(57)【要約】本発明は、化学療法後に細胞増殖抑制剤のアポトーシス効果を増大させる医薬品を製造するための、少なくとも１種の、DNA修復遺伝子及び／又は腫瘍遺伝子の過剰発現阻害剤の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法後に細胞増殖抑制剤のアポトーシス効果を増大させる医薬品を製造するための、少なくとも１種の、DNA修復遺伝子及び／又は腫瘍遺伝子の過剰発現阻害剤の使用。
【請求項２】
前記修復遺伝子がUBE2N及び／又はAPEXである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍遺伝子がDDX1、STAT3及び／又はJUN-Dである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
過剰発現阻害剤として、5-置換ヌクレオシド、その保護型、塩あるいはプロドラッグを使用する、請求項１〜３いずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
化学療法中に、少なくとも１種の細胞増殖抑制剤を、少なくとも１種のDNA修復遺伝子及び腫瘍遺伝子の過剰発現阻害剤と併用する、請求項１〜４いずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
過剰発現阻害剤として5-置換ヌクレオシドを使用する、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
化学療法中に、一定量の過剰発現阻害剤と併用して、所定期間に渡って投与量を増加させながら細胞増殖抑制剤を使用し、且つ化学療法後の回復期中に、過剰発現阻害剤単独で使用する、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
前記回復期が３〜１０日間である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記化学療法の周期期間が８〜３０日間である、請求項５〜８いずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
5-置換ヌクレオシドとして、(E)-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン(BVDU)、その保護型、塩及び／又はプロドラッグを使用する、請求項１〜９いずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
プロドラッグとして一般式Iの化合物を使用する、請求項１０に記載の使用。
【化１】
2006521283.tif 000005
【請求項１２】
血中濃度が0.02〜50μg/mlとなる投与量で、少なくとも１種の5-置換ヌクレオシドを使用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学療法後に細胞増殖抑制剤のアポトーシス効果を増大させる医薬品の製造のための、少なくとも１種の、DNA修復遺伝子及び／又は腫瘍遺伝子の過剰発現阻害剤の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌は人類にとって、死に至る主な原因の一つであり、その治療方法として化学療法が最もよく用いられている。化学療法による治療の見通しは、耐性が発現すれば不十分となる。これらの耐性のルーツは、細胞増殖抑制剤が遺伝子の発現に影響を与え、遺伝毒性効果を有する、すなわち、突然変異、遺伝子の増幅及び組み換えを誘発し、それによってゲノムを不安定化するという点にある。このようにして、化学療法により、耐性癌細胞が誘発あるいは選択される。しばしば、腫瘍遺伝子（例えば、Ras，Bc12，Bcr-abl，Myc，ErbB2など）は、細胞増殖抑制剤によって誘発されるこのような効果によって影響を受ける。調節不良の遺伝子発現もまた、DNA修復及び組換えと関連し、化学療法剤に対する耐性（例えば、p53遺伝子，BRCA1/2，UBE2N，APEX及びRad51）、さらに、細胞増殖抑制剤を代謝及び生理活性化する酵素（例えば、DHFR，DT-ジアフォラーゼ(DT-D)）、あるいは細胞増殖抑制剤を運搬するタンパク（例えば、MDR1）に影響を与える。
【０００３】
多くの細胞増殖抑制剤は、アポトーシスを誘導して腫瘍細胞を除去する。アポトーシスは、プログラム細胞死の一種であり、Kerr, J. F.等によってBr J Cancer, 26(4) (1972); 239 - 257.で最初に発表された。ネクローシスと異なり、アポトーシスは細胞死の生理的な形態である。細胞死は、ネクローシスとアポトーシスの２つの形態に区別できる。アポトーシスは、規則的なカスケードの事象として、連続的に発生する形態学的及び生化学的特徴によって定義される。連続的なプロセスは何段階かに分けることができる。アポトーシスの形態学的な特徴は、核クロマチン凝縮（核濃縮）、細胞質の収縮、アポトーシス小胞の形成、及び最終的なアポトーシス小体からなる。腫瘍細胞は、サバイバルメカニズムの過剰活性化によってアポトーシスを阻害する。化学療法剤への耐性メカニズムには、それゆえ、アンチ-アポトーシス作用遺伝子、例えば、STAT3、活性化された「シグナル伝達物質及びトランスクリプション3の活性化因子」あるいはJUN-D等も含まれる。
【０００４】
1995年に、これまで知られていなかった特定のホルモン及び5-置換ヌクレオシドの効果が発見された。これらは、チャイニーズハムスターの細胞において2-アミノ-6-メルカプトプリン(AMP)-誘導SV40増幅(Fahrig, R.等, Mutat Res., 356 (2), 1996, 217-224)及び酵母におけるトリエチレン・メラミン-誘導組換(Fahrig, R., Mutat Res, 372 (1), 1996, 133-139)を抑制する。欧州特許公報0 806 956号では、5-置換ヌクレオシドによるマウスの白血病細胞の治療が記載され、ドキソルビシン(アドリアマイシン)-誘導Mdrl遺伝子増幅及び化学療法剤に対する耐性が阻害された。
【０００５】
インビトロで実施された試験のデータでは、5-置換ヌクレオシド（すなわち、塩基類似体）は、常に一以上の細胞増殖抑制剤とともに用いられてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述した技術状態を基礎とし、本発明の目的は、耐性の形成によって引き起こされるアポトーシス効果の減少を阻害すること、あるいは少なくともそれを遅らせることであり、それによって従来技術における既知の治療形態と比べて改良された治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、請求項１に記載された使用によって達成される。さらに従属請求項は、有効な発展を明示する。
【０００８】
本発明は、化学療法後に細胞増殖抑制剤のアポトーシス効果を増大させる医薬品を製造するための、少なくとも一種の、DNA修復遺伝子及び／又は腫瘍遺伝子の過剰発現阻害剤の使用を提供する。
【０００９】
関連するDNA修復遺伝子としては特に UBE2N及び／又はAPEXを、腫瘍遺伝子としては特にDDX1、STAT3 及び／又はJUN-Dを挙げることができる。 
【００１０】
好ましくは、5-置換ヌクレオシド、その保護形態、塩あるいはプロドラッグを過剰発現阻害剤として使用する。
【００１１】
好ましくは、化学療法中に、少なくとも一の細胞増殖抑制剤を、少なくとも１のDNA修復遺伝子及び／又は腫瘍遺伝子の過剰発現阻害剤あるいは過剰発現阻害剤を含有する医薬品と併用しておく。
【００１２】
5-置換ヌクレオシドとして、(E)-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン(BVDU)を使用することができる。また、その保護形態、塩及び／又はプロドラッグを使用してもよい。本発明に係るBVDUのプロドラッグの一例を一般式Iに示す。
【００１３】
【化１】
2006521283.tif 000002
【００１４】
好ましくは、5-置換ヌクレオシドは、血中濃度が0.02〜50μg/mlとなる投与量で使用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
驚くべきことに、化学療法完了後に、5-置換ヌクレオシド（塩基類似体）単独で治療した場合、細胞がさらに増殖したとしても、その増殖は、細胞増殖抑制剤で化学療法を継続した場合よりも阻害されることが分かった。全く予想外のことに、5-置換ヌクレオシド(塩基類似体)の効果は、減少するどころか増加した。
【００１６】
この効果は、本発明に係るスクリーニングシステムを用いて確認された。このスクリーニング方法は、腫瘍細胞の治療をベースとし、該治療は、一般に８〜３０日の期間に渡る化学療法サイクル期間中に、細胞増殖抑制剤の量を増量させつつ、過剰発現阻害剤の量を一定にして投与することにより行った。
この併用療法後に、細胞増殖抑制剤を中止し、その後の治療は過剰発現阻害剤単独で継続した。この回復期(リカバリー・フェースとも呼ばれる)は、一般に３〜１０日間続く。このタイプの化学療法サイクルは、連続して最大６回まで実施することができる。
【００１７】
結果として、当業者にとって驚くべき様々な治療形態が明らかになった。
−5-置換ヌクレオシド単独では効果を示さない
−5-置換ヌクレオシドは細胞増殖抑制剤とともに投与すると効果を示す
−5-置換ヌクレオシドは、まず細胞増殖抑制剤と一緒に投与し、その後単独で投与すると（回復期）、効果が増大する。
【００１８】
この効果、すなわち、化学療法剤に対する耐性発現の阻止及び化学療法剤に対する感受性の増加は、特定の遺伝子の発現に影響を与えることにより、細胞増殖抑制剤が誘導するアポトーシスが無毒的に維持されることに基づくと考えられる。
これは以下のことによって起こる
１．回復期における「生存経路」の遮断
２．関連酵素のDNA修復の遮断
３．DT-ジアフォラーゼ活性の誘導
４．回復期におけるATP-生成酵素の発現の減少
【００１９】
１）については、BVDUのような塩基類似体は、細胞増殖抑制剤を中止した後、共治療の回復期中に主に「生存経路」を阻害し、その結果、アポトーシスを進行させる。
【００２０】
ラットのAH13r腫瘍細胞のHOPI二重着色法を用いて、ドキソルビシン(DOX)、ミトキサントロン(MXA)あるいはマイトマイシンC (MMC) のような細胞増殖抑制剤がアポトーシスを惹起するのを検出した。塩基類似体(E)-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン (BVDU)を用いた共治療は、STAT3及びJUN-Dを含むアンチ-アポトーシスの「生存経路」を遮断することによって、アポトーシスを推進する。
【００２１】
この効果は、実施例２に示すように、細胞の回復期においてまず発生する。
【００２２】
構成的に活性化したSTAT3は、発ガン作用を有し、種々のヒト癌を発達させる一因となる。これはアポトーシスの阻害に起因する。このように、STAT3は腫瘍細胞の生存を促進し、細胞を化学療法に対して耐性にする。
【００２３】
これに対応して、「STAT3シグナル伝達」の阻害はアポトーシスを誘導し、細胞増殖抑制剤に対する感受性を増大させる。
【００２４】
JUN-Dは、JUN遺伝子ファミリーのメンバーであり、偏在する発現度を有する「活性化タンパク質-1」(AP-1)転写因子複合体の必須成分である。JUN-D(-/-)初代線維芽細胞は早期老化を示し、UV照射あるいはTNFα治療後のアポトーシスを増加させた。この結果は、JUN-Dが「NFkappaB生存経路」を活性化するという仮定を導く。さらに、JUN-Dによって直接制御されるp202は、線維芽細胞をアポトーシス抵抗性にする。
【００２５】
BVDUによる共治療は、両方のJUN-Dイソ型の発現を約１／４まで減少させた。一方、STAT3は、回復期において約２／３に減少した（実施例２）。
【００２６】
マイトマイシンＣを用いた共治療後の回復期における効果は特に印象的である。この場合、塩基類似体は腫瘍遺伝子JUN-Dの過剰発現をコントロールレベルまで減少させた（実施例２）。
【００２７】
２）については、BVDUなどの塩基類似体はDDX1を妨害する。DDX1はMYCNで共増幅され、神経芽細胞腫(NB)及び網膜芽細胞腫の細胞株並びに腫瘍内で過剰発現する。DDX1及びMYCNの両方が増幅されたNB患者は、MYCN遺伝子増幅のみの患者より予後が悪い。DDX1にはそれゆえ発癌の可能性がある。
【００２８】
BVDUとMMCの共治療は、UBE2N及びAPEXの過剰発現を約１／３まで減少させる。UBE2Nの修飾は、DNA損傷への抵抗力に影響を与える。APEXヌクレアーゼはDNA修復酵素である。APEX発現の遮断は細胞溶解を倍加し、DNA切断を増加させる。
【００２９】
３）について、BVDUはDT-ジアフォラーゼを誘導する（実施例３）。後者は化学療法にとって重要な２つの性質を有する。それは一方でキノン類由来の細胞増殖抑制剤を活性化し、他方、活性酸素種の生成に基づく非特異的な毒性作用を減じる。
【００３０】
DT-D遺伝子の欠損は、p53及びp73発現の減少によって、骨髄過形成及びこれに対応してアポトーシス率の減少をもたらす。これは、多因子性「多剤耐性」表現型の腫瘍細胞が、DT-ジアフォラーゼ発現を減少させ増加させないという観察結果と一致している。興味深いことに、DT-D酵素活性もリンパ球集団を安定させる。この作用は、化学療法中の患者の免疫系の安定化に有利な効果をもたらす。
【００３１】
例えばDOX及びMXAなどの、多くの細胞増殖抑制剤は、癌細胞の酸化還元状態及びミトコンドリア呼吸を乱す。これは活性酸素種(ROS)の生成をもたらす。癌細胞のみでなく、全ての他の細胞がROSの突然の蓄積によって影響を受け、結果として、化学療法中に望まない副作用が発生する。
【００３２】
DT-DはROSを不活性にし、それにより細胞を非特異的ROS及び求電子攻撃から保護する。BVDUのこの効果の指標として、化学療法中の望まない副作用の減少、実施例４に記載するドキソルビシン＋BVDU-処置ラットの体重の増加がある。DOX治療単独では、毒性の副作用のため、体重の減少が起こる。BVDUによって、副作用（おそらくDOXの心毒性）のみが低減し、腫瘍に対する毒性作用は減少しないと考えられる。
【００３３】
４）について、細胞増殖抑制効果は、回復期中に様々な酵素の発現が変化することによって、細胞増殖抑制剤が存在しなくても維持される。実施例５に示すように、８つの遺伝子の発現が増加し、６つの遺伝子の発現が低減する。
【００３４】
遺伝子製品は、マイクロフィラメントの形成、分化、シグナル伝達及びATP生成に影響を与える。
【００３５】
以下の図面及び実施例を参照して、本発明に係る主題をより詳細に説明するが、本発明の主題は、記載された実施形態に限定されない。
【実施例１】
【００３６】
BVDU治療は、化学療法-誘発アポトーシスに対するAH13r肉腫細胞の感受性を増加させる。この効果は、いわゆる回復期において、細胞増殖抑制剤を中止した後でさえ維持される。
【００３７】
AH13r細胞は、細胞増殖抑制剤マイトマイシンＣ(MMC)の投与量を増加しながら処理した。BVDUは、単独で投与した場合毒性作用を示さなかった。MMC＋BVDU処理は、３回の治療周期後、MMC単独で処理した場合と比べて、細胞数をより減少させた。この抑制効果は、次のサイクルで細胞増殖抑制剤を中断した後、いわゆる回復期においても維持された。MMC及びBVDUで処理しなかった細胞は、抑制されることなく増殖し続けた。しかしながら、BVDUを投与され続けたものは、その増殖が著しく阻害された（図１参照）。
【００３８】
メトトレキサート(MTX)、ドキソルビシン(DOX)及びミトキサントロン(MXA)で行った対応試験結果を図２に示す。
【００３９】
細胞数の減少がアポトーシスに基づくということは、ヘキスト社の33258/プロピジウムヨウ化物(Hopi)二重着色法を用いて証明された。
【実施例２】
【００４０】
我々は、ウエスタンブロット分析を用いて様々な「生存経路」をテストした。分析は、Sambrook等の分子クローニング2001(Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning)(第３版)に記載された、標準的な方法に従って実施した。抗体希釈物：P-STAT3（細胞シグナル伝達）1：500、JUN-D（カリフォルニア州、サンタ・クルーズ）1：1000とした。２つのJUN-Dのバンドのうち、上のバンドは「完全長イソ型」を示し、下のバンドはアミノ酸が48短い「切断イソ型」を示す。両方のイソ型が転写を活性化できるが、「完全長」変異体は「切断」イソ型より効率が高い（図３参照）。
【００４１】
濃度測定により決定した腫瘍遺伝子蛋白JUN-D及びSTAT3の濃度は、回復期（r＝回復期）におけるDOX治療後、１／４あるいは２／３まで減少した。「回復期」中はBVDUのみ投与し、細胞増殖抑制剤は投与しなかった。
【００４２】
マイトマイシンＣ(MMC)を用いて試験を行い、対応する結果を得た（図４参照）。
【００４３】
マイトマイシンＣ(MMC)を用いた試験において、「回復期」に投与したBVDUは、MMCが誘導するJUN-Dの過剰発現（コントロールレベルに対する）を完全に阻害した。
【実施例３】
【００４４】
DT-ジアフォラーゼ（DT-D）の測定は、ジクマロール-抑制性NAD(P)H（Hodnick等のAnal. Biochem 252(1), 1997, 165-168に記載された、ジクロロフェノール・インドフェノール・還元酵素）で行った。DOX＋/−BVDUで処理した同じ数の細胞の抽出物を試験し、DT-D活性を調べた。BVDUで処理した細胞は、コントロール群あるいはDOX単独で処理した細胞群の細胞と比較して、約３倍のDT-D活性を示した（図５参照）。
【００４５】
ミトキサントロン(MXA) 及びメトトレキサート(MTX)を用いて対応する結果を得た。BVDU単独投与は、DT-D活性を常に増加させたが、ある部分ではごく弱かった。
【００４６】
メトトレキサート(MTX)及びヒトK562腫瘍細胞を用いた結果を図６に示す。MBはMTX＋BVDUを意味する。継代は、さらに増殖させるための細胞の希釈及び植え替えを意味する。相対DT-D活性はY軸で表す。
【実施例４】
【００４７】
ドキソルビシン(DOX)の有毒な副作用が減少することが、ラットを用いた試験で確認された（表１参照）。SDラットはジメチルベンズアントラセン(DMBA)で処置した。その結果誘発された腫瘍はDOX処置（1mg/kg）によりその増殖が抑制された。処置期間中及び各処置の翌日、すなわち回復期中に、ラットそれぞれに15mg/kgのBVDUを投与した。
【００４８】
【表１】
2006521283.tif 000003
【実施例５】
【００４９】
塩基類似体及びマイトマイシンＣを用いた処理によって影響を受けるタンパク質をリストアップした。二次元ゲル電気泳動の実施の結果を以下の表２にまとめる。
【００５０】
【表２】
2006521283.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、AH13r細胞の数に対する、細胞増殖抑制剤単独投与の効果、およびBVDUとの併用投与の効果を示す。
【図２】図２は、図１との比較であり、ドキソルビシン(DOX)、ミトキサントロン(MXA)及びメトトレキサート(MTX)の結果を示す。
【図３】図３は、ドキソルビシン(DOX)を用いた「生存経路」試験のウエスタンブロット分析を示す。
【図４】図４は、図３に対応し、マイトマイシン(MMC)を用いた実験結果を示す。
【図５】図５は、ドキソルビシン(DOX)を単独で用いた場合、あるいはBVDUと併用した場合における、DT-ジアフォラーゼ(DT-D)測定の結果を示す。
【図６】図６は、図５に対応し、メトトレキサート(MTX)を用いた実験結果を示す。
【図１】
2006521283.tif 000006
【図２】
2006521283.tif 000007
【図３】
2006521283.tif 000008
【図４】
2006521283.tif 000009
【図５】
2006521283.tif 000010
【図６】
2006521283.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月13日(2004.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法後に、細胞増殖抑制剤の追加投与なく、細胞増殖抑制剤のアポトーシス効果を増大させる医薬品を製造するための、(E)-5-(2-ブロモビニル)-2'-デオキシウリジン(BVDU)、その保護型、塩及び／又はプロドラッグの使用。
【請求項２】
化学療法中に、少なくとも１種の細胞増殖抑制剤を、BVDU、その保護型、塩及び／又はプロドラッグと併用する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化学療法中に、一定量のBVDU、その保護型、塩及び／又はプロドラッグと併用して、所定期間に渡って投与量を増加させながら細胞増殖抑制剤を使用し、且つ化学療法後の回復期中に、BVDU、その保護型、塩及び／又はプロドラッグ単独で使用する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記回復期が３〜１０日間である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記化学療法の周期期間が８〜３０日間である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
プロドラッグとして一般式Iの化合物を使用する、請求項１に記載の使用。
【化１】
2006521283.tif 000012
【請求項７】
血中濃度が0.02〜50μg/mlとなる投与量で、BVDU、その保護型、塩及び／又はプロドラッグを使用する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
2006521283.tif 000013
2006521283.tif 000014
2006521283.tif 000015
2006521283.tif 000016
2006521283.tif 000017
2006521283.tif 000018
2006521283.tif 000019
2006521283.tif 000020
2006521283.tif 000021
2006521283.tif 000022
2006521283.tif 000023
2006521283.tif 000024