(57)【要約】発現クローニングを用いる、細胞分化に必要な遺伝因子を特定する方法が開示される。どの遺伝因子によって出発細胞タイプから標的細胞タイプへの細胞分化が誘導されるかを決定するために、cDNAライブラリーを入手し、これを発現ベクターに詰めて出発細胞タイプの細胞に移す。前記発現ベクターはまた好ましくは、標的細胞タイプの組織タイプで稼動する組織特異的プロモーターの制御下にあるマーカー遺伝子系を含む。続いて、前記形質転換させた細胞を細胞分化が開始するまで培養し、続いて前記培養のスクリーニングまたは選別を実施して、標的細胞タイプへの分化を経た細胞を特定する。前記分化細胞中のcDNA挿入物を調べることによって、分化プロセスに必要な遺伝因子を特定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、出発細胞から標的細胞への分化に必要な遺伝因子を特定する方法：
前記標的細胞タイプで発現される遺伝子を表すｃDNAライブラリーを入手し；
前記ｃDNAのコピーを、前記出発細胞タイプで発現される発現ベクターに配置し；
前記発現ベクターで前記出発細胞タイプの細胞を形質転換し；
前記出発細胞タイプの細胞を、少なくともいくつかの細胞が分化するまで培養し；
標的細胞タイプに分化した少なくとも1つの細胞を前記培養細胞で特定し；さらに
前記分化した細胞でｃDNAを特定して、前記細胞分化に必要な遺伝因子を特定する。
【請求項２】
前記出発細胞タイプがヒト未分化幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現ベクターが、EBVベクターおよびレンチウイルスベクターから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記出発細胞が、さらに組織特異的プロモーターの制御下にあるマーカー系を含み、前記プロモーターが前記標的細胞タイプで前記マーカー系の組織特異的発現を惹起し、さらに前記少なくとも１つの細胞を特定する工程が、前記マーカー系を発現する細胞を特定することによって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカー系が選別可能マーカーである請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記cDNAを特定する工程が、前記分化細胞から回収したDNAについてPCRプロセスを実施することによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、出発細胞から標的細胞への分化に必要な遺伝因子を特定する方法：
前記標的細胞系列の細胞のmRNAからｃDNAライブラリーを作製し；
前記ｃDNAライブラリーのコピーを、前記出発細胞タイプで発現される発現ベクターに配置し；
前記発現ベクターで前記出発細胞タイプの細胞を形質転換し；
前記出発細胞タイプの細胞を、少なくともいくつかの細胞が分化するまで培養し；
標的細胞タイプに分化した少なくとも1つの細胞を前記培養細胞で特定し；さらに
前記分化した細胞でｃDNAを特定して、前記細胞分化に必要な遺伝因子を特定する。
【請求項８】
前記出発細胞タイプがヒト未分化幹細胞である請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターが、EBVベクターおよびレンチウイルスベクターから成る群から選択される請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記出発細胞が、さらに組織特異的プロモーターの制御下にあるマーカー系を含み、前記プロモーターが前記標的細胞タイプで前記マーカー系の組織特異的発現を惹起し、さらに前記少なくとも１つの細胞を特定する工程が、前記マーカー系を発現する細胞を特定することによって実施される請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカー系が選別可能マーカーである請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記cDNAを特定する工程が、前記分化細胞から回収したDNAについてPCRプロセスを実施することによって行われる請求項7に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願第S.N.60/365,359（2002年3月15日出願）についての優先権を主張する。
【０００２】
背景技術
現代細胞生物学には生きている生物の細胞にin vitroで操作を加える多様な技術が含まれている。特に重要で興味深い細胞培養カテゴリーは幹細胞として知られている。幹細胞は、多数のプロジェニター細胞タイプに分化する能力を有する未分化または部分的にのみ分化した細胞である。幹細胞という用語は、より大型の生物において１つのカテゴリーの細胞タイプの祖先である細胞タイプを指すために用いるか（例えば造血幹細胞）、または全体的に未分化の幹細胞を指すことができる。後者は、少なくとも理論的には全生物体の任意の組織に分化する能力を有する。幹細胞培養は様々な多数の動物の多様な組織から開発されている。
【０００３】
最近になって、霊長類の胚性幹細胞（ヒトの胚性幹細胞を含む）を作出し、これを培養し、維持することが可能になった。例えば米国特許5,843,780号および6,200,806号(両特許ともThomson)を参照されたい。霊長類の胚性幹細胞は、培養で無限に生存し、さらに霊長類の身体の主要な組織タイプに分化する能力を有する細胞で構成され、最初は胎児から採取された細胞から得られた幹細胞培養である。霊長類の胚性幹細胞は未分化の状態で培養で維持することができるが、また分化プロセスを開始させ、それによって細胞をいろいろの発生細胞系列に拘束することもできる。典型的には、幹細胞の種々の組織タイプへの分化は組織胚様体の形成で開始し、それによって組織胚様体中の幹細胞は種々の細胞タイプへの分化を前記胚様体の種々の部分で開始する。実際、未分化状態でヒト胚性幹細胞を維持するには培養条件に対する綿密な注意が要求される。なぜならば、培養条件が不正確な場合、それら細胞は偶発的に無制御分化を開始するからである。
【０００４】
幹細胞の開発によって可能になった目覚しい研究分野の1つは、どの遺伝子または因子によって未分化細胞が拘束された細胞系列への分化を開始するかを理解しようとするものである。学説によれば、幹細胞の極めて初期の分化の場合、ただ1つの遺伝子がONまたはOFFの切り換えを実施し、その後で前記幹細胞に（別の他の細胞ではなく）いくつかの遺伝子の発現を開始させ、それによって特定の細胞系列への拘束を獲得させる。この初期分化段階に必要な遺伝因子を特定することは些細な問題ではない。しかも学問的には前記の疑問は生物の初期発生を理解する上で重要である。
幹細胞と分化の第一段階を達成した細胞との間でRNA比較分析を実施し、幹細胞で産生されないどのRNA種が子孫細胞で産生されるかを特定することが可能である。RNA発現比較実験によって、ある細胞が特定の系列に拘束されたときどの遺伝子のスイッチが入れられるかを、前記細胞を生じた未分化幹細胞と比較して知ることが可能になった。しかしながら、スイッチを入れる遺伝子の目録を所有していても、前記プロセスの結果としてスイッチを入れられる多数の遺伝子の中から前記プロセスを開始させた遺伝子を識別するためには役立たない。実際、RNA比較分析を用いて、分化プロセスを開始させる遺伝子を特定することは極めて困難であるかまたは非現実的である。なぜならば、細胞内因子（例えば転写因子）は、細胞分化に変化をもたらす効果を示すために極めて大量に生成されるとは限らないからである。本方法は、一次細胞分化に必要な因子の特定にこれまで利用することができなかった。
【０００５】
発明の開示
本発明の要旨は、出発細胞タイプから標的細胞タイプへの細胞の分化に必要な細胞因子を特定する方法である。本方法は、ｃDNAライブラリー（標的細胞タイプに由来する）を使用して発現された遺伝子をランダムにクローニングすることから始まる。前記ｃDNA遺伝子を出発細胞タイプの細胞で有効な発現ベクターに移す。前記発現ベクターを出発細胞に移し、続いて前記細胞を標的細胞へ分化させることができるように前記細胞を培養する。所望の標的細胞へ分化したこれらの細胞を、好ましくは選別マーカーの使用により特定する。続いて前記DNAを分化した細胞から回収し、さらにそのDNAを分析してどの挿入DNAが標的細胞タイプへの分化をひき起こしたかを決定する。このようにして、特定の単一細胞の分化に必要な細胞性因子を特定することができる。
本発明の目的は、第一次細胞分化に必要な因子を特定する方法を提供することである。
本発明の特徴は、本発明はヒト胚性幹細胞から始まる細胞分化の最初のステージに必要な遺伝因子の特定を可能にするということである。
本発明の他の目的、利点および特徴は以下の明細書から明らかになろう。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、未分化細胞から分化細胞または部分的分化細胞への一次分化に必要な遺伝子または遺伝因子を特定することである。本明細書に開示する方法はまた、初期に分化した細胞をさらに身体の多様な細胞系列にさらに分化させる遺伝子または遺伝因子を特定するためにも用いることができる。本方法（本明細書では発現クローニングと称される）は遺伝子発現ライブラリーを利用し、前記ライブラリーを発現ベクターに移し、これを問題の未分化細胞に挿入する。続いて前記未分化細胞を分化させる。さらに所望の細胞タイプに分化した細胞を特定する。いったん標的細胞を特定したら、通常のDNA性状決定技術を用いて、どのcDNA種が未分化細胞から問題の細胞タイプへの分化を惹起するかを特定することができる。
【０００７】
本発明の方法は、細胞分化の第一ステージに必要な遺伝因子の特定を可能にするために、すなわち極めて未分化の細胞（多能幹細胞）に身体の種々の組織への分化プロセスを開始させる因子を特定するために開発された。特に、ヒト幹細胞を用いて前記プロセスにより、どの遺伝因子が、最終的にはヒトの身体の全ての細胞を構成する多様な細胞系列への分化プロセスを前記幹細胞に開始させるかを決定することが可能である。本発明の方法の技術および詳細はヒトの胚性幹細胞に適用できるように開発されているが、前記方法は、培養されている多くの細胞タイプについて（出発の未分化細胞から最終分化標的細胞まで）、多様な分化レベルで用いることができる。本明細書ではヒト未分化幹細胞という用語は、ヒト胚性幹細胞の発生能力を有する細胞（特に他の供給源に由来する細胞、例えばヒト胎児の生殖細胞系列の細胞および成熟体または成人の体に由来する幹細胞を含む）を指すために用いられる。
本発明の方法はしたがって、出発細胞タイプ（例えば未分化細胞タイプ）および標的細胞タイプ（例えば幹細胞から何らかの別のタイプの細胞の前駆細胞へとある分化段階を経た細胞）を選択することから開始する。例示すれば、前記標的細胞タイプは神経細胞系列に拘束された細胞である。前記細胞はしかしながらその他の点では未分化であり、本明細書では神経前駆細胞と称される細胞タイプである。
本プロセスの次ぎの工程は、前記細胞から発現された遺伝子ライブラリーを選択することである。この目的を達成するためには2つのおおまかな方法、ライブラリーの作製またはリファレンスライブラリーの使用がある。典型的には、遺伝子の発現が明らかな核酸の採集を所望するときは、問題の組織、細胞または生物のcDNAを使用するかまたは作製する。cDNAライブラリーは、典型的には標的細胞タイプの系列細胞に存在するmRNA種から作製されるが、もっとも適切には標的細胞タイプ自体から作製される。他の選択肢は、リファレンスライブラリーコレクションの使用である。例えば、米国NIHの指針に基づいて、哺乳類遺伝子コレクション（MGC）として知られる遺伝子コレクションを確立するために共同研究が進行中である。前記MGCは、個々の実験または研究のために作製されるmRNAを使用する場合の限界のいくつかを克服する明確な遺伝子発現ライブラリーとなろう。MGCは、マウスおよびヒトcDNAライブラリーから得られる完全長転写物のためのクローン、アイデンティファイヤーおよび配列を含むであろう。リファレンスライブラリーのクローンセットの使用によって、クローンが完全長であることが担保され、実験室で作製されるmRNAライブラリーに共通の2つの問題が回避される。前記の問題は、ｍRNAライブラリーは、それが作製された細胞で豊富に発現される遺伝子を過剰に表す（represent）傾向があるということと、前記ライブラリーのクローンはしばしば完全長ではないということである。一般的には、より公平なcDNA種の表示（representation）および完全長のクローンメンバーのために、発現遺伝子のリファレンスライブラリーを使用することが一般的にはより効果的で好ましい。リファレンスライブラリーの使用はまた、遺伝子またはクローンのサブセットの特定を可能にし、他の遺伝子よりも所望の遺伝子カテゴリー（例えば転写調節因子）を優先的に調査し、または作製しなければならないクローンの数を制限することができる。したがって、神経前駆細胞の例に戻れば、前記cDNAライブラリーは、最終分化神経細胞、神経前駆細胞、または前記2つの細胞の間に存在する細胞系列に位置する任意の細胞に存在するmRNA種を象徴するように前記いずれかの方法によって作製される。
【０００８】
本方法は分化に必要な遺伝子の検出に用いることができるが、前記はまた逆の場合でも同様に用いることができる。出発細胞が分化細胞であり、標的細胞が未分化幹細胞である場合は、本方法は1つの細胞の状態を幹細胞として制御する遺伝子の特定に用いることができる。
続いてcDNAライブラリーのcDNA種を霊長類未分化幹細胞で発現することができる発現ベクターでクローニングする。多くの哺乳類遺伝子発現ベクターは幹細胞では良好に機能しないことが判明したので、この発現ベクターの選択は重要なパラメーターであり、下記で詳細に考察されるであろう。
【０００９】
前記発現ベクターは、トランスフェクトされた幹細胞内で発現されるべきcDNA種のみを含むのではなく、前記はまた形質転換が成功した形質転換体の検出に用いることができるマーカー遺伝子系も含む。そのようなマーカー系は、下記の考察から理解されるように、所望の分化段階を経た幹細胞培養から前記細胞を特定するために必要である。マーカー遺伝子系（前記は形質転換体のために細胞をスクリーニングすることを可能にするスクリーニング可能マーカー、または選別物質が形質転換体を選別することを可能にする選別可能マーカーを含むことができる）は、前記マーカー遺伝子を発現する形質転換細胞の特定を可能にする。スクリーニング可能マーカー［例えば緑色蛍光タンパク質遺伝子（発現細胞に蛍光を与える）］の場合、細胞培養は検出可能な表現型（例えば細胞の蛍光）の発現についてスクリーニングされる。選別可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）の場合、細胞培養は選別物質［例えば抗生物質、前記は選別可能マーカー遺伝子(この場合は抗生物質耐性遺伝子)を発現している細胞以外の全ての細胞にとって毒性を有する］に暴露される。そのようなマーカー系の使用は遺伝子による形質転換プロセスにおいて一般的に実施され、他の多くのタイプのマーカーおよびマーカー例が当技術分野で知られている。
【００１０】
さらにまた、前記マーカー系は、標的細胞の細胞タイプに特異的な組織特異的プロモーターの制御下にあることが好ましい。例えば、神経前駆細胞への分化に必要な遺伝子を特定するプロセスで選別可能な抗生物質耐性遺伝子が用いられる場合、前記抗生物質耐性遺伝子は、神経細胞でそれが制御する遺伝子のみを発現させるプロモーターの制御下にあるであろう。このようにして、前記マーカーで形質転換された細胞が標的細胞タイプに分化したときにのみ、前記マーカーは発現されるであろう。
したがって、本方法は以下のように進行する。CDNAライブラリーを作製し、これを発現ベクター系でクローニングする。前記発現ベクター（cDNAライブラリーおよびマーカー系の両者を含む）で前記細胞タイプの細胞を形質転換する。続いて前記出発細胞タイプ培養を培養する。この培養は、細胞分化に有利な他の条件を含まないことが好ましい。実際、この段階の細胞培養は未分化状態を維持する細胞に有利であることが好ましい。このようにして、挿入cDNAが存在しこれを発現することによって分化が誘導された細胞のみが実際に分化するであろう。前記分化細胞は多くの方法によって検出することができる。ある方法は単純に所望の分化段階と一致する形態的変化について細胞を調べるものである。好ましい方法は、この目的のために発現ベクターに包含させたマーカー系を使用するものである。前記マーカー系は、前記系を発現している細胞を検出するために用いられる。前記マーカー系の発現は、前記マーカー系を駆動する組織特異的プロモーターが発現の駆動を開始したことを示す。前記発現駆動の開始は、前記細胞が標的細胞に分化したことを示す。この時点で、前記特定の細胞に形質転換させたcDNA種は、前記出発細胞タイプの標的細胞タイプへの分化に必要であるということが確実であろう。今やこのcDNAは何であるかを特定しなければならない。
【００１１】
次ぎの工程はPCR反応によって極めて容易に実施される。前記発現ベクターは以前に性状が調べられ、ベクター内のcDNAセグメント周囲の5'および3'フランキング領域が判明している。そこでDNAを分化細胞から回収し、前記発現ベクターの前記フランキング領域から選択したプライマー（前記はcDNA挿入物のいずれかの側に存在する）を用い前記回収DNAでPCRプロセスを実施する。前記PCRプロセスの生成物は、一方のプライマーから他のプライマーへ伸長し、したがってcDNA挿入物を縦断して伸長する増幅DNAであろう。前記PCR反応生成物のDNA配列決定によって、細胞分化を惹起したcDNA挿入物のDNA配列を決定することができる。細胞はただ１つの発現ベクターによって形質転換されたと仮定すれば、前記の事柄は、このただ１つのcDNAは、未分化細胞で発現されたとき前記細胞を標的細胞へ分化させるタンパク質をコードすることを示唆するであろう。換言すれば、前記のプロセスは細胞系列の分化のただ1つの段階に必要なただ1つの遺伝因子の特定を可能にする。
【００１２】
本方法はしたがって、分化事象に附随するクローンを見出すために多数のクローンをスクリーニングする必要があったことに留意されたい。多数のクローンをスクリーニングすることは困難であるので、範囲が限定されたライブラリーを使用することによってプロセス全体がより有効になることにまた留意されたい。実験室で作製されるライブラリーでは、完全長クローンの数は変動するであろう。本明細書でのスクリーニングは比較的稀な事象についてであるので、対象となりそうな遺伝子のみを含むようにライブラリーが限定されればされるほど、対象の遺伝子に対すると思われる検索は短くなるであろう。ノンランダムまたは限定ライブラリーを用いれば、ライブラリーのメンバー数が取り扱い可能な数であるライブラリーから開始することが可能である。例えば、ヒトゲノムは現在のところ約50,000の開放読み枠を含むだけであると考えられている。例えば、転写の制御に必要とされそうな種のみをカバーするためにライブラリーのクローンがさらに限定されるならば、前記の数を一層少なくすることができる。
【００１３】
以前に述べたように、この発現クローニング技術は、未分化細胞タイプで機能するクローニングベクターの使用を必要とする。ヒト胚性幹細胞の実験の場合、外来遺伝子をヒト胚性幹細胞で発現させるために適した発現ベクターを見つけることは、些細な作業ではないことが証明された。哺乳類細胞で有用なほとんどの発現ベクターが、ヒト胚性幹細胞では相応なレベルで有効に機能しない。ヒト胚性幹細胞で外来遺伝子の発現を可能にする2つの発現ベクターがあることが見出された。前記2つのベクターはエプスタイン-バーウイルス系ベクターであり、第二のタイプはレンチウイルス発現ベクターである。
エプスタイン-バーウイルス（EBV）発現ベクターは市販の発現ベクターを基にしている。前記EBVは約172kbのゲノムを含み、形質転換細胞内ではマルチコピー、環状エピソームとして過剰染色体により維持される。前記エピソームは細胞とともに複製し、娘細胞に忠実に分配される。EBVベクターは、挿入DNA構築物を含むエピソームをヒト胚性幹細胞に移すことができる。前記構築物は続いて忠実に前記形質転換細胞で発現される。EBV系発現ベクターに関する更なる情報は、本提出物に含まれる添付物1に記載されている。
【００１４】
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）を含むレトロウイルス類を基にしている。レンチウイルスベクターはヒト胚性幹細胞の形質転換に有効であることが立証された。レンチウイルスゲノムは全てのレトロウイルスに共通する構造遺伝子（gag、polおよびenv）を含み、その他に2つの調節遺伝子（tatおよびrev）および4つの附随遺伝子（vpr、vif、vpuおよびnef）を含む。前記4つの附随遺伝子はin vivoでの複製および病理発生で機能し、レンチウイルスベクターから排除することができるが、ただしこれらのいくつかは前記発現ベクターの機能についていくつかの細胞タイプに対しては利点を提供するかもしれない。本発明で開示する前記プロセスで用いることが意図されているレンチウイルスベクターでは、プラスミドベクターを用いてパッケージング細胞株でgag、pol、tatおよびrevを発現させるが、完全な遺伝子コピーは、幹細胞株に移されるトランスファー発現ベクターから除外される。レトロウイルスの親和性は、特定の細胞表面レセプターと結合するenvタンパク質によって主として決定される。したがって、適切な細胞表面レセプターを欠く細胞は前記レトロウイルスで形質転換させることは困難であろう。もっとも幅広い可能な親和性を前記発現ベクターに付与するために、水疱性口内炎ウイルス（VSV）のG糖タンパク質を用いてシュードタイプが作製されるであろう。VSV-Gは細胞膜のリン脂質成分に直接作用し、細胞膜との融合によりウイルスの細胞への侵入を仲介する。VSV-Gをレトロウイルスのenvタンパク質と置換えて、極めて広い親和性を有するハイブリッドシュードタイプウイルス粒子を作製することができる。前記発現ベクターは、パッケージング、逆転写および組み込みに必要なHIVのcis-作動性配列を含むベクターから誘導することができる。これらの配列は、HIV5'LTR、リーダー配列および5'スプライスドナー部位、gag遺伝子の約360塩基対（gag配列の翻訳を防止する制限エンドヌクレアーゼフレームシフト変異を含む）、env遺伝子の700塩基対（核外輸送のためにRev-反応性エレメント（RRE）を含む）、3'スプライスアクセプター部位およびHIV3'LTRを含む。内部プロモーターによって制御される遺伝子発現に対するウイルス配列の起こりえる干渉作用を減少させるために、全てのベクターはまた3'HIVLTRのU3領域に400塩基対の欠失を含む。この配列は、その後のゲノム組み込みでの逆転写の間に5'LTRにコピーされるので、5'LTRプロモーター／エンハンサーはホストゲノムに組み込まれた後機能を失う傾向がある。この改変をもつベクターは時に自己不活化型と称される。
【００１５】
レンチウイルスは非分裂細胞に感染することができる。このことは前記の目的のために重要な特性である。非分裂細胞に感染するレンチウイルスのこの能力はgag、polおよびvpr遺伝子の遺伝子産物により仲介される。最近になって、核内輸送に必要な別のエレメントはpolコード領域内に存在するcis-決定基［中央プリン帯（cPPT）として知られている］であることが特定された。この理由のために、cPPT領域は本発明で使用するレンチウイルスベクターに取り込まれる。レトロウイルスのゲノムへのランダムな組み込みに起因する組み込み場所による効果は、組み込み後すぐにベクターの転写サイレンシングに貢献し、さらにまた発現の多様化および発現の消滅にも貢献する。
【００１６】
実際のレンチウイルスベクターを構築するために、Robert Hawley（American Red Cross, Rockville, Md.）から譲渡されたレンチウイルスベクターpSIN-EF-EGFPから始めた。ヒト胚性幹細胞と一緒に使用するために前記ベクターを改変するために、前記ベクターを改変して構築物のサイズを減少させ、組換えをさらに効果的にした。その後のクローニング工程を単純にするために、ベクターをBamHIで消化し再度連結することによってGFPカセットを除去した。前記再連結したベクターをpSIN-EF-delと称する。ベクターのサイズを小さくするために、NcoI部位（8990）からHpaI部位（202）で1909の塩基対を欠失させ、pSIN-EF-del2と称するベクターを作製した。これによってベクターのサイズは10659から8750塩基対に減少した。続いてGATEWAY（Invitrogen, Life Sciences, Carlsbad, CA）ベクターコンバージョンカセットBを本来のベクターの塩基対4082のSmaI部位に付加してpSIN-EF-del2-GATEWAYと称するベクターを作製した。今やこのベクターを用いて、個々のクローン、クローン群、または完全なライブラリーを過剰発現実験で使用するためにレンチウイルスベクターに直接移すことができる。前記ベクターは図1に示されている。前記ベクターの配列は配列番号:1に含まれている。
【００１７】
EBV系ベクターの開発は繰り上げて実施された。EBVベクターはWilliam Sugden（University of Wisconsin）の研究室から入手した。ヒト胚性幹細胞と一緒に用いるために入手したので前記ベクター（p2300）を改変するために、プロモーターをCMVプロモーターからEF1アルファプロモーターに変更した。さらにまた、ポリリンカーを付加し、通常の連結仲介クローニング方法を用いる操作を実施しやすくした。さらにまた、GATEWAYカセットをベクターに付加し、前記組換え系にベクターを適合させた。
これらの変更を実施するために、緑色蛍光タンパク質（GFP）のための遺伝子を下記のプライマーJS1およびJS2（複数の制限部位を含む）を用いて増幅することにより開始した。PCR生成物をNotIおよびClaIで消化し、p2300のNotI／ClaI部位でクローニングした。得られたプラスミドをpJMS001と称した。次に、EF1アルファプロモーターを下記のプライマーJS5およびJS7を用いて増幅し、生成物をSmaIおよびEcoRIで消化し、得られたフラグメントをpJMS001のNruI／EcoRI部位に連結した。得られたプラスミドをpJMS002と名付けた。続いてpJMS002をEcoRIおよびBamHIで切断し、末端をT4-DNAポリメラーゼを用いて平滑端にした。GATEWAYカセットBを前記プラスミドに連結し、pJMS002-GATEWAYと称するプラスミドを得た。本明細書に開示した方法での使用に適応させた本ベクターは図2に示され、その配列は配列番号:2に示されている。
【００１８】
プライマーリスト
JS1：GCATCGATTTCGAAGAATTCCACCGGTCGCCACCATGGTG
JS2：AAAAGGAAAAGCGGCCGCCTCGAGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCC
JS5：CGGCCCGGGGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC
JS7：GGCGAATTCGAACTCGAGACCACGTGTTCACGACACC
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の方法での使用に適応させたベクターを示す。
【図２】本発明の方法での使用に適応させたベクターを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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