(57)【要約】本発明は、ペプチドを溶液状態で合成するための新しい方法に関する。上記方法は、ａ）化学式Ｒ１−ＳＯ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（式中、Ｒ１はアリール）のウレタン基で保護されたα−アミン作用基を有するペプチドまたはアミノ酸誘導体を有機溶媒の中で過量の脂肪族２次アミンで処理し、前記アミノ酸またはペプチド誘導体の遊離α−アミン作用基を放出させ、前記２次アミンと化学式Ｒ１−ＳＯ２−ＣＨ２＝ＣＨ２の遊離されたビニール化合物との間に３次アミン添加生成物を形成し；ｂ）前記溶媒と過量の２次アミンとを取り除き；ｃ）前記Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体と、前記Ｎα−保護基または他のウレタン保護基で保護されて次に連結されるペプチドまたはアミノ酸誘導体とを含む前記３次アミン添加生成物で形成した混合物を、Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体の遊離α−アミン作用基と次のＮα−保護されたペプチドまたはアミノ酸誘導体のα−カルボキシ作用基との間にペプチド結合を形成する条件下で反応させ；ｄ）前記新たに形成されるペプチドを前記反応混合物から取り除き；ｅ）所望のポリペプチドが得られるまで前記各過程を繰り返すことを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）化学式Ｒ１−ＳＯ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（式中、Ｒ１はアリール）のウレタン基で保護されたα−アミン作用基を有するペプチドまたはアミノ酸誘導体を有機溶媒の中で過量の脂肪族２次アミンで処理し、前記アミノ酸またはペプチド誘導体の遊離α−アミン作用基を放出させ、前記２次アミンと化学式Ｒ１−ＳＯ２−ＣＨ２＝ＣＨ２の遊離されたビニール化合物との間に３次アミン添加生成物を形成し、
ｂ）前記溶媒と過量の２次アミンとを取り除き、
ｃ）前記Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体と、前記Ｎα−保護基または他のウレタン保護基で保護されて次に連結されるペプチドまたはアミノ酸誘導体とを含む前記３次アミン添加生成物で形成した混合物を、Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体の遊離α−アミン作用基と次のＮα−保護されたペプチドまたはアミノ酸誘導体のα−カルボキシ作用基との間にペプチド結合を形成する条件下で反応させ、
ｄ）前記新たに形成されるペプチドを前記反応混合物から取り除き、
ｅ）所望のポリペプチドが得られるまで前記各過程を繰り返すことを含むペプチド合成方法。
【請求項２】
Ｒ１は、４−ニトロフェニル、４−フェニルスルホニルフェニル、４−メチルスルホニルフェニル、４−ジメチルアミドスルホニルフェニル、４−ジエチルアミドスルホニルフェニル、４−モルホリドスルホニルフェニルおよび４−ピペリドスルホニルフェニルからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪族２次アミンが、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ピペリジン、ピロリジンおよびモルホリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記有機溶媒が、揮発性の非陽性子性溶媒であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記揮発性の非陽性子性溶媒が、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンおよびジメチルスルホキシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒と過量の脂肪族２次アミンとの除去が蒸発によって行われることを特徴とする請求項３または４記載の方法。
【請求項７】
前記接触段階が、カップリング剤の存在下で行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記カップリング剤が、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾリル−１−オキシ（トリス−ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）およびウロニウムタイプのカップリング剤からなる群より選択されることを特徴とする請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを溶液状態で合成するための新しい方法に係り、全体の合成過程を実質的に容易にし、促進させるペプチド合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド合成の際の根本的な課題は、α−アミノ基が同一アミノ酸のカルボキシ基と相互作用することを遮断または防止することである。このような好ましくない同一アミノ酸での副反応は、ＮＨ２基を非反応性で作りながらも所望の反応を続けて進行させる保護基を一つのアミノ酸に取り付けることで防止される。アミノ基を保護する以外にも、前記保護基は合成の間に形成されたペプチド結合を含む残りの分子を化学的に変化させず容易に除去され得るようなものが好ましい。一般に、前記ペプチド鎖の連結過程は多数の連続的な合成サイクルにて構成されるが、それぞれのサイクルは次のような２つの基本的な化学的な各段階を含む：１）形成されるペプチドのα−アミノ基からの保護基の除去（Ｎα−保護基除去段階）、および、２）前記Ｎα−保護基の除去されたペプチドと次のＮα−保護されたアミノ酸またはペプチド断片とのカップリング。したがって、前記Ｎα−保護基除去段階を容易で速かに行うことが全体のペプチド連結工程の速度および効果のために重要となる。
【０００３】
ペプチド合成に対して報告された殆どのアミノ保護基は次のような３種類の基が中心となってきた：触媒水素化によって脱保護されるカルボベンズオキシ（ＺまたはＣｂｚ）；穏やかな酸加水分解によって脱保護される３次−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃまたはt−Ｂｏｃ）；および２次アミンによって脱保護される９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）。参照文献の例［Kocienski，P.Protecting Groups，Corrected Edition，Thieme：Stuttgart，NY，2000；Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in Organic Synthesis，３rd Edition；John Wiley & Sons，Inc.：New York，NY，1999］。このようなそれぞれの保護基は互いに対立するが、これは前記Ｂｏｃ基は２次アミンおよび水素化反応（hydrogenolysis）に対して安定で、前記Ｆｍｏｃ基は酸加水分解（acidolysis）に対して安定で、前記Ｚ基は２次アミンおよび穏やかな酸加水分解に対して安定であるからである。このような各保護基はペプチド化学においてそれぞれが位置づけられてきた。
【０００４】
短いペプチドから前記Ｚ基を加水素分解することは簡単であるが、その処理作業はただ触媒を取り除いて溶媒を蒸発させることを含む。しかし、ペプチドが長くなるほどその反応は非常に遅くなり得る。その他、硫黄含有のアミノ酸がペプチドに存在すれば触媒水素化が不可能となる。
【０００５】
前記Ｂｏｃ基の分解時には揮発性の副産物のみが生成するので、その処理作業は酸性の脱保護基を取り除くことを含む。次のカップリング段階を成功的に進めるために重要とされる前記酸の完全な除去には、殆どの場合、Ｎα−保護されたペプチドを数回にかけて蒸発させ、気を付けながら洗浄および乾燥させることが要求される。
【０００６】
今日のペプチド合成において幅広く利用される、塩基に不安定な保護基であるＦｍｏｃ基は、下記のような多数の長所を有するものとして確認された：すなわち、かかるＦｍｏｃ基は、酸安全性が優秀で、塩基によって促進されるβ−除去（base-promoted β-elimination）を通じて様々なアミンによって非加水分解的な形態で容易に脱保護され、かかる基の存在の際に他の標準ペプチド保護基（すなわち、Ｂｏｃ、ベンジル）が容易に除去されることができ、脱保護の際に発生するアミンが遊離塩基である（Atherton，Ｅ.：Sheppard，R.C.，in The
Peptides；Udenfriend，S.；Meienhofer，J.，Eds.；Academic Press：New York，NY，1987；Vol.9，p.1）。しかし、前記Ｆｍｏｃ方法が自動化固相ペプチド合成において幅広く適用されてきたが、溶相ペプチド合成でのその使用を妨げるいくつかの短所がある。第一に、Ｆｍｏｃ基で保護されたアミノ酸（およびペプチド）はカップリング段階において一般的に利用される弱塩基性のＤＭＦ溶液および中性のＤＭＦ溶液のいずれにおいても安全性が不十分である（Atherton，E.；Bury，C.；Sheppard，R.C.；Williams，B.J.，Tetrahedron Lett.1979，3041；Bodanszky，M.；Deshmane，S.S.；Martinez，J.J.Org.Chem.1979，44，1622）。第２に、おそらく最も不利なものとして、Ｆｍｏｃ分解アルケン生成物であるジベンゾフルベン（dibenzofulvene）が過量の脱保護剤である２次脂肪族アミンと比較的遅いが可逆的に反応する。したがって、ジベンゾフルベンをアミンで効率的に捕獲（trapping）した後、反応混合物から取り除くことが難しくなり、結局、標的ペプチド生成物が難溶性ジベンゾフルベン重合体によって汚染される。
【０００７】
ＦｍｏｃＮα−保護の利点を有しながらも欠点のない溶液状ペプチドの合成のための効率的で柔軟な方法が必要であることが明らかである。
【０００８】
以前、本発明の発明者らのうちの一部は、２−アリールスルホニルエタノールから誘導されたウレタンアミノ保護基が、Ｆｍｏｃ基に対して説明したことと非常に類似した機序である塩基−促進β脱離（base-promoted β-elimination）を通じて非加水分解的な条件下でアミンによって脱保護され得ることを確認した（Samukov，V.V.；Sabirov，A.N.；Troshkov，M.L.Zh.Obshchei Khim.1988，58，1432）。しかし驚くことに、Ｆｍｏｃ基とは反対に、過量の２次脂肪族アミンが脱保護剤として利用される場合、ウレタン分解生成物であるアリールビニールスルホンが非常に速くて非可逆的に捕獲されるという事実を確認した（Samukov，V.V.；Sabirov，A.N.；Pozdnyakov，P.I.，Tetrahedron Left.1994，35，7821；Sabirov，A.N.；Kim，Y.-D.；Kim,H.-J.；Samukov，V.V.Protein
Peptide Left.1997，4，307）。このような場合、捕獲生成物はビニールスルホンアミン添加生成物（すなわち、３次アミン）を表すので、前記過量の脱保護剤および溶媒を取り除けば、Ｎα−保護基の除去されたペプチドと前記３次アミンとの等モル混合物が得られる。したがって、既に存在するモル当量の３次アミンが媒質の塩基性を維持してアシル化反応を促進するための目的によく利用され得るようにするために、３次アミンが前記カップリング混合物に常に添加されるので、カップリング段階を始める前に前記混合物を取り除く必要がないものとして推定されてきた。
【０００９】
したがって、本発明は、前述した発見を利用して全体の合成過程を実質的に容易にし、促進させるものであって、ペプチドを溶液状態で合成するための新しい方法に関する。
【発明の開示】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、
ａ）化学式Ｒ１−ＳＯ２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−（式中、Ｒ１はアリールである。）のウレタン基で保護されたα−アミン作用基を有するペプチドまたはアミノ酸誘導体を有機溶媒の中で過量の脂肪族２次アミンで処理し、前記アミノ酸またはペプチド誘導体の遊離α−アミン作用基を放出させ、前記２次アミンと化学式Ｒ１−ＳＯ２−ＣＨ２＝ＣＨ２の遊離したビニール化合物との間に３次アミン添加生成物を形成し；
ｂ）前記溶媒と過量の２次アミンとを取り除き；
ｃ）前記Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体と、前記Ｎα−保護基または他のウレタン保護基で保護されて次に連結されるペプチドまたはアミノ酸誘導体とを含む前記３次アミン添加生成物で形成した混合物を、Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体の遊離α−アミン作用基と、次のＮα−保護されたペプチドまたはアミノ酸誘導体のα−カルボキシ作用基との間にペプチド結合を形成する条件下で反応させ；
ｄ）前記新たに形成されるペプチドを前記反応混合物から取り除き；
ｅ）所望のポリペプチドが得られるまで前記各過程を繰り返すことを含むペプチド合成方法を提供することにある。
【００１１】
前記ウレタン構造において、Ｒ１基は置換または非置換アリールであっても良いが、塩基促進β脱離によって適当な高速度のウレタン分解を提供するためには、強い電子求引性置換基（electron-withdrawing substituent）を有するアリールを利用することが好ましい。このような置換アリール基のうち最も好ましいものは、４−ニトロフェニルおよび４−スルホニル化フェニル（4-sulfonylated phenyl）である。Ｒ１が４−ニトロフェニルである場合、前記Ｎα−保護基は公知された２−（４−ニトロフェニル）スルホニルエトキシカルボニル（ＮｓＣ）基である（Samukov，V.V.；Sabirov，A.N.；Pozdnyakov，P.I.Tetrahedron Left.1994，35，7821；米国特許５,６１６,７８８号および６,２６５,５９０号）。前記４−スルホニル化フェニル基の例としては当業界でアミノ保護基として既に知られている２−（４−メチルスルホニルフェニル）スルホニルエトキシカルボニル（Ｍｐｃ）基が挙げられる（Verhart，C.；G.Rec.Trav.Chim.Pays-Bas.1988，107，621）。かかる基の他の好ましい例としては、４−フェニルスルホニルフェニルおよび様々な４−スルホンアミド誘導体、すなわち、４−ジメチルアミドスルホニルフェニル、４−ジエチルアミドスルホニルフェニル、４−モルホリドスルホニルフェニル、および４−ピペリジドスルホニルフェニルが挙げられる。
【００１２】
前記アミンによって促進されるβ脱離機序（Amine-Promoted β-elimination）によるウレタンの分解速度は、同等な条件下でＦｍｏｃ基の分解速度よりは遅いが、かかるアミノ保護基はカップリング段階において一般に利用される弱塩基性または中性反応溶液でＦｍｏｃに比べより一層安定である。
【００１３】
前述したＮα−保護基を迅速に分解し、遊離されたビニールスルホン化合物を効率よく捕獲するために、脱保護および捕獲剤として用いられる２次アミンは、強塩基性と求核性との物性を兼ね備えることが好ましい。また、重要であるのは前記アミンの物性である。前記Ｎα−保護基除去反応の後、反応混合物から過量のアミンを分離することは様々な方法で達成できるが、最も簡単で迅速な方法は、真空蒸溜（蒸発）させることである。よって、前記アミンは揮発性であることが好ましい。すなわち、沸点が低いことが好ましい。このような要件を満足させるアミン類の中で最も好ましいものは、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ−ｎ−プロピルアミン、ピペリジン、ピロリジン、およびモルホリンである。前記効率的な分解および捕獲に必要なアミンの過量は２〜１００モル当量の範囲であるが、それぞれのペプチドの合成において特定的に容易に選択されることができる。
【００１４】
前記Ｎα−保護基除去の段階を行うのに好適な溶媒は、出発物質および反応生成物を溶解させることのできる極性非陽性子性揮発性溶媒であることが好ましいが、かかる溶媒の例としては、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。
【００１５】
このように形成される揮発性分解剤は、Ｎα−保護基の除去を行った後に蒸発させて容易に取り除くことができる。一般に、反応混合物から２次アミンの完全な除去を確保するためには、新しい部分の溶媒を利用した単一の追加的な同時蒸着（co-evaporation）を用いれば十分である。
【００１６】
過量のアミンおよび溶媒を、例えば蒸発によって取り除いた後には、Ｎα−保護基の除去されたアミノ酸またはペプチド誘導体と、ビニールスルホンアミン添加生成物の等モル（molar equivalents）混合物が、いかなる追加的な処理を介さずに、上記のウレタンまたは他のウレタン基によってＮα−保護された後のペプチドまたはアミノ酸誘導体とのカップリング反応のために導入される。前記カップリングのためのＮα−保護された成分のα−カルボキシ基を活性化するには合成において知られている様々な方法によって達成できるが、かかる方法の例としては、４−ニトロフェニル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルまたはその他の公知された類型の活性エステルのような活性エステルを予め形成したり、対称または混合無水物に切り替えたり、アジドに切り替えるなどの方法がある。前記カップリングは、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、ベンゾトリアゾリル−１−オキシ（トリス−ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、その他多数のウロニウム（uronium）タイプのカップリング剤のような公知されたカップリング剤の存在下で行うこともできる。前記カップリング反応の間に反応媒質の塩基性を調節する際、１モル当量の塩基が反応混合物に既に存在するという事実を考慮しなければならない。
【００１７】
前記新たに形成されるペプチドを前記反応混合物から分離するには、抽出、沈澱、洗浄、クロマトグラフィーなどのような当業界で知られている一般的な方法を利用して行うことができる。
【００１８】
前述した全体の過程は所望のポリペプチド鎖が得られるまで繰り返して行うことができる。
【００１９】
所望または必要な場合、合成サイクルの間にアミノ酸またはペプチドの側鎖を適切な保護基で保護した後、保護基を取り除いて最終生成物を得ることができる。使用可能な保護基の性質および類型、これらの適用および除去は、文献に詳しく記載されており、当業者によく知られている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、例示の目的で提供されるが、本発明を制限するものとして解釈されない下記の実施例によって本発明を説明する。下記の説明でのすべてのアミノ酸は別に指摘しない限りＬ−配列を有する。本発明で用いられる作用基、保護基、溶媒および試薬などに対する略語は以下の通りである。
Ｂｏｃ：３次−ブトキシカルボニル
ＢＯＰ：ベンゾトリアゾリル−１−オキシ（トリス−ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＣｂＺ：ベンジルオキシカルボニル
ＤＣＣ：Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Ｄｅｓｐｓｃ：２−（４−ジエチルアミドスルホニル）フェニルスルホニルエトキシカルボニル
ＤＭＦ：Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｄｍｓｐｓｃ：２−（４−ジメチルアミドスルホニル）フェニルスルホニルエトキシカルボニル
ＦＣ：フラッシュクロマトグラフィー
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
Ｍｐｃ：２−（４−メチルスルホニル）フェニルスルホニルエトキシカルボニル
Ｍｓｐｓｃ：２−（４−モルホリドスルホニル）フェニルスルホニルエトキシカルボニル
ＮＭＭ：Ｎ−メチルモルホリン
Ｎｓｃ：２−（４−ニトロフェニルスルホニル）エトキシカルボニル
Ｐｆｐ：ペンタフルオロフェニル
Ｐｉｐｓｐｓｃ：２−（４−ピペリジドスルホニル）フェニルスルホニルエトキシカルボニル
Ｐｓｐｓｃ：２−（４−フェニルスルホニル）フェニルスルホニルエトキシカルボニル
ｔＢｕ：３次−ブチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＥＡ：トリエチルアミン
【００２１】
クロマトグラフィー移動度（Ｒｆ値）は、Alufolien Kiesegel 60 F2５4（Merck，Darmstadt，Germany）薄層クロマトグラフィープレートで現わす；クロロホルム／メタノール／酢酸（９５：５：３（Ａ）および９０：１０：３（Ｂ））および酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水（６０：５：１５：１０（Ｃ））を展開溶媒として使用し、斑点はＵＶ−吸光および／またはニンヒドリン反応によって検出する。分子イオン質量（Ｍ＋Ｈ）＋は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＶＩＳＩＯＮ２０００装置（Thermo Bioanalysis，England）を用いて測定した。
【００２２】
実施例１：２−（４−フェニルスルホニル）フェニルスルホニルエチルクロロホルメート（Ｐｓｐｓｃ−Ｃｌ）
ａ）２−（４−フェニルスルホニル）フェニルスルホニルエタノール
１０ｍｌのＤＭＦに溶解された２−（４−クロロフェニル）スルホニルエタノール（４.４１ｇ）およびチオフェノール（３.１ｇ）の撹拌溶液に、５ｍｌエタノールに溶解された１.４ｇのＫＯＨを添加する。常温で１０時間続けて撹拌した後、前記混合物を７０ｍｌの水で希釈し、１００ｍｌの酢酸エチルで抽出する。その抽出物を５％ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下で蒸発させる。得られた油状残留物を３０ｍｌのアセトンに溶解させる。その溶液に３ｍｌの０.３Ｍモリブデン酸ナトリウム水溶液を添加した後、撹拌しながら８ｍｌの３０％過酸化水素を加える。前記混合物を５０℃で６時間維持し蒸発させた後、１００ｍｌの水で処理する。その沈殿物をろ過し、水で洗浄し、乾燥させた後、酢酸エチル−石油から再結晶化して３.６ｇの表題の生成物を得る。融点：１０７〜１０８℃；Ｒｆ：０.３５（Ａ）。
Ｃ１４Ｈ１４Ｏ５Ｓ２（ＦＷ：３２６.３９）に対する元素分析
計算値：Ｃ；５１.５２％、Ｈ；４.３２％
実測値：Ｃ；５１.１４％、Ｈ；４.４０％
ｂ）Ｐｓｐｓｃ−Ｃｌ
３５ｍｌのＴＨＦと１０ｍｌのホスゲンの３０％トルエン溶液とを−１０℃に冷却した撹拌混合物に、２−（４−フェニルスルホニル）フェニルスルホニルエタノール（３.２ｇ）の微細粉末を添加した後、常温で撹拌する。前記混合物を蒸発乾燥させた後、その固体残留物をトルエンで処理してろ過分離し、トルエンおよび石油で洗浄し、減圧デシケーターで乾燥させる。収得量：３.５５ｇ；融点：１６０〜１６１℃。
Ｃ１５Ｈ１３ＣｌＯ６Ｓ２（ＦＷ：３８８.８５）に対する元素分析
計算値：Ｃ；４６.３３％、Ｈ；３.３７％
実測値：Ｃ；４５.９４％、Ｈ；３.４８％
【００２３】
実施例２：２−（４−ジメチルアミドスルホニル）フェニルスルホニルエチルクロロホルメート（Ｄｍｓｐｓｃ−Ｃｌ）
ａ）Ｎ,Ｎ−ジメチル−４−ブロモベンゼンスルホンアミド
１６ｍｌの３０％ジメチルアミン水溶液および５０ｍｌのジオキサンとが撹拌された冷却（氷湯煎）混合物に、４−ブロモベンゼンスルホニルクロライド（７.７ｇ）を１０分にかけて少しずつ添加する。前記混合物を蒸発させ、十分な量の水で処理し、その沈殿物をろ過して冷水で洗浄し、次の段階で直接使用する。
ｂ）２−（４−ジメチルアミドスルホニル）フェニルスルホニルエタノール
粗製のＮ,Ｎ−ジメチル−４−ブロモベンゼンスルホンアミド、３ｍｌの２−メルカプトエタノールおよび３０ｍｌのＤＭＦの混合物に、１８ｍｌのＫＯＨの２Ｎエタノール溶液を添加し、７０℃で８時間加温する。前記混合物を２００ｍｌの水で希釈し、７０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出する。その抽出物を５％ＮａＨＣＯ３水溶液および水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で蒸発させる。次いで、その油状残留物を５０ｍｌのアセトンに溶解させる。その溶液に４ｍｌの０.３Ｍモリブデン酸ナトリウム水溶液を添加した後、撹拌しながら１０ｍｌの３０％過酸化水素を加える。前記混合物を５０℃で５時間維持して蒸発させた後、１００ｍｌの水で処理する。その沈殿物をろ過して水で洗浄した後、乾燥させて酢酸エチルおよび石油で洗浄する。７.１ｇの表題生成物を得る。融点：１７１〜１７３℃；Ｒｆ：０.２７（Ａ）。
Ｃ１０Ｈ１５ＮＯ５Ｓ２（ＦＷ：２９３.３６）に対する元素分析
計算値：Ｃ；４０.９４％、Ｈ；５.１５％、Ｎ；４.７７％
実測値：Ｃ；４１.３５％、Ｈ；５.０５％、Ｎ；４.４２％
ｃ）Ｄｍｓｐｓｃ−Ｃｌ
実施例１ｂで説明したように、２−（４−ジメチルアミノスルホニル）フェニルスルホニルエタノールから表題生成物を製造する。融点：１３５℃（軟化）〜１４４℃。
Ｃ１１Ｈ１４ＣｌＮＯ６Ｓ２（ＦＷ：３５５.８２）に対する元素分析
計算値：Ｃ；３７.１３％、Ｈ；３.９７％、Ｎ；３.９４％
実測値：Ｃ；３７.４２％、Ｈ；４.０５％、Ｎ；３.７７％
なお、上記方法によって下記の各化合物を製造する：
２−（４−ピペリドスルホニル）フェニルスルホニルエタノール。融点：１８１〜１８２℃；Ｒｆ：０.３４（Ａ）。
Ｃ１３Ｈ１９ＮＯ５Ｓ２に対する元素分析
計算値：Ｃ；４６.８３％、Ｈ；５.７４％、Ｎ；４.２０％
実測値：Ｃ；４７.１８％、Ｈ；５.６５％、Ｎ；４.０５％
２−（４−ピペリジノスルホニル）フェニルスルホニルエタノール（Ｐｉｐｓｐｓｃ−Ｃｌ）。融点：１８５〜１８７℃
Ｃ１４Ｈ１８ＣｌＮＯ６Ｓ２（ＦＷ：３９５.８８）に対する元素分析
計算値：Ｃ；４２.４８％、Ｈ；４.５８％、Ｎ；３.５４％
実測値：Ｃ；４２.３２％、Ｈ；４.６５％、Ｎ；３.４２％
２−（４−モルホリドスルホニル）フェニルスルホニルエタノール。融点：１９０〜１９１℃；Ｒｆ：０.２３（Ａ）
Ｃ１２Ｈ１７ＮＯ６Ｓ２（ＦＷ：３３５.４０）に対する元素分析
計算値：Ｃ；４２.９７％、Ｈ；５.１１％、Ｎ；４.１８％
実測値：Ｃ；４２.６８％、Ｈ；５.２５％、Ｎ；４.０１％
２−（４−モルホリドスルホニル）フェニルスルホニルエチルクロロホルメート（Ｍｓｐｓｃ−Ｃｌ）。融点：１６６〜１６９℃
Ｃ１３Ｈ１６ＣｌＮＯ７Ｓ２（ＦＷ：３９７。８６）に対する元素分析
計算値：Ｃ；３９.２５％、Ｈ；４.０５％、Ｎ；３.５２％
実測値：Ｃ；３９.６１％、Ｈ；４.１５％、Ｎ；３.３９％
２−（４−ジエチルアミドスルホニル）フェニルスルホニルエタノール。融点：１６７〜１６８℃；Ｒｆ：０.３０（Ａ）
Ｃ１２Ｈ１９ＮＯ５Ｓ２（ＦＷ：３２１.４２）に対する元素分析
計算値：Ｃ；４４.８４％、Ｈ；５.９６％、Ｎ；４.３６％
実測値：Ｃ；４４.４８％、Ｈ；６.０８％、Ｎ；４.２１％
２−（４−ジエチルアミドスルホニル）フェニルスルホニルエチルクロロホルメート（Ｄｅｓｐｓｃ−Ｃｌ）。融点：１５５〜１５７℃；
Ｃ１３Ｈ１８ＣｌＮＯ６Ｓ２（ＦＷ：３８３.８７）に対する元素分析
計算値：Ｃ；４０.６８％、Ｈ；４.７３％、Ｎ；３.６５％
実測値：Ｃ；４０.２１％、Ｈ；４.８５％、Ｎ；３.４９％
【００２４】
実施例３：Ｎα−保護されたアミノ酸
１０ｍｌの無水クロロホルムに溶解されたアミノ酸（３.６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、クロロメチルシラン（８ｍｍｏｌ）を添加した後、撹拌・冷却しながら８ｍｍｏｌのＴＥＡを加える。４０℃で１時間撹拌した後、得られる透明な溶液にクロロホルメート（３ｍｍｏｌ，実施例１および２）を添加した後、常温で３時間続けて撹拌する。次いで、前記混合物を蒸発させ、その残留物を冷たい０.５Ｎ ＨＣｌ（２０ｍｌ）水溶液と酢酸エチル（３０ｍｌ）との間に分配する。得られる有機相を０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液および水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、減圧下で蒸発させる。その残留物を適切な溶媒で再結晶化するか、あるいはシリカゲルカラム上で分離した。このような方法によって製造されたＮα−アミノ酸類を下記表１に表す。
Ｎｓｃ−およびＭｐｃ−アミノ酸類を発表された過程によって製造する。
【００２５】
【表１】
2006511459.tif 000002
【００２６】
実施例４：Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（ロイシン−エンケファリンの合成）
ａ）Ｍｓｐｓｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
ロイシン３次−ブチルエステルヒドロクロライド（０.６ｍｍｏｌ）、Ｍｓｐｓｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（０.５ｍｍｏｌ，表１の番号４）とＨＯＢｔ（０.７４ｍｍｏｌ）とを２ｍｌのＤＭＦに溶解させる。この溶液に、ＮＭＭ（２ｍｍｏｌ）とＢＯＰ（０.６ｍｍｏｌ）とを加え、その混合物を常温で６０分間維持する。次いで、前記混合物を２５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配した後、得られる有機相を分離して水で洗浄し、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄した後、更に水で洗浄して蒸発乾燥させる。その残留物をエーテルで処理して収率８３％の表題のジペプチドを得る。Ｒｆ：０.５０（Ａ）。
ｂ）Ｐｉｐｓｐｓｃ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
ジペプチド（実施例４ａ）をＤＭＦ−ピペリジンの混合物（１：４ｖ／ｖ；３ｍｌ）に溶解させ、１０分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を３ｍｌのＤＭＦと共同蒸発させ、ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｐｉｐｓｐｓｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０.５ｍｍｏｌ，表１の番号１２）、ＨＯＢｔ（０.７４ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（０.６ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で１.５時間維持する。次いで、前記混合物を２５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離した後、水で洗浄し、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄した後、更に水で洗浄し、蒸発乾燥させる。その残留物をエーテルで処理して収率８６％の表題のトリペプチドを得る。Ｒｆ：０.３２（Ａ）。
ｃ）Ｄｍｓｐｓｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
実施例４ｂのトリペプチドをＤＭＦ−ピペリジンの混合物（１：４ｖ／ｖ；３ｍｌ）に溶解させ、１５分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を３ｍｌのＤＭＦと共同蒸発させ、ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｄｍｓｐｓｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０.４５ｍｍｏｌ，表１の番号１１）、ＨＯＢｔ（０.６ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（０.８ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（０.５ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で１.５時間維持する。次いで、前記混合物を３５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離した後、水で洗浄し、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄した後、更に水で洗浄し、蒸発乾燥させる。その残留物をエーテル−石油で処理して収率９３％の表題のテトラペプチドを得る。Ｒｆ：０.５５（Ｂ）。
ｄ）Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
実施例４ｃのテトラペプチドをＤＭＦ−ピペリジンの混合物（１：４ｖ／ｖ；３ｍｌ）に溶解させ、１５分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を３ｍｌのＤＭＦと共同蒸発させ、ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｏｃ）−ＯＰｆｐ（０.４ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で３０分間維持する。次いで、前記混合物を３５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離した後、水で洗浄し、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄した後、更に水で洗浄し、蒸発乾燥させる。その残留物を石油エーテルで処理して収率９０％の表題のペンタペプチドを得る。Ｒｆ：０.７５（Ｂ）。
ｅ）Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
実施例４ｄの保護されたペンタペプチドをクロロホルム−ＴＦＡ−水の混合物（５０：５０：２，１０ｍｌ）に溶解させ、常温で１時間維持する。次いで、その溶液を蒸発乾燥させ、その残留物をエーテルで粉碎する。エーテルを用いてエタノールからの再結晶化を行い１６０ｍｇ（出発のＭｓｐｓｃ−Ｐｈｅ−ＯＨに対して計算するとき４８％）のロイシン−エンケファリン−トリフルオロアセテートを得る。Ｒｆ：０.２７（Ｃ）；ｍ／Ｚ：−５５６.５、Ｍ＋Ｈ＋（計算値：５５６.７７）；純度：９４％（ＨＰＬＣによる）。
Ｎα−保護基とＮα−保護基除去剤の様々な組み合わせを用いて前記合成過程を繰り返して行った。このようにして行われる合成過程が下記の表２に要約されている。Ｎ−末端およびＣ−末端アミノ酸、合成規模およびカップリング条件は前述した通りである。アミノ酸残基をＮ−末端およびＣ−末端から計算し、保護基の除去された粗製（crude）のロイシン−エンケファリン−トリフルオロアセテートの全体の収率および純度を上記のように測定する。
【００２７】
【表２】
2006511459.tif 000003
【００２８】
実施例５：Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＴＨＦ−γ２）の合成
ａ）Ｎｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
Ｍｓｐｓｃ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ（０.８７ｍｍｏｌ，実施例４ａ）を、実施例４ｂで説明したように、Ｎα−保護基除去し、４ｍｌのＤＭＦに溶解させる。その溶液に、Ｎｓｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１.５ｍｍｏｌ）、およびＮＭＭ（２ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で１時間維持する。次いで、前記混合物を２５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離して静置し、決定化する。その沈殿物をろ過し、水で洗浄して収率８６％の表題のトリペプチドを得る。Ｒｆ：０.７２（Ｂ）。
ｂ）Ｎｓｃ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
トリペプチド（実施例５ａ）をＤＭＦ−ピペリデンの混合物（１：４ｖ／ｖ；５ｍｌ）に溶解させ、１５分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を３ｍｌのＤＭＦと共同蒸発させ、ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｎｓｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０.８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１.２ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（１.８ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（０.８５ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で１.５時間維持する。次いで、前記混合物を３５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離した後、水で洗浄し、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄した後、更に水で洗浄し、蒸発乾燥させる。その残留物をエーテルで処理して収率９１％の表題のテトラペプチドを得る。Ｒｆ：０.６０（Ｂ）。
ｃ）Ｎｓｃ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
テトラペプチド（実施例５ｂ）をＤＭＦ−ピペリジンの混合物（１：４ｖ／ｖ；５ｍｌ）に溶解させ、１５分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を５ｍｌのＤＭＦと共同蒸発させ、ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｎｓｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０.８ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１.２ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（１.８ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（０.８５ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で２.５時間維持する。次いで、前記混合物を３５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離した後、水で洗浄し、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液で洗浄した後、更に水で洗浄し、蒸発乾燥させる。その残留物を酢酸エチル−エーテルで処理し、収率９４％の表題のペンタペプチドを得る。Ｒｆ：０.５０（Ｂ）。
ｄ）Ｍｓｐｓｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ
５ｍｌのＴＨＦに溶解されたＭｓｐｓｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（１ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェニル（１.２ｍｍｏｌ）の冷却溶液に、ＤＣＣ（１ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で２時間撹拌する。その沈殿物をろ過し、そのろ液を蒸発させた後、４ｍｌのＤＭＦに溶解された１.１ｍｍｏｌのＨ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨと合わせる。その混合物を透明な溶液が形成されるまで１２時間撹拌した後、３０ｍｌの酢酸エチルと３０ｍｌの冷たい０.２５Ｎ ＨＣｌ水溶液との間に分配する。得られる有機相を分離した後、冷たい０.２５Ｎ ＨＣｌ水溶液および水で洗浄し、蒸発乾燥させる。その残留物をエーテルで処理し、収率８８％の所望のジペプチドを得る。Ｒｆ：０.５０（Ａ）。
ｅ）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ
ジペプチド（実施例５ｄ）をＤＭＦ−ピペリジンの混合物（１：４ｖ／ｖ；５ｍｌ）に溶解させ、１５分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を５ｍｌのＤＭＦと２回共同蒸発させ、ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ４−ニトロフェニルエステル（１.１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（０.２ｍｍｏｌ）を加える。その混合物を常温で３時間維持する。次いで、前記混合物を３５ｍｌの酢酸エチルと３０ｍｌの冷たい０.２５Ｎ ＨＣｌ水溶液との間に分配する。得られる有機相を分離した後、冷たい０.２５Ｎ ＨＣｌ水溶液および水で洗浄し、蒸発させてオイルを得る。その残留物を石油（２×１０ｍｌ）で粉碎して洗浄した後、真空乾燥させて収率７４％の所望のトリペプチドを固体発泡体の形態で得る。Ｒｆ：０.４０（Ａ）。
ｆ）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ＯｔＢｕ
実施例５ｃのペンタペプチド（０.３８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ−ピペリジンの混合物（１：４ｖ／ｖ；３ｍｌ）に溶解させ、１５分後１ｍｍＨｇ下で蒸発乾燥させる。その残留物を５ｍｌのＤＭＦと共同蒸発させ、ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解させる。その溶液に、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（０.４１ｍｍｏｌ，実施例５ｅ）、ＨＯＢｔ（１ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（１ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（０.５５ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を常温で４時間維持する。次いで、前記混合物を３５ｍｌの酢酸エチルと２０ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３水溶液との間に分配し、得られる有機相を分離した後、５％ＮａＨＣＯ３水溶液、０.５Ｎ ＨＣｌ水溶液および水で洗浄した後、蒸発させてオイルを得る。その残留物をエーテル−へキサンで処理し、収率９０％の表題の保護されたオクタペプチドを得る。Ｒｆ：０.４５０（Ａ）。
ｇ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ
前記保護されたオクタペプチド（４４０ｍｇ）を１０ｍｌの冷たいＴＦＡ−水の混合物（９：１，ｖ／ｖ）に溶解させ、常温で４０分間撹拌する。その溶液を蒸発させ、得られる濃い油状残留物を冷たいエーテルで処理する。その沈殿物をろ過し、エーテルで洗浄し、真空乾燥させて３８０ｍｇの粗製のオクタペプチド（純度８７％／ＨＰＬＣによる）を得る。前記ペプチドを４％酢酸水溶液に溶解させた後、酢酸の緩衝された水−エタノール勾配（gradient）を利用してＬｉｃｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ１８上で分取用逆相クロマトグラフィーによって精製する。最終の収率は２８０ｍｇ（９８％）の純粋なオクタペプチドである。ｍ／Ｚ＝９１９.５；Ｍ＋Ｈ＋（計算値：９１９.１３）；［α］Ｄ２０＝−６８.９゜（ｃ１、１％ＣＨ３ＣＯＯＨ水溶液）。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、ペプチドを溶液状態で合成するための新しい方法を提供することで、全体の合成過程を実質的に容易にし、促進させる。
【国際調査報告】
2006511459.tif 000004
2006511459.tif 000005