(57)【要約】複数の核酸分子の中で既知の配列を有する標的核酸分子を検出するための方法を開示する。該方法は、標的核酸分子上の隣接したヌクレオチド配列に２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせること、２つのオリゴヌクレオチドを互いに連結すること、および標的核酸分子上の５’ヌクレオチド配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズしたプライマーを伸長させることを含む。標的核酸分子が存在する（および、それによって２つのオリゴヌクレオチドが連結される）場合、プライマーの伸長によって、標的核酸分子上の３’ヌクレオチド配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの５’末端にハイブリダイズした検出プローブが除去される。本発明の方法を実施するためのキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の鋳型（a plurality of templates）における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；（ｉｖ）第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない、プライマー；および（ｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；
（ｂ）リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；
（ｃ）プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼと工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、
（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す；
を含む方法。
【請求項２】
複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；（ｉｖ）第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない、プライマー；および（ｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；
（ｂ）リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；
（ｃ）プライマーおよび第２プライマーの伸長によって標的核酸分子が増幅される条件下で、DNAポリメラーゼ、および第２プライマーの３’末端が、第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列と第２配列の両方に対して５’である第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である第２プライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、
（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す；
を含む方法。
【請求項３】
複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；
（ｂ）リガーゼが既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；
（ｃ）プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼ、および第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではないプライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、
（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す；
を含む方法。
【請求項４】
複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；
（ｂ）リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；
（ｃ）プライマーおよび第２プライマーの伸長によって標的核酸分子が増幅される条件下で、DNAポリメラーゼ、第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列に相補的ではないプライマー、ならびに第２プライマーの３’末端配列が、第１オリゴヌクレオチドの３’末端および第２配列の両方に対して５’である第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である第２プライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、
（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す；
を含む方法。
【請求項５】
複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；
（ｂ）検出プローブが第１オリゴヌクレオチドの第２配列にハイブリダイズする条件下で、ユニバーサル配列を含む検出プローブと、およびリガーゼが既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと、工程（ａ）の産物をインキュベートすること；
（ｃ）プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼ、および第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではないプライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、
（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す；
を含む方法。
【請求項６】
複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）（ｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；
（ｂ）検出プローブが第１オリゴヌクレオチドの第２配列にハイブリダイズする条件下で、ユニバーサル配列を含む検出プローブと、およびリガーゼが既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下でリガーゼと、工程（ａ）の産物をインキュベートすること；
（ｃ）プライマーおよび第２プライマーの伸長によって標的核酸分子が増幅される条件下で、DNAポリメラーゼ、第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではないプライマー、および第２プライマーの３’末端配列が、第１オリゴヌクレオチドの３’末端と第２配列の両方に対して５’である第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である、第２プライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、
（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す；
を含む方法。
【請求項７】
プライマーおよび第２プライマーのヌクレオチド配列が同一である、請求項２、４または６の方法。
【請求項８】
検出プローブの３’末端が標識されたものである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項９】
検出プローブの５’末端がクエンチング部分に共有結合したものである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１０】
第２オリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化されたものである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１１】
標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列が、長さ約２０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１２】
標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な第２オリゴヌクレオチドの５’末端配列が、長さ約２０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１３】
ユニバーサル配列が、長さ約２０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１４】
ユニバーサル配列が、長さ約６０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１５】
第２オリゴヌクレオチドが、長さ約４０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１６】
プライマーの３’末端配列が、長さ約２０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１７】
第２プライマーの３’末端配列が、長さ約２０ヌクレオチドである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１８】
ハイブリダイズしていない検出プローブが短くされ、短くされたハイブリダイズしていない検出プローブの存在が複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示すものである、請求項１、２、３、４、５または６の方法。
【請求項１９】
複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するためのキットであって、以下の：（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分に隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含み、該３’末端配列が標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではないプライマー；および（ｖ）ハイブリダイズしていない検出プローブの検出手段；を含むキット。
【請求項２０】
リガーゼをさらに含む、請求項１９のキット。
【請求項２１】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１９のキット。
【請求項２２】
第２プライマーをさらに含む、請求項１９のキットであって、第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列および第２配列の両方に対して５’である、第２プライマーの３’末端配列が第１オリゴヌクレオチドの一部と同一であるキット。
【請求項２３】
第１オリゴヌクレオチドの５’末端配列が第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的である、請求項１９のキット。
【請求項２４】
ハイブリダイズしていない検出プローブの検出手段が、短くされたハイブリダイズしていない検出プローブを検出できるものである、請求項１９のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年３月１３日に出願された「核酸検出方法」という名称の米国仮出願第60/364,230号の利益を主張し、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
発明の背景
本発明は、分子生物学の分野に関連する。特に、本発明は、サンプル中の特定の核酸分子の検出および定量に関する。
【０００３】
サンプル中の特定の核酸分子の存在を検出するための様々な方法が知られている。これらの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence based amplification）、鎖置換増幅（strand displacement amplification）、Ｑｏレプリカーゼによる増幅（例えば、米国特許第4,683,195号; Birkenmeye and Mushahwar, J. Virol. Method 35: 117-126, 1991; Landegren, Trends Genetics 9: 199-202, 1993を参照）を含む。
【０００４】
しかし、核酸分子の増幅が多数のために、前記の方法の全てで誤りが起こりやすい。さらに、配列特異的オリゴヌクレオチドおよびプライマーを、検出するそれぞれの特定の核酸分子について作成しなければいけないために、前記の方法は非常に高くつく。
【０００５】
従って、サンプル中の特定の核酸分子を検出するための、速く、確実かつ費用効率のよい方法を見つける必要がある。
【０００６】
発明の要約
本発明は、サンプル中の特定の核酸分子を検出するための、速く、確実かつ費用効率のよい方法を提供する。本発明の方法を用いて、多数の分子の中から、既知の配列を有する核酸分子の存在を検出することができる。
【０００７】
従って、１つの態様において、本発明は、複数の鋳型（a plurality of templates）における標的核酸分子の存在を検出するための方法を提供する。該方法は、（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、および検出プローブのユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；（ｉｖ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマー；および（ｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；（ｂ）リガーゼが第１オリゴヌクレオチドの３’末端（既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズしている）と、第２オリゴヌクレオチドの５’末端（既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズしている）の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；（ｃ）プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す、を含む。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の：（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、および検出プローブのユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；（ｉｖ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマー；および（ｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；（ｂ）リガーゼが、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズしている）と、第２オリゴヌクレオチドの５’末端（既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズしている）の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；（ｃ） 標的核酸分子が該プライマーおよび第２プライマーの伸長によって増幅される条件下で、DNAポリメラーゼと、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の一部に相補的である）および第１オリゴヌクレオチドの第２配列（ユニバーサル配列と相補的である）の両方に対して５’である、第１オリゴヌクレオチドの一部と同一の３’末端を含む第２プライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す、を含む方法を提供する。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。ある具体例において、該プライマーおよび第２プライマーのヌクレオチド配列は同一である。いくつかの具体例において、第２プライマーの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【０００９】
もう１つの態様において、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の：（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、および検出プローブのユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；（ｂ）リガーゼが、既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；（ｃ）プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼと、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す、を含む方法を提供する。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。
【００１０】
もう１つの態様において、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、および検出プローブのユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｖ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；（ｂ）リガーゼが、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズしている）と、第２オリゴヌクレオチドの５’末端（既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズしている）の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと工程（ａ）の産物をインキュベートすること；（ｃ） 標的核酸分子が該プライマーおよび第２プライマーの伸長によって増幅される条件下で、DNAポリメラーゼと、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマーと、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の一部に相補的である）および第１オリゴヌクレオチドの第２配列（ユニバーサル配列と相補的である）の両方に対して５’である、第１オリゴヌクレオチドの一部と同一の３’末端を含む第２プライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す、を含む方法を提供する。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。ある具体例において、該プライマーおよび第２プライマーのヌクレオチド配列は同一である。いくつかの具体例において、第２プライマーの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【００１１】
さらにもう１つの態様において、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、および検出プローブのユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること； （ｂ）検出プローブが第１オリゴヌクレオチドの第２配列にハイブリダイズする条件下で、ユニバーサル配列を含む検出プローブと、およびリガーゼが既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと、工程（ａ）の産物をインキュベートすること；（ｃ）プライマーが伸長する条件下で、DNAポリメラーゼ、および第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的な３’末端配列を含むプライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す、を含む。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。
【００１２】
もう１つの態様において、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分と隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および（ｉｉｉ）標的核酸分子を含む疑いのある複数の鋳型；を組み合わせることであって、相補鎖がもう一方にハイブリダイズする条件下で組み合わせること；（ｂ）検出プローブが第１オリゴヌクレオチドの第２配列にハイブリダイズする条件下で、検出プローブと、リガーゼが第１オリゴヌクレオチドの３’末端（既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズしている）と、第２オリゴヌクレオチドの５’末端（既知のヌクレオチド配列の第２部分にハイブリダイズしている）の間の共有結合を形成させる条件下で、リガーゼと、工程（ａ）の産物をインキュベートすること；（ｃ）標的核酸分子が該プライマーおよび第２プライマーの伸長によって増幅される条件下で、DNAポリメラーゼと、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマーと、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の一部に相補的である）および第１オリゴヌクレオチドの第２配列（ユニバーサル配列と相補的である）の両方に対して５’である、第１オリゴヌクレオチドの一部と同一の３’末端を含む第２プライマーと、工程（ｂ）の産物をインキュベートすること；次いで、（ｄ）ハイブリダイズしていない検出プローブの存在を検出することであって、ここにハイブリダイズしていない検出プローブの存在が、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示す、を含む方法を提供する。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。ある具体例において、該プライマーおよび第２プライマーのヌクレオチド配列は同一である。いくつかの具体例において、第２プライマーの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【００１３】
本発明の前記態様の様々な具体例において、検出プローブは標識される。特定の具体例において、検出プローブは蛍光標識、レポーター色素による標識、放射標識（例えば、32P、35S、もしくは3H）、および／または他の手段（例えば、ビオチン化）によって標識される。ある具体例において、検出プローブの３’末端が標識される。いくつかの具体例において、検出プローブの５’末端はクエンチング部分に共有結合する。
【００１４】
ある具体例において、第２オリゴヌクレオチドの５’末端はリン酸化される。
【００１５】
前記態様の特定の具体例において、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。ある具体例において、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な第２オリゴヌクレオチドの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【００１６】
本発明の前記態様のいくつかの具体例において、ユニバーサル配列は長さ約２０ヌクレオチドである。いくつかの具体例において、第１オリゴヌクレオチドは、長さ約６０ヌクレオチドである。いくつかの具体例において、第２オリゴヌクレオチドは、長さ約４０ヌクレオチドである。特定の具体例において、プライマーの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【００１７】
１つの態様において、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するためのキットであって、以下の工程：（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、および検出プローブのユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分に隣接するものであるオリゴヌクレオチド；（ｉｖ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマー；および（ｖ）ハイブリダイズしていない検出プローブの検出手段；を含むキットを提供する。いくつかの具体例において、ハイブリダイズしていない検出プローブは短くなる。
【００１８】
ある具体例において、第１オリゴヌクレオチドの第２配列は、第１オリゴヌクレオチドの中間にある。ある具体例において、該プライマーの３’末端配列は、第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的である。
【００１９】
本発明のこの態様のある具体例において、該キットは、さらにリガーゼを含む。いくつかの具体例において、該キットはＤＮＡポリメラーゼを含む。特定の具体例において、該キットは、さらに、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的である）、および第１オリゴヌクレオチドの第２配列（ユニバーサル配列と相補的である）の両方に対して５’である第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である３’末端配列を含む第２プライマーを含む。ある具体例において、該キットの第１オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的である。
【００２０】
詳細な記載
本明細書に引用された特許および科学文献は、当業者が入手可能な知識を明らかにするものである。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベースの配列を含む引用文献は、それぞれが特定かつ個別に参照により本明細書に組み込まれるとされるように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
本発明は、サンプル中の既知の核酸配列を有する標的核酸分子の存在を、迅速かつ正確に検出するための簡単な方法の発見に由来する。本発明によって、サンプル中の既知の核酸配列を有する標的核酸分子の存在の、迅速かつ正確な検出が可能となる。いくつかの具体例において、本発明の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用しない（図１Ａ〜１Ｄを参照）。本発明の他の具体例において、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、検出プローブのシグナルを増幅する（図２Ａ〜２Ｄを参照）。よって、本発明は、既知の配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、レポータープローブ、およびＤＮＡリガーゼを用いて、標的核酸分子の存在を検出するための非常に簡単な方法を提供する。
【００２２】
従って、本発明は、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を検出するための方法を提供する。
【００２３】
本明細書中で使用される、「核酸分子」とは、ヌクレオチドがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）である、ヌクレオチドを含む一本鎖分子を意味する。本発明の核酸分子は、あらゆる長さであってもよい（すなわち、あらゆる数のヌクレオチドを含んでいてよい）。２つの一本鎖核酸分子上の相補的なヌクレオチドが互いにハイブリダイズすることから、「核酸分子」という語は、「融解」して２つの相補的な一本鎖の核酸分子を生じることのできる二本鎖分子も含む（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994を参照）。
【００２４】
「複数の鋳型」という語は、タンパク質または炭水化物のごとき他の分子を含んでいてもよい核酸分子のサンプルを意味する。よって、複数の鋳型は、生物の全ゲノムのサンプル、ｃＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー、または生物の全ＲＮＡ（もしくはｍＲＮＡ）のサンプルを含むが、それらに限定されない。本発明で意図される「生物」とは、下等および高等な真核生物、例えば、植物（双子葉と単子葉の両方）および動物（例えば、ヒト、齧歯動物、ヒト以外の霊長類、鳥類、および家畜哺乳類）に加えて、原核生物、ウイルスを含む。
【００２５】
本発明の方法の第１の工程において、相補的な配列が互いにハイブリダイズする条件下で、以下の：（ｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列（すなわち、３’末端配列に対して５’）を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分に隣接するものであるオリゴヌクレオチド；ならびに（ｉｉｉ）標的核酸分子を含むと考えられる複数の鋳型；を組み合わせる。
【００２６】
第１の工程の変形において、組み合わせは、ユニバーサル配列を含む検出プローブも含む。第１の工程の変形において、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列（例えば、該プライマーの３’末端配列が、第２オリゴヌクレオチドの３’末端配列に相補的であるもの）を含むプライマーも組み合わせに含まれる。
【００２７】
本発明の目的のために、「相補的な」という語は、相補鎖間の塩基特異的水素結合によりWatson-CrickまたはHoogstein塩基対が形成された結果として、ゲノム領域、遺伝子、ｃＤＮＡまたはそれらのＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力を有することを意味する。本明細書で使用される「ハイブリダイズ」とは、一本鎖核酸分子間の塩基対相互作用の形成を意味する（例えば、前記のAusubel et al.,を参照）。
【００２８】
安定なハイブリダイゼーションを得るために相補的でなければならないヌクレオチドの厳密な割合は、ヌクレオチド配列（例えば、２つの一本鎖核酸分子の短い方のＧおよびＣの含量）、２つの分子のミスマッチの位置、ハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄溶液の塩および／またはホルムアミド濃度、温度、ならびにｐＨを含むがそれらに限定されない、多くのハイブリダイゼーション条件の要素によって変化する（例えば、Ausubel et al., supra; Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照）。２本鎖の核酸分子の融解温度（ＴＭ）（すなわち、２本鎖の分子が１本鎖になる温度）を算出するための式は既知である（例えば、前記のSambrook et al.、特に9.51および11.46を参照）。
【００２９】
本発明によると、「相補的な配列が互いにハイブリダイズする条件下で」核酸分子を組み合わせるとは、塩基対に関して正しく一致した、もしくは２つの配列間で小さな割合（１−１０％）しか塩基のミスマッチがない２つのヌクレオチド配列が、塩基対となり、検出を許容する程度に安定な２本鎖核酸分子を形成するようなハイブリダイゼーション条件である。よって、本発明によると、２つの一本鎖核酸分子が互いにハイブリダイズして２本鎖核酸分子を形成するためには、それらのヌクレオチドは、２つの１本鎖核酸分子の短い方のヌクレオチドの少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも１００％が塩基対を形成する。
【００３０】
本明細書中で使用される「３’末端配列」および「３’配列」とは、いずれも示された核酸分子の３’側半分に位置する；しかし、前者は示された核酸分子の３’末端に位置するが、後者は指示された核酸分子の３’末端に位置していてもよいがそうである必要はない点でそれらは異なる。例えば、３’配列は核酸分子の３’側半分に位置してもよいが、３’末端のヌクレオチドを含んでも含んでいなくてもよい。同様に、「５’末端配列」は「５’配列」と異なる。
【００３１】
本発明の目的のために、「オリゴヌクレオチド」、「プローブ」、および「プライマー」は、２つもしくはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらのいずれかの組み合わせのポリマーを含むことのできる１本鎖核酸分子である。本発明のかかるオリゴヌクレオチド、プローブ、およびプライマーは、長さ約８ないし約８０ヌクレオチド、長さ約１２ないし約５０ヌクレオチド、もしくは長さ約１５ないし約３０ヌクレオチドであってもよい。本発明のオリゴヌクレオチド、プローブ、もしくはプライマーは、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホルアミデート結合、またはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない多くのヌクレオチド間の結合によって、互いに結合していてもよい。
【００３２】
「検出プローブ」とは、検出可能な核酸分子を意味する。検出プローブは、その配列、長さに基づいて、またはそれが検出可能な部分で標識されることによって検出可能であってもよい。例えば、プローブは、色素で標識されてもよく、蛍光色素で標識されてもよく、放射標識（例えば、32P、3Hもしくは35Sで）されてもよく、または他の手段（例えば、ビオチン化）によって標識されてもよい。ある具体例において、検出プローブの３’末端は、蛍光色素のようなレポーター色素に共有結合している。検出プローブは検出可能な部分で標識される場合、検出プローブは、本発明の方法の第１の工程で使用する前に検出可能な標識をされている必要はない（すなわち、検出プローブは、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、および標的核酸分子を含むとされる複数の鋳型と組み合わせる際に、検出可能な標識をされている必要はない）ことに注意する。
【００３３】
本明細書で使用される「ユニバーサル配列」とは、相補鎖が互いにハイブリダイズする条件下で、相補鎖とハイブリダイズすることがあらかじめ決定された配列を意味する。ユニバーサル配列のいくつかの非限定的な基準は、高いG＋C含量、それ自身でヘアピンループを形成できないこと、複数の鋳型中にあらかじめ存在するヌクレオチドにハイブリダイズできないことを含む。ユニバーサル配列は、同じ検出プローブを使用して１より多い標的配列の存在を同定することを可能にする。例えば、天然に存在するヒトの配列にハイブリダイズしないことがわかっているユニバーサル配列を使用する場合、複数の鋳型がヒトの核酸分子より構成されても、同じ検出プローブを使用して、あらゆるヒト標的配列の存在を同定することができる。ある具体例において、ユニバーサル配列は、長さ１１ないし約２５ヌクレオチドである。例えば、ユニバーサル配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【００３４】
「第２の配列」という語は、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な第１オリゴヌクレオチドの３’ 末端配列に対して５’に位置する配列を意味するために使用される。よって、第２配列は、第１オリゴヌクレオチドの中間であっても、第１オリゴヌクレオチドの５’側半分にあっても、第１オリゴヌクレオチドの３’側半分にあってもよく、第２配列が第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列と重ならない限り、長くてもよい。
【００３５】
本発明によると、「オリゴヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドの一部が標的核酸分子の既知の配列の一部にハイブリダイズするように設計された１本鎖核酸分子のことである。核酸分子（すなわち、オリゴヌクレオチドもしくは標的核酸分子の既知の配列）の「部分」とは全核酸分子より小さいものを意味する。例えば、標的核酸分子中に１００ヌクレオチド長の既知の配列がある場合、核酸配列の既知の配列の部分は、１００未満のヌクレオチドを含む。
【００３６】
本発明は、それぞれが標的核酸分子の既知の配列の隣接部分にハイブリダイズするように設計される２つのオリゴヌクレオチド（第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドと呼ばれる）を提供する。本発明によると、第１オリゴヌクレオチドは、その３’末端が標的核酸分子の既知の配列の３’部分に相補となる（よって、ハイブリダイズする）ように設計される。第２オリゴヌクレオチドは、その５’末端が標的核酸分子の既知の配列の５’部分に相補となる（よって、ハイブリダイズする）ように設計される。図１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂに示すように、本発明によれば、第２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドがハイブリダイズする標的核酸分子のヌクレオチドは、第１オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドがハイブリダイズする、標的核酸分子中のヌクレオチドに５’側で隣接する。
【００３７】
ある具体例において、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分（すなわち、３’部分）に相補的である第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列は、長さ約１５ないし約５０ヌクレオチドである。例えば、第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。同様に、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分（すなわち、５’部分）に相補的である第２オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、長さ約１５ないし約５０ヌクレオチドである。例えば、第２オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。
【００３８】
本発明のいくつかの具体例において、第１オリゴヌクレオチドは、長さ約２５ないし約１５０ヌクレオチドである。例えば、第１オリゴヌクレオチドは、長さ約４０ヌクレオチド、もしくは長さ約６０ヌクレオチドであってもよい。いくつかの具体例において、第２オリゴヌクレオチドは、長さ約２５ないし約１５０ヌクレオチドである。例えば、第２オリゴヌクレオチドは、長さ約４０ヌクレオチド、もしくは長さ約４０ヌクレオチドであってもよい。
【００３９】
本発明の方法の第２の工程において、リガーゼが既知のヌクレオチド配列の第１部分にハイブリダイズした第１オリゴヌクレオチドの３’末端と、既知の配列の第２部分にハイブリダイズした第２オリゴヌクレオチドの５’末端との間で共有結合を形成する条件下で、本発明の方法の第１の工程の産物を、リガーゼとインキュベートする。この連結の概要を図１Ｃおよび２Ｃに示し、ここに、共有結合は第１および第２オリゴヌクレオチド間の黒い矢印として示される。
【００４０】
本明細書で使用される「リガーゼ」とは、第１核酸分子の５’末端と第２核酸分子の３’末端の間で共有結合を生成する酵素であり、ここに、第１核酸分子の５’末端および第２核酸分子の３’末端は、第３の核酸分子上の隣接したヌクレオチドにハイブリダイズしている。
【００４１】
よって、本発明によると、第２オリゴヌクレオチドの５’末端と第１オリゴヌクレオチドの３’末端がハイブリダイズしたヌクレオチドが、標的核酸分子において互いに隣接する場合にのみ、リガーゼは、第２オリゴヌクレオチドの５’末端と第１オリゴヌクレオチドの３’末端を共有結合させる。本明細書で使用される「隣接した」とは、標的核酸分子上の２つのヌクレオチドが、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（標的核酸分子の２つの隣接したヌクレオチドのうちの１つにハイブリダイズしている）が第２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド（２つの隣接した核酸分子の２つ目にハイブリダイズしている）と連結可能であるように、互いに隣り合うことを意味する。従って、接合点にさらなるヌクレオチド（すなわち、第２オリゴヌクレオチドの５’末端がハイブリダイズしたヌクレオチドと第１オリゴヌクレオチドの３’末端がハイブリダイズしたヌクレオチドの間にある標的核酸分子のさらなるヌクレオチド）が存在する場合、共有結合は形成されない。同様に、接合点にヌクレオチドが存在せず、第２オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは第１オリゴヌクレオチドの３’末端のいずれかが標的核酸分子にハイブリダイズしない場合、リガーゼによって共有結合は形成されない。
【００４２】
本発明のある具体例に置いて、第２オリゴヌクレオチドの５’末端はリン酸化される。
【００４３】
本発明によると、リガーゼはあらゆるソースに由来してもよい。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（バクテリオファージ  Ｔ４由来）を使用してもよい（例えば、New England Biolabs, Beverly, MAより市販されている）。本発明の方法において、あらゆるソースに由来するあらゆるリガーゼを使用してもよく、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ（バクテリオファージ  Ｔ７由来）、イー・コリ（E. coli）リガーゼ、ｔＲＮＡリガーゼ、酵母由来のリガーゼ、昆虫細胞由来のリガーゼ、哺乳類由来のリガーゼ（例えば、ネズミリガーゼ)、およびヒトDNAリガーゼ（例えば、ヒトＤＮＡリガーゼ IV/XRCC4）を含むがそれらに限定されない。 
【００４４】
本発明の方法の第３の工程において、本発明の第２の工程の産物を、プライマーが伸長する条件下で、ＤＮＡポリメラーゼとインキュベートする。
【００４５】
ある具体例において、プライマーの３’末端は、長さ約１５ないし約５０ヌクレオチドである。例えば、本発明のプライマーは、長さ約１０ヌクレオチドであってもよい。本明細書で使用される「プライマー」は、その３’末端が相補的な核酸分子上のヌクレオチドにハイブリダイズ可能である核酸分子であって、ＤＮＡポリメラーゼと適当な遊離ヌクレオチド（例えば、dATP、dGTP、dCTP、およびdTTP）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーが伸長されるものを意味する。プライマーの全配列が相補な核酸分子にハイブリダイズ可能であってもよいが、本発明は、相補な核酸分子に完全にはハイブリダイズしないプライマー、ハイブリダイズ可能であり、ＤＮＡポリメラーゼと遊離ヌクレオチドの存在下で伸長できる程の長さのプライマーも包含する。ある具体例において、プライマーの配列は、複数の鋳型中の元から存在するヌクレオチド配列のいずれともハイブリダイズしないように選択される。よって、該プライマーを、１つより多い標的核酸分子の検出のために使用することができる。
【００４６】
ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、プライマーがハイブリダイズした核酸分子を鋳型として用いてプライマーは伸長する。プライマーの伸長によって、プライマーがハイブリダイズした一本鎖核酸分子に相補的な新たな一本鎖核酸分子が生じる。従って、本発明によれば、プライマーが第２オリゴヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズすると、プライマーは、その３’末端が第２オリゴヌクレオチドの５’末端に到達するまで伸長する。いくつかの具体例において、プライマーの伸長は、標的核酸分子の既知の配列を第２オリゴヌクレオチドから置き換える。第２オリゴヌクレオチドの５’末端が第１オリゴヌクレオチドの３’末端とリガーゼによって共有結合していた場合（すなわち、既知のヌクレオチド配列を含む標的核酸分子が複数の鋳型中に存在する場合）、プライマーの伸長によって、伸長したプライマーの３’末端が第１オリゴヌクレオチド５’末端に相補となるようなプライマーの伸長が起こる。第１オリゴヌクレオチドの第２配列に到達すると、プライマーを伸長していたＤＮＡポリメラーゼは、検出プローブに遭遇し、それを置換する。よって、複数の鋳型において、ハイブリダイズしていない検出プローブの存在は、標的核酸分子の存在を示す。
【００４７】
いくつかの具体例において、本発明の方法で使用されるＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ（5' to 3' exonuclease）活性を有する（例えば、全長イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩは、本発明の方法において有用である）。本発明によると、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、検出プローブの５’末端を分解する。しかし、結局、検出プローブにほとんどのヌクレオチドが残らなければ、検出プローブは第１オリゴヌクレオチドにもはやハイブリダイズすることができず、接近しているＤＮＡポリメラーゼによって分解されずに減少するだろう。よって、本発明の方法のいくつかの具体例において、短くなったハイブリダイズしていない検出プローブは、複数の鋳型における標的核酸分子の存在を示すものであり、最終の工程の間に短くなったハイブリダイズしない検出プローブの存在が求められる。
【００４８】
検出プローブは、検出可能であるために、検出可能なプローブを検出する手段は、どのように検出プローブを検出可能にしたかにより様々である。
【００４９】
例えば、本発明のある具体例において、検出プローブは、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法を用いて検出可能となる(例えば、Mergny et al., Nucl. Acids Res. 22: 920-928, 1994参照)。この具体例によると、検出プローブは、１つの蛍光色素で標識され、第１オリゴヌクレオチドは異なる蛍光色素で標識される（例えば、第１オリゴヌクレオチドの５’末端にて）。２つの蛍光色素のうちの１つは、エネルギーを他の蛍光色素に移動させて、後者の蛍光色素が蛍光を発する。従って、プローブが第１オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合のみ、蛍光を発する。よって、ハイブリダイズしていない検出プローブは、蛍光を発しないために、検出可能となる。
【００５０】
本発明のある具体例において、検出プローブの３’末端はレポーター色素に共有結合で標識され、検出プローブの５’末端はクエンチング部分に共有結合で標識される。かかるレポーター色素およびクエンチング部分は（およびそれらを核酸分子に共有結合させる方法）は既知である（例えば、Singer et al., 米国特許第6,323,337号; Tyagi and Kramer, Nature Biotech. 14: 303-308, 1996; Tyagi et al., Nature Biotech. 16: 49-53, 1998を参照）。接近するＤＮＡポリメラーゼが検出プローブの５’末端を分解する際に、クエンチング部分を除去する。よって、ハイブリダイズしていない検出プローブは、レポーター色素を保持するが、クエンチング部分の不在下でもはや抑制されず、通常の方法を用いて容易に検出可能である。
【００５１】
ある具体例において、使用するＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、標的核酸分子の存在が短くなったハイブリダイズしていない検出プローブの存在によって示される場合、この短くなったハイブリダイズしていない検出プローブはその長さ、および他のハイブリダイズしていない検出プローブより短いことによって検出される。この具体例の非限定的な例において、過剰な検出プローブを、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチドの３’配列にハイブリダイズしたプライマー、および標的核酸を含むとされる複数の鋳型と組み合わせる。（リガーゼで）連結し、（ＤＮＡポリメラーゼで）プライマーを伸長させた後、標的核酸が存在すれば、検出プローブは、接近している５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって短くされる。しかし、過剰な検出プローブが存在するため、検出プローブのいくつかは第１オリゴヌクレオチドに全くハイブリダイズしない。この具体例における短くなった検出プローブの検出のために、核酸分子を融解（例えば、６５℃で１０分間加熱することによって）し、全ての核酸分子を１本鎖にすることができる。次いで、一本鎖核酸分子を、高密度ゲル（例えば、高いパーセンテージアクリルアミドまたはアガロースを含むゲル）上で分離することができる。プライマーは少なくとも第２オリゴヌクレオチドの長さに伸長されるため（標的核酸分子が存在せず、第２オリゴヌクレオチドの５’末端が第１オリゴヌクレオチドの３’末端に連結されなくても）、最も短い核酸分子は検出プローブか、あるとしても、短くなった検出プローブとなる。検出プローブを第１オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる前に検出可能な標識をするとすれば（例えば、検出プローブを32Ｐで放射標識するとすれば）、高密度ゲル（例えば、８％アガロースゲル）上で一本鎖核酸分子を分解した後、ゲルをＸ線フィルムに露光することによって、全長の検出プローブだけでなく短くなった検出プローブ（その長さにより、ゲルでは全長検出プローブとは異なるバンドに移動する）を検出することができる。逆に言えば、検出プローブを第１オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる前に検出可能な標識をしなければ、高密度ゲル上で一本鎖核酸分子を分解した後短くなった検出プローブを検出するためには、ゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外光下で観察することができる。短くなったハイブリダイズしていない検出プローブによって取り込まれた臭化エチジウムの強度に基づいて、複数の鋳型における標的核酸分子のコピー数は容易に定量される。
【００５２】
本明細書で使用される「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの付加によってプライマーを伸長する酵素であり、付加されたヌクレオチドは、プライマーがハイブリダイズした核酸に相補的なものである。本発明の方法で使用するためのＤＮＡポリメラーゼは、あらゆるソースに由来することができる。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例は、イー・コリ（E. coli）ＤＮＡポリメラーゼＩ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、およびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む。いくつかの具体例において、本発明の方法およびキットで使用されるＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。ある具体例において、本発明の方法およびキットで使用されるＤＮＡポリメラーゼは、関連したヘリカーゼおよび／またはギラーゼ活性を有する。
【００５３】
本発明の方法において使用されるプライマーは、複数の鋳型に元から存在しない配列にハイブリダイズするように設計されてもよいために、本発明の方法を使用して、同じ複数の鋳型における１より多くの標的核酸分子の存在を検出することができる。例えば、複数の鋳型がヒトｃＤＮＡライブラリーであり、２つの標的核酸分子がインスリンとヒト成長ホルモンである場合、第１および第２オリゴヌクレオチドがそれぞれの標的配列について作製される。さらに、異なるユニバーサル配列を含み、異なる色素によって標識された２つの検出プローブが作られる。もちろん、インスリンｃＤＮＡについての第２オリゴヌクレオチドとヒト成長ホルモンについての第２オリゴヌクレオチドは、それぞれ、プライマーに相補的な３’配列を有する。よって、ヒトｃＤＮＡライブラリー中にヒト成長ホルモンが存在し、インスリンｃＤＮＡが存在しない場合、短くなった検出プローブにある２つの色素のうちの１つが検出される。インスリンｃＤＮＡおよびヒト成長ホルモンｃＤＮＡの両方が存在すれば、両方の短くなった検出プローブが検出される。さらに、インスリンｃＤＮＡがヒト成長ホルモンｃＤＮＡより多く存在する場合（またはその逆）、色素の強度に基づいて定量を行ってもよい。
【００５４】
本発明の方法の変形において、第２プライマーが第３の工程において付加される。第２プライマーの３’末端配列は、第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的である）、および第１オリゴヌクレオチドの第２配列（検出プローブのユニバーサル配列に相補的である）の両方に対して５’である、第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である。ある具体例において、第２プライマーの３’末端配列は、長さ約１５ないし約５０ヌクレオチドである。例えば、第２プライマーの３’末端配列は、長さ約２０ヌクレオチドである。ある具体例において、第２オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプライマーの部分と、第１オリゴヌクレオチドと同一の第２プライマーの部分は同じ配列を有する。さらに、ある具体例において、該プライマーと第２プライマーは同一である（すなわち、同一の配列を有する）。この具体例の１つの例において、第１オリゴヌクレオチドの５’配列は、第２オリゴヌクレオチドの３’配列にハイブリダイズする。
【００５５】
本発明の第３の工程において第２プライマーが使用される場合（第２プライマーがプライマーと同一であるかどうかにかかわらず）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて本発明の方法を行い、標的核酸分子を増幅することができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来）、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来）、およびＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来；Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼとしても知られている）を含む。本発明のこの具体例において、図２Ｄに示すように、ＰＣＲの各ラウンドで第１オリゴヌクレオチドの第２配列に由来するヌクレオチド配列にハイブリダイズする検出プローブは、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーが伸長される際に、繰り返し短くなり、置換される。本発明のこの具体例によると、複数の鋳型中に標的核酸分子が存在し、実際に連結が行われるならば、ＰＣＲの最終増幅ラウンドの前に検出プローブを加え、短くなったハイブリダイズしていない検出プローブによってもたらされたシグナルを増幅することが望ましい。
【００５６】
本発明の方法のために、標的核酸分子のヌクレオチド配列の一部は既知でなければならない。例えば、目的の核酸分子がタンパク質（例えば、植物カルシウム依存的タンパク質キナーゼもしくはヒトインスリン）をコードする場合、既知のヌクレオチド配列は、コード配列（すなわち、ｍＲＮＡもしくはアミノ酸をコードするエキソンＤＮＡ配列に由来する配列）または非コード配列（例えば、イントロンＤＮＡ配列もしくはプロモーター／エンハンサー領域）のいずれかに由来することができる。
【００５７】
１つの非限定的な例において、標的核酸分子がタンパク質、例えば、トウモロコシ硝酸還元酵素（例えば、Chandok and Sopory, J. Biol. Chem. 273(30):19235-19242, 1998を参照）である場合、複数の鋳型は、生物の細胞より単離されたｍＲＮＡである。全ｍＲＮＡは、一般的な方法（例えば、前記のAusubel et al.を参照）によって単離される。トウモロコシ硝酸還元酵素の既知の配列（例えば、GenBank アクセッション番号AF153448; GenBankアクセッション番号 X64446; Long et al., Physiol. Plantarum 85: 561-566, 1992）を用いて、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドを、第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列がトウモロコシ硝酸還元酵素の配列の第１部分に相補的であり、第２オリゴヌクレオチドの５’末端配列がトウモロコシ硝酸還元酵素の第２部分に相補的となるように、一般的な方法に従って設計し、合成することができる。第１オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、第２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドに隣接するトウモロコシ硝酸還元酵素の配列のヌクレオチドに相補的である。
【００５８】
１つの非限定的な具体例において、本発明の方法はサンプル中の一塩基多型（ＳＮＰ）の存在の同定に有用である。ＳＮＰは、典型的には、生物の遺伝物質であるＤＮＡにおける１塩基の変異であり、該生物のタンパク質においてアミノ酸の変化を引き起こしても、そうでなくてもよい。あらゆる所定の個体は、特定のＳＮＰを含む遺伝子のアリルを１つもしくは２つ有してもよい。ＳＮＰの数は、同定されている（例えば、Sachidanandam et al., Nature 409: 928-33, 2001を参照）。
【００５９】
本発明の方法に従って、生物（例えば、ヒト）が特定のＳＮＰを含むアリルを含むゲノムを有するか否かを決定するために、第２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチド、または第１オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドのいずれかがＳＮＰにハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドを設計する。従って、標的核酸分子（すなわち、遺伝子）がＳＮＰを含まなければ、第２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドと第１オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドはいずれも標的核酸分子にハイブリダイズしないだろう。よって、リガーゼは第２オリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドを第１オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドに連結しないだろう。しかし、使用する複数の鋳型がヒトゲノムＤＮＡである場合、所定の遺伝子のアリルが２つあるために、本発明の方法より得られる３つの考えられる結果：いずれのアリルにもＳＮＰはない（この場合、短くなった検出プローブは生成しない）、いずれのアリルにもＳＮＰが存在する（この場合、多量の短くなった検出プローブが生成する）、または一方のアリルにＳＮＰが存在するが他方のアリルには存在しない（この場合、中程度の量の短くなった検出プローブが生成する）が存在する。
【００６０】
発現した遺伝子における変異を同定するための本明細書に記載の方法の使用も、本発明の範囲内である。ras p53、BRCA-1およびBRCA-2、RB1、ならびにerbBのごときタンパク質の変異型は、しばしば癌に関連している(Dahiya and Deng, Breast Cancer Research and Treatment 52:185-200, 1998; Russo, A. et al., Anticancer Research 20:4841-4852, 2000; and Doolittle et al., Exp. Mol. Pathol. 70(3):289-301, 2001)。さらに、タンパク質の変異型は、他の疾病にも関連している。例えば、プリオンタンパク質の変異型は、クロイツフェルトヤコブ症候群（Creutzfeld-Jacob syndrome）に冒されたヒト、およびウシ海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy）およびスクレイピー（scrapie）にかかっている家畜で見られる（例えば、Collinge, J., Annual Review of Neuroscience 24: 519-50, 2001を参照）。変異タンパク質は、１つの特定のアミノ酸で変異が起きている。例えば、ヒトＫ−ｒａｓにおいてよく見られる点変異は、１２、１３または６１位である。第１オリゴヌクレオチドの３’末端または第２オリゴヌクレオチドの５’末端が変異アミノ酸をコードするヌクレオチドにハイブリダイズするものを使用することによって、本発明の方法を使用して、Ｋ−ｒａｓタンパク質中の点変異を有するヒトの個体を短時間に同定することができる。
【００６１】
本発明は、複数の鋳型において標的核酸分子の存在を検出するためのキットも提供する。本発明のキットは、以下のもの：（ｉ）ユニバーサル配列を含む検出プローブ；（ｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的な３’末端配列、およびユニバーサル配列に相補的な第２配列を含む第１オリゴヌクレオチド；（ｉｉｉ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的な５’末端配列を含む第２オリゴヌクレオチドであって、標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分が既知のヌクレオチド配列の第１部分に隣接するものであるオリゴヌクレオチド；および、（ｉｖ）標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第２部分に相補的ではない第２オリゴヌクレオチドの一部に相補的な３’末端配列を含むプライマー；を含む。いくつかの具体例において、該キットは、さらに、ハイブリダイズしていない検出プローブの検出手段を含む。短くなったハイブリダイズしていない検出プローブを検出するためのかかる手段の非限定的な例は、検出プローブからの蛍光発光の検出装置、短くなった検出プローブからの色素の検出装置、および短くなった検出プローブの長さに基づく検出装置を含む。
【００６２】
本発明のある具体例において、該キットは、さらにリガーゼを含む。いくつかの具体例において、該キットは、さらにＤＮＡポリメラーゼを含む。前記のように、ＤＮＡポリメラーゼは、あらゆるソースに由来してもよく、該キットをＰＣＲ反応に使用する場合、ＤＮＡポリメラーゼは耐熱性生物に由来してもよい。いくつかの具体例において、ＤＮＡポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００６３】
特定の具体例において、該キットは、さらに、第２プライマーの３’末端が、第１オリゴヌクレオチドの３’末端（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的である）と第１オリゴヌクレオチドの第２配列（ユニバーサル配列に相補的である）の両方に対して５’である第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である、第２プライマーを含む。いくつかの具体例において、第２プライマーは、第１オリゴヌクレオチドの５’末端配列と同一の３’末端配列を含む。ある具体例において、該キットの第１オリゴヌクレオチドの５’末端配列は、第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的であることから、同じプライマー（すなわち、第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的な３’末端配列を含むプライマー）を用いて両鎖（すなわち、第２オリゴヌクレオチドに連結した初めの第１オリゴヌクレオチドと、プライマーの伸長によって生じた鎖）を増幅することが可能となる。
【００６４】
よって、本発明は、連結反応の高い感度に基づくものであり、１塩基変異の存在を検出すること（例えば、ＳＮＰを検出すること）、または同じ遺伝子ファミリーの異なる種を検出することができる。本発明は費用効率がよく、例えば、検出プローブ（ユニバーサル配列を有する）およびプライマーを用いて、１より多くの標的核酸分子を検出することができる。さらに、本発明の方法はｃＤＮＡの合成を必要としないことから、時間と費用のかかる、逆転写酵素を用いたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換操作を回避する。
【００６５】
さらに、利用可能な異なる色素があれば、単一の複数の鋳型より、１より多くのの標的核酸分子を同時に検出することができる（例えば、以下の実施例ＩＩを参照）。
【００６６】
以下の実施例は、本発明のある好ましい具体例をさらに示すためのものであって、全く限定するものではない。当業者であれば、ルーチンの実験をわずかに使用するだけで、本明細書に記載の特定物質および手順に均等な多くの事柄を理解し、確認することができる。
【実施例】
【００６７】
実施例１
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素をコードするトウモロコシｍＲＮＡの検出
トウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素をコードするｍＲＮＡの発現を検出するために、一般的な方法に従って、トウモロコシの全ＲＮＡを単離する（例えば、前記のAusubel et al.を参照）。
【００６８】
まず、ユニバーサル配列を選択する。いくつかの具体例において、ユニバーサル配列は元からあるトウモロコシＲＮＡにハイブリダイズしない。この実施例において使用するユニバーサル配列は、以下のヌクレオチド配列：
5'  CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC 3'  (配列番号1)
を有する。
【００６９】
配列番号１を用いて、ユニバーサル配列の５’末端がＴＡＭＲＡクエンチング部分に共有結合し、ユニバーサル配列の３’末端に結合した合成色素が６−ＦＡＭ色素である、検出プローブを設計する（例えば、Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Eighth Ed., 2001を参照）。検出プローブを、既知の方法に従って、ＴＡＭＲＡおよび６−ＦＡＭ部分で標識する（例えば、前記のMolecular Probes; 米国特許第6,323,337号参照）。
【００７０】
次いで、プライマーを設計する。いくつかの具体例において、プライマーの配列は、元からあるトウモロコシＲＮＡにハイブリダイズしない。この実施例において使用するプライマーは、以下のヌクレオチド配列：
5' CCAGGACCTGGTCGAGCT 3' (配列番号2)
を有する。
【００７１】
次いで、トウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡ配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡを使用するため（例えば、第１のｃＤＮＡ鎖ではない）、オリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡ鎖に相補となるよう設計する。トウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素のヌクレオチド配列は既知であり、図３として本明細書で提供される(配列番号3；例えば、GenBank アクセッション番号X64446; Long et al., Physiol. Plantarum 85: 561-566, 1992を参照）。（図３で提供される配列において、ウラシル残基はチミジン残基によって置換されていることに注意する。よって、図３で提供される配列は、実際には、トウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡ配列の第２鎖ｃＤＮＡである。）
【００７２】
第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドは、トウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡのヌクレオチド６１〜１００に基づいて設計される。該配列は以下の：
5' aagctctgca tgcgcgcgta cacgcccacg agccccgtcg 3' (配列番号4)
である。
【００７３】
第１オリゴヌクレオチドを、その３’末端の２０ヌクレオチドがトウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド８１〜１００に相補となるように設計する（すなわち、5' cacgcccacg agccccgtcg 3' (配列番号5)）。第１オリゴヌクレオチドの第２配列はユニバーサル配列に相補的である。第１オリゴヌクレオチドの５’末端の２０ヌクレオチドは、単に任意のヌクレオチドであり、その配列は元からあるトウモロコシＲＮＡにハイブリダイズしない。よって、本発明の非限定的な第１オリゴヌクレオチドは、以下の配列：
5' gaattcggat ccaatgcctt gggggggggg gggggggggg cgacggggct cgtgggcgtg 3' (配列番号6)
を有する。
【００７４】
第２オリゴヌクレオチドを、その５’末端の２０ヌクレオチドがトウモロコシＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド６１〜８０に相補となるように設計する（すなわち、5' aagctctgca tgcgcgcgta 3' (配列番号7)）。第２オリゴヌクレオチドの３’末端１８ヌクレオチドは、プライマーに相補的である。よって、本発明の非限定的な第２オリゴヌクレオチドは、以下の配列：
5' tacgcgcgca tgcagagctt agctcgacca ggtcctgg 3' (配列番号8)
を有する。
【００７５】
オリゴヌクレオチド、プライマーおよび検出プローブを、反応チューブ（例えば、エッペンドルフ微量遠心チューブ）中で、全トウモロコシＲＮＡと組み合わせ、室温にてハイブリダイズさせる。次いで、Ｔ４リガーゼを反応チューブに加え、チューブを１６℃で一晩インキュベートする。次いで、反応チューブを６５℃で１０分間加熱し、Ｔ４リガーゼを失活させる。このとき、反応チューブの内容物をフェノール：クロロホルム抽出および／またはエタノール沈殿して、Ｔ４リガーゼを除去してもよい。次いで、反応チューブにＤＮＡポリメラーゼと適量のｄＮＴＰを加え、チューブを３７℃にインキュベートして、ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させる。
【００７６】
このとき、全トウモロコシＲＮＡサンプル中にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡが存在すれば、検出プローブはＤＮＡポリメラーゼにより短くされ、それによって検出プローブの５’末端からＴＡＭＲＡクエンチング部分が除去される。従って、反応チューブの内容物を、６−ＦＡＭ蛍光色素を励起させる波長を発する光の下で測定する。全トウモロコシｍＲＮＡサンプル中に存在するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡのコピー数を、ＦＡＭ色素によって発光された蛍光量に基づいて定量する。
【００７７】
実施例ＩＩ
トウモロコシ全ＲＮＡにおける、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡおよびＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするトウモロコシｍＲＮＡの検出
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡおよびＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼをコードするトウモロコシｍＲＮＡの存在を同時に検出するために、実施例Ｉに記載のようにトウモロコシより全ＲＮＡを単離する。さらに、以下の分子：
１．ユニバーサル配列を有する第２検出プローブ（Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ用）を合成する。第２ユニバーサル配列は、以下の配列：
5' GGAGGAGGAG GAGGAGGAGA 3' (配列番号9).
を有する。
【００７８】
配列番号９を用いて、第２ユニバーサル配列の５’末端がＴＡＭＲＡクエンチング部分に共有結合し、該ユニバーサル配列の３’末端に結合した合成色素が、第１検出プローブに使用したＦＡＭ色素とは波長の異なる光を発するＴｅｔ色素である、第２検出プローブを設計する。
【００７９】
次いで、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ配列に基づいて、オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡを使用するため（例えば、第１のｃＤＮＡ鎖ではない）、オリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡ鎖に相補となるよう設計する。トウモロコシＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡのヌクレオチド配列は既知であり、図４として本明細書で提供される(配列番号10；例えば、GenBank アクセッション番号Y07767; Franceschetti et al., Biochem. J. 353 (Pt 2): 403-409, 2001を参照）。（図４で提供される配列は、実際には、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ配列の第２鎖ｃＤＮＡであることに注意する。）
【００８０】
第１オリゴヌクレオチドおよび第２オリゴヌクレオチドは、トウモロコシＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡのヌクレオチド９０１〜９４０に基づいて設計される。該配列は以下の：
5' tacccagagc aaccaatggt taaccttgag atgtgcatga 3' (配列番号11)
である。
【００８１】
第１オリゴヌクレオチドを、その３’末端の２０ヌクレオチドがトウモロコシＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ配列のヌクレオチド９２１〜９４０に相補となるように設計する（すなわち、5' taaccttgag atgtgcatga 3' (配列番号12)）。第１オリゴヌクレオチドの第２配列はユニバーサル配列に相補的である。第１オリゴヌクレオチドの５’末端の２０ヌクレオチドは、単に任意のヌクレオチドであり、該配列は元からあるトウモロコシＲＮＡにハイブリダイズしない。よって、本発明の非限定的な第１オリゴヌクレオチドは、以下の配列：
5' tggaacacca gttcttgggc tctcctcctc ctcctcctcc tcatgcacat ctcaaggtta 3' (配列番号13)
を有する。
【００８２】
第２オリゴヌクレオチドを、その５’末端の２０ヌクレオチドがトウモロコシＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ配列のヌクレオチド９０１〜９３０に相補となるように設計する（すなわち、5' tacccagagc aaccaatggt 3' (配列番号14)）。第２オリゴヌクレオチドの３’末端１８ヌクレオチドは、プライマーに相補的である（すなわち、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡのための第２オリゴヌクレオチドのこれらの３’末端の１８ヌクレオチドは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡ用の第２オリゴヌクレオチドの３’末端の１８ヌクレオチドと同一である）。よって、本発明の非限定的な第２オリゴヌクレオチドは、以下の配列：
5' accattggtt gctctgggta agctcgacca ggtcctgg 3' (配列番号15)
を有する。
【００８３】
検出プローブと、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡの両方のための第１および第２オリゴヌクレオチド、ならびにプライマー（両方のｍＲＮＡについて同じである）を、反応チューブ中でトウモロコシ全ＲＮＡと一緒にし、室温にてハイブリダイズさせる。次いで、反応チューブにイー・コリＤＮＡリガーゼを加え、チューブを１６℃で約３０分間インキュベートする。次いで、反応チューブを６５℃で１０分間加熱し、イー・コリＤＮＡリガーゼを失活させる。次いで、反応チューブにＤＮＡポリメラーゼおよび適量のｄＮＴＰを加え、チューブを３７℃でインキュベートし、ＤＮＡポリメラーゼによってプライマーを伸長させる。
【００８４】
次いで、反応チューブの内容物を、６−ＦＡＭ色素（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡ用）、およびＴｅｔ色素（Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡ用）の両方を励起させる波長を発光する光の下で測定する。いずれも存在しなければ、いずれの色素も見られない。同様に、一方が存在し、他方が存在しなければ、片方のｍＲＮＡの色素は観察されるが、他方は不在である。両方のｍＲＮＡが存在すれば、両方の色素が観察される。さらに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡおよびＳ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡを互いに比較するだけでなく、その相対量を定量することができる。例えば、全トウモロコシＲＮＡサンプルにおいて、Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼｍＲＮＡよりも多くのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素ｍＲＮＡが存在する場合、観察されるＴｅｔ色素の量に比べてより大量の６−ＦＡＭ色素が観察される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、本発明の１つの非限定的な方法の一連の略図を示す。図１Ａは、標的核酸分子、第１オリゴヌクレオチド（その３’末端配列が標的核酸分子の３’部分に相補的である）、第２オリゴヌクレオチド（その５’末端配列が標的核酸分子の５’部分に相補的である）、検出プローブ（第１オリゴヌクレオチドの第２配列に相補的なユニバーサル配列を含む）、およびプライマー（その３’末端配列が第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的である）の組み合わせを示す。図１Ｂに示すように、複数の鋳型において標的核酸分子が存在すれば、第１および第２オリゴヌクレオチドは標的核酸分子の隣接部分にハイブリダイズする。図１Ｃに示すように、核酸分子の５’および３’部分が隣接すれば、リガーゼの添加によって、第２オリゴヌクレオチドの５’末端配列と第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列の間の共有結合（黒三角で示される）が生じる。図１Ｄは、プライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼによる第１オリゴヌクレオチドからの検出プローブの置換を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、本発明の１つの非限定的な方法の一連の略図を示す。図２Ａは、標的核酸分子、第１オリゴヌクレオチド（その３’末端配列が標的核酸分子の３’部分に相補的である）、第２オリゴヌクレオチド（その５’末端配列が標的核酸分子の５’部分に相補的である）。検出プローブ（第１オリゴヌクレオチドの第２配列に相補的なユニバーサル配列を含む）、プライマー（その３’末端配列が第２オリゴヌクレオチドの３’配列に相補的である）および第２プライマー（その３’末端配列が、第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列（標的核酸分子の既知のヌクレオチド配列の第１部分に相補的である）と第１オリゴヌクレオチドの第２配列（検出プローブのユニバーサル配列に相補的である）の両方に対して５’である第１オリゴヌクレオチドの一部と同一である）の組み合わせを示す。図２Ｂにおいて、複数の鋳型中に標的核酸分子が存在すれば、第１および第２オリゴヌクレオチドは標的核酸分子の隣接部分にハイブリダイズする。図２Ｃおいて、核酸分子の５’および３’部分が隣接すれば、リガーゼの添加によって、第２オリゴヌクレオチドの５’末端配列と第１オリゴヌクレオチドの３’末端配列の間の共有結合（黒三角で示される）が生じる。図２Ｄは、まず、連結された第１および第２オリゴヌクレオチドを鋳型として使用して、次いで、第２プライマーの伸長によって生じた核酸分子を鋳型として使用してプライマーを伸長する、ＤＮＡポリメラーゼによる第１オリゴヌクレオチドからの検出プローブの反復置換である。
【図３】図３は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：硝酸還元酵素（配列番号３）をコードするジー・メイズ（Z. mays）ｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列の略図である。
【図４】図４は、受精−Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（配列番号１０）をコードするジー・メイズｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列の略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月11日(2004.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006504396000001.app
【国際調査報告】
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