(57)【要約】本発明は、虚血事象に続く患者の回復の促進におけるＥＰＯの有効性を示す。本発明は、虚血性発作の処置におけるＥＰＯの初期使用のための機会の、以前に理解されていたより長いウィンドウが存在することを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要としている患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなり、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ）後約８〜約２６時間以内にデリバー（ｄｅｌｉｖｅｒ）され、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く、虚血事象後の回復を促進するためのエリトロポイエチンの投薬養生（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）。
【請求項２】
ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象の約２４時間後にデリバーする請求項１の投薬養生。
【請求項３】
２回目の投薬を１回目の投薬の約２４時間後にデリバーする請求項２の投薬養生。
【請求項４】
虚血事象後約２０時間〜約６０時間以内にデリバーされるＥＰＯの３回目の投薬を患者に施すことをさらに含んでなる請求項１の投薬養生。
【請求項５】
ＥＰＯの３回目の投薬を２回目の投薬後約８〜２４時間以内にデリバーする請求項４の投薬養生。
【請求項６】
ＥＰＯの少なくとも１回の投薬を皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内投与経路によりデリバーする請求項１〜５のいずれかの投薬養生。
【請求項７】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約５００ＩＵ／ｋｇ〜約１００００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項１〜６のいずれかの投薬養生。
【請求項８】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇ〜約５０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項７の投薬養生。
【請求項９】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項７の投薬養生。
【請求項１０】
虚血事象が発作である請求項１〜９のいずれかの投薬養生。
【請求項１１】
デリバーされる少なくとも１回のＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項１０の投薬養生。
【請求項１２】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項１１の投薬養生。
【請求項１３】
エリトロポイエチンが長時間−作用性ＥＰＯである請求項１〜１２のいずれかの投薬養生。
【請求項１４】
患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなり、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く、虚血事象を経験した患者の処置方法。
【請求項１５】
ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象の約２４時間後にデリバーする請求項１４の方法。
【請求項１６】
２回目の投薬を１回目の投薬の約２４時間後にデリバーする請求項１５の方法。
【請求項１７】
虚血事象後約２０時間〜約６０時間以内にデリバーされるＥＰＯの３回目の投薬を患者に施すことをさらに含んでなる請求項１４の方法。
【請求項１８】
ＥＰＯの３回目の投薬を２回目の投薬後約８〜２４時間以内にデリバーする請求項１６の方法。
【請求項１９】
ＥＰＯの各投薬がＥＰＯの皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内注入を含んでなる請求項１４〜１８のいずれかの方法。
【請求項２０】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約５００ＩＵ／ｋｇ〜約１００００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項１４〜１８のいずれか１つの方法。
【請求項２１】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇ〜約５０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項２０の方法。
【請求項２２】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項２１の方法。
【請求項２３】
虚血事象が発作である請求項１４〜１８のいずれかの方法。
【請求項２４】
デリバーされる少なくとも１回のＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項２３の方法。
【請求項２５】
患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなり、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く、虚血事象後の患者における機能的回復を促進するための方法。
【請求項２６】
ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象の約２４時間後にデリバーする請求項２５の方法。
【請求項２７】
２回目の投薬を１回目の投薬の約２４時間後にデリバーする請求項２６の方法。
【請求項２８】
虚血事象後約２０時間〜約６０時間以内にデリバーされるＥＰＯの３回目の投薬を患者に施すことをさらに含んでなる請求項２５の方法。
【請求項２９】
ＥＰＯの３回目の投薬を２回目の投薬後約８〜２４時間以内にデリバーする請求項２８の方法。
【請求項３０】
ＥＰＯの各投薬がＥＰＯの皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内注入を含んでなる請求項２８〜３２のいずれかの方法。
【請求項３１】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約５００ＩＵ／ｋｇ〜約１００００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項２８〜３２のいずれかの方法。
【請求項３２】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇ〜約５０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項３１の方法。
【請求項３３】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項３２の方法。
【請求項３４】
虚血事象が発作である請求項２８〜３２のいずれかの方法。
【請求項３５】
デリバーされる少なくとも１回のＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項３４の方法。
【請求項３６】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項３５の方法。
【請求項３７】
投薬当たり約１５００ＩＵ／ｋｇ〜約４５００ＩＵ／ｋｇの量のＥＰＯを患者に投与することを含んでなり、ここでＥＰＯへの初期暴露に続くＥＰＯの１回目の投薬はＥＰＯへの初期暴露後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜約２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く、虚血事象から６時間以内にＥＰＯへの初期暴露を受けた患者における梗塞サイズを減少させるための方法。
【請求項３８】
ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象の約２４時間後にデリバーする請求項３７の方法。
【請求項３９】
２回目の投薬を１回目の投薬の約２４時間後にデリバーする請求項３８の方法。
【請求項４０】
虚血事象後約２０時間〜約６０時間以内にデリバーされるＥＰＯの３回目の投薬を患者に施すことをさらに含んでなる請求項３７の方法。
【請求項４１】
ＥＰＯの３回目の投薬を２回目の投薬後約８〜２４時間以内にデリバーする請求項４０の方法。
【請求項４２】
ＥＰＯの各投薬がＥＰＯの皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内注入を含んでなる請求項３７〜４１のいずれかの方法。
【請求項４３】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約１８００ＩＵ／ｋｇ〜約４０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項３７〜４１のいずれかの方法。
【請求項４４】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２０００ＩＵ／ｋｇ〜約３０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる請求項４３の方法。
【請求項４５】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項４４の方法。
【請求項４６】
虚血事象が発作である請求項３７〜４１のいずれかの方法。
【請求項４７】
デリバーされる少なくとも１回のＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項４６の方法。
【請求項４８】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項４７の方法。
【請求項４９】
患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなり、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く、虚血事象後の患者のＣＮＳにおけるアポトーシス又は炎症を抑制するための方法。
【請求項５０】
ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象の約２４時間後にデリバーする請求項４９の方法。
【請求項５１】
２回目の投薬を１回目の投薬の約２４時間後にデリバーする請求項５０の方法。
【請求項５２】
虚血事象後約２０時間〜約６０時間以内にデリバーされるＥＰＯの３回目の投薬を患者に施すことをさらに含んでなる請求項５１の方法。
【請求項５３】
ＥＰＯの３回目の投薬を２回目の投薬後約８〜２４時間以内にデリバーする請求項５２
の方法。
【請求項５４】
ＥＰＯの各投薬がＥＰＯの皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内注入を含んでなる請求項４９の方法。
【請求項５５】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項４９の方法。
【請求項５６】
虚血事象が発作である請求項４９の方法。
【請求項５７】
デリバーされる少なくとも１回のＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項５６の方法。
【請求項５８】
デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約２５００ＩＵ／ｋｇである請求項５７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術的分野
本発明は、発作（ｓｔｒｏｋｅ）のような虚血事象（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｅｖｅｎｔ）後の回復を促進するための種々のエリトロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＥＰＯ）投薬養生、（ｄｏｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）を提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
発作という用語は、頭蓋内もしくは−外血管の閉塞又は破裂から生ずる脳機能の突然の損傷を指す。それは、脳内のもしくは脳に通じる１個もしくはそれより多い血管が破裂するか又は血栓、じゅく状硬化斑又は何らかの他の粒子により詰まる時に起こる。結果として脳神経細胞はそれらの酸素供給が奪われ、数分以内に死に始め得る。失われた脳細胞は再生せず、梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ）として既知の液体で満たされた腔により置き換えられる。発作においては、いくらかの脳細胞が不可逆的且つ即時に失われ得る。他の細胞、例えば虚血病巣の回りの細胞は急性の損傷を受け、数時間危うい状態に置かれ得る。初期虚血事象の後、脳損傷が数日続き得ることも当該技術分野において既知である。
【０００３】
多くの場合、患者は発作事象の直後には緊急処置室に到着しないので、事象より後の時点に初めて施されても有用である新規な治療が必要である。
【発明の開示】
【０００４】
概略
本発明は虚血事象後のＥＰＯの投薬養生ならびにそのような事象を経験した患者のための処置方法を提供する。
【０００５】
本発明の１つの態様は、必要としている患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなる虚血事象後の回復を促進するためのエリトロポイエチンの投薬養生であり、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバー（ｄｅｌｉｖｅｒ）され、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【０００６】
本発明の他の態様は、患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなる虚血事象を経験した患者の処置方法であり、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【０００７】
さらに別の態様において、本発明は患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなる虚血事象後の患者における機能的回復を促進するための方法を提供し、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【０００８】
さらにもっと別の側面において、本発明は投薬当たり約１５００ＩＵ／ｋｇ〜約４５００ＩＵ／ｋｇの量のＥＰＯを患者に投与することを含んでなる、虚血事象から６時間以内にＥＰＯへの初期暴露を受けた患者における梗塞サイズを減少させるための方法にも関し、ここでＥＰＯへの初期暴露に続くＥＰＯの１回目の投薬はＥＰＯへの初期暴露後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜約２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【０００９】
さらに別の側面において、本発明は患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなる虚血事象後の患者のＣＮＳにおけるアポトーシス又は炎症を抑制するための方法に関し、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【００１０】
本発明のある好ましい態様においては、ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象から約２４時間後にデリバーする。やはり本発明のある好ましい態様において、２回目の投薬を１回目の投薬から約２４時間後にデリバーする。好ましくは、ＥＰＯの１回目の投薬を虚血事象から約２４時間後にデリバーし、２回目の投薬を虚血事象から約４８時間後にデリバーする。さらに、虚血事象から後の約２０時間〜約６０時間以内にＥＰＯの３回目の投薬をデリバーすることができる。好ましくは、ＥＰＯの３回目の投薬を２回目の投薬から後の約８〜２４時間以内にデリバーする。
【００１１】
本発明の好ましい態様は、ＥＰＯの各投薬がＥＰＯの皮下、筋肉内、静脈内又は腹腔内注入を含んでなる投薬養生及び処置方法を含む。
【００１２】
本発明の好ましい態様は、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量が約５００ＩＵ／ｋｇ〜約１００００ＩＵ／ｋｇから選ばれる投薬養生及び処置方法も含む。１つの態様において、特に虚血事象から６時間以内にＥＰＯへの初期暴露を受けた患者における梗塞サイズを減少させるために、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量は約１５００ＩＵ／ｋｇ〜約４５００ＩＵ／ｋｇから選ばれる。好ましくは、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量は約１８００ＩＵ／ｋｇ〜約４０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる。より好ましくは、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量は約２０００ＩＵ／ｋｇ〜約３０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる。最も好ましくは、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量は約２５００ＩＵ／ｋｇである。他の態様において、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量は約２５００ＩＵ／ｋｇ〜約５０００ＩＵ／ｋｇから選ばれる。好ましくは、デリバーされる少なくとも１回のＥＰＯ投薬量は約２５００ＩＵ／ｋｇである。より好ましくは、デリバーされる各ＥＰＯ投薬量は約２５００ＩＵ／ｋｇである。
【００１３】
本発明のより好ましい態様において、虚血事象は発作である。特に、虚血事象は病巣虚血性発作（ｆｏｃａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ）又は急性虚血性発作のようなＣＮＳ傷害である。
【００１４】
本発明の態様はさらに、エリトロポイエチンが長時間−作用性ＥＰＯである投薬養生及び処置方法を含む。
【００１５】
図面の簡単な記述
添付の図面は本発明のいくつかの側面を例示する。図面の簡単な記述は以下の通りである：
図１は、１日投薬が梗塞サイズ又は機能的結果に効果を有していないことを示す。ボックス−ホィスカーグラフ（ｂｏｘ−ｗｈｉｓｋｅｒ  ｇｒａｐｈ）（Ａ）及び（Ｂ）は、デキストロルファン（Ｄｅｘｔｒｏｒｐｈａｎ）及びＥＰＯが、閉塞の時点及び再度閉塞から１時間（ｈｒ）後に与えられると、ビヒクル処置された動物と比較して７−日の（Ａ）梗塞サイズの減少又は（Ｂ）機能的結果の向上において無効であったことを示す。
【００１６】
図２は、エリトロポイエチンの複数日投薬が梗塞サイズを減少させ、且つ機能的結果を向上させることを示す。中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に供され、閉塞から０時間、２４時間及び４８時間後にＥＰＯで処置されたラットは、ビヒクル処置された動物と比較して、グラフ（Ａ）中で２５００ＩＵ／ｋｇにおいて梗塞体積の統計的に有意な減少を、ならびにグラフ（Ｂ）中で２５００及び５０００ＩＵ／ｋｇにおいて機能的結果の有意な向上を
示した（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【００１７】
図３は、遅れた複数日のＥＰＯの投与が、梗塞サイズの減少と無関係に機能的結果を向上させることを示す。ＭＣＡＯに続く６時間、２４時間及び４８時間後のＥＰＯの投与は、２５００又は５０００ＩＵ／ｋｇにおいて与えられると（Ａ）梗塞サイズに効果を有していなかった；しかしながら、（Ｂ）両投薬レベルは機能的結果を有意に向上させた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）；
図４は、閉塞から２４時間後のように遅くに開始されるＥＰＯが機能的結果を向上させることを示す。ＥＰＯの初期投薬を閉塞から完全に２４時間遅らせ、４８時間における２回目の投薬が続く投薬養生は、（Ａ）梗塞サイズの減少に有効ではなかったが、（Ｂ）機能的結果を有意に向上させた（＊ｐ＜０．０１）。
【００１８】
詳細な記述
下記に記載する本発明の態様は徹底的であることも、続く詳細な記述において開示される特定の態様に本発明を制限することも意図されていない。そうではなく、当該技術分野における熟練した他者が本発明の原理及び実施を理解できるように、態様を記述する。下記で特にことわらなければ、以下の記述中で引用される各特許、公開特許出願及び公開文献の開示は、引用することによりその記載事項全体があらゆる目的のために本明細書の内容となる。
【００１９】
本発明は、必要としている患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなる虚血事象後の回復を促進するためのエリトロポイエチンの投薬養生を提供し、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、「虚血事象」は、患者が中枢神経系（ＣＮＳ）における一時的もしくは永久的な血流及び／又は酸素デリバーの減少を経験する場合に起こり、おそらく非−灌流領域の壊死又は梗塞のような損傷を生ずる。虚血事象には急性ＣＮＳ傷害、例えば発作、外傷、例えば外傷性脳もしくは脊髄傷害、一過性脳虚血発作、梗塞、虚血−再灌流傷害、網膜損傷、器官、組織もしくは細胞移植又は他の外科手術処置の故の虚血が含まれるが、これらに限られない。特に本発明の目的の場合、虚血事象は大脳虚血事象、特に頭蓋血流の中断である。さらに特定的に、虚血事象は病巣虚血性発作又は急性虚血性発作を含むがこれらに限られない発作である。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、虚血−再灌流は、脳のような器官への血流の局所的中断及び続く、通常は突然の血流の回復である。
【００２２】
急性虚血性発作から生ずる損傷は動態的（ｄｙｎａｍｉｃ）である。傷害は初期発作に続く数日に及んで展開される。複数の機構が、イオン的ホメオスタシスの喪失、フリーラジカル損傷、興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）及び炎症を含む神経細胞及び支持細胞の死の領域の拡大に寄与する（１）。
【００２３】
起こってしまった損傷をある程度補償する試みで、初期傷害に続く数週間から数ヶ月間、再構築及び再造形の機構が活発である（２）。損傷に責任のある事象及び回復に寄与する事象の両方が、治療が介在する機会を与える。望ましい処置は、細胞死を誘発する機構を遮断できるか、又は回復プロセスを強化することができるか、あるいは理想的には両方できる処置である。可能な候補処置は、本来の造血サイトカイン、エリトロポイエチンのラインに沿った赤血球生成活性を有する分子である。
【００２４】
近年エリトロポイエチンは、神経系におけるその機能を含む非−造血系におけるその効
果に関してかなりの注目を集めてきた（４）。中枢神経系（ＣＮＳ）において、エリトロポイエチンは低酸素に応答して星状細胞により局部的に生産され、放出されるが（５，６）、エリトロポイエチン受容体はニューロンのサブタイプならびに星状細胞及び小神経膠細胞に局在してきた（７，８）。これらの細胞型におけるエリトロポイエチンの機能は明確でないままであるが、それはグルタメート、低酸素（９）及び血清除去（ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）（１０）を含む複数の種々の刺激により誘導される試験管内におけるプログラムされた細胞死を遮断することが示され、それがアポトーシスの遮断により細胞生存を助長するように機能し得ることを示唆した（１１）。エリトロポイエチンは、その神経保護効果に加え、発作治療の別の可能な標的（１３）である炎症を調節する（１２）ことが報告された。さらにエリトロポイエチンは、発作（１４）、脊髄傷害（１５）、外傷性脳傷害（１４）及び網膜損傷（１６）のモデルを含むＣＮＳ傷害の動物モデルにおいて観察される損傷を軽減することが示され、近年、虚血前条件付け（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）の保護効果に関連付けられてきた（６）。
【００２５】
ＣＮＳ内におけるエリトロポイエチンの機能は、特に報告されたその神経保護活性の故にかなりの注意を引き付けてきた。関連するＣＮＳ傷害のモデルにおける損傷を制限するエリトロポイエチンの能力は、それが疾患プロセスにおけるいくつかの機構に作用する可能性を有することを示唆するデータと一緒になって、エリトロポイエチンを、発作を含む神経系の急性障害の処置のための魅力的な候補とする。エリトロポイエチンがこれらの保護効果を引き出す正確な機構は明確でないが、エリトロポイエチンが発作（１０）、脊髄傷害（１５）及び網膜傷害（１６）のモデルにおいてアポトーシスを減少させるというデータは、アポトーシスを遮断するその能力が決定的な機能であることを示唆する。アポトーシスが初期虚血事象に続く数日間起こり得るとして、発作に続く数日におけるエリトロポイエチンを用いる継続的投薬は、治療効果を最適化するために必要であり得る。今日まで、前臨床試験（ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ）はこの問題を提出しなかったが、数日に及ぶエリトロポイエチンの継続的投与は、虚血性発作の処置におけるエリトロポイエチンの評価のための試験的臨床研究において肯定的な結果を以って報告されている（１９）。
【００２６】
中性もしくは本来のエリトロポイエチンは３０−ｋＤａの糖タンパク質であり、それは赤血球前駆体細胞の分化、増殖及び生存を調節することにより、赤血球生成を制御する（３）。本発明で用いられる場合及び請求項中で定義される場合、「ＥＰＯ」という用語は、本来のエリトロポイエチン受容体を介して媒介される時に赤血球生成を刺激する能力を有するポリペプチド及びタンパク質を含む。「ＥＰＯ」という用語は、天然のもしくは本来のエリトロポイエチンならびに組換えヒトエリトロポイエチン（ｒ−ＨｕＥＰＯ）を含む。やはりＥＰＯの用語の範囲内に含まれるのはエリトロポイエチン類似体、エリトロポイエチンイソ型、エリトロポイエチンミメティック、エリトロポイエチンフラグメント、ハイブリッドエリトロポイエチンタンパク質、上記のものの融合タンパク質オリゴマー及びマルチマー、上記のものの同族体、上記のもののグルコシル化パターン変異体、上記のもののペプチドミメティック及び突然変異タンパク質であり、ならびにさらに組換え（ｃＤＮＡから生産されても又はゲノムＤＮＡから生産されても）、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性化法を含むがこれらに限られないそれらの合成もしくは製造法にかかわらず、そしてさらに上記で挙げた小さい変更を含有するエリトロポイエチン分子である。例えばペプチドミメティックの設計及び合成方法は当該技術分野における通常の熟練者に周知であり、例えば米国特許第４，８３３，０９２，４，８５９，７６５；４，８５３，８７１及び４，８６３，８５７号明細書に記載されており、それらのそれぞれの開示は引用することによりその記載事項全体がすべての目的のために本明細書の内容となる。赤血球生成活性を有するポリペプチド及びタンパク質の他に、赤血球生成を促進することができる小分子もＥＰＯの用語の範囲内であり、例えばエリトロポイエチン活性を有する化合物、例えば上流活性化事象を介してエリトロポイエチン生産を刺激する分子が含まれる。
【００２７】
特に好ましいＥＰＯ分子は、哺乳類において赤血球生成を刺激できる分子である。エリトロポイエチンの特定的な例にはエポエチンアルファ（Ｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａ）（ＥＰＲＥＸＲ，ＥＲＹＰＯＲ，ＰＲＯＣＲＩＴＲ）、新規な赤血球生成刺激タンパク質（ＮＥＳＰＴＭ，ＡＲＡＮＥＳＰＴＭ及びダルベポエチチンアルファ（ｄａｒｂｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａ））、例えば欧州特許出願公開第６４０６１９号明細書に記載されている組換えヒトエリトロポイエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ）の高グリコシル化類似体が含まれる。本発明の範囲内に包含される他のＥＰＯ分子にはヒトエリトロポイエチン類似体（例えば国際公開第９９／６６０５４号パンフレットに記載されているヒト血清アルブミン融合タンパク質）、国際公開第９９／３８８９０号パンフレットに記載されているエリトロポイエチン突然変異体、米国特許第５，６８８，６７９号明細書に記載されているヒトエリトロポイエチン遺伝子のＡｐａ  Ｉ制限フラグメントから生産され得るエリトロポイエチンオメガ、国際公開第９９／１１７８１号パンフレット及び欧州特許第１０６４９５１号明細書に記載されている改変グリコシル化ヒトエリトロポイエチン、国際公開第９８／０５３６３号パンフレット、国際公開第０１／７６６４０号パンフレット又は米国特許第５，６４３，５７５号明細書に記載されているＰＥＧ共役エリトロポイエチン類似体が含まれる。内在性ヒトエリトロポイエチンの発現のために改変された細胞系の特定の例は、国際公開第９９／０５２６８号パンフレット及び国際公開第９４／１２６５０号パンフレットに記載されている。一般的に好ましいＥＰＯの形態は、現在ＥＰＲＥＸＲ，ＥＲＹＰＯＲ，ＰＲＯＣＲＩＴＲ又はＡＲＡＮＥＳＴＴＭの商標の下に調製され、配られている精製された組換えヒトＥＰＯ（ｒ−ＨｕＥＰＯ）である。この節で挙げた特許及び公開特許出願のそれぞれの開示は、引用することによりその記載事項があらゆる目的のために本明細書の内容となる。
【００２８】
ＥＰＯの長時間−作用性形態も包含され、本発明のいくつかの態様において、投薬養生の２回目又は３回目の暴露としての投与のために好ましいかも知れない。本明細書で用いられる場合、「長時間−作用性ＥＰＯ」は徐放性組成物及び、典型的には免疫原性及びクリアランス速度の低下のような修正を介して達成される増加した循環半減期を有するＥＰＯの調剤ならびにポリマー微小球中に封入されたＥＰＯを含む。「長時間−作用性ＥＰＯ」の例には、国際公開第２００２０４９６７３号パンフレット（Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのエリトロポイエチンの共役体、国際公開第０２／３２９５７号パンフレット（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されているＰＥＧ−改質ＥＰＯ、国際公開第９４／２８０２４号パンフレット（Ｃｈｙｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている赤血球生成活性を有し、且つ非−抗原性ポリマーに共有結合した少なくとも１個の酸化炭水化物部分を有する糖タンパク質の共役体ならびにＳＣＭ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＳＢＡ−ＰＥＧを用いて製造される他のＰＥＧ−ＥＰＯが含まれるが、これらに限られない。これらの公開特許出願のそれぞれの開示は、引用することによりその記載事項全体がすべての目的のために本明細書の内容となる。
【００２９】
好ましいポリエチレングリコール部分はメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）部分である。該部分は、好ましくはメトキシポリエチレングリコール種のスクシンイミジルエステル誘導体を用いて加えられる。１つの例において、好ましいメトキシポリエチレングリコール種のスクシンイミジルエステル誘導体には：次式、
【００３０】
【化１】
2006521405.tif 000002
【００３１】
のカルボキシメチル化ポリエチレングリコールのスクシンイミジルエステル（ＳＣＭ−ＰＥＧ）、次式、
（Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＯＳｕ）
［式中、ＲはＣ１−８アルキルであり、ｎは整数である］
のポリ（エチレングリコール）プロピオン酸のスクシンイミジル誘導体（ＳＰＡ−ＰＥＧ）；ならびに次式、
（Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＯＳｕ）
［式中、ＲはＣ１−８アルキルであり、ｎは整数である］
のポリ（エチレングリコール）ブタン酸のスクシンイミジル誘導体（ＳＢＡ−ＰＥＧ）が含まれる。
【００３２】
ＳＣＭ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＳＢＡ−ＰＥＧの製造方法は当該技術分野において周知である。例えばＨａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５６７２６６２号明細書は、１個のプロピオン酸又はブタン酸部分を有し、他のエステル結合を有していないＰＥＧ酸及び関連ポリマーの活性エステルを記載している。ＳＣＭ−ＰＥＧの製造は、例えばＶｅｒｏｎｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１０：１９８９年，１４５−５４に記載されている。
【００３３】
ＳＰＡ−ＰＥＧにはｍＰＥＧ−ＳＰＡ（メトキシ−ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート）が含まれる。ＳＢＡ−ＰＥＧにはｍＰＥＧ−ＳＢＡ（メトキシ−ＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート）が含まれる。ＳＢＡ−ＰＥＧ及びＳＰＡ−ＰＥＧのような活性化ポリマーは両方とも商業的に入手可能であり、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から得ることができる。
【００３４】
ＳＣＭ−ＰＥＧ（Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＳｕ；ＲはＣ１−８アルキルであり、ｎは整数である）にはカルボキシメチル化ＰＥＧのメトキシ−ＰＥＧ−スクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＳＣＭ）が含まれる。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．に従うと、ＳＣＭ−ＰＥＧの“タンパク質との反応は安定なアミドを生成するが、ｐＨ８においてｔ１／２加水分解が＜１分であると報告され［Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ
Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，Ｊａｎ  １９９６カタログ，ｐ４６］、かくして水溶液中でのタンパク質改変のためのその有用性を最少にしている”（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，７（６），１９９６年，６３８−６４１）。
【００３５】
現在、例えばＤｅｌｍａｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ，Ｑｕｅｂｅｃ，ＣａｎａｄａによりＳＣＭ−ＰＥＧを注文合成することができる。
【００３６】
ＳＣＭ−ＰＥＧ、ＳＰＡ−ＰＥＧ及びＳＢＡ−ＰＥＧは主にリシンの第１級アミノ基及びＮ−末端アミノ基と反応する。ＥＰＯとの反応を下記においてそれぞれＳＣＭ−ＰＥＧ
５Ｋ、ＳＰＡ−ＰＥＧ５Ｋ及びＳＢＡ−ＰＥＧ５Ｋに関して示し、式中、ＯＳｕはｎ−ヒドロキシスクシンイミドを示し、ｍは１〜４であり、ｎは整数である：
（ＳＣＭ−ＰＥＧ）ＣＨ３Ｏ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＯＳＵ＋ＥＰＯ（ＮＨ２）Ｍ→ＣＨ３Ｏ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｎ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＥＰＯ
（ＳＰＡ−ＰＥＧ）ＣＨ３Ｏ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｎ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＯＳＵ＋ＥＰＯ（ＮＨ２）Ｍ→ＣＨ３Ｏ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｎ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＥＰＯ
（ＳＢＡ−ＰＥＧ）ＣＨ３Ｏ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｎ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＯＳＵ＋ＥＰＯ（ＮＨ２）Ｍ→ＣＨ３Ｏ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）Ｎ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−ＥＰＯ
エリトロポイエチンが発作を含むＣＮＳへの急性の傷害のための有用な治療薬であり得、おそらくアポトーシス及び炎症のような遅延神経毒性に責任のあるプロセスを妨げることができるという仮定を調査するために、出願人等は病巣虚血性発作のモデルにおけるエリトロポイエチンの最適活性を決定する試みで、いくつかの投薬養生を調べた。本明細書において出願人等は、数日に及んで施される複数投薬が、永久的中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に供されたラットの梗塞サイズを減少させ、機能的結果を向上させることができることを示す。さらに、閉塞から最高で約２４時間後までも遅れたエリトロポイエチンの投与が、梗塞サイズの減少と無関係に機能的結果を向上させることができる。
【００３７】
出願人等はまさしく、２５００ＩＵ／ｋｇのエリトロポイエチンを用いる複数日の投薬養生が、ＭＣＡＯに供されたラットの結果の向上に最も有効であったことを見出した。これらの研究において、梗塞サイズにおいて観察される減少は比較的穏やかであり（３０％）、これは、壊死が病巣虚血性発作の永久モデルにおける梗塞体積に寄与する細胞死の主な方法であると考えられているので、抗−アポトーシス的作用機構を有する分子の場合に驚くべきものではない（２０）。
【００３８】
かくして本発明は、患者に治療的に有効な量のエリトロポイエチンを投与することを含んでなる虚血事象を経験した患者の処置方法を提供し、ここでエリトロポイエチンの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるエリトロポイエチンの２回目の投薬が続く。特に、虚血事象を経験した患者の処置は、虚血事象のいずれかの結果、例えば神経学的損傷又は梗塞からの回復の促進を含む。１つの側面において、虚血事象からの回復は梗塞サイズの減少により示される。他の側面において虚血事象からの回復は、患者の機能的結果における向上、例えば行動得点システムにより決定されるものから得られる１つもしくはそれより多い得点における向上により示される。本発明により与えられる処置の結果を、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ＣＴＡ（コンピューター連動断層撮影血管造影法）及びＣＴ（コンピューター連動断層撮影法）スキャンのような医学的画像化システム、神経学的試験、ホィスカータッチ試験（ｗｈｉｓｋｅｒ  ｔｏｕｃｈ  ｔｅｓｔ）又はフットフォールト試験（ｆｏｏｔ  ｆａｕｌｔ  ｔｅｓｔ）を含むがこれらに限られない当該技術分野において周知の評価方法を用いて評価することができる（１９）。
【００３９】
本発明は、患者に治療的に有効な量のエリトロポイエチンを投与することを含んでなる、虚血事象後の患者においてＣＮＳにおけるアポトーシス又は炎症を妨げるための方法も提供し、ここでエリトロポイエチンの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるエリトロポイエチンの２回目の投薬が続く。
【００４０】
結果は、梗塞サイズの減少を達成するためには、エリトロポイエチンの初期の投与が必要であることを示した。処置が閉塞から６時間後に開始されると、効果は失われた。特に、閉塞の時点及び閉塞後２４時間及び４８時間に２５００ＩＵ／ｋｇの投薬量において与
えられるエリトロポイエチンの複数日の投薬は、梗塞サイズの３０％の減少を生じ、それは５０００ＩＵ／ｋｇ又は１２５０ＩＵ／ｋｇの投薬レベルにおいて観察されなかった。従って本発明は、投薬当たり約１５００ＩＵ／ｋｇ〜約４５００ＩＵ／ｋｇの量のエリトロポイエチンを患者に投与することを含んでなる、虚血事象から６時間以内にエリトロポイエチンへの初期暴露を受けた患者において梗塞サイズを減少させるための方法を提供し、ここでエリトロポイエチンの１回目の投薬はエリトロポイエチンへの初期暴露後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜約２６時間以内にデリバーされるエリトロポイエチンの２回目の投薬が続く。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、「暴露」という用語は、例えば長時間−作用性ＥＰＯの１回の投薬、繰り返される個々の投薬又は１回の投与の後に比較的継続的に与えられ得る投薬、例えばＥＰＯを含んでなる経皮パッチの適用あるいはＥＰＯ移植片の移植を指す。
【００４２】
さらに、今回驚くべきことに、出願人等は、永久的ＭＣＡＯに供されたラットにおいて、発作から約２４時間後にＥＰＯを与えた場合に有意な機能的向上を見出した。かくして本発明はさらに、患者に治療的に有効な量のＥＰＯを投与することを含んでなる虚血事象後の患者において機能的回復を促進するための方法を提供し、ここでＥＰＯの１回目の投薬は虚血事象後約８〜約２６時間以内にデリバーされ、１回目の投薬後約８〜２６時間以内にデリバーされるＥＰＯの２回目の投薬が続く。
【００４３】
関連する本発明の態様において、ＥＰＯを３回目の投薬として患者に投与することができる。３回目の投薬は、好ましくは虚血事象後約２０時間〜約６０時間以内に施すことができる。３回目の投薬を与える場合、それを２回目の投薬後約８〜約２４時間以内にデリバーすることができる。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、「機能的回復」という用語は、虚血事象の後の患者における行動的向上を指す。動物における機能的回復を、例えば修正Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｃｈａｌｌｅｒｔフットフォールト試験（１８）を用いて評価することができ、その試験では、０．５ｃｍの直径の金属棒の間に２ｃｍの空間を有する格子上に動物を置き、２分間観察し、その間にそれらの前肢及び後肢が空間を通って落ちる回数を数える。人間における機能的回復は、運動強度、感覚及び協調のような基本的な神経学的機能、記憶、言語及び指示に従う能力のような認識機能ならびに毎日の生活の基本的活動又は器械活動（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）のような機能的能力を測定するように設計される器械により評価することができる。基本的な神経学的機能の回復は、ＮＩＨ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｃａｌｅ（ＮＩＨＳＳ）（３１）のような器械を用いて測定することができ、認識機能の回復は、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｎａｍｉｎｇ  Ｔｅｓｔ、Ｔｒａｉｌ−ｍａｋｉｎｇ
Ｔｅｓｔ及びＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｖｅｒｂａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔのような神経心理学的試験を用いて測定することができ、毎日の生活の活動は、ＡＤＣＳ／ＡＤＬ（アルツハイマー病臨床研究／毎日の生活の活動）（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ／Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄａｉｌｙ  Ｌｉｖｉｎｇ）スケール又はＢｒｉｓｔｏｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄａｉｌｙ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｃａｌｅのような器械を用いて測定することができ、すべての試験及びスケールは当該技術分野において既知である。
【００４５】
本明細書に記載する通り、遅れた投薬の範例は梗塞サイズの減少を生じなかった。この観察に関する１つの可能な説明は、ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド）染色が梗塞領域を正確に示していないかも知れないことである。この可能性に向き合う（ａｄｄｒｅｓｓ）ために、代表的な動物からの切片についてもっと包括的な形態学的分析を行ない、ＴＴＣ分析と比較した。ＴＴＣ染色の境界内に無損傷のニューロンは検出されず（データは示されない）、この現象は我々の観察に関して責任がないことを示
唆した。従ってＥＰＯの遅れた投与は、おそらく梗塞の領域から遠い領域における遅れたアポトーシスを妨げることにより、あるいはおそらく内在性再構築及び再造形事象を強化することにより、梗塞領域のサイズの減少に無関係に機能を向上させる。
【００４６】
前に言及した通り、アポトーシスは虚血発作に続く数日間起こり得る。遅れたアポトーシスは虚血性周辺部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｐｅｎｕｍｂｒａ）において起こり、最終的な梗塞体積に寄与する（２１，２２）。それは梗塞領域から遠い領域においても起こり、その最もありそうな理由は、梗塞領域内への鍵の突出（ｋｅｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）を失ったニューロンのための栄養的支持の喪失である。ＥＰＯはニューロン集団のために栄養的であることが示されているので（１０，２３）、遅れたＥＰＯ投与の効果に関する可能な説明は、梗塞領域から解剖学的にある距離に位置するニューロンの遅れたアポトーシスの妨害である。これらのニューロンの集団の節約（ｓｐａｒｉｎｇ）は、我々の行動評価において観察される機能的性能の保存を説明することができる。
【００４７】
排除することができない他の説明は、軸索伸出（ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）、シナプス形成、シナプス強化又は露出（ｕｎｍａｓｋｉｎｇ）のような再構築及び再造形機構を支持することにより、ＥＰＯが機能的回復プロセスを強化することである。７日のように初期に観察される機能における向上は、新規な長距離の機能的連結の確立に反対の議論を主張するが、２つの報告は、少なくとも可塑性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）の開始が７日までに明らかになると示唆している。病巣虚血性発作のラットモデルにおける塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の効果を調べているＫａｗａｍａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２４）及び類似のモデルにおいてｄ−アンフェタミン処置を見ているＳｔｒｏｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２５）は、薬剤処置を用い、同時に梗塞サイズが減少することなく、機能的性能における向上を観察した。注目すべきことに、これらの研究において動物を最高で２ヶ月間観察したが、行動的向上は７日までに有意であった。
【００４８】
免疫組織化学的分析は、両研究において軸索発芽（ｎｅｕｒｉｔｅ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）の増加の証拠を明らかにし、それは成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ４３）発現における増加により決定され、それは閉塞から３日後にピークとなった。ＥＰＯは以前に軸索発芽を促進することが示されている（２６）。これらのデータは一緒になって、傷害に続く最初の数日以内になんらかの修復プロセスが開始され得ること、ならびにＥＰＯがこれらの初期のプロセスに作用して機能的回復を強化できることを示唆している。露出又はシナプス強化のような他の再構成プロセスは、もっとずっと短い時間をかけて起こり得るが、これらの事象へのＥＰＯの効果は示されていない。
【００４９】
当該技術分野における通常の熟練者は、種々の状況において投薬の適した量及び方法を容易に決定することができる。いずれかの与えられる投薬セグメント（ｄｏｓｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ）のいずれかの特定の暴露において投与されるべきＥＰＯの量は特に制限されず、ＥＰＯの投与の故の毒性の影響が実質的に現れない限り、暴露、投薬部分又は複数日投薬養生当たりにいずれの量のＥＰＯを投与することもできる。すなわち（ｔｈａｔ  ｂｅｉｎｇ  ｓａｉｄ）、そして追加の指針を与える目的のみのため且つそれに不必要に縛られずに、一般的な治療のガイドラインは、患者が望ましくはＥＰＯの各投薬において約５００ＩＵ／ｋｇ〜約１００００ＩＵ／ｋｇの治療的な有効な量を与えられることを示唆している。好ましくは、患者はＥＰＯの各投薬において約１２５０ＩＵ／ｋｇ〜約５０００ＩＵ／ｋｇの量を与えられる。より好ましくは、患者はＥＰＯの各投薬において、約２５００ＩＵ／ｋｇからの量を与えられる。上記の通り、ＥＰＯの投薬をいずれかの既知のあるいは新規に開発された投薬フォーマット（ｄｏｓｉｎｇ  ｆｏｒｍａｔ）において与えることができる。
【００５０】
本発明は、本発明の実施において多様なＥＰＯの投与経路を使用できることを意図して
いる。好ましくは、可能な限り迅速に患者にＥＰＯへの暴露を与えることができるフォーマットにおいて、望ましくはＥＰＯの各投薬を与えることができる。すなわち、静脈内投薬、皮下投薬、筋肉内もしくは腹腔内を含むがこれらに限られない多様な投与経路が意図されている。経口用調剤が利用可能であるか又は利用可能になる範囲で、そのような投与の道も考慮されており、本明細書に記載される２回目もしくは続くＥＰＯ投薬のために特に適しているかもしれない。
【００５１】
投薬養生から利益を得ることができる患者は特に制限されず、人間及び動物の患者の両方、好ましくは哺乳類の患者が含まれ得る。
【００５２】
以下の実施例は本発明を例示するために与えられ、本発明を制限するとみなされるべきではない。本発明は、図面及び下記の実施例を参照することによってより良く理解されるであろうが、当該技術分野における熟練者は、これらが前記の請求項にもっと十分に記載されている本発明の例でしかないことを容易に認識するであろう。
【実施例１】
【００５３】
材料及び方法
動物及びＭＣＡＯ外科手術
動物を含む方法は、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。２９０ｇ〜３２０ｇの体重の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を温度−制御環境中で、１２時間（６：００〜１８：００）明−暗サイクルにおいて個別に収容し、随意に食物及び水を与えた。２．５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて動物を麻酔し、体温を３７℃に保った。本質的にＺｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１７）により記載されている通りに永久的ＭＣＡＯを行なった。要するに、腹側で切開し、左右両方の総頸動脈（ＣＣＡ）を見えるようにした。４−０絹結紮糸を用い、右ＣＣＡを永久的に閉塞させた。卵円孔から１ｍｍ前方且つ３〜４ｍｍ外側において開頭を行い、右中大脳動脈（ＭＣＡ）を見えるようにした。次いでレンズ核線条体動脈に対して遠位の焼灼によりＭＣＡを永久的に閉塞させた。次いで動脈瘤クリップを用いて左ＣＣＡを１時間、一時的に閉塞させた。閉塞に続き、外科手術用ステープルを用いて切開を閉じ、ブピビカン（Ｂｕｐｉｖｉｃａｎｅ）（０．２５％）を切開部位に供給した。加温ランプ下で動物を麻酔から回復させた。
【００５４】
２４時間後、神経学的試験、ホィスカータッチ試験及びフットフォールト試験を用いてラットを評価した。表１に示す通りに、ＭＣＡＯに供されたラットを閉塞から２４時間後に傷害の重度に関して評価した。３つの試験を行なった：神経学的評価、ホィスカータッチ試験及びフットフォールト試験（１９）。予備−決定されたパラメーター外の得点を得た動物は、軽症すぎるか又は重症すぎる欠陥を有すると判断され、さらなる分析から除外した。神経学的得点で０の得点を得るか、又は≧１のホィスカータッチ得点及び≦２のフットフォールト得点を得た動物（傷害なし）あるいは≧２の神経学的得点を得た動物（重症の傷害）を、さらなる分析から除外した。
【００５５】
閉塞から７日後に、梗塞サイズ及び機能的結果に関して動物を分析した。
【００５６】
【表１】
2006521405.tif 000003
【００５７】
薬剤及び投与
デキストロルファン酒石酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＥＰＯのビヒクル（蒸留水中の４．３８ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌ，１．１ｍｇ／ｍｌ  ＮａＨ２ＰＯ４，１．６ｍｇ／ｍｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４，５．０ｍｇ／ｍｌ  グリシン，０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｔｗｅｅｎ  ８０，Ｐｈ６．９）中に、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。組換えヒトエリトロポイエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａ）を、ビヒクル溶液中でその最終的濃度まで希釈した。すべての薬剤を、３つの投薬養生の１つにより１ｍｌ／ｋｇの容積で尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した：
１）１日投薬養生−ビヒクル、デキストロルファン（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＥＰＯ（５０００ＩＵ／ｋｇ）を左ＣＣＡの閉塞の直前に（０時間）投与し、続いて２回目の投薬を１時間後、血流の回復の直後に与えた。
２）複数日投薬養生−ビヒクル又はＥＰＯ（５０００ＩＵ／ｋｇ，２５００ＩＵ／ｋｇもしくは１２５０ＩＵ／ｋｇ）を０時間に投与し、続く投薬を２４時間及び４８時間後に与えた。
３）遅延複数日投薬養生−ビヒクル又はＥＰＯ（５０００ＩＵ／ｋｇもしくは２５００ＩＵ／ｋｇ）を閉塞から６時間、２４時間及び４８時間後あるいは閉塞から２４時間及び４８時間後に与えた。
梗塞体積の決定
７日後に動物を犠牲にし、それらの脳を取り出し、氷冷ＰＢＳ中に入れた。脳マトリックス（Ｋｅｎｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて脳を２ｍｍの厚さの切片に切断し、次いで２％  ２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で染色した。立体顕微鏡に接続されたＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）カメラを用いて脳切片を画像化し、コンピューターの助けを借りて梗塞サイズを決定した。すべての切片の梗塞体積を合わせ、絶対梗塞体積を与えた。相対梗塞体積（絶対梗塞体積／大脳半球の全体積）も決定した。
行動分析
修正Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｃｈａｌｌｅｒｔフットフォールト試験（１８）を用い、動物を機能的回復に関して評価した。この試験では、０．５ｃｍの直径の金属棒の間に２
ｃｍの空間を有する格子上に動物を置く。動物を２分間観察し、それらの前肢及び後肢が空間を通って落ちる回数を数える。
統計的分析
Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｉｓ試験を用いて処置群の非−パラメーター分析（ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行ない、続いて後−ｈｏｃ分析（ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行なって処置群をビヒクル標準群と比較した。
【００５８】
結果
外科手術的結果
合計で２２９匹の動物がこの研究のためにＭＣＡＯを受けた。これらの中で２８匹は７日における分析の前に死亡し、４匹は２４時間評価の際に除外された（材料及び方法ならびに表１を参照されたい）。この研究における梗塞サイズ及び梗塞の位置に関して調整する試みで、皮質下が付随的に伴う梗塞（ｉｎｆａｒｃｔ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂ−ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）を有する動物（ｎ−２１）を分析から除外した。体重又は体温に関し、処置群の間で統計的な差はなかった。
１日投薬養生
ＥＰＯの１日投薬養生が梗塞体積を減少させ、機能的結果を向上させる力を調べた。デキストロルファン（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＥＰＯ（５０００ＩＵ／ｋｇ）で処置された動物は、閉塞から７日後に分析すると、ビヒクル処置動物と比較して梗塞体積及び機能的結果において差を示さなかった（図１）。デキストロルファンは、閉塞から２４時間後に分析すると、梗塞体積を減少させた（データは示されない）。
複数日投薬養生
閉塞の時点ならびに閉塞から２４時間及び４８時間後に与えられるＥＰＯの複数日の毎日の投薬の効果も調べた。２５００ＩＵ／ｋｇの投薬量においてＥＰＯを用いる複数日処置は、絶対梗塞サイズ（図２Ａ）及び相対梗塞サイズ（データは示されない）の両方における３０％減少を生じ、それらは統計的に有意であった（ｐ＜．０５）。この梗塞サイズにおける減少は、５０００ＩＵ／ｋｇの投薬レベルにおいても１２５０ＩＵ／ｋｇの投薬レベルにおいても観察されなかった。行動分析は、ビヒクル処置動物と比較して、５０００ＩＵ／ｋｇにおいて６１％及び２５００ＩＵ／ｋｇにおいて６５％の機能的回復における有意な向上を示した（それぞれｐ＜．０１及びｐ＜．００１，図２）。１２５０ＩＵ／ｋｇにおけるＥＰＯは機能的結果に効果を有していなかった。
遅延複数日投薬養生
発作の患者を発作発生の直後に緊急処置室に到達させることが、多くの場合に現実的でないかもしくは不可能であることは周知である。本発明は、ＥＰＯ処置の遅れた開始が発作回復の補助において有効であることを示す。本発明において、ＥＰＯの初期投薬を閉塞から６時間後に遅らせ、次いで２４時間及び４８時間に投薬した。処置を６時間遅らせると、ＥＰＯの５０００ＩＵ／ｋｇの投薬も２５００ＩＵ／ｋｇの投薬も梗塞サイズにおける有意な減少を生じなかった（図３）。予期に反して、５０００ＩＵ／ｋｇ及び２５００ＩＵ／ｋｇの投薬レベルの両方は、機能的得点をビヒクルよりそれぞれ４６％（ｐ＜．０５）及び５６％（ｐ＜．０１）向上させた。１日目の投薬を省き、傷害から２４時間及び４８時間後にＥＰＯを与えると、類似の結果、すなわち梗塞サイズにおける減少なしならびに５０００ＩＵ／ｋｇ（４９％）及び２５００ＩＵ／ｋｇ（６８％）における機能的結果のビヒクルを超える有意な向上が観察された（ｐ＜．０１）（図４）。
【００５９】
ＥＰＯの複数日投薬養生は、ビヒクル処置動物と比較して梗塞サイズを減少させ、機能的結果を向上させた。ＥＰＯの初期投薬を閉塞から２４時間後まで遅らせることは、機能的結果の向上において有効であるが、梗塞サイズの減少においては有効でない。１日投薬養生は梗塞サイズ又は機能的結果に効果を有していなかった。
【００６０】
本研究は、以前に報告された急性虚血性発作の動物モデルにおけるＥＰＯの有効性を支
持する。さらにデータは、ＥＰＯが機能的結果を向上させるために利用できる治療時間ウィンドウを延長するための証拠を提供し、神経系の障害のための治療としてＥＰＯを考える場合、投薬養生が重要であることを示す。
【００６１】
前記の明細書は本発明の原理を記載しており、例示の目的で実施例が与えられているが、本発明の実施は、前記の請求項及びそれらの同等事項の範囲内に含まれる通常の変更、応用及び／又は修正のすべてを包含することが理解されるであろう。
【００６２】
【表２】
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【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】１日の投薬が梗塞サイズに効果を有していないことを示すグラフ。
【図１Ｂ】１日の投薬が機能的結果に効果を有していないことを示すグラフ。
【図２Ａ】エリトロポイエチンの複数日投薬が梗塞サイズを減少させることを示すグラフ。
【図２Ｂ】エリトロポイエチンの複数日投薬が機能的結果を向上させることを示すグラフ。
【図３Ａ】遅れた複数日のＥＰＯの投与が梗塞サイズに効果を有していないことを示すグラフ。
【図３Ｂ】遅れた複数日のＥＰＯの投与が機能的結果を向上させることを示すグラフ。
【図４Ａ】閉塞から２４時間後のように遅くに開始されるＥＰＯが梗塞サイズの減少に有効ではないことを示すグラフ。
【図４Ｂ】閉塞から２４時間後のように遅くに開始されるＥＰＯが機能的結果を向上させることを示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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