(57)【要約】本発明は、膜孔を可逆的に形成するための海綿毒素、詳細には高分子１，３−アルキルピリジニウム塩（ポリ−ＡＰＳ）の使用、およびそのような孔を生成する方法に関する。
2006527594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜孔を可逆的に形成するための海綿毒素を含む組成物の使用。
【請求項２】
前記海綿毒素が、少なくとも１種の高分子１，３−アルキルピリジニウム塩（ポリ−ＡＰＳ）を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記海綿毒素が、海綿レニエラ・サライ、カリスポンジア・リドレイ、ハリクロナ・エリナ、ハリクロナ・ルベンス、ハリクロナ・ビリディス、アンピメドン・ビリディス、カリスポンジア・フィブロサ、およびアンピメドン・コンプレッサから得られる、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記海綿毒素が、５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記海綿毒素が、５．５ｋＤａ〜１８．９ｋＤａの分子量を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
海綿毒素の濃度が、０．５ｎｇ／ｍｌ〜５．０μｇ／ｍｌである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
海綿毒素の濃度が、０．５ｎｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
膜孔を可逆的に形成する方法であって、
ａ）請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物の存在下で膜をインキュベートする工程と、
ｂ）前記組成物を膜と接触した状態から除去する工程と、を含む方法。
【請求項９】
亜鉛溶液を添加して、膜孔の形成を低減する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
亜鉛溶液の濃度が、実質的に１〜２ｍＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
亜鉛の濃度が、１．５ｍＭである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
インビトロにおいて巨大分子を細胞へトランスフェクトする方法であって、
ａ）海綿毒素を含む組成物の存在下で細胞をインキュベートする工程と、
ｂ）組成物を膜と接触した状態から除去する工程と、
ｃ）前記巨大分子を添加する工程と、を含む方法。
【請求項１３】
前記巨大分子が、ｃＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、脂質またはオリゴヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
巨大分子を添加する前に、前記細胞を前記組成物の存在下で１〜２０分間にわたってインキュベートする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
巨大分子を添加する前に、前記細胞を前記組成物の存在下で５分間にわたってインキュベートする、請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１．０〜５．０μｇの核酸を添加する、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項１７】
２．５μｇの核酸を添加する、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物および巨大分子の存在下で細胞をインキュベートして、前記組成物および巨大分子を標準媒体で置換することを含む、請求項１２乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞を２０〜２００分間にわたってインキュベートする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞を１８０分間にわたってインキュベートする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
インビボにおいて巨大分子を細胞にトランスフェクトする方法であって、
ａ）海綿毒素および前記巨大分子を含む組成物の存在下で細胞をインキュベートする工程を含む方法。
【請求項２２】
前記巨大分子が、ｃＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、脂質またはオリゴヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記巨大分子が、細胞骨格蛋白タウである、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、海馬ニューロンである、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
神経学的疾患の研究またはその処置において用いられるモデルであって、海馬毒素、タウ蛋白およびホスファターゼ阻害剤を含む組成物を海馬に適用されたげっ歯類を含むモデル。
【請求項２６】
前記神経学的疾患が、アルツハイマー病である、請求項２５に記載のモデル。
【請求項２７】
前記げっ歯類が、ラットまたはマウスである、請求項２５または２６に記載のモデル。
【請求項２８】
神経学的疾患を調査する方法であって、
ａ）海馬毒素、タウ蛋白およびホスファターゼ阻害剤を含む組成物をげっ歯類の海馬に適用する工程と、
ｂ）げっ歯類への影響を調査する工程とを含む方法。
【請求項２９】
前記ホスファターゼ阻害剤が、オカダ酸である、請求項２５乃至２７に記載のモデル、または請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜孔を可逆的に形成するための海綿毒素、詳細には高分子１，３−アルキルピリジニウム塩（ポリ−ＡＰＳ）の使用、およびそのような孔を生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去５〜７億年にわたり、付着性の海綿は、変化する環境条件や、微生物による構造への侵入および潜在的捕食者の発生などの他の生物体の拡散やそれらとの競合による潜在的問題を生き抜くための様々な戦略を創り出してきた。海綿は、再生して単一細胞の形態をとることができるのに加え、化学的防御を多量に蓄えていることで、過剰な捕食を予防し、海綿コロニーの生成を促進し、他の海洋生物による海綿表面でのコロニー生成を制御する。海綿により生成される多数の異なる化学兵器の幾つかは、アルキルピリジニウム塩であり、それらは、活用される可能性のある興味深い生物学的特性を有している。ハリトキシン（１，３−ＡＰＳオリゴマー）は、元々、例えばハリクロナ、アンピメドンおよびカリスポンジアなどのハプロスセリド・ゲネラ（Ｈａｐｌｏｓｃｅｒｉｄ  ｇｅｎｅｒａ）海綿類から同定された。別種の生物学的活性が、異なるハリトキシン調製物で同定された。これには、細胞毒性、神経毒、活動電位の阻害、伝達物質放出の刺激、Ｋ＋コンダクタンスの阻害および抗コリンエステラーゼ活性が挙げられる。
【０００３】
平均分子量５ｋＤａの分画中にある幾種かの天然の孔形成ハリトキシンの化学的および生物学的特性が、過去に単離され特徴づけられた（非特許文献１参照）。海綿カリスポンジア・リドレイから単離されたこれらの化合物は、水溶液中で安定しており、この天然のハリトキシンの混合物は、カチオンを透過可能な孔を不可逆的に形成することによって、培養感覚ニューロンを脱分極することが見出された。これらの不可逆的な孔は、不可逆的な損傷を細胞壁に与え、それが細胞にとって致命的となる。人工の二重層に適用する場合、１４５〜２２８０ｐＳの単位コンダクタンスによって、毒素誘発チャネル様の事象が得られた。加えてハリトキシンは、細胞内ストアからＣａ２＋を放出することができる。
【０００４】
一重鎖ポリヌクレオチドＲＮＡおよびＤＮＡが、１〜２．５ｎｍ径の孔を形成する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）α毒素またはαヘモリシンで処理した脂質二重層を透過することが示された。これらの黄色ブドウ球菌α毒素またはαヘモリシンは、不可逆的な孔を生成する。二重鎖ＤＮＡは、脂質−ミセル媒介トランスフェクション（例えばリポフェクション）、エレクトロポレーションおよび顕微注入を利用して、脂質二重層を透過して細胞内に導入されたが、これらのアプローチは、結果が変動し易く制御が困難となる可能性があるため、多くの場合、専門の器具、または面倒な前処理および最適化が必要となる。
【非特許文献１】スコット他（２０００年）、ジャーナル・オブ・メンブレン・バイオロジー、第１７６巻、１１９〜１３１頁（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ（２０００）  Ｊ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌ  １７６  １１９−１３１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
よって、本発明の目的は、先行技術の不都合を克服することにある。
本発明によれば、膜孔を可逆的に形成するための海綿毒素を含む組成物の使用が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
海綿毒素を用いて孔を可逆的に形成し得る（即ち、孔を形成し得るが、その後、孔が潰
れて細胞膜の完全性を回復し得る）ことがここに確証された。用語「孔」は、海綿毒素によって生成された細胞膜の開口を説明するために用いた。このことは、観察されたコンダクタンスの一過性の変化および人工脂質二重層でのチャネル様の事象を考慮すると適切なことと思われる。孔を可逆的に生成する利点は、細胞にとって致命的となり得る永久的な損傷を細胞膜に与えることなく、孔を利用して材料（例えばＤＮＡまたは薬物）を細胞内に導入できることである。この一過性の安定なトランスフェクションは、先行技術では示されなかった。海綿毒素の利点は、それらが簡単に使用可能であり、化学的安定性が高く、水溶性が良好なことである。これに関連して、先行技術の幾つかの方法とは対照的に、トランスフェクションの前にＤＮＡをリポソームに封入する必要がない。
【０００７】
海綿毒素は、好ましくは、少なくとも１種の高分子１，３−アルキルピリジニウム塩（ポリ−ＡＰＳ）を含む。本明細書に挙げたハリトキシンの調製物は、多数（１０種）の異なる高分子１，３−アルキルピリジニウム化合物で構成されている。この調製物は、平均分子量が約５ｋＤａである。これに対してポリ−ＡＰＳ調製物は、図１ａに示される通り、２９個および９９個の反復モノマー単位を有する２種類の高分子１，３−アルキルピリジニウム化合物で構成されている。
【０００８】
ポリ−ＡＰＳは、水溶液中において、平均流体半径２３±２ｎｍを有する非共有結合の凝集体を形成することが示された。これらの凝集体内に形成された孔の半径は、ウシ赤血球で浸透保護剤を使用することによって推定され、レンキン式（Ｒｅｎｋｉｎ  ｅｑｕａｔｉｏｎ）によって約２．９ｎｍと算出された。その孔径と孔形成の一過性とを組み合わせることにより、特にＤＮＡなどの巨大分子が細胞膜を透過して輸送される場合に、ポリ−ＡＰＳが可逆的膜孔を形成する好ましい手段となることが分かる。
【０００９】
好ましくは海綿毒素は、海綿レニエラ・サライ（Ｒｅｎｉｅｒａ  ｓａｒａｉ）、カリスポンジア・リドレイ（Ｃａｌｌｙｓｐｏｎｇｉａ  ｒｉｄｌｅｙｉ）、ハリクロナ・エリナ（Ｈａｌｉｃｌｏｎａ  ｅｒｉｎａ）、ハリクロナ・ルベンス（Ｈａｌｉｃｌｏｎａ
ｒｕｂｅｎｓ）、ハリクロナ・ビリディス（Ｈａｌｉｃｌｏｎａ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、アンピメドン・ビリディス（Ａｍｐｈｉｍｅｄｏｎ  ｖｉｒｉｄｉｓ）、カリスポンジア・フィブロサ（Ｃａｌｌｙｓｐｏｎｇｉａ  ｆｉｂｒｏｓａ）、およびアンピメドン・コンプレッサ（Ａｍｐｈｉｍｅｄｏｎ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）から得られる。
【００１０】
多数の海綿類が、孔形成分子を生成する。ハリトキシン化合物は、多数のハプロスセリド・ゲネラから単離された。
好ましくは海綿毒素は、実質的に５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する。更に好ましくは海綿毒素は、５．５ｋＤａ〜１８．９ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態において組成物は、分子量がそれぞれ異なる海綿毒素を１種以上含む。
【００１１】
好適には海綿毒素は、図１ａに示されるとおり１〜１５０のモノマー単位から形成されている。海綿毒素は、好ましくは、２０〜１００のモノマー単位から形成されている。好ましい実施形態において、海綿毒素は、２９個または９９個のモノマー単位から形成されている。
【００１２】
好ましくは海綿毒素の濃度は、０．５ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌである。更に好ましくは海綿毒素の濃度は、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌである。好ましい実施形態において海綿毒素の濃度は、０．５ｎｇ／ｍｌ〜０．５μｇ／ｍｌである。
【００１３】
本発明の更なる態様によれば、膜孔を可逆的に形成する方法であって、
ａ）海綿毒素を含む組成物の存在下で膜をインキュベートする工程と、
ｂ）組成物を膜と接触した状態から除去する工程と、を含む方法が提供される。
【００１４】
本発明のこの方法は、インビトロおよびインビボ法で用いることができる。インビトロ法では本発明は、蛋白質、プラスミドｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチドおよび蛍光分子などの膜不透過性物質（例えばル、シファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ）、ニューロビオチン、ビオシチンおよびデキストランコンジュゲート）などの巨大分子を用いて細胞のトランスフェクションを試験する場合など、生化学研究のツールとしても用いることができる。さらに、インビボで本発明の方法を用いることにより、蛋白質、ペプチド、脂質およびオリゴヌクレオチドの導入に加えて、遺伝子療法においてＤＮＡを細胞に導入することができる。
【００１５】
好適には、亜鉛、水銀、ニッケルまたはコバルト溶液を用いて、膜孔の可逆的形成を低減する。好ましくは亜鉛溶液の濃度は、実質的に１〜２ｍＭである。好ましい実施形態において、亜鉛の濃度は、１．５ｍＭである。
【００１６】
ＤＮＡ、血清アルブミンおよびコレステロールを用いて、孔形成を低減または抑制することもできる。
本発明の更なる態様によれば、インビトロにおいてＤＮＡを細胞へトランスフェクトする方法であって、
ａ）海綿毒素を含む組成物の存在下で細胞をインキュベートする工程と、
ｂ）組成物を膜と接触した状態から除去する工程と、
ｃ）核酸を添加する工程と、を含む方法が付与される。
【００１７】
安定した手法で核酸（例えばｃＤＮＡなどのＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ）を細胞にトランスフェクトすることが、生物学研究のツールとして重要である。
好ましくは核酸を添加する前に、細胞を組成物の存在下で１〜２０分間にわたってインキュベートする。更に好ましくは核酸を添加する前に、細胞を組成物の存在下で５分間にわたってインキュベートする。
【００１８】
これらの時間インキュベートすると、許容され得るトランスフェクション率となり、細胞膜の破壊が最小限に抑えられることが見出された。
好ましくは、１．０〜５．０μｇの核酸を添加する。更に好ましくは、２．５μｇの核酸を添加する。
【００１９】
これらの量のＤＮＡを添加することによって、許容され得るトランスフェクション率になることが見出された。これに関連して、許容され得るトランスフェクション率は、２０％程度と思われる。
【００２０】
更に好ましくはその方法は、組成物および核酸の存在下で細胞をインキュベートする工程と、組成物およびＤＮＡを標準の細胞媒体で置換する工程とを更に含む。
好ましくは、細胞を組成物および核酸の存在下で実質的に２０〜２００分間にわたってインキュベートする。好ましくは、インキュベート時間は、１８０分である。
【００２１】
本発明の更なる態様によれば、インビボにおいて巨大分子を細胞にトランスフェクトする方法であって、
ａ）海綿毒素および前記巨大分子を含む組成物の存在下で細胞をインキュベートする工程を含む方法が提供される。
【００２２】
好ましくは、巨大分子は、蛋白質、ペプチド、脂質、オリゴヌクレオチドまたは核酸、例えばｃＤＮＡである。
更に好ましくは、巨大分子は、細胞骨格蛋白タウである。
【００２３】
好ましくは、細胞は、海馬ニューロンである。
本発明の更なる態様によれば、神経学的疾患の研究またはその処置のために用いられるモデルであって、海馬毒素、タウ蛋白およびホスファターゼ阻害剤を含む組成物を海馬に適用されたげっ歯類を含むモデルが提供される。
【００２４】
好ましくは神経学的疾患は、アルツハイマー病である。
好ましくはげっ歯類は、ラットまたはマウスである。
本発明の更なる態様によれば、神経学的疾患を調査する方法であって、
ａ）海馬毒素、タウ蛋白およびホスファターゼ阻害剤を含む組成物をげっ歯類の海馬に適用する工程と、
ｂ）げっ歯類への影響を調査する工程とを含む方法が提供される。
【００２５】
好ましくは、ホスファターゼ阻害剤は、オカダ酸である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ここに、添付の図面および実験データを参照しながら、本発明を更に詳細に説明する。
（実施例）
海綿毒素調製物
海綿レニエラ（＝ハリクロナ）・サライ、パリチャー−フィナリ（Ｐｕｌｉｔｚｅｒ−Ｆｉｎａｌｉ）（ハリクロニダ（Ｈａｌｉｃｌｏｎｉｄａｅ））から、ポリ−ＡＰＳ（図１ａ）を精製した。ポリ−ＡＰＳを含む水性抽出物を限外ろ過膜（３ｋＤａカットオフ）に通した。毒素をセファデックスＧ−５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０）およびセファクリルＳ−２００（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００）で溶出した（セプシック他  １９９７年；ジャーナル・オブ・ナチュラル・プロダクション  ６０  ｐ９９１〜９９６（Ｓｅｐｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ  １９９７；  Ｊ．  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｄ．  ６０  ９９１−９９６））。ハリトキシン調製物を、カリスポンジア・リドレイから単離した。ハリトキシンを含むブタノール抽出物を、親油性セファデックスＬＨ−２０ゲルろ過カラムに加え、５〜６ｋＤａ分画を単離して試験した（ジャスパース他  １９９４年；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー  ５９  ｐ３２５３〜３２５５（Ｊａｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９４；  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５９  ３２５３−３２５５）、およびスコット他  ２０００年；ジャーナル・オブ・メンブレン・バイオロジー  １７６  ｐ１１９〜１３１（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０００；  Ｊ．  Ｍｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １７６  １１９−１３１  ））。いずれかの毒素調製物５ｍｇ／ｍｌを含む原液を希釈して、ポリ−ＡＰＳまたはハリトキシン試験溶液を作製した。
【００２７】
細胞培養
後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの初代培養物を、断頭した２日齢スプラグー・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラットの後根神経節の酵素的および機械的分離によって調製した。ラミニン−ポリオルニチンをコーティングしたカバースリップに感覚ニューロンを載せ、１０％ウマ血清（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））、ペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマシイン（５０００ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（１４ｍＭ）および神経増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）を補ったＦ１４培地（インペリアル・ラボラトリーズ社（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に浸した。培養物を、５％ＣＯ２を含む加湿空気中、３７℃で最大２週間にわたって保持し、５〜７日ごとに新しい培地に交換した。
【００２８】
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎細胞系）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で保持した。トランスフェクション実験の調製物として、細胞を６穴プレートに５×１０５個／ウェルの密度で実験の２４時間前に播種した。共焦点および電気生理学／カルシウム
画像の実験でも３５ｍｍ培養皿で同じ播種密度を利用した。
【００２９】
実験は全て、室温（約２３℃）で実施した。オールセル記録法を利用して、膜電位、入力抵抗（−３０〜−２００ｐＡ電流コマンドで誘発した１００〜３００ｍｓの電気緊張性電位から評価）、および保持電流に対するポリ−ＡＰＳおよびハリトキシン調製物の作用を調査した。１５〜２０ｋＨｚのサンプリング率で操作したアキソクランプ−２Ａ（Ａｘｏｃｌａｍｐ−２Ａ）開閉電圧クランプ振幅器を用いて全細胞記録を行った。コフ（Ｋｏｐｆ）・モデル７３０、針／ピペットプラーを利用して、低抵抗（４〜１０または４〜７ＭΩ）のホウケイ酸ガラスパッチピペットを作製した。１３０ｍＭのＮａＣｌ、３．０ｍＭのＫＣｌ、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、０．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１．０ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および５．０ｍＭのグルコースを含むＮａＣｌベースの細胞外溶液に、ニューロンを浸した。これとは別に、亜鉛を含むＮａＣｌベースの細胞外溶液も作製したが、それは１．５ｍＭの亜鉛を含むものであった（亜鉛原子吸収標準溶液、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））。細胞外溶液のｐＨおよび浸透圧を、それぞれＮａＯＨおよびスクロースで、７．４および３１０〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｌに調整した。パッチピペット溶液は、１４０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、２．０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０．０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および２．０ｍＭのＡＴＰを含み、該溶液のｐＨおよび浸透圧を、それぞれ、トリスで７．２、スクロースで３１０〜３１５ｍＯｓｍｏｌ／ｌに調整した。電圧クランプの記録では、ニューロンを−９０ｍＶに保持し、−１７０〜−６０ｍＶの電位に対して、１００ｍｓ電圧ステップコマンドによって、直線性の電流−電圧関係を生じさせた。ポリ−ＡＰＳおよびハリトキシンを、記録されるニューロンから約１００ｍｍ離れた位置に先太マイクロピペット（チップ口径約１０ｍｍ）を通して低圧で注入することによって、細胞外環境に適用した。細胞を浴槽に保持し、持続的に灌流しなかったため、薬物濃度は圧力注入後に拡散によって降下した。
【００３０】
ＤＴＲ−１２００デジタルオーディオテープ（ＤＡＴ）レコーダ（バイオロジック社（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ））を用いて、電気生理学的データをＤＡＴに保存し、次にケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ）電圧クランプソフトウエア（バージョン６）を用いて分析した。膜電位または保持電流の変化をモニタリングするために、チャートレコーダ（グールド（Ｇｏｕｌｄ）２２００ｓペンレコーダ）で連続記録を得た。
【００３１】
１０μＭフラ−２ＡＭ（シグマ社、ジメチルホルムアミド中の１ｍＭ原液）を含むＮａＣｌベースの細胞外溶液中で、培養ＤＲＧニューロンおよびＨＥＫ２９３細胞を１時間インキュベートした。その後、細胞を２０分間洗浄して細胞外フラ−２ＡＭを除去し、Ｃａ２＋感受性蛍光染料を細胞質で脱エステル化（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｅ−ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）させる。細胞を絶えず灌流し（１〜２ｍｌ／分）、ＫＡＩ−１００１  Ｓ／Ｎ  ５Ｂ７８９０−４２０１オリンパスカメラを取り付けたオリンパスＢＸ５０Ｗ１倒立顕微鏡で観察した。３４０〜３８０ｎｍの励起波長で得られたデータの蛍光比測定の画像を観察して、オラカル・プロ（ＯｒａＣａｌ  ｐｒｏ）、マーリン形態計測・時間モード（Ｍｅｒｌｉｎ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｍｏｄｅ）（ライフサイエンシズ・リソーシズ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）、バージョン１．２）を用いて分析した。
【００３２】
データは全て、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で示し、適宜、一対のまたは独立したスチューデントの両側ｔ検定を用いて、統計的有意性を測定し、Ｐ値をテキストで報告した。
【００３３】
ＤＮＡの導入
用いたプラスミドｃＤＮＡは、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｈｃ
ｈ））、構成的活性ＳＶ４０プロモータ（ｐＥＧＦＰ）の対照下での緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡベクター、ヒト腫瘍壊死因子受容体−２（ＴＮＦＲ２）ｃＤＮＡ（スイス、バーゼルのワーナーレスラウアー社（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｅｓｌａｕｅｒ）の提供）およびｐＢＡＢＥハイグロマイシン耐性ｃＤＮＡ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））であった。対照トランスフェクションは、最適化したリポフェクタミン（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて実施し、脂質−ミセル媒介トランスフェクション・プロトコルによって、血清の非存在下で１μｇ  ｃＤＮＡおよびリポフェクションと共に細胞を３時間インキュベートした後、血清含有培地に再導入した。標準毒素トランスフェクション・プロトコルを開発し、この作業の経路全体を通して最適化させた。プロトコルは、無血清細胞を０．５μｇ／ｍｌの海綿毒素調製物とともに５分間にわたってインキュベートし、その後２．５μｇのｃＤＮＡを添加した。更に３時間インキュベートした後、ＤＭＥＭ培地を標準血清含有培地と交換した。リポフェクタミンおよびポリ−ＡＰＳの安定したトランスフェクションは、それぞれ１．０μｇまたは２．５μｇのｃＤＮＡ（ｐＥＧＦＰまたはＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡのいずれか）と１．０μｇのｐＢＡＢＥ  ｃＤＮＡとの同時トランスフェクションによって実施された。１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を含むＤＭＥＭ中で、安定してトランスフェクトされた細胞のコロニーを選択した。確定したら、クローニングディスクおよびトリプシンＥＤＴＡを用いてコロニーを剥離し、より大きな容器に播種して、十分な細胞を分析に利用できるまで保持した、変動性を低下させるために、１０μｌの量のｃＤＮＡを、１ｍｌの調製物に導入した。
【００３４】
クリスタルバイオレット・アッセイ
接着細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット染料（シグマ社）で染色し、次に溶出して、分光光度分析によってトランスフェクション後に損なわれていない生存細胞の量を定量した。
【００３５】
ＥＧＦＰ検出
エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）蛍光／可視光顕微鏡装置を用いてＥＧＦＰの細胞発現を評価し、細胞の蛍光発光の総量（％）を直接評価した。更に、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）マイクロラディアンス共焦点装置を用いて、細胞を撮像した。
【００３６】
ＦＡＣＳ分析
ＴＮＦＲ２を安定して過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、３ｍｌの細胞分離溶液（トリプシン不含、シグマ社）で培養容器から分離し、特異的なマウスｍＡｂ（それぞれｈｔｒ−９およびｕｔｒ−１）によってＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２発現を評価し、フルオロイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）抗マウスＩｇＧで二次標識し、その後、蛍光活性化細胞分類法（ベクトン・ディッキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を実施した。
【００３７】
共焦点分析
ＨＥＫ２９３−ＴＮＦＲ２安定クローンを、三重測定用３５ｍｍ皿に入れて、氷冷メタノールで固定した。各皿を、無抗体、ＴＮＦＲ１特異性マウスｍＡｂまたはＴＮＦＲ２特異性マウスｍＡｂ（それぞれｈｔｒ−９およびｕｔｒ−１）でプローブし、その後、ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧで二次標識した。その後、細胞ＦＩＴＣ標識をバイオラッド社、マイクロラディアンス共焦点装置を用いて評価して、ＴＮＦ受容体発現レベルを示した。
【００３８】
温度試験
ＨＥＫ２９３細胞に対するポリ−ＡＰＳの作用を、１２℃で評価した。ＨＥＫ２９３細胞にカルシウム感受性染料を加え（ジメチルホルムアミド中のフラ−２ＡＭ（１０μＭ）
で１時間）、その後、１２℃のＮａＣｌベースの細胞外溶媒で持続的に灌流した。０．１、０．５または１．０μＭポリ−ＡＰＳの適用によって、蛍光比の変化により測定されるＣａ２＋トランジェントが誘発された。これらのデータは、ポリ−ＡＰＳによる孔形成が１２℃で起こり得ることを示している。１．０μＭポリ−ＡＰＳでの結果を、図１２に示す。
【００３９】
プラスミドｃＤＮＡ（クローンテック社のｐＥＧＦＰ−Ｃ１）、構成的活性ＳＶ４０プロモータの対照下での改良型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）ｃＤＮＡベクターを使用した。温度を１２℃に低下させたこと以外は、全てのトランスフェクション手順を、ポリ−ＡＰＳを用いて過去に最適化させたとおり実施した。プロトコルは、細胞を１．０μｇ／ｍｌの海綿毒素調製物とともに無血清で５分間にわたってインキュベートすることを含み、その後２．５μｇのｃＤＮＡを添加し、更に３時間インキュベートした後、血清を添加して、細胞を３７℃で培養し続けた。２４時間後に、トランスフェクションを評価した。結果を図２２に示す。幾つかの調製物では、３０％のトランスフェクション効率を実現した。
【００４０】
ＨＥＫ２９３細胞を０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳに５分間にわたって暴露し、その後、ポリ−ＡＰＳおよび１ｍＭのルシファーイエローに３時間にわたって暴露した。洗浄（ＮａＣｌベースの生理食塩水）、毒素中でのプレインキュベート、およびルシファーイエロー中でのインキュベートを、７℃で実施した。実験を７℃で実施した場合、ルシファーイエローはほぼ全ての細胞に導入された。細胞を培地に戻して、３７℃で２４時間インキュベートした後では、ルシファーイエローの細胞内レベルは低下したが、依然、視認可能であった。ポリ−ＡＰＳの非存在下では、細胞内にルシファーイエローが見出されなかった。結果を図２３に示す。
【００４１】
エンドサイトーシスのプロセスは温度依存性であり、１２℃未満では阻害されるため、これらの温度実験は、巨大分子の内在化が、エンドサイトーシスによって起こるのではないことを示唆している。
【００４２】
細胞骨格蛋白タウおよびポリ−ＡＰＳのラット海馬への送達
これは、当該技術分野で周知の方法を用いて実施した。タウ蛋白およびポリ−ＡＰＳを適宜、穿孔を介して海馬に注入した。用いたポリ−ＡＰＳの濃度は、０．００５μｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．００５μｇ／ｍｌまたは５μｇ／ｍｌであった。タウの濃度は、１μｇ／ｍｌであった。オカダ酸を、濃度１．２ｎＭでミニポンプを通して７日間投与した。
【００４３】
エクスビボでの海馬スライスの採取
記録
海馬スライスを、生後３〜４週間の有色の冠毛つきリスター系ラットから得た。方法は、過去に詳細に記載されている（ホワイトおよびプラット（２０００年）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス  １２  ｐ３１５５〜３１６２（Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｌａｔｔ  （２０００）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２  ３１５５−３１６２））。簡潔に述べると、終末麻酔した（ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｓｅｄ）動物を断頭して、素早く脳を取り出し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で飽和したｐＨ７．４の氷冷人工脳脊髄液（ａＣＳＦ、組成物については表３を参照）に入れた。ビブロトーム（英国オックスフォード・インストゥルメンツ社（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を用いて、３５０μｍの傍矢状の海馬スライスを調製し、次に、約３０℃のａＣＳＦ中で少なくとも１時間にわたって保持した後、記録を開始した。
【００４４】
長期増強の測定
細胞外部分の記録のために、スライスを記録チャンバーに浸した。ＤＳ２  Ａ刺激アイ
ソレータ（英国ディジタイマ社（Ｄｉｇｉｔｉｍｅｒ））によって駆動される単極刺激電極（約０．５ＭΩ、米国ＷＰＩ社）を、視神経線維層の最外部に配置し、ａＣＳＦを充填した記録用ガラス電極（英国クラーク社（Ｃｌａｒｋ））を、刺激電極近傍の浅灰白層に配置した。誘発されたグルタミン酸媒介ｆＥＰＳＰを記録し（アキソクランプ２Ａ、ブリッジモード；米国アキソン社（Ａｘｏｎ））、コンピュータに保存し分析した（線維斉射からピークまでの初期上昇期の振幅および勾配；ＰＷＩＮソフトウエア・パッケージ）。オシロスコープ（米国テクトロニックス社（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ））でも、活性を持続的にモニタリングした。過去の文献（プラットおよびウィジントン（１９９８年）ニューロファーマコロジー  ３７  ｐ１１１１〜１１２２；ホワイトおよびプラット（２０００年）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス  １２  ｐ３１５５〜３１６２（Ｐｌａｔｔ  ａｎｄ  Ｗｉｔｈｉｎｇｔｏｎ  （１９９８）  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３７  １１１１−１１２２；Ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｌａｔｔ  （２０００）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １２  ３１５５−３１６２））と同様に、少なくとも２０分間にわたって安定したベースラインが得られるまで、スライスを最大ｆＥＰＳＰの７０〜８０％で３０秒毎に刺激した。
【００４５】
薬剤
３ｍＭのＧＡＢＡで７分間にわたって灌流することによって、ＬＴＰＧを誘導し、その後６０分間、ａＣＳＦで洗い流した。その後の実験では、カリウムイオンもしくはカルシウムイオンを低下させることによって、または重炭酸緩衝液をＮ−［ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ；ａＣＳＦ組成物の詳細については表３を参照）と置換することによって灌流溶液を操作した。特にＨＥＰＥＳ緩衝溶液での実験ではｐＨを繰り返しモニタリングし、実験の間ずっと安定していたことを見出した。ＣＡ阻害剤エトキシゾラミド（ＥＺＡ；５０μＭ）も使用した。ＮＫＣＣｌおよびＫＣＣ２阻害剤ブメタニド（５０μＭ）およびフロセミド（１００μＭ）も試験した。ａＣＳＦ用に用いた塩を英国ＢＤＨ社から得たことを別にすれば、薬物は全て米国シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。
【００４６】
【表１】
2006527594.tif 000003
【００４７】
データ解析
勾配および振幅の双方のベースライン値（％）に相対させて、ＬＴＰＧを計算した。ＧＡＢＡ適用前および適用後１時間目のデータについて、プリズム・フォー・ウィンドウズ（Ｐｒｉｓｍ  ｆｏｒ  ｗｉｎｄｏｗｓ）（バージョン３．００；米国グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を利用して、統計的有意性を評価した（各例の連続３回の値の平均）。ＧＡＢＡ適用後６０分目のＬＴＰＧ比較について、ダネット多重比較ポストホック検定による片側ＡＮＯＶＡ解析を実施した。対応のないスチューデントの両側ｔ検定および対応のある両側スチューデントｔ検定も利用して、それぞれ異なる条件でのＬＴＰＧの比較と、群内でベースライン値とＬＴＰＧ値との比較を行った。
【００４８】
ラットでのオープンフィールド水迷路
装置
用いたオープンフィールド水迷路は、過去に記載されたものであった。簡潔に述べると、直径２ｍのプールに温度２５±２℃の水を深さ約５０ｃｍまで満たし、ラテックスサブフローリングコンパウンドを添加して不透明にした。水面から約２ｃｍ下に、直径１１ｃｍのプラットフォームを沈め、ラットにとっての唯一の逃避手段を与えた。プールは、迷路外の手がかりを多数含む室内に配置した。プール環境の周りにカーテンを引いてもよい。
【００４９】
挙動の範例
馴化、ならびにその後の全訓練およびテストの間は、以下の条件を適用した。４つの基点（北、南、東および西）を、開始場所として半無作為に選択し、ラットをプールの壁に向かって開放した。ラットが１２０秒以内にプラットフォームに着くことができなければ試験を終了し、実験者がラットをプラットフォームに誘導した。ラットがプラットフォームを見つけたら、ラットを３０秒間プラットフォームに留置した後、ケージに戻した。水迷路室に隣接する部屋に置いた加熱ランプを用いて、テスト後のラットを乾かした。
【００５０】
結果
培養ＤＲＧニューロンの電気生理学的特性に対するポリ−ＡＰＳの不可逆的および可逆的作用
５０μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳを約２０秒間細胞外に適用した結果、試験した全てのＤＲＧニューロンにおいて、膜電位が不可逆的に暴落し、入力抵抗が劇的に降下した（図１ｂ）。平均膜電位は、−６５±１ｍＶから−９±３ｍＶ（ｎ＝１７；ｐ＜０．０００１）に脱分極され、これは、入力抵抗の３５０±７９Ωから５６±２７Ωへの低下（ｎ＝１７；ｐ＜０．０００１）に関連するものであった。ポリ−ＡＰＳを含む灌流ピペットの除去後１２０分目では、回復は認められなかった。ポリ−ＡＰＳは、５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌの濃度では、可逆的な脱分極を誘発し、これは入力抵抗の低下に関連していた（図１ｃ）。海綿毒素を約２０秒間適用した場合、ポリ−ＡＰＳは、ある程度の用量依存的作用を示し、入力抵抗の平均低下率（％）は、５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳで、それぞれ８４％、６７％および１７％であった。回復期間は様々であったが、ポリ−ＡＰＳを含む灌流ピペットの除去後２０分以内に回復が認められた。５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳに応答して、８例のうち６例のニューロンが、毒素の適用後に、膜電位および入力抵抗の少なくとも一部の回復を示した（図２ａおよび図２ｂ）。
【００５１】
細胞膜カルシウム透過性に対するポリ−ＡＰＳの可逆的作用
培養ＤＲＧニューロンに対するＣａ２＋画像化実験は、電気生理学的結果と一致して、ポリ−ＡＰＳが細胞内Ｃａ２＋を不可逆的（図３ｂ）および可逆的（図３ｂ）に上昇させることを示した。応答は非常に変動性があったが、用量依存的傾向は明白に示された。ポリ−ＡＰＳ（５μｇ／ｍｌ）は主に、一部のみの回復、または不可逆的な応答を生じ、０
．０５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳは、主に一過性の応答を誘発し、４５例のうち４例のニューロンは応答しなかった（表１）。これらの結果によって、可逆的な孔形成に必要な狭い濃度範囲と、高濃度のポリ−ＡＰＳによる細胞死の理由が明らか示される。
【００５２】
【表２】
2006527594.tif 000004
【００５３】
細胞内Ｃａ２＋の不可逆的および可逆的上昇の平均振幅と、５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳにより誘発された事象の平均振幅とを比較したときに、有意差は観察されなかった。これは、応答の大きな変動性に一部関係し、例えば５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳによる蛍光比の最大および最小の変化は、５．４２および０．４８であり、隣同士のニューロンでも同じ実験で応答に大きな違いが認められた。加えてポリ−ＡＰＳを、電気生理学的実験で毒素を適用した時間よりもかなり長い２〜２．５分間にわたって適用した。この試験で培養ＤＲＧニューロンを使用する一つの利点は、これらのニューロンが電位活性化Ｃａ２＋チャネルを発現し、これらを用いてポリ−ＡＰＳに暴露した後のニューロンの生存能力を評価できることである。図３ｃの実験トレースは、０．０５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳの適用前および適用後に、ＫＣｌ（３０ｍＭ）を含む細胞外溶液の脱分極パルスによって誘発されたＣａ２＋トランジェントが生じ得ることを示している。したがって、低用量のポリ−ＡＰＳの適用後に、反復可能な孔形成が得られ、電位依存性チャネルを介したＣａ２＋の流入には影響がないことが示され、少なくとも低濃度では、孔形成による細胞毒性障害が起こらないことが示された。しかし、細胞内でのＣａ２＋による不活性化に対するＣａ２＋チャネルの感受性があると仮定すると、電位依存性Ｃａ２＋チャネルが所定の孔形成時間の後でも機能したことは予想外であった。
【００５４】
ＨＥＫ２９３細胞の膜電位、入力抵抗およびＣａ２＋透過性に対するポリ−ＡＰＳおよびハリトキシン調製物の作用
ＨＥＫ２９３細胞の膜電位、入力抵抗およびＣａ２＋透過性に対するポリ−ＡＰＳおよびハリトキシン調製物の作用も評価した。ハリトキシン（０．５および５．０μｇ／ｍｌ
）を２０秒間にわたって適用したところ、主にＨＥＫ２９３細胞の電気生理学的特性に対する不可逆的影響が得られた（図４ｂ）。ハリトキシン（０．５μｇ／ｍｌ）は、膜電位を−４５±５ｍＶから−１６±５ｍＶ（ｎ＝６；ｐ＜０．００３）に低下させ、毒素適用後１０〜２０分で、一部であるが−２６±４ｍＶ（ｎ＝６；ｐ＜０．０２）への有意な回復が観察された。ハリトキシン（５μｇ／ｍｌ）は、膜電位を−４６±３ｍＶから−３±１ｍＶ（ｎ＝５；ｐ＜０．００３）に低下させたが、有意な回復は認められなかった。過分極電流コマンドによって誘発された電気緊張性電位から入力抵抗を測定した際に、同様の傾向が観察された。例えば静止入力抵抗は、０．５μｇ／ｍｌのハリトキシンによって９０３±３１３Ｍから３１５±２０６ＭＷ（ｎ＝６；ｐ＜０．０４）に低下したが、有意な部分的回復は観察されなかった。膜電位に対する影響は、０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌのハリトキシンにおいて明らかに用量依存的であり、膜電位をそれぞれ６４±１０％（ｎ＝６）および９４±３％（ｎ＝５；ｐ＜０．０３）低下させる証拠も示された。これに対して、２０秒間適用したポリ−ＡＰＳの作用は、５μｇ／ｍｌ（ｎ＝９細胞のうち６細胞、図４ｃおよび図４ｄ）および０．５μｇ／ｍｌ（ｎ＝９細胞のうち６細胞）で主に可逆的であった。用量依存性は、あまり明らかでなく、５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳの双方で、０．５μｇ／ｍｌハリトキシンで得られたものと同等の電気生理学的応答が得られた。
【００５５】
レシオ測定染料フラ−２を用いた実験でも、ハリトキシンとポリ−ＡＰＳの双方が、細胞内Ｃａ２＋を大きく変化させることが示された。最初に一つのプロトコルを利用して、海綿毒素の用量依存的影響を検討した。ハリトキシンまたはポリ−ＡＰＳを０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５．０μｇ／ｍｌの用量で１４０秒間適用し、各適用の間に、様々な洗浄時間を設けた。０．００５μｇ／ｍｌの用量で１４０秒間適用した場合には、海綿毒素に応答した細胞はほとんどなかった（ハリトキシンでは１１５細胞のうち１０細胞、ポリ−ＡＰＳでは９０細胞のうち２細胞）。したがって０．００５μｇ／ｍｌが、ＨＥＫ２９３細胞の検出可能なＣａ２＋トランジェントの閾値濃度であると思われる。３つの低用量の毒素に細胞をあらかじめ暴露した場合に、細胞溶解および染料喪失は、通常、５μｇ／ｍｌで観察されたため、ハリトキシン調製物は、幾つかの特異的な結果をもたらした。観察された蛍光比の平均ピーク変化は、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、および０．５μｇ／ｍｌのハリトキシンによって、それぞれ０．２±０．０３（ｎ＝１０）、０．４３±０．０３（ｎ＝８０）および１．０９±０．０４（ｎ＝１１４）であった。しかし少なくとも幾つかの細胞では、細胞内Ｃａ２＋の一過性の変化が、０．０５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌのハリトキシンで観察された（図５ａ）。用量依存で、かつ主に可逆的な応答が、ポリ−ＡＰＳ（０．００５〜５μｇ／ｍｌ；図５ｂ）によって得られた。観察された蛍光比の平均ピーク変化は、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５．０μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳによってそれぞれ０．１（ｎ＝２）、０．６５±０．０６（ｎ＝６３）、０．８８±０．０６（ｎ＝８３）および１．１７±０．０５（ｎ＝８９）であった。双方のデータ組でｎ数が異なるのは、異なるＨＥＫ２９３細胞では海綿毒素に対する感受性の閾値が変化することを示している。これに関連して、幾つかの細胞は、０．０５μｇ／ｍｌ毒素に応答しなかった。これとは別に各毒素を単一用量で適用したところ、海綿毒素によって異なる応答振幅および応答性が生じることが明らかに示された（図５ｃおよび５ｄ）。試験した細胞は全て、０．５μｇ／ｍｌおよび５．０μｇ／ｍｌの毒素に応答したため、これらの用量を次の実験で用いた。
【００５６】
ポリ−ＡＰＳによる孔形成に対する亜鉛の作用
ポリ−ＡＰＳの溶血作用が、ほぼイオン形態のＺｎ２＋と思われるＺｎによって低減されることが見出されており、そのためポリ−ＡＰＳを連続して適用する場合、またはポリ−ＡＰＳによる孔形成の後における亜鉛（Ｚｎ２＋）の保護性を検討した。ＤＲＧニューロンの同じ培養物で実験を実施し、２つのプロトコルを用いて得られた結果を比較した。
第１の実験プロトコルを用いると、ポリ−ＡＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）は、膜電位を−６６±２ｍＶから−１３±６ｍＶ（ｐ＜０．０００１）に低下させたが、次に１．５ｍＭ亜鉛を含む細胞外溶液を適用した際には、膜電位は有意に回復せず、−１７±６ｍＶ（ｎ＝８）の値であった。同様の結果パターンが、入力抵抗の測定で得られ、対照条件下、５０μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳの適用時、および亜鉛適用時に、２５２±５２Ω、１３±３Ω（対照と比較して有意、ｐ＜０．００５）、および１９±７Ω（ｎ＝８）の値であった。この実験から、一旦、ポリ−ＡＰＳが細胞膜に孔または損傷を形成すると、亜鉛がコンダクタンスを低減できないことが明らかとなった（図６ａ）。しかし、１．５ｍＭ亜鉛を含む細胞外溶液にニューロンを持続的に浸漬する第２の実験プロトコルを用いると、ポリ−ＡＰＳ作用の有意な阻害が得られた（図６ｂおよび６ｃ）。亜鉛の存在下での静止膜電位は、−４７±７ｍＶであり、ポリ−ＡＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）を亜鉛と一緒に適用すると、膜電位が−２７±６ｍＶに有意に低下した（ｎ＝７；ｐ＜０．０７）。同じく亜鉛の存在下での入力抵抗は、２６１±３４Ωであり、ポリ−ＡＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）を亜鉛と一緒に適用すると、入力抵抗が１１４±６２Ωに有意に低下した（ｎ＝７；ｐ＜０．０５）。図６ｃは、静止の値に関して標準化させたデータのバーチャートであるが、亜鉛がポリ−ＡＰＳの適用前および適用時に存在する場合、毒素の影響が有意に低減することを示している。
【００５７】
その後、電位活性化チャネルの影響を除外するために、電圧クランプ条件下で実験を実施した。ニューロンを−９０ｍＶに保持し、１．５ｍＭの亜鉛含有溶液の存在下および非存在下でポリ−ＡＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）によって電流を活性化させた。−１６０ｍＶ〜−７０ｍＶで電流−電圧関係を作成し、差し引いて、ポリ−ＡＰＳ誘発電流について電流電圧関係の相違を求めた（図７ｂ）。１０μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳでの結果から、亜鉛は毒素の作用を有意に低下させるが、毒素の作用は無くならないため、ポリ−ＡＰＳの濃度が低下したことが示された。１．５ｍＭの亜鉛含有溶液の存在によって、０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳにより誘発される内向き電流の有意な活性化が妨害された。亜鉛の非存在下では、細胞膜を−９０ｍＶに固定するのに必要な保持電流は、０．５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳの適用時に−１５０±３０ｐＡから−６００±１９０ｐＡに上昇した（ｎ＝５；ｐ＜０．０４）。１．５ｍＭ亜鉛含有溶液が連続して存在する場合とは異なり、ポリ−ＡＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）によって、保持電流は休止レベル−１２０±３０ｐＡから−１７０±７０ｐＡに有意に上昇しなかった（ｎ＝６；ＮＳ）。亜鉛の存在下と非存在下とでポリ−ＡＰＳによる電流の平均振幅にも、有意差があった（ｐ＜０．０５；図７ｂ）。
【００５８】
その後、画像実験を実施して、亜鉛がポリ−ＡＰＳによって誘発されたＣａ２＋の上昇を低減するかどうかを測定した。再度プロトコルを設計して、細胞膜の孔形成の前または後で亜鉛を適用した場合に、ポリ−ＡＰＳによるＣａ２＋の上昇を阻害する亜鉛の能力を評価した。洗浄の間に生じた応答が緩やかに、かつ部分的に回復するため、亜鉛をポリ−ＡＰＳの後に適用した場合の影響を明確に特徴づけることができなかった（図８ａ）。亜鉛自身の適用により、蛍光比が基底レベルを超えてわずかだが有意に上昇し、続いて亜鉛と一緒に適用したポリ−ＡＰＳ（５μｇ／ｍｌ）によって、蛍光比が持続的に上昇した（図８ｂ）。しかし亜鉛の存在下でのこれらの応答は、亜鉛の非存在下でのポリ−ＡＰＳによる応答よりも有意に小さかった（図８ａ、８ｂおよび８ｃ）。亜鉛の非存在下と存在下とでポリ−ＡＰＳによる平均蛍光比の変化には有意差があり、それぞれ３．４６±０．１８（ｎ＝４６）および１．２±０．０５（ｎ＝１３；ｐ＜０．０００１）であった。これらの実験は、２つのニューロン集団で実施したが、ポリ−ＡＰＳ濃度を低下させることによって、同一のニューロンにおいて、亜鉛の非存在下および存在下でのポリ−ＡＰＳの応答を記録することができるものと思われた。予備的観察によって、ポリ−ＡＰＳへの反復可能な応答が、幾つかのニューロンから得られることが示された。これらの実験において、平均の対照蛍光比は、０．９±０．０３であった。ポリ−ＡＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）の第１および第２の適用によって、蛍光比が５．３６±１．３８および３．４５±０．５
５の値に有意に上昇した（ｎ＝１０：対象と比較してｐ＜０．０１および０．０５）。ポリ−ＡＰＳに対する第１の応答と第２の応答とに、有意差はなかった。
【００５９】
次の実験は、０．０５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳで実施した。この実験では、対照条件下での平均蛍光比は、０．９４±０．０２であった。ポリ−ＡＰＳへの第１の応答によって、蛍光比が２．５３±０．３１に有意に上昇し（ｎ＝２２；ｐ＜０．０１）、続いて亜鉛の適用およびポリ−ＡＰＳ（０．０５μｇ／ｍｌ）の第２の適用によって、蛍光比が１．８５±０．１６（ｎ＝２２）に上昇し、応答が低減した。亜鉛の存在下での第２の応答は、基底レベル（ｐ＜０．０１）および第１の応答（ｐ＜０．０５）の双方と有意差があった。亜鉛のみでは予測よりも顕著な影響が得られたため、第２の応答は、ポリ−ＡＰＳ作用の過大評価であると思われる（図９ａ）。ポリ−ＡＰＳと亜鉛を同時に適用して、第２の応答を得た場合に、同様の応答が得られた（図９ｂ）。亜鉛は、ポリ−ＡＰＳの第１の適用時に生じた膜の残存する孔を通過して、蛍光比を緩やかに持続して上昇させたと思われる。
【００６０】
ＨＥＫ２９３細胞におけるポリ−ＡＰＳによる孔形成に対する亜鉛の作用
培養ＤＲＧニューロンにおけるポリ−ＡＰＳによる細胞内Ｃａ２＋の上昇を評価することが困難な理由の一つは、細胞内Ｃａ２＋の上昇が、ポリ−ＡＰＳによって形成した孔を介したＣａ２＋の流入に加え、電位依存性Ｃａ２＋チャネルの活性化およびストアからのＣａ２＋の移動によっても生じるためである。低用量のポリ−ＡＰＳへの反復可能な応答が得られたことに注目すべきであるが、細胞内Ｃａ２＋を上昇させる他の経路があると仮定すると、亜鉛の阻害効果を過小評価または過大評価する可能性がある。この理由から、電位依存性Ｃａ２＋チャネルを発現しないＨＥＫ２９３細胞で、予備実験を実施した。ＤＲＧニューロンと同様に、ポリ−ＡＰＳ（１．５μｇ／ｍｌ）は、細胞内Ｃａ２＋を反復的に上昇させた。ポリ−ＡＰＳの第１および第２の適用での平均蛍光比は、２．３１±０．２５および１．９６±０．３（ｎ＝７；有意差なし）であった。
【００６１】
その後、ポリ−ＡＰＳによるＣａ２＋流入に対する亜鉛の影響を評価する実験を実施した。対照条件下での平均蛍光比は、１．１６±０．０７であり、３０ｍＭのＫＣｌを含む細胞外記録溶液を短期間適用すると、有意な応答は生じなかった（ｎ＝１１；図１０ａおよび図１０ｂ）。亜鉛の非存在下および存在下でポリ−ＡＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）を適用すると応答が誘発され、これらの結果から、亜鉛がポリ−ＡＰＳによって生じた細胞内Ｃａ２＋の上昇を低減させることが明らかとなった。
【００６２】
こうして、亜鉛（Ｚｎ２＋）が、ポリ−ＡＰＳの適用時に持続的に存在すると、膜電位、入力抵抗、全細胞電流およびＣａ２＋透過性に対する海綿毒素調製物の影響を低減させ得ることが明白に実証された。
【００６３】
更にその結果から、ポリ−ＡＰＳがＤＲＧニューロンおよびＨＥＫ２９３細胞の膜に可逆的に孔を形成し得ること、さらに海綿毒素の調製物と一緒に細胞外に亜鉛を適用すると、これらの作用を低減させ得ることが示される。膜電位および入力コンダクタンスが劇的かつ一時的に変化した後も細胞が生存したことは、低用量のポリ−ＡＰＳによる一時的な孔形成を利用して、細胞障害を与えずに物質を細胞内環境に送達し得ることを意味している。
【００６４】
孔の特性、および受動的なＤＮＡ流動の潜在的メカニズムに関して以前に研究が行われている。さらに、一重鎖ポリヌクレオチドＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、径１〜２．５ｎｍの膜孔を形成する黄色ブドウ球菌α毒素またはαヘモリシンで処理した脂質二重層を透過することが示されている。これらのヌクレオチド分子による二重層の通過は、各分子が通過する際のチャネルコンダクタンスの変動によってシグナル化され、分子が特徴づけるこ
とができた。パーフォリン、補体、αエスシンおよびサポニンなどの洗剤、ならびにアラメチシンをはじめとする他の多数の異なる分子が、同様に脂質二重層に穿孔を形成することが示されたが、ＤＮＡに通路を付与するものは示されていなかった。脂質二重層を通したインタクト細胞へのＤＮＡ導入のより簡便なアプローチとしては、脂質−ミセル媒介トランスフェクション、例えばリポフェクタミン、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられるが、これらのアプローチでは、結果にばらつきが生じ、制御が困難となる可能性があり、多くの場合、専門的な器具、面倒な前処理および最適化が必要となる。
【００６５】
ポリ−ＡＰＳは、独特ではあるが、カチオン界面活性剤に匹敵する特性を有しているが、ポリ−ＡＰＳの様々な重合度によって、予測できない方法で生物学的活性が調節されるものと思われる。本発明において我々は、細胞膜特性に対するポリ−ＡＰＳの可逆的影響を同定した。過去に、関連する低分子量のハリトキシン調製物が、不可逆的孔形成と、関連する細胞膜入力コンダクタンスの変化を誘発した。ポリ−ＡＰＳで認められた膜電位、入力抵抗、電流および細胞内Ｃａ２＋の可逆的変化には可能な説明が複数ある。第一に、より少ないモノマー単位で構成された、より小さな分子に比べて、ポリ−ＡＰＳ中での重合度が大きいため、細胞膜での相互作用の安定性が低くなり、より大きな孔を形成する海綿毒素が洗い流されることによって一時的な孔形成が生じる可能性がある。第二に、そして可能性が高いのは、大きなポリ−ＡＰＳが十分に可撓性であるため、孔形成の後に脂質が単独で再配列して、細胞膜のイオン伝導性経路を遮断する可能性である。これは、毒素が膜内にある場合の「疎水性崩壊」により起こると考えられる。そのような環境では、アルキル鎖がピリジニウム基の全てを取り囲むと考えられ、そのためピリジニウム基は膜と反応を起こさない。平均流体力学的半径２３ｎｍの非共有結合凝集体を形成するポリ−ＡＰＳの能力、そのカチオン電荷密度および疎水性が、一過性の孔形成における重要な因子と考えられる。反復可能な孔形成を行うことができ、低用量ポリ−ＡＰＳの適用後に電位依存性チャネルを介したＣａ２＋の流入は依然損なわれない。これにより、少なくとも低濃度では、孔形成による細胞毒性障害が起こらないことが示された。
【００６６】
ポリ−ＡＰＳによって、変動性の高いＣａ２＋トランジェントが行われたが、それは、ＤＲＧニューロン内のＣａ２＋ストアの性質、および電位活性化Ｃａ２＋チャネルの変動し易い発現を反映する可能性がある。膜電位脱分極を誘発したポリ−ＡＰＳは、内因性Ｃａ２＋チャネルを活性化し、ポリ−ＡＰＳの孔と本来のチャネルの双方からＣａ２＋が流入して、Ｃａ２＋誘導性Ｃａ２＋放出によってＣａ２＋がストアから移動する。ＤＲＧニューロンにおいて、ＫＣｌ誘発性脱分極への応答の変動性が報告されたが、単一ニューロンは、ＫＣｌおよびポリ−ＡＰＳでの反復刺激に一定して応答することができる。海綿アンピメドン・ビリディスから得られる生物活性ピリジニウムアルカロイドを含む粗有機抽出物は、選択的な抗菌活性を示す。海綿礁と共生関係を持つ可能性のある幾種かの海洋細菌株は、毒素抽出物に対する耐性を有した。ポリ−ＡＰＳは、陸生で病原性のグラム陽性菌およびグラム陰性菌への抗菌活性を有することは見出されていなかった。異なる原核細胞類および真核細胞類における海綿毒素の作用については、匹敵するデータはほとんど得られていなかった。しかし、我々の結果によって、ポリ−ＡＰＳに対する細胞および生物体の感受性の変動性が、内因性の膜組成および性質に基づく可能性が高まった。ＤＲＧニューロン培養物に認められたポリ−ＡＰＳへの応答の変動性は、この調製物中のニューロンの異質集団を一部反映し、感覚ニューロンが、それらの解剖学的性質、生物物理学的性質および薬理学的性質を変動させる可能性がある。
【００６７】
亜鉛がポリ−ＡＰＳの適用時に継続して存在する場合、膜電位、入力抵抗、ホールセル電流およびＣａ２＋透過性に対する海綿毒素調製物の影響を低減させ得ることは、先にも明白に実証された。これは、亜鉛と細胞膜とが相互作用して、毒素が膜上の部位に接近するのを防ぐことを伴い得る。抗菌ペプチドの作用に関するシャイ−マツザキ−ハング・モ
デル（Ｓｈａｉ−Ｍａｔｓｕｚａｋｉ−Ｈｕａｎｇ  ｍｏｄｅｌ）が、ポリ−ＡＰＳによる孔形成のメカニズムを付与すると考えられる。モデルの初期段階には、外側の膜リーフレットを覆う孔形成分子を含み、これが、膜上の負電荷に結合する細胞外Ｚｎ２＋によって妨害されると考えられる。亜鉛の親和力は、ピリジニウム化合物のそれよりもかなり大きいと考えられ、つまりこの試験で認められるとおり、亜鉛とポリ−ＡＰＳとを予め混合することによって、孔形成が減少する。こうして亜鉛は、孔形成物質を膜に取り込み、外側のリーフレットを薄くして、相を転移させて、ポリ−ＡＰＳ分子により「虫食い穴」を形成し、最後に膜を貫通してコンダクタンス経路を生成するという、孔形成の更なる段階を妨害するものと思われる。あるいは、亜鉛は、ポリ−ＡＰＳと直接相互作用して、生物活性を崩壊させるのかもしれない。真核細胞に関する過去の研究で、Ｚｎ２＋および他の２価陽イオン（Ｈｇ２＋）がポリ−ＡＰＳによって生成された孔を閉鎖するが、低浸透圧ショックによる溶解を起こさないことが示唆されている。今回の試験ではこれは実証されなかったが、先に示唆されたとおりポリ−ＡＰＳと膜との相互作用が変動し、このため亜鉛の保護作用に影響を与える可能性があり、赤血球溶解のメカニズムは、ヘモグロビンの浸透圧性の影響とは区別される。
【００６８】
フラ−２を用いて、ポリ−ＡＰＳによる孔形成の後に生じた細胞内Ｃａ２＋の変化を測定したところ、亜鉛を適用した場合に、蛍光比の有意な低下が認められた。しかしＣａ２＋画像実験の複数の特徴を、更に考慮する必要がある。第一にフラ−２は、亜鉛感受性が高いため（ＫＤ値〜２ｎＭ）細胞内亜鉛の小さな上昇を測定するのに有用であることも立証されているが、亜鉛感受性はＣａ２＋に対する感受性よりも約１００倍低い。亜鉛の存在によって一貫して観察される小さな持続的応答は、Ｃａ２＋よりもむしろ亜鉛を検出するフラ−２を反映すると思われ、これらの事象の持続的性質は、Ｃａ２＋とは異なり亜鉛が細胞内コンパートメントからは容易に除去されないことを示している。これは、亜鉛がポリ−ＡＰＳによる孔を透過し得るが、Ｃａ２＋流入はデータが示すよりも大きく低減することを示唆している。電気生理学的データと合わせると、フラ−２での画像試験は、亜鉛が孔形成のレベルを低下させて、ポリ−ＡＰＳにより形成された孔を通したＣａ２＋流入も阻害し得ることを示している。しかしフラ−２と亜鉛との相互作用は、著しく競合してＣａ２＋検出を低下させる可能性がある。第二に亜鉛は、ポリ−ＡＰＳの応答に寄与し得るＣａ２＋によって運搬されるものなどの電位活性化ニューロンコンダクタンスを阻害することが示され、これによってポリ−ＡＰＳの影響に対する亜鉛の阻害作用を過大評価した可能性がある。しかしながら、亜鉛が電位活性化Ｃａ２＋チャネルとは独立してポリ−ＡＰＳによる孔形成を阻害するということと一致するデータが、電圧クランプの下においてＨＥＫ２９３細胞からも得られている。
【００６９】
ポリ−ＡＰＳは、ＤＲＧニューロンおよびＨＥＫ２９３細胞の膜に孔を可逆的に形成することができ、細胞外亜鉛を海綿毒素の調製物と一緒に適用してこれらの作用を低減させることができる。膜電位および入力コンダクタンスにおける劇的で一過性の変化の後でも細胞が生存したことから、低用量のポリ−ＡＰＳによる一過性の孔形成を利用して、細胞障害を与えずに物質を細胞内環境に送達し得ることが示唆される。
【００７０】
海綿毒素によって形成された孔の一過性で可逆的な性質によって、これらの一過性の膜孔／膜損傷が脂質二重層を介したプラスミドｃＤＮＡの伝達に十分であるかどうかを検討する更なる試験が促された。
【００７１】
これに関連して、０．５μｇ／ｍｌのポリ−ＡＰＳまたはハリトキシンおよび２．５μｇのｐＥＧＦＰと一緒にインキュベートしたＨＥＫ２９３細胞を、蛍光細胞の数を観察することによって定量的に評価したところ、トランスフェクションの成功が示された（図１１ａの下パネル）。これは、トランスフェクトされず、蛍光細胞が見られなかった、毒素のみとインキュベートした細胞（図１１ａ、上パネル）、またはｐＥＧＦＰのみとインキ
ュベートした細胞と対照的であった。市販のトランスフェクション試薬（リポフェクタミン）を使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトして（図１１ａの左パネル）、ｐＥＧＦＰ  ｃＤＮＡおよびトランスフェクト蛍光細胞の画像の双方の陽性対照を提供した。海綿毒素を使用したＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを最大限に行い、標準化プロトコルを提供するためには、広範な最適化実験が必要となる。そのような実験によって、多数の可変的因子のトランスフェクション効率に対する影響を検討し、トランスフェクトされた細胞の割合および細胞生存率の双方を評価した。
【００７２】
一定範囲のｃＤＮＡ濃度による実験で、２．５μｇのｐＥＧＦＰがトランスフェクション効率を最大にするとともに、耐容できない毒性を誘起しないことが示された。より少量のｃＤＮＡを使用すると毒性がかなり低くなるが、トランスフェクション効率も低くなり、より多量では逆の効果（高い毒性、中等度のトランスフェクション効率）を生じる。
【００７３】
毒素／ｃＤＮＡとのインキュベート期間に焦点をあてた実験で、ｃＤＮＡを添加する前に毒素と５分間にわたってインキュベートすると、同時添加の場合、または毒素とのプレインキュベートをより長期間にわたって行う場合と比較して、トランスフェクションが高レベルになることが明らかとなった。更に、ｃＤＮＡを添加した後１８０分間にわたってインキュベートすると最適となり、より短期間ではトランスフェクション効率が低下し、より長期間では毒性が過度に高くなった。血清は、脂質媒介ｃＤＮＡトランスフェクションに対して著しい影響を示すため、毒素媒介トランスフェクションによって同様の影響が認められるかどうかを検討した。無血清条件が、毒性レベルを上昇させることなく、毒素媒介トランスフェクションに対して最も有効であることが立証され、加えて、トランスフェクション後に標準の１０％血清含有培地に戻すと、２０％以上の血清レベルに上昇させた場合よりも有益であった。０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳ／ハリトキシンが、０．０５μｇ／ｍｌまたは５．０μｇ／ｍｌのいずれかよりもトランスフェクションのレベルが高くなることが、ｐＥＧＦＰトランスフェクションの定量によって示された（図１１ｂ）。双方の毒素で同等のレベルのトランスフェクションに達したが、０．５μｇ／ｍｌではポリ−ＡＰＳがわずかに高いトランスフェクション効率を示した（図１１ｂ）。これらの濃度依存的毒素活性は、図４および図５に示した電気生理学的毒素プロファイルと一致する。これらのトランスフェクションレベルは、リポフェクタミンのトランスフェクション効率よりも４倍低いが、それらは、ｃＤＮＡのみの対照レベル（一定して０）よりも高かった。これらの毒素の致死性を分析すると、いずれの毒素でも０．０５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌの双方で、リポフェクタミン媒介トランスフェクションで認められた耐容し得るレベル（通常は８８〜９５％のＨＥＫ２９３細胞が生存）を上回る細胞死を誘起しないことが示唆された（図１１ｃ）。しかし、５．０μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳおよびハリトキシンでは、約１０〜１２倍高い死滅を生じ（それぞれ１２％および６％生存）（図１１ｃ）、海綿毒素の毒性が用量依存性であり、細胞が最大０．５μｇ／ｍｌの毒素に耐容することが示唆された。さらに、この非常に高い毒性は、蛍光細胞の割合が低く（図１１ｂ）、毒素は５．０μｇ／ｍｌでは、細胞をトランスフェクトするのではなく、細胞を殺傷することを説明している。これは、Ｆ５Ａおよび５ｂのデータを支持し、孔の可逆性が用量依存的に低下したことに関連しており、そのような低下は毒性に大きく寄与する因子であり得る。
【００７４】
０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳを用いたＨＥＫ２９３細胞の安定トランスフェクションは、この毒素を潜在的に有用なトランスフェクションツールとして更に示している。ハイグロマイシンＢによる正常細胞の致死性を示すハイグロマイシンＢ耐性クローンを持たない対照細胞とは異なり（表２）、ハイグロマイシンＢ選択試薬中の安定したクローンを選択した後、リポフェクタミンまたはポリ−ＡＰＳを用いてトランスフェクトした６穴プレート中に、多数のコロニーが残った。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
加えてリポフェクタミンは、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞ではポリ−ＡＰＳよりも効果的であるが（リポフェクタミンのプレートではコロニーが２．５倍を超える）、ポリ−ＡＰＳを用いると市販のトランスフェクション試薬よりも低いが依然適切なトランスフェクションレベルに達する（表２および図１１ｂ）。さらに、ポリ−ＡＰＳは対照と比較してかなり多数の安定した細胞を示すが、リポフェクタミンのウェルではポリ−ＡＰＳでトランスフェクトしたウェルに比較して、多数の陽性細胞が存在することが、ｐＥＧＦＰ安定性クローンの共焦点視覚化によって示唆される（図１２ａ）。ｐＢＡＢＥと共に細胞に同時誘導されｃＤＮＡの種類は、安定した発現の成功に関係なく、ｐＥＧＦＰおよびＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡのポリ−ＡＰＳ媒介の安定トランスフェクションは、同等数の安定コロニーをもたらした。ＨＥＫ２９３細胞と２種のＴＮＦＲ２で安定にトランスフェクトされたクローンとのＴＮＦ受容体レベルの分析および比較によって、３種の細胞の全てにおいてＴＮＦＲ１の比較的低い標識および同等の標識が示され（図１２ｂ）、これは野生型ＴＮＦＲ１の発現と一致した。これに反して、クローン４だけが、ＴＮＦＲ２標識が上昇しており、ＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡの安定したトランスフェクションの成功が示される。クローン７は、ＴＮＦＲ２発現レベルの上昇を示さず、対照細胞と類似の非常に低い標識を有し（図１２ｂ）、ｐＢＡＢＥのみがトランスフェクションに成功し、ＴＮＦＲ２  ｃＤＮＡはトランスフェクションに成功せず、その結果、ハイグロマイシン耐性表現型のみの発現を生じることを示唆している。ＦＡＣＳを用いた同細胞の試験では、ＴＮＦＲ１特異性抗体で標識した場合を二次抗体のみと比較すると、３種の細胞全てで蛍光強度が同様に右側にシフトしていることが示されており（図１２ｃ）、３種の細胞でＴＮＦＲ１のレベルが同様であることが示された。しかし、ＴＮＦＲ２のシフトは、トランスフェクトされていない細胞すなわちクローン７細胞では見られず、ＴＮＦＲ２のヒストグラムの線は、二次抗体のみの線と重なっており（図１２ｃ）、野生型ＨＥＫ２９３細胞で認められたとおり、ハイグロマイシン耐性のみの安定クローン７では、ＴＮＦＲ２の発現は、ほとんどまたは全く示唆されていない。より高く発現する安定クローン４では、ＴＮＦＲ２の高い発現と一致して、ＴＮＦＲ２標識において蛍光強度のかなり上昇したことが明らかである（図１２ｃ）。こうして、共焦点分析およびＦＡＣＳ分析の双方で立証されたとおり、クローン４は、ポリ−ＡＰＳを用いた最初のトランスフェクションによってハイグロマイシン耐性表現型およびＴＮＦＲ２の高い表現型の双方を安定して同時に発現
し、これらの可逆的毒素が、トランスフェクション試薬として有用であることが実証された。トランスフェクション試薬を用いずに、ケラチノサイトがプラスミドＤＮＡを取り込む能力が報告されている。しかしこの天然のＤＮＡ取り込み工程は、特に外来遺伝子情報を自然に組み込むことができない周囲の線維芽細胞によるケラチノサイト細胞表現型と思われる。ケラチノサイトに特異的なプラスミドＤＮＡ結合蛋白質の存在が想定されていたが、トランスフェクト試薬の非存在下でｃＤＮＡ取り込みが検出されなかったため、そのようなメカニズムがＨＥＫ２９３細胞に存在しないことは明らかである（図１１ａおよび１２Ａ、ならびに表２）。
【００７７】
本発明によって、ポリ−ＡＰＳを用いた簡単なインキュベーションプロトコルで、回復不能な細胞損傷を生じることなく、大型のスーパーコイルＤＮＡを生存細胞に導入することができる。この新規で再生可能なアプローチは、簡便にプラスミドＤＮＡを用いて、一過性の安定なトランスフェクションを可能にする。そ従来、この性質の孔形成分子を用いてのようなトランスフェクションは行われていない。
【００７８】
培養した後根神経節ニューロンおよびＦ−１１細胞での結果と同じく、ハリトキシンおよびポリ−ＡＰＳ調製物は、ＨＥＫ２９３細胞の細胞膜での孔または損傷形成と一致する手法で、コンダクタンスの上昇をもたらし、細胞内Ｃａ２＋を上昇させた。重合度が、応答を逆行させる際の容易さに影響を与えると思われるが、双方の海綿毒素調製物（ハリトキシンおよびポリ−ＡＰＳ）は、２種以上の異なるアルキルピリジニウム化合物を含む。アルキルピリジニウム化合物のサイズに加えて、凝集および脂質膜構造の問題も、孔形成および細胞回復に影響を与えると思われ、一つの細胞系の細胞間でも、応答にかなり大きな変動が観察された。
【００７９】
細胞内でのプラスミドｃＤＮＡの輸送を可能にするポリ−ＡＰＳおよびハリトキシン調製物によって形成された厳密な孔径はこれまでに知られていないが、２．９ｎｍであると予測される。黄色ブドウ球菌α毒素の最大孔径は、イオン、および短い（２００ｂｐ未満）一重鎖オリゴヌクレオチドを流入させるのに十分であるだけで、二重鎖ＤＮＡまたは蛋白質などの他の生体分子では十分でないため、孔径は２．６ｎｍを超えていなければならないことが分かっている。その上、黄色ブドウ球菌α毒素のイオン成分は、複数のサブユニット形態の孔を通したＤＮＡ導入を妨害する。推定されたポリ−ＡＰＳ凝集体の孔は、わずかに大きな径であるが、ＤＮＡを寄せつけずプラスミドＤＮＡを細胞に輸送する能力を阻む高電荷部位を含まない。明らかにその孔径は、二重鎖αらせんＤＮＡ鎖の幅（２ｎｍ）よりも大きくなければならない。平均の予測ポリ−ＡＰＳ孔径は、２．９ｎｍであり、溶解性プラスミドｃＤＮＡを細胞に通過させるのに十分な大きさの、より大きな凝集した孔が存在する可能性がある。溶解したｃＤＮＡは、αらせんを絡めて、並んだ２つの二重鎖ＤＮＡ鎖の全体的径を最小限に抑えることもできる。形成した孔のサイズに加えて、ポリ−ＡＰＳおよびハリトキシンを用いて形成した孔の一過性の性質が、トランスフェクション化学物質としてこれらの試薬の使用が成功する理由であろう。サポニンおよびαエスシンなどの他の孔形成を行う化学物質は、かなり大きな１３５〜１５０ｋＤａ蛋白質を通過させるのに十分大きな孔を原形質膜に生成する。これらの非可逆的な孔形成を行う化学物質は、短期間の実験には適しているが、それらに暴露した細胞は、大きな壊死およびＣａ２＋の興奮毒性により結果的に死に至るであろう。そのような洗剤および毒素の効果的な非可逆的性質により、それらの洗剤および毒素は、後に細胞を長期間生存させる必要がある系におけるＤＮＡ導入のためには有効ではない。ｃＤＮＡのＨＥＫ２９３細胞への導入およびそれに続く蛋白質の発現によって、０．５μｇ／ｍｌの双方の海綿毒素調製物が、細胞毒性を示さずに、ｃＤＮＡ導入のための可逆的な孔を付与し得ることが示された。最適化プロトコルによって、ｃＤＮＡを添加する前に海綿毒素をプレインキュベートして孔形成することが有用であることが示され、溶解した毒素とｃＤＮＡとの相互作用が孔形成および／またはｃＤＮＡ導入を低減させることが示唆された。同様の効果が血清を存
在させることによって認められ、血清の存在により、ポリ−ＡＰＳによって行われたトランスフェクションの効率が低下した。ポリ−ＡＰＳは、血清蛋白質と強く相互作用し、この試験と同じく、ポリ−ＡＰＳを高度に希釈した血清とインキュベートすると、ポリ−ＡＰＳの溶血活性も妨害し得る。リポフェクタミンを用いた方法と海綿毒素調製物を用いた方法とを比較すると、リポフェクタミンのほうが高い効率を示すが、ポリ−ＡＰＳは、高い安定性および良好な水溶性など幾つかの明白な利点を有する。さらに、海綿毒素の方がより簡便で一貫した方法を提供し、インビボ試験で有利であることが示された。
【００８０】
要約すると、上記結果は、ＤＮＡをトランスフェクトされた生存細胞が、一過性の孔形成を行うアルキルピリジニウム海綿毒素を用いて簡便なプレインキュベーションプロトコルによって得られることを示している。
【００８１】
ポリ−ＡＰＳを用いて、細胞骨格蛋白タウを、インビトロで海馬ニューロンの培養物に送達し、インビボでラット海馬に送達した。高リン酸化タウは、アルツハイマー病患者の脳の重要な特徴であり、タウオパチーのモデルを作成する可能性を検討した。タウ蛋白による欠損を、電気生理学、Ｃａ２＋画像、および水迷路学習を利用して評価した。タウ特異性抗体を用いて、その蛋白質を含む調製物の細胞内負荷を評価した。タウを加えた培養海馬ニューロンは、少なくとも２４時間生存し、それらから正常な活動電位およびＣａ２＋トランジェントが記録できた。同様にインビボで、タウを海馬に正常に送達させた後に動物に水迷路学習および記憶テストを実施させた。しかし、タウの送達に加え、培養物をホスファターゼ阻害剤のオカダ酸で処理すると、活動電位および明確なＣａ２＋トランジェントが、生存したわずかのニューロンでは誘発できなかった。さらに、インビボでポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理した動物は、水迷路のプラットフォームを学習できたが、プラットフォームの位置を変えると逆転学習は損なわれた。エクスビボで海馬スライスにおいて測定した長期電位も低減した。
【００８２】
タウを細胞内コンパートメントに部位特異的に送達し、その後、高リン酸化すると、アルツハイマー病の細胞的様相を検討するための新しいアプローチが付与される。これらのデータは、ポリ−ＡＰＳを用いて、巨大分子を細胞に送達し、インビトロおよびインビボでトランスフェクションまたはモデル疾患の状態を実現することができる更なる証拠も提供される。
【００８３】
水迷路実験は、円形の浴槽の一つの四円分内にあるプラットフォームを動物に発見させる訓練を含む。動物がプラットフォームの位置を学習したら、プラットフォームを移動させて逆転学習を示す能力について動物をテストする。
【００８４】
図１３は、２つのトレールとプラットフォームまでの遊泳経路を示す。トレール１では、動物は浴槽の周囲を泳ぎ、プラットフォームの位置を学習しなかったが、トレール１６では、動物は直接プラットフォームまで泳いだ。
【００８５】
ポリ−ＡＰＳ（海綿毒素）を、単独またはタウと一緒に海馬に適用し、ポリ−ＡＰＳを含まないタウも適用した。その後、数匹の動物においてミニポンプを使用してオカダ酸を７日間にわたり送達したところ、これはホスファターゼを阻害して、タウ蛋白などの蛋白質を高リン酸化した。
【００８６】
図１４では、実験動物の各群ごとにプラットフォームの位置を学習したデータを示す。プラットフォームを含む四分円内で過ごした時間（２５％を超える）および遊泳経路の長さによって示されるとおり、全ての動物がプラットフォームの位置を学習した。プラットフォームの位置を移動させると、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸で処理した動物は、逆転学習を示すことができなかった（図１５）。他の全ての処理群は、逆転学習を示した。
【００８７】
エクスビボデータを示す図１６から分かるとおり、海馬スライスを用いて、長期増強（ＬＴＰ）を試験した。ＬＴＰは、数時間または数日続くニューロンの可塑性の一形態である。経路がテタヌス刺激（矢印）を受けると、その後の電気生理学的シグナリングが上昇する。ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理した動物の脳は、低いＬＴＰを示した。
【００８８】
図１７から分かるとおり、タウは、培養海馬ニューロンの細胞内コンパートメントに送達することができた。タウの特異的抗体を利用して、この蛋白質のレベル（黒）を検出した。
【００８９】
図１８に示すとおり、ポリ−ＡＰＳとタウとで処理した培養海馬ニューロンは活動電位を生成したが、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸で処理したニューロンは、かなり高い電流で刺激した場合でも活動電位の発生を示すことができなかった。
【００９０】
図１９に示すとおり、培養海馬ニューロンをＫＣｌパルスで刺激した。オカダ酸だけでなくポリ−ＡＰＳとタウとで処理したニューロンは、適切なカルシウムトランジェントを示すことができなかった。このことを図１８に示すデータと合わせると、これらのニューロンの興奮性が、おそらく電位活性化チャネルの機能不全によって阻害されたことが示される。
【００９１】
図２０に示すとおり、異なる処理に暴露したニューロンでのカルシウムトランジェントの平均データでは、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とに暴露したニューロンと、ポリ−ＡＰＳとオカダ酸とに暴露したニューロンと、ポリ−ＡＰＳとタウとに暴露したニューロンとが明らかに異なっていた。図１８および図１９のデータによれば、これは、これらのニューロンの興奮性が大きく低下し、それがおそらく電位活性化チャネルの機能不全に関与したことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１ａ】海綿レニエラ・サライから得たポリ−ＡＰＳの化学構造を示す図。用いた調製物は、反復単位（２９〜９９単位）で構成されたポリマーの混合物であった。
【図１ｂ】１００ｐＡ過分極電流コマンドによって誘発された膜電位および電気緊張性電位に対するポリ−ＡＰＳ（５０μｇ／ｍｌ）の不可逆的作用を示す図。
【図１ｃ】膜電位および電気緊張性電位（入力抵抗を計算するために用いた）に対するポリ−ＡＰＳ（５μｇ／ｍｌ）の可逆的作用を示す図。記録は培養ＤＲＧニューロンから得た。
【図２ａ】膜電位に対する５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳの可逆的作用を示すバーチャート（ｎ＝８）。ポリ−ＡＰＳを、培養ＤＲＧニューロンに２０秒間適用した。
【図２ｂ】入力抵抗に対する５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳの可逆的作用を示すバーチャート（ｎ＝８）。ポリ−ＡＰＳを、培養ＤＲＧニューロンに２０秒間適用した。
【図３ａ】５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳにより誘発された細胞内Ｃａ２＋の不可逆的上昇の記録を示す図。これらの記録は、細胞の異質集団から得たもので、そのため応答は様々である。
【図３ｂ】図３ａと同じ調製物中のニューロンから得た記録で、５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳにより誘発された細胞内Ｃａ２＋の可逆的上昇を示す図。
【図３ｃ】単一ニューロンから得たトレースで、０．０５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳの可逆的作用を示す図。
【図４ａ】ハリトキシンの構造を示す図。
【図４ｂ】５μｇ／ｍｌハリトキシンを２０秒間適用することにより誘発された膜電位および入力抵抗の不可逆的崩壊を示す記録であり、上のトレースは、３秒ごとに誘発された５０ｐＡの過分極電流コマンドを示し、下のトレースは、膜電位および電気緊張性電位を示す図。
【図４ｃ】５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳを２０秒間適用することにより誘発された膜電位および入力抵抗の可逆的低下を示す記録であり、上のトレースは、３秒ごとに誘発された４０ｐＡの過分極電流コマンドを示し、下のトレースは、膜電位および電気緊張性電位を示す図。
【図４ｄ】膜電位（黒い棒）および入力抵抗（白い棒）に対するポリ−ＡＰＳの影響を示す棒グラフであり、対照条件下（ｃｏｎ；ｎ＝９）、毒素の存在下（ｎ＝９）および１０分の回復時（ｒｅｃ；ｎ＝６）での平均値を表す図。
【図５ａ】フラ−２を加えたＨＥＫ２９３細胞の細胞内Ｃａ２＋に対するハリトキシン調製物の作用への単一持続的応答（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を示すトレースであり、０．００５および０．０５μｇ／ｍｌハリトキシンでは応答は得られず、＊＊＊は、５μｇ／ｍｌハリトキシンによって生じた染色喪失および細胞障害のポイントを示す図。
【図５ｂ】０．５μｇ／ｍｌハリトキシンへの一過性の応答を示すトレースであり、０．００５および０．０５μｇ／ｍｌハリトキシンでは応答は得られず、＊＊＊は、５μｇ／ｍｌハリトキシンによって生じた染色喪失および細胞障害のポイントを示す図。
【図５ｃ】細胞内Ｃａ２＋の上昇を示すフラ−２蛍光比に対するポリ−ＡＰＳの用量依存性作用を示す一例のトレースを示す図。
【図５ｄ】それぞれポリ−ＡＰＳ（５μｇ／ｍｌ）およびハリトキシン（５μｇ／ｍｌ）への一過性の応答および持続的応答を示す一例のトレースを示す図。
【図５ｅ】０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳおよびハリトキシンの作用（白い棒）、ならびに５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳおよびハリトキシンの作用（黒い棒）を検討するために実施した実験のための平均ピーク蛍光値を示す棒グラフ。
【図６ａ】ポリ−ＡＰＳが膜電位および入力抵抗の変化を誘発した後に適用した１．５ｍＭ亜鉛含有のＮａＣｌベース細胞外溶液を短期間適用した影響がないことを示す記録の図。
【図６ｂ】１．５ｍＭ亜鉛含有のＮａＣｌベース細胞外溶液を持続的に存在させながらポリ−ＡＰＳを細胞に適用した後のポリ−ＡＰＳへの応答が緩やかになり、かつ減少することを示した記録であり、記録の終了時に一定の電流注入を行って、膜電位を過分極して静止レベルに戻した。
【図６ｃ】膜電位（ｎ＝９および７）および入力抵抗（Ｎ＝８および７）のポリ−ＡＰＳ誘発変化に対する亜鉛の持続的存在の有意な影響を示すバーチャート。
【図７ａ】亜鉛の存在下および非存在下でのポリ−ＡＰＳ誘発電流に関する電流−電圧関係を示す図。直線性のＩ／Ｖ関係は、漏れを差し引いた後に１６０〜７０ｍＶで得られた（ｒ２値は、ポリ−ＡＰＳを単独で適用した場合、および亜鉛を連続して存在させた場合に、それぞれ０．９９６および０．９９５であった）。差込のトレースは、亜鉛の非存在下および存在下で適用したポリ−ＡＰＳにより９０ｍＶで誘発した電流を示す。
【図７ｂ】亜鉛によるポリ−ＡＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）による内向き電流の阻害を示すバーチャート。対照データは、９０ｍＶでニューロンをクランプするのに必要な平均保持電流を示すが、亜鉛は、平均保持電流に対して有意な影響を示さなかった。亜鉛の非存在下でのポリ−ＡＰＳは、有意な内向き電流を誘発したが（ｎ＝５）、亜鉛の存在下ではポリ−ＡＰＳによる有意な内向き電流は生じなかった（ｎ＝６）。
【図８ａ】５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳによって誘発された細胞内Ｃａ２＋の上昇を示す記録の図。亜鉛を適用したが、洗浄時に蛍光比が低減することにより、作用の測定が困難であったことに留意されたい。亜鉛を短期間適用することにより、不可逆的応答は低減しなかった。
【図８ｂ】亜鉛の持続的存在下でポリ−ＡＰＳを適用した場合に観察された蛍光比が、持続的だが比較的小幅に上昇したことを示す記録の図。
【図８ｃ】亜鉛の存在下（黒い棒、ｎ＝１３）および亜鉛の非存在下（白い棒、ｎ＝４６）でポリ−ＡＰＳ（５μｇ／ｍｌ）を適用して得られた平均画像データを示すバーチャート。亜鉛単独では有意であるが非常に小幅な蛍光比を上昇させたが、その後、ポリ−ＡＰＳへの応答を低減した。
【図９ａ】単一ＤＲＧニューロンでの蛍光比の変化の記録を示す図。ポリ−ＡＰＳ（０．０５μｇ／ｍｌ）は、Ｃａ２＋の一過性の上昇を誘発し、その後、亜鉛を適用して、蛍光を持続的に上昇させた。しかしポリ−ＡＰＳ（０．０５μｇ／ｍｌ）を更に適用しても、安定な蛍光比の値で示されるとおり細胞内Ｃａ２＋が更に上昇することはなかった。
【図９ｂ】亜鉛を予め適用せずに、ポリ−ＡＰＳ（０．０５μｇ／ｍｌ）の第２の適用と同時に適用したことを除いて、図９ａと同様の実験の記録を示す図。
【図１０ａ】は、ＨＥＫ２９３細胞が脱分極濃度（３０ｍＭ）のＫＣｌを含む細胞外溶液に応答せず、それゆえ電位活性化Ｃａ２＋チャネルを発現しなかったことを示す、ＨＥＫ２９３細胞からの一例の記録を示す図。しかしこの細胞は、ポリ−ＡＰＳの第１の適用には応答し、亜鉛が一緒に存在する第２のポリ−ＡＰＳ（０．０５μｇ／ｍｌ）の適用では蛍光比が少ししか上昇しなかった。
【図１０ｂ】３０ｍＭＫＣｌで刺激した際、および亜鉛の非存在下または存在下でポリ−ＡＰＳを適用した際の、対照条件下での平均フラ−２蛍光比を示すバーチャート。
【図１１ａ】ｐＥＧＦＰの非存在下（上パネル）または存在下（下パネル）でリポフェクタミン、０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳまたは０．５μｇ／ｍｌハリトキシンで処理したＨＫＥ２９３細胞を示す図。蛍光細胞の共焦点画像は、トランスフェクション後４８時間目に撮影されたものであるが、画像は、別の独立した反復実験を少なくとも３回行ったものの代表例である。
【図１１ｂ】リポフェクタミンまたは０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、５．０μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳ／ハリトキシンのいずれか１種を用いてｐＥＧＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクション後４８時間目の蛍光した細胞の総数のパーセント値として評価して示す図。示したデータは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。
【図１１ｃ】トランスフェクトして図１１ｂと同様に評価し、トランスフェクト後４８時間目にクリスタルバイオレット染色してインタクト細胞および接着細胞を定量したＨＥＫ２９３細胞を示す図。ｃＤＮＡのみの対照に比較した生存細胞の％値で表したデータを、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示した。
【図１２ａ】トランスフェクトしていないビヒクル（左パネル）、０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳ（中央パネル）またはリポフェクション（右パネル）を用いてｐＥＧＦＰおよびｐＢＡＢＥ  ｃＤＮＡで同時にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を示す図。ハイグロマイシンＢの選択の後、細胞を共焦点顕微鏡で造影し、写真を撮影した。写真は、別の独立した反復実験３回の代表例である。
【図１２ｂ】０．５μｇ／ｍｌポリ−ＡＰＳを用いてＴＮＦＲ２およびｐＢＡＢＥ  ｃＤＮＡで同時にトランスフェクトし、ハイグロマイシンＢで選択したＨＥＫ２９３細胞、ならびに無抗体（左パネル）、ＴＮＦＲ１特異性マウスモノクローナル抗体（中央パネル）またはＴＮＦＲ２特異性マウスモノクローナル抗体（右パネル）でプローブしたそれぞれの安定クローンを示す図。次に、ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧで二次標識して、共焦点方式で視覚化した。ここに示すのは、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（上のパネル）、陽性ＴＮＦＲ２クローン（クローン４）（中央のパネル）および陰性ＴＮＦＲ２クローン（クローン７）（下のパネル）である。写真は、別の独立した実験３回の代表例である。
【図１２ｃ】ポリ−ＡＰＳでトランスフェクトした安定ＴＮＦＲ２クローンを分離して、無抗体、ＴＮＦＲ１特異性マウスモノクローナル抗体またはＴＮＦＲ２特異性マウスモノクローナル抗体でプローブして、ＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧで二次標識したものの結果を示す図。次のＦＡＣＳ分析によって、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（左側のパネル）とＴＮＦＲ２陽性クローン（クローン４）（中央のパネル）とＴＮＦＲ２陰性クローン（クローン７）（右側のパネル）とでＴＮＦＲ発現を定量および比較した。ヒストグラムは、他の複数の反復実験の代表例である。
【図１３ａ】実験１および水迷路実験において動物がプラットフォームまで泳いだ経路を示す図。水迷路実験では、円形浴の四分円内にあるプラットフォームを見つけるように動物を訓練する必要がある。動物がプラットフォームの位置を学習したら、プラットフォームを移動させて、動物の逆転学習を示す能力をテストすることができる。実験１では、動物は、浴槽の周囲を泳ぎプラットフォームの場所を学習しなかった。
【図１３ｂ】実験１６および水迷路実験において動物がプラットフォームまで泳いだ経路を示す図。水迷路実験では、円形浴の四分円内にあるプラットフォームを見つけるように動物を訓練することを必要とする。動物がプラットフォームの位置を学習したら、プラットフォームを移動させて、動物の逆転学習を示す能力をテストすることができる。実験１６では、動物は直接プラットフォームまで泳いだ。
【図１４ａ】プラットフォームを含む四分円内で過ごした時間（２５％を超える）によって示されたとおり、水迷路実験でのプラットフォームの位置を全動物が学習したことを示すバーチャート。Ｙ軸は、目的の四分円内で過ごした時間（％）を表す。
【図１４ｂ】図１４ａで確認した上述の実験において、水迷路実験時にプラットフォームが円形浴のどの四分円に位置したかを示す図。
【図１４ｃ】４日間かけて遊泳路の長さが短縮したことによって示された通り、水迷路実験におけるプラットフォームの位置を全動物が学習したことを示す線グラフ。Ｙ軸は、センチメートルで表した経路の長さであり、Ｘ軸は、日数を表す。
【図１５ａ】水迷路実験時にプラットフォームを異なる四分円に移動させた場合に、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理した動物では逆転学習を示すことができず、他の全ての処理群はできたことを示すバーチャート。Ｙ軸は、目的の四分円で過ごした時間（％）を表す。
【図１５ｂ】図１５ａで確認した上述の実験において、水迷路実験時にプラットフォームが円形浴のどの四分円に位置したかを示す図。
【図１６】ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理した動物の脳では、長期増強（ＬＴＰ）が低くなることを示す図。ＬＴＰは、数時間または数日間持続するニューロン可塑性の一形態である。経路がテタヌス刺激（矢印）を受けると、次の電気生理学的シグナリングが増加することも示される。実験は、海馬スライスでエクスビボで行った。Ｙ軸は、集合スパイク電位のパーセント値を表し、Ｘ軸は、分で表した時間である。データ組１は、対照データを表し、データ組２は、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理した動物の脳を表す。
【図１７】培養海馬ニューロンの細胞内コンパートメントへのタウの送達を示す図。タウ特異性抗体を用いて、タウのレベル（黒）を検出している。データ組１は、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理した動物の脳を表し、データ組２は、対照データを表す。
【図１８ａ】ポリ−ＡＰＳとタウとで処理した培養海馬ニューロンの活動電位の記録を示す図。Ｙ軸は、１００ｍＶを表し、Ｘ軸は、５０ｍｓを表す。
【図１８ｂ】Ｙ軸は、１００ｍＶを表し、Ｘ軸は、５０ｍｓを表す。
【図１８ｃ】ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理したニューロンが、かなり大きな電流で刺激した場合でも活動電位の発生を示すことができないことを示す図。Ｙ軸は、２５ｍＶを表し、Ｘ軸は、１０ｍｓを表す。
【図１９ａ】ＫＣｌパルスで刺激した培養海馬ニューロンの記録を示す図。フラ−２カルシウム画像を用いて、カルシウムトランジェントを測定した。Ｙ軸は、蛍光比を表し、Ｘ軸は、秒で表した時間を表す。
【図１９ｂ】ＫＣｌパルスで刺激した培養海馬ニューロンの記録を示し、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理したニューロンが、適切なカルシウムトランジェントを示すことができないことを示す図。フラ−２カルシウム画像を用いて、カルシウムトランジェントを測定した。Ｙ軸は、蛍光比を表し、Ｘ軸は、秒で表した時間である。図１８ａ、１８ｂおよび１８ｃで記録したデータと合わせると、これらのニューロンの興奮性が、おそらく電位活性化チャネルの機能不全によって阻害されることが示された。
【図２０】確認された異なる処理に暴露したニューロンによって示されたカルシウムトランジェントの平均データの記録を示す図。ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理したニューロンは、明らかに別の蛍光比を示す。図１８および１９に記録したデータと合わせると、これらのニューロンの興奮性が、おそらく電位活性化チャネルの機能不全に関係して大きく低下したことが示される。Ｙ軸は、蛍光比を表し、Ｘ軸は、ｍＭで表したＫＣｌ濃度である。データ組１は、対照を表し、データ組２は、ポリ−ＡＰＳとオカダ酸とで処理したニューロンを表し、データ組３は、ポリ−ＡＰＳとタウとで処理したニューロンを表し、データ組４は、ポリ−ＡＰＳとタウとオカダ酸とで処理したニューロンを表す。
【図２１】１．０μＭのポリ−ＡＰＳを用いて１２℃で孔形成を行うことによってＣａ２＋流入を誘発させたＨＥＫ２９３細胞を示す図。
【図２２】蛍光蛋白質でのｃＤＮＡのトランスフェクションを、ポリ−ＡＰＳを用いて１２℃で実行することができたＨＥＫ１９３細胞を示す図。
【図２３】ポリ−ＡＰＳを用いて７℃でルシファーイエローの送達を行ったＨＥＫ２９３細胞を示す図。
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１５ａ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９ａ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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