(57)【要約】静電泳動解析を粒子集団に対して実施するシステムであって、このシステムは、壁を有するチャンバー（１５０）と、チャンバーの壁の上に配置される複数の電極と、複数の周波数のＡＣ電圧を複数の電極に印加するように構成される関数発生器（１４０）と、チャンバー内に配置されるサンプルの画像を取得するように構成される検出器（１２０）と、そして検出器（１２０）と電気的に接続される電子制御装置（１３０）と、を備える。
2006510020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中に懸濁する一つ以上の粒子を含む、チャンバー内の媒体に、複数の周波数の電界を連続して印加する工程と、
ＡＣ電界を印加しながらチャンバー内の一つ以上の粒子の位置を追跡する工程と、
各電界周波数で、一つ以上の追跡粒子の前記位置からのそれぞれの速度を算出する工程と、
算出速度から一つ以上の粒子の特性を求める工程と、
からなる方法。
【請求項２】
一つ以上の粒子の各々のサイズを測定する工程から更になる請求項１記載の方法。
【請求項３】
一つ以上の粒子の各々のサイズを測定する操作において、    チャンバー内の一つ以上の粒子の画像を取得し、同画像からそのサイズを求める工程からなる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記画像からサイズを求める操作において、該画像内の粒子に関する性能指数（ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｒｉｔ）を求める工程からなる請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記画像からサイズを求める操作において、前記性能指数を最適化する工程からなる請求項４記載の方法。
【請求項６】
一つ以上の粒子の位置を追跡する操作において、各周波数における一つ以上の粒子の一連の画像を取得する工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項７】
一つ以上の粒子の各々の位置を追跡する操作において、一つ以上の粒子を一の周波数における一連の画像内において識別する工程からなる請求項６記載の方法。
【請求項８】
粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子のサイズに基づいて正規化する工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項９】
粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子の位置に基づいて正規化する工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項１０】
粒子の速度を算出する操作において、粒子位置の電界強度に基づいて速度を正規化する工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項１１】
電界強度をコンピュータモデルを使用して求める工程からなる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
コンピュータモデルは電極素子の有限の厚さを明らかにするものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子位置での電界勾配に基づいて正規化する工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項１４】
電界勾配をコンピュータモデルを使用して求める工程からなる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
一つ以上の粒子の特性を求める操作において、粒子の静電泳動交差周波数を求める工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項１６】
一つ以上の粒子の静電泳動交差周波数を求める操作において、粒子速度を周波数に関連付
けるパラメータフィッティング機能を使用する工程からなる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
パラメータフィッティング機能は少なくとも３つのフィッティングパラメータを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
一つ以上の粒子の特性を求める操作において、一つ以上の粒子が正の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲を求める工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項１９】
一つ以上の粒子の各々の速度を算出する操作において、一つ以上の粒子が正の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲における速度に関する複数の速度値を算出する工程からなる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
一つ以上の粒子の特性を求める操作において、一つ以上の粒子が負の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲を求める工程からなる請求項１記載の方法。
【請求項２１】
一つ以上の粒子の各々の速度を算出する操作において、一つ以上の粒子が負の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲における速度に関する複数の速度値を算出する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
印加電界は正弦波を有する波形から生成される、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
印加電界はデジタル合成による合成波形から生成される、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
一つ以上の粒子は蛍光標識を付けた粒子である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
媒体を化学薬剤または物理薬剤により処理し、そして一つ以上の粒子の特性に対する処理の効果を時間の関数として求める工程から更になる請求項１記載の方法。
【請求項２６】
媒体に隣接する表面を薬剤により処理して表面との粒子群の内の一つ以上の粒子の反応を修正する工程から更になる請求項１記載の方法。
【請求項２７】
薬剤によって、表面は選択的に粒子群の内の一つ以上の粒子を引き付ける、または跳ね返す工程からなる請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
一つ以上の粒子の特性に対する処理の効果を時間の関数として求める工程から更になる請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
パールチェーン（ｐｅａｒｌ  ｃｈａｉｎ）を形成する一つ以上の粒子の内のいずれかの粒子を識別する工程から更になる請求項１記載の方法。
【請求項３０】
特性は、パールチェーンを形成しない粒子から求める、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
流体中に懸濁する複数の粒子を含む、チャンバー内の媒体に、複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加する工程と、
各電界周波数における複数の粒子の各々の速度を測定する工程と
粒子の静電泳動交差周波数を測定速度から求める工程と、
からなる方法。
【請求項３２】
流体中に懸濁する複数の粒子を含む、チャンバー内の媒体に、複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加する工程と、
各周波数における複数の粒子の一連の画像を取得する工程と、
各電界周波数における複数の粒子の各々の速度を測定する工程と、
複数の粒子の各々のサイズを測定するする工程と、
からなる方法。
【請求項３３】
粒子の交差周波数を測定速度から求める工程から更になる請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
複数の粒子の各々の速度を測定する操作において、一連の画像の各々における複数の粒子の位置をモニターする工程からなる請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
各粒子の速度を測定する操作において、画像間の各粒子の位置の変化を求める工程からなる請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
複数の粒子の交差周波数を求める操作において、個々の交差周波数を複数の粒子の各々に関して求める工程と、
個々の交差周波数を統計的に解析する工程と、
からなる請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
チャンバー内の媒体であって、
流体中に懸濁する複数の粒子を含む媒体に複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加する工程と、
各周波数における複数の粒子の一連の画像を電気的に取得する工程と、
粒子の交差周波数を画像から求める工程と、
からなる方法。
【請求項３８】
流体中に懸濁する複数の粒子を含む、チャンバー内の媒体に、複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加する工程と、
各周波数における複数の粒子の一連の画像を取得する工程と、
各粒子の速度を各一連の画像から求める工程と、
からなる方法。
【請求項３９】
静電泳動解析を粒子集団に対して実施するシステムであって、
壁を有するチャンバーと、
チャンバーの壁の上に配置される複数の電極と、
ＡＣ電圧を複数の電極に印加するように構成される関数発生器と、
チャンバー内に配置されるサンプルの画像を取得するように構成される検出器と、
検出器と電気的に接続される電子制御装置と、を備え、
システムの動作中において、関数発生器はＡＣ電圧を複数の電極に複数の周波数で連続して供給し、同時に検出器は、チャンバー内にあるサンプルであって、流体中に懸濁する一つ以上の粒子を含むサンプルの一連の画像を取得し、そして電子制御装置はチャンバー内の一つ以上の粒子の位置を追跡し、各電界周波数における一つ以上の粒子の各々の速度を追跡位置から算出し、そして一つ以上の粒子の特性を算出速度から求める、システム。
【請求項４０】
更に、サンプルを画像平面に撮像するようにチャンバーに対して位置する光学顕微鏡を備える請求項３９記載のシステム。
【請求項４１】
検出器は画像平面に位置させる請求項４０記載のシステム。
【請求項４２】
電極は多項式電極（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）含む請求項３９記載のシステム。
【請求項４３】
電極は櫛形電極（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を含む請求項３９記載のシステム。
【請求項４４】
複数の電極は電極領域群から成るアレイである請求項３９記載のシステム。
【請求項４５】
電極領域群から成るアレイは８×１２個の電極領域から成るアレイである請求項４４記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は静電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
静電泳動（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＥＰ）とは印加電界の電界勾配中の流体媒体に懸濁する粒子が受ける力を指す。印加電界の電界勾配により粒子と流体媒体に誘起される誘電分極の大きさの差によって粒子は静電泳動力を受ける。この効果は、マクスウェルの応力テンソルを使用して電磁気モーメントがバランスするという点から、または印加電界により粒子上に、かつ粒子内に生じる電荷量及び電荷分布により定量化することができる。大きな静電泳動を行なっている血液細胞のような粒子は通常、約１０−１１ニュートンの静電泳動力（ＤＥＰ  ｆｏｒｃｅ）を受け、この力は重力沈降（ｇｒａｖｉｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｅｔｔｌｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ）の約４０倍、そして最大ブラウン拡散（Ｂｒｏｗｎｉａｎ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｆｏｒｃｅ）の約２×１０５倍である。
【０００３】
粒子の構造特性及び物理化学特性は粒子の静電泳動（ＤＥＰ）挙動に影響する。この挙動は印加電界の周波数によっても変わる。このような依存性によって、印加電界周波数及び外部環境の変化を利用して異なる粒子サブ構造及び異なる粒子プロセスを同時に分析することができる。例えば、細胞膜容量、細胞膜抵抗及び細胞膜の伝導率のような細胞の幾つかの基本電気特性は、これらの細胞の静電泳動（ＤＥＰ）挙動に影響する。これらの特性は、イオン平衡を維持する細胞機能も表わし、そして代謝作用及び生物系の性能指数にもなる。従って、静電泳動（ＤＥＰ）によって、細胞集団を単一細胞にまで小さく分離した場合の細胞の電気特性を求める非侵襲法が実現する。
【０００４】
従って、静電泳動（ＤＥＰ）は多くの分野で利用することができる可能性を秘めている。例えば、静電泳動（ＤＥＰ）を新薬の発見手段として使用する、例えば薬剤化合物候補に対する細胞集団の静電泳動挙動をモニターすることができる。他の考えられる用途として、粒子集団の異なる静電泳動挙動を利用して粒子集団を分離するようなことが挙げられる。
【非特許文献１】Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  ｂｙ  Ｔ．  Ｂ．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｃｈ．  ６  ＆  ７，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）
【非特許文献２】Ｓａｕｅｒ，  Ｆ．Ａ．，  ｉｎ：Ｃｈｉａｂｒｅｒａ，  Ａ．，  Ｎｉｃｏｌｉｎｉ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｗａｎ，  Ｈ．Ｐ．  （ＥＤｓ．）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏｒｐ．  １９８５，  １８１−２０２．
【非特許文献３】Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｘ．−Ｂ．，  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｆ．  Ｆ．，  Ｇａｓｃｏｙｎｅ，  Ｐ．  Ｒ．  Ｃ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２８２，  ７６−８４（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した応用分野及び他の応用分野において効果を発揮するために、ＤＥＰシステムは粒子集団の高精度かつ有用な特性を妥当なスループット及び汎用性を維持しながら提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、幾つかの態様においては、本発明は一つ以上の粒子の静電泳動挙動をモニターする装置及び方法を特徴とし、このモニターは、変化するＤＥＰ力を受けている粒子の映像を連続して撮り、そして画像解析を行って電界に対する各粒子の挙動を求めることにより行なう。好適な実施形態においては、画像解析では、粒子速度を既知の電界分布を有する電界の周波数の関数として求め、そして各粒子に作用する静電泳動力を粒子サイズ及び速度から求める。
【０００７】
次に、本発明の種々の態様について要約する。
一般的に、第１の態様では、本発明は方法を特徴とし、この方法では、（ｉ）チャンバー内の媒体であって、流体中に懸濁する一つ以上の粒子（例えば細胞）を含む媒体に複数の周波数の電界を連続して印加し、（ｉｉ）ＡＣ電界を印加しながらチャンバー内の一つ以上の粒子の位置を追跡し、（ｉｉｉ）各電界周波数における一つ以上の追跡粒子の各々の速度を位置から算出し、そして（ｉｖ）一つ以上の粒子の特性を算出速度から求める。
【０００８】
本方法の実施形態は次の特徴及び／又は他の態様の特徴の内の一つ以上の特徴を含むことができる。
本方法においては、一つ以上の粒子の各々のサイズを測定する。一つ以上の粒子の各々のサイズを測定する操作において、チャンバー内の一つ以上の粒子の画像を取得し、そしてサイズを画像から求める。サイズを画像から求める操作において、画像内の粒子に関する性能指数を求める。サイズを画像から求める操作においては更に、性能指数を最適化する。
【０００９】
一つ以上の粒子の位置を追跡する操作において、各周波数における一つ以上の粒子の一連の画像を取得する。位置を追跡する操作において、一つ以上の粒子を、一の周波数における一連の画像内において識別する。
【００１０】
粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子のサイズに基づいて正規化する。幾つかの実施形態では、粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子の位置に基づいて正規化する。別の構成として、または追加する形で、粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子位置の電界強度に基づいて正規化する。電界強度はコンピュータモデルを使用して求める（例えば、電極素子の有限の厚さを明らかにするコンピュータモデル）。
【００１１】
粒子の速度を算出する操作において、速度を粒子位置の電界勾配に基づいて正規化する。電界勾配もコンピュータモデルを使用して求める。
一つ以上の粒子の特性を求める操作において、粒子の静電泳動交差周波数（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を求める。一つ以上の粒子の静電泳動交差周波数を求める操作において、粒子速度を周波数に関連付けるパラメータフィッティング機能を使用する。パラメータフィッティング機能は少なくとも３つのフィッティングパラメータを含む。
【００１２】
一つ以上の粒子の特性を求める操作において、一つ以上の粒子が正の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲を求める。一つ以上の粒子の各々の速度を算出する操作において、一つ以上の粒子が正の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲における速度に関する複数の速度値を算出する。
【００１３】
一つ以上の粒子の特性を求める操作において、一つ以上の粒子が負の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲を求める。一つ以上の粒子の各々の速度を算出する操作において、一つ以上の粒子が負の最大静電泳動力を受ける周波数または周波数範囲における速度に関する複数の速度値を算出する。
【００１４】
印加電界は正弦波を有する波形から、そして／またはデジタル合成による合成波形から生成される。
一つ以上の粒子は蛍光標識を付けた粒子である。
【００１５】
本方法においては更に、媒体を化学薬剤または物理薬剤により処理し、そして一つ以上の粒子の特性に対する処理の効果を時間の関数として求める。別の構成として、または追加する形で、本方法では、媒体に隣接する表面を薬剤により処理して表面との粒子群の内の一つ以上の粒子の反応を修飾する。薬剤によって、表面は選択的に粒子群の内の一つ以上の粒子を引き付ける、または跳ね返す。本方法では、一つ以上の粒子の特性に対する処理の効果を時間の関数として求める。
【００１６】
本方法では、パールチェーンを形成する一つ以上の粒子の内のいずれかの粒子を識別する。特性はパールチェーンを形成しない粒子から求めることができる。
別の態様においては、本発明は方法を特徴とし、この方法では、（ｉ）チャンバー内の媒体であって、流体中に懸濁する複数の粒子を含む媒体に複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加し、（ｉｉ）各電界周波数における複数の粒子の各々の速度を測定し、そして（ｉｉｉ）粒子の静電泳動交差周波数を測定速度から求める。
【００１７】
本発明の実施形態は他の態様の特徴の内の一つ以上を含むことができる。
更に別の態様において、本発明は方法を特徴とし、この方法では、（ｉ）チャンバー内の媒体であって、流体中に懸濁する複数の粒子を含む媒体に複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加し、（ｉｉ）各周波数における複数の粒子の一連の画像を取得し、（ｉｉｉ）各電界周波数における複数の粒子の各々の速度を測定し、そして（ｉｖ）複数の粒子の各々のサイズを測定する。
【００１８】
本発明の実施形態は次の特徴及び／又は他の態様の特徴の内の一つ以上の特徴を含むことができる。
本方法では、粒子の交差周波数を測定速度から求める。
【００１９】
複数の粒子の各々の速度を測定する操作において、一連の画像の各々における複数の粒子の位置をモニターする。各粒子の速度を測定する操作において、画像間の各粒子の位置の変化を求める。
【００２０】
複数の粒子の交差周波数を求める操作において、個々の交差周波数を複数の粒子の各々に関して求め、そして個々の交差周波数を統計的に解析する。
更に別の態様において、本発明は方法を特徴とし、この方法では、（ｉ）チャンバー内の媒体であって、流体中に懸濁する複数の粒子を含む媒体に複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加し、（ｉｉ）各周波数における複数の粒子の一連の画像を電気的に取得し、そして（ｉｉｉ）粒子の交差周波数を画像から求める。
【００２１】
本発明の実施形態は他の態様の特徴の内の一つ以上を含むことができる。
別の態様において、本発明は方法を特徴とし、この方法では、（ｉ）チャンバー内の媒体であって、流体中に懸濁する複数の粒子を含む媒体に複数の周波数のＡＣ電界を連続して印加し、（ｉｉ）各周波数における複数の粒子の一連の画像を取得し、そして（ｉｉｉ）各粒子の速度を各一連の画像から求める。
【００２２】
本発明の実施形態は他の態様の特徴の内の一つ以上の特徴を含むことができる。
別の態様において、本発明は静電泳動解析を粒子集団に対して実施するシステムを特徴とする。このシステムは、壁を有するチャンバーと、チャンバーの壁の上に配置される複数の電極と、ＡＣ電圧を複数の電極に印加するように構成される関数発生器と、チャンバ
ー内に配置されるサンプルの画像を取得するように構成される検出器と、そして検出器と電気的に接続される電子制御装置と、を備える。システムの動作中において、関数発生器はＡＣ電圧を複数の電極に複数の周波数で連続して供給し、同時に検出器は、チャンバー内にあるサンプルであって、流体中に懸濁する一つ以上の粒子（例えば、細胞）を含むサンプルの一連の画像を取得し、そして電子制御装置はチャンバー内の一つ以上の粒子の位置を追跡し、各電界周波数における一つ以上の粒子の各々の速度を追跡位置から算出し、そして一つ以上の粒子の特性を算出速度から求める。
【００２３】
本発明の実施形態は次の特徴及び／又は他の態様の特徴の内の一つ以上の特徴を含むことができる。
本システムは、サンプルを画像平面に撮像するようにチャンバーに対して位置する光学顕微鏡を備える。検出器は画像平面に位置させることができる。
【００２４】
電極は多項式電極（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）及び／又は櫛形電極（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を含むことができる。
幾つかの実施形態では、複数の電極は電極領域群から成るアレイである。電極領域群から成るアレイは８×１２個の電極領域から成るアレイを含むことができる（例えば、９６ウェルプレートに使用することができるように構成される）。
【００２５】
本発明の実施形態は次の利点の内の一つ以上の利点を含むことができる。
実施形態によって、粒子または粒子集団の物理特性（例えば、ＤＥＰ交差周波数及び粒子サイズ）を高速及び／又は高精度に測定することができる。測定が高速かつ高精度になるので、実施形態を使用して非常に多くの粒子（例えば、統計的変動が利用可能なレベルにまで小さくなるほど十分な数の粒子）のＤＥＰ特性を調査することができる。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ交差周波数は約５０個の粒子集団に関して２分未満の時間しか掛からない実験を１回行なうだけで求めることができる。幾つかの実施形態では、１０００個以上の粒子のＤＥＰ特性は２分未満の時間を要する実験を１回行なうだけで求めることができる。更に、非常に多くの粒子の特性を高速に求めることができるので、粒子パラメータを統計的に更に高精度に求めることができ、かつ生物学的変動に関連する生物粒子誤差を最小化することができる。
【００２６】
特に断らない限り、本明細書において使用する技術的及び科学的用語は、本発明が関わるこの技術分野の当業者が共通に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または等価な方法及び材料を実際に使用する、または本発明を吟味するために使用することができるが、適切な方法及び材料は以下に記載される。本明細書において引用する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、これらの刊行物を参照することによりこれらの刊行物の内容全体が本発明の開示に含まれる。矛盾が生じる場合には、定義を含む本明細書が優先する。更に、材料、方法、及び実施例は例示に過ぎず、本発明を制限するためのものではない。
【００２７】
本発明の他の特徴及び利点は次の詳細な記述及び請求項から明らかになる。  
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図１を参照すると、流体中の懸濁粒子に対する印加電界の効果を静電泳動（ＤＥＰ）システム１００を使用して分析する様子が示されている。ＤＥＰシステム１００は光学顕微鏡１１０を含み、この顕微鏡は粒子をＣＣＤカメラ１２０に撮像する。ＣＣＤカメラ１２０の出力はＰＣコンピュータ１３０に接続される。粒子はＤＥＰ電極装置１５０に密閉し、この装置は顕微鏡台１１４の上に位置して光学顕微鏡の対物レンズに対向する。関数発生器１４０の出力はＤＥＰ電極装置１５０の電極アレイに接続される。ＤＥＰ電極装置はまた、ＰＣコンピュータ１３０に関数発生器１４０を通して接続され、これによってＰＣ
は電極装置１５０に対する信号印加を制御することができる。この接続によってＰＣコンピュータ１３０はＤＥＰ電極装置１５０の電極における粒子運動をモニターすることができる。
【００２９】
ＤＥＰシステムが動作している間、関数発生器１４０はＡＣ電圧をＤＥＰ電極装置１５０のマイクロ電極に印加して、空間的に不均一な電界を流体中に発生させる。電界が或る周波数で印加されると、この電界によって流体中の粒子が移動する。ＰＣコンピュータ１３０に搭載されるイメージキャプチャカードによりＣＣＤカメラ１２０から画像を取得する。ＰＣコンピュータ１３０は取得画像を保存し、解析する。
【００３０】
イメージキャプチャカード及びＣＣＤカメラ１２０は適切な画像取得速度が得られるように選択することができる。適切な取得速度は、静電泳動力の影響を受ける連続フレームの間の粒子変位が十分に小さくなるように十分に高くし、粒子変位が十分に小さいと、粒子をフレーム毎に追跡することができる。多くの用途に適するフレームレートは約１０Ｈｚであるが、フレームレートは低く（例えば約１Ｈｚ以下）または高く（例えば約１００Ｈｚ以上）することができる。相対的に高いフレームレートを使用して、例えば化学薬剤に晒された後の細胞膜のイオンチャネル機能の変化のような高速に生じる細胞生理に関連するイベント（例えば、数ミリ秒または数十ミリ秒に渡って生じるイベント）をモニターすることができる。
【００３１】
図２によれば、ＤＥＰ電極装置は電極駆動ボード２１０を含み、このボードは関数発生器との接続を行なうコネクタを含む。電極駆動ボード２１０は電極搭載トレー２２０及び電極アレイ２３０を支持する。電極搭載トレー２２０によって電極アレイ２３０をＤＥＰ電極装置１５０に搭載し、そしてＤＥＰ電極装置から取り外す操作が容易になる。電極アレイ２３０は透明基板によって支持される幾つかの電極領域２４０を含む。これらの電極領域の各々は一つ以上の電極を含む。これらの電極は、電圧がこれらの電極に印加されると電極間の流体に所望の電界分布を生じさせるように設計される。
【００３２】
電極アレイ２３０はフォトリソグラフィ法を使用して形成することができる。これらの電極は透明基板（例えばガラス基板）の上に堆積する導電材料層をエッチングすることにより形成される。導電材料は透明（例えばインジウム錫酸化物）材料または不透明（例えば金またはクロム）材料とすることができる。
【００３３】
記載の実施形態では、電極アレイ２３０は取り外し可能なカバースリップにより覆われる。電極アレイ２３０及びカバースリップはチャンバーを形成し、このチャンバーは流体及び粒子を、電極領域２４０に近接する電極アレイ２３０の領域にほぼ密閉する。通常、ユーザはピペットで流体及び粒子を電極アレイ２３０の上面に滴下し、次に露出懸濁液をカバースリップで覆ってチャンバーを形成する。
【００３４】
図３（ａ）及び３（ｂ）によれば、電極領域は４つの電極素子３１０，３２０，３３０，及び３４０を含む。これらの電極素子は電気絶縁領域３５０によって分離される。電気絶縁領域３５０の中心３６０は、電極素子先端３１１，３２１，３３１，及び３４１から等距離に位置するポイントとして定義される。絶縁領域３５０の反対側に位置する各電極素子ペアは電圧源に接続される。別の表現をすると、電極素子３１０及び３３０は一つの電圧源に接続され、そして電極素子３２０及び３４０は別の電圧源に接続される。粒子３７０は絶縁領域３５０に隣接する流体に懸濁する。
【００３５】
電極素子３１０，３２０，３３０，及び３４０は多項式電極（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を形成する。本明細書において使用するように、多項式電極（ｐｏｌｙｎｏｍｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）とは、着目する電極システムによって生成
される全てのポイントにおける電位が、ラプラス方程式に従う多項式によって定義されるという仮定に基づいて設計される電極を指す。この多項式をラプラス方程式に代入すると、該当する等電位を求めることができ、今度はこれらの等電位を使用して電極境界を定義することができる。動作状態において、第１ＡＣ電位差を電極３１０と３４０との間に生じさせ（図３（ａ）及び３（ｂ）のＶ１ｓｉｎ（ωｔ）として示される）、そして別のＡＣ電位差を電極素子３２０と３３０との間に生じさせる（図３（ａ）及び３（ｂ）のＶ１ｃｏｓ（ωｔ）として示される）。２つの電位は同じ周波数及び振幅を有するが、位相が９０度だけ異なる。これらの電極間の電位差によって絶縁領域３５０に隣接する流体に電界が生じる。ＡＣ周波数及び電界強度によって変わるが、粒子３７０は電界に応答する形で移動することができる。特に図３（ａ）を参照すると、或る周波数においては、粒子は電極素子３１０，３２０，３３０，及び３４０から離れるように移動することができることが分かる。このような場合、粒子３７０の動きは負の静電泳動によって生じる。図３（ｂ）を参照すると、他の周波数では、粒子３７０は電極素子に向かって移動することができる。この動きは正の静電泳動によって生じる。
【００３６】
印加電圧の振幅は所望通りに変化させることができる。通常、分析対象の静電泳動応答の観察を可能にする十分に大きな振幅の電圧は、電極群にイメージキャプチャカードの所与のサンプルレートで印加される。例えば、対向電極先端が０．５ミリメートルだけ離間する電極構造に関して、約５ボルトの最大振幅を有する電圧が多くの粒子には十分な大きさである。
【００３７】
通常、印加ＡＣ電圧は正弦波電圧であるが、他のパルス波形電圧を用いることができる。他のパルス波形の例としては、方形パルス波、及び鋸歯波が挙げられる。幾つかの実施形態では、印加電圧は複数の正弦波形電圧の波形を重ねた波形とすることができる。正弦波の周波数及び／又は振幅は同じとする、または異ならせることができる。複数の正弦波形を重ねた波形により形成される印加電圧の一例として、周波数ωを有する波形及び高調波周波数（例えば、２ω，３ω，４ω，．．．）を有する波形により形成される電圧がある。幾つかの実施形態では、システム１００は波形シンセサイザを含むことができ、そして印加電圧は所望波形をデジタル合成することにより形成することができる。印加電圧波形はデータ取得中に所望通りに変化させることができる。波形が非正弦波形である場合、周波数とは波形が単位時間当たりに繰り返される回数を指す。
【００３８】
ＡＣ周波数は、粒子画像を取得している間に所望通りに変化させることができる。幾つかの実施形態では、パーソナルコンピュータ１３０によって、関数発生器１４０は或る周波数範囲を連続的に掃引し、同時に画像をＣＣＤカメラ１２０から或る範囲内の多くの周波数で取得することができる。幾つかの画像（例えば１００以上）が周波数の各々に関して取得される。
【００３９】
一般的に、掃引する周波数の範囲及び連続周波数の間の増分は、分析対象のサンプルによって変わる。例えば、血液細胞集団に対しては、掃引する周波数範囲は約０．１ＭＨｚ〜１ＭＨｚの範囲で０．１ＭＨｚ単位で増加させることができる。植物細胞集団の場合は、該当する周波数範囲は約１０ＫＨｚ〜０．１ＭＨｚの範囲とすることができ、そしてバクテリア集団の場合は、約１ＭＨｚから１０ＭＨｚに高くした周波数範囲を使用することができる。更に一般的には、周波数範囲はＨｚ範囲及びｋＨｚ範囲（例えば、約１，０００Ｈｚ，１００Ｈｚ，１０Ｈｚまたは１０Ｈｚ未満）からＭＨｚ範囲以上（例えば、約０．１ＭＨｚ，１ＭＨｚ，１００ＭＨｚまたは１００ＭＨｚ超）に高くすることができる。連続取得周波数の間の増分周波数は普通、周波数範囲によって変わる。この増分周波数は通常、周波数範囲内に十分な数のデータポイントを設けるために十分に小さく、かつ着目する周波数範囲全体を掃引するために十分に大きい。例えば、周波数範囲が狭い（例えば１，０００Ｈｚ）場合、増分周波数は、この周波数範囲に十分な数のデータポイントを設
けるために十分に小さくする（例えば、１００Ｈｚの周波数増分の場合は１０個のデータポイントとなる）。これとは反対に、周波数範囲が広い（例えば１ＭＨｚ）場合、増分周波数は同じようにして大きくすることができる（例えば０．１ＭＨｚ）。
【００４０】
周波数範囲は直線的に、または非直線的に掃引することができる。直線的掃引を行なっている間は、連続取得周波数間の増分周波数は一定のままである。しかしながら非直線的掃引を行なっている間は、この増分周波数は変化させることができる。非直線的な周波数掃引の一例として、大きな周波数増分を使用して、粒子が幾つかの識別可能な挙動を示すサブ周波数範囲を決定するような操作が挙げられる。このサブ周波数範囲内では、周波数増分を小さくしてデータポイントを追加し、これらのデータポイントによって粒子を一層正確に特徴付けることができる。
【００４１】
一般的に、ＤＥＰシステム１００を使用して、適切な流体または媒体に懸濁させることができる誘電体粒子を分析することができる。
幾つかの実施形態においては、粒子は生物粒子とすることができる。例えば、粒子は細胞、または細胞成分及び／又は微生物とすることができる。細胞成分はタンパク質及びＤＮＡを含む。微生物はバクテリアを含む。生物粒子はウィルスのような病原体も含む。
【００４２】
粒子は重合体とすることができる。例えば、粒子はポリスチレンミクロスフィアを含むことができる。
粒子は固体、半固体、液体、またはガスとすることができる。固体粒子は高分子真球またはタンパク質分子（マクロ分子）を含む。半固体粒子はポリアクリルアミドゲル粒子または寒天ゲル粒子を含む。液体粒子は、水中の滴下オイルのようなエマルジョンの分散相、またはエアロゾルの液体粒子を含む。ガス粒子は液体中のガス泡のような発泡体の分散相を含む。
【００４３】
幾つかの実施形態では、粒子を蛍光色素で修飾することができる。粒子を修飾して蛍光顕微鏡技術に使用することができる。
粒子サイズは変えることができる。通常、粒子は光学顕微鏡を使用して観察できる十分な大きさである（例えば、直径が１ミクロン以上のように約０．５ミクロン超である）。幾つかの実施形態では、粒子は直径が約１マイクロメートル超となるようにすることができる。しかしながら幾つかの実施形態では、非常に小さくて光学顕微鏡を使用しても直接観察することができないような大きさのものを使用することができる。例えば、サンプルは、蛍光標識を付けて光学顕微鏡での観察が容易になるようにしたタンパク質粒子またはウィルス粒子により構成することができる。
【００４４】
サンプルは一タイプの粒子、または粒子群の混合物を含むことができる。例えば、サンプルは、他のタイプの粒子の他に、赤血球細胞及び白血球細胞、血小板を含む血液サンプルのような混合物とすることができる。単一粒子サンプルの例として、純水中にコロイド状に分散したポリスチレン球が挙げられる。
【００４５】
サンプル中の粒子の数は変えることができる。幾つかの実施形態では、サンプルは十分に大きな数の粒子を含んで、これらの粒子のサイズまたは特性の生物学的変動または自然変動を考慮したものとすることができる。例えば、サンプルは１０個超の粒子（例えば、約２０個超の粒子、約５０個超の粒子、約１００個超の粒子、約１０００個超の粒子）を含むことができる。
データ取得及び解析
ＰＣ制御装置１３０が一連の画像（フレーム群とも呼ぶ）を取得すると、制御装置はソフトウェアアルゴリズムを実行し、このアルゴリズムによって各フレームの粒子を識別し、粒子をフレーム毎に追跡し、各印加周波数における粒子速度を求め、そして粒子の静電
泳動交差周波数（ＤＥＰ  ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を計算する。ＤＥＰ（静電泳動）交差周波数とは、電極に周波数が印加されると、議論対象の粒子に作用する正味の力が無くなるときの周波数である。このアルゴリズムについては図４に示すフローチャートに要約されている。
【００４６】
解析の第１ステップとして、アルゴリズムは背景画素を各フレームから取り除く。フレーム中の粒子の数によって変わるが、各画像の多くの画素は２セットの内の一方のセット、すなわち電極群に対応する低光強度セット、または電極群の間の電気絶縁領域に対応する高光強度セットに属することができる。粒子は普通、中間強度画素に対応するので、これらの低強度画素及び高強度画素をこれ以降に行なう解析から排除することができる。これらの画素を排除すると、アルゴリズムを高速に実行することができる。
【００４７】
背景画素を取り除くために、アルゴリズムではまず、全体画像の強度ヒストグラムを作成する。各画素は２４ビット色調を有する（すなわち、赤サブピクセル（サブ画素）、緑サブピクセル、及び青サブピクセルであり、各サブピクセルは８ビット中間諧調を有する）。従って、各サブピクセル（サブ画素）は０〜２５５の強度値を有する。各画素の強度は赤値／緑値／青値を平均することにより計算する。次に、２５６区分を有するヒストグラムアレイを使用して全体画像の強度ヒストグラムを生成する。通常、このヒストグラムは２つの異なるピークを有し、これらのピークはウィンドウ技術をＩＤヒストグラムアレイに適用して識別される。低強度ピークは電極を撮像した画素に対応し、そして高強度ピークは電気絶縁領域を撮像した画素に対応する。低強度しきい値を下回る画像の全画素（例えば、電極に対応する最大強度画素に対応する）には、第１強度値（例えば０）を割り当てる。高強度しきい値を上回る強度を有する画素（例えば、電気絶縁領域に対応する最小強度画素に対応する）には第２強度値（例えば２５５）を割り当てる。
【００４８】
解析の次のステップでは座標系を設定し、この座標系において粒子をフレーム毎に追跡することができる。
粒子位置は粒子中心からユーザ指定原点（例えば、電気絶縁領域３５０の中心３６０）までの距離によって定義される。再度図３（ａ）及び３（ｂ）を参照すると、多項式電極構造を有する記載の実施形態では、所与の粒子の速度は当該粒子と電気絶縁領域３５０の中心３６０との間の時間によって変わる距離に比例すると推測される。従って、アルゴリズムは電気絶縁領域３５０の中心３６０の画素座標を求める。
【００４９】
中心３６０の画素座標を求めるために、アルゴリズムは、電極素子３１０，３２０，３３０，及び３４０の先端３１１，３２，３３１，及び３４１の画素座標をそれぞれ求める。先端３４１を求める場合、アルゴリズムは画像の左側の縦方向中心画素からスタートし、そして第２強度値から第１強度値（例えば０から２５５）への遷移を探索する。第２強度値を有する最終画素は円の左側として定義される。同様な手順を使用して先端３１１，３２１，及び３３１を検出する。一旦、これらの先端の位置を特定してしまうと、座標系の中心を、水平座標の左側先端及び右側先端（すなわち、それぞれ先端３４１及び先端３２１）の平均、及び垂直座標の上側先端及び下側先端（すなわち、それぞれ先端３１１及び先端３３１）として定義する。
【００５０】
座標系を設定した後、アルゴリズムは進んで粒子に関する各フレームを走査する。アルゴリズムは探索を電極群の内側領域に限定することができ、そしてこの領域の背景を無視することができる。従ってアルゴリズムは着目領域内の個々の粒子を識別し、そしてこれらの粒子のサイズ及び位置を粗く推定することができる。
【００５１】
アルゴリズムは、フレームを１列ずつ走査し、そして背景強度（例えば、既に第１強度値が割り当てられている背景画素）とは異なる強度値を有する画素を識別することにより
粒子を検出する。アルゴリズムが、背景強度値とは異なる強度値を有する画素を検出すると、アルゴリズムは、背景とは異なる強度を有する隣接画素も探索する。従って、アルゴリズムは複数セットの隣接画素を識別する。一のセットが或る基準を満たすと（例えば、画素数、当該セットの垂直範囲及び水平範囲）、このセットの画素は粒子であると判定される。細胞のサイズ及び位置も、該当するセットの隣接画素のサイズ及び位置によって荒く求めることができる。
【００５２】
粒子を識別した後、アルゴリズムは各識別済み粒子のサイズ及び位置を求める。このステップでは、アルゴリズムは前に求めた中心の荒い推定値及び各粒子のサイズを使用して各粒子の中心及びサイズを更に正確に求める。
【００５３】
各粒子の位置及びサイズを更に正確に求めるために、アルゴリズムは所定の形（例えば、円、楕円、または方形または六角形のような多角形）を各粒子にフィッティングさせる。例えば、粒子が細胞である場合、アルゴリズムは円を各細胞膜の画像の暗部（すなわち低強度）にフィッティングさせることができる。通常、細胞の画像は３つの同心円領域、すなわち一つの暗い円が２つの相対的に明るい円に挟まれた構造の同心円領域を含む。図５を参照すると、細胞の中心の推定及び細胞の半径の推定からスタートして、アルゴリズムは、細胞の推定中心から始まる水平軸から測定される、一連の異なる方位角Θでの一セットの画素群に対応する画素群の強度を識別する。例えば、１５個のセクションについて、細胞画像近傍において等しい増分角度で分析することができる。各セクションに対して、アルゴリズムは、推定細胞中心から推定細胞半径だけ離れて位置する画素に最も近く隣接する画素群の強度に従って細胞画像の総合性能指数を求める。総合性能指数は２つのパラメータを追加することにより生成する。第１パラメータによって、フィッティングされた形状のエッジにおける細胞膜の暗さを定量化する。この第１パラメータが相対的に大きいと、細胞画像は相対的に明瞭になる。この第１パラメータは、焦点から外れる、または物理的に壊れた膜（例えば破裂した後の）を有する細胞に関しては絶対値が急激に小さくなる。第２パラメータによって、細胞外周の周りにおける膜の暗さの均一性を定量化する。この第２パラメータが相対的に小さいと、細胞膜は相対的に不均一になる。この第２パラメータは、非常に不均一で、不連続な、または奇異な形の細胞膜に対して大きな感度を示す。
【００５４】
最適中心座標及び細胞半径を求めるために、中心座標及び細胞半径を少しだけ変更し（例えば、一画素を水平方向及び／又は垂直方向に移動させることにより）、そして２つの性能指数パラメータを再度計算する。各セットの中心座標値及び細胞半径に対して、アルゴリズムは細胞に関する性能指数の和を求める。繰り返し手順では、アルゴリズムは細胞の推定垂直方向位置、細胞の推定水平方向位置、及び／又は細胞の推定半径の内の一つ以上を変更する。全ての位置に関する性能指数の和を大きくするこれらのパラメータの内の一つのパラメータが変化すると、一致度が大きくなった方向に当該パラメータを変化させ続ける操作が行なわれる。３つのパラメータの内のいずれかのパラメータに更に加えられる変化によって一致度が大きくならない場合、繰り返しサイクルを完了させ、細胞中心位置及び細胞半径の最終推定値を、当該フレームの細胞中心位置及び細胞半径として採用する。
【００５５】
一般的に、性能指数及び性能指数を求めるために使用する所定形状は分析対象の粒子のタイプに従って選択される。例えば、上の記述では、分析対象の粒子が細胞である場合の性能指数及び形状について特に参照したが、他の形状及び性能指数を使用することができる。
【００５６】
これらの設定は普通、実験中に得られる各フレームに関して実行される。結果として得られるデータは、フレーム毎の座標系に対する各粒子の位置（例えばｘ，ｙ座標）及びサ
イズ（例えば半径）を含む。実験において、前述のステップを第１フレーム（または最初の数フレーム）に関して１回よりも多くの回数だけ実施して各細胞の位置の初期推定値を取得することが望ましい。
【００５７】
次に、アルゴリズムは一連のフレームに関して各粒子の速度を計算する。通常、一連のフレームは或る特定周波数に関して取得されるフレーム群に対応する。従って、各取得周波数に関してこの解析を実行することにより、粒子速度が印加電界周波数の関数として得られる。
【００５８】
一般的に、粒子の速度は異なるフレーム間の粒子の中心位置の変位及び連続取得フレーム間の時間増分から求められる。この速度は、各フレームにおける各粒子に関する追跡粒子位置及び粒子サイズを前に記載したアルゴリズムを使用して付け加える粒子追跡ファイルを生成し、次にフレームレートに対応する位置変化を比較することにより計算される。速度は１秒当たりの画素数に換算して表わすことができる、または装置が校正され、かつ撮像領域が既知である場合は、速度は、例えばミクロン／秒として表わすことができる。
【００５９】
図６を参照すると、粒子の動的応答は、粒子位置を時間の関数として分析することにより求めることができることが分かる。この例では、粒子位置は、中心３６０からの半径方向の距離として求められる。この例に関する印加周波数では、粒子は負の静電泳動（ＤＥＰ）力を受け、そして中心３６０に向かって移動する。０秒における静止位置からスタートして、粒子はまず、静電泳動力の影響を受けながら加速し、そして約１秒後に定常速度に達する。粒子速度は、線形回帰をこのデータに対して実行し、粒子が加速している間の最初に取得するデータポイントを無視することにより求められる。
【００６０】
一般的に、速度は各印加周波数において一つ以上の粒子に関して求める。一の周波数における各粒子の速度を計算するために使用するフレーム群は当該周波数において取得されるフレーム群からなるサブセット（ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒａｍｅｓ）とすることができる。例えば、粒子が定常速度にはなっていない間に取得するフレーム群は、粒子速度を求めている間は無視することができる。
【００６１】
アルゴリズムはまた、電極形状を補正するために速度を調整する。例えば、上に記載した多項式電極形状の場合、速度は（１／Ｒ）の因子を乗じることにより調整され、この場合、Ｒは各フレームでの粒子中心の半径方向の位置である。この補正によって粒子速度を正規化して電界強度及び／又は電界勾配の変化が分かるようにし、この場合、電界強度及び電界勾配は共に、電極に対する粒子の位置によって変わる。
【００６２】
更に一般的には、各粒子の速度は、電極エッジ間の電界強度及び電界勾配の変化に対して正規化することができる。この補正を行なうために、特定の電極形状に関する電界分布はコンピュータによるモデル化を行なうことにより求めることができる。異なる電極形状に関する電界分布をモデル化するために使用することができるコンピュータソフトウェアの例として、Ａｎｓｏｆｔ（ペンシルバニア州、ピッツバーグ）製のＭａｘｗｅｌｌ  ３Ｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｆｉｅｌｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｏｒがある。好適な実施形態では、電界分布は電極の３次元的特徴を説明する形でモデル化される。別の表現をすれば、モデルは電極の有限の厚さを明らかにする。
【００６３】
静電泳動力の影響を受けながら、粒子は、粒子を加速する静電泳動力が加速に逆らう流体の粘性力と平衡するときに、その定常速度に達する。粘性力及び静電泳動力は共に粒子サイズによって変わるので、粒子速度も粒子サイズによって変わる。従って、幾つかの実施形態では、粒子速度も各粒子のサイズに対して正規化することができる。
【００６４】
一旦、粒子速度が各周波数に関して判明すると、アルゴリズムは各粒子の静電泳動（ＤＥＰ）交差周波数を求める。ＤＥＰ交差周波数は、或る範囲の周波数に渡る所与の粒子に関する速度値を使用して計算する。アルゴリズムが確実に機能するためには、粒子の負の静電泳動応答がＤＥＰ交差周波数よりも十分に低く（例えば、導電率が約４０ｍＳ／ｍの水媒体に懸濁する多くの細胞の場合、２０ＫＨｚの周波数は十分に低い）なる或る周波数において少なくとも一つの（好適には幾つかの）測定を行なう必要があり、そして粒子の正の静電泳動応答がＤＥＰ交差周波数よりも十分に高くなる或る周波数（例えば、導電率が約４０ｍＳ／ｍの懸濁媒体中のほとんどの細胞の場合には５００ＫＨｚ）において少なくとも一つの（好適には幾つかの）測定を行なう必要がある。
【００６５】
幾つかの場合においては、幾つかの粒子は互いに引き付けあって粒子チェーンを形成する。このような粒子チェーンは「パールチェーン（ｐｅａｒｌ  ｃｈａｉｎ）」と呼ばれることが多く、この現象は「ｐｅａｒｌ  ｃｈａｉｎｉｎｇ（パールつなぎ）」と呼ばれ、この「ｐｅａｒｌ  ｃｈａｉｎｉｎｇ」については非特許文献１（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  ｂｙ  Ｔ．  Ｂ．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｃｈ．  ６  ＆  ７，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５））に詳細が記載されている。印加電界に対するパールチェーンの粒子の応答は自由粒子（すなわち、パールチェーンを形成しなかった粒子）とは異なる。従って、パールチェーンに対応するデータを後続の解析から外すと便利である。
【００６６】
システム１００は、粒子のＤＥＰ交差周波数がどのようにして、粒子が他の粒子と相互作用してパールチェーンを形成する結果として変化するのかを解析することができる。この解析は、追跡粒子間の離間距離をモニターすることにより行なうことができる。ユーザは隣接追跡細胞間の最小離間距離を定義することができる。２つの粒子がこの最小離間距離よりも近接している場合、これらの粒子は２つの粒子から成るパールチェーンとして識別され、そして報告されるＤＥＰ交差周波数は単一粒子に関するデータとは別に報告されて別々の解析を行なうことができる。一緒にパールチェーンとなって付着する多数の粒子は同じようにして報告され、当該チェーンの一部として追跡される粒子の数が通知される。
【００６７】
上述の解析において取得するデータを粒子の物理特性及び／又は物理化学特性に関連付けるために、データを理論ＤＥＰモデルに使用する粒子パラメータに関連付けると有用である。特に、粒子が細胞である場合、細胞に作用する時間平均ＤＥＰ力＜Ｆ（ｔ）＞はマクスウェルの応力テンソルの公式（例えば、非特許文献２（Ｓａｕｅｒ，  Ｆ．Ａ．，  ｉｎ：Ｃｈｉａｂｒｅｒａ，  Ａ．，  Ｎｉｃｏｌｉｎｉ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｗａｎ，  Ｈ．Ｐ．  （ＥＤｓ．）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌ．  Ｃｏｒｐ．  １９８５，  １８１−２０２．）を参照されたし）を使用して表現することができるが、誘電損失が非常に大きい訳ではない一般的な場合に関しては、更に計算し易い等価双極子モーメントの公式を使用することができる。この場合、絶対値がＥで、勾配が▽Ｅの電界において粒子に作用する力は次式で与えられる。
【００６８】
＜Ｆ（ｔ）＞＝Ｒｅ｛ｍ（ω）｝▽Ｅ２／２Ｅ            （１）
上式において、Ｒｅは、細胞に生じる双極子モーメントｍ（ω）の実部（位相部分）を指す。生じる双極子モーメントは、次の関係に従って印加電界の角周波数ωとともに変化する。
【００６９】
ｍ（ω）＝４πεｍｒ３ｆ（εｐ＊，εｍ＊）Ｅ            （２）
上式において、ｒは細胞半径であり、そしてｆ（εｐ＊，εｍ＊）は次式で定義されるＣｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ関数である。
【００７０】
ｆ（εｐ＊，εｍ＊）＝（εｐ＊−εｍ＊）／（εｐ＊＋２εｍ＊）  （３）
因数εｐ＊及びεｍ＊はそれぞれ粒子及び懸濁媒体の複素誘電率であり、ε＊＝ε−ｊ（σ／ω）により定義され、εは誘電率、σは導電率、そしてｊ＝√（−１）である。
【００７１】
等式１〜３から、ＤＥＰ力は次式で与えられる。
＜Ｆ（ｔ）＞＝２πｒ３εｍα（▽Ｅ２）            （４）
上式において、αは等式３により定義されるＣｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ関数の実部であり、そしてこの実部は理論上、−０．５〜＋１．０の範囲の値を採り得る。
【００７２】
ＤＥＰＸ０周波数では、生じる双極子モーメントはゼロである。別の表現をすると、この周波数では、細胞は印加電界を透過するように見え、そして細胞上または細胞内には電荷は生じない。ＤＥＰ交差周波数の値ＤＥＰｆｘ０は、理論的に次の等式から求めることができる。
【００７３】
【数１】
2006510020.tif 000003
次にアルゴリズムは、曲線を速度対周波数データに、次のようにして生成され、３つのパラメータを用いるモデルを使用してフィッティングさせる。一つのシェルモデル（ｓｈｅｌｌ  ｍｏｄｅｌ）を粒子に関して使用して、Ｃｌａｕｓｉｕｓ−Ｍｏｓｓｏｔｔｉ関数の実部を、粒子及び媒体の導電率σｐ及びσｍ、及び誘電率εｐ及びεｍを用いて次式のように表現することができる。
【００７４】
【数２】
2006510020.tif 000004
上式において、τは、懸濁粒子が占める容積部分が小さい場合の粒子と粒子を取り囲む懸濁媒体との境界に生じる分極（電荷蓄積）を表わすＭａｘｗｅｌｌ−Ｗａｇｎｅｒ効果による緩和時間を表わす。次式を定義すると、
Ｋ１≡（σｐ−σｍ），
Ｋ２≡（２π）２τ２，
Ｋ３≡（εｐ−εｍ），                          （７）
等式６は次式のようになる。
【００７５】
【数３】
2006510020.tif 000005
上式を（１＋ω２Ｋ２）の項を共通にして表わすと、等式８は次式のようになる。
【００７６】
【数４】
2006510020.tif 000006
パラメータＫ１，Ｋ２，Ｋ３を次式のように再定義すると、
Ａ＝Ｋ１
【００７７】
【数５】
2006510020.tif 000007
Ｃ＝Ｋ２                                        （１０）
等式９は次式のように書き換えることができる。
【００７８】
【数６】
2006510020.tif 000008
ここで、ω２はＢ及びＣよりもずっと小さいので、等式１１の値は小さくなってほぼＡに等しくなることに注目されたい。アルゴリズムは等式１１で与えられる形の曲線を速度対周波数データにフィッティングさせ、パラメータＡ，Ｂ，及びＣを用いてフィッティングを最適化する。図７を参照すると、Ａは速度対周波数曲線の下側ポイントにより示される。高周波数では、ω２はＢ及びＣよりもずっと大きいので、これも図７に示すように、等式１１の値は小さくなってほぼＡＢ／Ｃに等しくなる。交差周波数では、等式１１の値はゼロに等しくなる。この条件は１＋Ｂω２＝０の場合に満たされる。従ってＢは負であり、交差周波数は次式で与えられる。
【００７９】
【数７】
2006510020.tif 000009
従って、ＤＥＰ交差周波数は、フィッティングパラメータ等式１２及びフィッティングパラメータＢにより求めることができる。
応用
ＤＥＰシステム１００を使用して、変化する化学及び／又は物理条件の下での粒子のＤＥＰ挙動を求めることができる。粒子のＤＥＰ挙動に関する知見を種々の目的に利用することができ、これらの目的には、例えば特定タイプの粒子の特性を特性化する、粒子混合物の粒子の小集団を解析する、そして／または種々の化学及び／又は物理薬剤に晒したときの挙動を解析する、ことなどが挙げられる。
【００８０】
幾つかの実施形態では、ＤＥＰシステム１００を使用して化学薬剤に対する細胞集団の反応を分析することができる。例えば、ＤＥＰシステム１００を細胞膜の生理変化に追随
するツールとして使用することができ、この場合の変化は膜貫通型受容体によるシグナル伝達イベントを伴なう（例えば、誘導好酸球（ホルボールミリステートアセテート：ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ）及びイオノマイシンを使用してシミュレートされるヒトＴリンパ球を分析する）。活性化された後のこのような細胞のＤＥＰ挙動の変化（例えば、ＤＥＰ交差周波数の変化）は、細胞膜構造の変化（例えば、細胞膜関連の微絨毛、水疱、及び／又はフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）の数の減少）に理論モデルを通して関連付けることができる。理論モデルの例として、細胞膜単位面積当たりの特定細胞膜容量及び導電率をＤＥＰ交差周波数に関連付ける方法が、非特許文献３（Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．，  Ｗａｎｇ，  Ｘ．−Ｂ．，  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｆ．  Ｆ．，  Ｇａｓｃｏｙｎｅ，  Ｐ．  Ｒ．  Ｃ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １２８２，  ７６−８４（１９９６））に開示されている。
【００８１】
更に一般的には、ＤＥＰシステム１００を使用して細胞集団に特定の反応を生じさせる薬剤を識別して新薬を発見することができる。
幾つかの実施形態では、ＤＥＰシステム１００を使用して特定タイプの粒子を他の粒子から分離する、そして／または識別するのに適するパラメータを求める、或いは分散液に含まれる種々のタイプの粒子を判別することができる。ＤＥＰシステム１００を使用して幾つかの粒子の混合物から成る成分を分析することができる。
【００８２】
ＤＥＰシステム１００を使用して基板に付着する粒子を特定することもできる。粒子に加わる静電泳動力は粒子の位置を電界分布に関連付けることによって求めることができるので、粒子を基板から引き離すために必要な力の大きさは、粒子が動き始めるときに求めることができる。基板を変更することにより（例えば、化学的及び／又は物理的表面処理により）、ＤＥＰシステム１００を使用して変更した結果としての基板との粒子の反応の変化をモニターすることができる。
別の実施形態
一般的に、流体をチャンバーに注入する、そして／または流体をチャンバーから排出する操作は、手動により、または自動で行なうことができる。記載の実施形態では、ユーザが流体を手動によりチャンバーに供給する。他の実施形態では、流体の供給は自動で行なうことができる。例えば、チャンバーは流入口及び排出口を含むことができ、これによってサンプル流体をチャンバーに注入し、そしてサンプル流体をチャンバーから排出することができる。チューブを流体供給源からチャンバーに至る経路の途中に接続することができる。ポンプによって所定量の流体を流体供給源から引き出し、そして要求があれば、流体をチャンバーに供給する。一旦、流体サンプルを分析してしまうと、流体サンプルをチャンバーからポンプによって排出口から排出する。分析対象の流体サンプルの性質によって変わるが、次の流体サンプルを導入する前に、チャンバーを洗浄サンプル（例えば純水）で洗い流すことができる。幾つかの実施形態では、パーソナルコンピュータ１３０により流体サンプルのチャンバーへの導入、及びチャンバーからの排出を制御することができる。
【００８３】
幾つかの実施形態では、ＰＣ１３０を使用して関数発生器を制御することもできる。これによってシステムの自動化レベルを上げることができる、というのは、一旦動作が始まると、システムは全周波数範囲をユーザに余計な入力操作を行なわせることなく掃引することができるからである。
【００８４】
上述の実施形態は４つの多項式電極素子を含むが、他の数の電極素子及び／又は他の電極構造も使用することができる。好適な実施形態では、隣接電極に印加される電圧の位相差の和は２πになる必要がある。例えば、４つの電極素子を有する記載の実施形態では、各隣接素子間の位相差はπ／２ラジアンである。同様に、Ｎ個の電極素子（例えば、Ｎ＝２，３，４，５，６，７，８，９，１０または１０超）を有する電極構成では、隣接電極
に印加される電圧の位相差は２π／Ｎラジアンである。幾つかの実施形態では、電圧を複数の電極に印加して進行波電界を生成することができる。
【００８５】
別の電極構造の一例は、櫛形電極構造（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ：指を交互に合せた形の組合せ構造）である。図８を参照すると、櫛形電極８００が１０本の平行電極素子を含んでいることが分かる。電極素子８１１，８１２，８１３，８１４，及び８１５が第１バスライン８１０に電気的に接触し、電極素子８２１，８２２，８２３，８２４，及び８２５が第２バスライン８２０に電気的に接触する。動作状態では、電源によってＡＣ電圧をバスライン８１０とバスライン８２０との間に印加する。従って、電極素子８１１〜８１５と８２１〜８２５との間の電位差によって電極間に電界が生じる。
【００８６】
櫛形電極素子の寸法は所望通りに変えることができる。幾つかの実施形態では、電極は幅が約５ミクロン以上（例えば、１０ミクロン、２０ミクロン、５０ミクロン、１００ミクロン）であり、そして長さが約２０ミクロン以上（例えば、３０ミクロン、４０ミクロン、５０ミクロン、７５ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、５００ミクロン）である。更に、隣接電極素子の間隔も変えることができる。幾つかの実施形態では、隣接電極の間隔は電極の幅よりも大きい。この間隔は、例えば約１０ミクロン超（例えば、２０ミクロン、３０ミクロン、５０ミクロン、１００ミクロン、２００ミクロン、または２００ミクロン超）とすることができる。
【００８７】
櫛形電極８００は１０個の電極素子を含むが、他の実施形態は、これよりも少ない数の、または多い数の電極素子を有することができる（例えば、２０素子超の、５０素子超の、１００素子超の素子）。
【００８８】
多項式電極構造及び櫛形電極構造について記載してきたが、一般的に、所望の電界分布を生じさせることができる電極構造であればどのような電極構造も使用することができる。
【００８９】
幾つかの実施形態では、電極アレイ２３０は複数の電極領域を含み、各電極領域は電界が種々の粒子サンプルに印加されるように構成される。特に、電極アレイ２３０はアレイサンプルに使用される、例えば９６ウェルプレートに使用されるように構成することができる。９６ウェルプレートの場合、電極アレイ２３０は８×１２アレイの電極領域を含み、各領域は９６ウェルプレートの一サンプルに対応する。このような実施形態によって高サンプルスループットが実現する、というのは、システムはサンプル群の各々を連続して自動的に分析し、初期設定後の追加のユーザ入力が最小限で済むように構成されるからである。一般的に、電極アレイ２３０はどのような数の電極領域を含むこともできる（例えば、９６個未満、または３８４個のような９６個超）。
【００９０】
ＤＥＰシステム１００はまた、粒子に更に別の力を加える機器を含むことができる。例えば、ＤＥＰシステム１００は、流体力、遠心力、重力、超音波力、電気泳動力、磁力、及び／又は光力を分散液中の粒子群の内の一つ以上の粒子に加える機器を含むことができる。例えば、光力を加えるために、レーザからの出力ビームを顕微鏡対物レンズを通して集光してチャンバー内で光捕獲作用を生じさせることができる。流体力は液体がチャンバーを所定の流量で通過するように液体を流すことにより加えることができる。超音波力を加えるための機器の例としてチャンバーに接続することができる超音波トランスデューサがある。遠心力を加えるためには、チャンバーを所望の力が加わるように十分に高い回転速度でチャンバーを回転させる。
【００９１】
別の構成として、または更に追加する形で、ＤＥＰシステム１００は、静電泳動挙動に
影響するチャンバー内の種々のパラメータをモニターするためのプローブを追加する形で含むことができる。例えば、ＤＥＰシステムは、静電泳動分析中にチャンバー内のサンプルの導電率をモニターするための導電率センサを含むことができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰシステム１００は、サンプルの温度をモニターするための温度計を含むことができる。モニター可能な静電泳動挙動に影響を及ぼすことのできる他のパラメータとして、誘電率、ｐＨ値、流体粘度、及び／又は電極壁及び／又はチャンバー壁の材料処理または化学処理が挙げられる。
【００９２】
パーソナルコンピュータ１３０により、粒子の静電泳動挙動に影響する更に別のシステムパラメータをモニターすることができる。例えば、電極アレイの上に温度プローブを設け、そしてこのプローブを電極アレイに接続することにより、ＰＣを使用してＤＥＰ操作中の分散液の温度をモニターすることができる。ＰＣ１３０により上述のパラメータのような他のパラメータをモニターすることができる。
【００９３】
記載の実施形態においては、画像はＣＣＤカメラ１２０を使用して検出されるが、他のタイプの検出器を使用することもできる（例えば、ＣＭＯＳイメージセンサチップまたは導光板）。更に、幾つかの実施形態では、ＰＣコンピュータ及びイメージキャプチャカードは、信号処理技術を使用して検出器からの信号を解析するように構成されるカスタム設計電子プロセッサに置き換えることができる。
【００９４】
上述の実施形態では、光学顕微鏡１１０は明視野観察用に構成され、試料に対して垂直方向に光を照射するタイプである。しかしながら他のタイプの光学顕微鏡を使用することもでき、例えば試料に対して斜め方向から光を照射し、試料の散乱光／回折光を観察する方法を用いる顕微鏡、試料に対して強い光を照射したときに発する「自家蛍光」を観察する方法を用いる顕微鏡、及び／又は共焦点顕微鏡が挙げられる。更に一般的には、上に記載した技術を、顕微鏡を用いないデータの採取方法、例えばＣＣＤアレイ、ＣＭＯＳアレイと連携して、またはこれらを利用する、或いはプレートリーダーを使用して適用することができる。
【００９５】
本発明の多くの実施形態について記載してきた。しかしながら、本発明の技術思想及び技術範囲から逸脱しない範囲において種々の変更を加え得ることを理解されたい。従って、他の実施形態は次の請求項に示す技術範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】静電泳動システムの一の実施形態を示す模式図。
【図２】図１に示す静電泳動システムに使用する電極装置の平面図。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は粒子の静電泳動挙動を示す模式図であり、（ａ）は粒子が負の静電泳動力を受ける場合、（ｂ）は粒子が正の静電泳動力を受ける場合の図。
【図４】ＤＥＰシステムを使用して取得される画像を解析するために使用するアルゴリズムのフローチャート。
【図５】粒子の半径に関する性能指数を求めるために使用する画素を示す模式図。
【図６】負の静電泳動力の影響を受けている状態での粒子の位置を時間の関数として示すプロット。
【図７】３つのパラメータフィッティング関数による速度／周波数データにフィッティングさせた曲線を示すプロット。
【図８】櫛形電極を示す模式図。
【００９７】
種々の図における同様の参照符号は同様の構成要素を指す。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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