(57)【要約】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を処置する方法および組成物を開示する。この方法は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージに遺伝学的にコードされる少なくとも１種類の溶菌酵素の有効量を感染またはコロニー形成部位に投与する工程を含むもので、上記少なくとも１種類の溶菌酵素が上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞壁に対して特異的であり、かつ該細胞壁を消化する能力を有する。上記溶菌酵素は、キメラ溶菌酵素または改造溶菌酵素であってもよく、ホリンタンパク質を用いることも可能である。溶菌酵素γバクテリオファージの配列を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を処置するための方法であって、
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージによりコードされる少なくとも１種類の溶菌酵素の有効量を感染またはコロニー形成部位に投与する工程を包含し、
前記少なくとも１種類の溶菌酵素が該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的であり、該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞壁を消化する能力を有する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種類の溶菌酵素が改造溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、およびその組み合わせからなる群から選択されるように、該少なくとも１種類の溶菌酵素の遺伝コードが変更される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージにより送達される前記遺伝コードに該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを感染させることによって、前記少なくとも１種類の溶菌酵素が生産される、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記溶菌酵素が、配列番号１の塩基配列またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の塩基の相補体にハイブリダイズする配列を有するＤＮＡに遺伝学的にコードされる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記配列番号１の塩基配列またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の塩基の相補体にハイブリダイズする配列を有するＤＮＡを含む核酸からの組み換え的生産によって、前記溶菌酵素が生産される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ファージゲノムから前記溶菌酵素に対する遺伝子を除去して、該遺伝子を運搬ベクター中に導入し、該運搬ベクターを発現系にクローニングすることによって、前記少なくとも１種類の溶菌酵素が生産される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記運搬ベクターがプラスミドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発現系が細菌である、請求項６〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択される、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記発現系が無細胞発現系である、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記感染部位への前記溶菌酵素の送達に適した送達様式によって該溶菌酵素を送達する工程をさらに包含する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記送達様式が、鼻腔スプレー、鼻腔ドロップ、鼻腔吸入剤、鼻腔軟膏、鼻腔洗浄剤、鼻腔注入剤、ゲル、鼻腔パッキング、ロゼンジ、トローチ、キャンディ、チューインガム、錠剤、スプレー、注入剤、粉剤、および液体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
吸入器によって前記酵素の乾燥無水型を送達する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
非経口、静脈内、筋肉内、皮下、または髄腔内で前記溶菌酵素を送達する工程をさらに包含する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種類の抗生物質を同時投与する工程をさらに包含する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１種類の抗生物質が、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、ペニシリン、セファロスポリン、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの胞子の発芽を補助するためのＬ−アラニンをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なホリンタンパク質の投与をさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ホリンタンパク質が、キメラホリンタンパク質、改造ホリンタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞壁を特異的に溶解できる実質的に精製された溶菌酵素。
【請求項２１】
前記溶菌酵素が配列番号１に示すアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の溶菌酵素。
【請求項２２】
前記溶菌酵素が前記配列番号１に示す配列に少なくとも約５０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の溶菌酵素。
【請求項２３】
前記溶菌酵素が、配列番号１と比べると、少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の溶菌酵素。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれかに記載の実質的に精製された溶菌酵素を含む組成物。
【請求項２５】
請求項２０〜２４のいずれかに記載の溶菌酵素をコードする単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２６】
前記配列がγファージのＤＮＡ内でコードされることが判明している請求項２５に記載のＤＮＡ配列。
【請求項２７】
ストリンジェントな条件下で請求項２５および２６のＤＮＡ配列にハイブリダイズする実質的に単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２８】
ａ．請求項２０〜２３記載の少なくとも１種類の溶菌酵素の有効量と、
ｂ．該溶菌酵素を感染部位に送達するために適したビヒクルと
を含むＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染を処置するための組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１種類の溶菌酵素が改造溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、およびその組み合わせからなる群から選択されるように、前記少なくとも１種類の溶菌酵素の遺伝コードが変更される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項５〜１０のいずれかに記載の方法にしたがって生産される溶菌酵素を含む、請求項２８または２９のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
送達様式が、鼻腔スプレー、鼻腔ドロップ、鼻腔吸入剤、鼻腔軟膏、鼻腔洗浄剤、鼻腔注入剤、ゲル、鼻腔パッキング、ロゼンジ、トローチ、キャンディ、チューインガム、錠剤、スプレー、注入剤、粉剤、および液体からなる群から選択される、請求項２８〜３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
吸入器での使用に適した乾燥無水形態の、請求項２８〜３０のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、非経口溶液、静脈内溶液、筋肉内溶液、皮下溶液、または髄腔内溶液である、請求項２８〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも１種類の抗生物質をさらに含む、請求項２８〜３３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
前記少なくとも１種類の抗生物質が、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、ペニシリン、セファロスポリン、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの胞子の発芽を補助するためのＬ−アラニンをさらに含む、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なホリンタンパク質の投与をさらに含む、請求項３４〜３６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
前記ホリンタンパク質が、キメラホリンタンパク質、改造ホリンタンパク質、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの胞子を検出する方法であって、
ａ．少なくとも１種類の発芽剤とともに該胞子をインキュベートする工程と、
ｂ．該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞壁を消化する溶菌酵素とともに該胞子をインキュベートする工程と、
ｃ．ルシフェリンおよびルシフェラーゼを添加する工程と、
ｄ．該ルシフェリンおよび該ルシフェラーゼの存在下でＡＴＰの放出を測定し、該ＡＴＰの放出からの発光をルミノメーターによって読み取る工程と
を包含する、方法。
【請求項４０】
前記ルミノメーターが手持ち型ルミノメーターである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記胞子を前記発芽剤とともにインキュベートする前に、フィルター上に該胞子を固定化する工程をさらに包含する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記胞子を液体に入れた後に前記液体をキュベット内に置く工程をさらに包含する、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記発芽剤がＬ−アラニンである、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記溶菌酵素がＰｌｙＧである、請求項３９〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記溶菌酵素が、キメラ溶菌酵素、改造溶菌酵素、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項３９〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ホリンタンパク質をさらに含む、請求項３９〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記ホリンタンパク質が、改造溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、仮米国出願６０／３８０，８７５号（２００２年５月１７日出願）の優先権を主張するもので、上記出願の全体を本明細書では援用する。
【０００２】
（分野）
本開示は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを迅速かつ特異的に検出および殺滅するファージ関連溶菌酵素の同定のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
医薬における重大な問題は、より多くの抗生物質が多種多様な疾患および他の症状に用いられるにつれて薬剤耐性細菌が発生することであった。より多くの抗生物質の使用と耐性を示す細菌の数とによって、処置に要する時間がより長くなる。さらに、広範な非特異的抗生物質は、より頻繁に現在用いられており、そのいくつかが患者に有害な作用を持っている。この使用の増加に関連する問題は、多くの抗生物質が粘膜（ｍｕｃｕｓ  ｌｉｎｉｎｇｓ）に容易には浸透しないということである。さらに、抗生物質に対するアレルギーを有する人々の数は増加し続けているようである。したがって、新規な抗生物質、特に新規の様式で作用するか、または病原性細菌を死滅させる新規の手段を与える抗生物質が商業的に必要とされている。
【０００４】
バクテリオファージの使用を介して細菌性疾患を処置するための試みがなされている。米国特許第５，６８８，５０１号（Ｍｅｒｒｉｌら）は、特定の細菌に特異的な溶菌または非溶菌バクテリオファージを用いて、動物での細菌による感染性疾患を処置する方法を開示している。
【０００５】
米国特許第４，９５７，６８６号（Ｎｏｒｒｉｓ）は、改善された歯科衛生法を開示しており、これは、唾液腺薄膜（ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｅｌｌｉｃｌｅ）に容易に接着する特性を持つ細菌に寄生するバクテリオファージを口腔内に導入することを含む。
【０００６】
しかし、バクテリオファージを動物に直接導入して疾患を予防しまたは疾患と闘わせることには、いくつかの欠点がある。特に、細菌およびファージの両方が、ファージが付着するために増殖周期が正確かつ同期していなければならない。さらに、細菌に付着するファージが正確な数でなければならない。すなわち、ファージが多すぎるかまたは少なすぎる場合、付着しないか、または溶菌酵素が生成されないかのいずれかである。ファージは、十分な活性もなくてはならない。ファージは、ファージが攻撃しようとする生物体からの細菌残屑を含む多くの物質にも阻害される。さらに、細菌感染を処置するためのバクテリオファージの直接使用を複雑にしているものは、ファージを機能させなくする免疫反応の可能性である。
【０００７】
その結果として、細菌感染を治療および予防するためのより安全かつより効果的な手段の使用が検討されている。具体的には、ファージ関連溶菌酵素の使用が検討されている。
【０００８】
バクテリオファージ溶解素は、病原性連鎖球菌の鼻咽頭輸送を除去するために近年提案された溶菌剤の類である（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．＆  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．Ｒａｐｉｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｃｅ１１  ｗａｌｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，２１７０−２（２００１）；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｏｏｍｉｓ，Ｌ．＆  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，４１０７−１２（２００１））。溶解素は、ウイルス粒子形成の完了と宿主溶解とを連係させるために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ファージによって用いられる溶菌機構の一部分である。Ｗａｎｇ，Ｉ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．＆Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｈｏｌｉｎｓ：ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌｏｃｋｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４，７９９−８２５（２０００）。感染の後期に、溶解素は、細胞壁マトリックスに転移し、そこで、該溶解素は、ペプチドグリカンの完全性に必須である共有結合を加水分解し、細菌溶解および付随する子孫ファージの放出を引き起こす。溶解素群に属するものは、モジュール設計を示し、その中で通常十分に保存された触媒ドメインがより多様な特異性または結合ドメインに融合する。Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｅ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．＆  Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｍｏｄｕｌａｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ｃｒｅａｔｅ  ｎｅｗ  ｌｙｓｉｎｓ？  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ  ３，１９９−２１１（１９９７）を参照せよ。
【０００９】
米国特許第５，６０４，１０９号（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら）は、半精製Ｃ群連鎖球菌ファージ関連溶解素酵素による細菌細胞壁の酵素消化を介した臨床標本中のＡ群連鎖球菌の迅速な検出に関する。
【００１０】
米国特許第５，９８５，２７１号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）および米国特許第６，０１７，５２８号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、敗血性咽頭炎として通常知られるＡ群連鎖球菌咽喉感染の予防的および治療的処置のために、Ｃ１バクテリオファージに感染したＣ群連鎖球菌細菌によって産生される溶解素酵素を含有するキャンディ、チューインガム、ロゼンジ、トローチ、錠剤、粉剤、エアロゾル、液体、または液体スプレー等の組成物の使用を開示している。
【００１１】
米国特許第６，０５６，９５４号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、皮膚、膣、または眼の細菌感染の予防的および治療的処置のための方法を開示しており、該方法は、感染細菌に特異的な溶菌酵素組成物の有効量を用いた個体の処置を含み、この際該溶菌酵素が感染部位にこの酵素を送達するためのキャリア内にある。
【００１２】
米国特許第６，０５６，９５５号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、皮膚組織への局所適用に適したキャリアと混合した溶解素酵素の使用による連鎖球菌感染の局所的処置のための方法および組成物を開示している。皮膚連鎖球菌感染の処置のための方法は、有効量の治療剤を含む組成物を投与することを含み、該治療剤は、Ｃ１バクテリオファージに感染したＣ群連鎖球菌細菌によって産生される溶解素酵素を含む。治療剤は、薬学的に許容されるキャリア内に含有させることができる。
【００１３】
米国特許第６，２４８，３２４号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、皮膚組織への局所適用に適したキャリア内の溶菌酵素を用いることによって皮膚感染を処置するための組成物を開示している。皮膚感染を処置するための方法は、有効量の治療剤を含む組成物を投与することを含み、該治療剤は、細菌をその細菌に特異的なファージに感染させることによって産生される溶菌酵素を含む。
【００１４】
米国特許第６，２５４，８６６号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、感染細菌に特異的な溶菌酵素の投与を含む消化管の細菌感染を処置するための方法を開示している。好ましくは、消化管内の感染部位への溶菌酵素を送達させるのはキャリアである。処置すべき細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。キャリアは、坐剤浣腸、シロップ剤、または腸溶性錠剤からなる群から選択される。
【００１５】
米国特許第６，２６４，９４５号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、侵襲性細菌に特異的な少なくとも１種類のファージ関連溶菌酵素と、患者へ該溶菌酵素を送達するための適当なキャリアとの非経口導入による細菌感染の処置のための方法および組成物を開示している。注射は、筋肉内、皮下、または静脈内でおこなうことができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（要旨）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの休眠および耐久胞子形態は、理想的な生物兵器であるとして報告されている（Ｍｏｃｋ，Ｍ．＆  Ｆｏｕｅｔ，Ａ．Ａｎｔｈｒａｘ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５５，６４７−７１（２００１），Ｉｎｇｌｅｓｂｙ，Ｔ．Ｖ．ら、Ａｎｔｈｒａｘ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗｅａｐｏｎ，２００２：ｕｐｄａｔｅｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｊａｍａ  ２８７，２２３６−５２（２００２））。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子は、ヒトに非常に有害であり、放出後はほとんど永久的に環境で生存できる。一旦吸入したら、胞子は、肺胞マクロファージによって縦隔および気管支周囲リンパ節に輸送され、そこで該胞子は出芽する。その後の栄養型クローン増殖は、手におえないほどの菌血症および妊娠中毒症を引き起こす。未処置の吸入炭疽に関連する死亡率は９９％に達し得るとともに、非特異的な熱症状の発症後に開始した場合抗生物質処置は大部分がうまくいかない。天然発生および遺伝子操作抗生物質耐性の潜在性によって、兵器化した胞子の脅威が増し、改良された処置および意図的な放出後の胞子検出のための方法の必要性が強調される。
【００１７】
本開示の実施形態は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの処置のための溶菌酵素に加えて、種々のバクテリオファージ関連ホリン（ｈｏｌｉｎ）タンパク質、キメラ溶菌酵素、および改造（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）溶菌酵素の抽出および使用を提供する。より具体的には、本発明は、１種類以上の細菌種から単離される少なくとも１種類の細菌関連ファージ酵素を含む医薬組成物を提供し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの予防的および治療的処置に用いることが可能な少なくとも１種類のファージ溶菌酵素および／またはホリンタンパク質を含む。
【００１８】
さらに、本開示の実施形態は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（単に炭疽（ａｎｔｈｒａｘ）ともいう）の治療および予防のための細菌ファージ関連溶菌酵素の抽出および使用に関する。１つのそのような実施形態では、感染した細菌内でγファージを増殖させ酵素を回収することによって、細菌ファージ関連溶菌酵素を調製する。別のそのような実施形態では、酵素を生成するトランスジェニック細菌を増殖させ、その後該細菌から酵素を回収することによって、細菌ファージ関連溶菌酵素を組み換え的に調製する。
【００１９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの迅速な検出および死滅のための酵素の固有の特異性を実証するための実験をおこなった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに高度に特異的なγファージから単離および精製されたＰｌｙＧ溶解素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよび桿菌のアンスラシス「群（ｇｒｏｕｐ）」に属する細菌を迅速かつ特異的に死滅させた。
【００２０】
本開示の一実施形態では、ＰｌｙＧ溶解素を配列決定する。
【００２１】
別の実施形態では、ＰｌｙＧ溶解素を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを予防的および治療的に処置する。
【００２２】
本開示のさらに別の実施形態では、ＰｌｙＧ溶解素を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを検出および同定する。
【００２３】
本開示のさらに別の実施形態では、改造溶菌酵素を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓが原因の細菌感染を予防的および治療的に処置する。
【００２４】
本開示のさらに別の実施形態では、ファージ関連溶菌酵素と組み合わせてホリンタンパク質を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓが原因の細菌性疾患を予防的および治療的に処置する。本開示の別の実施形態では、ホリンタンパク質を単独で用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓが原因の細菌感染を予防的および治療的に処置する。ホリンタンパク質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓによって生じた溶菌酵素に組み合わせたまたは非依存的な改造ホリンタンパク質またはキメラホリンタンパク質でよい。
【００２５】
本開示のさらに別の実施形態では、キメラおよび／または改造溶菌酵素を非経口投与し、この際ファージ関連溶菌酵素を筋肉内、髄腔内、真皮下、皮下、または静脈内投与して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ酵素による感染を処置する。
【００２６】
ファージ関連改造および／またはキメラ溶菌酵素を経静脈的に適用する本開示の別の目的は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの敗血症および一般感染を処置することである。
【００２７】
さらに別の実施形態では、キメラ菌溶酵素、改造溶菌酵素、ＰｌｙＧ溶解素の「非改変（ｕｎａｌｔｅｒｅｄ）」型、ホリンタンパク質、およびそれらの組み合わせを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓへの暴露を予防的および治療的に処置する。別の実施形態では、キメラ溶菌酵素、改造溶菌酵素、ＰｌｙＧ溶解素の「非改変（ｕｎａｌｔｅｒｅｄ）」型、ホリンタンパク質、およびそれらの組み合わせを用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを検出および同定する。一実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なファージ関連溶菌酵素を用いて、増殖状態のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを同定することが可能である。
【００２８】
図１に示すように、γファージからＰｌｙＧ溶解素の配列が単離されており、その一方でＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージ由来の他の溶菌酵素をＰｌｙＧの代わりに用いることが可能である。一実施形態では、溶菌酵素またはホリンタンパク質（それらのイソ酵素、類似体、または改変体を含む）をコードするＤＮＡを遺伝学的に改変した。別の実施形態では、溶菌酵素またはホリンタンパク質（それらのイソ酵素、類似体、または改変体を含む）を化学的に改変した。さらに別の実施形態では、溶菌酵素またはホリンタンパク質（それらのイソ酵素、類似体、または改変体を含む）を天然形態および修飾（遺伝学的的または化学的に改変した）形態を組み合わせて用いる。化学的合成および／またはＤＮＡ組み換え技術によって、溶菌酵素およびホリンタンパク質の修飾または改変形態を合成的に生成する。キメラ化および改造によって、該酵素を合成的に生成する。
【００２９】
バクテリオファージ溶菌酵素は、細菌細胞のペプチドグリカンに存在する結合を特異的に切断する酵素であることが、理解されるはずである。細菌細胞壁ペプチドグリカンは、全ての細菌間で高度に保存されているので、細胞壁を破壊するために切断すべき結合はほんのわずかである。これらの結合を切断する酵素は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼ、またはＮ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニン・アミダーゼ（以下、アミダーゼともいう）である。報告されているファージ酵素の大部分は、ムラミダーゼまたはアミダーゼのいずれかであり、バクテリオファージ・グルコサミニダーゼに関しては何ら報告されていない。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ他（１９７４）は、Ｃ１連鎖球菌ファージ溶解素酵素がアミダーゼであると報告した。Ｇａｒｃｉａ他（１９８７、１９９０）は、Ｃｐ−１ファージからのＳ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣｐ１溶解素がリゾチームであると報告した。ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２）は、φ６シュードモナス属ファージ由来の溶菌酵素が、メソ−ジアミノピメリン酸およびＤ−アラニンによって形成されるペプチド架橋を分割するエンドペプチダーゼであると報告した。Ｅ．ｃｏｌｉＴ１およびＴ６ファージ溶菌酵素は、Ｌｉｓｔｅｒｉａファージ（ｐｌｙ）由来溶菌酵素様のアミダーゼである（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６）。細胞壁を切断する他の酵素も存在する。
【００３０】
本開示は、特定のバクテリオファージに遺伝学的にコードされるそのような溶菌酵素を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓにさらされる可能性のある人々を予防するための予防的処置として、または感染により既に罹患した人々に対する治療的処置として用いる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的でありかつ特定のファージによって遺伝学的にコードされるファージ関連溶菌酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの細胞壁を効果的および効率的に破壊することができる。注目すべきことは、半精製酵素がタンパク質分解酵素活性を失う可能性があるため、細菌細胞壁の消化中に存在する場合、哺乳類タンパク質および組織が破壊されないと考えられることである。
【００３１】
別の実施形態は、上記用途のための融合タンパク質を含むキメラタンパク質またはペプチドフラグメントも提供する。
【００３２】
使用する単語の定義および本開示へのその適用範囲は、以下のとおりである。
【００３３】
すなわち、実施形態のこの文脈では、用語「バクテリオファージに遺伝学的にコードされる溶菌酵素（１ｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏｄｅｄ  ｆｏｒ  ｂｙ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ）」とは、宿主細菌に対して少なくともある程度の溶菌活性を有するポリペプチドを意味する。このポリペプチドは、溶菌酵素のネイティブ配列およびその改変体を包含する配列を有する。該ポリペプチドを、ファージ等の様々な供給源から単離すること、またはＧａｒｃｉａ他による方法等の組み換え法または合成法によって調製することが可能である。全てのポリペプチドは、２つのドメインを有する。一方のドメインは、カルボキシル末端側にあるコリン結合部分であり、他方のドメインは、アミノ末端側のペプチドグリカン内のアミド結合に作用するアミダーゼ活性である。一般的にいえば、本発明に係る溶菌酵素は、分子量２５，０００〜３５，０００ダルトンであり、単一のポリペプチド鎖を含む。しかし、これは、酵素鎖によって異なることができる。変性用ドデシル硫酸ナトリウム・ゲル電気泳動でのアッセイおよび分子量マーカーとの比較によって最も都合の良い分子量を決定する。
【００３４】
用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、出発物質から少なくとも部分的に精製されていることを意味する。用語「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、生物学的材料の濃度が任意の精製プロセスによって測定可能なかたちで増加し、それによって該材料の調製の際に含まれる前駆物質または他の化学物質等の不純物を部分的に、実質的に、または完全に除去することを意味する。このような精製プロセスとして、限定はされないが、カラム・クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、沈降、および電気泳動が挙げられる。したがって、相同または実質的に相同な（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー等の分離法で単一のタンパク質シグナルを生成する）材料は、単離および精製されるという意味に包含される。当業者は、必要な精製量が材料の用途に依存することを理解するだろう。例えば、ヒトへの投与を目的とした組成物は、通常、規制基準にしたがって高純度に精製されていなければならない。
【００３５】
「ネイティブ配列ファージ関連溶菌酵素（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｈａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）」とは、天然由来の酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドである。このようなネイティブ配列酵素を自然界から単離することができ、あるいは組み換えまたは合成手段によって生産することができる。用語「ネイティブ配列酵素（ｎａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｚｙｍｅ）」とは、具体的にはその酵素の天然に存在する形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態または修飾された形態）および天然に存在しない改変体を包含する。  本開示の一実施形態では、ネイティブ配列酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージ由来の遺伝子に遺伝学的にコードされる成熟または完全長のポリペプチドである。当然、多数の改変体があり得るとともに既知であり、Ｌｏｐｅｚら，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｃｓｉｓｔａｎｃｅ  ３：１９９−２１１（１９９７）；Ｇａｒｃｉａら，Ｇｅｎｅ  ８６：８１−８８（１９９０）；Ｇａｒｃｉａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９１４−９１８（１９８８）；Ｇａｒｃｉａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９１４−９１８（１９８８）；Ｇａｒｃｉａら，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＣｕｒｔｉｓ編，１９８７）；Ｌｏｐｅｚら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｌｅｔｔ．１００：４３９−４４８（１９９２）；Ｒｏｍｅｒｏら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５０６４−５０７０（１９９０）；Ｒｏｎｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：６２１−６２４（１９８７）、およびＳａｎｃｈｅｚら，Ｇｅｎｅ  ６１：１３−１９（１９８７）等の文献で確認される。本明細書では、これらの参考文献のそれぞれの内容、特に配列表と配列を比較する関連本文（配列ホモロジーに関する記述を含む）とは、その全体が参考として援用される。
【００３６】
「改変配列ファージ関連溶菌酵素（ｖａｒｉａｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｈａｇｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）」とは、下記に定義するように、配列番号１に示す配列に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも９９．５％ものアミノ酸配列同一性を有し、かつＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージに遺伝学的にコードされる機能的に活性な溶菌酵素を意味する。当然、当業者は、この配列のなかで結合および反応触媒等の機能に関連する部分を、容易に認識するだろう。したがって、ポリペプチド配列およびこれらの配列をコードする核酸は、配列番号１の各機能ドメインの少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを含むことが企図される。全配列のうちのそのような部分は、治療／予防法と同様に、診断法にも非常に有用である。実際、アミノ酸の数が５つほどの短い配列は、ファージ用のエピトープ・マーカーとしての有用性を持つ。より望ましくは、少なくとも８、９、１０、１２、１５、または２０アミノ酸サイズを有する、より大きなタンパク質フラグメントまたは領域とそれらの相同配列とは、エピトープの特徴を有するものであり、実施形態にもとづいて小ペプチドまたはより大きなタンパク質の切片として、用いられてもよい。これらの配列に対応する核酸また、企図される。
【００３７】
そのようなファージ関連溶菌酵素改変体として、例えば溶菌酵素ポリペプチドが挙げられ、１個以上のアミノ酸残基が配列番号１の配列のＮまたはＣ末端で付加また欠失する。一実施形態では、配列内の任意の位置または配列部分に対して、１個以上のアミノ酸を置換、欠失、および／または付加する。通常、ファージ関連溶菌酵素は、ネイティブなファージ関連溶菌酵素配列に少なくとも約（例えば厳密に）５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％アミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約（例えば厳密に）８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％アミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、ファージ関連溶菌酵素改変体は、配列番号１に示す配列に少なくとも約５０％（例えば厳密に５０％）、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または少なくとも９９．５％ものアミノ酸配列同一性を有する。
【００３８】
本明細書で同定されるファージ関連溶菌酵素配列に関する「％アミノ酸配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、同一リーディングフレーム内で配列のアラインメントをおこない、配列同一性の一部として何ら同類置換を考慮せずに、配列同一性の割合が最大となるように必要に応じてギャップを導入した後に、ファージ関連溶菌酵素配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合（パーセント値）として定義される。％アミノ酸配列同一性を決定することを目的としたアライメントは、当該分野の技術水準内である種々の方法で達成することができ、該方法として、限定されるものではないが、公的に入手可能なコンピュータ・ソフトウェア（例えば、ブラストソフトウェア）の利用が挙げられる。当業者は、アラインメントを測定するための適当なパラメータを決定することができ、該パラメータには、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムが含まれる。
【００３９】
各々の場合で、当然、％アミノ酸配列同一性を決定する際、保存的アミノ酸置換を同時におこなうことが可能である。例えば、１５アミノ酸長のタンパク質領域は、配列番号１の領域に５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％配列相同性を有することが可能である。同時に、該１５アミノ酸長のタンパク質領域は、保存的置換で置換した０．５％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６５％、７５％までのまたはより多くのアミノ酸を有することも可能である。好ましくは、該領域は、３０％、２０％、１０％より少ないまたはさらにより少ない保存的置換を有する。そのような場合での「％アミノ酸配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」の見積もりは、保存的アミノ酸置換がおこなわれた場合の実際の％配列同一性より高い。
【００４０】
本明細書で同定されるファージ関連溶菌酵素配列に関する「％核酸配列同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列のアラインメントをおこない、必要に応じて配列同一性の割合が最大となるようにギャップを導入した後に、ファージ関連溶菌酵素配列内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチドの割合（パーセント値）として定義される。％核酸配列同一性を決定することを目的としたアライメントは、当業者の範囲内である種々の方法で達成することができ、該方法として、限定されるものではないが、公的に入手可能なコンピュータ・ソフトウェアの利用が挙げられる。当業者は、比較される配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定用の適当なパラメータを決定することができる。
【００４１】
「ポリペプチド」とは、自然界で生ずるポリヌクレオチド配列にコードされるものに対応するアミノ酸から構成される分子を指す。ポリペプチドは、保存的置換を含むものであってもよく、自然界で生ずるアミノ酸を同様の特性を有するものと置換させることで、このような保存的置換によるポリペプチド機能の変化は生じない（例えばＬｅｗｉｎ“Ｇｅｎｅｓ  Ｖ”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｐｐ．９−１３  １９９４を参照せよ）。
【００４２】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに作用自在に結合する本開示のポリペプチドの全てまたは（好ましくは生物学的に活性な）部分を含む。例えば、２つ以上の活性部位を有する２種類以上のタンパク質を組み合わせることによって、キメラタンパク質またはペプチドを生産する。キメラタンパク質およびペプチドは同じまたは異なる分子に独立して作用することができるため、２種類以上の異なる細菌感染を同時に処置する潜在能力を有する。また、キメラタンパク質およびペプチドを用いて、細胞壁を一カ所以上切断することによって、細菌感染の処置がおこなわれる。
【００４３】
用語「作用自在に結合する（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、本開示のポリペプチドと異種ポリペプチドとをフレーム単位（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合することを意味する。本開示のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に異種ポリペプチドを融合することができる。化学的合成または組み換えＤＮＡ技術によって、キメラタンパク質を酵素的に生産する。多数のキメラ溶菌酵素を生産および研究している。遺伝子Ｅ−Ｌ、すなわちバクテリオファージｐｈｉＸ１７４およびＭＳ２溶菌タンパク質ＥおよびＬからそれぞれ構築されるキメラ溶菌に内部欠失を施し、改変溶菌または殺滅特性を有する一連の新規Ｅ−Ｌクローンを作製した。本研究では、異なる膜貫通ドメインの構造上の相違にもとづいて、親遺伝子Ｅ、Ｌ、Ｅ−Ｌ、およびＥ−Ｌの内部トランケーション形態の溶菌活性について調べ、異なる溶菌メカニズムの特徴付けをおこなった。細胞質および周辺質空間に対するマーカー酵素の放出と電子顕微鏡検査とによって、Ｅ．ｃｏｌｉの内膜または内膜および外膜のタンパク質の貫通に応じて、２つの異なる溶菌メカニズムが識別可能であることが明らかになった。ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９８  Ｊｕ１  １，１６４（１）；１５９−６７（本明細書中に参考として援用）。
【００４４】
別の実験では、ラクトコッカス・ファージＴｕｃ２００９溶解素のＮ末端半分をコードする領域と、主要なニューモコッカス自己溶解素のＣ末端ドメインをコードする領域とを融合することによって、活性キメラ細胞壁溶解酵素（ＴＳＬ）を構築した。このキメラ酵素は、コリン含有ニューモコッカス細胞壁を加水分解することができるグリコシダーゼ活性を示した。有用な融合タンパク質の一例には、ＧＳＴ融合タンパク質があり、その中で本開示のポリペプチドがＧＳＴ配列のＣ末端に融合される。そのようなキメラタンパク質によって、本開示の組み換え型ポリペプチドの精製が容易になり得る。
【００４５】
別の実施形態では、キメラタンパク質またはペプチドは、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有する。例えば、本開示のポリペプチドのネイティブなシグナル配列を除去し、別のタンパク質由来のシグナル配列と置換することができる。例えば、バキュロウイルス・エンベロープ・タンパク質のｇｐ６７分泌配列を異種シグナル配列として用いることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２、本明細書中に参考として援用）。真核生物の異種シグナル配列の他の例として、メリチンおよびヒト胎盤アルカリ・ホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の分泌配列が挙げられる。さらに別の例では、有用な原核生物の異種シグナル配列として、ｐｈｏＡ分泌シグナル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出）およびタンパク質Ａ分泌シグナル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。
【００４６】
別の実施形態では、免疫グロブリン融合タンパク質が開示されており、本開示のポリペプチドの全てまたは一部が、免疫グロブリン・タンパク質群の一タンパク質に由来した配列に融合される。免疫グロブリン融合タンパク質を医薬組成物中に組み込み、被験体に投与して、リガンド（可溶性または膜結合）および細胞表面上のタンパク質（受容体）間の相互作用を阻害して、それによって、インビボでのシグナル変換を抑制することができる。免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの同種リガンドのバイオアベイラビリティーを変化させることができる。リガンド／受容体相互作用の阻害は、細菌関連疾患および障害の処置ならびに細胞生存率の調節（すなわち、促進および阻害）の両方にとって治療上有用であり得る。さらに、本開示の免疫グロブリン融合タンパク質を免疫原として用い、被験体内の本開示のポリペプチドに対する抗体の生産、リガンドの精製ならびに、スクリーニング・アッセイでリガンドと受容体の相互作用を阻害する分子の同定をおこなうことができる。標準的組み換えＤＮＡ技術によって、本開示のキメラタンパク質ならびに融合タンパク質およびペプチドを生産することができる。
【００４７】
別の実施形態では、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって融合遺伝子を合成することができる。または、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハングを生じさせるアンカー・プライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実行することができ、その後で、該相補的オーバーハングをアニーリングおよび再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる（すなわち、Ａｕｓｕｂｅｌら（前出）を参照せよ）。さらに、融合部（すなわち、ＧＳＴポリペプチド）が既にコードされた多くの発現ベクターが市販されている。融合部が本開示のポリペプチドにフレーム単位で結合するように、本開示のポリペプチドをコードする核酸をそのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【００４８】
本明細書で使用するように、改造・タンパク質またはペプチド、遺伝子産物、あるいは２種類以上の関連ファージ・タンパク質に対するペプチドまたはタンパク質ペプチドフラグメントを無作為に切断して、より活性なタンパク質または特異的なタンパク質に再構築した。改造・オリゴヌクレオチド、ぺプチド、またはペプチドフラグメント分子を選択またはスクリーニングして、所望の機能特性を有する分子を同定する。この方法は、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、米国特許第６，１３２，９７０号（ポリヌクレオチドを改造する方法）；Ｋａｕｆｆｍａｎ、米国特許第５，９７６，８６２号（コドンに基づく合成を介した進化）、およびＨｕｓｅ、米国特許第５，８０８．０２２号（直接的コドン合成）に記載されている。これらの特許の内容を、参考として本明細書中に参考として援用する。改造を用いて、鋳型タンパク質より１０〜１００倍活性なタンパク質を構築する。多種多様な溶解素またはホリンタンパク質間で鋳型タンパク質を選択する。改造・タンパク質またはペプチドは、例えば、１つ以上の結合ドメインおよび１つ以上の触媒ドメインを構成する。各結合または触媒ドメインは、同じまたは異なるファージまたはファージ・タンパク質に由来する。改造・ドメインは、単独でまたは他の遺伝子もしくは遺伝子産物と組み合わせてペプチドフラグメント中に翻訳可能な遺伝子または遺伝子産物としてのオリゴヌクレオチド・ベースの分子であるか、あるいはペプチド・ベースの分子である。遺伝子フラグメントとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＥＳＴ、ＳＮＩＰ、および他のオリゴヌクレオチド・ベースの分子の任意のものが含まれ、それらは単独で、または他の分子と組み合わせて、ペプチド中に翻訳可能または不可能なオリゴヌクレオチド分子を産生する。
【００４９】
上に示したように、本開示は、ホリンタンパク質の使用を論じている。ホリンタンパク質は、細胞膜中に穴を生じさせる。より具体的には、ホリンは、致命的な膜損傷を形成する。溶菌タンパク質と同様に、ホリンタンパク質は、ファージにコードされ、保有される。実際、ホリンタンパク質の遺伝コードは、ファージ溶菌酵素に対するコードに隣接またはコード内にさえ存在するのが極めて一般的である。大部分のホリンタンパク質配列は短く、全体的に自然界では疎水性であるとともに、高度に親水性のカルボキシ末端ドメインを有する。多くの場合、推定ホリンタンパク質は、ファージの酵素活性ドメイン内の異なるリーディングフレーム上でコードされる。他の場合では、ホリンタンパク質は、細胞壁溶菌タンパク質をコードするＤＮＡに隣接または近接したＤＮＡ上にコードされる。ホリンタンパク質は、しばしば、ファージ感染の後期段階中で合成され、該ホリンタンパク質が膜損傷を引き起こす細胞膜内で見出される。
【００５０】
ホリンは、１次構造分析にもとづいて２つの一般的なクラスに分類できる。クラスＩホリンは、通常、９５残基長以上であり、３つの潜在的膜貫通ドメインを有することが可能である。クラスＩＩホリンは、通常、約６５〜９５残基とより短く、荷電または疎水性残基の分布が２つのＴＭドメインを示す（Ｙｏｕｎｇら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖ．８，ＮＯ．４，Ｍａｒｃｈ  ２０００）。しかし、少なくともグラム陽性宿主のファージに対しては、ニ成分溶菌系は、普遍的でなくてもよい。ホリンの存在が複数のファージで判明または示唆されている。しかし、全てのファージについて、推定ホリンをコードする遺伝子は未だ発見されていない。ホリンは複数の細菌に存在することが判明しており、該細菌としては、例えば、ラクトコッカス・バクテリオファージＴｕｃ２００９、ラクトコッカスＮＬＣ３、ニューモコッカス・バクテリオファージＥＪ−１、ラクトＢａｃｉｌｌｕｓ・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）バクテリオファージＮａｄｈ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）バクテリオファージＴｗｏｒｔ、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）バクテリオファージ、ニューモコッカス・ファージＣｐ−１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）ファージＭ２９、ラクトＢａｃｉｌｌｕｓ・デルブルエッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｋｉ）バクテリオファージＬＬ−Ｈ溶解素、および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）バクテリオファージＮ１１が挙げられる（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｇ．１９９９，ｐ，４４５２−４４６０）。
【００５１】
該タンパク質またはペプチドおよびペプチドフラグメントの改変または修飾形態としては、本明細書に開示するように、化学的に合成されるか、または組み換えＤＮＡ技術により調製されるか、あるいは両方によるタンパク質またはペプチドおよびペプチドフラグメントが挙げられる。これらの技術としては、例えば、キメラ化および改造が挙げられる。タンパク質またはペプチドを化学合成によって生産する際、化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましい。すなわち、該タンパク質またはペプチドは、タンパク質の合成に関連する化学的前駆物質または他の化学物質から分離される。したがって、そのようなタンパク質調製は、化学的前駆物質または目的のポリペプチド以外の化合物を約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満で有する。
【００５２】
本発明の一実施形態では、ポリペプチドのシグナル配列は、本発明のタンパク質およびペプチドおよびペプチドフラグメントの粘膜からおよび粘膜への膜貫通移動を促進することに加えて、分泌タンパク質または他の目的のタンパク質の分泌および単離を促進することができる。シグナル配列は、通常、１回以上の切断現象で分泌中に成熟タンパク質から概して切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴づけられる。そのようなシグナル・ペプチドは、このシグナル・ペプチドが分泌経路を通過するとき成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセッシング部位を含む。したがって、本発明は、シグナル配列を有する記載したポリペプチドと、シグナル配列自体およびシグナル配列が存在しないポリペプチド（すなわち、切断産物）とに属する。一実施形態では、本発明のシグナル配列をコードする核酸配列を発現ベクター中で目的のタンパク質に作用自在に結合することができ、目的のタンパク質としては、例えば、通常は分泌されないか、または単離することが困難なタンパク質がある。シグナル配列は、発現ベクターを形質転換させる真核生物宿主等からのタンパク質の分泌を導き、その後または同時に、このシグナル配列を切断する。その後、当該技術分野で認められる方法によって、細胞外媒体からタンパク質を容易に精製することができる。または、精製を容易にする配列（例えばＧＳＴドメインを有する）を用いてシグナル配列を目的のタンパク質に結合することができる。
【００５３】
別の実施形態では、シグナル配列を用いて、調節配列、すなわちプロモーター、エンハンサー、リプレッサーを同定することができる。シグナル配列はペプチドの大部分を占めるアミノ末端配列であるので、そのアミノ末端側にあるシグナル配列に隣接する核酸が転写に影響する調節配列であると考えられる。したがって、シグナル配列の全てまたは一部分をコードするヌクレオチド配列をプローブとして用いて、シグナル配列およびそのフランキング領域を同定および単離することができ、このフランキング領域を研究して、その中の調節エレメントを同定することができる。本発明は、本発明のポリペプチドの他の変異体にも関する。そのような変異体は、アゴニスト（模倣体）またはアンタゴニストとして機能することができる改変アミノ酸配列を有する。突然変異生成、すなわち別個の点突然変異またはトランケーションによって、変異体を生成することができる。アゴニストは、タンパク質の自然発生的形態の生物学的活性の実質的に同様のものまたはサブセットを保有することができる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む細胞内シグナル伝達カスケードの下流または上流側の一部分に競合的に結合することによって、タンパク質の自然発生的形態の１つ以上の活性を阻害することができる。したがって、限定的な機能の変異体を用いた処置によって、特異的な生物学的効果を誘出することができる。タンパク質の自然発生的形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体での被験体の処置は、タンパク質の自然発生的形態での処置と比べて、被験体内での副作用をより少なくすることができる。アゴニスト（模倣体）またはアンタゴニストとして機能する本発明のタンパク質の変異体を、突然変異体、すなわち本発明のタンパク質のトランケーション突然変異体の組み合わせライブラリをアゴニストまたはアンタゴニスト活性に対してスクリーニングすることによって同定することができる。一実施形態では、変異体の異型ライブラリ（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）は、核酸レベルでの組み合わせ突然変異生成によって生成され、遺伝子の異型ライブラリにコードされる。例えば、潜在的タンパク質配列の縮重セットが個々のポリペプチドとしてまたは代わりにより大きな融合タンパク質のセット（すなわち、ファージ・ディスプレイに対して）として発現可能であるように遺伝子配列中に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的にライゲートすることによって、変異体の異型ライブラリを生産することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的変異体のライブラリを生産するために用いることができる様々な方法がある。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該技術分野で公知である（すなわち、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅら、（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照せよ。全てが本明細書中に参考として援用される）。
【００５４】
さらに、本発明のポリペプチドのコーディング配列のフラグメントのライブラリを用いて、変異体のスクリーニングおよびその後の選択のために、ポリペプチドの異型集団（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を生成することができる。例えば、分子ごとに約１個のみニッキングが生じて、二本鎖ＤＮＡを変性し、このＤＮＡを復元して異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼでの処置によって再編成二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られたフラグメント・ライブラリを発現ベクターにライゲートする条件下で、目的のコーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処置することによって、コーディング配列フラグメントのライブラリを生成することができる。この方法によって、様々な大きさの目的のタンパク質のＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリを派生させることができる。点突然変異またはトランケーションによって作製される組み合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択した特性を有する遺伝子産物に対するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための複数の技術が当該技術分野で公知である。大きな遺伝子ライブラリをスクリーニングするための最も広く用いられている技術としては、ハイ・スループット分析に適用可能であり、通常、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られたベクターのライブラリで適当な細胞を形質転換すること、さらに、所望の活性の検出によって、遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子を発現させることが含まれる。ライブラリ中の機能的突然変異体の出現率を高める技術である再帰的アンサンブル突然変異生成（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＲＥＭ））をスクリーニング・アッセイと組み合わせて用いて、本発明のタンパク質の変異体を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【００５５】
タンパク質またはペプチドフラグメントの免疫学的活性部分には、ファージ酵素を認識する抗体に結合する領域が含まれる。この状況では、実施形態に係るタンパク質（またはこのタンパク質をコードする核酸）の最小部分は、溶解素タンパク質を生成するファージに特異的であるとして認識可能なエピトープである。したがって、抗体に結合すると予期でき、かつ複数の実施形態で有用な最小ポリペプチド（およびこのポリペプチドをコードする関連核酸）は、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５、または１００アミノ酸長であってもよい。８、９、１０、１１、１２、または１５アミノ酸長ほどの短さの小配列は、エピトープとして作用するのに十分な構造を確実に含むが、５、６、または７アミノ酸長のより短い配列は、いくつかの条件でエピトープ構造を示すことができ、一実施形態で有益である。したがって、タンパク質または配列番号１に記載される核酸配列の最小部分には、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長ほどの小ささのポリペプチドが含まれる。
【００５６】
そのような小タンパク質および／または核酸（あるいはタンパク質および／またはより大きな分子の核酸領域）と機能を共有する相同タンパク質および核酸を、当業者により認識されるように調製することができる。特異的に相同であり得るそのような小分子およびより大きな分子の短い領域が実施形態として意図される。好ましくは、そのような有益な領域の相同性は、配列番号１に対して、少なくとも５０％、６５％、７５％、８５％であり、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、または少なくとも９９％である。これらの％相同性値は、保存的アミノ酸置換が原因の改変は含まない。
【００５７】
当然、本明細書に記載されるエピトープを用いて、抗体を生成することが可能であり、かつこのエピトープを用いて、溶解素タンパク質を認識する分子への結合を検出することもできる。別の実施形態では、抗体または他の特異的な結合因子等の分子であり、この分子を、通常の免疫化またはファージ・ディスプレイ手法等によるエピトープの使用を介して生成することが可能であり、この際エピトープを用いて潜在的結合因子があるかについてライブラリをスクリーングすることができる。そのような分子は、溶解素タンパク質の１つ以上のエピトープまたは溶解素タンパク質をコードする核酸を認識する。エピトープを認識する抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、または抗体タンパク質の一部分であってもよい。望ましくは、エピトープを認識する分子は、この分子が血清アルブミンに対して持つ特異的結合の少なくとも１０倍強い特異的な結合をそのエピトープに対して有する。特異的結合を親和性（Ｋｍ）として測定することができる。より望ましくは、特異的結合は、同じ条件下で、血清アルブミンに対する特異的結合よりも、少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、またはそれよりもさらに高い。
【００５８】
望ましい実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、溶解素タンパク質の存在を検出するために有用な形態で存在する。種々の形態およびそれらの合成方法が当業者に認識されるように既知である。蛍光、光学シグナルを生成する酵素、化学発光団、微粒子、または放射性原子等のレポーター分子または原子と抗体を結合（共有結合的に複合体化）することが可能である。動物の免疫化後に、抗体または抗体フラグメントをインビボで合成することが可能である。例えば、遺伝学的組み換え後に細胞培養を介して、抗体または抗体フラグメントを合成することが可能である。細胞合成と化学的修飾との組み合わせによって、抗体または抗体フラグメントを調製することが可能である。
【００５９】
この実施形態のタンパク質またはペプチドフラグメントの生物学的活性部分には、本明細書に記載されるように、本発明のファージ・タンパク質のアミノ酸配列に十分に同一なまたは由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、このポリペプチドは、ファージ・タンパク質の完全長タンパク質より少ないアミノ酸を含み、対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。通常、生物学的活性部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本発明のタンパク質またはタンパク質フラグメントの生物学的活性部分を、例えば１０、２５、５０、１００以下のアミノ酸長であるポリペプチドとすることができる。さらに、タンパク質の他の領域が欠失または付加されている他の生物学的活性部分を、組み換え技術によって調製することができ、この実施形態のポリペプチドのネイティブ形態の１つ以上の機能的活性について評価することができる。
【００６０】
ファージ関連溶菌酵素をコードする多様な単離ｃＤＮＡ配列およびそのような遺伝子配列にハイブリダイズする部分的配列は、この溶菌酵素の組み換え的生産に有用である。この状況での代表的な核酸配列は、図１に示す配列番号１の配列と、ストリンジェントな条件下で図１の配列のＤＮＡの相補的配列にハイブリダイズする配列とである。入手可能な天然変異体を含むこれらの配列および図に示す配列にハイブリダイズする核酸配列のさらに別の変異体も、本発明に係る溶菌酵素の生産の際使用するために考察される。
【００６１】
多くの考えられる変異体ＤＮＡ分子としては、Ｍ１３プライマー突然変異生成等の標準的ＤＮＡ突然変異生成技術によって作製されるものが挙げられる。これらの技術の詳細については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中に参考として援用）に提供される。そのような技術を用いることによって、開示されているものとは細かい点で異なる変異体を作製することが可能である。本明細書で具体的に開示されているものの誘導体であり、かつＢＳＭＲタンパク質の機能特性を保持するタンパク質のコーディングを保ちながらヌクレオチドの欠失、付加、または置換をおこなうことによって開示されているものとは異なるＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列が、本開示によって検討される。開示するＤＮＡ分子に由来するある種の小ＤＮＡ分子も包含される。そのような小ＤＮＡ分子としては、ハイブリダイゼーションプローブとして、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用するのに適したオリゴヌクレオチドが挙げられる。このように、これらの小ＤＮＡ分子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージに遺伝学的にコードされる溶菌酵素の少なくともセグメントを含み、ＰＣＲ目的としては、遺伝子の少なくとも１０〜１５ヌクレオチド配列、より好ましくは１５〜３０ヌクレオチド配列を含む。上記のような開示されるＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列を、ストリンジェントな条件下で、開示されるＤＮＡ配列またはそのフラグメントにハイブリダイズするＤＮＡ配列として定義することも可能である。
【００６２】
ストリンジェンシーの特定の程度に対応するハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質と、用いられるハイブリダイズするＤＮＡの組成と長さとによって変わる。一般に、ハイブリダイゼーション温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にナトリウムイオン濃度）によって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決まる。特定の度合いのストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１（本明細書中に参考として援用）によって論じられている。
【００６３】
そのような計算の例は以下の通りである。すなわち、標的ＤＮＡ分子へのＤＮＡ分子（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージに遺伝学的にコードされる天然変異の溶菌酵素）のハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイゼーション実験を実行することが可能である。標的ＤＮＡ分子は、例えば、対応するｃＤＮＡでよく、このｃＤＮＡを、当該分野で周知かつＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中に参考として援用）に記載されている技術であるサザンブロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）．Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３）によって、アガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写する。６×ＳＳＣ等の高イオン強度溶液中で、融解温度のＴｍ（下記に記載）を２０〜２５℃下回る温度で、同位体Ｐ（３２）標識ｄＣＴＰで標識した標的プローブへのハイブリダイゼーションを実行する。サザンブロット法での標的ＤＮＡ分子がＤＮＡ１０ｎｇ以上を含有するそのようなサザンハイブリダイゼーション実験のために、放射標識プローブ１〜２ｎｇ／ｍｌ（比活性が１０９ＣＰＭ／ｍｕｇ以上のもの）を用いて、ハイブリダイゼーションを６〜８時間実行する。ハイブリダイゼーション後に、ニトロセルロースフィルターを洗浄して、バックグラウンドハイブリダイゼーションを除去する。洗浄条件は、特異的なハイブリダイゼーションシグナルを保有すると同時にバックグラウンドハイブリダイゼーションを除去するために可能な限りストリンジェントである。用語「Ｔｍ」とは、その温度を超えると、一般的なイオン条件下で放射標識プローブ分子がその標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズしない温度を表す。
【００６４】
そのようなハイブリッド分子のＴｍを以下の方程式によって概算することが可能である。すなわち、Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ナトリウムイオン濃度の常用対数）＋０．４１（％Ｇ十Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／ｌ）であり、式中ｌ＝塩基対中のハイブリッドの長さである。この方程式は、０．０１Ｍから４Ｍ範囲のナトリウムイオン濃度に対して有効であり、より高いナトリウムイオン濃度の溶液でのＴｍの計算に関しては精度が落ちる（ＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１３９０）（本明細書中に参考として援用）。上記方程式は、３０％から７５％内のＧ＋Ｃ含有量を有するＤＮＡに対しても有効であり、１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドにも適用する。オリゴヌクレオチドプローブの挙動については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中に参考として援用）の１１章に詳細に記載されている。本明細書に記載する好例の条件は、溶菌遺伝子の変異を選択する際使用するために特に考慮されている。
【００６５】
したがって、％ＧＣ＝４５％を有するｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの初めの１５０塩基対に由来する１５０塩基対ＤＮＡプローブの例として、特定のストリンジェンシーを得るために必要なハイブリダイゼーション条件の計算を、以下のようにおこなうことができる。
【００６６】
すなわち、ハイブリダイゼーション後に０．３×ＳＳＣ溶液でフィルターを洗浄したと仮定して、ナトリウムイオン＝０．０４５Ｍ、ＧＣ％＝４５％、ホルムアミド濃度＝０、ｌ＝１５０塩基対（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、の方程式参照）なので、Ｔｍ＝７４．４℃である。二本鎖ＤＮＡのＴｍは、相同性が１％減少するごとに１〜１．５℃減少する（Ｂｏｎｎｅｒら（１９７３）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８１：１２３）。したがって、この与えられた例では、０．３×ＳＳＣで、５９．４〜６４．４℃でフィルターを洗浄することによって、９０％（標的ＢＳＭＲｃＤＮＡに対して１０％を超える配列変異を有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない）に等価なハイブリダイゼーションストリンジェンシーが生じる。または、０．３×ＳＳＣで、６５．４〜６８．４℃の温度でハイブリダイズしたフィルターを洗浄することによって、９４％（標的ＢＳＭＲｃＤＮＡ分子に対して６％を超える配列変異を有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない）のハイブリダイゼーションストリンジェンシーが生じる。理論的説明によって、上記の例が完全に与えられる。当業者は、他のハイブリダイゼーション技術を利用することが可能であることと、実験条件を変更するにはストリンジェンシーを得るために別の計算方法が必要であることを十分理解するだろう。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態では、２５％を超える配列変異（「ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）とも称する」を有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件としてストリンジェントな条件を定義することが可能である。より好ましい実施形態では、ストリンジェントな条件は、１５％を超えるミスマッチを有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件であり、さらにより好ましくは、ストリンジェントな条件は、１０％を超えるミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。好ましくは、ストリンジェントな条件は、６％を超えるミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。
【００６８】
遺伝コードの縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を維持する一方でＤＮＡ分子のヌクレオチド配列での主要な変異を可能にするので、該実施形態の範囲をさらに広げる。例えば、代表的なアミノ酸残基はアラニンである。これは、ｃＤＮＡ内で、ヌクレオチドコドントリプレットＧＣＴにコードされる。遺伝コードの縮重のために、３種類の他のヌクレオチドコドントリプレット、すなわちＧＣＴ、ＧＣＣ、およびＧＣＡもアラニンをコードする。したがって、コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはタンパク質の特質に影響を及ぼすことなしに、この位置でこれらの３種類のコドンの任意のものに遺伝子のヌクレオチド配列を変化させることができる。特定のアミノ酸に対する遺伝コードおよびヌクレオチドコドンでの変異は、当業者に周知である。遺伝コードの縮合にもとづいて、上述の標準的ＤＮＡ突然変異生成技術を用いて、またはＤＮＡ配列の合成によって、変異ＤＮＡ分子は、本明細書に開示されるｃＤＮＡ分子から派生することが可能である。遺伝コードの縮重にもとづいた配列変異のために、ストリンジェントな条件下で、開示されるｃＤＮＡ配列にハイブリダイズしないＤＮＡ配列は、本開示により本明細書に包含される。
【００６９】
当業者は、本明細書に記載されるＤＮＡ突然変異生成技術が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージ溶解素をコードする多様なＤＮＡ分子を生産することができ、該ＤＮＡ分子は溶菌タンパク質の本質的な特質を維持していることを認識している。下記により詳細に記載されるように、溶菌酵素の特質に関する変異を得るために、新規に誘導されたタンパク質も選択することが可能である。そのような誘導体としては、少量の欠失、付加、および置換を含むアミノ酸配列での変異を有するものが挙げられる。
【００７０】
アミノ酸配列変異を導入するための部位を予め定める一方で、突然変異自体を予め定めておく必要はない。例えば、所定の位置での突然変異の実行を最適化するために、標的コドンまたは領域で無作為な当然変異生成を実行することが可能であり、所望の活性の最適組み合わせについて、発現したタンパク質変異体をスクリーニングすることが可能である。上述のような既知配列を有するＤＮＡ内の所定の部位で置換突然変異を構築するための技術は周知である。
【００７１】
アミノ酸置換は、通常、単一残基のアミノ酸置換である。挿入は、通常、約１〜１０程度のアミノ酸残基である。欠失は、約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、単一の形態であるが、好ましくは、隣接する対で、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入でおこなわれる。置換、欠失、挿入、またはその任意の組み合わせを組み合わせて、最終コンストラクトに到達することが可能である。明白なように、タンパク質をコードするＤＮＡ内で構築される突然変異は、リーディングフレーム外に配列を配置させてはならず、好ましくは、二次的なｍＲＮＡ構造を産生することが可能な相補的領域を生成しない（ＥＰ  ７５，４４４Ａ）。
【００７２】
置換変異体は、アミノ酸配列内の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されているものである。タンパク質の特質を精巧に調節することを所望する際、そのような置換を下記の表１にしたがっておこなうことが可能である。表１は、タンパク質内の元のアミノ酸に対して置換され得、かつ保存的置換としてみなされるアミノ酸を示す。
【００７３】
【表１】
2006513149.tif 000002
【００７４】
2006513149.tif 000003
【００７５】
表１内のものよりもあまり保存的でない置換を選択すること、すなわち、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンフォメーションとしての置換エリア内のポリペプチド骨格構造、（ｂ）標的部位にある分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のバルクを維持する上でのそれらの効果でより有意に異なる残基を選択することによって、機能または免疫学的アイデンティティでの実質的な変化をおこなう。タンパク質の特性で最大の変化を生じると一般的に考えられる置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルに対して（によって）置換されている、（ｂ）システインまたはプロリンが任意の他の残基に対して（によって）置換されている、（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルが電気陰性残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルに対して（によって）置換されている、あるいは（ｄ）バルキーな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが側鎖を持たないもの、例えばグリシンに対して（によって）置換されている置換である。
【００７６】
感染細菌宿主中のファージによって示されるＤＮＡ架橋剤への感度を補完する誘導体タンパク質の能力を分析することによって、これらのアミノ酸置換または欠失または付加の効果を溶菌タンパク質の誘導体に対して評価することが可能である。上述のように、細菌中に誘導体タンパク質をコードするＤＮＡ分子をトランスフェクションすることによって、これらのアッセイを実行することが可能である。
【００７７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージに遺伝学的にコードされる溶菌酵素およびその酵素のフラグメントをコードするヌクレオチド配列を本明細書で提供しており、それに対応して、ｃＤＮＡ分子の相補ＤＮＡ鎖およびストリンジェントな条件下で溶菌酵素ｃＤＮＡ分子にハイブリダイズするＤＮＡ分子またはその相補鎖を提供する。そのようなハイブリダイズする分子としては、ヌクレオチド置換、欠失、および付加を含む少量の配列変化によってのみ異なるＤＮＡ分子が挙げられる。ｃＤＮＡ分子またはその相補鎖の少なくともセグメントを含む単離オリゴヌクレオチドについてもこの開示によって企図され、該単離オリゴヌクレオチドには、例えば、効果的なＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして、またはポリメラーゼ連鎖反応で有用なプライマーとして用いることが可能なオリゴヌクレオチドがある。標準的分子生物技術によって、溶菌酵素ｃＤＮＡ上のハイブリダイズするＤＮＡ分子および変異体を容易に生成することが可能である。
【００７８】
特異的なオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌａｃｅら、（１９８６）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２５７−２６１）、直接的ＤＮＡ配列決定（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５）、制限酵素の使用（Ｆｌａｖｅｌｌら（１９７８）．Ｃｅｌｌ  １５：２５）、変性用試薬を用いたゲル内での電気泳動移動度にもとづく識別（ＭｙｅｒｓおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８６）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２７５−２８４）、ＲＮａｓｅ保護（Ｍｙｅｒｓら、（１９８５）．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）、化学的切断（Ｃｏｔｔｏｎら（１９８５）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７−４４０１）（本明細書で参考として援用）、およびリガーゼ媒介検出手順（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，１９８８）等の方法によって、特異的ＤＮＡ突然変異の検出を実行することが可能である。
【００７９】
市販の機械を用いて正常または突然変異配列に特異的なオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、同位体（３２Ｐ等）で放射的にまたはビオチン等のタグ（ＷａｒｄおよびＬａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３−６６５７  １９８１）（本明細書で参考として援用）で非放射的に標識し、ドットブロット法によってまたは電気泳動後のゲルからの転写によって膜または他の固体支持体に固定化した個々のＤＮＡ試料にハイブリダイズする。オートラジオグラフィーあるいは蛍光または比色反応等の方法によって、これらの特異的配列の有無を可視化する（Ｇｅｂｅｙｅｈｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：４５１３−４５３４  １９８７）（本明細書で参考として援用）。
【００８０】
ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８８）（本明細書で参考として援用）の直接的ＤＮＡ配列決定法によって、遺伝子の正常形態と突然変異形態との配列の相違も明らかにすることが可能である。クローニングしたＤＮＡセグメントをプローブとして用いて、特異的ＤＮＡセグメントを検出することが可能である。ＰＣＲと組み合わせると、この方法の感度が非常に高まる（Ｓｔｏｆｌｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４９１−４９４，１９８８）（本明細書で参考として援用）。この手法では、改変型ＰＣＲによって生成した二本鎖ＰＣＲ産物または一本鎖テンプレートとともに、増幅配列内にある配列決定プライマーを用いる。放射標識ヌクレオチドを用いた従来の手順によって、または蛍光タグを用いた自動化された配列決定法によって配列決定を実行する。そのような配列は、本発明の実施形態に係る溶菌酵素の生産に有用である。
【００８１】
本開示で見出される実施形態の付加的な目的および利点は、この後の説明で記載され、部分的には説明から自明であり、または実施形態の実施によって教示され得る。本発明の目的および利点は、添付の請求項の記載で具体的に指摘する手段および組み合わせによって理解および達成され得る。
【００８２】
本明細書に組み込まれ、かつ明細書の部分を構成する添付図面は、本開示の現在好ましい実施形態を説明し、上記に提供した一般的説明および下記に提供する好ましい実施形態の詳細な説明とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。
【００８３】
（詳細な説明）
（Ｇ溶解素の同定）
図１〜１７を参照すると、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｄｓＤＮＡファージは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの遺伝学的均一性を反映すると考えられる非常に相同なファミリーを形成する。Ｒｅｄｍｏｎｄ，Ｃ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｉ．，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｐ．Ｃ．Ｂ．＆Ｂｏｗｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  Ｍｅｄ  Ｂｕ１１−Ｓｐｅｃｉａ１  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ８７，６０−３（１９９６）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのγファージは、臨床研究所で標準的診断用ツールであるので、該γファージを溶解素ソースとして選択した。Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｒ．＆Ｃｈｅｒｒｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ９６，３４−９（１９５５）。  は、ビルレンスプラスミド治癒炭疽または潜在的な炭疽前駆体の環境的保有体を代表することが可能である密接に関連するが希少なＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）菌株を含む全てのＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ単離物の＞８５％に感染する。Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｐ．Ｃ．Ｂ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８７，２３７−４０（１９９９）。
【００８４】
γファージをＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓから単離し、Ｈａｎｓ  Ｗ．Ａｃｋｅｒｍａｎｎ（Ｌａｖａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。表１に示す菌株の新たな菌叢に高力価ｇアリコート１０ｍｌを添加することによって、ファージ感受性を始めに試験した。１６時間の増殖後のクリアランスが感受性を示した。ＲＳＶＦ１を用いて、２．２×１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）ｍｌ−１を含有する高力価ファージストックを従来記載の方法によって調製した（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．＆Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．Ｒａｐｉｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，２１７０−２（２００１））。ｐｆｕは、感染可能な細菌の菌叢上での感染、増殖、および放出の連続ラウンド後に小さい透明地帯またはプラークを形成する単一のファージである。ＲＳＶＦ−１由来ファージストックを図２に示す力価決定で用いた。
【００８５】
Ｈｅｌｇａｓｏｎらは、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）ＲＳＶＦ１およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ菌株が複数のアロザイム遺伝子座で単形態性であり、そのためＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）系統の同じクラスタの部分であることを示すそのような作用している菌株を示唆した。
【００８６】
γファージおよび得られた溶菌酵素の特異性および強度を研究するために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の異なる菌株を調製した。ルリアブロス（ＬＢ）またはブレイン−ハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ）（必要な際は、１．５％寒天を添加）中で、大部分の菌株を３０℃で増殖させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む分析を３７℃で実行した一方で、Ｂ．ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）を５５℃で処理した。菌株ＲＳＶＦ１は、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）参照菌株ＡＴＣＣ４３４２のストレプトマイシン耐性誘導体である。ＲＳＶＦ１およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ間の類似性にもかかわらず、重要な遺伝子型相違が存在し、ＲＳＦＶ１は、誤認されるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ菌株ではない（Ｐａｎｎｕｃｃｉ，Ｊ．，Ｏｋｉｎａｋａ，Ｒ．Ｔ．，Ｓａｂｉｎ，Ｒ．＆Ｋｕｓｋｅ，Ｃ．Ｒ．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｐＸＯｌ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４，１３４−４１（２００２）；Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｅ．，Ｃａｕｇａｎｔ，Ｄ．Ａ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｉ．＆Ｋｏｌｓｔｏ，Ａ．Ｂ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ａｎｄ  Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３８，１６１５−２２（２０００）；Ｔｉｃｋｎｏｒ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｓｏｉｌ  Ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７，４８６３−７３（２００１））。ＲＳＶＦ１のｖｒｒＡ遺伝子座の分析を記載されるように実行した（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｉｎ  ｖｒｒＡ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６３，１４００−５（１９９７））。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ操作は、Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｗ．Ｍａｙｅｒ（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）およびＡｂｒａｈａｍ  Ｌ．Ｔｕｒｅｔｓｋｙ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｐｒｏｖｉｎｇ  Ｇｒｏｕｎｄｓ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって提供された。その後、これらの細菌菌株をγファージに暴露した。
【００８７】
ＲＳＶＦ１は、ｇによる感染に感受性があり、図５に示すように、無光沢のコロニー形態、糸状構造、および超可変ｖｒｒＡ遺伝子座内で反復配列を示し、これら全てはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの特性であることが判明した。図５の誤差バーは、実験を３ないし５回、それぞれ独立して行った場合の標準偏差を示す。指定の液体細菌培養物のパネルをＰｌｙＧ（２０単位）またはリン酸緩衝液に暴露することによって、ＰｌｙＧの溶菌活性（γファージに産生されるγ溶解素）を調べた。殺傷倍数（ｆｏｌｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）は、緩衝液処置と比べて、溶菌後１５分で測定された細菌生存率の減少を表す。「Ｂｃ」および「Ｂｔ」接頭語はそれぞれ、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）またはＢ．チューリンジエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を示す。ＲＳＶＦ１は、ビルレンスプラスミドを持たないが、それにもかかわらず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよび適当なγファージ宿主に非常に関連する。
【００８８】
表現型スクリーニングを用いて、ＲＳＶＦ１を「外側から（ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ）」溶解するγファージ・タンパク質を同定した。Ｅ．ｃｏｌｉバックグラウンドでの誘導γファージ発現ライブラリを透過化処理して、ＲＳＶＦ１菌叢で覆った。キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）の１マキシ・キット（１  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ）を用いて、ＧゲノムＤＮＡを単離した。Ｔｓｐ５０９Ｉと、アラビノース誘導性発現ベクターｐＢＡＤ２４のＥｃｏＲＩ部位に０．５〜３．０ｋｂ範囲でクローニングしたフラグメントとで、ｇＤＮＡの５ｍｇアリコートを部分的に消化した。その後、得られた発現ライブラリをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅに形質転換し、１００ｍｇ  ｍｌ−１のアンピシリンおよび０．２５％アラビノースを含有するガラス製ＬＢプレート上で、溶解素活性についてスクリーニングした。誘導ライブラリをクロロホルム蒸気で透過化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）処理して、０．７５％ＬＢ寒天中で対数期のＲＳＶＦ１で覆った。２４時間のインキュベーション後に、ライブラリを構成するもの全体にわたって、はっきりとした透明帯、すなわち溶解帯を識別した。対応するプラスミドＤＮＡを調製および配列決定した。ＤＮＡ配列分析および操作には、ＢＲＡＳＴＰ（ＮＣＢＩ）、ＯＲＦファインダ（ＮＣＢＩ）、およびＳｅｑＭａｎ５．０（Ｄｎａｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）プログラムを必要とした。
【００８９】
ライブラリ・サーチで回収され、かつｐｌｙＧＯＲＦのみをコードするｐＢＡＤ２４：：ｐｌｙＧコンストラクトの１つを組換えＰｌｙＧのソースとして用いた。アンピシリン１００ｍｇ  ｍｌ−１を添加したＬＢ一晩培養物中で、０．２５％Ｌ−アラビノースによって発現を誘導した。細胞を洗浄して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、１６．６％濃度で添加されたクロロホルムで溶解した。細胞片およびクロロホルムを遠心により除去して、未精製ＰｌｙＧ上清を生成した。ＰｌｙＧの陽イオン性によって、ＰｌｙＧは、大分部の夾雑物に結合するＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過することができる。Ｍｏｎｏ  Ｓ  ＨＲ  ５／５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通して、１Ｍ  ＮａＣｌを含有する線形勾配中で溶出することによって、該酵素をさらに精製した。活性画分をプールして、ゲル電気泳動と、ゲル濾過スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのクロマトグラフィーとによって、純度を評価した。
【００９０】
図２に示すように、溶解地帯を生成したクローンは全て、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼと呼ばれる溶解素と相同な産物をコードする７０２ｂｐのｇＯＲＦを含有していた。ＴＰ２１およびｆ  １０５はそれぞれ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのファージ・アミダーゼを示す。ＣｗｌＡおよびＣｌｙＡはそれぞれ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのゲノム中でコードされる。濃い陰影は、配列同一性を表し、薄めの陰影は、類似性を表す。相同性は、それらの触媒ＮＨ２末端半分に限定されており、溶解素特異的ＣＯＯＨ−末端結合ドメイン中には存在しない。精製ＰｌｙＧのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたカラム・クロマトグラフィーによって、組換えｇ溶解素（名称ＰｌｙＧ、ファージ溶解素γに対するもの）を均質に精製した（図３）。カレイドスコープ（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）スタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の位置にもとづいて、分子質量を概算した（図示せず）。このバンドのＮ末端配列は、予測ＰｌｙＧ配列に一致する。ゲル濾過によって、２７ｋＤａまでの予測サイズが確認され、ＰｌｙＧが単量体として作用し、かつタンパク質分解処置されないことが示唆される。
【００９１】
（インビトロ溶解素活性）
複数の方法で活性を調べた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４分光高度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、精製ＰｌｙＧの段階希釈を用いて３７℃で１５分間インキュベートした対数期のＲＳＶＦ１のＯＤ６５０での降下を追跡した。その後、単位ｍｌ−１での酵素活性を記載されるように測定した（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｏｏｍｉｓ，Ｌ．＆Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，４１０７−１２（２００１））。酵素の１単位は、ＰｌｙＧ１ｍｇに相当すると推定された。溶解素特異性の未精製での測定を実行し、この際指定の菌株に由来する新たな菌叢に精製ＰｌｙＧ（０．５単位）の１０ｍｌを滴下した。一晩のインキュベーションの後に、透明地帯の出現を用いて、活性を評価した。液体殺滅アッセイ（ｌｉｑｕｉｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）も使用し、この際対数期の細胞１．０ｍｌ（〜１．０×１０８細胞）を、３７℃で１５分間、指定量のＰｌｙＧで処理した。指定時間点で、試料を取り出し、洗浄して、溶解素を除去し、計数用にプレートした。ＰｌｙＧ誘導溶解現象の測定として、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬およびマイクロルミノメーター（ＰＲＯＦＩＬＥ−１試薬キットおよびモデル３５５０ｉルミノメーター、Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）を含む反応で、製造元のプロトコールにしたがって、死滅しかけている細胞から放出されたＡＴＰを間接的に測定した。要約すると、指定の菌株の栄養細胞を、０．４ｍｌ反応チャンバの底部にある０．４５μＭフィルター上で固定化した。固定化した細胞を体細胞放出剤で２回洗浄して、夾雑物を除去し、リン酸緩衝液中のＰｌｙＧの０．１ｍｌを２分間添加した。キット付属のルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の０．０５ｍｌを添加して、直ちに、室温で１０秒間アッセイした。全ての試料を５回試験した。ＲＳＶＦ１に放出された相対光単位は、一貫して、その放出可能光全量の１０〜２０％であった（キット付属の強洗剤混合物を用いて測定）。
【００９２】
ＲＳＶＦ１は、アメリカ、欧州、アジア、およびアフリカから得たＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ単離物のセットと同程度にＰｌｙＧ殺滅に感受性があった（１３および表１）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに密接に関連する希少な菌株であるＢ．ｃｅｒｅｕｓ１０９８７は、ＰｌｙＧにわずかに感受性があった一方で、検査した他の菌株全ては、耐性であった。Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｅ．ら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ，ａｎｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ−ｏｎｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６，２６２７−３０（２０００）。ＰｌｙＧ媒介殺滅のより高感度な試験を、５．０×１０７までの細菌を含有する緩衝液で評価し、ＰｌｙＧの２０単位で１５分間処置した。ＲＳＶＦ１は、＞１．６×１０７倍減少した（図５）一方で、ＡＴＣＣ１０９８７は、〜１００倍減少した。検査した他の菌株、３時間のインキュベーション後でさえ耐性が大であった。ＰｌｙＧは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  クラスタへの強力かつ特異的な致死作用を明確に導くことができ、γファージ宿主範囲に密接に一致する基質特異性を示す。さらに、検査した複数のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ菌株の莢膜化状態によって、莢膜が細胞壁へのＰｌｙＧの侵入を遮断しないことが示された。
【００９３】
ＰｌｙＧは、大部分の溶解素と同様に、非常に活性な酵素であることが判明した。１．０×１０４までのＲＳＶＦ１にＰｌｙＧの２単位を添加することによって、細胞内ＡＴＰの即時放出が引き起こされ（ホタルルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光として測定）（図６）、これは、迅速な溶解効果と整合している。この効果は、ＲＳＶＦ１に特異的であり、試験した他の単離物では観測されなかったため、ＡＴＰ放出アッセイがｇ感受性Ｂａｃｉｌｌｕｓ対する強力な診断用ツールであることが示唆される。ＲＳＶＦ１死滅の異なる動力学的分析では、図７に示すように、２単位ほどの少量のＰｌｙＧで、２０秒以内に生存率が１．７×１０４倍減少し、２分目で殺菌が生ずることが判明した。ここで、培養物中のＲＳＶＦ１死滅の時間経過を緩衝液（ｒ）またはＰｌｙＧ（ＴＭ）１単位で処置した。各時間点で測定された培養物１ｍｌ当たりのコロニー形成単位として、これらの値を示す。ＰｌｙＧ処置試料（Ｉ）に対して測定された対応するＯＤ６００を示す。興味深いことに、培養物の光学密度の消失は、生存率での消失よりも遅れ、ＰｌｙＧによる殺滅が必ずしも広範な細胞壁分解を必要としないことが示唆される。
【００９４】
（顕微鏡検査）
溶解効果を可視的に検査するために、ＰｌｙＧ処置ＲＳＶＦ１の位相差顕微鏡検査を用いた。正常に糸状なＲＳＶＦ１（図８）は、暴露後３０秒で、短竿状形態およびミニ細胞状形態に迅速に変換することが判明した（図９）。細胞質物質のほぼ完全な消失が１５分目までに起こり、「ゴースト（ｇｈｏｓｔ）」細胞が残された（図１０）。竿状形態の透過電子顕微鏡検査によって、局所的細胞壁加水分解の領域から突出する細胞膜が明らかになった。これらの構造は、通常、極性および中隔位置で識別でき（図１１）、破裂して、ゴースト様形態を生成する（図１２）。
【００９５】
（インビボ溶解素活性）
ＰｌｙＧの溶解効果によって、それを用いて、マウス感染モデル内でｇ感受性細菌を殺滅できることが示唆された。４〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌は、チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、ロックフェラー大学（Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のラボラトリー・アニマル・リサーチ・センター（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）で飼育した。既述の方法を変更して、マウス感染を実行した。ＢＨＩ培地で増殖させた対数期のＲＳＶＦ１をペレット化し、５０ｍＭ  Ｋ−Ｐ０４緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。緩衝液中の１．０×１０６までの細胞のアリコートをマウスに０．１ｍｌ投与量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。１５分後に、緩衝液単独か、または緩衝液中に含有したＰｌｙＧの０．５ｍｌを腹膜腔に注入した。ＰｌｙＧ単独（細菌無し）の注入も実行して、毒性を評価した。３〜４日までの間、マウスをモニターし、その期間で、全ての生存マウスが正常かつ通常の外見を回復した。
【００９６】
複数のＢ．ｃｅｒｅｕｓ単離物のｉ．ｐ．注入によって、実験用炭疽と類似する迅速な致死性の疾患を誘導することができる。ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＲＳＶＦ１細胞（〜１．０×１０６）の注入は、５時間以下で全ての被験体を殺滅した（図１３）。より具体的には、マウスに、１．０×１０６以下のＲＳＶＦ１ｃｆｕをｉ．ｐ．注入し、１５分後にリン酸緩衝液（ｎ＝１５）か、５０ＵのＰｌｙＧ（ｎ＝１７）か、または１５０ＵのＰｌｙＧ（ｎ＝９）で処理を施した。付加的な対照として、細菌に攻撃されていないマウスに、５０ＵのＰｌｙＧ（ｎ＝５）を注入した。７２時間目に実験を停止した。感染マウスへの５０Ｕまたは１５０Ｕの投与は、緩衝液対照と比べて有意に予防的であった（Ｐ＜０．０００１）。緩衝液処置マウスに対する中央生存時間は、２時間であった。死亡時に、多くのマウスは、接種部位に重度の浮腫を示し、眼および口から出血を示した。感染後１５分に、ＰｌｙＧ（５０単位）をｉｐ注入したとき、顕著な治療効果が観察された。すなわち、１９匹のマウスのうち１３匹が完全に回復した一方で、残りは、６時間から２１時間生存した。ＰｌｙＧの１５０単位を用いたとき、類似の回復率が観察された。ＰｌｙＧ単独のｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．注入で、毒性は検出されなかった。したがって、ＰｌｙＧ投与量は、感染動物中のｇ感受性細菌を迅速に殺滅する。
【００９７】
次に、発芽胞子を分解するＰｌｙＧの能力を検査した。Ｍａｚａｓ，Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｓ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．，Ａｌｖａｒｅｚ，Ａ．Ｂ．＆Ｍａｒｔｉｎ，Ｒ．Ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ｓｐｏｒｅｓ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｅｓ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｗａｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５３，６１−７（１９９９）に記載されるように、胞子を調製した。位相差顕微鏡検査によって測定された９５〜９９％の屈折性内生胞子を含有する試料を水中に４℃で保存した。胞子殺滅実験として、２．０×１０８以下の胞子の０．２ｍｌアリコートを６５℃で５分間熱活性化した。試料をペレット化して、３７℃で５分間、Ｌ−アラニン１００ｍＭを含有する（発芽誘導のため）１．０ｍｌトリプチック・ソイ・ブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ）（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ）に懸濁した。その後、細胞を、３７℃で５分間、ＰｌｙＧ（１０単位）１．０ｍｌで処置して、計数用にプレートした。Ｌ−アラニンを有するＴＳＢは、各胞子型に対する発芽の強力な誘導物質であり、１５分以内に、使用した各胞子型の＞９９％を熱感受性形態に変換する。Ｄ−アラニンの存在下では、発芽頻度は、＜１０％に減少する。
【００９８】
胞子検出用に、マイクロルミノメーター（モデル３５５０ｉ、Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）とともに使用するために胞子殺滅プロトコールを改良した。基本的に、熱活性化胞子０．１ｍｌ（６５℃、５分）を、０．４ｍｌ反応管内の０．４５ｍＭフィルター上に固定化した。固定化した胞子を体細胞放出剤で２回洗浄して、室温で５分間、１００ｍＭのＬ−アラニンを有する０．１５ｍｌＴＳＢで処置した。その後、試料を洗浄して、室温で５分間、０．１５ｍｌのＰｌｙＧ（２単位）で処置した。指定期間の間、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬５０ｍｌを添加して、相対発光量として与えられる得られた光の定量的測度をルミノメーターによって示した。休眠状態では、胞子のペプチドグリカンまたは皮層は、タンパク質外被によって、リゾチームおよびアミダーゼから防護される。しかし、発芽誘導の１０分以内に、外被空隙率は、分解し始めるにつれて増加する。基盤をなすペプチドグリカンがＰｌｙＧに敏感であると推論された。
【００９９】
このことを評価するために、ＲＳＶＦ１、密接に関連するＢ．ｃｅｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ１４５７９）およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ３３６７９）菌株、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓから胞子を調製した。５分間、約１０８個の熱活性化胞子のアリコートを誘導して発芽させ、その後、ＰｌｙＧ（１０単位）で５分間処理した。得られた胞子生存率を、発芽阻害物質Ｄ−アラニンで処理した胞子の生存率と比較した（図１４）。全てのＤ−アラニン処理胞子試料がＰｌｙＧ耐性であった一方で、ＲＳＶＦ１のみがＬ−アラニンの存在下での発芽後に感受性であり、ｌｏｇ１０３．９の生存率の劇的な減少を示した。そのため、ＰｌｙＧが皮層に接近し得る可能性があるときに、発芽誘導後に殺胞子性作用が迅速に起こる。皮層の厚さを考慮すると、迅速なＰｌｙＧ効果によって、多量の分解作用ではなく、胞子成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を減じる微妙な変化が示唆される。
【０１００】
（胞子検出）
発芽胞子を殺滅するＰｌｙＧの能力を利用して、手持ち型ルミノメーターを用いたｇ感受性胞子を検出するための迅速かつ特異的なシステムを開発した。胞子を、フィルター上またはキュベット内（溶液中で）に固定化または位置させ、少なくとも１種類の発芽剤およびＰｌｙＧ（２単位）を用いて、少なくとも１回の５分間ラウンドでインキュベートした。インキュベーションをおこなう温度は、室温から６０℃までであった。初めに、胞子を発芽剤中でインキュベートし、その後、ＰｌｙＧ中またはＰｌｙＧおよび発芽剤とともにインキュベートした。ファージ関連溶菌酵素は、ＰｌｙＧである必要はないが、試験する胞子に特異的でなければならない。その後、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の存在下で放出される光「フラッシュ（ｆｌａｓｈ）」として、分解している胞子からのＡＴＰの放出を測定した。ルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で、ＰｌｙＧ処理発芽胞子から放出されたＡＴＰを評価した。２．５×１０３のＲＳＶＦ１胞子をＬ−アラニンで誘導して、発芽させ、２単位のＰｌｙＧで処理した。ＰｌｙＧ媒介フラッシュを図１５に示す。Ｂｃ１４５７９、Ｂｔ３３６７９、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの発芽胞子は活性を示さなかった。このことにより、ＰｌｙＧの予期された認識特異性が実証された。予想どおり、胞子調製物を混合すると、ＲＳＶＦ１を含有する組み合わせのみが光シグナルを生成した。ＲＳＶＦ１を含む（ＲＳＶＦ＋ミックス）かまたはＲＳＶＦ１を含まない（ＲＳＶＦ１−ミックス）、２．５×１０３のＢｃ１４５７９、Ｂｔ３３６７９、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの胞子を含有する試料を、Ｌ−アラニン中で誘導して、発芽させた。ＰｌｙＧ処理（２単位）後の発光強度を図１６に示す。約１００個程度の少数の胞子を含有する試料を用いて、本発明者らのシステムの感度を検査した。ＰｌｙＧおよびルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬の存在下での６０分間のインキュベーション後に、即時の光フラッシュよりもむしろ、ＲＳＶＦ１シグナルが観察された（図１７）。このシグナルは、低レベルの「グロー（ｇｌｏｗ）」と整合し、放出される可能性がある低レベルのＡＴＰに整合する。他の発芽胞子型の存在下では、グローは検出されなかったため、グローは、ｇ感受性胞子に特異的である。本発明者らの検出方法の特異性、迅速性、および高度な携帯性と組み合わせたこの感度によって、生物兵器としてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓが国内および戦場両方で使用されることをモニタリングする際の適用が示唆される。この技術を用いて、他の細菌種由来の胞子の存在を、それらの種に特異的なバクテリオファージ溶解素を用いて同定し得る。
【０１０１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子を溶菌するために用いられるファージ関連酵素は、溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、改造溶菌酵素、およびその組み合わせでもよい。ファージ関連溶菌酵素およびその改変形態は、ＰｌｙＧ酵素またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的な別のファージ関連溶菌酵素でもよい。
【０１０２】
ホリンタンパク質も用いて、発芽胞子を溶菌するのを補助し得る。ホリンタンパク質は、非改変ホリンタンパク質、キメラホリンタンパク質、改造・ホリンタンパク質、またはその組み合わせでもよい。
【０１０３】
ＡＴＰの検出用に用いられ得るルミノメーターの性質およびその使用方法は、米国特許第６，３９５，５０４号（本明細書中で参考として援用する）に見出され、かつ記載されている。
【０１０４】
（ＰｌｙＧ耐性のための変異誘発およびスクリーニング）
初めに、記載されているように（Ｌｏｅｆｆｌｅｒら）、寒天プレート上で低濃度にて、または液体アッセイで漸増濃度にて、ＰｌｙＧに繰り返し暴露することによって、自然発生的な溶解素耐性を検査した。耐性は検出されなかった。
【０１０５】
自然発生的な耐性が本当に可能であるかを決定するために、化学的に変異誘発した細胞を検査した。濃度１５０ｍＭでメタンスルホン酸エチルエステル（ＥＭＳ）を用いて、対数期のＲＳＶＦ１を４時間処理し、９０％殺滅を生じさせた。その後、その細胞をＢＨＩで洗浄して、−７０℃で冷凍する前に、３時間増殖させた（３回の細胞倍加）。１５０ｍｇ  ｍｌ−１のストレプトマイシン耐性（ｓｔｒｅｐＲ）または３．５ｍｇ  ｍｌ−１のノボビオシン耐性（ｎｏｖＲ）を生じる変異の頻度によって、変異誘発の効率を評価した。非変異誘発培養での自然発生頻度は、ｓｔｅｒｐＲに対して２．４×１０−９およびｓｔｒｅｐＲに対して４．０×１０−１０であった。ＥＭＳ処理ＲＳＶＦ１に関しては、頻度は、ｓｔｒｅｐＲに対して２．１×１０−６およびｓｔｒｅｐＲに対して４．３×１０−６であった。その後、スクリーニングのために、冷凍変異誘発細胞を解凍して、ＢＨＩで洗浄し、３０℃で３０分間増殖させた。１ｍｌアリコート（約１．０×１０８細胞）をＰｌｙＧとともに３７℃で３０分間インキュベートし、洗浄して、ＢＨＩで一晩プレートまたはインキュベートした。分光光度溶解素アッセイで、プレートした細胞から生じたコロニーを選別し、２０単位のＰｌｙＧへの耐性に対して評価した。一晩ＢＨＩ培養に対して、対数期の細胞を確立して、前回と同様に、再びＰｌｙＧで最終的に処理した。これを４日連続で繰り返した。実験の１つのセットでは、２０単位のＰｌｙＧを各処理で用いた一方で、別のセットでは、０．０５単位を使用した後、翌日に、連続的な１０倍より高い用量を用いた。各処理後に細菌をプレートし、その後、分光光度溶解素アッセイで、２０単位のＰｌｙＧへの耐性に対して検査した。耐性は検出されなかった。
【０１０６】
（γファージ溶解素結合部位に由来する新規の診断剤および治療剤）
γファージ溶解素結合部位は、そのタンパク質のカルボキシル末端領域に存在し、炭疽の検出および治療に特に有益である。
【０１０７】
本開示の実施形態は、本明細書で教示されるような配列を有する結合タンパク質間の結合反応によって、炭疽を検出および／または殺滅することができる新規のタンパク質、核酸、および他の分子を提供する。診断法のために、結合には、検出ステップが付随するか、または続き、この検出ステップは、例えば、金ゾル粒子の蓄積、連結タグからの蛍光、連結タグからの化学発光等がある。殺滅のためには、結合体結合部位と細菌壁との間に結合が生じ、この際、結合体の非結合部分が作用して、直接的または間接的に細菌を殺滅する。
【０１０８】
そのような実施形態では、発見されたγファージ溶解素結合部位を模倣した結合部位を用いて、シグナル伝達部分または殺菌部分を細菌に対して導く。細菌を殺滅する医薬品についての実施形態では、Ｎ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、グルコサミニダーゼ、ムラミダーゼ、および／またはエンドペプチダーゼ等の殺滅物質と結合部位領域を連結する。殺滅物質は、天然に存在するγファージ酵素から簡便に入手または誘導し得る。細菌検出のための実施形態では、金ゾル粒子、セレンゾル粒子、発色酵素、蛍光生成酵素、化学蛍光生成酵素、蛍石、化学発光団等の検出可能物質と結合部位領域を連結する。それぞれの場合で、結合部位は、細菌の外表面に特異的に（好ましくは少なくとも１０５、より好ましくは１０６、さらにより好ましくは１０７の親和性定数で）結合する。特異的結合によって、好適には結合部位に共有結合的に連結する共役部による検出および殺滅両方が可能になる。
【０１０９】
次に論じるように、検出剤および治療剤を標的とするために、多様な結合部位が利用可能である。
【０１１０】
（天然結合部位領域変化形）
この生物に著しく十分に結合する配列の発見に基づいて、結合部位領域を構築するために、多様なアミノ酸配列が有用である。図１に示すように、γファージ溶解素のアミノ末端部分は、ＴＰ２１、ＸｌｙＡ、ｐｈｉ−１０５、およびＣｗｌＡの触媒領域に高い相同性を示す。対照的に、残基番号約１５７から始まって２３３まで、これらの配列間で、より少ない配列相同性が見られ、この領域が、菌株および種特異的である特異的結合領域であることが示される。本開示の複数の実施形態では、位置１５７から２３３（「天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）」）に示される配列を有するアミノ酸ストレッチを含有するタンパク質および他の分子は、炭疽の検出および／または治療に非常に有用である。
【０１１１】
図１に図示するように、ＲでＫを、Ｖ、Ｉ、およびＬを互いに、かつＷ、Ｆ、およびＹを互いにというような配列への保存的アミノ酸変化を行い得る一方で、少なくともある程度の活性が保存される。さらに、多くのタンパク質とは異なり、本明細書中で示されるγファージ溶解素は、その細胞表面同種パートナーに著しく強力に結合し、１０１１程度の高い結合定数が測定された。したがって、１つ以上の保存的アミノ酸変化をこの配列におこなうことができる。そのような変化が結合親和性を１０，０００分の１に減少させる場合でさえ、そのタンパク質は、依然として、約１０７の結合定数で十分に結合する。この極度の結合のために、いくつかの場合では、保存的アミノ酸変化をおこなうことは、結合領域の構造を離調することによる成果を改善することができ、その結合領域が多様な結合パートナーに結合することにより、異なる壁特性を有する多様な炭疽菌株に潜在的に応答することを可能にする。
【０１１２】
高度に関連する生物、すなわちＢ．ｃｅｒｅｕｓに関する実験データによって、図１に示される厳密な配列を有するタンパク質がこの細菌の細胞壁と反応でき、かつその細胞壁を溶解できることが示された。すなわち、該データによって、保存的置換で１〜１０％のアミノ酸を置換すること等のアミノ酸修飾に関連する結合親和性の低下が有利な特性を提供できることが示される。考えられる特性は、実験結果により示される方法で、特異性領域を拡大するための１、２、５、８、１０、１２、または１５％までのアミノ酸の置換である。
【０１１３】
本発明の一実施形態では、少なくとも１０の５乗、１０の６乗、１０の７乗、１０の８乗、１０の９乗、１０の１０乗、または１０の１１乗でさえもの結合親和性を有するポリペプチドおよびフラグメントを用いる。この図に示される天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）に少なくとも５０％配列同一性、より好ましくは少なくとも６０％配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％配列同一性の相同配列を有する分子を用い得る。結合部位が少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも６０アミノ酸長、または少なくとも７０アミノ酸長であるとき、利点が見出され得、この際長さは、図に示す天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｉｄｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）に相同であるが、少なくとも８〜１０、１５、２０、２５、３０、および４０アミノ酸の配列が特に考慮される。この文脈での用語「に相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ）」とは、図１の４つの配列に見られるような最大同一性の対応のために並べられていることを意味する。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、前述のポリペプチドのアミノ酸配列の全てではないが部分として完全に同じであるアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドである。フラグメントは、「独立している（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」か、またはより大きなポリペプチド内に含まれていてもよく、そのより大きなポリペプチドのうち、このフラグメントは、最も好ましくは単一の連続領域として、単一のより大きなポリペプチドの部分または領域を形成する。
【０１１５】
フラグメントは、例えば、図１に示すように並べられるときの天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）またはその改変体の少なくとも５０アミノ酸長領域に対応する（例えば５０％配列同一性、より好ましくは少なくとも６０％配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９８％の配列同一性の）アミノ酸配列の一部分を有するトランケーション・ポリペプチドを含み得、該５０アミノ酸長領域は、例えば、アミノ末端を含む連続する一連の残基またはカルボキシル末端を含む連続する一連の残基である。宿主細胞内のこの実施形態のポリペプチドの分解形態もまた、有利である。さらに、α・ヘリックスおよびα・へリックス形成領域、β・シートおよびβ・シート形成領域、ターンおよびターン形成領域、コイルおよびコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、フレキシブル領域、表面形成領域、基質結合領域、ならびに高抗原性インデックス（ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）領域を含むフラグメント等の構造特質または機能特質によって特徴づけられるフラグメントが有利である。
【０１１６】
類似の活性または改良された活性を有するもの、あるいは望ましくない活性が減少されているものを含むＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに対して少なくとも１０６、１０７、１０８、または１０９の結合活性を有するフラグメントもまた、有利である。結合部位および検出可能タグまたは細菌タグの共役体もまた有利であり、これは、望ましい臨床機能を与え、それによって、結合領域が細菌壁に特異的に結合し、炭疽の検出または殺滅を可能にする。
【０１１７】
ペプチド合成によって対応する完全長ポリペプチドを生産するために、本開示のポリペプチドのフラグメントである改変体を利用し得る。したがって、本開示の実施形態の完全長ポリペプチドを生産するために、これらの改変体を中間体として用い得る。
【０１１８】
（結合部位および溶解素をコードするポリヌクレオチド）
本開示の別の態様は、完全長遺伝子を含む単離ポリヌクレオチドに関する。該ポリヌクレオチドは、図１の天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）の推論アミノ酸配列、それに密接に関連するポリヌクレオチド、およびその改変体を有する少なくとも結合部位領域ポリペプチドをコードする。
【０１１９】
本明細書に提供される情報を利用して、結合部位領域またはγ溶菌ポリペプチド全体をコードする本開示のポリヌクレオチドを、標準的なクローニングおよびスクリーニング法を用いて得ることが可能である。例えば、ファージを感染させた細胞を出発物質として用いて細菌から染色体ＤＮＡフラグメントのクローニングおよび配列決定を実行して、その後完全長クローンを得ることが可能である。図１に示した配列等の本開示のポリヌクレオチド配列を得るために、代表的に、部分的配列に由来する好ましくは１７ｍｅｒまたはより長い放射標識オリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉバックグラウンドまたは他の任意の適切な宿主内の誘導γファージ発現ライブラリを探索する。次いで、ストリンジェントな条件を用いて、プローブと同一のＤＮＡを保持するクローンを識別し得る。その後、元の配列から設計した配列決定・プライマーを用いてこのように同定される個々のクローンを配列決定することによって、両方向に配列を伸張して、完全な遺伝子配列を決定し得る。プラスミド・クローンから調製した変性二本鎖ＤＮＡを用いて、そのような配列決定を都合よく実行する。適切な技術については、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている（具体的には、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  １．９０  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  １３．７０を参照せよ）。
【０１２０】
本開示の別の実施形態は、全長にわたって図１のコーディング配列に同一なポリヌクレオチド配列を提供する。成熟ポリペプチドまたはそのフラグメントに対するコーディング配列自体と、リーダー配列または分泌配列、あるいはプレタンパク質、プロタンパク質、またはプレプロタンパク質配列をコードするもの等の他のコーディング配列を有するリーディングフレーム内の成熟ポリペプチドまたはフラグメントに対するコーディング配列ともまた、本開示により提供される。ポリヌクレオチドは、非コーディング配列も含み得、該非コーディング配列としては、限定はされないが、例えば、転写配列、非翻訳配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ＭＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、および付加的なアミノ酸をコードする付加的なコーディング配列等の非コーディング５’および３’配列が挙げられる。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。本開示の特定の実施形態において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で提供される、Ｇｅｎｔｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるヘキサヒスチジン・ペプチドまたはＨＡタグ（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）である。本開示のポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、構造遺伝子および遺伝子発現を制御するその天然で関連する配列を含むポリヌクレオチドもまた、挙げられる。
【０１２１】
本開示の実施形態は、天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）の推論アミノ酸配列を有するポリペプチドの改変体をコードする本明細書に記載されるポリヌクレオチドの改変体をさらに含む。本開示のポリヌクレオチドのフラグメントである改変体を用いて、本開示の完全長ポリヌクレオチドを合成し得る。
【０１２２】
さらに特に興味深い特徴は、複数、少数、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１、または０個のアミノ酸残基が、置換、欠失、または付加されているアミノ酸配列を任意の組み合わせ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ壁への結合を１００倍より多くは減少させないサイレントな置換、付加、および欠失を含む）で有する、天然結合領域（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）の改変体をコードする、ポリヌクレオチドである。
【０１２３】
本開示の更なる特徴は、天然結合配列（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、全長にわたって少なくとも５０％、６０％、または７０％同一なポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドである。あるいは、最高に好ましいのは、結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、全長にわたって少なくとも８０％同一な領域を含むポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドである。この点では、上記のものに、全長にわたって少なくとも９０％同一なポリヌクレオチドが特に有利であり、これらのポリヌクレオチドの中でも、少なくとも９５％であるものは、少なくとも９７％のものと、少なくとも９８％および少なくとも９９％のものとがそうであるように、特定の利点を有する。
【０１２４】
本開示はさらに、本明細書中の上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。この点では、本開示は特に、ストリンジェントな条件下で本明細書中の上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用するように、用語「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性があるときのみにハイブリダイゼーションが生じることを意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０マイクログラム／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベーションした後に、０．１×ＳＳＣ中で、約６５℃でハイブリダイゼーション支持体を洗浄することである。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、特にその中の１１章に例示されている。
【０１２５】
本開示は、本明細書で先述したポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントに相補的な配列を有するプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で先述したポリヌクレオチド配列に対する完全な遺伝子を含有する適切なライブラリをスクリーニングすることと、上記ＤＮＡ配列を単離することとによって得ることができるポリヌクレオチド配列から本質的になるポリヌクレオチドもまた、提供する。そのようなポリヌクレオチドを得るために有用なフラグメントとしては、例えば、配列から作製されるプローブおよびプライマーが挙げられる。
【０１２６】
本開示のポリヌクレオチド・アッセイに関して本明細書でさらに論じるように、例えば、上記に論じたような本開示のポリヌクレオチドを、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ，およびゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして用いて、結合領域をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノム・クローンを単離することと、結合領域または完全なγ溶解素遺伝子に高度に類似する配列を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム・クローンを単離することとが可能である。そのようなプローブは、一般的に、少なくとも１５個の塩基を含む。該プローブは、少なくとも３０個の塩基を有し得、少なくとも５０個の塩基を有してもよい。実施形態には、３０個と５０個との間の塩基を有するプローブが含まれる。
【０１２７】
本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、例えば、ポリヌクレオチド・アッセイに関して本明細書でさらに論じるように、疾患、特にヒト疾患の処置および診断の開発のための研究用試薬および材料として用い得る。
【０１２８】
（γ溶解素を発現するためのベクターおよび宿主細胞、ならびに結合部位試薬）
本開示の実施形態は、結合領域のみ、あるいは全溶解素タンパク質または他のタンパク質との結合領域のライゲーション体／共役体も含む本開示のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群を含むベクターもまた含む。他の実施形態は、本開示のベクターを用いて遺伝子操作された宿主細胞と、組み換え技術よる本開示のポリペプチドの生産とに関する。また、無細胞翻訳系を使用して、本開示のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを用いてそのようなタンパク質を生産し得る。
【０１２９】
組み換え的生産のために、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系またはその部分あるいは本開示のポリヌクレオチドを組み込み得る。Ｄａｖｉｓら，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）等の多くの標準的な実験室マニュアルに記載されるような方法によって、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入を実行し得、該方法は、例えば、リン酸カルシウム・トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、微量注入法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ・ローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染である。
【０１３０】
適切な宿主の代表例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞のような細菌細胞と、酵母細胞およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞のような真菌細胞と、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞と、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような動物細胞と、植物細胞とが挙げられる。
【０１３１】
多種多様な発現系を用いて、本開示のポリペプチドを生産することができる。そのようなベクターとしては、中でも、染色体ベクター、エピソーム・ベクター、およびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、トランスポゾン由来のベクター、酵母エピソーム由来のベクター、挿入エレメント由来のベクター、酵母染色体エレメント由来のベクター、バキュロウイルス由来のベクター、パポーバ・ウイルス（例えばＳＶ４０）由来のベクター、ワクシニア・ウイルス由来のベクター、アデノウイルス由来のベクター、鶏痘ウイルス由来のベクター、仮性狂犬病ウイルス由来のベクター、およびレトロウイルス等のウイルス由来のベクターと、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子（例えばコスミドおよびファージミド）に由来するもの等のそれらの組み合わせ由来のベクターとが挙げられる。発現系コンストラクトは、発現を調節および生成する制御領域を含有することが可能である。一般的に、この点について、ポリヌクレオチドを維持、増殖、もしくは発現すること、および／または宿主内でポリペプチドを発現させることに適した任意の系またはベクターを発現のために用いることが可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（前出）に記載されるもの等の種々の周知かつ常法の技術のいずれかによって、適当なＤＮＡ配列を発現系に挿入することが可能である。
【０１３２】
翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔、細胞周辺腔、または細胞外環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことが可能である。これらのシグナルはポリペプチドに対して内因性であり得るか、または該シグナルは異種性のシグナルであり得る。
【０１３３】
周知の方法によって本開示のポリペプチドを組み換え型細胞培養物から回収および精製することができ、該方法としては、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィー、およびレクチン・クロマトグラフィーが挙げられる。高速液体クロマトグラフィーも精製のために用いられる。単離および精製の途中でポリペプチドを変性する際、タンパク質の再折りたたみのための周知の技術を用いて、活性コンフォメーションを再生することも可能である。
【０１３４】
（診断アッセイ）
γ溶解素のＣ末端結合ドメインは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに極めて特異的であるため、炭疽菌の同定のための診断用ツールとしてこのドメインを用いることが可能である。広範囲なアッセイ技術で、高親和性結合部位を用いて、炭疽菌を検出することが可能である。これらの技術は、当業者に周知である。このようなアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、金ゾル放射免疫アッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタン・ブロット・アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０１３５】
検出アッセイは、異種形式を有利に用い、この際、共役結合物質と被分析物との間の結合反応が生じ、その後洗浄工程で、未結合の共役結合物質を除去する。例えば、粒子表面に固定化される結合タンパク質との結合領域を含むタンパク質を用いて、金ゾル粒子を調製することが可能である。タンパク質と細菌との間に結合が生じるので、粒子が同化し、有色産物を形成する。同様に、βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、またはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ等の酵素と、好ましくは共有結合的に結合タンパク質を複合することが可能である。洗浄後に、蛍光生成基質または化学発光生成基質等の基質を添加することによって、残存する結合酵素を検出することができる。希土類蛍石等のシグナルを生成することができる任意の他の試薬と、結合タンパク質を複合することが可能であり、時間分解蛍光、放射性物質によって検出することが可能であり、かつ放射能測定または通常の蛍光タグによって検出することが可能であり、かつ蛍光によって検出することが可能である。
【０１３６】
合成化学または生物学的過程によって、検出可能タグとの結合領域の共役を実行することが可能である。例えば、結合領域をコードするＤＮＡ配列または溶解素タンパク質全体のＤＮＡ配列を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の検出可能マーカーまたはアルカリ性ホスファターゼ等の酵素をコードする遺伝情報にリンクさせることができる。これは、Ｎ末端触媒ドメインを除去して、それを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のインジケーター分子とフレーム単位で置換し、炭疽菌同定用の発現融合分子を精製することにより結合ドメインに対するＤＮＡを分離することによって、達成され得る。結合ドメインは、免疫グロブリンＧ分子の類似の結合親和性を有するので、マークを付けた結合ドメインは、偽陽性の活性ほとんどなしで炭疽菌を効果的に同定する。必要であれば、ＧＦＰ分子または酵素を全溶解素酵素の５’末端で融合することも可能であり、そうすることによって、酵素ドメインは、少なくとも部分的に不活性化されるが、結合ドメインは、依然として機能して、Ｂａｃｉｌｌｕｓの細胞壁内のその基質に結合することが可能である。
【０１３７】
触媒ドメインから分離した単離結合ドメインを発現させ、精製し、多数の蛍光分子を用いて標識することが可能であり、該蛍光分子は、例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート、ローダミン・イソチオシアネート、および当業者に既知の他のものがある。同定するために、結合ドメインをビオチンで修飾して、結合領域が炭疽菌に付着した後、ビオチン−アビジン複合体の形成を可能にする。
【０１３８】
他の触媒ドメインを結合領域に付加することが可能である。別の系に対して、Ｄｉａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：８１２５（１９９０）に例示されるように、触媒ドメインを他のファージ溶菌酵素由来の触媒ドメインと置換して、炭疽菌のペプチドグリカン細胞壁内の他の結合を切断することが可能である。例えば、Ｎ末端触媒ドメイン（アミダーゼ）をコードするγ溶解素遺伝子の５’末端部分を除去して、他のＢａｃｉｌｌｕｓ・ファージのファージ溶菌酵素由来の、さらには他のグラム陽性およびグラム陰性細菌のファージ由来の触媒ドメインと置換することが可能である。これらの触媒ドメインは、他のアミダーゼ（高活性または特別の特徴を有し得る）、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、またはエンドペプチターゼであってもよく、それら全ては、γ溶解素の結合ドメインに遺伝学的に融合されるときに、炭疽菌のペプチドグリカン内のそれらそれぞれの結合を切断する。関連する実施形態では、単一のγ溶解素結合ドメインに異なる特異性の２つまたは３つ（以上）のタンデムの触媒ドメインを融合（すなわち、ムラミダーゼ−グルコサミニダーゼ−アミダーゼ）して、高度に活性な切断酵素を産生する炭疽菌細胞壁ペプチドグリカン内のこれらの結合を切断することが可能である。Ｎａｖａｒｒｅ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄ−ａｌａｎｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｍａｙ  ２８；２７４：１５８４７−５６．）は、３組の酵素ドメインがバクテリオファージ溶菌酵素内に存在することが可能であることを示している。
【０１３９】
種々の従来のリンカー、例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、カルボジイミド、ビス−ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド等を用いることができ、好ましくは、米国特許第４，６８０，３３８号に開示される無水イソチオシアネート・リンカー等の選択的配列リンカーを用いることができる。
【０１４０】
（炭疽感染を処置する際使用するための医薬品）
精製ＰｌｙＧ溶解素は、高度に特異的な方法で、強力な溶菌効果を導くことが判明した。すなわち、該精製ＰｌｙＧ溶解素は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ系列の関連菌株の炭疽菌クラスタのメンバーを迅速に殺滅する。したがって、ＰｌｙＧは、吸入性の炭疽感染を予防または処置する手段として、かつ炭疽菌増殖形態または胞子形態を検出するためのツールとして用いることが可能な酵素の一例である。
【０１４１】
溶菌酵素を用いて細菌感染、特に炭疽菌を処置することには多数の利点がある。特異な触媒および結合ドメインを有する溶解素のモジュール設計によって、それらドメインがドメイン・スワッピング実験用に理想的になり、該ドメイン・スワッピング実験では、他の病原菌に対して使用するために細菌特異性および触媒活性を改良または適応することができる。溶解素の触媒および結合ターゲット（それぞれ、ペプチドグリカンおよび関連糖質）は、生存率に対して非常に不可欠であるので、溶解素耐性は、極めて少ない。実際、ＲＳＶＦ１に対して、ＰｌｙＧに対する自然発生的な耐性（＜５．０×１０−９の頻度）は観察されなかった。さらに、１０３〜１０４倍高い突然変異率を持つ化学的に突然変異生成させたＲＳＶＦ１培養物でさえ、耐性が観察されなかった。自然発生的な突然変異よりむしろ、耐性を発生させるためには、遺伝子水平移動がより可能性のある手段である。しかし、炭疽菌の短い増殖期およびその拡大した休眠期を考慮すると、異種遺伝子座からのＰｌｙＧ耐性の獲得は可能性が薄いようである。
【０１４２】
したがって、炭疽菌に向けられたファージ溶菌酵素の使用は、生体の炭疽感染を処置すること、あるいは物体または表面エリアの炭疽汚染を処置することの実行可能な手段であると考えられる。
【０１４３】
部屋等の表面またはエリアの潜在的な汚染の場合、炭疽菌に向けられる溶菌酵素を、部屋の表面全体にわたって噴射することが可能であり、部屋に通じる任意の空気ダクトの表面上に、そして部屋から離れて噴射することができる。酵素に対するキャリアは、約４．０〜約８．０の範囲、より最適には約５．５〜約７．５の範囲のｐＨを有することが可能である。さらに、キャリアを緩衝すべきである。酵素は、安定化緩衝液が約４．０〜約８．０の範囲またはさらに約５．５〜約７．５の範囲のｐＨを有することができるように機能することが可能である。
【０１４４】
安定化緩衝液は、溶解素酵素の最適活性を考慮すべきである。緩衝液は、ジチオトレイトール等の還元試薬を含有することが可能である。安定化緩衝液はまた、エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩等の金属キレート化試薬であるか、または金属キレート化試薬を含むことも可能であり、あるいは、リン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、または任意の他の緩衝液を含有することも可能である。酵素の有効量または有効用量を提供すると考えられる酵素の活性単位の濃度を、流体１ｍｌ当たり約１００単位から約５００，０００単位の範囲とすることができる。いくつかの場合では、流体１ｍｌ当たりの活性単位の範囲は、かなりより高くてもよい。さらに、キャリアは、保存料および抗菌剤を含んでもよく（限定はされないが）、細菌生体がキャリアに入らないようにする。
【０１４５】
図１に示す配列によって説明されるような溶菌酵素を使用することに加え、さらに上記に列記した一覧表中の可能な置換変異体とともに、該溶菌酵素に追加または代用して、キメラ溶菌酵素および改造溶菌酵素も可能である。
【０１４６】
キャリアは、Ｌ−アラニンを含むものであってもよく、これは、存在する任意の炭疽菌胞子の発芽を補助することが可能である。
【０１４７】
局所的感染を処置するための組成物は、この開示にしたがって生産される少なくとも１種類の溶菌酵素の有効量と、感染皮膚に少なくとも１種類の溶菌酵素を送達するためのキャリアとを含む。溶菌酵素の適用様式には、多数の異なる種類および組成物のキャリアが含まれ、該キャリアとしては、水性液体、アルコールベース液体、水溶性ゲル、ローション剤、軟膏、非水性液体基剤、鉱油基剤、鉱油およびワセリンの混合物、ラノリン、リポソーム、血清アルブミンまたはゼラチン等のタンパク質キャリア、粉末セルロース・カーメル、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。治療剤を含有するキャリアの送達様式としては、塗抹、スプレー、徐放性貼付剤、液体吸収ワイプ（ｗｉｐｅ）、およびその組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。溶菌酵素を、直接または他のキャリアのいずれかで、包帯に適用することが可能である。包帯は、湿っているかまたは乾燥させて販売されており、この際酵素は、包帯上で凍結乾燥形態である。この適用方法は、感染皮膚の処置のために最も効果的である。
【０１４８】
局所的組成物のキャリアは、半固体およびゲル状ビヒクルを含んでよく、該ビヒクルは、ポリマー増粘剤、水、保存料、活性な界面活性剤または乳化剤、酸化防止剤、遮光剤、および溶剤または混合溶剤系を含む。米国特許第５，８６３，５６０号（Ｏｓｂｏｒｎｅ）は、薬物への皮膚の暴露を助けることができる多数の異なるキャリアの組み合わせについて論じている。
【０１４９】
使用可能なポリマー増粘剤としては、当業者に既知のものが挙げられ、例えば、化粧品産業および製薬産業でしばしば用いられる親水性および水性アルコール性のゲル化剤がある。好ましくは、親水性または水性アルコール性のゲル化剤は、「ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）」（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、「ＨＹＰＡＮ（登録商標）」（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｙｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、「ＮＡＴＲＯＳＯＬ（登録商標）」（Ａｑｕａｌｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、「ＫＬＵＣＥＬ（登録商標）」（Ａｑｕａｌｏｎ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、または「ＳＴＡＢＩＬＥＺＥ（登録商標）」（ＩＳＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗａｙｎｅ，Ｎ．Ｊ．）を含む。好ましくは、ゲル化剤は、組成物の約０．２重量％〜約４重量％を構成する。より具体的には、「ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）」に対する好ましい組成重量％範囲は、約０．５％〜約２％であり、一方「ＮＡＴＲＯＳＯＬ（登録商標）」および「ＫＬＵＣＥＬ（登録商標）」に対する好ましい重量％範囲は、約０．５％〜約４％である。「ＨＹＰＡＮ（登録商標）」および「ＳＴＡＢＩＬＥＺＥ（登録商標）」両方に対する好ましい組成重量％範囲は、約０．５％〜約４％である。
【０１５０】
「ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）」は、一般的に採用されている名称カルボマーが与えられている多数の架橋アクリル酸ポリマーの１つである。これらのポリマーは、水に溶解し、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、または他のアミン塩基等の苛性物質と中和すると、透明なまたはわずかに霞んだゲルを形成する。「ＫＬＵＣＥＬ（登録商標）」は、水中で分散され、完全に水和されると均一なゲルを形成するセルロースポリマーである。他の好ましいゲル化ポリマーとしては、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースゴム、ＭＶＥ／ＭＡデカジエンクロスポリマー、ＰＶＭ／ＭＡコポリマー、またはその組み合わせが挙げられる。
【０１５１】
この発明では、保存料も使うことが可能であり、好ましくは全組成物の約０．０５重量％〜約０．５重量％を構成する。保存料を使用することによって、産物が微生物に汚染されている場合、処方物が微生物の増殖を阻止または減少させることが確実になる。この発明で有用な複数の保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭヒダントイン、３−イオド−２−プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコネート、またはその組み合わせが挙げられる。
【０１５２】
二酸化チタンも遮光剤として用いて、光増感に対する予防として機能することが可能である。別の遮光剤としては、ケイ皮酸メチルが挙げられる。さらに、ＢＨＡも、エトキシジグリコールおよび／またはダプソンが酸化によって変色するのを防ぐことに加えて、酸化防止剤として用いることができる。別の酸化防止剤はＢＨＴである。
【０１５３】
この開示の全ての実施形態で使用するための医薬品としては、抗微生物剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、局所麻酔剤、コルチコステロイド、破壊療法剤、抗真菌剤、および抗男性ホルモン物質が挙げられる。局所的処方物内で用いることが可能な活性医薬品としては、抗微生物剤、特に、ダプソン、エリスロマイシン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、および他の抗微生物剤等の抗炎症特性を有するものが挙げられる。抗微生物剤の好ましい重量％は、０．５％〜１０％である。
【０１５４】
局所麻酔剤としては、テトラカイン、塩酸テトラカイン、リドカイン、塩酸リドカイン、ジクロニン、塩酸ジクロニン、ジメチソキン塩酸、ジブカイン、塩酸ジブカイン、ブタンベンピクレート（ｂｕｔａｍｂｅｎｐｉｃｒａｔｅ）、および塩酸プラモキシンが挙げられる。局所麻酔剤の好ましい濃度は、全組成物の約０．０２５重量％〜５重量％である。約２重量％〜約２５重量％の好ましい濃度で、ベンゾカイン等の麻酔剤も用いることが可能である。
【０１５５】
使用可能なコルチコステロイドとしては、二プロピオン酸ベタメタゾン、フルオシノロンアクチニド、吉草酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアクチニド、プロピオン酸クロベタゾール、デスオキシメタゾン、酢酸ジフロラゾン、アムシノニド、フルランドレノリド、吉草酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、およびデソニドが挙げられ、約０．０１重量％〜１．０重量％の濃度が推奨される。ヒドロコルチゾンまたは酢酸メチルプレドニゾロン等のコルチコステロイドに対する好ましい濃度は、約０．２重量％〜約５．０重量％である。
【０１５６】
サリチル酸または乳酸等の破壊療法剤も用いることが可能である。約２重量％〜約４０重量％の濃度が好ましい。カンタリジンは、約５重量％〜約３０重量％の濃度で好ましく利用される。局所的組成物内で使用可能な代表的な抗真菌剤およびそれらの好ましい重量濃度としては、硝酸オキシコナゾール（０．１％〜５．０％）、シクロピロックスオラミン（０．１％〜５．０％）、ケトコナゾール（０．１％〜５．０％）、硝酸ミコナゾール（０．１％〜５．０％）、および硝酸ブトコナゾール（０．１％〜５．０％）が挙げられる。他の局所剤を含んで、当業者に認識されるように生じ得る種々の局所的共感染に対処することが可能である。
【０１５７】
代表的に、薬剤の組み合わせを用いる処置としては、局所麻酔剤と組み合わせた抗生物質が挙げられ、例えば感染に対する予防および痛みの緩和を提供する局所抗生物質ゲル用のテトラカインと組み合わせた硫酸ポリミキシンＢおよび硫酸ネオマイシンがある。別の例は、円形脱毛症の処置のためのコルチコステロイド（例えば、二プロピオン酸ベタメタゾン）と組み合わせたミノキシジルの使用である。白癬感染の処置のためのケトコナゾール等の抗真菌剤とコルチゾン等の抗炎症剤の組み合わせも一例である。
【０１５８】
一実施形態では、本発明は、約０．５％〜１０％のカルボマーおよび約０．５％〜１０％の医薬品を有する皮膚科学的組成物も含み、カルボマーおよび医薬品は共に、溶解状態および微粒子状態で存在する。溶解された医薬品は、角質層を通過する能力がある一方で、微粒子状の医薬品にはない。アミン塩基溶液、カリウム溶液、水酸化物溶液、または水酸化ナトリウム溶液は、ゲルの形成を完全なものにする。より具体的には、この医薬品は、抗炎症特性を有する抗微生物剤であるダプソンを含み得る。溶解されたダプソンに対する微粒子状ダプソンの好ましい比率は、５以下である。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明は、約１％のカルボマー、約８０〜９０％の水、約１０％のエトキシジグリコール、約０．２％のメチルパラベン、約０．３％〜３．０％のダプソン（微粒子状タプソンおよび溶解したダプソンの両方を含む）、および約２％の苛性物質を含む。より具体的には、カルボマーとしては、「ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９８０」を挙げることが可能であり、苛性物質としては、水酸化ナトリウム溶液を挙げることが可能である。
【０１６０】
好ましい実施形態では、組成物は、ダプソンおよびエトキシジグリコールを含み、このことにより、溶解された薬物に対する微粒子状の薬物の比率を最適化することが可能である。この比率によって、角質層内または上部に保有されて角質層上ドメイン内で機能する薬物量と比較した、送達される薬物量が決定される。ダプソンおよびエトキシジグリコール系には、「ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）」ゲル化ポリマー、メチルパラベン、プロピルパラベン、二酸化チタン、ＢＨＡ、および「ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）」を中和するための苛性物質と組み合わせた精製水を含むことが可能である。
【０１６１】
溶菌酵素のための任意のキャリアを従来の手段により製造することが可能である。しかし、キャリア内にアルコールを用いる場合、この酵素は、酵素の変性を予防するために、ミセル、リポソーム、または「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」リポソームであるべきである。同様に、溶菌酵素をキャリア中に配置し、キャリアを加熱するか、または加熱した際は、そのような配置は、キャリアをある程度冷却した後に行い、この酵素の熱変性を避けるべきである。本発明の好ましい実施形態では、キャリアは無菌である。
【０１６２】
液状または凍結乾燥状のこれらの物質にこの酵素を添加することが可能であり、そこで酵素が液体に触れると可溶化される。
【０１６３】
炭疽暴露または炭疽感染を処置する際、非経口で、あるいは口腔または鼻腔を通って溶菌酵素を好ましく投与することが可能である。
【０１６４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染の予防的処置および治療的処置のために用いることが可能な組成物は、改造および／またはキメラ酵素、ならびに酵素がキャリア系または経口送達様式内に入れられて粘膜内層に達するような口腔および鼻腔の粘膜内層への適用手段（例えば、キャリア系または経口送達様式）を含む。
【０１６５】
修飾溶菌酵素をキャリア系または経口送達様式に入れる前に、または入れた時に、約４．０と約８．０との間またはより厳密に約５．０と約７．０との間のｐＨ範囲を維持するために、該酵素は、安定化緩衝液環境内にあることが可能である。
【０１６６】
安定化緩衝液は、溶解素酵素の最適活性を可能とするべきである。この緩衝液は、ジチオトレイトール等の還元試薬を含有することが可能である。安定化緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩等の金属キレート化試薬であってもよく、または金属キレート化試薬を含んでもよく、あるいはリン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、または任意の他の緩衝液を含有してもよい。これらのファージおよび他のファージのＤＮＡコードを改変することにより、組み換え型酵素が２つより多い場所で１つの細胞壁を攻撃すること、組み換え型酵素が１種類より多くの細菌の細胞壁を切断すること、組み換え型酵素が他の細菌を攻撃すること、または任意のその組み合わせが可能になる。組み換え型バクテリオファージ産生酵素に対する改変の種類および数は無数にある。任意数のキメラおよび改造溶菌酵素を、単独でまたはホリンタンパク質とともに構築して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓへの暴露を処置することが可能である。
【０１６７】
例えば、上気道の細菌感染がある場合、細菌に特異的なバクテリオファージに感染させた細菌により産生される少なくとも１種類の溶菌酵素の有効量と、口、咽喉または鼻経路にこの溶菌酵素を送達するためのキャリアとを含む組成物とを用いてこの感染を予防的または治療的に処置することができる。溶菌酵素は、ホリンタンパク質と組み合わせて用いることが可能な、溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、および／または改造溶菌酵素、あるいはその組み合わせであってもよい。溶菌酵素は、溶菌酵素の活性を可能にするｐＨを有する環境内にあることが可能である。この酵素の至適ｐＨ範囲は、約４〜８であり、最も至適なのは約６〜７のｐＨである。個体が、上気道障害を有する者にさらされたとき、溶菌酵素を粘膜内層に存在させ、感染性細菌のあらゆるコロニー形成を防ぐ。
【０１６８】
溶菌酵素（改変または非改変）の適用手段としては、限定はされないが、直接的な、間接的な、キャリアの、および特定の手段、または手段の任意の組み合わせが挙げられる。溶菌酵素の直接的な適用は、鼻腔スプレー、鼻腔ドロップ、鼻腔軟膏、鼻腔洗浄剤、鼻腔注入剤、鼻腔パッキング、気管支スプレー、および吸入器によるものでよく、あるいは咽喉ロゼンジ、口内洗浄剤、または含嗽剤の使用を介して間接的に、あるいは鼻孔に塗布する軟膏の使用を介して、あるいはこれらの適用法および類似の適用法の任意の組み合わせでもよい。溶菌酵素が投与され得る形態としては、限定はされないが、ロゼンジ、トローチ、キャンディ、注入剤、チューインガム、錠剤、粉剤、スプレー、液体、軟膏、およびエアロゾルが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓへの暴露が鼻を介していることが最も有望である。細菌への暴露を可能な限りすぐに処置することが最善である。
【０１６９】
鼻腔スプレー、鼻腔ドロップ、鼻腔軟膏、鼻腔洗浄剤、鼻腔注入剤、鼻腔パッキング、気管支スプレー、口腔スプレー、および吸入器の使用によって溶菌酵素を直接導入する際は、該酵素は、好ましくは、キャリアとして作用する液体を有する液体またはゲル環境内にある。吸入器または気管支スプレーによって修飾酵素の乾燥無水型を投与することが可能であるが、液体送達形態が好ましい。
【０１７０】
酵素を添加するロゼンジ、錠剤、またはガムは、砂糖、コーン・シロップ、種々の染料、ノンシュガー甘味料、香味料、任意の結合剤、またはその組み合わせを含有することが可能である。同様に、任意のガム・ベース産物は、アカシア、カルナウバ蝋、クエン酸、コーン・スターチ、食用着色剤、香味料、ノンシュガー甘味料、ゼラチン、グルコース、グリセリン、ガム基剤、シェラック、ナトリウムサッカリン、砂糖、水、白蝋、セルロース、他の結合剤、およびその組み合わせを含有することが可能である。
【０１７１】
ロゼンジは、ショ糖、コーン・スターチ、アカシア、トラガカントゴム、アネトール、亜麻仁、含油樹脂、鉱油、セルロース、他の結合剤、およびその組み合わせをさらに含有することが可能である。本発明の別の実施形態では、デキストロース、ショ糖、または他の砂糖の代わりに、砂糖代用品を用いる。
【０１７２】
上記で言及したように、酵素を鼻腔スプレー内に入れることも可能であり、この際該スプレーはキャリアである。鼻腔スプレーは、長時間作用性または徐放性スプレーでありえ、当技術で周知の手段によって製造され得る。酵素が肺内を含む気管支内にさらに深く到達することが可能であるように吸入剤も用いることが可能である。
【０１７３】
溶菌酵素用の任意のキャリアを従来の手段によって製造することが可能である。しかし、任意の口内洗浄剤または類似の種類の産物は、酵素の変性を防ぐためのアルコールを含有しないことが好ましいが、リポソームおよび他の予防様式および形態内の酵素は、アルコール内で用いることが可能である。同様に、製造過程で酵素を咳止めドロップ、ガム、キャンディ、またはロゼンジ内に配置する際は、ロゼンジまたはキャンディは硬化する前、しかし咳止めドロップまたはキャンディはある程度冷却した後でそのような配置をおこない、酵素の熱変性を避けるべきである。十分に高く有効な用量で、咳止めドロップ、ガム、キャンディ、またはロゼンジ表面全体にわたって酵素を噴射することもできる。
【０１７４】
液状または凍結乾燥状のこれらの物質に酵素を添加することが可能であり、そこで酵素が唾液等の体液と接触する際に可溶化される。酵素は、ミセルまたはリポソーム内にあってもよい。
【０１７５】
感染を処置するための酵素の有効用量の割合または量は、酵素を治療的または予防的に用いるかどうか、感染性細菌にレシピエントがさらされる継続期間、個体のサイズおよび重量等に部分的に依存する。酵素を含有する組成物の使用のための継続期間も、使用が短期間の時間単位、日にち単位、または週単位であり得る予防目的の使用であるかどうかに依存し、あるいは、用法が数時間、数日、または数週続くか、および／または日周基準であるか、または１日の間で時間調整した間隔であるというような組成物使用のより集中的な養生法が必要となり得る治療目的の使用であるかどうかに依存する。用いられる用量形態は、最小の時間量に対して、最小数の単位を提供するべきである。酵素の有効量または用量を提供することが可能な酵素の活性単位の濃度は、鼻腔および口腔経路の湿潤環境または湿気のある環境でおよび局所的にも、流体１ｍｌ当たり約（例えば厳密に）１００単位〜約５００，０００単位の範囲内とすることができ、かつ約１００単位／ｍｌから約５０，０００単位／ｍｌの範囲も可能性がある。したがって、代表値としては、約２００単位／ｍｌ、３００単位／ｍｌ、５００単位／ｍｌ、１，０００単位／ｍｌ、２，５００単位／ｍｌ、５，０００単位／ｍｌ、１０，０００単位／ｍｌ、２０，０００単位／ｍｌ、３０，０００単位／ｍｌ、および４０，０００単位／ｍｌが挙げられる。より具体的には、活性酵素単位への暴露時間は、１ｍｌ当たりの活性酵素単位の所望の濃度に影響を与えることが可能である。「長期間（ｌｏｎｇ）」または「緩慢（ｓｌｏｗ）」放出性キャリア（例えば、確実な鼻腔スプレーまたはロゼンジ等の）として分類されるキャリアは、より長い期間にわたるが、１ｍｌ当たりの活性（酵素）単位のより低い濃度を保持または提供することが可能である一方で、より短い期間ではあるが、「短期間（ｓｈｏｒｔ）」または「急速（ｆａｓｔ）」放出性キャリア（例えば含嗽剤等の）は、１ｍｌ当たりの活性（酵素）単位の高濃度を保持または提供することが可能であることに注意すべきである。１ｍｌ当たりの活性単位量および暴露時間の継続期間は、感染の性質、処置が予防的または治療的であるかどうか、および他の変数に依存する。したがって、用量回数は、状況に依存し、１日以上当たり１回〜４回の範囲でありえ、継続期間は１日から複数の週までである。感染は、皮膚に生じることができるため、米国特許第６，０５６，９５４号および第６，０５６，９５５号に記載されるもの等の周知のビヒクルを用いて、該組成物を局所的適用のためにも配合することが可能である。
【０１７６】
通常は胞子形態の細菌が鼻に吸入されるときに、大部分のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染が生じる。その時、胞子は、体内および肺内にさらに吸入され、そこで一連の工程を介して、胞子は発芽して、全身感染および死亡を生じることができる。したがって、可能な限りすぐに感染を処置することが重要であり、好ましくは、胞子が鼻腔または口腔内にある間に処置する。感染を処置するときは、キャリアは、溶菌酵素（および／またはキメラ溶菌酵素および／または改造溶菌酵素）が最も効果的であるように発芽剤、好ましくはＬ−アラニンをさらに含むべきである。
【０１７７】
別の実施形態では、修飾溶菌酵素の治療効果を増強するのに有効な量の弱界面活性剤を用いることが可能である。適当な弱界面活性剤としては、特に、ポリオキシエチレンソルビタンのエステル類および脂肪酸のエステル類（Ｔｗｅｅｎ系列）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ系列）、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−チオグルコピラノシド、ｎ−デカル−ベータ−Ｄグルコピラノシド、ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、および生物学的に発生する界面活性剤、例えば、脂肪酸類、グリセリド類、モノグリセリド類、デオキシコレート、およびデオキシコレートのエステル類が挙げられる。他の処置の全てのように、炭疽を罹患または伝染する任意の哺乳類種または任意の動物種でこの処置を用いることが可能である一方で、この産物の最も一般的な使用を、細菌戦争またはテロリズム下にあるヒトに対しておこなうことができる。
【０１７８】
上記で言及したように、溶菌酵素ならびにキメラ溶菌酵素および／または改造溶菌酵素、あるいはそれらのペプチドフラグメントを粘膜内部に指向させ、そこで存在して、それらは、コロニー形成する疾患細菌を殺滅する。本明細書に開示および記載されるように、粘膜内部としては、例えば、上および下気道、眼、口腔、鼻、直腸、膣、歯周ポケット、腸、および結腸が挙げられる。粘膜組織の天然の除去または浄化メカニズムのために、従来の用量形態は、任意の有意な時間長さで、適用部位で保有されない。
【０１７９】
これらの理由および他の理由のために、期間にわたって、１種類以上のファージ酵素および他の補助的な物質とともに投与される粘膜組織に付着を示す物質を有することが有利である。調節された放出能力を有する物質が特に望ましく、持効性粘膜粘着剤の使用が大きく注目されている。
【０１８０】
Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（米国特許第４，６１５，６９７号、本明細書中に参考として援用）は、粘膜薬剤送達で用いられる種々の調節放出性ポリマー組成物の評価を提供しており、該特許は、調節放出性処置組成物について記載しており、これは、生体粘着剤および有効量の処置剤を含む。生体粘着剤は、（ａ）反復単位の少なくとも約８０％が少なくとも１つのカルボキシル官能基を含有する多数の反復単位と、（ｂ）ポリアルケニルポリエーテルを実質的に含まない約０．０５から約１．５％の架橋剤とを含有し、かつ水により膨張することが可能であるが水に溶けない繊維性の架橋型カルボキシ官能ポリマーである。Ｒｏｂｉｎｓｏｎのポリマーは、水により膨張するが溶けない一方で、該ポリマーは、架橋されており、熱可塑性ではなく、本明細書のコポリマー系ほどは活性物質とともにかつ様々な用量形態中に容易に配合されない。ミセルおよびマルチラメラ・ミセルを用いて、酵素の放出の調節をすることも可能である。
【０１８１】
親水性および疎水性物質の組み合わせである粘膜粘着剤を含む他の手法が既知である。Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ＆Ｃｏ製のＯｒａｈｅｓｉｖｅ（登録商標）は、口腔粘膜に付着させるために粘着性の炭化水素ポリマー中でペクチン、ゲラチン、およびカルボキシルメチルセルロースナトリウムを組み合わせている粘着剤である。しかし、このような親水性および疎水性成分の物理的混合物は、最終的にはばらばらに分解される。対照的に、本発明の親水性および疎水性ドメインは、不溶性のコポリマーを産生する。
【０１８２】
米国特許第４，９４８，５８０号（参考として援用される）は、生体粘着性口腔薬剤送達系について記載している。その組成物は、分散ポリエチレンを含有する鉱油等の軟膏基剤内に分散させたコポリマーポリ（メチルビニルエーテル／無水マレイン酸）およびゼラチンから形成される凍結乾燥ポリマー混合物を含む。米国特許第５，４１３，７９２号（本明細書中に参考として援用）は、（Ａ）３：６から６：３の重量比率で好適に存在するポリオルガノシロキサンおよび水溶性ポリマー物質を含むベースト状基剤と、（Ｂ）活性成分とを含むペースト状の製剤を開示している。米国特許第５，５５４，３８０号は、少なくとも２つの相を有する油中水系を含有する固体または半固体の生体粘着性経口摂取可能薬物送達系を請求している。１つの相は、約２５容積％から約７５容積％の内側の親水性相を含み、もう１つの相は、約２３容積％から約７５容積％の外側の疎水性相を含み、この際この外側の疎水性相は、３つの成分、すなわち（ａ）乳化剤、（ｂ）グリセリドエステル、および（ｃ）蝋物質から構成される。
【０１８３】
米国特許第５，９４２，２４３号は、本発明の実施形態にしたがって抗菌剤を投与するために有用な複数の代表的な放出性物質について記載している。
【０１８４】
一実施形態では、生物学的活性物質の調節放出のために、親水性主鎖および疎水性グラフト鎖を含むグラフト・コポリマーから本質的になるポリマー粘膜粘着剤を含有する治療用組成物を特徴とする。グラフト・コポリマーは、（１）エチレン性不飽和官能基を有するポリスチレン・マクロモノマーと、（２）エチレン性不飽和官能基を有する少なくとも１種類の親水性酸性モノマーとの反応産物である。グラフト鎖は、ポリスチレンおよび親水性モノマー部の主ポリマー鎖から本質的になり、該親水性モノマー部のいくつかは酸性官能基を有する。グラフト・コポリマー中のポリスチレン・マクロモノマーの重量％は、約１〜約２０％であり、グラフト・コポリマー中の全親水性モノマーの重量％は、約８０〜９９％であり、この際、上記全親水性モノマーの少なくとも１０％は酸性であり、該グラフト・コポリマーは、完全に水和されるとき、少なくとも９０％の平衡水含有量を有する。
【０１８５】
コポリマーを含有する組成物は、適用部位での組織液の吸収により徐々に水和し、粘膜表面に付着を示す非常に柔らかいゼリー状の塊を生成する。期間の間で、組成物は、粘膜表面に付着し、該組成物は、粘膜組織により吸収される薬理学的に活性な物質の徐放性を提供する。
【０１８６】
これらの実施形態の組成物の粘膜粘着性は、大部分、ポリスチレングラフトコポリマー内の鎖の親水性酸性モノマーによって生成される。酸性モノマーとしては、限定はされないが、アクリル酸、メタクリル酸、２−アクリルアミド−２−メチル−プロパンスルホン酸、２−スルホエチルメタクリラート、およびビニルホスホン酸が挙げられる。他の共重合可能なモノマーとしては、限定はされないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、グリセリルメタクリラート、ポリエチレングリコールモノメタクリラート等が挙げられる。
【０１８７】
本開示の組成物は、任意に、組成物の粘膜粘着性に対して有害な効果を引き起こすことのない量で、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルピロリドン）、カルボキシメチルセルロースナトリウム可塑剤、および他の薬学的に受容可能な賦形剤等の他のポリマー物質を含有することが可能である。本開示の組成物の投薬量形態を従来の方法によって調製することができる。
【０１８８】
感染処置を促進するために、治療剤は、溶菌酵素の殺菌活性を増強することもできる少なくとも１種類の相補的物質をさらに含むことが可能である。相補的物質は、溶菌酵素の治療効果を相乗的に高めるために有効な量のエリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、マクロライドファミリーの他のメンバー、ペニシリン、セファロスポリンおよびその任意の組み合わせであり得る。実質的に、任意の他の抗生物質を修飾溶菌酵素とともに用いることが可能である。同様に、他の溶菌酵素をキャリア内に含んで、他の細菌感染を処置することが可能である。ホリンタンパク質を治療的処置に包含することが可能である。
【０１８９】
一旦Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓが鼻口腔を通過したら、全身感染の可能性が増加する。したがって、感染を非経口で処置することが必要となる。
【０１９０】
使用できる酵素は、上記のように、溶菌酵素、キメラ溶菌酵素、改造溶菌酵素、およびその組み合わせである。筋肉内、静脈内、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、またはその組み合わせで酵素を投与することができる。静脈内処置は、十分に感染した炭疽感染の最善の処置である可能性が最も高い。
【０１９１】
一実施形態では、適当な改造および／またはキメラ溶菌酵素ならびに酵素用のキャリアを含む治療剤を患者に注入することによって、感染を処置することが可能である。キャリアは、蒸留水、生理食塩水、アルブミン、血清、または任意のその組み合わせから構成され得る。より具体的には、輸液または注射用の溶液を従来の様式で調製することが可能であり、該方法は、例えばｐ−ヒドロキシベンゾエート等の保存料またはエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩等の安定剤を添加して、その後融合用容器、注射用バイアル、またはアンプルへ移すことが可能である。また、他の成分とともにまたは他の成分を含まずに、注射用の化合物を凍結乾燥して、使用時に、適宜、緩衝溶液または蒸留水中で可溶化することが可能である。不揮発性油、リポソーム、およびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルも本明細書で有用である。他のファージ関連溶菌酵素を、ホリンタンパク質とともに、組成物中に含むことが可能である。
【０１９２】
筋肉内注入が選択された投与様式である場合、好ましくは、等張処方物を用いる。一般に、等張性のための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが挙げられ得る。いくつかの場合では、リン酸緩衝生理食塩水等の等張溶液を用いる。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤を処方物に添加する。薬学的調製物は、無菌および発熱物質非含有で提供される。一般に、上記のように、静脈内注入が最も適切であり得る。
【０１９３】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質等の少量の添加物を適切に含有する。このような物質は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、グリシン、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、またはアルギニン）、単糖、二糖、および他の糖質（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロース、あるいはデキストリンを含む）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、対イオン（例えば、ナトリウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ならびに／あるいは中性塩（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２）等を含む。
【０１９４】
グリセリンまたはグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）は、薬学的使用のために市販されている。注入用の無菌水、あるいは塩化ナトリウム注入または他の薬学的に受容可能な水性注入液体でそれを希釈して、０．１から１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは１．０から５０％、より好ましくは約２０％の濃度で用いることが可能である。
【０１９５】
ＤＭＳＯは、多くの局所的に適用される薬物の浸透を高める際立った能力を有する非プロトン性溶媒である。注入用の無菌水、あるいは塩化ナトリウム注入または他の薬学的に受容可能な水性注入液体でＤＭＳＯを希釈して、０．１から１００％（ｖ／ｖ）の濃度で用いることが可能である。
【０１９６】
キャリアビヒクルは、特に静脈内溶液を調製する場合は、リンガー溶液、緩衝溶液、およびデキストロース溶液を含むことも可能である。
【０１９７】
酵素をキャリア系または経口送達様式に入れる前または入れる時に、約４．０と約８．０、より好ましくは約６．５と約７．５の間のｐＨ範囲を維持する安定化緩衝液環境内に酵素があることが望ましい。
【０１９８】
安定化緩衝液は、酵素の最適活性を可能にする。該緩衝液は、ジチオスレイトール等の還元剤でもよい。安定化緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩等の金属キレート試薬であってもよく、または金属キレート試薬を含んでもよく、あるいはリン酸緩衝液またはクエン酸−リン酸緩衝液を含有してもよい。キャリア内に見出される緩衝液は、溶菌酵素に対する環境を安定化するために機能することができる。
【０１９９】
非経口で投与される酵素の有効な投薬量の割合または量および処置の継続期間は、感染の重篤度、患者の体重、レシピエントが感染性細菌にさらされる継続期間、感染の重篤度、および種々の多数の他の変数に部分的に依存する。１日１回から数回で組成物を適用することが可能であり、短期間または長期間で適用することが可能である。用法は、数日から数週間続けてよい。用いられる任意の投薬量形態は、最小時間量に対して最小数の単位を提供すべきである。酵素の活性単位の濃度は、有効量を提供すると考えられ、また、酵素の投薬量は、組成物１ｍｌ当たり約１００単位から約１０，０００，０００単位の範囲、約１０００単位／ｍｌから約１０，０００，０００単位／ｍｌの範囲、および約１０，０００から１０，０００，０００単位／ｍｌの範囲であり得る。１ｍｌ当たりの活性単位量および暴露時間の継続期間は、感染の性質およびキャリアにより溶菌酵素が有することが可能になる接触量に依存する。酵素は、流動性環境内にある場合、最もよく作用することに注意すべきである。したがって、酵素の有効性は、部分的に、キャリアによって捕捉される水分量に関連する。処置に対する酵素の濃度は、血液および血液容量内の細菌数に依存する。
【０２００】
感染処置を促進するために、治療剤は、溶菌酵素の殺菌活性を増強することもできる少なくとも１種類の補助的物質をさらに含むことが可能である。補助的物質は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに対して有効な任意の抗生物質であり得る。同様に、他の溶菌酵素を含んで、他の細菌感染を処置することが可能である。
【０２０１】
さらに、多数の方法を用いて、細胞膜を越えて酵素を輸送する際に補助することができる。酵素を既知の技術によってリポソームに「挿入して（ｉｎｓｅｒｔｅｄ）」、酵素をリポソームで輸送することができる。同様に、酵素を逆ミセル内に入れることが可能である。酵素をポリエチレングリコール付加することもでき、酵素の非活性部分にポリエチレングリコールを連結する。また、疎水性分子を用いて、細胞膜を越えて酵素を輸送することができる。最終的には、酵素のグリコシル化を用いて、細胞膜上で、特異的な内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）受容体を標的することができる。
【０２０２】
製薬使用目的のために、任意数の異なる方法によって、溶解素を生産することが可能である。上記Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なバクテリオファージによって送達される遺伝コードで該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを感染させることによって、溶菌酵素を産生する。本開示の別の実施形態では、配列番号１の塩基配列またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の塩基の相補体とハイブリダイズする配列を有するＤＮＡを含む核酸からの組み換え的生産によって、溶菌酵素を生産する。ファージゲノムから溶菌酵素に対する遺伝子を除去して、該遺伝子を運搬ベクターに導入し、該運搬ベクターを発現系中にクローニングすることによって、溶菌酵素を産生することが可能であり、この場合、運搬ベクターは、プラスミドである。発現系は、上に列記した群の任意のものから、または最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓからなる群から選択される細菌であり得る。
【０２０３】
酵素の別の発現系生成は、無細胞発現系によるものである。
【０２０４】
本明細書に開示される実施形態は、γファージまたはＰｌｙＧ溶菌酵素の使用に限定されない。実際に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的であり、かつ単独でＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的であるバクテリオファージに遺伝学的にコードされる任意の溶菌酵素を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを同定および処置することが可能である。
【０２０５】
さらに、他の細菌に特異的な他の特定のファージ関連溶菌酵素を、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的な任意のファージ関連溶菌酵素を含有または構成する組成物とともに含むことが可能である。
【０２０６】
全ての引用参考文献は本明細書に援用される。
【０２０７】
上記の教示を鑑みて、本開示の多くの改変および変更が可能である。当業者に容易に自明なそのような他の改変および変更は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる。添付の特許請求の範囲では、「１つの（ａ）および（ａｎ）」ならびに「特定の（ｔｈｅ）」等の項目は、そうではないことが明記されていない限り、１つまたは１つより多いことを意味し得る。群の１つまたは１つより多いメンバー間で「もしくは、または、あるいは（ｏｒ）」を含む特許請求の範囲は、所定の産物またはプロセスで、群のメンバーの１つ、１つより多く、またはすべてが使用される場合に満たされると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】図１は、γ溶解素に対する配列である。
【図２】図２は、公知の細胞壁アミダーゼを有するｇ溶解素ＰｌｙＧの配列アラインメントである。
【図３】図３は、精製ＰｌｙＧのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【図４】図４は、アメリカ、欧州、アジア、およびアフリカから得たＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ単離物のセットである。
【図５】図５は、Ｂａｃｉｌｌｕｓの異なる菌株に関するｇ酵素の殺滅率を示すグラフである。
【図６】図６は、ＢａｃｉｌｌｕｓのＲＳＶＦ１菌株を溶菌するｇ酵素によって引き起こされる細胞内ＡＴＰの即時放出（ホタルルシフェリン／ルシフェラーゼによる発光として測定）を示すグラフである。
【図７】図７は、ＲＳＶＦ１死滅の動力学的分析を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｂａｃｉｌｌｕｓの正常な糸状ＲＳＶＦ１菌株の顕微鏡写真である。
【図９】図９は、溶菌酵素への暴露後３０秒の短竿状形態およびミニ細胞状形態を示すＢａｃｉｌｌｕｓのＲＳＶＦ１菌株の顕微鏡写真である。
【図１０】図１０は、酵素への暴露後１５分に生じた細胞質物質のほぼ完全な消失を示すＢａｃｉｌｌｕｓのＲＳＶＦ１菌株の顕微鏡写真である。
【図１１】図１１は、局所的細胞壁加水分解の領域から突出する細胞膜を現したＢａｃｉｌｌｕｓのＲＳＶＦ１菌株の竿状形態の顕微鏡写真である。
【図１２】図１２は、ＢａｃｉｌｌｕｓのＲＳＶＦ１菌株の破裂を示すＢａｃｉｌｌｕｓのＲＳＶＦ１菌株の顕微鏡写真である。
【図１３】図１３は、ＲＳＶＦ１に感染させたＰｌｙＧ処置ＢＡＬＢ／ｃマウスの生存を示すグラフである。
【図１４】図１４は、胞子生存率に対するＰｌｙＧの効果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、発芽胞子の特異的検出を示すグラフである。
【図１６】図１６は、胞子混合物中の発芽ＲＳＶＦ１胞子の検出を示すグラフである。
【図１７】図１７は、ＰｌｙＧ処置後の１００個のＲＳＶＦ１胞子の検出を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年4月27日(2005.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染の処置のための医薬の製造における組成物の使用であって、該組成物は、以下：
（ａ）配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する単離されたアミノ酸配列、および
（ｃ）２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、
からなる群から選択される、単離されたポリペプチドを含む、使用。
【請求項２】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
請求項１に記載の使用であって、前記溶菌酵素が、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する第１の単離されたアミノ酸配列を含み；そして、ここで、該溶菌酵素で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該溶菌酵素で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（ａ）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該溶菌酵素と約２分間接触させる工程；および、次いで、
（ｂ）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（ｃ）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含する、使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、前記溶菌酵素が、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する第１の単離されたアミノ酸配列を含み；そして、ここで、
（ａ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該溶菌酵素を該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；または
（ｂ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該溶菌酵素に接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する
、使用。
【請求項５】
請求項１に記載の使用であって、前記溶菌酵素が、２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列であって；そして、ここで、該溶菌酵素で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該溶菌酵素で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（ａ）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性試験細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該溶菌酵素と約２分間接触させる工程；および、次いで、
（ｂ）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（ｃ）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含する、使用。
【請求項６】
請求項１に記載の使用であって、前記溶菌酵素が、２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列であり；そして、ここで、
（ａ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該溶菌酵素を該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；または
（ｂ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該溶菌酵素に接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する
、使用。
【請求項７】
前記組成物が改造溶菌酵素、キメラ溶菌酵素またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記溶菌酵素が、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに特異的である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記組成物が、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なホリンタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物がキャリアをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記組成物が、感染部位に前記溶菌酵素を送達するために適切なビヒクルをさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物がさらに抗生物質を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
感染の処置のための医薬の製造のための組成物の使用であって、ここで、該組成物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされる少なくとも１種の溶菌酵素を含み、該溶菌酵素は、配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する単離されたアミノ酸配列、および２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、からなる群から選択される単離されたアミノ酸配列を含み、ここで、
（ａ）該溶菌酵素で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該溶菌酵素で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（ｉ）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌またはＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該溶菌酵素と約２分間接触させる工程；および、次いで、
（ｉｉ）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（ｉｉｉ）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含するか、あるいは
（ｂ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該溶菌酵素を該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；あるいは
（ｃ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該溶菌酵素に接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する、
使用。
【請求項１４】
前記組成物がさらに、感染部位に送達するためのキャリアおよびビヒクルをさらに含み、かつ、必要に応じてさらに抗生物質を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物がさらにホリンタンパク質を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢ．ｃｅｒｅｕｓ細菌へ曝露されたか、または曝露される危険性のある被験体の処置のための医薬の製造のための組成物の使用であって、該使用は、以下：
（ａ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む治療用組成物を患者に投与する工程を包含し；
（ｂ）ここで、
（ｉ）該ポリペプチドで処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該ポリペプチドで処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（１）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性試験細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該ポリペプチドと約２分間接触させる工程；および、次いで、
（２）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（３）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含するか、あるいは
（ｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該ポリペプチドを該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；あるいは
（ｉｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該ポリペプチドに接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する、
使用。
【請求項１７】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに曝露されたか、または曝露される危険性のある被験体を同定する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの胞子を分解するための使用であって、以下：
（ａ）Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの胞子に曝露したかもしくは曝露される危険性のあるサンプルを、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む組成物に接触させる工程を包含し；
（ｂ）該組成物を用いるＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのＬ−アラニン殺傷アッセイを実施することによって、Ｄ−アラニンアッセイと比較して、ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ胞子の生存率が少なくとも約１０３倍減少する
、使用。
【請求項１９】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌またはＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の集団を減少し、変異誘発に抵抗性である化合物を同定する方法であって、該方法は以下：
（ａ）Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌またはＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌を含む細菌集団を提供する工程；
（ｂ）変異原性試薬を用いて該細菌集団を処理する工程；
（ｃ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドに該細菌集団を接触させる工程であって、１５０ｍｇ  ｍｌ−１のストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐＲ）または３．５ｍｇ  ｍｌ−１のノボビオシン（ｎｏｖＲ）に対して抵抗性を付与する該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの変異頻度が、２０Ｕの該ポリペプチドを用いる処理後に、５．０×１０−９未満である、工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
製品であって、以下：
（ａ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む組成物を含有する容器であって；ここで
（ｉ）該組成物で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該組成物で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（１）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌またはＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該ポリペプチドと約２分間接触させる工程；および、次いで、
（２）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（３）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含するか、あるいは
（ｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該ポリペプチドを該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；あるいは
（ｉｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該ポリペプチドに接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する、
容器、ならびに
（ｂ）以下：
（ｉ）Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌またはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの胞子に曝露されたことが予測される患者を同定する工程；および
（ｉｉ）該患者に有効量の該組成物を投与する工程
を包含する方法において、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌またはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの胞子に曝露された該患者の処置における該組成物の使用のための指示書
を備える、製品。
【請求項２１】
パッケージング材料と、該パッケージング材料内に含まれる治療用組成物とを含む製品であって、
（ａ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを含む治療用組成物であって；ここで
（ｉ）該組成物で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該組成物で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（１）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性試験細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該ポリペプチドと約２分間接触させる工程；および、次いで、
（２）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（３）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含するか、あるいは
（ｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該ポリペプチドを該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；あるいは
（ｉｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該ポリペプチドに接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する、
組成物、ならびに
（ｂ）該パッケージング材料が、該治療用組成物は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌への曝露、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子への曝露およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ細菌による感染からなる群から選択される状態を処置するために使用され得ることを示すラベルを含む、製品。
【請求項２２】
感染の処置のための組成物であって、ここで、該組成物は、少なくとも１種の溶菌酵素を含み、該溶菌酵素は、以下：
（ａ）配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する単離されたアミノ酸配列、および
（ｃ）２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、
からなる群から選択される、単離されたポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２３】
前記単離されたポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載の組成物であって、前記溶菌酵素が、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する第１の単離されたアミノ酸配列を含み；そして、ここで、該溶菌酵素で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該溶菌酵素で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（ａ）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該溶菌酵素と約２分間接触させる工程；および、次いで、
（ｂ）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（ｃ）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含する、組成物。
【請求項２５】
請求項２２に記載の組成物であって、前記溶菌酵素が、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する第１の単離されたアミノ酸配列を含み；そして、ここで、
（ａ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該溶菌酵素を該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；または
（ｂ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該溶菌酵素に接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する
、組成物。
【請求項２６】
請求項２２に記載の組成物であって、前記溶菌酵素が、２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列であって；そして、ここで、該溶菌酵素で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該アミノ酸配列で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（ａ）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性試験細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該溶菌酵素と約２分間接触させる工程；および、次いで、
（ｂ）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（ｃ）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含する、組成物。
【請求項２７】
請求項２２に記載の組成物であって、前記溶菌酵素が、２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列であり；そして、ここで、
（ａ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該溶菌酵素を該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；または
（ｂ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該溶菌酵素に接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する
、組成物。
【請求項２８】
前記組成物が改造溶菌酵素、キメラ溶菌酵素またはこれらの組合せを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記溶菌酵素が、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに特異的である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物が、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的なホリンタンパク質をさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物がキャリアをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、感染部位に前記溶菌酵素を送達するために適切なビヒクルをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物がさらに抗生物質を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３４】
感染の処置のための組成物であって、ここで、該組成物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされる少なくとも１種の溶菌酵素を含み、該溶菌酵素は、配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有する単離されたアミノ酸配列、および２５までのアミノ酸置換を有する配列番号１のポリペプチドの単離されたアミノ酸配列、からなる群から選択される単離されたアミノ酸配列を含み、ここで、
（ａ）該溶菌酵素で処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該溶菌酵素で処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（ｉ）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌またはＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該溶菌酵素と約２分間接触させる工程；および、次いで、
（ｉｉ）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（ｉｉｉ）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含するか、あるいは
（ｂ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該溶菌酵素を該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；あるいは
（ｃ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該溶菌酵素に接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する、
組成物。
【請求項３５】
前記組成物がさらに、感染部位に送達するためのキャリアおよびビヒクルをさらに含み、かつ、必要に応じてさらに抗生物質を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物がさらにホリンタンパク質を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢ．ｃｅｒｅｕｓ細菌へ曝露されたか、または曝露される危険性のある被験体の処置のための組成物であって、以下：
（ａ）配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチドを包含し；
（ｂ）ここで、
（ｉ）該ポリペプチドで処理されたＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓのサンプルから放出されたＡＴＰの発光アッセイにおいて発された光が、該ポリペプチドで処理されたＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １４５７９についての発光よりも少なくとも１００倍高く、該ＡＴＰの発光アッセイが、以下：
（１）約１．０×１０４のフィルター固定化植物性試験細菌を、約１５０ｍＬの総容量を有する溶液中約２Ｕの該ポリペプチドと約２分間接触させる工程；および、次いで、
（２）該溶液に約５０ｍＬのルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を添加する工程；および
（３）約１０秒のインテグレーションで該放出された光を測定する工程
を包含するか、あるいは
（ｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌の６００ｎｍにおける細菌吸光度が、２Ｕの該ポリペプチドを該ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓに接触後１０分以内に、少なくとも５倍減少するか；あるいは
（ｉｉｉ）約１ｍＬの約１０８ＣＦＵの対数期ＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細菌含有物を、３７℃にて５分間２Ｕの該ポリペプチドに接触させることによって、サンプル中のＲＳＶＦ１  Ｂ．ｃｅｒｅｕｓの集団が少なくとも１０６ＣＦＵ減少する、
組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006513149000001.app
【国際調査報告】
2006513149.tif 000021
2006513149.tif 000022
2006513149.tif 000023