(57)【要約】【要約】  本発明は、鱗翅目の後部絹糸腺における有用ポリペプチド発現を指令する核酸およびその応用に係り、特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞における有用タンパク質の発現を指令する核酸に関するものである。また、本発明は、本願に記載の核酸の制御下に位置するポリヌクレオチドを含む発現カセットに関するものである。また、本発明は、本願に記載の核酸または発現カセットや、前記核酸または前記発現カセットをそのゲノムに導入することで修飾された宿主細胞を含む組込み型リコンビナントベクターに関するものである。
2006521802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺の細胞内における有用タンパク質の発現を指令する核酸であって、
この核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドと塩基配列が少なくとも９０％は同一であり、また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしていることを特徴とする特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺の細胞内における有用タンパク質の発現を指令する核酸。
【請求項２】
前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドを含み、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしていることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）特に前記絹糸腺細胞内における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、配列番号１の第１〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドを含み、また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしていることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
配列番号１の第１〜１３７９位塩基配列に、１つ以上４つ以下の配列番号２のポリヌクレオチドのコピーを導入することで修飾されたことを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれかに記載の核酸と相補的な配列を有することを特徴とする核酸。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸の制御下にあることを特徴とする有用ポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項７】
前記有用ポリヌクレオチドは有用ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項６に記載の発現カセット。
【請求項８】
前記有用ポリヌクレオチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、
少なくともフィブロインＬ鎖ポリペプチド配列の１７２Ｎ末端アミノ酸と、
有用ペプチドと、
を含む融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項６に記載の発現カセット。
【請求項９】
前記有用ペプチドは、以下のタンパク質、
すなわちクモのスピドロイン、
Ｇａｌｌｅｒｉａ属動物のフィブロイン、
ヒトインターロイキン２、
の中から選択されることを特徴とする請求項７または請求項８に記載の発現カセット。
【請求項１０】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセットを含むことを特徴とする遺伝子組込みリコンビナントベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子組込みリコンビナントベクターの塩基配列を含むことを特徴とするリコンビナントクローンベクター。
【請求項１２】
前記遺伝子組込みリコンビナントベクターは、２００３年２月２０日にパスツール研究所のＣＮＣＭに寄託し寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２９７５号を取得したＰｉｇｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）であることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子組込みリコンビナントベクター。
【請求項１３】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセット、または請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とするリコンビナント宿主細胞。
【請求項１４】
前記リコンビナント宿主細胞は、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）、Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、Ｇａｌｌｅｒｉａ属、Ｐｈｉｌｏｓａｍｉａ属、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属の中から選ばれた絹産出動物の細胞であることを特徴とする請求項１３に記載のリコンビナント宿主細胞。
【請求項１５】
前記リコンビナント宿主細胞は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の細胞であることを特徴とする請求項１３に記載のリコンビナント宿主細胞。
【請求項１６】
リコンビナント宿主細胞は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞であることを特徴とする請求項１３に記載のリコンビナント宿主細胞。
【請求項１７】
カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のトランスジェニック動物を得るための、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセット、または請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載のベクター、または請求項１３〜請求項１６のいずれかに記載のリコンビナント宿主細胞の使用。
【請求項１８】
カイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の前記トランスジェニック動物は、有用タンパク質を絹糸状に分泌することを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセット、または請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載のベクターをそのゲノムに組み込んだ形態のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
請求項８または請求項９に記載の発現カセットをそのゲノムに組み込んだ形態のフィブロインＬ鎖の分泌を欠如するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項２１】
請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセット、または請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載のベクターによりその発現が指示される、有用タンパク質を含む繭であって、前記有用タンパク質は、繭１ｍｇあたり５ｎｇを越える濃度、好ましくは繭１ｍｇあたり７０ｎｇを越える濃度で存在することを特徴とする有用タンパク質を含む繭。
【請求項２２】
ａ）カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵が生み出された後で胞胚形成前１〜５時間に、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセット、または請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載のベクターを前記卵に注入するステップと、
ｂ）請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセットをそのゲノムに組み込んだトランスジェニック動物を選別するステップと、
を備えたことを特徴とするカイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のトランスジェニック動物を得る方法。
【請求項２３】
さらに、
ｃ）前記ステップｂ）により得られた二つのトランスジェニック動物をそれぞれ交配させるステップと、
ｄ）導入遺伝子の同型接合体動物を選別するステップと、
を含むことを特徴とする請求項２１に記載の動物を得る方法。
【請求項２４】
ａ）請求項１９に記載のトランスジェニック動物を飼育するステップと、
ｂ）前記トランスジェニック動物が産出した絹を回収するステップと、
を含むことを特徴とする絹繊維を得る方法。
【請求項２５】
ａ）請求項１９に記載のトランスジェニック動物を飼育するステップと、
ｂ）前記トランスジェニック動物が産出した絹を回収するステップと、
ｃ）絹繊維から有用タンパク質を回収するステップと、
を含むことを特徴とする有用タンパク質を得る方法。
【請求項２６】
特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺の細胞内におけるフィブロインＨ鎖の合成を減少させる有用ＲＮＡの発現を指令する核酸であって、この核酸は、特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域を含んでおり、前記核酸は、配列番号１の第１１５０〜１４５１位塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一の塩基配列を含んでいることを特徴とする特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺の細胞内におけるフィブロインＨ鎖の合成を減少させる有用ＲＮＡの発現を指示する核酸。
【請求項２７】
配列番号１の第１〜１３７９位塩基配列に、１つ以上４つ以下の配列番号２のポリヌクレオチドのコピーを導入することで修飾されたことを特徴とする、請求項２６に記載の核酸からなる核酸。
【請求項２８】
請求項２６または請求項２７に記載の核酸の制御下に位置する有用ＲＮＡをコードする核酸を含む発現カセット。
【請求項２９】
請求項２６または請求項２７に記載の核酸、または請求項２８に記載の発現カセットを含む遺伝子組込みリコンビナントベクター。
【請求項３０】
請求項２６または請求項２７に記載の核酸、または請求項２８に記載の発現カセット、または請求項２９に記載のベクターを含むリコンビナント宿主細胞。
【請求項３１】
カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のトランスジェニック動物を得るための、請求項２６または請求項２７に記載の核酸、または請求項２８に記載の発現カセット、または請求項２９に記載のベクターの使用。
【請求項３２】
（ｉ）そのゲノムに組み込んだ形態で、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の核酸、または請求項６〜請求項９のいずれかに記載の発現カセット、または請求項１０〜請求項１２のいずれかに記載のベクターを含むとともに、
（ｉｉ）請求項２６または請求項２７に記載の核酸、または請求項２８に記載の発現カセット、または請求項２９に記載のベクターを含む
ことを特徴とするヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
そのゲノムに組み込んだ形態で、請求項２６または請求項２７に記載の核酸、または請求項２８に記載の発現カセット、または請求項２９に記載のベクターを含むことを特徴とする請求項２０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、織物材料として使用する繊維状タンパク質、特に新しい絹や生医学用タンパク質のような産業上有用なタンパク質の合成・分泌の分野に関するものである。本発明は、特に所定動物の組織内、より具体的にはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の絹糸腺（ｓｅｒｉｃｉｇｅｎｉｃ  ｇｌａｎｄ）内における有用ポリヌクレオチドおよび／または有用ポリペプチドの標的を定められた発現に関するものである。本発明によれば、カイコガの絹糸腺は、大量のタンパク質を生成し、それを精製される絹の繭に移出することが可能な「バイオリアクター」として使用される。
【背景技術】
【０００２】
従来、織物材料で使用される繊維状タンパク質を生成する方法、例えばトランスジェニックヤギの乳腺によるクモ糸フィラメントタンパク質を生成する方法がある（Ｎｅｘｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  １０００  Ｓｔ−Ｃｈａｒｌｅｓ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｂｌｏｃ  Ｂ，  Ｖａｕｄｒｅｕｉｌ−Ｄｏｒｉｏｎ，  ＱＣ，  Ｊ７Ｖ  ８ＰＶ，  Ｃａｎａｄａ）。しかし、この方法では、繊維状タンパク質を編糸状に組織化できない。これまでの生医学目的で使用するための可溶タンパク質の生成に関しては、バクテリアの培養、細胞系の培養、あるいはウシ、ヤギ、さらにはトランスジェニックウサギといった脊椎動物を伴うことになる。この種のリコンビナントタンパク質の生産は、とても高コストである。他方、脊椎動物系を用いてリコンビナントタンパク質を合成する場合、その産業利用、特に食品や医療で使用するにあたっては、そのリコンビナントタンパク質やそれを含む組成物において、ヒトへ伝達する病原性汚染物を有していないかを前もって検査することが必要となる。
【０００３】
リコンビナントタンパク質の生成が重要な経済的役割を有することからして、リコンビナントタンパク質を大量かつ低コストで生成する新たな方法や、主としてタンパク質が生医学目的に使用する場合には汚染問題を避けるためヒトから十分に遠い生物を使用する新たな方法が必要という技術状況にある。また、前記リコンビナントタンパク質が繊維状の場合、タンパク質が編糸状に組織化されることを可能にするリコンビナントタンパク質を生成する新たな方法の必要もある。生産物が高度のものとなるためには、タンパク質を特に組織内で合成し、動物、好ましくは無脊椎動物の外に移出しなければならない。
【０００４】
しかしながら、出願人の知る限り、上記の要求を満たすことのできる無脊椎動物は存在しない。例えばカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の遺伝子導入法は良く知られている。
【非特許文献１】Ｔａｍａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｌ．  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １８，  ２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、この方法を使用しても、いまだ、リコンビナントタンパク質の生産物を大量に生成できるには至っていない。
そこで、出願人は、特に無害性の上の弱点や従来のシステムの高コストを克服する発現システムの開発に労力を投入した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、この種のリコンビナントタンパク質発現システムを提供するものである。
本発明は、特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｅｒｉｃｉｇｅｎｉｃ  ｇｌａｎｄｓ）の細胞内における有用タンパク質の発現を指示する核酸に関するものであって、この核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％は塩基配列が同一であり、また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしている。
【０００７】
また、本発明は、上記に記載の核酸の制御下に位置する有用ポリヌクレオチドからなる発現カセットに関するものであって、この有用ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするセンスポリヌクレオチドである。
【０００８】
また本発明は、遺伝子組込み型リコンビナントベクターに関するものであって、そのベクターは、上記に記載の核酸または発現カセットや、前記核酸または前記発現カセットをそのゲノムに組み込むことで修飾された宿主細胞を含む。さらに、本発明の目的は、ヒト以外のトランスジェニック動物を得るため、上記に記載の核酸、発現カセット、リコンビナントベクターまたはリコンビナント宿主細胞を使用するところにある。
【０００９】
また、本発明は、核酸、発現カセット、リコンビナントベクターまたはリコンビナント宿主細胞をそのゲノムを組み込むことで修飾されたヒト以外のトランスジェニック動物を得るための方法に関するものである。
【００１０】
また本発明は、特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺におけるフィブロインＨ鎖の合成を減少させる有用ＲＮＡ発現を指示する核酸に関するものであって、この核酸は、特に前記絹糸細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域を有しており、この核酸は、配列番号１の第１１５０〜１４５２位塩基配列のポリヌクレオチドと、少なくとも９０％は塩基配列が同一である。
【００１１】
このような核酸は、「本発明による補足的な核酸」との見出しがなされた部分でより詳細に記載される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、カイコガの絹糸腺は、大量のタンパク質を生成し、それを精製される絹の繭に移出することが可能な「バイオリアクター」として使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明によれば、これまでのところ、
（ｉ）適切な転写プロモータ部位となるＳＧＦ１「フォークヘッド」型の転写因子の標的ヌクレオチドモチーフのコピーを一つ以上含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記調節領域の制御下に置かれて修飾シグナルペプチドをコードする領域とを含む核酸は、
特に鱗翅目のカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞における有用タンパク質の合成を指令することが可能であることが示されたが、これは、前記有用タンパク質をコードする塩基配列が、前記修飾シグナルペプチドをコードする塩基配列と「同位相で」融合する場合に可能である。
【００１４】
本発明によると、修飾シグナルペプチドをコードする配列の最終コドンの３’末端に局在するヌクレオチドが有用タンパク質をコードする配列の最初のコドンの５’末端に位置するヌクレオチドの前にある場合に、有用タンパク質をコードする塩基配列は、前記修飾シグナルペプチドをコードする塩基配列と「同位相で」融合する。
【００１５】
驚くべきことに、出願人は、絹糸繊維のプリプロプロテイン・フィブロヘキサメリン（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｉｂｒｏｈｅｘａｍｅｒｉｎ）に含まれるシグナルペプチドのシステインコドンを、アラニン、イソロイシンはもちろんロイシンような疎水性アミノ酸に置換すると、前記修飾ペプチドと融合したタンパク質を、絹糸を構成するタンパク質として、カイコガの絹糸腺の外へ移出させられることを示した。
【００１６】
本発明の目的は、特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺の細胞内における有用タンパク質の発現を指示する核酸に関するものであって、
この核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％は塩基配列が同一であり、また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしている。本発明による核酸およびポリペプチドは、単離された状態か精製された状態であるのが好ましい。
【００１７】
本発明の「単離された」という用語は、本来的環境（それが自然に見つかる環境）から抽出した状態の生物学的材料を意味する。例えば、生物内で自然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されているとはいえない。同じものでも、生物のゲノムに自然に挿入されている付近の核酸から分離したポリヌクレオチドは、単離している。この種のポリヌクレオチドは、ベクターに含まれており、（あるいは）そのようなポリヌクレオチドは、組成物に含まれているにもかかわらず単離された状態で残存するが、これはベクターまたは組成物がその天然環境を構成しないためである。天然環境から抽出されたポリペプチドにも同じ理由が当てはまる。
【００１８】
「精製された」という用語は、物質が絶対的な精製状態すなわち他の化合物を含有しない状態で存在することは必要としない。これは相対的な定義である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、出発物質または天然物質から少なくとも１桁、好ましくは２桁か３桁、さらに好ましくは４桁か５桁の精製の後には「精製された」状態にある。
【００１９】
本発明の目的においては、「塩基（ヌクレオチド）配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を示すのに区別なく用いられることがある。「塩基（ヌクレオチド）配列」という表現は、遺伝物質それ自体を包含するのであり、それゆえその配列に関する情報だけに限定されるものではない。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「塩基配列」という用語は、それが一本鎖状か二重鎖状かとは関係なしに、一つ以上のヌクレオチドのＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡの配列、さらにはハイブリッドのＲＮＡやＤＮＡ配列を含む。
【００２０】
「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）を示す。
【００２１】
本発明においては、第１のヌクレオチド配列の塩基がそれぞれ対向方向の第２のヌクレオチド配列の塩基と対となる場合、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと「相補的」であるとみなしている。
相補的「塩基」とは、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、ＣとＧである。
【００２２】
本発明によると、基準となる第２の核酸と少なくとも９０％が同一である第１の核酸は、前記の基準となる第２の核酸と少なくとも９０％、好ましくはアミノ酸配列において少なくとも９１％、  ９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．３％、９８．６％、９９％、９９．６％同一である。本発明の意味付けにおける二つの核酸配列の間の「パーセント一致率」の意味は、最適配置にある二つの配列を比較して決められ、比較ウィンドウに表示される。
【００２３】
そこで、比較ウィンドウ中の塩基配列部分は、二つの配列の最適配置を得るために、（追加部分や削除部分を含まない）基準配列との比較では、追加部分や削除部分（例えばギャップ）を含むことになる。パーセント一致率は、二つの配列を比較して同じ塩基が観察された位置数を判定し、二つの塩基が等しくなった位置数を比較ウィンドウ内の合計位置数で割り、それから二つの塩基配列のパーセント一致率を得るためその結果を１００倍することで計算される。
【００２４】
この比較のための配列の最適配置は、既知のアルゴリズムによるコンピュータを使用してなされる。
【００２５】
より好ましい方法においては、配列のパーセント一致率は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗソフトウェア（バージョン１．８２）を使用して以下の設定によって判定される。
すなわち、（１）ＣＰＵ  ＭＯＤＥ＝ＣｌｕｓｔａｌＷ  ｍｐ；（２）ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝“ｆｕｌｌ”；（３）ＯＵＴＰＵＴ  ＦＯＲＭＡＴ＝“ａｌｎｗ／ｎｕｍｂｅｒｓ”；（４）ＯＵＴＰＵＴ  ＯＲＤＥＲ＝“ａｌｉｇｎｅｄ”；（５）ＣＯＬＯＲ  ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ＝“ｎｏ”；（６）ＫＴＵＰ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（７）ＷＩＮＤＯＷ  ＬＥＮＧＴＨ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（８）ＳＣＯＲＥ  ＴＹＰＥ＝“ｐｅｒｃｅｎｔ”；（９）ＴＯＰＤＩＡＧ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１０）ＰＡＩＲＧＡＰ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１１）ＰＨＹＬＯＧＥＮＥＴＩＣ  ＴＲＥＥ／ＴＲＥＥ  ＴＹＰＥ＝“ｎｏｎｅ”；（１２）ＭＡＴＲＩＸ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１３）ＧＡＰ  ＯＰＥＮ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１４）ＥＮＤ  ＧＡＰＳ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１５）ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＳＩＯＮ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１６）ＧＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ＝“ｄｅｆａｕｌｔ”；（１７）ＴＲＥＥ  ＴＹＰＥ  ＝“ｃｌａｄｏｇｒａｍ”  ａｎｄ（１８）ＴＲＥＥ  ＲＡＰ  ＤＩＳＴＡＮＣＥＳ  ＝“ｈｉｄｅ”。
【００２６】
本発明による核酸と少なくとも９０％が一致している核酸は、本発明の核酸の「変種」を含んでいる。
【００２７】
本発明の核酸の「変種」とは、基準核酸を基準とした一つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加もしくは削除によって、基準核酸とは異なった核酸のことである。本発明による核酸の変種は、自然に存在する対立遺伝変種のような天然起源のものでありうる。また、このような核酸変種は、例えば突然変異誘発方法によって得られた非自然の核酸でもありうる。
【００２８】
一般に、基準核酸と変種核酸とがかなり類似した塩基配列を有しており、いくらかの同一の領域を有しているので、基準核酸と変種核酸との違いは少なくなっている。
【００２９】
本発明による調節核酸変種は、配列番号１の第１３７９〜１３９０位塩基配列の領域とでは１００％のヌクレオチド一致率を持つ。そして、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドに相当する本発明による調節核酸変種のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしている。
【００３０】
そこで、本発明による調節核酸では、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、以下から選択される。
すなわち、
（ｉ）アミノ酸アラニンをコードするトリヌクレオチド（ＧＣＵ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ）、
（ｉｉ）アミノ酸イソロイシンをコードするトリヌクレオチド（ＡＵＵ、ＡＴＴ、ＡＵＣ、ＡＴＣ、ＡＵＡ、ＡＴＡ）、
（ｉｉｉ）アミノ酸ロイシンをコードするトリヌクレオチド（ＣＵＵ、ＣＴＴ、ＣＵＣ、ＣＴＣ、ＣＵＡ、ＣＴＡ、ＣＵＧ、ＣＴＧ）。
【００３１】
本発明による調節核酸の変種は、鱗翅目の後部絹糸腺の細胞で所定ポリヌクレオチドの発現を指令する能力を保存する。配列番号１と塩基配列が９０％同一である核酸も含めた本発明による核酸の変種の機能特性を検証するため、当技術分野における専門家は実施例に記述されているようにレポーターまたはマーカー遺伝子による選択的発現テストを実施できる。
【００３２】
本発明の意味における「有用ポリヌクレオチド」とは、修飾シグナルペプチドと有用ポリペプチドとのポリペプチド融合合成を指示することが可能なポリヌクレオチドを意味する。
【００３３】
本発明による核酸は、プロモーター機能を備えた配列を有するのであって、このプロモーターは、特に鱗翅目の後部絹糸腺の細胞における有用ポリヌクレオチド発現を指示する制御シグナルを構成する。
【００３４】
本明細書において、「プロモーター」機能を有する核酸は、「プロモーター」、あるいは「プロモーター配列」とも呼ばれるのであって、ＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフ、より具体的には当技術分野における専門家にとっては良く知られた「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを有する核酸からなる。
【００３５】
本発明によれば、配列番号１の核酸は、特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現に必要な調節配列を有することが示された。この特性は、発現がカイコガの後部絹糸腺細胞に限定されていないＴａｍｕｒａによる調節配列では観察されていないものである（Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｌ．  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｉｇｇｙＢａｃ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １８，  ２０００）。また、本発明によれば、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドを５’末端から３’末端へ備えた核酸は、特にカイコガの後部絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現を指令できることも示された。
【００３６】
配列番号１は、５’末端から３’末端へ、第１〜１４５１位の塩基配列に、フィブロヘキサメリン遺伝子のプロモータを備えている。このプロモーターは、配列番号１の第１４２０〜１４２３位塩基配列に位置する「ＴＡＴＡ」ボックスを備えている。また、このプロモーターは、配列番号１の第１２５２〜１３６５位塩基配列に位置する「ＣＡＡＴ」ボックスも備えている。それから、このプロモータ配列は、配列番号１の第１３７９〜１３９０位塩基配列に位置する「ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」配列を備えている。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位から一般に約３０塩基離れたところに位置するプロモーターエレメント自体を構成する。ＣＡＡＴボックスは、ｉｎ  ｃｉｓで作用するエレメントであって、これはプロモーターおよびアクティベーター領域（「エンハンサー」）で共通に見られる。配列番号１は、修飾シグナルペプチドをコードする第１４５２〜１５２５位塩基配列におけるフィブロヘキサメリンのエクソン１を構成する。
【００３７】
配列番号１は、第１５２６〜２０２６位塩基配列においてフィブロヘキサメリンのイントロン１を含んでいる。配列番号１は、第２０２７〜２０４０位塩基配列において一つのポリヌクレオチドを含んでいる。この後者のポリヌクレオチドは、本発明にとって必ずしも必要ではないのであって、第２０４１〜２７２１位塩基配列においてリポータータンパク質「ＤｓＲｅｄ」をコードするポリヌクレオチド配列番号１の構成を促進するに過ぎない。
【００３８】
（ｉ）配列番号１の第１〜１４５１位塩基配列の転写調節領域あるいは、上記ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴボックスおよび一つ以上の「ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」配列を含むこの核酸の生物学的な活性フラグメントと、
（ｉｉ）かかる核酸の制御下にある修飾シグナルペプチドをコードする領域とを含む核酸は、
本発明の別の目的を構成する。
【００３９】
本発明により、上記のフィブロヘキサメリンのエクソン１は、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列に位置するトリヌクレオチドの修飾を有しているはずなので、有用ポリヌクレオチドによるコードがなされたポリペプチドの位置は正しいとともに、有用ポリヌクレオチドによるコードがなされたポリペプチドは絹糸とともに分泌することが示された。システインをコードする配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列に位置するトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれたアミノ酸をコードするトリヌクレオチドへと修飾されなければならない。本発明によれば、配列番号１の完全なあるいは最も限定的な部分を構成するＤＮＡ構造の実現により、本発明の核酸は、特にカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現を指示することが示された。また、ＤｓＲｅｄリポーター遺伝子が存在することにより、フィブロヘキサメリンのエクソン１の修飾により、有用ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの正しい分泌も可能となる。
【００４０】
リポーター遺伝子、すなわち上記調節核酸の制御下に置かれたＤｓＲｅｄタンパク質の遺伝子をコードする有用ポリヌクレオチドを含む発現カセットは、所定組織調節シグナル、修飾されたフィブロヘキサメリンのエクソン１、フィブロヘキサメリンのイントロン１全体、およびプロモータ機能を有する核酸を有する。
【００４１】
これらの発現カセットは、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）細胞の形質転換、より厳密には、リポーター遺伝子が種々の動物組織で発現した後のトランスジェニック動物を使用する配偶子先駆体の形質転換に使用されてきた。この結果は、特定の組織の転写活性およびカイコ後部絹糸腺細胞における強発現に必要な調節信号は、特に配列番号１の１１５０〜２０２６位塩基配列の領域に含まれているということを示す。
【００４２】
より具体的には、本発明によると、この領域は、配列番号１の１３７９〜１３９０位塩基配列において「ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」（配列番号２）というモチーフを含むことが示された。このモチーフは、ＳＧＦ１フォークヘッド型転写因子結合部位を構成する（Ｊｕｌｉｅｎ，  Ｅ−，  Ｂｏｒｄｅａｕｘ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｇａｒｅｌ，  Ａ．  ＆  Ｃｏｕｂｌｅ，  Ｐ．  （２００２  Ｆｏｒｋ  ｈｅａｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｒｉｖｅｓ  ｓｔａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋ  ｇｌａｎｄ  ｏｆ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２，  ３７７  ３８７））。
【００４３】
いかなる理論にも拘束されることを意図しないが、発明者は、「ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」というモチーフは、転写配列アクティベーター機能（「エンハンサー」）および特定組織発現調節機能）を有する、本発明の核酸の重要な構造特性を構成すると考えている。
【００４４】
本発明によれば、フィブロヘキサメリンのプロモーターに通常含まれるモチーフよりも上流側にある新しい「ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」モチーフは、有用ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド発現率を選択性を変えることなしに増大させる。
【００４５】
ｐｉｇｇｙＢａｃ組み込みベクターが有するＤＮＡを動物卵へマイクロインジェクトした後に得られたカイコのゲノムに導入すると、フィブロヘキサメリン遺伝子のエクソン１の修飾が、同等な有用タンパク質の絹フィラメント中への分泌に指定替えすることが可能にされた。言い換えると、有用ポリヌクレオチドが、フィブロヘキサメリン遺伝子のエクソン１の３’末端と同位相で融合する場合、修飾シグナルペプチドをコードするフィブロヘキサメリン遺伝子のエクソン１の修飾は、フィブロヘキサメリンの分泌と等しい有用タンパク質の分泌を保つ。
【００４６】
本発明によれば、「ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」モチーフを二量化して、それ故、特性の変更なしに有用ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド発現を強化するために、配列番号１０または配列番号１１のモチーフをフィブロヘキサメリンのプロモーターに組み込むことができる。配列番号１０および配列番号１１は、それぞれ天然のヌクレオチド環境に囲まれた上記の「ＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＡ」モチーフを含む。
【００４７】
同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）の他の発現アクティベーター配列は、フィブロヘキサメリンプロモーターに組み込むこともできる。例えば、当技術分野における専門家に良く知られた酵母のＧａｌ４／ＵＡＳシステムに相当する配列を挙げることができるが、これについては詳細には説明しない。また、カイコの細胞質アクチン遺伝子の増幅器に相当する配列について挙げることができる（Ｍａｎｇｅ  Ａ．  Ｊｕｌｉｅｎ  Ｅ．  Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ  ＪＣ．  ａｎｄ  Ｃｏｕｂｌｅ  Ｐ．  Ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＢＲＥ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ３  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｔｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｆ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９７  Ｊａｎ  ２４；  ２６５（３）：  ２６６−７４、およびＦａｔｙｏｌ  Ｋ．，  Ｉｌｌｅｓ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｚａｌａｙ  Ａ．Ａ．  Ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｍｂｙｘ  Ａ３  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｃｔｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ；  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９９  Ｍａｒ．  ２６１  （２）：  ３３７−４５）。最後に、バキュロウィルスＩＥ１／Ｈｒ５またはＨｒ３の増幅システムに相当する配列についても言及することができる。（Ｌｕ  Ｍ．，  Ｆａｒｒｅｌｌ  Ｐ．Ｊ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｒ．  ａｎｄ  ｌａｔｒｏｕ  Ｋ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９７  Ｄｅｃ  ５；  ２７２  （４９）：  ３０７２４−８）。
【００４８】
本発明による調節核酸。
本発明の目的は、有用タンパク質発現を指令する核酸に関するものであって、とりわけカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞におけるものに関する。この核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域、とりわけ前記絹糸腺細胞におけるもの、と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％は塩基配列が同一であり、
また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしている。
【００４９】
本発明の第１実施例によると、上述の核酸に特有のものとして、前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域、とりわけ前記絹糸腺細胞におけるものと、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、配列番号１の第１１５０〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドを含み、また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしていることを特徴としている。
【００５０】
前記核酸に関する本発明の第２実施例によると、前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、
（ｉ）特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域と、
（ｉｉ）前記転写調節領域の制御下に位置する修飾シグナルペプチドをコードする領域とで構成されるが、
前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、配列番号１の第１〜２０２６位塩基配列のポリヌクレオチドを含み、また、配列番号１の第１４８６〜１４８８位塩基配列のトリヌクレオチドは、アラニン、イソロイシン、ロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸をコードしていることを特徴としている。
【００５１】
本発明の第３実施例によると、本発明の核酸は、例えば、配列番号１の第１〜１３７９位塩基配列の間に配列番号２のポリヌクレオチドの１つ以上４つ以下のコピーを導入することにより修飾された上述の核酸で構成される。配列番号２のポリヌクレオチドのコピーを導入する場合、配列番号１の第１〜１３７９位塩基配列の間、特に第１３７８〜１３７９位塩基配列間に配列番号１０または配列番号１１の塩基配列を挿入できる。また本発明は、その配列が上述の核酸のいずれか一つの配列と相補的な核酸に関するものである。
【００５２】
既に述べた通り、本発明により追求する目的の一つは、有用ポリヌクレオチドによりコードされるカイコの後部絹糸腺細胞におけるポリヌクレオチドの高効率発現を得るところにある。
【００５３】
さらに、本発明の目的は、本明細書に記載のように、有用ポリペプチド発現指示の調節核酸と融合した、有用ポリペプチドをコードする有用ポリヌクレオチドを含む核酸を、とりわけカイコの後部絹糸腺細胞において、提供するところにある。有用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する核酸は、本発明では「発現カセット」とも表される。
【００５４】
さらに、本発明の目的は、上述の調節核酸の制御下にある有用ポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供することにある。
【００５５】
本発明による発現カセット。
第１実施例によれば、本発明による発現カセットは、ポリペプチドをコードする有用ポリヌクレオチドを特徴とする。
【００５６】
あるいは、有用ポリヌクレオチドは、Ｎ末端からＣ末端側へ、
−少なくともフィブロインＬ鎖ポリペプチド配列の１７２Ｎ末端アミノ酸（Ｔａｎａｋａ  Ｋ．，  Ｋａｊｉｙａｍａ  Ｎ．，  Ｉｓｈｉｋｕｒａ  Ｋ．，  Ｗａｇａ  ５．，  Ｉ  ｉｋｕｃｈｉ  Ａ，  Ｏｈｔｏｍｏ  Ｋ．，  Ｔａｋａｇｉ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｍｉｚｕｎｏ  Ｓ，  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｎｔａ  １４３２  （１９９９）  ９２−１０３）と、
−有用ポリペプチドと
を有する融合ポリペプチドをコードする。
【００５７】
好ましくは、有用ポリペプチドは、例えばクモスピドロイン（ｓｐｉｄｅｒ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ。Ｎｅｐｈｉｌａ属）、ガレリアフィブロイン、あるいはその伸強度または弾性性質が改良された絹フィラメントを得ることが可能な他のポリペプチドのようなタンパク質から選択される。
【００５８】
また、有用ポリヌクレオチドは、例えばホルモン、抗原、酵素、成長因子、あるいはレセプターといった生医学用の可溶性ポリペプチドをコードすることもできる。
【００５９】
特に、有用ポリヌクレオチドは、ヒトインターロイキン２をコードすることもできる。
【００６０】
本発明による発現カセットは、組込部位にかかわらず有用ポリペプチドを発現させることを意図して、一端あるいは両端がインシュレーターで囲むことができる。インシュレーターの例としては、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のジプシーインシュレーター（Ｇｅｒａｓｉｍｏｖａ  Ｔ．Ｉ．  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ  Ｖ．  Ｇ．：  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ．  Ｃｅｌｌ  １９９８，  ９２：  ５１１−５２１）や、ｓｃｓ／ｓｃｓ’（Ｋｅｌｌｕｍ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｄｌ  Ｐ．  １９９１  Ａ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  ６４：  ９４１−９５０）や  、さらには鶏ベータグロビン遺伝子の５’Ｈ  Ｓ４インシュレーター（Ｃｈｕｎｇ  Ｊ．Ｈ．，  Ｂｅｌｌ  Ａ．  ｃ．  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ．  （１９９７）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ９４：  ５７５−５８０）があげられる。
【００６１】
本発明によるリコンビナントベクター。
本発明は、上記の調節核酸または発現カセットを含む遺伝子組込みリコンビナントベクターに関するものである。本発明は、本発明による調節核酸が挿入されるリコンビナントベクターに存するのであって、有用ポリヌクレオチドがその制御下にある場合に特にカイコの後部絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現を可能にする調節シグナルを含む。
【００６２】
また、
ａ）本明細書に記載の調節核酸と、
ｂ）前記ａ）に記載の調節核酸の制御下にある有用ポリヌクレオチドと、
を含む遺伝子組込みリコンビナントベクターも、本発明の一部である。
【００６３】
有用ポリヌクレオチドは、検出可能なポリペプチドまたはマーカーポリペプチド（例えばＤｓＲｅｄタンパク質をコードするポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００６４】
上記定義に対応する本発明の遺伝子組込みリコンビナントベクターは、Ｐｉｇ  ｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）である（２００３年２月２０日にパスツール研究所のＣＮＣＭに寄託し、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２９７５号を取得）。
【００６５】
また、本発明は、上記に記載のような遺伝子組込みリコンビナントベクターの塩基配列を含むリコンビナントクローンベクターに関するものである。
【００６６】
本発明による調節配列のいずれかの一つを得るため、実施例に記載の技法やプライマーを使用することが可能である。また、当技術分野における専門家は、Ｐｉｇ  ｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３−  ＦＰ）を使用することもできる（２００３年２月２０日にパスツール研究所のＣＮＣＭに寄託し、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２９７５号を取得）。
【００６７】
本発明によるリコンビナントベクターの一般的な特徴。
本発明の「ベクター」は、任意の一本鎖状または二重鎖状の環状ＤＮＡまたはＲＮＡの分子を意味する。
本発明のベクターは、クローンベクターであるか、組込ベクターである。
【００６８】
本発明のある好ましい実施例によると、本発明のリコンビナントベクターは、ベクターＤＮＡ配列のコピーをカイコ種の動物のゲノムに挿入できる組込可能なベクターである。
【００６９】
好都合にも、リコンビナントベクター、あるいはその他の場合はベクターに含まれる発現カセットは、「ターミネーター」として知られる未翻訳の３’配列を含む。本発明の構成に使用されるターミネーターについては、ＳＶ４０ポリアデニル化配列があげられる。本発明による好ましい遺伝子組込みベクターは、この種に天然状態で存在するイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）から得られたトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃに由来する（Ｃａｒｙ，  Ｌ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ：  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ＩＦＰ２  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ＦＦ−ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７２，  １５６−６９  （１９８９））。
【００７０】
トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃは、転位によりゲノムの所定座から別の部位に移動することができるＤＮＡフラグメントを含む。これは、移動機能をコードする二つの短い逆向きの反復配列からなる左右の「足」を含む。
【００７１】
本発明による組込み可能なベクターは、取り除かれたトランスポゾン移動機能コード遺伝子の一部を有用核酸が置換した、修飾されたトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃである。
【００７２】
遺伝子組込みベクターは、遺伝子組込みベクターに抑制された可動性遺伝子（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｅｎｅ）の発現を可能にするヘルパーベクターとともに使用される。ヘルパーベクターと組み合わせた遺伝子組込みベクターは、転位に基づき本発明の核酸または発現カセットを宿主細胞のゲノムに組込むことを可能にする。
【００７３】
また、本発明の組込みベクターは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＨｏｂｏ配列あるいはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のトランスポゾンのＭｉｎｏｓに由来するものでありうる。
【００７４】
別の実施例によると、上記の遺伝子組込みベクターの塩基配列を増幅するために、リコンビナントクローンベクターが使用される。この別の実施例によると、上記遺伝子組込みリコンビナントベクターは、連結前に、レシーバーベクターのクローン部位またはポリサイトにおけるレシーバーベクターへの挿入に先立って、線状にされる。使用されるクローンベクターは、細菌性起源またはウィルス性起源である。例えば、当技術分野における専門家に知られたｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＳＫのようなプラスミドがその例であるが、ここでは詳細には記さない。
【００７５】
本発明によるリコンビナント宿主細胞。
本発明による調節核酸の制御下にある有用ポリヌクレオチドの発現を可能とするためには、本明細書に記載の調節核酸、発現カセット、あるいはリコンビナントベクターを宿主細胞に導入しなければならない。本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当技術分野における専門家に良く知られた方法を使ってｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。「核酸を含む宿主細胞」とは、一つ以上の核酸のコピーをそのゲノムに組み込んだ細胞のことをいう。
【００７６】
さらに、本発明の別の目的は、上記の調節核酸、発現カセット、あるいはリコンビナントベクターを含む宿主細胞にある。この宿主細胞は、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）、より具体的には系統には関係なくカイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）に属する動物細胞が好ましい。また、宿主細胞は、別の鱗翅目に属する種の動物細胞、例えばエリサン（Ｐｈｉｌｏｓｏｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）や、より一般的にカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）、Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、Ｇａｌｌｅｒｉａ属、Ｐｈｉｌｏｓａｍｉａ属、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属でありうる。
【００７７】
より好ましくは、本発明の宿主細胞は、カイコガの後部絹糸腺の細胞に存する。
【００７８】
本発明によるトランスジェニック動物。
さらに、本発明の他の目的は、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）の絹を産出するヒト以外のトランスジェニック動物を得るため、上記の核酸、発現カセット、ベクター、あるいはリコンビナント宿主細胞を使用するところにある。
【００７９】
好ましくは、このカイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）に属する前記トランスジェニック動物は、有用タンパク質を絹糸状で分泌する。また本発明は、上記の一つ以上の宿主細胞、発現カセット、リコンビナントベクターを含む多細胞のトランスジェニック生物にも関するものである。本発明の別の目的は、本明細書に記載のように、核酸または発現カセットをそのゲノムに組み込んだ形態のヒト以外のトランスジェニック動物である。
【００８０】
また本発明は、概して、トランスジェニック動物を得るために、上記の調節核酸、発現カセット、リコンビナントベクター、あるいは宿主細胞を使用することに関するものでもある。
【００８１】
また本発明は、フィブロインＬ鎖の分泌を欠如するヒト以外のトランスジェニック動物に関するものでもあるが、そのゲノムに、融合ポリペプチドをコードする有用ポリヌクレオチドを含む発現カセットを組み込んだ形態ものであって、そのポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端側に、
−少なくともフィブロインＬ鎖ポリペプチド配列の１７２Ｎ末端アミノ酸と、
−有用ポリペプチドと、
を含んでいる。
【００８２】
フィブロインＬ鎖を欠如するカイコは既知のものである。例えば、Ｎｄ−ｓ変種やＮｄ−ｓＤ変種があげられる（Ｋａｚｕｙｕｋｉ  Ｍｏｒｉ，  Ｋａｚｕｎｏｒｉ  Ｔａｎａｋａ，  Ｙｏｓｈｉｍｉ  Ｋｉｋｕｃｈｉ，  Ｍｉｈｏ  Ｗａｇａ，  Ｓｈｏｕ  Ｗａｇｅ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｅｋｉ  Ｍｉｚｕｎｏ  ：  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ａ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  −  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｎａｋｅｄ  ｐｕｐａ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｌｋｗｏｒｍ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９５）  ２５１，  ２１７−２２８）。
【００８３】
にもかかわらず、当技術分野における専門家は、フィブロインＬ鎖を欠如する動物を得るため、従来の遺伝子工学に頼ってきた。
【００８４】
例えば、フィブロインＬ鎖を欠如する動物を得たいと考える当技術分野における専門家は、カイコに突然変異を与え、フィブロインＬ鎖を欠如する動物を選別することができる。この突然変異には、従来のＵＶや化学的突然変異誘発や、フィブロインＬ鎖遺伝子に特定した突然変異法が含まれうる。
【００８５】
フィブロインＬ鎖を欠如する動物の選別は、繭に対してノーザンブロットやウエスタンブロットを行うことにより実施される。
【００８６】
あるいは、フィブロインＬ鎖を欠如する動物を生産したいと望む当技術分野における専門家は、ＲＮＡ干渉技術を利用することもできる。一般的に、絹糸腺（分泌腺）の後部細胞におけるフィブロインは、３つの異なったポリペプチド、すなわちＨ鎖（フィブロンＨ鎖）とＬ鎖（フィブロインＬ鎖）とフィブロヘキサメリン（ｆｉｂｒｏｈｅｘａｍｅｒｉｎ）とによる複合体である。フィブロインＨ鎖とフィブロインＬ鎖とのジスルフィド架橋による連鎖は、腺内部へのフィブロイン分泌に必須である。変種同型接合体のＮｄ−ｓまたはＮｄ−ｓＤにより生成されたフィブロインＬ鎖のＣ末端領域は、野生型により生産されたものとは異なっており、そしてこの変異フィブロインＬ鎖は、フィブロインＨ鎖とジスルフィド架橋できない（ジスルフィド結合に関与するシステインを含むエクソンのイントロン削除のためである）。この分泌欠如は、動物の生存率を変化させず、カイコ変種において、分泌腺の発達を遅らせることになるとともに、ほぼセリシンからなる高品位な繭（通常の繭と比較して、フィブロインが０．３％未満）の生産を可能にする。
【００８７】
このように、本発明は、フィブロインＬ鎖の分泌を欠如するヒト以外のトランスジェニック動物に関するものであり、そのゲノムに、融合ポリペプチドをコードする有用ポリヌクレオチドを含む発現カセットを組み込んだ形態であって、そのポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端側に、
−少なくともフィブロインＬ鎖ポリペプチド配列の１７２Ｎ末端アミノ酸と、
−有用ポリペプチドと、
を含んでいる。
【００８８】
本発明のこの実施例は、融合ポリペプチドにフィブロインＬ鎖の部位が存在するとともにこの動物が天然には生成するフィブロインＬ鎖が存在しないことによって、有用タンパク質の生成量が制御されるトランスジェニック動物の提供を可能にする。
【００８９】
本発明によるトランスジェニック動物は、上記に示した動物宿主細胞起源に関する種や属に属するのが好ましい。さらに、本発明の目的は、上記の核酸、発現カセット、またはベクターによりその発現が指令される有用タンパク質を含む繭にもあるのであって、この有用タンパク質は、繭１ｍｇあたり５ｎｇを上回り、好ましくは繭１ｍｇあたり７０ｎｇを越えて存在する。
【００９０】
実施例７に記載のプロトコルに従った本発明のトランスジェニック動物により、１〜１０μｇのヒトインターロイキン２を含む１４１ｍｇの繭が生成された。
【００９１】
さらに別の目的は、カイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のトランスジェニック動物を得る方法にあり、
この方法は、
ａ）卵が生み出された後で胞胚形成前１〜５時間において、上記核酸、発現カセット、またはベクターをカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵へ注入するステップと、
ｂ）本明細書に記載の核酸または発現カセットをそのゲノムに組み込んだトランスジェニック動物を選別するステップと、
を含むことを特徴とする。
【００９２】
さらに、本発明の別の目的は、カイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のトランスジェニック動物を得る方法にあり、この方法は前記の方法に加えて、
ｃ）ステップｂ）により得られた二つのトランスジェニック動物をそれぞれ交配させるステップと、
ｄ）導入遺伝子の同型接合体動物を選別するステップと、
を含むことを特徴とする。
【００９３】
さらに本発明の目的は、絹繊維を得る方法にもあり、この方法は、
ａ）本明細書に記載のトランスジェニック動物を繁殖させるステップと、
ｂ）トランスジェニック動物が産出した絹を回収するステップと、
を含むことを特徴とする。
【００９４】
さらに本発明の別の目的は、有用タンパク質を得る方法にあり、この方法は、
ａ）本明細書に記載のトランスジェニック動物を繁殖させるステップと、
ｂ）トランスジェニック動物が産出した絹を回収するステップと、
ｃ）絹繊維から有用タンパク質を回収するステップと、
を含むことを特徴とする。
【００９５】
本発明による補助核酸（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）。
本発明は、特に、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）後部絹糸腺細胞におけるフィブロインＨ鎖の合成を減少させる有用ＲＮＡの発現を指令する核酸に関するものでもあって、この核酸は、特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを含む転写調節領域を含んでおり、前記核酸は、配列番号１の第１１５０〜１４５１位塩基配列のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一の塩基配列を含んでいる。
【００９６】
この型の核酸は、本明細書の最初の部分に記された一般的定義、特に二つの配列のパーセント一致率の定義に従う。
【００９７】
絹糸腺細胞による外因性タンパク質の生成の成功は、とりわけ、タンパク質が合成のために移動可能となったタンパク質合成と関連性がある。このタンパク質の合成場所を移すことを可能にしたことに関係がある。
【００９８】
外因性タンパク質の発現率を最適化する一つの方法は、絹タンパク質の一つの発現を減少させることである。
とりわけ、フィブロインＨ鎖だけで絹糸腺から生成されるタンパク質の８０％となり、これは絹タンパク質の大部分である。そのような構造のため、絹繊維の生理化学的、機械的性質すなわち強度、弾性、難溶性に一定の役割を演じる。
【００９９】
このタンパク質を排除するとともにそれを既に述べたスピドロインやフィブロインＨ鎖Ｇａｌｌｅｒｉａ等の有用タンパク質で置換することにより、特に絹繊維の性質を改質することで、新たなバイオ材料を産出することができる。
【０１００】
絹糸腺後部におけるフィブロインＨ鎖遺伝子を安定に阻害するため、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）を使用した方法が好まれる。原核生物および真核生物の両者で検認されるこの一見、一般的な現象は、外因性二本鎖ＲＮＡの形成に対応したｍＲＮＡの減少による選択的で効果的な遺伝子阻害に存する。
【０１０１】
使用されうる有用なＲＮＡは、二重鎖ＲＮＡ、フィブロインＨ鎖のｍＲＮＡとの対合なしに二重鎖ＲＮＡを形成できるようなｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、または、フィブロインＨ鎖のｍＲＮＡとの対合を可能にするｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）でありうる。
【０１０２】
好ましくは、この有用ＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号１２である。
【０１０３】
この配列番号１２は、フィブロインＨ鎖遺伝子に由来する塩基配列の逆位反復組み合わせであり、実施例９に詳細に記載されている。
【０１０４】
発明者は、上記核酸を使用したカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の形質転換により、実施例９および図１３に示すように、フィブロインＨ鎖生成を十分に減少させることができることを発見した。このタンパク質合成の減少は、干渉ＲＮＡの原理、すなわち細胞内の二重鎖ＲＮＡの導入により引き起こされた転写後のプロセスに基づくものであって、配列選択的な方式により遺伝子の不活性化すなわち「無効化」にするものである。
【０１０５】
このような核酸により、特にフィブロインＨ鎖の生成が減少するが、これは絹繊維の組成に入り込む他のタンパク質の生成に影響を与えない。
【０１０６】
特定の理論に拘束されることは意図しないが、発明者は、所定ＲＮＡがヘアピン構造を形成してＲＮＡポリメラーゼを不安定化にすることでフィブロインＨ鎖の合成を減少させると考えている。
【０１０７】
カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のフィブロインＨ鎖合成率の減少は、本発明において、多大なる利益をもたらす。すぐ直前に記載した核酸は、有用ポリペプチドの発現を指令する核酸との組み合わせによって、その細胞が有用タンパク質の生成に転換された動物を提供することになる。本発明のこの実施例は、リコンビナントタンパク質を大量に生産するための産業的手段に対する利用要求を完全に満たす。トランスジェニック動物は、上記に記載した種々のタイプの核酸を含むが、より詳細に以下で説明する。好ましくは、本発明による核酸は、特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを有する転写調節領域を含み、前記核酸は、前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、配列番号１の第１１５０〜１４５１位塩基配列のポリヌクレオチドを含んでいる。
【０１０８】
好ましくは、本発明による核酸は、特に前記絹糸腺細胞における有用ポリヌクレオチド発現の調節シグナルを有する転写調節領域を含み、前記核酸は、５’末端から３’末端側へ、配列番号１の第１〜１４５１位塩基配列のポリヌクレオチドを含んでいる。
【０１０９】
本発明の別の目的は、配列番号１の第１〜１３７９位塩基配列間において配列番号２のポリヌクレオチドの１つ以上４つ以下のコピーを導入することにより形質転換された上記核酸にある。
【０１１０】
また本発明は、上記核酸と相補的な配列を有する核酸に関するものである。
【０１１１】
本発明による補助発現カセット。
本発明は、上記核酸の制御下にある有用ＲＮＡをコードする核酸を含む発現カセットに関するものである。
【０１１２】
好ましくは、この有用ＲＮＡは、配列番号１２の配列を有する核酸によりコードされる。
【０１１３】
本発明の発現カセットは、一端または両端がインシュレーターに囲まれることができ、これはその組込部位とは関係なしに有用ポリペプチドの発現をなさしめることを意図している。インシュレーターの例としては、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のジプシーインシュレーター（Ｇｅｒａｓｉｍｏｖａ  Ｔ．Ｉ．  ａｎｄ  Ｃｏｒｃｅｓ  Ｖ．Ｇ．  ：  Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ａｎｄ  ｔｒｉｔｈｏｒａｘ  ｇｒｏｕｐ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ，  Ｃｅｌｌ  １９９８，  ９２：  ５１１−５２１）や、ｓｃｓ／ｓｃｓ’（Ｋｅｌｌｕｍ  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｄｌ  Ｐ．  １９９１  Ａ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  ６４：  ９４１−９６０）や、５’Ｈ  Ｓ４インシュレーター（Ｃｈｕｎｇ  Ｊ．Ｈ．，  Ｂｅｌｌ  Ａ．  ｃ．  ａｎｄ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ  Ｇ．  （１９９７）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｉｎｓｕｌａｔｏｒ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ９４：  ５７５−５８０）が挙げられる。
【０１１４】
本発明による補助ベクター。
本発明の別の目的は、上記核酸または発現カセットを含む遺伝子組込みリコンビナントベクターである。
【０１１５】
そこで、本発明は、本発明の調節核酸が挿入されたリコンビナントベクターに存するのであって、ポリヌクレオチドがその制御下にある場合に、特にカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞におけるフィブロインＨ鎖の合成を減少する有用ＲＮＡ発現を可能にする調節シグナルを含んでいる。
また、
ａ）上記調節核酸と、
ｂ）ａ）の調節核酸の制御下にある有用ＲＮＡをコードする核酸と、
を含む遺伝子組込みリコンビナントベクターも本発明の一部を構成する。
【０１１６】
本発明の遺伝子組込みリコンビナントベクターは、上記「本発明のリコンビナントベクターの一般的性質」に記載のベクターの一般的定義に対応している。
【０１１７】
本発明は、上記遺伝子組込みリコンビナントベクターの塩基配列を含むリコンビナントクローンベクターに関するものである。
【０１１８】
本発明による調節配列のいずれかの一つを得るには、実施例に記載の技法やプライマーを使用することができる。当該技術の専門家は、ＤｓＲｅｄタンパク質の合成を指令する核酸配列のみを、フィブロインＨ鎖の合成を減少する所定ＲＮＡの合成を指令する配列に置換することができる。
【０１１９】
本発明のリコンビナント宿主細胞。
上記の調節核酸の制御下にありフィブロインＨ鎖の合成を減少させるＲＮＡの発現を可能にするためには、上記の調節核酸、発現カセット、またはリコンビナントベクターを宿主細胞に導入しなければならない。
【０１２０】
本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することは、当技術分野における専門家にとって既知の方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われうる。「核酸を有する宿主細胞」とは、一つ以上の核酸のコピーをそのゲノムに組み込んだ細胞のことをいう。  
【０１２１】
さらに、本発明の別の目的は、上記の調節核酸、発現カセット、さらにはリコンビナントベクターを含む宿主細胞にある。
【０１２２】
宿主細胞は、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）、より具体的には系統とは関係なしにカイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）に属する動物細胞が好ましい。また、宿主細胞は、別の鱗翅目に属する種の動物細胞、例えばエリサン（Ｐｈｉｌｏｓｏｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）や、より一般的にカイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）、Ａｎｔｈｅｒａｅａ属、Ｇａｌｌｅｒｉａ属、Ｐｈｉｌｏｓａｍｉａ属、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ属、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属でありうる。
【０１２３】
より好ましくは、本発明による宿主細胞は、カイコの後部絹糸腺細胞である。
【０１２４】
本発明による補助トランスジェニック動物。
さらに、本発明の目的は、カイコガ属（Ｂｏｍｂｙｘ）のトランスジェニック動物を得るために、上記の核酸、発現カセット、ベクターを使用することにある。
【０１２５】
好ましくは、このトランスジェニック動物はカイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）に属しており、有用タンパク質を絹糸状で分泌する。
【０１２６】
また本発明は、上記の一つ以上の宿主細胞、発現カセット、リコンビナントベクターを含む多細胞のヒト以外トランスジェニック生物に関するものである。
【０１２７】
本発明の別の目的は、ヒト以外のトランスジェニック動物であって、そのゲノムに下記を組み込んだ形で含むことを特徴とする。
（ｉ．）有用タンパク質の発現および分泌を指示する、明細書の最初の部分に記載の核酸、発現カセット、またはベクターと、
（ｉｉ．）フィブロインＨ鎖の合成を減少させる有用ＲＮＡの合成を指令する、
明細書の第２部分に記載の核酸、発現カセット、またはベクター。
【０１２８】
上記のトランスジェニック動物は、産業利用にとって非常に有用である。実際にかかる動物においては、フィブロインＨ鎖の合成の減少が、絹繊維の分泌に影響を与えずに有用タンパク質が合成されるように細胞資源を転用することを可能にする。本発明のこの実施例は、リコンビナントタンパク質を大量に生成する方法に対する利用要求を完全に満たす。
【０１２９】
また、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック動物に関するものであって、その動物は、
（ｉ．）フィブロインＬ鎖の分泌を欠如しており、
（ｉｉ．）少なくともフィブロインＬ鎖ポリペプチド配列の１７２Ｎ末端アミノ酸と有用ペプチドとの間における融合タンパク質の発現を指令する発現カセットをそのゲノムに組み込んだ形態で含んでおり、
（ｉｉｉ．）フィブロインＨ鎖の合成を減少させる有用ＲＮＡの合成を指令する、明細書の第２部分に記載の核酸、発現カセット、またはベクター、
を含む。
【０１３０】
本発明のこの特定の実施例は、本発明による利点を備えたトランスジェニック動物、すなわち、有用タンパク質の産出量が制御されるとともに細胞資源が有用タンパク質の合成へと振り向けられた動物を提供する。
このように、本発明は、リコンビナントタンパク質を多量に低コストで産出するために直ちに利用可能な方法を提供するものである。
【０１３１】
概して、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック動物を得るために、上記の調節核酸、発現カセット、リコンビナントベクター、さらには宿主細胞を使用することに関するものである。
【０１３２】
上記のトランスジェニック動物は、本発明の動物の宿主細胞の起源を考慮して、既に述べた種および属の動物であるのが好ましい。
【０１３３】
上記のトランスジェニック動物は、本明細書の第１部分に記載されたものと同等な方法により得ることができる。
【０１３４】
本願に記載の核酸を一つ以上含む動物を容易に識別できるようにするため、発明者は以下に記載の一群のプライマーを開発した。
【０１３５】
センスプライマーは、５’末端に、アラニン、イソロイシン、またはロイシンをコードするヌクレオチドに相当する３つのヌクレオチドを含有する。
【０１３６】
アンチセンスプライマーは、３’末端で相補鎖のセンスプライマーと結合するので、任意の手段で選択される。
【０１３７】
厳格な制御状態下におけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の際、プライマーにより、アラニン、イソロイシン、またはロイシンへのアミノ酸システインの変異を含むＤＮＡ配列の増幅のみがなされる。
【０１３８】
したがって、トランスジェニック動物は、野生型の動物には存在しないサザンブロットのバンドが存在することを特徴とする。
【０１３９】
塩基配列を増幅し、上記のプローブを使用してこの増幅の産出物中の変異されたシステイン残基の存否を検出するために、配列番号１３および配列番号１４を使用することができる。
【０１４０】
また、本発明は例示されるが、決して図面や以下の実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１４１】
実施例で用いられる一般的な材料および方法。
Ａ）材料。
使用された動物は、カイコガ種（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）であって、Ｕｎｉｔｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｓｅｒｉｃｏｌｅ（２５  ｑｕａｉ  Ｊｅａｎ−Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｒｏｕｓｓｅａｕ，  ６９３５０，  Ｌａ  Ｍｕｌａｔｉｅｒｅ，  Ｆｒａｎｃｅ）のＮｉｓｔａｒｉ系統に属する。これは、胎児期休眠なしで成長する多次繁殖の系統である。
クローニングに使用されるバクテリアは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社より入手可能なＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５  ａｌｐｈａ−Ｔｉ  Ｍａｘ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙである（４４００９７号）。
【０１４２】
Ｂ）方法。
＊動物の繁殖状態。
カイコは、動物囲いの「Ａｎｉｍａｌｅｒｉｅ  Ａ１」にて制御された状態、幼虫の日齢に応じて調節された温度（２２℃〜２５℃）、湿度７５％で育てられた。桑葉の粒状度に応じて調製された人工培地が供給された。
＊核酸の抽出。
プラスミド構造のＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社のＱｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（２７  １０６号）を用いて、バクテリアから抽出された。カイコのゲノムＤＮＡは、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールを用いて抽出された。
＊トランスジェニック動物の産出。
遺伝子組込みベクターの動物卵への注入は、卵が生み出された後で胞胚形成前の２〜５時間において、なされる。遺伝子組込みベクターおよび等量の「ヘルパー」ベクターは、５ｍＭのＫＣｌを含む０．５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製された。エッペンドルフマイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ  ５２４６）を使用して、１〜５ｎＬの前記溶液が注入された。インジェクションで生じた孔は、グルー（Ｌｏｃｔｉｔｅ  Ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ  ３，  Ｈｅｎｋｅｌ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｓ．Ａ．）を用いて塞ぐとともに、卵はその成長を継続するように２５℃に維持された。
＊トランスジェニック動物の選別。
Ｐｉｇｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）ベクターを有するトランスジェニック動物は、動物の目における３ｘＰ３−ＧＦＰ遺伝子の発現の早さにより選別された。
＊トランスジェニック動物にＤｓＲｅｄタンパク質が存在するかの検出テスト。
ＤｓＲｅｄタンパク質は、励起発光（５５８ｎｍ）装置および５８２ｎｍ発光フィルタおよびデジタルキャプチャ装置を備えたライカ蛍光拡大鏡（ＭＺＦＬ２）により、ｉｎ  ｓｉｔｕ（絹糸腺細胞）および繭にて視覚化される。繭の蛍光分析は乾燥状態で行われる。乾燥した絹糸腺はＰＢＳ中で拡大鏡にて観察された。ＤｓＲｅｄタンパク質の検出は、種々の発育段階、特に絹タンパク質を大量に合成する第５幼虫段階で行われた。
絹糸腺または絹繭から抽出したタンパク質に二重抗体、すなわちウサギの抗ＤｓＲｅｄ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，８３７０−１号）およびペルオキシダーゼに結合したヤギの抗ウサギ抗体（Ｂｉｏｒａｄ，１７０−６５１５号）を使用したウエスタンブロットにより検出が行われた。
＊絹糸腺、繭、およびカイコ繭毛羽からのサンプルにより行ったウエスタンブロットによるＤｓＲｅｄタンパク質の検出テスト。
ウエスタンブロットによるＤｓＲｅｄタンパク質の検出テストは、以下の複数のステップからなる。
−タンパク質のサンプルの抽出。
１／３の繭または一対の絹糸腺（貯留部から分離した分泌腺）を取り出し、マイクロチューブに移した。繭を粉々に破壊し、あるいは絹糸腺を１ｍＬの１０Ｍ  ＬｉＳＣＮ  中で粉砕し、それから攪拌装置を用いて定期的に撹拌しつつタンパク質抽出物を１時間以上室温にてインキュベートした。それからトリス緩衝液１０ｍＭ−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールに、タンパク質サンプルを４／５希釈した。
繭毛羽洗浄のために１５０μＬのＨ２０が加えられるマイクロチューブに繭または繭のブレーズ外皮を移した。超音波を１０分間抽出物に当てることにより、可溶性ＤｓＲｅｄタンパク質が得られた。
タンパク質抽出物を５分間、１００℃でＬａｅｍｍｌｉ  ５ｘ緩衝液に変性させることで、サンプルを調製した。
−電気泳動。
タンパク質抽出物をプリフォームゲル（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ  ｇｌｙｃｉｎｅ，１０ｗｅｌｌｓ，１．０ｍｍ）に負荷した。泳動バッファ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  Ｎｏｖｅｘ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０Ｘ））を使用して、１２０Ｖ、４０ｍＡで２時間３０分の間、タンパク質の泳動が行われた。
−タンパク質の転写。
タンパク質を９ｃｍ×６ｃｍのニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に転写した。使用されたワットマン紙のサイズは、１０ｃｍ×７．５ｃｍである。トランスファーバッファ（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ  （２５Ｘ））を使用して、１２０Ｖ、２５０ｍＡで１時間１５分の間、タンパク質の転写が行われた。
−ポンソーレッドによるタンパク質の染色。
転写タンパク質を視覚化するために、ニトロセルロース膜をポンソーレッド（Ｓｉｇｍａ）を使用して１分間インキュベートした。必要ならば、サイズマーカーバンドは、ペンを用いてマークしてもよい。
−膜のブロッキング。
前記膜をＰＬＴ（ＰＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎ−２％ｍｉｌｋ）に４℃で一晩インキュベートした。
−第１抗体とのインキュベーション。
第１抗体である抗ＤｓＲｅｄ抗体（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｏｌｏｒ  ＤｓＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をＰＬＴにて１／５００まで希釈し、室温で２時間インキュベートした。インキュベート後に、ＰＢＳ−０．０２％ｔｗｅｅｎで５分間、２回リンスした。
−第２抗体とのインキュベーション。
第２抗体（抗ウサギＩｇＧヤギ抗体（Ｈ＋Ｌ）、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ接合体、Ｂｉｏｒａｄ）は、ＰＬＴに１／３０００まで希釈するとともに、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後に、ＰＢＳ−０．０２％Ｔｗｅｅｎで１０分間、４回リンスした。
−膜の現像。
Ａ溶液（５ｍＬのＴｒｉｓ  １００ｍＭ、ｐＨ８．５，  ２２μＬのクマル酸、暗所で添加した５０μＬのルミノール）およびＢ溶液（５ｍＬのＴｒｉｓ  １００ｍＭ、ｐＨ８．５，  ３μＬのＨ２Ｏ２）。暗所にて溶液Ａと溶液Ｂの混合物を即座に調製し、それから溶液Ａ・Ｂ内にて１分間、発色のため前記膜をインキュベートした。前記膜をオートラジオグラフフィルムに３分間曝し、それからそのフィルムを現像した。
【０１４３】
実施例１：本発明の調節核酸の制御下にあってＤｓＲｅｄポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現カセットを含む遺伝子組込みベクターの構築、および特に配列番号１の一部を含む発現カセットの構築。
この構築の第１ステップは、図１Ａに示されている。この第１ステップには、２つのプラスミドが必要である。
まずはＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社により提供されたｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１であって（６９２１−１号）、これは５’末端から３’末端側に、
−ＣＭＶ  ＩＥプロモーターと、
−ＤｓＲｅｄ遺伝子と、
−ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−ｐＵＣプラスミドの複製起点と、
を含んでいる。
ＤｓＲｅｄタンパク質遺伝子は、制限酵素Ａｇｅ１およびＮｏｔ１の切断部位の間で両端を区切られている。
使用される第２プラスミドは、ｐｆｈｘ（ｓｐ＊）ＧＦＰと呼ばれ、５’末端から３’末端側に、
−修飾フィブロヘキサメリンのプロモーターと、
−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子と、
−ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−ｐＵＣプラスミドの複製起点と、
を含んでいる。
また、図１Ａに示すように、ｐｆｈｘ（ｓｐ＊）ＧＦＰプラスミドも、フィブロヘキサメリン遺伝子プロモーター配列の下流側に置かれた２つの制限酵素Ａｇｅ１およびＮｏｔ１の切断部位で区切られた塩基配列を含む。
ｐＤｓＲｅｄ１−Ｎ１から得られた、ＤｓＲｅｄタンパク質をコードする配列を含むＡｇｅ１・Ｎｏｔ１フラグメントは、Ａｇｅ１−Ｎｏｔ１切断部位でｐｆｈｘ（ｓｐ＊）ＧＦＰプラスミドにクローン化する。
このクローニングから生じたプラスミドは、ｐｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄと呼ばれ、図１Ｂに示されているが、５’末端から３’末端側に、
−修飾フィブロヘキサメリンのプロモーターと、
−ＤｓＲｅｄ遺伝子と、
−ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと、
−カナマイシン耐性遺伝子と、
−ｐＵＣプラスミドの複製起点と、
を含んでいる。
図１Ｂに示すように、修飾フィブロヘキサメリンのプロモーターとＤｓＲｅｄ遺伝子は、ＢｇｌＩＩ−ＮａｅＩ切断部位で区切られたフラグメントに含まれる。このフラグメントは、その構造が図１Ｂに示されるトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃに由来するｐＰｉｇＡ３ｃｙｐ６ａ２−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）２ベクターのＢｇｌＩＩ−ＳｔｕＩ間フラグメントの位置に、上記に記載と同じ方法を用いてクローン化される。このｐＰｉｇＡ３ｃｙｐ６ａ２−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）２ベクターは、図１Ｂに示すような、左足（Ｌ）と左足（Ｒ）を有している。この第２クローニングの端部で得られるベクターは、図１Ｃで示されるが、Ｐｉｇｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）と呼ばれ、本発明の遺伝子組み込みリコンビナントベクターの定義に当てはまる。
【０１４４】
実施例２：フィブロヘキサメリンのシグナルペプチドをコードする遺伝子のシステインコドンをイソロイシンコドンに置換する方法。
使用された方法は、図２に示されており、いくつかのステップからなる。まず最初に、フィブロヘキサメリンプロモーターのフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ消化により切り出す。第２ステップ、すなわち図２Ａ中でＰＣＲ１と名づけられたステップにおいては、配列番号４および配列番号５のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う。第３ステップは図２Ａ中でＰＣＲ１と名づけられているが、配列番号６および配列番号７のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う。配列番号５および配列番号６のプライマーは、フィブロヘキサメリンの天然シグナルペプチドのシステインコドンを置換するためのイソロイシンコドンを含む。それから増幅した核酸が連結され、図２Ｂに示すように、制限酵素のＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩ切断部位で区切られた配列の核酸が得られる。前記核酸は、太字で図２Ｂに示されるイソロイシンコドンを含んでおり、天然のシステインコドンを置き換える。それからフラグメントは、ｐｆｈｘ（ｓｐ＊）ＧＦＰプラスミドの対応する天然配列に置き換えてクローン化される。
【０１４５】
実施例３：配列番号１の第１〜１２７９位塩基配列間において、ＳＧＦ−１／フォークヘッド転写因子を結合する配列番号２のポリヌクレオチドの３つのコピーを追加することによるフィブロヘキサメリンプロモーター修飾のプロトコル（このプロトコルは図３に示されている）。
第１ステップにおいては、フィブロヘキサメリンプロモーター配列のポリメラーゼ連鎖反応が行われる。
この増幅は、図３Ａに示されるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄプライマーを用いて行われる（Ｂプライマーは配列番号８、Ｃプライマーは配列番号９）。
第２ステップにおいては、得られた核酸は、図３Ｂに示される配列の核酸を得るため連結される。
得られた核酸は、配列番号２のポリヌクレオチドの３つのコピーの添加により修飾されたフィブロヘキサメリンのプロモーター配列の一部を含む。それから、この核酸は、ＨｉｎｄＩＩＩ・ＰｓｔＩの制限部位により範囲が定まるフィブロヘキサメリンプロモーターの天然配列の位置において、ｐｆｈｘ（ｓｐ＊）ＧＦＰプラスミドにクローン化される。
上記手順によって得られた配列番号３の図は、図４に示される。
配列番号３は、５’末端から３’末端側へ、
−フィブロヘキサメリン遺伝子のプロモーター（１）と、
−天然配列に加えたＳＧＦ１／フォークヘッド要素（３）の三つの付着配列（２）と、
−そのシステインコドンが修飾されるフィブロヘキサメリンエクソン１（４）と、
−フィブロヘキサメリンイントロン１（５）と、
−配列番号１の構造を補助（ヘルプ）するポリヌクレオチド（６）と、
−ＤｓＲｅｄレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド（７）と、
を含む。
【０１４６】
実施例４：配列番号１を構成するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに由来するｐＰｉｇＦｂｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３−ＧＦＰ）ベクターを使用した、トランスジェニックカイコの絹糸腺におけるＤｓＲｅｄタンパク質の蓄積。
図５に示す写真ａｂｃｄｅｆは、配列番号３を含むトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃに由来するベクターを使用したトランスジェニックカイコにおけるＤｓＲｅｄタンパク質の組織選択的な発現を示している。写真ａｂｃは、昼光下にて撮影しそれぞれ３倍拡大したものである。ＤｓＲｅｄタンパク質の存在の検出テストは、既に述べたプロトコルを使用してなされた。写真ｄｅｆは、写真ａｂｃと対応するものであるが、ＤｓＲｅｄタンパク質の蛍光スペクトルにて撮られた。
これらの写真から、ＤｓＲｅｄタンパク質の蛍光発光が確認でき、それ故にその発現がカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の後部絹糸腺細胞（写真中の２およびＰＳＧ）に限定されていることが確認できる。
ＤｓＲｅｄタンパク質に相当する蛍光発光は、中部絹糸腺細胞（写真中の１およびＭＳＧ）では観察されなかった。本発明の核酸は、特に鱗翅目の後部絹糸腺細胞における有用ポリペプチド発現を導くということが推論できる。
かかる結果は、図６に示されるウエスタンブロットによって確認できる。このウエスタンブロットは、既に述べた条件で行われたが、カイコの後部絹糸腺細胞におけるＤｓＲｅｄタンパク質の存在検出を支援する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４％；トリス−グリシン；０．１％ＳＤＳ）をニトロセルロース膜に移し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅで染色した。ニトロセルロース膜は図６Ａに示されている。それからこの同じ膜を第１の抗ＤｓＲｅｄポリクローナル抗体でインキュベートし、それから西洋ワサビペルオキシダーゼで複合化した第２の抗ウサギ−ヤギ抗体を使用してなされた。この結果は、図６Ｂに示されている。化学発光により検出されたバンドは、ＤｓＲｅｄタンパク質の存在を示す。
カイコの後部絹糸腺からの４つの検体は、図６Ａおよび図６Ｂの膜上に見られる。このタンパク質は既に述べたプロトコルを使用した絹糸腺から抽出されたものである。４つの検体は、以下の通りである。
トラック１：非トランスジェニックカイコの中部絹糸腺からのタンパク質。
トラック２：配列番号１に含まれる導入遺伝子に関してヘテロ接合のトランスジェニックカイコの中部絹糸腺からのタンパク質。
トラック３：非トランスジェニックカイコの後部絹糸腺からのタンパク質。
トラック４：配列番号１に含まれる導入遺伝子に関してヘテロ接合のトランスジェニックカイコの後部絹糸腺からのタンパク質。
図６Ａに示された膜は、それぞれのトラックでほぼ同等のバンド強度を示している。ほぼ同量のタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷されたという結論を導くことができる。また、膜は、その右側に可視的サイズマーカーも含んでいる。同じ膜に上記の抗体処理を施した結果が、図６Ｂに示されている。ＤｓＲｅｄタンパク質が後部絹糸腺にかなりの量で存在していることが観察される。また、ＤｓＲｅｄタンパク質は、中部絹糸腺にも存在しているが、より程度は低い。この存在は、後部絹糸腺細胞から分泌されたＤｓＲｅｄタンパク質が中部絹糸腺内に移動したためと発明者は考えている。
【０１４７】
実施例５：配列番号１を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンに由来するＰｉｇｆｈｘ（ｓｐ＊）ＤｓＲｅｄ−（３ｘＰ３  ＧＦＰ）ベクターを用いたトランスジェニックカイコのＤｓＲｅｄタンパク質の蓄積。
ＤｓＲｅｄタンパク質の存在の検出テストは、既に述べたプロトコルに従って行われた。図７に示すように、絹繊維はＤｓＲｅｄタンパク質の存在に対応して蛍光発光している。このことから、本発明の核酸は鱗翅目の絹中への有用ポリペプチドの分泌を誘導するということが推測される。
この結果は、図８に示すウエスタンブロットで確認できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１４％；トリス−グリシン；０．１％ＳＤＳ）をニトロセルロース膜に写し、ポンソーレッドで染色した。
ニトロセルロース膜は図８Ａに示される。この同じフィルタを第１の抗ＤｓＲｅｄポリクローナル抗体とともにインキュベートし、それから西洋ワサビペルオキシダーゼで複合化した第２の抗ウサギ−ヤギ抗体を使用してなされた。この結果は、図６Ｂに示されている。化学発光により検出されたバンドは、ＤｓＲｅｄタンパク質の存在を示す。カイコ繭からの９つのタンパク質検体は、図８Ａおよび図８Ｂに示された膜上で視認される。タンパク質は既に述べたプロトコルを使用して抽出された。
すなわち、
トラックＣ１およびＣ２：非トランスジェニックカイコ繭からのタンパク質。
トラックＴ１およびＴ２：配列番号１の導入遺伝子に関してヘテロ接合のトランスジェニックカイコ繭からのタンパク質。
膜の左側に示されているサイズマーカーから数えて６つの第１の検体群は、ブレーズと呼ばれる外包を取り除いたカイコ繭からのタンパク質に対応している。残り３つの検体は、カイコ繭のブレーズ外包を水洗浄して得られたタンパク質に対応している。図８Ａに示す膜から、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに最初に負荷したタンパク質の量はほぼ等しいことが観察できる。上記の処置を施した同じフィルタは、図８Ｂに示される。ＤｓＲｅｄタンパク質は、トランスジェニックカイコ繭ブレーズ外包の洗浄から得られた分画部にかなりの量が存在していることが分かる。このことから、本発明の核酸は鱗翅目の絹において有用ポリペプチドの分泌させるということが推測される。
【０１４８】
実施例６：実施例１に記載の構造を用いたトランスジェニックカイコの絹繊維表面のＤｓＲｅｄタンパク質の蓄積。
図９は、走査電子顕微鏡で観察した繊維表面におけるＤｓＲｅｄタンパク質の存在を示している。このタンパク質は、種々のサイズ（凝集塊の数に応じて異なる）で繊維を覆う球粒子の形態で現れている。
トランスジェニックカイコ繭を水溶液で湿らせてから、（一般的なブラッドフォード法を用いて）上澄のタンパク質濃度測定を行ったが、繭一つあたり約１００μｇのＤｓＲｅｄが存在することが判明した。
図９から、非繊維状のＤｓＲｅｄタンパク質は、分泌過程で絹繊維の外面へ送られたことが分かる。この現象により、非繊維状の有用タンパク質の抽出が容易になる。同じ結論は、実施例７に記載のヒトインターロイキン２の産出物の場合にも導かれる。
【０１４９】
実施例７：ヒトＩＬ−２の産出。
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を分泌するトランスジェニックカイコの産出。
ＩＬ−２をコードする遺伝子は、実施例１に記載の遺伝子組込みベクターにおけるＤｓＲｅｄタンパク質をコードする遺伝子の代替となる。
トランスジェニック動物の選別。
トランスジェニック動物は、動物の目における３ｘＰ３−ＧＦＰ遺伝子の早期発現によって選別される。図１０は、ヘテロ接合のトランスジェニックカイコの繭における、本発明の核酸の制御下にあるＩＬ−２タンパク質の検出を示している。
トランスジェニック動物の絹糸腺または繭におけるＩＬ−２の検出テスト。
絹糸腺または繭より得られたタンパク質抽出物の検出は、二重抗体、すなわち抗１Ｌ２−ヒトポリクローナル抗体およびペルオキシダーゼと複合化した抗ウサギ−ヤギ抗体（Ｂｉｏｒａｄ，１７０−６５１５号）を用いたウエスタンブロット法により行われた。ウエスタンブロット法による外因性タンパク質検出テストは、タンパク質の抽出、電気泳動、転写および染色と、上記ＤｓＲｅｄタンパク質に関する材料・方法の部分の記述と同様な膜の撮像とのステップからなる。
タンパク質サンプルの抽出に相当するステップのみが、ＤｓＲｅｄタンパク質に関する記述と異なるので、以下に詳述する。
タンパク質サンプルの抽出。
１４１ｍｇの繭で開始する。
すなわち、
−４６ｍｇの繭は全体を抽出処理され（第１サンプル）、
−１９ｍｇの繭は外包ブレーズ（繭の外側包囲物）のみを抽出処理され（第２サンプル）、
−７６ｍｇの繭にはデガミング（繊維を覆うタンパク質であるセリシンの除去）を行って、一方が不溶性（第３サンプル）、
−他方が可溶性（第４サンプル）となった二つの分画が生じる。
サンプルの処理。
−第１サンプル：繭は小砕片にし室温でＬｉＳＣＮ  １０Ｍ（２５０μＬ）に１時間溶解し、それからトリス１０ｍＭ緩衝液−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールの４／５希釈を行った後で、室温で一晩、３７℃で３０分間、インキュベートした。
−第２サンプル：ブレーズ外包は、１時間、室温でＬｉＳＣＮ  １０Ｍ（２００μＬ）に溶解し、周囲温度で一晩、３７℃で３０分間インキュベートし、それからサンプルをトリス１０  ｍＭ緩衝液−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールで４／５希釈した。
−第３、第４サンプル：繭を１時間、１００℃で２ｍｌの石鹸水（７ｇ／Ｌ）にてインキュベートした（セリシンの除去）。可溶性分画（この除去されたセリシンを含む上澄）は、室温で一晩インキュベートした（第４サンプル）。不可溶性分画（フィブロインを含んでいる）は、周囲温度で一晩、ＬｉＳＣＮ  １０Ｍ（５００μＬ）に溶解し、それからサンプルをトリス１０ｍＭ緩衝液−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールで４／５希釈した（第３サンプル）。可溶性分画（セリシンを含む上澄）は、室温で一晩、インキュベートした（第４サンプル）。不可溶性分画（フィブロインを含んでいる）は、室温で一晩、ＬｉＳＣＮ  １０Ｍ（５００μＬ）に溶解し、それからサンプルをトリス１０ｍＭ緩衝液−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールで４／１希釈した（第３サンプル）。
電気泳動負荷に先立ち、タンパク質抽出物を含むサンプルをＬａｅｍｍｌｉ  ５ｘにて５分間、１００℃で変性させた。
以後のステップは、ＤｓＲｅｄについての記述と同じである。
図１０に示すウエスタンブロットは、サンプルのタイプとは関係なしに、ＩＬ−２タンパク質の存在を示した。
−トラック１：繭全体の抽出から得られたタンパク質（第１サンプル）。
−トラック３：ブレーズ外包の抽出から得られたタンパク質（第２サンプル）。
−トラック４：繭の不可溶性分画（フィブロイン）から得られたタンパク質（第３サンプル）。
−トラック５：繭の可溶性分画（セリシン）から得られたタンパク質（第４サンプル）。
−トラック２：第１サンプルと同じ条件で処理した対照繭（陰性対照）全体の抽出から得られたタンパク質。
−トラックＳ：１０ｎｇのヒトＩＬ−２を含む標準溶液。
このトラックＳを基準にして、繭あたりのＩＬ−２産出量の半定量的な評価が可能である。分析されたトランスジェニック系統による、この後者の繭あたりのＩＬ−２産出量は、１〜１０μｇの間で変化する。この実施例は、明らかに本発明が、医療用の分子、すなわちヒトインターロイキン産出の場合における有効性を有していることを示すものである。さらに、この生医学用の非繊維状タンパク質は、ＤｓＲｅｄタンパク質の場合の実施例６に既に示したように、その合成時に絹繊維の外面に送られるので、容易に精製できる。
【０１５０】
実施例８：ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）フィブロインＨ鎖の産出。
ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）のフィブロインＨ鎖（ＦｉｂＨＧｍ）を分泌するトランスジェニックカイコの産出。
実施例１に記載の遺伝子組込みベクターにおけるＤｓＲｅｄタンパク質をコードする遺伝子に代わって、ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）のフィブロインＨ鎖をコードする遺伝子が導入された。図１１は、ヘテロ結合のトランスジェニックカイコの絹糸腺（Ａ）または繭（Ｂ）における本発明の核酸の制御下にあるハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）のフィブロインＨ鎖タンパク質を示している。
トランスジェニック動物の絹糸腺または繭におけるハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）のフィブロインＨ鎖の検出テスト。
絹糸腺または繭から得られたタンパク質抽出物の検出は、二重抗体、すなわち抗ＦｉｂＨＧｍ−ヒトポリクローナル抗体およびペルオキシダーゼと複合化した抗ウサギ−ヤギ抗体（Ｂｉｏｒａｄ，１７０−６５１５号）を用いたウエスタンブロット法により行われた。ウエスタンブロット法による外因性タンパク質検出テストは、タンパク質の抽出、電気泳動、タンパク質の転写および染色と、上記のＤｓＲｅｄタンパク質に関する材料・方法の部分に記載の膜の撮像とのステップからなる。タンパク質サンプルの抽出に相当するステップのみが、ＤｓＲｅｄタンパク質に関する記述と異なるので、以下に詳述する。
タンパク質サンプルの抽出および処理
第５幼虫段階にあるトランスジェニック動物から取り出した一対の絹糸腺（貯留部から分離した分泌腺）をマイクロチューブに移し、粉砕して、５００μＬの１０Ｍ  ＬｉＳＣＮにて室温で２０分間、それから６０℃で１時間インキュベートした。それからサンプルをトリス１０ｍＭ緩衝液−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールで４／５希釈した。
小砕片にした繭（２０ｍｇ）は、６５℃で３０分間、ＬｉＳＣＮ  １０Ｍ（２５０μＬ）に溶解し、それから４／５トリス１０  ｍＭ緩衝液−２％ＳＤＳ−５％βメルカプトエタノールで希釈した。
電気泳動負荷に先立ち、タンパク質抽出物を含むサンプルをＬａｅｍｍｌｉ  ５ｘにて５分間、１００℃で変性させた。続くステップは、ＤｓＲｅｄについての記述と同じである。
−図１１に示すウエスタンブロットは、トランスジェニック個体の絹糸腺（貯留部および分泌腺）および繭におけるＦｉｂＨＧｍ（サイズ：１１５ｋＤａ）の存在を示しているが、このタンパク質は、非トランスジェニック動物から得られた、上記同じ条件で処理された対照サンプルには存在していない。
トラック１：トランスジェニック動物の絹糸腺の分泌部の抽出物から得られたタンパク質。
トラック２：トランスジェニック動物の絹糸腺の貯留部の抽出物から得られたタンパク質。
トラック３：トランスジェニック動物から得られた繭全体の抽出物から得られたタンパク質。
トラック１＊：対照動物の絹糸腺の分泌部の抽出物から得られたタンパク質。
トラック２＊：対照動物の絹糸腺の貯留部の抽出物から得られたタンパク質。
トラック３＊：対照動物から得られた繭の全体抽出物から得られたタンパク質。
この例は、明らかに本発明が高い機械的強度や弾性のような新規の特性を備えた絹混合物のような新規生体材料の生産に対する有効性を有していることを示している。
【０１５１】
実施例９：フィブロインＨ鎖の合成を減少させるＲＮＡの発現を指令する核酸を含むベクターを構成するプロトコル。
フィブロインＨ鎖を阻害するために、逆位反復配列の２つの有用遺伝子フラグメントからなる実施例１に記載の遺伝子導入のｐｉｇｇｙＢａｃベクターが生成される。フィブロインＨ鎖遺伝子（Ｈ−ｆｉｂ）に由来するセンス・アンチセンス配列は、中性安定化配列により離間しているとともに、フィブロヘキサメリンプロモーターの制御下にある（図１２）。このベクターは、フィブロインＨ鎖遺伝子のエクソン２に位置する繰り返し配列の４６５ｂｐ部分を標的とする、いわゆる「ヘアピン」の二次構造を構成するために折り畳まれた単鎖からなる二重鎖ｓＲＮＡを生成する。（図１２）この配列は、反復ドメインとアモルファスドメインから交互に形成されている。図１２から分かるように、フィブロインＨ鎖遺伝子のサイズは、１７ｋｂｐである。コード配列は、２つのエクソンからなる。すなわち一方は６７ｂｐ、他方は１５，７５０ｂｐである。この遺伝子は、エクソン２の極端な反復配列を特徴としている。この反復領域のそれぞれは、２０８ｂｐのサブドメインからなり、ＵａとＵｂのモチーフの反復で組織化されている。ｍＲＮＡを標的として使用される４６５ｂｐフラグメントの位置は、矢印で表されている。転写後に生成されたｍＲＮＡの反復配列は、灰色で図式的に示されている（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  Ｆｉｎｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｇｅｎｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２８，  ２４１３−２４１９）。
「一般的な材料および方法」の部分に記載したアシスタントベクター（ヘルパー）とともに注入した。この構造により、トランスジェニックカイコ系統が確立され、繭に産出されるフィブロインＨ鎖の量が計測された。
図１３（柱状図）に示すように、このＲＮＡ機序は、トランスジェニック系統に応じて異なるフィブロインＨ鎖の分泌に、測定可能な効果をもたらすものである。
トランスジェニックカイコが紡いだ繭は、標準の繭と比較して、２０％までフィブロインＨ鎖を減少させた。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
本発明は、織物材料として使用する繊維状タンパク質、特に新しい絹や生医学用タンパク質のようなタンパク質の合成・分泌の分野に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明によるベクターを構成するプロトコルを示す図である。
【図２】フィブロヘキサメリンをコードする遺伝子のシグナルペプチドにおいてシステインコドンをイソロイシンコドンに置換するプロトコルを示す図である。
【図３】配列番号２のポリヌクレオチドの３つのコピーを追加することでフィブロヘキサメリンのプロモーターを修飾するプロトコルを示す図である。
【図４】配列番号３を図式的に示す図である。
【図５】本発明による核酸の制御下にあるＤｓＲｅｄタンパク質の特定組織への蓄積を示す図である。
【図６】カイコの絹糸腺における本発明の核酸の制御下にあるＤｓＲｅｄタンパク質の検出を示す図である。
【図７】本発明の核酸の制御下にあるＤｓＲｅｄタンパク質の絹繊維への選択的な蓄積を示す図である。
【図８】カイコの繭における本発明の核酸の制御下にあるＤｓＲｅｄタンパク質の検出を示す図である。
【図９】走査型電子顕微鏡を使用して繊維を観察した、繊維表面におけるＤｓＲｅｄタンパク質の存在を示す図であって、このタンパク質は、種々のサイズ（凝集塊の数に応じて異なる）で繊維を覆う球粒子の形態で現れている。
【図１０】ヘテロ接合のトランスジェニックカイコの繭における本発明の核酸の制御下にあるＩＬ−２タンパク質の検出を示す図である。
【図１１】ヘテロ接合のトランスジェニックカイコの絹糸腺（Ａ）および繭（Ｂ）内における本発明の核酸の制御下にあるハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）のフィブロインＨ鎖タンパク質の検出を示す図である。
【図１２】フィブロインＨ鎖の合成を減少させるＲＮＡ発現を指令する核酸を含むベクターを構成するプロトコルを示す図である。
【図１３】図１２に示されたベクターを使用して形質転換した動物のフィブロインＨ鎖の合成の減少を示す図である。
【図１】
2006521802.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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