(57)【要約】本発明は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）ｓｐ細菌におけるＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３タンパク質をコードする３種の単離されたＤＮＡ分子、並びに診断、治療及びワクチン応用へのそれらのＤＮＡ分子の使用に関し、それらのタンパク質は、細菌免疫グロブリン様（Ｂｉｇ）反復ドメインを有する。本発明によれば、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３タンパク質をコードする単離された分子は、獣医学上重要なレプトスピラ種を含めて、ヒト及び他の哺乳動物において疾病を引き起こすことができるレプトスピラ種の感染の診断及び予防に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列を有する実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列をコードする単離されたポリヌクレオチドセグメント。
【請求項３】
配列番号１又はその機能的同等配列から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列を有する実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号３又はその機能的同等配列から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列を有する実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号６に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号５又はその機能的同等配列から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド配列がレプトスピラ種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）由来である、請求項２、５又は８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号８又はその機能的同等配列から選択される実質的に精製されたポリペプチド配列。
【請求項１２】
配列番号８に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列をコードする単離されたポリヌクレオチドセグメント。
【請求項１３】
配列番号７又はその機能的同等配列から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１０又はその機能的同等配列から選択される実質的に精製されたポリペプチド配列。
【請求項１５】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列又はその機能的同等配列をコードする単離されたポリヌクレオチドセグメント。
【請求項１６】
配列番号９又はその機能的同等配列から選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１、４、７、１１及び１４に記載の実質的に精製されたポリペプチド又は機能的同等配列と結合する抗体。
【請求項１８】
哺乳類対象において病原性スピロヘータに対する免疫応答を誘導するために使用される医薬組成物であって、薬剤として許容できる担体中に、免疫原として有効量の、請求項１、４、７、１１及び１４に記載の実質的に精製されたポリペプチド又はその機能的同等配列を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
前記薬剤として許容できる担体がアジュバントを含む、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記病原性スピロヘータがトレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びレプトスピラから選択される請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２１】
哺乳類対象に病原性スピロヘータに対する免疫応答をもたらすために有用な医薬組成物であって、薬剤として許容できる担体中に、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列と結合する免疫有効量の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む、哺乳類対象に病原性レプトスピラの感染に対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項２３】
請求項１９記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、哺乳類対象に病原性スピロヘータに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項２４】
病原体特異的細胞成分と結合する試薬を、病原性スピロヘータを含有する疑いのある試料に接触させること、及び前記成分に対する前記試薬の結合を検出することを含む、試料中の病原体を検出する方法。
【請求項２５】
前記病原体特異的細胞成分と結合する前記試薬が、ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３ポリヌクレオチドを同定するためのオリゴヌクレオチドである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記病原体特異的細胞成分と結合する前記試薬が、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２若しくはＢｉｇＬ３ポリペプチドに対する、又は機能的同等配列を有するポリペプチドに対する抗体である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記スピロヘータ特異的成分が、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記スピロヘータ特異的成分が、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列である、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
試料中の、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列に対する抗体の検出法であって、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列を前記抗体と結合させる条件で、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列を前記試料に接触させること、並びに請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列に対する前記抗体の結合を検出することを含む、検出法。
【請求項３０】
試料中の、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列の検出法であって、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチド又はその機能的同等配列に対する抗体を前記試料に接触させることにより、前記試料中の前記ポリペプチドを前記抗体と結合させること、並びに前記抗体に対する前記ポリペプチドの結合を測定することを含む、検出法。
【請求項３１】
試料中のＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３又はその機能的同等配列をコードする核酸の検出法であって、請求項１、４、７、１１及び１４に記載のポリペプチドをコードするか、又はその機能的同等配列をコードするポリヌクレオチドを使用する、検出法。
【請求項３２】
ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチド若しくは機能的同等配列を有するポリペプチド；ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３ポリヌクレオチド；又はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３ポリペプチド若しくは機能的同等配列を有するポリペプチドと結合する抗体、を検出するために有用なキット。
【請求項３３】
ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３又はその機能的同等配列をコードする核酸を検出するために有用なキットであって、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３核酸、又はその機能的同等配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する第１容器を備えた１つ又は複数の容器を含む担体手段を備えたキット。
【請求項３４】
ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３核酸又はその機能的同等配列に対する抗体の検出に有用なキットであって、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２若しくはＢｉｇＬ３ポリペプチド、又はその機能的同等配列を含有する第１容器を備えた１つ又は複数の容器を含む担体手段を備えたキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レプトスピラｓｐ細菌において細菌免疫グロブリン様（Ｂｉｇ）反復ドメインを有するタンパク質ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３をコードする３種の単離されたＤＮＡ分子、並びに診断、治療及びワクチン応用へのそれらの使用に関する。本発明によると、そのＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３をコードする単離された分子は、獣医学上重要な種を含めたヒト及び他の哺乳動物に発病可能なレプトスピラ種の感染の診断及び予防に使用される。
【背景技術】
【０００２】
スピロヘータは運動性で、ラセン型の細菌であり、ヒト及び他の動物の病原体であるレプトスピラ、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）及びトレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）の３属がある。ボレリア及びトレポネマはライム病、回帰熱、梅毒及びフランベジアを含めた疾病の原因因子である。レプトスピラは８つの病原性種及び４つの非病原性腐生種という遺伝的に多様な群から成る（１、２）。レプトスピラは血液型亜型状態によっても分類され、２００を超える病原性血液型亜型が同定されている。リポ多糖部分の構造の不均一性は、血液型亜型間で観察される抗原多様性の度合いが大きいことの根拠のようである（１、２）。
【０００３】
レプトスピラ症は人獣共通伝染病であり、ヒトへの伝染は飼い慣らし動物若しくは野生動物である保菌宿主、又はそれらの動物の尿によって汚染された環境との接触を介して起こる。感染によって広範囲の臨床症状が発現する。疾患の初期は発熱、悪寒、頭痛及び激しい筋肉痛を特徴とする。臨床感染の５〜１５％で疾病は進行して、黄疸、腎不全及び出血の発現のような多器官の重篤な合併症が生ずる（１〜４）。重症のレプトスピラ症は死亡率５〜４０％である。
【０００４】
レプトスピラ症は全世界に分布している。保菌宿主をつとめる動物種の範囲が大きいため、最も広まった人獣共通伝染病であるとみなされている（１）。レプトスピラ症は軍人、農民、鉱夫、下水及び廃棄物処理業者、獣医師並びに屠殺場労働者のようなリスクグループで伝統的に重要な職業病である（１〜３）。しかし、新しいパターンの疾病の伝染が近年出現し、そのことはレプトスピラ症が公衆衛生上の問題として重要性を増しつつあることを強調している。先進国ではレプトスピラ症は娯楽活動（１）及びスポーツイベント（１、４、５）に伴う大発生の原因となった。ブラジル及び他の発展途上国では根元的な貧困状態によって高い死亡率を伴うレプトスピラ症の都市部での大流行を招いた（４、５）。
【０００５】
公衆衛生への影響力に加えて、レプトスピラ症は、家畜やペットにおける疾病の原因として主要な経済的負担となっている（２）。レプトスピラ症はウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ及びイヌのような動物に流産、死産、不妊、発育不全、乳の産生の減少及び死亡を引き起こし、家畜において病原性レプトスピラ症の慢性感染及び放出を誘導する（２）。したがって、現行の国際及び国内検疫規制が原因で、レプトスピラ症は畜産業にとって経済的な損失のさらなる源となっている。
【０００６】
ヒト及び動物のレプトスピラ症の防除は、適切な診断手段が現在欠如していることに阻まれている。標準的な血清学的試験である顕微鏡下凝集試験（ＭＡＴ）は症例を迅速に同定するには不満足である。それは、ＭＡＴが少数の基準研究室でしか実施できず、十分な感度を得るためには対になった血清の分析を必要とするからである（１、２）。ＭＡＴへの依存はいくつかの研究でみられるように大発生の原因を立証する上で遅れを生じた（１、２）。全細胞レプトスピラ抗原調製物に基づく酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）及びその他の迅速血清学的試験がレプトスピラ感染をスクリーニングするための代替法として開発されているが、ＭＡＴが依然として症例の確定に必要である（１、２）。組換え抗原に基づく血清学的試験は、ライム病及び梅毒のようなスピロヘータ感染のスクリーニングに広く使用されているが、レプトスピラ症の血清診断のための組換えタンパク質の使用はあまり研究されてこなかった。近年、ウシレプトスピラ症の血清診断のための組換え鞭毛抗原の免疫捕獲アッセイが記載された（６）。組換え熱ショックタンパク質Ｈｓｐ５８はヒトの症例の少数から得た血清試料で高度のＥＬＩＳＡ反応性を示した（７）。しかし、レプトスピラ症の血清診断のための組換え抗原の利用性は、大規模な確認研究では調査されていない。
【０００７】
さらに、レプトスピラ症を防除又は予防する有効な介入法は、現在のところ得られていない。土壌中及び水中で病原性レプトスピラが長期間生存し、多数の野生動物及びペットが保菌宿主となるため、環境による防除措置は実行が困難である（１、３）。レプトスピラ症に対する介入として、防御免疫の発生に努力が集中した。現在利用できるワクチンは、病原性レプトスピラの不活性化全細胞又は膜調製物に基づき、そのワクチンはレプトスピラのリポ多糖に対する抗体を誘導することによって防御応答を誘導するようである（１、３）。しかし、これらのワクチンは感染に対して長期の防御を誘導しない。さらに、これらのワクチンはワクチン調製物に含まれていないレプトスピラの血液型亜型に対して交差防御免疫ももたらさない。病原性の血液型亜型が多数であること（＞２００）及び多血液型亜型ワクチンの製造コストが、全細胞又は膜調製物に基づく戦略によって有効なワクチンを開発する上での主な制限となっている。
【０００８】
レプトスピラ症の病原性のメカニズムは、ライム病及び梅毒のようなスピロヘータ病のように病原体が感染の初期段階で宿主内で広く播種できることに依存している（２）。膜結合レプトスピラタンパク質は、宿主の組織を介した進入と播種を可能にするような相互作用を媒介していると想像されている。推定表面結合毒性因子はワクチン戦略の候補として働き、宿主における播種を遮断する応答をこれらの因子に対して誘導する。さらに、膜結合タンパク質は宿主の感染時の免疫応答に利用できるであろうことから、抗体依存性食作用及び補体介在性細胞傷害のようなメカニズムを介した免疫防御の標的を構成するであろう。抗原であるこれらの標的を組換えタンパク質として生産することは、サブユニット性ワクチンとしてレプトスピラ症の防御免疫を得るための費用効果の高い手法となる。さらに、病原性レプトスピラに保存されている膜結合標的の選択によって、現在利用できる全細胞ワクチン製剤で遭遇している制限を避けることができる。
【０００９】
レプトスピラ症の分野における主な制限は、表面結合タンパク質及び宿主で発現されるタンパク質を従来の生化学的方法で同定することであった。スピロヘータであるボレリアブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）のゲノム配列から、１００種を超える表面結合リポタンパク質が同定された。ゲノムサイズとその生活環の生物学に基づいて、レプトスピラは顕著に多数の表面結合標的を有すると考えられる。現在のところ膜抽出物の単離、これらの抽出物中のタンパク質の精製及び特性決定、及びこれらのタンパク質標的の分子クローニングを介して１０種未満の表面結合タンパク質が特性決定された（８〜１４）（１２）。いくつかの同定された標的であるＬｉｐＬ３２、ＯｍｐＬ１及びＬｉｐＬ４１の組換えタンパク質を用いた免疫は、完全ではなく部分的な防御応答を誘導する（１１、１２）。
【００１０】
レプトスピラのタンパク質発現についてのさらなる包括的な理解を得るために、我々は感染時に発現されるタンパク質抗原のレポーターとしてヒトレプトスピラ症の際の体液性免疫応答を使用した。感染時に発現されるレプトスピラ抗原の同定は、新しい血清診断戦略及び免疫防御戦略の開発に潜在的に重要な意味を有する。レプトスピラゲノムＤＮＡファージライブラリーから、免疫反応性ポリペプチドを発現するクローンを同定するために、レプトスピラ症の患者の血清を使用した。これらのクローンの一部は、レプトスピラの膜結合タンパク質の新規なファミリーをコードすることが発見された。これらのポリヌクレオチド及びポリペプチドの同定、並びにレプトスピラ症の診断及び病原性スピロヘータに対する免疫応答を誘導することへのそれらの応用は本発明の基礎である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、レプトスピラにおけるＤＮＡ分子、及びそれらがコードする、細菌免疫グロブリン様反復ドメインを有するポリペプチドに関する。本発明は、本来Ｌ．キルシュネリ（Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）及びＬ．インテロガンス（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）から得られる３種のＤＮＡ分子の単離について記述している。それらのＤＮＡ分子は、ポリペプチドの推定アミノ酸配列に基づき、それぞれおよそ１１０、２０５及び２０５ｋＤａの分子量を有している、本明細書において「ＢｉｇＬ１」、「ＢｉｇＬ２」及び「ＢｉｇＬ３」と称するタンパク質をコードする。この３種のタンパク質はおよそアミノ酸９０個の縦列反復（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）配列１２〜１３個を有する。ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３の反復配列は互いに高度に関連し（＞９０％のアミノ酸配列同一性）、細菌病原体の毒性因子にみられる部分である細菌免疫グロブリン様（Ｂｉｇ）ドメインファミリーに属する。
【００１２】
本明細書においてレプトスピラのＢｉｇドメインを有するレプトスピラタンパク質をコードする、「ｂｉｇＬ１」、「ｂｉｇＬ２」及び「ｂｉｇＬ３」と呼ばれるＤＮＡ分子は、ペプチド及びポリペプチドを製造するための発現ベクターに異種ＤＮＡとして挿入できる。そのような発現ベクターで形質転換した代替宿主から組換えポリペプチドを精製できる。ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３由来のポリペプチドは進行中及び過去の感染の血清学的マーカーである。それは、病原性レプトスピラに感染しているか、又はそれを免疫されたレプトスピラ症の患者及び動物の血清が、単離されたポリペプチドを認識するからである。
【００１３】
さらに、組換え又は天然抗原調製物由来のＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチドは免疫原性である。精製組換えＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチドを免疫された実験動物から得た抗体は、レプトスピラ由来の天然抗原を認識し、感染が疑われる対象から得た試料中の病原性スピロヘータを検出するために有用である。
【００１４】
さらに、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチドは、病原性スピロヘータに対する免疫応答を誘導する。ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３由来ポリペプチド、これらのポリペプチドに対する抗体、並びにＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３をコードするポリヌクレオチドを単独又は薬剤として許容できる担体と組み合わせてレプトスピラの感染を治療又は予防するために使用できる。Ｂｉｇドメインは、他の細菌病原体での毒性に関連するタンパク質に存在することから、これらの部分はレプトスピラによって引き起こされる感染に無関係の感染を治療又は予防するために使用できる。
【００１５】
第１の実施形態では、本発明はｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３の単離されたＤＮＡ分子、並びにこれらのＤＮＡ分子によってコードされるか、又は機能的同等配列を有するポリペプチドを提供する。さらに、ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製造するための、及びこれらの配列から得られる実質的に精製されたポリペプチドを得るための方法を提供する。
【００１６】
本発明の第２の実施形態は、対象において病原性スピロヘータに対する免疫応答を誘導するための医薬組成物を提供することである。その医薬組成物は、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３、及び機能的同等配列を有するポリペプチドから成る群から選択された、免疫原として有効量の１つ又は複数の抗原を薬剤として許容できる溶剤中に含む。
【００１７】
第３の実施形態では、本発明はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３ポリペプチド又は機能的同等配列を有するポリペプチドと結合する化合物を同定するための方法を提供し、その方法は、その化合物及びＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２若しくはＢｉｇＬ３ポリペプチド、又は機能的同等配列を有するポリペプチドから成る成分をそれらの成分を相互作用させるのに十分な条件でインキュベートすること、並びにＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２若しくはＢｉｇＬ３ポリペプチド、又は機能的同等配列を有するポリペプチドに対するその化合物の結合を測定することを含む。好ましくは本発明の方法は、レプトスピラ又は関係する他の細菌病原体を活動性感染又は既往感染した疑いのある対象の血清を利用する血清診断法である。
【００１８】
第４の実施形態では、本発明は試料中の病原体を検出するための方法を提供し、その方法は、病原体特異的細胞成分と結合する試薬を病原性スピロヘータを含有する疑いのある試料に接触させること、及びその成分に対する試薬の結合を検出することを含む。一側面では、その病原体特異的細胞成分と結合する試薬は、ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３ポリヌクレオチドを同定するためのオリゴヌクレオチドである。別の側面では、その病原体特異的細胞成分と結合する試薬は、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２若しくはＢｉｇＬ３ポリペプチド、又は機能的同等配列を有するポリペプチドに対する抗体である。
【００１９】
第５の実施形態では、本発明はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチド若しくは機能的同等配列を有するポリペプチド、ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３ポリヌクレオチド、又はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２、ＢｉｇＬ３ポリペプチド若しくは機能的同等配列を有するポリペプチドの検出に有用なキットを提供する。
【００２０】
本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な説明によって明らかとなる。しかし、本発明の精神内及び範囲内である種々の変更及び改造は詳細な説明から当業者には明らかとなろうことから、本詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているものの、例示としてのみ述べられていることを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
便宜上、明細書、実施例及び添付の請求項に採用される特定の用語及び熟語の意味を以下に供する。他に規定しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する業界の通常の技術者の１人が一般に理解するものと同じ意味を有する。
【００２２】
「ＢｉｇＬ」は、配列相同性によれば細菌免疫グロブリン様（Ｂｉｇ）ドメインにそれぞれ類似した縦列反復配列を有するレプトスピラｓｐ．のポリペプチドである。Ｂｉｇドメインは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）及びボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）のような細菌病原体に発現している細菌タンパク質に存在し、宿主細胞との接着のような毒性機能を有する。
【００２３】
「参照配列」は、自然界の生物からの単離によって、又は遺伝子工学を介して得られた新しい配列であり、本発明に特徴的な正確な生体機能を示す。
【００２４】
「機能的同等配列」は、参照配列の特徴的な機能に修正を生じない多様性の結果である、すなわちヌクレオチド又はアミノ酸の置換及び／若しくは欠失及び／若しくは挿入、並びに／又はそれらの末端の一方における配列の伸長及び／若しくは短縮である、配列における自然発生又は誘導されたすべての修正の結果である、その参照配列に関係する配列である。機能的同等配列はその断片及びアナログを包含する。言い換えると、機能的に同等な配列は、参照アミノ酸配列又は参照核酸配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド又は核酸のような、参照配列と「実質的に同じ」又は「実質的に同一」である配列である。相同性は通常は配列解析を実行するソフトウェアシステム（遺伝学コンピュータグループ配列解析ソフトウェアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、マジソン、ウィスコンシン州、５３７０５）によって測定される。
【００２５】
前に指摘したように、宿主の感染時に発現されるレプトスピラ抗原は診断テスト及びワクチンの標的を同定するために重要である。ＬｉｐＬ３２タンパク質はこれらの標的の１つであり、自然感染時の体液性免疫応答によって主要抗原として同定された。しかし、レプトスピラ症が検出された急性期疾患時の患者血清では、ＬｉｐＬ３２に対する抗体の検出に基づいた血清学試験の感度は限定的である（Ｆｌａｎｎｅｒｙ、Ｂ：「レプトスピラ症の血清診断のための組換えレプトスピラ抗原に基づく酵素免疫検定法の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ）」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１；３９（９）：３３０３〜３３１０；ＷＯ９９４２４７８）。
【００２６】
本発明は、レプトスピラに属する細菌を含めたスピロヘータ細菌種に関連するＢｉｇＬタンパク質ファミリーの同定に基づく。
【００２７】
本発明によると、ＢｉｇＬタンパク質ファミリーは、病原性レプトスピラの感染時、又は病原性レプトスピラ若しくは組換えＢｉｇＬポリペプチドの免疫時に生成する宿主の体液性免疫応答の標的として同定された。ＢｉｇＬポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト及び動物の保菌宿主を含めた様々な種における自然感染を同定するための診断テストに有用である。それらのタンパク質に基づくこの診断テストは、標準的な診断テスト又は公表された文献に用いられた診断テストに比較して感度及び特異性の改善を示す。初期におけるレプトスピラ症の同定。さらに、ＢｉｇＬポリペプチドを免疫用の医薬組成物に使用すると、免疫応答を誘導できる。
【００２８】
本発明では、３種のＢｉｇＬポリペプチドは分子量１２８．４ｋＤ、２０１．３ｋＤ及び２００．４ｋＤを有すると特性決定する。これらの分子量はこれらのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであるｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３の推定アミノ酸配列に基づく。ＢｉｇＬポリペプチドのアミノ酸配列はシグナル配列及びスピロヘータのリポボックスに大きく一致するシグナルペプチダーゼ推定切断部位を有する。したがって、ＢｉｇＬポリペプチドは膜結合リポタンパク質である。１２８．４ｋＤ、２０１．３ｋＤ及び２００．４ｋＤのポリペプチドをそれぞれ「ＢｉｇＬ１」、「ＢｉｇＬ２」及び「ＢｉｇＬ３」と称する。
【００２９】
本発明のＢｉｇＬポリペプチドは、本来レプトスピラｓｐから単離されたが、それらは病原性生物であるレプトスピラｓｐ．に対するだけでなく、Ｂｉｇドメインを有する因子をもつ他のスピロヘータ細菌及び病原体に対しても免疫応答を誘導するために有用である。そのうえ、ＢｉｇＬポリペプチドはレプトスピラｓｐ．、他の病原性スピロヘータ及び細菌性病原体による感染の診断にも使用できる。
【００３０】
最先端技術の方法論を取り込んだいくつかの方法をＢｉｇＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を得るために使用できる。これら方法には、ヌクレオチドの相同配列を検出するためのプローブを使ったゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションを用いたＤＮＡの単離、構造面が共通であるクローニングされたＤＮＡの断片を検出するための発現ライブラリーの抗体のスクリーニング、目的ＤＮＡ配列を組換えできるイニシエーターを用いたゲノムＤＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びコンピュータに基づく配列データベースからのｂｉｇＬポリヌクレオチドと類似した配列の検索があるが、それらに限定されない。
【００３１】
本発明では、抗原の同定は培養（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）時及び宿主への感染（ｉｎ  ｖｉｖｏ）時にレプトスピラ抗原の発現が異なるという知識に基づいた。レプトスピラ抗原の発現が異なることが、感染時の宿主への適応に重要であると推定される。我々は免疫反応性抗原、すなわち宿主感染時に発現される抗原を同定する戦略を採った。病原性レプトスピラに感染した患者の血清を、λファージを用いたレプトスピラゲノムＤＮＡライブラリーから免疫反応性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を選択するために使用した。
【００３２】
本発明は配列番号１、配列番号３及び配列番号５に対応するヌクレオチド配列を有する３種のポリヌクレオチド、並びにそのようなヌクレオチドがコードするポリペプチドであるＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３のアミノ酸配列を同定し、単離した。
【００３３】
ステップ１  −  基本的に以下のステップから成る陽性クローンのスクリーニング：
（ａ）病原性レプトスピラのＤＮＡを適当な酵素で切断し、λファージゲノムの特異的部位に連結した。宿主細菌にファージを感染させ、結果として生じたＩＰＴＧを用いた誘導後に組換えポリペプチドを発現するクローンに免疫ブロットプロトコルを施した。そのプロトコルでは、検査室で確認されたレプトスピラ症患者の血清と共に、次にホースラディッシュペルオキシダーゼと結合した二次抗体と共に、コロニー溶解物の膜をインキュベートした。その二次抗体はヒト免疫グロブリンを認識する。陽性クローンを発色に基づく抗原抗体複合体についての指示反応によって検出した。
（ｂ）クローニングされ単離されたポリヌクレオチドの配列を配列決定反応のイニシエーターとしてファージベクター特異的配列を用いて決定した。クローンの配列の分析とプライマー歩行戦略の使用によって、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３をコードする遺伝子の完全なヌクレオチド配列を同定した。
（ｃ）得られた陽性クローンの大部分は熱ショックタンパク質Ｈｓｐ５８及びＤｎａＫ、並びに外膜タンパク質ＬｉｐＬ４１をコードする遺伝子を含んでいる。しかし、タンパク質ファミリー（Ｐｆａｍ）データベースで比較すると、複数のクローンが細菌型免疫グロブリン（Ｂｉｇ）タンパク質としてアミノ酸９０個を縦列に反復コードする遺伝子を含有することが分かった。クローンの配列の分析で３種の遺伝子が同定され、ｂｉｇＬ１では１２個の縦列反復配列を、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３では１３個の縦列反復配列を含んでいた。
【００３４】
ステップ２  −  タンパク質のサブクローニング発現と精製
−  ２つのＢｉｇＬタンパク質の配列に基づく２つのオリゴヌクレオチドの図
−  それらのオリゴヌクレオチドから反復領域の一部をコードする初発ＢｉｇＬ部分のＰＣＲ増幅
−  増幅産物の配列決定
−  配列決定された産物がコードする領域のサブクローニング
−  組換えタンパク質の発現
−  組換えタンパク質の精製
【００３５】
免疫ブロット分析は、病原性レプトスピラに感染したレプトスピラ症患者及びげっ歯類保菌宿主から得た血清が、ＢｉｇＬポリペプチドのＢｉｇＬドメイン反復配列に主として反応する抗体を産生することを実証した。このことは、ＢｉｇＬドメイン反復配列が感染時に認識される主要な抗原領域であることを示している。
【００３６】
本発明のポリペプチドに関して述べると、それらはＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列（及び相補的な核酸配列）、或いはそれらの機能的同等配列、すなわちＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３と称するポリペプチドの全体又は一部をコードする配列から成るが、それらは多様性が原因で同一ではない。
【００３７】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３、並びにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから成るが、さらにそれらには機能的同等配列を有するポリペプチド及びポリヌクレオチドが含まれる。
【００３８】
本発明では、ポリヌクレオチドとポリペプチドの両者がそれらの生物活性を付与するのに必要な純度を有する天然、合成又は組換え起源のものであってよい。
【００３９】
本発明は、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３をコードするポリヌクレオチドにもあてはまり、それらのポリヌクレオチドはｂｉｇＬポリヌクレオチドの完全断片又は部分増幅ＤＮＡ断片を得るためのＰＣＲ反応に使用される。そのＰＣＲ反応の目的は、試料中のレプトスピラの検出又は組換えＢｉｇＬポリペプチドの発現である。本発明のポリヌクレオチドの増幅に使用されるイニシエーターの場合は、それらのイニシエーターは天然又は合成の２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドでできたオリゴヌクレオチドである。
【００４０】
各イニシエーターは増幅の標的である配列鎖の隣接領域に実質的に類似するように好ましくは構築される。この意味で、考慮される利用又は応用に際して、同じ方法で対応するポリマーを同一にならずに製造できるならば、イニシエーターを機能的に同等と呼ぶことができる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチド配列は、組換えクローニングに使用されるプラスミド、ウイルス又は他の媒体のような発現ベクターにも挿入できる。この発現ベクターは、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３又はそれらの機能的同等配列をコードする全体又は部分ヌクレオチド配列の挿入又は組み込みによって使用される。そのような発現ベクターは、そのベクターが挿入された宿主における遺伝子配列からの効率的な転写を可能にするプロモーター配列を含有する。そのような宿主は、酵母のような微生物又は昆虫及び哺乳動物を含めた真核細胞又は原核細胞を含み得る。そのような発現ベクター構築物の使用方及び組換え配列の発現法は、適切にいうならば、専門技術者に十分公知である。
【００４２】
本発明は、ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３又はそれらの機能的同等配列の完全ポリペプチド又は部分ポリペプチドと結合する抗体の製造法を提供する。そのような抗体はスピロヘータ感染一般の検討及び診断における、さらに具体的レプトスピラ症の診断法、及び治療であれ予防であれ治療法の開発における研究及手段び診断手段として有用である。抗スピロヘータ治療の一部として、そのような抗体を単独、又はこれらの抗体及び薬剤として許容できる担体を使用する医薬組成物の一部として投与できる。
【００４３】
本発明は、ＢｉｇＬポリペプチド又はこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの医薬組成物をワクチンとして使用することに関し、そのワクチンは、病原性スピロヘータの感染若しくは常在化に対する免疫防御応答を誘導する疾病予防用のワクチンとして、或いは病原性スピロヘータにまさしく感染した対象における疾患の臨床経過の持続若しくは重篤度の減少に、又は長期間病原性スピロヘータを保有し排泄するブタ、ウシ、ラット若しくはイヌのような病原性スピロヘータの保菌動物の保菌宿主状態の減少に、有益な影響をもたらす治療用ワクチンとしてのどちらかである。そのような組成物を、それぞれＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３に対する免疫原として有効量の抗体を用いて、又はレプトスピラ病原体から単離された１つ若しくは複数のＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３若しくは組換えＢｉｇＬポリペプチド、又はその機能的同等配列を用いて、賦形剤及び添加剤又は佐剤中に調製できる。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、個体に病原性スピロヘータ、詳細にはレプトスピラｓｐ．に対する免疫応答を誘導するために使用される医薬組成物に関し、その医薬組成物は、薬剤として許容できる溶剤中に免疫有効量のＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３又はそれらの機能的同等配列を含む。我々は、「個体」としてヒト、げっ歯動物、ペット、実験動物並びに家畜を含めたあらゆる哺乳動物を呼称する。「免疫有効量」として個体にレプトスピラ若しくは他のいかなる病原性スピロヘータ又は細菌病原体に対する免疫応答を誘導するために必要なＢｉｇＬポリペプチド抗原の量を呼称する。本発明はさらに以下の目的のキットを提供する。
１−  ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチドの、又はそれらの機能的同等配列の、１つを検出すること、
２−  ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３又はそれらの機能的同等配列をコードする核酸を検出すること、
３−  ＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３のようなポリペプチド又はそれらの機能的同等配列に対する抗体を検出すること。
【００４５】
ＢｉｇＬポリペプチドの検出に使用されるキットには、１つ又は複数の容器を含有する媒体を使用するキットが含まれ、その第１容器はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３に対するか、又はそれらの機能的同等配列に対する連結試薬を含有する。
【００４６】
ＢｉｇＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出に使用されるキットには、１つ又は複数の容器を含有する媒体を使用するキットが含まれ、その第１容器はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３か、又はそれらの機能的同等配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを含有する
【００４７】
ＢｉｇＬポリペプチドに対する抗体の検出に有用なキットには、１つ又は複数の容器を含有する媒体を使用するキットが含まれ、その第１容器はＢｉｇＬ１、ＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３ポリペプチドか、又はそれらの機能的同等配列を含有する。
【００４８】
さて、本発明を実施例を参照して記述するが、その実施例が本発明を制限するものとしてみなすべきではない。
【実施例１】
【００４９】
例１Ａ：細菌株、プラスミド及び培地
レプトスピラキルシュネリセロバールグリッポチフォーザＲＭ５２株（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  ＲＭ５２）をブタの流産の誘発中に分離した（１９８３）。Ｌ．インテロガンスセロバールコペンハーゲニＦｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０株（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒａｉｎ  Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）をヒトレプトスピラ症患者の血流から分離した。Ｌ．キルシュネリセロバールグリッポチフォーザＲＭ５２株及び他のレプトスピラ株を国立レプトスピラ症参照センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）（米国農務省農業試究場国立動物疾病センター、［米国アイオワ州アムズ（Ａｍｅｓ）所在］）から入手した。レプトスピラ株をジョンソン−ハリスウシ血清アルブミン−Ｔｗｅｅｎ８０培地（Ｂｏｖｕｍｉｎａｒ  ＰＬＭ−５微生物培地、インタージェン（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ））で３０℃で培養した（２）。ＲＭ５２分離菌の少数回継代試料を液体窒素中で保存、又は多数回継代型を生み出すために液体培地で少なくとも２００回継代した。多数回継代株ではいかなる用量でもハムスターを致死させることは無理で、１０７用量の腹腔内接種によってハムスターに感染させ得たのみであった。
【００５０】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（□ｍｃｒＡ）１８３□ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３  ｅｎｄＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺ□Ｍ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））及び大腸菌ＰＬＫ−Ｆ’（ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｈｓｄＲ１７  ｌａｃ−  ｒｅｃＡ１  ｒｅｌＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１［Ｆ’ｌａｃＩｑＺ□Ｍ１５］）をそれぞれ、λＺａｐＩＩ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））ベクター及びλＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））ベクターを感染させる際の宿主株として使用した。大腸菌ＳＯＬＲ（ｅ１４−［ｍｃｒＡ］，□［ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ］１７１  ｓｂｃＣ  ｒｅｃＢ  ｒｅｃＪ  ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５［Ｋａｎｒ］ｕｖｒＣ  ｌａｃ  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｔｈｉ−１  ｅｎｄＡ１  λｒ，［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺ□Ｍ１５］，Ｓｕ−［ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ］）及び大腸菌ＢＭ２５．８（ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ□ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ［Ｆ’ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ＋  ｌａｃＩｑＺ□Ｍ１５］λｉｍｍ４３４（ｋａｎｒ）Ｐ１（ｃａｍｒ）ｈｓｄＲ（ｒＫ１２−ｍＫ１２−））をそれぞれ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミド及びｐＴｒｉｐｌＥｘファージミドのｉｎ  ｖｉｖｏでの除去に使用した。ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ［Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ  ｄｃｍ＿（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｃＲ）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ＣｍＲ）］（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））をｐＲＳＥＴ発現用ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の宿主株として使用した。大腸菌株を、適宜１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１００μｇ／ｍｌカルベニシリン又は２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを足したＬＢで培養した。抗生物質はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。
【００５１】
例１Ｂ：ｂｉｇＬ遺伝子の単離及び特徴：
本実施例は、ｂｉｇＬ遺伝子の同定及び単離について示す。イェルトン及びチャロン（Ｙｅｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｏｎ）の方法に従って、毒性の少数回継代Ｌ．キルシュネリセロバールグリッポチフォーザＲＭ５２株からゲノムＤＮＡを調製した（１５）。ゲノムＤＮＡ用のキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、Ｌ．インテロガンスセロバールコペンハーゲニＦｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０株の臨床用分離株からゲノムＤＮＡを調製した。精製ＤＮＡを得るためにＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用した。ゲノムＤＮＡをＴｓｐ５０９Ｉで部分分解し、付属の取扱説明書（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））に従ってλＴｒｉｐｌＥｘのアームに連結した。Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（スタラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、連結した分解ゲノムＤＮＡをλ頭部に詰め込んだ。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させてライブラリーのファージ力価を決定した。
【００５２】
ゲノムライブラリーのスクリーニングのために、約１０３ｐｆｕを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ上にまき、ニトロセルロース膜（シュレイシャー及びシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ））に写しとって、ＩＰＴＧで感作させ、推奨通りに（シュレイシャー及びシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ））処理した。ニトロセルロースフィルターを５％スキムミルク（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８）（ＴＢＳＴ）、又は０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳＴ）に溶解）でブロッキングして、検査で確認されたレプトスピラ症の患者からプールした血清の希釈液（１：５０）と共に１時間インキュベートした。１９９６年から１９９９年の間にブラジルの都市伝染病で同定された疾病の回復期の患者から血清を集めた。血清の使用に先立ち、大腸菌に対する抗体を取り除くために血清を大腸菌溶解物で予備吸着させた。膜をＴＢＳＴ又はＰＢＳＴで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヒトイムノグロビン抗体又はアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトイムノグロビン抗体（１：１０００希釈）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と１時間超インキュベートした。ＮＢＴ（０．３ｍｇ／ｍｌ）及びＢＣＩＰ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）を用いた検出、又はＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））の後にＨｙｐｅｒｆｉｌｍ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））に曝露させる現像を使用して抗原抗体複合体をもつプラークを同定した。
【００５３】
各陽性プラークを１ｍｌのＳＭ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５；０．０１％  ゼラチン、クロロホルム１、２滴）中で４℃で保存した。プールした血清に反応したλプラーククローンをさらに２段階にわけて精製した。大腸菌ＳＯＬＲ株（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）又は大腸菌ＢＭ２５．８株（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を供給元の説明通りにλクローンに感染させることによって、λバクテリオファージに挿入されたゲノムＤＮＡ断片を除去した。
【００５４】
挿入配列の近傍に結合するベクター特異的プライマーを使用して、挿入配列の最初の５００〜７００ヌクレオチドの配列を得た。１３１クローンのヌクレオチド配列を解析して、約９０アミノ酸の長さの縦列反復配列をコードするとみられるＤＮＡ断片が挿入された１３個のクローンを同定した。その後、それぞれの反復配列は、Ｐｆａｍ６．６（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）において細菌免疫グロブリン様（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ）（Ｂｉｇ）ドメインのＢｉｇ２ファミリーに属すると同定された。
【００５５】
推定アミノ酸配列に応じた完全長のタンパク質をコードする配列を同定するために、プライマー歩行法（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）及び内側欠失配列（ｎｅｓｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）の配列決定を組み合わせて得た個々の配列からクローンのヌクレオチド配列を組み立てた。挿入配列の内部から挿入配列に隣接するマルチクローニング部位中に伸びる制限酵素切断断片を除去することによって、プラスミドクローンから欠失配列を作製した。ジブコビーアールエル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）又はオペロン（Ｏｐｅｒｏｎ）からオリゴヌクレオチドを合成、入手した。遺伝子の残存部及び隣接ＤＮＡを含む配列を得るために逆ＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を行った。ＵＣＬＡ配列決定中核施設、エール／ケックＤＮＡ配列決定中核施設及びカリフォルニア大学バークレー校配列決定施設が配列決定反応を行った。
【００５６】
２種類のＬ．キルシュネリのクローン及び４種類のＬ．インテロガンスのクローンが、細菌免疫グロブリン様レプトスピラタンパク質１、ｂｉｇＬ１（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎｅ）と称する遺伝子をコードしていることが判明した。Ｌ．キルシュネリのｂｉｇＬ１の完全なヌクレオチド配列及びその遺伝子産物の推定アミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２に示す。６種類のＬ．キルシュネリのクローンがｂｉｇＬ２と称する第２の遺伝子をコードしていることが判明した。Ｌ．キルシュネリのｂｉｇＬ２の完全なヌクレオチド配列を配列番号３に示す。Ｌ．キルシュネリのｂｉｇＬ２は偽遺伝子のようである。１０１１番目のヌクレオチドに余分なアデニンが挿入された結果、フレームシフト変異を起こし下流にＴＡＧ停止コドンがくる。しかしながらプールした患者の血清を用いた抗体スクリーニングによって、ｂｉｇＬ２遺伝子産物をコードするＤＮＡ断片をもつλクローンを同定することができた。恐らくは、クローン化された断片にフレームシフト変異がなく、患者の血清によって認識される遺伝子産物を発現可能にするような向きに断片が挿入されたためである。フレームシフト変異のないＬ．キルシュネリのｂｉｇＬ２遺伝子産物の推定アミノ酸配列を配列番号４に示す。Ｌ．インテロガンスの５番目のクローンは、ｂｉｇＬ１に属すると当初考えられた数個のＢｉｇ反復配列をコードすることが判明した。しかしながらＬ．インテロガンスのこの５番目のクローンがコードする上流側のＤＮＡは、ｂｉｇＬ１の上流側の配列と異なっていることが判明した。ｂｉｇＬ１遺伝子に隣接する領域の配列決定によって、Ｌ．インテロガンスのこの５番目のクローンは、ｂｉｇＬ１の下流側に位置しｂｉｇＬ３と称する３番目の遺伝子に対応することが明らかになった（図２）。ｂｉｇＬ３の完全なヌクレオチド配列はＬ．キルシュネリＤＮＡから得られた。それを配列番号５に示し、Ｌ．キルシュネリのｂｉｇＬ３遺伝子産物の推定アミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００５７】
３種類のｂｉｇＬ遺伝子はいずれも、以前に定義されているようなスピロヘータ性リポボックスに大きく一致するシグナルペプチド及び推定シグナルペプチダーゼ切断部位をコードしている（ハーケ  ディー  エー（Ｈａａｋｅ，Ｄ．Ａ．、２０００年、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔａｌ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４６：１４９１−１５０４）。既知のスピロヘータ性リポタンパク質の配列間の比較は、スピロヘータ性リポボックスが大腸菌のリポボックスよりもはるかに緩やかに規定されていることを示す。例えば、大腸菌のリポタンパク質の多くはＣｙｓからみて−３位置にＬｅｕをもつのに対し、スピロヘータ性リポタンパク質はこの位置にＶａｌ、Ｐｈｅ及びＩｌｅを含むいくつかのその他の疎水性アミノ酸をもつこともできる。システインの後に続くアミノ酸の部位特異的変異誘発を含む大腸菌の実験は、酸性残基が細胞膜へのリポタンパク質の局在化を引き起こすことを示す。レプトスピラのリポタンパク質の配列解析は、類似の局在化シグナルがこれらの細菌にも存在することを示す。例えば、ＬｉｐＬ３１は、システインの後に続く始めの２つのアミノ酸中に反対電荷なしに負電荷をもつ唯一のリポタンパク質であり、細胞膜にだけ局在化される唯一のリポタンパク質でもある。外膜リポタンパク質ＬｉｐＬ３２及びＬｉｐＬ４１と同様に、ＢｉｇＬタンパク質も、＋２及び＋３位置に非荷電性アミノ酸をもつ。このことは、ＢｉｇＬタンパク質が外膜に局在化される可能性があることを示す。
【００５８】
シグナルペプチドに引き続いて、この３種類のタンパク質はいずれも長さ約９０アミノ酸の一連の縦列反復配列を含むものと思われる。成熟したＢｉｇＬ１タンパク質はほぼ全体として１３個の反復配列から構成されるかもしれないが、対照的にＢｉｇＬ２及びＢｉｇＬ３は大きなカルボキシ末端ドメインを後ろにもつ１２個の反復配列を含むかもしれない。これらの３種類のタンパク質にみられる３１個の独自の反復配列の間には非常に多くの配列上のばらつきがあるが、これらの反復配列はいずれもＰｆａｍデータベースによって細菌免疫グロブリン様Ｂｉｇタンパク質ファミリー（Ｅ−ｖａｌｕｅは４×ｅ−３０程度）と同定された。
【００５９】
Ｌ．インテロガンスのｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３並びにＬ．キルシュネリのｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３は関連性が高く、ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列において９０％より高い相同性をもつ。どちらの種にも、ｂｉｇＬ１及びｂｉｇＬ３の５’末端を含んでＤＮＡ配列の同一な領域がある（図２）。配列の同一な領域は、両遺伝子内の最初のＡＴＧ開始コドンから１８９０ｂｐの位置まで伸びる。ｂｉｇＬ１とｂｉｇＬ３の間で同一のＤＮＡ配列をもつ広い領域は、ＢｉｇＬ１の最初の６３０アミノ酸（１〜６３０番目）（配列番号２）及びＢｉｇＬ３の最初の６３０アミノ酸（１〜６３０番目）（配列番号６）の同一アミノ酸配列という結果になる。この同一な領域は最初の６個のＢｉｇＬドメイン反復配列に対応する。
【実施例２】
【００６０】
例２Ａ：ｂｉｇＬ遺伝子の特性決定及びｂｉｇＬのＤＮＡ及びＲＮＡの検出
本実施例は、レプトスピラ種間のｂｉｇＬ遺伝子の多重コピー分布並びに試料中のｂｉｇＬのＤＮＡ及びＲＮＡの検出方法について示す。
【００６１】
サザンブロット解析
Ｌ．インテロガンスＦｉｏｃｒｕｚＬ１−１３０株、Ｌ．キルシュネリＲＭ５２株及びＬ．ビフレクシ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘｉ）ＰａｔｏｃＩ株のゲノムＤＮＡ中のｂｉｇＬ遺伝子の多重コピーを同定するためにサザンブロット解析を行った。ＤＮＡ制限酵素及び修飾酵素をニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、［米国カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）所在］）を使用したレプトスピラ細胞の７日間培養物５００ｍｌからゲノムＤＮＡを抽出した。約３μｇのＤＮＡを５〜２０ユニットのＮｓｉＩで一晩、最終液量５０μｌで分解した。その後、ＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルで精製し、冷１００％エタノール及び３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄した。次に、精製したＤＮＡを５〜２０ユニットのＰａｃＩで一晩、最終液量２５μｌで再分解した。二重分解したＤＮＡを０．８％アガロースゲルで一晩、２０Ｖで分離した。その後、ゲルを変性バッファー（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｎ  ＮａＯＨ）に３０分ずつ２回、中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に３０分ずつ２回浸した。サザンの記述した方法に従って、ゲノムＤＮＡを正荷電したナイロン膜（ロッシュモルキュラーバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、［米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在］）に転移した。
【００６２】
ＰＣＲ  Ｄｉｇプローブ合成キット（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、［独国マンハイム（Ｍａｎｈｅｉｍ］所在）を使用してプローブを合成した。製造会社の指示に従って、５０μｌの最終液量で反応を行った。増幅の温度サイクルは、９４℃で５分、９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分を計３５回、最後に延長時間７分であった。プローブの配列は以下の通りである。ｂｉｇＬ反復ドメインをコードするｂｉｇＬ  ＤＮＡ断片を増幅するために、ｂｉｇＬ３の反復ドメイン４〜６をコードする領域に対応したｂｉｇＬ３のＤＮＡ配列を選択した。
【化１】
2006516083.tif 000002
各々のｂｉｇＬ遺伝子に特異的なｂｉｇＬ  ＤＮＡ断片を増幅するために、ＢｉｇＬ遺伝子産物のＣ末端領域をコードする配列を選択した。
【化２】
2006516083.tif 000003
【００６３】
ＵＶ架橋膜を４２℃で１時間、Ｄｉｇ  Ｅａｓｙハイブリダイゼーション溶液（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））中で予備ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションに先立ち、Ｄｉｇ標識したプローブを１０分間煮沸し、即座に氷に転移して５分間置いた。変性したプローブをハイブリダイゼーション溶液と混合し、膜を４２℃で一晩それに浸した。ハイブリダイゼーションに引き続き、膜を２×ＳＳＣ（ＮａＣｌ、クエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳで５分間ずつ２回洗浄した（室温）。次いで膜を０．１ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３０分間ずつ２回洗浄した（４２℃）。化学発光産物を検出するために、膜をＢｉｏｍａｘ  ＭＬフィルム（イーストマンコダック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）、［米国ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）所在］）に１〜３分間曝露した。
【００６４】
図１Ａ及びＢはサザンブロットの結果を示す。ＢｉｇＬ反復配列をコードするＤＮＡ配列に対応したプローブは、Ｌ．キルシュネリ及びインテロガンスの複数のＤＮＡ断片にハイブリダイズした（図１Ａ）。対照的に、非病原性のＬ．ビフレキシの分解ゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションはみられなかった。Ｌ．インテロガンスのｂｉｇＬ遺伝子産物の各々に特異的なＣ末端領域をコードする配列に基づいたプローブは、分解したＬ．インテロガンスのゲノムＤＮＡの独自の断片の１つにハイブリダイズした。それ故に、このことは実施例１で同定した３種類のｂｉｇＬ遺伝子の各々のコピーが１つずつ存在することを確認する（図１Ｂ）。これらの結果は、非病原性のレプトスピラには見られないＤＮＡ断片の検出に基づいて、病原性のレプトスピラを特異的に同定する方法を示している。
【００６５】
例２Ｂ：レプトスピラゲノムＤＮＡのｂｉｇＬ遺伝子配列のＰＣＲ検出
本実施例は、病原性のレプトスピラのｂｉｇＬ遺伝子の分布について示す。他のレプトスピラ種においてｂｉｇＬ遺伝子を検出するために、実施例１で同定されたＬ．キルシュネリＲＭ５２株及びＬ．インテロガンスＦｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０株のｂｉｇＬ遺伝子の配列に基づいて縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを設計した。ＢｉｇＬ−１ｕｐと称する「上流」プライマーの配列は、５’−（ＧＣ）ＡＡＡＧＴＴＧ（ＴＣ）（ＡＧ）（ＴＣ）Ｇ（ＴＧ）ＣＴＴＧＧＣＣ−３’で、ｂｉｇＬ１の４６〜６５番目（開始コドンのＡからみて）（配列番号１）及びｂｉｇＬ３の４６〜６５番目（開始コドンのＡからみて）（配列番号５）に対応する。ＢｉｇＬ−２ｄｎと称する「下流」プライマーの配列は、５’−（ＧＣ）（ＡＴ）ＡＣＣ（ＡＧ）ＴＣ（ＣＴ）ＧＡＡＡＡ（ＡＧ）ＡＴ（ＡＴ）ＣＣ−３’で、ｂｉｇＬ１の５０６〜４８７番目（開始コドンのＡからみて）（配列番号１）及びｂｉｇＬ３の５０６〜４８７番目（開始コドンのＡからみて）（配列番号５）に対応する。各々のプライマーの長さは２０ヌクレオチドである。これらのプライマーがｂｉｇＬ２の９７〜１１６番目及び５９０〜５７１番目（ｂｉｇＬ２の開始コドンのＡからみて）にアニーリングするように設計した（配列番号３）。
【００６６】
レプトスピラの多数回継代株及び少数回継代株から精製したゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ反応を行った。図３では、評価済みの４種類の病原性種すべての菌株のゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲ反応で、増幅したＤＮＡ断片を同定した。断片はｂｉｇＬ１／ｂｉｇＬ３配列（４６１ｂｐ）及びｂｉｇＬ２配列（４９４ｂｐ）に基づいて推定される電気泳動の移動度を示した。評価済みの２種類の非病原性レプトスピラ種においては、増幅したＤＮＡ断片は同定されなかった。それ故に、本実施例は試料中の病原性レプトスピラＤＮＡを特異的に同定するこのＰＣＲ法の適用について示す。
【００６７】
例２Ｃ：レプトスピラｂｉｇＬ  ＲＮＡの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による検出
本実施例は、試料中のｂｉｇＬ  ＲＮＡの検出について示す。Ｌ．キルシュネリ（Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ）ＲＭ５２株を指数増殖後期まで培養し、熱フェノール法を使用して１×１０１０個のレプトスピラ細胞から全ＲＮＡを抽出し、エタノール沈殿させた後に水に再懸濁した（参照）。〜２□ｇのレプトスピラＲＮＡを、７０□ｌのＤＮａｓｅ  Ｉバッファー（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ）の１×ＲＮＡ  ｓｅｃｕｒｅ中に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で６単位のＤＮａｓｅ  Ｉ（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を使用して３７□で３分間分解した。ＤＮａｓｅ  Ｉを失活させるために、１．７５□ｌの２５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応を止め、７０□で５分間加熱処理して酵素を失活させた。記載の通りに（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、〜２００ｎｇのレプトスピラＲＮＡ及びＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴを使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写酵素反応を行うために以下のプライマーを使用した。
【化３】
2006516083.tif 000004
【００６８】
Ｔａｑポリメラーゼ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用したＤＮＡ  ＰＣＲをＲＴ反応液で行った。ＰＣＲに先立ち、以下のプライマーをＲＴ反応液に添加した。
【化４】
2006516083.tif 000005
【００６９】
逆転写のために添加したプライマーにより、５００ｂｐ、４７９ｂｐ、４４０ｂｐ及び４３８ｂｐのＰＣＲ産物が予想される。ＰＣＲを行うために反応混合物をＴｅｃｈｎｅ  Ｐｒｏｇｅｎｅサーモサイクラー中に入れた。最初の９５□１分の変性ステップに引き続いて、９５□３０秒の変性、５３□３０秒のアニーリング及び７２□３０秒の伸長を３０回行った。そして最後に、７２□で３０秒間インキュベーションした。
【００７０】
図４の結果は、ＲＴ−ＰＣＲ法がＢｉｇＬ３転写物及び対照のＬｉｐＬ４６転写物を検出できることを示す。ＢｉｇＬ１転写物及びＢｉｇＬ２転写物は同定されなかった。このことは、ＢｉｇＬ３はレプトスピラで発現しているが、ＢｉｇＬ１及びＢｉｇＬ２は発現していないかもしれないことを示す。さらにまたこれらの結果は、試料中の特異的なＢｉｇＬ遺伝子転写物を同定するためのＲＴ−ＰＣＲ法の適用を示す。
【実施例３】
【００７１】
組換えＢｉｇＬタンパク質の発現及び精製
本実施例は、組換えＢｉｇＬポリペプチドを発現させ、精製するための、ｂｉｇＬ遺伝子のＤＮＡ配列の使用について示す。Ｌ．インテロガンスＢｉｇＬ３の２領域の発現に使用するために２対のオリゴヌクレオチドを設計した。第１の領域は、Ｌ．キルシュネリのＢｉｇＬ３内部の２〜６番目までの反復ドメインに対応する領域で、ＢｉｇＬ３  ＤＮＡ配列の１３１〜６４９番目（配列番号６）に対応した。実施例１で同定したλＬ．インテロガンスＢｉｇＬ３クローンの配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計した。その配列は以下の通りである。
【化５】
2006516083.tif 000006
【００７２】
オリゴヌクレオチド４５Ｂ−１及び４５Ｂ−２並びに精製したＬ．インテロガンスのゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅を行い、ＤＮＡ断片を得た。これらの断片をＸｈｏＩ及びＮｃｏＩ酵素（ニューバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌａｂｓ））で分解し、ｐＲＳＥＴＡ発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した（１６）。ベクターに特異的なプライマー及びプライマー歩行法を使用してクローン化産物の配列を決定した。１５５７ｂｐ産物の配列を配列番号７に示す。ＢｉｇＬ３領域１と称する５１９アミノ酸からなるポリペプチドの推定配列を配列番号８に示す。
【００７３】
Ｌ．インテロガンスＢｉｇＬ３のＣ末端領域の最後の２００アミノ酸を含む第２の領域を、発現させるために選択した。この領域は、Ｌ．キルシュネリＢｉｇＬ３の１６８７〜１８８６番目（配列番号６）までのアミノ酸に対応した。この領域をクローン化するために使用したオリゴヌクレオチドは、
【化６】
2006516083.tif 000007
【００７４】
オリゴヌクレオチドＢＩＧＬＣＴＥＲＭ１及びＢＩＧＬＣＴＥＲＭ２、並びに精製したＬ．インテロガンスのゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅を行い、ＤＮＡ断片を得た。これらの断片をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ酵素（ニューバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌａｂｓ））で分解し、ｐＲＳＥＴＡ発現ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に連結した（１６）。ベクターに特異的なプライマー及びプライマー歩行法を使用してクローン化産物の配列を決定した。６００ｂｐ産物のヌクレオチド配列を配列番号９に示す。ＢｉｇＬ３領域２と称する２００アミノ酸からなるポリペプチドの推定配列を配列番号１０に示す。
【００７５】
組換えタンパク質ｒＢｉｇＬ領域１及び２をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓｏｇｅｎ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に発現させた。Ｈｉｓ６融合タンパク質を発現させるために、レプトスピラＤＮＡ断片をコードするｐＲＳＥＴプラスミドで形質転換した大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））の対数増殖期培養物に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ：最終濃度２ｍＭ、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を添加した。培養菌のペレットを可溶化するために６Ｍのグアニジン塩酸を使用し、Ｈｉｓ６融合タンパク質をＮｉ２＋−ニトリロ三酢酸−アガロース（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）及びファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。溶出したＨｉｓ６融合タンパク質の純度を、ゲル電気泳動及びクーマシーブリリアントブルーの染色によって評価した。タンパク質を透析（ＰＢＳ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）した。透析後、タンパク質濃度をビシンコニン酸で決定した（４２）。精製したＢｉｇＬ３領域１を写しとった後のＰｏｎｃｅａｕ−Ｓ（シグマケム社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏ））染色ニトロセルロース膜を図７に示す。精製したＢｉｇＬ３の相対移動度は、組換えタンパク質の推定アミノ酸配列に基づいて計算される推定分子量約５８ｋＤにほぼ等しかった。
【実施例４】
【００７６】
例４Ａ：組換えＢｉｇＬタンパク質に対する抗体の検出
本実施例は、対象試料中の抗体を検出するためにＢｉｇＬポリペプチドを使用する方法のうち２つの方法を示す。さらにまた、本実施例は、感染の疑いのある被験者の感染を同定するための血清診断キット法を提供する。
【００７７】
感染被験者の試料中のＢｉｇＬポリペプチドに対する抗体の免疫ブロット検出
非連続性のバッファー系を使用して、精製した組換えＢｉｇＬ３領域２のポリペプチド（１μｇ／レーン）（実施例３）をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１２％）にかけて、前述通りにニトロセルロース膜（オスモミックス（Ｏｓｍｏｍｉｃｓ））に写しとった（１７）。ニトロセルロースフィルターを５％のスキムミルクを含むＴＢＳＴでブロッキングし、検査で確認されたレプトスピラ症の患者、捕獲ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（尿及び腎臓の培養物が病原性のレプトスピラ陽性を示すレプトスピラの保菌宿主）並びに実験用ラット及びウサギ（Ｌ．インテロガンスセロバールコペンハーゲニＦｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０株の全溶解物で免疫）からプールした血清と共に１時間余りインキュベートした。対照実験として、ブラジル国内の健常者、捕獲ラット（培養物用又は血清にレプトスピラ感染の証拠がないもの）並びに実験用ラット及びウサギ（免疫前のもの）からの血清と共にインキュベーションを行った。使用に先立ち、血清を１：１００に希釈した。洗浄後、１：１０００に希釈したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトγ鎖抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と共に膜を１時間余りインキュベートした。抗原抗体複合体をＮＢＴ（０．３ｍｇ／ｍｌ）及びＢＣＩＰ（０．１５ｍｇ／ｍｌ）を用いた発色反応で検出した。レプトスピラ症患者及び病原性レプトスピラに感染した捕獲ラットからプールした血清は、精製した組換えＢｉｇＬ３領域１タンパク質を強く認識した。しかしながら、レプトスピラ全溶解物で免疫したラットは目で確認できるほどにはＢｉｇＬ３ポリペプチドに結合しなかった。このことは、ＢｉｇＬ３は培養したレプトスピラには発現しているが（実施例２、図４）、ｂｉｇＬ３遺伝子の発現量が異なっているかもしれないことを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは十分な量の天然ＢｉｇＬ３タンパク質が存在していないかもしれないのに対し、自然感染の間に、ｉｎ  ｖｉｖｏのレプトスピラは、強い免疫反応を引き起こすのに十分な量のＢｉｇＬ３を生成する。さらにまた、本実施例は、ある範囲の動物が感染時及び免疫反応の検出時においてＢｉｇＬ３に対する免疫反応を示すこと、並びに被験者の感染を同定する方法として組換えＢｉｇＬ３ポリペプチドに対する抗体の検出が使用可能であることを示す。
【００７８】
組換えＢｉｇＬ３ポリペプチドに対する抗体の検出方法の使用についてより詳しく例示するために、検査で確認されたレプトスピラ症の患者、ブラジル国内及び米国内の健常者、レプトスピラ症以外と診断された入院患者又は外来診療所の患者からの血清を用いて免疫ブロット評価を行った。臨床的に疾病の疑われる患者においてレプトスピラ症の診断を確認するために、微量凝集反応試験及び培養菌分離を使用した（５）。レプトスピラ症患者から集めた血清は、ブラジルのサルバドール市でのレプトスピラ症に関する５年間の調査で集められたものである。対照の個人から集めた血清は、入院患者及び外来診療所患者に対する既存の血清銀行並びにブラジルのサルバドール市の健常者から、また米国の疾病対策予防センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）を通じて入手した。表１に使用した血清の一覧を示す。１：１００に希釈した血清を上述の方法に従って分析した。免疫ブロットでは、目で確認できる程度の組換えＢｉｇＬ３領域１ポリペプチド１μｇのバンドの発色を陽性反応とみなした。
【００７９】
図８は、個々のレプトスピラ症患者からの血清が組換えＢｉｇＬ３に反応することを示す。レプトスピラ症の入院患者の９０％以上及びレプトスピラ症の外来患者の約７０％が、活発な感染時にｒＢｉｇＬ３に反応することを示した結果を表１に要約する。レプトスピラ症患者のすべて（１００％）が、疾病の回復期においてｒＢｉｇＬ３に反応する。表２は、ｒＢｉｇＬ３に対する血清反応性を標準的な診断学的検査と比較している。ｒＢｉｇＬ３の血清反応性は、疾病の初期段階においては標準的な診断試験で観察されたものより大きかった。米国内の健常者及びブラジル国内の健常者の８８％はｒＢｉｇＬ３に反応しなかった。このことは、ｒＢｉｇＬ３に対するこの反応が特異的であることを示す。ブラジルの健常者間のＩｇＭ血清反応性の頻度に基づいて計算した場合、反応の特異性は１００％まで増加する。以上をまとめると、これらの結果は、この方法が活発な感染の血清学的マーカーとして使用できること及びレプトスピラ症の診断に使用できるキットの基礎となることを示す。
【００８０】
レプトスピラ症の危険性が高い伝染病地域におけるｒＢｉｇＬ３の血清反応性についての調査結果を表１に要約する。これらの地域に住む人口の２５％はｒＢｉｇＬ３  ＩｇＧ血清反応性を示す。このことは、この反応が過去の感染を同定する有用なマーカーとなり得ることを示す。レプトスピラ症と確認された患者のうち５６％が、レプトスピラ症感染後の２年の間にｒＢｉｇＬ３に対する血清反応を示した（表２）。レプトスピラ症感染後２〜４年の間に、１８％がｒＢｉｇＬ３に対する血清反応性を示した。以上をまとめると、これらの結果は、免疫ブロット法を基礎としたキットが過去のレプトスピラ症感染を検出できることを示す。
【００８１】
例４Ｂ：感染被験者の試料中のＢｉｇＬポリペプチドに対する抗体のＥＬＩＳＡ基準検出
本実施例は、ＢｉｇＬポリペプチドに対する抗体を検出する際、及び感染の疑いをもたれる人々の中でレプトスピラ症の患者を同定する際にＥＬＩＳＡ法が有用であることを示す。０．０５Ｍ  炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中に懸濁したＨｉｓ６融合ｒＢｉｇＬ３（０．５〜１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）で平底のポリスチレンマイクロタイタープレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））を４℃で一晩コートする（１６）。プレートを蒸留水で２回洗浄し、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。プレートをブロッキング溶液（ＰＢＳＴ／１％［ｗ／ｖ］ウシ血清アルブミン）で２時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳＴで４回洗浄後、−２０℃で使用時まで保存した。ブロッキング溶液で５〜２００倍に希釈した５０μｌの血清をウェルに加えて、室温で１時間振盪した。ＰＢＳＴで４回洗浄後、５０００〜２００００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ヒトμ又はγ鎖ヤギ抗体（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をウェルに加えて、室温で１時間振盪した。その後、プレートをＰＢＳＴで２回、ＰＢＳで３回洗浄し、１ウェルにつき５０μｌずつの０．０１％（ｗ／ｖ）３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（基質バッファー中（０．０３％［ｖ／ｖ］過酸化水素、２５ｍＭ  クエン酸、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５．０）に）でインキュベートした（２０分間、暗状態、室温）。２５μｌの２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して発色反応を止め、Ｅｍａｘマイクロプレートリーダー（モルキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、［米国カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）所在］）で４５０ｎｍの吸収を測定した。
【００８２】
検査で確認されたレプトスピラ症ケース（ｎ＝４）からの血清試料のＥＬＩＳＡ反応とブラジル国内のレプトスピラ症感染地域の健常者（ｎ＝４）からの血清試料のＥＬＩＳＡ反応を区別するのに最適の抗原濃度（μｇ／ｗｅｌｌ）を決定するために、最初のアッセイを行った。５０、１００、２００倍といった血清希釈及び１ウェルにつき２５、５０、１００、２００ｎｇの抗原濃度でチェッカーボード滴定を行った。図６は、対照の個人よりもレプトスピラ症患者の場合において、血清希釈及びｒＢｉｇＬ３ポリペプチドの濃度のすべてで吸収値の大幅な増大を観察したことを示す。
【００８３】
感受性及び特異性を決定するその後のアッセイでは、プレートを５０ｎｇのｒＢｉｇＬ３でコートした。５０倍希釈の一次血清及び１０，０００倍希釈の２次抗体結合体でプレートをインキュベートした。分析のために個々の血清試料を２組ずつ調べて、それらの平均をとった。測定値が１０％以上異なる組はもう一度調べ直した。すべての組換え抗原に陽性反応を示す対照血清試料の１つ及び陰性反応を示す対照血清試料の１つを品質管理手段としてそれぞれ２組ずつ各プレートに含めた。図７は、疾病の急性期にあるレプトスピラ症患者が対照の個人よりもＩｇＭ及びＩｇＧ血清反応性に対してはるかに大きい吸収を示すことを示す（図７）。疾病の回復期にある患者の吸収値を比較した場合、その違いは大きくなる。これらの実験は、ＥＬＩＳＡを基礎としたｒＢｉｇＬ３ポリペプチドに対する抗体検出方法がレプトスピラ症感染を同定するのに有用であり、診断キットとして使用できることを示す。
【実施例５】
【００８４】
被験者におけるレプトスピラ症免疫反応の誘発
本実施例は、組換えＢｉｇＬタンパク質の免疫を介してＢｉｇＬタンパク質に対する免疫反応を誘発できることを示す。実施例３に記述した方法で精製した組換えＢｉｇＬ３ポリペプチド（Ｌ．インテロガンス由来）を得た。実験室のラット（ウィスター系）をフロイントアジュバント（シグマ（Ｓｉｇｍａ））に懸濁した４０μｇのｒＢｉｇＬ３で免疫し、皮下に接種した。３週目及び６週目に２０μｇのｒＢｉｇＬ３で追加免疫を行った。最初の免疫から７週間後に血液を集めて、血清用に処理した。実施例４に従って、ｒＢｉｇＬ３（１μｇ／レーン）を用いた免疫ブロットを準備した。図９は、ｒＢｉｇＬ３で免疫したラットの血清反応性を示す。ｒＢｉｇＬ３は、計３回の免疫で１：２５００超の力価をもつｒＢｉｇＬ３血清反応性免疫ブロットを誘導するほど効果的な抗原であった。さらにまた、ｒＢｉｇＬ３ポリペプチドに対する抗体は、レプトスピラ全溶解物（１レーンにつき１０８のレプトスピラ）中において天然の抗原を認識した（図９）。免疫ブロットでは、２００ｋＤの相対移動度をもつバンドがわずかに染色されたが、それより小さな相対移動度をもつバンドがより強く染色される。このことは、２００ｋＤ以上の分子量のＢｉｇＬタンパク質が分解を受けていることを表しているかもしれない。免疫前の血清では反応がみられないので、これらの天然の抗原に対する血清反応性は特異的なものである。
【００８５】
精製した組換えＢｉｇＬポリペプチド（Ｌ．キルシュネリ由来）を用いて免疫原性実験を行った。精製した組換えタンパク質を１２％調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせ、電気泳動によって分離ゲルへ移動させた。１００〜２００μｇの組換えタンパク質を含むバンドをゲルから除去して乾燥させ粉末にして１ｍｌの水に懸濁し、１ｍｌのフロイント完全アジュバント（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と混ぜて、レプトスピラ抗体をもたないニュージーランド白ウサギ（ハーランスピラーグドーリー）の皮下及び筋肉内に接種した。最初の免疫の４週間後及び８週間後に、フロイント不完全アジュバント（シグマ（Ｓｉｇｍａ））と混合させた粉末アクリルアミドゲル中の等量の融合タンパク質で追加免疫を行った。最初の免疫から１０週間後にウサギから血液を集めて、血清用に処理した（ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ、１９８８））。１レーンにつき１０８個のレプトスピラ濃度で、以前に記述されている方法で（ゲレイロら（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ２００１））免疫ブロットを行った。
【００８６】
図１０は、Ｌ．キルシュネリ由来のｒＢｉｇＬ３を用いた免疫が、Ｌ．キルシュネリの天然ｒＢｉｇＬ３ポリペプチド及びＬ．インテロガンスといった他の病原性レプトスピラ種の天然ｒＢｉｇＬ３ポリペプチドに対して高い抗体力価を誘発することを示す。以上をまとめると、これらの結果は、ｒＢｉｇＬポリペプチドを用いた免疫が、組換えｒＢｉｇＬポリペプチドの設計に使用した種以外の病原性スピロヘータ種に対する免疫反応を誘発することを示す。さらにまた、この免疫方法で産生した抗体は試料中の病原性スピロヘータの検出に使用できる。
【００８７】
最後に本実施例は、天然ＢｉｇＬポリペプチドの存在が毒性の少数回培養継代株には観察されるが、無毒性の弱毒化多数回培養継代株には観察されないことを示す（図１０）。ｒＢｉｇＬ３で免疫したウサギの血清は、毒性株のレプトスピラ全溶解物においてＢｉｇＬ３に対応する予想通りの２００ｋＤａを認識したが、無毒性の弱毒化株のものにおいては認識しなかった。本実施例は、ＢｉｇＬタンパク質が毒性に対するマーカーとなること、及びＢｉｇＬタンパク質に対する抗体を毒性株の同定方法として使用できることを示す。ＢｉｇＬはそれ自体、毒性因子であり得るので、本実施例に示されるようなＢｉｇＬタンパク質に対する免疫応答の誘発はワクチンとしての適用に有用であろう。
【００８８】
【表１】
2006516083.tif 000008
【００８９】
【表２】
2006516083.tif 000009
【００９０】
種々の修正及び変更を本発明の化合物及び方法に加え得ることは当業者には明らかであろう。したがって、付帯する請求項及びそれらの同等物の範囲内に入る限り、本発明はそのような修正及び変更を包含することを意図する。よって、本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限される。
【００９１】
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【００９２】
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】レプトスピラにおけるｂｉｇＬ遺伝子配列のサザンブロット分析を示す図である。Ｌ．インテロガンスＦｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０株（レーン１）、Ｌ．キルシュネリＲｍ５２株（レーン２）及びＬ．ビフレキシ（Ｌ．ｂｉｆｌｅｘｉ）Ｐａｔｏｃ  Ｉ株（レーン３）から得たゲノムＤＮＡ（３ｍｃｇ／レーン）をＮｓｉＩで分解しアガロースゲル電気泳動にかけた。ニトロセルロース膜に写しとった後、これらの遺伝子にそれぞれ特有であるＢｉｇＬ反復ドメイン（ＢｉｇＬ３の第４ないし第６反復ドメイン、図１Ａ）、及びｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３のＣ末端領域（図１Ｂ）をコードするＤＮＡ断片をプローブとしてブロットを分析した。
【図２】Ｌ．キルシュネリにおいてＢｉｇＬ１及びＢｉｇＬ３タンパク質をコードする領域のゲノム編成を示す概略図である。ＢｉｇＬ１タンパク質はシグナルペプチド（斜線長方形）とアミノ酸９０個の細菌免疫グロブリン様ドメイン１３個（黒長方形）を含む。ＢｉｇＬ３タンパク質はシグナルペプチド、アミノ酸９０個の細菌免疫グロブリン様ドメイン１２個、及びアミノ酸７９３個のカルボキシ末端（Ｃ末端）ドメインを含む。ＤＮＡ配列が１００％一致する２１５６ｂｐ領域の位置を示す。描いた領域の編成はＬ．インテロガンス及びＬ．キルシュネリで保存されていた。
【図３】レプトスピラの病原性５種の株から得たＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を示す図である。位置４６〜６５ａａに対応するＢｉｇＬ３領域をコードするＬ．キルシュネリ及びＬ．インテロガンスの配列に基づき縮重プライマーを設計した。病原性の５種（Ｌ．キルシュネリ、Ｌ．ボルグペテルセニー（Ｌ．ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、Ｌ．インテロガンス、Ｌ．サンタロサイ（Ｌ．ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）及びＬ．ノグチ（Ｌ．ｎｏｇｕｃｈｉ））並びに非病原性の２種（Ｌ．ビフレキシ及びＬ．ウォルバキー（Ｌ．ｗｏｌｂａｃｈｉｉ））から精製したＤＮＡでＰＣＲ反応を行った。
【図４】ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３の特異的プライマーでＬ．キルシュネリのＲＮＡ抽出物のＲＴ−ＰＣＲによる増幅産物を示す図である。培養レプトスピラのＲＮＡ抽出物に逆転写反応（レーン「＋」）を行い、ｂｉｇＬ１、ｂｉｇＬ２及びｂｉｇＬ３内の特有配列と結合するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅ステップにかけた。ｌｉｐＬ４５内の配列に基づくプライマーを用いた増幅、並びに逆転写ステップを行わなかった試料に対するＰＣＲ反応を対照反応として実施した。
【図５】病原性レプトスピラに感染した患者及び動物保菌宿主、並びに全Ｌ．インテロガンス抗原の調製物を免疫した実験動物から得たプール血清の、組換えＢｉｇＬ３タンパク質（ｒＢｉｇＬ３）に対する免疫ブロットでの反応性を示す図である。精製ｒＢｉｇＬ３（１レーンあたり１ｍｃｇ、レーン３）を用いてウエスタンブロット分析を実施した。レプトスピラ症患者の血清（レーンＡ）、健康な個体（レーンＢ）、Ｌ．インテロガンスが常在化している捕獲ラット（レーンＣ）、Ｌ．インテロガンスが常在化していない捕獲ラット（レーンＤ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養したＬ．インテロガンスの全抗原調製物を免疫された実験用ラット（レーンＥ）及び免疫前に採取された実験用ラットの免疫前血清（レーンＦ）をプローブとして膜を分析した。全Ｌ．インテロガンス抗原調製物（レーン１）及び組換えＬｉｐＬ３２タンパク質（ｒＬｉｐＬ３２、レーン２）に対する反応性を比較のために示す。左の数字は分子量標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の位置と相対移動度（ｋＤａ）を示す。
【図６】レプトスピラ症の疾患急性期（レーンＡ）及び疾患回復期（レーンＢ）におけるｒＢｉｇＬ３に対する個々の患者の血清反応性を評価したＥＬＩＳＡを示す図である。レプトスピラ症患者４名（実線）及び健康な個体４名（点線）の血清を１：５０、１：１００及び１：２００の希釈でＲＢｉｇＬ３（１穴あたり２５〜２００ｎｇ）と共にインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合させた、μ鎖及びγ鎖に特異的な抗体をそれぞれＩｇＭ及びＩｇＧ血清反応性を測定するために使用した。平均吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）及び標準偏差をグラフに示す。
【図７】疾患急性期（レーン２）及び疾患回復期（レーン３）におけるレプトスピラ症患者２９名、並びに健康な個体２８名（レーン１）の血清におけるｒＢｉｇＬ３のＩｇＭ（Ａ）及びＩｇＧ（Ｂ）の反応性を示す図である。血清（１：５０希釈）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼと結合させた、μ鎖及びγ鎖に特異的な抗体を反応性を測定するために使用した。実線は平均吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。
【図８】疾患急性期（レーン６〜９）及び疾患回復期（レーン１０〜１３）における、ｒＢｉｇＬ３に対する個々のレプトスピラ症患者の免疫ブロットでの反応性を示す図である。精製ｒＢｉｇＬ３（１レーンあたり１ｍｃｇ、レーン３）を用いてウエスタンブロット分析を実施した。１：１００に希釈した血清をプローブとして膜を分析した。ＢｉｇＬ３領域１の５８ｋＤの組換えタンパク質（第２ないし第６Ｂｉｇ反復ドメイン）に対する反応性を測定するために、アルカリホスファターゼと結合させたγ鎖特異的抗体を使用した。ｒＬｉｐＬ３２（１レーンあたり１ｍｃｇ）に対する反応性を比較として実施した。それぞれＰｏｎｃｅａｕ−Ｓ及びクマシーブルーを用いて染色後の精製ｒＢｉｇＬ３２、精製ｒＬｉｐＬ３２（レーン１４）及び分子量標準（レーン１５）の移動度を示す。
【図９】ｒＢｉｇＬ３及びＬ．インテロガンス溶解物から得た天然抗原に対するラット抗ｒＢｉｇＬ３抗血清の免疫ブロットでの反応性を示す図である。精製ｒＢｉｇＬ３（１ｍｇ／レーン；レーン３、５、７、９）及び培養レプトスピラからの全抗原調製物（レプトスピラ１０８個／レーン；レーン２、４、６及び８）を用いて免疫ブロットを調製した。Ｌ．インテロガンス由来ｂｉｇＬ３のクローニング済みＤＮＡ断片を発現する大腸菌から得たｒＢｉｇＬ３を免疫されたラットからのプール血清（１：５００希釈［レーン４及び５］、１：１００希釈［レーン６及び７］、１：２５００希釈［レーン８及び９］）をプローブとして膜を分析した。初回免疫に先立って免疫前の血清を入手し、対照として免疫ブロット分析に使用した（レーン２及び３）。分子量標準の移動度（ｋＤａ）を図の左側に示す。
【図１０】レプトスピラ株の溶解物から得た天然抗原に対する、ウサギ抗ｒＢｉｇＬ３抗血清の免疫ブロットでの反応性を示す図である。以下の培養株の全抗原調製物を用いて免疫ブロットを調製した（レプトスピラ１０８個／レーン）。レーン１、Ｌインテロガンスｓｖポモナ（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｖ  ｐｏｍｏｎａ）（ケネウィッキ（ｋｅｎｎｅｗｉｃｋｉ）型）ＲＭ２１１株、少数回継代。レーン２、Ｌ．インテロガンスｓｖカニコラ（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｖ  ｃａｎｉｃｏｌａ）ＣＤＣ  Ｎｉｃ  １８０８株、少数回継代。レーン３、Ｌ．インテロガンスｓｖポモナＰＯ−０１株、多数回継代。レーン４、Ｌ．インテロガンスｓｖブラティスラバ（Ｌ．ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｖ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）ＡＳ−０５株、多数回継代。レーン５、Ｌ．キルシュネリｓｖグリッポチフォーザＲＭ５２株、少数回継代。レーン６、Ｌ．キルシュネリｓｖグリッポチフォーザＰ８８２７−２株、少数回継代。レーン７、Ｌ．キルシュネリｓｖグリッポチフォーザ８６−８９株、少数回継代。レーン８、Ｌ．キルシュネリｓｖグリッポチフォーザＭｏｓｋｖａ  Ｖ株、多数回継代。レーン９、Ｌ．キルシュネリｓｖモズドク（Ｌ．ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ  ｓｖ  ｍｏｚｄｏｋ）５６２１株、多数回継代。レーン１０、Ｌ．キルシュネリｓｖグリッポチフォーザＲＭ５２株、多数回継代。Ｌ．キルシュネリ由来ｂｉｇＬ３のクローニング済みＤＮＡ断片を発現する大腸菌からのｒＢｉｇＬ３を免疫したウサギから得た血清をプローブとして膜を分析した。組換えＬ．キルシュネリＧｒｏＥＬタンパク質を免疫したウサギの血清を対照測定とした。ＢｉｇＬ３及びＧｒｏＥＬに対応する天然抗原の位置及び分子量標準の移動度（ｋＤａ）をそれぞれ図の左側及び右側に示す。
【配列表】
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2006516083.tif 000019
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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