(57)【要約】複数の特異的な且つ／又はランダムな配列のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、特にコロニー及びプラーク抽出物中に存在するような、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子の形をとる標的ＤＮＡ配列の改良増幅法が、そのような増幅標的配列を検出するための方法と共に開示されており、ここではデオキシリボヌクレオチドの一部又は全てが、増幅産物のＴｍを低下させるデオキシリボヌクレオチドアナログに代わっている。この増幅産物は、ＤＮＡ配列決定、及びハイブリダイゼーションを行うその他の分析に使用する。本発明で使用される構成要素を含んだキットについても記載する。また、配列決定、一塩基置換の検出、制限酵素断片パターンの修飾、及びその他の分子生物学的用途での、この増幅ＤＮＡのさらなる使用についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列の増幅法であって、
ａ）複数の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーと１以上の増幅標的とＤＮＡポリメラーゼと複数のデオキシヌクレオシド三リン酸とを含有する混合物を形成する段階であって、
上記デオキシヌクレオシド三リン酸の１以上が、組み込まれたときに増幅ＤＮＡ産物の融解温度（Ｔｍ）を１以上の増幅標的の融解温度（Ｔｍ）から１℃以上変化させる修飾デオキシヌクレオシド三リン酸である段階、及び
ｂ）１以上の増幅標的がプライマーの２以上と結合してプライマーの伸長による１以上の増幅標的の複製を促進して複数の増幅ＤＮＡ産物を形成する条件下で混合物をインキュベートする段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記１以上の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸が、組み込まれたときに増幅ＤＮＡ産物の融解温度（Ｔｍ）を３℃以上変化させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記１以上の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸が、組み込まれたときに増幅ＤＮＡ産物の融解温度（Ｔｍ）を５℃以上変化させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
１以上の修飾ヌクレオチドを含有する増幅ＤＮＡ産物を、配列に基づく分析のための１以上のオリゴヌクレオチド又はハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズしてハイブリダイゼーションの存在又は程度の指標とする段階
をさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
増幅ＤＮＡ産物を配列決定用プライマーとハイブリダイズし、増幅ＤＮＡ産物をジデオキシ鎖終止法による配列決定又はサイクルシーケンシングする段階
をさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法で１以上の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下１以上の増幅標的を増幅することによって、１以上の増幅標的中に存在する１以上の制限部位を修飾する段階を含む、制限酵素による切断に対するＤＮＡの感受性を変化させる方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法で１以上の修飾デオキシヌクレオシド三リン酸を使用して標的を増幅することによって、１以上の増幅標的の一本鎖高次構造特性を変更する方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法によって１以上の増幅標的の一本鎖高次構造特性を変更する段階と、一本鎖高次構造多型分析に適した条件下、電気泳動によって増幅ＤＮＡ産物を分析する段階とを含む、一塩基置換を検出する方法。
【請求項９】
修飾デオキシヌクレオシド三リン酸が、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＩＴＰ、７−置換−７−デアザ−ｄＩＴＰ、７−置換−７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ又は関連アナログ、Ｎ４−アルキル−ｄＣＴＰ、５−アルキル−ｄＣＴＰ又は関連アナログ、及び５−置換ｄＴＴＰからなる群から選択される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
修飾デオキシヌクレオシド三リン酸がｄＩＴＰである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ポリメラーゼがφ２９型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ポリメラーゼが、φ２９ＤＮＡポリメラーゼの野生型、Ｎ６２Ｅ又はＮ６２Ｄ変異体から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
得られた増幅ＤＮＡ産物が、当初の１以上の増幅標的を切断しない加水分解酵素によって切断され易い、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
加水分解酵素がニッキング酵素である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
加水分解酵素がグリコシダーゼである、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
複数の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、組み込まれたときに増幅ＤＮＡ産物の融解温度（Ｔｍ）を１以上の増幅標的の融解温度（Ｔｍ）から変化させる１以上の修飾ヌクレオシド三リン酸とを含む、核酸配列を増幅するためのキット。
【請求項１７】
複数の一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、組み込まれたときに増幅ＤＮＡ産物の融解温度（Ｔｍ）を１以上の増幅標的の融解温度（Ｔｍ）から変化させる１以上の修飾ヌクレオシド三リン酸と、ジデオキシ鎖終止ＤＮＡ配列決定に適したＤＮＡポリメラーゼと、デオキシヌクレオシド三リン酸と、１以上の鎖終止ジデオキシヌクレオシド三リン酸とを含む、核酸配列決定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾産物が得られるように、多重開始ローリングサークルによってＤＮＡ増幅を行い、また多置換増幅を行うための、改良方法に関する。この増幅方法は、特に配列決定又はその他の方法によってさらに分析を行うため、改善された性質を上記産物に与える様々なヌクレオチドアナログを使用して実施する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を増幅するための有用な方法が幾つか開発されている。その大半は、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、３ＳＲ（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法及びＱβレプリカーゼを用いた増幅（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｓｈａｈｗａｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１１７−１２６（１９９１）；  Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：１９９−２０２（１９９３））を始め、所定のＤＮＡ標的及び／又はプローブの増幅に関して設計されている。
【０００３】
さらに、Ｍ１３などのバクテリオファージから、プラスミドやＤＮＡなどの環状ＤＮＡ分子を増幅する、幾つかの方法が用いられている。１つは、大腸菌の適切な宿主株内でこれらの分子を増殖させ、その後、十分確立されたプロトコルによって、ＤＮＡを単離することであった（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。ＰＣＲも、Ｍ１３のようなバクテリオファージからのプラスミドやＤＮＡなど、ＤＮＡ標的内の所定の配列を増幅するのに頻繁に使用される方法であった（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０，Ｅｄ．Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。これらの方法の幾つかは、困難で、費用がかかり、時間もかかり、非効率的で、感度に欠けている。
【０００４】
これらの方法に対する改善策として、線形ローリングサークル増幅（ＬＲＣＡ）では、環状標的ＤＮＡ分子にアニールしたプライマーを使用し、ＤＮＡポリメラーゼを添加する。増幅標的環（ＡＴＣ）は、新しいＤＮＡが作製される鋳型を形成し、それによって、環に相補的な反復配列の連続配列としてプライマー配列が伸長するが、１時間当たり数千程度のコピーしか生成されない。ＬＲＣＡに対する改善策は、指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）を、複製済みの相補配列にアニールする追加のプライマーと共に使用して、増幅の新しい中心を提供し、それによって、指数関数的動態をもたらし且つ増幅を増大させることである。指数関数的ローリングサークル増幅（ＥＲＣＡ）では、鎖置換反応のカスケードを用いるが、これはＨＲＣＡとも呼ばれる（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３１（１９９８））。しかしＥＲＣＡは、プライマーＰ１に特異的なＤＮＡ配列を知る必要があるために、また一本鎖ＤＮＡ環になる環状ＤＮＡ標的分子が必要であるために、環状ＤＮＡ標的分子にアニールした単一のプライマーＰ１だけの使用に限定される。
【０００５】
米国特許第６３２３００９号（米国特許出願第０９／９２０５７１号）では、標的ＤＮＡ分子を増幅する手段が導入されている。そのような増幅したＤＮＡは、ＤＮＡの配列決定、クローニング、マッピング、遺伝子型判定、ハイブリダイゼーション実験用のプローブの生成、及び診断同定を含めた後続の方法で頻繁に使用されるので、上記方法は価値あるものである。
【０００６】
米国特許第６３２３００９号の方法（本明細書では、多重開始増幅（ＭＰＡ）と呼ぶ）では、個々の標的環を増幅するのに複数のプライマーを使用することによって、線形ローリングサークル増幅の感度を向上させる手順を用いることによる欠点が回避される。ＭＰＡ法には、各環状標的ＤＮＡ分子から複数のタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）コピーを生成するという利点がある。さらにＭＰＡには、場合によっては環状標的ＤＮＡ分子の配列が未知のものである可能性があるが、同時に環状標的ＤＮＡ分子は一本鎖（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖（ｄｓＤＮＡ又は二重鎖ＤＮＡ）になる可能性があるという利点がある。ＭＰＡ法の別の利点は、一本鎖又は二本鎖環状標的ＤＮＡ分子の増幅を、等温的に且つ／又は室温で実施することができるということである。その他の利点には、ローリングサークル増幅の新しい用途で非常に有用であること、低コストであること、低濃度の標的環に感度があること、特に検出試薬の使用において柔軟性があること、及び汚染の危険性が低いことが含まれる。
【０００７】
ＭＰＡ法は、反応中に存在する可能性のあるエキソヌクレアーゼ活性による分解に耐性のある、複数のプライマーを使用することによって、増幅産生ＤＮＡの収量を向上させることができる。これには、エキソヌクレアーゼ活性を含み且つ長期のインキュベーション期間にわたり実施される可能性のある反応に、プライマーが関与し続けられるという利点がある。プライマーのこの持続性によって、反応のインキュベーション期間全体にわたり、新たな開始事象を引き起こすことが可能になるが、これはＥＲＣＡの顕著な特徴の１つであり、増幅したＤＮＡの収量を増大させるという利点がある。
【０００８】
ＭＰＡ法では、初めて、環内に閉じ込められている公知の又は未知の標的ＤＮＡの「生体外クローニング」が可能になり、即ち生物にクローニングすることを必要とせずに、そのクローニングが可能になる。ギャップ補充法によって環内に標的配列をコピーするのに、パドロックプローブを使用することができる（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３１（１９９８））。或いは標的配列を、多くのその他の一般に使用されている方法によって、環状ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡ内にコピー又は挿入することができる。ＭＰＡ増幅は、生物体内でクローニングすることによってＤＮＡの増幅収量をもたらすという必要性を克服する。
【０００９】
ＭＰＡ法は、合成速度及び収量を増大させることが可能な、ＬＲＣＡに優る改善策である。これは、ＤＮＡポリメラーゼ伸長に関する複数のプライマー部位から得られる。ランダムプライマーＭＰＡには、二本鎖産物を生成するという利点もある。これは、環状鋳型をコピーすることによって生成した線状ｓｓＤＮＡ産物そのものが、ＤＮＡ合成のランダム開始によって二重鎖の形に変換されるからである。二本鎖ＤＮＡ産物は、どちらの鎖のＤＮＡ配列決定も可能にし、また制限エンドヌクレアーゼ消化を可能にするのに有利であり、さらにクローニング、標識、及び検出で使用されるその他の方法においても有利である。
【００１０】
鎖置換ＤＮＡ合成は、ＭＰＡ法の実施中に引き起こされる可能性があり、指数関数的増幅をもたらすことも予測される。これは、ＨＲＣＡ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８））とも呼ばれる従来のＥＲＣＡに優る改善策であり、非常に大きい線状又は環状ＤＮＡ標的を指数関数的に増幅することができる。細菌性人工染色体（ＢＡＣ）を含めた大きい環状ＤＮＡの増幅は、ＭＰＡ法を使用して実用化されてきた。
【００１１】
縮重プライマー（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４６７６−１４６７９（１９９６））及びランダムプライマー（Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５８４７−５８５１（１９９２））を使用した全ゲノム増幅に関する方法が公表されており、ゲノムＤＮＡなど標的の複合混合物のサブセットが増幅される。複雑さを低下させることが、これらの方法の目的である。ＭＰＡ法のその他の利点は、「サブセット化」又はＤＮＡ標的の複雑さを低下させる必要なく、ＤＮＡ標的分子を増幅することである。
【００１２】
ＭＰＡ法は、そこで使用されるＤＮＡの全てのサンプルを素早く増幅し、二本鎖産物は、当初のサンプルと全く同じ配列を有する。非常に数多くの始動（開始）部位を有するタンデム状に反復したＤＮＡのコピーを含有することを除き、産生ＤＮＡの物理的性質は、出発時の鋳型の性質と非常によく似たものである。
【００１３】
Ｄｉｅｒｉｃｋ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｈ  ２１，４４２７−８（１９９３）は、ｄＧＴＰアナログｄＩＴＰ又は７−デアザ−ｄＧＴＰを使用した５６０ｂｐ配列のＰＣＲ増幅について述べている。ここでは、引き続き磁気ビーズを使用してＰＣＲ産物鎖を分離し、それらの配列決定をする場合、ｄＧＴＰアナログ、特にｄＩＴＰを使用してＰＣＲを実施したときに、改善された配列が得られることが報告されている。おそらくこれは、産生ＤＮＡ鎖の長さは確定されているが、その鎖の物理的性質が変化した結果であろう。しかしこの方法は、配列決定すべき領域に対して２個のＰＣＲプライマー配列を特異的にすることができる状況でのみ機能するものであり、ＰＣＲによって容易に増幅することのできる、最大でも約１０００のヌクレオチドの配列に限定され、さらに、増幅のために熱サイクルを必要とする。
【００１４】
したがって、ＰＣＲに制約のない増幅方法が求められている。例えばＰＣＲでは、１つのヌクレオチドへの別のヌクレオチドから置換する率は、特にｄＧＴＰからｄＩＴＰへ置換する場合、制限される恐れがある。さらに、ｄＩＴＰを使用したときのＰＣＲの忠実度が、損なわれることが分かっている。これらの問題について、以下にさらに詳細に述べる。
【特許文献１】米国特許第６３２３００９号明細書
【非特許文献１】Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｓｈａｈｗａｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５：１１７−１２６（１９９１）
【非特許文献２】Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：１９９−２０２（１９９３）
【非特許文献３】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４】ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０，Ｅｄ．Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
【非特許文献５】Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３１（１９９８）
【非特許文献６】Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４６７６−１４６７９（１９９６）
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５８４７−５８５１（１９９２）
【非特許文献８】Ｄｉｅｒｉｃｋ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｈ  ２１，４４２７−８（１９９３）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって本発明の目的は、たとえ配列が分からなくても任意のＤＮＡに使用することができ、正常なヌクレオチドからヌクレオチドアナログへの完全又はほぼ完全な置換をもたらすことができ、さらに、０℃に至る温度で等温的に実施することができる、新しい増幅方法を提供することである。この目的及びその他の目的は、配列決定又はその他の下流の分析目的で使用することのできるＤＮＡを調製する際に、非天然ヌクレオチドを使用した改良ＭＰＡ（ｍＭＰＡ）を用いる本発明に、適合するものである。
【００１６】
本発明は、特異的プライマー又はランダムプライマーを使用してＤＮＡ標的の増幅を高めるための方法に関する。特定の実施形態では、本発明のこの態様は、ＲＣＡからの増幅産物の収量を増大させるため、標的ＤＮＡ分子にアニールした複数のプライマー（特異的又はランダムなエキソヌクレアーゼに対して感受性があり、又はエキソヌクレアーゼに対して耐性がある）を用いる。複数のプライマーは、標的ＤＮＡ上の複数の位置にアニールし、ポリメラーゼによる伸長は、各位置から開始される。このように、複数の伸長が、標的ＤＮＡから同時に実現される。伸長プロセスは、１個以上のヌクレオチドアナログの存在下、任意選択で４個の正常なヌクレオチド全ての存在下で実施される。ヌクレオチドアナログは、その配列の内容を変化させることなく、産生ＤＮＡに独特の性質を与える。
【００１７】
複数のプライマーの使用は、幾つかの異なる方法で実現される。標的ＤＮＡ上の異なる配列にアニールする２個以上の特異的なプライマーを使用することによって、又は標的ＤＮＡ上の２カ所以上の個別の位置で反復した配列に対して１つの所与のプライマーアニールを有することによって、又は標的ＤＮＡ上の多くの位置にアニールすることのできるランダムプライマー又は縮重プライマーを使用することによって、実現される。
【００１８】
特に有利な実施形態では、増幅反応混合物中のｄＧＴＰの一部又は全ての代わりに、ｄＩＴＰを用いる。ｄＩＴＰの添加は、分かっていることであるが、ＭＰＡ反応に悪影響を与えず、かなりの量の増幅核酸を生成する。
【００１９】
しかし、ある特定の人為的電気泳動産物を防止するためにｄＩＴＰも利用する、現行のダイターミネーターサイクルシーケンシング法を使用して配列決定を行うことが、特徴的に難しい一群のＤＮＡ配列がある。この群に属する配列は全て、複雑さが低く、Ｇ及びＣに含量の高い反復配列を有し、これらの配列は、自己相補的で、ヘアピン型の２次構造を形成できることを示唆する対称性を有している。ＤＮＡ配列決定で必要とされるＤＮＡ合成中、新たに合成したＤＮＡ鎖（ｄＩを含有）は、これらの反復配列で、比較的高い温度でのサイクルシーケンシング中に特により強力な塩基対を形成するｄＧを含有する、鋳型ＤＮＡ鎖に取って代わることができる。本発明者等は、鋳型の鎖の中でｄＧをｄＩに置換することによって、この特定群の配列決定が極めて困難なＤＮＡが排除されること、及び配列分析用の鋳型ＤＮＡを調製するために、この置換が、ｍＭＰＡを使用することにより実に簡単に行われることを見出した。
【００２０】
別の実施形態では、ＭＰＡ反応で使用したデオキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸（ｄＮＴＰ）を、それらのアナログによって置換することができ、これが組み込まれると、増幅産物のＴｍが低下する。例えばｄＧＴＰは、７−デアザ−ｄＧＴＰ（Ｓｅｅｌａ、米国特許第４８０４７４８号及び同第５４８０９８０号）、７−デアザ−ｄＩＴＰ、７−置換−７−デアザ−ｄＩＴＰ又はｄＧＴＰ（Ｆｕｌｌｅｒ、ＭｃＤｏｕｇａｌｌ及びＫｕｍａｒ、英国特許出願公開第２３２３３５７号）によって置換することができる。同様に、ｄＡＴＰは、７−デアザ−ｄＡＴＰ又は関連するアナログによって置換することができ、ｄＣＴＰは、Ｎ４−アルキル−ｄＣＴＰ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，２７０９−１４）、５−アルキル−ｄＣＴＰ，又は関連するアナログによって置換することができ、ｄＴＴＰは、５−置換−ｄＴＴＰによって置換することができる。
【００２１】
幾つかの実施形態では、ＭＰＡ用のプライマーが、全てのタイプの修飾ヌクレオチドを含めたヌクレオチドを含有し、したがってこれらのヌクレオチドは、プライマーを酵素分解に対して耐性にする役割を果たすことができる。酵素分解は、ＤＮＡポリメラーゼに関連する３′５′エキソヌクレアーゼ活性などの特異的エキソヌクレアーゼによって、又は非特異的な汚染性エキソヌクレアーゼによって引き起こされる可能性がある。
【００２２】
本発明の目的及び特徴は、添付図面と併せて、以下の本発明の詳細な記載を検討することによって、より十分に明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、ＤＮＡの分析に関し、より詳細には、しばしば遺伝子型の決定に使用されるＤＮＡの配列、並びに当初の配列情報に依存する分析に関する。また本発明は、ＤＮＡ配列の増幅にも関する。増幅は、当初の配列に相補的な配列を有し且つ当初の配列情報を保存する、ＤＮＡの新しい鎖の合成を意味する。ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）などの幾つかの増幅方法は、非常に特異的であり、長さの決まった増幅産物をもたらすが、その他は一般的で、サンプル中に存在するＤＮＡ配列の全てを増幅し、長さが様々な産物をもたらすが、それでもなお当初の配列情報を含んでいる。この後者の種類の増幅例は、米国特許第６３２３００９号に記載されているＭＰＡである。
【００２４】
本発明は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定するための方法と定義されるＤＮＡ配列決定にも関し、連鎖停止剤が取り込まれるまでプライマーを伸長させる条件下、オリゴヌクレオチドプライマー、複数のデオキシヌクレオチド三リン酸、１種以上の連鎖停止剤、及びＤＮＡポリメラーゼと共に核酸分子をインキュベートする段階を含む。生成物をサイズに応じて分離し、検出し、それによって、当初のＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部を決定することができる（例えば米国特許第５６３９６０８号参照）。
【００２５】
より有利な配列決定法は、ジデオキシヌクレオチド停止剤によるサイクルシーケンシングである。サイクルシーケンシングでは、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して同じ鋳型から実施される、多数回のＤＮＡ合成がなされる。新たに合成した鎖は、熱変性によって、各合成サイクル後に鋳型の鎖から除去するが、このようにすることによって、配列決定プロセスで生成した鎖の数を増幅し、非常に少ない量のＤＮＡ鋳型を配列決定することが可能になる（米国特許第５６１４３６５号）。サイクルシーケンシングを行うのに特に有用な方法は、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼ、及び蛍光標識したジデオキシヌクレオチド停止剤を用いたものである（例えば、米国特許第５３６６８６０号）。これは、配列決定の最も一般的な方法であり、典型的な場合は電気泳動アーチファクトを無くすのにｄＩＴＰを利用し、４種のヌクレオチド塩基に対して４つの異なる蛍光標識を利用する。
【００２６】
ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）は、核酸又は核酸の混合物に含有される、１以上の特定の核酸配列を増幅するための方法と定義され、ここで核酸は、２個の個別の相補鎖からなるものである。まず、１個のプライマーから合成した伸長産物が、その補体から分離したときに他方のプライマーの伸長産物の合成用の鋳型として働くことができる条件下、特定の配列を増幅するために、これらの鎖を２個オリゴヌクレオチドプライマーと合わせる。ＤＮＡポリメラーゼを使用してプライマーを伸長し、次いで伸長産物が合成されている鋳型から、この伸長産物加熱することにより変性させて、一本鎖分子を生成する。アニーリング温度まで冷却したら、生成した一本鎖分子をプライマーとアニールし、再びＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる。このプロセスを１回以上回繰り返すことにより、開始部位の「間」の配列の指数関数的増幅が行われる（米国特許第４６８３２０２号）。
【００２７】
一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）は、多型の検出に使用することができるプロセスである（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ８６（８），Ａｐｒｉｌ  １９８９  ２７６６−７０；  Ｌｅｓｓａ−ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｅｃｏｌ  ２（２），ｐ．１１９−２９  Ａｐｒｉｌ  １９９３）。本質的には、標識したＤＮＡ変性断片を、変性能のない電気泳動ゲルに付着させる。多型（配列変異）がその断片中に存在する場合、一本鎖断片の高次構造は種々の配列に応じて異なるので、ゲル上に複数のバンドを観察することができる。
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、核酸が、相補的配列を有するその他の核酸鎖と特異的に結合する、という生来の性向を使用する技法である。事実、全ての分子生物学実験はハイブリダイゼーションを特徴とし、例えば配列決定用プライマーは、配列決定鋳型とハイブリダイズする。同様に、ＰＣＲプライマーは、所望の鋳型の鎖とハイブリダイズする。より一般的なハイブリダイゼーション実験では、「サザン」ハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９７５  ９８（３）：５０３−１７）、「ノーザン」ハイブリダイゼーション（Ａｌｗｉｎｅ  ｅｔ．Ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９７７；  ７４（１２）：５３５０−４）、及びより最近ではマイクロアレイハイブリダイゼーション（例えば国際公開第９２１０５８８号参照）と様々に呼ばれる技法で、固定した核酸と可溶性の標識済み又はタグ付き核酸とのハイブリダイゼーションを行うことができる。本発明は、ＤＮＡ合成を大幅に増幅し、ＤＮＡの量を大幅に増大させて、例えば標的ＤＮＡに含有される特異的核酸配列の検出を行うための手段としての、核酸配列増幅における複数のプライマーの使用に関する。前述の方法は、かなり複雑な標的をしばしば用いてきたが、本発明は、単純なプラスミド、コスミド、及び細菌性人工染色体（ＢＡＣ）標的など、比較的単純な標的を利用する。本発明に有用な標的ＤＮＡには、線状ＤＮＡ、さらに高分子量の線状ＤＮＡも含まれる。
【００２９】
本発明はさらに、増幅反応混合物中の正常なヌクレオチド（例えばｄＧＴＰ）の一部又は全てと修飾ヌクレオチドアナログ（例えばｄＩＴＰ、２′−デオキシイノシン三リン酸）との置換によって、配列決定される能力及び変化した温度でハイブリダイズする能力も含め、著しく向上した性質を有する増幅産物が生成される、という発見に関する。
【００３０】
さらに、その他の方法では、それほど複雑ではない増幅物質の集合体が生成されるよう、かなり複雑な標的ＤＮＡ分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡを含めた核酸であり、これらは、サンプル中に存在することが検出され又は配列が増幅されて、例えば、引き続き実施される方法又は手順で使用されるものであり、或いは、サンプル中に存在することにより、配列が増幅されることになる１種以上のその他の核酸の同定が行われる）のランダムサブセットを増幅する試みがなされてきたが、本発明は、標的中に存在する全ての配列の増幅に関するものであり、いかなる配列の複雑さの低減に関する試みもなされていない。
【００３１】
一実施形態では、複数のポリメラーゼもさらに含めたポリメラーゼ、ランダム配列ヘキサマーなどのヌクレアーゼで保護したオリゴヌクレオチドプライマー、必要とされるヌクレオシド三リン酸、適切な緩衝液、任意選択のポリホスファターゼ、及びその他の潜在的に望ましい成分を含む、キットの形をとるようなプレミックスを提供することができ、このような構成要素のそれぞれは、個別のバイアルに入れられ、或いは種々の組合せで一緒に混合されて、合計で１個、２個、３個又はそれ以上の個別のバイアルと、例えば増幅プロセスで使用される対象の標的核酸を懸濁させるための、ブランク又は緩衝液のバイアルとが形成されるようになされる。本発明の一実施形態は、ヌクレアーゼ耐性ランダムプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む、ＤＮＡ配列を増幅するためのキットを含む。別の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼが３′５′エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼがφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。最も好ましい実施形態では、正常なｄＮＴＰの１種以上を、全体的に又は部分的にアナログに代え、即ちそのアナログが産生ＤＮＡ中に存在することによって、産生ＤＮＡに又は配列依存性分析などの後続のプロセスに、幾つかの有利な性質が与えられるアナログに代える。
【００３２】
そのような実施形態の特定の用途では、ＤＮＡなどの核酸のサンプルをＴＥ緩衝液などの緩衝液に懸濁させ、次いで加熱し、冷却し、次いで上記列挙した構成成分と順次接触させ、或いは、前述のプレミックスのような構成要素を、温度やｐＨなどの条件を引き続き調節した状態で添加することにより、例えばそのような組合せを１０℃で維持することによって、接触させるプロセスが提供される。
【００３３】
さらに、本発明により開示したプロセスを実施するのに使用される条件は、任意の所与の用途で実施する間、変化させることができる。したがって非限定的な例として、プライマー及び標的ＤＮＡを、ハイブリダイゼーションが促進する条件下で添加することができ、ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸は、ポリメラーゼに対する基質又はポリメラーゼとして働くプライマー−標的複合体の変性を引き起こすことなく増幅を促進させる、種々の条件下で添加することができる。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、標的ＤＮＡが、少なくとも３、４、５、さらには１０個以上のプライマーオリゴヌクレオチドと結合又はハイブリダイズし、プライマーのそれぞれが、適切な条件下で個別のタンデム配列ＤＮＡ分子を生成するものである、本明細書に記載されるプロセスに関する。当然ながらタンデム配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）の配列は、鋳型として働く標的ＤＮＡの配列と相補的であるので、ＴＳ−ＤＮＡ産物は全て、プライマーの配列とは無関係に標的ＤＮＡと同じ配列を有することになり、またＴＳ−ＤＮＡ産物のヌクレオチド含量は、増幅プロセスで使用した１種以上のＤＮＡポリメラーゼの選択能を受ける増幅に使用される、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログの混合物によって決定されよう。
【００３５】
増幅プロセスで有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の所望の長さにすることができる。例えばそのようなプライマーは、少なくとも２ヌクレオチドから約３０〜５０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドの長さ、最も好ましくは約５ヌクレオチドから約１０ヌクレオチドの長さのものでよく、ヘキサマー及びオクタマーが特に好ましい実施形態である。本明細書で使用するような複数のプライマーは、等しく特異的なものだけでよく、又はランダム配列だけでよく、又はこれらの混合物でよく、ランダムプライマーは、形成し使用するのに特に有用であり便利である。
【００３６】
本発明のプロセスで有用な増幅標的ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、一般に４０〜１００００のヌクレオチドを含有するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子が含まれる。しかし、特に短いランダム配列プライマーを使用する場合、標的のサイズには上限がないことが予測される。標的が二重鎖である場合、そのような数は、個々のヌクレオチド残基ではなく塩基対を指すものとする。本明細書に開示したプロセスで有用な標的鋳型は、機能上異なる部分、又はセグメントを有してよく、そのため種々の目的に特に有用なものになる。そのような少なくとも２つの部分は、１個以上のオリゴヌクレオチドと相補的になり、存在する場合にはプライマー相補部分又は部位と呼ぶ。本発明で有用な増幅標的には、例えば細菌コロニーやバクテリオファージ、ウイルスプラーク、酵母コロニー、バキュロウイルスプラーク、並びに一時的にトランスフェクトした真核細胞などの供給源から直接得られたものが含まれる。そのような供給源は、標的を得る前に溶解しても溶解しなくてもよい。そのような供給源を溶解させた場合、そのような溶解は、一般に幾つかの手段によって実現され、この場合、溶解剤は熱、酵素であって、後者には、リゾチームやヘリカーゼ、グルシラーゼ、ザイモリアーゼなどが含まれるがこれらに限定されない酵素が含まれ、又はそのような溶解剤は、有機溶媒でよい。
【００３７】
ＭＰＡでは、増幅が各プライマーで生じ、それによって、各プライマーにより複製される、１次ＡＴＣ（又はＡＴＣ）に相補的なセグメントのタンデムリピートのコンカテマー（即ちＴＳ−ＤＮＡ）が形成される。したがってランダムプライマーを使用する場合、多くのそのようなＴＳ−ＤＮＡが各プライマーから１つ形成されて、対応する配列の増幅を大幅に増大させるが、これは、生成物のヌクレオチド配列又は構造が、鋳型の配列のみに依存するものであり、オリゴヌクレオチドプライマーがランダムなものであろうと又は特異的なものであろうと、或いはこれらの混合物であろうと、このオリゴヌクレオチドプライマーの配列には依存しないからである。
【００３８】
本発明で使用する増幅方法は、エキソヌクレアーゼ耐性プライマー（以下に述べる）と共に、この反応に好ましい酵素としてφ２９ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを使用する線状ＤＮＡ標的の増幅において、ランダム又は複数のプライマーの使用が容易になることにより、公表済みの改良ＰＣＲ法とは明らかに異なっている（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，Ｖ．Ｇ．ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１４６７６−１４６７９（１９９６）；及びＺｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，５８４７−５８５１（１９９２）参照）。したがって本発明は、高分子量ＤＮＡを含めた線状ＤＮＡ標的、並びにゲノム及びｃＤＮＡを増幅するための方法であって、φ２９ＤＮＡポリメラーゼと、φ２９ＤＮＡポリメラーゼに関連する３′５′エキソヌクレアーゼ活性に適合したエキソヌクレアーゼ耐性プライマーとの特徴を利用する方法を含み、線状ＤＮＡ標的は、環状ＤＮＡの代わりに又は環状ＤＮＡに加えて使用することができるものである。
【００３９】
二重環を用いる場合、増幅は、一般に、鋳型としての両方の鎖から引き起こされることになる。両方の環の同時増幅は、望んでも望まなくてもよい。二重環を、これらの環のＤＮＡの配列決定がなされるよう設計した反応でさらに用いる場合、両方の鎖を増幅することは望ましい特徴であり、したがって二重環を、さらに処理することなく（必要な場合はニックを形成することを除き）直接用いることができる。しかしその他の用途において、両方の鎖の同時増幅が望ましい特徴ではない場合、本発明のプロセスによって増幅前に鎖を変性し分離すること、或いは、二重環状鋳型の２本の鎖の一方のみに相補的な配列を含有する複数の特異的プライマーを用いることは、十分に当業者の範囲内にある。確かに、その他の有用な戦略は当業者には自明であり、本明細書でこれ以上説明する必要はなかろう。
【００４０】
ある状況では、生ずる増幅の程度を定量的に決定することが望ましいと考えられる。そのような場合、本発明の増幅段階は、特定のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を利用するなどの任意の数の標準的な検出スキームと共に十分機能し、そのため定量測定がより容易になる。最も一般的な例は、そのようなヌクレオチド基質が放射標識されているか、又は蛍光標識などのある他種の標識を結合していることである。これらは典型的な場合、産生ＤＮＡの組成の乱れが最小限に抑えられるように、微量で使用される。この場合も、そのような状況で用いることのできる方法は数多く、それに関係する技法は標準的で、当業者に周知である。したがって、そのような検出標識は、増幅した核酸に直接又は間接的に結び付けることができ、且つ直接又は間接的に測定可能で検出可能なシグナルをもたらす任意の分子を含む。核酸に組み込み又は核酸プローブに連結されるそのような多くの標識は、当業者に知られている。一般的な例には、放射性同位元素、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体、及びリガンドが含まれる。そのような微量の標識済み又はタグ付きヌクレオチドの使用は、産生ＤＮＡの融解温度を１℃程度から２０℃程度又はそれ以上に変化させるなど、産生ＤＮＡの物理的性質を著しく変えるのに十分な量のヌクレオチドアナログを使用する場合とは、明らかに異なると考えられる。
【００４１】
適切な蛍光標識の例には、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能な、Ｃｙ２やＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５などのＣｙ染料が含まれる（米国特許第５２６８４８６号）。適切な蛍光標識のその他の例には、フルオレセイン、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、及びローダミンが含まれる。好ましい蛍光標識は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）及びローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。これらは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏを含めた様々な商業上の供給元から得ることができる。
【００４２】
標識したヌクレオチドは、合成中に増幅産物に直接組み込むことができるので、検出標識の好ましい形態である。増幅したＤＮＡに組み込むことができる検出標識の例には、ＢｒｄＵｒｄ（Ｈｏｙ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｍｋｅ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９０：２１７−２３０（１９９３））やＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２２：２８３−２９３（１９９３））などのヌクレオチドアナログ、及びビオチンで修飾したヌクレオチド（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：６６３３（１９８１））、又はジゴキシゲニンなどの適切なハプテンで修飾したヌクレオチド（Ｋｅｒｋｈｏｆ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：３５９−３６４（１９９２））が含まれる。適切な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチアチアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰ、及びシアニン−５−ｄＵＴＰである（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））。ＤＮＡ用の好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）であり、好ましいヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５′−三リン酸（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。放射標識は、本明細書で開示した増幅方法に、特に有用である。したがって、そのようなｄＮＴＰは、本明細書で述べた蛍光標識など、容易に検出可能な部分を取り込むことができる。
【００４３】
本発明の方法は、増幅の標的である分子上に複数の開始事象が誘発されるので、高い増幅速度をもたらす。したがって、増幅の速度及び程度は、ＤＮＡ環をコピーする単一のＤＮＡポリメラーゼによって実現されるものに限定されない。代わりに、複数のＤＮＡポリメラーゼが誘発されて、各鋳型の環を同時にコピーし、プライマーの１つからそれぞれ１つが開始される。この特徴は、本発明の方法固有の利点を提供し、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰなどのヌクレオチドアナログを使用することによって、低下した合成速度を補うことである。
【００４４】
本明細書に開示したエキソヌクレアーゼ耐性プライマーは、エキソヌクレアーゼ消化に対して耐性を持たせるため、修飾ヌクレオチドを含んでよい。例えばプライマーは、プライマーの３′末端のヌクレオチド同士の間に、１、２、３、又は４個のホスホロチオエート結合を保有してよい。
【００４５】
したがって幾つかの実施形態で、増幅段階は、プライマーが、一般に酵素によって、特にエキソヌクレアーゼによって、最も特別には３′５′エキソヌクレアーゼ活性によってこのプライマーを分解しにくくする１以上のヌクレオチドを含有するプロセスに関する。そのような実施形態では、１以上のヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドでよく、又はいくらか修飾したヌクレオチドでよい。そのようなヌクレオチドは、一般に３′末端ヌクレオチドであるが、本発明の方法は、そのようなヌクレオチドが３′末端部位以外に位置付けられ、プライマーの３′末端ヌクレオチドを３′５′エキソヌクレアーゼ活性によって除去することができる実施形態にも関する。
【００４６】
標的鋳型又はオリゴヌクレオチドプライマーと固体担体との結合は有利な場合があり、プライマー又は標的鋳型を固体担体に結合するのに有効なある種のポリマー（生物由来又はその他）などの幾つかの分子種によって実現できる。そのような、本発明の方法で有用な固体担体は、オリゴヌクレオチドを連結することができる任意の固体材料を含むことができる。その材料には、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸などの材料が含まれる。固相基質は、薄膜又はメンブラン、ビーズ、ボトル、皿、繊維、織られた繊維、成形したポリマー、粒子、及び微粒子を含めた任意の有用な形を有することができる。固相基質に好ましい形は、ガラススライド又はマイクロタイターディッシュ（例えば、標準的な９６ウェルディッシュ）である。好ましい実施形態では、担体としてガラス又はプラスチックを利用する。別の配置構成に関しては、米国特許第５８５４０３３号に記載されているものを参照されたい。
【００４７】
オリゴヌクレオチドを固相基質に固定化するための方法は、十分確立されている。アドレスプローブ及び検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立された連結方法を使用して、基質に連結することができる。例えば適切な結合方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６（１９９４）に記載されている。オリゴヌクレオチドを固相基質に結合させる好ましい方法は、  Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
【００４８】
本発明で有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、確立されたオリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で周知である。そのような方法は、標準的な酵素消化の後にヌクレオチド断片の単離を行うこと（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９），Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９７）、及びＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，１９９７）参照）から、純粋な合成方法、即ちＭｉｌｌｉｇｅｎ又はＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成器（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．のＭｏｄｅｌ  ８７００自動合成器、又はＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用したシアノエチルホスホラミダイト法による合成方法にまで及ぶ。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成方法も、Ｉｋｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６（１９８４）（リン酸トリエステル法及び亜リン酸トリエステル法）、及びＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：６１０−６２０（１９８０）（リン酸トリエステル法）に記載されている。タンパク質核酸分子は、  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．５：３−７（１９９４）に記載されているような公知の方法を使用して、作製することができる。
【００４９】
化学的硫酸化作用によって、エキソヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートジエステルを含有するプライマーを合成するための方法は、十分確立されている。ランダムプライマーの固相合成は、３′末端に、１個又は数個の特異的に配置したヌクレオチド間ホスホロチオエートジエステルを用いる。ホスホロチオエートトリエステルは、ホスホロチオエートトリエステルがチオンとして存在する５価のリンが生成されるように、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシドｓｕｐ．１，２又はＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いてホスホラミダイトの化学作用中に得られた中間亜リン酸トリエステルを酸化することにより、導入することができる。このように形成したチオンは、ヌクレオチド間ホスホジエステルを生成するのに必要な、後続の酸化段階に対して安定である（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｅｇａｎ，Ｗ．，Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１２：  １２５３（１９９０）及びＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｌ．Ｒ．，Ｅｇａｎ，Ｗ．，Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ  Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５５：  ４６９３（１９９０））。
【００５０】
本明細書に記載したオリゴヌクレオチドの多くは、他のオリゴヌクレオチド又は核酸のある特定の部分に相補的になるよう設計され、その結果、それらの間にハイブリッドが形成されるようになる。これらハイブリッドの安定性は、Ｌｅｓｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１０８０７−１０８１５（１９９５），ＭｃＧｒａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６７４−６７８（１９９０）及びＲｙｃｈｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６４０９−６４１２（１９９０）に記載されているような、公知の方法を使用して計算することができる。
【００５１】
等温増幅段階で有用なＤＮＡポリメラーゼを、本明細書では増幅ＤＮＡポリメラーゼと呼ぶ。増幅では、鋳型の鎖に相補鎖を置換すること、即ち鎖置換と呼ばれるものが可能であり、且つ５′から３′のエキソヌクレアーゼ活性の無いＤＮＡポリメラーゼが好ましい。鎖置換は、標的鋳型の複数のタンデムコピーの合成をもたらすのに必要である。５′から３′のエキソヌクレアーゼ活性が存在する場合、合成した鎖の破壊が生ずる。開示した方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼは、非常に前進的であるこも好ましい。開示した方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼの適切さは、それが増幅を行うことができるかどうか評価することによって、容易に判断することができる。好ましい増幅ＤＮＡポリメラーゼ、即ちその全てが３′，５′−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、バクテリオファージ  φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｌａｎｃｏ他の米国特許第５１９８５４３号、及び同第５００１０５０号）、ファージＭ２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ８４：２４７（１９８９））、ファージＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８２８７（１９８７）及びＺｈｕ  ａｎｄ  Ｉｔｏ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：２６７−２７６（１９９４））、ＶＥＮＴ．ＴＭ．ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５（１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４５：６２３−６２７（１９７４））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ９７：１３−１９（１９９１））、及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅｎｋｏｖｉｃ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１４９−１５７（１９９５））である。φ２９ＤＮＡポリメラーゼが最も好ましい。同様に好ましいポリメラーゼには、天然のＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ（Ｔｔｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５７４４３１２号）、及びＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、又はＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼが含まれる。ファージの以下のＤＮＡポリメラーゼ：ファージφ２９、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、φ１５、φ２１、ＰＺＥ、ＰＺＡ、Ｎｆ、Ｍ２Ｙ、Ｂ１０３、ＳＦ５、ＧＡ−１、Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、及びＬ１７から選択されたφ２９型ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。特定の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼがバクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼであり、複数のプライマーがエキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するもので、標的ＤＮＡは、線状ＤＮＡ、特に高分量であり且つ／又は複雑な線状ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡである。
【００５２】
増幅中の鎖置換、特に、二重鎖標的鋳型を鋳型として使用する場合の鎖置換は、ヘリカーゼなどの鎖置換因子を使用することによって、促進させることができる。一般に、鎖置換因子の存在下で増幅を行うことのできる任意のＤＮＡポリメラーゼは、そのような因子が存在しない状態でＤＮＡポリメラーゼが増幅を行わないとしても、本発明の方法で使用するのに適している。増幅に有用な鎖置換因子には、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Ｔｓｕｒｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（１２）：７６４８−７６５３（１９９３））、アデノウイルスＤＮＡ結合性タンパク質（Ｚｉｊｄｅｒｖｅｌｄ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８（２）：１１５８−１１６４（１９９４））、単純ヘルペスウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Ｂｏｅｈｍｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７（２）：７１１−７１５（１９９３）；  Ｓｋａｌｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（２２）：１０６６５−１０６６９（１９９４））、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ；  Ｒｉｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｍａｎｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：８９１０−８９１９（１９９５））、及び子牛胸腺ヘリカーゼ（（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６７：１３６２９−１３６３５（１９９２））が含まれる。
【００５３】
ポリメラーゼが増幅を行うことのできる能力は、Ｆｉｒｅ  ａｎｄ  Ｘｕ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４６４１−４６４５（１９９５）及びＬｉｚａｒｄｉ（米国特許第５８５４０３３号、例えばその実施例１）に記載されているようなローリングサークル複製アッセイで、ポリメラーゼを試験することによって決定できる。
【００５４】
別の特定の実施形態では、標的ＤＮＡは、例えば一本鎖バクテリオファージＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡプラスミド、又はその他のベクターでよく、これらは、ＤＮＡの配列決定、クローニング又はマッピング、及び／又は検出を目的として増幅されるものである。以下の実施例は、特定のプロトコルを提供するが、条件は、増幅され且つ分析され又は配列決定されることになるＤＮＡの同一性に応じて変えることができる。
【００５５】
本発明は、増幅中に使用されるヌクレオチドを変化させることによって、産生ＤＮＡの物理的性質、特にＴｍや融解温度を変化させる能力に関する。実際に、標的鋳型の増幅は厳密には必要ではなく、幾つかの用途では、物理的性質が変化した鋳型の単なる複製だけで十分であると考えられるが、とにかく増幅が望ましいほとんどの実用的な用途に関しては、この段階を本発明者等は「増幅」と呼ぶ。
【００５６】
米国特許第６３２３００９号（米国特許出願第０９／９２０，５７１号も参照）には、標的ＤＮＡ分子を増幅する手段が記載されている。この方法の幾つかの実施形態は、当初の標的サンプル中に存在する配列全ての複数のコピーを生成するために、標的ＤＮＡに非常に過度に添加したランダム配列ヘキサマープライマー、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ、及び４種の正常なｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）を使用することを特徴とする。生成物が出発時の標的と同様であるかをチェック１つの方法は、生成物と出発時の標的鋳型との両方のＴｍを測定することである。もう１つの方法は、制限エンドヌクレアーゼを使用して産生ＤＮＡ及び当初の標的ＤＮＡを消化し、消化産物のサイズをゲル電気泳動により比較することである。同様に、標的と産生ＤＮＡの両方に関して、配列分析を行うことができる。
【００５７】
そのような比較を行った場合、Ｔｍ、制限消化、及び配列情報は、通常これらの方法によって測定することのできるパラメーターに関し、産生ＤＮＡが出発時の標的ＤＮＡと同じであることを明らかに示していた。したがって、産生ＤＮＡの全体的な分子サイズは出発時の標的ＤＮＡよりも非常に大きくなるが、その制限消化パターン、融解温度、及び配列は同じである。
【００５８】
しかし本発明者等は、この増幅方法によって生成したＤＮＡが一貫して高品質であり且つ高純度であるにも関わらず、配列分析を妨げ、反復領域で停止する特徴的な配列パターンをもたらす生成物が、いくらか残されていることを見出した。これらの配列は、より大量の培養物を増殖させ、またＤＮＡを増幅することなく宿主細菌から直接精製するなどの代替の手段によってＤＮＡを増幅したときに、同様に機能しなくなった。
【００５９】
本発明者等は、反応の温度及び時間を変更すると、ｄＧＴＰなどの正常なヌクレオチドをｄＩＴＰなどのアナログに完全に代えた場合であっても、正常なヌクレオチドのアナログを使用して鋳型ＤＮＡの増幅を実施できることも見出した。この結果、正常なヌクレオチドで作製したＤＮＡよりも最大２６℃低くなるＴｍ値を有する、注目すべき増幅産物が得られる。これは、溶媒に４０％ホルムアミドを添加することによって予測される、即ち非常に強力な変性条件で予測される、融解温度の変化に相当する。
【００６０】
本発明者等は、ある一定タイプの鋳型のＤＮＡ配列決定が、本発明の方法によって改善されることを見出したが、これは、その機能性のために核酸鎖のハイブリダイゼーションを利用する分析方法の一例にすぎない。配列決定プロセス中は、有用な結果を得るために、プライマーをその鋳型とハイブリダイズしなければならず、新たに合成した鎖は、その鋳型の鎖とハイブリダイズしたままでなければならない。多くのその他の分析方法は、ハイブリダイゼーション段階を利用する。これらは、サザンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼーションなど固体表面上で行われるハイブリダイゼーション、アレイ上及びマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションを含む。これらはまた、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）、即ちそれ自体は遺伝子型判定及びその他の分析に使用することのできる、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）による増幅も含む。ハイブリダイゼーションは、ＳＳＣＰ分析方法によって感知されるような分子内２次構造（例えば「ヘアピン」構造）を形成するための、自己ハイブリダイゼーションを含むこともできる。制限酵素又はリボヌクレアーゼＨによる消化など、さらに幾つかのヌクレアーゼ消化形態は、分析プロセス全体の一部として核酸鎖のハイブリダイゼーションを利用する。したがって、本発明の幾つかの実施形態は配列分析を特徴とするが、本発明の用途については、一般に核酸鎖のハイブリダイゼーションを利用する分析方法と組み合わせた改良ＭＰＡの使用を含む、任意のプロセスとして、より広く記載されている。
【００６１】
本発明の手順を実施するにあたり、特定の緩衝液、媒体、試薬、細胞、培養条件、及びｐＨなどへの言及は、限定を目的とするのではなく、考察が提示される特定の文脈において興味あるものであり又は価値あるものであると当業者が認めることのできる、全ての関連ある材料を含むように読むべきであると理解すべきである。例えば、ある緩衝系又は培地に別のものから代えて、同一でないとしても同様の結果を依然として実現することが、しばしば可能である。当業者なら、本明細書に開示した方法及び手順を使用して、その目的に最適となるよう、置換を過度な実験をせずに行えるような、系及び方法の十分な知識を持つであろう。本発明について、以下の実施例を参照することによりさらに記載する。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は、本発明の、ある好ましい実施形態を示すが、全ての実施形態の例示を目的とするものではない。これらの実施例は、添付の請求項及び／又は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００６３】
実施例１  標準的な改良多重開始増幅によって作製した、鋳型ＤＮＡの配列決定
ａ）標準多重開始増幅（ＭＰＡ）
二本鎖プラスミドＤＮＡ（例えば、ＣｌｏｎｅｔｅｃｈからのｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡ；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＸＸＵ０２４３３）２ｎｇを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、７５ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、及び０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、ランダムヘキサマー１００ｐｍｏｌ（２００ｎｇ）、及び１００ｎｇ  φ２９ＤＮＡポリメラーゼを含有する２０μｌの反応体積に加えたものから開始して、増幅を行った。反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートして、ＤＮＡを増幅させ、次いで６５℃で１０分間インキュベートして、ポリメラーゼを不活性化した。典型的な収量は、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用した蛍光アッセイによる測定では、ＤＮＡ産物が２〜４μｇである。
【００６４】
ｂ）改良多重開始増幅（ｍＭＰＡ）
上述の標準増幅反応を、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰを省略し、０．４ｍＭ  ｄＩＴＰ単独、又は０．８ｍＭ  ｄＩＴＰと０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰとの混合物に代えることによって改良した。プラスミドＤＮＡ（２ｎｇのｐＮＡＳＳβ）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、７５ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．４ｍＭ  ｄＩＴＰ又は０．８ｍＭ  ｄＩＴＰ及び０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰ、ランダムヘキサマー１００ｐｍｏｌ、及び１００ｎｇのφ２９ＤＮＡポリメラーゼを含有する２０μｌの反応混合物中で増幅した。この反応を、３０℃で１６時間インキュベートして、ｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡを増幅させ、次いで６５℃で１０分間インキュベートして、ポリメラーゼを不活性化した。ｄＩＴＰ単独の場合の典型的な収量は、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した蛍光アッセイによる測定では、ＤＮＡ産物が０．１〜０．３μｇである。ｄＩＴＰとｄＧＴＰとの混合物の場合の典型的な収量は、ＤＮＡが１〜２μｇである。収量は、染料結合の可能性ある差を補正しておらず、個別の実験でのＯＤ２６０の読みは、収量がかなり正確であることを示唆している。全ての場合において、生成したＤＮＡの量は、多重の配列分析に必要とされるよりも多かった。
【００６５】
ｃ）ＤＮＡ配列決定
ＭＨＸＰプライマー（ｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡに特異的）の配列は、５′ＡＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧ３′（配列番号１）である。ＭＨＸＰプライマー  ５ｐｍｏｌ及びＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ停止剤プレミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）８μｌを含有し、且つ水で全体積を２０μｌにした配列決定反応混合物に、各増幅反応混合物５μｌを移した。反応混合物を、９５℃で２０秒間；５０℃で３０秒間；及び６０℃で６０秒間循環させ、これを３０回繰り返した。次いで反応を、製造業者の使用説明書に従って実施される精製及び分析まで、４℃に保った。
【００６６】
サンプルを、ＡＢＩ  ３１００毛管配列決定機器上に流した。ｐＮＡＳＳβに関する、標準多重開始ローリングサークル増幅を使用して得られた電気泳動図を、図１に示す。得られた配列は、約４００ヌクレオチドまで正確であり、塩基３１０と塩基３２０の間でシグナル強度に大きな低下（「停止」）が生じた。改良多重開始ローリングサークル増幅（ｄＩＴＰのみ）を使用したＤＮＡ配列決定電気泳動図を、図２に示す。得られた配列は、約４５０ヌクレオチドまで正確であり、全体を通して比較的均等な強度を有していた（「停止」ではない）。同様の結果が、増幅中に０．８ｍＭ  ｄＩＴＰと０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰの混合物を使用して得られた（図３）。この場合、得られた配列は、少なくとも約６００ヌクレオチドまで正確であり、全体を通して比較的均等な強度を有していた（「停止」ではない）。
【００６７】
以上のように、改良多重開始増幅は、この鋳型に関するＤＮＡ配列決定結果を著しく改善する。
【００６８】
実施例２  標準又は改良多重開始増幅によって増幅した、ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）
実施例１で詳細に述べたように、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ（標準）、或いは０．４ｍＭ  ｄＩＴＰ、又は０．８ｍＭ  ｄＩＴＰと０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰとの混合物を用いた多重開始増幅によって、ＤＮＡ（プラスミドｐＮＡＳＳβ）を増幅した。それぞれ２０μｌである２０種の反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートし、次いで６５℃で１０分間インキュベートした。
２０種の反応混合物の各回分を、一緒に溜めて、エタノールで沈殿させ、１×ＳＳＣ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸Ｎａ３）４００μｌ中に再懸濁した。Ｔｍ測定を行うため、１×ＳＳＣ緩衝液を使用して、２６０ｎｍでのＯＤが０．２〜０．５の範囲内になるよう調節した。２６０ｎｍでのＯＤは、Ｌａｍｂｄａ  ２５ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して、温度を３０℃から９８℃に変化させて測定した。ＤＮＡのＴｍは、ほぼＯＤ２６０の増加全体の５０％が観察される温度でもある、ＯＤ２６０対温度曲線の１次導関数におけるピークとして決定した。ｄＧＴＰで増幅させたｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡのＴｍが９５℃であるのに対し、ｄＩＴＰで増幅させたＤＮＡのＴｍは６９℃であり、またｄＩＴＰ及びｄＧＴＰの混合物で増幅させた場合は７５℃である。
【００６９】
実施例３
改良多重開始増幅（ｍＭＰＡ）の反応産物では、標準多重開始増幅（ＭＰＡ）の産物よりも低い温度でサイクルシーケンシングを行うことができる。
ｐＵＣ１８のＴ．Ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＤＮＡのライブラリーからランダムに選択したクローンを、実施例１で詳細に述べたように、標準（ｄＧＴＰ）多重開始増幅、又は改良（ｄＩＴＰとｄＧＴＰの混合物）多重開始増幅によって増幅した。次いで−４０  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍ１３プライマー  ５ｐｍｏｌ、及びＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ停止剤プレミックス  ８μｌ、及び増幅したＤＮＡ  ５μｌを使用して、配列決定反応を行った。反応を、常温で繰り返し（９５℃で２０秒間、５０℃で３０秒間、及び６０℃の６０秒間を３０回）、又は低温で繰り返した（８２℃で２０秒間、４０℃で３０秒間、５０℃で６０秒間を３０回）。サンプルをエタノールで沈殿させ、９５％ホルムアミド２０μｌ中に溶解し、ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００毛管配列決定機器（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に流した。ｄＧＴＰで増幅させたクローンに関して得られた電気泳動図を、図４（高温サイクル）及び図５（低温サイクル）に示す。ｄＩＴＰ及びｄＧＴＰで増幅させたクローンから得た結果は、図６（高温サイクル）及び図７（低温サイクル）に示す。標準増幅及び低温サイクルを使用して得られた配列は、機器のソフトウェアで解析することが不可能な非常に弱いシグナルを有する。
【００７０】
図示されるように、改良増幅反応の産物についてのみ、低温熱サイクルを使用して配列決定することができる。
【００７１】
実施例４
改良多重開始増幅によって増幅したＤＮＡは、制限酵素による活性を変化させた。
【００７２】
二本鎖ｐＵＣ１９  ＤＮＡ（２ｎｇ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、実施例１で詳細に述べたように、ｄＧＴＰ（０．２ｍＭ）又はｄＩＴＰ（０．４ｍＭ）を用いた多重開始ローリングサークル増幅によって、増幅した。３０℃で一晩インキュベーションした後、各反応混合物１０μｌを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、及びウシ血清アルブミン２μｇを含有する反応体積２０μｌ中、３７℃で２時間、ＨｉｎｄＩＩＩ  ５単位で消化させた。さらに１０μｌの各反応産物も、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、及びウシ血清アルブミン２μｇを含有する２０μｌ体積中、３７℃で２時間、ＢａｍＨＩ  ５単位で消化させた。消化と共に、改良増幅及び標準増幅させたｐＵＣ１９  ＤＮＡの産物を、１×ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中の１％アガロースゲル上で、電気泳動により分離した。出発時のｐＵＣ１９と、標準的な条件下で増幅したｐＵＣ１９との両方を、ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩにより切断することができる。改良（ｄＩＴＰ）増幅によって調製したＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）（配列番号２）によって切断したが、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）（配列番号３）では切断されない。幾つかの制限エンドヌクレアーゼはｄＧからｄＩへの置換に耐え（Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐ．、Ｒｕｂｉｎ  ＲＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；１９７７  ２５２  ７２７３〜８）、しかしＢａｍＨＩは特に耐えることができないことが分かったが（Ｋａｎｇ  ＹＫ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９５  ２０６：９９７〜１００２）、これは、改良増幅産物において、ｄＧが確かにｄＩに取って代わったことを示唆している。
【００７３】
実施例５  改良多重開始増幅（ｍＭＰＡ）に向けたＤＮＡポリメラーゼ変異体の使用
野生型Ｐｈｉ  ２９  ＤＮＡポリメラーゼ１００ｎｇ、及び１つのアミノ酸置換を有する下記の変異体、即ちＮ６２Ｅ、Ｎ６２Ｄ、Ｄ１２Ａ、Ｅ１４Ａ、Ｄ６６Ａ、及びＤ１６９Ａのそれぞれを使用し（Ｂｅｒｎａｄ  Ａ、Ｂｌａｎｃｏ  Ｌ、Ｌａｚａｒｏ  ＪＭ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ、Ｓａｌａｓ  Ｍ．、Ｃｅｌｌ  １９８９  ５９：２１９〜２８、及びＥｓｔｅｂａｎ  ＪＡ、Ｓｏｅｎｇａｓ  ＭＳ、Ｓａｌａｓ  Ｍ、Ｂｌａｎｃｏ  Ｌ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９４  ２６９：３１９４６〜５４）、実施例１で詳細に述べたように、２ｎｇのｐＵＣ１９  ＤＮＡを、ｄＧＴＰ（０．２ｍＭ）又はｄＩＴＰ（０．４ｍＭ）或いはｄＩＴＰ（０．８ｍＭ）とｄＧＴＰ（０．５ｍＭ）の混合物を用いた多重開始増幅によって増幅した。反応混合物を、３０℃で１６時間インキュベートし、次いで６５℃で１０分間インキュベートした。バクテリオファージλＤＮＡを標準物質として使用して産生ＤＮＡを定量するのに、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ）を使用した。得られたＤＮＡの収量を、表１に示す。
【００７４】
【表１】
2006525023.tif 000002
【００７５】
φＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｎ６２Ｅ及びＮ６２Ｄは、ｄＩＴＰだけで改良増幅を用いた増幅ＤＮＡに関し、野生型φ２９よりも約１０倍高い収量をもたらす。ｄＩＴＰとｄＧＴＰの混合物を用いると、これらの変異体は、野生型φ２９よりも４〜５倍多い産物をもたらす。これらのポリメラーゼ変異体を使用して増幅させたＤＮＡは、野生型ポリメラーゼを使用して増幅させたＤＮＡと同様の粒度分布を持つように見え、またＤＮＡ配列決定実験用の鋳型として使用したときに、同様の結果をもたらした。
【００７６】
上述のような本発明の教示の利益を受ける当業者は、非常に数多くの改変をそこに加えることができる。これらの改変は、添付の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内に包含するものと解釈すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】鋳型としての２ｎｇのｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡ及び５ｐｍｏｌのＭＨＸＰプライマーから標準ＭＰＡによって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。
【図２】鋳型としての２ｎｇのｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡ及び５ｐｍｏｌのＭＨＸＰプライマーから、改良ＭＰＡ（０．４ｍＭ  ｄＩＴＰを単独で用いる）によって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。
【図３】鋳型としての２ｎｇのｐＮＡＳＳβ  ＤＮＡ及び５ｐｍｏｌのＭＨＸＰプライマーから、改良ＭＰＡ（０．８ｍＭ  ｄＩＴＰ及び０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰを用いる）によって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。
【図４】鋳型としての、Ｔ．Ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＤＮＡのランダムライブラリーのグリセロールストック１μｌから、標準ＭＰＡによって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。反応は、常温で循環させた（９５℃で２０秒、５０℃で３０秒、及び６０℃で６０秒を３０回）。
【図５】鋳型としての、Ｔ．Ｖｏｌｃａｎｉｓｍ  ＤＮＡのランダムライブラリーのグリセロールストック１μｌから、標準ＭＰＡによって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。反応は、低温で循環させた（８２℃で２０秒、４０℃で３０秒、及び５０℃で６０秒を３０回）。
【図６】鋳型としての、Ｔ．Ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＤＮＡのランダムライブラリーのグリセロールストック１μｌから、改良ＭＰＡ（０．８ｍＭ  ｄＩＴＰ及び０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰを用いる）によって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。反応は、常温で循環させた（９５℃で２０秒、５０℃で３０秒、及び６０℃で６０秒を３０回）。
【図７】鋳型としての、Ｔ．Ｖｏｌｃａｎｉｕｍ  ＤＮＡのランダムライブラリーのグリセロールストック１μｌから、改良ＭＰＡ（０．８ｍＭ  ｄＩＴＰ及び０．０５ｍＭ  ｄＧＴＰを用いる）によって増幅したＤＮＡを持つ、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用した、ＤＮＡ配列決定反応を示す電気泳動図である。反応は、低温で循環させた（８２℃で２０秒、４０℃で３０秒、及び５０℃で６０秒を３０回）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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