(57)【要約】ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量；およびｉｉ）免疫抑制剤の有効量：を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系の調節を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫抑制剤；
：を含む製品。
【請求項２】
Ｔ細胞活性の調節のための、請求項１で請求される通りの製品。
【請求項３】
炎症、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療のための、請求項１または請求項２で請求される通りの製品。
【請求項４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から４のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤＳＬまたはＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から４のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、少なくとも１個のＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項６で請求される通りの製品。
【請求項８】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１から３のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項１０】
免疫抑制剤が免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体である、前記請求項のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項１１】
免疫抑制剤がイムノフィリン結合性免疫抑制剤である、請求項１から９のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項１２】
免疫抑制剤が、シクロスポリンまたはシクロスポリン誘導体、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、またはＦＫ５０６またはＦＫ５０６誘導体から選択される、請求項１１で請求される通りの製品。
【請求項１３】
ステロイドまたはステロイド誘導体が、アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロプレドノール、コルチゾン、コルチバゾール、デオキシコルトン、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフルオロコルトロン、フルクロロロン、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロン、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオロコルチゾン、フルオロコルトロン、フルオロメトロン、フルランドレノロン、フルチカゾン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、アイコメタゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、チキソコルトールまたはトリアムシノロン、およびそのそれぞれの医薬品として許容される塩または誘導体から選択される、請求項１０で請求される通りの製品。
【請求項１４】
アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療のための、前記請求項のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項１５】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫抑制剤
：を組み合わせることによる、請求項１から１４のうちいずれか１つで請求される通りの製品を調製するための方法。
【請求項１６】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量；および
ｉｉ）免疫抑制剤の有効量
：を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞を、刺激シグナルおよび、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子および免疫抑制剤の組み合わせの適当な量と接触させ、調節Ｔ細胞への分化を促進することを含む、免疫系の調節のための方法。
【請求項１８】
免疫系を調節することにおける、同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫抑制剤；
の組み合わせ。
【請求項１９】
免疫系の調節における使用のための、免疫抑制剤との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子。
【請求項２０】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫抑制剤；
の組み合わせの使用。
【請求項２１】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、免疫抑制剤との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の使用。
【請求項２２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および免疫抑制剤を含む医薬キット。
【請求項２３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および免疫抑制剤および随意的に医薬品として許容されるキャリヤーを含む医薬組成物。
【請求項２４】
１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する段階；および別の処置手順で免疫抑制剤の有効量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【請求項２５】
１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階；および別の処置手順で免疫抑制剤の相乗作用的に有効な量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【請求項２６】
免疫系の調節を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）イムノフィリン結合性免疫抑制剤；
：を含む製品。
【請求項２７】
Ｔ細胞活性の調節のための、請求項２６で請求される通りの製品。
【請求項２８】
炎症、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療のための、請求項２６または請求項２７で請求される通りの製品。
【請求項２９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２６から２８のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦcセグメントを含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２６から２９のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤＳＬまたはＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２６から３０のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、少なくとも１個のＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３１で請求される通りの製品。
【請求項３３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項２６から２８のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２６から２８のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３５】
イムノフィリン結合性免疫抑制剤が、シクロスポリンまたはシクロスポリン誘導体、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、またはＦＫ５０６またはＦＫ５０６誘導体から選択される、請求項２６から３４のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３６】
アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療のための、請求項２６から３５のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項３７】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）イムノフィリン結合性免疫抑制剤
：を組み合わせることによる、請求項２６から３６のうちいずれか１つで請求される通りの製品を調製するための方法。
【請求項３８】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量；および
ｉｉ）イムノフィリン結合性免疫抑制剤の有効量
：を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞を、刺激シグナルおよび、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子およびイムノフィリン結合性免疫抑制剤の組み合わせの適当な量と接触させ、調節Ｔ細胞への分化を促進することを含む、免疫系の調節のための方法。
【請求項４０】
免疫系を調節することにおける、同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）イムノフィリン結合性免疫抑制剤；
の組み合わせ。
【請求項４１】
免疫系の調節における使用のための、イムノフィリン結合性免疫抑制剤との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子。
【請求項４２】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）イムノフィリン結合性免疫抑制剤；
の組み合わせの使用。
【請求項４３】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、イムノフィリン結合性免疫抑制剤との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の使用。
【請求項４４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子およびイムノフィリン結合性免疫抑制剤を含む医薬キット。
【請求項４５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子およびイムノフィリン結合性免疫抑制剤および随意的に医薬品として許容されるキャリヤーを含む医薬組成物。
【請求項４６】
１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する段階；および別の処置手順でイムノフィリン結合性免疫抑制剤の有効量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【請求項４７】
１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階；および別の処置手順でイムノフィリン結合性免疫抑制剤の相乗作用的に有効な量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【請求項４８】
免疫系の調節を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫学的に活性なステロイド；
：を含む製品。
【請求項４９】
Ｔ細胞活性の調節のための、請求項４８で請求される通りの製品。
【請求項５０】
炎症、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療のための、請求項４８または請求項４９で請求される通りの製品。
【請求項５１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４８から５０のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦcセグメントを含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４８から５１のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＤＳＬまたはＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４８から５２のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、少なくとも１個のＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド、またはそのようなタンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項５３で請求される通りの製品。
【請求項５５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項４８から５０のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４８から５０のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５７】
免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体が、アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロプレドノール、コルチゾン、コルチバゾール、デオキシコルトン、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフルオロコルトロン、フルクロロロン、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロン、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオロコルチゾン、フルオロコルトロン、フルオロメトロン、フルランドレノロン、フルチカゾン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、アイコメタゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、チキソコルトールまたはトリアムシノロン、およびそのそれぞれの医薬品として許容される塩または誘導体から選択される、請求項４８から５６のうちいずれかで請求される通りの製品。
【請求項５８】
アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療のための、請求項４８から５７のうちいずれか１つで請求される通りの製品。
【請求項５９】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫抑制剤．
：を組み合わせることによる、請求項４８から５８のうちいずれか１つで請求される通りの製品を調製するための方法。
【請求項６０】
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量；および
ｉｉ）免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体の有効量
：を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節するための方法。
【請求項６１】
Ｔ細胞を、刺激シグナルおよび、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子および免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体の組み合わせの適当な量と接触させ、調節Ｔ細胞への分化を促進することを含む、免疫系の調節のための方法。
【請求項６２】
免疫系を調節することにおける、同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体；
の組み合わせ。
【請求項６３】
免疫系の調節における使用のための、免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子。
【請求項６４】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、
ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子；および
ｉｉ）免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体；
の組み合わせの使用。
【請求項６５】
免疫系の調節のための薬剤の製造における、免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体との同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の使用。
【請求項６６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体を含む医薬キット。
【請求項６７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体および随意的に医薬品として許容されるキャリヤーを含む医薬組成物。
【請求項６８】
１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する段階；および別の処置手順で免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体の有効量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【請求項６９】
１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する段階；および別の処置手順で免疫学的に活性なステロイドまたはステロイド誘導体の相乗作用的に有効な量を投与する段階を含む、免疫系を調節するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫機能の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第９８／２０１４２号パンフレットは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の操作を、免疫療法にならびにＴ細胞媒介性疾患の予防および／または治療に用いる方法を記載する。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、腫瘍によって誘導されたＴ細胞系の異常、および感染症を標的とすることができる。
【０００３】
また、抗原特異的寛容を他のＴ細胞へ伝達することができる調節Ｔ細胞の一種を生じることが可能であることも示されており、伝染性寛容と呼ばれる過程である（国際公開第９８／２０１４２号パンフレット）。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の説明およびそれによって影響される条件は、たとえば、下記の我々の公開されたＰＣＴ出願に見出すことができる；
ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（出願日１９９７年１１月６日、国際公開第９８／２０１４２号；出願日１９９６年１１月７日の英国特許第９６２３２３６．８号、出願日１９９７年７月２４日の英国特許第９７１５６７４．９号、および出願日１９９７年９月１１日の英国特許第９７１９３５０．２号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（出願日１９９９年１２月１５日、国際公開第００／３６０８９号；出願日１９９９年１２月１５日の英国特許第９８２７６０４．１号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（出願日２０００年１１月１７日、国際公開第０１３５９９０号；出願日１９９９年１１月１８日の英国特許第９９２７３２８．６号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３５０３（出願日２００１年８月３日、国際公開第０２／１２８９０号；出願日２０００年８月４日の英国特許第００１９２４２．７号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２４３８（出願日２００２年５月２４日、国際公開第０２／０９６９５２号；出願日２００１年５月２５日の英国特許第０１１２８１８．０号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３８１（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１２１１１号；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５５．１号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３９７（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１２４４１号；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５３．６号、出願日２００２年４月５日の英国特許第０２０７９３０．９号、出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８２．８号および出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８３．６号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１１３１７号；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５３．６号、出願日２００２年４月５日の英国特許第０２０７９３０．９号、出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８２．８号および出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８３．６号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４３９０（出願日２００２年９月２７日、国際公開第０３／０２９２９３号；出願日２００１年９月２８日の英国特許第０１２３３７９．０号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３７（出願日２００２年１１月１３日、国際公開第０３／０４１７３５号；出願日２００１年１１月１４日の英国特許第０１２７２６７．３号、出願日２００２年７月２５日のＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６号、出願日２００２年９月７日の英国特許第０２２０８４９．４号、出願日２００２年９月１０日の英国特許第０２２０９１３．８号および出願日２００２年９月２７日のＰＣＴ／ＧＢ０２／００４３９０号の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３３（出願日２００２年１１月１３日、国際公開第０３／０４２２４６号；出願日２００１年１１月１４日の英国特許第０１２７２７１．５号および出願日２００２年９月１０日の英国特許第０２２０９１３．８号の優先権を主張）。
【０００５】
ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８号（国際公開第９８／２０１４２号）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３号（国際公開第００／３６０８９号）、ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１号（国際公開第０１３５９９０号）、ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３５０３号（国際公開第０２／１２８９０号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２４３８号（国際公開第０２／０９６９５２号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３８１号（国際公開第０３／０１２１１１号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３９７号（国際公開第０３／０１２４４１号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６号（国際公開第０３／０１１３１７号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４３９０号（国際公開第０３／０２９２９３号）、ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３７号（国際公開第０３／０４１７３５号）およびＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３３号（国際公開第０３／０４２２４６号）のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【０００６】
ホイネ（Ｈｏｙｎｅ）Ｇ．Ｆ．他（１９９９）Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１８：１２２−１２４；ホイネ他（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００：２８１−２８８；ホイネ，Ｇ．Ｆ．他（２０００）Ｉｎｔｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：１７７−１８５；ホイネ，Ｇ．他（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８２：２１５−２２７もまた参照される；そのそれぞれもまた参照により本開示に含まれる。
【０００７】
本発明は、免疫系を調節するためのさらなる方法を提供することを目指す。
【０００８】
ラパマイシン、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６といったイムノフィリン結合性免疫抑制剤は、免疫抑制作用を示すことが知られており、したがって移植片拒絶といった症状の治療のために一般に用いられている。
【０００９】
免疫活性ステロイドは免疫抑制作用を示すことが知られており、たとえば、炎症性疾患の治療のために一般に用いられている。
【００１０】
現在、そのような免疫抑制剤の免疫抑制作用はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の免疫調節作用を妨害しないこと、およびさらに、特にサイトカインプロファイルに関して、予想外に改善された活性のスペクトルおよび／または選択性を提供するためにそのような薬剤の組み合わせを使用しうることが見出されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の最初の一態様によると、免疫系の調節を目的とした同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための組み合わせ調製物として、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子（ここでは「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子」ともいう）および免疫抑制剤を含む製品が提供される。
【００１２】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の有効量および免疫抑制剤の有効量を同時に、同時期に、別々にまたは順次に投与することを含む、哺乳類において免疫系を調節する方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節における、同時の、同時期の、別々のまたは順次の使用のための、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子と免疫抑制剤との組み合わせが提供される。
【００１４】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節における免疫抑制剤との、同時の、同時期の、別々のまたは順次の組み合わせでの使用のための、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子が提供される。
【００１５】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための薬剤の製造における、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子と免疫抑制剤との組み合わせの使用が提供される。
【００１６】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための薬剤の製造における、免疫抑制剤と、同時に、同時期に、別々にまたは順次に組み合わせての、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子の使用が提供される。
【００１７】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子、および免疫抑制剤を含むキットが提供される。
【００１８】
本発明の別の一態様によると、未処置Ｔ細胞を刺激シグナルおよび適当な量のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子と免疫抑制剤との組み合わせに接触させ、調節Ｔ細胞への分化を促進することを含む、免疫系の調節のための方法が提供される。
【００１９】
本発明の方法、製品、および用途は、生物学的または治療的効果の促進を提供する。ここで用いられる「生物学的または治療的効果の促進」の語は、たとえば、効力の増大、有効性の増大、副作用の減少、活性スペクトルの改善、などを含む。
【００２０】
好ましい一実施形態では、免疫抑制剤はイムノフィリン結合性免疫抑制剤である。
【００２１】
好ましい一実施形態では、免疫抑制剤は免疫学的に活性なステロイドである。
【００２２】
一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子およびイムノフィリン結合性免疫抑制剤または免疫学的に活性なステロイドは、相乗的な（適切には優加法的な）量で用いられる。これは、必要に応じて、より少ない量の活性物質を用いることができるという特有の長所を持つ。
【００２３】
本発明の別の一態様によると、１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の有効量を投与する；および別の処置手順で免疫抑制剤の有効量を投与する段階を（任意の順序で）含む、免疫系を調節するための方法が提供される。
【００２４】
本発明の別の一態様によると、１つの処置手順でＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の相乗作用的に有効な量を投与する；および別の処置手順で免疫抑制剤の相乗作用的に有効な量を投与する段階を（任意の順序で）含む、免疫系を調節するための方法が提供される。
【００２５】
適切にはイムノフィリン結合性免疫抑制剤はシクロフィリンへ結合することによって作用しうる。
【００２６】
代替的にイムノフィリン結合性免疫抑制剤はマクロフィリン／ＦＫＢＰへ結合することによって作用しうる。
【００２７】
代替的にイムノフィリン結合性免疫抑制剤はｍＴＯＲまたはＲＡＰＴＯＲへ結合することによって作用しうる。
【００２８】
適切にはイムノフィリン結合性免疫抑制剤はラパマイシンまたはラパマイシン誘導体を含む。
【００２９】
代替的に、または加えて、イムノフィリン結合性免疫抑制剤はシクロスポリンまたはシクロスポリン誘導体を含む。
【００３０】
代替的に、または加えて、イムノフィリン結合性免疫抑制剤はＦＫ５０６（タクロリムス）またはＦＫ５０６誘導体を含む。
【００３１】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子 （「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子」）はＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化することができる物質である。好ましくはその物質は、リンパ球、好ましくはＴ細胞において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を活性化することができる。
【００３２】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４受容体といったＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができる物質である。適切には、たとえば、その調節因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈリガンドの生物学的に活性な断片または誘導体、またはそのようなＮｏｔｃｈリガンドのペプチドミメティックでありうる。好ましくはその物質は好ましくは哺乳類で、好ましくはヒトで、Ｔ細胞といったリンパ球において、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することができる。
【００３３】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、融合タンパク質を含みうるかまたは融合タンパク質をコードしうる。たとえば、調節因子はＮｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦcセグメントを含む融合タンパク質を含みうるかまたはコードしうる。
【００３４】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメントおよび免疫グロブリンＦcセグメント（たとえばＩｇＧ１ ＦｃまたはＩｇＧ４ Ｆｃ）を含む融合タンパク質、またはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。適切なそのような融合タンパク質は、たとえば国際公開第９８／２０１４２号パンフレットの実施例２に記載されている。ＩｇＧ融合タンパク質は、たとえば、米国特許第５４２８１３０号明細書（ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））に記載のように、本分野でよく知られている通りに調製することができる。
【００３５】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬまたはＥＧＦドメイン、またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含むタンパク質またはポリペプチドを含むかまたはコードする。
【００３６】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも２個、適切には少なくとも３個、たとえば少なくとも３ないし１６個またはより多くのＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする。適切にはそのＤＳＬおよびＥＧＦ配列は哺乳類配列であるかまたは哺乳類配列に対応する。好ましい配列はヒト配列を含む。
【００３７】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。
【００３８】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｄｅｌｔａまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｄｅｌｔａまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４０】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体、または、Ｎｏｔｃｈまたは断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４１】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制因子の優性阻害型をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４２】
代替的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流構成成分の発現または活性をアップレギュレートすることができるポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４３】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、抗体、抗体断片または抗体誘導体、または、抗体、抗体断片または抗体誘導体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４４】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は多量体化型で投与することができる。たとえば、一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は膜または担体に結合しうる。適切には複数または多数の調節因子（たとえば少なくとも５）が膜または担体に結合する。そのような膜または担体は本分野で既知であるものから選択することができる。好ましい一実施形態では、その担体は粒子状担体マトリクスである。さらにより好ましい一実施形態では、その担体はビーズである。そのビーズは、たとえば、磁気ビーズ（たとえば「ダイナル（Ｄｙｎａｌ）」の商品名で入手可能である通りの）、またはセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズといったポリマー性ビーズであることができる。
【００４５】
記載の適切な活性物質は、抗原または抗原決定基（たとえばアレルゲン、移植抗原または自己抗原）または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチドと、前記抗原または抗原決定基に対する免疫反応を調節するように、好ましくは低下するように、同時の、別々の、または順次の組み合わせで投与される。
【００４６】
好ましい一実施形態では本発明は：
ｉ）ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体；および
ｉｉ）適切にはＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも２ないし１６、たとえば少なくとも２ないし１０個のＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする活性化因子である、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化因子；
および随意的に抗原または抗原決定基、または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
の組み合わせを用いる。
【００４７】
別の一実施形態では、本発明は：
ｉ）シクロスポリンまたはシクロスポリン誘導体；および
ｉｉ）適切にはＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも２ないし１６、たとえば少なくとも２ないし１０個のＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする活性化因子である、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化因子；
および随意的に抗原または抗原決定基、または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
の組み合わせを用いる。
【００４８】
別の一実施形態では本発明は：
ｉ）ＦＫ５０６またはＦＫ５０６誘導体；および
ｉｉ）適切にはＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも２ないし１６、たとえば少なくとも２ないし１０個のＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする活性化因子である、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化因子；
および随意的に抗原または抗原決定基、または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
の組み合わせを用いる。
【００４９】
本発明の別の一態様によると、イムノフィリン結合性免疫抑制剤は、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体およびシクロスポリンまたはシクロスポリン誘導体の組み合わせを含む。
【００５０】
別の一実施形態によると、本発明は：
ｉ）ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体；
ｉｉ）シクロスポリンまたはシクロスポリン誘導体；および
ｉｉｉ）適切にはＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも２ないし１６、たとえば少なくとも２ないし１０個のＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする活性化因子である、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化因子；
および随意的に抗原または抗原決定基、または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
の組み合わせを用いる。
【００５１】
別の一実施形態によると、本発明は：
ｉ）ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体；
ｉｉ）ＦＫ５０６またはＦＫ５０６誘導体；および
ｉｉｉ）適切にはＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも２ないし１６、たとえば少なくとも２ないし１０個のＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする活性化因子である、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化因子；
および随意的に抗原または抗原決定基、または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
の組み合わせを用いる。
【００５２】
別の好ましい一実施形態では本発明は：
ｉ）免疫学的に活性なステロイド；および
ｉｉ）適切にはＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１ないし２０、適切には少なくとも２ないし１６、たとえば少なくとも２ないし１０個のＥＧＦ様ドメインを含むかまたはコードする活性化因子である、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化因子；
および随意的に抗原または抗原決定基、または抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
の組み合わせを用いる。
【００５３】
好ましくは免疫系の調節はＴ細胞活性の調節を含む。
【００５４】
一実施形態では免疫系の調節はＴ細胞活性の低下を含む。たとえば、免疫系の調節は、エフェクターＴ細胞活性の低下、たとえばヘルパー（ＴＨ）および／または細胞傷害性（ＴＣ）Ｔ細胞活性の低下を含みうる。適切には免疫系の調節は、Ｔｈ１またはＴｈ２免疫反応の低下を含みうる。
【００５５】
代替的に、または加えて、免疫系の調節は、Ｔｒ１またはＴｈ３調節Ｔ細胞活性の増大といった、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性の増大を提供する。
【００５６】
適切には免疫系の調節は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の生成および／またはＴｒｅｇ活性の増大を含む。
【００５７】
適切には免疫系の調節は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病または自己免疫疾患の治療を含む。
【００５８】
適切には本発明の組み合わせは、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現の調節に用いることができる。
【００５９】
適切には本発明の組み合わせは、ＩＬ−１０発現の増加のための薬剤の製造に用いることができる。
【００６０】
適切には本発明の組み合わせは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現の低下のための薬剤の製造に用いることができる。
【００６１】
適切には本発明の組み合わせは、ＩＬ−１０発現の増加およびＩＬ−４またはＩＬ−５発現の減少を有する免疫調節サイトカインプロファイルを生じさせるための薬剤の製造に用いることができる。
【００６２】
適切には本発明の組み合わせは、ＩＬ−１０発現の増加およびＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、Ｉｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−アルファ発現の減少を有する免疫調節サイトカインプロファイルを生じさせるための薬剤の製造に用いることができる。
【００６３】
このように本発明はさらに、本発明に記載の活性物質の組み合わせを投与することによる、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現の調節のための方法を提供する。
【００６４】
さらに、本発明に記載の活性物質の組み合わせを投与することによる、ＩＬ−１０またはＩＬ−４発現の増加のための方法を提供する。
【００６５】
さらに、本発明に記載の活性物質の組み合わせを投与することによる、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現の減少のための方法を提供する。
【００６６】
さらに、本発明に記載の活性物質の組み合わせを投与することによる、ＩＬ−１０発現の増加およびＩＬ−５発現の減少を有する免疫調節サイトカインプロファイルを生じさせるための方法を提供する。
【００６７】
さらに、本発明に記載の活性物質の組み合わせを投与することによる、ＩＬ−１０発現の増加およびＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−アルファ発現の減少を有する免疫調節サイトカインプロファイルを生じさせるための方法を提供する。
【００６８】
適切にはサイトカイン発現は、白血球、線維芽細胞または上皮細胞において、好ましくは樹状細胞、リンパ球またはマクロファージ、またはそれらの前駆細胞または組織特異的誘導体において改変されうる。
【００６９】
本発明の別の一態様によると、寛容を促進することができるリンパ球または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を作製する方法であって、患者または患畜から得られたリンパ球またはＡＰＣを（ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および（ｉｉ）ここに記載の通りの免疫抑制剤と共にインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００７０】
適切にはその方法は、患者または患畜から得られたリンパ球またはＡＰＣを、（ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および（ｉｉ）ここに記載の通りの免疫抑制剤の存在下で、ＡＰＣと共にインキュベートすることを含む。
【００７１】
本発明の別の一態様によると、Ｔ細胞に寛容を誘導することができるＡＰＣを作製する方法であって、ＡＰＣを（ｉ）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子および（ｉｉ）ここに記載の通りの免疫抑制剤と接触させることを含む方法が提供される。
【００７２】
本発明の別の一態様によると、寛容を促進することができるリンパ球またはＡＰＣを作製する方法であって、患者または患畜から得られたリンパ球またはＡＰＣを、上記の通り作製されたリンパ球またはＡＰＣと共にインキュベートすることを含む方法が提供される。
【００７３】
適切にはそのような方法ではそのリンパ球またはＡＰＣはｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏのどちらかでインキュベートすることができる。
【００７４】
適切には抗原または抗原決定基（または、抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド）もまた、本発明の方法、用途および製品の一部として投与することができる。その抗原または抗原決定基（または、抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチド）は、抗原または抗原決定基に対する免疫反応を調節するように、好ましくは低下させるように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子および免疫抑制剤と、同時の、別々のまたは順次の組み合わせで投与することができる。
【００７５】
一実施形態では抗原または抗原決定基は、自己抗原またはその抗原決定基、または、自己抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００７６】
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、アレルゲンまたはその抗原決定基、または、アレルゲンまたはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００７７】
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、移植抗原またはその抗原決定基、または、移植抗原またはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００７８】
適切には本発明における用途のためのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は：
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）１〜５個（および好ましくは５個以下）のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）随意的に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）随意的に１つ以上の異種アミノ酸配列；
を含むタンパク質またはポリペプチド、
またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含みうる。
【００７９】
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は：
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜４個（および好ましくは４個以下）のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）随意的に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）随意的に１つ以上の異種アミノ酸配列；
を含むタンパク質またはポリペプチド、
またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含みうる。
【００８０】
適切にはそのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子のうち１個以上は：
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜３個（および好ましくは３個以下）のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）随意的に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）随意的に１つ以上の異種アミノ酸配列；
を含むタンパク質またはポリペプチド、
またはそれをコードするポリヌクレオチド
を含みうる。
【００８１】
適切にはそのタンパク質またはポリペプチドは、下記の配列に対してその全長にわたって、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性（または好ましくは配列同一性）を有しうる：
ＭＧＳＲＣＡＬＡＬＡＶＬＳＡＬＬＣＱＶＷＳＳＧＶＦＥＬＫＬＱＥＦＶＮＫＫＧＬＬＧＮＲＮＣＣＲＧＧＡＧＰＰＰＣＡＣＲＴＦ
ＦＲＶＣＬＫＨＹＱＡＳＶＳＰＥＰＰＣＴＹＧＳＡＶＴＰＶＬＧＶＤＳＦＳＬＰＤＧＧＧＡＤＳＡＦＳＮＰＩＲＦＰＦＧＦＴＷＰＧ
ＴＦＳＬＩＩＥＡＬＨＴＤＳＰＤＤＬＡＴＥＮＰＥＲＬＩＳＲＬＡＴＱＲＨＬＴＶＧＥＥＷＳＱＤＬＨＳＳＧＲＴＤＬＫＹＳＹＲＦ
ＶＣＤＥＨＹＹＧＥＧＣＳＶＦＣＲＰＲＤＤＡＦＧＨＦＴＣＧＥＲＧＥＫＶＣＮＰＧＷＫＧＰＹＣＴＥＰＩＣＬＰＧＣＤＥＱＨＧＦ
ＣＤＫＰＧＥＣＫＣＲＶＧＷＱＧＲＹＣＤＥＣＩＲＹＰＧＣＬＨＧＴＣＱＱＰＷＱＣＮＣＱＥＧＷＧＧＬＦＣＮＱＤＬＮＹＣＴＨＨ
ＫＰＣＫＮＧＡＴＣＴＮＴＧＱＧＳＹＴＣＳＣＲＰＧＹＴＧＡＴＣＥＬＧＩＤＥＣ
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態を、非限定的な実施例を用いて、および添付の図を参照して、より詳細にここで説明する。
【００８３】
本発明の実施は、別に指示されない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物
学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文
献に説明されている。たとえば、Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリ
ッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９，『
分子クローニング；実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第二版、１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、 Ｆ．Ｍ．他 （１９９５および定期補遺；
『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）９，１３，および１６章，ジョン・ワイリー・アンド・サン
ズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク州ニューヨーク；Ｂ．ロー（
Ｒｏｅ）、Ｊ．クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）およびＡ．カーン（Ｋａｈｎ）、１９
９６，『ＤＮＡ単離および配列決定；基幹技術』（ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）ジョン・ワイリー
・アンド・サンズ社；Ｊ．Ｍ．ポラック（Ｐｏｌａｋ）およびジェームスＯ’Ｄ．マクジ
ー（Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ）、 １９９０，『Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼー
ション；原理と実践』（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）；オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）； Ｍ．Ｊ．ゲイト（Ｇａｉｔ）（編集）、１９８４，『オ
リゴヌクレオチド合成；実践的手法』（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｉｒｌ出版（Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ）
；Ｄ．Ｍ．Ｊ．リリー（Ｌｉｌｌｅｙ）およびＪ．Ｅ．ダールベルク（Ｄａｈｌｂｅｒｇ
）、１９９２，『酵素学の方法；ＤＮＡ構造パートＡ；ＤＮＡの合成および物理分析』（
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ
；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）；およびＪ．Ｅ．コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）、Ａ．Ｍ．クルイスビーク（Ｋ
ｒｕｉｓｂｅｅｋ）、Ｄ．Ｈ．マーグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）、Ｅ．Ｍ．シェバッ
ハ（Ｓｈｅｖａｃｈ）およびＷ．ストロバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）（１９９２および定期補
遺；『免疫学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク）を
参照。これらの一般的文献のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【００８４】
疑いを避けるため、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および脊椎動物名は互
いに交換可能に用いられ、およびすべてのホモログは本発明の範囲内に含まれる。
【００８５】
イムノフィリン結合性免疫抑制剤
ここで用いられる「イムノフィリン結合性免疫抑制剤」の語は、たとえば、シクロフィリン、ＦＫＢＰ１２およびＦＫＢＰ５０といったＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、ｍＴＯＲ（「ラパマイシンの標的（Ｔａｒｇｅｔ Ｏｆ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）」）、ＲＡＰＴＯＲなどのようなイムノフィリンと結合して、免疫反応の抑制を引き起こす物質を意味する。これらのイムノフィリンの多くはカルモジュリン／カルシニューリンと相互作用する。
【００８６】
（ａ）細胞周期のＧ１期からＧＳ期へのＴ細胞の移行を阻害する物質
一実施形態では、イムノフィリン結合性免疫抑制剤は、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体といった、イムノフィリンに結合することによって細胞周期のＧ１期からＧＳ期へのＴ細胞の移行を阻害する物質でありうる。
【００８７】
元の（「天然」）ラパマイシン（別名シロリムス）は、細菌株ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）から単離された下記の構造を有するマクロライド化合物である：
【化１】
2006513153.tif 000002
【００８８】
ラパマイシンの多数の誘導体が既知であり、それらは同一の種類の活性を有し、およびまた本発明に従って使用することができる。
【００８９】
したがって、ここで用いられる「ラパマイシン」の語は、天然ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミン、および、たとえば酸化または還元を通じてラパマイシン核上の官能基が修飾されているラパマイシンを含む（「ラパマイシン類化合物」ともいう）。
【００９０】
たとえば、米国特許第６３９９６２５号明細書（ワイス（Ｗｙｅｔｈ））で論述される
通り、ラパマイシンの４２−および／または３１−エステルおよびエーテルが下記の特許
で開示されており、それらの特許のすべてが参照により本開示に含まれる：ラパマイシン
のアルキルエステル（米国特許第４，３１６，８８５号明細書）；アミノアルキルエステ
ル（米国特許第４，６５０，８０３号明細書）；フッ化エステル（米国特許第５，１００
，８８３号明細書）；アミドエステル（米国特許第５，１１８，６７７号明細書）；カル
バメートエステル（米国特許第５，１１８，６７８号明細書）；シリルエーテル（米国特
許第５，１２０，８４２号明細書）；アミノエステル（米国特許第５，１３０，３０７号
明細書）；アセタール（米国特許第５，５１，４１３号明細書）；アミノジエステル（米
国特許第５，１６２，３３３号明細書）；スルホン酸および硫酸エステル（米国特許第５
，１７７，２０３号明細書）；エステル（米国特許第５，２２１，６７０号明細書）；ア
ルコキシエステル（米国特許第５，２３３，０３６号明細書）；Ｏ−アリール、−アルキ
ル、−アルケニル、および−アルキニルエーテル（米国特許第５，２５８，３８９号明細
書）；炭酸エステル（米国特許第５，２６０，３００号明細書）；アリールカルボニルお
よびアルコキシカルボニルカルバメート（米国特許第５，２６２，４２３号明細書）；カ
ルバメート（米国特許第５，３０２，５８４号明細書）；ヒドロキシエステル（米国特許
第５，３６２，７１８号明細書）；障害の大きいエステル（米国特許第５，３８５，９０
８号明細書）；複素環式エステル（米国特許第５，３８５，９０９号明細書）；ｇｅｍ−
２置換エステル（米国特許第５，３８５，９１０号明細書）；アミノカルボン酸エステル
（米国特許第５，３８９，６３９号明細書）；リン酸カルバメートエステル（米国特許第
５，３９１，７３０号明細書）；カルバメートエステル（米国特許第５，４１１，９６７
号明細書）；カルバメートエステル（米国特許第５，４３４，２６０号明細書）；アミジ
ノカルバメートエステル（米国特許第５，４６３，０４８号明細書）；カルバメートエス
テル（米国特許第５，４８０，９８８号明細書）；カルバメートエステル（米国特許第５
，４８０，９８９号明細書）；カルバメートエステル（米国特許第５，４８９，６８０号
明細書）；障害の大きいＮ−オキシドエステル（米国特許第５，４９１，２３１号明細書
）；ビオチンエステル（米国特許第５，５０４，０９１号明細書）；Ｏ−アルキルエーテ
ル（米国特許第５，６６５，７７２号明細書）；およびＰＥＧエステル（米国特許第５，
７８０，４６２号明細書）。これらのエステルおよびエーテルの調製は上に列記した特許
に開示されている。対応する１−オキソラパマイシンのエステルおよびエーテルの調製は
、これらの特許に開示される方法を用いて、１−オキソラパマイシンから開始して達成す
ることができる。
【００９１】
ラパマイシンの好ましい２７−エステルおよびエーテルは、参照により本開示に含まれ
る、米国特許第５，２５６，７９０号明細書に開示されている。これらのエステルおよび
エーテルの調製は上に列記した特許に開示されている。対応する１−オキソラパマイシン
のエステルおよびエーテルの調製は、これらの特許に開示される方法を用いて、１−オキ
ソラパマイシンから開始して達成することができる。
【００９２】
ラパマイシンの好ましいオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンは、参照に
より本開示に含まれる、米国特許第５，３７３，０１４号明細書、第５，３７８，８３６
号明細書、第５，０２３，２６４号明細書、および第５，５６３，１４５号明細書に開示
されている。これらのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンの調製は上に列
記した特許に開示されている。４２−オキソラパマイシンの調製は、参照により本開示に
含まれる、米国特許第５，０２３，２６３号明細書に開示されている。対応する１−オキ
ソラパマイシンのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンの調製は、これらの
特許に開示される方法を用いて、１−オキソラパマイシンから開始して達成することがで
きる。
【００９３】
特に好ましい１−オキソラパマイシンは、１−オキソラパマイシン、３−ヒドロキシ−
２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸との１−オキソラパマイシン４２−
エステル［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロピオン酸とのラ
パマイシン４２−エステルの調製については米国特許第５，３６２，７１８号明細書を参
照］，および４２−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル１−オキソラパマイシン［４２−Ｏ−
（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンの調製については米国特許第５，６６５，７７２
号明細書を参照；別名「ＳＤＺ−ＲＡＤ」］を含む。
【００９４】
ラパマイシン誘導体の他の例の一部は、たとえば下記を含む：
４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（４’−ヒドロキシメチル）ベンジル−ラパマイシン
４０−Ｏ−［４’−（１，２−ジヒドロキシエチル）］ベンジル−ラパマイシン
４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン
４０−Ｏ−［３’−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４（Ｓ）−イル］−プ
ロプ−２’−エン−１’−イル）−ラパマイシン
（２’Ｅ，４’Ｓ）−４０−Ｏ−（４’，５’−ジヒドロキシペント−２’−エン−１’
−イル）−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（３−ヒドロキシ）プロピル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（６−ヒドロキシ）ヘキシル−ラパマイシン
４０−Ｏ−［２−（２−ヒドロキシ）エトキシ］エチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−［（３Ｓ）−２，２−ジメチルジオキソラン−３−イル］メチル−ラパマイシ
ン
４０−Ｏ−［（２Ｓ）−２，３−ジヒドロキシプロプ−１−イル］−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−アセトキシ）エチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−ニコチノイルオキシ）エチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−［２−（Ｎ−モルホリノ）アセトキシ］エチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ）エチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル）アセトキシ］エチル−ラパマイシ
ン
３９−Ｏ−Ｄｅｓメチル−３９，４０−Ｏ，Ｏ−エチレン−ラパマイシン
（２６Ｒ）−２６−ジヒドロ４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン
２８−Ｏ−メチル−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−アミノエチル）−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−アセトアミノエチル）−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−ニコチンアミドエチル）−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−（Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルボキサミド）エチル）−ラパ
マイシン
４０−Ｏ−（２−エトキシカルボニルアミノエチル）−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−トリルスルホンアミドエチル）−ラパマイシン
４０−Ｏ−［２−（４’，５’−ジカルボエトキシ−１’，２’，３’−トリアゾール−
１’−イル）−エチル］−ラパマイシン
４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン。
【００９５】
（ｂ）細胞周期のＧ０期からＧ１期へのＴ細胞の移行を阻害する物質
代替的に、または加えて、イムノフィリン結合性免疫抑制剤は、たとえばシクロスポリン（たとえばシクロスポリンＡ）またはＦＫ５０６（タクロリムス）またはその誘導体のような、ＩＬ−２のようなサイトカインの転写を阻害する物質といった、イムノフィリンに結合することによって細胞周期のＧ０期からＧ１期へのＴ細胞の移行を阻害する物質でありうる。
【００９６】
シクロスポリンＡ（ＣｙｓＡ）は真菌から得られる環状ウンデカペプチド（ＣＡＳ番号５９８６５−１３−３；米国特許第３，７３７，４３３号明細書）であり、下記の構造を有する：
【化２】
2006513153.tif 000003
【００９７】
ここで用いられる「シクロスポリン」の語は、免疫抑制薬活性を有する環状オリゴペプチドのグループのうち任意のものを意味し、既知のシクロスポリンＡ、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロスポリンＤ、シクロスポリンＥ、シクロスポリンＦ、シクロスポリンＧ、シクロスポリンＨおよびシクロスポリンＩ（「シクロスポリン類の化合物」ともいう）を含む。特に、この語はシクロスポリンＡ、別名シクロスポリンを含む。合成により製造された、天然由来のまたは精製された、および組み換えにより製造された部分がその定義の中に含まれ、これらのうちの任意のものの類縁物質、誘導体、および医薬品として許容される塩もまたその定義の中に含まれる。その語はまた、Ｄ−アミノ酸、ＤまたはＬ立体配座の修飾された、誘導体化された、または天然に存在しないアミノ酸、および／またはペプチドミメティックまたはプロドラッグ単位を、構造の一部として有するシクロスポリンを含む。シクロスポリンＡが一般的に好ましい。
【００９８】
代替的に、または加えて、イムノフィリン結合性免疫抑制剤は免疫抑制性のアスコマイシンまたはアスコマイシン誘導体（「アスコマイシン類の化合物」ともいう）でありうる。アスコマイシンは、そのうちＦＫ−５０６およびアスコマイシンが最も良く知られているが、ラクタムマクロライドの一分類を形成し、そのうちの多数が強力な免疫抑制活性および抗炎症活性を有する。ＦＫ５０６は、ストレプトマイセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）によって産生されるラクタムマクロライドである。アスコマイシンはたとえば米国特許第３，２４４，５９２号明細書に記載されている。アスコマイシン；ＦＫ５０６、同様の生物学的活性を有する他の天然に存在するマクロライド、およびそれらの誘導体、たとえば合成類縁物質および誘導体を集合的に「アスコマイシン」という。合成類縁物質または誘導体の例はたとえば、欧州特許出願公開第４２７，６８０号明細書に開示されるような３３−エピ−クロロ−３３−デスオキシ−−アスコマイシンといったハロゲン化アスコマイシン、欧州特許出願公開第６２６，３８５号明細書に開示されるようなテトラヒドロピラン誘導体である。
【００９９】
ＦＫ５０６（別名タクロリムス）は下記の構造を有するマクロライドである：
【化３】
2006513153.tif 000004
【０１００】
ＦＫ５０６はストレプトマイセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ ９９９３によって産生されるマクロライド抗生物質である。ＦＫ５０６を調製する方法は 欧州特許第１８４１６２号明細書に記載されている。
【０１０１】
ＦＫ５０６の基本構造および少なくとも１つの生物学的性質（たとえば免疫学的性質）を保持している、ＦＫ５０６の多数の誘導体が知られている。そのような化合物の例は、たとえば、欧州特許第１８４１６２号明細書、欧州特許第３１５９７８号明細書、欧州特許第３２３０４２号明細書、欧州特許第４２３７１４号明細書、欧州特許第４２７６８０号明細書、欧州特許第４６５４２６号明細書、欧州特許第４７４１２６号明細書、国際公開第９１／１３８８９号パンフレット、国際公開第９１／１９４９５号パンフレット、欧州特許第４８４９３６号明細書、欧州特許第５３２０８８号明細書、欧州特許第５３２０８９号明細書、欧州特許第５６９３３７号明細書、欧州特許第６２６３８５号明細書および国際公開第９３／５０５９号パンフレットに記載されている。
【０１０２】
ＦＫ５０６類の好ましい化合物は欧州特許第４２７６８０号に、たとえば実施例６６ａに開示されている（３３−エピ−クロロ−３３−デスオキシアスコマイシンともいう）。ＦＫ５０６類の他の好ましい化合物は欧州特許第４６５４２６号明細書、欧州特許第５６９３３７号明細書、および欧州特許第６２６３８５号明細書に開示されており、たとえば欧州特許第５６９３３７号明細書の実施例６ｄの化合物、または欧州特許第６２６３８５号明細書の実施例８の化合物である。
【０１０３】
免疫学的に活性なステロイド
ここで用いられる「免疫学的に活性なステロイド」の語は、免疫反応を改変することのできるステロイドを含む。好ましくは免疫学的に活性なステロイドは糖質コルチコイド（ＧＣ）受容体を活性化する。適切にはそのステロイドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性を改変する。好ましくはそのステロイドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性を低下させる。
【０１０４】
「免疫学的に活性なステロイド」の語は、天然に存在する免疫学的に活性なステロイドおよびその誘導体、およびステロイド様免疫活性を有する合成または半合成ステロイドアナログを含む。好ましくはそのステロイドは、副腎皮質ステロイドまたは糖質コルチコイドである。たとえば、多数のそのようなステロイドは、シクロペンタノフェナントレンを基礎とする融合環構造の核を持つ。具体的な天然および合成ステロイドの例は下記を含むがそれらに限定されない：アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロプレドノール、コルチゾン、コルチバゾール、デオキシコルトン、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフルオロコルトロン、フルクロロロン、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロン、フルオシノニド、フルオコルチン ブチル、フルオロコルチゾン、フルオロコルトロン、フルオロメトロン、フルランドレノロン、フルチカゾン、ハルシノニド、ヒドロコルチゾン、アイコメタゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、チキソコルトールまたはトリアムシノロン、およびそのそれぞれの医薬として許容される塩または誘導体。そのようなステロイドの組み合わせもまた本発明において使用することができることが理解される。
【０１０５】
米国特許出願公開第 ２０００２００９０３７号明細書（ＤＮＡＸ）で論述される通り、糖質コルチコイド（ＧＣ） は、自己免疫疾患およびアレルギー疾患といった、炎症性疾患の治療に幅広く用いられている強力な抗炎症剤および免疫抑制剤である（ウィルケンス（Ｗｉｌｋｅｎｓ）およびデ・リイク（ｄｅ Ｒｉｊｋ）（１９９７） Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：４１８−４２４；シュライマー（Ｓｃｈｌｅｉｍｅｒ），他 （１９９７年編）『喘息における吸入糖質コルチコイド：機構および臨床作用』（Ｉｎｈａｌｅｄ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｉｎ Ａｓｔｈｍａ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｏｎｓ）デッカー社（Ｄｅｋｋｅｒ））。ＧＣは、Ｔ細胞およびＡＰＣの両方に対して、増殖およびサイトカイン産生のレベルで、ある条件下ではＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、およびＩＬ−５のダウンレギュレーションを伴うがしかし別の条件下ではＩＬ−４のアップレギュレーションを伴う、阻害作用を有することが示されている。ブロフタ（Ｂｌｏｆｔａ），他 （１９９７） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５５８９−５５９５；ラミレス（Ｒａｍｉｒｅｚ），他 （１９９６） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２４０６−２４１２； およびデインズ（Ｄａｙｎｅｓ）およびアラネオ（Ａｒａｎｅｏ）（１９８９） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：２３１９−２３２５を参照。これは間接的作用の結果として生じる可能性があり、たとえば、ＡＰＣ、抗原、およびＴ細胞を含む培養中で、ＧＣはＡＰＣによるＩＬ−１２の産生、したがってＴ細胞によるＩＦＮ−ｇ産生をダウンレギュレートし（ブロッタ（Ｂｌｏｔｔａ），他（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５５８９−５５９５；ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ），他 （１９９８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５２４５−５２５１； およびビッサー（Ｖｉｓｓｅｒ），他 （１９９８） Ｂｌｏｏｄ ９１：４２５５−４２６４）、およびしたがって一部の場合にはＩＬ−４ （Ｂｌｏｔｔａ，他 （１９９７） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：５５８９−５５９５）およびまたはＩＬ−５ （ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ），他 （１９９８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５２４５−５２５１） および／または ＩＬ−１０ （ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ），他 （１９９８） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５２４５−５２５１；およびビッサー（Ｖｉｓｓｅｒ），他（１９９８） Ｂｌｏｏｄ ９１：４２５５−４２６４） の産生を間接的にアップレギュレートしうる。近年、ＧＣはヒトＣＤ８＋Ｔ細胞分化を、高いＩＬ−１０および低いＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３産生を伴う安定した表現型へ進めることが示されている。リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）およびハウリロウイッツ（Ｈａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ）（２０００） Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２３４４−２３５４を参照。
【０１０６】
糖質コルチコイドは細胞質ＧＣ 受容体（ＧＲ）と結合し、これは次いで核へ移行して標的遺伝子の転写活性化を阻害する。シュライマー（Ｓｃｈｌｅｉｍｅｒ），他（１９９７年編）『喘息における吸入糖質コルチコイド：機構および臨床作用』（Ｉｎｈａｌｅｄ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｉｎ Ａｓｔｈｍａ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｏｎｓ）デッカー社（Ｄｅｋｋｅｒ）中のカリン（Ｋａｒｉｎ）の総説；およびカリン（Ｋａｒｉｎ）（１９９８） Ｃｅｌｌ ９３：４８７−４９０を参照。糖質コルチコイドは：１）タンパク質−タンパク質相互作用を介して、ＡＰ−１およびＮＦ−kＢといった相互作用因子の機能に干渉すること（デ・ボッシャー（Ｄｅ Ｂｏｓｓｃｈｅｒ），他（１９９７）９４：１３５０４−１３５０９）；およびサイトカイン遺伝子プロモーターへのＮＦＡＴ結合の阻害（チェン（Ｃｈｅｎ），他 （２０００） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：８２５−８３２）；２）保存程度の低いネガティブＧＣ応答配列（ＧＲＥ）への直接のＤＮＡ結合；または３）ＩｋＢａといった阻害因子の発現を誘導すること（シュライマー（Ｓｃｈｌｅｉｍｅｒ），他（１９９７年編）『喘息における吸入糖質コルチコイド：機構および臨床作用』（Ｉｎｈａｌｅｄ Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｉｎ Ａｓｔｈｍａ： Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｃｔｉｏｎｓ）デッカー社（Ｄｅｋｋｅｒ）中でカリン（Ｋａｒｉｎ）に総説されている）を通じて転写抑制を媒介する。さらに、ＧＲはプラスミノーゲン活性化因子ＰＡＩ−１遺伝子のＴＧＦ−ｂ転写活性化を、リガンド依存性の方法で、Ｓｍａｄ３およびＳｍａｄ４Ｃ末端活性化ドメインの両方によって抑制する。ソング（Ｓｏｎｇ），他 （１９９９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１１７７６−１１７８１を参照。
【０１０７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路またはその標的シグナル伝達経路の生物学的活性の変化または改変をいう。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子」（または「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子」）の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の拮抗因子または阻害因子、すなわちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、遮断する化合物をいうことができる。都合良く、ここではそのような化合物は阻害因子または拮抗因子ということができる。代替的に、および好ましくは「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の作用因子（または部分作用因子） 、すなわちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、刺激またはアップレギュレートする化合物をいうことができる。都合良く、そのような化合物はアップレギュレーターまたは作用因子ということができる。好ましくは使用するＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はＮｏｔｃｈシグナル伝達の作用因子であり、および好ましくはＮｏｔｃｈ受容体の作用因子（たとえばＮｏｔｃｈ１，Ｎｏｔｃｈ２，Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４受容体の作用因子で，好ましくはヒトＮｏｔｃｈ受容体である）。好ましくはそのような作用因子（「Ｎｏｔｃｈの活性化因子」）は、好ましくはヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４といったヒトＮｏｔｃｈ受容体を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体と結合しそれを活性化する。Ｎｏｔｃｈ受容体との結合および／またはその活性化は、たとえばここに記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ結合測定法および活性測定法を含む本分野で既知のさまざまな技術によって評価することができる。
【０１０８】
たとえば、任意の特定の物質がＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するかどうか（たとえばＮｏｔｃｈの活性化因子またはＮｏｔｃｈ作用因子である）は、任意の適当な測定法の使用によって、たとえばロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット（たとえばその実施例８および９を参照）に記載された型のＣＢＦ−１レポーター測定法の使用によって、容易に決定することができる。逆に、拮抗因子活性は、たとえば、ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第０３／０１２４４１号パンフレットまたは国際公開第０３／０４１７３５号パンフレット（たとえば実施例１０、１１および１２を参照）に記載されたように、既知のＮｏｔｃｈシグナル伝達作用因子によるシグナル伝達を低下させることにおけるその物質の何らかの効果を監視することによって容易に測定することができる（すなわちいわゆる「拮抗因子」測定法で）。
【０１０９】
本発明の活性物質はたとえば有機化合物またはその他の化学物質でありうる。一実施形態では、調節因子は２個以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物となる。ここで、「ヒドロカルビル基」の語は、少なくともＣおよびＨを含む基を意味し、および随意的に１つ以上の他の適当な置換基を含みうる。そのような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環状基などを含みうる。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組み合わせは環状基を形成しうる。ヒドロカルビル基が２個以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、少なくとも２個の炭素は、適当な元素または基を介して結合することができる。このように、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含むことができる。適当なヘテロ原子は当業者に明らかとなり、たとえば、硫黄、窒素、および酸素を含む。調節因子候補は少なくとも１つの環状基を含みうる。環状基は、非融合型多環基といった多環基であることができる。一部の用途のためには、本物質は、別のヒドロカルビル基と結合した、前記環状基のうち少なくとも１つを含む。
【０１１０】
好ましい一実施形態では、調節因子はアミノ酸配列またはその化学誘導体である。別の好ましい一実施形態では、調節因子はヌクレオチド配列であって、センス配列またはアンチセンス配列でありうる。調節因子はまた抗体であることができる。
【０１１１】
「抗体」の語は、完全な分子および、抗原決定基と結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖといったその断片を含む。これらの抗体断片はその抗原または受容体と選択的に結合する能力の一部を保持し、およびたとえば下記を含む；
（ｉ）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、酵素パパインを用いての完全な抗体の消化によって作製することができ、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を生じる；
（ｉｉ）Ｆａｂ’は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元して、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を生じることによって得ることができる；抗体分子あたり２個のＦａｂ’断片が得られる；
（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる；Ｆ（ａｂ’）2は２本のジスルフィド結合によって結びついた２個のＦａｂ’断片の二量体である；
（ｉｖ）ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域を融合した一本鎖分子として含む、遺伝
子操作された断片を含む。
【０１１２】
これらの断片を作製する一般的方法は本分野で既知である。（たとえば、参照により本開示に含まれる、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），『抗体：実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），ニューヨーク（１９８８）を参照）。
【０１１３】
たとえば、ＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドに対する抗体は、米国特許第５６４８４６４号明細書、米国特許第５８４９８６９号明細書、および米国特許第６００４９２４号明細書（エール大学／インペリアル・キャンサー・テクノロジー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））に記載されており、その本文は参照により本開示に含まれる。
【０１１４】
Ｎｏｔｃｈ受容体に対して作製された抗体もまた、国際公開第００２０５７６号パンフレット（その本文は参照により本開示に含まれる）に記載されている。たとえば、この文書はヒトＮｏｔｃｈ−１ ＥＧＦ様反復１１および１２に対する抗体の作製を開示する。たとえば、特定の実施形態で、国際公開第００２０５７６号パンフレットは、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５４を有しＡ６で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５６を有しＣｌｌで表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、およびＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５５を有しＦ３で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体を開示する。
【０１１５】
抗ヒト−Ｊａｇｇｅｄ１抗体はＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ）から整理番号ＭＡＢ１２７７１（クローン１８８３２３）として入手可能である。
【０１１６】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は多量体化された形であり、および好ましくは、少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、少なくとも３０、または少なくとも５０または１００以上のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含む構造を含みうる。
【０１１７】
たとえば、ビーズといった粒子状担体と結合したＮｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドの形のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第０３／０１１３１７号パンフレット（ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ））およびロランティス社の同時出願中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１５２５（２００３年４月４日出願）に記載されている（たとえば特にＰＣＴ／ＧＢ２００３／００１５２５の実施例１７、１８、１９を参照）。
【０１１８】
高分子担体と結合したＮｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドの形のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の同時出願中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００３２８５（２００３年８月１日出願、英国特許第０２１８０６８．５号の優先権を主張）に記載されている（たとえば特に、デキストラン複合体を開示するその実施例５を参照）。
【０１１９】
一形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節のための物質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのタンパク質でありうる。
【０１２０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのタンパク質とは、Ｎｏｔｃｈの活性化、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流現象、下流標的遺伝子の転写調節、および他の非転写的下流現象（たとえば既存のタンパク質の翻訳後修飾）を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体を介したシグナル伝達に関与する分子を意味する。より具体的には、そのタンパク質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子の活性化を可能にするドメイン、またはそれをコードするポリヌクレオチド配列を含みうる。
【０１２１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の非常に重要な成分は、Ｎｏｔｃｈ受容体／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用である。このようにＮｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈリガンドまたは受容体またはそれらの結果として生じる切断産物の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路膜タンパク質またはＧ−タンパク質、またはプロテアーゼ、キナーゼ（たとえばセリン／スレオニンキナーゼ）、ホスファターゼ、リガーゼ（たとえばユビキチンリガーゼ）またはグリコシルトランスフェラーゼといったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路酵素の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。代替的にシグナル伝達は、転写因子といったＤＮＡ結合配列の、発現、性質、量、または活性における変化に関与しうる。
【０１２２】
本発明では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は好ましくは特異的シグナル伝達を意味し、シグナル伝達が、サイトカインシグナル伝達といった何らかの他の顕著な干渉するかまたは競合する原因でなく、実質的に、または少なくとも主に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路から、および好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用から結果として生じることを意味する。好ましくはしたがってここで用いられる「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達」の語は、サイトカインシグナル伝達を除外する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を下記により詳細に説明する。
【０１２３】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
【０１２４】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
【０１２５】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
【０１２６】
Ｎｏｔｃｈ依存性転写活性化の主要な標的は、Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ複合体の遺伝子（Ｅ［ｓｐｌ］）である。さらにこれらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接の標的であること、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達に反応して転写活性化されることが示されている。哺乳類Ｓｕ（Ｈ）ホモログＣＢＦ１と相互作用してそれを転写抑制因子から転写活性化因子へ変換するウイルスコアクチベータータンパク質であるＥＢＮＡ２との類推によって、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と共同して、Ｓｕ（Ｈ）と結合してＳｕ（Ｈ）がＥ（ｓｐｌ）および他の標的遺伝子の転写を活性化することを可能にする活性化ドメインに寄与しうる。Ｓｕ（Ｈ）はすべてのＮｏｔｃｈ依存性の決定に必要ではないこともまた注目すべきであり、これは、Ｎｏｔｃｈが他のＤＮＡ結合性転写因子と結合することによって、または細胞外シグナルを伝達する他の機構を用いることによって、一部の細胞運命選択を媒介することを示す。
【０１２７】
本発明の一態様によると、活性物質はＮｏｔｃｈ、またはＮｏｔｃｈのシグナル伝達能力を保持するその断片、またはＮｏｔｃｈのシグナル伝達能力を有するＮｏｔｃｈのアナログであることができる。
【０１２８】
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈのアナログ」の語は、Ｎｏｔｃｈのシグナル伝達能力を保持しているその変異体を含む。「アナログ」には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達能力を持つが、しかし一般的にＮｏｔｃｈとは異なる進化的起源を有するタンパク質を含める。Ｎｏｔｃｈのアナログは、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０、またはＬＭＰ２Ａといった、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質を含む。
【０１２９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのタンパク質とは、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の任意の１つ以上の成分を活性化することができる分子を意味する。
【０１３０】
一実施形態では、活性物質は、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈリガンドをコードするポリヌクレオチドでありうる。本発明で有用であるＮｏｔｃｈリガンドは、典型的にはたとえば造血幹細胞といったさまざまな哺乳類細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドと結合することができる内因性Ｎｏｔｃｈリガンドを含む。
【０１３１】
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈリガンド」の語は、Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して生物学的効果を生じることができる物質を意味する。ここで用いられるその語はしたがって、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄといった天然に存在するタンパク質リガンド、および天然リガンドに対応する生物学的作用を有するＮｏｔｃｈ受容体に対する抗体、ペプチドミメティックおよび低分子を含む。好ましくはＮｏｔｃｈリガンドはＮｏｔｃｈ受容体と結合によって相互作用する。
【０１３２】
現在までに同定された哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの具体例は、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａまたはＤｅｌｔａ−ｌｏｋｅ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））およびＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ#０１６９４１−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））および米国特許第６１２１０４５号明細書（ミレニアム社（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ））、Ｄｅｌｔａ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４３８９４およびＡＦ２５３４６８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＳｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１およびＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７３４号パンフレット）Ｊａｇｇｅｄ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ７３９３６−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））およびＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＬＡＧ−２を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
【０１３３】
別の一実施形態では、活性化因子は構成的に活性であるＮｏｔｃｈ受容体またはＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン、またはそのような受容体または細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドであることができる。
【０１３４】
別の一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化因子はＮｏｔｃｈ受容体の下流で作用する。したがって、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化因子は構成的に活性であるＤｅｌｔｅｘポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることができる。本発明で有用であるＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の他の下流成分は、好ましくは構成的に活性な型での、Ｄｅｌｔｅｘによって触媒されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）といったＮｏｔｃｈのタンパク質分解切断に関与するポリペプチド、およびＮｏｔｃｈ標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチドを含む。
【０１３５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのポリペプチドとは、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として発現する任意のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの発現に関与する任意のポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意味する。
【０１３６】
好ましくは、阻害因子が受容体または受容体をコードする核酸配列である場合、受容体が活性化される。したがって、たとえば、その物質が核酸配列である場合、受容体は好ましくは発現された際に構成的に活性である。
【０１３７】
任意の１つ以上の適当な標的（たとえばアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列）を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を調節することができる化合物および／または標的化分子を同定するために、さまざまな医薬スクリーニング技術の任意のものにおいて、用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液中で遊離しているか、固体担体上に付加されているか、細胞表面上に保持されているか、または細胞内に位置することができる。
【０１３８】
医薬スクリーニングのための技術は、ゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）の１９８４年９月１３日公開の欧州特許第０１３８８５５号明細書に記載の方法に基づくことができる。要約すると、多数の異なる小ペプチド候補調節因子または標的化分子が、プラスチックピンまたは何らかの他の表面といった固体基材上に合成される。ペプチド被験化合物を適当な標的またはその断片と反応させ洗浄する。結合物をその後に、たとえば本分野でよく知られた方法を適当に当てはめることによって、検出する。精製された標的はまた、医薬スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接被覆することができる。高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）用に有用であるプレートは、好ましくは９６、３８４、または３８４を超えるウェル／プレートを有するマルチウェルプレートとなる。細胞はまた、「芝生状」として広げることができる。代替的に、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉して固体担体上に固定化することができる。高処理量スクリーニングを、合成化合物について上述したように、有機候補調節因子および標的化分子を同定するためにもまた用いることができる。
【０１３９】
本発明はまた、標的と結合することができる中和抗体が、標的との結合について特異的に被験化合物と競合する、競合医薬スクリーニング分析の使用も考慮する。
【０１４０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の成分と結合および調節することができる抗体、ペプチドミメティックおよび小有機分子といった物質のスクリーニングおよび開発のための技術は本分野でよく知られている。これらは、シグナル伝達タンパク質を発現するためのファージディスプレイ系の使用、およびトランスフェクションした大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはその他の微生物の培養を用いて結合化合物候補の結合試験のためのタンパク質を産生することを含む（たとえば、Ｇ．セサリーニ（Ｃｅｓａｒｉｎｉ），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３０７（１）：６６−７０（１９９２年７月）；Ｈ．グラム（Ｇｒａｍ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１６１：１６９−１７６ （１９９３）；およびＣ．サマー（Ｓｕｍｍｅｒ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３７５６−３７６０ （１９９２年５月）を参照）。他のライブラリおよびスクリーニング技術は、たとえば、米国特許第６２８１３４４号明細書（ファイロス（Ｐｈｙｌｏｓ））に記載されている。
【０１４１】
ポリペプチド、タンパク質、およびアミノ酸配列
ここで用いられる「アミノ酸配列」の語は、「ポリペプチド」の語および／または「タンパク質」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「ペプチド」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「タンパク質」の語と同義である。
【０１４２】
「ペプチド」は通常、アミノ酸１０個ないし４０個の長さ、好ましくはアミノ酸１０個ないし３５個の、短いアミノ酸配列をいう。
【０１４３】
アミノ酸配列は適当な起源から調製および単離することができ、または合成によって作製することができ、または組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０１４４】
本発明で有用な「タンパク質」の定義内で、問題のタンパク質がその内因性機能の少なくとも１つを保持するような方法で、特定のアミノ酸残基を修飾することができ、そのような修飾タンパク質を「変異体」という。変異体タンパク質は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも一個のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって修飾されうる。
【０１４５】
典型的には、修飾された配列が、必要な標的活性を、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する能力を保持するという条件で、アミノ酸置換を、たとえば１、２または３ないし１０または２０個の置換を行うことができる。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含みうる。
【０１４６】
本発明で有用であるタンパク質はまた、サイレント変異を生じおよび機能的に等価のタンパク質を結果として生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しうる。標的または調節機能が保持される限り、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または残基の両親媒的性質における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行いうる。たとえば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含む；および、同様の親水性値を有する、非荷電の極性頭部基を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【０１４７】
参照を簡略にするために、主要な天然に存在するアミノ酸の１文字記号および３文字記号（およびその対応するコドン）を下記に示す：
2006513153.tif 000005
【０１４８】
保存的置換は、たとえば下記の表に従って行うことができる。２列目で同一区分にあり、および好ましくは３列目で同一行にあるアミノ酸は、互いに置換が可能である：
2006513153.tif 000006
【０１４９】
ここで用いられる「タンパク質」の語は、一本鎖ポリペプチド分子、および個々の構成ポリペプチドが共有または非共有的方法によって結合している複数ポリペプチド複合体を含む。ここで用いられる「ポリペプチド」および「ペプチド」の語は、モノマーがアミノ酸でありおよびペプチドまたはジスルフィド結合を介して結びついているポリマーをいう。サブユニットおよびドメインの語はまた、生物学的機能を有するポリペプチドおよびペプチドをいうことができる。本発明で有用なペプチドは、少なくとも標的またはシグナル伝達調節能力を有する。「断片」はまた変異体でありその語は典型的には、結合測定法で対象であり、その結合相手が既知であるかまたは測定可能な、タンパク質の選択された領域をいう。「断片」はしたがって、完全長ポリペプチドの一部、たとえば長さが約８ないし約１５００アミノ酸、典型的には長さが約８ないし約７４５アミノ酸、好ましくは約８ないし約３００、より好ましくは約８ないし約２００アミノ酸、およびさらにより好ましくは長さが約１０ないし約５０または１００アミノ酸であるアミノ酸配列をいう。「ペプチド」は好ましくはアミノ酸１０個ないし４０個の長さ、好ましくはアミノ酸１０個ないし３５個の、短いアミノ酸配列をいう。
【０１５０】
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発といった標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。挿入を行う場合は、挿入部位の両側に天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域と共に挿入部をコードする合成ＤＮＡ。配列を適当な酵素を用いて切断することができ、および合成ＤＮＡを切断部に繋ぐことができるように、隣接領域は、天然に存在する配列中の部位に対応する便利な制限部位を含む。コードされたタンパク質を作製するために、ＤＮＡをその後に本発明にしたがって発現させる。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について本分野で既知である数々の標準技術の単なる例であり、および他の既知の技術もまた用いることができる。
【０１５１】
ヌクレオチド配列の変異体もまた作製することができる。そのような変異体は好ましくはコドンが最適化された配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡ安定性、および、したがって遺伝子発現を増大させる方法として本分野で既知である。遺伝子コードの冗長性は、いくつかの異なるコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性があることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、およびセリンはそれぞれ、６種類の異なるコドンによってコードされる。異なる生物はその異なるコドンの使用に優先性を示す。たとえば、ＨＩＶといったウイルスは、多数の稀なコドンを用いる。稀なコドンが対応する一般的に用いられる哺乳類コドンで置換されるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳類標的細胞における当該配列の発現増加を達成することができる。哺乳類細胞およびさまざまな他の生物について、コドン用法表は本分野で既知である。
【０１５２】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、追加の配列を除去しないことが好ましい可能性がある。
【０１５３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子または抗原／抗原決定基がヌクレオチド配列を含む場合、それは適切には、哺乳類細胞における発現のためにコドンを最適化されたものでありうる。好ましい一実施形態では、そのような配列は全体が最適化されている。
【０１５４】
核酸およびポリヌクレオチド
一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、ポリヌクレオチド、たとえばＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅといったＮｏｔｃｈリガンドまたはその活性部分をコードするポリヌクレオチドであることができる。適切には、たとえば、そのようなポリヌクレオチドは、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１個のＥＧＦドメイン、好ましくは少なくとも３個のＥＧＦドメインをコードすることができる。適切にはそのポリヌクレオチドはまた、Ｎｏｔｃｈリガンド膜貫通ドメインおよび好ましくはまたＮｏｔｃｈリガンド細胞内ドメインもコードすることができる。
【０１５５】
そのようなポリヌクレオチドは、たとえばＤＮＡワクチン接種などといった従来のＤＮＡデリバリー手法によって投与することができ、または注射することができ、または他の方法でたとえば針を用いない系によって配送することができる。非ウイルスデリバリー機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物（ＣＦＡ）およびその組み合わせを含む。そのようなデリバリー機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。
【０１５６】
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも長さ１０塩基で最大１０，０００塩基以上のヌクレオチドの高分子型で、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾形をいう。その語はＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖型、およびタンパク質核酸（ＰＮＡ）といった誘導体化型も含む。
【０１５７】
これらは標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて構築することができる。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであることができ、および好ましくはＤＮＡである。ＲＮＡである場合は、操作はｃＤＮＡ中間体を用いて実施することができる。一般的に、第一の領域をコードする核酸配列が調製され、適当な制限部位が５’および／または３’末端に与えられる。便利に配列はｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１９を基礎とするプラスミドベクターといった標準の実験ベクター中で操作される（下記参照）。適当な技術の正確な詳細については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他著の『分子クローニング』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（コールド・スプリング・ハーパー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ），１９８９）または同様の標準的参考書を参照することができる。
【０１５８】
第二の領域をコードする核酸は同様に、類似のベクター系において提供することができる。
【０１５９】
核酸の起源は、公表文献または、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータバンクへの参照によって確認することができる。目的の第一または第二の配列をコードする核酸は、起源が材料を提供してくれる場合は学術的起源または商業起源から、または配列データのみが利用可能である場合は適当な配列を合成またはクローニングすることによって、入手することができる。一般的にこれは、問題の遺伝子のクローニングを記載する文献情報源を参照することによって行うことができる。
【０１６０】
代替的に、利用可能な配列データが限られている場合、または、既知の核酸と相同であるか、でなければ関連した核酸を発現したい場合は、本分野で既知である核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として、典型的な核酸を特徴づけることができる。
【０１６１】
数々の異なるヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明に用いられる同一のタンパク質をコードすることができることが当業者に理解される。加えて、当業者は、通常の技術を用いて、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質に影響しないヌクレオチド置換を行って、標的タンパク質または本発明のＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質が発現される任意の特定の宿主生物のコドン用法を反映することができることが理解される。
【０１６２】
一般的に、本発明で用いられるヌクレオチド配列に関する「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」の語は、結果として生じるヌクレオチド配列がＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子をコードし対応する活性を保持するという条件で、当該配列からまたは当該配列への一個（以上）の核酸の、任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。
【０１６３】
上記に示す通り、配列ホモロジーに関して、好ましくは参照配列に対して少なくとも４０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％のホモロジーが存在する。より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％のホモロジーが存在する。ヌクレオチドホモロジー比較は上記の通り実施することができる。好ましい配列比較プログラムは上記のＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムである。初期設定のスコアリングマトリクスは同一のヌクレオチドごとに１０、およびミスマッチごとに−９の一致値を有する。初期設定のギャップ生成失点は−５０であり、初期設定のギャップ延長失点はヌクレオチド当たり−３である。
【０１６４】
本発明はまた、選択的に参照配列、またはその任意の変異体、断片または誘導体、または上記のいずれかの相補鎖とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも長さが１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さが２０、３０、４０または５０ヌクレオチドである。
【０１６５】
ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、「それによって、核酸鎖が相補鎖と塩基対形成を介して結びつく過程」およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施される増幅の過程を含むものとする。
【０１６６】
ここに示すヌクレオチド配列と、またはその相補鎖と、選択的にハイブリダイズすることができる、本発明で有用であるヌクレオチド配列は、一般的に、ここに示す対応するヌクレオチド配列と、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、たとえば少なくとも４０、６０または１００以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５または９０％、およびより好ましくは少なくとも９５％または９８％相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列と好ましくは少なくとも８０または９０％およびより好ましくは少なくとも９５％相同である、そのヌクレオチド配列と相同な領域を含む。
【０１６７】
「選択的にハイブリダイズ可能な」の語は、プローブとして用いられるヌクレオチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブとハイブリダイズすることが見出されている条件下で用いられることを意味する。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、たとえば、スクリーニングされているｃＤＮＡライブラリまたはゲノムＤＮＡライブラリ中に存在する他のヌクレオチド配列のために起こりうる。この現象において、バックグラウンドとは、プローブとライブラリの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生じる、標的ＤＮＡとで観察される特異的相互作用よりも強度が１０倍小さい、好ましくは１００倍小さいシグナルのレベルを意味する。相互作用の強度は、たとえば32Ｐを用いてプローブをたとえば放射性標識することによって測定することができる。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション条件は、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）（１９８７，『分子クローニング技術の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １５２，アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に示された通り、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、下記に説明する「厳密性(ストリンジェンシー)」を与える。
【０１６９】
最大の厳密性は典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じる；高い厳密性はＴｍの約５℃ないし１０℃下で；中等度の厳密性はＴｍの約１０℃ないし２０℃下で；および低い厳密性はＴｍの約２０℃ないし２５℃下で生じる。当業者によって理解される通り、最大厳密性のハイブリダイゼーションを用いて同一のヌクレオチド配列を同定または検出することができる一方、中等度（または低）厳密性ハイブリダイゼーションを用いて類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０１７０】
好ましい一態様では、本発明は、厳密条件下で（たとえば６５℃および０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ3、ｐＨ７．０）本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合は、二重鎖の両方の鎖が、個別にまたは組み合わせで、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列もまた本発明の範囲内に含まれることが理解される。
【０１７１】
ヌクレオチド配列はいくつかの方法で得ることができる。ここに記載された配列の変異体は、たとえばある範囲の起源から作製されたＤＮＡライブラリをプロービングすることによって得ることができる。加えて、他のウイルス／細菌または細胞ホモログ、特に哺乳類細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、および霊長類細胞）で見出される細胞ホモログを得ることができ、およびそのようなホモログおよびその断片は一般的に、ここで配列一覧中に示された配列と選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリまたはそれから作製されたｃＤＮＡライブラリをプロービングし、およびそのようなライブラリを、参照ヌクレオチド配列の全部または一部を含むプローブを用いて、中等度ないし高厳密性の条件下でプロービングすることによって得ることができる。同様の検討が、本発明で有用なアミノ酸および／またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。
【０１７２】
変異体および系統／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存された配列は、たとえば、いくつかの変異体／ホモログに由来するアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。配列の整列は、本分野で既知であるコンピューターソフトウェアを用いて実施することができる。たとえばＧＣＧウィスコンシン・パイルアップ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐ）プログラムは広く用いられている。縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つ以上の縮重部位を含み、および既知の配列に対する単一の配列プライマーを使用する配列クローニングに用いられるよりも低い厳密性条件で用いられる。
【０１７３】
代替的に、そのようなヌクレオチド配列は、特徴づけられた配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえば、ヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞についてコドン優先性を最適化するため、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされるＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の活性を変化させるため、他の配列変化が望まれる可能性がある。
【０１７４】
本発明で有用であるＤＮＡポリヌクレオチドといったヌクレオチド配列は、組み換えによって、合成によって、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。配列はまた標準的技術によってクローニングすることができる。一般的に、プライマーは、目的の核酸配列の、一度にヌクレオチド一個の段階的製法を含む合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は本分野で容易に利用可能である。
【０１７５】
より長いヌクレオチド配列は、一般的に組み換え手段を用いて、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて作製される。これは、クローニングを望む標的配列の領域に隣接する一対のプライマー（たとえば約１５ないし３０ヌクレオチドの）を作製し、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、目的領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、増幅された断片を単離し（たとえばアガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）、および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターへクローニングすることができるように、プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。より大きな遺伝子については、この方法で一部を別々にクローニングし、その後に繋いで完全な配列を形成することができる。
【０１７６】
タンパク質およびポリペプチド発現
組み換え産生のためには、宿主細胞を遺伝子操作して発現系または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はデービス（Ｄａｖｉｓ）他およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他といった多数の標準的な実験手引書に記載された通りの、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染といった方法によって実施することができる。そのような方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで薬物送達系として使用することもできることが理解される。
【０１７７】
適当な宿主の代表的な例は、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレ
プトミセス、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞といった細菌細
胞；酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞といった真菌細胞；
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
）Ｓｆ９細胞といった昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３
、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞といった動物細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞
といったＴ細胞株；Ａ２０細胞といったＢ細胞株；および植物細胞を含む。
【０１７８】
本発明で有用なポリペプチドを産生するためには、幅広い発現系を用いることができる
。そのようなベクターは、中でも、染色体由来、エピソーム由来、およびウイルス由来ベ
クター、たとえば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来
、酵母エピソーム由来、挿入配列由来、酵母染色体配列由来、バキュロウイルス、ＳＶ４
０といったパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、オー
エスキー病ウイルスおよびレトロウイルスといったウイルス由来のベクター、およびコス
ミドおよびファージミドといったプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子に由来す
るもののようなその組み合わせに由来するベクターを含む。発現系構造は、発現を調節す
ると共に引き起こす調節領域を含むことができる。一般的に、ポリヌクレオチドを維持、
増殖、または発現するためにおよび／または宿主においてポリペプチドを発現するために
適当な任意の系またはベクターを、この際に発現のために用いることができる。適当なＤ
ＮＡ配列は、たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他に示されたもののような幅
広い既知で通常の技術のうち任意のものによって発現系に挿入することができる。
【０１７９】
翻訳されたタンパク質の、小胞体内腔へ、細胞膜周辺腔へ、または細胞外環境への分泌
のために、適当な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。これらのシ
グナルは、ポリペプチドに対して内因性であることができ、または異種シグナルであるこ
とができる。
【０１８０】
本発明における使用のための活性物質は、組み換え細胞培養から、硫安またはエタノー
ル沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ
ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含
むよく知られた方法によって回収および精製することができる。非常に好ましくは、高速
液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチドが単離および／または精製の
間に変性する場合は、タンパク質再折りたたみのための技術を用いて活性立体構造を再生
することができる。
【０１８１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
Ｎｏｔｃｈは最初にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で、２つの異なるリガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅに対する受容体として機能する膜貫通タンパク質として記載された。脊椎動物は複数のＮｏｔｃｈ受容体およびリガンドを発現する（下記で論述）。少なくとも４種類のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、およびＮｏｔｃｈ−４）が現在までにヒト細胞で同定されている（たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３０８６０２、ＡＦ３０８６０１およびＵ９５２９９−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を参照）。
【０１８２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は胚における細胞運命二択決定を導く。Ｎｏｔｃｈは最初にショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で、２つの異なるリガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅに対する受容体として機能する膜貫通タンパク質として記載された。脊椎動物は複数のＮｏｔｃｈ受容体およびリガンドを発現する（下記で論述）。
【０１８３】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は単一のポリペプチド前駆体として合成され、フリン様転換酵素による切断を受けて２つのポリペプチド鎖を生じ、それがさらにプロセシングされて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体は２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解産物のヘテロ二量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部から成るＮ末端断片、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化する、Ｎｏｔｃｈのタンパク質分解による切断段階は、ゴルジ装置で起こり、およびフリン様転換酵素によって媒介される。
【０１８４】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、最大３６個の上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復［Ｎｏｔｃｈ１／２＝３６、Ｎｏｔｃｈ３＝３４、およびＮｏｔｃｈ４＝２９］、３個のシステインリッチ反復（Ｌｉｎ−Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）反復）を含む細胞外ドメイン、および細胞質ドメインを含む１個の膜貫通サブユニットを含むヘテロ二量体分子として膜に挿入されている。Ｎｏｔｃｈの細胞質ドメインは６個のアンキリン様反復、１個のポリグルタミン鎖（ＯＰＡ）および１個のＰＥＳＴ配列を含む。ＲＡＭ２３という別の１個のドメインがアンキリン反復の近位側に存在し、および、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではＨａｉｒｌｅｓｓ抑制因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ）［Ｓｕ（Ｈ）］、脊椎動物ではＣＢＦ１として知られる転写因子との結合に関与している（タムラ（Ｔａｍｕｒａ）Ｋ，他 （１９９５） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５；１４１６−１４２３ （ＴＡＭＵＲＡ））。Ｎｏｔｃｈリガンドはまた、複数のＥＧＦ様反復を細胞外ドメイン中に、すべてのＮｏｔｃｈリガンドに特徴的であるシステインに富むＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ Ｌａｇ２）ドメインと共に示す（アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：２２５−２３２、アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：７７０−７７６）。
【０１８５】
Ｎｏｔｃｈ 受容体は、Ｄｅｌｔａ、ＳｅｒｒａｔｅおよびＳｃａｂｒｏｕｓといった細胞外リガンドの、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインのＥＧＦ様反復との結合によって活性化される。Ｄｅｌｔａは活性化のために切断を必要とする。ＤｅｌｔａはＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼであるクズバニアン（Ｋｕｚｂａｎｉａｎ）によって細胞表面で切断され、その切断現象はＤｅｌｔａの可溶性の活性型を放出する。ヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発がん性変異体、別名ＴＡＮ−１は、短縮された細胞外ドメインを持つが、構成的に活性でありおよびＴ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
【０１８６】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を媒介する。非常に顕著なことに、ｃｄｃ１０／アンキリン反復は、Ｈａｉｒｌｅｓｓ抑制因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ）［Ｓｕ（Ｈ）］と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｂ細胞のエプスタイン・バーウイルス誘導性不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質であるＣ−プロモーター結合因子−１［ＣＢＦ−１］のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログである。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）はｃｄｃ１０／アンキリン反復と細胞質中で結合し、隣接する細胞上のリガンドであるＤｅｌｔａとのＮｏｔｃｈ受容体の相互作用の際に、核へ移動することが示されている。Ｓｕ（Ｈ）はいくつかの遺伝子のプロモーター中に見出される応答配列を含み、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路において重要な下流タンパク質であることが見出されている。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Ｈａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている。
【０１８７】
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）はまた、直接の核機能を有する（リーバー（Ｌｉｅｂｅｒ）他（１９９３）Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ ７（１０）：１９４９−６５（Ｌｉｅｂｅｒ））。近年の研究は実際に、Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６個のｃｄｃ１０／アンキリン反復が核に到達し転写活性化に参加することを必要とすることを示している。Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部のタンパク質分解切断部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間と同定されている（部位３、またはＳ３という）（シュレーター（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ），Ｅ．Ｈ．他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８３）：３８２−６（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ））。核への進入のためにｃｄｃ１０／アンキリン反復を放出するタンパク質分解切断段階は、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）活性に依存すると考えられている。
【０１８８】
細胞内ドメインは核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリータンパク質であるＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではＨａｉｒｌｅｓｓ抑制因子（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ），Ｓｕ（Ｈ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ではＬａｇ−２）と転写活性化因子複合体を形成することが示されている（シュレーター（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）；シュトルール（Ｓｔｒｕｈｌ），Ｇ．他 （１９９８） Ｃｅｌｌ ９３（４）；６４９−６０ （Ｓｔｒｕｈｌ））。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体はその後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｋｅ）１および５といった標的遺伝子を活性化する（ワインマスター（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）Ｇ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０：３６３−３６９（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）） 。このＮｏｔｃｈの核機能はまた、哺乳類Ｎｏｔｃｈホモログについても示されている（ルー（Ｌｕ），Ｆ．Ｍ．他（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３（１１）；５６６３−７ （Ｌｕ））。
【０１８９】
Ｓ３プロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に反応してのみ生じる。初期のＮｏｔｃｈ受容体のゴルジにおける翻訳後修飾（ムンロー（Ｍｕｎｒｏ）Ｓ，フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）Ｍ．（２０００） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０；８１３−８２０ （Ｍｕｎｒｏ）；ユー（Ｊｕ）ＢＪ，他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０５；１９１−１９５ （Ｊｕ））は、少なくとも部分的に、２種類のリガンドのどちらが細胞表面上に発現されるかを調節するように見える。Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｌｉｎ／Ｎｏｔｃｈモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ（Ｆｒｉｎｇｅ）によって細胞外ドメインで修飾される。フリンジは、Ｏ−結合型フコース基をＥＧＦ様反復に付加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ＤＪ，他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６：３６９−３７５ （Ｍｏｌｏｎｅｙ）、ブルッカー（Ｂｒｕｃｋｅｒ）Ｋ，他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６：４１１−４１５ （Ｂｒｕｃｋｅｒ））。フリンジによるこの修飾はリガンド結合を妨げないが、しかしリガンドに誘導されるＮｏｔｃｈにおける立体構造変化に影響しうる。さらに、近年の研究は、フリンジの作用はＮｏｔｃｈを修飾してＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドと機能性に相互作用することを妨げるが、しかし優先的にＤｅｌｔａと結合することを可能にすることを示唆する（パニン（Ｐａｎｉｎ）ＶＭ，他 （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７；９０８−９１２ （Ｐａｎｉｎ）、ヒックス（Ｈｉｃｋｓ）Ｃ，他 （２０００） Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２；５１５−５２０ （Ｈｉｃｋｓ））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は単一のフリンジ遺伝子を持つが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Ｒａｄｉｃａｌ，ＭａｎｉｃおよびＬｕｎａｔｉｃ Ｆｒｉｎｇｅｓ）（アーヴィン（Ｉｒｖｉｎｅ）ＫＤ （１９９９） Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．９；４３４−４４１ （Ｉｒｖｉｎｅ））。
【０１９０】
Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル伝達は、２つの異なる経路を介して起こりうる（たとえば図１を参照）。よりよく定義された経路は、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）のタンパク質分解切断を含み、ＮｏｔｃｈＩＣは核へ移動して、ＣＳＬファミリータンパク質のＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ，Ｓｕ（Ｈ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ではＬａｇ−２）と転写活性化因子複合体を形成する。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体はその後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｋｅ）１および５といった標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈはまた、亜鉛フィンガーを含む細胞質タンパク質Ｄｅｌｔｅｘが関与するＣＢＦ１−非依存的な方法でシグナル伝達することができる。ＣＢＦ１とは異なり、ＤｅｌｔｅｘはＮｏｔｃｈ活性化後に核へ移動しないが、代わりにＧｒｂ２と相互作用しおよびＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節することができる。
【０１９１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子は、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓファミリーの遺伝子（特にＨｅｓ−１）、分割増強剤（Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ）［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４およびＤｌｌ−１を含む。
【０１９２】
Ｄｅｌｔｅｘは、細胞内ドッキングタンパク質であり、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部との相互作用部位から離れる際にＳｕ（Ｈ）と置き換わる。Ｄｅｌｔｅｘは亜鉛フィンガーを含む細胞質タンパク質である（アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：２２５−２３２；アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：７７０−７７６；オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）Ｂ，ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）Ｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１；６５３−６６３ （Ｏｓｂｏｒｎｅ））。ＤｅｌｔｅｘはＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアンキリン反復と相互作用する。ＤｅｌｔｅｘはＧｒｂ２と相互作用しおよびＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節することにより、Ｎｏｔｃｈ経路活性化を促進することを研究が示している（マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）他（１９９５）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１（８）：２６３３−４４；マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）Ｋ，他（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：７４−７８）。Ｄｅｌｔｅｘはまた、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部と結合することを妨げるドッキングタンパク質として作用する（マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ））。このように、Ｓｕ（Ｈ）は核内へ放出され、そこで転写調節因子として作用する。近年の証拠はまた、脊椎動物Ｂ細胞系において、Ｓｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１でなくＤｅｌｔｅｘが、Ｅ４７機能の阻害を担っていることを示唆する（オルデントリッヒ（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ）他（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：２２３０−２２３９ （Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ））。Ｄｅｌｔｅｘの発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として、正のフィードバックループによってアップレギュレートされる。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｄｅｌｔｅｘ（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５３７００に見出される。
【０１９３】
Ｈｅｓ−１（Ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ−１）（タケバヤシ（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ Ｋ．）他（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（７）：１５０−６ （Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ）） は、へリックス−ループ−へリックスの基本構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１はＣＤ４サイレンサー中の重要な機能部位と結合し、ＣＤ４遺伝子発現の抑制に結びつく。このように、Ｈｅｓ−１はＴ細胞運命の決定に強力に関与している。Ｈｅｓファミリーからの他の遺伝子は、Ｎｏｔｃｈ活性化によってもまた発現がアップレギュレートされるＨｅｓ−５（Ｓｐｌｉｔホモログの哺乳類エンハンサー）、およびＨｅｓ−３を含む。Ｈｅｓ−１の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｈｅｓ−１の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１６４６４に見出される。
【０１９４】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（ライマイスター（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ）Ｃ．他（１９９９）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ８５（１−２）：１７３−７ （Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ））は７個の遺伝子を含み、そのうちＥ（ｓｐｌ）およびＧｒｏｕｃｈｏだけが、突然変異体の場合に目に見える表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）はＳｐｌｉｔ突然変異を促進する能力に因んで命名され、ＳｐｌｉｔはＮｏｔｃｈの別名である。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子はａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体遺伝子発現の調節を介してＤｅｌｔａを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。
【０１９５】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン産生を抑制することができる、Ｔｈ２細胞によって産生される因子としてマウスで最初に特徴づけられた。その後、ＩＬ−１０はマクロファージ、ケラチノサイト、Ｂ細胞、Ｔｈ０細胞、およびＴｈ１細胞を含む多数の他の細胞型によって産生されることが示された。ＩＬ−１０は、現在はウイルスＩＬ−１０と表されるエプスタイン−バーｂｃｒｆ１遺伝子と、大きなホモロジーを示す。いくつかの免疫刺激効果が報告されているが、ＩＬ−１０は主に免疫抑制性サイトカインと考えられている。Ｔ細胞応答のＩＬ−１０による阻害は、抗原提示細胞の付帯機能の低下を通じて主に媒介される。ＩＬ−１０は特に、マクロファージによる数々の炎症促進性サイトカインの産生を抑制すること、および共刺激分子およびＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害することが報告されている。ＩＬ−１０はまた、好中球および好酸球といった他の骨髄細胞に対して抗炎症作用を発揮する。Ｂ細胞に対しては、ＩＬ−１０はアイソタイプ転換および増殖に影響する。より近年に、ＩＬ−１０は調節Ｔ細胞の誘導において、およびその抑制作用の可能な媒介因子として、役割を果たすことが報告された。ＩＬ−１０がＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の直接の下流の標的かどうかは不明であるが、その発現はＮｏｔｃｈ活性化と一致して強くアップレギュレートされることが見出されている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ整理番号ＧＩ１０４１８１２に見出される。
【０１９６】
ＣＤ−２３は、Ｂ細胞活性化および増殖のための重要な分子であるヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）である。ＣＤ−２３はＩｇＥに対する低親和性受容体である。さらに、短縮型分子を分泌することができ、その後、強力な細胞分裂誘起性増殖因子として機能する。ＣＤ−２３の配列はＧｅｎＢａｎｋ整理番号ＧＩ１７８３３４４に見出される。
【０１９７】
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球活性化タンパク質４）は、Ｔ細胞の表面上に見出される付属分子であり、気道炎症細胞動員の調節およびアレルゲン吸入後のＴヘルパー細胞分化に役割を果たすと考えられている。ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子のプロモーター領域はＣＢＦ１応答配列を有し、その発現はＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ４の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１５００６に見出される。
【０１９８】
Ｄｌｘ−１（ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ−１）（ マクギネス（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ）Ｔ．他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５（３）：４７３−８５ （ＭｃＧｕｉｎｅｓｓ）） 発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１０００〜３に見出される。
【０１９９】
ＣＤ−４発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。ＣＤ−４抗原の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ００６９６６に見出される。
【０２００】
上記の通り、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーは、Ｔ細胞運命決定に影響する細胞−細胞シグナル伝達現象に関与する。このシグナル伝達において、ＮｏｔｃｈＩＣは核に局在化し、および活性化された受容体として機能する。哺乳類ＮｏｔｃｈＩＣは転写抑制因子ＣＢＦ１と相互作用する。ＮｏｔｃｈＩＣ ｃｄｃ１０／アンキリン反復はこの相互作用に必須であると提案されている。シェ（Ｈｓｉｅｈ）他（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６（３）：９５２−９５９）は、マウスＮｏｔｃｈＩＣのＮ末端１１４アミノ酸領域はＣＢＦ１相互作用ドメインを含むとさらに示している。また、ＮｏｔｃｈＩＣは核内のＤＮＡに結合したＣＢＦ１を標的にし、および抑制ドメインの遮蔽によりＣＢＦ１媒介抑制を止めることによって作用すると提案されている。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）不死化タンパク質ＥＢＮＡもまた、ＣＢＦ１拘束および抑制の遮蔽を利用して、ＣＢＦ１に抑制されたＢ細胞遺伝子の発現をアップレギュレートすることが知られている。このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の模倣が、ＥＢＶに導かれる不死化に関与する。ストローブル（Ｓｔｒｏｂｌ）他（Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４（４）：１７２７−３５）は、同様に「ＥＢＮＡ２はしたがって、活性化されたＮｏｔｃｈ受容体の機能的同等物とみなしうる」ことを報告する。このカテゴリに入る他のＥＢＶタンパク質は、ＢＡＲＦ０（クサノ（Ｋｕｓａｎｏ）およびラーブ・トルアブ（Ｒａａｂ−Ｔｒｕａｂ）（２００１） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５（１）：３８４−３９５ （Ｋｕｓａｎｏ ａｎｄ Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ））およびＬＭＰ２Ａを含む。
【０２０１】
Ｎｕｍｂ、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、およびＤｓｈといったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する他の遺伝子、およびＮｏｔｃｈ活性化によって発現が調節されるすべての遺伝子は、本発明の範囲に含まれる。
【０２０２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのポリペプチドおよびポリヌクレオチド
好ましい一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のための物質、好ましくはＮｏｔｃｈリガンドまたはその断片、変異体、誘導体、ホモログまたはミメティックとなる。
【０２０３】
現在までに同定された哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの例は、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））およびＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｓｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１およびＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７３４号パンフレット）、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＬＡＧ−２を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
【０２０４】
既知の哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの別のホモログは、標準的手法を用いて同定することができる。「ホモログ」によって、たとえば上述のような既知のＮｏｔｃｈリガンドのうち任意の１つと、アミノ酸または核酸配列ホモロジーのどちらかである配列ホモロジーを示す遺伝子産物を意味する。典型的には、既知のＮｏｔｃｈリガンドのホモログは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、適切には少なくとも１００個のアミノ酸の配列にわたって、またはＮｏｔｃｈリガンドの全長にわたって、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、対応する既知のＮｏｔｃｈリガンドとアミノ酸レベルで同一である。２つ以上のアミノ酸または核酸配列の間の配列ホモロジーを計算するための技術およびソフトウェアは本分野でよく知られている（たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖおよびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、『分子生物学の最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９５）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を参照）。
【０２０５】
上記の通り、現在までに同定されたＮｏｔｃｈリガンドは、タンパク質のアミノ末端に２０ないし２２アミノ酸を含む診断的なＤＳＬドメインを（Ｄ＝Ｄｅｌｔａ、Ｓ＝Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌ＝Ｌａｇ２）、および細胞外表面上に１４まで、またはそれ以上のＥＧＦ様反復を有する。したがって、Ｎｏｔｃｈリガンドのホモログはまた、Ｎ末端にＤＳＬドメインを、および細胞外表面上に１４まで、またはそれ以上のＥＧＦ様反復を含むことが好ましい。
【０２０６】
加えて、適当なホモログは好ましくはＮｏｔｃｈ受容体と結合する能力がある。結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合測定法を含む、本分野で既知であるさまざまな技術によって評価することができ、また受容体の活性化（作用因子または部分作用因子の場合）は、たとえば、本文書の実施例および、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット（ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ））に記載された通りの測定法の使用によって測定することができる。
【０２０７】
Ｎｏｔｃｈリガンドのホモログは、いくつかの方法によって、たとえばゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリを、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする核酸のすべてまたは一部を含むプローブを用いて、中等度ないし高厳密性条件下で（たとえば０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃ないし約６０℃にて）プロービングすることによって同定することができる。代替的に、ホモログはまた、保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログの中の配列を標的とするように設計されたプライマーを一般的に使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。そのプライマーは１つ以上の縮重位置を含み、および既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いた配列クローニングに使用されるよりも低い厳密条件下で用いられる。
【０２０８】
ポリペプチド物質は、哺乳類細胞から精製するか、適当な宿主細胞における組み換え発現によって得るか、または購入することができる。代替的に、当該ポリペプチドをコードする核酸構造を用いることができる。別の一例として、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅといったＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンドの過剰発現は、ＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａ遺伝子といった内因性遺伝子を活性化することができる核酸構造の導入によって引き起こすことができる。特に、遺伝子活性化は、標的細胞のゲノム中のＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａプロモーターといった天然プロモーターの代わりに異種プロモーターを挿入する、相同組み換えの利用によって達成することができる。
【０２０９】
本発明の活性化分子は、別の一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ−タンパク質発現または細胞膜上の提示またはシグナル伝達経路を修飾することができる可能性がある。標的細胞表面上の完全に機能するＮｏｔｃｈ−タンパク質の提示を促進する物質は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＫｕｚｂａｎｉａｎ遺伝子の産物といったマトリクスメタロプロテイナーゼ（ドクツ（Ｄｋｕｚ）他（１９９７）Ｃｅｌｌ ９０：２７１−２８０ （Ｄｋｕｚ））および他のＡＤＡＭＡＬＹＳＩＮ遺伝子ファミリーメンバーを含む。
【０２１０】
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
上記で論述した通り、Ｎｏｔｃｈリガンドは典型的にはいくつかの特徴的なドメインを含む。さまざまな天然に存在するヒトＮｏｔｃｈリガンドについての一部の予想／候補ドメイン位置（前駆タンパク質中のアミノ酸番号付けに基づく）を下記に示す：
【表１】
2006513153.tif 000007
【表２】
2006513153.tif 000008
【表３】
2006513153.tif 000009
【表４】
2006513153.tif 000010
【表５】
2006513153.tif 000011
【０２１１】
ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる：
2006513153.tif 000012
【０２１２】
好ましくはＤＳＬドメインは下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる：
2006513153.tif 000013
ここで：
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはヒスチジンといった芳香族アミノ酸残基である；
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンといった非極性アミノ酸残基である；
ＢＡＳは、アルギニンまたはリジンといった塩基性アミノ酸残基である；および
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンといった酸またはアミドアミノ酸残基である。
【０２１３】
好ましくはＤＳＬドメインは下記の共通アミノ酸配列の大部分または全部を含みうる：
2006513153.tif 000014
（ここでＸａａは任意のアミノ酸であることができ、およびＡｓｘはアスパラギン酸またはアスパラギンのどちらかである）。
【０２１４】
さまざまな起源に由来するＮｏｔｃｈリガンドからのＤＳＬドメインの整列を図３に示す。
【０２１５】
使用するＤＳＬドメインは、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０２１６】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２１７】
代替的に、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２１８】
代替的に、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２１９】
代替的に、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２０】
代替的に、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２１】
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含む、さまざまなタンパク質、およびＥＧＦおよびＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドで見つかっている（フュリーおよびフュリー（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ），１９８８，Ｃｅｌｌ ５３；５０５−５１８）。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸといった細胞外タンパク質で（リーズ（Ｒｅｅｓ）他，１９８８，ＥＭＢＯ Ｊ．７；２０５３−２０６１；フュリーおよびフュリー（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ），１９８８，Ｃｅｌｌ ５３：５０５−５１８）、他のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子で（クヌースト（Ｋｎｕｓｔ）他，１９８７ ＥＭＢＯ Ｊ．７６１−７６６；ロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）他，１９８８，Ｃｅｌｌ ５５：１０４７−１０５９）、およびトロンボモジュリン（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）他，１９８７，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８９１−１８９７）およびＬＤＬ受容体（ズドホフ（Ｓｕｄｈｏｆ）他，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：８１５−８２２）といった一部の細胞表面受容体タンパク質で見つかっている。タンパク質結合部位が、トロンボモジュリンおよびウロキナーゼ中のＥＧＦ反復ドメインにマッピングされている（クロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）他，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３：５９９３−５９９６；アペラ（Ａｐｐｅｌｌａ）他，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４３７−４４４０）。
【０２２２】
ＰＲＯＳＩＴＥによって報告された通り、典型的なＥＧＦドメインは、（ＥＧＦにおいて）ジスルフィド結合に関与すると示されている６個のシステイン残基を含みうる。主構造は、二本鎖のβ−シートに続くループとその後のＣ末端の短い二本鎖のシートであると提案されているが必ずしも必要ではない。保存されたシステインの間のサブドメインは、典型的なＥＧＦ様ドメインの下記の略図に示す通り、長さが大きく異なる：
【化４】
2006513153.tif 000015
ここで：
‘Ｃ’：ジスルフィド結合に関与する保存されたシステイン。
‘Ｇ’：しばしば保存されたグリシン
‘ａ’：しばしば保存された芳香族アミノ酸
‘ｘ’：任意の残基
５番目と６番目のシステインの間の領域は、２個の保存されたグリシンを含み、そのうち少なくとも１個は大部分のＥＧＦ様ドメイン中に通常存在する。
【０２２３】
使用するＥＧＦ様ドメインは、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはＥＧＦ様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０２２４】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２５】
代替的に、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２６】
代替的に、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２７】
代替的に、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２８】
代替的に、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２２９】
実際問題として、任意の特定のアミノ酸配列が別の配列と少なくともＸ％同一であるかどうかは、従来は既知のコンピュータープログラムを用いて決定することができる。たとえば、クエリー配列と対象配列との間の最良の全体の一致は、全体配列整列ともいうが、たとえば、ブルトラグ（Ｂｒｕｔｌａｇ）他（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムといったプログラム、またはここに記載の他のアルゴリズムを用いて決定することができる。配列整列では、クエリー配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは、両方ともアミノ酸配列である。全体配列整列の結果は、パーセント同一性として与えることができる。
【０２３０】
「ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン」の語は、Ｎｏｔｃｈリガンド配列の、Ｎ末端からＤＳＬドメインの開始までの部分を意味する。この語は天然に存在するドメインに対応する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、およびミメティックを含むことが理解される。
【０２３１】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２３２】
代替的に、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２３３】
代替的に、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２３４】
代替的に、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２３５】
代替的に、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０２３６】
ここで用いられる「異種アミノ酸配列」または「異種ヌクレオチド配列」の語は、天然の配列には見出されない配列（たとえばＮｏｔｃｈリガンド配列の場合には、天然のＮｏｔｃｈリガンド配列には見出されない）またはそのコード配列には見出されない配列を意味する。典型的には、たとえば、そのような配列は、ＩｇＦｃドメイン、またはＶ５Ｈｉｓタグといったタグでありうる。
【０２３７】
測定法
ある物質を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を調節するためにまたはＮｏｔｃｈ受容体を活性化するために用いることができるかどうかは、たとえば、国際公開第０３／０１２４４１号パンフレットとして公開された我々の同時出願中の国際出願に記載されたような、ここで実施例に記載されたような、またはバーナム−フィニー（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ）他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３，４３１３−４３１８ （２０００）に記載されたような、適切なスクリーニング測定法を用いて決定することができる。
【０２３８】
加えて、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、タンパク質測定法によって、または核酸測定法によって監視することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解切断、および細胞核へのその移動に繋がる。ここでいう「検出可能なシグナル」は、Ｎｏｔｃｈの切断された細胞内ドメインの存在に帰することができる任意の検出可能な徴候であることができる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、切断されたＮｏｔｃｈドメインの細胞内濃度を測定することによって、タンパク質レベルで評価することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化はまた、一連の下流の反応を触媒し、ある種の明確な遺伝子の発現のレベルの変化に繋がる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、たとえば特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することによって、核酸レベルで評価することができる。本発明の好ましい一実施形態では、測定法はタンパク質測定法である。本発明の別の好ましい一実施形態では、測定法は核酸測定法である。
【０２３９】
核酸測定法を用いることの利点は、核酸測定法は高感度であり少量の試料を分析することができることである。
【０２４０】
任意の時間に測定された、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、対応する遺伝子のその時点での発現レベルを反映する。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、免疫系のＴ細胞の間接的測定によって測定することができる。特に、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１および／またはＩＬ−１０ ｍＲＮＡのレベルの上昇はたとえば誘導された免疫反応不顕性を示しうる一方、Ｄｌｌ−１またはＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのレベルまたはＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３といったサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルの上昇は反応性の改善を示しうる。
【０２４１】
さまざまな核酸測定法が既知である。既知であるかまたは後に開示される任意の従来の技術を用いることができる。適当な核酸測定法の例は下記に示され、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ブロッティング、分光分析、レポーター遺伝子測定法、遺伝子チップアレイおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
【０２４２】
特に、遺伝子の存在、増幅および／または発現は、試料中で直接に、たとえば、従来のｍＲＮＡの転写を定量するサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、適当に標識化されたプローブを用いて測定することができる。当業者は必要に応じて、これらの方法をどのように改変しうるかを容易に考えることができる。
【０２４３】
ＰＣＲは最初は、不純な試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。その技術は、反応溶液を繰り返し加熱および冷却してプライマーを標的配列とアニーリングさせる温度サイクル、および複製娘鎖の形成のためのそれらのプライマーの伸長に基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いた最初のｃＤＮＡ鎖の生成に、ＲＮＡテンプレートを用いる。ｃＤＮＡはその後、標準のＰＣＲ手順に従って増幅する。合成および変性の繰り返しサイクルの結果として、生じる標的ＤＮＡのコピー数の指数的増加が起こる。しかし、反応成分が限られてくるにつれ、増幅の速度は低下して停滞状態に達し、その後はＰＣＲ産物の正味の増加はほとんどまたは全く無い。核酸標的の開始コピー数が多いほど、この「終点（エンドポイント）」に到達するのは早い。
【０２４４】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグまたは蛍光色素で標識化されたプローブを用い、一定数のサイクル後の産物蓄積の測定のためでなく、蓄積していくＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量測定のためのエンドポイントＰＣＲとは異なる。反応は、標的配列の増幅が蛍光の有意な増加によって最初に検出される際のサイクル反応中の時点によって特徴づけられる。
【０２４５】
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮａｓｅ保護）測定法は、溶液中の特定のＲＮＡの定量のための極めて高感度な技術である。リボヌクレアーゼ保護測定法は、標的として細胞ＲＮＡ全体またはポリ（Ａ）選択されたｍＲＮＡについて実施することができる。リボヌクレアーゼ保護測定法の感度は、高い比活性で放射性標識された相補ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物プローブの使用に由来する。プローブおよび標的ＲＮＡは溶液中でハイブリダイズされ、その後、混合物は希釈されてリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理され、残っている一本鎖ＲＮＡすべてが分解される。プローブのハイブリダイズした部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動とその後のオートラジオグラフィーによって可視化することができる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるため、リボヌクレアーゼ保護測定法を用いてｍＲＮＡ特性を正確にマッピングすることができる。プローブが標的ＲＮＡに関して過剰なモル数でハイブリダイズされるならば、結果として生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。
【０２４６】
遺伝子発現はまた、レポーター系を用いて検出することができる。そのようなレポーター系は、たとえば監視される遺伝子の発現系の調節下にある、容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出および選別が可能である蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰおよびルシフェラーゼである。別の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカー、すなわち細胞表面上に発現されしたがって容易に同定可能であるタンパク質である。
【０２４７】
一般的に、レポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナル伝達を検出するために有用なレポーター構造は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（１９８９）の一般的教示に従って構築することができる。典型的には、本発明に記載の構造は、目的の遺伝子によるプロモーター、およびたとえばＧＦＰまたはルシフェラーゼのような目的のレポーター構造をコードするコード配列を含む。ＧＦＰおよびルシフェラーゼをコードするベクターは本分野で既知でありおよび市販されている。
【０２４８】
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上記に例示された通り、本分野で既知である任意の技術によって実施することができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによって選別することができる。全般的参考には、『フローサイトメトリーおよびセルソーティング：実験の手引き』（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９９２）Ａ．ラドブルーフ（Ｒａｄｂｒｕｃｈ）（編）、スプリンガー・ラボラトリー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、を参照。
【０２４９】
フローサイトメトリーは、細胞を研究および精製するための強力な方法である。フローサイトメトリーは特に免疫学および細胞生物学で幅広い用途を見出している：しかし、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多数の分野で応用することができる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（蛍光活性化細胞選別）を表し、および「フローサイトメトリー」と相互に交換可能に用いられる。ＦＡＣＳの原理は、液体の細流中にある個々の細胞に一種類以上のレーザー光線を通過させると、光の散乱が起こり蛍光色素がさまざまな周波数で光を放出することである。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気シグナルに変換し、電気シグナルはソフトウェアで処理されて、当該細胞についてのデータを生成する。明確な特徴を持つ細胞の部分集団を特定し、および懸濁液から非常に高純度で（~１００％）自動的に選別することができる。
【０２５０】
ＦＡＣＳを用いて、ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡをトランスフェクションした細胞における遺伝子発現を測定することができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接的に、または、当該構造中のレポーター遺伝子を用いることによって間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例はβ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼ活性はＦＡＣＳによって、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）といった蛍光基質を用いて検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、および酵素によって切断されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕捉される。１つの酵素がしたがって大量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰ構造を発現している細胞は基質の添加無しで蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが同一のチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの突然変異体が入手可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置では、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、およびしたがって２種類のトランスフェクションを同時に測定することができる。
【０２５１】
細胞選別の別の方法もまた使用することができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現している細胞を個別に同定することができ、そのため細胞をその後に手作業でまたはＦＡＣＳ選別を用いて選別することができる。ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブは、上記に示す教示に従って、前出のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（１９８９）によって記載された一般的手順を用いて調製することができる。
【０２５２】
好ましい一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な、ＦＡＣＳ細胞選別に使用することができる蛍光団と結合した、アンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０２５３】
遺伝子発現および同一性についての情報を、いわゆる遺伝子チップアレイまたは高密度ＤＮＡアレイを用いて得るための方法もまた記載されている（チー（Ｃｈｅｅ）） 。これらの高密度アレイは、診断および予測診断目的に特に有用である。Ｉｎ Ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）もまた利用することができる（カミリ（Ｃａｍｉｌｌｉ））。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較して、たとえば治療または疾患の際にアップレギュレートされる遺伝子を特定する。
【０２５４】
タンパク質測定法を用いることの利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる測定法技術は当業者によく知られている。そのような測定法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、ＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡ測定法を含む。
【０２５５】
上述の通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はまた、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第００／３６０８９号パンフレットに記載される通り、容易に調製することができる。
【０２５６】
免疫系の細胞
抗原提示細胞
状況によっては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は「専門の」抗原提示細胞であることができ、または抗原をＴ細胞へ提示するように誘導されうる別の細胞であることができる。代替的に、培養条件下で分化するかまたは活性化されてＡＰＣを生じるＡＰＣ前駆細胞を用いることができる。本発明のｅｘ ｖｉｖｏの方法に用いられるＡＰＣは、典型的には患者の体内で見出される腫瘍または末梢血から単離される。好ましくはＡＰＣまたは前駆細胞はヒト起源である。しかし、適当な核酸配列を同定および試験するための予備ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング手続にＡＰＣが用いられる場合は、たとえば健康な被験者といった任意の適当な起源に由来するＡＰＣを用いることができる。
【０２５７】
ＡＰＣは、表面上にＭＨＣ分子（クラスＩまたはＩＩ）を発現するように活性化されたかまたはトランスフェクションによって操作された、指状嵌入（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）ＤＣまたは濾胞ＤＣといった樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、または他の、上皮細胞、線維芽細胞または内皮細胞のような細胞型を含む。ＡＰＣの前駆細胞は、ＣＤ３４+細胞、単球、線維芽細胞および内皮細胞を含む。ＡＰＣまたは前駆細胞は、培養条件によって修飾することができ、または、たとえば抗原提示に関与するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子および／または免疫増強作用を促進する選択されたサイトカイン遺伝子（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８など）との組み合わせのトランスフェクションによって、遺伝子操作することができる。そのようなタンパク質は、ＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＣＤ４０を含む。非常に好ましくはＤＣまたはＤＣ前駆細胞がＡＰＣの起源として含まれる。
【０２５８】
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの方法で単離／調製することができ、たとえばＤＣは末梢血から直接精製することができ、または、たとえばＧＭ−ＣＳＦを用いた処理による末梢血への移行後に、または骨髄から直接、ＣＤ３４+前駆細胞から発生させることができる。末梢血から、接着性の前駆細胞をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（イナバ（Ｉｎａｂａ）Ｋ，他（１９９２） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５：１１５７−１１６７ （Ｉｎａｂａ））、または骨髄から、非接着性のＣＤ３４+細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａで処理することができる（コー（Ｃａｕｘ）Ｃ，他（１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２５８−２６１ （Ｃａｕｘ））。ＤＣはまた、サルスト（Ｓａｌｌｕｓｔｏ）およびランザベキア（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ）の方法（Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１１０９−１１１８）と同様に、精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いておよび接着性細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で２時間処理して、ヒト提供者の末梢血から定型的に調製することができる。必要に応じて、ＤＣから磁気ビーズを用いてＣＤ１９+Ｂ細胞およびＣＤ３+、ＣＤ２+Ｔ細胞を除去することができる（コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）ＲＳ，他（１９９８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１８−７２２ （Ｃｏｆｆｉｎ））。培養条件は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４のような他のサイトカインを、樹状細胞または他の抗原提示細胞の維持および／または活性のために含むことができる。
【０２５９】
このように、ここで用いられる「抗原提示細胞など」の語は、ＡＰＣに限られないことが意図されると理解される。当業者は、Ｔ細胞集団に提示することができる任意の媒介物を用いることができることを理解し、便宜上ＡＰＣの語がこれらすべてをいうのに用いられる。上記に示す通り、適当なＡＰＣの好ましい例は、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞または脂質膜のような合成ＡＰＣを含む。
【０２６０】
Ｔ細胞
状況によっては、健常被験者といった任意の適当な起源由来のＴ細胞を、用いることができ、および血液または他の起源（たとえばリンパ節、脾臓、または骨髄）から得ることができる。Ｔ細胞は随意的に、標準的手順によって濃縮するかまたは精製することができる。Ｔ細胞は、同一のまたは別の個体から得られた、他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。代替的に、全血を、または白血球が濃縮された血液または精製白血球を、Ｔ細胞および他の細胞型の起源として用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+）を用いることが特に好ましい。代替的に、ＣＤ８+細胞のような他のＴ細胞を用いることができる。また、Ｔ細胞ハイブリドーマのような細胞株を用いることも便利である。
【０２６１】
ＡＰＣおよびＴ細胞への核酸配列の導入
ｅｘ−ｖｉｖｏ用途のためには、上記の通りのＴ細胞およびＡＰＣはＤＭＥＭまたは他の定義された培地といった適切な培地中で、随意的にウシ胎仔血清の存在下で、培養される。
【０２６２】
Ｔ細胞および／またはＡＰＣ中でポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードする核酸構造／ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をＴ細胞および／またはＡＰＣへｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏで投与することができる。同様に、アンチセンス構造をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってＴ細胞および／またはＡＰＣへ導入することができる。
【０２６３】
好ましい一実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド発現および／または活性のエンハンサーをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む調節配列に、調節可能に結合している。
【０２６４】
プロモーターは典型的には、哺乳類細胞中で機能するプロモーターから選択されるが、原核プロモーターおよび、他の真核細胞中で機能するプロモーターを用いることができる。プロモーターは典型的にはウイルス遺伝子または真核遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、発現が起こる細胞のゲノムに由来するプロモーターであることができる。真核プロモーターについては、遍在的な形で（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターのように）または、代替的に、組織特異的な形で（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターのように）機能するプロモーターであることができる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、および眼内の上皮細胞に特異的である、組織特異的プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、ｋｅｒａｔｉｎ１４、Ｗｎｔ−１およびロドプシンプロモーターである。好ましくは上皮細胞プロモーターＳＰＣが用いられる。また、たとえばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターのように、特定の刺激に反応するプロモーターであることができる。たとえばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターといった、ウイルスプロモーターもまた用いることができる。
【０２６５】
異種遺伝子の発現のレベルを、細胞の生涯の間に調節することができるように、プロモーターは誘導性であることもまた有利でありうる。誘導性とは、当該プロモーターを用いて得られた発現のレベルを調節することができることを意味する。
【０２６６】
上記のプロモーターのうち任意のものを、別の調節配列、たとえばエンハンサー配列の付加によって修飾することができる。二つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターもまた用いることができる。
【０２６７】
代替的に（または加えて）、調節配列は、目的の遺伝子が本発明で有用な細胞でだけ発現されるように、細胞特異的であることができる。そのような細胞は、たとえば、ＡＰＣおよびＴ細胞を含む。
【０２６８】
Ｎｏｔｃｈリガンド発現をアップレギュレートすることができる核酸配列を含む、結果として得られるＴ細胞および／またはＡＰＣが現在使用可能な状態である。必要に応じて、細胞の少量の一部をＮｏｔｃｈリガンド発現のアップレギュレーションについて上述の通り試験することができる。その細胞は患者への投与のために準備することができ、またはＴ細胞と共にｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でインキュベートすることができる。
【０２６９】
免疫反応および寛容化の測定法
上に記載された測定法（「測定法」を参照）のうち任意のものを、免疫細胞における反応性低下、免疫反応の変化および／または寛容化を測定または検出し、および、免疫反応の抑制および増大を臨床用途での使用のために検出するのに用いることができる
【０２７０】
免疫細胞活性は、当業者に既知である任意の適当な方法によって監視することができる。たとえば、細胞傷害性活性を監視することができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は活性化後に細胞傷害性活性の増大を示す。したがって細胞傷害性の何らかの低下または安定化は、反応性の低下の徴候となる。
【０２７１】
一旦活性化されると、白血球はさまざまな新しい細胞表面抗原を発現する。ＮＫ細胞は、たとえば、トランスフェリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２５ ＩＬ−２受容体を活性化後に発現する。反応性低下はしたがってこれらの抗原の発現を監視することによって測定することができる。
【０２７２】
ハラ（Ｈａｒａ）他『ヒトＴ細胞活性化：ＩＩＩ，１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−酢酸、マイトジェンおよび抗原によるリン酸化２８ｋＤ／３２ｋＤジスルフィド結合初期活性化抗原（ＥＡ−１）の迅速誘導』（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＩＩＩ，Ｒａｐｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ２８ ｋＤ／３２ｋＤ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｅａｒｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＥＡ−１） ｂｙ １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｍｉｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６４；１９８８（１９８６）、およびコスリッヒ（Ｃｏｓｕｌｉｃｈ）他『Ｔ細胞活性化の初期段階に関与する抗原（ＭＬＲ３）の機能的特徴づけ』（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＭＬＲ３） Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｓｔｅｐ ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），ＰＮＡＳ，８４：４２０５（１９８７）は、活性化の直後にＴ細胞上に発現される細胞表面抗原を記載している。これらの抗原、それぞれＥＡ−１およびＭＬＲ３は、２８ｋＤおよび３２ｋＤの主要成分を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１およびＭＬＲ３はＨＬＡクラスＩＩ抗原ではなく、およびＭＬＲ３ ＭａｂはＩＬ−１結合を遮断する。これらの抗原は、活性化されたＴ細胞上に１８時間以内に出現し、したがって免疫細胞反応性を監視するために用いることができる。
【０２７３】
加えて、白血球反応性は、参照により本開示に含まれる欧州特許第０３２５４８９号明細書に記載の方法で監視することができる。要約すると、これは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９６２７で表されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に認識される細胞性抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「抗Ｌｅｕ２３」）を用いて達成される。
【０２７４】
抗Ｌｅｕ２３は、活性化されたおよび抗原刺激された白血球上の細胞表面抗原を認識する。活性化ＮＫ細胞上では、その抗原Ｌｅｕ２３は活性化後４時間以内に発現され、および活性化後７２時間まで発現され続ける。Ｌｅｕ２３は、少なくとも２個のＮ結合型糖鎖を有する２４ｋＤサブユニットから構成されるジスルフィド結合ホモ二量体である。
【０２７５】
Ｌｅｕ２３のＮＫ細胞上での出現が細胞傷害性の発生と相関するため、およびＬｅｕ２３のある種のＴ細胞上での出現がＴ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、抗Ｌｅｕ２３は白血球の反応性を監視するのに有用である。
【０２７６】
免疫細胞反応性の監視のための技術のさらなる詳細は、参照により本開示に含まれる：『ナチュラルキラー細胞』（Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｃ．Ｅ．およびＪ．Ｏ’Ｄ．マクジー（ＭｃＧｅｅ）１９９２．オックスフォード大学出版会（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）； トリンチエリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）Ｇ．『ナチュラルキラー細胞の生物学』（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ） Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ ｖｏｌ ４７ ｐｐ１８７−３７６；『免疫反応遺伝子ハンドブック』（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ）の７章『免疫反応のサイトカイン』（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）マク（Ｍａｋ）Ｔ．Ｗ．およびＪ．Ｊ．Ｌ．シマード（Ｓｉｍａｒｄ）１９９８に見出すことができる。
【０２７７】
初回抗原刺激を受けたＡＰＣおよびリンパ球の調製
本発明の一態様によると免疫細胞を用いて抗原またはアレルゲンを提示することができ、および／または免疫細胞を処理してＮｏｔｃｈ、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、ＤＭＥＭまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、随意的にウシ胎仔血清といった血清の存在下で、培養することができる。最適サイトカイン濃度は滴定によって決定することができる。１つ以上のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子およびインターフェロンを、その後、典型的には目的の抗原（または抗原決定基）と共に培地に添加する。抗原は、当該物質の前、後、またはそれと実質的に同時に、添加することができる。細胞は典型的には、当該物質および抗原と共に、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、好ましくは少なくとも１２または少なくとも２４時間、約３７℃にてインキュベートする。必要に応じて、細胞の少量を、標的遺伝子発現の調節について上記の通り試験することができる。代替的に、国際公開第９８／２０１４２号パンフレットに記載の通り、細胞活性はＴ細胞活性化の阻害によって、表面マーカー、サイトカイン分泌または増殖を監視することで測定することができる。
【０２７８】
上で論述した通り、ＡＰＣ中でポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードする核酸構造／ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をＡＰＣへ投与することができる。同様に、抗原をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってＡＰＣへ導入することができる。結果として生じる、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のレベル上昇を示すＡＰＣが現在使用可能な状態である。
【０２７９】
下記の技術はＴ細胞に関して説明されているが、しかしＢ細胞にも等しく適用可能である。使用した技術は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されること以外は、ＡＰＣ単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたＡＰＣをまず作製し、次いでそれをＴ細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、それを沈澱させＰＢＳで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。このことは、たとえば、Ｔ細胞をＡＰＣに用いた物質とは異なる物質で処理したい場合、Ｔ細胞がＡＰＣに用いた別の物質と接触させられることがないという利点を有する。代替的に、Ｔ細胞をＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する第一の物質（または物質の組）とインキュベートし、洗浄し、再懸濁し、次いでＡＰＣを調節するために用いられた物質およびＴ細胞を調節するために用いられた物質の両方の非存在下で、初回抗原刺激を受けたＡＰＣとインキュベートすることができる。代替的に、抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）といったＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）と共にまたはそれ無しで、Ｔ細胞をＡＰＣの非存在下で培養しおよび初回抗原刺激することができ、または代替的にＴ細胞をＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば四量体）を用いて活性化することができる。
【０２８０】
インキュベートは典型的には少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３または６または１２または２４時間またはより長時間、適切な培地中で３７℃で行う。免疫寛容の誘導といった免疫反応の変化は、続いてＴ細胞に抗原を負荷し、およびＡＰＣに曝露されていない対照細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって測定することができる。
【０２８１】
この方法で初回抗原刺激を受けたＴ細胞またはＢ細胞は、本発明にしたがって、他のＴ細胞またはＢ細胞において免疫寛容を誘導するのに用いることができる。
【０２８２】
治療可能な症状
好ましくは免疫系の調節はＴ細胞活性の調節による。特に、本発明はＴ細胞に媒介され
る疾患および感染の治療に用いることができる。Ｔ細胞によって媒介されると説明されう
る疾患状態または感染状態は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、腫瘍に誘発さ
れるＴ細胞系の異常、および、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ミクロフィ
ラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、ト
キソプラズマ、エキノコッカス、Ｂ型インフルエンザ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ
型）、麻疹、Ｃ型肝炎または回虫によって引き起こされるものといった感染症のいずれか
１つ以上を含むがこれらに限定されない。このように、治療または予防されうる、Ｔ細胞
によって媒介される特定の症状は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、および糖尿病を含
む。本発明はまた、臓器移植術または骨髄移植術に用いることができる。
【０２８３】
上記に示す通り、本発明は、自己免疫疾患といった免疫疾患、または、同種異系移植片拒絶といった移植片拒絶の治療に有用である。
【０２８４】
たとえば、本発明は臓器移植（たとえば腎臓、心臓、肺、肝臓または膵臓移植）、組織移植（たとえば皮膚移植片）または細胞移植（たとえば骨髄移植または輸血）の処置に用いることができる。
【０２８５】
最も一般的な種類の臓器および組織移植の短い概観を下記に示す。
【０２８６】
１．腎臓移植：
腎臓は最も一般的に移植されている臓器である。腎臓は死亡者および生きたドナーの両方が提供することができ、および腎臓移植は数々の臨床徴候（糖尿病、さまざまな型の腎炎および腎不全を含む）を治療するのに用いることができる。腎臓移植術のための外科的手順は相対的に単純である。しかし、血液型および組織適合型を一致させることが、移植片拒絶を避けるために望ましい。最初の移植を拒絶後に多くの患者が「感作」されうるため、移植片が受容されることは実際に重要である。感作の結果として、腎臓抗原に対する抗体の形成および細胞機構の活性化が生じる。したがって、最初の移植片と共通する抗原を含むその後の移植片はどれも拒絶される可能性が高い。結果として、多数の腎臓移植患者はその後の生涯にわたって何らかの形の免疫抑制治療を受け続けなければならず、感染および代謝性骨疾患といった合併症の原因となる。
【０２８７】
２．心臓移植術
心臓移植術は非常に複雑で高リスクの手続である。ドナー心臓は、レシピエントに入れられた際に拍動を始めるような方法で維持しなければならず、したがって、限られた期間、非常に限定された条件下でのみ生存可能に保たれる。ドナー心臓はまた、脳死ドナーからのみ取ることができる。心臓移植を用いて、さまざまな型の心臓疾患および／または損傷を治療することができる。ＨＬＡ適合は明らかに望ましいが、心臓の供給が限られていることおよび手続の緊急性のために、しばしば不可能である。
【０２８８】
３．肺移植術
肺移植術は、（単独でまたは心臓移植術と組み合わせて）嚢胞性線維症および肺への急性損傷（たとえば煙の吸入によって生じた）といった疾患の治療に用いられる。移植に用いられる肺は通常は脳死ドナーからしか回収することができない。
【０２８９】
４．膵臓移植術
膵臓移植術は主に、膵臓中のインシュリンを産生する膵島細胞の機能異常によって引き起こされる疾患である糖尿病を治療するために用いられる。移植術用の臓器は、死亡者からしか回収できないが、調節された方法でインシュリンを産生するのに必要な機能を再生するためには膵臓全体の移植術は必要ないことに注意すべきである。実際、膵島細胞の移植術だけで十分でありうる。腎不全が進行型糖尿病の高頻度な合併症であるため、腎臓および膵臓の移植はしばしば同時に実施される。
【０２９０】
５．皮膚移植
大部分の皮膚移植は自家組織を用いて行われる。しかし、重度の火傷（たとえば）の場合には、外来組織の移植片が必要である可能性がある（が、移植片は宿主上では増殖せず、一定期間で交換しなければならないため、これらの移植片は一般的に生物学的包帯剤として用いられることに注意すべきである）。真の同種異系皮膚移植の場合には、拒絶は免疫抑制療法の使用によって防ぐことができる。しかし、これは感染のより高いリスクに結びつき、したがって火傷患者の主な障害である。
【０２９１】
６．肝臓移植術
肝臓移植は、肝炎といったウイルス疾患によって、または有害化学物質への曝露によって（たとえば慢性アルコール症によって）引き起こされた臓器障害を治療するために用いられる。肝臓移植はまた、先天性異常を治療するために用いられる。肝臓は大きくおよび複雑な臓器であり、これは移植術に最初は技術的な問題があったことを意味する。しかし、大部分の移植（６５％）は現在１年以上生存し、および、一人のドナーに由来する肝臓を分割して二人のレシピエントに与えることができることが見出されている。肺移植患者による移植片拒絶の率は相対的に低いが、ドナー臓器内の白血球は抗血液型抗体と共に、血液型不一致が存在する場合、レシピエント赤血球の抗体依存性溶血を媒介しうる。加えて、ドナーとレシピエントが血液型適合である場合でさえ、ＧＶＨＤの顕在化が肝臓移植で起こっている。
【０２９２】
治療されうる疾患の例は、一般に自己免疫疾患と呼ばれる一群を含む。自己免疫疾患の範囲は、臓器特異的疾患（たとえば甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症）から、慢性関節リウマチまたはエリテマトーデスのような全身性疾患にわたる。他の疾患は、アレルギー反応のような免疫過敏性を含む。
【０２９３】
より詳細には：臓器特異的自己免疫疾患は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、いくつかの型の貧血（再生不良性、溶血性）、自己免疫肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を含む。
【０２９４】
全身性自己免疫疾患は：慢性関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症および全身性硬化症、シェーグレン症候群、分類不能結合組織症候群、抗リン脂質症候群、さまざまな型の血管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛、本態性（混合）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬および乾癬性関節炎、好酸球性または非好酸球性びまん性筋膜炎、多発性筋炎および他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、さまざまな型の炎症性皮膚炎を含む。
【０２９５】
疾患のより広範囲のリストは：慢性関節リウマチを含む関節炎を含む不必要な免疫反応および炎症、過敏性、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫疾患に伴う炎症、アテローム性硬化症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に伴う炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および消化管の他の疾患に伴う炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および／または炎症性関連婦人科疾患、後部ブドウ膜、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜強膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫および炎症性要素、眼外傷の炎症性要素、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、たとえば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕、眼インプラントに対する免疫および／または炎症反応、および他の免疫および炎症性関連眼疾患、自己免疫疾患または症状に伴う炎症、または、中枢神経系（ＣＮＳ）または任意の他の臓器の両方で、免疫および／または炎症抑制が有益である疾患、パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆症候群、ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、症状、またはＣＮＳ疾患、脳卒中の炎症性要素、ポリオ後症候群、精神 疾患の免疫 および 炎症性 要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性 神経障害、亜急性 神経障害、慢性 神経障害、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病（ｃｈｏｒａ）、重症筋無力症、特発性頭蓋内圧亢進症、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染の炎症性要素、筋萎縮症および筋ジストロフィーの炎症性要素、および、中枢および末梢神経系の免疫および炎症性関連疾患、症状または疾患、外傷後炎症、敗血性ショック、感染症、手術または臓器の炎症性合併症または副作用、遺伝子治療のたとえばウイルスキャリヤーの感染による炎症性および／または免疫合併症および副作用、または体液性および／または細胞性免疫反応を抑制または阻害するための、ＡＩＤＳに関連する炎症、単球または白血球増殖性疾患、たとえば白血病を、単球またはリンパ球の量を減らすことによって治療または改善すること、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織といった天然または人工細胞、組織、および臓器の移植術の場合に移植片拒絶の防止および／または治療のため、を含む。
【０２９６】
本発明はまたがん治療法において有用である。本発明は特に、腺がん、たとえば小細胞肺がん、および腎臓、子宮、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、膀胱、卵巣、大腸および乳房のがんに関して有用である。
【０２９７】
医薬組成物
好ましくは本発明の活性物質（Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子およびインターフェロン、インターフェロンをコードするポリヌクレオチドおよび／またはインターフェロン誘導因子）は医薬組成物の形で投与される。当該医薬組成物は、ヒトおよび動物医学においてヒトまたは動物用途向けであることができ、および、１つ以上の活性物質に加えて、典型的には任意の１つ以上の、医薬品として許容される希釈剤、キャリヤー、または賦形剤を含む。治療的用途のための許容されるキャリヤーまたは希釈剤は医薬分野でよく知られており、たとえば、『レミントンの医薬科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（Ａ．Ｒ．ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、１９８５）に記載されている。医薬キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医薬実務に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。また、保存料、安定剤、色素および香料さえ、そのような医薬組成物中に提供することができる。保存料の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤もまた用いることができる。
【０２９８】
投与
典型的には、医師は個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、および投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。下記の投与量は、平均的な例の典型である。もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありうる。
【０２９９】
一実施形態では、本発明に用いられる治療剤を患者に直接ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。代替的に、または加えて、当該治療剤を細胞（たとえばＴ細胞および／またはＡＰＣまたは幹細胞または組織細胞）にｅｘ ｖｉｖｏの方法で投与することができる。たとえば、Ｔ細胞またはＡＰＣといった白血球を、患者またはドナーから既知の方法で得て、本発明の方法でｅｘ ｖｉｖｏで処理／インキュベートし、その後、患者に投与することができる。
【０３００】
一般的に、治療的に有効な一日量は、たとえば０．０１ないし５００ｍｇ／ｋｇ、たとえば０．０１ないし５０ｍｇ／治療される対象の体重ｋｇ、たとえば０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲に及びうる。本発明の物質はまた、たとえば０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲に及ぶ可能性が高い用量で、静脈輸液によって投与することができる。
【０３０１】
熟練した医師は、任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができる。好ましくは医薬組成物は単位用量剤形である。
【０３０２】
本発明の物質は、たとえば、経口、直腸内、経鼻、局所（皮内、経皮、エアロゾル、口内および舌下を含む）、膣内および非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与経路を含むがそれに限定されない、任意の適当な手段によって投与することができる。
【０３０３】
適切には活性物質は、上記の「医薬組成物」の見出しの下に記載の通りの、医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤と組み合わせて投与される。医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤は、たとえば、滅菌等張生理食塩水溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液であることができる。本発明の物質は、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤と適切に混合することができる。
【０３０４】
一実施形態では、化合物を経口的に活性な形に処方することが望ましい可能性がある。このように、一部の用途については、活性物質は、デンプンまたは乳糖といった賦形剤を含む錠剤の形で、または、カプセル剤または胚珠状で単独でまたは賦形剤と混合して、または、香料または着色料を含むエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、経口投与することができる。本物質を含む錠剤またはカプセル剤のような用量は、必要に応じて一度に１つずつまたは２個以上投与することができる。活性物質を徐放性処方で投与することもまた可能である。
【０３０５】
代替的に、または加えて、活性物質は吸入によって、経鼻的にまたはエアロゾルの形で、または坐剤またはペッサリーの形で投与することができ、または活性物質はローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に投与することができる。経皮投与の１つの選択手段は、皮膚パッチを用いることである。たとえば、活性物質はポリエチレングリコールまたは液体パラフィンの水系エマルジョンから成るクリームに取り入れることができ、たとえば重量で１ないし１０％の濃度で、白ロウまたは白色軟質パラフィン基剤と共に必要に応じて安定剤および保存料から成る軟膏に取り入れることができる。
【０３０６】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質／ポリペプチドといった活性物質もまた、ウイルス技術または非ウイルス技術によって投与することができる。ウイルスデリバリー機構は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むがそれらに限定されない。非ウイルスデリバリー機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物（ＣＦＡｓ）およびその組み合わせを含む。そのようなデリバリー機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。活性物質はまた、表皮または真皮またはその他の粘膜表面のような部位へのデリバリーのための粒子の弾丸デリバリー（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）といった、針を用いない系によって投与することができる。
【０３０７】
活性物質はまた、非経口的に、たとえば海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。
【０３０８】
非経口投与のためには、活性物質はたとえば、溶液を血液と等張にするための十分な塩または単糖といった他の物質を含みうる、無菌水溶液の形で用いることができる。
【０３０９】
口内または舌下投与のためには、物質はたとえば、従来の方法で処方することができる錠剤またはトローチ剤の形で投与することができる。
【０３１０】
対象（たとえば患者）への経口、非経口、口内および舌下投与のためには、活性物質およびその医薬品として許容される塩および溶媒和物の投与量レベルは、典型的には１０ないし５００ｍｇでありうる（一回または分割用量で）。このように、および例として、錠剤またはカプセル剤は、必要に応じて一度に１つずつまたは２つ以上の投与について、５ないし１００ｍｇの活性物質を含みうる。上記に示す通り、医師は個別の患者について最適となる実際の投与量を決定し、およびその投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上記の投与量は平均的な例の典型である一方、もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありえ、およびそのような用量範囲は本発明の範囲内であることに注意する。
【０３１１】
当業者は任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができるため、記載の投与経路および投与量は単に指針として意図される。
【０３１２】
ここで用いられる治療または療法の語は、診断および予防用途を包含すると考える。
【０３１３】
本発明の治療は、ヒトの用途および獣医学用途の両方を含む。
【０３１４】
本発明の活性物質は、たとえば、免疫抑制剤、ステロイドまたは抗がん剤のような、他の活性物質と共に投与することができる。
【０３１５】
ｅｘ−ｖｉｖｏで処理される場合、本発明の修飾細胞は好ましくは患者のリンパ節への直接注射によって宿主へ投与される。典型的には１０4ないし１０8個の処理細胞、好ましくは１０5ないし１０7個の細胞、より好ましくは約１０6個の細胞が患者に投与される。好ましくは、細胞は濃縮された細胞集団から採取される。
【０３１６】
ここで用いられる「濃縮された」の語は、本発明の細胞集団に用いられるとき、天然に共存する他の細胞がより少ない、細胞のより均一な集団をいう。濃縮された細胞の集団は、本分野で既知であるいくつかの方法によって達成することができる。たとえば、Ｔ細胞の濃縮された集団は、Ｔ細胞上だけに見出される決定基に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティクロマトグラフィーを用いて得ることができる。
【０３１７】
濃縮された集団はまた、混合細胞懸濁液から、ポジティブ選択（目的の細胞だけを回収する）またはネガティブ選択（望ましくない細胞を除去する）によって得ることができる。特異的な細胞をアフィニティ材料上に捕捉するための技術は本分野でよく知られている（ウィグゼル（Ｗｉｇｚｅｌ）他，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１２８：２３，１９６９；メイジ（Ｍａｇｅ）他，Ｊ．Ｉｍｎｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１５：４７，１９７７；ウィソッキ（Ｗｙｓｏｃｋｉ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：２８４４，１９７８；シュレンプ・デッカー（Ｓｃｈｒｅｍｐｆ−Ｄｅｃｋｅｒ）他，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．，３２：２８５，１９８０；ミュラー・ジーブルク（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ）他，Ｃｅｌｌ，４４：６５３，１９８６）。
【０３１８】
成熟分化細胞に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体が、望ましくない細胞を除去するさまざまなネガティブ選択法、たとえば、Ｔ細胞または悪性細胞をそれぞれ同種異系または自家骨髄移植片から除去するために用いられている（ジー（Ｇｅｅ）他，Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．８０：１５４，１９８８）。モノクローナル抗体および免疫磁気マイクロスフィアを用いたネガティブ選択によるヒト造血細胞の精製は、複数のモノクローナル抗体を用いて達成することができる（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）他，Ｂｌｏｏｄ，６３：９０４，１９８４）。
【０３１９】
細胞の分離のための手順は、抗体被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、たとえば、補体およびサイトトキシンのような、モノクローナル抗体と結合させたかまたはモノクローナル抗体と組み合わせて用いる細胞毒性物質、および、たとえば、プレートのような固体マトリクスに結合させた抗体を用いる「パンニング（濃縮）」、または他の便利な技術を含むことができる。正確な分離を提供する技術は、蛍光活性化セルソーターを含み、これはたとえば、複数の色チャンネル、低角度および鈍光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、などといったさまざまな程度の高度機能を持つことができる。
【０３２０】
併用治療
本発明の活性物質が、他の活性物質、抗原または抗原決定基と共に投与される併用治療もまた本発明の範囲内にある。
【０３２１】
「同時に」とは、活性物質が実質的に同一の時に、および好ましくは同一の処方中で一緒に、投与されることを意味する。
【０３２２】
「同時期に」とは、活性物質が近い時間に投与されることを意味し、たとえば、１つの物質がもう１つの物質の前または後約１分間以内から約１日以内に投与される。任意の同時期の時間が有用である。しかし、同時に投与されない場合、物質は約１分間以内から約８時間以内、および好ましくは約１ないし約４時間より短い間に投与される場合が多い。同時期に投与される場合、物質は好ましくは動物の同一の部位に投与される。「同一の部位」の語は正確な位置を含むが、しかし約０．５ないし約１５センチメートル以内、好ましくは約０．５ないし約５センチメートル以内であることができる。
【０３２３】
ここで用いられる「別々に」の語は、物質が、間隔を置いて、たとえば約１日ないし数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性物質はどちらの順序でも投与することができる。
【０３２４】
ここで用いられる「順次に」の語は、物質が順番に、たとえば分、時間、日、または週間隔で投与されることを意味する。必要に応じて、活性物質は規則的な反復サイクルで投与することができる。
【０３２５】
一実施形態では本発明に用いられる治療剤は、直接的に患者にｉｎ ｖｉｖｏ投与することができることが理解される。代替的に、または加えて、当該物質はＴ細胞および／またはＡＰＣのような免疫細胞にｅｘ ｖｉｖｏの方法で投与することができる。たとえば、Ｔ細胞またはＡＰＣのような白血球を、患者またはドナーから既知の方法で入手し、ｅｘ ｖｉｖｏで本発明の方法で処理／インキュベートし、その後患者に投与することができる。加えて、投与経路の組み合わせを必要に応じて用いることができることが理解される。たとえば、適切な場合には、１成分（たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子）をｅｘ−ｖｉｖｏで投与することができ、他方をｉｎ ｖｉｖｏで投与することができ、また逆も可能である。
【０３２６】
好ましくは活性物質は局所的に、経鼻的にまたは非経口的に（たとえば皮下に、皮内にまたは筋肉内に）、好ましくは同一の場所に投与され、および１つ以上を徐放型で投与することができる。
【０３２７】
化学的架橋化
化学的に結合した（架橋した）配列を、個別のタンパク質配列から調製しおよび既知の化学結合技術を用いて結合させることができる。複合体は、たとえば従来の溶液相または固相ペプチド合成法を用いて組み立てることができ、末端アミノ基だけが脱保護された反応性形である完全に保護された前駆体が得られる。この官能基は次いで、たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその適当な反応性誘導体と直接反応させることができる。代替的に、このアミノ基を、カーゴ部分またはリンカーを有する、反応に適した別の官能基へ変換することができる。このように、たとえば無水コハク酸とのアミノ基の反応は選択的に指定可能なカルボキシル基を与え、一方、システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長は、選択的に指定可能なチオール基を結果として生じる。適当な選択的に指定可能な官能基がデリバリーベクター前駆体中に一旦得られると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその誘導体を、たとえばアミド、エステル、またはジスルフィド結合形成を介して結合することができる。利用することができる架橋化試薬は、たとえば、ミーンズ（Ｍｅａｎｓ），Ｇ．Ｅ．およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ），Ｒ．Ｅ．，『タンパク質の化学修飾』（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ホールデン・デイ社（Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ），１９７４，ｐｐ．３９−４３で論述されている。
【０３２８】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達調節の調節因子は、必要に応じて、直接的に、または適切にはリンカー部分を介して間接的に、結合することができる。直接結合は、チオール、ヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ基といった、調節因子（たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質）上の任意の便利な官能基を通じて生じうる。しばしば好ましい可能性がある間接結合は、連結部分を介して起こる。適当な連結部分は、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体およびスクシンイミド誘導体のような、二官能性および多官能性アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリールまたはアラルキルアルデヒド酸エステルおよび無水物、スルフヒドリルまたはカルボキシル基を含み、または、臭化または塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステルまたはハロゲン化スルホンなどに由来することができる。
【０３２９】
修飾／ヒト化抗体
好ましくは、ヒト患者を治療するための用途向けの抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗
体である。抗体「ヒト化」技術は本分野でよく知られている。これらの技術は典型的には
、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための、組み換えＤＮＡ
技術の使用を含む。
【０３３０】
米国特許第５８５９２０５号明細書に記載された通り、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）をヒト化するための初期の方法は、１つの抗体の完全な可変領域を含む抗原結合部位が、別の抗体に由来する定常領域と結合している、キメラ抗体の産生を含んだ。そのようなキメラ化手順は欧州特許出願公開第０１２０６９４号明細書（セルテック社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ））、欧州特許出願公開第０１２５０２３号明細書（（ジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）およびシティ・オブ・ホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ））、欧州特許出願公開第０ １７１４９６号明細書（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、欧州特許出願公開第０ １７３ ４９４号明細書（スタンフォード大学）、および国際公開第８６／０１５３３号パンフレット（セルテック社）に記載されている。たとえば、国際公開第８６／０１５３３号パンフレットは、マウスＭＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体分子を調製するための製法を開示する。
【０３３１】
欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ））に記載さ
れた別の手法では、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト免疫グロブリンの可
変領域の骨格領域に、部位特異的突然変異誘発によって長オリゴヌクレオチドを用いて移
植される。そのようなＣＤＲ移植されたヒト化抗体は、ヒト化キメラ抗体よりも、それら
が含む非ヒトアミノ酸配列の大幅に低い比率の点から、抗−抗体反応を生じる可能性が大
幅に低い。リゾチームを認識するマウスＭＡｂおよびヒトＴ細胞上の抗原を認識するラッ
トＭＡｂがＣＤＲ移植によってヒト化された例が、ヴェルヘイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ
）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，１５３４−１５３６，１９８８）およびリーヒマン（Ｒ
ｉｅｃｈｍａｎｎ）他（Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４，１９８８）によってそ
れぞれ記載されている。ヒトＴ細胞上の抗原に対するＣＤＲ移植抗体の作製もまた、国際
公開第８９／０７４５２号パンフレット（英国医療審議会）に記載されている。
【０３３２】
国際公開第９０／０７８６１号パンフレットにおいて、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らはヒ
ト化免疫グロブリンを設計するための４つの基準を提示している。第一の基準は、ヒトア
クセプターとして、ヒト化する非ヒトドナー免疫グロブリンと著しく相同である特定のヒ
ト免疫グロブリンに由来する骨格を用いるか、または多数のヒト抗体に由来する共通骨格
を用いることである。第二の基準は、ヒト配列について骨格の特定残基でヒトアクセプタ
ー残基が稀であってドナー残基が典型的である場合は、アクセプターでなくドナーアミノ
酸を用いることである。第三の基準は、ＣＤＲに直に隣接する位置では、アクセプターで
なくドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。第四の基準は、ＣＤＲに直に隣接する
位置では、アクセプターでなくドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。第四の基準
は、アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルでＣＤＲの約３Ａ以内に側鎖原子を有し、
および抗原またはヒト化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用が可能であると予測される場
合は、その骨格位置でドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。基準２、３、または
４は基準１に加えて、またはその代替として適用することができ、および単独でまたは任
意の組み合わせで適用することができる。
【０３３３】
抗原およびアレルゲン
一実施形態では、本発明の物質は、抗原または抗原決定基（またはそれをコードするポリヌクレオチド）と同時、別々または順次の組み合わせで投与することができ、そのような抗原または抗原決定基に対する免疫反応を修飾（上昇または低下）することができる。
【０３３４】
本発明における用途に適した抗原は、免疫系によって認識されうる、および一般的に抗原受容体によって認識される、任意の物質であることができる。好ましくは本発明に用いられる抗原は免疫原である。宿主が、以前に遭遇した抗原に再曝露される時、アレルギー反応が起こる。
【０３３５】
抗原に対する免疫反応は一般的に細胞性（Ｔ細胞媒介殺作用）または体液性（完全な抗原の認識を介した抗体産生）のどちらかである。免疫反応に関与するＴＨ細胞によるサイトカイン産生のパターンは、これらの反応型のどちらが優位になるかに影響を与えることができる： 細胞性免疫（ＴＨ１）は高いＩＬ−２およびＩＦＮγとしかし低いＩＬ−４産生で特徴づけられる一方、体液性免疫（ＴＨ２）ではパターンは低いＩＬ−２およびＩＦＮγとしかし高いＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３である。分泌パターンは二次リンパ器官または細胞のレベルで調節されるため、特定のＴＨサイトカインパターンの薬理学的操作は、生じる免疫反応の種類および程度に影響を与えることができる。
【０３３６】
ＴＨ１−ＴＨ２バランスは、２つの異なる型のヘルパーＴ細胞の相対的な発現量をいう。２つの型は免疫系に対して大規模かつ相反する作用を有する。ある免疫反応がＴＨ１細胞を優先する場合、これらの細胞は細胞応答を推進し、一方でＴＨ２細胞は抗体に支配される反応を推進する。一部のアレルギー反応を担う種類の抗体はＴＨ２細胞によって誘導される。
【０３３７】
本発明に用いられる抗原またはアレルゲン（またはその抗原決定基）は、ペプチド、ポリペプチド、糖質、タンパク質、糖タンパク質、または、タンパク質複合体、細胞−膜調製物、完全な細胞（生存可能なまたは生存不能な細胞）、細菌細胞またはウイルス／ウイルス成分のような、複数の抗原性エピトープを含むより複雑な材料であることができる。特に、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症に関連）、コラーゲン（慢性関節リウマチに関連）、およびインシュリン（糖尿病）、またはＭＨＣ抗原またはその抗原決定基のような非自己組織の拒絶に関連する抗原、といった自己免疫疾患に関連することが知られている抗原を用いることが好ましい。初回抗原刺激を受けた本発明のＡＰＣおよび／またはＴ細胞が組織移植術手続に用いられる場合、抗原は組織ドナーから得ることができる。対象において発現される可能性がある抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチドもまた用いることができる。
【０３３８】
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態をここで、非限定的な実施例を用いて、より詳細に説明する。
【実施例】
【０３３９】
実施例１
ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質
ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインと融合したヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインを含む融合タンパク質（「ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ」）を、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（たとえばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２を参照）を発現ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス社（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国スラウ（Ｓｌｏｕｇｈ））に挿入し、および結果として生じる構造をＣＨＯ細胞で発現することによって調製した。結果として生じる発現された融合タンパク質のアミノ酸配列は下記の通りであった：
2006513153.tif 000016
ここで、第一の下線の配列はシグナルペプチド（成熟タンパク質から切断される）であり、および第二の下線の配列はＩｇＧ４Ｆｃ配列である。本タンパク質は通常は、システインジスルフィド結合によって結合した二量体として存在する（たとえば本文書の略図を参照）。
【０３４０】
実施例２
ラパマイシン存在下でのＮｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出するためのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）ＥＬＩＳＡ測定法
（ｉ）ＣＤ４＋細胞精製
脾臓をマウス（各種のＢａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週、Ｃ５７Ｂ／６雌、８〜１０週、Ｄ０１１．１０遺伝子導入雌、８〜１０週）から摘出し、および０．２μｍ細胞ストレーナーを通して、２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号２２４０９）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５ｘ１０-5Ｍβ−メルカプト−エタノールを含む１０％ウシ胎仔血清）へ入れた。細胞懸濁液を遠心分離し（１１５０ｒｐｍ ５分間）および培地を除去した。
【０３４１】
細胞は脾臓１個当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、１．０Ｍ ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡを含む二回蒸留水）を用いて４分間インキュベートした（赤血球を溶解するため）。細胞を次いでＲ１０Ｆ培地を用いて１回洗浄しおよび計数した。ＣＤ４＋細胞を磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）カラム（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、英国ビズリー（Ｂｉｓｌｅｙ）：カタログ番号１３０−０４２−４０１）でＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（ミルテニー・バイオテク社カタログ番号１３０−０４９−２０１）を用いて、取扱説明書に従って、懸濁液からポジティブ選択によって精製した。
【０３４２】
（ｉｉ）抗体被覆化
９６ウェル平底プレートを、ＤＰＢＳ＋１μｇ／ｍｌ抗ハムスターＩｇＧ抗体（ファー
ミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）カタログ番号５５４００７）＋１μｇ／ｍｌ抗Ｉ
ｇＧ４抗体を用いて被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆化混合物を加えた。プレー
トを一夜４℃にてインキュベートし、次いでＤＰＢＳで洗浄した。各ウェルに次いで、１
００μｌ ＤＰＢＳ＋抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）または、１００μｌ ＤＰＢＳ＋抗Ｃ
Ｄ３抗体（１μｇ／ｍｌ）＋ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（１０μｇ／
ｍｌ；上記の通り）のどちらかを加えた。プレートを２〜３時間３７℃にてインキュベー
トし、次いで、細胞（上記の通り調製した）を加える前に、ＤＰＢＳを用いて再び洗浄し
た。
【０３４３】
（ｉｉｉ）一次ポリクローナル刺激およびＥＬＩＳＡ
ＣＤ４＋細胞を、上記（ｉｉ）に従って予め被覆された９６ウェル平底プレート中で培
養した。細胞を、計数後、Ｒ１０Ｆ培地＋４μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体（ファーミンジェ
ン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）
中に２ｘ１０6／ｍｌで再懸濁した。ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液を加えた。１
００μｌのＲ１０Ｆ培地を次いで各ウェルに加え、終容量２００μｌとした（２ｘ１０5
細胞／ウェル、抗ＣＤ２８終濃度２μｇ／ｍｌ）。ラパマイシン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ
））をストック溶液（４ｍＭを含むＤＭＳＯ）から加え、終濃度０ないし５０００ｎＭと
した。プレートを次いで３７℃にて７２時間インキュベートした。
【０３４４】
上清１２５μｌをその後各ウェルから取り、およびＥＬＩＳＡによってＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮｇおよびＩＬ−１３についてＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（英国アビンドン（Ａｂｉｎｇｄｏｎ））の抗体対を用いて試験するまで−２０℃にて保存した。結果を図９に示す。
【０３４５】
実施例３
シクロスポリンＡ存在下でのＮｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出するためのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）ＥＬＩＳＡ測定法
ラパマイシンの代わりにシクロスポリンＡ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を加え（４ｍＭを含むエタノールのストック溶液から）、終濃度０ないし４０ｎＭを与えた点以外は、実施例２の手続を繰り返した。結果を図１０に示す。
【０３４６】
実施例４
ＦＫ−５０６存在下でのＮｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出するためのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）ＥＬＩＳＡ測定法
ラパマイシンの代わりにＦＫ−５０６（カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））を加え（４ｍＭを含むＤＭＳＯのストック溶液から）、終濃度０ないし８０００ｎＭを与えた点以外は、実施例２の手続を繰り返した。結果を図１１に示す。
【０３４７】
実施例５
デキサメタゾン存在下でのＮｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出するためのダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）ＥＬＩＳＡ測定法
（ｉ）ＣＤ４＋細胞精製
脾臓をマウス（各種のＢａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週、Ｃ５７Ｂ／６雌、８〜１０週、Ｄ
０１１．１０遺伝子導入雌、８〜１０週）から摘出し、および０．２μｍ細胞ストレーナ
ーを通して、２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ １６４０培地（ギブコ社（
Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号２２４０９）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニ
シリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５ｘ１０-5Ｍβ−メルカプト−エタノール
を含む１０％ウシ胎仔血清）へ入れた。細胞懸濁液を遠心分離し（１１５０ｒｐｍ ５分
間）および培地を除去した。
【０３４８】
細胞は脾臓１個当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、１．０Ｍ ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭ Ｎａ2ＥＤＴＡを含む二回蒸留水）を用いて４分間インキュベートした（赤血球を溶解するため）。細胞を次いでＲ１０Ｆ培地を用いて１回洗浄しおよび計数した。ＣＤ４＋細胞を磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ）カラム（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、英国ビズリー（Ｂｉｓｌｅｙ）：カタログ番号１３０−０４２−４０１）でＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（ミルテニー・バイオテク社カタログ番号１３０−０４９−２０１）を用いて、取扱説明書に従って、懸濁液からポジティブ選択によって精製した。
【０３４９】
（ｉｉ）抗体被覆化
９６ウェル平底プレートを、ＤＰＢＳ＋１μｇ／ｍｌ抗ハムスターＩｇＧ抗体（ファー
ミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）カタログ番号５５４００７）＋１μｇ／ｍｌ抗Ｉ
ｇＧ４抗体を用いて被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆化混合物を加えた。プレー
トを一夜４℃にてインキュベートし、次いでＤＰＢＳで洗浄した。各ウェルに次いで、１
００μｌ ＤＰＢＳ＋抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）または、１００μｌ ＤＰＢＳ＋抗Ｃ
Ｄ３抗体（１μｇ／ｍｌ）＋ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（１０μｇ／
ｍｌ；上記の通り）のどちらかを加えた。プレートを２〜３時間３７℃にてインキュベー
トし、次いで、細胞（上記の通り調製した）を加える前に、ＤＰＢＳを用いて再び洗浄し
た。
【０３５０】
（ｉｉｉ）一次ポリクローナル刺激およびＥＬＩＳＡ
ＣＤ４＋細胞を、上記（ｉｉ）に従って予め被覆された９６ウェル平底プレート中で培
養した。細胞を、計数後、Ｒ１０Ｆ培地＋４μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８抗体（ファーミンジェ
ン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、カタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）
中に２ｘ１０6／ｍｌで再懸濁した。ウェル当たり１００μｌの細胞懸濁液を加えた。１
００μｌのＲ１０Ｆ培地を次いで各ウェルに加え、終容量２００μｌとした（２ｘ１０5
細胞／ウェル、抗ＣＤ２８終濃度２μｇ／ｍｌ）。デキサメタゾンをストック溶液（４ｍ
Ｍを含むＤＭＳＯ）から加え、終濃度０ないし５０００ｎＭとした。プレートを次いで３
７℃にて７２時間インキュベートした。
【０３５１】
上清１２５μｌをその後各ウェルから取り、およびＥＬＩＳＡによってＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮｇおよびＩＬ−１３についてＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（英国アビンドン（Ａｂｉｎｇｄｏｎ））の抗体対を用いて試験するまで−２０℃にて保存した。結果を図１２に示す。ＩＬ−４およびＩＬ−５を用いた別の結果を図１３に示す。
【０３５２】
実施例６
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性を検出するためのルシフェラーゼ測定法
ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（実施例１）をストレプトアビジン−ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（英国ダイナル社（Ｄｙｎａｌ （ＵＫ） Ｌｔｄ）のセレクション（ＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ）・ビオチン・バインダー・ダイナビーズ［カタログ番号１１５．２１］、４．０ｘ１０8個／ｍｌ；「ビーズ」）上に、ビオチニル化−ＩｇＧ−４（ファーミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）［カタログ番号５５５８７９］のクローンＪＤＣ１４、０．５ｍｇ／ｍｌ）と組み合わせて下記の通り固定化した：
【０３５３】
測定した各試料について、ビーズ１ｘ１０7個（ビーズ４．０ｘ１０8個／ｍｌで２５μｌ）および２μｇのビオチニル化α−ＩｇＧ−４を用いた。ＰＢＳをビーズに加えて１ｍｌとし、および混合物を１３，０００ｒｐｍにて１分間遠沈した。さらに１ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄後、混合物を再び遠沈した。ビーズを次いで、ビオチニル化α−ＩｇＧ−４を含む終容量１００μｌのＰＢＳに、滅菌エッペンドルフチューブ中で再懸濁し、および振とう機上に室温にて３０分間置いた。ＰＢＳを加えて１ｍｌとし、および混合物を１３，０００ｒｐｍにて１分間遠沈し、次いで１ｍｌのＰＢＳでさらに２回洗浄した。
【０３５４】
混合物を次いで１３，０００ｒｐｍにて１分間遠沈し、およびビーズを試料当たり５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。５０μｌのビオチニル化α−ＩｇＧ−４−被覆ビーズを各試料に加え、および混合物を回転振とう機上で４℃にて一夜インキュベートした。チューブを次いで１０００ｒｐｍにて５分間室温にて遠心した。ビーズを次いで１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、遠沈し、１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、滅菌エッペンドルフチューブに移し、さらに１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、遠沈し、および終容量１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに、すなわちビーズ１．０ｘ１０5個／μｌにて再懸濁した。
【０３５５】
Ｎ２７＃１１細胞（完全長ヒトＮｏｔｃｈ２およびＣＢＦ１−ルシフェラーゼレポーター構造を発現しているＣＨＯ細胞；Ｔ80フラスコ；国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット、ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ）に記載の通り、たとえばその実施例７を参照）を、０．０２％ＥＤＴＡ（トリプシン含有）溶液（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いて採取し、遠沈し、およびＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。細胞１０μｌを計数し、および細胞密度を１．０ｘ１０5個／ｍｌへ、新しいＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓを用いて調整した。２４−ウェルプレートのウェル当たり細胞１．０ｘ１０5個を、容量１ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ中に播種し、および細胞をインキュベーター内に置いて少なくとも３０分間沈降させた。
【０３５６】
ビーズ２０μｌを次いで２連で、一対のウェルへ加え、ビーズ２．０ｘ１０6個／ウェル（ビーズ１００個／細胞）とした。プレートをＣＯ2インキュベーター内に一夜置いた。次いですべてのウェルから上清を除去し、１００μｌのステディグロー（ＳｔｅａｄｙＧｌｏ）（登録商標）ルシフェラーゼ測定試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加え、および結果として生じる混合物を室温に５分間置いた。
【０３５７】
混合物を次いでピペットで２回吸引上下して細胞溶解を確実にし、および各ウェルからの内容物を９６ウェルプレート（Ｖ型ウェルの）へ移し、およびプレートホルダー中で５分間１０００ｒｐｍで室温にて遠心した。
【０３５８】
清澄化した上清１７５μｌを次いで白色９６ウェルプレート（ヌンク社（（Ｎｕｎｃ））へ、ビーズ沈澱を残して移した。
【０３５９】
発光を次いでトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）（登録商標）（パッカード社（Ｐａｃｋａｒｄ））カウンターで読み取った。
参考文献（参照により本開示に含まれる）
Artavanis-Tsakonas S, et al. (1995) Science 268:225-232.
Artavanis-Tsakonas S, et al. (1999) Science 284:770-776.
Brucker K, et al. (2000) Nature 406:411-415.
Camilli et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2634-2638.
Chee M. et al. (1996) Science 274:601-614.
Dkuz (1997) Cell 90: 271-280
Hicks C, et al. (2000) Nat. Cell. Biol. 2:515-520.
Hoyne G.F. et al (1999) Int Arch Allergy Immunol 118:122-124; 
Hoyne et al. (2000) Immunology 100:281-288; 
Hoyne G.F. et al (2000) Intl Immunol 12:177-185; 
Hoyne, G. et al. (2001) Immunological Reviews 182:215-227
Irvine KD (1999) Curr. Opin. Genet. Devel. 9:434-441.
Ju BJ, et al. (2000) Nature 405:191-195.
Leimeister C. et al. (1999) Mech Dev 85(1-2):173-7.
Li et al. (1998) Immunity 8(1):43-55.
Lieber, T. et al. (1993) Genes Dev 7(10):1949-65.
Lu, F. M. et al. (1996) Proc Natl Acad Sci 93(11):5663-7.
Matsuno K, et al. (1998) Nat. Genet. 19:74-78.
Matsuno, K. et al. (1995) Development 121(8):2633-44.
Medhzhitov et al. (1997) Nature 388:394-397.
McGuiness (1996) Genomics 35(3): 473-485
Meuer S. et al (2000) Rapid Cycle Real-time PCR, Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH & Co.
Moloney DJ, et al. (2000) Nature 406:369-375.
Munro S, Freeman M. (2000) Curr. Biol. 10:813-820.
Ordentlich et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:2230-2239.
Osborne B, Miele L. (1999) Immunity 11:653-663.
Panin VM, et al. (1997) Nature 387:908-912.
Schroeter EH, et al. (1998) Nature 393:382-386.
Struhl G, Adachi A. (1998) Cell 93:649-660.
Struhl, G. et al. (1998) Cell 93(4):649-60.
Takebayashi K. et al. (1994) J Biol Chem 269(7):150-6.
Tamura K, et al. (1995) Curr. Biol. 5:1416-1423.
Valenzuela et al. (1995) J. Neurosci. 15:6077-6084.
Weinmaster G. (2000) Curr. Opin. Genet. Dev. 10:363-369.
Wilson and Hemmati-Brivanlou (1997) Neuron 18:699-710.
【図面の簡単な説明】
【０３６０】
【図１】図１はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の略図を示す。
【図２】図２はＮｏｔｃｈリガンドＪａｇｇｅｄおよびＤｅｌｔａの略図を示す。
【図３】図３はさまざまなショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンド由来のＤＳＬドメインのアミノ酸配列の整列を示す。
【図４】図４はヒトＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３およびＤｅｌｔａ−４のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５はヒトＪａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２のアミノ酸配列を示す。
【図６】図６はヒトＤｅｌｔａ−１のコード（ポリヌクレオチド）配列を示す。
【図７ａ】図７はヒトＪａｇｇｅｄ−１のコード（ポリヌクレオチド）配列を示す。
【図７ｂ】図７はヒトＪａｇｇｅｄ−１のコード（ポリヌクレオチド）配列を示す。
【図８】図８は本発明において使用することができるさまざまなＮｏｔｃｈリガンドドメイン／ＩｇＦｃドメイン融合タンパク質の略図を示す。
【図９】図９は実施例２の結果を示す。
【図１０】図１０は実施例３の結果を示す。
【図１１】図１１は実施例４の結果を示す。
【図１２】図１２は実施例５の結果を示す。
【図１３】図１３は実施例５の結果を示す。
【図１】
2006513153.tif 000017
【図２】
2006513153.tif 000018
【図３】
2006513153.tif 000019
【図４】
2006513153.tif 000020
【図５】
2006513153.tif 000021
【図６】
2006513153.tif 000022
【図７ａ】
2006513153.tif 000023
【図７ｂ】
2006513153.tif 000024
【図８】
2006513153.tif 000025
【図９】
2006513153.tif 000026
【図１０】
2006513153.tif 000027
【図１１】
2006513153.tif 000028
【図１２】
2006513153.tif 000029
【図１３】
2006513153.tif 000030
【国際調査報告】
2006513153.tif 000031
2006513153.tif 000032