(57)【要約】本発明は、拒食症、過食症、及び乱用薬物嗜癖のような強迫行動に関連した疾患又は肥満を治療及び／又は予防するための薬剤調製のために、一方で５−ＨＴ４受容体のリガンド又はこのリガンドの医薬的に許容可能な塩、かつ他方で機能的５−ＨＴ４受容体又は機能的に同等な受容体をコードする核酸の使用に関する。本発明は、強迫行動に関連した疾患又は肥満の治療及び／又は予防において生物活性を有する化合物を同定する方法であって、次のステップ：（ａ）５−ＨＴ４受容体又は機能的に同等な受容体を、生物活性を有する前記化合物と接触させること、及び（ｂ）生物活性を有する前記化合物が、５−ＨＴ４受容体又は機能的に同等な受容体の基礎活性を変調させることが可能であるか決定することを含むことを特徴とする方法にも同様に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満を治療及び／又は予防するための薬剤調製用の、５−ＨＴ４受容体のリガンド又はこのリガンドの医薬的に許容可能な塩の使用。
【請求項２】
前記リガンドは、５−ＨＴ３受容体のリガンドでないことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記リガンドは、５−ＨＴ４受容体に特異的であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記リガンドは、５−ＨＴ４受容体作動薬であること、及び前記疾患は、過食症及び肥満からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記リガンドは、５−ＨＴ４受容体拮抗薬であること、及び前記疾患は、拒食症及び乱用薬物嗜癖からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記リガンドは、５−ＨＴ４受容体逆作動薬であること、及び前記疾患は、拒食症及び乱用薬物嗜癖からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満を治療及び／又は予防するための薬剤を調製するための、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸の使用。
【請求項８】
前記核酸分子は、好適には、哺乳動物の５−ＨＴ４受容体をコードする分子であり、及び特にはヒト５−ＨＴ４受容体をコードする分子であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記核酸分子は、非ウイルス又はウイルスベクターのような、転移ベクターに含まれることを特徴とする請求項７又は８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
ウイルスベクターは、２型アデノウイルスに関連したウイルス、様々な偽型を有するレンチウイルスから生じたベクター、ネコの免疫不全ウイルスから生じたベクター、及び「泡沫状ウイルス」から生じたベクターからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記核酸分子は、ドーパミンを捕獲する輸送体をコードする遺伝子のプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項７から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満の治療で使用される可能性がある生物活性を有する化合物を同定する方法であって、次のステップ：
ａ）生物活性を有する前記化合物と、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を接触させること、及び
ｂ）生物活性を有する前記化合物が、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体の基礎活性を変調することが可能であるか決定すること、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ａ）は、次のステップ：
ｉ）機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を発現する細胞を培養すること、及び
ｉｉ）生物活性を有する前記化合物による前記細胞のインキュベーション、を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉ）で培養された細胞は、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を表面に過剰発現させる細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉ）で培養された細胞は、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸分子、又は適切な制御配列に関連した、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする、少なくとも１種の核酸分子を含むベクターによって形質転換されることを特徴とする請求項１３又は１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等の受容体をコードする核酸分子は、好適には、哺乳動物の５−ＨＴ４受容体をコードする分子であり、及び特にはヒト５−ＨＴ４受容体をコードする分子であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体の基礎活性の変調は、信号の形質導入の（作動薬に関して）活性化、又は（拮抗薬、又は逆作動薬に関して）阻害を経由して測定されることを特徴とする請求項１２から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）で、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体は、リポソーム中に挿入され、かつバイオセンサー中に加えられることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレスに関連する、又は関連しない拒食症、過食症、及び乱用薬物嗜癖のような強迫行動に関連する疾病の治療及び予防の分野、並びに肥満の治療及び予防の分野に関する。本発明は、特には、強迫行動に関連した前記疾病及び肥満を治療及び／又は予防するための薬剤を調製するための５−ＨＴ４受容体のリガンドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食事性障害は、不安及びうつ病と共存し、かつ先進国で懸念事項として増加している（Ｇａｒｒｏｗ、１９９１；Ｋｕｃｚｍａｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。大部分の神経精神医学疾患のように、環境因子及び遺伝的素因の影響の組み合わせが、これらの行動欠陥の原因であるように見える（Ｆａｉｒｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｌｉｌｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｂａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。７５％の拒食症女性の母親は、その子供の症状発現の１年前に、うつ病を患っているか、又はアルコール中毒である。拒食症候群に関連したいかなる遺伝子も同定されていないが、拒食症候群はまた、一般集団よりも同一の家族において頻繁に検出される。過食症行動は、同一の個人においてしばしば拒食症と同時に起きるが、多量の食物摂取の衝動的かつ反復的段階を特徴とする。
【０００３】
過食症も、嗜癖に関連する行動の中に分類される（国際精神医学定義、ＤＳＭ）。食物は、獲得が、意思に基づき（「ｗａｎｔｉｎｇ」：食欲／誘因動機」）、かつ快楽主義に関連した構成要素によって動機付けられる（「Ｌｉｋｉｎｇ：快楽／嗜好性」）報酬であるようにみなされ得る（Ｈｏｅｂｅｌ、１９９７；Ｓａｌａｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ、１９９７；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｙ、１９９９）。食物摂取の過剰又は欠如は、代謝及び／又は内分泌欠陥に限定されず、ストレス（Ｄｏｎｏｈｏｅ、１９８４；Ｍｏｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９８３；Ｖｅｒｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ、２０００）、不安（Ｇｏｄａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）、及びうつ病（Ｖｉｅｓｓｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｉｇ、１９８５；Ｃａｓｐｅｒ、１９９８）にも依存する。
【０００４】
視床下部、扁桃及び海馬は、食物消費の調節に関与する。更に、側坐核のニューロンの活性は、予想の際に、又は食物若しくは乱用薬物のような古典的報酬の獲得後に修飾される（Ｄｉ  Ｃｈｉａｒａ、１９９５；Ｈｏｅｂｅｌ、１９９７；Ｋｏｏｂ  ａｎｄ  Ｎｅｓｔｌｅｒ、１９９７；Ｓａｌａｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。
【０００５】
発見が出現したことにより、食物行動の調節における多数のペプチドの関与が証明されている（レプチン、オレキシン／ヒポクレチン、ＣＡＲＴ、ＮＰＹ、ＰＯＭＣ、ＣＲＨ、ＴＲＨ）が、セロトニン（５−ＨＴ）及びドーパミン（ＤＡ）のような古典的な神経伝達物質の影響は、依然として無視できない。ＧＡＢＡ及びグルタミン酸もまた考察すべきである（Ｔａｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｂｉｇｅｒ、１９９７；Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｗａｎｓｏｎ、１９９７；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｙ、１９９７；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。
【０００６】
側坐核のドーパミン作動性系は、報酬（乱用薬物、食物）の予測に関与する。ＤＡ受容体の拮抗薬である、クロザピンの慢性投与は、食欲亢進を引き起こす（Ａｃｋｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ、１９９８；Ａｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。ＤＡ伝達を増大させることで知られているコカイン及びアンフェタミンは、食欲不振誘発性である（Ｆｏｌｔｉｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ、１９９９）。
【０００７】
しかしながら、肥満患者においてセロトニンを捕獲する阻害剤である（Ｇｕｙ−Ｇｒａｎｄ  Ｂ、１９９５）、フェンフルラミンの使用のために、セロトニン作動性系は、食物摂取を制御する不可避なリンクにとどまっている（Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、１９９９）。
【０００８】
要するに、環境因子（ストレス）及び遺伝的因子（脳内に存在する受容体をコードする遺伝子）間の相互作用の組み合わせの欠陥が、過食症、拒食症又は乱用薬物嗜癖のような行動障害の原因であるように思える。これらの疾患、及びより明白には過食症は、今日、毒物嗜癖行動と考えられている。
【０００９】
神経生物学の次元で、我々の知識の現状により、食物行動を調節するために幾つかのニューロン系の組み合わされた介在が容易にされる。最も知られているものは、５−ＨＴがそうであるところの脳メッセンジャー（神経伝達物質）を発現するセロトニン作動性系である。それらの作用が現れる脳の領域は、主に視床下部、扁桃及び側坐核である。
【００１０】
ストレスの効果及び５−ＨＴ間の正確な関係は、セロトニン作動性系及び視床下部−下垂体軸の活性の間の相互影響によって複雑にされる（Ｃｈａｏｕｌｏｆｆ  Ｆ．、２０００）。それに反して、ストレスを加えることは、セロトニン作動性伝達の増加を引き起こす。
【００１１】
ストレスは、セロトニン作動性伝達の上昇をもたらす。ストレスが条件恐怖と結びついた実験パラダイムは、正中前前頭皮質（Ａｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７；Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）、側坐核（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）、扁桃（Ａｍａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）及び背面海馬（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７；Ｊｏｓｅｐｈ  ａｎｄ  Ｋｅｎｎｅｔｔ、１９８３）における５−ＨＴの代謝及び放出の増大をもたらす。特に、拘束ストレス（強制固定化）は、ラット及びマウスの視床下部および扁桃における５−ＨＴ再生を増大させる（Ｋｏｎｓｔａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。同様に、皮質中脳辺縁系のセロトニン作動性ニューロンに対する「コルチコトロピン放出ホルモン又は因子」（ＣＲＦ）の作用は、５−ＨＴの率を変更し得る（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｌｕｃｋｉ、２００１）。その上、グルココルチコイド受容体の働きの変化は、側坐核における５−ＨＴ濃度の変動を引き起こす（Ｓｉｌｌａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。更に、コルチコステロンの反復注射は、５−ＨＴ４受容体作動薬によって誘発される海馬（ＣＡ１）のニューロンの活性化を増大させる（Ｚａｈｏｒｏｄｎａ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。最後に多数の研究は、ＣＲＦがストレスの拒食症誘発性効果の原因であることを推測している。特に、ＣＲＦの脳室内注射は、マウスにおいて食物摂取の減少を誘発する（Ｍｏｍｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。
【００１２】
セロトニンは、食物摂取を阻害する。形質転換生成戦略に組み合わせた薬理学的アプローチは、５−ＨＴ１Ａ／１Ｂ及び５−ＨＴ２Ａ／２Ｃ受容体が、食物摂取、及び更にストレスの調節に関与することを示している（Ｂｏｎａｓｅｒａ  ｅｔ  Ｔｅｃｏｔｔ、２０００；Ｂｏｕｗｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｄｏｕｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９８６；Ｈｅｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｓａｍａｎｉｎ  ｅｔ  Ｇａｒａｔｔｉｎｉ、１９９６）。その場合、ストレスに関連した拒食症は、セロトニン作動性ニューロンの活性増大の結果生じると推測される。多数の研究は、フェンフルラミンの拒食症誘発性効果を、５−ＨＴ１Ｂ受容体の活性化によるものとしているが、他方で、５−ＨＴ放出を阻害する、５−ＨＴ１Ａ受容体（オートレセプター）の活性化は、食物摂取の上昇を誘発する。フェンフルラミン注射に対する５−ＨＴ１Ｂ受容体を有さないマウスの無感受性は、食物摂取調節におけるその関与を確認している（Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。５−ＨＴ２Ｃ受容体を失ったマウスは、肥満であることが判明しているので、５−ＨＴ２Ｃ受容体も食物消費に介在する（Ｈｅｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。レプチンは、食物摂取を減少させるとして知られているが、この肥満には関連しない（Ｎｏｎｏｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。
【００１３】
最近の研究は、５−ＨＴ２Ｃ受容体もフェンフルラミンの拒食症誘発性効果の原因であることを証明している（Ｖｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。最後に、５−ＨＴ３及び５−ＨＴ４受容体の拮抗薬であるトロピセトロン投与は、単一のアミノ酸によって変更される食餌療法の食物摂取を増大させる（Ｅｒｅｃｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）が、この効果は、５−ＨＴ３受容体によるものとされた（Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｇｉｅｔｚｅｎ、１９９４）。従って、食物摂取における５−ＨＴ４受容体の寄与に関して、今日ではいかなるデータも利用できない。
【００１４】
要するに、ストレスが食物摂取を減少させることを説明するための現在の仮説は、２つ群の並行する研究に立脚している。第１のものは、ストレスが、視床下部−下垂体軸（ストレス軸）及びセロトニン作動性ニューロンの活性を増大させることを記載している。その上、視床下部−下垂体軸の活動過剰は、ＣＲＦ、ウロコルチン、及び最終ステップでコルチコステロンのようなホルモンの率の増大をもたらす。第２の群の分析は、ストレス軸のホルモン及び５−ＨＴが、食物摂取を阻害することを示している。
【００１５】
従って、多数の著者は、次の事象シーケンスを提案している：
2006520319.tif 000002
【００１６】
５−ＨＴ受容体全体は、イオンチャネルである５−ＨＴ３受容体を除き、Ｇタンパク質に結合される（Ｓａｕｄｏｕ  ａｎｄ  Ｈｅｎ、１９９４）。５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｅ、及び５−ＨＴ１Ｆ受容体は、アデニル酸シクラーゼに陰性結合し、５−ＨＴに関して強い親和力を有する。５−ＨＴ２受容体の活性化は、ホスホリパーゼＣ（５−ＨＴ２Ａ／２Ｃ）の活性を刺激する。５−ＨＴの他の受容体は、アデニル酸シクラーゼに陽性結合し、かつショウジョウバエにおいて５−ＨＴ４、５−ＨＴｄｒｏ１を、かつ哺乳動物において５−ＨＴ６及び５−ＨＴ７受容体を含む。５−ＨＴ４受容体が、初めて小丘において記載され（Ｄｕｍｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８）、かつその刺激は、海馬、大脳皮質、心房及び食道においてｃＡＭＰ率の上昇を引き起こす。ヒトにおいて、５−ＨＴ４Ａ、５−ＨＴ４Ｂ、５−ＨＴ４Ｃ、５−ＨＴ４Ｄ、５−ＨＴ４Ｅ、５−ＨＴ４Ｆ、５−ＨＴ４Ｇ、５−ＨＴ４ＢＨ、及び５−ＨＴ４Ｎと名付けられた、５−ＨＴ４受容体の９種のサブタイプは、その端部、Ｃ末端により異なっている（Ｂｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、雑誌に印刷中）。５−ＨＴ５Ａ受容体の伝達系は、アデニル酸シクラーゼに陽性結合する。５−ＨＴ５Ｂのそれは、まだ同定されていない。
【００１７】
５−ＨＴ４受容体の機能的影響は、胃腸管において非常に研究されたが、その脳における寄与に関しては、僅かなデータしか利用できない。齧歯目及びヒトの脳の構造全体から、最も高密度の５−ＨＴ４受容体が、辺縁系において検出されている（Ｗａｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。特に、その濃度は、側坐核の「コア」よりも「シェル」において３倍高い（Ｃｏｍｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）。齧歯目の脳において、その率は、発育中に変化し、生後２１日目でなければ成体レベルに達しない（Ｗａｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。ラットの脳で、５−ＨＴ４受容体をコードするｍＲＮＡの率は、嗅覚系、線条体、側坐核、手綱及び海馬において最も高い（Ｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５；Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｖｉｌａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）。
【００１８】
５−ＨＴ４受容体の作動薬は、記憶化欠陥の減少をもたらし、かつアセチルコリン伝達の使用による学習を改良する（Ｂｏｃｋａｅｒｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。５−ＨＴ４受容体が、食物学習に関連した側坐核のニューロン機構に参加し得ると推測することは、魅力的である。４件の薬理学的研究が、ラット及びマウスの「不安」状態における５−ＨＴ４受容体の低い寄与を考慮した（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｓｉｌｖｅｓｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７；Ｃｏｓｔａｌｌ  ａｎｄ  Ｎａｙｌｏｒ、１９９７）。５−ＨＴ４受容体の阻害は、基礎条件でラット（Ｆｏｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）、生後２０〜２７日の若いマウス（Ｓｅｍｅｎｏｖａ  ａｎｄ  Ｔｉｃｋｕ、１９９２）において歩行活動の低下を引き起し、かつコカインによって誘発される過剰歩行運動を緩和し得る（Ｍｃ  Ｍａｈｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、１９９９）。
【００１９】
線条体において、５−ＨＴ４受容体の活性化による細胞外ＤＡ率のセロトニン作動性制御は、同時にエクサイター又はインヒビターとして記載されている（Ｂｏｎｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５；Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６；Ｄｅｕｒｗａｅｒｄｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。
【００２０】
最後に、５−ＨＴ４受容体の刺激は、カリウムイオンチャネルの閉鎖を誘発し（Ｂｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、それは、ニューロンの興奮性を維持し、かつ神経伝達物質の放出を増大させ得る。このデータを踏まえると、５−ＨＴ４受容体の刺激は、海馬において細胞外５−ＨＴ率上昇に至らせる。
【００２１】
要するに、神経生物学的次元で、５−ＨＴ４受容体は、学習及び記憶に介在するとして知られている。それらが運動行動及び不安状態に寄与し得ることは、今日、中程度として記載され、ほとんど研究されていないことが判明している。唯一の研究は、この受容体が歩行活動に対するコカインの効果に介在し得ることを示している。
【００２２】
更に、ＷＯ９７／２９７３９号で公開された国際特許出願は、セロトニン再同化の選択的インヒビターによって引き起こされる胃腸効果を回避、緩和、除去又は抑制するための薬剤調製のための５−ＨＴ４受容体の拮抗薬の使用を記載している。ＷＯ０２／１１７６６号で公開された国際特許出願は、ある種の心臓血管条件の予防又は治療における５−ＨＴ４受容体の拮抗薬の使用を記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
驚くべきことに、発明者は、胎児期からのセロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の欠如によって、成体マウスが、野生動物よりも拒食症誘発性ストレスに対する感受性を低くなることを証明した。換言すれば、ある種のストレスは、野生マウスにおいて食物摂取を減少させるが、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスにおいては効果が弱い。従ってこの受容体が欠如するなら、マウスは、遺伝的に修飾されていない同属種よりも多くの食物を消費する。
【００２４】
ストレスは、拒食症の出現に寄与し、過食症を伴い、かつ乱用薬物への感受性を増大させるので、発明者は、５−ＨＴ４受容体のリガンドが、これらの疾患の発現を緩和し得ることを提案した（ストレスに関連した、又は関連しない拒食症、過食症、乱用薬物嗜癖）。
【００２５】
本発明において、「５−ＨＴ４受容体」とは、５−ＨＴ４Ａ、５−ＨＴ４Ｂ、５−ＨＴ４Ｃ、５−ＨＴ４Ｄ、５−ＨＴ４Ｅ、５−ＨＴ４Ｆ、５−ＨＴ４Ｇ、５−ＨＴ４ＢＨ、及び５−ＨＴ４Ｎ受容体のような、５−ＨＴ４受容体のサブタイプ（又はスプライシングバリアント）のいずれかを意味する。
【００２６】
従って、本発明は、強迫行動に関連する疾患又は肥満を治療及び／又は予防するための薬剤調製用の、５−ＨＴ４受容体のリガンド又はこのリガンドの医薬的に許容可能な塩の使用に関する。
【００２７】
「強迫行動に関連する疾患」とは、食物障害を関与させる疾患、及び特にはストレスに関連した、又は関連しない拒食症、過食症、乱用薬物嗜癖を意味する。
【００２８】
強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満を治療及び／又は予防するための薬剤を調製するために、本発明の枠内で使用される５−ＨＴ４受容体のリガンドは、好ましくは５−ＨＴ３受容体のリガンドでなく、５−ＨＴ４受容体に特異的なリガンドである。
【００２９】
発明者は、５−ＨＴ４受容体が、ストレスの拒食症誘発性効果に関与することを明らかにしたので、この受容体の作動薬使用により、過食症を治療及び／又は予防するための薬剤を調製することが可能になり、他方でこの受容体の拮抗薬又は逆作動薬が、拒食症及び乱用薬物嗜癖からなる群から選択される強迫行動に関連する疾患を治療及び／又は予防するための薬剤を調製することに役立つことは、当業者にとって容易に理解できる。
【００３０】
本発明の枠内において：
−作動薬とは：内因性伝達物質に類似した生物学的応答を、その受容体への結合によって発生させることが可能なあらゆる分子を意味する。
−拮抗薬とは：作動薬の作用を遮断することが可能なあらゆる分子を意味する。
−逆作動薬とは：受容体の固有（又は基礎）活性を阻害することが可能なあらゆる分子を意味する。
【００３１】
公知の、又はまだ同定されない、５−ＨＴ４受容体に特異的な全ての作動薬、全ての逆作動薬及び全ての拮抗薬は、本発明の実施において使用される可能性がある。
【００３２】
Ｂｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）は、５−ＨＴ４受容体作動薬及び拮抗薬の化学構造を記載した。記載された作動薬は、６つの化学分類に属し、インドール、ベンズアミド、安息香酸、アリール−ケトン、ベンズイミダゾロン及び１，８−ナフタルイミドがそれである。記載された拮抗薬は、５つの化学分類に属し、インドールカルボキシレート、イミダゾールピリジン、安息香酸、アリール−ケトン、ベンズイミダゾロン及び１，８−ナフタルイミドがそれである。これらの作動薬及び拮抗薬は、本発明の枠内で使用可能である。Ｃｌａｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）及びＪｏｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に記載された逆作動薬も、同様に本発明の枠内で使用可能である。
【００３３】
更に、ＷＯ９７／２９７３９号及びＷＯ０２／１１７６６号で公開された国際特許出願、及びＷＯ０２／３６１１３号で公開された国際特許出願は、同様に本発明の枠内で使用可能である、５−ＨＴ４受容体の拮抗薬及び作動薬をそれぞれ記載している。
【００３４】
本発明の枠内で使用可能である作動薬は、メトクロプラミド、ＨＴＦ  ９１９（３−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イルメチレン）−Ｎ−ペンチルカルバズイミドアミド水素マレイン酸塩）、ＬＳ  ６５０１５５、ＢＲＬ  ２０６２７、ＢＲＬ  ２４６８２、ＢＲＬ  ２４９２４、シサプリド（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）、ＭＬ  １０３５（４−アミノ−５−クロロ−２−［２−（メチルスルフィニル）−エトキシ］−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−ベンズアミド塩酸塩）、モサプリド（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）、Ｒ０７６１８６、レンザプリド、ＲＳ  ６７５０６（１−（４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシフェニル）−３−［１−（２−メチルスルホニルアミノ）エチル−４−ピペリジニル］−１−プロパノン塩酸塩）、シニタプリド、ＳＢ  ２０５１４９、ＳＣ  ４９５１８（Ｎ−［エキソ−（ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロリジン−１−イル）メチル］−２−メトキシ−４−アミノ−５−クロロベンズアミド  ＨＣｌ）、ＳＣ  ５２４９１、ＳＣ  ５３１１６（４−アミノ−５−クロロ−Ｎ−［（ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロリジン−１−イル）メチル］２−メトキシベンズアミド）、ＳＤＺ  ２１６４５４、ＴＫＳ  １５９（４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシ−Ｎ−［（２Ｓ，４Ｓ）−１−エチル−２−ヒドロキシメチル−４−ピロリジニル］ベンズアミド）、Ｙ  ３４９５９、ＹＭ  ０９１５１（Ｎ−（１−ベンジル−２−メチルピロリジン−３−イル）−５−クロロ−２−メトキシ−４−メチルアミノゼンズアミド、ＹＭ  ４７８１３、ザコプリド（４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシ−Ｎ−（１−アザビシクロ［２．２．２］オクト−３−イルベンズアミド）、ＭＬ  １０３０２（２−ピペリジノエチル  ４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシ安息香酸塩）、ＲＳ  ５７６３９、ＳＲ  ５９７６８（２−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピペリジノ］エチル４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシ安息香酸塩）、ＡＤＲ  ９３２、プルカロプリド（Ｒ０９３８７７；４−アミノ−５−クロロ−２，３−ジヒドロ−Ｎ−［１−（３−メトキシプロピル）−４−ピペリジニル］−７−ベンゾフランカルボキサミド一塩酸塩）、ＳＫ  ９５１、ＲＳ  ６７３３３（１−（４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシフェニル）−３−（１−ｎ−ｂｕｔｙｌ−４−ピペリジニル）−１−プロパノン）、ＲＳ  １７０１７、ＲＳ  ５６５３２、ＹＭ  ５３３８９、ＢＩＭＵ１（３−エチル−２，３−ジヒドロ−Ｎ−［エンド−８−メチル−８−アザビシクロ（３．２．１）オクト−３−イル］−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−カルボキサミド）、ＢＩＭＵ８（エンド−Ｎ−８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，３−デヒドロ−２−オキソ−３−（プロプ−２−イル）−１Ｈ−ベンズイミド−アゾール−１−カルボキサミド）、ＤＡＵ  ６２１５（（３−アルファ−トロパニル）１Ｈ−ベンズイミダゾロン−３−カルボキサミド塩化物）、ＤＡＵ  ６２３６、５−メトキシトリプタミン、２−メチルセロトニン及び５−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジ−メチルトリプタミン及び５−カルボキサミドトリプタミンを含む群から選択される。
【００３５】
本発明の枠内で使用可能な拮抗薬は、好適には、トロピセトロン（ＩＣＳ  ２０５９３０；［（３ａトロパニル）−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸エステル］）、ＲＳ  １００２３５（１−（８−アミノ−７−クロロ−１，４−ベンゾジオキサン−５−イル）−３−［［３，４−ジメトキシフェニル）プロプ−１−イル］ピペリジン−４−イル］プロパン−１−オン）、ＲＳ  ３９６０６、Ａ−８５３８０（３−（２（Ｓ）−アゼチジニルメトキシ）ピリジン）、ＧＲ  １１３８０８（１−［２−［（メチルスルホニル）アミノ］エチル］−４−ピペリジニル］メチル  １−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸塩）、ＧＲ  １２５４８７（１−［（２−［（メチルスルホニル）アミノ］エチル］−４−ピペリジニル］メチル  ５−フルオロ−２−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸塩）、ＧＲ  １３８８９７（［１−［２−［（メチルスルホニル）アミノ］エチル］−４−ピペリジニル］メチル［（２−（３−メチル−１，２，４−オキサジアゾル−５−イル）フェニル］カルバミン酸塩、ＳＢ  ２０３１８６（１−ピペリジニル）エチル  １Ｈ−インドール  ３−カルボン酸塩）、ＳＤＺ  ２０５５５７  ２−メトキシ−４−アミノ−５−クロロ安息香酸  ２−（ジエチルアミノ）エチルエステル、塩酸塩、ＬＹ  ３５３４３３  （１，（１−メチルエチル）−Ｎ−（２−（４−（（トリシクロ［（２−（３．３．１．１３，７］デカ−１−イルカルボニル）アミノ）−１−ピペリジニル）エチル）−１Ｈ−インダゾール−３−カルボキサミド）、ＬＹ  ２９７５８２、ＲＳ２３５９７（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル−４−アミノ−クロロ−２−メトキシ安息香酸塩酸塩、ＳＢ  ２０４０７０（１−ブチル−４−ピペリジル）メチル  ８−アミノ−７−クロロ１，４−ベンゾジオキサン−５−カルボン酸塩）、ＤＡＵ  ６２８５｛（エンド−６−メトキシ−８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１  カルボン酸塩酸塩｝、ＳＣ  ５３６０６（１−Ｓ，８−Ｓ）−Ｎ−［（ヘキサヒドロ−１Ｈ−ピロリジン−１−イル）メチル］−６−クロロイミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−８−カルボキサミド塩酸塩）、ＳＣ  ５６１８４、ＲＳ  ６７５３２（１−（４−アミノ−５−クロロ−２−（３，５−ジメトキシベンジロキシフェニル）−５−（１−ピペリジニル）−１−ペンタノン）、ＧＲ  １２５４８７（１−［２（メチルスルホニル）アミノ］エチル］−４−ピペリジニル］メチル−５−フルオロ−２−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−カルボン酸塩酸塩）、ＳＢ  ２０７０５８、ＳＢ  ２０７２６６（Ｎ−［（１−ｎブチル−４−ピペリジニル）メチル］−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３］オキサジノ［３，２−ａ］インドール−１０−カルボキサミド）、ＲＳ  ３９６０４（１−［４−アミノ−５−クロロ−２−（３，５−ジメトキシフェニル）メチルオキシ］−３−［１［２−メチルスルホニルアミノ］エチル］ピペリジン−４−イル］プロパン−１−オン）、ＲＳ  １００３００２（Ｎ−（２−（４−（３−（８−アミノ−７−クロロ−２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−５−イル）−３−オキ��プロピル）ピペリジン−１−イル）エチル）−メタンスルホンアミド）、ＭＬ  １０３７５（２−（ｃｉｓ−３，５−ジメチルピペリジノ）エチル  ４−アミノ−５−クロロ−２−メトキシ安息香酸塩）、ＳＢ  ２０７７１０（１−ブチル−４−ピペリジニル）メチル−８−アミノ−７−ヨード−１，４−ベンゾジオキサン−５−カルボン酸塩）、ＳＢ  ２０５８００（Ｎ−（１−ブチル−４−ピペリジル）メチル−８−アミノ−７−クロロ−１，４−ベンゾジオキサン−５−カルボキサミド）、Ｎ  ３３８９、ＦＫ  １０５２及びＲ  ５０５９５を含む群から選択される。
【００３６】
本発明の枠内で使用可能な逆作動薬は、ＲＯ  １１６−２６１７、ＲＯ  １１６−００８６及びＲＯ  １１６−１１４８を含む群から選択される。
【００３７】
強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満の治療及び／又は予防において有効な、５−ＨＴ４受容体のリガンド又はこのリガンドの医薬的に許容可能な塩の量は、この障害の性質によって決まり、かつ標準的な実験及び臨床技術によって決定され得る。更に、インビトロテストは、最適分量範囲を同定するために、任意に使用され得る。有効量は、インビトロテストシステム又は動物モデルに対して得られる用量反応曲線から推定され得る。
【００３８】
５−ＨＴ４受容体のリガンドを含む、強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満を治療及び／又は予防するための医薬組成物は、標準的な医薬実務を踏まえて調製される。これらの医薬組成物は、非経口、経口、直腸、経鼻、経皮、肺、中枢又は全身投与に適した形状を呈する。
【００３９】
これらの医薬組成物は、５−ＨＴ４受容体のリガンド又はこのリガンドの医薬的に許容可能な塩に加えて、投与方法及び投与形状に応じて選択される、少なくとも１種の医薬的に許容可能なビヒクルを含む。
【００４０】
第２の実施形において、本発明は、強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満、および特には、疾患が５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子における１つ又は幾つかの突然変異によって引き起こされるという場合での強迫行動に関連する疾患を治療又は予防するための「野生」５−ＨＴ４受容体の、脳の標的領域における復元に関する。
【００４１】
従って、本発明は、強迫行動に関連する疾患を治療及び／又は予防するための薬剤を調製するための、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸の使用に関する。
【００４２】
「機能的５−ＨＴ４受容体」とは、正常な薬理学特性を有する野生５−ＨＴ４受容体を意味する。
【００４３】
「機能的に同等な受容体」とは、アミノ酸配列が、５−ＨＴ４受容体のそれと近く（少なくとも９０％同一、かつ好ましくは少なくとも９５％同一）、かつ野生５−ＨＴ４受容体と同じ作動薬により、かつ同じ強度で活性化される受容体を意味する。
【００４４】
機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸分子は、好適には、哺乳動物の５−ＨＴ４受容体をコードする分子であり、及び特にはヒト５−ＨＴ４受容体をコードする分子である。これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋで次の番号で得ることができる：
−ヒトに関して：Ｙ０９５８６（５−ＨＴ４Ａ）、Ｙ１０４３７（５−ＨＴ４Ｂ）、Ｙ１２５０６（５−ＨＴ４Ｃ）、Ｙ１５５０７（５−ＨＴ４Ｄ）、ＡＪ０１１３７１（５−ＨＴ４Ｇ）；
−マウスに関して：Ｙ０９５８７（５−ＨＴ４Ａ）、Ｙ０９５８５（５−ＨＴ４Ｂ）、Ｙ０９５８８（５−ＨＴ４Ｅ）、ＡＪ０１１３７０（５−ＨＴ４Ｆ）；
−ラットに関して：Ｕ２０９０６（５−ＨＴ４Ａ）、０２０９０７（５−ＨＴ４Ｂ）、及びＡＪ０１１３７１（５−ＨＴ４Ｅ）；
−テンジクネズミに関して：Ｙ１３５８５（５−ＨＴ４Ｂ）。
【００４５】
遺伝コード変質のために、実質的に同じアミノ酸をコードする核酸の他の配列が、本発明の枠内において使用され得る。これらの配列は、例として、かつ網羅的でなく、沈黙突然変異を生じさせるように、１つ又は幾つかのコドンのレベルで修飾された５−ＨＴ４受容体をコードする核酸の全部又は一部を含むヌクレオチド配列である。本発明の枠内で使用可能な核酸配列は、先行技術において公知である様々な方法によって、例えば逆転写後に５−ＨＴ４受容体のｍＲＮＡから得られるｃＤＮＡを経由して得ることができる。
【００４６】
好適には、側坐核、扁桃、海馬及び視床下部は、５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の発現を同時に修復すること、及びその欠如に関連する食物摂取の調節に対する欠陥を除去することが検討される脳構造である。この遺伝子の発現回復の結果の、分子及び細胞（例えば、内因性モノアミン率、セロトニン作動性ニューロン活性）、及び行動欠陥の同時修復のみにより、分子及び行動表現型の間の因果関係の妥当性を確かめることが可能になる。
【００４７】
好適には、側坐核、扁桃、海馬及び視床下部における機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を発現させるために、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸分子を含む非ウイルス又はウイルスベクターのような、転移ベクターの使用を検討することができる。
【００４８】
本発明の枠内で使用可能なウイルスベクターの中で、２型アデノウイルスに関連したウイルス、様々な偽型を有するレンチウイルスから生じたベクター、ネコの免疫不全ウイルスから生じたベクター、及び「泡沫状ウイルス」から生じたベクター等を挙げることができる。本発明の枠内で使用されるウイルスベクターは、あらゆる病原及び／又は有害効果を免れている。
【００４９】
前記ベクター内に含まれる機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸分子の発現は、好適には、標的組織に応じて、適切なプロモーターの制御下に置かれる。側坐核、扁桃、海馬及び／又は視床下部における機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体の発現に関して、好適には使用されるプロモーターは、側坐核に関してドーパミンを捕獲する輸送体をコードする遺伝子のプロモーターであっても良い。
【００５０】
第３の実施形において、本発明は、強迫行動に関連する疾患及び／又は肥満の治療及び／又は予防で使用される可能性がある生物活性を有する化合物、及び特には強迫行動に関連する疾患の治療及び／又は予防に関して生物活性を有する化合物を同定する方法であって、次のステップ：
ａ）生物活性を有する前記化合物と、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を接触させること、及び
ｂ）生物活性を有する前記化合物が、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体の基礎活性を変調することが可能であるか決定すること、を含むことを特徴とする方法に関する。
【００５１】
「生物活性を有する化合物」とは、投与後に、強迫行動に関連する疾患の症状を緩和することが可能な、あらゆる天然又は合成化合物を意味する。
【００５２】
本発明の対象である方法のステップ（ａ）は、最初に次のステップ：
ｉ）機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を発現する細胞を培養すること、及び
ｉｉ）生物活性を有する前記化合物による前記細胞のインキュベーション、を含み得る。
【００５３】
用語「機能的５−ＨＴ４受容体」及び「機能的に同等な受容体」は、先に定義された通りである。
【００５４】
好適には、本発明の対象である方法のステップ（ｉ）で培養された細胞は、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を表面に過剰発現させる細胞である。機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を表面に過剰発現させることが可能なあらゆる細胞は、本発明の枠内で使用可能である。例として、かつ網羅的でなくヒト胚細胞ＨＥＫ  ２９３が挙げられ得る。
【００５５】
機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸分子又はベクターは、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を過剰発現させる細胞を形質転換するために使用され得る。
【００５６】
機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を過剰発現させる細胞を形質転換するために、本発明の枠内で使用され得るベクターは、以上に記載したような、好適には細胞宿主中の前記受容体の発現又は生成方法に適した制御配列に関連した、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする、少なくとも１種の核酸分子を含む。使用されるベクターは、それが転移されるべきである宿主（培養細胞）に応じて選択される；プラスミドのような、あらゆるベクターのことであり得る。細胞宿主中の受容体の生成又は発現と全く同じように、これらベクターの調製は、当業者に周知である分子生物学及び遺伝子工学のあらゆる技術によって実行され得る。
【００５７】
受容体の基礎活性を変調することが可能な化合物は、前記受容体の作動薬か、逆作動薬か、拮抗薬である。受容体への作動薬、逆作動薬、又は拮抗薬の結合は、この受容体の立体配座の変更を引き起こし、かつ細胞中で第２メッセンジャーを介した信号の形質導入が観察される。従って、本発明の対象である方法のステップ（ｂ）の目的は、受容体及び生物活性を有する化合物の間の親和力を、それらを接触させた後に、あらゆる適切な方法によって測定することからなる。
【００５８】
好適には、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体の基礎活性の変ｈ工は、５−ＨＴ４受容体からの信号の形質導入の（作動薬に関して）活性化、又は（拮抗薬、又は逆作動薬に関して）阻害を経由して測定され得る。この受容体からの信号の形質導入の際に誘発される事象カスケードを知る当業者は、例えば、機能的に活性である化合物と接触させる前及び後でｃＡＭＰ量を測定して、５−ＨＴ４受容体からの信号の形質導入の活性化、又は阻害を測定するために適した方法及び条件を決定することが可能であろう。
【００５９】
本発明の対象の方法の第２の実施形において、ステップ（ａ）及び（ｂ）は、１つ又は幾つかの５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を１つ又は幾つかの膜に固定して行われ得る。５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体は、同様にバイオセンサー中に加えられ得る。かかるシステムにおいて、テストする化合物及び受容体の間の相互作用をリアルタイムで視覚化することが可能である。受容体／リガンド対のパートナーの１つは、脂肪鎖によって覆われたマトリックスを含み得る界面に固定される。この疎水性マトリックスは、接触して注射されるリポソームの自発溶解により、脂質層で容易に被覆され得る。その場合、リポソーム中に挿入される５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体は、バイオセンサー中に加えられ得る。その場合、生物活性を有する化合物は、１つ又は幾つかの５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体に対して分析される。バイオセンサーの技術により、結合の親和力を測定することが更に可能になる。
【００６０】
本発明は、先に定義したような、５−ＨＴ４受容体の有効量のリガンド、又は先に定義したような、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸を投与することからなる、強迫行動に関連する疾患を治療及び／又は予防する方法にも同様に関する。
【００６１】
出願人が得た結果により、５−ＨＴ４受容体が、レプチン率を制御し、かつ従って肥満の制御に介在し得ることを明らかにすることが可能になった。実際、この作業により、５−ＨＴ４受容体の欠如が、レプチン率の減少を誘発することが証明された。肥満は、月齢６ヶ月を超え、かつ従って以下の実験の部で使用されるマウスよりも年長である５−ＨＴ４受容体を失った突然変異マウスにおいて観察されたので、肥満におけるこの関与は、可能である。
【００６２】
従って、本発明は、肥満の治療及び／又は予防のための医薬組成物を調製するための、先に定義したような５−ＨＴ４受容体のリガンド、及び特には、先に定義したような５−ＨＴ４受容体の作動薬の使用に関する。強迫行動の治療及び／又は予防のための医薬組成物に関して検討した全ての実施形は、肥満の治療及び／又は予防に適用される。
【００６３】
本発明の特殊な実施形において、本発明は、疾患が５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子における１つ又は幾つかの突然変異によって引き起こされるという場合での肥満を治療又は予防するための「野生」５−ＨＴ４受容体の、脳の標的領域における復元に関する。
【００６４】
従って、本発明は、肥満を治療及び／又は予防するための薬剤を調製するための、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸の使用に関する。以上に検討された様々な実施形（哺乳動物の５−ＨＴ４受容体、ヒト５−ＨＴ４受容体、ウイルス又は非ウイルス転移ベクター等）は、肥満の治療及び／又は予防にも同様に適用される。
【００６５】
このように、本発明は、先に定義したような、５−ＨＴ４受容体の有効量のリガンド、及び特には作動薬、又は先に定義したような、機能的５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体をコードする核酸を投与することからなる、肥満を治療及び／又は予防する方法を提案する。
【００６６】
本発明は、肥満の治療及び／又は予防で使用される可能性がある生物活性を有する化合物、及び特には肥満の治療及び／又は予防に関して生物活性を有する化合物を同定する方法であって、次のステップ：
ａ）生物活性を有する前記化合物と、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体を接触させること、及び
ｂ）生物活性を有する前記化合物が、５−ＨＴ４受容体、又は機能的に同等な受容体の基礎活性を変調することが可能であるか決定すること、を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６７】
強迫行動に関連する疾病の治療及び／又は予防における生物活性を有する分子の同定の枠内で記載された実施は、肥満の治療及び／又は予防における生物活性を有する分子の同定に必要な変更を加えて適用される。出願人によって得られた結果を考慮すれば、肥満の治療及び／又は予防における活性分子が、５−ＨＴ４受容体の作動薬として機能べきであろうことは当業者にとって明白である。
【００６８】
本発明のその他の利点及び特徴は、セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウス及び野生マウスの比較研究に関し、かつ添付図面を参照する以下に続く実施例から現れるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
Ｉ．材料及び方法。
Ｉ．１．セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスの生成。
ａ．原則。
形質転換生成が、一般原理であり、かつ生体における対象となる遺伝子の発現修飾からなる。マウスにおいて、修飾は、３つの連続するステップを必要とする（図１）。第１のステップは、多数の分子生物学技術の使用を必要とする。それは、対象となる遺伝子の欠失又は挿入の結果生じるゲノム構造の獲得、又はある種の窒化塩基の定方向突然変異誘発による修飾からなる。第２のステップは、全能マウス胚細胞（「胚幹細胞」又はＥＳ）におけるゲノム構造のトランスフェクションによる胚細胞のトランスフェクションを必要とする。突然変異遺伝子のそのゲノムへの挿入は、無作為の相同組み換えによって、かつ安定して行われる。その場合、抵抗性遺伝子は、ゲノム構造作成の際に予め挿入されるので、組み換えクローンは、抗生物質（Ｇ４１８又はネオマイシン）の使用によって選択される。最後のステップは、芽細胞中への陽性クローン注射である（図２）。
【００７０】
ｂ．突然変異マウスにおける５−ＨＴ４受容体欠如の確認。
突然変異マウスにおいて５−ＨＴ４受容体欠如を確認するために、以前に記載されたように（Ｃｏｍｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）、野生、ヘテロ接合及び突然変異動物の脳切片からのＸ線撮影技術が使用された。５−ＨＴ４受容体の結合部位は、選択性放射性リガンド、５−ＨＴ４受容体の拮抗薬である、［３Ｈ］ＧＲ１１３８０８（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によってマーキングされた。
【００７１】
すでにラットにおいて観察されたように（Ｗａｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｃｏｍｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）、野生マウスにおいて、［３Ｈ］ＧＲ１１３８０８によってマーキングされた結合部位の不均質分布は、基底核、辺縁系又は海馬形成において観察された。突然変異マウスにおいては、いかなる特異的マーキングも検出されなかった。マーキングされた結合部位の密度は、野生マウスと比較して、ヘテロ接合マウスにおいて分析された脳構造全体で、減少した（表１）。
【００７２】
【表１】
2006520319.tif 000003
【００７３】
予め同定されたマウスの遺伝子型も、連鎖反応重合技術（「タッチダウンプロトコール  ＰＣＲ」）の使用によって確認された。全てのテストする動物は、ヘテロ接合の番から生まれており、かつ月齢４〜６ヶ月である。我々は、３年の期間で１８％の突然変異マウスを得た。我々は、メンデルの法則に従わないこの比の値に対する解釈を未だ有していない（表２）。
【００７４】
【表２】
2006520319.tif 000004
【００７５】
５−ＨＴ４受容体を失ったマウスは、その短期間の発育に対して野生マウスよりも体重増加が著しく高い点を除き、目立った障害もなく発育する（図３）。月齢４〜６ヶ月のマウスにおいて、体重のいかなる有意差も検出されなかった（図示せず）。ニューロン系の古典的な適応メカニズムは、発育中に現れ得るので、異例の状況が、成体期間中の食物消費障害を誘発し得るという仮説が、発明者によって表明された。
【００７６】
Ｉ．２．行動テスト。
従って、野生動物と比較した突然変異マウスの食物消費及び体重増加が、拒食症誘発性ストレスを構成することとして知られる、拘束（強制固定化）テストの使用後に測定された。同様に、食物摂取が、葛藤テスト：一段高くした十字の迷路及び「オープンフィールド」、の使用後に算定された。これら２つの実験テストにおいて、齧歯目は、新規環境を探検する動機及び開放及び／又は一段高くした空間の恐怖の間で葛藤に直面する。
【００７７】
ａ．動物。
野生及び突然変異動物は、Ｓｖ  １２９／Ｔｅｒ系統（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）から生じ、かつ２つの遺伝子型間の同じ遺伝的素因を保存するために、５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の突然変異のためにヘテロ接合（＋／−）マウスの交配から生まれた。動物は、標準照明条件で、２２℃の制御され、かつ一定の温度及び湿度で、かつ５５％の相対湿度で飼育され、かつ操作される。昼／夜サイクル（１２／１２時間）は、人工的に維持された。栄養物は、円筒形コイン型形状を有する（２３％のタンパク質；３．５％の粗脂肪；３％の粗セルロース；７．５％の粗灰分；１２％の含水量）。マウスの遺伝子型は、連鎖重合反応技術（「ポリメラーゼ連鎖反応」又はＰＣＲ）の使用によって同定される。全ての実験は、平均して月齢４〜６ヶ月の動物によって行われた。
【００７８】
ｂ．食物摂取の算定。
拘束テスト後。我々の各実験は、３つの段階に分割された：順応期間（７日）、拘束ストレスの日（１１０分間の固定化）及び回復ステップ（１０日）である。マウスは、基準及び拘束グループに分割された。ストレスの日、野生及び５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスは、ＮａＣｌ  ９％、５−ＨＴ４受容体の拮抗薬である、１ｍｇ／ｋｇのＲＳ  ３９６０４の注射を受ける。並行して、マウスの１グループは、いかなる処置も受けず、かつ先のマウスのように、体重を計量され、かつ操作開始後１０分に、必要な場合に固定化される。その場合食物消費は、回復期間中、２時間３０分、３及び５時間並びに毎日測定される。
【００７９】
３時間の隔離（手順１）後。動物は、無制限の栄養物及び水の存在下で檻に隔離される。栄養物の重量及び動物の体重は、隔離前及び３時間後に算定される。連続した２回の計量の間の差は、マウスによって摂取された栄養物の量を示す。檻の地面は、格子が張られているので、各動物によって浪費された栄養物の量を算定することが可能であった。
【００８０】
一段高くした十字の迷路（手順２：中程度ストレス）後。同じ動物が、収容室での１週間、檻によって４つに再編成される。実験の日、３０分の期間後に、動物は、一段高くした十字の迷路に置かれ、次にテスト開始後３時間に栄養物の消費を算定するために隔離される。
【００８１】
切開が先行する、一段高くした十字の迷路（手順３：重度ストレス）後。順応期間中、各マウスは、４日間（９６時間）、無制限に供給される栄養物及び水の存在下で隔離される。マウスの体重及び消費された食物の重量が、基線を確立するために、同じ時刻に毎日測定される。４日目に、尻尾の小型の切開が行われる。次に注射及び葛藤テスト前の血漿コルチコステロン率を分析するために、採血が１０分間行われる。一段高くした十字の迷路も、コルチコステロン率の増加を誘発するので、ストレス誘導物質になる（Ｒｏｄｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。切開は、テスト室と異なる部屋で行われ、この作業前には、尻尾切開及び固定化以外にあらゆるストレスを回避するためのあらゆる有効な予防策が取られた。得られた血液試料は、１００００回転／分で１０分間遠心分離され、かつ血漿は、後で定量されるまで−８０℃で貯蔵される。コルチコステロンは、放射免疫測定技術（ＩＣＮ  Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）の使用により定量される。一旦採取が終了すると、動物は、実験室に置かれる。
【００８２】
５日目に動物は、９でＮａＣｌの腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を受ける。注射は、一段高くした十字の迷路にマウスを置く１０分前になされる。動物は、ＮａＣｌにより処置される野生（ｎ＝８）及びＮａＣｌの注射を同様に受ける突然変異（ｎ＝１２）マウスの２つの実験グループに分割される。マウスは、注射の１０分後に一段高くした十字の迷路の中央に置かれる。尻尾の小型の切開が、テスト後３０分に改めて行われ、その時にコルチコステロン率は、最大に達し、かつ４時間高い状態にとどまる（Ｎａｔｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７）。テストに続き、食物摂取の２つの連続した算定が、テスト開始３時間後に行われる。
【００８３】
「オープンフィールド」後。「オープンフィールド」に直面することを開始した３時間後に食物摂取を算定するために、我々は、手順２の場合と同様に手続きを行った。その上、我々は、手順２及び３の１ヵ月後、マウスの運動活動を算定した。
【００８４】
薬物投与後。野生及び５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスを処置するために使用される各薬物は、ＮａＣｌ（０．９％）の塩水中で即時に希釈され、かつ全身注射された（ｉ．ｐ．）。各処置の注射量は、３０ｇに対して２００μＬである。野生又は５−ＨＴ４受容体に関して無効にされたマウス（ｎ＝３５）は、次の処置を受けた：ＮａＣｌ、ＭＤＭＡ（又は「エクスタシー」又は３，４−Ｎ−メチレンジオキシメタンフェタミン、ＳＩＧＭＡ、１０ｍｇ／ｋｇ）、ＲＳ  ３９６０４、ＲＳ  １０２２２１／ＭＤＭＡ。
【００８５】
ＭＤＭＡ（１０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ、使用免許９９００４３１  Ｓ、Ｖ．Ｃｏｍｐａｎ）及び５−ＨＴ４受容体の拮抗薬、ＲＳ  ３９６０４（０．５ｍｇ／ｋｇ）は、野生又は５−ＨＴ４受容体を失ったマウス（遺伝子型及び薬理学的生成物当たり、ｎ＝１２−１７）において、単独で、又は組み合わされた処置で投与された。ＲＳ  ３９６０４に関して０．５ｍｇ／ｋｇの分量が、選択された。なぜならば、その投与が、無制限に食料を与えた野生マウスにおいて、食物摂取の増加を誘発し、ＮａＣｌ又は様々な分量のＲＳ  ３９６０４（０．０１；０．１；１及び１０ｍｇ／ｋｇ；図示せず）により処置されたマウスの比較で、５−ＨＴ４受容体に関する突然変異動物において、効果がない状態にとどまる。
【００８６】
野生マウス及び５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスの食物摂取は、Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８によって記載された実験手順に従って算定された。異なるマウスが、無制限に供給される栄養物及び水の存在下で、３日間の順応期間中に隔離され、その期間中にマウスの体重及び消費された食物が、毎日同じ時刻に測定される。４日目に、マウスは、２４時間、その栄養物を喪失した。食物摂取に関する様々な処置の効果を決定するために、栄養物喪失期間後に、ＮａＣｌのように薬物が、注射される。栄養物は、他の処置のための１０分の間隔後に、各檻に再導入される。次に３回の連続した栄養物計量が、栄養物の再導入後３０分、１時間及び３時間に行われる。
【００８７】
ｃ．葛藤テスト。
一段高くした十字の迷路は、直角（９０°）に沿って固定される長方形の２つの領域（Ｌ：５７ｃｍ、ｌ：５ｃｍ）から構成される。２つの領域の一方は、高さ１５ｃｍの壁を有し、かつ「閉鎖アーム」と名付けられる。壁を有さない他方の領域は、「開放アーム」と呼ばれる。この装置は、地面の上３０ｃｍの高さで台座に置かれる。実験室中の３０分の順応期間後に、各動物は、２つの領域の交差点に置かれ、かつ実験者が居合わせずに５分間撮影される。データ分析は、マウスが開放又は閉鎖アームに入った数及び過ごした時間、中央で過ごした時間、及び動物が開放アームにいる時に地面に頭部を傾けた（「ヘッドディップ」）回数の算定からなる。テスト中に置かれると、マウスは、新規環境の探検及び開放空間及び高さの恐怖の間で葛藤に直面する。因子分析により、一方は、不安に関連し、かつ他方は、運動活動に関連する（Ｂｒｕｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）２つのタイプの行動を明らかにされる。マウスは、夜行性動物であるので、不安な動物が、閉鎖アーム中にしばしば戻り、かつ長期間とどまり、かつ開放アームに関しては逆であることが、一般に認められる。
【００８８】
「オープンフィールド」は、壁が３０ｃｍの高さである４３．２×４３．２ｃｍの領域である。赤外線センサが、互いに１．５ｃｍの距離で４辺に配置され、このようにしてマウスの身長に適応する。走行距離の記録は、動物が実験装置の中央に置かれる瞬間から３０分間、ソフトウェア（ＭＥＤ、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ）によって行われる。この手順は、続けて３日反復される。このように、この新規環境へのマウスの順応能力を算定することが、可能である。実験者は、記録中に実験室に居合わせない。赤外線の碁盤の目により、幾つかの変数の微妙な分析を行うことが可能になる。
【００８９】
ＩＩ．結果。
ＩＩ．１．拒食症誘発性ストレス：拘束ストレス又は強制固定化に対する、５−ＨＴ４受容体を失ったマウスの低感受性。
拒食症研究の実験モデルとして提案された（Ｒｙｂｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）、拘束ストレスは、ストレス後に食物を消費しない、５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスの抵抗限界をテストするために使用された。食物摂取及び体重増加の変動は、８日間の順応期間中及び１０日間の回復期間中に測定された（図４）。
【００９０】
８日間の隔離期間（順応期間）中、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスの食物摂取は、野生マウスのそれと異ならなかった。順応期間中のその体重増加の変動は、遺伝子型及び時間の間の有意相互作用が示すように、野生動物のそれよりも低かった（Ｆ１．３６０＝２．４５；ｐ＜０．０５）。換言すれば、突然変異マウスの体重増加のいかなる有意変動も、検出されなかった（Ｆ３９．１８６＝０．９４）が、他方で、野生マウスにおいては、増大した（Ｆ２９．１７４＝４．４５；ｐ＜０．００１）。８日目に固定化されるように又はされないようにプログラムされた、同じ遺伝子型の２つの動物グループの間の体重増加の変化又は食物摂取は、著しく異ならなかった（図４ａ、ｂ）。
【００９１】
拘束ストレス後に、統計分析（Ａｎｏｖａ反復測定）は、時間中の食物摂取に対するストレスの有意効果（Ｆ９．５６７＝１３．９９；ｐ＜０．０００１）及び遺伝子型×時間の有意相互作用（Ｆ９．５４９＝２．２；ｐ＜０．０５）を示した。分析（「二方向」Ａｎｏｖａ）も、食物摂取の低下を誘発する拘束ストレスの能力が、ストレスに続く最初の２４時間に遺伝子型によって決まること（Ｆ１．６１＝６．７３；ｐ＜０．０５）を同様に示した。食物消費は、ストレスを加えられない同じ遺伝子型のマウスと比較して、野生マウスにおいて著しく減少し（−３６．４％、図４ａ）、かつ突然変異マウスにおいてごく僅かな傾向にあった（−１９．６％、図４ｂ）。最も詳細な分析は、５−ＨＴ４受容体を失ったマウスが、固定化後２４時間に、野生マウスよりも多くの食物を著しく消費したことを示した（＋２４％、ｐ＜０．０５）。４８時間後、野生マウスのみが、対照動物に対して少ない食物を依然として消費する（−１６．４％、図４ａ）。突然変異マウスの食物摂取に対するストレスのいかなる有意効果も、強制固定化の４８時間後に検出されなかった（図４ｂ）。
【００９２】
並行して、統計分析（Ａｎｏｖａ反復測定）は、時間中の体重増加の変動に対するストレスの有意効果（Ｆ９．５２２＝１１．３３；ｐ＜０．０００１）及び遺伝子型×時間の有意相互作用（Ｆ９．５２２＝２．３８；ｐ＜０．０５）を示した。統計分析（Ａｎｏｖａ反復測定）は、拘束ストレスが、野生マウスにおいて体重増加の著しい低下を誘発した（Ｆ１．２５２＝５．７６、ｐ＜０．０５、図４ｃ）が、受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスにおいては誘発しなかった（Ｆ１．２７０＝０．０１４、図４ｄ）ことを示した。詳細な統計分析は、ストレスが、対照マウスと比較して、回復期間の最初の４日に野生マウスにおいて体重増加の低下をもたらしたことを示した（図４ｃ）。反対に、拘束ストレスは、体重増加が安定した状態にとどまり、かつ固定化後２４時間中にストレスを加えられた同属種と比較してより低いので、５−ＨＴ４受容体の不在下でごく僅かな効率を有した（図４ｄ）。
【００９３】
更に、出願人の結果は、拘束ストレスが、野生雌の強制固定化後に、５−ＨＴ４受容体の拮抗薬である、ＲＳ３９６０４注射に先行されるならば、野生マウスの食物摂取が、変更されないことを示した（図示せず）。換言すれば、５−ＨＴ４受容体の薬理学的不活性化は、拘束ストレスの拒食症誘発性効果を除去した。並行して、ＲＳ３９６０４投与は、ＮａＣｌによって処置された動物と比較して、野生マウスの体重損失を減少させた（図示せず）（Ｃｏｍｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【００９４】
ＩＩ．２．漸増強度の拒食症誘発性ストレスに対する５−ＨＴ４受容体を失ったマウスの低感受性。
この結果は、５−ＨＴ４受容体を失った成体マウスが、新規環境の拒食症誘発性効果に低い感受性を示したことを示す（図５）。統計分析は、遺伝子型（Ｆ１．４７＝５．５７；ｐ＜０．０５）及び使用した手順（Ｆ１．４７＝１８．５５；ｐ＜０．０００１）の有意効果を示した。
【００９５】
常用する檻から、食物摂取算定の檻へのマウスの単純な移転は、野生及び突然変異マウスの食物消費を変更しなかった（手順１、図５）。中程度ストレス（手順２）、視床下部−下垂体軸の活性を増大させることで知られている、５分間、一段高くした十字の迷路中に１回のみ露出させることは、野生マウスにおいて、食物摂取の著しい減少を誘発した（−３３．４％；ｐ＜０．０５；ｎ＝７）。このことは、突然変異マウスに関しては当てはまらなかった（図５、ｎ＝９）。５−ＨＴ４受容体を有さないマウスの食物消費は、中程度のストレス後に野生動物よりも著しく高かった（＋４８．４％；Ｆ１．１５＝７．９７；ｐ＜０．０５；ｎ＝１０；図５）。その他の一群の動物を使用すると、我々の結果は、強いストレス（手順３）が、手順２によって処置されたマウスと比較して、野生マウスにおいて、食物摂取の大きな減少を引き起こしたことを示す（−７８％；Ｆ２．１９＝１６．１１；ｐ＜０．０００１；ｎ＝８；図５）。５−ＨＴ４受容体の不在下でも食物摂取が減収するとしても、突然変異マウスは、強いストレス後に野生動物よりも多くの食物を消費する（＋１３２％；Ｆ１．２２＝６．７；ｐ＝０．００４２；図５；ｎ＝１０）。
【００９６】
ＩＩ．３．５−ＨＴ４受容体の欠如又は不活性化は、ＭＤＭＡ又は「エクスタシー」投与によって誘発される、食物を消費する動機阻害を阻む。
食物摂取の全体的統計分析は、遺伝子型（Ｆ１．１０５＝４．８６；ｐ＜０．０５）、処置（Ｆ１．１０５＝７．２４；ｐ＜０．００１）及び時間（Ｆ３．３１５＝３９０．１２；ｐ＜０．０００１）の有意効果を示す。遺伝子型及び処置間（Ｆ３．１０５＝２．７６；ｐ＜０．０５）、及び時間因子及び処置間（Ｆ９．３１５＝２９．３０；ｐ＜０．０００１）の相互作用も、同様に有意である。
【００９７】
ＭＤＭＡの場合に、統計分析は、それぞれ時間中に変動する（Ｆ３．１７７＝３．９７；ｐ＜０．０１）及び（Ｆ３．１７７＝５３．１２；ｐ＜０．０００１）、遺伝子型（Ｆ１．５９＝１１．９３；ｐ＜０．００１）、及び処置（Ｆ１．５９＝１５．７８；ｐ＜０．００１）の有意効果を示す。我々の結果は、ＭＤＭＡ投与が、ＮａＣｌによって処置された同じ遺伝子型の齧歯目と比較して、野生マウスにおいて、食物摂取の著しい減少を誘発したことを示す（図６）。この効果は、その投与後３０分（−９５．３８％、図６Ａ）及び１時間（−８８．５６％、図６Ｂ）で観察され、かつ３時間では不在である（図６Ｃ）。ＮａＣｌによって処置された突然変異齧歯目と比較して、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスにおいて、ＭＤＭＡは、その投与後３０分（−６９．０７％、図６Ａ）及び１時間（−６８．４９％、図６Ｂ）で、食物摂取の著しい減少を同様に誘発する。この効果は、マウスの処置後３時間ではもはや観察されない（図６Ｃ）。更に、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスにおける食物消費は、同じ処置を受けた野生動物と比較して、ＭＤＭＡ投与後１持間（＋６４５．５６％；ｐ＜０．００１、図６Ｂ）及び３時間（＋２４４．２３％；ｐ＜０．０５、図６Ｃ）で著しく高い。
【００９８】
５−ＨＴ４受容体の拮抗薬であるＲＳ  ３９６０４に関して、統計分析は、遺伝子型（Ｆ１．６３＝１．３７）も、処置（Ｆ１．６３＝３．９３）も、遺伝子型及び処置の有意因子の間の相互作用（Ｆ１．６３＝３．９３）の効果も示さない（図６）。
【００９９】
５−ＨＴ４受容体の選択的拮抗薬であるＲＳ３９６０４に組み合わされたＭＤＭＡの場合に、統計分析は、時間中（Ｆ３．１６５＝６８．８７；ｐ＜０．０００１）の処置の有意効果（Ｆ１．５５＝７．１０；ｐ＜０．０５）を示す。我々の結果は、ＭＤＭＡ及びＲＳ  ３９６０４の組み合わせた投与が、ＮａＣｌによって処置された同じ遺伝子型の齧歯目と比較して、野生マウスにおいて、食物摂取の著しい減少を誘発したことを示す。この効果は、ＭＤＭＡ／ＲＳ  ３９６０４の投与後３０分（−８３．７２％、図６Ａ）及び１時間（−６４．８９％、図６Ｂ）で観察される。動物の処置後３時間には、食物摂取のいかなる変動も観察されない（図６Ｃ）。我々の結果は、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスにおいて類似する。ＭＤＭＡ／ＲＳ  ３９６０４投与は、同じ遺伝子型のマウスと比較して、ＭＤＭＡ／ＲＳ  ３９６０４注射後３０分（−８２．１９％、図６Ａ）及び１時間（−７２．８８％、図６Ｂ）で、食物消費を著しく減少させ、かつ３時間では効果がない（図６Ｃ）。更に、我々の結果は、野生マウスの食物摂取が、ＭＤＭＡのみを受けた野生動物よりも、ＭＤＭＡ／ＲＳ  ３９６０４投与後１持間（＋２０６．８２％、図６Ｂ）及び３時間（＋５１．１８％、図６Ｃ）で著しく高いことを示す。この効果は、５−ＨＴ４受容体に関する突然変異マウスにおいて示されない。
【０１００】
ＩＩ．４．「オープンフィールド」における５−ＨＴ４受容体に関する突然変異マウスの新規な事物への反応。
図７に示した結果は、突然変異マウスが、その露出の１日目のみ、野生動物よりも「オープンフィールド」において著しく少ない距離を走行することを示す（Ｆ１．１４＝６．７６；ｐ＜０．０５）。２つの遺伝子型間のいかなる有意差も、露出２日目及び３日目に検出されなかった。５−ＨＴ４受容体を失ったマウスは同様に、「オープンフィールド」における露出１日目（Ｆ１．１４＝５．５０；ｐ＜０．０５）及び２日目（Ｆ１．１４＝４．５０；ｐ＜０．０５）にその野生同属種と比較して、中央に著しく短い時間とどまる。このことは、突然変異マウスにおいて、より高い不安レベルを示唆する（図７ｅ）。垂直活動に関して２つの遺伝子型間のいかなる有意差も検出されず（図７ｆ）、このことは、突然変異マウスが、探検活動欠陥を有さないことを示す。
【０１０１】
これらのデータは、野生マウスと比較して５−ＨＴ４受容体を失ったマウスの新規な事物への反応性及び／又は歩行活動の減少を示す（図７）。
【０１０２】
ＩＩ．５  ５−ＨＴ４受容体を失ったマウスの不安レベルの研究。
危険な類似にもかかわらず、発明者は、過食症患者における不安及び食物障害の変動の共存を考慮に入れた。その場合、５−ＨＴ４受容体を失ったマウスの「不安」状態の変動が、拒食症誘発性ストレスが加わるにもかかわらず、食物を執拗に消費し続けることに関連し得るか、分析した。
【０１０３】
このために、領域又は閉鎖及び開放アームから構成される一段高くした十字の迷路を使用した。齧歯目が、閉鎖アーム中を通過し、かつ入るほど、「不安である」ように見なされる。主要な結果は、手順３（強いストレス）は、手順２（中程度のストレス）と比較して、経過時間又は閉鎖アームに入った数の著しい上昇を誘発したことを示している（図８）。探検活動の指数である「ヘッドディップ」数のみが、野生マウスにおける手順２と比較して、手順３後に著しく減少する（図８）。これらの結果は、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスが、野生マウスに対して嫌悪状況（手順３）においてより高い「不安」レベルを有することを示唆している。
【０１０４】
その上、野生マウスに対する手順２（迷路のみ）の場合に、突然変異マウスの開放及び閉鎖アーム中に入った総数の著しい減少は、歩行活動及び／又は新規な事物への適応欠陥の低下を示唆する。
【０１０５】
ストレス影響下での食物行動研究は、歩行活動の影響を考慮せずに検討され得るように見えない。その増加は、明白に、より高いエネルギー欲求、及びこのようにしてより強い食物消費に関連し得、かつその逆も当てはまる。
【０１０６】
一段高くした十字の迷路の使用により得られるデータに関連した、新規な事物（上記ＩＩ．４．）への反応の研究の際に得られるデータは、５−ＨＴ４受容体の刺激が、歩行活動の増大及び／又は新規環境に直面するその反応性の適応しない増大に関連することを示唆している。この仮説は、嗜癖における５−ＨＴ４受容体の可能な関与の仮説を強化する。
【０１０７】
ＩＩＩ．考察
３つのタイプの分子メカニズムが、５−ＨＴ４受容体を失ったマウスに関して、拒食症誘発性ストレスへの抵抗を与えることが可能である。
【０１０８】
ＩＩＩ．１．突然変異マウスにおいて食物摂取を十分に阻害するために、ストレスに適応することが、セロトニン作動性系にとって不可能であること。
従って発明者は、５−ＨＴ４受容体の不在下でストレスを加えた後のセロトニン作動性伝達の欠陥の仮説を重視した。強制固定化は、野生マウスのみにおいて細胞外５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）率の上昇をもたらした。換言すれば、５−ＨＴの主要代謝物質率は、５−ＨＴ４受容体の不在下で不変のままである。
【０１０９】
このように、拒食症誘発性ストレスに対する突然変異マウスの低感受性は、細胞外５−ＨＩＡＡ率の変更の欠如に立脚し得る（図９）。
【０１１０】
ＩＩＩ．２．突然変異マウスにおいてＣＡＲＴペプチドをコードするｍＲＮＡの発現増大。
野生マウスと比較して、側坐核及び／又は視床下部で突然変異マウスにおいて観察される、ＣＡＲＴ（「コカイン−アンフェタミン関連転写」、ＭＤＭＡ実験パラダイム）ペプチド（図示せず）をコードするｍＲＮＡの発現増大は、次の仮説を表明することを可能にする：５−ＨＴ４受容体のリガンド全体は、そのＣＡＲＴペプチド発現の制御のために、食物消費を制御することが可能である。
【０１１１】
このペプチドの投与は、側脳室又は視床下部核へのそれぞれの投与に応じて、拒食症誘発性及び食欲促進効果を誘発し得る。
【０１１２】
ＩＩＩ．３．突然変異マウスにおいて検出されたレプチン率の低下。
５−ＨＴ４受容体に関して無効にされたマウスにおいて検出されたレプチン率の低下（図９、実験パラダイムＭＤＭＡ）は、レプチン率の制御により５−ＨＴ４受容体のリガンドが、食物消費及び体重の変動を調整し得ることを、提案することを可能にする。
【０１１３】
レプチン率変動の統計分析は、ＭＤＭＡによる処置の有意効果を示さなかった（ｐ＝０．９５）。これらの結果は、ＭＤＭＡの唯一の投与が、野生又は突然変異マウスにおいて、レプチン率を変えないことを示す（図９）。
【０１１４】
５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の不在下で、レプチン率変動の統計分析は、遺伝子型の有意効果を示す（Ｆ１．２７＝１０．４２；ｐ＜０．０１）。これらの結果は、レプチン率が、シェッフェのテストＦの使用が同様に示すように（ｐ＜０．０１）、野生動物（−２１％）と比較して、５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスにおいて、著しく高くないことを示す（図９）。
【０１１５】
ＩＩＩ．４．結論。
ストレスの拒食症誘発性効果は、第１のリンクが、視床下部−下垂体軸の活性増大である、事象カスケードに立脚するであろう。その結果、食物摂取を阻害するモノアミン（５−ＨＴ及びＤＡ）の伝達が上昇することになる。現在の知識状況では、５−ＨＴのいかなる受容体も、５−ＨＴ２Ａ／２Ｃ受容体に対する唯一の薬理学的研究（Ｇｒｉｇｎａｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）を除き、ストレスの拒食症誘発性効果の原因である分子要素に相当するとして示されなかった。５−ＨＴ２Ｃ受容体に関する突然変異マウスの体重は、拘束ストレスを反復して加える結果、野生マウスのそれに比較し得るように減少することが、ごく最近報告された（Ｃｌｉｆｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【０１１６】
行動結果は、拒食症誘発性ストレスに対する、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスの低感受性を明らかにし、食物消費に対する５−ＨＴの阻害制御を確認する。それらは、５−ＨＴ４受容体が、伝達物質の１つであるストレスの拒食症誘発性効果に５−ＨＴが寄与するという仮説を強化する。５−ＨＴ４受容体の不在下で、ＮＡｃ及び視床下部におけるセロトニン作動性パラメーターの変更を考慮すると、ストレスは、ストレス後に突然変異マウスの食物摂取を減少させるために十分な比率で、５−ＨＴの放出を増大させないことが、その場合可能である。
【０１１７】
データは、５−ＨＴ４受容体の活性化の結果、５−ＨＴ放出の正の対照に有利である。５−ＨＴ４受容体の刺激は、カリウムイオンチャネルの閉鎖を誘発し（Ｂｏｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、このことは、ニューロンの興奮性を維持し、かつ神経伝達物質の放出を増大させることが可能である。このデータを踏まえると、５−ＨＴ４受容体の刺激は、海馬における細胞外５−ＨＴ率上昇に至らせる（Ｇｅ  ＆  Ｂａｒｎｅｓ、１９９７）。（ストレスのない）基礎条件において、このデータは、視床下部及びＮＡｃ中の５−ＨＩＡＡ／５−ＨＴ比率の上昇を示し、このことは、５−ＨＴ４受容体の不在下で、５−ＨＴ代謝の変化を示唆する。その上、これらの結果は、トリチウム化シタロプラムによってマーキングされた５−ＨＴの膜輸送体密度は、ＮＲＤにおいて最も高いのであるが、ストレス後の視床下部中の５−ＨＴ率の可能な低下が、５−ＨＴ４受容体を失ったマウスにおいて補償されないであろうことを示唆している。
【０１１８】
興味深いことに、遺伝的無効化がマウスを肥満にするレプチンは、視床下部において５−ＨＴの再生率（Ｃａｌａｐａｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９；Ｈａｓｔｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）、並びに前頭皮質において５−ＨＴを捕獲する輸送体の濃度（Ｃｈａｒｎａｙ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）を増大させ得る。更に、レプチンをコードする遺伝子の無効化は、ＮＲＤ中で５−ＨＴの膜輸送体をコードするｍＲＮＡの率減少を誘発する（Ｃｏｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。マウスの正中縫線核（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）及びＮＲＤのセロトニン作動性ニューロンに対するレプチン受容体の局在化は、レプチン及びセロトニン作動性ニューロンの間の相互作用に有利な追加論拠となっている。ＭＤＭＡ使用の同じ実験パラダイムにおいて、この結果は、レプチン率が、突然変異マウスにおいて減少することを示す。その上、ＭＤＭＡ注射は、レプチン血症の変動を誘発しなかった。これらのデータは、５−ヒドロキシトリプトファン投与によって誘発されるレプチン上昇を踏まえて、２４時間の絶食後、５−ＨＴ４受容体の活性化の結果のレプチン率の正の対照を示唆している（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。しかしながら、レプチン率は、５−ＨＴ１Ｂ（Ｂｏｕｗｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）又は５−ＨＴ２Ｃ（Ｎｏｎｏｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）受容体に関して突然変異マウスにおいて変更されない。このデータは、レプチン血症が、野生マウスと比較して、拘束ストレス前及び後で５−ＨＴ４受容体を失ったマウスにおいて低いことを示す。レプチン率の上昇は、コルチコステロンのそれに続くので（Ｇｕｅｒｒｅ−Ｍｉｌｌｏ、１９９７）、この結果は、レプチン血症に対する栄養物喪失ストレスの効果が、５−ＨＴ４受容体の不在下で効力がなくなることを示唆する；その結果、拒食症誘発性ストレスに対する、５−ＨＴ４受容体に関して無効にされたマウスのより強い抵抗力が生じるであろう。
【０１１９】
レプチンは、視床下部室傍核中のＣＡＲＴペプチド発現を活性化するので（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、５−ＨＴ４受容体に関して無効にされたマウスの視床下部におけるＣＡＲＴペプチドの可能な変動は、野生マウスと比較して、分析中である。食物消費の調整におけるその関与は、その注射部位に従って可変である。このようにして、ＣＡＲＴペプチドの側脳室内投与は、拒食症という結果になり（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、他方で視床下部中の組織内投与は、食欲亢進をもたらす（Ａｂｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。Ａｂｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．によって記載された（２００１）視床下部室傍核中のＣＡＲＴペプチド注射の食欲亢進効果は、Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）の意見書によって反論された。発明者の結果は、ＮＡｃの「シェル」へのＣＡＲＴペプチド注射が、ＭＤＭＡ使用の同じ実験パラダイムにおいて食欲を減少させることを示している。従って結果全体は、ＭＤＭＡが、ＣＡＲＴペプチド発現の正の調整およびその放出を引き起こす５−ＨＴ４受容体の活性化により食欲を阻害することを示唆している。幾つかのデータが、かかるメカニズムに有利な論拠を構成する。すなわち（１）５−ＨＴ４受容体は、ＧＡＢＡを含むニューロン上に局在化される（Ｃｏｍｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）、（２）ＣＡＲＴペプチドは、ＮＡｃニューロン中でＧＡＢＡと共存する（Ｓｃｅａｒｃｅ−Ｌｅｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｓｃｅａｒｃｅ−Ｌｅｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）；（３）ここに示した結果は、ＮＡｃの「シェル」中のタンパク質ＣＡＲＴペプチド／５−ＨＴ４受容体及びｍＲＮＡ発現の局所共存を示唆する。しかしながら、これらの各処置後の細胞共存及びＮＡｃ中のペプチド濃度の算定は、これから確立せねばならない。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】トランスジェニックマウスを得るために設置される技術部門の目標の略図である。
【図２】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の無効化を示す。図２Ａは、セロトニンの５−ＨＴ４受容体の膜間領域ＩＩ及びＩＩＩをコードするＤＮＡ断片（６．５ｋｂ）の略図である（エクソンＩＩＩ）。ＤＮＡ配列（Ｐ）は、野生マウスにおいて４ｋｂのＤＮＡ分解酵素Ｉ断片をハイブリダイズするための外部プローブを示す。図２Ｂは、クローニングベクターの略図である。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）をコードする遺伝子の発現は、プロモーター（「ホスホグリセリン酸キナーゼＩプロモーター：ｐＧＫ」）の制御下にある。それは、５−ＨＴ４受容体の膜間領域ＩＩＩをコードするＤＮＡ配列において酵素制限部位Ｘｂａに挿入された。その場合外部プローブによってハイブリダイズされ得るＤＮＡ分解酵素Ｉ断片の寸法は、３．５ｋｂであり、かつ突然変異ＤＮＡを同定することを可能にする。図２Ｃは、酵素Ｉの使用によって予め消化され、かつ外部プローブ（Ｐ）によってハイブリダイズされた、株胚細胞の、ゲノムＤＮＡの「サザンブロット」である。
【図３】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスが、その短い発育期間中に、僅かに増大した体重増加を有することを示す。体重増加は、発育の所定の日（２１〜５６）に測定された体重及び生後２０日目のそれの間の差である。データは、１日当たりのｇで表現される体重増加の変動の平均±平均値の標準誤差である。体重は、毎日、野生（＋／＋）２１例及び突然変異（−／−）１５例の平均数からなり、１年で生まれた群から、離乳前２０日目、及び生後の生殖能獲得の５６日目の間で測定された。統計分析は、突然変異マウスの体重増加が、２７日目（＋１６％、Ｆ１．７２＝６．５４；ｎ＝４０  ＋／＋、ｎ＝３４  −／−）、２８日目（＋１２％、Ｆ１．６７＝４．７３；ｎ＝４２  ＋／＋、ｎ＝２７  −／−）、２９日目（＋３０％、Ｆ１．７２＝６．５４；ｎ＝２３  ＋／＋、ｎ＝１８  −／−）、３０日目（＋２１％、Ｆ１．７２＝６．５４；ｎ＝２０  ＋／＋、ｎ＝１９  −／−）、３６日目（＋１２％、Ｆ１．４０＝４．０６；ｎ＝２２  ＋／＋、ｎ＝２０  −／−）、及び３７日目（＋１３％、Ｆ１．４０＝６．１８；ｎ＝２５  ＋／＋、ｎ＝１７  −／−）のみ、野生動物のそれより著しく高いことを示した。他の日に関して、２つの遺伝子型の間に、いかなる有意差も検出されなかった。遺伝子型間の有意差は、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１によって示される。
【図４】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスが、拘束ストレス又は強制固定化の後に、異常な体重増加及び食物摂取反応を有することを示す。図４ａ及び４ｂは、野生（図４ａ）及び突然変異（図４ｂ）マウスにおける一日の食物摂取を示す。一日の食物摂取は、連続する２日間に算定される栄養量の間の差である。データは、順応期間（８日）及び回復期間（１０日）中に算定される。１１０分の急性拘束ストレスを、８日目に加える（矢印）。この強制固定化は、２日間の回復期間中、野生マウスにおいて、食物摂取の減少を誘発した（図４ａ）。この拒食症誘発性能力は、５−ＨＴ４受容体を有さないマウスにおいて、効果が低い（図４ｂ）。図４ｃ及び４ｄは、順応期間の（サイクルの９：００の照明部分）隔離１日目からの野生（図４ｃ）及び突然変異（図４ｄ）マウスの体重増加の一日の変動を示す。拘束ストレスは、野生マウスの体重増加の高い減少をもたらしたが（ｃ）突然変異マウスにおいては、減少が遥かに少ないか、無かった（ｄ）。データは、ストレスを加えない（ｎ＝１４）又は拘束（ｎ＝１８）の野生マウス及びストレス無し（ｎ＝１７）又は固定化した（ｎ＝１６）突然変異動物の群の平均±平均値の標準誤差（ｇ／日）である。ストレスを加えた又は加えない動物の間の有意差は、§§§  ｐ＜０．０００１；§§  ｐ＜０．００１；§  ｐ＜０．０５によって評価される。２つの遺伝子型間の有意差は、＊ｐ＜０．０５、及び遺伝子型×ストレスの有意相互作用は、＃  ｐ＜０．０５によって示される。
【図５】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスが、漸増強度の拒食症誘発性ストレス後に、野生動物よりも多くの食物を消費することを示す。換言すれば、状況が、徐々にストレスを生じさせる実験パラダイムは、野生マウスにおいて食物摂取の減少を誘発したが、他方で、拒食症誘発性効果は、５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の不在下で減少した。データは、齧歯目に関する新規及び／又は嫌悪実験状況での食物摂取の平均±平均値の標準誤差（ｇ．）を示す（手順１：３時間の隔離、手順２：一段高くした十字の迷路（ＥＰＭ、５分）及び３時間の隔離、手順３：９６時間の隔離、尻尾の小型切開、ＮａＣｌ注射及び、ＥＰＭ）。５−ＨＴ４受容体を有さないマウス及び野生マウスの間の有意差は、＊ｐ＜０．０５によって示される。各手順間の有意差は、§  ｐ＜０．０５；§§  ｐ＜０．０１によって評価される。
【図６Ａ】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスは、栄養物喪失後２４時間のＭＤＭＡ又は「エクスタシー」の拒食症誘発性効果に感受性が低いことが判明することを示す。「エクスタシー」の拒食症誘発性ストレスへのこの抵抗は、それがセロトニンの５−ＨＴ４受容体の選択的拮抗薬（ＲＳ  ３９６０４）と一緒投与されるならば、再生される。換言すれば、「エクスタシー」注射によって誘発される食物を消費する動機の大幅な緩和は、２４時間の栄養物喪失にもかかわらず、５−ＨＴ４受容体の欠如又は阻害によって阻まれる。データは、野生（＋／＋）又は５−ＨＴ４受容体を失った（−／−）マウスにおいて、ＮａＣｌ、ＭＤＭＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び／又はＲＳ３９６０４（０．５ｍｇ／ｋｇ）の注射後３０分（図６Ａ）、１時間（図６Ｂ）及び３時間（図６Ｃ）で測定した食物再摂取の平均±平均値の標準誤差（ｇ．）を示す。＊ｐ＜０．０５、シェッフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）のテストＦを伴った分散分析後の遺伝子型の有意効果。§  ｐ＜０．０５；§§§  ｐ＜０．００１；§§§§  ｐ＜０．０００１、ＮａＣｌによって処置された同じ遺伝子型の動物との比較による処置の有意効果（Ａｎｏｖａ、シェッフェのテストＦ）。＃  ｐ＜０．０５；＃＃  ｐ＜０．０１、ＭＤＭＡによって処置された野生動物との比較による処置の有意効果（Ａｎｏｖａ、シェッフェのテストＦ）。
【図６Ｂ】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスは、栄養物喪失後２４時間のＭＤＭＡ又は「エクスタシー」の拒食症誘発性効果に感受性が低いことが判明することを示す。「エクスタシー」の拒食症誘発性ストレスへのこの抵抗は、それがセロトニンの５−ＨＴ４受容体の選択的拮抗薬（ＲＳ  ３９６０４）と一緒投与されるならば、再生される。換言すれば、「エクスタシー」注射によって誘発される食物を消費する動機の大幅な緩和は、２４時間の栄養物喪失にもかかわらず、５−ＨＴ４受容体の欠如又は阻害によって阻まれる。データは、野生（＋／＋）又は５−ＨＴ４受容体を失った（−／−）マウスにおいて、ＮａＣｌ、ＭＤＭＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び／又はＲＳ３９６０４（０．５ｍｇ／ｋｇ）の注射後３０分（図６Ａ）、１時間（図６Ｂ）及び３時間（図６Ｃ）で測定した食物再摂取の平均±平均値の標準誤差（ｇ．）を示す。＊ｐ＜０．０５、シェッフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）のテストＦを伴った分散分析後の遺伝子型の有意効果。§  ｐ＜０．０５；§§§  ｐ＜０．００１；§§§§  ｐ＜０．０００１、ＮａＣｌによって処置された同じ遺伝子型の動物との比較による処置の有意効果（Ａｎｏｖａ、シェッフェのテストＦ）。＃  ｐ＜０．０５；＃＃  ｐ＜０．０１、ＭＤＭＡによって処置された野生動物との比較による処置の有意効果（Ａｎｏｖａ、シェッフェのテストＦ）。
【図６Ｃ】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスは、栄養物喪失後２４時間のＭＤＭＡ又は「エクスタシー」の拒食症誘発性効果に感受性が低いことが判明することを示す。「エクスタシー」の拒食症誘発性ストレスへのこの抵抗は、それがセロトニンの５−ＨＴ４受容体の選択的拮抗薬（ＲＳ  ３９６０４）と一緒投与されるならば、再生される。換言すれば、「エクスタシー」注射によって誘発される食物を消費する動機の大幅な緩和は、２４時間の栄養物喪失にもかかわらず、５−ＨＴ４受容体の欠如又は阻害によって阻まれる。データは、野生（＋／＋）又は５−ＨＴ４受容体を失った（−／−）マウスにおいて、ＮａＣｌ、ＭＤＭＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び／又はＲＳ３９６０４（０．５ｍｇ／ｋｇ）の注射後３０分（図６Ａ）、１時間（図６Ｂ）及び３時間（図６Ｃ）で測定した食物再摂取の平均±平均値の標準誤差（ｇ．）を示す。＊ｐ＜０．０５、シェッフェ（Ｓｃｈｅｆｆｅ）のテストＦを伴った分散分析後の遺伝子型の有意効果。§  ｐ＜０．０５；§§§  ｐ＜０．００１；§§§§  ｐ＜０．０００１、ＮａＣｌによって処置された同じ遺伝子型の動物との比較による処置の有意効果（Ａｎｏｖａ、シェッフェのテストＦ）。＃  ｐ＜０．０５；＃＃  ｐ＜０．０１、ＭＤＭＡによって処置された野生動物との比較による処置の有意効果（Ａｎｏｖａ、シェッフェのテストＦ）。
【図７】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスが、新規環境、ここでは「オープンフィールド」で歩行運動及び／又は適応の欠陥を有することを示す。データは、３０分間及び連続した３日間（１から３日目）の「オープンフィールド」の面積全体（図７ａ及び７ｂ）又は中央（図７ｃ及び７ｄ）での野生（＋／＋、ｎ＝７）及び突然変異（−／−、ｎ＝７）マウスによる走行距離（ｃｍ）の平均を示す。図７ｅのデータは、連続した３日間の「オープンフィールド」中央で過ごした平均時間を示す。図７ｆは、連続した３日間の垂直活動の平均データを示す。遺伝子型間の有意差は、＊ｐ＜０．０５によって、かつ異なる露出日の間は、§§  ｐ＜０．０１及び§  ｐ＜０．０５によって示す。
【図８】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされたマウスは、一段高くした十字の迷路（ＥＰＭ）では良く反応せず（図８ａ）、他方でストレスを更に加えた状況で、突然変異マウスがより不安であることが判明した（図８ｂ）ことを示す。ＥＰＭの区画全体に入る数は、５−ＨＴ４受容体の不在下で非常に著しく減少するので（平均±平均値の標準誤差、異なる研究室で３回再生される、遺伝子型当たりｎ＝８−９）、加えられる他のストレスがないＥＰＭにおいて、マウスは、対照動物よりも短時間、開放アームに留まり（図８ａ）、かつ良く反応しない。ストレスを更に加えた状況で、突然変異マウスは、開放アームに低い頻度で留まり、かつ入ったので（平均±平均値の標準誤差、遺伝子型当たりｎ＝１８−１９）、新規環境に反応し始め、かつその野性同属種よりも不安な行動を示した。遺伝子型間の有意差は、＊ｐ＜０．０５によって示される（Ａｎｏｖａ）。
【図９】セロトニンの５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子の欠如が、レプチン率の減少を誘発したことを示す。データは、平均して月齢６〜１０ヶ月の、野生（＋／＋）又は５−ＨＴ４受容体をコードする遺伝子に関して無効にされた（−／−）マウス（ｎ＝８）において、ＮａＣｌ（０．９％）又はＭＤＭＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与後、ｎｇ／ｍＬで表わされる血漿のレプチン率の平均±平均値の標準誤差を示す。＊＊ｐ＜０．０１、シェッフェのテストＦを伴った分散分析（ＡＮＯＶＡ）後の遺伝子型の有意効果。
【０１２１】
（参考文献）
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2006520319.tif 000009
2006520319.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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