(57)【要約】本発明は、免疫系のエフェクター細胞のCD16受容体に対する高親和性を示して、高いADCCを誘導し得るだけでなく、エフェクター細胞のADCC活性を増大し得るサイトカインおよびインターロイキン、特にIFNγの分泌を誘導する特性をも示し、したがって癌および病原体による感染症の治療に用いられ得る、選択された細胞株で産生されるヒト化またはヒトキメラモノクローナル抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して60%、70%、80%を上回る、または好ましくは90%を上回るFcγRIII (CD16)型ADCC率を有し、Jurkat CD16細胞または免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞による少なくとも1つのサイトカインの産生を、CHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して60%、100%を上回る、または好ましくは200%を上回る率で誘導する能力を有することを特徴とする抗体であって、抗体のFc断片の特定の糖鎖形成の特性に関して選択された細胞株において産生される、またはエクスビボでグリカン構造が修飾されている、ヒトまたはヒト化キメラモノクローナル抗体。
【請求項２】
CHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して、10 ng/ml以下の濃度において100%を上回るADCC率、およびCHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して、10 ng/ml以下の濃度において1000%を上回る、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞による少なくとも1つのサイトカインの産生率を有する、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
放出されるサイトカインがインターロイキンであることを特徴とする、請求項1および2のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４】
放出されるサイトカインがインターフェロンであることを特徴とする、請求項1および2のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
放出されるサイトカインが組織壊死因子(TNF)であることを特徴とする、請求項1および2のいずれか一項記載の抗体。
【請求項６】
選択された抗体が、CD16受容体発現エフェクター細胞による、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNFa、TGFβ、IP10、およびIFNγから選択される少なくとも1つのサイトカインの分泌を誘導する能力を有することを特徴とする、請求項1および2のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
選択された抗体が、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞によるIL-2の分泌を誘導する能力を有することを特徴とする、請求項1または2のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
エフェクター細胞が、CD16受容体発現Jurkat細胞、または特にNK（ナチュラルキラー）系統の白血球細胞、もしくは単球-マクロファージ群の細胞であることを特徴とする、請求項1、2、または7のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
ラット骨髄腫種の細胞株、特にYB2/0で産生されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１０】
病原細胞またはヒトに対して病原性である微生物の抗原、特に癌細胞の抗原に対して作製されることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
その特異性がヒト赤血球の抗Rh（Rhesus）Dであることを特徴とする、請求項10記載の抗体。
【請求項１２】
抗HLA-DRであることを特徴とする、請求項11記載の抗体。
【請求項１３】
Remitogen(登録商標)の発現株であるCHO株で発現させた同じ抗体と比較して、10 ng/ml以下の濃度において100%を上回るADCC率、および10 ng/ml以下の濃度において最大で1000%を上回る、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞によるIL-2産生率を有することを特徴とする、請求項12記載の抗体。
【請求項１４】
ラット骨髄腫株、特にYB2/0で産生されることを特徴とする、請求項12記載の抗体。
【請求項１５】
抗CD20であることを特徴とする、請求項10記載の抗体。
【請求項１６】
Rituxan(登録商標)と比較して、10 ng/ml以下の濃度において100%を上回るADCC率、および10 ng/ml以下の濃度において最大で1000%を上回る、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞によるIL-2産生率を有することを特徴とする、請求項15記載の抗体。
【請求項１７】
ラット骨髄腫株、特にYB2/0で産生されることを特徴とする、請求項15記載の抗体。
【請求項１８】
抗Ep-CAM、抗KIR3DL2、抗VEGFR、抗HER1、抗HER2、抗GD、抗GD2、抗GD3、抗CD23、抗CD30、抗CD33、抗CD38、抗CD44、抗CD52、抗CA125、および抗プロテインC；抗Ep-CAM、抗HER2、抗CD52、抗HER1、抗GD3、抗CA125、抗GD、抗GD2、抗CD23、および抗プロテインC；抗ウイルス：HBV、HCV、HIV、およびRSV、例えばFVIIIおよびFIXを含む凝固因子等の阻害剤に特異的な抗イディオタイプから選択されることを特徴とする、請求項10記載の抗体。
【請求項１９】
癌および病原体による感染症の治療を意図した医用製品を産生するための、請求項1〜18のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項２０】
MHCクラスII陽性細胞の癌、特にB細胞リンパ腫、急性B細胞白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、T細胞リンパ腫および白血病、非ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病の治療を意図した医用製品を産生するための、請求項12〜14および請求項15〜17のいずれか一項記載の抗体の使用。
【請求項２１】
特に癌および感染症の治療に有用である、免疫系のナチュラルエフェクター細胞によるTNF、IFNγ、IP10、およびIL-6の発現の誘導を意図した医用製品を産生するための、請求項12〜14および請求項15〜17のいずれか一項記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系のエフェクター細胞のCD16受容体に対する高親和性だけでなく、エフェクター細胞の細胞障害活性を調節し得るサイトカインおよびインターロイキンの分泌を誘導する特性をも示す、選択された細胞株で産生されるヒトまたはヒト化キメラモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体を用いた免疫療法は、医学の最も重要な局面の1つになりつつある。一方、臨床試験で得られる結果は対照的であるようである。実際に、モノクローナル抗体が十分に効果的でないことが示され得る。有効性の不足、および臨床的治療での使用と適合しない副作用等の様々な理由から、多くの臨床試験が中止されている。治療反応を補償するおよび得るために、比較的不活性である抗体が高用量で投与されることを考えると、これら2つの局面は密接に関連している。高用量の投与により、副作用が誘導されるばかりでなく、経済的にも存立できない。
【０００３】
ヒトまたはヒト化キメラモノクローナル抗体の産業開発において、これらは主要な問題である。一例として、Protein Design Labsという会社は、特定のB細胞およびT細胞白血病においてMHCクラスII陽性細胞の癌を治療するために使用され得る抗HLA-DR抗体である、Remitogen(登録商標)の第一相/第二相臨床試験を保留した。
【０００４】
抗体の機能特性を改善するため、今日、研究は免疫グロブリンFcγ断片に対して行われている。最終的に、これにより、エフェクター細胞（単球-マクロファージ、Bリンパ球、NK細胞、および樹上細胞）の受容体と相互作用し、これを活性化する抗体が得られるようにすべきである。
【０００５】
抗体のリガンドへの結合により、そのFc受容体を介した特定のエフェクター細胞の活性化が誘導され得るが、これが本発明の目的である。本発明者らは、ある抗体が、ADCCまたは補体の活性化等の機能特性を有するばかりでなく、サイトカインをも誘導することを示した。エフェクター活性化の部位で産生されるこれらのサイトカインは、様々な生物活性を働かせ得る。
【０００６】
したがって、これらの免疫反応調節因子の産生を誘導する、候補抗体の特性を試験する必要があると考えられる。実際に、エフェクター細胞受容体の活性化により非常に異なる反応が起こり、結果として1つまたは複数のサイトカインが放出されることが見出されている。これらのサイトカインは、それぞれに見合って、免疫系の特定の成分の活性化または阻害に関与する。例えば、所与の抗原に対して作製された同じ抗体が、マウス骨髄腫株で産生された場合には全く効果がないのに対して、他の細胞株で産生された場合には非常に効果的であると認められる場合がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは、例えば、抗体のリガンドへの結合により、CD16をトランスフェクションしたJurkat細胞の活性化が誘導でき、結果としてIL2の分泌が起こることを本明細書において実証する。Jurkat CD16によるIL2の分泌とエフェクター細胞のCD16媒介性ADCC活性との間に、強力な関連性が認められる。
【０００８】
本発明者らは、本発明者らの出願である国際公開公報第01/77181号(LFB)において、FcγRIII (CD16)型の強力なADCC活性を示す抗体を産生するには、細胞株の選択が重要であることを示した。本発明者らは、抗体の定常断片の糖鎖形成を修飾することにより、YB2/0等のラット骨髄腫株でADCC活性が改善され、そのグリカン構造は、短い鎖、低度のシアリル化、非挿入の末端結合部位マンノースおよびGlcNAc、ならびに低度のフコシル化を有する二本鎖型であることを見出した。
【０００９】
本発明との関連で、本発明者らは、CD16に対して高親和性を示すという利点が、サイトカイン産生を誘導する抗体の選択を目的とするさらなる試験により、さらに増大され得ることを見出した。
【００１０】
上記の2つの特徴は相互に補完する。実際に、本発明の方法により選択された抗体によって誘導されるサイトカインの産生は、抗体の細胞障害活性を亢進し得る。そのような活性化の作用の機構は、おそらくエフェクター細胞の正の自己分泌制御に由来する。抗体がCD16に結合すると、細胞障害活性をもたらすばかりでなく、IFNγの産生も誘導され、最終的にこれにより細胞障害活性のさらなる増大が起こると仮定され得る。
【００１１】
したがって本発明は、治療において入手可能な抗体の最大で100倍高い活性を有する抗体を提案する。具体的には、本発明は、Remitogen(登録商標)およびRituxan(登録商標)等のそれぞれの相同物よりも有意に効率的な抗HLD-DRおよび抗CD20を提供する。本発明は、50%活性を得るための有効量が現在使用されている抗体のものよりも非常に低い次世代を提供することで、臨床目的の抗体の開発において大きな転換点となる。
【００１２】
説明
したがって、本発明は、CHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して60%、70%、80%を上回る、または好ましくは90%を上回るFcγRIII (CD16)型ADCC率を有し、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞による少なくとも1つのサイトカインの産生を、CHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して60%、100%を上回る、または好ましくは200%を上回る率で誘導する能力を有することを特徴とする、抗体のFc断片の糖鎖形成の特性に関して選択された細胞株において産生される、またはエクスビボでグリカン構造が修飾された、ヒトまたはヒト化キメラモノクローナル抗体に関する。
【００１３】
好ましくは、この抗体は、CHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して、10 ng/ml濃度において100%を上回るADCC率、およびCHO株で産生された同じ抗体または市販の相同的抗体と比較して、10 ng/ml濃度において1000%を上回る、免疫系のエフェクター細胞、詳細にはCD16受容体を発現する免疫系のエフェクター細胞による少なくとも1つのサイトカインの産生率を有する。
【００１４】
放出されるそのようなサイトカインは、インターロイキン、インターフェロン、および組織壊死因子(TNF)である。
【００１５】
したがって、抗体は、免疫系のエフェクター細胞、詳細にはCD16受容体を発現する免疫系のエフェクター細胞による、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10等、TNFa、TGFβ、IP10、およびIFNγから選択される少なくとも1つのサイトカインの分泌を誘導する能力に関して選択される。
【００１６】
好ましくは、選択された抗体は、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞によるIFNγの分泌を誘導する能力を有する。分泌されるIFNγの量は、抗原結合の完全性（Fc機能）および能力（抗原性部位）に関する、CD16受容体に結合した抗体の質を反映する。さらに、IFNγの分泌は、エフェクター細胞の細胞障害活性の増大に寄与する。
【００１７】
エフェクター細胞は、内因性CD16を発現し得るか、または形質転換され得る。「形質転換細胞」という用語は、Fc受容体、詳細にはCD16受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を意味することを意図する。
【００１８】
特定の態様において、本発明の抗体は、特にNK（ナチュラルキラー）系統の白血球細胞、または単球-マクロファージ群の細胞による少なくとも1つのサイトカインの分泌を誘導し得る。好ましくは、抗体を選択するために、CD16受容体をコードする発現ベクターをトランスフェクションしたJurkat細胞をエフェクター細胞として使用する。この株は不死化されており、すなわち培地中で永久に増殖し、そのためCD16発現の安定性により再現性のある結果が得られるため、特に有利である。
【００１９】
さらに、抗体は、精製および/またはFc断片のグリカン構造の修飾によりエクスビボで修飾した後に、選択することもできる。
【００２０】
選択は、ラット骨髄腫株、詳細にはYB2/0およびその誘導体、ヒトリンパ芽球様細胞、昆虫細胞、ならびにマウス骨髄腫細胞等の、治療抗体の産生に通常用いられる細胞によって産生された抗体で行い得る。選択はまた、遺伝子組み換え植物または遺伝子組み換え哺乳動物によって産生される抗体の評価に適合させてもよい。この意味で、CHOにおける産生が、本発明による抗体を生じる産生系を比較し選択するための参照となる（CHOは医用製品抗体の産生に用いられている）。別法は、市販の抗体、詳細には開発過程の抗体、製造承認を取得した抗体、または臨床試験が中止され、比較的効果のないことおよび/もしくは投与される用量において副作用を生じることが見出された抗体との比較を行うことにある。実際に、上記のように、本発明の改変抗体は、免疫系のエフェクター細胞のADCCの活性化において最大で100倍効率的であり、このことは、投与量が上記の抗体を用いた場合の投与量よりも低いことを意味する。
【００２１】
本発明の抗体は、ラット骨髄腫種の細胞株、詳細にはYB2/0で産生され得る。抗体は、通常の非遍在性抗原（例えば、抗体の特異性はヒト赤血球の抗Rh（Rhesus）Dである）、または病原細胞もしくはヒトに対して病原性である微生物の抗原、詳細には癌細胞の抗原に対して作製され得る。好ましい局面において、抗体は抗HLA-DRである。この抗体は、Remitogen(登録商標)の発現株であるCHO株で発現させた同じ抗体と比較して、10 ng/ml以下の濃度において100%を上回るADCC率、および10 ng/ml濃度において最大で1000%を上回る、免疫系のCD16受容体発現エフェクター細胞によるIL-2産生率を有する。
【００２２】
本発明の抗HLA-DRは、ラット骨髄腫株、詳細にはYB2/0で産生され得る。
【００２３】
別の好ましい局面において、本発明の抗体は抗CD20である。この抗体は、Rituxan(登録商標)と比較して、10 ng/ml以下の濃度において100%を上回るADCC率、および10 ng/ml濃度において最大で1000%を上回る、Jurkat CD16細胞によるIL-2産生率を有する。
【００２４】
本発明の抗CD20は、ラット骨髄腫株、詳細にはYB2/0で産生され得る。
【００２５】
他の抗体は、抗Ep-CAM、抗KIR3DL2、抗VEGFR、抗HER1、抗HER2、抗GD、抗GD2、抗GD3、抗CD23、抗CD30、抗CD33、抗CD38、抗CD44、抗CD52、抗CA125、および抗プロテインC抗体；例えばFVIIIおよびFIXを含む凝固因子等の阻害剤に特異的な抗イディオタイプ、抗ウイルス：HBV、HIV、HCV、およびRSVから選択され得る。
【００２６】
別の局面において、本発明は、癌（例えば抗VEGFR）および病原体による感染症（例えば抗HIV）の治療を意図した医用製品を産生するための、上記抗体の使用に関する。
【００２７】
より詳細には、本発明は、MHCクラスII陽性細胞の癌、詳細にはB細胞リンパ腫、急性B細胞白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、T細胞リンパ腫および白血病、非ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病の治療を意図した医用製品を産生するための、上記の抗HLA-DR抗体または抗CD20抗体の使用に関する。
【００２８】
本発明の好ましい局面では、抗体は、まずCD16受容体親和性に関して選択され、次に、サイトカイン、詳細にはJurkat CD16細胞によるIL-2または血液のCD16発現エフェクター細胞によるIFNγの産生を誘導する特性に関して、上記のようにアッセイして選択され得る。
【００２９】
CD16を介したADCCの誘導およびIL-2産生の誘導というこの二重の特性を有するそのような抗体により、エフェクター細胞の細胞障害活性が非常に実質的に促進される。例えば、この抗体は、任意の細胞株で産生され、上記のアッセイ法により選択された上記の抗体であってよい。これらの抗体は、現在入手可能な相同物（表1を参照のこと）よりも効果的な次世代の抗体である可能性がある。
【００３０】
【表１】
2006516951.tif 000002
2006516951.tif 000003
【００３１】
本発明はまた、特に癌および感染症の治療に有用である、免疫系のナチュラルエフェクター細胞によるTNF、IFNγ、IP10、IL8、およびIl-6の発現の誘導を意図した医用製品を産生するための、上記抗体の使用に関する。
【００３２】
実施例1：抗HLA-DR
1.1：CD16媒介性ADCCアッセイ
YB2/0細胞およびCHO細胞において、キメラ抗HLA-DR抗体を発現させた。キメラ抗HLA-DR抗体は、HLA-DR抗原を表面に発現しているRaji細胞に対して、細胞障害活性を誘導し得る。これを行うため、HLA-DR抗原に特異的なIgG1をコードする同じ配列を、CHOおよびYB2/0にトランスフェクションする。抗体をRaji細胞（標的）およびヒトナチュラルキラー(NK)細胞と共にインキュベートする。16時間インキュベートした後、Raji細胞に対する抗体の細胞障害活性(ADCC)を評価した（図1を参照のこと）。
【００３３】
YB2/0（四角）およびCHO（三角）で発現させた2つの抗HLA-DR抗体は、ADCCによるRaji細胞の溶解を誘導する。YB2/0で発現させた抗体は、特に少量のエフェクターおよび低濃度の抗体条件下において、CHOよりも細胞障害性が強いことが認められる。
【００３４】
1.2：IL-2アッセイ
HLA-DR抗原に特異的なIgG1をコードする同じ配列を、CHOおよびYB2/0にトランスフェクションする。抗体を、Raji細胞（標的）および158位にアミノ酸フェニルアラニン(F)を有するJurkat CD16細胞（エフェクター）と共にインキュベートする。Jurkat CD16により分泌されるサイトカイン(IL2)の量を、ELISAにより測定する（図2を参照のこと）。
【００３５】
抗HLA-DR抗体は、IL2（サイトカイン）の強力な分泌を誘導する。抗体をYB2/0で発現させた場合（四角）、CHOで発現させた場合と比較して（三角）、試験したすべての濃度において、比較的分泌ひいては活性化の程度が高い。
【００３６】
実施例2：ADCCとJurkat CD16によるIL-2の放出とのインビトロ相関関係
この研究のため、3つの抗Dモノクローナル抗体(Mab)を比較した。
【００３７】
Mab DF5-EBVは、D陰性免疫化ドナーから得られたヒトBリンパ球を、EBVでの形質転換によって不死化して産生された。臨床試験において、この抗体が血液循環からRh陽性赤血球を除去できないことが示されたことから考えて、この抗体を陰性対照として使用した。
【００３８】
モノクローナル抗体(Mab) DF5-YB2/0は、YB2/0株においてDF5-EBVの一次配列を発現させることにより取得した。モノクローナル抗体R297および他の組換え抗体もまた、YB2/0で発現させた。
【００３９】
エフェクターとして単核球(PBL)を使用し、パパイン処理した赤血球の溶解を誘導する能力に関して、これらの抗体をインビトロでアッセイした。
【００４０】
生理的条件を再構成するため、アッセイはすべて、ヒト免疫グロブリン(IVIg)の存在下で行った。
【００４１】
IVIgは、FcγR1(CD64)と高親和性で結合すると考えられる。2つのMab、DF5-YB2/0およびR297は、WinRhoポリクローナル抗体のレベルと匹敵するレベルで赤血球溶解を誘導する。一方、Mab DF5-EBVは全く効果がない。
【００４２】
2系列めの実験では、精製NK細胞および未処理の赤血球を、それぞれエフェクターおよび標的として使用した。5時間インキュベートした後、抗D Mab、R297およびDF5-YB2/0は赤血球溶解を引き起こし得ることが示されたが、DF5-EBVは効果がないままであった。
【００４３】
これらの2つの実験において、赤血球溶解は、FCγRIII(CD16)に対して作製されたMab 3G8により阻害された。
【００４４】
要するに、これらの結果から、Mab R297およびMab DF5-YB2/0によって生じるADCCには、NK細胞の表面に発現したFCγRIIIが関与することが示される。
【００４５】
本発明との関連において、抗D抗体の有効性を評価するため、Jurkat CD16細胞を用いたインビトロアッセイより3系列めの実験を行った。Mabを、Rh陽性赤血球およびJurkat CD16細胞と共に一晩インキュベートした。上清へのIL-2の放出をELISAにより評価した。
【００４６】
ADCCとJurkat細胞活性化との間に強い相関関係が認められ、このことから、このアッセイを用いて、FcγRIII (CD16)に対する反応性に応じて、抗D Mab間の差異を識別することができることが示唆される。
【００４７】
同じ試料を、ADCCおよびJurkat IL2アッセイで評価する。結果を、参照抗体「LFB-R297」の割合として表す。2つの技法間の相関関係曲線は、0.9658の係数r2を有する（図3）。
【００４８】
要するに、これらのデータから、FcγRIII特異的ADCC活性を誘導する能力には、抗体のFc部分の翻訳後修飾が重要であることが示される。IL-2等のサイトカインの放出は、ADCCと相関関係がある。
【００４９】
実施例3：NK細胞の活性化ならびにIL2およびIFNγの産生
設定モデル：CD16受容体をコードする遺伝子をトランスフェクションしたJurkat細胞株。適用：抗腫瘍反応の亢進。活性化エフェクター細胞により産生されるIL2は、細胞増殖を促進し得るまで、Tリンパ球およびNK細胞の活性化を誘導する。IFNγはCTLの活性を促進し、マクロファージの活性を増大し得る。
【００５０】
実施例4：単球-マクロファージの活性化ならびにTNFおよびIL-1Raの産生
適用：食作用の亢進および抗炎症特性の誘導。活性化エフェクター細胞により産生されるTNFは、腫瘍浸潤リンパ球およびマクロファージのの増殖を促進する。IL-1Raはその受容体のレベルにおいてIL1と競合するサイトカインであり、したがって抗炎症効果を及ぼす。
【００５１】
実施例5：樹上細胞の活性化およびIL10の産生
適用：特定の抗原に特異的な寛容の誘導。IL10は、様々なエフェクター細胞の活性化およびサイトカインの産生を阻害する分子である。
【００５２】
実施例6：様々なエフェクター細胞によるサイトカイン分泌の誘導
3つの細胞集団を試験した：多核白血球、単核球、およびNK細胞。サイトカイン合成の誘導は、標的の存在に依存する。エフェクター細胞によって分泌されるサイトカインに関して、R297と抗Rh Dポリクローナル抗体との特性間にはほとんど相違がない。AD1は、通常サイトカイン分泌を誘導しない。
【００５３】
結果：
6.1：抗Rh Dモノクローナル抗体R297および抗Rh Dポリクローナル抗体WinRhoは、単核球の存在下においてIL8の相当量の分泌を誘導する。この分泌は、抗体濃度および抗原性標的の存在に依存する。抗体AD1は、単核球によるIL8産生の誘導において効果が非常に低い（図4）。
【００５４】
抗Rh Dモノクローナル抗体R297および抗Rh Dポリクローナル抗体WinRhoは、単核球によるTNFαの相当量の分泌、ならびにそれよりも弱いがAD-1により誘導される量よりは多いIL6、IFNγ、IP10、TNFα、およびTGFβの分泌を誘導する。この分泌は、IL6、IFNγ、およびIP10に関しては、抗体濃度の上昇につれて増加するが、TNFαおよびTGFβに関しては減少する（図5）。
【００５５】
6.2：抗Rh Dモノクローナル抗体R297および抗Rh Dポリクローナル抗体WinRhoは、非常に弱いがAD1よりも強い、多核白血球によるIL2、IFNγ、IP10、およびTNFの分泌を誘導する。この分泌は、抗体濃度依存的である（図6）。
【００５６】
6.3：モノクローナル抗体R297およびポリクローナル抗体WinRhoは、NK細胞によるIFNγ、IP10、およびTNFのかなりの量の分泌を誘導する。この分泌は、抗体濃度依存的である（図7）。
【００５７】
実施例7：YB2/0において産生される、最適化されたキメラ抗CD20抗体およびキメラ抗HLA-DR抗体
導入
本発明者らの最初の結果から、YB2/0において産生された抗D抗体および臨床的に使用されているポリクローナル抗体が、強力なADCC活性、および精製NK細胞または単核球からのサイトカイン、特にTNFαおよびインターフェロンγ(IFNγ)の産生を誘導することが示された。一方、他の細胞株で産生された他の抗D抗体は、ADCCに関して陰性であり、サイトカインのこの分泌を誘導できないことが認められた。
【００５８】
以下のさらなる結果から、この機構がRh陽性赤血球の存在下における抗D抗体に限られたものではなく、YB2/0で発現させた抗CD20抗体および抗HLA-DR抗体にもあてはまることが示される。CHOにおいて発現させると、実質性の低い活性化特性が抗体に付与される。このことは、ADCCで得られる結果と一致する。
【００５９】
材料
抗体
抗CD20：YB2/0にトランスフェクションしたキメラ抗CD20抗体を、CHOで産生された市販の抗CD20抗体（リツキサン）と比較する。
抗HLA-DR：キメラ抗HLA-DR抗体をコードする同じ配列を、CHO細胞(B11) またはYB2/0(4B7)にトランスフェクションする。
標的細胞：表面にCD20抗原およびHLA-DR抗原を発現するRaji細胞。
エフェクター細胞：ヒト血液バッグからネガティブ選択により精製されたヒトNK細胞。
【００６０】
方法
様々な濃度の抗CD20抗体および抗HLA-DR抗体を、Raji細胞およびNK細胞と共にインキュベートする。16時間インキュベートした後、細胞を遠心分離する。上清をTNFαおよびIFNγに関してアッセイする。
【００６１】
結果：
1) TNFα：結果は、アッセイした上清中のTNFαをpg/mlで示す。反応混合液に添加した抗体の様々な濃度をx軸に示す（図8）。
【００６２】
YB2/0で産生されたキメラ抗CD20抗体およびキメラ抗HLA-DR抗体は、CHOで産生された同じ抗体と比較して、標的（Raji）の存在下において、より多量のTNFを誘導する。TNFαの量は、明らかに添加した抗体の濃度に用量依存的である。10 ng/mlの抗体では、YB2/0で産生された抗体により、CHOで産生された抗体と比較して5倍のTNFαが誘導される。
【００６３】
2) IFNγ：結果は、アッセイした上清中のIFNγをpg/mlで示す。反応混合液に添加した抗体の様々な濃度をx軸に示す（図9）。
【００６４】
YB2/0で産生されたキメラ抗CD20抗体およびキメラ抗HLA-DR抗体は、CHOで産生された同じ抗体と比較して、標的（Raji）の存在下において、より多量のIFNγを誘導する。IFNγの量は、明らかに添加した抗体の濃度に用量依存的である。CHOで産生された抗HLA-DR抗体は、用いたすべての濃度（0〜200 ng/ml）においてIFNγの分泌を誘導しないが、YB2/0で産生された抗体40 ng/mlにより、約1000 pg/mlのIFNγが誘導される。
【００６５】
抗CD20抗体では、300 pg/mlのIFNγを誘導するのに、YB2/0で産生された抗体10 ng/ml未満、およびCHOで産生された抗体200 ng/mlを必要とする（図9）。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】CHO（三角）またはYB2/0（四角）で発現させた抗HLA-DR抗体によって誘導される、Raji細胞のADCC溶解。
【図２】CHO（三角）またはYB2/0（四角）で発現させた抗HLA-DR抗体によって誘導される、Jurkat CD16細胞によるIL2の分泌。
【図３】NK細胞によって提供されるADCCの割合とJurkat CD16細胞によるIL2の分泌との相関関係。
【図４】標的の存在下または非存在下において、MNCによって分泌されるIL8。
【図５】抗Rh抗体によって誘導される、MNCによるサイトカインの分泌（標的なしでの推定値）Tox 324 03 062。
【図６】抗Rh抗体によって誘導される、多核白血球によるサイトカインの分泌。
【図７】抗Rh抗体によって誘導される、NK細胞によるサイトカインの分泌。
【図８】CHOおよびYB2/0で発現させた抗CD20抗体および抗HLA-DR抗体によって誘導される、NK細胞によるTNFαの分泌（324 03 082）。
【図９】CHOおよびYB2/0で発現させた抗CD20抗体および抗HLA-DR抗体によって誘導される、NK細胞によるIFNγの分泌（324 03 082）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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