(57)【要約】本発明はＦｒａ−１濃度をＨＤＡＣ阻害のマーカーとして使用することに関する。また、ＨＤＡＣ阻害活性について化合物をインビボおよびインビトロでスクリーニングする方法；ならびに対象生体内でＨＤＡＣ阻害剤の治療効果を監視する方法；およびＨＤＡＣ阻害剤に対する耐性をインビトロまたはインビボで測定する方法；も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるＨＤＡＣ阻害をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ａ）当該細胞内および対照細胞内のＦｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること
を含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照濃度と比較して同様であるかまたは上方調節されているＦｒａ−１濃度は、インビトロでは当該細胞内でＨＤＡＣが阻害されないことを示す。
【請求項２】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象内のＨＤＡＣ阻害をインビボでスクリーニングする方法であって、
ａ）対象内および対照対象内のＦｒａ−１濃度をインビボで測定すること；および
ｂ）対象内Ｆｒａ−１濃度と対照対象内Ｆｒａ−１濃度とをインビボで比較すること
を含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照濃度と比較して同様であるかまたは上方調節されたＦｒａ−１濃度は、その対象ではインビボではＨＤＡＣが阻害されないことを示す。
【請求項５】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＨＤＡＣ阻害活性について化合物をインビトロでスクリーニングする方法であって、
ａ）化合物をインビトロで細胞に投与すること； 
ｂ）当該細胞および化合物を投与しなかった対照細胞についてＦｒａ−１濃度を検定すること；および
ｃ）当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照細胞内のＦｒａ−１濃度と比較して同様であるかまたは上方調節された当該細胞内のＦｒａ−１濃度は、その化合物はＨＤＡＣ阻害活性を持たないことを示す。
【請求項８】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
化合物をＨＤＡＣ阻害活性について対象のインビボでスクリーニングする方法であって、
ａ）対象内Ｆｒａ−１濃度を検定すること；
ｂ）化合物を対象に投与すること；
ｃ）化合物投与後に対象内Ｆｒａ−１濃度を再検定すること；および
ｄ）化合物投与前と投与後の対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること
を含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、化合物投与前の濃度と比較して同様であるかまたは上方調節された化合物投与後の対象内Ｆｒａ−１濃度は、その化合物がＨＤＡＣ阻害活性を持たないことを示す。
【請求項１１】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
既知ＨＤＡＣ阻害剤の対象内における治療効果を監視する方法であって、
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤を用いる処置前および処置後に対象内Ｆｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること
を含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、処置前の濃度と比較して下方調節されている処置後の対象内Ｆｒａ−１濃度は、ＨＤＡＣ阻害剤が治療的に有効であることを示す。
【請求項１４】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
既知ＨＤＡＣ阻害剤に対する細胞の耐性を測定する方法であって、
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤をインビトロで細胞に投与すること；および
ｂ）当該細胞内およびＨＤＡＣ阻害剤を投与しなかった対照細胞内のＦｒａ−１濃度についてスクリーニングすること；および
ｃ）当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること
を含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照細胞内Ｆｒａ−１濃度と比較して当該細胞内Ｆｒａ−１濃度の下方調節がないことは、ＨＤＡＣ阻害剤に対する細胞の耐性を示す。
【請求項１７】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
既知ＨＤＡＣ阻害剤に対する対象の抵抗性を測定する方法であって、
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤を用いる処置の前後に対象内Ｆｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること
を含んでなる方法、
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、処置前のＦｒａ−１濃度と比較して処置後に対象内Ｆｒａ−１濃度に下方調節がないことは、ＨＤＡＣ阻害剤に対するその対象の抵抗性を示す。
【請求項２０】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｆｒａ−１濃度がＦｒａ−１タンパク質の濃度である請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
増殖性疾患に罹患した対象の細胞内でＦｒａ−１ｍＲＮＡまたはＦｒａ-１タンパク質の低下した濃度を測定することを含む、ＨＤＡＣ阻害剤による処置が可能な増殖性疾患を診断する方法。
【請求項２３】
測定を生体外で行う請求項２２の方法。
【請求項２４】
ＨＤＡＣ阻害活性のバイオマーカーとしてのＦｒａ−１の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は細胞周期、ホルモンのシグナル発生および発達を調整するクロマチンの構造および転写の重要な制御剤である酵素である。ヒストンの脱アセチル化を阻害する薬剤、たとえばフェニルブチレートおよびトリコスタチンＡのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤については多数の抗増殖効果が報告されており、前骨髄球白血病の処置に有望であることを示す。加えて、ブチレートは、おそらくＮＦκＢ活性化の阻害およびヒストンデアセチラーゼの阻害によって、プロ炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６およびＩＬ１−βの発現を減少させる。また、微生物由来環状テトラペプチドであるトラポキシンＡ（trapoxin A: Tpx A；Itazaki et al., J. Antibiot, 43 (12): 1524〜1532 (1990)）は、ヒストンデアセチラーゼ１（ＨＤＡＣ１）に結合し、これを強力に阻害することが証明されている（Tauton et al., Science, 272：408〜411 (1996)）。
【０００２】
われわれは今回驚くべきことにＴｐｘＡおよびその他のＨＤＡＣ阻害剤に接触した細胞内では、細胞増殖の制御に関連するＦｏｓファミリープロテインの一員であるＦｒａ−１のｍＲＮＡが下方調節（down regulation）されることを発見した。そこで、Ｆｒａ−１のメッセージ濃度はＨＤＡＣ活性についてのマーカーとして使用できる。本発明は、Ｆｒａ−１濃度を測定することによってＨＤＡＣ阻害およびＨＤＡＣ阻害剤についてインビトロおよびインビボでスクリーニングする方法を提供する。本発明は、また、対象におけるＨＤＡＣ阻害剤の治療効果をインビボで監視する方法ならびにＨＤＡＣ阻害剤に対する抵抗性を測定するインビボおよびインビトロ法に関する。
【０００３】
（本発明の概要）
一側面では、本発明は細胞における細胞内のＨＤＡＣ阻害をインビトロでスクリーニングする方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）当該細胞内および対照細胞内のＦｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照濃度と比較して同様であるかまたは上方調節（up regulation）されたＦｒａ−１濃度は、当該細胞内ではＨＤＡＣが阻害されないことをインビトロで示す。
【０００４】
別な側面では、本発明は対象内のＨＤＡＣ阻害をインビボでスクリーニングする方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）その対象内および対照対象内のＦｒａ−１濃度をインビボで測定すること；および
ｂ）その対象内Ｆｒａ−１濃度と対照対象内Ｆｒａ−１濃度とをインビボで比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照濃度と比較して同様であるかまたは上方調節されているＦｒａ−１濃度は、その対象ではＨＤＡＣが阻害されないことをインビボで示す。
【０００５】
別な側面では、本発明はＨＤＡＣ阻害活性について化合物をインビトロでスクリーニングする方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）化合物を細胞にインビトロで投与すること；
ｂ）当該細胞内および化合物を投与しなかった対照細胞内のＦｒａ−１濃度について検定すること；および
ｃ）当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照細胞内と比較して同様であるかまたは上方調節されているＦｒａ−１濃度は、その化合物はＨＤＡＣ阻害活性を持たないことを示す。
【０００６】
別な側面では、本発明は化合物をＨＤＡＣ阻害活性について対象内でスクリーニングするインビボ法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）対象内Ｆｒａ−１濃度を検定すること；
ｂ）対象に化合物を投与すること；
ｃ）化合物投与後に対象内Ｆｒａ−１濃度を再検定すること；および
ｄ）化合物の投与前後の対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、化合物投与前濃度と比較して同様であるかまたは上方調節されている化合物投与後対象内Ｆｒａ−１濃度は、その化合物にはＨＤＡＣ阻害活性がないことを示す。
【０００７】
さらに別の側面では、本発明は既知ＨＤＡＣ阻害剤の治療効果を対象内で監視する方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤での処置前後に対象内Ｆｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、処置前の濃度と比較して下方調節されている処置後の対象内Ｆｒａ−１濃度は、ＨＤＡＣ阻害剤が治療的に有効であることを示す。
【０００８】
さらに別の側面では、本発明は既知ＨＤＡＣ阻害剤に対する細胞の耐性を測定する方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤を細胞にインビトロで投与すること；
ｂ）当該細胞内およびＨＤＡＣ阻害剤を投与しなかった対照細胞内のＦｒａ−１濃度についてスクリーニングすること；および
ｃ）当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照細胞内Ｆｒａ−１濃度と比較して細胞内Ｆｒａ−１濃度の下方調節がないことは、ＨＤＡＣ阻害剤に対する細胞の耐性を示す。
【０００９】
別の側面では、本発明は既知ＨＤＡＣ阻害剤に対する対象の抵抗性を測定する方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤による処置前後に対象内Ｆｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、処置前のＦｒａ−１濃度と比較して処置後の対象内Ｆｒａ−１濃度に下方調節がないことは、ＨＤＡＣ阻害剤に対する対象の抵抗性を示す。
【００１０】
関連する側面では、本発明はＨＤＡＣ阻害剤による処置が可能な増殖性疾患の診断法に関し、増殖性疾患に罹患した対象の細胞内でＦｒａ−１ｍＲＮＡまたはＦｒａ−１タンパク質の低下した濃度を測定することを含んでなる。この方法は好ましくは生体外で行う。
【００１１】
関連する別な側面では、Ｆｒａ−１はＨＤＡＣ阻害活性のバイオマーカーとして使用される。
【００１２】
関連する態様では、前記各方法ではＦｒａ−１タンパク質濃度および／またはｍＲＮＡ濃度を測定してもよい。
【００１３】
（発明の詳細な記載）
ＨＤＡＣ阻害剤に接触した哺乳類細胞ではＦｒａ−１のメッセージ濃度が下方調節されることを発見した。試験したＨＤＡＣ阻害剤の種類にかかわらずＦｒａ−１メッセージは着実に下方調節されるので、これらのデータはこのタンパク質のメッセージ濃度低下を生物学的システム中のＨＤＡＣ阻害についてのマーカーとして使うことができることを示す。
【００１４】
Ｆｒａ−１下方調節が必ずしも細胞培養内またはインビボで対象内のＨＤＡＣ阻害を示すとは限らない一方で、本明細書に開示するデータはＨＤＡＣ阻害がＦｒａ−１メッセージ濃度の下方調節に関連することを示す。この観察に基づけば、対照濃度と比較して正常なまたは上方調節された培養物内または対象内のＦｒａ−１濃度は明確にその培養物内または対象内ではＨＤＡＣが阻害されないことを示すことは明らかである。このような情報を用いてたとえば対象から得た罹患細胞の一次培養物または樹立された細胞系統を含む特定の細胞型を生化学的に特定し、ならびに生体の病状またはその他の病理学的状況に関するインビボ情報を提供し、および適切な臨床的処置法の選択に関する有用な情報を提供することができる。
【００１５】
それ故、一側面では本発明はインビトロまたはインビボでＦｒａ−１濃度を測定し、適切な対照におけるＦｒａ−１濃度と比較することを含んでなる、ＨＤＡＣ阻害についてのインビトロまたはインビボにおけるスクリーニング法に関する。この場合、「適切な対照」は比較のためのＦｒａ−１濃度を提供するために使用できる培養物またはインビボ対象（事例により）を示し、当業者が熟知するであろうものである。同様に、当業者が熟知している通常の科学的技術および操作法もこのスクリーニング法の実施に採用できる。
【００１６】
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣ阻害が望まれる疾患の処置を要する獣医学における動物を含む哺乳類またはヒトにおける治療剤としての使用に適しているものでよい。これに限定するものではないが、このような病状にはアテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性または免疫反応、乾癬およびたとえば癌のような異常増殖を伴う病状を含む。好適な態様ではこの病状はたとえば癌のような増殖性疾患である。そこで、ＨＤＡＣ阻害剤の臨床的重要性に鑑み、数千の化合物ライブラリーからそのような有用治療剤化合物の検出を促進する方法には重要な価値がある。ＨＤＡＣ阻害がＦｒａ−１メッセージの下方調節に関連するという驚くべき発見に基づいて、本発明は明らかにＨＤＡＣ阻害剤ではない化合物の確認を可能にすることによって新規ＨＤＡＣ阻害剤の確認を促進するための方法にＦｒａ−１メッセージ濃度を使用できることを意図する。ＨＤＡＣ阻害剤ではない化合物は適切な対照と比較してＦｒａ−１濃度（たとえばｍＲＮＡ濃度および／またはタンパク質濃度）の下方調節を起さないので確認できる。この化合物をＨＤＡＣ阻害剤候補の「リスト」から削除すれば、それ以上の試験が不要になる。次に、実際にＦｒａ−１濃度の下方調節を起す化合物に集中してＨＤＡＣ活性についての効果をさらに好適に確認するための通常の方法を使用する検定を行うことができる。
【００１７】
そこで別の側面では、本発明はＨＤＡＣ阻害活性について化合物をインビボでスクリーニングする方法に関し、次の各項を含んでなる：
対象中のＦｒａ−１濃度を検定すること；
化合物を対象に投与すること；
化合物投与後に対象内Ｆｒａ−１濃度を再検定すること；および
化合物の投与前後の対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、化合物投与前の濃度と比較して同様であるかまたは上方調節された化合物投与後の対象内Ｆｒａ−１の濃度は、その化合物がＨＤＡＣ阻害活性を持たないことを示す。
【００１８】
このインビボスクリーニング検定は通常の方法を用いて行うことができる。たとえば、通常の方法を使用して化合物投与前後に対象から採取した生物学的サンプル内のＦｒａ−１ｍＲＮＡの濃度をインビボで検定できる。同様にして被検対象はこれに限定されるものではないが、当業者が熟知している通常の実験動物モデル、たとえばマウスの異種移植片、正所性または転移性腫瘍モデルならびに管理された臨床研究におけるヒトの患者を含むことがある。
【００１９】
このスクリーニング法はインビトロで行うこともできる。そこで別な側面では、本発明は化合物をＨＤＡＣ阻害活性についてインビトロでスクリーニングする方法に関し、次の各項を含んでなる：
化合物をインビトロで細胞に投与すること；
当該細胞および化合物を投与しなかった対照細胞をＦｒａ−１濃度について検定すること；および
当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照細胞内のＦｒａ−１濃度と比較して同様であるかまたは上方調節された当該細胞内のＦｒａ−１濃度は、その化合物がＨＤＡＣ阻害活性を持たないことを示す。
【００２０】
インビボ法と同様に、インビトロスクリーニング法も当業者が熟知している技術を使用して行ってもよい。たとえば、ヒトまたはその他の哺乳類対象から分離した一次細胞を使用して、またはたとえばＨ１２９９、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６またはその他の細胞のようなＦｒａ−１ｍＲＮＡを検出可能に発現する各種細胞系統を使用してインビトロで化合物をスクリーニングしてもよい。本明細書で使用する「Ｆｒａ−１を検出可能な濃度で発現する細胞」は常法に従って検出するに十分な濃度でＦｒａ−１ｍＲＮＡおよび／またはＦｒａ−１タンパク質を発現する細胞を示す。そのような細胞系統はたとえばＡＴＣＣ（Manassas, Virginia）から商品として入手可能であり、当業者は過度の実験（undue experimentation）なしに理解するであろう。同様に被検化合物をインビトロで細胞に投与し、Ｆｒａ−１の下方調節を常法に従って検定してもよい。
【００２１】
本発明はまた対象内にある既知ＨＤＡＣ阻害剤の治療効果を監視する方法を提供し、これは次の各項を含んでなる：
ＨＤＡＣ阻害剤を用いる処置の前後に対象内Ｆｒａ−１濃度を測定すること；および
その対象内のＦｒａ−１濃度を比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、処置前濃度と比較して下方調節された処置後対象内Ｆｒａ−１濃度は、そのＨＤＡＣ阻害剤は治療的に有効であることを示す。たとえば、循環腫瘍上皮細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤処置を施している患者の血液（すなわち処置前後に得た生物学的サンプル）から精製し、細胞からＲＮＡを精製し、常法に従ってサンプル内Ｆｒａ−１濃度をＲＴ−ＰＣＲによって測定する。ＨＤＡＣ阻害剤を投与している患者でＦｒａ−１の下方調節がないことはその患者ではＨＤＡＣ阻害がないことを示し、対応する治療効果がなかろうことを示す。
【００２２】
そこで、対象の生物学的サンプル内Ｆｒａ−１濃度と投与を監視し、投与することによって下方調節の所望濃度を達成するようにＨＤＡＣ阻害剤の用量および処置法を最適化するための臨床マーカーとしてＦｒａ−１濃度を使用できる。従って、本発明の方法を選択した化合物の治療効果を監視するためにおよび／または選択した化合物の治療的有効量または処置法を発見するために、個々の患者の治療法を選択し、最適化するために使用することができる。ここで考慮すべき因子には処置すべき特定的病状、処置すべき哺乳類、個々の患者の臨床的病状、活性化合物の投与部位、活性化合物の型、投与方法、投与スケジュール、および臨床医が知っているその他の因子を含む。投与するＨＤＡＣ阻害剤の治療的有効量はそのような配慮に支配され、疾患の予防、緩和または処置に必要な最低量である。この量は対象にとって有毒な量、または対象を感染症に罹患しやすくする量よりも低いことが望ましい。
【００２３】
Ｆｒａ−１の発現濃度は生物学的サンプルからたとえばノーザンブロット分析、定量的ＰＣＲまたはＤＮＡマイクロアレイ（たとえばAffymetrix, Santa Clara, CAが市販）のようなＲＮＡ定量法など通常の技術を含むいかなる既知方法によって検定してもよい。本明細書では「生物学的サンプル」にはＦｒａ−１ｍＲＮＡまたはＦｒａ−１タンパク質濃度を検定するために使用できる血液、尿またはその他の生物学的材料を包含できる。
【００２４】
データはＨＤＡＣ阻害がＦｒａ−１下方調節に関連することを示すので、インビトロまたはインビボでＨＤＡＣ阻害剤の効果を検出する方法としてＨＤＡＣ阻害剤存在下にＦｒａ−１濃度を分析することもできる。
【００２５】
本発明の別な側面では、本発明は増殖性疾患に罹患した対象の細胞内におけるＦｒａ−１ｍＲＮＡまたはＦｒａ−１タンパク質の濃度低下を測定することを含んでなるＨＤＡＣ阻害剤による処置が可能な増殖性疾患の診断法に関する。この測定は好ましくは体外、すなわちたとえばその対象から予め分離しておいた組織または血液を用いて生体の外で行う。
【００２６】
別の側面では特定的には、本発明は既知ＨＤＡＣ阻害剤に対する細胞の耐性を測定する方法に関し、次の各項を含んでなる：
ＨＤＡＣ阻害剤を細胞にインビトロで投与すること；
当該細胞内およびＨＤＡＣ阻害剤を投与しなかった対照細胞内のＦｒａ−１濃度についてスクリーニングすること；および
当該細胞内Ｆｒａ−１濃度と対照細胞内Ｆｒａ−１濃度とを比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、対照細胞内のＦｒａ−１濃度と比較して当該細胞内でＦｒａ−１濃度の下方調節がないことは、当該細胞がＨＤＡＣ阻害剤に対して耐性であることを示す。これに限定するものではないが、この方法に従って分析できる細胞には腫瘍細胞系統ならびに患者の生物学的サンプルから得た新生物細胞または他種の細胞の一次培養物が含まれる。
【００２７】
同様に、関連する側面では、本発明は既知ＨＤＡＣ阻害剤に対する対象の抵抗性を測定する方法に関し、次の各項を含んでなる：
ａ）ＨＤＡＣ阻害剤を用いる処置前後に対象内Ｆｒａ−１濃度を測定すること；および
ｂ）対象内Ｆｒａ−１濃度を比較すること。
ここに、ＨＤＡＣ阻害はＦｒａ−１濃度の下方調節に関連するものであり、またここに、その対象内で処置前Ｆｒａ−１濃度と比較して処置後のＦｒａ−１濃度に下方調節がないことは、その対象のＨＤＡＣ阻害剤に対する抵抗性があることを示す。本明細書に開示する発明の全ての側面と同様に、ＨＤＡＣ阻害剤の投与およびＨＤＡＣ阻害剤に対する抵抗性を測定するためのＦｒａ−１濃度のインビトロおよびインビボ分析は当業者が熟知している通常の方法に従って行うことができる。
【００２８】
前記各側面でのＦｒａ−１ｍＲＮＡ濃度測定に加えて、本明細書ではＨＤＡＣ阻害がＦｒａ−１ｍＲＮＡ濃度の下方調節に関連するのみならず、インビボまたはインビトロのＦｒａ−１タンパク質濃度の下方調節に関連する場合にはＦｒａ−１タンパク質濃度で分析することも意図している。Ｆｒａ−１タンパク質の濃度は、イムノアッセイまたは電気泳動検定などの通常の技術を使用して測定してもよい。たとえば、生物学的サンプル内のＦｒａ−１濃度を測定または監視するためにＦｒａ−１特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてＦｒａ−１を測定するいずれかの標準的なイムノアッセイ形式によるイムノアッセイを使用できる。モノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）型検定ならびに通常のウェスタンブロット検定法もこのマーカープロテインの濃度を直接的に測定するために利用できる検定法の例である。Ｆｒａ−１に特異的な抗体は商品として入手可能である（たとえばウサギ−抗ヒトＦｒａ−１ポリクローナル抗体：Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）か、または公知方法に従って製造できる。たとえば、Ｆｒａ−１に対するモノクローナル抗体は、たとえばHarlow, E.およびLane編、1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harborなどに記載の常法に従って製造できる。
【００２９】
本発明を実施するには分子生物学における他の通常技術多数を使用してもよい。この技術はよく知られており、たとえば以下の文献に解説されている：Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel 編)； Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I/ Vol. II, 1985 (D. N. Glover編)； Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait編)； Nucleic Acid Hybridization, 1985 (Hames, Higgins)； Transcription and Translation, 1984 (HamesおよびHiggins編)； Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney編)； Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press)； Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloningシリーズ；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. MillerおよびM. P. Calos編), Cold Spring Harbor LaboratoryおよびMethods in Enzymology Vol. 154/Vol. 155 (各WuおよびGrossman; Wu編)。
【００３０】
（実施例）
以下の実施例は本発明をさらに例証するが、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００３１】
Ｔｐｘ処理したＨ１２９９およびＡ５４９細胞内におけるＦｒａ−１の差次発現
【００３２】
（材料および方法）
ＨＤＡＣの酵素活性を阻害または変調する多様な化合物（ＨＤＡＣ阻害剤）にはＴｐｘＡ、フェニルブチレート、トリコスタチンＡならびにＭＳ−２７−２７５と呼ばれるベンズアミドを含む（Jung（2001）Current Medicinal Chemistry 8, 1 505〜1511）。本明細書に開示する試験結果はＴｐｘＡ（Itazaki et al., J. Antibiotics（Tokyo） 43（12）:1524〜32（1990）が開示する方法に従って製造）およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤である数種のヒドロキサメート化合物、すなわちＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド （本明細書では「化合物Ａ」と呼称）およびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３− イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（本明細書では「化合物Ｂ」と呼称）を使用した実験の結果である。
この化合物とその合成はWO 02／22577に詳記されている。
【化１】
2006505241.tif 000002
【００３３】
化合物Ａは次の合成法によって製造してもよい：４−ホルミル桂皮酸メチルエステルはＭｅＯＨ−ＨＣｌ（６.７ｇ、０.1８モル）に４−ホルミル桂皮酸（２５ｇ、０.１４３モル）を添加して製造する。得られる懸濁液を３時間加熱還流し、冷却し、蒸発乾固する。得られる黄色固体をＥｔＯＡｃに溶解し、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、蒸発して淡黄色固体（２５.０ｇ、９２％）を得、これをさらに精製することなく使用する。トリプタミン（１６.３ｇ、１００ミリモル）と４−ホルミル桂皮酸メチルエステル（１９ｇ、１００ミリモル）のジクロロエタン溶液にＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２１ｇ、１００ミリモル）を加える。４時間後、混合物を１０％Ｋ２ＣＯ３溶液で希釈し、有機層を分離し、水溶液をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物を集めて乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、蒸発し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して３−（４−｛［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニル）−（２Ｅ）−２−プロペン酸メチルエステル（２９ｇ）を得る。ＫＯＨ（１２.９ｇ、８７％、０.２モル）のＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液をＨＯＮＨ２−ＨＣｌ（１３.９ｇ、０.２モル）のＭｅＯＨ（２００ｍＬ）溶液に添加すると沈殿が生じる。１５分後、混合物を濾過し、フィルターケーキをＭｅＯＨで洗浄し、濾液を約７５ｍＬまで真空蒸発する。混合物を濾過し、容積をＭｅＯＨで１００ｍＬとする。得られる溶液２Ｍ−ＨＯＮＨ２をＮ２下−２０℃に２週間まで貯蔵する。次に３−（４−｛［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニル）−（２Ｅ）−２−プロペン酸メチルエステル（２.２０ｇ、６.５０ミリモル）を２Ｍ−ＨＯＮＨ２のＭｅＯＨ溶液（３０ｍＬ、６０ミリモル）に加え、続いてＫＯＨ（４２０ｍｇ、６.５ミリモル）のＭｅＯＨ溶液（５ｍＬ）を加える。２時間後、反応混合物にドライアイスを加え、混合物を蒸発乾固する。残渣を熱ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）に溶解し、−２０℃で一夜保存する。得られる懸濁液を濾過し、固体を氷冷ＭｅＯＨで洗浄し、真空乾燥してＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド（ｍ／ｚ３３６［ＭＨ＋］）を得る。
【００３４】
化合物Ｂは次の合成法に従って製造してもよい：３−（４−｛［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ］メチル｝フェニル）−（２Ｅ）−２− プロペン酸メチルエステル（１２.６ｇ、３７.７ミリモル）、（２−ブロモエトキシ）−ｔ−ブチルジメチルシラン（１２.８ｇ、５３.６ミリモル）および（ｉ−Ｐｒ）２ＮＥｔ（７.４２ｇ、５７.４ミリモル）のＤＭＳＯ（１００ ｍＬ）溶液を５０℃に加温する。８時間後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏに分配する。有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、蒸発する。残渣をシリカゲルクロマトグラフして３−［４−（｛［２−（ｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペン酸メチルエステル（１３.１ｇ）を得る。化合物Ａの製造について前記した操作法に従って、３−［４−（｛［２−（ｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ｝メチル）フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペン酸メチルエステル（５.４ｇ、１１ミリモル）をＮ−ヒドロキシ−３−［４−（｛［２−（ｔ−ブチルジメチルシラニルオキシ）エチル］−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］−（２Ｅ）−２−プロペンアミド（５.１ｇ）に変換し、さらに精製することなく使用する。次にこのヒドロキサム酸（５.０ｇ、１３.３ミリモル）を９５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（５９ｍＬ）に溶解し、４０〜５０℃に４時間加熱する。混合物を蒸発し、残渣を逆相ＨＰＬＣで精製してＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドをトリフルオロ酢酸塩（２.１９ｇ）として得る。
【００３５】
ヒトＨ１２９９非小細胞肺癌細胞（ATCC, Manassas, VA）（ATCC # CRL-5803）を１０％ウシ胎児血清（FBS, Life Technologies）プラス５０ｐｇ／ｍＬゲンタマイシン（Life Technologies）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Life Technologies, Gaithersburg. MD）を用いて加湿培養器中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養する。ＴｐｘＡ処理前にＨ１２９９細胞を２ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Costar, Coming, NY）に塗布し、２４時間培養する。ＴｐｘＡ（ＤＭＳＯ中１ｍＭ−貯蔵溶液）を１〜１０００ｎＭの濃度で細胞に加え、細胞を２４時間または４８時間のいずれかの期間、３７℃で培養する。
【００３６】
ヒトＡ５４９非小細胞肺癌細胞（ATCC CCL-185, Manassas, VA）をグルコース４５００ｍｇ／Ｌ、１０％ウシ胎児血清（FBS, Life Technologies）およびゲンタマイシン５０μｇ／ｍＬ（Life Technologies）添加ＤＭＥＭ培地（Life Technologies, Gaithersburg, MD）中で５％ＣＯ２雰囲気下、加湿培養器中、３７℃で培養する。ＴｐｘＡ処理前に、Ａ５４９細胞を２ｘ１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Costar, Corning, NY）に塗布し、２４時間培養する。ＴｐｘＡ（ＤＭＳＯ中１ｍＭ−貯蔵溶液）を１〜１０００ｎＭの濃度で細胞に加え、細胞を２４時間または４８時間のいずれかの期間、３７℃でインキュベーションする。
【００３７】
ＴｐｘＡ処理ならびに未処理のＨ１２９９細胞およびＡ５４９細胞からの全ＲＮＡをRNeasy Mini kit（Qiagen, Hilden, Germany）を製造社の指示書に従って用いて製造する。このＲＮＡをＤＥＰＣ−処理Ｈ２Ｏ（ＲＮＡｓｅ不含）５０μＬに回収し、ＯＤ２６０をSpectraMax光度計（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）で測定してＲＮＡ濃度を定量する。
【００３８】
プライマー（BIG, Freiburg, Germany）の配列および５'−ＦＡＭ蛍光レポータおよび３'−ＴＡＭＲＡクェンチャー色素を含むＱ−ＰＣＲ用TaqManプローブ（Eurogentec, Seraing, Belgium）の配列は初期設定Primer Express Software（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて選択する：プライマーＴＭ必要条件：最小Ｔｍ：５８℃、最大Ｔｍ：６０℃、最適Ｔｍ：５９℃、 最大Ｔｍ差：２℃。プライマーＧＣ含有要件：最小％ＧＣ３０、最大％ＧＣ８０、０レシデューの３' クランプ。プライマー長要件：最短長：９、最大長：４０、最適長：２０。アンプリコン要件：最小Ｔｍ：０℃、最大Ｔｍ：８５℃、最短長：５０、最大長：１５０。TaqManプローブ基準：TaqManプローブＴｍはＰＣＲプライマーＴｍよりも１０℃以上高くなければならない。使用したプライマーは次の通り：
正方向：  ５'−CAACCCTCCTCGCTTTGTGA−３'：    配列番号１
逆方向：  ５'−GACATTGGCTAGGGTGGCAT−３'：    配列番号２
Taqman：  ５'−CGCCTGAGCCCTACTCCCTGCA−３'：  配列番号３
Ｑ−ＰＣＲは製造社の指示書に従ってTaqMan PCR Core reagent kit（Applied Biosystems Foster City, CA）を用いてABI Prism 7700 sequence detector （Applied Biosystems）で行う。表１のようにＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ １２μＬ中の全ＲＮＡ５０ｎｇをMicroAmp optical ９６ウェル反応プレート（Applied Biosystems）でTaqMan PCR reagent mix １３μＬにより製造する。
【表１】
2006505241.tif 000003
【００３９】
標的ＲＮＡの逆転写およびＱ−ＰＣＲによる検出の設定は５０℃、２分間；９５℃、１０分間、続いて９５℃−１５秒間から６０℃−１分間を５０サイクルである。増幅された産物の相対的測定は製造社の指示書（Applied Biosystems, ABI Prism 7700 sequence detection system, User Bulletin #2）に記載のように比較ＣＴ法を用いて行う。
【００４０】
実時間Ｑ−ＰＣＲを用いる実験結果はＨ１２９９細胞（表２、表４）およびＡ５４９細胞（表３、表５）の双方に見られるようにＨＤＡＣ阻害剤を用いる処理によって１０〜１０００ｎＭと広範囲の用量にわたってＦｒａ−１が高度に抑制されることを示す。また、このデータはＴｐｘＡの存在下に同じ細胞系統でＦｒａ−１ｍＲＮＡの発現が高度（２００倍以上）に抑制される（データ記載せず）ことを示す通常のマイクロアレイ技術を用いて得られた結果を確認する。
【表２】
2006505241.tif 000004
【表３】
2006505241.tif 000005
【表４】
2006505241.tif 000006
【表５】
2006505241.tif 000007
Ｈ１２９９細胞系統およびＡ５４９細胞系統について、ＩＣ５０は各々１〜１０ｎＭおよび１０〜５０ｎＭの範囲であることが確認される。
【実施例２】
【００４１】
ＴｐｘＡまたは化合物Ａで処理後のＨ１２９９およびＨＣＴ１１６細胞におけるＦｒａ−１の差次発現
【００４２】
Ｈ１２９９細胞およびＨＣＴ１１６細胞（ATCC, Manassas, VA）を培養し、ＴｐｘＡまたは化合物Ａと接触させ、Ｆｒａ−１メッセージの濃度を検定する。この実験ではＨ１２９９細胞を実施例１に記載のように培養する。ＨＣＴ１１６細胞は１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０培地中、５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で培養する。１００ｎＭ−トラポキシン、１００ｎＭ−化合物Ａまたは１００ｎＭ−ＤＭＳＯを密集度６０％の細胞に加えて６時間または２４時間増殖させる。前記実施例１に記載の方法論を用いて、ＴｐｘＡ、化合物Ａまたは対照としてのＤＭＳＯで処理した培養物からＲＮＡを調製し、Ｆｒａ−１濃度をＱ−ＰＣＲで分析する；この場合、表１に記載のようにTaqMan PCR reagent mix１３μＬとともに全ＲＮＡ８.７ｎｇのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ１２μＬ溶液をMicroAmp optical ９６ウェル反応プレート（Applied Biosystems）中に調製する。
【００４３】
表６および表７のデータはＴｐｘＡで処理したＨ１２９９細胞およびＨＣＴ１１６細胞ばかりでなく、化合物Ａで処理した培養物においても対照培養物と比較してＦｒａ−１メッセージが下方調節されることを示す。
【表６】
2006505241.tif 000008
【表７】
2006505241.tif 000009
【００４４】
他のＨＤＡＣ阻害剤で処理したＨ１２９９細胞およびＨＣＴ１１６細胞の別途の分析（資料未記載）はその阻害剤存在下にＦｒａ−１発現濃度の低下も示し、それによってＦｒａ−１濃度とＨＤＡＣ活性との間の関連性を強く提示する。異なるＨＤＡＣ阻害剤が異なる細胞系統でＦｒａ−１発現の阻害を起すことができる事実はＦｒａ−１メッセージ濃度の下方調節がＨＤＡＣ阻害の結果であって、特定細胞の特定化合物による処理に伴う無関連な副作用に起因するものではないことの強力な証拠である。
【実施例３】
【００４５】
化合物Ｂで処理後のＡ５４９細胞内におけるＦｒａ−１の示差発現
【００４６】
ヒトＡ５４９非小細胞肺癌細胞（ATCC、Manassas、VA）（ATCC # CCL-185）を１０％ウシ胎児血清（FBS, Life Technologies）および５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Life Technologies）添加ＤＭＥＭ培地（Life Technologies, Gaithersburg、MD）中で、加湿培養器で５％ＣＯ２添加空気中、３７℃で培養する。化合物Ｂ処理の前にＡ５４９細胞を５ｘ１０４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート（Costar, Corning、NY）に塗布し、２４時間培養する。化合物Ｂ（１０ｍＭ−ＤＭＳＯ貯蔵溶液）は組織培養培地中、最終濃度１００ｎＭに希釈し、細胞に添加する。対照として当量のＤＭＳＯを化合物Ｂ不含対照培養液に添加する。細胞を３７℃で１６時間、２４時間または４８時間のいずれかの期間培養する。細胞培養は全て２５反復を設定する。化合物処理ならびに未処理のＡ５４９細胞から得られた全ＲＮＡは製造社の指示書に従ってRNeasy Mini kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて製造する。このＲＮＡをＤＥＰＣ処理水（ＲＮＡse不含）５０μＬ中に回収し、ＯＤ２５０をSpectraMax光度計（Molecular Devices、Sunnyuale、CA）で測定してＲＮＡ濃度を定量する。ＲＮＡの量を５ｎｇ／μＬに調整する。各ＲＮＡサンプル反復２５μＬについてＱ−ＰＣＲ反応条件を表８に示すように設定する。
【表８】
2006505241.tif 000010
【００４７】
Ｆｒａ−１プライマーおよびプローブのＤＮＡ配列は前記の通りである。標的ＲＮＡの逆転写およびＱ−ＰＣＲによる検出の設定は５０℃、２分間；９５℃、１０分間；続いて９５℃、１５秒および６０℃、１分間を５０サイクルである。増幅された産物の相対的測定は製造社のマニュアル（Applied Biosystems社, ABI prism 7700 配列決定システム使用者用パンフレット#２）に記載の比較ＣＴ法を用いて行う。結果は未処理細胞から回収したＦｒａ−１ｍＲＮＡの量に対する百分率で示す。実験結果は化合物Ｂと接触したＡ５４９細胞内では対照と比較してＦｒａ−１が長時間にわたって高度に抑制されることを示す（表９）。
【表９】
2006505241.tif 000011
【実施例４】
【００４８】
トラポキシンＡ、化合物Ａおよび化合物Ｂ存在下のヒストンデアセチラーゼ活性
【００４９】
通常の方法を使用して、トラポキシンＡ、化合物Ａまたは化合物Ｂの存在下にヒストンＨ４の現存の酵素活性を試験する。要約すれば、トリチウム標識アセチル化ヒストンＨ４ペプチド３００００ｃｐｍを薬剤存在下または薬剤不在下にＨＤＡＣ検定緩衝液（１０ｍＭ−トリス−Ｃｌ、ｐＨ８.０、１０ｍＭ−ＮａＣｌ、１０％グリセリン）中、Ｈ１２９９細胞からイオン交換クロマトグラフィーによって精製したヒストンデアセチラーゼ活性とともにインキュベーションする。混合物を２時間３７℃に放置し、放射能標識アセチル基をヒストンデアセチラーゼ活性によって放出させ、酢酸エチルで抽出し、シンチレーションカウンターで計測する。ＩＣ５０は薬剤不在下におけるヒストンデアセチラーゼ活性の５０％を阻害する薬剤濃度を表す。実験結果はトラポキシンＡ、化合物Ａおよび化合物ＢがＨＤＡＣ阻害活性を有することを証明し；および本明細書に記載の実施例に開示する化合物の細胞への投与がＦｒａ−１の下方調節を起すのみならず、この下方調節が細胞内に現存するＨＤＡＣ阻害に関連するという発見を支持する（表１０参照）。
【表１０】
2006505241.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月2日(2005.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006505241000001.app
【国際調査報告】
2006505241.tif 000013
2006505241.tif 000014
2006505241.tif 000015
2006505241.tif 000016
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