1〜MTXPG7のレベルをそれぞれ決定する工程を含む、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
工程（c）が、ヒトに引き続き投与されるMTXの投薬量を変更する工程を含む、請求項66記載の方法。
【請求項７０】
工程（c）がヒトに引き続き投与されるMTXの投薬量を減らす工程を含む、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
工程（c）がヒトに引き続き投与されるMTXの投薬量を増やす工程を含む、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
工程（c）がヒトに引き続き投与される葉酸またはその誘導体の用量を変更する工程を含む、請求項66記載の方法。
【請求項７３】
細胞抽出物が赤血球抽出物である、請求項66記載の方法。
【請求項７４】
細胞抽出物が白血球抽出物である、請求項66記載の方法。
【請求項７５】
濃縮赤血球1リットルあたり、500nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項66記載の方法。
【請求項７６】
濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の個々のMTXPG種をそれぞれ検出できる、請求項66記載の方法。
【請求項７７】
ヒトが自己免疫疾患を有する、請求項66記載の方法。
【請求項７８】
自己免疫疾患が関節炎である、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデスおよび乾癬からなる群より選択される、請求項77記載の方法。
【請求項８０】
ヒトがガンを有する、請求項66記載の方法。
【請求項８１】
工程（a）がクロマトグラフィーを含む、請求項66記載の方法。
【請求項８２】
クロマトグラフィーがHPLCである、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
工程（b）が蛍光定量法を含む、請求項66または82記載の方法。
【請求項８４】
工程（b）が分光光度法を含む、請求項66または82記載の方法。
【請求項８５】
工程（b）が質量分析法を含む、請求項66または82記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、薬物療法をモニタリングするための方法に、そしてさらに詳細にはメトトレキセート薬物療法の有効性および毒性をモニタリングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
葉酸塩（葉酸）は、DNAの合成、複製および修復の生命維持プロセスに必須であるビタミンである。葉酸塩はまた、細胞の生存に中心的な別のプロセスである、タンパク質の生合成に重要である。プテリジン化合物であるメトトレキセート（MTX）は葉酸塩と構造的に類似であり、結果として、通常、DNAのプリンおよびピリミジンヌクレオチド前駆体の生合成のため、そしてタンパク質性合成の間のアミノ酸の相互変換のための補酵素として葉酸塩を用いる、多数の酵素の活性部位に結合し得る。葉酸に対して構造的に類似しているにもかかわらず、メトトレキセートは、葉酸塩を要する酵素による補因子としては用いられ得ず、代わりに酵素結合部位についての葉酸塩補因子と競合し、これによってタンパク質およびDNAの生合成を、従って細胞分裂を阻害する。
【０００３】
メトトレキセートが細胞分裂を阻害する能力は、急速なまたは異常な細胞増殖によって特徴付けられる多数の疾患および状態の処置において生かされている。例えば、自己免疫疾患は、正常な自系（自己）組織に対する不適切な免疫応答によって特徴付けられ、そしてT細胞またはB細胞を急速に複製することによって媒介される。メトトレキセートで処置されている自己免疫疾患としては、限定はしないが関節リウマチおよび他の形態の関節炎、乾癬、多発性硬化症、糖尿病の自己免疫段階（若年発症糖尿病または1型糖尿病）、自己免疫性ブドウ膜網膜症、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎および全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【０００４】
多くの悪性細胞は正常細胞よりも急速に増殖するので、メトトレキセートはまたガン性細胞増殖を選択的に損なうためにも用いることができる。結果として、メトトレキセートは、例えば、急性リンパ球性白血病、乳癌、頭頸部の扁平上皮癌、進行性菌状息肉腫、肺癌、非ホジキンリンパ腫、妊娠性絨毛癌、破壊性絨毛腺腫および胞状奇胎の処置において使用される、広範に用いられる抗癌剤である。
【０００５】
広範な種々の疾患および状態に対する治療有効性にかかわらず、メトトレキセートでの処置は、患者に対するリスクを示し得る。詳細には、メトトレキセートは、正常細胞および疾患細胞の複製および分裂に必要なプロセスを妨害するので、この薬物が不適切に高レベルであれば、能動的に増殖している非標的組織、例えば骨髄および腸粘膜の破壊がもたらされ得る。メトトレキセートは、いくつかの条件で必要となる「高用量レジメン（high-dose regimen）」で投与された場合、腎臓および肝臓の毒性をともなっている。さらに、低用量メトトレキセート療法は、この投薬量が影響する薬物動態パラメーター、例えば、薬物取り込み、標的化およびクリアランスにおける個々の変動に起因して適切ではない、ある患者では毒性および望ましくない副作用をもたらし得る。この状況は、メトトレキセートが長年にわたって投与され得る関節リウマチのような慢性状態の処置では特に問題である。
【０００６】
薬物動態のパラメーターにおける個々の相違を予想するのは困難であり得るので、安全かつ有効なメトトレキセート処置ストラテジーでは、メトトレキセートまたはメトトレキセート代謝物のレベルが処置されている患者でモニターされることを必要とする。バイオアッセイ、免疫学的検出およびクロマトグラフィーアッセイを含む、血漿中のメトトレキセート薬物濃度をモニタリングするための種々の方法が開発されている。このような血漿検出方法は、いくつかの臨床適用では高用量のメトトレキセート療法をモニタリングするために有用である。しかし、その感度の限界のせいで、これらの血漿検出方法は、メトトレキセート代謝物の細胞内レベルをアッセイしなければならない、低用量のメトトレキセート療法をモニタリングするのには有用ではない。
【０００７】
メトトレキセートは、哺乳動物細胞によって取り込みの際に代謝され、その結果一つまたは複数のグルタミル部分がメトトレキセートに添加されてポリグルタミン酸メトトレキセート（MTXPG）の混合物が得られる。MTXに添加され得るグルタミル部分の数は一般に2〜7の間で変化する。MTXPGは、細胞から容易に流出せず、従って、その細胞毒性効果を長期間にわたって発揮することができる。細胞内MTXPGのレベルは、メトトレキセート療法に応答しなかった患者における細胞内レベルに比較して、この療法に応答した患者では高いことが示されている。細胞内ポリグルタミン酸メトトレキセートレベルを測定するために現在利用可能な方法は、ジヒドロ葉酸還元酵素アッセイに基づくが、このアッセイではポリグルタミン酸メトトレキセートレベルはジヒドロ葉酸還元酵素を阻害する能力に基づいて算出される。しかし、これらのアッセイにおける酵素阻害の程度は、メトトレキセートに結合されたグルタミル残基の数に依存し、この方法では不可能なレベルの細胞内ポリグルタミン酸メトトレキセートの正確な決定が得られる。ジヒドロ葉酸還元酵素に基づくアッセイの変動はさらに、いくつかの状況では悪化し得る。なぜならメトトレキセート療法に対する個々の応答に依存して異なる量で存在する葉酸塩、および食餌によって影響される葉酸塩の量も、現行の酵素アッセイの結果に影響するからである。
【０００８】
従って、ポリグルタミン酸メトトレキセートの細胞内レベルを決定するため、ならびに低用量メトトレキセート療法を含むメトトレキセート療法の有効性および毒性をモニタリングするための新規な方法が必要である。本発明はこの必要性を満たして、同様に関連の利点を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、メトトレキセート療法を受けているヒトから得た細胞抽出物中において少なくとも1つのポリグルタミン酸メトトレキセート（MTXPG）を分離することによって細胞抽出物中のMTXPGのレベルを決定する工程と；少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程のための方法を提供する。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在する、MTXPG3、MTXPG4もしくはMTXPG5のレベルを決定するため、または各々のポリグルタミン酸メトトレキセート種（MTXPG1〜MTXPG7）のレベルを決定するために有用であり得る。
【００１０】
本発明はまた、細胞抽出物中で、天然の量以下の放射性同位体を含む少なくとも1つのポリグルタミン酸メトトレキセートを分離することによってこの細胞抽出物中のMTXPGのレベルを決定する工程と；少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程であって、この分離されたMTXPGの検出には他のMTXPG種からのこの分離されたMTXPGの分画を必要としない工程のための方法を提供する。一態様では、本発明の方法は、MTXPG3、MTXPG4またはMTXPG5のレベルを決定するために用いられる。別の態様では、本発明の方法は、MTXPG1〜MTXPG7種の各々のレベルを決定するために用いられるが、このMTXPG1〜MTXPG7の検出にはお互いからのMTXPG1〜MTXPG7の種の分画を必要としない。
【００１１】
本明細書においてさらには、細胞抽出物中で少なくとも1つのポリグルタミン酸メトトレキセートを分離することによってこの細胞抽出物中のMTXPGのレベルを決定する工程と；この少なくとも1つのMTXPGを照射して、これによって少なくとも1つの分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を生成する工程と；この少なくとも1つの分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出して、これによってこのMTXPGのレベルを決定する工程とのための方法が提供される。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在する、MTXPG3、MTXPG4もしくはMTXPG5のレベルを決定するため、またはMTXPG1〜MTXPG7種の各々のレベルを決定するために有用であり得る。
【００１２】
本発明によってまた、ヒトに投与されたメトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するかまたは毒性を軽減する方法であって、ヒトから得た細胞抽出物中で、少なくとも1つのMTXPGを分離する工程と；少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程と；この分離されたMTXPGのレベルに基づいてこのヒトに引き続いて投与される薬物または投薬を選択する工程による、方法が提供される。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在するMTXPG3、MTXPG4もしくはMTXPG5のレベルを決定ために、またはMTXPG1〜MTXPG7種の各々のレベルを決定するために有用であり得る。本発明の方法は、ヒトに引き続いて投与されるメトトレキセートの投薬量を変更する工程、例えば、ヒトに引き続いて投与されるメトトレキセートの投薬量を減らすかもしくは増加する工程、またはヒトに引き続き投与される葉酸もしくはその誘導体の用量を変更する工程を包含し得る。
【００１３】
発明の詳細な説明
本明細書に開示されるとおり、低用量メトトレキセート療法を受けている個体から調製した赤血球抽出物における個体のポリグルタミン酸メトトレキセート濃度の定量のための逆相液体クロマトグラフィーアッセイを開発した。実施例Iに開示されるとおり、このアッセイは、過塩素酸サンプル処理と、C18逆相カラムから構成され、移動相として酢酸アンモニウム/アセトニトリル緩衝液（pH6.5）を用いるHPLCシステムへの得られた上清の直接注入とを含む。メトトレキセート代謝物を評価するための以前に記載された酵素的な方法とは対照的に、過酸化水素の存在下でポストカラム光酸化の後にポリグルタミン酸メトトレキセートを蛍光定量的に検出した。実施例Iに開示されるように、日内および日間の精度の変動の係数は、高濃度および低濃度の両方のポリグルタミン酸メトトレキセートについて10％未満であった。さらに、濃縮赤血球1リットルあたり5nmol程度の少ないポリグルタミン酸メトトレキセートが検出された。本明細書にさらに開示されるとおり、低用量メトトレキセート療法（中央薬物用量が16mg/週）を受けている14例の関節炎の患者由来の赤血球サンプルにおいてポリグルタミン酸メトトレキセート濃度を決定した。
【００１４】
旧い方法論とは異なり、本発明の方法を用いれば、ポリグルタミン酸メトトレキセート代謝物を、低用量のメトトレキセート療法で処置された患者に存在するかなり低いレベルで検出することが可能であり、個々のポリグルタミン酸塩であるMTXPG1〜MTXPG7の各々を正確に検出するために有用であり得る。本発明の方法はさらに、複数の画分を放射性標識することまたはアッセイする必要なしに簡便に行なうことができる。
【００１５】
上記の知見に基づき、本発明では、メトトレキセート療法を受けているヒトから得た細胞抽出物において少なくとも1つのMTXPGを分離することによって、細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定する工程；および少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程ための方法が得られる。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在するMTXPG3、MTXPG4、もしくはMTXPG5のレベルを決定するために、またはポリグルタミン酸メトトレキセート種であるMTXPG1〜MTXPG7の各々のレベルを決定する工程を含むために有用であり得る。一態様では、この検出工程は、電気化学的検出を含まない。別の態様では、この検出工程は、電気化学的検出もUV可視化分光測定法も含まない。
【００１６】
限定はしないが赤血球抽出物および白血球抽出物を含む、メトトレキセート療法を受けているヒトからの種々の細胞抽出物は、本発明の方法において有用であり得る。特定の態様では、本発明において有用な細胞抽出物は、関節炎、全身性エリテマトーデスもしくは乾癬のような自己免疫疾患を有するヒト、またはガンを有するヒトに由来する。
【００１７】
本発明の方法は、ポリグルタミン酸メトトレキセートの低い細胞内レベルの検出のために有用であり得る。一態様では、本発明の方法は、濃縮赤血球1リットルあたり、500nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有する。別の態様では、本発明の方法は、濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有する。
【００１８】
本明細書においてさらに提供されるのは、細胞抽出物中で天然の量以下の放射性同位体を含む少なくとも1つのポリグルタミン酸メトトレキセートを分離することによってこの細胞抽出物中のMTXPGのレベルを決定する工程と；少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程であって、この分離されたMTXPGの検出には他のMTXPG種からのこの分離されたMTXPGの分画を必要としない工程のための方法である。一態様では、本発明の方法は、MTXPG3、MTXPG4またはMTXPG5のレベルを決定するために用いられる。別の態様では、本発明の方法は、MTXPG1〜MTXPG7の各々のレベルを決定するために用いられるが、このMTXPG1〜MTXPG7の種の検出にはお互いからのMTXPG1〜MTXPG7の種の分画を必要としない。
【００１９】
本発明はまた、細胞抽出物中で天然の量以下の放射性同位体を含む少なくとも1つのポリグルタミン酸メトトレキセートを分離することによってこの細胞抽出物中のMTXPGのレベルを決定する工程と；少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程のための方法を提供し、この方法によって、濃縮赤血球1リットルあたり500nmol未満の各々の個々のMTXPG種を検出する。一態様では、この検出工程は、電気化学的検出を含まない。別の態様では、この検出工程は、電気化学的検出もUV可視化分光測定法も含まない。本発明の方法は、例えば、濃縮赤血球1リットルあたり250nmol、100nmol、50nmol、20nmolまたは5nmol未満の各々の個々のMTXPG種を検出するために有用であり得る。
【００２０】
本発明の方法において有用な細胞抽出物としては、限定はしないが、赤血球抽出物および白血球抽出物が挙げられる。本発明において有用な細胞抽出物としてはさらに、メトトレキセート療法を受けているヒト由来の抽出物、および任意の種々の自己免疫疾患またはガンを有するヒト由来の抽出物が挙げられる。一態様では、本発明の方法は、濃縮赤血球1リットルあたり、500nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有する。別の態様では、本発明の方法は、濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有する。
【００２１】
少なくとも1つのMTXPGを分離するためおよび分離されたMTXPGを検出するための種々の技術は、本発明の上記の方法において有用であり得る。MTXPGは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）のようなクロマトグラフィーを用いて分離され得る。分離されたMTXPGは、例えば、蛍光定量法、分光光度法もしくは質量分析法、またはそれらの技術の組み合わせを用いて検出され得る。
【００２２】
細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを検出するための本発明の方法は、メトトレキセート療法を受けている個体におけるメトトレキセート代謝物の細胞内レベルを分析するために有用である。本明細書において用いる場合、メトトレキセートという用語は、MTXと同義であって図1Aに示される構造を有する分子を意味する。メトトレキセートは部分的には、p-アミノベンゾイル部分のアミノ基に6位で結合した2,4-ジアミノ置換プテリン環部分を含み、このp-アミノベンゾイル部分は、メチル化されたアミノ基を有しグルタミン酸部分に結合されたアミドである。以下に記載されるポリグルタミン酸メトトレキセート命名法に従い、「MTXPG1」はメトトレキセートと同義である。
【００２３】
メトトレキセートは、ジヒドロ葉酸塩（DHF）からのテトラヒドロ葉酸塩（THF）の生成を減らすように作用するジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）のインヒビターとして当技術分野において周知である。結果として、メトトレキセートはプリンおよびチミジンの合成ならびにアミノ酸の相互交換を間接的に阻害する。メトトレキセートはまた、DNAを合成するのに必要であるチミジル酸塩合成の阻害を通じて抗増殖活性を示す（Calvert,Semin.Oncol.26:3-10（1999））。メトトレキセートならびにその合成および特性は、U.S.Patent Nos.2,512,572；3,892,801；3,989,703；4,057,548；4,067,867；4,079,056；4,080,325；4,136,101；4,224,446；4,306,064；4,374,987；4,421,913；および4,767,859にさらに詳細に記載されている。ガンを処置するためにメトトレキセートを用いる方法は、例えば、U.S.Pat.Nos.4,106,488；4,558,690；および4,662,359に記載されている。
【００２４】
種々の自己免疫疾患およびガンの処置に有用であるメトトレキセートは、経口または非経口の経路によって投与され得る。この薬物は身体組織に容易に分布して、身体ではメトトレキセートは、還元葉酸担体であるRCF1および葉酸受容体のような成分を含む特定の担体系によって細胞中に輸送される。メトトレキセートは生理学的pHでのその高い極性に起因して、細胞膜を容易に通過せず、そして薬物のほとんどが特定の担体を介して細胞に入る。一旦細胞に入れば、メトトレキセートは、例えば、Kamen,Semin.Oncol.S18:30-39（1997）に記載のように、メトトレキセートのγカルボキシルに対するイソペプチド結合によって連結された、一つまたは複数のグルタミン酸部分を付加するフォリールポリ-γ-グルタミン酸合成酵素のような特定の酵素によって、ポリグルタミン酸メトトレキセートに変換される。
【００２５】
本発明の方法は、ポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定するのに役立つ。本明細書において用いる場合、「ポリグルタミン酸メトトレキセート（methotrexate polyglutamate）」という用語は、「MTXPG」と同義であり、図1Bの一般的な構造に示されるようにメトトレキセートのp-アミノベンゾイル部分にアミド結合されている2つ以上のグルタミン酸塩を有するメトトレキセートの誘導体を意味する。ポリグルタミン酸メトトレキセートのグルタミン酸塩の数は、2から7つ以上に変化し；グルタミン酸塩部分の数は、MTXPGnという命名法を用いて「n」で示すことが可能であり、その結果例えば、MTXPG2は、2つのグルタミン酸塩を有するMTXPGであり、MTXPG3は、3つのグルタミン酸塩を有するMTXPGであり、MTXPG4は、4つのグルタミン酸塩を有するMTXPGであり、MTXPG5は、5つのグルタミン酸塩を有するMTXPGであり、MTXPG6は、6つのグルタミン酸塩を有するMTXPGであり、MTXPG7は、7つのグルタミン酸塩を有するMTXPGであり、そしてMTXPG2-7は、MTXPG2、MTXPG3、MTXPG4、MTXPG5、MTXPG6、およびMTXPG7を含む混合物であって、ここでこの混合物中の個々のポリグルタミン酸型の比は規定されていない。
【００２６】
本発明の方法は、細胞抽出物中におけるポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定するのに有用である。本明細書において用いる場合「レベル（level）」という用語は、細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートの量または濃度を意味する。レベルとは、絶対レベル、例えばモル濃度もしくは重量であっても、または相対的レベル、例えば、この細胞抽出物中の一つまたは複数の他の分子に比較した割合もしくは画分であってもよいことが理解される。本明細書において用いる場合、「レベル」の定義から特に除外されるのは、ジヒドロ葉酸還元酵素または他の別の葉酸依存性酵素の阻害のような酵素活性に基づく推定または測定値である。
【００２７】
ポリグルタミン酸メトトレキセートに関して本明細書において用いる場合、「分離した（resolved）」という用語は、ポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルが決定できるように、他の分子から十分に分けられたことを意味する。従って、観察可能な特性を有するポリグルタミン酸メトトレキセート種は、同じ特性を有する他の分子からMTXPG種を十分に分けることによって、分離される。非限定的な例として、特定の励起波長および発光波長で蛍光によって検出可能なMTXPG種は、その同じ波長で実質的な励起および発光を有する他の分子からそれを分けることによって分離できる；MTXPG種は、異なる励起波長および発光波長を有する種々の他の分子から分けられても分けられなくてもよい。前述の観点から、ポリグルタミン酸メトトレキセートが分離されるか否かは部分的には、この方法で利用される検出手段によって決定されることが理解される。
【００２８】
本明細書において記載されるように、ポリグルタミン酸メトトレキセートは、実施例IおよびIIに示されるような逆相クロマトグラフィーを用いて他の細胞成分からクロマトグラフィーで分離されて、引き続き、例えば、一つまたは複数の公知の参照標準に比較して定量される。本明細書において実証されるように、ポリグルタミン酸メトトレキセートのクロマトグラフィー分離は、C18逆相カラムを通じて、2％アセトニトリル/98％移動相Aから12.5％アセトニトリル/87.5％移動相Aの20分の直線勾配から構成される移動相であって、移動相Aは10mM酢酸アンモニウム、pH6.5であり、過酸化水素は最終濃度0.2％である移動相中に、細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートの混合物を通過させることによって行なうことができる（実施例IおよびII）。
【００２９】
細胞抽出物中のMTXPGの混合物を分離するために有用な逆相カラムは、例えば、本明細書に例示されるように、25cm×4.6mmの寸法を有してもよい。より大きいかまたは小さい直径、長さまたはその両方を有するカラムも例えば、より大きいか小さいサンプルサイズに適合するように用いることができることが理解される。流速は、限定はしないが、0.2〜2.5ml/minuteで変化し得る。本明細書において実証されるように、移動相の流速は1ml/minuteであった。しかし、移動相の流速は、必要に応じて変化することができる。それより遅い流速、例えば、0.8ml/minute、0.5ml/minute、または0.2ml/minuteを、例えば、より小さいカラムで用いてもよいし、またはポリグルタミン酸メトトレキセート保持時間を延長するために用いてもよい。または、それより速い流速、例えば、1.5ml/minuteまたは2.0ml/minuteを例えば、より大きいカラムで用いてもよいし、またはポリグルタミン酸メトトレキセート保持時間を短くするために用いてもよい。
【００３０】
ポリグルタミン酸メトトレキセートは、クロマトグラフィーの方法および分光測定の方法、ならびにサイズもしくは電荷に基づいて分子を分離するように機能するような他の方法を含む、任意の種々の方法によって細胞抽出物の成分から分離され得る。有用なクロマトグラフィーの方法の例としては、限定はしないが、液相および気相のクロマトグラフィー方法、例えば、限定はしないが、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、等電点電気泳動法、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。例えば、限定はしないが、分光測定法は、質量分析法、タンデム型質量分析およびエレクトロスプレーイオン化を用いる分取質量分析である。必要に応じて、本発明の方法において少なくとも1つのMTXPGを分離するために、2つ以上の異なる技術を組み合わせてもよいことが理解される。非限定的な例であるが、可溶性分子は、細胞溶解および過塩素酸沈殿、その後のこの可溶性分子高速液体クロマトグラフィーの後に、タンパク質および他の沈殿した物質から分離され得る。
【００３１】
メトトレキセートで処置された細胞または個体に由来する細胞抽出物は代表的には、結合したグルタミン酸部分の数が異なるポリグルタミン酸メトトレキセート種の混合物を含む。本明細書において用いる場合、「細胞抽出物（cellular extract）」という用語は、異種の多数の細胞成分を含む混合物を意味する。本発明において有用な細胞抽出物は、例えば、異種の多数の可溶性細胞成分、タンパク質および代謝物を含んでもよく、そして単独の細胞タイプ、細胞タイプの混合物または組織供給源に由来してもよい。細胞抽出物の異質性は、種々の基準によって特徴付けられ得る。1つの基準によれば、本発明において有用な細胞抽出物は、この抽出物に存在する種々の細胞成分に関して異種である；このような細胞抽出物は、限定はしないが、少なくとも100、1000、1×104もしくは1×105以上の異なる細胞成分、例えば、少なくとも100、1000、1×104もしくは1×105以上の異なる細胞タンパク質を含んでもよい。異質性はまた、その抽出物が由来する細胞の異なる成分の総数の割合で表現できる。例えば、細胞抽出物は、その抽出物が由来する細胞に存在する種々の成分のうち少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、50％または75％に相当する細胞成分を含んでもよい。異質性はまた、その細胞抽出物中の他の成分の総数に比較した細胞抽出物中の任意の1つの細胞成分の割合に基づいて決定することもできる。従って、本発明において有用な細胞抽出物は、任意の1つの細胞成分が、この抽出物の重量あたりとして他の細胞成分の総量の多くとも90％、80％、70％、60％、50％、25％または10％に相当する混合物であってもよい。本発明の方法において有用な細胞抽出物は、タンパク質、100Daを超える成分、または約303nm〜313nm、もしくは約370nmで照射を吸収する成分などの成分の混合物を含んでもよい。
【００３２】
本発明の方法において有用な細胞抽出物は、一つまたは複数のポリグルタミン酸メトトレキセートを含む任意の細胞抽出物であってもよい。細胞抽出物に対して、所望の場合、さらなる外因性のポリグルタミン酸メトトレキセートを添加してもよいということが理解される。細胞抽出物への一つまたは複数の外因性MTXPGの添加は、定量のために標準曲線を決定するために、または検出条件を最適化するために有用であり得る。ポリグルタミン酸メトトレキセートを含む細胞抽出物は、細胞に対してメトトレキセートを添加すること、およびインビトロでポリグルタミン酸化をさせることによって得ることができる。従って、本発明の方法を用いて、細胞またはその成分、例えば、フォリールポリ-γ-グルタミン酸合成酵素のポリグルタミン酸化活性をモニターまたは決定することができる。細胞抽出物はまた、任意の経路によってメトトレキセートを投与された個体から単離した細胞から調製してもよい。
【００３３】
本発明において有用な細胞抽出物は、当技術分野において周知の方法を用いて細胞または組織から調製され得る。当業者には、供給源の細胞の位置および特徴に基づいてその供給源の細胞を得るために適切な方法は公知であるか、または決定することができる。例えば、赤血球および他の血球は、静脈内経路を通じて回収することによって得ることができる。細胞はまた、例えば、開放外科的切開、生検針または内視鏡を利用する方法などの公知の生検方法を用いて、ガン組織のような組織から取り出すこともできる。細胞は、部分的にはその細胞の特性に依存して、任意の種々の手段によって溶解できる。非限定的な例としては、細胞は、ガラスビーズ、Dounceホモジナイザー、フレンチプレスもしくは超音波での機械的破壊；細胞壁を分解するリゾチームもしくは他の酵素での酵素破壊；浸透圧破壊またはそれらの方法の組み合わせによって溶解され得る。
【００３４】
本発明の方法において有用な細胞抽出物は、例えば、ポリグルタミン酸メトトレキセートが富化されている部分的に精製された抽出物であってもよい。例えば、抽出物を、遠心分離によって部分的に精製して、膜および大きい細胞構造のような不溶性の物質を除去してもよい（実施例Iを参照のこと）。他の細胞成分から、ポリグルタミン酸メトトレキセートまたはそのアナログを含む細胞成分を分離するための部分的精製としては、限定はしないが、例えば、Rubino,J.Chromatog.764:217-254（2001）に記載されるような、遠心分離、タンパク質沈殿、液体間抽出、固相抽出またはクロマトグラフィー、例えば、逆相クロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィーもしくはイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。細胞抽出物を得て部分的に精製するために用いることができるさらなる方法は、例えば、Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,3rd Ed.,Springer-Verlag,New York（1994）and Coligan et al.,Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Baltimore,MD（2000）に記載されるように当技術分野において周知である。
【００３５】
本発明の方法では、タンパク質性の物質を、ポリグルタミン酸メトトレキセートおよび他の代謝物から沈殿して、タンパク質枯渇された上清をさらなる分離手順に供してもよい。本明細書において用いる場合、「酸（acid）」という用語は、ポリグルタミン酸メトトレキセートを沈殿させることなく、溶液からタンパク質性の物質の優先的な沈殿をもたらし得る試薬をいう。当業者は、本発明において有用な酸が実質的に、ポリグルタミン酸メトトレキセートを、破壊も、分解もせず、その検出にその他の影響を与えることもないということを理解する。本発明において有用な例示的な酸としては、限定はしないが、過塩素酸；硫酸、リン酸および氷酢酸が挙げられる。本発明において有用なさらなる酸は、70％過塩素酸と接触されたサンプルと比較して、特定のサンプルについて実質的に同様のポリグルタミン酸メトトレキセートレベルを得る能力によって同定することができる。
【００３６】
本発明の方法は、実施例IおよびIIに実証されるような赤血球抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定することによく適している。本明細書において例証される条件はまた、ポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定するために他のタイプの細胞抽出物に容易に適応可能である。細胞抽出物は、メトトレキセート療法の標的である細胞由来であってもよく、そうでなければメトトレキセート療法の有効性もしくは毒性の細胞指標であることが理解される。本発明において有用である細胞抽出物の非限定的な例としては、組織生検、赤血球、好中球および白血球から調製された抽出物が挙げられる。本発明において有用なさらなる細胞抽出物としては、限定はしないが、以下に示される任意の特定のガンから得られるような、新生物またはガン細胞の抽出物が挙げられる。本発明の方法において有用な細胞抽出物としてはさらに、限定はしないが、真核生物細胞抽出物、哺乳動物細胞抽出物、霊長類細胞抽出物、ヒト細胞抽出物、非ヒト霊長類細胞抽出物、ラット細胞抽出物、マウス細胞抽出物、ネコ細胞抽出物、イヌ細胞抽出物、トリ細胞抽出物およびウマ細胞抽出物が挙げられる。
【００３７】
本発明において有用な細胞抽出物は、例えば、低用量療法または高用量療法を含む、メトトレキセート療法で処置された任意の個体の細胞から得ることができる。一態様では、本発明の方法において有用な細胞抽出物は、自己免疫疾患を有するヒト由来である。本明細書において用いる場合、「自己免疫疾患（autoimmune disease）」という用語は、自己の組織または組織成分に対する免疫応答から生じる疾患を意味し、そして自己抗体応答または細胞媒介性応答を含む。本明細書において用いる場合、自己免疫疾患という用語は、器官特異的自己免疫疾患を包含し、自己免疫応答とは、単独の組織、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、I型糖尿病、重症筋無力症、白斑、グレーブス病、橋本病、アジソン病および自己免疫性胃炎；ならびに自己免疫性肝炎に対するものである。自己免疫疾患という用語はまた、器官に非特異的な自己免疫疾患を包含し、ここで自己免疫応答は体中のいくつかのまたは多くの器官に存在する成分に対するものである。このような自己免疫疾患としては例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、全身性進行性硬化症および変異型、多発性筋炎および皮膚筋炎が挙げられる。さらなる自己免疫疾患としては、限定はしないが、悪性貧血、自己免疫性胃炎、原発性胆汁性肝硬変症、自己免疫性血小板減少症、シェーグレン症候群、多発性硬化症および乾癬が挙げられる。当業者は、上記の自己免疫疾患がメトトレキセート療法で処置されていること、またはメトトレキセート療法で処置され得ることを理解しており、さらに本発明の方法が、任意の上記のまたは別の自己免疫疾患を有するヒトまたは他の哺乳動物から得られた細胞抽出物で用いられ得ることを認識する。
【００３８】
一態様では、本発明の方法において有用な細胞抽出物は、関節炎を有するヒトから得られる。本明細書において用いる場合、「関節炎（arthritis）」という用語は、関節に影響する炎症状態を意味する。関節炎は、限定はしないが、もともと感染性、自己免疫性または外傷性であってもよい；関節炎という用語は、限定はしないが急性関節炎、急性痛風性関節炎、細菌性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎（骨関節炎）、感染性関節炎、若年性関節炎、真菌性関節炎、神経障害性関節炎、多発性関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、性病性関節炎およびウイルス性関節炎を含む。
【００３９】
さらなる態様では、本発明の方法において有用な細胞抽出物は、関節リウマチを有するヒトから得られる。関節リウマチは、主に関節の慢性の全身性の疾患であって、通常多関節で、滑膜および関節構造の炎症性変化によって、ならびに筋萎縮および骨の粗鬆化によって特徴付けられる。メトトレキセートは、関節リウマチの処置に広範に用いられ、そして当業者は、本発明の方法が、関節リウマチまたは別の形態の関節炎を有するヒトまたは他の哺乳動物由来の細胞抽出物で行なわれ得ることを理解する。
【００４０】
別の態様では、本発明の方法は、ガンを有するヒト由来の細胞抽出物で行なわれる。本明細書において用いる場合、「ガン（cancer）」という用語は、異常な細胞の制御されない増殖によって特徴付けられる疾患のクラスの任意のメンバーを意味することが意図される。この用語は、悪性、良性、軟性組織または固形、ならびに前転移性癌および後転移性癌を含む、全ての段階および状態のガンのいずれで特徴付けられようと、全ての公知のガンおよび腫瘍性の状態を含む。ガンという用語は、限定はしないが、その各々がメトトレキセートを用いて広範に処置される白血病、例えば、急性リンパ球性白血病、および急性骨髄性白血病；リンパ腫；絨毛癌；頭頸部癌；ならびに骨原性肉腫を含む。ガンという用語はさらに、限定はしないが、消化器および胃腸の癌、例えば、肛門癌、胆管癌、胃腸類癌腫および結腸癌；食道癌、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、虫垂癌、小腸癌および胃（stomach（gastric））癌；乳癌；卵巣癌；肺癌；結腸癌；中枢神経系の癌；および皮膚癌を含む。一態様では、本発明の方法は、白血病を有するヒトから得た細胞抽出物で行なわれる。
【００４１】
関節リウマチおよび種々の他の自己免疫性障害、例えば、乾癬、全身性エリテマトーデスおよび宿主対移植片病は代表的には、いくつかのガン処置レジメンでも用いられる、低用量メトトレキセート療法で処置される。一態様では、本発明の方法は、低用量メトトレキセート療法を受けているヒト由来の細胞抽出物で行なわれる。本明細書において用いる場合、「低用量MTX療法（low-dose MTX therapy）」という用語は、1週あたり体表面積1m2あたり40mg未満の用量でのヒトに対するメトトレキセートの投与を意味する。代表的には、低用量メトトレキセート療法は、処置されている状態次第で、1週あたり体表面積1m2あたり2.5〜40mg、例えば、1週あたり体表面積1m2あたり2.5〜25mgの範囲の用量で経口投与される。
【００４２】
本発明の方法はまた、高用量メトトレキセート療法を受けているヒト由来の細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定するために有用であり得る。本明細書において用いる場合、「高用量MTX療法（high-dose MTX therapy）」という用語は、1日あたり体表面積1m2あたり少なくとも40mgの用量、例えば、1日あたり体表面積1m2あたり少なくとも100、500、1000、1500、3000mgまたは5000mgの用量での個体に対するメトトレキセートの投与を意味する。当業者は、高用量メトトレキセート療法が抗癌療法として頻繁に用いられ、そして処置されている状態または疾患次第で、1日あたり体表面積1m2あたり最大5gまたはそれ以上の用量で投与されてもよいということを理解する。当業者は、高用量メトトレキセート療法で代表的に用いられるMTXの用量が、例えば、静脈内にまたは経口的に投与されてもよいということ、そしてこのような高用量メトトレキセート療法が一般には、ロイコボリンによるレスキュー（薬学的救出）または別の形態の葉酸塩置換を含み得る回復期間を要するということを理解する。
【００４３】
高用量および低用量のメトトレキセート療法の定義で上記されるメトトレキセートの投薬範囲は種々の疾患の処置に関して一般化されていること、そして1つの疾患に投与されるメトトレキセートの用量の範囲は、別の疾患に投与される範囲とは異なり得るということが理解される。従って、1日あたり体表面積1m2あたり40mgの用量が一般に高用量MTX療法とみなされているが、ガンを処置するためには、比較的低用量がガン療法と当業者にはみなされ得る。同様に、1日あたり体表面積1m2あたり30mgの用量が一般に低用量MTX療法とみなされているが、関節リウマチを処置するためには、比較的高用量がリウマチ療法と当業者にはみなされ得る。
【００４４】
本発明の方法はまた、メトトレキセートアナログまたは他のポリグルタミン酸化可能な葉酸代謝拮抗薬（polyglutamylatable antifolate）の代謝物を検出するために用いられ得る。本明細書において用いる場合、「葉酸代謝拮抗薬（antifolate）」という用語は、葉酸塩と類似の構造、および一つまたは複数の葉酸依存性酵素に対する葉酸アンタゴニストとしての活性を有する分子を意味する。ポリグルタミン酸化可能な葉酸代謝拮抗薬は、フォリールポリ-γ-グルタミン酸合成酵素のような酵素によって細胞中でポリグルタミン酸化され得る葉酸代謝拮抗薬である。ポリグルタミン酸化可能な葉酸代謝拮抗薬の例としては、限定はしないが、アミノプテリン、ラルチトレキセド、ロメトレキソール、多標的葉酸代謝拮抗薬（MTA）、AQA、MTXおよびそれらのアナログが挙げられる。例えば、アミノプテリンは、メトトレキセートの構造と比較してN-10位置にメチル基の代わりに水素を有する。ラルチトレキセドは、例えば、Kamen,Semin.Oncol.,S18:30-39（1997）に記載のように、チミジル酸合成酵素の選択的インヒビターである。ロメトレキソールは、例えば、Calvert、前記、1999に記載のような新規なプリン合成の経路に関与する最初の酵素である、グリシンアミド・リボヌクレオチド・ホルミルトランスフェラーゼを選択的に阻害する。多標的の葉酸代謝拮抗薬は、複数の葉酸依存性酵素、例えばジヒドロ葉酸還元酵素、チミジル酸合成酵素およびグリシンアミド・リボヌクレオチド・ホルミルトランスフェラーゼのインヒビターである（例えば、Calvert、前記、1999を参照のこと）。
【００４５】
一態様では、本発明の方法は、メトトレキセートアナログのポリグルタミン酸化型を検出するために有用である。本明細書において用いる場合、「メトトレキセートアナログ（methotrexate analog）」という用語は、メトトレキセートに構造的および機能的な類似性を有する分子を意味する。メトトレキセートアナログは、部分的には、ジヒドロ葉酸還元酵素に対するその阻害活性によって、機能的に特徴付けられる。本発明において有用なメトトレキセートアナログは、フォリールポリ-γ-グルタミン酸合成酵素のような酵素による細胞中のポリグルタミン酸化のための基質として機能する。メトトレキセートアナログとしては、限定はしないが、パラ-アミノ安息香酸部分にハロゲン置換を有する4-アミノ誘導体、例えば、ジクロロメトトレキセート（例えば、Frei et al.,Clin.Pharmacol.Therap.6:160-71（1965））；7-メチル置換MTX（例えば、Rosowsky and Chen,J.Med.Chem.17:1308-11（1974）を参照のこと）；3’5’-ジフルオロMTX（例えば、Tomcuf,J.Organic Chem 26:3351（1961）を参照のこと）；アミノプテリンの2’および3’モノフルオロ酸誘導体（例えば、Henkin and Washtien,J.Med.Chem.26:1193-1196（1983）を参照のこと）；ならびに7,8-ジヒドロ-8-メチル-MTX（例えば、Chaykovsky,J.Org.Chem.40:145-146（1975）を参照のこと）が挙げられる。当業者は、本発明の方法が、メトトレキセート療法をモニタリングするために本明細書において開示されたのと同じ方式で、メトトレキセートアナログ療法または他のポリグルタミン酸化可能な葉酸代謝拮抗薬療法に関連する有効性または毒性を最適化またはモニターするために用いられ得ることを理解する。
【００４６】
本発明はまた、細胞抽出物中において少なくとも1つのMTXPGを分離する工程と；この少なくとも1つのMTXPGを照射して、これによって少なくとも1つの分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を生成する工程と；この少なくとも1つの分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出して、それによってこのMTXPGのレベルを決定する工程とによって、細胞抽出物中のポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルを決定するための方法を提供する。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在する、MTXPG3、MTXPG4、またはMTXPG5のレベルを決定するために、または各々のMTXPG1〜MTXPG7種のレベルを決定するために有用であり得る。
【００４７】
MTXPGは、例えば、高速液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーを用いて分離され得る。本発明の方法では、MTXPGは、例えば、UV照射を用いて照射されてもよい。一態様では、MTXPGは、0.05％〜1％のH2O2を有する溶媒中でUV照射される。別の態様では、MTXPGは、0.1％〜0.3％H2O2を有する溶媒中でUV照射される。さらなる態様では、MTXPGは、225nm〜275nmの範囲の波長、例えば、254nmの波長を有する照射を用いてUV照射される。この照射は、例えば、0.5〜60秒または0.5〜15秒の期間であってもよい。
【００４８】
本発明の方法では、分離された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出することは、例えば、240nm〜420nmの範囲で励起の際の蛍光を検出する工程を包含し得る。特定の態様では、蛍光は、240nm〜300nmの範囲のUV照射で励起の際に、例えば、274nmでUV照射を用いて励起の際に検出される。別の態様では、蛍光は360nm〜410nmの範囲のUV照射を用いて励起の際に検出される。蛍光は、適切な発光波長、例えば、320nm〜550nmの範囲の発光波長、または440nm〜500nmの範囲の発光波長で検出される。一態様では、蛍光は464nmの発光波長で検出される。さらなる態様では、蛍光は、励起の際に274nmのUV照射で、そして464nmの発光波長で検出される。
【００４９】
限定はしないがヒト細胞抽出物、赤血球抽出物および白血球抽出物を含む種々の細胞抽出物が本発明の方法において有用であり得る。このような細胞抽出物は、限定はしないが、低用量メトトレキセート療法を受けているヒトを含む、メトトレキセート療法を受けているヒト由来であってもよい。詳細な態様では、細胞抽出物は、自己免疫疾患、例えば、関節炎、関節リウマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデスもしくは乾癬を有するヒト由来であるか、またはガンを有するヒト由来である。本発明の方法は、例えば、濃縮赤血球1リットルあたり、500nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度、または濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有してもよい。
【００５０】
本明細書において開示される場合、蛍光MTXPG光分解性生成物は、ポリグルタミン酸メトトレキセートの照射によって生成され得る。「光分解性生成物（photolytic product）」という用語は、本明細書において用いる場合、照射によって電子的に励起されるポリグルタミン酸メトトレキセートにおける結合の切断によって生成される分子を意味する。光分解性生成物を生成するプロセスは、光分解と呼ばれる。一つまたは複数の「MTXPG光分解性生成物」を生成する一つまたは複数のMTXPGの光分解は、例えば、UV光を用いて行なうことができるが、UV光とは、約200〜400nmの範囲の任意の波長の光を含むことが当技術分野において理解される用語である。例えば、アーク灯もしくは石英ハロゲン灯、またはレーザーなどのランプを含む、UV光を生成する任意の光源が、本発明の方法においてポリグルタミン酸メトトレキセートを照射するために有用であり得ることがさらに理解される。実施例IIに実証されるとおり、蛍光MTXPG光分解生成物は、ピーク出力254nmで225〜275nmの範囲で放射線を発する、低圧水銀UV灯を用いてMTXPGを照射することによって生成された。MTXPGは、公知の光学的特徴に従って、適切な光源、光学フィルターまたはこれらの構成要素の組み合わせを用いることによって、UV範囲の特定の波長で選択的に照射されてもよいことが理解される。
【００５１】
分解された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出する工程を含む本発明の方法では、少なくとも1つのMTXPGを、適切な期間照射して、蛍光MTXPG光分解性生成物が得られる。特定の態様では、本発明の方法は、0.5〜60秒間、または0.5〜15秒間、少なくとも1つのMTXPGを照射することによって行なわれる。非限定的な例であるが、本発明の方法は、0.1〜100秒間、0.2〜60秒間、0.5〜60秒間、または0.5〜45秒間、0.5〜30秒間、0.5〜20秒間、0.5〜15秒間、0.5〜10秒間、1〜20秒間、1〜10秒間、2〜20秒間、または2〜10秒間にわたって少なくとも1つのMTXPGを照射することによって行なわれ得る。さらなる非限定的な例では、本発明の方法は、0.5〜6秒間、または0.5〜5秒間、0.5〜4秒間、1〜6秒間、1〜5秒間、1〜4秒間、または2〜4秒間にわたって少なくとも1つのMTXPGを照射することによって行なわれ得る。特定の態様では、本発明の方法は、0.5〜60秒間、0.5〜15秒間、または2〜4秒間にわたって少なくとも1つのMTXPGを照射することによって行なわれる。
【００５２】
本明細書に開示されるとおり、254nmの低圧水銀紫外灯を用いた3秒間のポリグルタミン酸メトトレキセートの照射によって、例えば、274nmの波長を有するUV照射および464nmの発光波長での励起の際に、容易に検出可能な重複する励起スペクトルを有する蛍光MTXPG光分解性生成物を生成した。例えば、実施例Iおよび図2Bを参照のこと。特定の適用について所望される場合、特徴的な特性を有する所望の蛍光MTXPG光分解性生成物を生成するために照射の時間を変更してもよいことが理解される。特定の蛍光光分解性生成物は、例えば、一つまたは複数の特徴的な特性、例えば、特徴的な蛍光励起および最大発光ピーク、ならびに例えば、検出の間に存在するpHおよびアセトニトリル量に依存した特徴的な蛍光強度レベルを有してもよい。
【００５３】
ポリグルタミン酸メトトレキセートの光分解は、過酸化水素（H2O2）または別の過酸化物の存在下で行なうことができる。非限定的な例としては、MTXPG5の照射の間に過酸化水素が添加される場合、この最終濃度は約0.03％以上であってもよい。詳細な態様では、MTXPGの光分解の間の過酸化水素の最終濃度は、0.05％〜1％、0.1％〜1％、0.1％〜0.5％、または0.1％〜0.3％の範囲である。
【００５４】
細胞抽出物中の特定のポリグルタミン酸メトトレキセートのレベルは、分解された蛍光MTXPG光分解性生成物に相当するレベルに基づいて決定され得る。1例では、蛍光MTX光分解性生成物の量または濃度は、以下の実施例に例示されるような光分解性生成物から蛍光の強度に基づいて決定され得る。本明細書において用いる場合、「蛍光（fluorescence）」という用語は、照射による電気的励起に応答するスペクトルのうち紫外（UV）、可視（VIS）または赤外（IR）の領域における光子の発光を意味する。MTXPG光分解性生成物に関して用いられる場合、「蛍光（fluorescent）」という用語は、照射による電気的励起に応答するスペクトルのうちUV、VISまたはIRの領域において光子を発する光分解性生成物を意味する。従って、蛍光MTXPG光分解性生成物とは、照射による電気的励起に応答するスペクトルのうちUV、VISまたはIRの領域において光子を発するポリグルタミン酸メトトレキセート由来の光分解性生成物である。蛍光MTXPG光分解性生成物は、例えば、溶液中の照射によって励起される場合、少なくとも0.01という量子収率で光子を発するとして特徴付けられ得る。特定の態様では、蛍光MTXPG光分解性生成物は、溶液中の照射によって励起される場合、少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9またはそれ以上である蛍光の量子収率によって特徴付けられる。
【００５５】
蛍光分子、例えば、蛍光MTXPG光分解性生成物はまた、その最大発光波長または最大励起波長に関して特徴付けられ得る。特定の態様では、本発明の方法は、スペクトルのうち赤外、赤、オレンジ、黄色、緑、青、紫または紫外の領域において最大の励起波長を有する分解された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出する工程を含む。さらなる態様では、本発明の方法は、スペクトルのうち赤外、赤、オレンジ、黄色、緑、青、紫または紫外の領域において最大の発光波長を有する分解された蛍光MTXPG光分解性生成物を検出することによって行なわれる。
【００５６】
蛍光は、任意の種々の励起光源および発光検出器を用いて本発明の方法において検出され得る。蛍光MTXPG光分解性生成物の励起は、例えば、限定はしないが光分解に関して上記される任意の励起光源を含む、ランプまたはレーザーのような励起光源を用いて達成できる。特定の波長または特定の波長範囲での励起は、例えば、所望の波長に調整されたレーザーまたは所望の波長範囲を含む出力を有するランプを用いて、本発明の方法において達成できる。適切な光学フィルターを、励起光源と蛍光MTXPG光分解性生成物との間に置いて、必要に応じて蛍光MTXPG光分解性生成物に接する波長の範囲をさらに制限してもよい。図2Bに示され、実施例Iに示されるように、各々の7つの蛍光MTXPG1〜MTXPG7光分解性生成物は、約240nm〜300nmのピークおよび約360nm〜410nmのピークを含む、240nm〜420nmの範囲における2つの励起ピークを有する。本発明の特定の態様では、蛍光MTXPG光分解性生成物は、約240nm〜420nm、約240nm〜300nmまたは約360nm〜410nmの範囲の波長で励起によって検出され得る。必要に応じて、本発明の方法は、274nmもしくはそれに近いピークで、またはこのピークに近い範囲で、励起を有してもよく、この励起としては、例えば、250nm〜300nmまたは260nm〜285nmの範囲の波長での励起が挙げられる。385nmもしくはそれに近いピークで、またはこのピークに近い範囲の励起も、本発明の方法において有用であり得、この励起としては、例えば、360nm〜400nmまたは375nm〜395nmの範囲の波長の励起が挙げられる。
【００５７】
発光は、任意の種々の検出器、例えば、限定はしないが、光電子増倍管、ダイオード、ダイオードアレイまたは電荷結合素子カメラなどを用いて蛍光MTXPG光分解性生成物から検出され得る。特定の波長でまたは特定の波長範囲内で光を検出する検出器が、本発明の方法において有用であり得る。必要に応じて、光学フィルターを、蛍光MTXPG光分解性生成物と検出器との間に置いて、検出される波長の範囲を制限してもよい。本明細書に開示されるように、蛍光MTXPG1〜MTXPG7光分解性生成物は、約320nm〜550nmで発光して、約440nm〜520nmの一次発光ピークを有する。本発明の詳細な態様では、蛍光MTXPG光分解性生成物からの発光は、約320nm〜550nm、または約440nm〜520nmの範囲の波長で検出され得る。必要に応じて、本発明の方法は、464nmもしくはそれに近いピークで、またはこのピークに近い範囲での発光、例えば、430nm〜510nmまたは450nm〜480nmの範囲の波長での発光の検出を包含してもよい。
【００５８】
分離されたMTXPG、またはその光分解性生成物の検出のために用いられる溶液の内容物は、例えば、pHまたはアセトニトリル含量に関して変化してもよい。MTXPGまたはその光分解性生成物が本発明の方法で検出されるpHは、例えば、約pH2〜8の範囲であっても、またはpH約4〜7の範囲であってもよい。特定の態様では、MTXPGまたはその光分解性生成物は、例えば、pH4、4.5、5、5.5、6、6.5、または7で検出され得る。MTXPGまたはその光分解性生成物の検出の間に存在するアセトニトリルの量は、例えば、約0％〜20％または約10％〜20％の範囲であってもよい。特定の態様では、存在するアセトニトリルの量は、例えば、5％、10％、15％もしくは20％、または11％、11.5％、12％、12.5％、13％もしくは13.5％であってもよい。
【００５９】
分離されたポリグルタミン酸メトトレキセートはまた、例えば、紫外または可視の光吸収特性、蛍光、電気化学的特性または質量を含む、ポリグルタミン酸メトトレキセートの一つまたは複数の他の観察可能な特性に基づいて本発明の方法で検出され得る。非限定的な例では、分離されたMTXPGは、UV/Vis吸収分光測定法、蛍光定量法、電気化学的検出または質量分析法を用いて検出できる。当業者は、確度、および所望の感度、および分析されている特定の細胞抽出物中の潜在的に影響する物質の存在に基づいて、ポリグルタミン酸メトトレキセートを検出するための適切な手段を既知であるか、または検出することができる。
【００６０】
ポリグルタミン酸メトトレキセートの十分な細胞内レベルは、有効性を伴い得、そしてそれより高いレベルは毒性に関連し得る。一つまたは複数のポリグルタミン酸メトトレキセートの細胞内レベルを決定することによって、本発明の方法は、ポリグルタミン酸メトトレキセートが治療範囲内にあるようにメトトレキセート療法の量または頻度を調節するために有用であり得、その結果、有効性を達成しながら、望ましくない毒性の副作用を回避することができる。
【００６１】
従って、本発明は、ヒトから得られた細胞抽出物中で少なくとも1つのMTXPGを分離することによってこのヒトに投与されたメトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するか、または毒性を軽減する工程と；少なくとも1つの分離されたMTXPGを検出して、これによってこの分離されたMTXPGのレベルを決定する工程と；この分離したMTXPGのレベルに基づいてヒトに引き続いて投与されるべき薬物または投薬量を選択する工程の方法を提供する。本発明の方法は、例えば、細胞抽出物中に存在するMTXPG3、MTXPG4もしくはMTXPG5のレベルを決定するため、または各々のMTXPG1〜MTXPG7種のレベルを決定するために有用であり得る。本発明の方法は、ヒトに引き続いて投与されるメトトレキセートの用量を変更する工程、例えば、ヒトに引き続き投与されるメトトレキセート投薬量を減少するかもしくは増大する工程、またはヒトに引き続いて投与される葉酸もしくはその代謝物の用量を変更する工程を包含し得る。
【００６２】
本発明の方法において有用な細胞抽出物としては、限定はしないが、赤血球抽出物；白血球抽出物；メトトレキセート療法を受けているヒト由来の細胞抽出物；および任意の種々の自己免疫疾患またはガンを有するヒト由来の細胞抽出物が挙げられる。本発明において有用な細胞抽出物としては、限定はしないが、関節炎、関節リウマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデスもしくは乾癬のような自己免疫疾患を有するヒト由来の細胞抽出物、またはガンを有するヒト由来の細胞抽出物が挙げられる。一態様では、本発明の方法は、濃縮赤血球1リットルあたり、500nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有する。別の態様では、本発明の方法は、濃縮赤血球1リットルあたり、50nmol未満の各々の個々のMTXPG種という感度を有する。
【００６３】
治療の有効性を最適化するかまたは毒性を軽減するための本発明の方法では、MTXPGは、例えば、高速液体クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーを用いて分離できる。分離されたMTXPGは、一つまたは複数の技術、例えば、限定はしないが、蛍光定量法、分光光度法または質量分析法を用いて検出できる。このような検出技術は、細胞抽出物中で少なくとも1つのMTXPGを分離するためのクロマトグラフィーまたは他の方法と組み合わせられ得る。
【００６４】
本明細書上記で記載されるような細胞抽出物の任意の種々のタイプが、メトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するか、または毒性を軽減するための本発明の方法において有用であり得る。細胞抽出物は、メトトレキセート療法の有効性または毒性の指標である任意の細胞または組織、例えば、疾患の細胞または組織、メトトレキセート療法の標的細胞、または疾患の細胞における薬物の量の指標である細胞から調製されてもよい。本明細書において用いる場合、「メトトレキセート療法の標的細胞（target cell for methotrexate therapy）」という用語は、疾患または状態を処置するためにメトトレキセートの取り込みが所望される細胞を意味する。非限定的な例として、細胞抽出物は、赤血球、白血球、好中球、ガン細胞および組織生検から調製されてもよい。
【００６５】
メトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するか、または毒性を軽減するための本発明の方法はさらに、ポリグルタミン酸メトトレキセートの決定されたレベルに基づいてヒトに引き続いて投与されるメトトレキセート投薬量を変更する工程を含む。一つまたは複数のポリグルタミン酸メトトレキセートの決定されたレベルが、治療範囲未満である場合、ヒトに投与されるメトトレキセートの用量または頻度は増大され得る。同様に、一つまたは複数のポリグルタミン酸メトトレキセートの決定されたレベルが治療範囲を上回る場合、このヒトに投与されたメトトレキセートの用量または頻度は、毒性をなくするために低下されてもよい。治療範囲は、特定の疾患または状態について、そして所望の場合、処置されているヒトの年齢、性別または医学的状態についての用量応答情報から決定できる。例えば、赤血球抽出物中で決定されるMTXPGのレベルは、赤血球ポリグルタミン酸メトトレキセートレベルと関節炎症状の低減に相関する用量応答の情報に比較され得る。用量応答情報はまた、特定の病理学的状態に関する周知の臨床手順を用いて得ることができる。
【００６６】
本発明の特定の態様では、メトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するか、または毒性を軽減するための本発明の方法において有用な細胞抽出物は、メトトレキセート療法の非標的細胞から得ることができる。本明細書において用いる場合、「メトトレキセート療法のための非標的細胞（non-target cell for methotrexate therapy）」という用語は、メトトレキセートの取り込みが所望されない細胞を意味する。このような非標的細胞は、MTXのレベルに感受性であるか、または特定の経路によって投与されたメトトレキセートを取り込むように配置されている正常細胞であってもよい。当業者は、非標的細胞由来の細胞抽出物におけるMTXPGレベルが標的細胞におけるレベルの指標であり得、従って、メトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するか、または毒性を軽減するために有用であり得るということを理解する。
【００６７】
メトトレキセート療法は、例えば、胃腸不耐性、口内炎、脱毛症および血球減少を含む、葉酸欠乏を模倣する種々の副作用を生じ得る。メトトレキセート療法の多くの副作用は、用量依存性であり、葉酸、フォリン酸またはフォリン酸アナログの代償性の用量の投与によって軽減され得る。従って、メトトレキセート療法に関連する治療有効性を最適化するか、または毒性を軽減するための本発明の方法は、さらに所望の場合、決定されたレベルの細胞内ポリグルタミン酸メトトレキセートに基づいてヒトに引き続いて投与される葉酸塩またはフォリン酸アナログの用量を変更する工程を包含し得る。本発明において有用なフォリン酸アナログとしては、限定はしないが、フォリン酸、ジヒドロフォリン酸、テトラヒドロフォリン酸、5-ホルミル-テトラヒドロフォリン酸および10-メチル-テトラヒドロフォリン酸が挙げられる。
【００６８】
以下の実施例は、本発明を例示する意図であって限定はしない。
【００６９】
実施例１
低用量メトトレキセート療法を受けている個体由来のサンプル中のポリグルタミン酸メトトレキセートの検出に適切なHPLCシステム
本実施例は、細胞サンプル中のポリグルタミン酸メトトレキセートの分離のために適切なクロマトグラフィーのシステム、条件および試薬を記載する。
【００７０】
A.試薬の調製
4-アミノ-10-メチルプテロイルグルタミン酸（メトトレキセート；MTXPG1）は、SIGMA（St.Louis,MO）から購入した。4-アミノ-10-メチルプテロイルジ-グルタミン酸（MTXPG2）、4-アミノ-10-メチルプテロイルトリ-グルタミン酸（MTXPG3）、4-アミノ-10-メチルプテロイルテトラ-グルタミン酸（MTXPG4）、4-アミノ-10-メチルプテロイルペンタ-グルタミン酸（MTXPG5）、4-アミノ-10-メチルプテロイルヘキサ-グルタミン酸（MTXPG6）、および4-アミノ-10-メチルプテロイルヘプタ-グルタミン酸（MTXPG7）は、Schircks laboratories（Jona,Switzerland）からアンモニウム塩として購入した。HPLC等級のアセトニトリルは、Fisher Chemicals（Fair Lawn,NJ）から購入した；過酸化水素（30％、v/v）、水酸化アンモニウム、および氷酢酸はSigmaから入手した。
【００７１】
メトトレキセートおよび個々の精製されたポリグルタミン酸メトトレキセートの各々を0.1N水酸化カリウムに溶解した。溶解後、標準の濃度をHitachi U-2000分光光度計、およびUVモル吸光係数（ε256nm＝23,000）を用いて確認した。個々の精製されたポリグルタミン酸メトトレキセート標準を水中に100μMの最終濃度まで希釈して-70℃で保管し、この温度では少なくとも6ヶ月間安定であった。
【００７２】
B.クロマトグラフィーのシステムおよび分離
液体クロマトグラフは、Agilent 1100 HPLCケムステーションシステムであって、これは、クォータナリポンプ、システム制御装置、自動注入装置、4℃に保持されたサンプル冷却装置および蛍光光度計から構成される。クロマトグラムはHewlett-Packard Vector XAコンピューター上で得て分析した。ポリグルタミン酸メトトレキセートは、細長い254nmの低圧水銀紫外灯を装備し、編んだコイルとしてアセンブルされ、分析カラムと蛍光光度計との間にオンライン接続された1/16”の外径のTEFLON（商標）配管（内径0.25mm）を備える光化学リアクターユニット（Aura Industries；New York,NY）を用いてポストカラム誘導体化によって検出した。この編んだコイルは光化学リアクターユニットを通じて縦方向に延び；この編まれたコイルの一部のみが照射されるように、この細長いランプの一部を除けば、ホイルで覆われている。詳細には、このランプは、このコイルの1メートルだけがランプで照射されるように覆われたが、これは、1ml/minの流速で、3秒間の照射に相当した。ポリグルタミン酸メトトレキセートの光分解性生成物は、他に示さない限り、274nmの励起波長で、そして464nmの発光波長で測定した。本明細書に記載される保持時間は、注入の時点からリアクターユニット後の蛍光光度計での検出の時点まで測定した。
【００７３】
HPLC分離は、保護カラムで保護された、25cm×4.6mm×Terra MS C18カラム（Waters；Milford,MA）、粒子サイズ5μmで行なった。このシステムはまた、200回注入ごとに交換されるC18プレカラムを備えた。移動相Aは、pH6.50の酢酸アンモニウム（10mM）と、過酸化水素（30％ v/v）を最終濃度0.2％とで構成された。移動相Bは、アセトニトリルから構成された。サンプルは、1ml/minの流速で溶出され、ここで20分の直線勾配は2〜12.5％のアセトニトリルであった。20分後、移動相は、100％の移動相Aに戻し、5分間再平衡した。サンプルを4℃で維持して、自動注入装置を用いて30分ごとに注入した。分析カラムは、500回の注入後までその能力の低下を示さなかった。
【００７４】
ポリグルタミン酸メトトレキセート光分解性生成物は、274nmの励起波長および464nmの発光波長で分析した。赤血球抽出物中でのポリグルタミン酸メトトレキセートポストカラム光分解性生成物の励起スペクトルを用いたスペクトルの同定は、水中でのメトトレキセートのポストカラム光分解性生成物の励起スペクトルとの比較によって行なった。
【００７５】
C.標準曲線の較正および調製
較正および標準曲線を本質的に以下のとおり行なった。標準曲線は、既知の量の精製したMTXPG1、MTXPG2、MTXPG3、MTXPG4、MTXPG5、MTXPG6、およびMTXPG7を、健常ドナーから単離した赤血球のプール（Blood bank；San Diego,CA）から調製した溶血血液に補充することによって調製した。これらの「補充された（supplemented）」赤血球標準は、濃縮赤血球1リットルあたり5〜50nmolに及ぶ濃度のポリグルタミン酸メトトレキセートを含む。標準曲線は、ピーク面積対濃度を用いて直線回帰によってあてはめた。
【００７６】
D.精度、確度および回収
このアッセイの精度、確度および回収は以下のとおり行なった。日内および日間の精度および確度は、赤血球溶血物に既知の量で補充した低濃度および高濃度のポリグルタミン酸メトトレキセートを分析することによって決定した。日内分析は、10の補充した複製で行い、そして日間の評価は、異なる5日において5つの複製で評価した。確度は、標的濃度に対する、補充したサンプルから測定した濃度の割合の誤差として算出した（測定した濃度/標的濃度×100％）。精度は、変動の係数を決定することによって決定した。ポリグルタミン酸メトトレキセートの回収は、補充した赤血球サンプルからのピーク高さを、バリデートした範囲内の同じ濃度での水を用いて調製したサンプルからのピーク高さと比較することによって決定した。
【００７７】
E.患者サンプルの処理
血液サンプル（5ml）は、書面でのインフォームドコンセントの後に低用量メトトレキセート療法を受けている患者から収集した。サンプルを10分間遠心分離して、赤血球から血漿およびバフィーコートを分離した。赤血球を2容積の生理食塩水で洗浄して、分析まで-70℃で貯蔵した。
【００７８】
RBC溶血血液の100μlのアリコートを、エッペンドルフチューブに入れた150μlの水で短時間ホモジナイズして、その後、25μlの70％過塩素酸をこの混合物に添加して、10秒間ボルテックスして、5分間遠心分離した。総容積80μlの赤血球上清をHPLCシステムに直接注入した。
【００７９】
結果は、濃縮赤血球1Lあたりのnmolとして表し、患者の結果は、平均プラスマイナス標準誤差（±SEM）として表した。ポリグルタミン酸メトトレキセートポストカラム光分解性生成物のスペクトル同定は、水中での精製したメトトレキセートのポストカラム光分解性生成物の励起スペクトルの比較によって行なった。
【００８０】
実施例２
ポストカラム誘導体化を用いたHPLC蛍光定量法による赤血球抽出物中でのポリグルタミン酸メトトレキセートの濃度の定量
本実施例は、低用量メトトレキセート療法で処置した患者におけるポリグルタミン酸メトトレキセートの細胞内濃度の決定を記載する。
【００８１】
A.細胞サンプル中のメトトレキセートおよびポリグルタミン酸メトトレキセートの分離および検出
7つ全てのポリグルタミン酸メトトレキセートを各々最終濃度25nmol/Lで水に含有する標準物のクロマトグラムを図2Aに示す。上記のHPLCシステムでの個々のポリグルタミン酸メトトレキセートの保持時間は以下のとおりであった。MTXPG7:12.5分；MTXPG6:13.0分；MTXPG5:13.7分；MTXPG4:14.5分；MTXPG3:15.7分；MTXPG2:17.5分；そしてMTXPG1:19.8分。図2Bに示されるように、MTXPG1〜MTXPG7の光分解性生成物の励起スペクトルは重なっており、異なる光分解性生成物のスペクトルは本質的に同一である。図2Bにさらに示されるように、MTXPG1〜MTXPG7の光分解性生成物は、最大励起波長274nmを示した。
【００８２】
対照の赤血球抽出物または既知の量の精製ポリグルタミン酸メトトレキセートを補充した赤血球抽出物の代表的なクロマトグラムを、図3Aおよび図3Bに示す。対照（図3A）および補充した（図3B）溶血血液を、上記のようにホモジナイズして過塩素酸処理した。標準曲線は、ピーク面積と濃度との間の直線的相関を示しており、ここでは相関係数は7つの分析物全てについて0.995より大きかった。
【００８３】
このアッセイの日内および日間の精度および確度を表Iにまとめる。日内および日間の精度の変動の係数は、低濃度および高濃度の分析物では15％未満であった。確度は、7つのMTXPGについて88％〜112％に及んだ。平均の抽出物回収は、以下のとおりであった。60％ MTXPG1；66％ MTXPG2；65％ MTXPG3；66％ MTXPG4:79％ MTXPG5；80％ MTXPG6；および60％ MTXPG7。検出限界は、シグナル対ノイズ比の3倍と規定され、濃縮赤血球1Lあたり2nmolであった。7つのポリグルタミン酸メトトレキセートの全てについての定量の限界は、濃縮赤血球1Lあたり5nmolであった。
【００８４】
B.患者の赤血球サンプルにおけるメトトレキセートおよびポリグルタミン酸メトトレキセートの検出
赤血球サンプルは、少なくとも3ヶ月間にわたって毎週低用量メトトレキセートを投与されている多発性関節炎の14例の患者から得た。メトトレキセートの毎週の用量は、1週あたり中央用量が16.2mgであって、10.0〜25.0mgに及んだ。図4Aは、1週あたり17.5mgのメトトレキセートを投与されている患者の代表的な患者クロマトグラムを示す。図4Bによって、患者サンプルから分離したポリグルタミン酸メトトレキセートの光分解性生成物の励起スペクトルが水中のメトトレキセートの光分解性生成物のスペクトルと極めて類似していたことが示される。
【００８５】
10.0〜25.0mg/週のメトトレキセートを投与されている14例の患者では、総ポリグルタミン酸メトトレキセート濃度は、69〜221nmol/L RBCに及び、中央値は135nmol/L RBCであった（図5を参照のこと）。MTXPG6およびMTXPG7は、14例の患者サンプル全てで検出されなかった（＜5nmol/L）が、MTXPG5は、14例の患者サンプル中8例で検出された。長鎖ポリグルタミン酸濃度の総平均（MTXPG4＋MTXPG5）は、31±5.7nmol/Lであって、総ポリグルタミン酸メトトレキセートの平均の23％に相当した。MTXPG3は、患者サンプル中で検出された主なポリグルタミン酸メトトレキセートであって、総ポリグルタミン酸メトトレキセートの平均の55％に相当した。
【００８６】
本出願を通して、種々の特許および非特許の刊行物を参照してきた。これらの刊行物の開示はその全体が、本出願において参照として本明細書に組み入れられており、本発明が属する当技術分野の状況をより詳細に記述している。
【００８７】
本明細書において用いる場合、「含む（comprising）」という用語は、制限しないことを意図しており、言及された要素を含むだけでなく、さらには任意のさらなる要素を含む。
【００８８】
本発明は、上記の実施例を参照して記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】メトトレキセートおよびポリグルタミン酸メトトレキセートの構造を示す。（A）メトトレキセートの化学構造。（B）ポリグルタミン酸メトトレキセートの化学構造であって、nはメトトレキセートに結合されたグルタミン酸塩の数を指す。
【図２】水中でのメトトレキセートおよびポリグルタミン酸メトトレキセートのクロマトグラム、ならびにこれらの分析物の光分解性生成物の励起スペクトルを示す。（A）7つのポリグルタミン酸メトトレキセート全てを各々25nmol/Lの最終濃度で含む水中での標準のクロマトグラム。（B）水中におけるMTXPG1〜MTXPG7の光分解性生成物の励起スペクトル。
【図３】ホモジナイズされて過塩素酸で処理された、対照および補充した赤血球サンプルのクロマトグラムを示す。励起波長は274nmで、発光波長は464nmであった。（A）対照の赤血球サンプルの代表的なクロマトグラム。（B）精製したMTXPG1〜MTXPG7を各々最終濃度25nmol/Lで補充した赤血球サンプルの代表的なクロマトグラム。標準曲線を示す式は、MTXPG1、y＝0.943×＋0.245；MTXPG2、y＝0.540×＋0.130；MTXPG3、y＝0.561×＋0.125；MTXPG4、y＝0.568×＋0.112；MTXPG5、y＝0.668×＋0.01；MTXPG6、y＝0.710×＋0.07；およびMTXPG7、y＝0.430×＋0.316、yはピーク面積であり、そしてxは補充濃度である。
【図４】低用量メトトレキセート療法で処置された患者の赤血球サンプルのクロマトグラムを示す。（A）少なくとも3ヶ月間にわたり毎週メトトレキセート17.5mgの患者のクロマトグラム。濃度は以下であった。39nmol/L MTXPG5；50nmol/L MTXPG4；64nmol/L MTXPG3；10nmol/L MTXPG2；および27nmol/L MTXPG1。MTXPG6およびMTXPG7はこのサンプル中では検出されなかった。（B）水中におけるメトトレキセート光分解性生成物の励起スペクトルに比較した、Aの患者サンプル由来の各々の検出されたポリグルタミン酸メトトレキセート光分解性生成物の励起スペクトル。適合する値は5つのスペクトルの比較の各々について900より大きかった。
【図５】関節リウマチを有する14例の患者における個々のMTXPG1〜MTXPG5の平均濃度を示す。MTXPG6およびMTXPG7は検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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