(57)【要約】本発明は、被検体を活性依存性神経栄養因子(ADNF)ポリペプチドで治療することによって、被検体における自己免疫疾患(多発性硬化症を含む)を、ADNFポリペプチドを用いて予防および/または治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における自己免疫疾患を予防または治療する方法であり、以下の段階を含む方法:
治療有効量の活性依存性神経栄養因子(ADNF)ポリペプチドを被検体に投与する段階であり、ADNFポリペプチドが、
(a)以下のアミノ酸配列:
Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)を有する活性コア部位を含むADNFIポリペプチド;
(b)以下のアミノ酸配列:
Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)を有する活性コア部位を含むADNFIIIポリペプチド;ならびに
(c)パート(a)のADNFIポリペプチドおよびパート(b)のADNFIIIポリペプチドの混合物からなる群より選択されるメンバーである、段階。
【請求項２】
ADNFポリペプチドが、完全長ADNFIポリペプチド、完全長ADNFIIIポリペプチド、ならびに完全長ADNFIポリペプチドおよび完全長ADNFIIIポリペプチドの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ADNFポリペプチドがADNFIポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ADNFIポリペプチドの活性コア部位が少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ADNFIポリペプチドの活性コア部位が全種類のD-アミノ酸を含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
ADNFIポリペプチドがSer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)である、請求項3記載の方法。
【請求項７】
ADNFIポリペプチドが、
2006516253.tif 000009
からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項８】
ADNFIポリペプチドが、活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含む、請求項3記載の方法。
【請求項９】
ADNFポリペプチドがADNFIIIポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ADNFポリペプチドが完全長ADNFIIIポリペプチドである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ADNFIIIポリペプチドがAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:1)である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
ADNFIIIポリペプチドの活性コア部位が少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
ADNFIIIポリペプチドの活性コア部位が全種類のD-アミノ酸を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
ADNFIIIポリペプチドが、
2006516253.tif 000010
からなる群より選択されるメンバーである、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
ADNFIIIポリペプチドが、活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
ADNFポリペプチドの少なくとも1つが、被検体に投与される核酸にコードされる、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
パート(a)のADNFIポリペプチドおよびパート(b)のADNFIIIポリペプチドが被検体に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドのいずれかの活性コア部位または両方の活性コア部位が少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドのいずれかの活性コア部位または両方の活性コア部位が全種類のD-アミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
ADNFIポリペプチドがSer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)であり、ADNFIIIポリペプチドがAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
ADNFIポリペプチドが、
2006516253.tif 000011
からなる群より選択されるメンバーであり、
ADNFIIIポリペプチドが、
2006516253.tif 000012
からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
ADNFIポリペプチドが、ADNFIポリペプチドの活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含み、ADNFIIIポリペプチドが、ADNFIIIポリペプチドの活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
被検体が自己免疫疾患を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
自己免疫疾患を予防するためにADNFポリペプチドが投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群(Guillan-Barre syndrome)(抗リン脂質抗体症候群)、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erytromatosis)、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、橋本病/甲状腺機能低下症(hypothyroiditis)、原発性胆汁性肝硬変、混合結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブス病/甲状腺機能亢進症(hyperthyroiditis)、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、糖尿病性腎症、および敗血症ショックからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
ADNFポリペプチドが鼻腔内に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
ADNFポリペプチドが経口投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
ADNFポリペプチドが注射される、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2003年1月2日に出願されたUSSN60/437,650の優先権を主張し、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本願は、PCT WO1/92333;1992年4月22日に出願されたU.S.S.N.07/871,973(現在、U.S.Patent No.5,767,240);1994年10月17日に出願され、WO96/11948として公開されているU.S.S.N.08/342,297(現在、U.S.Patent  No.6,174,862);1997年2月7日に出願され、WO98/35042として公開されているU.S.S.N.60/037,404;1998年11月11日に出願され、WO00/27875として公開されているU.S.S.N.09/187,330;1999年3月12日に出願され、WO00/53217として公開されているU.S.S.N.09/267,511;1999年8月18日に出願され、WO01/12654として公開されているU.S.S.N.60/149,956;2000年5月31日に出願されたU.S.S.N.60/208,944;および2001年2月8日に出願されたU.S.S.N.60/267,805に関連し、各々はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多発性硬化症(MS)は、再発寛解型または慢性進行型の臨床症状を伴う中枢神経系(CNS)の慢性障害疾患である。MSの原因はまだ完全に解明されていないが、免疫機構が疾患の発症および進行に関与していると考えられている。CNSにおけるMS病巣の主な組織学的特徴は、髄鞘の破壊とオリゴデンドロサイトの死による脱髄であるが、軽度から中等度の軸索損傷および消失も、この疾患の後期慢性進行段階において生じることが述べられている。MS患者における病理学的研究から、高頻度の終末軸索損傷が不可逆的な神経障害と相関することが証明されている。
【０００４】
現在、MSを治癒する方法は知られておらず、有効な治療法はほとんどない。本発明は、これらの問題および他の問題に対処する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明の態様は、出生後機能を改善するのに十分な量の活性依存性神経栄養因子(Activity Dependent Neurotrophic Factor:ADNF)ポリペプチドを投与することによって、被検体における自己免疫疾患を予防および/または治療する方法を提供する。ADNFポリペプチドとして、それぞれの活性コア部位を含み、神経保護機能および成長促進機能をもたらすADNFIおよびADNFIII(ADNPとも呼ぶ)ポリペプチド、類似体、部分配列、D-アミノ酸型(全てD-アミノ酸のペプチドまたはD-アミノ酸とL-アミノ酸の混合ペプチドのいずれか)、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【０００６】
ADNFIポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(「SALLRSIPA」または省略して「SAL」もしくは「ADNF-9」と呼ぶ)を含む活性コア部位を有する。ADNFIIIポリペプチドもまた、数個のアミノ酸残基、すなわち以下のアミノ酸配列:Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(「NAPVSIPQ」または省略して「NAP」と呼ぶ)を含む活性コア部位を有する。これらのADNFポリペプチドは、それぞれ単独で、神経変性に関連する動物モデルにおいて顕著な効力および活性を有することが以前に示されている。
【０００７】
1つの態様において、前記方法は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列を有する活性コア部位を含むADNFIポリペプチドであるADNFポリペプチドを投与する段階を含む。別の態様において、前記方法は、完全長ADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列からなるADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、ADNFIポリペプチドが
2006516253.tif 000002
からなる群より選択されるADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、活性コア部位のN末端またはC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を有するADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。ある特定の態様において、ADNFIポリペプチドは、ADNFIポリペプチドのN末端およびC末端の両方に20個までのアミノ酸を有する。
【０００８】
ある態様において、前記方法は、ADNFIIIポリペプチドを投与する段階を含み、ADNFポリペプチドはAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列を有する活性コア部位を含むポリペプチドである。さらに別の態様において、前記方法は、完全長ADNFIIIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列からなるADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、ADNFIIIポリペプチドが
2006516253.tif 000003
からなる群より選択されるADNFIIIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を有するADNFポリペプチドを投与する段階を含む。ある特定の態様において、ADNFポリペプチドは、ADNFポリペプチドのN末端およびC末端の両方に20個までのアミノ酸を有する。
【０００９】
さらに別の態様において、前記方法は、ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物を投与する段階を含む。本発明のこの局面および他の局面において、本明細書に記載のADNFIポリペプチドのいずれか1つまたはそれ以上を、本明細書に記載のADNFIIIポリペプチドいずれか1つまたはそれ以上と混合することができる。
【００１０】
別の態様において、ADNFポリペプチドの活性コア部位は少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む。別の態様において、ADNFポリペプチドの活性コア部位は全種類のD-アミノ酸を含む。
【００１１】
さらに別の態様において、ADNFポリペプチドの少なくとも1つは、被検体に投与される核酸にコードされる。
【００１２】
ある態様において、被検体は自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症)を有する。ある態様において、ADNFポリペプチドは、自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症)を予防するために投与される。
【００１３】
ある態様において、自己免疫疾患は、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群(Guillan-Barre syndrome)(抗リン脂質抗体症候群)、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erytromatosis)、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、橋本病/甲状腺機能低下症(hypothyroiditis)、原発性胆汁性肝硬変、混合結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブス病/甲状腺機能亢進症(hyperthyroiditis)、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、糖尿病性腎症、および敗血症ショックからなる群より選択される。
【００１４】
ある態様において、ADNFポリペプチドは鼻腔内に投与される。ある態様において、ADNFポリペプチドは経口投与される。ある態様において、ADNFポリペプチドは注射される。
【００１５】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の発明の詳細な説明、添付の図面、および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになるであろう。
【００１６】
定義
句「ADNFポリペプチド」は、SALLRSIPA(「SAL」と呼ぶ)もしくはNAPVSIPQ(「NAP」と呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性コア部位を有する1種類もしくはそれ以上の種類の活性依存性神経栄養因子(ADNF)、または神経栄養活性/神経保護活性を有する、その保存的に改変されたバリアントを意味する。神経栄養活性/神経保護活性は、例えば、Hill et al.,Brain Res.603,222-233(1993);Brenneman et al.,Nature 335,636(1988);Brenneman et al.,Dev.Brain Res.51:63(1990);Forsythe & Westbrook,J.Physiol.Lond.396:515(1988);Gozes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:427(1996)に記載のインビトロ皮質ニューロン培養アッセイ法を用いて測定される。ADNFポリペプチドは、ADNFIポリペプチド、ADNFIIIポリペプチド、神経保護作用/神経栄養作用を示す(例えば、インビトロまたはインビボで、中枢神経系において生じるニューロンに対して神経保護作用/神経栄養作用を示す)、その対立遺伝子、多型バリアント、類似体、種間ホモログ(interspecies homolog)、その任意の部分配列(例えば、SALLRSIPAもしくはNAPVSIPQ)または親油性バリアントでもよい。「ADNFポリペプチド」はまた、ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物を意味してもよい。
【００１７】
用語「ADNFI」は、約14,000ダルトンの分子量と8.3±0.25のpIを有する活性依存性神経栄養因子ポリペプチドを意味する。前記のように、ADNFIポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(「SALLRSIPA」または「SAL」もしくは「ADNF-9」とも呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性部位を有する。Brenneman & Gozes,J.Clin.Invest.97:2299-2307(1996);Glazner et al.,Anat.Embryol.200:65(1999);Brenneman et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,285:619-27(1998);Gozes & Brenneman,J.Mol.Neurosci.7:235-244(1996);Gozes et al.,Dev.Brain Res.99:167-175(1997);およびGozes Trends in Neurosci.24:700(2001)を参照のこと。これらの全ては参照として本明細書に組み入れられる。特別の定めのない限り、「SAL」は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Alaのアミノ酸配列を有するペプチドを意味し、Ser-Ala-Leuのアミノ酸配列を有するペプチドを意味しない。ADNFIの完全長アミノ酸配列はWO96/11948に記載され、WO96/11948はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
句「ADNFIIIポリペプチド」または「ADNFIII」は、NAPVSIPQ(「NAP」と呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性コア部位を有する1種類もしくはそれ以上の種類の活性依存性神経栄養因子(ADNF)、または神経栄養活性/神経保護活性を有する、その保存的に改変されたバリアントを意味する。神経栄養活性/神経保護活性は、例えば、Hill et al.,Brain Res.603,222-233(1993);Gozes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:427-432(1996)に記載のインビトロ皮質ニューロン培養アッセイ法を用いて測定されるADNFポリペプチドは、ADNFIIIポリペプチド、神経保護作用/神経栄養作用を示す(例えば、インビトロまたはインビボで、中枢神経系において生じるニューロンに対して神経保護作用/神経栄養作用を示す)、対立遺伝子バリアントもしくは多型バリアント、類似体、種間ホモログ、またはその任意の部分配列(例えば、NAPVSIPQ)でもよい。ADNFIIIポリペプチドは約8個のアミノ酸からでもよく、例えば、8個〜20個、8個〜50個、10個〜100個、もしくは1000個、またはそれ以上のアミノ酸を有してもよい。
【００１９】
完全長ヒトADNFIIIは、123,562.8Daの推定分子量(1000個を超えるアミノ酸残基)および約6.97のpIを有する。前記のように、ADNFIIIポリペプチドは、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(「NAPVSIPQ」または「NAP」とも呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性部位を有する。Zamostiano et al.,J.Biol.Chem.276:708-714(2001)およびBassan et al.,J.Neurochem.72:1283-1293(1999)を参照のこと。それぞれが参照として本明細書に組み入れられる。特別の定めのない限り、「NAP」は、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Glnのアミノ酸配列を有するペプチドを意味し、Asn-Ala-Proのアミノ酸配列を有するペプチドを意味しない。ADNFIIIの完全長配列はWO98/35042およびWO00/27875で見られる。
【００２０】
用語「被検体」は、生活の任意の段階にある任意の哺乳動物(特に、ヒト)を意味する。
【００２１】
用語「接触する」は、本明細書では以下と同義に用いられる:組み合わされる、添加される、混合される、通過される、インキュベートされる、流されるなど。さらに、本発明のADNFIIIポリペプチドまたはそれをコードする核酸は、例えば、非経口経路、経口経路、局所経路、および吸入経路などの任意の従来法によって「投与」することができる。ある態様において、非経口経路および鼻吸入経路が用いられる。
【００２２】
「十分な量」、「有効な量」、または「治療有効量」とは、自己免疫疾患の症状の発生を阻止する、ある特定のADNFポリペプチドの量、または自己免疫疾患の症状を部分的にもしくは完全に緩和する、ある特定のADNFポリペプチドの量である。例えば、「十分な量」、「有効な量」、または「治療有効量」は、本明細書に記載のように、被検体におけるミエリン塩基性タンパク質(MBP)反応性細胞の頻度を減らす、またはTNFおよびIFN-αを減少させる、またはカプラン‐マイヤー曲線において障害の持続的進行を遅らせる、ある特定のADNFポリペプチドの量である。投与範囲は、使用されるADNFポリペプチド、投与経路、および特定のADNFポリペプチドの効力に応じて変化することがあるが、前述のアッセイ法を用いて容易に決定することができる。
【００２３】
用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、自然状態で見られるような通常付随している成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。純度および均一性は、一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学の技法を用いて決定される。調製物に存在する最も多数を占める種であるタンパク質が実質的に精製される。特に、単離されたADNF核酸は、ADNF遺伝子に隣接し、ADNF以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されている。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを意味する。特に、用語「精製された」は、核酸またはタンパク質の純度が少なくとも85％であり、より好ましくは純度が少なくとも95％であり、最も好ましくは純度が少なくとも99％であることを意味する。
【００２４】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖の形をしたその重合体を意味する。この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される、合成、天然、および非天然の既知のヌクレオチド類似体または改変されたバックボーン残基もしくは結合を含む核酸を含む。このような類似体の例として、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
特別の定めのない限り、ある特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント(例えば、縮重コドン置換)および相補配列、ならびに明確に示された配列も言外に含む。用語「核酸」は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと同義に用いられる。
【００２６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を説明するために本明細書で同義に用いられる。この用語は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の類似体またはミメティック（mimetic）であるアミノ酸重合体、ならびに天然アミノ酸重合体に適用される。
【００２７】
用語「アミノ酸」は、天然アミノ酸、アミノ酸類似体、ならびに天然アミノ酸およびアミノ酸類似体と同じように機能するアミノ酸ミメティックを意味する。天然アミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後から改変されたアミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン)である。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を有する(すなわち、α炭素が水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合している)合成アミノ酸(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)を意味する。このような類似体は、R基が改変されている(例えば、ノルロイシン)、またはペプチドバックボーンが改変されているが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。天然アミノ酸およびアミノ酸類似体は両方とも合成によって生成することができる。アミノ酸ミメティックは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同じように機能する化合物を意味する。
【００２８】
アミノ酸は、IUPAC-IUB生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)により勧告された一般に知られている三文字記号または一文字記号のいずれかによって本明細書で示すことができる。同様に、ヌクレオチドも、一般に受け入れられている一文字暗号によって示すことができる。
【００２９】
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変されたバリアントは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。詳細に述べると、1つもしくはそれ以上の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することによって、縮重コドン置換を行うことができる(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19: 5081 (1991);Ohtsuka et al.,J.Biol Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。遺伝暗号の縮重のために、多くの種類の機能的に同一な核酸が任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが特定されている全ての位置において、そのコドンは、コードされているポリペプチドを変えることなく、記載の対応する任意のコドンに変更することができる。このような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列もまた、可能な限りの核酸サイレント変異を示す。当業者であれば、機能的に同一の分子を生じるように、(通常、メチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)核酸の各コドンを改変できることを理解するだろう。従って、記載の各配列には、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異が言外に含まれている。
【００３０】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされている配列において1個のアミノ酸または少数のアミノ酸を変化、付加、または欠失する核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、これらの変化によってアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合、「保存的に改変されたバリアント」であることを理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野において周知である。このような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に加えられるものであり、これらを排除しない。
【００３１】
以下の群はそれぞれ、互いが保存的置換であるアミノ酸を含む。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)セリン(S)、スレオニン(T);
3)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
4)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
5)システイン(C)、メチオニン(M);
6)アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);
7)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V);および
8)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)
(例えば、Creighton,Proteins(1984)を参照のこと)。
【００３２】
2つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況での用語「同一の」またはパーセント「同一性」は、同じ2つ以上の配列または部分配列を意味する。用語「実質的に同一の」は、比較ウィンドウ上での最大一致(maximum correspondence)を得るように比較およびアラインメントされた時に、ある特定のパーセントの同じ(すなわち、60％、70％、80％、90％、95％、または99％同一性の)アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つ以上の核酸またはポリペプチドの配列または部分配列を意味する。このパーセントは、以下の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定される。本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、または完全長ヒトADNFポリペプチドと実質的に同一のADNFIポリペプチドもしくはADNFIIIポリペプチドを使用する態様を含む。好ましくは、パーセント同一性は、少なくとも約25アミノ酸長の配列領域にわたって、より好ましくは50個もしくは100個のアミノ酸長の領域にわたって、またはポリペプチド配列全体にわたって存在する。
【００３３】
配列比較のために、一般的に、1つの配列が参照配列として働き、参照配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用した場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよく、別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００３４】
本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、20〜600、通常には約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選択される連続した位置の数のいずれか1つのセグメントについての言及を含む。このセグメントにおいて、ある配列と、同じ数の連続した位置の参照配列が最適にアラインメントされた後に比較することができる。比較のための配列のアラインメント方法は当技術分野において周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所的ホモロジーアルゴリズム、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似度法(similarity method)のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって行うことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995 補遺を参照のこと))。
【００３５】
パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムはBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschul et.al.,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)およびAltschul et.al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)で述べられている。BLASTおよびBLAST2.0は、本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を求めるために本明細書に記載のパラメータと共に用いられる。BLAST解析を行うためのソフトウエアは、米国立バイオテクノロジー情報センターから公的に入手することができる。このアルゴリズムは、まず最初に、データベース配列中の長さWのワードとアラインメントされた時にある正の値の閾値スコアTにマッチまたは適合する、クエリー配列中の同じ長さの短いワードを特定することによって、高スコア配列対(high scoring sequence pair)(HSP)を特定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)(Altschul et.al.,前出)と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いHSPを発見する検索を開始するための種として働く。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加するかぎり、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM(一対のマッチ残基のリワードスコア(reward score);常に>0)およびN(ミスマッチ残基のペナルティースコア(penalty score);常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが用いられる。累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量Xだけ減少した時に、1つもしくはそれ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが0もしくはそれ以下になった時に、またはいずれかの配列の末端に到達した時に、両方向でのワードヒットの延長は止まる。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照のこと)、50のアラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
【００３６】
BLASTアルゴリズムはまた2つの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin & Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993)を参照のこと)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は最小合計確率(smallest sum probability)(P(N))であり、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率を示す。例えば、試験核酸と参照核酸を比較した時の最小合計確率が約0.2未満、より好ましくは約0.01未満および、最も好ましくは約0.001未満であれば、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【００３７】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることを示す別のものは、下記のように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。従って、例えば、2つのポリペプチドが保存的置換の点でしか異ならない場合、一般的に、ポリペプチドは第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることを示す別のものは、下記のように、2つの分子またはその相補物がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらに別のものは、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。
【００３８】
句「選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」は、ある特定のヌクレオチド配列が複合混合物(例えば、全細胞またはライブラリーのDNAまたはRNA)に存在する時に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ある分子がこの配列のみに結合、二本鎖形成、またはハイブリダイズすることを意味する。
【００３９】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、その標的部分配列に(一般的に、核酸の複合混合物中で)ハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、様々な状況で異なる。長い配列は高温で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの広範囲にわたる手引きは、Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に記載されている。一般的に、ストリンジェントな条件は、特定のイオン強度pHで、特定の配列の熱融点(Tm)より約5℃〜10℃低いように選択される。Tmは、(特定のイオン強度、pH、および核酸濃度で)標的に相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在する時、Tmでは、プローブの50％が平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン濃度、一般的に、約0.01M〜1.0Mのナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、温度が、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)の場合少なくとも約30℃、長いプローブ(例えば、50を超えるヌクレオチド)の場合少なくとも約60℃の条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって得ることができる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のようなものでもよい:50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でのインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でのインキュベーション、0.2×SSCおよび0.1％SDS、65℃での洗浄。本発明は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、または本明細書で例示されるか、もしくは当業者に周知の他のADNFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸を含む。
【００４０】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸にコードされるポリペプチドが実質的に同一であれば、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸はそれでもなお実質的に同一である。これは、例えば、1コピーの核酸が、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を用いて作成される時に起こる。このような場合、核酸は、一般的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下」は、40％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDSの緩衝液中で37℃でのハイブリダイゼーション、および1×SSCで45℃での洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者であれば、同様のストリンジェンシーの条件を得るために、別のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を使用できることを容易に理解するであろう。
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明は、被検体における自己免疫疾患を予防および治療する方法を提供する。この方法は、自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群(抗リン脂質抗体症候群)、全身性エリテマトーデス、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、橋本病/甲状腺機能低下症、原発性胆汁性肝硬変、混合結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブス病/甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、糖尿病性腎症、および敗血症ショック)を予防または治療するのに十分な量のADNFIIIポリペプチドを被検体に投与する段階を含む。
【００４２】
I.ADNFポリペプチド
本発明の態様において、任意の適切なADNFポリペプチドを投与することができる。例えば、ADNFポリペプチドは、ADNFIポリペプチド、ADNFIIIポリペプチド、またはその混合物でもよい。ある態様において、ADNFポリペプチドは、全種類のL-アミノ酸、全種類のD-アミノ酸、またはその組み合わせを含んでもよい。ADNFポリペプチドが経口投与される時、好ましくは、ADNFポリペプチドは、その活性コア部位の中に少なくとも1種類のD-アミノ酸を含み、より好ましくは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に少なくとも1種類のD-アミノ酸を含み、さらにより好ましくは、活性コア部位全体にまたは分子の全長にわたって少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む。または、D-アミノ酸は、ポリペプチド配列の任意の適切な位置にあってもよい。ポリペプチドのD-鏡像異性体はそのL-鏡像異性体より酵素に対して、特に胃腸管内で安定であるので、D-アミノ酸を含むADNFポリペプチドは経口投与に特に有用である。
【００４３】
1つの局面において、前記方法は、以下のアミノ酸配列:Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Alaを有する活性コア部位を含むADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。1つの態様において、ADNFIポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Alaのアミノ酸配列を有する活性コア部位からなる。別の態様において、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端にさらなるアミノ酸を含んでもよい。例えば、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に40個までのアミノ酸を含んでもよい。別の実施例において、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に20個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の実施例において、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に10個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の態様において、ADNFIポリペプチドは完全長ADNFIポリペプチドでもよい。
【００４４】
別の局面において、前記方法は、以下のアミノ酸配列:Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Glnを有する活性コア部位を含むADNFIIIポリペプチドを被検体に投与する段階を含む。1つの態様において、ADNFIIIポリペプチドは、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Glnのアミノ酸配列を有する活性コア部位からなる。別の態様において、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端にさらなるアミノ酸を含んでもよい。例えば、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に40個までのアミノ酸を含んでもよい。別の実施例において、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に20個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の実施例において、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に10個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の態様において、ADNFIIIポリペプチドは完全長ADNFIIIポリペプチドでもよい。
【００４５】
好ましい態様において、ADNFIポリペプチドは、(R1)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-IIe-Pro-AIa-(R2)yのアミノ酸配列を含み、ADNFIIIポリペプチドは、(R3)w-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-(R4)zのアミノ酸配列を含む。
【００４６】
前記の式において、R1、R2、R3、およびR4はそれぞれ、存在する場合、1〜約40個のアミノ酸を含むアミノ酸配列であり、ここで、それぞれのアミノ酸は独立して選択される。用語「独立して選択される」は、例えば、アミノ酸配列R1を構成するアミノ酸が同一でもよく、異なってもよい(例えば、アミノ酸配列中のアミノ酸が全てスレオニンなどでもよい)ことを示すために本明細書で用いられる。さらに、前記で説明したように、アミノ酸配列R1を構成するアミノ酸は天然のアミノ酸でもよく、天然のアミノ酸と同じように機能する天然アミノ酸の既知の類似体(すなわち、アミノ酸ミメティック)でもよい。R1に関するこの説明は、R2、R3、およびR4に完全に適用できる。
【００４７】
前記のADNFIポリペプチドの式の中で、xおよびyは独立して選択され、0または1に等しい。用語「独立して選択される」は、xおよびyが同一でもよく、異なってもよいことを示すために本明細書で用いられる。例えば、xおよびyが両方とも0であってもよく、または、xおよびyが両方とも1であってもよい。さらに、xが0でもよく、yが1でもよい。または、xが1でもよく、yが0でもよい。さらに、xおよびyが両方とも1である場合、アミノ酸配列R1およびR2は同一でもよく、異なってもよい。従って、アミノ酸配列R1およびR2は独立して選択される。R1およびR2が同一である場合、これらは、鎖の長さおよびアミノ酸組成に関して同一である。例えば、R1およびR2は両方ともVal-Leu-Gly-Gly-Glyでもよい。R1およびR2が異なる場合、鎖の長さおよび/またはアミノ酸組成および/またはアミノ酸配列中のアミノ酸の順序に関して互いに異なってもよい。例えば、R1はVal-Leu-Gly-Gly-Glyでもよいのに対して、R2はVal-Leu-Gly-Glyでもよい。または、R1はVal-Leu-Gly-Gly-Glyでもよいのに対して、R2はVal-Leu-Gly-Gly-Valでもよい。または、R1はVal-Leu-Gly-Gly-Glyでもよいのに対して、R2はGly-Val-Leu-Gly-Glyでもよい。
【００４８】
同様に、前記のADNFIIIポリペプチドの式の中で、wおよびzは独立して選択され、0または1に等しい。用語「独立して選択される」は、wおよびzが同一でもよく、異なってもよいことを示すために本明細書で用いられる。例えば、wおよびzが両方とも0であってもよく、または、wおよびzが両方とも1であってもよい。さらに、wが0であり、zが1でもよく、またはwが1であり、zが0でもよい。さらに、wおよびzが両方とも1である場合、アミノ酸配列R3およびR4は同一でもよく、異なってもよい。従って、アミノ酸配列R3およびR4は独立して選択される。R3およびR4が同一である場合、これらは、鎖の長さおよびアミノ酸組成に関して同一である。例えば、R3およびR4は両方ともLeu-Gly-Leu-Gly-Glyでもよい。R3およびR4が異なる場合、鎖の長さおよび/またはアミノ酸組成および/またはアミノ酸配列中のアミノ酸の順序に関して互いに異なってもよい。例えば、R3はLeu-Gly-Leu-Gly-Glyでもよいのに対して、R4はLeu-Gly-Leu-Glyでもよい。または、R3はLeu-Gly-Leu-Gly-Glyでもよいのに対して、R4はLeu-Gly-Leu-Gly-Leuでもよい。
【００４９】
範囲内で、ある特定のADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチド、すなわち、x、y、w、およびzが全て0であるADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチド(すなわち、それぞれ、SALLRSIPAおよびNAPVSIPQ)が好ましい。xが1であり、R1がVal-Leu-Gly-Gly-Glyであり、yが0であるADNFIポリペプチドが同様に好ましい。xが1であり、R1がVal-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Glyであり、yが0であるADNFIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がGly-Glyであり、zが0であるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がLeu-Gly-Glyであり、zが1であり、R4がGln-SerであるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がLeu-Gly-Leu-Gly-Glyであり、zが1であり、R4がGln-SerであるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がSer-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Glyであり、zが1であり、R4がGln-SerであるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。インタクトなADNFIまたはADNFIII成長因子が驚くべき顕著な生物学的活性を示すことによって証明されるような生物学的活性を失うことなく、これらの活性部位(SALLRSIPAまたはNAPVSIPQ)のN末端およびC末端の両方に、さらなるアミノ酸を付加することができる。ADNFIポリペプチドの説明については、1994年10月17日に出願されたU.S.S.N.08/324,297(WO96/11948としても公開されている)、ADNFIIIポリペプチドの説明については、1997年2月27日に出願されたU.S.S.N.60/037,404および1997年9月23日に出願されたU.S.S.N.60/059,621(WO98/35042としても公開されている)を参照のこと。これらは全て参照として本明細書に組み入れられる。
【００５０】
さらに別の局面において、前記方法は、ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物を被検体に投与する段階を含む。本明細書に記載のADNFIポリペプチドのいずれか1つまたはそれ以上を、本明細書に記載のADNFIIIポリペプチドのいずれか1つまたはそれ以上と混合することができる。ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物は、これらのポリペプチドの2つまたはそれ以上を混ぜたものでもよい。ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物はまた、ADNFIポリペプチドの1つまたはそれ以上を、ADNFIIIポリペプチドの1つまたはそれ以上と(直接的または間接的に)結合させたものを意味してもよい。例えば、ADNFIポリペプチドはADNFIIIポリペプチドに共有結合されていてもよい。ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物は一種類の組成物として調製されてもよく、被検体に投与することができる。または、ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドは別々の組成物として調製されてもよい。次いで、別々の組成物を被検体に同時にまたは連続して投与することができる。さらに、異なる割合のADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドを被検体に投与することができる。例えば、被検体にADNFポリペプチドを投与することができ、ここで、ADNFIポリペプチドとADNFIIIポリペプチドの比は1:100〜100:1、1:10〜10:1、または1:2〜2:1の範囲でもよい。
【００５１】
ある局面において、ADNFポリペプチドは、PEG、脂質、または当技術分野においてポリペプチドを親油性にすることが知られている他の分子に結合される。ある局面において、ADNFポリペプチドはリポソームの中にある。
【００５２】
さらに別の局面において、自己免疫疾患を予防または治療するために、他のADNFポリペプチド(その対立遺伝子、多型バリアント、種ホモログ(species homolog)、およびその部分配列を含む)を使用することができる。自己免疫疾患は周知である。例えば、HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE(eds.,Fauci,et al.,1998)を参照のこと。例示的な自己免疫疾患として、例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群(抗リン脂質抗体症候群)、全身性エリテマトーデス、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、橋本病/甲状腺機能低下症、原発性胆汁性肝硬変、混合結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブス病/甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、糖尿病性腎症、および敗血症ショックが挙げられる。
【００５３】
II.投与および薬学的組成物
ADNFポリペプチドおよびADNFポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において周知の任意の適切な方法を用いて被検体に投与することができる。例えば、Gozes,et al.,Trends in Neuroscience,24(12):700-705(2001);Gozes,et al.,J.Molec.Neurosci.19:167-170(2002);Leker,et al.,Stroke.33(4):1085-1092(2002);Gozes, et al.,「Intranasal delivery of bioactive peptides or peptide analogues enhances spatial memory and protects against cholinergic deficits」In:The Proceedings of the 44th Oholo Conference:The Blood Brain Barrier Drug Delivery and Brain Pathology.363-370を参照のこと。例えば、ADNFポリペプチドまたは核酸は、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に薬学的組成物として処方することができる。本発明において使用するのに適した処方物は、参照として本明細書に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences(17th ed.1985))に記載されている。薬物送達方法の簡単な総説も、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、Langer,Science 249:1527-1533(1990)に記載されている。さらに、ペプチドおよびタンパク質を含む薬学的組成物は、例えば、Therapeutic Peptides and Proteins Formulations,Processing,and Delivery Systems,by Banga,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,PA(1995)に記載されている。
【００５４】
ADNFポリペプチドは、任意の薬学的に許容される組成物において投与することができる。通常用いられる任意の賦形剤と、一般的に10％〜95％、より好ましくは25％〜75％の濃度の活性成分を含めることによって、薬学的に許容される無毒の組成物が形成される。さらに、ADNFポリペプチドの経口吸収を改善するために、様々な担体系(例えば、ナノ粒子、微粒子、リポソーム、リン脂質、エマルジョン、赤血球など)を使用することができる。本発明のADNFポリペプチドを含む経口薬剤は、液体、錠剤、カプセルなどの経口投与に適した任意の形をしていてもよい。さらに、経口処方物は、胃の中での溶解を阻止または減少するようにコーティングまたは処理されてもよい。例えば、Therapeutic Peptides and Proteins,Formulation,Processing,and Delivery Systems,by A.K.Banga,Technomic Publishing Company,Inc.,1995を参照のこと。
【００５５】
さらに、ADNFポリペプチドは、非経口投与、局所投与、鼻投与、舌下投与、強制栄養、または局所投与用に処方することができる。例えば、薬学的組成物は、非経口投与(例えば、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、または鼻腔内投与)される。従って、本発明は、一種類のADNFポリペプチドまたはADNFポリペプチドの混合物が、許容される担体(好ましくは、水性担体)に溶解または懸濁された溶液を含む非経口投与用組成物を提供する。例えば、水、緩衝水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸などを含む様々な水性担体を使用することができる。これらの組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌されてもよく、滅菌濾過されてもよい。結果として得られた水溶液は、使用のためにそのままで包装されてもよく、凍結乾燥されて包装されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌溶液と混合される。組成物は、生理状態に近づけるのに必要とされる薬学的に許容される補助物質(pH調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなど)を含んでもよい。1つの態様において、ADNFポリペプチドをコードする核酸が裸のDNAとして投与される。
【００５６】
エアロゾル投与の場合、ADNFポリペプチドは、好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に超微粒子の形で供給される。もちろん、界面活性剤は無毒でなければならず、好ましくは、噴霧剤に溶解する。このような薬剤を代表するものは、6個〜22個の炭素原子を含む脂肪酸(例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸(olesteric acid)およびオレイン酸)と脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル(例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリド)を使用することができる。所望であれば、例えば、鼻腔内送達用のレシチンのように、担体も含めることができる。
【００５７】
固形組成物の場合、従来の無毒の固形担体を使用することができる。固形担体として、例えば、薬学グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【００５８】
SALLRSIPAおよびNAPVSIPQを含む小さなポリペプチドは血液脳関門を通過する。血液脳関門を通過しない長いポリペプチドの場合、脳にタンパク質を投与する方法が周知である。例えば、タンパク質、ポリペプチド、他の化合物および細胞は、脳室内(ICV)注射またはカニューレを介して哺乳動物脳に送達することができる(例えば、
2006516253.tif 000004
を参照のこと)。特に、神経栄養因子を哺乳動物に投与するために、カニューレを使用することができる(例えば、Motta & Martini,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.168:62-64(1981)(neurotensin);Peng et al.,Brain Res.632:57-67(1993)(NGF);Anderson et al.,J .Comp.Neurol.357:296-317(1995)を参照のこと)(BDNF、NGF、ニューロトロフィン-3)。
【００５９】
または、血液脳関門を通過しない長いADNFポリペプチドは、ADNFポリペプチドが血液脳関門を通過し、細胞の原形質膜または核などの細胞内区画の膜を横断するのを助ける材料と結合することができる。細胞膜は脂質-タンパク質二重層からなり、小さな非イオン性の親油性化合物は自由に透過することができ、極性化合物、高分子、および治療剤および診断剤は本質的に透過することができない。しかしながら、ADNFポリペプチドなどのポリペプチドを細胞膜を通って移行させることを可能にするタンパク質および他の化合物(例えば、リポソーム)が述べられている。
【００６０】
例えば、「膜移行ポリペプチド」は、膜移行担体として働くことができる両親媒性または疎水性のアミノ酸部分配列を有する。1つの態様において、ホメオドメインタンパク質が細胞膜を通って移行することができる。ホメオドメインタンパク質であるAntennapediaの最も短い内部移行可能なペプチドが、アミノ酸位置43位〜58位にある、このタンパク質の第3ヘリックスであることが発見された(例えば、Prochiantz,Current Opinion in Neurobiology 6:629-634(1996)を参照のこと)。別の部分配列である、シグナルペプチドの疎水性ドメインが同様の細胞膜移行特徴を有することが発見された(例えば、Lin et al.,J.Biol.Chem.270:14255-14258(1995)を参照のこと)。
【００６１】
細胞へのADNFポリペプチドの取り込みを促進するために本発明のADNFポリペプチドに連結することができるペプチド配列の例として、HIVのtatタンパク質の11アミノ酸ペプチド(Schwarze et al.,Science 285:1569-1572(1999)を参照のこと);p16タンパク質のアミノ酸84位-103位に対応する20残基ペプチド配列(Fahraeus et al.,Current Biology 6:84(1996)を参照のこと);Antennapediaの60アミノ酸長ホメオドメインの第3ヘリックス(Derossi et al.,J.Biol.Chem.269:10444(1994));カポジ(Kaposi)線維芽細胞増殖因子(K-FGF)h領域などのシグナルペプチドのh領域(Lin et al.,前記);またはHSVに由来するVP22移行ドメイン(Elliot & O'Hare,Cell 88:223-233(1997))が挙げられるが、これに限定されない。細胞取り込みを促進する他の適切な化学部分もADNFポリペプチドに化学的に連結することができる。
【００６２】
毒素分子もまた、細胞膜を通ってポリペプチドを輸送する能力を有する。多くの場合、このような分子は、少なくとも2つの部分:移行または結合用のドメインまたはポリペプチドおよび別個の毒素ドメインまたはポリペプチドからなる(「バイナリー毒素(binary toxin)」と呼ばれる)。一般的に、移行ドメインまたはポリペプチドは細胞受容体に結合し、次いで、毒素は細胞内に輸送される。内部融合またはアミノ末端融合としてペプチドを細胞サイトゾルに送達しようと、ウェルチ菌アイオータ毒素(Clostridium perfringens iota toxin)、ジフテリア毒素(DT)、シュードモナス(Pseudomonas)エキソトキシンA(PE)、百日咳毒素(PT)、炭疽菌(Bacillus anthracis)毒素、および百日咳アデニル酸シクラーゼ(CYA)を含む数種類の細菌毒素が用いられている。
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【００６３】
ADNFポリペプチドを細胞膜を通って移行させるために、このような部分配列を使用することができる。都合のよいことに、ADNFポリペプチドは、このような配列に融合することができ、またはこのような配列を用いて誘導体化することができる。一般的に、移行配列は融合タンパク質の一部として提供される。任意で、ADNFポリペプチドと移行配列を連結するためにリンカーを使用することができる。任意の適切なリンカー(例えば、ペプチドリンカー)を使用することができる。
【００６４】
ADNFポリペプチドおよびADNFポリペプチドをコードする核酸はまた、リポソームおよびリポソーム誘導体(例えば、イムノリポソームおよび脂質:核酸複合体)によって動物細胞(好ましくは、哺乳動物細胞)に導入することもできる。用語「リポソーム」は、水相をカプセル化する、1つまたはそれ以上の同心円状に配置された脂質二重層からなる小胞を意味する。水相は、一般的に、細胞に送達しようとする化合物(すなわち、ADNFポリペプチド)を含む。
【００６５】
リポソームは原形質膜と融合し、それによってADNFポリペプチドをサイトゾルに放出する。または、リポソームは貪食されるか、または細胞に取り込まれて輸送小胞の中に入る。エンドソームまたはファゴソームに入ったら、リポソームは分解するか、輸送小胞の膜と融合し、その内容物を放出する。
【００６６】
リポソームによる現行の薬物送達方法では、リポソームは最終的に透過性になり、カプセル化されている化合物(この場合、ADNFIIIポリペプチド)を標的組織または標的細胞で放出する。全身送達または組織特異的送達の場合、例えば、リポソーム二重層が体内の様々な因子の作用によって徐々に分解する受動的なやり方で、これを達成することができる。または、能動的薬物放出は、リポソーム小胞の透過性変化を誘導する薬剤を使用することを含む。リポソーム膜は、リポソーム膜の近くの環境が酸性になった時に不安定になるように構築することができる(例えば、Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 84:7851(1987);Biochemistry 28:908(1989)を参照のこと)。例えば、リポソームが標的細胞によってエンドサイトーシスされた時、不安定になり、その内容物を放出する。この不安定化は膜融合と呼ばれる。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)が多くの「膜融合」系の主成分である。
【００６７】
このようなリポソームは、一般的に、ADNFポリペプチドおよび脂質成分(例えば、中性脂質および/またはカチオン性脂質)を含み、任意で、受容体認識分子(例えば、予め決められた細胞表面受容体またはリガンド(例えば、抗原)に結合する抗体)を含む。例えば、
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に記載のように、リポソームを調製するために様々な方法を使用することができる。適切な方法として、例えば、超音波処理、押し出し、高圧/ホモジナイゼーション、顕微溶液化(microfluidization)、界面活性剤の透析、カルシウムによる小さなリポソーム小胞の融合、およびエーテル融合法が挙げられ、これらの全てが当技術分野において周知である。
【００６８】
本発明のある特定の態様において、ある特定の細胞型、組織などに特異的な標的化部分を用いて、本発明のリポソームを標的化することが望ましい。様々な標的化部分(例えば、リガンド、受容体、およびモノクローナル抗体)を用いたリポソームの標的化が以前に述べられている(例えば、U.S.Patent Nos.4,957,773および4,603,044を参照のこと)。標的化薬剤とリポソームを結合させる標準的な方法を使用することができる。これらの方法は、一般的に、標的化薬剤を取り付けるために活性化することができる脂質成分(例えば、ホスファチジルエタノールアミン)または誘導体化された親油性成分(例えば、脂質誘導体化ブレオマイシン)を、リポソームに組み込むことを含む。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインAを組み込むリポソームを用いて構築することができる(Renneisen et al.,J.Biol.Chem.,265:16337-16342(1990)およびLeonetti et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:2448-2451(1990)を参照のこと)。
【００６９】
または、治療用量のADNFポリペプチドを提供するために、ADNFをコードする核酸も使用することができる。これらの核酸は、標的細胞および標的生物のトランスフェクション用の多くの周知の任意のベクターに挿入することができる。例えば、核酸は、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合体化された核酸として送達される。ウイルスベクター送達系としてDNAウイルスおよびRNAウイルスが挙げられ、これらは、細胞に送達された後に、エピソームのゲノムまたは組み込まれたゲノムを有する。遺伝子療法の手順の概説については、
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を参照のこと。
【００７０】
核酸の非ウイルス送達法として、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質:核酸結合体、裸のDNA、人工ビリオン、および薬剤により促進されるDNAの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、U.S.Patent No.5,049,386、U.S.Patent No.4,946,787;およびU.S.Patent No.4,897,355で述べられており、リポフェクション試薬(例えば、トランスフェクタム(Transfectam)TMおよびリポフェクチン(Lipofectin)TM)は市販されている。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質として、Felgner、WO91/17424、WO91/16024の脂質が挙げられる。送達は細胞への送達(エクスビボ投与)でもよく、標的組織への送達(インビボ投与)でもよい。
【００７１】
治療適用において、自己免疫疾患の症状を軽減するのに十分な量の本発明のADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチド混合物が患者に投与される。これを達成するのに十分な量が「治療有効量」と定義される。この用途に有効な量は、例えば、使用される特定のADNFIポリペプチドまたはADNFIIIポリペプチド、投与方法、患者の体重および全身の健康状態、ならびに処方を行う医師の判断に左右される。「治療有効量」はまた、被検体において自己免疫疾患が発症しないようにするのに十分な量を含む。従って、用語「治療有効量」には予防量が含まれる。
【００７２】
III.多発性硬化症を治療および予防するための候補の特定
ADNFIIIポリペプチドによる治療に適した患者の中には、MS診断研究会(Poser et al.,Ann.Neurol.13:227(1983))によって規定された、臨床的に確実な多発性硬化症(MS)の診断を定める基準によって特定することができるものもいる。簡単に述べると、臨床的に確実なMSの個体は、1つの発作およびいずれかの病巣のクリニカルエビデンス(clinical evidence)、またはある病巣のクリニカルエビデンスおよび別の離れた病巣のパラクリニカルエビデンス(paraclinical evidence)を有した。確実なMSはまた、１つの発作のエビデンスおよび脳脊髄液中のIgGのオリゴクローナルバンド（oligoclonal band）によって、または１つの発作、2つの病巣のクリニカルエビデンス、および脳脊髄液中のIgGのオリゴクローナルバンドの組み合わせによって診断することもできる。臨床的に確からしいMSの診断には、わずかに低い基準が用いられる。
【００７３】
多発性硬化症の有効な治療は、いくつかの異なるやり方で調べることができる。以下の基準のいずれかを満たすことによって、有効な治療が証明される。3つの主な基準:EDSS(総合障害度評価尺度)、増悪の出現、またはMRI(磁気共鳴画像法)が用いられる。
【００７４】
EDSSは、MSによる臨床的障害を評価する手段である(Kurtzke,Neurology 33:1444(1983))。8つの機能系が神経障害のタイプおよび重篤度について評価される。簡単に述べると、治療前に、患者は、以下の系における障害について評価される:錐体路、小脳、脳幹、感覚、腸および膀胱、視覚、大脳、およびその他。所定の間隔で追跡調査が行われる。この尺度は0(正常)から10(MSによる死亡)まである。ある態様において、少なくとも1つの完全な段階の減少は、本発明の状況での有効な治療に相当する(Kurtzke,Ann.Neurol.36:573-79(1994))。
【００７５】
増悪は、MSに起因し、適切な新たな神経異常が付随する新たな症状の出現と定義される(IFNB MS Study Group,前記)。さらに、安定または改善が少なくとも30日間見られた後に、増悪は少なくとも24時間継続しなければならない。簡単に述べると、臨床医が患者に標準的な神経学的検査を行う。増悪は、神経症状評価尺度の変化によって軽度、中等度、または重篤のいずれかである(Sipe et al.,Neurology 34:1368(1984))。増悪のない患者の年間増悪率および比が求められる。ある態様では、これらの測定値のいずれかについて、治療群とプラセボ群との間で(または1人だけの被験者の場合、ADNFIIIポリペプチドで治療した後と被験者を治療する前を比較して)増悪のない患者の年間増悪率または比に統計的に有意な違いがあれば、治療は有効である。さらに、最初の増悪までの時間および増悪の期間ならびに重篤度も測定することができる。ある態様において、この点に関してADNFIIIポリペプチドを使用する有効性の判断基準は、対照群と比較して、治療群の最初の増悪までの時間または期間ならびに重篤度が統計的に有意に異なることである。
【００７６】
MRIは、ガドリニウム-DTPA-強調画像法(McDonald et al.,Ann.Neurol.36:14,1994)を用いて活動病巣を測定するのに、またはT2強調法を用いて病巣の位置および程度を測定するのに使用することができる。簡単に述べると、ベースラインMRIが得られる。後のそれぞれの試験について、同じ画像平面および患者位置が用いられる。病巣の検出を最大限にし、病巣の追跡を容易にするように、配置およびイメージングシーケンスが選択される。後の試験では、同じ配置およびイメージングシーケンスが用いられる。MS病巣の存在、位置、および程度は放射線科医によって決定される。病巣の領域の輪郭を描き、スライスごとに合計して、病巣の総面積を求める。少なくとも3つの側面:新たな病巣の証拠、活動病巣の出現率、病巣面積の割合の変化を調べることができる(例えば、Paty et al.,Neurology 43:665,1993を参照のこと)。ある態様において、ベースラインと比較して、または治療群対プラセボ群において個々の患者において統計的に有意な改善がある時に、ADNFIIIポリペプチド投与による改善を確かめることができる。
【００７７】
多発性硬化症を予防するための候補患者は、遺伝的要因の存在によって特定することができる。例えば、MS患者の大多数はDR2aおよびDR2bのHLA型を有する。治療に適した、MSになりやすい遺伝的性質を有するMS患者は2つの群の中に含まれる。第1の群は、再発寛解型の早期疾患を有する患者を含む。対象基準(entry criteria)は、1年を超える疾患期間、1.0〜3.5のEDSSスコア、0.5/年を超える増悪率、および試験前に2ヶ月間、臨床増悪が無いことを含む。第2の群は、過去2年にわたって1.0 EDSS単位/年を超える疾患進行を有する人を含む。
【００７８】
予防の状況でのペプチド類似体の効力は、以下の基準に基づいて判断される:限界希釈によって測定されるミエリン塩基性タンパク質(MBP)反応性T細胞の頻度、MBP反応性のT細胞株およびクローンの増殖応答、ならびに患者から樹立されたMBPに対するT細胞株およびクローンのサイトカインプロファイル。有効量は、反応性細胞の頻度を減らし、MBP反応性T細胞の増殖を低下させ、ならびに/またはTNFおよびIFN-αの濃度を低下させることができる。臨床での測定として、1年間隔および2年間隔での再発率、ならびにEDSSの変化(6ヶ月間持続するEDSSにおいて1.0単位のベースラインから進行までの時間を含む)が挙げられる。カプラン-マイヤー曲線において、障害の持続的進行の遅れが効力を示す。他の基準として、MRI T2画像の面積および体積の変化、ならびにガドリニウム強調画像によって測定された病巣の数および体積が挙げられる。ある態様において、これらのパラメータのいずれか1つまたはそれ以上が、ADNFIIIポリペプチドで治療された被検体において、例えば、治療前と比較して約10％、任意で少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％または約100％まで変化すれば、ADNFIIIポリペプチドは治療に有効である。
【００７９】
IV.ADNFポリペプチドを生成する方法
A.ADNFポリペプチドを生成するための組換え法
i.ADNF核酸のクローニングおよび単離
ADNFポリペプチドをコードするいくつかの特定の核酸が本明細書に記載される。例えば、Zamostiano et al.,J.Biol.Chem.276:708-714(2001)、およびBassan et al.,J.Neurochem 72:1283-1293(1999)も参照のこと。これらの開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。これらの核酸は、標準的な組換え法または合成法を用いて作成することができる。本発明の核酸があれば、当業者は、機能的に同等な核酸(例えば、同じADNFポリペプチドをコードする核酸)を含む様々なクローンを構築することができる。これらの目的を達成するクローニング法、および核酸配列を確認する配列決定法は当技術分野において周知である。適切なクローニング法および配列決定法、ならびに何回ものクローニング練習によって当業者を導くのに十分な説明書の例は、Sambrook et al,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.1989)およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.,1994)で見られる。
【００８０】
さらに、生物学的試薬の製造業者からの製品情報および実験装置もまた、既知の生物学的方法に有用な情報を提供する。このような製造業者として、シグマケミカルカンパニー(SIGMA chemical company)(Saint Louis,MO)、アールアンドディーシステムズ(R & Dsystems)(Minneapolis,MN)、ファルマシアLKBバイオテクノロジー(Pharmacia LKB Biotechnology)(Piscataway,NJ)、クロンテックラボラトリーズ(CLONTECH Laboratories,Inc.)(Palo Alto,CA)、ケムジーン(Chem Gene Corp.)、アルドリッチケミカルカンパニー(Aldrich Chemical Company)(Milwaukee,WI)、グレンリサーチ(Glen Research,Inc.)、ギブコBRLライフテクノロジーズ(GIBCO BRL Life Technologies,Inc.)(Gaithersberg, MD)、フルカケミカバイオケミカアナライティカ(Fluka Chemica-Biochemika Analytika)(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)、インビトロゲン(Invitrogen)(San Diego,CA)、およびアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)(Foster City,CA)、ならびに当業者に周知の他の多くの商業的供給元が挙げられる。
【００８１】
本発明の核酸組成物は、RNA、cDNA、ゲノムDNA、または様々な混合物のハイブリッドであっても、星状細胞、神経芽細胞腫細胞、または線維芽細胞などの生物学的供給源から単離されるか、インビトロで合成される。本発明の核酸は形質転換細胞またはトランスフェクトされた細胞に存在するか、形質転換細胞もしくはトランスフェクトされた細胞の溶解産物に存在するか、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で存在する。
【００８２】
分子プローブとして使用するための配列を増幅するのに適した、または後のサブクローニングのための核酸断片を作成するのに適したインビトロ増幅法が知られている。このようなインビトロ増幅法によって当業者を導くのに十分な技法の例(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼを介した技法(例えば、NASBA)を含む)は、Berger,Sambrook et al.およびAusubel et al.(全て前出)、ならびに
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で見られる。インビトロで増幅された核酸をクローニングする改善された方法はU.S.Patent No.5,426,039に記載されている。大きな核酸を増幅する改善された方法は、Cheng et al.,Nature 369:684-685(1994)およびそこに引用される参考文献で要約されている。当業者であれば、本質的に任意のRNAを、逆転写酵素およびポリメラーゼを用いて、制限消化、PCR増幅、および配列決定に適した二本鎖DNAに変換できることを理解するだろう。
【００８３】
プローブとして使用するための(例えば、インビトロADNF核酸増幅法で使用するための) オリゴヌクレオチドまたはADNF核酸検出用の核酸プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチドは、一般的に、Beaucage & Caruthers,Tetrahedron Letts.22(20):1859-1862(1981)に記載の固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、例えば、自動合成機(例えば、Needham-VanDevanter et al.,Nucleic Acid Res.12:6159-6168(1984)に記載の自動合成機)を用いて化学合成される。オリゴヌクレオチドはまた注文製作することができ、当業者に周知の様々な商業的供給元で注文することができる。オリゴヌクレオチドの精製が必要な場合、一般的に、未変性アクリルアミドゲル電気泳動によって、またはPearson & Regnier,J.Chrom.255:137-149(1983)に記載のように陰イオン交換HPLCによって行われる。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Methods in Enzyzmology 65:499-560(Grossman & Moldave,eds.,1980)に記載のマクサム-ギルバート化学分解法を用いて確認することができる。
【００８４】
当業者であれば、ある特定の核酸配列に変化を加える多くの方法があることを理解するだろう。このような周知の方法として、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅、変異誘発薬剤または放射線への核酸含有細胞の暴露、望ましいオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核酸を作成するために連結および/またはクローニングと併用する)、ならびに他の周知の技法が挙げられる(Giliman & Smith,Gene 8:81-97(1979);Roberts et al.,Nature 328:731-734(1987);およびSambrook et al.,Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.1989)を参照のこと)。
【００８５】
ii.ADNFIIIポリペプチドの組換え発現
1つの態様において、ポリペプチドまたはその部分配列は組換え核酸法を用いて合成される。一般的に、これは、タンパク質をコードする核酸配列を作成し、その核酸を、ある特定のプロモーターの制御下で発現カセットに配置し、タンパク質を宿主細胞において発現させ、発現されたタンパク質を単離し、必要に応じて、タンパク質を再生することを含む。
【００８６】
本発明のADNFポリペプチドをコードする核酸が単離およびクローニングされたら、核酸は、任意で当業者に周知の組換え操作された細胞において発現される。このような細胞の例として、細菌、酵母、植物、糸状菌、昆虫(特にバキュロウイルスベクターを使用した昆虫)、および哺乳動物の細胞が挙げられるが、これに限定されない。組換え核酸は、選択された宿主における発現に適した制御配列に作動可能に連結される。大腸菌の場合、例示的な制御配列として、T7、trp、またはλプロモーター、リボソーム結合部位、好ましくは、転写終結シグナルが挙げられる。真核細胞の場合、制御配列として、一般的に、プロモーター、好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサー、およびポリアデニル化配列が挙げられ、スプライスドナー配列およびスプライスアクセプター配列を含んでもよい。
【００８７】
所望の場合、組換え核酸は、ADNFポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードするように構築することができる。一例では、ADNFポリペプチド(例えば、ADNFIIポリペプチド、ADNFIIIポリペプチド、ADNFI/ADNFIIIポリペプチドの融合など)をコードする核酸を、別の核酸(例えば、ADNFポリペプチドを組織に送達するのを容易にする、HIV tat核酸の一部)に連結することができる。さらに別の例では、ADNFポリペプチドをコードする核酸を、タンパク質精製プロトコールを容易にするアフィニティタグをコードする核酸に連結することができる。ADNF核酸および異種ポリヌクレオチド配列は、その融合および融合ポリペプチドの後の発現を容易にするように改変することができる。例えば、ADNFポリヌクレオチド配列の3'停止コドンは、制限部位および/または切断部位を生じることができるインフレームリンカー配列で置換することができる。
【００８８】
本発明のプラスミドは、周知の方法によって、選択された宿主細胞に導入することができる。このような方法として、例えば、塩化カルシウム形質転換法(大腸菌の場合)およびリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーション法(哺乳動物細胞の場合)が挙げられる。プラスミドによって形質転換された細胞は、プラスミドに含まれる遺伝子(例えば、amp、gpt、neo、およびhyg遺伝子)によって付与される抗生物質耐性によって選択することができる。
【００８９】
組換えまたは天然のADNFポリペプチドが発現されたら、硫安沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準的な手順に従って精製することができる(例えば、Scopes,Polypeptide Purification(1982);Deutscher,Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Polypeptide Purification(1990)を参照のこと)。ADNFポリペプチドが部分的にまたは所望の均一性まで精製されたら、例えば、被検体における自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症)を予防または治療するのに使用することができる。例えば、Brenneman & Gozes,J.Clin.Invest.97:2299-2307(1996),Brenneman et al.,J.Pharm.Exp.Ther.285:619-627(1998)、およびZamostiano et al.,J.Biol.Chem.276:708-714(2001),Bassan et al.J.Neurochem 72:1283-1293(1999)も参照のこと。これらの開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００９０】
B.ADNFポリペプチドの合成
前述の組換え法に加えて、本発明のADNFポリペプチドは、任意で、多種多様な周知の技法によって合成により調製される。一般的に、比較的短い大きさのポリペプチドは、従来法に従って溶液中でまたは固体支持体上で合成される(例えば、Merrifield,Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963)を参照のこと)。様々な自動合成機およびシーケンサーが市販されており、既知のプロトコールに従って使用することができる(例えば、Stewart & Young,Solid Phase Peptide Synthesis(2nd ed.1984)を参照のこと)。配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に取り付けた後に、配列の残りのアミノ酸を連続的に付加する固相合成が、本発明のポリペプチドの化学合成に好ましい方法である。固相合成の技法は、Barany  & Merrifield,Solid-Phase Peptide Synthesis;pp.3-284 in The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol 2:Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.;Merrifield et al.,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156(1963);およびStewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis(2nd ed.1984)に記載されている。
【００９１】
化学合成、生物学的発現または精製の後、1つまたはそれ以上のポリペプチドは、構成ポリペプチドのネイティブなコンホメーションとは実質的に異なるコンホメーションを有することがある。この場合、ポリペプチドを変性および還元し、次いで、好ましいコンホメーションに再び折り畳むことが役立つ。ポリペプチドを還元および変性する方法ならびに再折り畳みを誘導する方法は当業者に周知である(Debinski et.al.,J.Biol.Chem.268:14065-14070(1993);Kreitman & Pastan,Bioconjug.Chem.4.581-585(1993);およびBuchner et.al.,Anal.Biochem.205:263-270(1992)を参照のこと)。Debinski et.al.は、例えば、グアニジン-DTEによる封入体ポリペプチドの変性および還元について述べている。次いで、ポリペプチドは、酸化型グルタチオンおよびL-アルギニンを含む酸化還元緩衝液の中で再び折り畳まれる。
【００９２】
当業者であれば、ポリペプチドの生物学的活性を低下させることなくポリペプチドに改変を加えることができることを理解するだろう。改変の中には、標的分子のクローニング、発現、または融合ポリペプチドへの組込みを容易にするために加えることができるものもある。このような改変は当業者に周知であり、例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、または都合よく配置された制限部位もしくは終結コドンもしくは精製配列を生じるために、いずれかの末端に配置される付加アミノ酸(例えば、ポリHis)を含む。
【００９３】
C.ADNF核酸およびポリペプチドの保存的改変
当業者であれば、本明細書で提供されるADNF核酸配列およびポリペプチド配列の多くの保存的バリアントが機能的に同一な産物を生じることを理解するだろう。例えば、遺伝暗号の縮重のために、「サイレント置換」(すなわち、コードされるポリペプチドを変えない核酸配列の置換)は、アミノ酸配列をコードする全ての核酸配列の言外の特徴である。同様に、アミノ酸配列中の1個または数個のアミノ酸が非常に似た特性を有する異なるアミノ酸で置換される「保存的アミノ酸置換」(前出の定義の項を参照のこと)もまた、開示されたアミノ酸配列、またはアミノ酸をコードする開示された核酸配列に非常に似ていることが容易に分かる。はっきりと列挙されている、それぞれの核酸配列およびアミノ酸配列のこのような保存的に置換されたバリアントは、本発明の特徴である。
【００９４】
当業者であれば、ある特定の核酸配列に変化を加える多くの方法があることを理解するだろう。このような周知の方法として、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅、変異誘発薬剤または放射線への核酸含有細胞の暴露、望ましいオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核酸を作成するために連結および/またはクローニングと併用する)、および他の周知の技法が挙げられる(Giliman & Smith,Gene 8:81-97(1979);Roberts et al.,Nature 328:731-734(1987)を参照のこと)。例えば、アラニンスキャニングを用いて、NAPVSIPQの保存的に改変されたバリアントを決定することができる(すなわち、各アミノ酸を1個ずつアラニンまたは他の小さな天然アミノ酸で置換し、本明細書に記載のように活性をアッセイすることによって決定することができる)。
【００９５】
ポリペプチド配列はまた、対応する核酸配列を変更し、ポリペプチドを発現させることによって変えることもできる。ポリペプチド配列はまた、任意の望ましいポリペプチドを作成するように市販のペプチド合成機を用いて合成により作成してもよい(Merrifield,前記およびStewart & Young,前記を参照のこと)。
【００９６】
さらに詳細に述べると、本発明のADNFポリペプチドが、当技術分野において周知の、または本明細書に記載の様々なアッセイ法を用いて多発性硬化症を予防または治療する能力について容易にスクリーニングできることは当業者に容易に明らかであろう。
【００９７】
これらのアッセイ法を使用すれば、当業者は、本発明の開示に従う多数のADNFポリペプチドを容易に調製し、次いで、本明細書に示したものに加えて、インタクトなADNFIII成長因子の神経保護活性/神経栄養活性を有するADNFIIIポリペプチドを発見するために、前述のアッセイ法を用いてスクリーニングすることができる。例えば、出発点としてADNFIII-8(すなわち、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln)を使用して、系統的に、例えば、Gly-、Gly-Gly-、Leu-Gly-Gly-をADNFIII-8のN末端に付加し、次いで、神経保護活性/神経栄養活性を有するかどうか確かめるために、これらのADNFIIIポリペプチドのそれぞれを前述のアッセイ法においてスクリーニングすることができる。こうすることで、インタクトなADNFIII成長因子が驚くべき顕著な生物学的活性を示すことによって証明されるような生物学的活性を失うことなく、さらなるアミノ酸を、新たに発見された活性部位(すなわち、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln)のN末端およびC末端の両方に付加できることが分かるだろう。この説明はADNFIポリペプチドにも当てはまる。
【００９８】
実施例
以下の実施例は例示のために示され、本発明を限定しない。
【００９９】
本研究は、ミエリン-オリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)により誘導された慢性自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおける軸索損傷および脱髄に焦点を当てている。MOG誘導EAEは、認められているMS動物モデルである。OffenおよびMelamedによる以前の研究では、EAEの発生における活性酸素種(ROS)に対する軸索の感受性および耐性の予想される役割が調べられた。彼らは、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターの制御下にあるヒトbcl-2遺伝子をニューロンだけで過剰発現するニューロン特異的エノラーゼ-bcl-2トランスジェニックマウスを使用した。この研究は、MOGにより誘導されるEAEの臨床特徴ならびに炎症および軸索損傷がNSE-bcl-2マウスにおいて著しく弱められることを証明する(Offen D et al.J.Mol.Neurosci.15(3):167-76(2000))。
【０１００】
本研究は、NAP(Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln,一文字記号:NAPVSIPQ)ペプチドを投与すると、MOG誘導EAEマウスの疾患の徴候が弱まることを証明する。
【０１０１】
方法および結果
EAEは、ラットMOGのアミノ酸35位〜55位を含むペプチドで免疫することによって誘導される。合成は、ウエイツマンインスティチュートシンセシスユニット(Weizmann Institute Synthesis Unit)によって固相法を用いてペプチド合成機(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems Inc.),Foster City,CA City)で行われた。6週齡のC57/bマウス(テルアビブ大学(Tel-Aviv University))の側腹部に、完全フロイントアジュバント(CFA)に溶解したMOGペプチド300μgおよび結核菌(シグマイスラエル(Sigma Israel))500μgを含むエマルジョン200μlを(皮下)注射した。1週間後に、もう一方の側腹部に同じように追加免疫を行った。脳炎誘発性の抗原投与10日後に、MOG処置マウスを毎日観察し、EAEの臨床徴候を、以下のスコアによって測定した:0=臨床症状なし;1=尾の緊張の消失;2=部分的な後肢の麻痺;3=完全な後肢の麻痺;4=部分的な前肢の麻痺;5=完全な前肢の麻痺;6=死亡。
【０１０２】
治療のために、NAPを、7.5mg/ml塩化ナトリウム、1.7mg/mlクエン酸一水和物、3.0mg/ml無水リン酸二ナトリウム(disodium phosphate dehydrate)、および0.2mg/mlの50％塩化ベンザルコニウム溶液を含む混合物において0.1μg/マウスで(鼻腔内)投与した。鼻投与を毎日、MOG注射の1時間後に行い、継続し、試験の1時間前に1日1回投与した。対照動物には、NAPを含まない前記の混合物を与えた。ここでの例では、MOG注射の10〜14日前に、NAPで毎日治療し始めた。
【０１０３】
結果から、NAPは、11日目に動物の臨床結果をP<0.01,t検定(図1)で有意に改善したことが分かった。
【０１０４】
追加実験では、前記に記載のOffen et al.のように行った増殖性T細胞反応を含めた。結果から、未処置と比較してNAPで処置されたMSモデルでの脾細胞の増殖反応が非常に低下したので(P<0.01)、NAPはインビボにおいて免疫応答(細胞増殖,図2)を阻害したことが分かった。さらに、MOGを添加すると未処置脾細胞において増殖が増大したのに対して(2μg/ウェルのMOGでも増大した,P<0.05)、NAPが注射された動物では25μgのMOGでさえ、影響は全く無かった。
【０１０５】
特定の実施例が示されたが、前記の説明は例示であり、制限するものではない。前記の態様の特徴のいずれか1つまたはそれ以上は、本発明の他の任意の態様の1つまたはそれ以上の特徴とどのようにも組み合わせることができる。さらに、本発明の多くの変化は、本明細書を見直せば当業者に明らかになるであろう。従って、本発明の範囲は、前記の説明を基準にして決定されてはならず、その代わりに、添付の特許請求の範囲とその均等物の全範囲を基準にして決定されなければならない。
【０１０６】
本願で引用された全ての刊行物および特許文書は、それぞれ個々の刊行物または特許文書が個々に示されるのと同じ程度に全ての目的のためにその全体が参照として組み入れられる。この文書における様々な参考文献の引用によって、出願人は、どの参考文献も本発明の「先行技術」と認めることはない。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ミエリン-オリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)で処置され、NAPで処置された、またはNAPで処置されていないマウスにおける自己免疫性脳脊髄炎の程度を示す。
【図２】NAPの存在下(黒丸)または非存在下(白丸)でのMOG誘導マウスモデルにおける脾細胞へのチミジン取り込みを示す。
【図１】
2006516253.tif 000013
【図２】
2006516253.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月6日(2005.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体における自己免疫疾患を予防または治療する方法であり、以下の段階を含む方法:
治療有効量の活性依存性神経栄養因子(ADNF)ポリペプチドを被検体に投与する段階であり、ADNFポリペプチドが、
(a)以下のアミノ酸配列:
Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)を有する活性コア部位を含むADNFIポリペプチド;
(b)以下のアミノ酸配列:
Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)を有する活性コア部位を含むADNFIIIポリペプチド;ならびに
(c)パート(a)のADNFIポリペプチドおよびパート(b)のADNFIIIポリペプチドの混合物からなる群より選択されるメンバーである、段階。
【請求項２】
ADNFポリペプチドが、完全長ADNFIポリペプチド、完全長ADNFIIIポリペプチド、ならびに完全長ADNFIポリペプチドおよび完全長ADNFIIIポリペプチドの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ADNFポリペプチドがADNFIポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ADNFIポリペプチドの活性コア部位が少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ADNFIポリペプチドの活性コア部位が全種類のD-アミノ酸を含む、請求項3記載の方法。
【請求項６】
ADNFIポリペプチドがSer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)である、請求項3記載の方法。
【請求項７】
ADNFIポリペプチドが、
2006516253.tif 000015
からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項８】
ADNFIポリペプチドが、活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含む、請求項3記載の方法。
【請求項９】
ADNFポリペプチドがADNFIIIポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ADNFポリペプチドが完全長ADNFIIIポリペプチドである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ADNFIIIポリペプチドがAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
ADNFIIIポリペプチドの活性コア部位が少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
ADNFIIIポリペプチドの活性コア部位が全種類のD-アミノ酸を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１４】
ADNFIIIポリペプチドが、
2006516253.tif 000016
からなる群より選択されるメンバーである、請求項9記載の方法。
【請求項１５】
ADNFIIIポリペプチドが、活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１６】
ADNFポリペプチドの少なくとも1つが、被検体に投与される核酸にコードされる、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
パート(a)のADNFIポリペプチドおよびパート(b)のADNFIIIポリペプチドが被検体に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドのいずれかの活性コア部位または両方の活性コア部位が少なくとも1種類のD-アミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドのいずれかの活性コア部位または両方の活性コア部位が全種類のD-アミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
ADNFIポリペプチドがSer-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)であり、ADNFIIIポリペプチドがAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
ADNFIポリペプチドが、
2006516253.tif 000017
からなる群より選択されるメンバーであり、
ADNFIIIポリペプチドが、
2006516253.tif 000018
からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
ADNFIポリペプチドが、ADNFIポリペプチドの活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含み、ADNFIIIポリペプチドが、ADNFIIIポリペプチドの活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２３】
被検体が自己免疫疾患を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
自己免疫疾患を予防するためにADNFポリペプチドが投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群(Guillan-Barre syndrome)(抗リン脂質抗体症候群)、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erytromatosis)、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、橋本病/甲状腺機能低下症(hypothyroiditis)、原発性胆汁性肝硬変、混合結合組織病、慢性活動性肝炎、グレーブス病/甲状腺機能亢進症(hyperthyroiditis)、強皮症、慢性特発性血小板減少性紫斑病、糖尿病性腎症、および敗血症ショックからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
ADNFポリペプチドが鼻腔内に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
ADNFポリペプチドが経口投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
ADNFポリペプチドが注射される、請求項1記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ADNFIポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(「SALLRSIPA(SEQ ID NO:1)」または省略して「SAL」もしくは「ADNF-9」と呼ぶ)を含む活性コア部位を有する。ADNFIIIポリペプチドもまた、数個のアミノ酸残基、すなわち以下のアミノ酸配列:Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(「NAPVSIPQ(SEQ ID NO:2)」または省略して「NAP」と呼ぶ)を含む活性コア部位を有する。これらのADNFポリペプチドは、それぞれ単独で、神経変性に関連する動物モデルにおいて顕著な効力および活性を有することが以前に示されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
1つの態様において、前記方法は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列を有する活性コア部位を含むADNFIポリペプチドであるADNFポリペプチドを投与する段階を含む。別の態様において、前記方法は、完全長ADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列からなるADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、ADNFIポリペプチドが
2006516253.tif 000019
からなる群より選択されるADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、活性コア部位のN末端またはC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を有するADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。ある特定の態様において、ADNFIポリペプチドは、ADNFIポリペプチドのN末端およびC末端の両方に20個までのアミノ酸を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
ある態様において、前記方法は、ADNFIIIポリペプチドを投与する段階を含み、ADNFポリペプチドはAsn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)のアミノ酸配列を有する活性コア部位を含むポリペプチドである。さらに別の態様において、前記方法は、完全長ADNFIIIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)のアミノ酸配列からなるADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、ADNFIIIポリペプチドが
2006516253.tif 000020
からなる群より選択されるADNFIIIポリペプチドを投与する段階を含む。さらに別の態様において、前記方法は、活性コア部位のN末端およびC末端の少なくとも1つに約20個までのアミノ酸を有するADNFポリペプチドを投与する段階を含む。ある特定の態様において、ADNFポリペプチドは、ADNFポリペプチドのN末端およびC末端の両方に20個までのアミノ酸を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
定義
句「ADNFポリペプチド」は、SALLRSIPA(SEQ ID NO:1)(「SAL」と呼ぶ)もしくはNAPVSIPQ(SEQ ID NO:2)(「NAP」と呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性コア部位を有する1種類もしくはそれ以上の種類の活性依存性神経栄養因子(ADNF)、または神経栄養活性/神経保護活性を有する、その保存的に改変されたバリアントを意味する。神経栄養活性/神経保護活性は、例えば、Hill et al.,Brain Res.603,222-233(1993);Brenneman et al.,Nature 335,636(1988);Brenneman et al.,Dev.Brain Res.51:63(1990);Forsythe & Westbrook,J.Physiol.Lond.396:515(1988);Gozes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:427(1996)に記載のインビトロ皮質ニューロン培養アッセイ法を用いて測定される。ADNFポリペプチドは、ADNFIポリペプチド、ADNFIIIポリペプチド、神経保護作用/神経栄養作用を示す(例えば、インビトロまたはインビボで、中枢神経系において生じるニューロンに対して神経保護作用/神経栄養作用を示す)、その対立遺伝子、多型バリアント、類似体、種間ホモログ(interspecies homolog)、その任意の部分配列(例えば、SALLRSIPA(SEQ ID NO:1)もしくはNAPVSIPQ(SEQ ID NO:2))または親油性バリアントでもよい。「ADNFポリペプチド」はまた、ADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチドの混合物を意味してもよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
用語「ADNFI」は、約14,000ダルトンの分子量と8.3±0.25のpIを有する活性依存性神経栄養因子ポリペプチドを意味する。前記のように、ADNFIポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(「SALLRSIPA(SEQ ID NO:1)」または「SAL」もしくは「ADNF-9」とも呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性部位を有する。Brenneman & Gozes,J.Clin.Invest.97:2299-2307(1996);Glazner et al.,Anat.Embryol.200:65(1999);Brenneman et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,285:619-27(1998);Gozes & Brenneman,J.Mol.Neurosci.7:235-244(1996);Gozes et al.,Dev.Brain Res.99:167-175(1997);およびGozes Trends in Neurosci.24:700(2001)を参照のこと。これらの全ては参照として本明細書に組み入れられる。特別の定めのない限り、「SAL」は、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Alaのアミノ酸配列を有するペプチドを意味し、Ser-Ala-Leuのアミノ酸配列を有するペプチドを意味しない。ADNFIの完全長アミノ酸配列はWO96/11948に記載され、WO96/11948はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
句「ADNFIIIポリペプチド」または「ADNFIII」は、NAPVSIPQ(SEQ ID NO:2)(「NAP」と呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性コア部位を有する1種類もしくはそれ以上の種類の活性依存性神経栄養因子(ADNF)、または神経栄養活性/神経保護活性を有する、その保存的に改変されたバリアントを意味する。神経栄養活性/神経保護活性は、例えば、Hill et al.,Brain Res.603,222-233(1993);Gozes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:427-432(1996)に記載のインビトロ皮質ニューロン培養アッセイ法を用いて測定されるADNFポリペプチドは、ADNFIIIポリペプチド、神経保護作用/神経栄養作用を示す(例えば、インビトロまたはインビボで、中枢神経系において生じるニューロンに対して神経保護作用/神経栄養作用を示す)、対立遺伝子バリアントもしくは多型バリアント、類似体、種間ホモログ、またはその任意の部分配列(例えば、NAPVSIPQ；SEQ ID NO:2)でもよい。ADNFIIIポリペプチドは約8個のアミノ酸からでもよく、例えば、8個〜20個、8個〜50個、10個〜100個、もしくは1000個、またはそれ以上のアミノ酸を有してもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
完全長ヒトADNFIIIは、123,562.8Daの推定分子量(1000個を超えるアミノ酸残基)および約6.97のpIを有する。前記のように、ADNFIIIポリペプチドは、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(「NAPVSIPQ(SEQ ID NO:2)」または「NAP」とも呼ぶ)のアミノ酸配列を含む活性部位を有する。Zamostiano et al.,J.Biol.Chem.276:708-714(2001)およびBassan et al.,J.Neurochem.72:1283-1293(1999)を参照のこと。それぞれが参照として本明細書に組み入れられる。特別の定めのない限り、「NAP」は、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)のアミノ酸配列を有するペプチドを意味し、Asn-Ala-Proのアミノ酸配列を有するペプチドを意味しない。ADNFIIIの完全長配列はWO98/35042およびWO00/27875で見られる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
1つの局面において、前記方法は、以下のアミノ酸配列:Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)を有する活性コア部位を含むADNFIポリペプチドを投与する段階を含む。1つの態様において、ADNFIポリペプチドは、Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala(SEQ ID NO:1)のアミノ酸配列を有する活性コア部位からなる。別の態様において、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端にさらなるアミノ酸を含んでもよい。例えば、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に40個までのアミノ酸を含んでもよい。別の実施例において、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に20個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の実施例において、ADNFIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に10個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の態様において、ADNFIポリペプチドは完全長ADNFIポリペプチドでもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
別の局面において、前記方法は、以下のアミノ酸配列:Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)を有する活性コア部位を含むADNFIIIポリペプチドを被検体に投与する段階を含む。1つの態様において、ADNFIIIポリペプチドは、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln(SEQ ID NO:2)のアミノ酸配列を有する活性コア部位からなる。別の態様において、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端にさらなるアミノ酸を含んでもよい。例えば、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に40個までのアミノ酸を含んでもよい。別の実施例において、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に20個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の実施例において、ADNFIIIポリペプチドは、活性コア部位のN末端および/またはC末端に10個までのアミノ酸を含んでもよい。さらに別の態様において、ADNFIIIポリペプチドは完全長ADNFIIIポリペプチドでもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
好ましい態様において、ADNFIポリペプチドは、(R1)x-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-IIe-Pro-AIa-(R2)y(SEQ ID NO:13)のアミノ酸配列を含み、ADNFIIIポリペプチドは、(R3)w-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-(R4)z(SEQ ID NO:14)のアミノ酸配列を含む。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
前記のADNFIポリペプチドの式の中で、xおよびyは独立して選択され、0または1に等しい。用語「独立して選択される」は、xおよびyが同一でもよく、異なってもよいことを示すために本明細書で用いられる。例えば、xおよびyが両方とも0であってもよく、または、xおよびyが両方とも1であってもよい。さらに、xが0でもよく、yが1でもよい。または、xが1でもよく、yが0でもよい。さらに、xおよびyが両方とも1である場合、アミノ酸配列R1およびR2は同一でもよく、異なってもよい。従って、アミノ酸配列R1およびR2は独立して選択される。R1およびR2が同一である場合、これらは、鎖の長さおよびアミノ酸組成に関して同一である。例えば、R1およびR2は両方ともVal-Leu-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15)でもよい。R1およびR2が異なる場合、鎖の長さおよび/またはアミノ酸組成および/またはアミノ酸配列中のアミノ酸の順序に関して互いに異なってもよい。例えば、R1はVal-Leu-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15)でもよいのに対して、R2はVal-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:16)でもよい。または、R1はVal-Leu-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15)でもよいのに対して、R2はVal-Leu-Gly-Gly-Val(SEQ ID NO:17)でもよい。または、R1はVal-Leu-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15)でもよいのに対して、R2はGly-Val-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:18)でもよい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
同様に、前記のADNFIIIポリペプチドの式の中で、wおよびzは独立して選択され、0または1に等しい。用語「独立して選択される」は、wおよびzが同一でもよく、異なってもよいことを示すために本明細書で用いられる。例えば、wおよびzが両方とも0であってもよく、または、wおよびzが両方とも1であってもよい。さらに、wが0であり、zが1でもよく、またはwが1であり、zが0でもよい。さらに、wおよびzが両方とも1である場合、アミノ酸配列R3およびR4は同一でもよく、異なってもよい。従って、アミノ酸配列R3およびR4は独立して選択される。R3およびR4が同一である場合、これらは、鎖の長さおよびアミノ酸組成に関して同一である。例えば、R3およびR4は両方ともLeu-Gly-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:19)でもよい。R3およびR4が異なる場合、鎖の長さおよび/またはアミノ酸組成および/またはアミノ酸配列中のアミノ酸の順序に関して互いに異なってもよい。例えば、R3はLeu-Gly-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:19)でもよいのに対して、R4はLeu-Gly-Leu-Gly(SEQ ID NO:20)でもよい。または、R3はLeu-Gly-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:19)でもよいのに対して、R4はLeu-Gly-Leu-Gly-Leu(SEQ ID NO:21)でもよい。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
範囲内で、ある特定のADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチド、すなわち、x、y、w、およびzが全て0であるADNFIポリペプチドおよびADNFIIIポリペプチド(すなわち、それぞれ、SALLRSIPAおよびNAPVSIPQ(SEQ ID NO:2))が好ましい。xが1であり、R1がVal-Leu-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15)であり、yが0であるADNFIポリペプチドが同様に好ましい。xが1であり、R1がVal-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:22)であり、yが0であるADNFIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がGly-Glyであり、zが0であるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がLeu-Gly-Glyであり、zが1であり、R4がGln-SerであるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がLeu-Gly-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:19)であり、zが1であり、R4がGln-SerであるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。wが1であり、R3がSer-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO:23)であり、zが1であり、R4がGln-SerであるADNFIIIポリペプチドも同様に好ましい。インタクトなADNFIまたはADNFIII成長因子が驚くべき顕著な生物学的活性を示すことによって証明されるような生物学的活性を失うことなく、これらの活性部位(SALLRSIPA(SEQ ID NO:1)またはNAPVSIPQ(SEQ ID NO:2))のN末端およびC末端の両方に、さらなるアミノ酸を付加することができる。ADNFIポリペプチドの説明については、1994年10月17日に出願されたU.S.S.N.08/324,297(WO96/11948としても公開されている)、ADNFIIIポリペプチドの説明については、1997年2月27日に出願されたU.S.S.N.60/037,404および1997年9月23日に出願されたU.S.S.N.60/059,621(WO98/35042としても公開されている)を参照のこと。これらは全て参照として本明細書に組み入れられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
SALLRSIPA(SEQ ID NO:1)およびNAPVSIPQ(SEQ ID NO:2)を含む小さなポリペプチドは血液脳関門を通過する。血液脳関門を通過しない長いポリペプチドの場合、脳にタンパク質を投与する方法が周知である。例えば、タンパク質、ポリペプチド、他の化合物および細胞は、脳室内(ICV)注射またはカニューレを介して哺乳動物脳に送達することができる(例えば、
2006516253.tif 000021
を参照のこと)。特に、神経栄養因子を哺乳動物に投与するために、カニューレを使用することができる(例えば、Motta & Martini,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.168:62-64(1981)(neurotensin);Peng et al.,Brain Res.632:57-67(1993)(NGF);Anderson et al.,J .Comp.Neurol.357:296-317(1995)を参照のこと)(BDNF、NGF、ニューロトロフィン-3)。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
当業者であれば、ある特定の核酸配列に変化を加える多くの方法があることを理解するだろう。このような周知の方法として、部位特異的変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅、変異誘発薬剤または放射線への核酸含有細胞の暴露、望ましいオリゴヌクレオチドの化学合成(例えば、大きな核酸を作成するために連結および/またはクローニングと併用する)、および他の周知の技法が挙げられる(Giliman & Smith,Gene 8:81-97(1979);Roberts et al.,Nature 328:731-734(1987)を参照のこと)。例えば、アラニンスキャニングを用いて、NAPVSIPQ(SEQ ID NO:2)の保存的に改変されたバリアントを決定することができる(すなわち、各アミノ酸を1個ずつアラニンまたは他の小さな天然アミノ酸で置換し、本明細書に記載のように活性をアッセイすることによって決定することができる)。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
これらのアッセイ法を使用すれば、当業者は、本発明の開示に従う多数のADNFポリペプチドを容易に調製し、次いで、本明細書に示したものに加えて、インタクトなADNFIII成長因子の神経保護活性/神経栄養活性を有するADNFIIIポリペプチドを発見するために、前述のアッセイ法を用いてスクリーニングすることができる。例えば、出発点としてADNFIII-8(すなわち、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln；SEQ ID NO:2)を使用して、系統的に、例えば、Gly-、Gly-Gly-、Leu-Gly-Gly-をADNFIII-8のN末端に付加し、次いで、神経保護活性/神経栄養活性を有するかどうか確かめるために、これらのADNFIIIポリペプチドのそれぞれを前述のアッセイ法においてスクリーニングすることができる。こうすることで、インタクトなADNFIII成長因子が驚くべき顕著な生物学的活性を示すことによって証明されるような生物学的活性を失うことなく、さらなるアミノ酸を、新たに発見された活性部位(すなわち、Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln；SEQ ID NO:2)のN末端およびC末端の両方に付加できることが分かるだろう。この説明はADNFIポリペプチドにも当てはまる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
本研究は、NAP(Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln,一文字記号:NAPVSIPQ；SEQ ID NO:2)ペプチドを投与すると、MOG誘導EAEマウスの疾患の徴候が弱まることを証明する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2006516253000001.app
【国際調査報告】
2006516253.tif 000022
2006516253.tif 000023