(57)【要約】本発明は、神経発生を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、プロキネチシンレセプターシグナル伝達を調節する化合物を提供する工程；神経幹細胞または前駆細胞をこの化合物と接触させる工程；および神経発生を調節するこの化合物の能力を決定する工程を包含する。本発明はまた、神経発生を調節する方法も提供する。この方法は、神経幹細胞または前駆細胞を、プロキネチシンレセプターシグナル伝達を調節する有効量の化合物と接触させる工程を包含する。このような方法は、神経再生が望まれるエキソビボまたはインビボのいずれの治療用途にも有用である。
2006516090.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経発生を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は：
（ａ）プロキネチシンレセプター（ＰＫＲ）シグナル伝達を調節する化合物を提供する工程；
（ｂ）神経幹細胞または前駆細胞を該化合物と接触させる工程；および
（ｃ）該化合物が神経発生を調節する能力を決定する工程、
を包含し、ここで、神経発生を調節する化合物が同定される、方法。
【請求項２】
ＰＫＲシグナル伝達を調節する前記化合物がＰＫＲアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）が、
ＰＫＲを１以上の候補化合物と、ＰＫ１またはＰＫ２がＧタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）シグナルを促進する条件下で接触させる工程、
該シグナルを促進する化合物を同定する工程、および
該化合物を提供する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記シグナルが、カルシウムイオン動員である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＫＲが、組み換えにより発現されるヒトＰＫＲである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＫＲが、配列番号１または配列番号２と称されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＰＫＲシグナル伝達を調節する前記化合物が、ＰＫＲアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が、
ＰＫＲを１以上の候補化合物と、ＰＫ１またはＰＫ２がＧＰＣＲシグナルを促進する条件下で接触させる工程、
該シグナルを低減する化合物を同定する工程、および
該化合物を提供する工程
を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記シグナルの低減が、ＰＫ１またはＰＫ２の存在下で起こる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記シグナルが、カルシウムイオン動員である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＫＲが、組み換えにより発現されるヒトＰＫＲである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＫＲが、配列番号１または配列番号２と称されるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記神経幹細胞または前駆細胞が、エキソビボで接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記神経幹細胞または前駆細胞が、インビボで接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
神経発生を調節する前記化合物が、神経発生を増大させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記増大した神経発生が、増大した細胞増殖によって証明される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
神経発生を調節する前記化合物が、神経発生を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記減少した神経発生が、減少した細胞増殖によって証明される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
神経発生を調節する方法であって、神経幹細胞または前駆細胞を、プロキネチシンレセプター（ＰＫＲ）シグナル伝達を調節する有効量の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２４】
ＰＫＲシグナル伝達を調節する前記化合物が、ＰＫＲアゴニストである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＫＲアゴニストが、プロキネチシンペプチドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロキネチシンペプチドが、配列番号５〜１５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロキネチシンペプチドが、配列番号５または配列番号７を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＫＲシグナル伝達を調節する前記化合物が、ＰＫＲアンタゴニストである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、エキソビボで接触される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経幹細胞または前駆細胞が、インビボで接触される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト細胞が、神経変性または神経損傷の障害を有する個体に存在する、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一部、国立衛生研究所により与えられた認可番号ＮＩＨ  ＭＨ５７８８９のもとで国庫補助によって行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に、Ｇタンパク質結合レセプターシグナル伝達および治療の分野に関し、より具体的には、プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）レセプターシグナル伝達および神経発生を調節するための化合物および方法に関する。
【０００３】
（背景情報）
近年、アルツハイマー病、パーキンソン病、および他の衰弱性神経変性疾患を発症する危険が最も高い高齢者人口の増加により、神経変性疾患が重要な関心事となりつつある。脳梗塞、または脳もしくは脊髄への外傷の結果としての神経の損傷は、死および身体障害の原因の第１位でもある。
【０００４】
新しいニューロン、星状細胞、およびグリア細胞を含む新しい機能性の神経細胞を病巣部位に供給することが、神経変性または神経の損傷を改善させるための手段として提案されている。この目標を達成するために提案されている１つの方法論は、神経幹細胞および神経前駆細胞を脳または脊髄に移植することであり、その結果、これらは特殊化した細胞へと発達する。別の方法論は、内因性の神経幹細胞または神経前駆細胞の増殖、分化、および移動を刺激するように、脳または脊髄に生物学的活性のある分子を供給することにより、内因性の神経発生を促進することである。理想的には、いずれかの手法を用いて、新しい細胞が神経回路を正確に再構築し、神経化学的に活性のある物質を生産し、そして損傷した軸策を再度髄鞘形成する。
【０００５】
しかし、神経障害を処置するための有効な治療の開発は、神経発生を制御している機構の理解が不足していることにより、現在は限界がある。したがって、改良された治療法を開発するためには、神経発生に関係しているシグナル伝達経路の同定、およびこれらの経路の調節因子の同定が必要である。このような経路および調節因子を同定することにより、エキソビボまたはインビボでの用途のいずれにおいても神経発生を調節する新しい薬剤を開発できる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、神経発生を調節する化合物および方法を同定する必要がある。本発明は、この要件を満たし、そして関連する利点を十分に提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、神経発生を調節する化合物を同定する方法を提供する。この方法には、プロキネチシンレセプターシグナル伝達を調節する化合物を提供する段階；神経幹細胞または前駆細胞をこの化合物と接触させる段階；および神経発生を調節するこの化合物の能力を決定する段階が含まれる。
【０００８】
本発明はまた、神経発生を調節するための方法も提供する。この方法には、神経幹細胞または前駆細胞をプロキネチシンレセプターによりシグナル伝達を調節する有効量の化合物と接触させる段階が含まれる。このような方法は、エキソビボおよびインビボのいずれの治療用途にも有用である。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プロキネチシンがラットの神経発生を効率よく促進することの決定に関する。プロキネチシンのこの重要な薬理学的上の役割に関するこの決定に基づいて、本発明は、神経発生を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法、および哺乳動物において神経発生を調節するための治療方法を提供する。
【００１０】
実施例Ｖに開示するように、脳室内注入による組み換えのヒトプロキネチシン２（ＰＫ２）の成体ラットへの投与は、前脳において新しく発生したニューロンの数の増大を生じた。詳細には、細胞増殖マーカーであるＢｒｄＵの取り込みは、コントロール動物と比較して、ＰＫ２で処置したラットにおいては脳室下領域で少なくとも２倍多かった。２つの関連するＧＰＣＲ（プロキネチシンレセプター１（ＰＫＲ１）およびプロキネチシンレセプター２（ＰＫＲ２）と名付けた）のｍＲＮＡが、成体マウスの脳の側脳室の脳室下領域（ＳＶＺ）、嗅球／嗅ヘルニア、および海馬の歯状回において高いレベルで発現されているという観察もまた、本明細書において開示される（実施例Ｉを参照）。さらに、ＰＫＲ２のｍＲＮＡは成体マウスの網膜内顆粒層でも発現されることが、実施例ＩＩに開示される。プロキネチシン２（ＰＫ２）のｍＲＮＡは、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２の両方のアゴニストであり、これは、成体マウスの脳の嗅球と海馬の歯状回の両方において発現されている。非神経性の周辺組織は、ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、またはＰＫ２を非常に低いレベルで発現する。これらの知見は、神経発生の調節におけるプロキネチシンレセプターを通じたシグナル伝達についての役割を示している。
【００１１】
神経発生を調節するための方法は、種々の重要な用途を有している。これには、以下にさらに詳細に記載されるように、神経変性、神経の損傷、および神経脱髄に関係している障害を有しているまたはそのような障害を発症する可能性のある個体を処置するための用途が含まれる。神経発生を調節する治療方法としては、神経発生を調節する化合物が個体に投与される、薬剤をベースとする治療法、および神経発生を調節する化合物を使用してエキソビボで作成され、増殖させられ、遺伝的に修飾された神経細胞が個体の神経系に移植される、細胞をベースとする治療法の両方が挙げられる。エキソビボで神経発生を調節する方法の開発もまた、神経系の増殖および分化の複雑なプロセスの理解を進めるために有用であり、これによりさらなる化合物の開発、および神経系の障害を診断および処置するためのアプローチを導くことができる。
【００１２】
したがって、本発明は、神経発生を調節する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法には、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物を提供する段階、神経発生を調節する化合物の能力を決定する段階が含まれる。
【００１３】
本発明はまた、神経幹細胞または前駆細胞をＰＫＲシグナル伝達を調節する有効量の化合物と接触させることにより、神経発生を調節する方法を提供する。
【００１４】
ＰＫＲによりシグナル伝達を調節する化合物は、一般的には、以下に記載されるように、適切なシグナル伝達アッセイにおいてシグナル伝達を、コントロール化合物と比較して、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも２５％、５０％、１００％、５００％、またはそれ以上促進するか、あるいは、適切なシグナル伝達アッセイにおいてシグナル伝達を、コントロール化合物と比較して、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも２５％、５０％、９０％、またはそれ以上低減させる。
【００１５】
ＰＫＲシグナル伝達を、直接または間接的のいずれかで、そしてＰＫＲレセプターまたはＰＫＲリガンドのいずれかの活性または量のいずれかを変化させることによって調節できることが、理解されるであろう。例えば、ＰＫＲシグナル伝達は、例えば、ＰＫＲをアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることによって、直接調節することができる。ＰＫＲシグナル伝達はまた、例えば、ＰＫＲの発現、局在化、安定性、またはエフェクター分子に結合する能力を変化させることによって、あるいはプロキネチシン（ＰＫ）
の発現、分泌、安定性、またはＰＫＲに結合するかまたはＰＫＲを活性化する能力を変化させることによって、間接的に調節することができる。ＰＫＲシグナル伝達を調節する種々の方法が、以下のプロキネチシンレセプターおよびプロキネチシンの記載に記載される。Ｇタンパク質結合レセプターを通じるシグナル伝達を質的または量的に調節する他の一般的なアプローチは当該分野で公知であり、本発明にしたがって、本明細書中の指針に与えられたプロキネチシンレセプターに対して適用することができる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合は、用語「プロキネチシンレセプター」または「ＰＫＲ」は、５重螺旋の膜貫通ポリペプチドをいい、これは、プロキネチシンに結合して、プロキネチシンの結合に応答してＧタンパク質結合シグナル伝達経路を通じてシグナルを伝達する。プロキネチシンレセプターは、Ｇαｑとして知られているＧαサブタイプにだけ結合して、これによってアゴニストに応答して細胞内カルシウムの動員を媒介すると考えられている。
【００１７】
プロキネチシンレセプターは、任意の種に由来するＰＫＲの自然界に存在しているアミノ酸配列を有していてよく、また、自然界に存在している配列に関して軽微な修飾を含んでいてもよい。例えば、ＰＫＲは、哺乳動物のＰＫＲ、例えば、ヒトＰＫＲ１（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ４８１２７；またＧＰＲ７３、ｆｂ４１ａ、ｈＺＡＱ、ｈＧＰＲｖ２１、およびＥＧ−ＶＥＧＦレセプター−１とも呼ばれる；Ｌｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１９２７６−１９２８０（２００２）、Ｍａｓｕｄａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９３：３９６−４０２（２００２）、国際公開番号ＷＯ００／３４３３４、国際公開番号ＷＯ０１／４８１８８、および国際公開番号ＷＯ０１／１６３０９）；ヒトＰＫＲ２（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ４８１２８；Ｉ５Ｅ、ｈＲＵＰ８、およびｈＺＡＱ２としてもまた知られている；Ｌｉｎ等、前出（２００２）、Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２）、国際公開番号９８／４６６２０、国際公開番号ＷＯ０１／３６４７１、および国際公開番号ＷＯ０２／０６４８３）；マウスＰＫＲ１（配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ４９５７０；Ｃｈｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：４０５−４１０（２００２）、および国際公開番号ＷＯ０２／０６４８３）；マウスＰＫＲ２（配列番号４；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ４９５７１；Ｃｈｅｎｇ等、前出（２００２）、および国際公開番号ＷＯ０２／０６４８３）；ラットＰＫＲ１（国際公開番号ＷＯ０２／０６４８３）；ラットＰＫＲ２（国際公開番号ＷＯ０２／０６４８３）；サルＰＫＲ２（ＡＸＯＲ８としても知られている；国際公開番号ＷＯ０１／５３３０８）；ウシＰＫＲ１（Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２））、または別の哺乳動物種、例えば、他の霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、もしくはヤギのＰＫＲ；あるいは別の脊椎動物種、例えば、両生類、爬虫類、魚類、もしくは鳥類のＰＫＲであることができる。
【００１８】
ＰＫＲ１とＰＫＲ２をコードするヌクレオチド配列間での、および種間のＰＫＲ型の間での高度な相同性に基づいて、当業者は、任意の他の種からＰＫＲを容易に同定し、クローン化することができる。例えば、他のＰＫＲを、ハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術のような標準的な分子生物学的アプローチを使用して核酸のライブラリーから同定することができる。さらに、他の種に由来するＰＫＲを、目的の種に特異的な核酸配列のデータベースから同定することができる。相同な核酸分子を同定し、単離し、そして増幅する方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ等（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（最新版））に記載されている。
【００１９】
同様に、ＰＫＲポリペプチド間での高度な相同性に基づいて、当業者は、別の種から、またはＰＫＲを発現する発現ライブラリーから、ＰＫＲ特異的抗体を用いて細胞を容易に同定することができる。ポリペプチドを同定するために抗体を調製して使用する方法が、当該分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載されている。
【００２０】
プロキネチシンレセプターはまた、ＰＫＲが、以下に記載されるヒトＰＫ１またはヒトＰＫ２のようなプロキネチシンに結合し、それに応答してシグナルを伝達するその能力を保持している限りは、自然界に存在しているＰＫＲに関して軽微な修飾を含むこともできる。
【００２１】
自然界に存在しているＰＫＲに関して軽微な修飾を含むプロキネチシンレセプターは、自然界に存在しているポリペプチド配列と比較して、自然界に存在しているアミノ酸または自然界には存在していないアミノ酸の、１つ以上の付加、欠失、または置換を含むことができる。このような修飾は、例えば、保存的変化であり、ここでは、置換されたアミノ酸は類似の構造的または化学的特性を有している。例えば、無極性アミノ酸の別の無極性アミノ酸での置換、電荷を有しているアミノ酸の類似の電荷を有している別のアミノ酸での置換などである。このような修飾はまた、非保存的変化であってもよい。ここでは、置換されたアミノ酸は、所望される生物学的活性に有害な影響を与えない程度に、異なるが、十分に類似している構造的または化学的特性を有している。さらに、軽微な修飾は、Ｌ型アミノ酸の、自然界には存在しない対応するＤ型アミノ酸での置換であってもよい。
【００２２】
さらに、軽微な修飾は、アルキル、アシル、またはアミノ基による水素の置換；適切なアルキルまたはアリール部分でのカルボキシル基のエステル化；エーテル誘導体を形成するためのヒドロキシルのアルキル化；セリン、スレオニン、またはチロシン残基のリン酸化または脱リン酸化；あるいは、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化のような、ポリペプチドに対する化学的または酵素的修飾であってもよい。
【００２３】
当業者は、自然界に存在しているプロキネチシンレセプター配列に対する軽微な修飾が本発明の方法において有利であるかどうかを決定することができる。軽微な修飾は、例えば、レセプターの安定性、選択性、生体活性を高めるために有用である。修飾されたＰＫＲポリペプチドは、例えば、組み換え法によって、合成法によって、合成後の化学的もしくは酵素的方法によって、またはこれらの方法の組み合わせによって調製することができ、そしてプロキネチシンに結合する能力またはＧタンパク質結合シグナル伝達経路を通じてシグナルを伝達する能力について試験される。
【００２４】
当業者は、結合またはシグナル伝達を損なうことなく修飾することができるプロキネチシンレセプターのアミノ酸配列中の領域を容易に予想することができる。このような予想は、配列分析、構造−機能研究、およびコンピューターアルゴリズムに基づいて行うことができる。例えば、ＰＫＲ２とＰＫＲ１のアミノ酸配列の比較、および種間のＰＫＲの比較により、修飾に寛容であるアミノ酸残基の決定における指針を提供することができる。さらに、公開されている多数のＧＰＣＲの構造−機能研究は、リガンド相互作用、Ｇタンパク質の結合、および膜貫通領域の形成に関係しているＧＰＣＲの領域を示しており、修飾に寛容であるＧＰＣＲの領域を示している（例えば、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４３２２−２４３２７（１９９８）およびＢｕｒｓｔｅｉｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７（１２）：４０５２−４０５８（１９９８）を参照）。さらに、当該分野で公知のコンピュータープログラムを使用して、ポリペプチドのどのアミノ酸残基を活性を損なうことなく修飾することができるかを決定することができる（例えば、Ｅｒｏｓｈｋｉｎ等、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：４９１−４９７（１９９３）；Ｇｕｅｒｏｓ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：３６９−３８７（２００２）を参照）。これらの方法を同様にＰＫＲに適用できる。
【００２５】
特定の適用について、ＰＫＲは、ヒトＰＫＲ１（配列番号１）またはヒトＰＫＲ２（配列番号２）のいずれかと、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上の同一性を有する。
【００２６】
別の種に由来するＰＫＲまたは修飾されたＰＫＲのような推定のＰＫＲが実際にＰＫＲであるかを、当該分野で公知のプロキネチシン結合アッセイおよびＧタンパク質結合レセプターシグナル伝達アッセイによって確認することができる（例えば、米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１、Ｌｉｎ等、前出（２００２）およびＭａｓｕｄａ等、前出（２００２）、および以下にさらに記載されるものを参照）。
【００２７】
意図される用途に応じて、当業者は、ＰＫＲについての適切な形態、例えば、生存している動物、組織抽出物、細胞、細胞抽出物中の、あるいは実質的に精製された形態を決定することができる。例えば、レセプター結合またはシグナル伝達アッセイについて、ＰＫＲは通常、細胞の表面で内生的に発現されるかまたは組み換えにより発現されるかのいずれかである。
【００２８】
ＰＫＲを内生的に発現する細胞は当該分野で周知であり、これには、例えば、Ｍ２Ａ７黒色腫細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクションからＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５００として入手することができる）、Ｍ２黒色腫細胞（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３２５−３２７（１９９２））、およびＲＣ−４Ｂ／Ｃ下垂体腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９０３）（米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１を参照）が含まれる。ＰＫＲを内生的に発現する他の細胞としては、例えば、回腸細胞および他の胃腸細胞（米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１を参照）、ＢＡＣＥ細胞のような内皮細胞（Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２））、および内分泌細胞（Ｌｉｎ等、前出（２００２））が挙げられる。本明細書中で開示されるように、ＰＫＲを発現する他の細胞には、神経幹細胞および前駆細胞が挙げられ、これらには、側脳室の脳室下領域、嗅球／嗅ヘルニア、海馬の歯状回、および網膜内顆粒層にあるそのような細胞が含まれる。
【００２９】
ＰＫＲを組み換えにより発現させる方法もまた、当該分野で周知である（例えば、Ｌｉｎ等、前出（２００２）、およびＭａｓｕｄａ等、前出（２００２）を参照）。ポリペプチドを組み換えによって発現させるために適切な宿主細胞は当該分野で周知であり、これらとして、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、酵母細胞（例えば、サッカロマイセスセレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセスポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））、および脊椎動物の細胞（例えば、哺乳動物の初代細胞および確立された細胞株）；ならびに両生類の細胞（例えば、アフリカツメガエルの胚および卵巣細胞）が挙げられる。特定の宿主細胞中でポリペプチドを発現させるために適切なベクターもまた、当該分野で周知であり、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、またはレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、および細菌由来のベクター、ならびにコスミドまたはプラスミドのような、細菌の配列と他の生物体に由来する配列との組み合わせが挙げられる。適切な発現ベクターは、通常、意図される宿主細胞と適合する複製起点；構成的または誘導性プロモータ配列；転写終結シグナル、およびＲＮＡプロセシングシグナル；意図される宿主細胞と適合する１つ以上の選択マーカー；１つ以上のマルチクローニング部位のようなエレメントを含み；そして必要に応じて、コードされるポリペプチドの発現または精製を容易にするタグ配列を含む。ポリペプチドを組み換えにより発現させる方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、前出（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ等、前出（最新版）に記載されている。
【００３０】
本明細書中で使用される場合は、「プロキネチシン」または「ＰＫ」は、プロキネチシンレセプターに結合し、そしてＧタンパク質結合シグナル伝達経路を通じたレセプターシグナル伝達を誘発するペプチドを意味する。
【００３１】
プロキネチシンは、任意の種に由来するＰＫの自然界に存在しているアミノ酸配列を有していてもよく、また、自然界に存在している配列に関して軽微な修飾を含んでいてもよい。例えば、ＰＫは、ヒトＰＫ１（配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ５８２９４；内分泌腺由来の内皮成長因子、またはＥＧ−ＶＥＧＦ、ＴＡＮＧＯ  ２６６、ＰＲＯ  １１８６、およびＺｖｅｎ２としても知られている；Ｌｉ等、前出（２００１）、ＬｅＣｏｕｔｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１２：８７７−８８４（２００１）、国際公開番号ＷＯ０１／３６４６５、国際公開番号ＷＯ９９／６３０８８、および国際公開番号ＷＯ００／５２０２２）；ヒトＰＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９ＨＣ２３；イソ型１、配列番号６、Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６２：１７７−１８１（１９９９）、またはイソ型２、配列番号７；Ｚｖｅｎｌとしても知られている、Ｌｉｎ等、前出（２００１））；マウスＰＫ１（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ４９５７３）；マウスＰＫ２（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ４９５７２）；ラットＰＫ１（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ０９１０４；Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２））；ラットＰＫ２（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＭ０９１０５；Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２））のような哺乳動物のＰＫ、あるいは別の哺乳動物種、例えば、他の霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、またはヤギのＰＫであってよい。
【００３２】
あるいはＰＫは、別の脊椎動物種、例えば、ヘビ、カエル、またはヒキガエルのＰＫであってもよい。例えば、ＰＫは黒ヘビのＰＫ（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ２５６８７；ＭＩＴ１としても知られている；Ｓｃｈｗｅｉｔｚ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１：１８３−１８８（１９９９））；バルカンキバラスズガエル（Ｂｏｍｂｉｎａ  ｖａｒｉｅｇａｔａ）のＰＫ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９ＰＷ６６；Ｂｖ８としても知られている；Ｍｏｌｌａｙ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４：１８９−１９６（１９９９）；オオスズガエル（Ｂｏｍｂｉｎａ  ｍａｘｉｍａ）のＰＫ）（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＮ０３８２２）、または別の脊椎動物種、例えば、両生類、爬虫類、魚類、または鳥類に由来するＰＫであってもよい。
【００３３】
プロキネチシンはまた、ＰＫが、上記のようなヒトＰＫＲ１またはＰＫＲ２のようなプロキネチシンレセプターに結合し、そしてプロキネチシンレセプターシグナル伝達を誘発するその能力を保持している限りは、自然界に存在しているＰＫに関して、軽微な修飾を含んでいてもよい。適切な軽微な修飾の型の例は、ＰＫＲに関して上記したものであり、これをまたＰＫにも適用することができる。ＰＫに対する軽微な修飾は、例えば、ＰＫの特性、例えば、安定性、インビボ利用性、生体活性、または特異性を高めることが望まれる用途に有用であり得る。
【００３４】
自然界に存在している配列から修飾されているが、活性を保持しているプロキネチシンの特異的な例としては、配列番号１５を有しているヒトプロキネチシンキメラ（Ｎ末端にＰＫ１、Ｃ末端にＰＫ２のキメラ）および配列番号１６を有しているヒトプロキネチシンキメラ（Ｎ末端にＰＫ２、Ｃ末端にＰＫ１のキメラ）が挙げられる。種内のＰＫ１とＰＫ２とのキメラ、または種をまたぐプロキネチシン間のキメラもまた、それらがＰＫ活性を保持している限りは、プロキネチシンとみなされる。
【００３５】
米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１に記載されているように、プロキネチシンは、全ての種にまたがって保存されているＮ末端の６個のアミノ酸（ＡＶＩＴＧＡ）、または１０個の保存されているシステイン残基のいずれでの付加、欠失、もしくは置換に関しては寛容ではない。しかし、Ｃ末端から１０番目のシステインまでの残基での修飾のような、他の内部残基での修飾には寛容である。
【００３６】
特定の適用について、ＰＫはヒトＰＫ１（配列番号５）またはヒトＰＫ２（配列番号６）のいずれかと、少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上の同一性を有する。
【００３７】
別の種に由来するＰＫまたは修飾されたＰＫのような推定されるＰＫが実際にＰＫであることは、当該分野で公知のプロキネチシン結合アッセイおよびＧタンパク質結合レセプターシグナル伝達アッセイによって確認することができる（例えば、米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１、Ｌｉｎ等、前出（２００２）、およびＭａｓｕｄａ等、前出（２００２））、およびさらに以下に記載されるものを参照）。
【００３８】
意図される用途に応じて、当業者は、ＰＫについて適切な形態、例えば、生存している動物、組織、組織抽出物、細胞、細胞抽出物、または実質的に精製された形態を決定することができる。プロキネチシンは、内生的にＰＫペプチドを含む任意の組織、細胞、または体液の供給源から実質的に精製することができ、また、組み換えにより生産し、次いで実質的に精製することもできる。内因性のＰＫの供給源としては、乳汁（Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２））、毒（Ｍａｓｕｄａ等、前出（２００２）、Ｍｏｌｌａｙ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７４：１８９−１９６（１９９９））、消化管、肝臓、脾臓、精巣、および胎盤を含む種々の胎児および成体組織（米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１）、ならびに、本明細書中に開示されているような、神経幹細胞および前駆細胞が挙げられる。このような供給源からプロキネチシンを実質的に精製する方法は、上記の参考文献に記載されている。
【００３９】
プロキネチシンを組み換えにより発現させる方法もまた、当該分野で公知である（細菌での発現の例については、米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１、およびＭａｓｕｄａ等、前出（２００１）を、真核生物での発現の例については、国際公開番号ＷＯ０１／３６４６５および国際公開番号ＷＯ００／５２０２２を参照）。このような方法には、最初に、融合タンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、Ｆｃタグ、６×Ｈｉｓタグ、ｍｙｃエピトープ、または当該分野で公知の他のタグ配列との融合体としてＰＫを発現させることが含まれ得る。組み換えによって発現されたプロキネチシンを実質的に精製し、付属のタグ配列を除去する方法もまた、当該分野で公知である。例えば、米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１には、タンパク質の凝集を模倣する、組み換えによって発現されたプロキネチシンを再度折り畳み、そして精製するための条件が記載されており、正確なジスルフィド結合の形成を確認する方法もまた記載されている。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明のスクリーニングおよび治療方法には、プロキネチシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストである化合物を提供する段階が含まれる。ＰＫＲアゴニストまたはアンタゴニストは、必要に応じて、ＰＫＲ１またはＰＫＲ２について選択することができるか、あるいは、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２の両方に関して同程度に活性であってもよい
本明細書中で使用される場合は、用語「プロキネチシンレセプターアゴニスト」は、ＰＫＲを通じた正常なＧタンパク質結合シグナル伝達を促進または増強する化合物をいう。ＰＫＲアゴニストは、例えば、通常のリガンド結合部位でＰＫＲに直接結合し、それによってレセプターシグナル伝達を促進することによるような、任意の作動機構によって作用することができる。ＰＫＲアゴニストはまた、例えば、内因性リガンドの結合活性を高めることによって、またはそのシグナル伝達活性を増大させるようにＰＫＲの立体構造を変化させることによって、間接的に作用することもできる。
【００４１】
ＰＫＲアゴニストの例として、上記のような、自然界に存在しているＰＫペプチド、キメラＰＫペプチド、および修飾されたＰＫペプチドが挙げられる。ＰＫＲアゴニストとしてまた、このようなＰＫペプチドのペプチド模倣物も挙げることができる。ペプチド模倣物を調製する方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｒｉｐｋａ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４４１−４５２（１９９８）およびａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ等、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：２０５−２２３（１９９８）に概説されている。他のＰＫＲアゴニストとして、例えば、以下に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される化合物が挙げられる。例示的な部分的なアゴニストはＰＫ２挿入断片（ＰＫのエキソン２とエキソン３との間の２３アミノ酸の挿入断片）であり、例示的な弱いアゴニストは、ＧＩＬ−ＰＫ１（ＰＫ１のＮ末端に付加された３ペプチドＧｌｙ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ）である。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、用語「プロキネチシンレセプターアンタゴニスト」は、ＰＫＲを通じた正常なＧタンパク質結合シグナル伝達を阻害するかまたは減少させる化合物をいう。ＰＫＲアンタゴニストは、ＰＫ結合部位でＰＫＲに直接結合し、それによってＰＫＲとそのリガンドとの間での結合を阻害することによるような、任意の拮抗機構によって作用することができる。ＰＫＲアンタゴニストはまた、例えば、ＰＫに結合することによって、またはＰＫＲのリン酸化もしくはグリコシル化の立体構造もしくは状態を変化させ、それによってリガンドへの結合もしくはリガンドに応答するその能力に影響を与えることによって、間接的に作用することもできる。用語「ＰＫＲアンタゴニスト」はまた、「逆アゴニスト」として作用する化合物を含むようにも意図され、これは、それらが恒常的なシグナル伝達活性の基底量よりもＰＫＲシグナル伝達を減少させることを意味している。
【００４３】
ＰＫＲアンタゴニストの例として、ヒトＰＫ１およびＰＫ２（米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１を参照）に関して、１つのＮ末端残基の付加、または１つのＮ末端残基の欠失のいずれかを有しているペプチドが挙げられる。他のプロキネチシンに関して同様の修飾を有しているか、またはヒトもしくは他のプロキネチシンの保存されたＮ末端の６残基に対する他の修飾を有しているペプチドもまた、ＰＫＲアンタゴニストであり得る。例示的なＰＫＲアンタゴニストはＭＶＩＴＧＡである。
【００４４】
ＰＫＲアンタゴニストの他の例は、ＰＫＲまたはＰＫについて選択的な抗体である。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を、さらには、そのような抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、およびＦｖ断片など）を含むように意図される。さらに、用語「抗体」は、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、ニ官能性抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体、さらにはそれらの抗原結合断片を含む、自然界には存在していない抗体を含むように意図される。
【００４５】
ペプチドおよびポリペプチド免疫原を使用して、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む抗体を調製し、単離する方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載されている。自然界には存在していない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組み換えによって生産することができ、また、例えば、可変重鎖および可変軽鎖から構成される組み合わせライブラリーをスクリーニングすることによって得ることもできる。このような方法は、例えば、Ｈｕｓｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３−２４６（１９９３）；Ｗａｒｄ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９）；Ｈｉｌｙａｒｄ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）；およびＢｏｒｒａｂｅｃｋ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）に記載されている。
【００４６】
プロキネチシンレセプターアゴニストは、通常、特定のアッセイにおいてヒトＰＫ１またはＰＫ２のＥＣ５０よりもわずかに２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、または１０００倍高いまたは低いＥＣ５０を有する。以下に記載される治療用途について、プロキネチシンレセプターアゴニストは、好ましくは、約１０−７Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、およびより好ましくは、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満のＥＣ５０を有し、プロキネチシンレセプターアンタゴニストは好ましくは、約１０−７Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、およびより好ましくは、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満のＩＣ５０を有する。しかし、化合物の安定性、選択性、および毒性に応じて、さらに高いＥＣ５０を有しているプロキネチシンレセプターアゴニスト、またはさらに高いＩＣ５０を有しているプロキネチシンレセプターアンタゴニストもまた、治療上有用であり得る。
【００４７】
ＰＫＲアゴニストおよびアンタゴニストの活性を同定または確認するためのシグナル伝達アッセイは当該分野で公知である。ＰＫＲはＧαｑ結合レセプターであるので、他のＧαｑ結合ＧＰＣＲについて通常使用されるシグナル伝達アッセイを、ＰＫＲシグナル伝達活性を決定するために使用することができる。Ｇαｑ結合ＧＰＣＲは、リガンドに結合すると、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化し、これは脂質であるホスファチジルイノシトール４，５−ビスリン酸（ＰＩＰ２）を切断して、二次メッセンジャーであるイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じる。これらの二次メッセンジャーは細胞内Ｃａ２＋濃度を増大させて、ＭＡＰキナーゼカスケードを活性化する。ＰＬＣの活性の変化、または下流のメッセージ量の変化は、ＧＰＣＲの活性化の反映である。
【００４８】
細胞表面レセプターに対するＧαサブユニットの特異性は、ＧαのＣ末端の５個のアミノ酸によって決定される。したがって、通常のＧαｑ経路以外のＧＰＣＲシグナル伝達経路をアッセイすることが望まれる場合には、Ｇαｑの５個のＣ末端残基と、別のＧαに対応しているタンパク質の残りを含むキメラＧαを細胞内で発現させることができる。その結果、ＰＫＲは異なるシグナル伝達経路に結合する（例えば、Ｃｏｎｋｌｉｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２７６（１９９３）、およびＫｏｍａｔｓｕｚａｋｉ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０６：１６５−１７０（１９９５）を参照）。例えば、ＰＫＲは、ＧαｓまたはＧαｉに結合することができ、アデニル酸シクラーゼの活性化または阻害が、当該分野で公知の方法によってアッセイされる。
【００４９】
Ｇαおよびアッセイシステムに応じて、決定することができるＧＰＣＲシグナルとして、カルシウムイオンの動員；アラキドン酸、アセチルコリン、ジアシルグリセロール、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、イノシトールリン酸、およびイオンの生産または放出の増加または減少；細胞膜電位の変化；ＧＴＰの加水分解；アミノ酸の流入または流出；細胞内タンパク質のリン酸化の増加または減少；ならびに上記の二次メッセンジャー経路のいずれかの下流にある内因性の遺伝子またはプロモータ−レポーター構造の転写の活性化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
細菌、酵母、バキュロウイルス／昆虫システム、および哺乳動物細胞の中で行われるアッセイを含む、種々の細胞をベースとするＧＰＣＲシグナル伝達アッセイは、例えば、Ｔａｔｅ等、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４２６−４３０（１９９６）に概説されている。より最近開発されたＧＰＣＲシグナル伝達アッセイとしては、例えば、カルシウムの動員を検出する細胞性エクオリンに基づく機能的アッセイである、ＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ（ＬｅＰｏｕｌ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．７：５７−６５（２００２））；ＭＡＰキナーゼレポーターアッセイ（Ｒｅｅｓ等、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．６：１９−２７（２００１）；および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づくＰＬＣ活性化アッセイ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１５３３７−１５３４４（２００１））が挙げられる。ＰＫＲシグナル伝達のアッセイのいくつかの例は、Ｌｉｎ等、前出（２００２）およびＭａｓｕｄａ等、前出（２００２）に記載されている。
【００５１】
必要に応じて、化合物を、それがＰＫＲに結合するかどうかを決定するために、最初に試験することができる。例えば、化合物は、ＰＫＲアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する可能性がある。レセプターへのリガンドの結合を検出するための競合および非競合結合アッセイは、例えば、Ｍｅｌｌｅｎｔｉｎ−Ｍｉｃｅｌｏｔｔｉ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７２：１８２−１９０（１９９９）；Ｚｕｃｋ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：１１１２２−１１１２７（１９９９）；およびＺｈａｎｇ等、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８；１３４−１４２（１９９９）に記載されている。ＰＫＲ結合アッセイの例は、Ｌｉｎ等、前出（２００２）およびＭａｓｕｄａ等、前出（２００２）に記載されている。
【００５２】
本発明の方法の特定の適用については、プロキネチシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する以外の機構によってＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物を使用することが有利である。
【００５３】
したがって、１つの実施形態では、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物は、内因性のプロキネチシンｍＲＮＡの発現を調節する化合物である。ＰＫの発現を調節する化合物は、例えば、ＰＫをコードするか、またはＰＫ遺伝子の発現を阻害するように作用する、発現させることが可能な核酸分子、例えば、アンチセンス核酸分子、リボザイム、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子であり得る。このような核酸分子を調製し、それらをエキソビボおよびインビボでの用途に使用する方法は当該分野で公知である。例えば、ウイルス送達システムは、Ｍａｈ等、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４１：９０１−９１１に；非ウイルス送達システムは、Ｌｉｎ等、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：２０１−２２６（２００１）に；ＲＮＡｉは、Ｈａｎｎｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−２５１（２００２）；アンチセンスは、Ｇａｌｄｅｒｉｓｉ等、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８１：２５１−２５７（１９９９）に、そしてリボザイムは、Ｌｅｗｉｎ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：２２１−２２８（２００１））に概説されている。
【００５４】
内因性のＰＫ  ｍＲＮＡの発現を増強する化合物はまた、スクリーニングアッセイによって同定される化合物でもある。例示的なスクリーニングアッセイでは、ＰＫを内生的に発現する動物、組織、または細胞が、１つ以上の候補の化合物と接触される。ＰＫ  ｍＲＮＡは、当該分野で公知の方法、例えば、検出可能なプローブもしくはプライマーとのハイブリダイゼーション、またはＰＣＲ、およびコントロールと比較したｍＲＮＡのレベルを使用して検出し、定量することができる。このような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、前出（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ等、前出（最新版）に記載されている。あるいは、ＰＫペプチドは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、抗体またはレセプターへの直接または競合的な結合をアッセイすることによって検出し、定量することができる。このような方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、前出（１９８８）に記載されている。
【００５５】
あるいは、内因性のＰＫ  ｍＲＮＡの発現を増強する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイでは、レポーター遺伝子、例えば、β−ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはβ−ガラクトシダーゼをコードする核酸分子に対して作動可能なように連結されたＰＫプロモータを使用することができる。このようなアッセイでは、プロモータ−レポーター構築物でトランスフェクトされた細胞が候補の化合物と接触させられ、レポーター遺伝子産物の発現が、特定のレポーターによって異なる当該分野で公知の方法によって検出される。
【００５６】
ＰＫ１およびＰＫ２プロモータのヌクレオチド配列は当該分野で公知であり、ヒトおよびマウスのプロモータ配列は、本明細書においては配列番号１７〜２１として示される。あるいは、プロキネチシンプロモータ配列のより小さい部分、例えば、転写開始部位の上流の少なくとも約１００ヌクレオチドの領域、例えば、少なくとも約２００、２５０、３００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００ヌクレオチド、またはそれ以上の領域を使用することができる。
【００５７】
ＰＫ１プロモータおよびＰＫ２プロモータのいずれもが、推定されるサイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含む。このエレメント中に、これらは核となるＣＲＥコンセンサス配列ＣＧＴＣＡを含む。ヒトＰＫ２プロモータにおいては、例えば、推定されるＣＲＥは、転写開始部位の約２００ヌクレオチド上流にある。したがって、プロキネチシンｍＲＮＡの発現を調節する化合物には、サイクリックＡＭＰの生産および／またはＭＡＰキナーゼの活性化を調節することが既知であるかまたはそのように予想される化合物、例えば、種々の成長因子が含まれると考えられる。
【００５８】
別の実施形態では、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物は、内因性のプロキネチシンペプチドの生産または分泌を増強する化合物である。プロキネチシンの生産および分泌を検出する方法としては、生体アッセイ、結合アッセイ、免疫アッセイなどを挙げることができ、当該分野で公知のペプチドアッセイおよび本明細書中に提供される指針に基づいて、プロキネチシンに対して適応させることができる。
【００５９】
さらなる実施形態では、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物は、ＰＫＲ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を調節する化合物であり得る。ＰＫＲの発現を調節する化合物は、例えば、ＰＫＲをコードするか、またはＰＫＲ遺伝子の発現を阻害するように作用する、発現させることができる核酸分子、例えば、アンチセンス核酸分子、リボザイム、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子であり得る。このような核酸分子を調製し、それらを使用する方法は、上記のように、当該分野で公知である。
【００６０】
ＰＫＲの発現を調節する化合物は、スクリーニングアッセイによって同定される化合物でもあり得る。例示的なスクリーニングアッセイでは、ＰＫＲを内生的に発現する動物、組織、または細胞が、１つ以上の候補の化合物と接触される。ＰＫＲ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、当該分野で公知の方法、例えば、プロキネチシンｍＲＮＡまたはペプチドの発現の増大を検出するための上記の方法と同様の方法を使用して検出し、そのレベルをコントロールと比較することができる。
【００６１】
当業者は、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物を同定するための上記方法が例示であることを理解するであろう。ＰＫＲまたはそのリガンドの量または活性を調節することにより、ＧＰＣＲシグナル伝達を調節するための別の方法および機構は当該分野で公知であるか、または本明細書中の指針に基づいて決定することができる。
【００６２】
上記のスクリーニングアッセイでは、ＰＫＲシグナル伝達を調節するその能力について試験される候補の化合物は、任意の型の生物学的または化学的分子であり得る。例えば、候補の化合物は、自然界に存在している高分子、例えば、ポリペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。候補の化合物はまた、そのような高分子、または組み合わせ化学法によって調製される分子のような有機低分子の、部分的または完全に合成による誘導体、類似体、または模倣物でもあり得る。特定のアッセイ形式において望まれる場合は、候補の化合物は検出できるように標識することができるか、または、固体支持体に結合させることもできる。
【００６３】
単純なまたは複雑な有機分子、金属を含む化合物、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、脂質タンパク質、核酸、抗体などを含む化合物の大きなライブラリーを調製するための方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｈｕｓｅ、米国特許第５，２６４，５６３号；Ｆｒａｎｃｉｓ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４２２−４２８（１９９８）；Ｔｉｅｔｚｅ等、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２：３６３−３７１（１９９８）；Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：７５−９４（１９９８）；Ｅｉｃｈｌｅｒ等、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８１−４９６（１９９５）などに記載されている。多数の自然界に存在している化合物および合成の化合物を含むライブラリーはまた、商業的供給源からも入手することができる。
【００６４】
本発明の方法において試験される種々の候補の化合物の数は、方法の用途に応じて異なる。例えば、手作業によるスクリーニング手順において、またはＰＫＲを調節する化合物として作用することが既知であるかもしくは推定されるいくつかの化合物の間で効果を比較することが望ましい場合には、１つまたは少数の候補の化合物が好都合であり得る。しかし、候補の化合物の数が多ければ多いほど、スクリーニングアッセイにおいて望ましい活性を有している化合物を同定できる可能性が大きくなることが理解されるであろう。さらに、ハイスループット自動スクリーニングアッセイでは、多数の化合物を処理することができる。したがって、用語「１つ以上の候補の化合物」は、例えば、２つ以上、例えば、５、１０、１５、２０、５０、または１００以上の異なる化合物、例えば、約１０３、１０５、または１０７の異なる化合物を意味し得る。このような候補の化合物は、例えば、化合物のプールにおいて、または並列アッセイにおいて同時に、あるいは連続してアッセイすることができる。
【００６５】
ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物を同定するためのアッセイ方法には、通常、コントロールとの比較が含まれる。「コントロール」の１つの型は、コントロールが候補の化合物に対して曝されていないことを除いて、試験調製物と同じように処理された調製物である。別の型の「コントロール」は、コントロール調製物がレセプターを発現しないか、またはＰＫに応答しないように修飾されていることを除いて、試験調製物と同様である調製物である。この状況では、試験調製物の候補の化合物に対する応答が、実質的に同じ反応条件下での同じ化合物に対するコントロール調製物の応答（応答がないこと）と比較される。
【００６６】
本発明の方法には、化合物が神経発生を調節できる条件下で、神経幹細胞または前駆細胞をＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物と接触させる段階が含まれる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合は、用語「神経発生」は、それによって神経幹細胞または前駆細胞がさらに分化した神経細胞を生じるようになるプロセスをいう。神経発生には、神経幹細胞および前駆細胞の増殖、これらの細胞の新しい神経細胞型への分化、さらには新しい細胞の移動および生存が含まれる。この用語は、通常の発生の間に生じるような神経発生、さらには疾患、損傷、または治療介入の後に生じる神経再生をカバーするように意図される。神経発生は、例えば、Ｏｋａｎｏ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６９：６９８−７０７（２００２）に概説されている。
【００６８】
多数の因子が、成体の哺乳動物の神経発生を調節することが明らかにされている。例えば、学習および環境の向上は、神経幹細胞および／または前駆細胞の生存生を高めることが示されているが、一方、ストレスはこれらの細胞の増殖を小さくすることが示されている。癲癇および脳卒中の動物モデルでは、神経発生が増強される。生化学的レベルで、多数の分子が神経発生に影響を与えることが示されている。例えば、成長因子ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、およびモノアミン神経伝達物質は、神経発生を刺激することが示されているが、一方、高濃度のコルチコステロン、グルタミン酸塩、γ−アミノ酪酸、およびオピオイドペプチドは神経発生を減少させる。
【００６９】
本明細書中で使用される場合は、用語「神経幹細胞」は、自己複製でき、複数の神経細胞系統の細胞、例えば、星状細胞、乏突起膠細胞、およびニューロンを生じることもできる、中枢神経系の細胞をいう。
【００７０】
本明細書中で使用される場合は、用語「前駆細胞」は、増殖できるが、神経幹細胞と比較してより系統が制限されている、中枢神経系の細胞をいう。前駆細胞には、ニューロンを生じるニューロン先祖細胞、星状膠細胞および／または乏突起膠細胞を生じる神経膠先祖細胞が含まれる。
【００７１】
神経発生は、嗅球（ＯＢ）、海馬の歯状回（ＤＧ）、および脳室下領域（ＳＶＺ）を含む、哺乳動物の中枢神経系のいくつかの神経領域において成体期を通じて生じることが示されている。アンモン角での低いレベルの神経発生もまた、報告されている。成体の哺乳動物のＯＢにおける新しいニューロン細胞は、ＳＶＺの前部において前駆細胞から生じる。ＳＶＺは、前脳の側脳室の壁にある組織の狭い領域である。ＳＶＺの前駆細胞は、ｒｏｓｔｒｏ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ＲＭＳ）によってＯＢへと移動し、ここで、顆粒細胞および糸球周辺細胞として知られるＯＢの介在ニューロンへと分化する。成体のＤＧの前駆細胞は、ＤＧの顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）で生じ、ＤＧの顆粒層でニューロン細胞およびグリア細胞へと分化する。新たに生じたニューロン細胞は、有糸分裂の４〜１０日後に直ちに、海馬のＣＡ３領域へと軸策を伸ばす（ＴａｕｐｉｎおよびＧａｇｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６９：７４５−７４９（２００２）に概説されている）。
【００７２】
神経幹細胞および／または前駆細胞は、脳室下領域（ＳＶＺ）、海馬、隔膜、線条体、大脳皮質、嗅球、ＳＶＺのｒｏｓｔｒａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、頸部、胸部、腰部、および仙椎のレベルを含む脊髄の種々のレベルを含む成体の中枢神経系の種々の領域から単離されている。脊髄では、神経幹細胞および／または前駆細胞は、室周囲の領域および柔組織から単離できる。神経幹細胞および／または前駆細胞はまた、成体の解剖した神経組織からも単離され、培養されており（ＴａｕｐｉｎおよびＧａｇｅ、前出（２００２）に概説されている）、成体の網膜内顆粒層にも存在している。
【００７３】
神経幹細胞は、中間フィラメントタンパク質であるネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ）（ＨｏｃｋｆｉｅｌｄおよびＭｃＫａｙ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：３３１０−３３２８（１９８５））；ＲＮＡ結合タンパク質であるＭｕｓａｓｈｉ１（Ｍｓｉ１）（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７６：２３０−２４２（１９９６））；および転写因子であるＳｏｘ１（Ｐｅｖｎｙ等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１９６７−１９７８（１９９８））を含む多数の免疫細胞化学的選択マーカーを発現する。これらのマーカーは、低いレベルではあるが、前駆細胞によっても発現される。神経幹細胞および前駆細胞は、それらが神経細胞接着分子のポリシアル化形態を発現することによって（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ；Ｒｏｕｓｓｅｌｏｔ等、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３５１：５１−６１（１９９５））、そしてそれらが線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）および表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターを発現することによって（Ｇｒｉｔｔｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：３２８７−３２９７（１９９９））も特徴付けられる。神経幹細胞および前駆細胞の他の特徴は当該分野で公知であり、例えば、Ｏｋａｎｏ等、前出（２００２）に概説されている。
【００７４】
神経発生を調節する化合物は、神経幹細胞および／または前駆細胞の増殖、分化、生存、または移動を増強するまたは減少させることによって作用することができる。神経発生を調節する化合物を同定するためのアッセイは、以下に記載されるように、エキソビボまたはインビボのいずれで行うこともできる。
【００７５】
神経発生を調節する化合物は、通常、以下に記載されるような適切な神経発生のアッセイにおいて、コントロールの化合物と比較して、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも２５％、５０％、１００％、５００％、またはそれ以上神経発生を促進するか、あるいは、そのようなアッセイにおいてコントロールの化合物と比較して、少なくとも約１０％、例えば少なくとも２５％、５０％、９０％、またはそれ以上神経発生を低減させる。
【００７６】
神経発生の調節は、細胞を化合物単独と、またはＥＧＦ、ＧＦＧ、もしくはＶＥＧＦのような別の神経調節因子と組み合わせて上記の化合物と接触させた後に明らかにすることができる。神経発生の調節はまた、通常のエキソビボまたはインビボ条件下で、あるいは神経疾患または神経の損傷を模倣する条件下でも明らかにすることができる。
【００７７】
以下に記載されるアッセイ方法での使用に適切な神経幹細胞および／または前駆細胞は、ヒト（解剖後または外科手術後）および実験動物（例えば、げっ歯類、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコなど）を含む哺乳動物から得ることができる。神経幹細胞および／または前駆細胞はまた、爬虫類、両生類、魚類、および鳥類を含む他の脊椎動物から、あるいは無脊椎動物からも得ることもできる。ヒトまたは動物は雄性であっても雌性であってもよく、胎児、幼体、成体、または老いた個体であってもよく、健常であっても、神経疾患または神経障害を発症しているかまたはそれらにかかりやすくてもよい。
【００７８】
特定の用途については組織外植片を使用することができるが、他の用途については、解離細胞またはニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を得ることができる。組織外植片または細胞は、上記のような脳および脊髄組織を含む神経幹細胞または前駆細胞を含む任意の神経組織から得ることができる。例示的な組織としては、嗅球（ＯＢ）、海馬の歯状回（ＤＧ）、側脳室の脳室下領域（ＳＶＺ）が挙げられる。実施例ＩＩＩには、成体マウスの側脳室から神経幹細胞および／または前駆細胞を得る方法が記載されている。他の方法は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，７５３，５０６号；およびＧｒｉｔｔｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：１０９１−１１００（１９９６）を参照）。
【００７９】
初代細胞に加えて、マウスの海馬を起源とするＭＨＰ３６細胞（Ｇｒａｙ等、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５４：１４０７−１４２１（１９９９））、ラットの中脳を起源とするＣＳＭ１４．１細胞（Ｈａａｓ等、Ｊ．Ａｎａｔ．２０１：６１−６９（２００２））、および神経系統に分化した胚性幹細胞のような、神経幹細胞および／または前駆細胞株を、神経発生のアッセイに使用することができる。
【００８０】
エキソビボでの神経発生のアッセイにおいては、増殖または分化のいずれか、あるいはそれらの両方を、当該分野で公知の方法によって容易に評価することができる。増殖および分化のアッセイによっても、間接的に細胞の生存性を測定することができる。
【００８１】
例示的な増殖アッセイにおいては、神経幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞組成物を、クローンの球状細胞コロニー、または「ニューロスフェア」を形成する条件下で培養することができる。これらのニューロスフェアは視覚的に見ることができ、光学顕微鏡下でカウントすることができる。その後、ニューロスフェアを解離させ、培養を継続して、二次およびそれ以降のニューロスフェアの数を増殖の指標として決定することができる。ニューロスフェアを培養および解離させるための条件は、実施例ＩＩＩに記載される。
【００８２】
他の例示的な増殖アッセイでは、細胞は、３Ｈチミジンまたは臭化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、チミジン類似体）を取り込むそれらの能力について評価されるか、あるいは、増殖している細胞の核抗原（ＰＣＮＡ）またはｃｄｃ２のような増殖マーカーの発現について評価される。このような増殖アッセイは当該分野で周知であり、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、第４版（２０００）に記載されている。
【００８３】
化合物が神経発生を調節するかどうかを決定するために適切な他の型の増殖アッセイは当該分野で公知であるか、または本明細書中の指針を使用して決定することができる。細胞の総数、または化合物の存在下および化合物が存在しない条件下で観察される、標識された細胞の数を比較して、神経発生が調節されているかどうかを決定することができる。
【００８４】
例示的な分化のアッセイでは、細胞は、検出することが望まれる１つまたは複数の型の細胞によって発現されるマーカーに特異的な適切な一次抗体と接触される。神経幹細胞および前駆細胞によって発現されるマーカーは上記に記載されている。実施例ＩＩＩに記載するように、ニューロンについてのマーカーはβ−チューブリンであり、星状細胞についてのマーカーはＧＦＡＰであり、乏突起膠細胞についてのマーカーはＯ４である。種々の神経系統の細胞に特異的な他のマーカーが当該分野で公知であり、それに対する抗体は商業的に入手できるか、または公知の方法によって作成することができる。
【００８５】
一次抗体が標識されていなければ、細胞は通常、その後に標識された二次抗体、例えば、酵素または蛍光標識された抗体と接触させられ、細胞が視覚化されるかまたは分類される。細胞を免疫標識する方法、ならびに免疫標識された細胞を検出し、分類するための方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ等、前出（２０００）に記載されている。化合物の存在下と化合物が存在しない条件下で観察された目的のそれぞれの系統の細胞の型および数を比較して、神経発生が調節されているかどうかを決定することができる。
【００８６】
神経発生のアッセイは、上記のように、ヒトまたは他の哺乳動物、脊椎動物、または無脊椎動物においてインビボで行うことができる。このようなアッセイは一般に、目的の組織が通常は固定され、目的の標識またはマーカーの検出の前に切片化されることをのぞいて、エキソビボでのアッセイと同様である。実施例ＩＶでは、ＢｒｄＵでインビボの増殖している細胞を標識し、続いてＢｒｄＵで標識された細胞、および神経段階に特異的な分化のマーカーを発現している細胞を免疫組織化学によって検出する方法を記載する。
【００８７】
あるいは、特にヒトまたは動物が死亡していない場合には、増殖および分化のマーカーの検出は、当該分野で公知の放射標識された抗体および非侵襲的な画像法、例えば、シングルフォトン断層法（ＳＰＥＣＴ）およびポジトロン断層撮影法（ＰＥＴ）を使用して行うことができる。
【００８８】
インビボでの適用については、治療用途について以下にさらに詳細に記載するように、種々の送達方法を使用して、目的の組織内の神経幹細胞または前駆細胞を、化合物と接触させることができる。送達方法は、目的の組織、化合物の性質（すなわち、その安定性および血液脳関門を通過する能力）、実験時間のような要因に応じて変化する。実施例ＩＶに記載するように、数週間の期間にわたって脳にペプチドおよびＢｒｄＵを送達するためには、浸透圧ミニポンプを神経領域、例えば、側脳室内に埋め込むことができる。あるいは、脳または脊柱の脳脊髄液への、あるいは眼への直接注射によって、化合物を投与することができる。化合物は、周辺に（例えば、静脈内もしくは皮下注射によるか、または経口送達による）投与することもでき、続いて血液脳関門を通過する。
【００８９】
有利なのは、インビボでの方法によって、化合物の効果を、正常な検体と、神経の損傷および神経疾患を有している検体の両方における神経発生に対するそれらの効果について試験できることである。ヒトの検体または実験動物モデルのいずれをも使用することができる。
【００９０】
脳梗塞または神経損傷による外傷の実験動物モデルは当該分野で公知である。脳梗塞の１つの実験モデルには、短期間でのラットの右中大脳動脈および両頸動脈の共通部分の閉塞、その後の再潅流が含まれる（Ｍｏｏｒｅ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８０：１１１−１１８）。中枢神経損傷の１つの実験モデルは、ｆｌｕｉｄ  ｐｅｒｃｕｓｓｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ（ＦＰＩ）モデルであり、ここでは、適度な衝撃（１．５〜２．０ａｔｍ）が頭骨頭頂部の大脳皮質に加えられる（Ａｋａｓｕ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３２９：３０５−３０８（２００２）。脊髄損傷の実験モデルもまた、当該分野で使用されている（Ｓｃｈｅｉｆｅｒ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３２３：１１７−１２０（２００２））。酸化的ストレス、低酸素症、放射線、および毒素が原因である神経の損傷の適切なモデルもまた当該分野で公知である。
【００９１】
ヒトの神経変性疾患の実験動物モデルもまた当該分野で公知である。アルツハイマー病の種々の実験モデルは、Ｊａｎｕｓ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．７３：８７３−８８６（２００１）に概説されており；パーキンソン病のモデルは、Ｔｏｌｗａｎｉ等、Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．４９：３６３−３７１（１９９９）に概説されており；ハンチントン病のモデルは、Ｍｅｎａｌｌｅｄ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２３：３２−３９（２００２）に概説されており；そして筋萎縮性側索硬化症のＳＯＤ−１トランスジェニックモデルは、Ｒｉｐｐｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６８９−６９３（１９９５）に記載されている。治療用途に関して以下に記載されるものを含むヒトの神経変性疾患についての他の動物モデルは、当該分野で公知である。
【００９２】
網膜での神経発生の実験動物モデルは、例えば、Ｍａｒｃｕｓ等、Ｖｉｓｕａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：４１７−４２４（１９９９）に記載されている。
【００９３】
実験用の自己免疫性脳脊髄炎の動物モデルのような、脱髄疾患の実験動物モデル（多発性硬化症のモデル）もまた当該分野で公知である。
【００９４】
いずれのインビボでのアッセイにおいても、化合物の存在下と、化合物が存在しない条件下での神経発生を比較して、その化合物が神経発生を調節するかどうかを決定することができる。このようなインビボでのアッセイにより、ヒトでの治療的使用について、調製物中の目的の化合物の安全性、毒性、薬物動態学、および治療効力の証拠をさらに提供することができる。
【００９５】
神経発生を調節する本発明の化合物は、神経発生を促進または阻害することが有益である種々の神経系の障害を予防または処置するための治療薬として、直接使用することができる。本発明の化合物はまた、エキソビボで神経発生を促進するために使用することもでき、その結果、神経幹細胞、前駆細胞、および／またはさらに分化した神経細胞を含む細胞組成物を、同じ兆候を予防または処置するために、続けて個体に投与することができる。
【００９６】
本発明の化合物で処置できる神経系の障害としては、神経系の損傷、および軸策の切断、ニューロンの縮小もしくは再生、または脱髄のいずれかを生じる疾患または障害が挙げられるがこれらに限定されない。このような疾患および障害として、例えば、以下の中枢神経系（脊髄および脳を含む）または末梢神経系の病変が挙げられる：
（１）虚血性の病変：ここでは、神経系の一部での酸素の欠乏により、脳梗塞もしくは虚血、または脊髄の梗塞もしくは虚血を含むニューロンの損傷または死が生じる；
（２）外傷性の病変：これには、物理的損傷によって、または外科手術に伴って生じる病変、例えば、神経系の一部を切断する病変または圧迫損傷が含まれる；
（３）悪性の病変：ここでは、神経系に関係している悪性腫瘍、または神経系以外の組織に由来する悪性腫瘍のいずれかである悪性組織によって、神経系の一部が破壊されるかまたは損傷する；
（４）感染性の病変：ここでは、神経系の一部が、例えば、膿瘍による感染、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹ウイルス、もしくは単純ヘルペスウイルスによる感染、またはライム病、結核、もしくは梅毒への感染の結果として破壊されるかまたは損傷する；
（５）変性性の病変：ここでは、神経系の一部が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および網膜変性に伴う変性を含むがこれらに限定されない変性プロセスの結果として破壊されるかまたは損傷する；
（６）栄養上の病気または栄養障害に関係する病変：ここでは、神経系の一部が、ビタミンＢ１２の欠乏、葉酸の欠乏、ウェルニッケ失語症、タバコ−アルコール性弱視、マルキャファーバ・ビニャミ（Ｍａｒｃｈｉａｆａｖａ−Ｂｉｇｎａｍｉ）症候群（脳梁の一次変性）、およびアルコール性小脳変性症を含むがこれらに限定されない代謝の栄養障害によって破壊されるかまたは損傷する；
（７）糖尿病（糖尿病性神経障害、顔面神経麻痺）、全身性エリテマトーデス、ガン、またはサルコイドーシスを含むがこれらに限定されない全身性疾患に伴う、神経学的病変；
（８）アルコール、鉛、または特定の神経毒を含む毒性物質によって引き起こされる病変；ならびに
（９）脱髄性の病変：ここでは、神経系の一部が、多発性硬化症、ＨＩＶ関連ミエロパシー、横断性脊髄症、または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミエリン溶解を含むがこれらに限定されない、脱髄性疾患によって破壊されるかまたは損傷する。
【００９７】
神経発生が学習および記憶に関係しているので、本発明の化合物はまた、学習および／または記憶を増強するために正常な個体に対して、あるいは学習および／または記憶に異常がある個体を処置するために使用することもできる。
【００９８】
神経発生を調節する化合物で効果的に処置することができる他の症状は当該分野で公知である（例えば、米国公開出願番号２００２０１０６７３１を参照）。
【００９９】
本明細書中に記載される方法によってＰＫＲシグナル伝達を調節し、さらに神経発生を調節する化合物として同定される化合物は、神経発生を調節することに加えて、有用な活性を有していると予想される。例えば、ＰＫＲ１および／またはＰＫＲ２は、本明細書中に記載されている神経組織から離れた種々の組織上で発現されている。ＰＫＲシグナル伝達の調節は、これらの組織に関係している症状、例えば、胃腸の運動の障害（米国公開出願番号２００２０１１５６１０Ａ１）、サーカディアンリズムの障害（Ｃｈｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：４０５−４１０（２００２））、および血管形成の障害（ＬｅＣｏｕｔｅｒ等、前出（２００１））を処置するために有効であると提案されている。
【０１００】
幹細胞は、培養物中で際限なく分裂して、特殊化した細胞を生じる能力を有している。受精卵は全能性であり、このことは、その能力が完全であることを意味している。数サイクルの細胞分裂の後、これらの全能性細胞は特殊化し始め、胚盤胞と呼ばれる細胞の中空の球体を形成する。胚盤胞の内部の細胞塊の細胞は多能性であり、多くではあるが胎児の発生に必要な全ての型ではない、細胞を形成し続ける。多能性幹細胞はさらに、特定の機能を有している細胞を生じることが決定されている幹細胞への特殊化を受ける。これらの細胞は多能性幹細胞と呼ばれる。多能性幹細胞の例として、赤血球、白血球、および血小板を生じる造血幹細胞；肝細胞および胆管上皮細胞へと分化する肝幹細胞；筋肉へと分化する筋原幹細胞；および上記の神経幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞は、肺、心臓、前立腺、皮膚、および消化管を含む多くの他の器官および組織において同定されている。
【０１０１】
神経幹細胞は他の型の幹細胞と特定の特徴、例えば、特定の表面マーカー（例えば、Ｋｌａｓｓｅｎ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．３１２：１８０−１８２（２００１）；Ｈｕｎｚｉｋｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７１：１１６−１１９（２０００））、ならびに自己複製し分化する能力を共有しているので、神経発生に関係していることが本明細書中で開示されているプロキネチシンレセプターを介したシグナル伝達はまた、全能性および他の多能性幹細胞の増殖および分化の調節においても重要であると予想される。したがって、神経発生を調節する化合物を同定し、使用するための本明細書中に記載されている方法は、当該分野で公知のエキソビボおよびインビボでの適用において、他の幹細胞の増殖および分化を調節する化合物を同定し、使用するように容易に適応させることができる。
【０１０２】
当業者は、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物についての他の有用な用途を決定することができる。
【０１０３】
神経発生を調節する本発明の化合物は、処置される症状；個体の体重、性別、年齢、および健康状態；特定の化合物の生化学的性質、生体活性、生体利用性、および副作用について適切な様式および量で；そして同時に行われる処置レジメと矛盾しない様式で、処方し、投与することができる。ヒトでの特定の治療適用について適切な量および処方は、本明細書中に記載されるエキソビボおよびインビボでの神経発生のアッセイにおける化合物の活性に基づいて推定することができる。
【０１０４】
全量の化合物を、１回の用量として、または比較的短い時間にわたる注入によって投与することができ、また、より長い時間にわたって投与される複数回の用量で投与することもできる。さらに、化合物は、標的組織の部位またはその付近での全身的な送達のために埋め込むことができる徐放マトリックスにおいて投与することもできる。治療用化合物を含む化合物の徐放に有用な意図されるマトリックスは当該分野で公知であり、ＤｅｐｏＦｏａｍ（登録商標）、生体高分子、マイクロポンプなどの物質が挙げられる。
【０１０５】
本発明の化合物は、例えば、大脳内、随腔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、関節内、腹腔内、後頭内、動脈内、経口、膣内、直腸内、局所、鼻腔内、または経皮を含む、当該分野で公知の種々の経路によって哺乳動物に投与することができる。
【０１０６】
通常、本発明の化合物は、化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物として動物に投与される。薬学的に許容される担体の選択は、化合物の投与経路、ならびにその特定の物理的および化学的特徴に応じて異なる。薬学的に許容される担体は当該分野で周知であり、これには、緩衝生理食塩水のような滅菌の水性溶媒、ならびにグリコール、グリセロール、オリーブオイルのような油、および注射可能である有機エステルのような他の溶媒または媒体が含まれる。薬学的に許容される担体はさらに、化合物を安定化させる、その可溶性を高める、またはその吸収を高める生理学的に許容される化合物を含むことができる。このような生理学的に許容される化合物としては、グルコース、スクロース、またはデキストラン（ｄｅｔｒａｉｎｓ）のような炭水化物；アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤；キレート化剤；および低分子量タンパク質が挙げられる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（１９９０）を参照）。
【０１０７】
脳血液関門を通過するか、または細胞膜を通過する化合物が必要な用途には、化合物の親油性を高める処方物が有用であり得る。例えば、本発明の化合物をリポソーム中に内蔵することができる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻から第ＩＩＩ巻、第２版（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ（１９９３））。作成することおよび投与することが比較的簡単であるリン脂質または他の脂質から構成されるリポソームには毒性はなく、生理学的に許容され、代謝することができる担体である。血液脳関門を通過するように化合物を処方するための他のアプローチは当該分野で公知であり、これには、１から１０００ｎｍまでの大きさの範囲の固体状のコロイド粒子であるナノ粒子の使用（Ｌｏｃｋｍａｎ等、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２８：１−１３（２００２）、ならびに輸送ベクターとして作用するペプチドおよびペプチド模倣物の使用（Ｒａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．１：１３１−１３９（２００２））が含まれる。
【０１０８】
中枢神経系への薬物送達には特有の課題があるが、ＣＮＳは免疫特権のある部位である。したがって、多くの適応症についてのその使用を妨げる免疫応答を誘発する化合物は、ＣＮＳに送達された場合でもなお有効な治療となり得る。したがって、免疫原性である可能性がある化合物、例えば、キメラプロキネチシンペプチド、他の種に由来するプロキネチシン、および特定の他のＰＫＲを調節する化合物を、ヒトの神経発生を調節するための有効な治療薬として使用することができる。
【０１０９】
薬剤のスクリーニングにおいて同定されるペプチドおよび化合物に加えて、本明細書中に記載されるＰＫＲを調節する化合物には、プロキネチシンまたはプロキネチシンレセプターをコードする核酸分子、さらには、リボザイム、アンチセンス分子、ＲＮＡｉなどが含まれる。治療的な使用のために個体に対して核酸分子を処方し送達する方法は当該分野で公知である。治療用核酸分子をＣＮＳに送達するために有用なベクターとしては、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＶＳＶ−Ｇ−シュードタイプレトロウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。核酸分子をＣＮＳに送達するための方法は、例えば、Ｈｓｉｃｈ等、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：５７９−６０４（２００２）に概説されている。
【０１１０】
神経幹細胞および前駆細胞、さらに分化した細胞、およびＰＫを発現する遺伝的に修飾されている細胞を含む、ＰＫＲを調節する化合物と接触させられた細胞は、本明細書中で記載される治療用途において使用することができる。治療的な使用のために個体に細胞を処方し送達する方法は当該分野で公知である（例えば、Ｃａｏ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．６８：５０１−５１０（２００２）、およびＰａｒｋ等、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：６１３−６２４（２００２）を参照）。
【０１１１】
神経発生の調節を増強するために、１つ以上の治療的なアプローチまたは治療用組成物を個体に提供するか、またはエキソビボで使用することができる。例えば、ＰＫＲシグナル伝達を調節する化合物を、ＥＧＦおよびＦＧＦのような神経成長因子と組み合わせて、または処置される障害または症状についての従来の治療法と組み合わせて使用することができる。医師は、本発明の化合物および方法と組み合わせて使用するために適切な同時または逐次の治療法を決定することができる。
【０１１２】
本明細書中に記載されるように、ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、およびＰＫ２は、神経性の活性がある脳および網膜の領域内の細胞上で発現される。したがって、これらのポリペプチドに特異的に結合する分子はエキソビボまたはインビボのいずれの用途においても使用することができ、神経性の活性のある細胞または領域を標識することができる。ＰＫＲおよびＰＫに特異的に結合する分子としては、それぞれ、それらの同種リガンドおよびレセプター、ならびに本明細書中に記載されるアッセイにおいて同定される抗体および結合化合物が挙げられる。
【０１１３】
したがって、本発明は、混合した細胞集団、組織、または動物を、ＰＫＲまたはＰＫに結合するリガンドと接触させ、上記リガンドの上記集団内の細胞、組織、または動物への結合を検出することによる、神経細胞を標識する方法を提供する。
【０１１４】
マーカーとしてのプロキネチシンおよびプロキネチシンレセプターの使用は、これらのマーカーが、上記のマーカーのような神経細胞を同定するために現在使用されている他のマーカーよりも特定の細胞型についてより豊富に存在しているかまたはより選択的である場合に、特に有利である。この標識方法は、種々の研究および臨床用途において、例えば、種々の型の細胞を同定および識別することにおいて、神経障害を診断することにおいて、および神経性の薬剤での治療効力をモニターすることにおいて使用することができる。当業者は、本明細書中に記載されている化合物および方法についての他の有用な用途を決定することができる。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明を説明するために意図され、限定するようには意図されない。
【実施例】
【０１１６】
（実施例Ｉ）
本実施例は、神経性の活性が高い脳の領域での、プロキネチシン２（ＰＫ２）、プロキネチシンレセプター１（ＰＫＲ１）、およびプロキネチシンレセプター２（ＰＫＲ２）の発現を示す。
【０１１７】
マウスの脳におけるＰＫＲ１、ＰＫＲ２、およびＰＫ２  ｍＲＮＡの発現のインサイチュハイブリダイゼーション分析を、以下の方法に従って行った。マウスＰＫ２のコード領域（登録番号ＡＦ４８７２８０；ヌクレオチド１〜５２８）またはマウスＰＫＲ２の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）（登録番号ＡＦ４８７２７９；ヌクレオチド１１４７−２２１１）、またはマウスＰＫＲ１の３’ＵＴＲ（登録番号ＡＦ４８７２７８；ヌクレオチド１２０８−２１８３）を含むアンチセンスおよびセンスリボプローブを作成した。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２の３’ＵＴＲを使用して、それぞれのｍＲＮＡを区別した。なぜなら、これらのレセプターはそれらのコード領域においては核酸配列のレベルで８０％を上回って同一であるからである。リボプローブをＴ７またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用して作成し、３５Ｓ−ＵＴＰで放射標識した。プローブを、１×１０７ｃｐｍ／ｍｌの濃度で使用した。
【０１１８】
成体Ｃ５７Ｂ１６雄性マウスから脳を素早く取り出し、−２０℃で３０秒間、イソペンタン抽出物で凍結させた。２０μｍの冠状断面または矢状断面を低温保持装置上で切り取り、連続する切片を回収した。組織切片を、Ｃｈｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：４０５−４１０（２００２）に記載されている方法にしたがってインサイチュハイブリダイゼーション用に処理した。簡単に言うと、組織切片をプロテイナーゼＫで前処理し、リボプローブと６０℃で１８時間ハイブリダイズさせ、その後、ＲＮＡｓｅ消化、高いストリンジェンシーでの洗浄、および脱水を行った。次いで、組織切片をＢｉｏＭａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ）に３〜４日間露光させた。ｍＲＮＡの分布をオートラジオグラムおよび乳濁液に浸した切片について分析した。特異的なハイブリダイゼーションシグナルを、ビデオ型コンピューター画像解析システム（ＭＣＩＤ、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅ’ｓ  Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用して既知の放射活性の１４Ｃ標準物と比較することによって定量的に分析した。光学密度対放射活性（ｄｐｍ／ｍｇ組織の湿重量の検量線を、１４Ｃ標準物を使用して構築した。オートラジオグラフの画像をＭＣＩＤを使用して獲得し、そして乳濁液に浸した脳の画像を、透過型顕微鏡（ＢＸ５０、Ｏｌｙｍｐｕｓ）下でＳｐｏｔカメラソフトウェアバージョン２．２．２（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）を使用することによって撮影した。図をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（バージョン５．５）を使用することにより作成した。
【０１１９】
ＰＫＲ１およびＰＫＲ２プローブでの成体マウスの脳切片のインサイチュハイブリダイゼーションでは、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２のｍＲＮＡが、側脳室の脳室下領域（ＳＶＺ）、嗅球、嗅ヘルニア（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）、および海馬の歯状回で発現されていることが明らかになった。これらの領域は全て、成体の脳において神経性の活性があることが示されている領域である。定量により、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２のｍＲＮＡの両方のレベルが最も高いのは、嗅球／嗅ヘルニアの領域であり、その後に側脳室のＳＶＺ、および海馬の歯状回が続くことが明らかになった。したがって、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２  ｍＲＮＡの発現レベルは、成体の脳における神経性の活性のレベルに関係している。
【０１２０】
ＰＫＲ１およびＰＫＲ２を活性化することができるリガンドの１つであるＰＫ２の発現もまた、神経性の活性が最も高い脳の領域である嗅球で検出された。ＰＫ２  ｍＲＮＡはまた、海馬の歯状回でも発現されている。
【０１２１】
神経性の活性を有している成体の脳の領域におけるプロキネチシンリガンドおよびレセプターの発現は、プロキネチシンおよびプロキネチシンレセプターが、神経系での神経発生を調節する重要なシグナル伝達分子であることを示している。したがって、プロキネチシンレセプターシグナル伝達を調節する化合物を、神経発生を促進または阻害することが望まれる用途において治療的に使用できる。
【０１２２】
（実施例ＩＩ）
本実施例は、成体の網膜におけるＰＫＲ２  ｍＲＮＡの発現を示す。
【０１２３】
成体マウスの網膜を、ＰＫＲ２  ３’ＵＴＲリボプローブを使用して実施例Ｉに記載したように免疫組織化学用に処理した。ＰＫＲ２  ｍＲＮＡの発現が網膜において、特に、網膜の内顆粒層において観察された。
【０１２４】
網膜形成の間に、７つの重要な網膜細胞型が、眼杯の内層に存在している多能性網膜先祖細胞（ＲＰＣ）の共通の集団から誘導されることが知られている（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ等、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：３２−３８（２００２）。内顆粒層、すなわち、層６が、成体の網膜の中での多能性幹細胞の予想位置である。
【０１２５】
網膜の内顆粒層におけるＰＫＲ２の発現は、網膜の神経発生におけるＰＫＲシグナル伝達についての役割と一致している。したがって、プロキネチシンレセプターシグナル伝達を調節する化合物を、網膜での神経発生を促進または阻害することが望まれる用途において治療的に使用することができる。
【０１２６】
（実施例ＩＩＩ）
本実施例は、神経幹細胞または前駆細胞をエキソビボでプロキネチシンと接触させ、そして神経発生に対する影響を評価する方法を示す。
【０１２７】
神経幹細胞培養物を、ニューロスフェアと呼ばれるクローン状の球状細胞コロニーを形成する条件下で、成体マウスの側脳室の外側壁から確立させた（ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：１７０７−１７１０（２００２））。次いで、神経幹細胞を９種類の異なる条件下で培養した：ＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＰＫ１、ＰＫ２、ＥＧＦ＋ＰＫ１、ＦＧＦ２＋ＰＫ１、ＥＧＦ＋ＰＫ２、ＦＧＦ＋ＰＫ２の存在下、または成長因子を含まない条件。エキソビボで、６種類の異なる培養条件でのニューロスフェアの総数を、５日後にカウントし、５回の独立した実験によるニューロスフェアの平均の数を計算した。それぞれの独立した実験において、４匹の動物に由来する３００，０００個の側脳室壁細胞を９種類の異なる条件に分けた。以前の報告によれば、成長因子を加えなかった培養物においては、ニューロスフェアが検出されないか、またはいくつかのごく少ない数のスフェアが検出される。数に加えて、ニューロスフェアの形態をそれらの大きさおよび外観について記録する。ＰＫとＥＧＦおよび／またはＦＧＦ２の相乗効果の可能性についてもまた決定した。
【０１２８】
その後、ニューロスフェアを形成している細胞を、それらが自己再生能力を有しているかどうか、および１つの条件下で増殖させた細胞が別の成長因子の存在下で増殖することができるかどうかを決定するために、異なる条件下で試験した。エキソビボで、８日後にニューロスフェアを解離させ、単一の成長因子の中で増殖させたそれぞれの培養物を２等分した；片方の半分は、継代前と同じ成長因子の中で増殖させ続け、他方の半分を他の成長因子の中で増殖させた。両方の成長因子の中で増殖させたニューロスフェアは、両方の成長因子の中で増殖させ続け、成長因子を含めずに増殖させたニューロスフェアは成長因子を含めずに増殖させ続けた。継代後５日で、ニューロスフェアの総数を、５回の独立した実験からカウントした。
【０１２９】
初代神経細胞を調製するために、４〜８ヶ月齢のＣＤ−１  ａｌｂｉｎｏマウスを、ペントバルビタールの腹腔内注射（１２０ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔し、頚椎脱臼によって屠殺した。脳を取り出し、人工的な脳脊髄液（ａＣＳＦ）（１２４ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、および１０ｍＭのＤ−グルコース、ｐＨ７．３）中に入れ、室温で９５％Ｏ２／５％ＣＯ２でエアレーションした。上衣下星細胞腫を冠状断面化の後に単離し、１ｍｍ３の小片になるように切断した。小片を、１．３ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｔｙｐｅ  ＸＩＩ，９０００  ＢＡＳＦ単位／ｍｇ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．６７ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（２０００単位／ｍｇ；Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍｇ／ｍｌのキヌレン酸（Ｓｉｇｍａ）を含む３０ｍｌのａＣＳＦ中に移し、連続的な酸化および攪拌下で３２〜３４℃で９０分間インキュベートした。その後、組織切片をａＣＳＦ中で１０分間リンスし、０．７ｍｇ／ｍｌのオボムコイド（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１：１ｖ／ｖ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に移し、炎で研磨した（ｆｉｒｅ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）パスツールピペットで注意深く粉砕した。細胞を遠心分離によって回収し、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．６％のグルコース、９．６ｇｍ／ｍｌのプトレッシン、６．３ｎｇ／ｍｌのプロゲステロン、５．２ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、０．０２５ｍｇ／ｍｌのインシュリン、０．１ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、および２μｇ／ｍｌのヘパリン（ナトリウム塩、等級ＩＩ；Ｓｉｇｍａ）（コントロール培地）を含む、成長因子を含まない化学的に定義されているＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地中に再懸濁した。
【０１３０】
上記のように調製した細胞を、成長因子（ＧＦ；ＦＧＦ２（ヒト組換え体、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ、もしくはＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、ＥＧＦ（ヒト組換え体、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）のいずれか）、または組み換えのヒトＰＫ１もしくはＰＫ２（１０ｎＭ、もしくは１０ｎｇ／ｍｌ）を含む３５ｍｍのペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）にプレートした。培地を３〜４日おきに交換した。
【０１３１】
集団の分析のために、初代細胞を３５００細胞／ｃｍ２でプレートし、８〜１０日後に形成したスフェアを集め、遠心分離（８００×ｇで１０分間）によって回収し、単細胞懸濁物になるように機械的に解離させ、適切なＧＦ（単数または複数）を含む培地中に再度プレートした。この手順を、６ヶ月までエキソビボで８〜１０日（ＤＩＶ）ごとに繰り返した。生存可能な細胞の総数を、トリパンブルー排除によってそれぞれの継代で評価し、カルセイン／ヨウ化プロピジウム技術によって確認した。
【０１３２】
初代培養物中の幹様細胞の数を評価するために、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、または組み換えヒトＰＫ２に応答する皿上にプレートされた幹様細胞の数の定量的決定ができる培養条件を確立した。この方法論は、成体の神経幹細胞について開発されており（Ｇｒｉｔｔｉ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：１０９１−１１００（１９９６））、これは種々の造血組織から単離されたクローン形成性細胞の型および数を評価するための従来からのアッセイにからは変更が加えられている（Ｂｏｄｉｎｅ等、Ｂｌｏｏｄ  １５；７８：９１４−９２０（１９９１）；Ｂｏｄｉｎｅ等、Ｂｌｏｏｄ  ７９：９１３−９１９（１９９２））。脳室下の組織を単細胞の懸濁物となるように解離させ、これをメチルセルロースゲルマトリックス（１．５％の最終濃度；Ｄｏｗ  Ｍｅｔｈｏｃｅｌｌ  Ａ４  Ｍ、ｐｒｅｍｉｕｍ  ｇｒａｄｅ）中に包埋して凝集を防ぎ、＜１０の生存可能な細胞／ｃｍ２の最終密度でプレートし、適切なＧＦの存在下で球状のクローンが形成されるまで培養した（８〜１０日間エキソビボで（ＤＩＶ））。ＦＧＦ２、ＥＧＦ、または組み換えＰＫ１もしくはＰＫ２の存在下で形成されたスフェアの数をカウントすることにより、試験した条件下で増殖することができるプレートされた幹細胞の数を得た。これらの培養物中の単細胞、ダブレット、およびトリプレットの数を評価するために、試料をガラスのカバースライド上に播種し、４’、６−ジアミノ−２−フェニルインドールジヒドロ塩酸塩で対比染色した（ＤＡＰＩ；メタノール中で１ｍｇ／ｍｌ；３７℃で１５分間）細胞核をカウントした。
【０１３３】
全ての他のサブクローニング段階で、および成長因子の変更後に、細胞のアリコートを培養物から抜き取り、クローンのスフェアを、解離させた単細胞をメチルセルロース中に包埋し、適切なＧＦの存在下でのクローン密度（＜１細胞／ｃｍ２）でプレートすることにより形成させた。クローンのスフェアを、逐次のサブクローニング実験において、自己再生能力および多能性についてのアッセイに使用した。自己再生については、個々のスフェアを顕微操作によって回収し、単細胞懸濁物になるように解離させ、メチルセルロース中に包埋し、適切なＧＦ（単数または複数）を含む培地中に、初代培養物について上記に記載したように再度プレートした。種々の条件下で生じたスフェアの数を８〜１０日後に評価し、プレーティングの３０分後の直接の観察によって決定したそれぞれのウェルにプレートした細胞の総数によって標準化した。
【０１３４】
ＧＦの変更後の幹細胞による多能性の保持を以下のように評価した。単細胞懸濁物を調製し、個々の細胞を高倍率下で選択し、顕微操作によって単一のウェルに移し、分離して増殖させた（１細胞／ウェル）。場所の同定を容易にするためにウェルに印を刻み、適切な間隔で顕微鏡写真を撮った。クローンのスフェアを形成させた後、これをさらに二次培養して拡大させ、生じた後代を複数のガラスカバースライド上にプレートし、分化させ、複数の免疫細胞化学のために以下に記載するように処理した。
【０１３５】
複数の免疫蛍光アッセイを以下のように行った。上衣下星細胞腫組織（１０００細胞／ｃｍ２）から新しく解離した細胞、および連続して継代したクローンのスフェアを、ポリオルニチンでコーティングしたガラスカバースライド上にプレートした。分化の実験のためにに、細胞を、ＧＦを含まない培養培地中に５日間、その後、ウシ胎児血清を加えてさらに２〜５日間エキソビボで（ＤＩＶ）プレートした。初代培養物または分化した培養物を、ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で固定し（２０分間）、ＰＢＳで３回リンスした。その後、カバースライドを、１０％の正常なヤギの血清（ＮＧＳ）、０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および適切な一次抗体または抗血清を含むＰＢＳ中で３７℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳおよび１０％のＮＧＳでの徹底的な洗浄の後、細胞を、二次フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスもしくは抗ウサギＩｇＧ抗体、またはローダミンイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスもしくは抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）とともに、あるいは、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸に結合させたロバ抗マウスＩｇＭ抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）とともに４５分間（室温）反応させた。カバースライドをＰＢＳ中で３回、蒸留水中で１回リンスし、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）でガラススライド上に取り付けた。免疫染色後、カバースライドをＤＡＰＩで対比染色した。
【０１３６】
使用した一次抗体または抗血清は、マウスモノクローナル抗微小管結合タンパク質−２（ＭＡＰ２；ＩｇＧ；１：１００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、抗−ｔａｕ−微小管結合タンパク質（ＩｇＧ；１：１００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、抗β−チューブリン（ＩｇＧ；１：１２５０；Ｓｉｇｍａ）、抗ガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ；ＩｇＧ；１：５０；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、抗Ｏ４（ＩｇＭ；１：２００；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、およびグリア細胞線維性酸性タンパク質に対するウサギ抗血清（ＧＦＡＰ；すぐに使用できる；Ｉｎｃｓｔａｒ）である。試料を、Ｎｉｋｏｎ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光倒立顕微鏡で観察し、写真を撮った。
【０１３７】
（実施例ＩＶ）
本実施例は、インビボで神経幹細胞または神経前駆細胞をプロキネチシンと接触させ、神経発生に対する効果を評価する方法を示す。
【０１３８】
組み換えプロキネチシンを脳室内（ＩＣＶ）注射によってラットの脳に投与し、神経発生を試験した。組み換えＰＫ１およびＰＫ２を注入するための手順は以下のとおりである。成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをケタミンで麻酔し、Ｃｈｅｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：４０５−４１０（２００２）に記載されているように、浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  ２００２；Ａｌｚａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を埋め込んだ。カニューレを右側脳室に、軟膜の表面に対して４．０ｍｍの深さ、ブレグマに対して＋０．０ｍｍの前後関係、および中線に対して１．８ｍｍ横に差し込んだ。それぞれのラットに、０．１ＭのＰＢＳ（１μｇ／ｍｌ）中に溶解させたヒト組み換えプロキネチシン１またはプロキネチシン２、あるいはＰＢＳのみのいずれかを、１０μｌ／日で１４日間注入した。プロキネチシンまたは媒体を注入した脳で新たに生じた細胞を標識するために、細胞増殖マーカーであるＢｒｄＵを、プロキネチシンまたはＰＢＳと同じ速さ（１２μｇ／日）で同じミニポンプによって注入した。プロキネチシンとＢｒｄＵ、またはＰＢＳとＢｒｄＵの注入の停止後、カニューレは側脳室に残し、動物をさらに１６日生存させておき、その後、潅流した。
【０１３９】
組み換えプロキネチシンのＩＣＶ注入により神経発生が調節されるかどうかを決定するために、ヒトプロキネチシン１または２の投与（ｎ＝３）後に前脳に新たに生じた細胞の分布および数を試験し、単独で与えたコントロールの媒体である０．１ＭのＰＢＳの投与後の結果と比較した。試験した領域には、側脳室の脳室下領域（ＳＶＺ）、嗅球、嗅ヘルニア、海馬の歯状回、大脳皮質領域、および神経の増殖、分化、または移動が生じるか、あるいはＰＫＲ１またはＰＫＲ２が発現されている脳の他の領域を含めた。
【０１４０】
化合物の脳室内投与の停止の１６日後に、動物をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％のパラホルムアルデヒドで心臓を通じて潅流させた。脳を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の３０％スクロースで凍結防止し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中に包埋し、低音保持装置の上で前頭面を２０μｍの切片に切断した。
【０１４１】
新たに生じたＢｒｄＵ陽性細胞を明らかにするために、切片を１ＮのＨＣｌ中で６０℃で３０分間インキュベートしてＤＮＡを変性させた。続いて、切片をブロッキング血清（０．０２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の１０％の正常なヤギの血清；ＮＧＳと略す）中で最初に１時間インキュベートし、その後、ＮＧＳ中のマウスＩｇＧ抗ＢｒｄＵ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）の１：２００希釈物とともに４８時間インキュベートした。ＢｒｄＵで標識された細胞の蛍光を視覚化するために、切片をローダミン結合ヤギ抗ラット二次抗体（１：２００希釈）中で室温で１時間インキュベートした。
【０１４２】
いくつかの切片を、ＢｒｄＵで標識された細胞のみが視覚化されるように処理し、一方他の切片は抗ＢｒｄＵと、新たに生じた細胞の表現形を決定するための細胞型特異的マーカーに対する抗体で二重標識した。ニューロンを同定するために、抗体ＴｕＪ１（１：４００）（Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）（これは、通常は未熟なニューロンによって発現されるニューロン特異的βＩＩＩ−チューブリンを認識するマウスポリクローナルＩｇＧである（Ｌｅｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：７１９５−７１９９（１９９０）））、または微小管結合タンパク質−２（ＭＡＰ２）（１：２００；Ｒｏｃｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（これは、より分化したニューロンを認識する（Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：９７７−９９１（１９８５）））を使用した。グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対するポリクローナル抗体（１：５００希釈；Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ；Ｂｉｇｎａｍｉ等、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４３：４２９−４３５（１９７２））も、星状細胞を固定するために、そして１：２００希釈（Ｃｈｅｎｇ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：５６７３−５６８１（１９９８））のマウスモノクローナル抗ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を乏突起膠細胞を同定するために使用した。未分化の細胞についてのマーカーとして、中間フィラメントタンパク質であるネスチンに対するマウスモノクローナル抗体（ＨｏｃｋｆｉｅｌｄおよびＭｃＫａｙ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：３３１０−３３２８（１９８５））；ＦｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎおよびＭｃＫａｙ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：５６７３−５６８１（１９８８））は、希釈していない上清として使用した（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ，ＩＡ）。
【０１４３】
全ての細胞型特異的抗体の蛍光を視覚化するために、フルオレセイン結合二次抗体を、１：２００希釈で使用した。全ての二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。スライドにＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でカバーガラスをかけ、ローダミンおよびフルオレセインフィルター、さらにはローダミンおよびフルオレセインの蛍光を同時に視覚化するための二重フィルターを取り付けたＮｉｋｏｎ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。個々のＢｒｄＵ＋細胞の表現形の確認のために、切片をさらに、Ｂｅｒｍａｋ等、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：４９２−４９８（２００１）に記載されているように、走査型共焦点レーザー顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して観察した。分析した構造の細胞構築を明らかにするために、いくつかの切片をエタノール中で脱水し、クリシルバイオレットで対比染色し、再水和し、ＤＰＸ（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）でカバースライドをかけた。全ての顕微鏡画像を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して処理した。
【０１４４】
１ｍｍ３あたりの細胞として表されるＢｒｄＵで標識された細胞の密度を、ＰＫ１またはＰＫ２を注入した脳、およびＰＢＳを注入した脳の両方において決定した。ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎによるラットの地図を使用して決定した、同じ細胞構築上の特徴を示す対応する冠状切片を、比較のために使用した。４０倍の倍率を使用し、外側壁または第３脳室壁から始まって、ＢｒｄＵ＋細胞がもはや検出できない柔組織にまで伸びる光学格子（野サイズ、２５０×２５０μｍ）を置くことによってカウントした。ＢｒｄＵで標識された細胞の密度を、全ての動物において分析したそれぞれの構造について計算し、スチューデントｔ検定を使用して統計分析を行った。
【０１４５】
（実施例Ｖ）
本実施例は、プロキネチシン２の投与により成体ラットの脳で神経発生が増大することを示す。
【０１４６】
プロキネチシンが神経発生を調節することを確認するために、組み換えヒトＰＫ２を、成体ラットの前脳への脳室内注入によって投与した。次いで、コントロール動物と比較して、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３ヶ月齢）の前脳で新たに生じた細胞の数を測定した。細胞増殖マーカーであるＢｒｄＵ（新たに生じた細胞を標識するために使用した）を、１回の腹腔内注射（５０ｍｇ／Ｋｇ）によって投与した。ＰＫ２の投与をプラスチックチューブを挿入することによりＩＣＶカニューレに接続したＡｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプを使用して行った。ＩＣＶカニューレを右側脳室に、軟膜表面に対して４．０ｍｍの深さ、ブレグマに対して＋０．０ｍｍの前後関係、および中線に対して１．８ｍｍ横に差し込んだ。
【０１４７】
短期の研究のために、ラットに、ａＣＳＦ（人工的な脳脊髄液）中に溶解させたヒトＰＫ２（１０μＭ）、またはｓＣＳＦのみのいずれかを３日または６日間にわたって注入した。ラットを、心臓を介したパラホルムアルデヒドの注入によって安楽死させた。長期の研究のために、ラットに、ａＣＳＦ中に溶解させたヒトＰＫ２（１０μＭ）またはａＣＳＦのみのいずれかを１４日間にわたって注入し、ＩＣＶ注入の開始の５週間後に、心臓を介したパラホルムアルデヒドの注入によって安楽死させた。
【０１４８】
動物をペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、心臓を介して０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％のパラホルムアルデヒドを注入した。脳を取り出し、４％のパラホルムアルデヒド中で一晩固定し（ｐｏｓｔ−ｆｉｘｅｄ）、０．３２Ｍのスクロースに移した。切片（４０μｍ）を凍結防止装置を用いて切断し、凍結防止溶液（グリセロール、エチレングリコール、および０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、３：３：４の容量）中で−２０℃で保存した。
【０１４９】
以下の抗体および最終希釈物を、免疫染色および検出のために使用した：ラット抗ＢｒｄＵ（１：１００、Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、マウス抗ＢｒｄＵ（１：４００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：２０、Ｒ．Ｍｕｌｌｅｎ博士、ユタ大学、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴによるクローンＡ６０）、ウサギ抗Ｓ１００（１：５０００、Ｓｗａｎｔ，Ｂｅｌｌｉｎｚｏｎａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ビオチニル化ウマ抗マウスＩｇＧ（１：１６０、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（１：１００、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＥＬＩＴＥ，ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびロバ抗ラット−ＦＩＴＣ、抗マウス−テキサスレッド、および抗ウサギ−ＣＹ５（全て１：３００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）。
【０１５０】
免疫ペルオキシダーゼの検出のために、自由に浮遊している切片を、ＴＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ、および０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中の０．６％のＨ２Ｏ２で３０分間処理して、内因性のペルオキシダーゼをブロックした。ＤＮＡを変性させるために、切片を５０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ（０．３ＭのＮａＣｌ、および０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）中で、６５℃で２時間インキュベートし、２×ＳＳＣで５分間リンスし、２ＮのＨＣｌ中で３７℃で３０分間インキュベートし、そして０．１Ｍのホウ酸（ｐＨ８．５）中で１０分間リンスした。ＴＢＳ中で数回リンスし、その後、ＴＢＳ／０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／３％の正常なウマの血清（ＴＢＳ−Ｔｈｓ）中で３０分間インキュベートし、そしてＴＢＳ−Ｔｈｓ中でマウス抗ＢｒｄＵ抗体とともに、４℃で一晩インキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔｈｓ中でリンスした後、切片をビオチニル化したウマ抗マウス抗体とともに１時間インキュベートした。ＴＢＳ中での断続的なリンスによって、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を１時間かけて加え、その後、ペルオキシダーゼ検出を５分間行った（０．２５ｍｇ／ｍｌのＤＡＢ、０．０１％のＨ２Ｏ２、０．０４％のＮｉＣｌ）。ＢｒｄＵ陽性細胞を、無作為計数法によって定量した。
【０１５１】
免疫蛍光のために、切片を上記のようにＤＮＡを変性させるために処理し、その後、ＴＢＳ中での数回のリンス、ＴＢＳ／０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／３％の正常なロバの血清（ＴＢＳ−Ｔｄｓ）中での３０分間のインキュベーションを行った。一次抗体を、＋４℃で４８時間かけてＴＢＳ−Ｔｄｓに加え、ＴＢＳ中で１０分間、３回リンスし、ＴＢＳ−Ｔｄｓ中で１０分間ブロックした。抗体を、ＦＩＴＣ、テキサスレッド、またはＣＹ５に結合させたロバ、ラット、マウス、またはウサギを用いて２時間検出した。蛍光シグナルを検出し、走査型共焦点レーザー顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ１０２４、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって処理した。
【０１５２】
図７Ａは、ＰＫ２で処置した動物およびコントロール動物における、脳室下領域（ＳＶＺ）の神経芽細胞のＢｒｄＵ免疫蛍光の代表的な画像を示す。図７Ｂは、ＰＫ２で処置した動物が、コントロール動物と比較してそれらのＳＶＺにおいて約２．５倍多いＢｒｄＵ陽性細胞を有していることを示している。これらの結果は、ＰＫ２の短期間での投与により神経発生の増大が生じたことを示している。
【０１５３】
図８は、処置の５週間後の、ＰＫ２で処置した動物による嗅球ニューロンのＢｒｄＵ免疫ペルオキシダーゼ染色の代表的な画像を示す。図８Ａは、脳の処置していない側から得られた組織で新たに生じたニューロンの数（図８Ｃ）と比較して、そしてコントロール動物において新たに生じたニューロンの数（図８Ｂおよび８Ｄ）と比較して、ＰＫ２を注射した脳の側から得られた組織で新たに生じたニューロンの数が多いことを示している。図９は、ＰＫ２で処置した動物およびコントロール動物についてのＢｒｄＵ陽性細胞の量を示し、ＰＫ２で処置した動物が、コントロール動物よりも約２．５倍多い新たに生じたニューロンを有していることを示している。これらの結果は、ＰＫ２の長期間の投与により、神経発生の増大が生じることを示している。
【０１５４】
カッコ内またはそれ以外の上記で提供される全ての刊行物、参考文献、ＧｅｎＢａｎｋおよび特許の引用は、既発表であるかどうかにはかかわらず、全てが参考として本明細書中で援用される。
【０１５５】
本発明は、上記に提供された実施例を参照して記載されているが、本発明の精神を逸脱することなく種々の変更を行うことができることが、理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、ＰＫＲ２の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）リボプローブを使用した成体マウスの脳の矢状断面のインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。ＰＫＲ２  ｍＲＮＡの発現が、側脳室の脳室下領域（ＳＶＺ）、嗅球、嗅ヘルニア（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）、および海馬の歯状回において見られる。ＲＭＳ：ｒｏｓｔｒａｌ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ；ＯＢ：嗅球；ＣＰｕ：ｃａｕｄａｔｅ  ｐｕｔａｍｅｎ。図１Ａおよび１Ｂは明視野画像であり；図１Ｃおよび１Ｄは暗視野画像であり；図１Ｅおよび１Ｆはニッスル染色である。
【図２】図２は、ＰＫＲ２の３’ＵＴＲリボプローブを使用した、成体マウスの脳の冠状断面のインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。ＰＫＲ２  ｍＲＮＡの発現は、側脳室のＳＶＺ、嗅球、嗅ヘルニアにおいて見られる。ＯＶ：嗅ヘルニア；Ｃｘ：大脳皮質。図１Ａ、１Ｄ、および１Ｆは明視野画像であり；図１Ｂおよび１Ｆは暗視野画像であり；図１Ｃおよび１Ｇはニッスル染色である。ＰＫＲ２  ｍＲＮＡは、種々の脳領域（例えば、皮質領域）の散在している細胞または細胞群においても発現されている（図１Ｆ）。
【図３】図３は、ＰＫＲ１の３’ＵＴＲリボプローブを使用した、成体マウスの脳の環状断面のインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。ＰＫＲ１  ｍＲＮＡの発現は、側脳室のＳＶＺ、嗅球、および海馬の歯状回において見られる。全てのパネルは明視野画像を示す。
【図４】図４は、ＰＫ２リボプローブを使用した、成体マウスの脳の環状断面のインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。ＰＫ２  ｍＲＮＡの発現は、嗅球で見られる。図１Ａは明視野画像であり；図１Ｂは暗視野画像であり；図１Ｃはニッスル染色である。
【図５】図５は、ＰＫＲ２の３’ＵＴＲリボプローブを用いた、成体マウスの網膜のインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。上段左：眼の暗視野画像；上段右：眼のニッスル染色；下段左：網膜でのＰＫＲ２の発現；下段右：ニッスル染色。
【図６−１】図６は、配列番号１〜２１と名付けたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を示す。ヒトＰＫ１プロモータ（配列番号１７）中の予想されるサイクリックＡＭＰ応答エレメントを、下線を伴って太字で示す。
【図６−２】図６−２は、図６−１の続きである。
【図６−３】図６−３は、図６−２の続きである。
【図６−４】図６−４は、図６−３の続きである。
【図６−５】図６−５は、図６−４の続きである。
【図６−６】図６−６は、図６−５の続きである。
【図６−７】図６−７は、図６−６の続きである。
【図６−８】図６−８は、図６−７の続きである。
【図６−９】図６−９は、図６−８の続きである。
【図６−１０】図６−１０は、図６−９の続きである。
【図６−１１】図６−１１は、図６−１０の続きである。
【図７Ａ】図７は、脳室下領域の神経芽細胞のＢｒｄＵの取り込みに対するＰＫ２の投与の短期間での効果を示す。図７Ａは、ＰＫ２で処置した動物およびコントロール動物に由来するニューロンのＢｒｄＵ免疫蛍光の代表的な画像を示し；図７Ｂは、ＰＫ２で処置した動物およびコントロール動物に由来するＢｒｄＵ陽性ニューロンの定量を示す。
【図７Ｂ】図７は、脳室下領域の神経芽細胞のＢｒｄＵの取り込みに対するＰＫ２の投与の短期間での効果を示す。図７Ａは、ＰＫ２で処置した動物およびコントロール動物に由来するニューロンのＢｒｄＵ免疫蛍光の代表的な画像を示し；図７Ｂは、ＰＫ２で処置した動物およびコントロール動物に由来するＢｒｄＵ陽性ニューロンの定量を示す。
【図８】図８は、ＰＫ２で長期間処置した動物および未処置の動物における嗅球（ＯＢ）ニューロンのＢｒｄＵ染色の代表的な画像を示す。
【図９】図９は、ＰＫ２で長期間処置した動物および未処置の動物におけるＢｒｄＵ陽性ＯＢニューロンの定量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９】
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【図８】
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【配列表】
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