(57)【要約】本発明は、標的リガンドに対する第1結合特異性を有する第1免疫グロブリン可変ドメインと、該標的リガンドの受容体に対する第2結合特異性を有する相補的または非相補的免疫グロブリン可変ドメインとを含む二重特異性リガンドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的リガンドに特異的な第1 dAbと、該標的リガンドの受容体に特異的な第2 dAbとを含んでなる二重特異性リガンド。
【請求項２】
開いたコンホメーションのリガンドであり、標的リガンドと標的リガンド受容体との両方に同時に結合しうる、請求項1記載の二重特異性リガンド。
【請求項３】
標的リガンドがTNFαである、請求項1または請求項2記載の二重特異性リガンド。
【請求項４】
TNFαに特異的なdAbが、表面プラズモン共鳴による測定で、50nM〜20pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 S-1のKoff速度定数でヒトTNFαから解離する、請求項3記載の二重特異性リガンド。
【請求項５】
TNFαに特異的なdAbがVκである、請求項3または請求項4記載の二重特異性リガンド。
【請求項６】
TNFαに特異的なdAbがTAR1-5-19のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項5記載の二重特異性リガンド。
【請求項７】
TNFαに特異的なdAbがTAR1-5のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項5記載の二重特異性リガンド。
【請求項８】
TNFαに特異的なdAbがTAR1-27のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項5記載の二重特異性リガンド。
【請求項９】
標的リガンド受容体がTNF受容体1（p55）である、請求項1〜3のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１０】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbが、表面プラズモン共鳴による測定で、50nM〜20pMの解離定数（Kd）および5×10-1〜1×10-7 S-1のKoff速度定数でヒトTNF受容体1から解離する、請求項9記載の二重特異性リガンド。
【請求項１１】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbが、標準的な細胞アッセイにおいて、500nM〜50pMのND50でヒトTNFαまたはTNF受容体1を中和する、請求項10記載の二重特異性リガンド。
【請求項１２】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbが、標準的な細胞アッセイにおいて、100nM以下のND50でTNF受容体1の活性に拮抗し、該dAbが、10μM以下の濃度で、TNF受容体1の活性を該アッセイにおいて5％以下しか作動させない、請求項10または請求項11記載の二重特異性リガンド。
【請求項１３】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbがTAR2h-10のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項10〜12のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１４】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbがTAR2h-10のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90％相同な配列を含む、請求項10〜12のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１５】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbがTAR2h-5のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項10〜12のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１６】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbがTAR2h-5のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90％相同な配列を含む、請求項10〜12のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１７】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbがTAR2h-10-27のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項10〜12のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１８】
TNF受容体1（p55）に特異的なdAbがTAR2h-10-27のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90％相同な配列を含む、請求項10〜12のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項１９】
TNFαおよび／またはTNF受容体1（p55）がヒト形態である、請求項3〜18のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項２０】
1以上のdAbが更に、末端Cys残基を含む、請求項1〜19のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項２１】
標的リガンドがTNFαであり、標的リガンド受容体がTNF受容体1（p55）である、請求項1または請求項2記載の二重特異性リガンド。
【請求項２２】
TAR1-5-19 Vκドメインまたはそれに対して少なくとも80％相同な配列、およびTAR2h-10-27 VHドメインまたはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項21記載の二重特異性リガンド。
【請求項２３】
TAR1-5-19 VκドメインおよびTAR2h-10-27 VHドメイン、またはそれらのホモログが、結合部位内の相補的ドメインとして配置されている、請求項22記載の二重特異性リガンド。
【請求項２４】
二量体である、請求項1〜23のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項２５】
三量体である、請求項1〜23のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項２６】
TNFαに特異的な2つのリガンド、およびTNF受容体1（p55）に特異的な1つのリガンドを含む、請求項23記載の二重特異性リガンド。
【請求項２７】
Fab、F(ab')2およびIgG免疫グロブリンよりなる群から選ばれる、請求項1〜26のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項２８】
二重特異性リガンドが、開いたコンホメーションを有し、2以上の標的に同時に結合することが可能であり、二重特異性リガンドが、TAR1-5-19またはそれに対して少なくとも80％相同な配列であるTNFαに特異的な少なくとも1つのdAbを含む、Fab、F(ab')2およびIgG免疫グロブリンよりなる群から選ばれる二重特異性リガンド。
【請求項２９】
少なくとも1つの更なるdAbを含み、その更なるdAbがVHドメインである、請求項28記載の二重特異性リガンド。
【請求項３０】
二重特異性リガンドが、開いたコンホメーションを有し、2以上の標的に同時に結合することが可能であり、二重特異性リガンドが、TAR2h-10-27またはそれに対して少なくとも80％相同な配列であるTNF受容体1（p55）に特異的な少なくとも1つのdAbを含む、Fab、F(ab')2およびIgG免疫グロブリンよりなる群から選ばれる二重特異性リガンド。
【請求項３１】
少なくとも1つの更なるdAbを含み、その更なるdAbがVκドメインである、請求項28記載の二重特異性リガンド。
【請求項３２】
更なるdAbが血清アルブミン（SA）に結合する、請求項29または請求項31記載の二重特異性リガンド。
【請求項３３】
血清アルブミン（SA）に特異的なdAbが、表面プラズモン共鳴による測定で、1nM〜500μMの解離定数（Kd）でSAから解離する、請求項32記載の二重特異性リガンド。
【請求項３４】
血清アルブミン（SA）に特異的なdAbが、標準的なリガンド結合アッセイにおいて、1nM〜500μMのIC50でSAに結合する、請求項32または請求項33記載の二重特異性リガンド。
【請求項３５】
血清アルブミン（SA）に特異的なdAbがMSA-16のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項32〜34のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項３６】
血清アルブミン（SA）に特異的なdAbがMSA-26のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも80％相同な配列を含む、請求項32〜34のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項３７】
二重特異性リガンドが、開いたコンホメーションを有し、2以上の標的に同時に結合することが可能であり、二重特異性リガンドが、TAR2h-10-27またはそれに対して少なくとも80％相同な配列であるTNF受容体1（p55）に特異的な少なくとも1つのdAb、およびTAR1-5-19またはそれに対して少なくとも80％相同な配列であるTNFαに特異的な少なくとも1つのdAbを含む、Fab、F(ab')2およびIgG免疫グロブリンよりなる群から選ばれる二重特異性リガンド。
【請求項３８】
汎用フレームワークを含む、請求項27〜37のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項３９】
汎用フレームワークが、DP47、DP45およびDP38よりなる群から選ばれるVHフレームワーク、および／またはDPK9であるVLフレームワークを含む、請求項38記載の二重特異性リガンド。
【請求項４０】
一般的リガンドへの結合部位を含む、請求項27〜39のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項４１】
一般的リガンド結合部位が、プロテインA、プロテインLおよびプロテインGよりなる群から選ばれる、請求項40記載の二重特異性リガンド。
【請求項４２】
請求項27〜41のいずれか1項記載の二重特異性リガンドであって、該リガンドが、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む1以上のフレームワーク領域を有する可変ドメインを含む、あるいは、該フレームワーク領域の1以上のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、合わせて5アミノ酸までの相違を含む、前記二重特異性リガンド。
【請求項４３】
請求項27〜41のいずれか1項記載の二重特異性リガンドであって、該リガンドが可変ドメインを含み、FW1、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである、あるいは、FW1、FW2、FW3およびFW4のアミノ酸配列が、該ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と比較して、合わせて10アミノ酸までの相違を含有する、前記二重特異性リガンド。
【請求項４４】
請求項42または請求項43記載の二重特異性リガンドであって、該リガンドが、FW1、FW2およびFW3領域を含む抗体可変ドメインを含み、該FW1、FW2およびFW3のアミノ酸配列が、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同じである、前記二重特異性リガンド。
【請求項４５】
ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントが、DP47、DP45、DP48およびDPK9よりなる群から選ばれる、請求項42〜請求項44のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項４６】
ラクダ科動物免疫グロブリン可変ドメインではないVHドメインを含む、請求項1〜46のいずれか1項記載の二重特異性リガンド。
【請求項４７】
ヒトVHドメインと比較してラクダ科動物免疫グロブリン可変ドメインに特異的な1以上のアミノ酸を含有しないVHドメインを含む、請求項46記載のリガンド。
【請求項４８】
TAR2h-10-27またはそれに対して少なくとも80％相同な配列であるTNF受容体1（p55）に特異的なdAb単量体dAb。
【請求項４９】
請求項48記載のdAb単量体をコードする核酸。
【請求項５０】
請求項49記載の核酸を含んでなる核酸ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は二重特異性リガンドに関する。特に、本発明は、第1抗原またはエピトープに結合する第1免疫グロブリン単一可変ドメインと、第2抗原またはエピトープに結合する第2免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む二重特異性リガンドの製造方法を提供する。より詳しくは、本発明は、第1および第2抗原またはエピトープの少なくとも一方に対する結合がリガンドのin vivo半減期を延長するように作用する、二重特異性リガンドに関する。2以上の結合特異性を含む開いたコンホメーションおよび閉じたコンホメーションのリガンドを記載する。
【背景技術】
【０００２】
序論
抗体の抗原結合ドメインは、2つの別個の領域、すなわち、重鎖可変ドメイン（VH）および軽鎖可変ドメイン（VL：これはVκまたはVλでありうる）を含む。抗原結合部位自体は、6個のポリペプチドループ（VHドメインからの3個（H1、H2およびH3）およびVLドメインからの3個（L1、L2およびL3））により形成される。VHおよびVLドメインをコードするV遺伝子の多様な一次（primary）レパートリーが、遺伝子セグメントの組合せ再構成により産生される。VH遺伝子は、3個の遺伝子セグメント（VH、DおよびJH）の組換えにより産生される。ヒトにおいては、ハプロタイプに応じて、約51個の機能的VHセグメント（CookおよびTomlinson (1995) Immunol Today, 16:237）、25個の機能的Dセグメント（Corbettら (1997) J. Mol. Biol., 268:69）および6個の機能的JHセグメント（Ravetchら (1981) Cell, 27:583）が存在する。VHセグメントは、VHドメインの第1および第2抗原結合ループ（H1およびH2）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、VH、DおよびJHセグメントは組み合わされてVHドメインの第3抗原結合ループ（H3）を形成する。VL遺伝子は、僅か2個の遺伝子セグメント（VLおよびJL）の組換えにより産生される。ヒトにおいては、ハプロタイプに応じて、約40個の機能的Vκセグメント（SchaebleおよびZachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374:1001）、31個の機能的Vλセグメント（Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264:220; Kawasakiら (1997) Genome Res., 7:250）、5個の機能的Jκセグメント（Hieterら (1982) J. Biol. Chem., 257:1516）および4個の機能的Jλセグメント（VasicekおよびLeder (1990) J. Exp. Med., 172:609）が存在する。VLセグメントは、VLドメインの第1および第2抗原結合ループ（L1およびL2）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードし、一方、VLおよびJLセグメントは組合されてVLドメインの第3抗原結合ループ（L3）を形成する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中程度のアフィニティーでほとんどすべての抗原に結合するのに十分な多様性を有すると考えられる。高アフィニティー抗体は、点突然変異の生成を伴う再構成遺伝子の「アフィニティー成熟」により産生され、改善された結合に基づいて免疫系により選択される。
【０００３】
抗体の構造および配列の分析は、6個の抗原結合ループのうちの5個（H1、H2、L1、L2、L3）が、限られた数の主鎖コンホメーションまたは規定（canonical）構造を有することを示している（ChothiaおよびLesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901; Chothiaら (1989) Nature, 342:877）。主鎖コンホメーションは、（i）抗原結合ループの長さ、および（ii）抗原結合ループおよび抗体フレームワーク内の特定の鍵部位における個々の残基または残基のタイプにより決定される。該ループ長および鍵残基の分析は、ヒト抗体配列の大多数によりコードされるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションを予測することを可能にした（Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227:799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14:4628; Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264:220）。H3領域は、配列、長さおよび構造の点で、より一層多様であるが（Dセグメントを利用しているため）、それはまた、該ループおよび該抗体フレームワーク内の鍵部位における個々の残基の長さ及び存在または残基のタイプに左右される短いループ長に対する限られた数の主鎖コンホメーションを形成する（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263:800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399:1）。
【０００４】
VHおよびVL領域の相補的ペアを含む二重特異性抗体が当技術分野において公知である。これらの二重特異性抗体は、各VH/VLペアが単一抗原またはエピトープに結合する2つのペアのVHおよびVLを含まなければならない。記載されている方法は、ハイブリッドハイブリドーマ（Milstein & Cuello AC, Nature 305:537-40）、ミニボディ（minibody）（Huら, (1996) Cancer Res 56:3055-3061）、ダイアボディ（Holligerら, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448; WO 94/13804）、キレート化組換え抗体（CRAbs; (Neri et al., (1995) J. Mol. Biol. 246, 367-373）、biscFv（例えば、Atwellら, (1996) Mol. Immunol. 33, 1301-1312）、「ノブ・イン・ホール（knobs in holes）」安定化抗体（Carterら, (1997) Protein Sci. 6, 781-788）を使用するものである。いずれの場合にも、各抗体種は2つの抗原結合部位を含み、それらのそれぞれはVHおよびVLドメインの相補的ペアにより形成される。それにより、各抗体は、2つの異なる抗原またはエピトープに同時に結合することが可能であり、各抗原またはエピトープへの結合はVHおよびその相補的VLドメインにより媒介される。これらの技術のそれぞれはその特有の欠点を有する。例えば、ハイブリッドハイブリドーマの場合には、不活性なVH/VLペアが二重特異性IgGの割合を著しく減少させうる。さらに、ほとんどの二重特異性アプローチは、異なるVH/VLペアを会合させて又はVH鎖とVL鎖とを会合させて、2つの異なるVH/VL結合部位を再生させることに基づくものである。したがって、組み立てられた分子内の各抗原またはエピトープに対する結合部位の比率を制御することは不可能であり、したがって、組み立てられた分子の多くは、一方の抗原またはエピトープには結合するが他方には結合しないであろう。いくつかの場合には、両方の抗原またはエピトープへの結合部位を有する分子の数を改善するために、サブユニット境界において重鎖または軽鎖を改変操作することが可能となっているが（Carterら, 1997）、これは、両方の抗原またはエピトープへの結合を示す全ての分子を与えるわけではない。
【０００５】
2つの異なる抗体結合特異性を同じ結合部位内に付与することが可能であろうという幾つかの証拠が存在するが、これらは、一般には、構造的に関連した抗原もしくはエピトープまたは広く交差反応する抗体に対応する2以上の特異性を表す。例えば、交差反応性抗体が記載されており、通常、それらの2つの抗原は、配列および構造において、例えば鶏卵白リゾチームおよびシチメンチョウリゾチーム（McCafferty et al., WO 92/01047）または遊離ハプテンおよび担体結合ハプテン（Griffiths ADら, EMBO J 1994 13:14 3245-60）に関連している。もう1つの例では、WO 02/02773（Abbott Laboratories）は、「二重特異性」を有する抗体分子を記載している。言及されている抗体分子は、複数の抗原に対して生成した又は選択された抗体であり、それらの特異性は2以上の抗原に及ぶ。WO 02/02773の抗体における各相補的VH/VLペアは、2以上の構造的に関連した抗原に対する単一の結合特異性を特定し、そのような相補的ペアにおけるVHおよびVLドメインはそれぞれ異なる特異性を有してはいない。したがって、それらの抗体は、構造的に関連している2つの抗原に及ぶ広い単一特異性を有する。さらに、構造的に関連していない少なくとも2つ（通常はそれ以上）の異なる抗原またはエピトープと反応する多反応性天然自己抗体が記載されている（Casali & Notkins, Ann. Rev. Immunol. 7, 515-531）。また、モノクローナル抗体に関するファージ提示技術を用いたランダムペプチドレパートリーの選択が、抗原結合部位に嵌る或る範囲のぺプチド配列を同定することが示されている。それらの配列のなかには、非常に関連していてコンセンサス配列に合致するものや、一方、非常に異なっていてミモトープ（mimotope）と称されているものもある（Lane & Stephen, Current Opinion in Immunology, 1993, 5, 268-271）。したがって、会合した及び相補的なVHおよびVLドメインを含む天然の4鎖抗体は、広範な公知抗原からの多数の異なる抗原への結合能を有することが明らかである。同一抗体内の2つの与えられた抗原に対する結合部
位（特に、必ずしも構造的に関連していないもの）の作製方法はそれほど明らかではない。
【０００６】
これに関連しうるタンパク質工学法が示唆されている。例えば、1つの可変ドメインを介した金属イオンに対する並びに金属イオンおよび相補的可変ドメインとの接触を介したハプテン（基質）に対する結合活性を有する触媒抗体が作製されうることも提示されている（Barbasら, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6385-6389）。しかし、この場合、該基質（第1抗原）の結合および触媒作用は金属イオン（第2抗原）の結合を要することが提示されている。したがって、VH/VLペアへの結合は、単一ではあるが多成分の抗原に関連したものである。
【０００７】
1つの抗原に対する結合接触が1つの可変ドメインにおいて生じ、もう1つの抗原に対する結合接触がもう1つの可変ドメインにおいて生じる、ラクダ抗体重鎖単一ドメインからの二重特異性抗体の作製方法が記載されている。しかし、該可変ドメインは相補的ではなかった。すなわち、第1の重鎖可変ドメインは第1抗原に対して選択され、第2重鎖可変ドメインは第2抗原に対して選択され、ついで両方のドメインが同一鎖上で互いに連結されて二重特異性抗体フラグメントを与える（Conrathら, J. Biol. Chem. 270, 27589-27594）。しかし、ラクダ重鎖単一ドメインは、それらが、軽鎖を有さない天然ラクダ抗体に由来する点で特異であり、実際、該重鎖単一ドメインは、相補的VHおよびVLペアが形成されるようラクダ軽鎖と会合することはない。
【０００８】
通常は軽鎖（モノクローナル抗体に由来するもの又はドメインのレパートリーに由来するもの；EP-A-0368684を参照されたい）と会合した天然抗体に由来する単一重鎖可変ドメインも記載されている。これらの重鎖可変ドメインは1以上の関連抗原と特異的に相互作用することが示されているが、2以上の異なる抗原に対する特異性を有するリガンドを得るために他の重鎖または軽鎖可変ドメインと組合せることは行われていない。さらに、これらの単一ドメインは、非常に短いin vivo半減期を有することが示されている。したがって、そのようなドメインは、限られた治療価値しか有さない。
【０００９】
異なる特異性の重鎖可変ドメインを互いに連結することにより二重特異性抗体フラグメントを製造することが示唆されている（前記のとおり）。このアプローチの欠点は、単離された抗体可変ドメインが、通常は軽鎖との相互作用をもたらし溶媒に露出され「付着性」となりうる疎水性界面を有することがあり、それによって該単一ドメインを疎水性界面に結合させうることである。さらに、相手軽鎖の非存在下では、2以上の異なる重鎖可変ドメインの組合せ及びそれらの会合（おそらく、それらの疎水性界面を介したもの）は、それらが単離状態で結合しうるリガンドの両方ではなく一方にそれらが結合するのを妨げうる。さらに、この場合、重鎖可変ドメインは相補的軽鎖可変ドメインとは会合せず、したがって、それほど安定ではなく容易に変性するであろう（Worn & Pluckthun, 1998 Biochemistry 37, 13120-7）。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明者らは、本発明者らの同時係属中の国際特許出願WO 03/002609および同時係属未公開英国特許出願0230203.2において、それぞれ異なる特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二重特異性免疫グロブリンリガンドを記載している。該ドメインは互いに競合的に又は独立して作用して、標的分子上の抗原またはエピトープに結合しうる。
【００１１】
第1の形態において、本発明は、本発明者らにより開発された二重特異性リガンドにおける更なる改良を提供するものであり、ここで、該リガンドの特異性の1つはタンパク質またはポリペプチド標的に対するものであり、もう1つの特異性は該標的の受容体に対するものである。
【００１２】
したがって、第1の態様においては、本発明は、標的リガンドに特異的な第1 dAbと、該標的リガンドの受容体に特異的な第2 dAbとを含んでなる二重特異性リガンドを提供する。
【００１３】
好ましくは、該二重特異性リガンドは、開いたコンホメーションのリガンドであり、標的リガンドと標的リガンド受容体との両方に同時に結合しうる。
【００１４】
好ましい二重特異性リガンドは、TNFαに対する少なくとも1つの特異性と、TNF受容体1（p55）に対する少なくとも1つの特異性とを含む。好ましくは、該特異性は、Fab、F(ab')2またはIgG形態で配置された1以上のdAbによりもたらされる。好ましいdAbは、後記のTAR1-5-19 VκおよびTAR2h-10-27 VHである。
【００１５】
本発明はまた、添付の特許請求の範囲に記載されており本明細書に詳細に記載されている二重特異性リガンドの更なる修飾物および形態を含みうる。
【００１６】
したがって、もう1つの態様において、第1抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する第1免疫グロブリン単一可変ドメインと、第2抗原またはエピトープに対する結合活性を有する第2相補的免疫グロブリン単一可変ドメインとを含む二重特異性リガンドが提供され、ここで、該抗原またはエピトープの一方または両方は、該リガンドのin vivo半減期を延長するように作用し、該第1および第2ドメインは、同じ特異性を共有する相互相補的ドメインを欠いており、ただし、該二重特異性リガンドは、抗HSA VHドメインおよび抗βガラクトシダーゼVκドメインよりなるものではない。好ましくは、第1または第2可変ドメインはいずれも、ヒト血清アルブミン（HSA）には結合しない。
【００１７】
本明細書に記載のリガンドの半減期を延長する抗原またはエピトープは、好ましくは、in vivoで生物において見出されるタンパク質またはポリペプチド上に存在する。具体例には、細胞外マトリックスタンパク質、血液タンパク質、および生物の種々の組織内に存在するタンパク質が含まれる。該タンパク質は、例えば、増量剤として作用することにより又はリガンドを所望の作用部位に繋ぎとめることにより、血液からのリガンドのクリアランスの速度を減少させるように作用する。in vivo半減期を延長する抗原／エピトープの具体例を、後記の付録1に記載する。
【００１８】
半減期の延長は、免疫グロブリン、特に、小さいサイズの抗体、さらに詳しくは、小さいサイズの抗体フラグメントのin vivoでの適用において有用である。そのようなフラグメント（Fv、ジスルフィド結合Fv、Fab、scFv、dAb）は体内からの迅速なクリアランスを受ける。したがって、それらがほとんどの身体部分に迅速に到達可能であり即座に製造され容易に取り扱えるにもかかわらず、それらのin vivo適用は、それらがin vivoで短時間しか存続しないために制限されている。本発明は、リガンドのin vivo半減期の延長、およびそれによる、該リガンドの機能的活性の体内持続時間の延長をもたらすことにより、この問題を解決するものである。
【００１９】
薬物動力学的解析およびリガンド半減期の測定のための方法は当業者に良く知られているであろう。詳細は、Kenneth, Aら: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPetersら, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)に記載されている。tαおよびtβ半減期ならびに血中濃度-時間曲線下面積（AUC）のような薬物動力学パラメーターを記載している“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)も参照されたい。
【００２０】
半減期（t1/2 αおよびt1/2 β）およびAUCは、時間に対する血清中リガンド濃度の曲線から決定されうる。WinNonlin解析パッケージ（Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USAから入手可能）を使用して、例えば、該曲線をモデル化することが可能である。第1相（α相）においては、リガンドは、いくらかの消失を伴いながら、主として、患者の体内に分布しつつある。第2相（β相）は最終相であり、この時、該リガンドは既に分布しており、リガンドが患者から排除されるにつれて、血清濃度が減少する。tα半減期は第1相の半減期であり、tβ半減期は第2相の半減期である。したがって、好ましくは、本発明は、15分以上の範囲のtα半減期を有するリガンドまたは本発明のリガンドを含む組成物を提供する。1つの実施形態においては、該範囲の下限は30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。それに加えて又はその代わりに、本発明のリガンドまたは組成物は、12時間まで（12時間を含む）の範囲のtα半減期を有する。1つの実施形態においては、該範囲の上限は11、10、9、8、7、6または5時間である。適当な範囲の例としては、1〜6時間、2〜5時間または3〜4時間が挙げられる。
【００２１】
好ましくは、本発明は、2.5時間以上の範囲のtβ半減期を有するリガンドまたは本発明のリガンドを含む組成物を提供する。1つの実施形態においては、該範囲の下限は3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、10時間、11時間または12時間である。それに加えて又はその代わりに、本発明のリガンドまたは組成物は、21日まで（21日を含む）の範囲のtβ半減期を有する。1つの実施形態においては、該範囲の上限は12時間、24時間、2日、3日、5日、10日、15日または20日である。好ましくは、本発明のリガンドまたは組成物は12〜60時間の範囲のtβ半減期を有する。もう1つの実施形態においては、それは12〜48時間の範囲である。さらにもう1つの実施形態においては、それは12〜26時間の範囲である。
【００２２】
前記の基準に加えて又はその代わりに、本発明は、1mg.分/ml以上の範囲のAUC（血中濃度-時間曲線下面積）値を有するリガンドまたは本発明のリガンドを含む組成物を提供する。1つの実施形態においては、該範囲の下限は5、10、15、20、30、100、200または300mg.分/mlである。それに加えて又はその代わりに、本発明のリガンドまたは組成物は600mg.分/mlまでの範囲のAUCを有する。1つの実施形態においては、該範囲の上限は500、400、300、200、150、100、75または50mg.分/mlである。好ましくは、本発明のリガンドは、15〜150mg.分/ml、15〜100mg.分/ml、15〜75mg.分/ml、および15〜50mg.分/mlよりなる群から選ばれる範囲のAUCを有する。
【００２３】
第1の実施形態においては、二重特異性リガンドは、2つの相補的可変ドメイン（すなわち、それらの天然環境において、コグネイトペアまたは群として互いに作用しうる2つの可変ドメインであり、これらは、本発明の場合においてそれらがそれらのコグネイトエピトープに別々に結合する場合であっても、そのように作用しうる）を含む。例えば、相補的可変ドメインは免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変ドメイン（VHおよびVL）でありうる。VHおよびVLドメインは、好ましくは、scFvまたはFab抗体フラグメントにより与えられる。可変ドメインは互いに連結されて多価リガンドを形成しうる。これは、例えば、各VドメインのC末端にヒンジ領域を及び該ヒンジ領域内のシステイン間にジスルフィド結合を設けることにより、あるいは、それぞれ該ドメインのC末端にシステイン（該システインは互いにジスルフィド結合している）を有するdAbを得ることにより、あるいは、V-CHおよびV-CLを産生させてFab形態を得ることにより、あるいは、ペプチドリンカー（例えば、後記のGly4Serリンカー）を使用して二量体、三量体および更には多量体を得ることにより達成されうる。
【００２４】
本発明者らは、相補的可変ドメインの使用により、それらの2つのドメイン表面が１つにパッキングされて溶媒から隔離されるようにすることが可能であることを見出した。さらに、該相補的ドメインはお互いを安定化しうる。また、それは、先行技術において使用されたハイブリッドハイブリドーマの欠点やサブユニット境界における重鎖または軽鎖の改変操作の必要性を伴うことなく、二重特異性IgG抗体の作製を可能にする。本発明の第1の態様の二重特異性リガンドは少なくとも1つのVH/VLペアを有する。したがって、本発明の二重特異性IgGは2つのそのようなペアを含み、1つのペアはY形分子の各アーム上に存在する。したがって、使用する鎖の比率がその製造の成功のための決定的要因であり実施上の問題を招く通常の二重特異性抗体またはダイアボディ（diabody）とは異なり、本発明の二重特異性リガンドは鎖の均衡の問題を伴わない。VL鎖1はVH鎖1と共に抗原またはエピトープ1に結合することが可能であり、VL鎖2はVH鎖2と共に抗原またはエピトープ2に結合することが可能であり、それらの2つの正しいペアが何らかの方法で互いに連結される場合には、通常の二重特異性抗体における鎖の不均衡はそのような2つの異なるVL鎖と2つの異なるVH鎖との会合から生じる。したがって、単一分子内でVL鎖1がVH鎖1とペア形成しVL鎖2がVH鎖2とペア形成した場合にのみ、二重特異性が生じる。そのような二重特異性分子は、2つの異なる方法で作製されうる。第1に、それらは、それぞれ異なる抗原またはエピトープに結合する2つの既存のVH/VLペアの会合により作製されうる（例えば、二重特異性IgGの場合）。この場合、すべてが二重特異性である分子集団を作製するためには、VH/VLペアは1:1の比で会合しなければならない。これは、（相補的CHドメインが「ノブ・イントゥー・ホール（knobs into holes）」操作により増強された場合であっても）決して生じるものではなく、二重特異性分子と、一方の抗原またはエピトープのみには結合しうるが他方には結合し得ない分子との混合物が生じる。二重特異性抗体を作製するための第2の方法は、2つの異なるVH鎖と、2つの異なるVL鎖との同時会合によるものである（例えば、二重特異性ダイアボディの場合）。この場合、VL鎖1はVH鎖1とペア形成しVL鎖2はVH鎖2とペア形成する傾向にあるが（これはVLおよびVHドメインの「ノブ・イントゥー・ホール（knobs into holes）」操作により増強されうる）、このペア形成は全ての分子において達成されるわけではなく、混合物が生じて、いずれの抗原またはエピトープにも結合し得ない誤ったペアが生じる。
【００２５】
本発明の第1の態様の二重特異性リガンドアプローチにより構築された二重特異性抗体はこれらの問題の全てを克服する。なぜなら、抗原またはエピトープ1への結合はVHまたはVLドメインにおいて生じ、抗原またはエピトープ2への結合は相補的VLまたはVHドメインにおいて生じるからである。VHドメインとVLドメインとは1:1でペア形成するため、すべてのVH/VLペアは二重特異性であり、したがって、これらのVH/VLペアを使用して構築された全ての形態（Fv、scFv、Fab、ミニボディ、IgGなど）は100％の二重特異性活性を有する。
【００２６】
本発明の場合には、第1および第2「エピトープ」は、単一の単一特異性リガンドには結合しない同じではないエピトープであると理解される。本発明の第1の形態においては、それらは、好ましくは、異なる抗原上に存在し、それらのうちの1つは、in vivoにおけるリガンドの半減期を増加させるように作用する。同様に、第1および第2抗原は、好ましくは、同じではない。
【００２７】
本発明の二重特異性リガンドは、WO 02/02773に記載のリガンドを含まない。したがって、本発明のリガンドは、任意の1以上の抗原またはエピトープに協働的に結合する相補的VH/VLペアを含まない。その代わりに、本発明の第1の態様のリガンドは、異なる特異性をVドメインが有するVH/VL相補的ペアを含む。
【００２８】
さらに、本発明の第1の態様のリガンドは、非構造的関連エピトープまたは抗原に対する異なる特異性を有するVH/VL相補的ペアを含む。構造的に関連したエピトープまたは抗原は、抗原またはエピトープに結合するよう協働的に作用する従来のVH/VL相補的ペアに結合するのに十分な構造類似性を有するエピトープまたは抗原である。構造的に関連したエピトープの場合には、該エピトープは、VH/VL二量体の抗原結合部位に形成される同一結合ポケット内に「嵌る（フィットする）」よう構造において十分に類似している。
【００２９】
もう1つの実施形態においては、本発明は、第1抗原またはエピトープ結合特異性を有する第1免疫グロブリン可変ドメインと、第2抗原またはエピトープ結合特異性を有する第2免疫グロブリン可変ドメインとを含むリガンドであって、該第1および第2可変ドメインの一方または両方が、該リガンドのin vivo半減期を増加させる抗原に結合し、可変ドメインが互いに相補的ではないことを特徴とするリガンドを提供する。
【００３０】
1つの実施形態においては、1つの可変ドメインへの結合が第2の可変ドメインへの該リガンドの結合をモジュレーションする。
【００３１】
この実施形態においては、該可変ドメインは、例えば、VHドメインのペアまたはVLドメインのペアでありうる。第1の部位における抗原の結合は第2の部位における該抗原の結合をモジュレーション（例えば、増強または抑制）しうる。例えば、第1の部位における結合は第2の部位における抗原の結合を少なくとも部分的に抑制する。そのような実施形態においては、該リガンドは、例えば、該リガンドの半減期を増加させるタンパク質への結合を介して、それが第2の標的抗原に結合し該半減期延長性タンパク質から解離する時点まで、対象生物の体内でin vivoで維持されうる。
【００３２】
前記の場合における結合のモジュレーションは、お互いに対する抗原結合部位の構造的接近の結果として達成される。そのような構造的接近は、それらの2以上の抗原結合部位を連結する構造的成分の性質により達成されることが可能であり、例えば、非常に接近した状態で抗原結合部位を保持する比較的強固な構造を有するリガンドを設けることにより達成されうる。好ましくは、それらの2以上の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子内のコンホメーション変化および／または立体障害が関わる過程により1つの部位がもう1つの部位における抗原の結合をモジュレーションするよう、お互いに物理的に非常に接近している。
【００３３】
第1および第2抗原結合ドメインは共有結合または非共有結合により結合していることが可能である。それらのドメインが共有結合している場合には、該結合は、例えば、ジスルフィド結合により、またはポリペプチドリンカー、例えば(Gly4Ser)n（ここで、n = 1〜8、例えば2、3、4、5または7）により媒介されうる。
【００３４】
本発明のリガンドは、非免疫グロブリン多リガンド構造へと組み合わされて多価複合体を形成し、これは、同一抗原を有する標的分子に結合し、それにより優れたアビディティをもたらし、一方、少なくとも1つの可変ドメインが抗原に結合して該多量体の半減期を増加させる。例えば、1以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを作製するためのCDRのグラフティングのためのスカフォールドとして、SpAのような天然細菌受容体が使用されている。この方法の詳細は米国特許第5,831,012号に記載されている。他の適当なスカフォールドには、フィブロネクチンおよびアフィボディ（affibody）に基づくものが含まれる。適当な方法の詳細はWO 98/58965に記載されている。他の適当なスカフォールドには、van den Beukenら, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601に記載されているリポカリン（lipocallin）およびCTLA4、ならびにWO0069907（Medical Research Council）に記載されているようなスカフォールド（これは、例えば、細菌GroELまたは他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づくものである）が含まれる。
【００３５】
他のスカフォールドを組合せることが可能であり、例えば、CDRをCTLA4スカフォールドにグラフティングし、免疫グロブリンVHまたはVLドメインと共に使用してリガンドを形成させることが可能である。同様に、フィブロネクチン、リポカリンおよび他のスカフォールドを組合せることが可能である。
【００３６】
可変ドメインが、例えば本明細書に記載のファージ提示技術を用いて選択されるV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、それらが本明細書に記載の特異的一般的リガンドにより認識されうるよう、汎用フレームワーク領域を含みうる。汎用フレームワーク、一般的リガンドなどの使用はWO99/20749に記載されている。本発明においては、ファージ提示に対する言及はファージおよび／またはファージミドの両方の使用を含む。
【００３７】
V遺伝子レパートリーを使用する場合には、ポリペプチド配列における変異は、好ましくは、可変ドメインの構造ループ内に位置する。各可変ドメインとその相補的ペアとの相互作用を増強するために突然変異により又はDNAシャフリングにより、いずれかの可変ドメインのポリペプチド配列が改変されうる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態においては、「二重特異性リガンド」は一本鎖Fvフラグメントである。本発明のもう1つの実施形態においては、「二重特異性リガンド」は抗体のFab領域よりなる。「Fab領域」なる語は、2つのVHまたは2つのVLドメインが使用されているFab様領域を含む。
【００３９】
可変領域は標的抗原またはエピトープに対する抗体から誘導されうる。あるいは、それは単一抗体ドメインのレパートリー（例えば、線維状バクテリオファージの表面上で発現されるもの）から誘導されうる。選択は、後記のとおりに行うことが可能である。
【００４０】
もう1つの態様においては、本発明は、第1の結合特異性を有する第1免疫グロブリン単一可変ドメインと、第2の（異なる）結合特異性を有する第2単一免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むリガンド（ここで、該結合特異性の一方または両方は、in vivoにおけるリガンドの半減期を増加させる抗原に特異的である）の製造方法を提供し、該製造方法は、
（a）第1可変ドメインを、第1エピトープへのその結合能により選択し、
（b）第2可変領域を、第2エピトープへのその結合能により選択し、
（c）それらの可変ドメインを組合せ、
（d）リガンドを、第1エピトープおよび第2エピトープへのその結合能により選択する
工程を含む。
【００４１】
該リガンドは第1および第2エピトープに同時に結合することが可能であり、あるいは、エピトープ結合に関して該結合ドメイン間で競合が生じる場合には、1つのドメインの結合は、そのコグネイトエピトープへのもう1つのドメインの結合を排除しうる。したがって、1つの実施形態においては、前記工程（d）は、第1および第2（そして恐らくは更なる）エピトープへの同時結合を要し、もう1つの実施形態においては、第1および第2エピトープへの結合は同時ではない。
【００４２】
それらのエピトープは、好ましくは、別々の抗原上に存在する。
【００４３】
該リガンドは更に、ラクダ化動物VHHドメインを含みうるが、但しリガンドは、好ましくは、前記の免疫グロブリン可変ドメインの組合せVH/VL、または組合せVH/VHもしくはVL/VLを含む。in vivoにおける該リガンドの半減期を増加させる抗原に特異的であるVHHドメインが鶏卵白リゾチーム（HEL）、ブタ膵αアミラーゼまたはNmC-A；hcg、BSA結合RR6アゾ色素またはエス・ミュータンス（S. mutans）HG982細胞［Conrathら, (2001) JBC 276:7346-7350およびWO99/23221（これらはいずれも、in vivoにおける該リガンドの半減期を増加させるための、半減期を増加させる抗原に対する特異性の利用を記載していない）に記載されている］に結合しない。
【００４４】
1つの実施形態においては、第1可変ドメインを、相補的可変ドメインの非存在下の第1エピトープへの結合に関して選択する。もう1つの実施形態においては、第1可変ドメインを、第3可変ドメインの存在下の第1エピトープ／抗原への結合に関して選択し、ここで、第3可変ドメインは第2可変ドメインとは異なるものであり、第1ドメインに相補的である。同様に、第2ドメインは、相補的可変ドメインの非存在下または存在下で選択することが可能である。
【００４５】
本発明のリガンドにより標的化される抗原またはエピトープは、半減期延長性タンパク質に加えて、任意の抗原またはエピトープでありうるが、好ましくは、治療利益を伴って標的化される抗原またはエピトープである。本発明は、任意のそのような標的（特に、本明細書中で更に特定される標的）に特異的である、開いたコンホメーション、閉じたコンホメーションおよび単離されたdAb単量体リガンドを含むリガンドを提供する。そのような標的は、天然に存在するもの若しくは合成体でありうるポリペプチド、タンパク質もしくは核酸またはそれらの一部でありうる。この場合、本発明のリガンドはエピトープまたは抗原に結合し、アンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、EPO受容体アゴニスト）として作用しうる。その選択は多種多様であると当業者は理解するであろう。それらは、例えば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補因子またはDNA結合タンパク質でありうる。適当なサイトカインおよび増殖因子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カーディオトロフィン（Cardiotrophin）-1、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エキソデゥス（Exodus）-2、EpoR、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67アミノ酸）、MDC（69アミノ酸）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67アミノ酸）、MDC（69アミノ酸）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆体抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3およびHER 4。サイトカイン受容体には、前記サイトカインの受容体が含まれる。この一覧は網羅的なものではないと理解されるであろう。
【００４６】
本発明の1つの実施形態においては、可変ドメインは抗原またはエピトープに対するそれぞれの抗体から誘導される。好ましい実施形態においては、可変ドメインは単一可変抗体ドメインのレパートリーから誘導される。
【００４７】
もう1つの実施形態においては、本発明は、少なくとも本明細書に記載の二重特異性リガンドをコードする1以上の核酸分子を提供する。該二重特異性リガンドは、単一の核酸分子上でコードされうる。あるいは、各ドメインが、別々の核酸分子によりコードされうる。該リガンドが、単一の核酸分子によりコードされる場合には、該ドメインはscFv分子の形態の融合ポリペプチドとして発現されることが可能であり、あるいは別々に発現され、ついで例えば化学的連結剤を使用して互いに連結されうる。別々の核酸から発現されたリガンドは、適当な手段により互いに連結される。
【００４８】
該核酸は更に、発現後に宿主細胞からポリペプチドを輸送するためのシグナル配列をコードすることが可能であり、発現後に線維状バクテリオファージ粒子の表面成分（または選択提示系の他の成分）に融合されうる。
【００４９】
もう1つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性リガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【００５０】
さらにもう1つの態様において、本発明は、本発明の二重特異性リガンドをコードするベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００５１】
そのようなベクターからの発現は、例えばバクテリオファージ粒子の表面上に選択用可変ドメインを産生するように操作されうる。これは、本発明の方法を用いて、提示された可変領域を選択すること、したがって「二重特異性リガンド」を選択することを可能にする。
【００５２】
本発明は更に、少なくとも本発明の二重特異性リガンドを含むキットを提供する。
【００５３】
本発明の二重特異性リガンドは、好ましくは、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの組合せを含む。例えば、該二重特異性リガンドはVHドメインおよびVLドメインを含むことが可能であり、これらはscFvの形態で互いに連結されうる。また、該リガンドは1以上のCHまたはCLドメインを含みうる。例えば、該リガンドはCH 1ドメイン、CH 2もしくはCH 3ドメイン、および／またはCLドメイン、Cμ1、Cμ2、Cμ3もしくはCμ4ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含みうる。ヒンジ領域ドメインも含まれうる。ドメインのそのような組合せは、例えば、天然抗体、例えばIgGもしくはIgM、またはそれらのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子を模擬しうる。他の構造体、例えば、VH、VL、CH1およびCLドメインを含むIgG分子の単一アームも予想される。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態においては、可変領域を単一ドメインV遺伝子レパートリーから選択する。一般には、単一抗体ドメインのレパートリーは線維状バクテリオファージの表面上に提示される。好ましい実施形態においては、各単一抗体ドメインを、抗原へのファージレパートリーの結合により選択する。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態においては、各単一可変ドメインを、相補的可変領域の非存在下でのその標的抗原またはエピトープへの結合に関して選択することが可能である。もう1つの実施形態においては、該単一可変ドメインを、相補的可変領域の存在下でのその標的抗原またはエピトープへの結合に関して選択することが可能である。したがって、第1単一可変ドメインを第3相補的可変ドメインの存在下で選択し、第2可変ドメインを第4相補的可変ドメインの存在下で選択することが可能である。該相補的第3または第4可変ドメインは、試験される単一ドメインと同じ特異性を有する天然コグネイト可変ドメイン、または非コグネイト相補的ドメイン、例えば「模擬（dummy）」可変ドメインでありうる。
【００５６】
好ましくは、本発明の二重特異性リガンドは、2つの可変ドメインしか含まないが、いくつかのそのようなリガンドが一緒に同一タンパク質に組み込まれることも可能であり、例えば、2つのそのようなリガンドがIgGまたは多量体免疫グロブリン、例えばIgMに組み込まれうる。あるいは、もう1つの実施形態においては、多量体を形成させるために複数の二重特異性リガンドを組合せる。例えば、四重特異性分子を作製するために2つの異なる二重特異性リガンドを組合せる。
【００５７】
本発明の方法により製造された二重特異性リガンドの軽鎖および重鎖可変領域は同一ポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に位置しうると当業者に理解されるであろう。それらの可変領域が、異なるポリペプチド鎖上に位置する場合には、それらは、リンカー、一般には、柔軟（flexible）なリンカー（例えば、ポリペプチド鎖）、化学的連結基または当技術分野で公知の任意の他の方法により連結されうる。
【００５８】
もう1つの態様においては、本発明は、本発明の方法により入手可能な二重特異性リガンドと製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００５９】
さらに、本発明は、本発明の「二重特異性リガンド」または組成物を使用する疾患の治療および／または予防方法を提供する。
【００６０】
第2の形態において、本発明は、少なくとも2つの非相補的可変ドメインを含む多重特異性リガンドを提供する。例えば、該リガンドはVHドメインのペアまたはVLドメインのペアを含みうる。好ましくは、該ドメインは非ラクダ科動物由来であり、好ましくは、それらはヒトドメインであり、またはヒトフレームワーク領域（FW）および1以上の異種CDRを含む。CDRおよびフレームワーク領域は、Sequences of Proteins of Immunological InterestのKabatデータベース内で特定されている免疫グロブリン可変ドメインの領域である。
【００６１】
好ましいヒトフレームワーク領域は、生殖系列遺伝子セグメントDP47およびDPK9によりコードされるものである。好ましくは、VHまたはVLドメインのFW1、FW2およびFW3はDP47またはDPK9からのFW1、FW2またはFW3の配列を有する。該ヒトフレームワークは、所望により、突然変異を含有することが可能であり、例えば、本発明のリガンドにおいて使用するヒトフレームワーク内に合わせて約5個までのアミノ酸の変化または約10個までのアミノ酸の変化を含有しうる。
【００６２】
本発明の第2の形態の多重特異性リガンド内の可変ドメインは、開いた又は閉じたコンホメーションで配置されうる。すなわち、該可変ドメインがそれらのコグネイトリガンドに、独立して及び同時に結合しうるように、または該可変ドメインの1つだけがそのコグネイトリガンドに任意の一時点で結合しうるように、該可変ドメインが配置されうる。
【００６３】
本発明者らは、ある構造条件下、非相補的ドメイン（例えば、2つの軽鎖可変ドメインまたは2つの重鎖可変ドメイン）がコグネイトペアとして一緒に作用しない場合であっても、第1可変ドメインへの第1エピトープの結合が第2可変ドメインへの第2エピトープの結合を抑制するよう該非相補的可変ドメインがリガンド内に存在しうることを見出した。
【００６４】
好ましくは、該リガンドは可変ドメインのペアの2以上を含む。すなわち、それは少なくとも4つの可変ドメインを含む。好ましくは、それらの4つの可変ドメインはヒト由来のフレームワークを含む。
【００６５】
好ましい実施形態においては、ヒトフレームワークはヒト生殖系列配列のものと同一である。
【００６６】
そのような抗体は、治療用および他の用途のためのリガンド結合アッセイにおいて特に有用である、と本発明者らは考えている。
【００６７】
したがって、第2の形態の第1の態様において、本発明は、
a）第1エピトープ結合ドメインを、第1エピトープへのその結合能により選択し、
b）第2エピトープ結合ドメインを、第2エピトープへのその結合能により選択し、
c）それらのエピトープ結合ドメインを組合せ、
d）閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを、第1エピトープおよび第2エピトープへのその結合能により選択する
工程を含む、多重特異性リガンドの製造方法を提供する。
【００６８】
第2の態様のもう1つの態様において、本発明は、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドの製造方法を提供し、ここで、第1結合特異性と第2結合特異性とは、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドが両方のエピトープに同時に結合し得ないよう、エピトープ結合に関して競合する。該製造方法は、
a）第1エピトープ結合ドメインを、第1エピトープへのその結合能により選択し、
b）第2エピトープ結合ドメインを、第2エピトープへのその結合能により選択し、
c）それらのエピトープ結合ドメインを、該ドメインが、閉じたコンホメーションとなるよう組合せ、
d）閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを、第1エピトープおよび第2エピトープへのその結合能（ただし、第1および第2エピトープの両方に同時に結合する場合は除く）により選択する
工程を含む。
【００６９】
さらに、本発明は、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを提供し、ここで、第1および第2結合特異性は、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドが両方のエピトープに同時には結合し得ないよう、エピトープ結合に関して競合する。
【００７０】
本発明の第2の形態の前記態様のもう1つの実施形態は、所望により、第3または第4エピトープ結合ドメインを選択することを含む追加的工程（b1）を含みうる。この場合、製造される多重特異性リガンドは、開いたコンホメーションであるか閉じたコンホメーションであるかには無関係に、3以上のエピトープ結合特異性を含む。本発明の第2の形態の好ましい態様において、多重特異性リガンドが、3以上のエピトープ結合ドメインを含む場合には、該ドメインの少なくとも2つは、閉じたコンホメーションであり、結合に関して競合し、他のドメインは結合に関して競合することが可能であり、あるいは、独立してそれらのコグネイトエピトープと自由に会合しうる。
【００７１】
本発明においては、「多重特異性リガンド」なる語は、本明細書中に定義されているとおりの2以上のエピトープ結合特異性を有するリガンドを意味する。
【００７２】
本明細書中に記載されている「閉じたコンホメーション」（多重特異性リガンド）は、1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合が、もう1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合と競合するよう、該リガンドのエピトープ結合ドメインが、場合によってはタンパク質骨格により、互いに結合または会合していることを意味する。すなわち、コグネイトエピトープは、各エピトープ結合ドメインによって個別に結合され、同時には結合されない。該リガンドの閉じたコンホメーションは、本明細書に記載の方法を用いて得ることが可能である。
【００７３】
「開いたコンホメーション」は、1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合が、もう1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合と競合しないよう、該リガンドのエピトープ結合ドメインが、場合によってはタンパク質骨格により、互いに結合または会合していることを意味する。
【００７４】
本明細書で用いる「競合」なる語は、1つのエピトープのそのコグネイトエピトープ結合ドメインへの結合が、もう1つのエピトープがそのコグネイトエピトープ結合ドメインに結合した場合に抑制されることを意味する。例えば、結合は、立体的に、例えば結合ドメインの物理的遮断により、あるいは結合ドメインの構造または環境の変化により抑制されて、エピトープに対するそのアフィニティーまたはアビディティが減少しうる。
【００７５】
本発明の第2の形態のもう1つの実施形態においては、該エピトープは、結合の際に互いに置換されうる。例えば、第1エピトープが、そのコグネイト第1結合ドメインへの結合の際に、第2結合ドメインの立体障害またはそれにおけるコンホメーション変化を引き起こす抗原上に存在することがあり、これにより、第2結合ドメインに結合しているエピトープを置換しうる。
【００７６】
好ましくは、結合は25％またはそれ以上、好ましくは、40％、50％、60％、70％、80％、90％またはそれ以上、好ましくは、100％まで又はほぼ100％減弱されて、結合が完全に抑制される。エピトープの結合は、通常の抗原結合アッセイ、例えばELISAにより、または蛍光に基づく技術、例えばFRETにより、または分子の質量を測定する表面プラズモン共鳴のような技術により測定することが可能である。
【００７７】
本発明の方法においては、好ましくは、各エピトープ結合ドメインは、異なるエピトープ結合特異性を有する。
【００７８】
本発明においては、第1および第2「エピトープ」は、単一の単一特異性リガンドに結合しない、同一ではないエピトープであると理解される。それらは、異なる抗原上に存在したり、あるいは同一抗原上に存在しうるが、通常の抗体の単一の単一特異性VH/VL結合ペアに結合しうる単一体をそれらが形成しない程度に十分な距離をあけて分離している。経験的には、単一鎖抗体形態（ドメイン抗体またはdAb）内の個々の可変ドメインの両方が別々に、2つのエピトープに対する単一特異性VH/VLリガンドにより競合される場合には、それらの2つのエピトープは、本発明における分離したエピトープとみなされるのに十分な程度には離れていない。
【００７９】
本発明の閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドは、WO 02/02773に記載のリガンドを含まない。したがって、本発明のリガンドは、任意の1以上の抗原またはエピトープに協同的に結合する相補的VH/VLペアを含まない。その代わりに、本発明のリガンドは、好ましくは、非相補的VH-VHまたはVL-VLペアを含む。好ましくは、各VH-VHまたはVL-VLペアにおける各VHまたはVLドメインは、異なるエピトープ結合特異性を有し、該エピトープ結合部位は、1つの部位におけるエピトープの結合が別の部位におけるエピトープの結合と競合するよう配置されている。
【００８０】
本発明においては、好ましくは、各エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン可変ドメインを含む。より好ましくは、各免疫グロブリン可変ドメインは可変軽鎖ドメイン（VL）または可変重鎖ドメインVHである。本発明の第2の形態においては、免疫グロブリンドメインは、本発明のリガンド上に存在する場合には、非相補的である。すなわち、それらは、VH/VL抗原結合部位を形成するよう会合しない。したがって、本発明の第2の形態において特定される多重特異性リガンドは、可変軽鎖ドメイン（VL）または可変重鎖ドメイン（VH）である同一サブタイプの免疫グロブリンドメインを含む。さらに、本発明のリガンドが、閉じたコンホメーションを有する場合には、免疫グロブリンドメインはラクダ科動物VHH型のものでありうる。
【００８１】
もう1つの実施形態においては、本発明のリガンドはラクダ科動物VHHドメインを含まない。より詳しくは、本発明のリガンドは、ヒトVHドメインと比較してラクダ科動物VHHドメインに特異的である1以上のアミノ酸を含まない。
【００８２】
好ましくは、単一可変ドメインは、異なる抗原またはエピトープに対する結合活性に関して選択された抗体から誘導される。例えば、可変ドメインは、少なくとも部分的には、ヒトへの免疫化により単離されうる。ヒト抗体ライブラリーからの単離および人工抗体遺伝子の合成を含む他の方法も当技術分野において公知である。
【００８３】
可変ドメインは、好ましくは、スーパー抗原、例えばプロテインAまたはプロテインLに結合する。スーパー抗原への結合は、正しくフォールディングした抗体可変ドメインの特性であり、そのようなドメインが例えば組換え又は突然変異ドメインのライブラリーから単離されるのを可能にする。
【００８４】
本発明のエピトープ結合ドメインはタンパク質スカフォールドおよびエピトープ相互作用部位（これは、好ましくは、タンパク質スカフォールドの表面上に位置する）を含む。
【００８５】
また、エピトープ結合ドメインは、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スカフォールドまたは骨格に基づくものでありうる。例えば、1以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを作製するためのCDRのグラフティングのためのスカフォールドとして、SpAのような天然細菌受容体が使用されている。この方法の詳細は米国特許第5,831,012号に記載されている。他の適当なスカフォールドには、フィブロネクチンおよびアフィボディ（affibody）に基づくものが含まれる。適当な方法の詳細はWO 98/58965に記載されている。他の適当なスカフォールドには、van den Beukenら, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601に記載されているリポカリン（lipocallin）およびCTLA4、ならびにWO0069907（Medical Research Council）に記載されているようなスカフォールド（これは、例えば、細菌GroELまたは他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づくものである）が含まれる。
【００８６】
タンパク質スカフォールドを組合せることが可能であり、例えば、CDRをCTLA4スカフォールドにグラフティングし、免疫グロブリンVHまたはVLドメインと共に使用して多価リガンドを形成させることが可能である。同様に、フィブロネクチン、リポカリンおよび他のスカフォールドを組合せることが可能である。
【００８７】
本発明の方法により製造された閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドのエピトープ結合ドメインは同一ポリペプチド鎖上または異なるポリペプチド鎖上に位置しうると当業者に理解されるであろう。それらの可変領域が、異なるポリペプチド鎖上に位置する場合には、それらは、リンカー、好ましくは、柔軟（flexible）なリンカー（例えば、ポリペプチド鎖）、化学的連結基または当技術分野で公知の任意の他の方法により連結されうる。
【００８８】
第1および第2エピトープ結合ドメインは共有結合または非共有結合により結合されうる。該ドメインが共有結合している場合には、該結合は例えばジスルフィド結合により媒介されうる。
【００８９】
本発明の第2の形態においては、第1エピトープと第2エピトープとは、好ましくは、異なる。それらは、天然に存在するもの若しくは合成体でありうるポリペプチド、タンパク質もしくは核酸またはそれらの一部でありうる。この場合、本発明のリガンドはエピトープまたは抗原に結合し、アンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、EPO受容体アゴニスト）として作用しうる。1つの実施形態におけるリガンドのエピトープ結合ドメインは、同じエピトープ特異性を有し、例えば、該エピトープの多重コピーが同一抗原上に存在する場合には、それらのエピトープに同時に結合しうる。もう1つの実施形態においては、これらのエピトープは、該リガンドが該エピトープに結合し該抗原を架橋しうるよう、異なる抗原上に設けられている。エピトープおよび抗原の選択は多種多様であると当業者は理解するであろう。それらは、例えば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補因子またはDNA結合タンパク質でありうる。適当なサイトカインおよび増殖因子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カーディオトロフィン（Cardiotrophin）-1、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エキソデゥス（Exodus）-2、EpoR、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72 a.a.）、IL-8（77 a.a.）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67アミノ酸）、MDC（69アミノ酸）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67アミノ酸）、MDC（69アミノ酸）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆体抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、TACE認識部位、TNF BP-IおよびTNF BP-II、ならびに本明細書の付録2または付録3に開示されている任意の標的（該付録に記載されているとおりの組合せで、または異なる組合せで、または個々に使用することが可能である）。サイトカイン受容体には、前記サイトカインの受容体、例えばIL-1 R1、IL-6R、IL-10R、IL-18R、ならびに付録2または付録3に記載のサイトカインの受容体、さらには、付録2および3に開示されている受容体が含まれる。この一覧は網羅的なものではないと理解されるであろう。該多重特異性リガンドが（同一または異なる抗原上の）2つのエピトープに結合する場合、該抗原はこの一覧から選ばれうる。
【００９０】
好ましくは、治療場面において生物の体内で相乗的に協働作用するサイトカインおよび他の分子を標的化するために、二重特異性リガンドを使用することが可能である。したがって、本発明は、2以上のサイトカインに結合しうる二重特異性リガンドを投与することを含む、2以上のサイトカインの活性を相乗的に作用させるための方法を提供する。本発明のこの態様においては、該二重特異性リガンドは、任意の二重特異性リガンド、例えば、相補的および／または非相補的ドメインから構成されるリガンド、開いたコンホメーションのリガンド、および閉じたコンホメーションのリガンドでありうる。例えば、本発明のこの態様は、VHドメインとVLドメインとの組合せ、VHドメインの単独体、およびVLドメインの単独体に関する。
【００９１】
治療場面における相乗作用は多数の方法で達成されうる。例えば、標的の組合せは、両方の標的がリガンドにより標的化された場合にのみ、治療的に活性でありうる。一方、一方の標的のみの標的化は治療的に有効ではない。もう1つの実施形態においては、一方の標的のみでも幾らかの低い又は最低限度の治療効果をもたらしうるが、もう1つの標的と一緒の場合には、その組合せは治療効果における相乗的増強をもたらす。
【００９２】
好ましくは、本発明のこの態様の二重特異性リガンドにより結合されるサイトカインは、付録2に示す一覧から選ばれる。
【００９３】
さらに、細胞傷害性細胞により発現されるCD89を一方の特異性が標的化し他方が腫瘍特異的である二重特異性リガンドは、腫瘍学的用途において使用されうる。標的化されうる腫瘍抗原の例を付録3に示す。
【００９４】
本発明の第2の形態の1つの実施形態においては、可変ドメインは第1および／または第2抗原またはエピトープに対する抗体から誘導される。好ましい実施形態においては、可変ドメインは単一可変抗体ドメインのレパートリーから誘導される。1つの例においては、該レパートリーは、動物においては生じないレパートリー、または合成レパートリーである。もう1つの例においては、単一変異ドメインは、動物への免疫化により（少なくとも部分的に）単離される。したがって、該単一ドメインはナイーブライブラリーから単離されうる。
【００９５】
本発明の第2の形態は、もう1つの態様において、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む多重特異性リガンドを提供する。第1結合特異性と第2結合特異性とは同一または異なりうる。
【００９６】
もう1つの態様において、本発明は、第1エピトープ結合特異性を有する第1エピトープ結合ドメインと、第2エピトープ結合特異性を有する非相補的第2エピトープ結合ドメインとを含む閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを提供し、ここで、第1結合特異性と第2結合特異性とは、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドが両方のエピトープに同時に結合し得ないよう、エピトープ結合に関して競合しうる。
【００９７】
さらにもう1つの態様において、本発明は、非相補的結合ドメインを含む開いたコンホメーションのリガンドを提供し、ここで、該ドメインは同一標的上の異なるエピトープに特異的である。そのようなリガンドは、増加したアビディティで標的に結合する。同様に、本発明は、IL-5、PDGF-AA、PDGF-BB、TGFβ、TGFβ2、TGFβ3およびTNFα、例えばヒトTNF受容体1およびヒトTNFαのような該エピトープの多重コピーを含む標的に対する、同一エピトープに特異的な非相補的結合ドメインを含む多価リガンドを提供する。
【００９８】
類似した態様においては、本発明のリガンドを、個々のエピトープには低いアフィニティーで結合するよう操作して、個々のエピトープへの結合は治療的に重要ではないものの、2つのエピトープへの結合から生じるアビディティの増加が治療利益をもたらすようにする。特定の例においては、正常な細胞型上には個別に存在するが異常または病的細胞（例えば、腫瘍細胞）上においてのみ一緒になって存在するエピトープを標的化することが可能である。そのような場合には、異常または病的細胞のみが本発明の二重特異性リガンドにより有効に標的化される。
【００９９】
また、同一エピトープの多重コピーまたは隣接エピトープ（同一標的上のもの）に特異的なリガンド（キレート化dAbとして公知である）は、3個、4個またはそれ以上の非相補的結合ドメインを含む三量体または多量体（四量体またはそれ以上）リガンドでありうる。例えば、3個または4個のVHドメインまたはVLドメインを含むリガンドを構築することが可能である。
【０１００】
さらに、多サブユニット標的に結合し、各結合ドメインが該標的のサブユニットに特異的であるリガンドを提供する。該リガンドは二量体、三量体または多量体でありうる。
【０１０１】
好ましくは、本発明の前記態様の多重特異性リガンドは本発明の第1の態様の方法により入手可能である。
【０１０２】
本発明の第2の形態の前記態様においては、好ましくは、第1エピトープ結合ドメインおよび第2エピトープ結合ドメインは、本明細書に定義されているとおりの非相補的免疫グロブリン可変ドメインである。それはVH-VHまたはVL-VL可変ドメインである。
【０１０３】
特にキレート化dAbは、本発明の好ましい態様に従い、すなわち、アンカーdAbを使用することにより製造することが可能であり、この場合、リンカー配列の上流または下流に一定（constant）のdAbを含むベクター（該リンカーのもう一方の側には第2、第3および第4 dAbのレパートリーが挿入される）を使用して二量体、三量体または多量体dAbのライブラリーが構築される。例えば、アンカーまたはガイド（guiding）dAbはTAR1-5（Vκ）、TAR1-27（Vκ）、TAR2h-5（VH）またはTAR2h-6（Vκ）でありうる。
【０１０４】
もう1つの方法においては、例えば、VHおよびVLのような結合ドメイン間の天然アフィニティーまたは非共有結合を用いることにより、リンカーの使用を避けることが可能である。したがって、本発明は、
（a）標的上の第1エピトープに特異的な単一結合ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを準備し、
（b）該標的上の第2エピトープに特異的な第2結合ドメインを含むレパートリーをコードするベクターを準備し、ここで、該エピトープは第1エピトープと同一であっても異なっていてもよく、第2エピトープは第1エピトープに隣接しており、
（c）第1および第2結合ドメインを発現させ、
（d）一緒になって標的結合性二量体を形成する第1および第2結合ドメインの組合せを単離する
工程を含む、キレート化多量体リガンドの製造方法を提供する。
【０１０５】
第1エピトープと第2エピトープとは隣接しており、そのため、多量体リガンドは両方のエピトープに同時に結合しうる。これは、結合する場合のアビディティの増加という利点を該リガンドに与える。それらのエピトープが同一である場合には、アビディティの増加は、アビディティ増強効果を得るために少なくとも2つのコピーの同時結合を可能にする該標的上の該エピトープの多重コピーの存在により得られる。
【０１０６】
該結合ドメインは、いくつかの方法またはリンカーの使用により会合させることが可能である。例えば、該結合ドメインは、cys残基、アビジンおよびストレプトアビジン基、または合成後の非共有結合のための他の手段を含みうる。標的に効率的に結合する組合せ体が単離されるであろう。あるいは、第1結合ドメイン、リンカーおよび第2結合ドメインのレパートリー（例えば、前記のとおり）を含む単一ベクターからの単一ポリペプチドとして発現される第1および第2結合ドメイン間にリンカーが存在しうる。
【０１０７】
好ましい態様においては、第1結合ドメインと第2結合ドメインとは、抗原に結合している場合には、自然に会合する。例えば、VHドメインとVκドメインとは、隣接エピトープに結合している場合には、3通りの相互作用により自然に会合して、安定な二量体を形成するであろう。そのような会合タンパク質は標的結合アッセイで単離されうる。この方法の利点は、標的に対するアビディティの増加の結果として、密接に隣接したエピトープに正しいコンホメーションで結合する結合ドメインのみが会合し、単離されることである。
【０１０８】
本発明の第2の形態の前記態様のもう1つの実施形態においては、少なくとも1つのエピトープ結合ドメインが非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドまたは「タンパク質骨格」（本明細書中で定義されているとおり）を含む。適当な非免疫グロブリンタンパク質スカフォールドには、SpA、フィブロネクチン、GroELおよび他のシャペロン、リポカリン、CCTLA4ならびにアフィボディ（前記のとおり）よりなる群から選ばれるもののいずれかが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
本発明の第2の形態の前記態様においては、好ましくは、エピトープ結合ドメインは「タンパク質骨格」に結合している。好ましくは、本発明のタンパク質骨格は免疫グロブリン骨格である。
【０１１０】
本発明において、「免疫グロブリン骨格」なる語は、少なくとも1つの免疫グロブリンフォールドを含み1以上のエピトープ結合ドメイン（本明細書中で定義されているとおり）のための核として作用するタンパク質を意味する。
【０１１１】
本明細書中で定義されている好ましい免疫グロブリン骨格には、以下のものから選ばれる任意の1以上が含まれる：少なくとも（i）抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインまたは（ii）抗体重鎖のCH1ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1およびCH2ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1、CH2およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン分子；あるいは抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインと一緒になったサブセット（ii）のいずれか。ヒンジ領域ドメインも含まれうる。ドメインのそのような組合せは、例えば、天然抗体、例えばIgGもしくはIgM、またはそれらのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子を模擬しうる。当業者であればこの列挙が網羅的であるとは意図されないことを理解するであろう。
【０１１２】
本明細書に定義されているとおりのエピトープ結合ドメインへの該骨格の連結は、ポリペプチドレベルで（すなわち、該骨格および／または該エピトープ結合ドメインをコードする核酸の発現後に）達成されうる。あるいは、該連結工程は、核酸レベルで行うことが可能である。本発明のタンパク質骨格を1以上のエピトープ結合ドメインに連結するための方法は、当業者によく知られており本明細書に記載されているタンパク質化学および／または分子生物学的技術の利用を含む。
【０１１３】
好ましくは、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドは、標的分子に結合しうる第1ドメインと、該リガンドの半減期を延長する分子または基に結合しうる第2ドメインとを含みうる。例えば、該分子または基は、嵩張った（bulky）物質、例えばHSAまたは細胞マトリックスタンパク質でありうる。本明細書中で用いる「リガンドの半減期を延長する分子または基」なる表現は、本明細書に記載の二重特異性リガンドにより結合された場合に、動物に投与されたそのような二重特異性リガンドのin vivo半減期を、その分子または基に結合しないリガンドと比較して増加させる分子または化学基を意味する。リガンドの半減期を延長する分子または基の具体例は後記に記載されている。好ましい実施形態においては、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドは、半減期延長性分子または基の離脱に際してのみ標的分子に結合しうるであろう。したがって、例えば、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドは、HSAのような嵩張った物質により、対象の血流循環中に維持される。標的分子との遭遇が生じると、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドの結合ドメイン間の競合がHSAの離脱および該標的の結合を引き起こす。
【０１１４】
本発明の任意の態様のリガンド、およびそのようなリガンドの構築に有用なdAb単量体は、好ましくは、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは、50nM〜20pM、もしくは5nM〜200pM、もしくは1nM〜100pM、1×10-7 M以下、1×10-8 M以下、1×10-9 M以下、1×10-10 M以下、1×10-11 M以下のKd、および／または5×10-1〜1×10-7 S-1、好ましくは、1×10-2〜1×10-6 S-1、もしくは5×10-3〜1×10-5 S-1、もしくは5×10-1 S-1以下、もしくは1×10-2 S-1以下、もしくは1×10-3 S-1以下、もしくは1×10-4 S-1以下、もしくは1×10-5 S-1以下、もしくは1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数で、それらのコグネイト標的から解離しうる。Kd速度定数はKoff/Konとして定義される。
【０１１５】
特に、本発明は、各dAbがTNFαに結合する抗TNFα dAb単量体（または、そのようなdAbを含む二重特異性リガンド）、ホモ二量体、ヘテロ二量体またはホモ三量体リガンドを提供する。該リガンドは、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは、50nM〜20pM、より好ましくは、5nM〜200pM、最も好ましくは、1nM〜100pMのKd（別の表し方では、Kdは1×10-7 M以下、好ましくは、1×10-8 M以下、より好ましくは、1×10-9 M以下、有利には、1×10-10 M以下、最も好ましくは、1×10-11 M以下である）および／または5×10-1〜1×10-7 S-1、好ましくは、1×10-2〜1×10-6 S-1、より好ましくは、5×10-3〜1×10-5 S-1、例えば、5×10-1 S-1以下、好ましくは、1×10-2 S-1以下、より好ましくは、1×10-3 S-1以下、有利には、1×10-4 S-1以下、更に有利には、1×10-5 S-1以下、最も好ましくは、1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数で、TNFαに結合する。
【０１１６】
好ましくは、該リガンドは、標準的なL929アッセイにおいて、500nM〜50pM、好ましくは、100nM〜50pM、有利には、10nM〜100pM、より好ましくは、1nM〜100pM、例えば、50nM以下、好ましくは、5nM以下、有利には、500pM以下、より好ましくは、200pM以下、最も好ましくは、100pM以下のND50で、TNFαを中和する。
【０１１７】
好ましくは、該リガンドは、500nM〜50pM、好ましくは、100nM〜50pM、より好ましくは、10nM〜100pM、有利には、1nM〜100pM、例えば、50nM以下、好ましくは、5nM以下、より好ましくは、500pM以下、有利には、200pM以下、最も好ましくは、100pM以下のIC50で、TNFα受容体I（p55受容体）へのTNFαの結合を抑制する。好ましくは、TNFαはヒトTNFαである。
【０１１８】
さらに、本発明は、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは、50nM〜20pM、より好ましくは、5nM〜200pM、最も好ましくは、1nM〜100pM、例えば、1×10-7 M以下、好ましくは、1×10-8 M以下、より好ましくは、1×10-9 M以下、有利には、1×10-10 M以下、最も好ましくは、1×10-11 M以下のKd、および／または5×10-1〜1×10-7 S-1、好ましくは、1×10-2〜1×10-6 S-1、より好ましくは、5×10-3〜1×10-5 S-1、例えば、5×10-1 S-1以下、好ましくは、1×10-2 S-1以下、有利には、1×10-3 S-1以下、より好ましくは、1×10-4 S-1以下、より一層好ましくは、1×10-5 S-1以下、最も好ましくは、1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数で、TNF受容体Iに結合する抗TNF受容体I dAb単量体、またはそのようなdAbを含む二重特異性リガンドを提供する。
【０１１９】
好ましくは、該dAb単量体リガンドは、標準的なアッセイ（例えば、本明細書に記載のL929またはHeLaアッセイ）において、500nM〜50pM、好ましくは、100nM〜50pM、より好ましくは、10nM〜100pM、有利には、1nM〜100pM、例えば、50nM以下、好ましくは、5nM以下、より好ましくは、500pM以下、有利には、200pM以下、最も好ましくは、100pM以下のND50で、TNFαを中和する。
【０１２０】
好ましくは、該dAb単量体またはリガンドは、500nM〜50pM、好ましくは、100nM〜50pM、より好ましくは、10nM〜100pM、有利には、1nM〜100pM、例えば、50nM以下、好ましくは、5nM以下、より好ましくは、500pM以下、有利には、200pM以下、最も好ましくは、100pM以下のIC50で、TNFα受容体I（p55受容体）へのTNFαの結合を抑制する。好ましくは、TNFα受容体I標的はヒトTNFαである。
【０１２１】
さらに、本発明は、1nM〜500μM（すなわち、×10-9〜5×10-4)、好ましくは、100nM〜10μMのKdで血清アルブミン（SA）に結合するdAb単量体（または、そのようなdAbを含む二重特異性リガンド）を提供する。好ましくは、第1抗SA dAbと別の標的に対する第2 dAbとを含む二重特異性リガンドの場合、第2 dAbのその標的に対するアフィニティー（例えば、例えばBiaCoreを使用する表面プラズモン共鳴により測定されたKdおよび／またはKoff）は、SAに対する第1 dAbのアフィニティーの1〜100000倍（好ましくは、100〜100000、より好ましくは、1000〜100000、または10000〜100000倍）である。例えば、第1 dAbは約10μMのアフィニティーでSAに結合し、一方、第2 dAbは、100pMのアフィニティーで、その標的に結合する。好ましくは、血清アルブミンはヒト血清アルブミン（HSA）である。
【０１２２】
1つの実施形態においては、第1 dAb（またはdAb単量体）は、約50、好ましくは、約70、より好ましくは、100、150または200nMのKdで、SA（例えば、HSA）に結合する。
【０１２３】
本発明は更に、本発明の前記態様の前記dAb単量体の二量体、三量体および重合体を提供する。
【０１２４】
dAb単量体、二量体および三量体を含む本発明のリガンドは、CH2およびCH3ドメインの一方または両方と、さらに場合によってはヒンジ領域とを含む抗体Fc領域に連結されうる。例えば、そのようなポリペプチドを製造するために、Fc領域に単一ヌクレオチド配列として連結されたリガンドをコードするベクターを使用することが可能である。
【０１２５】
本発明の第2の形態のもう1つの態様において、本発明は、本明細書中で定義されているとおりの少なくとも多重特異性リガンドをコードする1以上の核酸分子を提供する。1つの実施形態においては、該リガンドは、閉じたコンホメーションのリガンドである。もう1つの実施形態においては、該リガンドは、開いたコンホメーションのリガンドである。該多重特異性リガンドは単一核酸分子上でコードされうる。あるいは、各エピトープ結合ドメインが、別々の核酸分子によりコードされうる。該リガンドが単一核酸分子によりコードされる場合には、該ドメインは融合ポリペプチドとして発現されることが可能であり、あるいは別々に発現され、ついで、例えば化学的連結剤を使用して互いに連結されうる。別々の核酸から発現されたリガンドは、適当な手段により互いに連結される。
【０１２６】
該核酸は更に、発現後に宿主細胞からポリペプチドを輸送するためのシグナル配列をコードすることが可能であり、発現後に線維状バクテリオファージ粒子の表面成分（または選択提示系の他の成分）に融合されうる。細菌発現および／またはファージもしくはファージミド提示において使用しうるリーダー配列には、pelB、stII、ompA、phoA、blaおよびpelAが含まれる。
【０１２７】
本発明の第2の形態のもう1つの態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
【０１２８】
さらにもう1つの態様において、本発明は、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０１２９】
そのようなベクターからの発現は、例えばバクテリオファージ粒子の表面上に選択用可変ドメインを産生するように操作されうる。これは、本発明の方法を用いて、提示されたドメインを選択すること、したがって「二重特異性リガンド」を選択することを可能にする。
【０１３０】
本発明の第2の形態の好ましい実施形態においては、エピトープ結合ドメインは免疫グロブリン可変領域であり、単一ドメインV遺伝子レパートリーから選択される。一般には、単一抗体ドメインのレパートリーは線維状バクテリオファージの表面上に提示される。好ましい実施形態においては、各単一抗体ドメインを、抗原へのファージレパートリーの結合により選択する。
【０１３１】
本発明は更に、開いたコンホメーションまたは閉じたコンホメーションのリガンドでありうる本発明の多重特異性リガンドを少なくとも含むキットを提供する。本発明のキットは、例えば診断用キット、治療用キット、化学的または生物学的種の検出のためのキットなどでありうる。
【０１３２】
本発明の第2の形態の更にもう1つの態様においては、本発明は、本発明のリガンドを使用する均一イムノアッセイを提供する。
【０１３３】
本発明の第2の形態の更にもう1つの態様においては、本発明は、本発明の方法により入手可能な閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドと製薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【０１３４】
さらに、本発明は、本発明の「閉じたコンホメーションの多重特異性リガンド」または組成物を使用する疾患の治療方法を提供する。
【０１３５】
本発明の好ましい実施形態においては、該疾患は癌または炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ、喘息もしくはクローン病である。
【０１３６】
本発明の第2の形態のもう1つの態様においては、本発明は、本発明の閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドまたは組成物を使用する疾患の診断を含む診断のための方法を提供する。したがって、一般には、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドへのアナライトの結合を利用して、離脱の際にシグナルの生成を招く物質を離脱させることが可能である。例えば、アナライト（第2抗原）の結合は、特に酵素がその活性部位を介して抗体に保持されている場合にイムノアッセイの基礎をもたらす抗体結合酵素（第1抗原）を離脱させうるであろう。
【０１３７】
したがって、第2の形態の最終態様においては、本発明は、
（a）物質に結合した閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを準備し、ここで、該リガンドは標的分子および該物質に特異的であり、該リガンドに結合している物質は、該リガンドからの離脱に際して、検出可能なシグナルの生成を招き、
（b）その閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを該標的分子にさらし、
（c）該物質の離脱の結果として生成したシグナルを検出すること
を含む、標的分子の存在の検出方法を提供する。
【０１３８】
本発明の第2の形態の前記態様においては、好ましくは、該物質は、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドに結合している場合には不活性な酵素である。あるいは、該物質は、該リガンドに結合している場合には不活性であるか又は消光されている蛍光性、発光性または色素原性分子および酵素基質よりなる群から選ばれる任意の1以上のものでありうる。
【０１３９】
本明細書に開示されている配列に類似した又は相同な（例えば、少なくとも約70％の配列同一性の）配列も本発明の一部である。いくつかの実施形態においては、アミノ酸レベルでの配列同一性は約80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上でありうる。核酸レベルでは、配列同一性は約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上でありうる。あるいは、核酸断片が選択的ハイブリダイゼーション条件（例えば、非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件）下で該鎖の相補体にハイブリダイズする場合には、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞、細胞ライセート、または部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在しうる。
【０１４０】
2つの配列間の「相同性」または「配列同一性」または「類似性」（これらの用語は本明細書中では互換的に用いられる）の計算は以下のとおりに行う。それらの配列を、最適な比較を目的として整列（アライン）させる（例えば、最適なアライメントのために、第1および第2アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することが可能であり、比較のために非相同配列を無視することが可能である）。好ましい実施形態においては、比較のために整列させる参照配列の長さは該参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、より一層好ましくは少なくとも70％、80％、90％、100％である。ついで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列内の或る位置が第2配列内の対応位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、それらの分子はその位置において同一である（本明細書中で用いるアミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同じ意味である）。それらの2つの配列間の同一性（％）は、それらの2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【０１４１】
好ましくは、配列アライメントには、デフォルト値に設定されたパラメーターでBLASTアルゴリズム（バージョン2.0）を使用する。BLASTアルゴリズムは、米国政府（“.gov”）の米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）（“nih”）の米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（“.ncbi”）のワールド・ワイド・ウェブ・サイト（“www”）の、“/Blast/”ディレクトリーの“blast_help.html”ファイルに詳細に記載されている。検索パラメーターは以下のとおりに定められ、好ましくは、定められているデフォルトパラメーターに設定される。
【０１４２】
BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）は、プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムである。これらのプログラムの重要性は、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6):2264-8（前記の“blast_help.html”ファイルを参照されたい）の統計的方法を若干改善させて用いた場合に得られる知見から明らかである。BLASTプログラムは、例えば問合せ配列のホモログを同定するための配列類似性検索に応用された。それらのプログラムは、一般には、モチーフ形態の検索には有用でない。配列データベースの類似性検索における基本的問題の考察には、Altschulら (1994)を参照されたい。米国国立衛生研究所のウェブサイトにおいて入手可能なBLASTプログラムは以下のタスクを実行する。「blastp」はタンパク質配列データベースに対してアミノ酸問合せ配列を比較する。「blastn」はヌクレオチド配列データベースに対してヌクレオチド問合せ配列を比較する。「blastx」はタンパク質配列データベースに対してヌクレオチド問合せ配列（両鎖）の6フレームの概念上の翻訳産物を比較する。「tblastn」は、全6リーディングフレーム（両鎖）における動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質問合せ配列を比較する。「tblastx」はヌクレオチド配列データベースの6フレームの翻訳に対してヌクレオチド問合せ配列の6フレームの翻訳を比較する。
【０１４３】
BLASTは以下の検索パラメーターを使用する。HISTOGRAMは、各検索のためのスコアのヒストグラムを示す；デフォルトはyesである（BLASTマニュアル中のパラメーターHを参照されたい）。DESCRIPTIONSは、報告されたマッチ配列の短い記述の数を、指定された数に限定する；デフォルト限界は100の記述である（該マニュアルベージのパラメーターVを参照されたい）。EXPECTおよびCUTOFFも参照されたい。ALIGNMENTSは、データベース配列を、ハイスコアリングセグメントペア（HSP）が報告されている指定された数に限定する；デフォルト限界は50である。これを超えるデータベース配列がたまたま、報告に関する統計的有意性閾値を満たす場合には（後記のEXPECTおよびCUTOFFを参照されたい）、最大統計的有意性に帰されるマッチのみが報告される（BLASTマニュアルのパラメーターBを参照されたい）。EXPECTは、データベース配列に対するマッチの報告に関する統計的有意性閾値であり、KarlinおよびAltschul (1990)の確率論的モデルにより10個のマッチが単に偶然見出されると予想されるようデフォルト値は10である。マッチに帰される統計的有意性がEXPECT閾値より大きい場合には、該マッチは報告されない。より低いEXPECT閾値は、よりストリンジェントであり、より少ない偶然のマッチの報告につながる。分数（fractional）値は許容される（BLASTマニュアル中のパラメーターEを参照されたい）。CUTOFFは、ハイスコアリングセグメントペアの報告に関するスコアをカットオフする。デフォルト値はEXPECT値（前記を参照されたい）から計算される。HSPは、それに帰される統計的有意性が、CUTOFF値に等しいスコアを有する唯一のHSPに帰されるものと少なくとも同等に高い場合にのみ、データベース配列に関して報告される。より高いCUTOFF値は、よりストリンジェントであり、より少ない偶然のマッチの報告につながる（BLASTマニュアル中のパラメーターSを参照されたい）。典型的には、有意性閾値は、EXPECTを使用して、より直観的に処理されうる。
【０１４４】
MATRIXは、BLASTP、BLASTX、TBLASTNおよびTBLASTXのための代替的スコアリングマトリックスを指定する。デフォルトマトリックスはBLOSUM62（Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Aacad. Sci. USA 89(22):10915-9）である。妥当な代替的選択には、PAM40、PAM120、PAM250およびIDENTITYが含まれる。BLASTNには、代替的スコアリングマトリックスは利用できない。BLASTN要求において指示的なMATRIXを指定すると、エラー応答が返ってくる。
【０１４５】
STRANDは、TBLASTN検索をデータベース配列の先頭部または尾部の鎖のみに限定し、あるいはBLASTN、BLASTXまたはTBLASTX検索を問合せ配列の先頭部分または尾部の鎖上のリーディングフレームのみに限定する。
【０１４６】
FILTERは、Wootton & Federhen (1993) Computers and Chemistry 17:149-163のSEGプログラムにより測定した場合に低い複雑性の組成を有する問合せ配列のセグメント、あるいはClaverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17:191-201のXNUプログラムにより測定した場合またはBLASTNではTatusovおよびLipman（NCBIのワールド・ワイド・ウェブ・サイトを参照されたい）のDUSTプログラムにより測定した場合に短周期性内部反復よりなるセグメントをマスクする。フィルタリングは、統計的には有意だが生物学的には関心の無い報告をblast出力（例えば、一般的な酸性、塩基性またはプロリンリッチ領域に対するヒット）から排除して、データベース配列に対する特異的マッチに関して利用可能な問合せ配列の生物学的に関心のある領域を残しうる。
【０１４７】
フィルタープログラムにより見出された低い複雑性の配列は、ヌクレオチド配列においては「N」の文字（例えば、13回反復する「N」）およびタンパク質配列においては「X」の文字（例えば、9回反復する「X」）を使用して置換される。
【０１４８】
フィルタリングは問合せ配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトフィルタリングはBLASTNではDUST、他のプログラムではSEGである。SWISS-PROTにおける配列への適用では、SEG、XNUまたはそれらの両方により何も全くマスクされないことは珍しいことではない。したがって、フィルタリングが常に有効であると期待すべきではない。さらに、場合によっては、配列の全体がマスクされ、これは、フィルターされていない問合せ配列に対して報告されたいずれかのマッチの統計的有意性が疑わしいことを示している。
【０１４９】
NCBI-giは、アクセッションおよび／または遺伝子座名に加えてNCBI gi識別子が出力中に示されるようにする。
【０１５０】
最も好ましくは、配列比較は、前記のNCBIワールド・ワイド・ウェブ・サイトの“/BLAST”ディレクトリにおいて提供される簡便なBLAST検索アルゴリズムを使用して行う。
【０１５１】
もう1つの態様において、本発明は、第1抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する第1単一免疫グロブリン可変ドメインと、第2抗原またはエピトープに対する結合活性を有する第2免疫グロブリン単一可変ドメインとを含み、該第1および第2ドメインが、同一特異性を有する相互相補的ドメインを欠く、二重特異性リガンドを提供する。
【０１５２】
本発明の前記態様においては、好ましくは、該二重特異性リガンドは、哺乳類dAbの2つの相補的ペアを含むIgG形態を有し、各相補的ペアを含む各dAbは、異なる標的結合特異性を有する。好ましくは、本発明のこの実施形態の二重特異性分子は、50nM以上のエピトープ結合特異性を示す1以上のdAbを含む。
【０１５３】
本発明の前記態様においては、2つの異なるdAbは、両方のVHドメイン、両方のVLドメインまたは少なくとも一方のVHおよびVLドメインでありうる。
【０１５４】
本発明の前記態様においては、好ましくは、該二重特異性リガンドは、互いに相補的であるdAbのペアの少なくとも1つを含む。
【０１５５】
好ましくは、記載されているIgG形態を有する二重特異性リガンドはそのそれぞれの標的に非競合的に結合する。
【０１５６】
本発明の前記態様のもう1つの実施形態においては、前記のIgG形態を有する二重特異性リガンドはそのそれぞれの標的に競合的に結合する。
【０１５７】
好ましくは、本発明の前記態様の二重特異性リガンドはIgG形態を有し、対応標的の２コピーに同時に結合しうる同一dAbのペアの1つを含む。
【０１５８】
より好ましくは、本発明の前記態様の二重特異性リガンドは同一dAbのペアの2つを含み、ここで、同一dAbの両ペアは対応標的のコピーの2つに同時に結合しうる。
【０１５９】
好ましくは、本発明の前記態様の二重特異性リガンドは4つの同一dAb、好ましくは哺乳類dAbを含む。
【０１６０】
本発明の前記態様のもう1つの実施形態においては、本発明の二重特異性分子はFab形態を有する。
【０１６１】
好ましくは、本明細書に記載のFab形態を有する二重特異性リガンドはそのそれぞれの標的に非競合的に結合する。
【０１６２】
本発明の前記態様のもう1つの実施形態においては、前記のFab形態を有する二重特異性リガンドはそのそれぞれの標的に競合的に結合する。
【０１６３】
本発明の前記態様の二重特異性リガンドの適当な標的には、以下のものよりなる一覧中の任意の1以上が含まれる。エピトープおよび抗原の選択は多種多様であると当業者は理解するであろう。それらは、例えば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素、酵素の補因子またはDNA結合タンパク質でありうる。適当なサイトカインおよび増殖因子には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ApoE、Apo-SAA、BDNF、カーディオトロフィン（Cardiotrophin）-1、EGF、EGF受容体、ENA-78、エオタキシン、エオタキシン-2、エキソデゥス（Exodus）-2、EpoR、FGF-酸性、FGF-塩基性、繊維芽細胞増殖因子-10、FLT3リガンド、フラクタルカイン（Fractalkine）（CX3C）、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、インスリン、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8（72アミノ酸）、IL-8（77アミノ酸）、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18（IGIF）、インヒビンα、インヒビンβ、IP-10、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）、KGF、レプチン、LIF、リンホタクチン、ミュラー管抑制物質、単球コロニー抑制因子、単球誘引タンパク質、M-CSF、MDC（67アミノ酸）、MDC（69アミノ酸）、MCP-1（MCAF）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC（67アミノ酸）、MDC（69アミノ酸）、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、骨髄系前駆体抑制因子-1（MPIF-1）、NAP-2、ニュールツリン（Neurturin）、神経成長因子、β-NGF、NT-3、NT-4、オンコスタチンM、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、幹細胞因子（SCF）、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、腫瘍壊死因子（TNF）、TNF-α、TNF-β、TNF受容体I、TNF受容体II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF受容体1、VEGF受容体2、VEGF受容体3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ、HCC1、1-309、HER 1、HER 2、HER 3、HER 4、TACE認識部位、TNF BP-IおよびTNF BP-II、ならびに本明細書の付録2または付録3に開示されている任意の標的（該付録に記載されているとおりの組合せで、または異なる組合せで、または個々に使用することが可能である）。
【０１６４】
好ましくは、本発明の最終態様においては、二重特異性リガンドはin vitroにおいて又は細胞に基づくアッセイにおいて中和能を示す。
【０１６５】
本発明の任意の態様のリガンド、およびそのようなリガンドの構築に有用なdAb単量体は、好ましくは、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは、50nM〜20pM、もしくは5nM〜200pM、もしくは1nM〜100pM、1×10-7 M以下、1×10-8 M以下、1×10-9 M以下、1×10-10 M以下、1×10-11 M以下のKd、および／または5×10-1〜1×10-7 S-1、好ましくは、1×10-2〜1×10-6 S-1、もしくは5×10-3〜1×10-5 S-1、もしくは5×10-1 S-1以下、もしくは1×10-2 S-1以下、もしくは1×10-3 S-1以下、もしくは1×10-4 S-1以下、もしくは1×10-5 S-1以下、もしくは1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数で、それらのコグネイト標的から解離しうる。Kd速度定数はKoff/Konとして定義される。
【０１６６】
特に、本発明は、300nM〜5pM（すなわち、3×10-7〜5×10-12M）、好ましくは、50nM〜20pM、より好ましくは、5nM〜200pM、最も好ましくは、1nM〜100pMのKd（別の表し方では、Kdは1×10-7 M以下、好ましくは、1×10-8 M以下、より好ましくは、1×10-9 M以下、有利には、1×10-10 M以下、最も好ましくは、1×10-11 M以下である）および／または5×10-1〜1×10-7 S-1、好ましくは、1×10-2〜1×10-6 S-1、より好ましくは、5×10-3〜1×10-5 S-1、例えば、5×10-1 S-1以下、好ましくは、1×10-2 S-1以下、より好ましくは、1×10-3 S-1以下、有利には、1×10-4 S-1以下、更に有利には、1×10-5 S-1以下、最も好ましくは、1×10-6 S-1以下（表面プラズモン共鳴により測定した場合）のKoff速度定数の、標的への結合アフィニティーを有する二重特異性リガンドを提供する。
【０１６７】
好ましくは、該リガンドは、標準的なL929アッセイにおいて、500nM〜50pM、好ましくは、100nM〜50pM、有利には、10nM〜100pM、より好ましくは、1nM〜100pM、例えば、50nM以下、好ましくは、5nM以下、有利には、500pM以下、より好ましくは、200pM以下、最も好ましくは、100pM以下のND50で、TNFαを中和する。
【０１６８】
好ましくは、該リガンドは、500nM〜50pM、好ましくは、100nM〜50pM、より好ましくは、10nM〜100pM、有利には、1nM〜100pM、例えば、50nM以下、好ましくは、5nM以下、より好ましくは、500pM以下、有利には、200pM以下、最も好ましくは、100pM以下のIC50で、TNFα受容体I（p55受容体）へのTNFαの結合を抑制する。好ましくは、TNFαはヒトTNFαである。
【０１６９】
本発明の前記態様においては、二重特異性リガンドは、好ましくは、少なくとも50nMの結合アフィニティーを示す。
【０１７０】
好ましい態様においては、本発明は、標的リガンドに結合し、そして該標的リガンドの受容体に結合する二重特異性リガンドに関する。例えば、該リガンドはTNFαであることが可能であり、該標的リガンド受容体はTNF受容体1でありうる。好ましくは、本発明の二重特異性リガンドは該標的リガンドと該標的リガンド受容体との両方に同時に結合し、すなわち、それは、開いた配置を有する。
【０１７１】
本発明においては、好ましくは、本明細書に記載の二重特異性リガンドは、本明細書に記載のTAR1/TAR2二重特異性Fab、F(ab')2またはIgGであり、ヒトTNFαおよびヒトTNFR1（p55受容体）に特異的である。好ましくは、各アームは相補的VH/VLペアを含む。より好ましくは、各ペアのVLはVkである。さらに、より好ましくは、VKは標的としてTNFを有し、各ペアのVHは標的としてp55受容体を有する。これらのFabまたはIgG形態においては、dAbは、好ましくは、それらの標的に同時に、すなわち、有意な競合を伴うことなく結合する。
【０１７２】
最も好ましくは、TAR1/TAR2 IgGまたはFab形態の二重特異性リガンドは、本明細書の実施例に記載されているものである。
【０１７３】
当業者は、実施例に記載されておりTAR1/TAR2二重特異性リガンドおよびそれを含むdAbの作製に使用するベクター／構築物は、本発明の前記態様に従い使用する適当なベクター／構築物の単なる一例に過ぎないと理解するであろう。使用に適したベクター／構築物には、（a）真核性リーダー-VHまたはVL-CH1-ヒンジ-CH2-CH3が含まれる。この実施形態においては、該リーダーは哺乳類リーダー、例えばCD33またはIgG Kリーダーまたはこれらの機能的変異体／断片、あるいはこれらのリーダーのいずれかに少なくとも80％相同なものでありうる。
【０１７４】
本発明においては、前記（a）に記載の構築物を含む発現ベクター、好ましくは、実質的に酵母または哺乳類発現ベクターも提供する。
【０１７５】
さらにもう1つの態様においては、前記のベクターを含む宿主、好ましくは哺乳類細胞、例えばCos細胞を提供する。
【０１７６】
本発明の最終態様においては、以下に記載のアミノ酸配列を有しヒトTNF受容体1（p55受容体）に結合するTAR2h-10-27 dAbと称されるVH dAb単量体を提供する：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEWYWMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDAAVYYCAKVKLGGGPNFGYRGQGTLVTVSSAA。
【０１７７】
TAR2h-10-27核酸コード配列
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGAGTGGTATTGGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCAGCTATCAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACGCCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTTAAGTTGGGGGGGGGGCCTAATTTTGGCTACCGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCGGCCGC。
【０１７８】
好ましくは、このdAbは二重特異性リガンドから構成される。二重特異性リガンドはscFv、FabおよびIg分子を包含し、開いたコンホメーションまたは閉じたコンホメーションを有しうる。特に好ましいのは、相補的TAR1-5-19 VκおよびTAR2h-10-27 VHドメインを含む二重特異性FabおよびIgG形態である。好ましくは、該ポリペプチドは、開いたコンホメーションを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１７９】
定義
相補的
2つの免疫グロブリンドメインが「相補的」であるのは、それらが、コグネイトペアまたは群を形成する構造のファミリーに属する場合、またはそのようなファミリーに由来しこの特徴を保持する場合である。例えば、抗体のVHドメインおよびVLドメインは相補的であり、2つのVHドメインは相補的ではなく、2つのVLドメインは相補的ではない。相補的ドメインは、T細胞受容体のVαおよびVβ（またはγおよびδ）ドメインのような、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーにおいても見出されうる。本発明の第2の形態においては、非相補的ドメインは標的分子に協働的に結合しないが、同一または異なる分子上に存在しうる異なる標的エピトープ上で独立して作用する。人工的なドメイン、例えば、エピトープに結合するよう操作しない限りエピトープに結合しないタンパク質スカフォールドに基づくドメインは、非相補的である。同様に、（例えば）免疫グロブリンドメインおよびフィブロネクチンドメインに基づく2つのドメインは相補的ではない。
【０１８０】
免疫グロブリン
これは、2つのβシートと通常は保存ジスルフィド結合とを含有する、抗体分子に特徴的な免疫グロブリンフォールドを保有するポリペプチドのファミリーを意味する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、in vivoにおける細胞および非細胞相互作用の多数の態様、例えば、免疫系における広範な役割（例えば、抗体、T細胞受容体分子など）、細胞接着への関与（例えば、ICAM分子）および分子内シグナリング（例えば、PDGF受容体などの受容体分子）に関与している。本発明は、結合ドメインを有する全ての免疫グロブリンスーパーファミリー分子に適用可能である。好ましくは、本発明は抗体に関する。
【０１８１】
組合せ（合体）
本発明の可変ドメインは、組み合わせてドメイン群を形成させる。例えば、相補的ドメインを組合せる（合体させる）ことが可能であり、例えば、VLドメインをVHドメインと組合せることが可能である。非相補的ドメインを組合せることも可能である。ドメインは、共有的または非共有的手段によるドメインの連結を含む多数の方法で組合せることが可能である。
【０１８２】
ドメイン
ドメインは、折りたたまれたタンパク質構造体であり、該タンパク質の残部には無関係にその三次元構造を保有する。一般には、ドメインは、タンパク質の、分離した機能特性をもたらし、多くの場合、該タンパク質の残部および／または該ドメインの機能の喪失を伴うことなく付加され、除去され、または他のタンパク質に移されうる。単一抗体可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折りたたまれたポリペプチドドメインを意味する。したがって、それは、完全な抗体可変ドメイン、および修飾された可変ドメイン（この場合、例えば、1以上のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列により、あるいは末端切断型の又はNもしくはC末端伸長を含む抗体可変ドメインにより置換されている）、ならびに完全長ドメインの結合活性および特異性を少なくとも部分的に保持する、可変ドメインの折りたたまれた断片を含む。
【０１８３】
レパートリー
レパートリーは、多様な変異体（例えば、一次配列において異なるポリペプチド変異体）の集団である。本発明で使用するライブラリーは、少なくとも1000のメンバーを含むポリペプチドのレパートリーを含む。
【０１８４】
ライブラリー
ライブラリーなる語は、不均一なポリペプチドまたは核酸の混合物を意味する。ライブラリーは、各メンバーが単一のポリペプチドまたは核酸配列を有する複数のメンバーから構成される。この範囲においては、ライブラリーはレパートリーと同義である。ライブラリーメンバー間の配列相違は、ライブラリーに存在する多様性の原因となる。ライブラリーは、ポリペプチドまたは核酸の単純な混合物の形態をとることが可能であり、あるいは核酸のライブラリーで形質転換された生物または細胞の形態（例えば、細菌、ウイルス、動物または植物細胞など）でありうる。好ましくは、各個の生物または細胞は、ただ1つの又は限られた数のライブラリーメンバーを含有する。好ましくは、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、該核酸を発現ベクター内に組込む。したがって、好ましい態様においては、ライブラリーは、宿主生物（各生物は、対応するポリペプチドメンバーを産生するように発現されうる核酸形態のライブラリーの単一メンバーを含有する発現ベクターのコピーの1以上を含有する）の集団の形態をとりうる。したがって、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリーをコードする可能性を有する。
【０１８５】
「閉じたコンホメーションの多重特異性リガンド」は、本明細書中で定義されている少なくとも2つのエピトープ結合ドメインを含む、本明細書中で定義されている多重特異性リガンドを示す。「閉じたコンホメーション」（の多重特異性リガンド）は、1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合が、もう1つのエピトープ結合ドメインによるエピトープ結合と競合するよう、該リガンドのエピトープ結合ドメインが配置されていることを意味する。すなわち、コグネイトエピトープは、各エピトープ結合ドメインによって個別に結合され、同時には結合されない。該リガンドの閉じたコンホメーションは、本明細書に記載の方法を用いて得ることが可能である。
【０１８６】
抗体
抗体（例えば、IgG、IgM、IgA、IgDまたはIgE）またはフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、Fv、ジスルフィド結合されたFv、scFv、閉じたコンホメーションの多重特異性抗体、ジスルフィド結合したscFv、ダイアボディ）であり、抗体を天然で産生する種に由来するのか、組換えDNA技術により作製されたかには無関係であり、血清B細胞、ハイブリドーマ、形質転換体、酵母または細菌のいずれから単離されたかにも無関係である。
【０１８７】
二重特異性リガンド
本明細書中で定義されている第1免疫グロブリン単一可変ドメインと第2免疫グロブリン単一可変ドメインとを含むリガンドであり、それらの可変ドメインは、2つの異なる抗原へ、または単一特異性免疫グロブリンによっては通常は結合されない、同一抗原上の2つのエピトープへ結合しうる。例えば、それらの2つのエピトープは同一ハプテン上に存在しうるが、同一エピトープではなく、単一特異性リガンドによって結合されるのに十分な程度には接近し合っていない。本発明の二重特異性リガンドは、異なる特異性を有する可変ドメインから構成され、同一特異性を有する相互相補的可変ドメインペアを含有しない。
【０１８８】
抗原
本発明のリガンドにより結合される分子。典型的には、抗原は抗体リガンドにより結合され、in vivoで抗体応答を引き起こしうる。それはポリペプチド、タンパク質、核酸または他の分子でありうる。一般に、本発明の二重特異性リガンドは特定の抗原に対する標的特異性に関して選択される。通常の抗体およびそのフラグメントの場合には、可変ループ（L1、L2、L3およびH1、H2、H3）により特徴づけられる抗体結合部位が抗原に結合しうる。
【０１８９】
エピトープ
免疫グロブリンVH/VLペアにより通常結合される構造単位。エピトープは抗体に対する最小結合部位を定め、したがって、抗体の特異性の標的に相当する。単一ドメイン抗体の場合には、エピトープは、分離した可変ドメインにより結合される構造単位に相当する。
【０１９０】
一般的リガンド
レパートリーの全てのメンバーに結合するリガンド。一般には、前記の抗原結合部位を介して結合するものではない。非限定的な具体例には、プロテインA、プロテインLおよびプロテインGが含まれる。
【０１９１】
選択
スクリーニングにより誘導されるか、あるいはダーウィン的淘汰過程により誘導され、この場合、ドメインと抗原またはエピトープとの間で、あるいは抗体と抗原またはエピトープとの間で結合相互作用が生じる。したがって、第1可変ドメインは、相補的可変ドメインの存在下または非存在下の抗原またはエピトープへの結合に関して選択されうる。
【０１９２】
汎用フレームワーク
Kabat（“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, US Department of Health and Human Services）により定められた配列において保存された抗体の領域に対応する、あるいはChothiaおよびLesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917により定められたヒト生殖系列免疫グロブリンレパートリーまたは構造に対応する単一抗体フレームワーク配列。本発明は、超可変領域のみにおける変異により実質的に任意の結合特異性の誘導を可能にすることが判明している単一フレームワークまたはそのようなフレームワークのセットの使用を提供する。
【０１９３】
半減期
リガンドの血清中濃度が、例えば、自然メカニズムによるリガンドのクリアランスもしくは隔離および／またはリガンドの分解により、in vivoにおいて50％減少するのに要する時間。本発明のリガンドはin vivoにおいて安定化され、その半減期は、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に対して耐性を有する分子への結合により延長される。典型的には、そのような分子は、それ自体がin vivoにおいて長い半減期を有する天然に存在するタンパク質である。リガンドの機能活性が、該半減期延長性分子に特異的ではない同様のリガンドより長時間にわたりin vivoにおいて持続した場合、リガンドの半減期が延長されたといえる。したがって、HSAおよび標的分子に特異的なリガンドを、HSAに対する特異性が存在せずHSAに結合しないが別の分子には結合する同じリガンドと比較する。例えば、それは、標的分子上のもう1つのエピトープに結合しうる。典型的には、半減期は、10％、20％、30％、40％、50％またはそれ以上延長される。2×、3×、4×、5×、10×、20×、30×、40×、50×またはそれ以上の範囲の半減期の延長が可能である。その代わりに又はそれに加えて、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、150×までの範囲の半減期の延長が可能である。
【０１９４】
均一イムノアッセイ
結合した又は未結合の試薬を分離する工程を要することなくアナライトを検出するイムノアッセイ。
【０１９５】
実質的に同一（または「実質的に相同」）
第1のアミノ酸またはヌクレオチド配列が、第2の1つのアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一の又は等価な十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチド（例えば、類似の側鎖、例えば、保存されたアミノ酸置換を有するもの）を含有していて、第1および第2のアミノ酸またはヌクレオチド配列が類似活性を有すること。抗体の場合、第2の抗体は、同じ結合特異性を有し、そのアフィニティーの少なくとも50％を有する。
【０１９６】
本明細書中で用いる「低いストリンジェンシー」、「中等度のストリンジェンシー」、「高いストリンジェンシー」または「非常に高いストリンジェンシーの条件」なる語は、核酸のハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を示す。ハイブリダイゼーションを行うための指針はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。その参考文献には水性および非水性方法が記載されており、いずれを使用することも可能である。本明細書中で言及する特定のハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである：（1）約45℃、6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）中の低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、少なくとも50℃（低いストリンジェンシーの条件では、該洗浄の温度を55℃まで上昇させることが可能である）、0.2×SSC、0.1％ SDS中で2回の洗浄；（2）約45℃、6×SSC中の中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、少なくとも60℃、0.2×SSC、0.1％ SDS中で1回以上の洗浄；（3）約45℃、6×SSC中の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、65℃、0.2×SSC、0.1％ SDS中で1回以上の洗浄；ならびに好ましくは（4）約65℃、0.5M リン酸ナトリウム、7％ SDS中の非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、およびそれに続く、65℃、0.2×SSC、1％ SDS中で1回以上の洗浄。非常に高いストリンジェンシー条件（4）が、好ましい条件であり、特に示さない限り用いるべき条件である。
【０１９７】
TR1-5-19 Dabは、ヒトTNFαに特異的な単一ドメイン抗体（Dab）である。
【０１９８】
TAR2h-10-27 Dabは、ヒトTNF受容体1（p55受容体）に特異的な単一ドメイン抗体（Dab）である。
【０１９９】
TAR1/TAR2 Fab、F(ab')2またはIgGは、本明細書に記載のTAR1-5-19およびTAR2h-10-27 Dabを含むFab、F(ab')2またはIgG形態の二重特異性抗体である。
【０２００】
発明の詳細な説明
特に示さない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における当業者）により一般に理解されているのと同じ意義を有する。分子的、遺伝的および生化学的方法（全般的には、参照により本明細書に組み入れるSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい）ならびに化学的方法には、標準的な技術を用いる。
【０２０１】
免疫グロブリンに基づく多重特異性リガンドの製造
本発明の二重特異性リガンドは、本発明の所望の形態による開いたコンホメーションであるか閉じたコンホメーションであるかにかかわらず、scFv、「ファージ」抗体および他の操作された抗体分子の製造のための、抗体工学の分野において用いられる既に確立された技術により製造することが可能である。抗体、特に二重特異性抗体の製造のための技術は、例えば、以下の総説およびそれに引用されている参考文献に記載されている：Winter & Milstein, (1991) Nature 349:293-299; Plueckthun (1992) Immunological Reviews 130:151-188; Wrightら, (1992) Crti. Rev. Immunol.12:125-168; Holliger, P. & Winter, G. (1993) Curr. Op. Biotechn. 4, 446-449; Carterら, (1995) J. Hematother. 4, 463-470; Chester, K.A. & Hawkins, R.E. (1995) Trends Biotechn. 13, 294-300; Hoogenboom, H.R. (1997) Nature Biotechnol. 15, 125-126; Fearon, D. (1997) Nature Biotechnol. 15, 618-619; Plueckthun, A. & Pack, P. (1997) Immunotechnology 3, 83-105; Carter, P. & Merchant, A.M. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 449-454; Holliger, P. & Winter, G. (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45,128-130。
【０２０２】
本発明は、2つの異なる抗原またはエピトープに対する可変ドメインの選択、およびそれに続く、該可変ドメインの合体を提供する。
【０２０３】
該可変ドメインの選択に用いる技術は、当技術分野で公知のライブラリーおよび選択方法を用いる。ヒトB細胞から集められた再構成V遺伝子を使用する天然ライブラリー（Marksら, (1991) J. Mol. Biol., 222:581; Vaughanら, (1996) Nature Biotech., 14:309）が当業者によく知られている。合成ライブラリー（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissimら (1994) EMBO J., 13: 692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97）は、通常はPCRを用いて免疫グロブリンV遺伝子をクローニングすることにより製造される。PCR工程におけるエラーが高度のランダム化を招きうる。VHおよび／またはVLライブラリーが、別々に（この場合、単一ドメイン結合が直接的に選択される）または一緒に、標的抗原またはエピトープに対して選択されうる。
【０２０４】
本発明の二重特異性リガンドを製造するための好ましい方法は、第1抗原またはエピトープへの結合に関して可変ドメインのレパートリーが選択され第2抗原またはエピトープへの結合に関して可変ドメインのレパートリーが選択される選択系を使用することを含む。ついで、選択された第1可変ドメインと第2可変ドメインとを組合せ、第1および第2抗原またはエピトープの両方への結合に関して二重特異性リガンドを選択する。閉じたコンホメーションのリガンドは、分離している第1および第2抗原またはエピトープの両方への同時ではない結合に関して選択される。
【０２０５】
A．ライブラリーベクター系
本発明での使用に適した種々の選択系が当技術分野において公知である。そのような系の具体例を以下に説明する。
【０２０６】
バクテリオファージλ発現系は、バクテリオファージプラークとして又は溶原体のコロニーとして、どちらも既に記載されているとおりに（Huseら (1989) Science, 246:1275; CatonおよびKoprowski (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87; Mullinaxら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8095; Perssonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:2432）、直接スクリーニングすることが可能であり、本発明において有用である。そのような発現系は、106個までの異なるライブラリーメンバーをスクリーニングするのに使用することが可能であるが、それらは実際には、より多数（106個を超えるメンバー）のスクリーニングには適していない。
【０２０７】
ライブラリーの構築において特に関心が持たれるのは、選択提示系であり、これは、核酸を、それが発現するポリペプチドに関連づけることを可能にする。本明細書中で用いる選択提示系は、適当な提示手段により、一般的および／または標的リガンドへの結合により個々のライブラリーメンバーの選択を可能にする系である。
【０２０８】
大きなライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコールは当技術分野で公知であり、代表例としてファージ提示（ファージディスプレイ）技術が挙げられる。そのような系は、多様なペプチド配列を線維状バクテリオファージの表面上に提示させるものであり（ScottおよびSmith (1990) Science, 249: 386）、標的抗原に結合する特異的抗体フラグメントのin vitro選択および増幅のための抗体フラグメント（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有用であることが判明している（McCaffertyら, WO 92/01047）。VHおよびVL領域をコードするヌクレオチド配列は、それらを大腸菌（E. coli）の細胞周辺腔に導くリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、その結果、生じた抗体フラグメントはバクテリオファージの表面上に、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質（例えば、pIIIまたはpVIII）との融合体として提示される。あるいは、抗体フラグメントは、λファージカプシド（ファージボディー（phagebodies））上に外的に提示される。ファージに基づく提示系の利点は、それらが生物学的系であるため、選択されたライブラリーメンバーを含有するファージを細菌細胞内で増殖させることにより、選択されたライブラリーメンバーが簡便に増幅されうることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列はファージまたはファージミドベクター上に含有されているため、配列決定、発現およびそれに続く遺伝子操作が比較的容易である。
【０２０９】
バクテリオファージ抗体提示ライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの構築のための方法は当技術分野でよく知られている（参照により本明細書に組み入れるMcCaffertyら (1990) Nature, 348: 552; Kangら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clacksonら (1991) Nature, 352: 624; Lowmanら (1991) Biochemistry, 30: 10832; Burtonら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 88: 10134; Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133; Changら (1991) J. Immunol., 147: 3610; Breitlingら (1991) Gene, 104: 147; Marksら (1991) 前掲; Barbasら (1992) 前掲; HawkinsおよびWinter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marksら, 1992, J. Biol. Chem., 267: 16007; Lernerら (1992) Science, 258: 1313）。
【０２１０】
特に有利な1つのアプローチはscFvファージライブラリーの使用である（Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acid. Sci U.S.A., 85:5879-5883; Chaudharyら (1990) Proc. Natl. Acid. Sci U.S.A., 87:1066-1070; McCaffertyら (1990) 前掲; Clacksonら (1991) Nature, 352: 624; Marksら (1991) J. Mol. Biol., 222: 581; Chiswellら (1992) Trends Biotech., 10: 80; Marksら (1992) J. Biol. Chem., 267）。バクテリオファージコートタンパク質上に提示されるscFvライブラリーの種々の具体例が記載されている。改良されたファージ提示アプローチも公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れるWO96/06213およびWO92/01047（Medical Research Councilら）およびWO97/08320（Morphosys）に記載されている。
【０２１１】
ポリペプチドのライブラリーを作製するための他の系は、該ライブラリーメンバーのin vitro合成のための無細胞酵素装置の使用を含むものである。1つの方法においては、標的リガンドに対する選択とPCR増幅との交互のラウンドによりRNA分子を選択する（TuerkおよびGold (1990) Science, 249:505; EllingtonおよびSzostak (1990) Nature, 346:818）。所定のヒト転写因子に結合するDNA配列を同定するために、同様の技術を用いることができる（ThiesenおよびBach (1990) Nucleic Acids Res., 18:3203; BeaudryおよびJoyce (1992) Science, 257:635; WO92/05258およびWO92/14843）。同様にして、大きなライブラリーを作製するための方法として、ポリペプチドを合成するために、in vitro翻訳を用いることが可能である。安定化ポリソーム複合体を一般に含むこれらの方法はWO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、WO91/05058およびWO92/02536にも記載されている。ファージに基づくものではないもう1つの提示系（例えば、WO95/22625およびWO95/11922（Affymax）に開示されているもの）は、選択のためのポリペプチドを提示させるためにポリソームを使用する。
【０２１２】
さらにもう1つの範疇の技術は、人工的区画内でのレパートリーの選択を含むものであり、これは、遺伝子をその遺伝子産物に関連づけることを可能にする。例えば、所望の遺伝子産物をコードする核酸が、油中水型エマルションにより形成されたマイクロカプセル内で選択されうる選択系が、WO99/02671、WO00/40712およびTawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝的エレメントをマイクロカプセル内に区画化し、ついで該マイクロカプセル内で転写および／または翻訳させてそれらのそれぞれの遺伝子産物（RNAまたはタンパク質）を産生させる。ついで、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝的エレメントを選別する。このアプローチは、種々の手段により所望の活性を検出することにより、関心のある遺伝子産物を選択する。
【０２１３】
B．ライブラリーの構築
選択を意図されるライブラリーは、当技術分野で公知の技術（例えば、前記のもの）を用いて構築することが可能であり、あるいは商業的入手元から購入することが可能である。本発明において有用なライブラリーは、例えばWO99/20749に記載されている。ベクター系を選択し、関心のあるポリペプチドをコードする1以上の核酸配列を該ライブラリーベクター内にクローニングしたら、発現前に突然変異誘発を行なうことにより該クローン化分子内に多様性を生成させることができる。あるいは、前記のとおりに該コード化タンパク質を発現させ選択した後で突然変異誘発を行ない、追加的な選択ラウンドを行なうことができる。構造的に最適化されたポリペプチドをコードする核酸配列の突然変異誘発を、標準的な分子的方法により行なう。特に有用なのは、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちPCR（参照により本明細書に組み入れるMullisおよびFaloona (1987) Methods Enzymol., 155:335）である。PCRは、耐熱性DNA依存性DNAポリメラーゼの触媒により関心標的配列を増幅する複数サイクルのDNA複製を用いる方法であり、当技術分野でよく知られている。種々の抗体ライブラリーの構築が、Winterら (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55およびそこに引用されている参考文献において考察されている。
【０２１４】
鋳型DNA（少なくとも1fg、通常は1〜1000ng）および少なくとも25pmolのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCRを行なう。プライマーのプールが非常に不均一である場合には、より大量のプライマーを使用するのが有利かもしれない。なぜなら、各配列は該プールの分子のごく一部により表されるにすぎず、後の増幅サイクルにおいて量が限定的になるからである。典型的な反応混合物は、2μlのDNA、25pmolのオリゴヌクレオチドプライマー、2.5μlの10×PCRバッファー1（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、0.4μlの1.25μM dNTP、0.15μl（または2.5単位）のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Foster City, CA）、および合計容量を25μlにする脱イオン水を含む。鉱油を重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してPCRを行なう。PCRサイクルの各工程の時間および温度ならびにサイクル数は、実際のストリンジェンシー要件に応じて調節する。アニーリングの温度および時機は、プライマーが鋳型にアニーリングすると予想される際の効率および許容されるミスマッチの程度により決定される。核酸分子の増幅と突然変異誘発とを同時に行なう場合には、少なくとも合成の第1ラウンドにおいてミスマッチが要求されるのは明らかである。プライマーのアニーリング条件のストリンジェンシーを最適化することは、通常の当業者の知見の範囲内に十分に含まれるものである。30℃〜72℃のアニーリング温度を用いる。鋳型分子の最初の変性を、通常、92℃〜99℃で4分間行ない、ついで変性（94〜99℃で15秒〜1分間）、アニーリング（前記のとおりに決定される温度、1〜2分間）および伸長（72℃、増幅産物の長さに応じて1〜5分間）よりなる20〜40サイクルを行なう。最終的な伸長は一般には72℃で4分間であり、ついで無期限の（0〜24時間）な工程を4℃で行なってもよい。
【０２１５】
C．単一可変ドメインの組合せ
本発明において有用なドメインを選択したら、当技術分野で公知の種々の方法（例えば、共有的および非共有的方法）により、それらを組合せる（合体させる）ことが可能である。
【０２１６】
好ましい方法には、例えばscFv分子に関して記載されている（Birdら, (1988) Science 242:423-426）ポリペプチドリンカーの使用が含まれる。適当なリンカーの考察は、Birdら Science 242, 423-426; Hudsonら, Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudsonら, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883に記載されている。リンカーは、好ましくは、柔軟（flexible）であり、それによりそれらの2つの単一ドメインが相互作用することが可能である。リンカーの一例として、リンカー(Gly4Ser)n（ここで、n = 1〜8、例えば2、3、4、5または7）が挙げられる。それほど柔軟ではない、ダイアボディ（diabody）において使用されるリンカーを用いることも可能である（Holligerら, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448）。
【０２１７】
1つの実施形態においては、使用するリンカーは免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
【０２１８】
可変ドメインは、リンカー以外の方法を用いて組合せることも可能である。例えば、天然に存在する又は操作されたシステイン残基によりもたらされるジスルフィド架橋を利用してVH-VH、VL-VL、またはVH-VL二量体を安定化することが可能であり（Reiterら, (1994) Protein Eng. 7:697-704）、あるいは可変ドメイン間の境界を改造（remodel）することにより「嵌合い（fit）」を改善して相互作用の安定性を改善することが可能である（Ridgewayら, (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhuら, (1997) Protein Science 6:781-788）。
【０２１９】
免疫グロブリンの可変ドメイン、特に抗体VHドメインを連結または安定化するための他の技術を適宜用いることが可能である。
【０２２０】
本発明においては、二重特異性リガンドは、溶液中で「閉じた」コンホメーションを有しうる。「閉じた」配置は、抗体結合部位を形成する会合したVH-VLペアの場合のように2つのドメイン（例えば、VHおよびVL）が会合形態で存在している配置である。例えば、scFvは、VHドメインとVLドメインとを連結するのに使用するリンカーの配置に応じて、閉じたコンホメーションを有しうる。これが、それらのドメインが会合するのに十分な程度に柔軟であるか、またはそれらを会合位置で強固に保持する場合には、それらのドメインは、閉じたコンホメーションをとりうるであろう。
【０２２１】
同様に、VHドメインペアおよびVLドメインペアは、閉じたコンホメーションで存在しうる。一般に、これは、該リガンド分子における、例えば強固なリンカーによる、それらのドメインの密接な会合の結果であろう。閉じたコンホメーションのリガンドは、リガンドの半減期を延長する分子および第2の標的分子の両方には結合し得ないであろう。したがって、該リガンドは、典型的には、該リガンドの半減期を延長する分子から解離した際に、第2の標的分子に結合するにすぎない。
【０２２２】
さらに、リンカーを伴わないVH/VH、VL/VL、またはVH/VL二量体の構築は、それらのドメイン間の競合を引き起こす。
【０２２３】
本発明のリガンドは更に、開いたコンホメーションを有しうる。そのようなコンホメーションにおいては、該リガンドは、該リガンドの半減期を延長する分子と第2の標的分子との両方に同時に結合しうるであろう。典型的には、開いた配置の可変ドメインは、（VH-VLペアの場合には）、それらのドメインが相互作用せず抗体結合部位を形成しそれらのそれぞれのエピトープへの結合に関して競合しないのに十分な程度に遠く離れて保持される。VH/VHまたはVL/VL二量体の場合には、それらのドメインは、強固なリンカーによっては合体されない。もちろん、そのようなドメインペアは、抗原結合に関して競合せず、抗体結合部位を形成しない。
【０２２４】
開いた二重特異性リガンドおよび閉じた二重特異性リガンドは、種々の状況下、種々の平衡で存在しうると理解されるが、Fabフラグメントおよび全抗体は、主として、閉じたコンホメーションで存在するであろう。標的への該リガンドの結合は、平衡のバランスを、開いた配置へ移動させるらしい。したがって、本発明の或るリガンドは、溶液中では2つのコンホメーションで存在することが可能であり、そのうちの一方（開いた形態）は2つの抗原またはエピトープに、独立して結合することが可能であり、一方、もう1つのコンホメーション（閉じた形態）は1つの抗原またはエピトープにしか結合できず、したがって、このコンホメーションにおいては、抗原またはエピトープは該リガンドへの結合に関して競合する。
【０２２５】
したがって、開いた形態の二重特異性リガンドは、溶液中、閉じた形態との平衡状態で存在しうるが、該平衡は、閉じた形態に傾くと予想され、さらに、開いた形態は、閉じたコンホメーション内へ標的結合により隔離されうる。したがって、好ましくは、本発明の或る二重特異性リガンドは、2つの（開いた及び閉じた）コンホメーション間の平衡状態で存在する。
【０２２６】
本発明の二重特異性リガンドを修飾して、開いた又は閉じたコンホメーションに平衡が傾くようにすることが可能である。例えば、ジスルフィド結合によるVH-VL相互作用の安定化は、閉じたコンホメーションを安定化しうる。さらに、ドメイン（VHドメインおよびVLドメインペアを含む）を連結するために使用するリンカーを、開いた形態に有利となるように構築することが可能である。例えば、該リンカーは、例えば、適切な位置の大きなアミノ酸残基の取り込みにより、またはそれらのドメイン間に物理的に間隔を維持する適当な強固な構造の設計により、それらのドメインの会合を立体的に妨げうる。
【０２２７】
D．二重特異性リガンドの特徴づけ
二重特異性リガンドのその特異的抗原またはエピトープへの結合は、当業者によく知られた方法（例えば、ELISA）により試験されうる。本発明の好ましい実施形態においては、結合は、モノクローナルファージELISAを用いて試験される。
【０２２８】
ファージELISAは、任意の適当な方法により行うことが可能であり、典型的なプロトコールを以下に記載する。
【０２２９】
各ラウンドの選択において生成されたファージ集団を、選択された抗原またはエピトープへの結合に関してELISAによりスクリーニングして、「ポリクローナル」ファージ抗体を同定することが可能である。ついで、これらの集団の単一感染細菌コロニーからのファージをELISAによりスクリーニングして、「モノクローナル」ファージ抗体を同定することが可能である。抗原またはエピトープへの結合に関して可溶性抗体フラグメントをスクリーニングすることも望ましく、これもまた、例えばCまたはN末端タグに対する試薬を使用するELISAにより行うことが可能である（例えば、Winterら (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55およびこれにおいて引用されている参考文献を参照されたい）。
【０２３０】
また、選択されたファージモノクローナル抗体の多様性は、PCR産物のゲル電気泳動（Marksら 1991, 前掲; Nissimら 1994 前掲）、プロービング（Tomlinsonら, 1992 J. Mol. Biol. 227, 776）またはベクターDNAの配列決定により評価することが可能である。
【０２３１】
E．「二重特異性リガンド」の構造
前記のとおり、抗体は、本明細書中では、少なくとも1つの重鎖および軽鎖可変ドメイン、少なくとも2つの重鎖可変ドメインまたは少なくとも2つの軽鎖可変ドメインを含む抗体（例えば、IgG、IgM、IgA、IgA、IgE）またはフラグメント（Fab、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、ダイアボディ）と定義される。それは、少なくとも部分的には、抗体を天然で産生する任意の種に由来することが可能であり、あるいは組換えDNA技術により製造されうる（血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母または細菌のいずれから単離されたかには無関係である）。
【０２３２】
本発明の好ましい実施形態においては、二重特異性リガンドは、抗体の単一重鎖可変ドメインの少なくとも1つおよび抗体の単一軽鎖可変ドメインの1つ、または2つの単一重鎖または軽鎖可変ドメインを含む。例えば、該リガンドは、VH/VLペア、VHドメインのペア、またはVLドメインのペアを含みうる。
【０２３３】
そのようなリガンドの第1および第2可変ドメインは同一ポリペプチド鎖上に存在しうる。あるいは、それらは、別々のポリペプチド鎖上に存在しうる。それらが同一ポリペプチド鎖上に存在する場合には、それらはリンカー（前記のとおり、これは、好ましくはペプチド配列である）により連結されうる。
【０２３４】
第1および第2可変ドメインは共有的または非共有的に結合されうる。それらが共有結合している場合には、該共有結合はジスルフィド結合でありうる。
【０２３５】
可変ドメインが、例えば本明細書に記載のファージ提示技術を用いて選択されるV遺伝子レパートリーから選択される場合には、これらの可変ドメインは、それらが本明細書に記載の特異的一般的リガンドにより認識されうるよう、汎用フレームワーク領域を含みうる。汎用フレームワーク、一般的リガンドなどの使用はWO99/20749に記載されている。
【０２３６】
V遺伝子レパートリーを使用する場合には、ポリペプチド配列における変異は、好ましくは、可変ドメインの構造ループ内に位置する。各可変ドメインとその相補的ペアとの相互作用を増強するために突然変異により又はDNAシャフリングにより、いずれかの可変ドメインのポリペプチド配列が改変されうる。DNAシャフリングは当技術分野において公知であり、例えばStemmer, 1994, Nature 370: 389-391および米国特許第6,297,053号（それらを共に、参照により本明細書に組み入れることとする）に教示されている。突然変異誘発のための他の方法は当業者によく知られている。
【０２３７】
本発明の好ましい実施形態においては、「二重特異性リガンド」は一本鎖Fvフラグメントである。本発明のもう1つの実施形態においては、「二重特異性リガンド」はFab形態よりなる。
【０２３８】
もう1つの態様においては、本発明は、少なくとも本明細書に記載の「二重特異的リガンド」をコードする核酸を提供する。
【０２３９】
当業者は、本発明の態様に応じて、両方の抗原またはエピトープが同一抗体分子に同時に結合しうると理解するであろう。あるいは、それらは同一抗体分子への結合に関して競合しうる。例えば、両方のエピトープが同時に結合する場合には、二重特異性リガンドの両方の可変ドメインが、独立して、それらの標的エピトープに結合しうる。それらのドメインが競合する場合には、一方の可変ドメインはその標的に結合しうるが、もう一方の可変ドメインがそのコグネイト標的に結合するのとは同時には結合せず、あるいは該第1可変ドメインはその標的に結合しうるが、第2可変ドメインがそのコグネイト標的に結合するのと同時には結合しない。
【０２４０】
該可変領域は標的抗原またはエピトープに対する抗体から誘導されうる。あるいは、それらは、単一抗体ドメインのレパートリー（例えば、線維状バクテリオファージの表面上で発現されるもの）から誘導されうる。選択は、後記のとおりに行うことが可能である。
【０２４１】
一般に、本発明の実施に要する核酸分子およびベクター構築物は、標準的な実験マニュアル、例えばSambrookら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USAに記載のとおりに構築し操作することが可能である。
【０２４２】
本発明において有用な核酸の操作は、典型的には、組換えベクター中で行う。
【０２４３】
したがって、もう1つの態様においては、本発明は、少なくとも本明細書に記載の「二重特異性リガンド」をコードする核酸を含むベクターを提供する。
【０２４４】
本明細書中で用いるベクターは、異種DNAの発現および／または複製のために該異種DNAを細胞内に導入するために使用する別個のエレメントを意味する。そのようなベクターを選択または構築し、ついで使用するための方法は、当業者によく知られている。細菌プラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピソームベクターを含む多数のベクターが公に入手可能である。簡便なクローニングおよび突然変異誘発のために、そのようなベクターを使用することができる。あるいは、遺伝子発現ベクターを使用する。本発明において有用なベクターは、所望のサイズ（典型的には0.25キロベース（kb）〜40kb長以上）のポリペプチドコード配列を収容するように選択することができる。in vitroでのクローニング操作の後、適当な宿主細胞を該ベクターで形質転換する。各ベクターは、一般にはクローニング（または「ポリリンカー」）部位、複製起点および少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含む種々の機能的成分を含有する。与えられたベクターが発現ベクターである場合、それは更にエンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結およびシグナル配列の1以上を有し、それらはそれぞれ、クローニング部位付近に位置し、本発明のリガンドをコードする遺伝子に機能しうる形で連結されている。
【０２４５】
一般に、クローニングベクターおよび発現ベクターは共に、選択された1以上の宿主細胞内で該ベクターが複製されるのを可能にする核酸配列を含有する。クローニングベクターにおいては典型的には、この配列は、該ベクターが宿主染色体DNAから独立して複製されるのを可能にする配列であり、複製起点または自律複製配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに関してよく知られている。プラスミドpBR322由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、2ミクロンのプラスミド起点が酵母に適しており、種々のウイルス起点（例えば、SV40、アデノウイルス）が哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点を、高レベルのDNAを複製しうる哺乳類細胞（例えばCOS細胞）内で使用しない限り、複製起点は哺乳類発現ベクターには必ずしも必要でない。
【０２４６】
好ましくは、クローニングまたは発現ベクターは選択遺伝子（選択マーカーとも称される）を含有する。この遺伝子は、選択培地内で増殖させる形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。したがって、選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、該培地内で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与したり栄養要求性欠損を相補したり該増殖培地内に存在しない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０２４７】
本発明のリガンドをコードするベクターの複製は大腸菌（E. coli）内で最も簡便に行われるため、抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与する大腸菌（E. coli）選択マーカー（例えば、β-ラクタマーゼ遺伝子）が有用である。これらは、大腸菌（E. coli）プラスミド（例えば、pBR322）またはpUCプラスミド（例えば、pUC18またはpUC19）から得ることができる。
【０２４８】
発現ベクターは、通常、宿主生物により認識され関心コード配列に機能しうる形で連結したプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは誘導性または構成的でありうる。「機能しうる形で連結（された）」なる語は、記載されている成分がそれらの意図される様態で機能するのを可能にする関係で該成分が配置されていることを意味する。コード配列に「機能しうる形で連結」された制御配列は、該制御配列に適合した条件下で該コード配列の発現が達成されるように連結されている。
【０２４９】
原核宿主で使用するのに適したプロモーターには、例えば、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターが含まれる。また、細菌系内で使用するプロモーターは、一般には、機能しうる形でコード配列に連結したシャイン・ダルガーノ配列を含有するであろう。
【０２５０】
好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリーメンバーに対応するヌクレオチド配列の発現を可能にする発現ベクターである。したがって、第1および／または第2抗原またはエピトープでの選択は、ポリペプチドライブラリーメンバーを発現する単一クローンの、独立した増殖および発現により、あるいは任意の選択提示系を用いることにより行なうことができる。前記のとおり、好ましい選択提示系はバクテリオファージ提示である。したがって、ファージまたはファージミドベクター、例えばpIT1またはpIT2を使用することができる。本発明において有用なリーダー配列には、pelB、stII、ompA、phoA、blaおよびpelAが含まれる。一例として、大腸菌（E. coli）複製起点（二本鎖の複製用）、そしてまたファージ複製起点（一本鎖DNAの産生用）を有するファージミドベクターが挙げられる。そのようなベクターの操作および発現は当技術分野でよく知られている（HoogenboomおよびWinter (1992) 前掲; Nissimら (1994) 前掲）。簡潔に説明すると、該ベクターは、ファージミドに選択性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子およびlacプロモーターを発現カセットの上流に含有し、該発現カセットは（N末端からC末端方向に）、pelBリーダー配列（これは、発現されたポリペプチドを細胞周辺腔に導く）、マルチクローニング部位（該ライブラリーメンバーのヌクレオチド形態をクローニングするためのもの）、場合によっては、1以上のペプチドタグ（検出用）、場合によっては、1以上のTAG終結コドン、およびファージタンパク質pIIIよりなる。したがって、大腸菌（E. coli）の種々のサプレッサーおよび非サプレッサー株を使用し、グルコース、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）またはヘルパーファージ（例えば、VCS M13）を加えることにより、該ベクターは、発現されることなくプラスミドとして複製されて大量の該ポリペプチドライブラリーメンバーのみを産生したり、ポリペプチド-pIII融合体の少なくとも1コピーを表面に含有するファージを含むファージを産生しうる。
【０２５１】
本発明のリガンドをコードするベクターの構築においては、通常の連結技術を用いる。単離されたベクターまたはDNA断片を切断し、修飾し、必要なベクターを作製するのに望ましい形態で再連結する。所望により、構築したベクター内に正しい配列が存在することを確認するための分析を公知方法で行なうことができる。発現ベクターを構築し、in vitro転写産物を調製し、DNAを宿主細胞内に導入し、発現および機能の評価のための分析を行なうための適当な方法は当業者に公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在を検出し、またはその増幅および／または発現を常法（例えば、サザンまたはノーザン分析、ウエスタンブロット法、DNA、RNAもしくはタンパク質のドットブロット法、in situハイブリダイゼーション、免疫細胞化学または核酸もしくはタンパク質分子の配列分析）により定量する。所望によりこれらの方法が変更されうることは、当業者に容易に予想されるであろう。
【０２５２】
閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドの構造
本発明の第2の形態の1つの態様においては、2以上の非相補的エピトープ結合ドメインが、本明細書中で定義されているとおりの閉じたコンホメーションを有するよう、それらのドメインを連結する。好ましくは、それらは更に、本明細書に記載のリンカーの代わりに又はそれに加えてお互いに対してエピトープ結合部位の閉じたコンホメーションの形成および／または維持を促進しうる骨格に結合されうる。
【０２５３】
（I）骨格
骨格は、免疫グロブリン分子に基づくものであってよく、あるいは、前記のとおり、非免疫グロブリン性のものであってよい。本明細書中で定義されている好ましい免疫グロブリン骨格には、以下のものから選ばれる任意の1以上が含まれる：少なくとも（i）抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインまたは（ii）抗体重鎖のCH1ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1およびCH2ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のCH1、CH2およびCH3ドメインを含む免疫グロブリン分子；あるいは抗体のCL（κまたはλサブクラス）ドメインと一緒になったサブセット（ii）のいずれか。ヒンジ領域ドメインも含まれうる。ドメインのそのような組合せは、例えば、天然抗体、例えばIgGもしくはIgM、またはそれらのフラグメント、例えばFv、scFv、FabもしくはF(ab')2分子を模擬しうる。当業者は、この列挙が網羅的なものではないと認識するであろう。
【０２５４】
（II）タンパク質スカフォールド
各エピトープ結合ドメインは、1以上のエピトープと該ドメインとの特異的相互作用に関与する1以上のCDRおよびタンパク質スカフォールドを含む。好ましくは、本発明のエピトープ結合ドメインは3つのCDRを含む。適当なタンパク質スカフォールドには、以下のものよりなる群から選ばれる任意のものが含まれる：免疫グロブリンドメインに基づくもの、フィブロネクチンに基づくもの、アフィボディ（affibody）に基づくもの、CTLA4に基づくもの、GroELのようなシャペロンに基づくもの、リポカリン（lipocallin）に基づくもの、および細菌Fc受容体SpAおよびSpDに基づくもの。当業者は、この列挙が網羅的なものではないと意図されると理解するであろう。
【０２５５】
F：二重特異性リガンドの構築に使用するためのスカフォールド
i．主鎖コンホメーションの選択
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーはすべて、それらのポリペプチド鎖に関して、類似したフォールドを有する。例えば、抗体はそれらの一次配列においては非常に多様であるが、予想に反して、抗体の抗原結合ループの6個中5個（H1、H2、L1、L2、L3）は、限られた数の主鎖コンホメーションまたは規定（canonical）構造をとることが、配列および結晶構造の比較から示されている（ChothiaおよびLesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothiaら (1989) Nature, 342: 877）。したがって、ループ長および鍵残基の分析は、ヒト抗体の大多数で見出されるH1、H2、L1、L2およびL3の主鎖コンホメーションの予測を可能にした（Chothiaら (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinsonら (1995) EMBO J., 14: 4628; Williamsら (1996) J. Mol. Biol., 264: 220）。H3領域は、配列、長さおよび構造の点で、より一層多様性であるが（Dセグメントを用いるため）、それはまた、その長さ、該ループおよび抗体フレームワーク内の鍵部位における特定の残基の存在および残基のタイプに左右される短いループ長にわたり、限られた数の主鎖コンホメーションを形成する（Martinら (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shiraiら (1996) FEBS Letters, 399: 1）。
【０２５６】
本発明の二重特異性リガンドは、好ましくは、ドメインのライブラリー（例えば、VHドメインのライブラリーおよび／またはVLドメインのライブラリー）から組み立てられる。さらに、本発明の二重特異性リガンド自体がライブラリーの形態で提供されうる。本発明の1つの態様においては、メンバーの主鎖コンホメーションが既知であることが保証されるよう或るループ長および鍵残基が選択された二重特異性リガンドおよび／またはドメインのライブラリーを設計する。好ましくは、前記のとおりそれらが非機能的となる可能性を最小限に抑えるために、これらは、天然で見出される免疫グロブリンスーパーファミリー分子の真のコンホメーションである。生殖系列V遺伝子セグメントは、抗体またはT細胞受容体ライブラリーを構築するための1つの適当な基本的フレームワークとして有用である。他の配列も有用である。少数の機能的メンバーが、その機能に影響を及ぼさない改変された主鎖コンホメーションを有しうるよう、変異が低頻度で生じうる。
【０２５７】
また、リガンドによりコードされる種々の主鎖コンホメーションの数を評価したり、リガンドの配列に基づいて主鎖コンホメーションを予想したり、規定構造に影響を及ぼさない多様化のための残基を選択するためには、規定構造理論が有用である。ヒトVκドメインにおいては、L1ループは4つの規定構造のうちの1つをとることが可能であり、L2ループは単一の規定構造を有し、ヒトVκドメインの90％はL3ループの4つまたは5つの規定構造のうちの1つをとることが公知である（Tomlinsonら (1995) 前掲）。したがって、Vκドメイン単独で、異なる規定構造を組合せて一定範囲の異なる主鎖コンホメーションを得ることができる。VλドメインがL1、L2およびL3ループの規定構造の異なる範囲をコードしており、VκおよびVλドメインが、H1およびH2ループのいくつかの規定構造をコードしうる任意のVHドメインとペアになりうる場合、これらの5つのループで認められる規定構造の組合せの数は非常に大きくなる。このことは、主鎖コンホメーションにおける多様性の生成が、広範な結合特異性の生成に必須であるかもしれないことを示唆している。しかしながら、単一の公知主鎖コンホメーションに基づいて抗体ライブラリーを構築することにより、予想に反して、実質的にすべての抗原を標的化するのに十分な多様性を得るためには主鎖コンホメーションにおける多様性は要求されないことが判明した。より一層驚くべきことに、単一の主鎖コンホメーションは、必ずしもコンセンサス構造でなくてもよく、単一の天然に存在するコンホメーションを全ライブラリーの基礎として用いることが可能である。したがって、好ましい態様において、本発明の二重特異性リガンドは、単一の既知主鎖コンホメーションを有する。
【０２５８】
選択される単一主鎖コンホメーションは、好ましくは、問題の免疫グロブリンスーパーファミリーのタイプの分子の間で一般的なものである。天然に存在する分子の相当数が或るコンホメーションをとることが観察される場合には、そのコンホメーションが通常のものである。したがって、本発明の好ましい態様においては、免疫グロブリンドメインの各結合ループの種々の主鎖コンホメーションの自然発生を別々に検討し、ついで、それらの種々のループの主鎖コンホメーションの所望の組合せを有する天然に存在する可変ドメインを選択する。いずれも利用できない場合には、最も近い等価体を選択することが可能である。所望の主鎖コンホメーションをコードする生殖系列遺伝子セグメントを選択することにより、それらの種々のループの主鎖コンホメーションの所望の組合せを得るのが好ましい。選択した生殖系列遺伝子セグメントは天然で頻繁に発現されていることがより好ましく、それらが全ての天然生殖系列遺伝子セグメントのなかで最も頻繁に発現されていることが最も好ましい。
【０２５９】
二重特異性リガンドまたはそのライブラリーを設計する場合には、6個の抗原結合ループのそれぞれに関して種々の主鎖コンホメーションの頻度を別々に検討することが可能である。H1、H2、L1、L2およびL3について、天然に存在する分子の抗原結合ループの20％〜100％がとる所与のコンホメーションを選択する。典型的には、観察されるその頻度は35％以上（すなわち、35％〜100％）、理想的には、50％以上、さらには65％以上である。H3ループの大多数は規定構造を有さないため、規定構造を示すループに一般的な主鎖コンホメーションを選択するのが好ましい。したがって、該ループのそれぞれに関して、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されるコンホメーションを選択する。ヒト抗体では、各ループの最も一般的な規定構造（CS）は以下のとおりである：H1-CS1（発現されるレパートリーの79％）、H2-CS3（46％）、L1-VκのCS2（39％）、L2-CS1（100％）、L3-VκのCS（36%）（κ:λの比を70：30と仮定して計算している（Hoodら (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48:133））。規定構造を有するH3ループでは、残基94から残基101に塩橋を有する7残基のCDR3長（Kabatら (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and human Services）が最も一般的であるらしい。EMBLデータのライブラリーには、このコンホメーションを形成するのに必要なH3の長さおよび鍵残基を有する少なくとも16個のヒト抗体配列が存在し、該タンパク質データバンクには、抗体のモデル化の基礎として使用されうる少なくとも2個の結晶構造（2cgrおよび1tet）が存在する。規定構造のこの組合せのなかで最も頻繁に発現される生殖系列遺伝子セグメントは、VHセグメント3-23（DP-47）、JHセグメントJH4b、VκセグメントO2/O12（DPK9）およびJκセグメントJκ1である。したがって、所望の単一の主鎖コンホメーションを有するライブラリーを構築するための基礎として、これらのセグメントを組合せて使用することができる。
【０２６０】
あるいは、分離した結合ループのそれぞれの種々の主鎖コンホメーションの自然発生（natural occurrence）に基づいて単一主鎖コンホメーションを選択する代わりに、主鎖コンホメーションの組合せの自然発生を、単一主鎖コンホメーションを選択するための基礎として用いる。例えば、抗体の場合には、抗原結合ループの任意の2、3、4、5または全6個の規定構造の組合せの自然発生が決定されうる。本発明では、選択されるコンホメーションが、天然に存在する抗体に一般的なものであることが好ましく、それが天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されることが最も好ましい。したがって、ヒト抗体においては、例えば、5個の抗原結合ループH1、H2、L1、L2およびL3の天然の組合せを検討する場合には、規定構造の最も頻繁な組合せを決定し、ついで、単一主鎖コンホメーションを選択するための基礎として、H3ループの最も一般的なコンホメーションと組合せる。
【０２６１】
ii．規定構造の多様化
いくつかの既知主鎖コンホメーション、好ましくは、単一の既知主鎖コンホメーションを選択したら、構造的および／または機能的多様性を有するレパートリーを作製するために分子の結合部位を変異させることにより、本発明の二重特異性リガンドまたは本発明で使用するライブラリーを構築することが可能である。これは、一定範囲の活性を付与しうるのに十分なそれらの構造および／またはそれらの機能における多様性を有する変異体が作製されることを意味する。
【０２６２】
所望の多様性は、典型的には、選択した分子を1以上の位置において変異させることにより作製する。変化させる位置はランダムに選択されることが可能であり、あるいは、好ましくは選択される。ついでランダム化により変異を達成することが可能であり、その際、存在するアミノ酸を任意のアミノ酸またはその類似体（天然体または合成体）により置換して非常に多数の変異体を得たり、あるいは、存在するアミノ酸を一定のアミノ酸サブセットの1以上により置換することにより、より限定された数の変異体を得る。
【０２６３】
そのような多様性を導入するための種々の方法が報告されている。エラー頻発型（error-prone）PCR（Hawkinsら (1992) J. Mol. Biol., 226:889）、化学的突然変異誘発（Dengら (1996) J. Mol. Biol., 269:9533）または細菌突然変異誘発株（Lowら (1996) J. Mol. Biol., 260:359）を用いて、該分子をコードする遺伝子内にランダム突然変異を導入することができる。また、選択した位置を突然変異させるための方法は当技術分野でよく知られており、PCRを用いて又は用いずに、ミスマッチオリゴヌクレオチドまたは縮重オリゴヌクレオチドを使用することを含む。例えば、突然変異を抗原結合ループに標的化することにより、いくつかの合成抗体ライブラリーが作製されている。一定範囲の新規結合特異性を得るために、ヒト破傷風トキソイド結合性FabのH3領域がランダム化されている（Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457）。未突然変異フレームワーク領域を有する大きなライブラリーを得るために、ランダムまたは半ランダムH3およびL3領域が生殖系列V遺伝子セグメントに付加されている（Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbasら (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissimら (1994) EMBO J., 13: 692; Griffithsら (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruifら (1995) J. Mol. Biol., 248: 97）。そのような多様化は、その他の抗原結合ループの一部または全部を含むように拡張されている（Crameriら (1996) Nature Med., 2:100; Riechmannら (1995) Bio/Technology, 13:475; Morphosys, WO97/08320前掲）。
【０２６４】
ループのランダム化は、H3単独の場合には約1015個以上の構造体を、そしてその他の5つのループの場合には同様に多数の変異体を与える可能性を有するが、すべての可能な組合せを表現するライブラリーを得ることは、現在の形質転換技術を用いても、あるいは更には無細胞系を用いても不可能である。例えば、現在までに構築されている最大のライブラリーの1つにおいては、6×1010個の異なる抗体が作製されているが、これは、この設計のライブラリーに可能な多様性の一部にすぎない（Griffithsら (1994) 前掲）。
【０２６５】
好ましい実施形態においては、該分子の所望の機能の生成または修飾に直接関与する残基のみを多様化する。多くの分子の場合、その機能は標的リガンドに結合することであり、したがって該分子の全体的なパッキングまたは選択した主鎖コンホメーションの維持に決定的に重要な残基の変化を回避しつつ、多様性を標的リガンド結合部位に集中させるべきである。
【０２６６】
抗体ドメインに適用される場合の規定配列の多様化
抗体二重特異性リガンドの場合には、標的に対する結合部位は抗原結合部位であることが最も多い。したがって、非常に好ましい態様においては、本発明は、抗原結合部位内の残基のみが変異している抗体二重特異性リガンドのライブラリー、または該リガンドの組み立てのためのライブラリーを提供する。これらの残基は、ヒト抗体レパートリーにおいては非常に多様であり、高分解能抗体／抗原複合体において接触することが公知である。例えば、L2では、天然に存在する抗体においては50位および53位が多様であり抗原との接触が認められることが公知である。これに対して、通常のアプローチは、Kabatら (1991, 前掲)が定義している対応する相補性決定領域（CDR1）中のすべての残基（本発明で使用するライブラリーでは多様化されるのはそれらの2残基であるのに対して、この場合は約7残基である）を多様化することであった。これは、一定範囲の抗原結合特異性を得るのに必要な機能的多様性において顕著な改良を示す。
【０２６７】
実際には、抗体多様性は、ナイーブ一次レパートリー（いわゆる生殖系列および結合（junctional）多様性）を与える生殖系列V、DおよびJ遺伝子セグメントの体細胞組換えと、生じた再構成V遺伝子の体細胞超突然変異との2つの過程の結果である。一次レパートリーの多様性は抗原結合部位の中心部に集中しており、一方、体細胞超突然変異は、一次レパートリーにおいて高度に保存されている抗原結合部位の末梢領域にまで多様性を広げることが、ヒト抗体の配列の分析から示されている（Tomlinsonら (1996) J. Mol. Biol., 256: 813）。この相補性は、おそらく、配列空間（sequence space）を見出すための有効な戦略として進化したのであろう。それは、見掛け上は抗体に特有であるが、他のポリペプチドレパートリーに容易に適用されうる。変異させる残基は、標的に対する結合部位を形成する残基のサブセットである。所望により、標的結合部位内の異なる（重複を含む）サブセットの残基を、選択中の異なる段階で多様化させる。
【０２６８】
抗体レパートリーの場合、抗原結合部位内の残基のいくつか（必ずしもすべてではない）が多様化された初期「ナイーブ」レパートリーを作製する。本明細書中のこの文脈で用いる「ナイーブ」なる語は、所定の標的を有さない抗体分子を意味する。これらの分子は、多種多様な抗原刺激により未だチャレンジされていない免疫系を有する胎児および新生児個体のように免疫多様化を経験していない個体の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる分子に類似している。ついでこのレパートリーを一定範囲の抗原またはエピトープに対して選択する。ついで必要に応じて、該初期レパートリーにおいて多様化された領域以外に、さらなる多様性を導入することができる。この成熟レパートリーは、修飾された機能、特異性またはアフィニティーに関して選択することが可能である。
【０２６９】
本発明は、抗原結合部位内の残基の一部または全部が変異している、二重特異性リガンドの構築のための結合ドメインの2つの異なるナイーブレパートリー、または二重特異性リガンドのナイーブライブラリーを提供する。「一次」ライブラリーは天然一次レパートリーを模擬したものであり、その多様性は、生殖系列V遺伝子セグメントにおいて多様性であるか（生殖系列多様性）または組換え過程中に多様化される（結合多様性）抗原結合部位の中心部の残基に限局している。多様化される残基には、H50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96が含まれるが、これらに限定されるものではない。「体細胞」ライブラリーでは、多様性は、組換え過程中に多様化されるか（結合多様性）または高度に体細胞突然変異する残基に限局している。多様化される残基には、H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、L32、L34およびL96が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらのライブラリーにおける多様化に適したものとして前記で挙げた残基はすべて、1以上の抗体-抗原複合体において接触することが公知である。どちらのライブラリーにおいても、抗原結合部位内の残基のすべてが変異するわけではないため、所望により、残りの残基を変異させることにより追加的な多様性を選択中に加える。これらの任意の残基（または抗原結合部位を含む追加的な残基）の任意のサブセットを抗原結合部位の初期および／または後続の多様化に用いることができることが、当業者に明らかであろう。
【０２７０】
本発明で使用するライブラリーの構築においては、選択された位置の多様化は、典型的には、ポリペプチドの配列を特定するコード配列を改変して多数の可能なアミノ酸（全20個またはそれらのサブセット）がその位置に組込まれうるようにすることにより、核酸レベルで達成される。IUPACの命名法を用いると、最も汎用的なコドンは、すべてのアミノ酸およびTAG終結コドンをコードするNNKである。NNKコドンは、好ましくは、必要な多様性を導入するために使用される。同じ目的を達成する他のコドンも有用であり、それらには、追加的な終結コドンTGAおよびTAAの生成をもたらすNNNコドンが含まれる。
【０２７１】
ヒト抗体の抗原結合部位における側鎖多様性の特徴は、あるアミノ酸残基を優先する顕著な偏りである。VH、VκおよびVλの各領域内の最も多様性である10個の位置のアミノ酸組成を合計すると、側鎖多様性の76％以上が僅か7個の異なる残基（セリン（24％）、チロシン（14％）、アスパラギン（11％）、グリシン（9％）、アラニン（7％）、アスパラギン酸（6％）およびトレオニン（6％））に由来する。主鎖の柔軟性をもたらしうる小さな残基および親水性残基に対するこの偏りは、おそらく、広範な抗原またはエピトープに結合する傾向を有する表面の進化を反映するものであり、一次レパートリーにおいて必要とされる、抗体の無差別な混合の解明に役立つかもしれない。
【０２７２】
このアミノ酸分布を模擬することが好ましいため、変異させる位置のアミノ酸分布は、好ましくは、抗体の抗原結合部位に見られるアミノ酸分布を模擬している。一定範囲の標的抗原に対する或るポリペプチド（抗体ポリペプチドに限らない）の選択を可能にするアミノ酸の置換におけるそのような偏りは、任意のポリペプチドレパートリーに容易に適用される。変異させる位置のアミノ酸分布を偏らせるためには種々の方法があり（トリヌクレオチド突然変異誘発（WO97/08320を参照されたい）の使用を含む）、そのなかで好ましい方法は、合成の容易さのため、通常の縮重コドンの使用である。縮重コドンのすべての組合せ（各位置において等しい比率の一重、二重、三重および四重の縮重を有する）によりコードされるアミノ酸プロフィールを天然アミノ酸の使用と比較することにより、最も典型的なコドンを計算することが可能である。コドン(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)Cおよび(AGT)(AGC)(CT)（すなわち、IUPACの命名法を用いるとそれぞれDVT、DVCおよびDVY）は、所望のアミノ酸プロフィールに最も近いコドンであり、それらは、22％のセリンおよび11％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニンおよびシステインをコードする。したがって、好ましくは、多様化される各位置でDVT、DVCまたはDVYのいずれかのコドンを使用して、ライブラリーを構築する。
【０２７３】
G：リガンドの半減期を延長しうる抗原
本発明の1つの形態における本発明の二重特異性リガンドは、in vivoにおける該リガンドの半減期を延長しうる1以上の分子に結合しうる。典型的には、そのような分子は、望ましくない物質を生物体内から除去する内因性メカニズムによる分解または除去に対して耐性を有する、in vivoにおいて天然に存在するポリペプチドである。例えば、該生物の半減期を延長する分子は以下のものから選ばれうる：
細胞外マトリックス由来のタンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン。コラーゲンは細胞外マトリックスの主要タンパク質である。約15種のコラーゲン分子が現在公知であり、種々の身体部分で見出される。例えば、I型コラーゲン（身体コラーゲンの90％を占める）は骨、皮膚、腱、靱帯、角膜、内臓で見出され、II型コラーゲンは軟骨、椎間円板、脊索、眼の硝子体で見出される。
【０２７４】
血液中で見出される、以下のタンパク質：
血漿タンパク質、例えばフィブリン、α-2マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲンA、フィブリノーゲンB、血清アミロイドタンパク質A、ヘプタグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ-2-ミクログロブリン。
【０２７５】
酵素およびインヒビター、例えばプラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンC、α-1-アンチトリプシンおよび膵トリプシンインヒビター。プラスミノーゲンはトリプシン様セリンプロテアーゼプラスミンの不活性前駆体である。それは、通常、血流中に循環しているのが見出される。プラスミノーゲンが活性化されプラスミンに変換されると、それは、血餅中に血液細胞を絡まらせるフィブリノーゲン繊維を溶解する強力な酵素ドメインをアンフォールディングする。これは繊維素溶解と称される。
【０２７６】
免疫系タンパク質、例えばIgE、IgG、IgM。
【０２７７】
輸送タンパク質、例えばレチノール結合タンパク質、α-1ミクログロブリン。
【０２７８】
デフェンシン、例えばβ-デフェンシン1、好中球デフェンシン1、2および3。
【０２７９】
血液脳関門または神経組織に見出されるタンパク質、例えばメラノコルチン受容体、ミエリン、アスコルビン酸輸送体。
【０２８０】
トランスフェリン受容体特異的神経薬剤融合タンパク質（米国特許第5977307号を参照されたい）；
脳毛細血管内皮細胞受容体、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、インスリン、インスリン様成長因子1（IGF1）受容体、インスリン様成長因子2（IGF2）受容体、インスリン受容体。
【０２８１】
腎臓に限局しているタンパク質、例えばポリシスチン、IV型コラーゲン、有機陰イオン輸送体K1、ハイマン抗原。
【０２８２】
肝臓に限局しているタンパク質、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ、G250。
【０２８３】
血液凝固因子X。
【０２８４】
α1アンチトリプシン。
【０２８５】
HNF1α。
【０２８６】
肺に限局しているタンパク質、例えば分泌成分（IgAに結合する）。
【０２８７】
心臓に限局しているタンパク質、例えばHSP27。これは拡張性心筋症に関連している。
【０２８８】
皮膚に限局しているタンパク質、例えばケラチン。
【０２８９】
骨特異的タンパク質、例えば、骨形成活性を示す、トランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーのサブセットである骨誘導因子（BMP）。具体例には、BMP-2、-4、-5、-6、-7（骨形成タンパク質（OP-1）とも称される）および-8（OP-2）が含まれる。
【０２９０】
腫瘍特異的タンパク質、例えばヒト栄養膜抗原、ハーセプチン受容体、エストロゲン受容体、カテプシン、例えばカテプシンB（肝臓および脾臓に見出される）。
【０２９１】
疾患特異的タンパク質、例えば、活性化T細胞上のみで発現される抗原、例えばLAG-3（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテグリン（osteoprotegerin）リガンド（OPGL）（例えば、Nature 402, 304-309;1999を参照されたい）、OX40（活性化T細胞上で発現されるTNF受容体ファミリーメンバーであり、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）産生細胞において特異的にアップレギュレーションされることが知られている唯一の共刺激T細胞分子）（J Immunol. 2000 Jul 1;165(1):263-70を参照されたい）；メタロプロテアーゼ（関節炎／癌に関連している）、例えばCG6512ショウジョウバエ（Drosophila）、ヒトパラプレジン、ヒトFtsH、ヒトAFG3L2、マウスftsH；血管増殖因子、例えば酸性繊維芽細胞増殖因子（FGF-1）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血管内皮増殖因子／血管透過性因子（VEGF／VPF）、トランスフォーミング増殖因子-a（TGFa）、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、アンギオゲニン、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-8（IL-8）、血小板由来内皮増殖因子（PD-ECGF）、胎盤増殖因子（PlGF）、ミッドカイン血小板由来増殖因子BB（PDGF）、フラクタルカイン（fractalkine）。
【０２９２】
ストレスタンパク質（熱ショックタンパク質）；HSPは、通常、細胞内に見出される。それが細胞外に見出された場合には、そのことは、細胞が死亡しその内容物を漏出したという指標である。このプログラムされていない細胞死（壊死）は外傷、疾患または損傷の結果としてのみ生じ、したがって、in vivoにおいて、細胞外HSPは、感染および疾患に対抗する免疫系からの応答を誘発する。細胞外HSPに結合する二重特異性体は疾患部位に局在化されうる。
【０２９３】
Fcの輸送に関与するタンパク質、
ブランベル（Brambell）受容体（FcRBとしても公知である）；
このFc受容体は2つの機能を有し、それらは共に、運搬に潜在的に有用である。その機能は以下のとおりである：
（1）母から子への胎盤を横切ったIgGの輸送、
（2）IgGを分解から防ぎ、それにより、IgGの血清中半減期を延長する。該受容体はエンドソームからIgGをリサイクルすると考えられる。Holligerら, Nat Biotechnol 1997 Jul;15(7):632-6を参照されたい。
【０２９４】
本発明のリガンドは、in vivoにおける半減期の延長を要することなく又はin vivoにおける半減期を延長することなく、前記標的に特異的となるよう設計されうる。例えば、本発明のリガンドは、半減期の延長とは無関係に（ただし、これが生じうる）、組織特異的な治療的に重要な標的に結合するdAb単量体、または組織特異的でありそれにより該二重特異性リガンドの組織特異的標的化を可能にする前記のものから選ばれる標的に特異的でありうる。さらに、該リガンドまたはdAb単量体が腎臓または肝臓を標的化する場合には、これにより、該リガンドまたはdAb単量体は別のin vivoクリアランス経路に導かれうる（例えば、該リガンドは肝クリアランスから腎クリアランスに導かれうる）。
【０２９５】
H：本発明の第2の形態の多重特異性リガンドの用途
本発明の第2の形態の方法の多重特異性リガンドは、in vivoにおける治療および予防用途、in vitroおよびin vivoにおける診断用途、in vitroにおけるアッセイおよび試薬の用途などに使用することが可能である。例えば、抗体分子は、当業者に公知の方法に従い、抗体に基づくアッセイ技術、例えばELISA技術において使用することが可能である。
【０２９６】
前記で触れたとおり、本発明の多重特異性リガンドは診断、予防および治療方法において有用である。本発明の多重特異性抗体は、ウエスタン分析およびin situタンパク質検出（標準的な免疫組織化学的方法によるもの）において診断的に有用であり、これらの用途に使用する場合には、該リガンドを、当技術分野で公知の技術により標識することが可能である。また、そのような抗体ポリペプチドは、クロマトグラフィー担体（例えば、樹脂）と複合体を形成している場合には、アフィニティークロマトグラフィー法において予備的に使用されうる。すべてのそのような技術は当業者によく知られている。
【０２９７】
本発明の閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドの診断用途には、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドが2つの標的に競合的に結合する（したがって、2つの標的は同時には結合し得ない）能力（閉じたコンホメーションの場合）または2つの標的に同時に結合する能力（開いたコンホメーションの場合）を利用する、アナライトに関する均一アッセイが含まれる。
【０２９８】
真の均一イムノアッセイ形態が、薬物の発見および開発に用いる研究アッセイ系および診断薬の製造業者により精力的に探し求められている。主な診断薬の需要には、病院、医院、診療所、商業的照会研究所、血液銀行におけるヒトに対する試験、ならびに家庭におけるヒト以外に対する診断（例えば、食品の試験、水の試験、環境の試験、生物保護、および獣医学的試験）、そして最後に、研究（薬品開発、基礎研究および学術的研究を含む）が含まれる。
【０２９９】
現在、すべてのこれらの需要においては、化学発光、ELISA、蛍光、または少数の場合にはラジオイムノアッセイ技術に基づいて作られたイムノアッセイ系が利用されている。これらのアッセイ形態のそれぞれは分離工程（結合した試薬を未結合試薬から分離するための工程）を必要とする。場合によっては、いくつかの分離工程が必要である。これらの追加的な工程の付加は試薬および自動化を付加し、必要時間を増し、最終的なアッセイ結果に影響を及ぼす。ヒトに対する診断では、該分離工程を自動化することが可能であり、それによりこの問題は回避されるが、それは排除されない。自動化、追加的な試薬、追加的なインキュベーション時間などは、相当な経費および複雑さを付加する。非常に低いレベルの試験分子に対して文字どおり数百万のサンプルが一度に試験されるハイスループットスクリーニングのような薬品開発においては、追加的な分離工程の付加はスクリーニングの実施能を排除しうる。一方、分離の回避は、読み出しにおける余りにも大きなノイズを生成する。したがって、現在のアッセイ形態から得られうる範囲の感度を与える真の均一形態が必要とされている。好ましくは、アッセイは、完全に定量的な読み取りを、高い感度および大きなダイナミックレンジで与える。感度は、必要サンプル量の減少に伴って、重要な要件である。これらの特徴はどちらも、均一系がもたらす特徴である。これは、注意を要する試験においては、およびサンプルが貴重である薬品開発においては、非常に重要である。当技術分野で現在利用可能な不均一系は大量のサンプルおよび高価な試薬を要する。
【０３００】
均一アッセイの用途には癌の試験が含まれ、その最も主要なアッセイは、前立腺癌に関する男性のスクリーニングに用いられる前立腺特異抗原に対するアッセイである。他の用途には生殖能の試験が含まれ、これは、妊娠に関するβhcgを含む、妊娠を試みている女性に対する一連の試験を提供する。感染症に関する試験には、肝炎、HIV、風疹、および他のウイルスおよび微生物および性感染症に関する試験が含まれる。試験、特にHIV、A型、B型、C型、非A非B型肝炎に関する試験が、血液銀行により利用される。治療薬モニター試験には、効力に関する及び毒性を避けるための、患者における処方薬のレベルのモニターが含まれる（例えば、不整脈に対するジゴキシン、精神病におけるフェノバルビタールレベル、喘息に対するテオフィリン）。診断試験は更に、乱用薬物の試験、例えばコカイン、マリファナなどに関する試験に有用である。甲状腺機能、貧血ならびに他の生理的障害および機能を測定するためには、代謝試験が用いられる。
【０３０１】
均一イムノアッセイ形態は更に、標準的な臨床化学アッセイの製造において有用である。イムノアッセイと化学アッセイとを同一装置に組み込むことは、診断試験において非常に好都合である。適当な化学アッセイには、グルコース、コレステロール、カリウムなどに関する試験が含まれる。
【０３０２】
均一イムノアッセイのもう1つの主な用途は薬物の発見および開発である。ハイスループットスクリーニングは、超大容量で、標的に対して組合せ（コンビナトリア）化学ライブラリーを試験することを含む。シグナルを検出し、ついで陽性群を、より小さな群に分け、最終的には、細胞内で、ついで動物において試験する。これらの全てのタイプの試験において、均一アッセイを用いることが可能である。薬品開発、特に、動物研究および臨床試験においては、イムノアッセイが多用される。均一アッセイはこれらの操作処理を著しく促進し簡便化する。他の用途には、食品および飲料の試験；大腸菌（E. coli）、サルモネラなどに関する肉および他の食品の試験；水の試験、例えば、水関連施設における、大腸菌（E. coli）を含むあらゆるタイプの汚染物に関する試験；ならびに獣医学的試験が含まれる。
【０３０３】
広範な実施形態において、本発明は、本発明の閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドに結合した検出可能な物質を含む結合アッセイを提供し、ここで、その検出可能な特性は、その閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドへのアナライトの結合により変化する。そのようなアッセイは、いくつかの異なる方法で設計することが可能であり、そのそれぞれにおいては、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドの前記レパートリーを利用する。
【０３０４】
該アッセイは、物質がアナライトにより直接的または間接的に置換されて、該物質の検出可能な特性が変化することに基づく。例えば、該物質が、検出可能な終点を有する反応を触媒しうる酵素である場合には、該酵素は、例えばその活性部位を遮るように該リガンドにより結合され、それにより該酵素を不活性化することができる。アナライトも、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドにより結合され、該酵素を離脱させ、活性部位を遊離させることにより該酵素を活性にする。ついで該酵素は基質と反応して、検出可能な事象を引き起こしうる。もう1つの実施形態においては、該リガンドは活性部位以外において酵素に結合し、該酵素のコンホメーションに影響を及ぼしてその活性を改変する。例えば、活性部位の構造が該リガンドの結合により束縛され、あるいは、活性に必要な補因子の結合が妨げられうる。
【０３０５】
該アッセイの物理的手段は、当技術分野で公知の任意の形態をとりうる。例えば、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンド／酵素複合体を試験ストリップ上に提供することが可能であり、該試験ストリップの別の領域に、基質を提供することが可能であり、アナライトを含有する溶媒がリガンド／酵素複合体内を移動して、該酵素を離脱させ、それを該基質領域に運んでシグナルを生成するようにすることができる。あるいは試験スティックまたは他の固体相上に該リガンド／酵素複合体を提供し、それをアナライト／基質溶液中に浸して、アナライトの存在に応答して酵素を該溶液中に遊離させることができる。
【０３０６】
アナライトの各分子は1つの酵素分子を潜在的に遊離するため、該アッセイは定量的であり、ある与えられた時間内に生成するシグナルの強度は溶液中のアナライトの濃度に依存する。
【０３０７】
閉じたコンホメーションにおいてアナライトを利用する他の形態も可能である。例えば、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドを、酵素のアロステリック部位に結合して該酵素を活性化するように設計することが可能である。そのような実施形態においては、該酵素はアナライトの非存在下では活性である。アナライトの添加は酵素を離脱させ、アロステリック活性化を失わせて該酵素を不活性化する。
【０３０８】
アナライトの濃度の尺度として酵素活性を利用する前記実施形態においては、該酵素の活性化または不活性化は、シグナル生成反応を該酵素が触媒する能力として測定される該酵素の活性の増加または減少を意味する。例えば、該酵素は、検出不可能な基質から、その検出可能な形態への変換を触媒しうる。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは色素原性または化学発光性基質と共に当技術分野で広く使用されており、それらは商業的に入手可能である。酵素の活性の増加または減少のレベルは10％〜100％、例えば20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％であってよく、活性の増加の場合には、該増加が100％を超えること、すなわち、200％、300％、500％またはそれ以上であってもよく、あるいは、阻害される酵素のベースライン活性が検出不能である場合には比率として測定できないこともある。
【０３０９】
もう1つの形態においては、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドは、酵素／基質ペアの、酵素ではなく基質に結合しうる。したがって、アナライトの結合により、閉じたコンホメーションの多重特異性リガンドから該基質が遊離されるまでは、該基質は該酵素によっては利用されない。この形態の実施は、酵素に結合する形態の場合と同様である。
【０３１０】
さらに、リガンドへの結合の際に蛍光が消光されるようなコンホメーションで蛍光分子（例えば、フルオレセインまたは他の発蛍光団）に結合するよう、該アッセイを設計することが可能である。この場合、該リガンドへのアナライトの結合は蛍光分子を離脱させてシグナルを生成する。本発明において有用な、蛍光分子の代替物には、発光性物質、例えばルシフェリン／ルシフェラーゼ、および色素原性物質、例えば、イムノアッセイにおいて一般に使用される物質、例えばHRPが含まれる。
【０３１１】
本発明に従い製造された多重特異性リガンドの治療および予防的使用は、本発明のリガンドを受容哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。多重特異性は、抗体を多量体抗原に、大きなアビディティで結合させうる。多重特異性リガンドは、例えば、腫瘍細胞系の殺細胞を媒介する細胞傷害性T細胞のリクルーティングにおいて、2つの抗原の架橋を可能にしうる。
【０３１２】
哺乳動物に対する投与には、少なくとも90〜95％の均質性の実質的に純粋なリガンドまたはその結合タンパク質（例えば、dAb単量体）が好ましく、医薬用途、特に、該哺乳動物がヒトである場合には、98〜99％以上の均質性が最も好ましい。該リガンドは、部分的に又は所望の均質性にまで精製した後、診断用または治療用（体外におけるものを含む）に、あるいはアッセイ法、免疫蛍光染色などの開発および実施に使用することが可能である（LefkoviteおよびPernis, (1979および1981) Immunological Methods, Volumes IおよびII, Academic Press, NY）。
【０３１３】
本発明のリガンドまたはその結合タンパク質（例えば、dAb単量体）は、典型的には、炎症状態、アレルギー過敏症、癌、細菌またはウイルス感染および自己免疫障害（I型糖尿病、喘息、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が含まれるが、これらに限定されるものではない）の予防、抑制または治療に有用である。
【０３１４】
この用途における「予防」なる語は、疾患の誘発前に防御用組成物を投与することを含む。「抑制」は、疾患の誘発事象の後であって疾患の臨床的出現の前に、該組成物を投与することを意味する。「治療」は、疾患の症状が顕著になった後で防御用組成物を投与することを含む。
【０３１５】
疾患に対する防御または疾患の治療における抗体またはその結合性タンパク質の有効性をスクリーニングするために使用しうるモデル動物系が入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）の試験方法が当技術分野で公知である（Knightら (1978) J. Exp. Med., 147:1653; Reinerstenら (1978) New Eng. J. Med., 299:515）。重症筋無力症（MG）は、SJL/J雌マウスにおいて、別の種に由来する可溶性AchRタンパク質で該疾患を誘発させることにより試験される（Lindstromら (1988) Adv. Immunol., 42:233）。関節炎は、II型コラーゲンの注射によりマウスの感受性系統において誘発される（Stuartら (1984) Ann. Rev. Immunol., 42:233）。マイコバクテリア熱ショックタンパク質の注射により感受性ラットにおいてアジュバント関節炎を誘発させるモデルが記載されている（Van Edenら (1988) Nature, 331:171）。甲状腺炎は、文献記載（Maronら (1980) J. Exp. Med., 152:1115）のとおりにチログロブリンを投与することによりマウスにおいて誘発される。インスリン依存性糖尿病（IDDM）は自然発生するか、または或る系統のマウス（例えば、Kanasawaら (1984) Diabetologia, 27:113に記載のもの）において誘発されうる。マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトにおけるMSのモデルとして有用である。このモデルにおいては、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄性疾患が誘発される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischerら編, GruneおよびStratton, New York, pp. 179-213; McFarlinら (1973) Science, 179:4778: およびSatohら (1987) J. Immunol, 138:179を参照されたい）。
【０３１６】
一般には、このリガンドは、薬理学的に適した担体と共に、精製形態で使用される。典型的には、これらの担体には、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液（いずれも、塩類液および／または緩衝化媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸添加リンゲル液が含まれる。必要に応じてポリペプチド複合体を懸濁液中に維持するための生理的に許容される適当な補助剤が、増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギナートから選択されうる。
【０３１７】
静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤および電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスが存在していてもよい（Mark (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。
【０３１８】
本発明のリガンドは、別々に投与される組成物として、あるいは他の物質と共に使用することが可能である。これらには、種々の免疫療法薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチニウムおよびイムノトキシンが含まれうる。医薬組成物には、種々の細胞毒性剤または他の物質と本発明のリガンドとの「カクテル」、さらには、種々の特異性を有する本発明のリガンド（例えば、種々の標的抗原またはエピトープを使用して選択されたリガンド）（それらは投与前にプールされているか否かには無関係である）の組合せが含まれうる。
【０３１９】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に公知の任意のものでありうる。治療（免疫療法が含まれるが、これに限定されるものではない）の場合には、本発明の選択されたリガンドを、標準的な技術に従い任意の患者に投与することが可能である。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺経路を含む適当な任意の方法により行うことが可能であり、あるいは、適当な場合には、カテーテルによる直接注入によっても行うことが可能である。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対症適応（counterindications）、および臨床家が考慮すべき他のパラメーターに左右されるであろう。
【０３２０】
本発明のリガンドは、保存用に凍結乾燥され、使用前に適当な担体で再構成されうる。この技術は通常の免疫グロブリンを用いて有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再構成技術を用いることが可能である。凍結乾燥および再構成は種々の度合の抗体活性低下を招くことがあり（例えば、通常の免疫グロブリンの場合、IgM抗体は、IgG抗体より大きな活性低下を受ける傾向がある）、それを補うために使用レベルを上方修正しなければならないことがある、と当業者に理解されるであろう。
【０３２１】
このリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的治療用に投与することが可能である。ある治療用途においては、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺細胞または他のいくつかの測定可能なパラメーターを達成するための適当な量が、「治療的に有効な量」と定義される。この用量を得るために必要な量は、疾患の重症度、患者自身の免疫系の全身的状態に左右されるが、一般には、リガンド、例えば抗体、受容体（例えば、T細胞受容体）またはそれらの結合性タンパク質として、体重1キログラム当たり0.005〜5.0mgであり、0.05〜2.0mg/kg/用量の投与量がより一般的に用いられる。また、予防的用途には、このリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様の又はそれより若干低い投与量で投与することが可能である。
【０３２２】
本明細書に記載の組成物を使用して行う治療は、治療前に存在したそのような症状と比較して、またはそのような組成物で治療されていない個体（ヒトまたはモデル動物）におけるそのような症状と比較して、1以上の症状が（例えば、臨床評価尺度において少なくとも1ポイントまたは少なくとも10％）軽減した場合に、「有効」とみなされる。症状は、標的疾患または障害に応じて明らかに変化するが、通常の技量を有する臨床家または技術者により測定されうる。そのような症状は、例えば、疾患または障害の1以上の生化学的指標のレベル（例えば、疾患に相関する酵素または代謝産物のレベル、罹患細胞数など）をモニターすることにより、あるいは物理的徴候（例えば、炎症、腫瘍サイズなど）をモニターすることにより、あるいは受け入れられている臨床評価尺度、例えばExpanded Disability Status Scale（多発性硬化症に関するもの）、Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnaire（32ポイントの評価により、腸機能、全身症状、社会的活動および情緒状態に関して生活の質を評価するものであり、スコア範囲は32〜224であり、より高いスコアが、より良好な生活の質を示す）、Quality of Life Rheumatoid Arthritis Scale、または当技術分野で公知の他の受け入れられている臨床評価尺度により測定されうる。与えられた臨床尺度で1以上のポイントまたは少なくとも10％の、疾患または障害の症状における持続的（例えば、1日以上、好ましくは、それより長期）な軽減が、「有効」な治療を示す。同様に、本明細書に記載の組成物を使用して行う予防は、該組成物で治療されていない同様の個体（ヒトまたは動物モデル）におけるそのような症状と比較して、1以上の症状の発現または重症化が遅れた又は軽減した又は阻止された場合に、「有効」である。
【０３２３】
本発明のリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、殺細胞または除去を助けるために予防的および治療的状況で使用することができる。また、標的細胞集団を殺し、枯渇させ、あるいは不均一な細胞集団から有効に除去するために、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはin vitroで選択的に使用することが可能である。標準的な技術に従い、哺乳動物からの血液を、該リガンド、例えば抗体、細胞表面受容体またはそれらの結合性タンパク質と体外で一緒にし、それにより、望ましくない細胞を殺したり該血液から除去して該血液を該哺乳動物に戻すことが可能である。
【０３２４】
I：本発明の半減期延長性二重特異性リガンドの用途
本発明の方法の二重特異性リガンドは、in vivoにおける治療および予防用途、in vivoにおける診断用途などにおいて使用することが可能である。
【０３２５】
本発明に従い製造した二重特異性リガンドの治療および予防的使用は、本発明のリガンドを受容哺乳動物（例えば、ヒト）に投与することを含む。本発明の二重特異性抗体は半減期延長性分子に対する少なくとも1つの特異性を含み、1以上の他の特異性が標的分子に向けられうる。例えば、二重特異性IgGは4つのエピトープに特異的であることが可能であり、それらのうちの1つは半減期延長性分子上に存在する。二重特異性は、抗体を多量体抗原に、大きなアビディティで結合させうる。二重特異性抗体は、例えば、腫瘍細胞系の殺細胞を媒介する細胞傷害性T細胞のリクルーティングにおいて、2つの抗原の架橋を可能にしうる。
【０３２６】
哺乳動物に対する投与には、少なくとも90〜95％の均質性の実質的に純粋なリガンドまたはその結合タンパク質（例えば、dAb単量体）が好ましく、医薬用途、特に、該哺乳動物がヒトである場合には、98〜99％以上の均質性が最も好ましい。該リガンドは、部分的に又は所望の均質性にまで精製した後、診断用または治療用（体外におけるものを含む）に、あるいはアッセイ法、免疫蛍光染色などの開発および実施に使用することが可能である（LefkoviteおよびPernis, (1979および1981) Immunological Methods, Volumes IおよびII, Academic Press, NY）。
【０３２７】
本発明のリガンドは、典型的には、炎症状態、アレルギー過敏症、癌、細菌またはウイルス感染および自己免疫障害（I型糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が含まれるが、これらに限定されるものではない）の予防、抑制または治療に有用である。
【０３２８】
この用途における「予防」なる語は、疾患の誘発前に防御用組成物を投与することを含む。「抑制」は、疾患の誘発事象の後であって疾患の臨床的出現の前に、該組成物を投与することを意味する。「治療」は、疾患の症状が顕著になった後で防御用組成物を投与することを含む。
【０３２９】
疾患に対する防御または疾患の治療における該二重特異性リガンドの有効性をスクリーニングするために使用しうるモデル動物系が入手可能である。感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（SLE）の試験方法が当技術分野で公知である（Knightら (1978) J. Exp. Med., 147:1653; Reinerstenら (1978) New Eng. J. Med., 299:515）。重症筋無力症（MG）は、SJL/J雌マウスにおいて、別の種に由来する可溶性AchRタンパク質で該疾患を誘発させることにより試験される（Lindstromら (1988) Adv. Immunol., 42:233）。関節炎は、II型コラーゲンの注射によりマウスの感受性系統において誘発される（Stuartら (1984) Ann. Rev. Immunol., 42:233）。マイコバクテリア熱ショックタンパク質の注射により感受性ラットにおいてアジュバント関節炎を誘発させるモデルが記載されている（Van Edenら (1988) Nature, 331:171）。甲状腺炎は、文献記載（Maronら (1980) J. Exp. Med., 152:1115）のとおりにチログロブリンを投与することによりマウスにおいて誘発される。インスリン依存性糖尿病（IDDM）は自然発生するか、または或る系統のマウス（例えば、Kanasawaら (1984) Diabetologia, 27:113に記載のもの）において誘発されうる。マウスおよびラットにおけるEAEは、ヒトにおけるMSのモデルとして有用である。このモデルにおいては、ミエリン塩基性タンパク質の投与により脱髄性疾患が誘発される（Paterson (1986) Textbook of Immunopathology, Mischerら編, GruneおよびStratton, New York, pp. 179-213; McFarlinら (1973) Science, 179:4778: およびSatohら (1987) J. Immunol, 138:179を参照されたい）。
【０３３０】
エンドサイトーシスに関与する細胞外標的（例えば、クラトリン）に結合しうる本発明の二重特異性リガンドおよびdAb単量体は、二重特異性リガンドがエンドサイトーシスされるのを可能にし、細胞内標的に結合しうるもう1つの特異性が細胞内環境に運搬されるのを可能にする。この戦略は、細胞内での二重特異性リガンドの機能の維持を可能にする物理的特異性を有する二重特異性リガンドを要する。あるいは、最終目的部位の細胞内区画が酸化性である場合には、十分にフォールディングするリガンドはジスルフィド非含有である必要はないかもしれない。
【０３３１】
一般には、この二重特異性リガンドは、薬理学的に適した担体と共に、精製形態で使用される。典型的には、これらの担体には、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液（いずれも、塩類液および／または緩衝化媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムおよび乳酸添加リンゲル液が含まれる。必要に応じてポリペプチド複合体を懸濁液中に維持するための生理的に許容される適当な補助剤が、増粘剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギナートから選択されうる。
【０３３２】
静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充剤および電解質補充剤（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）が含まれる。また、保存剤および他の添加剤、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスが存在していてもよい（Mark (1982) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。
【０３３３】
本発明のリガンドは、別々に投与される組成物として、あるいは他の物質と共に使用することが可能である。これらには、種々の免疫療法薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキセート、アドリアマイシンまたはシスプラチニウムおよびイムノトキシンが含まれうる。医薬組成物には、種々の細胞毒性剤または他の物質と本発明のリガンドとの「カクテル」が含まれうる。
【０３３４】
本発明の医薬組成物の投与経路は、当業者に一般に公知の任意のものでありうる。治療（免疫療法が含まれるが、これに限定されるものではない）の場合には、本発明の選択されたリガンドを、標準的な技術に従い任意の患者に投与することが可能である。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経肺経路を含む適当な任意の方法により行うことが可能であり、あるいは、適当な場合には、カテーテルによる直接注入によっても行うことが可能である。投与の用量および頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対症適応（counterindications）、および臨床家が考慮すべき他のパラメーターに左右されるであろう。
【０３３５】
本発明のリガンドは、保存用に凍結乾燥され、使用前に適当な担体で再構成されうる。この技術は通常の免疫グロブリンでは有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥および再構成技術を用いることが可能である。凍結乾燥および再構成は種々の度合の抗体活性低下を招くことがあり（例えば、通常の免疫グロブリンの場合、IgM抗体は、IgG抗体より大きな活性低下を受ける傾向がある）、それを補うために使用レベルを上方修正しなければならないことがある、と当業者に理解されるであろう。
【０３３６】
このリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的治療用に投与することが可能である。ある治療用途においては、選択された細胞集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、モジュレーション、殺細胞または他のいくつかの測定可能なパラメーターを達成するための適当な量が、「治療的に有効な量」と定義される。この用量を得るために必要な量は、疾患の重症度、患者自身の免疫系の全身的状態に左右されるが、一般には、体重1キログラム当たりリガンド0.005〜5.0mgであり、0.05〜2.0mg/kg/用量の投与量がより一般的に用いられる。また、予防的用途には、このリガンドまたはそのカクテルを含有する組成物を、同様の又はそれより若干低い投与量で投与することが可能である。
【０３３７】
本発明のリガンドを含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の改変、不活性化、殺細胞または除去を助けるために予防的および治療的状況で使用することができる。
【０３３８】
また、標的細胞集団を殺し、枯渇させ、あるいは不均一な細胞集団から有効に除去するために、本明細書に記載のポリペプチドの選択されたレパートリーを体外またはin vitroで選択的に使用することが可能である。標準的な技術に従い、哺乳動物からの血液を、該リガンド、例えば抗体、細胞表面受容体またはそれらの結合性タンパク質と体外で一緒にし、それにより、望ましくない細胞を殺したり該血液から除去して該血液を該哺乳動物に戻すことが可能である。
【０３３９】
以下の実施例において、単なる例示目的で、本発明を更に詳しく説明することとする。dAbの命名の目的で、本明細書中で用いるヒトTNFαをTAR1と称し、ヒトTNFα受容体1（p55受容体）をTAR2と称している。
【実施例１】
【０３４０】
ヒト血清アルブミン（HSA）およびβ-ガラクトシダーゼ（β-gal）に対する二重特異性scFv抗体（K8）の選択
本実施例では、生殖系列（模擬）VHドメインに連結されたVκ可変ドメインのレパートリーがβ-galへの結合に関して選択され、生殖系列（模擬）Vκドメインに連結されたVH可変ドメインのレパートリーがHSAへの結合に関して選択される、β-galおよびHSAに対する二重特異性抗体の製造方法を説明する。ついで、選択された可変VH HSAおよびVκβ-galドメインを組合せ、β-galおよびHSAへの結合に関して抗体を選択する。HSAは、ヒト血液内に見出される半減期延長性タンパク質である。
【０３４１】
この実験においては、4つのヒトファージ抗体ライブラリーを使用した。
【０３４２】
ライブラリー1      生殖系列Vκ/DVT VH      8.46×107
ライブラリー2      生殖系列Vκ/NNK VH      9.64×107
ライブラリー3      生殖系列VH/DVT Vκ      1.47×108
ライブラリー4      生殖系列VH/NNK Vκ      1.45×108。
【０３４３】
すべてのライブラリーは、VH（V3-23/DP47およびJH4b）およびVκ（O12/O2/DPK9およびJκ1）の単一のヒトフレームワークに基づくものであり、側鎖多様性は相補性決定領域（CDR2およびCDR3）に含まれる。
【０３４４】
ライブラリー1およびライブラリー2は模擬Vκ配列を含有し、一方、VHの配列はH50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97およびH98位において多様化されている（それぞれDVTまたはNNKによりコードされている）（図1）。ライブラリー3およびライブラリー4は模擬VH配列を含有し、一方、Vκの配列はL50、L53、L91、L92、L93、L94およびL96位において多様化されている（それぞれDVTまたはNNKによりコードされている）（図1）。それらのライブラリーはファージミドpIT2/ScFv形態（図2）であり、一般的リガンド、すなわちプロテインAおよびプロテインLへの結合に関して予備選択されており、したがって、非選択ライブラリー内のクローンの大多数は機能的である。前記のライブラリーのサイズは予備選択後のサイズに対応する。ライブラリー1とライブラリーとを抗原上での選択前に混合して単一VH/模擬Vκライブラリーを得、ライブラリー3とライブラリー4とを混合して単一Vκ/模擬VHライブラリーを得た。
【０３４５】
Vκ/模擬VHライブラリーを使用してβ-gal上で3ラウンドの選択を行い、VH/模擬Vκライブラリーを使用してHSA上で3ラウンドの選択を行った。β-galの場合には、ファージ力価は第1ラウンドにおける1.1×106から第3ラウンドにおける2.0×108まで上昇した。HSAの場合には、ファージ力価は第1ラウンドにおける2×104から第3ラウンドにおける1.4×109まで上昇した。KM13ヘルパーファージ（これは、D2ドメインとD3ドメインとの間にプロテアーゼ切断部位を有するpIIIタンパク質を含有する）を使用しファージをPBS中の1mg/ml トリプシンで溶出したこと以外は、Griffithら, (1993)に記載されているとおりに、該選択を行った。トリプシンの添加はヘルパーファージ由来のpIIIタンパク質（ファージミド由来のものではない）を切断し、c-mycタグ内での切断により結合scFv-ファージ融合体を溶出して（図2）、その結果、機能的scFvを発現するファージの更なる富化およびバックグラウンドにおける対応する減少をもたらす（Kristensen & Winter, Folding & Design 3: 321-328, Jul 9, 1998）。選択は、100μg/mlの濃度のHSAまたはβ-galのいずれかでコートされたイムノチューブを使用して行った。
【０３４６】
結合を確認するために、各選択の第3ラウンドからの24個のコロニーをモノクローナルファージELISAによりスクリーニングした。ファージ粒子は、Harrisonら, Methods Enzymol. 1996;267:83-109に記載のとおりに産生させた。96ウェルELISAプレートをPBS中10μg/mlの濃度の100μlのHSAまたはβ-galで4℃で一晩コートした。抗M13-HRPコンジュゲートでの結合ファージの検出を用いる標準的なELISAプロトコールに従った（Hoogenboomら, 1991）。クローンの選択は、50μlの上清で、1.0を超えるELISAシグナルを与えた。
【０３４７】
つぎに、QIAprep Spin Miniprepキット（Qiagen）を使用して、HSA上で選択されたVH/模擬Vκライブラリーから及びβ-gal上で選択されたVκ/模擬VHライブラリーから、DNA調製物を調製した。多様性のほとんどを得るために、DNA調製物を第3ラウンドの選択のそれぞれから調製し、ついで該抗原のそれぞれに関して一緒にした。ついでDNA調製物をSalI/NotIで37℃で一晩消化した。該断片のゲル精製の後、β-gal上で選択されたVκ/模擬VHライブラリーからのVκ鎖を、HSA上で選択されたVH/模擬Vκライブラリーの模擬Vκ鎖の代わりに連結して、3.3×109個のクローンのライブラリーを作製した。
【０３４８】
ついでこのライブラリーをHSA（第1ラウンド）およびβ-gal（第2ラウンド）上（HSA/β-gal選択）、またはβ-gal（第1ラウンド）およびHSA（第2ラウンド）上（β-gal/HSA選択）で選択した。選択は、前記のとおりに行った。それぞれの場合に、第2ラウンド後、48個のクローンをモノクローナルファージELISA（前記のとおり）により及び可溶性scFv断片のELISAにより、HSAおよびβ-galへの結合に関して試験した。可溶性抗体フラグメントはHarrisonら, (1996)に記載のとおりに産生させ、そして、2％ Tween/PBSをブロッキングバッファーとして使用し結合scFvをプロテインL-HRPで検出したこと以外はHoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133の標準的なプロトコールに従った。HSA/β-gal選択からの3個のクローン（E4、E5およびE8）およびβ-gal/HSA選択からの2個のクローン（K8およびK10）は両方の抗原に結合することが可能であった。これらのクローンからのscFvをPCR増幅し配列決定した（プライマーLMB3およびpHENseqを使用して、Ignatovichら, (1999) J Mol Biol 1999 Nov 26;294(2):457-65に記載のとおりに行った）。配列分析は、すべてのクローンが同一であることを示した。したがって、二重特異性抗体をコードする唯一のクローン（K8）を更なる研究に選択した（図3）。
【実施例２】
【０３４９】
K8抗体の結合特性の特徴づけ
まず、モノクローナルファージELISAによりK8抗体の結合特性を特徴づけした。96ウェルプレートをPBS中10μg/mlのアルカリホスファターゼ（APS）、ウシ血清アルブミン（BSA）、落花生凝集素、リゾチームおよびシトクロームc（交差反応性の確認のため）と共に100μlのHSAおよびβ-galで4℃で一晩コートした。K8クローンからのファージミドを、Harrisonら, (1996)に記載のとおりにKM13でレスキューし、ファージ含有上清（50μl）を直接的にアッセイした。抗M13-HRPコンジュゲートでの結合ファージの検出を用いる標準的なELISAプロトコール（Hoogenboomら, 1991）に従った。二重特異性K8抗体は、1.0を超える吸光シグナルを伴って該ファージの表面上に提示された場合には、HSAおよびβ-galに結合することが判明した（図4）。BSAへの強力な結合も観察された（図4）。HSAとBSAとはアミノ酸レベルで76％相同であるため、K8抗体が、これらの構造的に関連したタンパク質の両方を認識したことは驚くべきことではない。他のタンパク質との交差反応性は検出されなかった（図4）。
【０３５０】
つぎに、K8抗体の結合レパートリーを可溶性scFv ELISAにおいて試験した。可溶性scFvフラグメントの産生を、Harrisonら, (1996)に記載のとおりにIPTGにより誘導した。K8 scFvの発現レベルを測定するために、HarlowおよびLane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harborに記載のとおりにプロテインA-セファロースカラムを使用して、該可溶性抗体フラグメントを50mlの誘導物の上清から精製した。ついでOD280を測定し、Sambrookら, (1989)に記載のとおりにタンパク質濃度を計算した。K8 scFvは上清中に19mg/lで産生された。
【０３５１】
ついで、既知濃度のK8抗体フラグメントを使用して、可溶性scFv ELISAを行った。96ウェルプレートを100μlのHSA、BSAおよびβ-gal（10μg/ml）ならびに100μlのプロテインA（濃度1μg/ml）でコートした。K8 scFvの系列希釈物50μlを適用し、結合抗体フラグメントをプロテインL-HRPで検出した。ELISAの結果はK8抗体の二重特異性を証明した（図5）。
【０３５２】
β-galへの結合がVκドメインにより決定され、HSA/BSAへの結合がK8 scFv抗体のVHドメインにより決定されることを確認するために、該VκドメインをSalI/NotI消化によりK8 scFv DNAから切り出し、模擬VH鎖を含有しSalI/NotIで消化されたpIT2ベクター内に連結した（図1および2）。得られたクローンK8Vκ/模擬VH鎖の結合特性を可溶性scFv ELISAにより分析した。可溶性scFvフラグメントの産生をHarrisonら, (1996)に記載のとおりにIPTGにより誘導し、scFvを含有する上清（50μl）を直接的にアッセイした。可溶性scFv ELISAを実施例1に記載のとおりに行い、結合scFvをプロテインL-HRPで検出した。このクローンはβ-galに尚も結合しうるが、BSAへの結合は消失したことが、そのELISAの結果から示された（図6）。
【実施例３】
【０３５３】
抗原AおよびBに対する単一VHドメイン抗体ならびに抗原CおよびDに対する単一Vκドメイン抗体の選択
本実施例では、抗原AおよびBに対する単一VHドメイン抗体ならびに抗原CおよびDに対する単一Vκドメイン抗体を、相補的可変ドメインの非存在下でのそれら抗原への結合に関してバージン単一抗体可変ドメインのレパートリーを選択することにより製造するための方法を説明する。
【０３５４】
結合性クローンの選択および特徴づけを、既に記載されているように行う（PCT/GB 02/003014の実施例5を参照されたい）。さらなる研究に以下の4個のクローンを選択する。 
VH1 - 抗AVH
VH2 - 抗BVH
VK1 - 抗CVκ
VK2 - 抗DVκ
【０３５５】
実施例1〜3に前述した操作手順を、記載されたのと同様にして用いて、VHドメインの組合せ（すなわち、VHリガンド-VHリガンド）およびVLドメインの組合せ（すなわち、VLリガンド-VLリガンド）を含む二量体分子を得ることが可能である。
【実施例４】
【０３５６】
二重特異性ScFv抗体（抗原AおよびBに対するVH1/VH2ならびに抗原CおよびDに対するVK1/VK2）の作製および特徴づけ
本実施例は、ScFvベクター中でそれぞれの抗原に対して選択されたVκおよびVH単一ドメインを組合せることにより二重特異性ScFv抗体（抗原AおよびBに対するVH1/VH2ならびに抗原CおよびDに対するVK1/VK2）が作製されうることを示す。
【０３５７】
二重特異性抗体VH1/VH2を作製するために、VH1単一ドメインを可変ドメインベクター1（図7）からNcoI/XhoI消化により切り出し、NcoI/XhoIで消化された可変ドメインベクター2（図7）内に連結して、VH1/可変ドメインベクター2を得る。5'末端にSalI制限部位を及び3'末端にNotI制限部位を導入するプライマーを使用して、VH2単一ドメインを可変ドメインベクター1からPCR増幅する。ついでPCR産物をSalI/NotIで消化し、SalI/NotIで消化されたVH1/可変ドメインベクター2中に連結して、VH1/VH2可変ドメインベクター2を得る。
【０３５８】
同様にして、VK1/VK2/可変ドメインベクター2を作製する。得られたVH1/VH2 ScFvおよびVK1/VK2 ScFvの二重特異性を、既に記載されているとおりに（PCT/GB 02/003014の実施例6を参照されたい）、可溶性ScFv ELISAにおいて試験する。競合ELISAを、既に記載されているとおりに（PCT/GB 02/003014の実施例8を参照されたい）行う。
【０３５９】
考えられうる結果：
・VH1/VH2 ScFvは抗原AおよびBに同時に結合できる；
・VK1/VK2 ScFvは抗原CおよびDに同時に結合できる；
・VH1/VH2 ScFv結合は競合的である（VH1/VH2 ScFvは、抗原Aに結合している場合には抗原Bには結合できない）；
・VK1/VK2 ScFv結合は競合的である（VK1/VK2 ScFvは、抗原Cに結合している場合には抗原Dには結合できない）。
【実施例５】
【０３６０】
二重特異性VH1/VH2 FabおよびVK1/VK2 Fabの構築ならびにそれらの結合特性の分析
VH1/VH2 Fabを作製するために、VH1単一ドメインを、NcoI/XhoIで消化されたCHベクター（図8）中に連結してVH1/CHを得、VH2単一ドメインを、SalI/NotIで消化されたCKベクター（図9）中に連結してVH2/CKを得る。VH1/CHおよびVH2/CKからのプラスミドDNAを使用して、既に記載されているとおりに（PCT/GB02/003014の実施例8を参照されたい）コンピテント大腸菌（E. coli）細胞を共形質転換する。
【０３６１】
ついで、既に記載されているとおりに（PCT/GB02/003014の実施例8を参照されたい）、VH1/CHおよびVH2/CKプラスミドを含有するクローンをIPTGにより誘導して可溶性VH1/VH2 Fabを得る。
【０３６２】
同様にして、VK1/VK2 Fabを得る。
【０３６３】
得られたFabの結合特性を、既に記載されているとおりに（PCT/GB02/003014の実施例8を参照されたい）競合ELISAにより試験する。
【０３６４】
考えられうる結果：
・VH1/VH2 Fabは抗原AおよびBに同時に結合できる；
・VK1/VK2 Fabは抗原CおよびDに同時に結合できる；
・VH1/VH2 Fab結合は競合的である（VH1/VH2 Fabは、抗原Aに結合している場合には抗原Bには結合できない）；
・VK1/VK2 Fab結合は競合的である（VK1/VK2 Fabは、抗原Cに結合している場合には抗原Dには結合できない）。
【実施例６】
【０３６５】
キレート化dAb二量体
概要
柔軟（flexible）なポリペプチドリンカーを使用したdAb-リンカー-dAb形態で、VHおよびVKホモ二量体を作製する。種々の長さのグリシン-セリンリンカー（3U:(Gly4Ser)3, 5U:(Gly4Ser)5, 7U:(Gly4Ser)7）を含有するdAbリンカー-dAb形態で、ベクターを作製した。該リンカーのガイド（guiding）dAb［TAR1-5 (VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)またはTAR2-6(VK)］と、該リンカーの後の対応する第2のdAbのライブラリーとを使用して、二量体ライブラリーを作製した。この方法を用いて、新規二量体dAbを選択した。抗原結合に対する二量体化の効果を、ELISAおよびBIAcore研究により、ならびに細胞中和および受容体結合アッセイにおいて確認した。TAR1-5およびTAR1-27の両方の二量体化は結合アフィニティーレベルおよび中和レベルにおける有意な改善をもたらした。
【０３６６】
1.0  方法
1.1  ライブラリーの作製
1.1.1  ベクター
pEDA3U、pEDA5UおよびpEDA7Uベクターは、dAb-リンカー-dAb形態に適合した種々のリンカー長を導入するように設計した。pEDA-3Uの場合には、センスおよびアンチセンスの73塩基対のオリゴリンカーを、0.1M NaCl、10mM Tris-HCl pH7.4を含有するバッファー中でゆっくりとしたアニーリングプログラム（95℃-5分間、80℃-10分間、70℃-15分間、56℃-15分間、42℃-使用前まで）を用いてアニールさせ、XhoIおよびNotI制限部位を用いてクローニングした。該リンカーは3個の(Gly4Ser)単位を含み、SalIクローニング部位とNotIクローニング部位との間にスタッファー領域が収容されていた（スキーム1）。ファージ提示により単量体dAbが選択される可能性を減少させるために、該スタッファー領域を、3個の終結コドンと、SacI制限部位と、第2 dAbが存在しない場合に該領域をフレームから外すためのフレームシフト突然変異とを含有するように設計した。pEDA5Uおよび7Uの場合には、必要なリンカーの長さを考慮して、各ベクターについて重複したオリゴリンカーを設計し、アニールさせ、クレノウを使用して伸長させた。ついでその断片を精製し、適当な酵素を使用して消化した後、XhoIおよびNotI制限部位を使用してクローニングした。
【０３６７】
2006523090.tif 000002
【０３６８】
1.1.2  ライブラリーの調製
ガイドdAbに対応するN末端V遺伝子を、NcoIおよびXhoI制限部位を使用して該リンカーの上流にクローニングした。VH遺伝子は既存の適合部位を有するが、VK遺伝子のクローニングは、適当な制限部位の導入を要した。これは、SuperTaq（HTBiotechnology Ltd）とpfu turbo（Stratagene）との2:1混合物を使用する30サイクルのPCR増幅において、修飾性PCRプライマー（VK-DLIBF: 5’ cggccatggcgtcaacggacat; VKXho1R: 5’ atgtgcgctcgagcgtttgattt 3’）を使用することにより達成された。これは5'末端にNcoI部位を維持する一方で、隣接するSalI部位を破壊し、3'末端にXhoI部位を導入した。5個のガイドdAb［TAR1-5 (VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、TAR2-6(VK) およびTAR2-7(VK)］を3つの二量体ベクターのそれぞれにクローニングした。すべての構築物を配列決定分析により確認した。
【０３６９】
ベクター（pEDA3U、5Uおよび7U）のそれぞれにおいてリンカーの上流にガイドdAb［TAR1-5 (VK)、TAR1-27(VK)、TAR2-5(VH)、またはTAR2-6(VK)］をクリーニングした後、該リンカーの後に、対応する第2のdAbのライブラリーをクローニングした。これを達成するために、TAR1-5またはTAR1-27がガイドdAbである場合にはヒトTNFαに対するVKライブラリー（第1ラウンド後に約1×106の多様性）、あるいはTAR2-5またはTAR2-6がそれぞれガイドdAbである場合にはヒトp55 TNF受容体に対するVHまたはVKライブラリー（共に、第1ラウンド後に約1×105の多様性）のいずれかの第1ラウンドの選択から回収されたファージから相補的dAbライブラリーをPCR増幅した。VKライブラリーについては、SuperTaqとpfu turboとの2:1混合物を使用する30サイクルのPCR増幅においてプライマーを使用してPCR増幅を行った。VHライブラリーは、該遺伝子の5'末端にSal1制限部位を導入するためのプライマーを使用してPCR増幅した。dAbライブラリーのPCR産物を適当な制限酵素で消化し、Sal1/Not1制限部位を使用して対応するベクター中の該リンカーの下流に連結し、新たに調製されたコンピテントTG1細胞内にエレクトロポレーションした。
【０３７０】
各ライブラリーについて得られた力価は以下のとおりである：
TAR1-5: pEDA3U = 4x108, pEDA5U = 8x107, pEDA7U = 1x108 
TAR1-27: pEDA3U = 6.2x108, pEDA5U = 1x108, pEDA7U = 1x109 
TAR2h-5: pEDA3U = 4x107, pEDA5U = 2x108, pEDA7U = 8x107
TAR2h-6: pEDA3U = 7.4x108, pEDA5U = 1.2x108, pEDA7U = 2.2x108。
【０３７１】
1.2  選択
1.2.1  TNFα
イムノチューブ上に受動的にコートされたヒトTNFαを使用して選択を行った。簡潔に説明すると、イムノチューブを1〜4mlの必要な抗原を加えて一晩コートする。ついで該イムノチューブをPBSで3回洗浄し、PBS中の2％ 粉乳で1〜2時間ブロッキングし、PBSで更に3回洗浄した。ファージ溶液をPBS中の2％ 粉乳で希釈し、室温で2時間インキュベートする。ついで該チューブをPBSで洗浄し、該ファージを1mg/ml トリプシン-PBSで溶出する。3回の選択方策をTAR1-5二量体ライブラリーに関して調べた。第1ラウンドの選択は、ヒトTNFαを1μg/mlまたは20μg/mlで使用してコートしたイムノチューブ中、PBS 0.1％ Tween中での20回の洗浄を用いて行った。TG1細胞に該溶出ファージを感染させ、力価を測定する（例えば、Marksら J Mol Biol. 1991 Dec 5;222(3):581-97, Richmannら Biochemistry. 1993 Aug 31;32(34):8848-55）。
【０３７２】
得られた力価は以下のとおりであった：
pEDA3U = 2.8x107 (1μg/ml TNF) 1.5x108 (20μg/ml TNF) 
pEDA5U = 1.8x107 (1μg/ml TNF), 1.6x107 (20μg/ml TNF) 
pEDA7U = 8x106 (1μg/ml TNF), 7x107 (20μg/ml TNF)。
【０３７３】
第2ラウンドの選択は、3つの異なる方法を用いて行った。
【０３７４】
1．イムノチューブ中、一晩のインキュベーションを伴う20回の洗浄、およびそれに続く更に20回の洗浄。  
2．イムノチューブ中、20回の洗浄、およびそれに続く、1μg/ml TNFαを含む洗浄バッファー中、室温で1時間のインキュベーション、および更に10回の洗浄。  
3．33pmolのビオチン化ヒトTNFαを使用するストレプトアビジンビーズ上での選択（Henderikxら, 2002, Selection of antibodies against biotinylated antigens. Antibody Phage Display : Methods and protocols, Ed. O'Brien and Atkin, Humana Press）。第2ラウンドの選択からの単一のクローンを96ウェルプレート内に拾い入れ、粗上清調製物を2mlの96ウェルプレートフォーマットで調製した。
【０３７５】
2006523090.tif 000003
【０３７６】
TAR1-27の場合には、以下の変更を伴う以外は既に記載されているとおりに選択を行った。第1ラウンドの選択は、ヒトTNFαを1μg/mlまたは20μg/mlで使用してコートしたイムノチューブ中で、PBS 0.1％ Tween中での20回の洗浄を用いて行った。第2ラウンドの選択は、イムノチューブ中、一晩のインキュベーションを伴う20回の洗浄、およびそれに続いて更に20回の洗浄をすることにより行った。第2ラウンドの選択からの単一のクローンを96ウェルプレート内に拾い入れ、粗上清調製物を2mlの96ウェルプレートフォーマットで調製した。
【０３７７】
TAR1-27の力価は以下のとおりである。
【０３７８】
2006523090.tif 000004
【０３７９】
1.2.2  TNF受容体1（p55受容体；TAR2）
TAR2h-5ライブラリーのみについては、既に記載されているとおりに選択を行った。3ラウンドの選択を、1μg/ml ヒトp55 TNF受容体または10μg/ml ヒトp55 TNF受容体のいずれかを使用して、イムノチューブ中で、一晩のインキュベーションを伴うPBS 0.1％ Tween中での20回の洗浄、およびそれに続く更に20回の洗浄を用いて行った。第2および第3ラウンドの選択からの単一のクローンを96ウェルプレート内に拾い入れ、粗上清調製物を2mlの96ウェルプレートフォーマットで調製した。
【０３８０】
TAR2h-5の力価は以下のとおりである。
【０３８１】
2006523090.tif 000005
【０３８２】
1.3  スクリーニング
第2または第3ラウンドの選択からの単一のクローンを、適当な場合には、種々の選択方法由来の3U、5Uおよび7Uライブラリーのそれぞれから拾った。クローンを、100μg/ml アンピシリンおよび1％ グルコースを含有する2×TY中、37℃で一晩増殖させた。この培養物の1/100希釈物を、2mlの96ウェルプレートフォーマット中、100μg/ml アンピシリンおよび0.1％ グルコースを含有する2mlの2×TYに接種し、OD600が約0.9に達するまで、振とうしながら37℃で増殖させた。ついで該培養物について1mM IPTGを用いて30℃で一晩かけて誘導した。上清を、ソーバル（sorval）プレート遠心機中、4000rpmで15分間の遠心分離により清澄化した。上清調製物を初期スクリーニングに使用した。
【０３８３】
1.3.1  ELISA
二量体の組換えタンパク質の結合活性を、プロテインA/L ELISAまたは抗原ELISAにより単量体と比較した。簡潔に説明すると、96ウェルプレートを抗原またはプロテインA/Lで4℃で一晩かけてコートする。該プレートを0.05％ Tween-PBSで洗浄し、2％ Tween-PBSで2時間ブロッキングする。サンプルを該プレートに加え、室温で1時間インキュベートする。該プレートを洗浄し、二次試薬と共に室温で1時間インキュベートする。該プレートを洗浄し、TMB基質を用いて発色させる。プロテインA/L-HRPまたはインディア-HRPを二次試薬として使用した。抗原ELISAの場合には、使用した抗原濃度は、ヒトTNFαおよびヒトTHF受容体1について、PBS中1μg/mlであった。ほとんどの場合にガイドdAbが存在するため、二量体は陽性ELISAシグナルを与えた。そのため、BIAcoreにより解離速度（off rate）の測定を行った。
【０３８４】
1.3.2  BIAcore
TAR1-5およびTAR2h-5クローンに関してBIAcore分析を行った。スクリーニングのために、ヒトTNFαを高密度（約10000 RU）でCM5チップに結合させた。50μlのヒトTNFα（50μg/ml）を、酢酸バッファー（pH5.5）中、該チップに5μl/分で結合させた。標準的な方法を用いる、分析後の該チップの再生は、ヒトTNFαが不安定だったため不可能であった。そこで、各サンプルを分析した後、該チップをバッファーで10分間洗浄した。TAR1-5の場合には、第2ラウンドの選択からのクローン上清をBIAcoreによりスクリーニングした。以下の選択方法を用いて、得られた3U、5Uおよび7Uライブラリーのそれぞれから、48個のクローンをスクリーニングした：
R1：1μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、R2 1μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、一晩の洗浄。
【０３８５】
R1：20μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、R2 20μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、一晩の洗浄。
【０３８６】
R1：1μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、R2 33pmolのビオチン化ヒトTNFα（ビーズ上）。
【０３８７】
R1：20μg/ml ヒトTNFαイムノチューブ、R2 33pmolのビオチン化ヒトTNFαビーズ。
【０３８８】
スクリーニングのために、ヒトp55 TNF受容体を高密度（約4000 RU）でCM5チップに結合させた。100μlのヒトp55 TNF受容体（10μg/ml）を、酢酸バッファー（pH5.5）中、該チップに5μl/分で結合させた。標準的な再生条件（グリシンpH2またはpH3）を調べたが、各場合においては、TNFαの場合と同様に抗原を該チップの表面から除去した。すなわち、各サンプルを分析した後、該チップをバッファーで10分間洗浄した。
【０３８９】
TAR2-5について、第2ラウンドの選択由来のクローン上清をスクリーニングした。以下の選択方法を用いて、3U、5Uおよび7Uライブラリーのそれぞれから、48個のクローンをスクリーニングした：
R1：1μg/ml ヒトp55 TNF受容体イムノチューブ、R2 1μg/ml ヒトp55 TNF受容体イムノチューブ、一晩の洗浄。
【０３９０】
R1：10μg/ml ヒトp55 TNF受容体イムノチューブ、R2 10μg/ml ヒトp55 TNF受容体イムノチューブ、一晩の洗浄。
【０３９１】
1.3.3  受容体および細胞アッセイ
受容体アッセイにおける本発明の二量体の中和能を以下のとおりに調べた。
【０３９２】
受容体結合
組換えTNF受容体1（p55）へのTNFの結合を抑制する能力に関して、抗TNFdAbを試験した。簡潔に説明すると、Maxisorpプレートを30mg/ml 抗ヒトFcマウスモノクローナル抗体（Zymed, San Francisco, USA）と共に一晩インキュベートした。そのウェルを、0.05％ Tween-20を含有するリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、ついでPBS中1％ BSAでブロッキングした後、100ng/ml TNF受容体1 Fc融合タンパク質（R&D Systems, Minneapolis, USA）と共にインキュベートした。洗浄されたウェルに10ng/mlの最終濃度で加えたTNFと抗TNF dAbとを混合した。0.2mg/ml ビオチン化抗TNF抗体（HyCult biotechnology, Uben, Netherlands）を使用し、ついで1/500希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Amersham Biosciences, UK）を使用し、ついでTMB基質（KPL, Gaithersburg, USA）と共にインキュベートして、TNFの結合を検出した。HClの添加により該反応を停止させ、吸光度を450nmで測定した。抗TNF dAb活性は、TNFのみの対照と比較して、TNF結合の低下を、したがって、吸光度の低下を招く。
【０３９３】
L929細胞傷害性アッセイ
また、マウスL929繊維芽細胞上のTNFの細胞傷害性を中和する能力に関して、抗TNF dAbを試験した（Evans, T. (2000) Molecular Biotechnology 15, 243-248）。簡潔に説明すると、マイクロタイタープレート上にプレーティングされたL929細胞を抗TNF dAb、100pg/ml TNFおよび1mg/ml アクチノマイシンD（Sigma, Poole, UK）と共に一晩インキュベートした。[3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム（Promega, Madison, USA）と共にインキュベートした後、490nmで吸光度を測定することにより、細胞生存度を測定した。抗TNF dAb活性は、TNFのみの対照と比較して、TNF細胞傷害性の低下を、したがって、吸光度の上昇を招く。
【０３９４】
初期スクリーニングにおいては、前記のとおりBIAcore分析のために調製された上清を受容体アッセイにも使用した。また、選択された二量体の更なる分析を、精製タンパク質を使用する受容体および細胞アッセイにおいて行った。
【０３９５】
HeLa IL-8アッセイ
HeLa細胞におけるTNFによるIL-8分泌の誘導を中和する能力に関して、抗TNFR1または抗TNFα dAbを試験した（HUVECにおけるIL-1によるIL-8の誘導を記載しているAkeson, L.ら (1996) Journal of Biological Chemistry 271, 30517-30523の方法を改変した方法；ここでは、本発明者らはヒトTNFαによる誘導に注目しており、本発明者らはHUVEC細胞系の代わりにHeLa細胞を使用している）。簡潔に説明すると、マイクロタイタープレート中にプレーティングされたHeLa細胞をdAbおよび300pg/ml TNFと共に一晩インキュベートした。インキュベーション後、上清を吸引して該細胞を除去し、IL-8濃度をサンドイッチELISA（R&D Systems）により測定した。抗TNFR1 dAb活性は、TNFのみの対照と比較して、上清へのIL-8分泌の低下を招く。
【０３９６】
以下の実験の全体において、L929アッセイを用いるが、抗TNF受容体1（p55）リガンドの測定にはHeLa IL-8アッセイの使用が好ましい。L929アッセイにおけるマウスp55の存在はその使用に一定の制限を課す。
【０３９７】
1.4  配列分析
該BIAcoreおよび受容体アッセイスクリーニングにおいて興味深い特性を有することが判明した二量体を配列決定した。配列は配列表に詳細に記載されている。
【０３９８】
1.5  準備
1.5.1  TAR1-5-19二量体
良好な中和特性を有することが示されたTAR1-5二量体を再び準備し、該細胞および受容体アッセイにおいて分析した。TAR1-5ガイドdAbをアフィニティー成熟クローンTAR1-5-19により置換した。これを達成するために、TAR1-5を個々の二量体ペアからクローニングし、PCRにより増幅されたTAR1-5-19により置換した。また、TAR1-5-19ホモ二量体も3U、5Uおよび7Uベクター中に構築した。該遺伝子のN末端コピーをPCRにより増幅し、前記のとおりにクローニングし、既存のSalIおよびNotI制限部位を使用してC末端遺伝子断片をクローニングした。
【０３９９】
1.5.2  突然変異誘発
TAR1-5二量体ペア中のC末端dAbの一方であるdAb2内に存在するアンバー終結コドンを部位特異的突然変異誘発によりグルタミンに突然変異させた。
【０４００】
1.5.3  Fab
TAR1-5またはTAR1-5-19を含有する二量体をFab発現ベクター中に再び準備した。dAbを、SfiIおよびNotI制限部位を使用して、CKまたはCH遺伝子のいずれかを含有する発現ベクター中にクローニングし、配列分析により確認した。該CKベクターは、pUCに基づくアンピシリン耐性ベクターから作製され、該CHベクターは、pACYCクロラムフェニコール耐性ベクターから作製される。Fab発現のために、dAb-CH構築物およびdAb-CK構築物をHB2151細胞中へ共形質転換し、0.1％ グルコース、100μg/ml アンピシリンおよび10μg/ml クロラムフェニコールを含有する2×TY内で増殖させた。
【０４０１】
1.5.3  ヒンジ二量体化
シスチン結合形成によるdAbの二量体化を調べた。ヒトIgGC1ヒンジの改変形態である短いアミノ酸配列EPKSGDKTHTCPPCPをdAb上のC末端領域に作製した。この配列をコードするオリゴリンカーを合成し、アニールさせた（既に記載されているとおりに行った）。XhoIおよびNotI制限部位を使用して、TAR1-5-19を含有するpEDAベクター内に該リンカーをクローニングした。二量体化はペリプラズム内でin situで生じる。
【０４０２】
1.6  発現および精製
1.1.6  発現
上清を、既に記載されているとおりに、初期スクリーニング用の2mlの96ウェルプレートフォーマット中に調製した。初期スクリーニング工程の後、選択された二量体を更に分析した。TOP10F'またはHB2151細胞で二量体構築物を上清として発現させた。簡潔に説明すると、新たにストリークされたプレートからの個々のコロニーを、100μg/ml アンピシリンおよび1％ グルコースを含有する2×TY中、37℃で一晩増殖させた。この培養物の1/100希釈物を、100μg/ml アンピシリンおよび0.1％ グルコースを含有する2×TY中に接種し、OD600が約0.9に達するまで、振とうしながら37℃で増殖させた。ついで該培養物について1mM IPTGで30℃で一晩誘導した。その細胞を遠心分離により除去し、上清をプロテインAまたはLアガロースで精製した。
【０４０３】
Fabおよびシステインヒンジ二量体をHB2152細胞内でペリプラズムタンパク質として発現させた。一晩培養物の1/100希釈物を、0.1％ グルコースおよび適当な抗生物質を含有する2×TYに接種し、OD600が約0.9に達するまで、振とうしながら30℃で増殖させた。ついで該培養物について1mM IPTGで25℃で3〜4時間誘導した。その細胞を遠心分離により集め、ペレットをペリプラズム調製バッファー（30mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA, 20％ スクロース）に再懸濁させた。遠心分離した後、上清を取っておき、ペレットを5mM MgSO4に再懸濁させた。上清を再び遠心分離により集め、プールし、精製した。
【０４０４】
1.6.2  プロテインA/L精製
プロテインLアガロース（Affitech, Norway）またはプロテインAアガロース（Sigma, UK）からの二量体タンパク質の精製の最適化を検討した。タンパク質をバッチにより又はカラム溶出（蠕動ポンプを使用）により溶出した。3つのバッファー（0.1M リン酸-クエン酸バッファー pH2.6、0.2M グリシン pH2.5および0.1M グリシン pH2.5）を検討した。最適な条件は、0.1M グリシン pH2.5を10カラム容量以上で使用する蠕動ポンプ条件下であると決定された。プロテインAからの精製を、0.1M グリシン pH2.5を使用する蠕動ポンプ条件下で行った。
【０４０５】
1.6.3  FPLC精製
AKTA Explorer 100システム（Amersham Biosciences Ltd）上のFPLC分析により更なる精製を行った。TAR1-5およびTAR1-5-19二量体を、50mM酢酸バッファー（pH4）中の0〜1M NaCl勾配で溶出する陽イオン交換クロマトグラフィー（1ml Resource S − Amersham Biosciences Ltd）により分画した。ヒンジ二量体を、25mM Tris HCl（pH 8.0）中の0〜1M NaCl勾配で溶出するイオン交換（1ml Resource Q Amersham Biosciences Ltd）により精製した。PBS中の0.05％ tweenを0.5ml/分の流速で流すスーパーロース（superose）12（Amersham Biosciences Ltd）カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより、Fabを精製した。精製後、ビバスピン（vivaspin）5Kカットオフ濃縮器（Vivascience Ltd）を使用してサンプルを濃縮した。
【０４０６】
2.0  結果
2.1  TAR1-5二量体
すべてのライブラリーおよび選択条件を含む第2ラウンドの選択から6×96個のクローンを拾った。上清調製物を調製し、それを、抗原およびプロテインL ELISA、BIAcoreにより、また受容体アッセイにおいて、アッセイした。ELISAにおいては、陽性結合クローンを各選択方法から同定し、3U、5Uおよび7Uライブラリーに分配した。しかし、ガイドdAbが常に存在するため、この方法によっては、高アフィニティー結合体と低アフィニティー結合体とを識別することが不可能であった。そこで、BIAcore分析を行った。
【０４０７】
BIAcore分析は、2mlの上清を使用して行った。BIAcore分析は、二量体Koff速度が、単量体TAR1-5と比較して著しく改善したことを示した。単量体Koff速度は10-1Mの範囲内であったが、一方、二量体Koff速度は10-3〜10-4Mの範囲内であった。非常に遅いoff速度を有するらしい16個のクローンを選択し（これらは3U、5Uおよび7Uライブラリーに由来する）、配列決定した。また、受容体アッセイにおいてヒトTNFαを中和する能力に関して、上清を分析した。
【０４０８】
これらのアッセイにおいて中和した6個のリードクローン（以下のd1〜d6）が、配列決定された。結果が示すところによれば、得られた6個のクローンのうち、異なる第2 dAbは3個のみであり（dAb1、dAb2およびdAb3）、但し第2 dAbが2回以上見出される場合には、それらは、異なる長さのリンカーに連結されている。
【０４０９】
TAR1-5d1: 3Uリンカー第2 dAb=dAb1 − 1μg/ml Ag イムノチューブ 一晩の洗浄
TAR1-5d2: 3Uリンカー第2 dAb=dAb2 − 1μg/ml Ag イムノチューブ 一晩の洗浄
TAR1-5d3: 5U リンカー第2 dAb=dAb2 − 1μg/ml Ag イムノチューブ 一晩の洗浄
TAR1-5d4: 5U リンカー第2 dAb=dAb3 − 20μg/ml Ag イムノチューブ 一晩の洗浄
TAR1-5d5: 5U リンカー第2 dAb=dAb1 − 20μg/ml Ag イムノチューブ 一晩の洗浄
TAR1-5d6: 7U リンカー第2 dAb=dAb1− R1:1μg/ml Ag イムノチューブ 一晩の洗浄, R2:ビーズ。
【０４１０】
それらの6個のリードクローンを更に研究した。タンパク質をペリプラズムから生成し、上清をプロテインLアガロースで精製し、細胞および受容体アッセイにおいて調べた。中和レベルは様々であった（表1）。タンパク質の調製のための最適条件を決定した。上清としてHB2151細胞から産生されたタンパク質が最高の収量を与えた（約10mg/L培養物）。上清をプロテインLアガロースと共に室温で2時間または4℃で一晩インキュベートした。該ビーズをPBS/NaClで洗浄し、蠕動ポンプを使用してFPLCカラムに充填した。該ビーズを10カラム容量のPBS/NaClで洗浄し、0.1Mグリシン（pH2.5）で溶出した。一般には、二量体タンパク質は、単量体の後に溶出される。
【０４１１】
TAR1-5d1-6二量体をFPLCにより精製した。3つの種をFPLC精製により得、SDS PAGEにより同定した。1つの種は単量体に相当し、残りの2つの種は、異なるサイズの二量体に相当する。それらの2つの種のうちの大きい方は、おそらく、C末端タグの存在によるものであろう。これらのタンパク質を受容体アッセイにおいて調べた。表1に示すデータは、それらの2つの二量体種から得られた最適な結果を示す（図11）。
【０４１２】
二量体ペアからの3つの第2 dAb（すなわち、dAb1、dAb2およびdAb3）を単量体としてクローニングし、ELISAにより、そして細胞および受容体アッセイにおいて、試験した。抗原ELISAによれば、3つ全てのdAbが、TNFに特異的に結合し、プラスチックまたはBSAとは交差反応しない。単量体としては、それらのdAbはいずれも、細胞または受容体アッセイにおいて中和しない。
【０４１３】
2.1.2  TAR1-5-19二量体
それらの6個のリードクローンにおいて、TAR1-5の代わりにTAR1-5-19を使用した。特に示さない限り、全タンパク質（プロテインL精製物のみ）を使用して、細胞および受容体アッセイにおいて全てのTAR1-5-19二量体の分析を行った（表2）。TAR1-5-19d4およびTAR1-5-19d3は該細胞アッセイにおいて最良のND50（約5nM）を有し、これは該受容体アッセイの結果と合致し、TAR1-5-19単量体（ND50 約30nM）より優れている。精製されたTAR1-5二量体は該受容体および細胞アッセイにおいて様々な結果を与えるが、TAR1-5-19二量体では、より一貫していた。異なる溶出バッファーをタンパク質の精製に使用した場合に、ばらつきが示された。0.1Mリン酸-クエン酸バッファー（pH2.6）または0.2Mグリシン（pH2.5）を使用する溶出は、ほとんどの場合において、プロテインLアガロースから全てのタンパク質を溶出するものの、その機能を喪失させた。
【０４１４】
TAR1-5-19d4を発酵槽内で発現させ、陽イオン交換FPLC上で精製して、完全に純粋な二量体を得た。TAR1-5d4の場合と同様に、FPLC精製により3つの種が得られ、それらは単量体および2つの二量体種に相当した。この二量体のアミノ酸を配列決定した。ついでTAR1-5-19単量体およびTAR1-5-19d4を受容体アッセイにおいて調べた。得られたIC50は、単量体については30nM、二量体については8nMであった。受容体アッセイの結果を、TAR1-5-19単量体、TAR1-5-19d4およびTAR1-5d4と比較して、図10に示す。
【０４１５】
TAR1-5-19ホモ二量体を3U、5Uおよび7Uベクター中に作製し、発現させ、プロテインL上で精製した。それらタンパク質を細胞および受容体アッセイにおいて試験し、得られたIC50（受容体アッセイに関して）およびND50（細胞アッセイに関して）を求めた（表3、図12）。
【０４１６】
2.2  Fab
また、TAR1-5およびTAR1-5-19二量体をFab形態内にクローニングし、発現させ、プロテインLアガロース上で精製した。受容体アッセイにおいてFabを評価した（表4）。その結果から、TAR1-5-19およびTAR1-5二量体の両方において、中和レベルは、それらが由来する元のGly4Serリンカー二量体に類似していたことが、示された。TAR1-5-19をCHおよびCKの両方において提示させた場合には、TAR1-5-19 Fabを発現させ、プロテインLで精製し、受容体アッセイにおいて評価した。得られたIC50は約1nMであった。
【０４１７】
2.3  TAR1-27二量体
すべてのライブラリーおよび選択条件を含む第2ラウンドの選択から、3×96個のクローンを拾った。ELISAおよびバイオアッセイにおける分析のために、2mlの上清調製物を調製した。抗原ELISAは71個の陽性クローンを与えた。粗上清の受容体アッセイは、抑制特性（TNF結合0〜60％）を有する42個のクローンを与えた。大多数の場合には、抑制特性は、強力なELISAシグナルと相関した。42個のクローンを配列決定した。これらのうちの39個は、特有の第2 dAb配列を有する。最良の抑制特性を示した12個の二量体を更に分析した。
【０４１８】
12個の中和性クローンを200mlの上清調製物として発現させ、プロテインL上で精製した。これらをプロテインLおよび抗原ELISA、BIAcoreにより、そして受容体アッセイにおいて評価した。すべての場合に、強力な陽性ELISAシグナルが得られた。BIAcore分析は、すべてのクローンが、速いオンおよびオフ速度を有することを示した。単量体TAR1-27と比較して、オフ(off)速度は改善されたが、TAR1-27二量体のオフ速度（Koffは約10-1〜10-2Mの範囲内である）は、既に調べられているTAR1-5二量体（Koffは約10-3〜10-4Mの範囲内である）より速かった。精製された二量体の安定性が疑問視された。そこで、安定性を改善するために、2種のTAR1-27二量体（d2およびd16）の精製に、5％ グリセロール、0.5％ Triton X100または0.5％ NP40（Sigma）の添加を含めた。NP40またはTriton X100（商標）の添加は精製産物の収量を約2倍改善した。両方の二量体を受容体アッセイにおいて評価した。TAR1-27d2は全ての精製条件下で約30nMのIC50を与えた。TAR1-27d16は、安定剤を使用することなく精製された場合には中和効果を示さなかったが、安定化条件下で精製された場合には約50nMのIC50を与えた。更なる分析は行わなかった。
【０４１９】
2.4  TAR2-5二量体
すべてのライブラリーおよび選択条件を含む第2ラウンドの選択から、3×96個のクローンを拾った。分析のために2mlの上清調製物を調製した。プロテインAおよび抗原ELISAを各プレートについて行った。30個の興味深いクローンが良好なオフ(off)速度（10-2〜10-3Mの範囲のKoff）を有することがBIAcoreにより確認された。該クローンを配列決定し、配列分析により13個のユニークな二量体を同定した。
【０４２０】
2006523090.tif 000006
* 注）二量体2および二量体3は、同じ第2 dAb（dAb2と称される）を有するが、異なるリンカー長を有する（d2 = (Gly4Ser)3, d3 = (Gly4Ser)3）。dAb1は二量体1、5および6のパートナーdAbである。dAb3は二量体4のパートナーdAbである。パートナーdAbはいずれも、単独では中和しない。特に示さない限り、FPLC精製は陽イオン交換による。FPLCにより得られた各二量体について最適な二量体種がこれらのアッセイにおいて決定された。
【０４２１】
2006523090.tif 000007
【０４２２】
2006523090.tif 000008
【０４２３】
2006523090.tif 000009
【実施例７】
【０４２４】
末端システイン連結によるdAb二量体化
概要
dAb二量体化のために、そのタンパク質のC末端に遊離システインを作製した。該タンパク質は、発現されると、二段階の精製方法により精製されうる二量体を形成する。
【０４２５】
TAR1-5-19-CYS二量体のPCR構築
dAb三量体を記載している実施例8を参照されたい。該三量体プロトコールは単量体、二量体および三量体の混合物を与える。
【０４２６】
TAR1-5-19CYS二量体の発現および精製
実施例8に概説されているとおり、プロテインLアガロース上での捕捉により、該二量体を培養物の上清から精製した。
【０４２７】
TAR1-5-19CYS二量体からのTAR1-5-19CYS単量体の分離
陽イオン交換分離の前に、PD-10カラム（Amersham Pharmacia）を該製造業者の指針に従い使用して混合した単量体／二量体サンプルを50mM 酢酸ナトリウムバッファー（pH4.0）中へとバッファー交換した。ついで該サンプルを、50mM 酢酸ナトリウム（pH4.0）で予め平衡化された1mlのResource S陽イオン交換カラム（Amersham Pharmacia）にアプライした。50mM酢酸ナトリウム（pH4.0）中の以下の塩勾配を使用して、単量体および二量体を分離した：
150〜200mM塩化ナトリウム、15カラム容量に及ぶ；
200〜450mM塩化ナトリウム、10カラム容量に及ぶ；
450〜1000mM塩化ナトリウム、15カラム容量に及ぶ。
【０４２８】
二量体のみを含有する画分をSDS-PAGEを利用して同定し、ついでそれをプールし、1/5容量の1M Tris（pH8.0）の添加によりpHを8に増加させた。
【０４２９】
in vitro機能的結合アッセイ：TNF受容体アッセイおよび細胞アッセイ
ヒトTNFαに対する二量体のアフィニティーを、TNF受容体および細胞アッセイを用いて測定した。該受容体アッセイにおけるIC50は約0.3〜0.8nMであり、該細胞アッセイにおけるND50は約3〜8nMであった。
【０４３０】
他の可能性のあるTAR1-5-19CYS二量体形態
PEG二量体およびカスタム合成マレイミド二量体
Nektar（Shearwater）は一定範囲のビ-マレイミドPEG [mPEG2-(MAL)2またはmPEG-(MAL)2]を提供しているが、それらは、単量体が、dAbを分離する小さなリンカーを有し両者が5〜40kDaのサイズ範囲のPEGに連結されている二量体として調製されるようにするものである。5kDaのmPEG-(MAL)2（すなわち、[TAR1-5-19]-Cys-マレイミド-PEG×2であり、そのマレイミドは二量体内で互いに連結されている）は、TNF受容体アッセイにおいて約1〜3nMのアフィニティーを有することが示されている。また、該二量体は、TMEA（トリス[2-マレイミドエチル]アミン）（Pierce Biotechnology）または他の二官能性リンカーを使用することによっても製造されうる。
【０４３１】
また、2,2'-ジチオジピリジン（Sigma Aldrich）および還元された該単量体を使用する化学カップリング法を用いて、ジスルフィド二量体を製造することも可能である。
【０４３２】
dAbのC末端へのポリペプチドリンカーまたはヒンジの付加
小さなリンカー、いずれかの(Gly4Ser)n［ここで、n=1〜10、例えば1、2、3、4、5、6または7］、免疫グロブリン（例えば、IgGヒンジ領域またはランダムペプチド配列（例えば、ランダムペプチド配列のライブラリーから選択されたもの））を、dAbと末端システイン残基との間に作製することが可能である。ついでこれを使用して、前記で概説した二量体を製造することが可能である。
【実施例８】
【０４３３】
dAb三量体化
概要
dAb三量体化のためには、そのタンパク質のC末端に遊離システインが必要である。該システイン残基は、いったん還元されて遊離チオールを生じた後、ついでそれを使用して、該タンパク質を三量体マレイミド分子、例えばTMEA（Tris[2-マレイミドエチル]アミン）に特異的にカップリングすることが可能である。
【０４３４】
TAR1-5-19-CYSのPCR構築
以下のオリゴヌクレオチドを使用して、クローニングのための、そしてC末端システイン残基を導入するためのSalIおよびBamHI部位を含有するTAR1-5-19を特異的にPCR増幅した：
2006523090.tif 000010
【０４３５】
フォワードプライマー
5’-TGGAGCGCGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCA-3’
リバースプライマー
5’-TTAGCAGCCGGATCCTTATTAGCACCGTTTGATTTCCAC-3’。
【０４３６】
PCR反応物（50μl容量）を以下：200μM dNTPs、0.4μMの各プライマー、5μlの10×Pfu Turboバッファー（Stratagene）、100 ngの鋳型プラスミド（TAR1-5-19をコードする）、1μLのPfu Turbo酵素（Stratagene）を含むように準備し、そしてその容量を無菌水を使用して50μLに調節した。以下のPCR条件を用いた：最初の変性工程として94℃で2分間、ついで94℃で30秒間、64℃で30秒間および72℃で30秒間の25サイクル。72℃で5分間の最終伸長工程も含めた。PCR産物を精製し、SalIおよびBamHIで消化し、同じ制限酵素で同様に切断されたベクター内に連結した。正しいクローンをDNA配列決定により確認した。
【０４３７】
TAR1-5-19CYSの発現および精製
TAR1-5-19YSベクターを、BL21(DE3)pLysSの化学的コンピテント細胞（Novagen）内に、製造業者のプロトコールに従って形質転換した。dAbプラスミドを含有する細胞を、100μg/mL カルベニシリンおよび37μg/mL クロラムフェニコールを使用して選択した。500mLのテリフィック（terrific）ブロス（Sigma-Aldrich）、100μg/mL カルベニシリンおよび37μg/mL クロラムフェニコールを含有する2Lバッフル（baffled）フラスコ内に培養物を準備した。該培養物を30℃、200rpmで1〜1.5のO.D.600まで増殖させ、ついで1mM IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド；Melford Laboratories製）を用いて誘導した。dAbの発現を30℃で12〜16時間継続した。dAbのほとんどが培地中に存在することが判明した。そこで、該細胞を遠心分離（8,000×gで30分間）により該培地から分離し、上清を使用してdAbを精製した。上清1リットル当たり30mLのプロテインLアガロース（Affitech）を加え、攪拌しながら2時間にわたりdAbをバッチ（batch）結合させた。ついで該樹脂を重力によりさらに1時間沈降させた後、上清を吸い出した。ついで該アガロースをXK50カラム（Amersham Phamacia）内に拾い入れ、10カラム容量のPBSで洗浄した。結合したdAbを100mM グリシン（pH2.0）で溶出し、ついで1/5容量の1M Tris（p8.0）の添加によりタンパク質含有画分を中和した。培養上清1リットル当たり20mgの精製タンパク質が単離され、これは二量体に対して単量体を50:50の比率で含有していた。
【０４３８】
TAR1-5-19CYSの三量体化
2.5mlの100μM TAR1-5-19CYSを5mMジチオトレイトールで還元し、室温で20分間放置した。ついで、PD-10カラム（Amersham Pharmacia）を使用して、サンプルをバッファー交換した。該カラムは5mM EDTA、50mMリン酸ナトリウム（pH6.5）で予め平衡化しておき、そこに該サンプルをアプライし、該製造業者の指針に従い溶出した。該サンプルを、必要になるまで氷上に配置した。TMEA（Tris[2-マレイミドエチル]アミン）はPierce Biotechnologyから購入した。TMEAの20mM ストック溶液を100％ DMSO（ジメチルスルホキシド）中に調製した。3:1（dAb:TMEAのモル比）を超えるTMEA濃度は該タンパク質の急速な沈殿および架橋を引き起こすことが判明した。また、pHの上昇と共に沈殿および架橋の速度も上昇した。したがって、100μMの還元されたTAR1-5-19CYSを使用して、該タンパク質を三量体化するために25μM TMEAを加え、該反応を室温で2時間進行させた。20％（v/v）までのグリセロールまたはエチレングリコールのような添加物の添加は、該カップリング反応が進行するにつれて、該三量体の沈殿を有意に低減させることが判明した。カップリング後、SDS-PAGE分析は溶液中の単量体、二量体および三量体の存在を示した。
【０４３９】
三量体TAR1-5-19CYSの精製
TMEA-TAR1-5-19cys反応物1ml当たり40μLの40％ 氷酢酸を加えて、pHを約4に減少させた。ついで該サンプルを、50mM 酢酸ナトリウム（pH4.0）で予め平衡化した1mLのResource S陽イオン交換カラム（Amersham Pharmacia）にアプライした。30カラム容量に及ぶ340〜450mM塩化ナトリウムの塩勾配、50mM酢酸ナトリウム（pH4.0）を使用して、単量体および二量体を部分分離した。三量体のみを含有する画分をSDS-PAGEを利用して同定し、ついでそれをプールし、1/5容量の1M Tris（pH8.0）の添加によりpHを8に増加させた。濃縮工程（5Kカットオフ・ビバスピン濃縮器（Vivascience）を使用）における三量体の沈殿を妨げるために、10％グリセロールを該サンプルに加えた。
【０４４０】
in vitro機能的結合アッセイ：TNF受容体アッセイおよび細胞アッセイ
ヒトTNFαに対する三量体のアフィニティーを、TNF受容体および細胞アッセイを用いて測定した。該受容体アッセイにおけるIC50は約0.3nMであり、該細胞アッセイにおけるND50は3〜10nMの範囲内（例えば、3nM）であった。
【０４４１】
他の可能性のあるTAR1-5-19CYS三量体形態
以下の試薬を使用して、TAR1-5-19CYSを三量体に調製することが可能である。
【０４４２】
PEG三量体およびカスタム合成マレイミド三量体
Nektar（Shearwater）は一定範囲のマルチアームPEGを提供しているが、それらは該PEGの末端において化学修飾されうるものである。したがって、各アームの末端にマレイミド官能基を有するPEG三量体の使用は、TMEAを使用する前記で概説したものと同様の方法で、dAbの三量体化を可能にするであろう。また、該PEGは、三量体の溶解度を増加させて凝集の問題を防ぐという利点を有する。したがって、PEG三量体に連結されたマレイミド官能基に連結されたC末端システインを各dAbが有するdAb三量体を製造することが可能であろう。
【０４４３】
dAbのC末端へのポリペプチドリンカーまたはヒンジの付加
小さなリンカー、いずれかの(Gly4Ser)n［ここで、n=1〜10、例えば1、2、3、4、5、6または7］、免疫グロブリン（例えば、IgGヒンジ領域またはランダムペプチド配列（例えば、ランダムペプチド配列のライブラリーから選択されたもの））をdAbと末端システイン残基との間に作製することが可能であろう。これを多量体（例えば、二量体または三量体）の製造に使用する場合にも、同様に個々の単量体間の柔軟性の程度および距離を増加させるであろう。それは、標的（例えば、ヒトTNFαのような複数サブユニット標的）に対する結合特性を改善しうる。
【実施例９】
【０４４４】
ヒト血清アルブミン（HSA）およびマウス血清アルブミン（MSA）に対する単一ドメイン抗体（dAb）の集団の選択
本実施例では、血清アルブミンに対する単一ドメイン抗体（dAb）の製造方法を説明する。マウス血清アルブミン（MSA）およびヒト血清アルブミン（HSA）の両方に対するdAbの選択を説明する。3つのヒトファージ提示抗体ライブラリーを本実験において使用した。それらのそれぞれは、VH（図13を参照されたい：V3-23/DP47およびJH4bに基づく模擬VHの配列）またはVκ（図15を参照されたい：o12/o2/DPK9およびJk1に基づく模擬Vκの配列）の単一ヒトフレームワークに基づくものであり、相補性決定領域（CDR1、CDR2およびCDR3）内に組み込まれたNNKコドンによりコードされた側鎖多様性を有していた。
【０４４５】
ライブラリー1（VH）：
H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98位において多様性を有する。  
ライブラリーサイズ：6.2×109。
【０４４６】
ライブラリー2（VH）：
H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a, H100b位において多様性を有する。  
ライブラリーサイズ：4.3×109。
【０４４７】
ライブラリー3（Vκ）：
L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94, L96位において多様性を有する。  
ライブラリーサイズ：2×109。
【０４４８】
これらVHおよびVκライブラリーは、一般的リガンドであるそれぞれプロテインAおよびプロテインLへの結合に関して予備選択されたものであり、したがって、非選択ライブラリー内のクローンの大多数は機能的である。前記で示したライブラリーのサイズは予備選択後のサイズに相当する。
【０４４９】
該ライブラリーのそれぞれを別々に使用して、血清アルブミンについて2ラウンドの選択を行った。各選択のために、4mlのPBS中、100μg/mlの濃度の抗原をイムノチューブ（nunc）上にコートした。第1ラウンドの選択において、それらの3つのライブラリーのそれぞれをHSA（Sigma）およびMSA（Sigma）に対して別々にパンニングした。第2ラウンドの選択においては、6つの第1ラウンドの選択のそれぞれからのファージを（i）繰り返し同じ抗原（例えば、第1ラウンドでMSA、第2ラウンドでMSA）に対して、および（ii）異なる抗原（例えば、第1ラウンドではMSA、第2ラウンドではHSA）に対してパンニングして、合計12の第2ラウンドの選択を行った。それぞれの場合に、第2ラウンドの選択の後、48個のクローンをHSAおよびMSAへの結合に関して試験した。Harrisonら, Methods Enzymol. 1996;267:83-109にscFvフラグメントに関して記載されているとおりに、可溶性dAb断片を製造した。2％ tween PBSをブロッキングバッファーとして使用し、プロテインL-HRP（Sigma）（Vκの場合）およびプロテインA-HRP（Amersham Pharmacia Biotech）（VHの場合）を用いて結合したdAbを検出した以外は、標準的なELISAプロトコール（Hoogenboomら (1991) Nucleic Acids Res., 19: 4133）に従った。
【０４５０】
MSA、HSAまたはそれらの両方への結合を示す、バックグラウンドを超えるシグナルを与えたdAbを、プラスチックのみへの結合に関してELISA不溶性形態で試験したが、すべては、血清アルブミンに特異的であった。ついでクローンを配列決定したところ（後記の表を参照されたい）、21個のユニークなdAb配列が同定されたことが示された。選択されたVκdAbクローン間の最小類似性（アミノ酸レベル）は86.25％であった（(69/80)×100；多様化残基の全てが異なる場合（例えば、クローン24および34）の結果）。選択されたVH dAbクローン間の最小類似性は94％であった（(127/136)×100）。
【０４５１】
つぎに、血清アルブミン結合性dAbを、それが溶液からビオチン化抗原を捕捉する能力に関して試験した。ELISAプレートを1μg/ml プロテインL（Vκクローンの場合）および1μg/ml プロテインA（VHクローンの場合）でコートした以外は、ELISAプロトコール（前記のとおり）に従った。該プロトコールと同様にして、可溶性dAbを溶液から捕捉し、ビオチン化MSAまたはHSAおよびストレプトアビジンHRPで検出を行った。該ビオチン化MSAおよびHSAは、血清アルブミン分子1個当たり平均2個のビオチンとなるよう、製造業者の指示に従い製造されたものである。ELISAにおいて溶液からビオチン化MSAを捕捉した24個のクローンが同定された。これらのうちの2個（後記のクローン2および38）はビオチン化HSAをも捕捉した。つぎに、CM5ビアコア（biacore）チップ上にコートされたMSAへのdAbの結合能に関して、dAbを試験した。該ビアコア上でMSAに結合した8個のクローンが見出された。
【０４５２】
2006523090.tif 000011
【０４５３】
いずれの場合にも、フレームワークは、前記表に示されているように、CDRにおいて多様性を有する対応模擬配列におけるフレームワークと同一であった。
【０４５４】
ビアコア（biacore）上でMSAに結合した8個のクローンのうち、大腸菌（E. coli）内で高発現された2個のクローン（クローンMSA16およびMSA26）を、さらなる研究のために選択した（実施例10を参照されたい）。MSA16および26の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図16に示す。
【実施例１０】
【０４５５】
マウスにおけるMSA結合性dAb MSA16およびMSA26のアフィニティーおよび血清中半減期の測定
dAb MSA16およびMSA26を大腸菌（E. coli）のペリプラズム内で発現させ、プロテインL-アガロースアフィニティー樹脂（Affitech, Norway）へのバッチ吸収およびそれに続くpH2.2のグリシンでの溶出により精製した。ついで、精製されたdAbを抑制ビアコア（biacore）により分析してKdを決定した。簡潔に説明すると、高密度のMSAでコートされたビアコアCM5チップ上で200RUの応答を得るのに必要なdAbの濃度を決定するために、精製されたMSA16およびMSA26を試験した。dAbの必要濃度が決定されたら、予想されるKd付近の濃度範囲のMSA抗原をdAbと予混し、一晩インキュベートした。ついで該予混物のそれぞれにおけるMSAコート化ビアコアチップへのdAbの結合を30μl/分の高流速で測定した。得られた曲線を使用してクロッツプロットを作成し、それによりMSA16では200nM、MSA26では70nMの推定Kdが示された（図17AおよびB）。
【０４５６】
つぎに、クローンMSA16およびMSA26を、HAタグ（核酸配列：TATCCTTATGATGTTCCTGATTATGCAおよびアミノ酸配列：YPYDVPDYA）を有する発現ベクター内にクローニングし、2〜10mgの量を大腸菌（E. coli）内で発現させ、プロテインL-アガロースアフィニティー樹脂（Affitech, Norway）で上清から精製し、pH2.2のグリシンで溶出した。dAbの血清中半減期をマウスにおいて測定した。MSA26およびMSA16の約1.5mg/kgを1回の静脈内注射によりCD1マウスに投与した。血清レベルの分析をヤギ抗HA（Abcam, UK）捕捉およびプロテインL-HRP（invitrogen）検出ELISA（これは4％ Marvelによりブロッキングされた）により行った。洗浄は0.05％ tween PBSで行った。既知濃度のdAbの標準曲線を1×マウス血清の存在下で作成して、試験サンプルとの比較が可能となるようにした。2コンパートメント・モデルでのモデル化は、MSA26が0.16時間のt1/2α、14.5時間のt1/2βおよび465時間.mg/mlの曲線下面積（AUC）を有し（データ非表示）、MSA16が0.98時間のt1/2α、36.5時間のt1/2βおよび913時間.mg/mlのAUCを有することを示した（図18）。両方の抗MSAクローンは、0.06時間のt1/2αおよび0.34時間のt1/2βを有するHEL4（抗鶏卵白リゾチームdAb）と比較して相当に延長した半減期を有していた。
【実施例１１】
【０４５７】
VH-VHおよびVκ-Vκ二重特異性Fab様フラグメントの作製
本実施例では、VH-VHおよびVκ-Vκ二重特異性体をFab様フラグメントとして製造する方法を説明する。記載されているFab様フラグメントのそれぞれを構築する前に、まず、選択した標的に結合するdAbを、実施例9に記載されているのと同様にしてdAbライブラリーから選択した。鶏卵リゾチーム（Sigma）に結合するVH dAb, HEL4を単離し、TNFα受容体（RおよびD系）に結合するもう1つのVH dAb（TAR2h-5）も単離した。これらの配列を配列表に示す。TNFαに結合するVκdAb（TAR1-5-19）を選択およびアフィニティー成熟により単離し、該配列も配列表に示す。図17Bに示す配列を有する実施例9に記載のもう1つのVκdAb（MSA26）も、これらの実験において使用した。
【０４５８】
前記の4つのdAbを含有する発現ベクターからのDNAを酵素SalIおよびNotIで消化して、該dAbをコードするDNAを切り出した。該消化物をアガロースゲル上で泳動させ、該バンドを切り出し、ついでQiagenゲル精製キット（Qiagen, UK）を使用してゲル精製することにより、予想サイズ（300〜400bp）のバンドを精製した。ついで、以下の表に示すように、dAbをコードするDNAをCHまたはCκベクター（図8および9）内に挿入した。
【０４５９】
2006523090.tif 000012
【０４６０】
VH CHおよびVH Cκ構築物をHB2151細胞内に共形質転換した。それとは別に、Vκ CHおよびVκ Cκ構築物をHB2151細胞内に共形質転換した。そのそれぞれの共形質転換細胞系の培養物を一晩増殖させた［5％ グルコース、10μg/ml クロラムフェニコールおよび100μg/ml アンピシリン（CHおよびCκプラスミドの両方に対する抗生物質による選択を維持するためのもの）を含有する2×Ty中］。該一晩培養物を使用して、新鮮な培地（2×Ty、10μg/ml クロラムフェニコールおよび100μg/ml アンピシリン）に接種し、OD 0.7〜0.9まで増殖させた後、IPTGの添加により誘導して、それらのCHおよびCκ構築物を発現させた。ついで、発現したFab様フラグメントをプロテインA精製（共形質転換されたVH CHおよびVH Cκの場合）およびMSAアフィニティー樹脂精製（共形質転換されたVκ CHおよびVκ Cκの場合）によりペリプラズムから精製した。
【０４６１】
VH-VH二重特異性体
VH CHおよびVH Cκ二重特異性体の発現を、該タンパク質をゲル上で泳動させることにより試験した。該ゲルをブロッティングした。mycタグおよびflagタグの両方を用いてウエスタンブロット上でFabフラグメントの予測サイズのバンドを検出することができた。このことは、該Fab様フラグメントのVH CHおよびVH Cκ部分の両方が存在したことを示している。つぎに、該二重特異性体の半分の2つが、同じFab様フラグメント内に存在するかどうかを確認するために、ELISAプレートを、炭酸水素ナトリウムバッファー中、3mg/mlの鶏卵リゾチーム（HEL）100μl/ウェルで4℃で一晩かけてコートした。ついで該プレートを2％ tween PBSでブロッキングし（実施例1に記載のとおり）、ついでVH CH/VH Cκ二重特異性Fab様フラグメントと共にインキュベートした。HELへの該二重特異性体の結合の検出は、9e10（mycタグに結合するモノクローナル抗体, Roche）および抗マウスIgG-HRP（Amersham Pharmacia Biotech）を使用する、非コグネイト鎖を用いるものであった。単独で発現されたVH Cκ鎖に関するバックグラウンドシグナルは0.069であったが、VH CH/VH Cκ二重特異性Fab様フラグメントに関するシグナルは0.154であった。このことは、該Fab様フラグメントが標的抗原に対する結合特異性を有することを示している。
【０４６２】
Vκ-Vκ二重特異性体
共形質転換されたVκ CHおよびVκ Cκ二重特異性Fab様フラグメントをMSAアフィニティー樹脂上で精製した後、得られたタンパク質を使用して、1μg/ml TNFαでコートされたELISAプレート、および10μg/ml MSAでコートされたELISAプレートをプローブした。予想どおり、両方のELISAプレート上で、プロテインL-HRPで検出を行った場合に、バックグラウンドを超えるシグナルが認められた（データ非表示）。このことは、MSAに結合しうる（したがって、MSAアフィニティーカラム上で精製される）タンパク質画分が後続のELISAにおいてTNFαにも結合しうることを示したものであり、該抗体フラグメントの二重特異性を証明している。ついでこのタンパク質画分を2つの後続の実験に使用した。まず、1μg/ml TNFαでコートされたELISAプレートを二重特異性Vκ CHおよびVκ Cκ Fab様フラグメントで、そして対照TNFα結合性dAb（該ELISA上で同様のシグナルが得られるように計算した濃度のもの）でプローブした。該二重特異性体および該対照dAbの両方を使用して、2mg/ml MSAの存在下および非存在下で該ELISAプレートをプローブした。二重特異性ウェル内のシグナルは50％以上減少したが、dAbウェル内のシグナルは全く減少しなかった（図19aを参照されたい）。受容体アッセイにも、同じ二重特異性タンパク質をMSAの存在下および非存在下で加えたところ、MSAによる競合も示された（図19c）。このことは、該二重特異性体へのMSAの結合がTNFαへの結合と競合することを示している。
【実施例１２】
【０４６３】
マウス血清アルブミンおよびTNFαに対する特異性を有するVκ-Vκ二重特異性cys結合二重特異性体
本実施例では、ジスルフィド結合を介した化学的カップリングによる、マウス血清アルブミンおよびTNFαの両方に特異的な二重特異性抗体フラグメントの製造方法を説明する。MSA16（実施例1からのもの）およびTAR1-5-19 dAbの両方を、C末端システインを含有しタグを含有しない、pET系ベクター内に再クローニングした。それらの2つのdAbを4〜10mgのレベルで発現させ、プロテインL-アガロースアフィニティー樹脂（Affitiech, Norway）を使用して上清から精製した。ついで該システインタグ付きdAbをジチオトレイトールで還元した。ついでTAR1-5-19 dAbをジチオジピリジンでカップリングさせてジスルフィド結合の再形成を阻止して、PEP 1-5-10ホモ二量体を形成させた。ついで、それらの2つの異なるdAbをpH6で混合して、ジスルフィド結合の形成およびTAR1-5-19, MSA16 cys結合ヘテロ二量体の生成を促した。2つの異なるタンパク質のコンジュゲートを製造するためのこの方法は、Kingら（King TP, Li Y  Kochoumian L Biochemistry. 1978 vol17:1499-506 Preparation of protein conjugates via intermolecular disulfide bond formation.）により最初に記載された。陽イオン交換により単量体種からヘテロ二量体を分離した。SDSゲル上に予想サイズのバンドが存在することにより、分離が確認された。得られたヘテロ二量体種をTNF受容体アッセイにおいて試験したところ、それはTNFの中和に関して約18nMのIC50を有することが判明した。つぎに、該受容体アッセイを一定濃度のヘテロ二量体（18nM）ならびにMSAおよびHSAの系列希釈物を用いて繰り返した。或る範囲の濃度（2mg/mlまで）のHSAの存在は、TNFαを抑制する該二量体の能力における減少を引き起こさなかった。しかし、MSAの添加は、TNFαを抑制する該二量体の能力の用量依存的減少を引き起こした（図20）。このことは、MSAとTNFαとがcys結合TAR1-5-19, MSA16二量体への結合に関して競合することを示している。
【実施例１３】
【０４６４】
TAR1/TAR2二重特異性Fabのクローニングおよび発現
TAR1-5-19 VκdAb（ヒトTNFαに特異的）をSalI/NotI断片としてpDOM3 CK Ampベクター（図21）内にクローニングした。TAR2h-10-27 VH dAb（ヒトTNFRIに特異的）をSalI/NotI断片としてpDOM3 CH Chlorベクター（図21）内にクローニングした。
【０４６５】
クローン化dAbを含有するそれらの2つのベクターを使用して、コンピテントHB2151細胞を共形質転換した。Fabの大規模（10リットル）発酵槽調製物を調製するために、Amp/Chlor耐性クローン（両プラスミドを含有）を使用した。
【０４６６】
産生されたFabを、連続的なプロテインA/プロテインL精製により、培養上清から単離した（25℃で3時間の誘導の後）。該Fabの収量は1.5mgであった。
【実施例１４】
【０４６７】
ELISAにおけるFabの特性の分析
a）TAR1およびTAR2へのFabの結合
TNFおよびTNFR1へのTAR1/TAR2 Fabの結合をELISAにおいて試験した。96ウェルプレートを、PBS中1μg/mlの濃度の100μl TNFおよびTNFR1で4℃で一晩かけてコートした。ついで50μl（3μM）のFabを該ウェルに加え、非コグネイト鎖を用いて（すなわち、TNFコート化ウェル上でプロテインA-HRPを、TNFR1コート化ウェル上でプロテインL-HRPを使用して）、結合Fabを検出した。ELISAは、両方の抗原への該Fabの結合能を示した（図22）。
【０４６８】
b）サンドイッチELISA
両方の抗原にTAR1/TAR2 Fabが同時に結合（開いた／閉じたコンホメーション？）する能力を試験するために、サンドイッチELISAを行った。ここでは、96ウェルプレートを、PBS中、1μg/mlの濃度の突然変異TNF［TNFRIには結合しないが、PEP1-5-19には結合する（データ非表示）；突然変異TNFは、それをTNFRIに結合できないようにする単一箇所突然変異（N141Y）を含有する（Yamadishiら, 1990, Protein Eng., 3, 713−9）］で4℃で一晩コートした。ついで50μlのFab（0.5μM）を加えた。この後、TNFRI-Fc融合タンパク質（R&D Systems）を加え、抗Fc-HRPで検出した。TAR1/Cκ鎖とCH鎖に融合した無関係なVHとを含有する対照Fabを使用して、同じサンドイッチELISAを行った。ELISAの結果は、該Fabが両方の抗原（TNFおよびTNFRI）に同時に結合する能力を示しており、このことは、該分子の、開いたコンホメーションを示唆している（図23）。
【０４６９】
c）競合ELISA
TAR1/TAR2 Fabが両方の抗原に同時に結合する能力を試験するために、2つの競合ELISAを行った。
【０４７０】
96ウェルプレートを、PBS中1μg/mlの濃度の100μl TNFRIで4℃で一晩コートした。プロテインL-HRPでの検出の際に0.3のOD450が得られるように、Fabの希釈物を選択した。この濃度は6nMであった。該Fabを、漸増濃度の突然変異TNF（160×モル過剰まで）と共に室温で1時間プレインキュベートした。陰性対照として、Fabを、BSAの存在下の同じインキュベーションに付した。これらのインキュベーションの後、該混合物をTNFRIコート化ELISAプレート上に加え、さらに1時間インキュベートした。プロテインL-HRPを使用して、結合TAR1/TAR2 Fabを検出した。ELISAは、TNFRIに結合するTAR1/TAR2 Fabが競合する抗原による影響を受けなかったことを示した（図24）。
【０４７１】
96ウェルプレートを、PBS中1μg/mlの濃度の100μl 突然変異TNFで4℃で一晩コートした。9E10（Sigma）およびそれに続く抗mo-HRP（Sigma）での検出の際に0.3のOD450が得られるように、Fabの希釈物を選択した。この濃度は25nMであった。該Fabを、次第に増加する濃度の可溶性TNFRI（10×モル過剰まで）と共に室温で1時間プレインキュベートした。陰性対照として、Fabを、BSAを加えた同じインキュベーションに付した。これらのインキュベーションの後、該混合物を突然変異TNFコート化ELISAプレート上に加え、さらに1時間インキュベートした。9E10およびそれに続いて抗mo-HRPを使用して、結合TAR1/TAR2 Fabを検出した。ELISAは、突然変異TNFに結合するTAR1/TAR2 Fabが競合する抗原による影響を受けなかったことを示した（図24）。
【実施例１５】
【０４７２】
細胞アッセイにおけるFabの特性の分析
TAR1/TAR2 Fabにおける各dAbの機能性の度合を調べるために、該二重特異性分子の性能を以下の細胞アッセイで試験した。
【０４７３】
マウス細胞に対するヒトTNF細胞傷害性
TAR2 Dabは、該細胞の表面上で発現されるマウスTNF受容体には結合できないため、このアッセイではTAR1 Dabの活性を試験する。TAR1-5-19 DabおよびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。結果は、Fab内のTAR1-5-19 Dabが単量体TAR1-5-19 dAbと同様にうまく挙動することを示している（図25）。
【０４７４】
ヒト可溶性TNF受容体を使用するマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性アッセイ
このアッセイではTAR2h-10-27の活性（このアッセイにおいては、可溶性ヒトTNFRIへの結合）を試験する。TAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。結果は、Fab内のTAR2h-10-27が単量体TAR2h-10-27 dAbと同様にうまく挙動することを示している（図25）。
【０４７５】
ヒト細胞上でのマウスTNF誘導性IL-8分泌
このアッセイではTAR2h-10-27 Dabの活性（このアッセイにおいては、膜結合型ヒトTNFRIへの結合）を試験する。TAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1 ＋ TAR2 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。この結果は、Fab内のTAR2h-10-27が単量体TAR2h-10-27 dAbと同様にうまく挙動することを示している（図25）。
【０４７６】
ヒト細胞上でのヒトTNF誘導性IL-8分泌
このアッセイではTAR1-5-19およびTAR2h-10-27 Dabの両方の活性を試験する。TAR1-5-19 DabおよびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。その結果は、Fabが、TAR2h-10-27 dAbおよびTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物に対して同様の効果をもたらすことを示している（図25）。
【０４７７】
可溶性ヒトTNFRIおよび漸増濃度の突然変異TNFの存在下のマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性（細胞上での競合）
このアッセイは、漸増濃度の突然変異TNF（TAR1-5-19 Dabに結合する）が溶液中のTNFRIへのTAR2h-10-27 dAbの結合を妨げるかどうかを試験するために行った。該アッセイの結果は、そのようなことは生じず、該Fabが2つの抗原に同時に結合しうることを示している（図26）。
【０４７８】
前記のアッセイは、Fab分子内の各dAbが単量体dAbと同様にうまく機能することを示している。
【実施例１６】
【０４７９】
IgGベクターの構築
IgG1重鎖定常領域および軽鎖κ定常領域をクローニングするために、それぞれpcDNA3.1(+)およびpDNA3.1/Zeo(+)骨格（Invitrogen）を使用した。該ベクターの概要を図27に示す。
【０４８０】
リーダー：
発現されるタンパク質の分泌を促進するために、以下の2つの択一的な種類のリーダーを使用した：CD33リーダー、IgG K-鎖リーダー。
【０４８１】
該リーダーを、2つの相補的オリゴ（表5）のアニーリングにより構築し、NheI/HindIII断片としてpcDNA3.1(+)およびpcDNA3.1/Zeo(+)内にクローニングした（図27）。
【０４８２】
IgG1重鎖のクローニング：
CH1ドメインを、表5に示すプライマーを使用してCHベクター（WO 03/002609に記載されているとおり）からPCR増幅した。
【０４８３】
ヒンジ領域、CH2およびCH3ドメインを、表5に示すプライマーを使用してpIgplusベクター（Novagen）からPCR増幅した。
【０４８４】
ついでそれらの2つのPCR産物を、IgG1重鎖定常領域を形成するようにPCRによって組み立てて、これをNotI/XhoI断片としてpcDNA3.1(+)内にクローニングした（図27）。
【０４８５】
κ軽鎖のクローニング：
CKドメインを、表5に示すプライマーを使用してCKベクター（WO 03/002609に記載されているとおり）からPCR増幅した。
【０４８６】
ついで、それをcDNA3.1/Zeo(+)内にNotI/XhoI断片としてクローニングした（図27）。
【実施例１７】
【０４８７】
IgGベクター内へのTAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbのクローニングならびにIgGの作製：
TAR1-5-19 VK dAb（ヒトTNFαに特異的）をIgGκベクター（CD33およびIgKリーダーを有する）内にHindIII/NotI断片としてクローニングした（図27）。
【０４８８】
TAR2h-10-27 VH dAb（ヒトTNFRIに特異的）をIgG重鎖ベクター（CD33およびIgKリーダーを有する）内にHindIII/NotI断片としてクローニングした（図27）。
【０４８９】
ついで重鎖プラスミドと軽鎖プラスミドとをCOS7細胞内にコトランスフェクトし、IgGを一過的に5日間発現させた。産生したIgGを、流線型（streamline）プロテインAを使用して精製した。発現レベル：250ng/ml。CD33およびIgG Kリーダーは同レベルの発現をもたらした。
【０４９０】
精製されたIgGが、還元および非還元SDSゲル上で確認された（予想サイズのバンドが得られた）（データ非表示）。
【実施例１８】
【０４９１】
ELISAにおけるIgGの特性の分析
a）TNFおよびTNFRIへのIgGの結合
TNFおよびTNFRIへのTAR1/TAR2 IgGの結合をELISAにおいて試験した。96ウェルプレートを、PBS中1μg/mlの濃度の100μl TNFおよびTNFRIで4℃で一晩コートした。ついで50μl（200nM）のIgGを該ウェルに加え、結合IgGを抗Fc-HRPにより検出した。ELISAは両方の抗原にIgGが結合できる能力を証明した（図28）。
【実施例１９】
【０４９２】
細胞アッセイにおけるIgGの特性の分析
TAR1/TAR2 IgGにおける各dAbの機能性の度合を調べるために、該二重特異性分子の性能を以下の細胞アッセイで試験した。
【０４９３】
マウス細胞に対するヒトTNF細胞傷害性：
TAR2h-10-27 Dabは、該細胞の表面上で発現されるマウスTNF受容体には結合できないため、このアッセイではTAR1-5-19 Dabの活性を試験する。TAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。結果は、IgG内のTAR1-5-19が単量体TAR1-5-19 dAbより良好に挙動することを示し、このことは、IgGが2つのTNFの分子に同時に結合しうることを示している（二重特異性分子のND50）（図29）。
【０４９４】
ヒト可溶性TNF受容体を使用するマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性アッセイ
このアッセイではTAR2h-10-27の活性（このアッセイにおいては、可溶性ヒトTNFRIへの結合）を試験する。TAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。結果は、IgG内のTAR2h-10-27が単量体TAR2h-10-27 dAbと同様にうまく挙動することを示している（図29）。
【０４９５】
ヒト細胞上でのマウスTNF誘導性IL-8分泌
このアッセイではTAR2h-10-27 Dabの活性（このアッセイにおいては、膜結合型ヒトTNFRIへの結合）を試験する。TAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。結果は、IgGが該細胞表面上の2つのTNFR1の分子に結合しうることを示している（アゴニスト活性）（図29）。ヒトTNFの非存在下においても、このアッセイを繰り返した。結果は、該IgGが、30nMの濃度までは、ヒト細胞上のIL-8の遊離を誘導するが、その後はアゴニスト活性が低下することを示している（図30）。
【０４９６】
ヒト細胞上でのヒトTNF誘導性IL-8分泌
このアッセイではTAR1-5-19およびTAR2h-10-27の両方の活性を試験する。TAR1-5-19およびTAR2h-10-27 dAbならびにTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物をこのアッセイにおける対照として使用した。結果は、IgGが、TARh-10-27 dAbおよびTAR1-5-19 ＋ TAR2h-10-27 dAb混合物に対して同様の効果を及ぼすことを示している（図29）。マウスTNFの非存在下においても、このアッセイを繰り返した。結果は、該IgGが、30nMの濃度までは、ヒト細胞上のIL-8の遊離を誘導するが、その後はアゴニスト活性が低下することを示している（図30）。
【０４９７】
表5．プライマー／オリゴ
CkbckNot
5’ AAGGAAAAAAGCGGCCGCAACTGTGGCTGCACCATC 3’
CkforXho
5’CCGCTCGAGTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG 3’
Ch1bckNot
5’AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC 3’
Ch1for
5’GTGAGGTTTGTCACAAGATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCCACC 3’
Fcbck
5’CCCAAATCTTGTGACAAACCTCAC 3’
FcforXho
5’CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG 3’
リーダー CD33:
Leacd1
5’P CTAGCCACCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCACTGCTGTGGGCAGGAGCACTGGCTATGGATA 3’
Leacd2
5’P AGCTTATCCATAGCCAGTGCTCCTGCCCACAGCAGTGGCAGCAGTAGCAGCAGCGGCATGGTGG 3’
リーダーIGGK:
Leak1
5’P CTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACA 3 ’
Leak2
5’P AGCTTGTCACCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGCAGCAGTACCCATAGCAGGAGTGTGTCTGTCTCCATGGTGG 3’
SEQBACK
5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’
SEQFOR
5’ TAGAAGGCACAGTCGAGG 3’
【０４９８】
データの要約
上記実施例に記載の実験で得られたデータの要約を付録4に記載する。
【０４９９】
本明細書中に記載の全ての刊行物および該刊行物において引用されている参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神からの逸脱を伴わない、本発明の記載されている方法および系の種々の修飾および変更が当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して説明されているが、特許請求されている本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されている形態の種々の修飾が、特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０５００】
付録1：in vivoにおける半減期を延長するポリペプチド
α-1 糖タンパク質 (オロソムコイド) (AAG)
α-1 抗キモトリプシン (ACT)
α-1 抗トリプシン (AAT)
α-1 ミクログロブリン (プロテインHC) (AIM)
α-2 マクログロブリン (A2M)
抗トロンビン III (AT III)
アポリポタンパク質A-1 (Apo A-1)
アポリポタンパク質B (Apo B)
β-2-ミクログロブリン (B2M)
セルロプラスミン (Cp)
補体成分 (C3)
補体成分 (C4)
C1エラスターゼインヒビター (C1 INH)
C反応性タンパク質 (CRP)
シスタチンC (Cys C)
フェリチン (FER)
フィブリノーゲン (FIB)
フィブロネクチン (FN)
ハプトグロビン (Hp)
ヘモペキシン (HPX)
免疫グロブリン A (IgA)
免疫グロブリン D (IgD)
免疫グロブリン E (IgE)
免疫グロブリン G (IgG)
免疫グロブリン M (IgM)
免疫グロブリン軽鎖 (κ/λ)
リポタンパク質(a) [Lp(a)]
マンノース結合タンパク質 (MBP)
ミオグロビン (Myo)
プラスミノーゲン (PSM)
プレアルブミン (トランスチレチン) (PAL)
レチノール結合タンパク質 (RBP)
リウマチ因子 (RF)
血清アミロイドA (SAA)
可溶性トランスフェリン受容体 (sTfR)
トランスフェリン (Tf)。
【０５０１】
2006523090.tif 000013
2006523090.tif 000014
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【０５０２】
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【０５０３】
付録４
2006523090.tif 000023
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【図面の簡単な説明】
【０５０４】
【図１】VH HSAの抗原結合部位内に存在するH50、H52、H52a、H53、H55、H56、H58、H95、H96、H97、H98位（それぞれDVTまたはNNKによりコードされる）のVH/HSAの多様化を示す。VKの配列はL50、L53位において多様化される。
【図２】ファージ提示／ScFv形態における、ライブラリー1：生殖系列VK/DVT VH、ライブラリー2：生殖系列VK/NNK VH、ライブラリー3：生殖系列VH/DVT VK、ライブラリー4：生殖系列VH/NNK VKを示す。これらのライブラリーを、該クローンおよび選択ライブラリーの大多数が機能的となるよう、一般的リガンドであるプロテインAおよびプロテインLへの結合に関して予備選択した。ライブラリーを、HSA（第1ラウンド）およびβ-gal（第2ラウンド）もしくはHSA β-gal選択により、またはβ-gal（第1ラウンド）およびHSA（第2ラウンド）β-gal HSA選択により選択した。PCRのこれらのクローンからの可溶性scFvを該配列において増幅した。二重特異性抗体K8をコードする1つのクローンを更なる研究のために選択した。
【図３】VH鎖およびVK鎖のアライメントを示す。
【図４】K8抗体の結合特性を示す。K8抗体の結合特性はモノクローナルファージELISAにより特徴づけられた。二重特異性K8抗体はHSAに結合することが判明し、1.0より大きな吸収シグナルでファージの表面上に提示された。他のタンパク質との交差反応性は検出されなかった。
【図５】既知濃度のK8抗体フラグメントを使用して行った可溶性scFv ELISAを示す。96ウェルプレートを100μgのHSA、10μg/mlおよび100μg/mlのBSAおよびβ-galならびに1μg/ml濃度のプロテインAでコートした。K8 scFvの50μgの系列希釈物を適用し、結合抗体フラグメントをプロテインL-HRPで検出した。ELISAの結果は該K8抗体の二重特異性を証明している。
【図６】可溶性scFv ELISAを用いて分析したクローンK8 VK/模擬VHの結合特性を示す。可溶性scFvフラグメントの産生を、Harrisonら, Methods Enzymol. 1996;267:83-109に記載されているとおりにIPTGにより誘導し、scFvを含有する上清を直接的にアッセイした。可溶性scFv ELISAを実施例1に記載のとおりに行い、結合scFvをプロテインL-HRPで検出した。このクローンは尚もβ-galに結合しうるが、BSAへの結合は阻止されたことが、このELISAの結果から示された。
【図７】可変ドメインベクター1および2の配列を示す。
【図８】VH1/VH2多重特異性リガンドを構築するために使用するCHベクターの地図である。
【図９】Vκ1/Vκ2多重特異性リガンドを構築するために使用するVκベクターの地図である。
【図１０】TAR1-5二量体4、TAR1-5-19二量体4およびTAR1-5-19単量体を比較するTNF受容体アッセイ。
【図１１】TAR1-5二量体1-6を比較するTNF受容体アッセイ。すべての二量体はFPLCにより精製されており、最適な二量体種に関する結果が示されている。
【図１２】種々の形態、すなわち、3U、5Uまたは7Uリンカーを有するdAb-リンカーdAb形態、Fab形態およびシステインヒンジリンカー形態のTAR1-5 19ホモ二量体のTNF受容体アッセイ。
【図１３】ライブラリー1の模擬VH配列。生殖系列配列DP47-JH4bに基づくVHフレームワークの配列。NNKランダム化（N = AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K = GまたはTヌクレオチド）がライブラリー1内に組込まれている位置が、下線付き太字で示されている。
【図１４】ライブラリー2の模擬VH配列。生殖系列配列DP47-JH4bに基づくVHフレームワークの配列。NNKランダム化（N = AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K = GまたはTヌクレオチド）がライブラリー2内に組込まれている位置が、下線付き太字で示されている。
【図１５】ライブラリー3の模擬Vκ配列。生殖系列配列DPK9-JK1に基づくVκフレームワークの配列。NNKランダム化（N = AまたはTまたはCまたはGヌクレオチド; K = GまたはTヌクレオチド）がライブラリー3内に組込まれている位置が、下線付き太字で示されている。
【図１６】抗MSA dAb MSA16およびMSA26のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図１７−１】MSA16および26の抑制ビアコア（biacore）。Kdを測定するために、精製されたdAb MSA16およびMSA26を抑制ビアコアにより分析した。簡潔に説明すると、高密度のMSAでコートされたビアコアCM5チップ上で200RUの応答を得るのに必要なdAbの濃度を決定するために、dAbを試験した。dAbの必要濃度が決定したら、予想されるKdの周辺の濃度範囲のMSA抗原をdAbと予混し、一晩インキュベートした。ついで該予混体のそれぞれにおけるMSAコート化ビアコアチップへのdAbの結合を30μl/分の高流速で測定した。
【図１７−２】MSA16および26の抑制ビアコア（biacore）。Kdを測定するために、精製されたdAb MSA16およびMSA26を抑制ビアコアにより分析した。簡潔に説明すると、高密度のMSAでコートされたビアコアCM5チップ上で200RUの応答を得るのに必要なdAbの濃度を決定するために、dAbを試験した。dAbの必要濃度が決定したら、予想されるKdの周辺の濃度範囲のMSA抗原をdAbと予混し、一晩インキュベートした。ついで該予混体のそれぞれにおけるMSAコート化ビアコアチップへのdAbの結合を30μl/分の高流速で測定した。
【図１８】注射後のMSA16の血清レベル。dAb MSA16の血清中半減期をマウスにおいて測定した。MSA16を約1.5mg/kgの1回の静脈内注射でCD1マウスに投与した。2コンパートメント・モデルでのモデル化は、MSA16が0.98時間のt1/2α、36.5時間のt1/2βおよび913時間.mg/mlのAUCを有することを示した。0.06時間のt1/2αおよび0.34時間のt1/2βを有するHEL14（抗鶏卵白リゾチームdAb）と比較して、MSA16は、著しく延長した半減期を有していた。
【図１９】MSA26CkとTAR1-5-19CHとを含むFab様フラグメントへのTNFの結合の抑制を示すELISA（a）およびTNF受容体アッセイ（c）。Fab様フラグメントと共にMSAを加えると、抑制のレベルが減少する。1μg/ml TNFαでコートされたELISAプレートを二重特異性VκCHおよびVκCκFab様フラグメントで並びに対照TNFα結合dAb（ELISA上で同様のシグナルが得られるように計算した濃度のもの）でプローブした。該二重特異性体および該対照dAbの両方を使用して、2mg/ml MSAの存在下および非存在下で該ELISAプレートをプローブした。二重特異性ウェル内のシグナルは50％以上減少したが、dAbウェル内のシグナルは全く減少しなかった（図19aを参照されたい）。該受容体アッセイにも、同じ二重特異性タンパク質をMSAの存在下および非存在下で加えたところ、MSAによる競合も示された（図19c）。このことは、該二重特異性体へのMSAの結合がTNFαへの結合と競合することを示している。
【図２０】TAR1-5-19 dAbおよびMSA16 dAbのジスルフィド結合ヘテロ二量体へのTNFの結合の抑制を示すTNF受容体アッセイ。該二量体と共にMSAを加えると、抑制のレベルが用量依存的に減少する。一定濃度のヘテロ二量体（18nM）ならびにMSAおよびHSAの希釈系列物の存在下、TNF受容体アッセイ（図19（b））を行った。或る範囲の濃度（2mg/mlまで）のHSAの存在は、TNFαを抑制する該二量体の能力における減少を引き起こさなかった。しかし、MSAの添加は、TNFαを抑制する該二量体の能力における用量依存的減少を引き起こした（図19a）。このことは、MSAとTNFαとがcys結合TAR1-5-19, MSA16二量体への結合に関して競合することを示している。MSAおよびHSAの単独体は該アッセイにおけるTNF結合レベルに影響を及ぼさなかった。
【図２１】本発明のFabの構築に使用したベクターを示す。
【図２２】TNFおよびTNFR1への、TAR1/TAR2 Dabを含むFabの結合を、ELISAアッセイにおいて示す。
【図２３】TNFおよびTNFR抗原の両方にTAR1/TAR2 Fabが同時に結合する能力を試験するための、すなわち、該Fabが、開いたコンホメーションを有するのか、閉じたコンホメーションを有するのかを試験するためのサンドイッチELISAの結果を示す。
【図２４】両方の抗原にTAR1/TAR2 Fabが同時に結合する能力を試験するための、すなわち、該Fabが、開いたコンホメーションを有するのか、閉じたコンホメーションを有するのかを試験するための競合ELISAの結果を示す。
【図２５】本発明のFab二重特異性リガンドを使用する、細胞に基づくアッセイの結果を示す。（a）マウス細胞に対するヒトTNF細胞傷害性の試験。（b）ヒト可溶性TAR2を使用するマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性アッセイを示す。（c）ヒト細胞上のマウスTNF誘導性IL-8分泌を示す。（d）ヒト細胞上のヒトTNF誘導性IL-8分泌を示す。
【図２６】可溶性ヒトTNFR1および漸増濃度の突然変異TNFの存在下のマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性（細胞上で競合）を示す。
【図２７】それぞれIgG1重鎖定常領域および軽鎖κ定常領域を発現するIgGベクターの構築を示す。
【図２８】ELISAアッセイにおけるTNFおよびTNFR1へのTAR1/TAR2 IgGの結合を示す。
【図２９−１】細胞アッセイにおけるTAR1/TAR2 IgG特性の分析を示す。（a）マウス細胞に対するヒトTNF細胞傷害性の試験。（b）ヒト可溶性TNF受容体を使用するマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性アッセイ。（c）ヒト細胞からのヒトTNF誘導性IL-8遊離。（d）ヒト細胞からのマウスTNF誘導性IL-8分泌を示す。
【図２９−２】細胞アッセイにおけるTAR1/TAR2 IgG特性の分析を示す。（a）マウス細胞に対するヒトTNF細胞傷害性の試験。（b）ヒト可溶性TNF受容体を使用するマウス細胞に対するマウスTNF細胞傷害性アッセイ。（c）ヒト細胞からのヒトTNF誘導性IL-8遊離。（d）ヒト細胞からのマウスTNF誘導性IL-8分泌を示す。
【図３０】ヒト細胞上のヒトTNF誘導性IL-8分泌を示す。
【図３１】ヒトTNFR1（p55受容体）に結合するTAR2と称されるDabのアミノ酸配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2006523090.tif 000062
【図２６】
2006523090.tif 000063
【図２７】
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【図２８】
2006523090.tif 000065
【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
2006523090.tif 000069
【国際調査報告】
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2006523090.tif 000071
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2006523090.tif 000073
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