(57)【要約】本発明は、一般に自己免疫性糖尿病などのような自己免疫疾患の症状を治療もしくは改善、または発症のリスクを抑制もしくはさもなければ最小限に抑える方法に関する。特に、本発明は免疫寛容および／または防御免疫を誘発する抗原提示細胞の元となる一つまたは複数の自己抗原をコードする遺伝物質を発現する遺伝的に修飾された造血幹細胞および／または造血前駆細胞の使用に関する。従って、本発明は、I型糖尿病のような自己免疫疾患状態の治療および／または予防のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患に関連する自己抗原を提示する抗原提示細胞（APC）を作製するための方法であって、被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、該自己抗原をコードする遺伝物質を、HSCおよび／またはHPCが該自己抗原を産生するように該遺伝物質が発現する条件下において、一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法。
【請求項２】
APCが樹状細胞、Bリンパ球、上皮細胞、単球およびマクロファージからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
APCが樹状細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
被験者がヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、トリ、ニワトリ、チャボ、ガチョウ、およびシチメンチョウからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
HCSおよび／またはHPCが寛骨由来の骨髄、骨髄、臍帯血、肝由来の血液、組織由来の血液、およびPBMCからなる群より選択される供給源に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
HSCおよびHPCが寛骨由来の骨髄に由来する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
自己抗原がI型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病、全身性ループス、クローン病、心筋症、溶血性貧血、線維筋痛、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、好中球減少症、乾癬、慢性疲労症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病、強皮症、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、橋本病、複合性結合織疾患、間質性膀胱炎、悪性貧血、白質脳炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、原発性胆汁性肝硬変、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、自己免疫性アジソン病、慢性活動性肝炎、尋常性白斑、自己免疫性高脂血症、自己免疫性心筋炎、側頭動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、軸索型および神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、アレルギー性喘息、骨関節炎、シャーガス病、ブドウ膜炎、慢性炎症性脱髄性多発性根神経障害（CIDP）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎、円板状ルーパス、レンズ抗原性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、ドレスラー症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、グッドパスチャー症候群、アレルギー性鼻炎、ギラン・バレー症候群、低γグロブリン血症、封入体筋炎、小水疱水疱性皮膚症、ヴェゲナー肉芽腫症、メニエール病、ランバート-イートン症候群、モーレン潰瘍、非典型的セリアック病、眼球瘢痕性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、心膜切開後症候群、強膜炎、精子および睾丸自己免疫、全身強直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、交感性眼炎、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、多腺性自己免疫性症候群1型、多腺性自己免疫性症候群2型、悪性貧血、および子宮内膜症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
自己抗原がプロインスリン、またはその免疫原性相同体、抗原誘導体、部分、断片もしくは一部である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
プロインスリンがヒト由来である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであり、該プロインスリンがウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットから選択される群に由来する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患に関連する自己抗原を提示するAPCを被験者に導入する工程を含む被験者の自己免疫疾患を予防または治療する方法であって、被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、該自己抗原をコードする遺伝物質を、該遺伝物質が発現してHSCおよび／またはHPCが該自己抗原を産生するような条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法。
【請求項１４】
APCが樹状細胞、Bリンパ球、上皮細胞、単球およびマクロファージから選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
APCが樹状細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
被験者がヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、トリ、ニワトリ、チャボ、ガチョウおよびシチメンチョウからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
被験者がヒトである、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
細胞が寛骨からの骨髄、骨髄、臍帯血、肝からの血液、組織からの血液、およびPBMCに由来する、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
細胞が寛骨からの骨髄に由来する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
自己抗原が、I型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病、全身性ループス、クローン病、心筋症、溶血性貧血、線維筋痛、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、好中球減少症、乾癬、慢性疲労症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病、強皮症、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、橋本病、複合性結合織疾患、間質性膀胱炎、悪性貧血、白質脳炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、原発性胆汁性肝硬変、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、自己免疫性アジソン病、慢性活動性肝炎、尋常性白斑、自己免疫性高脂血症、自己免疫性心筋炎、側頭動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、軸索型および神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、アレルギー性喘息、骨関節炎、シャーガス病、ブドウ膜炎、慢性炎症性脱髄性多発性根神経障害（CIDP）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎、円板状ルーパス、レンズ抗原性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、ドレスラー症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、グッドパスチャー症候群、アレルギー性鼻炎、ギラン・バレー症候群、低γグロブリン血症、封入体筋炎、小水疱水疱性皮膚症、ヴェゲナー肉芽腫症、メニエール病、ランバート-イートン症候群、モーレン潰瘍、非典型的セリアック病、眼球瘢痕性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、心膜切開後症候群、強膜炎、精子および睾丸自己免疫、全身強直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、交感性眼炎、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、多腺性自己免疫性症候群1型、多腺性自己免疫性症候群2型、悪性貧血、および子宮内膜症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項13記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項13記載の方法。
【請求項２２】
自己抗原がプロインスリンまたはその免疫原性相同体、誘導体、部分、断片もしくは一部である、請求項13記載の方法。
【請求項２３】
プロインスリンがヒト由来である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであって、該プロインスリンがブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットからなる群に由来する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
被験者における自己免疫疾患を治療または予防するための方法であって、
（a）被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程；
（b）該自己抗原をコードする遺伝物質を、HSCおよび／またはHPCが該自己抗原を産生するように該遺伝物質が発現する条件下において、一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程；および
（c）遺伝的に修飾された該細胞を該被験者に注入または導入する工程を含む方法。
【請求項２６】
HSCおよび／またはHPCがサイトカイン介在性の動員（mobilisation）を受ける、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
被験者がヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、トリ、ニワトリ、チャボ、ガチョウおよびシチメンチョウからなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
被験者がヒトである、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
HSCおよびHPCが寛骨由来の骨髄、骨髄、臍帯血、肝由来の血液、組織由来の血液およびPBMCから選択される供給源に由来する、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
HSCおよびHPCが寛骨由来の骨髄に由来する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
自己抗原がI型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病、全身性ループス、クローン病、心筋症、溶血性貧血、線維筋痛、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、好中球減少症、乾癬、慢性疲労症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病、強皮症、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、橋本病、複合性結合織疾患、間質性膀胱炎、悪性貧血、白質脳炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、原発性胆汁性肝硬変、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、自己免疫性アジソン病、慢性活動性肝炎、尋常性白斑、自己免疫性高脂血症、自己免疫性心筋炎、側頭動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、軸索型および神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、アレルギー性喘息、骨関節炎、シャーガス病、ブドウ膜炎、慢性炎症性脱髄性多発性根神経障害（CIDP）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎、円板状ルーパス、レンズ抗原性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、ドレスラー症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、グッドパスチャー症候群、アレルギー性鼻炎、ギラン・バレー症候群、低γグロブリン血症、封入体筋炎、小水疱水疱性皮膚症、ヴェゲナー肉芽腫症、メニエール病、ランバート-イートン症候群、モーレン潰瘍、非典型的セリアック病、眼球瘢痕性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、心膜切開後症候群、強膜炎、精子および睾丸自己免疫、全身強直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、交感性眼炎、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、多腺性自己免疫性症候群1型、多腺性自己免疫性症候群2型、悪性貧血、および子宮内膜症からなる群より選択される疾患に関連する、からなる群より選択される疾患に関連する、請求項25記載の方法。
【請求項３２】
自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項25記載の方法。
【請求項３３】
自己抗原がプロインスリンまたはその免疫原性相同体、誘導体、部分、断片もしくは一部である、請求項25記載の方法。
【請求項３４】
プロインスリンがヒト由来である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであって、該プロインスリンがブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットからなる群より選択される供給源に由来する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
被験者からHSCおよび／またはHPCの供給源を受けるために改造された最初の区画；自己抗原をコードする遺伝物質を含むように改造された二番目の区画；任意で試薬を含むように改造された三番目またはより多くの区画を含む多くの区画に分かれた形のキットであって、被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、該自己抗原をコードする遺伝物質を該遺伝物質が発現してHSCおよび／またはHPCが該自己抗原を産生するような条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法における使用のための説明書を含むキット。
【請求項３７】
導入されたAPCを含む被験者であって、該APCが被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、該自己抗原をコードする遺伝物質を該遺伝物質が発現してHSCおよび／またはHPCが該自己抗原を産生するような条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法を用いて作製される被験者。
【請求項３８】
疾患に関連する、自己抗原を提示するように遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCから作製されるAPCの自己免疫疾患の治療のための医薬品の製造における使用。
【請求項３９】
APCが樹状細胞、Bリンパ球、上皮細胞、単球およびマクロファージからなる群より選択される、請求項38記載の使用。
【請求項４０】
APCが樹状細胞である、請求項2記載の使用。
【請求項４１】
HSCおよび／またはHPCがヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ニワトリ、チャボ、ガチョウ、およびシチメンチョウからなる群より選択される供給源に由来する、請求項38記載の使用。
【請求項４２】
HSCおよび／またはHPCがヒトに由来する、請求項41記載の使用。
【請求項４３】
HSCおよび／またはHPCが寛骨由来の骨髄、骨髄、臍帯血、肝由来の血液、組織由来の血液、およびPBMCからなる群より選択される供給源に由来する、請求項38記載の使用。
【請求項４４】
自己抗原がI型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病、全身性ループス、クローン病、心筋症、溶血性貧血、線維筋痛、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、好中球減少症、乾癬、慢性疲労症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病、強皮症、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、橋本病、複合性結合織疾患、間質性膀胱炎、悪性貧血、白質脳炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、原発性胆汁性肝硬変、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、自己免疫性アジソン病、慢性活動性肝炎、尋常性白斑、自己免疫性高脂血症、自己免疫性心筋炎、側頭動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、軸索型および神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、アレルギー性喘息、骨関節炎、シャーガス病、ブドウ膜炎、慢性炎症性脱髄性多発性根神経障害（CIDP）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎、円板状ルーパス、レンズ抗原性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、ドレスラー症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、グッドパスチャー症候群、アレルギー性鼻炎、ギラン・バレー症候群、低γグロブリン血症、封入体筋炎、小水疱水疱性皮膚症、ヴェゲナー肉芽腫症、メニエール病、ランバート-イートン症候群、モーレン潰瘍、非典型的セリアック病、眼球瘢痕性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、心膜切開後症候群、強膜炎、精子および睾丸自己免疫、全身強直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、交感性眼炎、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、多腺性自己免疫性症候群1型、多腺性自己免疫性症候群2型、悪性貧血、および子宮内膜症からなる群より選択される疾患に関連する、請求項38記載の使用。
【請求項４５】
自己免疫疾患がインスリン依存性糖尿病である、請求項38記載の使用。
【請求項４６】
自己抗原がプロインスリン、またはその免疫原性相同体、誘導体、部分、断片もしくは一部である、請求項38記載の使用。
【請求項４７】
プロインスリンがヒト由来である、請求項46記載の使用。
【請求項４８】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであり、該プロインスリンがブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットから選択される供給源に由来する、請求項38記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に自己免疫性糖尿病などのような自己免疫疾患の症状を治療もしくは改善、または発症のリスクを抑制もしくはさもなければ最小限に抑える方法に関する。特に、本発明は免疫寛容および／または防御免疫を誘発する抗原提示細胞の元となる一つまたは複数の自己抗原をコードする遺伝物質を発現する遺伝的に修飾された造血幹細胞および／または造血前駆細胞の使用に関する。従って、本発明は、I型糖尿病のような自己免疫疾患状態の治療および／または予防のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書において示される参照の詳細な文献一覧は、本明細書の末尾に列記する。
【０００３】
本明細書における先行技術に対する参照は、この先行技術がいずれかの国における広く一般的な知識の一部をなすことの承認または何らかの形の示唆ではなく、またそのように解釈されるべきではない。
【０００４】
インスリン依存性、即ち、I型糖尿病は、自己免疫に介在される膵島β細胞の破壊に起因するインスリンの欠乏によって惹起される。I型糖尿病被験者は、血糖値を制御するために、定期的なインスリン注射を必要とする。この方法で被験者を治療することができないと、死に至る可能性がある。
【０００５】
より長期間の治療方法は自己免疫状態の予防を主目的とすることが要求される。
【０００６】
現時点では膵臓移植がI型糖尿病の唯一の治療方法であるが、これは潜在的に有害である一生涯の免疫抑制剤を必要とすること、およびヒトドナーの死によって妨げられる。
【０００７】
最近では、臨床的に重度の自己免疫疾患を治療するために、骨髄（BM）または造血幹細胞（HSC）移植が用いられている（Burt et al., Blood 99: 768-784, 2002）。前臨床動物モデルでは、自然発生性の自己免疫疾患の有効な治療は疾患耐性系統からのBMまたはHSCの移植を必要とする。現在までのことろ、これは完全または混合キメラリズム（Li et al., J. Immunol. 156: 380-388, 1996; Kaufman et al., J. Immunol. 158: 2435-2442, 1997）に至る同種BM移植（BMT）によって達成されている（Ikehara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7743-7747, 1985; LaFace and Peck, Diabetes 38: 894-901, 1989; El-Badri et al., Transplantation 70: 870-877, 2000; Himeno and Good, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2235-2239, 1998; Kirzner et al., Biol. Blood Marrow Transplant. 6: 513-522, 2000）。しかし、宿主の細胞毒性馴化が必要であること、および移植片拒絶（Castro-Malaspina et al., Blood 99: 1943-1951, 2002）または移植片対宿主病（Ratanatharathorn et al., Bone Marrow Transplant 28: 121-129, 2001）のリスクのために、このアプローチは幅広い臨床応用に不適切である。
【０００８】
従って、自己免疫糖尿病およびその他の自己免疫疾患状態の発症を予防する代替となるストラテジーおよびアプローチを開発する必要がある。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
文脈からそうでないことが要求される場合を除いて、本明細書を通して「含む（comprise）」という用語または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」という語尾変化は、記載される要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群を含んで、その他の何らかの要素もしくは完全体、または要素もしくは完全体の群を排除しないことを意味することが理解される。
【００１０】
抗原を中でもB細胞、樹状細胞、上皮細胞またはマクロファージのような休止抗原提示細胞（APC）にターゲティングすることは、免疫学的無応答性（寛容）および／または防除免疫を誘発する方法として提唱されている。すべての免疫細胞は造血幹細胞（HSC）および造血前駆細胞（HPC）に由来するので、本発明に従って、自己抗原をコードするHSCおよび／またはHPCは自己抗原を発現するAPCに分化することが提唱される。次に、これらを、自己免疫疾患を予防するための抗原特異的療法として使用する。同系のHSCおよび／またはHPCの移植は宿主における馴化措置の必要を回避して、自己免疫疾患状態を予防または治療するための安全かつ有効な新規のストラテジーである。
【００１１】
自己免疫糖尿病に関して、プロインスリンが重要な自己抗原であることが提唱されている。
【００１２】
従って、本発明に従って、プロインスリンをコードするHSCおよび／またはHPCの同系移植は休止APCにおけるプロインスリンの発現を可能として、この結果、自己免疫糖尿病の発症が防止される。これは、自己免疫糖尿病およびその他の自己免疫状態に応用することのできる安全かつ有効な抗原特異的ストラテジーである。
【００１３】
従って、本発明は動物または鳥類における自己免疫介在性状態の予防またはそうでない場合は発症のリスクの軽減、および／または程度の軽減のための方法を企図する。この方法は、治療されるべき動物もしくは鳥類または適合可能なドナーからのHSCおよび／またはHPCの採取、特定の自己免疫疾患に関連する一つまたは複数の自己抗原をコードする遺伝物質を発現するようにそのHSCおよび／またはHPCの一部またはすべての遺伝的修飾、ならびに治療すべき動物または鳥類へのこれらの導入を伴う。APCによる自己抗原の提示は、T細胞の無応答性もしくは寛容および／または防御免疫を誘導することが提唱されている。HSCおよび／またはHPCは骨髄から採取されるか、または末梢血、臍帯血もしくは肝臓のようなその他の都合のよい部位から単離することができる。遺伝的に修飾されると、これらの細胞は末梢血に入るように被験者に全身性に注入される。この投与経路には、門脈を介するような肝臓への注入または導入が含まれる。
【００１４】
従って、一つの態様において、本発明は自己免疫疾患に関連する自己抗原を発現する抗原提示細胞（APC）を作製するための方法であって、被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、自己抗原をコードする遺伝物質をその遺伝物質が発現してHSCおよび／まはたHPCが自己抗原を産生するような条件下にて一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法を企図する。
【００１５】
一つの好ましい態様において、自己免疫疾患または状態はI型糖尿病である。しかし、本発明は一連の自己免疫疾患に拡大する。自己免疫糖尿病に関して、好ましい自己抗原はプロインスリンまたはその抗原性断片もしくは一部である。
【００１６】
最も好ましい動物はヒトであるが、本発明はその他の霊長類、ならびに家畜、実験動物、コンパニオンアニマル、捕獲された野生動物、ならびに駕籠に入れられた（飼育場の）トリ、家禽、および猟鳥のような鳥類に拡大する。
【００１７】
本発明は多くの区画に分かれた形のキットを提供して、このキットは被験者からHSCおよび／またはHPCの供給源を受けるために改造された最初の区画；自己抗原をコードする遺伝物質を含むように改造された二番目の区画：任意で試薬を含むように改造された三番目またはより多くの区画を含み、そのキットは被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、自己抗原をコードする遺伝物質をその遺伝物質が発現してHSCおよび／またはHPCが自己抗原を産生するような条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法における使用のための説明書を含む。
【００１８】
本明細書で用いられる略号の一覧を表1に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、自己免疫疾患状態を治療および／または予防するための安全かつ有効なプロトコルを提供する。
【００２１】
このプロトコルは一般に次の工程を伴う：
（i）被験者からHSCおよび／またはHPCの試料を採取する工程；
（ii）HSCおよび／またはHPCが自己免疫疾患に関連する一つまたは複数の自己抗原を産生するようにHSCおよび／またはHPCのすべてまたは一部を遺伝的に修飾する工程；および
（iii）遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCを同一の被験者または適合可能な被験者に導入して、細胞は最終的に自己抗原を発現するAPCとなる工程。
【００２２】
上記の工程は組み合わせることおよび／または順序を変更することが可能である。さらなる工程を含めることもできる。
【００２３】
ヒトの被験者および動物またはトリの被験者のような「被験者」を参照されたい。治療される動物に関連する「個体（individual）」および「被験者（subject）」という用語は互換的に用いることができる。「動物」は、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウマ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、ブタ）、実験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、または捕獲された野生動物を含む。「鳥類」には、駕籠または飼育場のトリ、家禽（例えば、ニワトリ、チャボ、ガチョウ、シチメンチョウ）、および猟鳥が含まれる。
【００２４】
医学の面で最も好ましい動物はヒトである。しかし、本発明は、ヒト以外の動物における自己免疫疾患状態を抑制するためにプロトコルの獣医学的使用に拡大する。
【００２５】
HSCおよび／またはHPCは、一般に寛骨に穴を開けるような骨髄試料から得られる。但し、本発明は、臍帯血および肝臓からの血液を含む末梢血からのHSCおよびHPCの単離ならびに必要ならばソーティングにさらに拡大する。細胞は、一般に、例えば静脈内注射もしくは末梢血系への注入、または門脈を介して肝臓からレシピエントに導入される。但し、好ましくはないが、それにも関わらず、レシピエントの骨髄中への直接導入が本発明によって企図される。
【００２６】
本発明のプロセスは、HSCおよび／またはHPCが単離される動物種における被験者およびその細胞を受け取る被験者に関して「同系」、「同種」または「異種」であることができる。「同系」のプロセスは、HSCおよび／またはHPCが由来する被験者が遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCのレシピエントと同一のMHC遺伝子型を持つことを意味する。「同種」プロセスは、HSCおよび／またはHPCが導入されるべき被験者に対して、HSCおよび／またはHPCがMHC不適合の被験者に由来する場合である。「異種」プロセスは、HSCおよび／またはHPCが導入される動物種に対して、HSCおよび／またはHPCが異なる動物種に由来する場合である。好ましくは、本発明の方法は同系プロセスとして実施される。同種または異種プロセスのいずれかが用いられる限り、外来免疫適格細胞の混合に起因して生じる可能性のある免疫学的反応が最小限となるようにプロトコルを変更する必要がある可能性があることが理解されるべきである。
【００２７】
従って、本発明は被験者における自己免疫状態を予防するもしくはそうでない場合は発症のリスクを最小限に抑える、または程度を抑制するための方法を企図して、該方法は自己免疫状態に関連する一つまたは複数の自己抗原を産生するように遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCを該被験者に導入する工程を含む。
【００２８】
特に、本発明は自己免疫疾患に関連する自己抗原を示す抗原提示細胞（APC）を産生するための方法を提供して、その方法は被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、自己抗原をコードする遺伝物質をその遺伝物質が発現してHSCおよび／またはHPCが自己抗原を産生するような条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む。
【００２９】
HSCおよび／またはHPCは特定の自己抗原を発現するAPCに発現される。APCの例には樹状細胞、Bリンパ球、上皮細胞またはマクロファージが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
上記の通り、被験者はヒト、ヒト以外の動物および鳥類の被験者を含む。好ましくは、被験者はヒトである。被験者（例えば、ヒト）は病状発現前の糖尿病である可能性があり、または糖尿病発症のリスクがある、もしくは臨床的糖尿病である可能性がある。
【００３１】
同じく上記の通り、その方法は被験者へのHSCおよび／またはHPCの同系、同種または異種投与を伴う。但し、同系プロトコルが好ましい。
【００３２】
従って、好ましい態様において、本発明は被験者における自己免疫疾患を予防もしくはそうでない場合は発症のリスクを最小限とする、または程度を抑制するための方法を提供して、該方法は自己免疫状態に関連する一つまたは複数の自己抗原を産生するように遺伝的に修飾された同系HSCおよび／またはHPCを該被験者に投与する工程を含む。
【００３３】
好ましい自己免疫疾患は、I型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病としても知られている自己免疫性糖尿病である。しかし、本発明は一連の自己免疫状態の治療における被験者プロトコルの使用に拡大する。唯一の基準は、疾病状態に関連する自己抗原が把握されていることである。本明細書において企図される自己免疫状態の例には、中でも全身性ループス、クローン病、心筋症、溶血性貧血、線維筋痛、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、血管炎、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、好中球減少症、乾癬、慢性疲労症候群、若年性関節炎、若年性糖尿病、強皮症、乾癬性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、橋本病、複合性結合織疾患、間質性膀胱炎、悪性貧血、白質脳炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、原発性胆汁性肝硬変、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、自己免疫性アジソン病、慢性活動性肝炎、尋常性白斑、自己免疫性高脂血症、自己免疫性心筋炎、側頭動脈炎、自己免疫性甲状腺疾患、軸索型および神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、アレルギー性喘息、骨関節炎、シャーガス病、ブドウ膜炎、慢性炎症性脱髄性多発性根神経障害（CIDP）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、脱髄性ニューロパシー、皮膚筋炎、円板状ルーパス、レンズ抗原性ブドウ膜炎、結節性多発動脈炎、ドレスラー症候群、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンズ症候群、グッドパスチャー症候群、アレルギー性鼻炎、ギラン・バレー症候群、低γグロブリン血症、封入体筋炎、小水疱水疱性皮膚症、ヴェゲナー肉芽腫症、メニエール病、ランバート-イートン症候群、モーレン潰瘍、非典型的セリアック病、眼球瘢痕性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、心膜切開後症候群、強膜炎、精子および睾丸自己免疫、全身強直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、交感性眼炎、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、多腺性自己免疫性症候群1型、多腺性自己免疫性症候群2型、悪性貧血、および子宮内膜症が含まれる。
【００３４】
好ましい態様に従って、本発明はヒトの被験者における自己免疫性糖尿病を予防する、発症のリスクまたは程度を最小限とする方法を企図して、該方法はヒトの該被験者に該ヒト被験者または同種被験者から単離されて自己免疫性糖尿病に関連する自己抗原を発現するように遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCの有効量を投与する工程を含む。
【００３５】
好ましい自己抗原は、プロインスリンもしくは免疫原性相同体、またはその抗原誘導体、部分、断片もしくは一部である。プロインスリンは一般にヒト由来であるが、例えば、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスまたはラット由来のヒト化されたプロインスリン分子も企図される。
【００３６】
最も好ましい態様に従って、本発明はヒトの被験者における自己免疫性糖尿病を予防する、発症のリスクまたは程度を最小限に抑える方法を提供して、該方法は該ヒト被験者または同種被験者から単離されてプロインスリンを産生するように遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCの有効量を投与する工程を含む。
【００３７】
本明細書では、遺伝的に修飾されたHSCおよび／またはHPCの同種移植が造血コンパートメント内に由来する自己免疫疾患の調節の原理を進める抗原特異的免疫療法への新しいアプローチであることが提唱される。
【００３８】
プロインスリンがヒト（Rudy et al., Mol. Med. 1: 625- 633, 1995）およびマウス（Chen et al., J. Immunol. 167: 4926-4935, 2001）のI型糖尿病に関与するT細胞エピトープを含むことから、好ましくは、自己免疫疾患は糖尿病であり、自己抗原はプロインスリンである。本発明に至る作業において、本発明者らはMHCクラスIIプロモーターによってAPCにターゲティングされたプロインスリンを形質転換により発現しているNODマウスは野生型NODマウスに骨髄移植後に自己免疫性糖尿病の発症に対する防御を適応的に伝達するために用いることのできる骨髄を含むことを確認した。糖尿病からの防御はNOD-PIマウス由来骨髄のレシピエントにおいて顕著であった。高度に精製されたHSCまたはHPCの伝達によって、防御は骨髄全体またはT細胞枯渇骨髄に伝達されたその他の潜在的な免疫調節細胞というよりは移植されたHSC／HPCのAPC子孫に帰することができる。最も重要な点として、糖尿病は遺伝的に修飾された少量のHSCの伝達によって完全に予防される。HSC移植は、野生型NOD HSCに伝達された糖尿病が、糖尿病誘発性T細胞の伝達というよりは糖尿病誘発性T細胞の新規の産生に起因することをさらに示している。それにも関わらず、糖尿病誘発性T細胞は明らかにAPCにプロインスリンを発現するように運命づけられているマウスにおいてエフェクター機能を発現しないか、または獲得できない。これらの結果は、遺伝的に修飾されたHSCの自己免疫疾患の予防のための治療用ツールとしての原理の証拠を提供する。
【００３９】
抗原提示が生じる状況はT細胞免疫のバランスを制御する（Garza et al., J. Exp. Med. 191: 2021-2027, 2000; Frazer et al., J. Immunool 167: 6180- 6187, 2001）。休止APCによって提示される抗原はT細胞の不活化を誘発して（Niimi et al., 1998、前記; Finkelman et al., 1996;前記; Hawiger et al., 2001、前記）、抗原特異的Ab産生を阻害する（Finkelman et al., 1996、前記）。形質転換によりターゲティングする抗原発現によって、樹状細胞（DC）は胸腺の抗原特異的T細胞の欠失において重要な役割を担うことが示されている（Brocker et al., J. Exp. Med. 185: 541-550, 1997）。重要な点として、末梢におけるT細胞応答の抑制はDCターゲティングされた抗原の投与後に述べられている（Finkelman et al., 1996、前記; Hawiger et al., 2001、前記）。末梢の免疫寛容メカニズムを利用する能力は、自己反応性T細胞を持つ被験者における自己抗原特異的免疫療法に対する手がかりとなる可能性が高い。
【００４０】
本発明者らはドナーHSCの最大移植に有利であるために放射線照射を用いた骨髄除去の条件づけを用いたが、これは無症候性の前臨床自己免疫性糖尿病被験者には許容可能ではない。しかし、MHCバリアが存在しないので、このアプローチは有毒な前骨髄移植条件づけを必要としないプロトコルに適用可能である。トランスジェニックマウスに由来するHSCを用いることによって、HSC療法にとって大きな障害とされているエクスビボにおいてHSCを遺伝的に操作する必要性が回避される。ヒトへの応用に関しては、移植後の長期間の遺伝子発現のためにHSCを効果的に形質導入することのできるベクターが必要である。レンチウイルスベクターによるヒトHSCの形質転換によって、インビボにおいて遺伝子発現をMHCクラスII+ APCに効果的にターゲティングすることができる（Cui et al., Blood 99: 399-408, 2002）。従って、任意でサイトカインに誘発される動員後にHSCおよび／またはHPCを末梢血から回収して、遺伝的に修飾して再注入するストラテジーは自己免疫疾患の療法に対する好ましいアプローチである。
【００４１】
従って、本発明のもう一つの局面はヒトにおける糖尿病を治療または発症のリスクを抑制もしくは程度を抑制する方法を企図して、該方法は、
（i）任意でサイトカインに介在されるHSCおよび／またはHPC動員の工程を含む末梢血または骨髄からHSCおよび．／またはHPCを単離する工程；
（ii）細胞がプロインスリンまたは免疫原性の相同体、抗原性誘導体、その部分、断片もしくは一部を産生してAPCと同様にそれを継続するようにHSCおよび／またはHPCを遺伝的に修飾する工程；および
（iii）遺伝的に修飾された細胞をヒトの被験者に注入または導入する工程を含む。
【００４２】
遺伝的に修飾されるHSCおよび／またはHPCに対する参照は、プロインスリンまたはその他の自己抗原をコードする核酸分子を細胞ゲノムに導入する工程を含む。一般に、核酸分子はDNAである。DNAは完全長の自己抗原、多くの完全長の自己抗原、または抗原性エピトープを有する一つもしくは複数の自己抗原の一つもしくは複数の断片をコードすることができる。
【００４３】
本発明のさらにもう一つの局面は、プロインスリンのような自己抗原をコードする遺伝物質の導入に有効なベクターを提供して、該ベクターは自己抗原またはその抗原性断片をコードするヌクレオチド配列および選択可能なマーカーを含む。
【００４４】
ベクター内の選択可能なマーカーは自己抗原をコードするDNAを安定的に取り込んだターゲティングされた細胞の選択を可能とする。これは、典型的には1000個中1個よりも少ない細胞が外因性DNAを安定的に取り込む電気穿孔法、リン酸カルシウム沈降法、およびリポソーム融合法のような比較的効率の低い形質転換技術を用いる場合に特に有用である。ウイルスベクターおよび核内へのマイクロインジェクションのような効率の高い方法を用いる場合、典型的には細胞の5〜25％がDNAを取り込む；従って、選択可能なマーカーの安定的組込みについて最初に選択する必要がなくターゲティングされた細胞を直接スクリーニングできる。同質または非同質DNAのいずれも使用することができる。
【００４５】
選択可能なマーカーの例には、抗生物質のような化合物に対する耐性を付与する遺伝子、特定の基質上での生育能を付与する遺伝子、蛍光のような検出可能なシグナルを産生するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（neo）およびハイグロマイシン耐性遺伝子（hyg）のような抗生物質耐性遺伝子を含むこのような様々なマーカーが知られていて入手可能である。選択可能マーカーには、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）での生育能を付与するtk遺伝子（チミジンキナーゼ）またはhprt遺伝子（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）；MAX培地（ミコフェノール酸、アデニンおよびキサンチン）での生育を可能とする細菌性gpt遺伝子（グアニン／キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）も含まれる。哺乳動物細胞での使用のためのその他の選択可能マーカーおよび一連の選択可能マーカーを運搬するプラスミドについては、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, New York, USA, 1990に述べられている。
【００４６】
選択可能マーカーは発現に関してその独自のプロモーターに依存する可能性があり、マーカー遺伝子はターゲティングされる有機体以外の非常に異なる有機体に由来する可能性がある（例えば、哺乳動物細胞のターゲティングに用いられる原核性マーカー遺伝子）。しかし、レシピエントの細胞で機能することが知られている転写機構で元々のプロモーターを置き換えることが好ましい。このような目的には、例えばメタロチオネインプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、β-アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、SV40プロモーターおよびヒトサイトメガロウイルスプロモーターを含む多くの転写開始領域が有効である。広く用いられる例は、SV40初期プロモーターの制御下において細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を持つpSV2-neoプラスミドであり、哺乳動物細胞においてG418（ネオマイシンに関連する抗生物質）に対する耐性を付与する。ポリ(A)配列の付加および合成翻訳開始配列の付加のように、動物細胞において選択可能マーカーの発現を促進するためにその他の多くの変異型を用いることができる。構成的および誘導可能プロモーターの双方を用いることができる。
【００４７】
DNAは好ましくは相同的組換えによって修飾される。ターゲットDNAは核およびミトコンドリアを含むHSCまたはHPCの任意の細胞小器官であることができて、無傷の遺伝子、エクソンもしくはイントロン、調節配列、または遺伝子間の任意の領域であることができる。
【００４８】
相同DNAは、参照DNA配列と少なくとも70％一致するDNA配列である。二つの配列が相同であることの指標は、それらが互いにストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることである（Sambrook et al., 1990、前記）。
【００４９】
本発明は、多くの区画に分かれた形のキットも提供して、このキットは被験者からHSCおよび／またはHPCの供給源を受けるために改造された最初の区画；自己抗原をコードする遺伝物質を含むように改造された二番目の区画：任意で試薬を含むように改造された三番目またはより多くの区画を含み、そのキットは被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、自己抗原をコードする遺伝物質をその遺伝物質が発現してHSCおよび／またはHPCが自己抗原を産生するような条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法での使用のための説明書を含む。
【００５０】
関連する局面において、本発明は末梢血または骨髄からのHSCおよび／またはHPCの単離に使用するために改造された試薬および／または区画を含む薬学的キット、プロインスリンをコードするDNAもしくはその抗原性部分、または自己免疫性糖尿病に関連するもう一つの自己抗原を発現するための遺伝子操作、および／または遺伝的に修飾された細胞を末梢血系もしくは骨髄に対して被験者に再導入するための方法をさらに提供する。
【００５１】
本発明は、次の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【００５２】
実施例1
一般的方法
マウス
NOD（非肥満糖尿病）およびNOD.scidマウスは特定病原体除去条件下にて飼育した。MHCクラスII（I-Eα）プロモーターの制御下におけるマウスプロインスリンIIに関するトランスジェニックNODマウス（NOD-PI）はホモ接合性まで繁殖した後に使用した。自然発生性糖尿病の発生率は野生型NODの雌において極めて高いことから、雌のみをレシピエントおよび骨髄（BM）ドナーとして使用した。
【００５３】
抗体およびフローサイトメトリー
フローサイトメトリーによる分析は既述（Steptoe et al., J. Immunol. 168: 5032-5041, 2002）の通り実施した。次のmAbを組織培養上清から精製した後に抱合反応において使用した：Gr-1（Ly-6G；RB6-8C5）、F4/80（F4/80）、CDllb（5C6またはM1/70）、CDllc（N418）、MHCクラスII（10.2.16 [I- Ak,g7,r,f,S]）、MHCクラスI（M1/42）、M-CSF R（AFS-98）、CD40（FGK-45）、B220（RA3-6B2）およびCD86（GL-1）ストレプトアビジン（SA）-フルオロクロム抱合体（SA-FITC、SA-フィコエリトリン、SA-アロフィコシアニン、SA-テキサスレッド）に方向付けられた抗体、CD4（CT-CD4）、CD8α（CT-CD8a）およびFITC、PEおよびトリカラーストレプトアビジン抱合体に対するmAbはCaltag（Burlingame, CA）から得た。抗CD3（145-2C11）、SCA-1（E13-161.7）、CD40（3/23）、MAC-3（M3/84）、CD13（R3-242）、CD62-L（MEL-14）、CD31（MEC13.3）、CD43（S7）、CD11a（2D7）、CD49d（R1-2）に方向付けられたモノクローナル抗体はPharMingen（San Diego, CA）から購入した。さらに、抗マウスFIRE、抗CD3（KT3）、c-kit（ACK-2）が用いられた。
【００５４】
PBLの分析に備えて、マウスはファインガラスキャピラリーチューブを用いて後眼窩静脈叢穿刺により採血した。血液はAlsever抗凝固剤中に回収して、赤血球を溶血させ、白血球を染色してフローサイトメトリーにより分析した。血球計を用いて測定された白血球数を、得られた血液容積に応じてキャリブレートした。実験間の変動を制御するために、年齢の対応する3匹の雌性NODを各分析に含めた。脾臓を圧してステンレススチールのメッシュに通して、細胞を10％ v/v FCS加RPMIに懸濁した。
【００５５】
BMの調製およびトランスファー
マウス（8〜12週齢）を安楽死させて、大腿骨および頸骨を冷却マウス張性リン酸緩衝生理食塩液（PBS）中に回収した。2.5％ v/v FCS（F2.5）（Trace Scientific, Melbourne Australia）を含む氷冷PBSを用いてBMをフラッシュして、赤血球をNH4Cl／TRIS緩衝液溶解により除去した。BMをF2.5で洗って、遠心分離により回収した。T細胞除去のため、BMをF2.5に再度懸濁して、抗CD3 mAb（KT3、5μg/ml）を用いて4℃にて30分間インキュベートした後、F2.5で洗った。抗体で標識した細胞を抗ラットIgG免疫磁気ビーズ（Dynabeads, Dynal Biotech, Carlton South, Victoria, Australia）を用いて枯渇させた。ソートしたHSCまたはHPCについて、FITC抱合型細胞系特異的mAb混合物（KT3、M1/70、RA3.6B2、RB6-8C5、TER-119）を予め求められた至適濃度で用いて免疫磁気ビーズにより細胞系マーカー陽性細胞を除去した。残りの細胞を抗c-kit-フィコエリトリンで標識した。HSC単離のため、細胞系除去細胞を抗SCA-1-ビオチンでさらに共染色して、洗浄し、ストレプトアビジン-トリカラーで染色した。Lin-/c-kit+/SCA-1+（HSC）またはlin-/c-kit+（HPC）細胞を無菌ソーティング（FACSII, Becton Dickinson, San Diego, CA）によって回収した。放射線照射マウスに2〜3時間の間隔をあけて等量ずつ2回、合計950 cGy（Theratron 60Co, Theratronics, Kanata, ON, Canada）を投与した。細胞（特記する場合を除いて、BMまたはT細胞除去BM 107個）をPBSに懸濁して、放射線照射マウスの場合は照射後1〜3時間にHSC（103個）およびHPC（2.5×104個）について250μlを腹腔内投与または100μlを静脈内投与にて注射した。放射線照射マウスは、BMT後3週間、ネオマイシンを添加した飲水で飼育した。BMT直後の期間に身体的苦悶の徴候を示すマウスは安楽死させて解析から除外した。
【００５６】
T細胞再生反応
マウスは、フロイント完全アジュバント（Difco, Detroit, MI）中の100μgオブアルブミン（OVA）（Grade V, Sigma St Louis, MO）を用いて側腹部に皮下注射して免疫した。14日後に安楽死させたマウスから採取した脾臓を圧してステンレススチールのメッシュに通して、細胞を10％ v/v FCS（Trace Scientific, Melbourne Australia）、10-3Mピルビン酸ナトリウム、10-4M可欠アミノ酸（GIBCO）、2×10-3Mグルタミン、5×10-5M 2-メルカプトエタノール（Sigma）を含むRPMI培地（GIBCO, Rockville, MA）に懸濁した。脾細胞を、OVA（100μg/ml）の存在下または非存在下において三連にて接種した（ウェル当たり細胞1.5×105個、200μl、96穴平底プレート）。4日目に細胞をガラスフィルターマット上に回収した。培養終了前の18時間に、3H-チミジン（1μCi/ウェル）を加えた。細胞増殖を反映する取り込まれた放射能をシンチレーションカウンター（Topcount, Packard, Groningen, The Netherlands）で測定して、結果を平均刺激指数（SI）±標準偏差で示した。
【００５７】
糖尿病のモニタリング
マウスは、Diastix試験紙（Bayer, Pymble, NSW Australia）を用いて週1回、グルコースについて尿検査を行った。糖尿マウスについては、計器（Accu-Chek, Roche, Castle Hill, NSW, Australia）を用いて血糖を測定した。連続2回の血糖判定値が＞12.0mMであった場合、マウスを糖尿病と判断した。糖尿または身体的苦悶の徴候を示した場合はマウスを安楽死させた。
【００５８】
膵島炎および唾液腺炎の評価
安楽死させたマウスから膵臓を摘出して、ブアン固定液に24時間浸漬した後、70％ v/vエタノールに移した。固定した組織をパラフィンに包埋して、250〜300μm毎に薄切したH& E染色切片を作製した。膵島炎は既報（Leiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 630-634, 1982）の通り盲検法にて判定した。舌下腺を摘出して、膵臓と同様に調製した。存在する炎症巣の数を数えて、切片当たりの平均値として示した。
【００５９】
統計学的解析
Kaplan-Meier生存曲線の比較は対数順位検定（GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego, CA）を用いて実施した。BMT群間の膵島炎スコアは、Student-t検定により比較した。
【００６０】
実施例2
NOD-PI骨髄移植は糖尿病を予防する
NODまたはNOD-PIマウスに由来する全BMを放射線照射した4週齢の雌性NODレシピエントに移植した。発症は若干遅延したものの、NOD BMレシピエントにおける全体の糖尿病発生率（7/12）は無処置対照群（15/23）と同等であった（図1A）。これに対して、NOD-PI BMのレシピエントでは糖尿病がほぼ完全に予防された（1/16、P＝0.0032）（図1A）。NODマウスは免疫監視障害または電離放射線への曝露によって増悪化する胸腺腫の発症について本質的に高いリスクを有する（Prochazka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3290-3294, 1992; Shultz et al., J. Immunol. 164: 2496-2507, 2000）。剖検時に胸腺腫と診断されたマウスを除外することによって双方の群において糖尿病マウスの割合が増加したが（NOD 7/10、NOD-PI 1/5）、糖尿病発生率における差は依然、群間で有意であった（P＝0.041）。糖尿病がない場合の生存期間がより長いために、NOD-PI BMのレシピエントはNOD BMレシピエント（2/12）に比較して胸腺腫の割合（11/16）が高かった。
【００６１】
実施例3
T細胞除去は移植されたNOD-PI BMの保護作用を変化させない
異なる研究により、NOD BMの成熟T細胞が免疫欠損NOD.scidマウスに糖尿病を伝達し得ることが明らかとなった。従って、全BM移植後の糖尿病発症は、移植された成熟T細胞の糖尿病原性を反映した可能性がある。しかし、全NOD BMが非放射線照射T細胞欠損NOD.scidマウスの少なくとも50％に糖尿病を伝達したのに対して、NOD-PIマウス由来のBMを投与されたマウスは糖尿病を発症しなかった。
【００６２】
NOD-PIではなくNODの成熟T細胞は糖尿病を伝達することができたので、放射線照射した4週齢のマウスに対するT細胞除去BM移植の効果について試験を行った。T細胞除去NOD BMのレシピエントは、無処置対症（7/12）と同等の割合および発生率（10/15）で糖尿病を発症した（図1B）。これに対して、T細胞除去NOD-PI BMのレシピエントでは糖尿病の発症が有意に低かった（3/17、P＝0.003）（図1B）。剖検時に胸腺腫が認められたマウスを解析から除外した場合、群間差は依然、統計学的に有意（P＝0.012）であった。
【００６３】
膵島の細胞性免疫浸潤（膵島炎）はBMT（T細胞除去BM 1×107個）後100日に評価した。NOD-PI T細胞除去BMのレシピエントでは、膵島の54％が膵島炎を示さず（図2A）、単核細胞浸潤は膵島周辺に限定された（膵島周囲炎）。一方、NOD T細胞除去BMのレシピエントでは、膵島炎がみられなかった膵島は28％のみであり、膵島に広範な浸潤が見られた（図2B）。これらの所見は、NODレシピエントに比較してNOD-PIにおける平均膵島炎スコアの有意な減少を反映した（P＝0.008）（図2C）。同等の結果が5×106個のT細胞除去BMの移植後に認められた。膵島炎とは対照的に、舌下腺の単核細胞浸潤（唾液腺炎）はNOD-PIまたはNOD T細胞除去BMのレシピエントおよび齢期が相当する未処置対照において同等であった（図2D）。このことは、NOD-PI BMが膵島自己免疫に特異的な保護作用を伝達することを示す。
【００６４】
実施例4
PIコード造血幹細胞および前駆細胞は糖尿病予防を伝達する
造血幹細胞（lin-/c-kit+/SCA-1+）または前駆細胞（HPC）（lin-/c-kit+）は、NODおよびNOD-PI BMから無菌的に精製した。それらの糖尿病発症に対する影響を調べるために、少数のHSCまたはHPCを4週齢の放射線照射マウスに移植した。造血再構築は速やかであり、PBL集団はBMT後8週までに回復した。糖尿病はNOD-PI HSCのレシピエントでは完全に予防されて、その発生率はNOD-PI HPCのレシピエントでは有意に低い値であった（図3）。
【００６５】
実施例5
NOD-PI BMによる糖尿病予防は障害された免疫の再構築に起因しない
NOD-PI BMTの保護作用が障害された免疫再構築の結果である可能性を除外するために、先ず末梢血白血球（PBL）集団を解析した。T細胞除去BMT後10〜14日にNODおよびNOD-PI双方のレシピエントにおいて循環白血球数が実質的に減少した（図4A）。Tリンパ球（CD4+、CD8+）およびBリンパ球（B220+）の割合は齢期の相当する対照群に比して低下して（それぞれ、50〜75％、25％および80〜85％）、骨髄性（CD11b+）細胞の割合は約2.5倍に増加した。BMT後8および16週、総PBL数（図4A）およびPBLサブセットの相対的割合（図4B）は正常であり、群間の再構築が同等であることを示している。続いて、BMTレシピエントのT細胞介在性免疫応答マウント能について検討した。齢期の相当する正常NODマウスおよびNODまたはMOD-PI T細胞除去BMのレシピエントをBMT後100日にオブアルブミン（OVA）で免疫した。2週間後にインビトロにおけるOVAに対する再生反応は無処置マウスおよび双方のBMT群において同等であった（図5）。従って、NOD-PI BMTは障害された免疫の再構築の証拠には関連しなかった。
【００６６】
実施例6
サイトカイン刺激骨髄性細胞は未分化のDC前駆細胞を含む
「未熟」DC（iDC）の供給源として、GM-CSFおよびTGF-beta（G+T）においてBMを培養した。これらの培養物は細胞タイプの混合物を含み、骨髄球分化マーカーであるGr-1を発現した環状または分葉核を持つ小さな円形細胞が優勢であり、未分化の骨髄性前駆細胞を特徴とした。細胞のごく一部は単球様または未熟なDC様の外観を持ち、主として細胞内顆粒に限定される少量のMHCクラスIIを発現した。これらの細胞亜集団をさらに定義するために、GM-CSF／TGF-β1およびGM-CSF／IL-4の間で培養BMを比較した結果、後者は表現型的に成熟および未成熟なDCならびに少数の未分化の骨髄性細胞の混合物を含む。GM-CSF／IL-4において培養したBM細胞とは対照的に、GM-CSF／TGF-β1において培養したBMはDC特異的マーカーであるCD11cを発現している細胞をごく低い頻度で含み（図6Aを参照されたい）、残りはほぼ全てがGr-1+細胞を含んだ。GM-CSF／TGF-β1で培養したBMにおいてCD11c＋DCに発現した抗原提示分子（MHCクラスII）および共刺激分子（CD86およびCD40）の量は少なく、GM-CSF／IL-4において産生された表現型の点で未熟なCDの量と同等であった（図6Aを参照されたい）。機能的に未熟な（CD11c+／CD86lo）DCの特徴であるエンドサイトーシス活性はFITCデキストラン取り込みによって測定した。GM-CSF／IL-4添加培地において、CD11c+／CD86lo未熟DCのみがエンドサイトーシスの面で活性であり、GM-CSF／TGF-β1添加培地ではCD11c+細胞のみがエンドサイトーシスの面で活性であった。
【００６７】
G+T BM由来のiDCは少量のMHCクラスIIおよび共刺激分子を発現して（図6）、混合リンパ球反応における弱い刺激物質であった。対照NODマウスではなくNOD-PI由来のG+T BMは、4週齢の雌性NODマウスにおいて静脈内注射によりトランスファーされた際に糖尿病発症を有意に阻害した（p＜0.01）（図7）。さらなる検討の結果、G+T BMがCD11c+／CD11b+／Gr-1- iDCに加えて多くの未分化なCD11c-／CD11b+／Gr-1+骨髄性細胞を含むことが明らかとなった。
【００６８】
実施例7
DC前駆細胞
Gr-1+細胞の除去はG+T BMの糖尿病阻害能を抑制したのに対して、CD11c+ iDCの除去は阻害能を示さなかった（図9）。対照NODマウスではなくNOD-PIマウスに由来する精製Gr-1+骨髄性細胞のトランスファーはレシピエントマウスにおける糖尿病発症を阻害して、これらの細胞の保護的役割が確認された（図10）。
【００６９】
iDCとは異なり、CD11c-／CD11b+／Gr-1+骨髄性細胞は活性化刺激（LPS、抗CD40）に反応して速やかに成熟CD11c+／CD86hi表現型を獲得しなかった。その代わり、それらの細胞はGM-CSF／IL-4／TNF-α中での培養時に5〜7日間を通して成熟DCの特性を徐々に獲得した。従って、G+T BM培養中に存在するCD11c-／CD11b+／Gr-1+細胞はDC前駆細胞である。故に、上述のデータは、疾患特異的自己抗原（プロインスリン）をコードする骨髄性DC前駆細胞が自己免疫疾患を予防できることを示す。
【００７０】
実施例8
骨髄性細胞はインビボにおいてCD11c+／MHCクラスII+DCに分化する
インビボにおいてトランスファーした細胞の分化および生存性を調べるために、GM-CSF／TGF-β1培養プロインスリンNOD BMからCD11c+細胞を除去することによってGr1+細胞を精製した。続いて、この細胞をCFSEで標識して、直接脾臓に注射した。脾臓の凍結切片を免疫蛍光分析に備えて染色した。CFSEおよび抗体で標識された細胞（MHCクラスII、CD11c、CD11bまたはGR-1のいずれか）の位置は免疫蛍光顕微鏡を用いて調べた。図11は、CFSEおよび調べた4種類すべてのマーカーについて陽性に着色する細胞の同定を示す。左側のパネルはCFSE標識細胞を示して、中央のパネルはmABを抱合するテキサスレッドで可視化された細胞を示し、右側のパネルは重ね合わせた画像を示す。二重染色は、右側パネルの明るい白色スポットの存在によって示される。
【００７１】
免疫組織学
OCTに包埋した凍結組織（Tissue-Tek, Miles Inc. Elkhart, IN）からクリオスタット切片（5um）を切り出して、風乾し、免疫染色または封入前に冷却100％エタノールで固定した。アビジン／ビオチン遮断試薬（Vector, Burlingame, CA）を用いてアビジン／ビオチン結合部位を遮断して、非特異的なタンパク質相互作用は1％BSAで遮断した。ビオチン化した一次抗体を予め求められた至適濃度で室温にて1時間、適用した。洗浄後、ストレプトアビジン-HRP（Vector ABC-Elite, Vector, Burlingame, CA）またはストレプトアビジン-テキサスレッドをさらに1時間、適用した。免疫過酸化酵素スライドを洗って、酵素基質（VectorRed, Vector, Burlingame, CA）を用いて発色させた。免疫蛍光スライドはすすいで、蛍光退色防止試薬（DAKO Corp., Carpinteria, CA）に封入した。
【００７２】
サイトスピン
サイトスピンはサイトフュージ（Shandon, Pittsburgh, PA）を用いて作製した。サイトスピンは、Diff Quik（Lab Aids Pty Ltd., Narrabeen, NSW Australia）を用いて、または記載の通り免疫組織化学により染色した。
【００７３】
当業者は、本明細書に記載される発明には具体的に記載される以外の変更および修正の余地があることを認識する。本発明がこのようなすべての変更および修正を含むことが理解されるべきである。本発明は、さらに本明細書において引用または記載されるすべての工程、特徴、組成物および化合物を個々にまたは一括して含み、任意の二つまたはそれよりも多い該工程または特徴のすべてのあらゆる組み合わせを含む。
【００７４】
参考文献一覧
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図1のグラフは、NOD-PI BMの移植が糖尿病の発症を阻害することを示す。（A）糖尿病発生率は、NOD BMマウス（上黒三角）（P＝0.003）または無処置NODマウス（黒四角）（P＝0.001）に比べて、NOD-PI BM（下黒三角）のレシピエントにおいて有意に低下した。NOD BMレシピエントに、無処置マウスとの差違はなかった。データは、NOD-PIマウスまたはNODマウスからのBMTが並行して実施された2回の実験からプールされたものである。（B）糖尿病発生率は、T細胞除去NOD BM（上黒三角）（P＝0.003）または無処置NODマウス（黒四角）（P＝0.036）に比べて、T細胞除去NOD-PI BM（下黒三角）のレシピエントにおいて有意に低下した。NOD BMレシピエントに、無処置マウスとの差違はなかった。データは、NOD-PIマウスまたはNODマウスからのBMTが並行して実施された2回の実験からプールされたものである。
【図２】図2は、T細胞除去NOD-PI BMの移植が膵島炎は予防するが唾液腺炎は予防しないことを示す顕微鏡写真とグラフである。（A）NOD-PI BMのレシピエントでは炎症性浸潤（膵島炎）のない島細胞が一般的であり、存在する場合でも島細胞の周辺に限定的であった（矢印）。（B）NOD BMのレシピエントでは、広範に浸潤した島細胞（*）が一般的であった。（C）NOD BM細胞（下黒三角）に比べてT細胞除去NOD-PI BMのレシピエント（上黒三角）では膵島炎が有意に減少した（P＝0.008）。比較のため、齢期が相当するNOD（黒四角）およびNOD-PI（黒ひし形）マウスのデータを含める。（D）舌下腺炎症巣の数（唾液腺炎スコア）は、BMTおよび無処置マウスで差違を示さなかった。NODおよびNOD-PIマウスからのBMTが並行して実施された2回の実験から得られた個々のマウスのスコアをプールする（横線は平均値を示す）。
【図３】図3は、NOD-PI造血幹細胞（HSC）または造血前駆細胞（HPC）のトランスファーが糖尿病の発症を予防することを示すグラフである。（A）糖尿病発生率は、NOD HSCのレシピエント（上黒三角）（P＝0.019）または無処置NODマウス（黒四角）（P＝0.029）に比べて、NOD-PI HSC（下黒三角）のレシピエントにおいて有意に低下した。NOD HSCレシピエントおよび無処置NODマウスに有意な差違はなかった。（B）糖尿病発生率は、NOD HPCのレシピエント（上黒三角）（P＝0.035）または無処置NODマウス（黒四角）（P＝0.021）に比べて、NOD-PI HPC（下黒三角）のレシピエントにおいて有意に低下した。NOD HPCレシピエントおよび無処置NODマウスに有意な差違はなかった。データは、NOD-PIマウスまたはNODマウスからのBMTが並行して実施された1回（A）または2回（B）の実験からプールされたものである。
【図４】図4は、T細胞除去NODまたはNOD-PI BMのレシピエントにおける末梢血白血球（PBL）の再構築を示すグラフおよび表形式のデータを示す。（A）PBLは、齢期の相当する無処置NODマウス（黒四角）に比べて、NOD（下黒三角）およびNOD-PI（上黒三角）T細胞除去BMレシピエントの双方において放射線照射およびBMT後10〜14日にPBLを著しく枯渇させたが、8週までに再構築した。（B）NODまたはNOD-PIドナー由来のT細胞除去BMのレシピエントにおけるPBLサブセットは同等に再構築して、齢期の相当するNOD対照と同等であった。データは、NODおよびNOD-PIマウスからのBMTが並行して実施された2回の実験からの平均値±SDである。
【図５】図5はオブアルブミン（OVA）免疫化に対するT細胞再生反応を示すグラフである。BMT後100日にOVAの皮下注射によりマウスを免疫して、14日後に脾臓T細胞の再生反応を測定した。OVAの存在下におけるT細胞増殖は、齢期の相当する対照NODマウス（黒四角）およびT細胞除去したNOD（下黒三角）またはNOD-PI（上黒三角）BMのレシピエントにおいて同等であった。中空の記号は、OVAの非存在下における増殖を示す。データは、NODおよびNOD-PI BMTが並行して実施された異なる3回の実験からプールされた個々のマウスのデータである。
【図６】図6はGM-CSF／IL-4またはGM-CSF／TGF-β1中で培養して5日目に細胞を回収してフローサイトメトリーにより細胞表面マーカーを解析したBMのグラフである。数値は、その象限に回収された細胞のパーセントを示す（A）。GM-CSF／IL-4またはGM-CSF／TGF-β1で培養されたBMを5日目に回収して、FITC-デキストランの取り込みによりエンドサイトーシス活性を測定した。プロットは、GM-CSF／IL-4で培養されたBM由来のCD11cでゲートをかけた細胞におけるFITC-デキストランの取り込み対CD86の発現、またはGM-CSF／TGF-β1で培養されたBM全体におけるFITC-デキストランの取り込み対CD11cの発現を示す（B）。BMはGM-CSF／TGF-β1中で培養して、5日目に細胞を回収した。Gr-1+およびCD11c+細胞上に発現した細胞表面マーカーを、4カラーフローサイトメトリーを用いて解析した。左上のドットプロットは、Gr-1+およびCD11c+でゲートをかけた細胞の解析に用いたゲート設定を示す。ヒストグラムのオーバーレイは、Gr-1（影付き）およびCD11c（中空）でゲートをかけた細胞を示す（C）。G+T BM由来のiDCは少量のMHCクラスIIおよび共刺激分子を発現して、混合リンパ球反応（MLR）における弱い刺激物質であった。
【図７】図7は、対照NODマウスではなくNOD-PI由来のG+T BMが、4週齢の雌性NODマウスに静脈内注射によりトランスファーされた際に糖尿病発症を有意（p<0.01）に阻害することを示すグラフである。
【図８】図8は、G+T BMがCD11c+／CD11b+／Gr-1- iDCに加えて、多数の未分化のCD11-／CD11b+／Gr-1+骨髄性細胞を含むことを示す一連のフローサイトメトリードットブロットである。
【図９】図9は、プロインスリンをコードするGr-1+細胞が投与4週時に糖尿病を阻害することを示すグラフである。
【図１０】図10は、プロインスリンをコードするGr-1+細胞が投与（1.8×106 CD11c除去、静脈内注射）4週時に糖尿病を阻害することを示すグラフである。
【図１１】図11は、Gr-1+骨髄性細胞がインビボにおいてCD11c+／MHCクラスII+ DCに分化することを示す写真である。Gr-1+細胞はGM-CSF／TGF-β1培養プロインスリンNOD BMからCD11c+細胞を除去することによって精製して、CFSEで標識し、脾臓に直接注射した。脾臓の凍結切片を免疫蛍光分析に備えて染色した。CFSEおよび抗体で標識した細胞の位置は、免疫蛍光顕微鏡法によって調べた。パネルは、CFSE標識細胞（左）、mAbを抱合するテキサスレッドで可視化した細胞（中央）および重ね合わせた画像（右）を示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月8日(2004.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患に関連するプロインスリンを提示するAPCを被験者に導入する工程を含む被験者におけるインスリン依存性糖尿病の予防または治療するための方法であって、被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程、該プロインスリンまたは免疫原性の同族体、部分、断片、もしくはその一部をコードする遺伝物質を、HSCおよび／またはHPCが該プロインスリンまたは免疫原性の同族体、部分、断片、もしくはその一部を産生するように該遺伝物質が発現する条件下において一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程を含む方法。
【請求項２】
APCが樹状細胞、Bリンパ球、上皮細胞、単球およびマクロファージから選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
APCが樹状細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
被験者がヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、トリ、ニワトリ、チャボ、ガチョウ、およびシチメンチョウからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験者がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
細胞が寛骨由来の骨髄、骨髄、臍帯血、肝由来の血液、組織由来の血液、およびPBMCに由来する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
細胞が寛骨由来の骨髄に由来する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
プロインスリンがヒト由来である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであり、該プロインスリンがブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットから選択される群に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
被験者におけるインスリン依存性糖尿病を治療または予防するための方法であって、
（a）被験者から造血幹細胞（HSC）および／または造血前駆細胞（HPC）の試料を採取する工程；
（b）プロインスリンまたは免疫原性の同族体、部分、断片、もしくはその一部をコードする遺伝物質を、HSCおよび／またはHPCがプロインスリンまたは免疫原性の同族体、部分、断片、もしくはその一部を産生するように該遺伝物質が発現する条件下において、一つまたは複数のHSCおよび／またはHPCに導入する工程；および
（c）遺伝的に修飾された該細胞を該被験者に注入または導入する工程を含む方法。
【請求項１１】
HSCおよび／またはHPCがサイトカイン介在性の動員（mobilisation）を受ける、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
被験者がヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、トリ、ニワトリ、チャボ、ガチョウおよびシチメンチョウからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
被験者がヒトである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
HSCおよびHPCが寛骨由来の骨髄、骨髄、臍帯血、肝由来の血液、組織由来の血液およびPBMCから選択される供給源に由来する、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
HSCおよびHPCが寛骨由来の骨髄に由来する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
プロインスリンがヒト由来である、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであって、該プロインスリンがブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットからなる群より選択される供給源に由来する、請求項10記載の方法。
【請求項１８】
インスリン依存性糖尿病に関連する、プロインスリンまたは免疫原性の同族体、部分、断片、もしくはその一部を提示するように遺伝的に修飾されたAPCの、インスリン依存性糖尿病の治療のための医薬品の製造における使用。
【請求項１９】
APCが樹状細胞、Bリンパ球、上皮細胞、単球およびマクロファージからなる群より選択される、請求項18記載の使用。
【請求項２０】
APCが樹状細胞である、請求項18記載の使用。
【請求項２１】
HSCおよび／またはHPCがヒト、霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ロバ、ブタ、ヤギ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ニワトリ、チャボ、ガチョウ、およびシチメンチョウからなる群より選択される供給源に由来する、請求項18記載の使用。
【請求項２２】
HSCおよび／またはHPCがヒトに由来する、請求項21記載の使用。
【請求項２３】
HSCおよび／またはHPCが寛骨由来の骨髄、骨髄、臍帯血、肝由来の血液、組織由来の血液、およびPBMCからなる群より選択される供給源に由来する、請求項18記載の使用。
【請求項２４】
プロインスリンがヒト由来である、請求項18記載の使用。
【請求項２５】
プロインスリンがヒト化されたプロインスリンであり、該プロインスリンがブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、マウスおよびラットから選択される供給源に由来する、請求項18記載の使用。
【国際調査報告】
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2006511208.tif 000018
2006511208.tif 000019