(57)【要約】敗血症の早期予測または診断により、疾患が初期段階を超えて迅速に進行し、高い死亡率と関連する重篤な敗血症または敗血症性ショックなどのより重篤な段階となる前に臨床行為を有利に行うことができる。早期予測または診断は、個体のバイオマーカーの発現のプロフィールを、敗血症を発生する集団を含み得る１つまたは複数の対照すなわち参照集団から得たプロフィールと比較することを含む分子診断学的手法によって行う。敗血症の発症に特徴的な個体のバイオマーカープロフィールの特性を認識することにより、臨床医が単一時点の個体の単離した体液から敗血症の発症を診断することが可能になる。したがって、患者を経時的に監視する必要性が回避され、敗血症の重大な症状が発症する前に臨床行為を行うことが有利に可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表２〜１０のうち任意の１つに記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される少なくとも２つの核酸宿主反応バイオマーカーを含むキット。
【請求項２】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表２に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項３】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表３に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項４】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表４に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項５】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表５に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項６】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表６に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項７】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表７に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項８】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表８に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項９】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表９に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項１０】
少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーが表１０に記載の核酸およびそれらの相補体からなる群より選択される、請求項１記載のキット。
【請求項１１】
表２〜１０のうち任意の１つに記載の核酸からなる群より選択される少なくとも２つの宿主反応バイオマーカーとハイブリダイズすることができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプローブを含むキット。
【請求項１２】
少なくとも６０％の精度で参照集団に個体が含まれることの推測に寄与する少なくとも２つの特性を含むバイオマーカープロフィールであって、該特性が核酸の測定可能な特徴であり、該参照集団が、正常な参照集団、ＳＩＲＳ陽性参照集団、感染した／ＳＩＲＳ陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行の一段階にある参照集団、約０〜３６時間後に慣用技術によって敗血症に罹患していると確認されたＳＩＲＳ陽性参照集団、約３６〜６０時間後に慣用技術によって敗血症に罹患していると確認されたＳＩＲＳ陽性参照集団、および約６０〜８４時間後に慣用技術によって敗血症に罹患していると確認されたＳＩＲＳ陽性参照集団からなる群より選択されるものである、上記バイオマーカープロフィール。
【請求項１３】
宿主反応バイオマーカーの単離方法であって、
（ａ）個体の集団から参照バイオマーカープロフィールを得ること、
（ｂ）敗血症または敗血症の一段階を予測または診断する上記参照バイオマーカープロフィールの特性であって、核酸に相当する特性を同定すること、
（ｃ）上記特性に対応する宿主反応バイオマーカーを同定すること、ならびに
（ｄ）上記宿主反応バイオマーカーを単離すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体において敗血症またはその進行段階を診断または予測する方法に関する。本発明はまた、個体において全身性炎症反応症候群を診断する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれている２００２年１１月１２日出願の米国仮特許出願第６０／４２５，３２２号の優先権を主張する。
【０００３】
病状の早期検出は、典型的にはより有効な治療的処置、およびそれに対応してより望ましい臨床結果をもたらす。しかし、多くの場合、疾患の症状の早期検出には問題があり、したがって、診断が可能となる前に疾患は比較的進行し得る。全身性炎症状態は、このような疾患クラスの１つを表す。これらの状態、特に敗血症は、典型的には病原性微生物と宿主において過剰かつ調節不全の炎症反応を始動させる宿主の防御系との差から生じる。全身性炎症反応中の宿主の反応の複雑さにより、疾患の病因を理解しようとする努力が困難になっている（Healy、Annul. Pharmacother.、36:648-54、(2002)に総説）。立ち代って、疾患の病因の不完全な理解が、診断用バイオマーカーの発見を困難にすることに寄与している。しかし、敗血症は非常に迅速に生命を脅かす状態へと進行するので、早期かつ信頼性のある診断は必須である。
【０００４】
敗血症は良く記載されている経時変化に従い、全身性炎症反応症候群（「ＳＩＲＳ」）陰性からＳＩＲＳ陽性へ、そして敗血症へと進行し、その後、重篤な敗血症、敗血症性ショック、多臓器機能障害（「ＭＯＤ」）、および最終的には死へと進行し得る。敗血症はまた、感染した個体において、個体が引き続いてＳＩＲＳを発症した場合にも生じ得る。「ＳＩＲＳ」は一般に、以下のパラメータの２つ以上の存在として定義される：体温が３８℃より高いまたは３６℃未満である；心拍数が毎分９０回より高い；呼吸数が毎分２０回より高い；ＰＣＯ２が３２ｍｍＨｇ未満である；および白血球数が４．０×１０９個の細胞／Ｌ未満であるもしくは１２．０×１０９個の細胞／Ｌより高い、または１０％より高い未熟なバンドの形成を有する。「敗血症」は一般に、確認された感染性プロセスを伴ったＳＩＲＳとして定義される。「重篤な敗血症」は、ＭＯＤ、低血圧、播種性血管内血液凝固（「ＤＩＣ」）または乳酸アシドーシス、乏尿、および精神状態の変化を含めた低灌流性異常に関連している。「敗血症性ショック」は一般に、輸液蘇生法に耐性があり、さらに低灌流性異常が存在する敗血症誘発性低血圧として定義されている。
【０００５】
敗血症において臨床的に有意な病原性微生物の存在を記録することは、困難であることが分かっている。原因微生物は、典型的には患者の血液、痰、尿、創傷分泌物、留置カテーテルの表面などを培養することによって検出する。しかし、原因微生物は特定の身体微小環境中にしか存在しないかもしれず、培養した特定の材料が汚染微生物を含まないかもしれない。検出は、感染部位に微生物が少数しか存在しないことによってさらに困難になり得る。血液中に病原体が少数しか存在しないことは、血液の培養による敗血症の診断に特に問題を表す。たとえば一研究では、敗血症の臨床症状を示している患者の１７％でしか陽性の培養結果が得られなかった（Rangel-Frausto他、JAMA、273:117-23、(1995)）。診断は、非病原性微生物による試料の汚染によってさらに困難になり得る。たとえば、敗血症に罹患している７０７人の患者の研究において、検出された微生物の１２．４％しか臨床的に有意でなかった（Weinstein他、Clinical Infectious Diseases、24:584-602、(1997)）。
【０００６】
敗血症の早期診断が困難なことは、この疾患に関連した罹患率および死亡率が高いことに反映されている。敗血症は現在、米国において死因の第１０位であり、非冠状動脈集中治療室（ＩＣＵ）の入院患者の間で特に流行しており、ここではこれが死の最大の原因である。死亡率の全体の率は３５％と高く、米国だけで年間推定７５０，０００件が発生している。敗血症を処置する年間費用は米国だけで１０億ドルの桁にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、有効な処置および予防を可能にするための、十分早期に敗血症を診断する方法の必要性が存在する。既存の敗血症の採点システムや予測モデルのほとんどは、既に敗血症であると考えられている患者において死を含めた後期合併症の危険性のみを予測する。しかし、このようなシステムおよびモデルでは、敗血症自体の発生が予測されない。ＳＩＲＳに罹患している患者のうち誰が敗血症を発生し誰が発生しないかを分類する方法が特に必要である。本明細書中で、本研究者らは、典型的には敗血症患者群対正常（すなわち非敗血症の）対照患者群において異なるレベルで発現される単一のバイオマーカーを定義する。その全体が本明細書中に参考として組み込まれている、２００３年３月２６日出願の米国特許仮出願第１０／４００，２７５号は、様々なバイオマーカーの発現レベルの時間依存性の変化を分析することによって早期敗血症を指摘する方法を開示している。したがって、早期敗血症を診断する最適な方法は、現在では、複数のバイオマーカーを測定することおよびこれらのバイオマーカーの発現を経時的に監視することをどちらも必要とする。
【０００８】
患者を経時的に監視する必要のない、特異性および感度をもって敗血症を診断する緊急の必要性が当分野で常に存在する。理想的には、単一時点での複数のバイオマーカーを正確、迅速、かつ同時に測定する技術によって診断が行われ、これにより診断に必要な時間の間に進行する疾患を最小限に抑えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、単一時点に生体試料から採取した複数のバイオマーカーの測定によって正確、迅速、かつ感度の高い敗血症の予測および診断を可能にする。これは、個体、特に敗血症を発生する危険性にある、敗血症に罹患している、または敗血症に罹患していると疑われる個体から単一時点でのバイオマーカープロフィールを得て、個体のバイオマーカープロフィールを参照バイオマーカープロフィールと比較するという分子診断的手法によって行われる。参照バイオマーカープロフィールは、たとえば、敗血症に罹患したまたは敗血症の発症もしくは敗血症の進行における特定の段階に罹患している個体の集団（「参照集団」）から得られうる。個体のバイオマーカープロフィールが参照集団のバイオマーカープロフィールの適切な特徴となる特性を含む場合は、その個体は敗血症になる可能性がより高い、敗血症に罹患している、または参照集団と同じ敗血症における進行の特定の段階にあると診断される。参照バイオマーカープロフィールはまた、ＳＩＲＳに罹患している者または感染症に罹患しているがＳＩＲＳには罹患していない者を含めた個体の様々な集団からも得られうる。したがって、本発明は、臨床医が、とりわけＳＩＲＳに罹患していない患者、ＳＩＲＳに罹患しているが調査の期間中に敗血症を発生する可能性が低い患者、敗血症に罹患している患者、いつかは敗血症になる危険性にある患者を判定することを可能にする。
【００１０】
本発明の方法はＳＩＲＳ患者における敗血症の発症の検出または予測に特に有用であるが、当業者であれば、本発明の方法を、それだけには限定されないが、ＳＩＲＳに罹患しているまたは敗血症の任意の段階にあると疑われる患者を含めた任意の患者で使用し得ることを理解しうる。たとえば、生体試料を患者から採取し、試料中のバイオマーカーのプロフィールを、それぞれのプロフィールがたとえばＳＩＲＳに罹患しているまたは敗血症の特定の段階にある者などの個体由来である、いくつかの異なる参照バイオマーカープロフィールと比較することができる。患者のバイオマーカープロフィールが特定の参照集団由来のプロフィールに対応するという分類は、この患者が参照集団内に含まれることの予測に用いられる。本発明の方法の結果もたらされる診断に基づいて、適切な治療計画をその後開始することができる。
【００１１】
ＳＩＲＳ、敗血症または敗血症の進行の段階を診断または予測する既存の方法は、非特異的な臨床的徴候および症状に基づいており、その結果もたらされる診断はしばしば臨床的有用性が制限されている。本発明の方法は敗血症の様々な段階を正確に検出するので、これを用いて適切に治療研究に参加している可能性のある個体を同定することができる。単一時点に得られた生体試料中のバイオマーカーの発現の「スナップショット」から敗血症を予測または診断し得るので、この治療研究は重大な臨床的症状が発症する前に開始し得る。生体試料をそのバイオマーカープロフィールについてアッセイするので、特定のバイオマーカーの同定は不要である。それにもかかわらず、本発明は、敗血症または敗血症の進行の特定の段階に特徴的なプロフィールを有する特異的なバイオマーカーを同定する方法を提供する。このようなバイオマーカー自体が、敗血症を予測または診断において有用なツールとなる。
【００１２】
この目的のため、本発明は、種々の核酸バイオマーカーまたは核酸バイオマーカーの組み合わせを提供する。核酸バイオマーカーは、個体から採取した生体試料（例えば血液試料）から同定される。理論に拘束または制限されるものではないが、ＳＩＲＳまたは種々の敗血症の段階（例えば、慣用技術を用いた敗血症の臨床的疑いの前における敗血症の発症）に対する宿主反応に関与するタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡの発現レベルは、敗血症のその段階を予測もしくは診断可能であり、またはＳＩＲＳを診断可能である。これらのタンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する生体試料中の細胞、およびこれらのｍＲＮＡの発現レベルの検出は、個体における敗血症の状態を判定し、またはＳＩＲＳを診断するために用いることができる。本発明の核酸バイオマーカーには、限定されるものではないが、ｍＲＮＡ、これらのｍＲＮＡから作製される核酸、およびｍＲＮＡと二本鎖を形成可能な核酸などが含まれる。本発明の核酸バイオマーカーは、「宿主反応バイオマーカー」と称する。
【００１３】
従って、本発明はまた、表２〜１０の任意の一つに例示される核酸からなる群より選択される、少なくとも１、２、３、４、５、１０またはそれ以上の宿主反応バイオマーカーを含むキットを提供する。表２〜１０に例示される核酸は、それらがコードするタンパク質によって特徴付けられる。本発明の目的のための宿主反応バイオマーカーには、限定されるものではないが、同定されたタンパク質をコードするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡ、および同定されたタンパク質をコードするｍＲＮＡと特定の複合体（例えばハイブリダイズした二本鎖）を形成することが可能なＤＮＡもしくは他の分子が含まれる。一実施形態において、キットは、表２〜１０に例示されたバイオマーカーに対応するｍＲＮＡと二本鎖を形成することが可能なＤＮＡプローブ（例えばｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチオド）を含む。別の実施形態において、本発明は、個体の生体試料中に存在するｍＲＮＡバイオマーカーを検出することにより該個体において敗血症の状態を判定するまたはＳＩＲＳを診断することが可能な核酸アレイをＤＮＡプローブを用いて構築する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、核酸の測定可能な特徴であり、かつ少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の精度における個体の参照集団への分類に寄与する、少なくとも２、３、４、５、１０もしくは２０またはそれ以上の特性を含む宿主反応バイオマーカーのプロフィールを提供する。参照集団は、正常な参照集団、ＳＩＲＳ陽性参照集団、感染した／ＳＩＲＳ陰性参照集団、敗血症陽性参照集団、敗血症の進行の段階にある参照集団、約０〜３６時間後に慣用技術によって敗血症に罹患していると確認されたＳＩＲＳ陽性参照集団、約３６〜６０時間後に慣用技術によって敗血症に罹患していると確認されたＳＩＲＳ陽性参照集団、および約６０〜８４時間後に慣用技術によって敗血症に罹患していると確認されたＳＩＲＳ陽性参照集団からなる群より選択され得る。
【００１５】
本発明はさらに、個体において敗血症の状態を判定またはＳＩＲＳを診断する方法において使用することが可能な、宿主反応バイオマーカーを単離する方法を提供する。この方法は、個体の集団から採取した生体試料から宿主反応バイオマーカーの参照バイオマーカープロフィールを得、個体における敗血症の状態を判定またはＳＩＲＳを診断することが可能な参照バイオマーカープロフィールの特性を同定することを含む。その後、上記特性に対応する宿主反応バイオマーカーを同定し、単離する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、個体から単一の時点で（「スナップショット」）または疾患の進行の過程で得られた１つまたは複数の生体試料を用いた、敗血症の迅速、感度の高い、かつ正確な診断または予測を可能にする。有利なことに、敗血症を臨床的症状の発症の前に診断または予測し得、その結果より有効な治療行為が可能になる。
【００１７】
「全身性炎症反応症候群」、すなわち「ＳＩＲＳ」とは、２４時間の間に以下の状態の２つ以上に見られるように様々な重篤な臨床的状態（insult）に対する臨床反応をいう：
・体温が３８℃（１００．４°Ｆ）より高いまたは３６℃（９６．８°Ｆ）未満である；
・心拍数（ＨＲ）が９０回／分より高い；
・呼吸数（ＲＲ）が２０回／分より高い、またはＰＣＯ２が３２ｍｍＨｇ未満である、もしくは人口呼吸を必要とする；および
・白血球数（ＷＢＣ）が１２．０×１０９個／Ｌより高いもしくは４．０×１０９個Ｌ未満であるか、または１０％より高い未熟な形成（バンド）を有する。
【００１８】
これらのＳＩＲＳの症状は、将来改善された定義によって変更または補完され得る、ＳＩＲＳの共通定義を表す。本定義は、現在の臨床慣行を明確にするために使用し、本発明の重要な態様を表すものではない。
【００１９】
ＳＩＲＳに罹患している患者は、上に定義したＳＩＲＳとして分類される臨床症状を有するが、敗血症であるとは臨床的にみなされない。敗血症を発生する危険性にある個体には、ＩＣＵの患者および火傷または他の損傷などの他の生理的外傷を患った患者が含まれる。「敗血症」とは、確認された感染症のプロセスに関連するＳＩＲＳ陽性状態をいう。敗血症の臨床上の疑いは、ＳＩＲＳ患者のＳＩＲＳ陽性状態が感染症のプロセスの結果ではないかという疑惑から生じる。本明細書中で使用する「敗血症」には、それだけには限定されないが、敗血症の発症、重篤な敗血症および敗血症の最終段階に関連するＭＯＤを含めた敗血症のすべての段階が含まれる。
【００２０】
「敗血症の発症」とは、敗血症の早期段階、すなわち、臨床症状が敗血症の臨床上の疑いを支持するのに十分となる前の段階をいう。本発明の方法を用いることにより、慣用技術を用いた場合に敗血症が疑われる時点より前に敗血症を検出するので、早期敗血症での患者の疾患状態を、敗血症の症状がより明らかになった時に遡及的に確認することしかできない。患者が敗血症となる正確な機構は本発明の重要な態様ではない。本発明の方法では、感染症のプロセスの起源に依存せずにバイオマーカープロフィールの変化を検出することができる。敗血症がどのように生じるかにかかわらず、本発明の方法によって、以前に使用した参照によって分類した、敗血症またはＳＩＲＳを罹患しているまたは罹患していると疑われる患者の状態を判定することが可能となる。
【００２１】
「重篤な敗血症」とは、臓器不全、低灌流性異常、または敗血症誘発性低血圧に関連する敗血症をいう。低灌流性異常には、それだけには限定されないが、乳酸アシドーシス、乏尿、または精神状態の急性の変化が含まれる。「敗血症性ショック」とは、十分な静脈輸液負荷に応答性がなく、末梢低灌流の症状を有する敗血症誘発性低血圧をいう。「転換患者」とは、患者を監視している期間の間、典型的にはＩＣＵに滞在中に敗血症の臨床上の疑いへと進行するＳＩＲＳ陽性患者をいう。「非転換患者」とは、患者を監視している期間の間、典型的にはＩＣＵに滞在中に敗血症の臨床上の疑いへと進行しないＳＩＲＳ陽性患者をいう。
【００２２】
「バイオマーカー」とは、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機または無機化学物質、天然ポリマー、および小分子など、生体試料中に存在し、かつ生体試料から単離し得るまたは生体試料中で測定され得る、事実上任意の生体化合物である。さらに、バイオマーカーは、完全な分子全体、あるいは部分的に機能的である、またはたとえば抗体もしくは他の特異的結合タンパク質によって認識可能なその一部分であることができる。バイオマーカーは、バイオマーカーの測定可能な性状が敗血症の特定の段階などの患者の所定の状態に関連している場合は、情報価値があるとみなされる。このような測定可能な性状には、たとえば、個体の生体試料中にバイオマーカーが存在すること、存在しないこと、もしくはその濃度、および／またはそれがバイオマーカーのプロフィールの一部として存在することが含まれ得る。バイオマーカーのこのような測定可能な性状は、本明細書中では「特性」として定義される。この特徴はバイオマーカーの２つ以上の測定可能な性状の比であってもよく、バイオマーカーは、たとえば何であるかが知られているものであっても知られていないものであってもよい。「バイオマーカープロフィール」は、少なくとも２つのこのような特性を含み、この特性はたとえば核酸および炭水化物などの同一または異なるバイオマーカーのクラスに対応していることができる。バイオマーカープロフィールはまた、少なくとも３、４、５、１０、２０、３０以上の特性を含み得る。一実施形態では、バイオマーカープロフィールは数百、数千もの特性を含む。別の実施形態では、バイオマーカープロフィールは少なくとも１つの内部標準の少なくとも１つの測定可能な性状を含む。
【００２３】
「表現型の変化」とは、患者の所定の状態に関連するパラメータにおける検出可能な変化である。たとえば、表現型の変化は体液中のバイオマーカーの増加または低減を含み得、この変化は敗血症または敗血症の発症に関連している。表現型の変化はさらに、バイオマーカーの測定可能な性状の変化ではない患者の所定の状態の検出可能な性状における変化を含み得る。たとえば、表現型の変化には体温、呼吸数、脈拍、血圧、または他の生理的パラメータにおける検出可能な変化が含まれ得る。このような変化は、当業者に周知の慣用技術を用いた臨床観察および測定によって判定することができる。本明細書中で使用する「慣用技術」とは、本発明によるバイオマーカープロフィールを得ずに表現型の変化に基づいて個体を分類する技術である。
【００２４】
「判断基準」とは、患者の分類に使用する方法である。この基準は、その全体が本明細書中に参考として組み込まれているHastie他、「The Elements of Statistical Learning」、Springer-Verlag、(Springer、New York、(2001))に例示されているように、当分野で知られている１つまたは複数の形態をとることができる。試料中の分子の複雑な混合物におけるバイオマーカーの分析により、データセットに特性が生じる。判断基準を用いて特性のデータセットに従って、特に敗血症の発症の予測、敗血症の進行の判定、敗血症の診断する、またはＳＩＲＳの診断を行い得る。
【００２５】
判断基準の当てはめには完全な分類は必要でない。一実施形態では、分類を少なくとも約９０％、またはそれ以上の確実性で行い得る。他の実施形態では、確実性は少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約６０％である。確実性の有用な度合いは、本発明の具体的な方法に応じて変動し得る。「確実性」とは、正確に分類された個体の合計数を分類に供した個体の合計数で割算したものと定義される。本明細書中で使用する「確実性」とは、「精度」を意味する。分類はまた、その「感度」によって特徴づけられ得る。分類の「感度」は、敗血症に罹患していると正しく同定された敗血症患者の割合に関連する。当分野において「感度」とは、真の陽性の数を真の陽性と偽の陰性との合計で割算したものと定義される。対照的に、この方法における「特異性」は、敗血症に罹患していないと正しく同定された患者の割合として定義される。すなわち、「特異性」は、真の陰性の数を真の陰性と偽の陽性との合計で割算したものに関連する。一実施形態では、感度および／または特異性は、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％または少なくとも約６０％である。十分な確実性で個体を分類するのに使用し得る特性の数は、典型的には約４つである。しかし、求められる確実性の度合い次第では特性の数はそれ以上またはそれ以下であってもよいが、すべての場合で少なくとも１つはある。一実施形態では、個体を分類するのに使用し得る特性の数は、高い確実性で個体を分類することを可能にするように最適化されている。
【００２６】
患者における敗血症またはＳＩＲＳの「状態の判定」とは、（１）患者において敗血症もしくはＳＩＲＳの存在を検出する、（２）患者において敗血症の発症もしくはＳＩＲＳを予測する、または（３）患者において敗血症の進行を測定するために患者のバイオマーカープロフィールを分類することを包含する。敗血症またはＳＩＲＳの「診断」とは、患者において敗血症またはＳＩＲＳを同定または検出することを意味する。本発明は、明白に観察可能な臨床症状の前に敗血症を検出する感度が高いので、敗血症の同定または検出には、上で定義した敗血症の発症の検出が含まれる。すなわち、「敗血症の発症の予測」とは、患者のバイオマーカープロフィールを、ＳＩＲＳの特定の段階から敗血症へ、または感染した状態から敗血症へ（すなわち、感染症から汚染ＳＩＲＳによる感染症）と進行している個体由来のプロフィールに対応していると分類することを意味する。敗血症またはＳＩＲＳの「進行の検出」または「進行の判定」とは、既に敗血症またはＳＩＲＳに罹患していると診断された患者のバイオマーカープロフィールを分類することを意味する。たとえば、敗血症に罹患していると診断された患者のバイオマーカープロフィールを分類することは、敗血症から重篤な敗血症またはＭＯＤを伴った敗血症への患者の進行を検出または判定することを包含することができる。
【００２７】
本発明によれば、敗血症は、個体から得た試料からバイオマーカーのプロフィールを得ることによって診断または予測し得る。本明細書中で使用する「得る」とは、「手に入れる」ことを意味する。本発明は、感染症、またはさらには敗血症に罹患しているが、未だ敗血症に罹患していると診断されていない個体、敗血症に罹患していると疑われている個体、または敗血症を発生する危険性にある個体において敗血症を予測および診断するのに特に有用である。同様に、本発明を個体においてＳＩＲＳを検出および診断するのに使用し得る。すなわち、本発明は、ＳＩＲＳの臨床上の疑いを確認するために使用し得る。本発明はまた、感染症、菌血症、敗血症、重篤な敗血症、敗血症性ショックなどの敗血症の様々な段階を検出するためにも使用し得る。
【００２８】
個体から得たバイオマーカーのプロフィール、すなわち試験バイオマーカープロフィールを、参照バイオマーカープロフィールと比較する。参照バイオマーカープロフィールは、１の個体または２以上の個体の集団から作成することができる。集団は、たとえば３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上の個体を含み得る。さらに、本発明の方法において比較する参照バイオマーカープロフィールおよび個体の（試験）バイオマーカープロフィールは、試験および参照バイオマーカープロフィールは異なる時点で採取した生体試料から作成されたものであり、互いに比較するという条件で、同じ個体から作成してもよい。たとえば、試料を研究期間の開始時に個体から得てよい。その後、その試料から採った参照バイオマーカープロフィールを、同じ個体のその後の試料から作成したバイオマーカープロフィールと比較し得る。このような比較は、たとえば、経時的な繰返しの分類によって個体における敗血症の状態を判定するために使用し得る。
【００２９】
参照集団は、ＳＩＲＳに罹患していない個体（「ＳＩＲＳ陰性」）、ＳＩＲＳには罹患していないが感染症のプロセスを患っている個体、ＳＩＲＳを患っているが敗血症が存在しない個体（「ＳＩＲＳ陽性」）、敗血症の発症を患っている個体、敗血症陽性であり敗血症の進行の段階の１つを患っている個体、敗血症を発生する危険性を増大させる生理的外傷を有する個体から選択され得る。さらに、参照集団はＳＩＲＳ陽性であり得、その後に慣用技術を用いて敗血症を診断される。たとえば、参照プロフィールの作成に用いたＳＩＲＳ陽性患者の集団は、参照バイオマーカープロフィールを作成する目的で生体試料を採取した約２４、４８、７２、９６時間以上後に敗血症を診断されるかもしれない。一実施形態では、ＳＩＲＳ陽性個体の集団は、慣用技術を用いて、生体試料を採取した約０〜３６時間、約３６〜６０時間、約６０〜８４時間、または約８４〜１０８時間後に敗血症を診断される。バイオマーカープロフィールが敗血症またはその進行段階の１つを表示している場合は、臨床医は、敗血症の臨床的症状が現れる前に処置を開始し得る。処置は、典型的には、感染源を判定するために患者を検査することを含む。感染源の場所を判定した後、臨床医は、典型的には、好ましくは膿瘍の排出または感染したカテーテルの除去などの関連する経験的抗菌治療を開始する前、および場合によっては追加の補助療法手段の前に、感染部位から培養物を得る。敗血症の治療法は、Healy、上記に総説されている。
【００３０】
本発明の方法は、個体のバイオマーカープロフィールを参照バイオマーカープロフィールと比較することを含む。本明細書中で使用する「比較」には、個体および参照バイオマーカープロフィールの少なくとも１つの差異を識別する任意の手段が含まれる。したがって、比較はクロマトグラフィースペクトルの目視検査を含み得、また、比較はプロフィールの特性に割り当てられた値の演算的または統計的な比較を含み得る。このような統計的な比較には、それだけには限定されないが、判断基準を当てはめることが含まれる。バイオマーカープロフィールが少なくとも１つの内部標準を含む場合は、バイオマーカープロフィールの差異を識別するための比較はこれら内部標準の特徴も含み得、そのようなバイオマーカーの特性を内部標準の特徴と相関させる。比較によって、特に敗血症もしくはＳＩＲＳを獲得する見込みを予測することができる；または、比較によって敗血症もしくはＳＩＲＳが存在することもしくは存在しないことを確認することができる；または、比較によって個体がその段階であり得る敗血症の段階を示すことができる。
【００３１】
したがって、本発明により、ある監視期間に亘る時間集約的なアッセイを実施する必要性およびそれぞれのバイオマーカーを同定する必要性が除かれる。本発明は個体を分類するための監視期間を必要としないが、個体に危険性がなくなるまで、個体の繰返しの分類、すなわち繰返しのスナップショットを経時的にとり得ることは理解されよう。あるいは、個体から得たバイオマーカーのプロフィールを、同じ個体から異なる時点で得た１つまたは複数のバイオマーカーのプロフィールと比較し得る。当業者は、繰返しの分類の過程で行われるそれぞれの比較により、個体が参照集団のメンバーであるかどうかを分類できることを理解されよう。
【００３２】
敗血症が存在しない状態からＭＯＤまでの敗血症の進行における様々な段階に対応する様々な生理的状態にある個体は、特徴的なバイオマーカープロフィールによって識別し得る。本明細書中で使用する「個体」とは、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトまたは非ヒト霊長類である。用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書中で互換可能に使用される。個体は、正常である、ＳＩＲＳもしくは敗血症に罹患していることが疑われている、ＳＩＲＳもしくは敗血症を発症する危険性にある、またはＳＩＲＳもしくは敗血症に罹患していることが確認されているとすることができる。敗血症の進行に関連付けられている多くの既知のバイオマーカーが存在するが、これらのマーカーのすべてが初期の前臨床段階に現れるわけではない。初期段階敗血症に特徴的なバイオマーカーのサブセットは、実際、最終的に敗血症の臨床的症状を示す個体から得た試料の遡及的な分析によってしか決定されないかもしれない。理論に拘束されるものではないが、敗血症をもたらす初期病理学的感染症さえもバイオマーカーの発現における特定の変化に反映される生理的変化を引き起こし得る。たとえば敗血症の一段階の特徴的なバイオマーカープロフィールが決定された後は、個体から得た生体試料からのバイオマーカーのプロフィールをこの参照プロフィールと比較して、試験対象もその敗血症の特定の段階にあるかどうかを判定し得る。
【００３３】
敗血症の一段階から別の段階へ、または正常な状態（すなわち敗血症もしくはＳＩＲＳを罹患していないことに特徴づけられる状態）から敗血症もしくはＳＩＲＳへ、およびその逆の、集団の進行は、バイオマーカープロフィールの変化によって特徴づけられ、特定のバイオマーカーがますます高いレベルで発現され、他のバイオマーカーの発現がダウンレギュレートされていく。バイオマーカープロフィールのこれらの変化は、たとえば感染症および／または炎症に対する参照集団における生理応答の進行的な確立を反映している可能性がある。当業者であれば、生理応答が鎮静するにつれて参照集団のバイオマーカープロフィールも変化することを理解されよう。上述のように、本発明の利点の１つは、単一の生体試料由来のバイオマーカープロフィールを用いて、個体が特定の集団のメンバーであると分類する能力である。しかし、当業者であれば、特定の生理応答が確立されているのか鎮静されているのかの判定が、その後の個体の分類によって容易になり得ることを理解されよう。このために、本発明は、敗血症またはＳＩＲＳに対する生理応答が確立されるまたは鎮静するにつれて発現のレベルが上昇も低下もする数々のバイオマーカーを提供する。たとえば、調査者は、敗血症に対する生理応答が確立されるにつれて強度が変化することが知られている個体のバイオマーカープロフィールの特性を選択することができる。個体のその後の生体試料由来のプロフィールにおける同じ特性を比較することによって、個体がより重篤な敗血症に向かって進行しているのか、または正常な状態に向かって進行しているのかを確立することができる。
【００３４】
バイオマーカーの分子の種類は本発明に重要でない。実際、本発明は既に同定されたバイオマーカーに限定されるべきでない（２００３年３月２６日出願の米国特許出願第１０／４００，２７５号参照）。したがって、所定の個体集団、特に敗血症の早期段階の１つにある集団に特徴的である新規のバイオマーカーが同定されることが期待される。本発明の一実施形態では、バイオマーカーを同定および単離する。その後、これを使用して、様々な診断的アッセイにおいてバイオマーカーの検出を容易にすることができる特異的に結合する抗体を産生させ得る。この目的のために、任意の免疫アッセイにおいてバイオマーカー分子に結合することができる任意の抗体、抗体フラグメントまたは誘導体を使用し得る（たとえばＦａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖフラグメント）。このような免疫アッセイは当分野で周知である。バイオマーカーがタンパク質である場合、これの配列決定を行い、十分に確立されている技術を用いて、それをコードする遺伝子をクローニングし得る。
【００３５】
本発明の方法は、たとえばＩＣＵに収容された患者のスクリーニングに使用し得る。たとえば血液などの生体試料を、収容直後に採取する。血液中のタンパク質および他の分子の複雑な混合物をバイオマーカーのプロフィールとして分離する。これは、何らかの物理的または化学的特性に基づいてこれらの分子を再現可能に識別する任意の技術または技術の組合せを使用することによって行い得る。一実施形態では、分子をマトリックス上に固定し、その後、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析によって分離および識別する。各分子またはその断片の質量／電荷比を反映する特徴的な脱離パターンによってスペクトルが作成される。別の実施形態では、細胞抽出物から得られた様々なｍＲＮＡ種からバイオマーカーを選択し、個体のｍＲＮＡ種をｃＤＮＡのアレイとハイブリダイズさせることによってバイオマーカープロフィールを得る。ｃＤＮＡアレイの診断的使用は当分野で周知である（たとえば、Zou他、Oncogene、21:4855-4862、(2002)参照）。さらに別の実施形態では、タンパク質および核酸の分離方法の組合せを用いてプロフィールが得られる。
【００３６】
本発明はまた、個体において敗血症の状態を判定するまたはＳＩＲＳを診断するのに有用なキットを提供する。本発明のキットは、少なくとも１つのバイオマーカーを含む。本発明において有用な特定のバイオマーカーを本明細書中に記載した。キットのバイオマーカーを使用して、本発明によるバイオマーカープロフィールを作成し得る。一般に、キットのバイオマーカーは、少なくともある程度の特異性をもって、バイオマーカープロフィールを作成した生体試料中に含まれるバイオマーカー分子に結合する。キットの化合物のクラスの例には、それだけには限定されないが、タンパク質およびその断片、ペプチド、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物、脂質、核酸、有機および無機化学物質、ならびに天然および合成ポリマーが含まれる。バイオマーカー（もしくは複数のバイオマーカー）はアレイの一部であるか、またはバイオマーカー（もしくは複数のバイオマーカー）を別々にかつ／もしくは個別にパッケージしてもよい。キットはまた、本発明のバイオマーカープロフィールを作成するために使用する少なくとも１つの内部標準も含み得る。同様に、内部標準は上述の化合物のクラスの任意のものであることができる。本発明のキットはまた、バイオマーカープロフィールを作成した生体試料中に含まれるバイオマーカーを検出可能に標識するために使用することができる試薬も含み得る。この目的のために、キットは、バイオマーカーを記載した以下の表のうち任意の１つに示した、少なくとも２、３、４、５、１０、２０種以上のバイオマーカーと特異的に結合する抗体またはその機能的フラグメントのセットを含み得る。抗体自体を検出可能に標識してもよい。キットはまた、アプタマーなどの特異的なバイオマーカー結合構成成分も含み得る。バイオマーカーが核酸を含む場合は、キットは、バイオマーカーまたはバイオマーカーの相補鎖と二重鎖を形成する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを提供し得る。オリゴヌクレオチドプローブは検出可能に標識し得る。
【００３７】
本発明のキットは、バイオマーカーを用いて抗体を生成させる場合、製薬用賦形剤、希釈剤および／または助剤も含み得る。製薬用助剤の例には、それだけには限定されないが、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤が含まれる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸（phenol sorbic acid）などを含むことによって確実にすることができる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を含めることが望ましいこともある。注射用製薬剤形の吸収時間の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤を含むことによってもたらすことができる。
【００３８】
バイオマーカープロフィールの作成
一実施形態によれば、本発明の方法は、個体から採取した生体試料からバイオマーカーのプロフィールを得ることを含む。生体試料は、血液、血漿、唾液、血清、痰、尿、脳脊髄液、細胞、細胞抽出物、組織試料、組織生検、糞便試料などであり得る。参照バイオマーカープロフィールは、たとえば、ＳＩＲＳ陰性個体、ＳＩＲＳ陽性個体、敗血症の発症を患っている個体および既に敗血症に罹患している個体からなる群より選択される個体の集団から得ることができる。既に敗血症に罹患している個体由来の参照バイオマーカープロフィールは、感染症、菌血症、重篤な敗血症、敗血症性ショックまたはＭＯＤなどの敗血症の進行の任意の段階で得ることができる。
【００３９】
一実施形態では、試料中のバイオマーカーのサブセットだけが分析されるようにバイオマーカーのプロフィールを作成するために、分離方法を使用し得る。たとえば、試料中の分析されるバイオマーカーは、試料中の核酸バイオマーカーのみが得られるように分画した細胞抽出物由来のｍＲＮＡ種からなるか、または、バイオマーカーはクロマトグラフィー技術によって分画した試料中のタンパク質の全量の一部分からなり得る。あるいは、分離方法を用いずにバイオマーカーのプロフィールを作成することができる。たとえば、試料中のバイオマーカーと特異的な複合体を形成する標識した化合物を用いて生体試料を検索することができ、この場合、特異的複合体内の標識の強度がバイオマーカーの測定可能な特徴である。このような特異的複合体の形成に適切な化合物は、標識した抗体である。一実施形態では、増幅可能な核酸を標識として、抗体を用いてバイオマーカーを測定する。さらに別の実施形態では、それぞれが核酸標識の一方の鎖にコンジュゲートした２つの抗体が、２つの核酸鎖が増幅可能な核酸を形成するようにバイオマーカーと相互作用した場合に、核酸標識が増幅可能となる。
【００４０】
別の実施形態では、バイオマーカープロフィールは、バイオマーカーが核酸またはその相補対であり得る核酸のアレイなどのアッセイ由来であり得る。たとえば、バイオマーカーはリボ核酸であり得る。また、バイオマーカープロフィールを、核磁気共鳴、核酸アレイ、ドットブロット、スロットブロット、逆転写増幅およびノーザン分析からなる群より選択された方法を用いて得てもよい。別の実施形態では、バイオマーカープロフィールを、バイオマーカーに特異的な抗体またはその機能的フラグメントを反応させることによって免疫学的に検出する。抗体の機能的フラグメントとは、完全な抗体が結合する抗原に結合する能力を少なくともある程度保持している、抗体の一部分である。それだけには限定されないがｓｃＦｖフラグメント、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメントを含めたフラグメントは、組換えによって産生させるか、酵素的に産生させることができる。別の実施形態では、アプタマーなど抗体以外の特異的結合分子を用いてバイオマーカーに結合させ得る。さらに別の実施形態では、バイオマーカープロフィールは、感染性因子またはその成分の測定可能な性状を含み得る。さらに別の実施形態では、バイオマーカープロフィールは、タンパク質もしくは核酸の断片が含まれ得る、または代謝物が含まれ得る小分子の測定可能な性状を含み得る。
【００４１】
バイオマーカープロフィールは、１つまたは複数の分離方法を用いて作成し得る。たとえば、適切な分離方法には、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎは０より大きい整数である）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎなどの質量分析方法が含まれ得る。他の質量分析方法には、とりわけ、四重極、フーリエ変換型質量分析（ＦＴＭＳ）およびイオントラップが含まれ得る。他の適切な分離方法には、化学抽出分離、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）または薄層、ガスもしくは液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー、あるいはそれらの任意の組合せが含まれ得る。一実施形態では、分離方法を適用する前に生体試料を分画し得る。
【００４２】
バイオマーカープロフィールは、バイオマーカー自体の物理的な分離を必要としない方法によっても作成し得る。たとえば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析を使用して分子の複雑な混合物からバイオマーカーのプロフィールを分解し得る。腫瘍を分類するためのＮＭＲの類似の使用が、たとえばHagberg、NMR Biomed.、11:148-56、(1998)に開示されている。さらなる手順には、個々のバイオマーカーを物理的に分離せずにバイオマーカーのプロフィールを作成するために使用し得る核酸増幅技術が含まれる（たとえばStordeur他、J. Immunol. Methods、259:55-64、(2002)およびTan他、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA、99:11387-11392、(2002)参照）。
【００４３】
一実施形態では、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析を使用して、バイオマーカーが入射レーザーの照射によってイオン化されて固体担体から気化されたタンパク質またはタンパク質断片であるバイオマーカーのプロフィールを作成する。その後、その質量対電荷（「ｍ／ｚ」）比に依存するそれぞれのタンパク質に特徴的な飛行時間によってプロフィールを作成する。様々なレーザー脱離／イオン化が当分野で知られている（たとえば、Guttman他、Anal. Chem.、73:1252-62、(2001)およびWei他、Nature、399:243-46、(1999)参照）。
【００４４】
レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析により、大量の情報を比較的短時間で作成することが可能となる。生体試料を、試料中のバイオマーカーのすべてまたはそのサブセットに結合する種々の担体に塗布する。細胞溶解液または試料をこれらの表面に、事前に精製または分画してまたはせずに、少ない場合は０．５μＬの体積を直接塗布する。溶解物または試料は、担体表面に塗布する前に濃縮または希釈することができる。その後、レーザー脱離／イオン化を使用して、３時間もの短時間の間に試料または複数の試料の質量スペクトルが作成される。
【００４５】
別の実施形態では、個体の細胞抽出物からの全ｍＲＮＡをアッセイし、生体試料から得られた様々なｍＲＮＡ種をバイオマーカーとして使用する。プロフィールは、当分野で知られている標準方法を用いて、たとえば、これらのｍＲＮＡをオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡを含み得るプローブのアレイにハイブリダイズさせることによって得られうる。あるいは、ｍＲＮＡを、すべて当分野で知られているゲル電気泳動またはドットブロット、スロットブロットもしくはノーザン分析などのブロット方法に供し得る（たとえば、Sambrook他、「Molecular Cloning、第3版」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、(2001)参照）。ｍＲＮＡプロフィールはまた、たとえばStordeur他、上記に記載されているように、逆転写、次いで生じたｃＤＮＡの増幅および検出によっても得られうる。別の実施形態では、プロフィールは、質量分光分析と組み合わせた核酸アレイなどの方法の組合せを用いて得られうる。
【００４６】
データ分析アルゴリズムの使用
一実施形態では、個体のバイオマーカープロフィールを参照バイオマーカープロフィールと比較することは、判断基準を当てはめることを含む。この判断基準はコンピュータパターン認識アルゴリズムなどのデータ分析アルゴリズムを含むことができる。他の適切なアルゴリズムには、それだけには限定されないが、特性の値の分布の差を検出するロジスティック回帰またはノンパラメトリックアルゴリズムが含まれる（たとえばウィルコクソンの符号付検定）。判断基準は、１、２、３、４、５、１０、２０以上の特性に基づき得る。一実施形態では、判断基準は数百以上の特性に基づく。判断基準の当てはめは、分類木アルゴリズムの使用も含み得る。たとえば、参照バイオマーカープロフィールは少なくとも３つの特性を含み得、これらの特性が分類木アルゴリズムにおける予測の判断材料である。データ分析アルゴリズムでは、集団（またはクラス）内のメンバーであるかどうかが少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％および少なくとも約９０％の精度で予測される。
【００４７】
適切なアルゴリズムが当分野で知られており、その一部がHastie他、上記に総説されている。このようなアルゴリズムでは、血液試料などの生体材料由来の複雑なスペクトルを分類して、個体を、正常であるか、またはバイオマーカーの発現レベルが特定の病状に特徴的であるとして識別する。このようなアルゴリズムを、判断基準を当てはめる速度および有効性を増大させるため、および調査者による偏りを避けるために使用し得るが、当業者は、本発明の方法の実施にはコンピュータに基づいたアルゴリズムは必要ないことを理解されるであろう。
【００４８】
バイオマーカープロフィールの作成に用いた方法にかかわらず、アルゴリズムをバイオマーカープロフィールの比較に当てはめ得る。たとえば、Harper、「Pyrolysis and GC in Polymer Analysis」、Dekker、New York、(1985)に記載のように、適切なアルゴリズムを、ガスクロマトグラフィーを用いて作成したバイオマーカープロフィールに当てはめることができる。さらに、Wagner他、Anal. Chem、74:1824-35、(2002)は、静電飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）によって得られたスペクトルに基づいて個体を分類する能力を向上させるアルゴリズムを開示している。さらに、Bright他、J. Microbiol. Methods、48:127-38、(2002)は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを分析することによって細菌株を高い確実性（７９〜８９％の正しい分類率）で識別する方法を開示している。Dalluge、Fresenius J. Anal. Chem.、366:701-11、(2000)は、複雑な生体試料中のバイオマーカーのプロフィールの分類におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよび液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ）の使用について記載している。
【００４９】
バイオマーカー
本発明の方法は、敗血症またはＳＩＲＳの診断または予測に用いるバイオマーカープロフィールを作成することによって実施することができる。プロフィールの作成が本発明の実施には十分であるので、プロフィールを構成するバイオマーカーは知られている必要がなく、またその後に同定する必要もない。
【００５０】
まとめると、本発明の方法に従って個体において敗血症の状態を判定するまたはＳＩＲＳを診断するのに有用な内因性バイオマーカーは、本明細書において「宿主反応バイオマーカー」と定義する。本発明のバイオマーカープロフィールを作成するために使用するバイオマーカーには、感染症に対する免疫系の応答の状態についての情報を与えることが知られているものが含まれ得るが、これらのバイオマーカーはすべて同等に情報価値があるわけではない。これらのバイオマーカーには、コートタンパク質、リポ多糖（内毒素）、リポテイコ酸などの宿主または病原体自体由来のホルモン、自己抗体、可溶性および不溶性受容体、成長因子、転写因子、細胞表面マーカーおよび可溶性マーカーが含まれることができる。他のバイオマーカーには、それだけには限定されないが、ＣＤ６４タンパク質などの細胞表面タンパク質；ＣＤ１１ｂタンパク質；ＨＬＡ−ＤＲタンパク質およびＨＬＡ−ＤＱタンパク質を含めたＨＬＡクラスＩＩ分子；ＣＤ５４タンパク質；ＣＤ７１タンパク質；ＣＤ８６タンパク質；表面結合腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）；Ｔｏｌｌ様受容体などのパターン認識受容体；インターロイキンＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１８などの可溶性マーカー；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）；ネオプテリン；Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）；プロカルシトニン（ＰＣＴ）；６−ケトＦｌα；トロンボキサンＢ２；ロイコトリエンＢ４、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｄ４およびＥ４；インターフェロンγ（ＩＦＮγ）；インターフェロンα／β（ＩＦＮα／β）；リンフォトキシンα（ＬＴα）；補体成分（Ｃ’）；血小板活性化因子（ＰＡＦ）；ブラジキニン、一酸化窒素（ＮＯ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；マクロファージ抑制因子（ＭＩＦ）；インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）；可溶性腫瘍壊死因子受容体（ｓＴＮＦｒ）；可溶性インターロイキン受容体ｓＩＬ−１ｒおよびｓＩＬ−２ｒ；トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）；プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；ならびに他の炎症伝達物質が含まれる（Oberholzer他、Shock、16:83-96、(2001)およびVincent 他、「The Sepsis Text」、Carlet他編、(Kluwer Academic Publishers、2002)に総説）。一般的にかつ臨床的に菌血症に関連付けられているバイオマーカーも、このようなバイオマーカーが生体試料中に一般的であり高頻度に発生することを条件として、本発明に有用なバイオマーカーの候補である。バイオマーカーは、タンパク質もしくは核酸の断片であることができる低分子量化合物を含むことができ、または代謝物を含み得る。代謝物などの低分子量化合物が存在することまたはその濃度は、敗血症および／またはＳＩＲＳに関連する表現型の変化を反映し得る。具体的には、小分子バイオマーカーの濃度の変化は、低体温症もしくは高体温、心拍数もしくは呼吸数の上昇、組織低酸素症、代謝性アシドーシスまたはＭＯＤなどの、ＳＩＲＳおよび／または敗血症に対する応答における任意の生理的変化から生じる細胞代謝の変化に関連しているかもしれない。また、バイオマーカ���はタンパク質バイオマーカーをコードしているＲＮＡおよびＤＮＡ分子も含み得る。
【００５１】
バイオマーカーは、好中球の活性化または単球の非活性化などの白血球の変化に関与する少なくとも１つの分子を含むこともできる。ＣＤ６４およびＣＤ１１ｂの発現の増加は、好中球および単球の活性化の徴候として認識される（Oberholzer他、上記およびVincent他、上記に総説）。本発明において有用となり得るバイオマーカーは、とりわけ、マクロファージ溶解産物に関連するものおよびサイトカイン代謝の変化のマーカーである（Gagnon他、細胞、110:119-31、(2002);Oberholzer他、上記;Vincent他、上記参照）。
【００５２】
バイオマーカーはまた、炎症プロセスに関与していることが知られている、または関与していることが判明したシグナル伝達因子も含むことができる。シグナル伝達因子は、受容体結合、受容体活性化、細胞内キナーゼの活性化、転写因子の活性化、遺伝子の転写および／または翻訳レベルの変化、ならびに代謝プロセスの変化などを含めた事象の細胞内カスケードを開始し得る。シグナル伝達分子およびこれらの分子によって活性化されたプロセスを、本発明の目的のためにまとめて「敗血症経路に関与する生体分子」と定義する。関連する予測用のバイオマーカーは敗血症経路に関与する生体分子を含むことができる。
【００５３】
したがって、本発明の方法は、予測に用いるバイオマーカーを同定するために偏りのない手法を使用し得るが、当業者には、生理応答または様々なシグナル伝達経路に関連するバイオマーカーの特定の群が特定の注目の対象であり得ることが明らかであろう。これは、生体試料由来のバイオマーカーを、バイオマーカーとの直接かつ特異的な相互作用によって様々なバイオマーカーの量を測定するために使用することができるアレイ（たとえば抗体アレイまたは核酸アレイ）と接触させる場合に特にそうである。この場合、アレイの成分の選択は、特定の経路が個体における敗血症またはＳＩＳＲの状態の判定に関連するという示唆に基づいていてよい。特定の生体分子が敗血症またはＳＩＲＳの予測または診断的に用いる特性を有していることが示されているため、強調的に生理調節されている他の生体分子も同様に予測または診断に用いる特性をもたらし得るという期待が生じ得る。しかし、当業者であれば、生物系の複雑さが原因でこのような期待は実現されないかもしれないことを理解されよう。たとえば、特異的ｍＲＮＡバイオマーカーの量が予測に用いる特性である場合、他のバイオマーカー発現が翻訳後のレベルで調節されているのであれば、別のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現の協奏的な変化は測定可能ではないかもしれない。さらに、バイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルは、敗血症に対する生理応答に関与しているまたは関与していないかもしれない複数の収束する経路によって影響を受け得る。
【００５４】
バイオマーカーは、例として示し限定するものではないが、宿主あるいは患者由来の血液、血漿、唾液、血清、尿、脳脊髄液、痰、糞便、細胞および細胞抽出物、または他の体液試料、組織試料もしくは組織生検であることができる任意の生体試料から得ることができる。個体から採取する明確な生体試料は異なり得るが、サンプリングは、好ましくは最小限の侵襲性であり、かつ慣用技術によって容易に行えるものである。
【００５５】
表現型の変化の測定は、任意の慣用技術によって実施し得る。体温、呼吸数、脈拍、血圧、または他の生理的パラメータの測定は、臨床観察および測定によって行うことができる。バイオマーカー分子の測定には、たとえば、存在、濃度、発現レベル、またはバイオマーカー分子に関連する任意の他の値を示す測定が含まれ得る。バイオマーカー分子を検出する様式は、典型的には生体試料からこれらのバイオマーカーのプロフィールを生成する方法に依存する。たとえば、２Ｄ−ＰＡＧＥによって分離したバイオマーカーは、当分野で十分に確立されているクマシーブルー染色または銀染色によって検出する。
【００５６】
有用なバイオマーカーの単離
有用なバイオマーカーは既に同定されていない、または関係する生理状態に関連しているバイオマーカーを含むことが期待される。本発明の一態様では、有用なバイオマーカーは、生体試料からのバイオマーカープロフィールの成分として同定される。このような同定は、免疫アッセイまたは自動マイクロシーケンシングを含めた当分野の任意の周知の手順によって行い得る。
【００５７】
有用なバイオマーカーを同定した後、バイオマーカーを数多くの周知の単離手順のうち１つによって単離し得る。したがって、本発明は、個体の集団から得た参照バイオマーカープロフィールを得ること、敗血症または敗血症の進行における段階の１つの予測または診断に用いる参照バイオマーカープロフィールの特性を同定すること、その特性に対応するバイオマーカーを同定すること、およびバイオマーカーを単離することを含む、敗血症の診断または予測に用いるバイオマーカーを単離する方法を提供する。単離した後、バイオマーカーを用いて、たとえばそれがタンパク質である場合はバイオマーカーに結合する抗体を産生させるために使用するか、核酸である場合は特異的オリゴヌクレオチドプローブを生じさせるために使用し得る。
【００５８】
当業者であれば、バイオマーカーの分子構造を決定するために有用な特性をさらに特徴づけることができることを容易に理解されよよう。この方式で生体分子を特徴づける方法は当分野で周知であり、高分解能質量分析、赤外線分光測定、紫外線分光測定および核磁気共鳴が含まれる。核酸バイオマーカーのヌクレオチド配列、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列、ならびに炭水化物バイオマーカーの組成および配列を決定する方法も、当分野で周知である。
【００５９】
本発明のＳＩＲＳ患者への応用
一実施形態では、本明細書中に記載した方法を使用して敗血症を発生する危険性に特にあるＳＩＲＳ患者をスクリーニングする。ＳＩＲＳ陽性患者から生体試料を採取し、試料中のバイオマーカーのプロフィールを、最終的に敗血症へと進行したＳＩＲＳ陽性個体由来の参照プロフィールと比較する。患者のバイオマーカープロフィールが、敗血症へと進行したＳＩＲＳ陽性集団の参照プロフィールに対応しているとする分類は、ＳＩＲＳ陽性患者も同様に敗血症へと進行することの診断指標である。その後、敗血症の進行を制するまたは予防するために治療計画を開始し得る。
【００６０】
別の実施形態では、本明細書中に記載した方法を使用して患者がＳＩＲＳに罹患しているという臨床上の疑いを確認する。この場合、試料中のバイオマーカーのプロフィールを、ＳＩＲＳに罹患しているまたはＳＩＲＳに罹患していない個体の参照集団と比較する。その後、患者のバイオマーカープロフィールが１つの集団または他の集団に対応しているとする分類を使用して、個体がＳＩＲＳに罹患しているまたはＳＩＲＳに罹患していないとして診断することができる。
【００６１】
実施例
以下の実施例は本発明に包含される実施形態の代表的なものであり、決して本発明に含まれる目的を限定するものではない。
【実施例１】
【００６２】
１．１．生体試料の受取および分析
患者ボランティアの２つの集団について参照バイオマーカープロフィールを確立した。第１の集団（「ＳＩＲＳ群」）は、ＳＩＲＳを発症して、「１日目」に本試験に参加したが、入院中に敗血症へと進行しなかった患者を表す。第２の集団（「敗血症群」）は、同様にＳＩＲＳを発症して、１日目に本試験に参加したが、試験に参加後、典型的には少なくとも数日後に敗血症へと進行した患者を表す。各試験群から血液試料を約２４時間毎に採取した。敗血症群における敗血症の臨床上の疑いは「０時間」に起こった。「−２４時間の時点」および「−４８時間の時点」は、敗血症群において敗血症の発症の臨床上の疑いが起こった日のそれぞれ２４時間および４８時間に採取した試料を表す。すなわち、敗血症群の試料には、試験に参加した日（１日目）、敗血症の臨床上の疑いの４８時間前（−４８時間の時点）、敗血症の臨床上の疑いの２４時間前（−２４時間の時点）、および敗血症の発症の臨床上の疑いが起こった日（時間０）に採取したものが含まれる。
【００６３】
１．２．生体試料由来のｍＲＮＡの分析
当業者に知られている方法を用いて、患者から単離した全血試料を抽出してｍＲＮＡを取り出した。適切なＲＮＡ単離手順は、たとえば、RNA METHODOLOGIES, A LABORATORY GUIDE FOR ISOLATION AND CHARACTERIZATION、第2版、R.E. Farrell, Jr.編、Academic Press、(1998)、55-104ページに見つかる。ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）システム（Ｐｈｅｎｏｌ−Ｆｒｅｅ全ＲＮＡ単離キット、カタログ番号１９１２、バージョン９９０８；Austin, Texas）を用いた使用に記述されているように、フィルターに基づいた全ＲＮＡ単離手法を使用し得る。ＲＮＡの単離および続く操作に使用した手順は、Source Precision Medicineに譲渡されているＷＯ０３／０４０４０４号にさらに記載されている。
【００６４】
単離した後、メッセージ特異的プライマーまたはランダムプライマーを用いて選択されたＲＮＡ種を増幅した。特異的プライマーを、Ｕｎｉｇｅｎｅ（National Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine、Bethesda, Maryland）などの公開データベースから得たデータから設計した。プライマーは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、当業者に一般に知られている原理を用いて試料中に存在する特異的ＲＮＡ配列を増幅するように設計した（ＷＯ０３／０４０４０４号、２２ページ、２４−３２行参照）。ＲＮＡ配列は、ＡＢＩ９６００、９７００、または７７００サイクラー（Applied Biosystems、Foster City, California）などの恒温または熱サイクラーのいずれかを用いて増幅し得る。その後、増幅したＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ（商標）システム（ＰＣＲ試薬キット、プロトコル、パート第４０２８２３、改定Ａ（1996）、Applied Biosystems、Foster City, California）に記載のように、たとえば蛍光標識検出プライマーを用いて検出し得る。ＲＮＡの検出および定量は当分野で周知の技術によって行い得る（たとえば、ＷＯ０３／０４０４０４号、２３ページ、５−１３行参照）。
【００６５】
患者の血液からＲＮＡを単離し、ＲＮＡを精製した後、以下のプロトコルを使用してＲＮＡを増幅し、表１に示した核酸プローブを有する７２メンバーの遺伝子発現アレイと反応させた。
【００６６】
材料
１．Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット（Ｐ／Ｎ  ８０８−０２３４）。キットの構成成分：１０×ＴａｑＭａｎ  ＲＴ緩衝液、２５ｍＭの塩化マグネシウム、デオキシＮＴＰ混合物、ランダムヘキサマー、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（５０Ｕ／ｍＬ）、およびＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅを含まない水（ＡｍｂｉｏｎのＤＥＰＣ処理水（製品番号９９１５Ｇ）または同等物）。
【００６７】
方法
２．ＲＮＡ試料を−８０℃の冷凍庫から取り出し、室温で解凍し、すぐに氷上に置いた
３．それぞれのＲＴ反応について以下の逆転写酵素試薬のカクテルを調製した：
１回の反応あたり（ｍＬ）
１０×ＲＴ緩衝液            １０．０
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２          ２２．０
ｄＮＴＰ                    ２０．０
ランダムヘキサマー            ５．０
ＲＮａｓｅ阻害剤              ２．０
逆転写酵素                    ２．５
水                          １８．５  
合計：                      ８０．０ｍＬ
【００６８】
４．１．５ｍＬのマイクロ遠心管中で各ＲＮＡ試料を全体積２０ｍＬとし、８０ｍＬのＲＴ反応混合液を加えた。ピペットの吸い出しにより溶液を混合した
５．試料を室温で１０分間インキュベートした
６．その後、試料を３７℃で１時間インキュベートした
７．最後に、試料を９０℃で１０分間インキュベートした
８．その後、試料をマイクロ遠心機で短時間遠心した
９．その後、ＰＣＲをすぐに行う場合は試料を氷上に置いた。それ以外の場合は、今後の使用のために試料を−２０℃で保存した
１０．すべてのＲＴ試料で、１８Ｓ  ｒＲＮＡおよびβアクチンｍＲＮＡを対照として用いてＰＣＲの品質対照を行なった。
【００６９】
第１鎖ｃＤＮＡを用いたプライマープローブの使用は上述の通りであった。７２メンバーの遺伝子発現アレイに結合した増幅ＲＮＡの測定を、以下の手順に従って行なった。
【００７０】
材料
１．各目的遺伝子用に２０×プライマー／プローブ混合物；１８Ｓ内在対照用に２０×プライマー／プローブ混合物；２×ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス；血液試料から抽出したＲＮＡから転写したｃＤＮＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの９６ウェルの光学反応プレート；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの光学キャップ、または光学的に透明なフィルム；およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｓｍ７７００配列検出機。
【００７１】
方法
２．目的遺伝子用のプライマー／プローブ、１８Ｓ内在対照用のプライマー／プローブ、および２×ＰＣＲマスターミックスを含む、各プライマー／プローブ混合物のストックを作成した。以下の例は、１つの遺伝子で、２つの条件を試験する４つ組の試料（２つのプレート）の典型的な設定を例示する
１×（１ウェルあたり）
２×マスターミックス                              １２．５０
２０×１８Ｓ用プライマー／プローブ混合物            １．２５
２０×目的遺伝子用プライマー／プローブ混合物        １．２５
合計                                              １５．００μＬ
【００７２】
３．ｃＤＮＡ９５μＬを２０００μＬの水で希釈することによってｃＤＮＡ標的のストックを作成した。ｃＤＮＡの量を、Ｃｔ値が１０〜１８、典型的には１２〜１３となるように調節した
３．プライマー／プローブ混合物１５μＬをピペットでＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの９６ウェルの光学反応プレートの適切なウェルに入れた
４．ｃＤＮＡストック溶液１０μＬをピペットでＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの９６ウェルの光学反応プレートの各ウェルに入れた
５．プレートをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの光学キャップ、または光学的に透明なフィルムで密閉した
６．その後、ＡＢ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出機を用いてプレートを分析した。
【００７３】
ＴａｑＭａｎ方式を用いる場合、蛍光の閾値レベルを生じさせるのに必要な増幅サイクルの数により、試料中に存在していた各遺伝子に対応するｍＲＮＡの量の半定量的な推定値がもたらされる。この方式で実施した場合、測定値の平均変動係数（ＳＤ／平均×１００）は典型的に５％未満であり、２％未満であり得る。リアルタイムＰＣＲ増幅を定量する方法は、たとえばHirayama他、Blood、92:46-52、(1998)に記載されている。定量的リアルタイム増幅のさらなる態様は、たとえばＷＯ０３／０４０４０号、２０−２３ページに記載されており、このような方法の変形は当分野で周知である。
【００７４】
１．３．データ分析および結果
各試料について、発現アレイ上の７２個の異なるｃＤＮＡプローブと結合したｍＲＮＡの濃度を測定した。この例では、各ｍＲＮＡがバイオマーカーであり、試料中のそれぞれの濃度がそのバイオマーカーの特徴となることができる。バイオマーカーの濃度を、アレイの様々なｃＤＮＡプローブと特異的な二重鎖を形成するその能力によって決定した。アレイのｃＤＮＡプローブは、表１に示すように、様々なサイトカイン、ケモカインまたは成長因子、細胞マーカー、プロテイナーゼまたはプロテイナーゼインヒビター、受容体、転写調節因子、および酵素を含めたタンパク質をコードする遺伝子に対応する。星印で示したプローブは、ＷＯ０３／０４０４０４号、４６−５２ページに記載のアレイ上に存在する。
【表１】
2006506070.tif 000002
2006506070.tif 000003
【００７５】
１．３．１．相互検証
様々な手法を使用して、個体をＳＩＲＳまたは敗血症群に分類するための判断基準の情報を与えることができる特性を同定でき、これらを以下に記載する。選択の偏りは、判断基準が比較的少数のバイオマーカープロフィールからの多数の特性に基づいている場合、判断基準の情報を与える特性の同定に影響を与えることがある（Ambroise他、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA、99:6562-66、(2002)参照）。選択の偏りは、特性を選択するためにデータを使用し、その後、選択プロセスにおける変動を考慮せずに選択された特性を条件として性能を推測する場合に起こり得る。この結果は、分類精度の過大評価である。選択の偏りを補わなければ、判断基準がランダム入力パラメータに基づいている場合でも分類精度は１００％に至り得る（同書）。選択の偏りは、性能の推定プロセスに特性の選択、すなわちその性能の推定プロセスが１０倍相互検証であるのか、ブートストラップ手順の一種であるのかを含めることによって回避し得る（たとえば、本明細書中に参考として組み込まれているHastie他、上記、７．１０−７．１１参照）。
【００７６】
本発明の一実施形態では、モデルの性能を１０倍相互検証によって測定する。１０倍相互検証は、データを１０個の排他的な群にランダムに分けることによって進行する。各群を順次除外し、モデルを残りの９個の群に当てはめる。当てはめたモデルを除外した群に当てはめ、予測クラスの確率が生じる。単に予測クラスを作成することによって、予測クラスの確率を実際のクラスのメンバーシップと比較することができる。たとえば、敗血症の確率が０．５より高ければ、予測クラスは敗血症である。
【００７７】
逸脱度は、確率を実際の結果と比較する手段である。本明細書中で使用する「逸脱度」とは、以下のように定義される：
【数１】
2006506070.tif 000004
【００７８】
［式中、Ｐは指定したクラスの確率である。］
逸脱度は、クラスの確率が実際のクラスに対して高い場合に最少となる。２つのモデルが所定のデータに対して同じ予測を生じることができるが、好ましいモデルの予測用の逸脱度はより小さい。１０倍相互検証の１０回の繰返しのそれぞれにおいて、その回でモデルの当てはめから排除した症例について予測逸脱度を計算する。この結果は、１０個の偏りのない逸脱度である。典型的には、これら１０個の逸脱度を合計して、全データセットのモデル性能（すなわち精度）の全体的な要約を作成する。実際に１０個の異なるモデルを当てはめたので、相互検証では特定のモデルの性能を証明するわけではない。むしろ、１０個のモデルは一般的なモデリングプロセスによって作成され、相互検証によってこのプロセスの性能は証明された。このプロセスにより生じる１１番目のモデルは、最初の１０個と同様の予測用の性能を有する可能性が高い。典型的には、１０倍相互検証を使用することにより１００％未満のモデル性能が生じるが、１０倍相互検証の後に得られる性能は、試験セット以外の試料から得たバイオマーカープロフィールに当てはめた場合に、生物学的に意味のある判断基準の予測用の精度をより綿密に反映することが期待される。
【００７９】
１．３．２．分類木分析
このデータを分析する１つの手法は、大きなデータセットにおいてパターンおよび関係性を検索する分類木アルゴリズムを使用することである。「分類木」とは、患者をクラスの１つに正確に配置するように設計された一連の質問を用いて特定の患者を特定のクラス（たとえば敗血症またはＳＩＲＳ）に分類するための再帰的区分である。それぞれの質問は、患者の状態が所定の予測の判断材料を満たすかどうかを質問し、それぞれの質問を、患者が分類されるクラスが決定されるまでユーザを分類木に沿って導くために用いる。本明細書中で使用する「予測の判断材料（predictor）」とは、ある特性の値の範囲である。本実施例では、特性は核酸バイオマーカーの濃度である。核酸バイオマーカーは表２〜１０のうち任意の１つに記載のものから選択され得るが、当業者は、他の核酸バイオマーカーが本発明に有用であり得ることを理解されよう。「状態」とは、個体のバイオマーカープロフィールにおいて測定する特性の単一の特異的な値である。本実施例では、「クラス名」は敗血症およびＳＩＲＳである。したがって、分類木では、ユーザは、個体のバイオマーカープロフィールにおいて測定した第１の核酸バイオマーカーの濃度が第１の特性の予測用の範囲の所定の範囲内にあるかどうかを最初に質問する。最初の質問の答えは、個体がＳＩＲＳまたは敗血症に罹患しているかどうかを判定する方向を決定し得る。他方で、最初の質問の答えは、ユーザが、個体のバイオマーカープロフィールにおいて測定した第２の核酸バイオマーカーの濃度が第２の特性の予測用の範囲の所定の範囲内にあるかどうかを質問することを、さらに指示するかもしれない。ここでも、第２の質問の答えは、方向を決定し得るか、または患者の分類が最終的に決定されるまで分類木に沿ってユーザを導き得る。
【００８０】
１．３．３．多重加法回帰木
多重加法回帰木（ＭＡＲＴ）を使用する自動化された順応性のあるモデリング技術を用いて、特性のセットを２つの集団うち１つに属するとして分類した。ＭＡＲＴモデルでは、すべての予測に適用される定数を指定する開始オフセットを使用し、次いで一連の回帰木を使用する。その当てはめは、それぞれの木の決定点の数、当てはめる木の数、および特定の木がどの程度根本的にＭＡＲＴモデルに影響を与えるかを指定する「粒状度定数」によって指定される。それぞれの繰返しで、回帰木を当てはめて、当てはめ基準の最も急な下降の方向を推定する。その方向に粒状度定数によって指定された長さを有するステップをとる。これにより、ＭＡＲＴモデルは開始オフセットおよび回帰木によって提供されたステップからなる。観察値と予測値との差を再度計算し、サイクルが再度進み、予測の漸進的な改良（refinement）がもたらされる。このプロセスは、事前に決定されたサイクル数の間、または何らかの停止基準が始動されるまで続く。
【００８１】
それぞれの木における分岐の数は、特に有意な当てはめパラメータである。それぞれの木が１つの分岐しか有さない場合は、モデルは１つの特性しか見ず、２つの予測の判断材料を組み合わせる能力を有さない。それぞれの木が２つの分岐を有する場合は、モデルは特性間の２方向の相互作用に適応することができる。３つの木では、モデルは３方向の相互作用に適応することができ、以降同様である。
【００８２】
特性および既知のクラスの状態（たとえば敗血症またはＳＩＲＳ）を用いて、データセットについて予測するクラスの状態における特性セットの値を決定した。ＭＡＲＴは、分類判断基準に対する個々の特性の寄与または重要性の尺度を提供する。具体的には、所定の木に分岐での選択において単一の特性が判断基準に寄与する度合いを測定して、最終的な判断基準の判定におけるその重要性に応じて特性の順序を提供することができる。同じデータセットでＭＡＲＴ分析を繰り返すことにより、特に判断基準の確立において重要性がより低い特性に関して僅かに異なる特性順序が得られうる。したがって、本発明において有用な、予測に用いる特性のセットおよびその対応するバイオマーカーは、本明細書中に記載したものから僅かに異なり得る。
【００８３】
ＭＡＲＴ技術の１つの実装は、Ｒ統計的プログラミング環境のモジュール、すなわち「パッケージ」中に見つかる（Venables他、Modern Applied Statistics with S、第4版、(Springer、2002);www.r-project.org参照）。この文献中に報告されている結果は、Ｒのバージョン１．７．０および１．７．１を用いて計算されている。「ｇｂｍ」と呼ばれるＧｒｅｇ  Ｒｉｄｇｅｗａｙ博士によって書かれたＭＡＲＴを実施するモジュールは、無料でダウンロード可能である（www.r-project.org参照）。ＭＡＲＴアルゴリズムは１０倍相互検証に影響を受けやすい。粒状度パラメータを０．０５に設定し、ｇｂｍパッケージの内部停止基準は、それぞれの印した繰返しでデータ数の２０％を除外することに基づいていた。相互作用の度合いは１に設定したので、特性間の相互作用は考慮されなかった。Ｇｂｍパッケージは各特性の相対的な重要性をパーセンテージで推定し、バイオマーカープロフィールのすべての特性で累積的に１００％に等しくなる。合わせて全重要性の少なくとも９０％を占める最も高い重要性の特性が、潜在的に予測値を有するものとして報告される。すべてのＭＡＲＴモデルの当てはめにおける停止基準がモデルの当てはめおよび特性の選択における確率的な構成要素に寄与することに注目されたい。したがって、同じデータに基づいて行う複数のＭＡＲＴモデリングで、僅かに、または場合によっては完全に異なる特性セットを選択し得る。このような異なるセットは同じ予測用の情報を伝えるので、すべてのセットが本発明において有用である。ＭＡＲＴモデルを十分な回数当てはめることによって、バイオマーカープロフィール内の予測に用いる特性のすべての可能なセットが得られることが期待される。したがって、予測の判断材料の開示したセットは、個体を集団へと分類するために使用することができる特性セットの代表的なものでしかない。
【００８４】
様々な試料から得た核酸バイオマーカープロフィールからのデータを、上述のようにＭＡＲＴを用いて分析した。この分析では、０時間の時点の敗血症集団は２３人の患者からなり、ＳＩＲＳ集団は２４人の患者からなっていた。一方、−２４時間の時点および−４８時間の時点の集団は、それぞれ２４人および２１人の敗血症およびＳＩＲＳに罹患した個体からなっていた。表１に記載の７２個のバイオマーカーすべてに対応する特性を分析した。
【００８５】
０時間の時点の集団では、当てはめたモデルは２３個の木を含んでおり、モデルは特性間の相互作用を許容しなかった。１０倍相互検証を用いて、モデルは２４人のＳＩＲＳ患者のうち１９人および２３人の敗血症患者のうち１５人を正しく分類し、モデルの感度６５％および特異性７９％が得られた。表２に、モデルによって決定された重要性の順序に従ってバイオマーカーを示す。重要性が０の特性はすべて除外した。「−１」の符号で示したマーカーは、敗血症が進行するにつれて敗血症陽性集団において漸進的に高いレベルで発現され、一方、「１」の符号で示したバイオマーカーは漸進的に低いレベルで発現された。
【表２】
2006506070.tif 000005
【００８６】
−２４時間の時点の集団では、当てはめたモデルは１２個の木を含んでおり、モデルは特性間の相互作用を許容しなかった。１０倍相互検証を用いて、モデルは２１人のＳＩＲＳ患者中１５人および２４人の敗血症患者中１７人を正しく分類し、モデルの感度７１％および特異性７１％が得られた。表３に、モデルによって決定された重要性の順序に従ってバイオマーカーを示す。
【表３】
2006506070.tif 000006
【００８７】
−４８時間の時点の集団では、当てはめたモデルは９個の木を含んでおり、モデルは特性間の相互作用を許容しなかった。１０倍相互検証を用いて、モデルは２１人中８人のＳＩＲＳ患者および２４人中２０人の敗血症患者を正しく分類し、モデルの感度８３％、特異性３８％、および精度６２％が得られた。表４に、モデルによって決定された重要性の順序に従ってバイオマーカーを示す。
【表４】
2006506070.tif 000007
【００８８】
１．３．４．ロジスティック回帰分析
ロジスティック回帰は、上述の分析からのデータストリームを分析するさらに別の手段を提供する。「シグナル強度」は、特定の核酸バイオマーカーの濃度に等しい。所定の核酸バイオマーカーのシグナルが存在しければ、シグナル強度「０」が割り当てられる。その後、所定の核酸バイオマーカーのシグナル強度の標準偏差（ＳＤ）から合わせたＳＩＲＳ集団および敗血症集団のプロフィールから得られる。ＳＩＲＳ集団と敗血症集団との間にシグナル強度の差がない場合（すなわちＳＤ＝０）、シグナル強度をそれ以上考慮しない。回帰分析の前に、当分野で周知の方法を用いてシグナル強度をスケーリングする。スケーリングアルゴリズムは、Hastie他、上記、第１１章に概説されている。
【００８９】
１．３．５．ウィルコクソンの符号付検定の分析
さらに別の方法では、ウィルコクソンの符号付検定などのノンパラメトリック試験を使用して目的の個々のバイオマーカーを同定することができる。バイオマーカープロフィールの特性は、そのバイオマーカーを個体が特定の参照集団に属すると分類するために使用することができる確実性の度合いを示す「ｐ値」を割り当てられる。一般に、予測値を有するｐ値は約０．０５未満である。低いｐ値を有するバイオマーカーは、それ自体で個体の分類に使用することができる。あるいは、個体を分類するために２つ以上のバイオマーカーの組合せを使用することができ、この場合、組合せはバイオマーカーの相対ｐ値に基づいて選択される。一般に、所定のバイオマーカーの組合せには、低いｐ値を有するバイオマーカーが好ましい。個体をこの方式で分類するために少なくとも３、４、５、６、１０、２０または３０個以上のバイオマーカーの組合せも使用することができる。当業者は、任意の所定のバイオマーカーの相対ｐ値は、参照集団の大きさに応じて変動し得ることを理解されよう。
【００９０】
ウィルコクソンの符号付検定を用いて、表１に記載のプローブを有する発現アレイと特異的な二重鎖を形成した（すなわちハイブリダイズした）バイオマーカーに、所定の時間に敗血症集団とＳＩＲＳ集団とを比較することによってｐ値を割り当てた。すなわち、０時間の時点、−２４時間の時点、および−４８時間の時点に採取した生体試料から得たバイオマーカープロフィールの特性にｐ値を割り当てた。これらのｐ値をそれぞれ表５、６および７に記載した。この分析では、敗血症およびＳＩＲＳの集団は、時間０（表５）ではそれぞれ２３人および２４人の患者からなっており、敗血症およびＳＩＲＳの−２４時間の時点および−４８時間の時点（表６および７）の集団は、それぞれ２４人および２１人の患者からなっていた。
【表５】
2006506070.tif 000008
【００９１】
【表６】
2006506070.tif 000009
【００９２】
【表７】
2006506070.tif 000010
【００９３】
ノンパラメトリック検定（たとえばウィルコクソンの符号付検定）を代わりに用いて、敗血症に向かって進行している集団における特性の漸進的な出現または消失に基づいた特性のｐ値を見出すことができる。この試験方式では、敗血症およびＳＩＲＳ群の試験に参加した時点（１日目の試料）からのデータを用いて、まず所定の特性の基底値を測定する。その後、敗血症およびＳＩＲＳの試料中の特性の強度を、特性の強度がその基底値から増加したか減少したかを判定するために、たとえば−４８時間の時点の試料と比較する。最後に、敗血症集団対ＳＩＲＳ集団における特性の強度の基底からの差にｐ値を割り当てる。表８〜１０に記載した以下のｐ値は、これらの差を基底からｐ値で測定した際に得られたものである。
【表８】
2006506070.tif 000011
【００９４】
【表９】
2006506070.tif 000012
【００９５】
【表１０】
2006506070.tif 000013
【００９６】
特定の代表的な実施形態および詳細を参照して本発明を完全に記載したが、本明細書中に記載した本発明の精神または範囲から逸脱せずに変更および改変を行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＳＩＲＳから敗血症への進行を示す図である。敗血症の状態は少なくとも３つの段階からなり、敗血症患者は重篤な敗血症から敗血症性ショックから多臓器機能障害へと進行する。
【図２】敗血症とＳＩＲＳとの関係を示す図である。ベン図に示す様々なセットは、示した状態に罹患している個体の集団に対応する。
【図１】
2006506070.tif 000014
【図２】
2006506070.tif 000015
【国際調査報告】
2006506070.tif 000016
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