(57)【要約】本発明は、一般に、鬱病の治療および診断に関する。特に、本発明はポリペプチドならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンへの内分泌応答を媒介することにおいて中心的役割を果たすことが示されている。これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、鬱病の診断、処置および／もしくは予防において有用である。
2006516387.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質であって、配列番号：４６および配列番号：４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡである請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号：４５、配列番号：４７および配列番号：４９よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項４】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号：４５、配列番号：４７および配列番号：４９よりなる群から選択される核酸配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質であって、配列番号：４６および配列番号：４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが発現制御配列に操作可能に連結されている請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質であって、配列番号：４６および配列番号：４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を発現することができる宿主細胞。
【請求項９】
調節配列を含んでなるベクターでトランスフェクションした請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項６もしくは７に記載のベクターでトランスフェクションした請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
ａ）細胞を化合物の有無でＣＲＨと接触させること；
ｂ）該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定すること；および
ｃ）該化合物の有無で該タンパク質の量を比較すること；
を含んでなり、
ここで該副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択される、
細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法。
【請求項１２】
細胞がマウス下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系ＡｔＴ−２０のような真核細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合する抗体を用いて決定されている請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定されている請求項１１もしくは１２に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子転写のレベルが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価されている請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現のレベルがマイクロアレイ技術を用いて分析される請求項１４もしくは１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現のレベルが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの群をコードするポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて評価される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）細胞を試験化合物の有無で接触させること；ならびに
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを決定すること
を含んでなる細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法。
【請求項１９】
遺伝子の発現レベルが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて決定される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させること；ならびに
ｂ）該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法。
【請求項２１】
細胞が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列を有するタンパク質の群を発現する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＲＨ応答活性が、遺伝子レベルで転写の変化として評価されている請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＲＨ応答活性が、マイクロアレイ技術を用いて評価されている請求項２１もしくは２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのタンパク質を発現することができる宿主細胞である請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞が、調節配列を含んでなる少なくとも１つのベクターでトランスフェクションされている請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１つのベクターでトランスフェクションされている請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）個体の生物学的サンプルを得ること；および
ｂ）該生物学的サンプルにおける副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されている。）
を含んでなる個体におけるＣＲＨ誘発性鬱病を診断する方法。
【請求項２８】
生物学的サンプルが体液もしくは組織サンプルである請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合する抗体を用いて決定されている請求項２７もしくは２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定されている請求項２７もしくは２８に記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子転写のレベルが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価されている請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子転写のレベルがマイクロアレイ技術を用いて分析される請求項３０もしくは３１に記載の方法。
【請求項３３】
遺伝子転写のレベルが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの群をコードするポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
遺伝子転写のレベルが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて分析される請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、鬱病の治療および診断に関する。特に、本発明はポリペプチドならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモンへの細胞性応答を媒介することにおいて中心的役割を果たすことが示されている。これらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、鬱病の診断、処置および／もしくは予防において有用である。
【背景技術】
【０００２】
最近の社会経済分析により、鬱病は身体障害の主要原因且つ他の疾患の発症の主要危険因子であることが見出された。さらに、世界的規模で鬱病は過少診断され、そして過少治療されている。現在の抗鬱剤は有効であることが判明しているが、作用の遅い発現および副作用を抱える。この上に、どの薬理学的作用機序によりそれらがその臨床効果を及ぼすかはまだ明らかではない。鬱病のコルチコステロイド受容体仮説に基づく仮説駆動研究は、薬剤標的として脳神経ペプチド受容体、特に副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）受容体に焦点を当てる新しい概念をもたらしている。
【０００３】
４１アミノ酸ポリペプチドの副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）は、視床下部−下垂体−副腎系の調節において中心的役割を果たし、様々なストレス因子への内分泌応答を媒介する。視床下部ニューロンはストレスに応答してＣＲＨを下垂体門脈系に放出し、下垂体アドレノコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）の分泌および生合成を刺激し、増加した副腎グルココルチコイド生産をもたらす（非特許文献１）。いくつかの臨床および前臨床研究は、鬱病の発症におけるＣＲＨ系の改変の因果的役割の方に向かせる（非特許文献２）。ヒトにおけるＣＲＨでの最初の研究は、ＣＲＨへのＡＣＴＨ応答が鬱病患者において鈍化しており、常に増加した視床下部ＣＲＨ分泌に伴うＣＲＨ受容体脱感作を反映することを示した（非特許文献３；非特許文献４）。増加したＣＲＨ放出の結果としての鈍化したＡＣＴＨ応答の裏づけとして、鬱病にかかっている患者の脳脊髄液における上昇したＣＲＨレベルの結果がある。鬱状態におけるＣＲＨ分泌過多のこの概念を強化する他の結果は、鬱病を患った自殺犠牲者における増加したＣＲＨ分泌ニューロン数および減少したＣＲＨ受容体数である（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００４】
ＣＲＨには２つの高親和性受容体が記述されており（ＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２）、これらの両方ともいくつかのスプライスバリアント形態で存在する。ＣＲＨによるこれらの受容体の活性化は、アデニルシクラーゼのＧｓ媒介性刺激をもたらし、増加した細胞内ｃＡＭＰレベルを引き起こす。これはそれ自体がｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化し、そして最終的にｃＡＭＰおよびＣａ２＋の増加したサイトゾルレベルをもたらす。増加したｃＡＭＰおよびＣａ２＋レベルは、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣＡＭＫＩＩ）およびｐ４２／ｐ４４マイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）のようないくつかの他の追加のキナーゼの活性化をもたらす。結果としてＣａ２＋／ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）がリン酸化され、そしてこれは、今度は、プロモーター領域にｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を含有する遺伝子の転写を調節する。ＣＲＨシグナリングの調節に関与することが示されているそのような遺伝子の例には、ｃ−ｆｏｓ、マクロファージ遊走阻止因子遺伝子Ｍｉｆ、オーファン核受容体Ｎｕｒｒ７７およびＮｕｒｒ１が包含される。
【０００５】
ＣＲＨ活性化受容体の下流経路は、コルチコトロフの細胞モデルのＡｔＴ−２０細胞において詳細に研究されそしてシグナリングカスケードに関与する多数の遺伝子の同定をもたらしたことにもかかわらず、主要な領域は探究されていない。従って、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体活性化遺伝子ネットワークに関与するさらなる遺伝子を同定するために全ゲノムレベルでＣＲＨ刺激への転写応答を探究することは、本発明の目的であった。このようにして同定されるポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、スクリーニング技術による薬剤標的として薬剤開発の新しい機会を提供し、または鬱病の診断、予防および／もしくは処置において有用である。
【非特許文献１】Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ＥＢ  １９９５  Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０：７８９−８１９
【非特許文献２】Ｈｏｌｓｂｏｅｒ  Ｆ  ２００１  Ｓｔｒｅｓｓ，ｈｙｐｅｒｃｏｒｔｉｓｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ａｆｆｅｃｔ  Ｄｉｓｏｒｄ  ６２：７７−９１
【非特許文献３】Ｈｏｌｓｂｏｅｒ，Ｆ，Ｇｅｒｋｅｎ  Ａ，Ｓｔａｌｌａ  ＧＫ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＯＡ  １９８７  Ｂｌｕｎｔｅｄ  ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ＡＣＴＨ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｈｕｍａｎ  ＣＲＨ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｃｈｉａｔｒｙ  １４４：２２９−２３１
【非特許文献４】Ｈｏｌｓｂｏｅｒ  Ｆ，Ｇｅｒｋｅｎ  Ａ，ｖｏｎ  Ｂａｒｄｅｌｅｂｅｎ  Ｕ，Ｇｒｉｍｍ  Ｗ，Ｂｅｙｅｒ  Ｈ，Ｍｕｌｌｅｒ  ＯＡ，Ｓｔａｌｌａ  ＧＫ  １９８６  Ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｉｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２１：６０１−６１１
【非特許文献５】Ｎｅｍｅｒｏｆｆ  ＣＢ，Ｏｗｅｎｓ  ＭＪ，Ｂｉｓｓｅｔｔｅ  Ｇ，Ａｎｄｏｒｎ  ＡＣ，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｍ  １９８８  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｏｆ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｖｉｃｔｉｍｓ．Ａｒｃｈ  Ｇｅｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４５：５７７−５７９
【非特許文献６】Ｒａａｄｓｈｅｅｒ  ＦＣ，Ｈｏｏｇｅｎｄｉｊｋ  ＷＪ，Ｓｔａｍ  ＦＣ，Ｔｉｌｄｅｒｓ  ＦＪ，Ｓｗａａｂ  ＤＦ  １９９４  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ６０：４３６−４４４
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、全ゲノムレベルでのＣＲＨ刺激への転写応答に関与する多数の遺伝子の同定に関する。特に、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９およびその機能的アナログよりなる群から選択される配列を有する、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする多数のこれまで未知の遺伝子の同定に関する。
【０００７】
さらなる態様として、本発明はこれらの配列を含んでなるベクター、上記の配列の１つをコードするベクターを含有する宿主細胞ならびに本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターを含んでなるトランスジェニック非ヒト動物を包含する、上記のヌクレオチド配列の組み換え使用に関する。
【０００８】
ＣＲＨシグナリングとこれまで関連付けられていなかった、従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を調節する化合物を同定する方法においてもしくは個体におけるＣＲＨ誘発性鬱病を同定するための診断方法において有用である多数の遺伝子を提供することもまた本発明の目的である。１つの態様として、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法は、該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させることおよび配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含んでなる。このスクリーニング方法において、発現レベルは、典型的には上記のポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、好ましくはアレイ技術方法を用いて評価される。従って、特定の態様として、本発明は細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を調節する化合物を同定する方法を提供し、該方法は、該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９の核酸配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含んでなり、ここで、これらの配列の発現プロファイルの変化は、該細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物の指標となる。
［発明の詳細な記述］
本明細書において用いる場合、「化合物」もしくは「因子」という用語は、単純なもしくは複雑な有機分子、ペプチド、タンパク質もしくはオリゴヌクレオチドのような生物学的もしくは化学的化合物を意味する。「試験化合物」は、本明細書において用いる場合、該化合物がＣＲＨシグナリング活性を調節するかどうかを評価するために本発明の方法において使用する「化合物」もしくは「因子」をさす。
【０００９】
「ＣＲＨシグナリング」は、本明細書において用いる場合、該細胞におけるＣＲＨによる副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体の活性化の後の遺伝子転写の細胞性変化をさす。それは、ＣＲＨ特異的遺伝子発現プロファイルを誘導する。転写レベルでの変化は、タンパク質レベルでもしくは遺伝子、ＲＮＡレベルで評価することができる。
【００１０】
「ＣＲＨ応答活性」は、本明細書において用いる場合、一般に、ＣＲＨに該細胞をさらすことの結果としての検出可能な細胞パラメーターの変化をさす。検出可能な細胞パラメーターには、とりわけ、膜電位の変化、該細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節する酵素の酵素活性の変化、本発明のタンパク質の発現レベルの変化またはｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋もしくはＩＰ３のような二次メッセンジャーの量の変化が包含される。
【００１１】
「アナログ」もしくは「機能的アナログ」という用語は、該アナログがインビボおよび／もしくはインビトロで未改変のタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を保持するように少なくとも１個のアミノ酸置換が行われている本発明のタンパク質の改変形態をさす。
【００１２】
「機能的アナログ」という用語には、本発明のポリペプチドの「フラグメント」、「バリアント」、「縮重バリアント」、「アナログ」および「ホモログ」もしくは「化学的誘導体」が包含されるものとする。ポリペプチドの有用な化学的誘導体は当該技術分野において周知であり、そして例えば、二次的化学要素（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）によるポリペプチド内に含まれる反応性有機部位の共有結合修飾が包含される。周知の架橋試薬は、例えば、ビオチン、蛍光色素のようなアフィニティータグを導入するために、もしくはポリペプチドを固相表面に結合するために（例えばアフィニティー樹脂を作製するために）アミノ、カルボキシルもしくはアルデヒド残基に反応させるのに有用である。
【００１３】
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドのバリアント（１つもしくは複数）は、該用語を本明細書において用いる場合、それぞれ、基準ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドと異なるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドである。ポリヌクレオチドのバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントのような天然に存在するバリアントであることができ、もしくはそれは天然に存在することが知られていないバリアントであることができる。（１）ヌクレオチド配列が別の基準ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチド。一般に、差異は、基準およびバリアントのヌクレオチド配列が全体的に極めて類似しそして多くの領域において同一であるように限定される。下記のように、バリアントのヌクレオチド配列の変化は、サイレントであることができる。すなわち、それらはポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を改変しないことができる。改変がこのタイプのサイレント変化に限定される場合、バリアントは基準と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。また下記のように、バリアントのヌクレオチド配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変することもできる。そのようなヌクレオチド変化は、上記に説明するように、基準配列によりコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーションをもたらすことができる。（２）アミノ酸配列が別の基準ポリペプチドと異なるポリペプチド。一般に、差異は、基準およびバリアントの配列が全体的に極めて類似しそして多くの領域において同一であるように限定される。バリアントおよび基準ポリペプチドは、任意の組み合わせで存在することができる、１つもしくはそれ以上の置換、付加、欠失、融合およびトランケーションによりアミノ酸配列が異なることができる。
【００１４】
「相補的な」もしくは「相補性」という用語は、本明細書において用いる場合、二本鎖核酸分子を形成するように水素結合によって結合するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの能力をさす。以下の塩基対は、相補性の関係にある：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；およびアデニンとウラシル。本明細書において用いる場合、「相補的な」は、上記の関係が該分子の全長にわたって２つの１本鎖核酸分子を含んでなる実質的に全ての塩基対に当てはまることを意味する。「部分的に相補的な」は、分子の一方の一部が一本鎖のままであるように２つの１本鎖核酸分子の一方がもう一方より長さが短い場合の上記の関係をさす。
【００１５】
「保存的置換」もしくは「保存的アミノ酸置換」という用語は、ある種のアミノ酸の当該技術分野で認められている置換可能性に基づく親分子の生物学的活性に影響を与えない親タンパク質における１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換をさす（例えば、Ｍ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐ．３，ｐｇ  ３４５−３５２，１９７８を参照）。
【００１６】
「そのフラグメント」は、該フラグメントが親タンパク質もしくは核酸分子における連続する５個もしくはそれ以上のアミノ酸、または１０個もしくはそれ以上のヌクレオチドを含んでなるような、その配列が本明細書に開示されている核酸もしくはタンパク質分子のフラグメント、断片もしくはサブ領域をさす。
【００１７】
「機能性フラグメント」は、本明細書において用いる場合、本明細書に開示するタンパク質もしくは例えば受容体の活性部位のような機能的に異なった領域を含んでなるアミノ酸の配列の単離されたサブ領域もしくはフラグメントをさす。機能性フラグメントは、クローニング技術により、もしくは選択的スプライシングメカニズムの天然産物として製造することができる。
【００１８】
「ホモログ」もしくは「相同な」という用語は、異なる核酸分子もしくはアミノ酸配列間の関係を表し、ここで、該配列もしくは分子は、該分子もしくは配列内の１つもしくはそれ以上のブロックもしくは領域での部分的同一性もしくは類似性により関連している。「単離された核酸化合物」は、その天然の位置と位置的に異なる、いかに構築されもしくは合成されようとも（ｈｏｗｅｖｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｅｄ  ｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）、任意のＲＮＡもしくはＤＮＡ配列をさす。
【００１９】
「核酸プローブ」もしくは「プローブ」は、本明細書において用いる場合、別の核酸化合物とハイブリダイズする標識核酸化合物である。「核酸プローブ」は、一本鎖標的核酸配列とハイブリダイズする一本鎖核酸配列を意味する。核酸プローブは、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチドポリマーであることができる。「プローブ」は、通常、プローブの末端（１つもしくは複数）に結合しているかもしくはプローブの配列の内部にあることができる検出可能な部分を含有する。
【００２０】
「プライマー」という用語は、例えば核酸分子の酵素もしくは合成による伸長の開始基質として機能する核酸フラグメントである。
【００２１】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書において用いる場合、一本鎖核酸分子がヌクレオチド塩基対合によって相補鎖と結合するプロセスをさす。
【００２２】
「ストリンジェンシー」という用語は、ハイブリダイゼーション条件をさす。高いストリンジェンシー条件は、非相同的塩基対合を退ける。低いストリンジェンシー条件は、逆の効果を有する。ストリンジェンシーは、例えば、温度および塩濃度により改変することができる。「ストリンジェントな条件」は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性した剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液における４２℃で一晩のインキュベーション、続いて約６５℃で０．１ｘＳＳＣにおいてフィルターを洗浄することをさす。さらなる適当なハイブリダイゼーション条件は、実施例に記述されている。
【００２３】
「低いストリンジェンシー条件」には、６Ｘ  ＳＳＰＥ（２０Ｘ  ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％  ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含んでなる溶液における３７℃で一晩のインキュベーション；続いて５０℃で１Ｘ  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄が包含される。さらに、いっそう低いストリンジェンシーを得るために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に行う洗浄をさらに高い塩濃度（例えば５Ｘ  ＳＳＣ）で行うことができる。ここで留意すべきは、上記の条件のバリエーションが、ハイブリダイゼーション実験におけるバックグラウンドを抑えるために用いられる代わりのブロッキング試薬の包含および／もしくは代用によって実施できることである。典型的なブロッキング試薬には、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性したサケ精子ＤＮＡおよび市販されている専売配合物が包含される。特定のブロッキング試薬の包含は、適合性の問題のために、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００２４】
「融合タンパク質」という用語は、本明細書において用いる場合、ドメインもしくはリンカー領域の組み合わされた機能を得る目的のために複数のタンパク質ドメインもしくはリンカー領域を組み合わせることの結果であるタンパク質構築物をさす。これは、所望の融合タンパク質をコードする新しいポリヌクレオチド配列をもたらすためにそのようなドメインをコードするヌクレオチド配列の分子クローニングにより実施することができる。あるいはまた、融合タンパク質の作製は、２つのタンパク質を化学的に連結することにより実施することができる。
【００２５】
「リンカー領域」もしくは「リンカードメイン」という用語または同様のそのような記述用語は、本明細書において用いる場合、クローニングベクターもしくは融合タンパク質の構築において使用するポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列をさす。リンカー領域の機能には、ヌクレオチド配列へのクローニング部位の導入、２つのタンパク質ドメイン間のフレキシブル成分もしくはスペース作製領域の導入、または特異的分子相互作用のためのアフィニティータグの作製を包含することができる。リンカー領域は、ポリペプチドもしくはヌクレオチド配列構築中に行われる選択によりもたらされる融合タンパク質に導入することができる。
スクリーニング方法
本発明は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）誘発性鬱病およびストレスを調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。それは、ＣＲＨ活性化ＣＲＨ受容体の下流モジュレーターとしての多数の遺伝子の同定に基づく。特に、本発明は、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は；
ａ）該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；
ｂ）該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の転写レベルでの変化を決定すること；および
ｃ）該タンパク質の転写レベルを該化合物の有無で比較すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択される。）
を含んでなる。
【００２６】
転写の変化をタンパク質レベルで決定するために、当該技術分野で既知の技術を用いて該タンパク質の量を決定することができる。例えば、クーマシーもしくは銀染色のようなタンパク質染色技術と組み合わせて等電点電気泳動法もしくはＳＤＳ−ｐａｇｅのような分離技術を用いる。あるいはまた、酵素であるタンパク質では、既定溶液もしくは組織抽出物における量は、反応生成物へのその基質の転化である、酵素がもたらす触媒効果に関して測定するかもしくはアッセイすることができる。例えば、キナーゼでは、キナーゼ特異的リン酸化部位を含んでなる基質を用いてそして該基質への放射性ホスフェートの導入により基質のリン酸化を測定することによってキナーゼ活性を評価することができる。このアッセイは、試験する化合物の有無の両方で行うことができる。酵素ではないタンパク質では、他の定量方法が必要とされる。例えば、輸送タンパク質は、それらが輸送する分子へのそれらの結合により、そしてホルモンおよび毒素は、それらがもたらす生物学的効果により評価することができる。
【００２７】
転写の変化を遺伝子レベルで評価するために、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡを検出に直接用いることができ、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。好ましくは、該分析方法は、遺伝子の適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブの使用を含んでなる。
【００２８】
従って、好ましい態様として、遺伝子転写のレベルは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価される。
【００２９】
別の態様として、遺伝子発現の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術方法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる（例えば：Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６）を参照）。従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供することは本発明の目的であり、該方法は；該細胞を試験する化合物の有無でＣＲＨと接触させること；ならびに配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列を有するポリペプチドの群をコードするポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて遺伝子転写のレベルを決定することを含んでなる。
【００３０】
代わりの態様として、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法は；
ａ）該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；および
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドの発現レベルを決定すること
を含んでなる。
【００３１】
発現レベルの変化を評価するために、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡを検出に直接用いることができ、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。好ましくは、該分析方法は、ポリヌクレオチドの適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブの使用を含んでなる。従って、好ましい態様として、遺伝子転写のレベルは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９よりなる群から選択される核酸配列を含んでなるポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて評価される。
【００３２】
別の態様として、遺伝子発現の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。この態様として、本発明は、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は、該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；ならびに配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９の核酸配列を有するポリヌクレオチドの発現レベルを決定することを含んでなる。特に、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９の核酸配列を有するポリヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いる。
【００３３】
別の態様として、遺伝子発現の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる（例えば：Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６）を参照）。
【００３４】
ゲノムＤＮＡを直接使用しない場合には、ｍＲＮＡを単離し、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施することができる。２回目のＤＮＡ合成を第二鎖の生成のために実施することができる。次に、特異的ＰＣＲ増幅によって、単離されたｃＤＮＡを得ることができる。必要に応じて、二本鎖ｃＤＮＡを任意の適当なベクター、例えばプラスミドにクローン化し、それによりｃＤＮＡライブラリーを生成せしめることができる。上記と同様にして、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする遺伝子の任意の適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブでバクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが可能である。例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照。
【００３５】
原核もしくは真核細胞における増殖のためにプラスミドもしくはファージのような適当なベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者に周知である［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．上記を参照］。適当なクローニングベクターは周知であり、そして広く利用可能である。
【００３６】
さらなる態様として、遺伝子転写の変化はｍＲＮＡレベルで決定される。減少したもしくは増加した発現は、例えば；核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲによる）；ＲＮアーゼ保護；ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のような、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野において周知である方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。ホストから得られるサンプルにおける、本発明のポリペプチドのようなタンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが包含される。タンパク質誘導体もしくはバリアントの存在を決定するために用いることができるアッセイ技術は、とりわけ、質量分析法を含んでなる。
【００３７】
従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答を改変することができる化合物を同定する方法を提供することは本発明の目的であり、該方法は；
ａ）該細胞を該化合物の有無でＣＲＨと接触させること；
ｂ）該細胞における副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定すること；および
ｃ）該タンパク質の量を該化合物の有無で比較すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択される。）
を含んでなる。
【００３８】
好ましくは、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量をアッセイする方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに結合する抗体を用いている。
【００３９】
従って、別の態様として、本発明は、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質と免疫学的に反応する単一特異性抗体を提供し、該タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択される。本発明のポリペプチドに対して作製される抗体は、日常的プロトコルを用いて、該ポリペプチドもしくはエピトープ保有フラグメント、アナログまたはこれらを発現する細胞を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の製造には、連続細胞系培養により生産される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が包含される。
【００４０】
米国特許第４，９４６，７７８号に記述されているもののような、一本鎖抗体の製造のための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。また、ヒト化抗体を発現するためにトランスジェニックマウス、もしくは他の哺乳類を包含する他の生物を用いることもできる。
【００４１】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するためもしくは同定するためにまたはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために用いることができる。
【００４２】
本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、とりわけ、ＣＲＨ誘発性ストレスもしくは鬱病のようなＣＲＨ代謝関連疾患を処置するために用いることもできる。
【００４３】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量を決定するために、本発明の抗体は、通常の免疫学的技術において用いられる。適当な免疫学的技術は当業者に周知であり、そして例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析、競合的もしくはサンドイッチイムノアッセイなどが包含され、別に周知であるようにそれらは全て抗原−抗体免疫複合体の形成に依存し、ここで、アッセイの目的のために、抗体を例えば放射性、酵素もしくは蛍光標識で検出可能に標識することができ、または不溶性担体上に固定することができる。
【００４４】
例えば、ＥＬＩＳＡスクリーニングフォーマットでは、担体（ＢＳＡのような）に結合しているタンパク質もしくはそのペプチドフラグメントのいずれかでコーティングされている固相（例えばマイクロプレートの底）に該抗体を加え、そして次に、酵素、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくは１２５Ｉのような放射性同位体のような検出可能な標識と結合した抗免疫グロブリン抗体（例えば、免疫付与をマウスにおいて行う場合、抗マウス免疫グロブリン抗体を用いる、例えばヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Ｉｇ））を加える。
【００４５】
従って、サンプルにおけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の決定もしくは検出のためのイムノアッセイを提供することは本発明の目的であり、該方法は、サンプルを本発明のタンパク質に対する抗体と接触させることおよび抗体と該タンパク質との間で免疫複合体が形成されるかどうかを決定することを含んでなる。これらの方法は、組織サンプルもしくは体液サンプルで行うことができ、そして一般に、被験体の体からサンプルを得ること；検出可能に標識した本発明の抗体のイメージング有効量と該サンプルとを接触させること；およびサンプルにおけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の存在を明らかにするために標識を検出することを含んでなる。
【００４６】
本発明の抗体を用いる測定方法は、特に限定されない。測定する抗原の量に対応する抗体、抗原もしくは抗原−抗体複合体の量が、化学的もしくは物理的手段により検出され、そして既知の量の抗原を含有する標準溶液の使用により作製される標準曲線から計算される限り、任意の測定方法を用いることができる。例えば、比濁法、競合法、免疫測定法およびサンドイッチ法を適切に用いる。感度および特異性に関して、下記のサンドイッチ法を用いることが特に好ましい。
【００４７】
ラベリング物質を用いる測定方法では、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質などをラベリング因子として用いる。放射性同位体の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃが包含される。酵素は、通常、次に検出可能な反応を触媒する適切な基質の結合により検出可能にする。その例には、例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼが包含される。発光物質には、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリンおよびルシフェラーゼが包含される。さらに、アビジン−ビオチン系もまた、本発明の抗体および免疫原を標識するために用いることができる。
【００４８】
従って、さらなる態様として、本発明は：
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞を試験化合物と接触させること；および
ｂ）該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変する化合物を同定しそして得る方法を提供する。
【００４９】
膜電位の変化は、通常の電気生理学的技術を用いて、そして利用可能になる場合には、現在開発中の新規な高速大量処理方法を用いて測定することができる。膜電位の変化は、通常、イオン流動の結果であるので、代わりの方法として、膜電位の変化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを包含する供給業者からのｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、ｆｌｕｏ−５Ｎ、ｆｕｒａ  ｒｅｄ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＢＦＩおよび他の同様のプローブを包含するイオン感受性蛍光色素を用いて細胞内イオン濃度の変化によって間接的に測定することができる。ＤＩＢＡＣ４（３）もしくはＤｉ−４−Ａｎｅｐｐｓ他のような、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓを包含する供給業者からの他の蛍光色素は、膜電位変化を検出することができる。例えば、カルシウムおよびナトリウムイオン流動は、画像解析アルゴリズムと組み合わせたレーザー共焦点法の有無で、蛍光顕微鏡検査を包含する、蛍光光度法および蛍光イメージング技術を用いて、このようにしてリアルタイムで特性化することができる。
【００５０】
好ましい態様として、このアッセイは、蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（（ＦＬＩＰＲ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる装置に基づく。その最も一般的な形態において、それはフルオレセインに基づく色素により出される蛍光を励起しそして測定する。それは、フルオロフォアの４８８ｎｍでの高出力励起をもたらすためのアルゴンイオンレーザー、９６〜３８４ウェルプレートの底一面を迅速に走査するための光学系および出された蛍光を捕獲するための高感度の冷却したＣＣＤカメラを使用する。それはまた、装置が９６／３８４ウェルプレートのウェルに試験因子の溶液を送達することを可能にする９６／３８４ウェルピペッティングヘッドも含有する。ＦＬＩＰＲアッセイは、全ての９６／３８４ウェルから同時に、リアルタイムで、化合物の添加の前に、間にそして後に細胞の集団からの蛍光シグナルを測定するように設計される。
【００５１】
従って、細胞におけるＣＲＨ応答を調節することにおいて機能的に活性がある化合物をスクリーニングしそして特性化するために用いるＦＬＩＰＲアッセイを提供することは本発明の目的であり、該細胞は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４よりなる群から選択されるタンパク質を発現する。
【００５２】
代わりの態様として、細胞の活性は、電気生理学的方法を用いて評価することができる。従って、細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質は、全細胞および単一チャンネル電気生理学を用いて特性化することができる。
【００５３】
従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供することは本発明のさらなる目的であり、該方法は；
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるタンパク質を発現する宿主細胞を試験する化合物と接触させること；
（ｂ）電気生理学的技術を用いて該細胞の膜電位への試験化合物の影響を測定すること；および
（ｃ）該細胞のＣＲＨ応答活性を該化合物の有無で比較すること
を含んでなる。あるいはまた、上記のスクリーニング方法における宿主細胞は、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４よりなる群から選択されるタンパク質を発現する。
【００５４】
好ましい態様として、宿主細胞はゼノパス卵母細胞であり、そして電気生理学的測定は、別個の膜電位で電圧固定技術を用いて膜電流を測定することからなる。
【００５５】
該細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節する酵素の酵素活性の変化は、一般に、反応生成物へのその基質の転化である、酵素がもたらす触媒効果に関して測定するかもしくはアッセイすることができる。例えば、キナーゼでは、キナーゼ特異的リン酸化部位を含んでなる基質を用いてそして該基質のリン酸化を測定することによりキナーゼ活性を評価することができる。同様にホスファターゼでは、リン酸化基質を用いてそして該基質の脱リン酸化を測定することによりホスファターゼ活性を評価することができる。これらのアッセイは、試験する化合物の有無の両方で行うことができる。
【００５６】
従って、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法を提供することは本発明の目的であり、該方法は；
ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８よりなる群から選択されるキナーゼを含んでなる混合物をホスフェート源および適当なキナーゼ基質と接触させること；
ｂ）該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることおよび；該試験化合物のない場合の該基質のリン酸化のレベルと比較して該化合物の存在下での該基質のリン酸化のレベルを測定すること
を含んでなる。
【００５７】
本発明のアッセイにおいて、キナーゼはタンパク質として提供することができ、もしくは該キナーゼをコードするｍＲＮＡとしてアッセイ混合物において提供することができる。アッセイが無細胞成分を含んでなる場合、キナーゼはタンパク質として提供される。アッセイが細胞の環境において行われる場合、キナーゼはタンパク質としてもしくは該キナーゼをコードするｍＲＮＡとして提供することができ、ここで、キナーゼがアッセイにおいて利用可能であるように、該ｍＲＮＡは翻訳され、そしてそれによりキナーゼタンパク質が生産される。キナーゼを特定するｍＲＮＡを得、そして該ｍＲＮＡをキナーゼタンパク質の生産のために細胞に注入するのが簡単な事であるのは、本明細書に提供する実施例から明らかである。キナーゼはまた、キナーゼタンパク質をコードするプラスミドの発現により提供することもできる。キナーゼタンパク質をコードする操作可能なプラスミドを構築するためにそして該プラスミドを細胞において発現するために標準的な分子生物学技術を用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００５８】
本明細書に説明するように、キナーゼモジュレーターを同定する方法は、アッセイ混合物が無細胞である場合のインビトロで、生細胞をアッセイに含む場合のインビトロで、もしくは動物においてインビボで行うことができる。従って、本発明の１つの態様として、混合物は真核細胞内に含まれ、そして本発明の方法を行うことができ、ここで、アッセイ混合物の成分のいくつかは、その中に成分の微量注入によって細胞に外因的に提供することができ、そして成分のいくつかは細胞において内在性であることができる。
【００５９】
「細胞において内在性である」という用語は、本明細書において用いる場合、該成分が対象細胞において生来生産されることを意味する。
【００６０】
「細胞に外因性である」という用語は、本明細書において用いる場合、該成分が対象細胞に生来存在しないか、もしくは低レベルでその中に存在し、そしてそこに加えられることを意味する。
【００６１】
本発明の方法が真核細胞を用いて行われる場合、１つもしくはそれ以上のキナーゼタンパク質、キナーゼ基質および試験化合物をインキュベーションの前に真核細胞に注入することができる。次に、そのように注入した細胞をプロテインキナーゼ活性を促進する条件下でインキュベーションし、そして次に、本明細書に記述するアッセイを用いてインキュベーション期間の後にプロテインキナーゼ活性のレベルを測定する。
【００６２】
本発明の方法において有用な真核細胞は、ゼノパス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、ゼノパス・レービス胚細胞、哺乳類細胞（ＩＯＴＩ／２細胞のような）、ドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｓ２細胞、ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）細胞および酵母細胞のいずれか１つであることができる。さらにより好ましくは、真核細胞はマウス下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系細胞ＡｔＴ−２０である。
【００６３】
本発明の方法に使用するホスフェート源は、ＡＴＰもしくはＧＴＰのようなしかしこれらに限定されるものではないヌクレオチド３リン酸が包含されるがこれらに限定されるものではない任意の一般的なホスフェート源であることができる。好ましい態様として、ホスフェート源は、その上に検出可能な標識を結合しており、この標識は、反応中にキナーゼ基質にリン酸基とともに導入される。このように、リン酸化基質は検出可能な標識を含有し、一方、非リン酸化基質は標識を含有しない点においてリン酸化キナーゼ基質を非リン酸化キナーゼ基質と区別することができる。別の態様として、ホスフェート源は、その上に検出可能な標識を結合しておらず；その代わりに、リン酸化キナーゼ基質は、例えば、抗体により、基質の一方の形態を認識するが、もう一方を認識しないことにより、非リン酸化キナーゼ基質と区別することができる。
【００６４】
本発明の方法において有用な検出可能な標識には、プロテインキナーゼ活性の結果としてキナーゼ基質にそれへのリン酸基の導入の際に導入される任意の既知のもしくはこれまで知られていない検出可能な標識を包含することができる。
【００６５】
有用な標識には、γ３２Ｐ、３１Ｓのような放射性標識、およびビオチンなどのような非放射性標識が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
別の態様として、本発明は、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法を提供し、該方法は；
ａ）配列番号３６および配列番号３８よりなる群から選択されるホスファターゼおよび適当なリン酸化基質を含んでなる混合物を接触させること；
ｂ）該混合物を該化合物の有無でインキュベーションすることおよび；該試験化合物のない場合の該基質のリン酸化のレベルと比較して該化合物の存在下での該基質のリン酸化のレベルを測定すること
を含んでなる。
【００６７】
キナーゼアッセイでのように、本発明のアッセイにおけるホスファターゼはタンパク質として提供することができ、もしくは該ホスファターゼをコードするｍＲＮＡとしてアッセイ混合物において提供することができる。リン酸化基質は、典型的に、検出可能なリン酸残基で標識される。有用な標識には、γ３２Ｐ、３１Ｓのような放射性標識、およびビオチンなどのような非放射性標識が包含されるがこれらに限定されるものではない。ホスファターゼ活性アッセイにおける使用には、基質は、好ましくは、典型的にはγ３２Ｐで標識される、チロシンもしくはセリン残基でリン酸化される、ペプチド基質からなる。一般に、リン酸化は様々な方法で実施することができる。典型的には、プロテインチロシンキナーゼを用いる。例えば、３２Ｐで標識したＡＴＰと組み合わせた可溶性ＥＧＦ受容体キナーゼを本発明のペプチド上のチロシン残基をリン酸化するために用いることができる。そのようなリン酸化反応は、典型的に、３０℃で約２時間もしくは室温で一晩にわたって進行させる。次に、以下に「ホスホペプチド」と称するリン酸化ペプチドをリン酸化反応混合物から精製する。例えば、ペプチドは、トリクロロ酢酸の添加および遠心分離により反応混合物から分離することができ、ここで、ペプチドは上清に残る。ペプチドは、一般に、カラムクロマトグラフィーにより、例えばＣ１８上でさらに精製される。精製されたリン酸化ペプチドを凍結乾燥し、そして使用前に−２０℃で保存することができる。
【００６８】
インキュベーション後に、脱リン酸化されないホスホペプチド（「非脱リン酸化ホスホペプチド」）をホスホペプチドの脱リン酸化により遊離される放射活性から（すなわち、脱リン酸化により遊離される遊離の放射性リンから）分離する。本明細書において用いる場合、「放射性リン」という用語には、放射性リン原子がチロシン残基上に存在しそして脱リン酸化により取り除かれることができる（例えばリン酸基として）全ての形態が包含される。典型的に、ホスホペプチドの脱リン酸化により遊離される遊離の放射性リンからの非脱リン酸化ホスホペプチドの分離は、非放射性ホスフェートおよび木炭を含む物質の添加による脱リン酸化反応の停止後に、遠心分離によりもたらされる。上清における放射活性は、当業者に周知である手段により決定される。ホスホペプチドによって最初にアッセイ混合物に加えられた放射活性の量および脱リン酸化により遊離される放射活性としてアッセイの最後に検出される放射活性の量に基づいて、アッセイするサンプルのホスファターゼ酵素活性を計算することができる。
【００６９】
また、細胞におけるＣＲＨシグナリング応答活性を改変することができる化合物を同定する方法を提供することも本発明の態様であり、該方法は；
ａ）配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞を該試験化合物と接触させること；および
ｂ）該化合物の有無で、該細胞におけるｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ２＋もしくはＩＰ３のような二次メッセンジャーのレベルを比較すること
をふくんでなる。
【００７０】
二次メッセンジャーのレベルは、上記のタンパク質の１つを含んでなる全細胞もしくは細胞抽出物のいずれかにおいて当該技術分野で既知の技術を用いて決定することができる。
【００７１】
細胞におけるＣＲＨシグナリングを改変することができる化合物を同定するさらなる方法は、遺伝子プロモーターもしくは調節配列要素が転写因子結合部位を含んでなることを特徴とする遺伝子プロモーターもしくはその調節配列要素に操作可能に連結された、レポーター遺伝子のような、遺伝子の使用に基づき、ここで、該転写因子は細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節することができる。好ましい態様として、細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節することができる転写因子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８から選択されている。従って、本発明は、上記に定義するような遺伝子プロモーター領域を含んでなる組み換えＤＮＡ分子を提供する。該組み換えＤＮＡ分子において、プロモーター領域は、レポーター遺伝子のような、検出可能な生成物をコードする核酸分子に操作可能に連結することができる。「操作可能に連結される」という用語は、本明細書において用いる場合、プロモーターの制御下で遺伝子を発現するために適切なフレームで遺伝子とプロモーターとを機能的に融合させることを意味する。本明細書において用いる場合、「レポーター遺伝子」という用語は、簡単な安価な方法もしくは試薬を用いて同定することができそしてプロモーター領域もしくはその活性フラグメントに操作可能に連結することができる遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。例えば、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を本発明のスクリーニングアッセイにおいて転写活性を決定するために用いることができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１８５，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照；また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，上記も参照）。好ましい態様として、レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼ遺伝子である。本発明はまた、上記に定義するような組み換えＤＮＡ分子を含んでなるベクター、ならびにそのようなベクターでもしくは一般に本発明の組み換えＤＮＡ分子で安定に形質転換した宿主細胞も提供する。「ベクター」という用語は、宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製および／もしくは適切な発現のために宿主細胞にＤＮＡを導入するのに有用な外因性ＤＮＡの任意のキャリアをさす。従って、特定の態様として、該ベクターは、ｐＧＬ３ｌｕｃ、ｐＢＬＣＡＴ５（ＬＭＢＰ２４５１）、ｐＧＭＣＳＦｌａｃＺ（ＬＭＢＰ２９７９）、ｐＥＧＦＰもしくはｐＳＥＡＰｂａｓｉｃ（ＤＭＢ３１１５）のような発現ベクターであり、ここで、ＬＭＢＰおよびＤＭＢ番号は、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓでのこれらの発現ベクターの受託番号をさす。
【００７２】
別の態様として、本発明は、ＣＲＨシグナリング活性を調節する化合物の同定の方法を提供し、該方法は：（ｉ）上記に定義するような遺伝子プロモーター領域と候補因子とを接触させる段階；および（ｉｉ）該候補因子が、検出可能な生成物の発現を調節するかどうかを決定する段階（そのような調節は、ＣＲＨシグナリング活性を調節することができる因子の指標である）を含んでなる。検出可能な生成物は、遺伝子によりコードされるタンパク質またはルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子の生成物のいずれかをさす。検出可能な生成物を定量する方法は、当該技術分野において一般に既知であり、そしてとりわけ、発現生成物が酵素である場合には比色定量基質の使用、ＲＩＡもしくはＥＬＩＳＡアッセイにおける特異的抗体の使用またはプロモーターに操作可能に連結された遺伝子から転写されるｍＲＮＡのレベルの測定（ここで、該ｍＲＮＡは標準的な方法を用いて直接的にもしくは間接的に測定することができる）が包含される。好ましくは、遺伝子プロモーターは、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８よりなる群から選択される転写因子の転写因子結合部位を含んでなる。
ＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードする核酸配列の同定
別の態様として、本発明は、ＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードする単離されそして精製された核酸分子に関し、ここで、該核酸分子はＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかである。
【００７３】
特に、本発明には：
（ａ）配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに少なくとも７０％の同一性を有するＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸分子；
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的な核酸分子；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドの少なくとも１５個の連続塩基を含んでなる核酸分子；
（ｄ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して遺伝暗号の結果として縮重しているヌクレオチド配列を含んでなるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸分子
よりなる群から選択されるメンバーを含んでなる単離されそして精製された核酸分子が包含される。
【００７４】
遺伝暗号の縮重のために、コードされるアミノ酸（１つもしくは複数）もしくはタンパク質生成物の同一性を改変せずに配列番号：４５、配列番号：４７もしくは配列番号：４９として同定される配列にヌクレオチド塩基対の多数の「サイレント」置換を導入できることを当業者は認識する。全てのそのような置換は、本発明の範囲内であるものとする。
【００７５】
さらなる態様として、本発明は、ヒトプリンパーミアーゼポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドには、配列番号：４６および配列番号：４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、該アミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドが包含される。この関連において、少なくとも９７％の同一性を有するポリペプチドは非常に好ましく、一方、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものはさらに非常に好ましく、そして少なくとも９９％の同一性を有するものは最も非常に好ましい。そのようなポリヌクレオチドには、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９から選択されるポリヌクレオチド配列から本質的になるポリヌクレオチドが包含される。
【００７６】
従って、さらなる態様として、本発明は：
ａ）配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、該ポリヌクレオチドの全長にわたって、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して、該ポリヌクレオチドの全コーディング領域にわたって、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号４５、配列番号４７および配列番号４９よりなる群から選択されるポリヌクレオチドからなるヌクレオチド配列
を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００７７】
上記に概説するようなポリヌクレオチドは、特に、本発明のスクリーニング方法もしくは診断方法における使用のために提供される（特に、細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節することができる（化合物を）同定するためにもしくは個体における改変されたＣＲＨ代謝を診断するために）。
【００７８】
同一性もしくは類似性は、当該技術分野において既知であるように、配列を比較することにより決定されるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によっては、そのような配列のストリング間のマッチにより決定されるような、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。同一性および類似性は両方とも容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。２つのポリヌクレオチドもしくは２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定する多数の方法があるが、両方の用語は当業者に周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３）。配列間の同一性もしくは類似性を決定するために一般に用いられる方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，（１９８８）ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８，１０７３に開示されているものが包含されるが、これらに限定されるものではない。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大のマッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムにおいて体系化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）、３８７）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）が包含されるが、これらに限定されるものでは��い。
【００７９】
ＣＲＨ活性を調節することができるタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする核酸配列は、脳、心臓、腎臓、膵臓、肝臓および皮膚のようなしかしこれらに限定されるものではない、該遺伝子が発現される組織から単離することができる。該配列はまた、ヒトおよびマウス以外の哺乳類から単離することもできる。他の細胞および細胞系もまた、哺乳類プリンパーミアーゼｃＤＮＡを単離するために使用するのに適当であることができる。適当な細胞の選択は、本明細書に記述するように、細胞抽出物においてもしくは全細胞アッセイにおいてＣＲＨ調節活性をスクリーニングすることにより行うことができる。これらのアッセイのいずれか１つにおいてＣＲＨ調節活性を保有する細胞は、プリンパーミアーゼＤＮＡもしくはｍＲＮＡの単離に適当であることができる。
【００８０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを分子クローニングするために当該技術分野において既知である様々な方法のいずれかを用いることができる。１つの方法として、ｍＲＮＡを単離し、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成を実施する。２回目のＤＮＡ合成を第二鎖の生成のために実施することができる。次に、ＣＲＨシグナリングを調節する精製されたタンパク質のアミノ酸配列からの縮重オリゴヌクレオチドプライマーの設計によるＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅によって、単離されたｃＤＮＡを得ることができる。必要に応じて、二本鎖ｃＤＮＡを任意の適当なベクター、例えばプラスミドにクローン化し、それによりｃＤＮＡライブラリーを生成せしめることができる。別の方法は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９の任意の適当な領域を標的とする標識オリゴヌクレオチドプローブでバクテリオファージもしくはプラスミドシャトルベクターにおいて構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照。
【００８１】
原核もしくは真核細胞における増殖のためにプラスミドもしくはファージのような適当なベクターにおいてｃＤＮＡライブラリーを構築する方法は、当業者に周知である［例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．上記を参照］。適当なクローニングベクターは周知であり、そして広く利用可能である。
【００８２】
他のタイプのライブラリー、ならびに他の細胞もしくは細胞タイプから構築されるライブラリーが、本発明の核酸配列を単離するために有用であり得ることは当業者に容易に明らかである。他のタイプのライブラリーには、他の細胞由来の、ヒトおよびマウス以外の生物由来のｃＤＮＡライブラリー、ならびにＹＡＣ（酵母人工染色体）およびコスミドライブラリーを含むゲノムＤＮＡライブラリーが包含されるが、これらに限定されるものではない。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当該技術分野において周知である標準的な技術により行うことができる。周知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．Ｃｈａｐ．１４（１９８９）に見出すことができる。
【００８３】
多くの場合において、単離されたｃＤＮＡ配列は、ポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡの５’末端で足りない点において、不完全であることを当業者は認識する。これは、第一鎖ｃＤＮＡ合成中にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完成することができない、本質的に低い「伸長性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）」（重合反応中に鋳型に結合したままである酵素の能力の尺度）を有する酵素である逆転写酵素の結果である。
【００８４】
全長のｃＤＮＡを得るか、もしくは短いｃＤＮＡを伸長するための利用可能なそして当業者に周知であるいくつかの方法、例えば、ｃＤＮＡ末端の急速増幅法（ＲＡＣＥ）（Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，８９９８−９００２）、もしくはＭａｒａｔｈｏｎＴＭ技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）により例示される、この技術の最近の改変に基づくものがある。
【００８５】
上記の方法により本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化するためには、該核酸配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が必要であり得る。これを実施するために、本発明のタンパク質を精製し、そして部分アミノ酸配列を自動シークエネーターにより決定することができる。全アミノ酸配列を決定する必要はないが、タンパク質からの６〜８アミノ酸の２つの領域の直鎖状配列を部分ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用のプライマーの製造のために決定する。
【００８６】
いったん適当なアミノ酸配列が同定されると、それらをコードすることができるＤＮＡ配列を合成する。遺伝暗号は縮重しているので、特定のアミノ酸をコードするために１個より多くのコドンを用いることができ、従って、アミノ酸配列は１組の同様のＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによりコードすることができる。該組の１つのメンバーのみが本発明のポリヌクレオチド配列と同一であり、そしてミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でさえ、所望のタンパク質をコードするＤＮＡにハイブリダイズすることができる。これらの方法により単離されるＤＮＡは、様々な細胞タイプからの、無脊椎動物および脊椎動物起源からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、そして相同遺伝子を単離するために用いることができる。
ポリペプチド
さらなる態様として、本発明は、ＣＲＨシグナリングを調節する実質的に純粋な形態のポリペプチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、本発明の単離されそして精製された核酸分子によりコードされる。好ましい態様として、ポリペプチドは、配列番号４６、配列番号４８およびその機能的アナログよりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８７】
本発明のタンパク質は、本発明の核酸によりコードされる、該分子によりコードされるポリペプチドを包含しそして保存的アミノ酸変化を有する、全ての可能なアミノ酸バリアントを含む。
【００８８】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質は、例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅もしくはデノボＤＮＡ合成を包含する複数の組み換えＤＮＡ技術により得ることができることを当業者は認識する（例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．Ｃｈａｐ．１４（１９８９）を参照）。
【００８９】
ＣＲＨシグナリングを調節する精製された生物学的活性タンパク質は、いくつかの異なる物理的形態を有することができる。本発明のポリペプチドは、全長の新生のもしくはプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。全長の新生ポリペプチドは、とりわけ、全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特異的タンパク質分解切断事象により、翻訳後に修飾されることができる。フラグメント、もしくは複数のフラグメントの物理的会合は、本発明のタンパク質と関連する完全な生物学的活性を有することができ；しかしながら、ＣＲＨ調節活性の程度は、個々のフラグメント間で異なり得る。
【００９０】
また、本発明のこの態様において好ましいのは、ポリペプチドの構造もしくは機能特性を特徴とするフラグメントである。この点において本発明の好ましい態様には、本発明のポリペプチドのαヘリックスおよびαヘリックス形成領域、βシートおよびβシート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、高抗原性指数（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）領域を含んでなるフラグメントおよびそのようなフラグメントの組み合わせが包含される。好ましい領域は、本発明のポリペプチドの活性を媒介するものである。この点において最も非常に好ましいのは、同様の活性もしくは向上した活性を有するか、または減少した望ましくない活性を有するものを包含する、本発明の応答調節因子ポリペプチドの化学的、生物学的もしくは他の活性を有するフラグメントである。
ＣＲＨ活性を調節するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの組み換え発現
別の態様として、本発明のポリヌクレオチドは、適当なプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含有する発現ベクターへの分子クローニングにより組み換え的に発現し、そしてＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質を製造するために原核もしくは真核宿主細胞に導入することができる。そのような操作の技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，上記に十分に記述されており、そして当該技術分野において周知である。
【００９１】
従って、さらなる態様として、本発明は、組み換え宿主におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現のための発現ベクターを提供し、ここで、該ベクターは、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸配列およびその機能的アナログを含有する。本発明のさらに好ましい態様として、この発現ベクターは、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９およびその機能的アナログよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸分子を含有するか、もしくはＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードするゲノムＤＮＡを含有する。
【００９２】
発現ベクターは、適切な宿主における遺伝子のクローン化コピーの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要とされるＤＮＡ配列と本明細書において定義する。そのようなベクターは、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を包含する細菌、シアノバクテリア、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、酵母細胞を包含する真菌細胞、および動物細胞のような様々な宿主において真核生物遺伝子を発現するために用いることができる。
【００９３】
特に設計されたベクターは、細菌−酵母もしくは細菌−動物細胞もしくは細菌−真菌細胞もしくは細菌−無脊椎動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは：宿主細胞における自律複製のための複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の潜在能力、および活性プロモーターを含有することができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合しそしてＲＮＡ合成を開始するように導くＤＮＡ配列と定義する。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特に設計されたプラスミドもしくはウイルスを包含することができるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする、本発明の単離されそして精製された核酸分子は、組み換え宿主細胞における発現のために発現ベクターにクローン化することができる。組み換え宿主細胞は、エシェリキア・コリのような細菌、酵母のような真菌細胞、ゼノパス卵母細胞のような両生類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系が包含されるがこれらに限定されるものではない哺乳類細胞、ならびにドロソフィラおよびカイコ由来の細胞系が包含されるがこれらに限定されるものではない昆虫細胞が包含されるがこれらに限定されるものではない、原核生物もしくは真核生物のものであることができる。適当であることができそして市販されている哺乳類種由来の細胞系には、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ細胞、神経芽細胞腫、グリア細胞およびＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）が包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
従って、さらなる態様として、本発明はＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする組み換え的にクローン化された核酸分子もしくはその機能的アナログを含有する組み換え宿主細胞に関する。さらなる態様として、本発明の組み換え宿主細胞は、ゲノムＤＮＡであるかもしくは（配列番号：４５）；（配列番号：４７）；（配列番号：４９）；およびその機能的アナログよりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸分子を含有する。
【００９６】
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクションおよび電気穿孔が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の技術のいずれか１つによって宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含有する細胞をクローン的に増やし、そしてそれらがＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質を生産するかどうかを決定するために分析する。パーミアーゼを発現する宿主細胞クローンの同定は、本発明のポリペプチドに対する抗体との免疫学的反応性および宿主細胞に関連する哺乳類プリンパーミアーゼ活性の存在が包含されるがこれらに限定されるものではない、いくつかの手段により行うことができる。
【００９７】
従って、本発明はまた、本明細書に概説するような発現ベクターからのＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含んでなる、組み換え宿主細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現の方法にも関する。本発明のタンパク質は、直接発現により、または自己、酵素的もしくは化学的切断により取り除くことができる別のタンパク質もしくはペプチドとの翻訳融合物として興味のあるタンパク質を含んでなる融合タンパク質として合成することができる。従って、特定の態様として、本発明は、該ポリペプチドが融合タンパク質の一部である本発明のタンパク質を提供する。
【００９８】
融合タンパク質としての発現は、寿命を延長し、所望のペプチドの収量を増加し、もしくは該タンパク質を精製する都合のよい手段を提供することが、組み換え系におけるある種のペプチドの製造においてしばしば認められる。これは、原核生物宿主において哺乳類タンパク質を発現する場合に特に該当する。特定の部位でポリペプチドを切断するか（例えば、エンテロキナーゼおよびトロンビン）、またはペプチドをペプチド鎖のアミノもしくはカルボキシ末端から消化する（例えば、ジアミノペプチダーゼ）様々なペプチダーゼが既知である。さらに、特定の化学物質（例えば、臭化シアン）は、ポリペプチド鎖を特定の部位で切断する。部位特異的内部切断部位を導入するためにアミノ酸配列（および組み換え手段を用いる場合には合成もしくは半合成のコーディング配列）に必要な改変を当業者は認識する。例えば、Ｐ．Ｃａｒｔｅｒ，“Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９０）を参照。
【００９９】
さらに、例えば、上記のようなＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする核酸分子をそのゲノムにすでに含んでなるが、それを発現しないかもしくは例えば弱いプロモーターのために適切に発現しない哺乳類細胞を用い、そしてその発現を誘導するために該哺乳類細胞に該プリンパーミアーゼポリペプチドをコードする内在性核酸分子のすぐ近くに強力なプロモーターのような調節配列を導入することができる。
【０１００】
異種の転写および／もしくは調節配列もしくはタンパク質の制御下のＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組み換え宿主細胞はそのようなものとして、本発明の別の態様である。
【０１０１】
これに関連して、「調節配列」という用語は、ＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子のすぐ近くでの細胞のゲノムへのその組込みのために、プリンパーミアーゼポリペプチドの発現を増加するために用いることができる核酸分子を意味する。そのような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、不活性化サイレンサーイントロン配列、３’ＵＴＲおよび／もしくは５’ＵＴＲコーディング領域、タンパク質および／もしくはＲＮＡ安定化要素、ＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導するかもしくは引き起こすことができる調節タンパク質、例えば転写因子をコードする核酸分子または遺伝子発現を活性化しそして／もしくは遺伝子産物の量を増加することが既知である他の遺伝子発現制御要素を含んでなる。該調節配列の導入は、ＣＲＨシグナリングを調節するポリペプチドの発現の増加および／もしくは誘導を引き起こし、細胞における該ポリペプチドの増加した量の結果をもたらす。従って、本発明は、ＣＲＨシグナリングを調節するポリペプチドのデノボおよび／もしくは増加した発現を提供することを目的とする。
【０１０２】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、カチオン性脂質により媒介されるトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染もしくは他の方法によりもたらすことができる。そのような方法は、Ｄａｖｉｓ，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）のような多数の標準的な実験室マニュアルに記述されている。特に、ＣＲＨシグナリングを調節するポリペプチドは、実際には、組み換えベクターを欠く宿主細胞により発現することができると考えられる。
【０１０３】
さらに、本発明のポリヌクレオチドの発現はまた、インビトロで製造された合成ｍＲＮＡを用いて行うこともできる。合成ｍＲＮＡもしくはＣＲＨシグナリングを調節することができる細胞から単離されたｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物が包含されるがこれらに限定されるものではない様々な無細胞系において効率よく翻訳することができ、同様にカエル卵母細胞への微量注入が包含されるがこれに限定されるものではない細胞に基づく系において効率よく翻訳することができ、カエル卵母細胞への微量注入が一般に好ましい。
トランスジェニック非ヒト動物
本発明はまた、生殖細胞、胚細胞、幹細胞もしくは卵またはそれら由来の細胞への本発明のポリヌクレオチドもしくはベクターの導入を含んでなる、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはトランスジェニックマウスの製造の方法にも関する。非ヒト動物は、本明細書に記述する本発明のスクリーニング方法に従って用いることができ、そして非トランスジェニックの健康な動物であることができ、またはリン酸摂取もしくは再吸収障害、好ましくはＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質における少なくとも１つの突然変異に起因する障害を有することができる。そのようなトランスジェニック動物は、例えば、上記のポリペプチドの突然変異体型と関連して薬剤の薬理学的研究によく適している。トランスジェニック胚の製造およびそれらのスクリーニングは、例えば、Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより記述されているように行うことができる。胚の胚膜のＤＮＡは、例えば、適切なプローブでのサザンブロットを用いて分析することができる；上記参照。
【０１０４】
好ましくは、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、対応する哺乳類ＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つの不活性化された野生型対立遺伝子をさらに含んでなる；上記参照。この態様は、例えば、ＣＲＨ代謝の障害と関連する疾患の臨床症状の発現に関する本発明のポリペプチドの様々な突然変異体型の相互作用の研究を可能にする。トランスジェニック動物に関して以上に説明されている全ての適用は、２つ、３つもしくはそれ以上の導入遺伝子（例えば中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）をコードする）を保有する動物にも当てはまる。トランスジェニック動物の発生および／もしくは生涯のある段階でＣＲＨシグナリング発現もしくは機能を調節するタンパク質を不活性化することもまた望ましい可能性がある。これは、例えばＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードするＲＮＡ転写産物に対するアンチセンスもしくはリボザイムの発現を導く例えば組織特異的、発生および／もしくは細胞調節性および／もしくは誘導性プロモーターを用いることにより行うことができる；同様に上記参照。適当な誘導系は、例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９  ＵＳＡ（１９９２），５５４７−５５５１）およびＧｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（１９９４），５８−６２）により記述されているような例えばテトラサイクリン調節性遺伝子発現である。同様に、ＣＲＨシグナリングを調節する突然変異体タンパク質の発現   をそのような調節要素により制御することができる。
【０１０５】
さらに、本発明はまた、本発明の核酸分子もしくはその一部を含有する（好ましくはそのゲノムに安定に組み込んだ）トランスジェニック哺乳類細胞にも関し、ここで、該核酸分子もしくはその一部の転写および／もしくは発現は、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の合成の減少をもたらす。
【０１０６】
好ましい態様として、該減少は、アンチセンス、センス、リボザイム、共抑制および／もしくは優性突然変異体効果により行われる。「アンチセンス」および「アンチセンスヌクレオチド」は、天然に存在する遺伝子産物の発現を阻止するＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物を意味する。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドの提供は、上記のようなタンパク質の減少したレベルを有する、従って、リン酸代謝の欠損を有するトランスジェニック非ヒト動物を製造する可能性を広げる。これをいかにして成し遂げるかの技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムの、アンチセンスおよびリボザイム機能を組み合わせる分子の、そして／もしくは共抑制効果を与える分子の発現が包含される；同様に上記参照。細胞におけるＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の量の減少にアンチセンス方法を用いる場合、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸分子は、好ましくは、形質転換に使用する動物種に関して相同な起源のものである。しかしながら、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする内生的に存在する核酸分子に高度の相同性を示す核酸分子を用いることもまた可能である。この場合、相同性は好ましくは８０％より高く、特に９０％より高く、そしてさらにより好ましくは９５％より高い。トランスジェニック哺乳類細胞における本発明のタンパク質の合成の減少は、例えばアデニン再吸収の改変をもたらすことができる。そのような細胞を含んでなるトランスジェニック動物において、これは様々な生理学的、発生的および／もしくは形態学的変化をもたらすことができる。
【０１０８】
従って、本発明はまた、上記のトランスジェニック細胞を含んでなるトランスジェニック非ヒト動物にも関する。これらは、例えば、以下の特徴：
（ａ）ＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードする内在性遺伝子（１つもしくは複数）の破壊；
（ｂ）本発明のポリヌクレオチドを含んでなる転写産物に対する少なくとも（１つの）アンチセンスＲＮＡおよび／もしくはリボザイムの発現；
（ｃ）本発明のポリヌクレオチドのセンスおよび／もしくは非翻訳ｍＲＮＡの発現；
（ｄ）本発明の抗体の発現；
（ｅ）本発明の調節配列の機能性もしくは非機能性コピーの導入；または
（ｆ）本発明の組み換えＤＮＡ分子もしくはベクターの導入
の少なくとも１つをもたらす外来ＤＮＡの安定なもしくは一時的な存在のために野生型動物と比較してＣＲＨ代謝の欠損を示すことができる。
【０１０９】
本発明のポリペプチド、それらのコードポリヌクレオチドおよびベクターを用いて、今度は、患者および罹患表現型のＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質における特定の突然変異に関して薬剤の効能をインビボおよびインビトロで研究することが可能である。さらに、本発明のポリペプチドの突然変異体型は、ＣＲＨ代謝に関連する障害の処置に、特にＣＲＨ誘発性ストレスもしくは鬱病の改善に有効であることができる薬剤の薬理学的プロファイルを決定するためにそしてさらなる薬剤の同定および製造に用いることができる。
【０１１０】
従って、本発明はまた、本発明のＣＲＨシグナリングを調節することができるタンパク質をコードするポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくはベクターの治療的に有効な量を哺乳類被験体に投与することを含んでなるＣＲＨ受容体関連障害を包含するＣＲＨ代謝の障害に関連する病状を予防する、処置するもしくは改善する方法にも関すると理解される。
診断アッセイ
本発明はさらに、診断試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。機能障害と関連する配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９のポリヌクレオチドを特徴とする遺伝子の突然変異型の検出は、該遺伝子の不十分な発現、過剰発現または改変された空間的もしくは時間的発現に起因する疾患もしくは疾患へのかかりやすさの診断を加えるかもしくは特定することができる診断手段を提供する。該遺伝子に突然変異を保有する個体は、様々な技術によりＤＮＡレベルで検出することができる。
【０１１１】
従って、本発明は：
（ａ）本発明のポリヌクレオチドにおける突然変異の有無を決定すること；および
（ｂ）該突然変異の有無に基づいて病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断すること
を含んでなるＣＲＨ活性の障害に関連する被験体における病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断する方法を提供することが理解される。診断のための核酸は、血液、尿、唾液、組織生検もしくは検視解剖材料のような、被験体の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出に直接用いることができ、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることにより酵素的に増幅することができる。ＲＮＡもしくはｃＤＮＡもまた、同様に用いることができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した増幅産物のサイズの変化により検出することができる。点突然変異は、標識した哺乳類プリンパーミアーゼヌクレオチド配列に増幅ＤＮＡをハイブリダイズすることにより同定することができる。好ましくは、マッチする配列をミスマッチ二本鎖からＲＮアーゼ消化によりもしくは融点の違いにより区別することができる。ＤＮＡ配列の違いはまた、変性剤の有無で、キャピラリー電気泳動カラムもしくはゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動移動度の改変により、またはダイレクトＤＮＡシーケンスにより検出することもできる（例えば、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１２４２）。特定の位置での配列変化はまた、特定の制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼおよびＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイもしくは化学切断方法により示すこともできる（Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８５）８５：４３９７−４４０１を参照）。別の態様として、例えば遺伝子突然変異の効率のよいスクリーニングを行うためにＣＲＨ活性を調節することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術方法は周知であり、一般的適用性を有し、そして遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性を包含する分子遺伝学における様々な問題に取り組むために用いることができる（例えば：Ｍ．Ｃｈｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ  ２７４，ｐｐ６１０−６１３（１９９６））を参照）。
【０１１２】
診断アッセイは、記述する方法によるＣＲＨ調節タンパク質をコードする遺伝子における突然変異の検出によって疾患へのかかりやすさを診断するもしくは決定する方法を提供する。さらに、そのような疾患は、被験体から得られるサンプルからポリペプチドもしくはｍＲＮＡの異常に減少したもしくは増加したレベルを決定することを含んでなる方法により、ならびに該サンプルから正常構造と比較してタンパク質誘導体の存在を決定することにより診断することができる。減少したもしくは増加した発現は、例えば；核酸増幅（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲによる）；ＲＮアーゼ保護；ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション方法のような、ポリヌクレオチドの定量のための当該技術分野において周知である方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。ホストから得られるサンプルにおける、本発明のポリペプチドのような、タンパク質のレベルを決定するために用いることができるアッセイ技術は、当業者に周知である。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが包含される。タンパク質誘導体もしくはバリアントの存在を決定するために用いることができるアッセイ技術は、とりわけ、質量分析法を含んでなる。
【０１１３】
従って、別の態様として、本発明は：
（ａ）生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドもしくはその誘導体の存在もしくはその発現の量を決定すること；および
（ｂ）ポリペプチドもしくはその誘導体の存在もしくはその発現の量に基づいて病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断すること
を含んでなる長期ＣＲＨ暴露の障害に関連する被験体における病的症状もしくは病的症状へのかかりやすさを診断する方法を提供する。
【０１１４】
特に、本発明は、個体におけるＣＲＨ誘発性遺伝子発現プロファイルを診断する方法を提供し、該方法は：
ａ）該個体の生物学的サンプルを得ること；および
ｂ）該生物学的サンプルにおける副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節する少なくとも１つのタンパク質の量を決定すること；
（ここで、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）シグナリングを調節するタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択される。）
を含んでなる。代わりの態様として、ＣＲＨ誘発性発現プロファイルを診断する方法は、本発明の少なくとも１つのタンパク質に限定されないが、ＣＲＨシグナリングに関与していると同定されるタンパク質、すなわち、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８のアミノ酸配列を有するタンパク質の群の発現レベルの同時評価を必要とする。
【０１１５】
好ましくは、該タンパク質の量は、好ましくはそれに結合する抗体を用いて、タンパク質レベルで、もしくは好ましくは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６および配列番号４８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに結合するプローブを用いて、遺伝子転写レベルで決定される。ＣＲＨシグナリングに関与するタンパク質の群の同時評価において、遺伝子発現のレベルはマイクロアレイ技術を用いて分析される。
【０１１６】
あるいはまた、ＣＲＨ誘発性遺伝子発現プロファイルは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる遺伝子の遺伝子転写のレベルを評価することにより決定される。遺伝子転写のレベルを決定する方法は上文に記述されており、そして好ましい態様として配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７もしくは配列番号４９またはその相補物よりなる群から選択されるポリヌクレオチドに結合する、好ましくは選択的に結合するプローブの使用を含んでなる。別の態様として、個体のサンプルにおける遺伝子転写のレベルの効率のよいスクリーニングを行うために本発明のヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。
【０１１７】
さらなる態様として、本発明は：
（ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９もしくはそのフラグメントのヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）のものに相補的なヌクレオチド配列；
（ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号：４６、配列暗号：４８もしくはそのフラグメントのポリペプチド；または
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する、好ましくは、配列番号：４６もしくは配列番号：４８のポリペプチドに対する抗体および場合により検出のための適当な手段
を含んでなる診断キットに関する。
【０１１８】
任意のそのようなキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）は、実質的な成分を含んでなることができることが理解される。そのようなキットは、疾患もしくは疾患へのかかりやすさ、特にＣＲＨ誘発性ストレスもしくは鬱病のようなＣＲＨ代謝関連障害を診断することにおいて有用である。
【０１１９】
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体位置確認にも有用である。これらの配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、そしてそれとハイブリダイズすることができる。本発明による染色体への関連配列のマッピングは、それらの配列を遺伝子関連疾患と相関させることにおける重要な第一段階である。いったん配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の該配列の物理的位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能）に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされている遺伝子と疾患との関係を連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）によって同定する。本発明の遺伝子は、ヒト第１５染色体にマッピングする。
【０１２０】
罹患個体と非罹患個体の間のｃＤＮＡもしくはゲノム配列の違いもまた決定することができる。突然変異が罹患個体のいくらかもしくは全てにおいて認められるが、正常個体では認められない場合、該突然変異は該疾患の原因因子であると思われる。
【０１２１】
本発明のヌクレオチド配列はまた、組織位置確認にも有用である。そのような技術は、組織における本発明のポリペプチドの発現パターンの決定を、それらをコードするｍＲＮＡの検出により可能にする。これらの技術には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術およびヌクレオチド増幅技術、例えばＰＣＲが包含される。そのような技術は、当該技術分野において周知である。これらの研究からの結果は、生物におけるポリペプチドの正常機能の指標を提供する。
【０１２２】
本発明のポリペプチドもしくはそれらのフラグメントまたはそのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞はまた、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を製造するために免疫原として用いることもできる。「免疫特異的な」という用語は、抗体が、先行技術における他の関連ポリペプチドに対するそれらの親和性より本発明のポリペプチドに対して実質的に大きな親和性を有することを意味する。
【０１２３】
従って、別の態様として、本発明は、哺乳類プリンパーミアーゼと免疫学的に反応する単一特異性抗体を提供する。好ましい態様として、該抗体は、（配列番号：４６）；（配列番号：４８）；およびその機能的アナログよりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと免疫学的に反応するか、もしくは該抗体は、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の活性を阻害する。
【０１２４】
本発明のポリペプチドに対して作製される抗体は、日常的プロトコルを用いて、該ポリペプチドもしくはエピトープ保有フラグメント、アナログまたはこれらを発現する細胞を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより得ることができる。モノクローナル抗体の製造には、連続細胞系培養により生産される抗体を提供する任意の技術を用いることができる。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）が包含される。
【０１２５】
米国特許第４，９４６，７７８号に記述されているもののような、一本鎖抗体の製造のための技術もまた、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。また、ヒト化抗体を発現するためにトランスジェニックマウス、もしくは他の哺乳類を包含する他の生物を用いることもできる。
【０１２６】
上記の抗体は、ポリペプチドを発現するクローンを単離するためもしくは同定するためにまたはアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するために用いることができる。
【０１２７】
本発明のポリペプチドに対する抗体はまた、ＣＲＨ代謝関連障害を処置するために用いることもできる。
【０１２８】
さらなる態様として、本発明は、本発明のポリペプチドもしくはそのフラグメント、および様々なサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）の免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の様々な部分を含んでなる遺伝子工学によって作られた可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとして好ましいのは、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ  Ｉの重鎖の定常部分であり、この場合、融合はヒンジ領域で行われる。特定の態様として、Ｆｃ部分は、例えば血液凝固因子Ｘａで切断することができる切断配列の導入により簡単に取り除くことができる。さらに、本発明は、遺伝子工学によるこれらの融合タンパク質の製造方法に、そして薬剤スクリーニング、診断および治療のためのその使用に関する。本発明のさらなる態様はまた、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質技術の例は、国際特許出願第ＷＯ９４／２９４５８号およびＷＯ９４／２２９１４号に見出すことができる。
治療有用性
本発明のさらなる態様は、哺乳類ホストに導入した場合に、本発明のポリペプチドに対して該哺乳類において免疫学的応答を誘導する免疫学的／ワクチン製剤（組成物）に関し、ここで、該組成物は本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを含んでなる。ワクチン製剤はさらに、適当な担体を含んでなることができる。ポリペプチドは胃において分解され得るので、それは好ましくは非経口的に投与される（例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは皮内注射）。非経口投与に適当な製剤には、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および製剤をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性もしくは非水性の滅菌した注射溶液；ならびに沈殿防止剤もしくは増粘剤を含むことができる水性および非水性の滅菌した懸濁剤が包含される。製剤は、単位用量もしくは複数用量容器、例えば、密閉アンプルおよびバイアルにおいて与えることができ、そして使用直前に滅菌した液状担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。ワクチン製剤はまた、水中油滴系および当該技術分野において既知である他の系のような、製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含むこともできる。投与量はワクチンの比活性により決まり、そして日常的な実験により容易に決定することができる。
【０１２９】
さらに別の態様として、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質をコードする遺伝子の発現は、発現ブロッキング技術を用いて阻害することができる。既知のそのような技術は、内部で作製されるかもしくは外部から投与されるいずれかの、アンチセンス配列の使用を伴う（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）を参照）。あるいはまた、遺伝子と三重らせん（「トリプレックス」）を形成するオリゴヌクレオチドを提供することができる（例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３７０３；Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を参照）。これらのオリゴマーは、それ自体投与することができ、もしくは関連オリゴマーをインビボで発現することができる。合成アンチセンスもしくはトリプレックスオリゴヌクレオチドは、修飾塩基もしくは修飾バックボーンを含んでなることができる。後者の例には、メチルホスホネート、ホスホロチオエートもしくはペプチド核酸バックボーンが包含される。そのようなバックボーンは、ヌクレアーゼによる分解からの保護を与えるためにアンチセンスもしくはトリプレックスオリゴヌクレオチドに導入され、そして当該技術分野において周知である。これらのおよび／もしくは他の修飾バックボーンで合成されるアンチセンスおよびトリプレックス分子もまた、本発明の一部をなす。
【０１３０】
細胞における標的遺伝子の発現を阻害する別の方法として、部分的なもしくは完全に二本鎖の特徴を有するＲＮＡを細胞にもしくは細胞外環境に導入する。阻害ＲＮＡを製造するために標的遺伝子の一部からのヌクレオチド配列を選択する点において阻害は特異的である。該ＲＮＡは、重合したリボヌクレオチドの１本もしくはそれ以上の鎖を含んでなることができ；それはホスフェート−糖バックボーンもしくはヌクレオシドのいずれかへの修飾を含むことができる。二本鎖構造は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖もしくは２本の相補鎖により形成することができる。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝子阻害の標的となる点において配列特異的である。標的配列の一部と同一であるヌクレオチド配列を含有するＲＮＡが好ましい。ＲＮＡ阻害技術の例は、国際特許出願ＷＯ９９／３２６１９に見出すことができる。
【０１３１】
さらに、ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の発現は、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列に特異的なリボザイムを用いることにより阻害することができる。リボザイムは、天然もしくは合成のものである触媒活性ＲＮＡである（例えば、Ｕｓｍａｎ，Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ（１９９６）６（４），５２７−３３を参照）。合成リボザイムは、選択した位置で上記のｍＲＮＡを特異的に切断するように設計され、それにより機能性ポリペプチドへの該ｍＲＮＡの翻訳を妨げることができる。リボザイムは、ＲＮＡ分子に通常存在するように、天然のリボースホスフェートバックボーンおよび天然の塩基で合成することができる。あるいはまた、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護を与えるために非天然のバックボーンで合成することができ（例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、そして修飾塩基を含有することができる。
【０１３２】
ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の不十分な発現と関連する異常な症状を処置するために、いくつかの方法もまた利用可能である。１つの方法は、製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて、本発明のポリペプチドを活性化する化合物、すなわち、上記のようなアゴニストの治療的に有効な量を被験体に投与してそれにより異常な症状を軽減することを含んでなる。あるいはまた、被験体における関連細胞による哺乳類プリンパーミアーゼの内因的生産をもたらすために遺伝子治療を用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記に説明するように、複製欠損性レトロウイルスベクターにおける発現用に設計することができる。次に、レトロウイルス発現構築物を単離し、そしてパッケージング細胞が今度は興味のある遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生産するように本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞に導入することができる。これらの生産細胞は、インビボで細胞を設計することおよびインビボでのポリペプチドの発現のために被験体に投与することができる。遺伝子治療の概略は、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびその中に引用される参考文献），Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｔ  Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ａ  Ｐ  Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）を参照。別の方法は、適当な製薬学的担体と組み合わせて本発明のポリペプチドの治療量を投与することである。
【０１３３】
さらなる態様として、本発明は、製薬学的に許容しうる担体もしくは賦形剤と組み合わせて、本発明のポリペプチドの可溶性形態のようなポリペプチド、アゴニスト／アンタゴニストペプチドもしくは小分子化合物の治療的に有効な量を含んでなる製薬学的組成物を提供する。そのような担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが包含されるが、これらに限定されるものではない。本発明はさらに、本発明の上記の組成物の成分の１つもしくはそれ以上を詰めた１つもしくはそれ以上の容器を含んでなる製薬学的パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独でもしくは治療化合物のような他の化合物とともに用いることができる。
【０１３４】
組成物は、例えば全身もしくは経口経路による、投与の経路に適合させる。全身投与の好ましい形態には、典型的には静脈内注射による、注射が包含される。皮下、筋肉内もしくは腹腔内のような他の注射経路を用いることができる。全身投与の代わりの手段には、胆汁塩もしくはフシジン酸もしくは他の溶剤のような浸透剤を用いる経粘膜および経皮投与が包含される。さらに、本発明のポリペプチドもしくは他の化合物を腸溶性もしくはカプセル化製剤に調合することができる場合、経口投与もまた可能であることができる。これらの化合物の投与はまた、パッチ、軟膏、泥膏、ゲルなどの形態で、局所的および／もしくは局部的であることもできる。
【０１３５】
必要な投薬量範囲は、本発明のペプチドもしくは他の化合物の選択、投与の経路、製剤の性質、被験体の症状の性質、および主治医の判断により決まる。しかしながら、適当な投薬量は、被験体のｋｇ当たり０．１〜１００μｇの範囲である。しかしながら、利用可能な化合物の多様性および様々な投与経路の異なる効率を考慮すると必要な投薬量の幅広いバリエーションが予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与より高い投薬量を必要とすると予想される。これらの投薬量レベルのバリエーションは、当該技術分野において十分に理解されているように、最適化のための標準的な実験ルーチンを用いて調整することができる。
【０１３６】
処置に用いるポリペプチドはまた、上記のような「遺伝子治療」と呼ばれることが多い治療法において、被験体中で内生的に作製することもできる。従って、例えば、被験体からの細胞をエクスビボでポリペプチドをコードするようにＤＮＡもしくはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターの使用により操作することができる。次に、これらの細胞を被験体に導入する。
【実施例１】
【０１３７】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することによりさらによく理解されるが、これらはその後に続く請求項にさらに十分に記述されているような本発明を説明するにすぎないことを当業者は容易に理解する。さらに、本願の全体にわたって、様々な公開が引用される。これらの公開の開示は、本発明が関連する最新技術をさらに十分に記述するために本願に引用することにより本明細書に組み込まれる。
実験方法
細胞培養およびサンプル調製−ＡｔＴ−２０細胞はＡＴＣＣから購入し、そして１０％のウシ胎仔血清、５％のウマ血清および４．５ｇ／ＬのＤ−グルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において加湿空気中５％のＣＯ２において３７℃で維持した。実験には、細胞を２５ｃｍ２フラスコに接種した。培地を４８時間後に交換し、そして細胞を新しい培地において０．１％のＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ中１μＭのＣＲＨ（Ｓｉｇｍａ）、ＤＭＳＯ中１μＭのＲ１２１９１９もしくはＤＭＳＯ中１μＭのＣＲＨ＋１μＭのＲ１２１９１９のいずれかで０、０．５、１、２、４、８および２４時間処理した。インキュベーション培地を吸引し、そして細胞の溶解のために３ｍｌのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えることによりインキュベーションを止めた。全ＲＮＡを製造業者の説明書に従ってトリゾールを用いて抽出した。１００μｇの全ＲＮＡをカラム上でＤＮアーゼＩ処理とともにＲｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてさらに精製した。
マイクロアレイハイブリダイゼーション−ｃＲＮＡを下記のように調製した。逆転写は、Ｔ７−オリゴ（ｄＴ）２４プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１０μｇの全ＲＮＡで４２℃で１時間行った。第二鎖ｃＤＮＡ合成は、エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡリガーゼおよびＲＮアーゼＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて１６℃で２時間行った。フェーズロックゲル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いたフェノール−クロロホルム抽出の後に、インビトロ転写をビオチン標識リボヌクレオチドでのＢｉｏａｒｒａｙ高収量ＲＮＡ転写産物ラベリングキット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて３７℃で６時間行った。ｃＲＮＡサンプルをＱｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙカラム上で精製し、続いて９５℃で３５分間断片化した。ｃＲＮＡ収量は、５０〜１００μｇの間であった。サンプルをＧｅｎｅＣｈｉｐｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）上で処理した。各サンプルの品質を調べるために、５μｇの標識ｃＲＮＡをＴｅｓｔ２アレイ上で行った。実際の実験は、ＵｎｉＧｅｎｅデータベース（Ｂｕｉｌｄ  ７４）からの約１２，０００個の全長マウス遺伝子およびＥＳＴクラスターを調べるプローブ組を含有するマウスゲノムＵ７４Ａｖ２アレイ上で行った。ハイブリダイゼーションは、１５μｇのｃＲＮＡを用いて連続回転下で４５℃で１６時間行った。アレイは、アフィメトリックスフルイディクスステーションにおいてストレプトアビジン／フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）を用いて染色し、続いて抗ストレプトアビジン抗体および二次ＳＡＰＥ染色で染色した。次に、アレイをＨＰ−レーザースキャナーで走査し、そしてデータをＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で解析した。この段階でスケーリングも正規化も行わなかった。実験の質は、全てのサンプルにわたる提示コール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌ）率に基づいて評価し、それは平均して４７．０６±２．４５％であった。細胞質β−アクチンおよびＧＡＰＤＨ５’／３’比は、それぞれ、１．１０±０．０８および０．９３±０．０５であった。
データ解析および遺伝子の選択
各アレイ上の生強度は、以下のグローバル平均アルゴリズムを用いてアライメントした：
【０１３８】
【数１】
2006516387.tif 000003
【０１３９】
基本的に、このアライメントは、全てのアレイにわたって測定される平均に対する１つのアレイの平均強度を定め、ハイブリダイゼーション、洗浄および染色におけるアレイごとのバリエーションを補正し、最終的にアレイ間の妥当な比較を可能にする。アライメント後に磨かれたデータを加重スペクトルマッピングを用いて解析した。加重スペクトルマッピングは、２つの最も高い主成分を表す特殊化した視覚化と組み合わせたデータのダブルセンタリング（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）を含む非監視（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）多変量解析法である。ダブルセンタリングは、アレイデータの「サイズ」成分を除くが、この情報は、それぞれのサンプルおよび遺伝子のサイズを表す記号の面積によって視覚化において再導入される。この方法は、大きいマイクロアレイデータセットの減少を可能にし、そしてデータにおける遺伝子および／もしくは対象のクラスターを視覚的に調べそしてそれにより同定する手段を提供する（７）。さらに詳細な解析は、ＯｍｎｉＶｉｚプログラムを用いて実施した。全ての実験において存在しなかった全ての記録を除き、そして２０未満の全てのシグナルを２０に設定した。ＣＲＨ、Ｒ１２１９１９およびＣＲＨ＋Ｒ１２１９１９処理の遺伝子発現倍数差を各時間点で計算した。これらの計算では比率を計算するためにＤＭＳＯ処理サンプルにおける対応する時間点でのシグナルを用いた。
定量的ＲＴ−ＰＣＲ−マイクロアレイデータを、リアルタイムＰＣＲ解析を用いて確かめた。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ランダムヘキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて０．５μｇの全ＲＮＡで行った。定量的ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲキットを用いてＡＢＩＰｒｉｓｍ  ７７００サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ｃＤＮＡの連続希釈物を用いてβ−アクチン、ｃ−ｆｏｓ、Ｃｒｈ−Ｒ１、Ｃｒｈ−Ｒ２、Ｒｇｓ２および興味のある遺伝子（配列は表２を参照）の濃度の対数に対する閾値サイクルの標準曲線を作製した。標準曲線から計算される線形回帰直線は、異なる時間点からのＲＮＡサンプルにおける転写産物レベルの決定を可能にした。
結果
ＣＲＨへの転写応答をＣＲＨ−Ｒ１を発現するマウスＡｔＴ−２０下垂体コルチコトロフ由来腺腫細胞系において研究した。ＣＲＨ−Ｒ１は、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴｑ）およびウェスタンブロットの両方により容易に検出可能であったが、ＣＲＨ−Ｒ２発現はＡｔＴ−２０細胞において認めることができなかった。ＣＲＨ−Ｒ１特異的応答を同定するために細胞を１μＭのＣＲＨ、１μＭのＣＲＨ−Ｒ１特異的アンタゴニストＲ１２１９１９の存在下で１μＭのＣＲＨに、そしてＲ１２１９１９のみにさらした。転写応答を第１の投与後２４時間まで経時的に追跡した。処理効果を評価するために、アレイ実験を実施する前に異なる処理および時間点からのＲＮＡでＲＴｑによりｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡレベルを決定した。以前の報告と一致して、ＣＲＨにさらすことは、０．５〜１時間後にレベルがすでに下降する、ｃ−ｆｏｓ転写の一時的な急増を引き起こした（図１参照）（８；９）。この応答は、Ｒ１２１９１９の存在下でほとんど完全に抑制された。興味深いことに、０．１％のＤＭＳＯにより誘導されるｃ−ｆｏｓ発現レベルは、しかしながら、ＣＲＨにより誘導される発現と比較して５〜１０倍の間低かった。
【０１４０】
全ての時間点を、約１２０００個のマウス遺伝子およびＥＳＴを含有するマイクロアレイ上で解析した。スペクトルマッピング（いわゆる非監視法）を用いる発現プロファイルの全体的解析は、遺伝子発現の認められる変化の大部分を説明する進行時間を示唆した（図２参照）。代謝産物の蓄積および進行する細胞培養は追加の要因であるが、新しい培地および血清の添加により誘導されるこれらの培養物における細胞周期の同期化は、この現象を説明することができると思われる。スペクトルマップ解析はまた、ＣＲＨ処理サンプルが主に初期の時間点において（０．５時間〜２時間まで）他のサンプルと異なり、発現の全体的な違いは、８時間後に非常に小さくなることも示した。時間のこの明白な影響のために、発現測定は、ＤＭＳＯ処理コントロールサンプルの対応する時間点において認められるものに対して解析した。調節される遺伝子は、任意の１つの時間点で転写産物レベルの２倍より大きい変化を示すものと定義した。ＯｍｎｉＶｉｚ  Ｔｒｅｅｓｃａｐｅビューを用いて、アンタゴニストでの処理と比較してＣＲＨでの処理の後に発現の差異を示す、この基準を満たした１１１個の遺伝子を選択した。１１１個の遺伝子のうち２６個は、ＣＲＨでの３０分の処理後にすでに２倍の変化を示す、「初期レスポンダー」であった。３２個の遺伝子は、処理の１〜２時間後に応答する「中間レスポンダー」であり、そして５３個の遺伝子は、処置後２時間もしくはそれ以上後に応答を示す「後期レスポンダー」であった（図３参照）。これらの応答は、ＣＲＨ−Ｒ１アンタゴニストＲ１２１９１９により抑制された。初期レスポンダーの中には、転写因子Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒｒ７７、Ｊｕｎ−ＢのようなＣＲＨ−Ｒ１の下流の経路における既知のプレーヤー（ｐｌａｙｅｒ）があり、アッセイを実証した。
【０１４１】
同定される興味深い新規のプレーヤーには、転写因子（例えば、ｈａｉｒｙ／ｅｎｈａｎｃｅｒ−ｏｆ−ｓｐｌｉｔ関連１（Ｈｅｙ１）、インターロイキン３により調節される核因子（ＮＦＩＬ３）、ｃＡＭＰ応答配列モジュレーター（ＣＲＥＭ）および前立腺特異的ｅｔｓ転写因子（Ｐｓｅ））、受容体およびチャンネル調節因子（例えば、Ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質（ＧＥＭ）および受容体（カルシトニン）活性修飾タンパク質３（ＲＡＭＰ３））、分泌ペプチド（例えば、アドレノメジュリン、カルシトニン、コレシストキニン）ならびに細胞内シグナリングに関与するタンパク質（例えば、Ｇタンパク質シグナリングの調節因子２（Ｒｇｓ２）、ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ４Ｂ（Ｐｄｅ４ｂ）、イノシトール１，４，５−３リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ１）および調節サブユニットホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、ｐ８５）が包含される。他の興味深い調節される遺伝子は、ピリオドホモログＰｅｒ１、繊維芽細胞増殖因子受容体２（Ｆｇｆｒ２）、血清／グルココルチコイド調節キナーゼおよび血清誘導性キナーゼを含んでなる（図４）。興味深いことに、上記の基準に従って同定される全てのレスポンダーは、ＣＲＨにさらした後にアップレギュレーションされた。この誘導は一時的であり、そして誘導された遺伝子のほとんど全ては４〜８時間後にベースラインに戻る。誘導された転写産物の多くは、ＣＲＨ−Ｒ１シグナリングに負のフィードバックを及ぼすタンパク質をコードし（例えば、Ｐｄｅ４、Ｒｇｓ２、ＣＲＥＭなど）、誘導の一時的な性質に寄与すると思われる。この負のフィードバックに加えて、リン酸化および内在化によるＣＲＦ１の脱感作のような他のメカニズムが転写誘導の一時的な性質に寄与する。この点において、ＣＲＦでのチャレンジがラット下垂体細胞においてＣＲＦ１  ｍＲＮＡを素早くダウンレギュレーションすることに留意することは興味深い。しかしながら、１μＭのＣＲＦにさらした下垂体由来ＡｔＴ−２０細胞におけるＣＲＦ１  ｍＲＮＡのいかなる改変も検出することはできなかった。マイクロアレイデータの確認は、ハイブリダイゼーション実験に用いるものと同じサンプルでそして反復実験で定量的リアルタイムＰＣＲ分析を用いて実施した。マイクロアレイにより同定される調節のレベルおよび時間経過は、図５においてＲｇｓ２について示すように定量的ＰＣＲにより認められるものと一致した。試験したこれらの遺伝子は、未処理のサンプルと比較した誘導のレベルを図４に示す。
説明
ＣＲＨ−Ｒ１特異的アンタゴニストを用いてＡｔＴ−２０細胞においてＣＲＨ−Ｒ１の下流の転写経路を同定した。我々の結果は、ＣＲＨでの刺激の際のｃＡＭＰおよびＣａ２＋のようないくつかの二次メッセンジャーの活性化と一致する。転写応答のいくつかは、ＣＲＥＢのリン酸化およびその後のｃＡＭＰ応答配列の下流の遺伝子の転写により説明することができる。これらの配列は、例えば、Ｐｅｒ１、Ｎｕｒｒ１、ＣＲＥＭ−ＩＣＥＲ、ｃ−Ｆｏｓのプロモーターにおいて見出されている。さらに、これらの遺伝子の誘導の反応速度プロファイルは、ｃＡＭＰ形成の０．５時間後のＣＲＥＢによる認められる最大転写速度と一致する。ＣＲＥＭ−ＩＣＥＲの誘導は、ｃＡＭＰへの転写応答を弱めることにおける負のフィードバックメカニズムを構成する。興味深いのは、下垂体の中葉における急性ストレスに応答したＣＲＥＭ−ＩＣＥＲの報告される誘導である。ＣＲＥＭ−ＩＣＥＲを欠損するマウスは、β−エンドルフィンレベルの慢性増加を示し、ＣＲＥＭ−ＩＣＥＲ誘導がストレスに応答した遺伝子発現の調節に関与し得ることを示唆する（１０）。我々の結果は、ＣＲＥＭ−ＩＣＥＲがＣＲＨシグナリングの調節に直接関与し、そして結果として、ＣＲＥＭ−ＩＣＥＲの除去がストレスシグナルへの改変された応答をもたらし得ることを示唆する。ＣＲＨシグナリングの別の新規な推定上の負のフィードバック調節因子は、Ｒｇｓ２である。我々は、ＣＲＨでの刺激の際のこの遺伝子の初期応答挙動の可能な説明を与える、ヒトＲＧＳ２遺伝子のプロモーターにおける２つの単一のＣＲＥモチーフを同定した。我々の結果の裏づけとして、ホスホイノシチドシグナリングおよびｃＡＭＰの両方が、ヒト星状細胞腫および神経芽細胞腫細胞においてＲｇｓ２  ｍＲＮＡの迅速で且つ一時的な増加を誘導することを示す最近の報告がある。Ｒｇｓ２タンパク質は、Ｇｑα機能の選択的インヒビターである。最近、Ｒｇｓ２は、Ｇαに作用することによってではなく、アデニリルシクラーゼＩＩＩ型の活性を直接阻害することにより、臭気物質により誘発されるｃＡＭＰ生産を減少することが示されている。Ｒｇｓ２は、最初は活性化Ｔリンパ球における前初期応答遺伝子として同定されたが、Ｒｇｓ２欠損マウスにおける研究は、これらのマウスが増加した不安および攻撃性を示すようにそれがストレス関連挙動の調節においても役割を果たすことを示唆する（１１）。ｃＡＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ４Ｂ（Ｐｄｅ４ｂ）の誘導もまた、ｃＡＭＰシグナルを直接弱める、負のフィードバック下に分類することができる。ＣＲＨでの刺激の際に生成される別の重要な二次メッセンジャーは、Ｃａ２＋である。ＣＲＨは、電位依存性Ｃａ２＋チャンネルを介した定常状態脱分極により刺激される細胞外Ｃａ２＋流入を引き起こし、そしてイノシトール１，４，５−３リン酸（ＩｎｓＰ３）感受性Ｃａ２＋プールからの放出によって細胞内Ｃａ２＋濃度を上昇することが示されている（１２）。ＩｎｓＰ３受容体およびホスファチジルイノシトール３−キナーゼのｐ８５調節サブユニットは両方ともアップレギュレーションされ、長期のＣａ２＋シグナリングの相殺メカニズムを説明すると思われる。低分子量Ｇタンパク質���ｉｒ／Ｇｅｍのアップレギュレーションもまた、長期のＣａ２＋シグナリングの減衰の方に向かせる。最近の研究により、Ｇｅｍがβ補助サブユニットによって細胞膜でＣａ２＋チャンネル発現を調節することが示されている。Ｇｅｍの増加したレベルは、Ｃａ２＋誘発性エキソサイトーシスを阻害することが示されており、そしてＧｅｍはＣａ２＋過負荷に対する防御効果を有し得ることが提示されている。細胞内Ｃａ２＋はまた、二次メッセンジャーとしてのその役割に加えて、遺伝子発現を調節することにおいて重要な役割を果たすことも示されている。興味深いのは、カルシニューリン／ＮＦＡＴおよびＣａＭキナーゼシグナリングによるＮＦＩＬ３／Ｅ４ＢＰ４の調節であり、ＣＲＨ処理の際のＮＦＩＬ３  ｍＲＮＡレベルの増加を説明する。Ｂリンパ球において、ＮＦＩＬ３の発現は、Ｒａｆマイトジェン活性化プロテインキナーゼおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ経路の両方を通してインターロイキン３により誘導される。この細胞タイプにおいて、ＮＦＩＬ３は、Ｂｃｌ−ｘＬ依存性経路との相乗作用においてアポトーシスを抑制する。我々のデータは、ＡｔＴ−２０細胞のアポトーシスの防止におけるＮＦＩＬ３の役割を示唆する。
【０１４２】
ＣＲＨは、最も有効なＡＣＴＨ分泌促進薬である。残念なことに、使用したマイクロアレイは、ＰＯＭＣレベルに関して調べなかった。しかしながら、コレシストキニン（ＣＣＫ）ならびに２つのカルシトニンペプチドファミリーメンバー、アドレノメジュリン（ＡＤＭ）およびカルシトニン（ＣＴ）のようないくつかの他のプレプロペプチドｍＲＮＡは、ＣＲＨ投与後にアップレギュレーションされることが見出された。また、この点において興味深いのは、ＲＡＭＰ３のアップレギュレーションである。ＲＡＭＰは、カルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）の輸送およびグリコシル化を制御する。ＲＡＭＰ３の場合、ＣＲＬＲと一緒にそれはＡＤＭ受容体を生成することが示されている。この遺伝子のアップレギュレーションは、ＲＡＭＰ３が他のＧ共役受容体を調節する可能性があるかどうか不明であるようにＣＲＨにさらした後のＡＤＭへのもしくは他の細胞外刺激へのＡｔＴ−２０細胞の応答性を調節することにおいて役割を果たす可能性がある。ＣＣＫはＡｔＴ−２０細胞により分泌されるが、ＣＲＨによるその発現の誘導はこれまで報告されていない（１３）。しかしながら、ＣＣＫとＣＲＨとの間の相互作用は詳細に研究されており、そしてパニック発作、鬱病、不安および胃内容排出において示されている（１４〜１９）。これらの実験の大部分は、ＣＣＫの中枢効果を媒介することにおけるＣＲＨの役割の方に向かせる。我々のデータは、ＣＲＨがさらにＣＣＫ分泌促進薬として機能する可能性があることを示唆する。ＣＣＫのものと非常に同じような状況は、アドレノメジュリンでも同様にそうであるように思われる。ＡＤＭは下垂体において発現され、そして動物における基礎およびＣＲＨにより刺激されるＡＣＴＨ放出に影響を及ぼすことが示されており、従って、視床下部−下垂体−副腎系を調節することにおけるその潜在的役割を示唆する（２０〜２３）。現在の発現データは、ＣＲＨがＡＤＭおよびＣＴを誘導することを示す。さらに、最近の結果は、循環するアドレノメジュリンがクッシング病において増加され、そして下垂体がＡＤＭの高められた生産の部位に相当し得ることを示し（２４）、ＣＲＨがＡＤＭを誘導している可能性があることを示唆する。
【０１４３】
要するに、我々は、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン受容体１活性化遺伝子ネットワークの一部を解明し、そしてこのシグナリングカスケードのいくつかの新規な標的を同定した。我々の結果は、細胞および丸ごとの生物レベルの両方でＣＲＨ刺激へのこれらの転写応答の機能を解明するためのさらなる実験の必要性を誘発する。
【０１４４】
【表１】
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【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
［表１］  ＣＲＨシグナリングを調節するタンパク質の一覧表。
【０１４８】
【表４】
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【０１４９】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】異なる時間点（時間）のＤＭＳＯ、ＣＲＨ、ＣＲＨ＋Ｒ１２１９１９もしくはＲ１２１９１９で処理したＡｔＴ−２０細胞におけるβ−アクチンｍＲＮＡレベル（１００％と見なす）に対して正規化した定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価した場合のｃ−ｆｏｓ  ｍＲＮＡレベル。
【図２】全ての時間点および処理の正規化したマイクロアレイデータに適用する対応分析。四角は異なるサンプルを示し、一方、丸は遺伝子を示す。四角の間の距離は、サンプル間の類似性の尺度である。既定サンプルと遺伝子との正の関連（すなわち、その特定のサンプルにおけるその遺伝子のアップレギュレーション）は、図心（十字で示す）を通した共通線上の該遺伝子およびサンプルのポジショニングをもたらす。対応分析は、サンプル間の主要な識別子として明らかに時間を同定する。さらに、ＣＲＨでの処理の効果は、初期の時間点において最も顕著であると同定することができる。
【図３】ＣＲＨ処理の際に変化している遺伝子を示すヒートマップ。値は、対応する時間点でのＤＭＳＯサンプルの強度で各サンプルの強度を割ることにより計算した。これらの計算された比率をｌｏｇ２スケール単位を用いて（ｕｓｉｎｇ  ｏｎ  ａ  ｌｏｇ２  ｓｃａｌｅ）カラーランプに転化する。このようにして発現の誘導の異なるタイミングが明白になる。ＣＲＨでの処理の３０分後に２倍の変化を示す遺伝子は「初期レスポンダー」と呼ばれ、「中間レスポンダー」は処理の１〜２時間後に変化を示し、そして「後期レスポンダー」は２時間もしくはそれ以上後に応答を示す。
【図４】本文に説明するような経路もしくは機能により分類されるＣＲＨにより誘導される遺伝子のセレクションの概略。値は、対応する時間点でのＤＭＳＯサンプルの強度で各サンプルの強度を割ることにより計算した。これらの計算された比率をｌｏｇ２スケール単位を用いてカラーランプに転化し、そしてヒートマップに示す。
【図５】ＡｔＴ−２０細胞におけるＣＲＨによるＲｇｓ２の誘導。誘導は、任意の処理の前のＡｔＴ−２０細胞において認められるレベルと比較して計算する。上には、Ｒｇｓ２で得られるアレイデータを示す。下には、アレイ実験に使用したものと同じサンプルで定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した場合のそして反復実験で測定した場合のＲｇｓ２  ｍＲＮＡのレベルを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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