(57)【要約】本発明は、全般的には、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製に対して許容性である細胞および細胞系、ならびにそれらを製造し使用するための方法および物質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した細胞を培養し、
（ｂ）（ａ）の細胞からＨＣＶを除去し、
（ｃ）ＨＣＶの複製に対して許容性である、（ｂ）の除去処理された細胞の亜系統を同定することを含んでなる、ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞系の製造方法。
【請求項２】
（ｂ）の除去工程が、（ａ）の感染細胞を抗ウイルス剤での処理に付すことを含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
抗ウイルス剤が抗ウイルス性サイトカインである、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
抗ウイルス性サイトカインがインターフェロンである、請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
（ａ）の細胞が脊椎動物細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項６】
脊椎動物細胞がヒト細胞である、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
（ａ）の細胞が肝細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項８】
肝細胞がヒト肝細胞である、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
（ｃ）の亜系統が少なくとも３０％の頻度でＨＣＶの複製を支持する、請求項１記載の製造方法。
【請求項１０】
（ａ）複製性ゲノムまたはサブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡを含む細胞系を準備し、
（ｂ）（ａ）の細胞系からＨＣＶ  ＲＮＡを除去し、
（ｃ）ＨＣＶの複製に対して許容性である、（ｂ）の除去処理された細胞系の亜系統を同定することを含んでなる、ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞系の製造方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）の除去が抗ウイルス剤での処理を含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
該剤が抗ウイルス性サイトカインである、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
抗ウイルス性サイトカインがインターフェロンである、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
（ａ）の細胞系が、適応突然変異を含有しない複製性サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡを含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１５】
（ａ）の細胞系が、適応突然変異を含む複製性サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡを含む、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１６】
ＨＣＶに感染した宿主細胞系を除去処理に付し、ついで、ＨＣＶの複製に対して許容性である除去処理された亜系統を選択することにより製造された、ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞系。
【請求項１７】
除去処理が、該宿主細胞系をインターフェロンで処理することを含む、請求項１６記載の細胞系。
【請求項１８】
インターフェロンでの処理によりＨＣＶ  ＲＮＡが除去された、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対して許容性である細胞系。
【請求項１９】
（ａ）複製性ＨＣＶ  ＲＮＡで宿主細胞をトランスフェクトし、
（ｂ）該宿主細胞からＨＣＶ  ＲＮＡを除去する条件に該宿主細胞を付し、
（ｃ）（ｂ）の除去処理された細胞集団を選択し、
（ｄ）（ｃ）の選択された除去処理された細胞集団を増殖させて、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対して許容性である細胞系を得ることを含んでなる、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対して許容性である細胞系の製造方法。
【請求項２０】
工程（ａ）のＨＣＶ  ＲＮＡがサブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡである、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）が、該宿主細胞を抗ウイルス剤で処理することを含む、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２２】
抗ウイルス剤が抗ウイルス性サイトカインである、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２３】
抗ウイルス性サイトカインがインターフェロンである、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２４】
インターフェロンがインターフェロンαである、請求項２１記載の製造方法。
【請求項２５】
（ｄ）の細胞系が約１０％〜約７５％の頻度でＨＣＶ  ＲＮＡの複製を支持する、請求項１９記載の製造方法。
【請求項２６】
（ｄ）の細胞系が約１０％〜約３０％の頻度でＨＣＶ  ＲＮＡの複製を支持する、請求項２５記載の製造方法。
【請求項２７】
（ｄ）の細胞系が少なくとも３０％の頻度でＨＣＶ  ＲＮＡの複製を支持する、請求項２５記載の製造方法。
【請求項２８】
（ｄ）の細胞系が少なくとも５０％の頻度でＨＣＶ  ＲＮＡの複製を支持する、請求項２７記載の製造方法。
【請求項２９】
該宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項１９記載の製造方法。
【請求項３０】
該宿主細胞がヒト細胞である、請求項２９記載の製造方法。
【請求項３１】
該宿主細胞が肝細胞である、請求項２９記載の製造方法。
【請求項３２】
該宿主細胞がヒト細胞である、請求項３０記載の製造方法。
【請求項３３】
請求項１９記載の製造方法により製造された細胞系。
【請求項３４】
該宿主細胞がサブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡを含有する、請求項３３記載の細胞系。
【請求項３５】
サブゲノムＨＣＶ  ＲＮＡが適応突然変異を含む、請求項３４記載の細胞系。
【請求項３６】
適応突然変異がＳ２２０４Ｉであり、その位置が、コアコード領域から開始する、遺伝子型１ｂ  Ｃｏｎ１完全長ＨＣＶゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３８７９９）とのアライメントにより特定される、請求項３５記載の細胞系。
【請求項３７】
請求項１記載の製造方法により製造された細胞系。
【請求項３８】
請求項１０記載の製造方法により製造された細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製に対して許容性である細胞、ならびにそれを製造し使用するための方法および物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
検出可能なレベルの複製を支持するＨｕｈ−７細胞の頻度およびＲＮＡの複製を増強するＨＣＶ非構造タンパク質における適応突然変異が既に同定されている（Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１９７２−１９７４，２０００；Ｇｕｏ，Ｊ．Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：８５１６−８５２３，２００１；Ｋｒｅｉｇｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４６１４−４６２４，２００１；Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１４３７−１４４９，２００１）。特に、ＮＳ５Ａの２２０４位のイソロイシンによるセリン残基の置換は、トランスフェクト化Ｈｕｈ−７細胞の〜１０％においてＨＣＶ複製を許容し（非突然変異ＨＣＶと比べて２０，０００倍の向上）、トランスフェクション後の早い時点でのＨＣＶ  ＲＮＡの検出に十分なレベルにまで複製を増強する（Ｂｌｉｇｈｔら，２０００）。ＨＣＶの複製を支持するＨｕｈ−７細胞の頻度が低いことは、細胞環境がＨＣＶ複製効率の主要決定因子でありうることを示唆している。
【発明の開示】
【０００３】
説明
本明細書中で用いる、特定の細胞または細胞系におけるＨＣＶ複製に対して「許容性」なる語は、その特定の細胞または細胞系が、それが由来する細胞または細胞系の頻度より大きな頻度でＨＣＶの複製を支持することを意味する。例えば、本明細書に記載の或る実施形態においては、Ｈｕｈ−７亜系統は、それが由来するＨｕｈ−７細胞系より高いＨＣＶ複製頻度を支持する。したがって、該亜形態はＨＣＶの複製に対して許容性であると称される。いくつかの実施形態においては、該細胞または細胞系は約１０％〜約３０％の頻度でＨＣＶの複製を支持する。他の実施形態においては、該細胞または細胞系は約１０％〜約７５％の頻度でＨＣＶの複製を支持する。
【０００４】
「除去（された）」なる語は、自己複製性ＨＣＶ  ＲＮＡを実質的に含有しない細胞を指す。本明細書中で用いるその用語の意味における、細胞に対して除去を行うための１つの手段の説明が、実施例１に記載されている。
【０００５】
「トランスフェクション」なる語は、ポリヌクレオチドが細胞に感染すること意味する。該ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。細胞をトランスフェクトするための方法は当技術分野において公知であり、それらの任意の方法を用いることが可能である。
【０００６】
頻度は、複製性ＨＣＶ  ＲＮＡを有する細胞の比率（％）を測定することにより確認される。頻度を測定するための１つの簡便な方法は、ＨＣＶ  ＲＮＡにより付与される特徴を示す細胞の比率（％）を測定することであり、これを達成するための当技術分野において公知の任意の方法が適している。本明細書における実施例は、Ｇ４１８選択およびｎｅｏ遺伝子を含むＨＣＶ  ＲＮＡを使用するそのような方法を記載している。
【０００７】
特に示さない限り、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術を用いる。それらのすべては当業者の技量の範囲内であり、文献に記載されている。
【０００８】
ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞系を得るために、適応性および非適応性のサブゲノムまたは完全長ＲＮＡの複製を支持するＨｕｈ−７細胞系のクローンおよび集団から、インターフェロン（ＩＦＮ）での処理によりＨＣＶ  ＲＮＡを除去した。ＨＣＶの複製はＩＦＮにより容易に阻止されうるため、ＩＦＮでの持続的な処理は細胞からＨＣＶ  ＲＮＡを除去する。より高い比率の除去細胞はＨＣＶの複製を支持する能力を有し、複数のアッセイによるサブゲノムおよび完全長の両方の複製の検出を促進した。したがって、本明細書に記載の１つの実施形態は、ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞および細胞系の製造方法を含む。そのような方法は、ＨＣＶ感染細胞に対して除去を行うことを含む。ついで、ＨＣＶの複製を細胞が支持する頻度を測定するために、該除去細胞をアッセイすることが可能である。
【０００９】
該細胞は、適応または非適応ＨＣＶ  ＲＮＡ複製を支持しうる任意の脊椎動物細胞でありうる。本明細書に記載の、細胞および細胞系の製造方法は、適応または非適応ＨＣＶ  ＲＮＡ複製を支持しうる任意の細胞型に適用可能であると考えられる。そのような細胞には、例えば、肝細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞または包皮繊維芽細胞が含まれうる。そのような細胞は哺乳類細胞、より詳しくは、ヒト細胞でありうる。特に有用な細胞型は肝細胞である。例えば、Ｈｕｈ−７細胞はＨＣＶ  ＲＮＡの複製を支持することが示されている。
【００１０】
除去処理されたＨｕｈ−７亜系統はＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対して許容性であることが、本明細書中に示されている。高適応性ＮＳ５Ａ  Ｓ２２０４Ｉ突然変異を含有するレプリコンでは、Ｈｕｈ−７．５細胞の少なくとも３０％はＧ４１８耐性に変換されうる。比較しうる画分は、ＦＡＣＳによればＮＳ３抗原に関して陽性であった。同様に、ｎｅｏを欠くＳＧレプリコンでは（図１）、少なくとも５０％の開始効率が得られた。より高感度のＦＡＣＳ分析からのデータ（データは非表示）は、該トランスフェクション操作の後に生存している細胞の＞７５％が複製性ＨＣＶ  ＲＮＡを含有することを示している。これらの許容細胞は、レプリコン含有細胞クローンをＩＦＮによる除去に付すことにより得られた。
【００１１】
他の実施形態は、ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞および細胞系の製造方法を含む。そのような方法は、感染細胞を除去に付し、ついで亜系統をアッセイして、個々の亜系統がＨＣＶの複製を支持する頻度を測定することを含む。ついで、特に許容性である亜系統を同定することが可能である。該感染細胞は、任意の手段により、除去に付されうる。例えば、インターフェロンαでの処理は、ＨＣＶの感染を細胞から除去するための有効な手段であるが、本発明の範囲内で任意の有効な除去手段を用いることが可能である。
【００１２】
ＮＳ３−５Ｂ領域に（集団配列レベルで）適応変化を伴わないレプリコンを含有するＧ４１８選択クローンから、最高許容性亜系統（Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７．８）を得た。これらの細胞は、未修飾レプリコンの複製に対して許容性である及び適応突然変異含有レプリコンに関して、より許容性である元のＨｕｈ−７親系統の亜集団に相当しうる。他のレプリコン含有細胞系の除去は、被検レプリコンに関して、より許容性である細胞集団を常に与えるわけではなかった。例えば、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）レプリコンを含有するＨｕｈ−７集団に対する除去は、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）を支持する能力においては不変であるがＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）の開始に関しては低効率（２３倍低い）である細胞基質を与えた（図２）。
【００１３】
Ｇ４１８選択を行わなくてもトランスフェクションの直後にＨＣＶの複製を調べることが可能となったため、完全長ＨＣＶゲノムＲＮＡおよびｎｅｏを欠くサブゲノムレプリコンの複製を調べることが可能になった。コアの最初の１２アミノ酸とＮＳ３との間に細胞性ユビキチンをインフレームで融合させることによりモノシストロン性レプリコン｛ＳＧ−５’Ｕｂ−ＮＳ３（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝を作製するための初期の試みは不成功に終わった。ＮＳ３−５Ｂに融合したユビキチンを含有するビシストロン性誘導体は生存可能であったが、このことは、ＳＧ−５’Ｕｂ−ＮＳ３（Ｓ２２０４Ｉ）が複製されなかったのが、ユビキチン／ＮＳ３連結部におけるプロセシングの欠損によるものではなかったことを示唆している（データ非表示）。むしろ、ＨＣＶ  ５’ＮＴＲ付近のユビキチン−コード配列の融合が、有害なＲＮＡ二次構造の形成により翻訳を妨げているか、あるいはＨＣＶ  ５’ＮＴＲに存在するＲＮＡ要素またはその相補体を破壊することによりＲＮＡの複製を妨げている可能性がある。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳへのＨＣＶ  ５’ＮＴＲの融合は、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）より良好に複製されるサブゲノムレプリコンを与えた（図３）。ビシストロン性ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）からの最初のシストロン（Ｃ−Ｎｅｏ融合体をコードする配列）の欠失が複製を刺激した理由は不明であるが、ＥＭＣＶおよびＨＣＶ  ＩＲＥＳ要素間の競合の減少ならびに通常のＨＣＶ翻訳開始部位への４０Ｓリボソームサブユニットの結合の阻止によるレプリカーゼの翻訳の増強によるものかもしれない（Ｊ．ＭａｒｃｏｔｒｉｇｉａｎｏおよびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，未公開の結果）。
【００１４】
ＮＳ５Ａ  Ｓ２２０４Ｉ適応変化を含有する完全長構築物の複製において、同様の状況が観察された（図４）。Ｈｕｈ−７．５細胞においては、Ｃ−Ｎｅｏシストロンを含有するビシストロン性構築物｛ＦＬ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳに融合したＨＣＶ  ５’ＮＴＲを含有するＲＮＡ｛ＦＬ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝より低い効率で複製を開始した。未修飾（ＮＳ５ＡにおけるＳ２２０４Ｉ置換以外）のＨＣＶゲノムを含有するＦＬ構築物は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより翻訳が媒介されるＲＮＡよりも、複製の開始において良好であったが（図４）、このことは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより駆動される翻訳がＨｕｈ−７．５細胞内でのＨＣＶの複製に要求されず、したがって未修飾ＨＣＶゲノムＲＮＡの研究が可能であることを示している。この後者の点は、疑いなく、感染粒子内へのＨＣＶ  ＲＮＡの被パッケージング能に影響を及ぼしうるであろう。しかし、本発明者らの研究（Ｋ．Ｊ．ＢｌｉｇｈｔおよびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，未公開の結果）および最近の報告（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４００８−４０２１，２００２）においては、これらの未修飾ＦＬ  ＲＮＡの選択的パッケージングはＨｕｈ−７細胞内で観察されなかった。完全長ＨＣＶ  ＲＮＡは、対応する適応サブゲノムレプリコンよりも、複製の確立において低効率であったが、このことは、構造ＮＳ２コード領域の付加がＨＣＶ複製の開始を阻害することを示唆している。これがこの領域内に存在するコード化タンパク質またはＲＮＡ要素（または両方）（３１）によるものであるかどうかは、現在のところ明らかではない。本発明者らは、Ｓ２２０４Ｉ含有ＦＬおよびＦＬ−Ｎｅｏ  ＲＮＡのＨＣＶ複製レベル（ＨＣＶタンパク質およびＲＮＡレベルにより測定した場合）が、非同調的トランスフェクト化細胞集団における完全長ＲＮＡの複製開始能を損ないうる細胞周期に左右されることを観察している（Ｂａｌｆｅら，投稿中）。
【００１５】
細胞培養内のＨＣＶの複製を更に増強する試みにおいて、ＮＳ５Ａの２２０４位における他のアミノ酸置換の効果を調べた。効率的なサブゲノムＲＮＡの複製が、２２０４位のＩｌｅおよびＶａｌならびにそれより遥かに軽度ではあるがＡｌａで観察された（図５）。ＶａｌまたはＩｌｅは、小さなβ分枝状無極性残基であり、Ａｌａは、類似した特性を有するが、β分枝状ではない。これに対して、２２０４位のＴｙｒ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｐのような極性残基はＨＣＶの複製を著しく妨げたが（図５）、このことは、複製には、この位置に無極性残基が位置することが好ましいことを示唆している。天然ではこの遺伝子型１ｂ分離体の２２０４位にＳｅｒが存在し（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１１０−１１３，１９９９）、他のＨＣＶ遺伝子型間で保存されている（Ｔａｎｊｉ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３９８０−３９８６，１９９５）ことに注目することは興味深い。このことは、この残基がインビボでのＨＣＶの複製および／または病原性に重要でありうることを示唆している。
【００１６】
ＮＳ５Ａ適応突然変異の組合せは、Ｈｕｈ−７．５細胞において、損なわれた（Ａ２１９９Ｔ＋Ｓ２２０４Ｉ）または複製不能（Ｓ２１９７Ｐ＋Ａ２１９９Ｔ＋Ｓ２２０４Ｉ）のレプリコンを与えた（図６）。ＨＣＶ  ＮＳコード領域内の他の位置における適応突然変異の不和合性が既に記載されている（Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１４３７−１４４９）。例えば、ＮＳ５Ｂ（Ｒ２８８４Ｇ）内の適応突然変異とＮＳ４Ｂ（Ｐ１９３６Ｓ）またはＮＳ５Ａ（Ｅ２１６３Ｇ）内の適応突然変異との組合せはＧ４１８耐性コロニーの形成の効率を劇的に減少させた。一方、あるＮＳ３およびＮＳ５Ａ適応突然変異の組合せは複製効率を増加させうる（Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：４６１４−４６２４，２００１）。しかし、ＮＳ３内の突然変異Ｅ１２０２ＧおよびＴ１２８０ＩがＮＳ５Ａ内のＳ２１９７Ｐと相乗的に作用して複製効率を増加させるという観察にもかかわらず（Ｋｒｉｅｇｅｒら，２００１、ならびにＫ．Ｊ．ＢｌｉｇｈｔおよびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，未公開の結果）、これらのＮＳ３の変化をＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）に改変しても、本発明者らの系においては複製は増強されなかった（図７）。この場合も、これらの結果は、種々のＨｕｈ−７細胞環境での適応突然変異の最適化が実験観察によってもたらされるものであることを強く示している。
【００１７】
ＮＳ５Ａのリン酸化は種々のＨＣＶ遺伝子型間で保存されているが（Ｒｅｅｄ，Ｋ．Ｅ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：７１８７−７１９７，１９９７）、このことは、それがウイルスの生活環において重要な役割を果たしていることを示唆している。本発明者らは、ＮＳ５Ａの高リン酸化がＨＣＶの複製に必須ではないことを既に示している（Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：１９７２−１９７４，２０００）。Ｓ２１９４がサブタイプ１ｂの主要リン酸受容部位として最近同定されたことをうけ（Ｋａｔｚｅ，Ｍ．Ｇ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８：５０１−５１３）、この位置をＡｌａまたはＡｓｐで置換し、Ｓ２２０４Ｉ適応突然変異と関連づけてＨＣＶの複製に対する効果を調べた。いくつかのＮＳ５Ａ突然変異を組合せた場合に観察される不和合性を考慮すると、異なる突然変異体の絶対的な複製効率は評価し得ないであろうが、２１９４位にこれらの置換を含有する複製性ＲＮＡが回収された。これらの結果は、Ｓ２１９４位のリン酸化がこのサブタイプ１ｂ分離体の複製のための絶対的要件ではないことを示している。
【００１８】
以下の実施例において、本発明の種々の実施形態を説明する。これらの実施例は単なる例示に過ぎないとみなされるべきであり、限定的なものではない。
【００１９】
実施例
【実施例１】
【００２０】
細胞培養およびインターフェロン処理
１０％  熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と０．１ｍＭ  非必須アミノ酸とで補足されたダルベッコ変法最少必須培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ）内でＨｕｈ−７細胞単層を増殖させた。サブゲノムレプリコンを支持する細胞の場合には、７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を該培地に加えた。まず、Ｇ４１８の非存在下で細胞を２回継代することにより、レプリコン含有Ｈｕｈ−７細胞からＨＣＶ  ＲＮＡを除去した。第３継代において、１００  ＩＵ／ｍｌのヒト白血球由来ＩＦＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で細胞を培養した。３〜４日後、コンフルエントな単層をトリプシン処理し、プレーティングし、２４時間培養した後、ＩＦＮを加えた。ＩＦＮの存在下で細胞を合計４回継代し、その第４の継代の前に、ＩＦＮの非存在下で細胞を３日間増殖させた。除去細胞系を増殖させ、初期継代レベルで凍結保存した。これらの凍結保存種ロットからの２０〜３０回未満の継代回数の細胞を使用して、更なる実験を行った。
【実施例２】
【００２１】
プラスミドの構築
すべてのプラスミドを構築し精製するためには、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いた。プライムドＤＮＡ合成をＫｌｅｎＴａｑＬＡ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＷａｙｎｅ  Ｂａｒｎｅｓにより快く提供されたもの）で行い、ＰＣＲにより増幅された領域を自動ヌクレオチド配列決定により確認した。インビトロ転写のためのプラスミドＤＮＡを大規模細菌培養から調製し、ＣｓＣｌ勾配中の遠心分離により精製した。
【００２２】
すべてのヌクレオチドおよびアミノ酸の番号は、コアコード領域から開始する、遺伝子型１ｂ  Ｃｏｎ１完全長ＨＣＶゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＪ２３８７９９）内の位置を示す。既に記載されている（５）のと実質的に同じ方法で、この配列を、逐次的ＰＣＲアッセイにおいて化学合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドから構築した。簡潔に説明すると、１６ｎｔの特有の相補的重複を有する１０〜１２個のゲル精製オリゴヌクレオチド（６０〜８０ｎｔ長）を使用して、６００〜７５０塩基に及ぶｃＤＮＡを合成した。最終的なＰＣＲ産物を精製し、適当な制限酵素で消化し、同様に切断されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）プラスミドベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内に連結した。複数の組換えクローンを配列決定し、正しいクローンを同定し、重複ｃＤＮＡ断片を合体させて以下の連続的ゲノム配列を得た：５’ＮＴＲ−Ｃ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−３−４Ａ−４Ｂ−５Ａ−５Ｂ−３’ＮＴＲ（ｐＨＣＶＢＭＦＬ）。選択可能なレプリコンｐＨＣＶｒｅｐｌｂＢａｒｔＭａｎ／ＡｖａＩＩ｛ＳＧ−Ｎｅｏ（ｗｔ）；図１｝ならびに誘導体ｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩ｛ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）｝およびｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＩ｛ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）｝（それぞれ、ＮＳ５Ａ適応突然変異、Ｓ２２０４Ｉ
およびｎｔ６９６０−７１０２の４７アミノ酸のインフレーム欠失（Δ４７ａａ）を含有する）は既に記載されている（５）（図１）。プラスミドｐＨＣＶＢＭＦＬ／Ｓ２２０４Ｉ｛ＦＬ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝は、ＮＳ５Ａ適応変化Ｓ２２０４Ｉを有する完全長ゲノムを含有する。該ゲノムおよびサブゲノム構築物では、活性部位内のＧｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ（ＧＤＤ）モチーフをＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（ＡＡＧ）に変化させる三重のアミノ酸置換を含有するＮＳ５Ｂポリメラーゼ欠損誘導体を作製し（５）、本明細書中に全体において、これはｐｏｌ−と称される。
【００２３】
ｎｅｏ遺伝子およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの代わりにユビキチンを含有するプラスミドｐＣ−Ｕｂｉ−ＮＳ３／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ｛ＳＧ−５’Ｕｂ−ＮＳ３（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝を以下のとおりに構築した。プライマー１２８９および１２９０（表１）でｐＨＣＶｒｅｐｌ２／Ｎｅｏ（Ｂｌｉｇｈｔら，未公開の結果）から増幅されＡｓｃＩ−ＳａｃＩで消化されたＰＣＲ断片と、プライマーペア１２９１／１２９２（表１）およびｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩを使用して得た第２のＰＣＲ産物のＳａｃＩ−ＢｓｒＧＩ部分とを、ＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩからのＸｂａＩ−ＡｓｃＩ断片と共にＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩのＸｂａＩおよびＢｓｒＧＩ部位間に連結した。ｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩからｎｅｏ遺伝子を欠失させるために、合成重複オリゴヌクレオチド１２８７および１２８８（表１）をハイブリダイズさせ伸長させて５’ＮＴＲとＥＭＣＶ  ＩＲＥＳとを連結させた。この産物をＡｐａＬＩおよびＡｃｌＩで消化し、ｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩからのＸｂａＩ−ＡｐａＩおよびＡｃｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片と共に、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩで消化されたｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩ内に挿入した。この構築物をｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ｛ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝と命名した。Ｓ２２０４ＩをＮＳ５ＡΔ４７で置換するために、ｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＩからのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を、同様に切断されたｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ内に連結して、ｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＩ｛ＳＧ−５’ＨＥ（５ＡΔ４７）；図１｝を得た。
【００２４】
ｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩからのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、プライマー１２９３および１２９４を使用してｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩから増幅されたＰＣＲ産物のＨｉｎｄＩＩＩ−ＡａｔＩＩ断片、ならびにｐＨＣＶＢＭＦＬ／Ｓ２２０４ＩからのＡａｔＩＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩで予め消化されたｐＨＣＶＢＭＦＬ／Ｓ２２０４Ｉ内に連結することにより、プラスミドｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶＦＬＢＭ（Ｓ２２０４Ｉ）｛ＦＬ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝を作製した。ｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩからのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶＢＭＦＬ（Ｓ２２０４Ｉ）からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片とをｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩのＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位間に連結することにより、選択可能なビシストロン性完全長ＨＣＶクローンｐＨＣＶＢＭＦＬ（Ｓ２２０４Ｉ）／Ｎｅｏ｛ＦＬ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）；図ｌ｝を構築した。
【００２５】
２２０４位に突然変異を有するプラスミドを得るために、およびＡ２１９９Ｔ単一突然変異またはＳ２１９７Ｐ／Ａ２１９９Ｔ二重突然変異をｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ内に導入するために、まず、鋳型としてのｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩをリバースプライマー１０３０および以下の突然変異フォワードプライマーの１つと共に使用して、ＰＣＲを行った：１３１９（Ｓ２２０４Ｖ）、１３２０（Ｓ２２０４Ａ）、１３２２（Ｓ２２０４Ｙ）、１３２４（Ｓ２２０４Ｅ）、１３２５（Ｓ２２０４Ｔ）、１１８４（Ｓ２２０４Ｄ）、１３２６（Ａ２１９９Ｔ＋Ｓ２２０４Ｉ）および１３２７（Ｓ２１９７Ｐ＋Ａ２１９９Ｔ＋Ｓ２２０４Ｉ）（表１）。ＰＣＲ増幅産物をＢｌｐＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩのこれらの部位内にクローニングした。ｐＨＣＶｒｅｐｌｂＢａｒｔＭａｎ／ＡｖａＩＩからのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を、同様に切断されたｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ内に挿入することにより、Ｓ２２０４を作製した。
【００２６】
ｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＣｌｏｎｅＡ（Ｑ１１１２Ｒ＋Ｓ２２０４Ｉ）を作製するために突然変異Ｑ１１１２Ｒをｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ内に設けるために、突然変異プライマー１３５８およびオリゴヌクレオチド８８５（表１）を使用して、ｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩからＮＳ３のｎｔ３６４０−３９９１をＰＣＲ増幅した。得られた産物をＢｓｒＧＩおよびＥａｇＩで消化し、連結反応混合物中でｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩからのＥａｇＩ−ＥｃｏＲＩおよびＢｓｒＧＩ−ＥｃｏＲＩ断片と一緒にした。ＮＳ３内の二重突然変異（Ｅ１２０２Ｇ＋Ｔ１２８０Ｉ）を複数工程のクローニング操作により作製した。まず、フォワードプライマー１３５９およびリバースプライマー１３５６（表１）でｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩから増幅されたＰＣＲ断片をＡｐａＬＩおよびＸｂａＩで消化し、ＮＳ３内にｎｔ３４２０−４１２４を含有する（Ｋ．Ｊ．ＢｌｉｇｈｔおよびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，未公開の結果）ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）／ＨＣＶｌｂｎｔｌ７９６−２５２４からのＥｃｏＲＩ−ＡｐａＬＩ断片と共に、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化されたｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）内にクローニングして、中間プラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）／ＨＣＶｌｂｎｔｌ７９６−２５２４ＮＳ３＊を得た。ついで、４段階のクローニング法において、ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）／ＨＣＶｌｂｎｔｌ７９６−２５２４ＮＳ３＊から切り出されたＢｓｒＧＩ−ＢｓａＡＩ断片を、ｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩからの断片ＢｓａＡＩ−ＢｓｓＨＩＩおよびＢｓｓＨＩＩ−ＥｃｏＲＩと共に、ＢｓｒＧＩおよびＥｃｏＲＩで切断されたｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ内に挿入した。得られたプラスミドをｐ５’ＮＴＲ−ＥＭＣＶ／ＨＣＶｒｅｐＢＢＶＩＩ＋ＮＳ３＊（Ｅ１２０２Ｇ＋Ｔ１２８０Ｉ＋Ｓ２２０４Ｉ）と命名した。
【００２７】
ｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩからＮＳ５Ａ内のｎｔ  ６８９７−７１８６をＰＣＲ増幅するためにプライマーペア５’Ａｌａ／１０３０および５’Ａｓｐ／１０３０（表１）を使用して、それぞれ突然変異Ｓ２１９４ＡおよびＳ２１９４Ｄを導入した。ＢｌｐＩ−ＸｈｏＩ部分を、ＢｌｐＩ−Ｘｈｏｌで消化された対応するＰＣＲ産物で置換することにより、これらの突然変異をｐＨＣＶｒｅｐｌｂ／ＢＢＶＩＩ内に組み込んだ。
【実施例３】
【００２８】
ＲＮＡ転写
完全長およびサブゲノムＨＣＶ配列を含有するプラスミドＤＮＡをＳｃａＩで線状化し、ポリオウイルスサブゲノムレプリコンをＢａｍＨＩで消化した。該線状化ＤＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１）抽出し、エタノールで沈殿させた。ペレット化ＤＮＡを８０％  エタノールで線状し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁させた。４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  スペルミジン、１０ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、３ｍＭの各ヌクレオチド三リン酸、０．０２５Ｕの無機ピロリン酸（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１００ＵのＲＮアシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１００ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２μｇの線状化ＤＮＡを含有する１００μｌの反応混合物中、ＲＮＡ転写産物を３７℃で９０分間合成した。ＲＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノールで沈殿させ、該ペレットを８０％  エタノールで洗浄した後、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁させた。１０ＵのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、６６ｍＭ  ＫＣＩ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＤＴＴ中、３７℃で２０分間の３回の連続的なＤＮアーゼ消化により、ＤＮＡ鋳型を除去した。ＤＮアーゼにより消化されたＲＮＡをフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、エタノールで沈殿させ、８０％  エタノールで洗浄した後、該ＲＮＡペレットをｄｄＨ２Ｏに再懸濁させた。２６０ｎｍの光学密度の測定によりＲＮＡ濃度を測定し、１％  アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により完全性および濃度を確認した。
【実施例４】
【００２９】
培養細胞のトランスフェクション
インビトロで転写されたＲＮＡをＨｕｈ−７およびＩＦＮ除去処理（すなわち、ＩＦＮにより除去処理された）細胞内にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。簡潔に説明すると、サブコンフルエントなＨｕｈ−７細胞をトリプシン処理により解離させ、遠心分離（５００×ｇ、５分間）により集め、ＲＮアーゼ非含有氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１．２５×１０７細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁させた。ＲＮＡ転写産物（１μｇ）を２ｍｍ  穴（ｇａｐ）キュベット（ＢＴＸ）内で０．４ｍｌの洗浄Ｈｕｈ−７細胞と混合し、直ちに、ＢＴＸ  ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒを使用してパルス（０．９２ｋＶ、９９μ秒パルス幅、５パルス）した。パルス化細胞を室温（ｒｔ）で１０分間放置して回収し、ついで１０ｍｌのＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ中に希釈した。細胞を、（ｉ）ＨＣＶ  ＲＮＡの定量および代謝標識実験には、３５ｍｍ径ウェル、（ｉｉ）免疫蛍光研究には、８ウェルチャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、または（ｉｉｉ）蛍光標識式細胞分取（ＦＡＣＳ）分析およびＧ４１８選択には、１００ｍｍ径のディッシュ内でプレーティングした。Ｇ４１８耐性コロニー形成の効率を測定するために、全細胞数が１００ｍｍ径のディッシュ当たり２×１０５細胞に維持されるよう、ｐｏｌ−ＲＮＡ転写産物でトランスフェクトされた細胞と共に、トランスフェクト化細胞を複数の密度（１×１０３〜２×１０５細胞）でプレーティングした。プレーティングの４８時間後、培地を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８で補足されたＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳと交換した。３週間後、Ｇ４１８耐性フォーカスを７％  ホルムアルデヒドで固定し、５０％  エタノール中の１％  クリスタルバイオレットで染色してコロニーの計数を容易にした。エレクトロポレーション後のＨｕｈ−７細胞の数に対するＧ４１８選択コロニーの数に基づいて、Ｇ４１８形質導入効率を計算した。
【００３０】
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ａ．Ａ．ＫｏｌｙｋｈａｌｏｖおよびＣ．Ｍ．Ｒｉｃｅ，未公開の結果）を発現するポリオウイルスサブゲノムレプリコンを同時にエレクトロポレーションすることにより、各系列のＲＮＡに関してトランスフェクション効率をモニターした。ポリオウイルスレプリコン誘発性細胞変性効果に関してトランスフェクト化細胞を観察し、蛍光倒立顕微鏡を使用してＧＦＰ発現を可視化した（トランスフェクションの１２〜１６時間後に行った）。２４時間後、生存付着細胞（恐らく、該ポリオウイルスレプリコンでトランスフェクトされていないもの）をトリプシン処理し、トリパンブルーと混合し、生細胞を計数して、エレクトロポレーションされた細胞の比率（％）を求めた。
【実施例５】
【００３１】
ウイルスＲＮＡの分析
ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を該製造業者のプロトコールに従い使用して、全細胞ＲＮＡを単離した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＨＣＶ特異的ＲＮＡレベルを定量するために、各ＲＮＡサンプルの１０分の１を使用した。ＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲコア試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ならびにＨＣＶ  ５’ＮＴＲに特異的なプライマー：
【００３２】
【化１】
2006506074.tif 000002
（センス、５０μＭ）、
【００３３】
【化２】
2006506074.tif 000003
（アンチセンス、５０μＭ）および
【００３４】
【化３】
2006506074.tif 000004
（プローブ、１０μＭ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、リアルタイム逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅を行った。ＲＴ反応物を６０℃で３０分間インキュベートし、ついで９５℃で７分間にわたり、Ｔａｑポリメラーゼの活性化と共役した逆転写酵素の不活性化を行った。９５℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクリング条件で４０サイクルのＰＣＲを行った。既知濃度の合成ＨＣＶ  ＲＮＡ標準体を反応の各組に含め、それを使用して標準曲線を算出した。ＳＤＳ  ｖ１．６．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、該リアルタイムＰＣＲのシグナルを分析した。
【実施例６】
【００３５】
ＦＡＣＳ分析
トランスフェクト化細胞単層をベルセン／ＥＤＴＡ処理により１００ｍｍ径の培養皿から取り出し、細胞を１６ゲージの針および７４μｍ孔の膜に通過させることにより単細胞懸濁液を調製した。細胞を２×１０６／ｍｌで再懸濁させ、等容量の４％  パラホルムアルデヒドを細胞懸濁液に加え、室温で２０分間インキュベートした。固定された細胞をＰＢＳで２回洗浄し、得られた細胞ペレットを２×１０６細胞／ｍｌで０．１％  サポニン／ＰＢＳに再懸濁させた。室温で２０分間インキュベートした後、３％  ＦＢＳ／０．１％  サポニン／ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌに希釈されたＨＣＶ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ；コア（Ｃ７５０）、ＮＳ３（１Ｂ６）およびＮＳ５Ｂ（１２Ｂ７）；すべて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ＧｅｒｍａｎｙのＤａｒｉｕｓ  Ｍｏｒａｄｐｏｕｒにより快く提供されたものである）で細胞を染色した（室温で１時間）。細胞を０．１％  サポニン／ＰＢＳで３回洗浄し、３％  ＦＢＳ／０．１％  サポニン／ＰＢＳ中で１：１０００に希釈されたＡｌｅｘａ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）結合抗マウスＩｇＧと共に室温で１時間インキュベートすることにより結合ｍＡｂを検出した。染色細胞を０．１％  サポニン／ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣＳフローバッファー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁させ、直ちに、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【実施例７】
【００３６】
間接免疫蛍光
８ウェルチャンバースライドに播かれエレクトロポレーションされたＨｕｈ−７．５細胞をＰＢＳで洗浄し、４％  パラホルムアルデヒドで室温で２０分間固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１％  サポニン／ＰＢＳと室温で２０分間インキュベートすることにより透過性促進させ、３％  ヤギ血清で室温で２０分間ブロッキングした。ＮＳ５Ｂ  ｍＡｂ（１２Ｂ７）を０．１％  サポニン／３％  ヤギ血清／ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、室温で１時間インキュベートし、ついで０．１％  サポニン／ＰＢＳで３回した。０．１％  サポニン／３％  ヤギ血清／ＰＢＳ中で１：１０００に希釈されたＡｌｅｘａ  ４８８結合抗マウスＩｇＧと共に室温で１時間インキュベートすることにより、結合ｍＡｂを検出した。ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で核を室温で２０分間染色した。未結合蛍光コンジュゲートを０．１％  サポニン／ＰＢＳでの３回の洗浄により除去し、細胞をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内にマウントし、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００）で観察した。
【実施例８】
【００３７】
タンパク質の代謝標識および免疫沈降
３５ｍｍ径のウェル内の細胞単層を、正常濃度の１／４０のメチオニン、５％  透析ＦＢＳおよびＥｘｐｒｅｓｓ  ３５Ｓタンパク質標識混合物（１４０μＣｉ／ｍｌ；ＮＥＮ）を含有するメチオニン・システイン欠損ＭＥＭ中、０．５〜１０時間インキュベートした。標識細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、２００μｌのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）細胞溶解バッファー（０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１％  ＳＤＳ、１×完全プロテアーゼインヒビター混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、８０μｇ／ｍｌ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））中で集め、２７．５ゲージの針への反復通過により細胞ＤＮＡをせん断した。等量のタンパク質ライセート（５０μｌ）を７５℃で１０分間加熱し、遠心分離により清澄化した後、２００μｌのＴＮＡ（１ｍｌ当たり５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６７％  ウシ血清アルブミン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３３％  トリトンＸ−１００、８０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）と混合した。１μｌのＨＣＶ陽性患者の血清（ＪＨＦ）を加え、振とうしながら４℃で一晩インキュベートすることにより免疫複合体を形成させた。予め洗浄された５０μｌのパンソルビン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）細胞（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を加え、振とうしながら室温で１〜２時間インキュベートすることにより、免疫複合体を集めた。免疫沈降物を遠心分離により集め、ＴＮＡＳ（０．１２５％  ＳＤＳを含有するＴＮＡ）中で３回、ＴＮＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、８０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ）で１回洗浄し、タンパク質サンプルバッファー中で８０℃で２０分間加熱することにより可溶化し、ＳＤＳ−１０％  ポリアクリルアミドゲル上で分離した。代謝的に標識されたタンパク質をフルオログラフィーにより可視化した。
【実施例９】
【００３８】
ＨＣＶの複製に対して許容性である細胞系
２２個のＧ４１８耐性クローン（Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．２０００）から、ＨＣＶ  ＮＳ領域内にアミノ酸変化を有さないＳＧ−Ｎｅｏサブゲノムレプリコンを含有するクローンＨｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７．７、ならびにＮＳ５Ａ内の２２０４位にＳｅｒからＩｌｅへの変化を有するレプリコンを含有するクローンＨｕｈ−７．４を除去に付した。また、ＮＳ５Ａ内のＳ２２０４Ｉ｛ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝または４７アミノ酸のＮＳ５Ａ欠失｛ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡＡ４７）；図１｝を含有するサブゲノムレプリコンのトランスフェクションの後にＧ４１８で選択された未クローン化集団系Ｈｕｈ−７／Ｓ２２０４ＩおよびＨｕｈ−７／５ＡΔ４７（Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．２０００）をＩＦＮで処理した。ＨＣＶの複製をＨｕｈ−７細胞が支持する能力がＩＦＮ処理のみによって改変されうる可能性を排除するために、平行して、親Ｈｕｈ−７細胞をＩＦＮで処理した。ＩＦＮ処理の後、３’ＮＴＲに特異的なネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲ（その検出限界は〜１０分子のＨＣＶ  ＲＮＡである（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖ，Ａ．Ａ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３６３−３３７１））およびＧ４１８に対する感受性により、細胞はＨＣＶ  ＲＮＡを欠くことが示された。
【００３９】
ＨＣＶの複製をＩＦＮ除去処理細胞系が支持する能力を調べるために、Ｇ４１８で選択可能な３個のレプリコン、すなわち、親Ｈｕｈ−７細胞においてそれぞれ１０％、０．２％および０．０００５％のＧ４１８形質導入効率を有するＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）およびＳＧ−Ｎｅｏ（ｗｔ）（図１）を使用した（Ｂｌｉｇｈｔ，Ｋ．Ｊ．２０００）。インビトロで合成されたＲＮＡをＩＦＮ除去処理された細胞内にエレクトロポレーションし、４８時間後、Ｇ４１８選択を行い、固定および染色後、得られたコロニーを計数した。エレクトロポレーション後にプレーティングされたＨｕｈ−７細胞の数に対するＧ４１８選択コロニー数に基づいて、形質導入効率を計算した。ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）の複製を支持しうるＨｕｈ−７．５細胞の頻度は親Ｈｕｈ−７細胞より〜３倍高かった（図２）。細胞系Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７．８では、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）のトランスフェクション後に得られたＧ４１８耐性コロニーの数は、親Ｈｕｈ−７細胞の場合より有意に大きかった（それぞれ〜３３および９倍の増加；図２）。Ｈｕｈ−７．４においても同様であったが、この場合には、コロニー形成の頻度の増加はそれほど大きくはなかった（〜３倍；図２）。また、ＳＧ−Ｎｅｏ（ｗｔ）レプリコンはＨｕｈ−７．５、Ｈｕｈ−７．８およびＨｕｈ−７．４細胞における複製能の増強を示した（それぞれ１０、２および２倍の増加；図２）。
【００４０】
除去処理された２つの細胞集団Ｈｕｈ−７／５ＡΔ４７およびＨｕｈ−７／Ｓ２２０４Ｉは、該集団系内に元々存在する適応レプリコンＲＮＡのトランスフェクション後のＧ４１８形質導入効率における比較しうる又は若干の増加を示した（図２）。Ｈｕｈ−７／５ＡΔ４７細胞にＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）をエレクトロポレーションした場合には、Ｇ４１８耐性コロニーの頻度は〜２．５倍増加し、一方、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）でのトランスフェクションはＧ４１８形質導入効率における若干の減少を引き起こした（図２）。しかし、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）でのＨｕｈ−７／Ｓ２２０４Ｉ細胞のトランスフェクション後に、コロニー形成における２３倍の減少が観察された（図２）。親Ｈｕｈ−７細胞とＩＦＮ処理Ｈｕｈ−７細胞との間で、Ｇ４１８耐性コロニー形成における有意な相違は認められなかったが（データ非表示）、このことは、ＩＦＮ媒介除去プロトコールが、ＨＣＶの複製をこれらの細胞が支持する能力に安定には影響を及ぼさなかったことを示している。ポリメラーゼ欠損レプリコンＲＮＡ（ｐｏｌ−）を平行にトランスフェクトした場合には、Ｇ４１８耐性コロニーは観察されなかった（データ非表示）。したがって、除去処理されたクローン系における、より高い頻度の細胞、特に、適応突然変異を伴わないＲＮＡの複製を元々支持しうるもの（Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７．８）が、ＨＣＶの複製に対して許容性である。
【実施例１０】
【００４１】
非選択Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞におけるＨＣＶの複製
試験したもののなかでは、除去処理されたＨｕｈ−７．５系が最も許容性であったため、本発明者は、いくつかの異なる方法を用いて、親Ｈｕｈ−７細胞と比較して、この亜系統においてＨＣＶの複製を調べた。本発明者は、Ｇ４１８選択の必要性を伴わずにトランスフェクション後に早期にＨＣＶの複製の評価を可能にする一過性アッセイに焦点を合わせた。ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）およびＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）ＲＮＡ（図１）でのトランスフェクションの９６時間後、Ｈｕｈ−７．５およびＩＦＮ処理Ｈｕｈ−７細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより定量した。投入ＲＮＡと生産的複製により生じたＲＮＡとの識別が可能となるよう、平行して、複製欠損レプリコン（ｐｏｌ−）をトランスフェクトした。図３に示すとおり、トランスフェクト化Ｈｕｈ−７．５細胞においては、ＨＣＶ  ＲＮＡのレベルは、一貫して、ｐｏｌ−対照の場合より高かった。ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）およびＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）ＲＮＡでのトランスフェクションは、Ｈｕｈ−７．５細胞においては、それぞれ４１０倍および２８倍の増加を引き起こしたが（図３、レーン４および５）、Ｈｕｈ−７細胞においては僅か８５倍および６倍の増加を引き起こしたに過ぎなかった（図３、レーン１０および１１）。これらの増加は、複製欠損ｐｏｌ−対照と比較して測定されているため、それらは、投入ＲＮＡの分解に対する新たに合成されたＲＮＡの蓄積を反映している。Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞においては、残留ｐｏｌ−ＲＮＡのレベルは各時点で約１０倍減少した。Ｈｕｈ−７．５細胞においては、ＲＮＡは、｛ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）のように｝良好な複製能を有し、時間経過と共に蓄積する傾向にあり、９６時間までに約１０倍の増加が観察された。｛ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）のように｝より低い複製能を有するものは一定のままであるか、または若干減少したが、ｐｏｌ−対照のレベルには達しなかった。Ｈｕｈ−７細胞では、状況は多少異なっていた。例えば、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）ＲＮＡは比較的一定のままであり、一方、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）ＲＮＡは時間経過と共に減少したが、この場合にも、ｐｏｌ−対照ほどには減少しなかった。
【００４２】
この知見は、ＦＡＣＳ分析により測定したＮＳ３陽性細胞の頻度によって示された。ＮＳ３陽性細胞の比率（％）は、一貫して、Ｈｕｈ−７．５細胞においては｛ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）では２１％およびＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）では５％；図３、レーン４および５｝、Ｈｕｈ−７細胞の場合｛ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）では３％ならびにＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）およびｐｏｌ−ＲＮＡでは検出不能；図３、レーン７および１１｝より高かった。より大きな割合のＨｕｈ−７．５細胞が、検出可能なレベルのＨＣＶの複製を支持するという、本発明者らのこれまでの結論を、これらの結果は確認している。ＦＡＣＳにより定量したＨＣＶ抗原陽性細胞の頻度が、Ｇ４１８形質導入効率の場合と比較して低いのは、ＨＣＶ特異的抗体によって様々となるＦＡＣＳ分析の感度（未公開の観察）に起因する。
【００４３】
トランスフェクションの９６時間後に、細胞を代謝的に標識することにより、ＨＣＶタンパク質の蓄積を調べた。３５Ｓ−メチオニンおよび−システインで細胞単層を１０時間標識し、ついでＳＤＳ媒介細胞溶解を行い、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａを認識するＨＣＶ陽性患者の血清（ＪＨＦ）（Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１３８５−１３９５）でＨＣＶタンパク質の免疫沈降を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる標識タンパク質の分離の後、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａは、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）でトランスフェクトされたＨｕｈ−７．５細胞（図３、レーン４）において視覚的に観察されうる過ぎなかった。ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）、ｐｏｌ−またはＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）ＲＮＡでトランスフェクトされたＨｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞においては（図３、レーン１、５、７、１０および１１）、ＨＣＶタンパク質は何ら検出されなかった。アクチノマイシンＤの存在下のＨＣＶ  ＲＮＡの代謝標識の後でも、同様の結果が得られた（データ非表示）。これらの分析は、ＲＮＡ蓄積、ＦＡＣＳ分析およびウイルスタンパク質の代謝標識によるＨＣＶの複製の迅速な分析のためにＨｕｈ−７．５細胞を使用する利点を示している。
【実施例１１】
【００４４】
サブゲノムおよびゲノムＨＣＶ  ＲＮＡの複製効率
選択を行うことなくＨＣＶの複製をモニターしうることにより、ビシストロン性レプリコンの必要性がなくなり、最小異種要素を有する構築物の試験が可能となった。ＨＣＶ  ５’ＮＴＲとコアの１２アミノ酸とがユビキチンおよびそれに続くＮＳ３−５Ｂコード領域（ＮＳ５Ａ内にＳ２２０４Ｉ適応突然変異を含む）および３’ＮＴＲに融合したコアサブゲノムレプリコン｛ＳＧ−５’Ｕｂ−ＮＳ３（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝を構築した。このポリタンパク質においては、細胞ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼはユビキチン／ＮＳ３連結部で切断して、基準となる（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）Ｎ末端Ａｌａ残基を有するＮＳ３を産生する（２，２１）。インビトロで合成されたＲＮＡをＨｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞内にエレクトロポレーションし、９６時間後にＲＴ−ＰＣＲによりＨＣＶ  ＲＮＡのレベルを定量した。驚くべきことに、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルはｐｏｌ−対照とは異ならなかったが（データ非表示）、このことは、ＳＧ−５’Ｕｂ−ＮＳ３（Ｓ２２０４Ｉ）ＲＮＡが複製されなかったことを示している。ユビキチンが機能的ＮＳ３タンパク質の産生を妨げうる可能性がある。しかし、ユビキチン／ＮＳ３−５Ｂの発現がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの制御下にあるビシストロン誘導体はＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）ＲＮＡと同等に複製されたが（データ非表示）、このことは、ＨＣＶ  ＩＲＥＳにより駆動される翻訳が、コア−ユビキチンコード配列内に存在するＲＮＡ要素に感受性でありうることを示唆している。
【００４５】
ｎｅｏを欠くがＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを保有するレプリコン（ＳＧ−５’ＨＥ誘導体；図１）も試験した。ｐｏｌ−対照に対するＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）およびＳＧ−５’ＨＥ（５ＡΔ４７）ＲＮＡレベルをトランスフェクションの９６時間後に測定したところ、それは、Ｈｕｈ−７．５細胞およびＨｕｈ−７．５細胞の両方において、選択可能体より高いことが判明した（図３）。さらに、ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）およびＳＧ−５’ＨＥ（５ＡΔ４７）ＲＮＡのレベルは、Ｈｕｈ−７．５細胞においては、Ｈｕｈ−７細胞の場合より有意に高かった（図３、レーン２、３、８および９）。ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）のトランスフェクション後には、Ｈｕｈ−７．５細胞の約５２％がＮＳ３抗原に関して陽性に染色され、一方、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）ＲＮＡでは２１％であった（図３、レーン２および４）。同様に、ＳＧ−５’ＨＥ（５ＡΔ４７）でのエレクトロポレーション後には、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）の場合より高い頻度のＨｕｈ−７．５細胞がＮＳ３を発現した（１１％対５％;図３、レーン３および５）。予想どおり、トランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞においては、より低い頻度のＮＳ３陽性細胞が観察された（図３）。Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞からの免疫沈降３５Ｓ標識ＨＣＶタンパク質の相対量はＮＳ３陽性細胞の頻度および相対ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの両方に対応した（図３）。これらのデータは、ｎｅｏ遺伝子を欠くレプリコンが、より効率的にＲＮＡの複製を開始することを示している。これらの構築物は、高許容性Ｈｕｈ−７．５亜系統と共に、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に関する遺伝的研究のための貴重な手段であり、それらのいくつかは本明細書中に後記されている。
【００４６】
また、ＮＳ５Ａ内にＳ２２０４Ｉを含有する完全長ＨＣＶ  ＲＮＡ｛ＦＬ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝の複製をＨｕｈ−７．５細胞が支持する能力を評価した。Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞のトランスフェクションの９６時間後、ＨＣＶ  ＲＮＡおよびタンパク質の相対レベルを前記のとおりに測定した。Ｈｕｈ−７．５細胞のトランスフェクション後には、ｐｏｌ−に対するＨＣＶ  ＲＮＡにおける５０倍の増加が観察され、一方、Ｈｕｈ−７細胞では３倍の増加が観察されたに過ぎなかった（図３、レーン６および１２）。同様に、代謝的に標識されたタンパク質の免疫沈降およびＦＡＣＳ分析は、ＦＬ  ＲＮＡでトランスフェクトされたＨｕｈ−７細胞においてはＨＣＶ抗原の発現を検出しなかったが、Ｈｕｈ−７．５細胞の１４％および１０％はそれぞれコア抗原およびＮＳ３抗原を発現し、３５Ｓ標識ＮＳ３が検出可能であった（図３、レーン６および１２）。コア抗原陽性細胞の頻度は、一貫して、ＮＳ３関して見られるものより高かったが、これは恐らく、抗体アフィニティーにおける相違を反映しているのであろう。完全長ＨＣＶ  ＲＮＡがＨｕｈ−７．５細胞内で複製を確立しうることは、複製が、ＨＣＶコード化レプリカーゼ成分の、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳにより駆動される翻訳に依存したものではないことを示している。実際、ＨＣＶ  ５’ＮＴＲの下流へのＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの組込み｛ＦＬ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝、またはｎｅｏ遺伝子が付加されたビシストロン性構築物の作製｛ＦＬ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）；図１｝は、ＦＬ（２２０４Ｉ）ＲＮＡの場合と比較して複製を妨げた（図４）。完全なＨＣＶコード配列を含有する構築物のすべて（Ｓ２２０４Ｉを含有するＦＬ、ＦＬ−５’ＨＥおよびＦＬ−Ｎｅｏ）が、複製の確立において、構造ＮＳ２コード領域を欠くサブゲノムレプリコン｛例えば、ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）；図４｝ほど効率的ではないことに注目することは興味深い。このことは、ゲノムのこの領域においてコードされるシスＲＮＡ要素またはタンパク質がこの系におけるＨＣＶの複製の効率をダウンレギュレーションしうることを示唆している。それにもかかわらず、Ｈｕｈ−７．５細胞がＦＬおよびＦＬ−Ｎｅｏ  ＲＮＡの両方の複製を支持しうることにより、粒子集合における段階を研究するために、および宿主細胞生物学に対する全ＨＣＶタンパク質相補体の影響を調べるために有用でありうる系がもたらされる。
【実施例１２】
【００４７】
ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＮＳ３およびＮＳ５Ａ内の突然変異の効果
これまでのところ、同定されている最良の単一突然変異体はＮＳ５Ａ内のＳ２２０４Ｉ置換である。この位置におけるＩｌｅの重要性を調べるために、また、複製効率が更に改善されうるかどうかを検討するために、多数の他のアミノ酸をこの位置において試験し、これらのレプリコンの複製効率をＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）または未修飾の親ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４）（図５）の場合と比較した。ＨＣＶ  ＲＮＡレベルをＳＧ−ｐｏｌ−対照と比較することにより、ＲＮＡトランスフェクト化Ｈｕｈ−７．５細胞において複製能を評価した。２２０４位にＩｌｅまたはＶａｌを含有するレプリコンでは、９６時間の時点で、比較しうるレベルのＨＣＶ  ＲＮＡが観察されたが、Ａｌａ置換は、ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）と比較してＨＣＶ  ＲＮＡにおける３倍の減少を引き起こした（図５）。これとは対照的に、残りのアミノ酸置換は、未修飾親レプリコンＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４）に類似したレベルにまでＨＣＶ  ＲＮＡを劇的に減少させた（〜１４００倍の減少；図５）。予想どおり、相対ＨＣＶ  ＲＮＡレベルは、トランスフェクションの２４および４８時間後には、より低かったが、これらのレベルは、４８時間の時点での複製能を評価するのに十分なものであった（図５）。Ｓ２２０４Ｉで観察されるもの以上にサブゲノム複製を増強する置換は見出されなかったが、ＶａｌおよびＡｌａは、効率的なＲＮＡ複製を可能にした。
【００４８】
ＮＳ５Ａ内に複数の適応突然変異を含有するサブゲノムレプリコンの複製効率を調べた。ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２１９７Ｐ、Ａ２１９９ＴおよびＳ２２０４Ｉは、独立して、Ｇ４１８耐性コロニー形成をそれぞれ約２，５００倍、１５，０００倍および２０，０００倍増強する（５）。Ａ２１９９ＴまたはＡ２１９９Ｔのいずれか及びＳ２１９７Ｐと共にＳ２２０４Ｉを含有するＳＧ−５’ＨＥレプリコン（図１）を構築し、Ｈｕｈ−７．５細胞におけるＨＣＶ  ＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した。これらのＮＳ５Ａ突然変異の組合せは、ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）と比較してＨＣＶ  ＲＮＡレベルにおける減少を引き起こし、Ａ２１９９ＴおよびＳ２２０４Ｉの組合せでは１３倍の減少、３つ全てが組合された場合には、無視しうる複製が生じた（図６）。これらのＮＳ５Ａ適応突然変異の単体のそれぞれは複製を増強することが観察されたが、組合されると、サブゲノムＲＮＡの複製能は減少した。このことは、これらの組合せが不和合性であることを示唆している。
【００４９】
１１１２位（ＱからＲへ）、１２０２位（ＥからＧへ）および１２８０位（ＴからＩへ）のＮＳ３の変化をＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）内に施し（図１）、ＨＣＶ  ＲＮＡレベル、抗原陽性細胞の頻度を測定することにより、および３５Ｓ標識タンパク質を検出することにより（トランスフェクションの９６時間後に行った）、それらの複製をＨｕｈ−７．５細胞において比較した。ｐｏｌ−  ＲＮＡ対照に対する同等レベルのＨＣＶ  ＲＮＡが各レプリコンで観察された（図７Ａ）。ＦＡＣＳ（〜３０％；図７Ａ）および免疫蛍光（図７Ｂ）により検出されたＮＳ５Ｂ陽性細胞の比率（％）も同様であった。一方、ＮＳ３陽性細胞の頻度は、ＮＳ３突然変異を含有するレプリコンでは、より高かったが（〜７３−８７％；図７Ａ）、これは単に、これらのＮＳ３突然変異体に対するＮＳ３特異的抗体のアフィニティーの変化を反映しているに過ぎない可能性がある。最後に、免疫沈降したＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａのレベルは比較しうるものであった（図７Ａ）。Ｑ１１１２Ｒの単体が適応性であることは証明されなかったが、Ｋｒｉｅｇｅｒらは、Ｅ１２０２ＧおよびＴ１２８０Ｉの単体または組合せが複製効率をそれぞれ〜１３倍、６倍および２５倍増加させたと既に報告している（Ｋｒｉｅｇｅｒら，２００１）。これらのＮＳ３適応突然変異は、ＮＳ５Ａ内のＳ２２０４Ｉと組合せた場合には、複製をそれ以上は増強しない。
【実施例１３】
【００５０】
Ｓ２１９４  ＮＳ５Ａリン酸化部位の突然変異誘発
ＨＣＶの複製におけるＮＳ５Ａのリン酸化の役割は依然として謎である。ＮＳ５Ａ内に異なる適応突然変異誘発を有するレプリコン間のＮＳ５Ａのリン酸化の度合における相違が既に認められている（Ｂｌｉｇｈｔら，２０００）。例えば、Ｓ２１９７Ｃ、Ｓ２１９７ＰまたはＳ２２０４Ｉを有するレプリコンは、免疫沈降ＮＳ５Ａの一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離による評価では、最低限度のｐ５８を発現するか又はｐ５８を全く発現しなかった。このことは、ＮＳ５Ａの高リン酸化がＨＣＶの複製に必須ではないことを示唆している。最近、サブタイプ１ｂ分離体のＮＳ５Ａ内のＳ２１９４がｐ５６のリン酸化の主要部位として同定された（Ｋａｔｚｅら，２０００）。ＮＳ５Ａ  Ｓ２１９４のリン酸化のための考えられうる要件を評価するために、リン酸化をそれぞれ除去または模擬するためにＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）においてこの残基をＡｌａ（Ｓ２１９４Ａ＋Ｓ２２０４Ｉ）またはＡｓｐ（Ｓ２１９４Ｄ＋Ｓ２２０４Ｉ）に突然変異させた。Ｈｕｈ−７細胞におけるこれらのレプリコンのＧ４１８形質導入効率はＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）より有意に低かった（１２０倍および１７倍低い；図８Ａ）。この位置における復帰によりＧ４１８耐性フォーカスが生成された可能性を排除するために、全細胞ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりＮＳ５Ａコード領域を増幅し、直接的に配列決定した。２１９４位における元のＡｌａおよびＡｓｐ置換が確認された（データ非表示）。変化を相殺する考えられうるもう１つの部位の影響を最小限にするために、ＨＣＶ  ＲＮＡおよびタンパク質の発現をＨｕｈ−７．５細胞のＲＮＡトランスフェクションの９６時間後に測定した。ｐｏｌ−対照に対するＳ２１９４Ａ＋Ｓ２２０４ＩおよびＳ２１９４Ｄ＋Ｓ２２０４ＩのＨＣＶ  ＲＮＡレベルはＳＧ−Ｎｅｏ（ＳＳ２２０４Ｉ）より〜３７倍および５倍低かった（図８Ｂ）。このことは、それらがＨｕｈ−７細胞をＧ４１８耐性にする能力の低下に符合している。また、Ｓ２１９４Ａ＋Ｓ２２０４Ｉにおいては、Ｓ２１９４Ｄ＋Ｓ２２０４Ｉの場合より低い頻度のＮＳ５Ｂ陽性細胞が明らかであり、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）およびＳ２１９４Ｄ＋Ｓ２２０４ＩでトランスフェクトされたＨｕｈ−７．５細胞においては、３５Ｓ標識ＮＳ３およびＮＳ４Ｂが検出可能であるに過ぎなかった（図８）。Ｓ２１９４Ａ＋Ｓ２２０４Ｉから及びＳ２１９４Ｄ＋Ｓ２２０４Ｉから発現されたＮＳ５Ａのリン酸化状態を直接的に研究することは不可能であった。なぜなら、一過的にトランスフェクトされた細胞内で発現されたＮＳ５Ａのレベルが検出限界未満だったからである（図８およびデータ非表示）。Ｓ２１９４置換とＳ２２０４Ｉ適応変化との組合せが不和合性となる可能性があることを考慮すると、Ｇ４１８形質導入および複製効率における定量的相違の解釈は困難であるが、これらのデータは、Ｓ２１９４のリン酸化がＨＣＶの複製のための絶対的要件ではないことを示している。
【００５１】
図面の説明
図１。この研究において使用したＨＣＶ  ＲＮＡの概要図。５’および３’ＮＴＲの構造が示されており、ＯＲＦが中空の枠で示されており、ここで、ポリタンパク質の切断産物が示されている。コアコード領域の最初の１２アミノ酸（黒塗りの枠）、ｎｅｏ遺伝子（Ｎｅｏ；影付きの枠）、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ；実線）およびユビキチン（線影付きの枠）が示されている。ＮＳ５Ａ適応突然変異Ｓ２２０４Ｉ（＊）およびΔ４７ａａの位置が示されている。
【００５２】
図２。ＨＣＶの複製に関して高許容性のＨｕｈ−７系の同定。十分なＩＦＮ処理により自己複製性サブゲノムＲＮＡが除去されたＨｕｈ−７細胞に１μｇの該サブゲノムレプリコン、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）およびＳＧ−Ｎｅｏ（ｗｔ）をエレクトロポレーションした。４８時間後、細胞をＧ４１８選択に付し、得られたコロニーを固定し、クリスタルバイオレットで染色した。代表的なプレートが示されており、１００ｍｍ径のディッシュ当たりに播いたトランスフェクト化細胞の数が左側に示されている。各ディッシュの下の数は該レプリコンの算出Ｇ４１８形質導入効率を意味する。Ｇ４１８形質導入効率を測定するために、トランスフェクト化細胞を、ｐｏｌ−レプリコンでエレクトロポレーションされたフィーダー細胞と共に、１００ｍｍ径のディッシュ当たり５×１０５から１０３細胞まで系列的（ｓｅｒｉａｌｌｙ）に力価測定した。得られたＧ４１８耐性フォーカスを少なくとも３細胞の密度に関して計数し、最初にプレーティングされたエレクトロポレーション化細胞の数でコロニーの数を割り算した後、相対Ｇ４１８形質導入効率をパーセントで表した。２つの独立したトランスフェクションにおいても同様の形質導入効率が得られた。平行して、ＧＦＰを発現するポリオウイルスサブゲノムレプリコン（「方法」を参照されたい）をエレクトロポレーションした。ＧＦＰ陽性細胞の割合およびレプリコン誘発性細胞変性の両方に基づけば、通常は、細胞の〜９０％がトランスフェクトされた。ＮＴ＝試験せず。
【００５３】
図３．ＨＣＶ  ＲＮＡで一過的にトランスフェクトされたＨｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞におけるＨＣＶのタンパク質およびＲＮＡの検出。最上部パネル：Ｈｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞をサブゲノムレプリコン、ｐｏｌ−（レーン１および７）、ＳＧ−５’ＨＥ（Ｓ２２０４Ｉ）（レーン２および８）、ＳＧ−５’ＨＥ（５ＡΔ４７）（レーン３および９）、ＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）（レーン４および１０）、ＳＧ−Ｎｅｏ（５ＡΔ４７）（レーン５および１１）およびＦＬ（Ｓ２２０４Ｉ）ＨＣＶ  ＲＮＡ（レーン６および１２）でトランスフェクトした。トランスフェクションの９６時間後、３５Ｓ−メチオニンおよび−システインの存在下、単層を１０時間インキュベートした。標識細胞を細胞溶解し、ＨＣＶ陽性ヒト血清（ＪＨＦ、抗ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａ）で免疫沈降させ、標識タンパク質をＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥにより分離した。レーン６および１２（２×）においては、免疫沈降サンプルの２倍の量をローディングしたことに注目すべきである。左側には分子量基準体（ＭＷ）の移動度が示されており、右側にはＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａおよび５ＡΔ４７の移動度が示されている。中央パネル：全細胞ＲＮＡをトランスフェクションの９６時間後に抽出し、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルに関して定量した（「材料および方法」に記載のとおりに行った）。ｐｏｌ−欠損レプリコンに対するＨＣＶ  ＲＮＡの比率（ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−）が示されている。３つの独立した実験において、ｐｏｌ−対照に対するＨＣＶ  ＲＮＡレベルは比較しうるものであった。下部の２つのパネル：トランスフェクションの９６時間後、細胞を４％  パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％  サポニンで透過性促進させ、ＨＣＶコアまたはＮＳ３抗原に関して染色し、ＦＡＣＳにより分析した。イソタイプが一致した無関係なＩｇＧに対する、コアおよびＮＳ３を発現する細胞の比率（％）が示されている。１．５未満の値は陰性（−）とみなした。
【００５４】
図４。完全長ＨＣＶ  ＲＮＡでＨｕｈ−７．５細胞をトランスフェクトした後のＨＣＶ  ＲＮＡの蓄積。１μｇのインビトロ転写ＲＮＡをＨｕｈ−７．５内にエレクトロポレーションし、２×１０５細胞を３５ｍｍ径のウェル内でプレーティングした。全細胞ＲＮＡをトランスフェクションの２４、４８および９６時間後に単離し、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを定量した（「材料および方法」に記載のとおりに行った）。ｐｏｌ−欠損サブゲノムＲＮＡに対するＨＣＶ  ＲＮＡの比率（ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−）をトランスフェクション後の時間に対してプロットした。この実験を繰返したところ、同様の結果が得られた。
【００５５】
図５。ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対する２２０４位における代替的置換の効果。示されているアミノ酸置換を含有する１μｇのＳＧ−５’ＨＥレプリコンをＨｕｈ−７．５細胞にトランスフェクトし、２×１０５細胞を３５ｍｍ径のウェル内でプレーティングした。培養内で２４、４８および９６時間後、全細胞ＲＮＡを抽出し、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを測定した（「材料および方法」に記載のとおりに行った）。ｐｏｌ−欠損サブゲノムＲＮＡに対するＨＣＶ  ＲＮＡの比率（ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−）をトランスフェクション後の時間に対してプロットした。ｐｏｌ−を上回るＨＣＶ  ＲＮＡにおける増加が各棒グラフの上に示されている。この図において、ｐｏｌ−に対するＨＣＶ  ＲＮＡのレベルは、本発明者がこれまでに達成したもののなかで最高のものである。これらのＲＮＡを、もう一度、Ｈｕｈ−７．５細胞内にトランスフェクトしたところ、ＨＣＶ  ＲＮＡの蓄積における同様の傾向が観察された。
【００５６】
図６。ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＮＳ５Ａ適応突然変異の組合せに対する効果。サブゲノムレプリコンをＨｕｈ−７．５細胞内にトランスフェクトし、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを、図５に記載のとおりに定量した。ｐｏｌ−欠損サブゲノムＲＮＡに対するＨＣＶ  ＲＮＡの比率（ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−）をトランスフェクション後の時間に対してプロットした。ｐｏｌ−を上回るＨＣＶ  ＲＮＡにおける増加が各棒グラフの上に示されている。さらなるトランスフェクション実験は、ここに示されているのと同様のＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−比率を与えた。
【００５７】
図７。ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＮＳ３およびＮＳ５Ａ突然変異の組合せの効果。Ｓ２２０４Ｉを含有しＮＳ３内に更なる突然変異を含有しｎｅｏを欠くサブゲノムレプリコンを作製した。（Ａ）最上部：Ｈｕｈ−７．５細胞のＲＮＡトランスフェクションの９６時間後、単層を３５Ｓタンパク質標識混合物で標識し、細胞溶解し、ＮＳ３、ＮＳ４ＡおよびＮＳ５Ａを免疫沈降、ＳＤＳ−１０％  ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析した。左側に分子量基準体の位置が示されており、右側にＨＣＶ特異的タンパク質が示されている。中央部：全細胞ＲＮＡをトランスフェクションの９６時間後に抽出し、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルを定量した（「材料および方法」に記載のとおりに行った）。ｐｏｌ−陰性対照に対するＨＣＶ  ＲＮＡの比率（ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−）が示されている。２つの独立した実験において、比較しうる比率が得られた。下部の２つのパネル：トランスフェクションの９６時間後、細胞を４％  パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％  サポニンで透過性促進させ、ＨＣＶ  ＮＳ３およびＮＳ５Ｂ抗原に関して染色し、ＦＡＣＳにより分析した。イソタイプが一致した無関係なＩｇＧに対する、ＮＳ３およびＮＳ５Ｂを発現する細胞の比率（％）が示されている。１．５未満の値は陰性（−）とみなした。（Ｂ）８ウェルチャンバースライド内に播いたトランスフェクト化細胞を固定し、透過性促進させ、免疫蛍光によりＮＳ５Ｂに関して染色した（培養内で９６時間後に行った）。核をＨｏｅｓｃｈｔ  ３３３４２で対比染色し、染色細胞を蛍光顕微鏡検査（×４０の倍率）により可視化した。
【００５８】
図８。ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＳ２１９４ＡおよびＳ２１９４Ｄ突然変異の効果。選択可能なビスシストロンレプリコンＳＧ−Ｎｅｏ（Ｓ２２０４Ｉ）において、Ｓ２１９４をＡｌａまたはＡｓｐにより置換し、ＲＮＡをインビトロで転写した。（Ａ）ＲＮＡ転写産物をＨｕｈ−７細胞内にトランスフェクトし、Ｇ４１８により選択されたコロニーを固定し、クリスタルバイオレットで染色した。相対Ｇ４１８形質導入効率が各ディッシュの下に示されている。（Ｂ）トランスフェクションの９６時間後、Ｈｕｈ−７．５細胞を３５Ｓ−メチオニンおよび−システインで１０時間標識した。細胞を細胞溶解し、ＮＳ３、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５Ａに特異的な患者の血清を使用してＨＣＶタンパク質を免疫沈降により単離した。ＨＣＶタンパク質およびタンパク質分子量基準体の位置（キロダルトン単位）が示されている。トランスフェクションの９６時間後のｐｏｌ−陰性対照に対するＨＣＶ  ＲＮＡの比率（ＨＣＶ  ＲＮＡ／ｐｏｌ−）が各移動路の下に示されている。示されている結果は、２つの独立したトランスフェクションの代表例である。
【００５９】
本明細書に記載され例示されている構築物および方法には、本発明の範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうるため、前記の説明に含まれる又は添付図面に示されている全てのものは、限定的なものではなく例示的なものであると解釈されると意図される。したがって、本発明の広さ及び範囲は前記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきではない。
【００６０】
【表１】
2006506074.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】種々のＨＣＶ  ＲＮＡの概要を示す。
【図２】ＨＣＶの複製に対して高許容性である細胞系の選択を示す。
【図３】ＨＣＶ  ＲＮＡで一過的にトランスフェクトされたＨｕｈ−７．５およびＨｕｈ−７細胞におけるＨＣＶのタンパク質およびＲＮＡの検出を示す。
【図４】完全長ＨＣＶ  ＲＮＡでのＨｕｈ７．５細胞のトランスフェクションの後のＨＣＶ  ＲＮＡの蓄積を示す。
【図５】ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対する２２０４位における他の置換の効果を示す。
【図６】ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＮＳ５Ａ適応突然変異の組合せの効果を示す。
【図７Ａ】ＨＣＶの複製に対するＮＳ３およびＮＳ５Ａ突然変異の組合せの効果を示す。
【図７Ｂ】ＨＣＶの複製に対するＮＳ３およびＮＳ５Ａ突然変異の組合せの効果を示す。
【図８Ａ】ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＳ２１９４ＡおよびＳ２１９４Ｄ突然変異の効果を示す。
【図８Ｂ】ＨＣＶ  ＲＮＡの複製に対するＳ２１９４ＡおよびＳ２１９４Ｄ突然変異の効果を示す。
【図１】
2006506074.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2006506074.tif 000012
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年9月28日(2005.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【化１】
2006506074.tif 000016
（センス、５０μＭ）、
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
【化２】
2006506074.tif 000017
（アンチセンス、５０μＭ）および
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
【化３】
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（プローブ、１０μＭ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、リアルタイム逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ増幅を行った。ＲＴ反応物を６０℃で３０分間インキュベートし、ついで９５℃で７分間にわたり、Ｔａｑポリメラーゼの活性化と共役した逆転写酵素の不活性化を行った。９５℃で１５秒間および６０℃で１分間のサイクリング条件で４０サイクルのＰＣＲを行った。既知濃度の合成ＨＣＶ  ＲＮＡ標準体を反応の各組に含め、それを使用して標準曲線を算出した。ＳＤＳ  ｖ１．６．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、該リアルタイムＰＣＲのシグナルを分析した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
【表１】
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【国際調査報告】
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