(57)【要約】本発明は、コリスミ酸合成酵素の構造座標の同定について記載する。分子又は分子複合体の三次元表示を作成するようにコンピュータをプログラムし、ここで、上記分子又は分子複合体は、以下：（ａ）図１のＡｒｇ３９、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ｔｈｒ１３６、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９；若しくは、（ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｓｐ５４、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９：の構造座標によって定義される結合ドメインを含むか、又は、上記分子複合体若しくは結合ドメインは、保存された残基の骨格原子を、上記アミノ酸の構造座標によって記載された相当骨格原子に重ね合わせた際に、二乗平均平方根偏差が２Å未満であるかのいずれかである。
2006510957.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子又は分子複合体の三次元表示を作成するようにプログラムされたコンピュータであって、
前記分子又は分子複合体は、以下：
（ａ）図１のＡｒｇ３９、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ｔｈｒ１３６、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９；若しくは、
（ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｓｐ５４、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９：
の構造座標によって定義される結合ドメインを含むか、又は、
前記分子複合体若しくは結合ドメインは、保存された残基の骨格原子を、前記アミノ酸の構造座標によって記載された相当骨格原子に重ね合わせた際に、二乗平均平方根偏差が２Å未満であるかのいずれかである
ことを特徴とするコンピュータ。
【請求項２】
（ａ）が以下：
（ｉ）図１のＡｒｇ４５、Ｇｌｙ１０９、Ａｌａ１１１、Ｓｅｒ１３１、Ａｌａ１３３、Ｌｙｓ２３８、Ａｓｐ２４０、Ｉｌｅ２５０、Ａｓｎ２５１、Ａｌａ２５２、Ｐｈｅ２５３、Ｐｈｅ２９４、Ｇｌｙ２９６、Ｍｅｔ３１０、Ｉｌｅ３１３、Ｐｒｏ３１４、Ａｌａ３４２、Ａｌａ３４５、Ａｌａ３４６及びＶａｌ３４９：
の構造座標を更に含むか、若しくは；
（ｂ）が以下：
（ｉｉ）図１のＡｒｇ４５、Ｍｅｔ４９、Ａｓｐ８０、Ｓｅｒ１３１及びＴｈｒ１３７：
の構造座標を更に含むか、又は、
前記分子複合体若しくは結合ドメインは、保存された残基の骨格原子を、前記アミノ酸の構造座標によって記載された相当骨格原子に重ね合わせた際に、二乗平均平方根偏差が２Å未満であるか、又は、
分子複合体若しくは結合ドメインが、（ｉ）若しくは（ｉｉ）に明記するアミノ酸についての保守的アミノ酸置換を有するかのいずれかである
ことを特徴とする請求項１に記載のコンピュータ。
【請求項３】
（ａ）が図１のＳｅｒ３３８の構造座標を更に含むか、又は、
（ｂ）が図１のＡｒｇ４８、Ｇｌｕ３３６及びＳｅｒ３３８の構造座標を更に含むかのいずれかである
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のコンピュータ。
【請求項４】
前記分子がコリスミ酸合成酵素である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項５】
前記分子が肺炎レンサ球菌由来のコリスミ酸合成酵素である
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項６】
ある化学物質がコリスミ酸合成酵素と結合する可能性を調べる方法であって、
以下の段階：
ａ）前記化学物質と、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構造座標によって定義されたコリスミ酸合成酵素結合ドメインとの適合操作をコンピュータで行う段階；及び、
ｂ）前記適合操作の結果を分析して結合量を定量する段階：
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記のコンピュータによる操作を請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンピュータによって実施する
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コリスミ酸合成酵素結合ドメインと相互作用する可能性のある阻害剤又は物質を同定する方法であって、
以下の段階：
（ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載の原子座標を使用して、コリスミ酸合成酵素結合ドメインを含む分子の三次元構造を作成する段階；
ｂ）前記三次元構造を使用して前記阻害剤又は物質を設計又は選択する段階；
ｃ）前記阻害剤又は物質を合成する段階；及び、
ｄ）前記阻害剤又は物質を前記コリスミ酸合成酵素結合ドメインと接触させて、前記阻害剤又は物質が前記ドメインと相互作用できるかどうかを調べる段階：
を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項９】
コリスミ酸合成酵素の結合ドメインの結晶であって、
前記結合ドメインは、図１の原子構造座標によって特徴づけられる三次元構造を有する
ことを特徴とする結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染症、真菌感染症及び寄生虫感染症を治療するための、病原体阻害剤の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリスミ酸合成酵素（ＣＳ）は、シキミ酸生合成経路の第七段階及び最終段階を触媒している。ＣＳによる触媒反応の生成物はいくつかの生合成経路の前駆体であり、芳香族アミノ酸やその他の重要な代謝産物の生成を導く。シキミ酸経路は細菌、植物、真菌及びアピコンプレクサ類寄生虫において同定されているが、動物には存在しない。この理由のために、この経路の酵素は、抗感染剤、抗真菌剤及び除草剤を生産するためのターゲットとして公知であり、かつ、認証されており、また、抗寄生虫剤のためのターゲットとできる可能性があると提案されている。ＣＳはシキミ酸経路の分岐点に存在しており、また、その生成物であるコリスミ酸はその後の異なる５つの経路の前駆体であるため、抗感染剤のターゲットとして特に関心が高い。重要なことに、これらの分岐の１つが葉酸経路へとつながっている。葉酸経路の酵素も動物には存在せず、これらのうち数種は、既存の抗感染剤を使用して開発され、非常によく特徴づけられた抗感染ターゲットである。
【０００３】
ＣＳは、１位及び４位のリン酸基をアンチ脱離（ａｎｔｉ−ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）させることによって、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸（ＥＰＳＰ）からコリスミ酸（Ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅ）への反転を触媒する。この反応の立体化学は自然界においては一種類である。この酵素ＣＳは、更に非常に珍しい態様として、活性化する際に還元型フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）に対して絶対的な要求を有していて、この反応は酸化還元反応状態における全面的な変化を含まない。このことから、ＦＭＮが構造的な役割のみを果たしているということが示唆されるが、ＦＭＮが実際に反応機構に関与しているという証拠がある（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】Ｒａｍｊｅｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，Ｖｏｌ  １１３，ｐ８５６６−８５６７
【非特許文献２】Ｍａｃｈｅｒｏｕｘら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，Ｖｏｌ  ２７１，ｐ２５８５０−２５８５８
【非特許文献３】Ｍａｃｈｅｒｏｕｘら，Ｐｌａｎｔａ，１９９９，Ｖｏｌ  ２０７，ｐ３２５−３３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の要約
本発明は、コリスミ酸合成酵素の構造座標の同定、特にコリスミ酸合成酵素における２つの結合ドメインの構造座標の同定に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記２つの結合ドメインのうちの一方又は両方と相互作用するであろう物質を、構造座標に基づいて作製できる可能性がある。
【０００６】
本発明の第一の態様によれば、
分子又は分子複合体の三次元表示を作成するようにコンピュータをプログラムすることであって、
上記分子又は分子複合体は、以下：
（ａ）図１のＡｒｇ３９、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ｔｈｒ１３６、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９；若しくは、
（ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｓｐ５４、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９：
の構造座標によって定義される結合ドメインを含むか、又は、
上記分子複合体若しくは結合ドメインは、保存された残基の骨格原子を、上記アミノ酸の構造座標によって記載された相当骨格原子に重ね合わせた際に、二乗平均平方根偏差が２Å未満であるかのいずれかである。
【０００７】
本発明の第二の態様によれば、
ある化学物質がコリスミ酸合成酵素と結合する可能性を調べる方法は、以下の段階：
ａ）上記化学物質と、
（ａ）図１のＡｒｇ３９、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ｔｈｒ１３６、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９；若しくは、
（ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｓｐ５４、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９
のいずれか又は両方の構造座標によって定義されたコリスミ酸合成酵素結合ドメインとの適合操作をコンピュータで行う段階；及び、
ｂ）上記適合操作の結果を分析して結合量を定量する段階：
を含む。
【０００８】
本発明の第三の態様によれば、
コリスミ酸合成酵素結合ドメインを含む分子と結合する可能性のある阻害剤／物質を同定する方法は、以下の段階：
（ａ）
（ａ）図１のＡｒｇ３９、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ｔｈｒ１３６、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９；若しくは、
（ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｓｐ５４、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９
の原子座標を使用して、コリスミ酸合成酵素結合ドメインを含む分子の三次元構造を作成する段階；
ｂ）上記三次元構造を使用して上記阻害剤／物質を設計又は選択する段階；
ｃ）上記阻害剤／物質を合成する段階；及び、
ｄ）上記阻害剤／物質を上記分子と接触させて、上記阻害剤／物質が上記分子と相互作用できるかどうかを調べる段階：
を含む。
【０００９】
本発明の第四の態様によれば、
コリスミ酸合成酵素結合ドメインを含むコリスミ酸合成酵素分子の結晶であって、
上記結合ドメインが図１の原子構造座標によって特徴づけられる三次元構造を有するような結晶がある。
【００１０】
図面の説明
本発明は、付随する図面を参照して記載する。
図１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
図２は、病原菌、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫由来のコリスミ酸合成酵素についての配列アライメントを示す。
図３（ａ）はコリスミ酸合成酵素のトポロジーを示していて、α−ヘリックス構造は黒色の長方形で示し、β−シート構造は灰色の矢印で示している。
図３（ｂ）は、グラム陽性病原体四種（上側）及びグラム陰性病原体四種（下側）の配列アライメントを示す。図３（ａ）と同一の色付き図を使用し、肺炎レンサ球菌ＣＳの配列に基づいて番号を付けて、ＣＳの二次構造因子を付記する。
【００１１】
本発明の詳細な説明
本発明は、図１中に、コリスミ酸合成酵素の２つの結合ドメインの原子座標データを記載する。第一の結合ドメインは、ＦＭＮ分子と相互作用することから、ＦＭＮ結合ドメインとして本明細書中に記載する。第二のドメインは、基質であるＥＰＳＰと相互作用することから、ＥＰＳＰ結合ドメインとして本明細書中に記載する。
【００１２】
コリスミ酸合成酵素について作製した構造座標を使用するためには、通常、これらを三次元に変換して表現しなければならない。これは、分子を三次元で図示できる従来のソフトウェアを使用することによって実施できる。適切なソフトウェア・パッケージは以下を含む：Ｒａｓｍｏｌ、Ｃｅｒｉｕｓ、Ｉｎｓｉｇｈｔ、Ｑｕａｎｔａ、Ｓｙｂｙｌ、Ｍｏｌｃａｄ、ＶＭＤ、Ｏ。
【００１３】
コリスミ酸合成酵素の結晶構造を解明する際に、
ａ）図１のＡｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ｇｌｙ１０９、Ｈｉｓ１１０、Ａｌａ１１１、Ｓｅｒ１３１、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ｔｈｒ１３６、Ｉｌｅ２５０、Ａｓｎ２５１、Ａｌａ２５２、Ｐｈｅ２５３、Ｌｙｓ２５４、Ｍｅｔ３１０、Ｌｙｓ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｒｏ３１４、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７、Ｓｅｒ３３８、Ａｓｐ３３９、Ａｌａ３４２、Ａｌａ３４５、Ａｌａ３４６及びＶａｌ３４９
のアミノ酸は、ＦＭＮコファクターを含む原子から５Å以内の距離にあることが分かり、従って、ＦＭＮ結合ドメインの一部を形成していると考えられる。また、残基Ａｓｐ２４０、Ｐｈｅ２９４、Ｇｌｕ２９５、Ｇｌｙ２９６及びＧｌｙ２９７は、隣接するモノマーの一部であり、また、上記と同様にＦＭＮコファクターを含む原子から５Å以内の距離にあるため、上記結合部位の一部を形成している。また、残基Ｌｙｓ２３８は水を媒介としたＦＭＮのリン酸基との相互作用において確認されていて、これもまた、ＦＭＮ結合ドメインの一部を形成している。
【００１４】
ＥＰＳＰ結合ドメインの一部を形成しているアミノ酸残基は、
ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ａｒｇ４８、Ｍｅｔ４９、Ａｓｐ５４、Ａｓｐ８０、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３１、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ｔｈｒ１３７、Ｇｌｕ３３６、Ａｒｇ３３７、Ｓｅｒ３３８及びＡｓｐ３３９
である。
【００１５】
コリスミ酸合成酵素の他のアイソフォームにおけるアミノ酸の番号付けが、本明細書中で明記したものと異なっている可能性があることは、当業者には容易に明白となるであろう。コリスミ酸合成酵素の他のアイソフォームにおける対応するアミノ酸は、例えば市販のホモロジー設計ソフトウェア・パッケージ又は従来の配列アライメント・パッケージを使用して、上記アミノ酸配列と比較することによって容易に同定できる。
【００１６】
結合ドメインを定義するのに必要となる重要なアミノ酸は以下である。
（ａ）図１のＡｒｇ３９、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ｔｈｒ１３６、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９；又は、
（ｂ）図１のＳｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｓｐ５４、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｒｇ３３７及びＡｓｐ３３９。
【００１７】
好ましい実施形態において、（ａ）についての結合ドメインは、
（ｉ）図１のＡｒｇ４５、Ｇｌｙ１０９、Ａｌａ１１１、Ｓｅｒ１３１、Ａｌａ１３３、Ｌｙｓ２３８、Ａｓｐ２４０、Ｉｌｅ２５０、Ａｓｎ２５１、Ａｌａ２５２、Ｐｈｅ２５３、Ｐｈｅ２９４、Ｇｌｙ２９６、Ｍｅｔ３１０、Ｉｌｅ３１３、Ｐｒｏ３１４、Ａｌａ３４２、Ａｌａ３４５、Ａｌａ３４６及びＶａｌ３４９
のアミノ酸についてのデータによって更に定義され、（ｂ）については、
（ｉｉ）図１のＡｒｇ４５、Ｍｅｔ４９、Ａｓｐ８０、Ｓｅｒ１３１及びＴｈｒ１３７
のアミノ酸についてのデータによって更に定義される。
【００１８】
また、（ｉ）又は（ｉｉ）中で明記するアミノ酸残基の任意のものについて保守的アミノ酸置換をすることによって得られるデータもまた、本発明の範囲内である。
【００１９】
更に好ましい実施形態によれば、（ａ）によって定義された結合ドメインはＳｅｒ３３９についてのデータを更に含む、及び／又は、結合ドメイン（ｂ）はＡｒｇ４８、Ｇｌｕ３３６及びＳｅｒ３３８についてのデータを更に含む。
【００２０】
コリスミ酸合成酵素の各アミノ酸は、図１中で示す一連の構造座標によって定義される。「構造座標」という用語は、結晶状のタンパク質の原子又はタンパク質とリガンドとの複合体の原子によって単色Ｘ線を回析させた際に得られたパターンについての数学的方程式に由来するデカルト座標を示す。回析データを使用して上記結晶の繰り返し単位の電子密度地図を算出する。その後、この電子密度地図を使用して、上記酵素又は酵素複合体の個々の原子の位置を決定する。
【００２１】
座標のデータセットにおける変化から、類似した形又は同一の形を調べることができるということは、当業者には明白であろう。個々の座標がわずかに変化しても、構造全体にはほとんど影響がないであろう。結合ドメインについては、このような変化が、上記ドメインに結合するであろうリガンドの性質及び上記リガンドと上記ドメインとの親和性を著しく変化させるとは考えにくいであろう。
【００２２】
座標の変化は、構造座標の結晶学的置換、構造座標の分割、構造座標のセットへの整数の加減、構造座標の反転、又は、これらの任意の組み合わせを操作することによって生じる可能性がある。また、アミノ酸の変化、付加、置換及び／若しくは欠失による結晶構造の変化、又は、任意の結晶構成成分におけるその他の変化もまた、構造座標の変化に寄与する可能性がある。また、別の結晶形が、分子間のインターフェースにおける変化を呈する可能性がある。上記変化が元の座標と比較して許容できる標準誤差の範囲内である場合、生じる三次元形状は同一であると考えられる。従って、分子又は分子の結合ドメイン部分が本明細書中に記載するコリスミ酸合成酵素結合ドメインと十分に類似しているかどうかを調べるためには、様々なコンピュータ分析が必要である可能性がある。この分析は、ＱＵＡＮＴＡのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｑｕａｎｔａ２０００版（アクセルリス社、カリフォルニア州サンディエゴ）又はＣＣＰ４のｌｓｑｋａｂを含む従来のソフトウェア・パッケージを使用することによって実施できる。
【００２３】
プログラムＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙを使用すれば、既に定義されている構造にターゲット構造を重ね合わせることによって所定の原子当量を用いて異なる構造同志を比較することができ、適合操作を実施できる。本発明を実施するために、比較する２つの構造間で保存されている全ての残基について、相当する原子をタンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃ及びＯ）として定義する。また、厳密な適合操作を実施する。
【００２４】
本発明を実施するために、保存されている残基の骨格原子を、図１の構造座標によって記載された相当骨格原子に重ね合わせた際に、二乗平均平方根偏差が２Å未満であるような任意の分子又は分子複合体又はこれらの結合ドメインは、同一であると考える。より好ましくは上記二乗平均平方根偏差は１Å未満であり、更に好ましくは０．５Å未満である。
【００２５】
「二乗平均平方根偏差」という用語は、平均値由来の偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。
【００２６】
本発明は、図１中に記載する構造座標で適切にプログラムされている、又は、上記に明記した２つの結合ドメインのいずれか若しくは両方に関係のある、標準的なコンピュータ・ハードウェア及びソフトウェアを使用してもよい。
【００２７】
本発明は、コリスミ酸合成酵素結合ドメインの一方又は両方と結合できる（阻害剤、アゴニスト又はアンタゴニストを含む）化学物質を同定、選択又は設計するために分子設計技術を使用できる。本発明は、病原体による感染を治療するために使用できる阻害性化合物の同定において特に有用である。
【００２８】
特定の酵素と相互作用する化合物をコンピュータを使用して設計することは、現在十分に確立されている。
【００２９】
阻害剤として可能性のある物質は、様々な化学物質をスクリーニングして上記結合ドメインの１つ以上に結合できる物質を選択するという一連の段階によって評価することができる。化学物質を選択するこの過程で使用するコンピュータプログラムは以下：
１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，“Ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐｐ．  ８４９−８５７（１９８５））；ＧＲＩＤはオックスフォード大学（英国オックスフォード）から入手できる；
２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｐｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，ｐｐ．２９−３４（１９９１））；ＭＣＳＳはアクセルリス社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手できる；
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ”，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，ｐｐ．１９５−２０（１９９０））；ＡＵＴＯＤＯＣＫはスクリップス研究所（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）から入手できる；
４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら，“Ａ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，ｐｐ．２６９−２８８（１９８２））；ＤＯＣＫはカリフォルニア大学サンフランシスコ校（カリフォルニア州）から入手できる；
５．Ｇｌｉｄｅ−Ｈａｌｇｒｅｎ，Ａｂｓｔｒ．ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，Ｖ２２０，８３−ＰＨＹＳ  ｐａｒｔ２；
６．Ｃｅｒｉｕｓ−Ｄｉｌｌｅｒ＆Ｋ．Ｍ．Ｍｅｒｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００１，Ｖｏｌ  ４３，ｐ１１３−１２４、及び、Ｊａｉｎ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，１９９６，Ｖｏｌ  １０，ｐ４２７−４４０；
７．ＦｌｅｘＸ−Ｒａｒｅｙら，“Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９９９，１５：２４３−２５０；Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（ミズーリ州セントルイス）によって入手できる；
８．ＧＯＬＤ−Ｎｉｓｓｉｎｋら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００２；４９：４５７−４７１；ＣＣＤＣ（英国ケンブリッジ）から入手できる：
を含む。
【００３０】
適切な化学物質の同定においては、効率良く実施するために単一の化合物を集めて試験することができる。
【００３１】
上記結合ドメインの１つ以上と結合する化合物を同定する別の方法は、Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ法、例えば：
１．ＬＵＤＩ（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ，“Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＬＵＤＩ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６．ｐｐ．６１−７８（１９９２））；ＬＵＤＩはアクセルリス社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手できる；
２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，ｐ．８９８５（１９９１））；ＬＥＧＥＮＤは（Ｔｒｉｐｏｓ）サンディエゴ（カリフォルニア州）から入手できる；
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（ミズーリ州セントルイス）から入手できる）；
４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら，“ＳＰＲＯＵＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）”，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，７，ｐｐ．１２７−１５３（１９９３））；ＳＰＲＯＵＴはリーズ大学（英国）から入手できる；
５．Ｒａｃｈｅｌ−Ｃ．Ｈｏ；リード化合物を最適化するための高性能ツール；Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（ミズーリ州セントルイス）から入手できる；
６．ＳＫＥＬＧＥＮ−Ｍ．Ｓｔａｈｌら；自動化されたｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｓｉｇｎの実使用についての確認調査；Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ  Ｄｅｓ．２００２；１６：４５９−７８；Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（英国ケンブリッジ）から入手できる：
を使用する方法である。
【００３２】
また、その他の分子設計方法を本発明に従って使用してもよい［例えば以下を参照する：Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，ｐｐ．８８３−８９４（１９９０）；Ｍ．Ａ．Ｎａｖｉａ及びＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，ｐｐ．２０２−２１０（１９９２）；Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓら，“Ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，ｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５，Ｋ．Ｂ．Ｌｉｐｋｏｗｉｔｚ及びＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ，編，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３３７−３８０（１９９４）；Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，“Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，ｐｐ．７７７−７８１（１９９４）］。
【００３３】
その後、コンピュータを使用して設計した化合物を合成し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて試験して、その活性を測定することができる。適切なアッセイは、コリスミ酸合成酵素に対して化合物をスクリーニングするための従来のアッセイを基にして、当業者には明白であろう。例えば、適切な酵素的アッセイは、Ｗｅｂｓｔｅｒら（英国特許出願０１３０５２９．１）が明らかにしたものでもよい。
【００３４】
本発明は、肺炎レンサ球菌由来のコリスミ酸合成酵素の結晶構造に基づくものである。しかしながら、上記以外の微生物中におけるアイソフォームを、例中に示すように、同じ方法を使用して調製してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下の例によって本発明を説明する。
【００３６】
例：肺炎レンサ球菌由来の野生株及びＳｅＭｅｔＣＳの生産及び精製
ＳｐＣＳ遺伝子を、他の公知のＣＳ遺伝子及びタンパク質とのホモロジーに基づいて、公のデータベースに寄託されている肺炎レンサ球菌の未注釈のゲノム配列から同定した。上記遺伝子は、まず、ポリメラーゼ連鎖反応を使用し、かつ、増幅したＳｐＣＳ遺伝子に対応するＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＴ２２ｂ中にクローニングしたものを使用して、肺炎レンサ球菌のゲノムの相当する領域を増幅させることによってクローニングした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株中において公知の方法によりタンパク質を過剰発現させた。ＳｐＣＳタンパク質は、可溶性の活性型酵素として発現していることが分かった。
【００３７】
Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈらが発表したプロトコール（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６；１４２（１０）：２９４３−２９５０）を改変したプロトコールを使用して、ＳｐＣＳタンパク質を精製した。まず、細胞をバッファー（バッファーＡ：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、グリセリン１０％）中で超音波をかけて破砕し、破砕物を遠心分離によってペレット状にした。次に、陰イオン交換クロマトグラフィーのカラム（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社より購入）上に上清を直接のせ、１５０〜３００ｍＭのＫＣｌ勾配をつけたバッファーＡで結合しているタンパク質を溶出させた。分画を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び酵素的アッセイによってＳｐＣＳを含む分画を同定した。次に、ＳｐＣＳを含む分画を集め、ＫＣｌを３００ｍＭ添加したバッファーＡであらかじめ平衡にしたＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ樹脂（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）の上に直接のせた。ＫＣｌを６００ｍＭ添加したバッファーＡで結合しているタンパク質を溶出させた。ＳｐＣＳ活性をバッファーＢ（２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、０．５ｍＭのＤＴＴ、グリセリン１０％）に対して広範囲で透析した。製造メーカーの使用説明書に従って、リン酸セルロースＰ１１樹脂（Ｗｈａｔｍａｎ社）を使用直前に新しく調製し、バッファーＢであらかじめ平衡にした。この樹脂の上にＳｐＣＳタンパク質をのせ、２５〜５００ｍＭのＫＰＯ４勾配をつけて結合しているタンパク質を溶出させた（ｐＨ７．０）。ＳｐＣＳ分画を集めて濃縮し、最終的に、グリセリン５０％を添加したバッファーＡ中へ透析して、−２０℃で長期間保持できるようにした。
【００３８】
＜肺炎レンサ球菌由来のＣＳの結晶化＞
異なる二種の結晶化条件下で結晶構造を調製したところ、合計四種の結晶形が得られた。
【００３９】
（ｉ）肺炎レンサ球菌由来のＣＳを、ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法によって結晶化させた。２μＬのＣＳ複合体溶液（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＦＭＮ及び１ｍＭのＥＰＳＰの中に１０ｍｇ／ｍｌ）のドロップを、等容量の貯蔵バッファー（９％のＰＥＧ８０００（ｗ／ｖ）、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０％のエチレングリコール）と混合した。その後、ＮＣＯの２５０ｍＭ溶液を０．２μＬ添加し、２３℃で一定にしてドロップをインキュベートした。単斜晶系の結晶（空間群Ｐ２１）（ａ＝８１．０５９、ｂ＝１２４．５８２、ｃ＝８５．１６３、β＝１１５．１５度）が一週間以内に成長した。同一の状態の結晶が野生株とＳｅＭｅｔ試料とから得られた。また、上記の条件下で、斜方晶系の結晶（空間群Ｐ２１２１２１）（ａ＝８５．６２Å、ｂ＝１２５．２９Å、ｃ＝１４８．１５Å）も得られ、両結晶型が同一のドロップから得られた。
【００４０】
（ｉｉ）肺炎レンサ球菌由来のＣＳを、ｈａｎｇｉｎｇ−ｄｒｏｐ蒸気拡散法によって結晶化させた。２μＬのＣＳ複合体溶液（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＦＭＮ及び１ｍＭのＥＰＳＰの中に１０ｍｇ／ｍｌ）のドロップを、等容量の貯蔵バッファー（３６％のＰＥＧ４００（ｖ／ｖ）、１００ｍＭのＮａ／ＫＰＯ４（ｐＨ６．２）、２００ｍＭのＮａＣｌ）と混合した。２３℃で一定にしてドロップをインキュベートした。斜方晶系の結晶（空間群Ｐ２１２１２）（ａ＝９２．９２Å、ｂ＝１２２．３２Å、ｃ＝７２．７２Å）が一週間以内に成長した。また、上記の条件下で、単斜晶系の結晶（空間群Ｐ２１）（ａ＝８３．８１Å、ｂ＝９６．０２Å、ｃ＝１３１．９６Å及びβ＝１０８．１１度）も得られ、両結晶型が同一のドロップから得られた。
【００４１】
＜構造の解析及び精密化＞
ＳｅＭｅｔＣＳの構造を解明するために使用した全データセットをＭａｒ電荷結合検知器（Ｍａｒ  ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用してＥＳＲＦ（グルノーブル、フランス）に集め、プログラムＨＫＬ及びＣＣＰ４を使用して処理して変換した。三波長のＭＡＤ（多波長異常散乱）データセットを２．７Åで収集し、高分解能データセットを１．９Åで収集した。両方の場合において、結晶は単斜晶系であり、上述の条件（ｉ）から成長させた。セレン原子サイト４８個のうち３０個をＳｈａｋｅ’ｎ  Ｂａｋｅ（ＳｎＢ）を使用して同定し、プログラムＣＣＰ４を使用して残りのセレン原子サイトの位置を見つけ、これらの原子パラメータを精密化してＭＡＤ位相を作成した。初期地図は、上記結晶中の非結晶学的対称（ＮＣＳ）を描写するマトリックスを決定するのに十分な質を有するものであった。プログラムＤＭを使用して溶媒平滑化、位相拡張及び４回ＮＣＳの平均化（ｆｏｕｒ−ｆｏｌｄ  ＮＣＳ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ）を組み合わせて実施し、Ｆｉｇｕｒｅ  ｏｆ  Ｍｅｒｉｔ（ＦＯＭ）の平均値が分解能２．０Åで０．７７であるトレース可能な地図を作成した。
【００４２】
モデル構築（Ｑｕａｎｔａ）及び精密化（ＲＥＦＭＡＣ）のサイクルを繰り返し実施することによって、タンパク質モデルを構築した。最初はＮＣＳ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔを適用したが、非結晶学的対称の関係にある分子（ＮＣＳ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の間に差異があることが明白になったために緩和した。フリーＲ値によって精密化の進行を監視した。最終モデルは、４つのモノマー各々の３８８残基全てを含む。タンパク質の原子全てについて、電子密度が良好に定義される。４つの活性部位各々はＦＭＮ及びＥＰＳＰを含む。また、その他の２つのＦＭＮ分子も、上記タンパク質の表面に結合していることが明らかになった。また、上記最終モデルは、エチレングリコール（ＥＴＧ）分子７個、ヘキサアミンコバルト（ＩＩＩ）クロリド分子９個、ナトリウムイオン４個及び水分子１９２５つを更に含む。精密化モデルのＲ因子は１５．６９％（Ｒｆｒｅｅ＝２２．２４％）であり、ＰＲＯＣＨＥＣＫを使用してモデルの外面的形態を確認した。表１中に、本明細書中に記載するＣＳの構造を解明するために使用した結晶学的データセットを示す。
【００４３】
【表１】
2006510957.tif 000003
【００４４】
ＥｆＣＳ及びＨｉＣＳはそれぞれ、エンテロコッカス・フェカーリス及びインフルエンザ菌由来のコリスミ酸合成酵素を示す。
【００４５】
＜四種の異なるＣＳ阻害剤に浸漬したＳｐＣＳ結晶から得られるＳｐＣＳ／阻害剤複合体の構造＞
複合体の構造は、ＣＳ阻害剤である５−カルボキシメトキシ−イソフタル酸（ＣＭＩＰ）、４−カルボキシメチルスルホニル−ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＣＭＳＰＤ）、４−（４−カルバモイル（ｃａｒｂａｍｏｙｌ）−フェノキシ）−３−シアノ−安息香酸（ＣＰＣＤ）及びベンゼンスルホニルアミノ−５−（（Ｅ）−２−カルボキシビニル）安息香酸（ＢＳＡＣＢ）に由来するものであった。
【００４６】
ＳｐＣＳ阻害剤に浸漬した際のデータセットは、ＡＤＳＣ  ｑｕａｎｔｕｍ４電荷結合検知器を使用してＤａｒｅｓｂｕｒｙ研究所（英国ウォリントン）に集めるか、又は、Ｒｉｇａｋｕ／ＭＳＣ  ＲａｘｉｓＩＶ＋＋イメージングプレートを使用して組織内に集め、プログラムＨＫＬ及びＣＣＰ４を使用して処理して変換した。ＡｍｏＲｅを使用して分子置換法によりタンパク質の構造が解析され、また、初期の電子密度地図から、各場合において上記阻害剤がＥＰＳＰサイトに存在していることが明らかに分かった。阻害剤の表現はＣｅｒｉｕｓ２を使用して構築し、電子密度に適応させた。タンパク質及び阻害剤の両方についてモデル構築（Ｑｕａｎｔａ）及び精密化（ＲＥＦＭＡＣ）のサイクルを繰り返し行い、上記最終モデルを得た。４７〜５１の残基は電子密度によってあまり明らかになっていないため、各複合体のタンパク質モデルから省略した。従って、各阻害剤について、最終構造は、非対称単位中のモノマー４個、ＦＭＮ分子４個及び阻害剤分子４個のそれぞれについて残基３８８個のうち３８３個を含む。表２は、ＣＳ複合体それぞれの精密化の統計値を示す。
【００４７】
【表２】
2006510957.tif 000004
【００４８】
＜コリスミ酸合成酵素−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の三次元構造＞
ＳｐＣＳの構造は、モノマーが四量体として配置されたものである。各四量体においては密接に結合した二量体が２つあるが、これらは全体で四量体として集合する程十分に強くまとまってはいない。ＳｐＣＳのモノマーの構造を結合タンパク質（ＦＭＮ結合タンパク質及びＦＡＤ結合タンパク質）及び非結合タンパク質の三次元構造と比較したところ、構造の著しいホモロジーは観察されなかった。従って、ＳｐＣＳの全般的な折り畳みは全ての公知の構造に照らして特有であり、また、ＣＳの三次元座標を配列のみから正確にモデル構築することは不可能であったであろう。
【００４９】
ＳｐＣＳモノマーは、様々なループ及び二次構造の不連続的な伸張によって囲まれた大きなコアドメイン１つからなる。このドメインは、長いα−ヘリックス構造４つが内側で層になっていて、その両側にβ−シート構造４本が位置している。β−α−βの二次構造の配置は非常に珍しく、一般的に使用されているタンパク質立体配座の階層分類であるＳＣＯＰデータベース（Ｍｕｒｚｉｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５；２４７：５３６−５４０）中にもほんのわずかしか記載されていない。
【００５０】
１）二次構造の決定
β−シート構造１は上記タンパク質のＮ末端を含み、逆平行に並んだβ−ストランド構造Ｂ１、Ｂ２、Ｂ７及びＢ４からなる（二次構造の要素の定義に関しては図３を参照）。中央のヘリックス層は、ｕｐ−ｄｏｗｎ−ｄｏｗｎ−ｕｐに配列されたヘリックス構造Ａ１、Ａ２、Ａ６及びＡ５からなる。第二のβ−シート構造もまた逆平行であって、ストランド構造Ｂ８、Ｂ１０、Ｂ１４及びＢ１１からなる。ＦＭＮ結合部位は、β−シート構造２とヘリックス層の一端との間のインターフェースに存在する。この点で４つのヘリックス構造が分岐して、ＦＭＮイソアロキサジン環系のための結合部位の一部である小さな疎水性ポケットが残る。ＦＭＮ及びＥＰＳＰ結合部位の残りは、上記二次構造を有していないβ−シート構造２及び数個のループによって形成される。活性部位については以下に詳細に記載する。
【００５１】
２）二量体と四量体とのインターフェースの記載
主要なＳｐＣＳ二量体は強く結合しているように見えるにも関わらず、その形は非常に長い。二量体のインターフェースの主要な特徴は、各モノマーに由来するβ−シート構造２が、逆平行β−シート構造８本へと拡張していることである。上記のβ−シート構造２つはストランド構造Ｂ１１で集まって良好な水素結合を４つ形成するが、二量体のインターフェースでは他にも多くの相互作用がある。上記二量体の安定化に深く関与しているその他の二次構造要素はヘリックス構造Ａ５のみであり、これはモノマー中でＢ１１の真下に位置する。このように対称関係にある一対のヘリックス構造はインターフェースにおいて長さ方向に束になっていて、特定の親水性の相互作用は形成していないが、相互作用する場合には相当量の疎水性表面がこの中に埋まる。上記構造のその他の領域のうちのいくつか、特にＢ５とＡ１０の間、及び、Ｂ１１とＢ１４の間の、モノマーから伸びて二量体の相手と共に束になっているループは、二量体化に関与している。強い水素結合はたくさんあるが、二量体のインターフェースに存在する可能性のある塩橋はただ１つだけである。（すなわち、）一方のモノマーのＬｙｓ２３８が、その近辺由来の活性部位ＦＭＮ分子のホスフェート部分と（水を媒介として）相互作用する。
【００５２】
四量体のインターフェースの主要な要素は、各モノマーに由来するβ−シート構造１である。このシート構造は、隣接する二量体の同等の部分とのβ−サンドイッチ型の相互作用に関与している。また、このシート構造の両側にはループがあり、これらのループ、特にストランド構造Ｂ７とヘリックス構造Ａ２との間のループ、並びに、ストランド構造Ｂ３、Ｂ５及びＢ６によって形成された短いβ−シート構造もまた、二量体同志の相互作用に関与している。このインターフェースのほとんどは疎水性であるが、いくつかの著しい水素結合、及び、四量体の完全性にとって明らかに重要な２つの強い塩橋がある。１つのモノマー上で隣接していて非結晶学的対称軸の１つに近いＡｒｇ１３及びＡｓｐ７５は、第二のモノマー上のそれぞれのＮＣＳ関連残基と塩橋を形成している。残基間距離及び相互作用の指向性から、これらは強く結合しているようである。Ａｒｇ６３とＡｓｐ１２３との間、及び、Ａｒｇ１２０とＡｓｐ３７２との間には更なるイオン対の相互作用がある。
【００５３】
３）活性部位の決定
三量体の結晶構造において、上記酵素は二種の異なる状態で存在する。これらの状態を、本明細書中において「ｏｐｅｎ」型及び「ｃｌｏｓｅｄ」型と称する。「ｏｐｅｎ」型において、上記活性部位の一部分は溶媒と接触でき、「ｃｌｏｓｅｄ」型においては、活性部位におけるリガンドは両方とも溶媒と接触できない。このような差異は、単純に、活性部位を囲むループのいくつかの動きによるものである可能性がある。従って、「ｃｌｏｓｅｄ」型はタンパク質の遷移状態の立体配座に類似しており、「ｏｐｅｎ」型は反応サイクルの最初又は終末に近い活性部位の断片であって、基質の進入又は活性部位からの物質の離脱を可能にしていると考えることができる。両方の立体配座が上記タンパク質において得られるため、両者は、可能性のある阻害剤又は物質をクレームの方法で同定するためのターゲットとして有効である。
【００５４】
ＣＳは基質及びコファクターの両方と結合するが、これらの２つのリガンドは互いに強く結合していて、上記酵素は活性部位又はリガンド結合部位を１つ有すると考えることができる。ＦＭＮ分子は上記酵素の内部に深く埋まっており、また、ＥＰＳＰはイソアロキサジン環の露出したままの部分の上端に結合していて、ＦＭＮを完全に埋めている。この理由から、上記２つのリガンドはそれぞれ、もう一方のための結合部位の一部を形成している。
【００５５】
上述したように、β−シート構造２の末端の１つは、平坦で非常に疎水性の高い表面を提供していて、これをＦＭＮイソアロキサジン環が包んでいる。ＦＭＮのリビチル（ｒｉｂｉｔｙｌ）部分は、ＦＭＮ水酸基及びリン酸基との相互作用を供給する３つのループの間に挟まれて十分に埋まっている。上記モノマーにおいてＦＭＮホスフェートは溶媒と接触することができるが、二量体になるとこの基は完全に埋まる。ＦＭＮホスフェートには３つのリジン残基、Ｌｙｓ３１１、Ｌｙｓ２５４（水を媒介として）及びＬｙｓ２３８（水を媒介として）が配位結合していて、Ｇｌｙ２９６及びＡｌａ２５２の主鎖の窒素原子と密接に接している。Ｌｙｓ２３８及びＧｌｙ２９６との相互作用は、これらの残基が主要な二量体中の隣接した分子に属していて、従って二量体の安定化に寄与しているため、特に重要である可能性がある。
【００５６】
ＦＭＮはＣＳ二量体構造中に十分に埋まっていると上述したが、ＦＭＮのホスフェート及びリビチル領域の両方に近接している溶媒分子の数は非常に多い。これらの水分子は独立して良好に配列されていて、そのうちの多くがＦＭＮとＣＳとの間の相互作用を仲介しており、また、ＥＰＳＰに配位結合しているものもわずかにある。ＦＭＮ酸素Ｏ５＊及びＯ４＊はいくつかの溶媒分子に囲まれていて、そのいずれも上記タンパク質と直接には全く相互作用していない。酸素Ｏ３＊もまたＣＳと相互作用していないが、ＦＭＮホスフェートの酸素の１つとの分子内での強い水素結合に関与していて、これは、活性部位中に存在する立体配座中においてＦＭＮを安定化しているようである。酸素Ｏ２＊はＥＰＳＰと直接相互作用している唯一のＦＭＮ原子であり、ＥＰＳＰカルボン酸エステルの酸素の１つとＯ２＊との間に水素結合がある。また、Ｏ２＊も、保存されている残基Ａｓｎ２５１の側鎖の窒素と配位結合している。
【００５７】
上記ＦＭＮ分子の残りとは対照的に、イソアロキサジン環はＣＳと特異的な相互作用はほとんどしていないが、それにも関わらず、疎水性表面の相当な領域を補助的に埋めている。ＦＭＮ結合タンパク質には珍しく、タンパク質とＦＭＮとの間にはπスタッキング相互作用はない；代わりに、イソアロキサジン環との結合表面が小さな疎水性残基Ａｌａ３４２、Ａｌａ３４６、Ａｌａ２５２、Ｉｌｅ３１３及びＭｅｔ３１０によって形成されている。これは、タンパク質が還元状態で適応するのを補助している可能性があり、この状態において、イソアロキサジン系は、中心の２つの窒素原子の周囲をわずかに弓状に曲がっていると提案されている。
【００５８】
イソアロキサジン環のピリミジンジオン部分が行う相互作用は、上記タンパク質が「ｏｐｅｎ」型又は「ｃｌｏｓｅｄ」型のいずれであるかを決定する活性部位のループの立体配座の影響を受ける。触媒作用を有するヒスチジン残基Ｈｉｓ１１０は「ｏｐｅｎ」型においてＦＭＮのＮ１及びＯ２の両方に近接していて、上記結晶構造中においてＯ２と水素結合しているようである。しかしながら、「ｃｌｏｓｅｄ」型においては、上記ヒスチジン側鎖はＦＭＮと相対的に動いており、相互作用はしない。Ｈｉｓ１１０の移動は残基Ｐｒｏ３１４とＬｅｕ３２０との間のループの立体配座の変化と相互に関連しているため、残基Ｔｈｒ３１５は「ｃｌｏｓｅｄ」型においてＦＭＮに非常に近い。「ｏｐｅｎ」型においてＦＭＮのＯ２は３１５のＮから３．４Åの距離であるが、「ｃｌｏｓｅｄ」型において主鎖の窒素はより強い水素結合を形成していて、Ｏ２からの距離はわずか３．１Åである。また、Ｔｈｒ３１５の側鎖の立体配座が変化して、側鎖の水酸基がＦＭＮのＯ２と水素結合することもできるようになっている。
【００５９】
Ｔｈｒ３１５を含むループの立体配座の変化は、残基Ｔｙｒ３３１とＰｒｏ３４０との間のループの立体配座の協調した変化に関与している。「ｏｐｅｎ」型において、このループ由来の残基はタンパク質とＦＭＮとの相互作用に関与しているが、そのいずれも溶媒によって仲介されている。２つの水分子は、ＦＭＮのＮ３及びＯ４と強く水素結合していて、また、残基Ｓｅｒ３３８、Ａｓｐ３３９及びＡｒｇ４５の側鎖とも水素結合している。「ｃｌｏｓｅｄ」型において、３３１〜３４０の間の残基のいくつかの位置が大きく変化していて、上記ループがＦＭＮ分子の近くに移動していて、ＦＭＮのＮ３及びＯ４と結合している２つの水分子を置換している。従って、ＣＳが「ｃｌｏｓｅｄ」型である場合、ＦＭＮのＮ３及びＯ４の両方は上記タンパク質と直接相互作用していて、このことによる結合エネルギーは非常に大きいであろう。Ａｓｐ３３９の主鎖は１．７Åを超えて遠くへ移動していて、ＦＭＮのＯ４から残基３３９の主鎖の窒素までの水素結合を可能にしている。Ｓｅｒ３３８の位置が約３Åシフトしていることがより明白であり、これにより、１つの水分子の位置から０．６Å以内の位置にあるこの残基の側鎖の酸素が「ｏｐｅｎ」型から離れ、ＦＭＮのＮ３と水素結合を形成している。
【００６０】
残ったＦＭＮのヘテロ原子はＮ５であり、これは上記タンパク質と直接的な相互作用は全くしていないが、上記酵素が「ｏｐｅｎ」型及び「ｃｌｏｓｅｄ」型のいずれであっても、水分子と水素結合している。いずれの場合においても、溶媒分子もまたＡｒｇ４５及びＡｓｐ３３９の両方と水素結合している。この相互作用の他には、Ｎ５がＥＰＳＰのＣ２のほぼ真下に位置していて、それに面しているｐｒｏ−Ｒ水素原子を引き抜こうとする状態にある。Ａｓｐ３３９は塩基として作用してＦＭＮのＮ５を脱プロトン化していて、従って、ＥＰＳＰからのＣ６−ｐｒｏ−Ｒプロトンの除去を促進している。ＣＳが「ｏｐｅｎ」型及び「ｃｌｏｓｅｄ」型のいずれであっても、原子Ｎ５とＣ２の間の間隙は３．５Åである。
【００６１】
ＥＰＳＰはＦＭＮとはわずかに１つしか相互作用していないが、ＥＰＳＰと上記酵素との間には多くの相互作用がある。エノール−ピルビン酸部分は特に強く結合していて、保存されている３つのアルギニン残基が閉鎖型の結合部位を形成している。Ａｒｇ３９とは強い塩橋があり、ＮとＯとの間の間隙は２．６Å（ＮＨ１とＯ２０）及び２．９Å（ＮＨ２とＯ１９）である。また、Ｏ２０からＡｒｇ４５のＮＨ２（２．７Å）までの間、及び、Ｏ１９からＡｒｇ１３４のＮＨ１（３．１Å）までの間には更に強い水素結合がある。これらの残基及び隣接するその他の残基はタイトなポケットを形成していて、その中にピルビン酸部分がぴったりと適合している。ＥＰＳＰのＯ１５はＡｒｇ４５のＮＨ２と更に相互作用していて、また、そのビニル基はＡｒｇ１３４及びＡｒｇ４８の脂肪族部分に囲まれている。
【００６２】
ＥＰＳＰの第二のカルボキシル基の相互作用については既に記載した。ＦＭＮのＯ２＊との間に水素結合があり、また、Ｈｉｓ１１０（「ｃｌｏｓｅｄ」型）と又はＨｉｓ１１０にも結合している溶媒分子（「ｏｐｅｎ」型）とも相互作用している。この他にも、上記酵素が「ｏｐｅｎ」型及び「ｃｌｏｓｅｄ」型のいずれの場合でも、ＥＰＳＰのＯ８と保存されているＡｒｇ１０７のＮＨ１との間に水を媒介とした相互作用が１つある。この残基は、Ａｓｐ１１２との相互作用によって適切な場所に保持されていて（これらの残基は両方とも完全に保存されている）、その位置は「ｏｐｅｎ」型及び「ｃｌｏｓｅｄ」型のいずれにおいても同じである。
【００６３】
ＥＰＳＰのＯ２１は結合にほとんど寄与していないようである。そして、Ａｓｐ３３９の側鎖と水を媒介とした相互作用を１つしていて、その位置は隣接する残基の立体配座変化の影響をほとんど受けない。
【００６４】
これと対照的に、ＥＰＳＰのリン酸基の結合は、残基３３１と３４０との間のループの立体配座によって非常に大きな影響を受ける。特にＡｒｇ３３７のグアニジノ基は、「ｃｌｏｓｅｄ」型の立体配座においては、ループの上端に存在していてＥＰＳＰホスフェートと強く相互作用するが、「ｏｐｅｎ」型においては、活性部位から約１０Å離れている。いずれの形態においても、リン酸基はＨｉｓ１０及びＡｒｇ４８の側鎖と配位結合している。「ｏｐｅｎ」型においては、ホスフェートは上記タンパク質と更なる相互作用はせず、多くの溶媒分子に囲まれている。しかし、「ｃｌｏｓｅｄ」型においては、ホスフェートはＡｒｇ３３７の主鎖カルボニル基及びグアニジノ基の両方と直接水素結合を形成していて、後者は強い塩橋である。Ａｒｇ３３７のカルボニル基との相互作用にはホスフェートの酸素原子のプロトンが必要であり、ホスフェートの残りの酸素原子の適切なプロトン付加状態を決定している。ＥＰＳＰのＯ１０は、活性部位の「ｏｐｅｎ」型及び「ｃｌｏｓｅｄ」型のいずれにおいても水分子と強く水素結合している。また、この水は、完全に保存されているセリン残基Ｓｅｒ９及びＳｅｒ１３２の側鎖と配位結合もしている。その位置は、実際に非常に強く結合している（Ｂ因子が低い）ため、触媒機構に関与していることが示唆される。これはＥＰＳＰのＯ１０と直接相互作用してこの原子と唯一の強い水素結合を形成するため、これとＣ１との間の結合が伸びて最終的に切れる際にＯ１０上にかかるであろう部分的な負電荷の安定化に関与しているようである。この水分子は、阻害剤の酸素の１つによって水分子が置換されているＢＳＡＣＢの構造を除いて、上記阻害剤の構造において保存されており、また、温度因子を比較することによって、隣接する溶剤に関して非常によく配列されている。その他にもいくつかの水分子の位置がいずれのＣＳの結晶構造中においても保存されている。そのため、これらの１つをＳｐＣＳ−ＣＭＳＰＤ構造中のカルボン酸エステルの酸素で置換することによって実証されるように、上記水分子の位置により、阻害剤である可能性のある物質に対する多くの相互作用点が定義される。
【００６５】
また、ＥＰＳＰは、（Ａｒｇ１０１の側鎖を含む）多くのその他の主鎖及び側鎖の原子と水を媒介とした水素結合を形成している。この残基の側鎖の立体配座は上記酵素の二種の型の間で大きく異なっているため、この相互作用が可能になる。
【００６６】
４）コリスミ酸合成酵素−ＦＭＮ−ＣＭＩＰ複合体の三次元構造
ＳｐＣＳとＦＭＮとの複合体に結合しているＣＭＩＰの構造を、分解能２．０Åで調べた。ＣＭＩＰ及び三量体構造からの上記タンパク質座標の重なりから、これらの間に著しい差異はほとんどないことが分かった。これらのうちで最も重要なのは、阻害剤が結合した構造におけるＳｐＣ１活性部位の「ｏｐｅｎ」型の欠失であった。その後、このことは、三量体構造の単斜晶系の対称とは対照的に、阻害剤の構造の斜方晶系の対称の結果生じたことが実証された。結晶の接触は単斜晶系の型には存在するが斜方晶系の型には存在せず、三量体構造における活性部位の「ｏｐｅｎ」型の存在に関与している。従って、ＳｐＣ１−ＦＭＮ−ＣＭＩＰ構造中の４つのモノマーのいずれも、活性部位において「ｃｌｏｓｅｄ」型の立体配座を有している。三量体及び阻害剤の構造の両方の「ｃｌｏｓｅｄ」型におけるＣαの位置を比較すると、ＲＭＳＤは１．２Åであり、これらが本質的に同一であることが分かる。いずれの場合においてもタンパク質骨格は同じ経路をたどるが、阻害剤の構造において、ＥＰＳＰリン酸基が欠失しているために側鎖の位置が異なる。リン酸基が存在する場合、これは（上述したように）多くの相互作用をするが、このような相互作用は阻害剤の構造においては不可能である。特に、Ａｒｇ３３７の側鎖は、ＥＰＳＰホスフェートの配位結合に決定的に関与していて、阻害剤の構造において大きく異なる立体配座をとっている。活性部位に著しい影響を及ぼすような差異のあるその他の領域は、残基Ｔｙｒ４３とＧｌｕ５２の間のループであって、これは三量体構造においてらせん型の立体配座を有している。この（Ｇｌｙ４７からＩｌｅ５１までの）ループの中心にある５つの残基は、阻害剤の構造についての電子密度の中に配置できないが、欠失しているものの両側の残基の位置から、このループが三量体構造での位置と同じ領域にないことは明らかである。これもまた、ＥＰＳＰのリン酸基が欠失している結果として生じたものである：「欠失している」ループの上端のＡｒｇ４８は、リン酸基と強く水素結合しているもう１つの残基であり、従って、このループをらせん型立体配座中に結合させるためにはこの相互作用が必要であるようである。このループからは５つの残基が欠失しているが、これらの残基が存在していた可能性のある位置から、この（Ｔｙｒ４３からＧｌｕ５２までの）ループは活性部位から屈曲しており、従って、ＥＰＳＰ部位で、特にＯ２１（水酸基）及びＣ１７（ビニル基）位、及び、ホスフェートのそれにおいて利用可能な空間が大きくなっているということが明らかである。また、その他のいずれのＳｐＣＳ−阻害剤の構造についても、この斜方晶系の結晶の形態において既に調べたところ、活性部位の「ｃｌｏｓｅｄ」型だけが両方の構造中に存在することが分かった。また、ＣＭＩＰの構造について上記で概説した構造上の差異についても、下記のその他の阻害剤の構造の両方について観察された。
【００６７】
ＣＭＩＰは、ＥＰＳＰの２つのカルボキシル基が行う相互作用の各々を模倣している。三量体及びＣＭＩＰの構造に由来するタンパク質座標が重なる場合、両リガンドに由来する２つのカルボキシル基の酸素原子の位置はほぼ正確に重なる。ＥＰＳＰとＣＭＩＰは両方とも、トランス型の立体配座において原子５つからなる鎖で分離された２つのカルボキシル基を有していて、この単純なモチーフは、両分子が結合していることを決定する主要な要因であるようである。しかしながら、違いが１つある。それは、ＥＰＳＰにおいて、５つのリンカー原子のほとんど及びＥＰＳＰ環中のものの全部が飽和していてかつｓｐ３混成であるということである。これとは対照的に、ＣＭＩＰ中のリンカー原子５つのうち３つはフェニル環に由来していて、従って、この場合、リンカーの大多数は不飽和でかつｓｐ２混成である。カルボキシメトキシ鎖はｓｐ３混成している原子を２つ有するが、これらは阻害剤のフェニル環とほぼ同一平面上にある。このため、上記阻害剤は、上記２つの重要なカルボキシル基を適切な位置に配置して、ＥＰＳＰの相互作用に相当する相互作用を形成するための第二の方法を示す。ＥＰＳＰの飽和環系及びその後のＣ５におけるねじれが欠失しているため、上記阻害剤は、５つの原子リンカー中の結合のいくつかがＥＰＳＰ自身の中のものより短いような、ほぼ平面の系で埋め合わせている。これにもかかわらず、ＣＭＩＰ中のカルボキシル基の炭素原子間の距離（７．２Å）は、ＥＰＳＰ中における距離（７．０Å）よりもわずかに長い；このことは、この距離を短くすることにより、上記阻害剤の親和性が改善される可能性があることを示唆する。
【００６８】
２つのカルボキシル基はこのように良好に重なっているが、２つの分子の残りの部分はそうではない。それらの中央の環は、活性部位の全く異なる領域を占めている。特に、ＥＰＳＰ中においてＦＭＮの上に位置していてＨｉｓ１１０と相互作用するカルボキシレートは中央の環に直接付着したカルボキシレートであるが、上記阻害剤の構造において対応する相互作用は、フェニル環に直接付着していないカルボキシレートが行う。従って、上記２つのリガンドの中央の環は全く重なっていない。ＥＰＳＰにおける場合と比較して、上記阻害剤の中央の環はＦＭＮ環の平面から非常に遠い位置にあるため、Ａｌａ１３３及びＡｒｇ１３４の主鎖の原子とファンデルワールス的な接触をする状態になり、かつ、Ａｒｇ１３４の側鎖の脂肪族部分を包む。これとは対照的に、ＥＰＳＰの有する中央の環はねじれていて、いくつかの原子（Ｃ１、Ｃ６及びペンダント型水酸基の酸素Ｏ２１）がＦＭＮ環の平面近くに配置されている。これは、上述するように、これらの原子を上記タンパク質に十分近づけて任意の直接の相互作用をさせるものではないが、ＥＰＳＰを、水分子を介してＯ２１と相互作用しているＡｒｇ４５及びＡｓｐ３３９に間隙を介して近づけている。
【００６９】
ＣＭＩＰは、中央の６員環上にＥＰＳＰ中において見られるものと類似した１，３，５−置換パターンを示すが、残りの置換基（５−カルボン酸）が近くに移動してＥＰＳＰ中において対応する部分（リン酸基）に重なることはない。その代わり、ＣＭＩＰの５−カルボン酸は、Ａｒｇ４８側鎖のグアニジノ基の位置の近くに位置する。既に記載したように、これにより、上記タンパク質のこの領域が三量体の立体配座となることができないが、更には、ＥＰＳＰのリン酸基が行う任意の相互作用を上記阻害剤が行えないという影響も及ぼされる。上記タンパク質は「ｃｌｏｓｅｄ」型であるにもかかわらず、「蓋」上の残基は上記阻害剤の５−カルボン酸から離れすぎていて、かつ、配向がこの５−カルボン酸に対して不適切であるため、全く相互作用できない。従って、上記阻害剤の構造における活性部位のこの領域にはあとわずかな空間があり、この空間は溶媒分子で満たされていて、この分子のいくつかは５−カルボン酸と強く相互作用している。また、両方の結晶構造中において位置が保存されている溶媒分子も多い。特に興味深いものとしては、上述した、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１３２及びＥＰＳＰのＯ１０の間の相互作用を仲介している水分子である。
【００７０】
５）コリスミ酸合成酵素−ＦＭＮ−ＣＭＳＰＤ複合体の三次元構造
ＳｐＣＳとＦＭＮとの複合体に結合しているＣＭＳＰＤの構造を、分解能２．６Åで調べた。ＣＭＳＰＤ由来のタンパク質座標と三量体構造とが重なっていることから、これらの間には著しい差異はほとんどないということが分かった。三量体構造とＣＭＳＰＤ構造との「ｃｌｏｓｅｄ」型のＣαの位置を比較すると、これらが本質的に同一であり、ＲＭＳＤは０．６２Åであることが分かった。ＣＭＩＰ構造についての場合と同様に、Ｇｌｙ４７とＩｌｅ５１との間の残基５つをＣＭＳＰＤ構造についての電子密度の中に配置することはできなかった。周囲の残基の（存在していた可能性のある）位置から、これらの残基を有している（Ｔｙｒ４３からＧｌｕ５２までの）ループは活性部位から屈曲しており、従って、ＥＰＳＰ部位で、特にＯ２１（水酸基）及びＣ１７（ビニル基）位、及び、ホスフェートのそれで利用可能な空間が大きくなっているということが明らかである。
【００７１】
ＣＭＳＰＤは、ＣＭＩＰと類似する方法で、ＥＰＳＰのカルボキシル基が行う相互作用を模倣している。また、ＥＰＳＰ、ＣＭＩＰ及びＣＭＳＰＤ複合体に由来するタンパク質座標が重なる場合、両リガンドに由来するカルボキシル基の酸素原子の位置はほぼ正確に重なる。ＣＭＳＰＤ及びＣＭＩＰは両方とも、トランス型の立体配座において原子５つからなる鎖で分離されている２つのカルボキシル基を有していて、この単純なモチーフは、両分子が結合していることを決定する主要な要因であるようである。ＣＭＩＰの結合型とは対照的に、両リガンドが重なっている場合、ＣＭＳＰＤの中央のフェニル環の位置はＥＰＳＰのそれに近い。ＣＭＳＰＤにおいて、ＦＭＮ  Ｏ２及びＨｉｓ１１０の側鎖と相互作用するのは安息香酸（ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）である。ペンダント型チオ酢酸基は、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５及びＡｒｇ１３４の側鎖と類似した相互作用をしている、ＥＰＳＰ中のエノールピルビン酸塩部分の立体配座を模倣している。ＣＭＩＰとは対照的に、残りのカルボキシル基は、ＥＰＳＰにおいてリン酸基が占める位置の近くに位置する。このことによって、カルボキシル基とＨｉｓ１０の側鎖との間の水素結合の形成が可能であり、かつ、水を媒介としたＡｒｇ１０７との相互作用が可能である。これらの更なる相互作用が形成されるために、ＣＭＩＰとＣＭＳＰの結合型が異なるようである。
【００７２】
６）コリスミ酸合成酵素−ＦＭＮ−ＣＰＣＤ複合体の三次元構造
ＳｐＣＳとＦＭＮとの複合体に結合しているＣＰＣＤの構造を、分解能２．６Åで調べた。ＣＰＣＤ由来のタンパク質座標と三量体構造とが重なっていることにより、これらの間には著しい差異はほとんどないということが分かった。三量体構造とＣＰＣＤ構造との「ｃｌｏｓｅｄ」型のＣαの位置を比較すると、これらが本質的に同一であり、ＲＭＳＤは１．１５Åであることが分かった。ＣＭＩＰ構造についての場合と同様に、Ｇｌｙ４７とＩｌｅ５１との間の残基５つを上記阻害剤の構造についての電子密度の中に配置することはできなかった。このループが移動して活性部位から離れることによって、三量体構造中のＥＰＳＰのリン酸基が占める領域中に更に空間ができ、この空間はＣＰＣＤの結合において使用される。
【００７３】
ＣＰＣＤは、カルボキシル基を１つだけ有するという点でＣＭＩＰ及びＣＭＳＰＤとは異なっている。ＦＭＮのＯ２及びＨｉｓ１１０の側鎖との相互作用を模倣しているのは、この安息香酸である。ＥＰＳＰ及びその他の阻害剤とは対照的に、ＣＰＣＤは、シアノ基によってＡｒｇ３９と相互作用している。シアノ基はこの位置においてカルボキシル基をあまり模倣しておらず、ＥＰＳＰが水素結合を４つ（Ａｒｇ３９との間に２つ、Ａｒｇ４５及びＡｒｇ１３４との間に１つずつ）を形成しているのとは対照的に、Ａｒｇ３９と水素結合を１つだけ形成している。また、ＣＰＣＤも、フェニル環と更に結合して分子を長くしていて、その結果、その他の阻害剤と比較してＣＰＣＤが活性部位から非常に離れた位置まで拡張しているという点で、ＣＭＩＰ及びＣＭＳＰＤと異なっている。ＣＰＣＤのエーテルの酸素は上記タンパク質と直接には相互作用していないが、末端のカルボキシアミドは、完全に保存されているＡｒｇ３３７のＮＥと水素結合を形成していて、かつ、Ａｒｇ４５及びＧｌｙ４７の主鎖のカルボニル基と水を媒介として相互作用している。このカルボキシアミドは、活性部位から上記タンパク質の完全には保存されていない領域へ伸びているが、位置が制限された主鎖原子との間、又は、保存されている側鎖原子との間で相互作用が観察されている。この構造において、Ａｒｇ３３７の側鎖はＥＰＳＰの構造中におけるその位置からわずかに移動していて、カルボキシアミドの酸素との間で水素結合を形成していることが観察されている。第二のカルボキシレートをシアノ基で置換すると、共通の相互作用点において上記阻害剤が行う相互作用の数が減少するが、この減少は、ＣＰＣＤの全面的な形適合、及び、カルボキシアミド基が行う更なる相互作用によって相殺される。
【００７４】
７）コリスミ酸合成酵素−ＦＭＮ−ＢＳＡＣＢ複合体の三次元構造
ＳｐＣＳとＦＭＮとの複合体に結合しているＢＳＡＣＢの構造を、分解能２．３Åで調べた。ＢＳＡＣＢ由来のタンパク質座標と三量体構造とが重なっていることにより、これらの間には著しい差異はほとんどないということが分かった。三量体構造とＢＳＡＣＢ構造との「ｃｌｏｓｅｄ」型のＣαの位置を比較すると、これらが本質的に同一であり、ＲＭＳＤは０．６７Åであることが分かった。その他の構造についての場合と同様に、Ｇｌｙ４７とＩｌｅ５１との間に残基が５つ欠失していることによって、三量体構造中のＥＰＳＰのリン酸基が占める領域の中に更に空間ができ、この空間はＢＳＡＣＢによって使用される。
【００７５】
ＢＳＡＣＢはカルボキシル基を２つ有していて、これらの相互作用は、ＣＭＩＰ、ＣＭＳＰＤ及びＥＰＳＰの２つのカルボキシレートが行う相互作用と類似している。結合型はＣＭＩＰの結合型と類似していて、安息香酸部分がＡｒｇ３９と相互作用し、一方、ケイ皮酸部分のカルボキシレートがＦＭＮのＯ２及びＨｉｓ１１０の側鎖と相互作用している。スルホンアミドリンカー基は三量体構造中においてＥＰＳＰのリン酸基の近くに位置しているが、対応する残基とは全く相互作用していない。しかしながら、スルホンアミドの酸素原子の１つは、ＥＰＳＰの構造中において保存されている水分子が占める位置に位置している。この水分子はＳｅｒ９及びＳｅｒ１３２によって配位結合していて、更にＥＰＳＰのＯ１１と相互作用している。ＢＳＡＣＢの第二のフェニル環は、更なる任意の特異的な相互作用をするための基が欠失しているが、活性部位の表面との相補的な形適合を提供する。
【００７６】
８）新規のＣＳ構造を解明するための分子置換の使用
病原菌エンテロコッカス・フェカーリス及びインフルエンザ菌のそれぞれに由来するＣＳの三次元座標を決定するために、分子置換法を使用した。肺炎レンサ球菌由来のＣＳの結晶の構造座標を初期モデルとして使用して、近似的な位相情報を調べた。この位相を電子密度地図を決定する際に使用し、その地図は上述のように処理した。これらの新規のコリスミ酸合成酵素と初期モデルとの間の（配列及び構造の両方における）差異はこれらの地図から明らかであり、これによってＥｆＣＳ及びＨｉＣＳの三次元座標を正確に決定できた。
【００７７】
＜ＣＳ活性部位の定義＞
ＣＳ活性部位を構成する残基は２つの群に分けることができる。第一に、上記タンパク質とＦＭＮとの間の接触に関与する残基である（「ＦＭＮ結合部位」）。第二に、上記タンパク質とＥＰＳＰとの間の接触に関与する残基である（「ＥＰＳＰ結合部位」）。これらは概して別個のものであるが、これら２つの部位の含有物はいくらか重なっている。ＦＭＮ結合部位におけるリガンド（ＦＭＮ）とＥＰＳＰ結合部位におけるリガンド（ＥＰＳＰ、ＣＭＩＰ  ＣＭＳＰＤ、ＣＰＣＤ又はＢＳＡＣＢ）との間には更なる相互作用があり、従って、両リガンドはもう一方の結合部位の一部を含んでいると考えることができる。上記の阻害剤の複合体の構造においては、阻害剤分子がＥＰＳＰ結合部位の中に適応していて、かつ、ＣＳ−ＦＭＮ複合体によるＥＰＳＰの結合に関与している残基とのみ相互作用している。ＳｐＣＳ、ＥｆＣＳ及びＨｉＣＳの構造を比較することによって、これらのタンパク質全ての活性部位が同一であること、及び、ＦＭＮ結合部位及びＥＰＳＰ結合部位を含む残基の位置が本質的に同一であることが分かった。
【００７８】
ＦＭＮ結合部位は、タイトな二量体化により結合している２つのモノマーに由来する残基を含む。特に、ＦＭＮが結合しているモノマーに由来する残基Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ｇｌｙ１０９、Ｈｉｓ１１０、Ａｌａ１１１、Ｓｅｒ１３１、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ｔｈｒ１３６、Ｉｌｅ２５０、Ａｓｎ２５１、Ａｌａ２５２、Ｐｈｅ２５３、Ｌｙｓ２５４、Ｍｅｔ３１０、Ｌｙｓ３１１、Ｉｌｅ３１３、Ｐｒｏ３１４、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７、Ｓｅｒ３３８、Ａｓｐ３３９、Ａｌａ３４２、Ａｌａ３４５、Ａｌａ３４６、Ｖａｌ３４９は、ＦＭＮ原子から５Å以内の距離にあり、従って、結合部位の一部を形成していると考えることができる。また、隣接するモノマーに由来する残基Ａｓｐ２４０、Ｐｈｅ２９４、Ｇｌｕ２９５、Ｇｌｙ２９６、Ｇｌｙ２９７もまたＦＭＮから５Å以内の距離にあり、結合部位の一部を形成している。また、隣接するモノマーに由来する残基Ｌｙｓ２３８はＦＭＮからの距離が５Åを超えるが、ＦＭＮのリン酸基との水を媒介とした相互作用に関与していて、従って、ＦＭＮ結合部位の一部であると考えられるに違いない。上述したように、ＥＰＳＰ自身もＦＭＮ結合部位の一部を形成している。
【００７９】
ＥＰＳＰ結合部位はＦＭＮに対して二量体のインターフェースから移動していて、従って、上記リガンドが直接結合しているモノマーのみに由来する残基を含む。特に、残基Ｓｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ａｒｇ４８、Ｍｅｔ４９、Ａｓｐ５４、Ａｓｐ８０、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３１、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ｔｈｒ１３７、Ｇｌｕ３３６、Ａｒｇ３３７、Ｓｅｒ３３８、Ａｓｐ３３９は、活性部位が「ｃｌｏｓｅｄ」型のＥＰＳＰから５Å以内の距離にあって、従って、ＥＰＳＰ結合部位の一部を形成していると考えることができる。上述したように、ＦＭＮ自身もＥＰＳＰ結合部位の一部を形成している。
【００８０】
図２は、以下の細菌種に由来するＣＳについての配列アライメントを示す：大腸菌、チフス菌、ペスト菌、インフルエンザ菌、緑膿菌、髄膜炎菌、淋菌、クロストリジウム・ディフィシル、黄色ブドウ球菌、枯草菌、肺炎レンサ球菌、エンテロコッカス・フェカーリス、結核菌、パスツレラ・ムルトシダ、ヘリコバクター・ピロリ。比較するために、真菌類（アカパンカビ）、植物（シロイヌナズナ）及びアピコンプレクサ類寄生虫（熱帯熱マラリア原虫、トキソプラズマ）由来の配列も含む。上述した、ＦＭＮ及びＥＰＳＰ結合部位を含む残基を強調する。これらのうち、Ｓｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ａｓｐ５４、Ａｓｐ８０、Ａｒｇ１０７、Ｇｌｙ１０９、Ｈｉｓ１１０、Ａｌａ１１１、Ｓｅｒ１３１、Ｓｅｒ１３２、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３４、Ｔｈｒ１３６、Ａｓｐ２４０、Ｉｌｅ２５０、Ａｓｎ２５１、Ａｌａ２５２、Ｌｙｓ２５４、Ｇｌｙ２９６、Ｇｌｙ２９７、Ｌｙｓ３１１、Ｔｈｒ３１５、Ａｒｇ３３７、Ａｓｐ３３９、Ａｌａ３４６、Ｖａｌ３４９は完全に保存されているか、又は、非常によく保存されているかのいずれかであり、細菌性病原体、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫の全ての配列に渉って生じる変化はわずかである。また、Ｍｅｔ４９、Ｔｈｒ１３７、Ｐｈｅ２５３、Ｐｈｅ２９４、Ｍｅｔ３１０、Ａｌａ２４２の位置の残基は、種の同じ領域において、大きさ及び疎水性の点で良好に保存されている。（Ｈｉｓ１１０、Ｌｙｓ３１１を含む）ＦＭＮ、又は、（Ｓｅｒ９、Ｈｉｓ１０、Ａｒｇ３９、Ａｒｇ４５、Ａｒｇ１０７、Ｈｉｓ１１０、Ｓｅｒ１３２、Ａｒｇ１３４及びＡｒｇ３３７を含む）ＥＰＳＰ若しくは阻害剤ＣＭＩＰ、ＣＭＳＰＤ、ＣＰＣＤ及びＢＳＡＣＢのいずれかとの水素結合又は塩橋に関与している残基は、（グラム陽性菌において完全に保存されているＡｒｇ４５を除いて、）上に挙げた全ての種において完全に保存されているが、他の種にはそれほど保存されていない。しかしながら、（グラム陽性菌においてはＡｌａであるが、その他の全ての種においては完全に保存されたアルギニンである）残基３４５は、Ａｒｇ４５が存在しない場合に、ＥＰＳＰ又は阻害剤と相互作用するために正確に配置されている。アルギニンが３４５の位置に配置される場合、グアニジノ基は、Ａｒｇ４５のグアニジノ基から１Å以内の距離にある。従って、ＣＳとリガンド又は阻害剤との間の本質的な水素結合又は塩橋のために必要な残基は全て、細菌、真菌類、植物及び寄生虫の種において存在する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１−１】図１−１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２】図１−２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３】図１−３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４】図１−４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５】図１−５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６】図１−６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７】図１−７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８】図１−８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９】図１−９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０】図１−１０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１】図１−１１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２】図１−１２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３】図１−１３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４】図１−１４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５】図１−１５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６】図１−１６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７】図１−１７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１８】図１−１８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１９】図１−１９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２０】図１−２０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２１】図１−２１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２２】図１−２２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２３】図１−２３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２４】図１−２４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２５】図１−２５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２６】図１−２６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２７】図１−２７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２８】図１−２８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−２９】図１−２９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３０】図１−３０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３１】図１−３１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３２】図１−３２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３３】図１−３３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３４】図１−３４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３５】図１−３５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３６】図１−３６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３７】図１−３７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３８】図１−３８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−３９】図１−３９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４０】図１−４０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４１】図１−４１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４２】図１−４２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４３】図１−４３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４４】図１−４４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４５】図１−４５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４６】図１−４６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４７】図１−４７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４８】図１−４８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−４９】図１−４９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５０】図１−５０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５１】図１−５１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５２】図１−５２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５３】図１−５３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５４】図１−５４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５５】図１−５５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５６】図１−５６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５７】図１−５７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５８】図１−５８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−５９】図１−５９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６０】図１−６０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６１】図１−６１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６２】図１−６２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６３】図１−６３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６４】図１−６４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６５】図１−６５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６６】図１−６６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６７】図１−６７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６８】図１−６８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−６９】図１−６９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７０】図１−７０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７１】図１−７１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７２】図１−７２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７３】図１−７３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７４】図１−７４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７５】図１−７５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７６】図１−７６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７７】図１−７７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７８】図１−７８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−７９】図１−７９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８０】図１−８０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８１】図１−８１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８２】図１−８２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８３】図１−８３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８４】図１−８４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８５】図１−８５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８６】図１−８６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８７】図１−８７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８８】図１−８８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−８９】図１−８９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９０】図１−９０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９１】図１−９１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９２】図１−９２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９３】図１−９３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９４】図１−９４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９５】図１−９５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９６】図１−９６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９７】図１−９７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９８】図１−９８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−９９】図１−９９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１００】図１−１００は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０１】図１−１０１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０２】図１−１０２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０３】図１−１０３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０４】図１−１０４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０５】図１−１０５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０６】図１−１０６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０７】図１−１０７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０８】図１−１０８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１０９】図１−１０９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１０】図１−１１０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１１】図１−１１１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１２】図１−１１２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１３】図１−１１３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１４】図１−１１４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１５】図１−１１５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１６】図１−１１６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１７】図１−１１７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１８】図１−１１８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１１９】図１−１１９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２０】図１−１２０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２１】図１−１２１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２２】図１−１２２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２３】図１−１２３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２４】図１−１２４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２５】図１−１２５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２６】図１−１２６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２７】図１−１２７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２８】図１−１２８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１２９】図１−１２９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３０】図１−１３０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３１】図１−１３１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３２】図１−１３２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３３】図１−１３３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３４】図１−１３４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３５】図１−１３５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３６】図１−１３６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３７】図１−１３７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３８】図１−１３８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１３９】図１−１３９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４０】図１−１４０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４１】図１−１４１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４２】図１−１４２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４３】図１−１４３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４４】図１−１４４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４５】図１−１４５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４６】図１−１４６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４７】図１−１４７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４８】図１−１４８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１４９】図１−１４９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５０】図１−１５０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５１】図１−１５１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５２】図１−１５２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５３】図１−１５３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５４】図１−１５４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５５】図１−１５５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５６】図１−１５６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５７】図１−１５７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５８】図１−１５８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１５９】図１−１５９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６０】図１−１６０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６１】図１−１６１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６２】図１−１６２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６３】図１−１６３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６４】図１−１６４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６５】図１−１６５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６６】図１−１６６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６７】図１−１６７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６８】図１−１６８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１６９】図１−１６９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７０】図１−１７０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７１】図１−１７１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７２】図１−１７２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７３】図１−１７３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７４】図１−１７４は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７５】図１−１７５は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７６】図１−１７６は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７７】図１−１７７は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７８】図１−１７８は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１７９】図１−１７９は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１８０】図１−１８０は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１８１】図１−１８１は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１８２】図１−１８２は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図１−１８３】図１−１８３は、ＳｐＣＳ−ＦＭＮ−ＥＰＳＰ複合体の構造座標を示す。
【図２−１】図２−１は、病原菌、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫由来のコリスミ酸合成酵素についての配列アライメントを示す。
【図２−２】図２−２は、病原菌、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫由来のコリスミ酸合成酵素についての配列アライメントを示す。
【図２−３】図２−３は、病原菌、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫由来のコリスミ酸合成酵素についての配列アライメントを示す。
【図２−４】図２−４は、病原菌、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫由来のコリスミ酸合成酵素についての配列アライメントを示す。
【図２−５】図２−５は、病原菌、真菌類、植物及びアピコンプレクサ類寄生虫由来のコリスミ酸合成酵素についての配列アライメントを示す。
【図３】図３（ａ）はコリスミ酸合成酵素のトポロジーを示し、図３（ｂ）はグラム陽性病原体四種（上側）及びグラム陰性病原体四種（下側）の配列アライメントを示す。
【図１−１】
2006510957.tif 000005
【図１−２】
2006510957.tif 000006
【図１−３】
2006510957.tif 000007
【図１−４】
2006510957.tif 000008
【図１−５】
2006510957.tif 000009
【図１−６】
2006510957.tif 000010
【図１−７】
2006510957.tif 000011
【図１−８】
2006510957.tif 000012
【図１−９】
2006510957.tif 000013
【図１−１０】
2006510957.tif 000014
【図１−１１】
2006510957.tif 000015
【図１−１２】
2006510957.tif 000016
【図１−１３】
2006510957.tif 000017
【図１−１４】
2006510957.tif 000018
【図１−１５】
2006510957.tif 000019
【図１−１６】
2006510957.tif 000020
【図１−１７】
2006510957.tif 000021
【図１−１８】
2006510957.tif 000022
【図１−１９】
2006510957.tif 000023
【図１−２０】
2006510957.tif 000024
【図１−２１】
2006510957.tif 000025
【図１−２２】
2006510957.tif 000026
【図１−２３】
2006510957.tif 000027
【図１−２４】
2006510957.tif 000028
【図１−２５】
2006510957.tif 000029
【図１−２６】
2006510957.tif 000030
【図１−２７】
2006510957.tif 000031
【図１−２８】
2006510957.tif 000032
【図１−２９】
2006510957.tif 000033
【図１−３０】
2006510957.tif 000034
【図１−３１】
2006510957.tif 000035
【図１−３２】
2006510957.tif 000036
【図１−３３】
2006510957.tif 000037
【図１−３４】
2006510957.tif 000038
【図１−３５】
2006510957.tif 000039
【図１−３６】
2006510957.tif 000040
【図１−３７】
2006510957.tif 000041
【図１−３８】
2006510957.tif 000042
【図１−３９】
2006510957.tif 000043
【図１−４０】
2006510957.tif 000044
【図１−４１】
2006510957.tif 000045
【図１−４２】
2006510957.tif 000046
【図１−４３】
2006510957.tif 000047
【図１−４４】
2006510957.tif 000048
【図１−４５】
2006510957.tif 000049
【図１−４６】
2006510957.tif 000050
【図１−４７】
2006510957.tif 000051
【図１−４８】
2006510957.tif 000052
【図１−４９】
2006510957.tif 000053
【図１−５０】
2006510957.tif 000054
【図１−５１】
2006510957.tif 000055
【図１−５２】
2006510957.tif 000056
【図１−５３】
2006510957.tif 000057
【図１−５４】
2006510957.tif 000058
【図１−５５】
2006510957.tif 000059
【図１−５６】
2006510957.tif 000060
【図１−５７】
2006510957.tif 000061
【図１−５８】
2006510957.tif 000062
【図１−５９】
2006510957.tif 000063
【図１−６０】
2006510957.tif 000064
【図１−６１】
2006510957.tif 000065
【図１−６２】
2006510957.tif 000066
【図１−６３】
2006510957.tif 000067
【図１−６４】
2006510957.tif 000068
【図１−６５】
2006510957.tif 000069
【図１−６６】
2006510957.tif 000070
【図１−６７】
2006510957.tif 000071
【図１−６８】
2006510957.tif 000072
【図１−６９】
2006510957.tif 000073
【図１−７０】
2006510957.tif 000074
【図１−７１】
2006510957.tif 000075
【図１−７２】
2006510957.tif 000076
【図１−７３】
2006510957.tif 000077
【図１−７４】
2006510957.tif 000078
【図１−７５】
2006510957.tif 000079
【図１−７６】
2006510957.tif 000080
【図１−７７】
2006510957.tif 000081
【図１−７８】
2006510957.tif 000082
【図１−７９】
2006510957.tif 000083
【図１−８０】
2006510957.tif 000084
【図１−８１】
2006510957.tif 000085
【図１−８２】
2006510957.tif 000086
【図１−８３】
2006510957.tif 000087
【図１−８４】
2006510957.tif 000088
【図１−８５】
2006510957.tif 000089
【図１−８６】
2006510957.tif 000090
【図１−８７】
2006510957.tif 000091
【図１−８８】
2006510957.tif 000092
【図１−８９】
2006510957.tif 000093
【図１−９０】
2006510957.tif 000094
【図１−９１】
2006510957.tif 000095
【図１−９２】
2006510957.tif 000096
【図１−９３】
2006510957.tif 000097
【図１−９４】
2006510957.tif 000098
【図１−９５】
2006510957.tif 000099
【図１−９６】
2006510957.tif 000100
【図１−９７】
2006510957.tif 000101
【図１−９８】
2006510957.tif 000102
【図１−９９】
2006510957.tif 000103
【図１−１００】
2006510957.tif 000104
【図１−１０１】
2006510957.tif 000105
【図１−１０２】
2006510957.tif 000106
【図１−１０３】
2006510957.tif 000107
【図１−１０４】
2006510957.tif 000108
【図１−１０５】
2006510957.tif 000109
【図１−１０６】
2006510957.tif 000110
【図１−１０７】
2006510957.tif 000111
【図１−１０８】
2006510957.tif 000112
【図１−１０９】
2006510957.tif 000113
【図１−１１０】
2006510957.tif 000114
【図１−１１１】
2006510957.tif 000115
【図１−１１２】
2006510957.tif 000116
【図１−１１３】
2006510957.tif 000117
【図１−１１４】
2006510957.tif 000118
【図１−１１５】
2006510957.tif 000119
【図１−１１６】
2006510957.tif 000120
【図１−１１７】
2006510957.tif 000121
【図１−１１８】
2006510957.tif 000122
【図１−１１９】
2006510957.tif 000123
【図１−１２０】
2006510957.tif 000124
【図１−１２１】
2006510957.tif 000125
【図１−１２２】
2006510957.tif 000126
【図１−１２３】
2006510957.tif 000127
【図１−１２４】
2006510957.tif 000128
【図１−１２５】
2006510957.tif 000129
【図１−１２６】
2006510957.tif 000130
【図１−１２７】
2006510957.tif 000131
【図１−１２８】
2006510957.tif 000132
【図１−１２９】
2006510957.tif 000133
【図１−１３０】
2006510957.tif 000134
【図１−１３１】
2006510957.tif 000135
【図１−１３２】
2006510957.tif 000136
【図１−１３３】
2006510957.tif 000137
【図１−１３４】
2006510957.tif 000138
【図１−１３５】
2006510957.tif 000139
【図１−１３６】
2006510957.tif 000140
【図１−１３７】
2006510957.tif 000141
【図１−１３８】
2006510957.tif 000142
【図１−１３９】
2006510957.tif 000143
【図１−１４０】
2006510957.tif 000144
【図１−１４１】
2006510957.tif 000145
【図１−１４２】
2006510957.tif 000146
【図１−１４３】
2006510957.tif 000147
【図１−１４４】
2006510957.tif 000148
【図１−１４５】
2006510957.tif 000149
【図１−１４６】
2006510957.tif 000150
【図１−１４７】
2006510957.tif 000151
【図１−１４８】
2006510957.tif 000152
【図１−１４９】
2006510957.tif 000153
【図１−１５０】
2006510957.tif 000154
【図１−１５１】
2006510957.tif 000155
【図１−１５２】
2006510957.tif 000156
【図１−１５３】
2006510957.tif 000157
【図１−１５４】
2006510957.tif 000158
【図１−１５５】
2006510957.tif 000159
【図１−１５６】
2006510957.tif 000160
【図１−１５７】
2006510957.tif 000161
【図１−１５８】
2006510957.tif 000162
【図１−１５９】
2006510957.tif 000163
【図１−１６０】
2006510957.tif 000164
【図１−１６１】
2006510957.tif 000165
【図１−１６２】
2006510957.tif 000166
【図１−１６３】
2006510957.tif 000167
【図１−１６４】
2006510957.tif 000168
【図１−１６５】
2006510957.tif 000169
【図１−１６６】
2006510957.tif 000170
【図１−１６７】
2006510957.tif 000171
【図１−１６８】
2006510957.tif 000172
【図１−１６９】
2006510957.tif 000173
【図１−１７０】
2006510957.tif 000174
【図１−１７１】
2006510957.tif 000175
【図１−１７２】
2006510957.tif 000176
【図１−１７３】
2006510957.tif 000177
【図１−１７４】
2006510957.tif 000178
【図１−１７５】
2006510957.tif 000179
【図１−１７６】
2006510957.tif 000180
【図１−１７７】
2006510957.tif 000181
【図１−１７８】
2006510957.tif 000182
【図１−１７９】
2006510957.tif 000183
【図１−１８０】
2006510957.tif 000184
【図１−１８１】
2006510957.tif 000185
【図１−１８２】
2006510957.tif 000186
【図１−１８３】
2006510957.tif 000187
【図２−１】
2006510957.tif 000188
【図２−２】
2006510957.tif 000189
【図２−３】
2006510957.tif 000190
【図２−４】
2006510957.tif 000191
【図２−５】
2006510957.tif 000192
【図３】
2006510957.tif 000193
【国際調査報告】
2006510957.tif 000194
2006510957.tif 000195
2006510957.tif 000196
2006510957.tif 000197
2006510957.tif 000198
2006510957.tif 000199