(57)【要約】本発明は、アポトーシス関連疾患に関連するポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に関連する新規の遺伝子に関する。本発明は、ＴＲＡＩＬ核酸、それらの組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはディジェネレート変異体、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、および、このような遺伝子産物に対して向けられた抗体、哺乳動物ＴＲＡＩＬ遺伝子分子を含むクローニングベクター、および、このような分子を発現するように遺伝操作された宿主を包含する。本発明はさらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現および遺伝子産物を調節する化合物の同定方法、ならびに、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の治療におけるこのような化合物の治療剤としての使用に関する。本発明はまた、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の診断の評価、遺伝学的試験および予後のための方法、ならびに、これらの疾患を治療するための方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２１に示されるポリペプチド；または、
ｂ）配列番号２３に示されるポリペプチド、
を含む、ＴＲＡＩＬをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号２０で示される核酸；または、
ｂ）配列番号２２で示される核酸、
を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子の相補体を含む単離された核酸分子。
【請求項４】
高ストリンジェントな条件下で請求項１に記載の核酸分子の相補体にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項５】
核酸によってコードされたポリペプチドの発現を制御する調節核酸と操作可能に結合した請求項１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項６】
核酸によってコードされたポリペプチドの発現を制御する調節核酸と操作可能に結合した請求項１に記載の核酸を発現するように遺伝子操作された、宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を含む導入遺伝子を含むように遺伝子操作された、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
ａ）配列番号２１；または、
ｂ）配列番号２３、
および、場合により、いずれかの配列に融合した融合ペプチドのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項８に記載の単離されたポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１０】
被験体におけるＴＲＡＩＬ配列の機能、活性および／または発現を調節する化合物を被験体に投与することを含む、被験体においてアポトーシス関連疾患を治療する方法。
【請求項１１】
化合物が、小さい有機分子、抗体、リボザイム、および、アンチセンス分子からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシス関連疾患が、ガン、神経変性病、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、および、多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＲＡＩＬ配列の発現を調節する化合物を同定する方法であって：
ａ）試験化合物と、ＴＲＡＩＬ配列を発現する細胞とを接触させること；
ｂ）上記細胞中のＴＲＡＩＬ配列の発現のレベルを測定すること；
ｃ）上記試験化合物の存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列の発現のレベルと、上記試験化合物の非存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列の発現のレベルとを比較すること（ここで、上記試験化合物の存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列の発現のレベルが、上記試験化合物の非存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列の発現のレベルと異なる場合、ＴＲＡＩＬ配列の発現を調節する化合物が同定される）、
を含む、上記方法。
【請求項１４】
ＴＲＡＩＬ配列産物の活性を調節する化合物を同定する方法であって：
ａ）試験化合物と、ＴＲＡＩＬ配列産物を発現する細胞とを接触させること；
ｂ）細胞中のＴＲＡＩＬ配列産物のレベルを測定すること；
ｃ）上記試験化合物の存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列産物活性のレベルと、上記試験化合物の非存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列産物活性のレベルとを比較すること（ここで、上記試験化合物の存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列産物活性のレベルが、試験化合物の非存在下の細胞中のＴＲＡＩＬ配列産物活性のレベルと異なる場合、ＴＲＡＩＬ配列産物の活性を調節する化合物が同定される）、
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、今回ガン細胞のアポトーシスの誘導に関連することが示されたポリヌクレオチド配列に関する。より特定には、本発明は、ガン細胞アポトーシス誘導物質のＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）をコードする新規のポリヌクレオチド配列に関する。本発明は、ＴＲＡＩＬタンパク質をコードする核酸、組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子、および、それらのディジェネレート変異体、このようなＴＲＡＩＬをコードする核酸を含むベクター、および、このような分子を発現するように遺伝子操作されている、および／または、このような分子を含む宿主を包含する。本発明はさらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、および、このような遺伝子産物に対して向けられた抗体に関する。本発明はさらに、このようなＴＲＡＩＬをコードする核酸の発現、合成および活性を調節する化合物を同定する方法、および、本発明においてアポトーシス関連疾患の治療における治療剤と同定された化合物のような化合物を用いる方法に関し、このような疾患としては、これらに限定されないが、例えば、ガン、同様に、神経変性病、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、多発性硬化症が挙げられる。本発明はまた、アポトーシス関連疾患の診断の評価、遺伝学的試験および予後の方法に関し、このような疾患としては、これらに限定されないが、例えば、ガン、同様に、神経変性病、紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、多発性硬化症が挙げられる。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスプロセスは、胚の発達、および、生物のホメオスタシスなどの様々な生物学的プロセスに重要である。アポトーシスは、ウイルス感染細胞の除去、免疫反応が終わる際の活性化リンパ球の削除、および、体内の異常な細胞の除去のような極めて重要な生理学的な役割を有する（Ｊａｃｏｂｓｏｎ等，１９９７年，Ｃｅｌｌ  ８８：３４７〜３５４）。進化の間、生物学的な系、特に哺乳動物は、特定の細胞に活発に死を指示するアポトーシスシグナル伝達メカニズムを発達させてきた。アポトーシスは、抗ガン剤、成長因子の喪失、同様に、デス因子（ｄｅａｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）などの様々な刺激によって誘導することができる（Ｎａｇａｔａ，１９９７年，Ｃｅｌｌ  ８８：３５５〜３６５）。デス因子に関するメカニズムは、細胞表面のデス受容体とデスリガンドとの相互作用を含む。これらのリガンドのうち３種、すなわちＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、Ｆａｓ／ＣＤ９５Ｌ、およびＬＴ−αは、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが可能であることから、特に注目されてきた。しかしながら、これら３種のタンパク質はインビボで正常な組織に対して急性毒性作用を有することから、その使用可能性は限定されている。
【０００３】
ＴＲＡＩＬは、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、まず、ＴＮＦ、ＣＤ９５ＬおよびＬＴ−αを含むその細胞外ドメインの相同体と同定された（Ｗｉｌｅｙ等，１９９５年，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６７３〜６８２）。ＴＲＡＩＬのＣ末端細胞外領域は、ファミリーメンバー間で保存されており、「ジェリーロール」構造を有し、三量体を形成する（ＡｓｈｋｅｎａｚｉおよびＤｉｘｉｔ，１９９８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０５〜１３０８）。ＴＲＡＩＬタンパク質は、様々な腫瘍細胞系でアポトーシスを誘導するが、形質転換されていない正常な細胞では誘導しないことが報告されている（Ｗａｌｃｚａｋ等，１９９９年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１５７〜１６３；Ｗｉｌｅｙ等，１９９５年，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６７３〜６８２：Ｐｉｔｔｉ等，１９９６年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１２６８７〜１２６９０）。加えて、マウスとヒト以外の霊長類における前臨床の研究によれば、ＴＲＡＩＬ投与は、ヒトの腫瘍でアポトーシスを誘導することが可能であるが、正常な臓器または組織では細胞毒性は観察されないことが示されている（Ｗａｌｃｚａｋ等，１９９９年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１５７〜１６３；Ａｓｈｋｅｎｚｉ等，１９９９年，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１５５〜１６２）。
【０００４】
２０００年には、ポリヒスチジンタグが付された組換えヒトＴＲＡＩＬ（残基１１４〜２８１）は、インビトロで、単離されたヒト肝細胞でアポトーシスを誘導するが、非ヒト肝細胞では誘導しないことが発見された（Ｊｏ等，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６：５６４〜５６７）。この発見により、ガン治療においてＴＲＡＩＬを用ると、インビボで肝臓毒性を引き起こす可能性があるという関連を生じた（Ｎａｇａｔａ，２０００年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６（５）：５０２〜５０３）。しかしながら、近年、組換え型のＴＲＡＩＬバージョンの分化した肝細胞毒性およびその他の生化学的特性が報告されている（Ｌａｗｒｅｎｃｅ等，２００１年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７（Ａ）：３８４〜３８５）。本分析において、可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の野生型は作用を示さないが、一方で、Ｈｉｓタグを付されたＴＲＡＩＬは、実質的なアポトーシスを誘導した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ガンは、ヒトを困惑させるだけでなく、イヌの自然死の最も一般的な原因でもある（Ｂｒｏｎｓｏｎ，１９８２年，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ，４３（１１）２０５７〜９）。イヌは、ヒトよりも２倍高い頻度で腫瘍を発達させ、１０歳またはそれ以上生きているイヌの４５〜５０％が年齢に関わらずガンに罹っていること；および、剖検に提出されたイヌの２３％がガンで死亡していることが報告されている（Ｂｒｏｎｓｏｎ，１９８２年，Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ，４３（１１）２０５７〜９）。外科的な腫瘍の除去が最も一般的な治療法であるが、浸潤性／転移性の腫瘍を有するイヌの予後は極めて悪く、平均生存時間は数週間から数ヶ月である。放射線療法および化学療法のようなその他の治療が成功することはかなりまれである（Ｂｏｓｔｏｃｋ，１９８６年，Ｂｒ  Ｖｅｔ  Ｊ  １４２（６）：５０６〜１５；Ｂｏｓｔｏｃｋ，１９８６年，Ｂｒ  Ｖｅｔ  Ｊ  １４２（１）：１〜１９；ＭａｃＥｗｅｎ，１９９０年，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ９（２）：１２５〜３６）。従って、例えばイヌのガンのような血管新生病のより有効な治療が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に関連する新規のヌクレオチド配列を包含する。より特定には、本発明は、ＴＲＡＩＬをコードするヌクレオチド配列に関する。加えて、本発明は、ＴＲＡＩＬ核酸、組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子、または、それらのディジェネレート変異体を提供する。本発明はまた、ＴＲＡＩＬ核酸分子を含む発現ベクターなどのベクター、および、このようなＴＲＡＩＬ遺伝子産物を発現するように遺伝子操作されている、および／または、このようなＴＲＡＩＬ遺伝子産物を含む宿主を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、新規のＴＲＡＩＬ遺伝子産物、および、このような遺伝子産物またはそれらの変異体もしくはフラグメントに対して向けられた抗体に関する。
【０００８】
本発明はさらに、ＴＲＡＩＬ介在プロセスの調節方法、および、少なくとも１つの疾患の症状の回復または予防を含むガンのようなアポトーシス関連疾患の治療方法に関し、このような方法は、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物を投与することを含む。一実施形態において、本発明は、このような疾患の症状を治療または改善するための、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、または、それらのフラグメント、類似体もしくはミメティック、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に対して向けられた抗体もしくは抗体フラグメントの使用方法に関する。
【０００９】
本発明はさらに、ＴＲＡＩＬ介在プロセスの調節方法、および、細胞の異常なアポトーシスに関連する疾患の少なくとも１つの症状の回復または予防を含む細胞の異常なアポトーシスに関連する疾患の治療方法に関し、このような方法は、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物を投与することを含む。一実施形態において、本発明は、このような疾患の症状を治療または改善するための、新規のＴＲＡＩＬ遺伝子産物、または、それらのフラグメント、類似体もしくはミメティック、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に対して向けられた抗体もしくは抗体フラグメントの使用方法に関する。
【００１０】
本発明はさらに、受容体アンタゴニストとして作用する類似体を用いて、ＴＲＡＩＬと、そのそれぞれの受容体との相互作用をブロックする方法に関する。これらのアンタゴニストは、アポトーシスを促進し得る。このような作用は、これらに限定されないが、活性化Ｔ細胞の不十分なアポトーシス、および、自己免疫疾患などの状態において望ましいことがある。本発明で用いられる用語「ＴＲＡＩＬ関連疾患」は、ＴＲＡＩＬ遺伝子もしくは遺伝子産物に関与する疾患、または、正常な、影響を受けていない、障害のない個体で見出されるレベル、臨床的に正常な個体で見出されるレベル、および／または、集団のレベルが基準の平均ＴＲＡＩＬレベルを示す集団で見出されるレベルに対して、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現、遺伝子産物合成および／または遺伝子産物活性それぞれの異常なレベルに関与する疾患を意味する。本発明で用いられる用語「ＴＲＡＩＬ介在プロセス」は、直接的または間接的に、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現、遺伝子産物合成および／または遺伝子産物活性のレベルに依存する、および／または、それらに反応するプロセスを含む。
【００１１】
他の実施形態において、このような方法は、ＴＲＡＩＬ介在プロセスまたは疾患が治療される（例えば症状が改善される）ように、細胞におけるＴＲＡＩＬ遺伝子産物の発現レベルまたは活性を調節することを含んでもよい。他の実施形態において、このような方法は、ＴＲＡＩＬ介在プロセスまたは疾患が治療される（例えば症状が改善される）ように、細胞中のＴＲＡＩＬ遺伝子産物のレベル、発現または活性を増加させるために、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子を供給することを含んでもよい。ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子は、活性または発現レベルが増加した突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードしてもよい。
【００１２】
本発明はさらに、ＴＲＡＩＬ介在プロセスの調節方法、または、ガンのようなＴＲＡＩＬ関連疾患の治療方法に関し、このような疾患としては、これらに限定されないが、ＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異、および／または、ＴＲＡＩＬ発現または活性の異常なレベルにより生じる疾患、ならびに、１またはそれ以上のＴＲＡＩＬ遺伝子または遺伝子産物に関与する疾患が挙げられ、この場合の治療は、このような疾患の少なくとも１つの症状の回復または予防を含む。一実施形態において、このような方法は、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物が発現され、疾患が治療される（例えば症状が改善される）ように、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子を、治療が必要な哺乳動物に供給することを含んでもよい。「障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物」は、変化していない、または、野生型のＴＲＡＩＬ遺伝子産物を意味する。他の実施形態において、このような方法は、細胞が、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物を発現し、疾患が治療される（例えば症状が改善される）ように、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を、治療が必要な哺乳動物に供給することを含んでもよい。さらなる他の実施形態において、このような方法は、調節化合物を、治療が必要な哺乳動物に供給することを含み、このような調節化合物としては、例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子または遺伝子産物の活性を調節することができる小さい分子、ペプチドまたは抗体が挙げられる。
【００１３】
加えて、本発明は、ガンのような血管新生関連疾患の診断の評価、遺伝学的試験および／または予後のための、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物配列を利用する方法を目的とする。例えば、本発明は、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の診断方法に関し、このような方法は、患者のサンプルにおいてＴＲＡＩＬ遺伝子発現を測定すること、または、このような疾患を示す疑いのある哺乳動物のゲノムにおいて、このような疾患の存在または進行と相互関係を示すＴＲＡＩＬ突然変異を検出することを含んでもよい。
【００１４】
本発明はまた、ヒト染色体のマッピングのためのマーカーとしてＴＲＡＩＬ遺伝子配列および／または遺伝子産物を利用することを目的とする。
【００１５】
本発明はさらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の合成または活性を調節することができる化合物を同定する方法に関し、このような方法は、化合物と、このようなＴＲＡＩＬ遺伝子を発現する細胞とを接触させること、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定すること、および、このようなレベルと、このような化合物の非存在下の細胞によって生産されたＴＲＡＩＬ遺伝子発現、遺伝子産物または遺伝子産物活性のレベルとを比較すること（このような化合物の存在下で得られたレベルが、それが非存在下で得られたレベルと異なる場合に、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の合成または活性を調節することができる化合物が同定される）を含む。
【００１６】
定義
本発明で用いられる以下の用語は、以下に示す略語を有するものとする。
ＢＡＣ：細菌人工染色体
ｂｐ：塩基対
ｄｂＥＳＴ：発現された配列タグデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
ＥＳＴ：発現された配列タグ
オリゴ：デオキシオリゴヌクレオチド
ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写酵素ＰＣＲ
ＳＮＰ：単一ヌクレオチド多型
ＳＳＣＰ：一本鎖高次構造多型
ＹＡＣ：酵母人工染色体。
【００１７】
添付図面において：
図１：イヌおよびネコの細胞系におけるＴＲＡＩＬ遺伝子発現である。トータルＲＮＡを、細胞系ＣＲＬ−６１３０（Ｆｃ２８．Ｌｕ，ネコの肺）、ＣＲＬ−６２５２（ＥＣＦ５０．ＨＴ，イヌの心臓）、ＣＲＬ−６５６９（Ｆｃ２．Ｌｕ，ネコの肺）から単離した。プライマーの２つのペア（ペア１は、配列番号１と配列番号２；ペア２は、配列番号２と配列番号２）を、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬの内部領域を増幅するのに用いた。第一鎖のプライマーとして、トータルＲＮＡ（１μｇ）を、ｐｄ（Ｎ）6（１μｇ）と共に、ＲＴ−ＰＣＲビーズに加えた（アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ），カタログ番号２７−９２６７−０１，イリノイ州）。逆転写酵素を不活性化し、テンプレートを完全に変性させた後、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
【００１８】
図２：イヌのＴＲＡＩＬのヌクレオチド配列（配列番号２０）であり、太字の配列は、オープンリーディングフレームに関する配列を示す。下線の配列は、開始コドンおよび停止コドンを示す。
【００１９】
図３：イヌのＴＲＡＩＬタンパク質である。図２の配列（配列番号２１）から翻訳されたイヌのＴＲＡＩＬのアミノ酸配列である。
【００２０】
図４：ネコのＴＲＡＩＬのヌクレオチド配列（配列番号２２）である。太字の配列は、オープンリーディングフレームに関する配列を示す。下線の配列は、開始コドンおよび停止コドンを示す。
【００２１】
図５：ネコのＴＲＡＩＬタンパク質である。図３の配列（配列番号２３）から翻訳されたネコのＴＲＡＩＬのアミノ酸配列である。
【００２２】
図６Ａ〜６Ｄ：全て既知の（ヒト、マウス、イヌおよびネコの）ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列のアライメントである。太字の残基は、コンセンサスとの違いを示す。
【００２３】
図７Ａ〜７Ｂ：全て既知の（ヒト、マウス、イヌおよびネコの）可溶性ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列のアライメントである。太字の残基は、コンセンサスとの違いを示す。
【００２４】
図８Ａ〜８Ｂ：哺乳動物細胞で発現されたＴＲＡＩＬタンパク質のウェスタン免疫ブロット分析である。ＣａｌＰｈｏｓ哺乳動物トランスフェクションキット（クロンテック・ラボラトリーズ社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）．，パロアルト，カリフォルニア州）を用いて、ヒト２９３細胞を、イヌまたはネコのＴＲＡＩＬをコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後２日目に、培養上清と細胞溶解産物の両方を製造した。タンパク質を４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレン（ＮＯＶＥＸ，サンディエゴ，カリフォルニア州）にトランスファーした。免疫ブロット分析のために、ＨＡ抗体（８Ａ）または抗ヒトＴＲＡＩＬ抗血清（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ），８Ｂ）のいずれかを、プローブとして用いた。結合した抗体を、ホスファターゼ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ，ゲイザースバーグ，メリーランド州）を用いて検出した。マーカー，分子量マーカー；ｃａＴＲＡＩＬ，イヌのＴＲＡＩＬ；ｆｅＴＲＡＩＬ，ネコのＴＲＡＩＬ；ｐＧＬ２，トランスフェクションコントロールとして用いられたプラスミド。
【００２５】
図９Ａ〜９Ｃ：哺乳動物発現ＴＲＡＩＬのアポトーシス分析である。Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、トランスフェクトされた２９３細胞の調整培地から生産されたＴＲＡＩＬタンパク質の存在または非存在下で成長させた。９Ａは、ＭＴＴ成長阻害分析における、哺乳動物発現ＴＲＡＩＬによる成長阻害を示す。９Ｂは、細胞死ＥＬＩＳＡ分析において、アポトーシスにより誘導された活性を示す。９Ｃは、アネキシンＶ  ＦＡＣＳアポトーシス分析において、アポトーシスにより誘導された活性を示す。Ｓｔａｕ，スタウロスポリン（０．４μＭ），有効なアポトーシス誘導物質；ｈｕＴＲＡＩＬ，ヒトＴＲＡＩＬ  （アップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１００ｎｇ／ｍｌ）；ｃａＴＲＡＩＬ，イヌのＴＲＡＩＬ；ｆｅＴＲＡＩＬ，ネコのＴＲＡＩＬ；ベクター，トランスフェクションコントロールとして用いられたプラスミド。
【００２６】
図１０Ａ〜１０Ｅ：細菌においてｐＢＡＤ−チオプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現および溶解性である。様々なアラビノース誘導条件下（ａ，０．２％アラビノース；ｂ，０．０２％；ｃ，０．００２％；および、ｄ，アラビノースなし）でｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ＴＲＡＩＬプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉのＴＯＰ１０細胞を回収し、超音波破砕し、溶解産物の可溶性および不溶性フラクションを得た。各フラクションの等量を、１０％ビス−トリスゲル（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｇｅｌ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した。１０Ａ〜１０Ｂ，様々な誘導条件下のＴＲＡＩＬ発現である。１０Ｃ〜１０Ｅ，様々な誘導条件下のＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性である（Ｐ，ペレット；Ｓ，可溶性フラクション）。Ｈｕ−Ｔ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するヒトＴＲＡＩＬ；Ｈｕ，タグを有さないヒトＴＲＡＩＬ；Ｃａ−Ｔ，タグを有するイヌのＴＲＡＩＬ；Ｃａ，タグを有さないイヌのＴＲＡＩＬ；Ｆｅ−Ｔ，タグを有するネコのＴＲＡＩＬ；Ｆｅ，タグを有さないネコのＴＲＡＩＬ。
【００２７】
図１１Ａ〜１１Ｂ：ヒトおよびイヌのＴＲＡＩＬ−チオの、Ｈｉｓ−バンドクイック（Ｈｉｓ−ｂａｎｄ  Ｑｕｉｃｋ）９００カートリッジカラムのフラクションである。ヒトおよびイヌのＴＲＡＩＬ−チオタンパク質を含む細菌細胞溶解産物を、Ｈｉｓ−バンドクイック９００カートリッジ（ノヴァジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））にローディングした。８個のフラクション（溶出液，０．５ｍｌ／フラクション）を回収し、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した。Ｆ１，溶解産物をカラムに１回通過させる流出液；Ｆ２，溶解産物をカラムに２回通過させる流出液；Ｗ１，結合緩衝液でのカラム洗浄液；Ｗ２，洗浄緩衝液でのカラム洗浄液。
【００２８】
図１２：細菌発現ＴＲＡＩＬ−チオタンパク質のアポトーシス分析である。Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、細菌細胞から発現および精製されたヒトおよびイヌのＴＲＡＩＬ−チオタンパク質の存在または非存在下で成長させた。アポトーシスにより誘導された活性が、アネキシンＶ  ＦＡＣＳ解析で測定された。スタウロスポリン（０．４μＭ），Ｆａｓリガンド（１００ｎｇ／ｍｌ，アップステート・バイオテクノロジー）、および、市販のヒトＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ，アップステート・バイオテクノロジー）を、ポジティブコントロールとして用いた。本分析において、２種のヒトＴＲＡＩＬ−チオ調製物（ｈｕＴＲＡＩＬ  Ｅ３、および、Ｅ４）、ならびに、２種のイヌのＴＲＡＩＬ−チオ調製物（ｃａＴＲＡＩＬ  Ｅ３、および、Ｅ２＋Ｅ４）を用いた。
【００２９】
図１３Ａ〜１３Ｂ：細菌においてＴ７プロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現である。ＩＰＴＧ誘導有り（＋）またはなし（−）でｐＴ７−ＴＲＡＩＬプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１細胞を回収し、ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、続いて、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、ウェスタン解析のためにイモビロンＰ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））にトランスファーした。１３Ａ，抗Ｖ５抗体（インビトロジェン）を、プローブとして用いた。１３Ｂ，抗ＴＲＡＩＬタンパク質（ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ）を、プローブとして用いた。Ｔ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するＴＲＡＩＬタンパク質；Ｎ，タグを有さないＴＲＡＩＬタンパク質；Ｈｕ，ヒトＴＲＡＩＬ；Ｃａ，イヌのＴＲＡＩＬ；Ｆｅ，ネコのＴＲＡＩＬ；ＣＡＴ遺伝子，クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ポジティブコントロールとして用いられた）。ＴＲＡＩＬ−Ｈ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するＴＲＡＩＬタンパク質；ＴＲＡＩＬ，タグを有さないＴＲＡＩＬタンパク質。
【００３０】
図１４Ａ〜１４Ｂ：細菌においてＴ７プロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性である。ｐＴ７−ｈｕＴＲＡＩＬプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉのＢＬ２１細胞を溶解させ、３回遠心分離し、続いて、陰イオン交換Ｑファストフロー（Ｆａｓｔ−Ｆｌｏｗ）カラムと、陽イオン交換Ｓ−セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムにローディングした。各サンプルを、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）で電気泳動し、０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した（図１４Ａ）。または、ウェスタン解析のために、抗ＴＲＡＩＬタンパク質（ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ）をプローブとして用いて、ゲルをイモビロンＰ（ミリポア）にトランスファーした（図１４Ｂ）。レーン１，溶解産物；２，Ｑカラムの溶出液；３，Ｑカラムの流出液；４，透析後のサンプル；５，第二の遠心分離後の上清；６，第一の遠心分離からのペレット；７，第二の遠心分離からのペレット；８，第三の遠心分離からのペレット；９，ＳＰカラムの流出液；１０，ＳＰカラムの洗浄液；１１，ＳＰカラムの溶出液。
【００３１】
図１５Ａ〜１５Ｃ：細菌においてｐＢＡＤプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現である。アラビノース誘導有り（＋，０．０２％）またはなし（−）、イヌおよびネコのｐＢＡＤ−ＴＲＡＩＬプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉのＴＯＰ１０細胞を、ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、続いて、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した（図１５Ａ）。または、ウェスタン解析のために、ゲルを、イモビロンＰ（ミリポア）にトランスファーした（図１５Ｂ、および、１５Ｃ）。パネルＢ，抗ＴＲＡＩＬタンパク質（ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ）抗体を、プローブとして用いた。パネルＣ，抗Ｖ５（インビトロジェン）を、プローブとして用いた。各プラスミドコンストラクトの２種のクローンを試験した。Ｃａ，イヌのＴＲＡＩＬ；Ｆｅ，ネコのＴＲＡＩＬ；ＣａＨ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するイヌのＴＲＡＩＬ；ＦｅＨ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するネコのＴＲＡＩＬ。ＴＲＡＩＬ−Ｈ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するＴＲＡＩＬタンパク質；ＴＲＡＩＬ，いかなるタグも有さないＴＲＡＩＬタンパク質。
【００３２】
図１６Ａ〜１６Ｂ：細菌においてｐＢＡＤプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性である。０．０２％アラビノース誘導下でイヌおよびネコのｐＢＡＤ−ＴＲＡＩＬプラスミドの両方を発現するＥ．ＣｏｌｉのＴＯＰ１０細胞を回収し、超音波破砕し、溶解産物の可溶性（Ｓ）および不溶性（Ｐ）フラクションを得た。２種の異なる成長温度（３０℃および３７℃）も用いられた。各フラクションの等量を、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した（図１６Ａ）。または、ウェスタン解析のために、ゲルを、抗ＴＲＡＩＬ抗体（ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ，図１６Ｂ）と共にイモビロンＰ（ミリポア）にトランスファーした。Ｃａ，イヌのＴＲＡＩＬ；Ｆｅ，ネコのＴＲＡＩＬ；ＣａＨ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するイヌのＴＲＡＩＬ；ＦｅＨ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するネコのＴＲＡＩＬ；ＴＲＡＩＬ−Ｈ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するＴＲＡＩＬタンパク質；ＴＲＡＩＬ，いかなるタグも有さないＴＲＡＩＬタンパク質。
【００３３】
図１７Ａ〜１７Ｈ：イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのＨｉｓ−バンドクイック９００カートリッジカラムのフラクションである。イヌのＴＲＡＩＬタンパク質（図１７Ａおよび１７Ｂ）、ならびに、ネコのＴＲＡＩＬタンパク質（図１７Ｃおよび１７Ｄ）を含む細菌細胞溶解産物を、Ｈｉｓ−バンドクイック９００カートリッジ（ノヴァジェン）にローディングした。８〜１０個のフラクション（溶出液，０．５ｍｌ／フラクション）を回収し、６μｌを、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、シルバー・エクスプレス（ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ）染色キット（図１７Ａ−１７Ｄ，インビトロジェン）で染色した。または、ウェスタン免疫ブロット分析のために、ゲルを、抗ＴＲＡＩＬ抗体（図１７Ｅ−１７Ｈ，ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ，図１７Ｆ）と共に、イモビロンＰ（ミリポア）にトランスファーした。Ｍ，分子量マーカー；Ｆ，溶解産物の流出液；Ｗ１，結合緩衝液でのカラムの洗浄液；Ｗ２，洗浄緩衝液でのカラムの洗浄液。ＴＲＡＩＬ−Ｈ，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有するＴＲＡＩＬタンパク質；ＴＲＡＩＬ，いかなるタグも有さないＴＲＡＩＬタンパク質。
【００３４】
図１８Ａ〜１８Ｃ：細菌発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、細菌細胞から生産されたＴＲＡＩＬタンパク質の存在または非存在下で成長させた。アポトーシスにより誘導された活性を、ＭＴＴ成長阻害分析（図１８Ａ）；細胞死ＥＬＩＳＡアポトーシス分析（図１８Ｂ）；アネキシンＶＦＡＣＳアポトーシス分析（図１８Ｃ）によって測定した。ＰＢＳ，リン酸緩衝生理食塩水；スタウロスポリン（０．４μＭ）、および、市販のヒトＴＲＡＩＬ（ｈｕＴＲＡＩＬ，１００ｎｇ／ｍｌ，アップステート・バイオテクノロジー）を、ポジティブコントロールとして用いた。また、哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質上清（ｃａＴＲＡＩＬ，ｆｅＴＲＡＩＬ、および、コントロールとしてベクタープラスミド）も、本分析のポジティブコントロールとして用いらた。細菌発現サンプルは、Ｓ５〜Ｓ９である。Ｓ５，ＴＲＡＩＬを含まない細菌のカラムのフラクションは、ネガティブコントロールとして用いられる；Ｓ６，Ｈｉｓ−バンドクイック９００カートリッジカラムから精製されたネコのＴＲＡＩＬ。Ｓ７，Ｖ５−Ｈｉｓタグを有する精製されたネコのＴＲＡＩＬ。Ｓ８，半精製されたイヌのＴＲＡＩＬ，カラムからの洗浄液。Ｓ９，半精製されたネコのＴＲＡＩＬ，カラムからの洗浄液。
【００３５】
図１９Ａ〜１９Ｂ：様々なヒトガン細胞系の哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。ヒト腫瘍細胞（ＨＥＬＡ，ＰＴ−３，ＨＴ−２９，ＳＷ４８０、およびＵ９３７）を、哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質上清の存在または非存在下で成長させた。アポトーシスにより誘導された活性を、ＭＴＴ成長阻害分析（図１９Ａ）、および、細胞死ＥＬＩＳＡアポトーシス分析（図１９Ｂ）によって測定した。スタウロスポリン（０．４μＭ）、および、市販のヒトＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ，アップステート・バイオテクノロジー）を、ポジティブコントロールとして用いた。ベクタープラスミドでトランスフェクトされた細胞からの上清を、ネガティブコントロールとして用いた。示されたデータは、８つの値の平均である。
【００３６】
図２０Ａ〜２０Ｂ：様々なイヌのガン細胞系の哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。イヌの細胞（Ｄ２２，Ｄ１７，ＣＦ２１．Ｔ，ＣＦ１１．Ｔ，ＭＤＣＫ，ＤＨ８２，０３０９、および、０３０Ｅ，ヒト腫瘍細胞Ｕ９３７を、コントロールとして用いた）を、哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質上清の存在または非存在下で成長させた。アポトーシスにより誘導された活性を、ＭＴＴ成長阻害分析（図２０Ａ）、および、細胞死ＥＬＩＳＡ分析（図２０Ｂ）で測定した；スタウロスポリン（０．４μＭ）、および、市販のヒトＴＲＡＩＬ（アップステート・バイオテクノロジー，細胞死ＥＬＩＳＡ分析に関してのみ１００ｎｇ／ｍｌ）を、ポジティブコントロールとして用いた。ベクターでトランスフェクトされた細胞からの上清を、ネガティブコントロールとして用いた。示されたデータは、３回のＭＴＴ分析、および、２回の細胞死ＥＬＩＳＡ分析の平均である。
【００３７】
図２１Ａ〜２１Ｂ：イヌ肝細胞の哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。正常なイヌ肝細胞を、哺乳動物発現イヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質上清（ｃａＴＲＡＩＬおよびｆｅＴＲＡＩＬ）の存在または非存在下で成長させた。Ｆａｓリガンド（１００ｎｇ／ｍｌ，アップステート・バイオテクノロジー）と、市販のヒトＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ，アップステート・バイオテクノロジー）の両方を、本分析のためのコントロールとして用いた。アポトーシスにより誘導された活性を、ＭＴＴ成長阻害分析（図２１Ａ）；細胞死ＥＬＩＳＡアポトーシス分析（図２１Ｂ）によって測定した。
【００３８】
表の簡単な説明
表１．様々な抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体を用いたイヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質のクロス・リアクティビティーである。
【００３９】
発明の詳細な説明
アポトーシス関連疾患に関連する核酸配列に関連する組成物および方法を本発明において説明する。アポトーシス関連疾患に関連する新規の遺伝子が同定された。このような遺伝子は、ＴＲＡＩＬをコードする。特に、ＴＲＡＩＬ核酸分子、同様に、これらの分子を含むベクター、このような分子を含む、および／または、発現するように操作された宿主細胞、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、ならびに、このような遺伝子産物を特異的に認識する抗体が以下で説明される。また、これらの核酸、ポリペプチド、および、抗体の様々な使用、同様に、それらの検出方法も説明される。例えば、アポトーシス関連プロセスの調節、および、ガンのような血管新生関連疾患の治療のためのこれらの分子の使用方法が、説明される。また、ＴＲＡＩＬ遺伝子または遺伝子産物と相互作用する、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子または遺伝子産物活性を調節する化合物のスクリーニング分析も以下で説明される。さらに、本発明の組成物、および、本発明の方法によって同定された組成物を用いたアポトーシス関連疾患の治療方法も説明される。最終的に、本発明の組成物が共に用いられる医薬組成物が説明される。
【００４０】
この章では、ＴＲＡＩＬ核酸分子を説明する。特に指定がない限り、用語「ＴＲＡＩＬ核酸」は、集合的に、本発明で説明される配列を意味する。
【００４１】
本発明のＴＲＡＩＬ核酸分子としては、以下が挙げられる：
（ａ）イヌのＴＲＡＩＬ（図２，配列番号２０）のＤＮＡ配列を含む核酸分子、および、それらのフラグメント；
（ｂ）ネコのＴＲＡＩＬ（図４，配列番号２２）のＤＮＡ配列を含む核酸分子、および、それらのフラグメント；
（ｃ）イヌのＴＲＡＩＬ核酸配列（例えば、図２（配列番号２０）に示された核酸配列）を含む核酸分子、または、それらのフラグメント；
（ｄ）ネコのＴＲＡＩＬ核酸配列（例えば、図４（配列番号２２）に示された核酸配列）を含む核酸分子、または、それらのフラグメント；
（ｅ）イヌのＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子；
（ｆ）ネコのＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子；
（ｇ）イヌのＴＲＡＩＬ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを含む核酸分子；
（ｈ）ネコのＴＲＡＩＬ遺伝子の少なくとも１つのエキソンを含む核酸分子；
（ｉ）上記（ｃ）に記載のイヌのＴＲＡＩＬヌクレオチド配列の、上流の非翻訳領域、イントロン領域、および／または、下流の非翻訳領域のＴＲＡＩＬ遺伝子配列を含む核酸分子、または、それらのフラグメント；
（ｊ）上記（ｄ）に記載のネコのＴＲＡＩＬヌクレオチド配列の、上流の非翻訳領域、イントロン領域、および／または、下流の非翻訳領域のＴＲＡＩＬ遺伝子配列を含む核酸分子、または、それらのフラグメント；
（ｋ）１またはそれ以上のドメインの全部または一部が、欠失または改変している、イヌのＴＲＡＩＬ遺伝子産物の突然変異体をコードする、本発明で開示される新規のＴＲＡＩＬ配列を含む核酸分子、および、それらのフラグメント；
（ｌ）１またはそれ以上のドメインの全部または一部が、欠失または改変している、ネコのＴＲＡＩＬ遺伝子産物の突然変異体をコードする本発明で開示される新規のＴＲＡＩＬ配列を含む核酸分子、および、それらのフラグメント；
（ｍ）異種ポリペプチドに融合した、イヌのＴＲＡＩＬ遺伝子産物を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、または、それらのフラグメント；
（ｎ）異種ポリペプチドに融合した、ネコのＴＲＡＩＬ遺伝子産物を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、または、それらのフラグメント；
（ｏ）上記ｃ）およびｄ）に記載のイヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子（例えばプライマー）内、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子の端にある、染色体のヌクレオチド配列内の核酸分子（これは、ガンのようなアポトーシス関連疾患に関する危険を有する個体、または、それを示す個体を同定および診断するための本発明の方法の一部として利用することができる、または、ヒト染色体のマッピングに用いることができる）；および、
（ｐ）上記のｃ）およびｄ）に記載のイヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子内、または、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子の端にある、染色体のヌクレオチド配列内の核酸分子（これは、ガンのようなアポトーシス関連疾患と相互関係を示す）。
【００４２】
本発明のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列としてはさらに、１またはそれ以上のエキソン、または、それらのフラグメントが欠失している上記（ａ）〜（ｐ）に記載のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列が挙げられる。
【００４３】
また、本発明のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列としては、塩基対の長さが、２０超、３０超、４０超、５０超、６０超、７０超、８０超、９０超、１００超またはそれ以上であり、上記の（ａ）〜（ｐ）に記載のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列も挙げられる。しかしながら、本発明の核酸分子は、単にｄｂＥＳＴからのヌクレオチド配列のみからなる核酸分子は含まれないものとする。
【００４４】
本発明のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列としてはさらに、上記の（ａ）〜（ｐ）に記載のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が挙げられる。
【００４５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント同一性を決定するために、最適に比較できるように配列を並べる（例えば、第二のアミノまたは核酸配列との最適なアライメントのために、第一のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列において対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドである場合、その位置においてその分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一なオーバーラップする位置数（＃）／オーバーラップする位置の総数（＃）×１００％）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。
【００４６】
２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて完成させることもできる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８、これは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７において改変されている）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて行い、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ有りアライメントを得るために、ギャップ有りＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２で説明されているように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の離れた関係を検出するための繰り返しのサーチを行うことができる（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）。ＢＬＡＳＴを利用する場合、ギャップ有りＢＬＡＳＴ、および、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラム、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを、用いることができる（http://www.ncbi.nfm.nih.govを参照）。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムのその他の好ましい非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４〜２２６８、これは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５８７７で改変されている）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２を用いて行い、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて行い、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ有りアライメントを得るために、ギャップ有りＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２で説明されているように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子間の離れた関係を検出するための繰り返しのサーチを行うことができる（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９７年）。��ＬＡＳＴ、ギャップ有りＢＬＡＳＴ、および、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照）。配列比較に利用される数学的アルゴリズムのその他の好ましい非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８８年，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する際、ＰＡＭ１２０の重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップの伸長ペナルティー＝１２、および、ギャップペナルティー＝４を用いることができる。
【００４７】
２つの配列間のパーセント同一性は、上述の技術に類似した、ギャップを入れることが可能な、または可能でない技術を用いて決定することができる。パーセント同一性を計算する際、一般的には、正確なマッチのみをカウントする。
【００４８】
本発明のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列としてはさらに、以下が挙げられる：（ａ）ストリンジェントな条件下で本発明のＴＲＡＩＬ核酸分子にハイブリダイズするあらゆるヌクレオチド配列［上記条件は、例えば、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃での、フィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約５０〜６５℃での１回またはそれ以上の洗浄のことである］、または、（ｂ）高ストリンジェントな条件下で本発明のＴＲＡＩＬ核酸分子にハイブリダイズするあらゆるヌクレオチド配列［例えば、６×ＳＳＣ中、約４５℃での、フィルターに結合した核酸へのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、約６８℃での１回またはそれ以上の洗浄］、または、当業者周知のその他のハイブリダイゼーション条件下で本発明のＴＲＡＩＬ核酸分子にハイブリダイズするあらゆるヌクレオチド配列（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．等編，１９８９年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；第Ｉ巻，グリーン・パブリッシング・アソシエイツ社（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ）、および、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ．Ｉｎｃ．），ニューヨーク，ｐｐ．６．３．１〜６．３．６および２．１０．３を参照）。好ましくは、上記の（ａ）および（ｂ）で説明した条件下でハイブリダイズするＴＲＡＩＬ核酸分子が、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子の相補体を含むことである。好ましい実施形態において、上記の（ａ）および（ｂ）に記載の条件下でハイブリダイズする核酸分子は、例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と機能的に同等の遺伝子産物のような遺伝子産物をコードする。
【００４９】
他の実施形態において、本発明は、中程度にストリンジェントな条件下で本発明のＴＲＡＩＬ核酸にハイブリダイズするあらゆるヌクレオチド配列を含み、上記条件は、例えば、６Ｍ尿素を含む緩衝液中、約４２℃でのフィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約５５℃での１回またはそれ以上の洗浄のことである。
【００５０】
機能的に同等のＴＲＡＩＬ遺伝子産物としては、同じ、または異なる種に存在する、天然に存在するＴＲＡＩＬ遺伝子産物が挙げられる。また、機能的に同等のＴＲＡＩＬ遺伝子産物としては、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の生物学的活性少なくとも１つが保持された遺伝子産物、および／または、このような遺伝子産物に対して向けられた抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって認識され、それに結合する遺伝子産物も挙げられる。
【００５１】
本発明の核酸分子のなかでも、高ストリンジェントまたはストリンジェントな条件下で、上述のＴＲＡＩＬ核酸分子にハイブリダイズするデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）が挙げられる。一般的に、長さが１４〜７０個のヌクレオチドプローブでは、融解温度（Ｔｍ）は、以下の式を用いて計算される：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［１価陽イオン（モル濃度）］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（５００／Ｎ）（式中、Ｎは、プローブの長さである）。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液中で行われる場合、融解温度は、以下の方程式を用いて計算される：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［１価陽イオン（モル濃度）］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６１（％ホルムアミド）−（５００／Ｎ）（式中、Ｎは、プローブの長さである）。一般的に、ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより約２０〜２５℃低い温度（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド用）で、または、Ｔｍより１０〜１５℃低い温度（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド用）で行われる。
【００５２】
代表的な高ストリンジェントな条件は、例えば、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中、３７℃（約１４塩基のオリゴ用）、４８℃（約１７塩基のオリゴ用）、５５℃（約２０塩基のオリゴ用）、および、６０℃（約２３塩基のオリゴ用）で洗浄することを意味し得る。
【００５３】
本発明の核酸分子はさらに、上述の核酸の相補体を含む。このような分子は例えば、例えばＴＲＡＩＬ遺伝子の調節において有用なアンチセンス分子として、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして作用し得る。
【００５４】
本発明の核酸配列は、リボザイム、および／または、三重らせん配列の一部として用いてもよく、これは、ＴＲＡＩＬ遺伝子の調節に有用でもある。さらにその上、このような分子は、診断方法の構成要素として用いてもよく、それによって、例えば、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に関与する特定のＴＲＡＩＬ対立遺伝子の存在を検出することができ、または、それにおいて、本方法は、対立遺伝子によって囲まれたヒト染色体の領域をマッピングすることを含む。
【００５５】
ＴＲＡＩＬ核酸分子のフラグメントは、長さが、少なくとも１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００またはそれ以上の連続したヌクレオチドであり得るＴＲＡＩＬ核酸配列を意味する。あるいは、このようなフラグメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０またはそれ以上の連続した、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物のアミノ酸残基をコードする配列を含み得る。一実施形態において、ＴＲＡＩＬ核酸分子は、対応するＴＲＡＩＬ遺伝子産物の少なくとも１つの生物学的活性を示す遺伝子産物（例えばＴＲＡＩＬ遺伝子産物）をコードする。ＴＲＡＩＬ核酸分子のフラグメントはまた、ＴＲＡＩＬのエキソンまたはイントロンも意味し、さらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物のドメインをコードするＴＲＡＩＬのコード領域部分も意味し得る。
【００５６】
ＴＲＡＩＬヌクレオチド配列の同定および単離に関して、このような配列は、例えば、標準的な配列解析、および、細菌人工染色体（ＢＡＣ）技術を利用することによって、容易に得ることができる。
【００５７】
当業者周知であるように、ＴＲＡＩＬ遺伝子のＤＮＡ配列多型は、個々の生物集団内（例えば、ヒトまたはイヌの集団内）に存在すると考えられる。このような多型は、例えば、天然の対立遺伝子変異による集団内の個々の生物間で存在する可能性がある。このような多型としては、アミノ酸配列の変化を引き起こす多型が挙げられる。本発明で用いられる成句「対立遺伝子変異体」は、所定の遺伝子座に存在するヌクレオチド配列、または、このようなヌクレオチド配列によってコードされた遺伝子産物を意味する。このような天然の対立遺伝子変異は、所定の遺伝子のヌクレオチド配列において、１〜５％、５〜２０％、または、２０〜５０％の相違を引き起こす可能性がある。対立遺伝子は、所定の遺伝子座で代替的に生じる遺伝子群の一つである。代替の対立遺伝子は、多数の異なる個々の生物における対象の遺伝子を配列解析することによって同定することができる。これは、様々な個々の生物における同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いて容易に行うことができる。本発明で用いられる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」としてはさらに、上流の、および／または、エキソン／イントロンの配列および構造（すなわちステム−ループ構造のような二次構造）を含む核酸分子が挙げられる。
【００５８】
ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子のさらなる対立遺伝子変異体、ならびに、他の種（例えば、モルモット、雌牛、マウス、イヌ、ネコ）由来の相同体およびオーソログのクローニングに関して、本発明で開示される単離されたＴＲＡＩＬ遺伝子配列を標識して用い、対象の生物（例えば、モルモット、雌牛、マウス、イヌ、ネコ）由来の適切な細胞または組織（例えば脾臓）から得られたｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。用いられるハイブリダイゼーション条件は、一般的に、ｃＤＮＡライブラリーが、標識された配列を得た生物タイプとは異なる生物由来である場合、より低いストリンジェンシーの条件とし、例えば標的生物と参照生物との相対的な関連に基づき通常通りに決定することができる。
【００５９】
あるいは、標識されたフラグメントを用いて、対象の生物由来のゲノムライブラリーを適度にストリンジェントな条件を用いて再度スクリーニングしてもよい。適切なストリンジェンシー条件は、上述したように当業者周知であり、ライブラリーおよび標識された配列を得た特定の生物に応じた予想に従って変更することもある。このような条件に関するガイダンスとしては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，ニューヨーク；および、Ａｕｓｕｂｅｌ等，１９８９〜１９９９年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン・パブリッシング・アソシエイツ社、および、ワイリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ），ニューヨークを参照（これらはいずれも、参照によりその全体を本発明に加入させる）。
【００６０】
さらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子の対立遺伝子変異体は、本発明で開示されるＴＲＡＩＬ遺伝子産物内のアミノ酸配列に基づき設計された２つのディジェネレートオリゴヌクレオチドプライマープールを用いたＰＣＲを行うことによって、例えばヒトまたはイヌの核酸から単離してもよい。このような反応のためのテンプレートは、例えば、野生型または突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子の対立遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのあるヒトまたは非ヒト細胞系または組織（例えば脾臓細胞）から製造されたｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡでもよい。
【００６１】
増幅した配列が、ＴＲＡＩＬ遺伝子核酸配列の配列を示すことを確認するために、ＰＣＲ産物をサブクローニングし、配列解析してもよい。次に、ＰＣＲフラグメントを、様々な方法によって全長ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いてもよい。例えば、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、増幅したフラグメントを標識して用いてもよい。あるいは、ゲノムライブラリーのスクリーニングによってゲノムクローンを単離するために、標識されたフラグメントを用いてもよい。
【００６２】
また、ＰＣＲ技術を利用して、全長ｃＤＮＡ配列、同様に、オルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡ種に対応するｃＤＮＡ配列を単離してもよい。例えば、ＲＮＡは、適切な細胞または組織源（すなわち、ＴＲＡＩＬ遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのある細胞または組織源、例えば、生検または検死によって得られた脾臓組織サンプル）から、標準的な手順に従って単離してもよい。逆転写反応は、第一鎖合成を開始させるための、増幅したフラグメントの５’末端の最も端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＮＡで行ってもよい。次に、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで「末端処理（ｔａｉｌｅｄ）」し、ハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化し、続いて、ポリ−Ｃプライマーを用いて第二鎖合成を開始させてもよい。従って、増幅したフラグメントの上流のｃＤＮＡ配列は、簡単に単離することができる。使用可能なクローニング方法の総論としては、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年、または、上記のＡｕｓｕｂｅｌ等を参照。
【００６３】
対立遺伝子（例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異体、変異体）のｃＤＮＡは、例えば、当業者周知のＰＣＲ技術を用いて単離してもよい。この場合、第一のｃＤＮＡ鎖は、個々の生物において突然変異ＴＲＡＩＬ対立遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのある組織から単離されたｍＲＮＡに、オリゴ−ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせること、および、新しい鎖を逆転写酵素で伸長させることによって、合成してもよい。次に、正常な遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡの第二の鎖が合成される。これらの２種のプライマーを用いて、次に、産物をＰＣＲで増幅させ、適切なベクターにクローニングし、当業者周知の方法によってＤＮＡ配列解析で処理する。突然変異ＴＲＡＩＬ対立遺伝子のＤＮＡ配列と、正常なＴＲＡＩＬ対立遺伝子のＤＮＡ配列とを比較することによって、突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の機能の損失または変更に関与する突然変異を確認することができる。
【００６４】
あるいは、ゲノムライブラリーは、突然変異ＴＲＡＩＬ対立遺伝子を有する疑いのある、または、それがわかっている個々の生物から得られたＤＮＡを用いて構築することができ、または、ｃＤＮＡライブラリーは、突然変異ＴＲＡＩＬ対立遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのある組織からのＲＮＡを用いて構築することができる。次に、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子、または、あらゆる適切なそれらのフラグメントを標識し、このようなライブラリーにおいて対応する突然変異ＴＲＡＩＬ対立遺伝子を同定するためのプローブとして用いてもよい。次に、突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子配列を含むクローンを精製して、当業者周知の方法に従って配列解析で処理してもよい。さらに、発現ライブラリーは、例えば、このような突然変異対立遺伝子を有するの疑いのある、または、それがわかっている個々の生物において突然変異ＴＲＡＩＬ対立遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのある組織から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを利用して構築することができる。この方法において、以下で説明するように、推定の突然変異組織によって作製された遺伝子産物が発現され、正常なＴＲＡＩＬ遺伝子産物に対して生じた抗体を併用した標準的な抗体スクリーニング技術を用いてスクリーニングしてもよい（スクリーニング技術に関しては、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，１９８８年，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，コールドスプリングハーバーを参照）。
【００６５】
ＴＲＡＩＬ突然変異により、機能が改変された遺伝子産物（例えば、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の結果として）が発現された場合、抗ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の抗体のポリクローナル群は、突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子産物とクロス反応する可能性が高い。それらと、このような標識された抗体との反応によって検出されたライブラリークローンを精製し、当業者周知の方法に従って配列解析で処理することができる。
【００６６】
ＴＲＡＩＬ突然変異または多型を、ＰＣＲ増幅技術を用いてさらに検出することができる。プライマーは、プロモーター調節領域を含むＴＲＡＩＬ配列全体のオーバーラップ領域を増幅するように通常通りに設計することができる。一実施形態において、プライマーは、コード領域が突然変異をスキャンするように、エキソン−イントロンの境界をカバーするように設計される。
【００６７】
本発明はまた、核酸分子を含み、好ましくは、上述の段落に記載のヌクレオチド配列の相補体であるＤＮＡ分子である。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、異種（例えば、ベクター、発現ベクターまたは融合タンパク質）配列を含む、または、それをコードする核酸配列を含む核酸分子の一部として存在する。
【００６９】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、上述のＴＲＡＩＬ遺伝子配列を含む核酸分子によってコードされた遺伝子産物を含む。加えて、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、機能的に同等の遺伝子産物を示すタンパク質を含んでもよい。このような同等のＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、上述のＴＲＡＩＬ遺伝子配列によってコードされたアミノ酸配列内での、および／または、それに隣接した、アミノ酸残基の欠失（内部欠失など）、付加（融合タンパク質を生じる付加など）、または、置換を含んでもよいが、これらは、「サイレント」変化を起こす（この場合、その変化により、機能的に同等のＴＲＡＩＬ遺伝子産物が生産される）。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または、両親媒性の性質における類似性に基づいて作製してもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、および、メチオニンが挙げられる；極性が中性のアミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、および、グルタミンが挙げられる；正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、および、ヒスチジンが挙げられる；および、負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、および、グルタミン酸が挙げられる。
【００７０】
あるいは、機能の改変が望ましい場合、欠失  または  非保存的な改変を、改変されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物が生産されるように施すことができる。このような改変により、例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の生物学的機能の１またはそれ以上を改変することができる。さらに、このような改変は、選択された宿主細胞における発現、スケールアップ等により適したＴＲＡＩＬ遺伝子産物が生じるように選択することができる。例えば、ジスルフィド架橋を除去するために、システイン残基を欠失させるか、または、その他のアミノ酸残基で置換させることができる。
【００７１】
ＴＲＡＩＬタンパク質、同様に、融合タンパク質の１またはそれ以上のドメインに相当するペプチドおよび／またはタンパク質（ここで、ＴＲＡＩＬタンパク質またはＴＲＡＩＬタンパク質の一部、例えばトランケーションされたＴＲＡＩＬタンパク質またはペプチド、もしくは、ＴＲＡＩＬタンパク質ドメインが、関係のないタンパク質に融合している）も本発明の範囲内である。このようなタンパク質およびペプチドは、上述のＴＲＡＩＬヌクレオチド配列に基づき、および／または、本発明で開示されるＴＲＡＩＬアミノ酸配列に基づき設計することができる。融合タンパク質としては、これらに限定されないが、ＴＲＡＩＬタンパク質またはペプチドを安定化し、インビボでの半減期を延長させるＩｇＦｃ融合体；または、融合タンパク質を細胞膜に固定させることができるあらゆるアミノ酸配列への融合体；または、ＴＲＡＩＬタンパク質ドメインのマーカーへの融合体が挙げられ、このようなマーカーとしては、これらに限定されないが、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質、フラッグまたはＶ５、Ｈｉｓエピトープタンパク質またはペプチドが挙げられる。
【００７２】
本発明のＴＲＡＩＬタンパク質はまた、ｃＤＮＡ配列の少なくとも１つのエキソンによってコードされたドメインが欠失しているＴＲＡＩＬタンパク質配列、または、それらのフラグメントも含む。
【００７３】
上述のＴＲＡＩＬタンパク質配列としては、分泌のために、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を標的とするシグナル配列を含むドメインが挙げられる。本発明で用いられるように、シグナル配列は、長さが少なくとも約１５または２０個のアミノ酸残基からなるペプチドを含み、これは、分泌性および膜結合タンパク質のＮ末端に存在しており、疎水性アミノ酸残基（例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、プロリン、チロシン、トリプトファンまたはバリン）を少なくとも約７０％含む。好ましい実施形態において、シグナル配列は、少なくとも約１０〜４０個のアミノ酸残基、好ましくは約１９〜３４個のアミノ酸残基を含み、少なくとも約６０〜８０％、より好ましくは６５〜７５％、より好ましくは少なくとも約７０％の疎水性残基を有する。シグナル配列は、このような配列を含むタンパク質を、脂質二重層に向かわせるのに役立つ。
【００７４】
本発明のポリペプチドのシグナル配列を用いて、分泌されたタンパク質、またはその他の対象のタンパク質の分泌および単離を容易にすることができる。シグナル配列は、一般的に、疎水性アミノ酸コアを特徴とし、このようなコアは、一般的に、分泌中に１回またはそれ以上の切断事象で成熟タンパク質から切断される。このようなシグナルペプチドは、それらが分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含む。従って、本発明は、シグナル配列を有する上述のＴＲＡＩＬポリペプチド（すなわち「未成熟」ポリペプチド）、同様に、ＴＲＡＩＬシグナル配列それ自体、および、シグナル配列非存在下のＴＲＡＩＬポリペプチド（すなわち「成熟」ＴＲＡＩＬ切断産物）に関する。当然ながら、本発明のＴＲＡＩＬポリペプチドはさらに、上述の特徴を有するあらゆるシグナル配列、および、成熟ＴＲＡＩＬポリペプチド配列を含むポリペプチドを含み得る。
【００７５】
本発明のＴＲＡＩＬポリペプチドはさらに、翻訳後修飾を含んでもよく、翻訳後修飾としては、これらに限定されないが、糖付加、アセチル化、ミリスチル化、および、リン酸エステル化が挙げられる。天然ＴＲＡＩＬタンパク質がこのような修飾を可能にする認識モチーフを有さない場合、改変されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物が生産されるように、酵素認識シグナルのようなモチーフをコードするヌクレオチド配列をＴＲＡＩＬ遺伝子に導入することが当業者にとって一般的であると考えられる。
【００７６】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、それらのペプチドフラグメント、および、それらの融合タンパク質は、当業界周知の技術を用いて組換えＤＮＡ技術によって生産してもよい。従って、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列を含む核酸を発現することによって、本発明のＴＲＡＩＬ遺伝子のポリペプチド、ペプチド、融合ペプチド、および、融合ポリペプチドを製造する方法を本発明で説明する。当業者周知の方法を、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物のコード配列、ならびに、適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するのに用いることができる。これらの方法としては、例えば、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、および、インビボでの遺伝子組換えが挙げられる。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年、および、上記のＡｕｓｕｂｅｔ等，１９８９年で説明された技術を参照。あるいは、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物配列をコードすることができるＲＮＡは、例えばシンセサイザーを用いて化学合成してもよい。例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，１９８４年，Ｇａｉｔ編，ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ），オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）で説明された技術を参照。
【００７７】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明のＴＲＡＩＬ遺伝子のコード配列を発現させてもよい。このような宿主−発現系は、対象のコード配列が生産され、その後精製することができる媒体を意味するが、さらに、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで本発明のＴＲＡＩＬ遺伝子産物を示し得る細胞も示す。このような細胞としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：微生物、例えば組換えバクテリオファージのＤＮＡで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする配列を含むプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター；ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ）；ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染させた植物細胞系、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、または、哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを含む哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ，ＣＨＯ，ＢＨＫ，２９３，３Ｔ３）。
【００７８】
細菌系において、発現させようとするＴＲＡＩＬ遺伝子産物に関して意図された用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、ＴＲＡＩＬタンパク質の医薬組成物を製造するために、または、ＴＲＡＩＬタンパク質に対する抗体を生じさせるために、大量のこのようなタンパク質を生産しようとする場合、例えば、容易に精製される、高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい。ｐＧＥＸベクターはまた、融合タンパク質として、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と共に、外来ポリペプチドを発現するのにも用いることができる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解させた細胞から簡単に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、ＧＳＴ成分からクローニングされた標的遺伝子産物が放出されるように、トロンビンまたはファクターＸａプロテアーゼ切断部位が含まれるように設計される。
【００７９】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。このようなウイルスは、スポドプテラ・フルギペルタ細胞中で成長する。ＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする配列は、個々に、ウイルスの必須ではない領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。ＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする配列のうまい挿入により、ポリヘドリン遺伝子の不活性化、および、非包埋組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質様のコートを欠くウイルス）の生産が起こり得る。次に、これらの組換えウイルスを用いて、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させることができ、この細胞において、挿入された遺伝子が発現される（例えば、Ｓｍｉｔｈ等，１９８３年，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６，５８４；Ｓｍｉｔｈ，米国特許第４,２１５,０５１号を参照）。
【００８０】
哺乳動物の宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、対象のＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列）にライゲーションしてもよい。次に、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの必須ではない領域（例えば領域Ｅ１またはＥ３）への挿入により、生存可能であり、感染した宿主中でＴＲＡＩＬ遺伝子産物を発現することができる組換えウイルスが生じ得る（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ，１９８４年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，３６５５〜３６５９を参照）。また、挿入されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする配列の効率的な翻訳のために、特定の開始シグナルが必要であることもある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン、および、隣接する配列を含む。その上、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実するために、望ましいコード配列のリーディングフレームを含むフェーズ内でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナル、および、開始コドンは、様々な起源のものが可能であり、天然でも合成でもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含ませることによって高めることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ等，１９８７年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，５１６〜５４４を参照）。
【００８１】
加えて、挿入された配列の発現を調節する宿主細胞株、または、特定の望ましい様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。このような、タンパク質産物の修飾（例えば糖付加）およびプロセシング（例えば切断）は、タンパク質の機能にとって重要な場合がある。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特徴と特定のメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的のために、適切な一次転写物のプロセシング、遺伝子産物の糖付加およびリン酸エステル化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、および、Ｗ１３８が挙げられる。
【００８２】
組換えタンパク質の長期の高収率生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を安定して発現する細胞系を作製することができる。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、適切な発現制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、配列，転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されたＤＮＡで宿主細胞を形質転換させてもよい。外来ＤＮＡの導入後、作製された細胞を強化培地中で１〜２日間成長させ、次に、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に耐性を付与し、細胞は、プラスミドをそれらの染色体に安定して統合させ、成長させて、順にクローニングされ細胞系に広がることができる増殖巣を形成する。この方法は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を発現する細胞系を作製するのに有利に用いることができる。このように作製された細胞系は、特に、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の内因性の活性に作用する化合物のスクリーニングおよび評価に有用であり得る。
【００８３】
多数の選択システムを用いることができ、このような選択システムとしては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ等，１９７７年，Ｃｅｌｌ  １１，２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８，２０２６）、および、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ等，１９８０年，Ｃｅｌｌ  ２２，８１７）遺伝子は、それぞれｔｋ−，ｈｇｐｒｔ−、または、ａｐｒｔ−細胞に用いることができる。また、以下の遺伝子の選択基準として、代謝拮抗物質耐性を用いることもできる：ｄｈｆｒ、これは、メトトレキセートに対する耐性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒ等，１９８０年，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７，３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ等，１９８１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，１５２７）；ｇｐｔ、これは、マイコフェノール酸に対する耐性を付与する（ＭｕｌｌｉｇａｎおよびＢｅｒｇ，１９８１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８，２０７２）；ｎｅｏ、これは、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ等，１９８１年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０，１）；および、ｈｙｇｒｏ、これは、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅ等，１９８４年，Ｇｅｎｅ  ３０，１４７）。
【００８４】
あるいは、あらゆる融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に特異的な抗体を利用することによって容易に精製することができる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ等によって説明されたシステムは、ヒト細胞系で発現された未変性の融合タンパク質の容易な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ等，１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，８９７２〜８９７６）。このシステムにおいて、対象の遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳によって融合するように、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングされる。組換えワクシニアウイルスに感染させた細胞からの抽出物を、Ｎｉ2+ニトリロ酢酸−アガロースカラムにローディングし、イミダゾール含有緩衝液を用いてヒスチジンタグを有するタンパク質を選択的に溶出させる。
【００８５】
あるいは、異種ＤＮＡの調節因子を、安定な細胞系またはクローニングされた微生物のゲノムに挿入し、挿入された調節因子を内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子と操作可能に結合させることによって、細胞、細胞系、または、微生物内の内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現の特徴を改変することができる。例えば、通常は「転写上サイレント」な内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子、すなわち、通常は発現されないＴＲＡＩＬ遺伝子、または、細胞、細胞系または微生物において極めて低いレベルでしか発現されないＴＲＡＩＬ遺伝子を、細胞、細胞系または微生物において通常発現される遺伝子の産物の発現を促進することができる調節因子を挿入することによって活性化してもよい。あるいは、転写上サイレントな内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子は、あらゆる細胞型に作用するプロミスカスな調節因子の挿入によって活性化することができる。
【００８６】
異種調節因子は、標的化相同組換えのような技術を用いて、安定な細胞系またはクローニングされた微生物に、内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子に操作可能に結合されるように挿入することができ、このような技術は、当業者周知であり、例えば、Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５,２７２,０７１号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／０６６６７（１９９１年５月１６日公開）で説明されている。
【００８７】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物はまた、トランスジェニック動物で発現させることができる。あらゆる種の動物としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、小型ブタ、ヤギ、ヒツジ、ならびに、非ヒト霊長類、例えばヒヒ、サルおよびチンパンジーが挙げられ、これらは、ＴＲＡＩＬトランスジェニック動物を得るのに用いることができる。本発明で用いられる用語「トランスジェニック」は、異なる種由来のＴＲＡＩＬ遺伝子配列を発現する動物（例えばヒトまたはイヌのＴＲＡＩＬ配列を発現するマウス）、同様に、内因性（すなわち同じ種）のＴＲＡＩＬ配列を過剰発現するように遺伝子操作されている動物、または、内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子配列を発現しないように遺伝子操作されている動物（すなわち「ノックアウト」動物）、および、それらの子孫を意味する。
【００８８】
当業界既知のあらゆる技術を、ＴＲＡＩＬ遺伝子の導入遺伝子を動物に導入して、トランスジェニック動物のファウンダー系を製造するのに用いることができる。このような技術としては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：前核のマイクロインジェクション（ＨｏｐｐｅおよびＷａｇｎｅｒ，１９８９年，米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系へのレトロウイルス介在遺伝子トランスファー（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ等，１９８５年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８２，６１４８〜６１５２）；胚幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９８９年，Ｃｅｌｌ  ５６，３１３〜３２１）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，１９８３年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３〜１８１４）；および、精子介在遺伝子トランスファー（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等，１９８９年，Ｃｅｌｌ  ５７，７１７〜７２３）。（このような技術の総論としてはＧｏｒｄｏｎ，１９８９年，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５，１７１〜２２９を参照）。
【００８９】
当業界既知のあらゆる技術が、ＴＲＡＩＬ導入遺伝子を含むトランスジェニック動物クローンを製造するのに用いることができ、例えば、休止状態に誘導された培養胚細胞、胎児細胞または成体細胞から摘出された核の卵母細胞への核トランスファーがある（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等，１９９６年，Ｎａｔｕｒｅ  ３８０，６４〜６６；Ｗｉｌｍｕｔ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３８５，８１０〜８１３）。
【００９０】
本発明は、それら全ての細胞にＴＲＡＩＬ導入遺伝子が含まれるトランスジェニック動物、および、細胞の一部（ただしそれら全てではない）に導入遺伝子が含まれる動物、すなわちモザイク動物を提供する。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、またはコンカテマー（例えば頭−頭タンデムまたは頭−尾タンデム）中に統合させることができる。導入遺伝子はまた、例えば、Ｌａｓｋｏ等（Ｌａｓｋｏ等，１９９２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，６２３２〜６２３６）の教示に従って、選択的に特定の細胞型に導入し、その細胞中で活性化することもできる。このような細胞型特異的な活性化に必要な調節配列は、対象の特定の細胞型によって様々であり、当業者周知である。ＴＲＡＩＬ遺伝子の導入遺伝子が内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子の染色体の部位に統合されることが望ましい場合、遺伝子を標的とすることが好ましい。簡単に言えば、このような技術が利用され得る場合、染色体配列との相同組換えによって、内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子のヌクレオチド配列に統合させ、内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子のヌクレオチド配列の機能を破壊する目的のために、内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子と相同ないくつかのヌクレオチド配列を含むベクターが設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に、選択的に導入することができ、そうすることによって、その細胞型においてのみ内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子は不活性化される。このような細胞型特異的な不活性化に必要な調節配列は、対象の特定の細胞型によって様々であり、当業者周知である。
【００９１】
トランスジェニック動物が作製されれば、標準的な技術を利用して組換えＴＲＡＩＬ遺伝子の表現型発現を分析することができる。導入遺伝子の統合が生じているかどうかを分析するために動物組織を解析するための、初期のスクリーニングは、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって達成することができる。また、トランスジェニック動物の組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、これらに限定されないが、このような動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション解析、および、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）のような技術を用いて評価することができる。また、ＴＲＡＩＬ遺伝子を発現する組織のサンプルは、ＴＲＡＩＬ導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することができる。
【００９２】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物またはそれらのペプチドフラグメントは、様々な用途のために製造することができる。例えば、このような遺伝子産物またはそれらのペプチドフラグメントは、診断分析における抗体の生成、または、ガンのような血管新生関連疾患の調節に関与するその他の細胞性または細胞外遺伝子産物のマッピングおよび同定に用いることができる。このようなＴＲＡＩＬ遺伝子産物としては、これらに限定されないが、可溶性誘導体が挙げられる、例えばＴＲＡＩＬ遺伝子産物、特に、それらの１またはそれ以上の疎水性ドメインが欠失するように改変されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物の１またはそれ以上のドメインに相当するペプチドまたはポリペプチドである。あるいは、ＴＲＡＩＬタンパク質に対する抗体、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を模擬する抗イディオタイプ抗体（Ｆａｂフラグメントなど）、アンタゴニストもしくはアゴニストを、ガンのような血管新生関連疾患を治療するのに用いることができる。さらにその他のアプローチにおいて、このようなＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードするヌクレオチドコンストラクトは、インビボでこのようなＴＲＡＩＬ遺伝子産物を発現するように宿主細胞を遺伝子操作するのに用いることができる；これらの遺伝子操作された細胞は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、ＴＲＡＩＬペプチドまたは可溶性ＴＲＡＩＬポリペプチドの連続供給を行う体内の「バイオリアクター」として機能し得る。
【００９３】
本発明は、１またはそれ以上のＴＲＡＩＬ遺伝子産物エピトープ、または、保存された変異体もしくは遺伝子産物のペプチドフラグメントのエピトープを特異的に認識することができる抗体の生産方法を提供する。
【００９４】
このような抗体としては、これらに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、イヌの、および、イヌ化した、または、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生産されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および、上記いずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。このような抗体は、例えば、生物学的サンプルにおけるＴＲＡＩＬ遺伝子産物の検出において用いてもよく、それゆえに、診断または予後技術の一部として利用することができ、それによって、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の異常なレベル、および／または、このような遺伝子産物の異常な形態の存在に関して被験体を試験することができる。このような抗体はまた、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物レベルおよび／または活性に対する試験化合物の作用を評価するために、例えば以下で述べるような化合物のスクリーニングスキームと共に利用することができる。さらに、このような抗体は、例えば、それらを被験体に導入する前に、正常な、および／または、操作されたＴＲＡＩＬ発現細胞を評価するために、以下で述べる遺伝子治療技術と共に用いることができる。
【００９５】
抗ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の抗体は、さらに、異常なＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性を阻害する方法として用いることができる。従って、このような抗体は、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の治療法の一部として利用することができる。
【００９６】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に対する抗体を生産するために、様々な宿主動物は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物またはそれらの部分を注入することによって免疫化することができる。このような宿主動物としては、これらに限定されないが、いくつか例を挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが挙げられる。様々なアジュバントを、宿主種に応じて免疫反応を増加させるのに用いることができ、このようなアジュバントとしては、これらに限定されないが、フロインド（完全および不完全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、および有用な可能性のあるヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）、および、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が挙げられる。
【００９７】
ポリクローナル抗体は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、またはそれらの抗原機能を有する誘導体のような抗原で免疫化された動物血清から得られた抗体分子の、異種集団体である。ポリクローナル抗体を生産するために、上述したような宿主動物は、上述したようなアジュバントが追加されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物を注入することによって免疫化することができる。
【００９８】
モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の同種の集団体であり、これらは、連続的に培養した細胞系によって抗体分子の生産を提供するあらゆる技術によって得ることができる。このような技術としては、これらに限定されないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５年，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５〜４９７；および、米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ等，１９８３年，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２；Ｃｏｌｅ等，１９８３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，２０２６〜２０３０）、および、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ等，１９８５年，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６）が挙げられる。このような抗体としては、あらゆる免疫グロブリンクラスに属するものが可能であり、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのあらゆるサブクラスである。本発明のｍＡｂを生産するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養することができる。この方法は、インビボで高タイターのｍＡｂが生産されるために、目下好ましい生産方法である。
【００９９】
加えて、イヌおよび非イヌ部分の両方を含む組換え抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができ、これらは、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、それぞれの部分が異なる動物種由来である分子であり、例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域を有するキメラ抗体がある。（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ等，米国特許第４,８１６,５６７号；および、Ｂｏｓｓ等，米国特許第４,８１６３９７号を参照、これらは、参照によりその全体を本発明に加入させる）。イヌ化抗体は、非ヒト種由来の１またはそれ以上の相補鎖決定領域（ＣＤＲ）、および、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である。（例えば、Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５,５８５,０８９号を参照、これらは、参照によりその全体を本発明に加入させる）。このようなキメラおよびイヌ化モノクローナル抗体は、当業界既知の組換えＤＮＡ技術によって、例えば以下で説明された方法を用いて生産することができる：ＰＣＴ公報番号ＷＯ８７／０２６７１；欧州特許出願第１８４,１８７号；欧州特許出願第１７１,４９６号；欧州特許出願第１７３,４９４号；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４,８１６,５６７号；欧州特許出願第１２５,０２３号；Ｂｅｌｔｅｒ等（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕ等（１９８７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕ等（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎ等（１９８７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等（１９８７年）Ｃａｎｅ．Ｒｅｓ．４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄ等（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６〜４４９；および、Ｓｈａｗ等（１９８８年）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  （１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉ等（１９８６年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ等（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；および、Ｂｅｉｄｌｅｒ等（１９８８年）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４１：４０５３〜４０６０。
【０１００】
ヒト患者の治療的処置には、完全ヒト抗体が特に望ましい。このような抗体は、例えば、内因性免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部）で、正常な様式で免疫化される。抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスに含まれるヒト免疫グロブリンの導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成され、その後クラススイッチと体細胞変異を受ける。従って、このような技術を用いて、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を生産することが可能である。このヒト抗体生産技術の総論としては、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒを参照（１９９５年，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５〜９３）。このヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体生産技術、および、このような抗体を生産するためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、米国特許第５,６２５,１２６号；米国特許第５,６３３,４２５号；米国特許第５,５６９,８２５号；米国特許第５,６６１,０１６号；および、米国特許第５,５４５,８０６号を参照。加えて、アブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，フレモント，カリフォルニア州）のような会社は、上述の技術に類似した技術を用いて、選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供することを受け付けている。
【０１０１】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択」という技術を用いて生成することができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）は、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするのに用いられる。（Ｊｅｓｐｅｒｓ等（１９９４年）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９〜９０３）。
【０１０２】
あるいは、一本鎖抗体の生産について説明された技術（米国特許第４,９４６,７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎ等，１９８８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５８７９〜５８８３；および、Ｗａｒｄ等，１９８９年，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４，５４４〜５４６）を、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に対する一本鎖抗体を生産するように適合させることができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖と軽鎖フラグメントとを連結させ、一本鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成される。
【０１０３】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技術で生成することができる。例えば、このようなフラグメントとしては、これらに限定されないが、抗体分子をペプシン消化することによって生産することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、および、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成させることができるＦａｂフラグメントが挙げられる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーは、望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で簡単な同定が可能なように構築してもよい（Ｈｕｓｅ等，１９８９年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５〜１２８１）。
【０１０４】
本発明において、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列、ペプチドフラグメントなどのＴＲＡＩＬ遺伝子産物、および、それらの融合タンパク質の様々な用途、および、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物およびそれらのペプチドフラグメントに対して向けられた抗体の様々な用途が説明される。このような用途としては、例えば、血管新生関連疾患（例えばガン）の予後および診断評価、および、本発明で説明するような疾患の素因を有する被験体の同定が挙げられる。加えて、このような用途としては、以下で述べるようなＴＲＡＩＬ遺伝子の発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物の同定方法、および、以下で述べるようなアポトーシス関連疾患（例えばガン）の治療方法が挙げられる。
【０１０５】
加えて、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列および遺伝子産物としては、ペプチドフラグメント、および、それらの融合タンパク質、ならびに、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に対して向けられた抗体、および、それらのペプチドフラグメントが挙げられ、これらは、アポトーシス関連疾患およびプロセスにおいてＴＲＡＩＬが持つ可能性のある役割から独立した目的で用途を有する。例えば、ペプチドフラグメントなどのＴＲＡＩＬ遺伝子産物、同様に、ＴＲＡＩＬ特異的抗体は、融合タンパク質の構築のために、その他の対象タンパク質の回収、検出または局在化を促進するのに用いることができる。加えて、ＴＲＡＩＬ遺伝子および遺伝子産物は、遺伝子マッピング、すなわち遺伝子地図を洗練するのに用いることができる。例えば、ＴＲＡＩＬに特異的な抗体を、ヒト染色体またはヒト染色体の部分を含む体細胞ハイブリッドにおいてヒトＴＲＡＩＬの発現を検出するためのプローブとして用いることができる。このようなＴＲＡＩＬ特異的抗体は、ＴＲＡＩＬの染色体領域を含む細胞を同定するのに用いることができる。この方法は、例えば、対象の遺伝子または特色を染色体のこの領域に位置決定するのに用いることができる。
【０１０６】
ＴＲＡＩＬ遺伝子配列および遺伝子産物は、染色体地図をマッピングし洗練するのに用いることができる。ＴＲＡＩＬ配列は、様々なアポトーシス関連疾患（これらに限定されないが、ガンなど）に関連する染色体のインターバルをさらに洗練するための、新しい遺伝子マーカーを開発するのに用いることができる。熟練した技術者には明白と思われるが、病気に関連する遺伝子のインターバル内の核酸配列を、新しいマーカー（例えばマイクロサテライト）についてスキャンすることができる。マイクロサテライトは、単純反復配列（ＳＳＲ）としても知られており、１〜５個のヌクレオチドのジ−、トリ−、または、テトラヌクレオチドリピートからなる超可変タンデム配列リピートである。このようなマイクロサテライトは、ヒトゲノムわたって遍在的に分布しており、リピート長さにおいて高度に可変性であり、高い多型性である傾向があるため、連鎖の研究のための優れた遺伝子マーカーとなる。比較的一般的なマイクロサテライト（例えば（ＣＡ）ｎジヌクレオチドリピート）は、約３００〜５００ｋｂ毎に生じる。マイクロサテライトリピートに加えて、上記領域を、他のタイプの洗練されたマッピングに有用な多型性の部位についてスキャンすることができ、このような部位としては、例えばミニサテライト（９〜６４個のヌクレオチドリピート）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、および、単一ヌクレオチド多型があり、これらは、それほど高い頻度では生じない。新しい配列で多型性の部位が同定されたら、多型性の部位の端にあるＰＣＲプライマーを合成し、マイクロサテライト、またはその他の多型性の部位を増幅するのに用いることができる。次に、リピートの長さを、ポリアクリルアミド配列解析ゲルでＰＣＲ産物を解析することによって決定することができる。次に、リピートの頻度と可変性を決定するために、ヒト集団からのゲノムＤＮＡを単純配列長多型（ＳＳＬＰ）について分析することができる。高品質のＳＳＬＰが見出されたら、ガンのような血管新生関連疾患が新しいマーカーに連鎖しているかどうかを決定するために、影響を受けた集団について連鎖解析を行うことができる。サザンブロットハイブリダイゼーションおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のようなその他の技術が、ＰＣＲベースの方法に加えて、または、それと共に、ゲノム集団における多型を分析するために用いることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ等（編）ジョン・ワイリー＆サンズ社，１９９８年を参照）。
【０１０７】
他の実施形態において、ＴＲＡＩＬ遺伝子、タンパク質またはそれらのフラグメントもしくはドメインは、融合タンパク質の構築に用いることができる。最終的に、ＴＲＡＩＬ核酸および遺伝子産物は、食品添加剤または化粧品用の核酸、タンパク質およびアミノ酸の追加の源のような一般的な用途を有する。
【０１０８】
本発明において同定されたｃＤＮＡ配列（および対応する完全な遺伝子配列）の部分またはフラグメントは、多数の方法において、ポリヌクレオチド試薬として用いることができる。例えば、これらの配列を、以下に用いることができる：（ｉ）ＴＲＡＩＬ遺伝子特異的な突然変異または多型をスクリーニングすること、（ｉｉ）それら個々の遺伝子を染色体上にマッピングし、それによって、遺伝病に関連する遺伝子領域の位置を決定すること；（ｉｉｉ）微小な生物学的サンプルから個々の生物を同定すること（組織タイピング）；および、（ｉｖ）生物学的サンプルの法医学的な同定を補助すること。これらの用途は、下記の小区分で説明する。
【０１０９】
様々な方法を、ＴＲＡＩＬ遺伝子特異的な突然変異または多型（ＴＲＡＩＬ遺伝子の端にある多型などであり、例えば、特定のＴＲＡＩＬ対立遺伝子と共に共分離している多型）の存在をスクリーニングすること、および、ＴＲＡＩＬ核酸配列のレベルを検出および／または分析することに用いることができる。
【０１１０】
ＴＲＡＩＬ遺伝子内の、またはそれに隣接する突然変異または多型は、多数の技術を利用することによって検出することができる。あらゆる有核細胞、または、対象のＴＲＡＩＬ遺伝子を発現するあらゆる細胞からの核酸を、このような分析技術の開始点として用いることができ、当業者周知の標準的な核酸製造手順に従って単離してもよい。
【０１１１】
ＴＲＡＩＬ核酸配列を生物学的サンプルのハイブリダイゼーションまたは増幅分析で用いて、点突然変異、挿入、欠失、逆位、転座および染色体再編成などのＴＲＡＩＬ遺伝子構造に関する異常を検出ることができる。このような分析としては、これらに限定されないが、サザン解析、一本鎖高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）、および、ＰＣＲ解析が挙げられる。
【０１１２】
ＴＲＡＩＬ遺伝子特異的な突然変異または多型を検出するための診断方法は、例えば、サンプルから得られた核酸、例えば、患者のサンプルまたはその他の適切な細胞源由来の核酸を、１またはそれ以上の標識された核酸試薬（上述したような組換えＤＮＡ分子、クローニングされた遺伝子またはそれらのディジェネレート変異体など）とこれらの試薬がＴＲＡＩＬ遺伝子内またはそれに隣接するそれらの相補配列に特異的にアニールするのに好ましい条件下で接触させ、インキュベートすることを含み得る。本発明の診断方法は、ＴＲＡＩＬ遺伝子の単一ヌクレオチド突然変異または多型を検出するために、核酸を接触させ、インキュベートすることをさらに包含する。好ましくは、これらのＴＲＡＩＬ遺伝子内の核酸試薬配列、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子に隣接する染色体ヌクレオチド配列の長さは、１５〜３０個のヌクレオチド長である。
【０１１３】
インキュベート後、全てのアニールしていない核酸を核酸から除去する：ＴＲＡＩＬ分子がハイブリッドする。次に、ハイブリダイズしている核酸の存在が、このようなあらゆる分子が存在する場合、検出される。このような検出スキームを用いて、対象の細胞型または組織からの核酸は、例えば、メンブレンまたはプラスチック表面（例えばマイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズ上のプラスチック表面）のような固体支持体に固定させることができる。この場合、インキュベート後、上述のタイプのアニールしていない標識された核酸試薬は、簡単に除去される。残存するアニールした標識されたＴＲＡＩＬ核酸試薬の検出は、当業者周知の標準的な技術を用いて達成される。ＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異が存在するかどうかを決定するために、核酸試薬がアニールしたＴＲＡＩＬ遺伝子配列を、正常なＴＲＡＩＬ遺伝子配列から予測されたアニールパターンと比較することができる。
【０１１４】
好ましい実施形態において、ＴＲＡＩＬ突然変異または多型は、基質または「ジーンチップ」に固定されたマイクロアッセイＴＲＡＩＬ核酸配列を用いて検出することができる（例えば、Ｃｒｏｎｉｎ等，１９９６年，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４〜２５５を参照）。
【０１１５】
患者のサンプルまたはその他の適切な細胞源においてＴＲＡＩＬ遺伝子特異的核酸分子（またはＴＲＡＩＬ隣接配列）を検出するその代わりの診断方法は、それらの増幅を含んでもよく、例えば、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７年，米国特許第４,６８３,２０２号に記載の実験の実施形態）、それに続き、上述したような当業者周知の技術を用いて増幅した分子の解析によってなされる。病気を引き起こすＴＲＡＩＬ対立遺伝子を含む連鎖不均衡においてＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異または多型が存在するかどうかを決定するために、得られた増幅配列を、増幅された核酸がＴＲＡＩＬ遺伝子の正常なコピーのみを含むと予測される配列と比較することができる。
【０１１６】
加えて、周知の遺伝子型解析技術を行って、ＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異を有する個々の生物を同定することができる。このような技術としては、例えば、用いられる特異的な制限酵素の認識部位のいずれか１つにおいて配列変異を含む制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用が挙げられる。
【０１１７】
さらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子特異的な突然変異の同定に利用することができるＤＮＡ多型を解析する改良方法が説明されており、これは、制限酵素部位間で縦列に反復した様々な数の短いＤＮＡ配列の存在を利用している。例えば、Ｗｅｂｅｒ（米国特許第５,０７５,２１７号）は、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎの短いタンデムリピートのブロックにおける長さの多型に基づくＤＮＡマーカーを説明している。（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎブロックの平均距離は、３０,０００〜６０,０００ｂｐと推定される。このように間隔が近接したマーカーは、高い頻度の共遺伝を示し、例えばＴＲＡＩＬ遺伝子内の突然変異のような遺伝子の突然変異の同定、および、ＴＲＡＩＬ突然変異に関連する病気や疾患の診断に極めて有用である。
【０１１８】
また、Ｃａｓｋｅｙ等（米国特許第５,３６４,７５９号）は、短いトリおよびテトラヌクレオチドリピート配列を検出するためのＤＮＡプロファイリング分析を説明している。このプロセスは、ＴＲＡＩＬ遺伝子のような対象のＤＮＡを抽出すること、抽出物されたＤＮＡを増幅すること、および、リピート配列を標識して、個々の生物のＤＮＡの遺伝子型地図を形成することを含む。
【０１１９】
当業界周知のその他の方法を、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定するのに用いることができ、このような単一ヌクレオチド多型としては、二対立遺伝子ＳＮＰ、または、２つの対立遺伝子を有する二対立遺伝子マーカーが挙げられ、いずれも集団中で極めて高い頻度で存在する。ＳＮＰを検出するための従来技術としては、例えば、従来のドットブロット分析、ＳＳＣＰ解析が挙げられる（例えば、Ｏｒｉｔａ等，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２７６６〜２７７０を参照）、変性濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖解析、ミスマッチ切断検出、およびその他の慣例的な当業界周知の技術（例えば、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ等，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：５８５５〜５８９２；Ｇｒｏｍｐｅ，１９９３年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：１１１〜１１７を参照）。その代わりの、ＳＮＰを検出しマッピングする好ましい方法は、マイクロシークエンス技術を含み、この場合、標的ＤＮＡにおけるＳＮＰ部位は、シングルヌクレオチドプライマー伸長反応によって検出される（例えば、Ｇｏｅｌｅｔ等，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９２／１５７１２；Ｍｕｎｄｙ，米国特許第４,６５６,１２７号；ＶａｒｙおよびＤｉａｍｏｎｄ，米国特許第４,８５１,３３１号；Ｃｏｈｅｎ等，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／０２０８７；Ｃｈｅｅ等，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９５／１１９９５；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ等，１９８８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７〜１０８０；Ｎｉｃｅｒｓｏｎ等，１９９０年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８９２３〜８９２７；Ｐａｓｔｉｎｅｎ等，１９９７年，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６０６〜６１４；Ｐａｓｔｉｎｅｎ等，１９９６年，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４２：１３９１〜１３９７；Ｊａｌａｎｋｏ等，１９９２年，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３８：３９〜４３；Ｓｈｕｍａｋｅｒ等，１９９６年，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：３４６〜３５４；Ｃａｓｋｅｙ等，ＰＣＴ公報番号ＷＯ９５／００６６９を参照）。
【０１２０】
また、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現のレベルを分析することもできる。例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのある細胞型または脾臓のような組織からのＲＮＡを単離し、上述のようなハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術を利用して試験することができる。単離された細胞は、細胞培養物または被験体から得ることができる。培養物から採取した細胞の解析は、細胞の評価において、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として用いられる、またあるいは、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現への化合物の作用を試験するために必要な工程であり得る。このような解析により、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現の活性化または不活性化などのＴＲＡＩＬ遺伝子の発現パターンの定量的および定性的な形態のいずれも明らかにすることができる。
【０１２１】
このような検出スキームの一実施形態において、ｃＤＮＡ分子は、対象のＲＮＡ分子から合成される（例えば、ＲＮＡ分子からｃＤＮＡへの逆転写によって）。次に、ｃＤＮＡ内の配列は、ＰＣＲ増幅反応のような核酸増幅反応等のためのテンプレートとして用いられる。この方法の逆転写および核酸増幅工程において合成開始試薬（例えばプライマー）として用いられる核酸試薬は、上述のＴＲＡＩＬ遺伝子の核酸試薬の中から選択される。このような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも９〜３０個のヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、放射標識した、または放射標識してないヌクレオチドを用いて核酸増幅を行ってもよい。あるいは、標準的なエチジウムブロマイド染色によって、または、あらゆるその他の適切な核酸染色方法を利用することによって産物が可視化されるように、十分量の増幅産物を作製してもよい。
【０１２２】
加えて、核酸の精製が必要ないように、インサイチュで、すなわち生検または切除術から得られた被験体の組織の組織断片（固定および／または凍結された）で直接的に、このようなＴＲＡＩＬ遺伝子発現分析を行うことが、可能である。上述のような核酸試薬を、このようなインサイチュの手順のためのプローブおよび／またはプライマーとして用いることができる（例えば、Ｎｕｏｖｏ，ＧＪ．，１９９２年，“ＰＣＲ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照）。
【０１２３】
あるいは、十分な量の適切な細胞が得られる場合、ＴＲＡＩＬ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定するために、標準的なノーザン解析を行うことができる。
【０１２４】
遺伝子の配列（または配列の一部）が単離されたら、この配列は、染色体上の遺伝子の位置をマッピングするのに用いることができる。従って、本発明で説明される核酸分子、または、それらのフラグメントは、染色体上の対応する遺伝子の位置をマッピングするのに用いることができる。配列の染色体へのマッピングは、これらの配列と病気に関連する遺伝子との相互関係を示すことにおいて重要な第一工程である。
【０１２５】
簡単に言えば、本発明の遺伝子の配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐの長さ）を製造することによって、遺伝子を染色体にマッピングすることができる。本発明の遺伝子の配列のコンピューター解析は、ゲノムＤＮＡ中の１個超のエキソンを含まないプライマーを迅速に選択するのに用いることができ、それにより、増幅プロセスを簡単にすることができる。次に、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドをＰＣＲスクリーニングするのに用いられることができる。上記遺伝子配列に対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが、増幅したフラグメントを生産し得る。この技術の総論としては、Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ等，１９８３年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２０：９１９〜９２４を参照。
【０１２６】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てるための迅速な手順である。１つのサーマルサイクラーを用いて、１日あたり３またはそれ以上の配列を割り当てることができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために本発明の核酸配列を用いて、サブローカライゼーションは、特定の染色体からのフラグメントのパネルを用いて達成することができる。遺伝子をその染色体にマッピングするのに同様に用いらることができるその他のマッピング方法はとしては、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｆａｎ等，１９９０年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６２２３〜２７に記載されている）、標識されたフローソーティングした染色体を用いたプレスクリーニング（Ｐｏｐｐ  Ｓ等，１９９３年，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．，９２（６）：５２７〜３２）、および、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ選択が挙げられる。ＤＮＡ配列の分裂中期の染色体分布への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに用いて、１つの工程で正確な染色体位置を得ることができる。（この技術の総論としては、Ｖｅｒｍａ等，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８８年を参照）。
【０１２７】
染色体マッピングのための試薬は、１つの染色体またはその染色体上の１つの部位を特徴付けるのに個々に用いることができ、または、試薬のパネルは、複数の部位および／または複数の染色体を特徴付けるのに用いることができる。実際に、上記遺伝子の非コード領域に対応する試薬は、マッピング目的に好ましい。コード配列は、遺伝子ファミリー内で保存される可能性がより高いため、染色体マッピングの際にクロスハイブリダイゼーションが起こる見込みが高くなる。
【０１２８】
配列が正確な染色体位置にマッピングされたら、染色体上の配列の物理的な位置により、遺伝子地図データとの相互関係を示すことができる。（このようなデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎで見出され、これは、ジョン・ホプキンス大学のウェルチ・メディカル・ライブラリー（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｗｅｌｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ）を通じてオンラインで利用可能である）。次に、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気との関係は、連鎖解析で同定することができ（物理的に隣接した遺伝子の共遺伝）、例えば、Ｅｇｅｌａｎｄ等，１９８７年，Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：７８３〜７８７で説明されている。
【０１２９】
その上、本発明の遺伝子に関連する病気の影響を受けた、および、影響を受けていない個々の生物間のＤＮＡ配列における差を決定することができる。突然変異が、影響を受けた個々の生物の一部または全部で観察されるが、あらゆる  影響を受けていない個々の生物では全く観察されない場合、その突然変異は、特定の病気の原因となる因子である可能性が高い。一般的に、影響を受けた、および、影響を受けていない個々の生物の比較は、まず、欠失または転座のような染色体中の構造的な改変を探索することを含み、これらは、染色体分布から明らかであるか、または、そのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出可能である。最終的に、数個の個々の生物からの遺伝子の完全な配列解析を行い、突然変異の存在を確認し、多型からの突然変異と区別することができる。
【０１３０】
本発明の核酸配列はまた、微小な生物学的サンプルから個々の生物を同定するのに用いることができる。例えば、米国軍は、その兵士の同定に制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用することを考慮している。この技術において、個々の生物のゲノムＤＮＡを１またはそれ以上の制限酵素で消化し、同定に特有のバンドが生じるようにサザンブロットで調査する。この方法は、無くしたり、差し替えられたり、または、盗まれたりする可能性があり確かな同定を困難にする現行の「認識票（Ｄｏｇ  Ｔａｇ）」の制限を受けない。本発明の配列は、ＲＦＬＰの追加のＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５,２７２,０５７号で説明されている）。
【０１３１】
その上、本発明の配列は、個々の生物のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定するための代替の技術を提供するのに用いることができる。従って、本発明で説明される核酸配列は、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを製造するのに用いることができる。これらのプライマーは、個々の生物のＤＮＡを増幅し、続いてそれを配列解析するのに用いることができる。
【０１３２】
各個々の生物は、このようなＤＮＡ配列の対立遺伝子の差による固有の群を有し得るため、この方法で製造された個々の生物からの対応するＤＮＡ配列のパネルは、固有の個々の同定を提供することができる。本発明の配列は、このような個々の生物および組織からの同定配列を得るのに用いることができる。本発明の核酸配列は、ヒトゲノムの部分を独特に示す。対立遺伝子変異は、これらの配列のコード領域にある程度存在し、より高い頻度で非コード領域に存在する。個々のヒト間の対立遺伝子変異は、５００塩基ごとに約１回の頻度で存在すると推定される。本発明で説明される各配列は、ある程度、標準として用いることができ、このような標準に対して、個々の生物からのＤＮＡを同定目的で比較することができる。非コード領域にはより多数の多型が存在するため、個体を識別するのに必要な配列はより少ない。
【０１３３】
本発明で説明される核酸配列からの試薬のパネルが、個体の固有の同定データベースを作製するのに用いられる場合、これと同じ試薬が、その後にその個体からの組織を同定するのに用いることができる。固有の同定データベースを用いて、個々の生物の確実な同定が、その生物が生存していても、死亡していても、極めて小さい組織サンプルから作製することができる。
【０１３４】
ＤＮＡに基づく同定技術はまた、法医学的な生物学で用いることができる。法医学的な生物学とは、例えば犯罪の加害者を確実に同定するための手段としての、犯罪現場で発見された生物学的証拠の遺伝子型決定を用いる科学分野である。このような同定をなすために、ＰＣＲ技術は、犯罪現場で発見される組織（例えば毛髪もしくは皮膚）または体液（例えば血液、唾液もしくは精液）のような極めて少ない生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列を増幅するのに用いることができる。次に、増幅した配列は、標準と比較することができ、それによって、生物学的サンプルの源の同定が可能になる。
【０１３５】
本発明の配列は、ポリヌクレオチド試薬、例えばヒトゲノムにおける特異的な遺伝子座を標的とするＰＣＲプライマーを提供するのに用いることができ、これは、例えばその他の「同定マーカー」（すなわち特定の個々の生物に固有のその他のＤＮＡ配列）を提供することによってＤＮＡに基づく法医学的な同定の信頼度を高めることができる。上述したように、実際の塩基配列情報は、制限酵素により生じたフラグメントによって形成されたパターンの正確な選択肢として同定に用いることができる。非コード領域を標的とする配列が、この用途に特に適しているが、これは、非コード領域にはより多数の多型が存在するため、この技術を用いて個々の生物を識別することをより簡単にすることができるためである。ポリヌクレオチド試薬の例としては、本発明の核酸配列またはそれらの部分、例えば長さが少なくとも２０または３０塩基の非コード領域由来のフラグメントが挙げられる。
【０１３６】
本発明で説明される核酸配列はさらに、ポリヌクレオチド試薬、例えば、標識された、または、標識可能なプローブを提供するのに用いることができ、このようなプローブは、例えばインサイチュハイブリダイゼーション技術で用いて、特異的な組織（例えば肝臓組織）を同定することができる。これは、源が未知の組織が法医学の病理学者に提供される場合に、極めて有用であり得る。このようなプローブのパネルは、種および／または臓器のタイプによって組織を同定するのに用いることができる。
【０１３７】
また、上述の障害のない、または、突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子産物または保存された変異体、または、それらのペプチドフラグメントに対して向けられた抗体は、本発明で説明するような血管新生関連疾患（例えばガン）の診断および予後として用いることができる。このような方法は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物合成または発現のレベルにおける異常、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の構造、一時的な発現および／または物理的な位置における異常を検出するのに用いることができる。以下で述べる抗体および免疫分析方法は、例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の精製、および、血管新生関連疾患（例えばガン）の治療の有効性の評価において、重要なインビトロでの用途を有する。以下で述べるような抗体または抗体フラグメントは、可能性のある治療化合物をインビトロでスクリーニングするのに用いることができ、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現およびＴＲＡＩＬペプチド生産に対するそれらの作用を決定することができる。血管新生関連疾患（例えばガン）に有用な作用を有する化合物を同定し、治療上有効な用量を決定することができる。
【０１３８】
インビトロでの免疫分析はまた、例えば、血管新生関連疾患（例えばガン）のための細胞ベースの遺伝子治療の有効性を評価するのにも用いることができる。ＴＲＡＩＬペプチドに対して向けられた抗体は、インビトロで、例えば、ＴＲＡＩＬペプチドを生産するように遺伝子操作された細胞で達成されたＴＲＡＩＬ遺伝子発現のレベルを決定するのに用いることができる。細胞内ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の場合、このような評価は、好ましくは細胞溶解産物または抽出物を用いて行われる。このような解析は、インビボでの治療有効性、同様に、遺伝子置換プロトコールの最適化を達成するのに必要な、形質転換された細胞の数を決定することを可能にする。
【０１３９】
一般的に、分析しようとする組織または細胞型としては、ＴＲＡＩＬ遺伝子を発現することがわかっている、または、その疑いのあるものが挙げられる。本発明で用いられるタンパク質単離方法、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス，コールドスプリングハーバー，ニューヨーク）で説明されているものがある。単離された細胞は、細胞培養物または被験体から得ることができる。培養物から得られた細胞の解析は、細胞の評価において、細胞ベースの遺伝子治療技術の一部として用いられる、またあるいは、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現への化合物の作用を試験するために必要な工程であり得る。
【０１４０】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチドフラグメントの検出のための好ましい診断方法は、例えば免疫分析を含んでもよく、この場合、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物または保存された変異体またはペプチドフラグメントは、それらと、抗ＴＲＡＩＬ遺伝子産物特異的抗体との相互作用によって検出される。
【０１４１】
例えば、本発明において有用な上述のような抗体または抗体フラグメントは、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチドフラグメントの存在を定量的または定性的に検出するのに用いることができる。これは、例えば、蛍光標識された抗体（この章の以下を参照）を用いる免疫蛍光技術を、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光による検出と合わせて用いることによって達成することができる。細胞表面に発現されるＴＲＡＩＬ遺伝子産物には、このような技術が特に好ましい。
【０１４２】
さらに、本発明において有用な抗体（またはそれらのフラグメント）は、組織学的に、インサイチュでのＴＲＡＩＬ遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチドフラグメントの検出のために、例えば免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法において用いることができる。インサイチュでの検出は、組織標本を被験体より採取し、それに本発明の標識された抗体を適用することによって達成してもよい。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは、標識された抗体（またはフラグメント）を生物学的サンプルに置くことによって適用される。このような手順の使用を通じて、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物もしくは保存された変異体またはペプチドフラグメントの存在だけでなく、その試験された組織における分布を決定することが、可能である。本発明を用いて、当業者であれば、容易に理解できるが、このようなインサイチュでの検出を達成するために、あらゆる多種多様な組織学的方法（例えば染色手順）を改変することができる。
【０１４３】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチドフラグメントの免疫分析は、一般的には、生体液、組織抽出物、新しく回収した細胞、または、細胞の溶解産物のようなサンプル（これらは、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物もしくは保存された変異体またはそれらのペプチドフラグメントを同定することができる検出可能に標識された抗体の存在下で細胞培養物中でインキュベートされている）をインキュベートすること、および、当業界周知の多数のあらゆる技術によって結合した抗体を検出することを含み得る。
【０１４４】
生物学的サンプルは、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定できるニトロセルロース、またはその他の固体支持体のような固相支持体またはキャリアーと接触させ、固定させることができる。次に、支持体は、適切な緩衝液で洗浄し、続いて検出可能に標識されたＴＲＡＩＬ遺伝子特異的抗体で処理することができる。次に、固相支持体は、緩衝液で２回洗浄し、未結合の抗体を除去することができる。次に、固体支持体上の結合した標識の量を、従来の手段で検出することができる。
【０１４５】
「固相支持体またはキャリアー」は、抗原または抗体を結合させることができるあらゆる支持体を意味するものとする。周知の支持体またはキャリアーとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩および磁鉄鉱が挙げられる。キャリアーの性質は、本発明の目的において、ある程度可溶性であるか、または、不溶性のいずれかが可能である。支持体の材料は、実質的には、カップリングされた分子が、抗原または抗体に結合にできる限り、考えられるあらゆる構造を有し得る。従って、支持体の構造は、球状（例えばビーズ中）、または、円筒状（例えば試験管の内表面、または、ロッドの外表面）が可能である。あるいは、その表面は、平坦であってもよく、例えばシート、試験ストリップなどである。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者であれば、抗体または抗原を結合させるための多くのその他の適切なキャリアーが既知であり、または、慣例的な実験の使用によって上記のことを確認することができると考えられる。
【０１４６】
抗ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の抗体の所定のロットの結合活性は、周知の方法に従って決定することができる。当業者であれば、慣例的な実験を用いることによるそれぞれの決定に対して、稼動する最適な分析条件を決定できると考えられる。
【０１４７】
ＴＲＡＩＬ遺伝子のペプチドの特異的抗体を検出可能に標識する方法の一つは、上記抗体を酵素に結合させ、酵素免疫分析（ＥＩＡ）で使用することである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ｔｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，１９７８年，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２，１〜７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．等，１９７８年，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１，５０７〜５２０；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，１９８１年，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３，４８２〜５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），１９８０年，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．等（編），１９８１年，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，科学書院（Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ），東京）。抗体に結合する酵素は、このような方法において、例えば分光光度法、蛍光法または視覚的手段によって検出することができる化学成分が生産されるように、適切な基質、好ましくはクロモジェニック基質と反応し得る。抗体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素としては、これらに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、β−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ，−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、および、アセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素に対してクロモジェニック基質を用いる比色分析方法によって達成することができる。検出はまた、同様に製造された標準との比較において、基質の酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成することができる。
【０１４８】
検出はまた、様々な他の免疫分析のいずれかを用いて達成することができる。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射標識することによって、放射免疫分析（ＲＩＡ）の使用によってＴＲＡＩＬ遺伝子のペプチドを検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８６年３月を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、または、オートラジオグラフィによって検出することができる。
【０１４９】
蛍光化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体が適切な波長の光に晒されると、蛍光によりその存在を検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物のなかでも、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンが挙げられる。
【０１５０】
抗体はまた、蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することができ、このような金属としては、例えば１５２Ｅｕ、または、ランタニド系のその他の金属が挙げられる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を用いて抗体に結合させることができる。
【０１５１】
抗体はまた、抗体を化学発光化合物にカップリングさせることによって、検出可能に標識することができる。次に、化学発光タグを有する抗体の存在は、化学反応の最中に発生した発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識した化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルである。
【０１５２】
同様に、生物発光化合物を、本発明の抗体を標識するのに用いることができる。生物発光は、生物系で見出される化学発光のタイプであり、この場合、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識目的で重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、および、エクオリンである。
【０１５３】
以下の分析は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と相互作用するタンパク質（例えば細胞内タンパク質）またはタンパク質部分に結合する化合物、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と細胞内タンパク質との相互作用に干渉する化合物、および、ＴＲＡＩＬ遺伝子の活性を調節する（すなわち、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現のレベルを調節する、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルを調節する）化合物が同定されるように設計されている。分析はさらに、ＴＲＡＩＬ遺伝子調節配列（例えばプロモーター配列；例えば、Ｐｌａｔｔ，１９９４年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２８５５８〜２８５６２を参照）に結合する化合物、および、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現のレベルを調節できる化合物を同定することに利用することができる。このような化合物としては、これらに限定されないが、小さい有機分子、例えば、血液脳関門を通過し、適切な細胞への侵入を高め、ＴＲＡＩＬ遺伝子またはＴＲＡＩＬ調節経路に関与するその他の数種の遺伝子の発現に作用を与えるすることができるような分子、または、細胞内タンパク質が挙げられる。
【０１５４】
このような細胞内タンパク質の同定方法は、以下で説明される。このような細胞内タンパク質は、状態（ｍｏｏｄ）の制御および／または調節に関与する可能性がある。さらに、これらの化合物の中でも、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルに作用する化合物、および、以下で述べるようなＴＲＡＩＬ疾患（例えばガン）の治療的処置で用いることができる化合物が挙げられる。
【０１５５】
このような化合物としては、これらに限定されないが、例えば可溶性ペプチドのようなペプチドが挙げられ、このようなペプチドとしては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：Ｉｇで末端処理された融合ペプチド、および、ランダムペプチドライブラリーのメンバー；（例えば、Ｌａｍ等，１９９１年，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８２〜８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ等，１９９１年，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４，８４〜８６を参照）、および、Ｄ型および／またはＬ型アミノ酸で作製されたコンビナトリアルケミストリーで得られた分子ライブラリー、ホスホペプチド（例えば、これらに限定されないが、ランダムまたは部分的に変性した、誘導されたホスホペプチドライブラリーのメンバーが挙げられる；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ等，１９９３年，Ｃｅｌｌ  ７２，７６７〜７７８を参照）、抗体（例えば、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、ならびに、ＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、ならびに、それらのエピトープ結合フラグメントが挙げられる）、および、小さい有機または無機分子。
【０１５６】
このような化合物はまた、アポトーシス関連疾患の症状を改善または悪化させることがわかっている化合物、特に薬剤、または、薬剤のクラスまたはファミリーのメンバーも含んでもよい。このような化合物としては、これらに限定されないが、血管新生阻害剤：メタロプロテアーゼ阻害剤、ＦＧＰおよびＶＥＧＦ受容体阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＩＮＦ、ＩＬ−１２、タキソール、ビンブラスチン、サリドマイドなどが挙げられる。好ましくは、このような化合物は、これまでにこのような化合物が投与されている方式と異なる方式（例えば様々な投与量、投与様式、および／または、１またはそれ以上の追加の化合物との共投与）で利用される。
【０１５７】
本発明で説明されるような分析によって同定された化合物は、例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の生物学的機能を達成させることにおいて、および、アポトーシス関連疾患（例えばガン）を改善するために有用であり得る。例えば、このような技術によって同定された化合物は、ＴＲＡＩＬ介在プロセスを調節する能力、および／または、アポトーシス関連疾患の症状を改善する能力に関して試験されるリード化合物を提供し得る。例えば上述したような技術によって同定された化合物の有効性を試験する分析を以下で述べる。
【０１５８】
例えばＴＲＡＩＬポリペプチドのような本発明のＴＲＡＩＬ遺伝子産物と結合する化合物が同定されるように、インビトロ系を設計することができる。同定された化合物は、例えば、障害のない、および／または、突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の活性を調節することにおいて有用であり、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の生物学的機能を解明するのに有用であり、正常なＴＲＡＩＬ遺伝子産物の相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングに利用することができ、または、それ自体でこのような相互作用を破壊することができ、および、ＴＲＡＩＬ介在プロセスを調節する能力、および／または、アポトーシス関連疾患の症状を改善する能力についてさらに試験されるリード化合物を提供することができる。
【０１５９】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に結合する化合物を同定するのに用いられる分析の原理は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と試験化合物の反応混合物を、２つの成分が相互作用し結合し複合体を形成するのに十分な条件および時間で製造することを含み、この複合体は、反応混合物中で除去および／または検出することができる。これらの分析は、様々な方法で行うことができる。例えば、このような分析を行う１つの方法は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物または試験物質を固相に固定すること、および、反応の最後に固相に固定されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物／試験化合物複合体を検出することを含み得る。このような方法の一実施形態において、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、固体表面に固定させることができ、試験化合物は、固定されておらず、直接的または間接的のいずれかで標識することができる。
【０１６０】
実際には、マイクロタイタープレートは、固相として都合よく利用することができる。固定された成分は、非共有結合または共有結合での付着によって固定させることができる。非共有結合での付着は、単に固体表面をタンパク質の溶液でコーティングし、乾燥させることによって達成することができる。あるいは、固定された抗体、好ましくは、固定しようとするタンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、タンパク質を固体表面に固定するのに用いることができる。表面を予め製造し、保存しておいてもよい。
【０１６１】
上記分析を行うために、固定されていない成分は、固定された成分を含むコーティングされた表面に加えられる。反応が完了した後、形成された全ての複合体が、固体表面に固定されたままになるような条件下で、未反応の成分を除去する（例えば洗浄することによって）。固体表面に固定された複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。予め固定されていない成分がプレ標識されている場合において、表面に固定された標識が検出されることは、複合体が形成されたことを示す。予め固定されていない成分がプレ標識されていない場合において、間接的な標識を用いて表面に固定された複合体を検出することができ、例えば、予め固定されていない成分に特異的な標識された抗体を用いることによって検出できる（この抗体は順に、標識された抗Ｉｇ抗体で直接的に標識してもよいし、または、間接的に標識してもよい）。
【０１６２】
あるいは、反応を液相で行い、未反応の成分から反応生成物を分離し、複合体を検出することができる；例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に特異的な固定された抗体、または、溶液中で形成されたあらゆる複合体を固定する試験化合物、および、考えられる複合体のその他の成分に特異的な標識された抗体を用いて、固定された複合体を検出することができる。
【０１６３】
タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに適切なあらゆる方法を、ＴＲＡＩＬタンパク質−タンパク質相互作用を同定するのに用いることができる。
【０１６４】
用いることができる従来の方法の中でも、共免疫沈降反応、架橋、および、濃度勾配またはクロマトグラフィーカラムによる共精製が挙げられる。このような手順を利用することにより、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と相互作用する細胞内タンパク質などのタンパク質の同定が可能になる。一度単離されれば、このようなタンパク質を同定し、標準的な技術を併用して、それが相互作用するタンパク質を同定するのに用いることができる。例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と相互作用するタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部を、当業者周知の技術を用いて確認することができ、例えばエドマン分解技術によってである（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３年，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，”Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．．Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．３４〜４９を参照）。得られたアミノ酸配列は、このようなタンパク質をコードする遺伝子配列をスクリーニングするのに用いることができるオリゴヌクレオチド混合物生成のガイドとして用いることができる。作製されたスクリーニングは、例えば標準的なハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術によって達成することができる。オリゴヌクレオチド混合物生成技術およびスクリーニング技術は周知である。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、および、１９９０年，“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｉｎｎｉｓ等編，アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ニューヨークを参照）。
【０１６５】
加えて、ＴＲＡＩＬタンパク質と相互作用するタンパク質をコードする遺伝子が同時に同定できる方法を用いることができる。これらの方法としては、例えば、周知のラムダgt１１ライブラリーの抗体プロービング技術に類似した方法でＴＲＡＩＬタンパク質を用い、標識されたＴＲＡＩＬタンパク質で発現ライブラリーをプロービングすることが挙げられる。
【０１６６】
インビボでタンパク質相互作用を検出する方法の１つの、ツーハイブリッドシステムを、実例として詳細に説明するが、限定するものではない。このシステムの１つの改変法が説明されており（Ｃｈｉｅｎ等，１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８〜９５８２）、クロンテック（パロアルト，カリフォルニア州）から市販されている。
【０１６７】
簡単に言えば、このようなシステムを利用するために、２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される：２つのハイブリッドタンパク質の１つは、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物に融合した転写アクチベータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインからなり、もう一方は、ｃＤＮＡライブラリーの一部として、このプラスミドに組換えられたｃＤＮＡによってコードされる未知のタンパク質に融合した転写アクチベータータンパク質の活性化ドメインからなる。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドおよびｃＤＮＡライブラリーは、調節領域に転写アクチベーターの結合部位を含むレポーター遺伝子（例えばＨＢＳまたはｌａｃＺ）を含む酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化することはできない：ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないため、活性化することができず、活性化ドメインハイブリッドは、アクチベーターの結合部位に局在することができないため、活性化することができない。２つのハイブリッドタンパク質の相互作用により、機能的アクチベータータンパク質が元に戻り、レポーター遺伝子の発現を引き起こし、これは、レポーター遺伝子産物の分析によって検出される。
【０１６８】
ツーハイブリッドシステムまたは関連する方法論は、「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質に関して活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。非限定的な例において、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、ベイト遺伝子産物として用いることができる。トータルのゲノムまたはｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合する。このライブラリーと、ＤＮＡ結合ドメインに融合したベイトＴＲＡＩＬ遺伝子産物のハイブリッドをコードするプラスミドは、酵母レポーター株に共形質転換され、得られた形質転換体は、レポーター遺伝子を発現するものに関してスクリーニングされる。非限定的な例としては、ベイトＴＲＡＩＬ遺伝子配列、例えばＴＲＡＩＬ遺伝子のオープンリーディングフレームは、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳によって融合するようにベクターにクローニングすることができる。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子発現に関与するライブラリープラスミドが単離される。次に、ＤＮＡ配列解析するが、ライブラリープラスミドによってコードされたタンパク質を同定するのに用いられる。
【０１６９】
そのタンパク質がベイトＴＲＡＩＬ遺伝子産物と相互作用する細胞系のｃＤＮＡライブラリーを、当業界で慣例的に実施される方法を用いて作製することができる。本発明で説明される特定のシステムに従って、例えば、ｃＤＮＡフラグメントは、それらが、ＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳によって融合するようにベクターに挿入することができる。このライブラリーは、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターによって稼動されるｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株に、ベイトＴＲＡＩＬ遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドと共に共形質転換することができる。ベイトＴＲＡＩＬ遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合したタンパク質をコードしたｃＤＮＡは、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構築することがあり、それによってＨＩＳ３遺伝子の発現を稼動させる。ＨＩＳ３を発現するコロニーは、半固体寒天ベースのヒスチジン欠乏培地を含むペトリ皿でそれらを成長させることによって検出することができる。次に、これらの株からｃＤＮＡを精製し、当業界で慣例的に実施される技術を用いてベイトＴＲＡＩＬ遺伝子と相互作用するタンパク質を生産および単離するのに用いることができる。
【０１７０】
本発明のＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、インビボで、細胞または細胞外高分子（例えばタンパク質）などの１またはそれ以上の高分子と相互作用する可能性がある。このような高分子としては、これらに限定されないが、その他のタンパク質（例えば細胞受容体）、または、上述のような方法で同定された核酸分子およびタンパク質が挙げられる。例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、ペプチドホルモンまたは神経ペプチドとして受容体と相互作用できる。この考察の目的のために、高分子は、本発明において「結合パートナー」と称する。この方法においてＴＲＡＩＬ結合を破壊する化合物は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、特に突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の活性を調節するのに有用である。例えば、このような化合物は、その受容体を有するＴＲＡＩＬ遺伝子産物の相互作用を干渉することができる。このような化合物としては、これらに限定されないが、例えば上述したようなペプチドのような分子などが挙げられ、これらは、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物への接近を高めることができる。
【０１７１】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と、その結合パートナーとの間の相互作用を干渉する化合物を同定するのに用いられる上記分析システムの基本原理は、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と結合パートナーを含む反応混合物を、２者が相互作用および結合できるのに十分な条件下および時間で製造すること；このようにして、複合体を形成することを含む。化合物を阻害活性に関して試験するために、試験化合物の存在下および非存在で反応混合物を製造する。試験化合物を最初に反応混合物に加えることができ、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物およびその結合パートナーの添加の後に加えてもよい。コントロール反応混合物を、試験化合物なしで、または、プラセボと共にインキュベートする。次に、ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質と結合パートナーとのあらゆる複合体の形成が検出される。試験化合物を含む反応混合物ではなく、コントロール反応において複合体が形成されることは、その化合物が、ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質と、相互作用する結合パートナーとの相互作用を干渉することを示す。さらに、試験化合物と正常なＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質を含む反応混合物内での複合体形成はまた、試験化合物と突然変異ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質を含む反応混合物内での複合体形成と比較してもよい。この比較は、正常なＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質ではなく突然変異体の相互作用を破壊する化合物を同定することが望ましい
場合に重要であり得る。
【０１７２】
ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と結合パートナーとの相互作用を干渉する化合物の分析は、ヘテロジニアスまたはホモジニアス形式で行うことができる。ヘテロジニアスアッセイは、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物または結合パートナーのいずれかを固相にを固定すること、および、反応の終わりに固相に固定された複合体を検出することを含む。ホモジニアスアッセイにおいて、全ての反応は液相で行われる。いずれのアプローチにおいても、反応物の添加は様々な順番が可能であり、試験される化合物についての様々な情報を得ることができる。例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物と、結合パートナーとの間の相互作用を干渉する（例えば競合によって）試験化合物は、試験物質の存在下での反応を行うことによって同定することができる；すなわち、ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質、および、相互作用する細胞内結合パートナーの前に、または、それらと同時に試験物質を反応混合物に加えることによってなされる。あるいは、予め形成された複合体を破壊する試験化合物（例えば、より高い結合定数を有する、複合体からの成分の一つを解離させる化合物）を、複合体が形成された後に試験化合物を反応混合物に加えることによって試験することができる。様々な形式を以下に簡単に説明する。
【０１７３】
ヘテロジニアスアッセイシステムにおいては、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、または、相互作用する結合パートナーのいずれかが固体表面に固定され、同時に、固定されていない種は、直接的または間接的のいずれかで標識される。実際には、マイクロタイタープレートが都合よく利用されている。固定された種は、非共有結合または共有結合での付着によって固定してもよい。非共有結合での付着は、固体表面をＴＲＡＩＬ遺伝子産物または結合パートナーの溶液でコーティングし、乾燥させることによって簡単に達成してもよい。あるいは、固定される種に特異的な固定された抗体は、種を固体表面に固定するのに用いてもよい。表面を予め製造し、保存しておいてもよい。
【０１７４】
上記分析を行うために、固定された種のパートナーは、試験化合物と共に、または、それら無しで、コーティングされた表面に晒される。反応が完了した後、未反応の成分を除去すると（例えば、洗浄することによって）、形成されたあらゆる複合体が固体表面に固定されたままとなる。固体表面に固定された複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。固定されていない種がプレ標識されている場合、表面に固定された標識が検出されることは、複合体が形成されたことを示す。固定されていない種がプレ標識されていない場合、間接的な標識は、表面に固定された複合体を検出するのに用いることができる；例えば、最初に固定されていない種に特異的な標識された抗体を用いてなされる（この抗体は順に、標識された抗Ｉｇ抗体で直接的に標識してもよいし、または、間接的に標識してもよい）。反応成分の添加の順番に応じて、複合体形成を阻害する試験化合物、または、予め形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。
【０１７５】
あるいは、上記反応は、試験化合物の存在または非存在下で液相で行い、反応生成物を未反応の成分から分離し、複合体を検出することができる；例えば、結合成分の１つに特異的な固定された抗体を用いて、溶液中で形成されたあらゆる複合体を固定することができ、および、他のパートナーに特異的な標識された抗体を用いて、固定された複合体を検出することができる。再度、液相への反応物の添加の順番に応じて、複合体を阻害する、または、予め形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
【０１７６】
本発明のその代わりの実施形態において、ホモジニアスアッセイを用いることができる。このアプローチにおいて、ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質と相互作用する結合パートナーとの予め形成された複合体が製造され、ここで、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物、または、その結合パートナーのいずれかが標識されるが、標識によって生じたシグナルは、複合体形成により消光される（例えば、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎによる米国特許第４,１０９,４９６号を参照、これは、このアプローチを免疫分析に利用している）。予め形成された複合体からの種の１つと競合し、置換を起こす試験物質を添加すると、バックグラウンドを越えるシグナルの生成を引き起こし得る。この方法において、ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質／結合パートナー相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
【０１７７】
特定の実施形態において、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を、上述の組換えＤＮＡ技術を用いて固定化するために製造することができる。例えば、ＴＲＡＩＬのコード領域は、得られた融合タンパク質においてその結合活性が維持されるような方法で、融合ベクター（例えばｐＧＥＸ−５Ｘ−１）を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子に融合させることができる。当業界で慣例的に実施される、上述の方法を用いて、相互作用する結合パートナーを精製し、モノクローナル抗体を生じさせるのに用いることができる。この抗体は、例えば当業界で慣例的に実施される方法によって放射性同位体１２５Ｉで標識することができる。ヘテロジニアスアッセイにおいて、例えば、ＧＳＴ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロースビーズに固定させることができる。次に、相互作用する結合パートナーを、試験化合物の存在または非存在下で、相互作用および結合を起こすような方法で加えることができる。反応時間の終わりに、未結合の材料を洗浄して除去し、標識されたモノクローナル抗体をシステムに加えて、複合体化した成分への結合を可能にすることができる。ＴＲＡＩＬ遺伝子タンパク質と、相互作用する結合パートナーと間の相互作用は、グルタチオン−アガロースビーズに結合したままの放射活性の量を測定することによって検出することができる。試験化合物による相互作用の阻害がうまくいくことによって、測定された放射活性の減少が起こり得る。
【０１７８】
あるいは、固形のグルタチオン−アガロースビーズを含まない液体中で、ＧＳＴ−ＴＲＡＩＬ遺伝子融合タンパク質、および、相互作用する結合パートナーを共に混合することができる。試験化合物は、これらの種を相互作用させている間に、または、その後のいずれかに加えることができる。次に、この混合物をグルタチオン−アガロースビーズに加えることができ、未結合の材料は、洗浄して除去される。再度、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物／結合パートナー相互作用の阻害の程度は、標識された抗体を加え、ビーズに関連する放射活性を測定することによって検出することができる。
【０１７９】
本発明の他の実施形態において、これらと同じ技術を用いることができ、この場合、ＴＲＡＩＬタンパク質の結合ドメイン、および／または、相互作用または結合パートナーの結合ドメイン（結合パートナーがタンパク質である場合）に対応するペプチドフラグメントを、全長タンパク質の一方または両方の変わりに用いてなされる。多数の当業界で慣例的に実施される方法を、結合部位を同定し単離するのに用いることができる。これらの方法としては、これらに限定されないが、上記タンパク質のいずれかをコードする遺伝子変異誘発、および、共免疫沈降反応分析における結合の破壊のスクリーニングが挙げられる。次に、複合体中で、第二の種をコードする遺伝子における相殺性の突然変異を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列解析により、相互作用性の結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が解明され得る。あるいは、１つのタンパク質を、この章の上で説明されている方法を用いて固体表面に固定させ、その標識された結合パートナー（トリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理されている）と相互作用させ、結合させることができる。洗浄の後、結合ドメインを含む短い標識されたペプチドは固形材料に結合したまま残る可能性があり、このペプチドを単離し、アミノ酸配列解析によって同定することができる。また、そのセグメントをコードする遺伝子を、上記タンパク質のペプチドフラグメントが発現されるように操作することができたら、次に、これを結合活性について試験し、精製または合成することができる。
【０１８０】
非限定的な例としては、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物は、ＧＳＴ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質を作製することによって、この章で上述したような固形材料に固定させ、グルタチオンアガロースビーズへ結合させることができる。得られた相互作用する結合パートナーは、３５Ｓのような放射性同位体で標識し、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で切断することができる。次に、切断産物は、固定されたＧＳＴ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質に加えられ、結合させることができる。未結合のペプチドを洗浄して除去した後、標識された結合した材料（結合パートナー結合ドメインを示す）を、周知の方法で溶出させ、精製し、アミノ酸配列を分析することができる。このようにして同定されたペプチドを、合成により生産することができ、または、組換えＤＮＡ技術を用いて適切な促進型のタンパク質に融合させることができる。
【０１８１】
上述のような分析技術によって同定された結合化合物など（これらに限定されない）の化合物は、アポトーシス関連疾患の症状（例えばアポトーシス依存性のガン）を改善する能力について試験することができ、このようなアポトーシス関連疾患の症状としては、例えば、固形腫瘍、白血病のような血液由来の腫瘍、および、腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および、化膿性肉芽腫；リウマチ様関節炎；乾癬；眼の血管新生病、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑部変性、角膜移植後拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、皮膚潮紅；オスラー−ウェーバー症候群；心筋の血管新生；プラークの血管新生；末梢血管拡張症；血友病患者の関節；血管線維腫；創傷の肉芽組織；冠状の側副枝（ｃｏｒｏｒｎａｒｙ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳の側副枝（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；動静脈奇形；虚血性の四肢の血管新生；糖尿病性血管新生；黄斑部変性；骨折；脈管形成；造血；排卵；月経；胎盤形成；腸管癒着症；アテローム性動脈硬化症；強皮症；肥厚性瘢痕、すなわちケロイド；猫ひっかき病（ロシエルミナリアクイントサ（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ））；および、潰瘍（ヘリコバクターピロリ）が挙げられる。これは、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現に作用すること、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルに作用することのいずれかによる、ＴＲＡＩＬ遺伝子活性である。例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物が関与する経路におけるその他の工程に関与する化合物、および、これと同じ経路に作用することによって、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の進行へのＴＲＡＩＬの作用を調節する可能性のある化合物を同定することができる。このような化合物を、上記疾患を治療するための治療方法の一部として用いることができる。
【０１８２】
以下、このようなアポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状を改善する能力を示す化合物を同定するための細胞ベースの、および、動物モデルベースの分析を説明する。
【０１８３】
第一に、細胞ベースの系は、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状を改善するように作用し得る化合物を同定するのに用いることができる。このような細胞系としては、例えば、組換え細胞または非組換え細胞（例えばＴＲＡＩＬ遺伝子を発現する細胞系）が挙げられる。
【０１８４】
このような細胞系を利用することにおいて、ＴＲＡＩＬを発現する細胞を、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状を改善する能力を示す可能性のある化合物に、十分な濃度、十分な時間で晒し、晒された細胞においてこのような症状の改善を惹起させることができる。晒した後、細胞を分析して、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現の変化を測定することができ、これは、例えば、細胞溶解産物をＴＲＡＩＬのｍＲＮＡ転写に関して分析することによって（例えばノーザン解析によって）、または、細胞によって発現されたＴＲＡＩＬ遺伝子産物に関して分析することによってなされる；ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現を調節する化合物は、治療剤として有望な候補である。あるいは、細胞は、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に関連する１またはそれ以上の細胞表現型が改変されているかかどうかを決定するために試験され、より正常な、または障害のない、影響を受けていない表現型であるかどうか、または、疾患の症状の発生率がより低い表現型、または、疾患の症状が重症である可能性がより高い表現型であるかどうかを比較することができる。
【０１８５】
加えて、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に関する動物ベースの系またはモデルは、上記疾患の症状を改善することができる化合物を同定するのに用いることができる。このような動物ベースの系またはモデルとしては、例えば、トランスジェニックマウス、例えば外因性または内因性ＴＲＡＩＬ配列を発現するように遺伝子操作されているマウス、またあるいは、内因性ＴＲＡＩＬ遺伝子配列を発現しなくなったマウス（すなわち「ノックアウト」マウス）が挙げられる。このような動物モデルを、このような疾患を治療するのに有効な可能性のある薬剤、医薬、療法および介入を同定するための試験基質として用いることができる。例えば、動物モデルを、症状を改善する能力を示す可能性のある化合物に、十分な濃度、十分な時間で晒し、晒された動物においてこのようなアポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状の回復を惹起させることができる。晒すことに対する動物の反応は、このような症状が解消することを評価することによってモニターすることができる。
【０１８６】
介入に関しては、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状のあらゆる形態を解消するあらゆる治療が、このような疾患におけるヒトの治療的介入の候補として考慮されるものとする。試験物質の投与量は、以下で述べる用量応答曲線を得ることによって決定してもよい。
【０１８７】
アポトーシス関連疾患（例えばガン）の診断および予後の評価、および、このような疾患の素因を有する被験体の同定のために、様々な方法を用いることができる。
【０１８８】
例えば、このような方法は、上述のＴＲＡＩＬ遺伝子のヌクレオチド配列、および、上述したようなＴＲＡＩＬ遺伝子産物（例えばそれらのペプチドフラグメント）に対して向けられた抗体のような試薬を利用することができる。特に、このような試薬は、例えば、以下に関して用いることができる：
（１）ＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異の存在の検出、または、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の状態より過剰な、または、それを下回るＴＲＡＩＬ遺伝子のｍＲＮＡ発現いずれかの検出；
（２）影響を受けていない状態より過剰な、または、それを下回るＴＲＡＩＬ遺伝子産物の量いずれかの検出；および、
（３）影響を受けていない状態に対して、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性の異常なレベルの検出。
【０１８９】
例えば、ＴＲＡＩＬ遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば上述のＴＲＡＩＬ突然変異の検出技術を用いて、アポトーシス関連疾患を診断するのに用いることができる。
【０１９０】
本発明で説明される方法は、例えば、少なくとも１種の本発明で説明される特定のＴＲＡＩＬ遺伝子の核酸、または、抗ＴＲＡＩＬ遺伝子の抗体試薬を含む予め包装された診断キットを利用することによって行うことができ、このようなキットは、例えば、臨床的な環境において、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の異常を示す被験体を診断するのに都合よく用いることができる。
【０１９１】
ＴＲＡＩＬ突然変異の検出のために、あらゆる有核細胞を、ゲノム核酸の初発の源として用いることができる。ＴＲＡＩＬ遺伝子発現またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物の検出のために、ＴＲＡＩＬ遺伝子が発現されるあらゆる細胞型または組織を利用することができる。
【０１９２】
核酸に基づく検出技術は上述されている。ペプチド検出技術は上述されている。
【０１９３】
その上、本発明で説明される方法は、本発明のポリペプチドの異常な発現または活性に関連する病気または疾患を有する、または、それらを発症する危険を有する被験体を同
定するための診断または予後分析として利用することができる。例えば、本発明で説明される分析、例えば上述の診断分析または以下の分析は、本発明のポリペプチドの異常な発現または活性に関連する疾患を有する、または、それを発症する危険を有する被験体を同定するのに利用することができる。あるいは、予後分析は、このような病気または疾患を有する、または、それを発症する危険を有する被験体を同定するのに利用することができる。従って、本発明は、試験サンプルを被験体から得て、本発明のポリペプチドまたは核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する方法を提供し、この場合、ポリペプチドまたは核酸の存在は、上記ポリペプチドの異常な発現または活性に関連する病気または疾患を有する、または、それを発症する危険を有する被験体の診断である。本発明で用いられるように、「試験サンプル」は、対象の被験体から得られた生物学的サンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、生体液（例えば血清）、細胞サンプル、または、組織が可能である。
【０１９４】
その上、本発明で説明される予後分析は、本発明のポリペプチドの異常な発現または活性に関連する病気または疾患を治療するために、被験体に、物質（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小さい分子、またはその他の薬剤候補）を投与することができるかどうかを決定するのに用いることができる。例えば、このような方法は、被験体を、特定の物質または物質クラス（例えばポリペプチドの活性を減少させるタイプの物質）で有効に治療することができるかどうかを決定するのに用いることができる。従って、本発明は、被験体を、本発明のポリペプチドの異常な発現または活性に関連する疾患のための物質で有効に治療することができるかどうかを決定する方法を提供し、この方法において、試験サンプルを得て、上記ポリペプチドまたは上記ポリペプチドをコードする核酸が検出される（例えば、この場合、ポリペプチドまたは核酸の存在は、上記ポリペプチドの異常な発現または活性に関連する疾患を治療するための物質を投与することができる被験体の診断である）。
【０１９５】
本発明の方法はまた、本発明の遺伝子における遺伝子の損傷または突然変異を検出するのに用いることができ、それによって損傷した遺伝子を有する被験体が、本発明のポリペプチドの異常な発現または活性を特徴とする疾患に関する危険を有するかどうかが決定される。好ましい実施形態において、本方法は、被験体からの細胞サンプルにおいて、遺伝子の損傷または突然変異の存在または非存在を検出することを含み、この遺伝子の損傷または突然変異は、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の完全性、または、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のミス発現に作用する改変の少なくとも１つを特徴とする。例えば、このような遺伝子の損傷または突然変異は、以下の少なくとも１つが存在することを確認することによって検出することができる：１）上記遺伝子からの１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）上記遺伝子への１またはそれ以上のヌクレオチドの添加；３）上記遺伝子の１またはそれ以上のヌクレオチドの置換；４）上記遺伝子の染色体再編成；５）上記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの転写のレベルにおける改変；６）上記遺伝子の異常な改変、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの改変；７）上記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの転写の非野生型のスプライシングパターンの存在；８）上記遺伝子によってコードされたタンパク質の非野生型レベル；９）上記遺伝子の対立遺伝子の喪失；および、１０）上記遺伝子によってコードされたタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本発明で説明するように、上記遺伝子における損傷を検出するのに用いることができる当業界既知の多数の分析技術がある。
【０１９６】
特定の実施形態において、上記損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、および、第４，６８３，２０２号を参照）、またあるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ等（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７〜１０８０；および、Ｎａｋａｚａｗａ等（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０〜３６４を参照）を含み、後者は、遺伝子中の点突然変異を検出するのに特に有用であり得る（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ等（１９９５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５〜６８２を参照）。この方法は、以下の工程を含み得る：被験体からの細胞サンプルを回収する工程、サンプルの細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離する工程、核酸サンプルと、１またはそれ以上のプライマーとを接触させる工程（前記プライマーは、遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で選択された遺伝子に特異的にハイブリダイズする）、および、増幅産物の存在または非存在を検出する工程、または、増幅産物のサイズを検出する工程、および、コントロールサンプルと長さを比較する工程。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本発明で説明される突然変異を検出するのに用いられる技術のいずれかと共に、予備的な増幅工程として用いるのに望ましいと予想される。
【０１９７】
その代わりの増幅方法としては：自律的に維持される配列の複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等（１９９０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４〜１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ等（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３〜１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ等（１９８８年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、または、その他のあらゆる核酸増幅方法が挙げられ、続いて、当業者周知の技術を用いて増幅した分子が検出される。これらの検出スキームは、このような分子が極めて少数しか存在しない場合、核酸分子の検出に特に有用である。
【０１９８】
その代わりの実施形態において、サンプル細胞から選択された遺伝子における突然変異は、制限酵素切断パターンを改変することによって同定することができる。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡを単離し、増幅し（場合により）、１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、フラグメント長さをゲル電気泳動によって決定し、比較する。サンプルとコントロールＤＮＡとのフラグメント長さのサイズにおける差は、サンプルＤＮＡにおいて突然変異があることを示す。その上、配列特異的リボザイムの使用（例えば、米国特許第５,４９８,５３１号を参照）は、リボザイム切断部位の発生または喪失による特定の突然変異の存在についてスコア付けするのに用いることができる。
【０１９９】
その他の実施形態において、遺伝子の突然変異は、サンプルおよびコントロール核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定することができる（Ｃｒｏｎｉｎ等，１９９６年，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４〜２５５；Ｋｏｚａｌ等，１９９６年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３〜７５９）。例えば、遺伝子の突然変異は、上記のＣｒｏｎｉｎ等で説明されたような光発生ＤＮＡプローブを含む二次元アレイで同定することができる。簡単に言えば、プローブの第一のハイブリダイゼーションアレイは、サンプルおよびコントロールにおけるＤＮＡの長い伸張を通じてスキャンするのに用いることができ、それにより、連続的なオーバーラッププローブの直線状アレイを作製することによって配列間の塩基の変化を同定することができる。この工程により、点突然変異の同定が可能である。この工程に続いて、第二のハイブリダイゼーションアレイを用い、それにより、検出された全ての変異体または突然変異に相補的な、より小さい特殊化したプローブアレイを用いることによって、特定の突然変異の特徴付けが可能になる。それぞれの突然変異アレイは、パラレルプローブ群で構成され、その一方は、野生型遺伝子に相補的であり、他方は、突然変異体の遺伝子に相補的である。
【０２００】
さらなる他の実施形態において、当業界既知の様々な配列解析反応のいずれかを用いることができ、それによって、選択された遺伝子を直接的に配列解析し、サンプル核酸の配列を、対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって突然変異を検出することができる。（配列解析反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ，１９７７年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０  ｏｒ  Ｓａｎｇｅｒ，１９７７年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３によって開発された技術に基づく反応が挙げられる）。また、診断分析を行う際に様々な自動配列解析方法のいずれかを利用することも考慮され（１９９５年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）、これは、マススペクトロメトリーによって配列解析することが含まれる（例えば、ＰＣＴ公報番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ等，１９９６年，Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７〜１６２；および、Ｇｒｉｆｆｉｎ等，１９９３年，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７〜１５９を参照）。
【０２０１】
選択された遺伝子において突然変異を検出するその他の方法としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、または、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチ塩基を検出するのに切断物質からの保護を用いる方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓ等，１９８５年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般的に、ミスマッチ切断技術は、野生型配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡと、組織サンプルから得られた突然変異体の可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズさせることによって形成されたヘテロ二本鎖を提供することが必要である。二本鎖デュプレックスは、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチのために存在し得るようなデュプレックスの一本鎖領域を切断する物質で処理される。ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスをＲＮアーゼで処理して、ミスマッチ領域を消化することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を消化することができる。その他の実施形態において、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのいずれかを、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理し、ピペリジンで処理してもよい。ミスマッチ領域を消化した後、次に、突然変異部位を決定するために、得られた材料を変性ポリアクリルアミドゲルで大きさごとに分離する。（例えば、Ｃｏｔｔｏｎ等，１９８８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ等，１９９２年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６〜２９５を参照）。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識することができる。
【０２０２】
さらなる他の実施形態において、細胞サンプルから得られたｃＤＮＡ中の点突然変異を検出し、マッピングするために設定された系において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチした塩基対を認識する１またはそれ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復酵素」）を用いる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチのＡを切断し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチのＴを切断する（Ｈｓｕ等，１９９４年，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７〜１６６２）。代表的な実施形態によれば、選択された配列（例えば野生型配列）に基づくプローブを、試験細胞からのｃＤＮＡ、またはその他のＤＮＡ産物にハイブリダイズさせる。デュプレックスをＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物（存在する場合）を電気泳動プロトコールなどで検出することができる。（例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照）。
【０２０３】
その他の実施形態において、電気泳動移動度における改変を、遺伝子中の突然変異を同定するのに用いることができる。例えば、突然変異体と野生型核酸との電気泳動移動度の差を検出するのに、ＳＳＣＰを用いてもよい（Ｏｒｉｔａ等，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２７６６；さらに、Ｃｏｔｔｏｎ．１９９３年，Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ，１９９２年，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３〜７９も参照）。サンプルおよびコントロール核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性することがあり、さらに、元の状態に戻ることがある。一本鎖核酸の二次構造は配列によって様々であり、電気泳動移動度で得られた改変から、１塩基の変化でも検出が可能である。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識または検出することもできる。上記分析の感度は、ＲＮＡ（ＤＮＡではない）を用いることによって高めることができ、この場合、二次構造は、配列における変化に対してより高い感度を有する。好ましい実施形態において、本方法は、ヘテロ二本鎖解析を利用して、電気泳動移動度における変化に基づき二本鎖化したヘテロ二本鎖分子を分離することができる（Ｋｅｅｎ等，１９９１年，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
【０２０４】
さらなる他の実施形態において、変性剤の濃度勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて分析する（Ｍｙｅｒｓ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）。解析方法としてＤＧＧＥが用いられる場合、確実に完全には変性しないように、例えばＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点ＧＣ−リッチＤＮＡのＧＣクランプを加えることによって、ＤＮＡを改変し得る。さらなる実施形態において、変性濃度勾配の代わりに温度濃度勾配が、コントロールとサンプルＤＮＡとの移動度における差を同定するのに用いられる（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ，１９８７年，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）。
【０２０５】
点突然変異を検出するその他の技術の例としては、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または、選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを、既知の突然変異が中心に置かれるように製造することができ、続いて、完全なマッチングが見出される場合にのみハイブリダイゼーションが可能な条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる（Ｓａｉｋｉ等，１９８６年，Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３；Ｓａｉｋｉ等，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイズメンブレンに結合しており、標識された標的ＤＮＡにハイブリダイズしている場合、このようなオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲで増幅した標的ＤＮＡ、または、多数の異なる突然変異にハイブリダイズされる。
【０２０６】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子特異的な増幅技術を、本発明と共に用いることができる。特異的増幅のためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、対象の突然変異を分子の中心に有していてもよく（増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに応じるように）（Ｇｉｂｂｓ等，１９８９年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７〜２４４８）、または、１つのプライマーの３’末端の最も端に有してもよく、この場合、適切な条件下でミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を妨害または減少させることができる（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ，１９９３年，Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）。加えて、新規の制限部位を突然変異の領域に導入して、切断に基づく検出を起こすことが、望ましい可能性がある（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ等，１９９２年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用のＴａｑリガーゼを用いて行うこともできると予想される（Ｂａｒａｎｙ，１９９１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ  ８８：１８９）。このような場合において、ライゲーションは、５’配列の３’末端に完全なマッチングがある場合にのみ生じるものであり、そのため、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の突然変異の存在を検出することを可能にする。
【０２０７】
本発明で説明される方法は、例えば、本発明で説明される少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む予め包装された診断キットを利用することによって行うことができ、本キットは、例えば、臨床的な環境において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関与する病気または疾病の症状または家族歴を示す被験体を診断するために都合よく用いることができる。その上、あらゆる細胞型または組織、好ましくは末梢血液の白血球（本発明のポリペプチドが発現される）を、本発明で説明される予後分析に利用することができる。
【０２０８】
本発明はさらに、本発明で説明されるＴＲＡＩＬ遺伝子および遺伝子産物の使用および／または検出を容易にするキットを提供する。本発明で説明されるキットは、例えば、臨床的な環境において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関与する病気または疾病の症状または家族歴を示す被験体を診断するために都合よく用いることができる。その上、あらゆる細胞型または組織（本発明のポリペプチドが発現される）を、本発明で説明される予後分析に利用することができる。
【０２０９】
一実施形態において、ＴＲＡＩＬ遺伝子または遺伝子産物をミス発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットが提供される。この実施形態において、１またはそれ以上の容器に、オリゴヌクレオチド（例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド）を含む診断キットが提供される。他の実施形態において、１またはそれ以上の容器に、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の増幅に有用な一対のプライマーを含むキットが提供される。様々なその他の実施形態において、本キットはまた、例えば、緩衝物質、保存剤、または、タンパク質安定化剤を含んでもよい。本キットはまた、検出可能な物質（例えば酵素または基質）を検出するのに必要な成分を含んでもよい。本キットはまた、コントロールサンプル、または、一連のコントロールサンプルを含んでもよく、これらを分析し、試験サンプルと比較することができる。本キットの各成分は、通常、個々の容器内に封入されており、それぞれの容器は全て、１つのパッケージになっており、試験された被験体が、上記ポリペプチドの異常な発現に関連する疾患に罹っているかどうか、または、それを発症させる危険を有するかどうかを観察するための説明書が共に含まれる。このようなキットを用いて、例えば、被験体からの細胞サンプルにおいて、上記タンパク質をコードする核酸分子のレベルを測定することができ、例えばｍＲＮＡレベルを検出すること、または、上記タンパク質をコードする遺伝子が、突然変異または欠失しているかどうかを決定することができる。
【０２１０】
他の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル（試験サンプル）中で本発明のポリペプチドまたは核酸の存在を検出するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、本発明の配列の使用に関する上記の章で述べたように、被験体が、本発明のポリペプチドの異常な発現に関連する疾患に罹っているかどうか、または、それを発症させる高い危険を有するかどうかを決定するのに用いることができる。この実施形態において、以下を含む１またはそれ以上の容器を含むキットが提供される：（１）本発明のポリペプチドに結合する第一の抗体（例えば固体支持体に結合させる）；および、場合により、（２）第二の異なる抗体（上記ポリペプチドまたは第一の抗体のいずれかに結合し、検出可能な物質に接合されている）。このようなキットは、被験体が、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に罹っているかどうか、または、その危険が高いかどうかを決定するのに用いることができる。
【０２１１】
以下に、ＴＲＡＩＬ介在プロセスを調節することができる、および／または、アポトーシス関連疾患（例えばガン）を治療することができる方法および組成物について説明する。
【０２１２】
例えば、このような方法は、プロセスが調節されるように、または、上記疾患の症状が改善されるように、ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現、および／または、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物を投与することを含み得る。
【０２１３】
あるいは、アポトーシス関連疾患（例えばガン）が、ＴＲＡＩＬ活性を低くするＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異、または、ＴＲＡＩＬ活性をなくするＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異が原因であるような場合それぞれにおいて、このような方法は、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子を哺乳動物に供給することを含んでもよく、この場合、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物が発現され、上記疾患の症状が改善される。
【０２１４】
ＴＲＡＩＬ遺伝子の突然変異が原因で生じる哺乳動物のアポトーシス関連疾患（例えばガン）の治療方法のその他の実施形態において、このような方法は、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物をコードする核酸分子を含む細胞を、哺乳動物に供給することを含んでもよく、この場合、このような細胞は、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子産物を発現し、上記疾患の症状が改善される。
【０２１５】
正常なＴＲＡＩＬ遺伝子産物機能の喪失により、アポトーシス関連疾患の表現型（例えばガン）が発症する場合において、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルが不十分であることを示す個々の生物において、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性の増加によって、無症状の状態への進行を促進することがある。ＴＲＡＩＬの発現または合成を強化する方法としては、例えば、以下で述べるような方法が挙げられる。
【０２１６】
あるいは、アポトーシス関連疾患の表現型（例えばガン）の症状は、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルを減少させる化合物を投与することによって改善される可能性がある。ＴＲＡＩＬ合成または発現のレベルを阻害する方法、または、それらを減少させる方法としては、例えば以下で述べるような方法が挙げられる。
【０２１７】
治療法の一実施形態において、投与された化合物は、血管新生関連疾患の症状を改善する、または、悪化させることが報告されている化合物、特に薬剤は含まれない。このような治療法がこのような化合物を含む場合、好ましくは、このような化合物は、これまでにこのような化合物が投与されている方式とは異なる方式で（例えば異なる投与量、投与様式、および／または、１またはそれ以上の追加の化合物との共投与）利用される。
【０２１８】
他の実施形態において、本発明で説明される疾患（例えばガン）の症状をＴＲＡＩＬタンパク質療法によって改善することができ、例えば、上述のＴＲＡＩＬタンパク質、融合タンパク質およびペプチド配列を用いて、または、ＴＲＡＩＬ遺伝子または遺伝子産物と相互作用し、それによってその活性を阻害する、または強めるタンパク質またはタンパク質フラグメント（例えばペプチド）の投与によってＴＲＡＩＬのレベルおよび／または活性を減少または増加させることによって改善することができる。
【０２１９】
このようなタンパク質療法は、例えば、機能的なＴＲＡＩＬタンパク質、または、機能的なＴＲＡＩＬドメインを示すＴＲＡＩＬタンパク質フラグメント（例えばペプチド）の投与を含み得る。
【０２２０】
一実施形態において、機能的なＴＲＡＩＬ結合ドメインを示すＴＲＡＩＬフラグメントまたはペプチドは、ペプチドがＴＲＡＩＬ結合タンパク質（例えばＴＲＡＩＬ受容体）に結合するように、個々の生物に投与される。このようなフラグメントまたはペプチドは、個々の生物において、ＴＲＡＩＬと競合し、それにより、ＴＲＡＩＬの結合タンパク質への結合が阻害されることによって、ＴＲＡＩＬ活性を阻害するように作用させることができ、本発明で説明される疾患の症状を改善する。あるいは、このようなフラグメントまたはペプチドは、個々の生物において、インビボでＴＲＡＩＬの機能を模擬することによってＴＲＡＩＬ活性を高めることができ、それによって本発明で説明される疾患の症状を改善する。
【０２２１】
本発明の方法において用いることができるタンパク質およびペプチドとしては、合成（例えば組換え、または、化学合成された）タンパク質およびペプチド、同様に、天然に存在するタンパク質およびペプチドが挙げられる。このようなタンパク質およびペプチドは、天然に存在する、および、天然に存在しないアミノ酸残基（例えばＤ−アミノ酸残基）の両方、および／または、１またはそれ以上の非ペプチド結合（例えばイミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド、および、アゾ結合）を含み得る。このようなタンパク質またはペプチドはまた、例えば上記ペプチドの安定性、生物学的利用率および／または阻害活性が高くなるように、アミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加の化学基（すなわち官能基）を含んでもよい。代表的な官能基としては、疎水性基（例えばカルボベンゾキシル、ダンシル、および、ｔ−ブチルオキシカルボニル基）、アセチル基、９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基、および、高分子キャリアー基（例えば脂質−脂肪酸結合体、ポリエチレングリコール、または、炭化水素）、例えばペプチド基などが挙げられる。
【０２２２】
他の実施形態において、特定のアポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状を、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルを減少させることによって改善することができ、これは、周知のアンチセンス、遺伝子「ノックアウト」、リボザイム、および／または、三重らせん方法と共にＴＲＡＩＬ遺伝子配列を用いて、ＴＲＡＩＬ遺伝子発現のレベルを減少させることによって改善することができる。ＴＲＡＩＬ遺伝子の活性、発現または合成を調節する能力（例えば血管新生関連疾患（例えばガン）の症状を改善する能力）を示し得る化合物の中でも、アンチセンス、リボザイム、および、三重らせん分子が挙げられる。このような分子は、障害のない、または、場合によっては突然変異体の標的遺伝子活性のいずれかを減少させる、または、阻害するように設計することができる。このような分子の生産および使用のための技術は、当業者周知である。
【０２２３】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質翻訳を妨害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンス法は、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計を含む。上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的遺伝子のｍＲＮＡの転写物に結合し、翻訳を妨害し得る。完全な相補性が好ましいが、必ずしも必要ではない。
【０２２４】
本発明で用いられるＲＮＡの一部に「相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズすることができ、安定なデュプレックスを形成するのに十分な相補性を有する配列を意味する；二本鎖アンチセンス核酸の場合、デュプレックスＤＮＡの１つの鎖を試験してもよいし、または、トリプレックス形成を分析してもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性と長さの程度両方に依存し得る。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、含まれる可能性のあるＲＮＡとの塩基ミスマッチがより多く生じ、それでも安定なデュプレックスが形成される可能性がある（または、場合によってはトリプレックス）。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するために、標準的な手順の使用によりミスマッチの許容できる程度を確認することができる。
【０２２５】
一実施形態において、ＴＲＡＩＬ遺伝子の非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス法で用いて、内因性ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。アンチセンス核酸は、少なくとも長さが６個のヌクレオチドであるものとし、好ましくは長さが６〜約５０個のヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、少なくとも２５個のヌクレオチド、または、少なくとも５０個のヌクレオ
チドである。
【０２２６】
標的配列の選択にかかわらず、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの遺伝子発現を阻害する能力を定量するために、インビトロでの研究が最初に行われることが好ましい。これらの研究は、アンチセンス遺伝子阻害と、オリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的作用とを区別するコントロールを利用することが好ましい。また、これらの研究で、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと、内部コントロールＲＮＡまたはタンパク質のレベルとを比較することが好ましい。さらに、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果と、コントロールオリゴヌクレオチドを用いて得られた結果とを比較することが想定される。コントロールオリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであること、および、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、単に標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを妨害するのに必要なアンチセンス配列とは違うことことが好ましい。
【０２２７】
上記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、キメラ混合物もしくは誘導体、または、それらの修飾された改変体、一本鎖または二本鎖が可能である。上記オリゴヌクレオチドは、塩基成分、糖成分またはリン酸主鎖で修飾することができ、例えば、分子安定性、ハイブリダイゼーション安定性などを改善することができる。上記オリゴヌクレオチドは、その他の付加された基を含んでもよく、このような基としては、例えば、ペプチド（例えば宿主細胞受容体をインビボで標的化するため）、または、細胞膜を通過する輸送を容易にする物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等，１９８９年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６，６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ等，１９８７年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，６４８〜６５２；ＰＣＴ公報番号ＷＯ８８／０９８１０，１９８８年１２月１５日公開を参照）、または、血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公報番号Ｗ０８９／１０１３４，１９８８年４月２５日に公開を参照）、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質（例えば、Ｋｒｏｌ等，１９８８年，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６，９５８〜９７６を参照）、または、挿入剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８年，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５，５３９〜５４９を参照）が挙げられる。この目的のために、上記オリゴヌクレオチドを、その他の分子に接合させてもよく、その他の分子としては、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションを開始させる架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーションを開始させる切断物質などが挙げられる。
【０２２８】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された塩基成分を含んでもよく、このような修飾された塩基成分は、これらに限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および、２，６−ジアミノプリンからなる群より選択される。
【０２２９】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの修飾された糖成分を含んでもよく、このような修飾された糖成分は、これらに限定されないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、および、ヘキソースからなる群より選択される。
【０２３０】
さらなる他の実施形態において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾されたリン酸主鎖を含み、このようなリン酸主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、および、ホルムアセタールまたはそれらの類似体からなる群より選択される。
【０２３１】
さらなる他の実施形態において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成しており、そのストランドは、通常のベータユニットとは反対に互いに平行に並んでいる（Ｇａｕｔｉｅｒ等，１９８７年，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５，６６２５〜６６４１）。上記オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ等，１９８７年，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５，６１３１〜６１４８）、または、キメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ等，１９８７年，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５，３２７〜３３０）である。
【０２３２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当業界既知の標準的な方法によって合成することができ、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーの使用（例えばバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ），アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）などから市販されている）によって合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎ等の方法（１９８８年，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６，３２０９）によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御多孔質ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ等，１９８８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．ＳＡ．８５，７４４８〜７４５１）などの使用によって製造することができる。
【０２３３】
標的遺伝子のコード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いることができるが、転写された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０２３４】
アンチセンス分子は、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に運搬されるものとする。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に運搬する多数の方法が開発されている；例えば、アンチセンス分子は、組織部位に直接的に注入させてもよいし、または、望ましい細胞を標的化するように設計された改変アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現された受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結させたアンチセンス）を、全身投与することができる。
【０２３５】
しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは、しばしば、困難である。それゆえに、好ましいアプローチでは、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置かれている組換えＤＮＡコンストラクトが利用される。このようなコンストラクトを被験体中で標的細胞をトランスフェクトするのに使用することによって、十分な量の一本鎖ＲＮＡが転写され、この一本鎖ＲＮＡは、内因性標的遺伝子の転写物と相補的な塩基対を形成し、それによって標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨害することができる。例えば細胞に摂取され、アンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、例えばベクターを、導入することができる。このようなベクターは、ベクターが転写されて望ましいアンチセンスＲＮＡを生産するのであれば、エピソームに残存していてもよいし、または、染色体に統合されてもよい。このようなベクターは、当業界で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって構築することができる。ベクターは、当業界既知のプラスミド、ウイルスなどが可能であり、哺乳動物細胞における複製および発現に用いられる。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞において作用することが当業界既知のあらゆるプロモーターによってなされる。このようなプロモーターは、誘導性でもよいし、構成的でもよい。このようなプロモーターとしては、これらに限定されないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１年，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０，３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ等，１９８０年，Ｃｅｌｌ  ２２，７８７〜７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ等，１９８１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，３９〜４２）など。あらゆるタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターが、組織部位に直接的に導入することができる組換えＤＮＡコンストラクトを製造するのに用いることができる。あるいは、選択的に望ましい組織に感染するウイルスベクターを用いることができ、この場合、投与は、その他の経路（例えば全身性）によって達成してもよい。
【０２３６】
また、標的遺伝子のｍＲＮＡの転写を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子も、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨害し、それによって標的遺伝子産物の発現を妨害するのに用いることができる。（例えば、ＰＣＴ国際特許公報ＷＯ９０／１１３６４，１９９０年１０月４日に公開；Ｓａｒｖｅｒ等，１９９０年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１２２２〜１２２５を参照）。
【０２３７】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的なＲＮＡ分子である。（総論として、Ｒｏｓｓｉ，１９９４年，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，４６９〜４７１を参照）。リボザイム作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼによる切断現象を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な１またはそれ以上の配列を含まなければならなず、さらに、ｍＲＮＡ切断に関与する周知の触媒配列を含まなければならない。この配列については、例えば、米国特許第５,０９３,２４６号を参照、これらは、参照によりその全体を本発明に加入させる。
【０２３８】
部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムは、標的遺伝子のｍＲＮＡを破壊するのに用いることができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成するフランキング領域によって指示された位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが、以下の２つの塩基からなる配列、５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生産は、当業界周知であり、以下でより詳細に説明されている：Ｍｙｅｒｓ，１９９５年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨパブリッシャーズ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ニューヨーク（特に図４の第８３３頁を参照）、および、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，１９８８年，Ｎａｔｕｒｅ，３３４，５８５〜５９１、これらは、参照によりその全体を本発明に加入させる。
【０２３９】
好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が、標的遺伝子のｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように作製され、すなわち、効率を増加させ、非機能的ｍＲＮＡの転写物が細胞内に蓄積することを最小限にすることができる。
【０２４０】
また、本発明のリボザイムとしては、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム」という）も挙げられ、例えばＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｎｎｏｐｈｉｌａに天然に存在するもの（ＩＶＳ、または、Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）およびＴｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよびｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓによってよく説明されているもの（Ｚａｕｇ等，１９８４年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，５７４〜５７８；ＺａｕｇおよびＣｅｃｈ，１９８６年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３１，４７０〜４７５；Ｚａｕｇ等，１９８６年，Ｎａｔｕｒｅ，３２４，４２９〜４３３；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．の、公開された国際特許出願番号ＷＯ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，１９８６年，Ｃｅｌｌ，４７，２０７〜２１６）である。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、８塩基対の活性部位を有し、これが標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、標的遺伝子中に存在する８塩基対の活性部位配列を標的化するＣｅｃｈ型リボザイムを包含する。
【０２４１】
アンチセンス法と動揺に、リボザイムは、改変されたオリゴヌクレオチド（例えば安定性、標的化の改良など）で構成することができ、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に運搬されるものとする。好ましい運搬方法は、トランスフェクトされた細胞が内因性標的遺伝子メッセージを破壊するのに十分な量のリボザイムを生産し、翻訳を阻害するように、強力な構成的なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下にリボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトを用いることを含む。アンチセンス分子と異なりリボザイムは触媒性であるため、効率に必要な細胞内濃度はより低い。
【０２４２】
また、標的化された相同組換えを用いて、標的遺伝子またはそのプロモーターの不活性化または「ノックアウト」によって、内因性標的遺伝子発現を減少させることもできる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ  ３１７，２３０〜２３４；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７年，Ｃｅｌｌ  ５１，５０３〜５１２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，１９８９年，Ｃｅｌｌ  ５，３１３〜３２１を参照；これらそれぞれ、参照によりその全体は本発明に加入させる）。例えば、内因性標的遺伝子（標的遺伝子のコード領域または調節領域のいずれか）と相同なＤＮＡでフランキングされた突然変異体、非機能的標的遺伝子（または全く関係のないＤＮＡ配列）を、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカー有りまたは無しで用いることができ、インビボで標的遺伝子を発現する細胞をトランスフェクトすることができる。標的化された相同組換えによるＤＮＡコンストラクトの挿入は、標的遺伝子の不活性化を引き起こす。このようなアプローチは、特に、不活性な標的遺伝子を含む動物の子孫を生じさせるのにＥＳ（胚幹）細胞への改変を用いることができる農芸分野で適切である（例えば、上記のＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７年、および、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９８９年を参照）。しかしながら、組換えＤＮＡコンストラクトが直接的に投与される、または、適切なウイルスベクターを用いてインビボにおいて必要な部位を標的化するという条件であれば、このアプローチをヒトでの使用に適合してもよい。
【０２４３】
あるいは、体内で標的細胞中の標的遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造が形成されるように、標的遺伝子の調節領域（すなわち標的遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的化することによって、内因性標的遺伝子発現を減少させることができる。（一般的に、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１年，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，６（６），５６９〜５８４；Ｈｅｉｅｎｅ等，１９９２年，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０，２７〜３６；および、Ｍａｈｅｒ，１９９２年，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２），８０７〜８１５を参照）。
【０２４４】
転写を阻害するための三重らせん形成で用いられる核酸分子は、一本鎖であり、デオキシヌクレオチドで構成されるものとする。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対形成の規則により三重らせん形成を促進するように設計されなければならず、一般的には、相当な大きさのプリンまたはピリミジンいずれかの伸張を、二本鎖の一方の鎖に存在させることが必要である。ヌクレオチド配列は、ピリミジンに基づくものであってもよく、それにより、得られた三重らせんの３本の連結した鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットを生じる可能性がある。ピリミジン−リッチ分子は、二本鎖の１つの鎖のプリン−リッチ領域に対する塩基相補性を、その鎖に対して平行な方向で提供する。加えて、プリン−リッチな核酸分子（例えば、Ｇ残基の伸張を含む核酸分子）を選択してもよい。これらの分子は、ＧＣ対がリッチなＤＮＡデュプレックスと三重らせんを形成することが可能であり、この場合、プリン残基の大半は、標的化された二本鎖の１つの鎖に存在し、トリプレックス中の３本の鎖にわたってＧＧＣトリプレットを生じる。
【０２４５】
あるいは、三重らせん形成を標的化する可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を形成することによって増加し得る。スイッチバック分子は、それらが、デュプレックスの第一の１本の鎖と塩基対を形成し、続いて他方の鎖と塩基対を形成するように、５’−３’、３’−５’のいずれかの形式で合成され、すなわち、相当な大きさのプリンまたはピリミジンいずれかの伸張をデュプレックスの１本の鎖に存在させる必要性を省くことができる。
【０２４６】
本発明で説明されるアンチセンス、リボザイム、および／または、三重らせん分子が突然変異体遺伝子発現を阻害するのに利用された場合、上記技術は、正常な標的遺伝子の対立遺伝子によって生産されたｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンス，リボザイム）（これらは、存在する正常な標的遺伝子産物の濃度が正常な表現型が必要とする濃度より低いという可能性がある）を効率的に減少させることができる、または、効率的に阻害することができる。このような場合において、標的遺伝子活性の実質的に正常なレベルが維持されることを確認するために、それゆえに、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子のポリペプチドをコードし、それを発現する核酸分子を、以下で説明されるような遺伝子治療方法によって、アンチセンス、リボザイムまたは三重らせん処理のいずれもが利用されている可能性のある配列を含まない細胞に導入することができる。あるいは、標的遺伝子が細胞外タンパク質をコードする場合、標的遺伝子活性の必要なレベルを維持するために、正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましい場合がある。
【０２４７】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および、三重らせん分子を、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関して上述したように、当業界既知のあらゆる方法によって製造することができる。これらの例としては、当業界周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成する技術（例えば固相ホスホラミダイト化学合成）が挙げられる。あるいは、ＲＮＡ分子は、インビトロおよびインビボでの、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の転写によって生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様なベクターに組み込んでもよい。あるいは、用いられるプロモーターに応じて構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡコンストラクトを、安定して細胞系に導入することができる。
【０２４８】
正常なＴＲＡＩＬ遺伝子発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルの増加に関しては、例えば、上述のＴＲＡＩＬ遺伝子核酸配列を、血管新生関連疾患（例えばガン）の治療に利用することができる。このような治療は、例えば、遺伝子置換治療の形態で施すことができる。特に、正常なＴＲＡＩＬ遺伝子の１またはそれ以上のコピー、または、正常なＴＲＡＩＬ遺伝子機能を示すＴＲＡＩＬ遺伝子産物の生産を指示するＴＲＡＩＬ遺伝子の一部を、ベクターを用いて被験体中の適切な細胞に挿入してもよく、このようなベクターとしては、これらに限定されないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、および、レトロウイルスベクターが挙げられ、加えて、細胞にＤＮＡを導入するその他の粒子、例えばリポソームも挙げられる。
【０２４９】
ＴＲＡＩＬ遺伝子は脳で発現される可能性があるので、このような遺伝子置換治療技術は、被験体中のこれらの細胞型にＴＲＡＩＬ遺伝子配列を運搬することができるものとする。従って、一実施形態において、当業者周知の技術（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公報番号Ｗ０８９／１０１３４を参照）を用いて、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列を、容易に血液脳関門を通過させ、その配列を脳中の細胞に運搬することを可能にする。血液脳関門を通過させることができる運搬に関しては、例えば上述したような  ウイルスベクターが好ましい。
【０２５０】
他の実施形態において、運搬のための技術は、このようなＴＲＡＩＬ遺伝子配列を、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列が発現され得る細胞部位へ直接投与することを含む。
【０２５１】
全体的なＴＲＡＩＬ遺伝子発現および／またはＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性のレベルを増加させるに利用することができるさらなる方法としては、適切なＴＲＡＩＬ発現細胞（好ましくは自家細胞）を、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状を改善するのに適した位置および数で被験体に導入することが挙げられる。このような細胞は、組換え細胞でもよいし、非組換え細胞でもよい。
【０２５２】
被験体において全体的なＴＲＡＩＬ遺伝子発現のレベルを増加させるための投与できる細胞の中でも、ＴＲＡＩＬ遺伝子を発現する正常な細胞（好ましくは肝細胞）が挙げられる。
【０２５３】
あるいは、細胞、好ましくは自家細胞は、ＴＲＡＩＬ遺伝子配列を発現するように操作することができ、次に、被験体に、アポトーシス関連疾患（例えばガン）の症状の回復に適した位置で導入してもよい。あるいは、障害のないＴＲＡＩＬ遺伝子を発現し、ＭＨＣが適合した個々の生物由来の細胞を利用することができ、例えば肝細胞が挙げられる。ＴＲＡＩＬ遺伝子配列の発現は、適切な遺伝子調節配列によって制御され、このような発現が必要な細胞型において発現を可能にする。このような遺伝子調節配列は当業者周知である。このような細胞ベースの遺伝子治療技術は当業者周知である（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎの米国特許第５,３９９,３４９号を参照）。
【０２５４】
投与される細胞が非自家細胞の場合、それらは、導入された細胞に対する宿主免疫反応が進行しないようにする周知の技術を用いて投与することができる。例えば、細胞をカプセル封入された形態で導入することができ、このような形態は、すぐに細胞外環境と成分を変換し得るが、導入された細胞は宿主免疫系によって認識されない。
【０２５５】
加えて、ＴＲＡＩＬ遺伝子産物活性を調節することができる化合物、例えば上述したような技術で同定された化合物は、当業者周知の標準的な技術を用いて投与することができる。投与される化合物が脳の細胞との相互作用に関与する場合、投与技術は、血液脳関門の通過を可能にする周知の技術を含むものとする。
【０２５６】
上記ポリペプチドの異常な活性に関連する疾患を治療する（予防的または治療的に）ために、本発明で説明されるスクリーニング分析によって同定された、本発明のポリペプチドの活性または発現に対して刺激または阻害作用を有する物質またはモジュレーターを個々の生物に投与することができる。このような治療と共に、個々の生物の薬理ゲノム学（すなわち、個々の遺伝子型と、その個々の外来化合物または薬剤に対する反応との関係の研究）を考慮してもよい。治療剤の代謝における差によって、薬理学的に活性な薬剤の用
量と血中濃度との関係が変化することによって深刻な毒性または治療の失敗を起こす可能性がある。従って、個々の生物の薬理ゲノム学によって、個々の生物の遺伝子型の考察に基づいた予防または治療的処置に有効な物質（例えば薬剤）の選択が可能になる。さらに、このような薬理ゲノム学を用いて、適切な投与量および治療計画を決定することができる。従って、個々の生物における本発明のポリペプチドの活性、本発明の核酸の発現、または、本発明の遺伝子の突然変異の内容を決定することによって、個々の生物の治療または予防的処置に適した物質を選択することができる。
【０２５７】
薬理ゲノム学は、改変された薬剤の性質や、影響を受けた個々の生物における異常な作用による、薬剤に対する反応における臨床的に顕著な遺伝的な変異を扱うものである。例えば、Ｌｉｎｄｅｒ（１９９７年）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４〜２６６を参照。一般的に、２タイプの遺伝薬理学的な条件を区別することができる。薬剤が体に作用する方法を変化させる一つの因子として伝えられた遺伝子学的条件を、「改変された薬剤の作用」という。体が薬剤に作用する方法を変化させる一つの因子として伝えられた遺伝子学的条件を、「改変された薬剤の代謝」という。これらの遺伝薬理学的な条件は、まれな欠損または多型のいずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素欠損症であり、主な臨床上の合併症は、酸化薬剤（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取、および、ファーバビーンズ（ｆａｖａ  ｂｅａｎｓ）の摂取の後の溶血である。
【０２５８】
説明のための実施形態として、薬剤を代謝する酵素の活性は、薬剤の作用の強度と持続期間両方の主要な決定要因である。薬剤を代謝する酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）、ならびに、チトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型を発見することにより、標準的で安全な薬剤用量を摂取した後に、ある種の被験体がなぜ予測された薬剤作用を示さないか、または、過剰な薬剤反応と深刻な毒性を示すかに関して説明が提供される。これらの多型は、集団において、代謝能が速い群（ＥＭ）と、代謝能が遅い群（ＰＭ）という２つの表現型で示される。ＰＭの罹患率は、異なる集団によって様々である。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、数種の突然変異がＰＭで同定されており、これらは全て機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を起こす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝能が遅い群は、薬剤を標準用量で摂取した場合、かなり高頻度で過剰な薬剤反応と副作用を起こす。代謝産物が活性な治療成分である場合、ＰＭは治療的な反応を示さないと考えられ、これは、そのＣＹＰ２Ｄ６が形成する代謝産物であるモルヒネが介在するコデインの鎮痛作用によって示される。その他の極端な例は、いわゆる代謝能が極端に速い群であり、これは、標準用量には反応しない。近年、極端に速い代謝の分子的な根拠は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものと同定された。
【０２５９】
従って、本発明のポリペプチドの活性、本ポリペプチドをコードする核酸の発現、または、個々の生物における本ポリペプチドをコードする遺伝子の突然変異の内容を決定することによって、個々の生物の治療または予防的処置に適した物質を選択することができる。加えて、遺伝薬理学的な研究を用いて、薬剤を代謝する酵素をコードする多型の対立遺伝子の遺伝子型解析を、個々の生物の薬剤に反応を示す表現型の同定に適用することができる。この知見を投与または薬剤の選択に適用される場合、それによって、本ポリペプチドの活性または発現モジュレーター（例えば代表的な本発明で説明されるスクリーニング分析のいずれかによって同定されたモジュレーター）で被験体を治療する際に、逆の反応または治療の失敗を回避することができ、従って、治療または予防効率を高めることができる。
【０２６０】
物質（例えば薬剤、化合物）の、本発明のポリペプチドの発現または活性に対する影響（例えば、異常な細胞増殖走化性および／または分化を調節するする能力）をモニターすることは、基礎的な薬剤スクリーニングに加えて、臨床試験にも適用することができる。例えば、本発明で説明するようなスクリーニング分析によって決定された物質の、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を増加させることにおける有効性は、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の減少を示す被験体の臨床試験でモニターが可能である。あるいは、スクリーニング分析によって決定された物質の、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性を減少させることにおける有効性は、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の増加を示す被験体の臨床試験でモニターが可能である。このような臨床試験において、本発明のポリペプチドの発現または活性、および、好ましくは、例えば細胞増殖に関する疾患に関与するその他のポリペプチドの発現または活性を、特定の細胞の免疫反応性のマーカーとして用いることができる。
【０２６１】
非限定的な例としては、本発明のポリペプチドの活性または発現（例えば本発明で説明されるスクリーニング分析で同定された）を調節する物質（例えば化合物、薬剤または小さい分子）での治療によって細胞中で調節される遺伝子（例えば本発明の遺伝子など）を、同定することができる。従って、例えば、臨床試験において、物質の細胞増殖に関する疾患に対する作用を研究するこために、細胞を単離し、ＲＮＡを製造し、上記疾患に関与する本発明の遺伝子およびその他の遺伝子の発現のレベルについて分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち遺伝子発現パターン）は、本発明で説明されるノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、またはあるいは、本発明で説明される方法のいずれかによって生産されたタンパク質の量を測定することによって、または、本発明の遺伝子またはその他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって定量することができる。この方法において、遺伝子発現パターンは、細胞の物質に対する生理学的反応の指標となるマーカーとして役立ち得る。従って、この反応の状態は、上記物質での個々の生物の治療の前、および、その最中の様々な時点で決定することができる。
【０２６２】
好ましい実施形態において、本発明は、物質（例えば、本発明で説明されるスクリーニング分析によって同定されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小さい分子、またはその他の薬剤候補）での被験体の治療の有効性をモニターする方法を提供し、本方法は、以下の工程を含む：（ｉ）上記物質の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得ること；（ｉｉ）投与前サンプルにおける本発明のポリペプチドまたは核酸のレベルを検出すること；（ｉｉｉ）被験体から１またはそれ以上の投与後サンプルを得ること；（ｉｖ）投与後サンプルにおいて本発明のポリペプチドまたは核酸のレベルを検出すること；（ｖ）投与前サンプルにおける本発明のポリペプチドまたは核酸のレベルと、投与後サンプルにおける本発明のポリペプチドまたは核酸のレベルとを比較すること；および、（ｖｉ）それに応じて、上記物質の被験体への投与を変更すること。例えば、検出されたレベルより高いレベルに本ポリペプチドの発現または活性を増加させるために、すなわち上記物質の有効性を増加させるために、上記物質の投与を増加させることが望ましい可能性がある。あるいは、検出されたレベルより低いレベルに本ポリペプチドの発現または活性を減少させるために、すなわち上記物質の有効性を減少させるために、上記物質の投与を減少させることが望ましい可能性がある。
【０２６３】
本発明の化合物は、活性成分を上記物質の哺乳動物の体内の作用部位に接触させるあらゆる手段によって、様々な血管新生関連疾患を阻害するように製剤化し、投与することができる。それらは、個々の治療上の活性成分として、または、治療上の活性成分を組み合わせて、医薬と併用することができる従来のあらゆる手段によって投与することができる。これらは単独で投与してもよいが、一般的には、選択された投与経路および標準的な製薬上の実施に基づき選択された医薬キャリアーと共に投与される。
【０２６４】
投与された化合物の投与量は、血管新生関連疾患の症状を改善させるのに十分な治療上有効な量であり、当然ながら既知のファクターに応じて変更可能であり、このようなファクターとしては、特定の活性成分の薬力学的特徴、および、その投与様式および経路；レシピエントの年齢、性別、健康および体重；症状の性質および程度；現行の治療の種類、治療頻度および望ましい作用が挙げられる。
【０２６５】
このような化合物の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物において、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死ぬ量）とＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための標準的な製薬的な手順によって決定することができる。毒性と治療的な作用との間の用量比は、治療係数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として示すことができる。大きい治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いてもよいが、感染していない細胞に対して起こり得るダメージを最小限にし、それによって副作用が減少するように、影響を受けた組織の部位にこのような化合物を標的化する運搬システムを設計するように注意すべきである。
【０２６６】
細胞培養物の分析と動物の研究から得られたデータは、ヒトに使用する範囲の投与量を製剤化するのに用いることができる。好ましくは、このような化合物の投与量は、ＥＤ５０を含み、毒性がわずかな、または毒性が無い循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態および利用された投与経路に応じて、この範囲内で変更してもよい。本発明の方法で用いられるあらゆる化合物について、治療上有効な用量は、まずは細胞培養物の分析から推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分に達する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲が達成される用量を製剤化してもよい。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより精密に決定するのに用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０２６７】
また、抗体には、特定の投与量を利用してもよい。一般的には、好ましい投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（一般的に１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）であり、抗体が脳で作用する場合、通常、適切な投与量は、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。抗体が部分的なヒト抗体または完全ヒト抗体である場合、一般的に、ヒトの体において他の抗体より長い半減期を有すると考えられる。従って、場合によっては部分的なヒト抗体および完全ヒト抗体は、より低い投与量が可能である。抗体をさらに安定化するために、さらなる改変を用いてもよい。例えば、抗体を安定化し、摂取および組織透過性（例えば脳への）を高めるために、脂質化を用いることができる。抗体の脂質化方法は、Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋ等によって説明されている（（１９９７年）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４：１９３）。
【０２６８】
タンパク質またはポリペプチドの治療上有効な量（すなわち有効な投与量）の範囲は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または、５〜６ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２６９】
その上、治療上有効な量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体での被験体の治療は、１回の治療でなされることが可能であり、または、好ましくは、一連の治療でなされることが可能である。好ましい例において、抗体、タンパク質またはポリペプチドでの被験体の治療は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で、１週あたり１回で、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらにより好ましくは約４、５または６週間で行われる。
【０２７０】
本発明は、発現または活性を調節する物質をさらに包含する。このような物質は、例えば、小さい分子が可能である。例えば、このような小さい分子としては、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量が約１０,０００グラム／モル未満の有機または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機および有機金属化合物など）、分子量が約５,０００グラム／モル未満の有機または無機化合物、分子量が約１,０００グラム／モル未満の有機または無機化合物、分子量が約５００グラム／モル未満の有機または無機化合物、ならびに、このような化合物の塩、エステル、およびその他の製薬上許容できる形態が挙げられる。
【０２７１】
当然ながら、物質が小さい分子である場合の適切な用量は、当業者（例えば医師）既知の多数のファクターに依存する。小さい分子の用量は、変更することができ、例えば、被験体または処理されるサンプルの性質、大きさおよび状態に応じて、必要であればさらに本組成物が投与される経路に応じて、および、専門家が本発明の核酸またはポリペプチドを有するその小さい分子に望む作用に応じる。代表的な用量は、被験体またはサンプルのｋｇ体重あたり、小さい分子の量のｍｇまたはμｇである（例えば約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または、約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）。
【０２７２】
本発明に従って使用される医薬組成物は、従来の方法で、１またはそれ以上の生理学的に許容できるキャリアーまたは添加剤を用いて製剤化することができる。
【０２７３】
従って、本化合物およびそれらの生理学的に許容できる塩および溶媒化合物は、吸入法または通気法による投与（口または鼻いずれかを通じて）用に、または、経口、口腔、非経口もしくは直腸投与用に製剤化することができる。
【０２７４】
経口投与用には、本医薬組成物は、例えば錠剤またはカプセルの形態をとることができ、これらは、製薬上許容できる添加剤を用いて従来の手段で製造され、このような添加剤としては、以下が挙げられる：結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロース  または  リン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えばポテトスターチまたはナトリウムスターチグリコレート）；または、湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は、当業界周知の方法でコーティングされていてもよい。経口投与用の液状製剤は、例えば溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとることができ、または、それらは、使用前に水またはその他の適切な媒体で溶解させるための乾燥製品として提供されてもよい。このような液状製剤は、製薬上許容できる添加剤を用いて従来の手段によって製造することができ、このような添加剤としては、以下が挙げられる：懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または食用硬化油）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは精留した植物油）；および、保存剤（例えばメチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、または、ソルビン酸）。このような製剤はまた、必要に応じて、緩衝塩、矯味矯臭薬、着色剤および甘味剤を含んでもよい。
【０２７５】
経口投与用の製剤は、活性化合物が制御されて放出されるように適切に製剤化することができる。
【０２７６】
口腔投与用に、本組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形態をとることができる。
【０２７７】
吸入法による投与用に、本発明に係る使用のための化合物は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガス）を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー仕様の形態でうまく運搬される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、定量を運搬するためのバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または注入器に使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチン製）は、本化合物の粉末ミックス、および、適切な粉末ベース（例えばラクトースまたはスターチ）を含ませて製剤化することができる。
【０２７８】
注射（例えばボーラス注射または連続的な注入）による非経口投与用に、本化合物を製剤化することができる。注射用の製剤は、例えばアンプルに、または、複数回投与用の容器に、単位投与形態で、添加された保存剤と共に提供することができる。本組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤のような成形剤を含んでもよい。あるいは、活性成分は、適切な媒体（例えば滅菌パイロジェンフリー水）との構成のために、使用前に粉末状であってもよい。一般的に、非経口用の溶液には、水、適切な油、生理食塩水、水性デキストロース（グルコース）および関連する糖溶液およびグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが、適切なキャリアーである。非経口投与用の溶液は、好ましくは、水溶性の活性成分の塩、適切な安定化剤、必要に応じて緩衝物質を含み得る。抗酸化剤（例えば硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸）は適切な安定化剤であり、単独または組み合わせのいずれかが可能である。また、クエン酸およびその塩、ならびに、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）も用いられる。加えて、非経口用の溶液は、保存剤を含んでもよく、このような保存剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、および、クロロブタノールが挙げられる。適切な医薬キャリアーは、この分野の標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに説明されている。
【０２７９】
本化合物はまた、例えば、坐剤または保留浣腸のような直腸用組成物に製剤化することができ、これらは、従来の坐剤ベース（例えばカカオバターまたはその他のグリセリド）を含む。
【０２８０】
これまでに述べられた製剤に加えて、本化合物はまた、デポ製剤として製剤化することができる。このような持続型製剤は、埋め込み（例えば皮下または筋肉内）、または、筋肉注射によって投与することができる。従って、本化合物は例えば、適切な高分子材料または疎水性材料（例えば許容できる油中のエマルジョンなど）、または、イオン交換樹脂と共に、または、わずかに可溶性の誘導体（例えばわずかに可溶性の塩）として、製剤化することができる。
【０２８１】
加えて、標準的な製剤方法を用いて、作用の持続期間を制御することができる。このような製剤は当業界周知であり、例えば制御放出製剤が挙げられ、適切な高分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミンを含み得る。高分子の濃度、同様に、取り込み方法は、放出を制御するために調節することができる。
【０２８２】
さらに、上記物質は、高分子材料（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）、または、エチレンビニルアセテートコポリマー）の粒子に取り込ませてもよい。取り込みに加えて、これらの物質はまた、マイクロカプセルに本化合物を封じ込めるのにも用いることができる。
【０２８３】
本組成物は、必要に応じて、パックまたはディスペンザー装置に提供されてもよく、これらは、活性成分を含む単位投与形態の１またはそれ以上を含んでもよい。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔で構成されてもよい（例えばブリスターパック）。パックまたはディスペンザー装置には、投与のための説明書が添付されていてもよい。
【０２８４】
本発明の化合物の投与のための有用な製薬の投与形態は、以下のように説明できる：
カプセル：カプセルは、標準的な２ピースのハードゼラチンカプセルに、望ましいの量の粉末化した活性成分、ラクトース（１７５ｍｇ）、タルク（２４ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（６ｍｇ）それぞれを充填することによって製造される。
【０２８５】
ソフトゼラチンカプセル：ダイズ油中の活性成分の混合物を製造し、容積形ポンプ手段によってゼラチンに注入され、望ましいの量の活性成分を含むソフトゼラチンカプセルを形成する。次に、カプセルを洗浄し、乾燥する。
【０２８６】
錠剤：錠剤は、従来の手順によって投与量単位が、望ましいの量の活性成分となるように製造される。コロイド状二酸化ケイ素（０．２ｍｇ）、ステアリン酸マグネシウム（５ｍｇ）、微結晶性セルロース（２７５ｍｇ）、コーンスターチ（１１ｍｇ）およびラクトース（９８．８ｍｇ）。美味性を増加させる、または、吸収を遅らせるために、適切なコーティングを適用してもよい。
【０２８７】
注射用：注射による投与に適切な非経口用組成物は、１０容量％のプロピレングリコールおよび水中で、１．５重量％の活性成分を撹拌することによって製造される。この溶液を塩化ナトリウムで等張にし、滅菌する。
【０２８８】
懸濁液：経口投与用の水性懸濁液は、各５ミリリットルに、細粒化した活性成分（１００ｍｇ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（２００ｍｇ）、安息香酸ナトリウム（５ｍｇ）、ソルビトール溶液Ｕ．Ｓ．Ｐ．（１．０グラム）およびバニリン（０．０２５ミリメートル）が含まれるように製造する。
【０２８９】
遺伝子治療用の投与：必要に応じて、遺伝子治療用ベクターは、固体、半固体、液体またはガス状で、それらそれぞれの投与経路に応じた通常の方法で、例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射液、吸入剤およびエアロゾルのような製剤に製剤化することができる。当業界既知の手段を利用して、標的の臓器に到達するまでに本組成物が放出および吸収されることを妨害する、または、本組成物の持続放出を確実にすることができる。本発明の組成物の作用を無効にしない製薬上許容できる形態が用いられるべきである。製薬の投与形態において、本組成物を、単独で、または、適切に結合させて、同様に、その他の医薬的に活性な化合物と組み合わせて用いることができる。
【０２９０】
従って、本発明の医薬組成物は、様々な経路で動物の体の様々な部位に運搬され、特定の作用を達成することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９１年），上記の；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３  ９（２），３１  １Ａ（１９９１ａ）；上記のＪａｆｆｅ等；上記のＢｅｒｋｎｅｒを参照）。当業者には当然であるが、２以上の経路を投与に用いることができるが、特定の経路が、その他の経路より高い即効性と有効な反応を提供する可能性がある。局所または全身への運搬は、体腔への製剤の適用または点滴注入、エアロゾルの吸入法または通気法などの投与によって、または、筋肉内に、静脈内、腹膜内、皮下、皮内などの非経口の導入によって、同様に、局所投与によって達成することができる。
【０２９１】
本発明の組成物は、単位投与形態で提供することができ、ここで、各投与量単位、例えば茶さじ一杯、錠剤、溶液または坐剤は、予め決められた量の本組成物を、単独で、または、適切に他の活性物質と組み合わせて含む。本発明で用いられる用語「単位投与形態」は、ヒトおよび動物の被験体の単位投与量として適切な、物理的に別々の単位を意味し、各単位は、望ましい作用を生じるのに十分な量で計算された、予め決められた量の本発明の組成物を、単独で、または、他の活性物質と組み合わせて、必要に応じて製薬上許容できる希釈剤、キャリアーまたは媒体と共に含む。本発明の単位投与形態の詳細は、特定の宿主において達成され得る特定の作用、および、本医薬組成物に関連する特定の薬力学によって様々である。
【０２９２】
従って、本発明はまた、治療用遺伝子を宿主にトランスファーする方法を提供し、本方法は、上述の投与経路または当業者既知の特定の用途に適したその代わりの経路のいずれか用いて、本発明のベクターを投与すること（好ましくは組成物の一部として）を含む。本組成物の「有効量」は、宿主において望ましい作用が生じるような量であり、これは、当業者既知のいくつかの評価項目を用いてモニターが可能である。本発明に従って、宿主細胞にベクターの有効な遺伝子をトランスファーすることは、治療作用（例えば治療されている特定の病気に関連するいくつかの症状緩和）についてモニターが可能であり、または、さらに、トランスファーした遺伝子または宿主中での遺伝子の発現の証拠によってモニターが可能である（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を、配列解析、ノーザンもしくはサザンハイブリダイゼーション、または、宿主細胞中で核酸を検出するための転写分析と共に用いて、または、免疫ブロット分析、抗体介在検出、ｍＲＮＡまたはタンパク質の半減期の研究、または、トランスファーした核酸によってコードされた、または、このようなトランスファーによってレベルまたは機能に影響を受けたタンパク質またはポリペプチドを検出するのに特化した分析を用いて）。
【０２９３】
本発明で説明されるこれらの方法は、決して包括的ではなく、平均的な熟練した技術者であれば特定の用途に適したさらなる方法を理解することができる。その上、本組成物の有効量は、望ましい作用を奏することがわかっている化合物から類推してさらに近接させることができる。
【０２９４】
その上、実際の用量およびスケジュールは、本組成物が、その他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかに応じて、または、薬物動態学、薬剤の性質および代謝における個々の差に応じて変更することができる。同様に、インビトロでの用途において、利用された特定の細胞系に応じて量を変更することができる（例えば、細胞表面に存在するアデノウイルス受容体の数、または、その細胞系において複製する遺伝子のトランスファーに用いられる特定のベクターの能力に基づいて）。その上、細胞あたり添加されるベクターの量は、ベクターに挿入された治療用遺伝子の長さおよび安定性、同様に配列の性質に応じて変化する可能性があり、これは特に、経験的に決定する必要があるパラメーターであり、本発明の方法に固有ではないファクターに応じて改変することができる（例えば合成に関連するコスト）。当業者であれば、特定の状況に従って必要なあらゆる調節を簡単に行うことができる。
【０２９５】
インビトロジェンのキットを用いて単離された本発明に関連するオリジナルのクローンを、２００３年４月１５日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），１０８０１ユニバーシティ・ブラバード（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ），マナサス，バージニア州２０１１０〜２２０９に寄託した。これらのクローンは、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＩＲ１株ＩＮＶ−１（プラスミドｐＵｃａＴＲＡＩＬを含む）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５１３７）、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＩＲ１株ＩＮＶ−２（プラスミドｐ１４ｆｅＴＲＡＩＬを含む）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５１３８）、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＩＲ１株ＩＮＶ−３（プラスミドｐ６８ｃａＴＲＡＩＬｓｈを含む）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５１３９）、および、Ｅ．ｃｏｌｉのＰＩＲ１株ＩＮＶ−４（プラスミドｐＳｆｅＴＲＡＩＬｓｈを含む）（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５１４０）。ＴＲＡＩＬｓｈは、可溶性型ＴＲＡＩＬである。
【０２９６】
以下の実施例は、例として提供されるものであり、本発明の範囲をいかなる方式に限定するものではない。
【実施例】
【０２９７】
実施例１
ＴＲＡＩＬ遺伝子の同定およびクローニング
この章に示す実施例において、アポトーシス関連疾患（例えばガン）に関与する新規のイヌの遺伝子（本発明においてＴＲＡＩＬと呼ばれる）を同定する研究について説明する。
【０２９８】
１．イヌおよびネコの細胞系からのＲＮＡの単離
ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション，ロックビル，メリーランド州）から、以下の３種の細胞系を得た：ＣＲＬ−６１３０（Ｆｃ２８．Ｌｕ，ネコの肺）、ＣＲＬ−６２５２（ＥＣＦ５０．ＨＴ，イヌの心臓）、ＣＲＬ−６５６９（Ｆｃ２．Ｌｕ，ネコの肺）。上記３種の細胞系のコンフルエントの細胞を、Ｔ７５フラスコ中に溶解させ、ＳｖトータルＲＮＡ単離システム（Ｓｖ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を製造元（プロメガ社，カリフォルニア州）からの説明書に従って用いてトータルＲＮＡを精製した。ＲＮＡ（１０〜４５μｇ）を単離し、Ｈ2Ｏ（１００μｌ）に懸濁した。
【０２９９】
２．これら細胞系におけるＴＲＡＩＬのＲＴ−ＰＣＲ増幅および検出
ヒト由来のコンセンサス配列（寄託番号Ｕ３７５１８）、および、マウス由来のコンセンサス配列（寄託番号Ｕ３７５２２）に基づいて、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡの内部領域を増幅するように、２対のプライマーを設計した。それぞれの対の５’プライマーは以下の通り：Ｎ４０６６Ｅ０９−ＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＭＡＧＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号１）、これは、ヒトＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド＃３８２〜４０８、同様に、マウスＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド＃３５４〜３８０に対応する。セット１の３’プライマーは：Ｎ４０６６Ｅ０６−ＴＣＣＴＧＡＡＡＴＣＧＲＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＡ（配列番号２）であり、これは、ヒトＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド＃６３４〜６６９に対応する。セット２の３’プライマーは：Ｎ４０６６Ｅ１１−ＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＹＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴ（配列番号３）であり、これは、ヒトＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド＃８４１〜８６６に対応する。これらのオリゴプライマーを増幅反応に用いた。アマシャム・ファルマシア（カタログ番号２７−９２６７−０１，イリノイ州）製のレディー−トゥー−ゴー（Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ）ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。トータルＲＮＡ（１μｇ）を、第一鎖のプライマーとしてｐｄ（Ｎ）6（１μｇ）と共に、ＲＴ−ＰＣＲビーズに加えた。逆転写反応を４２℃で３０分間行った。次に、この反応液を９５℃で５分間インキュベートし、逆転写酵素を不活性化し、テンプレートを完全に変性させた。ＰＣＲプログラムは、以下の通りである：９５℃で５分間保持、続いて、９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、６８℃で１分間、および、７４℃で７分間の伸長を３０サイクル。ＰＣＲ産物を、電気泳動によって分析した。
【０３００】
３種のイヌおよびネコの細胞系（ＣＲＬ−６１３０，Ｆｃ２８．Ｌｕ，ネコの肺；ＣＲＬ−６２５２ＥＣＦ５０．ＨＴ，イヌの心臓；ＣＲＬ−６５６９Ｆｃ２．Ｌｕ，ネコの肺）から、トータルＲＮＡを単離した。これら細胞系におけるＴＲＡＩＬの遺伝子発現を試験するために、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬの内部領域を増幅する２対のプライマーをＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。１対のプライマーから５０４ｂｐのＰＣＲフラグメントが生産され、他方のプライマーからは２８８ｂｐのフラグメントが生産された。結果によれば、これらの３種の細胞系においてＴＲＡＩＬが豊富に発現されたことが明白に示された（図１）。
【０３０１】
３．イヌおよびネコのＴＲＡＩＬフラグメントのＲＡＣＥ−ＰＣＲ
３種の内部ＴＲＡＩＬオリゴプライマーがＰＣＲ−ＲＡＣＥでうまく用いられた。それらを以下に示す：Ｎ４０６６Ｅ０６−ＴＣＣＴＧＡＡＡＴＣＧＲＡＡＧＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＴＡ（配列番号２，上記を参照）、Ｎ４０６６Ｅ０７−ＴＡＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＴＡＣＴＴＹＣＧＡＴＴＴＣＡＧＧＡ（配列番号４）、これは、ヒトＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド＃６３４〜６６９、同様に、マウスＴＲＡＩＬ  ｃＤＮＡのヌクレオチド＃６０５〜６４０に対応する。Ｎ４０６６Ｅ０９−ＡＣＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＴＴＣＭＡＧＡＡＡＡＧＣＡ（配列番号１，上記を参照）。クロンテック・ラボラトリーズ（カタログ番号Ｋ１８１１−１，パロアルト，カリフォルニア州）製のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットを用いて、ＰＣＲ−ＲＡＣＥ反応を行った。第一の鎖のｃＤＮＡ合成を行い、それぞれ５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡと、３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡを製造した。トータルのイヌおよびネコのＲＮＡ（上記を参照）（１μｇ）を、５’−ＣＤＳプライマーと共に混合し、同様に、５’−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡについてはＳＭＡＲＴ  ＩＩオリゴと共に混合した。３’−ＲＡＣＥ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡについては、ＲＮＡサンプルを、３’−ＣＤＳプライマーと混合した。この反応液を７０℃で２分間インキュベートし、次に、氷上で２分間冷却した。第一の鎖の緩衝液、ＤＴＴ、ｄＮＴＰミックスおよびＭＭＬＶ逆転写酵素をこの混合物に加え、４２℃で１．５時間インキュベートした。次に、トリシン−ＥＤＴＡ緩衝液（１００μｌ）を加え、−２０℃で保存した。
【０３０２】
ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を、クロンテックの説明書に従って行い、水と、アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２  ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰミックス、および、アドバンテージ２ポリメラーゼミックスとを混合することによってＰＣＲマスターミックスを製造した。５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（上記を参照）、１０×ＵＰＭ、遺伝子特異的プライマー（プライマーＥ０７またはＥ０９，上記を参照）、および、ＰＣＲマスターミックスを混合することによって、５’ＲＡＣＥサンプルを得た。３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（上記を参照）、１０×ＵＰＭ、遺伝子特異的プライマー（プライマーＥ０６，上記を参照）、および、ＰＣＲマスターミックスを混合することによって、３’ＲＡＣＥサンプルを得た。タッチダウン（Ｔｏｕｃｈ  Ｄｏｗｎ）ＰＣＲプログラムは、以下の通りである：９４℃で５秒間、および、７２℃で３分間を５サイクル、続いて、９４℃で５秒間、および、７０℃で１０秒間、および、７２℃で３分間を５サイクル、さらに続いて、９４℃で５秒間、６５℃で１０秒間、および、７２℃で３分間を３５サイクル。ＰＣＲ産物を電気泳動によって分析した。可能性のあるＲＡＣＥ  ＤＮＡバンドを、サザン解析によってさらに分析した。シュライヒャー＆シュエル社（Schleicher & Schuell Inc．）のターボブロッター（Turboblotter）を用いてトランスファーを行った。ベーリンガー・マンハイム社（Boeringer Mannheim Inc．）のDIG キットを用いて、ヒトＴＲＡＩＬのＤＮＡプローブを作製した。
【０３０３】
ヒト脾臓のマラソン（ｍａｒａｔｈｏｎ）−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（クロンテック社）（４．１μｌ）を、プライマーＮ４０６６Ｅ１２（５’−ＧＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＴＧ，配列番号５）、および、Ｎ４０６６Ｆ０２（５’−ＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＧＴＴＡ，配列番号６）、ＰＣＲ緩衝液、ＤＩＧミックス、ならびに、酵素ミックスと共に混合した。以下のようにＰＣＲを行った：９４℃で３分間保持、続いて、９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で１．５分間および７４℃で７分間の伸長を３０サイクル。ＤＩＧ標識されたＰＣＲ産物を、電気泳動によって分析した。
【０３０４】
プレハイブリダイゼーションを４２℃で３時間行った。ＤＩＧ標識されたＴＲＡＩＬ  ＰＣＲ  ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを４２℃で一晩行った。ブロットを、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む緩衝液で２回５分間洗浄し、続いて、０．１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む緩衝液で６５℃で２回洗浄した。
【０３０５】
ブロッキング溶液（１００ｍｌ）で３０分間メンブレンをインキュベートし、続いて、抗体溶液（抗ＤＩＧ−ＡＰ，７５ｍＵ／ｍｌ）（２０ｍｌ）で３０分間インキュベートすることによってＥＣＬ検出を行った。次に、ブロットを、洗浄緩衝液（マレイン酸緩衝液＋０．３％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０，ｖ／ｖ）で１５分間、２回洗浄した。メンブレンを検出緩衝液（２０ｍｌ）で２〜５分間平衡化した後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（１：１００希釈で）をメンブレンに加え、Ｘ線フィルムに露光した。
【０３０６】
４．ＴＲＡＩＬのＲＡＣＥ  ＤＮＡのクローニング
製造元の説明書に従って、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物を真核性のＴＡクローニングベクターｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）にクローニングし、それぞれｐＵｎｉ−ｃａＴｒａｉｌ−Ｅ０６、ｐＵｎｉ−ｃａＴｒａｉｌ−Ｅ０７、および、ｐＵｎｉ−ｃａＴｒａｉｌ−Ｅ０９として、イヌのクローン用に設計した。ネコのクローン用に、それらを、それぞれｐＵｎｉ−ｆｅＴｒａｉｌ−Ｅ０６、ｐＵｎｉ−ｆｅＴｒａｉｌ−Ｅ０７、および、ｐＵｎｉ−ｆｅＴｒａｉｌ−Ｅ０９として設計した。予測サイズ（ＲＡＣＥプライマーＥ０６については０．７ｋｂ，ＲＡＣＥプライマーＥ０７については１．１ｋｂ、および、ＲＡＣＥプライマーＥ０９については０．７ｋｂ）のインサートを含む４種の独立したクローンを配列解析した（アドバンスト・ジェネティック・アナリシス・センター（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｎｔｅｒ），セントポール，ミネソタ州）。その配列をアセンブルし、ＤＮＡＳｔａｒ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳｔａｒ  Ｉｎｃ．），マディソン，ウィスコンシン州）を用いて分析した。
【０３０７】
ヒトＴＲＡＩＬとマウスＴＲＡＩＬとのＤＮＡ配列相同性が低いため、内部プライマーを設計し、イヌおよびネコのｃＤＮＡを得るためのＲＡＣＥ技術を用いた。イヌおよびネコのＴＲＡＩＬの一部をコードするｃＤＮＡを、ＲＡＣＥ−ＰＣＲによってイヌおよびネコから増幅した。イヌのＴＲＡＩＬのヌクレオチド配列を、図２（配列番号２０）に示し、予測されたアミノ酸配列を、図３（配列番号２１）に示す。ネコのＴＲＡＩＬのヌクレオチド配列を、図４（配列番号２２）に示し、予測されたアミノ酸配列を、図５（配列番号２３）に示す。図２において、イヌのＴＲＡＩＬタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに対応する領域を太字で示し、図４において、ネコのＴＲＡＩＬタンパク質のコード配列に対応する領域を太字で示す。図６Ａ〜６Ｄは、全て既知のＴＲＡＩＬのアミノ酸配列のアライメントを示し、イヌのＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスのＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ８０．３％および６３．５％である。ネコのＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスのＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ８３．２％および６５．３％である。イヌのＴＲＡＩＬとネコのＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、９２．９％である。図７Ａ〜７Ｂは、全て既知の可溶性ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列のアライメントを示し、イヌの可溶性ＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスの可溶性ＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ７６．９％および６６．９％である。ネコの可溶性ＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスの可溶性ＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ８２．２％および６９．９％である。イヌの可溶性ＴＲＡＩＬとネコの可溶性ＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、９２．４％である。
【０３０８】
５．完全長イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのクローニング
完全長イヌおよびネコの遺伝子を以下のように得た。ネコのＴＲＡＩＬに関しては、５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡ（上記を参照）、および、３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡをそれぞれ、ＲＣＲ反応のテンプレートとして用いた。用いられたプライマーを以下に示す：Ｎ７９７４Ｃ０１−ＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＡＣ（配列番号７）（上流プライマー用）、および、Ｎ７９７４Ｃ０２−ＣＣＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号８）（下流プライマー用）。用いられたＰＣＲプログラムは、以下の通りである：９５℃で５分間テンプレートを変性させ、続いて、９４℃で３０秒間、および、５５℃で１分間、および、６８℃で１．５分間を３０サイクル、続いて、７４℃で７分間。ＰＣＲ産物を電気泳動によって分析した。可能性のある完全長ＴＲＡＩＬのＤＮＡをサザン解析によって上述したようにさらに分析した。ＤＩＧ標識されたヒトＴＲＡＩＬのＤＮＡを、プローブとして用いた。
【０３０９】
ＴＲＡＩＬプローブとハイブリダイズしたＰＣＲ産物を電気泳動で再度分析し、長さが約０．９ｋｂのＤＮＡバンドを切り出し、アガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて単離した。次に、精製されたバンドを、製造元の説明書に従って、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）にクローニングした。予測サイズ（０．９ｋｂ）のインサートを含む２２種の独立したクローンを配列解析した（アドバンスト・ジェネティック・アナリシス・センター，セントポール，ミネソタ州）。唯一クローン（＃１４）だけが、ネコのＲＡＣＥ配列と比較して完全に正しい配列を有していた。これを、ｐＵｎｉ−ｆｅＴＲＡＩＬ−＃１４として設計した。
【０３１０】
イヌのＴＲＡＩＬのために、イヌの心臓のトータルＲＮＡ（ＣＲＬ６２５２）を、オリゴｐｄＮ６およびＡＭＶ逆転写酵素の存在下での、第一の鎖のｃＤＮＡ合成反応に用いた。この反応を、室温で１０分間、続いて４２℃で５０分間、続いて７０℃で１０分間行った。次に、上記のＤＮＡを、ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いた。用いられたプライマーを以下に示す：Ｎ７４２９Ａ１２−ＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴＡＣＧＣＧＧＧＡＧＣＡＣＧＧＡＣＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＡＧ（配列番号９）（上流プライマー用）、および、Ｎ９２９４Ｇ０７−ＣＣＡＡＧＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＣＡＧＣ（配列番号１０）（下流プライマー用）。Ｐｆｘポリメラーゼ（ＧＩＢＣＯ−ライフテクノロジーズ）をＰＣＲ反応に用いた。用いられたＰＣＲプログラムは、以下の通りである：９５℃で５分間テンプレートを変性させ、続いて、９４℃で３０秒間、および、５５℃で１分間、および、６８℃で１．５分間を３０サイクル、続いて、７４℃で７分間。ＰＣＲ産物を、電気泳動によって分析した。約１．２ｋｂの豊富なバンドが、肉眼ではっきり観察された。このバンドを、プローブとしてＤＩＧ標識されたヒトＴＲＡＩＬのＤＮＡを用いてサザン解析によってさらに確認した。
【０３１１】
次に、上記のＰＣＲ産物を、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）に、製造元の説明書に従ってクローニングした。予測サイズ（１．２ｋｂ）のインサートを含む２０種の独立したクローンを配列解析した（アドバンスト・ジェネティック・アナリシス・センター，セントポール，ミネソタ州）。これら２０種のクローンのうち１４種（＃１、２、３、４、５、８、１０、１１、１４、１７、１８、２２、２４および２５）が、イヌのＲＡＣＥ配列と比較して完全に正しい配列を有していた。これを、ｐＵｎｉ−ｃａＴＲＡＩＬ−＃１等として設計した。
【０３１２】
それゆえに、テンプレートとして第一の鎖のｃＤＮＡを用いて、完全長イヌおよびネコのｃＤＮＡクローンをＰＣＲ反応によって得た。イヌのＴＲＡＩＬのために、イヌの心臓のトータルＲＮＡ（ＣＲＬ６２５２）を、オリゴｐｄＮ６およびＡＭＶ逆転写酵素の存在下での、第一の鎖のｃＤＮＡ合成反応に用いた。ネコのＴＲＡＩＬのために、５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡ（ネコの肺，上記を参照）、および、３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡをそれぞれＲＣＲ反応のテンプレートとして用いた。用いられたプライマーは、ＴＲＡＩＬのコード領域のちょうど外側に存在する。イヌおよびネコの完全長クローンはいずれも、制限解析によって分析され、配列解析によって確認された。
【０３１３】
６．イヌおよびネコの可溶性ＴＲＡＩＬのクローニング。
この実験において、ヒト可溶性ＴＲＡＩＬ遺伝子を、ポジティブコントロールとして得た。アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）ＨＦ（正確度が高いＤＮＡポリメラーゼ，インビトロジェン社）を用いたＰＣＲ反応において、ヒト脾臓のマラソン−ｒｅａｄｙ  ＤＮＡを用いた。ヒト可溶性ＴＲＡＩＬ用の上流プライマーとして、以下が用いられた：Ｎ７９７４Ｃ０６−ＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴ（配列番号１１）。下流プライマー（ベクター中でＶ５タグおよびＨｉｓタグとの融合を起こす）：Ｒ４４２８Ｃ１０−ＴＴＣＣＡＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号１２）。下流プライマー（Ｖ５−Ｈｉｓタグが生じない）：Ｒ４４２８Ｃ１１−ＴＴＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号１３）、イヌの可溶性ＴＲＡＩＬ用の上流プライマー：Ｎ８０７１Ｈ１１−ＡＴＴＣＣＴＴＡＣＡＴＧＧＴＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧ（配列番号１４）。下流プライマー（ベクター中でＶ５タグおよびＨｉｓタグとの融合を起こす）：Ｒ１８８６Ｂ０８−ＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＧＣＧＴＡＴＧＴＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡ（配列番号１５）。下流プライマー（Ｖ５−Ｈｉｓタグが生じない）：Ｒ４４２９Ａ０９−ＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＧＣＧＴＡＴＴＴＡＧＣＣＧ（配列番号１６）。ネコの可溶性ＴＲＡＩＬ用の上流プライマー：Ｎ８０７１  Ｈ１０−ＴＡＣＡＴＧＧＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＴＡＧＣＡ（配列番号１７）。下流プライマー（ベクター中でＶ５タグおよびＨｉｓタグとの融合を起こす）：Ｒ１８８６Ｂ１０−ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号１８）。下流プライマー（Ｖ５−Ｈｉｓタグが生じない）：Ｒ４４２９Ａ１１−ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣ（配列番号１９）。イヌおよびネコ両方の可溶性ＴＲＡＩＬ遺伝子のために、５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡ、および、３’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ＤＮＡ（上記を参照）を、ＲＣＲ反応のテンプレートとして用いた。全てのＰＣＲ反応において、用いられたＤＮＡポリメラーゼは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ（インビトロジェン社，カールスバッド，カリフォルニア州）であり、ＰＣＲ条件は以下の通り：９５℃で５分間テンプレートを変性させ、続いて、９４℃で３０秒間、および、５５℃で１分間、および、６８℃で１．５分間を３０サイクル、続いて、７４℃で７分間。ＰＣＲ産物を、電気泳動によって分析した。次に、上記のＰＣＲ産物を、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）に、製造元の説明書に従ってクローニングした。予測サイズ（０．６ｋｂ）のインサートを含む約６種の独立したクローンを配列解析し（アドバンスト・ジェネティック・アナリシス・センター，セントポール，ミネソタ州）、それら全ては、イヌのＲＡＣＥ配列と比較して完全に正しい配列を有していた。
【０３１４】
ヒトＴＲＡＩＬタンパク質の可溶性の改変型（遺伝子の細胞外の部分を含む）は、ガン細胞に対してアポトーシス誘導活性、すなわち腫瘍傷害活性を有することが実証された。このタンパク質形態は、細菌中でうまく生産することができる。イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子可溶性の改変型をクローニングするために、ヒトタンパク質配列との配列相同性に基づいてプライマーを設計し、第一の鎖のｃＤＮＡを、テンプレートとして用いた。各遺伝子（ヒト、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ）の細胞外部分を、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター（インビトロジェン，カールスバッド，カリフォルニア州）にクローニングした。２種のクローンの改変型を設計した：１つは、タンパク質がそのＣ末端でベクターのＶ５−Ｈｉｓタグと融合している；他方は、タグを有さない天然タンパク質のみを含む。正しいサイズのインサートを含む各コンストラクトの６種の
独立したクローン（トータルで６種）を送付し、配列解析によって確認した。それらは、以下のように設計される：ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ。
【０３１５】
実施例２
可溶性ＴＲＡＩＬ遺伝子の発現ベクターへのクローニング
この章で示される実施例において、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬを様々な発現ベクターにサブクローニングすることに関する研究を説明する。
【０３１６】
１．ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬの哺乳動物発現ベクターへのサブクローニング
ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター中のイヌおよびネコの可溶性ＴＲＡＩＬ遺伝子をＰＣＲ増幅することによって、可溶性部分イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子をｐＤｉｓｐｌａｙベクターにサブクローニングした：５’プライマー（イヌのＴＲＡＩＬ遺伝子用）、Ｓ２６３３Ｂ１０−ＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧ（配列番号３２）；５’プライマー（ネコのＴＲＡＩＬ遺伝子用）、Ｓ２６３３Ｂ０９−ＧＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号３３）、３’プライマー、
【化１】
2006506985.tif 000002
クローニングを促進するために、２つの制限酵素部位ＢｇｌＩＩ（５’プライマー）、および、ＰｓｔＩ（３’プライマー）を、下線で示したようにプライマー配列に組み込んだ。インサートを、ベクターに存在するシグナルペプチドおよびＨＡエピトープ配列にインフレームで融合した。翻訳を停止させるために、ＴＲＡＩＬの停止コドンＴＡＡ（太字で示される）を３’プライマーに含ませ、それゆえに、最終的なプラスミドコンストラクト（ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＨＡ−ｃａ−ＴＲＡＩＬ、および、ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＨＡ−ｆｅ−ＴＲＡＩＬ）において、インサート下流のベクターによりコードされたＰＤＧＦＲ膜貫通ドメインは翻訳されなかった。
【０３１７】
２．イヌのＴＲＡＩＬ（ＨＡタグを含まない）のサブクローニング
以下のプライマーを用いたｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクターにおけるイヌおよびネコの可溶性ＴＲＡＩＬ遺伝子のＰＣＲ増幅によって、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬをｐＳｅｃＴａｇ２Ｂベクターにサブクローニングした：５’プライマー（イヌのＴＲＡＩＬ遺伝子用）、Ｓ２６３３Ｂ０６−ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴＣＡＧ（配列番号３５）；５’プライマー（ネコのＴＲＡＩＬ遺伝子用）、Ｓ２６３３Ｂ０８−ＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧ（配列番号３６）、３’プライマー、
【化２】
2006506985.tif 000003
クローニングを促進するために、２つの制限酵素部位ＫｐｎＩ（５’プライマー）、および、ＸｈｏＩ（３’プライマー）を、下線で示したようにプライマー配列に組み込んだ。インサートを、ベクターに存在するシグナルペプチド配列にインフレームで融合した。翻訳を停止させるために、ＴＲＡＩＬの停止コドンＴＡＡ（太字で示される）を３’プライマーに含ませた。最終的なプラスミドコンストラクトを、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｃａ−ＴＲＡＩＬ、および、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｆｅ−ＴＲＡＩＬとして設計した。
【０３１８】
３．細菌の発現ベクター、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｅへの可溶性ヒト、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのクローニング
Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で、インビトロジェンの製造元の説明書に従って、ｐＵｎｉ−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター：ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬにおけるヒト、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子を、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−Ｅに組換えした。新しい細菌の発現プラスミドにおいて、ＴＲＡＩＬ遺伝子は細菌のプロモーターｐＢＡＤ（アラビノース誘導性）下に置かれた。全てのタンパク質のＮ末端でチオ−タンパク質（チオレドキシン）が融合した。組換え反応を３７℃で３０分間行い、６５℃、５分間で反応を止めた。正しい制限解析パターンを有する各コンストラクトの３種の独立したクローンの配列を確認した。これらのプラスミドは、以下のように設計される：ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ；ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ。
【０３１９】
４．細菌の発現ベクター、ｐＣＲＴ７−Ｅへの可溶性ヒト、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのクローニング
ｐＵｎｉ−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター：ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬにおけるヒト、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子を、ｐＣＲＴ７−Ｅで、Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で、インビトロジェンの製造元の説明書に従って組換えした。新しい細菌の発現プラスミドにおいて、ＴＲＡＩＬ遺伝子は、細菌のプロモーターｐＴ７（ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）誘導性）下に置かれた。組換え反応を３７℃で３０分間行い、６５℃、５分間で反応を止めた。正しい制限解析パターンを有する各コンストラクトの３種の独立したクローンの配列を確認した。これらのプラスミドは、以下のように設計される：ｐＣＲＴ７−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ。
【０３２０】
５．細菌の発現ベクター、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ  Ａへのイヌおよびネコの可溶性ＴＲＡＩＬのクローニング
ｐＵｎｉ−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯクローニングベクター（ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＵｎｉ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、および、ｐＵｎｉ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ）におけるイヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子を、ＰＣＲ反応におけるＤＮＡテンプレートとして用いた。新しい細菌の発現プラスミドにおいて、ＴＲＡＩＬ遺伝子は、細菌のプロモーターｐＢＡＤ（アラビノース誘導性）に置かれた。天然ＴＲＡＩＬタンパク質のみが発現され、Ｎ末端におけるチオタンパク質の融合は起こらない。ポリメラーゼとしてＰｆｕを用いてＰＣＲ反応を以下のように行った：９４℃で５分間テンプレートを変性させ、続いて、９４℃で４５秒間、および、５２℃で４５秒間、および、７２℃で１．５分間を３０サイクル、続いて、７２℃で１０分間。用いられたプライマー：イヌのＴＲＡＩＬ上流：４３１１４−００１−ＧＡＡＴＴＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＧＧＴＴＣＴ（配列番号３８）。イヌのＴＲＡＩＬの下流プライマー（Ｖ，５−Ｈｉｓタグの融合を生じない）：４３１１４−００３−ＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号３９）。イヌのＴＲＡＩＬの下流プライマー（Ｖ５−Ｈｉｓタグの融合を生じる）：４３１１４−００４−ＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧ（配列番号４０）。ネコのＴＲＡＩＬ上流：４３１１４−００２−ＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴ（配列番号４１）。ネコのＴＲＡＩＬ下流プライマー（Ｖ５−Ｈｉｓタグの融合を生じない）：４３１１４−００５−ＣＴＣＣＣＧＡＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＣＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＧ（配列番号４２）。ネコのＴＲＡＩＬ下流プライマー（Ｖ５−Ｈｉｓタグの融合を生じる）：４３１１４−００６−ＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＴＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号４３）。電気泳動解析でＰＣＲバンドを視覚的した後、ＰＣＲ反応液をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットで精製した。次に、精製されたＤＮＡをＮｃｏＩおよびＰｓｔＩで３７℃で３時間消化した。次に、電気泳動ゲルから、キアゲンのゲル抽出キットを用いて消化されたＰＣＲのＤＮＡフラグメントを切り出し、精製した。次に、ゲルから精製されたＰＣＲフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼの存在下で、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで二重に消化したプラスミドベクターｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓにライゲーションした。ライゲーション反応を室温で１時間行った。正しい制限解析パターンを有する各コンストラクトの３種の独立したクローンの配列を確認した。これらのプラスミドは、以下のように設計された：ｐＢＡＤ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、および、ｐＢＡＤ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ。
【０３２１】
実施例３
哺乳動物細胞におけるＴＲＡＩＬ遺伝子の発現
この章で示される実施例において、哺乳動物細胞で発現された新規のイヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子を発現させ、分析する方法を同定することに関する研究を説明する。
【０３２２】
１．ＴＲＡＩＬのトランスフェクション
リポフェクトアミンプラス（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ゲイザースバーグ，メリーランド州，カタログ番号１０９６４−０１３）を用いて、６ウェルプレートで成長したヒト２９３細胞を、イヌまたはネコのＴＲＡＩＬをコードするプラスミド（２．５μｇ）でトランスフェクトした。
【０３２３】
２．免疫ブロット分析によるＴＲＡＩＬの検出
プラスミドｐＤｉｓｐｌａｙ−ＨＡ−ｃａ−ＴＲＡＩＬ、および、ｐＤｉｓｐｌａｙ−ＨＡ−ｆｅ−ＴＲＡＩＬでトランスフェクションして２日後に、ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプル緩衝液（ＮＯＶＥＸ，サンディエゴ，カリフォルニア州）で溶解させることによって細胞を回収した。培養上清を、遠心分離によって３０００ｒｐｍで１５分間回収した。ＭＥＳランニング緩衝液を用いた１０％ビス−トリスゲルでタンパク質を分離し、ニトロセルロースメンブレン（ＮＯＶＥＸ，サンディエゴ，カリフォルニア州）にトランスファーした。免疫ブロット分析のために、ＨＡエピトープに対するＨＡ抗体、または、抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ，カタログ番号ＡＦ３７５）を１：１０００に希釈し、ブロットを１．５時間インキュベートした。アルカリホスファターゼに連結した抗マウスＩｇＧ（１：１０００，ベーリンガー・マンハイム，インディアナポリス，インディアナ州）と３０分間インキュベートした後、結合した抗体を、ホスファターゼ基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ，ゲイザースバーグ，メリーランド州）を用いて検出した。細胞溶解産物と培養上清との両方からトランスフェクトされたＴＲＡＩＬの発現がはっきりと検出された（図８）。
【０３２４】
イヌおよびネコのＴＲＡＩＬをコードするｃＤＮＡも哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２へサブクローニングし、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｃａ−ＴＲＡＩＬ、および、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｆｅ−ＴＲＡＩＬを作製した。これらのプラスミドでヒト２９３細胞をトランスフェクトした。解析のために、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。ＴＲＡＩＬの発現をウェスタン免疫ブロット分析で研究した。ＴＲＡＩＬ発現は、細胞溶解産物からは検出されたが、培養上清からは検出されなかった（データ示さず）。
【０３２５】
様々な抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体を、それらのイヌまたはネコのＴＲＡＩＬタンパク質とのクロス反応性について試験した。表１に試験結果を示す。ＡＦ３７５，抗ヒトＴＲＡＩＬヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄシステムズ）は、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質の両方との最も強い反応性を示す。シグマ製およびアップステート・バイオテクノロジー製の抗体は、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬの両方に関して明らかなクロス反応性を示さなかった。
【０３２６】
３．細胞成長阻害に関するＭＴＴ分析
この分析のために、細胞増殖分析キット（ロシュ，カタログ番号１  ４５６  ００７）を用いた。Ｕ９３７またはその他のあらゆるタイプの細胞を２,０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、細胞を完全成長培地に再懸濁し、細胞数を２×１０5細胞／ｍｌに調整した。９６−ウェルプレートに、細胞（１×１０4）（５０μｌ）、および、上清（５０μｌ）またはアポトーシス誘導物質（例えばＴＲＡＩＬ）を含むその他の溶液を用いた。３７℃で２４または４８時間インキュベートした後、ＭＴＴ溶液（１０μｌ）を各ウェルに加え、ＣＯ2インキュベーターで４時間プレートをインキュベートした。次に、ＭＴＴ溶媒（１００μｌ）を加えた。３７℃のインキュベーターにプレートを一晩放置し、ＭＴＴ結晶を完全に溶解させた。次に、プレートを、５７０ｎｍおよび６９０ｎｍ（バックグラウンド）で、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。
【０３２７】
ＴＲＡＩＬの１つの重要な特徴は、特異的にアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞の細胞成長を阻害する能力である。Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、トランスフェクトされた２９３細胞の調整培地から生産されたＴＲＡＩＬタンパク質の存在または非存在下で成長させた。増殖速度を、通常の成長培地で処理されたコントロール細胞に対して正規化した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトされた細胞からの調整培地を用いて、その他のコントロール実験を行った。図９Ａに、２つの独立した実験から得られた結果をまとめた。ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬの添加により、Ｕ９３７細胞の細胞成長がコントロールの細胞成長の３５％を越えて阻害された。ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬで観察された阻害活性は、ヒトの市販のＴＲＡＩＬタンパク質（アップステート・テクノロジーズ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），コントロールの４０％のレベル）での阻害活性に同等であった。
【０３２８】
４．アポトーシスに関する細胞死検出ＥＬＩＳＡプラス（ＥＬＩＳＡ  Ｐｌｕｓ）分析
上記分析は、ＤＮＡおよびヒストンそれぞれに対して向けられたマウスモノクローナル抗体を用いた定量的サンドイッチ酵素免疫分析原理に基づく。この分析により、細胞溶解産物の細胞質画分におけるモノ−およびオリゴヌクレオソームを特異的に決定することができる。この分析には、ロシュのキット（カタログ番号１  ７７４  ４２５）を用いた。４８−ウェルプレートにおいて、Ｕ９３７またはその他のあらゆるタイプの細胞（２×１０4）（０．１ｍｌ）、および、組織培養上清、またはアポトーシス誘導物質（例えばＴＲＡＩＬ）を含むその他の溶液（０．１ｍｌ）をこの分析のために用いた。３７℃で２４または４８時間インキュベートした後、細胞を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に、細胞ペレットを、溶解緩衝液（２００μｌ）に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。次に、細胞溶解産物を２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、インキュベート緩衝液で１：１０に希釈した。希釈した溶解産物（２０μｌ）を、コーティングされたプレート（キットからのＭＴＰ）に加え、免疫試薬（８０μｌ）を各ウェルに加えた。次に、ＭＴＰを粘着性のカバーホイルで多い、穏かに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。次に、この溶液を軽くたたきながら徹底的に除去し、その後、インキュベート緩衝液（２５０μｌ）で３回リンスした。ＡＢＴＳ溶液（１００μｌ）を加え、プレート振盪器で２５０ｒｐｍで１５分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーで４０５ｎｍおよび４９０ｎｍ（バックグラウンド）で読み取った。
【０３２９】
Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、トランスフェクトされた２９３細胞の調整培地から生産されたＴＲＡＩＬタンパク質の存在または非存在下で成長させた。この分析で、アポトーシスにより誘導された細胞死を測定した。通常の成長培地を用いて１回のコントロール実験を行った。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトされた細胞からの調整培地を用いて、その他のコントロール実験を行った。図９Ｂに、２つの独立した実験から得られた結果をまとめた。ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬの添加により、アポトーシス特異的なＵ９３７細胞の細胞死が、それぞれコントロールの細胞死の２．５および４倍誘導された。ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬで観察された阻害活性は、ヒトの市販のＴＲＡＩＬタンパク質での阻害活性に同等であった（アップステート・テクノロジーズ，コントロールの７倍）。
【０３３０】
５．アネキシンＶアポトーシス分析
ＡｐｏＳｃｒｅｅｎアネキシンＶアポトーシスキット（カタログ番号１００１０−０２，サザン・バイオテクノロジー・アソシエイツ社（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．））をこの分析に用いた。アネキシンＶは、細胞膜中のホスファチジルセリン（ＰＳ）位置の変化を検出する。非アポトーシス細胞において、ほとんどのホスファチジルセリン分子は、細胞質膜の内部層に存在する。アポトーシスを誘導した後、ＰＳは、膜の外部層へ再分布される。ＰＳの転位はさらなるアポトーシス現象の前に起こるため、アポトーシスの初期検出を可能にする。分析には、６−ウェルプレートにおいて、Ｕ９３７細胞（２×１０4）（１ｍｌ）またはその他のあらゆるタイプの細胞、および、上清またはアポトーシス誘導物質（例えばＴＲＡＩＬ）を含むその他の溶液（１ｍｌ）を用いた。４８時間インキュベートした後、細胞を冷ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（２ｍｌ）で洗浄し、冷１×結合緩衝液（１００μｌ）に再懸濁した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（１０μｌ）を各チューブに加え、チューブを穏かにボルテックスで混合し、その後、暗所で４℃で１５分間インキュベートした。冷１×結合緩衝液（２００μｌ）を各チューブに加え、さらにＰＩ（１０μｌ）を各チューブに加えた。次に、フローサイトメトリーで染色を分析した。
【０３３１】
Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、トランスフェクトされた２９３細胞の調整培地から生産されたＴＲＡＩＬタンパク質の存在または非存在下で成長させた。この分析において、調整培地によって誘導されたＵ９３７細胞のアポトーシスを測定した。通常の成長培地を用いて１回のコントロール実験を行った。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトされた細胞からの調整培地を用いて、その他のコントロール実験を行った。図９Ｃに、２つの独立した実験から得られた結果をまとめた。ＧＦＰでトランスフェクトされた細胞からの培地および調整培地では、バックグラウンドのアポトーシスが１５〜２０％誘導された一方で、ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬの添加により、Ｕ９３７細胞のアポトーシスが４０％誘導された。ＨＡタグを有するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬで観察されたアポトーシスにより誘導された活性は、ヒトの市販のＴＲＡＩＬタンパク質（アップステート・テクノロジーズ，４５％のアポトーシス）での活性と同等であった。
【０３３２】
実施例４
細菌細胞におけるＰＢＡＤ−チオプロモーター下でのＴＲＡＩＬ遺伝子の発現
この章で示される実施例において、細菌細胞で発現された、新規のイヌのＴＲＡＩＬ、同様に、ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子を発現させ、分析する方法を同定することに関する研究を説明する。
【０３３３】
１．細菌におけるｐＢＡＤ−チオプロモーター下の可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の発現
細菌の発現プラスミド、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｔｈｉｏ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬを、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン，カリフォルニア州）に形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬブロス（Ｌ５０Ｋａｎブロス）（４ｍｌ）に植え付けたシングルコロニーを３７℃の振盪器で一晩成長させた。この一晩の培養液（０．１ｍｌ）を新しいＬ５０Ｋａｎブロス（４ｍｌ）に植え付け、３７℃で２時間振盪した。この時点で、アラビノースを３つの異なる濃度で各培養液に加えた：０．２％、０．０２％および０．００２％。培養液を３７℃で４時間以上振盪した後、各培養液（１ｍｌ）を遠心分離し、細菌のペレットを、１×サンプル緩衝液（１００μｌ）に７０℃で１０分間溶解させた。これらの溶解産物サンプル（１５μｌ）を、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、および、７％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した。
【０３３４】
全てのアラビノース濃度（図１０Ａ〜１０Ｂ）で、６種全てのコンストラクト［ヒト（タグを有する、および、有さない）；イヌ（タグを有する、および、有さない）、ならびに、ネコ（タグを有する、および、有さない）］に関してＴＲＡＩＬ−チオタンパク質の発現の導入が極めてはっきり観察された。抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体（カタログ番号ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ，データ示さず）、同様に、抗Ｖ５抗体（カタログ番号４６−０７０８，インビトロジェン、データ示さず）を用いたウェスタン免疫ブロット分析で、これらのＴＲＡＩＬ−チオタンパク質の同一性をさらに確認した。
【０３３５】
２．細菌におけるｐＢＡＤ-チオプロモーター下の可溶性ＴＲＡＩＬ-チオタンパク質の溶解性
細菌溶解産物をドライアイスで凍結させ、３７℃の水槽で融解させることを２回行い、続いて、２０％デューティサイクル、出力コントロール３で超音波破砕（ブランソン・ソニフィアー（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ）２５０）を行うことによって、発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性を試験した。次に、全溶解産物を１２,０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、不溶性物（すなわちペレット（Ｐ））から可溶性画分（Ｓ）を分離した。両方の画分を、タンパク質サンプル緩衝液と混合した。等量の両方の画分を、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，カリフォルニア州）にローディングし、０．２５％ブリリアントブルーＲで染色した。５０％超のＴＲＡＩＬ−チオタンパク質が不溶性画分に存在していたが、顕著なの量のＴＲＡＩＬ−チオが可溶性画分に存在していた（図１０Ｃ〜１０Ｅ）。
【０３３６】
３．ｐＢＡＤ−チオプロモーター下で発現されたＴＲＡＩＬ−チオタンパク質の精製
ｐＢＡＤ−チオプロモーター下でヒトまたはイヌのＴＲＡＩＬタンパク質を発現する細菌培養液（３００ｍｌ）を遠心分離し、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）のＥｍｕｌｓｉ  Ｆｌｅｘ−Ｃ５機械溶解装置を用いて細胞ペレットを溶解緩衝液（３０ｍｌ）に溶解させた。溶解産物を１０,０００ｒｐｍで２０分間、次に再び１８,０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清（２５ｍｌ）を、製造元の説明書に従って（ノヴァジェン）、予め湿らせたＨｉｓ−バンドクイック９００カートリッジにローディングした。最初の流出液をカラムに再ローディングし、ＴＲＡＩＬタンパク質のカラムへの結合をさらに高めた。続いて２回洗浄した：１回目は、１×結合緩衝液（２０ｍｌ）（５ｍＭイミダゾール，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．９および０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）、２回目は、０．５×洗浄緩衝液（１５ｍｌ）（３０ｍＭイミダゾール，０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．９および０．１％トリトンＸ−１００）で洗浄した。溶出緩衝液（４ｍｌ）（１Ｍイミダゾール，０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．９）をカラムに加え、８個の画分（０．５ｍｌ／チューブ）を回収した。
【０３３７】
各画分（６μｌ）を、１０％ビス−トリスゲルにローディングし、０．２５％ブリリアントブルーＲで染色した。画分３および４において、ヒトおよびイヌ両方のＴＲＡＩＬ−チオタンパク質が肉眼ではっきり観察された（図１１Ａ〜１１Ｂ）。画分の４サンプル（ｈｕ−Ｅ３、ｈｕ−Ｅ４、ｃａ−Ｅ３およびｃａＥ２＋Ｅ４）を体積１０ｍｌに増量し、１×ＰＢＳ（２リットル）に対して４℃で一晩透析した。用いられた透析装置は、スライド−Ａ−ライザーカセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）（７，０００ＭＷＣＯ，３〜１２ｍｌ，ＰＩＥＲＣＥ，ロックフォード，イリノイ州）である。最終的な透析したタンパク質サンプルを、最終濃度０．１ｍＭのＤＴＴに加え、−２０℃で保存した。
【０３３８】
４．アネキシンＶ分析における細菌発現ＴＲＡＩＬ−チオによるヒト腫瘍細胞のアポトーシスの誘導
Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、上述のように半精製されたＴＲＡＩＬ−チオタンパク質の存在または非存在下で成長させた。この分析において、これらタンパク質によって誘導されたヒト腫瘍細胞Ｕ９３７のアポトーシスを測定した。ネガティブコントロールＰＢＳはほとんどいかなるバックグラウンドアポトーシスも誘導しなかった一方で、イヌのおよびヒト両方のＴＲＡＩＬ−チオにより誘導されたＵ９３７細胞のアポトーシスは、約２０〜３０％であった（図１２）。この実験において、ヒトの市販のＴＲＡＩＬタンパク質（アップステート・テクノロジーズ）のアポトーシスを誘導する活性は、極めて強かった（上記８５％）。
【０３３９】
実施例５
細菌細胞におけるＴ７プロモーター下でのＴＲＡＩＬ遺伝子の発現
この章で示される実施例において、細菌細胞で発現された新規のネコおよびイヌのＴＲＡＩＬ遺伝子を発現させ、分析する方法を同定することに関する研究を説明する。
【０３４０】
１．細菌におけるＴ７プロモーター下の可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の発現
細菌の発現プラスミド、ｐＣＲＴ７−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−ｓｈ−ｈｕＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、ｐＣＲＴ７−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬを、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ２１細胞（インビトロジェン，カリフォルニア州）に形質転換した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬブロス（Ｌ５０Ｋａｎ３４Ｃｍブロス）（４ｍｌ）にシングルコロニーを植え付け、３７℃の振盪器で一晩成長させた。これらの一晩の培養液（３．２ｍｌ）を新しいＬ５０ｋａｎ３４Ｃｍブロス（１５０ｍｌ）に植え付け、３０℃で３時間振盪した。この時点で、ＩＰＴＧ溶液を最終濃度１ｍＭになるように各培養液に加えた。この培養液を３０℃で２．５時間以上振盪した後、各培養液（１ｍｌ）を遠心分離し、細菌のペレットを、１×サンプル緩衝液（１００μｌ）に７０℃で１０分間溶解させた。これらの溶解産物サンプル（１５μｌ）を、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、および、７％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した。
【０３４１】
ブリリアントブルーＲで染色したゲルで分析したところ、６種全てのコンストラクト［ヒト（タグを有する、および、有さない）；イヌ（タグを有する、および、有さない）、ならびに、ネコ（タグを有する、および、有さない）］に関して、ＩＰＴＧの存在下でＴＲＡＩＬタンパク質発現の誘導ははっきり観られなかった（データは示さず）。同じサンプルをさらに、ウェスタン免疫ブロット分析で、抗Ｖ５（インビトロジェン）および抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体（ＡＦ３７５，Ｒ＆Ｄシステムズ）をプローブとして用いて分析した。ＩＰＴＧの存在下で、ネコおよびヒトのＴＲＡＩＬタンパク質発現のわずかな誘導が観られた（図１３Ａおよび１３Ｂ）。ポジティブコントロールでさえも、ＩＰＴＧでＣＡＴ発現がほんのわずか高められた。数種の独立したクローンで何回か試みたが、イヌのＴＲＡＩＬタンパク質（Ｖ５−Ｈｉｓタグを有する、または、タグを有さない）は発現されなかった。これら２種のイヌのＴＲＡＩＬコンストラクトで配列エラーは発見されなかった。
【０３４２】
２．細菌におけるｐＴ７プロモーター下の可溶性ＴＲＡＩＬ−タンパク質の溶解性
細菌培養液（３リットル）を遠心分離し、アンダーソンのＥｍｕｌｓｉ  Ｆｌｅｘ−Ｃ５機械溶解装置を用いて細胞ペレットを溶解緩衝液（３００ｍｌ）に溶解させた。溶解産物を９,０００ｒｐｍで３０分間（第一ペレット）、続いて、再び１９,０００ｒｐｍで９０分間（第二ペレット）遠心分離した。次に、上清を、０．１Ｍトリス（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換Ｑファストフローカラムにローディングした。次に、流出液を、３Ｋ  ＭＷＣＯの透析バッグで５０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ６．８）に対して透析し、続いて１９,０００ｒｐｍで９０分間遠心分離し（第三ペレット）、０．２２μｍフィルターに通過させた。次に、上記の上清（５０ｍｌ）を、５０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ６．５）で平衡化した陽イオン交換Ｓ−セファロースカラム（Ｈｉ  ＴｒａｐTM  ＳＰ  ＨＰ，アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にローディングした。カラムを５０ｍＭ  ＮａＰＯ4（５ｍｌ，ｐＨ６．５）で洗浄し、５０ｍＭ  ＰＯ4（ｐＨ６．５）＋１Ｍ  ＮａＣｌ（８ｍｌ）で溶出させた。全てのサンプルを、ＳＤＳタンパク質サンプル緩衝液と混合し、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，カリフォルニア州）にローディングし、これを次に、０．２５％ブリリアントブルーＲで染色するか、または、ウェスタン解析を行った。
【０３４３】
Ｔ７プロモーターから発現されたＴＲＡＩＬの溶解性は極めて低いようであり、ＴＲＡＩＬタンパク質の大半が、溶解産物ペレット（すなわち不溶性画分）に存在していた（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０３４４】
実施例６
細菌細胞におけるｐＢＡＤプロモーター下でのＴＲＡＩＬ遺伝子の発現
この章で示される実施例において、細菌細胞で発現された新規のイヌおよびネコのＴＲＡＩＬ遺伝子を発現させ、分析する方法を同定することに関する研究を説明する。
【０３４５】
１．細菌におけるｐＢＡＤプロモーター下の可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の発現
細菌の発現プラスミド、ｐＢＡＤ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−ｓｈ−ｃａＴＲＡＩＬ、ｐＢＡＤ−Ｖ５Ｈｉｓ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬ、および、ｐＢＡＤ−ｓｈ−ｆｅＴＲＡＩＬを、Ｅ．ｃｏｌｉのＴＯＰ１０細胞（インビトロジェン，カリフォルニア州）に形質転換した。シングルコロニーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬブロス（Ｌ１００Ａｍｐブロス）（４ｍｌ）に植え付け、３７℃の振盪器で一晩成長させた。これらの一晩の培養液（０．１５ｍｌ）を新しいＬ１００Ａｍｐブロス（４ｍｌ）に植え付け、３７℃で２時間振盪した。この時点で、アラビノースを最終濃度０．０２％になるように加えた。培養液を３７℃で４時間以上振盪した後、各培養液（０．５ｍｌ）を遠心分離し、細菌のペレットを１×サンプル緩衝液（１５０μｌ）に７０℃で１０分間溶解させた。これらの溶解産物サンプル（１２μｌ）を、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，ＮｕＰＡＧＥ１．０ｍｍ×１５ウェル，ＮＰ０３０３）にローディングし、４０％（ｖ／ｖ）メタノール、および、７％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．２５％（ｗ／ｖ）ブリリアントブルーＲで染色した。
【０３４６】
ネコのコンストラクト（タグを有する、および、有さない）に関してＴＲＡＩＬタンパク質発現の誘導が極めてはっきり観られた；イヌのＴＲＡＩＬタンパク質発現のレベルは比較的低かった（図１５Ａ）。抗ヒトＴＲＡＩＬ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ，図１５Ｂ）、同様に、抗Ｖ５抗体（インビトロジェン，図１５Ｃ）を用いてウェスタン免疫ブロット分析において、イヌのＴＲＡＩＬタンパク質の発現が肉眼ではっきり観察された。
【０３４７】
２．細菌におけるｐＢＡＤプロモーター下の可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性
細菌培養液を３０℃または３７℃のいずれかで成長させ、細菌溶解産物をドライアイスで凍結させ、３７℃の水槽で融解させることを２回行い、続いて、２０％デューティサイクル、出力コントロール３で５分間超音波破砕（ブランソン・ソニフィアー２５０）することによって、発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性を試験した。次に、全溶解産物を１２,０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、不溶性物から可溶性画分を分離した。両方の画分を、タンパク質サンプル緩衝液と混合した。同量の両方の画分を、１０％ビス−トリスゲル（インビトロジェン，カリフォルニア州）にローディングし、０．２５％ブリリアントブルーＲで染色し、または、抗ＴＬＡＩＬ抗体を用いたウェスタン免疫ブロットで分析した。３０℃または３７℃のいずれにおいても大半のＴＲＡＩＬタンパク質が可溶性画分に存在していた（図１６Ａおよび１６Ｂ）。その上、可溶性ＴＲＡＩＬタンパク質のレベルは、３０℃より３７℃のほうが豊富であった。
【０３４８】
３．ｐＢＡＤプロモーター下で発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の精製
ｐＢＡＤプロモーター下でイヌまたはネコのＴＲＡＩＬタンパク質を発現する細菌培養液（７ｍｌ）を遠心分離し、細胞ペレットを溶解緩衝液（４ｍｌ）に再懸濁し、続いて、ドライアイスで凍結させ、３７℃の水槽で融解させることを２回行い、２０％デューティサイクル、出力コントロール３で５分間超音波破砕した（ブランソン・ソニフィアー２５０）。溶解産物を１２,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次に、上清を、製造元の説明書に従って（ノヴァジェン）、予め湿らせたＨｉｓ−バンドクイック９００カートリッジにローディングした。最初の流出液をカラムに再ローディングし、ＴＲＡＩＬタンパク質のカラムへの結合をさらに高めた。続いて２回洗浄した：１回目は、１×結合緩衝液（２０ｍｌ）（５ｍＭイミダゾール，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．９および０．１％トリトンＸ−１００）、２回目は、０．５×洗浄緩衝液（１５ｍｌ）（３０ｍＭイミダゾール，０．２５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．９および０．１％トリトンＸ−１００）で洗浄した。溶出緩衝液（４ｍｌ）（１Ｍイミダゾール，０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．９）をカラムに加え、８個の画分（０．５ｍｌ／チューブ）を回収した。
【０３４９】
各画分（６μｌ）を、１０％ビス−トリスゲルにローディングし、シルバー・エクスプレス・ステイニングで染色した（インビトロジェン，パネルＩ、または、抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いたウェスタン免疫ブロットでの分析，パネルＩＩ）。イヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質（Ｃ末端にＶ５−Ｈｉｓタグを有する）に関しては、画分２、３および４で溶出したＴＲＡＩＬが肉眼ではっきり観察された（図１７Ｂおよび１７Ｄ）。しかしながら、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬ（いかなるタグも有さない）に関しては、タンパク質は、溶出画分１〜８をカバーする極めて広いピークを示した（図１７Ａおよび１７Ｃ）。さらに、イヌおよびネコ両方のＴＲＡＩＬタンパク質（いかなるタグも有さない）に関しては、相当量のＴＲＡＩＬタンパク質を０．５×洗浄緩衝液で洗浄して除去した（パネル図１７Ａおよび１７ＣのレーンＷ２）。画分をあわせてプールした：イヌのＴＲＡＩＬ（Ｖ５−Ｈｉｓタグを含まない）（Ｅ２〜６）；イヌのＴＲＡＩＬ（Ｖ５−ｈｉｓタグを含む）（Ｅ２〜７）；ネコのＴＲＡＩＬ（Ｖ５−Ｈｉｓタグを含まない）（Ｅ１〜８）；ネコのＴＲＡＩＬ（Ｖ５−Ｈｉｓタグを有する）（Ｅ２〜８）。各サンプルを体積１０ｍｌに増量し、１×ＰＢＳ（４リットル）に対して４℃で一晩透析した。用いられた透析装置は、スライド−Ａ−ライザーカセット（７,０００ＭＷＣＯ，３〜１２ｍｌ，ＰＩＥＲＣＥ，ロックフォード，イリノイ州）である。最終的な透析したタンパク質サンプルを、最終濃度０．１ｍＭのＤＴＴに加え、−２０℃で保存した。
【０３５０】
４．ＭＴＴ分析における、細菌によって発現されたＴＲＡＩＬによるヒト腫瘍細胞の成長阻害
Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を、上述の細菌から発現され精製されたＴＲＡＩＬタンパク質の存在または非存在下で成長させた。増殖速度を、通常の成長培地で処理されたコントロール細胞に対して正規化した。その他のコントロール実験をＰＢＳ緩衝液を用いて行った。スタウロスポリン（０．４μＭ）、および、市販のヒトＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）の両方をポジティブコントロールとして同時に分析した。この分析において、哺乳動物発現イヌおよびネコのＴＲＡＩＬの上清、同様に、ベクターでトランスフェクトされた上清も用いられた。この実験において、５種の細菌の精製サンプルを分析した。Ｓ５は細菌のカラムの画分（ＴＲＡＩＬを含まない）であり、ネガティブコントロールとして役立つ。Ｓ６は、Ｈｉｓ−バンドクイック９００カートリッジカラムからの精製されたネコのＴＲＡＩＬである。Ｓ７は、精製されたネコのＴＲＡＩＬ（Ｖ５−Ｈｉｓタグを有する）である。Ｓ８は、半精製されたイヌのＴＲＡＩＬであり、カラムからの洗浄液である（図１７ＡのレーンＷ２）。Ｓ９は、半精製されたネコのＴＲＡＩＬであり、カラムからの洗浄液である（図１７ＣのレーンＷ２）。この結果により、半精製されたイヌおよびネコのＴＲＡＩＬの添加により、Ｕ９３７細胞の細胞成長は、コントロールの細胞成長の８０％を超えて阻害されることが示される（図１８Ａ）。
【０３５１】
５．細胞死ＥＬＩＳＡ分析における、細菌により発現されたＴＲＡＩＬによるヒト腫瘍細胞のアポトーシスの誘導
ＭＴＴ成長阻害分析で用いられたのと同じサンプル群の存在下または非存在下で、Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を成長させた。この分析において、半精製されたＴＲＡＩＬタンパク質サンプル（Ｕ９３７細胞のアポトーシスを誘導することができる）、Ｓ８およびＳ９に加えて、さらに精製されたＴＲＡＩＬサンプルであるＳ６およびＳ７も、陽性であった（図１８Ｂ）。
【０３５２】
６．アネキシンＶ分析における、細菌により発現されたＴＲＡＩＬによるヒト腫瘍細胞のアポトーシスの誘導
上述のＴＲＡＩＬタンパク質サンプル群の存在下または非存在下で、Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞を成長させた。この分析において、これらタンパク質によって誘導されたヒト腫瘍細胞Ｕ９３７のアポトーシスを測定した。細胞死ＥＬＩＳＡ分析の結果と一致して、Ｓ８およびＳ９、半精製されたＴＲＡＩＬタンパク質サンプルは、コントロールサンプルＳ５の７倍超でＵ９３７細胞のアポトーシスを誘導することができる（図１８Ｃ）。その上、この分析において、さらに精製されたＴＲＡＩＬサンプル、Ｓ６およびＳ７も陽性であった。ヒトの市販のＴＲＡＩＬタンパク質（アップステート・テクノロジーズ）のアポトーシスを誘導する活性は、細菌サンプルＳ８およびＳ９に類似していた。
【０３５３】
実施例７
様々なガン細胞／正常な細胞に対するＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導活性
この章で示される実施例において、様々なガン細胞／正常な細胞に対するＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導活性の特異性を同定することに関する研究を説明する。
【０３５４】
１．様々なヒト腫瘍細胞系に対するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導活性
５種のヒト腫瘍細胞系（ＨＥＬＡ，頚部の類上皮細胞ガン；ＰＴ−３，ＨＴ−２９，結腸腺ガン；ＳＷ４８０，結腸腺ガン；および、Ｕ９３７，組織球性リンパ腫）を、哺乳動物発現イヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質に対するそれらの感受性について分析した。ＭＴＴ成長阻害分析、および、細胞死ＥＬＩＳＡアポトーシス分析の両方を行った。ＭＴＴ分析については、Ｕ９３７に加えて、その他のヒト腫瘍細胞系のＰＴ−３は、イヌおよびネコ両方のＴＲＡＩＬによって誘導されたアポトーシスに対して極めて高い感受性を有していた。ＳＷ４８０に対する作用はあまり明確ではなかった（図１９Ａ）。
【０３５５】
細胞死ＥＬＩＳＡ分析も５種のヒト腫瘍細胞系に対して行った。この分析において、５種全ての細胞系が、ＴＲＡＩＬで誘導されたアポトーシスに対して感受性を示した（図１９Ｂ）。その上、イヌおよびネコ両方のＴＲＡＩＬは、極めて有効にアポトーシスを誘導した。この結果により、ＴＲＡＩＬは、広範な治療範囲を有する効力のある抗ガン治療剤であることがさらに確認された。
【０３５６】
２．様々なイヌの腫瘍細胞系に対するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導活性
８種のイヌの腫瘍細胞系（Ｄ２２，イヌ骨肉腫；Ｄ１７，その他のイヌ骨肉腫；ＣＦ２１．Ｔ，イヌの腕／肩のガン；ＣＦ１１．Ｔ，イヌ骨肉腫；ＭＤＣＫ，イヌ腎臓細胞系；ＤＨ８２，イヌの組織球増殖症；０３０９および０３０Ｅ，いずれも独立したイヌの組織球増殖症クローン）を、哺乳動物発現イヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質に対するそれらの感受性に関して分析した。Ｕ９３７ヒト腫瘍細胞系を同時に分析し、ポジティブコントロールとして用いた。ＭＴＴ細胞成長阻害分析に関して、培養上清を含むイヌのＴＲＡＩＬは、試験された全て細胞系において明らかなアポトーシスを誘導した；一方、細胞系ＭＤＣＫ、ＣＦ２１．Ｔ、Ｄ１７およびＤ２２において、ネコのＴＲＡＩＬの作用はそれほど明確ではなかった（図２０Ａ）。この結果により、イヌの腫瘍細胞系に対して効力のある治療剤としてのイヌのＴＲＡＩＬの有効性が実証された。
【０３５７】
細胞死ＥＬＩＳＡアポトーシス分析に関しては、イヌのＴＲＡＩＬは、Ｄ２２、Ｄ１７では明白なアポトーシスを誘導し、ＣＦ２１．Ｔおよび０３０９ではその程度は低かった（図２０Ｂ）。ネコのＴＲＡＩＬもまた、Ｄ１７、ＣＦ２１．Ｔ、０３０９および０３０Ｅに対して作用を有していた。興味深いことに、市販のヒトＴＲＡＩＬは、ヒトＵ９３７細胞に対して効力のあるアポトーシスを誘導するが、イヌの細胞系に対する作用は極めて低かったことが特記される（図２０Ｂ，データ示さず）。イヌおよびネコのＴＲＡＩＬは、様々なヒト腫瘍細胞系に対して効力のあるアポトーシス誘導性の活性を示した（図１９Ａおよび１９Ｂ）。その感受性のある細胞系に対するＴＲＡＩＬの種の特異性は、一方向性である、すなわち、イヌおよびネコのＴＲＡＩＬは、ヒト腫瘍細胞系のアポトーシスを誘導するが、ヒトＴＲＡＩＬは、イヌの腫瘍細胞系のアポトーシスを有効に誘導することができない、と考えられる。
【０３５８】
３．正常なイヌの肝細胞に対するイヌおよびネコのＴＲＡＩＬのアポトーシス誘導性の活性
正常なイヌ肝細胞を、哺乳動物発現イヌおよびネコのＴＲＡＩＬタンパク質に対するそれらの感受性に関して分析した。細胞死ＥＬＩＳＡ分析により、正常なイヌ肝細胞はＦａｓリガンド処理に対して極めて高い感受性を有するのに対して、イヌおよびネコ両方のＴＲＡＩＬタンパク質は、これら細胞に対して作用を有しないが、Ｕ９３７はＦａｓリガンド処理とＴＲＡＩＬ処理との両方に対して感受性であった（図２１Ｂ）。この結論は、ＭＴＴ分析の結果によって支持された（図２１Ａ）。Ｆａｓリガンドは、インビボで肝臓毒性を引き起こす周知の物質である。ＴＲＡＩＬタンパク質がインビトロで肝細胞のアポトーシスを引き起こさないことは、インビボで用いる場合、ＴＲＡＩＬタンパク質の肝臓毒性が存在したとしてもわずかである可能性が高いことを示す。
【０３５９】
本発明において、イヌおよびネコのアポトーシス誘導物質であるＴＲＡＩＬ遺伝子のクローニングについて報告する。イヌのＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスのＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ８０．３％および６３．５％である。ネコのＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスのＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、８３．２％および６５．３である。可溶性ＴＲＡＩＬの既知のアミノ酸配列全てのアライメントから、イヌの可溶性ＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスの可溶性ＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ７６．９％および６６．９％である。ネコの可溶性ＴＲＡＩＬと、ヒトおよびマウスの可溶性ＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、それぞれ８２．２％および６９．９％である。イヌの可溶性ＴＲＡＩＬとネコの可溶性ＴＲＡＩＬとの相同性の程度は、９２．４％であった。ウェスタン免疫ブロット分析により、ＴＲＡＩＬが哺乳動物細胞で発現される場合、そのタンパク質は調整培地に分泌されたことが確認された。イヌおよびネコ両方のＴＲＡＩＬはまた、ガン細胞のアポトーシスを特異的に誘導し、そのレベルは、それらのヒト対照と同等であることが示された。
【０３６０】
ヒトＴＲＡＩＬは、多種多様な原発腫瘍および転移性の腫瘍の成長を阻害することが示された。その上、ＴＲＡＩＬでの治療は、薬剤耐性または副作用を引き起こすことなく多くの回数繰り返すことができる。これらのアポトーシス誘導物質はまた、その他のガン治療（例えば外科手術、化学療法、放射線療法および免疫療法）とうまく合わせて、優れた治療的な作用を達成することもできる。これらの特性により、安全で有効な、かつ広範な治療を非常に必要としている場合に、ＴＲＡＩＬは、イヌおよびネコのガンを治療するための極めて魅力的な候補となる。しかしながら、ガン治療のようなＴＲＡＩＬの成功した用途はおそらく、長期の腫瘍抑制および遅延を達成するためには、繰り返しの連続した治療が含まれる。イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのクローニングおよび同定により、種特異的なアポトーシス阻害剤を用いたイヌおよびネコの腫瘍の治療が可能になり、それによって繰り返し投与の際の免疫反応が発生する危険を最小限にすることができる。最終的に、自然発生するイヌの腫瘍は、組織病理学的および生物学的挙動において、それらのヒトの相互関係に極めて類似しており（ＭａｃＥｗｅｎ，１９９０年，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ９（２）：１２５〜３６）、それゆえにイヌの腫瘍から得られた実験結果はまた、ヒトのガンの生物学および治療に関する価値のある情報を提供すると考えられる。
【０３６１】
本発明は、本発明で説明される特定の実施形態の範囲に限定されず、これら実施形態は、本発明の個々の形態の単なる説明であり、機能的に同等の方法および成分も本発明の範囲内であるとする。実際には、本発明で示されたものや説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、上述の説明および添付の図面より当業者には明白であると考えられる。このような改変は、添付の請求項の範囲内に含まれるものとする。
【０３６２】
本明細書で示された全ての出版物および特許出願は、参照により本発明に加入され、それぞれ個々の出版物または特許出願が、特に、および、個々に参照により加入されるように示されるのと同等とする。
【０３６３】
配列表
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【０３６４】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０３６５】
【図１】イヌおよびネコの細胞系におけるＴＲＡＩＬ遺伝子発現である。
【図２】イヌのＴＲＡＩＬのヌクレオチド配列（配列番号２０）である。
【図３】イヌのＴＲＡＩＬタンパク質である。図２の配列（配列番号２１）から翻訳されたイヌのＴＲＡＩＬのアミノ酸配列である。
【図４】ネコのＴＲＡＩＬのヌクレオチド配列（配列番号２２）である。
【図５】ネコのＴＲＡＩＬタンパク質である。図３の配列（配列番号２３）から翻訳されたネコのＴＲＡＩＬのアミノ酸配列である。
【図６Ａ】全て既知の（ヒト、マウス、イヌおよびネコの）ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列のアライメントである。
【図６Ｂ】６Ａの続きである。
【図６Ｃ】６Ｂの続きである。
【図６Ｄ】６Ｃの続きである。
【図７Ａ】全て既知の（ヒト、マウス、イヌおよびネコの）可溶性ＴＲＡＩＬのアミノ酸配列のアライメントである。
【図７Ｂ】７Ａの続きである。
【図８】哺乳動物細胞で発現されたＴＲＡＩＬタンパク質のウェスタン免疫ブロット分析である。
【図９】哺乳動物発現ＴＲＡＩＬのアポトーシス分析である。
【図１０−１】細菌においてｐＢＡＤ−チオプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現および溶解性である。
【図１０−２】細菌においてｐＢＡＤ−チオプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現および溶解性である。
【図１１】ヒトおよびイヌのＴＲＡＩＬ−チオの、Ｈｉｓ−バンドクイック（Ｈｉｓ−ｂａｎｄ  Ｑｕｉｃｋ）９００カートリッジカラムの画分である。
【図１２】細菌発現ＴＲＡＩＬ−チオタンパク質のアポトーシス分析である。
【図１３】細菌においてＴ７プロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現である。
【図１４】細菌においてＴ７プロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性である。
【図１５】細菌においてｐＢＡＤプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の発現である。
【図１６】細菌においてｐＢＡＤプロモーターから発現されたＴＲＡＩＬタンパク質の溶解性である。
【図１７−１】イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのＨｉｓ−バンドクイック９００カートリッジカラムの画分である。
【図１７−２】イヌおよびネコのＴＲＡＩＬのＨｉｓ−バンドクイック９００カートリッジカラムの画分である。
【図１８】細菌発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。
【図１９】様々なヒトガン細胞系の哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。
【図２０】様々なイヌのガン細胞系の哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。
【図２１】イヌ肝細胞の哺乳動物発現ＴＲＡＩＬタンパク質のアポトーシス分析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2006506985.tif 000047
2006506985.tif 000048
2006506985.tif 000049
2006506985.tif 000050