(57)【要約】本発明は癌に対する化学療法剤としての環状デプシペプチドの使用に関する。シクロ[(３Ｒ)-３-ヒドロキシデカノイル-Ｌ-セリル-(３Ｒ)-３-ヒドロキシデカノイル-Ｌ-セリル]との名もあるセラタモライドはセラチア・マルセッセンスの種の細菌の培養から単離された環状デプシペプチドである。セラタモライドは異なった癌細胞（白血病、骨髄腫、癌腫等々）の生存度を減少させ、該細胞にアポトーシスを誘導し、非癌性細胞には実質的に何ら作用しない。このため、セラタモライド及びその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物は化学療法抗癌剤として、特に白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、黒色種及び肉腫に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療及び／又は予防のためのセラタモライド又はその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物。
【請求項２】
癌が白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、黒色種及び肉腫からなる群から選択される請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
癌の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、セラタモライド又はその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物の使用。
【請求項４】
癌が白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、黒色種及び肉腫からなる群から選択される請求項３に記載の使用。
【請求項５】
薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と共に、治療的に有効量のセラタモライド又はその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物を活性成分として含有する、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項６】
癌が白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、黒色種及び肉腫からなる群から選択される請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この発明は既知の天然由来の環状デプシペプチドを使用する腫瘍又は癌の治療に関する。
【０００２】
背景
化学療法によってある種の癌を治癒することが可能である。その他多くのタイプの癌でも化学療法は一時的に又は部分的に効果がある。しかしながら、薬物に対して耐性のある癌もある。殆どの抗癌薬はその有用性が限られているので、新しい化学療法抗癌剤に対する需要が存在する。
【０００３】
癌の化学療法の一つの問題は、細胞のある割合だけが常に分裂し、殆どの薬物が細胞集団の分裂を受けている部分のみを破壊することができることである。別の問題は、抗癌薬が正常細胞及び組織をもまた損傷することである。また、癌細胞のなかには最終的に薬物耐性になるものもある。
【０００４】
プログラム細胞死とも呼ばれるアポトーシスは適当なトリガーに応答して細胞を自己破壊に誘導する機構である。アポトーシスは様々な状況で開始せしめられ、例えば細胞が体内においてもはや必要とされていない場合や、その生物の健康を脅かすようになった場合などである。アポトーシスは胚発生と成熟生物の毎日の維持に必要である。アポトーシスの異常な阻害又は開始が癌を含む多くの疾病の原因となる。アポトーシスは、傷害から生じる壊死と呼ばれる他の型の細胞死とは区別される。アポトーシスは細胞増殖を停止させる正常な生理プロセスである。制御できずに増殖し癌性腫瘍を形成する細胞を含む実質的に全ての組織の細胞が、生物のためにアポトーシスを通して死ぬ可能性がある。
【０００５】
アポトーシスは幾つかの化学療法剤の作用に関連している。この数年間にアポトーシスに基づく新規な抗癌薬が幾つかスクリーニングされている。それらは、白血病や肺腫瘍のように高い増殖性を持つ腫瘍に対して、また胃腸腫瘍のように満足できる治療ができないものに対して効果的であることが期待されている。
【０００６】
シクロ[(３Ｒ)-３-ヒドロキシデカノイル-Ｌ-セリル-(３Ｒ)-３-ヒドロキシデカノイル-Ｌ-セリル]との名もあるセラタモライド（Serratamolide）（ＣＡＳ ＲＮ５２８５−２５−６）は、その４つのキラル中心にある特定の立体化学を持ち、以下に示す式を持つ環状デプシペプチドである。これはセラチア・マルセッセンス培養物から１９６１年に初めて単離された。セラタモライドの全合成もまた知られている（M.M. Shemyakin等, Tetrahedron Lett. 1964, pp.47-54）。
【０００７】
セラタモライドが多くの細菌、酵母及び病原性真菌に対して活性を持っていることは非常に早く見出された（H.H. Wasserman等, J. Am. Chem. Soc. 1961, vol.83, p.4107; 1962, vol.84, p.2978）。更に最近では、セラタモライドの湿潤／伝播及び血球凝集性活性が報告されている（T. Matsuyama等, J. Gen. Microbiol. 1986, vol.132, p.865；Y. Kawai等, Eur. J. Biochem. 1988, vol.171, p.73）。しかし、抗癌剤としてのセラタモライドの使用はこれまでに報告も示唆もされていない。
【化１】
2006501291.tif 000002
【０００８】
発明の概要
次の実施例に示すように、セラタモライドが幾つかの癌細胞（白血病、骨髄腫、癌腫等々）の生存度を減少させ、それらにアポトーシスを誘導し、非癌細胞には実質的に作用がないことがここで初めて開示される。これによって、セラタモライドは化学療法抗癌剤として役立つ。
【０００９】
従って、本発明の一態様は、癌の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、セラタモライド又はその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物の使用である。好適な実施態様では、癌は白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、黒色種及び肉腫からなる群から選択される。
【００１０】
癌の治療及び／又は予防のためのセラタモライド又はその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物はまた本発明の一部である。同じように、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体と共に、治療的に有効量のセラタモライド又はその薬学的に許容可能な付加塩及び／又は溶媒和物を活性成分として含有する、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物もまた本発明の一部である。
本発明を限定するものと解釈すべきではない添付の実施例で例証しているように、セラタモライドは、セラチア・マルセッセンス種の細菌培養物から単離することができる。
【実施例】
【００１１】
実施例１：セラタモライドの単離
（バルセロナ大学微生物学部から提供された）細菌セラチア・マルセッセンス２１７０細胞をメタノールと１ＮのＨＣｌの混合物（２４：１）と共に振盪することによってセラタモライドを抽出した。遠心分離（６８００ｘｇ、１５分間）後、上清の溶媒を真空下で蒸発させた。抽出物の大気圧液体クロマトグラフィーを、溶媒としてクロロホルムとメタノールを用いてシリカゲルで実施した。２種の主要な生成物（更にプロジギオシン及びセラタモライドとして特徴付けされる）を含む溶出した有色画分をプールし、クロロホルム／メタノール抽出物を真空蒸発させ、Ｈ２Ｏに再溶解させて凍結乾燥させた。ＶＧ-Ｑｕａｔｔｒｏ(登録商標)三連四重極質量分析計（Micromass, VG-Biotech, U.K.）を使用する熱スプレーイオン化／質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、またボイジャー遅延抽出（ＤＥ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計（Perseptive Biosystems, Framingham, USA）を使用するマトリックス支援デーザー脱離法（ＭＡＬＤＩ）によって試料混合物を分析した。セラタモライドに対して予想される分子量と一致する分子量データ（ｍ／ｚ ５１５）の生成物が、２回の連続のＭＰＬＣ（中圧液体クロマトグラフィー）工程によって有色混合物から単離された。ＭＰＬＣはＣＦＧ(登録商標)Ｐｒｏｍｉｎｅｎｔ／Ｄｕｒａｍａｔポンプ、可変波長検出器ＬＫＢ(登録商標)Ｂｒｏｍｍａ２１５８ＵＮＩＣＯＲＤ ＳＤ（２０６ｎｍフィルター）、ＧｉｌｓｏｎコレクターＦＣ２０５及びＰｈａｒｍａｃｉａ-ＬＫＢ ＲＥＣ１０１レジスターを具備するシステムで実施した。第一の工程では、Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ Ｃ８が逆相ガラスカラム（２０ｘ４ｃｍ）を、０−１００％Ｂ線形勾配（Ａ：０．０１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７、Ｂ：１００％アセトニトリル）、１０００ｍｌ全容積、流量２４０ｍｌ／ｈとして用いた。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ(登録商標)Ｃ１８分析用逆相カラム（２５ｘ０．４ｃｍ）を用いてシマズ機器ＬＣ-６ＡでＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって、またＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによって、溶出した画分を分析した。セラタモライドを含む画分をプールし、真空蒸発させ、凍結乾燥した。第二のＭＰＬＣ精製工程を、Ｃ１８逆相ガラスカラム（２６ｘ２．５ｃｍ）及び３５−５５％Ｂ線形勾配（Ａ：Ｈ２Ｏ ０．０４５％トリフルオロ酢酸、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ ０．０３６％トリフルオロ酢酸）、８００ｍｌ全容積、流量１２０ｍｌ／ｈを用いて実施した。溶出した画分をＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ及びＨＰＬＣによって分析した。所望の画分をプールし、真空蒸発させ、凍結乾燥させた後に、６．６ｍｇの生成物（ＨＰＬＣで測定して９６％純度）を得た。スルホン化ポリスチレンカラム（２５ｘ０．４ｃｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ７３００／６３００）を備えたＢｅｃｋｍａｎ６３００自動分析器でのアミノ酸解析によって定量化を実施した。生成物は質量分析法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法及びガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって特徴付けした。
【００１２】
質量分析：化学イオン化（ＣＩ）による正確な質量測定、（ＡｕｔｏＳｐｅｃ磁気セクター質量分析計Ｎ／Ｓ−Ｘ１３４でメタン使用）：ｍ／ｚ ５１５．３３５０２０（Ｍ＋Ｈ）＋。ＥＳＩ-ＭＳ：ｍ／ｚ ５１５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ：ｍ／ｚ ５１５．８（Ｍ＋Ｈ）＋、５３７．８（Ｍ＋Ｎａ）＋、５５３．８（Ｍ＋Ｋ）＋。分子量データはセラタモライドの分子式：Ｃ２６Ｈ４６Ｎ２Ｏ８（モノアイソトピックＭＷ：５１４．３２５４、平均：５１４．６５９９）に一致した。
【００１３】
ＮＭＲ分光分析：ＮＭＲスペクトルを、それぞれ１Ｈ及び１３Ｃに対して５００ＭＨｚ及び１２５ＭＨｚで操作して、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ-５００又はＢｒｕｋｅｒ ＤＭＸ-５００分光計の何れかで記録した。スペクトルは２９８ＫにてＣＤ３ＯＨ又はＣＤ３ＯＤ中で記録した。ＮＭＲシグナルの割り当ては、１Ｈ-１Ｄ；１Ｈ-ＣＯＳＹ；１３Ｃ-１Ｄ；１３Ｃ-ＤＥＰＴ及び１Ｈ-１３Ｃ-ＨＳＱＣ実験の組み合わせを用いて実施した。結果は過去のＮＭＲ実験と一致していた（C.H. Hassall等, J. Chem. Soc. (B), 1971, pp.1757-61を参照）。
【００１４】
ガスクロマトグラフィー：
（ａ）セラタモライドの酸加水分解。−  セラタモライド（１．５ｍｇ）を１１０℃で３０時間、０．５ｍｌのＨＣｌ ６Ｎで加熱した。試料を清浄な乾燥窒素を用いて蒸発乾固させた。これらの条件でのセラタモライド加水分解産物は２ｅｑのセリンと２ｅｑの３-ヒドロキシデカン酸を生じた。セリンの立体中心を、このアミノ酸をＮ-ペンタフルオロプロピオン酸イソプロピルエステルへ誘導体化し、キラルカラムでのＣＧにより粗生成物を分析することによって決定した。誘導体化Ｌ-セリン及びＤＬ-セリン基準物との試料の同時注入を実施した。
【００１５】
（ｂ）Ｎ-ＰＦＰイソプロピルエステルへのセリンの誘導体化。−  イソプロピルアルコール中２ＮのＨＣｌ ０．５ｍｌを乾燥試料に添加し、１００℃で１時間加熱した。反応混合物を清浄な乾燥窒素を用いて蒸発乾固させた。０．５ｍｌの酢酸エチルと５０μｌのペンタフルオロプロピオン酸無水物（ＰＦＰＡ）を添加し、混合物を１００℃で３０分間加熱した。乾燥窒素を用いて蒸発乾固を再び実施し、残渣を１０μｌの塩化メチレン中に溶解しＣＧによって分析した。
【００１６】
（ｃ）分離。−  セリン誘導体（並びにアミノ酸一般）のＤ-及びＬ-異性体の分離のＧＣ条件は次の通りとした：５０ｍのＣＨＩＲＡＳＩＬ−ＶＡＬ−ＩＩＩカラム（Ａｌｌｔｅｃｈカタログ番号１３１３７）。温度勾配：８０℃（３分）−１９０℃、４℃／分。ＨＰ５８９０ガスクロマトグラフを使用した。一つの主要なピークが、滞留時間がＬ-セリン誘導体に対応する加水分解し誘導体化したセラタモライドのクロマトグラフィー分析で得られた。Ｄ-セリンに対応するピークは観察されなかった。
【００１７】
セラタモライドの立体配置研究を分子動力学を用いて実施した。ＮＭＲデータとセリンの立体構造を考えると、結果は(Ｒ)-３-ヒドロキシデカン酸とのみ一致していた。
【００１８】
実施例２：癌細胞の生存に対するセラタモライドの活性
次の癌細胞を使用した：
−  ジャーカットクローンＥ６−１：急性ヒトＴ細胞白血病細胞。
−  Ｍｏｌｔ−４：末梢血、急性ヒトリンパ性白血病。
−  ＮＳＯ：ヒト骨髄腫細胞。
−  ＧＬＣ−４Ｓ：ヒト小細胞肺癌細胞。
−  ＨＧＴ−１：ヒト胃癌細胞。
−  ＨＴ−２９：ヒト大腸腺癌細胞。
次の非悪性細胞株を比較目的に使用した：
−  ＮＩＨ−３Ｔ３：スイスマウス胎仔細胞。
−  ＮＲＫ−４９Ｆ：正常なラット腎臓細胞。
−  ＩＥＣ−１８：ラット回腸の正常な上皮細胞。
【００１９】
様々な癌細胞株（ジャーカット、Ｍｏｌｔ−４、ＮＳＯ、ＨＧＴ−１、ＨＴ−２９及びＧＬＣ−４Ｓ）及び非悪性細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＲＫ−４９Ｆ及びＩＥＣ−１８）の生存に対するセラタモライドの作用をＭＴＴアッセイ（J. Mosmann, J. Immunol. Meth. 1983, vol.65, pp.55-63参照）によって決定した。ここで、ＭＴＴは３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、チアゾールブルーの略である。このアッセイでは、１００μｌの最終体積中、５から４０μＭの範囲の増大量のセラタモライドの存在下又は非存在下（コントロール細胞）で、９６ウェルのマイクロタイター細胞培養プレートで２０ｘ１０３の細胞をインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、１０μＭのＭＴＴを各ウェルに加えて更に４時間経過させた。青色のＭＴＴホルマザン沈殿物を１００μｌのイソプロパノール：１Ｎ ＨＣｌ（２４：１）中に溶解させ、５５０ｎｍでの吸光度をマルチウェルプレートリーダーで測定した。細胞生存度はコントロールに対するパーセントとして表した。生存細胞数の用量依存的減少が実験した全ての癌細胞株で観察されたが、非悪性細胞株の生存に有意な減少は観察しなかった。ＩＣ５０はジャーカットで１５．０μＭ、Ｍｏｌｔ−４で１２．２μＭ、ＮＳＯで１７．１μＭ、ＧＬＣ−４Ｓで１７．３μＭ、ＨＧＴ−１で２５．８μＭ、ＨＴ−２９で３８．９μＭであった。しかしながら、ＮＲＫ−４９Ｆは、３０μＭのセラタモライドの存在下で生存細胞数に減少を示さず、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の８５％とＩＥＣ−１８の７５％が同用量の存在下で生存した。
【００２０】
実施例３：癌細胞におけるセラタモライドのアポトーシスの誘導
観察された細胞毒性効果がアポトーシスによるものであったかどうかを決定するために、セラタモライドがアガロースゲル電気泳動法によるＤＮＡ断片化を誘導するかどうかを分析した。このアッセイでは、１０６細胞／ｍｌを２０μＭのセラタモライドに暴露し一晩（１６時間）インキュベートした。細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、氷冷溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のトリトンＸ-１００）に再懸濁させた。４℃で１５分間インキュベーションした後、細胞可溶化液を１４０００ｘｇで１５分間遠心分離して無傷のクロマチンから低分子量ＤＮＡを分離した。上清を、３７℃で４時間、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ ｐＨ８．０、４０ｍＭのＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含むバッファー中０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで処理した。ＤＮＡ調製物を２回フェノール／クロロホルム抽出してタンパク質を除去した。ＤＮＡを、１４０ｍＭのＮａＣｌと２容量のエタノールを用いて−２０℃で一晩かけて沈殿させた。ＤＮＡ沈殿物を１４０００ｘｇで４℃にて１０分間遠心分離して回収し、冷却した７０％エタノールで２回洗浄し空気乾燥させた。ＤＮＡペレットを１５μｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、３７℃で１時間、ＤＮａｓｅ非含有ＲＮａｓｅ（Boehringer Mannheim）で処理した。３．２μｌの負荷バッファーを各チューブに添加し、ＤＮＡ調製物を臭化エチジウムを含む１％アガロースゲルで電気泳動させた。ゲルをＵＶ光ボックスに配してＤＮＡラダーパターンを可視化させた。ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動はジャーカット造血性癌細胞株においてアポトーシスの特徴的なラダーパターンを示した。しかしながら、ＤＮＡラダー化はＮＩＨ−３Ｔ３非悪性細胞では観察されなかった。更に、アポトーシス体の特徴はセラタモライドでの処置後のジャーカット細胞には観察されたが、ＮＲＫ−４９Ｆ処置細胞には観察されなかった。
【国際調査報告】
2006501291.tif 000003
2006501291.tif 000004