(57)【要約】本発明は、ＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）受容体のアルファ鎖の細胞外領域のＮ−末端に融合したヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のＮ−末端領域の６０アミノ酸フラグメントからなる組換えキメラタンパク質に関するものである。インビトロにおいて該タンパク質はＴ細胞増殖刺激活性を示し、Ｔ細胞におけるＩＬ−２増殖刺激活性を阻害し、ＩＦＮγによるＨＬＡ−ＤＲの誘導を阻害し、そしてＩＦＮγの抗増殖活性を阻害する。本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、慢性炎症、敗血症、虚血再潅流症候群及び動脈硬化のような種々の病気を治療するための医薬品に使用するのに適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４を超えるアミノ酸を有するペプチドによりサイトカイン受容体の細胞外領域に共有結合しているサイトカイン又はサイトカインフラグメントからなる組換えキメラタンパク質。
【請求項２】
４を超えるアミノ酸を有するペプチドを介してヒトγインターフェロン受容体の細胞外領域に共有結合しているサイトカインインターロイキン−２又はそのフラグメントからなることを特徴とするＡｎＴＨ１と呼ばれる組換えキメラタンパク質。
【請求項３】
配列表の配列番号５で規定されるヒトインターロイキン−２のＮ−末端領域の６０アミノ酸をコードするサイトカインフラグメントと、配列表の配列番号７で規定されるヒトγインターフェロン受容体のアルファ鎖の細胞外Ｎ−末端部分をコードするサイトカイン受容体の細胞外領域とを含むことを特徴とする請求項１に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項４】
配列表の配列番号６で規定される配列によりコードされる結合ペプチドを形成していることを特徴とする請求項１及び２に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項５】
配列表の配列番号８で規定されるヌクレオチド配列によりコードされ、この配列の発現による産物であることを特徴とする請求項１，２及び３に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項６】
組換え微生物、植物細胞又は遺伝子修飾生物において生産されることを特徴とする請求項１，２，３及び４に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項７】
インターロイキン−２、γインターフェロン、又は両サイトカインの生物活性を阻害することを特徴とする請求項１，２，３，４及び５に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項８】
Ｔ細胞増殖刺激活性を有し、インターロイキン−２の増殖刺激活性を阻害し、γインターフェロンの抗−増殖活性を阻害し、そしてγインターフェロンによるＨＬＡ−ＩＩの誘導を阻害することを特徴とする請求項１，２，３，４，５及び６に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項９】
インターロイキン−２、γインターフェロン、又は両サイトカインの作用により仲介される病気を治療するための医薬組成物の一部を形成することを特徴とする請求項１，２，３，４，５，６及び７に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項１０】
自己免疫疾患、炎症性疾患、移植片拒絶又は微生物感染を治療するための医薬組成物の一部を形成することを特徴とする請求項１，２，３，４，５，６，７及び８に記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項１１】
多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、糖尿病、慢性関節リュウマチ、消化管炎症性疾患、敗血症、乾癬、動脈硬化又は虚血再潅流により生じる疾患を治療するための医薬組成物の一部を形成することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の組換えキメラタンパク質。
【請求項１２】
配列表の配列番号８で規定される配列を有し、請求項１から１０に記載の組換えキメラタンパク質をコードすることを特徴とする核酸鎖。
【請求項１３】
請求項１から１０に記載の組換えキメラタンパク質を発現するための担体分子又はベクターの一部を形成することを特徴とする請求項１１に記載の核酸鎖。
【請求項１４】
インターロイキン−２、γインターフェロン、又は両サイトカインの作用により生じる病気を治療のための医薬組成物の一部を形成することを特徴とする請求項１１及び１２に記載の核酸鎖。
【請求項１５】
自己免疫疾患、炎症性疾患又は微生物感染を治療するための医薬組成物の一部を形成することを特徴とする請求項１０，１１及び１２に記載の核酸鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、バイオテクノロジー及び医学に関するものであり、特に体の種々の機能の調節に作用すると共に病的状態において増量を示す二つのサイトカイン、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）の生物活性を阻害することができる薬物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｔヘルパーリンパ球（ＣＤ４＋）及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）によるサイトカインの生産は、Ｔｈ１及びＴｈ２として規定されるサイトカイン生産パターンを生じる。Ｔｈ１パターンは、ＩＬ−２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びＩＦＮγの生産を特徴とし、一方Ｔｈ２パターンは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６などの生産に対応する。この種の応答は、種々の免疫異常反応を促進するのみならず、身体保護に重要な役割を果たす。
【０００３】
炎症の免疫反応や無制御の免疫反応は、炎症性疾患や自己免疫性疾患の発現、進展、そして永続化に至る一連の状態をもたらす。このような疾患の中にはＩＬ−２及びＩＦＮγの病理的な役割が実証された例がある。
【０００４】
多発性硬化症は、変性性脱ミエリン自己免疫疾患である。ＩＦＮγの役割は、この自己免疫疾患については非常に明白である。即ち、ＩＦＮγを使用した臨床試験において、ＩＦＮγ処理が病気を悪化させることが示されている（Ｐａｎｉｔｃｈ  ＨＳ．ｅｔ  ａｌ．インターフェロンガンマで治療した患者における多発性硬化症の悪化、Ｌａｎｃｅｔ  １，８９３−５，１９８７．）。また、この病気に罹患した患者において、ＩＬ−２及びＩＦＮγに対応するタンパク質のみならず、対応するメッセンジャーＲＮＡが高いレベルにあることも示されている（Ｌｉｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．多発性硬化症患者の末梢血単核細胞におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ及びＴＮＦ−アルファｍＲＮＡ発現、Ｃｈｕｎｇ  Ｋｕｏ  Ｉ  Ｈｓｕｅｈ  Ｋｏ  Ｈｓｕｅｈ  Ｙｕａｎ  Ｈｓｕｅｈ  Ｐａｇｅ  １９，２４−８，１９９７）。患者の細胞によるこれ等二つのサイトカインの生産は、多発性硬化症の再発のマーカーとしてこれらを使用できることを示唆する（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．多発性硬化症の再発のマーカーとしてのインビトロＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２及びＩＦＮ−ガンマ生産、Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ９８，２８６−９０，１９９６）。ＩＬ−２及びＩＦＮγが中枢神経系の脱ミエリン化に至る非特異的をリンパ球の活性化に関与することも観察されている（Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．親炎症性サイトカインは多発性硬化症患者において二つの異なるカルシウム−シグナリング経路による抗原非依存Ｔ細胞活性化を調節する、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４３，３４０−４９，１９９８）。βＩＦＮ治療に反応しないこの疾患の患者において、ダクリズマブとして知られている抗ＩＬ−２抗体を使用した臨床試験が実施されている。
【０００５】
全身性エリテマトーデスは、高レベルのＩＬ−２及びＩＦＮγの存在が病気の悪化と関連するもう一つの全身性自己免疫疾患である（Ｖｉａｌｌａｒｄ  ＪＦ．ｅｔ  ａｌ．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴｈ１（ＩＬ−２、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）及びＴｈ２（ＩＬ−１０，ＩＬ−４）サイトカインの生産、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１５、１８９−９５、１９９９）。他方では、ループス動物モデルにおいて、ＩＦＮγの受容体の欠失により自己抗体の生産が減少し（Ｈａａｓ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮ−ガンマ受容体の除去は、ループス発症（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける自己抗体生産及び糸球体腎炎を阻止する、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０，３７１３−１８，１９９８）、ＩＦＮγの可溶性受容体が存在すると、この病気の発症が抑制される（Ｏｚｍｅｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．全身性エリテマトーデスの実験的治療：マウス可溶性インターフェロン受容体によるＮＺＢ／Ｗマウスの治療は糸球体腎炎の発症を抑制する、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，６−１２，１９９５）。このことは最近、免疫グロブリンのＦｃフラクションに融合したＩＦＮγの細胞外領域を含むキメラタンパク質と共にマウスループスモデルを使用して試験された（Ｌａｗｓｏｎ  ＢＲ．ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮ−ガンマＲ／ＦｃをコードするｃＤＮＡによるマウスループスの治療、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０６、２０７−１５、２０００）。しかし、全身性エリテマトーデスにおけるこの型の分子の有効性は、全身性エリテマトーデス患者のＦｃ受容体の明らかな機能障害により制約された（Ｆｒａｎｋ  ＭＭ．ｅｔ  ａｌ．全身性エリテマトーデス患者における不完全な細網内皮系Ｆｃ−受容体機能、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３００，５１８−２３，１９７９，Ｄｉｊｓｔｅｌｂｌｏｅｍ  ＨＭ．ｅｔ  ａｌ．全身性エリテマトーデスにおけるＦｃガンマ受容体多形：病気と免疫複合体のインビボクリアランスの関係、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ４３，２７９３−８００，２０００）。
【０００６】
重症筋無力症は、抗アセチルコリン受容体自己抗体により仲介される器官特異的な自己免疫疾患と考えられ、Ｔ細胞に依存し、そして筋肉の衰弱及び疲労が特徴である。最近、ＩＦＮγがアセチルコリン受容体に対する自己抗体の生成を促進し、その一方、ＩＦＮγ受容体がない場合には動物モデルにおいてこの病気になりにくいことが示された（Ｚｈａｎｇ  ＧＸ．ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮ−ガンマ受容体に欠陥のあるマウスは実験的自己免疫重症筋無力症になりにくい、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，３７７５−８１，１９９９）。ＩＬ−２及びその他のサイトカインは、ＩＦＮγの共存の下に、この病気の進行に関与している（Ｚｈａｎｇ  ＧＸ．ｅｔ  ａｌ．サイトカイン及び重症筋無力症の病因。Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ．２０，５４３−５１，１９９７）。
【０００７】
１型糖尿病（インスリン依存性）又は真性糖尿病において、膵臓のベータ細胞は自己免疫機構により破壊されている。ＩＦＮγは膵臓のベータ細胞に対して有害であるというインビトロでの証拠がある（Ｓｔｅｒｎｅｓｊｏ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．インターフェロンガンマ及び腫瘍壊死因子−アルファへのインビトロの長期暴露によるラット膵島の酸化窒素及びインスリン生産に対する影響。Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ２０，１８５−９０，１９９５，Ｄｕｎｇｅｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．腫瘍壊死因子−アルファ及びインターフェロン−ガンマはインスリン分泌を抑制し、そして未離乳ラット島におけるＤＮＡ損傷を生じる。酸化窒素関与の程度。Ｄｉａｂｅｔｅｓ４５，１８３−９，１９９６，Ｂａｌｄｅｏｎ  Ｍｅ．ｅｔ  ａｌ．インターフェロン−ガンマはＭＨＣクラスＩ抗原プロセッシング経路を活性化するが膵臓ベータ細胞系におけるグルコース応答性を減少する。Ｄｉａｂｅｔｅｓ４６，７７０−８，１９９７）。しかし、その他の研究は、膵臓中のインスリンを生産する細胞に対するＩＦＮγの作用は間接的なものであることを示している（Ｓａｒｖｅｎｔｉｃｋ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，インターフェロン−ガンマのベータ細胞発現により誘導される膵島耐性の消失。Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８４４−７，１９９０）。
【０００８】
最も可能性が高いのは、その作用はＩＬ−１、ＴＮＦα及び酸化窒素の生産についてはマクロファージを介して活性化され、生成したこれ等の物質が直接ベータ細胞に作用しそしてベータ細胞におけるＭＨＣ  Ｉの発現を促進し、その結果細胞傷害性リンパ球による破壊が促進される（Ｔｈｏｍａｓ  ＨＥ．ｅｔ  ａｌ．膵臓ベータ細胞に対するＩＦＮ−ガンマの作用はクラスＩ  ＭＨＣの上方調節を生じるが糖尿病は生じない。Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０２，１２４９−５７，１９９８，Ｔｈｏｍａｓ  ＨＥ．ｅｔ  ａｌ．非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）における自己免疫糖尿病の進行におけるベータ細胞破壊。Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  Ｒｅｖ１６，２５１−６１，２０００）。ＩＦＮγが存在しない場合は糖尿病の発症は遅れるが、阻止はしないことも示されている（Ｈｕｌｔｇｒｅｎ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．ＮＯＤマウスにおいて遺伝子的にガンマ−インターフェロンを欠乏させると糖尿病を遅らせるが阻止はしない。Ｄｉａｂｅｔｅｓ４５，８１２−７，１９９６）。
【０００９】
いくつかの論文では、糖尿病を阻止するためにＩＦＮγの生物活性の不活化をどのように利用することができるかを示している（Ｄｅｂｒａｙ−Ｓｃａｈｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．マウスＩＦＮガンマに対する抗体で治療したＮＯＤマウスにおける糖尿病の予防。Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ４，２３７−４８，１９９１，Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．ヒトインターフェロン−ガンマ受容体の２価免疫付着因子はＩＦＮ−ガンマ活性の有効な阻害物質である(Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ１５，１１１１−５，１９９５，Ｐｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ  ＧＪ．ｅｔ  ａｌ．インターフェロン−ガンマ受容体／ＩｇＧ１融合タンパク質をコードする非ウイルスベクターを使用する筋肉内遺伝子治療による自己免疫糖尿病の予防。Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ６，７７１−７，１９９９）。Ｔリンパ球の活性物質として、ＩＬ−２がインスリン生産細胞を破壊する際の反応に寄与し得ることも示されている。最近診断された１０歳から２１歳の小児／青春期子供における１型糖尿病の治療について、抗ＩＬ−２抗体ダクリズマブを使用する臨床試験が最近開始された（Ｒｉｌｅｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｐｒｏｊｅｃｔ：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ（ＰＤＰＴ）．ｗｗｗ．ｒｉｌｅｙｈｏｓｐｉｔａｌ．ｏｒｇ．）。この研究は、最近診断された子供におけるベータ細胞の破壊の進行を阻止することが意図されている。
【００１０】
移植拒絶反応は、細胞性免疫及び循環する抗体が重要な役割を果たす複雑な過程である。標準的な抗拒絶治療では、シクロスポリン、ラパマイシン、アザチオプリン、ステロイドなどの薬物を併用する。しかし、この治療をしても、腎臓の移植を受けた人の５０％より多く１０年の間に徐々に移植片の拒絶を生じる。移植片対宿主病は骨髄移植を受けた患者における死亡の主な原因である。移植を防げ移植を受けた患者の生命を危うくするこの反応において、ＩＬ−２及びＩＦＮγがその進展に関与していることが示されている（Ｈｕ  ＨＺ．ｅｔ  ａｌ．急性移植片対宿主病の初期相におけるインターフェロン−ガンマ分泌の動態及びその調節因子。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９８，３７９−８５，１９９９，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．同種骨髄移植後の急性移植片対宿主病患者における可溶性ＩＬ−２受容体、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及びＩＦＮ−ガンマの血清レベル。Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６，Ｓ４５−５０．２０００）。
【００１１】
慢性関節リュウマチ（ＲＡ）は病因が明らかにされていない慢性の全身性疾患であり、炎症、滑液過形成及び罹患関節の破壊を特徴とする。ＩＬ−２は、一般的に自己免疫関節炎のようなＴｈ１型疾患の状態を悪化させる親−炎症性サイトカインと考えられている。最近の研究によると、動物モデルにおいて、コラーゲンにより誘発された関節炎の急性期にＩＬ−２メッセンジャーＲＮＡが増加することが示されている（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．コラーゲン誘発関節炎に対するＩＬ−２の不均一な影響。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６５，１５５７−６３，２０００）。他方、動物モデルにおいてＩＦＮγの増加に伴ってこの病気の悪化が認められている（Ｔｅｌｌａｎｄｅｒ  ＡＣ．ｅｔ  ａｌ．コラーゲン誘発関節炎における抗−ＣＤ４０による強力なアジュバント効果。病気の悪化はＩＩ型コラーゲン反応性ＩｇＧ２ａ及びＩＦＮ−ガンマの生産増加を伴う。Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ１４，２９５−３０２，２０００）。ＩＬ−２及びＩＦＮγの両者は、ＲＡ患者の滑液組織において著しく増加していた（Ｃａｎｅｔｅ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．慢性関節炎における異なるＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインパターン：インターフェロンガンマは血清反応陰性の脊椎関節症に比較して慢性関節リュウマチの粘液膜において高度に発現する。Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ５９，２６３−８，２０００）。
【００１２】
腸の炎症性疾患には、二つの胃腸管疾患：クローン病及び潰瘍性結腸炎がある。これ等の病気は腸の慢性的炎症を特徴とする。クローン病は、腸壁の内層周辺に（ａｒｏｕｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｎｅ）拡大しそして最も深い層にまで侵入する炎症性の疾患である。この炎症は、消化器系のいずれの部分（食道、胃、小腸、大腸又は肛門）にも見出すことができる。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ社は、抗ＩＦＮγ抗体を使用して中等度から重症のクローン病患者における第Ｉ／ＩＩ相臨床試験（ＳＭＡＲＴ抗−ガンマインターフェロン抗体）を開始することを報じている（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓはクローン病におけるＳＭＡＲＴ抗−ガンマインターフェロン抗体のＩ／ＩＩ相試験を報じている。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｎａｓｄａｑ）．２００１年１月１０日）。潰瘍性結腸炎は、大腸（結腸及び直腸）の粘膜及び粘膜下に限定されている。最近、アメリカ消化器学会の年会において、血流中のＩＦＮγレベルの減少が何如にして結腸炎の軽減マーカーになるかがマウスモデルで示された（Ｙａｒｏｎ  Ｉ．Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｍａｙ２０−２３，２００１．Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｃｅｎｔｅｒ．Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）。
【００１３】
敗血症ショックは、血流を介して強い感染性の微生物が広まった結果である。これは院内感染によるグラム陰性菌によって頻繁に引き起こされ、そして免疫能が低下している患者及び慢性疾患を持つ患者に生じやすい。患者の１／３ではグラム陽性微生物及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓにより生じる。グラム陰性及びグラム陽性菌により生じる敗血症ショックのいずれでも、ＩＦＮγ及びＩＬ−２は、それらが関与する免疫反応の致死性に関係している。ＩＦＮγは、敗血症ショックの動物モデルにおける致死性仲介物質である（Ｈｅｒｅｍａｎｓ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．インターフェロンガンマ、マウスにおける致死的リポポリ多糖−誘発シュバルツマン様ショック反応の仲介物質。Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７１，１８５３−６９，１９９０，Ｗｙｓｏｃｋａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．マウスのリポポリ多糖−誘発ショックにおけるインターフェロン−ガンマ生産及び致死性にインターロイキン−１２は必要である。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２５，６７２−６，１９９５，Ｋｕｓｃｈｎａｒｏｆｆ  ＬＭ  ｅｔ  ａｌ．老齢マウスにおけるブドウ球菌エンテロトキシンＢ注射による死亡率増加及び障害クローン除去：サイトカイン及び酸化窒素生産の関係。Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ４６９−７８，１９９７）。このほかの病気の動物モデルの場合と同様に、その動物におけるＩＦＮγ受容体の消失は、その動物をエンドトキシンショックに対し耐性とする（Ｃａｒ  ＢＤ  ｅｔ  ａｌ．インターフェロンガンマ受容体欠失マウスはエンドトキシンショックに抵抗性である。Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７９，１４３７−４４，１９９４）。
【００１４】
同様に、いくつかの報告は、敗血症ショックの発症と致死性におけるＩＬ−２の関与を示している（Ｍｉｃｕｓａｎ  ＶＶ，ｅｔ  ａｌ．トキシックショック症候群外毒素−１によるヒト及びマウスインターロキキン−２の生産。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５８，２０３−８，１９８６，Ａｒａｄ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．スーパー抗原拮抗物質は致死性ショックを防ぎそしてＴ細胞活性化の新しいドメインを定義する。Ｎａｔ  Ｍｅｄ．６，３７８−９，２０００，Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＤＬ．ｅｔ  ａｌ．壊死性筋膜炎を伴う連鎖球菌トキシンショック症候群。Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ５１，２７１−８８，２０００）。インビトロにおいてＩＬ−２の存在下に増殖した単核細胞はＩＬ−１、ＴＮＦαのような二次サイトカインを分泌し、そしてＩＦＮγは敗血症ショックの病的生理に関係する。
【００１５】
尋常性乾癬は、障害のあるＴ細胞によって生産される親−炎症性サイトカインにより仲介されている可能性がある複雑で多遺伝子性の皮膚病である。これ等のサイトカインの不適切な慢性的な発現により、細胞の免疫活性化及び組織傷害を生じる。この疾患は、皮膚細胞の過剰増殖と血管増生を特徴とし、おそらくこれらが、この病状の一部をなす潮紅と丘疹をもたらす。乾癬について、ＩＦＮγ及びＩＬ−２の病理的役割は明らかにされている。尋常性乾癬の表皮細胞の大部分は、ＩＬ-２，ＩＦＮγ及びＴＮＦαを生産し、これらは傷害性Ｔ細胞と定義される。乾癬患者では高レベルのＩＦＮγ及びＩＬ−２が検出されるがＩＬ−４は検出されない。このことは、これ等の細胞の持続的又は慢性的な免疫活性化に関与するＴ細胞集団の不均衡に関係する可能性がある（Ｓｃｈａａｋ  ＪＦ  ｅｔ  ａｌ．尋常性乾癬に関与するＴ細胞はＴｈ１サブセットに属す。Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １０２，１４５−９，１９９４，Ａｕｓｔｉｎ  ＬＭ，ｅｔ  ａｌ．尋常性乾癬傷害部の表皮Ｔ細胞の大部分は１型サイトカイン、インターフェロン−ガンマ、インターロイキン−２、及び腫瘍壊死因子−アルファを生産することができ、Ｔｃ１（細胞傷害性Ｔリンパ球）及びＴＨ１エフェクター集団であることを示す：１型分化の偏りは乾癬患者の循環血液Ｔ細胞にも認められる。Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ１１３，７５２−９，１９９９）。
【００１６】
乾癬の治療にダクリズマブを使用して優れた結果が示されている（Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＪＭ  ｅｔ  ａｌ．乾癬患者に対するヒト化抗−Ｔａｃ抗体の投与によるＴ細胞上のＣＤ２５（高親和性インターロイキン２受容体）のインビボ阻害の成功。Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４３，４４８−５８，２０００）。最近この薬物を使用して新しい試験が開始された（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓは国際乾癬シンポジウムにおいて乾癬に対する臨床開発を行っている３個のヒト化抗体を発表。２０００年６月２２日。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＰＤＬ）  Ｎａｓｄａｑ）。
【００１７】
このほかにＩＬ−２及びＩＦＮγに対する拮抗物質の使用がやはり有用であることが研究されている病気がある；その例はアテローム性動脈硬化及び虚血／再潅流である。アテローム性動脈硬化及び移植後アテローム性動脈硬化の特徴は、単核白血球の浸潤の結果としての動脈内膜の肥厚、血管平滑筋細胞の増殖及び細胞外マトリックスの蓄積並びにＩＦＮγの存在である（Ｒｏｓｓ  Ｒ．アテローム性動脈硬化−炎症性疾患。Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０，１１５−２６，１９９９，Ｈａｎｓｓｏｎ  ＧＫ  ｅｔ  ａｌ．アテローム性動脈硬化における免疫機構。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ９，５６７−７８，１９８９，ｙ  Ｌｉｂｂｙ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．移植関連冠状動脈硬化の発生に関係する血管壁細胞の機能。Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２１，３６７７−８４，１９８９）。動物モデルにおいて外来性ＩＦＮγはアテローム性動脈硬化を促進することが示されている（Ｗｈｉｔｍａｎ  ＳＣ  ｅｔ  ａｌ．アポリポタンパク質Ｅ−／−マウスにおいて外来性インターフェロン−ガンマはアテローム性動脈硬化を促進する。Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ１５７，１８１９−２４，２０００）。
【００１８】
他方、血清中のＩＦＮγの中和並びにその遺伝子の除去により内膜肥厚の範囲が減少することが示されている（Ｇｕｐｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいてＩＦＮγはアテローム性動脈硬化を増強する。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９，２７５２−６１，１９９７，Ｎａｇａｎｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．インターフェロンγ欠乏は環状動脈硬化を予防するが移植マウス心臓における心筋拒絶は予防しない。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００，５５０−５７，１９９７，
2006506958.tif 000002
Ａ．ｅｔ  ａｌ．インターフェロンγノックアウトレシピエントに移植されたマウス同種移植心臓における移植動脈硬化の減少。Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，３５９−６５，１９９８）。さらに最近では、白血球の非存在下でＩＦＮγがアテローム性動脈硬化作用を促進することが立証されている（Ｔｅｌｌｉｄｅｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．白血球の非存在下にインターフェロンγは動脈硬化を引き起こす。Ｎａｔｕｒｅ４０３，２０７−１１，２０００）。
【００１９】
虚血及び再潅流は、ある領域における血流の中断を特徴とし、その結果酸素と栄養素の供給が止まり、そして虚血した組織に血流が再潅流し、完全に若しくは部分的に回復することであり、これは臨床的にはしばしば生じる。血液量減少性ショック、敗血症ショック、心筋梗塞、栓塞形成、コンパーチメント症候群、凍結、臓器移植、などで認めることができる。いずれにしても、組織の酸素欠乏は、よく知られている複雑な生化学的変更及び分子的変更が恒常的に誘導される細胞代謝の変化を生じる。再潅流による傷害は、結果的に、血液組織（ｂｌｏｏｄ  ｔｉｓｓｕｅ）の回復による細胞死及び内皮機能不全を生じる。ＩＦＮγ及びＩＬ−２は、虚血及び再潅流により臓器に生じる傷害の仲介物質であることが報告されている（Ｓｅｒｒｉｃｋ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．肺同種移植における虚血再潅流障害後のインターロイキン−２、腫瘍壊死因子−アルファ及びインターフェロン−ガンマの早期放出。Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ５８，１１５８−６２，１９９４，Ｍａｒｃｋ  ＡＲＣ  ｅｔ  ａｌ．虚血／再潅流−誘発ＩＦＮ−ガンマ上方調節：ＩＬ−１２及びＩＬ−１８の関与。Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１６２，５５０６−１０，１９９９）。
【００２０】
数人の著者がＩＦＮγに対する拮抗物質を記述している。組換え可溶性受容体によるヒトＩＦＮγの抗ウイルス活性の阻害が欧州特許ＥＰ  ０  ３９３  ５０２Ａ１に記述されている。マウスＩＦＮγの組換え可溶性受容体は、マウスにおける糸球体腎炎の発症を抑制することも記述されている（Ｏｚｍｅｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．全身性エリテマトーデスの実験的治療：マウス可溶性インターフェロン−ガンマ受容体を使用する治療によりＮＺＢ／Ｗマウスの糸球体腎炎の発症を抑制する。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，６−１２，１９９５）。３個のマウスＩＦＮγが構築された。これ等は、ＩＦＮγに対するマウス受容体の細胞外領域及び免疫グロブリン分子の定常ドメインにより形成されたキメラタンパク質からなる。これ等構造体は、マウスＩＦＮγの抗ウイルス活性を中和し、そして血液中で長期の平均寿命を有している（Ｃｏｒｎｅｌｉａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．新規インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）阻害タンパク質の構築、精製、及び分析。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６７，９３５４−６０，１９９２及び欧州特許ＥＰ  ０  ６１４  ９８１Ａ１）。人間におけるエリテマトーデスに使用される可溶性ＩＦＮγ受容体に融合した免疫グロブリンのフラグメント又はそのＦｃ領域を使用する可能性は、この自己免疫疾患におけるＦｃに対する受容体の明らかな機能不全により制限されることがある（Ｆｒａｎｄ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．全身性エリテマトーデスにおける欠陥のある細網内皮系Ｆｃ−受容体機能。Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３００，５１８−２３，１９７９）。この種の阻害物質は単機能性であるため、作用の範囲は狭い。
【００２１】
マウスにおいて、中和抗−ＩＦＮγ抗体の使用により移植片対宿主病の発生は減少する（Ｍｏｗａｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮガンマに対する抗体は免疫的に誘発されたマウス移植片対宿主反応による腸管障害を予防する。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６８，１８−２３，１９８９）。皮膚の同種移植研究において、抗ＩＦＮγ抗体は、移植片がＭＨＣクラスＩＩ抗原に不適合である場合にのみ拒絶を抑制する。このことからＩＦＮγはＭＨＣクラスＩＩ抗原の誘導を介して同種移植の拒絶に関与していることが示唆される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．抗−ＩＦＮガンマモノクロナール抗体のインビボ投与による皮膚同種移植片と異なるＭＨＣクラスＩＩの特異的延長。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，４６４８−５０，１９９０）。細菌で発現したヒトＩＦＮγに対する可変領域（ｓｃＦｖ）を持つ一本鎖抗体が得られ、マウスＩＦＮγの生物活性を中和するのに有効であることが示されている（Ｆｒｏｙｅｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ヒトインターフェロンγの生物活性を中和する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）のバクテリアにおける発現。Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，８０５−１２，１９９３）。
【００２２】
ヒトの治療に抗体を使用する場合には、これ等の異種分子の免疫原性領域に対する宿主の応答という問題に直面し、キメラ及びヒト化抗体の場合には、親和性及び特異性の喪失（Ｍｅｒｌｕｚｚｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．治療的使用のための薬物として可能性のあるヒト化抗体。Ａｄｖ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈ．４，７７−８５，２０００）並びに毒性発現（Ｃｌａｒｋ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮガンマに対する抗体は免疫的に誘発されたマウス移植片対宿主反応による腸管障害を予防する。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６８，１８−２３，２０００）という問題に直面する。
【００２３】
その他の同様な解決策も記述されている。サイトカインとその可溶性受容体の混合物が提案されたが、その目的はサイトカインの影響を増強することであった。この場合では、米国の特許ＷＯ９４／２１２８２に示されているように、サイトカインとその受容体は別々に作製され、後で一製剤中に混合される。シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６及びラパマイシンは、免疫系、特にＴ細胞、の強力な抑制物質であり、移植片拒絶の予防に使用されている。最初の二つは、初期活性化遺伝子の転写を導くＴ細胞に対する抗原受容体によって開始されるシグナル伝達を抑制する。これは細胞周期の静止期Ｇ０からＧ１相へ移行させるために必要なＩＬ−２をコードする遺伝子の転写を含んでいる。ラパマイシンは、Ｔ細胞によるサイトカインの初期合成に影響を及ぼさないが、細胞周期のＧ１相からＳに移行するために必要なＩＬ−２に対するこれ等の細胞の応答を抑制する（Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−２／ＩＬ−２受容体システム：合理的な免疫介入の標的。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １４，２６４−７０，１９９３）。
【００２４】
ラパマイシンは、Ｔ細胞を特異的に活性化をすることができるが、ＩＬ−２受容体のベータ鎖（ＲβＩＬ−２）によるシグナリングの妨害を介してクローン増殖を妨げる（Ｗｏｅｒｌｙ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現に及ぼすラパマイシンの影響。Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０３，３２２−７，１９９６）。シクロスポリンＡは、腎臓同種移植片の生存を顕著に増加するが、自己免疫疾患も減少させる。これ等の免疫抑制薬の使用は、消化器系の障害、歯肉肥大及び特に用量依存的腎毒性、及び高血圧を含む毒作用のために制限されている（Ｈｏｒｔｅｌａｎｏ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．腎臓の近位尿細管細胞におけるシクロスポリンＡ及びＦＫ５０６誘発アポトーシスの酸化窒素による増強。Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １１，２３１５−２３，２０００，Ｔｓｉｍａｒａｔｏｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．シクロスポリンで治療した小児肺移植レシピエントにおける腎機能。Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ６９，２０５５−９，２０００）。
【００２５】
ＩＬ−２とその受容体の相互作用を阻害するモノクロナール抗体が、移植片対宿主病及び同種移植の拒絶を抑制するために動物モデルにおいて使用されている。これ等の抗体は、自己免疫疾患を抑制するためにげっ歯類においても使用されている。臨床試験において、ＩＬ−２受容体のアルファ鎖（ＲαＩＬ−２）に対する抗体は、ステロイド治療に対して抵抗性の移植片対宿主病を改善した。しかしこの取り組みはこれ等の抗体の抗原性のために制限される。欧州特許ＥＰ  ０  ６２１  ３３８  Ａ２に記述されているように、可変領域の一本鎖抗体がＩＬ−２のＩＬ−２受容体γサブユニットへの結合を阻害し、マウス細胞系ＣＴＬＬ−２において試験したＩＬ−２の生物活性を妨害することが認められている。この種の治療を改善するヒト化抗体の作成はまだ前記のような欠点を有している。この種の治療においてトキシンと結合した或いは放射能標識したモノクロナール抗体も試験されている（Ｗａｌｄｍａｎｎ  Ｔ．Ａ．放射性核種を結合した遺伝子操作モノクロナール抗体。Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，２０５−１２，１９９３）。
【００２６】
抗ＩＬ−２抗体又はＩＬ−２に融合したトキシンを使用することで、ＩＬ−２に対する受容体を発現して病的状態の進展に関与する細胞を除去することが米国の特許ＷＯ９２／２０７０１及び欧州特許ＥＰ  ０  ３６９  ３１６  Ａ２に記述されている。免疫毒の非特異的な毒性（ＦｒａｎｋｅｌＡ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．標的トキシンの臨床試験。Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６，３０７−１７，１９９５）並びにその免疫原性（Ｃｈｅｎ  Ｓ−Ｙ．ｅｔ  ａｌ．トキシン免疫原性を除去するための遺伝子免疫トキシンの設計。Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ２，１１６−２３，１９９５）がこれ等の薬物の使用を勧めがたいものにしている。抗ＩＬ−２抗体がＲＡの治療のために開発されている（Ｓｉｍｏｎ  ＬＳ．ｅｔ  ａｌ．リュウマチ関節炎の新しいそして将来の薬物治療。Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）  ３９  Ｓｕｐｐｌ  １：３６−４２，２０００）。ＲαＩＬ−２を標的とした抗体が腎臓移植の拒絶を回避するために使用されている（Ｏｌｙａｅｉ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．腎臓移植におけるバシリキシマブ及びダクリズマブの使用。Ｐｒｏｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １１，３３−７，２００１）。長期治療における抗体使用の限界はそれらに記述されている。
【００２７】
ＴＮＦα（Ｂｅｕｔｌｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．カケクチン／腫瘍壊死因子に対する受動免疫はエンドトキシンの致死効果からマウスを保護する。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，８６９−７１，１９８９）又はＩＬ−１（Ｎａｔａｎｓｏｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．提案された発病機構に基づく敗血症ショックの治療方針の選択。Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２０，７７１−８３，１９９４）のような親−炎症性サイトカインの中和は、数種の動物モデルにおける敗血症による死亡を減少させる。しかし、臨床試験においては、ＩＬ−１に対する拮抗物質の使用（ＩＬ−１受容体の拮抗物質）（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．敗血症症候群患者における組換えヒトインターロイキン−１受容体拮抗物質：無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験の結果。ＪＡＭＡ  ２７１，１８３６−４３，１９９４）及びＴＮＦαに対する拮抗物質の使用（組換えキメラタンパク質：可溶性受容体  ＴＮＦ／Ｆｃ）（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．腫瘍壊死因子受容体による敗血症ショックの治療。Ｆｃ融合タンパク質。Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３３４，１６９７−１７０２，１９９６）は改善を生じないだけでなく、免疫系の不活性化のために死亡率を増加させた。
【００２８】
ＦＤＡは、ＲＡの治療において好ましい効果を示したＴＮＦαに対する二個の拮抗物質（Ｌｉｐｓｋｙ  ＰＥ．ｅｔ  ａｌ．慢性関節リュウマチの治療におけるインフリキシマブ及びメトトレキセート。Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３４３，１５９４−１６０２，２０００）を承認した。このうちの一つは、ＴＮＦαの受容体のサブユニットに対する抗体（インフリキシマブ）である。あるレベルを超えてＴＮＦαを中和することは、ＲＡのラットモデルにおいて示されているように、免疫系の不活性化をもたらす可能性がある（Ｃｏｌａｇｉｏｖａｎｎｉ  ＤＢ．ｅｔ  ａｌ．二量体ＴＮＦＩ型受容体分子によるＴＮＦ−アルファ阻害は選択的に適応免疫反応を抑制する。Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ２２，６２７−５１，２０００）。インフリキシマブで治療した患者においてそれを使用しない対照群（プラセボ群）よりも高い頻度の感染（Ｓｃｈａｉｂｌｅ  ＴＦ．インフリキシマブの長期安全性。Ｃａｎ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １４  Ｓｕｐｐｌ  Ｃ：２９Ｃ−３２Ｃ，２０００）、並びに自己抗体の出現及びループスの発生（Ｍａｒｋｈａｍ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．インフリキシマブ：慢性関節リュウマチ管理における使用の総説。Ｄｒｕｇｓ  ５９，１３４１−５９，２０００）が認められている。
【００２９】
エタネルセプトは、ＴＮＦαの可溶性受容体及びＩｇＧ１のＦｃ部分に結合するキメラタンパク質である（Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ＬＷ  ｅｔ  ａｌ．慢性関節リュウマチのエタネルセプト治療。無作為化、コントロール試験。Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １３０，４７８−８６，１９９９）。治療の中止により病気は再発した；したがって、この薬物は病気を治癒しない。このことは、患者は長期間治療を受けなければならないことを意味する。短期間の試験であったので重篤な副作用は生じなかったが、長期治療ではこの分子に対する抗体の出現を生じるかもしれない（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．エタネルセプトを使用した患者ではモノクロナール抗体臨床検査を妨害する抗体を生成する可能性がある。Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４３，９４４−４７，２０００）。エタネルセプトで治療した患者の数例に、致命的な再生不良性貧血並びに汎血球減少症及び脱ミエリン症候群が発生したことが報告されている（Ｋｌｉｐｐｅｌ  ＪＨ．慢性関節リュウマチの治療。Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４３，１６４０−１，２０００）。
【００３０】
これまで、ＩＦＮγに対する拮抗物質は臨床的に使用されたことはない。一時的又は慢性的な変化により身体に害を与える炎症及び免疫反応を防御し、減少させ又は除去するために、サイトカイン拮抗物質を使用することが多くのサイトカインについて探索されてきた。それらの多くは効果がなかった。ある場合には拮抗物質はサイトカイン分子に限定され、そしてその毒性のために用量を増加できないので、その作用と強度の範囲は制限されている。サイトカインを中和することができるものは、その影響が強すぎて、身体にとって重要な機能（免疫系）の不活性化を生じた。
【００３１】
ＩＬ−２はそのＲαＩＬ−２と相互作用する。このサブユニットはＩＬ−２を細胞内に取り込むことができ、このことはＴ及びＢリンパ球について示されている。このサブユニットはおそらく再び表面に戻ってくるが、その一方ではこの受容体のほかの鎖は、取り込まれた後に分解される（Ｈｅｍａｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．ヒトＴリンパ球におけるインターロイキン２受容体のエンドサイトーシス：受容体アルファ、ベータ、及びガンマ鎖の異なる分子内局在と動態。Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２９，５５−６４，１９９５）。ＩＦＮγは細胞内に取り込まれ、その受容体が再利用されている間に、分解される（Ｃｅｌａｄａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．マウスマクロファージによる受容体結合インターフェロン−ガンマの細胞内取り込み及び分解。受容体リサイクリングの実証。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９，１４７−５３，１９８７）。ＩＬ−２ＲαによるＩＬ−２の細胞内取り込み並びにＩＦＮγのその受容体による細胞内取り込みの特徴は、少なくとも、キメラ拮抗物質ＡｎＴｈ１の部分を形成するＩＦＮγに対する受容体の細胞外領域のリサイクリングの可能性を示している。このことは、血流中にこの分子が長期間存在し、そのために、その効果を長期間持続させる結果をもたらすであろう。
【００３２】
二つの分子の連結又は結合は、新規分子の創造の結果として生じる立体構造の変化の発生又は空間的相互作用のために関係分子の生物活性の著しい減少又は消失を生じることが多い（Ｋｎｕｓｌｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾は好中球プライミング活性を増強するがコロニー刺激活性は増強しない。Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ８２，６５４−６３，１９９２）。例えば米国特許＃５，０７３，６２７において、ある種の代替法が使用されており、それには、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−３を融合した連結ペプチドの記述がある。この種のペプチドの問題点はそれらが固定していて柔軟性がないことである。この結果として、生物活性を適切に発揮するために必要な正しい立体構造をとることができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
したがって、二つの分子を結合することができ、同時にそれぞれが適切な立体構造を取ることができるペプチドであって、生物活性分子を産生するものを設計し見い出すことが必要である。後者を考慮すると、より安全で、より有効性があり、より特異的な免疫抑制物質及び抗炎症薬が必要である。したがって、標的薬物の病的作用又は機能を全て阻害するが、同時に身体に重要な機能は働かせることができ、患者の生命を危険に曝すことなく長期に使用することができる多彩な能力を持つ分子を考えることが重要である。二つのサイトカインを同時に阻害することができ、そして免疫を無効にすることがない拮抗物質はこれまで設計されたことがない。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明の本質は、ＡｎＴＨ１と呼ばれる組換えキメラタンパク質であり、これは４個のアミノ酸ペプチドを介して２２８アミノ酸を含むＩＦＮγ受容体のαサブユニットのＮ−末端細胞外領域に融合したヒトＩＬ−２のＮ−末端領域の６０アミノ酸フラグメントにより形成されている。このタンパク質はＴ細胞の増殖刺激活性を有し、ＩＬ−２により誘発されるＴ細胞の増殖刺激活性を阻害し、ＩＦＮγによるＨＬＡ−ＩＩの誘導を阻害し、そしてＩＦＮγの抗増殖活性を阻害する。ヒトＩＬ−２のＮ−末端の最初の６０アミノ酸及び結合ペプチドに対応するＤＮＡ配列（配列番号５）及び結合ペプチドの配列及びＲαＩＦＮγの細胞外領域の２２８アミノ酸をコードするＤＮＡ（配列番号７）は、それぞれ、Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｊｉ細胞からＲＮＡポリＡの逆転写および特異的プライマーを使用するＰＣＲにより増幅して得た（実施例１、配列番号１及び配列番号２、配列番号３、配列番号４参照）。結合ペプチド（配列番号６）に対応するＤＮＡ配列は、その目的のために設計し、ＲαＩＦＮγの可溶性受容体の領域を増幅するために使用したプライマーに加えた。
【００３５】
本発明はまた、組換えタンパク質ＡｎＴＨ１のＥ．ｃｏｌｉにおける生産のためのベクター、（ｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）と呼ぶ）、についても記述している。このベクターは、２００２年５月６日に登録番号ＬＭＢＰ４５３５でＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（ＢＣＣＭ）に寄託された。このベクターは組換えＤＮＡ技術を使用して調製された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。このベクターを修飾し、最終的には、選択したマーカー、トリプトファンプロモーター、並びにヒトＩＬ−２の６０アミノ酸結合ペプチド、及びＲαＩＦＮγの細胞外領域の２２８アミノ酸をコードする配列（配列番号８）を含んでいる。得られたベクターの最終的構築物をｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）と呼ぶ（実施例２、図１参照）。
【００３６】
本発明はｐＨｕベクター（ＡｎＴＨ１）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ株も記述する。ｐＨｕベクター（ＡｎＴＨ１）をＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０Ｐ３株を形質転換するために使用した。ｐＨｕベクター（ＡｎＴＨ１）を含むＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０Ｐ３株を増殖し、組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の発現を誘導した。この株は高度のタンパク質発現を達成した（実施例４参照）。このタンパク質は他の宿主細胞（適当なベクターを使用して昆虫細胞、哺乳動物細胞、及び植物細胞）中に発現させることができる。本発明は、生物活性タンパク質の８０−９０％純度の調製品が得られる方法により、生物活性の評価において適当な純度を有する組換えキメラタンパク質の製造も記述している。導入後の株を培養して得た細胞ペレットを、組換えタンパク質を得るために処理する。溶出（変性）剤を使用してペレットを続けて洗うことにより、Ｅ．ｃｏｌｉからのタンパク質の混入を最小限にしながら目的のタンパク質の抽出が行われる。このような方法を使用して適当な純度（８０−９０％）で得た後、ＡｎＴＨ１タンパク質を含む調製品を再生する。この操作は変性剤を徐々に除去することからなる。この操作は実施例５に示される。
【００３７】
本発明は組換えタンパク質ＡｎＴＨ１の生物活性を記述している。このタンパク質はＴ細胞増殖刺激活性を有す（実施例７）。マウス細胞系ＣＴＬＬ−２においてヒトＩＬ−２により生じるＴ細胞の増殖刺激を妨害することができる（実施例８）。細胞系Ｈｅｐ−２においてヒトＩＦＮγの抗増殖活性を阻害することができる（実施例９）。そしてまたＣＯＬＯ２０５細胞系においてＨＬＡ−ＩＩ発現のＩＦＮγによる刺激を阻害する（実施例１０）。ＩＦＮγとは逆に、ヒトＩＬ−２はマウス細胞に作用することができる。
【００３８】
この組換えタンパク質は、ＩＬ−２及びＩＦＮγが共に病理的役割をしている病気に対して有用な医薬組成物の調製に使用することができる。このような病気としては、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、インスリン依存性糖尿病、活動型慢性肝炎及び劇症肝炎のような自己免疫型；慢性関節リュウマチ及び乾癬、並びに臓器移植における移植片対宿主病及び敗血症ショック及びアテローム性動脈硬化のような炎症性疾患などの自己免疫／炎症型がある。
【００３９】
本発明により、種々の病気において病理的機能を有する二つのサイトカインの作用を予防し、阻止し、そして／又は除去するための、新しい方法が創出される。したがって、標的はより特異的な形態において増加する。同じ病的状態に関与する二つのサイトカインシグナリングシステムを中和しそして阻止することができるキメラタンパク質を使用することにより、その阻害方法の範囲、したがってその有効性の範囲を拡大することができるであろう。ある程度のＴ細胞増殖刺激活性を有することにより、免疫系の好ましくない不活性化を回避するのでそれを必要とする患者に長期に使用することができる。したがって、この薬物はより安全であり、そしてより有効である。本発明の目的はヒトＩＬ−２及びＩＦＮγの機能を阻止することができるヘテロ−２価拮抗物質を創り出すことであり、分子の治療可能性を増大し、そして副作用を回避することである。
【００４０】
微生物の寄託：
ｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）プラスミドを、微生物保護に関するブダペスト条約に従い２００２年５月６日に登録番号ＬＭＢＰ４５３５でＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（ＢＣＣＭ）に寄託した。
【実施例１】
【００４１】
ヒトＩＬ−２の最初の６０アミノ酸及びヒトＩＦＮγの可溶性受容体のαサブユニット（ＲαＩＦＮγ）の細胞外領域をコードする相補的ＤＮＡ鎖の単離
ヒトの相補的ＤＮＡを単離するために、Ｒａｊｉ（Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−８６）及びＪｕｒｋａｔ（ヒト急性Ｔ細胞白血病、ＡＴＣＣ：ＴＩＢ−１５２）細胞を、５Ｌフラスコに入れた１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％ＣＯ２雰囲気の下、３７℃で穏やかに振とうしながら増殖した。Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｊｉからの全ＲＮＡの抽出はＣｈｏｍｃｚｙｓｋｉの方法により行った（Ｃｈｏｍｃｚｙｓｋｉ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．酸グアニジウム  チオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ抽出の一段階法。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−９，１９８７）。次いで、ＲＮＡ−ポリＡを市販のメッセンジャーＲＮＡ単離システム（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｅｓｓａｇｅｍａｋｅｒｒ  ｃａｔ．＃１０５５１−０１８）を使用して抽出した。ヒトＩＬ−２の最初の６０アミノ酸及びヒトＲαＩＦＮγの細胞外アミノ末端部分の２８８アミノ酸をコードする相補的ＤＮＡは、Ｊｕｒｋａｔ及びＲａｊｉ細胞からそれぞれ得たポリＡ  ＲＮＡの逆転写により単離し、ＰＣＲで増幅した。ランダム６量体を使用して約１−２μｇのポリＡ  ＲＮＡを処理した。
【００４２】
ヒトＩＬ−２の最初の６０アミノ酸のＤＮＡの相補鎖を増幅するために使用したオリゴヌクレオチド（プライマー）の配列は、配列番号１（プライマー１）及び配列番号２（逆プライマー１）に記述されている。ヒトＲαＩＦＮγのアミノ末端の２２８アミノ酸の相補鎖ＤＮＡを増幅するために使用したプライマーの配列は、配列番号３（プライマー２）及び配列番号４（逆プライマー２）に記述されている。
【００４３】
増幅されたヒトＩＬ−２の最初の６０アミノ酸及び結合ペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号５）を制限酵素Ｎｃｏ  Ｉで消化した（プライマー１、配列番号１、の配列に下線をつけた）。次いでフェノール−クロロホルム抽出を行い、酵素及び緩衝液を除去した。それを沈殿し、そして適当な緩衝液に再懸濁して、−７０℃で保存した。結合ペプチドの配列（配列番号６）を参照。
【００４４】
増幅された結合ペプチド及びＲαＩＦＮγの２３１アミノ酸をコードするＤＮＡ（配列番号７）を付着末端でクレノーポリメラーゼと結合して前記のように精製した。次いで制限酵素ＢａｍＨ  Ｉで消化し（逆プライマー２の配列に下線をつけた）、そして上記のように精製した。結合ペプチドの配列（配列番号６）を参照。
【００４５】
増幅されたバンド（配列番号５及び７）を計算した比率で適当な緩衝液中に混合して、結合ペプチドに対応する配列（配列番号６）によってヒトＲαＩＦＮγの細胞外領域の２３１アミノ酸に対応する配列に結合したヒトＩＬ−２の最初の６０アミノ酸に対応するＤＮＡ配列を含む新しいバンドを得た。この新しいバンドをＰＣＲにより増幅した。
【００４６】
増幅したＤＮＡ（配列番号８）を前記のように精製した。増幅したＤＮＡを制限酵素Ｂａｍ  ＨＩで消化し、記述したように酵素及び緩衝液を除去する操作を行った。その後、ＤＮＡを再度ＮｃｏＩ酵素で消化し、記述のように精製した。
【実施例２】
【００４７】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１を発現するための遺伝子構築物
発現ベクターは、強力なトリプトファンプロモーターを含んでいる。このベクターをＢａｍＨ  Ｉ酵素で消化した。次いでフェノール−クロロホルムで抽出を行い、酵素及び緩衝液を除去し、沈殿し、そして適当な緩衝液中に再度懸濁した。その後、Ｎｃｏ  Ｉ酵素で消化した。ベクターは最終的に前記のようにゲルで分離した。したがってこのベクターはトリプトファンプロモーター、Ｎｃｏ  Ｉフリー付着部位、ＢａｍＨ  Ｉフリー付着部位、ターミネーターＴ４及びアンピシリン耐性遺伝子を有している。
【００４８】
リガーゼＴ４酵素を使用して配列番号８に対応するＤＮＡをベクターに連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を遺伝子構築物で形質転換した。ヒトＩＬ−２の最初のアミノ酸並びに結合ペプチド及びヒトＲαＩＦＮγの２３１アミノ酸に対応する相補的ＤＮＡフラグメントを含む形質転換体は、酵素Ｎｃｏ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩを使用して行った制限分析により、トリプトファンプロモーターと同じディレクションにあることが確認された。得られたプラスミドをｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）と呼ぶ（図１参照）。
【実施例３】
【００４９】
配列分析
最終的遺伝子構築物を配列分析した。Ｓａｎｇｅｒの方法に基づくプロトコールで配列分析を行った（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．チェーンターミネーティング阻害物質を使用するＤＮＡ配列分析。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４，５４６３−６７，１９７７）。構築物は、制御下にあるＩＬ−２をコードする遺伝子の一部（アミノ末端から始まる６０アミノ酸）と、その後にヒトＲαＩＦＮγのアミノ末端の２２８アミノ酸をコードする領域に結合している、連結ペプチドをコードするヌクレオチドの配列（配列番号６）を有することが確認された。配列番号８参照。
【実施例４】
【００５０】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１のＥ．ｃｏｌｉにおける発現
宿主株はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０  Ｐ３（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈ  Ｆ−）であり、プラスミドはｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）であった。発現のために、プラスミドをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びＬ−トリプトファン（１００μｇ／ｍＬ）を加えた５ｍＬのＬＢ培地に接種し、振とうしながら６時間３７℃でインキュベートした。この培養にＬＢ培地の５０ｍＬを加えて１００ｒ．ｐ．ｍ．の振とう機中で６時間３７℃に置いた。この培養を０．２％加水分解カゼイン、０．４％グルコース、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを添加した５００ｍＬのＭ９培地（３３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，８．５ｍＭ  ＮａＣｌ，１８ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に加え、培養の最初の光学密度（６２０ｎｍ）が０．３になるようにした。次いで上記と同じ条件下に８時間インキュベートし、最後に遠心分離により細胞沈殿を回収した（図２参照）。
【実施例５】
【００５１】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の抽出、精製及び再生
ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２）１ｍＬ当り湿ったバイオマス（ｄａｍｐ  ｂｉｏｍａｓｓ）０．１ｇの濃度で、ポリトロンを使用して細胞をホモジナイズした。この懸濁液にリゾチームによる酵素的破壊プロセスを行った。前段階で得られたペレットを、１Ｍから８Ｍまでの異なるモル濃度の尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２，１ｍＭ  ＥＤＴＡでセル洗浄した。ホモジナイズはポリトロンで行った。最初１分間ホモジナイズし、３分間静置し、ついでもう１分間ホモジナイズした。全操作は４℃で行った。尿素約１５０ｍＬで可溶化したタンパク質を、予め３倍容積の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ９，４Ｍ尿素で平衡したセファデックスＧ−１００樹脂を入れたＫ９／６０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スエーデン）に３ｍＬ／分の流速で適用した。溶出は同じ緩衝液で行った。タンパク質を含むフラクションを集め、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ９に対して透析を行った。その後、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に対して透析を継続した。（図３及び４参照）
【実施例６】
【００５２】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１に対するガンマＩＦＮの結合
再生後の組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の１μＬ（約１μｇの全タンパク質）をニトロセルロースストリップに適用した。このストリップを１０％脱脂乳と２時間室温（ＲＴ）でインキュベートした。膜をＴｒｉｓ緩衝食塩液（ＴＢＳ）で５分間２回洗った。洗った後、標識していない過剰のガンマＩＦＮの存在下または非存在下に、ストリップを放射活性ヨード３５μｃｉ／μｇで標識したガンマＩＦＮ（１２５Ｉ−ＩＦＮガンマ）と１時間室温でインキュベートした。その後、ニトロセルロースストリップをＴＢＳで５分間２回、次いでＴＢＳ＋０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０で５分間洗った。最後に、放射線感光フィルムをストリップで露光し、−７０℃で７２時間保存し、次いで現像した。（図５参照）。
【実施例７】
【００５３】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１のＴ細胞増殖刺激活性
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の生物活性を、ＩＬ−２依存性マウスＴリンパ球の細胞系を使用して試験した。この細胞を、１ｍＭピルビン酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０μＭ２−メルカカプトエタノール及び１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地上で比活性１．２ｘ１０７ＩＵ／ｍｇのヒト組換えインターロイキン−２を８ＩＵ／ｍＬを添加して増殖した。使用前に細胞を３回洗い、ＩＬ−２を除いた完全培地に懸濁して、湿ＣＯ２雰囲気中１時間３７℃でインキュベートした。次いで細胞を洗い、４ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、ｒｈＩＬ−２の１：２連続希釈液又は検体（組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１）の１００μｌを完全培地中に含む９６ウエル（ウエル当り１００μｌ）のプレートに接種した。この試験に使用した国際標準はＩＬ−２０１０３９７であった。３７℃で３６時間インキュベーション後、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Ｃ１８Ｈ１６Ｎ５ＳＢｒ）の２０μｌを各ウエルに加え、同じ条件で４時間インキュベートした。最後に、５０μｌ／ウエルの１０％ＳＤＳ、０．１Ｎ  ＨＣｌ、５０％イソプロパノールを加え、プレートを１時間３７℃で振とうし、プレートリーダーを使用して５７０ｎｍの吸光度を測定した（図６参照）。
【実施例８】
【００５４】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１によるＴ細胞増殖を刺激するＩＬ−２活性の阻害
ＩＬ−２に対する生物活性をＩＬ−２依存性マウスＴリンパ球の細胞系を使用して試験した。細胞を前の実験と同じ形で増殖した。使用前に細胞を３回洗い、ＩＬ−２を含まない完全培地に再懸濁し、１時間３７℃で湿ＣＯ２雰囲気中インキュベートした。次いで細胞を洗い、４ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、ｒｈＩＬ−２の１：２連続希釈液又は検体（ｒｈＩＬ−２＋組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１又は組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１のみ）の１００μｌを完全培地中に含む９６ウエル（ウエル当り１００μｌ）のプレートに接種した。この試験に使用した国際標準はＩＬ−２０１０３９７であった。３７℃で３６時間インキュベーション後、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Ｃ１８Ｈ１６Ｎ５ＳＢｒ）の２０μｌを各ウエルに加え、同じ条件で４時間インキュベートした。最後に、５０μｌ／ウエルの１０％ＳＤＳ、０．１Ｎ  ＨＣｌ、５０％イソプロパノールを加えた。次いでプレートを１時間３７℃で振とうし、プレートリーダーを使用して５７０ｎｍの吸光度を測定した。結果はｒｈＩＬ−２の標準希釈曲線及び検体の系統希釈のデータに基づいて、ｒｈＩＬ−２の単位として示した（図７参照）。
【実施例９】
【００５５】
組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１によるＩＦＮγの抗増殖活性の阻害
１０％ウシ胎児血清を添加したＭＥＭ  ＣＡＮＥ培地（非必須アミノ酸を加えた必須最小培地）中で２．５ｘ１０３細胞／ウエルのＨｅｐ−２の増殖を９６ウエルプレートで行った。これを５％ＣＯ２のインキュベーター中２４時間３７℃でインキュベートした。この後培地を交換し、評価する検体並びにそれぞれの対照を連続希釈して加えた。７２時間のインキュベーションの後、細胞を０．５％クリスタルバイオレットで２分間染色し、プレートリーダーでプレートを測定した（図８参照）。
【実施例１０】
【００５６】
ＩＦＮγによるＨＬＡ  ＩＩの誘導の組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１による阻害
これはＳｅｅｌｉｎｇ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．ヒトγ−インターフェロンの受容体ペプチド拮抗物質の開発及びｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙを使用するリガンド結合立体構造の解析。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９２４１−５３，１９９５によって記述された細胞に対するＥＬＩＳＡ試験である。細胞系Ｃｏｌｏ２０５を使用した。これを９６ウエル培養プレート中で、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０の０．１ｍＬ中２．５ｘ１０５細胞／ウエルで増殖した。細胞を５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中１２時間３７℃でインキュベートした。次いで、培地中で増殖した細胞を、組換えキメラタンパク質及びγＩＦＮを含む０．１ｍＬ中に加え１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、培地で３回洗った。その後培地の１．２ｍＬの分割液をウエルに加え、プレートを４８時間３７℃でインキュベートしてＨＬＡ−ＤＲ抗原を誘導させた。ウエルをＰＢＳで洗い、２分間純エタノールを加えて細胞を固定した。洗浄を繰り返し、プレートをＰＢＳ０．５％ウシ血清アルブミンで希釈したマウスモノクロナール抗体  抗−ＨＬＡ−ＤＲとともに１時間室温でインキュベートした。ウエルをＰＢＳで洗い、同じ条件で抗−ＩｇＧマウス−パーオキシダーゼコンジュゲートとインキュベートした。洗浄を３回繰り返し、１００μＬ／ウエルの０．１５％Ｈ２Ｏ２＋５ｍｇ／ｍｌ  Ｏ−フェニレンジアミンを加えることにより現像した。反応の検出は５０μＬ／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により行い、プレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した（図９）。
【実施例１１】
【００５７】
マススペクトル分析
精製タンパク質の分割液（０．５μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＺｎ−イミダゾールを用いる逆染色（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａ  Ｌ  ｙ  ｃｏｌｓ．イミダゾール及び亜鉛ＩＩの塩による電気泳動ゲル中のバイオ分子の検出：研究の１０年。Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．２００１，２２，８６４−７）により分析した。バンドを切り取り、クエン酸溶液（１％）で完全に無色になるまで５分間インキュベートし、さらに１０分間水中でインキュベートして過剰のキレート剤を除去した。透明なバンドをさらに約１ｍｍ３の小さな角形に切り、ＴＦＡを含まない９０％アセトニトリル水溶液で脱水し、高速真空で完全に乾燥した。このゲル片を、１２．５ｎｇの修飾トリプシンを含み、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＭＡ，ＵＳＡ）の配列分析純度を有する５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶液の２０−３０μＬで浸した。テルモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，ＵＳＡ）中３７℃で終夜ゲル内消化を行った。２０μＬの５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３溶液をさらに加え、４５分間さらにインキュベートし、トリプシン消化ペプチドを、メーカーが推奨するように予め活性化し平衡したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ＵＳＡ）のＺｉｐＴｉｐｓ  Ｃ１８を使用して抽出した。トリプシン消化ペプチドを抽出するために２０回のローディングサイクルを行った。消化物を蟻酸で酸性とし、室温で４５分間インキュベートし、さらに２０回のローディングサイクルを行った。Ｚｉｐｔｉｐを５％蟻酸溶液を使用してよく洗い、そしてタンパク分解ペプチドを２μＬの１％蟻酸を含む６０％アセトニトリルで溶出した。
【００５８】
低エネルギーＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｚ−ｓｐｒａｙナノフローエレクトロスプレーイオン源を装着したＭｉｃｒｏｍａｓｓ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，英国）のｈｙｂｒｉｄ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ＱＴＯＦを使用して測定した。マススペクトロメーターはイオン源を８０℃とし乾燥ガス流を５０Ｌ／ｈとして運転した。ペプチドを約５ｐｍｏｌｅ／μＬの濃度に溶解した。２マイクロリットルのトリプシン分解ペプチドをホウ珪酸塩ナノフローチップ上に載せ、ナノフローチップ及びエントランスコーンにそれぞれ９００Ｖ及び３５Ｖの電圧をかけた。ＭＳ／ＭＳスペクトルをとるにはＧｏｎｚａｌｅｚ，Ｌ．ｙ  ｃｏｌｓ．エレクトロスプレーイオン化及び低エネルギータンデムマススペクトルによるアルファ−及びベータ−アスパラギン酸の区別。Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００，１４，２０９２−２１０．により記述されている方法を使用した。最初の四重極を４−５Ｔｈの枠内の前駆イオンを選択するために使用した。３ｘ１０−２以上の圧のＰａ衝突ガス（アルゴン）を６極衝突室内で使用してフラグメントイオンを得た。適当な衝突エネルギーを使用して前駆体イオンの強度を元の強度の半分を超える強度に減少させた。データの取得及び操作はＭｉｃｒｏｍａｓｓのＭａｓｓＬｙｎｘ  ｓｙｓｔｅｍ（ｖ３．５）を使用して行った。
【００５９】
ＡｎＴｈ１タンパク質由来トリプシン分解ペプチドのＥＳＩ−ＭＳ分析
【表１】
2006506958.tif 000003
ａ．ペプチドの配列のナンバリングは図１０に示したＡｎＴｈ１タンパク質に従う。
ｂ．個々のペプチドの荷電状態。
ｃ．検出したペプチドの理論的質量と実験分子質量の絶対質量差を示す。
ｄ．ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより配列決定されたペプチド。
ｅ．トリプシンの非特異的切断によって生じたペプチド。
ｆ．フリーシステインを含むペプチド。
【００６０】
提案した解決策の利点
本発明は、一つの分子中に、免疫調節及び炎症の機構に影響を及ぼす二つのシグナル系に介入する能力を結合している。キメラタンパク質の設計は、４アミノ酸ペプチドを介するリガンド（ＩＬ−２６０）と細胞外受容体（ＲαＩＦＮγ）の融合からなる。この組み合わせは、組換えキメラタンパク質とＲαＩＬ−２をその表面に持つ細胞との結合を可能とする。このサブユニットは主に、非活性Ｔ細胞、及び活性化Ｔ細胞の高親和性ＩＬ−２受容体（ＲαβγＩＬ−２）に存在する（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．インターロイキン−２受容体。Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，３９７−４０３，１９８９及びＳｔｒｏｍ，Ｔ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．インターロイキン−２受容を指向する治療：抗体又はサイトカインに基づく標的分子。Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４４，３４３−５０，１９９３）。
【００６１】
ＡｎＴＨ１タンパク質が休止期の細胞のＲαＩＬ−２に結合した場合には、細胞がそのタンパク質を取り込むことができ、外部へとリサイクルする条件下でＲαＩＦＮγを細胞質に残し、細胞の活性化のために生産されるγＩＦＮを妨害する。細胞質のγＩＦＮと、γＩＦＮの生物活性を発現する可能性のある膜受容体の細胞内領域の相互作用は記述されている（Ｓｚｅｎｔｅ  Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＩＦＮの同定（ＪＡＫ２に対する受容体結合部位及びＩＦＮγ及びそのＣ−末端ペプチドＩＦＮγ（９５−１３３）による結合の増強。Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５，５６１７−２２，１９９５）。体によって生産されたＩＬ−２の活性を減少させる必要があるような病気の際に、ＡｎＴＨ１タンパク質を与えた場合には、ＩＬ−２６０部分を介して免疫系の活性化した細胞の高親和性複合体（ＲαβγＩＬ−２）のアルファサブユニットに結合し、免疫系の細胞により分泌された完全なＩＬ−２（天然）との結合を阻害してその生物活性を阻害するであろう。他方、活性化Ｔ細胞から既に分泌されたγＩＦＮはキメラタンパク質のＲαＩＦＮγ部分によって隔離され、膜受容体に結合できない。このようにして、自己免疫及び／又は炎症反応を、活性化及び反応の進行過程の、二つの異なる場面において調節することができる。
【００６２】
本発明はＩＬ−２及びγＩＦＮの生物活性を阻害するヘテロ−２価キメラタンパク質を提供する。組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１がＴ細胞増殖刺激活性も持つことを考慮すると、既に臨床的に実証されているサイトカイン拮抗物質による免疫系の重大な不活性化は少ないと期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の発現用の遺伝子構築プラスミドｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）。
【図２】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１のＥ．ｃｏｌｉにおける発現。還元条件下における１２．５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動。ａ：分子量標準；ｂ，ｃ，ｄ：陰性対照株、０，８及び１８時間誘導；ｅ，ｆ，ｇ：０，８及び１８時間の誘導条件下のプラスミドｐＨｕ（ＡｎＴＨ１）を含む株。
【図３】精製過程の種々の段階における組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の存在。Ａ：還元条件下の１２．５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動。レーンａ：分子量標準、ｂ：醗酵、ｃ：尿素８Ｍ抽出、ｄ：混合ゲル濾過クロマトグラフィーのフラクション、ｅ：透析後のフラクションの混合物。Ｂ：１％ＰＢＳ／脱脂乳で１：１０００に希釈した抗−ＡｎＴＨ１抗血清を使用した「ウエスタンブロット」、抗−Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０Ｐ３抗体から放出された。Ｂ：レーンｂ，ｃ，ｄ，ｅは図Ａの電気泳動と同じ検体及び同じ順序（分子量標準は適用しなかった）。
【図４】「ウエスタンブロット」を使用したキメラタンパク質ＡｎＴＨ１の同定。抗−ＩＬ−２（Ａ）及び抗−ＡｎＴＨ１（Ｂ）抗血清を同定のために使用した。両者の希釈係数は１：１０００であった。透析後再生したＡｎＴＨ１調製品を使用し（レーンａ）、レーンｂにはＩＬ−２を適用した。
【図５】「ドットブロット」を使用するキメラタンパク質ＡｎＴＨ１に対するＩ１２５標識ヒトＩＦＮγの結合検定。ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出液約１μｌをニトロセルロース膜に使用した。ストリップをＩ１２５標識ヒトＩＦＮγ（３５μＣｉ／μｇ）と過剰のヒトＩＦＮγ（１００倍過剰）の非存在下（レーンａ）及び存在下（レーンｂ）にインキュベートした。
【図６】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１によるＴ細胞の増殖刺激活性。バー１：２．８ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２、バー２：１．５ｎｇ／ｍｌのＡｎＴＨ１、バー３：培地。
【図７】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１によるマウス細胞系ＣＴＬＬ−２におけるヒトＩＬ−２の増殖刺激活性の阻害（結果はＩＬ−２の国際単位で示した）。
【図８】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１によるヒトＩＦＮγの抗増殖活性の阻害結果。バー１：４  ＩＵ／ｍｌのγＩＦＮ（４ｎｇ／ｍｌ）、バー２：４  ＩＵ／ｍｌのγＩＦＮ＋５０μｇ／ｍｌ  ＡｎＴＨ１、バー３：５０μｇ／ｍｌ  ＡｎＴＨ１。
【図９】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１によるＨＬＡ  ＩＩ誘導ＩＦＮγの阻害。バー１：基準レベル（ＩＦＮγ＝０  ＩＵ／ｍｌ）、バー２：ＩＦＮγ５００  ＩＵ／ｍｌ（０．５μｇ／ｍｌ）、バー３：ＩＦＮγ５００  ＩＵ／ｍｌ＋１．５μｇ／ｍｌ  ＡｎＴＨ１。
【図１０】組換えキメラタンパク質ＡｎＴＨ１のアミノ酸配列。マス質量分析により決定したペプチドを示した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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