(57)【要約】本発明は、骨髄腫、とりわけ慣用的細胞傷害性化学療法に耐性の骨髄腫を有する温血動物、とりわけヒトの処置方法であって、当該動物に、エポチロンの治療上有効量、好ましくは式（Ｉ）【化１】2006504727.tif 000006で示されるエポチロンの治療上有効量を投与することを含んでなる方法、同時的、個別的または逐次的使用のためエポチロンを含んでなる組合せ剤；ならびに当該組合せ剤を含んでなる医薬組成物および市販パッケージに関する。
2006504727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄腫を有する温血動物の処置方法であって、エポチロンの治療上有効量を投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
エポチロンが、式Ｉ
【化１】
2006504727.tif 000004
〔式中、Ａは、ＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮは、水素または低級アルキルであり、Ｒは、水素または低級アルキルであり、Ｒ'は、メチル、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたはメチルチオであり、そしてＺは、Ｏまたは結合である。〕
で示される化合物
または医薬上許容されるその塩であって、それを必要としている温血動物用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温血動物がヒトである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
骨髄腫が慣用的細胞傷害性化学療法に耐性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
多剤耐性タンパク質ｐ１７０の過剰発現が観察される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
骨髄腫がタキサン、たとえばパクリタキセルに耐性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
疾患が多発性骨髄腫である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
式Ｉの化合物がエポチロンＢである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前回の処置から１〜６週間の間隔の後に３週間にわたって、約０.１〜６ｍｇ／ｍ２の用量でエポチロンＢを、週に１回投与することを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための、（ａ）式Ｉ
【化２】
2006504727.tif 000005
〔式中、Ａは、ＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮは、水素または低級アルキルであり、Ｒは、水素または低級アルキルであり、Ｒ'は、メチル、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたはメチルチオであり、そしてＺは、Ｏまたは結合である。〕
で示されるエポチロン、ならびに（ｂ）アルキル化剤、コルチコステロイドおよびアントラサイクリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物（ここで、活性成分（ａ）および（ｂ）は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤。
【請求項１１】
エポチロンがエポチロンＢである、請求項１０に記載の組合せ剤。
【請求項１２】
多発性骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための、請求項１１または１２に記載の組合せ剤。
【請求項１３】
骨髄腫の処置用医薬の製造のための、請求項１１または１２に記載の組合せ剤の使用。
【請求項１４】
骨髄腫の処置方法であって、それを必要としている温血動物に、骨髄腫に対して共同で治療上有効量の請求項１１において定義した組合せ剤を投与することを含んでなる方法。
【請求項１５】
骨髄腫に対して共同で治療上有効量の請求項１１に記載の組合せ剤および少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための指示書とともに、請求項１１において定義した組合せ剤を含んでなる市販パッケージ。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、骨髄腫、とりわけ慣用的細胞傷害性化学療法に耐性の骨髄腫を有する温血動物、とりわけヒトの処置方法であって、当該動物に、エポチロン、とりわけ本明細書において定義した式Ｉのエポチロンの治療上有効量を投与することを含んでなる方法；同時的、個別的または逐次的使用のための、エポチロン、ならびにアルキル化剤、コルチコステロイドおよびアントラサイクリンからなる群から選択される化合物および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤；ならびに当該組合せ剤を含んでなる医薬組成物および市販パッケージ（commercial package）に関する。
【０００２】
タキサン、たとえばパクリタキセルおよびドセタキセルは、多くの増殖性疾患、たとえば卵巣癌のような固形腫瘍疾患においてよく使用される微小管安定化剤のクラスを表す。しかしながら、タキサンは、骨髄腫の処置においてあまり期待されていなかった。エポチロン、たとえばエポチロンＡ、ＢおよびＤのみならず、そのアナログも、新たなクラスの微小管安定化剤を表す（Gerth, K. et al., J. Antibiot. 49, 560-3 （1996）；またはHoefle et al., DE 41 38 042参照）。驚くべきことに、今回、エポチロン、とりわけ本明細書において定義した式Ｉのエポチロンおよび、特に、エポチロンＢが骨髄腫細胞の増殖および生存を直接的に阻害することが見いだされた。
【０００３】
さらに、骨髄ストローマ細胞（ＢＭＳＣ）への患者の多発性骨髄腫細胞の接着は、多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害し、そしてＢＭＳＣに接着する骨髄腫細胞の細胞死増殖を促進するエポチロンの能力を増強する。
【０００４】
それゆえ、本発明は、骨髄腫、とりわけ慣用的細胞傷害性化学療法に耐性の骨髄腫の処置方法であって、それを必要としている温血動物、好ましくはヒトに、エポチロンの治療上有効量、好ましくは式Ｉ
【化１】
2006504727.tif 000003
〔式中、Ａは、ＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮは、水素または低級アルキルであり、Ｒは、水素または低級アルキルであり、Ｒ'は、メチル、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたはメチルチオであり、そしてＺは、Ｏまたは結合である。〕
で示されるエポチロン
または医薬上許容されるその塩の治療上有効量を投与することを含んでなる方法に関する。
【０００５】
本発明は、特に
（ａ）多剤耐性タンパク質ｐ１７０の過剰発現が観察され、そして／または
（ｂ）骨髄腫がタキサン、たとえばパクリタキセルまたはドセタキセルに耐性である
骨髄腫の処置方法に関する。
【０００６】
本明細書において使用される「骨髄腫」なる用語は、骨髄内で通常見られる種類の細胞から構成される腫瘍に関する。本明細書において使用される「多発性骨髄腫」なる用語は、多発性骨髄腫病巣およびＭ成分（モノクローナル・イムノグロブリン・フラグメント）の分泌により特徴づけられ、骨疼痛、病的骨折、高カルシウム血症および正球性正色素性貧血をもたらす広範な溶骨性病片を伴う、形質細胞の拡散した悪性新生物を意味する。多発性骨髄腫を、慣用的細胞傷害性および高用量化学療法剤の使用により治療することはできない。
【０００７】
本明細書および特許請求の範囲を通して、骨髄腫は、好ましくは多発性骨髄腫（ＭＭ）を意味する。
【０００８】
特記しない限り、本明細書において、「低級」と示された有機基および化合物は、７以下、好ましくは４以下の炭素原子を含む。
【０００９】
ＡがＯを表し、Ｒが水素であり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺがＯである式Ｉの化合物は、エポチロンＡとして知られ；ＡがＯを表し、Ｒがメチルであり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺがＯである式Ｉの化合物は、エポチロンＢとして知られ；ＡがＯを表し、Ｒが水素であり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺが結合である式Ｉの化合物は、エポチロンＣとして知られ；ＡがＯを表し、Ｒがメチルであり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺが結合である式Ｉの化合物は、エポチロンＤとして知られている。
【００１０】
ＡがＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮが水素または低級アルキルであり、Ｒが水素または低級アルキルであり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺがＯまたは結合である式Ｉのエポチロン誘導体、およびかかるエポチロン誘導体の製造方法は、特に、包括的にかつ具体的に、以下の特許および特許出願：ＷＯ  ９３／１０１２１、ＵＳ  ６,１９４,１８１、ＷＯ  ９８／２５９２９、ＷＯ  ９８／０８８４９、ＷＯ  ９９／４３６５３、ＷＯ  ９８／２２４６１およびＷＯ  ００／３１２４７に、それぞれの場合において、特にその化合物クレームおよび実施例の最終産物において開示されている；これらの最終産物、医薬調製物および請求項の発明主題を、これらの文献を引用することにより本願の一部とする。同様に、当該文献に開示されている、対応する立体異性体ならびに対応する結晶変形（crystal modification）、たとえば溶媒和物および結晶多形なども含まれる。式Ｉのエポチロン誘導体、特にエポチロンＢは、ＷＯ ９９／３９６９４に開示された医薬組成物の一部として投与され得る。
【００１１】
ＡがＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮが水素または低級アルキルであり、Ｒが水素または低級アルキルであり、Ｒ'がメトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたはメチルチオであり、そしてＺがＯまたは結合である式Ｉのエポチロン誘導体、およびかかるエポチロン誘導体の製造および投与方法は、特に、包括的にかつ具体的に、特許出願ＷＯ  ９９／６７２５２（これを、出典明示により本願の一部とする。）において開示されている。同様に、当該文献に開示されている、対応する立体異性体ならびに対応する結晶変形（crystal modification）、たとえば溶媒和物および結晶多形なども含まれる。
【００１２】
エポチロンＢの対応するラクタムへの変換については、ＷＯ  ９９／０２５１４のスキーム２１（３１、３２ページ）および実施例３（４８〜５０ページ）に開示されている。エポチロンＢとは異なる式Ｉの化合物の、対応するラクタムへの変換は、同様に実施され得る。ＲＮが低級アルキルである対応する式Ｉのエポチロン誘導体は、ＲＮが水素であるエポチロン誘導体から出発して、還元的アルキル化反応のような当分野において既知の方法により製造することができる。
【００１３】
方法の議論において、活性成分についての言及は、医薬上許容される塩も包含することを意味することが理解されるであろう。これらの活性成分が、もしたとえば少なくとも１つの塩基性中心を有するならば、それらは酸付加塩を形成することができる。対応する酸付加塩を、所望によりさらに存在する塩基性中心を有するように形成させることもできる。酸性基（たとえば、ＣＯＯＨ）を有する活性成分は、また、塩基との塩を形成し得る。活性成分またはその医薬上許容される塩は、また、水和物の形態で使用されるか、または結晶化に使用した他の溶媒を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の１つの好適な実施態様において、ＡがＯを表し、Ｒが低級アルキル、とりわけメチル、エチルまたはｎ−プロピル、または水素であり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺがＯまたは結合である式Ｉのエポチロン誘導体が使用される。さらに好ましくは、ＡがＯを表し、Ｒがメチルであり、Ｒ'がメチルであり、そしてＺがＯである式Ｉのエポチロン誘導体（この化合物はエポチロンＢとしても知られている。）が使用される。
【００１５】
本明細書において使用される「処置」なる用語は、骨髄腫を有するか、当該疾患の前段階にある患者の処置を含み、この処置は、当該患者において疾患の進行の遅延をもたらし、そして好ましくは処置に対する完全寛解（complete response）、処置に対する部分寛解（partial response）または疾患の安定化（stable disease）をもたらすことを目的とする。
【００１６】
本明細書において使用される「完全寛解」なる用語は、特にすべての測定可能または評価可能な疾患の解消を意味する。
【００１７】
本明細書において使用される「部分寛解」なる用語は、特に、任意の特定の病変部位における進行の不存在下で測定可能または評価可能な疾患の５０％を超えるかまたはそれに等しい減少を意味する。
【００１８】
本明細書において使用される「疾患の安定化」なる用語は、特に、測定可能または評価可能な疾患の５０％未満の減少または２５％未満の増加を意味する。
【００１９】
本発明は、特に、骨髄腫の処置において使用するための同時的、個別的または逐次的使用のための、（ａ）エポチロン、ならびに（ｂ）アルキル化剤、コルチコステロイドおよびアントラサイクリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含んでなる組合せ剤（combination）にも関する。
【００２０】
本明細書において使用される「アルキル化剤」なる用語は、アルキルスルホナート、アジリジン、エポキシド、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、イミダゾテトラジノン、ダカルバジン、マンノムスチン（mannomustine）、ミトブロニトール、ミトラクトール（mitolactol）、ピポブロマンおよびプロカルバジンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２１】
本明細書において使用される「アルキルスルホナート」なる用語は、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（piposulfan）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２２】
本明細書において使用される「アジリジン」なる用語は、ベンゾデパ（benzodepa）、カルボコン、メツレデパ（meturedepa）およびウレデパ（uredepa）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
本明細書において使用される「エチレンイミンおよびメチルメラミン」なる用語は、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
本明細書において使用される「ナイトロジェンマスタード」なる用語は、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキサイド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン（prednimustine）、トロホスファミド（trofosfamide）およびウラシルマスタードを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
本明細書において使用される「ニトロソウレア」なる用語は、カルムスチン、クロロゾトシン（chlorozotocin）、サイテムスチン（cytemustine）、フォテムスチン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ニムスチンおよびラニムスチンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
本明細書において使用される「イミダゾテトラジノン」なる用語は、テモゾロマイドおよびミトゾロミドを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２７】
「テモゾロマイド」なる用語は、ＵＳ ５,２６０,２９１において記載されている。テモゾロマイドの合成は、たとえば Wang et al., J. Org. Chem. 1997, 62, 7288-7294のように、よく知られている。テモゾロマイドは、たとえばＴＥＭＯＤＡＬ（商標）、ＴＥＭＯＤＡＲ（商標）またはＴＥＭＯＸＯＬ（商標）の商標名で商品として入手可能であり、そしてＵＳ ５,９４２,２４７において記載されたように、または中入れ書（package insert）の情報にしたがって投与され得る。「ロムスチン」なる用語は、Johnson P et al., J. Med. Chem. 1966, 9, 892において記載され、そして製造されるような化合物を意味する。ロムスチンは、ＢＥＴＵＬＵＳＴＩＮＥ（商標）の商標名で商品として入手可能であり、そして中入れ書の情報にしたがって投与され得る。
【００２８】
本明細書において使用される「アントラサイクリン」は、ドキソルビシンおよびダウノルビシンを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２９】
さらに、本明細書において名前により記載された活性成分の構造は、標準的概説書「ザ・メルク・インデックス（The Merck Index）」の現行版から、またはデータベース、たとえばパテンツ・インターナショナル（Patents International）（たとえば、IMS World Publications）から取り出すことができる。その対応する内容を、引用により本明細書の一部とする。当業者であれば、これらの文献に基づいて、標準的な試験モデルにおいて、インビトロおよびインビボの両方で医薬適用および特性を、製造および試験することができる。
【００３０】
（ａ）エポチロン、ならびに（ｂ）アルキル化剤、コルチコステロイドおよびアントラサイクリンなる群から選択される少なくとも１つの化合物（ここで、活性成分は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）および所望により医薬上許容される少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤を、以下、本明細書において「本発明の組合せ剤」と称する。
【００３１】
「本発明の組合せ剤」は組合せ調製物（combined preparation）または医薬組成物（pharmaceutical composition）であり得る。
【００３２】
本明細書において使用される「組合せ調製物」なる用語は、上で定義した活性成分が独立に投与され得るか、または当該成分の識別し得る量での異なる一定の組合せで投与され得る、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与され得るという意味で、「パーツのキット（kit of parts）」と特に定義する。「パーツのキット」のパーツは、したがって、同時に投与されるか、または時間をずらして、すなわち、異なる時点で、同じまたは異なる時間間隔で、「パーツのキット」のいずれかのパーツを投与され得る。特に好ましいのは、パーツの併用使用により処置する疾患に対する効果が活性成分のいずれか一方のみの使用により得られる効果よりも大きくなるように時間間隔を選定することである。組合せ調製物として投与すべき活性成分１と活性成分２の総量比は、処置すべき患者下位集団の必要性に対処するために、または患者個人に必要であって、その異なる必要性がその患者の特定の疾患、年齢、性別、体重などによるものである場合、それに対処するために変更することは可能である。好ましくは、少なくとも一つの有益性があること、たとえば、第一成分および第二成分の作用を相互に、特に相乗的に強め合うこと、たとえば、相加作用よりも強いこと、さらなる有利な作用があること、副作用が少ないこと、第一および第二活性成分の一方または双方の非有効用量で併用治療効果のあること、また極めて好適には第一および第二活性成分の強力な相乗効果のあることである。
【００３３】
さらに、本発明は、骨髄腫の処置方法であって、それを必要としている温血動物に、骨髄腫に共同で治療上有効量の「本発明の組合せ剤」を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３４】
当業者であれば、関連する試験モデルを選択して、エポチロンまたは「本発明の組合せ剤」の本明細書に前記または後記する骨髄腫に対する有益な効果を証明することができる。エポチロンまたは「本発明の組合せ剤」の薬理学的活性は、たとえば適当な臨床試験でまたは下記実施例によって証明され得る。下記の方法により、エポチロンＢは、１〜１０ｎＭのＩＣ９０でＭＭ細胞の増殖および生存を阻害することが示され得る。エポチロンＢは、ＭＭ細胞におけるＧ２Ｍアレストおよびその後のアポトーシスを誘導する。適当な臨床試験には、たとえば進行骨髄腫患者におけるオープンラベル、非無作為化、用量漸増試験である。かかる研究は、特に、「本発明の組合せ剤」で観察される相乗作用を証明する。骨髄腫への有益な効果は、当業者に自体公知の試験の結果からまたは研究設計の変更によって直接判定できる。たとえば、１つの組合せパートナーを固定用量で投与し、第二の組合せパートナーの用量を最大耐性用量（ＭＴＤ）に達するまで増量できる。あるいは、プラセボ対照、二重盲検を行っても本明細書に記載した「本発明の組合せ剤」の利点を証明できる。
【００３５】
本発明の１つの目的は、「本発明の組合せ剤」を含む骨髄腫に対して共同で治療上有効量を含む医薬組成物を提供することである。この組成物において、組合せパートナーは、一緒に、一方の後に他方を、または１つの組合せ単位投与形態もしくは２つの個別的単位投与形態で個別的に投与され得る。単位投与形態は、また、固定組合せ剤（fixed combination）であり得る。
【００３６】
組合せパートナーの個別投与のための、および固定組合せ剤、すなわち少なくとも２つの組合せパートナーを含んでなる単一ガレヌス組成物での投与のための本発明の医薬組成物は、自体既知の方法で製造され得、そしてヒトを含む哺乳類（温血動物）への経腸、たとえば経口または経直腸、および非経腸投与に適したものであり、そして単独で、または１もしくはそれ以上の医薬上許容される担体（とりわけ、経腸もしくは非経腸適用に適したもの）と組み合わせて少なくとも１つの薬理学的に活性な組合せパートナーの治療上有効量を含む。
【００３７】
新規医薬組成物は、たとえば、約１０％〜約１００％、好ましくは約２０％〜約６０％の活性成分を含有する。経腸もしくは非経腸投与のための組合せ治療用医薬調製物は、たとえば、単位用量形態のもの、たとえば糖衣錠、錠剤、カプセル剤または坐剤、およびさらにアンプル剤である。特記しない限り、これらは、自体公知の方法で、たとえば慣用的混合、造粒、シュガーコーティング、溶解または凍結乾燥により製造される。各投与形態のそれぞれの用量に含まれる組合せパートナーの単位含量はそれ自体で有効量を構成する必要はない。というのは、必要な有効量は複数の投与単位の投与により達成され得るからである。
【００３８】
特に、「本発明の組合せ剤」の組合せパートナーのそれぞれの治療上有効量は、同時的または逐次的に、および任意の順序で投与され得、そして成分は個別的または固定された組合せとして投与され得る。たとえば、本発明の骨髄腫の処置方法は、同時的または任意の順序で逐次的に、共同で治療上有効量の、好ましくは相乗的に有効な量で、たとえば本明細書において記載した量に対応する１日用量で、（ｉ）遊離または医薬上許容される塩の形態の組合せパートナー（ａ）の投与および（ｉｉ）遊離または医薬上許容される塩の形態の組合せパートナー（ｂ）の投与を含み得る。「本発明の組合せ剤」の個々の組合せパートナーは、治療過程の異なる時点で個別的に、または分割もしくは単一組合せ形態で同時一体的（concurrently）に投与され得る。さらに、「投与」なる用語は、また、インビボで組合せパートナー自体に変換される組合せパートナーのプロドラッグの使用を含む。したがって、本発明は、同時的または交互的処置のかかるレジメンのすべてを包含すると理解されるべきであり、そして「投与」なる用語もそれに応じて解釈されるべきである。
【００３９】
「本発明の組合せ剤」において使用されるエポチロンおよび組合せパートナーの有効用量は、使用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、処置される骨髄腫のタイプ、処置される骨髄腫の重度に依存して変動する。したがって、投与レジメン「本発明の組合せ剤」は、投与経路ならびに患者の腎臓および肝臓機能を含む種々の因子にしたがって選択される。通常の知識を有する医師、臨床医または獣医は、病状の進行を予防し、対抗し、または阻止するのに必要とされるエポチロンまたは「本発明の組合せ剤」の単一活性成分の有効量を容易に決定し、そして処方することができる。有効性を示し毒性を示さない範囲内での活性成分濃度を決める最適精度を得るには、標的部位での活性成分の利用能の動力学に基づくレジメンが必要である。
【００４０】
「本発明の組合せ剤」において使用される組合せパートナーが単一薬物として市販されている形態で適用される場合、それらの用量および投与様式は、特記しない限り、本明細書において記載した有利な効果をもたらすために、個々の市販薬の中入れ書（package insert）に提供された情報にしたがって行われ得る。
【００４１】
温血動物がヒトである場合、成人患者の場合には、式Ｉの化合物の用量は、好ましくは、２〜４週間、たとえば３週間毎週１回、約０.１〜７５、好ましくは０.２５〜５０の範囲、たとえば２.５または６ｍｇ／ｍ２で、その後、６〜８日間休止する。
【００４２】
本発明の１つの実施態様において、エポチロンＢは、先行治療の後、１〜６週間の間隔、とりわけ１週間の間隔をおいた後に３週間、約０.１〜６ｍｇ／ｍ２、好ましくは０.１〜３ｍｇ／ｍ２、たとえば２.５ｍｇ／ｍ２の用量で毎週投与される。本発明の別の実施態様において、該エポチロンＢは、好ましくは、約０.５〜７.５ｍｇ／ｍ２の用量で、１８〜２４日毎にヒトに投与される。
【００４３】
テモゾロマイドは、好ましくは、２８日サイクルにつき、５連続日のサイクルで５０〜３００ｍｇ／ｍ２／日、最も好ましくは２００ｍｇ／ｍ２／日の用量で毎日投与される。以前に化学療法を受けた患者については、処置は、一般に、１５０ｍｇ／ｍ２／日にて開始される。
【００４４】
ロムスチンは、好ましくは、６週間ごとに１回６０〜１８０ｍｇ／ｍ２の単回用量で、好ましくは１３０ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【００４５】
さらに、本発明は、骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための指示書とともに、活性成分として「本発明の組合せ剤」を含んでなる市販パッケージを提供する。
【００４６】
本発明は、また、骨髄腫の処置用医薬の製造のための本明細書において定義した式Ｉの化合物の使用および「本発明の組合せ剤」の使用を提供する。
【００４７】
実施例
一般的事項
ＲＰＭＩ８２２６およびＵ２６６ヒトＭＭ細胞系統は、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。患者由来のＭＭ細胞を、Y.T. Tai, G. Teoh, Y. Shima et al, J. Immunol. Methods 235:11, 2000に記載のようにして患者のＢＭサンプルから精製する。ヒトＭＭ細胞系統を、すべて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタチオン（L-glut, GIBCO, Grand Island, NY）２ｍｍｏｌ／Ｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ（P/S, GIBCO）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（Sigma Chemical, St. Louis, MO）中で培養する。ＭＭ患者の細胞では、９５％以上がＣＤ３８＋、ＣＤ４５ＲＡ−である。骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）は、ＭＭ患者ならびに健康なドナーの吸引物からD. Gupta, S. Treon, Y. Shima et al, Leukemia, 2001 およびS. Gartner, H.S. Kaplan, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 77:4756, 1980に記載のようにして調製する。細胞を、２０％ＦＢＳ、Ｌ−ｇｌｕｔ２ｍｍｏｌ／Ｌ、およびＰ／Ｓ１００μｇ／ｍＬ添加ＩＳＣＯＶＥ修正ダルベッコ培地で培養する。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ・Ｐ１６８）を、Clonetics, Biowhittakerから購入し、そしてＥＧＭ−２ＭＶ培地（Clonetics, Biowhittaker）中に維持する。エポチロンをジメチルスルホキシド（DMSO; Sigma）に溶かし、使用するまで−２０℃でストック溶液として貯蔵する。全ての検定で、化合物を０．０１μＭから１００μＭまでの範囲の濃度に培養用培地で希釈する。
【００４８】
サイトカイン濃度は、前記の共培養系からの上清中で測定する。ＶＥＧＦおよびＩＬ−６濃度は商品として入手可能なＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定する。
【００４９】
細胞タンパク質溶解物、免疫沈澱およびウェスタンブロット分析
ＭＭ細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ中で１２時間スターブし、次いでＦＢＳ不含ＲＰＭＩ−１６４０中で、エポチロンまたはＤＭＳＯ対照の存在下で１時間インキュベーションする。続いて、これらの細胞をK. Podar, Y.T. Tai, et al in Blood 98:428, 2001の記載にしたがって１００ｎＭ−ＶＥＧＦ１６５で刺激する。次いで、細胞を１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ バナジン酸ナトリウムおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Protease inhibitor cocktail）（Boehringer Mannheim）添加ＲＩＰＡ緩衝液中に溶解させる。溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で直接分析するか、またはＦｌｔ−１に対する抗体（Ａｂ）ならびにプロテインＧ・プラス−アガロース（共にSanta Cruz Biotechnology, CA、製品）と共に一夜インキュベーションする。全細胞溶解物（レーン当り３０μｇ）または免疫沈澱物を８％〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析し；Hybond C Super paper（Amersham, Arlington Heights, IL）に移す；次いで、ホスホ−ＥＲＫに対するネズミＭｏＡｂ、ホスホ−チロシン残基に対するネズミＭｏＡｂ、またはＦｌｔ−１またはＥＲＫ２に対するＡｂｓ（Santa Cruz）でプローブし；そしてＨＲＰ−複合抗ネズミまたは抗ウサギＡｂ（共にSanta Cruz）および強化化学発光（ＥＣＬ）基質溶液（Amersham）を使用して検出して証明する。
【００５０】
ウエスタンブロッティング
薬物処理したおよび対照ＭＭ細胞からのタンパク質溶解物を、プロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、および１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムの存在下でＲＩＰＡを用いて調製する。溶解物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルで直接的に分析し；Hybond C Super paper（Amersham, Arlington Heights, IL）に移し；ｂｃｌ−２（Santa Cruz, Santa Cruz, CA）、ｂａｘ（Santa Cruz）、またはＰＡＲＰ（Biomol, West Grove, PA）に対するネズミＭｏＡｂ、またはキャスパーゼ３（Santa Cruz）に対するウサギポリクローナル抗体、ならびにアクチンに対するヤギポリクローナル抗体でプローブし；そしてＨＲＰ−複合抗ネズミまたは抗ヤギ抗体（共にSanta Cruz）および強化化学発光（ＥＣＬ）基質溶液（Amersham）を使用して検出する。
【００５１】
増殖および細胞生存率の検定
ＭＭ細胞を、最初に１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１２時間スターブし、次いで、薬剤またはＤＭＳＯ対照の存在下で９６ウェルマイクロタイタープレート（Costar, Cambridge, MA）に塗布する。実験を、またＶＥＧＦ１６５（R and D Systems）の存在下または不存在下でも行う。増殖を、［３Ｈ］−チミジン（NEN Products, Boston, MA）の取り込みによって測定する。具体的には、細胞を、４８時間培養の最後の６時間に［３Ｈ］−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）でパルスし、automatic cell harvester（Cambridge Technology, Cambridge, MA）を用いてガラスフィルター上に収集し、LKB Betaplateシンチレーションカウンター（Wallac, Gaithersburg, MD）を使用してカウントする。細胞生存率の測定を、CellTiter96 AQueous One Solution Reagent（Promega, Madison, WI）を利用するＭＴＳ検定によって比色的に行う。細胞を、４８時間培養の最後の２時間にＭＴＳと接触させ、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダー（Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA）を用いて５７０ｎｍにおけるＯＤを測定して吸光度を測定する。
【００５２】
細胞周期分析
ＭＭ細胞（１×１０６細胞）を、エポチロンＢまたはＤＭＳＯ対照の存在下で２４、４８および７２時間培養する。次いで、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、７０％エタノールで固定し、そしてＲＮＡｓｅ（Sigma）で処理する。次に、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５μｇ／ｍＬ）で染色し、Epics flow cytometer（Coulter Immunology, Hialeah, FL）を用いるＭソフトウェアで細胞周期の特徴を判定する。
【００５３】
実施例１：付着システム中でのＭＭ細胞の増殖
ＢＭＳＣ（１×１０4細胞／ウェル）を、９６ウェルマイクロタイタープレートに塗布し、ＩＳＣＯＶＥ培地（２０％ＦＢＳ）中、３７℃で２４時間インキュベーションする。次いで、ＭＭ細胞を、エポチロンまたはＤＭＳＯ対照の存在下でＢＭＳＣ含有ウェル（５×１０４細胞／ウェル）に添加する。ＭＭ．１Ｓ細胞を使用する場合は、ＢＭＳＣとＭＭ細胞との双方を２％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１２時間スターブする。患者ＰＣＬ細胞を使用する場合は、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ培地中で共培養を行う。ＢＭＳＣおよびＭＭ細胞は個別に培養して対照とする。４８時間後、増殖および細胞生存率を前記のようにして分析する。増殖検定のために全ての細胞が捕集されることを確認するために、収集の１０分前に１０×トリプシン（Sigma）を各ウェルに添加する。
【００５４】
実施例２：修正Boyden ChamberトランスウェルシステムにおけるＭＭ細胞の増殖
増殖を、０．４ｍｍポアサイズ挿入物入り２４ウェルプレート（Costar）を使用して修正Boyden chamberトランスウェルシステムで測定する。ＢＭＳＣ（４×１０４細胞／ウェル）を下室に塗布し、スターブし、そして前記のようにエポチロン中でインキュベーションする。次いで、ＭＭ細胞（２０×１０４細胞／ｍＬ）を上室に入れ（注入）、そして４８時間後に各室への［３Ｈ］−チミジン取り込みを前記のように測定する。
【００５５】
実施例３：サイトカイン濃度の測定
サイトカイン濃度を、上記の共培養システムからの上清中で測定した。ＶＥＧＦおよびＩＬ−６の濃度を、商品として入手可能なＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定した。
【００５６】
実施例４：ＭＭ．１Ｓ細胞増殖に及ぼすエポチロンＢの効果
ＭＭ．１Ｓ細胞をトランスウェル共培養システムの上室に入れて、ＭＭ細胞とＢＭＳＣとの間の直接的接触は妨害されるが、体液性因子の拡散が可能になるようにする。両細胞型の間に接触がないにも拘らず、ＢＭＳＣとインキュベーションしたＭＭ．１Ｓ細胞による［３Ｈ］−ｄＴの取り込みは４８時間で約２．２倍（ｐ＜０．０００１）増加する。対照的に、この共培養システムにおけるＢＭＳＣは［３Ｈ］−ｄＴ取り込みの有意な増加を示さない。この共培養システムにより、エポチロンＢがＭＭ．１Ｓ細胞の増殖を低下させることが示され得る。
【００５７】
実施例５：インビボでのヒトＭＭ細胞に対するエポチロンＢの効果
マウスの右脇腹に、１００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０中の３×１０７ ＭＭ細胞を、１００μＬのマトリゲル基底メンブランマトリックス（Becton Dickinson, Bedford, MA）とともに、皮下接種する。注射後第６日目に、マウスを、エポチロンＢを投与された処置群または対照群に振り分ける。エポチロンＢでの処置は、第６日目に始まって、週に１回４週間にわたって尾静脈を介して経静脈的に２.５ｍｇ／ｋｇにて投与されるか、または第６日目に１度に４ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。対照群は、ビヒクルのみ（０.９％塩化ナトリウム中３０％ＰＥＧ−３００）を毎週投与される。最長直交腫瘍直径のキャリパー測定を週に２回行い、楕円の三次元的容積を表す以下の式：
４／３×（幅／２）２×（長さ／２）
を用いて腫瘍容積を推定する。それらの腫瘍が２ｃｍに達するか、またはマウスが瀕死となった場合、動物を屠殺する。腫瘍注射の最初の日から死ぬまで、生存を評価する。
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月14日(2004.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄腫を有する温血動物を処置するための、式Ｉ
【化１】
2006504727.tif 000007
〔式中、Ａは、ＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮは、水素または低級アルキルであり、Ｒは、水素または低級アルキルであり、Ｒ'は、メチル、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたはメチルチオであり、そしてＺは、Ｏまたは結合である。〕
で示されるエポチロン
または医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２】
温血動物がヒトである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
骨髄腫が慣用的細胞傷害性化学療法に耐性である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
多剤耐性タンパク質ｐ１７０の過剰発現が観察される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
骨髄腫がタキサン、たとえばパクリタキセルに耐性である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
疾患が多発性骨髄腫である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
式Ｉの化合物がエポチロンＢである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前回の処置から１〜６週間の間隔の後に３週間にわたって、約０.１〜６ｍｇ／ｍ２の用量でエポチロンＢを、週に１回投与することを含んでなる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＡがＯであり；Ｒがメチルであり；Ｒ'がメチルチオであり；そしてＺがＯである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための、（ａ）式Ｉ
【化２】
2006504727.tif 000008
〔式中、Ａは、ＯまたはＮＲＮを表し、ＲＮは、水素または低級アルキルであり、Ｒは、水素または低級アルキルであり、Ｒ'は、メチル、メトキシ、エトキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノまたはメチルチオであり、そしてＺは、Ｏまたは結合である。〕
で示されるエポチロン、ならびに（ｂ）アルキル化剤、コルチコステロイドおよびアントラサイクリンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物（ここで、活性成分（ａ）および（ｂ）は、それぞれの場合において、遊離の形態または医薬上許容される塩の形態で存在する。）および所望により少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる組合せ剤。
【請求項１１】
エポチロンがエポチロンＢである、請求項１０に記載の組合せ剤。
【請求項１２】
ＡがＯであり；Ｒがメチルであり；Ｒ'がメチルチオであり；そしてＺがＯである、請求項１０に記載の組合せ剤。
【請求項１３】
多発性骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組合せ剤。
【請求項１４】
骨髄腫の処置用医薬の製造のための、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組合せ剤の使用。
【請求項１５】
それを必要としている温血動物に、骨髄腫に対して共同で治療上有効量である、請求項１０に記載の組合せ剤。
【請求項１６】
骨髄腫に対して共同で治療上有効量の請求項１０に記載の組合せ剤および少なくとも１つの医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
骨髄腫の処置における同時的、個別的または逐次的使用のための指示書とともに、請求項１０において定義した組合せ剤を含んでなる市販パッケージ。
【国際調査報告】
2006504727.tif 000009
2006504727.tif 000010
2006504727.tif 000011
2006504727.tif 000012
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