(57)【要約】本発明は、病原性真菌種、とりわけ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、Ｆ．ｃａｒｏｔａｅ、及び、Ｐｙｔｈｉｕｍ種による土壌又は植物の真菌感染を検出する検査方法を提供する。本発明の方法は、土壌又は植物試料を得ること、前記試料の真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、及び、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を検出することを含む。前記一組のプライマーは、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性真菌種、とりわけ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、Ｆ．ｃａｒｏｔａｅ、及び、Ｐｙｔｈｉｕｍ種による土壌又は植物の真菌感染を検出する検査方法であって、
土壌又は植物の試料を得ること、前記試料を処置して真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、及び、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を検出することを含み、
前記一組のプライマーが、式Ｉａ（配列番号１）、Ｉｂ（配列番号２）、ＩＩａ（配列番号３）、ＩＩｂ（配列番号４）、ＩＩＩａ（配列番号５）、ＩＩＩｂ（配列番号６）、ＩＶａ（配列番号７）、ＩＶｂ（配列番号８）、Ｖａ（配列番号９）、Ｖｂ（配列番号１０）、ＶＩａ（配列番号１１）、ＶＩｂ（配列番号１２）、ＶＩＩａ（配列番号１３）、ＶＩＩｂ（配列番号１４）、ＶＩＩＩａ（配列番号１５）、ＶＩＩＩｂ（配列番号１６）、ＩＸａ（配列番号１７）、ＩＸｂ（配列番号１８）、Ｘａ（配列番号１９）、Ｘｂ（配列番号２０）、ＸＩａ（配列番号２１）、ＸＩｂ（配列番号２２）、ＸＩＩａ（配列番号２３）、ＸＩＩｂ（配列番号２４）、ＸＩＩＩａ（配列番号２５）、ＸＩＩＩｂ（配列番号２６）、ＸＩＶａ（配列番号２７）及びＸＩＶｂ（配列番号２８）のオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む検査方法。
【化１】
2006504424.tif 000007
【請求項２】
病原性Ｐｙｔｈｉｕｍ種による土壌の真菌感染を検出する請求項１に記載の検査方法であって、
土壌試料を得ること、前記試料を処置して真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、及び、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を検出することを含み、
前記一組のプライマーが、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ及びＸｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む検査方法。
【化２】
2006504424.tif 000008
【請求項３】
病原性真菌種による土壌又は植物の真菌感染を検出する請求項１に記載の検査方法であって、
土壌又は植物の試料を得ること、前記試料を処置して真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、及び、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を検出することを含み、
前記一組のプライマーが、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む検査方法。
【化３】
2006504424.tif 000009
【請求項４】
前記一組のプライマーが、式Ｉａ及びＩｂ、又は、ＩＩａ及びＩＩｂ、又は、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ、又は、ＩＶａ及びＩＶｂ、又は、Ｖａ及びＶｂの一組のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む請求項２に記載の検査方法。
【請求項５】
前記一組のプライマーが、式ＸＩａ及びＸＩｂ、又は、ＸＩＩａ及びＸＩＩｂの一組のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む請求項３に記載の検査方法。
【請求項６】
病原性真菌種、とりわけ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、Ｆ．ｃａｒｏｔａｅ、及び、Ｐｙｔｈｉｕｍ種による土壌又は植物の真菌感染を検出する検査方法であって、
土壌又は植物の試料を得ること、前記試料を処置して真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含むプライマーがその表面に固定された担体と接触させること、及び、前記プライマーに結合したＤＮＡ断片を検出することを含む検査方法。
【化４】
2006504424.tif 000010
【請求項７】
１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーであって、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列から選択されるオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ及びＸｂのオリゴヌクレオチド配列から選択されるオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列から選択されるオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１０】
前記プライマーが、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ若しくはＸＩＶｂ、又は、それらの誘導体の配列を含む請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１１】
担体であって、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列から選択されるオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つがその表面に固定された担体。
【請求項１２】
前記プライマーが、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ若しくはＸＩＶｂ、又は、それらの誘導体の配列を含む請求項１１に記載の担体。
【請求項１３】
プライマー組成物であって、一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、その少なくとも一方が、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ又はＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列と、必要に応じて、担体と共に、ハイブリダイズ可能なプライマー組成物。
【請求項１４】
前記プライマーの少なくとも一方が、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ若しくはＸＩＶｂ、又は、それらの誘導体の配列を含むプライマーである請求項１３に記載のプライマー組成物。
【請求項１５】
一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、その少なくとも一方が、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ又はＸｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含み、その少なくとも一方が、式ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ又はＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１から５のいずれか１項に記載の検査方法を実施するためのキットであって、請求項１から５のいずれか１項のおいて規定した少なくとも１組のプライマーを、前記検査方法を実施するための使用説明書と共に含むキット。
【請求項１８】
土壌から核酸を抽出する方法であって、
（１）少なくとも１００ｇ、好ましくは、少なくとも２００ｇの土壌の混合試料から採取した約０．１〜１ｇ、好ましくは、０．５ｇの土壌試料を、真菌細胞溶解液と接触させ、
（２）少なくとも１００００×ｇで少なくとも１０分間遠心分離をして上清を回収し、
（３）前記上清を粒子状のＤＮＡ結合剤と接触させ、
（４）遠心分離をしてＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（５）前記粒子をカオトロピック試薬水溶液（例えば、グアニジンチオシアン酸水溶液）に懸濁し、遠心分離してＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（６）少なくとも１回前記（５）工程を繰返し、
（７）前記粒子を、塩／エタノール洗浄液に懸濁し、遠心分離してＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（８）少なくとも１回前記（７）工程を繰返し、
（９）前記粒子を、ＤＮＡ放出剤水溶液に懸濁し、
（１０）遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収し、そして、必要に応じて、
（１１）前記粒子を、ＤＮＡ放出剤水溶液に再懸濁し、上清を回収して混合することを含む方法。
【請求項１９】
土壌から核酸を抽出するキットであって、
（ｉ）真菌細胞溶解水溶液と、
（ｉｉ）ＤＮＡ結合粒子と、
（ｉｉｉ）カオトロピック試薬水溶液（例えば、グアニジンチオシアン酸水溶液）と、
（ｉｖ）塩及びエタノール水溶液と、
（ｖ）ＤＮＡ放出剤水溶液とを、
請求項１３に記載の方法に前記キットを使用するための使用説明書と共に含むキット。
【請求項２０】
宿主植物組織から病原体ＤＮＡを抽出する方法であって、
（ｉ）少なくとも２０ｍｇの乾燥粉末状の植物組織（好ましくは、皮等の表面組織）を、少なくとも５μＬ／ｍｇ−乾燥組織の真菌細胞溶解水溶液と接触させ、
（ｉｉ）インキュベートし、
（ｉｉｉ）少なくとも４．５μＬ／ｍｇ−乾燥組織のタンパク質及び多糖類沈殿剤の水溶液と混合し、
（ｉｖ）遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収し、
（ｖ）ろ過し、
（ｖｉ）ＤＮＡを含むろ液をＤＮＡ結合担体と接触させ遠心分離し、
（ｖｉｉ）ＤＮＡを担持する前記担体をエタノール水溶液で洗浄し、遠心分離して液相を取り除き、
（ｖｉｉｉ）少なくとも１回前記（ｖｉｉ）工程を繰返し、
（ｉｘ）ＤＮＡを担持する前記担体を乾燥し、
（ｘ）ＤＮＡを担持する前記担体をＤＮＡ放出剤水溶液と接触させ、遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収することを含む方法。
【請求項２１】
宿主植物組織から病原体ＤＮＡを抽出するキットであって、
（ａ）真菌細胞溶解剤と、
（ｂ）タンパク質及び多糖体沈殿剤と、
（ｃ）ＤＮＡ結合担体と、
（ｄ）エタノール洗浄水溶液と、
（ｅ）ＤＮＡ放出剤水溶液とを、
宿主植物組織から病原体ＤＮＡを抽出するための前記キットの使用説明書と共に含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、田畑及び植物の真菌感染を検出する検査方法、並びに、その方法に用いる化合物、キット、及びマイクロアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ニンジン作物のほぼ三分の一が、世界中で、疫病や疾病で失われる。
【０００３】
ニンジンが生育する田畑や収穫したニンジンの化学処理は、ニンジン作物の損失を低減するために使用することができる一方、非常に高価であり、また、そのニンジンは、「有機栽培」として販売することができない。
【０００４】
それゆえ、収穫量の損失を低減するための診断方法の差し迫った必要性がある。
【０００５】
ニンジンのような根菜類は、とりわけ、それらが生育する土壌に存在する病原体、特に、真菌感染の影響を受けやすい。そのような真菌感染は、まだ地面の中にある間からニンジンに損傷を与えうる。また、その後の収穫後の貯蔵期間においても損傷が生じ得る。
【０００６】
ニンジンのとりわけ有害な真菌感染の一つが、キャビティスポット（ｃａｖｉｔｙ  ｓｐｏｔ）と呼ばれるもので、Ｐｙｔｈｉｕｍ種の真菌、特に、Ｐ．ｖｉｏｌａ及びＰ．ｓｕｌｃａｔｕｍにより引き起こされる。この感染は、まだ地面の中にある間に、ニンジンの根表面に損傷を与え、ニンジンを本質的に無価値とする。
【０００７】
ニンジンのとりわけ有害な真菌感染のもう一つが、カンゾウ根腐れ（ｌｉｑｕｏｒｉｃｅ  ｒｏｔ）と呼ばれるもので、真菌Ｍｙｃｏｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒａ  ａｃｅｒｉｎａにより引き起こされる。より一層有害な真菌感染の一つは、クレーターロット（ｃｒａｔｅｒ  ｒｏｔ）と呼ばれるもので、真菌Ｆｉｂｕｌａｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃａｒｏｔａｅにより引き起こされる。これらの感染は、共に、収穫後の貯蔵期に発現し、同様に、ニンジンを本質的に無価値とする。
【０００８】
ニンジンが生育する田畑の真菌感染は、上述したように、例えば、メタラクシル（ｍｅｔａｌａｋｓｙｌ）等の抗真菌剤を前記田畑に散布することで治療することができる。あるいは、感染した田畑を、その感染が消滅するまで、Ｐｙｔｈｉｕｍ種、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、又はＦ．ｃａｒｏｔａｅによる真菌感染に感受性がない他の作物に使用してもよい。しかしながら、感染が消えるのを待つことは、長期かつ不明確な仕事である。なぜなら、その真菌は、感染可能な他の種類の宿主がある場合もあり、また、生存可能な真菌胞子は、土壌中で何年間も、休眠期を維持できるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ニンジンが生育することとなる田畑の土壌を分析して前記土壌がＰｙｔｈｉｕｍ種、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、又はＦ．ｃａｒｏｔａｅに感染しているかどうかを測定すれば、栽培者が、抗真菌剤を散布するべきかどうかや、感染が消え去る後のシーズンまでそのような土壌にニンジンの種まきを避けるべきかどうかについて決定できるようになることを、我々は見出した。同様に、症状がでてないニンジンの組織や表面の土壌を、例えば、収穫の前又はその短時間後にテストすることで、貯蔵期限を延ばすための殺真菌剤による処置が必要かどうか判断したり、長期間貯蔵することよりは、むしろ、速やかにそのニンジンを使用（例えば、販売、調理、瓶詰、缶詰等）するべきかどうかを判断できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
それゆえ、一つの態様として、本発明は、病原性真菌種、とりわけ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、Ｆ．ｃａｒｏｔａｅ、及び、Ｐｙｔｈｉｕｍ種による土壌又は植物の真菌感染を検出する検査方法であって、土壌又は植物の試料を得ること、前記試料を処置して真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、及び、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を検出することを含み、前記一組のプライマーが、式Ｉａ（配列番号１）、Ｉｂ（配列番号２）、ＩＩａ（配列番号３）、ＩＩｂ（配列番号４）、ＩＩＩａ（配列番号５）、ＩＩＩｂ（配列番号６）、ＩＶａ（配列番号７）、ＩＶｂ（配列番号８）、Ｖａ（配列番号９）、Ｖｂ（配列番号１０）、ＶＩａ（配列番号１１）、ＶＩｂ（配列番号１２）、ＶＩＩａ（配列番号１３）、ＶＩＩｂ（配列番号１４）、ＶＩＩＩａ（配列番号１５）、ＶＩＩＩｂ（配列番号１６）、ＩＸａ（配列番号１７）、ＩＸｂ（配列番号１８）、Ｘａ（配列番号１９）、Ｘｂ（配列番号２０）、ＸＩａ（配列番号２１）、ＸＩｂ（配列番号２２）、ＸＩＩａ（配列番号２３）、ＸＩＩｂ（配列番号２４）、ＸＩＩＩａ（配列番号２５）、ＸＩＩＩｂ（配列番号２６）、ＸＩＶａ（配列番号２７）及びＸＩＶｂ（配列番号２８）のオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含む検査方法である。
【００１１】
【化５】
2006504424.tif 000002
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の検査方法が、ＰｙｔｈｉｕｍよりもむしろＭ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅの感染に対する検査を主題としている場合、前記試料は、適宜、植物又は土壌試料でよく、使用する前記プライマーは、式ＸＩａ〜ＸＩＶｂの配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のものから適宜選択できる。しかしながら、本発明の検査方法が、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅよりもむしろＰｙｔｈｉｕｍの感染に対する検査を主題とする場合、前記試料は、土壌試料が好ましく、使用する前記プライマーは、式Ｉａ〜Ｘｂの配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のものから適宜選択できる。本発明の検査方法が、Ｐｙｔｈｉｕｍ並びにＭ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅの感染に対する検査を主題としている場合、前記試料は、土壌試料が好ましく、使用する前記プライマーは、式Ｉａ〜Ｘｂ及びＸＩａ〜ＸＩＶｂの配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のものから適宜選択できる。
【００１３】
本発明の検査方法において、前記一組のプライマーは、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ及びＸＩＩｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つとハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含むことが好ましい。さらにより好ましくは、前記一組のプライマーは、式Ｉａ及びＩｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ、ＩＶａ及びＩＶｂ、Ｖａ及びＶｂ、ＸＩａ及びＸＩｂ、又は、ＸＩＩａ及びＸＩＩｂの一組のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基を含む。Ｐｙｔｈｉｕｍ感染の測定のためには、前記一組のプライマーは、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ及びＶｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つとハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含むことが好ましい。特に好ましくは、Ｐｙｔｈｉｕｍ感染の測定のために、前記一組のプライマーは、式Ｉａ及びＩｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ、ＩＶａ及びＩＶｂ、又は、Ｖａ及びＶｂの一組のオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基を含む。Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅの感染の測定のためには、前記一組のプライマーは、式ＸＩａ及びＸＩｂ、又は、ＸＩＩａ及びＸＩＩｂの一組のオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含むことが特に好ましい。前記一組のプライマーの第二プライマーは、前者ほど好ましくはないが、全て又は実質的に全ての真菌ＤＮＡに結合する一般プライマーを使用することも好ましい。そのような一般プライマーは、典型的には、同様に１８〜２４塩基であって、公知であり、ポリメラーゼ連鎖反応を効率的に機能させることができる。実際、全ての菌類、全ての卵菌及び全ての植物のＤＮＡにハイブリダイズするそのような一般プライマーは公知である。
【００１４】
そのような一般プライマーの例は、下記を含む。
【００１５】
【化６】
2006504424.tif 000003
【００１６】
一般プライマー（Ａ）（配列番号２９）及び（Ｅ）（配列番号３３）は、とりわけ、式ＶＩａ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＶａ、ＸＩｂ及びＸＩＩｂ、又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、Ｉｂ、ＩＩｂ、ＩＩＩｂ、ＩＶｂ及びＶｂの配列にハイブリダイズする特定のプライマーとともに使用する場合に有用である。一般プライマー（Ｄ）（配列番号３２）は、とりわけ、式ＶＩｂ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸｂ、Ｘｂ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶｂ、ＸＩａ及びＸＩＩａ、又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、Ｉａ、ＩＩａ及びＩＩＩａの配列にハイブリダイズする特定のプライマーとともに使用する場合に有用である。
【００１７】
一般プライマー（Ｃ）（配列番号３１）は、とりわけ、式Ｉａ、ＩＩａ、ＩＩＩａ、ＸＩｂ及びＸＩＩｂの配列にハイブリダイズする特定のプライマーとともに使用する場合に有用である。一般プライマー（Ｂ）（配列番号３０）は、とりわけ、式Ｉｂ、ＩＩｂ、ＩＩＩｂ、ＩＶｂ、Ｖｂ、ＸＩａ及びＸＩＩａの配列にハイブリダイズする特定のプライマーとともに使用する場合に有用である。
【００１８】
「〜にハイブリダイズ可能」とは、そのような配列を有するＤＮＡのその部位に、ＰＣＲ反応中にプライマーアニーリングが実施される条件下で、アニールできることを意味する。一般に、ＰＣＲは、後述するように、高いストリンジェンシーのプライマー結合条件下で行われる。
【００１９】
一つのプライマーは、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ若しくはＸＩＶｂ、又は、それらの誘導体の配列からなる又は前記配列を含む化合物であることが好ましい。前記誘導体は、最大５ヌクレオチドが、削除（欠失）若しくは異なる残基と置換したもの、又は、挿入されたもの、又は、３’若しくは５’末端から削除（欠失）若しく３’若しくは５’末端に付加したものである。そのような誘導体の場合、３’末端からは１個及び５’末端からは３個を超えて削除されないことが好ましく、一つのＣ残基もＡ残基と置換されないことが好ましく、３個超えてＣ又はＧ残基が置換されないことが好ましく、１個を超える削除又は挿入が配列表にリストされた配列に起きないことが好ましく、３’末端の伸張が、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂに対し、それぞれ、５’−ＣＡＡＣＡ−３’、５’−ＣＣＡＣＣ−３’、５’−ＴＧＣＴＧ−３’、５’−ＡＣＡＧＧ−３’、５’−ＣＣＧＧＣ−３’、５’−ＴＴＴＧＣ−３’、５’−ＡＧＡＣＡ−３’、５’−ＡＧＡＡＧ−３’、５’−ＣＧＡＧＡ−３’、５’−ＧＴＴＴＧ−３’、５’−ＧＧＣＧＣ−３’、５’−ＧＣＣＧＡ−３’、５’−ＧＧＣＴＧ−３’、５’−ＡＧＧＣＣ−３’、５’−ＧＧＴＣＧ−３’、５’−ＣＣＡＡＡ−３’、５’ＴＴＡＴＧ−３’、５’−ＡＡＣＡＣ−３’、５’−ＴＡＴＧＣ−３’、５’−ＣＡＧＡＴ−３’、５’−ＧＣＧＧＧ−３’、５’−ＧＣＡＧＣ−３’、５’−ＧＴＧＣＡ−３’、５’−ＡＴＴＧＴ−３’，５’−ＣＣＴＴＴ−３’、５’−ＧＣＴＧＣ−３’、５’−ＡＣＣＣＡ−３’若しくは５’−ＣＡＡＡＴ−３’、又は、それぞれの５’末端の断片であることが好ましい。そのような誘導体は、３残基を超える置換又は削除がないこと、とりわけ、２個のＣ又はＧ残基を超える置換がないことが好ましい。
【００２０】
その他の好ましい誘導体においては、Ｃ又はＧ残基は、置換又は削除（欠失）しない。より好ましい誘導体においては、あらゆるヌクレオチドの置換、削除（欠失）又は付加は、前記プライマー配列の５’部分、例えば、前記プライマー配列の５’半分側でなされる。８個以上のヌクレオチド、例えば、８、９又は１０残基が、前記プライマー配列の３’端で変化しないことが好ましい。
【００２１】
式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ又はＸＩＶｂの配列にハイブリダイズ可能であるそのような誘導体の断片も、同様に含まれる。
【００２２】
本願において使用される場合、核酸配列に関して「実質的に相同」であるとは、特定の配列と約６０％以上、例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくはそれ以上の相同性又は同一性のある配列を有する配列、また、機能的に同等な変異体、並びに、一塩基又は複数塩基の置換、付加、及び／又は、欠失による修飾をされた関連する配列を含む。前記「機能的に同等」とは、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ又はＸＩＶｂの配列に、上述の定義のとおり、ハイブリダイズ可能であるヌクレオチド配列を意味する。そのような機能的に同等な変異体は、前記プライマーのハイブリダイゼーション機能が保持できるのであれば、合成又は修飾ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【００２３】
本願において、プライマー誘導体の定義に関して、「ハイブリダイズする」配列とは、低い又は好ましくは高いストリンジェンシーの条件下で、特定の（特異的な）ＤＮＡ配列と、結合又はアニール（ハイブリダイズ）する配列である。そのような条件は、当該技術分野において周知であり文書化されている。例えば、そのような配列は、特定のＤＮＡ配列と非ストリンジェントな条件下（例えば、６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、室温）でハイブリダイズでき、かつ、低ストリンジェンシー（例えば、２×ＳＳＣ、室温、より好ましくは、２×ＳＳＣ、４２℃）、又は、高ストリンジェンシー（例えば、２×ＳＳＣ、６５℃）の条件下で洗浄しうる（ここで、ＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）。
【００２４】
概括して言えば、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする配列が、本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
Ｐｙｔｈｉｕｍ感染の検出には、前記一組のプライマーの１つのプライマーは、式Ｉａ〜Ｘｂのいずれか一つ若しくはその前記誘導体の配列からなる又は前記配列を含む化合物であることが好ましい。Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅの感染の検出には、１つのプライマーは、式ＸＩａ〜ＸＩＶｂのいずれか一つ若しくはその前記誘導体の配列からなる又は前記配列を含む化合物であることが好ましい。Ｐｙｔｈｉｕｍ感染の検出には、前記プライマーの１つは、式ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ若しくはＸｂ、若しくはその前記誘導体の配列からなる又は前記配列を含む化合物であることが好ましい。より好ましくは、前記一組のプライマーは、式ＶＩａ及びＶＩｂ、ＶＩＩａ及びＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ及びＶＩＩＩｂ、ＩＸａ及びＩＸｂ、若しくはＸａ及びＸｂ、若しくはその前記誘導体の配列からなる又はその配列を含む２つの化合物である。
【００２６】
Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅの感染の検出には、前記プライマーの一つは、式ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ若しくはＸＩＶｂ、若しくはその前記誘導体の配列からなる又は前記配列を含む化合物であることが好ましい。より好ましくは、前記一組のプライマーは、式ＸＩＩＩａ及びＸＩＩＩｂ、若しくはＸＩＶａ及びＸＩＶｂ、若しくはその前記誘導体の配列からなる又はその配列を含む２つの化合物である。
【００２７】
特に好ましくは、前記プライマーは、式ｎａ及びｎｂの配列からなる又は前記配列を含む配列の２又は３組の化合物を含む。ここで、前記ｎは、ＶＩ〜Ｘ、ＸＩＩＩ及びＸＩＶであって、例えば、ＶＩａ及びＶＩｂ並びにＸＩＩＩａ及びＸＩＩＩｂ、又は、ＶＩａ及びＶＩｂ並びにＸＩＶａ及びＸＩＶｂ又はＸＩＩＩａ及びＸＩＩＩｂ並びにＸＩＶａ及びＸＩＶｂである。このようにして、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ及びＦ．ｃａｒｏｔａｅの２〜３種による感染を検出することができる。
【００２８】
前記１８〜２４塩基のプライマーは、従来の化学技術、例えば、固相合成等により調製することができる。本願において、「一組のプライマー」は、ＤＮＡ増幅（ＰＣＲを含む）の任意の形態においてＤＮＡ断片を増幅するために利用される異なる配列の２つの異なるプライマーに関連する。前記プライマーは、それゆえ、それぞれ、増幅されるＤＮＡの反対側（相補）鎖にアニール（結合又はハイブリダイズ）する。前記プライマー結合部位は、増幅される領域の側面に位置し、したがって、確実に、所定の領域のみが増幅されることとなる。
【００２９】
本願において、「プライマー」の用語は、ターゲットＤＮＡ（又は核酸）配列に結合又はアニールするオリゴヌクレオチドに関連する。そのようなプライマーは、ヌクレオチドの短いポリマーであって、一般的に、ＤＮＡ増幅のプライミングのために使用する場合、上記定義のとおり、１８〜２４ヌクレオチド長である。プライミングの用語は、オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列との間に起こる、ＤＮＡ増幅の合成を開始するための前記ターゲットに結合した３’ＯＨの自由端を提供する任意のアニーリング事象を含む。
【００３０】
本願において、「プライマー」は、さらに、オリゴヌクレオチドプローブとして利用することができる。なぜなら、前記プライマーは、上記定義のとおり、相補又は実質的に相補の配列に特異的にハイブリダイズ（又はアニール）可能であるからである。当該技術分野の当業者であれば、そのようなオリゴヌクレオチドが、通常１３〜３５ヌクレオチド長であり、すなわち、１５〜２５、２０、２５、３０又は３５ヌクレオチド長であって、しかし、また、より短いもの、すなわち、８〜１５ヌクレオチド長、すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチド長であってもよいことを理解するであろう。
【００３１】
２組のプライマーを、本発明の方法で使用することが特に好ましい。一方の一組は、式Ｉａ及び／又はＩｂ（又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、ＶＩａ及び／又はＶＩｂ）の配列にハイブリダイズするプライマーを含み、他方の一組は、式ＩＩａ及び／又はＩＩｂ（又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、ＶＩＩａ及び／又はＶＩＩｂ）の配列にハイブリダイズするプライマーを含む。さらに、式ＩＩＩａ及び／又はＩＩＩｂ（又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、ＶＩＩＩａ及び／又はＶＩＩＩｂ）の配列にハイブリダイズするプライマーを含む一組を、また、使用することがより好ましい。またさらに、式ＩＶａ及び／又はＩＶｂ（又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、ＩＸａ及び／又はＩＸｂ）の配列とハイブリダイズするプライマーを含む一組を使用することが、一層より好ましい。最も好ましくは、式Ｉａ〜Ｖｂの配列にハイブリダイズする５組のプライマーを使用することである。式Ｉａ〜Ｖｂ（又はＶＩａ〜Ｘｂ）の一組のプライマーは、それぞれ、Ｐ．ｓｕｌｃａｔｕｍ、Ｐ．ｖｉｏｌａ  Ｌ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｐ．ｓｙｌｖａｔｉｕｍ及びＰ．ｖｉｏｌａｅ／Ｐ．ｐａｒｅｏｃａｎｄｒｕｍの感染を検出する。
【００３２】
また、２組のプライマーを本発明において使用することが、特に好ましい。一方の一組のプライマーは、式ＸＩａ及び／又はＸＩｂ（又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、ＸＩＩＩａ及び／又はＸＩＩＩｂ）の配列にハイブリダイズするプライマーを含み、他方は、式ＸＩＩａ及び／又はＸＩＩｂ（又は、前者ほど好ましくはないが、好ましくは、ＸＩＶａ及び／又はＸＩＶｂ）の配列にハイブリダイズするプライマーを含む。すわわち、それぞれ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ及びＦ．ｃａｒｏｔａｅの感染を検出するためのものである。これらの２組は、前パラグラフにおいて言及した２組に加えて、又は、替えて使用することができる。
【００３３】
そのような、２以上の一組のプライマーの使用は、同時でもよいが、試料を分注した別個のＰＣＲ反応で使用することが、より好ましい。
【００３４】
前記プライマーは、それら自身が新規な化合物であり、本発明の更なる一態様を成す。
【００３５】
この態様として、本発明は、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂの配列から選択される（例えば、式Ｉａ〜Ｘｂ又はＸＩａ〜ＸＩＶｂの一つである）オリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
【００３６】
さらなる態様として、本発明は、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂの配列から選択される少なくとも一つ（例えば、式Ｉａ〜Ｘｂ又はＸＩａ〜ＸＩＶｂの一つ）であるオリゴヌクレオチド配列に、必要に応じて、担体とともに、ハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマー組成物を提供する。
【００３７】
一実施形態において、本発明の組成物は、式Ｉａ及びＩｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ、ＩＶａ及びＩＶｂ、又は、Ｖａ及びＶｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことが好ましく、必要に応じて、２、３、４、又は、５組を含む。その他の実施形態において、本発明の組成物は、式ＸＩａ及びＸＩｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに／又は、式ＸＩＩａ及びＸＩＩｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含むことが好ましい。特に好ましい実施形態において、前記組成物は、式Ｉａ及びＩｂ、ＩＩａ及びＩＩｂ、ＩＩＩａ及びＩＩＩｂ、ＩＶａ及びＩＶｂ、又は、Ｖａ及びＶｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、必要に応じて、２、３、４、又は、５組を含み、その他にもまた、式ＸＩａ及びＸＩｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマー、並びに／又は、式ＸＩＩａ及びＸＩＩｂのオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一組の１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
【００３８】
本発明の方法の検出段階では、例えば、放射性同位体、又は、発色団、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）若しくは酵素等により標識されたプライマーを使用できる。そのように標識化された本発明のプライマー、及び、それらを含む組成物も、本発明の更なる態様である。
【００３９】
さらなる態様として、本発明は、本発明の検査方法を実行するためのキットを提供する。前記キットは、少なくとも一組の本発明にかかるプライマーを、前記検査方法を実行するための使用説明書と共に含む。前記キットは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼもまた、有利に含む。前記キットは、ＤＮＡ抽出のための一揃いの構成部品（例えば、化学組成物等）を、特に有利に含む。
【００４０】
土壌試料は、各ＰＣＲ反応につき約０．５ｇであるが、大規模試料から採集することが好ましい。前記大規模試料は、例えば、少なくとも１００ｇ、より好ましくは、少なくとも２００ｇ、例えば、最大１０００ｇを、（例えば、前記大規模試料の物理的混合により、又は、前記大規模試料の異なる部分の部分標本を共に加えることにより）混合し、分析する試料が、前記大規模試料の典型となるようにする。この点が、前記典型試料が実施されない従来のＰＣＲに基づく土壌のＤＮＡ分析と、明確な対照となる。前記試料は、単一の場所から採集してもよく、又は、生育エリア内（例えば、田畑）の複数の場所からの試料を組合せてもよい。田畑の異なる場所からの複数の試料は、別個の分析が好ましいが、経済性の点からは、組合せた試料の解析が好ましい。
【００４１】
前記土壌は、深さ３０ｃｍまで、特に、１〜２０ｃｍで採集することが好ましい。また、試料は、生育エリアの周辺部分及び中央部分の両方から採集することが好ましく、生育エリアの端から少なくとも３ｍの距離（例えば、生垣、溝、フェンス、路等）から採集することも好ましい。
【００４２】
前記田畑が、既に植物、例えば、ニンジンの生産に使用されている場合、前記土壌試料は、１０ｃｍ以内の土壌から、より好ましくは、生育する植物の５ｃｍ以内から、有利に採集される。とりわけ都合よくは、植物を根こそぎにして、その根こそぎにした植物上の土壌を前記検査に使用する。
【００４３】
我々は、前記土壌中の腐植土が、本発明の検査方法の正確性を低減させることを見出した。それゆえ、前記土壌試料から病原体ＤＮＡの抽出は、好ましくは下記工程を含む。
【００４４】
（１）少なくとも１００ｇ、好ましくは、少なくとも２００ｇの土壌の混合試料から採取した約０．１〜１ｇ、好ましくは、０．５ｇの土壌試料を、真菌細胞溶解液と接触させ、
（２）少なくとも１００００×ｇで少なくとも１０分間遠心分離をして上清を回収し、
（３）前記上清を粒子状のＤＮＡ結合剤と接触させ、
（４）遠心分離をしてＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（５）前記粒子をカオトロピック試薬水溶液（例えば、グアニジンチオシアン酸水溶液）に懸濁し、遠心分離してＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（６）少なくとも１回前記（５）工程を繰返し、
（７）前記粒子を、塩／エタノール洗浄液に懸濁し、遠心分離してＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（８）少なくとも１回前記（７）工程を繰返し、
（９）前記粒子を、ＤＮＡ放出剤水溶液に懸濁し、
（１０）遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収し、そして、必要に応じて、
（１１）前記粒子を、ＤＮＡ放出剤水溶液に再懸濁し、上清を回収して混合する。
【００４５】
市販のキットである土壌用ファストＤＮＡスピンキット（ＱｂｉｏｇｅｎｅＩｎｃ／Ｂｉｏ１０１社製  Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いた土壌からのＤＮＡ抽出と比較すると、このＤＮＡ抽出手順は、溶解後のかなり長い遠心分離、及び、ＤＮＡを保持する粒子の洗浄の繰返しを含む。また、概して、結合マトリクスからＤＮＡを自由にするための放出剤を、かなり大量に使用する。それにもかかわらず、結果として生ずる前記手順は、植物が生育する全ての範囲の土壌の型に対して、よい結果を与える。従来の抽出技術は、比較すると、検査に用いる土壌の型に非常に過敏である。
【００４６】
それゆえ、さらなる態様として、本発明は、土壌から核酸（例えば、ＤＮＡ）を抽出する方法を提供する。この方法は、下記工程を含む。
【００４７】
（１）少なくとも１００ｇ、好ましくは、少なくとも２００ｇの土壌の混合試料から採取した約０．１〜１ｇ、好ましくは、０．５ｇの土壌試料を、真菌細胞溶解液（例えば、セラミックとシリカの粒子）と接触させ、
（２）少なくとも１００００×ｇで少なくとも１０分間遠心分離をして上清を回収し、
（３）前記上清を粒子状のＤＮＡ結合剤と接触させ、
（４）遠心分離をしてＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（５）前記粒子をカオトロピック試薬水溶液（例えば、グアニジンチオシアン酸水溶液）に懸濁し、遠心分離してＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（６）少なくとも１回前記（５）工程を繰返し、
（７）前記粒子を、塩／エタノール洗浄液（一般的に、水／エタノールの体積比は、約１：１０）に懸濁し、遠心分離してＤＮＡを保持する前記粒子を回収し、
（８）少なくとも１回前記（７）工程を繰返し、
（９）前記粒子を、ＤＮＡ放出剤水溶液に懸濁し、
（１０）遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収し、そして、必要に応じて、
（１１）前記粒子を、ＤＮＡ放出剤水溶液（例えば、発熱物質を含まない水中のＤＮａｓｅ）に再懸濁し、上清を回収して混合する。
【００４８】
さらなる態様として、本発明は、核酸（例えば、ＤＮＡ）を土壌から抽出するキットを提供する。前記キットは、下記のものを、前記キットを本発明の前記方法に使用するための使用説明書と共に含む。
【００４９】
（ｉ）真菌細胞溶解水溶液。
（ｉｉ）ＤＮＡ結合粒子。
（ｉｉｉ）カオトロピック試薬水溶液（例えば、グアニジンチオシアン酸水溶液）。
（ｉｖ）塩及びエタノール水溶液。
（ｖ）ＤＮＡ放出剤水溶液。
【００５０】
分析される前記試料が、土壌よりはむしろ植物組織の試料の場合、表面組織、とりわけ、根（又は、塊茎）の表面組織が好ましい。そのような試料は、例えば、必要に応じて、土壌を取り除くために洗浄し、ふき取り、又は、リンスした後に、前記根（又は、塊茎表面）を剥がすことで採集できる。前記試料は、生育期間又は貯蔵期間の任意の段階で採集してもよいが、（キャビティスポットに関するＰｙｔｈｉｕｍ  ｓｓｐ．の分析の場合は、）播種２週間後から収穫まで、より好ましくは、播種４週間後から収穫までに採集することが好ましい。前記植物としては、ニンジンが好ましいが、その場合、我々は、ニンジンの根の不飽和有機化合物が、本発明の検査方法の正確性を低減することを見出した。それゆえ、植物組織試料から病原体ＤＮＡの抽出は、好ましくは下記工程を含む。
【００５１】
（ｉ）少なくとも２０ｍｇの乾燥粉末状の植物組織（好ましくは、皮等の表面組織）を、少なくとも５μＬ／ｍｇ−乾燥組織の真菌細胞溶解水溶液と接触させ、
（ｉｉ）インキュベートし、
（ｉｉｉ）少なくとも４．５μＬ／ｍｇ−乾燥組織のタンパク質及び多糖類沈殿剤水溶液と混合し、
（ｉｖ）遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収し、
（ｖ）ろ過し、
（ｖｉ）ＤＮＡを含むろ液をＤＮＡ結合担体と接触させ、遠心分離し、
（ｖｉｉ）ＤＮＡを保持する前記担体をエタノール水溶液で洗浄し、遠心分離して液相を取り除き、
（ｖｉｉｉ）少なくとも１回前記（ｖｉｉ）工程を繰返し、
（ｉｘ）ＤＮＡを保持する前記担体を乾燥し、
（ｘ）ＤＮＡを保持する前記担体をＤＮＡ放出剤水溶液と接触させ、遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収する。
【００５２】
市販のＧｅｎＥｌｕｔｅ植物ゲノムＤＮＡキット（シグマ社製）を用いた植物組織からのＤＮＡ抽出と比べると、このＤＮＡ抽出手順は、乾燥粉末の植物利用を使用すること、大量の溶解剤及び沈殿剤の水溶液を使用すること、エタノールを取り除くためにＤＮＡを保持する担体を乾燥させることを含む。それにもかかわらず、前記手順は、著しくよい結果をもたらす。それゆえ、さらなる態様としては、本発明は、宿主植物組織から病原体ＤＮＡを抽出する方法を提供する。前記方法は、下記工程を含む。
【００５３】
（ｉ）少なくとも２０ｍｇの乾燥粉末状の植物組織（好ましくは、皮等の表面組織）を、少なくとも５μＬ／ｍｇ−乾燥組織の真菌細胞溶解水溶液と接触させ、
（ｉｉ）インキュベートし、
（ｉｉｉ）少なくとも４．５μＬ／ｍｇ−乾燥組織のタンパク質及び多糖類沈殿剤水溶液と混合し、
（ｉｖ）遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収し、
（ｖ）ろ過し、
（ｖｉ）ＤＮＡを含むろ液をＤＮＡ結合担体と接触させ、遠心分離し、
（ｖｉｉ）ＤＮＡを保持する前記担体をエタノール水溶液で洗浄し、遠心分離して液相を取り除き、
（ｖｉｉｉ）少なくとも１回前記（ｖｉｉ）工程を繰返し、
（ｉｘ）ＤＮＡを保持する前記担体を乾燥し、
（ｘ）ＤＮＡを保持する前記担体をＤＮＡ放出剤水溶液と接触させ、遠心分離してＤＮＡを含む上清を回収する。
【００５４】
さらなる態様として、本発明は、宿主植物組織から病原体ＤＮＡを抽出するキットを提供する。前記キットは、下記のものを、前記キットを宿主植物組織から病原体ＤＮＡを抽出するための使用説明書と共に含む。
【００５５】
（ａ）真菌細胞溶解剤。
（ｂ）タンパク質及び多糖体沈殿剤。
（ｃ）ＤＮＡ結合担体。
（ｄ）エタノール洗浄水溶液。
（ｅ）ＤＮＡ放出剤水溶液。
【００５６】
これらの技術において、前記真菌細胞溶解剤は、例えば、酵素（例えば、Ｌ１３９３若しくはＬ１４１２：シグマ社製）又は、緩衝化界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン若しくはドデシル硫酸ナトリウム）等であってもよい。
【００５７】
これらの技術において、タンパク質、多糖類及び核酸は、異なる段階で分離することができる。タンパク質は、例えば、溶液の浸透圧を調整することで、核酸を前記溶液中に残したまま沈殿させることができる。例えば、塩、一般的には、高塩濃度溶液、他えば、３Ｍ酢酸ナトリウムを加える。あるいは、タンパク質は、例えば、クロロホルムやフェノール等の有機溶媒を使用して抽出できる。
【００５８】
試料から抽出されたＤＮＡは、一般的には、本発明のプライマーを使用したＰＣＲに用いられる前に、精製される。これは、例えば、クロマトグラフィー等の従来の方法で実施できる。例えば、ＤＮＡを精製するために、マイクロバイオスピンクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ社製、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を、不溶性ポリビニルポリピロリドン粉末（例えば、Ｐ６７５５：シグマ社製）と併せて使用できる。
【００５９】
式Ｉａ及びＩｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約６４６ｂｐであり、式ＩＩａ及びＩＩｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約３５２ｂｐであり、式ＩＩＩａ及びＩＩＩｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約３８０ｂｐであり、式ＩＶａ及びＩＶｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約３３０ｂｐであり、式Ｖａ及びＶｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約３２９ｂｐであり、式ＸＩａ及びＸＩｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約２９４ｂｐであり、式ＸＩＩａ及びＸＩＩｂの配列にハイブリダイズする一組のプライマーで増幅されるＤＮＡセクションは、約３５９ｂｐである。
【００６０】
ＰＣＲ反応自体は、従来どおりに実施できる。例えば、前記一組のプライマー、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（以下、「ヌクレオチド」という）、及び、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｐポリメラーゼ：Ｒｏｃｈｅ社製）を使用できる。一般的に、十分なＰＣＲ反応は、少なくとも２５サイクル、より好ましくは、３０〜５０サイクルである。
【００６１】
当然ながら、化学修飾ヌクレオチド、その類似物若しくはその誘導体を含み、標識化ヌクレオチドを含む、任意の適したヌクレオチドが使用できる。
【００６２】
次に、増幅されたＤＮＡは、存在する場合、従来技術、例えば、ゲル分離又は標識化プローブ（例えば、放射性同位元素標識、若しくは、発色団／蛍光団標識プローブ）により検出することができる。標識化プローブを使用する場合、一般には、前記一組のプライマーの一方の標識化、又は、ＰＣＲ増幅断片に特異的にハイブリダイズ可能な標識化オリゴヌクレオチドが含まれる。この実施形態において、前記ＰＣＲ産物は、一般的に、ＰＣＲ増幅中に光検出器により検出し、又は、多穴性担体に取り込まれ、標識化プローブで処理されて洗浄された後、前記担体表面に保持されたプローブのシグナルを、例えば、光度計若しくは放射線検出器を使用して検出することができる。ＰＣＲ反応において、一組を超えるプライマーが使用された場合、同様に、１を超えるプローブが使用でき、同一又は異なる方法で標識できる。例えば、異なる特有の吸収若しくは発光エネルギー又は波長の標識を使用できる。
【００６３】
あるいは、ＰＣＲは、１つ以上の標識化ヌクレオチド、例えば、蛍光団で標識されたもの等を用いて実施でき、増幅反応混合液中のそのような標識は、標準的な手段で検出できる。
【００６４】
増幅されたＤＮＡの検出は、土壌試料における病原体の蔓延の定性的、半定量的又は定量的な指標を提供できる。例えば、単位重量当たりの細胞数等である。又、増幅されたＤＮＡの検出は、土壌の病原体含有量が所定の閾値の上か下かの指標を提供できる。例えば、植物作物の植付けをするかしないかや、殺真菌剤を適用するかしないかを決定するための境界値等である。
【００６５】
本発明の方法の特に好ましい実施形態においては、前記土壌試料の一部を、また、他の植物の根の病気を引き起こす真菌病原体の存在について同様の方法で検査することが好ましい。例えば、輪腐れ病（Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ種、とりわけ、Ｐ．ｍｅｇａｓｐｅｒｍａに起因する）、グレイモールド（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａに起因する）、スクレロチナロット（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍに起因する）、カラロプシスロット（Ｃｈａｌａｒｏｐｓｉｓ  ｔｈｉｅｌａｖｉｏｄｅｓに起因する）及びＡｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｄａｕｃｉ、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ  ｃａｒｏｔａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ等に引き起こされる他の病気が挙げられる。
【００６６】
本発明の方法が、ニンジン作物がＭ．ａｃｅｒｉｎａ及び／又はＦ．ｃａｒｏｔａｅに感染していることを示す場合、その収穫した作物は、約４週間以内に消費又は加工（例えば、調理、缶詰又は瓶詰）されるべきである。
【００６７】
本発明の検査方法で使用される一組のプライマーは、明らかに、植物（例えば、ニンジン）のＤＮＡそれ自体にハイブリダイズしない。本発明の方法は、ニンジンが育成される又は育成されている田畑の土壌への使用に特に適しているが、本発明の方法は、また、一般的に、植物（特に、根菜類）及びポテト、とりわけ、アメリカボウフウ（ｐａｒｓｎｉｐ）、セロリ、レタス、アブラナ属（ｂｒａｓｓｉｃａ）及びポテトを生産する田畑に適用できる。
【００６８】
プライマーＩａ〜Ｘｂに代えて、本発明の方法においては、さらに、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｉｏｌａｅ／Ｐ．ｐａｒｅｏｃａｎｄｒｕｍ  ｌｉｋｅ、Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｐ．ｓｙｌｖａｔｉｕｍ、Ｐ．ｓｕｌｃａｔｕｍ、Ｐ．ｓｕｌｃａｔｕｍ  ｌｉｋｅ及びＰ．ｖｉｏｌａ  Ｌから選択されるＰｙｔｈｉｕｍ種のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプライマーを使用することが可能である。特異的なハイブリダイゼーションとは、前記プライマーが、ＰＣＲ反応において特定のＰｙｔｈｉｕｍ種のＤＮＡの増幅に使用でき、非病原性Ｐｙｔｈｉｕｍ種のＤＮＡ又はニンジンのＤＮＡを増幅には使用できないことを意味する。一般的には、ニンジンＤＮＡ、並びに、例えば、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａｔｕｍＣＢＳ６７６．９５及びＰ．ｍｏｎｏｓｐｅｒｍｕｍＣＢＳ７９０．９５等の寄託Ｐｙｔｈｉｕｍ株のＤＮＡに対して特異性を検査することができる。これらの株は、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓに寄託されており、公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｋｎａｗ．ｎｌ／ａｄｄｒｅｓｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）。本発明の方法及びキットにおいて、式Ｉａ〜Ｘｂのプライマーに代えてこれらのプライマーを使用することは、本発明の範囲内であると考えられる。
【００６９】
本願に記載するプライマーを使用した真菌ＤＮＡのＰＣＲ増幅は（感染試料の場合）、ゲルで検出できるオリゴヌクレオチドを産出するが、オリゴヌクレオチドを検出する他のルーチン方法を使用できる。例えば、ＰＣＲ反応においては、標識化ヌクレオチドが使用でき、結果として、それ自体が標識化されたオリゴヌクレオチドを産出できる。オリゴヌクレオチドが、（例えば、クロマトグラフィーによって）未反応ヌクレオチドと分離している場合には、標識（例えば、放射性同位体標識若しくは発色団若しくは蛍光団）を検出することで、検出できる。さらなるＤＮＡ断片検出方法は、表面上に前記断片を捕捉できる「プライマー」が固定化された担体（又は固体支持体）を使用するものである。そして、結合した断片は、例えば、表面プラズモン共鳴により、又は、標識ヌクレオチドを使用してＰＣＲを実施した場合は標識を検出して、検出することができる。そのような実施形態において、前記プライマーは、当然に、それらの相補配列にハイブリダイズ（アニール）してオリゴヌクレオチドプローブを捕捉するように作用する。
【００７０】
一実施形態において、本発明のプライマーが相補的なＤＮＡ断片の捕捉に利用される場合、結合したＤＮＡは、当該技術分野の任意の公知方法で検出できる。そのような方法は、前記ＤＮＡ断片と前記プライマーへの結合について競合する標識又は非標識断片を使用する競合検査を含む。表面プラズモン共鳴は、前記プライマーと結合した非標識断片を検出することに使用できる。あるいは、前記ＤＮＡ断片に結合する標識化プローブを使用するサンドイッチ検査も可能であると考えられ、非結合又は結合プローブの存在が検出され、ＤＮＡ断片が存在するかどうかが示される。
【００７１】
選択的な態様として、検出工程において、前記プライマーは、ＰＣＲ反応のオリゴヌクレオチド産物の捕捉に使用できる。この態様において、前記プライマーは、担体、例えば、プレート、ロッド、ビーズ等の固体支持体上に固定され、これにより、前記プライマー配列と相補的なオリゴヌクレオチドも固定される。固定化されたオリゴヌクレオチドは、次に、標準的な方法、例えば、ＰＣＲ反応において標識化ヌクレオチドを使用した場合には標識を検出して、又は、表面プラズモン共鳴により、検出できる。この態様において、ＰＣＲ反応は、本願に記載のプライマーを使用して実施できるが、あるいは、一般（すなわち、ユニバーサル）プライマーを代わりに使用できる。なぜなら、固定化された特異的プライマーが、ＰＣＲ産物の中から感染を示すオリゴヌクレオチドを分離する役割を果たすからである。前記プライマーは、従来の手段、例えば、「Ｌａａｓｓｒｉら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１２：  ６７−７８  （２００３）」又は、「Ｋｅｒａｍａｓら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １７：  １８７−１９６  （２００３）」に記載の方法により、前記担体表面に結合できる。望ましくは、前記担体は、複数位置で捕捉用プライマーが備えられることが好ましい。例えば、異なるプライマーは、異なる（既知）の部位に備えられ、そして、好ましくは、少なくとも１つの部位に一般（ユニバーサル）プライマーがコントロールとして備えられることが好ましい。最も好ましくは、前記担体は、マイクロアレイプレートの形をとり、例えば、異なるプライマーが、アレイの異なる部位にプリントされることが好ましい。
【００７２】
さらなる態様として、本発明は、病原性真菌種、とりわけ、Ｍ．ａｃｅｒｉｎａ、Ｆ．ｃａｒｏｔａｅ、及び、Ｐｙｔｈｉｕｍ種による土壌又は植物の真菌感染を検出するアレイ法であって、土壌又は植物の試料を得ること、前記試料を処置して真菌細胞を溶解すること、一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、前記真菌細胞の溶解により放出されたＤＮＡ上でポリメラーゼ連鎖反応をすること、前記ポリメラーゼ連鎖反応で産出されたＤＮＡ断片を式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列のいずれか一つにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基を含むプライマーがその表面に固定された担体と接触させること、及び、前記プライマーに結合したＤＮＡ断片を検出することを含むアレイ法を提供する。
【００７３】
【化７】
2006504424.tif 000004
【００７４】
さらなる態様として、本発明は、式Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂ、Ｖａ、Ｖｂ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩＩａ、ＶＩＩｂ、ＶＩＩＩａ、ＶＩＩＩｂ、ＩＸａ、ＩＸｂ、Ｘａ、Ｘｂ、ＸＩａ、ＸＩｂ、ＸＩＩａ、ＸＩＩｂ、ＸＩＩＩａ、ＸＩＩＩｂ、ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのオリゴヌクレオチド配列から選択されるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な１８〜２４塩基のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つをその表面に固定化された担体、例えば、マイクロアレイプレートを含む。本発明は、また、本発明の担体及び本発明の検査方法を実施するための使用説明書を含む本発明の検査方法を実施するためのキットを提供する。
【００７５】
以下に、本発明を、限定されない実施例により、さらに説明する。
【実施例１】
【００７６】
実施例１〜１０
式ＶＩａ〜Ｘｂのプライマー
これらは、式ごとに発注し、従来法を使用して、商業的に調達した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、Ｓｅｒａｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。あるいは、これらは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ装置を使用して、支持体マトリクス上で調製できる。調製されたプライマーは、次に、１ｍＬアンモニア中で５５℃オーバーナイトのインキュベーションすることで、脱保護され、前記支持体マトリクスから遊離される。保護基及びアンモニアは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＮＡＰ１０カラムを使用したクロマトグラフィーにより除去でき、プライマーは、１ｍＬの水で溶出される。プライマー濃度は、２６０ｎｍでのファクター１ＡＵ＝２０μｇ／ｍＬとして、分光光度法で測定できる。
【００７７】
実施例１１
土壌からのＤＮＡ抽出
この実施例では、土壌用ファストＤＮＡスピンキット（ＱｂｉｏｇｅｎｅＩｎｃ／Ｂｉｏ１０１社製）が使用される。土壌試料は、以下のように採集され、処理される。
１．３００〜５００ｍｇの土壌を、Ｍｕｌｔｉｍｉｘ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｍａｔｒｉｘチューブに加え、氷上に置く。ＦａｓｔＰｒｅｐ装置で、２０秒、スピード４．５で処理して、氷上に置く。９８０μｌのリン酸ナトリウムバッファー及び１２２μｌのＭＴバッファーを加え、ＦａｓｔＰｒｅｐ装置で、３０秒、スピード５．５で処理して、氷上に置く。
２．遠心分離を１４，０００×ｇで１５分間行い、氷上に置く。
３．上清を新しいチューブ（１．５ｍｌチューブ）に移し、２５０μｌのＰＰＳを加える。
４．手で前記チューブを１０回反転させて混合し、遠心分離を１４，０００×ｇで５分間行う。
５．上清を新しいチューブ（２ｍｌチューブ）に移し、１ｍｌの再懸濁された結合マトリクス懸濁液を加え、手で２回反転する。
６．遠心分離を１４，０００×ｇで５秒間行い、上清を排出する。
７．１ｍｌの５．５Ｍグアニジンチオシアン酸水溶液に再懸濁する。
８．遠心分離を１４，０００×ｇで５秒間行い、上清を排出する。
９．６００μｌの５．５Ｍグアニジンチオシアン酸水溶液に再懸濁し、スピンフィルターを備えた新しいチューブに移す。
１０．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、キャッチチューブを空にする。
１１．５００μｌのＳＥＷＳ−Ｍ（塩／エタノール水溶液）をスピンフィルターに加え（洗浄１）、マトリクスを再懸濁する。
１２．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、キャッチチューブを空にする。
１３．５００μｌのＳＥＷＳ−Ｍをスピンフィルターに加え（洗浄２）、マトリクスを再懸濁する。
１４．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、キャッチチューブを空にする。
１５．遠心分離を１４，０００×ｇで２分間行う。
１６．スピンフィルターを新しいチューブに配置し、５分間風乾する。
１７．１００μｌのＤＥＳを加え、マトリクスを再懸濁する。
１８．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行う。
１９．冷蔵庫又は−２０℃で保管する。
【００７８】
実施例１２
ニンジンの皮からのＤＮＡ抽出
この実施例では、ＧｅｎＥｌｕｔｅ植物ゲノムＤＮＡキット（シグマ社製）が使用される。ニンジン組織試料は、ニンジンを水で洗った後、葉っぱから先端までの長さの三分の一を剥ぎ取り調製した。剥ぎ取ったものは、凍結乾燥し、パウダーとした。ＤＮＡ抽出は、以下のように進む。
１．約５０ｍｇの乾燥ニンジン組織パウダーを微小遠心チューブに配置する。
２．７００μｌの溶解溶液パートＡ及び１００μｌの溶解溶液パートＢを加える。
３．ボルテックス及び反転により混合し、時折反転させて６５℃で１０分間インキュベートする。
４．２６０μｌ沈殿溶液を加え、反転して混合する。
５．氷上に５分間置く。
６．遠心分離を（細胞のデブリ、タンパク質及び多糖類を小球状とするため、）１４，０００×ｇで５分間行う。
７．上清を、注意深くフィルターカラム（コレクションチューブのブルーフィルター）に移す。
８．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、上清を排出する。
９．７００μｌの結合溶液を加え、３回上下にピペッティングして混合する。
１０．約７００μｌを、核酸結合カラム（コレクションチューブに赤いＯリングがついた無色のもの）に移す。
１１．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、コレクションチューブを空にする。
１２．前記（９）工程の液体の残りを核酸結合カラムに移す。
１３．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、コレクションチューブを捨てる。
１４．カラムを新しいコレクションチューブに配置し、５００μｌの希釈した洗浄溶液を加える（洗浄１）。
１５．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行い、コレクションチューブを空にする。
１６．５００μｌの希釈した洗浄溶液を加える（洗浄２）。
１７．遠心分離を１４，０００×ｇで１分間行う。
１８．カラムを新しいコレクションチューブに移して、５分間風乾する。
１９．１００μｌの予め加温した（６５℃）溶出溶液で、遠心分離を１４，０００×ｇで１分間することで、ＤＮＡを溶出する。
【００７９】
実施例１３
ＤＮＡ精製
この実施例では、マイクロバイオスピンクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ社製）及び不溶性ポリビニルポリピロリジンパウダー（Ｐ６７５５：シグマ社製）が使用される。ＤＮＡ精製は、以下のように行われる。
１．カラムを１．５ｍｌ遠心チューブに配置する。
２．カラムのエッジの１ｍｍ下までポリビニルポリピロリジンを充填し、４００ｍｌの２回蒸留Ｈ2Ｏを加える。
３．遠心分離を、４，０００ｒｐｍ（卓上遠心分離機）で５分間行う。
４．カラムを新しい１．５ｍｌ遠心チューブに移し、実施例１１又は１２のＤＮＡ抽出物を加える。
５．遠心分離を、４，０００ｒｐｍ（卓上遠心分離機）で４分間行い、カラムを捨てる。
６．−２０℃で保管する。
【００８０】
実施例１４〜１８
実施例１〜１０のプライマーを使用したＤＮＡ増幅
反応は、全容積２５μｌで行われ、ＰＣＲ反応混合物は、実施例１〜８のプライマーに対して、以下のように調製される。
１５．８７μｌ  Ｈ2Ｏ
２．５μｌ      １５ｍＭ  ＭｇＣｌ2含有１０×ＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ社製）
２．０μｌ      ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ
２．５μｌ      ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１ｍｇ／ｍｌ
０．５μｌ      フォワードプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．５μｌ      リバースプライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．１３μｌ    ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）５Ｕ／μｌ
１．０μｌ      鋳型ＤＮＡ
実施例９及び１０の一組のプライマーに対しては、１４．３７μＬのＨ2Ｏを使用し、１．５μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2をさらに使用する。
【００８１】
実施例１〜６のプライマーに使用されるＰＣＲプログラムは、以下のとおり。
１．  変性  ９４℃５分
２．  ９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル
３．  最終伸張  ７２℃２分
４．  保存  ４℃
実施例７〜１０のプライマーに使用されるＰＣＲプログラムは、以下のとおり。
１．  変性  ９４℃５分
２．  ９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃３０秒を３０サイクル
３．  最終伸張  ７２℃２分
４．  保存  ４℃
増幅後、１０μｌのＰＣＲ産物に、２μｌのＤＮＡローディングバッファーを加え、１．２％アガロースゲルを用いて、１×ＴＢＥ又は１×ＴＡＥバッファー中、１００Ｖ、４５分間、電気泳動をする。
【００８２】
実施例１４〜１８において、フォワード及びリバースプライマーは、それぞれ、実施例１及び２の式ＶＩａ及びＶＩｂ、実施例３及び４の式ＶＩＩａ及びＶＩＩｂ、実施例５及び６の式ＶＩＩＩａ及びＶＩＩＩｂ、実施例７及び８の式ＩＸａ及びＩＸｂ、並びに、実施例９及び１０の式Ｘａ及びＸｂのプライマーである。
【００８３】
実施例１９
感度
実施例１／２、３／４、５／６、７／８及び９／１０の一組のプライマーを、下記のものから抽出したＤＮＡに対してテストした。
Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｕｌｃａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｕｌｃａｔｕｍ  ｌｉｋｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｎｇｕｓｔａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｑｕａｔｉｌｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｃｏｌｏｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｃｏｎｎａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｅｌｉｅｎｓｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｔｏｃｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍａｍｉｌａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｉｄｄｌｅｔｏｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｏｎｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｍｙｒｉｏｔｙｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｒｏｓｔｒａｔｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｔｒａｃｈｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒｏｕｐ  Ｆ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒｏｕｐ  Ｔ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｇｒｏｕｐ  ＨＳ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｙｌｖａｔｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｉｏｌａｅ  Ｌ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｉｏｌａｅ／Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｐａｒｅｏｃａｎｄｒｕｍ  ｌｉｋｅ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｓｐ．、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐ．、健康体のニンジン、Ｍｙｃｏｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒａ  ａｃｅｒｉｎａ、及び、Ｆｉｂｕｌａｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｃａｒｏｔｅａ。
【００８４】
その結果を下記表１に示す。
【００８５】
【表１】
2006504424.tif 000005
【００８６】
実施例２０〜２３
式ＸＩＩＩａ〜ＸＩＶｂのプライマー
これらは、式ごとに発注し、従来法を使用して、商業的に調達した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社、Ｓｅｒａｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。あるいは、これらは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ  Ｐｌｕｓ装置を使用して、支持体マトリクス上で調製できる。調製されたプライマーは、次に、１ｍＬアンモニア中で５５℃オーバーナイトのインキュベーションすることで、脱保護され、前記支持体マトリクスから遊離される。保護基及びアンモニアは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＮＡＰ１０カラムを使用したクロマトグラフィーにより除去でき、プライマーは、１ｍＬの水で溶出される。プライマー濃度は、２６０ｎｍでのファクター１ＡＵ＝２０μｇ／ｍＬとして、分光光度法で測定できる。
【００８７】
実施例２４〜２５
ＤＮＡ増幅
反応は、全容積２５μｌで行われ、ＰＣＲ反応混合物は、以下のように調製される。
１３．７５μｌ  Ｈ2Ｏ
２．５μｌ      １５ｍＭ  ＭｇＣｌ2含有１０×ＰＣＲバッファー（Ｒｏｃｈｅ社製）
２．５μｌ      ｄＮＴＰ  ２ｍＭ
２．５μｌ      ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）１ｍｇ／ｍｌ
１．２５μｌ    フォワードプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）
１．２５μｌ    リバースプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．２５μｌ    ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）５Ｕ／μｌ
１．０μｌ      鋳型ＤＮＡ
使用されるＰＣＲプログラムは、以下のとおり。
１．  変性  ９４℃５分
２．  ９４℃２０秒、６２℃３０秒、７２℃３０秒を４５サイクル
３．  最終伸張  ７２℃２分
４．  保存  ４℃
増幅後、１０μｌのＰＣＲ産物に、２μｌのＤＮＡローディングバッファーを加え、１．２％アガロースゲルを用いて、１×ＴＢＥ又は１×ＴＡＥバッファー中、１００Ｖ、４５分間、電気泳動をする。
【００８８】
実施例２４において、フォワード及びリバースプライマーは、実施例２０及び実施例２１の式ＸＩＩＩａ及びＸＩＩＩｂのプライマーである。実施例２５において、フォワード及びリバースプライマーは、実施例２０及び実施例２１の式ＸＩＶａ及びＸＩＶｂのプライマーである。
【００８９】
前記反応混合物は、あるいは、１５．８７μｌの水、２．５μｌのバッファー（上記のもの）、２．０μｌのｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ、０．５μｌのフォワードプライマー（５０ｐｍｏｌ／ｌ）、０．５μｌのリバースプライマー（５０ｐｍｏｌ／ｌ）、０．１３μｌのＴａｐＤＮＡポリメラーゼ（上記のもの）、１．０μｌのＤＮＡ鋳型、及び、２．５μｌのＢＳＡ（上記のもの）を含んでもよく、そして、産物は、１％のアガロースゲルで、上述のように電気泳動してもよい。
【００９０】
実施例２６
感度
実施例１／２、３／４、５／６、７／８及び９／１０の一組のプライマーを、下記のものから抽出したＤＮＡに対してテストした。
Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｓｙｌｖａｔｉｕｍ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｉｏｌａｅ  Ｌ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｖｉｏｌａｅ／Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｐａｒｅｏｃａｎｄｒｕｍ  ｌｉｋｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｕｌｔｉｍｕｍ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  "ｐｏｗｄｅｒｙ  ｐｏａｅ"、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅ
ｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｖｅｎａｃｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｄｏｃｃｉｕｍ  ｎｉｖａｌｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｐ．、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｓｐ．、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｓｐ、健康体のニンジン、Ｍ．  ａｃｅｒｉｎａ、及び、Ｆ．  ｃａｒｏｔｅａ。
その結果を、下記表２に示す。
【００９１】
【表２】
2006504424.tif 000006
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１〜２８  ＰＣＲプライマーがハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
配列番号２９〜３３  ＰＣＲ用一般プライマー
【配列表】
2006504424000001.app
【国際調査報告】
2006504424.tif 000011
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