(57)【要約】開示するのは、ランチビオティックを含有する粗または部分精製した溶液からランチビオティックを精製する方法である。好適な態様ではランチビオティックはナイシンであるが、ランチビオティックの共通する構造的特徴が、ランチビオティック種の他の員について開示された精製法の効力を必然的に定める。この方法にはランチビオティックおよびタンパク質分解酵素を含有する溶液を含んでなるインキュベーション混合物を形成し、そして混合物を選択的なタンパク質分解活性について至適化された条件下でインキュベーションする工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランチビオティックを精製する方法であって：
ａ）精製するランチビオティックを含有する溶液を準備し；
ｂ）タンパク質分解酵素を準備し；そして
ｃ）ランチビオティックおよびタンパク質分解酵素を含有する溶液を含んでなるインキュベーション混合物を形成し、そして混合物を、非ランチビオティックタンパク質またはポリペプチド不純物の選択的分解に至適化されているが、ランチビオティックは実質的に未消化のままとする条件下でインキュベーションする、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
さらに消化後にタンパク質分解酵素を除去または不活性化する工程を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）の準備された溶液が発酵産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ランチビオティックが、ナイシン、サブチリン、エピダーミン、ガリダーミン、ムタシン、ペプ５、エピシジン、エピランシン、サイトリシン、ラクチシン、スタフィロコクシン、サルバリシン、ラクトシン、ストレプトコクシン、サブランシン、カルノシン、バリアシン、サイペマイシン、コンナマイシン、ジュラマイシン、アンコベニン、メルサシジンおよびアクタグルジンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ランチビオティックがナイシンである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質分解解酵素がトリプシンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
選択的分解に至適化された条件が５．５から６．２５の間のｐＨを含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質分解酵素がトリプシン、エンドペプチダーゼＡｒｇ−Ｃ、サーモリシン、Ｖ８プロテアーゼ、サブチリシン、プロティナーゼＫ、クロストリパイン、リシルエンドペプチダーゼ、パパイン、エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子およびキモトリプシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
選択的活性に至適化された条件が５．５から６．２５の間のｐＨを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解酵素がペプシンである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
選択的活性に至適化された条件が約４．５より高いｐＨを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質分解酵素が固体支持体に結合されている、請求項１に記載の方法。  
【請求項１３】
タンパク質分解酵素の有効量が約４００／１（重量／重量）のランチビオティック／タンパク質分解酵素である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ランチビオティックを含有する粗または部分精製された溶液からランチビオティックを精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトの疾患を処置するために使用されている通常の抗生物質に対するバクテリアの耐性は、国際的に重大な局面のレベルに高まった。この要因は生命を脅かすほどではない感染を処置するために広まった抗生物質の使用であった。最近では、ランチビオティック（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）として知られている有望な新たなクラスのバクテリオシンに一層注目が集まったてきた。現在、ランチビオティックは食品工業で広範囲に使用されている。ランチビオティックは重要な工業的価値および広い応用性を有し、そして現実的なそれらの生産法には重大な経済的影響がある。
【０００３】
バクテリオシンはバクテリアにより生産される、関連するバクテリア域に対して成長阻害活性を表す抗微生物タンパク質である。ランチビオティックは特定の細菌により生産され、そしてそれらのポリペプチド的性質および生物活性的特性から他の抗生物質と識別可能なポリペプチド抗微生物剤である。例えば特定の食品の保存剤として使用されるナイシン（ｎｉｓｉｎ）は、通常ではないアミノ酸残基であるランチオニンおよびβ−メチル−ランチオニンを有する。リシンが豊富なランチビオティックであるナイシンは、ヒトおよび動物に非毒性であり、高温に対して耐性であり、そして大変低濃度で静菌性である。ランチビオティックは汎用的であり、そして独自でしかも有利な特性を有するが、不幸にも高純度で単離するための工業的に現実的な方法が無いことがそれらの用途を制限している。
【０００４】
乳業でナイシンを使用するための機会の分析は、経済的な精製法が欠如している影響の実例を示す。最近、乳業へのナイシンの潜在的価値が、特にウシの乳房炎の感染との戦いに役立つナイシンの能力と関連して認識された。ナイシンにより提供される利点は、大部分が「抑制期間（ｗｉｔｈｈｏｌｄ  ｐｅｒｉｏｄ）」則を下げるか、または排除するナイシンの潜在能力から生じる。抑制期間はウシの乳房炎感染の処置の際、いつまで感染したウシからの乳が廃棄されなければならないかの確立された時期である。すなわち乳房炎感染のためにナイシンにより処置されたウシからの乳は、従来の抗生物質処置よりも一層早く流動乳流（ｆｌｕｉｄ  ｍｉｌｋ  ｓｔｒｅａｍ）に入ることができる。
【０００５】
不幸なことには、現在利用できる生産および精製法により工業的に生産されているナイシンは食品級の品質であり、そして製薬学的応用に十分な純度ではないと考えられる。これはウシに投与した時に炎症反応を引き起こすペプチド不純物を含有する。したがってそのような不純物を選択的に除去することができる効率的な代替的精製法の欠如により、ナイシンでの乳房炎の処置によりもたらされる価値が、現行のプラクティスを埋め合わせるには不十分である。したがってランチビオティックの純度を向上させ、そして工業的規模で使用するために現実的な方法が必要である。
【０００６】
工業的に現実的となるためには、精製スキームが比較的高収量であり、そして低コストでなければならない。ランチビオティック生産に関しては、比較的簡単、廉価であり、そして所望のバクテリオシンを自然に発現するか、または発現するように操作された生物を培養することは日常的である。しかし必ず、ランチビオティックは、生物により同時に発現され、そして初期調製物中に混入する不純物を表す多数のタンパク質から分離されなければならない。ランチビオティックはポリペプチドであり、したがって他のタンパク質と生化学的特徴を共有するので、ランチビオティックと他のタンパク質またはポリペプチド不純物との間を識別することができる現実的プロトコールを設計することは困難であった。
【０００７】
幾つかの例外を除き、プロテアーゼまたはプロテアーゼ様活性を有する酵素の使用は、精製されるタンパク質が多くがそのような処理に対して感受性であるという事実から、タンパク質精製プロトコールでは回避されている。例えばトリプシンは、トリプシンが内部リシンまたはアルギニン残基を認識し、そしてそのような残基を含有するタンパク質またはポリペプチドをそれらの位置で分解するので、そのような残基を含有するペプチドの精製法に使用することができない。さらにプロテアーゼに基づく精製スキームを使用したタンパク質の純度および回収には、逆の関係もあり得る。これは目的のタンパク質の上昇した回収を好む条件下では、不純物が十分に消化されないままの残る傾向にあることを意味する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、ランチビオティックを含有する粗または部分精製された溶液からランチビオティックを精製する方法に関する。好適な態様ではランチビオティックはナイシンであるが、ランチビオティックの共通する構造的特徴により、ランチビオティック種の他の員についても開示する精製法の効力を適用する。この方法には、ランチビオティックおよびタンパク質分解酵素を含有する溶液を含んでなるインキュベーション混合物を形成し、そして酵素の選択的なタンパク質分解活性について至適化された条件下で混合物をインキュベーションし、これによりランチビオティックを含有する溶液の非ランチビオティックタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド成分を消化するが、ランチビオティックは実質的に未消化のままとする工程を含む。
発明の詳細な説明
ランチビオティックは、リボゾームで合成され、翻訳後に修飾された通常ではないアミノ酸を含有するペプチドの一群である。そのようなアミノ酸には、２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）および２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）のような多数の修飾残基に加えて、チオエーテルアミノ酸であるランチオニン（Ｌａｎ）および／またはＭｅＬａｎを含む。これらの残基の存在およびランチビオティックの構造および活性に及ぼす影響は、重要な研究努力題の主題であった。
【０００９】
例えばセリン（Ｄｈａへの）およびトレオニン（Ｄｈｂへの）の配列特異的脱水は、隣接する求核基と反応することができる求電子中心を持つ修飾アミノ酸をもたらすことが観察された。チオエーテルランチオニンは、Ｄｈａ中の二重結合が隣接するシステイン残基のチオール（−ＳＨ）基により攻撃される時に形成される。これらの分子内架橋の存在の結果として、ランチビオティックは多数のランチオニン環を含有する多環構造である。これらランチオニン環の存在は、例えばペプチドの剛性および熱不活性化に対する耐性の維持を含め、多数の重要なランチビオティック特性に必須であると考えられている。
【００１０】
本発明は、ランチビオティックの粗または部分精製調製物を、ランチビオティックの重要なタンパク質分解無しに、タンパク質またはポリペプチド不純物に対して選択的なタンパク質分解活性を生じる条件下でプロテアーゼ処理に供することができるという出願人の驚くべき知見に基づく。そのような条件の使用は、ランチビオティックの精製に効果的な方法を表す。
【００１１】
プロテアーゼ消化に対すランチビオティックの感度に関する従来技術の教示を合わせる。これらの報告の多くが、十分に研究されたランチビオティックであるナイシンに具体的に関連している。例えばＧｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９３（１８）（１９７１）４６３４−４６３５）は、ナイシンがトリプシン感受性であると報告した。Ｗｉｌｉｍｏｗｓｋａ−Ｐｅｌｃにより矛盾した報告が後に公開された（Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｏｌ  Ａ８（１）（１９７６）７１−７７）。さらに最近では、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９０（２００１）２６７−２８１）は、ナイシンがトリプシン消化に供されることを報告したが、減少した比率であった。まとめると従来技術の関連する教示に精通している当業者は、粗または部分精製されたランチビオティックを含有する溶液中に存在する非ランチビオティックタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド不純物を、溶液中に存在するランチビオティックを実質的に分解せずにタンパク質分解酵素の作用により選択的に分解することができる条件を同定することが可能となる確実性の程度を予測できなかった。この知見は、製薬学的使用に適するランチビオティック調製物を生じる改善された経済的で高純度なランチビオティックの精製法が長い間必要であったことを考慮すれば極めて重要である。
【００１２】
本発明に関連して効果的であると決定されたプロテアーゼ消化の条件は、選択的と特徴付けることができる。すなわち不純物を含むランチビオティックおよびタンパク質分解酵素を含むインキュベーションに確立された条件は、タンパク質分解酵素が非ランチビオティック不純物を分解するために選択的に作用する条件である。これらの選択的条件をモジュレートするために変動させることができるパラメーターには、改変されたｐＨ範囲、ランチビオティックに対して減少したプロテアーゼ比、低下した温度等を含む。タンパク質分解酵素の選択的操作を至適化するために改変することができるこのパラメーターのこの列挙は、当業者が所望の目的を行うために改変することができる他のパラメーターを認識しているので、包括的であることを意図していない。
【００１３】
当業者は特定のタンパク質分解酵素について最適条件を容易に決定することができる。工業的に生産されるならば、製造者は典型的には酵素を輸送する包装材料中のそのような情報を提供する。あるいはそのような条件を経験的に決定することは、日常的な実験の事柄である。
【００１４】
しかし最適条件は、必ずしも選択的条件ではない。所定のタンパク質分解酵素について最適なインキュベーション条件下で、ランチビオティックならびにタンパク質またはポリペプチド不純物の両方が分解されるかもしれない。一般に、選択的条件は経験的に決定される。そのような決定の出発点は、製造元の推薦する最適条件である。これらの条件下で、ランチビオティックおよび不純物の両方が分解される場合、条件を「脱調整（ｄｅ−ｔｕｎｅｄ）」して選択的条件に到達することができる。例えば以下で検討するように、酵素トリプシンについて報告された最適ｐＨは約８．０になると報告された。しかし明細書に記載する最適な選択条件には、他は同一のインキュベーション条件下で、約５．５０〜約６．２５の範囲内のｐＨを含む。
【００１５】
以下の実施例の章では、徹底的に研究されたランチビオティックであるナイシンを使用した。しかし上に示したように、代表的なランチビオティック種は多くの構造的特徴を共有し、その中の幾つかはタンパク質分解に対するそれらの相対的耐性に寄与することが同定された。例えばランチオニン環が、これに関して具体的に引用された。すなわち実施例の章は主にランチビオティックのナイシンに焦点をあてているが、本明細書に確立した原理は、ランチビオティックを定める構造的特徴の存在により、すべてのランチビオティックに適用されると期待される。他のランチビオティックには例えば、サブチリン（ｓｕｂｔｉｌｉｎ）、エピダーミン（ｅｐｉｄｅｒｍｉｎ）、ガリダーミン（ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ）、ムタシン（ｍｕｔａｃｉｎ）、ペプ（ｐｅｐ）５、エピシジン（ｅｐｉｃｉｄｉｎ）、エピランシン（ｅｐｉｌａｎｃｉｎ）、ラクチシン（ｌａｃｔｉｃｉｎ）サイトリシン（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ）、スタフィロコクシン（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉｎ）、サルバリシン（ｓａｌｖａｒｉｃｉｎ）、ラクトシン（ｌａｃｔｏｃｉｎ）、ストレプトコクシン（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉｎ）、サブランシン（ｓｕｂｌａｎｃｉｎ）、カルノシン（ｃａｒｎｏｃｉｎ）、バリアシン（ｖａｒｉａｃｉｎ）、サイペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）、コンナマイシン（ｃｏｎｎａｍｙｃｉｎ）、ジュラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉｎ）、アンコベニン（ａｎｃｏｖｅｎｉｎ）、メルサシジン（ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ）およびアクタグルジン（ａｃｔａｇｕｒｄｉｎｅ）を含む。
【００１６】
本発明の方法は粗または部分精製した発酵ブロス中に存在するランチビオティックのタンパク質分解的精製に特に良く適している。例えばナイシンの発酵では、ＧＣ／ＭＳ／ＭＳによるペプチド分析により、ナイシンと同時に精製される４０種以上のペプチドが同定された。以下に続く実施例の章では、同時に精製される不純物の分解におけるトリプシンの効力を明らかに証明する。
【００１７】
トリプシンのタンパク質分解活性に関して、最適ｐＨは８．０になると報告された。他は同一インキュベーション条件下で、明細書に記載する至適化された選択的条件には約５．５０から約６．２５の範囲内のｐＨを含む。同様な条件が例えば、エンドペプチダーゼＡｒｇ−Ｃ、サーモリシン、Ｖ８プロテアーゼ、サブチリシン、プロティナーゼＫ、ペプシン、パパイン、クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）、リシルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼＡｓｐ−Ｎ、エンテロキナーゼまたは第Ｘａ因子を含む他のプロテアーゼに関する選択範囲内にある。好ましくはこれらの他のプロテアーゼによるナイシン不純物の選択的消化のための条件は、約５．５０〜６．２５の範囲内のｐＨを含んでなる。好適な態様では、ｐＨは５．８０である。ペプシンに関しては、ｐＨ３．５が選択的限界内である。
【００１８】
非ランチビオティック不純物の選択的消化により定められるような選択的なプロテアーゼ消化条件は、種々の方法で達成することができる。これには例えばランチビオティックに対して低いプロテアーゼ比、低下した温度、改変したｐＨ等を含むことができる。種々の関連パラメーターを独立して、または組み合わせて改変することができる。
【００１９】
タンパク質分解的消化を完了した後、プロテアーゼを除去することが望ましいかもしれない。消化後のプロテアーゼの除去を助けるための特に都合が良い方法は、固体支持体（例えばアガロースまたは磁気ビーズ）に結合したプロテアーゼを提供することである。この様式では、固体支持体は消化後にインキュベーション混合物から容易に分離される。あるいは単純なふるいカラム工程を採用して、プロテアーゼの除去を行ってもよい。タンパク質分解的消化後のプロテアーゼを除去するための他の技術は当該技術分野で知られており、それらには親和性、イオン交換および疎水性に基づくもののようなクロマトグラフィー技法を含む。
【００２０】
不純物を消化した後にプロテアーゼを除去することが望ましいかもしれないが、すべての応用で必ずしもそのようにする必要はない点に留意すべきである。例えば精製したランチビオティックが食品で消費されることを意図する場合、プロテアーゼは関連する規制を満たすために除去される必要はないかもしれない。例えばトリプシンは特定の食料に応用するために一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）状態と認可された。
【実施例１】
【００２１】
ナイシンは中性からわずかにアルカリ性のｐＨおよびナイシンに対する高いトリプシン比でトリプシンによるタンパク質分解に感受性である
ナイシンは、タンパク質分解酵素であるトリプシンの有力な標的となる２つの内部リシン残基を有する。ナイシンはトリプシンにより消化できるのかどうかを測定するために、消化反応混合物を調製し、ここでナイシン調製物である発酵実験から部分精製したナイシンを、トリプシン活性に最適な条件下でトリプシンに暴露した。これらの条件には７．０の反応ｐＨおよび約１０：１（重量／重量）のナイシン対トリプシン比を含む。サンプルを３０℃でインキュベーションし、そしてアリコートを分析用にゼロ時で始めて２４時間毎に取り出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色では、使用した条件下でナイシンがトリプシンにより分解されたことが示された。さらに種々の時点でのナイシンの定量的ＨＰＬＣ分析で、ナイシンの回収がトリプシンへの暴露後２４時間までに減少し始めることが明らかとなった。処置から９６時間後に、９０％より多くのナイシンが分解された。
ナイシンは低ｐＨおよびナイシンに対する低いトリプシン比ではトリプシン消化に耐性である
ペプチド分析ではナイシンと同時に精製される４０種以上のペプチドが同定された。これらのペプチドすべてが乳酸球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の発酵産物であると同定された。ナイシンは中性からわずかにアルカリ性のｐＨ、およびナイシンに対する高いトリプシン比でトリプシンによるタンパク質分解にかけられることが決定されたので、トリプシンがナイシンを分解しないが、ナイシンサンプル中のペプチド不純物を分解する条件を同定するために条件を改変した。１１ｍｇ／ｍｌの濃度のナイシン調製物、および２７．５μｇ／ｍｌ濃度のＵＳＰ級トリプシンを含有する反応混合物を、室温で一晩インキュベーションした（４００：１重量／重量）。混合物のｐＨは、５．２５〜６．５の範囲であった。ブロスのナイシンおよび不純物の両方の最小の加水分解はｐＨ５．５０未満で起こり、定量的ＨＰＬＣ分析ではナイシンの回収はｐＨ６．２５以下で最高であることが示された。これらの結果は、希釈トリプシンおよび５．５０から６．２５の間のｐＨが関与する条件がナイシン調製物からペプチド不純物を除去するために最適であり、トリプシン消化に対するナイシンの損失が最小であることを示した。
【００２２】
トリプシン消化によりナイシン調製物からペプチド不純物を除去するための条件をさらに至適化するために、２リットルの部分精製したナイシンを４．５５ｍｇ／ｍｌに調製し、そして２５ｍｇのＵＳＰ級トリプシンと３０℃で１６時間、１０ｍＭクエン酸、ｐＨ５．８０で調製した。ＨＰＬＣ分析では、約９５％の総ナイシン回収が明らかになった。さらに続いて分子量カットオフ膜を使用したトリプシンの除去により、８７．５％のナイシンの回収および０．３８％のトリプシンが得られた。
【００２３】
ナイシン調製物の不溶性トリプシン処理も、ナイシン自体ではなく不純物の消化に効果的であるのかどうかを決定するために、１．６リットルの９．５５ｍｇ／ｍｌ濃度の部分精製したナイシン調製物を、ビーズ状アガロースに結合した１．６ｍｌのＴＰＣＫ処理化不溶性トリプシンで処理した。３０℃で６時間のインキュベーション後、遠心により不溶性トリプシンを除去した後の総ナイシン回収は約９０％であった。
トリプシンで処理したナイシンは抗微生物活性を保持する
上記の条件下でトリプシンを用いたナイシン調製物の処理は、逆相ＨＰＬＣカラムでの移動度により、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる移動により判断されるナイシンの物理的構造に影響を及ぼさない。ナイシンの生物活性も不変であることを確認するために、インビトロの殺バクテリア活性アッセイを行った。トリプシンで処理したナイシンを、ストレプトコッカス  アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（＃２０株）の乳房炎単離物に対する抗バクテリア活性について９６ウェルプレートアッセイで分析し、そしてバクテリアの成長をＥＬＩＳＡリーダー上での吸収の読み取りとして読んだ。これらの実験で、トリプシン処理したナイシンの抗微生物活性は対照の未処理ナイシンの活性と実質的に異ならないことが示された。
トリプシン処理は不純物を含むナイシン中に存在する炎症因子を減少させる
不純物を含むナイシンのウシ乳房内注入は、炎症反応の一部として乳の中に高レベルの体細胞生産を刺激する。表１に示すように、３０ｍｇの部分精製したナイシンの注入により処置した非乳房炎のウシは、大きく上昇した体細胞のカウントを有する。対照的にトリプシンで精製したナイシンでの注入により処理した乳房区の乳の体細胞カウントは一層低く、そしてバッファーのみで処理した乳房区と統計的に異ならなかった。
他のプロテアーゼはナイシンの不純物に対して選択的活性を現す
ナイシンは上記の至適化された条件下でトリプシンによるタンパク質分解に対して比較的耐性である。ナイシンが他のタンパク質分解酵素に対しても類似条件下で耐性であるかどうかを決定するために、部分精製したナイシンをペプシン、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ（Ｅｎｄｏ  Ｇｌｕｃ）、サブチリシン、パパイン、サーモリシンまたはクロストリパインにｐＨ５．８０で暴露した。ペプシン暴露もｐＨ３．５０で行った。結果はナイシンが酵素によるタンパク質分解的消化に対して耐性であることが示された。ｐＨ５．８０でのペプシン、およびトロンビンは、不純物に対しても効果がないようであった。ｐＨ３．５０でペプシンはナイシン不純物の消化に効果的であったが、ナイシンを消化しなかった。これらの結果は低ｐＨ条件下、およびトリプシン処理について記載したプロテアーゼに対するナイシン比で、他のプロテアーゼもナイシンの不純物に対して選択的活性を現すことを示している。
方法
トリプシン消化
ナイシン（５０ｍｇ）のトリプシン消化は、５０ｍｌのバッファー（２５ｍＭ  酢酸ナトリウム、６ｍＭ  Ｔｒｉｓアセテート、５ｍＭ  ＣａＣｌ２およびｐＨ７．０からなる）中で行った。１ｍｌのＵＳＰ級トリプシン（５ｍｇ／ｍｌ）を加えた後、３０℃でインキュベーションした。その後、トリプシンの５００μｌのアリコートを２４、４８、７２および９６時間で加えた。実験の各時点で、２ｍｌのアリコートをさらなる分析用に取り出し、その１００μｌは混入の測定用に血液寒天プレートに即座にまいた。残る１．８ｍｌは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ分析のために実験が終わるまで−２０℃で保存した。
プロテアーゼ消化
可溶性トリプシンを用いたナイシンの処理には、発酵産物に由来する２リットルの部分精製したナイシンを、４．５５ｍｇ／ｍｌに１０ｍＭクエン酸バッファーおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２中で調製した。２５ｍｇのＵＳＰ級トリプシンを加えた後、反応混合物を３０℃で一晩インキュベーションした。トリプシンに対するナイシンの重量比は、約４００：１（重量／重量）であった。ＮａＯＨを使用して消化反応のｐＨを５．２５から６．５０の間の範囲に調整した。ナイシンの回収および純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣにより測定した。消化反応は３Ｎ  ＨＣｌを使用してｐＨを３．０に下げることにより止めた。結果に基づき、５．８０のｐＨを選択し、そして他のプロテアーゼが関与するすべての後の反応に使用した。
【００２４】
ペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）、トロンビン（ＥＣ３．４．２１．５）、Ｖ８プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．１９）、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、パパイン（ＥＣ．３．４．２２．２）、サーモリシン（ＥＣ．３．４．２４．２７）およびクロストリパイン（ＥＣ．３．４．２２．８）を使用した消化実験を、トリプシンについて本質的に記載したように、そしてｐＨ５．８０で行った。ペプシン消化もｐＨ３．５０で行った。固体マトリックスに結合したトリプシン（例えば不溶性トリプシン）を使用したトリプシン消化については、１．６リットルの部分精製したナイシンを９．５ｍｇ／ｍｌに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌおよびｐＨ５．５０で調製した。ビーズ状アガロースに結合した１．６ｍｌのＴＰＣＫ−処理トリプシン（シグマケミカル社：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を加えた後、反応混合物を３０℃で６時間、周期的に撹拌しながらインキュベーションした。不溶性トリプシンは約４０００ｘｇで７分間遠心することにより除去した。ナイシンを含有する生じた上清をＨＰＬＣ分析用に調製した。
乳房注入
非乳房炎のウシを、賦形剤、未処理およびトリプシン処理ナイシン（３０ｍｇ／１０ｍｌ）の注入により４回目、５回目および６回目の搾乳後に乳房区で処置した。乳の体細胞カウントは、搾乳の前、最中および後に記録した。高い体細胞カウントは、炎症反応を示していた。不等分散がある両側ｔ−検定比較を使用して統計的分析を行った。
ナイシンの生物学的活性
ナイシン活性は、ストレプトコッカス  アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＩＣ２０）の乳房炎単離物に対する抗バクテリアアッセイを使用して、９６ウェルプレートアッセイで測定した。試験サンプルはＭ１７  １０％ラクトース培地に順次希釈し、次いで等容量の１０４ｃｆｕ／ｍｌと混合した。室温で６６時間インキュベーションした後、プレートをＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにて読んだ。バクテリアの成長を含むウェルは、高い吸収の読みを与えた。データは４つのパラメーターの曲線−フィッティングソフトウェアを使用して分析した。
【００２５】
【表１】
2006501854.tif 000002
【国際調査報告】
2006501854.tif 000003