(57)【要約】式（I）：【化１】2006516588.tif 000023［式中、Rは水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；そしてR1はビシクリル又はヘテロビシクリルである］の化合物は、CD23が媒介する症状の治療及び予防に有用である。
2006516588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
【化１】
2006516588.tif 000015
［式中、Rは水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；そして
R1はビシクリル又はヘテロビシクリルである］
で表される化合物。
【請求項２】
式（IA）：
【化２】
2006516588.tif 000016
で表される化合物。
【請求項３】
Rがアリールもしくはアルコキシであり、及び／又はR1がヘテロビシクリルである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Rがフェニルもしくはプロピルオキシであり、及び／又はR1がキノリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
N-ヒドロキシ-2-フェニル-3-(3-キノリン-3-イルメタンスルホニル)-プロピオンアミド及び(R)-N-ヒドロキシ-2-プロポキシ-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-プロピオンアミドから選択される化合物。
【請求項６】
s-CD23の過剰産生が示唆される疾患を治療又は予防する医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項７】
s-CD23の過剰産生が示唆される疾患を治療又は予防する方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物をそれを必要とするヒト又は非ヒト哺乳動物に投与することを含んでなる前記方法。
【請求項８】
s-CD23の過剰産生が示唆される疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物及び任意にその薬学的に許容される担体とを含んでなる前記医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物を製造する方法であって、
(a)  式（II）：
【化３】
2006516588.tif 000017
［式中、R及びR1は先に定義した通りであり、そしてPは保護基である］
の化合物を脱保護する工程；
(b)  式（III）：
【化４】
2006516588.tif 000018
［式中、R及びR1は先に定義した通りである］
を酸化する工程、又は
(c)  式（I）で表される化合物を、先に定義した式（I）の異なる化合物に変換する工程、又は
(d)  式（VIII）：
【化５】
2006516588.tif 000019
の化合物をヒドロキシルアミン又はその塩と反応させる工程、
を含んでなる前記方法。
【請求項１０】
式（II）：
【化６】
2006516588.tif 000020
［式中、R及びR1は先に定義した通りであり、そしてPは保護基である］
の化合物。
【請求項１１】
式（III）：
【化７】
2006516588.tif 000021
［式中、R及びR1は先に定義した通りである］
の化合物。
【請求項１２】
式（VIII）
【化８】
2006516588.tif 000022
の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可溶性ヒトCD23生成の新規インヒビターならびに可溶性CD23（s-CD23）の過剰産生に関連する症状、例えば自己免疫疾患及びアレルギーの治療における前記インヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
CD23（低親和性IgE受容体FceRII、Blast 2）は、様々な成熟細胞の表面上に発現される45KDaのII型内在性タンパク質であり、前記細胞には、B及びTリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、ランゲルハンス細胞、単球、及び血小板が含まれる（Delespesseら, Adv Immunol, 49 [1991] 149-191）。CD23様分子はまた、好酸球上にも存在する（Grangetteら, J Immunol, 143 [1989] 3580-3588）。CD23は免疫反応の調節に関わることが示唆されている（Delespesseら, Immunol Rev, 125 [1992] 77-97）。ヒトCD23は、別個に調節される２種のイソ型ａ及びｂとして存在し、これらのイソ型は細胞内N端末のアミノ酸だけが異なる（Yokotaら, Cell, 55 [1988] 611-618）。ヒトにおいて、構成的なイソ型ａはBリンパ球上のみに見出されるが、IL4により誘導されるイソ型ｂはCD23を発現できる全ての細胞上に見出される。
【０００３】
細胞と結合した無傷のCD23（i-CD23）は細胞表面から切断されて複数のよく定義された可溶性断片（s-CD23）を生成すること、これらの可溶性断片が複雑な一連のタンパク分解事象の結果として産生されることは公知であるが、その生成の機構はまだよく理解されていない（Bourgetら, J Biol Chem, 269 [1994] 6927-6930）。まだ証明されてないが、これらのタンパク分解事象の主な可溶性断片（Mr 37、33、29及び25kDa）は全てi-CD23に共通のC末端レクチンドメインを保持し、前記事象は最初の37kDa断片の生成を経由して逐次的に起こると説明されている（Letellierら, J Exp Med, 172 [1990] 693-700）。代わりの細胞内切断経路は、C末端ドメインがi-CD23と異なる安定な16kDa断片をもたらす（Grenier-Brosetteら, Eur J Immunol, 22 [1992] 1573-1577）。
【０００４】
ヒトにおいては複数の活性が膜結合したi-CD23に因るとされていて、これらの活性は全てIgE調節にある役割を果たすことが示されている。具体的な活性には、a)抗原提示、b)IgEが媒介する好酸球細胞傷害性、c)リンパ節及び脾臓の胚センターへのＢ細胞ホーミング、及びd)IgE合成のダウンレギュレーション（Delespesseら, Adv Immunol, 49, [1991] 149-191）が含まれる。３種のより高い分子量の可溶性CD23断片（Mr 37、33及び29kDa）は多機能サイトカイン特性を有し、IgE産生に大きな役割を果たすようである。従って、s-CD23の過剰生成は、IgEの過剰産生、すなわちアレルギー疾患、例えば外因性喘息、鼻炎、アレルギー性結膜炎、湿疹、アトピー性皮膚炎及びアナフィラキシーの特徴に関わることが示唆されている（Sutton及びGould, Nature, 366, [1993] 421-428）。
【０００５】
s-CD23に帰せられる他の生物学的活性には、Ｂ細胞増殖の刺激及び単球からのメディエーターの放出の誘導が含まれる。従って、s-CD23のレベルの向上がB-慢性リンパ性白血病の患者の血清中に（Sarfatiら, Blood, 71 [1988] 94-98）及び慢性関節リウマチの患者の滑液中に（Chomaratら, Arthritis and Rheumatism, 36 [1993] 234-242）観察されている。炎症においてCD23の役割があることは複数の文献により示唆されている。最初にs-CD23は、活性化されると細胞が媒介する炎症事象に関わる細胞外受容体と結合することが報じられている。従って、s-CD23は単球TNF、IL-l、及びIL-6放出（Armantら, vol 180, J.Exp. Med., 1005-1011 (1994)）を直接活性化することが報じられている。CD23は、単球／マクロファージ上のB2-インテグリン接着分子、CD11b及びCD11cと相互作用することが報じられていて（S. Lecoanet-Henchozら, Immunity, vol 3; 119-125 (1995)）、この相互作用がNO2-、過酸化水素及びサイトカイン（IL-l、IL-6、及びTNF）放出をトリガーする。最後に、IL-4又はIFNは、ヒト単球によるCD23の発現及びそのs-CD23としての遊離を誘導する。膜結合したCD23受容体のIgE／抗IgE免疫複合体又は抗CD23 mAbとのライゲーションは、cAMP及びIL-6産生ならびにトロンボキサンB2生成を活性化し、炎症における受容体を介するCD23の役割を実証する。
【０００６】
これらのCD23の様々な役割の故に、s-CD23の生成を抑制する化合物は二重の作用、すなわち、a)Ｂ細胞の表面上のi-CD23のレベルを維持することによりIgE合成のネガティブフィードバックの抑制を増強する作用、及びb)s-CD23のより高い分子量の可溶性断片（Mr37、33及び29kDa）の免疫刺激性サイトカイン活性を抑制する作用を有するに違いない。さらに、CD23切断の抑制はs-CD23が誘導する単球活性化及びメディエーター生成を軽減し、それにより炎症性応答を低下させるに違いない。
【０００７】
国際特許出願WO 97/27174号（Shionogi & Co., Ltd）及び国際特許出願WO 95/35275号（British Biotech Ltd）は、式（A）：
【化１】
2006516588.tif 000003
【０００８】
［式中、R1はアリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである］
で表される特定の化合物がメタロプロテイナーゼの有効なインヒビターであることを開示している。
【０００９】
国際特許出願WO 98/46563号（British Biotech Ltd）は、R1がフェニルアルキル又はへテロアリールアルキルであることを特徴とする前記式（A）のある特定の化合物がマトリックスメタロプロテアーゼの有効なインヒビターであることを開示している。
【００１０】
WO 99/06361（Abbott）及びWO 00/12478（Zeneca Limited）は、メタロプロテアーゼインヒビターとして使用するための、リバースヒドロキサメートスルホニル及びスルホンアミド化合物を含むある範囲の化合物を記載している。
【００１１】
WO 99/38843（Darwin Discovery Limited）は、とりわけCD23の剥離に関わる酵素により媒介される症状の治療に有用な化合物の包括的範囲を開示し、これは式（Ｂ）：
【化２】
2006516588.tif 000004
【００１２】
［式中、B、R1及びR2はある範囲の有機基から選択される］
の化合物を包含する。
【００１３】
PCT EP01/05798は、CD23の剥離に関わる酵素により媒介される症状の治療及び予防に有用な化合物を開示し、これは式（Ｃ）：
【化３】
2006516588.tif 000005
【００１４】
［式中、Rは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；R1はビシクリル又はへテロビシクリルである］の化合物を包含する。
【発明の開示】
【００１５】
本発明によれば、式（I）：
【化４】
2006516588.tif 000006
【００１６】
［式中、Rは水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり；
R1はビシクリル又はへテロビシクリルである］
の化合物が提供される。
【００１７】
本明細書で意味するアルキル、アルコキシ、アルケニル及びアルキニル基は、単独で又は他の基の部分として直鎖、分枝鎖又は環状であってもよい。
【００１８】
本明細書でR基の定義において意味するアルキル、アルコキシ、アルケニル及びアルキニル基は、8個までの炭素原子を含有し、任意に、アリール、ヘテロシクリル、(C1-6)アルキルチオ、(C2-6)アルケニルチオ、(C2-6)アルキニルチオ、アリールオキシ、アリールチオ、ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、(C1-6)アルコキシ、アリール(C1-6)アルコキシ、アリール(C1-6)アルキルチオ、アミノ、モノ-又はジ-(C1-6)アルキルアミノ、アシルアミノ及びスルホニルアミノ（ここで、アミノ基は任意に(C1-6)アルキルにより置換されていてもよい）、シクロアルキル、シクロアルケニル、カルボン酸(C1-6)エステル、ヒドロキシ、ハロゲン及びカルボキサミド：CONR2R3（式中、R2及びR3は独立して水素、アルキル、アリール、アリールアルキル及びヘテロシクリルからなる群から選択され、かつR2及びR3をヘテロシクリル基の部分として含む）からなる群から選択される１以上の基により置換されている。
【００１９】
本明細書でR基の定義において意味するシクロアルキル及びシクロアルケニル基は3〜8個の環炭素原子を有する基を含むものでありかつ任意に先に記載の通りアルキル、アルケニル及びアルキニル基に置換されている。
【００２０】
本明細書でR基の定義に用いるときに用語「アリール」はフェニルを含む。好適なように、フェニルを含むいずれのアリール基も任意に5個までの、好ましくは3個までの置換基により置換されていてもよい。好適なように、いずれの2個の置換基も任意に一緒に縮合環を形成してもよくかつ任意に3個までのヘテロ原子が環内に割り込んでもよく、ここで前記へテロ原子はそれぞれ酸素、窒素及び硫黄から選択される。好適な置換基は、ハロゲン、ハロ(C1-6)アルキル又はポリハロ(C1-6)アルキル例えばCF3、ハロ(C1-6)アルキルオキシ又はポリハロ(C1-6)アルキルオキシ例えばOCF3、CN、(C1-6)アルキル、(C1-6)アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノ、アシルアミノ（例えばアセチルアミノ）（ここで、アミノ基は任意に(C1-6)アルキルにより置換されていてもよい）、アシルオキシ、カルボキシ、(C1-6)アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノカルボニル、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノアルキル、(C1-6)アルキルスルホニルアミノ(ここで、アミノ基は任意に(C1-6)アルキルにより置換されていてもよい)、アリール(C1-6)アルコキシカルボニルアミノ(ここで、アミノ基は任意に(C1-6)アルキルにより置換されていてもよい)、(C1-6)アルコキシカルボニルアミノ（ここで、アミノ基は任意に(C1-6)アルキルにより置換されていてもよい）、アミノスルホニル、(C1-6)アルキルチオ、(C1-6)アルキルスルホニル、(C1-6)アルキルスルホニルオキシ、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノスルホニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリル(C1-6)アルキル、アミノスルホニルオキシ及び(C1-6)モノ-及びジアルキルアミノスルホニルオキシを含む。用語「アリール」は単環及び縮合環を含み、前記環の少なくとも1個は、置換されていなくても又は、例えば、3個までの先に記載した置換基により置換されていてもよい芳香族である。それぞれの環は好適なように4〜7個、好ましくは6もしくは7個の環原子を有する。
【００２１】
本明細書でR基の定義に用いるときに、用語「ヘテロアリール」は、好適なように、少なくとも１つの芳香族環（ヘテロ環又は炭素環）を組み込むいずれかのヘテロシクリル基を含む。好適なヘテロアリール基は、チオフェン例えばチオフェン-2-イル及びチオフェン-3-イル；フラン例えばフラン-2-イル及びフラン-3-イル；ベンゾチオフェン例えばベンゾチオフェン-2-イル；ピラゾール例えばピラゾール-3-イル；及びイソキサゾール例えばイソキサゾール-3-イルを含む。
【００２２】
本明細書でR基の定義に用いるときに、用語「ヘテロシクリル（heterocyclyl）」及び「ヘテロ環の（heterocyclic）」は好適なように、特に断らない限り、芳香族及び非芳香族の、単環及び縮合環の環を含むものであって、前記環の１個以上は好適なようにそれぞれの環内に4個以下の酸素、窒素及び硫黄から選択されるヘテロ原子を含有し、前記環は無置換であっても又は例えば3個以下の置換基により置換されていてもよい。それぞれの環は、好適なように4〜7個、好ましくは5又は6個の環原子を有する。縮合したヘテロ環系は炭素環を含んでもよく、ヘテロ環のみである必要はない。好適なヘテロアリール基は、ベンゾジオキサン例えば2,3-ジヒドロベンゾ[1,4]ジオキシン-6-イル；ベンゾジオキセピン例えば3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]ジオキセピン-7-イル；及びベンゾキサジン例えば3-オキソ-3,4-ジヒドロ-2H-ベンズ[1,4]オキサジン-6-イルを含む。
【００２３】
好適なヘテロアリール又はヘテロシクリル基に対する置換基は、ハロゲン、ハロ(C1-6)アルキル又はポリハロ(C1-6)アルキル例えばCF3、ハロ(C1-6)アルキルオキシ又はポリハロ(C1-6)アルキルオキシ例えばOCF3、(C1-6)アルキル、(C1-6)アルコキシ、ヒドロキシ、CN、アミノ、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノ、アシルアミノ（例えばアセチルアミノ）（ここで、アミノ基は任意に(C1-6)アルキルにより置換されていてもよい）、アシルオキシ、カルボキシ、(C1-6)アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノカルボニル、(C1-6)アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、モノ-及びジ-N-(C1-6)アルキルアミノスルホニル、(C1-6)アルキルチオ及び(C1-6)アルキルスルホニルを含む。
【００２４】
本明細書でR1基の定義に用いるときに、「ビシクリル(bicyclyl)」は、それぞれの環内に4〜7個、好ましくは5又は6個の環原子を含有する縮合二環を意味する。ビシクリルの１つの環は飽和していても又は部分的に飽和していてもよい。好適なビシクリル基は、ナフチル例えば2-ナフチル、テトラヒドロナフチル例えば1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン-2-イル、及びインダニル例えば2-インダニルを含む。
【００２５】
本明細書でR1基の定義に用いるときに、ヘテロビシクリルは、それぞれの環内に4個以下のそれぞれ酸素、窒素及び硫黄から選択されるヘテロ原子を含有する縮合二環の芳香族及び非芳香族環を意味する。それぞれの環は、好適なように、4〜7個、好ましくは5又は6個の環原子を含有する。縮合二環系は、1つの炭素環を含んでもよくかつ環の1つは飽和していても又は部分的に飽和していてもよい。好適なヘテロビシクリル基は、ベンゾチオフェン例えばベンゾチオフェン-5-イル及びベンゾチオフェン-6-イル；ベンゾフラン例えばベンゾフラン-2-イル、ベンゾフラン-5-イル及びベンゾフラン-6-イル；キノリン例えばキノリン-3-イル；チエノピリジン例えばチエノ[2,3-b]ピリジン-5-イル及びチエノ[3,2-b]ピリジン-6-イル；イソキノリン例えばイソキノリン-3-イル；キノキサリン例えばキノキサリン-2-イル；及びベンゾチアゾール例えばベンゾチアゾール-6-イルを含む。
【００２６】
ビシクリル及びヘテロビシクリル環系の芳香族環は、任意に3個以下の置換基により置換されていてもよい。好適な置換基はフッ素を含む。置換されたヘテロビシクリル基の例は、2-フルオロベンゾチオフェン-5-イル及び3-フルオロベンゾチオフェン-5-イルを含む。
【００２７】
本発明の特定の態様においては、Rはフェニル又はアルコキシであり、及び／又はR1はキノリンである。好ましくは、Rはフェニルもしくはプロピルオキシであり及び／又はR1はキノリン-3-イルである。さらに好ましくは、式（I）で表される本発明の化合物は下記の実施例に記載の化合物からなる群から選択される。
【００２８】
さらなる態様によれば、本発明は、s-CD23の過剰産生が示唆される疾患、例えばアレルギー、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎及び他のアトピー性疾患、炎症性障害、及び自己免疫疾患を治療又は予防する医薬の製造のための、式（I）の化合物の使用を提供する。
【００２９】
さらなる態様において本発明は、s-CD23の過剰産生が示唆される疾患、例えばアレルギー、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎及び他のアトピー性疾患、炎症性障害、及び自己免疫疾患を治療又は予防する方法であって、式（I）の化合物をそれを必要とするヒト又は非ヒト哺乳動物に投与することを含んでなる前記方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、s-CD23の過剰産生が示唆される疾患、例えばアレルギー、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎及び他のアトピー性疾患、炎症性障害、及び自己免疫疾患を治療又は予防するための医薬組成物であって、式（I）の化合物及び任意にその薬学的に許容される担体を含んでなる前記医薬組成物も提供する
具体的な炎症性障害には、CNS障害、例えばアルツハイマー病、多発性硬化症、及び多発性脳梗塞性痴呆、ならびに炎症が媒介する脳卒中及び頭痛の後遺症が含まれる。
【００３１】
式（I）の化合物の薬学的に許容される塩、溶媒和物及び他の薬学的に許容される誘導体も本発明に包含されることは理解されなければならない。
【００３２】
式（I）の化合物の塩には、例えば無機又は有機酸から誘導される酸付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、p-トルエンスルホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩及び安息香酸塩が含まれる。
【００３３】
塩はまた塩基により生成させることもできる。かかる塩には、無機又は有機塩基から誘導される塩、例えばアルカリ金属塩、例えばナトリウムもしくはカリウム塩、及び有機アミン塩、例えばモルホリン、ピペリジン、ジメチルアミン又はジエチルアミン塩が含まれる。
【００３４】
本発明の化合物は、いずれの適当な通常の方法を使用して製造してもよい。
【００３５】
従って、本発明のさらなる態様は、先に定義した式（I）の化合物を製造する方法であって、
(a)  式（II）：
【化５】
2006516588.tif 000007
【００３６】
［式中、R及びR1は先に定義した通りであり、そしてPは保護基、例えばアリル、アリルオキシカルボニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル、テトラヒドロピラニル、p-メトキシベンジル、t-ブチルジメチルシリル又はトリメチルシリル、アシル例えばアセチル又はベンゾイルである］
の化合物を脱保護する工程、又は
(b)  式（III）：
【化６】
2006516588.tif 000008
【００３７】
［式中、R及びR1は先に定義した通りである］
の化合物を酸化する工程、又は
(c)  式（I）の化合物を先に定義した式（I）の異なる化合物に変換する工程、又は
(d)  式（VIII）の化合物：
【化７】
2006516588.tif 000009
【００３８】
をヒドロキシルアミン又はその塩と反応させる工程を含んでなる方法を提供する。
【００３９】
式（II）、（III）又は（VIII）の化合物は新規であって本発明のさらなる態様を形成する。
【００４０】
次の反応スキームは、式（I）の化合物を製造するために利用しうる方法を説明するものである。
【００４１】
反応スキーム
式（I）の化合物を製造する一方法をスキーム１に示した。チオール、又はチオール前駆体例えばチオ酢酸エステル（IV）を、アクリル酸エステル例えば（V）［式中、Qは保護基又は脱離基である］と反応させてスルフィド（VI）を得る。スルフィド（VI）のスルホン（VII）への酸化は過酸、例えばメタ-クロロ過安息香酸を用いて実施することができる。エステル（VII）の酸（VIII）への変換は、エステルがベンジルのように水素化分解可能であるときは水素化により、又はtert-ブチルエステルに対するTFAのような標準保護基の特異的脱保護により、水酸化ナトリウム又はHClなどの塩基性もしくは酸性の加水分解条件のもとで実施することができる。酸クロリドへの変換による酸（XVIIIA）の活性化、無水物又はN-ヒドロキシヘテロ環との混合、及び次いでヒドロキシルアミン（in situ保護したヒドロキシルアミン又は保護したヒドロキシルアミン）との反応、次いで適合しうる脱保護、例えばO-ベンジルヒドロキシルアミンの水素化分解によってヒドロキサム酸（I）を得る。
【化８】
2006516588.tif 000010
【００４２】
立体異性体を含む本発明の化合物の異性体は、かかる異性体の混合物として、又は個々の異性体として製造することができる。個々の異性体はいずれの適当な方法により製造してもよく、例えば個々の立体異性体を、キラル基質から出発して立体特異的化学合成により、又はエナンチオマーの混合物又はジアステレオマーの混合物をキラル分取HPLCなどの公知の方法を用いて分離することにより製造することができる。
【００４３】
好ましい態様において、本発明は、式（IA）：
【化９】
2006516588.tif 000011
【００４４】
の化合物を提供する。
【００４５】
タイプ（IA）のヒドロキサム酸は、スキーム２に記載のように、キラルジオール（XA）［式中、Pは保護基である］から出発して到達することができる。これらのジオールは、Pがメチルエステルである市販のジオキサロン（IXA）を酸性脱保護するなどを含めて、容易に入手可能である。（XA）の一級アルコールの、例えばハロゲン化シリル及びアミン塩基による好適な保護と、次いで（XIA）の、水素化ナトリウムなどの塩基の存在のもとでのアルキルハライド、メシラート又はトシラートによるアルキル化により、エーテル（XIIA）［式中、Yはアルキル（C1-8）である］を得る。（XIA）のアルキル化をアリルハライド、メシラート又はトシラートを用いて実施したときは、得られるアリルエーテル（XIIA）をさらに、水素と好適な触媒、例えばパラジウムを用いて水素化することにより修飾して（XIIA）を得ることができる。シリル基を除去するための酸性又はフッ化物触媒下での（XIIA）の脱保護により一級アルコール（XIIIA）を得て、そしてMitsunobu条件下でのチオ酢酸との反応により、チオ酢酸エステル（XIVA）を得る。水酸化ナトリウム又はナトリウムメトキシドによる（XIVA）のチオールへのin situ変換、及び遊離したチオールのハライドによるアルキル化によりスルフィド（XVIA）を得る。スルフィド（XVIA）の過酸、例えばメタ-クロロ過安息香酸による酸化により、スルホン（XVIIA）を得る。適当な標準的技法による保護エステル基の除去又はアルキルエステルの加水分解により、カルボン酸（XVIIIA）を得る。酸クロリドへの変換による酸（XVIIIA）の活性化、無水物又はN-ヒドロキシヘテロ環との混合、及び次いでヒドロキシルアミン（in situ保護したヒドロキシルアミン又は保護したヒドロキシルアミン）との反応、次いで適合しうる脱保護、例えば、O-ベンジルヒドロキシルアミンの水素化分解により、ヒドロキサム酸（IA）を得る。
【化１０】
2006516588.tif 000012
【００４６】
他の出発物質及び他の試薬を市場で購入するか又は公知及び通常の方法により合成することができる。
【００４７】
化合物は実質的に純粋な形態に単離されていることが好ましい。
【００４８】
本明細書で説明したように、可溶性ヒトCD23生成のインヒビターは有用な医薬特性を有する。好ましくは、活性化合物を薬学的に許容される組成物として投与する。
【００４９】
組成物は好ましくは経口投与用に適合させる。しかし、組成物を他の投与様式、例えば、気道障害を治療するためにスプレー、エアロゾル又は他の通常の吸入用の方法に；又は心疾患の患者用の非経口投与に適合させてもよい。他の代わりの投与様式には舌下又は経皮投与が含まれる。
【００５０】
組成物は錠剤、カプセル、散剤、顆粒、ロゼンジ錠、座剤、用事調製可能な粉末、又は液体製剤、例えば経口又は無菌非経口溶液又は分散液であってもよい。
【００５１】
投与の一貫性を得るために、本発明の組成物は単位用量の剤形であることが好ましい。
【００５２】
経口投与用の単位用量提供剤形は錠剤及びカプセルであってもよく、通常の賦形剤、例えば、結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントもしくはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば乳糖、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールもしくはグリシン；製錠滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えばデンプン、ポリビニルピロリドン、グリコールデンプンナトリウムもしくは微結晶セルロース；又は薬学的に許容される湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムを含有してもよい。
【００５３】
固体経口組成物は、通常のブレンド、充填又は製錠の方法により製造することができる。ブレンド操作を反復して利用し、活性薬をこれらの大量の充填剤を用いる組成物全体に分布させることができる。かかる操作は勿論、当技術分野で通常使われている。錠剤を、通常の製薬作業で周知の方法によって、特に腸用コーティングを用いてコーティングすることができる。
【００５４】
経口液体製剤は、例えば、乳濁剤、シロップ、又はエリキシルの剤形であってもよく、又は水もしくは他の好適なビヒクルによる用事調製用の乾燥製品として提供することができる。かかる液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用脂肪；乳濁化剤、例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン、又はアラビアゴム；非水ビヒクル（食用油を含んでもよい）、例えばアーモンドオイル、分留ココナッツオイル、グリセリンのエステルなどの油状エステル、ポリプロピレングリコール、又はエチルアルコール；保存剤、例えばp-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸；ならびに、もし所望であれば、通常の香料又は着色剤を含有してもよい。
【００５５】
非経口投与用には、液体単位用量剤形を活性化合物と無菌ビヒクルを用いて調製し、そして、使用濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁又は溶解させることができる。溶液を調製するには、活性化合物を注射用水に溶解して滅菌濾過した後に、好適なバイアルもしくはアンプル中に充填してシールしてもよい。好都合なように、アジュバント、例えば局所麻酔薬、保存剤及び緩衝化剤をビヒクル中に溶解することができる。安定性を増強するために、組成物をバイアルに充填した後に凍結して、水を真空下で除去することができる。非経口懸濁液は、活性化合物をビヒクル中に溶解する代わりに懸濁すること及び濾過による滅菌を実施できないことを除くと、実質的に同じ方法で調製する。活性化合物を酸化エチレンに曝すことにより滅菌することができる。好都合なように、界面活性剤又は湿潤剤を組成物中に含有させて、活性化合物の均一な分布を促進する。
【００５６】
本発明の組成物はまた、気道への投与のために、嗅剤もしくはエアロゾルもしくは噴霧器用溶液として、又は吹送用微粉末として、単独又は不活性な担体、例えば乳糖と組合わせて好適なように提供することもできる。かかる場合には、活性化合物の粒子は、好適なのは、50ミクロン未満、好ましくは10ミクロン未満の直径、例えば1〜50ミクロン、1〜10ミクロン又は1〜5ミクロンの範囲の直径を有する。適当であれば、小量の他の抗喘息薬及び気管支拡張薬、例えば交感神経様作用アミン例えばイソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリン及びエフェドリン；キサンチン誘導体例えばテオフィリン及びアミノフィリン；コルチコステロイド例えばプレドニソン；ならびに副腎刺激薬例えばACTHを含有させてもよい。
【００５７】
組成物は、投与方法に応じて、重量で0.1％〜99％、好ましくは重量で10〜60％の活性物質を含有することができる。吸入投与用の好ましい範囲は10〜99％、特に60〜99％、例えば90、95又は99％である。
【００５８】
微粉末製剤は、好適なように、エアロゾルで定用量として又は好適な呼吸作動デバイスを使って投与することができる。
【００５９】
好適な定用量エアロゾル製剤は、通常の噴霧剤、共溶媒例えばエタノール、界面活性剤例えばオレイルアルコール、滑剤例えばオレイルアルコール、乾燥剤例えば硫酸カルシウム、及び密度改変剤例えば塩化ナトリウムを含有する。
【００６０】
噴霧器用の好適な溶液は等張性無菌溶液であって、場合によっては、例えばpH4〜7の間に緩衝化され、20mg/ml以下、もっと一般的には0.1〜10mg/mlの化合物を含有して、標準の噴霧装置により使用される。
【００６１】
有効量は、本発明の化合物の相対的効力、治療する疾患の重症度、及び患者の体重に依存しうる。好適なように、本発明の化合物の単位用量剤形は、本発明の化合物の0.1〜1000mg（吸入経由で0.001〜10mg）そしてさらに通常は1〜500mg、例えば1〜25又は5〜500mgを含有しうる。かかる組成物を、１日当たり1〜6回、さらに通常は１日当たり2〜4回の頻度で、毎日用量が70kg体重の成人に対して1mg〜1g、そしてさらに特定すると5〜500mgとなるようにして投与することができる。すなわち、この用量は約1.4 x 10-2mg/kg/日〜14mg/kg/日の範囲、さらに特定すると約7 x 10-2mg/kg/日〜7mg/kg/日である。
【００６２】
次の実施例は本発明を説明するものであるが、いずれの方法でも決して限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
製造１：3-アセチルチオメチルキノリン
方法Ａ
工程１：3-キノリルメタノール
エタノール（260ml）中のキノリン-3-カルボキシアルデヒド（13.18g）を0℃に冷却した後、水素化ホウ素ナトリウム（1.62g）を小分けして加えた。温度を0℃に15分間維持した後、6N HCl（28ml）を加え、その間、反応温度を0〜5℃の間に維持した。次いで溶液を、1M NaOHを用いて中和した。粗反応混合物をストリッピングして乾燥し、エタノールを除去し、そして残渣を水とEtOAcの間で分配した。次いでEtOAc層を乾燥し（MgSO4）、シリカゲルに吸着させ、そしてクロマトグラフィ（フラッシュシリカゲル、ステップ勾配：0〜100％ EtOAc／ヘキサン）で処理して標題の化合物を白色の固体（9.85g）として得た。
【００６４】
工程２：3-クロロメチルキノリン塩酸塩
3-キノリルメタノール（9.85g）を乾燥ベンゼン（200ml）中に取り、攪拌し、次いで塩化チオニル（14.69ml）を加えた。直ちに黄色沈殿を得た。攪拌したまま、室温で2時間維持した。淡黄色固体を濾過除去し、乾燥して標題の化合物（13g）を得た。
【００６５】
工程３：3-アセチルチオメチルキノリン
3-クロロメチルキノリン塩酸塩（5.2g）をアセトン（100ml）中に取り、次いでチオ酢酸カリウム（1.8g）を加え、そして室温で一夜攪拌した。反応混合物をシリカゲルに吸着させ、クロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配0〜50％エーテル／石油エーテル）で処理して表題化合物をオレンジ色の固体（4.2g）として得た。1H NMR δ(DMSO-d6): 8.85 (1H, d, J=2Hz), 8.25(1H, d, J=2Hz), 8.01(1H, d, J=8.4Hz), 7.95 (1H, d, J=8.4Hz), 7.74 (1H, t, J=8.4Hz), 7.61 (1H, t, J=8.4Hz), 4.33 (2H, s), 2.38 (3H, s)。
【００６６】
方法Ｂ
CCl4（50ml）中の3-メチルキノリン（5g）を氷酢酸（1.85ml）、NBS（8.5g）及びAIBN（1.5g）を用いて処理した。反応液を100Wハロゲン光を用いて還流し、そして10分間還流した。冷却後、EtOAc（60ml）を加え、反応液をシリカのプラグを通して濾過し、半容積まで濃縮し、そしてDMF（150ml）に溶解したチオ酢酸カリウム（10g）を炭酸カリウム（2g）とともに加えた。次いで反応液をさらに蒸発により濃縮して150mlとした。2時間後、反応液をEtOAc（300ml）を用いて希釈し、そして炭酸水素ナトリウム飽和溶液及び飽和食塩水（8x）を用いて洗浄した。有機相を蒸発し、そして残渣をクロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配0〜50％エーテル／石油エーテル）処理して表題化合物（3.1g）を得た。
【００６７】
実施例１  N-ヒドロキシ-2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルホニル)-プロピオンアミド
【化１１】
2006516588.tif 000013
【００６８】
工程１：2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルファニル)-プロパン酸エチル
3-アセチルチオメチルキノリン（0.65g）のエタノール（6ml）中の溶液を水酸化ナトリウム水溶液（1.5ml, 2M）に加えた。10分後、1-フェニルプロペン酸エチル（J R Ames及びW Davey, J Chem Soc, 1958, 1794）（0.62g）のエタノール（2ml）中の溶液を加えて30分間攪拌後、その溶液を塩化アンモニウム水溶液とジエチルエーテルの間に分配した。有機層を乾燥し（MgSO4）、蒸発させ、そして残渣をシリカのクロマトグラフィで処理し、ヘキサン-酢酸エチル混合物を用いて溶出して標題の化合物（0.64g）を得た。
【００６９】
工程２：2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルホニル)-プロパン酸エチル
2-フェニル-3-（3-キノリルメタンスルファニル）-プロパン酸エチル（0.64g）のジクロロメタン（10ml）中の溶液を0℃で3-クロロ過安息香酸（65％、900mg）を用いて処理し、30分間攪拌後、その溶液を1％亜硫酸ナトリウムを含有する炭酸水素ナトリウム水溶液とジクロロメタンの間で分配した。有機層を乾燥し（MgSO4）、蒸発させ、そして残渣をシリカのクロマトグラフィで処理し、ヘキサン-酢酸エチル混合物を用いて溶出して標題の化合物（0.40g）を得た。
【００７０】
工程３：2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルホニル)-プロパン酸塩酸塩
2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルホニル)-プロパン酸エチル（0.30g）の塩酸（5ml、11M）中の溶液を還流にて2時間加熱し、次いで蒸発させて標題の化合物（0.27g）を得た。
【００７１】
工程４：N-ヒドロキシ-2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルホニル)-プロピオンアミド
2-フェニル-3-(3-キノリルメタンスルホニル)-プロパン酸塩酸塩（30mg）のジクロロメタン（5ml）中の懸濁液を塩化オキサリル（0.5ml）及びDMF（1滴）を用いて処理した。1時間後、その混合物を蒸発させ、得られる固体をさらにジクロロメタン（5ml）及びO-トリメチルシリルヒドロキシルアミン（0.5ml）を加えて懸濁させた。1時間後、水を加え、そして塩酸（1M）を用いてpHを7に調節し、次いで酢酸エチルを用いて抽出した。有機抽出物を乾燥し（MgSO4）、蒸発させ、そして残渣をジエチルエーテルから結晶化して表題化合物（14mg）を得た。MS (+ve イオンエレクトロスプレー) 371 (MH+, 100％), 1H NMR δ(CD3OD) 8.9 (1H, m), 8.4 (1H, m), 8.09 (1H, d, J=8Hz), 7.95 (1H, d, J=8Hz), 7.78 (1H, t, J=8Hz), 7.62 (1H, t, J=8Hz),7.2-7.4 (5H, m), 4.60 (2H, ABq), 4.1及び4.2 (2H, 2m),及び3.5 (1H, m)。
【００７２】
実施例２  (R)-N-ヒドロキシ-2-プロポキシ-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-プロピオンアミド
【化１２】
2006516588.tif 000014
【００７３】
工程１：(S)-3-(t-ブチルジメチルシリルオキシ)-2-ヒドロキシプロピオン酸メチル
（S）-2,2-ジメチル-1,3-ジオキサラン-4-カルボン酸メチル（5.67g）の乾燥MeOH（90ml）中の攪拌溶液を、室温でジオキサン中の4M HClを用いて処理した。2時間後、その溶液を蒸発させ、次いでMeOH／トルエン（2x30ml）及びCHCl3（30ml）から再蒸発させた。ジオールを乾燥DMF（80ml）中に溶解して氷中で冷却した。その攪拌溶液をイミダゾール（2.41g）及びt-ブチルジメチルシリルクロリド（5.34g）を用いて処理した。2時間後その混合物を、EtOAc（500）を用いて希釈し、水（3x200ml）、飽和食塩水（100ml）を用いて洗浄し、乾燥し（MgSO4）、そして蒸発させた。残渣をクロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配、軽油40°〜60°中の0〜15％EtOAc）で処理して標題の化合物（5.85g）を得た。1H NMR δ(CDCl3) 4.18 (1H,m), 3.89 (2H,m), 3.74 (3H,s), 2.97 (1H,d,J=8Hz), (0.83 (9H,s), 0.01 (6H,s)。
【００７４】
工程２：(S)-3-(t-ブチルジメチルシリルオキシ)-2-アリルオキシプロピオン酸メチル
(S)-3-（t-ブチルジメチルシリルオキシ）-2-ヒドロキシプロピオン酸メチル（5.84g）及びアリルブロミド（10.6ml）のMeCN（50ml）中の攪拌溶液を、室温で水素化ナトリウム（油中の60％分散物、1.2g）を用いて5分間にわたり小分けして処理した。泡立ちが止まった後、5％クエン酸溶液（100ml）及びEtOAc（100ml）を加えた。有機相を回収して水（2x100ml）、飽和食塩水（100ml）を用いて洗浄し、乾燥し（MgSO4）、そして蒸発させた。残渣をクロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配、軽油40°〜60°中の0〜10％EtOAc）で処理して標題の化合物（1.2g）を得た。MS APCI (+イオン) 275 (MH+), 1H NMR δ(CDCl3) 5.83 (1H.m), 5.16 (2H,m), 4.05 (3H,m), 3.82 (2H,dJ=6.8Hz),  3.69 (3H,s), 0.83 (9H,s), 0.01 (6H,s)。
【００７５】
工程３：(S)-3-ヒドロキシ-2-プロポキシプロピオン酸メチル
（S）-3-（t-ブチルジメチルシリルオキシ）-2-アリルオキシプロピオン酸メチル（1.2g）及びシクロヘキセン（5ml）のMeOH（20ml）中の攪拌溶液をアルゴン下で室温にて10％Pd/C（100mg）を用いて処理した。72時間後に、触媒を濾過除去し、溶液を蒸発させた。残渣をMeOH（10ml）に再溶解し、そしてジオキサン中の4M HClを加えた。2時間後にその溶液を蒸発させて標題の化合物（0.6g）を得た。1H NMR δ(CDCl3), 4.02-3.51 (5H,m), 3.77 (3H,s), 2.21 (1H,bs), 1.65 (2H,m), 0.93 (3H,t,J=7.5Hz)。
【００７６】
工程４：(R)-3-アセチルチオ-2-プロポキシプロピオン酸メチル
トリフェニルホスフィン（1.94g）の乾燥THF中の氷冷溶液をアルゴン下でアゾジカルボン酸ジイソプロピル（1.46ml）を用いて段階的に処理した。30分後、（S）-3-ヒドロキシ-2-プロポキシプロピオン酸メチル（0.6g）及びチオ酢酸（0.53ml）の乾燥THF（5ml）中の溶液を滴状で加えた。混合物を室温にて一夜放置し次いで蒸発させた。残渣をヘキサン（120ml）を用いて抽出し、そして溶液を蒸発させた。その油状物をクロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配、軽油40°〜60°中の5〜12％EtOAc）で処理して標題の化合物（0.7g）を得た。1H NMR δ(CDCl3), 3.96 (1H,m), 3.77 (3H,s), 3.14-3.60 (4H,m),2.35 (3H,s),  1.65 (2H,m), 0.93 (3H,t,J=7.5Hz)。
【００７７】
工程４：(R)-3-(キノリン-3-イルメタンスルファニル)-2-プロポキシプロピオン酸メチル
3-クロロメチルキノリン塩酸塩（0.6g）及び（R）-3-アセチルチオ-2-プロポキシプロピオン酸メチル（1.09g）のMeOH（50ml）中の攪拌溶液を室温にて1M NaOH（5.51ml）を滴状で用いて処理し、そして混合物を一夜攪拌した。MeOHを蒸発させて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10ml）を加えた。その水溶液をMDC（3x10ml）を用いて抽出し、乾燥し（MgSO4）、そして蒸発させた。残渣をクロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配、軽油40°〜60°中の10〜40％EtOAc）処理して標題の化合物（0.83g）を得た。MS APCI (+イオン) 320 (MH+), 1H NMR δ(CDCl3) 8.90 (1H,d,J=2Hz), 8.10(2H,m), 7.80 (1H,d,J=6.8Hz), 7.69 (1H,t,J=6.8Hz), 7.55 (1H.t,J=6.8Hz), 4.0 (3H,m), 3.74 (3H,s), 3.31-3.71 (2H,m), 2.76 (2H,m), 1.65 (2H,m), 0.97 (3H,t,J=7.5Hz)。
【００７８】
工程５：(R)-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-2-プロポキシプロピオン酸メチル
(R)-3-(キノリン-3-イルメタンスルファニル)-2-プロポキシプロピオン酸メチル（0.83g）のMDC（20ml）中の溶液を0℃に冷却し、次いでMCPBA（50％）（2.89g）を加え、そして0℃で30分間攪拌した。反応混合物を10％Na2SO3（10ml）及び飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（10ml）を用いてクエンチした。MDC層を乾燥し（MgSO4）、蒸発させ、そしてクロマトグラフィ（シリカゲル、ステップ勾配、軽油40°〜60°中の30〜60％EtOAc）処理をして標題の化合物（0.6g）を得た。MS APCI (+イオン) 352 (MH+), 1H NMR δ(CDCl3) 8.92 (1H,d,J=2Hz), 8.28(1H,s), 8.13 (1H,d,J=6.8Hz ), 7.85(1H,d,J=6.8Hz), 7.77 (1H,t,J=6.8Hz), 7.60 (1H.t,J=6.8Hz), 4.68-4.48 (3H,m), 3.78(3H,s), 3.90-3.15 (4H,m), 1.83 (2H,m), 1.06 (3H,t,J=7.5Hz)。
【００７９】
工程６：(R)-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-2-プロポキシプロピオン酸
(R)-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-2-プロポキシプロピオン酸メチル（595mg）の濃HCl（10ml）中の溶液を30分間還流し、室温に冷却し、そして蒸発させた。残渣をMeOH（10ml）及びDCM（10ml）から再蒸発させて標題の化合物（0.45g）を得た。MS APCI (+イオン) 338 (MH+), 1H NMR δ(DMSO) 9.00 (1H,d,J=2Hz), 8.63 (1H,s), 8.18 (2H,m), 7.95 (1H,t,J=6.8Hz), 7.77 (1H.t,J=6.8Hz), 4.86 (2H,Abq),4.34 (1H,m), 3.41-3.71 (4H,m),  1.61 (2H,m), 0.89 (3H,t,J=7.5Hz)。
【００８０】
工程７：(R)-N-ヒドロキシ-2-プロポキシ-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-プロピオンアミド
(R)-3-(キノリン-3-イルメタンスルホニル)-2-プロポキシプロピオン酸（100mg）のMDC（5ml）中の攪拌溶液を、室温にて塩化オキサリル（0.3ml）及びMDC中のDMF（10％溶液中の1滴）を用いて処理した。45分後、混合物を蒸発させ、そしてMDC（2x5ml）から再蒸発させた。残渣をMDC（5ml）に懸濁し、ヒドロキシルアミン塩酸塩（37mg）及びN-メチルモルホリン（0.15ml）を用いて処理した。30分後、水（5ml）を加え、pHを7に調節した（2M HCl）。水層をMDC（5ml）を用いて抽出し、そして組合わせたMDC層を乾燥し（MgSO4）、蒸発させ、そしてクロマトグラフィ処理（酸洗浄したシリカゲル、ステップ勾配、MDC中の0〜3％MeOH）して表題化合物（17mg）を得た。MS APCI (+イオン) 353 (MH+), 1H NMR δ(DMSO), 10.95 (1H,s), 9.09 (1H,s), 8.85 (1H,d,J=2Hz), 8.38(1H,s), 8.05 (2H,m), 7.82 (1H,t,J=6.8Hz), 7.65 (1H.t,J=6.8Hz), 4.80 (2H,Abq),4.20(1H,m), 3.38-3.70 (4H,m),  1.61 (2H,m), 0.91 (3H,t,J=7.5Hz)。
【００８１】
生物学的試験法
試験法１：  可溶性CD23の遊離を抑制する試験化合物の能力を、以下の試験法を用いて研究した。
【００８２】
RPMI 8866 細胞膜CD23切断活性アッセイ：
高レベルのCD23を発現するRPMI 8866細胞、すなわちエプスタイン-バー（Epstein-Barr）ウイルスで形質転換した培養ヒトＢ細胞株（Sarfatiら, Immunology 60 [1987] 539-547）からの形質膜を、水抽出法を用いて精製する。均質化バッファー（20mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM DTT）中に再懸濁した細胞を、パール細胞破砕装置（Parr bomb）中でN2キャビテーションにより破壊し、他の膜と混合した形質膜画分を遠心分離により10,000Xgにて回収する。軽いペレットを0.2M燐酸カリウム、pH 7.2中に1〜3g湿細胞当たり2mlを用いて再懸濁し、そして核ペレットを捨てる。膜をさらに、10〜15mg膜タンパク質当たり全16gで、0.25Mスクロースにて、デキストラン500（6.4％w/w）とポリエチレングリコール（PEG）5000（6.4％w/w）（参考）の間に分配することにより分画する［Morre及びMorre, BioTechniques 7, 946-957 (1989)］。相を、簡単な遠心分離により1000Xgにて分離し、PEG（上層）相を回収し、20mMリン酸カリウムバッファーpH7.4を用いて3〜5倍に希釈し、100,000Xgにて遠心分離し、その相中の膜を回収する。ペレットをリン酸緩衝化塩類溶液中に再懸濁すると、3〜4倍濃縮した形質膜ならびに若干の他の細胞膜（例えば、リソソーム、ゴルジ）から構成される。膜のアリコートを作って-80℃にて保存する。6.6％デキストラン／PEGで分画すると、10倍濃縮された形質膜が得られる。
【００８３】
分画した膜を37℃にて4時間までインキュベートしてCD23の断片を作製し、WO 95/31457からの製造１｛WO 90/05719の実施例11に記載の方法により製造した[4-(N-ヒドロキシアミノ)-2-(R)-イソブチル-3-(S)-(2-チオフェンチオメチル)スクシニル]-(S)-フェニルアラニン-メチルアミドナトリウム塩｝の5uMを用いてアッセイをクエンチした後、前記CD23の断片を膜から0.2ミクロンDurapor濾過プレート（Millipore）での濾過により分離する。膜から遊離されるs-CD23を、The Binding Site社（Birmingham、英国）製EIAキット又は類似のキットを使用し、MHM6抗CD23mAb［Roweら, Int. J. Cancer, 29, 373-382 (1982)］又は他の抗CD23mAbをサンドイッチEIAの捕獲抗体に用いて測定する。全容積50ulリン酸緩衝化塩類溶液中の0.5ug膜タンパク質により作られた可溶性CD23の量をEIAにより測定し、様々な濃度のインヒビターの存在のもとで作られた量と比較する。インヒビターは水又はジメチルスルホキシド（DMSO）の溶液中で調製し、最終DMSO濃度は2％濃度以下にする。IC50は曲線フィッティングにより、インヒビターなしでインキュベートした対照との間のs-CD23の差と比較してs-CD23産生の50％抑制が観察された濃度として決定する。
【００８４】
結果
実施例１の化合物は0.01μMのIC50値を示した。
【００８５】
実施例２の化合物は0.11μMのIC50値を示した。
【００８６】
試験法２：マトリックスメタロプロテアーゼを抑制する試験化合物の能力を、以下の試験法を用いて研究した。
【００８７】
コラゲナーゼ抑制アッセイ
コラゲナーゼのインヒビターとして作用する化合物の効力を、本明細書に参照により組み入れられるCawston及びBarrett（Anal. Biochem. 99, 340-345, 1979）の方法により決定したが、この方法では、試験するインヒビターの1mM溶液又はその希釈液を、37℃にて18時間、コラーゲン及び滑膜線維芽細胞からクローニングして大腸菌（E.coli）から発現しそして精製したヒト組換えコラゲナーゼとともにインキュベートした（15mM塩化カルシウム、0.05％Brij 35、200mM塩化ナトリウム及び0.02％ナトリウムアジドを含有する150mM Tris、pH 7.6を用いて緩衝化した）。コラーゲンは、Cawston及びMurphy（methods in Enzymology 80, 711,1981）の方法により調製したアセチル化3Hの１型ウシコラーゲンであった。サンプルを遠心分離して未消化コラーゲンを沈降させ、放射性上清のアリコートを取除いて加水分解の尺度としてシンチレーションカウンターで試験した。1mMインヒビター、又はその希釈液の存在のもとでのコラゲナーゼ活性を、インヒビターを含有しない対照の活性と比較し、その結果をコラゲナーゼの50％に影響を与える濃度（IC50）として報じた。
【００８８】
結果
実施例１の化合物は、＞10uMのIC50を示した。
【００８９】
一般的MMP抑制アッセイ
マトリックスメタロプロテアーゼ活性の抑制を、適当な基質による蛍光クエンチアッセイを用いて決定した。例えば、Larkら（Connective Tissue Res. 25, 52 (1990)）に従って、MMP活性をトリプシンにより活性化したMMPを用いて決定した。MMPを、室温にて、0.15M Tris Cl、15mM CaCl2、0.2M NaCl、pH 7.6（アッセイ用バッファー）を含有する全容積100ulのマイクロタイタープレート中で、100uM以下の濃度のインヒビター、2％以下のDMSO最終濃度、10uM基質(例えば、MMP-1用のSDP-3815-PI、Peptides International)の条件のもとでインキュベートした。MMP濃度は＜10nMであり、そして30分間に蛍光発光の少なくとも20倍増加を与える適当な基質を実験的に決定した。蛍光励起波長は355nm、発光波長400〜460nmであった。そしてデータポイントを集めてスロープ（時間とともに蛍光の変化）を作製した。それぞれの濃度に対するパーセント抑制は時点ゼロのスロープから、そしてIC50値は濃度依存度から計算した。MMP-1、2、3、7、9、13、14を、それぞれの酵素に対して有効であると報じられる市販の基質を用いて、全て同じ方法でアッセイすることができる。酵素はCalbiochem社から入手し、同じトリプシン法を用いて活性化した。
【００９０】
結果
実施例１の化合物は、MMP-3に対して＞10uMのIC50値を示した。
【００９１】
実施例２の化合物は、MMP-13に対して7uMのIC50値を示した。
【国際調査報告】
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