(57)【要約】少なくとも１つのアザアミノ酸を含み、βシート破壊能力を有するペプチドが提供される。このペプチドは、たとえば、アルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆のような、疾病の治療および予防において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉの化合物であって：
【化１】
2006520321.tif 000026
式中、Ｒ1が、Ｈ、Ｃ2〜Ｃ6アシルおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が独立して、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ｒ6が、ＯＨおよびＮＲ7Ｒ8から選択されるが、ここでＲ7およびＲ8は独立して、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5が独立して、ＣＲ9またはＮから選択され、ここでＲ9はＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択されるが、ただしＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の内の少なくとも１つがＮであるという条件を満たす、
化合物、および、それらの各種キラル誘導体。
【請求項２】
Ｒ1がＣ2〜Ｃ6アシルであり、Ｒ6がＮＲ7Ｒ8であるが、ここでＲ7およびＲ8は独立して、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5が、独立してＣＨおよびＮから選択されるが、ただしＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の内の少なくとも１つがＮであるという条件を満たす、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5がＨであり、Ｒ1が−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3であり、Ｒ6がＮＨ2であり；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5が、独立してＣＨおよびＮから選択されるが、ただしＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の内の少なくとも１つがＮであるという条件を満たす、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ2がＮである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ3がＮである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
以下の群：
Ａｃ−Ｌ−Ｐ−Ｆa−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2；
Ａｃ−Ｌ−Ｐa−Ｆ−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2；および
Ａｃ−Ｌ−Ｐa−Ｆa−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2、
から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
医薬品として使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物および、製薬上許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
アルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆から選択される疾病または状態を治療または予防するための医薬品を生産するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
前記疾病がアルツハイマー病である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
異常タンパク質のアミロイドへの折りたたみおよびアミロイド様沈着物に伴う疾病の治療のための医薬品を調製するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１３】
工程：
ａ）式（ＩＩ）のアザ−アミノ酸構成単位を、アミノ酸、アザ−アミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドと反応させて、アザ−ペプチドカップリングを介してアザ−ペプトイド結合を形成させる工程であって；
【化２】
2006520321.tif 000027
式中、Ｒが、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ａがアミノ酸の任意の官能基であり；
ＲおよびＡが、Ｃ3〜Ｃ6ヘテロシクロアルキル環を形成することが可能な工程、および、
ｂ）パラ−ニトロカルボベンジルオキシ基を除去する工程、
を含む方法により得ることができるアザ−ペプチドを調製するための方法。
【請求項１４】
前記ライブラリーの工程ａ）における少なくとも１つのアザ−アミノ酸構成単位が、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶIから選択されるものであり：
【化３】
2006520321.tif 000028
式中、Ｒが、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
ＲZが−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2および−ｔｅｒｔ−ブチルから選択される、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＲがＨである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
全配列が２〜１０ペプトイド単位の長さを有するアザ−ペプチドを調製するための、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項１７】
全配列が２〜５単位のペプトイド単位の長さを有するアザ−ペプチドを調製するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
２〜１０個のアザ−アミノ酸を有するアザ−ペプチドを調製するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
２〜５個のアザ−アミノ酸を有するアザ−ペプチドを調製するための、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
式Ｉのアザ−ペプチドを調製するための、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶIから選択される式を有する、合成アザ−ペプチド構成単位。
【請求項２２】
ＲがＨである、請求項２１に記載の合成アザ−ペプチド構成単位。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βシート破壊ペプチド、特にアルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆などのような疾病の治療におけるその使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、バイエルンの精神科医アロイス・アルツハイマー（Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）によって１９０７年に最初に報告されたもので、短期記憶喪失で始まり、進行性の認知機能および行動における減退が特徴である進行性神経障害である。この疾病の病状が進行すると、見当識障害や、判断、論理性、注意力および会話力に障害が起こり、最後には痴呆に至る。この疾病の経過では通常、発症後４〜１２年の間に、衰弱して寝たきり状態となって、死亡する。ＡＤは、６５歳以上の人口の内の５〜１１パーセント、８５歳を超えると４７パーセントが罹患しているであろうと推定されている。ＡＤを管理するための社会的コストは非常に高いものになるが、その主たる理由は、ＡＤ患者を保護するだけでも、広汎な介護が必要だからである。ＡＤの生理病理学を理解することを目的とした努力が積み重ねられてはいるが、この疾病の進行を顕著に抑制する治療法は、現在のところ無い。
【０００３】
病理学的には、ＡＤの特徴は、患者の脳に明瞭な病変が存在することで、これは剖検により明らかになる。それらの脳の病変としては、神経原繊維変化（ＮＴＦ）と呼ばれる異常な細胞内線維や、老人斑またはアミロイド斑の中のアミロイド形成性タンパク質の細胞外沈着、などが挙げられる。アミロイド沈着物はさらに、ＡＤ患者の脳血管壁にも存在する。アミロイド斑の主たるタンパク質成分は、４．３キロダルトンのペプチドと同定され、これは、βアミロイドペプチド（Ａβ）と呼ばれている［１］。Ａβのびまん性沈着物は、健常な成人の脳において観察されることも多いが、それに対してＡＤでの脳組織は、もっと堅く締まった、中心部の密度が高いβ−アミロイド斑であることが特徴である［２］。これらの観察から、Ａβの沈着が進行して、ＡＤにおいて発生するニューロンの破壊に寄与していると推論される［３］。βアミロイドが培養、ｉｎ  ｖｉｖｏのいずれにおいても、成熟ニューロンに対して毒性を有することが示されることによって、Ａβが直接的に病原性の役割を果たしていることがさらに立証された［４］。
【０００４】
大脳皮質および脳血管系の内部にびまん性βアミロイドの沈着物があることが特徴の、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）の患者は、点突然変異を有していて、それがＡβの内部でのアミノ酸置換につながっていることが証明された［５］。
【０００５】
Ａβはさらに、アミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆［６］および拳闘家痴呆［７］にも関係があるとされてきた。
【０００６】
天然のＡβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるもっと大きなタンパク質から、タンパク質分解により誘導される［８］。ＡＰＰ遺伝子は第２１染色体に位置づけられ、それによって、第２１染色体のトリソミーが原因で、ダウン症候群を持つ個人が若年において、βアミロイドが沈着することについての説明が与えられる［９］。
【０００７】
ＡＰＰのタンパク質分解により誘導される、天然のＡβは、長さが３９〜４３のアミノ酸残基であって、その長さはカルボキシル末端終末点によって決まり、それが異質性を示す。ＡＤ患者および健常成人のいずれでも、血液および脳脊髄液中で流れているＡβの形は主として、Ａβ１−４０である［１０］。しかしながら、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３は、β−アミロイド斑の中にも見出される［１１］。
【０００８】
Ａβの病原性は、タンパク質の高次構造の変化の結果であるということについて、かなりの証拠が蓄積されてきた［１２］。アルツハイマー病、アミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆およびＨＣＨＷＡ−Ｄにおける症状に導く決定的な事象は、天然で非病原性のタンパク質が再折りたたみされて、病原性の形態が生じることであると考えられている。この再折りたたみは、タンパク質の一次構造は変化させずに、その二次および三次構造を変化させる。
【０００９】
アミロイドとは、共通的な構造モチーフ、βプリーツシートコンホメーションを有する線維性凝集物に与えられる一般的な用語である［１３］。これらの凝集物は特殊な染色性を示して、たとえば、コンゴーレッドを用いた染色により緑色の複屈折光を発光する能力や、蛍光色素のチオフラビンＳと結合する能力を有している［１４］。これらの染色性が、βアミロイド沈着物を検出するために使用されるアッセイの基礎となっている。
【００１０】
アルツハイマー病の治療および予防のための１つのアプローチは、アミロイド形成に含まれると考えられる天然タンパク質の配列といくつかの同じ配列相同性を有するが、βプリーツシートコンホメーションの形成に不利な、あるいは不安定化させる１または複数のアミノ酸を有する、短鎖のペプチドを開発しようとするものである［１５］。そのペプチドが、βアミロイドの凝集を妨げ、それによって、細胞毒性効果を防止する。このアプローチは、アルツハイマー病や、プリオン関連障害において提案され［１６］［１７］［１８］、そして、中でも、下記のβシート破壊ペプチド［１９］が導かれた：
【化１】
2006520321.tif 000002
【００１１】
米国特許第６，３１９，４９８号明細書（プラエシス・ファーマシューティカルズ（Ｐｒａｅｃｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））では、Ａβに基づくβシート破壊ペプチドが提案され、その例としてアミノ末端ビオチン化ペプチドが挙げられている。米国特許第６，３０３，５６７号明細書（プラエシス・ファーマシューティカルズ（Ｐｒａｅｃｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ））では、βシート破壊ペプチドとして、βアミロイドペプチドに基づくが、完全にＤ−アミノ酸からなる、ペプチドが提案されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これら公知のβシート破壊ペプチドは貴重な情報を与え、アルツハイマー病の治療にも用いられてはきたが、ペプチド医薬品の開発は、天然のペプチドは腸内、肝臓内および血液循環において分解や、急速な代謝を受けやすいという事実があるために、厳しい限界がある。さらに、多くのアミロイド関連障害の治療のための望ましい作用部位が脳内であるために、ペプチドが、他の多くの分子と同様に、血液脳関門を通過するのが困難である。脳そのものの中にも、ペプチド分子を分解させるペプチダーゼで満ちあふれている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、改良された薬理学的特性を有するβシート破壊ペプチドを提供することである。
【００１４】
第１の態様において、本発明は一般式Ｉの化合物を提供する：
【化２】
2006520321.tif 000003
式中：
Ｒ1は、Ｈ、任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アシルおよび任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は独立して、Ｈおよび任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ｒ6は、ＯＨおよびＮＲ7Ｒ8から選択されるが、ここでＲ7およびＲ8は独立して、Ｈまたは任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5は独立して、ＣＲ9またはＮから選択され、ここでＲ9はＨおよび任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキルから選択されるが、ただしＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の内の少なくとも１つはＮであるという条件を満たす必要がある；
【００１５】
第２の態様において、本発明は、医薬品として使用するための一般式Ｉの化合物を提供する；
【００１６】
第３の態様において、本発明は、式Ｉの化合物を製薬上許容できる賦形剤または担体と共に含む、医薬組成物を提供する。
【００１７】
第４の態様において、本発明は、アルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆から選択される疾病または状態を治療または予防するための医薬品を調製するための、式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００１８】
第５の態様において、本発明は、アルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆から選択される疾病または状態を治療または予防するための、式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００１９】
第６の態様において、本発明は、患者の必要に応じて患者に式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む、アルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆を治療するための方法を提供する。
【００２０】
第７の態様において、本発明は、タンパク質が異常に折りたたまれてアミロイドおよびアミロイド様沈着物となることに伴う疾病を治療するための、医薬品を調製するための式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００２１】
第８の態様において、本発明は、タンパク質が異常に折りたたまれてアミロイドおよびアミロイド様沈着物となることに伴う疾病を治療するための、式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００２２】
第９の態様において、本発明は、患者の必要に応じて患者に式Ｉの化合物の有効量を投与することを含む、タンパク質が異常に折りたたまれてアミロイドおよびアミロイド様沈着物となることに伴う疾病を治療するための方法を提供する。
【００２３】
第１０の態様において、本発明は、式（ＩＩ）のアザ−アミノ酸構成単位を、アミノ酸、アザ−アミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドと反応させて、アザ−ペプチドカップリングを介してアザ−ペプトイド結合を形成させる工程を少なくとも含む方法を用いた、アザ−ペプチドを調製するための方法を提供する：
【化３】
2006520321.tif 000004
式中：
Ｒは、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択されるが、好ましくはＨであり；
Ａは、任意に保護基によって保護されていてもよいアミノ酸の任意の官能基であり；
そしてＲおよびＡは、任意に置換されたＣ3〜Ｃ6−ヘテロシクロアルキル環、好ましくはピラゾリジニル−、ジアゼチジン−、ヘキサヒドロピリダジン−、１，２−ジアゼパン−、または１，２−ジアゾオクタン基を形成することもできる。
【００２４】
第１１の態様において、本発明は、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶIから選択される式を有するアザ−ペプチド構成単位を提供する：
【化４】
2006520321.tif 000005
式中：
Ｒは、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択されるが、好ましくはＨであり；
ＲZは−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2および−ｔｅｒｔ−ブチルから選択される。
【００２５】
第１２の態様において、本発明は、式Ｉのアザ−ペプチドを調製するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の化合物は、公知のβシート破壊ペプチドよりも改良された薬理学的特性を有するβシート破壊ペプチドである。
【００２７】
βシート破壊活性は、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて検出することができるが、たとえばソト（Ｓｏｔｏ）らによる記述に従って［１４］、アミロイド線維の形成を防止する試験化合物の性能を測定する。
【００２８】
アミロイド線維は、アポトーシスによる細胞死を含めて、細胞毒性を有している［２０］。本発明の化合物は、アミロイド線維によって誘発される細胞死を防止するそれらの能力について、試験することができる。結果は、実施例において報告する。
【００２９】
改良された薬理学的特性を有する化合物とは、公知の化合物に比較して、本明細書に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの、血漿中および／または脳ホモジネート中のいずれかまたは両方における安定性の向上により測定されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の向上、または、ｉｎ  ｖｉｖｏでのラットの脳におけるアミロイドの沈着の防止性する性能の向上をもたらす化合物と考えられる。「改良された」という用語には、これらのパラメーターのいずれか１つ、または２つ以上において向上が認められる化合物を包含する。その改良は、統計的に有意なものであるのが好ましく、たとえば確率の値が、０．０５未満であるのが好ましい。結果が統計的に有意であるかどうかを決める方法については、よく知られており、当業者の間でのテキストや他の適切な方法を使用すればよい。
【００３０】
式Ｉの化合物において好ましい基として、Ｒ1は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチロイル、アミノアセチル、メチルアミノアセチル、ジメチルアミノアセチル、アミノエチル、メチルアミノエチル、ジメチルアミノエチルおよびメチルから選択される。特に好ましいＲ1としては、アセチル、メチルアミノアセチル、ジメチルアミノアセチルから選択され、最も好ましいのはアセチルである。
【００３１】
式Ｉの化合物においてまた別な好ましい基として、Ｒ6はＮＨＭｅまたはＮＨ2、特に好ましくはＮＨ2である。
【００３２】
式Ｉの化合物においてまた別な好ましい基として、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、Ｈ、メチルおよびエチルから選択されるが、特に好ましくはＨまたはメチルである。化合物において特に好ましい基は、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5がＨである。化合物においてまた別の特に好ましい基は、Ｒ3がメチルである。化合物において特に好ましい基は、Ｒ3がメチルで、Ｒ2、Ｒ4およびＲ5がＨである。
【００３３】
式Ｉの化合物においてまた別な好ましい基として、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5が独立して、ＣＲ9またはＮから選択されるが、ここでＲ9は好ましくはＨまたはメチルであるが、ただしＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5の内の少なくとも１つはＮであるという条件を満たす必要がある；
【００３４】
式Ｉの化合物においてまた別な好ましい基として、Ｘ1、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5が独立して、−ＣＨまたはＮから選択され、Ｘ2がＮである；
【００３５】
式Ｉの化合物においてまた別な好ましい基として、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ4およびＸ5が−ＣＨまたはＮから選択され、Ｘ3がＮである；
【００３６】
式Ｉの化合物においてまた別な好ましい基として、Ｘ1、Ｘ4およびＸ5が−ＣＨまたはＮから選択され、Ｘ2およびＸ3がＮである；
【００３７】
本発明の化合物は塩として単離し、精製することができる。そのような塩も本発明の範囲に含まれる。患者に投与するという目的から、それらの塩が製薬上許容できるものであるのが望ましい。
【００３８】
本発明の化合物は塩として投与することができる。そのような塩の例としては、本発明のペプチドのカルボキシル基の塩またはアミノ基の酸付加塩などが挙げられる。カルボキシル基の塩は、当業者公知の手段を用いて形成させることができ、無機塩の、たとえば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩など、および有機塩基との塩の、たとえば、アミン、たとえばトリエタノールアミン、アルギニンまたはリシン、ピペリジン、プロカインなどとから形成されるものなどが挙げられる。酸付加塩としては、たとえば、鉱酸、たとえば塩酸または硫酸との塩や、有機酸、たとえば酢酸またはシュウ酸との塩などが挙げられる。
【００３９】
「アザ−アミノ酸」は、アミノ酸のα−炭素を窒素原子で置き換えることによって形成される、ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）部分と定義される。ペプチド配列中に挿入された場合、このアザ−アミノ酸が、α−炭素が置換された位置において「アザ−ペプトイド」結合を形成する。
【００４０】
「アザ−ペプチド」は、１つまたは複数のアザ−アミノ酸を含むペプチドと定義される。
【００４１】
「アザチド（Ａｚａｔｉｄｅ）」は、「純粋な」アザ−ペプチド、すなわち、アザ−アミノ酸だけで構成されているペプチドと定義される。
【００４２】
「通常のアミノ酸」は、アミノ酸のα−炭素が窒素で置き換えられていないアミノ酸と定義される。
【００４３】
「ペプトイド単位」とは、アザ−ペプチド骨格を構成するアミノ酸またはアザ−アミノ酸のいずれかを指す。アザ−ペプチド中のペプトイド単位の総数が、アザ−ペプチドの長さを決める。たとえば、ジアザ−ペプチドは全長で２個のペプトイド単位を含み、ペンタ−アザペプチドは、５個のペプトイド単位を含む。それを拡張して、アザチドの場合も、ペプトイド単位の数が、その配列中のアザ−アミノ酸の全数に対応する。
【００４４】
「アザ−ペプチドカップリング」とは、他のアミノ酸、他のアザ−アミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチド、またはアザチドに対してペプチド結合または「アザ−ペプトイド」結合を形成することによる、アミノ酸のカップリングまたはアザ−アミノ酸のカップリングのことを指す。
【００４５】
アミノ酸の「官能基」とは、それぞれ個々のアミノ酸に特有の側鎖を指す。たとえば、フェニルアラニンの官能基はベンジルであり、ロイシンのそれはイソブチルである。
【００４６】
「キラル誘導体」とは、通常のアミノ酸（Ｌ−鏡像異性体）を、対応するＤ−鏡像異性体に各種の置き換えをしたものを指す。
【００４７】
アミノ酸は、それらに対応する一文字表記で表し、すなわちＤがアスパラギン酸、Ｆがフェニルアラニン、Ｌがロイシン、Ｐがプロリンである。
【００４８】
一文字表記の後に付けた添字の「ａ」は、アザ−アミノ酸結合であることを表す。
【００４９】
「Ｃ1〜Ｃ6−アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有する、１価の分岐状または非分岐状のアルキル基を指す。この用語の基の例を挙げれば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどがある。
【００５０】
「Ｃ1〜Ｃ5−アルキル」とは、１〜５個の炭素原子を有する、１価の分岐状または非分岐状のアルキル基を指す。この用語の基の例を挙げれば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、プロピル、ペンチルなどがある。
【００５１】
「Ｃ2〜Ｃ6アシル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基を指し、ここでＲには「Ｃ1〜Ｃ5−アルキル」基が含まれる。
【００５２】
「Ｃ3〜Ｃ6−ヘテロシクロアルキル」は、３〜６個の原子を有し、少なくとも２個のＮを含む飽和または部分的に不飽和な環を指す。例を挙げれば、ピラゾリジニル−、ジアゼチジン−、ヘキサヒドロピリダジン−、ジアゼパン−およびジアゾオクタンなどがある。
【００５３】
「製薬上許容できる塩」は、所望の生物活性を維持する、式Ｉの化合物の塩を指す。そのような塩の例を、非限定的に挙げれば、無機酸（たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）とから形成される付加塩、および、有機酸たとえば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸とから形成される塩などがある。前記化合物は、当業者には公知の製薬上許容できる４級塩として投与することができるが、その具体例としては、式−ＮＲＲ’Ｒ”+Ｚ-の４級アンモニウム塩などが挙げられ、ここでＲ、Ｒ’、Ｒ”は独立して、水素、アルキル、またはベンジルであり、Ｚは対イオンであるが、たとえば、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、アルコキシド、トルエンスルホン酸イオン、メチルスルホン酸イオン、スルホン酸イオン、リン酸イオン、またはカルボン酸イオン（たとえば、安息香酸イオン、コハク酸イオン、酢酸イオン、グリコール酸イオン、マレイン酸イオン、リンゴ酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン、アスコルビン酸イオン、ケイ皮酸イオン、マンデル酸イオン、およびジフェニル酢酸イオンなどが挙げられる。
【００５４】
医薬品として用いる場合には、本発明の化合物は典型的には、医薬組成物の形態で投与される。そのような組成物は、医薬品業界では公知の方法で調製することができ、少なくとも１つの有効化合物を含む。一般に本発明の化合物は、薬剤的有効量で投与される。実際に投与される化合物の量は、典型的には、医師が関連の環境を配慮しながら決めるが、配慮すべきこととしては、治療を受ける状況、選択する投与経路、実際に投与される化合物、個々の患者の年齢、体重およびレスポンス、患者の症状の重篤度などがある。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、各種の経路で投与することができるが、たとえば、経口、経直腸、経皮、クモ膜下、皮下、静脈内、筋肉内、および鼻孔内などの経路が挙げられる。本発明の化合物は、皮下、筋肉または静脈への注射または注入により投与するのが好ましい。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様においては、本発明の化合物が、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を超えるのを促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質に融合させる。このことは、ＣＮＳがその疾病に含まれているような場合には、作用部位に対して、その分子を適切に向かわせるのに役立つ。ＢＢＢを通過しての薬物送達の様式は、浸透圧の手段を用いるか、あるいはブラジキニンのような血管作動性物質を使用した生化学的な方法を用いるかのいずれかによる、ＢＢＢの突破を伴う。ＢＢＢを通過させるためのまた別の戦略は、受動拡散の利用、および内因性輸送システムの使用を伴うものであってもよく、そのようなものとしては、グルコースおよびアミノ酸担体のような担体介在輸送体；インスリンまたはトランスフェリンのための受容体介在経細胞輸送；吸着体介在経細胞輸送などが挙げられる。ＢＢＢの向こう側への薬物送達のための戦略には脳内移植などがさらに挙げられる。
【００５７】
目的とする送達経路に合わせて、それらの化合物を、注射用または経口用組成物の配合とすることができる。経口投与のための組成物は、バルク液剤もしくは懸濁剤、またはバルク散剤の形態をとることができる。しかしながらより一般的には、組成物は、正確な投与量を与えるために、単位剤形の形で提供する。「単位剤形」という用語は、ヒトの対象者およびその他の哺乳類にとっての単位用量として適している物理的に分割した単位であって、それぞれの単位には、所望の治療効果を与えるよう計算された活性物質の予め定めた量と、それと共に適切な医薬品添加物とが含まれている。典型的な単位剤形としては、液状組成物のプレフィルド、プレメジャードアンプルまたはシリンジや、固形組成物の場合の、丸剤、錠剤、カプセル剤などが挙げられる。そのような組成物の中では、本発明の化合物は通常微量成分（約０．１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約４０重量％）であって、残りは、様々な賦形剤または担体や、所望の剤形を形成させるのに有用な加工助剤などである。
【００５８】
経口投与に適した液状の形態には、緩衝剤、懸濁剤および分配剤、着色剤、付香剤などを含む適切な水系または非水系ビヒクルが含まれていてもよい。固形の形態には、たとえば下記の成分や類似の特性を有する化合物など各種のものが含まれていてもよい：結合剤、たとえば微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、たとえばデンプンまたはラクトース；崩壊剤、たとえばアルギン酸、プリモゲル剤、またはコーンスターチ；滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム；潤滑剤、たとえばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、たとえばスクロースまたはサッカリン；または、付香剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料。
【００５９】
注射剤組成物は典型的には、注射用無菌生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、またはその他当業者公知の注射剤用キャリアをベースとする。
【００６０】
経口投与または注射剤投与のための上述の成分は、単に代表的なものを挙げたにすぎない。さらなる原料や、加工技術などは、当業熟練者には公知である［２１］。
【００６１】
本発明の化合物を、徐放性の形態で、または徐放性薬物送達システムから投与することもまた可能である。代表的な徐放性材料についての記述は、当業熟練者には公知である［２２］［２３］［２４］。
【００６２】
本発明の化合物は、アルツハイマー病、拳闘家痴呆（頭部外傷を含む）、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆の発症および病状の進行にともなう、Ａβの凝集を防止する。これらの化合物を使用する方法では、化合物を、定期的な間隔を置きながらの、注射または注入するのが好ましい。本発明の化合物の投与は、患者において何かの症状が認められるより前に始めるのが好ましく、またその後も継続するのが好ましい。アルツハイマー病、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）およびアミロイドアンジオパシーを伴う血管性痴呆の症状が現れるハイリスクな患者としては、それらの疾病の家族歴を有する患者が挙げられる。
【００６３】
さらに、本発明の態様としては、アザ−ペプチドを調製するための方法があるが、それに含まれる工程は：
ａ）式（ＩＩ）のアザ−アミノ酸構成単位を、アミノ酸、アザ−アミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドと反応させて、アザ−ペプチドカップリングを介してアザ−ペプトイド結合を形成させる工程；
【化５】
2006520321.tif 000006
式中、Ｒは、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択され；
Ａは、任意に保護基によって保護されていてもよいアミノ酸の任意の官能基であり；
ＲおよびＡは、任意に置換されたＣ3〜Ｃ6−ヘテロシクロアルキル環、好ましくはピラゾリジニル−、ジアゼチジン−、ヘキサヒドロピリダジン−、１，２−ジアゼパン−、または１，２−ジアゾオクタン基を形成することも可能である：
ｂ）パラ−ニトロカルボベンジルオキシ基を除去する工程、である。
【００６４】
上記の方法の工程ａ）のための、アザ−ペプチドカップリングにとっての好適な条件は、典型的には、低温でアザ−アミノ酸を予備活性化させるためのたとえばＤＩＥＡのような３級塩基の存在下に、トリホスゲンのようなカルボニル放出剤を使用するものである。
【００６５】
上記の方法（工程ｂ）のパラ−ニトロカルボベンジルオキシ基を除去するのに好適な条件は、典型的には、塩化スズ（ＩＩ）二水和物、亜ジチオン酸ナトリウムおよび触媒としてのパラジウム存在下の水素ガスから選択される還元剤を使用するものである。ＳｎＣｌ2×２Ｈ2Ｏを使用するのが、最も好ましい。
【００６６】
本発明のまた別な態様は、上述の方法であって、工程ｂ）における少なくとも１つのアザ−アミノ酸構成単位が、式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶIから選択されるものである：
【化６】
2006520321.tif 000007
式中、Ｒは、ＨおよびＣ1〜Ｃ6アルキルから選択されるが、好ましくはＨであり；
ＲZは−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2および−ｔｅｒｔ−ブチルから選択される。
【００６７】
本発明のまた別な好ましい実施態様は、全配列の長さが２〜１０、好ましくは２〜５、最も好ましくは５ペプトイド単位のアザ−ペプチドを調製するための、上述の方法からなる。
【００６８】
本発明のまた別な好ましい実施態様は、２〜１０個、好ましくは２〜５、最も好ましくは１または２個のアザ−アミノ酸を有するアザ−ペプチドを調製するための、上述の方法からなる。
【００６９】
本発明のまた別な好ましい実施態様は、式Ｉのアザ−ペプチドを調製するための上述の方法からなる。
【００７０】
本発明のさらなる態様は、式ＩＩＩ〜ＶIから選択される式を有する合成アザ−ペプチド構成単位である。
【００７１】
式Ｉの化合物を調製するための典型的または好適な実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）がわかれば、特に断らない限り、その他の実験条件を使用することも可能であることは、理解されたい。最適な反応条件は、使用する特定の反応剤または溶媒によって変化するが、そのような条件は、当業者ならば、日常的な最適化手順によって求めることができる。
【００７２】
本発明の化合物は、当業熟練者には公知であるペプチド合成方法を使用して調製することが可能である［２５］、［２６］。好ましい実施態様においては、本発明の化合物は、固相反応方法を使用して合成される。
【００７３】
本発明の化合物を目的とした好適な経路は、スキーム３に示しているが、具体的には、以下の実施例の項において説明する。
【００７４】
略号
本明細書においては以後、付属の実施例において以下の略号を使用する：
ｍｉｎ（分）、ｈｒ（時間）、ｇ（グラム）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、ｍ．ｐ．（融点）、ｅｑ（当量）、ｍＬ（ミリリットル）、μＬ（マイクロリットル）、ＡＣＮ（アセトニトリル）、Ａｌｌ（アリル）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、Ｂｏｃ（ブトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（カルボキシベンジル）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＩＥＡまたはＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノ−ピリジン）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）、Ｅｔ2Ｏ（ジエチルエーテル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ＨＡＴＵ（０−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）、ｒｔ（室温）、ＴＥＡ（トリエチルアミン）、ＴＦＡ（トリフルオロ−酢酸）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＮＭＰ（Ｎ−メチル−ピロリドン）、ｃｐｍ（カウント／分）、Ｃｉ（キュリー）。
【００７５】
本発明の化合物の合成：
本発明の化合物は、容易に入手可能な出発物質から、以下の一般的な方法および手順を使用して調製することができる。典型的または好適な実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）がわかれば、特に断らない限り、その他の実験条件を使用することも可能であることは、理解されたい。最適な反応条件は、使用する特定の反応剤または溶媒によって変化する。そのような条件は、当業者ならば、日常的な最適化手順によって求めることができる。
【００７６】
一般的なプロトコル：
一般式（Ｉ）に従うアザ−ペプチド／アザチド誘導体は一般に、ペプチドカップリング工程に関するかぎり、溶液中、固相のいずれの方法でも、標準的なペプチド合成テクニックを使用して合成することができる。いずれのアプローチでも、典型的なカップリング試薬を使用するが、それらについては、当業者には公知である。アザペプチドの合成例はガンテ（Ｇａｎｔｅ）によって与えられている［２７］。
【００７７】
ここでもまた、典型的または好適な実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）がわかれば、特に断らない限り、その他の実験条件を使用することも可能であることは、理解されたい。最適な反応条件は、使用する特定の反応剤または溶媒によって変化するが、そのような条件は、当業者のよく知るところである。一般的な合成経路を下記のスキーム１に示す。
【００７８】
アザ−ペプチド配列中で希望するアザ−アミノ酸の位置と数に従って、本発明のアザ−ペプチドを、スキーム１の左側（アザ−アミノ酸のカップリング）に従うか、またはスキーム１の右側（通常のアミノ酸のカップリング）に従って合成することができるが、これを（アザ）ペプチド配列全体にわたって繰り返す。
【００７９】
スキーム１において与えた一般的な例では、第１の（アザ）アミノ酸（Ａ）に第２の（アザ）アミノ酸をカップリングさせて、ジ−（アザ）ペプチド（Ｂ）を合成している。
【化７】
2006520321.tif 000008
【００８０】
式Ｉのアザ−ペプチドは、スキーム１の左側のプロトコルを使用し、少なくとも１回のカップリング工程を行うことにより合成される。
【００８１】
アザチドは、それぞれのカップリング工程でスキーム１の左側だけを使用することにより、得られる。
【００８２】
アザ−アミノ酸のカップリング工程は、対応する式ＶＩＩのＮ1−保護−Ｎ2アルキル化ヒドラジン誘導体（構成単位）を使用し、カルボニル−放出剤（プレアクチベーター）および塩基の存在下で実施する（スキーム１、工程１、左側プロトコル）。
【化８】
2006520321.tif 000009
ここでヒドラジン上での「アルキル化」は、対応するアミノ酸の側鎖を表し（たとえば、アルキル化＝ベンジル（Ｂｎ）は、アザ−アミノ酸、すなわち、アザ−フェニルアラニンに対応する）；
ヒドラジンの「保護基」はアミノ保護基であって、最終的には、構造を損なうことなく開裂させることが可能である（ブッツ・アンド・グリーン（Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ）第３版）。好適な保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル、４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル（ｐ−ＮＯ2−Ｚ）である。Ｒは、窒素基の側鎖である。
【００８３】
通常のアミノ酸のカップリング工程は、対応する式ＶＩＩＩの通常のアミノ酸を使用し、古典的なペプチド合成法を用いて実施する（スキーム１、工程１、右側プロトコル）。
【化９】
2006520321.tif 000010
【００８４】
好ましい実施態様においては、式（Ｉ）のアザ−ペプチドは、上記のスキーム１の記述に従って、固相支持体の上で合成することができる。
【００８５】
次のスキーム２において与えた一般的な例では、樹脂に結合された第１の（アザ）アミノ酸（Ａ）に第２の（アザ）アミノ酸をカップリングさせて、ジ−（アザ）ペプチド（Ｂ）を与えている。
【化１０】
2006520321.tif 000011
【００８６】
この場合は、式ＶＩＩのヒドラジンの「保護基」は、アミノ保護基であって、これは最終的には構造を損なったりあるいは樹脂から対応する生成物を放出したりすることなく、開裂させることができる（ブッツ・アンド・グリーン（Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ）第３版）。
【００８７】
この合成は、たとえば、Ｃ末端アミドを導くのに好適なリンク−アミド（Ｒｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ）樹脂を使用して実施することができる。樹脂の上でＣ−アミノ化アザ−ペプチドの全合成を実施するための好適な保護基は、アザ−アミノ酸の場合には、４−ニトロベンジル−オキシカルボニル（ｐ−ＮＯ2−Ｚ）である。
【００８８】
このパラ−ニトロカルボベンジルオキシ基は、塩化スズ（ＩＩ）二水和物、亜ジチオン酸ナトリウムおよび触媒としてのパラジウム存在下の水素ガスから選択される還元剤を使用することによって、好適に除去される。ＳｎＣｌ2×２Ｈ2Ｏを使用するのが、最も好ましい［２８］。
【００８９】
一般式Ｉに従うペンタ−アザ−ペプチドを調製するために好ましい経路を（ここでＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4およびＸ5は先に定義したもの）下記のスキーム３に示す：
【化１１】
2006520321.tif 000012
【００９０】
アザ−アミノ酸のカップリングに使用されるカルボニル−放出剤は、脱離基に隣接したカルボニル基を含む化学物質で、たとえば、カルボニルジイミダゾール、ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート、ビス（２，４−ジニトロフェニル）カーボネート、（ビス（トリクロロメチル）カーボネート）、ビス（ペンタフルオロフェニル）カーボネート、４−ニトロフェニルクロロフォーメート、クロロギ酸、トリクロロメチルエステルなどがあるが、好ましくはクロロギ酸−トリクロロメチルエステル、最も好ましくはビス（トリクロロメチル）カーボネート（トリホスゲン）である。
【００９１】
アザアミノ酸のカップリングに使用される塩基としては、放出されてくるプロトン性の脱離基を捕捉することが可能な、各種のタイプの第三級アミン、たとえばＮ−Ｍｅ−ピロリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、または類似のｐＫａを有する各種３級塩基を用いることができる。
【００９２】
典型的には、アザ−アミノ酸のカップリング反応は次のようにして実施する。すなわち、式ＶＩＩのヒドラジン誘導体（ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドに対して１．５〜２当量）を、不活性溶媒、たとえばテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム中、好ましくはテトラヒドロフラン中で、−５０℃〜−１０℃、好ましくは−２０℃で、カルボニル−放出剤（ヒドラジン誘導体に対して１〜１．２当量）を用いて、不活性雰囲気下で１５分〜２時間かけて予備活性化する。
【００９３】
次いでこの混合物を、Ｎ末端の遊離のアミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドに添加して、２〜１５時間、好ましくは３時間撹拌する。
【００９４】
アミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドが、樹脂に結合している場合には、その樹脂を、予備活性化ヒドラジン構成単位を添加する前に５分間、ＤＣＭ中に５％濃度のＮ−Ｍｅ−ピロリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンまたは同様のｐＫａを有する各種の第三級塩基を用いて洗浄する。
【００９５】
次いでその反応混合物を、典型的には固相有機合成に使用される別な有機溶媒を用いて慎重に洗浄する。
【００９６】
アザ−アミノ酸をカップリングさせるために使用するＮ1−保護−Ｎ2アルキル化ヒドラジン誘導体は式（ＶＩＩ）で表されるものであるが、ここでその「アルキル化」は−ＣＨＲsであり、ここで−ＣＨＲsは、その対応するアミノ酸の側鎖を表し、また式（ＶＩＩ’）でも表される。
【００９７】
これらのＮ1−保護−Ｎ2アルキル化ヒドラジン誘導体は、対応する式（ＩＸ）のヒドラゾン誘導体から、スキーム４に示すような当業者公知の、パラジウム触媒を用いた水素化手順により、誘導される：
【化１２】
2006520321.tif 000013
【００９８】
典型的には、対応する式（ＩＸ）のＮ1−保護−Ｎ2アルキル−ヒドラゾン誘導体を水素化に適した有機溶媒中に溶解させ、次いで、スキーム４に示したように、活性炭担持パラジウムまたはパラジウムを添加する。この混合物を水素化試験装置中で撹拌し、その試験装置に水素を充填して２〜１５バールとする。水素の化学量論的な吸収をモニターする。
【００９９】
対応する式（ＩＸ）のヒドラゾンそれ自体は、対応する式（Ｘ）のＮ1−保護−ヒドラジンを、所望のアルキル部分を担持する式（ＸＩ）のアルキルカルボニル誘導体と反応させることにより、誘導される（スキーム４）。典型的には、式（Ｘ）のＮ1−保護−ヒドラジンを、不活性溶媒たとえばアセトン、テトラヒドロフランまたはその他の当業者が使用する各種溶媒の中で、対応する式（ＸＩ）のカルボニル誘導体と混合する。典型的には、ヒドラゾンがその溶媒混合物から沈殿する。
【０１００】
所望のアルキル部分が最後の水素化工程に適していないような場合には、式（Ｘ）のＮ1−保護−ヒドラジンを直接アルキル化することも用いてもよい（スキーム５参照）。
【化１３】
2006520321.tif 000014
【０１０１】
典型的には、Ｎ1−保護−ヒドラジン（Ｘ）を、捕捉剤としての塩基の存在下で、対応する式（ＸＩＩ）のアルキル−ハライド（ここでＸはハロゲン）と反応させる。過剰アルキル化を防止するために、Ｎ1−保護−ヒドラジンを１．２〜５当量過剰に使用する。こうして得られる、式（ＶＩＩ’’）または式（ＶＩＩ）のＮ1−保護−Ｎ2アルキル化ヒドラジン誘導体（ここで「アルキル化」は−Ｒsであり、この−Ｒsは対応するアミノ酸の側鎖を表す）を、標準的なクロマトグラフィー技術を用いて精製する。
【０１０２】
アザプロリン誘導体は、式（ＸＩＩＩ）のＮ1，Ｎ2−ビス−保護−ヒドラジンから合成することができるが、それを下記のスキーム６に示す：
【化１４】
2006520321.tif 000015
【０１０３】
環化工程は、式（ＸＩＶ）の１，３−ビス−ハロゲン−プロパン誘導体（ここでＸはハロゲン）を使用して、強塩基、たとえばＫＨ、Ｋ−ＯｔＢｕ、好ましくはＮａＨの存在下、不活性溶媒たとえば、ＴＨＦ、ジオキサン、ＤＭＦ、ＤＭＡまたはＮＭＰの中、−２０℃〜２０℃で、実施することができる。
【０１０４】
典型的には、第１の工程でジ−アニオン種が発生し、次いで式（ＸＩＶ）の１，３−ビス−ハロゲン−プロパン誘導体を添加すると、式（ＸＶ）のＮ1，Ｎ2−ビス−保護−アザプロリン誘導体の式（ＸＶ）が生成する。１つの保護基を適当に除去することで、対応する式（ＶＩＩ’’’）または式（ＩＩ）のＮ1−保護−アザプロリン誘導体が生成するが、ここでＲと「アルキル化」部分が一緒になって、ピラゾリジニル環を形成する。
【０１０５】
アミノ酸、ペプチド、アザ−ペプチドまたはアザチドが溶液中にある場合には、その反応混合物を標準的な手順を用いて処理し、その粗製物を、フラッシュ−クロマトグラフィーを用いて精製する。
【０１０６】
Ｎ末端の脱保護−カップリング−脱保護−カップリングのサイクルを実施して、本発明のペンタペプチドとする場合、最後の脱保護工程に続けて、本発明の所望の化合物Ｎ末端をブロックする場合には、Ｎ末端のアシル化を行うことができる。この工程は、遊離のＮ末端を持つ本発明の化合物の場合には省略する。
【０１０７】
次いで、樹脂から開裂させることによって、本発明のペプチドのＣ末端の最後の脱保護を行うと、アミノ化Ｃ末端を有する本発明の化合物が得られる。
【０１０８】
精製は次のようにして実施する：分取用ＨＰＬＣ；ウォーターズ・プレップ・ＬＣ４０００・システム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣ  ４０００  Ｓｙｓｔｅｍ）、カラム；プレップ・ノバ・パック（Ｐｒｅｐ  Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（商標）ＨＲ  Ｃ１８、６μｍ、６０Å、４０×３０ｍｍ（最大１００ｍｇ）または４０×３００ｍｍ（最大１ｇ）。精製はすべて、ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ０．０９％ＴＦＡのグラジエントをかけて実施した。
【０１０９】
遊離のＣ末端アザ−ペプチドの合成をするには、ワング（Ｗａｎｇ）またはサスリン（Ｓａｓｒｉｎ）（商標）樹脂が好ましい。その方法は、先に述べた方法と類似している。
【０１１０】
それぞれのカップリング工程においてアザ−アミノ酸のみのカップリングを繰り返すと、アザチドが得られる。
【０１１１】
アザチドは、アザ−アミノ酸のための保護基として好ましくはｔ−ブチルオキシカルボニルを使用して、好ましくは溶液中で合成することができる。アザチドは、公知のプロトコルに従って、液相で合成することも可能であるが、その１例が、ハン（Ｈａｎ）およびジャンダ（Ｊａｎｄａ）によって示されている［２９］。
【０１１２】
次のような構成単位が、スイス国のベイケム（Ｂａｃｈｅｍ）またはノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）から市販されている：Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシンおよびＦｍｏｃ−Ｄ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ。
【０１１３】
ＮＯ2−Ｚ−ＮＨ−ＮＨ−Ｂｎ（Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−Ｎ2−ベンジル−ヒドラジン）、ＮＯ2−Ｚ−アザ−プロリン（ピラゾリジン−１−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステル）、ＮＯ2−Ｚ−ＮＨＮＨ−イソブチル（アザ−ロイシン）、Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−Ｎ2−イソブチル−ヒドラジン、ＮＯ2−Ｚ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＨ2ＣＯＯＨ（アザ−アスパラギン酸）、［Ｎ’−（４−ニトロ−ベンジルオキシカルボニル）−ヒドラジノ］−酢酸は、市販の原料から下記に引用する方法により調製した。
【０１１４】
カップリング試薬は、スイス国のノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）から市販されている。
【実施例】
【０１１５】
実施例１〜７の化合物は、本発明の好ましい実施態様である：
【０１１６】
実施例１：構成単位：Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−Ｎ2−ベンジル−ヒドラジン（１）：
実施例１の化合物は、式（ＩＩＩ）の化合物で、ＲがＨであるもので、以下のスキーム４〜５に従って合成することができる：
１）Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−Ｎ2−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル）−ヒドラジン（１ａ）：
【化１５】
2006520321.tif 000016
【０１１７】
１．２３ｇ（９．２８ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル−カルバゼートと３．２ｍＬ（１５．５５ｍｍｏｌ）のｄｉｐｅａを、５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた。この溶液に、５０ｍＬのＤＣＭに２ｇ（９．２８ｍｍｏｌ）の４−ニトロベンジルクロロホーメートを溶解させた溶液を滴下により加えた。
【０１１８】
その混合物をマグネチックスターラーで１時間撹拌した。その溶液を０．１ＮのＨＣｌを用いて洗浄し、硫酸マグネシウムを用いてその有機相を乾燥させ、真空下で濃縮すると、黄みがかった固形物が得られ、そのものは、化合物１ａであった（２．４５ｇ、収率８６％）。ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ−Ｂｏｃ＋１）+＝２１２；（Ｍ−１）-＝３１０．２。  1Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）、δ：１．４７（ｓ、９Ｈ）；５．３２（ｓ、２Ｈ）；６．４５（ｂｓ、１Ｈ）；６．８２（ｂｓ、１Ｈ）；７．０２；（ｄ、２Ｈ）、８．２３（ｄ、２Ｈ）。  13Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：２８．５０；６６．４６；８２．５０５；１２１．１６；１２８．５６；１４３．４１；１４８．１０；１５４．００；１７０．３０。
【０１１９】
２）Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−ヒドラジン（１ｂ）：
【化１６】
2006520321.tif 000017
２．４ｇの化合物１ａを１０ｍＬのＤＣＭ／ＴＦＡ（２５％）に溶解させた。その混合物を２時間撹拌してから、溶媒を蒸発させ、５ｍＬのジエチルエーテルを添加すると、目的の生成物が結晶化した（化合物１ｂ）。その結晶を濾過し、エーテルを用いて洗浄した。ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ＋）+＝２１２；（Ｍ−１）-＝２１０．２６。
【０１２０】
３）Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−Ｎ2−ベンジル−ヒドラジン（１）：
【化１７】
2006520321.tif 000018
５．２ｇの化合物１ｂと、６．９ｍＬのｄｉｐｅａを１２０ｍＬのエタノールに溶解させた。その溶液に、２．４ｍＬのベンジルブロミドを５０ｍＬのエタノールに溶解させた溶液を添加した。その混合物を一夜還流させてから、溶媒を真空下で蒸発させ、１５０ｍＬの酢酸エチルを添加した。白色の固形物を濾過し、濾液を濃縮してから、フラッシュクロマトグラフィーでシクロヘキサン：酢酸エチル（８：２）を溶出液として用い、精製した。４．４ｇ（７２％）の目的とするモノアルキル化生成物（１）を単離することができた。1Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ、３００Ｍｚ）、δ：３．３８（ｂｓ、１Ｈ）；４．１３（ｓ、２Ｈ）；５．１（ｓ、２Ｈ）；７．５８（ｄ、２Ｈ）；８．２５；（ｂ、７Ｈ）；８．４８（ｂｓ、１Ｈ）。
【０１２１】
実施例２：構成単位：ピラゾリジン−１−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステル（２）：
実施例２の化合物は、式（ＶI）の化合物または式（ＶＩＩ’’’）の化合物であるが、ここでＰｒｏｔ１は４−ＮＯ2−Ｃｂｚであって、次のスキーム６に従って合成することができる：
【０１２２】
１）Ｎ1−ｔｅｒｔ−ブチルオキシ−カルボニル−Ｎ2−ベンジルオキシ−カルボニル−ヒドラジン（２ａ）：
【化１８】
2006520321.tif 000019
１０ｇの市販のｔｅｒｔ−ブチル−カルバゼートを４００ｍＬのＤＣＭに溶解させ、それに対して、２５．９ｍＬのＤＩＰＥＡを１００ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液を滴下により添加し、その後で、１１．８８ｍＬのベンジルオキシカルボニルクロリドを１００ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液を添加した。この混合物をマグネチックスターラーで一夜撹拌した。その後、０．１ＮのＨＣｌと塩水を用いてその溶液を洗浄した。硫酸マグネシウムを用いてその有機相を乾燥させてから、真空下で濃縮すると、黄色の油状物（２ａ）が得られた（２０．２ｇ、９９％）。ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ−１）-＝２６５．２２。1Ｈ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ、３００Ｍｚ）δ：１．４８（ｓ、９Ｈ）；５．１９（ｓ、２Ｈ）；６．３９（ｂｓ、１Ｈ）；６．６３（ｂｓ、１Ｈ）；７．３７（ｍ、５Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ、３００Ｍｚ）δ：２８．５１；６８．１５６；８２．２４；１２８．９４；１３６．００；１５８．４０。
【０１２３】
２）ピラゾリジン−１，２−ジカルボン酸１−ベンジルエステル２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｂ）：
【化１９】
2006520321.tif 000020
充分に乾燥させた５００ｍＬの３口フラスコの中で、１００ｍＬのＤＭＦ中に１．５ｇのＮａＨ（６０％）を懸濁させた。その混合物を０℃に冷却した。３．９ｇのｔｅｒｔ−ブチルカルバゼート（２ａ）を１００ｍＬのＤＭＦに溶解させた溶液を滴下により添加した。混合物の色が赤色に変化した。１．９１ｍＬの１，３−ジブロモプロパンを１００ｍＬのＤＭＦに溶解させた溶液を添加し、その反応物を０℃で３０分間撹拌してから、室温で一夜撹拌した。
【０１２４】
溶媒を蒸発させて乾固させ、酢酸エチル（１００ｍＬ）を用いてその固形物を洗浄した。白色の粉体を濾過で除き、塩水（３×５０ｍＬ）を用いて有機層を洗浄してから、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させると、黄色の油状の残分（５．４ｇ）が得られたので、それを最終的にフラッシュ−クロマトグラフィーにより精製した（２ｂ）。ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ−Ｂｏｃ＋１）+＝２０７；（Ｍ−５６−１）-＝２６５。1Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：１．３５（ｓ、９Ｈ）；１．９７（ｍ、２Ｈ）；３．２０（ｍ、２Ｈ）；３．８５（ｍ、２Ｈ）；５．１０（ｍ、２Ｈ）；７．２７（ｍ、５Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：１４．５８；２８．４６；６８．１５；４６．６６；６０．７８；８１．９６；１２８．４５；１３６．６０；１５７．１５；１７４．１０。
【０１２５】
３）ピラゾリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ｂｏｃ−アザプロリン）（２ｃ）：
【化２０】
2006520321.tif 000021
ピラゾリジン−１，２−ジカルボン酸１−ベンジルエステル−２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｂ）をＭｅＯＨ中に溶解させた。１１０ｐｓｉの水素圧をかけて、一夜反応器を撹拌させた。得られた組成物は、その後の反応をさせるには充分な純度のものであった（収率６０％）（２ｃ）。
1Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：１．４２（ｓ、９Ｈ）；１．９５（ｍ、２Ｈ）；３．００（ｍ、２Ｈ）；３．３６（ｍ、２Ｈ）；３．７５（ｂｓ、１Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：２８．４１；２８．８５；４５．９６；４８．１７；８０．５７；１５５．４５。
【０１２６】
４）ピラゾリジン−１，２−ジカルボン酸１−（４−ニトロベンジル）エステル２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｄ）：
【化２１】
2006520321.tif 000022
化合物（２ｄ）の合成は、化合物（２ａ）を得るための工程１）におけるのと同一のプロトコルに従って実施し、先に示したようにして、化合物（２ｃ）を４−ニトロベンジルオキシカルボニルクロリドの存在下で反応させた。その粗製物を、シリカゲルで、溶出液としてシクロヘキサン：ＴＨＦ（６０：４０）を用いて精製すると、収率４３％で、化合物（２ｄ）が得られた。ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ＋１）+＝３５２．２２。1Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：１．３９（ｓ、９Ｈ）；２．００（ｍ、２Ｈ）；３．２５（ｍ、２Ｈ）；３．８８（ｍ、２Ｈ）；５．２０（ｍ、２Ｈ）、７．４７（ｄ、２Ｈ）、８．１４（ｄ、２Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：２６．００；２８．５０；４６．５３；４７．５１；６６．５２；８２．２７；１２４．０６；１２８．５２；４１；１４４．１０；１４７．９５；１５６．４８，１５６．５９。
【０１２７】
５）ピラゾリジン−１−カルボン酸−（４−ニトロベンジル）エステル（２）：
【化２２】
2006520321.tif 000023
３．２ｇのピラゾリジン−１，２−ジカルボン酸−１−（４−ニトロベンジル）エステル−２−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｄ）を１５ｍＬのＤＣＭに溶解させ、それに５ｍＬのＴＦＡを滴下により添加した。その反応混合物を２時間撹拌してから、１５０ｍＬのエチルエーテルを添加すると、白色の固形物（２）が得られた。ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ＋１）+＝２５２．３３。1Ｈ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：２．１３（ｍ、２Ｈ）；３．２６（ｍ、２Ｈ）；３．５８（ｍ、２Ｈ）；５．３２（ｍ、２Ｈ）；７．６７（ｄ、２Ｈ）；８．２３（ｄ、２Ｈ）；９．３（ｂｓ、１Ｈ）。13Ｃ−ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ3、３００Ｍｚ）δ：２５．６９；４６．３５；４６．７８；６６．２２；１２３．８７；１２８．６７；１４４．２９；１４７．４８；１５３．７６。
【０１２８】
実施例３：構成単位：Ｎ1−（４−ニトロベンジルオキシ−カルボニル）−Ｎ2−イソブチル−ヒドラジン（３）：
実施例３の化合物は、式（ＩＶ）の化合物で、ＲがＨのものであり、化合物（１）の場合に述べたスキーム４〜５に従って合成することができる。
【０１２９】
実施例４：構成単位：［［Ｎ1−（４−ニトロ−ベンジルオキシカルボニル）−ヒドラジノ］−酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４）：
実施例４の化合物は、式（Ｖ）の化合物で、ＲがＨ、Ｒzが−ｔｅｒｔ−ブチルのものである。このものは、化合物（１）の場合に述べたスキーム４〜５に従って合成することができる。
【０１３０】
実施例５：Ａｃ−Ｌ−Ｐ−Ｆa−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2（５）
実施例５の化合物はスキーム３に従って合成するが、それぞれ、第１のカップリング工程では右側のカップリングプロトコルに従い、次いで、第２のカップリングでは左側のプロトコル、次いで残りの２つのカップリングでは、右側のプロトコルに従う。合成条件は以下の通りである：
【０１３１】
１）樹脂への最後のアミノ酸の結合：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆｍｏｃ（５ａ）の形成：
本発明のアザ−ペプチドの最後のアミノ酸を、以下のようにして、まず樹脂に結合させて、スキーム３（式５ａ）における式Ａの、樹脂に結合したアミノ酸を形成させる：
【０１３２】
５００ｍＬの固相反応器の中で、１１．７ｇのリンク（Ｒｉｎｋ）樹脂のノバシン（ＮＯＶＡＳＹＮ）（商標）ＴＧＲ樹脂ＬＬ（０．２３ｍｍｏｌ／ｇ）を、５分間、２００ｍＬのＤＭＦを用いて２回、ＤＣＭを用いて２回振盪させた。
【０１３３】
試験管の中で、樹脂ビーズを数個、カイザー・テスト（ＫＡＩＳＥＲ  ＴＥＳＴ）キットのそれぞれの試薬を３滴入れて、１２０℃で５分間加熱したときに、青色の生成物があれば陽性と判定した。
【０１３４】
２５０ｍＬの固相反応器中で、１１ｇの樹脂を１００ｍＬのＮＭＰの中に懸濁させた。１．８ｇ（１．５ｅｑ）のＦｍｏｃ−Ｄ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ、２．０５ｇ（２．０ｅｑ）のＨＡＴＵ、および１．７４ｇ（５ｅｑ）のＤＩＰＥＡを１００ｍＬのＮＭＰに溶解させて、樹脂懸濁物の中に加えた。
【０１３５】
その混合物を２時間揺動させてから、樹脂（式５ａ）をＤＭＦ（３×２００ｍＬ）とＤＣＭ（３×２００）を用いて洗浄したが、それぞれの洗浄の時間は５分とした。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  Ｔｅｓｔ）陰性）。
【０１３６】
２）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）ＮＨ2（５ｂ）の形成
上述の樹脂（５ａ）を、３００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪させ、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（５ｂ）が得られる。
【０１３７】
３）第４のアミノ酸のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆｍｏｃ（５ｃ）の形成：
１．５６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン、２．０５のＨＡＴＵ、および１．７４５ｇのＤＩＰＥＡを１００ｍＬのＮＭＰに溶解させた、新たに調製した溶液を、（５ｂ）を１１．７４ｇ含む懸濁液に添加し、その混合物を１ｈ振盪させた。樹脂を、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ）とＤＣＭ（３×２００）を用いて、各５分ずつ洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（５ｃ）が得られる（スキーム３における化合物Ｃ）。
【０１３８】
４）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−ＮＨ2（５ｄ）の形成：
上述の樹脂（５ｃ）を、３００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪させ、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（５ｄ）が得られる。
【０１３９】
５）アザ−フェニルアラニン（Ｆa）のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−（ＮＯ2）Ｚ（５ｅ）の形成：
５０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中に３５０ｍｇのトリホスゲンを溶解させた冷却溶液（−２０℃）に、１ｇのＮＯ2−Ｚ−ＮＨ−ＮＨ−Ｂｎ（化合物１）と２ｍＬのＤＩＥＡを２５ｍＬのＴＨＦに溶解させた溶液を添加した。この混合物をＮ2雰囲気下で２時間撹拌し、次いで、７ｇの（５ｄ）の懸濁液を添加した。その反応溶液を徐々に加温して室温とし、５ｈ撹拌した。洗浄：ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（５ｅ）が得られる。（アリコートの開裂後、５ｍＬＴＦＡ９５％、２ｈ）、ＬＣ−ＭＳ、室温、１．９８ｍｉｎ；（Ｍ＋１）+＝６４６．９３；（Ｍ−１）-＝６４４．７９。
【０１４０】
６）還元的開裂：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−ＮＨ2（５ｆ）の形成：
樹脂（５ｅ）をＤＭＦに膨潤させ、１００ｍＬのＳｎＣｌ2（２ＭのＳｎＣｌ2；１．６ｍＭのＡｃＯＨ；０．０１Ｍのフェノール）のＤＭＦ溶液で、各２時間ずつ３回処理し、ＮＯ2−Ｚ保護基を除去した。次いでその樹脂を、順にＤＭＦ、ＤＣＭ：ＴＥＡ（９：１）、ＤＭＦ、最後にＤＣＭ（２×１００ｍＬ）を用いて各５分ずつ洗浄した；ＬＣ−ＭＳ；（Ｍ＋１）+＝４６８．２７；（Ｍ−１）-＝４６６．１９。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。化合物（５ｆ）が得られる（スキーム３における化合物Ｃ）。
【０１４１】
７）第２のアミノ酸のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐ−Ｆｍｏｃ（５ｇ）の形成：
樹脂（５ｆ）を２００ｍＬのＮＭＰの中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン（１．５ｅｑ）、ＨＡＴＵ（２．０ｅｑ）および１．９ｍＬ（５．０ｅｑ）のＤＩＥＡを２００ｍＬのＮＭＰに溶解させたフレッシュな溶液を添加した。その反応物を２時間振盪させ、順にＤＭＦ、ＤＣＭ３×１００ｍＬを用いて、各５分洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（５ｇ）が得られる。
【０１４２】
８）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐ−ＮＨ2（５ｈ）の形成：
上述の樹脂（５ｇ）を、２００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪し、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（５ｈ）が得られる（スキーム３における化合物Ｄ）。
【０１４３】
９）第１のアミノ酸のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐ−Ｌ−Ｆｍｏｃ（５ｉ）の形成：
樹脂（５ｈ）（８．５ｇ）を２００ｍＬのＮＭＰの中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン（１．２１ｇ、１．５ｅｑ）、ＨＡＴＵ（１．７４ｇ、２．０ｅｑ）および１．９５ｍＬ（５．０ｅｑ）のＤＩＥＡを１００ｍＬのＮＭＰに溶解させた新たな溶液を添加した。その混合物を２時間振盪させ、順にＤＭＦ、３×１００ｍＬのＤＣＭを用いて、各５分洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（５ｉ）が得られる。
【０１４４】
１０）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐ−Ｌ−ＮＨ2（５ｊ）の形成：
上述の樹脂（５ｉ）を、２００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪し、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（５ｊ）が得られる。
【０１４５】
１１）Ｎ末端のアシル化：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐ−Ｌ−Ａｃ（５ｋ）の形成：
８ｇの上述の樹脂（５ｊ）を、１．６ｍＬのＤＩＥＡを１５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液で処理した。この懸濁液に、２．１６ｍＬの無水酢酸を５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液を添加した。その混合物を３時間撹拌してから、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（５ｋ）が得られる。
【０１４６】
１２）Ｃ末端アミノ酸の脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ−Ｆ−Ｆa−Ｐ−Ｌ−Ａｃ（５ｌ）の形成：
上述の樹脂（８．５ｇ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）（５ｋ）を、８０ｍＬのＤＣＭと５．６ｍＬのＰｈＳｉＨ3（４．９ｇ、２０ｅｑ）からなる溶液を用いて、窒素雰囲気下で５分間処理した。この懸濁液に、５３０ｍｇ（０．２ｅｑ）のＰｄ（ＰＰｈ3）4を８０ｍＬのＤＣＭに溶解させたものを添加した。その混合物を２０分間振盪させた。このサイクルを４回繰り返してから、樹脂をＤＭＦ：水（９：１）３×１５０ｍＬ、ＤＭＦ３×１５０ｍＬ、ＤＣＭ３×１５０ｍＬを用いて、各５分ずつ洗浄した。樹脂（５ｌ）が得られる。
【０１４７】
１３）樹脂からの開裂：Ａｃ−Ｌ−Ｐ−Ｆa−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2（５）の形成：
樹脂（５ｌ）を、１５０ｍＬのＴＦＡと共に３時間振盪させ、次いで、３×１５０ｍＬのＤＣＭを用いて洗浄した。濾液を集めて、真空下で濃縮した。その粗製物を、溶出液としてアセトニトリル／水を用いて分取用ＨＰＬＣにより精製すると、式Ｉの化合物（５）が白色の粉末として得られた。ＬＣ−ＭＳ、室温、１．２４ｍｉｎ；（Ｍ＋１）+＝６８０．４０；（Ｍ−１）-＝６７８．１０。
【０１４８】
実施例６：Ａｃ−Ｌ−Ｐa−Ｆ−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2（６）
実施例６の化合物はスキーム３に従って合成するが、それぞれ、２つの第１のカップリング工程では右側のカップリングプロトコルに従い、次いで、第３のカップリングでは左側のプロトコル、次いで残りの最後のカップリングでは、もう一度右側のプロトコルに従う。合成条件は以下の通りである：
【０１４９】
１）Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−ＮＨ2（５ｄ）の合成：
Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−ＮＨ2は、化合物（５）の中間体（５ｄ）を得るのに使用した、カップリング工程のプロトコルに従って合成した（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。
【０１５０】
２）第３のアミノ酸のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−Ｆｍｏｃ（６ａ）の形成：
１．５６ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン、２．０５のＨＡＴＵ、および１．７４５ｇのＤＩＰＥＡを１００ｍＬのＮＭＰに溶解させた新たな溶液を、（５ｄ）を１１．７４ｇ含む懸濁液に添加し、その混合物を１ｈ振盪させた。樹脂を、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ）とＤＣＭ（３×２００）を用いて、各５分ずつ洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（６ａ）が得られる。
【０１５１】
３）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−ＮＨ2（６ｂ）の形成：
上述の樹脂（６ａ）を、３００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪し、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（６ｂ）が得られる（スキーム３における化合物Ｃ）。
【０１５２】
４）アザ−プロリン（Ｐa）のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−Ｐa−（ＮＯ2）Ｚ（６ｃ）の形成：
４３３ｍｇのトリホスゲンを１５ｍＬのＴＨＦに溶解させた冷却溶液（−２０℃）に、１．６ｇのピラゾリジン−１−カルボン酸−４−ニトロ−ベンジルエステルトリフルオロアセテート（（ＮＯ2）Ｚ−アザ−プロリン  ×  ＴＦＡ）（化合物２）および８００マイクロリットルのＤＩＥＡを１０ｍＬのＴＨＦに溶解させた溶液を添加した。その混合物を窒素雰囲気下で２時間撹拌してから、上述の樹脂（６ｂ）の懸濁液（１％ＤＩＥＡ／ＴＨＦ、２５０ｍＬ中９ｇ樹脂）に添加した。その溶液を徐々に加温して室温とし、５ｈ撹拌した。洗浄：ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。部分開裂：ＬＣ−ＭＳ：室温、２．０９、（Ｍ＋１）+＝７４５．５；（Ｍ−１）-＝７４２．８１。樹脂（６ｃ）が得られる。
【０１５３】
５）還元的開裂およびアミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−Ｐa−ＮＨ2（６ｄ）の形成：
樹脂（６ｃ）をＤＭＦに膨潤させ、１００ｍＬのＳｎＣｌ2（２ＭのＳｎＣｌ2；１．６ｍＭのＡｃＯＨ；０．０１Ｍのフェノール）のＤＭＦ溶液で、各２時間ずつ３回処理し、ＮＯ2−Ｚ保護基を除去した。次いでその樹脂を、順にＤＭＦ、ＤＣＭ：ＴＥＡ（９：１）、ＤＭＦ、最後にＤＣＭ（２×１００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（６ｄ）が得られる（スキーム３における化合物Ｄ）。
【０１５４】
６）第１のアミノ酸のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−Ｐa−Ｌ−Ｆｍｏｃ（６ｅ）の形成：
樹脂（６ｄ）（８．５ｇ）を２００ｍＬのＮＭＰの中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン（１．２１ｇ、１．５ｅｑ）、ＨＡＴＵ（１．７４ｇ、２．０ｅｑ）および１．９５ｍＬ（５．０ｅｑ）のＤＩＥＡを１００ｍＬのＮＭＰに溶解させた新たな溶液を添加した。その混合物を２時間振盪させ、順にＤＭＦ、３×１００ｍＬのＤＣＭを用いて、各５分洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（６ｅ）が得られる。
【０１５５】
７）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−Ｐa−Ｌ−ＮＨ2（６ｆ）の形成：
上述の樹脂（６ｅ）を、２００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪させ、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（６ｆ）が得られる。
【０１５６】
８）Ｎ末端のアシル化：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆ−Ｐa−Ｌ−Ａｃ（６ｇ）の形成：
８ｇの上述の樹脂（６ｆ）を、１．６ｍＬのＤＩＥＡを１５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液で処理した。この懸濁液に、２．１６ｍＬの無水酢酸を５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液を添加した。その混合物を３時間撹拌してから、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（６ｇ）が得られる。
【０１５７】
９）Ｃ末端アミノ酸の脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ−Ｆ−Ｆ−Ｐa−Ｌ−Ａｃ（６ｈ）の形成：
上述の樹脂（８．５ｇ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）（６ｇ）を、８０ｍＬのＤＣＭと５．６ｍＬのＰｈＳｉＨ3（４．９ｇ、２０ｅｑ）からなる溶液を用いて、窒素雰囲気下で５分間処理した。この懸濁液に、５３０ｍｇ（０．２ｅｑ）のＰｄ（ＰＰｈ3）4を８０ｍＬのＤＣＭに溶解させたものを添加した。その混合物を２０分間振盪させた。このサイクルを４回繰り返してから、樹脂をＤＭＦ：水（９：１）３×１５０ｍＬ、ＤＭＦ３×１５０ｍＬ、ＤＣＭ３×１５０ｍＬを用いて、各５分ずつ洗浄した。樹脂（６ｈ）が得られる。
【０１５８】
１０）樹脂からの開裂：Ａｃ−Ｌ−Ｐa−Ｆ−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2（６）の形成：
樹脂（６ｈ）を、１５０ｍＬのＴＦＡと共に３時間振盪させ、次いで、ＤＣＭ３×１５０ｍＬを用いて洗浄した。濾液を集めて、真空下で濃縮した。その粗製物を、溶出液としてアセトニトリル／水を用いて分取用ＨＰＬＣにより精製すると、式Ｉの化合物（６）が白色の粉末として得られた（純度９５％）。ＬＣ−ＭＳ：室温、１．３５、（Ｍ＋１）+＝６７９．９９；（Ｍ−１）-＝６７７．９９。
【０１５９】
実施例７：Ａｃ−Ｌ−Ｐa−Ｆa−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2（７）
実施例７の化合物はスキーム３に従って合成するが、それぞれ、２つの第１のカップリング工程では右側のカップリングプロトコルに従い、次いで、第３および第４のカップリングでは左側のプロトコル、次いで残りの最後のカップリングでは、もう一度右側のプロトコルに従う。合成条件は以下の通りである：
【０１６０】
１）Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−ＮＨ2（５ｆ）の合成：
Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−ＮＨ2は、化合物（５）の中間体（５ｆ）を得るのに使用した、カップリング工程のプロトコルに従って合成した（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。
【０１６１】
２）アザ−プロリン（Ｐa）のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐa−（ＮＯ2）Ｚ（７ａ）の形成：
４３３ｍｇのトリホスゲンを１５ｍＬのＴＨＦに溶解させた冷却溶液（−２０℃）に、１．６ｇのピラゾリジン−１−カルボン酸−４−ニトロ−ベンジルエステルトリフルオロアセテート（（ＮＯ2）Ｚ−アザ−プロリン  ×  ＴＦＡ）（化合物２）および８００マイクロリットルのＤＩＥＡを１０ｍＬのＴＨＦに溶解させた溶液を添加した。その混合物を窒素雰囲気下で２時間撹拌してから、上述の樹脂（５ｆ）の懸濁液（１％ＤＩＥＡ／ＴＨＦ、２５０ｍＬ中９ｇ樹脂）に添加した。その溶液を徐々に加温して室温とし、５時間撹拌した。洗浄：ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。部分開裂：ＬＣ−ＭＳ：室温、２．０９、（Ｍ＋１）+＝７４５．５；（Ｍ−１）-＝７４２．８１。樹脂（７ａ）が得られる。
【０１６２】
３）還元的開裂およびアミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐa−ＮＨ2（７ｂ）の形成：
樹脂（７ａ）をＤＭＦに膨潤させ、１００ｍＬのＳｎＣｌ2（２ＭのＳｎＣｌ2；１．６ｍＭのＡｃＯＨ；０．０１Ｍのフェノール）のＤＭＦ溶液で、各２時間ずつ３回処理し、ＮＯ2−Ｚ保護基を除去した。次いでその樹脂を、順にＤＭＦ、ＤＣＭ：ＴＥＡ（９：１）、ＤＭＦ、最後にＤＣＭ（２×１００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（７ｂ）が得られる（スキーム３における化合物Ｄ）。
【０１６３】
４）第１のアミノ酸のカップリング：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐa−Ｌ−Ｆｍｏｃ（７ｃ）の形成：
樹脂（７ｂ）（８．５ｇ）を２００ｍＬのＮＭＰの中で膨潤させた。Ｆｍｏｃ−Ｌ−ロイシン（１．２１ｇ、１．５ｅｑ）、ＨＡＴＵ（１．７４ｇ、２．０ｅｑ）および１．９５ｍＬ（５．０ｅｑ）のＤＩＥＡを１００ｍＬのＮＭＰに溶解させた新たな溶液を添加した。その混合物を２時間振盪させ、順にＤＭＦ、ＤＣＭ３×１００ｍＬを用いて、各５分洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（７ｃ）が得られる。
【０１６４】
５）アミンの脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐa−Ｌ−ＮＨ2（７ｄ）の形成：
上述の樹脂（７ｃ）を、２００ｍＬのピペリジン（ＤＭＦ中２５％）の中で２時間振盪し、次いで、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陽性）。樹脂（７ｄ）が得られる。
【０１６５】
６）Ｎ末端のアシル化：Ｐｏｌ−Ｄ（Ａｌｌ）−Ｆ−Ｆa−Ｐa−Ｌ−Ａｃ（７ｅ）の形成：
８ｇの上述の樹脂（７ｄ）を、１．６ｍＬのＤＩＥＡを１５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液で処理した。この懸濁液に、２．１６ｍＬの無水酢酸を５０ｍＬのＤＣＭに溶解させた溶液を添加した。その混合物を３時間撹拌してから、ＤＭＦ（３×２００ｍＬ、各５分）およびＤＣＭ（３×２００ｍＬ、各５分）を用いて洗浄した。（カイザー・テスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）陰性）。樹脂（７ｅ）が得られる。
【０１６６】
７）Ｃ末端アミノ酸の脱保護：Ｐｏｌ−Ｄ−Ｆ−Ｆa−Ｐa−Ｌ−Ａｃ（７ｆ）の形成：
上述の樹脂（８．５ｇ、０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）（７ｅ）を、８０ｍＬのＤＣＭと５．６ｍＬのＰｈＳｉＨ3（４．９ｇ、２０ｅｑ）からなる溶液を用いて、窒素雰囲気下で５分間処理した。この懸濁液に、５３０ｍｇ（０．２ｅｑ）のＰｄ（ＰＰｈ3）4を８０ｍＬのＤＣＭに溶解させたものを添加した。その混合物を２０分間振盪させた。このサイクルを４回繰り返してから、樹脂をＤＭＦ：水（９：１）３×１５０ｍＬ、ＤＭＦ3×１５０ｍＬ、ＤＣＭ３×１５０ｍＬを用いて、各５分ずつ洗浄した。樹脂（７ｆ）が得られる。
【０１６７】
８）樹脂からの開裂：Ａｃ−Ｌ−Ｐa−Ｆa−Ｆ−Ｄ−ＮＨ2（７）の形成：
樹脂（７ｆ）を、１５０ｍＬのＴＦＡと共に３ｈ振盪させ、次いで、ＤＣＭ３×１５０ｍＬを用いて洗浄した。濾液を集めて、真空下で濃縮した。その粗製物を、溶出液としてアセトニトリル／水を用いて分取用ＨＰＬＣにより精製すると、式Ｉの化合物（７）が白色の粉末として得られた（純度９５％）。ＬＣ−ＭＳ：室温、１．３５、（Ｍ＋１）+＝６７９．９９；（Ｍ−１）-＝６７７．９９。
【０１６８】
実施例８：
比較例８
次の化合物が、国際公開第０１／３４６３１号パンフレット（アクソニックス・インコーポレーテッド（Ａｘｏｎｙｘ  Ｉｎｃ．））において開示されており、参照化合物として挙げる。
【化２３】
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【０１６９】
実施例９：生物学的アッセイ
ペプチドの安定性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明の化合物の安定性は、参照化合物（実施例８）と比較しながら、試験をすることができる。
【０１７０】
ペプチドは、１μｇ／μＬの水溶液として調製した。２０μＬのペプチド溶液を、フレッシュなヒト血漿または１０％ラット脳ホモジネート（ＰＢＳ中で調製）の８０μＬに加えて希釈した。得られた溶液を３７℃で時間を変えてインキュベートしたが、その反応は、プロテアーゼインヒビターのコンプリート・カクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を添加することによって停止させた。血漿および脳タンパク質のバルク（ペプチドを含まない）を、冷メタノール（混合物／ＭｅＯＨ＝４／５（ｖ／ｖ））中で、１時間、−２０℃で沈殿させた。この沈殿タンパク質を、遠心分離（１００００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）により、ペレット化した。ペプチドを含む上清を、真空下で５回濃縮し、逆相ＨＰＬＣにより分離した。無損傷ペプチドに相当するピーク面積を測定し、ＰＢＳ中でインキュベートした同等のサンプルの場合と比較した。その結果を表１に、３７℃で２４時間のインキュベーションの後における、ヒト血漿中およびラット脳ホモジネート中での無損傷ペプチドのパーセントとして示す。それらの数値は、実施例８の参照化合物において得られた値に比較すれば、優れている。
【０１７１】
【表１】
2006520321.tif 000025
【０１７２】
活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明の化合物が凝集原線維の形成を阻害する活性は、アミロイド線維に対する親和性を有するフルオロフォアの蛍光シグナルにおける変化を追跡することによって試験することができる。
【０１７３】
アミロイドの形成は、アミロイド線維に結合したチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の蛍光発光から定量的に評価することが可能であるが、これについては、レバイン（Ｌｅｖｉｎｅ）［３０］およびソト（Ｓｏｔｏ）ら［３１］の報告がある。このアッセイにおいては、０．１Ｍトリス中で０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ｐＨが７．４のＡβ１−４２（アルツハイマー患者の脳の中のアミロイド斑における沈着物と同じ配列を持つ合成ペプチド）のアリコートを、それらの化合物の非存在下、または各種の濃度での存在下で、ロータリー振盪機上で穏やかに旋回させながら、３７℃で５日間インキュベートする。そのインキュベーション期間が終わったら、５０ｍＭのグリシン、ｐＨが９．２で２μＭのＴｈＴを、最終的な容積が２ｍＬになるように添加する。パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）ＬＳ５０Ｂ型蛍光分光計を用いて、励起４３５ｎｍ、発光４８５ｎｍにおける蛍光を測定する。分析試験法［３２］を使用することで、本発明の化合物によってもたらされる、原線維生成の阻害パーセントを計算することができる。
【０１７４】
活性の細胞アッセイ
アミロイド線維は、アポトーシスによる細胞死を含めて、細胞毒性を有している［１８］。本発明の化合物がアミロイド形成を防止する能力は、細胞アッセイにおける細胞毒性の阻害を測定することによって、評価することが可能である。
【０１７５】
０．１Ｍトリス中で０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、ｐＨが７．４のＡβ１−４２のアリコートを、単独または、各種の濃度の化合物の存在下で、ロータリー振盪機上で穏やかに旋回させながら、３７℃で３６時間インキュベートした。インキュベーション期間が終わったら、その溶液のアリコートをＰＣ１２細胞の培地に加えて、Ａβの最終的な濃度が５．５μＭになるようにした。その細胞を２４ｈインキュベートしてから、その細胞生存度を、ＭＴＴキット（ドイツ国マンハイム（Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のロシェ（Ｒｏｃｈｅ））を使用し、メーカーの指示に従って評価した。本発明の化合物は、実施例８の化合物の阻害活性と同等の、アミロイド細胞毒性に対する阻害活性を示す。
【０１７６】
血液脳関門の透過性の検討
本発明の化合物がＢＢＢを通過できる能力は、キャピラリー・ディプリーション（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）実験によって調べることが可能であり、その脳内への移行の動力学を測定することが可能である。
【０１７７】
ａ）キャピラリー・ディプリーションおよび血液の洗い出し（ｗａｓｈｏｕｔ）
キャピラリー・ディプリーションを用いて、本発明の化合物の脳内への移行を評価することができる。「洗い出し」工程では、脳から血液を取り除くので、脳実質内に存在する本発明の化合物のレベルを測定することができる。
【０１７８】
キャピラリー・ディプリーションの検討［３２］は、雄性ＣＤ−１マウス（２８〜３６ｇ）で実施することができる。ウレタン（４０％）を用いてマウスに腹腔内麻酔をかけ、左頸静脈を露出させる。トリチウムでラベル化した本発明のペプチドを経静脈で注入する。動物を屠殺する前に、血液を、頸動脈から（グループ１）または下行大動脈から（グループ２）採取する。血液試料を採取してから、グループ１のマウスを屠殺するか、または、２０ｍＬの乳酸リンゲル液（７．１９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．３ｇ／ＬのＫＣｌ、０．２８のＣａＣｌ2、２．１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、０．１６ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．３７ｇ／ＬのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．９９ｇ／ＬのＤ−グルコース、１０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、ｐＨが７．４）を心臓の左室に３０秒間で注入することにより血液を除去したが、それにより、脳内の血管容量の９５％超が除去される（血液脳洗い出し、グループ２）。
【０１７９】
脳／血清比率（μＬ／g）は、次式により求める：脳／血清比率＝（ｃｐｍ／ｇ脳）／（ｃｐｍ／μＬ血清）。大脳皮質を秤量し、生理緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、２．８ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＳＯ4、１ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、および１０ｍＭのＤ−グルコース、ｐＨが７．４）の中でホモジナイズする。次いで、デキストラン溶液（１．６ｍＬ、２６％溶液）をそのホモジネートに加える。遠心分離（５，４００ｇ、１５ｍｉｎ、４℃）にかけて、脳脈管構造（ペレット）と実質（上清み）を分離し、それぞれのフラクションについて放射能を測定することができる。
【０１８０】
ｂ）血液脳関門透過性の検討：
本発明の化合物の脳内への移行の動力学は、血液脳関門透過性の実験から評価することができる。次いで、脳内で見出される注入したペプチドのパーセントを計算することができる。
【０１８１】
ウレタン（４０％）を用いてマウスに腹腔内麻酔をかけ、左頸静脈を露出させる。１％のＢＳＡとトリチウムラベル化ペプチド（「ホット」）を含む、０．２ｍＬの乳酸リンゲル溶液（７．１９ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．３ｇ／ＬのＫＣｌ、０．２８のＣａＣｌ2、２．１ｇ／ＬのＮａＨＣＯ3、０．１６ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．３７ｇ／ＬのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．９９ｇ／ＬのＤ−グルコース、１０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、ｐＨが７．４）を注入する。ラベル化ペプチドを注入した後、タイムポイントを変えながら右頚動脈から動脈血を採取する。血清は遠心分離（４８００ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）により得る。動脈血のサンプル採取の後、マウスを断頭し、松果体と下垂体を除く脳全体を採取し、秤量する。ＴＳ−２溶液（イリノイ州マウント・プロスペクト（Ｍｏｕｎｔ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ）のＲＰＩ）中への可溶化工程を一夜４０℃で行った後で、脳および血清中の放射能の量を測定することができる。全放射能の脳血清比率を、注入してからの時間について求めることができる。次いで、脳対血清の比率（μＬ／ｇ）は、次式から推定することが可能である：脳／血清比率＝（ｃｐｍ／ｇ脳）／（ｃｐｍ／μＬ血清）。
【０１８２】
脳対血清の比率を時間に対してプロットすれば、流入速度Ｋｉ（傾き）と、分布容積（Ｙ切片）Ｖｉとを誘導することができる。流入速度（Ｋｉ、μＬ（血清）／ｇ（組織重量）・ｍｉｎ）は、化合物が血液循環から脳へと移行した速度を表す。分布容積（Ｖｉ、μＬ（血清）／ｇ（組織重量））は、時間ゼロのところでの、脳実質に分布している物質の見かけの容積である。
【０１８３】
大脳Ａβ沈着の動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ検討
化合物はさらに、Ａβ１−４２を注入された動物の脳内でのアミロイド沈着の、本発明の化合物による阻害を測定する、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いた試験をすることもできる。
【０１８４】
本発明の化合物が有する、アミロイド沈着物形成に対する阻害活性は、本発明のペプチドの存在下および非存在下で、抗Ａβ１−４２抗体と共に大脳組織切片を染色することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで可視化することができる。
【０１８５】
雄性フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）−３４４ラットは、体重２５０〜３００ｇで、受け入れ時で月齢３〜４月である。それらの動物はケージに２匹ずつ入れ、食物と水は自由に与えながら、１２時間の明暗サイクル内に維持し、２〜３週間かけて環境に馴化させてから、手術を行う。手術は、ナトリウムペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）麻酔下で実施する。
【０１８６】
動物に麻酔をかけてから、硫酸アトロピン（０．４ｍｇ／ｋｇ）およびアンピシリンナトリウム塩（５０ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射する。Ａβ１−４２をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、さらに水で希釈してＤＭＳＯの濃度を１６．７％とする。動物に対して、インシサー・バー・セット（ｉｎｃｉｓｏｒ  ｂａｒ  ｓｅｔ）を有するコップ（Ｋｏｐｆ）定位脳手術装置を用いることにより、両耳ライン（ｉｎｔｅｒａｕｒａｌ  ｌｉｎｅ）より下３．３ｍｍでそれぞれの口蓋扁桃の中へ、５．０ｎｍｏｌのＡβ１−４２を両側注入する。ブレグマおよび頭蓋表面から測定される注入座標（ＡＰ−３．０、ｍＬ±４．６、ＤＶ−８．８）は、パキシノス（Ｐａｘｉｎｏｓ）およびワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）のアトラスから経験的に決めることができる。ＣＭＡ／１００マイクロシリンジポンプを用い、５．０ｎｍｏｌのＡβ１−４２の溶液の容積３．０μＬを、６分かけて投与する（流速０．５μＬ／ｍｉｎ）。注入後２分間はカニューレをその位置のまま放置し、次いで、それを０．２ｍｍだけ引き抜いて３分間放置、次いでこの５分の経過後に、カニューレをゆっくりと抜き取る。手術の後では、立ち直り反射が得られるまで、動物を電気パッドの上で温めてやる。次いでそれらの動物を本発明の化合物を用いて処置する。濃度４．４ｍＭで０．９％のＮａＣｌ中で可溶化させたペプチドを、７週間半の間、１週間に４回、皮下注射により投与（注入は毎回０．５ｍＬ）する。
【０１８７】
化合物を用いた処置が終わったら、ナトリウムペントバルビタール（１５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）大動脈経由で灌流させて、過剰投与することにより、動物を屠殺する。組織学的検査のため、脳の連続冠状断面（４０μｍ）を切り出し、染色するまでは、エチレングリコール凍結保護剤の中に浸漬し、−２０℃で貯蔵しておく。組織の切片は、公知の方法で、抗−Ａβ１−４２抗体を用いて染色する。画像解析システムを用いて、アミロイド沈着物の大きさを測定する。それらのデータは、二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）により、さらに、事後解析のための、ニューマン・カールス（Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ）の多重検定により解析することができる。
【０１８８】
［１］セルコー（Ｓｅｌｋｏｅ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７５巻、１９９７年、ｐ．６３０〜６３１
［２］マスターズ（Ｍａｓｔｅｒｓ），Ｃ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８２巻、１９８５年、ｐ．４２４５〜４２４９
［３］デイビーズ（Ｄａｖｉｅｓ），Ｌ．ら、ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、第３８巻、１９８８年、ｐ．１６８８〜１６９３
［４］コワール（Ｋｏｗａｌｌ），Ｎ．Ｗ．ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・サイエンス・オブ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８８巻、１９９１年、ｐ．７２４７〜７２５１
［５］レイビー（Ｌｅｖｙ），Ｅ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４８巻、１９９０年、ｐ．１１２４〜１１２６
［６］モウリー（Ｍａｕｒｙ），Ｃ．Ｐ．、ラボラトリー・インベスティゲーション（Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第７２巻、１９９５年、ｐ．４〜１６
［７］ジョーダン（Ｊｏｒｄａｎ），Ｂ．Ｄ．、セミン・ニューロロジー（Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．）、第２０巻、２０００年、ｐ．１７９〜８５
［８］カン（Ｋａｎｇ），Ｊ．ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２５巻、１９８７年、ｐ．７３３
［９］マン（Ｍａｎｎ），Ｄ．Ｍ．、ヒストパソロジー（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第１３巻、１９８８年、ｐ．１２５〜３７
［１０］ショージ（Ｓｈｏｊｉ），Ｍ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５８巻、１９９２年、ｐ．１２６
［１１］モリ（Ｍｏｒｉ），Ｈ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２６７巻、１９９２年、ｐ．１７０８２
［１２］ソト（Ｓｏｔｏ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第７７巻、１９９９年、ｐ．４１２〜４１８
［１３］サーペル（Ｓｅｒｐｅｌｌ）ら、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンス（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．）、第５３巻、１９９７年、ｐ．８７１〜８８７
［１４］ソト（Ｓｏｔｏ），Ｃ．ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７０巻、１９９５年、ｐ．３０６３〜３０６７．
［１５］ビスニエウスキー（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ）ら、バイオケミカル・ソサイエティ・トランザクションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ）、第３０巻、第４号、２００２年、ｐ．５７４〜５７８
［１６］国際公開第９６／３９８３４号パンフレット（ニューヨーク大学（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））
［１７］国際公開第０１／３４６３１号パンフレット（アクソニックス・インコーポレーテッド（Ａｘｏｎｙｘ  Ｉｎｃ．））
［１８］米国特許第５，９４８，７６３号明細書（ニューヨーク大学（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））
［１９］ヘンテニイ（Ｈｅｎｔｅｎｙｉ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・ストラクチャー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）第５４２巻、２００１年、ｐ．２５〜３１
［２０］ヤンカー（Ｙａｎｋｎｅｒ），Ｂ．Ａ．、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）、第１６巻、１９９６年、ｐ．９２１〜９３２
［２１］ゲナーロ（Ｇｅｎｎａｒｏ），Ａ．Ｒ．ら、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）第８部：第１８巻、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）編、ザ・マック・パブリッシング・カンパニー（Ｔｈｅ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９９５年
［２２］『オーラル・サステインド・リリース・フォーミュレーションズ：デザイン・アンド・エバリュエーション（Ｏｒａｌ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）』、アブラハム・ヤコビ（Ａｖｒａｈａｍ  Ｙａｃｏｂｉ）、エバ・ハルペリン＝ワレガ（Ｅｖａ  Ｈａｌｐｅｒｉｎ−Ｗａｌｅｇａ）編、第１版、ペルガモン・プレス（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８８年４月
［２３］『サステインド・リリース・インジェクタブル・プロダクツ（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）』、ジュディー・シニア（Ｊｕｄｙ  Ｓｅｎｉｏｒ）編、インターファーム・プレス（Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ）、２０００年７月
［２４］『エンキャプシュレーション・アンド・コントロールド・リリース（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）』、Ｄ．Ｒ．カルサ（Ｋａｒｓａ）、Ｒ．Ａ．スティーブンソン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ）編、シュプリンガー・フェルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、１９９３年１２月
［２５］『プリンシプルズ・オブ・ペプチド・シンセシス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（シュプリンガー・ラボラトリー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））』、ミクロス・ボダンスキー（Ｍｉｋｌｏｓ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、ミルコス・ボダンスキー（Ｍｉｌｋｏｓ  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）改訂第２版、シュプリンガー・フェルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）
［２６］『Ｆｍｏｃ・ソリッド・フェース・ペプチド・シンセシス：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）』、ウェン・Ｃ・チャン（Ｗｅｎｇ  Ｃ．Ｃｈａｎ）編、ピーター・Ｄ・ホワイト（Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．  Ｗｈｉｔｅ）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）
［２７］ガンテ（Ｇａｎｔｅ）、シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第６巻、第１号、１９８９年、ｐ．４０５〜４１３
［２８］ペルーソ（Ｐｅｌｕｓｏ）ら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第６４巻、第１９号、１９９９年、ｐ．７１１４〜７１２０
［２９］ハン（Ｈａｎ），Ｈ．およびジャンダ（Ｊａｎｄａ），Ｋ．Ｄ．、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、第１１８巻、１９９６年、ｐ．２５３９〜２５４４
［３０］レバイン（Ｌｅｖｉｎｅ），Ｈ、プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２巻、第３号、１９９３年、ｐ．４０４〜４１０
［３１］ソト（Ｓｏｔｏ）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第４巻、第７号、１９９８年、ｐ．８２２〜６
［３２］トリグエロ（Ｔｒｉｇｕｅｒｏ），Ｄ．ら、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．）、第６巻、１９９０年、ｐ．１８８２〜１８８８
【国際調査報告】
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