(57)【要約】本発明は、さまざまな起源に由来するヒトアルブミンの、結晶化および繰り返しの結晶化による精製および製造に関する。発明された製法の基本的特徴は、アルブミン結晶化を最大にする特定の反応条件および沈澱化試薬を提供することを含む。発明した方法の工程管理のための基礎として溶解度図を利用する。本発明は具体的には、リン酸塩濃度、ｐＨおよび温度を調節して、結晶化動力学および結晶収率を正確に導く。
2006506435.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法によって得られる物質の少なくとも一部を含む結晶性ヒトアルブミン製品：
ａ）アルブミン含有溶液を、該溶液が溶液１リットル当たり少なくとも１５グラムのアルブミンを含むようになるまで濃縮し；
ｂ）第一のリン酸塩混合物を、該リン酸塩混合物の濃度が２．４〜２．６Ｍになるまで前記アルブミン含有溶液に加え；
ｃ）前記アルブミン含有溶液に第一の濾過を行い、不純物を除去して結晶化バッチ溶液を形成し；
ｄ）前記結晶化バッチ溶液の濾液を、１５℃以下の温度まで冷却し；
ｅ）前記結晶化バッチ溶液中のヒトアルブミンを結晶化させ；
ｆ）最高で３．０Ｍの濃度にするのに十分な、前記第一のリン酸塩混合物を前記結晶化バッチ溶液に加え；
ｇ）残りの液体からのアルブミン結晶の第一の分離を行い；
ｈ）アルブミン結晶の第一の分離によって得られたアルブミン結晶を、２．７〜３．０Ｍの濃度の第二のリン酸塩混合物に懸濁させ；
ｉ）前記アルブミン結晶の結晶懸濁液を、４０〜５０℃の温度まで加熱して結晶を溶解させ；
ｊ）前記溶解したアルブミン結晶の結晶懸濁液に第二の濾過を行い；
ｋ）前記濾過したアルブミン結晶の結晶懸濁液を、１５℃以下の温度まで冷却し；さらに
ｌ）前記冷却した結晶懸濁液からアルブミン結晶を形成させ；それによって、所定のヒトアルブミンを含む供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項２】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項４】
前記第一のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項５】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル中１５〜５０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項６】
添加時の前記第一のリン酸塩混合物の温度が２０〜３０℃であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項７】
添加時の前記第一のリン酸塩混合物が、ｐＨ６．０〜６．７のｐＨを有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項８】
前記結晶化バッチ溶液を濾過した後に回収される濾液を、１０℃以下の温度まで冷却することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項９】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で１２時間結晶化させることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１０】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で２４時間結晶化させることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１１】
前記結晶化バッチ溶液を、少なくとも２４時間結晶化させることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１２】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、濾過によって達成されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１３】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、遠心分離によって達成されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１４】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、比重分離によって達成されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１５】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、乾燥によって達成されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１６】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１７】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１８】
前記第二のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１９】
アルブミン結晶の第一の分離からの溶解した結晶懸濁液を、１０℃以下の温度まで冷却することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２０】
溶解した結晶懸濁液から析出するアルブミン結晶を、少なくとも１回、溶液中に再度溶解させて戻しさらに再結晶させることを特徴とする請求項１９記載の製品。
【請求項２１】
前記アルブミン含有溶液が、溶液中から不純物を除去するために事前に清澄化されていることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２２】
前記供給流が、遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁または他の体液であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２３】
遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁が、清澄化されて不純物および一部の乳タンパク質を除去されていることを特徴とする請求項２２記載の製品。
【請求項２４】
与えられた供給流中の純度レベルが少なくとも１０％であり、すなわち、与えられた溶液中の総タンパク質の少なくとも１０％をヒトアルブミンが構成することを特徴とする請求項２２記載の製品。
【請求項２５】
前記結晶化バッチ溶液のｐＨが５．６〜７．８であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２６】
前記結晶化バッチ溶液のｐＨが６．０〜６．５であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２７】
前記結晶化バッチ溶液のｐＨが７．０〜７．８であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２８】
前記第一のリン酸塩混合物の濃度が２．２〜３．０Ｍであることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項２９】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜４００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３０】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜３００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３１】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜１００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３２】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜４０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３３】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜１０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３４】
医薬調製物中の添加物として利用されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３５】
医薬組成物中の治療剤として利用されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３６】
前記供給流が組み換えヒトアルブミンを発現する宿主に由来する培養上清または体液であることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項３７】
前記宿主が哺乳類培養細胞であることを特徴とする請求項３６記載の製品。
【請求項３８】
前記宿主が酵母培養細胞であることを特徴とする請求項３６記載の製品。
【請求項３９】
前記宿主が昆虫培養細胞であることを特徴とする請求項３６記載の製品。
【請求項４０】
前記宿主が原核培養細胞であることを特徴とする請求項３６記載の製品。
【請求項４１】
疾患の治療に利用されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項４２】
前記疾患が
ａ）浮腫；
ｂ）血液量減少；
ｃ）低アルブミン血症；
ｄ）成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；
ｅ）ネフローゼ；
ｆ）新生児溶血性疾患（ＨＤＮ）；
ｇ）重度火傷；
ｈ）低タンパク血症；および，
ｉ）急性膵炎：より成る群から選択されることを特徴とする請求項４１記載の製品。
【請求項４３】
心肺バイパス手術中に利用されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項４４】
以下の工程を含むことを特徴とする、結晶性ヒトアルブミンを製造する方法：
ａ）アルブミン含有溶液を、該溶液が溶液１リットル当たり少なくとも１５グラムのアルブミンを含むようになるまで濃縮し；
ｂ）第一のリン酸塩混合物を、該リン酸塩混合物の濃度が２．４〜２．６Ｍになるまで前記アルブミン含有溶液に加え；
ｃ）前記アルブミン含有溶液に第一の濾過を行い、不純物を除去して結晶化バッチ溶液を形成し；
ｄ）前記結晶化バッチ溶液の濾液を、１５℃以下の温度まで冷却し；
ｅ）前記結晶化バッチ溶液中のヒトアルブミンを結晶化させ；
ｆ）最高で３．０Ｍの濃度にするのに十分な、前記第一のリン酸塩混合物を前記結晶化バッチ溶液に加え；
ｇ）残りの液体からのアルブミン結晶の第一の分離を行い；
ｈ）アルブミン結晶の第一の分離によって得られたアルブミン結晶を、２．７〜３．０Ｍの濃度の第二のリン酸塩混合物に懸濁させ；
ｉ）前記アルブミン結晶の結晶懸濁液を、４０〜５０℃の温度まで加熱して結晶を溶解させ；
ｊ）前記溶解したアルブミン結晶の結晶懸濁液に第二の濾過を行い；
ｋ）前記濾過したアルブミン結晶の結晶懸濁液を、１５℃以下の温度まで冷却し；さらに
ｌ）前記冷却した結晶懸濁液からアルブミン結晶を形成させ；それによって、所定のヒトアルブミンを含む供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項４５】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
前記第一のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル中１５〜５０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４９】
添加時の前記第一のリン酸塩混合物の温度が２０〜３０℃であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５０】
添加時の前記第一のリン酸塩混合物が、ｐＨ６．０〜６．７のｐＨを有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５１】
前記結晶化バッチ溶液を濾過した後に回収される濾液を、１０℃以下の温度まで冷却することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５２】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で１２時間結晶化させることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５３】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で２４時間結晶化させることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５４】
前記結晶化バッチ溶液を、少なくとも２４時間結晶化させることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５５】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、濾過によって達成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５６】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、遠心分離によって達成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５７】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、比重分離によって達成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５８】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、乾燥によって達成されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項５９】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６０】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６１】
前記第二のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６２】
アルブミン結晶の第一の分離からの溶解した結晶懸濁液を、１０℃以下の温度まで冷却することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６３】
溶解した結晶懸濁液から析出するアルブミン結晶を、少なくとも１回、溶液中に再度溶解させて戻しさらに再結晶させることを特徴とする請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記アルブミン含有溶液が、溶液中から不純物を除去するために事前に清澄化されていることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６５】
前記供給流が、遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁または他の体液であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６６】
遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁が、清澄化されて不純物および一部の乳タンパク質を除去されていることを特徴とする請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
与えられた供給流中の純度レベルが少なくとも１０％であり、すなわち、与えられた溶液中の総タンパク質の少なくとも１０％をヒトアルブミンが構成することを特徴とする請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
前記結晶化バッチ溶液のｐＨが５．６〜７．８であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項６９】
前記結晶化バッチ溶液のｐＨが６．０〜６．５であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７０】
前記結晶化バッチ溶液のｐＨが７．０〜７．８であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７１】
前記第一のリン酸塩混合物の濃度が２．２〜３．０Ｍであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項７２】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜４００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７３】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜３００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７４】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜１００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７５】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜４０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７６】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜１０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７７】
前記結晶性ヒトアルブミンが、医薬調製物中の添加物として利用されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７８】
前記結晶性ヒトアルブミンが、医薬組成物中の治療剤として利用されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項７９】
前記供給流が、組み換えヒトアルブミンを発現する宿主に由来する培養上清または体液であることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項８０】
前記宿主が哺乳類培養細胞であることを特徴とする請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記宿主が酵母培養細胞であることを特徴とする請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
前記宿主が昆虫培養細胞であることを特徴とする請求項７９記載の方法。
【請求項８３】
前記宿主が原核細胞であることを特徴とする請求項７９記載の方法。
【請求項８４】
前記結晶性ヒトアルブミンが、疾患の治療に利用されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項８５】
前記疾患が、
ａ）浮腫；
ｂ）血液量減少；
ｃ）低アルブミン血症；
ｄ）成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；
ｅ）ネフローゼ；
ｆ）新生児溶血性疾患（ＨＤＮ）；
ｇ）重度火傷；
ｈ）低タンパク血症；および，
ｉ）急性膵炎
：より成る群から選択されることを特徴とする請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
前記結晶性ヒトアルブミンが、心肺バイパス手術中に利用されることを特徴とする請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
以下の工程を含む方法によって得られる物質の少なくとも一部を含むヒトアルブミン製品：
ａ）アルブミン含有溶液を、該溶液が溶液１リットル当たり少なくとも１５グラムのアルブミンを含むようになるまで濃縮し；
ｂ）第一のリン酸塩混合物を、該リン酸塩混合物の濃度が２．６〜３．０ＭでかつｐＨが６．１〜６．３になるまで、前記アルブミン含有溶液に加え；
ｃ）結晶化バッチ溶液の濾液を、１５℃以下の温度まで冷却し；
ｄ）前記結晶化バッチ溶液中のヒトアルブミンを結晶化させ；さらに
ｅ）アルブミン結晶を残りの液体から分離し；それによって、所定のヒトアルブミンを含む供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項８８】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項８９】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９０】
前記第一のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９１】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル中１５〜５０グラムのアルブミンの濃度を有することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９２】
添加時の前記第一のリン酸塩混合物の温度が２０〜３０℃であることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９３】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で１２時間結晶化させることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９４】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で２４時間結晶化させることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９５】
前記結晶化バッチ溶液を、少なくとも２４時間結晶化させることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９６】
アルブミン結晶の第一の分離が、濾過によって達成されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９７】
アルブミン結晶の第一の分離が、遠心分離によって達成されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９８】
アルブミン結晶の第一の分離が、比重分離によって達成されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項９９】
アルブミン結晶の第一の分離が、乾燥によって達成されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１００】
溶解した結晶懸濁液から析出するアルブミン結晶を、少なくとも１回、溶液中に再度溶解させて戻しさらに再結晶させることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０１】
前記供給流に由来する前記アルブミン含有溶液が、溶液中から不純物を除去するために事前に清澄化されていることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０２】
前記供給流が、遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁または他の体液であることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０３】
遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁が、清澄化されて不純物および一部の乳タンパク質を除去されていることを特徴とする請求項１０２記載の製品。
【請求項１０４】
所定の供給流中の純度レベルが少なくとも１０％であり、すなわち、所定の溶液中の総タンパク質の少なくとも１０％をヒトアルブミンが構成することを特徴とする請求項１０２記載の製品。
【請求項１０５】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜４００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０６】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜３００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０７】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜１００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０８】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜４０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１０９】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜１０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１１０】
医薬調製物中の添加物として利用されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１１１】
医薬組成物中の治療剤として利用されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１１２】
前記供給流が、組み換えヒトアルブミンを発現する宿主に由来する培養上清または体液であるか、あるいはそれらに由来することを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１１３】
前記宿主が哺乳類培養細胞であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１１４】
前記宿主が遺伝子導入哺乳類であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１１５】
前記宿主が遺伝子導入鳥類であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１１６】
前記宿主が遺伝子導入植物であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１１７】
前記宿主が酵母培養細胞であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１１８】
前記宿主が昆虫培養細胞であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１１９】
前記宿主が原核培養細胞であることを特徴とする請求項１１２記載の製品。
【請求項１２０】
疾患の治療に利用されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１２１】
前記疾患が、
ａ）浮腫；
ｂ）血液量減少；
ｃ）低アルブミン血症；
ｄ）成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；
ｅ）ネフローゼ；
ｆ）新生児溶血性疾患（ＨＤＮ）；
ｇ）重度火傷；
ｈ）低タンパク血症；および，
ｉ）急性膵炎：より成る群から選択されることを特徴とする請求項１２０記載の製品。
【請求項１２２】
心肺バイパス手術中に利用されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１２３】
以下の工程を含む１または複数回の再結晶によって、アルブミン結晶がさらに精製されることを特徴とする請求項８７記載の製品：
ａ）アルブミン結晶の第一の分離によって得られたアルブミン結晶を、２．７〜３．０Ｍの濃度および６．１〜６．３のｐＨを有する第二のリン酸塩混合物中に懸濁させ；
ｂ）前記アルブミン結晶の結晶懸濁液を、４０〜５０℃の温度まで加熱して結晶を溶解させ；
ｃ）前記溶解したアルブミン結晶の結晶懸濁液に第二の濾過を行い；
ｄ）前記濾過したアルブミン結晶の結晶懸濁液を、１５℃以下の温度まで冷却する；
ｅ）前記冷却した結晶懸濁液からアルブミン結晶を形成させ；さらに
ｆ）アルブミン結晶を残りの液体から分離し；それによって、所定の供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項１２４】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項１２３記載の製品。
【請求項１２５】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項１２３記載の製品。
【請求項１２６】
前記第二のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項１２３記載の製品。
【請求項１２７】
以下の工程を含む方法によって得られる物質の少なくとも一部を含むヒトアルブミン製品：
ａ）アルブミン含有溶液を、該溶液が溶液１リットル当たり少なくとも１５グラムのアルブミンを含むようになるまで濃縮し；
ｂ）第一のリン酸塩混合物を、該リン酸塩混合物の濃度が最高で２．６ＭでかつｐＨが６．１〜６．３になるまで、前記アルブミン含有溶液に加え；
ｃ）前記アルブミン含有溶液に第一の濾過を行い、不純物を除去して結晶化バッチ溶液を形成し；
ｄ）前記結晶化バッチ溶液の濾液を、１５℃以下の温度まで冷却し；
ｅ）最高で３．０Ｍの濃度にするのに十分な、前記第一のリン酸塩混合物を前記結晶化バッチ溶液に加え；
ｆ）前記結晶化バッチ溶液中のヒトアルブミンを結晶化させ；さらに
ｇ）アルブミン結晶を残りの液体から分離し；それによって、所定の供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項１２８】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１２９】
前記第一のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３０】
前記第一のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３１】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル中に１５〜５０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３２】
添加時の前記第一のリン酸塩混合物の温度が２０〜３０℃であることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３３】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で１２時間結晶化させることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３４】
前記結晶化バッチ溶液を、最長で２４時間結晶化させることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３５】
前記結晶化バッチ溶液を、少なくとも２４時間結晶化させることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３６】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、濾過によって達成されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３７】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、遠心分離によって達成されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３８】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、比重分離によって達成されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１３９】
アルブミン結晶の前記第一の分離が、乾燥によって達成されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４０】
溶解した結晶懸濁液から析出するアルブミン結晶を、少なくとも１回、溶液中に再度溶解させて戻しさらに再結晶させることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４１】
前記供給流に由来する前記ヒトアルブミン含有溶液が、溶液中から不純物を除去するために事前に清澄化されていることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４２】
前記供給流が、遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁または他の体液であることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４３】
遺伝子導入哺乳類に由来する乳汁が、清澄化されて不純物および一部の乳タンパク質を除去されていることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４４】
所定の供給流中の純度レベルが少なくとも１０％であり、すなわち、所定の溶液中の総タンパク質の少なくとも１０％をヒトアルブミンが構成することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４５】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜４００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４６】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜３００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４７】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜１００グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４８】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり３〜４０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１４９】
前記アルブミン含有溶液が、溶液１リットル当たり２〜１０グラムのアルブミン濃度を有することを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１５０】
医薬調製物中の添加物として利用されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１５１】
医薬調製物中の治療剤として利用されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１５２】
前記供給流が、組み換えヒトアルブミンを発現する宿主に由来する培養上清または体液であることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１５３】
前記宿主が哺乳類培養細胞であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１５４】
前記宿主が遺伝子導入哺乳類であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１５５】
前記宿主が遺伝子導入鳥類であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１５６】
前記宿主が遺伝子導入植物であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１５７】
前記宿主が酵母培養細胞であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１５８】
前記宿主が昆虫培養細胞であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１５９】
前記宿主が原核培養細胞であることを特徴とする請求項１５２記載の製品。
【請求項１６０】
疾患の治療に利用されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１６１】
前記疾患が、
ａ）浮腫；
ｂ）血液量減少；
ｃ）低アルブミン血症；
ｄ）成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；
ｅ）ネフローゼ；
ｆ）新生児溶血性疾患（ＨＤＮ）；
ｇ）重度火傷；
ｈ）低タンパク血症；および，
ｉ）急性膵炎
：より成る群から選択されることを特徴とする請求項１６０記載の製品。
【請求項１６２】
心肺バイパス手術中に利用されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１６３】
以下の工程を含む１または複数回の再結晶によって、アルブミン結晶がさらに精製されることを特徴とする請求項１２７記載の製品：
ｇ）アルブミン結晶の第一の分離によって得られたアルブミン結晶を、２．７〜３．０Ｍの濃度および６．１〜６．３のｐＨを有する第二のリン酸塩混合物中に懸濁させ；
ｈ）前記アルブミン結晶の結晶懸濁液を、４０〜５０℃の温度まで加熱して結晶を溶解させ；
ｉ）前記溶解したアルブミン結晶の結晶懸濁液に第二の濾過を行い；
ｊ）前記濾過したアルブミン結晶の結晶懸濁液を、１５℃以下の温度まで冷却し；
ｋ）前記冷却した結晶懸濁液からアルブミン結晶を形成させ；さらに
ｌ）アルブミン結晶を残りの液体から分離し；それによって、所定の供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項１６４】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸ナトリウム塩から成ることを特徴とする請求項１６３記載の製品。
【請求項１６５】
前記第二のリン酸塩混合物がリン酸カリウム塩であることを特徴とする請求項１６３記載の製品。
【請求項１６６】
前記第二のリン酸塩混合物がナトリウム塩およびカリウム塩の両方から成ることを特徴とする請求項１６３記載の製品。
【請求項１６７】
前記ヒトアルブミンを含む供給流が、溶解したヒト血清アルブミン製品に結合した化合物を含み、該化合物が、
ａ）カプリル酸塩；
ｂ）脂肪酸；および
ｃ）長鎖アルコール
：より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１６８】
前記ヒトアルブミン製品が濃縮物に精製され、該濃縮物は、
ａ）結晶；
ｂ）ゲル；
ｃ）沈澱物；および
ｄ）小滴
：より成る群から選択される状態の相の何れかにあることを特徴とする請求項１記載の製品。
【請求項１６９】
前記ヒトアルブミンを含む供給流が、溶解したヒト血清アルブミン製品に結合した化合物を含み、該化合物が、
ａ）カプリル酸塩；
ｂ）脂肪酸；および
ｃ）長鎖アルコール
：より成る群から選択されることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１７０】
前記ヒトアルブミン製品が濃縮物に精製され、該濃縮物は、
ａ）結晶；
ｂ）ゲル；
ｃ）沈澱物；および
ｄ）小滴
：より成る群から選択される状態の相にあることを特徴とする請求項８７記載の製品。
【請求項１７１】
前記ヒトアルブミンを含む供給流が、溶解したヒト血清アルブミン製品に結合した化合物を含み、該化合物が、
ａ）カプリル酸塩；
ｂ）脂肪酸；および
ｃ）長鎖アルコール
：より成る群から選択されることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１７２】
前記ヒトアルブミン製品が濃縮物へ精製され、前記濃縮物は
ａ）結晶；
ｂ）ゲル；
ｃ）沈澱物；および
ｄ）小滴
：より成る群から選択される状態の相の何れかにあることを特徴とする請求項１２７記載の製品。
【請求項１７３】
以下の工程を含むことを特徴とする、結晶性ヒトアルブミンを製造する方法：
ａ）アルブミン含有溶液を、該液体が溶液１リットル当たり少なくとも１５グラムのアルブミンを含むようになるまで濃縮し；
ｂ）第一の化学修飾剤の十分量を、前記アルブミン含有溶液に加え；
ｃ）前記アルブミン含有溶液に第一の濾過を行い、不純物を除去して結晶化バッチ溶液を形成し；
ｄ）前記結晶化バッチ溶液の濾液を、２０℃以下の温度まで冷却し；
ｅ）前記結晶化バッチ溶液中のヒトアルブミンを結晶化させ；
ｆ）最高で３．０Ｍの濃度にするのに十分な、前記第一の化学修飾剤を前記結晶化バッチ溶液に加え；
ｇ）残りの液体からのアルブミン結晶の第一の分離を行い；
ｈ）アルブミン結晶の第一の分離によって得られたアルブミン結晶を、第二の化学修飾剤に懸濁させ；
ｉ）前記溶解したアルブミン結晶の結晶懸濁液を、４０〜５０℃の温度まで加熱して結晶を溶解させ；
ｊ）前記溶解したアルブミン結晶の結晶懸濁液に第二の濾過を行い；
ｋ）前記濾過したアルブミン結晶の結晶懸濁液を、１５℃以下の温度まで冷却し；さらに
ｌ）前記冷却した結晶懸濁液からアルブミン結晶を形成させ；それによって、所定のヒトアルブミンを含む供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化をもたらす。
【請求項１７４】
前記第一の化学修飾剤がポリエチレングリコールであり、かつ前記第二の化学修飾剤がデカノールであることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１７５】
前記第一の化学修飾剤が（ＮＨ４）２ＳＯ４であり、かつ前記第二の化学修飾剤がデカノールであることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１７６】
前記第一の化学修飾剤がポリエチレングリコールであり、かつ前記第二の化学修飾剤がカプリル酸であることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１７７】
前記第一の化学修飾剤が（ＮＨ４）２ＳＯ４であり、かつ前記第二の化学修飾剤がカプリル酸であることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１７８】
前記第一の化学修飾剤が２−プロパノールであり、かつ前記第二の化学修飾剤がＭｇＣｌ２であることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１７９】
前記第一の化学修飾剤がベンジルアルコールであり、かつ前記第二の化学修飾剤がＭｇＣｌ２であることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１８０】
前記第一の化学修飾剤が塩化カリウムであり、かつ前記第二の化学修飾剤が塩化カリウムであることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１８１】
前記第一の化学修飾剤がポリエチレングリコールであり、かつ前記第二の化学修飾剤が酢酸アンモニウムであることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１８２】
前記第一の化学修飾剤がポリエチレングリコールであり、かつ前記第二の化学修飾剤がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【請求項１８３】
前記第一の化学修飾剤がポリエチレングリコールであり、かつ前記第二の化学修飾剤が２−プロパノールであることを特徴とする請求項１７３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトアルブミンを結晶化する信頼性が高い方法および商業的に実現可能な方法を提供する。より詳細には、本発明は、特に遺伝子導入動物または他の組み換え起源を含むさまざまなアルブミン起源から精製された、結晶性ヒトアルブミンを製造する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ヒト血清アルブミン（「ｈＳＡ」）（本明細書において、ｈＳＡをヒト血清アルブミンの語と互換的に用いる）を結晶化する改良法に関する。本方法は、好ましくは治療用途においてまたは医薬調製物中の添加物として後で利用することができる組み換えｈＳＡの精製手順を向上させるために行われる。医薬調製物に関して、本明細書に記載の通り精製されたヒトアルブミンを、治療剤としてまたは添加物として使用することができる。いずれの場合にも、適当な処方は、それぞれ参照により本開示に含まれる非特許文献１および非特許文献２に見出すことができる。 
ｈＳＡの治療用途について、アルブミン投与の目的は主に、血漿コロイド浸透圧を維持することによって循環血漿量を維持すること、および血管内への腔内および間隙液を血管へ移動させることによって他の方法では難治性の重度の浮腫を治療することである。
【０００３】
アルブミン製品は、急性低タンパク血症に起因する症状、および他の治療法に抵抗性である慢性低タンパク血症の結果として生じる症状において、アルブミンを補充することによって症状の一過性改善を達成するために用いられる。 
アルブミンは、血液増量剤としての臨床利用のための最初の天然コロイド組成物であり、およびアルブミンは他のコロイド製品との比較のための標準コロイド剤である。アルブミンを用いて、患者において血管内コロイド浸透圧を上昇させそれによって血管内容量を増大させることができる具体的な医療適応として以下のものを含む：血液量減少性ショック；重度；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；腹水；肝不全；膵炎および心肺バイパスを受けている患者において（非特許文献３）。アルブミンはまた、新生児高ビリルビン血症、低タンパク血症、およびネフローゼ症候群を治療するのに用いることができる（非特許文献４）。 
ヒト血液のアルブミン部分は３つの主な生理学的役割を果たす：（１）血漿コロイド浸透圧の維持，（２）ビリルビンの輸送および捕捉、および（３）ホルモンおよび酵素といった、脂肪酸および他の中間代謝体の輸送。（非特許文献５）。アルブミンは血漿のコロイド浸透圧の約８０％を占めるため、血清アルブミン濃度の５０％低下は結果としてコロイド浸透圧の６６％低下を生じる（非特許文献６）。危篤状態の患者では、死亡の危険性は血清アルブミン濃度と反比例する（非特許文献３）。ＧｏｌｄｗａｓｅｒとＦｅｌｄｍａｎは、血清アルブミン濃度の低下２．５ｇ／ｄＬごとに、死亡の危険性が２４％〜５６％上昇すると推計している（非特許文献７）。この概算は他の共変数（たとえば、腎機能、血清 トランスアミナーゼ、乳酸アシドーシス）について補正後に行われ、およびアルブミン輸液が直接的な細胞保護作用を有しうることを強く示唆する（非特許文献３）。 
上記を考慮すると、ｈＳＡを記載する入手可能な科学文献の量およびそれが用いられる工業用途の数の両方から判断して、ｈＳＡはおそらく、血漿タンパク質すべてのうちで最も良く知られていることは明らかである。しかし、この豊富な知識量は主にその生理学およびアルブミンの臨床用途に注目しており、それを精製するのに用いられる方法論または血漿分画以外のものからその分子を調達することには注目していない。最も良く知られておりかつ今尚幅広く用いられている精製方法は、Ｃｏｈｎと共同研究者によって６０年前に開発された（非特許文献８）。Ｃｏｈｎ血漿分画法は、幅広い臨床用途のための精製血漿製品を製造するために主に用いられる。Ｃｏｈｎはまた、ヒト血清アルブミンについての使用のための血漿分画法からよく知られているものと同様の原理を利用する、幅広く用いられている結晶化方法を開発した。しかしながら、本方法はかなり非効率であり、さらに高度に精製されたｈＳＡの適当な供給をしばしば提供しない。
【０００４】
ｐＨの効果
ｐＨの効果はタンパク質結晶化における主要な因子の１つである。通常、タンパク質結晶は溶解度の明確な最小点を特定のｐＨで有する。タンパク質結晶化の一般的文献では、この最小溶解度は標的タンパク質の等電点にあることが非常に多い。しかし、ｈＳＡは、幅広いイオン強度に亘り、等電点で高度に可溶性である。したがって、アルブミンの結晶化特性は多数の他のタンパク質のものよりもはるかに複雑であり、信頼性の高い結晶化および／または精製を困難にしている。 
アルブミンは、受けた化学処理に応じて、さまざまな等電点を有する。６つの結合脂肪酸の完全な補完を伴うとき、ｈＳＡのｐＩは通常は４．６であるが、しかし、完全に脱脂された場合そのｐＩは５．６になるであろう。したがって、ｈＳＡの結晶化特性は、その「天然」および脱脂状態の間で異なり、さらにｈＳＡ自体の結晶化について報告されている最適ｐＨは、下はｐＨ４．６から上はｐＨ８．０まで相当に異なり、さらに、バッチ毎におけるｈＳＡの分子状態に高度に依存する。このように、文献中に記載のｈＳＡの結晶化に最適と考えられているｐＨの幅広さは混乱を招き、およびさまざまな沈澱化試薬に明らかに依存し、使用された沈澱化試薬はそれぞれさまざまな濃度を有し、さらに、ｈＳＡの可能な分子状態のうち１つにしか最適でない可能性がある。
【０００５】
たとえば、Ｃｏｈｎアルコール処理で予想されるような、イオン強度の低いｈＳＡについては、結晶化は天然アルブミンの等電点に近いｐＨ４．９〜５．３で最適に進行する。より高いイオン強度の条件下でかつ強く緩衝されている場合、ＰＥＧ溶液による結晶化のための最適ｐＨは７．４である。つまり、ｈＳＡの最適結晶化について報告されているｐＨ効果は、見かけ上不規則な様式で試薬組成に依存するため、先行技術および先行技術の方法論を参照することによって確かな結論を下すことができない。実際、先行技術の教示の状況を考えると、新しい試薬および技術を特定のｐＨまたは他の一変数に従って苦労して最適化し、結晶化条件を導く間それを一定に保たなければならない。
【０００６】
沈澱化試薬の効果
ｈＳＡはさまざまな塩濃度において非常に高い溶解度を有することに注意すべきである。ｈＳＡは低イオン強度でエタノール（Ｃｏｈｎ法；非特許文献８）または他の溶媒を加えて沈澱または結晶化することができる。あるいは、非常に高い塩濃度を用いて塩析することが可能であり、さらに初期の文献はその大部分が、硫酸アンモニウムまたはエタノールを用いたことを記載している。より近年の文献では、さまざまな分子量のＰＥＧ溶液が広く利用されている。しかし、文献に現れる試薬は、残る夾雑物のために、得られたｈＳＡの臨床用途に許容されない。先行技術のうちでは沈澱化試薬のエタノールおよび硫酸アンモニウムだけがｈａｓの製造に有用である。しかし、それらは両方とも、重大で実際的な問題を有する。エタノールを用いる結晶化は、ベンゼンまたは重金属といった有毒な有機修飾剤の添加を必要とする。硫酸アンモニウムは最終アルブミン処方に適した塩ではなく、したがって除去する必要がある。
【０００７】
特定の試薬の効果
他の特性に加えて、アルブミンは幅広い低分子およびイオンを結合および付着させる並外れた能力を有する。さまざまな長鎖アルコールおよび脂肪酸のｈＳＡとの結合は、分子ｈＳＡの結晶化プロファイルに強く影響し、さらに臨床品質のヒト血清アルブミンの製造を非常に変動しやすくおよび予測不能にするように作用する。ｈＳＡの結晶化プロファイルに顕著に影響を及ぼし得る試薬の例として：デカノール、パルミチン酸およびカプリル酸が挙げられる。
【０００８】
温度の効果
エタノール溶液中でｈＳＡを結晶化させるための先行技術の試みは、典型的には０〜１０℃の範囲の低温で行われていることにもまた注意すべきである。高塩およびＰＥＧ手順はしばしば４〜２０℃のより広い温度範囲で行われている。これらの先行技術の試みでは、アルブミン沈澱に対する温度の効果が実際に何であるかは明らかでない。エタノール中で結晶溶解度は見かけ上、低温ではより低い。温度の効果は、先行技術で見出されるＰＥＧおよび塩の方法においては明らかに説明されていない。製造効率および商業的に実現可能な製法のためには、温度は主要な因子の１つである。全体として、温度の意義は先行技術によって説明または開示されていない。
【０００９】
動力学および種結晶添加
先行技術によると、所定の反応が完了するアルブミンの結晶化に必要な時間は、最大で数日を要しうる。しかし、先行技術の方法の中では、エタノールを使用する方法が最も迅速であり、結晶化を開始するのに１２ないし２４時間しか必要としない。同じく先行技術の方法によると、アルブミンの実際の結晶化は、先行する反応から形成された結晶を反応混合物に播種することを含む添加剤無しでは全く不可能であろう。加えて、ＰＥＧに依存する結晶化の方法は、この種類の添加剤を利用してもしなくてもよい。本分野における混乱を考えて、一貫して信頼性の高い結果を与えるかまたは高収量の結晶を生じる利用可能な参考文献は一般的に存在しないが、種結晶添加は結晶成長を有意に加速させることに注意すべきである。
【表１】
2006506435.tif 000003
【００１０】
無機塩を用いる先行技術の方法論
先行技術（非特許文献９）は、ヒト血清アルブミンを、５０％飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４；１５〜２０％Ｎａ２ＳＯ４；２．２Ｍリン酸Ｋ（ｐＨ６．８）および３Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ５．０）を含むさまざまな無機塩を用いて結晶化する方法を提供した。これらの先行技術の方法において、デカノールは必須の結晶化助剤であることが見出された。分子骨格中に５個を超える炭素原子を有する他の脂肪族アルコールもまた有用であることが見出された。しかし、結晶化条件および手順についての記載が非常に少ない。物質バランスは示されていない。この引用文献から利用可能なデータに基づいて、十分に制御されたかまたは信頼性の高い方法でアルブミンの結晶化を行うことは不可能である。
【００１１】
先行技術文献の概観は、提案された結晶化方法がいくつかある一方で、該当する引用文献は、工業または商業スケールで効率的である製法を教示せず、治療薬または添加物の製造における用途には利用できない方法を教示し、またはＸ線回折研究においてのみ有用な単結晶の製造にのみ有用な製法を提供することを示す。このように、先行技術の制限は、治療用、医薬添加物、または医療用アジュバントの役割におけるｈＳＡの大スケール結晶化製法の設計に必要な結晶化条件の広範囲の知識の発展を妨げる。さらに、先行技術は、ヒト血漿以外の起源を使用することを教示しない。したがって、アルブミンの結晶を信頼性高くおよび商業スケールでさまざまな起源から製造する物理的および化学的条件を理解する必要が存在する。
【非特許文献１】ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１６ｔｈ ａｎｄ１８ｔｈ Ｅｄｓ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０ ａｎｄ １９９０） ）
【非特許文献２】ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＴＯ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ （４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９８５） ）
【非特許文献３】Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８
【非特許文献４】Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５
【非特許文献５】Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ ｅｔ．ａｌ．
【非特許文献６】Ｒａｉｎｅｙ Ｔ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，１９９４
【非特許文献７】Ｇｏｌｄｗａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７
【非特許文献８】Ｃｏｈｎ Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９４７
【非特許文献９】Ｈａｕｐｔ ａｎｄ Ｈｅｉｄｅ （１９６７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は結晶性ヒトアルブミンを製造するための改良法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本方法は：ヒト血漿、および培養哺乳類細胞、遺伝子導入哺乳類の乳汁およびその他の体液、遺伝子導入植物、遺伝子導入鳥類、培養組み換え細菌細胞、培養組み換え酵母細胞または培養組み換え昆虫細胞といった組み換えアルブミン起源由来を含むさまざまなアルブミン起源に適する。すなわち、本方法は結晶化されたおよび医薬品質のｈＳＡの製造に、それが由来する供給流に関わりなく有用である。本方法は高い精製力を有するため、結晶性アルブミンを特定の開始材料または供給流中に存在する他のタンパク質、細菌、脂肪酸または他の分子種から効果的に分離することができる。本発明の別の一実施形態では、アルブミンを結晶化媒体中で加熱および冷却サイクルによって溶解および再結晶化することができる。この、再結晶化手順は、本発明の使用者の必要に従って無制限の回数反復することができる。アルブミンの純度は再結晶化手順において規則的に改善される。
【００１４】
本発明の方法はまた、結晶性ヒトアルブミンの製造の最適化を可能にする試薬および条件の正確な組み合わせを提供する。これらの方法において、ｐＨおよび温度といった重要な製法パラメーターは正確に操作される。本発明の別の一実施形態は、リン酸ナトリウムまたはカリウムおよび／またはカプリル酸またはカプリル酸塩の沈澱化剤の最適濃度を提供する。
【００１５】
本発明の製法は、ヒトアルブミンの結晶化に影響を与える主要な因子に基づく。好ましくは、本発明の製法は、下記の通り結晶化手順パラメーターを最適化するために、特定の方法で下記の変数を最適化する：
１．リン酸塩濃度を計画的段階で変化させる；
２．反応混合物の温度を、加熱および冷却手順を連続的に加える計画的段階で変化させる；
３．反応混合物のｐＨを、計画的段階の方法で調節するかまたは変化させる；
４．これらの特定段階の適用が、所定の供給流からのヒトアルブミンの精製および結晶化を可能にする。
【００１６】
本発明の他の特性および利点は、添付の図面を参照しながら、下記の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明で明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
下記の略語は本明細書中で指定の意味を有する：
略語キーワード：
ｐＨ  よく知られた科学パラメーターに従って化学物質または化合物の水素イオン活性を記載するために用いられる用語
ＰＥＧ  ポリエチレングリコールの略語
用語の説明： 
コロイド  毛細管壁を容易に通過しない大きな分子をいう。これらの化合物はコロイド浸透圧（すなわち、それらは液体を引き寄せる）負荷を有し、および通常は血管内容量を回復させおよび組織灌流を改善するために投与される
ダイアフィルトレーション  効率的に塩または他の低分子を高分子溶液から除去するために限外濾過膜を組み込んだ操作。目的は溶液中のアルブミンから低分子を除去しおよび次の手順のために緩衝液を調整することである
組織灌流  組織への血流の量
供給流  工程または方法のために提供されおよび目的のタンパク質を含む、原材料または原溶液。
【００１８】
ｈＳＡの結晶化のための本発明の方法は、さまざまな他のタンパク質成分を含む供給流からアルブミンを分離および精製するための非常に望ましい方法を提供する。結晶はタンパク質の最も純粋な形態であり、いったん沈澱すると結晶は非晶質沈澱よりも顕著に良好な機械的取り扱い特性を有し、および本分野で知られたさまざまな方法によって分離することができる。たとえば、結晶は工業フィルター上で効率的に分離および洗浄することができる。結晶化は精製化学品および医薬品の最も良く用いられる最終精製方法である。
【００１９】
本発明の好ましい一実施形態では、アルブミンはリン酸ナトリウムおよびカリウムの混合物を用いて結晶化される。結晶化は発明された処理条件を系統的な方法で用いることによって最適化される。条件が最適に調整されていない場合、アルブミンは非晶質相、小液滴またはゲルとして沈澱する。非晶質沈澱は取り扱いが非常に難しく、フィルター上で効率的に分離および洗浄することができない。非晶質相は結晶に容易に変換しない。結晶の製造は本発明に従って処理条件を調整する際に最適化される。本発明のさまざまな実施形態を下記に示す。
【００２０】
１．リン酸塩：
結晶化はリン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムの何れかを単独で用いて行ってもよいが、リン酸ナトリウムおよびカリウムの混合物が好ましく用いられる。リン酸塩ＮａＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４は、４Ｍの水溶液まで濃縮液に溶解させることができるため好ましい。これらの４Ｍリン酸塩は、さまざまな望ましいｐＨ値を持つ４Ｍ結晶化緩衝液を作製するためにあらゆる割合で混合することができる。
【００２１】
好ましくは、アルブミンは、相対的に高いリン酸塩濃度、典型的には約２．７Ｍ以上で結晶化する。リン酸塩の濃度の意義は、異なるモル濃度のリン酸塩でのアルブミン結晶の溶解度を示す図１および２で非常に明らかに示される。図２の半対数プロットは、結晶溶解度がリン酸塩のモル濃度を上昇させることによって体系的に低下することを示す。より高いモル濃度のリン酸塩を用いることによって、その製法におけるアルブミン収率を望ましいレベルに調整することができる。使用可能なリン酸塩の濃度の上限は、リン酸塩の溶解度によって設定される。リン酸塩の溶解度は、温度を下げかつアルブミン濃度を上げることによって低下する。本製法の一実施形態では、リン酸塩の溶解度は試薬温度を１０℃未満に下げることによって顕著に低下する。試薬温度を下げ、かつアルブミン濃度を上げることによって、有効水分の濃度(available water concentration)も下がる。
【００２２】
本発明の好ましい一実施形態によると、不純物の大部分は開始材料においてリン酸塩濃度２．０〜２．７Ｍで効果的に沈澱し、この範囲でアルブミンは室温（２５〜３０℃）では容易に結晶化しない。不純物は濾過されることによって取り除かれる（リン酸塩濃度を２．０〜２．７Ｍに調整後）。その後、アルブミンが結晶化する１０℃に濾液を冷蔵する。さらに、リン酸塩濃度を上昇させて、結晶中のアルブミン収率を上げることができる（図１および２の情報を利用）。表２および図４も参照。
【００２３】
２．ｐＨの意義
本発明によると、結晶化バッチのｐＨは、リン酸塩混合物を用いて完全に調節する。さまざまなｐＨ値を持つ混合物の例、およびアルブミン結晶に対する効果を表１に示す。アルブミン結晶溶解度に対するｐＨの効果を図２に図式的に示す（表２も参照）。アルブミン結晶溶解度は、ｐＨをｐＨ５．６から約６．６に上昇させることによって低下する。結晶溶解度は少なくともｐＨ７．４まで非常に低レベルに留まる。ｐＨ５．５未満は結晶が完全に溶解する。
【００２４】
ｐＨは結晶化動力学に対して特異的効果を有し、従ってより高いｐＨ範囲６．３〜７．４は、単純な方法では用いることができない。より高いｐＨ範囲では、そのようなｐＨを処理の最初に調節した場合、アルブミンは非晶質（小液滴）相として沈澱する。このように、結晶化処理は、好ましくは最初はリン酸塩（ｐＨ６．２）を用いて行われる（リン酸塩の混合配合については表１をおよび図２および３を参照）。後でアルブミンが大部分結晶化したとき、結晶収率を高めるために、リン酸塩濃度を高め、ｐＨをより高い値に調整する。より高いｐＨはまた、結晶を洗浄する際にアルブミンの損失が少なくなるため有利に用いられる。
【００２５】
３．温度の効果
異なる温度およびリン酸塩濃度でのアルブミン結晶の溶解度を図３に図示する。アルブミン結晶溶解度はより高い温度で上昇する。最低の溶解度は約０℃で認められる。しかしながら、より低い温度ではリン酸塩が結晶化して製法を制御不能にする可能性があるため、好ましい結晶化温度は約１０℃である。リン酸塩の結晶化は相対的に遅いため、約０℃の実施例の方法を実施することは可能であった。
【００２６】
アルブミンの結晶化動力学は室温では非常に遅い。したがって、アルブミンを沈澱化または結晶化することなく、リン酸塩濃度を２．６−２．７に室温で調整することができる。しかし、不純物は室温で容易に沈澱する。濾過後、アルブミン溶液を好ましくは１０℃で冷蔵する。溶液を攪拌し、アルブミンを結晶化させる。
【００２７】
加熱サイクルを利用することによってアルブミンを再結晶させることができる。結晶は４５℃に加熱することによって溶解する。アルブミンは１０℃に冷却することによって再び結晶化される。再結晶化を用いて、結晶純度を改善することができる。各結晶化後に、濾過することによって母液を除去する。冷却した３Ｍリン酸塩を用いて結晶をフィルター上で洗浄する。再結晶化サイクルは無限回反復することができる。再結晶化を用いて、アルブミン純度を改善することができる。表７および８および図７を参照のこと。
【００２８】
アルブミンは相対的に熱安定性である。アルブミンは、６５〜７０℃の温度まで長時間加熱することができる。大部分の他のタンパク質は、そのような高温では変性および沈澱する。このように、６５〜７０℃での加熱処理を、結晶化前にアルブミン溶液を精製するために用いることができる。最高許容温度は、アルブミン溶液の組成およびｐＨに関係する。高いリン酸塩濃度（ｐＨ６．２）では、最高温度は６５℃である。低塩溶媒およびｐＨ５．４では、７０℃で２〜３時間の加熱が可能である。熱処理の効果の実施例を表２および３および図６に示す。
【００２９】
４．カプリル酸塩
アルブミンは、結晶化可能となるにはカプリル酸塩で飽和する必要がある。カプリル酸塩はまた、アルブミン、特に熱安定性に対して、安定化効果を有する。他の長鎖脂肪酸および長鎖アルコールも代替として有用である。デカノールは非常に効果的であり、先行技術で周知である。カプリル酸塩はそれがどのように用いられるかによって二つの効果を有する。カプリル酸塩はアルブミンの結合部位を飽和するためだけに用いられる場合に有益である。しかし、過剰のカプリル酸塩は結晶を溶解させ、さらにアルブミン収率を低下させる。
【００３０】
カプリル酸塩の効果を図４で明らかにする。洗浄した結晶へのカプリル酸塩の添加は、明らかに結晶溶解度を高めた。結晶溶解度は、カプリル酸塩を１０ｍＭまで上昇させた際に速やかに上昇した。カプリル酸塩を１０ｍＭから２０ｍＭに増加させた場合、溶解度の上昇はより小さかったが、なお有意であった。リン酸塩濃度２．６３Ｍおよび温度１０℃で、アルブミン溶解度は、１０ｍＭカプリル酸塩での９ｍｇ／ｍｌから、１０ｍＭカプリル酸塩での２１ｍｇ／ｍｌに上昇した。より高いリン酸塩濃度２．８２Ｍおよび温度１０℃では、アルブミン溶解度は、０ｍＭカプリル酸塩での２ｍｇ／ｍｌから、１０ｍＭカプリル酸塩での１２ｍｇ／ｍｌに上昇した。
【００３１】
カプリル酸塩の溶解効果は顕著であるため、遊離カプリル酸塩の濃度を、結晶化工程において、よく制御しかつ可能な限り低く維持すべきである。１〜２ｍＭの低レベルの遊離カプリル酸塩は、そうしなければアルブミン結晶の溶解度が非常に低くなるような条件の場合、許容可能である。図２から図７を参照のこと。 
５．アルブミン：濃度、純度
実験用溶液では、開始溶液中のアルブミン濃度は、使用した条件における結晶の溶解度よりも高いレベルに設定される。本発明によると、遺伝子導入動物または培養細胞を起源とする供給流を扱う場合、通常、最初の清澄化工程を用いて、ｈＳＡ結晶の溶解度よりも高くなるようにアルブミン濃度および他の化学パラメーターが調整または操作された溶液を提供する。これらの両方の場合においてアルブミン回収率は、状態図における溶解度情報を用いることによって推定することができる（図１〜４）。本発明によると、供給流溶液中のアルブミンの濃度レベルは通常、結晶化バッチ１リットル中にアルブミン１５〜３００グラムの範囲にある。生物起源由来のおよびｈＳＡの商業的または工業的製造に使用可能な供給流において、これらと同様の範囲の濃度が認められる。
【００３２】
さらに、本発明の好ましい実施形態によると、結晶化過程において、アルブミンは純粋である必要がない。本発明によって開発および提供される方法は、原料物質中のアルブミンを結晶化して採取するのに利用することができ、その純度レベルは約１０％であり、すなわち、与えられた溶液の総タンパク質のうち１０％だけをアルブミンが占める。たとえば、遺伝子導入起源または培養細胞のどちらかを起源とするｈＳＡについては、清澄化手順後に残っている不純物の大部分は、２．６Ｍ濃度レベルまでのリン酸塩の最初の添加による沈澱後に除去することができる。典型的には乳汁であるが血液または尿といった他の体液も含む遺伝子導入起源は、それら体液または組織におけるｈＳＡ（または他の目的タンパク質）の安定発現をもたらすように設計されたＤＮＡ構造の挿入の結果としてｈＳＡを含むことに注意する。沈澱および濾過した後に、アルブミン濃度レベルを高めるために濾液をさらに限外濾過によって濃縮する。その後、濃縮されたアルブミン溶液を、本発明に従って冷蔵および結晶化する。
【実施例】
【００３３】
実施例１
好ましい結晶化製法
この製法の説明は、精製アルブミン溶液の結晶化について行われ、その目的のために、リン酸塩溶液の使用についてのみ記載する。しかし、本発明によると、この方法は、本明細書において提供する追加の工程を加えて、遺伝子導入または培養細胞供給流から見出されような、不純なまたは部分精製しかされていない開始材料でも用いることができる。本発明の方法の変法、たとえば相当に不純な材料を用いた開始溶液を利用することを、以下に示す。
【００３４】
工程１．沈澱
２．８モルのＮａＨ２ＰＯ４および１．２モルのＫ２ＨＰＯ４を水に溶解し、１．０リットルにメスアップしたリン酸塩ストック溶液を結晶化に用いた。この４Ｍリン酸塩溶液は、０．５Ｍへの希釈後に測定したときｐＨ６．２であった。その後、精製されたアルブミン溶液２００ｍｌを、ｐＨ６．２の４．０Ｍリン酸塩ストック溶液３７１ｍｌを加えることによって沈澱させた。加えた量に基づいて、リン酸塩濃度は２．６Ｍであった。溶液を室温で４〜１８時間沈澱させた。先行技術の方法ではすべての場合で２４時間未満であるが、本発明のこの変法での時間はそれと比して短い。生じた沈澱の量はアルブミン溶液中の不純物の量と直接関連する。
【００３５】
工程２．濾過
その後、沈澱したｈＳＡを、約１μｍ孔径を有するグラスファイバーまたはセルロース繊維紙を通して濾過した。濾過した溶液はその後、本発明に記載の好ましい結晶化手順で使用した。
【００３６】
工程３．結晶化
結晶化は１０℃サーモスタットインキュベーター内で実施した。上部駆動式プロペラを用いてバッチを低速で攪拌した（約７０ｒｐｍ）。ｐＨ６．２での４Ｍリン酸塩２２９ｍｌを加えることによって、リン酸塩濃度を２．６Ｍから３Ｍに徐々に増加させた。結晶化バッチは、採集および洗浄の前に４日間継続した。
【００３７】
工程４．結晶の採集および洗浄
本発明の好ましい一実施形態によると、グラスファイバー紙（孔径１μｍ、直径１４２ｍｍ）を用いてバッチを濾過することによってｈＳＡ結晶を採取した。濾過した後、次いで冷却した３Ｍリン酸塩ｐＨ６．２約８０ｍｌを用いて結晶を洗浄した。その後、冷却した３Ｍリン酸塩ｐＨ６．２約１５０ｍｌに結晶を再懸濁させた。
【００３８】
以下の表２および本発明の好ましい結晶化製法に関して、混合容量比は固定して保たれれば好ましい。好ましくは、緩衝液混合物を作製後、ｐＨを調整しない。ｐＨ値はリン酸塩濃度の変化と共に変わるため、本発明のこの実施形態についてｐＨ値は概算である。本発明の緩衝液は、結晶溶解度に対するｐＨの効果の試験で用いた。下記の表２に見られる通り、緩衝液番号１０は、結晶発生について一貫して最適化された条件を提供し、およびこの緩衝液について与えられたその条件は本発明の標準緩衝液のために好ましい条件である。（図１１〜１３も参照）。
【表２】
2006506435.tif 000004
【００３９】
また、本開示の図６で、２．６３Ｍリン酸塩中のアルブミンの溶解度のプロファイルを、カプリル酸塩濃度および温度の関数として示していることにも注意する：白丸（○）は１０℃でインキュベートした試料を示し、黒四角（■）は５℃でインキュベートした試料を示す。
【００４０】
実施例２
微量拡散法を用いたアルブミンの結晶化
４８試料からの結晶化試料を、本分野で既知であるハンギング液滴微量拡散法に従って調製した。試料溶液は、精製されたアルブミン１９８ｍｇ／ｍｌおよびカプリル酸ナトリウム３．２ｍｇ／ｍｌを含む。アルブミン溶液３μｌを１．８〜２．３Ｍリン酸塩３μｌと混合することによってアルブミンの溶液を調製した。密閉した微量拡散ウェル内で液滴を平衡化させ、５℃で冷蔵した。本発明のこの実施形態に従って、結晶は２４時間以内に形成された。本発明によると、他の原料物質由来の供給流、特に、遺伝子導入および培養細胞起源もまた、微量拡散ハンギング液滴法で利用することができる。
【００４１】
結晶を顕微鏡で観察し、さらにデジタルカメラで写真撮影した。結晶の形成に関する情報を表１９および２０に示す。これらの実施例は、カプリル酸塩で飽和したアルブミンは、明確に定められたｐＨ範囲、すなわちｐＨ５．０〜６．４にある１．８Ｍから２．３Ｍリン酸塩中で結晶化することを示す。結晶形成に最も好ましいｐＨは、下記の表３に示すとおり、ｐＨ６．２であった。与えられた実験条件は、代替的な供給流起源において見られた濃度および溶液パラメーターの範囲を有効に包含する（表４を参照）。
【表３】
2006506435.tif 000005
【表４】
2006506435.tif 000006
【００４２】
実施例３
不純な開始材料中のアルブミンの結晶化
下記の製法の説明は、結晶化に干渉する多量の不純物を含む組み換えｈＳＡ開始材料のために行う。最初の処理工程は、不純物の除去のために必要である。より高純度のアルブミンが用いられる場合、工程数を対応して減らす。
【００４３】
工程１．濃縮
開始材料は限外濾過によって可能な限り濾過して濃縮すべきである。高いタンパク質濃度はリン酸塩の使用を減らし、さらに結晶化可能なｒｈＳＡの収率を上昇させる。また、事前の処理工程に由来する塩を減少させるために、濃縮手順の最後に水を用いて材料を濾過すべきである。タンパク質濃度のガイドライン：Ａ２８０ｎｍ＝１５０〜２００。
【００４４】
工程２．リン酸塩を用いた最初の沈殿
４Ｍリン酸塩（ｐＨ６．２）の２．５容量をｒｈＳＡ濃縮液１．５容量に加える。この工程でのリン酸塩終濃度は、不純物を沈殿させるがアルブミンは沈殿させない２．５Ｍである。この手順は好ましくは室温で実施する。
【００４５】
工程３．濾過
ブフナー漏斗または圧力容器フィルターを用いて濾別した沈澱を除去する。沈澱は非常に粒子の細かい非晶質物質であるため、珪藻土を濾過助剤として用いる。沈澱は液体上に浮かばないため、遠心分離は便利な選択ではない。
【００４６】
工程４．結晶化
ｈＳＡの結晶化は、４Ｍリン酸塩（ｐＨ６．２）を濃度が２．８Ｍとなるまで濾液に追加することによって開始する。結晶化は、低温、好ましくは約５．０℃で実施する。ｈＳＡの結晶化は、本発明のこの実施形態によると、２４時間以内に自発的に開始する。代替的な一実施形態では、種結晶の添加がその過程をより迅速化する。
【００４７】
工程５．結晶の洗浄
本発明の好ましい実施形態によると、結晶を遠心分離によって、あるいは好ましくは濾過することによって、洗浄する。遠心分離では、結晶はリン酸緩衝液の上に浮かぶ。洗浄は２．８Ｍリン酸塩溶液を用いて約＋５℃の温度で実施する。結晶洗浄は、０．１ｂａｒ未満の低い圧力差で行うべきである。洗浄は、濾液の可溶性タンパク質がほぼ一定の低レベル、Ａ２８０ｎｍ＝１．０以下のままとなるまで、３〜４回繰り返す。
【００４８】
工程６．結晶ストックの作成
洗浄した結晶を少量の２．８Ｍリン酸緩衝液に分散する。結晶は次の工程のために処方するまでこの中で保存することができる。
【００４９】
実施例４
熱処理後の不純なアルブミンの結晶化
開始材料
この実施例に用いられた供給流材料は、相当量のタンパク質を不純物として有していた。アルブミンは、存在するタンパク質の約３０％であった。既述のように、これは清澄化または部分精製された遺伝子導入または培養細胞起源から供給される供給流材料の通常の範囲内である。使用した溶液は４Ｍリン酸塩ｐＨ６．２を１０７ｍｌ含み、開始材料溶液（この工程の前に２Ｍリン酸塩溶液であった）２００ｍｌに加えて２．７０Ｍ溶液を得た。本発明によるとこの沈澱した溶液を結晶化のための開始溶液として使用した。
【００５０】
熱処理
沈澱した開始溶液（２．７０Ｍリン酸塩溶液）を５５℃で９０分間インキュベートした。相当量の桿状結晶が非晶質沈澱と共にこの熱処理の結果として形成された。総タンパク質の約７５％から８０％が結晶化または沈澱した。結晶および沈澱は、スラリーが熱いうちにグラスファイバーフィルターを通して濾過することによって除去した。いくらかの珪藻土を濾過助剤として使用した。アルブミンを含む上清濾液だけを次の工程のために採取した。
【００５１】
濃縮および濾過
濾過した後、溶液は結晶化には低すぎるアルブミン濃度を有していた。したがって、これを５５℃でFresenius Polysulfone UF 6.2 Hemoflow F5HPS透析カートリッジを用いて濃縮およびダイアフィルトレーションした。処理工程の詳細なデータを表６に示す。
【００５２】
ｈＳＡ結晶化
濃縮溶液のリン酸塩濃度を高め、ゆっくりと２．８に調整した。ｈＳＡを結晶化させるため、同時にバッチを冷蔵庫内で緩やかに攪拌した。
【００５３】
ｈＳＡ結晶を真空濾過によって採取および洗浄した。洗浄溶液は２．８８Ｍリン酸塩ｐＨ６．４であった。下記の表５および図７に示すとおり、不純物の熱結晶化は、開始材料溶液の主な不純物を除去するための技術的に容易および迅速な方法である
【表５】
2006506435.tif 000007
【表６】
2006506435.tif 000008
【００５４】
実施例５
加熱および冷却サイクルを用いることによるアルブミンの再結晶化
以前に作製した、２．７Ｍリン酸塩ｐＨ６．２中のタンパク質濃度３７．５ｇ／ｌのｈＳＡ結晶スラリーを、本発明の好ましい一実施形態に従って実施したこの試験のための開始材料として使用した。結晶スラリーの試料５点、各０．５０ｍｌをそれぞれ、４０、４５、５５、６５または７０℃で６０分間インキュベートした。結晶は試験したすべての温度で溶解した。加熱の最後に、０．４５μｍフィルターを通して試料を濾過した。濾液の可溶性タンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって測定した。
【００５５】
表７および８におよび図１３に示すとおり、結晶スラリーを４０〜５０℃で１時間インキュベートした場合、総タンパク質の約１０％が沈澱した。この値はこの温度範囲ではかなり一定しており、それは加熱濾過手順で除去された不純物を表した。温度を６５から７０℃に上げた場合、試料の可溶性タンパク質は８３％から３７％に減少した。濾過した後、試料１から５までを６５℃まで加熱し、５℃に設定した冷蔵庫内で１８時間後にすべて良好に再結晶化した。試料５を７０℃でインキュベートした場合、濾液中に結晶は生じず、これはアルブミンがその温度では２．７Ｍリン酸塩中で安定でないことを示す（表８を参照）。これらの実施例は、本発明の好ましい一実施形態によると、６５℃まで加熱し、その後濾過し、さらに適当な再結晶化サイクルを経ることによって、アルブミンを良好に精製できることを示す。
【表７】
2006506435.tif 000009
【表８】
2006506435.tif 000010
【００５６】
実施例６
より高いｐＨでのアルブミンの結晶化
本発明に従って実施した試験は、アルブミン結晶溶解度および結晶化がｐＨに依存しうることを示す。もう一つの問題は、リン酸緩衝液の存在化でのカプリル酸塩の分離である。カプリル酸塩の溶解度は、より高いｐＨで上昇する。したがって、わずかに高いｐＨでさえ最適な結晶形成には望ましい。本発明に基づき、３つの異なるリン酸塩のモル濃度で、ｐＨ６．２〜６．６の範囲で結晶化の試行を行った。実験の詳細を以下の表９に示す。
【００５７】
結果の評価
以下の表９に示されるように、ｐＨが６．４および６．５に上昇したとき、アルブミンは非常に効果的に結晶化した。アルブミンの溶解度は、ｐＨ６．４より高いｐＨでは非常に低かった。残念ながら、より高いｐＨレベルでは、アルブミンは非常に小さい針状として結晶化した（図１０〜１３を参照）。結晶の大きさは、結晶化をより低いｐＨ６．２または６．３で開始することによって、より大きく成長する傾向がある。ほぼ平衡を達成後、４Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４を徐々に加えることによってｐＨをより高いレベルに調整することができる。
【表９】
2006506435.tif 000011
【００５８】
実施例７
アルブミン結晶の再結晶化および洗浄
再結晶化および洗浄
洗浄した結晶（１０２−１２）を５分間４５℃で加熱した。結晶は速やかに溶解した。溶液を温かいうちに０．４５μｍシリンジフィルターを用いて濾過した。濾過した溶液を２℃で結晶化するまで攪拌した（３日間）。そのバッチはよく結晶化した（図２）。結晶は２．８２ＭｐＨ６．２リン酸塩を用いて０．４５μｍ（直径５０ｍｍ）Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ膜上で濾過および洗浄することによって採集した。洗浄した結晶は２．８２Ｍリン酸緩衝液中に分散した。
【表１０】
2006506435.tif 000012
【００５９】
適応および用途
血液量減少
血液量減少は、本発明の方法によって精製されかつ利用可能になったアルブミン、２５％溶液、Ｂｕｍｉｎａｔｅ２５％の可能な適応である。血液量減少を逆転させることにおけるその有効性は全般に、間質液を循環中に引き寄せるその能力に依存する。よく水分補給されている患者について非常に効果的である。血液量減少が長期にわたり、さらに低アルブミン血症が適当な水和または浮腫を伴って存在する場合には、２５％アルブミンは５％タンパク質溶液よりも好ましい。しかし、適当なまたは過剰な水和の非存在下では、５％タンパク質溶液を用いるべきであるかまたは、結晶質で２５％アルブミンを希釈すべきである。結晶質溶液およびコロイド含有代用血漿をショックの緊急処置に用いることができるが、アルブミンは長い血管内半減期を有する。血液量不足が出血によるものである場合は、適合する赤血球または全血を可能な限り速やかに投与すべきである。
【００６０】
低アルブミン血症
低アルブミン血症は、本発明の方法によって精製されかつ利用可能になったアルブミン、２５％溶液、Ｂｕｍｉｎａｔｅ２５％の用途のためのもう一つの可能な適応である。低アルブミン血症は下記のうち一つ以上の結果として生じうる：産生不全（栄養失調、火傷、大きな外傷、感染症、など）；過剰な異化作用（火傷、大きな外傷、膵炎、など）；体からの損失（出血、過剰な腎排泄、火傷滲出物、など）；および体内再分布（大きな外科手術、さまざまな炎症性症状、など）。
【００６１】
アルブミン欠乏が過剰なタンパク質損失の結果である場合は、その基になる疾患が逆転されない限りアルブミンの投与の効果は一時的である。大部分の場合には、基になる疾患の同時の治療に伴うアミノ酸および／またはタンパク質の栄養置換の増加が、アルブミン溶液よりも効果的に正常な血漿アルブミンレベルを回復する。時々、重度の外傷、感染症または膵炎に伴う低アルブミン血症は迅速に逆転することができず、および栄養補助で血清アルブミンレベルを回復できない可能性がある。これらの場合には、アルブミン（ヒト）、２５％溶液、Ｂｕｍｉｎａｔｅ２５％は有用な治療用添加剤となりうる。
【００６２】
火傷
火傷の初期治療におけるアルブミン、電解質および液体の使用のための最適な投薬計画は確立されていないが、しかし、適当な結晶質療法と併せて、アルブミン（ヒト）、２５％溶液、Ｂｕｍｉｎａｔｅ２５％を、広範囲火傷の最初の２４時間後のコロイド浸透圧不足の治療、および重度火傷に伴うタンパク質損失の回復に適用することができる。
【００６３】
成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）
ＡＲＤＳの特徴は、間質性肺水腫の原因として関係している可能性がある低タンパク血症的状態である。これらの患者におけるアルブミン輸液の正確な適応に関して不確実性はあるが、低アルブミン血症を伴う肺過負荷が存在する場合、２５％アルブミン溶液は利尿剤と併用する場合に治療効果を有するであろう。
【００６４】
ネフローゼ
アルブミン（ヒト）、２５％溶液は、ステロイドおよび／または利尿剤を投与されている重度のネフローゼの患者において浮腫を治療するのに有用な助剤であろう。
【００６５】
心肺バイパス手術
アルブミン（ヒト）、２５％溶液、Ｂｕｍｉｎａｔｅ２５％は、心肺バイパス手術の前またはその間に推奨されているが、結晶質溶液よりも優れていることを示す明らかなデータは存在しない。
【００６６】
新生児溶血性疾患（ＨＤＮ）
アルブミン（ヒト）、２５％溶液、Ｂｕｍｉｎａｔｅ２５％は、重度のＨＤＮを有する乳児において非結合ビリルビンを結合および無毒化する目的で投与することができる。
【００６７】
本発明の方法によって精製されたアルブミンを、医薬品の輸送のための添加物として用いることもまた可能である。
【００６８】
結晶スクリーニング実験
ハンギングドロップスクリーン（hanging drop screen）を、４行（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）および６列に分割した２４ウェルを持つ箱の中に作製する。そのスクリーンは、下記の通り試薬の一覧としてのみ予備報告書に示す。結果への短いコメントが提供されている。最終報告書では結果は下記の表の実施例と同様の、完全な詳細を含む表で提供されている。
【００６９】
顕微鏡法と表
顕微鏡法による試料評価を実験の始めに、２〜３日の頻度で、および後に週１回で行った。表中の顕微鏡観察は下記の記号を用いた短縮形である：
Ｎ＝沈澱または他の相分離なし
Ｃ＝いくらかの結晶が存在
ＣＣ＝相当な量の結晶が存在
Ａ＝非晶質沈澱、雲または茶系の煙のように見える不透明な粒子の雲、粒子の大きさは光学顕微鏡の分解能の下限界に近い
ＡＡ＝相当な量の非晶質沈澱
Ｌ＝液相分離、球状の透明な小滴、水中油のように見える
ＬＬ＝顕著な液体分離
Ｇ＝ゲル塊、直径数ミリメートルの不規則なガラス性透明粒子
ＧＧ＝相当な量のゲル
Ｘ＝汚染または乾燥した液滴、中断された実験
【表１１】
2006506435.tif 000013
【表１２】
2006506435.tif 000014
【表１３】
2006506435.tif 000015
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
2006506435.tif 000021
【表２０】
2006506435.tif 000022
【表２１】
2006506435.tif 000023
【表２２】
2006506435.tif 000024
【表２３】
2006506435.tif 000025
【表２４】
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【表２５】
2006506435.tif 000027
【００７０】
組み換え産生
ますます多数の組み換えタンパク質が治療および診断用途のために開発されている。しかし、これらのタンパク質の多くは、機能する形でおよび／または必要な量を従来の方法を用いて製造するのは困難であるかまたは費用がかかる。従来の方法は、特定のタンパク質の産生を担う遺伝子を、細菌、酵母、または哺乳類細胞、たとえば、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞といった宿主細胞に挿入し、さらに次いでその細胞を培地中で増殖させることを含む。その後、培養細胞が目的タンパク質を合成する。従来の細菌または酵母系は、機能する形態で多数の複雑なタンパク質を産生することができない場合がある。哺乳類細胞は複雑なタンパク質を複製することができる一方、哺乳類細胞は一般的に増殖させるのが困難でありおよび費用を要し、およびしばしばｍｇ／Ｌ量のタンパク質しか産生しない。加えて、非分泌タンパク質は培地中に分泌されないため、原核または哺乳類細胞から精製するのが相対的に困難である。
【００７１】
一般的に、遺伝子導入技術は、通常は分泌されないタンパク質（非分泌タンパク質）を作製および分泌させる方法を扱う。本方法は、以下のものを含む核酸構造からタンパク質を発現させることを含む：
（ａ）プロモーター、たとえば、乳腺上皮特異的プロモーター、たとえば、乳タンパク質プロモーター；
（ｂ）タンパク質の分泌を導くことができるシグナル配列、たとえば乳汁特異的タンパク質由来のシグナル配列；
（ｃ）随意的に、遺伝子導入哺乳類のたとえば乳汁中への非分泌タンパク質の分泌を可能にするのに十分な、分泌タンパク質、たとえば、乳汁中に分泌されるタンパク質の、アミノ末端コード領域の一部分をコードする配列；および
（ｄ）非分泌タンパク質をコードする配列であって、
要素（ａ）、（ｂ）、必要に応じて（ｃ）、および（ｄ）は好ましくは記載の順に調節可能に結合している。
【００７２】
好ましい実施形態では：要素ａ、ｂ、ｃ（あれば）、およびｄは同一の遺伝子に由来する；要素ａ、ｂ、ｃ（あれば）、およびｄは２個以上の遺伝子に由来する。
【００７３】
好ましい実施形態では分泌は遺伝子導入哺乳類の乳汁中に行われる。
【００７４】
好ましい実施形態では：シグナル配列はβ−カゼインシグナル配列である；プロモーターはβ−カゼインプロモーター配列である。
【００７５】
好ましい実施形態では、非分泌タンパク質コード配列は：ヒト起源である；短縮ポリペプチド、核ポリペプチド、または細胞質ポリペプチドをコードする；ヒト血清アルブミンまたは他の望ましい目的タンパク質をコードする。
【００７６】
本発明の実施は、別に指定されない限り、本分野の技術内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の方法を使用する。そのような方法は文献に記載されている。たとえば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,ed.by Sambrook,Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning,Volumes I and II (D.N.Glover ed.,1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed.,1984); Mullis et al.U.S.Patent No : 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984); Culture Of Animal Cells (R.I.Freslmey,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press,1986); B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise,Methods In Enzymology (Academic Press,Inc.,N.Y.) ; GeneTransfer Vectors For Mamlmalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology,Vols.154 and 155 (Wu et al.eds.)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,19
87) ; Handbook Of Experimental Immunology,VolumesI-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986); Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照。 
乳汁特異的プロモーター
本発明の実施に有用な転写プロモーターは、カゼイン、ベータラクトグロブリン（Clark et al.,(1989)Bio/Technology 7:487-492）、乳漿酸性タンパク質 （Gorton et al.(1987) Bio/Technology5:1183-1187）、およびラクトアルブミン （Soulier et al.,(1992)FEBSLetts.297:13）といった乳タンパク質をコードする遺伝子を調節するプロモーターを含む、乳腺上皮細胞で優先的に活性化されるプロモーターである。カゼインプロモーターは、任意の哺乳類種のアルファ、ベータ、ガンマまたはカッパカゼイン遺伝子に由来することができる；好ましいプロモーターはヤギベータカゼイン遺伝子に由来する（DiTullio,(1992)Bio/Technology 10: 74-77）。乳汁特異的タンパク質プロモーターまたは乳腺組織で特異的に活性化されるプロモーターは、ｃＤＮＡまたはゲノム配列のどちらかに由来しうる。好ましくは、それらはゲノム起源である。
【００７７】
上に列記した乳腺特異的遺伝子のすべてについて、少なくとも１種類、およびしばしば数種類の生物において、ＤＮＡ配列情報が利用可能である。たとえば、Richards et al.,J.Biol.Chem.256,526-532 (1981) （α−ラクトアルブミン、ラット）； Campbell et al.,Nucleic Acids Res.12,8685-8697 (1984) （ラットＷＡＰ）； Jones et al.,J.Biol.Chem.260,7042-7050 (1985) （ラットβ−カゼイン） ； Yu-Lee & Rosen,J.Biol.Chem.258,10794-10804 (1983) （ラットγ−カゼイン）； Hall,Biocheen.J.242,735-742 (1987) （α−ラクトアルブミン、ヒト）； Stewart,Nucleic Acids Res.12,389 (1984)（ウシαｓ１およびκカゼインｃＤＮＡ）； Gorodetsky et al.,Gene 66,87-96 (1988) （ウシβカゼイン）； Alexander et al.,Eur.J.Biochem.178,395-401 (1988) （ウシκカゼイン）； Brignon et al.,FEBSLett.188,48-55 (1977) （ウシαＳ２カゼイン） ； Jamieson et al.,Gene 61,85-90 (1987)、 Ivanov et al.,Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369,425-429 (1988)、 Alexander et al.,Nucleic Acids Res.17,6739 (1989) （ウシβラクトグロブリン）； Vilotte et al.,Biochimie 69,609-620 (1987) （ウシα−ラクトアルブミン）を参照。さまざまな乳タンパク質遺伝子の構造および機能はMercier &Vilotte,J.Dairy Sci.76,3079-3098 (1993）による総説がある（その全体が参照により本開示に含まれる）。追加の配列データが必要とされうる程度まで、既に得られた領域に隣接する配列は、既存の配列をプローブとして用いて容易にクローニングすることができる。さまざまな生物に由来する乳腺特異的調節配列は、既知の同族ヌクレオチド配列、または同族タンパク質に対する抗体をプローブとして用いて、そのような生物に由来するライブラリをスクリーニングすることによって同様に得られる。
【００７８】
シグナル配列
本発明に従って有用であるシグナル配列には、真核または原核タンパク質の分泌を結果として生じる、乳汁特異的シグナル配列または他のシグナル配列がある。好ましくはそのシグナル配列は乳汁特異的シグナル配列から選択される、すなわち、それは乳汁中へ分泌される産物をコードする遺伝子に由来する。非常に好ましくは、乳汁特異的シグナル配列は、本発明の発現系に用いられる乳汁特異的プロモーターと関係している。シグナル配列の大きさは本発明のために決定的ではない。必要なのは、その配列がたとえば乳腺組織において、組み換えタンパク質の分泌を起こさせるのに十分な大きさであることだけである。たとえば、アルファ、ベータ、ガンマまたはカッパカゼインといったカゼイン、ベータラクトグロブリン、乳漿酸性タンパク質、およびラクトアルブミンをコードする遺伝子に由来するシグナル配列が本発明において有用である。好ましいシグナル配列はヤギβ−カゼインシグナル配列である。
【００７９】
他の分泌タンパク質、たとえば、肝細胞、腎細胞、または膵細胞によって分泌されるタンパク質に由来するシグナル配列もまた使用することができる。
【００８０】
遺伝子導入哺乳類
目的タンパク質、この場合はヒト血清アルブミンのＤＮＡ構造は、哺乳類の生殖細胞系へ導入される。たとえば、その構造の１コピーまたは数コピーを、標準的な遺伝子導入法によって哺乳類胚のゲノムへ組み込むことができる。
【００８１】
任意の非ヒト哺乳類を本発明において有効に用いることができる。哺乳類とはここでは、乳腺を有しおよび乳汁を産生する、ヒトを除くすべての動物と定義する。好ましくは、多量の乳汁を産生しおよび長い乳汁分泌期間を有する哺乳類が好ましい。好ましい哺乳類は、乳牛、ヒツジ、ヤギ、マウス、雄牛、ラクダおよびブタである。もちろん、これらの哺乳類のそれぞれは、本発明の任意の所定の発現配列について他の哺乳類ほど有効でない可能性がある。たとえば、ある特定の乳汁特異的プロモーターまたはシグナル配列は、１種類の哺乳類において他の哺乳類よりも有効でありうる。しかし、当業者は本発明の教示に従うことによってそのような選択を容易に行いうる。
【００８２】
上記の発明を、理解を目的とした図および実施例によって一部の詳細を説明してきたが、一定の変更および改変を実施しうることは当業者に明らかとなる。したがって、説明および実施例は、付属の請求項によって線引きされる本発明の範囲を制限すると解釈してはならない。
【００８３】
アルブミンはさまざまな化合物、エタノールおよびリン酸塩を含む無機塩を用いて結晶化される一方、リン酸塩を用いた結晶化の工業的方法は文献に見出されないことにもまた注意する。本発明の好ましい実施形態を通じて、本発明の発明された主要な処理パラメーターおよび／または条件を十分に利用することによってリン酸塩を用いてヒトアルブミンを有利に結晶化することができることが現在見出されている。発明されたパラメーターおよびその変形の一部が上記に列挙および説明されている。
【００８４】
したがって、結晶化および精製されたヒトアルブミンを提供する本発明の実施形態は、本発明の原理の応用の単なる説明であることが理解される。開示内容の要素の、形態、使用方法、応用における変化を、本発明の精神、または付属の請求項の範囲を離れることなく用いることができることが上記の説明から明らかとなる。
【００８５】
参照により本開示に含まれる先行技術文献
【参考文献】
【００８６】
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2006506435.tif 000029
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、組み換えヒト血清アルブミンの結晶化についての製法フローチャートを示す。
【図２】図２は、異なる温度でｐＨ６．２でのアルブミン溶解度を、指数近似曲線と共に示す。
【図３】図３は、異なる温度でｐＨ６．２でのアルブミン溶解度を、近似直線と共に示す。
【図４】図４は１５℃でのアルブミン結晶のｐＨ溶解度を示す。
【図５】図５は、ｐＨ６．２の様々なリン酸塩溶液中での、洗浄したアルブミン結晶の溶解度試験を示す。
【図６】図６は、さまざまなカプリル酸塩濃度の２．６３Ｍリン酸塩溶液中での、洗浄したアルブミン結晶の溶解度試験を示す。
【図７】図７は、２．７Ｍリン酸塩ｐＨ６．２中のｈＳＡ結晶スラリーの熱沈澱試験を示す。
【図８】図８は、アルブミンの予備的結晶化についての製法フローチャートを示す。
【図９】図９は、組み換えヒト血清アルブミンの結晶化についての製法フローチャートを示す。
【図１０】図１０は、組み換えヒト血清アルブミンの再結晶化についての製法フローチャートを示す。
【図１１】図１１は、ｐＨ６．２の２．３Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ；カプリル酸塩１．４ｍｇ／ｍｌ；ｈＳＡ８０ｍｇ／ｍｌの混合溶液中、４℃で一夜、２時間室温（ＲＴ）で気密室内で結晶化した結晶化ヒトアルブミンを示す。
【図１２】図１２は結晶化ヒトアルブミンを示す。ｐＨ６．２の２．５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ；カプリル酸塩で飽和；ｈＳＡ４６．５ｍｇ／ｍｌの混合溶液中で、４℃で一夜結晶化した結晶化ヒトアルブミンを示す。
【図１３】図１３は、ｐＨ６．２の２．３Ｍリン酸Ｎａ−Ｋ；カプリル酸塩１．４ｍｇ／ｍｌ；ｈＳＡ８０ｍｇ／ｍｌの混合溶液中で、４℃で一夜、０時間室温（ＲＴ）で気密室内で結晶化した結晶化ヒトアルブミンを示す。
【図１４】図１４は、より多くの非晶質沈澱と共に本発明のアルブミン結晶を示す。典型的な結晶の大きさは約０．１×０．４ｍｍである。沈澱は時間の経過と共に消失し結晶性となる。結晶は０．０８％デカノール；０．０５Ｍリン酸Ｎａ−Ｋを含むｐＨ７．４の２．７Ｍ硫酸アンモニウム中で４℃で調製した。４℃で結晶化した。ｈＳＡ５８．７ｍｇ／ｍｌ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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