(57)【要約】花弁、葉又は花弁と葉が非突然変異体マリーゴールド中の比に対して高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むマリーゴールド植物、その再生可能な部分及び種子が開示される。花弁がゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、キサントフィルがアルコールとして分析される場合に、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成する、マリーゴールド植物、その再生可能な部分及び種子がまた開示される。また、このような植物の調製方法、このようなカロテノイド比を有するオレオレジン及び食用物質が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントフィルをアルコールとして分析した場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中におけるネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、β-カロテン比、リコペン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を含むことを特徴とするマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項２】
前記β-カロテン比が、約1:10より大きい、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項３】
葉が、高められたβ-カロテン比を示す、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項４】
花弁が、高められたβ-カロテン比を示す、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項５】
前記β-カロテン比が、約2:10より大きい、請求項４記載のマリーゴールド花弁。
【請求項６】
ハイブリッドから、請求項４記載のマリーゴールド花弁。
【請求項７】
微粉砕形態で存在する、請求項４記載のマリーゴールド花弁。
【請求項８】
非突然変異体マリーゴールド植物に対し高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の少なくとも一つを更に示す、請求項４記載のマリーゴールド花弁。
【請求項９】
前記β-カロテン比が、約3:10より大きい、請求項４記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１０】
前記リコペン比が、約1:10より大きい、請求項１記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項１１】
花弁が、高められたリコペン比を示す、請求項１０記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項１２】
前記リコペン比が、約2:10より大きい、請求項１０記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１３】
ハイブリッドからの、請求項１０記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１４】
微粉砕形態で存在する、請求項１０記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１５】
非突然変異体マリーゴールド植物に対して、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の少なくとも一つを更に示す、請求項１０記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１６】
前記リコペン比が、約3:10より大きい、請求項１０記載のマリーゴールド花弁。
【請求項１７】
マリーゴールド植物又はその再生可能な部分であって、その花弁、葉又は花弁と葉の両方が、キサントフィルをアルコールとして分析した場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中におけるネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、β-カロテン比、リコペン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を含むことを特徴とする、マリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１８】
花弁のβ-カロテン比が、約1:10より大きい、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項１９】
葉が、高められたβ-カロテン比を示す、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２０】
花弁が、高められたβ-カロテン比を示す、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２１】
化学的に誘導された突然変異体である、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２２】
電離放射線誘導突然変異体である、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２３】
組換え誘導突然変異体である、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２４】
キサントフィルをアルコールとして分析する場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中におけるネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を更に示す、請求項１８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２５】
前記β-カロテン比が、約2:10より大きい、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２６】
ハイブリッドである、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２７】
再生可能な部分が、胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花からなる群から選ばれた細胞、又はこれらに由来するプロトプラストもしくはカルスである、請求項１８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２８】
花弁のリコペン比が、約1:10より大きい、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項２９】
キサントフィルをアルコールとして分析する場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中におけるネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を更に示す、請求項２８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３０】
前記β-カロテン比が、約2:10より大きい、請求項２８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３１】
ハイブリッドである、請求項２８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３２】
再生可能な部分が、胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花からなる群から選ばれた細胞、又はこれらに由来するプロトプラストもしくはカルスである、請求項２８記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３３】
花弁、葉又は花弁と葉の両方が、約0.2〜約１のネオキサンチン＋ビオラキサンチン比を示す、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３４】
花弁が、ケン化後にアルコールとして分析される場合のα-クリプトキサンチン対α-クリプトキサンチン＋ルテインの比として約0.25〜約0.9を示す、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３５】
花弁が、約0.3〜約１のフィトエン比を示す、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３６】
花弁が、約0.2〜約１のフィトフルエン比を示す、請求項１７記載のマリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３７】
花弁が、約0.25〜約0.9であるα-クリプトキサンチン比を示す、マリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３８】
請求項１７記載のマリーゴールド植物の花粉。
【請求項３９】
請求項１７記載のマリーゴールド植物の胚珠。
【請求項４０】
好適な環境に植え付け、成熟まで成長させると、請求項１７記載のキサントフィルマリーゴールド植物を生じる種子。
【請求項４１】
必要によりルテインと混合されてもよい、ネオキサンチン＋ビオラキサンチン、β-カロテン、リコペン、α-クリプトキサンチン、フィトエン及びフィトフルエンからなる群から選ばれた一種以上のマリーゴールド由来色素を溶解又は分散した食用媒体を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、ルテインに対する存在する前記色素のいずれかの比が、約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項４２】
ゼアキサンチン比が、約2:10より大きい、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
前記食用媒体が、食用油である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４４】
前記食用媒体が医薬上許される結合剤である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４５】
食用媒体中で溶解又は分散された、ルテイン及びネオキサンチン＋ビオラキサンチン、β-カロテン、リコペン、α-クリプトキサンチン、フィトエン及びフィトフルエンからなる群から選ばれた一種以上の色素のマリーゴールド由来脂肪酸エステルの混合物を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、キサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ルテインに対する存在する前記色素のいずれかの比が約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項４６】
β-カロテン比が、約2:10より大きい、請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
リコペン比が、約2:10より大きい、請求項４５記載の組成物。
【請求項４８】
前記食用媒体が、食用油である、請求項４５記載の組成物。
【請求項４９】
前記食用媒体が、医薬上許される結合剤である、請求項４５記載の組成物。
【請求項５０】
突然変異体マリーゴールドのオレオレジンであって、前記オレオレジンが、非突然変異体マリーゴールドからのオレオレジンに対し高められたリコペン比を有することを特徴とするオレオレジン。
【請求項５１】
突然変異体マリーゴールドのオレオレジンであって、前記オレオレジンが、遊離の、未エステル化キサントフィルを含むことを特徴とするオレオレジン。
【請求項５２】
α-クリプトキサンチンを含む着色カロテノイドを含むことを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項５３】
α-クリプトキサンチンが、花弁中に存在する最も多量のカロテノイドである、請求項５２記載のマリーゴールド花弁。
【請求項５４】
ルテインを実質的に含まず、かつキサントフィルがアルコールとして分析される場合に、そのカロテノイドの少なくとも約半分が、ゼアキサンチン及びβ-カロテンを含むことを特徴とするマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項５５】
キサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ゼアキサンチン及びβ-カロテンが一緒になって意図される植物の葉及び／又は花弁中に存在する抽出可能なカロテノイド色素の約60質量％〜約95質量％を構成する、請求項５４記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項５６】
β-カロテンが、意図される植物の葉及び／又は花弁中に存在するカロテノイド色素の約５質量％〜約80質量％を構成する、請求項５４記載のマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項５７】
ゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、かつキサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成することを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項５８】
花弁が、ゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、かつキサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成することを特徴とするマリーゴールド植物、又はその再生可能な部分。
【請求項５９】
請求項５８記載のマリーゴールド植物の花粉。
【請求項６０】
請求項５８記載のマリーゴールド植物の胚珠。
【請求項６１】
好適な環境に植え付け、成熟まで成長させて、請求項５８記載のマリーゴールド植物を生じる種子。
【請求項６２】
マリーゴールドオレオレジンであって、そのカロテノイドがゼアキサンチンエステルを含み、かつ前記オレオレジンが、ケン化後に分析される場合にネオキサンチンエステル及びビオラキサンチンエステルの両方を実質的に含まないことを特徴とするマリーゴールドオレオレジン。
【請求項６３】
食用媒体中に溶解又は分散されるゼアキサンチンエステル及び一種以上のその他のカロテノイドを含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適したカロテノイド組成物であって、ネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、ゼアキサンチンが、カロテノイドの約50％から90％未満までを構成し、かつ前記の一種以上のその他のカロテノイドが、ケン化後に分析される％量を有しかつキサントフィル％がアルコールとして測定される、カロテン、キサントフィル、又はキサントフィルエステルの一種以上であることを特徴とするカロテノイド組成物。
【請求項６４】
キサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するゼアキサンチン比、ネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、β-カロテン比、リコペン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を含むマリーゴールド花弁又は花を含むことを特徴とする食品添加物。
【請求項６５】
前記花弁が、実質的に全体である、請求項６４記載の食品添加物。
【請求項６６】
前記花弁が、微粉砕される、請求項６４記載の食品添加物。
【請求項６７】
前記花弁が、乾燥される、請求項６４記載の食品添加物。
【請求項６８】
前記花弁が、ゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まず、ゼアキサンチンが、ケン化後にジアルコールとして測定される場合に抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成する、請求項６４記載の食品添加物。
【請求項６９】
乾燥され、微粉砕されたマリーゴールド花弁を含むことを特徴とする食品添加物。
【請求項７０】
前記花弁が、ケン化後にジアルコールとして測定される主要キサントフィルとしてルテイン及びゼアキサンチンを含む、請求項６９記載の食品添加物。
【請求項７１】
前記ゼアキサンチン比が、約３〜約７：100である、請求項７０記載の食品添加物。
【請求項７２】
前記ゼアキサンチン比が、約1:10より大きい、請求項７０記載の食品添加物。
【請求項７３】
前記花弁が、ゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まず、ゼアキサンチンがケン化後にジアルコールとして測定される場合に抽出可能なカロテロイドの少なくとも約半分を構成する、請求項６９記載の食品添加物。
【請求項７４】
前記花弁が、非突然変異体マリーゴールドからの乾燥され、微粉砕された花弁に対し高められたリコペン比を含む、請求項６９記載の食品添加物。
【請求項７５】
前記α-クリプトキサンチンが、乾燥され、微粉砕された花弁中に存在する最も多量のカロテノイドである、請求項６９記載の食品添加物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は2001年６月29日に出願された米国仮特許出願第60/302,460号の優先権をそれ自体主張した、2002年６月26日に出願された米国特許出願第10/180,775号の一部継続出願であった、2002年12月19日に出願された米国特許出願第10/325,265号の一部継続出願である。
本発明は通常の比以外で存在するカロテノイド色素を含むマリーゴールド植物に関する。更に特別には、本発明は花弁、葉又は花弁と葉の両方がルテインに対し高められた比の一種以上のカロテノイド化合物を含む、マリーゴールド植物、その再生可能な部分、ハイブリッド又はその後の世代、そしてまたこのようなマリーゴールド植物を生じる種子、このような花又は葉から生じたオレオレジン並びにゼアキサンチン及びルテインを使用してつくられた食用製品に関する。このような意図されたマリーゴールドの花弁はまた典型的には測定可能な量のゼータ-カロテン（マリーゴールド花弁中に通常見られない化合物）を含む。
【背景技術】
【０００２】
種々の集団における多くの疫学的研究はカロテノイドに富むかなりの量の果実及び野菜の消費が幾つかの型の癌になるリスクを低減し得ることを示していた。結果として、科学者らは癌、心血管疾患及び眼の疾患の予防におけるベータ（β）-カロテンの如きカロテノイドの保護効果の研究に集中していた。これらの研究はβ-カロテンがその消費が健康上の利益と関連していた果実及び野菜に見られる唯一の主要なカロテノイドであるという事実にもかかわらず行なわれていた。このような集中の理由はβ-カロテンのプロビタミンＡ活性及びその他の主要な食物カロテノイドの制限された商用上の利用可能性に起因し得る。
食事から入手でき、人体により吸収、代謝、又は利用し得る40〜50種のカロテノイドの中で、わずかに13種のカロテノイド及びそれらの立体異性体のうちの12種がヒト血清及び母乳中に尋常に見られる〔Khachikら, Anal. Chem., 69:1873-1881 (1997)を参照のこと〕。加えて、３種の食物カロテノイド：ルテイン、ゼアキサンチン及びリコペンの一連の酸化還元反応から生じる８種のカロテノイド代謝産物及び一種の立体異性体がヒト血清又は血漿中にある。これらの代謝産物が最初にKhachikらにより単離され、特性決定された〔Khachikら, Anal. Chem., 64:2111-2122 (1992)を参照のこと〕。
別の研究において、食物(3R,3'R,6'R)-ルテイン及び(3R,3'R)-ゼアキサンチンの精製サプリメントの摂取はヒト中のこれらの化合物の血液レベルの増大をもたらすだけではなく、血漿中のそれらの酸化代謝産物の濃度の増大をもたらすことが示された〔Khachikら, J. Cellular Biochem., 22: 236-246 (1995)を参照のこと〕。これらの知見はカロテノイドが疾患予防において酸化防止剤として機能し得るという予備の証拠を与えた。加えて、これらの結果はまた非ビタミンＡ活性食物カロテノイド、特に、ルテイン、ゼアキサンチン、及びリコペンの重要性を証明した。
黄斑色素カロテノイド、ルテイン及びゼアキサンチンは年齢関連黄斑変性(ARMD)、白内障形成、及びその他の光誘導酸化的眼損傷の予防に重要な役割を果たし得るという証拠が増しつつある。1985年及び1993年に、Boneらはヒト黄斑色素がルテイン及びゼアキサンチンの組み合わせであることを実証し、これらの食物カロテノイドが眼疾患ARMDの予防に役割を果たし得ると考察した〔Boneら, Vision Research, 25:1531-1535 (1985)及びBoneら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 34: 2033-2040 (1993)を参照のこと〕。特にルテイン及びゼアキサンチンに富む、果実及び野菜の高消費がその後のARMDの43％低いリスクと相関関係があるというケースコントロール疫学的研究における更なる研究がその考察を確認した〔Seddonら, J. A. Med. Assoc., 272(18) 1413-1420 (1994)を参照のこと〕。また、β-カロテン以外の血清カロテノイドの増大されたレベルは心臓疾患の低い罹患率と関連することが報告されていた〔Morrisら, J. Amer. Med. Assoc., 272(18):1439-1441 (1994)を参照のこと〕。
Bernsteinらはヒトの眼の全ての組織中の食物カロテノイド及びそれらの酸化代謝産物を同定し、定量し、ガラス体、角膜及び強膜を除く試験した殆ど全ての眼の構造が定量可能なレベルの食物(3R,3'R,6'R)-ルテイン、ゼアキサンチン、それらの幾何(E/Z)異性体だけでなく、それらの代謝産物、(3R,3'S,6'R)-ルテイン(3'-エピルテイン)及び3-ヒドロキシ-β,ε-カロテン-3'-オンを有すると報告した。虹彩中で、これらの色素はおそらく光障害性短波長可視光をフィルターするのに役割を果たし、毛様体中で酸化防止剤として作用すると考えられた。両方のメカニズムが網膜色素上皮／脈絡膜（RPE/脈絡膜）中で機能性であり得る〔Bernsteinら, Exp. Eye Research, 72(3): 215-223 (2001)を参照のこと〕。
【０００３】
ヒト網膜中の黄斑色素立体異性体の分布の研究は成人網膜、特に斑点中の(3S,3'S)-ゼアキサンチンを同定した。食事ルテイン及びゼアキサンチンは血清中に見られるのと同じ比率で個体の網膜に輸送されるが、２種の色素は血液中に見られる比とは異なる比で眼中に存在することが提案された。こうして、ゼアキサンチンはか領域中で2:1より大きい比だけルテインよりも優位であり、黄斑色素光学密度が100倍だけ低下し、ゼアキサンチン対ルテイン比が約1:2に反転する〔Boneら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 29:843-849 (1988)を参照のこと〕。若干のルテインが主として黄斑中で非食事メソ-ゼアキサンチンに変換される〔Boneら, Exp. Eye Res., 64(2): 211-218 (1997)を参照のこと〕。このような論文は眼のカロテノイドの重要な役割を支持し、それ故、一般に食事カロテノイド、特にルテイン及びゼアキサンチンの商用生産の重要性を支持する。
タゲテス属はキク科の一員であり、強いかおりのある一年草又は多年草の30種ほどの種を含む。タゲテスはアリゾナ及びニューメキシコからアルゼンチンまで自生している〔Hortus Third A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States and Canada, MacMillan Publishing Company (1976)を参照のこと〕。培養された属として、タゲテス・エレクタ(Tagetes erecta)（普通アフリカンマリーゴールドと称される）、タゲテス・パツラ(Tagetes patula)（普通フレンチマリーゴールドと称される）、タゲテス・エレクタ x パツラ（普通三倍体マリーゴールドと称される）、及びタゲテス・テヌイフォリア(Tagetes tenuifolia)（またミニマリーゴールド又はシグネット(signet)マリーゴールドとして知られている）が挙げられる。
マリーゴールド花序は数百の無柄又は亜無柄の小さい花（また小花として知られている）の稠密な花房を含む単頂である。マリーゴールドは舌状又は中央の管形中心小花のまわりのストラップ形である外部舌状小花を有する放線状花頭を有する。マリーゴールド花頭の幾つかの形態はそれらの中心花の殆どが舌状花に変形されており、あったとしても、わずかな中心花を含む。このような花頭が八重咲き性と称される。
【０００４】
舌状花又は小花はまた花頭を花と称し得る取り木人により花弁としばしば称される。容易な理解のために、マリーゴールド花頭は本明細書中花又は花頭と称され、一方、花頭成分の花又は小花、おしべ、柱頭及び心皮は花弁と称される。
培養されたマリーゴールドは目のさめるような美しい花を有し、観賞目的に有益である。加えて、その属は天然着色剤、必須オイル、及びチオフェンの源として認められている。乾燥マリーゴールド花弁及び所謂キサントフィルマリーゴールドから得られたマリーゴールド花弁濃厚物は養鶏工業で飼料添加剤として使用されて卵黄及びブロイラー皮膚の黄色を強化する〔Piccaliaら, Ind. Crops and Prod., 8:45-51 (1998)を参照のこと〕。家禽組織中に所望されるカロテノイドはそれらの食事濃度の関数である。何とならば、家禽はカロテノイドを新たに合成する能力を有しないからである〔Balnaveら, Asian-Australiasian J. Animal Sci., 9(5): 515-517 (1996)を参照のこと〕。
キサントフィルマリーゴールドは観賞用マリーゴールドとは幾つかの特徴を異にする。第一に、かつ真っ先に、キサントフィルマリーゴールドはカロテノイドの抽出可能な源として使用され、観賞用マリーゴールドとは異なる植物習性を有する。観賞用マリーゴールドは典型的には地面からわずかに約45〜約60cmまで成長し、一方、キサントフィルマリーゴールドは地面から約65〜約70cmまで成長する。キサントフィルマリーゴールドは観賞用マリーゴールドよりも良く茂る習性で成長し、ロークロップのように生育でき、一方、観賞用マリーゴールドは典型的にはそれができない。キサントフィルマリーゴールドは典型的には色が暗オレンジであり、一方、観賞用は色が白色、黄色、又はオレンジであり、又はアントシアニン色素の存在のためにマホガニー色を含む、混合色を有し得る。
マリーゴールド花弁粉の着色能力は主としてキサントフィル、主にルテインエステルとして知られている酸素化カロテノイドフラクションにある〔Piccaliaら, Ind. Crops and Prod., 8:45-51 (1998)を参照のこと〕。またマリーゴールド花弁中に見られる、キサントフィルゼアキサンチンは、ブロイラー着色剤として有効であり、高度に許される黄色〜黄色-オレンジ色を生じることが示されていた〔Marusichら, Poultry Sci., 55:1486-1494 (1976)を参照のこと〕。キサントフィルのうち、色素ルテイン及びゼアキサンチンが商用で入手し得るハイブリッド中で最も多量である。ルテイン及びゼアキサンチンに関する構造式が以下に示される。
【０００５】
【化１】
2006506060.tif 000002
【０００６】
ルテイン
【０００７】
【化２】
2006506060.tif 000003
【０００８】
ゼアキサンチン
ルテイン及びゼアキサンチンの夫々はそれらの末端環構造の夫々中に一つのヒドロキシル基を含み、その結果、夫々の分子は二つのヒドロキシル基を含む。ルテインはα-カロテンの二つの別々のヒドロキシル化により生物学的に生成されると考えられ、一方、ゼアキサンチンはβ-カロテンの二つの別々のヒドロキシル化により生物学的に生成されると考えられる。
α-カロテン及びβ-カロテンの両方はδ-カロテン又はγ-カロテン（これらはその後に更に環化してα-カロテン又はβ-カロテンを夫々生成する）を最初に生じるリコペンに対する適当なシクラーゼ酵素の作用により生成されると理解される。リコペン、γ-カロテン、α-カロテン及びβ-カロテンは夫々炭化水素カロテノイド（これらは当業界でカロテンと称される）である。こうして、カロテノイド色素は二つのファミリー：炭化水素カロテン又は酸素化キサントフィルの一方又は他方に類別し得る。その経路中の最初のC40カロテロイドであるフィトエンは無色の炭化水素である。β-カロテン以外の炭化水素カロテン色素は典型的にはマリーゴールドの葉又は花部分中に蓄積せず、一方、キサントフィルは葉及び花部分の両方中に蓄積する。
図１はフィトエンからリコペン、γ-カロテン、α-カロテン及びβ-カロテンを経由してルテイン及びゼアキサンチン並びにその後の生成物の生成のための生物学的合成経路の略図を示す。ルテイン及びゼアキサンチンは主として脂肪酸のモノエステル及びジエステルとしてマリーゴールド花弁中に存在する。図１はまたゼアキサンチンから生じ得るエポキシドを含むその後の生成物を示し、そのうちのビオラキサンチンはアブシジン酸生合成経路の中間体である。
飼料添加物工業について、キサントフィルマリーゴールドは主としてメキシコ、ペルー、アフリカ、インド、中国及びタイで生産される。最新の商用品種として、初期のキサントフィル生成品種の一種である、“オレンジエード(Orangeade)”、及び一層大きい花及び一層大きい色素歩留りを有する“ディープオレンジエード”を含む、“オレンジエード”の商用改良、並びにキサントフィル濃度の改良である“スカーレットエード(Scarletade)”が挙げられる。こうして、“オレンジエード”は乾燥全花頭（がくを含む）1g当り約9-12mgのキサントフィルを含むと報告され、“ディープオレンジエード”は1g当り約10-13mgのこれらの色素を有すると報告され、“スカーレットエード”はがくとともに計量された乾燥花頭1g当り約12-18mgのキサントフィル色素を含むと言われている。これらの品種はパンアメリカン・シード社（622タウン・ロード、ウェスト・シカゴ、IL 60185）から入手し得る。
【０００９】
ルテインはマリーゴールド花中の主要キサントフィルであり、一方、幾つかの現在の品種は典型的には３〜５％範囲のゼアキサンチン比〔ゼアキサンチン／（ルテイン＋ゼアキサンチン）〕を有する抽出生成物を生じる（Product Profile, Kemin Foods L.C., 600 E. Court Ave. Suite A, Des Moines, IA 50309を参照のこと）。以下の結果からわかるように、“スカーレットエード”を使用して得られたゼアキサンチン対ルテイン比は典型的には約４〜約７％である。こうして、これらの既知のキサントフィルマリーゴールドは約3:100〜約7:100のゼアキサンチン比を示す。
Moehsら, Plant Mol. Biol., 45:281-293 (2001)は暗オレンジの花を有する所謂野生型を含む、アフリカンマリーゴールドの観賞品種、並びに黄色、淡黄色及び白色の花を有する植物中のカロテノイドの生合成を分析した。その他の知見の中で、これらの研究者らは異なる植物が白色（突然変異体）から暗オレンジに至る花の色の範囲を有するが、これらの花の色の相違は異なるカロテノイド生成物又は中間体の蓄積よりむしろ、非常に異なる量の同カロテノイド、ルテインの蓄積のためであると言われると報告した。研究した植物間の相違は生成されたカロテノイドの特定の型又は生合成中間体の蓄積ではなく、主としてカロテノイド経路中のフラックスの調節に関連することが明らかであった。
加えて、所謂野生型及び突然変異体（白色の花の植物）の葉は花の色にかかわらず、ほぼ同じ相対量のカロテノイド色素を含むと報告された。これらの色素は花弁中に存在する色素とは異なった。こうして、花弁について報告された唯一の色素はルテインであり、一方、葉はルテインだけでなく、β-カロテン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンを含むと報告された。図１からわかるように、ルテインではなくβ-カロテンが後者の２種の色素の前駆体であり得る。
Moehsらの著者らはまた彼らが単離したアフリカンマリーゴールド遺伝子をシロイスナズナ（下記のPogsonらの文献）の葉から得られた同様のカロテノイド生成遺伝子と比較した。約70〜約80％の遺伝子産物間の同一性はタンパク質レベルで報告され、シグナルペプチドを標的とする推定プラスチドが排除された場合には高レベルであり、またDNAレベルでは低レベルの同一性であった。シロイスナズナの葉中で、ルテインが主要カロテノイドであり、またβ-カロテン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンが生成されるが、ゼアキサンチンは通常蓄積されない。
アフリカンマリーゴールド中のカロテノイド生合成は多くの遺伝子そしておそらく二つの経路を伴う複雑な系である。カロテノイド生成に関する遺伝子突然変異の影響は優先を予測し得ない。しかしながら、古典的育種技術は上昇したレベルの上記キサントフィルを生じる“オレンジエード”、“ディープ・オレンジエード”及び“スカーレットエード”アフリカンマリーゴールド品種を生産した。これらの比較的最近育種された入手し得る品種はゼアキサンチン比を増大しようと試みて遺伝子突然変異を誘発する処理にかけられていなかった。
【００１０】
幾人かの研究者らはマリーゴールドを含む、顕花植物に関する突然変異原、例えば、γ放射線、エチルメタンスルホネート(EMS)及びニトロソメチル尿素(NMU)の効果を調べていた。例えば、Zahariaら, Buletinul Institutului Agronomic Cluj-Napoca. Seria Agricultura 44(1): 107-114 (1991)はジニア・エレガンス(Zinnia elegans)、アフリカンマリーゴールド及びカリステパス・チャイネンシス(Callistephus chinensis)の種子が種々の量のγ放射線で照射された後の子葉鞘中のカロテノイドのクロロフィル欠乏効果について報告した。Geethaらによる論文、Acta Botanica Indica, 20(2): 312-314 (1992)はフレンチマリーゴールドに関するγ放射線のクロロフィル欠乏効果について報告している。
Diaconu, Agronomie, 34(1): 17-21 (1991)は通称ポットマリーゴールド、又はカレンジュラ(Calendula)（これらはタゲテス属のうちで同等ではない）のF2多交雑からの種子の発芽に関するEMSの効果について報告した。これらの研究者らは花の色、花序構造、M2-M4植物中の生物学的に活性な物質の歩留り及び含量の広い変化に注目した。
Pogsonら, Plant Cell, 8:1627-1639 (1996)による研究はEMSを使用してシロイスナズナの植物を突然変異誘発した。4000のM2系列のこの詳細な研究はγ-カロテンからのルテインの生成と関係する葉中のカロテノイド生合成経路中の二つの遺伝子座を見つけたと報告した。これらの遺伝子座がlut1及びlut2と称された。lut2遺伝子座はリコペンε-環シクラーゼ酵素と関連すると報告され、一方、lut1遺伝子座はリコペンε-環ヒドロキシラーゼと関連すると報告された。これらの研究者らはルテイン生成の減少がその他のカロテノイドの存在量の等モル変化により相殺されるが、わずかに少量のこれらの変化がゼアキサンチンの増大された生成のためであることに注目した（1631頁）。
Cetlら, Folia Fac. Sci. Nat. Univ. Purkynianae Brun Biol., 21(1):5-56 (1980)は不十分な記載から全てが観賞品種であることが明らかであるアフリカンマリーゴールド及びその他のタゲテス種を用いる広範な研究を報告した。これらの研究中で、これらの著者らはアフリカンマリーゴールド種子に関するNMUの種々の濃度の効果を調べ、約2000より多い植物を調べた。親交雑の表現型から逸脱する全てのM2植物が記録され、表現型の異なる植物のM2種子からのM3植物が研究された。
【００１１】
これらの研究者らは植物の高さ、植物の直径、花頭の直径及び花頭の高さだけでなく、開花の時期、分枝量、分枝の長さ、子葉及び葉のサイズ、並びに花柄の長さを分析した。花の色又は葉もしくは花弁中のカロテノイドレベルに関して言及されていない。
DellaPennaらの公開されたPCT出願WO 00/32788はマリーゴールド中のカロテノイド生合成を調節する方法を主張している。これらの研究者らはリコペンからのゼアキサンチンの調製に必要とされるリコペンβ-環シクラーゼ及びリコペンβ-環ヒドロキシラーゼをコードするものであると言われているポリヌクレオチド配列を提供する。また、リコペンからのα-カロテンの調製のためにリコペンβ-環シクラーゼとともに有益なリコペンε-環シクラーゼが開示されている。ルテイン生成に必要とされるリコペンε-環ヒドロキシラーゼの教示は示されていない。
カロテノイド生合成はPCT出願WO 00/32788では先に注目されたものの如きマリーゴールド中に既に存在するカロテノイド合成酵素をコードする遺伝子の発現により、又は提供されたこのようなヌクレオチド配列によりコードされたアンチセンスRNAの使用により調節されると言われている。このような調節の証拠はその出願には示されていない。相同遺伝子の追加が天然遺伝子及びトランスジーンの両方を発現させない同時抑制として知られている現象はこれらの研究者らにより取り扱われていない〔例えば、Frayら, Plant Mol. Biol., 22:589-692 (1993)又はFinneganら, Bio/Technology 12:883-888 (1994年９月)を参照のこと〕。
【００１２】
Soudantらの米国特許第6,383,474号はフィトエン及びフィトフルエンが一緒になって酸化及び紫外線への暴露から生じる損傷を防止するのに有効であると教示している。この組み合わせは局所製剤として、医薬として、又は食品添加物として有効であると言われている。
β-カロテン及びリコペンは公知の食品添加物であり、リコペン消費が前立腺癌の低減されたリスクを与えると最近報告されている〔Giovannucciら, J. Natl. Cancer Inst., 87(23): 1767-1776 (1995)を参照のこと〕。リコペンはトマトの皮中の赤色色素として天然に存在し、一方、β-カロテンはニンジン中の主要カロテノイド色素である。Hauptmannらの米国特許第5,618,988号はニンジンの如き形質転換植物の貯蔵器官中のβ-カロテンの如きカロテノイド色素の調製を教示している。Ausichらの米国特許第5,858,700号はトマトの皮から調製し得るようなオレオレジンからのリコペン結晶の単離を教示している。リコペン及びβ-カロテンの構造式が以下に示される。
【００１３】
【化３】
2006506060.tif 000004
【００１４】
リコペン
【００１５】
【化４】
2006506060.tif 000005
【００１６】
β-カロテン
ゼアキサンチン対ルテインの増大された比は赤色キサントフィル、アスタキサンチンを含む付加的なキサントフィルのバイオテクノロジー的生成に魅力的な基質を与え得る。アスタキサンチンは培養された魚及び貝の着色剤として広く使用される。アスタキサンチンの完全な生物医学的性質は解明されるべく残っているが、初期の結果はそれが癌及び腫瘍予防に重要な役割を果たし得るだけでなく、免疫系からの積極的な応答を誘発することを示唆する〔Tanakaら, Carcinogenesis 15(1): 15-19 (1994); Jyonouchiら, Nutrition and Cancer 19(3):269-280 (1993)及びJyonouchiら, Nutrition and Cancer 16(2): 93-105 (1991)を参照のこと〕。
生物学的源、例えば、甲殻類、酵母及び緑藻類から供給されたアスタキサンチンは有機合成方法により得られたものと比較される場合に低い歩留り及びコストのかかる抽出方法により制限される。しかしながら、通常の合成方法は許容し得ないと考えられる副生物を生成する。それ故、水産養殖における飼料サプリメントとして、またその他の工業用の有益な薬品として使用される(3S,3'S)アスタキサンチンの比較的安価な源を見つけることが望ましい。
生物学的系中のアスタキサンチン生成の生産性を増大するための一つのアプローチは遺伝子操作技術を使用することである。この変換に適した遺伝子が報告されていた。
例えば、Misawaら（米国特許第6,150,130号を参照のこと）は海洋細菌アグロバクテリウム・アウランチアカス(Agrobacterium aurantiacus) sp. nov. MK1又は4-ケトゼアキサンチンにより基質としてのゼアキサンチンからのアスタキサンチンの生成に使用される遺伝子（crtWと称される）をコードするアルカリゲネス(Alcaligenes) sp. PC-1から単離されたものを含むDNA配列を特定した。Kajiwaraら（米国特許第5,910,433号を参照のこと）は宿主微生物又は植物からの(3S,3'S)アスタキサンチンの生成のためのβ-C-4-オキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヘマトコッカス・プルビアリス(Haematococcus pluvialis)から単離されたポリヌクレオチド分子（bktと称される）を同定した。加えて、Hirschbergら（米国特許第5,965,795号を参照のこと）は4-ケトゼアスタンチンによりゼアスタンチンからアスタキサンチンを合成する酵素をコードするヘマトコッカス・プルビアリスからの別のDNA遺伝子配列（crtOと称される）を記載した。更に、Cunningham（WO 99/61652を参照のこと）は一部ケトカロテノイドアスタキサンチンの蓄積のために暗赤色の花の色を有する植物種、アドニス・エスチバリス(Adonis aestivalis)からのケトラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAの単離を報告した。
【００１７】
それ故、花弁もしくは葉又はその両方が商業上有益な量のキサントフィル並びにルテイン及びゼアキサンチンの変化された比を含み、その結果、通常報告された４〜約７％のゼアキサンチンレベルが上昇され、ルテインの量が減少されたマリーゴールド植物が提供し得ることは有益であろう。また、その他の色素の比が上昇され、またこのような植物がそれに隣接して生育された通常のマリーゴールド植物と実質的に同じ表現型の特徴を有することは有益であろう。更に、花弁もしくは葉又はこれらの両方中にβ-カロテンもしくはリコペン又はその両方を蓄積したマリーゴールドが生産し得ることは有益であろう。本発明は幾つかのマリーゴールド植物、花弁、葉、それらを生じる種子、ハイブリッド、オレオレジン、ゼアキサンチンとルテインの混合物、マリーゴールド中に通常見られない割合のリコペン及びβ-カロテンだけでなく、食用媒体に溶解又は分散されたゼアキサンチン、ルテイン、α-クリプトキサンチン、アンテラキサンチン、ネオキサンチン及びビオラキサンチン、リコペン、フィトエン及びβ-カロテンを含む食用物質を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は花弁、葉又は花弁と葉の両方が非突然変異体マリーゴールド中に存在するような比と較べて高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むマリーゴールド植物を意図している。加えて、花弁はしばしば測定可能な量のゼータ-カロテン（ζ-カロテン）を含み、一方、その化合物は非突然変異体マリーゴールド植物の花弁中では測定可能ではなく、即ち、0.1％又は0.2％未満で存在する。
記載された比は以下に説明されるクロマトグラフィー技術によりケン化後に測定してその色素とルテインの％の合計により割られた最初の名前の色素の％として測定される。こうして、ゼアキサンチン比は本明細書中で〔ゼアキサンチン％／（ゼアキサンチン％＋ルテイン％）〕と例示して定義される。
このような植物の花弁、葉又は花弁と葉の両方は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までのゼアキサンチン比を少なくとも示すことが好ましい。その比は１までであってもよい。何とならば、ルテインは幾つかの葉中に検出し得ず、かつ花弁中にゼアキサンチンの如き別の色素に対し非常に少ない量で存在するからである。幾つかの実施態様において、花弁が採取される花は乾燥質量1g当り約４〜約25mgのカロテノイド含量を有し、一方、その他の植物では、花弁カロテノイド含量が低いことがある。葉のカロテノイド含量は典型的には乾燥質量1g当り約0.5〜約1.25mgである。花弁及び葉は典型的には微粉砕形態で存在する。
【００１９】
本発明の別の局面は花弁もしくは葉又はその両方が高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含み、好ましくは約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までのゼアキサンチン比を少なくとも含むマリーゴールド植物、又はその再生可能な部分を意図している。意図される植物の花弁は典型的には、先に説明したように、測定可能な量のゼータ-カロテンを含む。
幾つかの意図される植物はあったとしてもわずかなキサントフィルを含み、むしろ合計約50％以上のβ-カロテン異性体及びリコペン異性体を含む花弁を有する。これらの植物の花弁はカロテノイド色素によりオレンジから赤色までであり、これらの色はマリーゴールドでは通常見られない。マリーゴールドは細胞液可溶性アントシアニン色素のために若干赤色の着色を示し得る。
所望の花弁及び葉を生じた植物はカロテノイド以外の表現型が隣接して生育された非突然変異体植物のそれと実質的に同じであってもよく、又は表現型が異なってもよい突然変異体である。一局面において、意図されるマリーゴールド植物は同系繁殖体又は別の意図される突然変異体植物と非突然変異体（その非突然変異体植物はその親のいずれもが突然変異体ではないハイブリッドである）のハイブリッドである。別の局面において、意図されるマリーゴールド植物は２種の突然変異体の親の交雑種（ハイブリッド）である。
一実施態様において意図される植物は典型的には親の一つが突然変異により生じたハイブリッド又はその後の世代のハイブリッドである。一局面の意図されるマリーゴールド植物は乾燥花1kg当り約４〜約25g又は乾燥質量1g当り約４〜約25mgである、花から抽出可能なケン化色素として測定される、カロテノイドの量を含む。別の局面の意図されるマリーゴールドはそれより少ないカロテノイド含量を含む。このような植物の花粉及び胚珠がまた別に意図されている。このような意図される植物の再生可能な部分は胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花を含む細胞、又はそれに由来するプロトプラストもしくはカルスを含む。
【００２０】
別の実施態様は適当な環境に植え付け、成熟まで成長させて花弁もしくは葉又はその両方が高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含むマリーゴールド植物を生じる種子を意図している。好ましくは、上記比は少なくとも約1:10より大きく、更に好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。意図される植物の花弁は再度典型的には先に説明したように、測定可能な量、典型的には少なくとも１％以上のゼータ-カロテンを含む。
非突然変異体マリーゴールドからのオレオレジンに対し高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を有する突然変異体マリーゴールド植物オレオレジンがまた意図されている。再度、上記比は好ましくは少なくとも約1:10より大きく、更に好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。意図されるオレオレジンはまた通常先に説明したように、測定可能な量のゼータ-カロテンを含む。
乾燥形態又は自然形態の実質的に全体又は部分のマリーゴールド花弁を含む食品添加物がまた意図されている。このような意図される花弁は本明細書に説明された植物のいずれからのものであってもよく、これらの全てが非突然変異体マリーゴールドからの花弁に対し高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を示す。このような花弁の一つのグループはゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まず、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成し、ケン化後にジアルコールとして測定される。
一種以上のマリーゴールド由来カロテノイド色素を含む食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物がまた意図されている。食品又は飼料サプリメントは食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテイン脂肪酸エステルの混合物を含み、そのゼアキサンチン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した別の組成物は食用媒体中に溶解又は分散されたゼアキサンチン及びルテインを含み、そのゼアキサンチン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。食品用に適した更なる組成物は食用媒体中に溶解又は分散されたフィトエン、リコペン又はβ-カトテンを含み、そのフィトエン、リコペン又はβ-カロテン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。
【００２１】
本発明の更に別の局面はマリーゴールド植物、又はその再生可能な部分を意図しており、その花弁はゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まず、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成し、ケン化後にジアルコールとして測定される。別の実施態様は好適な環境に植え付け、成熟まで生育すると上記マリーゴールド植物を生じる種子を意図している。カロテノイドがゼアキサンチンエステルを含み、ネオキサンチン及びビオラキサンチンエステルの両方を実質的に含まないマリーゴールドオレオレジンがまた意図されている。少なくとも約半分のゼアキサンチン及び10％より多い一種以上のその他のカロテノイドを含むが、ネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まない食品又は飼料サプリメントとしての使用に適したカロテノイド組成物が更に意図されている。
本明細書に使用される“ゼアキサンチン比”という用語は花弁又は葉中に存在するゼアキサンチン＋ルテインの量により割られた乾燥花弁又は葉中に存在するゼアキサンチンの量〔ゼアキサンチン／（ルテイン＋ゼアキサンチン）〕と定義される。“ネオキサンチン＋ビオラキサンチン比”はこれらの２種の色素＋ルテインの合計により割られたネオキサンチン＋ビオラキサンチンの比として同様に計算される。“β-カロテン比”、“リコペン比”、“α-クリプトキサンチン比”、“フィトエン比”及び“フィトフルエン比”は分子としてのその異性体の合計としての指定された色素量及び分母としてのその色素＋ルテインの合計を使用して同様に計算される。これらの合計はまた％としてであってもよい。これらの色素量は以下に説明されるような乾燥花弁又は葉抽出物のケン化後に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定され、その結果、ルテイン及びゼアキサンチン（又はその他の色素）の夫々の量が生の花弁中に存在するエステル化形態、及び葉抽出物中に存在することがあり、分解されるクロロフィルではなく、ケン化後に存在する、遊離化合物形態、例えば、ルテイン及びゼアキサンチンについてのアルコール形態で測定される。本明細書に説明された植物の花弁及び葉の幾つかが非常に低く、又は測定できない量、例えば、約0.1-0.2％未満のルテイン又はルテインエステルを含む。その場合には、比の分母中のルテインの量がゼロに近づき、その比が１に近づく。
【００２２】
“オレオレジン”という用語は本明細書中で時折或る量のその他の植物産物及び色素、例えば、β-カロテンの如きその他のカロテノイドだけでなく、少量の溶媒、例えば、ヘキサン又はアセトン、典型的には１％未満の有機溶媒により随伴された、本明細書に説明された植物色素、例えば、キサントフィルをそれらのエステル化形態で含む植物組織の抽出物を意味するのに使用される。キサントフィルは典型的には花弁中にモノエステル又はジエステルとして存在し、典型的にはマリーゴールドの葉中に遊離アルコールとして存在する。カロテン、例えば、β-カロテン又はリコペンは遊離の、非化学的に化合された化合物として存在する。クロロフィルはマリーゴールドの葉中に存在し、花弁中には殆ど不在である。こうして、花弁から調製されたオレオレジンはキサントフィルエステル及び／又は炭化水素カロテンを含み、クロロフィルを殆ど含まず、一方、マリーゴールドの葉から調製されたオレオレジンはクロロフィル及び遊離キサントフィル並びにカロテンを含む。クロロフィルエステル及びキサントフィルエステルの両方はオレオレジンのケン化により分解される。意図されるオレオレジンは固体又は半固体の物質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明はマリーゴールド植物、種子、花弁、葉及びこれらから調製し得る物質を意図している。意図される植物は既に知られているマリーゴールド植物と較べて高められた一種以上のカロテノイドの比を含む花弁、葉又はこれらの両方を更に有する。こうして、意図される植物の花弁及び／又は葉は高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含む。意図される植物の葉又は花弁はルテインを含まなくてもよい。即ち、葉又は花弁は抽出可能な、ケン化されたカロテノイドの約0.1％〜約0.2％未満のルテインを含む。これらの意図されるマリーゴールド植物はフレンチマリーゴールドもしくはメキシカンマリーゴールド、又はその他のタゲテス種と較べてアフリカンマリーゴールドである。加えて、意図される植物はこのような植物が先に記載され、また当業者により理解されるように、キサントフィルマリーゴールドであってもよい。
マリーゴールド花弁中のゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインの通常の比は約1:15〜約1:25のオーダであり、その結果、ゼアキサンチン及びルテインの量のみが計算に使用される場合、ゼアキサンチンはルテイン＋ゼアキサンチンの量の約５〜約７％である。Quackenbushらによる文献、J. Assoc. Off. Agri. Chem., 55:617-621 (1972)は約1:4.4と異常に高いアメリカの黄色のアフリカンマリーゴールド花弁の一つのグループにおけるゼアキサンチン対ルテイン比を報告し、一方、これらの花弁中のキサントフィルの全濃度は乾燥質量1g当り約0.4mgと異常に低かった。メキシコ品種は凍結乾燥花弁が分析される場合には11.1％のゼアキサンチン、また生の花弁が分析される場合には3.8％を含むとこれらの著者らにより言われた。その高い値はデータの残部と一致しておらず、不正確であると考えられる。ここで意図される花弁中の好ましいゼアキサンチン比は以下に説明されるように、一層大きく、約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までであり、花弁カロテノイドの量は好ましくは乾燥質量1g当り少なくとも約4mgである。
【００２４】
意図されるマリーゴールド植物は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きいゼアキサンチン比を含む花弁を有する。更に好ましくは、意図されるマリーゴールド植物は約3:10より大きいゼアキサンチン比を含む花弁を有する。最も好ましくは、その比は5:10より大きく、約1.0であってもよい。花弁が採取される花は乾燥質量1g当り約４〜約25mg、好ましくは乾燥質量1g当り約10〜約20mgのカロテノイド含量を有する。このようなマリーゴールド植物はまた好ましくは約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きいゼアキサンチン比を含む葉を有する。更に好ましくは、意図されるマリーゴールド植物は約3:10より大きいゼアキサンチン比を含む葉を有する。最も好ましくは、その比は5:10より大きく、約1.0であってもよい。意図される葉は乾燥質量1g当り約0.2〜約1.25mg、好ましくは乾燥質量1g当り約0.5〜約1mgのカロテノイド含量を有する。
幾つかの実施態様において、意図される植物の花弁のルテイン濃度は親の、非突然変異体植物中に存在するルテインの約80〜約90％である。その他の実施態様において、ルテインの量は非突然変異体植物中に存在する量の約75％未満である。更に別の実施態様において、花弁中に存在するルテインの量は非突然変異体マリーゴールド植物の花弁中に存在する量の約15％未満である。実際に、ルテインは特に好ましい植物の葉又は花弁には実質的に不在であり、即ち、カロテノイドの約0.2％未満で存在する。
意図されるマリーゴールドはまたルテインに対する一種以上のその他の色素の比の相違を示し得る。こうして、親植物中のネオキサンチン＋ビオラキサンチン比は非突然変異体花弁抽出物について約0.01〜約0.022、また葉中では約0.17〜約0.33であってもよい。一つの好ましい実施態様の意図される突然変異体植物の花弁及び葉中のその比は約1:5(0.2)〜約1:1(1)である。以下の幾つかの表中で、ネオキサンチン及びビオラキサンチンは一緒に測定される。何とならば、それらはクロマトグラフィーで分離し難かったからである。
非突然変異体植物中のβ-カロテン比は典型的には花弁について約0.007未満であり、また葉について約0.25〜約0.3である。意図される突然変異体マリーゴールドにおいて、その比は花弁中で約1:10であり、好ましくは約2:10より大きい。更に好ましくは、意図されるマリーゴールド植物は約3:10より大きいβ-カロテン比を含む花弁を有する。最も好ましくは、その比は5:10より大きく、約1.0であってもよい。突然変異体マリーゴールドの葉についてのその比は約0.4〜１である。
リコペンはマリーゴールドの葉又は花弁中に通常見られない。それ故、リコペン異性体比は典型的には通常の、突然変異誘発されないマリーゴールドについてゼロである。意図される突然変異体植物は花弁中で約1:10、好ましくは約2:10より大きいリコペン比を示し得る。更に好ましくは、意図されるマリーゴールド植物は約3:10より大きいリコペン比を含む花弁を有する。最も好ましくは、また一層通常に、マリーゴールド花弁からのリコペンの通常の不在のために、その比は5:10より大きく、約1.0である。
【００２５】
α-クリプトキサンチンは典型的には非突然変異体植物花弁の着色カロテノイドの１％未満を構成し、その結果、α-クリプトキサンチン比は非突然変異体花弁中で約0.01である。α-クリプトキサンチン比は好ましい突然変異植物の花弁中で約0.25〜約0.9であり、最も好ましくは、また通常では約１である。
フィトエンは非突然変異体植物中のカロテノイドの約３〜約0.3％で花弁中に存在することがあり、典型的には減少された量のルテインを含む幾つかの突然変異体花弁中に約35％で存在し得る。例示のフィトエン比は非突然変異体植物中の約0.003〜約0.03のフィトエン比と較べて意図される植物中で約0.3〜約１であり得る。フィトエン濃度は非突然変異体植物の葉と較べて突然変異体植物の葉中で殆ど変化されない。
非突然変異体植物花弁中のフィトフルエン量は典型的にはフィトエンについて観察された量とほぼ同じであり、一方、意図される突然変異体植物の花弁中に存在する量は一般にフィトエン量の約40〜約70％である。非突然変異体植物に関するフィトフルエン比は通常約0.005〜約0.03であり、一方、意図される突然変異体植物に関するその比は約0.2〜約１である。フィトフルエンは葉抽出物中に観察されなかった。
上記比で観察される増大は典型的には少なくとも約２倍である。特別な実施態様において、比は約10〜約100倍だけ高められる。増強の％にもかかわらず、上記カロテノイドの夫々対夫々のカロテノイド＋ルテインの比は1:10以上、好ましくは約2:10以上である。
特別な植物の花弁もしくは葉又はその両方は上記の高められた比の一つ以上を有し得る。通例では、前記の高められた比の二つ以上が存在する。こうして、例えば、ゼアキサンチン比及びβ-カロテン比が高められ、リコペン比及びβ-カロテン比が高められ、又はゼアキサンチン比及びネオキサンチン＋ビオラキサンチン比が高められる。同様に、これらの比の三つ以上が高められる。
【００２６】
α-クリプトキサンチンは幾つかの突然変異体中で比較的高いレベルで存在することがわかり、それ以外では容易に入手し得ない点で特に重要な化合物である。こうして、α-クリプトキサンチンは幾つかの突然変異体中の着色カロテノイドの約20〜約40％で存在した。このような植物のα-クリプトキサンチン比は従って花弁が通常の量よりも多いカロテノイドプロフィールを含むこれらの植物と較べて大いに高められた。
意図される植物の花弁は典型的には測定可能な量のゼータ-カロテン（ζ-カロテン）を含み、一方、その色素は非突然変異体マリーゴールド植物の花弁中に測定可能な量で存在せず、即ち、0.2％未満で存在する。典型的には、ゼータ-カロテンは花弁カロテノイドの少なくとも約１％の量で存在する。ゼータ-カロテンのその量は幾つかの実施態様では約３〜約７％の範囲であることがあり、またその他の実施態様では約20％であり得る。
色素の測定可能な量はその色素、使用される分離系、使用されるクロマトグラフィーカラム、溶離溶媒だけでなく、当業者に公知の幾つかのその他の変数に依存する。この開示の目的のために、色素はその存在が約0.1-0.2％未満である場合に不在と考えられる。
本発明の別の局面は葉及び／又は花弁がルテインを実質的に含まず（即ち、存在するカロテノイドの合計質量の約５質量％未満のルテインを含み）、かつそのカルテノイドの少なくとも約半分がゼアキサンチン及びβ-カロテンを含むマリーゴールド植物を意図している。こうして、一緒になって、ゼアキサンチン＋β-カロテンは全カロテノイドの少なくとも約半分を構成する。更に好ましくは、ゼアキサンチン及びβ-カロテンは一緒になって意図される植物の葉及び／又は花弁中に存在するカロテノイド色素の約60質量％〜約95質量％を構成する。
マリーゴールド花弁はそれらのカロテノイド及びカロテノイドエステルの抽出に使用し得るだけでなく、それら自体で食品添加物として使用し得る。意図される食品添加物は乾燥形態又は天然形態（花頭から摘み取られるような水和形態）の全体又は部分のマリーゴールド花弁を含む。こうして使用される花弁は食品、例えば、サラダ及びデザートに装飾付け合せとしてだけでなく、カロテノイドを摂取することから得られる利益のために散在され得る。実質的に全体の花弁、即ち、花弁が花頭から摘み取られる形態、天然形態の花弁が装飾目的のために好ましく、一方、微粉砕され、乾燥された花弁のような部分花弁が調理食品への添加物又は動物飼料への添加物に典型的に使用される。
【００２７】
このような意図される花弁は本明細書に説明された植物のいずれからのものであってもよく、これらの全てが非突然変異体マリーゴールドからの花弁に対し高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を示す。このような花弁の一つのグループがゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まず、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成し、ケン化後にジアルコールとして測定される。
マリーゴールド花弁の別の好ましい使用は乾燥され、微粉砕されたマリーゴールド花弁を含む食品添加物としてである。このマリーゴールド食品はマリーゴールド粉と称され、レッドペッパーフレーク又は粉砕オリガノ葉のように多量に食品に振り掛けられ、又は振り混ぜられる。
このようなマリーゴールド粉は花弁がルテイン及びゼアキサンチンをケン化後にジアルコールとして測定されるような主要キサントフィルとして含むように既知のマリーゴールドから調製でき、そのゼアキサンチン比が約３〜約７：100である。更に好ましくは、花弁が高められたゼアキサンチン比、高められたネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、高められたβ-カロテン比、高められたリコペン比、高められたα-クリプトキサンチン比、高められたフィトエン比又は高められたフィトフルエン比の一つ以上を含む。これらの高められた比の夫々が先に説明されたように約1:10以上、好ましくは約2:10以上である。
【００２８】
幾つかの実施態様において、花弁がゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まず、ゼアキサンチンがケン化後にジアルコールとして測定される場合に抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成する。別の実施態様において、花弁が非突然変異体マリーゴールドからの乾燥され、微粉砕された花弁に対し高められたリコペン比を含む。更に別の実施態様において、α-クリプトキサンチンが乾燥され、微粉砕された花弁中に存在する最も多量のカロテノイドである。
幾つかのこれらの実施態様において、葉及び／又は花弁中に存在するルテインは抽出可能なカロテノイドの約３質量％未満、更に好ましくは約１質量％未満である。これらの花弁及び／又は葉中に存在するβ-カロテンはカロテノイドの約５％〜約80％で存在し得る。
本発明の更なる局面は花弁がゼアキサンチンを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まない、マリーゴールド植物、又はその再生可能な部分を意図しており、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成し、ケン化後にジアルコールとして測定される。こうして、存在するゼアキサンチンは典型的にはいずれかに記載されたようにモノエステル又はジエステルとして存在するが、花弁エキスのケン化後に遊離ジオールとして測定される。驚くことに、ここに意図される植物はネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まない花弁を有する。
表6a-6c中のデータからわかるように、従来技術の植物及び本明細書で調製された幾つかの突然変異体植物の例示の花弁は高められたゼアキサンチン対ゼアキサンチン＋ルテインの比並びにネオキサンチン及びビオラキサンチンの容易に測定可能な量を有する。一方で、表8a-8cの植物に関するデータはゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの半分以上を構成し、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの量が以下に説明される操作を使用して測定可能な量よりも小さい数種の植物を示し、その結果、このような植物の花はこれらの２種のカロテノイドを実質的に含まない。
別の実施態様は好適な環境に植え付け、成熟まで生育すると直前に記載されたようなマリーゴールド植物を生じる種子を意図している。
【００２９】
カロテノイドがゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチンエステル及びビオラキサンチンエステルの両方を実質的に含まないマリーゴールドオレオレジンがまた意図されている。少なくとも約半分のゼアキサンチン及び10％より多い一種以上のその他のカロテノイドを含むが、ネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方を実質的に含まない食品又は飼料サプリメントとしての使用に適したカロテノイド組成物が更に意図されている。
既に注目されたように、キサントフィル、例えば、ルテイン及びゼアキサンチンは花弁中に遊離ジオール化合物としてではなく、主として脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等のモノエステル又はジエステルとして存在する。このようなものとして、ゼアキサンチン又はその他のキサントフィル比が本明細書中に説明される場合、その比は一種以上の花弁をヘキサン又はその他の適当な溶媒で抽出してエステル化キサントフィルを含むオレオレジンの如き組成物を得ることにより測定される。次いでその組成物が塩基、例えば、水酸化カリウムを使用してケン化されてエステルを開裂し、遊離カロテノイドアルコールを生成する。遊離カロテノイドキサントフィルアルコールはその後にケン化反応混合物から分離され、所望により高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して分離される。存在する物質の比は通常の積分方法を使用して適当なHPLCピークの下の面積により測定される。
以下の表10は幾つかの意図される植物が通常見られるキサントフィルエステルではなく、遊離キサントフィルをそれらの花弁中に示すことを示すことが注目されるべきである。このようなものとして、遊離キサントフィルを含む食用の食品及び飼料サプリメントが調製でき、これらはケン化を必要としない。
色素比を測定するのにここで利用される分析方法は以下に例示され、他者により公表されたのと同様の結果を与え、異なる特定技術が主として便宜の理由のために異なる研究所により使用される。ここで好ましい操作を使用して、約98％充分に開いた花が分析に選ばれる。花弁が選ばれた花から花の中心からの距離の約1/3除去される。
葉が実質的にあらゆる時期で回収され、抽出し得る。キサントフィルは典型的にはカロテンのように葉中に遊離化合物として存在する。葉中に存在するクロロフィルがまたカロテノイド色素とともに抽出され、こうして分析が抽出物のケン化後に行なわれる。何とならば、その処理がクロロフィルを破壊するからである。葉が花弁と同様にカロテノイド含量について分析される。
【００３０】
植物抽出物中のカロテノイドレベルを測定するのに工業で使用される通常の分析方法はAOAC 1984, Official Methods of Analysis (第14編), the Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, USAの方法であり、その分析の結果はここで得られた結果と同様である。
意図されるマリーゴールド植物は親系列の突然変異体である。即ち、第一系列もしくは交雑又は種子が突然変異原で処理されて（突然変異誘発されて）典型的には１回以上自家受粉（自殖）される突然変異誘発植物を得る。ここに意図される植物は突然変異誘発それ自体、自殖の一つ、又は別の突然変異誘発植物もしくは非突然変異誘発植物との突然変異誘発植物もしくは子孫の交雑から生じ得る。
実質的にあらゆる種類の突然変異原が意図される植物を生産するのに使用でき、例示の突然変異原が以下に説明される。幾つかの意図される突然変異体マリーゴールドは隣接して生育された非突然変異体マリーゴールド親植物の表現型とは実質的に異なる表現型を有するが、その他の意図される突然変異体は、カロテノイドに関係する表現型形質以外は、隣接して生育される非突然変異体親植物の表現型と実質的に同じ表現型を示す。後者の植物について更に詳しくは、植物の性質、例えば、植物高さ、植物直径、花頭直径、花頭高さ、開花の時期、分枝量、分枝の長さ、花柄長さ、胚軸長さ、子葉長さ及び子葉幅を親と突然変異体植物の間で比較する場合、幾つかの意図される突然変異体植物に関するこれらの性質の値は夫々親植物の値の約90％以内である（測定における標準偏差を含む）。更に好ましくは、突然変異体のこれらの性質に関する値は親の約95％以内であり、最も好ましくは、これらの値は標準偏差内で同じである。一方、その他の突然変異体植物は一つ以上の表現型形質を大いに異にする。
【００３１】
親植物と突然変異体植物の間のカロテノイド関連表現型の相違は突然変異体の花から得られるキサントフィル色素又はカロテン色素の量である。親植物、例えば、“スカーレットエード”又は“ディープオレンジエード”は典型的には乾燥全花頭質量1g当り約10〜約18mgの抽出可能なキサントフィル色素を有し、非常に少ないカロテンを含む。高いゼアキサンチン比を有する意図される突然変異体植物は花弁中にほぼ同じ量のカロテノイドを含むことが好ましいが、特にゼアキサンチン対ルテインの比が約9:1以上のように非常に高い場合に、乾燥質量1g当り約4mg程度に少量を含み得る。その他の突然変異体は少ないキサントフィル及び比較的多い量の一種以上のカロテンを含み得る。
意図されるマリーゴールドの葉はまたカロテノイド含量だけでなく、ケン化オレオレジン中で測定して葉中に存在する先に説明したカロテノイド比の一つ以上を含む、幾つかの点の一つ以上において親植物と突然変異体植物の間で表現型の相違を示し得る。Moehsらの先に注目された論文、Plant Mol. Biol., 45:281-293 (2001)は葉カロテノイド比及び含量が一定であり、一方、花弁中のカロテノイド濃度が異なると報告した。ここで、突然変異体植物中の前記ゼアキサンチン比、アンテラキサンチン比、ネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、フィトエン比、フィトフルエン比、β-カロテン比、リコペン比及びα-クリプトキサンチン比の一つ以上は親の非突然変異体植物とはかなり異なったことがわかる。加えて、試験した突然変異体植物の花弁は測定可能な量のゼータ-カロテンを示し、一方、測定可能な量のゼータ-カロテンが親の非突然変異体植物中に存在することが観察されなかった。
表現型の比較が隣接して生育された植物の間でなされる。本明細書に使用される“隣接して生育された”という用語は成長条件が表現型を支配しないように得られるのと同様の光、熱、生育媒体、湿度及び栄養の条件下で生育された植物を意味するのに使用される。温室生育植物について、“隣接して生育された”は同じベンチでできるだけ同様の条件下で生育された植物を意味する。現地生育植物について、“隣接して生育された”は同じ現地又は隣接現地でできるだけ同様の条件下で生育された植物を意味する。
【００３２】
植物を変化するのに有益な変異原がこのような薬剤の使用の方法と同様に当業界で公知である。例示の化学突然変異原として、ニトロソメチル尿素(NMU)、エチルメタンスルホネート(EMS)、メチルメタンスルホネート、ジエチル硫酸、ニトロソグアニジン、及びエチルニトロソ尿素が挙げられ、そのうちでEMSがここでは好ましい。NMUはCetlら, Folia Fac. Sci. Nat. Univ. Purkynianae Brun. Biol., 21(1): 5-56 (1980)に説明されたように使用でき、一方、EMSは典型的には約0.25〜約１容量％(v/v)、好ましくは約0.2〜約0.8％で利用される。ガンマ放射線がまた種子を200〜約20,000ラド（0.2〜約20キロラド）の線量で照射するのに使用される場合に有益な変異原である。
化学的突然変異体に加えて、植物はまたγ線又は中性子によるような電離放射線を使用して、そしてまた組換えDNA技術により突然変異し得る。以下に説明されるように、電離放射線及び組換えDNA技術、例えば、遺伝子サイレンシングがまたカロテノイドプロフィールの変化を行なうのに使用し得る。これらの植物はこうして夫々、化学的に誘導された突然変異体、電離放射線誘導突然変異体及び組換え誘導突然変異体と称し得る。結果として、突然変異体マリーゴールドは化学的に誘導された突然変異、電離放射線誘導突然変異又は組換え誘導突然変異により得られたマリーゴールド植物と本明細書に定義される。
こうして、γ線及び高速中性子衝撃はその他の植物が一種以上の遺伝子の欠失を生じるために使用されていた。遺伝子サイレンシングは同時抑制と称されるメカニズムによりダウンレギュレーションをもたらす遺伝子のセンスストランドの過剰発現により行ない得る。ダウンレギュレーションはまたカロテノイド生成経路に存在する一種以上の酵素のアンチセンス遺伝子の発現により達成し得る。更に別の技術が当業者に公知である。
【００３３】
使用される変異原にもかかわらず、カロテノイド関連形質、例えば、ゼアキサンチン比及び花弁中のキサントフィルの量を含む、得られる突然変異体植物の表現型は通常親のそれと実質的に同じであり、その結果、得られた突然変異体の非常に大きい比率が有益ではない。加えて、親と同じ表現型を有すると思われる植物は所望の突然変異体植物を配置するためにスクリーニングされる必要がある。これらのスクリーニングは、面倒ではあるが、ルーチンで行なわれており、一種以上の単一の花弁もしくは葉又はその両方からのカロテノイド色素の分析を伴う。こうして、所望の突然変異体の調製は比較的稀であるが、反復可能なイベントである。例えば、本明細書における一つの研究において、23種の有益な突然変異体が試験したほぼ22,000の突然変異体植物から得られた。別の研究において、約8,200の試験した植物からの約24の有益な突然変異体が得られた。
既に注目されたように、意図される植物は突然変異誘発種子から成長する植物であってもよく、又は自殖もしくは交雑であってもよい。一つの好ましい実施態様において、意図されるマリーゴールドは独立のM1植物からの２種の異なる突然変異誘発植物から生じた２種の植物の花を交雑することにより生成されたハイブリッド（M2 x M2）である。別の実施態様において、意図されるマリーゴールドは一つの突然変異誘発植物から生じた一つの植物の花を非突然変異誘発植物と交雑することにより生成されたハイブリッドである。更に別の実施態様において、意図される植物はハイブリッドをその直ぐ親の花の一方又は他方と戻し交雑することにより生成されたハイブリッドである。２種の異なるハイブリッド植物の交雑の産物がハイブリッドの自殖の産物と同様に意図されている。
既に記載されたように、意図されるマリーゴールド植物それ自体が突然変異イベントの即時の産物、例えば、突然変異プロセス後に生産された種子の産物であってもよい。その植物はまた別の突然変異体との一種の突然変異体の１回以上の交雑の産物又は突然変異体自殖の産物であってもよい。意図される植物はまた突然変異体植物と非突然変異体の親植物の間の交雑の結果であってもよい。生産された植物が所望のカロテノイド特性についてスクリーニングされ、選択される。
【００３４】
本発明はまた意図される植物の花粉及び胚珠を意図している。意図される植物の再生可能な部分がまたそれ自体意図され、胚、分裂組織、花粉、葉、やく、根、根先端、及び花からなる群から選ばれた細胞、又はそれらに由来するプロトプラストもしくはカルスを含む。植物を細胞から再生するための方法は当業者に公知であり、マリーゴールドの如き双子葉植物がこのような再生を特に受け易い。
ゼアキサンチン比が約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きいルテイン及びゼアキサンチンの脂肪酸エステルを含むマリーゴールドオレオレジンがまた意図されている。更に好ましくは、その比は約3:10より大きく、最も好ましくは約1.0である。意図されるマリーゴールドオレオレジンは先に説明した意図されるマリーゴールドの花弁又は葉中に存在するようなゼアキサンチン比を含む。オレオレジンは商用の品目であり、ヒト又はその他の動物の食品又は飼料サプリメントの製造における更なる処理のために加工業者に販売される。意図されるオレオレジンはまた典型的には測定可能な量のゼータ-カロテンを含む。
例示のマリーゴールドオレオレジン調製において、キサントフィルエステル、即ち、ゼアキサンチン又はゼアキサンチンエステル及びルテインエステルそしておそらくその他のキサントフィルエステルの混合物並びにカロテン、例えば、ゼータ-カロテンは乾燥マリーゴールド花からヘキサン、アセトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒドロフラン(THF)等の有機溶媒、又はこれらの混合物で抽出される。抽出は当業界で知られている操作に従って行なわれる。一種以上の溶媒が除去されて、典型的には高レベルのキサントフィルエステルを含み、抽出有機溶媒約99％、好ましくは約99.9％を含まず、即ち、約１質量％未満、好ましくは約0.1質量％未満の有機溶媒を含む抽出物をもたらす。得られる無溶媒抽出物はマリーゴールドオレオレジンと称される。葉抽出物が同様に調製され、遊離キサントフィル、カロテン及びクロロフィルを含む。
ヒト又はその他の動物、例えば、ニワトリ及びシチメンチョウのような家禽、マス及びサケのような魚並びにシュリンプ、ロブスター及びカニのような甲殻類の食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物がまた意図されている。意図される食品又は飼料サプリメントは色をこれらの動物の皮膚及び脂肪だけでなく、このような動物、特にニワトリの卵黄に与えるのに使用し得る。
【００３５】
一種の食品又は飼料サプリメントはゼアキサンチン単独又はマリーゴールドオレオレジン中に存在するようなゼアキサンチン、ルテイン及びその他のカロテノイドの脂肪酸エステルの混合物を含む。マリーゴールド由来の殆どの脂肪酸エステルのその混合物が食用媒体に溶解又は分散され、ゼアキサンチン及びルテインの脂肪酸エステルが約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、更に好ましくは約3:10より大きく、約1.0までであるゼアキサンチン比で存在する。こうして、この食品又は飼料サプリメントは溶解及び濾過によるような前記オレオレジンの好適な精製、続いて適当な食用媒体中の精製混合エステルの溶解又は分散により調製し得る。
オレオレジン及び食品は本明細書に注目されたその他の色素、例えば、フィトエン、β-カロテン及びリコペンの高められた比を示す植物を使用してマリーゴールド花弁、葉又はその両方から同様に調製し得る。所望の一種以上のマリーゴールド由来色素がキサントフィルではなく、カロテンである場合、ケン化がエステルを加水分解するのに典型的には必要とされない。何とならば、エステルが存在しないからである。しかしながら、米国特許第5,858,700号で注目されたように、ケン化反応はリコペンの如き色素を周囲の植物物質から遊離するのに使用し得る。
【００３６】
幾つかの実施態様において、食用媒体は食用トリグリセリドオイルであり、一方、その他の実施態様において、食用媒体はピル及び錠剤の如き医薬製品中に頻繁に見られるような結合剤（医薬上許される結合剤）である。錠剤又はカプセルについて、混合物のキサントフィルエステル含量の如きカロテノイド含量は例示として遊離キサントフィルとして測定されるように典型的にはカロテノイドの錠剤又はカプセル当り約0.1〜約25mg、更に通常錠剤又はカプセル当り約５〜約20mgである。
結合剤及び接着剤は充分な凝集を固体に加えて通常の加工、例えば、サイジング、潤滑、圧縮及び包装を可能にすることが好ましいが、錠剤又はカプセルが崩壊し、組成物が摂取後に溶解することを依然として可能にする。例示の結合剤として、ラクトース一水和物、アカシア、トラガカント、蔗糖、ゼラチン、グルコース、セルロース又はサッカリド物質、例えば、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPLC)、ヒドロキシプロピルセルロース（クルセルTM）、エチルセルロース（エトセルTM）、メチルセルロース及びナトリウムカルボキシメチルセルロース（例えば、タイロースTM）（これらに限定されない）、前ゼラチン化澱粉（例えば、ナショナルTM1511及びスターチ1500）、ポリサッカリド酸、アルギン酸及びアルギン酸の塩、マグネシウムアルミニウムシリケート、ポリエチレングリコール、グアーガム、ベントナイト、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、並びにポリメタクリレートが挙げられる。
【００３７】
例示の食用油として、カンデリラ油、ヤシ油、タラ肝臓油、綿実油、ニシン科の油、オリーブ油、パーム油、トウモロコシ油、大豆油、落花生油、ポピー実油、サフラワー油及びヒマワリ油が挙げられる。比較的高い濃度の不飽和脂肪酸を有する油の使用が好ましく、即ち、約100-150のヨウ素価を有する油の使用が好ましい。混合は公知であるように、典型的には高せん断混合装置を使用して行なわれる。補助溶媒及び添加剤、例えば、エタノール及びα-トコフェロールが夫々また米国特許第5,382,714号に記載されるように存在し得る。
別の実施態様において、ゼアキサンチンとルテインの混合物、ゼアキサンチン単独、又はその他のマリーゴールド由来カロテノイド化合物、例えば、β-カロテンもしくはリコペン、又は混合物が0.5〜約20％、好ましくは約１〜約４％のカロテノイドを含む概して球形の小ペレット（これらは通常“ビードレット”と称される）の形態で用意される。これらのビードレットは所望の量で米国特許第5,270,063号に開示されているような穀物を食するのに供されるようなヒト食品に混合されて使用でき、又は米国特許第5,849,345号、同第5,695,794号、同第5,605,699号及び同第5,043,170号に飼料添加剤について開示されたビードレット又はその他の粒子のようにニワトリもしくはその他の動物飼料に混合し得る。
例示のビードレットは水不溶性であり、米国特許第4,670,247号に開示されているように架橋ゼラチン又はアルギン酸ナトリウムの如きアルギン酸塩によるキサントフィル組成物のカプセル化により調製される。一種以上の所望のカロテノイドを含む水不溶性ビードレットは一種以上のカロテノイド、水、ゼラチン、及び糖を含むエマルションを生成することにより調製される。エマルションは液滴からの粒子がそれらの粒状形態が永久に確立されるまで互いに分離されて保たれるような様式で澱粉状の粉末の塊中に個々に集められる液滴に変換される。カロテノイドを含む粒子は澱粉状の回収粉末から分離され、約90℃〜約180℃の温度で熱処理される。熱処理工程は糖のカルボニル基とゼラチン分子の遊離アミノ部分との間の反応によりビードレットのゼラチンマトリックスを不溶化する。得られるビードレットは水不溶性であり、飼料ペレット化の応力に対する増大された安定性を示す。架橋プロセスはビードレットをつくる際に使用される成分を利用し、組成物への架橋試薬又は添加剤の添加を必要としない。
【００３８】
米国特許第5,695,794号は家禽飼料用の添加剤としてのここの使用に適し得るビードレットの別の形態を開示している。こうして、約30〜約55ミクロンの直径を有するビードレットが水添植物油、例えば、水添綿実油、小麦胚油、サフラワー油、大豆油等（これはまた水添大豆モノグリセリド及びジグリセリド、綿実モノグリセリド及びジグリセリドから調製されたもののようなモノグリセリド及びジグリセリドだけでなく、酸化防止剤としてのクエン酸及び2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール(BHT)を含んでもよい）中の所望の量の一種以上のカロテノイド、即ち、ゼアキサンチン、ゼアキサンチンとルテインの混合物、又は本明細書に記載されたその他のカロテノイド混合物の融解溶液を噴霧することにより調製される。その他の酸化防止剤、例えば、エトキシキン、ビタミンＥ等が公知であるようにまた使用し得る。溶融混合物は約160°F（約70℃）の温度で噴霧冷却器（例えば、ニロ社（コロンビア、Md.）から入手し得る）のサイクロン空気流に噴霧されて冷却すると固化するビードレットを生じる。冷却されたビードレットがサプリメントとして飼料に添加されることが好ましいビードレットを生成するのに公知であるようなケーキング防止剤、例えば、ヒュームドシリカ、リン酸カルシウム、粉末澱粉又はセルロースで散粉される。例示のビードレットは1g当り約10〜約100mg（mg/g）、好ましくは約10〜約50mg/gのゼアキサンチンを含む。
意図されるマリーゴールド由来カロテノイド色素、例えば、ゼアキサンチン又はゼアキサンチン-ルテイン、β-カロテン、リコペン、又はこのような色素の混合物が添加される動物飼料は当業界で公知である。上記米国特許第5,849,345号、同第5,695,794号、同第5,605,699号及び同第5,043,170号が家禽に特に有益である例示の食を提供する。米国特許第5,935,624号及び同第2,918,370号が更なる例示の家禽食を提供する。
米国特許第5,258,189号はβ-カロテンが植物油に分散された、又は乾燥形態の調理された穀物製品と混合されるヒト用の穀物製品を食するのに供されるためのβ-カロテンの添加を教示している。本明細書のいずれかに説明されたようなゼアキサンチン又はゼアキサンチンとルテインの混合物は同様の食品中にβ-カロテンに代えて所望のレベルで使用し得る。
【００３９】
食品又は飼料サプリメントとしての使用に適した別の組成物は食用媒体に溶解又は分散されたマリーゴールド由来カロテノイド色素、例えば、ゼアキサンチンとルテイン、リコペン、フィトエン、β-カロテン等の混合物を含み、存在するゼアキサンチン比は約1:10より大きく、好ましくは約2:10より大きく、約1.0までである。この組成物はマリーゴールドオレオレジン中に存在するエステルと較べて遊離ゼアキサンチン及びルテインであるケン化キサントフィルを含む。
“マリーゴールド由来”という表現は本明細書に記載された突然変異体マリーゴールドから得られるカロテノイド色素について本明細書に使用される。こうして、マリーゴールド由来カロテノイド色素の食品又は飼料サプリメント中に存在するカロテノイド色素の実質的に全て（90％より多く、好ましくは95％より多い）が、別の植物からのものであること、又は合成により生成されることに較べて、マリーゴールドからのものである。色素は遊離カロテンもしくはキサントフィルであってもよく（以下の表10に示されるように）、又はケン化キサントフィルであってもよい。
マリーゴールドオレオレジンをケン化して遊離キサントフィルを得るための方法は公知である。例えば、Tyczkowskiら, Poultry Sci. 70(3): 651-654, 1991、及び米国特許第5,382,714号を参照のこと。そのルテインは有機溶媒の添加によりケン化マリーゴールドオレオレジンから結晶化された。
加えて、Ausichらの米国特許第5,648,564号はオレオレジンをプロピレングリコール及びアルカリ水溶液、好ましくは水酸化カリウムを含む組成物と混合してオレオレジン及びプロピレングリコールが一緒に少なくとも75質量％を構成する反応混合物を生成することによるマリーゴールドオレオレジンからの結晶性ルテインの製造を教示している。こうして生成された反応混合物がキサントフィルエステルをケン化し、結晶の形態の遊離キサントフィルを含むケン化反応混合物を生成するのに充分な時間の期間（典型的には少なくとも３時間）にわたって約65℃〜約80℃の温度に保たれる。ケン化抽出物が希釈量の水と混合されて水溶性不純物を溶解し、反応混合物の粘度を低下する。希釈された混合物が均一まで穏やかに混合され、次いで濾過されてキサントフィル結晶を集める。集められたキサントフィル結晶が温水で洗浄され、乾燥される。プロピレングリコール以外の有機溶媒はキサントフィルエステルを含むオレオレジンからのキサントフィルの単離及び精製に使用されない。こうして生成された乾燥キサントフィル結晶が典型的には先に説明したトリグリセリドの如き食用媒体と混合される。混合物のキサントフィル含量は典型的には約0.1〜約35質量％、好ましくは約１〜約10質量％である。
更に説明しないが、当業者は先の記載を使用して本発明をその最も充分な程度まで利用し得ると考えられる。それ故、下記の好ましい特別な実施態様は単なる例示と見なされるべきであり、開示の残部の限定と何ら見なされるべきではない。
【実施例】
【００４０】
実施例１：アフリカンマリーゴールド“スカーレットエード”のEMS処理
“スカーレットエード”と称されるアフリカンマリーゴールドキサントフィルマリーゴールドの種子（パンアメリカン・シード社（622タウンロード、ウェスト・シカゴ、IL60185）から市販されている）をエチルメタンスルホネート（EMS、シグマ・ケミカル社（セントルイス、MO63178）から市販されている）で処理した。約2,500の種子を0.4％(v/v)又は0.8％(v/v)のEMS 400mlに添加し、周囲温度で８時間にわたって穏やかに撹拌した。EMS処理後の４時間の期間中に、種子を16回洗浄し、夫々の洗浄は蒸留水400mlと一緒の連続撹拌を使用した。次いで処理された種子（M1種子と同定された）を無土壌鉢植えミックスを含むトレイ中に植え付けた。
数週後に、幼植物を無土壌鉢植えミックスを含む鉢に移植し、温室中で管理した。これらの植物により生じた花を自然に自家受粉させた。得られる種子（M2種子と同定された）を約2,300の植物から回収した。これらの2,300の植物のうち、約1,500を0.4％のEMSで処理された種子から生育し、約800を0.8％のEMSで処理された種子から生育した。突然変異体植物の同定を促進するために、50のM1植物の夫々からのM2種子を一つのロットに合わせ、合計47の種子ロットを生じた。2000年の夏中に、47のロットの夫々からの500の種子を植え付け、得られる植物をパンアメリカン・シード社（サンタ・パウラ、CA93060）で現地生育した。
【００４１】
実施例２：EMS処理アフリカンマリーゴールド“スカーレットエード”のHPLCスクリーニング
EMS処理“スカーレットエード”植物をパンアメリカン・シード社（サンタ・パウラ、CA93060）で現地生育し、変化したゼアキサンチン比についてHPLCによりスクリーニングした。約98％充分に開いた花を分析のために選んだ。夫々の花から、一つの花弁を花の中心からの距離の1/3だけ除去し、ガラスビーズ約5gを含む3.5”x0.75”のガラスバイアルに入れた。バイアルにドライアイスを詰め、その後に-80℃で貯蔵した。
分析のために、溶媒送出及びアリコート除去を単一インジェクター弁ギルソン232XL及び402 2S1V希釈装置を含むロボット系〔ギルソン社、米国、3000Wベルトライン・ハイウェイ、ミドルトン、WI〕で行なった。ケン化のために、50％の水酸化カリウム水性エタノール溶液（４水：１エタノール）3mlを夫々のバイアルに添加し、続いてオクタノール3mlを添加した。ケン化処理を15時間にわたって250運動／分でIKA HS 501水平シェーカー〔ラブワールド-オンライン社、ウィルミントン、NC〕上に維持されたバイアルを用いて室温で行ない、続いて約１時間の静止期があった。
ケン化後に、上澄みをメタノール0.9mlで希釈した。メタノールの添加を加圧下で行なってサンプル均一性を確実にした。0.25mlのシリンジを使用して、アリコート0.1mlを除去し、分析のためにHPLCバイアルに移した。
【００４２】
HPLC分析のために、クォータナリーポンプ、真空脱気系、６方向注入弁、温度調節オートサンプラー、カラムオーブン及び光ダイオードアレイ検出器で完成した、ヒューレット・パッカード1100HPLCを使用した〔ウルトラ・サイエンティフィック社（250スミス・ストリート、ノース・キングスタウン、RI）により入手し得るアギレント・テクノロジーズ〕。カラムは同じ材料のガードカラム〔ウォーターズ、34メープル・ストリート、ミルフォード、MA〕を備えたウォーターズYMC30、５ミクロン、4.6x250mmであった。移動相用の溶媒は0.2％のBHT（2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール）で安定化された81メタノール：４水：15テトラヒドロフラン(THF)であった。注入は20μlであった。分離は30℃で1.7ml/分の流量で無勾配であった。ピーク応答を447nmにおける吸光度により測定した。
このプロトコルを使用して、最初の2,546のサンプルからの結果を統計分析してルテイン及びゼアキサンチン含量に関する平均値を確立した。これは半定量分析スクリーンであったので、ピーク面積値を使用した。平均より高いルテイン及び／又はゼアキサンチン濃度を有する突然変異体を同定するために、平均より大きい三つの標準偏差の値を計算した。計算したピーク面積平均、標準偏差及びゼアキサンチン比を下記の表１に示す。
【００４３】
【表１】
2006506060.tif 000006
【００４４】
上記値に基づいて、1565より大きいルテインピーク面積及び／又は91より大きいゼアキサンチンピーク面積を有するサンプルを選んだ。また、サンプルを高ルテインピーク面積についてのみ、また10％より大きいゼアキサンチン比について選んだ。これらの選択パラメーターを使用して、合計88の突然変異体を21.754の分析したサンプルから同定した。夫々のEMS種子処理から得られる突然変異体の合計数を下記の表２に示す。
【００４５】
【表２】
2006506060.tif 000007
【００４６】
ルテイン及びゼアキサンチンの相対レベルについてのこれらの分析の更に特別な結果を下記の表３に示す。
【００４７】
【表３】
2006506060.tif 000008
【００４８】
約21,700の植物は約４〜約７％（約1:25〜約1:15）の典型的なゼアキサンチン比を示した。上記データは意図される突然変異の相対的稀度だけでなく、低下されたゼアキサンチンレベルを示すほぼ等しい数の植物を示す。また、データは変異原対ここで使用されたその他のものの一つのレベルの使用についての優位性を示さない。
実施例３：アフリカンマリーゴールド13819のEMS処理
13819と称されるアフリカンマリーゴールドキサントフィルマリーゴールド（パンアメリカン・シード社（622タウン・ロード、ウェスト・シカゴ、IL60185）の独占育種選択）の種子をエチルメタンスルホネート（EMS、シグマ・ケミカル社（セントルイス、MO63178）から市販されている）で処理した。約7,000の種子を0.2％(v/v)又は0.4％(v/v)のEMS 600mlに添加し、周囲温度で８時間にわたって穏やかに撹拌した。EMS処理後の４時間の期間中に、種子を16回洗浄し、夫々の洗浄は蒸留水600mlと一緒の連続撹拌を使用した。
次いで処理された種子（M1種子と同定された）を無土壌鉢植えミックスを含むトレイ中に植え付けた。３〜４週後に、幼植物を現地に移植した。これらの植物により生じた花をバッグに入れて交雑受粉を防止し、自然に自家受粉させた。得られる種子（M2種子と同定された）を約2,391の植物から回収した。これらの植物のうち、約951を0.2％のEMSで処理された種子から生育し、約1,440を0.4％のEMSで処理された種子から生育した。
突然変異体植物の同定を促進するために、50の植物の夫々からのM2種子を一つのロットに合わせた。このグルーピングは合計48の種子ロットを生じた。2000年の10月後半から11月中ごろまでに、0.4％のEMS処理の15のロットの夫々からの1000の種子を植え付け、夫々のロットの700の植物をシービュー・ナーサリー（エル・リオ、CA93060にある）で温室生育した。加えて、48のロットの全てからの1,500の種子を2000年10月後半に植え付け、ロットの夫々からの765の植物をゼミラス・パンアメリカン・チャイルLTDA（ピチデグア、チャイルにある）で現地生育した。
【００４９】
実施例４：EMS処理アフリカンマリーゴールド13819のHPLCスクリーニング
EMS処理13819 M2植物をシービュー・ナーサリー（エル・リオ、CA93060にある）で温室生育し、またセミラス・パンアメリカン・チャイルLTDA（ピチデグア、チャイルにある）で現地生育し、変化したゼアキサンチン比についてスクリーニングした。約98％充分に開いた花を分析のために選んだ。これらの花から、花弁を花の中心からの距離の1/3だけ除去した。花弁組織約100mgをプラスチックバッグに入れ、分析まで凍結して貯蔵した。乾燥質量をガラスビーズ約5gを含む3.5”x0.75”のガラスバイアルに入れられた二つの花弁について測定した。
分析のために、溶媒送出及びアリコート除去を単一インジェクター弁ギルソン232XL及び402 2S1V希釈装置を含むロボット系で行なった。ケン化のために、50％の水酸化カリウム水性エタノール溶液（４水：１エタノール）3mlを夫々のバイアルに添加し、続いてオクタノール3mlを添加した。ケン化処理を15時間にわたって250運動／分でIKA HS 501水平シェーカー上に維持されたバイアルを用いて室温で行ない、続いて約１時間の静止期があった。
ケン化後に、上澄みをメタノール0.9mlで希釈した。メタノールの添加を加圧下で行なってサンプル均一性を確実にした。0.25mlのシリンジを使用して、アリコート0.1mlを除去し、分析のためにHPLCバイアルに移した。
HPLC分析のために、クォータナリーポンプ、真空脱気系、６方向注入弁、温度調節オートサンプラー、カラムオーブン及び光ダイオードアレイ検出器で完成したヒューレット・パッカード1100を使用した。カラムは同じ材料のガードカラムを備えたウォーターズYMC30、５ミクロン、4.6x250mmであった。標準物質をDHI-ウォーター＆エンビロンメント（DK-2970ホースホルム、デンマーク）及びシグマ・ケミカル社（セントルイス、MO 63178）から得た。移動相用の溶媒は0.2％のBHTで安定化された81メタノール：４水：15テトラヒドロフランであった。注入は20μlであった。分離は30℃で1.7ml/分の流量で無勾配であった。ピーク応答を447nmで測定した。
このプロトコルを使用して、最初の507のサンプルからの結果を統計分析してルテイン及びゼアキサンチン含量に関する平均値を確立した。平均より高いか、又は低いルテイン及び／又はゼアキサンチン濃度を有する突然変異体を同定するために、平均より大きいか、又は小さい三つの標準偏差の値を計算した。計算した平均、標準偏差及びゼアキサンチン比を下記の表４に示す。
【００５０】
【表４】
2006506060.tif 000009
【００５１】
上記値に基づいて、10％より大きいゼアキサンチン比、1.12mg/g生質量より大きい合計ルテイン及びゼアキサンチン含量並びに0.24mg/g生質量未満の合計ルテイン及びゼアキサンチン含量を有するサンプルを選んだ。これらの選択パラメーターを使用して、1.12mg/gより大きいルテイン＋ゼアキサンチンの合計を有する合計347の突然変異体を同定し、また10％より大きいゼアキサンチン比を有する43の突然変異体を8192のサンプルから同定した。夫々のEMS種子処理から得られる突然変異体の合計数を下記の表５に示す。
【００５２】
【表５】
2006506060.tif 000010
【００５３】
約10％のゼアキサンチンより大きいゼアキサンチン比を有する突然変異体のうち、約47％が10％から13％未満までを有し、一方、53％が13％以上を示した。
実施例５：選択マリーゴールドの花弁中のカロテノイド組成
カロテノイド組成を“スカーレットエード”野生型及び実施例２に記載されたスクリーニング操作で同定されたものから選ばれた突然変異体サンプルについて測定した。花弁サンプルを突然変異体が同定されるまで-80℃の冷蔵庫中で貯蔵した。サンプルを凍結乾燥し、乾燥組織を分析に供するまでアルゴン雰囲気下で-80℃で貯蔵した。
抽出操作を赤色光のもとで行なった。乾燥した花弁を粉砕してNo. 40の篩メッシュサイズに通した。粉砕サンプルを正確に計量し、100mlの赤色のメスフラスコに移した。サンプルに、H2O 500マイクロリットル（μl）を添加し、その混合物を１分間撹拌した。抽出溶媒（ヘキサン10ml＋アセトン7ml＋無水アルコール6ml＋トルエン7ml）30mlを添加し、フラスコを160rpmで10分間振とうした。
ケン化のために、40％のメタノール性KOH2mlをフラスコに添加し、次いでこれを１分間撹拌した。フラスコを56℃の水浴に20分間入れた。エアーコンデンサーを取り付けて溶媒の損失を防止した。サンプルを取り付けたコンデンサーで１時間にわたって暗所で冷却した。冷却後、ヘキサン30mlを添加し、フラスコを160rpmで10分間振とうした。
振とうしたサンプルを10％の硫酸ナトリウム溶液で或る容積(100ml)まで希釈し、１分間激しく振とうした。サンプルが暗所に少なくとも30分間留まった。アリコート35mlを約50mlの上相から除去し、サンプルカップに移した。ヘキサン更に30mlをフラスコに添加し、次いでこれを160rpmで10分間振とうした。約１時間後に、上相を合わせた。HPLC分析のために、アリコート10mlを窒素雰囲気下で乾燥させ、アルゴン雰囲気下で-80℃で貯蔵した。
【００５４】
HPLC装置は冷凍オートサンプラー、カラムヒーター及びウォーターズ光ダイオードアレイ996検出器（ウォーターズ社、34メープル・ストリート・ミルフォード、MA01757）を備えたアライアンス2690を含んでいた。分離を同じ材料のガードカラムを備えたYMC C30 カラム、３μm、2.0x150mmで得た。標準物質をICCヨードファイン・ケミカルズ（サマービル、ニュージャージー088876）及びDHI-ウォーター＆エンビロンメント（DK-2970ホースホルム、デンマーク）から得た。
乾燥した突然変異体サンプルをテトラヒドロフラン及びメタノール中で200μlの合計容積まで再懸濁させ、濾過し、一方、対照を更に濃縮しなかった。勾配方法を使用してカロテノイドを分離した。初期の勾配条件は0.4ミリリットル/分(ml/分)の流量で90％メタノール：５％水：５％メチルtert-ブチルエーテルであった。０分から15分まで、移動相を初期条件から80メタノール：５水：15メチルtert-ブチルエーテルに変え、15分から60分まで20メタノール：５水：75メチルtert-ブチルエーテルに変えた。その後の10分間にわたって、移動相を初期条件に戻し、カラムを更に10分間にわたって平衡にした。カラム温度を27℃に維持し、流量は0.4ml/分であった。注入は10μlであった。ピーク応答の大半を450nmで測定し、追加の面積を286、348、400及び472nmの抽出チャンネルから加えた。
全面積の％としてのピーク面積を使用して、選ばれた突然変異体のカロテノイドプロフィールに関する値を下記の表6a、6b及び6cに示す。示された化合物同定は抽出されたスペクトル及び夫々のクロマトグラム中の主要ピークについて得られたエタノール中の最大吸光度（ラムダ最高；ETOH）に基づき、これらの幾つかを既知の標準物質の保持時間により確かめた。値は同じ化合物の推測異性体を合わせる。幾つかの化合物はわずかな不純物を含み得る。Quackenbushら, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 55(3):617-621 (1972)に記された黄色のアメリカンマリーゴールド（黄色マリーゴールド）に関する値が表に含まれる。単一エントリーをここで使用された操作により分離し得なかったネオキサンチン／ビオラキサンチン化合物対及びクリサンテマキサンチン／フラボキサンチン化合物対について表6a-6c中に使用する。
【００５５】
【表６】
2006506060.tif 000011
【００５６】
【表７】
2006506060.tif 000012
* nf = 実測せず
** nr = 報告せず
【００５７】
【表８】
2006506060.tif 000013
* nf = 実測せず
** nr = 報告せず
【００５８】
実施例６：選択マリーゴールドの葉中のカロテノイド組成
幾つかのマリーゴールド植物の葉を存在する着色カロテノイドの相対濃度について分析した。“スカーレットエード”及び13819からの葉を突然変異体植物からの葉との比較のための対照として使用した。分析を実施例５のように行ない、下記の表7a及び7bに示し、そこでは単一エントリーを分離し得なかったネオキサンチン／ビオラキサンチン化合物対及びクリサンテマキサンチン／フラボキサンチン化合物対について使用する。表7a及び7b中のデータを異なる条件下で生育された植物の異なるグループから集めた。
【００５９】
【表９】
2006506060.tif 000014
【００６０】
【表１０】
2006506060.tif 000015
【００６１】
実施例７：突然変異体の育種による少ないルテインレベル及び高いゼアキサンチン、フィトエン、リコペン又はβ-カロテンレベルを有するマリーゴールドの調製
野生型と較べて増大されたゼアキサンチン対ルテイン比を示すマリーゴールド突然変異体選択124-257を自殖し、得られる種子を管理した。マリーゴールド選択124-257の自殖からの植物を雌の親パンアメリカン・シード所有の育種系F9 Ap(85368-4)との交雑における雄親として使用した。この交雑から、F1植物を生育し、自殖してF2集団を生じた。
薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用して、F2交雑からの15の幼植物をルテインの不在について分析した。夫々の幼植物からの生の葉組織約50mgを５個のガラスビーズを含む100x13mmのスクリュートップ管に計り取った。シールしたバイアルを-20℃で貯蔵した。
分析のために、抽出剤溶媒（ヘキサン10ml＋アセトン7ml＋無水アルコール6ml＋トルエン7ml）500μlを添加し、シールした管を最小45分間にわたって撹拌した。撹拌後に、その溶液を4mlの黄褐色のバイアルに移し、窒素雰囲気下で蒸発させた。サンプルを上記抽出溶媒125μl中で再懸濁させ、10μlを19チャンネルシリカゲルプレートにスポットした。プレートを約10分間にわたって乾燥させ、次いで2:1の酢酸エチル：ヘキサン溶液100mlを含む２チャンネルの25cmの展開タンク中で25分間にわたって展開した。除去後、サンプルをルテインの不在について評価した。
【００６２】
このスクリーンから、F2マリーゴールド選択14649-3を同定した。この選択を突然変異体101-190及び100-198との交雑における雌親として使用し、これらは野生型と較べて低減されたエポキシカロテノイド（例えば、ネオキサンチン及びビオラキサンチン）生成を有することに加えて増大されたゼアキサンチン対ルテイン比を示す。
マリーゴールド突然変異体選択100-198を自殖し、得られる種子を管理した。マリーゴールド選択100-198の自殖からの植物を上記雌親選択14649-3との交雑における雄親として使用した。この交雑から、F1種子を集め、これらのうちの30の種子を植え付けた。得られる植物のうちの11を自殖した。この交雑から、F2種子を集め、これらの種子の400を植え付け、生育した。
上記TLC分析を使用して151の幼植物の葉を分析した。32の植物を突然変異体選択100-198の典型的な低減されたエポキシカロテノイド生成に基づいて同定した。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して、残りのTLC抽出物を分析し、改良された実施例５のプロトコルを使用して行なった。改良は以下のことを含む：乾燥サンプルをメチルtert-ブチルエーテル及びメタノール中で再懸濁させ、全ての勾配条件が６％に増大された水とともにメタノールの相当する１％の減少を使用し、カラム温度を25℃に維持した。
分析は32の植物のうちの７つが突然変異体選択124-257の典型的な増大されたゼアキサンチン対ルテイン比を示すことを確かめた。７の選択の花弁サンプル及び葉サンプルを上記改良を伴う実施例５のプロトコルに従って抽出し、分析した。花弁に関する結果を下記の表8aに示し、葉に関する結果をその後の表9aに示す。加えて、非ケン化花弁サンプルを分析して非エステル化ゼアキサンチンの％（存在する場合）を測定した。これらのデータを表10に示す。
【００６３】
マリーゴールド突然変異体選択101-190を自殖し、得られる種子を管理した。マリーゴールド選択101-190を上記雌親選択14649-3との交雑における雄親として使用した。この交雑から、F1種子を集め、これらの種子のうちの30を植え付けた。得られる植物の６つを自殖した。この後者の交雑から、F2種子を集め、植え付け、生育した。
現行のTLC分析方法がこの集団に不確実であることを測定した。それ故、約30の植物をオレンジ色のがく片表現型を有することに基づいてHPLC分析に選んだ。
サンプルをTLCについてのように抽出した。しかしながら、HPLC分析を行なった。30の選択のうちの10が選択124-257の典型的な増大されたゼアキサンチン対ルテイン比を有することに加えて突然変異体選択101-190の典型的な低減されたエポキシカロテノイド生成を有することがわかった。
10の選択の花弁サンプル及び葉サンプルを上記改良を伴う実施例５のプロトコルに従って抽出し、分析した。花弁に関する結果を表8b及び表8cに示し、葉に関する結果を表9b及び表9cに示す。加えて、非ケン化花弁サンプルを分析して非エステル化ゼアキサンチンの％を測定した。これらのデータを表10に示す。
【００６４】
【表１１】
2006506060.tif 000016
【００６５】
【表１２】
2006506060.tif 000017
【００６６】
【表１３】
2006506060.tif 000018
【００６７】
【表１４】
2006506060.tif 000019
【００６８】
【表１５】
2006506060.tif 000020
【００６９】
【表１６】
2006506060.tif 000021
【００７０】
【表１７】
2006506060.tif 000022
【００７１】
野生型と較べて増大されたゼアキサンチン対ルテイン比を有すると特性決定された、突然変異体選択119-494（表6a）を自殖し、得られる種子を管理した。野生型と較べて増大されたフィトエン対ルテイン比を有すると特性決定された、突然変異体選択115-004（表6c）を自殖し、得られる種子を管理した。
自殖された選択115-004を雄親の自殖された119-494との交雑における雌親として使用した。この交雑から、F1植物を生育し、自殖してF2集団を生じた。野生型アフリカンマリーゴールドと較べて増大されたリコペン異性体蓄積を示すF2植物を温室植付中にそれらの赤色により認めた。分析がリコペン蓄積だけでなく、フィトエン及びβ-カロテンの増大されたレベルを確かめた。第二のヘキサン抽出を行なわなかった以外は先に概説されたHPLCプロトコルに従って、サンプルを分析した。33457-1、33458-1、33459-1、33456-2、33458-2及び33461-1と称される６種の選択からのデータを下記の表11に報告する。
続いて、付加的なリコペン蓄積物、フィトエン蓄積物及びβ-カロテン蓄積物を認めた。選択27774-105はこの実施例に記載された雌親14649-3及び雄親101-190（表8b）の交雑からのものであった。花弁を上記のように分析し、データを表11に報告する。
選択23012-3は雌親としての大きい二重花パンアメリカン・シード所有の育種系85394-2及び雄親としての124-257の交雑から得られるF3植物である。自殖後に、低減されたルテインレベルを有すると特性決定されたF2選択をTLC操作により同定し、得られるF3種子をパンアメリカン・シード（サンタ・パウラ、CA）に位置される現地で植え付けた。この集団中で、選択23012-3をその赤色の花弁により同定した。花弁を上記のように分析し、データを表11に報告する。
【００７２】
【表１８】
2006506060.tif 000023
【００７３】
*或るピークは特性決定されず、有意な数の先にリストされたピークだけでなく、その他のピークがリコペン異性体であるかもしれない。
実施例８：アフリカンマリーゴールド中の変化されたカロテノイドプロフィールを生じるための別法
化学的突然変異誘発の使用により変化されたカロテノイドプロフィールを有するアフリカンマリーゴールドを生じることに加えて、変化されたカロテノイドプロフィールを与えるための別法を利用することができる。例示の別法は電離放射線及び組換えDNA技術を使用する遺伝子サイレンシングの使用を含む。
更に詳しくは、電離放射線を使用して欠失突然変異により遺伝子発現を変更した。γ線がデンドランテマ(Dendranthema)、グラジオラス及びヒャクニチソウを含む観賞種の花の色を変更すると報告されていた〔Dattaら, Zeitshrift fur Pflanzen., 120(1):91-92 (2001); Masakazuら, J. Japanese Soc. For Hort. Sci., 70(1):126-128 (2001)及びVenkatachalamら, Ind. Jour. Gen & Plant Breed., 57(3):255-261 (1997)を参照のこと〕。高速中性子は植物中に欠失突然変異を生じるのに有効であった。こうして、欠失突然変異体が51,840植物の突然変異されたアラビドプシス集団からの標的遺伝子座の84％について得られ〔Liら, The Plant Journal, 27(3):235-242 (2001)を参照のこと〕、一方、Loveら, Amer. Soc. Hort. Sci., 88:627-630 (1966)はコリウス中で茎葉アントシアニン突然変異を調製した。更に最近、ダリアの花の色の突然変異体が報告された〔Abeら, In Vitro Cell. & Dev. Bio. 38:93A (2002)を参照のこと〕。
【００７４】
変化された花着色プロフィールの如き望ましい表現型を調製するために、遺伝子サイレンシングがまた標的遺伝子を不活化するのに使用し得る。このような方法は転写レベルだけでなく、後転写レベルにおける遺伝子サイレンシングを含む。
組換えにより誘導され、安定に組み込まれたトランジジーンだけでなく、複製DNAウイルス及びRNAウイルスがサイレンシングイベントを媒介し得る。転写遺伝子サイレンシングはプロモーターメチル化及び／又はクロマチン縮合による転写開始の欠陥から生じる。赤レンガ色のペラルゴニジン花着色のトランスジーンを含むトランスジェニックペチュニアのホモ接合の子孫は予期しないことに超メチル化CaMV 35Sプロモーターを有する白色の誘導体を生じた〔Meyerら, Plant Journal 4(1):89-100 (1993)を参照のこと〕。
転写が生じるが、RNAが蓄積できない、後転写遺伝子サイレンシングは、RNAの異常なセンス形態、アンチセンス形態、又は二本鎖形態が生成される場合にmRNAの分解から生じる。ペチュニアでは、フラバノイド生合成経路の酵素カルコンシンターゼをコードする組換えにより導入され、転写されたセンストランスジーンが相同内因性遺伝子及びトランスジーンRNAの発現をダウンレギュレーションすることができ、その現象が同時抑制と称された。コードされた酵素の予想された増大された生成に代えて、トランスジェニック植物の42％が白色であり、かつ／又は白色で模様化された花を有していた〔Napoliら, Plant Cell, 2(4):279-289 (1990)を参照のこと〕。
同時抑制の発見の前に、内因性遺伝子のダウンレギュレーションがアンチセンストランスジーンで達成された。センス及びアンチセンスのカルコンシンターゼトランスジェニックペチュニアの比較はセンストランスジェニック体の75％及び変化された花着色を有するようなアンチセンストランスジェニック体の82％を同定した〔Jorgensenら, Plant Mol. Biol., 31(5):957-973 (1996)を参照のこと〕。
二本鎖RNAから、小さい干渉RNA（siRNA）がプロセシングされ、これらが植物中の遺伝子をサイレンシングするのに有効であることが示されていた〔Hamiltonら, Science, 286 (5441):950-952 (1999)を参照のこと〕。RNA分解の中間体が同時抑制されたペチュニア植物で同定された〔Metzlaffら, Cell 88(6):845-854 (1997)を参照のこと〕。二重らせんを形成することができるRNAを生じる形質転換ベクターがシロイスナズナ中の４花関連遺伝子又は分裂組織関連遺伝子の特異的かつ遺伝性遺伝子干渉を生じた〔Chuangら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97(9):4985-4990 (2000)を参照のこと〕。
【００７５】
加えて、後転写遺伝子サイレンシングはRNAを開裂し得るリボザイムを発現するように操作されたベクターにより行ない得る。“小リボザイム”と称される一つのクラスはヘアピンリボザイム及びハンマーヘッドリボザイムを含む。有効な遺伝子サイレンシングはまた自己相補性ヘアピンRNAをコードする構築物を使用して広範囲の植物種で実証された。イントロンを含む構築物は一般に遺伝子サイレンシングを示す独立のトランスジェニック体の90〜100％を生じた〔Wesleyら, Plant Journal, 27(6):581-590 (2001)を参照のこと〕。ジャガイモ紡錘塊茎ウイロイドRNAに対し誘導されるハンマーヘッドリボザイムを発現するトランスジェニックジャガイモ植物はその複製に対する高い耐性を示した。この耐性が子孫に安定に遺伝された〔Yangら, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:4861-4865 (1997)を参照のこと〕。
本発明において、遺伝子サイレンシングに適した組換えにより得られたトランスジーンはカロテノイド生成に必要な一種以上の酵素をコードするタゲテス植物の一種以上の配列を含む発現ベクターを含む。発現ベクターを植物組織に導入する方法は直接遺伝子導入方法、例えば、ミクロプロジェクタイル媒介送出、DNA注入、エレクトロポレーション等を含む〔Gruberらの下記の文献; Mikiら著, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glickら編集, CRC Press, Boca Raton, FL, 67-88頁 (1993); Kleinら, Biotechnology 10:268 (1992)を参照のこと〕。発現ベクターはまた直接感染又はアグロバクテリウム・ツメファシエンスとの植物組織の同時培養により植物組織に導入される〔Horschら, Science 227:1229 (1985)を参照のこと〕。アグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介遺伝子導入のための方法の記載がGruberら著, “植物形質転換のためのベクター”, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glickら編集, 89-119頁（CRC Press, 1993）、Mikiらの上記文献、及びMoloneyら, Plant Cell Reports 8:238 (1989)により提示される。
本明細書に引用された特許及び文献の夫々は参考として含まれる。冠詞“a”又は“an”の使用は一種以上を含むことが意図されている。
以上の記載及び実施例は例示として意図され、限定と解されるべきではない。本発明の精神及び範囲内の更なるその他の変化が可能であり、当業者に容易にわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】植物中のルテイン及びゼアキサンチンの生成のための生物学的合成経路の略図であり、その経路における最初のC40カロテノイドである、フィトエンが数工程（四つの矢印）でゼータ-カロテン（ζ-カロテン）を経てリコペンに変換され、その後にその経路が分かれてδ-カロテン（これは一つのε-環を含む）、次いでα-カロテン（これは一つのε-環及び一つのβ-環を含む）を生成し、又はγ-カロテン（これは一つのβ-環を含む）次いでβ-カロテン（これは二つのβ-環を含む）を生成し、そして数工程後に、夫々、ルテイン又はゼアキサンチンに変換され、ゼアキサンチン分岐がエポキシド含有キサントフィル、アンテラキサンチン、ビオラキサンチン及びネオキサンチンへと続く。
【図１】
2006506060.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月30日(2005.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キサントフィルをアルコールとして分析した場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中におけるネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、β-カロテン比、リコペン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を含むことを特徴とするマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項２】
マリーゴールド植物又はその再生可能な部分であって、その花弁、葉又は花弁と葉の両方が、キサントフィルをアルコールとして分析した場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中におけるネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、β-カロテン比、リコペン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を含むことを特徴とする、マリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項３】
花弁が、約0.25〜約0.9であるα-クリプトキサンチン比を示す、マリーゴールド植物又はその再生可能な部分。
【請求項４】
必要によりルテインと混合されてもよい、ネオキサンチン＋ビオラキサンチン、β-カロテン、リコペン、α-クリプトキサンチン、フィトエン及びフィトフルエンからなる群から選ばれた一種以上のマリーゴールド由来色素を溶解又は分散した食用媒体を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、ルテインに対する存在する前記色素のいずれかの比が、約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項５】
食用媒体中で溶解又は分散された、ルテイン及びネオキサンチン＋ビオラキサンチン、β-カロテン、リコペン、α-クリプトキサンチン、フィトエン及びフィトフルエンからなる群から選ばれた一種以上の色素のマリーゴールド由来脂肪酸エステルの混合物を含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適した組成物であって、キサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ルテインに対する存在する前記色素のいずれかの比が約1:10より大きいことを特徴とする組成物。
【請求項６】
突然変異体マリーゴールドのオレオレジンであって、前記オレオレジンが、非突然変異体マリーゴールドからのオレオレジンに対し高められたリコペン比を有することを特徴とするオレオレジン。
【請求項７】
突然変異体マリーゴールドのオレオレジンであって、前記オレオレジンが、遊離の、未エステル化キサントフィルを含むことを特徴とするオレオレジン。
【請求項８】
α-クリプトキサンチンを含む着色カロテノイドを含むことを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項９】
ルテインを実質的に含まず、かつキサントフィルがアルコールとして分析される場合に、そのカロテノイドの少なくとも約半分が、ゼアキサンチン及びβ-カロテンを含むことを特徴とするマリーゴールド花弁、葉又は花弁と葉の両方。
【請求項１０】
ゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、かつキサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成することを特徴とするマリーゴールド花弁。
【請求項１１】
花弁が、ゼアキサンチンエステルを含み、かつネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、かつキサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、ゼアキサンチンが抽出可能なカロテノイドの少なくとも約半分を構成することを特徴とするマリーゴールド植物、又はその再生可能な部分。
【請求項１２】
マリーゴールドオレオレジンであって、そのカロテノイドがゼアキサンチンエステルを含み、かつ前記オレオレジンが、ケン化後に分析される場合にネオキサンチンエステル及びビオラキサンチンエステルの両方を実質的に含まないことを特徴とするマリーゴールドオレオレジン。
【請求項１３】
食用媒体中に溶解又は分散されるゼアキサンチンエステル及び一種以上のその他のカロテノイドを含む食物又は飼料サプリメントとしての使用に適したカロテノイド組成物であって、ネオキサンチン及びビオラキサンチンの両方のエステルを実質的に含まず、ゼアキサンチンが、カロテノイドの約50％から90％未満までを構成し、かつ前記の一種以上のその他のカロテノイドが、ケン化後に分析される％量を有しかつキサントフィル％がアルコールとして測定される、カロテン、キサントフィル、又はキサントフィルエステルの一種以上であることを特徴とするカロテノイド組成物。
【請求項１４】
キサントフィルが、アルコールとして分析される場合に、非突然変異体マリーゴールドの花弁、葉又は花弁と葉の両方中に存在するゼアキサンチン比、ネオキサンチン＋ビオラキサンチン比、β-カロテン比、リコペン比、α-クリプトキサンチン比、フィトエン比又はフィトフルエン比と較べて、高められたこれらの比の一つ以上を含むマリーゴールド花弁又は花を含むことを特徴とする食品添加物。
【請求項１５】
乾燥され、微粉砕されたマリーゴールド花弁を含むことを特徴とする食品添加物。
【国際調査報告】
2006506060.tif 000025
2006506060.tif 000026