(57)【要約】富化された神経幹細胞集団および神経前駆体細胞集団、ならびに細胞表面マーカーに結合する試薬を使用して神経幹細胞を同定し、単離し、そして富化する方法を、提供する。本発明は、ヒト非造血前駆体および非ヒト造血幹細胞、特に、長期的神経球を惹起し得る、中枢神経系神経幹細胞、前駆体、またはこれらの組合せを、同定、単離および富化するための方法を提供する。本発明はまた、神経球および前駆体細胞を惹起し得る中枢神経系幹細胞を含む富化された集団を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得る、ヒト中枢神経系幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せが富化された神経組織から集団を産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）神経細胞もしくは神経由来細胞を、ＣＤ４９ｆに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および
ｂ）該モノクローナル抗体に結合する該神経細胞もしくは該神経由来細胞を選択する工程
を包含し、ここで、該選択された細胞が、ヒトＣＮＳ−ＳＣを富化されている、方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が蛍光色素を結合した抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が磁気粒子に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択する工程が、フローサイトメトリー（蛍光活性化細胞選別）または高勾配磁気選択による、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
神経細胞もしくは神経由来細胞を含む前記集団が、神経球培養物もしくは粘着培養物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
神経細胞もしくは神経由来細胞を含む前記集団が、一次神経組織から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
ｃ）前記選択された細胞を、ＣＤ２４抗原を識別する二次モノクローナル抗体ＳＣ２０と接触させる工程；および
ｄ）ＳＣ２０＋（ＣＤ２４＋）である細胞を除去する工程
によって、神経組織由来の集団にＣＮＳ−ＳＣをさらに富化する工程をさらに包含する方法であって、ここで、該集団における該選択された細胞が、ＳＣ２０−／ｌｏ（ＣＤ２４−／ｌｏ）であって、かつ、ＣＮＳ−ＳＣが富化されている、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、以下の工程：
ｃ）前記選択された細胞を、抗ＣＤ−１３３モノクローナル抗体と接触させる工程；および
ｄ）該抗ＣＤ−１３３モノクローナル抗体に結合する細胞を、さらに選択する工程
によって、集団にＣＮＳ−ＳＣをさらに富化する工程をさらに包含し、ここで、さらに選択された細胞がＣＮＳ−ＳＣを富化されている、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記神経細胞もしくは前記神経由来細胞が、工程ａ）の接触の前に、抗ＣＤ−１３３モノクローナルと接触している、方法。
【請求項１０】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）細胞培養物もしくは粘着細胞培養物を惹起し得るヒト中枢神経系幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せが富化された集団を産生するための方法であって、神経細胞もしくは神経由来細胞の集団からＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記選択が、前記細胞の集団を、モノクローナル抗体ＧｏＨ３およびモノクローナル抗体４Ｆ１０からなる群から選択される抗ＣＤ４９ｆ抗体と接触させる工程、ならびに抗ＣＤ４９ｆ抗体に結合しない細胞を除去する工程によって達成される、方法。
【請求項１２】
神経細胞もしくは神経由来細胞の前記残存する集団からＣＤ２４−／ｌｏである細胞を選択する工程によって、一次神経組織から得られた集団にＣＮＳ−ＳＣをさらに富化する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＤ２４を識別するモノクローナル抗体ＳＣ２０に結合する細胞を除去する工程によって、前記集団をさらに富化する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
神経細胞の集団に、神経球惹起幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）画分の集団を富化するための方法であって、モノクローナル抗体ＧｏＨ３もしくはモノクローナル抗体４Ｆ１０に結合することによってＣＤ４９ｆを発現する細胞を、該神経細胞から選択する工程を包含し、ここで、該選択された細胞は、神経細胞の該集団と比較してＮＳ−ＩＣの画分中に富化される、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ＣＤ２４＋である細胞を除去することによって、一次組織由来のＮＳ−ＩＣの画分をさらに富化する工程をさらに包含し、ここで、残存する細胞は、ＣＤ２４−／ｌｏである、方法。
【請求項１６】
一次神経組織から神経球惹起幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離するための方法であって、以下の工程：
ａ）神経細胞もしくは神経由来細胞の集団からＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択する工程；
ｂ）ＣＤ２４＋である細胞を除去する工程であって、ここで、残存する細胞がＣＤ２４−／ｌｏである、工程
ｃ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ＦＧＦ−２）およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含有する無血清培養培地に、工程ｂ）後に残存する細胞を導入する工程、および
ｄ）該培養培地中で該残存する細胞を増殖させる工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
神経球を（ＮＳ−ＩＣ）惹起し得るヒト中枢神経系幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）を富化された集団を産生するための方法であって、該方法は、ＣＮＳ−ＳＣが富化された集団を産生するために、ＣＤ４９ｆ＋であって、かつモノクローナル抗体ＧｏＨ３およびモノクローナル抗体４Ｆ１０からなる群から選択される抗ＣＤ４９ｆ抗体に結合する細胞を、神経細胞もしくは神経由来細胞から選択する工程を包含し、ここで、該選択する工程が固相への結合および固相からの分離による、方法。
【請求項１８】
ＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する抗体であって、ここで、該ＣＤ４９ｆ抗原がモノクローナル抗体ＧｏＨ３もしくはモノクローナル抗体４Ｆ１０に特異的に結合する、抗体。
【請求項１９】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株により産生されるモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体が、前記ＧｏＨ３抗体もしくは前記４Ｆ１０抗体による前記ＣＤ４９ｆ抗原への同時結合をブロックする、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒト中枢神経系神経幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せを富化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）神経細胞もしくは神経由来細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する試薬と合わせる工程；および
ｂ）該試薬に結合する細胞を選択する工程
を包含し、ここで、該選択された細胞は、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せを富化されている、方法。
【請求項２２】
前記試薬が少なくとも１つの抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒト中枢神経系幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せを富化された集団を産生するための方法であって、該方法は、ＣＤ４９ｆを発現し、かつモノクローナル抗体ＧｏＨ３もしくはモノクローナル抗体４Ｆ１０に結合する細胞を、神経細胞もしくは神経由来細胞から選択して、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せが富化された集団を産生する工程を包含する、方法。
【請求項２４】
前記抗体がモノクローナル抗体ＧｏＨ３である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体がモノクローナル抗体４Ｆ１０である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
神経細胞もしくは神経由来細胞を含む前記集団が、神経球培養物もしくは粘着単層培養物から得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
神経細胞もしくは神経由来細胞を含む前記集団が、神経組織から得られる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒト中枢神経系幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せを富化された集団を産生するための方法であって、ここで、該集団は、一次神経組織から得られ、該方法は、神経細胞もしくは神経由来細胞の集団からＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択する工程を包含し、ＣＤ２４−／ｌｏである細胞をさらに選択することによって、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せをさらに富化する工程をさらに包含する、方法
【請求項２９】
神経球を惹起する幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離するための方法であって、以下の工程：
ａ）モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０に結合する少なくとも１つの選択された細胞を、神経細胞もしくは神経由来細胞の集団から選択する工程；
ｂ）少なくとも１つの選択された細胞を、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含有する無血清培養培地に導入する工程；および
ｃ）少なくとも１つの選択された細胞を該培養培地中で増殖させる工程
を包含する、方法。
【請求項３０】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒト中枢神経系幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せが富化された、さらに再分割された集団を産生する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）神経細胞もしくは神経由来細胞を、ＣＤ１５に結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および
ｂ）ＣＤ１５−／ｌｏもしくはＣＤ１５＋である該神経細胞もしくは該神経由来細胞を選択する工程であって、ここで、該選択された細胞が、ヒトＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せが富化され、そして、該ＣＤ１５−／ｌｏ細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ集団の部分集合である、工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
神経細胞もしくは神経由来細胞を含む前記集団が、一次神経組織から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法であって、以下の工程：
ｃ）前記選択された細胞を、二次モノクローナル抗体ＳＣ２０と接触させる工程；および
ｄ）ＳＣ２０−／ｌｏである細胞をさらに選択する工程
によって、集団に、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体、もしくはこれらの組合せをさらに富化する工程をさらに包含する方法であって、ここで、該集団のさらに選択された細胞が、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せを富化される、方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の方法であって、以下の工程：
ｃ）前記選択された細胞を、抗ＣＤ−１３３モノクローナル抗体と接触させる工程；および
ｄ）該抗ＣＤ−１３３モノクローナル抗体に結合する細胞をさらに選択する工程
によって、集団に、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体、もしくはこれらの組合せをさらに富化する工程をさらに包含する方法であって、ここで、該さらに選択された細胞が、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せを富化される、方法。
【請求項３４】
前記選択が、細胞の前記集団を、ＣＤ１５抗原を識別するモノクローナル抗体ＭＭＡと接触させる工程、およびモノクローナル抗体ＭＭＡに結合しない細胞を除去する工程によって達成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＤ１５抗原に特異的に結合する抗体であって、ここで、該ＣＤ１５抗原が、モノクローナル抗体ＭＭＡに特異的に結合し、ここで、該抗体が、ハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体である、抗体。
【請求項３６】
前記モノクローナル抗体が、ＭＭＡモノクローナル抗体によって同時に前記抗原に結合するのをブロックする、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
請求項３４に記載の方法であって、神経細胞もしくは神経由来細胞の残存する集団からＣＤ２４＋である細胞を除去する工程によって、前記集団にＣＮＳ−ＳＣをさらに富化する工程をさらに包含し、ここで、該細胞が、一次神経組織から得られる、方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、ＣＤ２４＋である細胞を除去する工程によって、前記集団をさらに富化する工程をさらに包含し、ここで、前記残存する細胞がＣＤ２４−／ｌｏである、方法。
【請求項３９】
神経細胞の集団に、神経球惹起幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）画分の集団を富化するための方法であって、該方法は、該神経細胞からモノクローナル抗体ＭＭＡに結合する細胞を選択する工程を包含し、ここで、該選択された細胞は、神経細胞の集団と比較した場合に、ＮＳ−ＩＣの画分中に富化されている、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、ＳＣ２０＋である細胞を除去する工程によって、ＮＳ−ＩＣの画分をさらに富化する工程をさらに包含し、ここで、残存する細胞がＳＣ２０−／ｌｏであって、そして、該細胞が、一次神経組織から得られる、方法。
【請求項４１】
神経球惹起幹細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離するための方法であって、以下の工程：
ａ）神経細胞もしくは神経由来細胞の集団からＣＤ１５＋もしくはＣＤ１５−／ｌｏである細胞を選択する工程であって、ここで、該ＣＤ１５−／ｌｏ細胞が、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ集団の部分集合である、工程；
ｂ）ＳＣ２０＋である細胞を除去する工程であって、ここで、残存する細胞がＳＣ２０−／ｌｏである、工程；
ｃ）該残存細胞を、白血球抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；ＦＧＦ−２）およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含有する無血清培養培地に導入する工程；および
ｄ）該残存細胞を、培養培地中で増殖させる工程
を包含する、方法。
【請求項４２】
神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒト中枢神経系神経幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）、前駆体、もしくはこれらの組合せを富化するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）神経細胞もしくは神経由来細胞を、ＣＤ１５抗原に特異的に結合する試薬と合わせる工程；および
ｂ）ＣＤ１５＋もしくはＣＤ１５−／ｌｏである細胞を選択する工程であって、ここで、該ＣＤ１５−／ｌｏ細胞がＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏの部分集合である、工程
を包含し、ここで、該選択された細胞は、ＣＮＳ−ＳＣ、前駆体もしくはこれらの組合せが富化されている、方法。
【請求項４３】
前記試薬が少なくとも１つの抗体である、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、富化された神経幹細胞集団および前駆体細胞集団、ならびに神経幹細胞および前駆体細胞を同定し、単離し、そして富化するための方法に関し、特に中枢神経系神経幹細胞および前駆体細胞、そしてより詳しくは富化された神経球惹起細胞（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＮＳ−ＩＣ）の集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
幹細胞集団は、体内の細胞の総数の僅かな割合を構成するのみであるが、身体を再増殖するその能力ゆえに、非常に興味深い。幹細胞の寿命の長いことおよび幹細胞前駆体の散在性は、望ましい特徴である。幹細胞は多くの臨床用途を有するため、これらの方法には、かなりの商業上の利益がある。また、遺伝子治療のビヒクルとしての幹細胞の利用において、医学的利益も存在する。
【０００３】
幹細胞集団および前駆体細胞集団上に見出されるタンパク質および他の細胞表面マーカーは、これらの集団の分離および単離のための試薬を調製する際に有用である。細胞表面マーカーはまた、これらの重要な細胞をさらに特徴付けるために有用である。
【０００４】
神経幹細胞は、成体の脳室下領域（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）（ＳＶＺ）および海馬から単離されている（Ｇａｇｅ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，１４３３−３８）。これらの細胞は、新規のニューロンの重要な供給源であり、新規の中枢神経系（ＣＮＳ）修復治療の見込みを提供する。
【０００５】
ＣＮＳ幹細胞は、通常、代表的な神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）または多くの神経細胞型を含む大型粘着クローン（ｌａｒｇｅ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｃｌｏｎｅ）を産生するその能力によって、遡及的に同定され（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５，１７０７−１０；ＤａｖｉｓおよびＴｅｍｐｌｅ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２，２６３−２６６；ならびにＰａｌｍｅｒら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．８，３８９−４０４）、これは初期幹細胞集団の研究を不可能にする。例えば、どの特異的遺伝子産物を発現するかなど、ＣＮＳ幹細胞の独特の生物学については僅かしか知られていない。ＣＮＳ幹細胞によって発現される「独特な」遺伝子産物の同定は、これらの重要な細胞の理解を広げ、そのインビボでの同定を助け、そして研究および使用のためのインビトロでのポジティブな富化を可能にする。
【０００６】
２つの異なった細胞集団が、ＳＶＺ幹細胞を含むとして近年同定された：ＧＦＡＰ発現星状細胞（Ｄｏｅｔｓｃｈら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９７  ７０３−１６；Ｄｏｅｔｓｃｈら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１１６１９−１１６２４）および、脳室を内張りするＮｏｔｃｈ１発現線毛上衣細胞（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６，２５−３４）である。これらの２つの異なった細胞型は、インビボで非常に密接に局在しており、物理的に分離するのは困難である。その代わり、幹細胞の特異的特徴を明らかにすることは、そのインビボの同一性を明らかにすることを助けるためのマーカーを提供する。
【０００７】
成体ＣＮＳ幹細胞によって発現される遺伝子としては、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｎｏｔｃｈ１およびＧＦＡＰが挙げられる（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら（１９９６）Ｄｅｖｅｌ  Ｂｉｏｌ．１７６，２３０−４２；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６，２５−３４；Ｄｏｅｔｓｃｈら（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９７，７０３−１６）が、他のＣＮＳ細胞型もまた、これらを発現する。さらに、これらのマーカーの多くは細胞内マーカーであり、幹細胞富化についてのその有用性を限定するが、この問題は、蛍光レポーター遺伝子発現を有するトランスジェニックマウスの作製によって克服し得る（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１７，２５９−２７３）。より一般的に有用なマーカーは、幹細胞の局在化および野生型マウスからの精製を可能にする、細胞表面分子である。従って、ヒト非造血前駆体およびヒト非造血幹細胞（特に中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞および前駆体細胞）を単離し特徴付ける際に有用なモノクローナル抗体のようなツールの必要性が残存する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ヒト非造血前駆体およびヒト非造血幹細胞、特に、長期的神経球を惹起し得る、中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞、前駆体、またはこれらの組み合わせを、同定、単離および富化するための方法を提供する。本発明はまた、神経球および前駆体細胞を惹起し得るＣＮＳ幹細胞を含む富化された集団を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「神経球惹起細胞（ＮＳ−ＩＣ）」は、長期神経球培養物を惹起し得る細胞をいう。当業者は、ＮＳ−ＩＣが、使用した培養条件に依存して、幹細胞または前駆体またはこれらの組み合わせを含むことを理解する。また、「神経球」は、細胞の凝集体または塊であり、これは神経幹細胞および始原前駆体を含む。神経球の同定、培養、増殖および使用は、Ｗｅｉｓｓらの米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓらの米国特許第５，８５１，８３２号において開示され、これらは両方とも本明細書中で参考として援用される。用語「ＮＳ−ＩＣ」は、細胞が神経球を形成する能力（ａｂｉｌｉｔｙ）または能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）によって定義されるが、これらの細胞はまた、粘着性培養物において適切に増殖され得る（例えば、Ｊｏｈｅの米国特許第５，７５３，５０６号およびＷｅｉｓｓの米国特許第５，７５０，３７６号（これらは両方とも本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。）。本明細書中で記載される方法および集団は、ＮＳ−ＩＣの懸濁培養に限定されない。ＮＳ−ＩＣは、ネスチン＋であり、そして適切な分化条件下で、ニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞に分化する能力を有する。
【０００９】
非造血幹細胞および前駆体細胞（好ましくは、ＮＳ−ＩＣを含む、ＣＮＳ神経幹細胞および／または前駆体）の富化された集団、およびこのような細胞を同定、単離、または富化する方法は、少なくとも１つの幹細胞またはＮＳ−ＩＣもしくは前駆体細胞を含む細胞の集団を、ＣＤ４９ｆに特異的に結合する抗体（「抗ＣＤ４９ｆ抗体」）によって識別される表面マーカー糖タンパク質抗原（「ＣＤ４９ｆ抗原」）に結合する試薬、またはＣＤ１５に特異的に結合する抗体（「抗ＣＤ１５抗体」）によって識別される細胞表面炭水化物部分（「ＣＤ１５抗原」）に結合する試薬と接触させる工程により、達成される。本明細書中で使用されるように、用語「試薬」は、抗原に結合可能であるか、係合可能であるか、またはこれを識別する、任意の組成物または化合物を意味する。このような試薬の例としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、低分子、レセプター、リガンド、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、核酸、核酸フラグメント、抗体フラグメント、および当業者に公知の任意の他の「試薬」が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１０】
本明細書中で記載される方法は、ＮＳ−ＩＣについての神経細胞の集団を富化するためのＣＤ４９ｆ抗原の使用を言及するが、ＣＮＳ−ＳＣにおいて見出される他の細胞表面マーカーもまた、使用され得る。このような細胞表面マーカーの例としては、抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体（例えば、モノクローナル抗体ＡＣ１３３）によって識別されるＣＤ１３３抗原および抗ＣＤ１５モノクローナル抗体（ＭＭＡが挙げられるが、これに限定されない）によって識別されるＣＤ１５が挙げられるが、これに限定されない。また、当業者は、本明細書中に記載されるＣＤ４９ｆ抗原および／または抗ＣＤ４９ｆ抗体を用いる任意の方法が、ＣＤ１３３および／もしくはＣＤ１５抗体ならびに／または抗原を識別する、抗体ならびに／または抗原との組み合わせにおいて達成され得ることを、理解する。また、当業者は、神経幹細胞、前駆体またはＮＳ−ＩＣ上に存在する任意の他の細胞表面マーカーが、本発明の方法において使用され得ることを理解する。さらに、当業者は、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１３３および／もしくはＣＤ１５抗体ならびに／または抗原の任意の組み合わせが、ＮＳ−ＩＣについて富化した集団を産生するために使用され得ることを理解する。当業者はまた、抗ＣＤ１３３、抗ＣＤ１５および／または抗ＣＤ４９ｆ抗体への任意の言及が、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、モルモット、および／またはブタの抗体を包含することを理解する。
【００１１】
本発明の富化した集団はまた、少なくとも１つの幹細胞またはＮＳ−ＩＣ前駆体を含む細胞の集団を、ＣＤ１３３抗原に結合する試薬（ＡＣ１３３抗体が挙げられるが、これに限定されない）と接触させる工程により、達成される。この接触は、ＣＤ４９ｆに結合する試薬（例えば、抗ＣＤ４９ｆ抗体）またはＣＤ１５に結合する試薬（例えば、抗ＣＤ１５抗体）との接触の前、接触の間、および／または、接触の後に行われ得る。ＣＤ１３３に対する抗体としては、例えば、モノクローナル抗体ＡＣ１３３が挙げられる。本明細書中で記載される場合、用語「ＣＤ１３３抗体」および「ＣＤ１３３モノクローナル抗体」は、ＣＤ１３３抗原を識別するＡＣ１３３を含むが、これに限定されない抗体を含む。さらに、ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ１３３抗原を含む細胞として定義される。
【００１２】
１つの好ましい実施形態において、試薬は、抗ＣＤ４９ｆ抗体である（本明細書中で、２つのこのような抗ＣＤ４９ｆ抗体が、「ＧｏＨ３」または「４Ｆ１０」として言及される）。別の好ましい実施形態において、試薬は、抗ＣＤ１５抗体である（抗ＣＤ１５抗体の好ましい実施形態は、本明細書中でＭＭＡと呼ばれる）。細胞選別のための従来技術（例えば、免疫選択による（例えば、ＦＡＣＳ））の使用は、試薬とＣＤ４９ｆ抗原またはＣＤ１５抗原との間の接触が検出されている細胞の、同定、単離および／または富化を可能にする。
【００１３】
本発明はまた、抗体を使用して非造血幹細胞および前駆体細胞、好ましくは神経球を惹起し得るＣＮＳ神経幹細胞および前駆体細胞の富化された集団を提供する方法を、提供する。これらの集団は、少なくとも１つの幹細胞、ＮＳ−ＩＣまたは前駆体細胞を含む細胞の集団と、抗ＣＤ４９ｆ抗体または抗ＣＤ１５抗体とを接触させる工程により、このような細胞を、同定するか、単離するかまたは富化する方法において、使用され得る。
【００１４】
本発明の細胞（好ましくはＣＮＳ神経幹細胞）は、ＣＤ４５およびＣＤ３４についての細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４５−およびＣＤ３４−）を欠くとして、さらに特徴付けられる。
【００１５】
本発明は、本明細書中でＳＣ２０と呼ばれる抗体を提供する。この抗体は正式には８Ｇ１として公知であり（Ｕｃｈｉｄａら，ＰＮＡＳ  ２０００）、ＣＤ２４を識別し、ＣＮＳ神経幹細胞の集団（ＳＣ２０−／ｌｏまたはＣＤ２４−／ｌｏとして特徴付けられる）とＣＮＳ前駆体細胞の集団（ＳＣ２０＋またはＣＤ２４−／ｌｏとして特徴付けられる）との間の部分選択（ｓｕｂｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を可能にすると思われる。胎児の脳から単離されるＣＮＳ−ＳＣは、ＣＤ１３３＋ＳＣ２０−／ｌｏであり、これはまた、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏとも呼ばれる。ＣＮＳ−ＳＣをインビトロで増殖させて神経球細胞とした場合、これらは、ＣＤ２４を発現し得る。従って、ＣＤ２４抗原は、これらの細胞を増殖するようにアップレギュレートされると思われる。従って、ＣＮＳ−ＳＣに由来する神経球細胞は、ＣＤ２４発現について不均質である（低レベルまたは高レベルである）。ＣＤ２４を識別する他の抗体としては、３２Ｄ１２［Ｄｉａｔｅｃ，Ｏｓｌｏ，ＮＯＲＷＡＹ（カタログ番号ＣＤ２４  ３０６１−ａｂ５３１）］；ＡＬＢ９［Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；ＢＥＫ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ（カタログ番号ＡＨＳ２４０２）；Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｃ４８３；カタログ番号Ｃ４８４）；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ］；ＣＬＢ１３４［Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ（カタログ番号ＭＯＮ  １１１９）］；ＣＬＢＧＲＡＮＢＬｙ１［Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ］；ＳＮ３［Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ（カタログ番号ＭＨＣＤ２４００；ＭＨＣＤ２４０１；ＭＨＣＤ２４０４）］；ＭＬ５［ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（カタログ番号５５５４２７；  カタログ番号５５５４２８；  カタログ番号５５５４２６）］；および２４Ｃ０２［Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ（カタログ番号ＭＳ−１２７９）；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ］が挙げられる。
【００１６】
本発明はまた、ヒトＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体についての富化された集団を産生する工程であって、これらの集団は、神経細胞または神経由来細胞をＣＤ４９ｆに結合するモノクローナル抗体またはＣＤ１５に結合するモノクローナル抗体と接触させることにより、神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得る、工程；このモノクローナル抗体に結合する細胞（例えば、ＣＤ４９ｆ＋細胞、ＣＤ１５＋細胞およびＣＤ１５−／ｌｏ細胞）を選択する工程；ならびに必要に応じて結合細胞を除去する工程であって、ここで、選択された細胞は、ヒトＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体について富化され、ここで、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である工程に関する方法を、包含する。神経細胞または神経由来細胞を含む集団は、神経球培養物もしくは粘着性培養物、または一次神経組織から得られ得る。本発明の種々の実施形態において、モノクローナル抗体は、蛍光色素に結合し得るか、または磁気粒子に結合し得る。さらに、選択工程は、蛍光活性化細胞選別によっても、高勾配磁気選択（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）であっても、または固相への結合および分離によってもよい。
【００１７】
この方法はまた、一次神経組織から得られた集団を、除去した細胞を二次モノクローナル抗体ＳＣ２０と接触させ、ＳＣ２０＋（ＣＤ２４＋）またはＳＣ２０ｈｉ（ＣＤ２４ｈｉ）である細胞を除去し、ＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体について富化された集団を産生することによって、ＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体についてさらに富化する工程であって、ここで、集団内の選択された細胞は、ＳＣ２０−／ｌｏ（ＣＤ２４−／ｌｏ）である工程を、包含する。あるいは、選択された細胞は、ＳＣ２０−／ｌｏ（ＣＤ２４−／ｌｏ）である細胞についてさらに選択され得る。
【００１８】
この方法はまた、残留した細胞を抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体と接触させ、そして抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体に結合する細胞を選択して、ＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体について富化された集団を得ることにより、集団をＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体についてさらに富化する工程を、包含する。あるいは、神経細胞または神経由来細胞を、ＣＤ４９ｆに結合するモノクローナル抗体もしくはＣＤ１５に結合するモノクローナル抗体と接触させる前、接触の間または接触の後に、抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体（例えば、ＡＣ１３３）と接触させ得る。本明細書を通して、抗体Ｘ＋という用語は、抗体Ｘｈｉという用語と、本明細書中で相互交換可能に使用される。
【００１９】
本発明は、神経細胞または神経由来細胞の集団からＣＤ４９ｆ＋である細胞を選択する工程により、神経球（ＮＳ−ＩＣ）または粘着培養物を惹起し得るＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体について、富化された集団を産生する方法に関する。これは、集団を抗ＣＤ４９ｆ抗体、好ましくは、モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０と接触させ、そしてモノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０と結合しない細胞を除去する工程により、達成され得る。１つの実施形態において、本発明はまた、ＣＤ２４＋である細胞を残留の集団から除去する工程、またはＣＤ２−／ｌｏである細胞を選択する工程により、一次神経組織からの集団をさらに富化するための工程を提供する。これは、例えば、高レベルのＣＤ２４を発現する細胞を識別するモノクローナル抗体ＳＣ２０に結合する細胞を選択する工程（例えば、ＣＤ２４（ＣＤ２４＋細胞）を識別  するモノクローナル抗体ＳＣ２０に結合する細胞を除去する工程、またはＣＤ２４−／ｌｏである細胞を選択する工程）により、行われ得る。残留する細胞は、ＣＤ２４−／ｌｏであり得る。このような方法はまた、ＣＤ１３３＋である細胞を選択する工程により集団をさらに富化する工程を包含し得る。あるいは、神経細胞または神経由来細胞の集団は、ＣＤ４９ｆ＋細胞について選択する前、またはこれと同時に、ＣＤ１３３＋細胞について選択され得る。ＣＤ１５ｈｉである細胞は、モノクローナル抗体ＭＭＡを用いて選択され得る。
【００２０】
本発明は、モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０のような抗ＣＤ４９ｆ抗体に結合する細胞（またはモノクローナル抗体ＭＭＡのような抗ＣＤ１５抗体に結合する細胞（例えば、ＣＤ１５−／ｌｏまたはＣＤ１５ｈｉである細胞であり、ここで、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ集団の部分集合である））について神経細胞から選択する工程によって、神経細胞の集団から、神経球惹起幹細胞および／または前駆体（ＮＳ−ＩＣ）画分の集団について富化するための方法に関し、ここで、選択された細胞は、神経細胞の集団と比較して、ＮＳ−ＩＣの画分中において富化される。一次神経組織から得られた画分は、モノクローナル抗体ＳＣ２０のような抗ＣＤ２４抗体に結合する細胞を除去する工程（例えば、ＣＤ２４＋である細胞を除去することにより、残留した細胞がＣＤ２４−／ｌｏであり得るようにする工程、またはＣＤ２４−／ｌｏである細胞を選択する工程）により、さらに富化され得る。さらに、この画分は、モノクローナル抗体ＡＣ１３３のような抗ＣＤ１３３抗体に結合する細胞について選択する工程により、さらに富化され得る。モノクローナル抗体ＡＣ１３３のような抗ＣＤ１３３抗体に結合する細胞は、モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０のような抗ＣＤ４９ｆ抗体（またはモノクローナル抗体ＭＭＡのような抗ＣＤ１５抗体）に結合する細胞について選択する前、選択の間、または選択後に選択され得る。
【００２１】
本発明はまた、神経細胞または神経由来細胞の集団から、ＣＤ４９ｆ＋である細胞またはＣＤ１５ｈｉもしくはＣＤ１５−／ｌｏである（ここで、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である）細胞について選択する工程；モノクローナル抗体ＳＣ２０に強く結合する細胞（すなわち、ＳＣ２０＋細胞であり、残留する細胞は、ＣＤ２４−／ｌｏ細胞である）を除去する工程；ＬＩＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含有する無血清培養培地に残留する細胞を導入する工程；ならびに、残留する細胞を培養培地内で増殖させる工程により、一次神経組織から得られた神経球惹起幹細胞および／または前駆体細胞（ＮＳ−ＩＣ）を単離するための方法を提供する。選択された細胞は、ＣＤ１３３＋である細胞を選択する工程により、さらに富化され得る。このさらなる富化工程は、ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１５＋、またはＣＤ１５−／ｌｏである細胞について選択する前、選択の間、または選択後のいずれかで達成され得る。
【００２２】
ＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する抗体もまた提供され、ここで、ＣＤ４９ｆ抗原は、ＧｏＨ３抗体または４Ｆ１０抗体に特異的に結合する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生され得る。幾つかの実施形態において、この抗体は、抗体ＧｏＨ３および／または４Ｆ１０抗体による、ＣＤ４９ｆ抗原に対する同時の結合をブロックし得る。
【００２３】
ＣＤ１５抗原に特異的に結合する抗体もまた提供され、ここで、ＣＤ１５抗原は、ＭＭＡ抗体に特異的に結合する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生され得る。幾つかの実施形態において、この抗体は、抗体ＭＭＡによる、ＣＤ１５抗原に対する同時の結合をブロックし得る。
【００２４】
神経細胞または神経由来細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原および／またはＣＤ１５抗原に特異的に結合する試薬と合わせる工程、ならびにＣＤ４９ｆ試薬またはＣＤ１５試薬に結合する細胞を選択する工程であって、ここで、選択された細胞（ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１５ｈｉ、またはＣＤ１５−／ｌｏであり、ここで、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である）は、ＮＳ−ＩＣについて富化されている工程により、神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒトＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体の富化のための方法もまた、提供される。この試薬は、少なくとも１つの抗体を含み、そしてこの少なくとも１つの抗体は、蛍光色素結合し得、ここで、選択工程は、フローサイトメトリーによって達成される。あるいは、少なくとも１つの抗体が、磁気粒子と結合体化し得、ここで、選択工程は、高勾配磁気選択による。このような方法は、選択された細胞をＣＤ１３３抗原と特異的に結合する第二の試薬と合わせる工程、および第二の試薬に結合する細胞について選択する工程により、集団をさらに富化する工程を、さらに包含する。神経細胞または神経由来細胞の集団は、ＣＤ４９ｆ抗原もしくはＣＤ１５抗原に特異的に結合する試薬に結合する細胞に対する選択の前、選択の間、または選択の後に、ＣＤ１３３抗原に特異的に結合する試薬に結合する細胞について選択され得る。
【００２５】
本明細書中に記載される方法のいずれかにおいて、細胞の集団は、ＣＤ２４−／ｌｏである細胞を選択する工程、またはＣＤ２４＋である細胞を集団から除去し、その結果、残留する細胞がＣＤ２４−／ｌｏである工程のどちらかにより、ＣＮＳ−ＳＣについてさらに富化され得る。
【００２６】
神経細胞または神経由来細胞の集団からＣＤ４９ｆ＋である細胞またはＣＤ１５＋もしくはＣＤ１５−／ｌｏである細胞について選択する工程であって、ここでＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である工程により、神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒトＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体について富化される集団を産生するための方法もまた、提供される。
【００２７】
さらに、モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０のような抗ＣＤ４９ｆ抗体に結合する細胞について神経細胞または神経由来細胞から選択し、ＣＮＳ−ＳＣについて富化された集団を産生する工程であって、ここで、選択工程は、固相への結合および分離によって達成される工程により、神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒトＣＮＳ−ＳＣおよび／または前駆体について富化された集団を産生するための方法もまた、提供される。この集団は、モノクローナル抗体ＡＣ１３３のような抗ＣＤ１３３抗体に結合する細胞を選択する工程によって、さらに富化され得る。さらに、この集団は、モノクローナル抗体ＧｏＨ３またはモノクローナル抗体４Ｆ１０のような抗ＣＤ４９ｆ抗体に結合する細胞について選択する工程の前、選択工程の間および選択工程の後に、抗ＣＤ１３３抗体（例えば、ＡＣ１３３）に結合する細胞について選択する工程によって、さらに富化され得る。
【００２８】
本発明は、ＣＮＳ−ＳＣについて富化された集団を産生するために、ＣＤ１５抗原（例えば、ＣＤ１５ｈｉ細胞もしくはＣＤ１５−／ｌｏ細胞であり、ここでＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である）を識別  するモノクローナル抗体ＭＭＡに結合する細胞について神経細胞または神経由来細胞から選択することにより、ヒトＣＮＳ−ＳＣについて富化された集団および／または神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得る前駆体を産生するための方法に関連し、ここで、選択工程は、固相への結合および固相からの分離によって達成される。この集団は、モノクローナル抗体ＡＣ１３３のような抗ＣＤ１３３抗体に結合する細胞を選択する工程により、さらに富化され得る。この集団は、モノクローナル抗体ＭＭＡのようなＣＤ１５抗体に結合する細胞について選択する工程の前、選択工程の間、または選択工程の後に、モノクローナル抗体ＡＣ１３３のような抗ＣＤ１３３抗体に結合する細胞を選択する工程により、さらに富化され得る。
【００２９】
さらに、本発明は、神経細胞または神経由来細胞をＣＤ１５に結合するモノクローナル抗体と接触させる工程、およびモノクローナル抗体に結合する神経細胞または神経由来細胞を選択する工程（例えば、ＣＤ１５ｈｉ細胞またはＣＤ１５−／ｌｏ細胞について選択する工程であり、ここで、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である）、ならびに、必要に応じて、結合細胞（または非結合細胞）を除去する工程であって、ここで、選択された細胞は、ニューロン前駆体または神経膠前駆体からなる群から選択されるヒト中枢神経系前駆体細胞の部分集合である工程により、ヒト中枢神経系前駆体細胞の部分集合を単離するための方法を提供する。例えば、この抗体は、モノクローナル抗体ＭＭＡであり得る。
【００３０】
最後に、本発明は、ＣＤ１５＋またはＣＤ１５−／ｌｏである（ここで、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の部分集合である）細胞について、神経細胞または神経由来細胞の集団から選択する工程であって、ここで、選択された細胞は神経前駆体および神経膠前駆体からなる群から選択されたヒト中枢神経系前駆体細胞の部分集合である工程により、ヒト中枢神経系前駆体細胞の部分集合を単離するための方法に関する。
【００３１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本発明の実践において、本明細書中に記載された方法および材料と類似のものまたは等価物が使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中で挙げられた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。抵触の場合において、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであり、限定することを意図しない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲において明らかにされる。
【００３２】
（発明の詳細な説明）
細胞の集団は、成体中枢神経系（ＣＮＳ）内に存在し、これは、幹細胞特徴を示す。これらは、自己再生する能力および成体ＣＮＳの分化した成熟細胞表現型を産生する能力を有する。これらの幹細胞は、ＣＮＳ全体にわたって見出され、特に、脳室下領域および海馬の歯状回において見出される。
【００３３】
増殖因子反応性幹細胞は、マウスＣＮＳ組織、げっ歯類ＣＮＳ組織およびヒトＣＮＳ組織の、異なった発生段階の脳脊髄幹の多くの領域から単離され得る。これらの細胞は、ＥＧＦ、基本（ｂａｓｉｃ）ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２）およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）のような増殖因子に対する反応において変化し、培養物において、未分化状態で長期間、維持されかつ増殖され得る。成体および胚性のマウス前駆体細胞は、ＥＧＦに反応し、そして未分化細胞の球体として増殖する。これらの細胞は、多分化能を有し、そして血清含有条件においてニューロン、星状細胞および希突起膠細胞に分化し得、そしてＥＧＦ投与下で未分化のままであり、増殖を続ける部分集団を維持するという点で、幹細胞の特徴を示す。マウスＥＧＦ反応性前駆体細胞は、インビトロでＥＧＦレセプターについてのｍＲＮＡを発現する。ヒトＣＮＳ神経幹細胞培養物もまた、同定される。哺乳動物（ヒトを含む）神経幹細胞培養物（懸濁培養物としてまたは粘着培養物としてのどちらか）の同定、培養、増殖および使用は、Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号（両方とも本明細書中で参考として援用される）において開示される。同様に、Ｊｏｈｅ、米国特許第５，７５３，５０６号（これもまた本明細書中で参考として援用される）は、粘着ＣＮＳ神経幹細胞培養物を言及する。懸濁物中で培養された場合、ＣＮＳ神経幹細胞培養物は、代表的に、神経球を形成する。
【００３４】
図１は、神経球に発達するＮＳ−ＩＣの増殖、その後のニューロン表現型および神経膠表現型への分化、ならびに前駆体ＮＳ−ＩＣの産生を示す。１つ以上の増殖誘導増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の存在下において、ＮＳ−ＩＣは、分裂して、より多くの幹細胞および前駆体細胞で構成される未分化細胞の球（「神経球」）を生じる。クローン的に誘導される神経球が、解離され、そして１つ以上の増殖誘導増殖因子の存在下で１つの細胞としてプレート培養される場合、各ＮＳ−ＩＣは、新規の神経球を産生し得る。１つの神経球の細胞は、天然においてクローンである。何故なら、これらは、１つの神経幹細胞の前駆体であるからである。継続した増殖誘導増殖因子（例えば、ＥＧＦなど）の存在下で、神経球内の前駆体細胞は、分裂し続け、神経球の大きさの増大および未分化神経細胞数の増加をもたらす。神経球は、神経フィラメント（ＮＦ；ニューロンについてのマーカー）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ；ニューロンについてのマーカー）、神経膠繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；星状細胞についてマーカー）、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ；希突起膠細胞についてマーカー）について、免疫応答性でない。しかし、神経球内の細胞は、ネスチン（未分化ＣＮＳ細胞の多くの型において見出される媒介フィラメントタンパク質）について免疫応答性である（Ｌｅｈｎｄａｈｌら，６０  ＣＥＬＬ  ５８５−５９５（１９９０），本明細書中で参考として援用される）。ネスチンを同定するための抗体が使用され得、その抗体としては、Ｒａｔ４０１と呼ばれるラット抗体が挙げられる。分化を可能にする条件下で神経球が培養される場合、前駆体細胞はニューロン、星状細胞および希突起膠細胞に分化する。神経幹細胞前駆体から誘導され得る分化した細胞型に伴う成体表現型は、主にネスチン表現型についてネガティブである。
【００３５】
未分化、多分化能、自己再生性の神経細胞について使用される用語は、発達しており、現在、これらの細胞は、「神経幹細胞」と呼ばれる。神経幹細胞は、クローン原生の的に多分化能の幹細胞であり、これは、分裂し得、適切な条件下で、ＮＳ−ＩＣについて自己再生能力を有し、その前駆体娘細胞（最後にニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞に分化し得る）を含み得る。従って、神経幹細胞は、「多分化能」である。何故なら、幹細胞前駆体は、多くの分化経路を有するからである。神経幹細胞は、自己維持可能であり、これは、各細胞分裂について、１つの娘細胞もまた、平均的な幹細胞になることを意味する。
【００３６】
神経幹細胞の非幹細胞前駆体は、代表的に、「前駆体」細胞と呼ばれ、これは、１つ以上の系統に、種々の細胞型を生じ得る。用語「神経前駆体細胞」は、神経幹細胞に由来し、それ自体は幹細胞ではない、未分化細胞をいう。幾つかの前駆体細胞は、１つ以上の細胞型に分化可能な前駆体を産生し得る。例えば、Ｏ−２Ａ細胞は、神経膠前駆体細胞であり、希突起膠細胞および２型星状細胞を生じ、従って、「二分化能」前駆体細胞と呼ばれる。前駆体細胞の特徴の識別は、幹細胞の特徴の識別と違い、自己維持を示さず、そして代表的に、分化の特定の経路に託されると考えられ、適切な条件下で、最終的に神経膠またはニューロンに分化する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「前駆体細胞」は、神経幹細胞の前駆体をいい、従って、前駆体細胞および娘神経幹細胞の両方を含む。
【００３８】
（細胞マーカー）
本発明は、神経球（ＮＳ−ＩＣ）を形成可能な神経幹細胞および／または前駆体の同定、単離、富化、および培養を提供する。ＮＳ−ＩＣは、ＮＳ−ＩＣの表面上に見出される抗原の、細胞表面抗原を特異的に結合する試薬への結合を介して同定または選択される。
【００３９】
コントロールに対して分布を基準化するため、各細胞を、特定の染色強度を有するデータ点として記録した。これらのデータ点は、対数スケールに従って示され得、ここで、測定の単位は、任意の染色強度である。１つの例において、集団の中で最も強く輝く細胞を、最低レベルの染色を有する細胞より３対数強い強度として示す。この様式において示した場合、最高対数の染色強度にある細胞は明るいが、最低強度の細胞はネガティブであることが明らかである。２〜３対数の染色強度の「低い」染色の細胞は、ネガティブな細胞およびポジティブな細胞から独特の性質を有し得る。代替のコントロールは、その表面上にマーカーの所定の密度を有する基質（例えば、ビーズ製品または細胞株）を使用し得、これは、強度のポジティブコントロールを提供する。「低」表示は、アイソタイプ適合コントロールの光度より高い染色のレベルを示すが、集団中に通常見出される最も明るく染まった細胞の強度ほど高いレベルを示さない。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語ＣＤ１５ｌｏおよび／もしくはＣＤ１５ｌｏｗならびに／またはＣＤ１５−／ｌｏは、「低い」染色細胞をいい、これは、染色強度の第１〜第２の対数内である。所定の抗原における幾つかの分子（＜１００〜５００）が細胞表面上に発現される場合、シグナル対ノイズの比率は、所定の抗原が細胞表面上に発現されるか否かを決定するには貧弱であり得る。当業者は、本明細書中に記載の任意の抗体もまた、意図される意味を変更することなく、「ｌｏ」または「ｌｏｗ」の表示（すなわち、抗体Ｘｌｏまたは抗体Ｘｌｏｗ）を用いて記載され得ることを理解する。同様に、本明細書中で使用される場合、用語ＣＤ１５ｈｉ、ＣＤ１５ｈｉｇｈおよび／またはＣＤ１５ｂｒｉｇｈｔは、集団中で最低レベルの染色を有する細胞より３対数強い強度として示される細胞をいう。さらに、当業者は、意図される意味を変更することなく、これらの表示を使用して、任意の抗体を記載し得る（すなわち、抗体Ｘｈｉ、抗体Ｘｈｉｇｈまたは抗体Ｘｂｒｉｇｈｔ）ことを理解する。表示抗体Ｘｍｅｄは、「ｌｏｗ」と「ｂｒｉｇｈｔ」との間にある染色強度を有する抗体をいうことを意図する。さらに、本明細書中で使用される場合、表示抗体Ｘ＋および抗体Ｘｈｉは、相互交換可能に使用される。
【００４１】
ＮＳ−ＩＣの表面上で見出される抗原の１つは、ＡＣ１３３モノクローナル抗体に結合する抗原（すなわち、ＣＤ１３３抗原）である。Ｙｉｎら，米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用される）は、ＡＣ１３３と呼ばれるモノクローナル抗体を記載し、これは、造血幹細胞および造血前駆体細胞上の表面マーカー糖タンパク質に結合する。ＡＣ１３３抗原（また、本明細書中で「ＣＤ１３３抗原」または「ＣＤ１３３」とも呼ばれる）は、１１７ｋＤａの分子量を有する、５回膜貫通細胞表面抗原である。この抗原の発現は、非常に組織特異的であり、ヒト骨髄、胎児の骨髄および肝臓、臍帯血ならびに成体周辺血に由来する造血前駆体細胞の部分集合において検出されている。ＡＣ１３３抗体によって識別される細胞の部分集合は、ＣＤ３４ｂｒｉｇｈｔであり、ＣＤ３４＋集団内に存在する実質的に全てのＣＦＵ−ＧＭ活性を含み、ＡＣ１３３を、ヒト造血前駆体細胞およびヒト造血幹細胞を単離しそして特徴付ける試薬として有用にする。
【００４２】
ＡＣ１３３抗体（本明細書中で５Ｆ３抗体とも呼ばれる）は、例示的な抗体実施形態の試薬であり、これは、プロミニン（ｐｒｏｍｉｎｉｎ）と呼ばれるヒト細胞マーカーを識別する。プロミニンは、種々の上皮細胞で発現される、ポリトロープ膜タンパク質である（Ｗｅｉｇｍａｎｎら，９４（２３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１２４２５−３０（１９９７）；Ｃｏｒｂｅｉｌら，１１２（Ｐｔ  ７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０２３−３３（１９９９）；Ｃｏｒｂｅｉｌら，９１（７）Ｂｌｏｏｄ  ２６２５−６（１９９８）；Ｍｉｒｉｇｌｉａら，９１（１１）Ｂｌｏｏｄ  ４３９０−１（１９９８））。種々のＡＣ１３３抗体が、米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中で参考として援用される）に記載される。マウスハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３の寄託は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  ＭＤ  ２０８５２において、１９９７年４月２４日になされ、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２３４６を受けた。これらのＡＣ１３３抗体は、本発明において、目的のヒト細胞の部分集合について免疫選択可能である。好ましいＡＣ１３３モノクローナル抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）から市販され、ＡＣ１３３／１−ＰＥ抗体（カタログ番号８０８−０１）およびＡＣ１３３／２−ＰＥ抗体（カタログ番号８０９−０１）が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＡＣＳ分離のために、モノクローナル抗体の５０：５０混合物が、好ましい。ＡＣ１３３発現の高い組織特異性は、非常に精製されたＮＳ−ＩＣ集団についての富化の間、特に有利である。ＮＳ−ＩＣを選択するためのＡＣ１３３抗原の使用についての考察は、米国特許第６，４６８，７９４号（本明細書中で参考として援用される）において見出される。
【００４３】
「抗ＣＤ１３３抗体」は、ＦＡＣＳおよび免疫沈降実験においてネイティブで、ならびにウエスタンブロット実験における変性構造での、ＣＤ１３３タンパク質への結合によって、特徴付けられる。ＣＤ１３３抗原は、米国特許第５，８４３，６３３号に従って１２５ｋＤａ〜１２７ｋＤａの範囲の、そして米国特許出願公開第２００１００５１３７２号に従って１１５ｋＤａ〜１２７ｋＤａの範囲の、低減された分子量を有することが報告されている。抗ＣＤ１３３抗体の例としては、ＡＣ１３３およびＳＣ１１１（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
ＣＤ４５は、Ｔ２００／白血球共通抗原である。ＣＤ４５に対する抗体は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）（カタログ番号１３０−０８０−２０１；１３０−０８０−２０２）およびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１３４３ｃｌｂ；ＲＤＩ−ＣＢＬ１２４；ＲＤＩ−ＣＢＬ１４８；ＲＤＩ−ＣＢＬ４６４など）から市販される。好ましい実施形態において、本発明の細胞およびこれらを含む培養物は、ＣＤ４５のような細胞表面マーカーを欠くことでさらに（プロミニンポジティブであることに加えて）特徴付けられる。
【００４５】
ＣＤ３４はまた、ｇｐ１０５−１２０としても知られる。ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）（カタログ番号１３０−０９０−９５４）；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１６３６ｃｌｂ；ＲＤＩ−ＣＢＬ１２８；ＲＤＩ−ＣＢＬ４９６ＦＴ；ＲＤＩ−Ｍ２２８１ｃｌｂ；ＲＤＩ−ＣＤ３４−５８１など）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（カタログ番号５５０７６０））から市販される。抗ＣＤ３４モノクローナル抗体は、リンパ性造血幹／前駆体細胞を、研究および臨床的骨髄移植のために定量し、そして精製するために使用されている。ＣＤ３４は、ヒト前駆体細胞上で選択的に発現される、約１１０ｋＤａの分子量を有する単量体細胞表面抗原である。この遺伝子は、造血前駆体細胞に加えて小血管上皮細胞によって発現される、一本鎖１０５〜１２０ｋＤａの非常にＯ−グリコシル化された膜貫通糖タンパク質である。この配列は、Ｓｉｍｏｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４８：２６７−２７１によって開示される。
【００４６】
モノクローナル抗体ＳＣ２０（正式には８Ｇ１として公知である（Ｕｃｈｉｄａら，ＰＮＡＳ  ２０００）は、ＣＤ２４を識別すると考えられる。これは、細胞型の制限されたスペクトルで発現されるヒトＬＲＰ／Ａ２ＭＲの５１５キロダルトンのα鎖と特異的に反応する。肝細胞、組織マクロファージ、中枢神経系のニューロンおよび星状細胞の部分集合、線維芽細胞、平滑筋細胞、および動脈壁におけるアテローム硬化性病変における単球由来泡沫細胞において、強い免疫組織化学反応が見られる。この抗体はまた、慢性および急性の白血病の骨髄単球性サブタイプ（ＣＤ９１）の部分集合の特徴付けのために使用され得る。ＣＤ９１に対する抗体は、例えば、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）から市販される（カタログ番号ＲＤＩ−ＰＲＯ６５１１０２；ＲＤＩ−ＰＲＯ６１０１０２；ＲＤＩ−ＰＲＯ６１０６５など）。
【００４７】
ＣＤ２４を識別する抗体の他の例としては、３２Ｄ１２［Ｄｉａｔｅｃ，Ｏｓｌｏ，ＮＯＲＷＡＹ（カタログ番号ＣＤ２４３０６１−ａｂ５３１）］；ＡＬＢ９［Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；ＢＥＫ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｂｉｏｍｅｄａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ（カタログ番号ＡＨＳ２４０２）；Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ（カタログ番号Ｃ４８３；Ｃ４８４）；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ］；ＣＬＢ１３４［Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ（カタログ番号ＭＯＮ１１１９）］；ＣＬＢＧＲＡＮＢＬｙ１［Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ］；ＳＮ３［Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ（カタログ番号ＭＨＣＤ２４００；ＭＨＣＤ２４０１；ＭＨＣＤ２４０４）］；ＭＬ５［ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（カタログ番号５５５４２７；５５５４２８；５５５４２６）］；および２４Ｃ０２［Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ（カタログ番号ＭＳ−１２７９）；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ，ＭＡ］が挙げられる。
【００４８】
当業者は、表示ＳＣ２０＋およびＣＤ２４＋ならびにＳＣ２０−／ｌｏおよびＣＤ２４−／ｌｏは、同義であり、本明細書を通して相互交換可能に使用されることを認識する。胎児の脳から単離されたＣＮＳ−ＳＣは、ＣＤ１３３＋ＳＣ２０−／ｌｏ細胞である（例えば、その細胞は、低レベルのＣＤ２４を発現する）。ＣＮＳ−ＳＣがインビトロで神経球として増殖される場合、これらは、ＣＤ２４を発現し得る。ＣＤ２４抗原は、細胞が増殖するにつれてアップレギュレートされると思われる。従って、ＣＮＳ−ＳＣに由来する神経球細胞は、ＣＤ２４発現について不均質である（低レベルから高レベルまで）。このような細胞もまた、ＣＤ１３３＋である。
【００４９】
ＣＤ４９ｆ（インテグリンα−６としても知られる）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５３５８６；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ登録番号Ｐ２３２２９）は、１５０ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、これは、主に上皮細胞によって発現されるインテグリンへテロ二量体の一部である。インテグリンα−６は、インテグリンβ−１（ＣＤ２９）鎖と結合してＶＬＡＡ−６を形成し、そしてインテグリンβ−４鎖と結合してラミニンレセプターおよびカリニン（ｋａｌｉｎｉｎ）レセプターを形成する。ＣＤ４９ｆは、主にＴ細胞、単球、血小板、上皮細胞および内皮細胞、神経周囲細胞、ならびに胎盤の栄養膜上で発現される。ＣＤ４９ｆの配列は、例えば、Ｔａｍｕｒａら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：１５９３−６０４（１９９０）（本明細書中で参考として援用される）において見出され得る。ＣＤ４９ｆ  ｃＤＮＡの２つの代替のスプライシング形態が存在し、これは、異なった細胞質ドメインを有することが記載されている。Ａ形態は、単独で肺、肝臓、膵臓、および子宮頚に発現される。Ｂ形態のみが、脳、卵巣、および腎臓において観察され、そして両形態は、他の組織において検出されている。ＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９α６β１は、血小板、単球およびＴリンパ球状のラミニンレセプターであり、そしてラミニンに結合するＣＤ４９ｆ／ＣＤ２９媒介性Ｔ細胞は、Ｔ細胞に対し、活性化および増殖のための同時刺激性シグナルを提供する。
【００５０】
ＣＤ４９ｆに対する抗体は、非造血幹細胞または前駆体細胞（特に中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞および前駆体細胞）を同定、単離または富化するための方法において使用されていない。
【００５１】
ＣＤ４９ｆの配列は、以下の表Ａにおいて提示される。α−６は、インテグリンβ−１（ＣＤ２９）鎖に結合してＶＬＡＡ−６を形成し、そしてインテグリンβ−４鎖に結合してラミニンレセプターおよびカリニンレセプターを形成する。ＣＤ４９ｆを識別する抗体としては、ＧｏＨ３［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１５６６およびＲＤＩ−Ｍ１６７２ｃｌｂ）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）（カタログ番号５５７１０、５５７５１１、５５１１４０、５５１１２９、５５５７３４、５５５７３５、５５５７３６）；およびＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄ（ｗｗｗ．ｉｎｃｂｉｏｍｅｄ．ｃｏｍ）］ならびに４Ｆ１０［Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ（カタログ番号ＲＤＩ−ＣＢＬ４５８）］が挙げられる。  
【００５２】
【化１】
2006511206.tif 000002
ＣＤ１５（Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、またはＬｅＸとしても公知である）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ  ００２０３３）は、２２０ｋＤａの分枝五糖である。ＣＤ１５炭水化物エピトープは、成熟ヒト好中球、単球、および好酸球、ならびに成体マウス脳室下領域（ＳＶＺ）幹細胞において発現される。これはまた、胚性組織および腺癌、骨髄性白血病およびＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞においても見い出され得る。このような組織において、Ｌｅｗｉｓ  Ｘエピトープは、細胞−細胞相互作用に関わると考えられる。ＣＤ１５は、ＣＤ１１／ＣＤ１８およびＣＤ６６糖タンパク質によって運ばれる。ＣＤ１５抗体は、末端三糖構造Ｇａｌβ１→４［Ｆｕｃα１→３］ＧｌｃＮＡｃ（ＬｅＸ抗原）を識別する。ＣＤ１５抗体の大部分は、ＩｇＭであり、そしてこれらは、ＣＤ１５のシアリル化形態であるＣＤ１５ｓと交叉反応しない。
【００５３】
ＣＤ１５は、フコース含有三糖であり、多くの組織において広範に分布し、幾つかのげっ歯類組織およびヒト組織（すなわち、脳および肺、ならびにマウス初期胚）において発展的に発現される。さらに、ＣＤ１５は、マウス肺幹細胞および始原生殖細胞のような多能性幹細胞の表面上に存在する。ＣＤ１５の配列は、表Ｂに提示する。ＣＤ１５は、幹細胞の局在化および精製を可能にするので、細胞型マーカーとして有用である。ヒトＣＤ１５を識別する抗体としては、ＭＭＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）（カタログ番号３４０７０３、３４０８５０、３４７４２０、３４７４２３、５５９０４５））が挙げられる。
【００５４】
細胞表面炭水化物部分は、細胞型マーカーとして有用である（Ｊｅｓｓｅｌｌら，（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３，２２７−５５）。ＳＳＥＡ−１（段階特異的胚性抗原１）またはＣＤ１５（分化１５の白血球塊）としても公知の三糖３−フコシル−Ｎ−アセチルラクトサミンまたはＦＡＬであるＬｅＸ抗原（Ｇｏｏｉら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２，１５６−５８）は、多能性幹細胞において高度に発現する：これは、マウスおよびヒトの胚性癌腫細胞、マウス着床前胚、胚性幹細胞、奇形癌細胞および始源生殖細胞上において見出される（ＳｏｌｔｅｒおよびＫｎｏｗｌｅｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，５５６５−６９；Ｆｏｘら（１９８１）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．８３，３９１−９８；ＢｉｒｄおよびＫｉｍｂｅｒ（１９８４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０４，４４９−６０；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，（１９９４）Ｎａｇｏｙａ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５７，９５−１０８；Ｍａｒａｎｉら（１９８６）Ａｃｔａ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．Ｎｅｅｒｌ．Ｓｃａｎｄ．２４，１０３−１１０；Ｇｏｍｐｅｒｔｓら，（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，１３５−４１）。興味深いことに、種々の種におけるＣＮＳ細胞部分集団もまた、発生の間および成体期に、このマーカーを発現する。ＬｅＸは、マウス胚終脳における胚領域（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｚｏｎｅ）（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，３０４５−４９；Ａｌｌｅｎｄｏｅｒｆｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６，３８１−９５；Ａｌｌｅｎｄｏｅｒｆｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１１，２０８−１９；Ｔｏｌｅら（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １５，６２４−２７；ＡｓｈｗｅｌｌおよびＭａｉ，（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２８９，１７−２３）ならびに脊髄（ＤｏｄｄおよびＪｅｓｓｅｌｌ（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１２９，２２５−３８）、ならびに小脳外部顆粒層（ＭａｒａｎｉおよびＴｅｔｔｅｒｏｏ（１９８３）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８，１５７−６１において発現される。成体マウスＣＮＳにおいて、ＬｅＸは、星状細胞、タン細胞、および幾つかのニューロンの部分集団によって発現される（ＢａｒｔｓｃｈおよびＭａｉ（１９９１）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２６３，３５３−６６；Ｇｏｃｈｔら（１９９６）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１１，１００７−２８；ＡｓｈｗｅｌｌおよびＭａｉ（１９９７）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．２８９，１７−２３）。
【００５５】
【化２】
2006511206.tif 000003
ＣＤ１３３＋ＳＣ２０−／ｌｏ細胞の少なくとも二つの異なる部分集合が存在し、それらは、ＣＤ１５−／ｌｏおよびＣＤ１５ｈｉである。部分集合は両方とも増殖し、神経球を生じる。ＣＤ１５−／ｌｏ細胞またはＣＤ１５ｈｉ細胞のどちらがより初期のＣＮＳ−ＳＣであるかは明らかではない。細胞のＣＤ１５−／ｌｏ部分集合由来の神経球細胞は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスで、うまく移植される。
【００５６】
（ＣＤ１５（ＬｅＸ）の生物学的重要性）
ＬｅＸは、胚多能性幹細胞および成体ＣＮＳ幹細胞で発現される。Ｌｅｘは、胚盤胞付着に作用し（Ｂｉｒｄ，Ｊ．Ｍ．ら、（１９８４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０４、４４９〜４６０；Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．Ｉ．（１９９２）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４、７７１〜７７６）、ＣＮＳ幹細胞粘着に作用し得る。プロテオグリカンの炭水化物外部ドメインは、細胞外マトリックス中に発散され得、そこで、増殖因子と相互作用する（Ｋａｔｏ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４、６９１〜６９７）。Ｌｅｘは、細胞外マトリックスに存在し（Ｇｏｃｈｔ，Ａ．ら、（１９９６）Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１１、１００７〜１０２８）、インビトロでの成体ＳＶＺ細胞によるＬｅＸ＋物質の発散および神経性領域の散在性のＬｅＸ染色が観察されている。ＬｅＸ無しの低濃度は、ＦＧＦ２のオリゴマー形成を促進し得、胚幹細胞に対して、その分裂促進性を刺激し得る（Ｍｉｌｅｖ，Ｐ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、２１４３９〜２１４４２；Ｊｉｒｍａｎｏｖａ，Ｌ．ら、（１９９９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３、５５５〜５６２）。しかし、過剰のＬｅＸは、ＦＧＦ２分裂促進性を阻害する（Ｄｖｏｒａｋ，Ｐ．ら、（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１１、２９４５〜２９５２）。従って、細胞外環境における種々の濃度のＬｅＸは、増殖因子がＣＮＳ幹細胞に接近し、そしてＣＮＳ幹細胞に作用するのを調節し得る。胚では、ＬｅＸ含有炭水化物は、Ｗｎｔに結合し得、そして成体における重要な増殖調節因子に結合し続け得る。発生中のＣＮＳおよび成体の神経性領域で同定されたＬｅＸに対する大きなキャリア分子は、その調節的役割に対して重要であり得る。
【００５７】
（幹細胞および前駆体細胞の部分集合の単離）
特定の細胞の発生運命地図の階層性の確立が現在、マウスの造血性幹細胞およびその子孫で達成されている。この発生運命地図作成は、本発明に適用されている技術を利用し、より記述的には、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＪ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９４  １１月；１（８）：６６１〜７３；Ｋｏｎｄｏ  Ｍ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ、Ａｋａｓｈｉ  Ｋ．Ｃｅｌｌ  １９９７  １１月２８日；９１（５）：６６１〜７２；Ａｋａｓｈｉ  Ｋ、Ｔｒａｖｅｒ  Ｄ、Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｔ、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  ３月９日；４０４（６７７４）：１９３〜７中に見出され得る。最初に記載されたマウス造血幹細胞集団のさらなる精査は、短期再増殖画分および長期再増殖加画分の両方に造血幹細胞集団を再分割するための表面表現型を使用して達成された。次いで、この技術を、造血幹細胞の子孫に適用し、リンパ骨髄の前駆体、骨髄の制限的な前駆体および一般的なリンパ球前駆体を同定する。
【００５８】
（ＮＳ−ＩＣの部分集合の単離）
ＮＳ−ＩＣは、インビトロでの増殖の前に、神経組織（代表的には、胎児脳組織）から単離された細胞集団から得られる。結果として、ＮＳ−ＩＣ集団は、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏまたはＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏであり得る。インビトロ増殖の後は、細胞のこの集団は、ＣＤ２４ｈｉであり得る。後の培養から得たＮＳ−ＩＣは、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋として分類され得る。
【００５９】
本発明は、ＮＳ−ＩＣの部分集合（幹細胞および前駆体を含む）を単離するために使用され得る細胞マーカーＣＤ４９ｆを使用する選択方法論を提供する。このような部分集合の単離は、ＣＤ１３３＋細胞および／またはＣＤ４９ｆ＋細胞の選択の前か後かのどちらかで行なわれ得る。ＣＤ１５は、ＮＳ−ＩＣが富化されたＣＤ１５ｈｉＣＤ２４−／ｌｏ細胞集団およびＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞集団を単離するために使用され得る。図７に示されるように、ＣＤ１５の発現は、増殖可能なＣＮＳ幹細胞および前駆体の種々の部分集合を定義する。実施例６に示されるように、ＣＤ１５−／ｌｏ細胞は、神経球を発生させ、後の移植でうまく移植する能力を有する。
【００６０】
（細胞寄託）
８Ｇ１．７培養物（現在は、ＳＣ２０として公知である）を、微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従って、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９９３およびＰＴＡ−９９４に基づいて、ＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９に寄託した。米国特許第５，８４３，６３３号に記載されるように、ネズミのハイブリドーマ細胞株ＡＣ１３３を、ブダペスト条約の規定に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ２０８５２に寄託した（ＡＴＣＣ名称  ＨＢ１２３４６）。
【００６１】
抗ＣＤ４９ｆ抗体および抗ＣＤ１５抗体は、市販されている。
【００６２】
（細胞の単離、富化および選択）
ＮＳ−ＩＣが単離された細胞の集団は、神経組織、神経組織から分離した細胞の集団または細胞培養物の細胞の集団（例えば、神経球培養物または粘着神経幹細胞培養物）であり得る。
【００６３】
本発明は、ＮＳ−ＩＣの単離および同定を提供する。神経球を惹起する幹細胞または前駆体（ＮＳ−ＩＣ）の同定は、神経細胞の集団（または神経細胞もしくは神経由来細胞を含む集団）を、ＣＤ４９ｆ抗原に結合する試薬および／またはＣＤ１３３抗原に結合する試薬および／またはＣＤ１５抗原に結合する試薬と接触させる工程、ならびに細胞の表面上でのＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３および／またはＣＤ１５抗原に結合する試薬とＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３および／またはＣＤ１５抗原との間の接触を検出する工程を包含する。ＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１３３および／またはＣＤ１５試薬（例えば、ＣＤ１５ｈｉ細胞またはＣＤ１５−／ｌｏ細胞）が結合する細胞は、ＮＳ−ＩＣと同定される。これらの細胞の同一性は、神経球の惹起、自己再生および多分化が可能な細胞が実際にＮＳ−ＩＣであることをを示すアッセイによって確認され得る。
【００６４】
本発明の方法はまた、ＮＳ−ＩＣの画分を含む神経細胞の集団を、ＣＤ４９ｆ抗原（またはＣＤ１５抗原）に特異的に結合する試薬と接触させる工程、次いで、選択前の神経細胞の集団と比較して、ＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣ（またはＣＤ１５ｈｉＮＳ−ＩＣもしくはＣＤ１３３＋ＣＤ１５−ｌ／ｏＣＤ２４−ｌ／ｏＮＳ−ＩＣ）に富化された、選択された集団を産生するために、ＣＤ４９ｆ＋細胞（またはＣＤ１５ｈｉ細胞もしくはＣＤ１５−ｌ／ｏ細胞）を選択する工程によって、抗ＣＤ４９ｆ抗体を使用して、ＣＤ４９ｆ細胞からＣＤ４９ｆ＋細胞を単離するため（または抗ＣＤ１５抗体を使用して、ＣＤ１５ｈｉ細胞もしくはＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞を単離するため）に使用され得る。従って、本発明はさらに、神経組織または神経幹細胞培養物（例えば、神経球懸濁培養物または神経幹細胞粘着培養物）由来のＮＳ−ＩＣの富化を提供する。従って、本発明は、幹細胞および前駆体細胞が低頻度で生じる、または渇枯した可能性のある神経組織（例えば、後期胚、若年の組織および／または成年の組織）からＮＳ−ＩＣを富化するために有用である。当業者は、ＮＳ−ＩＣの画分を含む神経細胞の集団とＣＤ４９ｆ抗原またはＣＤ１５抗原に特異的に結合する試薬を組合せて、ＣＤ４９ｆ＋細胞、ＣＤ１５＋細胞またはＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞を選択し得る。このようにして、選択されたＣＤ４９ｆ＋細胞、ＣＤ１５＋細胞またはＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞は、神経細胞の集団と比較して、ＮＳ−ＩＣの画分に富化される。
【００６５】
本発明はまた、ＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合する抗体を提供し、ここで、ＣＤ４９ｆ抗原は、ＧｏＨ３抗体および／または４Ｆ１０抗体に特異的に結合する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生され得る。このモノクローナル抗体は、抗体ＧｏＨ３および／または抗体４Ｆ１０によるＣＤ４９ｆ抗原への同時結合をブロックし得る。特に興味深いのは、ＣＤ４９ｆ抗原に結合する抗体である交差反応抗体（すなわち、ＧｏＨ３抗体および／もしくは４Ｆ１０抗体と同一のエピトープに結合し、同時結合を実質的に阻害する抗体）、これらのアナログ種、これらの結合フラグメントならびに／またはこれらの複合物である。
【００６６】
同様に、本発明はまた、ＣＤ１５抗原に特異的に結合する抗体を提供し、ここで、ＣＤ１５抗原は、ＭＭＡ抗体に特異的に結合する。この抗体は、ハイブリドーマ細胞株によって産生され得る。このモノクローナル抗体は、抗体ＭＭＡによるＣＤ１５抗原への同時結合をブロックし得る。特に、興味深いのは、ＣＤ１５抗原に結合する抗体である交差反応抗体（すなわち、ＭＭＡ抗体と同一のエピトープに結合し、同時結合を実質的に阻害する抗体）、これらのアナログ種、これらの結合フラグメントならびに／またはこれらの複合物である。
【００６７】
ＣＤ４９ｆ＋の集団またはＣＤ１５＋もしくはＣＤ１５−／ｌｏ神経細胞もしくは神経由来細胞の集団を、ＣＤ２４抗原に特異的に結合する試薬と併用する工程、およびＣＤ２４＋である細胞を除去する工程（ここで、残存する細胞はＮＳ−ＩＣが富化されている）による、神経球（ＮＳ−ＩＣ）を惹起し得るヒトＣＮＳ−ＳＣおよび前駆体のさらなる富化のための方法もまた、提供され、ここで、残留する細胞は、ＮＳ−ＩＣを富化される。例えば、この試薬は、抗体であり得る。
【００６８】
本発明のどの方法であっても、細胞を、ＣＤ４９ｆ抗原に結合する試薬と接触させる工程の前、その間、および／またはその後に、細胞を、ＣＤ１３３抗原に特異的に結合する試薬（すなわち、抗ＣＤ１３３抗体（例えば、ＡＣ１３３モノクローナル抗体））と接触させる工程によって、神経細胞もしくは神経由来細胞の集団は、さらに富化され得る。同様に、本発明のどの方法であっても、細胞を、ＣＤ４９ｆ抗原に結合する試薬と接触させる工程の前、その間、および／またはその後に、細胞を、ＣＤ１５抗原と特異的に結合する試薬（すなわち、抗ＣＤ１５抗体）と接触させる工程によって、神経細胞または神経由来細胞の集団はさらに、富化され得る。
【００６９】
本発明に従った細胞選択は、任意の適切な当該分野で公知の手段によって、達成され得、その手段としては、フローサイトメトリー（例えば、蛍光色素結合抗体を使用する、蛍光活性化細胞選別による）が挙げられる。この選択はまた、磁気粒子に結合する抗体を使用する高勾配磁気選択によるものであり得る。同様に、固相への付着および固相からの脱離を包含する任意の他の適切な方法はまた、本発明の範囲内であることが企図される。
【００７０】
細胞の集団は、抗ＣＤ４９ｆ抗体を使用する免疫選択により誘導され得る。細胞の集団は、少なくとも３０％のＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣ、好ましくは、少なくとも５０〜７０％のＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣ、および、より好ましくは、９０％より多くのＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣ含むべきである。最も好ましくは、少なくとも９５％のＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣを含む実質的に純粋なＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣの集団である。獲得され、そして実際に使用される富化の程度は、選択の方法、増殖の方法および神経球の惹起のための培養物中に置かれる細胞の量を含む多くの因子に依存する。
【００７１】
細胞の集団は、後期胚、若年哺乳動物のＣＮＳ組織または成体哺乳動物のＣＮＳ組織に由来し得るかまたは神経幹細胞の存在する培養物に由来し得る。これらは、Ｗｅｉｓｓの米国特許第５，７５０，３７６号またはＪｏｈｅの米国特許第５，７５３，５０６号に記載される。最も好ましい実施形態において、ＮＳ−ＩＣはヒトＮＳ−ＩＣである。いくつかの実施形態において、集団内のＣＤ４９ｆ＋細胞は、内皮細胞に複合体化され得る。
【００７２】
ＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣの富化された集団を含む本明細書で記載されるインビトロの細胞培養物は一般的に、ネスチンに対する陽性染色、ならびに、分化を誘導する条件の存在下でのニューロン、星状細胞および希突起膠細胞に分化する子孫細胞の産生として特徴付けられる。
【００７３】
当業者は、単離されたＣＤ４９ｆ＋細胞を培養培地に導入し得、単離されたＣＤ４９ｆ＋細胞を、特に神経球として、培地中で増殖させ得、単離されたＣＤ４９ｆ＋細胞がニューロン、星状細胞および希突起膠細胞に分化する条件下で、単離されたＣＤ４９ｆ＋細胞の子孫を培養し得、次いで、ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞の存在を検出し得る。ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞の存在は、単離されたＣＤ４９ｆ＋細胞を、ＮＳ−ＩＣとして特徴付ける。
【００７４】
代表的に、ＣＤ４９ｆ＋ＮＳ−ＩＣは、神経球の成長および増殖を可能にする培地中で培養される。単離されたＣＤ４９ｆ＋細胞が増殖する培地は、１つ以上の所定の、多能性神経幹細胞増殖を誘導するために有効な増殖因子を含有する無血清培地であり得る。培養培地は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２；ｂＦＧＦ）またはこれらの組合せから選択される増殖因子を補充され得る。培養培地はさらに、神経生存因子（ＮＳＦ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、ＣＡ）を補充され得る。ＣＤ４９ｆ＋細胞がニューロン、星状細胞および希突起膠細胞に分化する条件は、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２またはＬＩＦを含まないウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する培養培地のラミニン被覆表面で、ＣＤ４９ｆ＋細胞子孫を培養する工程を包含し得る。
【００７５】
本発明はまた、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響する増殖因子の存在を同定するための方法を提供する。当業者は、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響する少なくとも１つの増殖因子を含有すると考えられる組成物を、ＮＳ−ＩＣを含有する組成物と合わせ得、次いで、ＮＳ−ＩＣの増殖を、この組成物の存在の関数として決定し得る。変化した（増加した、減少したなど）ＮＳ−ＩＣの増殖は、ＮＳ−ＩＣの増殖に影響する増殖因子の組成物中での存在を示す。増殖因子の同定は、当該分野で公知の技術を使用して決定され得る。
【００７６】
（ＣＤ１３３に対する抗体）
ＣＤ１３３に対する抗体は、米国特許第５，８４３，６３３号（本明細書中に、参考として援用される）に議論されるように、得られ得、調製され得る。ＣＤ１３３抗原を、抗体（例えば、種々の抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体（例えば、ＡＣ１３３））と接触させ得、この抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体は、ＣＤ１３３抗原に対して、特異性を有する。「抗ＣＤ１３３抗体」は、ＦＡＣＳおよび免疫沈降実験において、ＣＤ１３３タンパク質への結合によってネイティブで、ならびにウエスタンブロット実験において変性して、構造を特徴付けられる。ＣＤ１３３抗原は、米国特許第５，８４３，６３３号によると、１２５ｋＤａ〜１２７ｋＤａの範囲の分子量を有すると報告されており、米国公開特許出願第２００１００５１３７２号によると、１１５ｋＤａ〜１２７ｋＤａの範囲の分子量を有すると報告されている。ＣＤ１３３抗原は、ヒト骨髄、胎児の骨髄および肝臓、臍帯血ならびに成体の末梢血に由来する前駆体細胞の部分集合で発現される。
【００７７】
（ＣＤ４９ｆに対する抗体）
ＣＤ４９ｆに対する抗体は、市販されているかまたは、当業者に公知の方法に従って調製され得る。ＣＤ４９ｆ抗原を、抗体（例えば、種々の抗ＣＤ４９ｆモノクローナル抗体）と接触させ得、この抗体は、ＣＤ４９ｆ抗原に対して特異性を有する。抗ＣＤ４９ｆ抗体は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに由来するウエスタンブロット条件下で、ＣＤ４９ｆ抗原に結合することによって、特徴付けられる。本明細書で使用される場合、用語「抗ＣＤ４９ｆ抗体」とは、ＣＤ４９ｆ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をいう。抗ＣＤ４９ｆ抗体の例としては、ＧｏＨ３および４Ｆ１０が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ４９ｆ抗原は、市販の基準に基づくと、約１４０ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＣＤ４９ｆ抗原は、胸腺細胞、Ｔリンパ球および単球で発現される。活性化されたＴ細胞および記憶Ｔ細胞で、発現の増加が見出される。Ａスプライシング改変体のみが、肺、肝臓、脾臓および子宮頸部で発現される。Ｂスプライシング改変体のみが、脳、卵巣および腎臓で発現される。両方の型とも他の組織でも検出される。
【００７８】
（ＣＤ１５に対する抗体）
ヒトＣＤ１５に対する抗体は、市販されているかまたは、当業者に公知の方法に従って調製され得る。ＣＤ１５抗原を、抗体（例えば、種々の抗ＣＤ１５モノクローナル抗体）と接触させ得、この抗体は、ＣＤ１５抗原に対して特異性を有する。抗ＣＤ１５抗体は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに由来するウエスタンブロット条件下で、ＣＤ１５抗原に結合することによって、特徴付けられる。本明細書で使用される場合、用語「抗ＣＤ１５抗体」とは、ＣＤ１５抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をいう。抗ＣＤ１５抗体の例としては、ＭＭＡが挙げられるが、これに限定されない。ＣＤ１５抗原は、市販の基準に基づくと、約２２０ｋＤａの範囲の分子量を有する。ＣＤ１５抗原は、成熟ヒト好中球、単球および好酸球で発現される。ＣＤ１５抗原はまた、胚組織および腺癌、骨髄性白血病およびリード−シュテルンベルク細胞で存在が見出される。
【００７９】
（抗体の調製）
ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４９ｆ抗原および／またはＣＤ１５抗原に対する抗体は、異種間の免疫応答性哺乳動物宿主（マウス、げっ歯類、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む）を、ヒト前駆体細胞で免疫化することにより、得られ得る。特定の宿主の選択は、主に、便利なものの１つである。免疫化に適切な前駆体細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を、サイトカインが集結する末梢血、骨髄、胎児肝臓などから単離することによって得られ得る。さらに、免疫化に適切な前駆体細胞集団は、ＣＮＳ神経幹細胞または他のＮＳ−ＩＣから得られ得る。免疫化は、従来的な技術に従って実施され、ここで、細胞は、皮下、筋肉内、腹腔内、血管内などに注射され得る。通常は、約１０６〜１０８個の細胞が使用され、それらの細胞は、約１週間〜約３週間の期間にわたって１回以上（通常は、約８回以下）の注射に分けられる。この注射は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、スぺコール（ｓｐｅｃｏｌ）、ミョウバンなど）を用いてもよく、またはアジュバントなしであってもよい。
【００８０】
免疫化計画の完了後、抗血清は、前駆体細胞の表面膜タンパク質に特異的な多角形の抗血清（ＣＤ１３３抗原、ＣＤ４９ｆ抗原および／またはＣＤ１５抗原が挙げられる）を提供するための従来的な方法に従って回収され得る。リンパ球は、適切なリンパ組織（例えば、脾臓、排出リンパ節など）から回収され、適切な融合パートナー（通常は、特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生する骨髄腫株）と融合される。目的の抗原特異性に対するハイブリドーマのクローンのスクリーニングは、従来的な方法に従って実施される。
【００８１】
抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体は、通常の多量体構造ではなく、一本鎖として産生され得る。一本鎖抗体は、例えば、Ｊｏｓｔら、２６９、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６２６７〜７３（１９９４）に記載され、これは本明細書に参考として援用される。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、小さな中性アミノ酸（グリシンまたはセリンを含む）の少なくとも約４個のアミノ酸をコードするスペーサーにライゲーションされる。この融合物にコードされるタンパク質は、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能性可変領域の集合を可能にする。抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体はまた、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用により産生され得る（Ｌｉｕら、８４  ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．３４３９（１９８７）および１３９  Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．３５２１（１９８７）、これらは、本明細書中に参考として援用される）。ｍＲＮＡは、ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞から単離され、ｃＤＮＡを産生するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって増幅され得る（米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号）。
【００８２】
あるいは、ライブラリーは、目的の配列を単離するために作製され、スクリーニングされる。次いで、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列は、ヒト定常領域配列に融合される。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」  Ｎ．Ｉ．Ｈ．ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に利用可能である。次いで、ヒト化キメラ抗体が、従来的な方法によって発現される。
【００８３】
抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体はまた、抗体フラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂとして）として産生され得る。抗体フラグメントは、インタクトのタンパク質の切断（例えば、プロテアーゼ切断または化学的切断）によって調製され得る。あるいは、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）遺伝子が設計され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメインおよびＨ鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含み、短縮分子を産生する翻訳終止コドンが続く。
【００８４】
（免疫染色）
生物学的サンプルは、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ４９ｆ＋細胞および／またはＣｄ１５＋細胞またはＣＤ１５−／ｌｏ細胞の存在について、対象の抗体が結合した表面分子を発現する細胞の存在についての任意の従来的な免疫アッセイ方法によってアッセイされる。アッセイは、細胞溶解物、インタクトの細胞、凍結切片などで実施され得る。任意の市販の抗体が、細胞の直接的な免疫蛍光染色に適している。
【００８５】
（細胞選別）
ＮＳ−ＩＣ細胞で見出される細胞表面抗原の使用は、前駆体細胞集団の陽性免疫選択に関する手段ならびにフローサイトメトリーを使用する前駆体細胞集団の表現型分析のための手段を提供する。ＣＤ４９ｆ抗原および／またはＣＤ１５抗原の発現のために選択された細胞は、他の幹細胞および前駆体細胞マーカー（ＣＤ１３３を含む）の選択によって、さらに精製され得る。
【００８６】
実質的に純粋な前駆体細胞および幹細胞の調製のために、前駆体細胞の部分集合は、ＣＤ４９ｆおよび／またはＣＤ１５結合に基づいて、他の細胞から分離される。前駆体および幹細胞は、当該分野で公知の他の表面マーカー（ＣＤ１３３を含む）に結合することによってさらに分離され得る。ＣＤ１３３＋細胞の選択は、ＣＤ４９ｆ＋細胞および／またはＣＤ１５＋細胞もしくはＣＤ１５−／ｌｏ細胞の選択の前、その間、または、その後に完了され得る。同様に、ＣＤ１５＋細胞またはＣＤ１５−／ｌｏ細胞の選択は、ＣＤ４９ｆ＋細胞および／またはＣＤ１３３＋細胞の選択の前、その間、またはその後に完了され得る。分離のための手順としては、抗体被覆磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィーおよび固体マトリックスに結合した抗体との「パニング」（例えば、プレート技術または他の従来的な技術）が挙げられ得る。正確な分離を提供する技術としては、異なる程度の精巧さを有し得る蛍光活性化細胞選別機（例えば、多色チャネル、ローアングルかつ鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど）が挙げられる。死細胞は、死細胞と結合する色素（ヨウ化プロピジウム［ＰＩ］、ＬＤＳ）を用いる選択により除去され得る。
選択された細胞の生存度に対して過度に有害ではない、当業者に公知の任意の技術が使用され得る。
【００８７】
好都合なことに、抗体は、特定の細胞型の分離を容易にする標識（例えば、磁気ビーズ、高い親和性でアビジンまたはストレプトアビジンと結合するビオチン、蛍光活性化細胞選別機とともに使用され得る蛍光色素、ハプテンなど）と結合される。多色分析は、ＦＡＣＳで、または免疫磁気分離およびフローサイトメトリーと組み合わせて使用され得る。多色分析は、複合的な表面抗原（例えば、ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ４９ｆ−ＣＤ２４＋、ＣＤｌ５＋ＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４＋、ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ２４＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ１３３−ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ、ＣＤ１３３−ＣＤ４９ｆ−ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏなど）に基づいた細胞の分離について目的の分析である。
【００８８】
多色分析での使用を見出す蛍光色素としては、フィコビリンタンパク質（例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン）、フルオレセインおよびテキサスレッドが挙げられる。ネガティブの表示は、染色のレベルがネガティブコントロールと同等のアイソタイプの明度以下であることを示す。暗いすなわち低い表示は、染色のレベルがほぼネガティブ染色のレベルであり得ることを示すが、またコントロールと同等のアイソタイプより明るくもあり得る。
【００８９】
１つの実施形態において、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体は、直接または間接的に、磁気試薬（例えば、超常磁気微粒子（微粒子））に結合する。微粒子に対する直接の結合は、当該分野で公知の種々の化学結合基の使用によって達成され得る。抗体は、側鎖アミノ基またはスルフヒドリル基およびヘテロ機能性架橋試薬を介して微粒子に結合され得る。多数のヘテロ機能性化合物が、全体への結合に関して利用可能である。好ましい架橋基は、抗体上の反応性スルフヒドリル基および磁気粒子上の反応性アミノ基を有する３−（２−ピリジルジチオ（２−ｐｙｒｉｄｙｉｄｉｔｈｉｏ））プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）である。
【００９０】
あるいは、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体は、間接的に磁気粒子に結合され得る。この抗体は、ハプテンに直接に結合され、そして、ハプテン特異的二次抗体は、その粒子に結合される。適切なハプテンとしては、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどが挙げられる。ハプテンのタンパク質への結合のための方法は、当該分野で公知であり、このような結合のためのキットが市販されている。
【００９１】
本発明の方法を実施するために、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体が細胞サンプルに添加される。特定の細胞の部分集合を結合するために必要な抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体の量は、試験分離および分析を実施することによって、実験的に決定される。細胞ならびに抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体は、複合体を形成するのに十分な時間、通常は、少なくとも約５分間、より通常には少なくとも約１０分間、そして、通常は、１時間を超えず、より通常には、３０分間を超えない時間、インキュベートされる。
【００９２】
細胞はさらに、抗体または、前駆体もしくは幹細胞に存在するかまたは存在しないものとして知られる細胞表面マーカーに特異的である結合分子とともにインキュベートされ得る。例えば、細胞は、さらに富化されたＮＳ−ＩＣの集団を産生するために、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１５抗体とともにインキュベートする前かその間かもしくはその後に、抗ＣＤ１３３抗体とともにインキュベートされ得る。細胞は、さらに富化されたＮＳ−ＩＣの集団を産生するために、抗ＣＤ４９ｆ抗体および／または抗ＣＤ１３３抗体とともにインキュベートする前かその間かもしくはその後に、抗ＣＤ１５抗体とともにインキュベートされ得る。標識された細胞は、特定の抗体調製に従って分離される。蛍光色素標識抗体は、ＦＡＣＳ分離に有用であり、磁気粒子は、免疫磁気選択（特に高勾配磁気選択（ＨＧＭＳ））などに有用である。例示的な磁気選択デバイスは、ＷＯ９０／０７３８０、ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３およびＥＰ４３８，５２０中に記載され、これらは、それぞれ本明細書中に参考として援用される。ＡＣ１３３細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ａｕｂｕｒｎ  ＣＡ）は、ＡＣ１３３＋細胞のポジティブな選択のために使用され得る。このキットは、ＡＣ１３３＋細胞（すなわち、ＣＤ１３３抗原を有する細胞）の１工程の単離のためのツールを提供する。ＡＣ１３３細胞単離キットは、ＦｃＲブロック試薬およびモノクローナルマウス抗ヒトＡＣ１３３抗体に結合するＭＡＣＳコロイドマイクロビーズを備える。
【００９３】
精製された細胞集団は、任意の適切な培地で回収され得る。種々の市販の培地が使用され得、それらとしては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、Ｈａｎｋの塩基性塩溶液（ＨＢＳＳ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられ、多くの場合、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などが補充される。
【００９４】
ヒト前駆体または幹細胞が高度に富化された集団は、この様式で達成される。所望の細胞は、３０％以上の細胞組成物、好ましくは、５０％以上の細胞集団、より好ましくは、９０％以上の細胞集団、および最も好ましくは９５％以上（すなわち、実質的に純粋である）の細胞集団である。
【００９５】
（精製された幹細胞／前駆体細胞の使用）
ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ４９ｆ＋、および／または、ＣＤ１５＋ＣＤ４９ｆ＋幹細胞／前駆体細胞は、種々の方法で有用である。ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ４９ｆ＋、および／または、ＣＤ１５＋ＣＤ４９ｆ＋細胞は、その細胞が、疾患または傷害を介して失われた宿主を再構成するために使用され得る。細胞と関連した遺伝的疾患は、遺伝的欠損を補正するために、または疾患に対して防御するように処置するために、自己または同種の幹細胞の遺伝的改変によって処置され得る。あるいは、正常な同種の前駆体細胞が、移植され得る。細胞と関連する疾患以外の疾患もまた、処置され得、ここで、この疾患は、特定の分泌された産物（例えば、ホルモン、酵素、増殖因子など）の欠如と関連する。ＣＮＳ障害は、多数の苦痛（例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病））、急性脳損傷（例えば、発作、頭部損傷、脳性麻痺）および多数のＣＮＳ機能障害（例えば、うつ病、てんかんおよび統合失調症）を含む。近年、神経変性疾患は、高齢の集団（これらの疾患の危険性が最も大きい）が増加しているために、重要な懸念事項になってきた。アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症およびパーキンソン病を含む、これらの疾患は、ＣＮＳの特定の位置における神経細胞の変性と結びついていて、これらは、これらの細胞または脳の領域が意図された機能を成し遂げるのを不可能にする。特定の種々の増殖因子を介して、１つ以上の選択された系統への、成熟化、増殖および分化を提供することによって、前駆体細胞は、用いる細胞の源として使用され得る。神経球はまた、種々の血液細胞型（骨髄およびリンパ球、ならびに初期造血細胞を含む）を産生するために、使用され得る（Ｂｊｏｒｎｓｏｎら、２８３  ＳＣＩＥＮＣＥ  ５３４（１９９９）を参照のこと。これは、本明細書に参考として援用される）。
【００９６】
ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ４９ｆ＋および／またはＣＤ１５＋ＣＤ４９ｆ＋細胞はまた、細胞の分化および成熟に関連した因子の単離および評価に使用され得る。従って、この細胞は、増殖因子活性、系統の専門化（ｄｅｄｉｃａｔｉｏｎ）との関係などについて、液体を評価するため、培地（例えば、調整培地）の活性を決定するアッセイに使用され得る。
【００９７】
ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５＋、ＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ１５−／ｌｏ、ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ４９ｆ＋、および／またはＣＤ１５＋ＣＤ４９ｆ＋細胞は、液体窒素温度で凍結され得、長期間保存され得、解凍され再使用され得る。細胞は、通常５％ＤＭＳＯおよび９５％ウシ胎仔血清中で保存される。一旦解凍されると、細胞は、幹細胞の増殖および分化と関連した増殖因子または間質細胞の使用によって増殖され得る。
【００９８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に説明するために、示される。これらの実施例は、付属の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定すると考えられるべきでは決してない。
【実施例】
【００９９】
（実施例１）
（種々のマーカーによるＮＳ−ＩＣの単離）
ＣＤ２４抗原（例えば、ＳＣ２０（８Ｇ１）モノクローナル抗体により識別される）をまた、神経幹細胞の下位選択物（ｓｕｂｓｅｌｅｃｔｏｒ）として評価した。新鮮な胎児脳の単離物中で、ＣＤ２４−／ｌｏ（８Ｇ１−／ｌｏ）である細胞は、より幹細胞様の特性を示し、それに対して、ＣＤ２４ｍｅｄ／ｈｉ（８Ｇ１ｍｅｄ／ｈｉ）である細胞は、より前駆体細胞様の特性を示す（図３）。
【０１００】
培養後、ＣＤ２４発現は、細胞周期状態、最後の継代後の日数、および培地条件に依存してアップレギュレートされ得る。従って、ＣＤ２４−ｌ／ｏ胎児脳細胞由来の長期の神経球細胞は、ＣＤ２４発現について不均一になる。
【０１０１】
（実施例２）
（神経球惹起細胞は、ＣＤ４９ｆ発現に基づいて分離され得る：フローサイトメトリー細胞分別（ＦＡＣＳ）アプローチ）
この実施例の目的は、ＣＤ４９ｆ＋細胞が多能性ＮＳＣ活性を有する脳における細胞のみであるかどうかを試験することである。神経幹細胞の活性および初期前駆体活性を測定するために、所定の集団におけるＮＳ−ＩＣの頻度を決定するためのＮＳ−ＩＣアッセイを確立する。ＮＳ−ＩＣが稀で、かつＣＤ４９ｆ抗原を発現する場合、ＮＳ−ＩＣは、ＣＤ４９ｆ＋選択によって富化され得、それに対応して他の画分は枯渇する。
【０１０２】
（モノクローナル抗体の取得源）
ＣＤ４９ｆ抗原は、少なくとも以下のモノクローナル抗体によって識別される：ＧｏＨ３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）；およびＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄ（ｗｗｗ．ｉｎｃｂｉｏｍｅｄ．ｃｏｍ））ならびに４Ｆ１０（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ））。
【０１０３】
ヒト胎児脳（ＦＢＲ  １０〜２０妊娠週［「ｇ．ｗ」］）を、インフォームドコンセント後に得る。ヒト胎児脳組織を、外科用メスを使用して１〜３ｍｍの立方体断片に切断し、５０ｍＬの遠心管に移し、０．０２％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で一度で洗浄する。組織片を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの存在下で、３７℃で１時間、酵素的に解離する。
【０１０４】
２日目、解離した組織片を、一度０．０２％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄し、トリプシンの存在下で、３７℃で１５分間、酵素的に解離させる。組織片および凝集体を、細胞懸濁液を７０ミクロンのフィルターカップを通してろ過することにより取り除く。代表的には、１〜１０×１０８個の細胞を１６〜２０妊娠週の各ＦＢｒ組織から得た。細胞を０．１％ヒト血清アルブミンおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁した。
【０１０５】
ＦＢｒ由来のＣＮＳ−ＳＣの染色および選別は、以下のように行なった。代表的には、解離したＦＢｒ細胞をインキュベートし、ＣＤ１３３、ＣＤ２４−ＦＩＴＣおよびＣＤ４９ｆ−ＰＥに対して、ｍＡｂで染色した。染色した細胞を洗浄し、０．１％ヒト血清アルブミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）および０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有するＨＢＳＳに再懸濁し、二重レーザーＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤＩＳ）で選別した。
【０１０６】
ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏＦＡＣＳ分離した細胞を代表的に、Ｘビボ１５またはＸビボ１５の組合せで培養し、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地を基本培地として使用する。神経球の発生を最大にするために、選別した細胞を代表的に、以下の実施例３に記載するように、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＥＧＦの存在下で培養する。ＣＤ４９Ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別細胞から樹立した神経球細胞は、ネスチンを発現する。従って、培養約７日間後に試験し、マウス抗ヒトネスチン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を検出し得る。例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能なＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別ＣＮＳ−ＳＣに由来する神経球細胞は、ネスチンを発現する。増殖後、増殖した神経球細胞を、記載したように、新生仔ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに移植した。それらは、発明者らが観察したＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏＣＮＳ−ＳＣに由来する神経球細胞に相当する強固な移植を示した。分化を誘導した場合、ＣＤ４９＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球細胞は、形態的には、ｂチューブリンＩＩＩを発現するニューロンに分化し得、ＧＦＡＰを発現する成熟星状細胞形態に分化し得る。この特定の分化アッセイでは、神経球細胞を、０．１％  ＦＢＳ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦまたはＥｐｏの存在下で、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２およびＬＩＦは含まないポリオルニチン被覆表面上で培養する。
【０１０７】
ＮＳ−ＩＣのニューロン、星状細胞および希突起膠細胞への分化を誘導するために、他の分化アッセイを使用し得る。
【０１０８】
定量ＮＳ−ＩＣアッセイを、未精製の組織細胞、ＣＤ４９ｆ＋選別細胞およびクローン神経球細胞株に、実施し得る。
【０１０９】
（実施例３）
（ＮＳ−ＩＣの増殖および継代のための細胞培養培地）
Ｗｅｉｓｓら、米国特許第５，７５０，３７６号およびＷｅｉｓｓら、米国特許第５，８５１，８３２号は、「多能性神経幹細胞増殖を誘導するために効果的な、１つ以上の所定の増殖因子を含有する培養培地」および「分化誘導条件」を開示する。しかし、種々の基本培地が使用され得、その基本培地としては、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）；Ｘビボ１５（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；神経前駆体基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）または上に挙げた基本培地の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
ヒト神経球細胞を培養するための代表的な培地組成を、表１に提供する。
【０１１１】
【表１】
2006511206.tif 000004
培地をろ過した後、ＥＧＦを、ヒト神経球のための１００ｍｌの基本培地に添加する。ＥＧＦは、培地中で比較的安定である。培地を使用のために準備する前に、ＦＧＦ−２およびＬＩＦを添加する。補充試薬の最終濃度は、以下の表２のとおりである：
【０１１２】
【表２】
2006511206.tif 000005
培地組成の最適化は、初期脳組織から惹起されるより高い割合の神経球の確立を可能にする。Ｘビボ１５培地が好ましい。培地組成の最適化はまた、神経球のより堅実な増殖を可能にする。
【０１１３】
（実施例４）
（ＣＤ４９ｆは、長期の神経球培養由来の細胞で発現する重要な細胞表面マーカーである）
長期の神経球細胞培養物は、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能である。大部分の細胞は、ＣＤ１３３（＞９０％）およびＣＤ４９ｆ（＞８０％）を発現する。Ｘビボ１５を基本培地として使用する場合、より高い割合の神経球培養物が、１８ｇ．ｗ．から惹起される。従って、神経球が発生するにつれて増加するＣＤ４９ｆ細胞を評価することが可能である。一旦、神経球細胞がよく確立すると、視覚的に神経球を形成する全ての細胞が、ＣＤ１３３およびＣＤ４９ｆを発現する（図５）。
【０１１４】
（実施例５）
（神経球惹起細胞（ＮＳ−ＩＣ）をＣＤ１５発現に基づいて、分離し得る：ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ胎児脳細胞およびＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ胎児脳細胞を単離するためのフローサイトメトリー細胞分別（ＦＡＣＳ）アプローチ）
この実施例の目的は、ＣＤ１５ｈｉ細胞が、脳内で、多能性ＮＳＣ活性を有する唯一の細胞であるかどうかを試験することである。神経幹細胞活性および初期前駆体活性を測定するために、所定の集団でのＮＳ−ＩＣの頻度を決定するためのＮＳ−ＩＣアッセイを確立する。ＮＳ−ＩＣが稀であり、ＣＤ１５抗原を発現する場合、ＮＳ−ＩＣは、ＣＤ１５＋選択によって富化され得、それに対応して他の画分では、枯渇され得る。
【０１１５】
（モノクローナル抗体の取得原）
ＣＤ１５抗原は、少なくとも以下のモノクローナル抗体によって識別される：ＭＭＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｗｗｗ．ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）（カタログ番号３４０７０３、３４０８５０、３４７４２０、３４７４２３、５５９０４５））。
【０１１６】
ヒト胎児脳（ＦＢＲ  １０〜２０妊娠週［「ｇ．ｗ」］）を、インフォームドコンセント後に得た。ヒト胎児脳組織を、外科用メスを使用して１〜３ｍｍの立方体断片に切断し、５０ｍＬの遠心管に移し、０．０２％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で一度で洗浄する。組織片を、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼの存在下で、３７℃で１時間、酵素的に解離し、４℃で一晩保存した。
【０１１７】
２日目、解離した組織片を、一度０．０２％  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄し、トリプシンの存在下で、３７℃で１５分間、酵素的に解離させた。組織片および凝集体を、細胞懸濁液を７０ミクロンのフィルターカップを通してろ過することにより取り除く。代表的には、１〜１０×１０８個の細胞を１６〜２０妊娠週の各ＦＢｒ組織から得た。細胞を０．１％ヒト血清アルブミンおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含有するＨＢＳＳ緩衝液に再懸濁した。
【０１１８】
ＦＢｒ由来のＣＮＳ−ＳＣの染色および選別は、以下のように行う。代表的には、解離したＦＢｒ細胞をインキュベートし、ＣＤ１３３、ＣＤ１５およびＣＤ２４に対して、ｍＡｂで染色する。染色した細胞を洗浄し、０．１％ヒト血清アルブミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）および０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有するＨＢＳＳに再懸濁し、二重レーザーＶａｎｔａｇｅ  ＳＥ（ＢＤＩＳ）で選別する。
【０１１９】
ＣＤ１３３＋ＣＤ１５ｈｉＣＤ２４−／ｌｏ細胞集団およびＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞集団の両方において、ＮＳ−ＩＣ活性を高く富化する（図７）。ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４ｈｉ細胞集団からは、ＮＳ−ＩＣ細胞は、視覚的には検出されなかった。
【０１２０】
ＣＤ１５ｈｉＣＤ２４−／ｌｏＦＡＣＳ分離した細胞を、Ｘビボ１５またはＸビボ１５の組合せで培養し、Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地を基本培地として使用する。神経球の発生を最大にするために、選別した細胞を代表的に、実施例３に記載するように、ＬＩＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦの存在下で培養する。ＣＤ１５ｈｉＣＤ２４−／ｌｏ選別細胞から樹立した神経球細胞は、ネスチンを発現する。従って、培養約７日間後に試験し、マウス抗ヒトネスチン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を検出し得る。例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能な神経球細胞は、ネスチンを発現する。分化を誘導した場合、ＣＤ１５ｈｉＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球細胞は、形態的には、ｂチューブリンＩＩＩを発現するニューロンに分化し得、ＧＦＡＰを発現する成熟星状細胞形態に分化し得る。この特定の分化アッセイでは、神経球細胞を、０〜１％  ＦＢＳ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦまたはＥｐｏの存在下で、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２およびＬＩＦは含まないポリオルニチン被覆表面上で培養する。
【０１２１】
ＮＳ−ＩＣのニューロン、星状細胞および希突起膠細胞への分化を誘導するために、他の分化アッセイを使用し得る。分化については、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞は、多能性である（図６）。
【０１２２】
（実施例６）
（ＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球細胞およびＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球細胞の新生仔ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへの移植）
ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスは、造血幹細胞を含む多数の種々のヒト細胞型の移植に対する卓越したモデル系を提供している。６〜１０継代した、増殖したＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ神経球細胞またはＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ神経球細胞を回収し、コラゲナーゼを用いて穏やかに解離する。新生仔マウス（Ｐ０−Ｐ１）を氷中に５〜１０分間配置することにより麻酔する。一旦、寒冷麻酔すると、その仔を定位デバイス上に配置し、１０５〜１０６細胞／注射の範囲の細胞を１〜２μｌ、側脳室内へ注射する。注射したマウスを、ヒト細胞の移植を試験する前に、１８〜２７週間飼育する。
【０１２３】
（インビボでのヒト細胞の追跡のためのヒト特異的モノクローナル抗体の産生）
ヒトＣＮＳ−ＳＣ神経球を、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄ新生仔マウスの側脳室に移植した。新生仔（Ｐ０−Ｐ１）マウスに、各側脳室に１０５細胞／部位で注射した。ヒト細胞移植物を移植の１〜１０ヶ月後に、免疫組織化学により評価した。
【０１２４】
神経細胞の特徴づけに使用されるタンパク質の配列の種間の保存（多くの場合、＞９０％の相同性）に起因して、神経細胞（例えば、βチューブリンＩＩＩ、ＧＦＡＰ、ＭＢＰ）に対するほとんどの市販のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、マウス、ラット、霊長類およびヒトにおける抗原を識別する。市販のｍＡｂの広範な試験は、異種レシピエントのヒト細胞を区別する抗原を全く同定しない。従って、ヒト特異的ｍＡｂのパネルを、ヒト細胞の移植および移行の評価に対して有益であるＳＣＩで産生した。マウスの脳およびラットの脳における広範な試験は、ヒト特異的ｍＡｂがマウスおよびラットの神経細胞と交差反応しないことを確認した。ＳＣ１２１の中の一つを、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄレシピエントにおけるヒト細胞移植のマーカーとして、慣用的に、再現可能に使用している。ウエスタンブロット解析は、ヒト細胞では見出されるが、マウス細胞では存在しない２５ｋＤＡのタンパク質を、ＳＣ１２１が識別することを示す。移植していないラットの脳を用いる免疫組織化学染色は、ラットの脳においてもまた、交差反応がないことを示す。ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ．は、特定の神経系統（例えば、ニューロン、星状細胞および希突起膠細胞）を区別するヒト特異的ｍＡＢを作製した（表３）。これらのヒト特異的試薬は、ヒト細胞の移植、移行および分化を評価するために有益であった。ヒト移植の評価法については、Ａｌｕ−１リピートに対するヒト特異的ＤＮＡプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーションを実施することが可能である。
【０１２５】
【表３】
2006511206.tif 000006
移植後６〜３６週間で、注射したマウスに、４％パラホルムアルデヒドを灌流する。マウスの脳を４０μｍの厚さで、矢状面で切片化する。移植したヒト細胞を検出するために、切片をｍＡｂ  ＳＣ１２１（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）とともにインキュベーションし、その後、予備研究で使用した方法を使用して、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧおよびＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＥＬＩＴＥ  ＡＢＣキットの成分とともにインキュベーションする。ＮｏｖａＲＥＤ基質（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して、抗体−免疫ペルオキシダーゼ複合体を検出する。
【０１２６】
インビボの移植物の移行およびｈＣＮＳ−ＳＣの分化適応力を評価するために、７〜１０継代したＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球培養物またはＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球培養物由来の１０５個の細胞を、新生仔ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの側脳室に注射し得る。ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖神経球細胞と同様に、それらは、確実に移植され、嗅球および海馬に移行し、ニューロンおよび神経膠に形態的に分化する（図７）。
【０１２７】
【化３】
2006511206.tif 000007
【０１２８】
【化４】
2006511206.tif 000008
【０１２９】
【化５】
2006511206.tif 000009
【０１３０】
【化６】
2006511206.tif 000010
【０１３１】
【化７】
2006511206.tif 000011
（他の実施形態）
本発明は、本発明の詳細な説明と組み合わせて記載されるが、先の記載が例示を意図するものであって、本発明の範囲を制限することを意図せず、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によって定義されることが理解される。他の局面、効果および改変は、添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、ＮＳ−ＩＣの増殖および分化を図示する図である。
【図２】図２は、神経球培養物が、一細胞選別されたＣＤ１３３＋細胞から惹起され得ることを示す一連の写真である。
【図３】図３は、細胞表面マーカーによる、ヒト神経幹細胞の単離を示すＦＡＣＳ選別データのドットプロットである。この図は、ＳＣ２０（８ＧＩ）抗体について、ＮＳ−ＩＣが、代表的に、ネガティブレベルから低レベルのＣＤ２４抗原を発現することを示す。ＮＳ−ＩＣは低レベルのＣＤ１３３抗原を発現したため、ＣＤ１３３検出のためのシグナルは、多工程染色法（ｍｕｌｔｉ−ｓｔｅｐ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）において増幅した。
【図４】図４は、ＣＤ４９ｆに対するモノクローナル抗体を、単独でまたはＣＤ２４を識別  する抗体と組み合わせて用いた細胞表面マーカーを用いた、ヒトＣＮＳ神経幹細胞の単離を示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データのドットプロットである。パネルＡにおいて、ｘ軸は、ＣＤ２４に対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１３３に対する抗体についての細胞染色を表す。パネルＢにおいて、ｘ軸は、ＣＤ４９ｆに対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１３３に対する抗体についての細胞染色を表す。パネルＣにおいて、ｘ軸は、ＣＤ４９ｆに対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ２４に対する抗体についての細胞染色を表す。パネルＤおよびパネルＥにおいて、ｘ軸は、ＣＤ２４に対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１３３に対する抗体についての細胞染色を表す。
【図５】図５は、ＣＤ１３３に対するモノクローナル抗体を、単独でまたはＣＤ４９ｆを識別  する抗体と組み合わせて用いた細胞表面マーカーを用いた、ヒトＣＮＳ幹細胞の単離を示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データの一連のドットプロットであり、これは、長期神経球細胞の大部分がＣＤ１３３＋ＣＤ４９ｆ＋であることを示し、ｘ軸は、ＣＤ４９ｆに対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１３３に対する抗体についての細胞染色を表す。
【図６】図６は、ヒト胎児脳細胞の表現型分析を示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）データの一連のドットプロットである。パネルＡにおいて、ｘ軸は、ＣＤ１３３に対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１５に対する抗体についての細胞染色を表す。パネルＢにおいて、ｘ軸は、ＣＤ２４に対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１５に対する抗体についての細胞染色を表す。細部の領域は、ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞の限界希釈（４．５分の１（２２．５％））を表す。パネルＣにおいて、ｘ軸は、ＣＤ２４に対する抗体についての細胞染色を表し、そしてｙ軸は、ＣＤ１３３に対する抗体についての細胞染色を表す。パネルＢおよびパネルＣにおいて示されるように、ＣＤ１３３＋ＣＤ２４−／ｌｏ細胞は、ＣＤ１５ｈｉＣＤ２４−／ｌｏ細胞およびＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ細胞からなる。
【図７】図７は、ＣＤ１５発現が、増殖可能なＣＮＳ幹細胞および前駆体の異なった部分集合を定義することを示す図である。パネルＡは、実験的設計の模式図である。パネルＢは、異なった部分集合におけるＮＳ−ＩＣ活性の割合を示す。神経球の８０．５６％、１１．８１％、および７．３５％が、それぞれ、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ部分集合、ＣＤ１３３＋ＣＤ１５−／ｌｏＣＤ２４−／ｌｏ部分集合、およびＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋ＣＤ２４＋部分集合に由来する。
【図８】図８は、嗅球においてＣＤ１３３＋ＣＤ１５＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖した神経球細胞（Ａ）および海馬においてＣＤ４９ｆ＋ＣＤ２４−／ｌｏ選別／増殖した神経球細胞（Ｂ）を移植されたＮＯＤ−Ｓｃｉｄ脳の免疫組織化学を示す。神経球細胞は、新生児のＮＯＤ−Ｓｃｉｄの側脳室内に移植され、移植片は移植６ヵ月後に回収した。
【図１】
2006511206.tif 000012
【図２】
2006511206.tif 000013
【図３】
2006511206.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006511206.tif 000018
【図８】
2006511206.tif 000019
【国際調査報告】
2006511206.tif 000020
2006511206.tif 000021