(57)【要約】商業的原核生物発酵系に有用な、新規ベンゾエート−又はアントラニレート−誘導性プロモーター、及び新規タンデムプロモーター並びにそれらの変異体及び改良突然変異体、前記プロモーターを含む核酸構成体、それらを用いる発現系、それらの使用によるタンパク質の発現方法、それによって発現されるタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の天然ベンゾエートプロモーターの−１０領域の上流に１５−２０ヌクレオチドリンカーによって結合されたシュードモナス・フルオレッセンスの天然プロモーターの−３５領域を含んでなる、単離されたベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項２】
前記プロモーターがベンゾエートプロモーターアクチベータータンパク質結合部位を更に含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項３】
前記プロモーターがすぐ上流に結合された、前記天然プロモーターのすぐ上流に自然状態で位置する約５０ヌクレオチドの部分の天然配列を更に含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項４】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２９６−１３０１のすぐ上流に１５−２０ヌクレオチドリンカーによって結合されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１２８０を含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項５】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０１及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項６】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０７及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２２８−１３０１及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２２８−１３０７及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が請求項１〜８に記載されたプロモーターのいずれかのヌクレオチド配列に少なくとも９０％相同であり、且つそれに非相同である突然変異プロモーターを得るために、請求項１〜８のいずれか１項に記載されたベンゾエートプロモーター核酸の突然変異によって形成された突然変異プロモーター核酸。
【請求項１０】
ベンゾエートプロモーターアクチベータータンパク質コード配列を更に含む請求項１〜９のいずれか１項に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項１１】
前記ベンゾエートプロモーターアクチベータータンパク質コード配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５、Ａｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５及びＡｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５並びに、場合によっては、そこに列挙された少なくとも１つの突然変異のいずれか１つに少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有するベンゾエートプロモーターアクチベータータンパク質をコード化する請求項１０に記載のベンゾエートプロモーター核酸。
【請求項１２】
シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の天然アントラニレートプロモーターの−１０領域の上流に１５−２０ヌクレオチドリンカーによって結合されたシュードモナス・フルオレッセンスの天然アントラニレートプロモーターの−３５領域を含む単離されたアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１３】
前記プロモーターがアントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質結合部位を更に含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１４】
前記プロモーターが、すぐ上流に結合された、前記天然プロモーターのすぐ上流に自然状態で位置する約１１０ヌクレオチド部分の天然配列を更に含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１５】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２４４及び１２６４−１２６８、１５−２０ヌクレオチドリンカーによってヌクレオチド１２６４−１２６８の上流に結合したヌクレオチド１２３９−１２４４並びに、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１６】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１７】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２７４及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１８】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１１３０−１２６８及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項１９】
前記プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１１３０−１２７４及び、場合によっては、その列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項１２に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項２０】
ヌクレオチド配列が請求項１２〜１９に記載されたプロモーターのいずれかの１つのヌクレオチド配列に少なくとも９０％相同であり、且つそれに非相同である突然変異プロモーターを得るために、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載されたアントラニレートプロモーター核酸の突然変異によって形成された突然変異アントラニレートプロモーター核酸。
【請求項２１】
アントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質コード配列を更に含む、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項２２】
前記アントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質コード配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０及びＡｌａ２６８を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０のいずれか１つに少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有するアントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質をコード化する請求項２１に記載のアントラニレートプロモーター核酸。
【請求項２３】
自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターの上流に結合された非カタボライト抑制されたプロモーターを含むタンデムプロモーターであって、自然状態でカタボライト抑制された前記プロモーターのカタボライト抑制が克服されるか、若しくは異なる改良されたプロモーター特性が示されるか、又は両者であるタンデムプロモーター。
【請求項２４】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーター及び前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが共にシュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ）及び近縁細菌から得られる請求項２３に記載のタンデムプロモーター。
【請求項２５】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーター及び前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが共にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属から得られる請求項２４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項２６】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーター及び前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが共に同一種から得られる請求項２４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項２７】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーター及び前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが共に同一種から得られる請求項２５に記載のタンデムプロモーター。
【請求項２８】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーター及び前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが共にシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）から得られる請求項２７に記載のタンデムプロモーター。
【請求項２９】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーター及び前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが共に代替炭素源利用酵素又は経路をコード化する遺伝子又はオペロンから得られる請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３０】
前記の非カタボライト抑制されたプロモーターがアントラニレート分解経路をコード化するオペロンから得られ、且つ前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターがベンゾエート分解経路をコード化するオペロンから得られる請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３１】
前記非カタボライト抑制プロモーターが前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターのすぐ上流に結合される請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３２】
前記非カタボライト抑制プロモーターが前記の自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターの上流にポリヌクレオチドリンカーによって結合される請求項２３〜２８のいずれか１項に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドリンカーがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のｇ１３９６−ａ１４２９のヌクレオチド配列を有する請求項３２に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３４】
前記非カタボライト抑制プロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１２２１−１３５９、１２２１−１３７１、１３２８−１３５９及び１３２８−１３７１並びに、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つからなる群から選ばれたアントラニレートプロモーターであり、且つ前記カタボライト抑制プロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１４３０−１５０３、１４３０−１５０９、１４７７−１５０３及び１４７７−１５０９並びに、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つからなる群から選ばれたベンゾエートプロモーター配列である請求項２８に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３５】
前記プロモーターがベンゾーエート「−３５から−１０領域」から上流であってその近位にベンゾエートアクチベータータンパク質結合部位を、そしてアントラニレート「−３５から−１０領域」から上流であってその近位にアントラニレートアクチベータータンパク質結合部位を更に含む請求項２３に記載のタンデムポリマー。
【請求項３６】
前記タンデムプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１３２９−１５０３及び、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項３４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３７】
前記タンデムプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１３２９−１５０９及び、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項３４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３８】
前記タンデムプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１１２１−１５０３及び、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含んでなる請求項３４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項３９】
前記タンデムプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１１２１−１５０９及び、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項３４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項４０】
前記タンデムプロモーターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１３２９−１５４１及び、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項３４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項４１】
前記タンデムプロモーターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１１２１−１５４１及び、場合によっては、そこに列挙された突然変異の少なくとも１つを含む請求項３４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項４２】
（Ａ）（１）請求項１、１２、２３若しくは３０に記載のプロモーター；
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも塩基１２７５−１３０７；
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも塩基１２３９−１２７４；又は
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも塩基１３２９−１５０９
のいずれか１つの塩基配列に少なくとも９０％等しく且つ非相同である塩基配列を有する少なくとも１種のポリヌクオチドを獲得し；
（Ｂ）発現構成体中の転写産物コード化ポリヌクレオチドに作動可能なように結合された場合に原核生物宿主細胞中においてその転写を導く能力及び、場合によっては、少なくとも１つのプロモーター特性に関して前記ポリヌクレオチドをスクリーニングし；そして
（Ｃ）前記スクリーニングの結果に基づいて、発現構成体中の転写産物コード化ポリヌクレオチドに作動可能なように結合された場合に原核生物宿主細胞中においてその転写を導く能力を有し且つ、場合によっては、工程（Ａ）（１）−（Ａ）（４）のプロモーターの特性に比べて改良された少なくとも１つのプロモーター特性を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを同定する
工程を含む方法によって作成される改変プロモーター。
【請求項４３】
（Ａ）（１）（ａ）（ｉ）請求項１、１２、２３若しくは３０に記載のプロモーター；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも塩基１２７５−１３０７；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも塩基１２３９−１２７４；又は
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも塩基１３２９−１５０９
のいずれか１つの塩基配列を有し；且つ
（ｂ）転写産物コード化ポリヌクレオチドに作動可能なように結合された場合に原核生物宿主細胞中においてその転写を導く能力を有する
プロモーターポリヌクレオチド、又は
（２）前記プロモーターポリヌクレオチドの塩基配列に相当する情報ストリング
を提供し；
（Ｂ）（１）少なくとも１つの突然変異誘発法若しくは少なくとも１つの組換え法又はその両者を前記プロモーターポリヌクオチドに関して実施して、少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを作成することによって、あるいは
（２）前記情報ストリングを修飾して、前記情報ストリングに少なくとも９０％同一で且つ少なくとも１つの改変配列を示す少なくとも１つの修飾ストリングを作成し、且つ
（ａ）前記改変配列を有する少なくとも１種の配列改変ポリヌクオチドを合成し、又は
（ｂ）（ｉ）前記修飾ストリングに同一な少なくとも１つの同一ストリングに関する、少なくとも１種のポリヌクレオチド源に対応する少なくとも１つの配列記録を検索し、
（ｉｉ）少なくとも１つの前記同一ストリングの少なくとも１つの発生を同定し、そして
（ｉｉｉ）前記同一ストリングの同定された発生が対応するポリヌクレオチド源を選択し、それによって、少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを獲得する
ことによって前記修飾ストリングを利用する
ことによって、又は
（３）（ａ）前記情報ストリング又はその相補体に少なくとも９０％同一な少なくとも１つの非相同ストリングに関する少なくとも１つの配列記録を検索し（前記非相同ストリングは少なくとも１つの改変配列に相当し且つ前記配列記録は少なくとも１種のポリペプチド源に対応する）、
（ｂ）少なくとも１つの前記非相同ストリングの少なくとも１つの発生を同定し、そして
（ｃ）前記非相同ストリングの同定された発生が対応するポリヌクレオチド源を選択し、それによって少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを獲得する
ことによって前記情報ストリングを利用することよって、又は
（４）前記プローブと少なくとも１つの非相同試験ポリヌクレオチドとを、前記プローブの相補体に少なくとも９０％同一である前記試験ポリヌクレオチド内の標的配列に前記プローブをハイブリッド形成できるストリンジェントな条件下で合し、且つ前記プローブがハイブリッド形成する試験ポリヌクレオチドを選択し、それによって少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを得ることによって、前記プロモーターポリヌクレオチドをプローブとして使用することによって
少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを獲得し；
（Ｃ）少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを、少なくとも１つのプロモーター特性に関して及び発現構成体中の転写産物コード化ポリヌクレオチドに作動可能なように結合された場合に原核生物宿主細胞内でその転写を導くことができるその能力に関してスクリーニングし；そして
（Ｄ）前記スクリーニングの結果に基づき、
（１）工程（Ａ）（１）のプロモーターポリヌクレオチドの特性に比べて改良された少なくとも１つのプロモーター特性を有し、且つ
（２）転写産物コード化ポリヌクレオチドに作動可能なように結合された場合に、原核生物宿主細胞内でその転写を導く能力を有する
少なくとも１つの配列改変ポリヌクレオチドを同定し、それによって改良プロモーターを獲得する
工程を含む方法によって作成される改良プロモーター。
【請求項４４】
前記方法が転写産物コード化ポリヌクレオチドに前記改良プロモーターを作動可能なように結合させて発現カセットを形成する工程を含む請求項４３に記載の改良プロモーターの利用方法。
【請求項４５】
前記方法がベクター内に前記発現カセットを組み込む工程を更に含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が前記発現カセットから発現を引き起こすことができる宿主細胞を前記ベクターによって形質転換させる工程を更に含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、改良プロモータ−を誘導する増殖条件下に前記宿主細胞を保持することによって、前記発現カセットによってコード化される発現産物を産生する工程を更に含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程（Ｂ）（４）における前記プロモーターポリヌクレオチドのプローブとしての前記利用が、少なくとも１０塩基の長さの前記プロモーターポリヌクレオチドの塩基配列を含むポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類縁物質の分子を獲得し、そして前記分子を標識し、それによって前記プローブを提供することを含む請求項４３に記載の改良プロモーター。
【請求項４９】
工程（Ｂ）（４）における前記プロモーターポリヌクレオチドのプローブとしての前記利用が、少なくとも１０塩基の長さの前記プロモーターポリヌクレオチドの塩基配列を含むポリヌクレオチド分子を獲得し、そして場合によっては、前記分子を標識し、それによって前記プローブを提供し、更に前記プローブを標的配列にハイブリッド形成後、前記プローブがプライマーの役割をする核酸重合を実施することを含む請求項４３に記載の改良プロモーター。
【請求項５０】
全長の相補体がストリンジェントなハイブリッド形成及び洗浄条件下において、
（Ａ）請求項１、１２、２３若しくは３０に記載のプロモーター；
（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも塩基１２７５−１３０７；
（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも塩基１２３９−１２７４；又は
（Ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも塩基１３２９−１５０９
のいずれかの１つの塩基配列を有する核酸塩基ポリマー分子にハイブリッド形成する核酸配列を含む原核細胞中でプロモーターとしての役割をすることができる単離核酸分子。
【請求項５１】
原核生物細胞中でプロモーターとしての役割をすることができる、ポリヌクレオチド分子の塩基配列を有する単離核酸塩基ポリマー分子であって、前記核酸塩基ポリマー分子が、
（Ａ）請求項１、１２、２３若しくは３０に記載のプロモーター；
（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも塩基１２７５−１３０７；
（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも塩基１２３９−１２７４；又は
（Ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも塩基１３２９−１５０９
のいずれかの１つの塩基配列に少なくとも９０％同一である塩基配列を含む単離核酸塩基ポリマー分子。
【請求項５２】
原核生物細胞中で発現構成体としての役割をすることができる組換え核酸分子であって、前記分子が、
（Ａ）請求項１、１２、２３若しくは３０に記載のプロモーター；
（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも塩基１２７５−１３０７；
（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも塩基１２３９−１２７４；又は
（Ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも塩基１３２９−１５０９
のいずれかの塩基配列に少なくとも９０％同一である塩基配列を含むプロモーターを含んでなる組換え核酸分子。
【請求項５３】
前記発現構成体がｍＲＮＡコード化配列を含む請求項５２に記載の組換え発現構成体。
【請求項５４】
前記発現構成体がベクターである請求項５２に記載の組換え発現構成体。
【請求項５５】
前記ベクターがプラスミド、トランスポゾン又は人工染色体である請求項５４に記載の組換え発現構成体。
【請求項５６】
請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の組換え発現構成体を含む遺伝子操作原核生物宿主細胞。
【請求項５７】
請求項５６に記載の遺伝子操作原核生物宿主細胞を含む発現系。
【請求項５８】
前記宿主細胞が前記組換え発現構成体のプロモーターに関連するアクチベータータンパク質をコード化する遺伝子の少なくとも１つのコピー、好ましくは１つより多いコピーを更に含む請求項５６に記載の遺伝子操作原核生物宿主細胞。
【請求項５９】
前記遺伝子操作原核生物宿主細胞が更に、前記組換え発現構成体のプロモーターに関連するアクチベータータンパク質をコード化する遺伝子の少なくとも１つのコピー、好ましくは１つより多くのコピーを含む請求項５７に記載の発現系。
【請求項６０】
請求項５８に記載の遺伝子操作原核生物宿主細胞を増殖させ、その中で組換え発現構成体を誘導し、それによって、前記組換え発現産物によってコード化される転写産物を発現させることを含む、転写産物の製造方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法によってｍＲＮＡ転写産物を発現させ、更に原核生物宿主細胞に、前記ｍＲＮＡをそれによってコード化されるポリペプチドに翻訳させることを含む、ポリペプチドの製造方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法によって製造されるポリペプチド。
【請求項６３】
（Ａ）（１）非カタボライト抑制原核生物プロモーターポリヌクレオチド、及び
（２）カタボライト抑制原核生物プロモーターポリヌクレオチド
を提供し；そして
（Ｂ）前記カタボライト抑制プロモーターに及びその上流に前記非カタボライト抑制プロモーターを共有結合させる
ことを含む方法によって産生されるタンデムプロモーター。
【請求項６４】
ポリヌクレオチドのプロモーター間リンカーが、非カタボライト抑制プロモーターを前記カタボライト抑制プロモーターに及びその上流に、共有結合している請求項６３に記載のタンデムプロモーター。
【請求項６５】
前記のポリヌクレオチドのプロモーター間リンカーがヌクレオチド約１００個又は１００個未満の長さである請求項６４に記載のタンデムプロモーター。
【請求項６６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５又はＡｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５のアミノ酸配列を有する、単離された転写アクチベータータンパク質。
【請求項６７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５又はＡｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５のアミノ酸配列を有する、単離された転写アクチベータータンパク質。
【請求項６８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０又はＡｌａ２６８を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０のアミノ酸配列を有する、単離された転写アクチベータータンパク質。
【請求項６９】
請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の転写アクチベータータンパク質のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一で且つ非相同であるアミノ酸配列を有する、単離された転写アクチベータータンパク質。
【請求項７０】
請求項６６〜６９のいずれか１項に記載の転写アクチベータータンパク質をコード化する塩基配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７１】
請求項７０に記載の転写アクチベータータンパク質をコード化する塩基配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記アクチベータータンパク質及び前記プロモーターが以下：
（Ａ）前記アクチベータータンパク質が、
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５、
（２）Ａｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５。
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５、及び
（４）Ａｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５
のいずれか１つのアミノ酸配列を有するベンゾエートプロモーターアクチベータータンパク質で且つ前記プロモーターがベンゾエート誘導性プロモーター；又は
（Ｃ）前記アクチベータータンパク質が、
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０、及び
（２）Ａｌａ２６８を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０
のいずれかの１つのアミノ酸配列を有するアントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質で且つ前記プロモーターがアントラニレート誘導性プロモーター
のいずれか１つである請求項５９に記載の発現系。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細菌における遺伝子発現には、任意の生物と同様に、遺伝子の転写を起こすためにコード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から５’に位置する（即ち、上流の）調節領域にプロモーターが存在することが必要である。プロモーターは構成プロモーターと調節プロモーターに分類されている。商業的に有用な細菌の発現系において、調節プロモーターは、目標遺伝子が不活性でありながら、菌のバイオマスを増加させることができるので、特に有用であることがわかっている。このため、宿主生物又は菌（ｈｏｓｔ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）は細胞分裂及び成長に最大エネルギーを注ぐことができる。調節プロモーターがその後に活性化／誘導される場合には、より多くの細胞が目標遺伝子の発現に利用可能であり、従って、目標遺伝子製品の収率が増加する。
【０００２】
調節プロモーターには、（１）活性化可能なプロモーター、即ちアクチベータータンパク質が５’調節領域に結合するまでは不活性であるプロモーター；及び（２）抑制可能なプロモーター、即ちリプレッサータンパク質が５’調節領域に結合している間は不活性であるプロモーターがある。一部の遺伝子又はオペロンは２つ以上のメカニズムで調節される。例えば、一部の細菌遺伝子及びオペロンは、第１の活性化又は抑制解除調節メカニズムと、「カタボライト抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」と称される第２の調節メカニズムの両方に供される。「グルコースカタボライト抑制」又は「カーボンカタボライト抑制」とも称されるカタボライト抑制は、調節プロモーターの制御下にある遺伝子もグルコース（主要な炭素源）の濃度が閾値以下に下がるまで、例えばグルコース飢餓の状態まで発現されない状態に保たれる現象である。即ちこのような遺伝子は、２つの条件：１）グルコース減少／飢餓及び２）調節プロモーターの活性化又は抑制解除が満たされるまでは発現されることができない。一方又は他方の条件のみの存在は、このような遺伝子の発現の達成には充分でない。カタボライト抑制を受けることわかっている遺伝子及びオペロンの中には、非グルコース炭素源、即ち代替炭素源を利用するのに必要な酵素及び／又は経路（ｐａｔｈｗａｙ）をコード化するものが多々ある。
【０００３】
カタボライト抑制のメカニズムはまだ精査を受けている段階である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるいくつかのカタボライト抑制されたオペロンの場合には、カタボライト抑制が「活性化可能なプロモーター（ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」メカニズムによって克服される転写レベルの制御が割り当てられる。例えば大腸菌ラクトースオペロン（ｌａｃＺＹＡ）はグルコース飢餓が「カタボライト・アクチベータータンパク質」をオペロンの５’調節領域に結合させるまで転写できない状態に保たれ；その後、ラクトースが存在する場合には、Ｌａｃリプレッサータンパク質が５’調節領域の１つ又は複数の別の部位（１つ又は複数のｌａｃオペレーター）から除去され、その結果、抑制解除され、転写が開始される。大腸菌におけるｌａｃオペロンコード化ｍＲＮＡの形成には、両方の条件、即ちグルコース飢餓及びラクトースの存在の両者が必要である。
【０００４】
一部の例では転写後調節が疑われる。例えば、シュードモナス菌及び近縁種では、ｃｒｃ遺伝子を含むカタボライト抑制が転写後に媒介される証拠がある。このことは、ｂｄｋＲの調節の研究からわかる［Ｒｅｆ．７］。転写アクチベーター、ｂｄｋＲタンパク質は、シュードモナス・ピュチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）において分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの発現調節に関与している。提示されたデータは、濃い培地において、ｂｄｋＲ転写物の存在にかかわらず、野生型Ｐ．ピュチダにおいてはｂｄｋＲタンパク質は検出できないことを示している。しかし、ｃｒｃが損なわれたか、又は不活性化された突然変異体シュードモナス・ピュチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）において、ｂｄｋＲタンパク質が検出され、ｂｄｋＲ転写物のレベルは野生型菌株に見られるよりもわずかに低く、ｂｄｋＲ調節遺伝子の転写物、ｂｄｋＡは約４倍誘導される。更に、ｂｄｋＲのカタボライト抑制が克服される突然変異体において確認された突然変異は、ｃｒｃ遺伝子又はその同族遺伝子ｖａｃＢに位置付けられている。シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）においては、ｖａｃＢタンパク質は転写後にビルレンス遺伝子を調節する；これは、ｃｒｃが転写後に作用するという付随的であるが追加の証拠を示す［Ｒｅｆ．１３］。
【０００５】
商業的原核生物系において、発酵によるタンパク質及び化学物質の生成に関連した重要な技術的な問題の１つは、導入遺伝子発現（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の全体的な制御である。当該導入遺伝子の発現に使用するために選択されるプロモーターは、以下の特性を有さなければならない。即ち以下のことが必要である。
１．反応から成長を分離すること；
２．効率的／最大産物収量を得るために遺伝子発現を制御すること；
３．低／無コストで関係（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）遺伝子を誘導すること；及び
４．抑制又は非誘導状態で有意なレベルの転写をさせないこと。
このため、調節プロモーターへの依存が大きい。詳細には、ｌａｃプロモーター（即ちｌａｃＺプロモーター）及びその誘導体、特に米国特許第４，５５１，４３３号（ＤｅBｏｅｒ）に記載されたｔａｃ及びｔｒｃプロモーター、並びに表Ｉに記載された関連プロモーターにほぼ例外なく依存している。
【０００６】
【表１】
2006506049.tif 000002
【０００７】
典型的な商業的細菌発酵系においては、宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）は、発現しようとする遺伝子又はオペロンにｔａｃプロモーターが作動（又は動作）可能なように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合された構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む。ｌａｃＩ遺伝子は、ｌａｃオペレーターに結合するＬａｃリプレッサータンパク質をコード化する、恒常的に発現される遺伝子であり、これもまた、細菌宿主細胞に含まれる（ｌａｃＩ遺伝子の多コピーが通常はこれに含まれる）。所望の量又は密度のバイオマスの成長後、ｔａｃプロモーターを抑制解除し且つ目標遺伝子又はオペロンの発現を可能にするために、培養物にインデューサーが添加される。
【０００８】
ｔａｃプロモーターのようなｌａｃ型プロモーター用いた商業的発酵系においては、無償性インデューサー、ＩＰＴＧ（「イソプロピルチオガラクトシド」とも称するイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）がほとんど普遍的に使用される。しかし、ＩＰＴＧは高価であり、生体系に著しく有毒であるので慎重に制御されなければない。ＩＰＴＧ標準品は、現在、グラム当たり約１８ＵＳ＄又は１０グラム当たり約１２５ＵＳ＄で入手できる。これらのＩＰＴＧ標準品も同じように生体系に有毒なジオキサンを含む。ジオキサンを含まないＩＰＴＧも市販されているが、価格がＩＰＴＧ標準品の価格の約２倍である（即ち、現在のところ、グラム当たり３６ＵＳ＄又は１０グラム当たり２５０ＵＳ＄である）。費用及び発酵系自体に対する高毒性の問題に加えて、発現産物又は発酵産物を販売する予定の場合には、ＩＰＴＧはヒト、動物及び他の生物に対して毒性の危険を有するので、ＩＰＴＧの存在に関して環境上及び健康上の規制の問題が生じる。
【０００９】
その結果として、商業的発酵生産系に有用であると共に無毒性又は低毒性のインデューサーによって活性化されるプロモーターが必要とされている。
【００１０】
ｌａｃプロモーター及びそれらの誘導体の使用の更なる難点は、天然の抑制された状態でさえ、プロモーターは比較的高い背景レベルの発現を可能にするので、「リーキー（ｌｅａｋｙ）］であることである。従って、ｌａｃ型プロモーターの抑制度を増加させるために、ＬａｃＩリプレッサータンパク質遺伝子の多コピーが通常、発現宿主細胞内に含まれる。このため、商業的発酵系に有用であると共に、誘導されるまでは不活性の状態に厳重に制御することが容易であるプロモーターが必要である。
【００１１】
これらの問題を考慮して、商業的原核生物発酵系において遺伝子発現を調節するために他の非ｌａｃ型プロモーターがいくつか提案されている（表II参照）。
【００１２】
【表２】
2006506049.tif 000003
【００１３】
表IIに記載した最初の２つのプロモーターに関しては、高温によって誘導されるプロモーターは以下の理由で問題がある。
高温は宿主細胞培養物に有害である可能性がある。
大規模の商業的発酵容量全体にわたって均一な温度スパイクを発生することは、実行不可能なことが多い。
このような誘導に必要な温度よりも低い温度で市販発酵装置を操作することが好ましい。表IIに記載した他の４つの提案されたプロモーターは、本発明者らの知る限りでは、大規模発酵条件において充分に機能することが証明されておらず、また、Ｐｕプロモーターのアルキル−及びハロ−トルエンインデューサーは生体系に著しく有毒である。
【００１４】
従って、商業的発酵生産系に有用であり、低コスト、低毒性の化学インデューサーによって活性化され且つ厳密に制御されるプロモーターが依然として必要である。
【００１５】
更に、１つの原核生物を用いて商業的発酵プラットフォーム中におけるタンパク質（及び他の発現産物）並びに化学物質（発現産物及び／又は宿主細胞の作用によって処理される）の生成のための遺伝子発現の制御を容易にするために、発現カセットのライブラリーがあれば望ましい。これらのカセットは、それぞれ、強度が異なり且つ／又は異なる成長条件下で若しくは異なる化学物質によって誘導される１種又はそれ以上の種々のプロモーターを含む。次に、これらの発現カセットは種々の関係遺伝子に連結されて、発酵に有益な条件下でそれらの遺伝子の全体的制御を達成する。このように、各種の増殖期依存性の又は化学的に誘導され得るプロモーターの同定及び最適化は、このような発酵プラットフォーム中にでの発酵時における（導入）遺伝子発現の制御に不可欠である。
【００１６】
更に、最初の遺伝子又はオペロンが１つ又はそれ以上の次の遺伝子又はオペロンの抑制又は活性化をもたらす遺伝回路の構築が、遺伝子発現の非常に細かい制御の手段として提案された。直線的（例えば、直列及びカスケード）並びに環状（例えば、連鎖）遺伝回路が共に作成された。例えば、米国特許公開２００１００１６３５４Ａｌ（Ｃｅｂｏｌｌａ  Ｒａｍｉｒｅｚら）を参照されたい。これらの遺伝回路は、機能するためには複数の異なるプロモーターを必要とする。商業的発酵においては、遺伝回路は、商業的発酵条件において有効であるプロモーターに依存する必要があろう。従って、商業的発酵において有用なより多くの種類のプロモーターが遺伝回路の分野で必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前述のように、商業的発酵系に使用するプロモーターは、発現が誘導時にのみ起こる（好ましくは発酵生産の後の方に行われる）ように、厳密に調節すべきである。プロモーターを誘導するために使用される化学物質は低コストで、宿主細菌（ｈｏｓｔ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び他の生物に対して低毒性でなければならず、しかも、遺伝子発現を厳密に調節しなければならない。前記考察に鑑みて、厳密に調節され且つ低毒性のインデューサーを用いて低コストで誘導される新規プロモーターが当業界で必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、商業的発酵における遺伝子発現に有用な新規プロモーターを提供する。より具体的な側面において、本発明は、細菌の商業的発酵系において使用することができるベンゾエート−誘導性プロモーター、アントラニレート−誘導性プロモーター及びタンデムプロモーターを提供する。
【００１９】
本発明は、
１５−２０ヌクレオチドリンカーによってシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の天然ベンゾエートプロモーターの−１０領域の上流に；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に見られる作動プロモーター核酸セグメントに結合したシュードモナス・フルオレッセンスの天然ベンゾエートプロモーターの−３５領域を含む単離及び／又は組換えベンゾエートプロモーター核酸；
ヌクレオチド配列がこのようなプロモーター核酸に少なくとも９０％相同である突然変異及び近縁プロモーター核酸；
ベンゾエートプロモーター・アクチベータータンパク質（ＢｅｎＲ）結合部位を更に含むこのようなプロモーター核酸；並びに
ベンゾエートプロモーター・アクチベータータンパク質コード配列を更に含み、且つこのようなアクチベータータンパク質コード配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示された天然、突然変異及び／又は切断型アクチベータータンパク質アミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有するベンゾエートプロモーター・アクチベータータンパク質をコード化するようなプロモーター核酸
を提供する。
【００２０】
本発明は、また、
１５−２０ヌクレオチドリンカーによってシュードモナス・フルオレッセンスの天然アントラニレートプロモーターの−１０領域の上流に；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に見られる作動プロモーター核酸セグメントに結合したシュードモナス・フルオレッセンスの天然アントラニレートプロモーターの−３５領域を含む単離及び／又は組換えアントラニレートプロモーター核酸；
ヌクレオチド配列がこのようなプロモーター核酸に少なくとも９０％相同である突然変異及び近縁プロモーター核酸；
アントラニレートプロモーター・アクチベータータンパク質（ＡｎｔＲ）結合部位を更に含むこのようなプロモーター核酸；並びに
アントラニレートプロモーター・アクチベータータンパク質コード配列を更に含み、且つこのようなアクチベータータンパク質コード配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示された天然、突然変異及び／又は切断型アクチベータータンパク質アミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有するアントラニレートプロモーター・アクチベータータンパク質をコード化するこのようなプロモーター核酸
を提供する。
【００２１】
本発明は、また、
自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターに及びその上流に、直接又はプロモーター間プロモーターリンカーによって結合した（即ち、共有結合した）非カタボライト抑制プロモーターを含むタンデムプロモーター（自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターのカタボライト抑制は克服され且つ／又は異なる改良されたプロモーター特性が示される）；
原核生物の、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターに及びその上流に、原生動物の非カタボライト抑制プロモーターを、直接又はプロモーター間ポリヌクレオチドリンカーによって共有結合させることを含む方法によって作成されるタンデムプロモーター；
プロモーター間ポリヌクレオチドリンカーが約１００ヌクレオチド又はそれ以下の長さであるこのようなタンデムプロモーター；
成分非カタボライト抑制プロモーター及び自然の状態でカタボライト抑制されたプロモーターが原核生物プロモーター又は細菌プロモーターであるこのようなプロモーター；成分プロモーターがシュードモナス菌及び近縁細菌の、及び／若しくはシュードモナス属の種々の種の同一のもの、並びに／又はシュードモナス・フルオレッセンスからのから得られたタンデムプロモーター；成分プロモーターが、代替炭素源利用酵素又は経路をコード化する遺伝子又はオペロンから得られるタンデムプロモーター；非カタボライト抑制プロモーターが、アントラニレート分解経路をコードするオペロンから得られ且つ自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターが、ベンゾエート分解経路をコード化するオペロンから得られ、且つ／又はアントラニレートプロモーター及びベンゾエートプロモーターが前段落で要約されたものの中から選ばれるタンデムプロモータ−；更に
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３に見られる又はそれに示される成分プロモーターから構築される作動タンデムプロモーター
を提供する。
【００２２】
本発明は、また、
特許請求の範囲に記載されたプロモーターのいずれか１つの塩基配列若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１２７５−１３０７の塩基、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１２３９−１２７４の塩基及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも１３２９−１５０９の塩基のいずれかの１つの配列と少なくとも９０％同一で且つ非相同である塩基配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを獲得し；前記ポリヌクレオチドを、原核生物宿主細胞中における直接転写能力に関して及び、場合によっては、少なくとも１つのプロモーター特性に関してスクリーニングし；その結果に基づいて、少なくとも１つのプロモーター（場合によっては少なくとも１つの改良された特性を有する）を同定することを含む方法によって作成される改変プロモーター；並びに
特許請求の範囲に記載されたプロモーターのいずれか１つの塩基配列若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１２７５−１３０７の塩基、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１２３９−１２７４の塩基及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも１３２９−１５０９の塩基のいずれか１つのの配列を有するプロモーターポリヌクレオチドを、それと少なくとも９０％相同である配列改変ポリヌクレオチドのためのハイブリッド形成プローブとして用い、又は前記プロモーターポリヌクレオチドに対して突然変異誘発及び／若しくは組換えを実施して前記配列改変ポリヌクレオチドを作成し、又は前記プロモーターポリヌクレオチドの塩基配列を示す情報ストリングを用いて、それに少なくとも９０％相同である非相同ストリングを検索し且つ前記非相同ストリングによって示される塩基配列を有する配列改変ポリヌクレオチドを提供し；又はこのような情報列をこのような非相同ストリングに変更し、前記変更ストリングを用いてそれと同一の情報ストリングを同定し、次いで前記情報ストリングによって示される塩基配列を有する配列改変ポリヌクレオチドを提供し；その後に、前記配列改変ポリヌクレオチドを、原核生物宿主細胞中における直接転写能力及び少なくとも１つのプロモーター特性に関してスクリーニングし；その結果に基づいて、少なくとも１つの改良された特性を有する少なくとも１つのプロモーターを同定する方法によって作成された改良プロモーター
を提供する。
【００２３】
本発明はまた、
相補体がストリンジェントなハイブリッド形成及び洗浄条件下で、特許請求の範囲に記載されたプロモーターの任意の１つの又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１２７５−１３０７の塩基、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１２３９−１２７４の塩基及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも１３２９−１５０９の塩基のいずれか１つの塩基配列を有する核酸塩基ポリマー分子とハイブリッド形成する核酸配列を含んでなる単離核酸分子であって、原核生物細胞中でプロモーターの役割をするもの；並びに
特許請求の範囲に記載されたプロモーターのいずれか１つの又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１２７５−１３０７の塩基、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１２３９−１２７４の塩基及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも１３２９−１５０９の塩基のいずれかの１つの塩基配列と少なくとも９０％等しい塩基配列を有する原核生物プロモーターポリヌクレオチド分子の塩基配列を有する単離核酸塩基ポリマー分子
を提供する。
【００２４】
本発明はまた、
特許請求の範囲に記載されたプロモーターのいずれか１つの若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１２７５−１３０７の塩基、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１２３９−１２７４の塩基及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３の少なくとも１３２９−１５０９の塩基のいずれか１つの塩基配列に少なくとも９０％等しい塩基配列を含むプロモーターを含む、原核生物細胞中で発現構成体の役割をすることができる組換え核酸分子；ｍＲＮＡコード化配列を含むこのような発現構成体；前記発現構成体がベクターであるこのような組換え発現構成体；前記ベクターがプラスミドであるこのような組換え発現構成体；任意のこのような組換え発現構成体、及び好ましくは更に、前記組換え発現構成体のプロモーターに関連するアクチベータータンパク質をコード化する遺伝子の少なくとも１つのコピー、より好ましくは１つより多いコピーを含む遺伝子改変原核生物宿主細胞（前記遺伝子は前記宿主細胞中で発現される）；組換え発現構成体のプロモーターに関連したアクチベータータンパク質をコード化する遺伝子の、好ましくは少なくとも１つのコピー、より好ましくは１つより多いコピーを含む（前記遺伝子は宿主細胞中で発現される）このような遺伝子改変原核生物宿主細胞を含んでなる発現系；並びに前記プロモーターがベンゾエート誘導性プロモーターであり且つ前記アクチベータータンパク質が、Ａｓｎ１５２を場合によっては含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残余（又は残基）（ｒｅｓｉｄｕｅ）１−３３５又は２１−３３５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するこのような発現系；及び前記プロモーターがアントラニレート誘導性プロモーターであり且つ前記アクチベータータンパク質が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残余１−３３０若しくはＡｌａ２６８を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残余１−３３０のいずれかのアミノ酸配列を有するこのような発現系
を提供する。
【００２５】
本発明は、また、
このような遺伝子改変原核生物宿主細胞を成長させ、その中で組換え発現構成体を誘導し、その結果、それによってコード化される転写産物を発現させることを含んでなる転写産物の作成方法；及びこのような転写産物作成方法を用いてｍＲＮＡ転写産物を発現させ、更に宿主細胞に前記ｍＲＮＡをそれによってコード化されるポリペプチドに翻訳させることを含んでなるポリペプチドの生産方法
を提供する。
【００２６】
本発明はまた、原核生物細胞中で作動する転写アクチベータータンパク質を提供する。これらは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残余１−３３５、Ａｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残余１−３３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残余２１−３３５及びＡｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残余２１−３３５のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有する転写アクチベータータンパク質；並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残余１−３３０又はＡｌａ２６８を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基余１−３３０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列を有する転写アクチベータータンパク質を含む。本発明は、また、このような転写アクチベータータンパク質をコード化する塩基配列を含むポリヌクレオチド分子を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
図１は本発明に係るベンゾエート誘導性プロモーターＰｂｅｎ５０９を含むベクターであるｐＤＯＷ１０１９のプラスミドマップを示す。
【００２８】
図２は本発明に係るベンゾエート誘導性プロモーターＰｂｅｎ２７８を含むベクターであるｐＤＯＷ１０２８のプラスミドマップを示す。
【００２９】
図３は本発明に係るアントラニレート誘導性プロモーターを含み、そのアクチベータータンパク質のコード配列を含むベクターであるｐＤＯＷ１０３５のプラスミドマップを示す。
【００３０】
図４は本発明に係るアントラニレート−ベンゾエートタンデムプロモーターを含むベクターであるｐＤＯＷ１０５７のプラスミドマップを示す。
【００３１】
図５はＰｂｅｎ５０９ベンゾエート誘導性プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｃ９９４−ｃ１５０２）及びＰｂｅｎ２７８ベンゾエート誘導性プロモータター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｇ１２２８−ｃ１５０２）のヌクレオチド配列の比較を示す。上流のＯＲＦのＴＴＡ翻訳停止点、推定上の−３５領域（ＴＴＧＡＣＧ）、−１０領域（ＴＡＣＧＧＴ）及び「Ｃ」転写開始点に下線を引いてある。Ｐｂｅｎ２７８配列中の二重下線を引いた「Ｃ」は、Ｐｂｅｎ５０９及びそのゲノム配列と異なるＰｂｅｎ２７８中の突然変異を示す。この突然変異は、ＰＣＲ増幅中に導入された。
【００３２】
図６は安息香酸ナトリウム０ｍＭ（白グラフ）若しくは１０ｍＭ（黒グラフ）の存在下における、Ｐｂｅｎ５０９（ｐＤＯＷ１０１９）又はＰｂｅｎ２７８（ｐＤＯＷ１０２８）の制御下にあるβ−ガラクトシダーゼ導入を示す棒グラフを示す。ｐＤＯＷ１０１７はプロモーターを含まないベクターである。示した結果は誘導後２４時間において検定されたトリプリケートのウェルからの平均測定値である（宿主細胞は誘導前に２４時間、所定の塩培地中で成長させた）。
【００３３】
図７は４種のＰａｎｔプロモーター：Ｐａｎｔ＋ＡｎｔＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のａ１−ｃ１３９５）、Ｐａｎｔ７１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ５９２−ｃ１３０４）、Ｐａｎｔ７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ５９２−ｇ１２８８）及びＰａｎｔ３１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ９９４−ｃ１３０４）のヌクレオチド配列の比較を示す。二重下線を引いたヌクレオチドトリプレット（ＴＣＡ及びＣＡＴ）はそれぞれ、示されたストランドに相補的なストランドによってコード化される、ＡｎｔＲ  ＯＲＦの停止及び開始コドンを示す。二重下線を引いた単独の「Ａ」は、ＡｎｔＲコード配列内にある、両ストランド上において確認されるゲノム配列からの突然変異を示し；この変化は、ＡｎｔＲタンパク質中のアラニンからセリンへの発現変化をもたらす。推定上の−３５領域（ＡＴＡＧＣＣ）、−１０領域（ＣＴＴＡＡＴ）、転写開始点（「Ａ」）及び推定上のリボソーム結合部位（ＧＧＡＧＧ）の相補体は全て下線を引いてある。
【００３４】
図８は５ｍＭのアントラニレート又は２ｍＭの６−クロロアントラニレートで誘導された場合における、Ｐａｎｔ７１３構成体（ｐＤＯＷ１０２９）の活性をａｎｔＲ／Ｐａｎｔ構成体（ｐＤＯＷ１０３５）の活性と比較するグラフを示す。全ての構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）において、プロモーターはβ−ガラクトシダーゼコード化配列に融合させた。β−ガラクトシダーゼレセプターの活性を、誘導後８時間の時間的経過にわたって追跡した。結果は、誘導後のｐＤＯＷ１０３５の活性はｐＤＯＷ１０２９の活性よりもはるか速く起こり且つはるかに高いことを示している。
【００３５】
図９はＰａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター構成体の誘導及び成分プロモーター構成体の誘導を示す棒グラフを示す。全ての構成体において、プロモーターは、β−ガラクトシダーゼコード化配列に融合させた。ベンゾエート又はアントラニレートによるＰａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター構成体（ｐＤＯＷ１０５７）の誘導を、成分プロモーターの１つを含む構成体：Ｐｂｅｎ２７８を含むＰｂｅｎプロモーター構成体（ｐＤＯＷ１０２８）及びａｎｔＲ／Ｐａｎｔを含むＰａｎｔプロモーター構成体（ｐＤＯＷ１０３５）の誘導と比較して示す。図９Ａは誘導後５時間の結果を示し、図９Ｂは誘導後２４時間の結果を示す。
【００３６】
図１０はＰｂｅｎ５０９の活性と、Ｐｂｅｎ５０９の誤りがちなＰＣＲによって作成された、改良突然変異体２ｄ３及び２１ｂ５の活性との棒ブラフ比較を示す。発現構成体は、プロモーター含有フラグメントをｐｈｏＡレセプター遺伝子に融合させることによって形成した。構成体を含む培養物は、１０ｍＭのベンゾエートによって誘導し、アルカリホスファターゼの活性を誘導の２４時間後に測定した。
【００３７】
図１１はＰｂｅｎ５０９のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃ９９４−ｃ１５０２のヌクレオチド）と、誤りがちなＰＣＲによって作成された２つのその改良突然変異体：突然変異体２ｄ３（ａ１１０６→ｔ１１０６である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃ９９４−ｃ１５０２のヌクレオチド）及び突然変異体２１ｂ５（ｃ１２２３→ｔ１２２３及びｇ１３０２→ａ１３０２である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃ９９４−ｃ１５０２のヌクレオチド）のヌクレオチド配列の比較を示す。上流のＯＲＦのＴＴＡ翻訳停止点、推定上の−３５領域（ＴＴＧＡＣＧ）、−１０領域（ＴＡＣＧＧＴ）及び「Ｃ」転写開始点には下線を引いてある。突然変異は二重下線を引いて示してある。
【００３８】
図１２は２０Ｌ発酵条件におけるアントラニレート誘導発現のグラフを示す。ａｎｔＲ／Ｐａｎｔ構成体ｐＤＯＷ１０３５（黒四角）及びタンデムプロモーター構成体ｐＤＯＷ１０５７（黒三角）を、５ｍＭアントラニル酸ナトリウム＋１ｍＭ／時のアントラニレート供給材料によって誘導した。各２０Ｌ発酵ランに関する活性レベルを示してある。
【００３９】
図１３は宿主細胞（シュードモナス・フルオレッセンス）中のａｎｔＡ遺伝子の単一交差ノックアウトによって作成されたａｎｔＡノックアウト宿主中のタンデムプロモーター構成体（ｐＤＯＷ１０５７）からの改良アントラニレート誘導発現を示すグラフを示す。結果は、約５ｍＭのアントラニル酸ナトリウムの目標レベルにおいて誘導された２０Ｌの発酵に関して示し、誘導後４８時間の時間的経過にわたって追跡してある。アントラニレート供給材料は必要でなかった。図１３Ａは、レセプター遺伝子構成体から発現されたβ−ガラクトシダーゼの活性を示し；図１３Ｂは、アントラニレート濃度の維持を示し、これは、ノックアウト宿主細胞がアントラニレートを代謝しないことを示している。
【００４０】
図１４はＰｂｅｎ−１０突然変異体の誘導を示す棒グラフを示す。図示したＰｂｅｎ：：ｐｈｏＡ融合物を含むＰ．フルオレッセンスのアルカリホスファターゼ活性を、０ｍＭ（白グラフ）又は５ｍＭ（黒グラフ）安息香酸ナトリウムを用いた２４時間の誘導後について示してある。トリプリケートのサンプルの代表的な実験を示してある。
【００４１】
図１５はＰａｎ−１０突然変異体の誘導を示す棒グラフを示す。示したＰａｎｔ：：ｐｈｏＡ融合物を含むＰ．フルオレッセンスのアルカリホスファターゼ活性を、０ｍＭ（白グラフ）又は５ｍＭ（黒グラフ）アントラニレートを用いた２４時間の誘導後について示してある。トリプリケートのサンプルの代表的な実験を示してある。
【００４２】
図１６は、ａｎｔＲ−Ｐａｎｔ３１１−Ｐｂｅｎタンデムプロモーターの活性に対するＰｂｅｎ８８−１０突然変異の影響を示す棒グラフを示す。示したタンデムプロモーター：：ｌａｃＺ融合物を含むＰ．フルオレッセンスのβ−ガラクトシダーゼ活性を、０ｍＭ（白グラフ）又は５ｍＭ（黒グラフ）安息香酸ナトリウム（図１６Ａ）又はアントラニレート（図１６Ｂ）を用いた２４時間の誘導後について示してある。トリプリケートのサンプルの代表的な実験を示してある。
【００４３】
図１７は、ｐＤＯＷ１０９０による多コピー中にｂｅｎＲが存在する場合における２０Ｌの発酵中のベンゾエート消費のグラフを示す。示したデータは、２つの２０Ｌ発酵槽の誘導全体にわたって、デュプリケート発酵：標識されたラン「０３０２１１Ｉ」（黒グラフ）及びラン「０３０２１１Ｋ」（黒グラフ）においてベンゾエートの濃度を測定するＨＰＬＣ分析である。
【００４４】
図１８は、タンデムプロモーター構成体の活性の棒グラフ比較を示す。示したタンデムプロモーター：：ｌａｃＺ融合物を含むＰ．フルオレッセンスのβ−ガラクトシダーゼ活性（ａｎｔアクチベーター−Ｐａｎｔ３１１：：ｌａｃＺであるｐＤＯＷ１０３５；ｂｅｎアクチベーターＰｂｅｎ８８-１０コンセンサス：：ｌａｃＺであるｐＤＯＷ１１２６を除く）を、０若しくは５ｍＭ安息香酸ナトリウムによる導入後（図１８Ａ及び１８Ｂは２、４及び２４時間の時点について）又はアントラニレートによる導入後（図１８Ｃ及び１８Ｄは０、２、６及び２４時間の時点について）に関して示してある。トリプリケートのサンプルの代表的実験を示す。時点は文字「Ｉ」によって「導入後」として示してある。
【００４５】
図１９は、ｂｅｎＡＢノックアウト菌株におけるＰｂｅｎ活性の分析を示す棒グラフを示す。ｐＤＯＷ１０１９（Ｐｂｅｎ２７８：：ｌａｃＺ）を保持するＰ．フルオレッセンスＭＢ１０１  ｂｅｎＡＢノックアウト菌株のβ−ガラクトシダーゼ活性を、０ｍＭ（白グラフ）又は５ｍＭ（黒グラフ）安息香酸ナトリウムによる誘導の結果として２４時間までに関して示してある。細胞はＬＢ培地で成長させた。
【００４６】
本発明は、細菌の商業的発酵系において使用できる、商業的に有用なベンゾエート誘導性プロモーター、アントラニレート誘導性プロモーター及びタンデムプロモーターを提供する。このような系に使用するのに好ましい細菌宿主細胞としては、シュードモナス菌及び近縁細菌が挙げられる。これらのプロモーターの化学的インデューサーとしては、安息香酸及びアントラニル酸、それらの有効な化学類縁物質並びにそれらの生物学的に許容され得る塩が挙げられる。
【００４７】
安息香酸及びアントラニル酸並びにそれらの生物学的に許容され得る塩、好ましくはナトリウム若しくはカリウム塩は、毒性の低い安価な化学物質であり、シュードモナス菌及び近縁細菌を含む細菌宿主細胞によって（代替）炭素源として利用されることができる。例えば、これらの化学的インデューサーは、グラムあたり約０．１５ＵＳ＄未満で市販されている（これに対して、ＩＰＴＧはグラム当たり約１８ＵＳ＄又は３６ＵＳ＄である）。
【００４８】
本発明者らは、グルコースの不存在下においてベンゾエートによって誘導されることができるＰ．フルオレッセンスのベンゾエート（ｂｅｎＡＢＣＤ）分解遺伝子及びアントラニレートによって誘導されることができるＰ．フルオレッセンス（ａｎｔＡＢＣ）分解遺伝子の発現を引き起こす天然プロモーターを単離し、配列決定し、特性決定した。（これらのオペロンの発現産物は、それぞれ、シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡ中でベンゾエート及びアントラニレートの分解を引き起こす異化経路酵素である）。これらのプロモーターは、５ｍＭ安息香酸ナトリウム及び５ｍＭアントラニル酸ナトリウムで誘導する場合に、外来性遺伝子の発現をベンゾエートプロモーターの場合には約２５０倍、且つアントラニレートプロモーターの場合には約２５から約３５倍誘導できることが判明した。本発明者らは、これらのプロモーターが、シュードモナス菌及び近縁細菌を含む細菌宿主細胞においてタンパク質及び化学物質を生成するために、商業的発酵系に使用するのに充分に誘導性であることを見い出した。
【００４９】
更に、本発明者らは、非カタボライト抑制プロモーターが、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターの上流で連結され、タンデムプロモーター構成体を作成した。それによって、意外なことに、それらは自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターのカタボライト抑制を克服し且つ／又はそれによって異なる改良特性（例えば誘導強度の増加又は調節の厳格さの増加）を示す。タンデムプロモーター構成体の少なくとも１つの例が、外来遺伝子の発現に関して記載されている［６］。しかし、この例は同一プロモーターＰｌａｃの２つのコピーのタンデム配列であり、この参考文献は、タンデムＰｌａｃ−Ｐｌａｃプロモーターが単一Ｐｌａｃプロモーターよりも有利であることを示唆する証拠を示していない。同様に、異なる種又は属において作動する２つのプロモーターが、２つの異なる種又は属のいずれにおいても遺伝子が発現され得るように同一遺伝子に作動可能なように結合されたデュアルプロモーター構成体、例えば、シャトルベクターに使用されるものが知られている。
【００５０】
これらのタンデム及びデュアルプロモーター構成体とは異なり、２つの同一でないプロモーターがタンデム配列で配置されたタンデムプロモーター構成体のこの作成は意外なことに、両プロモーターの有利な特性を保持することが判明した。例えばアントラニレートプロモーターＰａｎｔ及びベンゾエートプロモーターＰｂｅｎのタンデム配列は、発酵条件下でアントラニレートによって誘導された場合に、カタボライト抑制がなく（Ｐｂｅｎが持たない、Ｐａｎｔの望ましい特徴）、且つ誘導強度が改良されている（Ｐａｎｔが持たない、Ｐｂｅｎの望ましい特徴）タンデムプロモーターの形成を引き起こす。従って、本発明のタンデムプロモーターは、個々のプロモーター成分の望ましい特性を保持することができ、その結果、得られるタンデムプロモーターが改良された特性：例えば誘導強度の増加、若しくは調節の厳密さの増加（即ちプロモーターのアクチベーター又はリプレッサータンパク質の当該インデューサーとの接触時にのみ転写）；及び／又はカタボライト抑制の欠如を示すことができる。
【００５１】
用語解説
Ａ＃＃＃（吸収）
本明細書中において分析検出に関して使用される「Ａ４５０」のような用語は、「４５０ｎｍの波長における吸収」を意味する。
【００５２】
単数形
本明細書及び添付した「特許請求の範囲」において使用する単数形は、前後関係からそうでないことが明確でない限り、単数及び複数の対象を両方含む。従って、例えば、「宿主細胞（ａ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」への言及は事実上、単一の宿主細胞のみを使用するそれらの実施態様、単一型の複数の宿主細胞を使用するそれらの実施態様及び複数の型の複数の宿主細胞を使用するそれらの実施態様を全て定義する。
【００５３】
*（アステリスク）
本明細書中で計算に関して使用する「*」記号（アステリスク）は、数学的乗法機能を示す。
【００５４】
ＢＣＩＰ
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、例えばその二価の塩、例えば二ナトリウム塩。これは、例えば以下のようなテトラゾリウム塩と共に使用される。Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）のハロゲン化物塩、例えばビス−［２−（４−イル−２−メトキシフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド］；又はＩｏｄｏｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍとも称するＩｎｄｏ−Ｎｉｔｒｏ−Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＩＮＴ）のハロゲン化物塩、例えば２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド。
【００５５】
含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）
本明細書中で使用する用語「含んでなる」（又は含む）は、対象が用語「含んでなる」の後に列挙された要素も、列挙されなかった任意の他の要素も含むことを意味する。この場合、用語「含んでなる」は広く且つ制限のない用語と解釈すべきであるので、列挙された要素を「含んでなる」対象に関する請求項は包括的に解釈すべきである、即ち、列挙された要素に限定されないと解釈すべきである。従って、用語「含んでなる」は、例えば、「有する」、「含む」又は「包含する」のような用語と同義であるとみなすことができる。
【００５６】
本明細書中に記載した本発明は、用語「含んでなる」及び「を特徴とする」を用いて記載されている。しかし、これよりも狭い意味を有する単語及び句もまた、本発明をより狭く説明し、定義し又は特許請求する際にこれらの制限のない用語の代わりとして役立つ。
【００５７】
対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）
本明細書中でポリヌクレオチド源「に対応する」配列記録に関して使用される用語「対応する」は、その配列記録内に情報ストリングとして含まれる所定の塩基配列が、そのポリヌクレオチド源内の物理的核酸塩基配列含有分子の形態で存在することを意味する。
【００５８】
ｄｄＨ2Ｏ
本明細書中で使用するｄｄＨ2Ｏは、Ｑ−ＧＡＲＤ精製パックを含むＭｉｌｌｉ−Ｑ勾配系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通して精製された蒸留、脱イオン水を表す。
【００５９】
ｄＮＴＰｓ
特に断わりのない限り、本明細書中でポリヌクレオチド合成反応用の試薬に関して使用する用語「ｄＮＴＰｓ」は、４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）のそれぞれの等モル溶液を意味する。従って、例えば１０ｍＭのｄＮＴＰｓへの言及はｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰのそれぞれを１０ｍＭ含む溶液を示す。
【００６０】
「外来性（Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」及び「外来（Ｆｏｒｅｉｇｎ）」
用語「外来性」とは、所定の細胞又は分子の「外部の源から」を意味する。本発明においては、当業界においてよく使用されるように、この用語は、同義語としての用語「外来」と同じように使用される。これらの用語はいずれも本明細書中において、所定の対象が所定の細胞又は分子（例えば、プロモーターポリヌクレオチド）にとって異物であること、即ち、自然状態では細胞中に検出されないこと及び／又は自然状態で分子と共に検出されることも分子に接続されることもないことを示す。
【００６１】
非相同（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）
本明細書中で使用する用語「非相同」は、配列が「非同一である」（塩基配列が１００％は同一でない）ことを意味する。
【００６２】
「中（ｉｎ）」及び「上（ｏｎ）」
増殖培地の使用による生物の成長に関して本明細書中で使用するように、生物は、培地「中」又は「上」で成長させると述べることができる。本発明の発現系において、培地は好ましくはゲル又は液体培地、より好ましくは水性ゲル又は液体培地、更に好ましくは水性液体培地である。従って、これに関連して、用語「中」及び「上」は、培地と接触している宿主細胞の成長を示すのに互いに同義で使用する。
【００６３】
情報ストリング
本明細書中で使用する句「情報ストリング」は、特定の１組の核酸の情報を示す１組のデータ成分（例えば、ビット、バイト又は英数字）を意味する。
【００６４】
ＩＰＴＧ
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド。
【００６５】
ＯＮＰＧ
Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドとしても知られる）。
【００６６】
ＯＲＦ
オープンリーディングフレーム（読み取り枠、翻訳領域）。
【００６７】
ＰＮＰＰ
ｐ−ニトロフェニルホスフェート、例えばその二価の塩、例えば二ナトリウム塩。４−ニトロフェニルホスフェートとも称する。
【００６８】
ポリヌクレオチド長
本明細書中で使用する用語「ヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの長さを記載するの用いる。しかし、これに関連して、この述語は、一本鎖ポリヌクレオチドに関するヌクレオチド自体の長さ及び二本鎖ポリヌクレオチドに関する塩基対の長さを表すものとする。
【００６９】
ポリヌクレオチド源
本明細書中で使用する句「ポリヌクレオチド源」は、所定の核酸塩基配列を含む核酸の物理的実施態様の全ての源、例えば核酸サンプル、クローン及びこのようなポリヌクレオチドを含む天然細胞を意味する。
【００７０】
プロモーターアクチベータータンパク質の用語
所定のプロモーターの天然のアクチベーターは、例えばＰｂｅｎ及びＰａｎｔプロモーターの天然アクチベーターのそれぞれに関するＢｅｎＲ、ＡｎｔＲのように、「Ｒ」を用いて示す。
【００７１】
プロモーターの用語
「Ｐａｎｔ」：Ｐ．フルオレッセンスのアントラニレートオペロンに関するプロモーター。
「Ｐｂｅｎ」：Ｐ．フルオレッセンスのベンゾエートオペロンに関するプロモーター。
「Ｐｌａｃ」：大腸菌のラクトースオペロンに関するプロモーター。
「Ｐｔａｎｄｅｍ」及び「タンデムプロモーター」：０から約１００個のヌクレオチドの配列によってカタボライト抑制プロモーターに又はその上流に非カタボライト抑制プロモーターが結合したプロモーターのタンデム（縦列）配列。これは本明細書中において、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター構成体によって例示される。
「プロモーター」：原核生物の「−３５領域から−１０領域」を含む少なくとも２５個、より普通には約３０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。好ましくは、この「−３５領域から−１０領域」は、単一遺伝子から得られる「−３５領域から−１０領域」であるか、あるいは同族遺伝子から得られる−３５領域と−１０領域との組合せであり、前記遺伝子は、少なくとも１種の原核生物から、より好ましくは「シュードモナス菌及び近縁種」の少なくとも１種の生物から得られる。好ましくは、「−３５領域から−１０領域」は、σ７０の「−３５領域から−１０領域」であり、組合せの「−３５領域」及び「−１０領域」はそれぞれ、σ７０の−３５領域及びσ７０の−１０領域である。
【００７２】
前記−３５領域は、好ましくは約１５〜約２０個のヌクレオチドからなるプロモーター内ポリヌクレオチドによって、−１０領域の上流に連結される。より好ましくは、本発明に係るプロモーターは、約３５個のヌクレオチドを含み、これは、「−３５領域から−１０領域」の他に、すぐ下流の約５〜約１０個のヌクレオチドのセグメント、より好ましくはすぐ下流の６〜７個のヌクレオチドのセグメントを含み、このセグメントは転写開始点ヌクレオチドで終了する。好ましい実施態様において、このセグメントは−３５又は−１０領域の少なくとも一方を提供するのと同一遺伝子から得られる。特に好ましい実施態様において、プロモーターはまたプロモーターアクチベータータンパク質結合部位、好ましくはＡｒａＣ／ＸｙｌＳクラス結合部位を含む約２０から約２５０個の、より好ましくは約４０から約１５０個のヌクレオチドからなるすぐ上流の領域を含む。好ましい実施態様において、結合部位領域は−３５又は−１０領域の少なくとも一方を提供するのと同じ遺伝子から得られる。
【００７３】
本明細書中で使用する用語「−３５領域」又は「マイナス３５領域」は、転写開始点を「＋１」として、転写開始点から約３５ヌクレオチド上流で（即ち、５’の方向で）始まる５−６ヌクレオチドの配列を示す。同様に、用語「−１０領域」又は「マイナス１０領域」は、転写開始点を「＋１」として、転写開始点から約１０ヌクレオチド上流で（即ち、５’の方向で）始まる５−６ヌクレオチドの配列を示す。
【００７４】
ＲＮＡ用語
本明細書中で使用する以下のＲＮＡ用語は、以下に列挙した定義を有する。
ａＲＮＡ：アンチセンスＲＮＡ。
ｃＲＮＡ：細胞質ＲＮＡ。
ｇＲＮＡ：ガイドＲＮＡ（ミトコンドリア・プレｍ−ＲＮＡの編集のための）。
ｈｎＲＮＡ：異核ＲＮＡ。
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ。
ｍｉＲＮＡ：ミクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ発現の調節のための）。
ｍｔＲＮＡ：ミトコンドリアＲＮＡ。
ｎＲＮＡ：核ＲＮＡ。
ｎｃＲＮＡ：非コードＲＮＡ。
ｐＲＮＡ：パッケージングＲＮＡ（ウィルス及びファージ粒子アセンブリ）。
ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ。
ｓａｔＲＮＡ：サテライトＲＮＡ。
ｓｃＲＮＡ：細胞質低分子ＲＮＡ。
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）。
ｓｎＲＮＡ：核内低分子ＲＮＡ。
ｓｎｏＲＮＡ：核小体低分子ＲＮＡ。
ｓｒｐＲＮＡ：シグナル認識粒子ＲＮＡ。
ｓｔＲＮＡ：一時的低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ）。
ｔＲＮＡ：トランスファーＲＮＡ。
ｔｍＲＮＡ：トランスファー−メッセンジャー様ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ−ｌｉｋｅ  ＲＮＡ）（それに続く分解のために、失速したリボソーム中の未完成ポリペプチドを標識するための）。
ｖＲＮＡ：ウィルス（及び／又はファージ）ＲＮＡ。
【００７５】
検索
本明細書中で情報の探索に関して使用する用語「検索」は、同一又は非同一情報ストリングを同定するために既知の情報ストリングと他の情報ストリングとの間の１つ又はそれ以上の比較を実施する（手動、目視又は自動手段によって）ことを意味する。
【００７６】
配列記録
本明細書中において使用する「配列記録」は、コンピューター可読記録又は紙記録のような１つ又はそれ以上の情報ストリングの貯蔵態様を意味する。
【００７７】
−１０変異プロモーターの名称
「−１０ｃｏｎ」：天然の−１０領域がコンセンサス−１０配列「ｔａｔａａｔ」と置き換えられた変異プロモーターを示す。
「−１０ｂｅｎ」：天然−１０領域がＰ．フルオレッセンスのＰｂｅｎからの−１０領域「ｔａｃｇｇｔ」で置き換えられた変異プロモーターを示す。
「−１０ｂｅｎＡｃ」：天然−１０領域がアシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）Ｐｂｅｎからの−１０領域「ｔａａｇｇｔ」で置き換えられた変異プロモーターを示す。
「−１０ｗｔ」：野生型−１０配列を保持する切断型天然プロモーターを示す。
【００７８】
〜（波形記号）
〜記号（波形記号）は、本明細書中においては「約」を示すのに用いる。
【００７９】
×（掛け算）
溶液の濃度に関して本明細書中で使用する×記号（掛け算記号）は、例えば、同一溶液組成に関して（即ち、溶液中に含まれる全成分の同一相対量に関して）５×配合物は１×配合物の５倍濃縮されていることを意味する。
【００８０】
Ｔｒｉｓ
本明細書中で使用する「Ｔｒｉｓ」は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡから市販されている）を意味する。
【００８１】
Ｘ−ｇａｌ
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
【００８２】
一般的な材料＆方法
特に断らない限り、分子生物学の分野において知られている標準的な技法、ベクター、制御配列成分及び他の発現系成分を、核酸の操作、形質転換及び発現に使用する。このような標準的な技法、ベクター及び成分は、例えば以下に記載されている：Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；及びＢｕｋｈａｒｉら（編）、ＤＮＡ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｎｄ  Ｅｐｉｓｏｍｅｓ（１９７７）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【００８３】
本発明のプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスからのベンゾエートプロモーター、シュードモナス・フルオレッセンスからのアンニレートプロモーター及びそれらの誘導体を含む。本発明のプロモーターはまた自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターの上流に連結された非カタボライト抑制プロモーターを有するタンデムプロモーターを含み、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターのカタボライト抑制は克服され且つ／又は異なる改良プロモーター特性が示される。
【００８４】
本発明のプロモーターは、発現系に使用する場合には一般にＤＮＡの形態である。しかし、プロモーターの核酸塩基配列はＤＮＡ、ＲＮＡ又は当業界で知られた全ての核酸類縁物質、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の形態で存在し得る。
【００８５】
ベンゾエートプロモーター
好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスの天然ベンゾエートプロモーター又はその改良突然変異体である。本発明者らは、このプロモーターが安息香酸、安息香酸類縁物質（例えばｍ−トルイル酸）及び生物学的に許容され得るその塩（例えば安息香酸ナトリウム）で誘導できることを見い出した。
【００８６】
好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、１５−２０ヌクレオチドリンカーによってシュードモナス・フルオレッセンスの天然プロモーターの−１０領域の上流に結合したシュードモナス・フルオレッセンスの天然プロモーターの−３５領域を含んでなる。好ましい実施態様において、リンカーは１５ヌクレオチドの長さである。
【００８７】
好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、１５−２０ヌクレオチドリンカーによってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２９６−１３０１の上流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１２８０を含む。好ましい実施態様において、リンカーは１５ヌクレオチドの長さである。特に好ましい実施態様において、リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２８１−１２９５であり、その結果、この好ましい実施態様のベンゾエートプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０１を含む。好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、長さが約６ヌクレオチドの、好ましくは６ヌクレオチドのスペーサーセグメントのすぐ上流に結合し且つ転写開始点としての役割とするヌクレオチドで終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０１を含む。好ましい実施態様において、スペーサーセグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１３０２−１３０７であり、その結果、この好ましい実施態様のベンゾエートプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０７を含む。
【００８８】
好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、「−３５から−１０領域」及びベンゾエートプロモーターアクチベーター（又はリプレッサー）タンパク質結合部位、好ましくはアクチベータータンパク質結合部位の両方を含む。好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、長さ約５０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０１を含む。好ましい実施態様において、本発明のベンゾーエートプロモーターは、長さ約４５ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０１を含む。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２７５の上流約５０ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２７４で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２７５の上流約４５ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２７４で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２２８−１２７４の配列を有し、それによってこの好ましい実施態様のベンゾエートプロモーターはヌクレオチド１２２８−１３０１の配列を含む。
【００８９】
好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、前記スペーサーセグメントのすぐ上流に結合し且つ前記スペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２７５−１３０１を含む。好ましい実施態様において、本発明のベンゾエートプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１２２８−１３０７を含む。
【００９０】
好ましい実施態様において、本発明に係るベンゾエートプロモーターを使用する発現系においては、宿主細胞はまたベンゾエートプロモーターアクチベータータンパク質をコード化する少なくとも１つの核酸を含み且つ発現する。更に好ましいのは、Ｐｂｅｎアクチベータータンパク質をコード化するこのような核酸の複数の発現コピーの使用である。好ましい実施態様において、Ｐｂｅｎアクチベータータンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２若しくはその残基１５２（Ａｓｎ）変異体のアミノ酸配列、又はＳＥＱ  ＮＯ：２の残基２１−３３５若しくはその残基１５２（Ａｓｎ）変異体のアミノ酸配列を有するであろう。好ましい実施態様において、Ｐｂｅｎアクチベータータンパク質をコード化する核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の塩基２８５−１２２９若しくは突然変異によるその塩基６７９変異体の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の塩基２２５−１２２９若しくは突然変異によるその塩基６７９変異体；あるいはこれらのいずれかの相補体；あるいはこれらのいずれかのＲＮＡ相当物を含む。
【００９１】
アントラニレートプロモーター
好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスの天然のアントラニレートプロモーター又はその改良突然変異体である。本発明者らは、このプロモーターがアントラニル酸、アントラニル酸類縁物質（例えば、ハロアントラニル酸）及び生物学的に許容され得るその塩（例えば、アントラニル酸ナトリウム）並びにｏ−トルエート（ｏ−トルエートは、アントラニレートと同様にこのプロモーターを誘導することが判明した）で誘導できることを見い出した。
【００９２】
好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、１５−２０ヌクレオチドリンカーによって、より好ましくは１６−１９ヌクレオチドリンカーによってシュードモナス・フルオレッセンスの天然アントラニレートプロモーターの−１０領域の上流に結合したシュードモナス・フルオレッセンスの天然アントラニレートプロモーターの−３５領域を含む。好ましい実施態様において、リンカーは１９ヌクレオチドの長さである。
【００９３】
好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、１５−２０ヌクレオチドリンカーによってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２６４−１２６８の上流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２４４を含んでなる。好ましい実施態様において、リンカーは１９ヌクレオチドの長さである。特に好ましい実施態様において、リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２４５−１２６３であり、その結果、この好ましい実施態様のアントラニレートプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さが約６ヌクレオチドの、好ましくは６ヌクレオチドのスペーサーセグメントのすぐ上流に結合し且つ転写開始点としての役割をするヌクレオチドで終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、スペーサーセグメントはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２６９−１２７４であり、その結果、この好ましい実施態様のアントラニレートプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２７４を含む。
【００９４】
好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、「−３５から−１０領域」及びアントラニレートプロモーターアクチベーター（又はリプレッサー）タンパク質結合部位、好ましくはアクチベータータンパク質結合部位の両方を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約２５０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約２００ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約１５０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約１２０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約１１０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約１００ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約８５ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約８０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約７５ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約７０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約６５ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約６０ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約５５ヌクレオチドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、長さ約５０ヌクレオ��ドのスペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２６８を含む。
【００９５】
好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約１００ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約８５ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約８０ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約７５ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約７０ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約６５ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約６０ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域は、ヌクレオチド１２３９の上流約５５ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域はヌクレオチド１２３９の上流約５０ヌクレオチドから始まり且つヌクレオチド１２３８で終了する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される領域の配列を有する。好ましい実施態様において、スペーサー領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１１３９−１２３８の配列を有し、それによってこの好ましい実施態様のアントラニレートプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１１３９−１２３８の配列を含む。
【００９６】
好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、前記スペーサーセグメントのすぐ上流に結合し且つ前記スペーサー領域のすぐ下流に結合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１２３９−１２７４を含む。好ましい実施態様において、本発明のアントラニレートプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド１１３９−１２７４を含む。
【００９７】
好ましい実施態様において、本発明に係るアントラニレートプロモーターを使用する発現系においては、宿主細胞はまた、アントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質をコード化する少なくとも１つの核酸を含み且つ発現する。更に好ましいのは、Ｐａｎｔアクチベータータンパク質をコード化するこのような核酸の複数の発現コピーの使用である。好ましい実施態様において、Ｐａｎｔアクチベータータンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列又はその残基２６８（Ａｌａ）変異体を有する。好ましい実施態様において、Ｐａｎｔアクチベータータンパク質をコード化する核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の塩基１−９９０若しくはその塩基８０２変異体；あるいはこれらのいずれかの相補体；あるいはこれらのいずれかのＲＮＡ相当物の配列を含む。
【００９８】
突然変異体及び近縁アクチベータータンパク質並びにそれをコード化するポリヌクレオチド
突然変異体プロモーターを獲得するのに使用する下記と同じ方法を同様に用いて、突然変異アクチベータータンパク質並びにそのコード配列及び遺伝子を得ることができる。この場合、所定のアクチベータータンパク質をコード化する遺伝子の少なくとも一部、例えばそのコード配列の全て又は一部分は、ハイブリッド形成探索用のブローブとして使用するか又は前記プローブの形成に使用することもできるし；あるいは試験のために構造的に関連のある配列を探してデータベースを検索するために、それと同一の又は少なくとも９０％同一の情報ストリングの形態で使用される塩基配列を提供することもできる。同様に、アクチベータータンパク質のアミノ酸配列の全て又は一部分を、このような検索を実施するために情報ストリングとして使用することもできる。ハイブリッド形成又は生物情報検索によって同定された得られた配列は次に、プロモーター活性化活性及び／又は改良特性に関して試験する。
【００９９】
従って、本発明の範囲には更に以下のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であって且つ非相同であるアミノ酸配列を有する転写アクチベータータンパク質が含まれる：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５、Ａｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基１−３３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２１−３３５及びＡｓｎ１５２を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の残基２１−３３５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＰｂｅｎアクチベータータンパク質；並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０及びＡｌａ２６８を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の残基１−３３０のいずれかのアミノ酸配列を有するＰａｎｔアクチベータータンパク質。本発明はまた前記変異体及び近縁転写アクチベータータンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む。
【０１００】
タンデムプロモーター
好ましい実施態様において、本発明のタンデムプロモーターは、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターの上流に結合した（自然状態で）非カタボライト抑制されたプロモーターを含み、自然状態でカタボライト抑制された前記プロモーターのカタボライト抑制は克服され且つ／又は異なる改良プロモーター特性が示される。
【０１０１】
好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーター及び自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターはいずれも原核生物から選ばれる。好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーター及び自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターはいずれも細菌から選ばれる。好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーター及び自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターは、いずれも、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）；好ましくはグラム陰性プロテオバクテリアから選ばれる。好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーター及び自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターはいずれも、「シュードモナス菌及び近縁細菌」又は以下に定義するようなその亜群から選ばれる。
【０１０２】
好ましい実施態様において、両プロモーターは同一種から選ばれる。好ましい実施態様において、両プロモーターは、「シュードモナス菌及び近縁細菌」の間から、又は以下に定義するようなその亜群から選ばれた１つの属の同一種から、得られる。好ましい実施態様において、両プロモーターは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の生物から選ばれる。好ましい実施態様において、両プロモーターは、シュードモナス属の同一種から選ばれる。好ましい実施態様において、両プロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスから選ばれる。好ましい実施態様において、両プロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡから選ばれる。
【０１０３】
本発明に係るタンデムプロモーターに使用するために選ばれる個々のプロモーターは、活性化可能なプロモーター、抑制可能なプロモーター又はそれらの組合せであることができる。好ましい実施態様において、個々のプロモーターの少なくも１つ、好ましくは両方が活性化可能なプロモーターである。抑制可能なプロモーターがこのようなタンデムプロモーター中にプロモーター成分として存在する場合には、好ましくはタンデムプロモーターを使用する細胞は更にプロモーターの調節を媒介するリプレッサータンパク質の表現可能なコード配列の少なくとも１つのコピー、好ましくは１つより多いコピーを含む。活性化可能なプロモーターがこのようなタンデムプロモーター中にプロモーター成分として存在する場合には、好ましくはタンデムプロモーターを使用する細胞は更にプロモーターの調節を媒介するアクチベータータンパク質の表現可能なコード配列の少なくとも１つのコピー、好ましくは１つより多くのコピーを含む。
【０１０４】
好ましい実施態様において、両プロモーターは、細胞が代替炭素源を利用（例えば移入、搬出、輸送又は代謝）することを可能にすることができる酵素及び／若しくは経路をコード化する遺伝子又はオペロンの天然プロモーターとして得られる。好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーターは、生体触媒作用によってアントラニレートを分解できる酵素及び／若しくは経路をコード化する遺伝子又はオペロンの天然プロモーター、即ち「アントラニレートプロモーター」である。好ましい実施態様において、自然の状態でカタボライト抑制されたプロモーターは、生体触媒作用によってベンゾエートを分解できる酵素及び／若しくは経路をコード化する遺伝子又はオペロンの天然プロモーター、即ち「ベンゾエートプロモーター」である。好ましい実施態様において、アントラニレートプロモーターは、前述のアントラニレートプロモーターである。好ましい実施態様において、ベンゾエートプロモーターは前述のベンゾエートプロモーターである。
【０１０５】
好ましい実施態様において、本発明のタンデムプロモーターは、シュードモナス・フルオレッセンスの天然アントラニレートプロモーターをシュードモナス・フルオレッセンスの天然ベンゾエートプロモーターに、又はその上流に、連結することによって形成された構成体である。本発明者らはこのようなプロモーター配列がアントラニル酸、アントラニル酸類縁物質（例えばハロアントラニル酸）及び生物学的に許容され得るそれらの塩（例えばアントラニル酸ナトリウム）；安息香酸及び生物学的に許容され得るその塩；並びにｏ−トルエート（ｏ−トルエートはアントラニレートと同様にこのプロモーターを誘導することが判明した）によって誘導され得ることを見い出した。
【０１０６】
好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーターは、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターのすぐ上流に結合させる。この結合は、プロモーター間で直接（若しくはプロモーターを含む天然核酸セグメント間で直接）又は例えばプロモーター（若しくはセグメント）を互いに接続するポリヌクレオチドリンカーによって行うことができる。好ましい実施態様において、非カタボライト抑制プロモーターは、プロモーター間リンカーによって、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーターの上流に結合させる。好ましくは、ポリヌクレオチドリンカーが転写終結シグナルの役割をする配列を含まないならば、プロモーター間リンカーはポリヌクレオチドとする。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さが約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド１００未満のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド９０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド８０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド７０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド６０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド５０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド４０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド３０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド２０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド１０又はそれ以下のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さがヌクレオチド少なくとも約５、又は少なくとも約１０、又は少なくも約２０、又は少なくとも約３０、又は少なくとも約４０のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様において、プロモーター間リンカーは、長さがヌクレオチド約５−約５０、又は約１０−約５０、又は約２０−約５０、又は約３０−約５０のポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーは長さが４３ヌクレオチドのポリヌクレオチドである。好ましい実施態様においてプロモーター間リンカーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を有する。
【０１０７】
好ましい実施態様において、タンデムプロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１４３０−１５０３、１４３０−１５０９、１４７７−１５０３及び１４７７−１５０９からなる群から選ばれたベンゾエートプロモーター配列の上流に結合されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１２２１−１３６５、１２２１−１３７１、１３２９−１３６５及び１３２９−１３７１からなる群から選ばれたアントラニレートプロモーター配列を含む。好ましい実施態様において、本発明のタンデムアントラニレート−ベンゾエートプロモーターは、ベンゾエートプロモータータンパク質に関しては、「−３５から−１０領域」及びベンゾエートプロモーターアクチベーター（又はリプレッサー）タンパク質結合部位、好ましくはアクチベータータンパク質結合部位を含む。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１３２９−１５０３を含む。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１３２９−１５０９を含む。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１２２１−１５０３を含む。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１２２１−１５０９を含む。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１３２９−１５４４を含む。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のヌクレオチド１２２１−１５４４を含む。
【０１０８】
好ましい実施態様においてアントラニレートアクチベータータンパク質コード配列又はベンゾエートアクチベータータンパク質コード配列は、それぞれ、本発明のＰａｎｔ含有又はＰｂｅｎ含有タンデムプロモーターを用いる系中に含まれ、系内で発現される。タンデムプロモーターがＰａｎｔ及びＰｂｅｎを共に含む場合には、好ましくはアントラニレートプロモーターアクチベータータンパク質コード配列は、例えばＰａｎｔプロモーターに関して前述したアントラニレート−アクチベータータンパク質（ＡｎｔＲ）である。いずれの発現系においてもより好ましいのは、このような発現コード配列が多コピーで存在することである。
【０１０９】
タンデムプロモーターの構成に使用する天然プロモーター源
本発明に係るタンデムプロモーターは、原核生物細胞、好ましくは細菌細胞から、代替炭素源、即ちグルコース以外の炭素源の利用を引き起こす遺伝子又はオペロンコード化酵素からの天然プロモーターを得ることによって構成又は構築できる。好ましい実施態様において細菌細胞は「シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ）及び近縁細菌（ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」又は以下に定義するその１９種の亜群（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）のいずれかに属する細菌細胞の中から選ぶものとする。
【０１１０】
広範囲の代替炭素源を利用できる細菌が知られている。好ましい実施態様においてタンデムプロモーターを作成するために選ばれる天然プロモーターは以下の中から選ばれる少なくとも１種の代替炭素源に対する分解活性を有する酵素を発現する遺伝子又はオペロンから得るものとする。
【０１１１】
・直鎖、分岐鎖、環状及び脂環式ホモ−及びヘテロ−炭化水素（飽和又は不飽和）並びにそれらの誘導体；
・芳香族及びアルキルアリール化合物並びにそれらの誘導体、例えばベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、トルエン、キシレン、ビフェニル；
・複素環式化合物及びそれらの誘導体、例えばステロイド類、ステロール類、アラントイン類、環状テルペン類、ヨヒンビン類、インドール類、イミダゾール類、オキサジン類、キノリン類、フェナジン類、キサンテン類；
・アルコール類及びポリオール類並びにそれらの誘導体、例えばエタノール、フェノール、ナフトール、クレゾール、カテコール、グリセロール、ベンジルアルコール、メタノール；
・酸、エステル、無水物及びそれらの誘導体、例えばアセテート、サリチレート、ベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、アントラニレート、フタレート、ベンジルアルカノエート、ゲンチゼート、アミノ酸類（例えばグルタメート）；モノ−、ジ−及びトリ−カルボン酸；脂肪酸、脂質及び関連化合物；
・アルデヒド、ケトン、エーテル及びそれらの誘導体；
・ハロゲン化有機化合物及びそれらの誘導体、例えばクロロベンゾエート、クロロフェノール類、ヨードナフタレン、ブロモキシレン、フルオロペンタン、トリクロロプロパン；
・有機リン化合物及びそれらの誘導体、例えば有機ホスホネート、有機ホスフェート、有機ホスファイト、ホスファ化合物、ホスホ化合物；
・有機硫黄化合物及びそれらの誘導体、例えば有機スルホネート、有機スルフェート、有機スルファイト、チア化合物、チオ化合物；
・有機窒素化合物及びそれらの誘導体、例えば有機ナイトレート、ニトロ有機化合物（例えば、ニトロベンゾエート、ニトロフェノール）、シアノ化合物、ヒドラジン類、アミン類、イミン類、アミド類、イミド類、プリン類、ピリミジン類、アザ化合物、アゾ化合物；
・他のヘテロ有機化合物、例えば有機硼素化合物、有機珪素化合物、有機金属化合物、マルチ−ヘテロ原子−有機化合物；並びに
・多官能価有機化合物。
【０１１２】
これらの生分解活性をコード化する遺伝子及びオペロンは、前述のようにカタボライト抑制されていても非カタボライト抑制されていてもよい。その天然プロモーターは、当業者によって当業界でよく知られた方法によって、例えばこのような酵素をコード化するｍＲＮＡを単離し且つそれから作成されるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの核酸配列を用いて、対応するＤＮＡ遺伝子の発生に関して細菌ゲノム（又はそのゲノム配列の記録）を探索することによって、容易に得ることができる。これに続いて、コード配列のすぐ上流の（即ち、コード配列に対して５’の）ＤＮＡのセグメント中に位置する、転写開始点を含む調節領域を同定する。次いで、このような調節領域の核酸配列を含む発現構成体を形成し、発現構成体を、１種又はそれ以上の代替炭素源化合物による細菌宿主細胞における誘導に関して、グルコースの存在下及び不存在下の両方において試験する。これにより本発明に係るタンデムプロモーターの構築に使用できるカタボライト抑制プロモーター及び非カタボライト抑制プロモーターが提供される。
【０１１３】
（ａ）代替炭素源を利用する（例えば輸送、同化若しくは異化する）酵素をコード化するか、又は（ｂ）このような酵素をコード化する遺伝子及びオペロンからの発現を制御する調節遺伝子をコード化する、種々のカタボライト抑制及び非カタボライト抑制遺伝子及びオペロンが知られている。この型の典型的な遺伝子又はオペロンのプロモーターは、それからの転写が関連代替炭素源又はその類縁化合物の存在に依存するため、即ちその存在によって誘導又は抑制解除されるため、調節される。
【０１１４】
このようなカタボライト抑制遺伝子及びオペロンの例としては、例えば以下のものが挙げられる。
・スチレンをフェニルアセテートに転化するのに必要な酵素をコード化する、シュードモナス・フルオレッセンスＳＴのｓｔｙＡＢＣＤオペロン［Ｒｅｆ．８］；
・トルエンのベンゾエートへの転換及びキシレン類のトルエート類への変換に必要な酵素をコード化する、Ｐ．ピュチダｍｔ−２のｘｙｌＣＭＡＢＮオペロン［Ｒｅｆ．９］；
・アルカン及びアルケンの代謝に必要なアルカンヒドロキシラーゼを含む酵素をコード化する、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）のａｌｋＢＦＧＨＪＫＬオペロン［Ｒｅｆ．１０］；
・塩基性アミノ酸及びカルバペネム（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ）抗生物質、イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、チエナマイシン誘導体の取り込みを促進する特異的なポーリンをコード化する、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）遺伝子、ｏｐｒＤ［Ｒｅｆ．１１］；
・アルギニン及びオルチニンの輸送に必要な酵素をコード化するオペロンの一部分である、Ｐ．アエルギノーザ遺伝子、ａｏｔＪ［Ｒｅｆ．１２］；並びに
・分岐鎖アミノ酸の代謝に必要な分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体をコード化するオペロンの発現を調節するタンパク質をコード化する、Ｐ．ピュチダ及びＰ．アエルギノーザの遺伝子、ｂｋｄＲ［Ｒｅｆ．１３］。
【０１１５】
このような非カタボライト抑制遺伝子及びオペロンの例としては、例えば以下のものが挙げられる。
・二次トルエン流出系（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｅｆｆｌｕｘ  ｓｙｓｔｅｍ）の酵素をコード化するＰ．ピュチダＤＯＴ−Ｔ１ＥのｔｔｇＤＥＦオペロン［Ｒｅｆ．１４］；
・アルギニン誘導性ＮＡＤ（＋）依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコード化する、Ｐ．アエルギノーザ遺伝子、ｇｄｈＢ［Ｒｅｆ．１５］；並びに
・プロリン利用に必要な酵素をコード化するＰ．ピュチダｍｔ−２のｐｕｔＡ及びｐｕｔＰ遺伝子［Ｒｅｆ．１６］。
【０１１６】
プロモーター及びポリペプチドの突然変異及び近縁配列
好ましい実施態様のプロモーターから作成される突然変異プロモーターも公知の種々のランダム及び／又は定方向突然変異誘発技術のいずれかを用いて作成できる。好ましい実施態様において、部位特異的突然変異誘発を実施するものとする（例えば変異原性オリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発によって）。好ましい実施態様において、改良突然変異プロモーターは、プロモーターポリヌクレオチド上で行われる、誤りがちなポリメラーゼ連鎖反応（ＥＰ−ＰＣＲ）によって作成される突然変異体のライブラリーから選ぶものとする。前のラウンドから生じるポリヌクレオチドのプールについて、又はそれから選ばれた１種又はそれ以上の突然変異プロモーターについて、複数ラウンドの突然変異誘発を実施できる。改良プロモーターにおいて確認される有利な突然変異はまた、改良の更なる増加を得るために（例えば、累積改良のために）組合せることができる。
【０１１７】
非突然変異タンデムプロモーター（即ち個々のプロモーター成分自体が天然配列を有するタンデムプロモーター）について前述した方法の１つ又はそれ以上を実施することによって突然変異タンデムプロモーターを作成することに加えて、個々の突然変異プロモーターも本発明に係るタンデムプロモーターの形成において使用できる。例えば、本発明に係るタンデムプロモーターを形成するために、２種の突然変異プロモーターを連結することもできるし、又は突然変異プロモーターと非突然変異プロモーターを連結することもできる。更に、所定のラウンドにおいて複数のプロモーター−プロモーターの組合せを作成するために、定方向突然変異誘発及び／又は組換えを実施できる（例えば、ＷＯ  ９１／１６４２７に記載されたような方法を用いて）。
【０１１８】
近縁プロモーターは、当業界で知られた種々のプロトコールのいずれかに従って、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成プローブとしてタンデム及び／又は天然プロモーター構成体及び／又は成分を含むポリヌクレオチドを用いることによって得ることができる。ストリンジェントなハイブリッド形成プロトコールの代表例は以下に示す。あるいは、このようなプロモーターの塩基配列を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）又は他の核酸類縁物質をハイブリッド形成プローブとして使用できる。好ましくは、プローブは、塩基が少なくも約６個、少なくとも約８個、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個、少なくとも約４５個、又は少なくとも約５０個の長さの塩基配列を含むものとする。好ましい実施態様において、プローブは、塩基が約１００個以下、約８０個以下、約６０個以下又は約５０個以下の長さの塩基配列を含むものとする。好ましい実施態様において、プローブは、塩基が約２０から５０個、又は約２５から約４５個、又は約３０から約４０個の長さの塩基配列を含むものとする。
【０１１９】
標的核酸の、例えばプロモーターを含むことが少なくとも疑われる標的ＤＮＡのハイブリッド形成探索を実施するために、探索すべき標的ＤＮＡは、標準プロトコールに従って変性させ、ブロットし、ニトロセルロース又はナイロン膜に架橋させる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ］，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．］参照）。次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら若しくはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載されたようにして標準緩衝液を用いて、又はＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のような市販のハイブリッド形成緩衝液を用いてブロットをプレハイブリダイズする。プレハイブリダイゼーションは５０から６５℃の範囲の温度で実施することができる。
【０１２０】
使用するプローブ（アントラニレート又はベンゾエーロプロモーターフラグメントに相当する又はそれを含むＤＮＡ）を標識して、特異的に結合した標的ＤＮＡを同定することもできるし、且つ／又はプローブ核酸をプライマーとして使用して、特異的に結合した標的ＤＮＡを酵素的にコピーすることもできる。プローブは、公知の方法のいずれかに従って標識することができる。プローブは例えば以下のものと含むがこれらに限定されない任意の検出可能な標識で標識することができる。ペプチドタグ、免疫原性部分、アビジン、ビオチン、螢光又は着色部分、検出可能なキレート又は放射性核種部分。好ましい実施態様において核酸、好ましくはＤＮＡをプローブとして使用する。好ましい実施態様においてプローブのＤＮＡを標識する。好ましい実施態様において標識は放射性部分、例えばγ−32Ｐ  ｄＡＴＰのような放射性核種含有化合物である。このような標識を実施するためのキットは市販されており、例えばＨＩＧＨ  ＰＲＩＭＥ  ＤＮＡ標識キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）は、γ−32Ｐ  ｄＡＴＰのような放射性核種含有ヌクレオシド−５’−三リン酸と共に使用することができる。プローブ又は標識プローブは、次に、煮沸し、プレハイブリダイゼーション緩衝液に添加する。ブロットをプローブと共に５０から６５℃において一晩インキュベートし、次いで室温において２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳで１回当たり５分間として２回洗浄する。次に、ブロットを５０から６５℃において０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回当たり１５分間として２回洗浄する。次いで、特異的に結合した標識プローブを視認するために、ブロットを必要に応じて展開する。例えば、放射性核種部分をプローブ上の標識として使用する場合には、ブロットを用いて、視認のためにフィルム又は螢光スクリーンを露光する。
【０１２１】
あるいは、既知のプロモーター成分（即ち介在配列を有する−３５及び−１０の配列）に、又は既知のアクチベータータンパク質結合部位にハイブリッド形成するオリゴ又は１組のオリゴを設計することもできるし；少なくとも１つが当該標的配列にハイブリッド形成できる１組の変性オリゴを設計することもできる。これらは前述のようなサザンブロット分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）用のプローブとして使用することもできるし、あるいは当該プロモーターと相同であることができる一本鎖（１オリゴ）又は二本鎖（２オリゴ）ＤＮＡの合成の開始に使用することもできる。ＤＮＡ合成は、例えばＴａｑポリメラーゼによって（伸長は７２℃において又は製造メーカーのプロトコールに示されるようにして実施）又は他のポリメラーゼによって、製造メーカによって供給される緩衝液、濃度１−５ｍＭのプライマー及び最終濃度０．２−１ｍＭのｄＮＴＰ混合物を用いて実施できる。最適の増幅を達成するために、アニーリング温度を変化させることができる。ポリメラーゼに関する伸長時間は、目的産物の長さに応じて２０から６０秒であることができる。必要ならば、第２のストランドの合成及び増幅を可能にするために一本鎖フラグメントにリンカーを加えることもできるであろう。次いで、伸長／増幅のために設計されたプライマーを用いて、二本鎖フラグメントが配列決定することができる。オリゴ上に制限部位もまた設計する場合には、このフラグメントは、例えば配列分析のためにｐＵＣ１８のような標準ベクターに直接、クローン化することができるであろう。
【０１２２】
次いで、視認されたプローブ−標的ハイブリッドを選択することによって、プローブが特異的に結合された標的核酸が選択される。好ましい実施態様において、選択される標的核酸は、プローブ又はその相補的塩基配列に塩基配列に少なくとも９０％相同である、即ち少なくとも９０％同一であるものとする（ＴとＵは、この目的では等しい塩基と見なす）。好ましい実施態様において、選択される標的核酸は、これに少なくとも９５％相同であるものとする。好ましい実施態様において、選択される標的核酸は、これに少なくとも９８％相同であるものとする。このような標的核酸が、より大きいポリヌクレオチド分子内の一部分として位置する場合には、標的核酸又は前記標的核酸を含むフラグメントは、例えばエンドヌクレアーゼ消化及びエクソヌクレアーゼ消化を含む公知の任意の手段によって、それから回収することができる。
【０１２３】
あるいは、プローブの塩基配列は、ヌクレオチド配列記録、例えばポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド配列の紙又は電子データベース記録の検索を実施するために情報ストリングの形態で使用できる。検索パラメーターは、成功した適合はプローブ情報ストリングと１００％同一でなければならない（１００％相同でなければならない）か又は１００％未満同一でなければならない（非相同でなければならない）ことを指定できる。好ましくは、検索パラメーターは、成功した適合が必ず、プローブ情報ストリングに少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％相同であるように選ぶものとする。好ましくは、検索パラメーターは、成功した適合が必ず、プローブ情報ストリングと非相同であるように選ぶものとする。成功した適合が同定されたら、それに対応するポリヌクレオチド源を選択する。
【０１２４】
あるいは、プローブ情報ストリングは、所定のプロモーターの核酸塩基配列を示す第１の情報ストリングを、所定の前記プロモーターの核酸塩基配列に少なくとも９０％相同である非相同塩基配列に相当する修飾情報ストリングから変更することによって作成することができる。次いで、この修飾情報ストリングは、その塩基配列を含むポリヌクレオチド分子の合成に使用することもできるし、又は前記のような同一情報ストリングのヌクレオチド配列記録の検索に使用することもできる。成功した適合については、それに相当するポリヌクレオチドを選択する。
【０１２５】
プローブ配列に少なくとも９０％相同であるポリヌクレオチドが得られたら、次に、それを用いて発現構成体を形成し、前記発現構成体を原核生物宿主細胞のような転写系（又は転写及び翻訳系）に挿入し、そして得られた系、例えば、形質転換細胞を、前記ポリヌクレオチドが転写を導く能力に関してスクリーンニングすることによって、前記ポリヌクレオチドを試験する。好ましくは、スクリーニングも最初のプロモーターの特性に比べて改良された少なくとも１つのプロモーター特性を同定することを含む。
【０１２６】
相同配列に関するアラインメント及び検索は、Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）プログラム、ＭｅｇａＢＬＡＳＴ（現在のところ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において入手できる）を用いて実施できる。このプログラムを、同一性パーセントに関する選択肢が９０％に設定されたこのプログラムを用いると、クエリー配列に９０％又はそれ以上相同なそれらの配列が同定される。当業界で知られた他のソフトウェアもまた、相同配列、例えば本発明に係るプロモーター塩基配列又はアクチベータータンパク質コード化塩基配列を含む情報ストリングに少なくとも９０％相同である配列のアラインメント及び／又は検索に利用できる。例えばクエリー配列に少なくとも９０％相同である配列を同定するための対照用のアラインメントは、例えばＧＣＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５から入手可能）で利用できるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡプログラムを、そこで指定されたデフォルトパラメーター＋９０％に設定された相同度に関するパラメーターと共に使用することによって実施することができる。例えばＣＬＵＳＴＡＬプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌ．製のＰＣ／Ｇｅｎｅソフトウェアパッケージにおいて利用できる）も使用可能である。
【０１２７】
これら及びその他の配列アラインメント法は、当業界でよく知られており、手動アラインメントによって、目視検査によって、又は配列アラインメントアルゴリズム（例えば前記プログラムによって具体化されるもののいずれか）の手動的若しくは自動的適用によって実施されることができる。種々の有用なアルゴリズムとしては、例えば以下のようなものが挙げられる。Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４−４８（Ａｐｒ  １９８８）に記載された類似性検索法；Ｔ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．  ２：４８２−８９（１９８１）及びＪ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−９７（１９８１）に記載された局部的相同性法（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄ）；Ｓ．Ｂ．Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｃ．Ｄ．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３−５３（Ｍａｒ  １９７０）に記載された相同性アラインメント法；更に、例えばＷ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１（３）：６３５−５０（Ｎｏｖ  １９９１）によって、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１及び２５：３６５−８９（１９９４）によって、並びにＤ．Ｇ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｐ．Ｍ．Ｓｈａｒｐ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ’ｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１−５３（１９８９）及びＧｅｎｅ  ７３（１）：２３７−４４（１５  Ｄｅｃ  １９８８）に記載された種々の方法。
【０１２８】
好ましい実施態様において、所定のプロモーター、プロモーター領域又は他の非コドン−若しくは非アンチコドン−含有ポリヌクレオチドセグメントの塩基配列に非相同である、即ちその塩基配列がそれに非相同である核酸塩基ポリマー（例えばポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド類縁物質）は、それに少なくとも９０％相同、好ましくは約９３％若しくは少なくとも９３％相同、好ましくは約９５％若しくは少なくとも約９５％相同、好ましくは約９６％若しくは少なくとも約９６％相同、好ましくは約９７％若しくは少なくとも約９７％相同、好ましくは約９８％若しくは少なくとも約９８％相同、好ましくは約９９％若しくは少なくとも約９９％相同であるものとする。
【０１２９】
好ましい実施態様において、所定のポリペプチド（又はそのセグメント）のアミノ酸配列に非相同である、即ちそのアミノ酸配列がそれに非相同であるポリペプチド（又はそのセグメント）は、それに少なくとも９０％相同、好ましくは約９３％若しくは少なくとも約９３％相同、好ましくは約９５％若しくは少なくとも約９５％相同、好ましくは約９６％若しくは少なくとも約９６％相同、好ましくは約９７％若しくは少なくとも約９７％相同、好ましくは約９８％若しくは少なくとも約９８％相同、好ましくは約９９％若しくは少なくとも約９９％相同であるものとする。
【０１３０】
好ましい実施態様において、所定のコドン−若しくはアンチコドン−含有ポリヌクレオチド（又はセグメント）の塩基配列に非相同である、即ちその塩基配列がそれに非相同である核酸塩基ポリマー（又はそのセグメント）は、それに少なくとも９０％相同、好ましくは約９３％若しくは少なくとも９３％相同、更に好ましくは約９５％若しくは少なくとも約９５％相同、更に好ましくは約９６％若しくは少なくとも約９６％相同であるものとする。好ましい実施態様において、このような核酸塩基ポリマーは、核酸塩基ポリマーによってコード化されたアミノ酸配列が、所定のポリヌクレオチドのアミノ酸配列に少なくとも９０％相同、好ましくは約９３％若しくは少なくとも約９３％相同、好ましくは約９５％若しくは少なくとも約９５％相同、好ましくは約９６％若しくは少なくとも約９６％相同、好ましくは約９７％若しくは少なくとも約９７％相同、好ましくは約９８％若しくは少なくとも約９８％相同、好ましくは約９９％若しくは少なくとも約９９％相同であるような、所定のコドン若しくはアンチコドン含有ポリヌクレオチドへの相同度を有する。
【０１３１】
好ましい実施態様において、所定のコドン若しくはアンチコドン含有ポリヌクレオチド（又はそのセグメント）の塩基配列に非相同である、即ち、その塩基配列がそれに非相同である核酸塩基ポリマー（又はそのセグメント）は、それに約９７％若しくは少なくとも約９７％相同、好ましくは約９８％若しくは少なくとも約９８％相同、好ましくは約９９％若しくは少なくとも約９９％相同である。
【０１３２】
発現構成体
本発明に係る発現構成体、例えば遺伝子又はオペロンにおいて、転写産物をコード化する配列を含む核酸は、本発明に係るプロモーター、スペーサーに作動可能なように連結されるものとする。転写産物がｍＲＮＡ又はその前駆体分子である場合には、スペーサーはリボソーム結合部位を含有するスペーサー（「ＲＢＳスペーサー」）とする。
【０１３３】
「転写産物コード化ポリヌクレオチド」は転写産物コード化配列を含む任意のポリヌクレオチドであり、前記転写産物は以下のものを含む（それに限定されない）任意の機能性又は構造的ＲＮＡ分子である。例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｎＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｐＲＮＡ、ｓａｔＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｒｐＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｖＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（「ａＲＮＡ」とも称する）、アプタマーＲＮＡ、染色体ＲＮＡ、酵素阻害剤ＲＮＡ、遺伝子制御成分ＲＮＡ、プラスチドＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、自己切断ＲＮＡ、自己スプライシングＲＮＡ、テロメラーゼＲＮＡ（ＴＥＲ又はＴＥＲＣ）、Ｘ−染色体不活化ＲＮＡ（ＸＩＳＴ  ＲＮＡ）、又は任意のこのようなＲＮＡ分子の前駆体ＲＮＡ。好ましい実施態様において転写産物はｍＲＮＡ又はそれに対する前駆体ＲＮＡ分子とする。
【０１３４】
発現構成体には他の成分も含ませることができる。このような成分としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない。例えば転写エンハンサー配列；翻訳エンハンサー配列；リーダーペプチドコード化配列（例えば、細胞内ターゲティングペプチド又は分泌シグナルペプチドに関する）；プロペプチド−、プレペプチド−及びプレプロペプチド−コード化配列；他のプロモーター；翻訳開始及び終結信号；ポリアデニル化信号；転写ターミネーター；イントロン；並びにタグ配列、例えば、ヌクレオチド配列「ｔａｇ」又は「ｔａｇｓ」ペプチドコード化配列（「ｔａｇ」は、ヌクレオチド配列タグが使用される発現ポリヌクレオチドの同定、分離、精製又は単離を容易にし、あるいは「ｔａｇ」ペプチドコード化配列が使用される発現ポリペプチドの同定、分離、精製又は単離を容易にする）。
【０１３５】
最低でも、本発明に係る発現構成体は、（転写産物コード化配列に作動可能なように連結された、プロモーター及びスペーサー又はＲＢＳスペーサーに加えて）転写ターミネーターを含むものとする。転写産物がｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡである場合には、発現構成体は少なくとも、転写産物コード化配列に作動可能なように連結された翻訳開始及び終結信号を更に含むものとする。本明細書中で使用する用語「作動可能なように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、宿主細胞の作動中に又はその作動によって調節成分がコード化配列の発現を指示できるような配置（コード化配列に対する）でコード化配列に転写及び任意の翻訳調節成分が共有結合している任意の立体配置を意味する。発現構成体中の調節成分はいずれも、転写産物コード化配列に「作動可能なように連結」しなければならない。細胞が転写前に発現構成体をプロセシングするか又は発現構成体から転写されたＲＮＡ前駆体をプロセシングする場合には、調節成分を中に作動可能なように連結する発現構成体又はプレＲＮＡを細胞のプロセシング系が操作できるように、調節成分を配置しなければならない。同様に、発現構成体がポリヌクレオチドの異なるセグメントの細胞中に存在する場合には、セグメント、即ち、調節成分及び転写産物コード化配列を一括して含むポリヌクレオチド分子又は領域は、調節成分が転写産物コード化配列に作動可能なように連結されている発現構成体を作成するか又は再結合するセグメントを細胞が操作できるように配置されなければならないか、あるいは調節成分が作動可能なように連結する、転写されるべきプレＲＮＡを細胞プロセシング系が操作できるように配置されなければならない。
【０１３６】
このような発現構成体中には任意の原核生物リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を使用できる。好ましくは、細菌ＲＢＳを使用する。好ましい実施態様において、グラム陽性細菌中で作動するＲＢＳを使用し；より好ましくはグラム陰性細菌中で作動するＲＢＳを使用する。多くの様々な特異的なコンセンサスＲＢＳが知られている。これらは、例えば、Ｄ．Ｆｒｉｓｈｍａｎら，Ｓｔａｒｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｓ：  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，  Ｇｅｎｅ  ２３４（２）：２５７−６５（８  Ｊｕｌ  １９９９）；及びＢ．Ｅ．Ｓｕｚｅｋら．Ａ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｔａｒｔ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（１２）：１１２３−３０（Ｄｅｃ  ２００１）に記載及び参照されている。更に天然又は合成ＲＢＳも使用できる。これらは、例えばＥＰ  ０２０７４５９（合成ＲＢＳ）；Ｏ．Ｉｋｅｈａｔａら，Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｌｅ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１（３）：５６３−７０（１９８９）（ＡＡＧＧＡＡＧの天然ＲＢＳ配列）；又はＪ．Ａ．Ｗｅｌｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１（２２）：７９１１−２５（１９８３）（ＧＡＧＡＧＧの天然ＲＢＳ配列）に記載されている。
【０１３７】
更に、発現を検証するために、１つ若しくはそれ以上のマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を発現系に使用できる。多くのこのような有用なマーカー又はレポーター遺伝子は当業界で知られている。例えば米国特許第４，７５３，８７６号（Ｈｅｍｍｉｎｇら）及びＤＬ  Ｄａｙら，Ｊ．Ｂａｃｔ．１５７（３）：９３７−３９（Ｍａｒ  １９８４）を参照されたい。好ましい実施態様においてマーカー遺伝子は抗生物質耐性を授与するマーカー遺伝子の中から選ばれる。好ましい実施態様においてマーカー遺伝子は、テトラサイクリン及びカナマイシン耐性遺伝子の中から選ばれる。好ましい実施態様において、レポーター遺伝子は、（１）螢光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）；（２）有色タンパク質；及び（３）螢光又は色を促進又は誘導するタンパク質をコード化するものの中から選ばれる。（３）には、例えば、ルミナーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。アルカリホスファターゼは、ＢＣＩＰを加水分解して青色を形成し、ＰＮＰＰを加水分解して黄色を形成する。β−ガラクトシダーゼは、Ｘ−ｇａｌを加水分解して青色誘導体を生成し、ＯＮＰＧを加水分解して黄色を形成する。螢光基質もアルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼに関して入手できる。
【０１３８】
本発明において有用である方法、ベクター並びに翻訳及び転写成分、更に他の成分のその他の例は、例えば米国特許第５，０５５，２９４号（Ｇｉｌｒｏｙ）及び米国特許第５，１２８，１３０号（Ｇｉｌｒｏｙら）；米国特許第５，２８１，５３２号（Ｒａｍｍｌｅｒら）；米国特許第４，６９５，４５５号及び第４，８６１，５９５号（Ｂａｒｎｅｓら）；米国特許第４，７５５，４６５号（Ｇｒａｙら）；並びに米国特許第５，１６９，７６０号（Ｗｉｌｃｏｘ）に記載されている。
【０１３９】
ベクター
非常に多くの細菌ベクターが、細菌におけるタンパク質の発現に有用であることが当業界で知られており、本発明に係る遺伝子の発現にはこれらの任意のものを使用できる。このようなベクターとしては、例えばプラスミド、コスミド及びファージ発現ベクターが挙げられる。有用なプラスミドベクターの例としては、発現プラスミドｐＭＢ９、ｐＢＲ３１２、ｐＢＲ３２２、ｐＭＬ１２２、ＲＫ２、ＲＫ６及びＲＳＦ１０１０が挙げられるがこれらに限定されない。このような有用なベクターの他の例には、例えば以下に記載されたものがある。Ｎ．Ｈａｙａｓｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（９）：３３３６−４２（Ｓｅｐ  １９９４）；Ａ．Ａ．Ｌｕｓｈｎｉｋｏｖら，Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ３０：６５７−６２（１９８５）；Ｓ．Ｇｒａｕｐｎｅｒ＆Ｗ．Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｅｎｇ．１７（１）：１１−１６（Ｏｃｔ  ２０００）；Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（５）：４３９−４５（Ｏｃｔ  ２００１）；Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ＆Ｋ．Ｎ．Ｔｉｍｍｉｓ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：４７−６７（１９８２）；Ｔ．Ｉｓｈｉｉら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１６（３）：３０７−１３（Ｍａｒ  １，１９９４）；Ｉ．Ｎ．Ｏｌｅｋｈｎｏｖｉｃｈ＆Ｙ．Ｋ．Ｆｏｍｉｃｈｅｖ，Ｇｅｎｅ  １４０（１）：６３−６５（Ｍａｒ  １１，１９９４）；Ｍ．Ｔｓｕｄａ＆Ｔ．Ｎａｋａｚａｗａ，Ｇｅｎｅ  １３６（１−２）：２５７−６２（Ｄｅｃ  ２２，１９９３）；Ｃ．Ｎｉｅｔｏら，Ｇｅｎｅ  ８７（１）：１４５−４９（Ｍａｒ  １，１９９０）；Ｊ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ＆Ｎ．Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ，Ｇｅｎｅ  ６１（３）：２９９−３０６（１９８７）；Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎら，Ｇｅｎｅ  １６（１−３）２３７−４７（Ｄｅｃ  １９８１）；Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．（ＮＹ）２３：６９−８１（２００１）；Ｐ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら，Ｊ．Ｂａｃｔ．  １７２（１）：４７７−８０（Ｊａｎ  １９９０）；Ｄ．Ｏ．Ｗｏｏｄら，Ｊ．Ｂａｃｔ．１４５（３）：１４４８−５１（Ｍａｒ  １９８１）；及びＲ．Ｈｏｌｔｗｉｃｋら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４７（Ｐｔ２）：３３７−４４（Ｆｅｂ  ２００１）。
【０１４０】
有用なシュードモナス発現ベクターの他の例としては、表IIIに記載したものが挙げられる。
【０１４１】
【表３】
2006506049.tif 000004
【０１４２】
発現プラスミド、ＲＳＦ１０１０は、例えばＦ．Ｈｅｆｆｒｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２（９）：３６２３−２７（Ｓｅｐ  １９７５）及びＫ．Ｎａｇａｈａｒｉ＆Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３（３）：１５２７−２９（Ｍａｒ  １９７８）に記載されている。プラスミドＲＳＦ１０１０及びその誘導体は、本発明において特に有用なベクターである。当業界で知られたＲＳＦ１０１０の有用な誘導体の例としては、例えばｐＫＴ２１２、ｐＫＴ２１４、ｐＫＴ２３１及び関連プラスミド、並びにｐＭＹＣ１０５０及び関連プラスミド（例えば米国特許第５，５２７，８８３号及び第５，８４０，５５４号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）を参照）、例えばｐＭＹＣ１８０３が挙げられる。他の有用なベクターの例としては、米国特許第４，６８０，２６４号（Ｐｕｈｌｅｒら）に記載されたものが挙げられる。
【０１４３】
好ましい実施態様において発現プラスミドを発現ベクターとして使用する。好ましい実施態様においてＲＳＦ１０１０若しくはその誘導体を発現ベクターとして使用する。好ましい実施態様においてｐＭＹＣ１０５０若しくはその誘導体又はｐＭＹＣ１０８３若しくはその誘導体を発現ベクターとして使用する。
【０１４４】
次いで、ベクターを細菌宿主細胞に形質転換することができる。
【０１４５】
形質転換
ベクターによる宿主細胞の形質転換は公知の任意の形質転換法を用いて実施でき、細菌宿主細胞は無傷の細胞として又はプロトプラスト（即ちサイトプラストを含む）として形質転換できる。形質転換法の例としては、ポレーション法、例えばエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌の接合、及び二価陽イオン処理、塩化カルシウム処理又はＣａＣｌ／Ｍｇ2+処理が挙げられる。
【０１４６】
発現構成体の前記成分の他に、細菌宿主細胞はまた、プロモーターのアクチベーター又はリプレッサータンパク質のコード配列を含む遺伝子の少なくとも１つの、好ましくは１つより多くのコピーを含むものとする。この遺伝子は発現構成体に結合させることもできるし、あるいは別の核酸の一部であることもできる。好ましい実施態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド４−９９３に示されたコード配列の相補体によってコード化されたアミノ酸配列を有するアントラニレートアクチベータータンパク質を使用し；且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド２２５−２２９又は２８５−１２２９でコード化されたベンゾエートアクチベータータンパク質を使用するものとする。好ましくはアクチベーター（又はリプレッサー）コード化遺伝子は細菌宿主細胞中で恒常的に発現するものとする。（例えば外来性）コード化配列の発現が望ましい場合には、宿主細胞はアクチベーター（又はデ−リプレッサー）化合物と接触させて発現を誘導するものとする。好ましい実施態様において、細菌宿主細胞は、アントラニレートプロモーター及びベンゾエートプロモーターの場合にはそれぞれ、アントラニル酸若しくは安息香酸又はそれらの生物学的に許容され得る塩（好ましくはナトリウム塩）と接触させるものとする。タンデムプロモーターの好ましい実施態様においては、細菌宿主細胞は、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーター成分又はその（自然状態で）非カタボライト抑制されたプロモーター成分を誘導するインデューサー化合物と接触させるものとする。タンデムプロモーターの好ましい実施態様において安息香酸、アントラニル酸又はその生物学的に許容され得る塩（好ましくはナトリウム塩）をインデューサー（アクチベーター）化合物として使用するものとする。
【０１４７】
宿主細胞
好ましい実施態様においてプロモーターを使用する宿主細胞は原核生物から選ばれるものとする。好ましい実施態様において宿主細胞は細菌から選ばれる。好ましい実施態様において宿主細胞はプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）から選ばれる。好ましい実施態様において宿主細胞は以下に定義するような「シュードモナス菌及び近縁細菌」又はその亜群から選ばれる。好ましい実施態様において、宿主細胞はシュードモナス属から選ばれる。シュードモナス属の特に有用な種は、Ｐ．フルオレッセンスであり、より好ましいのはシュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡである。
【０１４８】
好ましい実施態様において、天然プロモーターを入手する生物及び本発明に係るプロモーターを用いる宿主細胞は共に原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）から選ばれるものとする。好ましい実施態様において天然プロモーターを入手する生物及び本発明に係るプロモーターを用いる宿主細胞は共に細菌から選ばれるものとする。好ましい実施態様において天然プロモーターを入手する細菌及び本発明に係るプロモーターを用いる細菌宿主細胞は共にプロテオバクテリアから選ばれるものとする。好ましい実施態様において天然プロモーターを入手する細菌及び本発明に係るプロモーターを用いる細菌宿主細胞は共に以下に定義するようなシュードモナス菌及び近縁細菌又はその亜群から選ばれるものとする。
【０１４９】
好ましい実施態様においてプロモーター源の生物及び宿主細胞は同一種から選ばれるものとする。この種は好ましくは原核生物であり、より好ましくは細菌であり、更に好ましくはプロテオバクテリアであるものとする。特に好ましい実施態様において、プロモーター源の生物及び宿主細胞は、以下に定義するようなシュードモナス菌及び近縁細菌又はその亜群から選ばれた属中の、より好ましくはシュードモナス属の同一種から選ばれるものとする。特に好ましいのはシュードモナス・フルオレッセンス種、より好ましくはシュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡである。
【０１５０】
好ましい実施態様において、プロモーターを用いる宿主細胞には、インデューサー化合物：例えばベンゾエート若しくはアントラニレート又はその類縁物質；及び／又はもしあれば、誘導を直接引き起こすその分解生成物；及び／又は無償性インデューサー化合物を分解するのに有効な生体触媒が欠如しているものとする。このような宿主細胞はノックアウト突然変異体から容易に得られる。例えば、本発明者らは、アントラニレートプロモーターの場合には、宿主細胞のａｎｔＡＢＣオペロンの少なくともａｎｔＡ部分の不活性化がアントラニレートインデューサーの消費を阻害し、それによってインデユーサーが持続的な誘導を行えるようにすることを見出した。ａｎｔＡオペロン・リーディングフレームは、アントラニレートの分解経路において使用される第１の酵素の大きなサブユニットをコード化する。同様に、ベンゾエートプロモーターの場合には、本発明者らは、宿主細胞のｂｅｎＡＢＣＤオペロンのｂｅｎＡＢ部分の、例えば遺伝子欠失又は突然変異による不活性化がベンゾエートインデューサーの消費を阻害し、それによって誘導レベルを改良することを見出した。少なくともｂｅｎＡの不活性化は、これがベンゾエートの分解経路において使用される第１の酵素の大きいサブユニットをコード化するので、同様に働く。
【０１５１】
遺伝子のノックアウトは当業界において有効であることが知られた任意の方法に従って構築できる。遺伝子挿入による遺伝子の不活性化についてはこれまでに文献記載されている。例えばＤＬ  Ｒｏｅｄｅｒ＆Ａ  Ｃｏｌｌｍｅｒ、Ｍａｒｋｅｒ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｐｅｃｔａｔｅ  ｌｙａｓｅ  ｉｓｏｚｙｍｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４（１）５１−５６（１９８５）を参照されたい。簡潔には、分裂させるべき遺伝子の一部分を、標的宿主中で複製できない、抗生物質耐性遺伝子のような選択可能なマーカーを含むベクター中に増幅及びクローン化させる。遺伝子の染色体コピーとプラスミド上に含まれる標的遺伝子の一部分との間の相同的組換えは、遺伝子の染色体コピーの分裂及び抗生物質耐性マーカーの取り込みを引き起こす。あるいは、トランスポゾン突然変異誘発及び所望の表現型（例えばベンゾエート又はアントラニレートを代謝できないこと）の選択を用いて、標的遺伝子が挿入不活性化された細菌菌株を単離することができる。例えばＫ  Ｎｉｄａ＆ＰＰ  Ｃｌｅａｒｙ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５５（３）：１１５６−６１（１９８３）を参照されたい。個々の遺伝子において特異的な突然変異又は欠失は、例えばＪＡ  Ｗｅｌｌｓら，Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４（２−３）：３１５−２３（１９８５）に記載されたようなカセット式突然変異誘発を用いて構築でき；それによって、直接突然変異又はランダム突然変異が、遺伝子の選択部分において引き起こされ、次に相同的組換えによって遺伝子の染色体コピーに取り込まれる。
【０１５２】
シュードモナス菌及びその近縁細菌
本明細書中で使用する「シュードモナス菌及びその近縁細菌」は、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１（Ｇｒａｍ（−）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  １）」と本明細書中で定義された群と同一の広がりを有する。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は、より詳細には、Ｒ．Ｅ．Ｂｕｃｈａｎａｎ及びＮ．Ｅ．Ｇｉｂｂｏｎｓ（編），Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２１７−２８９（第８版，１９７４）（Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）（以下、「Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）」）による「Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｒｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｃｃｉ」と称する分類学的「パート（Ｐａｒｔ）」の範囲に含まれる科及び／又は属、そしてアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属と定義される。表IVは、Ｂｅｒｇｅｙの分類学的「パート」に記載された科及び属を示している。
【０１５３】
【表４】
2006506049.tif 000005
【０１５４】
「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は、その下に分類される全てのプロテオバクテリア及び分類学的「パート」を形成に使用された基準に従ってその下に分類されるであろう全てのプロテオバクテリアを含む。従って、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は、例えば全てのグラム陽性細菌；このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）分類の１９の「パート」のその他の範囲に入るエンテロバクテリアセエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のようなグラム陰性細菌；このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「パート」の「科Ｖ．ハロバクテリアセエ（この科はその後、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）という非細菌の科であると認識されている）；並びにこのＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「パート」内に記載されたサーマス属（この属はその後、細菌の非プロテオバクテリア属であると認識されている）を除外する。
【０１５５】
また、この定義によると、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」は更にこのＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「パート」に定義された属及び科に属する（且つ以前はその種と称されていた）プロテオバクテリアであって、その後他のプロテオバクテリアの分類学的名称を与えられているものを含む。一部の例では、これらの改名が新しいプロテオバクテリア属全体の基準をもたらした。例えば属アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ハイドロジェノファーガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）、オセアニモナス（Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）及びステノトロフォモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）は、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）に定義されたシュードモナス属に属する（前にはシュードモナス属と称されていた）微生物を再編することによって作り出された。同様に、例えばスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）（及びそれに由来するブラストモナス（Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ）属）は、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）において定義されたキサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属に属する（且つ以前はその種と称されていた）微生物を再編することによって作り出された。同様に、例えば、アシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）属は、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）に定義されたアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する（且つ以前はその種と称されていた）微生物を再編することによって作り出された。このような後で配置転換された種も本明細書中で定義された「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」の範囲内に含まれる。
【０１５６】
別の場合には、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「パート」において定義された属及び科の範囲に入るプロテオバクテリアの種はプロテオバクテリアの他の既存の属の下に単純に分類し直された。例えばシュードモナス属の場合には、シュードモナス・エナリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎａｌｉａ）（ＡＴＣＣ  １４３９３）、シュードモナス・ニグリファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  １９３７５）及びシュードモナス・プトレファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ８０７１）は、その後それぞれ、アルテロモナス・ハロプランクチス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、アルテロモナス・ニグリファシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）及びアルテロモナス・プトレファシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）と再分類されている。同様に、例えばシュードモナス・アシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  １５６６８）及びシュードモナス・テストステロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）（ＡＴＣＣ  １１９９６）はその後それぞれ、コマモナス・アシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）及びコマモナス・テストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）と再分類されており；シュードモナス・ニグリファシエンス（ＡＴＣＣ  １９３７５）及びシュードモナス・ピシシーダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  １５０５７）は、その後それぞれ、シュードアルテロモナス・ニグリファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）及びシュードアルテロモナス・ピシシーダ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）と再分類されている。このような後で配置転換されたプロテオバクテリアの種もまた、本明細書中で定義された「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」の範囲内に含まれる。
【０１５７】
同様に、この定義によれば、「グラム（−）プロテオバクテリア群１」は更に、その後発見された、又はその後、このＢｅｒｇｅｙ（１９７４）「パート」のプロテオバクテリア科及び／又は属の範囲内に属するものと再分類されたプロテオバクテリア種を含む。プロテオバクテリア科に関しては、「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」も以下の科のいずれかに属するものと分類されたプロテオバクテリアを含む：シュードモナダセエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾトバクテラセエ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）（現在は大抵シュードモナダセエの「アゾトバクター群（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ）」という異名で称される）、リゾビアセエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）及びメチロモナダセエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）（現在では大抵「メチロコッカセエ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）」という異名で称される）。従って、本明細書中で別の方法で記載された属の他に、「グラム（−）プロテトバクテリア亜群１」の範囲に入る別のプロテオバクテリア属としては以下のものが挙げられる。１）アゾリゾフィラス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ）属のアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）群の細菌；２）セルビブリオ（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ）、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）及びテレジニバクター（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ）属の科シュードモナダセエの細菌；３）ケラトバクター（Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ）、エンジファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、リベリバクター（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）（「カンジダツス・リベリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）」とも称する）及びシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の科リソビアセエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）細菌；並びに４）メチロバクター、メチロカルドゥム（Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロサルシナ（Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ）及びメチロスファエラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ）属の科メチロコッカセエの細菌。
【０１５８】
好ましい実施態様において細菌は前に定義した「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」から選ばれる。
【０１５９】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義する（カタログ掲載された、公的に入手可能なその寄託菌株の総数を括弧内に示す；特に断らない限り、寄託は全てＡＴＣＣに行われている）。アシドモナス（２）；アセトバクター（９３）；グルコノバクター（３７）；ブレバンディモナス（２３）；ベイエリンキア（１３）；デルキシア（２）；ブルセラ（４）；アグロバクテリウム（７９）；ケラトバクター（２）；エンジファー（３）；リゾビウム（１４４）；シノリゾビウム（２４）；ブラストモナス（１）；スフィンゴモナス（２７）；アルカリゲネス（８８）；ボルデテラ（４３）；バークホルデリア（７３）；ラルストニア（３３）；アシドボラックス（２０）；ハイドロゲジェノファーガ（９）；ゾーグレア（９）；メチロバクター（２）；メチロカルドゥム（ＮＣＩＭＢに１）；メチロコッカス（２）；メチロミクロビウム（２）；メチロモナス（９）；メチロサルシナ（１）；メチロスフェラ；アゾモナス（９）；アゾリゾフィラス（５）；アゾトバクター（６４）；セルビブリオ（３）；オリゲラ（５）；シュードモナス（１１３９）；フランシセラ（４）；キサントモナス（２２９）；ステノトロフォマス（５０）；オセアニモナス（４）；及びアシネトバクター（１６０）。
【０１６０】
「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」の代表的な種としては以下の細菌が挙げられるがこれらに限定するものではない（代表的な菌株のＡＴＣＣ寄託番号又は他の寄託番号を括弧内に示す）。アシドモナス・メタノーリカ（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ４３５８１）；アセトバクター・アセチ（ＡＴＣＣ  １５９７３）；グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）（ＡＴＣＣ  １９３５７）；ブレバンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）（ＡＴＣＣ１１５６８）；ベイエリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ９０３９及びＡＴＣＣ  １９３６１）；デルキシア・グンモーザ（Ｄｅｒｘｉａ  ｇｕｍｍｏｓａ）（ＡＴＣＣ  １５９９４）；ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ２３４５６）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２３４４８）；アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ２３３０８）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（ＡＴＣＣ  １９３５８）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  １１３２５）；ケラトバクター・ヘインツィ（Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｉｎｔｚｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２９６００）；エンジファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈｅｒｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３３２１２）；リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  １０００４）；シノリゾビウム・フレディイ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３５４２３）；ブラトモナス・ナタトリア（Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ  ｎａｔａｔｏｒｉａ）（ＡＴＣＣ  ３５９５１）；スフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ２９８３７）；アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ８７５０）；ボルデテラ・パータッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ９７９７）；バークホルデリア・セパシア（ＡＴＣＣ  ２５４１６）；ラルストニア・ピケッティイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２７５１１）；アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １１２２８）；ハイドロジェノファーガ・フラバ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ  ｆｌａｖａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６７）；ゾーグレア・ラミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ）（ＡＴＣＣ  １９５４４）；メチロバクター・ルテウス（Ｍｅｔｈｙｏｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｕｓ）（ＡＴＣＣ  ４９８７８）；メチロカルドゥム・グラシーレ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ  ｇｒａｃｉｌｅ）（ＮＣＩＭＢ  １１９１２）；メチロコッカス・カプスラツス（Ｍｅｔｈｙｏｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（ＡＴＣＣ  １９０６９）；メチロミクロビウム・���ギレ（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｇｉｌｅ）（ＡＴＣＣ  ３５０６８）；メチロモナス・メタニカ（Ｍｅｔｈｙｏｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３５０６７）；メチロサルシナ・フィブラータ（Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ  ｆｉｂｒａｔａ）（ＡＴＣＣ  ７００９０９）；メチロスフェラ・ハンソニイ（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｈａｎｓｏｎｉｉ）（ＡＣＡＭ  ５４９）；アゾモナス・アギリス（Ａｚｏｍｏｎａｓ  ａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ７４９４）；アゾリゾフィラス・パスパリ（Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｓｐａｌｉ）（ＡＴＣＣ  ２３８３３）；アゾトバクター・クロオコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）（ＡＴＣＣ  ９０４３）；セルビブリオ・ミクスツス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｘｔｕｓ）（ＵＱＭ  ２６０１）；オリゲラ・ウレトラリス（Ｏｌｉｇｅｌｌａ  ｕｒｅｔｈｒａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １７９６０）；シュードモナス・アエルギノーザ（ＡＴＣＣ  １０１４５）、シュードモナス・フルオレッセンス（ＡＴＣＣ  ３５８５８）；フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ６２２３）；ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（ＡＴＣＣ  １３６３７）；キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（ＡＴＣ  ３３９１３）；オセアニモナス・ドウドロフィイ（Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ  ｄｏｕｄｏｒｏｆｆｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２７１２３）；及びアシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２３０５５）。
【０１６１】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群３」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群３」は、以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレバンディモナス、アグロバクテリウム；リゾビウム；シノリゾビウム；ブラストモナス；スフィンゴモナス；アルカリゲネス；バークホルデリア；ラルストニア；アシドボラックス；ハイドロジェノファーガ；メチロバクター；メチロカルドゥム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスフェラ；アゾモナス；アソリゾフィラス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６２】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群４」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群４」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。ブレバンディモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；バークホルデリア；ラルストニア；アシドボラックス；ハイドロジェノファーガ；メチロバクター；メチロカルドゥム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスフェラ；アゾモナス；アゾリゾフィラス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６３】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群５」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群５」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。メチロバクター；メチロカルドゥム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスフェラ；アゾモナス；アゾリゾフィラス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ステノトロフォモナス；キサントモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６４】
好ましい実施態様において宿主細胞は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群６」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群６」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。ブレバンディモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；バークホルデリア；ラルストニア；アシドボラックス；ハイドロジェノファーガ；アゾモナス；アゾリゾフィラス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；ステノトロフォモナス；キサントモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６５】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群７」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群７」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。アゾモナス；アゾリゾフィラス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリゲラ；シュードモナス；テレジニバクター；ステノトロフォモナス；キサントモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６６】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群８」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群８」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。ブレバンディモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；バークホルデリア；ラルストニア；アシドボラックス；ハイドロジェノファーガ；シュードモナス；ステノトロフォモナス；キサントモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６７】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群９」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群９」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。ブレバンディモナス；バークホルデリア；ラルストニア；アシドボラックス；ハイドロジェノファーガ；シュードモナス；ステノトロフォモナス；オセアニモナス；及びアシネトバクター。
【０１６８】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１０」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１０」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。バークホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；ステノトロフォモナス；キサントモナス；及びアシネトバクター。
【０１６９】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１１」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１１」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。シュードモナス；ステノトロフォモナス；キサントモナス；及びアシネトバクター。
【０１７０】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１２」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１２」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。バークホルデリア；ラルストニア；シュードモナス。
【０１７１】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１３」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１３」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。バークホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；キサントモナス；及びアシネトバクター。
【０１７２】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１４」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１４」は以下の属のプロテオバクテリアの群と定義される。シュードモナス及びキサントモナス。
【０１７３】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１５」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１５」は、シュードモナス属のプロテオバクテリアの群と定義される。
【０１７４】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１６」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１６」はシュードモナス種のプロテオバクテリアの群と定義される（代表的な菌株のＡＴＣＣ寄託番号又は他の寄託番号を括弧内に示す）。シュードモナス・アビエタニフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ  ７００６８９）；シュードモナス・アエルギノーザ（ＡＴＣＣ  １０１４５）；シュードモナス・アルカリゲネス（ＡＴＣＣ  １４９０９）；シュードモナス・アンギリセプチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６０）；シュードモナス・シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １３６７４）；シュードモナス・フラベセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ５１５５５）；シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）（ＡＴＣＣ  ２５４１１）；シュードモナス・ニトロレデュセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６３４）；シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ８０６２）；シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  １７４４０）；シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  １４２３５）；シュードモナス・ストラミネア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ）（ＡＴＣＣ  ３３６３６）；シュードモナス・アガリシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｇａｒｉｃｉ）（ＡＴＣＣ  ２５９４１）；シュードモナス・アルカリフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ）；シュードモナス・アルギノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ）；シュードモナス・アンデルゾニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）；シュードモナス・アスプレニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｓｐｌｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２３８３５）；シュードモナス・アゼライカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ２７１６２）；シュードモナス・ベイエインキイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  １９３７２）；シュードモナス・ボレアリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ）；シュードモナス・ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６６２）；シュードモナス・ブラッシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）；シュードモナス・ブタノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ）（ＡＴＣＣ  ４３６５５）；シュードモナス・セルローザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓａ）（ＡＴＣＣ  ５５７０３）；シュードモナス・オーランチアカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６３）；シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＡＴＣＣ  ９４４６，ＡＴＣＣ  １３９８５、ＡＴＣＣ  １７４１８，ＡＴＣＣ  １７４６１）；シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）（ＡＴＣＣ  ４９７３）；シュードモナス・ランデンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ４９９６８）；シュードモナス・テトロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４６８３）；シュードモナス・シッシコーラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｓｓｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ３３６１６）；シュードモナス・コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）；シュードモナス・ディテルペニフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ）；シュードモナス・エロンガータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｎｇａｔａ）（ＡＴＣＣ  １０１４４）；シュードモナス・フレクテンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｅｃｔｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  １２７７５）；シュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）；シュードモナス・ブレンネリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒｅｎｎｅｒｉ）；シュードモナス・セドレラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｅｌｌａ）；シュードモナス・コルガータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２９７３６）；シュードモナス・エクストレモリエンタリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナス・フルオレッセンス（ＡＴＣＣ  ３５８５８）；シュードモナス・ゲッサルジイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）；シュードモナス・リバネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・マンデリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００８７１）；シュードモナス・マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １０８４４）；シュードモナス・ミグレ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｉｇｕｌａｅ）；シュードモナス・ムシドレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４６８５）；シュードモナス・オリエンタリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナス・ロデシエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）；シュードモナス・シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ）（ＡＴＣＣ  ９８９０）；シュードモナス・トラアシイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｌａａｓｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３３６１８）；シュードモナス・ベロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００４７４）；シュードモナス・フレデリックスベルゲンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・ゲニキュラータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）（ＡＴＣＣ  １９３７４）；シュードモナス・ジンゲリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｅｒｉ）；シュードモナス・グラミニス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）；シュードモナス・グリモンチイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；シュードモナス・ハロデニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ��  ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）；シュードモナス・ハロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）；シュードモナス・ヒビシコーラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  １９８６７）；シュードモナス・ハッティエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  １４６７０）；シュードモナス・ハイドロジェノボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ）；シュードモナス・ジェッセニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００８７０）；シュードモナス・キロネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・ランセオラータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（ＡＴＣＣ  １４６６９）；シュードモナス・リニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｎｉ）；シュードモナス・マルギナータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２５４１７）；シュードモナス・メフィチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｐｈｉｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６５）；シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ  １９２４４）；シュードモナス・ペルツシノゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）（ＡＴＣＣ  １９０）；シュードモナス・ピクトラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｃｔｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２３３２８）；シュードモナス・サイクロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）；シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ）（ＡＴＣＣ  ３１４１８）；シュードモナス・モンテイリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００４７６）；シュードモナス・モッセリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｓｓｅｌｉｉ）；シュードモナス・オリジハビタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４３２７２）；シュードモナス・プレコグロシシーダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  ７００３８３）；シュードモナス・ピュチダ（ＡＴＣＣ  １２６３３）；シュードモナス・リアクタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅａｃｔａｎｓ）；シュードモナス・スピノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  １４６０６）；シュードモナス・バレリカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ）；シュードモナス・ルテオラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｔｅｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ４３２７３）；シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＡＴＣＣ  １７５８８）；シュードモナス・アミグダリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ）（ＡＴＣＣ  ３３６１４）；シュードモナス・アベラネ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｌｌａｎａｅ）（ＡＴＣＣ  ７００３３１）；シュードモナス・カリカパパイエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）（ＡＴＣＣ  ３３６１５）；
シュードモナス・シコリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ）（ＡＴＣＣ  １０８５７）；シュードモナス・フィカセレクテ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）（ＡＴＣＣ  ３５１０４）；シュードモナス・フスコバギネ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）；シュードモナス・メリエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｉａｅ）（ＡＴＣＣ  ３３０５０）；シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）（ＡＴＣＣ  １９３１０）；シュードモナス・ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）（ＡＴＣＣ  １３２２３）；シュードモナス・サーモカルボキシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３５９６１）；シュードモナス・サーモトレランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）；シュードモナス・シべルバレンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ）；シュードモナス・バンクベレンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ７００６８８）；シュードモナス・ウィスコンシネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）；及びシュードモナス・キシアメネンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ）。
【０１７５】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１７」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１７」は例えば以下のシュードモナス種に属するものを含む「螢光性シュードモナス菌」として当業界で知られたプロテオバクテリアの群と定義される。シュードモナス・アゾトフォルマンス；シュードモナス・ブレンネリ；シュードモナス・セドレラ；シュードモナス・コルガータ；シュードモナス・エクストレモリエンタリス；シュードモナス・フルオレッセンス；シュードモナス・ゲッサルジイ；シュードモナス・リバネンシス；シュードモナス・マンデリイ；シュードモナス・マルギナリス；シュードモナス・ミグレ；シュードモナス・ムシドレンス；シュードモナス・オリエンタリス；シュードモナス・ロデシエ；シュードモナス・シンキサンタ；シュードモナス・トラアシイ；及びシュードモナス・ベロニイ。
【０１７６】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１８」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１８」は例えば以下に属するものを含む種シュードモナス・フルオレッセンスの全ての亜種、変種、菌株及び他の下位単位の群と定義される（代表的な菌株のＡＴＣＣ寄託番号又は他の寄託番号を括弧内に示す）。シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡ（ｂｉｏｖａｒ  １又はｂｉｏｖａｒ  Ｉとも称する）（ＡＴＣＣ  １３５２５）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＢ（ｂｉｏｖａｒ  ２又はｂｉｏｖａｒ  ＩＩとも称する）（ＡＴＣＣ  １７８１６）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＣ（ｂｉｏｖａｒ  ３又はｂｉｏｖａｒ  ＩＩＩとも称する）（ＡＴＣＣ  １７４００）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＦ（ｂｉｏｖａｒ  ４又はｂｉｏｖａｒ  ＩＶとも称する）（ＡＴＣＣ  １２９８３）；シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＧ（ｂｉｏｖａｒ  ５又はｂｉｏｖａｒ  Ｖとも称する）（ＡＴＣＣ  １７５１８）シュードモナス・フルオレッセンスの亜種セルローザ（ＮＣＩＭＢ  １０４６２）。
【０１７７】
好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１９」から選ばれる。「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１９」はシュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡの全ての菌株の群と定義される。このバイオタイプの特に好ましい菌株はＰ．フルオレッセンス菌株ＭＢ１０１（米国特許第５，１６９，７６０号（Ｗｉｌｃｏｘ）を参照）及びその誘導体である。
【０１７８】
特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群２」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群３」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群５」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群７」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１２」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１５」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１７」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１８」から選ばれる。特に好ましい実施態様において細菌は「グラム（−）プロテオバクテリア亜群１９」から選ばれる。
【０１７９】
本発明に係る発現系は任意の発酵形式で培養することができる。例えば任意の容量のバッチ、フェドバッチ、半連続及び連続発酵法を使用できる。
【０１８０】
本発明において、宿主細胞の成長、培養及び／又は発酵は、宿主細胞を生き残らせることができる温度範囲、好ましくは約４℃から約５５℃（約４℃と約５５℃を含む）の範囲内の温度で実施する。従って、例えば本明細書中で本発明の宿主細胞に関して使用する用語「成長」（及び「成長する」、「成長している」）、「培養」（及び「培養物」）並びに「発酵」（及び「発酵させる」、「発酵している」）は、本質的に且つ必然的に約４から約５５℃（約４℃と約５５℃を含む）の温度範囲内における「成長」、「培養」及び「発酵」を意味する。更に、「成長」は、活性な細胞分裂及び／又は拡大の生物学的状態、並びに分裂していない且つ／又は拡大していない細胞が代謝的に維持されている生物学的状態の両方を示すのに用い、用語「成長」の後者の使用は、用語「維持」と同義である。
【０１８１】
更に、本発明の細菌宿主細胞及び発現系に関して使用する場合の「発現を可能にする条件下における」成長は、本明細書中においては以下を意味するものと定義する。（１）作動可能なようにコード配列に連結された制御配列に使用されるプロモーターが構成プロモーターである場合には、；並びに（２）作動可能なようにコード配列に連結された制御配列に使用されるプロモーターが調節プロモーターである場合には、（ａ）そのインデューサーの存在下における（即ち、それと接触している）組換え細菌宿主細胞の成長、及び（ｂ）そのインデューサーの不存在下における組換え細菌宿主細胞の成長、それに続く、系へのこのようなインデューサーの添加、それによる細胞とインデューサーとの接触。
【０１８２】
生体触媒の調製
プロモーターの制御下にあるコード配列が発現された後は、得られる遺伝子産物及び／若しくは前記遺伝子産物の発現によって生じる二次産物（例えば、代謝産物）は、このような産物、例えばタンパク質、核酸又は他の分子に関して有用な公知の任意の回収及び／若しくは精製方法を用いて分離し、単離し且つ／又は精製できる。あるいは、宿主細胞自体を、例えばホールセル・バイオリアクター又は他の用途に使用できる。
【実施例】
【０１８３】
材料＆方法
プロモーター及びプロモーター−プラスミド構成体
以下のプロモーターヌクレオチド配列に本明細書中で言及する：
Ｐｂｅｎ５０９：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｃ９９４−ｃ１５０２。
Ｐｂｅｎ２７８：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｃ１２２８−ｃ１５０２。
Ｐｂｅｎ８８：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｃ１２２８−ｃ１３１６（ｇ１３０６は欠失）。
Ｐａｎｔ７１３：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ５９２−ｃ１３０４。
Ｐａｎｔ７０５：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ５９２−ｃ１２９６。
Ｐａｎｔ３１１：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ９９４−ｃ１３０４。
Ｐａｎｔ２８９：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチド９９４−１２８３（ｇ１２６９及びｔ１２７８は欠失）。
ＡｎｔＲ＋Ｐａｎｔ（また、Ｐａｎｔ＋ＡｎｔＲ）：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３のａ１−ｃ１３９５。
Ｐｔａｎｄｅｍ：  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３。
【０１８４】
以下の、プロモーターを含まないプラスミド構成体に本明細書中で言及する：
ｐＤＯＷ１０１７：  プロモーターは含まないが、プロモーターを含まないｌａｃＺレセプター遺伝子を有する。
ｐＤＯＷ１０３３：  プロモーターは含まないが、プロモーターを含まないｐｈｏＡレセプター遺伝子を有する。
【０１８５】
表Ｖ及びVIに記載したプラスミドプロモーター構成体に本明細書中で言及する。
【０１８６】
【表５】
2006506049.tif 000006
【０１８７】
【表６】
2006506049.tif 000007
【０１８８】
表VIIに記載したオリゴヌクレオチドを、以下の実施例に使用する。
【０１８９】
【表７】
2006506049.tif 000008
【０１９０】
宿主細胞
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から入手）、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手）及びシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）バイオタイプＡ（菌株ＭＢ１０１及びＭＢ２１４）。Ｐ．フルオレッセンスＭＢ２１４は菌株ＭＢ１０１の誘導体（野生型原栄養体Ｐ．フルオレッセンスｂｉｏｖａｒ  Ａ）である。ＭＢ２１４は、大腸菌ｌａｃＩＺＹＡオペロン（ｌａｃＺプロモーター領域を欠失）をＭＢ１０１菌株の染色体中に組み込んで、ｌａｃプロモーター及びその誘導体がラクトース若しくはＩＰＴＧで調節されて当該導入遺伝子の導入性発現を推進できる宿主細胞を形成することよって調製した。ＭＢ１０１菌株はＬａｃ（−）であり、ＭＢ２１４菌株はＬａｃ（＋）である。
【０１９１】
インデューサー化合物
以下の実施例中で使用する用語「アントラニレート」インデューサーは、アントラニル酸ナトリウムを意味し、「ベンゾエート」インデューサーは安息香酸ナトリウムを意味する。
【０１９２】
形質転換のプロトコール
大腸菌：  大腸菌の形質転換は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）製の菌株ＪＭ１０９の化学的コンピテント細胞を用いて、製造メーカーのプロトコールに従って行った。
【０１９３】
Ｐ．フルオレッセンス：  Ｐ．フルオレッセンスのエレクトロポレーションを、オーバーナイト培養物（肥沃な培地中で成長させた；本発明の実施例はＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ（即ち、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ、Ｍｉｌｌｅｒ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．から市販）を使用した）１ｍＬをＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ  ５０ｍＬ中に継代培養し、そしてＡ６００測定値が０．４から０．６の範囲に入るまで振盪しながら３０℃においてインキュベートすることによって実施した。得られた細胞を５０ｍＬの冷ｄｄＨ2Ｏで２回洗浄し、冷ｄｄＨ2Ｏ  １ｍＬ中に再浮遊させた。コンピテント細胞の１００μＬアリコートに、ギャップ０．２ｃｍのエレクトロポレーション・キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌ．）中の当該プラスミド約１０ｎｇを加えた。エレクトロポレーションは、以下の条件下で行った。２００オーム，２５μＦ，２．２５ｋＶ。これに続いて、１ｍＬの冷ＬＢブロスを添加した。細胞を２分間氷上で回復させ、次いで３０℃において振盪せずに２時間〜一晩インキュベートした。次いで、細胞を選択培地上に蒔いた；本発明の実施例は、選択培地として、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を追加したＬＢ寒天Ｍｉｌｌｅｒ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．から市販）を用いた。
【０１９４】
細胞成長のプロトコール：
誘導に関する細胞成長：  前記菌株を、０．５％若しくは１％（ｗ／ｖ）グルコース、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4及び微量元素（微量元素に関しては、本発明の実施例はナトリウム、マグネシウム、マンガン、鉄及びコバルトの塩を、全て０．５ｍｇ／ｍｌ未満の最終濃度で含む溶液を用いた）を追加した１×Ｍ９最小塩培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から購入した５×製剤から希釈）中で一晩（３０℃において２５０ｒｍで振盪しながら）成長させた。次いで、菌株を同じ媒体中で１：４で容量１０又は２０ｍＬに継代培養し、次いで、示される０−１０ｍＭの濃度のアントラニレート又はベンゾエートで誘導させた。
【０１９５】
プラスミド増殖に関する細胞成長：  前記プラスミドを含む大腸菌細胞を、１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン若しくは１００μｇ／Ｌのアンピシリン（単離すべきプラスミドによって決まる）を追加した５０−２００ｍＬのＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ中で３７℃において、２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩成長させた。プラスミドの調製は、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮキット（５ｍＬまでの培養容量で使用するためのプラスミドＤＮＡ精製「ミニプレップ」キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌ．）から市販されている）又はＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤキット（２００ｍＬまでの培養容量で使用するためのプラスミドＤＮＡ精製「ミディプレップ」キット；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌ．）から市販されている）を用いて行った。
【０１９６】
誘導のプロトコール：
当該菌株を、０．５％又は１％（ｗ／ｖ）グルコース、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4及び５Ｌ／Ｌ微量元素（前述の通り）並びに場合によっては１５ｕｇ／ｍＬのテトラサイクリンを追加した１×Ｍ９培地中で３０℃において一晩成長させた。次いで、これらを、同じ培地中で１：４又は１：５で継代培養し、次に、示した濃度のアントラニレート、ベンゾエート又は他のインデューサーで所望の時間（例えば２、４、６、８、１２若しくは２４時間、又は一晩）誘導した。示した時間にサンプルを採取し、それらのサンプルを、レポーター遺伝子活性に関してアッセイした。結果は誘導後の所定の時間数で採取した時点で報告する。時点は、時間数に関する数字で示し、この数は一部の例では誘導後を示す文字「Ｉ」を直前につける。
【０１９７】
ＥＰ−ＰＣＲのプロトコール
以下のプロトコールを、誤りがちなＰＣＲ突然変異誘発に用いた（「Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ”、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ（２００２）（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照）。以下の試薬を合した：水６３μＬ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．３）  １０μＬ、１Ｍ  ＫＣｌ  ５μＬ、１Ｍ  ＭｇＣｌ2  ０．７μＬ、ｄＮＴＰミックス（ミックス＃１［２５ｍＭ  ｄＣＴＰ，２５ｍＭ  ｄＴＴＰ，５ｍＭ  ｄＡＴＰ，５ｍＭ  ｄＧＴＰ］又はミックス＃２［２０ｍＭ  ｄＣＴＰ，２０ｍＭ  ｄＴＴＰ，２ｍＭ  ｄＡＴＰ，２ｍＭ  ｄＧＴＰ］）４μＬ、１００μＭ  Ｍ１３フォワードプライマー（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）２μＬ、１００μＭ  Ｍ１３リバースプライマー（ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）２μＬ、鋳型（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）から市販されているプラスミド、ｐＮＥＢ１９３にクローン化されたＰａｎｔ又はＰｂｅｎプロモーターポリヌクレオチドからなる）１μＬ（〜５ｎｇ）、２５ｍＭ  ＭｎＣｌ2  ２μＬ、及びＴａｑポリメラーゼ（５単位／μＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手）１μＬ。ＰＣＲの条件は以下の通りであった。９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間及び７２℃で９０秒間の周期を３０回；４℃に保持。ＰＣＲ産物を、ＭＩＣＲＯＣＯＮ  ＹＭ−１００又はＭＩＣＲＯＣＯＮ−ＰＣＲカラム（核酸精製カラム；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）を用いて、ＡＭＩＣＯＮ装置に関する製造メーカーの指示に従って精製した。産物を、１×ＮＥＢＵＦＦＥＲ  ＢＡＭＨＩ＋ＢＳＡ（ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから市販）中でＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって消化し、３００ｂｐ及びそれ以下のフラグメントに関してはＱＩＡＥＸ  ＩＩ（ゲル抽出キット；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌ．から）を及び３００ｂｐより大きいフラグメントに関してはＰＲＥＰ−Ａ−ＧＥＮＥ（ＤＮＡ精製キット；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）を用いてゲル抽出によって精製した。次いで、フラグメントをそれぞれ、ｐＤＯＷ１０１７又はｐＤＯＷ１０３３のｌａｃＺ又はｐｈｏＡレポーター遺伝子の上流でクローン化した。
【０１９８】
ノックアウトのプロトコール
ＡｎｔＡノックアウトの構成：  ａｎｔＡ遺伝子の内部フラグメントを、Ｐ．フルオレッセンスのゲノムＤＮＡからのプライマーＡｎｔＡＫＯ５（ＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びＡｎｔＡＫＯ３（ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＣＴＣＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位はそれぞれ斜体で示した）を用いて増幅した。以下を合して反応混合物を形成した。１０×緩衝液（即ち、Ｔａｑポリメラーゼと共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給される緩衝液；前記緩衝液は２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ  ８．４）及び５００ｍＭ  ＫＣｌを含んでいた）５μＬ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ2  ２．５μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μＬ、１００μＭ  ＡｎｔＫＯ３  ０．５μＬ、１００μＭ  ＡｎｔＫＯ５  ０．５μＬ、（５単位／μＬ）Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌ．）１μＬ、Ｐ．フルオレッセンスＭＢ２１４ゲノムＤＮＡ０．５μＬ（〜５０ｎｇ）、及びｄｄＨ2Ｏ  ３９μＬ。使用したＰＣＲ周期条件は次の通りであった。９６℃で２分間；９６℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の周期３０回。得られたＰＣＲ産物を、Ｐ．フルオレッセンス中で複製できないプラスミド中にクローン化した（ｐＵＣ型プラスミドを用いたが、例えば、ｐＢＲ型プラスミドも作動するであろう）。得られたプラスミドは、エレクトロコンピテントＰ．フルオレッセンス細胞中に形質転換し、形質転換体を適当な抗生物質を用いて選択した。このプラスミドはＰ．フルオレッセンス中では複製できないので、ａｎｔＡ遺伝子座において組み込まれてプラスミドを有して、プラスミド主鎖によって分離された２つの切断型ａｎｔＡ  ＯＲＦを生じた細菌のみが選択されることができる。いくつかの形質転換体を、３０℃において２４時間振盪しながらＭ９培地＋１．０％グルコース、５ｍＭアントラニレート中で培養し、培養物上清を、アントラニレート濃度に関してＨＰＬＣによって分析した。
【０１９９】
ＢｅｎＡＢノックアウトの構成：  一般に、Ｐ．フルオレッセンス中のＡｎｔＡ遺伝子を欠失するための前記方法に従って、ｂｅｎＡＢ遺伝子の欠失を容易にするために、以下のようにしてプラスミドｐＤＯＷ１１３９を構成した。ｂｅｎＲ遺伝子の３’部分及びｂｅｎＣ遺伝子の５’部分を、鋳型としてＰ．フルオレッセンスＭＢ２１４ゲノムＤＮＡを用いて増幅した。ｂｅｎＲ領域は、プライマーＨ３＿５’ｂｅｎＡＫＯｃｌｅａｎ及びＢｅｎＫＯｍｅｇａを用いて増幅した。ｂｅｎＣ領域は、プライマーＨ３＿３’ＢｅｎＢＫＯｃｌｅａｎ及びＩｎｖｂｅｎＫＯｍｅｇａを用いて増幅した。両反応に関して、サイクリング条件は９５℃で５分間；（９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；７２℃で１分間）を３５回；；次いで７２℃で５分間であった。この反応を、製造メーカーのプロトコールに従ってＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。ｂｅｎＲ及びｂｅｎＣフラグメントを、プライマーＨ３＿５’ｂｅｎＡＫＯｃｌｅａｎ及びＨ３＿３’ｂｅｎＢＫＯｃｌｅａｎを用いて両フラグメントを鋳型として融合させた。この融合反応は、ＫＯＤ  ＨＯＴＳＴＡＲＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、９４℃で２分間；（９４℃で３０秒間；５０℃で３０秒間；６８℃で１．５分間）を３５回；次いで６８℃で５分間の条件下で行った。予想される１．１ｋｂフラグメントを、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、ＳｒｆＩ消化プラスミドＤＮＡ中にクローン化して、プラスミドｐＤＯＷ１１３９を形成した。次いで、ｐＤＯＷ１１３９をＰ．フルオレッセンスに形質転換した。形質転換体を、選択のためのテトラサイクリンを含むＬＢ培地上に蒔くことによって選択した。プラスミドはＰ．フルオレッセンス中で複製できないので、テトラサイクリンに耐性のコロニーは、染色体に組み込まれているプラスミドから生じた。プラスミドの組み込み部位を、ＰＣＲによって分析した。相同領域間の組換えによって組み込みプラスミドを失った菌株を得るために、第１の形質転換体のシングルコロニーを液体ＬＢ培地中に接種し、一晩成長させ、次いで選択培地上に蒔いて、プラスミドの減少に関して対抗選択を行った（データは示さず）。予想される表現型を有する分離株を選択した。得られた菌株からのＤＮＡを、ＰＣＲによってプライマー５’ＢｅｎＡ＿ｓｅｑ、Ｓｅｑ＿３’ＢｅｎＢ、Ｍ１３Ｒ２１、１２６１−８３７８Ｆ及び１２６１−１０３Ｒを用いて分析して、ｂｅｎＡＢ領域の除去を確認した。
【０２００】
Ｐ．フルオレッセンス染色体ＢｅｎＲ遺伝子の不活性化：  ｂｅｎＡ遺伝子の上流のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）。ＯＲＦの部分を含むＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによってＢｅｎａｃｔＫＯｆｏｒ及びＢｅｎａｃｔＫＯｒｅｖプライマー並びに鋳型としてのＰ．フルオレッセンスＭＢ２１４ゲノムＤＮＡを用いて増幅した。組換えＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から）を、製造メーカーのプロトコールに従って用いた。以下のサイクリング・プロフィールを用いた。９４℃で２分；（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）の周期を３０回；次いで７２℃で７分間。得られた産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から）中にクローン化し、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換した。形質転換体を、コロニーＰＣＲによって前記プライマー／条件を用いて挿入断片に関してスクリーニングし、陽性のクローンを更に、ＤＮＡ塩基配列決定法によって確認した。次いで、得られたプラスミドを用いて、対応する染色体ＯＲＦを挿入不活性化した。ＮＵＣＬＥＯＢＯＮＤプラスミドミディプレップキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．から）を用いてＤＮＡサンプルを調製し、プラスミドＤＮＡ  ４μｇをＰ．フルオレッセンス菌株ＭＢ１０１に形質転換した。得られた形質転換体をコロニーＰＣＲによって再びスクリーニングした。このために、推定上のノックアウトクローンを選択してＨ2Ｏ  ２０μｌ中に入れ、１００℃において１０分間インキュベートした。得られた溶解細胞のＤＮＡについて、以下のＰＣＲ反応条件を用いてＰＣＲを実施した。プレインキュベートされたクローン２０μｌ，１０×緩衝液５μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2  ３μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １μｌ，５μＭ  ＢｅｎａｃｔＫＯ−ｆｏｒ  ５μｌ，５μＭ  Ｍ１３Ｆ（−４０）及びＭ１３Ｒ（−２１）  ５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から）０．５μｌ、及びＨ2Ｏ  ５．５μｌ。以下のＰＣＲ反応周期条件を用いた。９４℃で１分間；（９４℃で１分間；５０℃で３０秒間；７２℃で２分間）の周期を３０回；次いで７２℃で１０分間、その後、４℃に保持。ＭＢ１０１ゲノムＤＮＡ及びｐＤＯＷ１１２５を対照として用いた。このＢｅｎＲ遺伝子の不活性化により、ノックアウト宿主細胞は、形質転換したＰｂｅｎレセプター遺伝子構成体を活性化できなくなると共に、ベンゾエートを代謝できなくなった。
【０２０１】
部位特異的突然変異誘発のプロトコール
部位特異的突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６−４１に記載されていることがわかっている。Ｐｂｅｎ−１０プロモーター突然変異体の構築を以下のようにして行った。１ｕＭプライマーｂｅｎＬ２７８及び１ｕＭのｂａｍｂｅｎｃｏｎｓｈｏｒｔ，ｂａｍｂｅｎｗｔｓｈｏｒｔ又はｂａｍｂｅｎＡｃｓｈｏｒｔと共に、プラスミドｐＤＯＷ１０２２をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として用いた。組換えＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から）は、製造メーカーの指示に従って用いた。反応サイクリング・プロトコールは以下の通りであった。９４℃で２分間；（９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間及び７２℃で３０秒間）を２５回；次いで７２℃で７分間。得られた産物を、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中にクローン化し、大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。突然変異プロモーターを含む挿入断片をＢａｍＨＩ及びＰａｃＩで消化し、続いて、同じ制限酵素で消化されたｐＤＯＷ１０３３に連結して、プラスミドｐＤＯＷ１０８１及び１０８３−１０８４を生成した。これらはプロモーター：：ｐｈｏＡ転写融合物を有する。これらのプラスミドを鋳型として、プライマー１８０３Ｈ３ｓｅｑ及びｂａｍｂｅｎｃｏｎｓｈｏｒｔ、ｂａｍｂｅｎｗｔｓｈｏｒｔ又はｂａｍｂｅｎＡｃｓｈｏｒｔを用い且つ組換えＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から）を用いて製造メーカーの指示に従って再増幅した。反応サイクリング条件は以下の通りであった。９４℃で１分間、（９４℃で１分間、５０℃で３０秒間、及び７２℃で１分間）を３０回；７２℃で７分間。得られた産物を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、続いて、同じ制限酵素で消化されたｐＤＯＷ１０１７に連結した。これによって、プロモーター：：ｌａｃＺ融合物ｐＤＯＷ１１０２、１１０６及び１１００が形成された。
【０２０２】
Ｐａｎｔ−１０プロモーター突然変異体の構成を以下のようにして行った。１ｕＭプライマー３’Ａｎｔａｃｔｉｖ及び１ｕＭのプライマーｂａｍａｎｔｗｔｓｈｏｒｔ又はｂａｍａｎｔｃｏｎｓｈｏｒｔと共に、プラスミドｐＤＯＷ１０３９をＰＣＲの鋳型として用いた。組換えＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から）を製造メーカーの指示に従って用いた。反応サイクリング・プロトコールは以下の通りであった。９４℃で２分間；（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を２５回；次いで７２℃で７分間。得られた産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＤＯＷ１０３３の同じ部位にクローン化した。プラスミドｐＤＯＷ１０９５及び１０９８は、プロモーターの−１０領域の変異と共にａｎｔＲ−Ｐａｎｔ：：ｐｈｏＡ融合物を含む。
【０２０３】
ＤＮＡ配列決定のプロトコール
クローン化された挿入断片を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌ．）からのＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢＩＧＤＹＥ  Ｖ２．０又はＶ３．０  ＤＮＡ配列決定キットを用いて以下のようにして配列決定した。プレミックス（緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼ及びダイ・ターミネーターを含む；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキットの形で供給）４μＬ、プラスミド鋳型５０ｆｍｏｌ、所望の配列決定プライマー３．２−５ｐｍｏｌ、及び５×緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキットの形で供給）２μＬを合した（最終容量２０μＬ）。使用したＰＣＲサイクリング・プロフィールは以下の通りであった：９５℃で３０秒間、５０℃で２０秒間及び６０℃で４分間の周期を４５回。サンプルを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−５０（核酸のクロマトグラフ精製用のビーズ型デキストランゲル；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から）を用いて精製し、乾燥させ、ホルムアミド中に再浮遊させ、次いでＡＢＩ３１００自動ＤＮＡ配列決定装置（１６キャピラリーアレイ、自動ＤＮＡ配列決定装置；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から）にかけた。
【０２０４】
プライマー伸長のプロトコール
ＲＮＡの単離：  Ｐ．フルオレッセンスＰａｎｔ及びＰｂｅｎプロモーターの制御下にある転写開始点を同定するために、ＲＮＡ単離法に従った。使用した方法は以下の通りである。適当なプラスミドを保有するＰ．フルオレッセンスＭＢ１０１のオーバーナイト培養物を、１％グルコース（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4及び微量元素（前述の通り）を追加した１×Ｍ９培地中で成長させ、同じ培地中で１：４（ｖ／ｖ）で最終容量５０ｍＬまで継代培養した。培養物を、必要に応じて５ｍＭベンゾエート又はアントラニレートで８又は２４時間誘導した。細胞をペレット化し、全ＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹキット（Ｑｉａｎｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌ．）からの「マキシ」細菌ＲＮＡ単離キット）を用いて単離した。ＲＮＡを、最終容量２００μＬまで再浮遊させ、製造メーカーのプロトコールに従ってＤＮＡｓｅＩ（リボヌクレアーゼ非含有；Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）から）１０単位で処理した。ＤＮＡｓｅＩ処理の後、ＲＮＡは、必要に応じてＲＮＥＡＳＹカラム（「ミディ」又は「ミニ」ＲＮＡ精製カラム；Ｑｉａｇｅｎから）を用いて精製した（ＲＮＥＡＳＹ「ミディ」カラムは１ｍｇまでのＲＮＡ量に用い；ＲＮＥＡＳＹ「ミニ」カラムは１００μｇまでのＲＮＡ量に用いた）。精製後、ＲＮＡ濃度を、製造メーカーのプロトコールに従ってＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（ＲＮＡ定量キット；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）から）を用いて、定量した。
【０２０５】
プライマー標識：  １０μＭプライマー（ｌａｃＺＰＥ，ＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、又はｌａｃＺＰＥ２，ＧＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））１μＬ、１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（７００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），１００ｍＭ  ＭｇＣｌ2，５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ））１μＬ、32Ｐ−γＡＴＰ（５０μＣｉ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５μＬ、Ｔ４キナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）１μＬ及びｄｄＨ2Ｏ  ２μＬを混合し、得られた反応混合物を３７℃で３０−６０分間インキュベートすることによってこれを実施した。インキュベート後、反応混合物５μＬを、「配列決定ラダー」分析に使用するために取っておいた。ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））２０μＬを、もう１つ５μＬに添加し、混合し、得られたものを、ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ  Ｇ−２５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）によって回転させて、取り込まれなかったヌクレオチドを除去し、それによって最終濃度０．２μＭの標識プライマーを生成した。
【０２０６】
配列決定ラダー：  これは、ＦＭＯＬキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．製のＤＮＡ配列決定キット）に付属しているプロトコールに従って、１ピコモル（ｐｍｏｌ）の前記標識プライマーを用いて行った。使用したプラスミド鋳型は、伸長反応のためにＲＮＡを単離した菌株に含まれるものと一致する。
【０２０７】
プライマーの伸長反応：  プライマーの伸長反応は、全ＲＮＡ１０−２０μｇを０．２ｐｍｏｌのプライマーと混合して、最終容量を１２μＬとし、次いで７０℃で１０分間インキュベートすることによって行った。次いで、以下のものを添加した。５×ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），３７５ｍＭ  ＫＣｌ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、現在はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌ．）から市販）４μＬ、１Ｍ  ＤＴＴ２μＬ、１０ｍ  ｄＮＴＰ  １μＬ及びＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ（逆転写酵素；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ、今はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）１μＬ。次いで、４２℃で１時間インキュベートした。次いで、得られた混合物を、配列決定停止液（ホルムアミド及び追跡用色素を含む；Ｐｒｏｍｅｇａ  ＦＭＯＬキットの形態で供給）の添加によって；又はシグナルが弱い場合には、３Ｍ酢酸ナトリウム２μＬ／１００％エタノール４０μＬで沈殿させ、次いで１０分間遠心分離して、浮遊物質をペレット化し、前記ペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ  ２μＬ＋配列決定停止液４μＬ中に再浮遊させることによって処理した。次いで、プライマー伸長反応によって得られた産物混合物を、配列決定ラダーの次に８Ｍ尿素及び１．２×ＴＢＥ（即ち、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）から入手された１０×ＴＢＥから希釈されたＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ）を含むＬＯＮＧ  ＲＡＮＧＥＲゲル（６％予備混合ゲル溶液（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）から作成）上で、０．６×ＴＢＥを電気泳動「ランニング」緩衝液として用いて電気泳動させた。ゲルを乾燥させ、螢光スクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、今はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから）に暴露して、放射標識ＤＮＡフラグメントを検出し、ＴＹＰＨＯＯＮ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、今はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｎｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で画像処理した。
【０２０８】
Ｔｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いたプライマーの伸長：  全ＲＮＡ  ３０ｎｇ、０．２μＭプライマー及びｄｄＨ2Ｏ（最終容量１２μＬまで）を混合し、次いで７０℃において１０分間インキュベートした。この混合物に、５×ｃＤＮＡ合成緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸塩（ｐＨ８．４）、３７５ｍＭ  酢酸カリウム，４０ｍＭ酢酸マグネシウム）４μＬ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  １μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、ＴＨＥＲＭＯＳＣＲＩＰＴ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．からの逆転写酵素）１μＬを添加し、得られた混合物を５５℃において１時間インキュベートした。反応生成物を沈殿させ、乾燥し、ｄｄＨ2Ｏ  ４μＬ＋停止液（前記）２μＬ中に再浮遊させた。前記ゲル上に負荷する直前に全反応を２分間７０℃において加熱した。ゲルを前述のように試験した。
【０２０９】
マイクロタイターβ−ガラクトシダーゼアッセイ
我々は、９６ウェルプレートの各サンプルウェルに（即ち、各サンプルの反応過程における各測定時点で少なくとも１つのウェルが使用される全使用ウェルに）供給するのに充分な以下のアッセイ培地を調製した。Ｚ緩衝液（０．０６Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ  、０．０４Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ、０．０１Ｍ  ＫＣｌ、０．００１Ｍ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）１５２μＬ＋１Ｍβ−メルカプトエタノール８μＬ。得られたミックス各９００μＬに関して、０．１％  ＳＤＳを１滴及びＣＨＣｌ3を２滴添加し、混合し（ボルテックス型ミキサーを用いて）、次いでその１４４μＬを各ウェルに加えた。次いで、各ウェルに細胞１６μLを加え、プレートをプラスチックプレートシーラーでシールした。次いで、プレートを１０秒間混合し（ボルテックスで）、次にインキュベーション温度（室温）まで５分間平衡させた。次いで、４ｍｇ／ｍL  ＯＮＰＧ  ５０μLを添加した。はっきりした黄色が発現したら、９０μLの停止液（１Ｍ  Ｎａ2ＣＯ3）を添加し、反応時間を記録した。次に、各サンプルに関する得られた色強度をＡ４２０及びＡ５５０において読み取った。更に、各サンプルにおいて使用する細胞１６μＬを提供する各培養物の細胞密度をＡ６００において読み取った。Ｍｉｌｌｅｒ単位を以下のようにして計算した：
１０００＊（（Ａ４２０−（１．７５＊Ａ５５０）／（時間（分）＊０．１＊Ａ６００））。
【０２１０】
アルカリホスファターゼのアッセイ
このアッセイのために、ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）基質；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から）を、製造メーカーによって提供された各タブレットの１つ（各ＰＮＰＰ及びＴｒｉｓ当たりタブレット１つ；−２０℃で貯蔵）をｄｄＨ2Ｏ  ２０ｍＬに加え、最終濃度１ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＰ及び０．２ＭのＴｒｉｓを生じることによって調製した。各時点において、各サンプルについで、ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴ基質５０μＬを細胞５μＬと合した。次いで、得られたものを室温で３０分間インキュベートした。次に、各サンプルに関する得られた色強度をＡ４１０において読み取った。更に、各試験サンプルにおいて使用する細胞５μＬを提供する各培養物の細胞密度をＡ６００において読み取った（即ち、細胞培養物を９６ウェルプレート中で読み取った）。次いで、Ａ４１０／（０．１＊Ａ６００）の値を計算して、アルカリホスファターゼ活性／細胞を示した。
【０２１１】
実施例１
ベンゾエート誘導性プロモーターのクローン化及び分析
ベンゾエートは安価で、本質的に無毒性の化合物であるため、インデューサーの理想的な候補である。Ｐ．フルオレッセンスＤＮＡの５０９ｂｐ領域をクローンした。この領域は、ベンゾエートジオキシゲナーゼのサブユニットのコード配列の一部である推定上のｂｅｎＡ翻訳開始点の上流に位置することがわかった（図５）。クローン化領域はベンゾエート誘導性プロモーター（Ｐｂｅｎ）を含むことがわかり、「Ｐｂｅｎ５０９」と命名された。
【０２１２】
ベンゾエート誘導性プロモーター活性は、容易にアッセイできるレポーター遺伝子（即ち、主要レポーター遺伝子として使用された、β―ガラクトシダーゼをコード化するｌａｃＺ、又はｐｈｏＡ）の上流に、Ｐｂｅｎ５０９の又はＰｂｅｎ２７８の（下記）推定上のプロモーター配列を含むＤＮＡフラグメントを融合させることによって試験した。得られたプラスミドをＰ．フルオレッセンスＭＢ１０１に形質転換した。安息香酸ナトリウムの添加後、色素生産性基質ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用いてβ―ガラクトシダーゼ活性の誘導を測定した（図６参照）。ｐｈｏＡレポーター遺伝子及び色素生産性基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を用いて、同様な実験を実施した。これらの構成体を保有するＰ．フルオレッセンス菌株は、１−１０ｍＭの安息香酸ナトリウムの添加時にそれぞれ、β−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼ活性を示す。インデューサーの濃度及び／又は誘導時間を変化させると、レポーター遺伝子発現のレベルが変化した（データは示さず）。
【０２１３】
予想される翻訳開始点（図５）の上流に２７５ｂｐの部分（この部分は「Ｐｂｅｎ２７８」と命名された）を含むプロモーター＋レポーター遺伝子構成体の切断型は、Ｐｂｅｎ５０９のそれと同様な活性を保持することわかった（図６）
【０２１４】
Ｐｂｅｎ５０９及びＰｂｅｎ２７８プロモーター活性は共に、発酵の間に、少ないが有意な濃度のグルコースの存在により阻害されることがわかった。従って、これらのプロモーターはカタボライト抑制される。
【０２１５】
ノーザン分析は、Ｐｂｅｎからの発現がインデューサー化合物（例えば、安息香酸ナトリウム）の添加時にのみ起こることを示した。これは、Ｐｂｅｎの誘導性発現がプロモーターのｌａｃ系統の誘導性発現のように漏出性でないことを示している（データを示さず）。ｌａｃＺに融合されたＰｂｅｎ５０９又はＰｂｅｎ２７８を保有するＭＢ１０１の誘導培養物から単離された全ＲＮＡのプライマー伸長分析は、転写開始点が、予想されるｂｅｎＡ翻訳開始点の１９６ヌクレオチド（ｎｔ）上流であることを示した。これは、プロモーター配列及び正の調節のｃｉｓ作用性要素が、Ｐｂｅｎ２７８クローン中の転写開始の上流８２ｂｐ以内に含まれることを示している。
【０２１６】
文献は、ベンゾエートの代謝産物、シス，シス−ムコネートがアシネバクターｓｐ．及びＰ．ピュチダのような他の細菌のｂｅｎＡＢＣＤオペロンを誘導するように作用することを教示している。しかし、シス，シス−ムコネート及びベンゾエート分解のための既知の代謝経路における推定先行化合物、即ち、カテコールは共に、Ｐｂｅｎ５０９の活性もＰｂｅｎ２７８の活性も誘導できない（データは示さず）。結果として、ベンゾエート又は最初のベンゾエート誘導体、例えば、２−ヒドロ−１，２−ジヒドロキシベンゾエートは、ベンゾエートプロモーターの誘導を直接引き起こすことができる。
【０２１７】
実施例２
アントラニレート誘導性プロモーターのクローン化及び分析
アントラニレートも、ベンゾエートと同様に、Ｐ．フルオレッセンスによって利用されることができる安価な低毒性化合物であるため、インデューサーとして研究するための理想的な化合物である。４つのプロモーター構成体を、ｌａｃＺ又はｐｈｏＡレポーターの上流でクローン化し、それらはアントラニレートによる誘導時に同様な活性を有することがわかった：Ｐａｎｔ７１３、Ｐａｎｔ７０５、Ｐａｎｔ３１１、及びＰａｎｔ＋ａｎｔＲコード配列（ＣＤＳ）（図７）。Ｐａｎｔ７１３とＰａｎｔ７０５とは同じ５’末端を有するが、Ｐａｎｔ７１３はａｎｔＡ遺伝子の予想されるリボソーム結合部位を含むのに対し、Ｐａｎｔ７０５は含まない（Ｐａｎｔ７１３に関して示した最終オクタマー中の、下線を引いたＣＣＴＣＣを参照）。アントラニレート誘導活性化に必要なＤＮＡの最小領域を割り出すために、Ｐｂｅｎ７１３構成体を５’末端で３１１塩基対（ｂｐ）に切断した。Ｐａｎｔ３１１構成体は、Ｐａｎｔ７１３と同様な活性を保持することがわかった（図示せず）。ａｎｔＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写アクチベーター遺伝子５’を含ませるためのプロモータークローンの増殖は、ｌａｃｚ融合物の発現レベルを増加させた。転写開始点を、Ｐａｎｔ７１３及び転写アクチベーターＡｎｔＲを含む増殖クローンの両者に関して、予測されるａｎｔＡ翻訳開始点の３１ヌクレオチド上流に位置付けた（データは示さず；これも図７参照）。ｌａｃＺ融合物を有する多コピー中のａｎｔＲの存在は、より迅速且つより強力な誘導を可能にすることがわかった（図８参照）。
【０２１８】
更に、ＡｎｔＲの発現の更なる増大は、Ｐａｎｔプロモーターによるアントラニレート誘導性発現をより改良することがわかった。例えば、図８に示されるように、ｐＤＯＷ１０２９−及びｐＤＯＷ１０３５−構成体が共に、Ｐ．フルオレッセンス宿主細胞中で誘導された。図８は、誘導速度及び２４時間の研究過程においてこれらのプロモーターのそれぞれに関して達成された最大誘導レベルがかなり異なることを示している。ｐＤＯＷ１０２９は、ａｎｔＲコード配列を欠いているＰａｎｔ７１３プロモーターを含み；ｐＤＯＷ１０３５は、完全なアクチベーターＣＤＳを含む。使用したＰ．フルオレッセンス宿主細胞は、ａｎｔＲ  ＣＤＳの活発に発現された染色体コピーを含む。従って、ｐＤＯＷ１０２９に関して図８に示された結果は、ａｎｔＲ遺伝子が１つのコピー中に存在する系に関するが、ｐＤＯＷ１０３５に関する結果は２コピー系に相当する。これらの結果は、ａｎｔＲ遺伝子の追加のコピーの存在がＰａｎｔプロモーターの応答の速度及びレベルを共に劇的に改良することを示している。このような改良された発現は、非常に強力なプロモーターによってａｎｔＲの発現を促進することによって、二者択一的に得ることもできるし、あるいは更に向上させることもできる。改良された誘導／発現はまた、下記のようにして、インデューサー化合物（例えば、アントラニレート）の分解を引き起こす鍵遺伝子（例えば、ａｎｔＡ）が不活性化されている宿主細胞を用いることによって得ることができる。更に、アクチベーター及び／又はプロモーター配列の突然変異（及び活性の増大した突然変異体の選択）もまた、アクチベーター／プロモーター相互作用を向上させ、それによってＰａｎｔによるより改良されたアントラニレート誘導性発現を実現できるであろう。
【０２１９】
アントラニレートプロモーターはまた、ハロ置換アントラニル酸誘導体：３−クロロ、４−クロロ、５−クロロ及び６−クロロ−アントラニレートを含むアントラニレート類縁物質によって誘導できることがわかった。６−クロロアントラニレートは、アントラニレート代謝の無償性インデューサーとして働くことがわかっている。即ち、それはＰ．フルオレッセンスによって代謝されず、アントラニレートプロモーターからの発現を誘導する。例えば、６−クロロアントラニレートは、Ｐａｎｔ７１３及びａｎｔＲ／Ｐａｎｔ構成体を誘導することがわかった（図８）。総合すれば、これらの結果は、アントラニレート自体が代謝経路を誘導すること；及び宿主生物のアントラニレート代謝経路の不活性化に代わる手段として無償性インデューサーとしての置換アントラニレート化合物を使用することができることを示している。
【０２２０】
実施例３
融合Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーターの構築及び試験
多コピーａｎｔＲを有するＰａｎｔプロモーターの相対強度は、Ｐｂｅｎ２７８プロモーターの約１／５であることがわかった。しかし、カタボライト抑制されたＰｂｅｎプロモーターとは異なり、Ｐａｎｔプロモーターの活性は発酵の間に阻害されなかった。これら２つのプロモーターの融合物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるようにそれらを結合することによって、即ち、ｌａｃｚに融合されたＰｂｅｎ２７８プロモーターの上流でフラグメントａｎｔＲ及びＰａｎｔをクローン化することによって作成した。
【０２２１】
アントラニレートによって誘導されたタンデム「’ａｎｔＲ／Ｐａｎｔ’−’Ｐｂｅｎ２７８’」構成体の強度は意外なことに、アントラニレートによる誘導時の「ａｎｔＲ／Ｐａｎｔ」単独の強度よりも改良されることがわかった。ベンゾエートによる誘導時のタンデムプロモーターの強度は、Ｐｂｅｎ２７８単独の強度と同様であることがわかった（図９）。グルコースの存在下でのアントラニレートの添加時にタンデムプロモーターからより大きいβ−ガラクトシダーゼ活性が誘導されることは、自然状態でカタボライト抑制されたＰｂｅｎがコード配列の近位に位置するタンデムプロモーターからの転写が意外にもＰｂｅｎのカタボライト抑制によって阻害されないことを示している。これは、（１）タンデムプロモーター中のＰｂｅｎ及びＰａｎｔ成分の細菌源及び（２）誘導を試験した宿主細胞が同一である、即ち、シュードモナス・フルオレッセンスのバイオタイプＡであるという事実に鑑みると、更に意外である。従って、Ｐｂｅｎ成分が宿主細胞に固有であったとしても、自然状態で非カタボライト抑制されたプロモーター（Ｐａｎｔ）が上流に存在すると、自然状態でカタボライト抑制されたプロモーター（Ｐｂｅｎ）のカタボライト抑制を克服できる。更に、Ｐｂｅｎプロモーターの上流にａｎｔＲ及びＰａｎｔが存在すると、Ｐｂｅｎのカタボライト抑制が解放されるように見える。これは、タンデムプロモーターが、発酵中にグルコースの存在下においては活性であるためである（（図１２及び１３参照）。
【０２２２】
実施例４
Ｐｂｅｎ５０９の改良突然変異体
Ｐｂｅｎプロモーターを改良するために、Ｐｂｅｎ５０９プロモーターを誤りがちなＰＣＲによる突然変異誘発に供した。振盪フラスコ規模で１０ｍＭベンゾエートで誘導した後に突然変異体を改良された活性に関してスクリーニングした。同定した突然変異体は、野生型プロモーターに比べて約２倍の改良を示した（図１０）。ポジティブヒットをＰ．フルオレッセンスに再び形質転換し、再試験して、改良された活性が実際に新しい構成体によることを裏付けた。
【０２２３】
配列分析（図１１）は、突然変異体２ｄ３中の１つの変化及び突然変異体２１ｂ５の２つの変化を明らかにした。添付図に示されるように、単離された２ｄ３中の突然変異、及び２１ｂ５中の突然変異の１つは、上流のＯＲＦのコード領域の範囲内に入る。この領域は、Ｐｂｅｎ２７８構成体中には含まれない。これらの突然変異が改良されたプロモーター突然変異体において単離されるという事実は、上流の領域は転写に影響を与える可能性があるが、活性化された転写には必要ないことを示している。２１ｂ５中において同定されたもう１つの突然変異は、転写開始点の５塩基対上流に位置する。
【０２２４】
実施例５
合理的に突然変異されたＰｂｅｎ及びＰａｎｔプロモーター
Ｐｂｅｎ−１０突然変異体の構成及び分析：  天然のＰｂｅｎの、予想される−１０領域は、プロモーター活性を改良するために突塩変異させた。「材料及び方法」に記載したようにして、プロモーター自体を８８ｂｐに切断し、−１０の３つの誘導体：野生型（ＴＡＣＧＧＴＴ）、コンセンサス（ＴＡＴＡＡＴ）、及びアシネトバクター（Ａｃ）Ｐｂｅｎ−１０（ＴＡＡＧＧＴ）を構成した。予め同定した転写開始部位の上流の１ｂｐ（Ｇ：Ｃ）が除去され且つ予め同定された転写開始点の下流の９ｂｐが含まれるように、プライマーを構成した。これらのプロモーターをｐｈｏＡレポーター遺伝子に融合させ、Ｐ．フルオレッセンスＭＢ１０１中における活性に関して評価した。図１４は、Ｐｂｅｎプロモーターの８８ｂｐへの切断は、ベンゾエート活性化発現を与えるのに充分であるが、−１０領域の、コンセンサスＴＡＴＡＡＴへの又はアシネトバクターＰｂｅｎの−１０配列への変化は、ベンゾエート誘導プロモーター活性をそれほど改良しないようであることを示している。
【０２２５】
Ｐａｎｔ−１０突然変異体の構成及び分析：  Ｐｂｅｎに関して前述したように、Ｐａｎｔプロモーターの予想される−１０領域を、プロモーター活性を改良するために突然変異させた。２つのＰａｎｔ−１０突然変異体の構成において、プロモーターを２８９ｂｐに切断した。アントラニレート転写アクチベーター及び突然変異プロモーターを含むフラグメント並びにＤＮＡをｐｈｏＡレポーター遺伝子に融合させた。得られたプラスミドを、ａｎｔＡ遺伝子が挿入不活性化されたＭＢ１０１の誘導体に形質転換した。図１５は、アントラニレートによる誘導後には、プロモーターの２８９ｂｐへの３’切断が活性に影響を与えないことを示している（ｐＤＯＷ１０９５）。推定上の−１０領域をコンセンサス−１０（ｐＤＯＷ１０９８）に変化させると、誘導化合物の不存在下でも発現できるようになったプロモーターが得られた。アントラニレートの添加によってより高い発現が得られた。このことは、プロモーターが依然として誘導性であったことを示している。
【０２２６】
実施例６
突然変異Ｐｔａｎｄｅｍプロモーター
ｐＤＯＷ１０５７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）に示された配列を有するタンデムプロモーターを、以下のようにしてＰｂｅｎ−１０領域において突然変異させて、突然変異Ｐｔａｎｄｅｍプロモーターを構成した。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩによるｐＤＯＷ１０３９の消化によって得られた、ａｎｔＲ及びＰａｎｔを含む１．６ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．からのＱＩＡＥＸ  ＩＩゲルカラムを用いて）、ｐＤＯＷ１１０２（Ｐｂｅｎ８８ｗｔ−１０）、ｐＤＯＷ１１０６（Ｐｂｅｎ８８ｃｏｎ−１０）及びｐＤＯＷ１１００（Ｐｂｅｎ８８Ａｃ−１０）（これらはそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｍｅＩで消化してある）のそれぞれに連結した。宿主細胞への形質転換後、陽性のクローンを、各プラスミドに関してコロニーＰＣＲによって同定し、次いでＤＮＡ配列決定法によって確認した。得られたプラスミドはそれぞれ、ｐＤＯＷ１１０７、ｐＤＯＷ１１０８及びｐＤＯＷ１１０９と命名した。
【０２２７】
Ｐｂｅｎ突然変異体のＰｔａｎｄｅｍ活性に対する影響を、振盪フラスコ規模で評価した。図１６に示されるように、突然変異は、ベンゾエート−又はアントラニレート−誘導Ｐｔａｎｄｅｍ活性に対して有意な影響を及ぼさない。ｐＤＯＷ１１０７−１１０９は全て、元の構成体ｐＤＯＷ１０５７によって示されるβ−ガラクトシダーゼ活性の２倍以内のβ―ガラクトシダーゼ活性を示した。興味深いことに、Ｐｂｅｎ８８−１０コンセンサス突然変異体は、単独で又はタンデムプロモーターの一部として、ベンゾエート又はアントラニレートによる誘導前に発現されるようであることがわかった。インデューサーとしてベンゾエートを添加すると、単独での（ｐＤＯＷ１１０６）又はタンデムの一部としての（ｐＤＯＷ１１０８）Ｐｂｅｎ８８−１０コンセンサスからの発現が増大した（図１６Ａ）。しかし、アントラニレートの添加は、Ｐｂｅｎ８８−１０コンセンサスタンデム構成体ｐＤＯＷ１１０８からのｌａｃＺの発現を増加させなかった（図１６Ｂ）。
【０２２８】
２０Ｌ規模でのｐＤＯＷ１１０８の分析は、２４時間にわたって２ｍＭ又は５ｍＭベンゾエートパルスによって誘導されたｐＤＯＷ１１０８を保有するＭＢ１０１は活性であるだけでなく、ベンゾエートを代謝できることを明らかにした（データは示さず）。比較的高いレベルのβ−ガラクトシダーゼ活性がＩ０において検出された。これはおそらく「漏出性」発現の結果であり、振盪フラスコ規模で検出された（図１６Ａ参照）。活性の最初の低下は、ベンゾエートによる誘導時に一貫して検出されるが、活性は次に、Ｉ０において検出されたレベルよりも高いレベルまで上昇した。２０Ｌ規模において２４時間の間４時間毎に２ｍＭアントラニレートでｐＤＯＷ１１０８を誘導することにより、アントラニレートは効率よく代謝されるが、β−ガラクトシダーゼ活性によって測定されるクローン化タンデムプロモーターの発現は、振盪フラスコ規模で観察されるように漏出性であるが、アントラニレートの添加後には実際には減少することがわかった（図１８参照）。元のタンデムプロモーター構成体ｐＤＯＷ１０５７を保有するＰ．フルオレッセンスの、２０Ｌ規模におけるベンゾエートによる比較誘導は、ベンゾエートがｐＤＯＷ１１０８と同様に代謝されることを示している。しかし、β−ガラクトシダーゼ活性の誘導は、ｐＤＯＷ１１０８構成体の同様な２ｍＭ用量での誘導（増加した活性は、誘導後３０から４８時間に対して、４から２４時間で検出された）に比較して遅れるようである（データは示さず）。
【０２２９】
実施例７
発酵時における遺伝子発現制御へのベンゾエート及びアントラニレート誘導プロモーターの使用
２０Ｌ規模におけるＰｂｅｎ５０９  ｌａｃＺ融合物の試験により、振盪フラスコ規模では検出されなかった転写調節の問題点が明らかになった。５又は１０ｍＭのベンゾエートによる融合物の誘導は一貫しては観察されなかった（データは示さず）。ベンゾエート消費とＰｂｅｎ５０９活性化との相関も観察された。グリコースの存在は、レポーター遺伝子発現を引き起こすと考えられる。これらの実験に続いて、振盪フラスコの実験において、ベンゾエートの代謝はグルコースの枯渇に続いて起こることが観察された。ベンゾエート誘導性の系は、グルコース以外の炭素源を利用する発酵プロセスにおいて有用であることができる。振盪フラスコの実験は、クエン酸塩を炭素源として用いた場合に最高レベルの誘導が観察されることを示している。この観察は発酵規模に当てはまるはずである。
【０２３０】
２０Ｌ規模におけるａｎｔＲ  Ｐａｎｔ構成体及びタンデムプロモーター構成体の試験は、振盪フラスコ規模で観察されたのと同様な活性を示した。インデューサーが培養物によって消費されるため、アントラニレートを導入過程において供給した。活性は、経時的に増加するのが観察された。インデューサーを代謝できない菌株においてはより高い活性が観察されると考えられる。振盪フラスコ及び２０Ｌ発酵実験において観察されるように、タンデムプロモーター構成体はａｎｔＲ  Ｐａｎｔ構成体よりも活性である（図１２）。ａｎｔＡ遺伝子の挿入不活性化によるアントラニレート代謝の不活性化は、２０Ｌ規模においてタンデムプロモーター：ｌａｃＺ融合物のより多くの発現を可能にした。図１３に示されるように、アントラニレートは誘導過程において代謝されず、観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、アントラニレートを代謝する菌株において観察されるβ−ガラクトシダーゼ活性のレベルよりもはるかに高い。
【０２３１】
実施例８
ｂｅｎＡＢノックアウト菌株の特性決定
ベンゾエートが実際にＰｂｅｎプロモーターのインデューサーであるか及びその下流の代謝産物でないかを検証するために、Ｐ．フルオレッセンスのｂｅｎＡＢ遺伝子ノックアウト菌株を更に特性決定した。ｂｅｎＡ及びｂｅｎＢ遺伝子はそれぞれ、ベンゾエート１，２ジオキシゲナーゼの大きいサブユニット及び小さいサブユニットをコードする。ｂｅｎＡＢノックアウト菌株の単離された２つを更に、以下のようにしてベンゾエート代謝能力に関して試験した。細胞をＬＢ−プロリン−ウラシル中で高密度まで成長させ；次いで、ベンゾエートを最終濃度〜５ｍＭまで培養物に添加してから、それらを戻して、２４時間インキュベートした。ＨＰＬＣによって測定された、細胞を含まないブロス中に残っているベンゾエートの濃度は、ｂｅｎＡＢ欠失突然変異株はベンゾエートを代謝できないのに対し、親の非ノックアウト菌株はベンゾエートを効率的に代謝することを示した。ＰｂｅｎプロモーターがｂｅｎＡＢノックアウト菌株中で依然として活性であるか否かを評価するために、Ｐｂｅｎ２７８：：ｌａｃＺ構成体を含むプラスミドを菌株の１つに形質転換し、形質転換体をＬＢ培地中で成長させた。形質転換体を０又は５ｍＭベンゾエートで誘導した。ｌａｃＺ活性は、ベンゾエートが確かに、下流の代謝産物ではなく、Ｐｂｅｎのインデューサーであることを実証した（図１９参照）。
【０２３２】
実施例９
ｂｅｎＲの多コピー発現の影響
Ｐｂｅｎプロモーターと共にｂｅｎＡの上流にＢｅｎＲ  ＯＲＦを含むＤＮＡフラグメントを、Ｐ．フルオレッセンスＭＢ２１４ゲノムＤＮＡから、プライマーＢｅｎａｃｔ５’及びＢａｍｂｅｎｃｏｎｓｈｏｒｔを用いて以下の条件下で増幅した：９４℃で１分間；（９４℃で１分間；５０℃で３０秒間；７２℃で９０秒間）の周期を３０回；次いで、７２℃で１０分間、そして４℃に保持。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ベクターに連結し、配列を検証した。挿入フラグメントを、ＰｍｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ｐＤＯＷ１０３３に連結した。得られたプラスミドをｐＤＯＷ１０９０として貯蔵した。ｐｈｏＡレポーターＡを除去するためにｐＤＯＷ１０９０をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、そしてｌａｃＺレポーター遺伝子を含むｐＤＯＷ１０３５の３Ｋｂ  ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントと置き換えることによって、同じプロモーター構成体をｌａｃＺレポーターに融合させた。
【０２３３】
ｂｅｎＲ  ＯＲＦを、ｐｈｏＡレポーター遺伝子の上流でＰｂｅｎプロモーターと共にクローン化して、多コピー中における転写アクチベーターの発現がベンゾエート活性化遺伝子発現を改良するどうかを調べた。振盪フラスコ規模においては、多コピーのｂｅｎＲに関するプロモーター活性に有意差は観察されなかった。転写アクチベーターの過剰発現はカタボライト抑制を克服できることが文献中に示されているので、ｐＤＯＷ１０９０を保有するＰ．フルオレッセンスＭＢ１０１の２０Ｌ発酵を試験した。以前の研究は、Ｐｂｅｎ：：ｌａｃＺ融合物を保有するＭＢ１０１は、コーンシロップ供給材料を用いた発酵の間にベンゾエートを代謝できないことを示した。本発明者らは、ｐＤＯＷ１０９０を保有するＭＢ１０１は２０Ｌ規模においてベンゾエートを代謝できることを見い出した。ベンゾエートは、トリプリケートの２０Ｌ発酵において一貫して代謝されることがわかった。このことは、染色体のＰｂｅｎプロモーターが活性であったことを示している。従って、ｂｅｎＲの多コピー発現の存在はカタボライト抑制を克服した（図１７参照）。
【０２３４】
結果として、本発明者らは、ｂｅｎＲの過剰発現により、Ｐ．フルオレッセンスが、Ｐｂｅｎのみを含む構成体を試験した場合に２０Ｌ規模においてはベンゾエート代謝に関して観察されるカタボライト抑制を克服できることを見い出した。Ｐｔａｎｄｅｍの制御下におけるアントラニレート誘導活性がＰａｎｔのアントラニレート誘導活性よりも既に強いとしても、タンデムプロモーターのベンゾエート誘導活性化は振盪フラスコ規模ではアントラニレート誘導活性よりも大きいので、２０Ｌ規模におけるベンゾエート誘導プロモーター活性の実証は重要な改良である。ｐＤＯＷ１０５７及びｐＤＯＷ１１０８は共に、２０Ｌ規模ではベンゾエート誘導性であることがわかった。有意な発現がインデューサーの添加前に起こる点で、ｐＤＯＷ１１０８構成体は「漏出性」であるが、タンパク質発現への使用には大きな問題とならないであろう。更に、ＰｂｅｎはｂｅｎＡＢノックアウト菌株中で活性であることがわかったので、このようなノックアウト菌株の使用は、Ｐｔａｎｄｅｍと同様にＰｂｅｎに関するベンゾエート誘導プロモーター活性を改良するであろう。同様に、タンデムプロモーター構成体ｐＤＯＷ１０５７のアントラニレートによる誘導は、挿入不活性化された染色体ａｎｔＡ遺伝子を保有する菌株中で改良されることが示されたので、改良されたアントラニレート誘導プロモーター活性はＰｔａｎｄｅｍと同様にＰａｎｔに関して増強されるであろう。
【０２３５】
従って、細菌発現系に使用するためのアントラニレート及びベンゾエート誘導性プロモーターが開発された。これらのプロモーターは、転写の厳格な調節を可能にすることがわかった。これらは、ベンゾエート及びアントラニレートのような低コスト化合物によって誘導可能である。また、多コピー中におけるａｎｔＲの存在は、Ｐａｎｔプロモーターの活性を著しく改良することもわかった。更に、細菌発現系に使用するための新しい型のタンデムプロモーターが開発された。これは、Ｐａｎｔ自体よりも増加したレベルのアントラニレート誘導遺伝子発現を示すことがわかったＰａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーターによって実証された。Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーターは、ベンゾエート誘導性であること、即ち、Ｐｂｅｎ自体と同レベルまでベンゾエート誘導性であることがわかった。また、これらは意外にも、Ｐｂｅｎ単独が受けるカタボライト抑制を克服することがわかった。更に、本研究は、Ｐａｎｔプロモーター（ａｎｔＲを含む）及びタンデムプロモーター構成体が共に、発酵規模条件下で（例えば、２０Ｌ規模で）アントラニレート誘導性遺伝子発現を示すこと；タンデムプロモーター構成体が発酵規模条件下でベンゾエート誘導性遺伝子発現も示すことを実証した。
【０２３６】
前記の好ましい実施態様は本発明の単なる代表例であること、並びに本明細書中で使用した用語は好ましい実施態様を説明するためにのみ使用し、従って、前記説明のために選択した好ましい実施態様は本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。前述の本発明、他の実施態様、代替物、変形物、及び自明の変更は、本明細書中で詳述したそれらの好ましい実施態様、方法、プロトコール、ベクター、試薬、成分及び組合せの相当物として、当業者には日常的な実験のみによって明らかであろう。このような相当物は、本発明の範囲内であると見なすものとし、本発明の精神及び範囲から逸脱するものとは見なさない。このような相当物は全て、添付した「特許請求の範囲」の範囲内に含まれるものとし、従って、本発明の真の範囲は、添付した「特許請求の範囲」によって定義される。
【０２３７】
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５．Ｒ．Ｓｌａｔｅｒ  ＆  Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ編）ｐｐ．１２５−５４（２０００）（Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
６．Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４−４８（１９７９）。
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１０．Ｍ．Ｍ．Ｍａｒｉｎら，Ｔｈｅ  ａｌｋａｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ  ＲＲ１０  ｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（１４）：４２０２−０９（２００１）。
１１．Ｍ．Ｍ．Ｏｃｈｓら，Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｍａｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｒｉｎ  ＯｐｒＤ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１（１７）：５４２６−３２（１９９９）。
１２．Ｔ．Ｎｉｓｈｉｊｙｏら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｐｅｒｏｎ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＡｒｇＲ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１８０（２１）：５５５９−６６（１９９８）。
１３．Ｋ．Ｌ．Ｈｅｓｔｅｒら，Ｃｒｃ  ｉｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｋｄ  ｏｐｅｒｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ａｎｄ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（４）：１１４４−４９（２０００）。
１４．Ｇ．Ｍｏｓｑｕｅｄａ  ＆  Ｊ．Ｌ．Ｒａｍｏｓ，Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｅｆｆｌｕｘ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＤＯＴ−Ｔ１Ｅ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｏｄ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｏｌｕｅｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（４）：９３７−４３（２０００）。
１５．Ｃ．Ｄ．Ｌｕ  ＆  Ａ．Ｔ．Ａｂｄｅｌａｌ，Ｔｈｅ  ｇｄｈＢ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ａｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＮＡＤ（＋）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｔｏ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（２）：４９０−９９（２００１）。
１６．Ｓ．Ｖｉｌｃｈｅｚら，Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ｐｕｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｌｉｎｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．Ａｐｐｌ．  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（１２）：５２２１−２５（２０００）。
【図面の簡単な説明】
【０２３８】
【図１】本発明に係るベンゾエート誘導性プロモーターＰｂｅｎ５０９を含むベクターであるｐＤＯＷ１０１９のプラスミドマップ。
【図２】本発明に係るベンゾエート誘導性プロモーターＰｂｅｎ２７８を含むベクターであるｐＤＯＷ１０２８のプラスミドマップ。
【図３】本発明に係るアントラニレート誘導性プロモーターを含み、そのアクチベータータンパク質のコード配列を含むベクターであるｐＤＯＷ１０３５のプラスミドマップ。
【図４】本発明に係るアントラニレート−ベンゾエートタンデムプロモーターを含むベクターであるｐＤＯＷ１０５７のプラスミドマップ。
【図５】Ｐｂｅｎ５０９ベンゾエート誘導性プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｃ９９４−ｃ１５０２）及びＰｂｅｎ２７８ベンゾエート誘導性プロモータター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチドｇ１２２８−ｃ１５０２）のヌクレオチド配列の比較。
【図６】安息香酸ナトリウム０ｍＭ（白グラフ）若しくは１０ｍＭ（黒グラフ）の存在下における、Ｐｂｅｎ５０９（ｐＤＯＷ１０１９）又はＰｂｅｎ２７８（ｐＤＯＷ１０２８）の制御下にあるβ−ガラクトシダーゼ導入を示す棒グラフ。
【図７】４種のＰａｎｔプロモーター：Ｐｎａｔ＋ＡｎｔＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のａ１−ｃ１３９５）、Ｐａｎｔ７１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ５９２−ｃ１３０４）、Ｐａｎｔ７０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ５９２−ｇ１２８８）及びＰａｎｔ３１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のヌクレオチドｃ９９４−ｃ１３０４）のヌクレオチド配列の比較。
【図８】５ｍＭのアントラニレート又は２ｍＭのクロロアントラニレートで誘導された場合における、Ｐａｎｔ７１３構成体（ｐＤＯＷ１０２９）の活性をａｎｔＲ／Ｐａｎｔ構成体（ｐＤＯＷ１０３５）の活性と比較するグラフ。
【図９】Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター構成体の誘導及び成分プロモーター構成体の誘導を示す棒グラフ。
【図１０】Ｐｂｅｎ５０９の活性と、Ｐｂｅｎ５０９の誤りがちなＰＣＲによって作成された、改良突然変異体２ｄ３及び２１ｂ５の活性との棒ブラフ比較。
【図１１】Ｐｂｅｎ５０９のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃ９９４−ｃ１５０２のヌクレオチド）と、誤りがちなＰＣＲによって作成された２つのその改良突然変異体：突然変異体２ｄ３（ａ１１０６→ｔ１１０６である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃ９９４−ｃ１５０２のヌクレオチド）及び突然変異体２１ｂ５（ｃ１２２３→ｔ１２２３及びｇ１３０２→ａ１３０２である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃ９９４−ｃ１５０２のヌクレオチド）のヌクレオチド配列の比較。
【図１２】２０Ｌ発酵条件におけるアントラニレート誘導発現のグラフ。
【図１３】宿主細胞（シュードモナス・フルオレッセンス）中のａｎｔＡ遺伝子の単一交差ノックアウトによって作成されたａｎｔＡノックアウト宿主中のタンデムプロモーター構成体（ｐＤＯＷ１０５７）からの改良アントラニレート誘導発現を示すグラフ。
【図１４】Ｐｂｅｎ−１０突然変異体の誘導を示す棒グラフ。
【図１５】Ｐａｎ−１０突然変異体の誘導を示す棒グラフ。
【図１６】ａｎｔＲ−Ｐａｎｔ３１１−Ｐｂｅｎタンデムプロモーターの活性に対するＰｂｅｎ８８−１０突然変異の影響を示す棒グラフ。
【図１７】ｐＤＯＷ１０９０による多コピー中にｂｅｎＲが存在する場合における２０Ｌの発酵中のベンゾエート消費のグラフ。
【図１８】タンデムプロモーター構成体の活性の棒グラフ比較。
【図１９】ｂｅｎＡＢノックアウト菌株におけるＰｂｅｎ活性の分析を示す棒グラフ。
【図１】
2006506049.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2006506049.tif 000031
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