(57)【要約】本発明は、複数の結合部位に結合するプローブ化合物を用いたヒト血清アルブミンに対する試験化合物の分子アフィニティを決定するための蛍光スペクトロスコピー法を特徴とする。
2006513414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）緩衝溶液を提供する；
ｂ）上記溶液に被検体を添加する；
ｃ）上記溶液に複数のヒト血清アルブミン部位に結合するプローブ化合物を添加する；
ｄ）上記溶液にヒト血清アルブミンを添加する；
ｅ）上記被検体、プローブ化合物、及びヒト血清アルブミンを含む上記溶液を照射する；
ｃ）上記照射された溶液の蛍光を計測する；及び
ｄ）上記計測された蛍光に基づいて上記被検体の結合アフィニティを計算する
を含む、被検体の結合アフィニティの測定方法。
【請求項２】
上記プローブは以下の式Ｉ：
【化１】
2006513414.tif 000017
｛式中：
Ｘはハロゲン、−ＣＮ、ＮＯ2、アリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｒの群から選ばれる１〜３の置換基であり、ここで、Ｒは場合により置換されるＣ１−Ｃ４アルキル又は場合により置換されるアリールであり；そして
Ｙは置換される又は置換されないヘテロアリールである。｝で表される化合物
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｙは場合により置換されるインドリルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｙは１−メチル−インドール−２−イルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記プローブは５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
上記被検体の結合アフィニティの計算は、以下の式：
Ｄ＝１００−［（ｆ0−ｆa）／（ｆ0−ｆb）］*１００
｛ここで、Ｄは被検体によりヒト血清アルブミンから置換されたパーセントＴＨＥ  ＰＲＯＢＥであり、ｆ0は緩衝溶液中のＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、ｆbはＨＳＡに結合したＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、そしてｆaは被検体及びプローブ化合物を含む溶液の蛍光である。｝
を介してプローブのパーセント置換を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記蛍光は４８０〜５８０ｎｍの間で計測される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プローブ化合物及び被検体を含む溶液の蛍光を計測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
以下のステップ：
ａ）複数の緩衝溶液を提供する；
ｂ）複数の被検体を提供する；
ｃ）複数の上記緩衝溶液に上記複数からの１の被検体を添加する；
ｄ）被検体を含む複数の上記溶液にヒト血清アルブミンの部位Ｉ及び部位ＩＩに結合するプローブ化合物を添加する；
ｅ）被検体、及び上記プローブ化合物を含む複数の上記溶液にヒト血清アルブミンを添加する；
ｆ）上記被検体、上記プローブ化合物、及びヒト血清アルブミンを含む複数の上記溶液を照射する；
ｇ）上記照射された溶液の蛍光を計測する；及び
ｈ）上記計測された蛍光に基づいて上記溶液のそれぞれにおける上記被検体の結合アフィニティを計算する
を含む、ハイスループットスクリーニングの実行方法。
【請求項１０】
上記プローブは以下の式Ｉ：
【化２】
2006513414.tif 000018
｛式中：
Ｘはハロゲン、−ＣＮ、ＮＯ2、アリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｒの群から選ばれる１〜３の置換基であり、ここで、Ｒは場合により置換されるＣ１−Ｃ４アルキル又は場合により置換されるアリールであり；そして
Ｙは置換される又は置換されないヘテロアリールである。｝により表される化合物
である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｙは場合により置換されるインドリルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｙは１−メチル−インドール−２−イルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記プローブは５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
それぞれの被検体の結合アフィニティの計算は、以下の式：
Ｄ＝１００−［（ｆ0−ｆa）／（ｆ0−ｆb）］*１００
｛ここで、Ｄは被検体によりヒト血清アルブミンから置換されたパーセントＴＨＥ  ＰＲＯＢＥであり、ｆ0は緩衝溶液中のＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、ｆbはＨＳＡに結合したＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、そしてｆaは被検体及びプローブ化合物を含む溶液の蛍光である。｝
を介してプローブのパーセント置換を決定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
上記蛍光は４８０〜５８０ｎｍの間で計測される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
プローブ化合物及び被検体を含む複数の溶液の蛍光を計測することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒト血清アルブミンに対する薬物候補物質の分子アフィニティを決定するための新規の蛍光に基づいた分析を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの薬物及びいくつかの内因性物質はヒト血清アルブミンに可逆的に及び高いアフィニティで結合する。例えば、Ｏｔａｇｉｒｉ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２５，  ６９５（２００２）を参照のこと。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は２の主な疎水性結合ポケット、ＩＩＡドメイン上の部位Ｉ及びＩＩＩＡドメイン上の部位ＩＩを有する。アルブミンへの可逆的な結合は血漿中の薬物の寿命を延長するが、それはまた生理学的活性に有効な遊離薬物の濃度を減少させる。このため、薬物発見プロセスにおける段階としてアルブミンに対する薬物候補物質のアフィニティを知ることは重要である。したがって、アルブミンに対するリガンドの結合アフィニティの迅速な定量方法について要求がある。
【発明の開示】
【０００３】
発明の要約
一般的に、本発明はＨＳＡに対するある薬物候補物質の分子アフィニティを決定するための蛍光スペクトロスコピー法を特徴付ける。上記方法はプローブ化合物からの蛍光シグナルをモニターし、ある薬物候補物質の分子アフィニティを決定することを含む。
１の局面において、本発明は：
ａ）緩衝溶液を提供する；
ｂ）上記溶液に被検体を添加する；
ｃ）上記溶液に複数のヒト血清アルブミン部位に結合するプローブ化合物を添加する；
ｄ）上記溶液にヒト血清アルブミンを添加する；
ｅ）上記被検体、プローブ化合物、及びヒト血清アルブミンを含む上記溶液を照射する；
ｃ）上記照射された溶液の蛍光を計測する；及び
ｄ）上記計測された蛍光に基づいて上記被検体の結合アフィニティを計算する
の段階を含む被検体の結合アフィニティの決定方法を特徴付ける。
【０００４】
他の局面において、本発明はハイスループットスクリーニングを行う方法を特徴付ける。上記方法は：
ａ）複数の緩衝溶液を提供する；
ｂ）複数の被検体を提供する；
ｃ）複数の上記緩衝溶液に上記複数からの１の被検体を添加する；
ｄ）被検体を含む複数の上記溶液にヒト血清アルブミンの部位Ｉ及びＩＩに結合するプローブ化合物を添加する；
ｅ）被検体、及び上記プローブ化合物を含む複数の上記溶液にヒト血清アルブミンを添加する；
ｆ）上記被検体、上記プローブ化合物、及びヒト血清アルブミンを含む複数の上記溶液を照射する；
ｇ）上記照射された溶液の蛍光を計測する；及び
ｈ）上記計測された蛍光に基づいて上記溶液のそれぞれにおける上記被検体の結合アフィニティを計算する
の段階を含む。
【０００５】
本発明のそれぞれの局面は１以上の以下のものを含みうる。上記被検体の結合アフィニティを計算することは上記プローブのパーセント置換を決定することを含む。上記プローブのパーセント置換は式：
Ｄ＝１００−［（ｆ0−ｆa）／（ｆ0−ｆb）］*１００
を介して決定され、ここで、Ｄは上記被検体によりヒト血清アルブミンから置換されたパーセントＴＨＥ  ＰＲＯＢＥであり、ｆ0は上記緩衝溶液中のＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、ｆbはＨＳＡに結合したＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、及びｆaは上記被検体及び上記プローブ化合物を含む溶液の蛍光である。上記蛍光は４８０〜５８０ｎｍの間で計測される。上記方法は上記プローブ化合物及び上記被検体を含む溶液の蛍光を計測することをさらに含む。
【０００６】
上記プローブは式Ｉの化合物：
【化１】
2006513414.tif 000003
｛式中：
Ｘはハロゲン、−ＣＮ、ＮＯ2、アリール、−Ｃ（Ｏ）−Ｒの群から選ばれる１〜３の置換基であり、ここで、Ｒは場合により置換されるＣ１−Ｃ４アルキル又は場合により置換されるアリールであり；及びＹは置換される又は置換されないヘテロアリールである｝
である。Ｙは１−メチル−インドール−２−イルの如き、場合により置換されるインドリルでありうる。上記プローブは５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸でありうる。
【０００７】
都合のよいことに、上記プローブ化合物は高い量子産出及び上記試験化合物の吸収バンドよりも長い励起波長を有する。予想外に、本発明に係るプローブ化合物はＨＳＡ内の２の区別できる部位において、例えば、部位Ｉの近隣で及び部位ＩＩで、高いアフィニティで結合する。本発明に係るプローブ化合物は他の同様の構造のより蛍光を発しない化合物との置換研究に及びハイスループットスクリーニングに使用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
定義
使用される略語：ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；ダンシル−、５−（ヂメチルアミノ）−１−ナフタレンスルフォニル−；ＤＮＳＡ、ダンシル−１−スルフォンアミド；ＤＳ、ダンシルサルコシン；ＰＢＺ、フェニルブタゾン；Ｋｄ、解離定数；ＰＢＳ、リン酸緩衝塩水；ＭＴＢＥ、メチル−ｔ−ブチルエーテル；Ｍ2ＯＨ、メタノール；ＮａＯＨ、水酸化ナトリウム；ＥｔＯＨ、エタノール；ＮＢＳ、Ｎ−ブロモ−スクシンイミド；ＡＩＢＮ、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル；ＲＴ、室温；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＤＣＭ、ヂクロロメタン；
【０００９】
上記用語「ハロ」はＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、及びＦから選ばれるハロゲン原子をいう。
上記用語「アルキル」は直鎖の及び有枝鎖の基をいう。別段の定めなき限り、アルキル基は１〜９の炭素原子を含む。
上記用語「アルケニル」は少なくとも１の−Ｃ＝Ｃ−を含む直鎖の及び有枝鎖の基をいう。別段の定めなき限り、アルケニル基は１〜９の炭素原子を含む。
上記用語「アルキニル」は少なくとも１の−Ｃ≡Ｃ−を含む直鎖の及び有枝鎖の基をいう。別段の定めなき限り、アルキニル基は１〜９の炭素原子を含む。１〜６の炭素原子。
上記用語「アルコキシ」は−Ｏ−アルキル基をいう。
【００１０】
上記用語「シクロアルキル」は環状アルキル基をいう。別段の定めなき限り、シクロアルキル基は３〜９の炭素原子を含むであろう。
上記用語「シクロアルケニル」は環状アルケニル基をいう。別段の定めなき限り、シクロアルケニル基は環状環内に５〜９の炭素原子及び少なくとも１の−Ｃ＝Ｃ−基を含むであろう。
上記用語「アミノ」は−ＮＨ2をいう。
上記用語「スルフォンアミド」は−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ（Ｑ10）2をいう。
【００１１】
上記用語「アリール」はフェニル及びナフチルをいう。
上記用語「ヘト」はＯ、Ｓ、及びＮから選ばれる少なくとも１のヘテロ原子を含む単又は二環状環系をいう。それぞれの単環状環は芳香族、飽和又は部分的に不飽和でありうる。二環状環系はシクロアルキル又はアリール基と融合した少なくとも１のヘテロ原子を含む単環状環を含みうる。二環状環系はまた他のヘト、単環状環系と融合した少なくとも１のヘテロ原子を含む単環状環をも含みうる。
【００１２】
「ヘト」の例は、非限定的に、ピリヂン、チオフェン、フラン、ピラゾリン、ピリミヂン、２−ピリヂル、３−ピリヂル、４−ピリヂル、２−ピリミヂニル、４−ピリミヂニル、５−ピリミヂニル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、３−ピラジニル、４−オキソ−２−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、５−ピラゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、４−オキソ−２−オキサゾリル、５−オキサゾリル、１，２，３−オキサチアゾール、１，２，３−オキサヂアゾール、１，２，４−オキサヂアゾール、１，２，５−オキサヂアゾール、１，３，４−オキサヂアゾール、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、３−イソチアゾール、４−イソチアゾール、５−イソチアゾール、２−フラニル、３−フラニル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピローリル、３−ピローリル、３−イソピローリル、４−イソピローリル、５−イソピローリル、１，２，３−オキサチアゾール−１−オキシド、１，２，４−オキサヂアゾール−３−イル、１，２，４−オキサヂアゾール−５−イル、５−オキソ−１，２，４−オキサヂアゾール−３−イル、１，２，４−チアヂアゾール−３−イル、１，２，４−チアヂアゾール−５−イル、３−オキソ−１，２，４−チアヂアゾール−５−イル、１，３，４−チアヂアゾール−５−イル、２−オキソ−１，３，４−チアヂアゾール−５−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−５−イル、１，２，３，４−テトラゾール−５−イル、５−オキサゾリル、３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル、１，３，４−オキサヂアゾール、４−オキソ−２−チアゾリニル、５−メチル−１，３，４−チアヂアゾール−２−イル、チアゾールヂオン、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，４−ヂチアゾロン、フタリミド、キノリニル、モルフォリニル、ベンゾキサゾイル、ヂアジニル、トリアジニル、キノリニル、キノキサリニル、ナフチリヂニル、アゼチヂニル、ピローリヂニル、ヒダントイニル、オキサチオラニル、ヂオキソラニル、イミダゾリヂニル、及びアザバイシクロ［２．２．１］ヘプチルを含む。
【００１３】
上記用語「ヘテロアリール」は少なくとも１の環状環が芳香族である単又は二環状ヘトをいう。
【００１４】
上記用語「置換されるアルキル」はハロ、ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、−ＯＱ10、−ＳＱ10、Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝Ｎ−Ｏ−Ｑ10）Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｎ（Ｑ10）Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＯＱ10、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、及び−ＳＮＱ10Ｑ10から選ばれる１〜４の置換基を含むアルキル基をいう。ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールのそれぞれはハロ及びＱ15から独立に選ばれる１〜４の置換基で場合により置換される。
【００１５】
上記用語「置換されるアリール」は−ＯＱ10、−ＳＱ10、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＯＱ10）Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＯＱ10、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｎ（Ｑ10）Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｎ（Ｑ10）Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、−ＳＮＱ10Ｑ10、アルキル、置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘト、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールから選ばれる１〜３の置換基を有するアリール基をいう。上記ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルケニル、アルキニル、及びアリールはハロ及びＱ15から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００１６】
上記用語「置換されるヘト」は、非限定的に、置換されるインドリルを含み、及び−ＯＱ10、−ＳＱ10、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＯＱ10）Ｑ10、ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＯＱ10、−Ｏ−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、−ＳＮＱ10Ｑ10、アルキル、置換されるアルキル、ヘト、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールから選ばれる１〜４の置換基を含むヘト基をいう。上記ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールはハロ及びＱ15から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００１７】
上記用語「置換されるアルケニル」は１〜３の置換基−ＯＱ10、−ＳＱ10、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＯＱ10）Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、−ＳＮＱ10Ｑ10、アルキル、置換されるアルキル、ヘト、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールを含むアルケニル基をいう。上記ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールはハロ及びＱ15から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００１８】
上記用語「置換されるアルコキシ」は１〜３の置換基−ＯＱ10、−ＳＱ10、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＯＱ10）Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、−ＳＮＱ10Ｑ10、アルキル、置換されるアルキル、ヘト、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールを含むアルコキシ基をいう。上記ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールはハロ及びＱ15から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００１９】
上記用語「置換されるシクロアルケニル」は１〜３の置換基−ＯＱ10、−ＳＱ10、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＯＱ10）Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、−ＳＮＱ10Ｑ10、アルキル、置換されるアルキル、ヘト、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールを含むシクロアルケニル基をいう。上記ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールはハロ及びＱ15から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００２０】
上記用語「置換されるアミノ」は１又は両方のアミノ水素が−ＯＱ10、−ＳＱ10、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＱ10）Ｑ10、−Ｃ（＝ＮＯＱ10）Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ10）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ10）2、−ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ10、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｏ）ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｃ（Ｓ）ＮＱ10Ｑ10、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ10Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）2Ｑ10、−ＮＱ10Ｓ（Ｏ）Ｑ10、−ＮＱ10ＳＱ10、−ＮＯ2、−ＳＮＱ10Ｑ10、アルキル、置換されるアルキル、ヘト、ハロ、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールから選ばれる基で置換されるアミノ基をいう。上記ヘト、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールはハロ及びＱ15から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００２１】
それぞれのＱ10は−Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘト、シクロアルケニル、及びアリールから独立に選ばれる。上記ヘト、アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びアリールはハロ及びＱ13から選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００２２】
それぞれのＱ11は−Ｈ、ハロ、アルキル、アリール、シクロアルキル、及びヘトから独立に選ばれる。上記アルキル、アリール、シクロアルキル、及びヘトはハロ、−ＮＯ2、−ＣＮ、＝Ｓ、＝Ｏ、及びＱ14から独立に選ばれる１〜３の置換基で場合により置換される。
【００２３】
それぞれのＱ13はＱ11、−ＯＱ11、−ＳＱ11、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ11、−Ｓ（Ｏ）Ｑ11、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ11、−Ｃ（＝ＮＱ11）Ｑ11、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ11）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ11）2、−ＳＣ（Ｏ）Ｑ11、−ＮＱ11Ｑ11、−Ｃ（Ｏ）Ｑ11、−Ｃ（Ｓ）Ｑ11、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ11、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ11、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ11Ｑ11、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＱ11Ｑ11、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ11Ｑ11、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ10、−ＣＮ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＱ11Ｃ（Ｏ）Ｑ11、−ＮＱ11Ｃ（Ｓ）Ｑ11、−ＮＱ11Ｃ（Ｏ）ＮＱ11Ｑ11、−ＮＱ11Ｃ（Ｓ）ＮＱ11Ｑ11、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ11Ｑ11、−ＮＱ11Ｓ（Ｏ）2Ｑ11、−ＮＱ11Ｓ（Ｏ）Ｑ11、−ＮＱ11ＳＱ11、−ＮＯ2、及び−ＳＮＱ11Ｑ11から独立に選ばれる。
【００２４】
それぞれのＱ14は−Ｈ又は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＱ16、−ＳＱ16、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ16、−Ｓ（Ｏ）Ｑ16、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ16、−ＮＱ16Ｑ16、−Ｃ（Ｏ）Ｑ16、−Ｃ（Ｓ）Ｑ16、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ16、−ＮＯ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ16Ｑ16、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ16Ｑ16、−ＣＮ、−ＮＱ16Ｃ（Ｏ）Ｑ16、−ＮＱ16Ｃ（Ｓ）Ｑ16、−ＮＱ16Ｃ（Ｏ）ＮＱ16Ｑ16、−ＮＱ16Ｃ（Ｓ）ＮＱ16Ｑ16、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ16Ｑ16、及び−ＮＱ16Ｓ（Ｏ）2Ｑ16から独立に選ばれる１〜４の置換基でそれぞれ場合により置換されるアルキル、シクロアルキル、フェニル若しくはナフチルから選ばれる置換基である。上記アルキル、シクロアルキル、及びシクロアルケニルは＝Ｏ又は＝Ｓでさらに場合により置換される。
【００２５】
それぞれのＱ15はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、フェニル又はナフチルであり、それぞれ−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＱ16、−ＳＱ16、−Ｓ（Ｏ）2Ｑ16、−Ｓ（Ｏ）Ｑ16、−ＯＳ（Ｏ）2Ｑ16、−Ｃ（＝ＮＱ16）Ｑ16、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｏ）（Ｑ16）2、−Ｓ（Ｏ）2−Ｎ＝Ｓ（Ｑ16）2、−ＳＣ（Ｏ）Ｑ16、−ＮＱ16Ｑ16、−Ｃ（Ｏ）Ｑ16、−Ｃ（Ｓ）Ｑ16、−Ｃ（Ｏ）ＯＱ16、−ＯＣ（Ｏ）Ｑ16、−Ｃ（Ｏ）ＮＱ16Ｑ16、−Ｃ（Ｓ）ＮＱ16Ｑ16、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｑ16）2ＯＣ（Ｏ）Ｑ16、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＱ10Ｑ10、−ＣＮ、−ＮＱ16Ｃ（Ｏ）Ｑ16、−ＮＱ16Ｃ（Ｓ）Ｑ16、−ＮＱ16Ｃ（Ｏ）ＮＱ16Ｑ16、−ＮＱ16Ｃ（Ｓ）ＮＱ16Ｑ16、−Ｓ（Ｏ）2ＮＱ16Ｑ16、−ＮＱ16Ｓ（Ｏ）2Ｑ16、−ＮＱ16Ｓ（Ｏ）Ｑ16、−ＮＱ16ＳＱ16、−ＮＯ2、及び−ＳＮＱ16Ｑ16から独立に選ばれる１〜４の置換基で場合により置換される。上記アルキル、シクロアルキル、及びシクロアルケニルは＝Ｏ又は＝Ｓでさらに場合により置換される。
【００２６】
それぞれのＱ16は−Ｈ、アルキル、及びシクロアルキルから独立に選ばれる。上記アルキル及びシクロアルキルは１〜３のハロを場合により含む。
それぞれのＱ17は−Ｈ、−ＯＨ、及び１〜３のハロ及び−ＯＨを場合により含むアルキルから独立に選ばれる。
【００２７】
本発明は本明細書中に示される有用な特性を有する、本発明に係る化合物のいかなるラセミ、光学活性、同質異像、互変異性若しくは立体異性形又はそれらの混合物をも含むことが理解されるべきである。
【００２８】
上記用語「場合により置換される」は本明細書中に定義される１以上の基により置換されうる基をいう。例えば、場合により置換されるインドリルは、上記句置換されるヘトについて、上記に示される１以上の基を場合により含むインドリル（ヘト）をいう。
【００２９】
詳細な説明
本発明の目的はヒト血清アルブミンに対する化合物のアフィニティを決定するための蛍光に基づいた分析を提供することである。本発明のさらなる目的は高い量子産出を有する蛍光プローブを提供することである。他の目的はほとんどの他の化合物の吸収バンドより長い励起波長を示す蛍光プローブを提供することである。またさらなる目的はほとんどの他の化合物による妨害がほとんどない範囲に蛍光発光波長を有するプローブを提供することである。
【００３０】
本発明はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する試験化合物の分子アフィニティ（平衡解離定数、Ｋd’ｓ又は結合定数）を決定する方法を示す。上記分子アフィニティは、後にプローブと呼ばれる式Ｉの蛍光化合物の置換を計測することにより決定される。ＨＳＡに対する単一の化合物のアフィニティ又は化合物アフィニティのハイスループット（ＨＴ）決定はこの方法及び蛍光リーダーを用いて得られうる。ＨＴスクリーニングは「一度に」のように連続して又は複数のサンプルセルを同時に計測することによるように並行した様式でサンプルセルを計測することにより行われうる。
【００３１】
上記プローブは高い量子産出及び４８０〜５８０ｎｍの最大蛍光発光波長及び３１０〜４３０ｎｍの励起波長の如き有用な蛍光特性を示す。上記プローブの励起波長範囲は多くの通常の薬物分子より長く、及びそれにより不確定な内部フィルター又は化合物吸収効果を減少させる。
【００３２】
ＨＳＡでの上記プローブの滴定は、上記プローブはＨＳＡに結合し及び上記プローブがＨＳＡに結合するときに観察される５３０ｎｍでの発光の消滅と共に環境に感受性であることを示した。ＨＳＡ上の既知の部位に結合するリガンド（イブプロフェン、フェニルブタゾン、ワルファリン及びヂクロフェナク）を用いたプローブ置換実験は、上記プローブは部位Ｉ及び部位ＩＩと相互作用する化合物により置換されうることを示した。上記プローブがＨＳＡ上の複数の部位に結合するというさらなる確認は、等温線滴定カロリメトリー実験により決定されるように、ＨＳＡのそれぞれの分子に結合した２分子のプローブの化学量論により示された。
【００３３】
この方法を用いて分子の結合定数を決定するために、緩衝された水中のプローブの溶液をキュベットに若しくはマルチウェルプレート中のウェルに又は蛍光リーダー中に入れられうる他の好適なサンプルセルに添加する。上記プローブ溶液の蛍光を計測し、１モーラー過剰のヒト血清アルブミンを添加し、及び蛍光における変化を記録する。上記試験化合物をその後上記キュベットに添加し、及び室温で３０〜６０分間平衡化する。上記蛍光を再び読み、及びＨＳＡから競合的に置換されたプローブのパーセントを以下の式により計算する：
置換されたパーセントプローブ＝１００−［（ｆ0−ｆa）／（ｆ0−ｆb）］×１００：
ここで、ｆ0は緩衝液中のプローブの蛍光であり、
ｆbはＨＳＡ中のプローブの蛍光であり、及び
ｆaは化合物、ＨＳＡ及びプローブの蛍光である。
上記置換されたパーセントプローブはＨＳＡ上の２の通常の薬物結合部位に対する試験化合物のアフィニティの定量的な計測を提供する。
【００３４】
全体の平衡解離定数、Ｋdは式：
Ｋd＝（ｆ−ｆb）／（ｆ0−ｆ）*［Ｉ0−Ｂ0*（ｆ0−ｆ）／（ｆ0−ｆb）］
によりシングルポイント置換値から計算されることができ、ここで、Ｉ0は試験化合物濃度であり、及びＢ0はＨＳＡ濃度である。
上記蛍光は一度に１のサンプルで計測されうる又は複数のサンプルは同時に計測されうる。
【実施例】
【００３５】
実施例
さらなる詳細なしに、当業者は前記記述を用いてその最も完全な程度まで本発明を実施しうると考えられる。以下の詳細な実施例はどのように本発明のさまざまなプロセスを行うかを示し、及び単に例示であり及びいかなるようにも前記開示の限定ではないと解釈されるべきである。以下の実施例において「プローブ」と呼ばれる化合物は５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸である。当業者は好適なプローブについて及び分析条件及び技術について上記手順から適切な変形を即座に認識するであろう。
【００３６】
プローブ及びそのアナログの合成
【化２】
2006513414.tif 000004
【００３７】
メチル２−メチル−５−ニトロ安息香酸
【化３】
2006513414.tif 000005
２−メチル−５−ニトロ安息香酸（５．０ｇ、２７．６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（０．４Ｌ）中に溶解し、続いてＨ2ＳＯ4（７ｍＬ）を添加した。上記混合物を還流で３６時間熱し、その後室温まで冷却し、及び約１００ｍＬまで濃縮させた。上記溶液をＭＴＢＥで希釈し、６Ｎ  ＮａＯＨで中和し、１Ｎ  ＮａＯＨ、塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、及び吸引下で濃縮させ、４．７２ｇ（８７％）のメチル２−メチル−５−ニトロ安息香酸を白色固体として得た。
【００３８】
メチル２−メチル−５−ニトロ安息香酸についての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＣＤＣｌ3）δ８．８０，８．２５，７．４４，３．９７，２．７４。
メチル５−アミノ−２−メチル安息香酸
【化４】
2006513414.tif 000006
【００３９】
メチル２−メチル−５−ニトロ安息香酸（５．０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）をＨ2の３５ｐｓｉ気体下でＲａｎｅｙニッケルを含むＥｔＯＨ中に溶解した。上記反応を２０時間攪拌し、その後Ｃｅｌｉｔｅをとおしてろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、及び吸引下で濃縮させ、４．２ｇ（１００％）のメチル５−アミノ−２−メチル安息香酸を得た。
【００４０】
メチル５−アミノ−２−メチル安息香酸についての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＣＤＣｌ3）δ７．３２，７．０６，６．８２，３．８９，２．４９。
メチル５−シアノ−２−メチル安息香酸
【化５】
2006513414.tif 000007
【００４１】
メチル５−アミノ−２−メチル安息香酸（４．２ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（２０ｍＬ／４６ｍＬ）中に溶解し、氷浴で冷却し、続いてＨＣｌ（５４ｍＬ）、ＮａＮＯ2（２．６３ｇ、３８．１ｍｍｏｌ、Ｈ2Ｏ  ６０ｍＬ中）を添加した。上記混合物を１／２時間攪拌し、その後固体ＮａＨＣＯ3、大量の気体放出で中和した。その後Ｈ2Ｏ（４０ｍｌ）／ＥｔＯＡｃ（８０ｍＬ）中のＫＣＮ（２．４８ｇ、３８ｍｍｏｌ）及びＣｕＣＮ（２．９ｇ、３３ｍｍｏｌ）の冷混合物を添加した。上記反応を１／２時間攪拌し、その後Ｃｅｌｉｔｅをとおしてろ過し、ＥｔＯＡｃで抽出し、その後Ｈ2Ｏ、塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、及び吸引下で濃縮させた。上記残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン／ＤＣＭ  １９／１、９／１、１／１、１／０）により精製し、１．８９ｇ（４２％）のメチル−５−シアノ−２−メチル安息香酸を白色固体として得た。
【００４２】
メチル−５−シアノ−２−メチル安息香酸についての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＣＤＣｌ3）δ８．２３，７．６８，７．３８，３．９４。
メチル２−（ブロモメチル）−５−シアノ安息香酸
【化６】
2006513414.tif 000008
【００４３】
メチル５−シアノ安息香酸（４．５０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（５．０３ｇ、２８．２５ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１５０ｍｇ）をヂクロロエタン（１６０ｍＬ）中に溶解した。上記混合物を光ランプで２時間照射した。上記混合物を室温まで冷却し、及び吸引下で濃縮させた。上記残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ヘプタン  １／９、１／４、１／１、１／０）により精製し、４．７９ｇ（７３％）のメチル２−（ブロモメチル）−５−シアノ安息香酸を得た。
【００４４】
メチル２−（ブロモメチル）−５−シアノ安息香酸についての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＣＤＣｌ3）δ８．２９，７．７９，７．６３，４．９７，４．００。
メチル２−｛［ブロモ（トリフェニル）フォスフォラニル］メチル｝−５−シアノ安息香酸
【化７】
2006513414.tif 000009
【００４５】
メチル２−（ブロモメチル）−５−シアノ安息香酸（２．８０ｇ、１０．９ｍｏｌ）をトルエン（５０ｍＬ）中のトリフェニルフォスフィン（２．８７ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。生ずる混合物を還流で３時間熱し、室温まで冷却し、上記沈殿物をろ過により単離し、ペンタンで洗浄し、４．６４ｇ（８２％）のメチル２−｛［ブロモ（トリフェニル）フォスフォラニル］メチル｝−５−シアノ安息香酸を白色固体として得た。
【００４６】
メチル２−｛［ブロモ（トリフェニル）フォスフォラニル］メチル｝−５−シアノ安息香酸についての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ８．２２，８．０８，８．７９−７．５１，５．６３，３．４８。
（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）メタノール
【化８】
2006513414.tif 000010
【００４７】
１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルボキシレート（１．０ｇ、５．７１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中のＬｉＡＩＨ4（２１７ｍｇ、５．７１ｍｍｏｌ）に添加した。気体放出が観察され、及び上記反応を室温で６時間攪拌し、その後Ｈ2Ｏ（３００μＬ）、その後６Ｎ  ＮａＯＨ（３００μＬ）、続いてＨ2Ｏ（６００μＬ）で停止させた。上記混合物を室温で２０分間攪拌させ、その後ｃｅｌｉｔｅをとおしてろ過し、及び吸引下で濃縮させ、８５５ｍｇ（９３％）の（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）メタノールを得た。
【００４８】
（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）メタノールについての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ７．４９，７．４０，７．１４−６．９６，６．３４，５．２２，４．６３，３．７３。
１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルブアルデヒド
【化９】
2006513414.tif 000011
【００４９】
（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）メタノール（８５０ｍｇ、５．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解し、続いてクロロクロム酸ピリヂニウム（２．３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合物を室温で４時間攪拌し、その後シリカプラグをとおして注ぎ、ＤＣＭで溶離した。上記溶媒を吸引下で蒸発させ、及び上記残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ヘプタン／ＭｅＯＨ  １／１／０、１／０／０、１９／０／１）により精製し、２１６ｍｇ（２５％）の１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルブアルデヒドを得た。
【００５０】
１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルブアルデヒドについての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ3）δ９．９０，７．７５，７．４８−７．４１，７．２８，７．２３−７．１７，４．１２。
メチル５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸
【化１０】
2006513414.tif 000012
【００５１】
メチル２−｛［ブロモ（トリフェニル）フォスフォラニル］メチル｝−５−シアノ安息香酸（８４２ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２０ｍＬ）中に溶解し、続いてＮａＨ（６６ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を添加した。気体放出が観察され、上記反応を６０℃で２時間熱し、その後室温まで冷却させ、及び１−メチル−１Ｈ−インドール−２−カルブアルデヒド（２１６ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を添加し、及び上記反応を室温で２時間攪拌した。上記混合物をＭＴＢＥで希釈し、Ｈ2Ｏ、塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、及び吸引下で濃縮させた。上記残留物をシリカゲルプラグ（ＤＣＭ）により精製し、Ｚ／Ｅ混合物を得た。上記固体をトルエン（５０ｍＬ）中に溶解し、続いてチオフェノール（１００μＬ）及びＡＩＢＮ（１４ｍｇ）を添加した。上記反応を還流で１２時間熱し、その後吸引下で濃縮させた。上記残留物をＭｅＯＨから再結晶化し、２７２ｍｇ（６３％）の５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸をＥ／Ｚ（１２．６／１）混合物として得た。
【００５２】
メチル５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸についての分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ，ＣＤＣｌ3）δ８．２７，８．１１，７．８８（Ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝１．７，８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６３，７．３５−７．１１，３．６９，３．８８。
５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸
【化１１】
2006513414.tif 000013
【００５３】
メチル５−シアノ−２−［（Ｅ）−２−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）エテニル］安息香酸（２７２ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解し、及び６Ｎ  ＮａＯＨ（５ｍＬ）を添加し、生ずる混合物を室温で４８時間攪拌し、その後ＭＴＢＥで希釈し、１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ2Ｏ、塩水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過し、及び吸引下で濃縮させた。上記残留物をＭｅＯＨから再結晶化し、１９７ｍｇ（７５％）を純粋なＥ−のみの異性体として得た。
【００５４】
分析データ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）δ  １３．７０，８．２４−８．２１，８．０３−８．００，７．９９，７．６０，７．５６，７．４７，７．１９−７．１５，７．０４，６．８７，３．８８。
【００５５】
実施例１：一般的な手順
緩衝されたプローブ溶液（２００μＬのリン酸緩衝塩水中の０．５μＭプローブ）を器械上の自動化液体注入装置を用いて９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加した。それぞれのウェルに、最後の行のウェルを除いて、１５μＬの２０μＭ  ＨＳＡを添加した。上記プレートの最後の２行を除いて、試験化合物をウェルに添加し、室温で６０分間平衡化し、及びその後蛍光を試験化合物ウェル（ｆ）、プローブ、緩衝液及びＨＳＡを含むウェルの行（ｆ0）、及びプローブ及び緩衝液のみを含むウェルの最後の行（ｆb）について読んだ。蛍光計測における精度は３〜６％以内であると決定され、及び１ヶ月の延長された期間にわたる分析再現性はＨＳＡ、プローブ溶液及びストック試験化合物の複合的な調製物を用いて１０％以内であった。
【００５６】
実施例２：薬品、装置及び分析ストック溶液
酢酸セルロース電気泳動により示される≧９５％の純度のヒト血清アルブミン、フラクションＶをＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ番号１２６６６）から購入した。マグネシウム又はカルシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）をＧｉｂｃｏから購入した。ヂメチルスルフォキシドをＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。ＨＳＡストック溶液を５ｍｇ／ｍＬ（７７μＭ）の名目上の濃度でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ中に調製した。ＨＳＡストック溶液の正確な濃度をＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ  ４０  ＵＶスペクトロフォトメーター、ε280＝３５，６００Ｍ-1ｃｍ-1で２８０ｎｍの５００μｌストック溶液の吸収を計測することにより決定した。ＨＳＡストック溶液を５℃で貯蔵した。ＴＨＥ  ＰＲＯＢＥのストック溶液、ＦＷ  ３０２．３ｇ／ＭをＤＭＳＯ中に１０ｍＭで調製した、１５０μＬ  ＤＭＳＯ中０．４５ｍｇのＴＨＥ  ＰＲＯＢＥ。この溶液を５℃で琥珀色の瓶中に貯蔵した。
【００５７】
ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＧＥＭＩＮＩデュアルスキャニングマイクロプレートスペクトロフルオロメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）を蛍光データを集めるために使用し、及びＢＭＧ  Ｐｏｌａｒｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）からの自動インジェクターシステムを分析プレートに緩衝液及びアルブミンを分配するために使用した。Ｃｏｒｎｉｎｇからの分析プレート（カタログ番号３９１５）は平底の黒色ポリスチレン、９６ウェルであった。
【００５８】
実施例３：プローブ置換分析手順
被検体溶液をＤＭＳＯ中に５ｍＭで調製した。等分、０．５μＬをウェルＡ１、Ｂ１及びＣ１で開始して三重で分析ウェルに分配した。これは２００μＬのＰＢＳ＋ＴＨＥ  ＰＲＯＢＥ及び１５μＬの２０μＭのＨＳＡの添加後、１２μＭの最終被検体濃度をもたらす。次の被検体をウェルＤ１、Ｅ１及びＦ１に添加した。この様式で、列当たり２の被検体又は全体で２１化合物が１の９６ウェルプレート上で分析されうる。上記分析プレートの最後の２列は標準の分析のために残しておき、及び最後の２行はコントロール及びブランクの繰り返し分析のために残しておいた。典型的なプレートレイアウトは表１中に示される。
【００５９】
５μｌ等分のＴＨＥ  ＰＲＯＢＥを０．５μＭの最終プローブ濃度になるように１００ｍＬのＰＢＳ中に希釈した。Ｐｏｌａｒｓｔａｒのインジェクター１番をこの溶液で満たし、及び２００μｌのプローブ溶液を上記分析プレートのそれぞれのウェルに添加した。上記プレートをデータ収集のためにＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉリーダーに移した。アルブミンが添加されていないこのはじめのリードを蛍光応答に対する被検体の影響を決定するために行った。データ取得を２４℃の一定温度でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー上のＳＯＦＴｍａｘ  ＰＲＯ３．１．１ソフトウェアを用いて制御した。励起波長は３７０ｎｍであり、及び発光波長は５３０ｎｍのカットオフフィルターを伴って５３３ｎｍであった。検出器応答を１４リード／ウェルで高い感受性に設定した。それぞれの化合物を三重で分析し、平均及び標準偏差をＳＯＦＴｍａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを用いて計算した。
【００６０】
ストックＨＳＡ溶液を１．７ｍＬのＰＢＳに０．６０ｍＬの７７μＭストックを添加することにより２０μＭまで希釈した。Ｐｏｌａｒｓｔａｒのインジェクター２番を２０μＭ  ＨＳＡで満たし、及びブランクを除く全てのウェルに添加された１５μｌ等分は１．４μＭの最終ＨＳＡ濃度をもたらした。上記ＨＳＡ添加が完了した後、上記プレートを同じパラメーターを用いて再び読み、及びさらなるリードを２４℃で６０分間のインキュベーション後に行った。上記プレートを最後の時間について読んだ後、ＨＳＡから競合的に置換されたＴＨＥ  ＰＲＯＢＥのパーセントを式：
【００６１】
Ｄ＝１００−［（ｆ0−ｆa）／（ｆ0−ｆb）］*１００
【００６２】
により平均相対蛍光値から計算し、ここで、Ｄは被検体によりＨＳＡから置換されたパーセントＴＨＥ  ＰＲＯＢＥであり、ｆ0はＰＢＳ中のＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、ｆbはＨＳＡに結合したＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの蛍光であり、及びｆaは被検体が添加された蛍光である。
【００６３】
実施例４：部位Ｉ及び部位ＩＩに結合することが知られる化合物によるＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの置換
実施例３の分析プロトコルにしたがって、部位Ｉ又は部位ＩＩでＨＳＡに結合することが知られる化合物をＨＳＡからＴＨＥ  ＰＲＯＢＥを置換するそれらの能力について試験した。使用された化合物は部位ＩＩに高いアフィニティを有するイブプロフェン、部位Ｉに高いアフィニティを有するワルファリン及びフェニルブタゾン及び両方の部位にアフィニティを有するヂクロフェナクを含んだ。上記化合物のそれぞれにより置換されたＴＨＥ  ＰＲＯＢＥのパーセントは表２中に示される。
【００６４】
実施例５：等温線滴定カロリメトリー
等温線滴定カロリメトリー実験をＭｉｃｒｏｃａｌ，  Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＭＡ）からのＯＭＥＧＡ滴定マイクロカロリメーターを用いて行った。データ収集、分析、及びプロット化を器械業者により供給されるＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）に基づいたソフトウェアパッケージ（Ｏｒｉｇｉｎ  ５．０）を用いて行った。上記滴定マイクロカロリメーターは断熱囲い中に保たれるサンプル及びリファレンスセルから成った。上記カロリメーターを既知の値に対して適用された熱パルスの計測された領域を比較することにより較正した。既知の及び実験で計測された値は２％以内に一致した。
【００６５】
上記プローブを１０ｍＭでＤＭＳＯ中に調製し、及びＰＢＳ中に５００μＭまで希釈した。上記プローブ及びＨＳＡ溶液を分析前に脱気した。リファレンスセルをＰＢＳで満たした。ＰＢＳ中のＨＳＡの２０μＭ溶液を１．３７ｍＬサンプルセル中に入れ、及び上記プローブ（０．５ｍＭ）を２５０μＬシリンジ中に保った。プローブの３０インジェクション（それぞれ６μＬ）を３７℃で保たれたＨＳＡで満たされたサンプルセル中へコンピュータ制御ステッピングモーターにより行った。上記シリンジ攪拌速度は４００ｒｐｍであった。それぞれの注入で吸収された又は放出された熱をＭｉｃｒｏｃａｌ  ｎａｎｏｖｏｌｔ  ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒにつなげられたサーモエレクトリック装置により計測した。結合相互作用についての滴定等温線はそれぞれの注入についての異なる熱フロウから成った。透析緩衝液へのリガンドの注入により得られる希釈の熱は小さかったが、上記データをフィッティングする前にさし引かれた。等温線は上記器械に含まれる相互作用非直線最小二乗法アルゴリズムを用いて単一部位モデルによくフィットする（Ｗｉｓｅｍａｎ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８９）１７９，  １３１−１３７）。
【００６６】
全てのパラメーターを、最小のＸ2が実験の及びフィットデータの間で得られるまで相互作用中で変動させた。この方法による等温線のデコンヴォルーションはそれぞれの相互作用についての結合の結合定数、Ｋ、エンタルピーにおける変化、ΔＨ、及び化学量論、Ｎを提供した。自由エネルギーにおける変化（ΔＧ）及びエントロピーにおける変化（ΔＳ）をギブスの自由エネルギーの式を用いて決定した。
【００６７】
実施例６：プローブ及びそのＨＳＡとの相互作用の特徴付け
図１は上記プローブの励起及び発光スペクトルを示す。最大励起は３７０ｎｍであり、及び最大発光は５３３ｎｍであった。強度対プローブの濃度における直線性の応答は調べられた範囲にわたり検出された。０．５μＭの上記プローブのＨＳＡ（フラクションＶ）での滴定は、上記プローブの蛍光発光強度が環境に感受性であることを示した。図２Ａ中に示されるように、５３３ｎｍでの上記プローブの蛍光強度はＨＳＡの増大する濃度と共に減少し、及び４７０ｎｍでの強度における対応する増大があった。上記プローブについてのＨＳＡ結合部位（単数又は複数）の画分飽和はそれゆえプローブが結合する又はＨＳＡから放出されるにつれて上記プローブの蛍光における変化を追うことにより決定されうる。図２Ｂは上記プローブのＨＳＡとの相互作用について得られた平均結合等温線を示す。上記データは２３℃でＰＢＳ中でのＨＳＡでの１１０ｎＭプローブの三重滴定からの平均等温線を示す。これらのデータは単一部位結合等温線についての式を用いてよくフィットされ、０．３９μＭの平衡解離定数、Ｋdをもたらした。上記データは単一部位モデルにフィットするが、上記プローブはＨＳＡ上の部位Ｉ又は部位ＩＩのいずれかに結合することが知られる化合物により置換されうる（Ｓｕｄｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  １１，  ８２４（１９７５））。表２は、１２μＭイブプロフェン、ワルファリン、ヂクロフェナク及びフェニルブタゾンがそれぞれＨＳＡから上記プローブを置換することができることを示した。イブプロフェンは〜１μＭの部位ＩＩでのアフィニティを有する（Ｐｅｔｅｒｓ，  Ａｌｌ  ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ４３２（１９９６））。ワルファリン及びフェニルブタゾンはそれぞれ、３及び１．４μＭのＫdで部位Ｉで結合した（Ｐｅｔｅｒｓ，  １９９６）。ヂクロフェナクの高いアフィニティ結合（Ｋd＝２μＭ）はベンゾヂアゼピン部位で、及びワルファリンと共有される第二の部位で（Ｋd＝１７μＭ）起こることが示された（Ｃｈａｍｏｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  ３４（１０），  １６９５，  （１９８５））。
【００６８】
単一濃度置換実験に加えて、ＨＳＡからの上記プローブの置換をＨＳＡに結合したプローブの溶液をイブプロフェン又はフェニルブタゾンで滴定することにより調べた。図３は上記プローブの出発濃度がＰＢＳ中１９μＭ  ＨＳＡを伴って０．５μＭであった実験の結果を示す。イブプロフェンはＨＳＡに結合したプローブの約７５〜８０％を置換することができ、及び結合した残るプローブのほとんどはフェニルブタゾンでの滴定により置換されることができた。
【００６９】
図３は等温線滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）により計測される上記プローブのＨＳＡとの相互作用についての結合等温線を示す。上部パネルはＨＳＡへの上記プローブの６μＬ注入当たりの熱フロウを示す。緩衝液への上記プローブの希釈の熱はごくわずかであった。図３の下部パネルはそれぞれの注入についての統合された熱及び使用された単一部位モデルからの最もよいフィットラインを示す。上記モデル及び上記データの間の一致は優れており、及び約２分子のプローブが１ＨＳＡ当たり結合したことを示した。上記相互作用についてのエンタルピー変化は−１０．４ｋｃａｌ／Ｍであり、全ての結合相互作用についての平均アフィニティは１５μＭであった。
【００７０】
実施例７：プローブの競合的置換により決定されるＨＳＡアフィニティ
アナログシリーズ中の抗菌活性を有する化合物を実施例３中に示される競合的置換分析を用いて調べた。化合物のそれぞれについてのＨＳＡからのプローブのパーセント置換は表３中に列挙される。表３はまた１０％血清を伴う及び伴わないそれぞれの化合物についてのＳ．  ａｕｒｅｕｓ  ９２１８に対するＭＩＣ値の率をも列挙する。０．６７の相関でパーセント置換値及びＭＩＣ率の間には直線性の関係があった。このことは、ＨＳＡに対する化合物のアフィニティがこのセットの抗菌化合物についてはＭＩＣに対する血清効果に直接的に関連することを示した。
【００７１】
【表１】
2006513414.tif 000014
【００７２】
【表２】
2006513414.tif 000015
【００７３】
【表３】
2006513414.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】図１ＡはＰＢＳ中での２．０μＭ（ダイアモンド）、１．５μＭ（三角）、１．０μＭ（四角）、及び０．５μＭ（丸）のプローブの励起スペクトルのプロットである。示される追加のスペクトルはＰＢＳのベースラインスキャンである。
【図１Ｂ】図１ＢはＰＢＳ中での２．０μＭ（ダイアモンド）、１．５μＭ（三角）、１．０μＭ（四角）、及び０．５μＭ（丸）のプローブの発光スペクトルのプロットである。示される追加のスペクトルはＰＢＳのベースラインスキャンである。
【図２Ａ】図２Ａは２３℃でＰＢＳ中での、ＨＳＡ（Ｖ）、等分当たり０．１７μＭ  ＨＳＡで滴定した０．５μＭプローブの蛍光発光スペクトルのプロットである。５３０ｎｍで最も大きな強度を有するスペクトルは緩衝液中のプローブである。５３０ｎｍでのスペクトル強度は飽和までＨＳＡのそれぞれの注入と共に減少する。
【図２Ｂ】図２ＢはＰＢＳ、ｐＨ７．０中でのＨＳＡ（Ｖ）での１１０ｎＭ  ＴＨＥ  ＰＲＯＢＥの三重滴定からの平均結合等温線を示すデータポイントのプロットであり、エラーバーは標準偏差を示す。連続した線は単一部位結合等温線について示される式を用いてデータにフィットする最小二乗法曲線に由来した。
【図３】図３はフェニルブタゾン（丸）又はイブプロフェン（四角）による１９μＭ  ＨＳＡからのプローブの競合的置換のプロットである。
【図４】図４は２のプロットを示す。下部のプロットは、等温線滴定カロリメトリー結果、ＰＢＳ中のＨＳＡ（Ｖ）とのプローブ相互作用についての統合されたエンタルピー及び最小二乗法曲線フィットを示す。上部のプロットは３５℃のＰＢＳ中のＨＳＡ（Ｖ）の２０μＭ溶液へのプローブの０．５ｍＭ溶液の６μＬ注入当たりのエンタルピー変化を示す。
【図１Ａ】
2006513414.tif 000019
【図１Ｂ】
2006513414.tif 000020
【図２Ａ】
2006513414.tif 000021
2006513414.tif 000022
【図３】
2006513414.tif 000023
【図４】
2006513414.tif 000024
【国際調査報告】
2006513414.tif 000025