(57)【要約】アミロイドペプチド凝集体上に見出される一個以上の立体配座エピトープを含む問題の組成物、このようなエピトープに対する抗体、ならびにこれらの組成物、エピトープおよび／または抗体を作製および使用するための方法。本発明は、アミロイド疾患（例えばアルツハイマー病）に罹患しているか、またはそれを発症する可能性があるヒト患者または獣医学的患畜中に存在するペプチド凝集体（例えば毒性ペプチド凝集体）上に見出される特定の立体配座エピトープを含むか、またはそのようなエピトープからなる合成組成物または単離された組成物を含む。本発明は、このような組成物を使用したヒトまたは動物における疾患の検出、治療および予防のための方法を含む。本発明はさらに、この立体配座エピトープに結合する抗体だけでなく、このような抗体を作製するための方法、そしてこのような抗体を使用した疾患の検出、治療および予防のための方法ならびに／または潜在的治療剤の同定のための方法（例えば薬物スクリーニング）を含む。
2006516535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
始原原線維凝集体の立体配座エピトープを含む単離された組成物であって、該始原原線維凝集体はａ）ヒトまたは動物において形成し、かつｂ）アミロイド原線維形成に寄与する組成物。
【請求項２】
前記組成物は合成品である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物はペプチドを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが立体配座的に拘束されている請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが配列番号１である請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が表面によって支持されている請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記表面が湾曲または平坦である請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記表面が固体を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記表面がフィルム、粒子またはシートの表面を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記表面がタンパク質を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記タンパク質がα−プリーツシートを含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が前記支持体表面に結合している請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が前記支持体表面に化学的に結合している請求項７に記載の組成物。
【請求項１５】
前記化学的な結合が共有結合である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記支持体が、金、亜鉛、カドミウム、錫、チタン、銀、セレン、ガリウム、インジウム、砒素、ケイ素、これらの混合物およびこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む請求項７に記載の組成物。
【請求項１７】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記始原原線維凝集体が５個以上のモノマーを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
アミロイドペプチドモノマーが前記エピトープを実質的に含まない請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
アミロイド原線維が前記エピトープを実質的に含まない請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が医薬組成物である請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物がワクチンである請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
始原原線維凝集体のエピトープを含む単離された組成物であって、該始原原線維凝集体は、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与し、前記アミロイド原線維は前記エピトープを実質的に含まない組成物。
【請求項２９】
前記組成物は合成品である請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
アミロイドペプチドモノマーが前記エピトープを実質的に含まない請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物がペプチドを含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ペプチドが立体配座的に拘束されている請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ペプチドが配列番号１である請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物が表面によって支持されている請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
前記表面が湾曲または平坦である請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記表面が固体を含む請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記表面がフィルム、粒子またはシートである請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記表面がタンパク質を含む請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
前記タンパク質がα−プリーツシートを含む請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記組成物が前記支持体表面に結合している請求項３５に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が前記支持体表面に化学的に結合している請求項３５に記載の組成物。
【請求項４３】
前記化学的な結合が共有結合である請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記支持体が、金、亜鉛、カドミウム、錫、チタン、銀、セレン、ガリウム、インジウム、砒素、ケイ素、これらの混合物およびこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む請求項３５に記載の組成物。
【請求項４５】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項２８に記載の組成物。
【請求項４６】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項４７】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項４８】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項４９】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項２８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物が医薬組成物である請求項２８に記載の合成組成物。
【請求項５３】
前記組成物がワクチンである請求項２８に記載の組成物。
【請求項５４】
単離された抗体を含む組成物であって、該抗体は、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープに結合する組成物。
【請求項５５】
前記抗体が前記始原原線維凝集体の毒性を低減させるのに有効である請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項５４に記載の組成物。
【請求項５８】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項５４に記載の組成物。
【請求項５９】
アミロイドペプチドモノマーが前記立体配座エピトープを実質的に含まない請求項５４に記載の組成物。
【請求項６０】
アミロイド原繊維が前記エピトープを実質的に含まない請求項５４に記載の組成物。
【請求項６１】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項５４に記載の組成物。
【請求項６２】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項５４に記載の組成物。
【請求項６３】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項６２に記載の組成物。
【請求項６５】
前記組成物が医薬組成物である請求項５４に記載の組成物。
【請求項６６】
単離された抗体を含む組成物であって、該抗体は、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープに結合し、該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まない組成物。
【請求項６７】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
アミロイドペプチドモノマーが前記エピトープを実質的に含まない請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記抗体が前記始原原線維凝集体の毒性を低減させるのに有効である請求項６６に記載の組成物。
【請求項７０】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項６６に記載の組成物。
【請求項７１】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項６６に記載の組成物。
【請求項７２】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項６６に記載の組成物。
【請求項７３】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項６６に記載の組成物。
【請求項７４】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
前記組成物が医薬組成物である請求項６６に記載の組成物。
【請求項７７】
ヒトまたは動物の被験体において疾患または症状を予防または治療する方法であって、該疾患または症状はアミロイド沈着の存在によって特徴付けられ、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープを含む組成物の治療有効量または予防量を該被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項７８】
工程Ａが前記立体配座エピトープに対する免疫応答を誘導する工程を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記組成物がペプチド成分を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記ペプチドが立体配座的に拘束されている請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ペプチドが配列番号１である請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記組成物が表面によって支持されている請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記表面が湾曲または平坦である請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記表面が固体を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記表面がフィルム、粒子またはシートである請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記表面がタンパク質を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記タンパク質がα−プリーツシートを含む請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記組成物が前記支持体表面に結合している請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記組成物が前記支持体表面に化学的に結合している請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記化学的な結合が共有結合である請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記支持体が、金、亜鉛、カドミウム、錫、チタン、銀、セレン、ガリウム、インジウム、砒素、ケイ素、これらの混合物およびこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項７７に記載の方法。
【請求項９５】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項７７に記載の方法。
【請求項９６】
アミロイドペプチドモノマーが前記エピトープを実質的に含まない請求項７７に記載の方法。
【請求項９７】
アミロイド原線維が前記エピトープを実質的に含まない請求項７７に記載の方法。
【請求項９８】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項９９】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項７７に記載の方法。
【請求項１００】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項９９に記載の組成物。
【請求項１０２】
前記組成物がワクチンである請求項７７に記載の組成物。
【請求項１０３】
ヒトまたは動物において、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患または症状を予防または治療する方法であって、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープを含む組成物の治療有効量または予防量を該被験体に投与する工程を含み、
該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まない方法。
【請求項１０４】
工程Ａが前記立体配座エピトープに対する免疫応答を誘導する工程を含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記アミロイドペプチドモノマーが前記エピトープを実質的に含まない請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組成物がペプチド成分を含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ペプチドが立体配座的に拘束されている請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびこれらの混合物からなる群から選択される請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ペプチドが配列番号１である請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記組成物が表面によって支持されている請求項１０３に記載の方法。
【請求項１１１】
前記表面が湾曲または平坦である請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記表面が固体を含む請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
前記表面がフィルム、粒子またはシートである請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
前記表面がタンパク質を含む請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
前記タンパク質がα−プリーツシートを含む請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記組成物が前記支持体に結合している請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１７】
前記組成物が前記支持体に化学的に結合している請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１８】
前記化学的な結合が共有結合である請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記支持体が、金、亜鉛、カドミウム、錫、チタン、銀、セレン、ガリウム、インジウム、砒素、ケイ素、これらの混合物およびこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む請求項１１０に記載の方法。
【請求項１２０】
アミロイド原線維が前記エピトープを実質的に含まない請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２１】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２２】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２３】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２４】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記組成物がワクチンである請求項１０３に記載の方法。
【請求項１２９】
ヒトまたは動物の被験体において、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患または症状を予防または治療する方法であって、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物において形成して原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープに抗体を結合させる工程を含む方法。
【請求項１３０】
工程Ａが治療有効量または予防量の抗体を前記被験体に投与する工程を含む請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３２】
前記抗体が前記始原原線維凝集体の毒性を低減させるのに有効である請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３５】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３６】
アミロイドペプチドモノマーが前記エピトープを実質的に含まない請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３７】
アミロイド原線維が前記エピトープを実質的に含まない請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３８】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３９】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記組成物が、脊髄内投与、髄腔内投与、経口投与、経皮投与、肺投与、静脈内投与、皮下投与、経鼻投与、動脈内投与、頭蓋内投与、皮内投与、腹腔内投与、筋内投与、直腸投与および口腔投与からなる群から選択される方法によって投与される請求項１２９に記載の方法。
【請求項１４２】
ヒトまたは動物の被験体において、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患または症状を予防または治療する方法であって、該方法は、
Ａ．単離された抗体をヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープに結合させる工程を含み、
該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まない方法。
【請求項１４３】
工程Ａが治療有効量または予防量の抗体を前記被験体に投与する工程を含む請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記始原原線維凝集体が５個のモノマーを含む請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４６】
前記始原原線維凝集体が８個のモノマーを含む請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４７】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４８】
前記抗体が前記始原原線維凝集体の毒性を低減させるのに有効である請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４９】
アミロイド原線維が前記エピトープを実質的に含まない請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５０】
前記始原原線維凝集体が毒性種を含む請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５１】
前記始原原線維凝集体が、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５２】
前記疾患が、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスからなる群から選択される請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
前記組成物が、脊髄内投与、髄腔内投与、経口投与、経皮投与、肺投与、静脈内投与、皮下投与、経鼻投与、動脈内投与、頭蓋内投与、皮内投与、腹腔内投与、筋内投与、直腸投与および口腔投与からなる群から選択される方法によって投与される請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５５】
抗体を作製する方法であって、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープを得る工程を含む方法。
【請求項１５６】
工程Ａがヒトまたは動物から前記抗体を回収する工程を含む請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
抗体を作製する方法であって、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープを含む組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含み、
該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まない方法。
【請求項１５８】
工程Ａが前記ヒトまたは動物から前記抗体を回収する工程を含む請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物の患者由来の組織または流体と、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープに結合する抗体を含む組成物とを混合する工程を含む方法。
【請求項１６０】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記組織または流体が脳脊髄液である請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６２】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を診断する方法であって、該方法は、
Ａ．ヒトまたは動物の患者由来の組織または流体と、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープに結合する抗体を含む組成物とを混合する工程を含み、
該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まない方法。
【請求項１６３】
前記疾患がアルツハイマー病である請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記組織または流体が脳脊髄液である請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６５】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物の治療方法の有効性を評価する方法であって、該方法は、
Ａ．薬剤での治療の前に、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープに特異的な抗体の、患者由来の組織サンプル中におけるベースライン量を決定する工程、および
Ｂ．前記薬剤での治療後の該被験体由来の該組織サンプル中の該抗体の量を、該抗体のベースライン量と比較する工程を含む方法。
【請求項１６６】
前記治療後に測定されて前記抗体のベースライン量と比較された前記抗体の量の低下またはそれらの間の有意な差異の欠如がネガティブな治療結果を示す請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記治療後に測定されて前記抗体のベースライン量と比較された前記抗体の有意に大きい量がポジティブな治療結果を示す請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記抗体の量が抗体力価として測定される請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
前記抗体の量がＥＬＩＳＡアッセイによって測定される請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物の治療方法の効力を評価する方法であって、該方法は、
Ａ．薬剤での治療の前に、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープに特異的な抗体の、患者由来の組織サンプル中におけるベースライン量を決定する工程であって、該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まない工程、
Ｂ．前記薬剤での治療後の該被験体由来の該組織サンプル中の該抗体の量を、該抗体のベースライン量と比較する工程を含む方法。
【請求項１７１】
前記治療後に測定されて前記抗体のベースライン量と比較された前記抗体の量の低下またはそれらの間の有意な差異の欠如がネガティブな治療結果を示す請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記治療後に測定されて前記抗体のベースライン量と比較された前記抗体の有意に大きい量がポジティブな治療結果を示す請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記抗体の量が抗体力価として測定される請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
前記抗体の量がＥＬＩＳＡアッセイによって測定される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７５】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を検出するのに有用な診断キットであって、該キットは、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープに結合する抗体を含有する組成物を含むキット。
【請求項１７６】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を検出するのに有用な診断キットであって、該キットは、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープに結合する抗体を含む単離された組成物を含み、該アミロイド原線維は該エピトープを実質的に含まないキット。
【請求項１７７】
試験物質のアミロイドオリゴマー中間体の形成を阻害する能力を評価するための方法であって、該方法は、
Ａ．該試験物質およびアミロイドペプチドを含む第１の混合物を調製する工程；
Ｂ．任意の阻害効果の非存在下、且つアミロイドオリゴマー中間体が該アミロイドペプチドから形成される条件下で、該第１の混合物を定温放置する工程；
Ｃ．工程Ｂからの該定温放置された混合物と、該オリゴマー中間体の立体配座エピトープを認識する抗体とを混合することによって、第２の混合物を調製する工程；及び
Ｄ．該オリゴマー中間体の立体配座エピトープに対する該抗体の結合に基づいて、形成されたオリゴマー中間体の量を決定する工程を含む方法。
【請求項１７８】
工程ＤがＥＬＩＳＡによって実施される請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
試験物質のアミロイドオリゴマー中間体の分解、解離または実質的な破壊を引き起こす能力を評価するための方法であって、該方法は、
Ａ．アミロイドオリゴマー中間体および該試験物質を含む第１の混合物を調製する工程；
Ｂ．工程Ａからの該混合物と、該オリゴマー中間体の立体配座エピトープを認識する抗体とを混合することによって、第２の混合物を調製する工程；及び
Ｃ．該第２の混合物中に残留する該オリゴマー中間体の立体配座エピトープに対する該抗体の結合に基づいて、分解、解離または実質的な破壊を受けていないアミロイドオリゴマー中間体の量を決定する工程を含む方法。
【請求項１８０】
工程ＣがＥＬＩＳＡによって実施される請求項１７８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、医学、免疫学およびタンパク質生化学の分野に関し、より詳しくは、アミロイド疾患の診断、治療および／またはモデリングにおいて有用な特定の抗原性組成物および抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物学的機能の少なくとも一部は、タンパク質の種々の配列依存的な構造をとる能力に起因して生じている。しかし、特定のタンパク質配列は、アミロイド原線維として知られている異常な折り畳み構造の不溶性凝集体をしばしば形成し得る。これらのアミロイド原線維は、遺伝起源、感染起源および／または自発起源の種々のアミロイド疾患の病原に関与すると考えられ、アミロイド疾患は、海綿状脳症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＩＩ型糖尿病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、おそらく黄斑変性、種々のプリオン病および多数の他の疾患を含む。これらのアミロイド疾患の内の少なくともいくつかにおいて、アミロイド原線維はアミロイド斑の発生を引き起こす。
【０００３】
アミロイドペプチドは、アミロイド斑の主な構成成分である。アルツハイマー病の場合、これらのペプチドは、Ａβペプチドまたはβ−アミロイドペプチドと称される。Ａβペプチドは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の３９〜４３アミノ酸の内部フラグメントである。ＡＰＰタンパク質内のいくつかの変異がＡＤの存在と相関している。例えば、ゴーテら（Ｇｏａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）第３４９巻、７０４頁（バリンからイソロイシンへ）；シャルティエ  ハーランら（Ｃｈａｒｔｉｅｒ  Ｈａｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）第３５３巻、８４４頁（バリンからグリシンへ）；ミュレルら（Ｍｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）第２５４巻、９７頁（バリンからフェニルアラニンへ）；ミュランら（Ｍｕｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．（１９９２）第１巻、３４５頁（リジン５９５−メチオニン５９６からアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変化する二重変異）を参照のこと。このような変異は、ＡＰＰからＡへの増大または変更されたプロセシングを生じることによって、ＡＤを引き起こすと考えられている。特に、より長い形態のＡ、例えばＡ１−４２およびＡ１−４３の蓄積を生じるＡＰＰのプロセシングは、ＡＤの原因において重要であると考えられている。他の遺伝子（例えば、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２）における変異は、ＡＰＰのプロセシングに間接的に影響を与えて、長い形態のＡの産生を生じると考えられている。例えば、ハーディ（Ｈａｒｄｙ）、ＴＩＮＳ（１９９７）第２０巻、１５４頁を参照のこと。
【０００４】
欧州特許公報第ＥＰ５２６，５１１号（マクマイケル（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ））およびＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ／９９２７９４４号（シェンク（Ｓｃｈｅｎｋ））は、アルツハイマー病の治療または予防のための患者へのＡβの投与を記載している。しかし、トランスジェニックマウスへのＡβの能動免疫は見かけの利益を生じるものの、このアプローチをＡＤ患者へと拡大したところ、何人かの被験者において中枢神経系の望ましくない炎症が生じた。ハーディ（Ｈａｒｄｙ）、ディー、ジェイ  セルコー（Ｄ．Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅ）（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２９７巻、３５３〜３５６頁を参照のこと。
【０００５】
可溶性Ａβには、Ａβモノマー、並びに始原原線維凝集体（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）と称されるこのようなモノマーの凝集体が含まれる。これらの始原原線維凝集体は、アミロイド原線維の発生を生じる。ヒト脳の可溶性Ａβ含量は、アミロイド斑の蓄積に比べてＡＤの重症度により相関する。例えば、ワイ．エム．クオら（Ｙ．Ｍ．Ｋｕｏ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻、４０７７〜４０８１頁；シー．エイ．マクレーンら（Ｃ．Ａ．ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  第４６巻、８６０〜６頁；エル．エフ．リューら（Ｌ．Ｆ．Ｌｕｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  第１５５巻、８５３〜８６２頁を参照のこと。さらに、最近の報告は、Ａβおよび他のアミロイド原性タンパク質の毒性は、可溶性モノマーまたは蓄積する不溶性原線維には存在しないが、始原原線維凝集体においてかなり存在することを示唆している。例えば、ハートリーら（Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９９）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  第１９巻、８８７６〜８８８４頁；ランバートら（Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（１９９８）第９５巻、６４４８〜５３頁；およびブチャンティーニら（Ｂｕｃｃｉａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ（２００２）第４１６巻、５０７〜５１１頁；およびハートリーら（Ｈａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）Ｎａｔｕｒｅ（２００２）第４１８巻、２９１頁を参照のこと。併せて考えると、これらの結果は、始原原線維凝集体が、アミロイドペプチドの他の形態よりもより病理学的に重要である可能性があり、したがって、ＡＤのようなアミロイド疾患の予防または治療において、より所望される標的であり得ることを示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
高い特異性でアミロイドの毒性形態に結合し、それによってアミロイド疾患の病原性を阻害する抗体を産生し得る抗原の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、Ａβペプチド凝集体に特異的に結合し、かつ可溶性の低分子量ＡβまたはＡβ原線維に結合しない抗体を産生するために有用な抗原を提供する。また、これらの抗体は、本明細書中で試験した他の全ての型のアミロイド原性ペプチドおよびタンパク質から産生されたアミロイドペプチド凝集体を特異的に認識するが、対応する低分子量アミロイドペプチドまたは原線維には結合しない。
【０００８】
本発明によれば、ヒトまたは動物において形成してアミロイド原線維形成に寄与する始原原線維凝集体のエピトープ、例えば立体配座エピトープを含む単離された組成物、例えば抗原性組成物が提供される。アミロイド原線維は、この組成物のエピトープを含まなくてもよいし、またはこの組成物のエピトープを実質的に含まなくてもよい。さらに、アミロイドペプチドモノマーは、この組成物のエピトープを含まなくてもよいし、またはこの組成物のエピトープを実質的に含まなくてもよい。これらのエピトープに結合する抗体を含む組成物もまた提供される。一実施形態において、これらの組成物は、天然供給源から単離されている。他の実施形態において、これらの組成物は合成品である。一つの有用な実施形態において、これらの組成物は医薬組成物、例えばワクチンである。さらに本発明によれば、これらの組成物は、立体配座的に拘束され得るペプチドまたはタンパク質を含む。これらのペプチドは、天然から単離され得るか、または合成品であり得る。一実施形態において、このペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびこれらの混合物からなる群から選択される。
【０００９】
さらに本発明によれば、これらの組成物は、湾曲または平坦を含む任意の形状であり得る表面によって支持される。一つの有用な実施形態において、この表面は固体を含む。この表面は、フィルム、粒子またはシートであり得る。一実施形態において、この表面は機能的に改変され、例えば自己集合したペプチド単層の形成を可能にするように機能的に改変される。さらに、この表面は、タンパク質、例えば−プリーツシートからなり得る。一実施形態において、ペプチドは、この支持体表面に結合している。例えば、これらのペプチドは、この支持体表面に化学的に結合され得る。化学的結合には、イオン結合、水素結合、共有結合およびファンデルワールス引力が含まれる。一つの特に有用な実施形態において、この化学的結合は共有結合である。これらの組成物は、これらのペプチドを表面に結合させるのに有効なリンカーからなり得る。これらのリンカーには、限定するものではないが、ストレプトアビジン、炭化水素分子、例えばクエン酸塩、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ、ホスホルアミド−ＮＨ２、環状または酸性のジスルフィド−Ｒ−ＣＯＯＨが含まれるがこれらに限定されない炭化水素鎖、環状または酸性のジスルフィド−Ｒ−ＮＨ２、Ｓｉ（ＯＣＨ３）３−Ｒ−ＮＨ２、Ｓｉ（ＯＣＨ３）３−Ｒ−ＣＯＯＨおよび−マレイミドが含まれ得る。この支持体は、金、亜鉛、カドミウム、錫、チタン、銀、セレン、ガリウム、インジウム、砒素、ケイ素、これらの混合物またはこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない任意の適切な材料からなり得る。
【００１０】
さらに本発明によれば、本明細書中に記載されるような始原原線維凝集体は、約１０ｋＤａ〜約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有し得る。一実施形態において、この始原原線維凝集体は５つのモノマーを含む。他の実施形態において、この始原原線維凝集体は８つのモノマーを含む。この始原原線維凝集体は、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在し、かつ毒性種を含み得る。本発明は、始原原線維凝集体の毒性を低減させるのに有効であり得る抗体を提供する。
【００１１】
さらに本発明によれば、この始原原線維凝集体は、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在する。例えば、この疾患は、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫および海綿状脳症（例えば、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性、脳血管アミロイドーシス、プリオン病または別のアミロイド疾患であり得る。
【００１２】
さらに本発明によれば、ヒトまたは動物の被験体において疾患または症状を予防または治療する方法が提供され、この疾患または症状は、アミロイド沈着の存在によって特徴付けられる。これらの方法は、治療有効量または予防量の組成物をこの被験体に投与する工程を含み得る。一実施形態において、この方法は、立体配座エピトープに対する免疫応答を誘導する工程を含む。
【００１３】
さらに本発明によれば、ヒトまたは動物においてアミロイド沈着によって特徴付けられる疾患または症状を予防または治療する方法が提供され、この方法は、抗体を、ヒトまたは動物において形成して原線維形成に寄与する始原原線維凝集体の立体配座エピトープに結合させる工程を含む。一実施形態において、これらの方法は、抗体を投与する工程を含む。この組成物は、脊髄内投与、髄腔内投与、経口投与、経皮投与、肺投与、静脈内投与、皮下投与、筋内投与、経鼻投与、直腸投与、舌下投与または口腔投与によって投与され得る。
【００１４】
さらに本発明によれば、本発明の組成物をヒトまたは動物に投与する工程を含み得る抗体を作製する方法が提供される。この方法はまた、ヒトまたは動物から抗体を回収する工程を含み得る。
【００１５】
さらに本発明によれば、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を診断する方法が提供され、この方法は、ヒトまたは動物の患者由来の組織または流体と、本発明の抗原性組成物または本発明の抗体とを混合する工程を含む。一実施形態において、この組織または流体は脳脊髄液である。この疾患には、限定するものではないが、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、および狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、トランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）関連のアミロイドーシス、例えば家族性アミロイド多発性神経症および血清アミロイドーシス、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスが含まれる。抗体の量は抗体力価として測定され得る。一実施形態において、抗体の量はＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定される。
【００１６】
さらに本発明によれば、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物の治療方法の効力を評価する方法が提供され、この方法は、薬剤での治療の前に、患者由来の組織サンプル中において本発明の組成物を構成する抗原に特異的な抗体のベースライン量を決定する工程、およびこの薬剤での治療の後に、この被験体由来の組織サンプル中の抗体の量を抗体のベースライン量と比較する工程を含み得る。一実施形態において、治療後に測定されて抗体のベースライン量と比較された抗体の量の低下またはそれらの間の有意な差異の欠如は、ネガティブな治療結果を示す。他の実施形態において、治療後に測定されて抗体のベースライン量と比較された抗体の有意に大きい量は、ポジティブな治療結果を示す。
【００１７】
さらに本発明によれば、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物の治療方法の効力を評価する方法が提供され、この方法は、薬剤での治療の前に、患者由来の組織サンプル中において本発明の抗体に特異的な始原原線維凝集体のベースライン量を決定する工程、およびこの被験体由来の組織サンプル中の本発明の抗体に特異的な始原原線維凝集体の量を始原原線維凝集体のベースライン量と比較する工程を含み得る。一実施形態において、治療後に測定されて始原原線維凝集体のベースライン量と比較された始原原線維凝集体の量の低減またはそれらの間の有意な差異の欠如は、ネガティブな治療結果を示す。他の実施形態において、治療後に測定されて始原原線維凝集体のベースライン量と比較された始原原線維凝集体の有意に大きい量は、ポジティブな治療結果を示す。
【００１８】
さらに本発明によれば、ヒトまたは動物においてアミロイド疾患またはアミロイド疾患に対する感受性をモニタリングする方法が提供され、この方法は、患者由来のサンプル中において本発明の組成物に対する免疫応答を検出する工程を含み得る。
【００１９】
さらに本発明によれば、抗体の量は抗体力価として測定され、抗原の量は抗原力価として測定され得る。一実施形態において、抗体の量はＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。一実施形態において、抗原の量はＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。
【００２０】
さらに本発明によれば、免疫応答の検出は、本発明の組成物に特異的に結合する抗体を検出する工程および／または本発明の組成物と特異的に反応するＴ細胞を検出する工程を含み得る。
【００２１】
さらに本発明によれば、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を検出するのに有用な診断キットが提供され、このキットは、本発明の抗原または本発明の抗体を含む本発明の単離された組成物を含み得る。
【００２２】
本明細書中に記載される各々および全ての特徴、ならびに２つ以上のこのような特徴の各々および全ての組合せは、このような組合せ中に含まれる特徴が互いに矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の態様および利点は、以下の図面、詳細な説明、実施例および特許請求の範囲に示される。
定義
用語「アジュバント」とは、抗原と組み合わせて投与された場合にこの抗原に対する免疫応答を増強するが、単独で投与された場合にはその抗原に対する免疫応答を生じない化合物のことである。アジュバントは、リンパ球の遊走、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかの機構によって、免疫応答を増強し得る。
【００２４】
用語「Ａ」または「Ａβペプチド」とは、低分子量の可溶性オリゴマー、始原原線維凝集体、原線維およびアミロイド沈着を構成するペプチドのことであり、各々がＡＤに関連する。アミロイドＡβペプチドには、限定するものではないが、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３が含まれ、これらはそれぞれ、３９アミノ酸長、４０アミノ酸長、４１アミノ酸長、４２アミノ酸長および４３アミノ酸長である。
【００２５】
「アミロイドペプチド」は、アミロイドペプチド中間体、低分子量の可溶性オリゴマー、アミロイド原繊維およびアミロイド斑を含むアミロイド形態中に存在するペプチドである。
【００２６】
用語「抗体」は、無傷の抗体およびその結合フラグメントを含むように使用され、これには、例えば、全長抗体（例えばＩｇＧ抗体）または抗原結合部分のみ（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、フラグメントは、それが抗原への特異的な結合のために誘導された無傷な抗体と同等である。必要に応じて、抗体またはその結合フラグメントは、他のタンパク質に化学的に結合され得るか、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。
【００２７】
「抗オリゴマー抗体」または「抗オリゴマー」とは、アミロイドペプチド凝集中間体に結合するが、アミロイドペプチドのモノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーに結合することも、これらに特異的に結合することもない抗体のことである。
【００２８】
一種以上の列挙された要素を「含む」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、アミロイドＡβペプチドを含む組成物は、より大きいポリペプチド配列の成分、または多数の要素を含む組成物の一部の両方として、単離されたアミロイドＡβペプチドを包含し得る。
【００２９】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞が応答する抗原上の部位、または抗体が産生される分子上の部位および／もしくは抗体が結合する分子上の部位のことである。例えば、エピトープは、それを規定する抗体によって認識され得る。
【００３０】
「線状エピトープ」は、認識されるエピトープをアミノ酸の一次配列が構成するエピトープである。線状エピトープは一般に、独自の配列中に、少なくとも３アミノ酸、より通常は少なくとも５アミノ酸、例えば、約８〜約１０アミノ酸を含む。
【００３１】
「立体配座エピトープ」は、線状エピトープとは対称的に、エピトープを構成するアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを規定する単独の成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、そのエピトープを規定する抗体によって必ずしも認識されないエピトープ）である。一般に、立体配座エピトープは、線状エピトープに比べて増大した数のアミノ酸からなる。立体配座エピトープの認識に関して、この抗体は、ペプチドまたはタンパク質の３次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて３次元構造を形成する場合、立体配座エピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格は並置されて、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体配座を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴分光学および部位特異的スピンラベリングおよび電子常磁性共鳴分光法が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、グレン  イー．モリス（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ）編（１９９６）（この開示は、本明細書中でその全体が参考により援用される）を参照のこと。
【００３２】
用語「免疫学的応答」または「免疫応答」は、受容患者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔ）におけるアミロイドペプチドに対する有益な体液性（抗体媒介性）応答および／または細胞性（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物によって媒介される）応答の発生に関する。このような応答は、免疫原の投与によって誘導される能動的応答、または抗体もしくは初回抗原刺激を受けたＴ細胞の投与によって誘導される受動的応答であり得る。細胞性免疫応答は、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子に関連したポリペプチドエピトープの提示によって導かれ、抗原特異的なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。この応答はまた、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹枝状細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、好酸球または先天性免疫の他の成分を含み得る。
【００３３】
「免疫原性因子」、「免疫原」または「抗原」は、必要に応じてアジュバントと組み合わせて、被験体への投与の際にそれ自体に対する免疫学的応答を誘導し得る。
「単離された」とは、精製されたこと、実質的に精製されたこと、または部分的に精製されたことを意味する。単離されたとはまた、天然の環境以外の環境中に存在することを意味し得る。例えば、天然に存在する場合に抗体が本来見出される全血清中に存在しない抗体は、単離された抗体である。
【００３４】
「低分子量凝集体」、「低分子量アミロイド凝集体」、「低分子量オリゴマー」および「低分子量可溶性オリゴマー」とは、ペプチドが４つまたは５つより少ない凝集体中に存在するアミロイドペプチドのことである。一つの特定の例において、低分子量Ａβとは、ＡＤに関連して見出される低分子量可溶性オリゴマーのことである。
【００３５】
用語「患者」には、治療的処置、予防的処置もしくは診断的処置を受けるヒトおよび他の動物の被験体、または疾患を有するか若しくは疾患に罹りやすいヒトもしくは動物が含まれる。
【００３６】
「始原原線維凝集体」、「ミセル凝集体」、「高分子量凝集中間体」、「高分子量アミロイドペプチド凝集体」、「高分子量可溶性アミロイドペプチド凝集体」、「アミロイドペプチド凝集体」、「可溶性凝集中間体」、「アミロイドオリゴマー中間体」、「オリゴマー中間体」および「オリゴマー凝集体」、または単に「中間体」とは、３個より多い個々のペプチドモノマーまたはタンパク質モノマー、例えば４個より多いペプチドモノマーまたはタンパク質モノマーを含む凝集体をいう。上位のサイズ（ｕｐｐｅｒ  ｓｉｚｅ）の始原原線維凝集体はオリゴマーの凝集体を含み、該オリゴマーの凝集体は、原線維形成を導く球状構造体またはミセルおよびミセルの棘を形成する。
【００３７】
「環状始原原線維」は、３〜１０個の球状オリゴマーサブユニットが、電子顕微鏡写真または原子間力顕微鏡写真中の孔として現れる中空を有して環状様式または円状様式で配列される始原原線維凝集体の特定のサブユニットである。
【００３８】
始原原線維凝集体の分子量は、約１０ｋＤａ〜約１００，０００，０００ＫＤａの範囲内、例えば約１０ｋＤａ〜約１０，０００，０００ＫＤａまたは１，０００，０００ＫＤａであり得る。しかし、このサイズ範囲は限定されるものではなく、かつ始原原線維凝集体は分子量範囲によって規定されない。
【００３９】
「始原原線維」は、曲線構造を形成する球状構造体の棘を示すように見えるアミロイドＡβペプチドを含有する球状構造体を含む始原原線維凝集体である。
２つの実体間の「特異的結合」は、少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１より高い親和性が、特異的結合に好ましい。
【００４０】
用語「実質的に同一」とは、例えば、２つのペプチド配列が初期ギャップ重量（ｄｅｆａｕｌｔ  ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）を用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって必要に応じて整列される場合、２つのペプチド配列が少なくとも６５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％もしくは９０％の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性、例えば９９％以上の配列同一性を共有することである。
【００４１】
好ましくは、同一でないアラインメント中の残基位置は、保存的アミノ酸置換、即ち、あるアミノ酸の同じクラスまたは同じ群の他のアミノ酸での置換が異なる。いくつかのアミノ酸は、以下のように分類され得る：群Ｉ（疎水性側鎖）：ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；群ＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；群ＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；群ＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；群Ｖ（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および群ＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。非保存的置換は、これらクラスの１つのメンバーを、他のクラスのメンバーと交換することを含み得る。
【００４２】
配列比較のために、代表的には１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、配列座標が指定され、そして必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。次いで、この配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列についての％配列同一性を計算するために使用され得る。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．第２巻：４８２頁（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびヴンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３頁（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８５巻：２４４４頁（１９８８）の類似性についての検索方法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティクスコンピュータグループ社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン、サイエンス  ドライブ５７５（５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ）所在のコンピュータ実施、または視覚的検査によって実施され得る。
【００４３】
％配列同一性および配列類似性を決定するのに適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して、公に入手可能である。一般に、デフォルトプログラムパラメータが配列比較を実施するために使用され得るが、カスタム化されたパラメータもまた使用され得る。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する。例えば、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８９巻、１０９１５頁（１９８９）を参照のこと。保存的置換は、同じクラス中のアミノ酸間での置換を含む。
【００４４】
「合成」とは、天然に存在しないことである。例えば、合成組成物は、全体または一部が天然には見出されない組成物である。
「治療的薬剤」または「治療剤」は、患者における疾患の治療または予防に有用な物質である。本発明の治療的薬剤は一般に、実質的に純粋である。これは、薬剤が、概して少なくとも約５０ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であり、かつこの治療剤の効力を妨害するタンパク質および混入物を実質的に含まない。これらの薬剤は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０％ｗ／ｗまたは約９５％ｗ／ｗの純度であり得る。しかし、従来のタンパク質精製技術を使用すると、９９％ｗ／ｗ以上の同種のペプチドが産生され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中に存在するアミロイドペプチド凝集体上に見出される１個以上のエピトープを有する組成物、このようなエピトープに対する抗体、ならびにこれらの組成物および抗体を作製および使用するための方法を提供する。
【００４６】
より詳しくは、本発明は、限定するものではないが、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物中のペプチド凝集体（例えばアミロイドペプチド凝集体）上に見出されるエピトープ（例えば立体配座エピトープ）を含む組成物、これらの組成物を作製する方法、これらの組成物を使用する方法（限定するものではないが、疾患の検出、治療および予防のためのものが含まれる）、これらの組成物上に存在する立体配座エピトープに対する抗体、これらの抗体を作製する方法およびこれらの抗体を使用する方法（限定するものではないが、疾患の検出、治療および予防のためのものが含まれる）を包含する。
【００４７】
アミロイド疾患は、患者におけるアミロイド斑もしくはアミロイド斑への前駆体の蓄積、または患者におけるアミロイド斑もしくはアミロイド斑への前駆体の蓄積への素因によって特徴付けられる。アミロイド斑の主な構成要素の１つは、アミロイドペプチドである。アミロイドペプチドの一般的な立体構造は疾患によって変動し得るが、このペプチドはしばしば、特徴的な−プリーツシート構造を有する。アミロイドペプチドは、約１０アミノ酸長または約２０アミノ酸長〜約２００アミノ酸長のペプチドおよびタンパク質を含む。このサイズ範囲は限定されるものではなく、本発明では、より少ないアミノ酸またはより多いアミノ酸を有するアミロイドペプチドまたはタンパク質が意図される。
【００４８】
始原原線維凝集体は、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患（例えばアルツハイマー病）を有するヒトまたは動物のアミロイド斑中に蓄積する不溶性原線維の産生における中間体である。始原原線維凝集体は、４個のアミロイドペプチドほどの小ささ、５個のアミロイドペプチドほどの小ささ、６個のアミロイドペプチドほどの小ささ、７個のアミロイドペプチドほどの小ささ、または８個のアミロイドペプチドほどの小ささであり得る凝集体を含む。一実施形態において、始原原線維凝集体は、ミセル状凝集体またはミセルまたはミセルの棘である。始原原線維凝集体は、本発明の抗体によって認識される立体配座エピトープを形成するのに有効である。
【００４９】
始原原線維凝集体上に見出される本発明の立体配座エピトープは、アミロイドペプチド（例えばアミロイドペプチドのモノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマー）の固有の前駆タンパク質中にも、それらの特徴的なクロスβｘ線線維回折パターンによって規定される成熟アミロイド線維中にも、アミロイド斑中にも実質的に見られない。本発明の抗体によって認識される立体配座エピトープを生じる特定のポリペプチド構造を含む始原原線維凝集体は、ほぼ五量体、六量体、七量体または八量体〜１，０００，０００ダルトンを超える分子量を有するミセル形態または始原原線維のサイズ範囲を有する。本発明の免疫原には、これらのエピトープを含む組成物が含まれる。本発明の抗体は、これらのエピトープに結合するのに有効である。
【００５０】
本発明の免疫原は、任意の適切な供給源から得られることができる。例えば、これらの免疫原は、天然に存在する供給源から精製され得る。一つの特に有用な実施形態において、これらの免疫原は合成品である。
【００５１】
本発明の抗体を産生するために必要なエピトープを提示する免疫原は、アミロイドペプチドまたはタンパク質を含むオリゴマー中間体模倣物として調製され得る。例えば、Ａβペプチド（例えばＡ４０およびＡ４１）、−シヌクレイン、ＩＡＰＰ（Ｃ２ＡおよびＣ７Ａ、ここでは、アラニンがＩＡＰＰ中の天然に存在するシステインに置換されている）、ポリグルタミンＫＫＱ４０ＫＫまたはポリグルタミン（ここで、Ｑ残基の数は３２より大きい）、カルシトニン、ＴＴＲおよびその変異体ＴＴＲ  Ｐｒｏ５５、ＴＴＲ  Ｐｈｅ７８、ビトロネクチン（ｖｉｔｒｏｎｉｃｔｉｎ）、ポリリジン、ポリアルギニン、血清アミロイドＡ、シスタンチンＣ（ｃｙｓｔａｎｔｉｎ  Ｃ）、ＩｇＧκ軽鎖、本明細書中に開示される他のアミロイドペプチドおよび本明細書中に開示される各々のアミロイド疾患に関連するアミロイドペプチドが使用され得る。
【００５２】
本発明において有用なペプチドは天然の供給源から得られることができ、例えば天然に存在する供給源から精製され得るか、または製造され得る。製造方法には、固相合成および異種遺伝子発現が含まれるがこれらに限定されない任意の適切な方法が含まれる。
【００５３】
本発明の抗原が広く変動する一次配列のアミロイドに共通するという事実は、このエピトープが、立体配座エピトープと称される特定の３次元立体配座のポリペプチド骨格から形成されることを示す。
【００５４】
ペプチドの固相合成および精製は、ディー．バーディックら（Ｄ．Ｂｕｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２６７巻、５４６〜５４頁（その開示は、本明細書中で参考により援用される）に記載されるような連続流動半自動機器を使用して、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル化学によって実施され得る。
【００５５】
簡潔に述べると、第１のＦｍｏｃ−アミノ酸は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のｓｕｌｆａｍｙｌｂｕｔｙｒｙ−ＡＭ−ＰＥＧＡ樹脂（ノババイオケム社（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）に手動でカップリングされる。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）が添加され、この混合物は、室温で２０分間攪拌され、−１０℃〜−２０℃に冷却され、そしてＢｙＢｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ））−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）が添加される。この混合物は−１０℃〜−２０℃で８〜９時間攪拌される。カップリング効率は、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験（これは、ペプチド合成の分野で周知である）を使用してチェックされ得る。
【００５６】
アセチル化は、無水酢酸を使用して実施され得る。アミノ酸の鎖伸長は、連続流動半自動機器を使用したフルオレン−９−イルメトキシカルボニル化学による。このペプチドは、合成容器中で、Ｎ−メチル−２−ピロリドン５×（ＮＭＰ）５．０ｍＬのＮＭＰ、１８５μＬのｉ−Ｐｒ２ＥｔＮ（１．１ｍｍｏｌ）および４００μＬのヨードアセトニトリル（予め暗中でアルミナ塩基性フィルタ床で濾過した）で洗浄される。次いで、この反応混合物は、ロータリープレート上および暗中で２４時間攪拌される。この樹脂は、５×ＮＭＰおよび５×ＤＭＦで洗浄され、その後５×ＣＨ２Ｃｌ２を使用して洗浄され、次いで乾燥される。樹脂は５×ＴＨＦで洗浄され、その後、ＴＨＦおよびＴＭＳ−ＣＨ２Ｎ２（５０：５０、ｖ／ｖ、ヘキサン）が添加される。２時間攪拌された後、この樹脂はＴＨＦおよびＤＭＦで洗浄される。
【００５７】
この樹脂は１２０μＬのエチル−３−メルカプトプロピオネートに添加され、この混合物はロータリープレート上で２４時間攪拌される。この樹脂は濾過され、次いで３×３ｍｌ  ＤＭＦで洗浄される。この濾液および洗浄液が回収され、３４℃でロータリーエバポレートされる。
【００５８】
得られたペプチドは、標準的な方法（ＴＦＡおよびスカベンジャー）を使用して脱保護され、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製される。その純度は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよび電子スプレー質量分析法によってチェックされ得る。
【００５９】
これらのペプチドは、標準的な異種遺伝子発現方法によっても産生され得る。例えば、組換え発現は、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）または酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞中であり得る。組換え発現のための手順は、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（シー．エス．エイチ．ピー．プレス社（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州所在、第２版、１９８９）に記載されている。さらに、ヒトインスリンまたはリゾチームを含む多数のアミロイドペプチドは、商業的供給元から入手し得る。
【００６０】
本発明において有用なペプチドは、本明細書中で記載されるような有用なエピトープを形成するために、有利に凝集され得るか、または立体配座的に拘束され得る。一つの有用な実施形態において、これらのペプチドは表面に結合され、例えば、本発明の抗体によって認識されるエピトープの産生を可能にするような様式で、表面に物理的に付着されるか、または化学的に結合される。
【００６１】
例えば、Ｃ末端チオエステルは、当業者に公知であるような従来の様式で、これらのペプチドに付着され得る。例えば、Ｆｍｏｃ化学によるこれらのペプチドのＣ末端チオエステル化は、実質的に、インジニト、アールら（Ｉｎｇｉｎｉｔｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  第１２１巻、１１３６９〜１１３７４頁に記載されるように実施され得る。Ｃ末端チオエステル化ペプチドは、金属表面のような表面に容易に付着される。
【００６２】
これらのペプチドが結合または付着する表面は、任意の適切な表面であり得る。例えば、この表面は固体であり得る。この表面は、炭化水素、ポリマー（単数または複数）、プラスチック、ガラス、金属、セラミックまたは一種以上の生体分子（例えば、タンパク質、脂肪、核酸および炭水化物）の一種以上を含み得る。これらの成分の一種以上が、この表面を構成し得る。例えば、粒子は、金属でコーティングされたポリマーからなり得る。この表面は、平坦であり得るか、または湾曲表面のような３次元形状を有し得る。さらに、この表面は粒子であり得る。一実施形態において、オリゴマー凝集体分子模倣物は、ナノスフィア（ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）を使用して産生される。これらのナノスフィアは、任意の適切なサイズのものであり得る。例えば、これらのナノスフィアの直径は、約０．０１ｎｍ〜約１ｃｍの範囲内であり得る。一つの有用な実施形態において、これらのナノスフィアの直径は約５ｎｍである。
【００６３】
一つの特に有用な実施形態において、分子模倣物を産生するために金ナノスフィアが使用される。簡潔に述べると、これらのナノスフィアは、０．２ｍｇ／ｍｌのＣ末端チオエステルペプチド（ｐＨ５．０〜５．５）溶液中で３時間定温放置され得、その後、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０（０．２％のアジ化ナトリウム）を用いてｐＨが７．４に調整される。室温での６時間のインキュベーションの後、これらの分子模倣物は遠心分離によって回収され、取り込まれていないペプチドを除去するためにＰＢＳ  ｐＨ７．６  で３回洗浄され、次いで０．０２％のアジ化ナトリウム中に４℃で保存される。このような分子模倣物の集合を図１に示す。しかし、これは、本発明の分子模倣物を産生するための方法の一例である。これらの模倣物を産生する他の方法は、当業者に容易に明らかである。
【００６４】
本発明は、アミロイド中間体上に存在するエピトープを認識するが、アミロイドのモノマー、ダイマー、トリマーもしくはテトラマー上に存在するエピトープも、成熟アミロイド原線維のエピトープも、不溶性の塊に凝集したアミロイドペプチドを含むアミロイド沈着のエピトープも認識しない抗体を包含する。
【００６５】
本発明の抗体は、任意の適切な手段によって作製され得る。例えば、これらの抗体は実験動物中で産生され得る。一つのこのような場合、ニュージーランド白ウサギ、Ｂａｌｂ／Ｃ、Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウスまたは飼いイヌに、上記のように産生された多量の分子模倣物を注射する。抗原は、注射の前にフロイント不完全アジュバントであるミョウバンアジュバントと混合されるか、またはアジュバントなし（ＰＢＳのみ）である。第１の注射について、同量部の抗原とアジュバントとが使用される。引き続く注射では、この抗原をアジュバントと混合し、例えば２週間間隔で各々を注射する。動物は、肩甲部上のチェッカー盤様式の１部位当たり０．１ｍＬの小さい増分で皮下注射され得る。
【００６６】
この抗原は、立体配座において拘束されて、抗体によって認識される立体配座依存的なエピトープの抗原の産生およびこの抗原の溶媒アクセス可能な表面上での提示を生じる。詳しくは、表面基材へのカルボキシル末端の付着は、この領域をこの表面に密接に並置して維持し、これは、可溶性オリゴマー中のＡβペプチドの配列を模倣する［ガルソン−ロドリゲス（Ｇａｒｚｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）、２０００  ＃６８９０］。固体支持体に対するカルボキシル末端の付着は、可溶性オリゴマーからアミロイド原線維への構造的遷移の間に生じるペプチドのこの領域の再配列を防止する。アミロイド原線維において、このカルボキシル末端は自由に可動であり、かつアミロイド原線維の溶媒アクセス可能な表面で見出される［ガルソン−ロドリゲス（Ｇａｒｚｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）、２０００  ＃６８９０］［トロック（Ｔｏｒｏｋ）、２００２  ＃８９２７］［アントズトキン（Ａｎｔｚｕｔｋｉｎ）、２００３  ＃１０５５５］。固体支持体へのカルボキシル末端の付着はまた、ポリペプチド鎖の平行配列を維持し、かつこのポリペプチドの、そのモノマー形態、または低分子量のモノマー形態、ダイマー形態、トリマー形態およびテトラマー形態への解離を防止する。
【００６７】
本発明の好ましい抗体は、１時間を超える洗浄時間の間に結合を保持し、従って、比較的高い結合親和性を示すように思われる。本発明の抗体の少なくともいくつかにおいて、解離についての半減期は１時間より長い。
【００６８】
この抗体は配列に関わらずエピトープを認識し、このエピトープは、広範なアミロイド原性ペプチドおよびタンパク質由来の可溶性オリゴマーに共有されるか、またはそれらに共通する。このエピトープは、これらのペプチドの低分子量形態およびアミロイド原線維中において、存在しないか、またはその構造もしくはアクセス可能性が実質的に低減されている。このエピトープは、このペプチドの共通の構造的特徴および立体配座特徴（この特徴には、多数の異なるタンパク質配列およびペプチド配列によって形成されるポリペプチド骨格の特定の立体配座が含まれるが、これに限定されない）からなる。このエピトープはこの抗体によって認識され、その結果、このエピトープへの抗体の結合は、このエピトープを提示するタンパク質配列またはペプチド配列に関わらず、可溶性オリゴマーの毒性を実質的に低減または排除する。しかし、本発明のこの記載は異なる配列のために特異的な抗体、即ち、このような抗体が可能であり、かつこれらの抗体が１つのペプチド上の同じエピトープに結合するがこれらの抗体は配列特異的であり得、かつ他の全てのアミロイドを認識しない抗体を必ずしも除外しないことが理解されるべきである。
【００６９】
血清回収について、ＩｇＧ画分が、例えばプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ上で親和性精製されて溶出され、次いでＰＢＳに対して透析され得る。中間凝集体特異的な抗体は、上記のように産生されたアミロイドオリゴマー中間体分子模倣物をＩｇＧ画分と混合し、約２時間定温放置し、その後洗浄することによって、この分子模倣物上での吸着によって精製され得る。溶出後、この抗体はＰＢＳに対して透析され、０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中に４℃または−７０℃で保存され得る。
【００７０】
ウサギ、イヌまたは他の動物の、本明細書中に開示された分子模倣物でのワクチン接種により産生されたポリクローナル血清は、アミロイドペプチド凝集中間体に特異的であり、かつ可溶性の低分子量のアミロイド種または原線維アミロイド種とは検出可能に反応性ではない。実施例４を参照のこと。驚くべきことに、低分子量の凝集体または原線維に対する抗オリゴマー免疫反応性は未分画血清については観察されず、このことは、この分子模倣物に対する免疫応答が非常に特異的であることを示している。例えば、Ａβ分子模倣物に対して産生された抗体は、Ａβ分子模倣物でウサギを１２時間ブーストした後であっても、Ａβ低分子量凝集体またはＡβ原線維に結合しない。
【００７１】
Ａβペプチド凝集体模倣物に対して産生された抗体は、試験した全ての他のアミロイド型のアミロイド凝集中間体に結合することが示されている。図６を参照のこと。さらに、これらの抗体は、試験した全ての毒性アミロイド（すなわち、アミロイド中間体）のオリゴマー形態の毒性を中和することが示されている。図７、８および９を参照のこと。アミロイド中間体が共通の構造を共有することが示唆される。従って、本発明は、１つの型のアミロイドペプチドを含む分子模倣物を使用して産生された抗体が、他のアミロイドペプチド中間体型（例えば全てのアミロイドペプチド中間体型）に特異的な抗体（例えば立体配座依存的抗体）を産生することを意図する。例えば、−シヌクレインペプチドを含む分子模倣物から調製された抗体は、−シヌクレイン始原原線維凝集体と特異的に反応するだけではなく、他のアミロイドオリゴマー中間体形態（例えば全ての他のアミロイドオリゴマー中間体形態）のオリゴマー中間体とも特異的に反応する。
【００７２】
以下のアミロイドペプチドの各々は、本発明の抗体（例えば、Ａβペプチドオリゴマー中間体に対して産生された抗体）によって認識される立体配座エピトープを産生するアミロイドペプチド凝集体を形成することが示されている。これらのペプチドのうちいくつかは、アミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を有するヒトまたは動物のアミロイド沈着中に存在する。本発明は、列挙されたペプチド配列またはタンパク質配列にも、これらの配列のうちいくつかに関連する特定の疾患にも限定されない。本発明は、他のアミロイドペプチド凝集体または他の全てのアミロイドペプチド凝集体に結合するとともに、本明細書中に記載されるような抗体を意図する。特に本発明は、他の疾患に関連するアミロイド前駆体凝集体を形成する他のペプチド配列またはタンパク質配列に対する本発明の方法および組成物の適用を意図する。
Ａ４０（配列番号１）
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ
Ａ４２（配列番号２）
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ  ＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦ  ＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡ  ＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ  ＩＡ
ヒトＩＡＰＰ（配列番号３）
ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱ  ＲＬＡＮＦＬＶＨＳＳ  ＮＮＦＧＡＩＬＳＳＴ  ＮＶＧＳＮＴＹ
ヒトプリオン１０６−１２６（配列番号４）
ＫＴＮＭＫＨＭＡＧＡ  ＡＡＡＧＡＶＶＧＧＬ  Ｇ
ステファニ（Ｓｔｅｆａｎｉ）および共同研究者ら（ブチャンティーニら（Ｂｕｃｃｉａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ）（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  第４１６巻、５０７〜５１１頁）は最近、非疾患関連のタンパク質から形成されたアミロイドペプチド凝集体が生得的に細胞傷害性であることを報告しており、これは、これらのアミロイドペプチド凝集体が、疾患関連のアミロイドペプチドと共通する構造を有し得ることを示唆する。以下の非疾患関連のアミロイドペプチドを含む非疾患関連のアミロイドペプチド凝集体もまた、本発明の抗体に結合することが示されている。
ポリグルタミン合成ペプチドＫＫ（Ｑ４０）ＫＫ（配列番号５）
ＫＫＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱ  ＱＱＫＫ
ヒトリゾチーム（配列番号６）
ＭＫＡＬＩＶＬＧＬＶ  ＬＬＳＶＴＶＱＧＫＶ  ＦＥＲＣＥＬＡＲＴＬ  ＫＲＬＧＭＤＧＹＲＧ  ＳＬＡＮＷＭＣＬＡＫ  ＷＥＳＧＹＮＴＲＡＴ  ＮＹＮＡＧＤＲＳＴＤ  ＹＧＩＦＱＩＮＳＲＹ  ＷＣＮＤＧＫＴＰＧＡ  ＶＮＡＣＨＬＳＣＳＡ  ＬＬＱＤＮＩＡＤＡＶ  ＡＣＡＫＲＶＶＲＤＰ  ＱＧＩＲＡＷＶＡＷＲ  ＮＲＣＱＮＲＤＶＲＱ  ＹＶＱＧＣＧＶ
ヒトインスリン（配列番号７）
ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬ  ＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤ  ＰＡＡＡＦＶＮＱＨＬ  ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹ  ＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹ  ＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ  ＬＱＶＧＱＶＥＬＧＧ  ＧＰＧＡＧＳＬＱＰＬ  ＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧ  ＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣ  ＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
ヒトトランスサイレチン（配列番号８）
ＭＡＳＨＲＬＬＬＬＣ  ＬＡＧＬＶＦＶＳＥＡ  ＧＰＴＧＴＧＥＳＫＣ  ＰＬＭＶＫＶＬＤＡＶ  ＲＧＳＰＡＩＮＶＡＶ  ＨＶＦＲＫＡＡＤＤＴ  ＷＥＰＦＡＳＧＫＴＳ  ＥＳＧＥＬＨＧＬＴＴ  ＥＥＥＦＶＥＧＩＹＫ  ＶＥＩＤＴＫＳＹＷＫ  ＡＬＧＩＳＰＦＨＥＨ  ＡＥＶＶＦＴＡＮＤＳ  ＧＰＲＲＹＴＩＡＡＬ  ＬＳＰＹＳＹＳＴＴＡ  ＶＶＴＮＰＫＥ
ヒトαシヌクレイン（配列番号９）
ＭＤＶＦＭＫＧＬＳＫ  ＡＫＥＧＶＶＡＡＡＥ  ＫＴＫＱＧＶＡＥＡＡ  ＧＫＴＫＥＧＶＬＹＶ  ＧＳＫＴＫＥＧＶＶＨ  ＧＶＡＴＶＡＥＫＴＫ  ＥＱＶＴＮＶＧＧＡＶ  ＶＴＧＶＴＡＶＡＱＫ  ＴＶＥＧＡＧＳＩＡＡ  ＡＴＧＦＶＫＫＤＱＬ  ＧＫＮＥＥＧＡＰＱＥ  ＧＩＬＥＤＭＰＶＤＰ  ＤＮＥＡＹＥＭＰＳＥ  ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ
さらに、野生型Ａ４２、Ａ４０の改変体およびフラグメント（限定するものではないが、Ａ４２（Ａ２１Ｇ）フランドル型変異、Ａ４２（Ｅ２２Ｑ）オランダ型変異、Ａ４２（Ｅ２２Ｇ）北極型変異、Ａ４２（Ｄ２３Ｎ）ロワ（ｌｏｗａ）型変異、Ａ４０（Ａ２１Ｇ）フランドル型変異、Ａ４０（Ｅ２２Ｑ）オランダ型変異、Ａ４０（Ｅ２２Ｇ）北極型変異、Ａ４０（Ｄ２３Ｎ）ロワ型変異、Ａ４０（Ｅ２２Ｑ＆Ｄ２３Ｎ）オランダ型＆ロワ型変異、Ａβ３−４２（ｐＧｌｕ３）、Ａβ３−４０（ｐＧｌｕ３）、Ａ８−４２、Ａ１７−４２、Ａ１−１６、Ａ３−１１、Ａ２５−３５、Ａ４−１６（３種の類似体：Ｃｙｓ１６Ａ４−１６、Ａｌａ４Ａ４−１６およびＡｌａ１０Ａ４−１６）、Ｈｉｓ６  Ａ４０Ｃ４０（ＡβＣ４０のアミノ末端に付加された６個のヒスチジン）が含まれる）から形成されたオリゴマー中間体が、本発明の抗体によって認識される。本発明の抗体によって認識される他のオリゴマー中間体には、限定するものではないが、ＩＡＰＰ（Ｃ２ＡおよびＣ７Ａ）（ここではアラニンが、ＩＡＰＰ中の天然に存在するシステインに置換されている）、ポリグルタミンＫＫＱ４０ＫＫまたはポリグルタミン（ここで、Ｑ残基の数は３２より大きい）、カルシトニン、ＴＴＲおよびその変異体ＴＴＲ  Ｐｒｏ５５、ＴＴＲ  Ｐｈｅ７８、ビトロネクチン、ポリリジン、ポリアルギニン、血清アミロイドＡ、シスタンチンＣ、ＩｇＧκ軽鎖から形成されたオリゴマー中間体、本明細書中に開示される他のアミロイドペプチドから産生されたオリゴマー中間体、および本明細書中に開示される各々のアミロイド疾患に関連するアミロイド中間体が含まれる。
【００７３】
本発明は、アミロイドオリゴマー中間体に対する特異的免疫応答を誘導するアミロイド疾患の治療剤を提供する。これらの治療剤には、アミロイドペプチドの凝集体の立体配座エピトープと、このアミロイドペプチドの改変体の凝集体の立体配座エピトープと、本発明の抗体を誘導し、かつ／または本発明の抗体と交差反応するアミロイドペプチドの類似体および模倣物の凝集体の立体配座エピトープと、抗体またはこのような抗体と反応性のＴ細胞とを含有する分子模倣物が含まれる。免疫応答の誘導は、免疫原が患者においてアミロイドペプチド中間体と特異的に反応性の抗体またはＴ細胞を誘導するために投与される場合に能動的であり、または患者においてアミロイドペプチド中間体にそれ自体特異的に結合する抗体が投与される場合に受動的であり得る。
【００７４】
類似体には、対立遺伝子改変体、種改変体および誘導された改変体が含まれる。類似体は一般に、しばしば保存的置換の長所によって、１つまたはいくつかの位置で天然に存在するペプチドとは異なる。類似体は一般に、天然のペプチドと少なくとも８０％または９０％の配列同一性を示す。いくつかの類似体はまた、非天然のアミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸の改変を含む。非天然のアミノ酸の例は、Ａ−２置換アミノ酸、−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、ｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ｅ−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン（Ｏ−ｐｈｏｓｐｇｏｓｅｒｉｎｅ）、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ｗ−Ｎ−メチルアルギニンである。
【００７５】
治療剤にはまた、より長いペプチドまたはタンパク質の凝集体（これは、例えば、他のアミノ酸と共に、アミロイドペプチド、活性なフラグメントまたは類似体を含む）が含まれる。例えば、Ａβペプチドは、無傷のＡＰＰタンパク質またはそのセグメント（例えば、ＡβのＮ末端で開始し、かつＡＰＰの末端まで続くＣ−１００フラグメント）として存在し得る。このようなポリペプチドは、以下に記載されるように、動物モデルにおいて予防効力または治療効力についてスクリーニングされ得る。Ａβペプチド、類似体、活性フラグメントまたは他のポリペプチドは、低分子量のオリゴマーまたは原線維上に実質的に存在しない３次元エピトープまたは立体配座エピトープに対する免疫応答を提供する形態で投与され得る。
【００７６】
治療剤はまた、ペプチドおよび他の化合物を含み、これらは、アミロイドタンパク質との有意なアミノ酸配列の類似性を必ずしも有さないが、それにも拘ら、アミロイドオリゴマー中間体の立体配座エピトープに対する免疫応答を提供する本発明の抗原として機能する。例えば、−プリーツシートを形成する任意のペプチドおよびタンパク質は、適切性についてスクリーニングされ得る。アミロイド中間体またはアミロイド中間体の合成模倣物に対するモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体もまた、使用され得る。このような抗Ｉｄ抗体は、抗原を模倣し、かつこの抗体に対する免疫応答を生じる（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ロイ（Ｒｏｉｔ）編、ブラックウェル  サイエンティフィック  パブリケーションズ社（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）所在、第６版）、１８１頁を参照のこと）。
【００７７】
ペプチドまたは他の化合物のランダムライブラリーもまた、本明細書中での使用のために適切性についてスクリーニングされ得る。コンビナトリアルライブラリーは、段階的様式で合成され得る多数の型の化合物について生成され得る。このような化合物には、ポリペプチド、βターン模倣物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマー置換グリシンおよびオリゴカーバメート（ｏｌｉｇｏｃａｒｂａｍａｔｅ）が含まれる。これらの化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、アフィマックス（Ａｆｆｙｍａｘ）のＷＯ９５／１２６０８号、アフィマックスのＷＯ  ９３／０６１２１号、コロンビア大学のＷＯ９４／０８０５１号、ファルマコピア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）のＷＯ９５／３５５０３号およびスクリプッス（Ｓｃｒｉｐｐｓ）のＷＯ９５／３０６４２号（これらは各々、全ての目的のために参考により援用される）に記載されるコードされた合成ライブラリー（ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＥＳＬ））法によって実施され得る。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法によって生成され得る。例えば、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ）のＷＯ９１／１８９８０号を参照のこと。
【００７８】
任意のペプチド凝集体、天然もしくは合成の、または目的の他の化合物が、オリゴマー中間体に対して特異的であることが公知の抗体またはリンパ球（ＢまたはＴ）にこの凝集体または化合物が結合する能力を決定することによって、本明細書中での使用のための免疫原または抗原としての適切性について最初にスクリーニングされ得る。例えば、最初のスクリーニングは、オリゴマー中間体に対する任意のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体で実施され得る。
【００７９】
このようなスクリーニングによって同定された化合物は、オリゴマー中間体に対する抗体または反応性リンパ球を誘導する能力について、さらに分析され得る。例えば、血清の多数の希釈物が、本発明のオリゴマー中間体模倣物または精製されたオリゴマー中間体で予めコーティングされたマイクロタイタープレート上で試験され、標準的なＥＬＩＳＡが、反応性抗体について試験するために実施され得る。次いで、化合物は、予防および治療の有効性について、当該分野で理解されるように、例えば、アミロイド原性疾患に罹りやすいトランスジェニック動物において試験され得る。このような動物には、例えば、ゲイムスら（Ｇａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）（前出）によって記載されるＡＰＰの７１７変異を保有するマウス、ならびにマクコンログら（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．）の米国特許第５，６１２，４８６号およびシャオら（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２７４巻、９９頁；ストーフェンビールら（Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）第９４巻、１３２８７〜１３２９２頁；スターチュラー−ピエラら（Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９４巻、１３２８７〜１３２９２頁；ボルチェルトら（Ｂｏｒｃｈｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｅｕｒｏｎ（１９９７）第１９巻、９３９〜９４５頁によって記載されるようなＡＰＰのスイス型変異を保有するマウスが含まれる。同じスクリーニングアプローチが、上記の治療剤を含む他の可能性のある治療剤に対して使用され得る。
【００８０】
本発明の治療剤はまた、オリゴマー中間体に特異的に結合する抗体を含む。このような抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。一つの有用な実施形態において、これらの抗体は、立体配座エピトープに結合する。非ヒト（例えば、マウスまたはラット）のモノクローナル抗体の産生は、例えば、本発明のオリゴマー中間体模倣物でこの動物を免疫することによって達成され得る。精製されたアミロイド中間体で動物を免疫することもまた意図される。
【００８１】
本発明のマウス抗体のヒト化形態は、非ヒト抗体のＣＤＲ領域を組換えＤＮＡ技術によってヒト定常領域に連結させることによって生成され得る。クイーンら（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８６巻、１００２９〜１００３３頁（１９８９）およびＷＯ９０／０７８６１号（全ての目的のために参考により援用される）を参照のこと。
【００８２】
ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を使用して得られ得る。例えば、ダワーら（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）のＷＯ９１／１７２７１号およびマクカフェルティら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）のＷＯ９２／０１０４７号を参照のこと。これらの方法において、メンバーがそれらの外面上に異なる抗体を提示するファージのライブラリーが生成される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージが、親和性富化によって選択される。オリゴマー中間体に対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座および不活化された内因性免疫グロブリン遺伝子座の少なくともセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から産生され得る。例えば、ロンバーグら（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．）のＷＯ９３／１２２２７号（１９９３）；クチェルラパティ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）のＷＯ９１／１０７４１号（１９９１）（これらは各々、全ての目的のためにその全体が参考により援用される）を参照のこと。特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するヒト抗体が、競合的結合実験または他の方法によって選択され得る。このような抗体は、マウス抗体の有用な機能的特性が共通している可能性が特に高い。
【００８３】
ヒトポリクローナル抗体もまた、本発明の免疫原で免疫したヒトから血清の形態で提供され得る。必要に応じて、このようなポリクローナル抗体は、例えば親和性試薬として本発明の免疫原を使用して、親和性精製によって濃縮され得る。
【００８４】
ヒト抗体またはヒト化抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥの定常領域、ならびに任意のアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）を有するように設計され得る。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含むテトラマーとして、別個の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖の可変ドメインがスペーサーを介して連結された単鎖抗体として発現され得る。
【００８５】
本発明の方法において使用するための治療剤はまた、アミロイドオリゴマー中間体に結合するＴ細胞を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、昆虫細胞系統からヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子およびヒト−２−ミクログロブリン遺伝子を発現させることによって、中間体に対して活性化され、それによって空の複合体がこれらの細胞の表面上に形成され、かつオリゴマー中間体抗原に結合し得る。この細胞系統と接触したＴ細胞は、この抗原に対して特異的に活性化され得る。ピーターソンら（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の米国特許第５，３１４，８１３号を参照のこと。ＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する昆虫細胞系統が同様に、ＣＤ４Ｔ細胞を活性化するために使用され得る。
【００８６】
特定の例において、本発明の免疫原を適切な担体に連結させることが所望され得る。適切な担体には、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素もしくは他の病原性細菌（例えば、ジフテリア、Ｅ．ｃｏｌｉ、コレラまたはＨ．ｐｉｌｏｒｉ）由来のトキソイド、または弱毒化毒素誘導体が含まれる。免疫応答を刺激または増強するための他の担体には、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ペプチドおよびＩＬ−１βペプチド、ＩＬ−２、ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦならびにケモカイン（例えば、Ｍ１Ｐ１およびＭ１Ｐ１β、ならびにＲＡＮＴＥＳ））が含まれる。免疫原はまた、オマホニー（Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ）のＷＯ９７／１７６１３号およびＷＯ９７／１７６１４号に記載されるように、組織を横断する輸送を増強するペプチドに連結され得る。
【００８７】
本発明の免疫原は、化学的架橋によって担体に連結され得る。免疫原を担体に連結するための技術には、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用したジスルフィド結合の形成（このペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、これは、システイン残基の付加によって提供され得る）が含まれる。これらの試薬は、それら自体とペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合を１個のタンパク質上に生成し、リジン上のｅ−アミノまたは他のアミノ酸中の他の遊離アミノ基を介してアミド結合を生成する。種々のこのようなジスルフィド／アミド形成薬剤が、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．第６２巻、１８５頁（１９８２）に記載されている。他の２官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、これには、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルが含まれる。これらのカルボキシル基は、これらのカルボキシル基をスクシンイミドまたは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸のナトリウム塩と合わせることによって活性化され得る。
【００８８】
本発明の免疫原に含まれるペプチドはまた、融合タンパク質として発現され得る。このペプチドは、アミノ末端、カルボキシル末端または内部で、担体に連結され得る。例えば、これらのペプチドは、担体または任意の有用なペプチド配列もしくはタンパク質配列と融合され得る。
【００８９】
治療を受け入れる患者には、疾患の危険性があるが症状を示さない個体、ならびに現在症状を示している患者が含まれる。ＡＤを含む特定のアミロイド疾患の場合、事実上誰もがこの疾患に罹患する危険性がある。
【００９０】
従って、本発明の組成物は、対象患者の危険性を評価することなしに、例えば、ワクチンによって一般的な集団に予防的に投与され得る。本発明の方法は、アミロイド疾患（例えばＡＤ）の既知の遺伝的な危険性を有する個体に対して特に有用である。このような個体には、アミロイド疾患を経験した親族を有する個体、および遺伝的マーカーもしくは生化学的マーカーの分析によって危険性が決定された個体、またはこのような疾患の発症もしくは実際の存在についての可能性を示す症状もしくは前駆症状を示す個体が含まれ得る。例えば、ＡＤに対する危険性の遺伝的マーカーには、ＡＰＰ遺伝子における変異、特に位置７１７ならびに位置６７０および位置６７１における変異（それぞれ、ハーディ（Ｈａｒｄｙ）変異およびスイス型変異と称される）（ハーディ（Ｈａｒｄｙ）、ＴＩＮＳ（前出）を参照のこと）が含まれる。ＡＤについての危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子（ＰＳ１およびＰＳ２）およびＡｐｏＥ４における変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症である。
【００９１】
アミロイド疾患の症状は当業者の医師に明らかである。例えば、アルツハイマー病に現在罹患している個体は、特徴的な痴呆症、ならびに上記の危険因子の存在から認識され得る。さらに、多数の診断試験が、アミロイド疾患を有する個体を同定するために利用可能である。例えば、ＡＤの場合、これらにはＣＳＦτレベルおよびＡ４２レベルの測定値が含まれる。上昇したτレベルおよび減少したＡ４２レベルは、ＡＤの存在を意味する。
【００９２】
無症候性の患者において、治療は、任意の年齢（例えば、１０歳、２０歳、３０歳、４０歳、５０歳、６０歳または７０歳）で開始し得る。治療は、一回以上の投薬（例えば、ある期間にわたる多数の投薬量）をもたらし得る。治療は、この治療剤（例えば、オリゴマー中間体模倣物）に対する抗体または活性化されたＴ細胞もしくはＢ細胞の応答を経時的に分析することによって、あるいは存在する始原原線維凝集体のレベルを経時的に分析することによって、モニタリングされ得る。一実施形態において、本発明の単一の治療剤（例えば、本発明の単一の免疫原）の投与による治療は、２種以上のアミロイド疾患（例えば、全てのアミロイド疾患）のための治療として、またはこれらのアミロイド疾患に対する予防的測定として働き得る。
【００９３】
予防的適用において、本発明の組成物または医薬は、特定の疾患に対して感受性の患者またはこの特定の疾患の危険性がある患者に、この疾患の危険性を排除もしくは低減するか、またはこの疾患の発症を遅延させるのに充分な量で投与される。治療的適用において、組成物またはメジアン（ｍｅｄｉａｎｓ）は、このような疾患の疑いがある患者またはこのような疾患にすでに罹患している患者に、この疾患の症状およびその合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるのに充分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、治療的有効量または薬学的有効量として規定される。予防レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）および治療レジメンの両方において、治療剤は通常、充分な免疫応答が達成されるまで、いくつかの投薬形態で投与される。一般に、この免疫応答はモニタリングされ、免疫応答が減衰し始める場合に、反復された投薬量が与えられる。
【００９４】
本発明の組成物の有効量は、上記の状態の治療について、多数の異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の投薬、および治療が予防目的であるか治療目的であるかが含まれる）に応じて異なる。通常、この患者はヒトであるが、いくつかの疾患（例えば、狂牛病）において、この患者は非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ亜科の動物）であり、またはアルツハイマー病の場合には、この患者はイヌであり得る。治療投薬量は、安全性および効力を最適化するために滴定される必要がある。免疫原の量はアジュバントもまた投与されるか否かに依存し、より高い投薬量がアジュバントの非存在下で必要とされる。投与のための免疫原の量はしばしば、患者１人当たり約１μｇ〜約５００μｇで変動し、より通常は、ヒト投与のための注射１回当たり約５μｇ〜５００μｇで変動する。時々、注射１回当たり約１ｍｇ〜約２ｍｇのより高い用量が使用される。典型的には、約１０μｇ、約２０μｇ、約５０μｇまたは約１００μｇが、各々のヒト注射のために使用される。注射のタイミングは、１日１回〜１年に１回〜１０年に１回で有意に変動し得る。免疫原の投薬が与えられる任意の所定の日に、この投薬量は、アジュバントもまた投与される場合、患者１人当たり１μｇより高く、通常は患者１人当たり１０μｇより高く、そしてアジュバントの非存在下では、患者１人当たり１０μｇより高く、通常は患者１人当たり１００より高い。この投薬量中に存在するペプチドの質量は、使用される治療剤の量を計算するために使用され得る。
【００９５】
１つの代表的なレジメンは、６週間間隔でのブースター注射に従う免疫付与からなる。他のレジメンは、１カ月後、２カ月後および１２カ月後のブースター注射に従う免疫付与からなる。他のレジメンは、生涯にわたる２カ月毎の注射をもたらす。あるいは、ブースター注射は、免疫応答のモニタリングによって示されるような不規則な基準に基づき得る。
【００９６】
抗体での受動免疫について、この投薬量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの範囲であり、より通常は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約５ｍｇの範囲である。
【００９７】
免疫応答を誘導するための治療剤は、予防的治療および／または治療的治療に適切な任意の手段（例えば、非経口手段、局所手段、静脈内手段、経口手段、皮下手段、腹腔内手段、経鼻手段または筋内手段）によって投与され得る。最も代表的な投与経路は皮下であるが、他の経路が等しく有効であり得る。次に最も一般的なのは筋内注射である。このタイプの注射は、最も典型的には、腕または脚の筋肉において実施される。静脈内注射ならびに腹腔内注射、動脈内注射、頭蓋内注射または皮内注射もまた、免疫応答を生じさせるのに有効であり得る。いくつかの方法において、これらの治療剤は、沈着が蓄積しているかまたは蓄積し得る特定の組織中に直接注射される。
【００９８】
本発明の組成物は、必要に応じて、アミロイド原性疾患の治療において少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与され得る。アミロイド沈着が脳において生じるアルツハイマー病およびダウン症候群の場合、本発明の治療剤はまた、血液脳関門を横切る本発明の組成物の通過を増大させる他の薬剤と共に投与されてもよい。
【００９９】
本発明の免疫原性薬剤（例えば、ペプチド）はしばしば、アジュバントと組み合わせて投与される。種々のアジュバントが、免疫応答を惹起するために、本発明の免疫原と組み合わせて使用され得る。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響を与える免疫原における立体配座変化を引き起こすことなしに、この免疫原に対する内在性の応答を増強する。好ましいアジュバントには、ミョウバン、３  デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（ＧＢ  ２２２０２１１を参照のこと）が含まれる。ＱＳ２１は、南アフリカにおいて見出されたＱｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサポニンである（ケンシルら（Ｋｅｎｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ポウェル（Ｐｏｗｅｌｌ）およびニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）編、プレナム  プレス社（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州所在、１９９５）；および米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）。他のアジュバントは、必要に応じて免疫刺激剤（例えば、モノホスホリルリピドＡ）と組み合わせた水中油エマルジョン（例えば、スクアレンまたはピーナツ油）である。例えば、ストウトら（Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９７）第３３６巻、８６〜９１頁を参照のこと。他の有用なアジュバントは、１９９８年１１月１５日のＢｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙに記載されたＣｐＧである。あるいは、免疫原はアジュバントにカップリングされ得る。例えば、この免疫原のリポペプチドバージョンは、Ｂ型肝炎抗原ワクチン接種についてリビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）第１５９巻、１３８３〜１３９２頁に記載されるように、本発明の免疫原を構成する一種以上のペプチドのＮ末端に、パルミチン酸または他の脂質を直接カップリングすることによって調製され得る。しかし、このようなカップリングは、この免疫原に対する免疫応答の性質に影響を与えるように、この免疫原を構成するペプチドの立体配座を実質的に変化させるべきではない。アジュバントは、活性薬剤と共に治療組成物の成分として投与され得るか、または治療剤の投与とは別個に、治療剤の投与の前に、治療剤の投与と同時に、または治療剤の投与の後に投与され得る。
【０１００】
好ましいクラスのアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム）である。このようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤（例えば、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ）、ＱＳ２１、ポリマーアミノ酸またはモノマーアミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸またはポリリジン）とともに、またはこの免疫刺激剤なしに使用され得る。
【０１０１】
別のクラスのアジュバントは、水中油エマルジョン製剤である。このようなアジュバントは、他の特定の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシ  プロピルアミド（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ  ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ、ＤＴＰ−ＤＰＰ、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、または他の細菌細胞壁成分とともに、またはこの免疫刺激剤なしに使用され得る。水中油エマルジョンには、（ａ）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙミクロフルイダイザー（ミクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、マサチューセッツ州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）所在）のようなミクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと処方された５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％Ｓｐａｎ  ８５を含む（種々の量のＭＴＰ−ＰＥを必要に応じて含む）ＭＦ５９（ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）サブミクロンのエマルジョンへと微小流動化された、またはより大きい粒子サイズのエマルジョンを生じるためにボルテックスされた１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群由来の１種以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（リビイムノケム社（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、モンタナ州ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）所在）が含まれる。
【０１０２】
他のクラスの好ましいアジュバントは、サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎｓ（ＱＳ２１、アキラ社（Ａｑｕｉｌａ）、マサチューセッツ州ウースター（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）所在））またはこれから生成された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）である。他のアジュバントには、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれる。他のアジュバントには、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））および／またはケモカイン（例えばＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５）が含まれる。
【０１０３】
アジュバントは単一の組成物として免疫原と共に投与され得るか、またはこの免疫原の投与の前、この免疫原の投与と同時、もしくはこの免疫原の投与の後に投与され得る。免疫原およびアジュバントは、同じバイアル中に包装されて供給され得るか、または別個のバイアル中に包装されて使用前に混合され得る。免疫原およびアジュバントは概して、意図された治療適用を示すラベルと共に包装される。免疫原およびアジュバントが別個に包装される場合、この包装は概して、使用前に混合するための指示書を含む。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含むワクチンの安定性、投与経路、投与スケジュール、ワクチン接種される種についてのアジュバントの効力に依存し、そしてヒトにおいては、薬学的に許容されるアジュバントは、適切な規制機関によってヒトへの投与について承認されているか、または承認され得るアジュバントである。例えば、フロイント完全アジュバントはヒトへの投与に適切ではない。必要に応じて、２種以上の異なるアジュバントが同時に使用され得る。好ましい組合せには、ミョウバンおよびＭＰＬと、ミョウバンおよびＱＳ２１と、ＭＰＬおよびＱＳ２１と、ミョウバン、ＱＳ２１およびＭＰＬとが含まれる。また、フロイント不完全アジュバントは、必要に応じてミョウバン、ＱＳ２１およびＭＰＬならびにこれらの全ての組合せのいずれかと組み合わせて使用され得る（チャンら（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  第３２巻、１７３〜１８６頁（１９９８））。
【０１０４】
本発明の組成物は、種々の他の薬学的に許容される成分からなる医薬組成物としてしばしば投与される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、マックパグリッシングカンパニー社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルバニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）所在、１９８０）を参照のこと。好ましい形態は、意図された投与様式および治療適用に依存する。これらの組成物はまた、所望される製剤に依存して、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を処方するために一般に使用される賦形剤として規定され、且つ薬学的に許容される非毒性の担体または希釈剤を含み得る。この希釈剤は、この組合せの生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。さらに、この医薬組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバントまたは非毒性で非治療的な非免疫原性安定剤などを含み得る。しかし、フロイント完全アジュバントのような動物への投与に適切ないくつかの試薬は概して、ヒトへの使用のための組成物中には含まれない。
【０１０５】
医薬組成物はまた、大きくてゆっくりと代謝される高分子（例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えばラテックス官能化セファロース（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、アガロース、セルロースなど）、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）を含み得る。さらに、これらの担体は免疫刺激剤（即ちアジュバント）として機能し得る。
【０１０６】
非経口投与について、本発明の組成物は、生理学的に許容される希釈剤中の物質の溶液または懸濁物の注射可能な投薬として、滅菌液体（例えば水、油、生理食塩水、グリセロースまたはエタノール）であり得る薬学的担体と共に投与され得る。
【０１０７】
補助物質（例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝化物質など）が組成物中に存在し得る。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物または合成起源の成分（例えばピーナツ油、ダイズ油および鉱油）である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールは、特に注射可能な溶液のために好ましい液体担体である。
【０１０８】
組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして注射可能物として調製され、注射前に液体溶媒中の溶液または懸濁物にするのに適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、リポソームまたは微小粒子（例えばポリラクチド、ポリグリコリドまたは上記で考察されたような増強されたアジュバント効果のためのコポリマー）中に乳化またはカプセル化され得る。ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）第２４９巻、１５２７頁およびヘインズ（Ｈａｎｅｓ）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９７）第２８巻、９７〜１１９頁を参照のこと。本発明の組成物は、活性成分の徐放または拍動性放出を許容するような様式で処方され得るデポ注射またはインプラント調製物の形態で投与され得る。
【０１０９】
他の投与様式に適切なさらなる製剤には、経口製剤、経鼻製剤および肺製剤、坐剤、ならびに経皮投与が含まれる。
坐剤について、結合剤および担体には、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、このような坐剤は、０．５％〜約１０％の範囲内、例えば約１％〜約２％の範囲内の活性成分を含む混合物から形成され得る。経口製剤は、賦形剤（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウム）を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放製剤または粉末の形態をとり、約１０％〜９５％の活性成分、例えば約２５％〜約７０％の活性成分を含み得る。
【０１１０】
局所適用は、経皮送達または皮内送達を生じ得る。局所投与は、この組成物と、コレラ毒素もしくは無毒化誘導体またはそれらのサブユニット、あるいは他の類似の細菌毒素との同時投与によって促進され得る。グレンら（Ｇｌｅｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）第３９１巻、８５１頁を参照のこと。同時投与は、混合物として、または化学的架橋もしくは融合タンパク質としての発現によって得られる連結された分子として、これらの成分を使用することによって達成され得る。
【０１１１】
あるいは、経皮送達は、皮膚通路を使用して、またはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を使用して達成され得る。例えば、ポールら（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）第２５巻、３５２１〜２４頁；セベクら（Ｃｅｖｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  （１９９８）第１３６８巻、２０１〜１５頁を参照のこと。
【０１１２】
本発明は、ＡＤのようなアミロイド疾患に罹患しているか、またはこれに対して感受性である患者において、アミロイドオリゴマー中間体に対する免疫応答を検出する方法を提供する。これらの方法は、患者に投与される治療過程をモニタリングするために特に有用である。これらの方法は、症状のある患者に対する治療的治療および無症状の患者に対する予防的治療の両方をモニタリングするために使用され得る。
【０１１３】
いくつかの方法は、組成物の調剤を投与する前に、患者において免疫応答のベースライン値を決定する工程と、およびこの値を治療後の免疫応答についての値と比較する工程とを内含する。免疫応答の値の有意な増大（すなわち、このような測定値の平均からの１標準偏差として表され、同じサンプルの反復測定値における実験誤差の標準的な限界よりも高い増大）は、ポジティブな治療結果（すなわち、この組成物の投与が免疫応答を達成または増強したこと）を示す。免疫応答についての値が有意に変化しないかまたは減少する場合、ネガティブな治療結果が示される。一般に、組成物での治療の最初の過程を受ける患者は、最終的に停滞期に達する連続的な投薬での免疫応答における増大を示すことが予測される。組成物の投与は一般に、免疫応答が増大しながら継続される。
【０１１４】
停滞期の到達は、この治療が中断され得るか、または投薬量もしくは頻度において低減され得ることの指標である。
他の方法において、免疫応答のコントロール値（すなわち、平均および標準偏差）が、コントロール集団について決定される。典型的には、コントロール集団中の個体は、以前に治療を受けていないものである。次いで、治療組成物を投与した後に患者において測定された免疫応答の値は、コントロール値と比較される。コントロール値と比較した有意な増大（例えば、平均から１標準偏差より大きい）は、ポジティブな治療結果を示す。有意な増大の欠如または減少は、ネガティブな治療結果を示す。
【０１１５】
組成物の投与は一般に、免疫応答がコントロール値に対して増大する間、継続される。
前述と同様に、コントロール値に対する停滞期の到達は、治療の投与が中断され得るか、または投薬量もしくは頻度において低減され得ることの指標である。
【０１１６】
他の方法において、免疫応答のコントロール値（例えば、平均および標準偏差）は、治療組成物での治療を受け、かつその免疫応答が治療に応答して停滞期に達した個体のコントロール集団から決定される。患者における免疫応答の測定値はコントロール値と比較される。患者における測定されたレベルがコントロール値から有意に異ならない場合（例えば、一標準偏差より大きくない場合）、治療は中断され得る。患者におけるレベルがコントロール値より有意に低い場合、組成物の継続された投与が保証される。患者におけるレベルがコントロール値よりも低いままである場合、治療レジメンにおける変更（例えば、異なるアジュバントの使用）が示され得る。
【０１１７】
他の方法において、現在治療を受けていないが以前に治療過程を受けた患者は、治療の再開が必要であるか否かを決定するために、免疫応答について観察される。この患者における免疫応答の測定値は、以前の治療過程の後にこの患者において以前に達成された免疫応答の値と比較され得る。以前の測定値に対する有意な減少（例えば、同じサンプルの反復測定値における誤差の代表的な限界より大きいこと）は、治療が再開され得ることの指標である。あるいは、患者において測定された値は、治療過程を受けた後に患者集団において決定されたコントロール値（平均＋標準偏差）と比較され得る。
【０１１８】
あるいは、患者において測定された値は、予防的に治療されて疾病の症状を依然として有さない患者の集団におけるコントロール値、または治療的に治療されて疾病の特徴の改善を示す患者の集団におけるコントロール値と比較され得る。これらの場合の全てにおいて、コントロール値に対する有意な減少（例えば、一標準偏差より大きい減少）は、治療が患者において再開されるべきであることの指標である。
【０１１９】
分析のための組織サンプルは一般に、患者由来の血液、血漿、血清、粘液または脳脊髄液である。このサンプルは、アミロイドペプチド凝集体またはアミロイドペプチド凝集体模倣物に対する免疫応答の指標について分析され得る。この免疫応答は、例えば、アミロイドペプチド凝集体またはアミロイドペプチド凝集体模倣物に特異的に結合する抗体またはＴ細胞の存在から決定され得る。組成物に特異的な抗体を検出するＥＬＩＳＡ法は、実施例の項に記載される。
【０１２０】
本発明はさらに、上記の診断方法を実施するための診断キットを提供する。一般的に、このようなキットは、オリゴマー中間体に対する抗体に特異的に結合する組成物、またはオリゴマー中間体に特異的なＴ細胞と反応する組成物を含む。このキットはまた、標識を含み得る。アミロイドペプチド凝集体に対する抗体の検出について、この標識は一般に、標識された抗イディオタイプ抗体の形態である。抗体の検出について、この組成物は、マイクロタイターディッシュ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｄｉｓｈ）のウェルのような固相に予め結合されて供給され得る。反応性Ｔ細胞の検出の場合、この標識は、増殖応答を測定するために、３Ｈ−チミジンを含んで供給され得る。キットはまた、一般的に、このキットの使用のための指示書を含む。この指示書は、測定された標識のレベルを、オリゴマー中間体に対する抗体のレベルまたはオリゴマー中間体と反応性のＴ細胞のレベルと相関させるチャートまたは他の対応するレジメンを含み得る。
【０１２１】
実施例
実施例１
アミロイドペプチド凝集体の分子模倣物を、以下のように合成した。
【０１２２】
ペプチド合成：
Ａ４０（配列番号１）、Ａ４２（配列番号２）、ＩＡＰＰ（配列番号３）およびヒトプリオン１０６〜１２６（配列番号４）の固相合成および精製を、ディー、バーディックら（Ｄ．Ｂｕｒｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２６７巻、５４６〜５４頁に既に記載されたように、連続流動半自動機器を使用して、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル化学によって実施した。Ｆｍｏｃ化学によるＣ末端チオエステルを、インギニト、アールら（Ｉｎｇｉｎｉｔｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）、（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  第１２１巻、１１３６９〜１１３７４頁に実質的に記載されるように実施した。
【０１２３】
各ペプチドについて、１０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）中のｓｕｌｆａｍｙｌｂｕｔｙｒｙ−ＡＭ−ＰＥＧＡ樹脂（ノババイオケム社（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）所在）１ｇに５当量の第１のアミノ酸（（Ａ４２についてＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ）、（Ａ４０についてＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ）および（ＩＡＰＰについてＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕｔ）−ＯＨ））を添加して第１のアミノ酸をｓｕｌｆａｍｙｌｂｕｔｙｒｙ−ＡＭ−ＰＥＧＡ樹脂に手動でカップリングし、続いて１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加した。この混合物を室温で２０分間攪拌し、次いで−１０℃〜−２０℃に冷却した。４．７当量のＢｙＢｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）を添加し、この混合物を−１０℃〜−２０℃で８〜９時間攪拌した。ペプチド合成の分野で周知であるカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）試験を使用してカップリング効率を確認してＦｍｏｃ切断方法を使用して決定したところ、置換レベルは約０．１８〜０．２０ｍｍｏｌｅ／ｇであることが見出された。無水酢酸を使用してアセチル化を実施した。アミノ酸鎖を、連続流動半自動機器を使用して、フルオレン−９−イルメトキシカルボニル化学によって伸長させた。１００ｍｇのペプチドを、合成容器中でＮ−メチル−２−ピロリドン５×（ＮＭＰ）５．０ｍＬのＮＭＰ、１８５μＬのｉ−Ｐｒ２ＥｔＮ（１．１ｍｍｏｌ）および４００μＬのヨードアセトニトリル（予め暗中でアルミナ塩基性フィルタ床で濾過した）で洗浄した。この反応混合物を、ロータリープレート上および暗中で２４時間攪拌した。この樹脂を５×ＮＭＰおよび５×ＤＭＦで洗浄し、続いて５×ＣＨ２Ｃｌ２を使用して洗浄し、次いで乾燥した。１００ｍｇの樹脂を５×ＴＨＦで洗浄し、続いて２．７ｍＬのＴＨＦを添加した。次いで、２．７ｍＬのＴＭＳ−ＣＨ２Ｎ２（５０：５０、ｖ／ｖ、ヘキサン）を添加した。２時間攪拌した後、この樹脂を５×５ｍＬ  ＴＨＦおよび５×５ｍＬ  ＤＭＦで洗浄した。
【０１２４】
この樹脂を１２０μＬのエチル−３−メルカプトプロピオネートに添加し、この混合物をロータリープレート上で２４時間攪拌した。次いで、この樹脂を濾過した後に３×３ｍｌ  ＤＭＦで洗浄した。その濾液および洗浄液を回収し、３４℃でロータリーエバポレートした。収率は約６０％であった。
【０１２５】
得られたペプチドを、標準的な方法（ＴＦＡおよびスカベンジャー）を使用して脱保護し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。その純度を分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよび電子スプレー質量分析法によって確認した。
【０１２６】
ヒトインスリン、リゾチーム、ポリグルタミンＫＫＱ４０ＫＫおよび−シヌクレインは、商業的供給元または他の供給元から入手した。
Ｃ末端チオエステルを、これらの合成ペプチドおよび市販のペプチドの各々に従来の様式で加えた。
【０１２７】
コロイド金アミロイドオリゴマー分子模倣物集合：
コロイド金ナノスフィア（平均直径５．３ｎｍ）をテッドペラインコーポレイテッド社（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）から購入し、１ＭのＨＣＬで洗浄し後に蒸留水で３回洗浄した。これらの金ナノスフィアを、０．２ｍｇ／ｍｌのＣ末端チオエステルペプチド（ｐＨ５．０〜５．５）の溶液中で３時間定温放置した。次いで、このｐＨを１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）（０．２％  アジ化ナトリウム）で７．４に調整した。
【０１２８】
室温で６時間定温放置した後、３０，０００×Ｇ、４℃、及び３０分間の遠心分離によって抗原を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で３回洗浄して取り込まれていないペプチドを除去し、次いで０．０２％のアジ化ナトリウム中に分散させた。得られたミセル分子模倣物を原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、円偏光二色性分光法、チオフラビンＴ蛍光、ビス−ＡＮＳ蛍光およびＵＶ／可視分光法によって分析し、この金上のペプチド単層が、溶液中のオリゴマーアミロイド中間体表示と同じ二次構造および立体配座を有することを確認した。この溶液を４℃で保存した。
【０１２９】
分子模倣物の集合を図１に示す。
実施例２
コロイド金アミロイドオリゴマー分子模倣物に対する抗体の産生を、以下のように実施した。
【０１３０】
ニュージーランド白ウサギ、Ｂａｌｂ／Ｃ、Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウスおよび飼いイヌに、約０８．〜約１．０ｍｇのＡβペプチドに対応するとともに、実施例１に記載されるように産生された多量の分子模倣物を注射した。金結合抗原は、注射前にフロイント不完全アジュバントであるミョウバンアジュバントと混合したか、またはアジュバントなし（ＰＢＳのみ）とした。ウサギを１ｍＬの抗原（４℃で一晩ＰＢＳに対して透析したウサギ１匹当たり０．０８〜０．１ｍｇのペプチド）で免疫した。第１の注射について、同量部の抗原とフロイント完全アジュバントとを使用した。引き続く１１回の注射について、この抗原をフロイント不完全アジュバントと混合し、各々を２週間間隔で注射した。動物に肩甲部上のチェッカー盤様式の１部位当たり０．１ｍＬの小さい増分で皮下注射した。
【０１３１】
血清を静脈穿刺によって回収した。ＩｇＧ画分をプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ上で親和性精製し、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）中で溶出し、Ｔｒｉｓ緩衝液でｐＨ７．４に中和し、次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。アミロイドオリゴマー中間体分子模倣物をＩｇＧ画分と混合し、約２時間定温放置し、その後洗浄することにより、この分子模倣物上での吸着によって中間凝集体特異的な抗体（オリゴマー抗体と称する）を精製した。このオリゴマー中間体特異的抗体を０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．２）中で溶出し、その後中和し、ＰＢＳに対して透析した。防腐剤として０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中において、この抗体を４℃または−７０℃で保存した。
【０１３２】
この分子模倣物によるウサギのワクチン接種によって産生されたポリクローナル血清は、アミロイドペプチド凝集中間体に特異的であり、かつ可溶性の低分子量のＡβ種または原線維Ａβ種とは検出可能に反応性ではない（実施例４を参照のこと）。驚くべきことに、低分子量ＡβまたはＡβ原線維に対する抗オリゴマー免疫反応性は、ウサギを１２回ブーストした（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）後でさえ、未分画血清について観察されず、このことは、これらの分子模倣物に対する免疫応答が非常に特異的であることを示している。
【０１３３】
実施例３
モノマーまたは低分子量の凝集体、オリゴマー中間体および成熟アミロイド原線維の産生を説明する。
【０１３４】
Ａβのモノマーおよび低分子量の凝集体の調製：
モノマーペプチドおよび低分子量凝集体を、室温で４００μＬのＨＦＩＰ中に１．０ｍｇのＡβを溶解させることによって調製した。１００μＬの得られたＡβ溶液をシリコン処理エッペンドルフチューブ中の９００μＬのＤＤ  Ｈ２Ｏに添加した。室温で１０〜２０分間定温放置した後、これらのサンプルを１４，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清画分（ｐＨ２．８〜３．５）を新たなシリコン処理チューブに移し、Ｎ２の穏やかな流れに５〜１０分間供してＨＦＩＰを蒸発させた。次いで、これらのサンプルを直ぐに使用したか、または任意の原線維もしくはオリゴマー中間体をも除去するためにゲル透過によって分画した。
【０１３５】
Ａβオリゴマー中間体の調製：
アミロイドペプチド凝集体を、室温で１０〜２０分間にわたり４００μＬのＨＦＩＰ中に１．０ｍｇのＡβを溶解させることによって調製した。１００μＬの得られたＡβ溶液を、シリコン処理エッペンドルフチューブ中の９００μＬのＤＤ  Ｈ２Ｏに添加した。室温で１０〜２０分間定温放置した後、これらのサンプルを１４，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清画分を新たなシリコン処理チューブに移し、Ｎ２の穏やかな流れに５〜１０分間供してＨＦＩＰを蒸発させた。これらのサンプルを、テフロンコーティングしたミクロスターラーバーを使用して、２４〜４８時間、２２℃、および５００ＲＰＭで攪拌した。ＡＦＭまたはＥＭによる観察のために、１０μｌのアリコートを６〜１２時間間隔で採取した。中間体の高純度サンプルを調製するために、残留トリフルオロ酢酸イオンを、１ｍＭ  ＨＣｌ中での凍結乾燥と、続く５０％アセトニトリル中での凍結乾燥とによって除去した。
【０１３６】
最適レベルの中間体を得るために必要な攪拌時間は、攪拌速度およびペプチド濃度を含む当業者に明らかで微妙な因子に依存する。Ａβについての最も高いレベルの中間体を、６時間と３日間との間の攪拌の後に回収した。
【０１３７】
オリゴマー中間体およびモノマーまたは低分子量の凝集体の量を、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  ＴＳＫ  ３００ゲル透過カラムまたはＳｕｐａｒｏｓｅ  ＨＲ７５  ＦＰＬＣカラムを使用して注意深く観察した。この中間体を、カラムの含有容積またはその近傍で溶出するモノマーＡβまたは低分子量Ａβから、カラムの空隙容積またはその近傍で回収した。
【０１３８】
原線維からの中間体の精製は、１００，０００×Ｇ、及び１時間の遠心分離によって行う。モノマーまたは低分子量の凝集体は、ゲル透過クロマトグラフィーカラムへの上清の適用によって除去する。中間体はカラムの空隙容積の近傍で溶出され、モノマーおよび低分子量の凝集体は、含有容積の近傍で溶出して廃棄される。
【０１３９】
始原原線維の調製：
球状オリゴマーを上記のように調製し、次いで同容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して２４時間攪拌し、球状オリゴマーの湾曲した繊維を生成した。
【０１４０】
環状始原原線維の調製：
環状始原原線維の調製のために、オリゴマー中間体を上記のように調製した。このサンプルを、緩徐なエバポレーションによって乾燥しながら、激しい攪拌に供する。実質的に同じ結果を得るために、サンプルを攪拌しながら、数滴（総体積の５％未満）のヘキサンを添加する。これを、各添加について５分間の攪拌期間で１０回行う。
【０１４１】
原線維の調製：
原線維を、３つの異なる条件（各々０．０２％のアジ化ナトリウムを含む水（ｐＨ３．８〜４．２）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））下で調製した。Ａβの最終ペプチド濃度は０．３〜０．５ｍｇ／ｍｌ（８０〜１２５μＭ）であった。これらのサンプルを、テフロンコーティングしたミクロスターラーバーにより、室温、及び５００ｒｐｍで６〜９日間攪拌した。原線維形成を、チオフラビンＴ蛍光およびＵＶ光散乱によって観察した。原線維形成が完了したら、これらの溶液を１４，０００×Ｇ、及び２０分間で遠心分離し、原線維ペレットを２回蒸留した水で３×洗浄し、次いで所望の緩衝液中に再懸濁した。成熟原線維形態の存在、ならびに球状オリゴマー中間体および始原原線維の欠如を、ＡＦＭまたはネガティブ染色ＥＭによって確認した。
【０１４２】
実施例４
抗オリゴマー凝集抗体の特異性を、ドットブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗オリゴマー抗体と反応する細胞性タンパク質についてＳＨＳＹ５Ｙ細胞の溶解物をスクリーニングすることによって試験した。
【０１４３】
ドットブロットアッセイ
モノマーまたは低分子量の凝集体、オリゴマー中間体およびアミロイド原線維を実施例３に記載されるように調製し、使用の直前に、各々を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＤ  Ｈ２Ｏ中に溶解させた。２μｌの各サンプルをニトロセルロースメンブレンに注いだ。０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＴ−Ｔ）中の１０％の脱脂粉乳により、このメンブレンを室温で１時間ブロック（ｂｌｏｃｋ）した。このメンブレンを、ＴＢＳ−Ｔで３回（各々５分間）洗浄し、次いで室温で１時間にわたって、親和性精製した抗オリゴマー抗体（ＴＢＳ−Ｔ中の３％ＢＳＡ中０．１μｇ／ｍｌ）または血清（３％  ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔ中に１：１，０００希釈）と共に定温放置した。より高い濃度の洗剤は、抗オリゴマーによるアミロイドペプチド凝集体の検出を妨げることが示されていることから、Ｔｗｅｅｎ  ２０の濃度は、通常使用される濃度の１０分の１よりも低い。これらのメンブレンをＴＢＳ−Ｔで３回（各々５分間）洗浄し、３％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））と共に定温放置し、そして室温で１時間定温放置した。これらのブロットをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、アマシャム−ファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在製のＥＣＬ化学ルミネセンスキットで発色させた。抗オリゴマーについて、上記したように同じメンブレンをストリッピング緩衝液（１００ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．７）中、６５℃、及び４５分間定温放置することによって揮散（ｓｔｒｉｐ）し、ＴＢＳ−Ｔで５分間にわたって５回洗浄し、１０％脱脂粉乳でブロックし、そして６Ｅ１０で免疫検出した。６Ｅ１０は、ヒトβアミロイドペプチドのアミノ酸残基１〜１７を検出する公知のモノクローナル抗体である。
【０１４４】
図２に示すように、以下をニトロセルロースメンブレンに塗布し、抗オリゴマー凝集体（抗オリゴ）でプローブした：
１−可溶性Ａ４０オリゴマー凝集体中間体；
２−可溶性低分子量Ａ４０；および
３−Ａ４０原線維。
【０１４５】
抗オリゴマーのみが可溶性凝集中間体を認識し、６Ｅ１０は全てのＡ種を認識することが図２において理解され得る。
ＥＬＩＳＡアッセイ
サンプルを９６ウェルのプレートに塗布し、実施例２に記載されるように産生された抗オリゴマー凝集体抗血清を使用するＥＬＩＳＡによって分析した。可溶性低分子量Ａ４０（▲）、可溶性Ａ４０オリゴマー（○）、Ａ４０原線維（■）についての分析結果を図３に示す。
【０１４６】
サンプルをコーティング緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中に希釈し、１００μｌの緩衝液中の０ｎｇと１００ｎｇとの間の各アミロイド型を９６ウェルのマイクロプレートの別個のウェルに添加した。これらのプレートを３７℃で２時間定温放置し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いで３％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔにより、３７℃で２時間ブロックした。使用したＢＳＡは、ＩｇＧフリー（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））であった。次いで、これらのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００μｌの抗オリゴマー（３％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００希釈）を添加し、３７℃で１時間定温放置した。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００μｌのホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、３％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００希釈）を添加し、続いて３７℃で１時間定温放置した。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ケーピーエル社（ＫＰＬ）、メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ）所在）を使用して発色させた。この反応を、１００μＬの１Ｍ  ＨＣｌで停止させ、これらのプレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０１４７】
図３から、アミロイドペプチド凝集Ａ４０中間体のみが抗オリゴマー血清によって認識され、可溶性低分子量Ａ４０およびＡ４０原線維は、バックグラウンド値しか示さなかったことが判る。
【０１４８】
実施例５
原線維形成中の抗オリゴマー免疫反応性の反応速度論を、タイムポイントドットブロットアッセイによって分析した（図４）。
【０１４９】
球状凝集体は、変性Ａβペプチドの新たに可溶化した溶液中に最初は存在せず、経時的に発生する。さらに、球状オリゴマーの形成は、曲線をなす繊維または始原原線維の形成に先行することが公知である。例えば、ハーパーら（Ｈａｒｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ）（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第３８巻、８９７２頁を参照のこと。
【０１５０】
図４は、Ａ４０溶液およびＡ４２溶液がＨＦＩＰ中に溶解され、５６μＭのＡβに希釈され、そして１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中、２５℃で攪拌しながら定温放置されたタイムポイントドットブロットアッセイを示す。示された時間において、アリコートをニトロセルロースメンブレンに塗布し、抗オリゴマー抗体（上のパネル）でプローブし、次いで揮散して６Ｅ１０で再プローブした（下のパネル）。
【０１５１】
Ａ４２について、免疫反応性は６時間目に観察され、２４時間と１６８時間との間で最大である。３３２時間目に免疫反応性は失われる。Ａ４０についての反応速度論は、中間体の形成が約１８〜２４時間遅延される（これは、Ａ４２がＡ４０より速くオリゴマーを形成するという以前の観察と一致する）こと以外は、Ａ４２の反応速度論とほぼ同じである。これらのサンプルを電子顕微鏡によって調べて、この経時実験中の形態を決定した。免疫反応性の初期において、これらのサンプルは球状オリゴマーを主に含むが、後期においては、伸長された「始原原線維」を主に含むことが確認された。この観察は、始原原線維およびあまり発達していない中間体アミロイド形態が、抗オリゴマーによって認識される同じ立体配座エピトープを提示することを示す。
【０１５２】
実施例６
抗オリゴマー凝集体エピトープの見かけに対するペプチド凝集体サイズの依存を、ソレハムら（Ｓｏｒｅｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ）（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２６９巻、２８５５１頁に記載されるようなサイズ排除クロマトグラフィーによるアミロイドペプチド凝集体を分画することによって試験した。
【０１５３】
各種サイズのオリゴマーの集団に有利な異なる条件下で、Ａ４０オリゴマーの溶液を定温放置した。（−）ＤＤ  Ｈ２Ｏ（ｐＨ２．５〜４）中で３日間定温放置したＡ４０、（・−・−・）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で２日間定温放置したＡ４０、（−−−−）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中に新たに溶解したＡ４０、（・・・・）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）中で２日間定温放置したＡ４０。ピークを回収し、各々からのアリコートをニトロセルロースメンブレン上にドットし、抗オリゴマー抗体または  および６Ｅ１０抗体でプローブした。結果を図５に示す。
【０１５４】
約４０ｋＤａの位置（これはオクタマーのおよそのサイズに対応する）で溶出する４０ｋＤａのペプチド凝集体は、抗オリゴマーによって認識される。テトラマー、ダイマーおよびモノマーに対応する位置で溶出するピークは、抗オリゴマーとの反応性を示さない。
【０１５５】
実施例７
実施例２で産生された抗オリゴマー血清の特異性を、ＥＬＩＳＡによる他のアミロイド原性のタンパク質およびペプチドとの反応性によって分析した。これには、−シヌクレイン、島アミロイドＩＡＰＰ、ポリグルタミン、リゾチーム、ヒトインスリンおよびヒトプリオンペプチド１０６〜１２６由来の始原原線維凝集体、低分子量オリゴマーおよびアミロイド原線維の分析が含まれる。
【０１５６】
サンプルを９６ウェルのプレートに塗布し、抗オリゴマー抗血清を使用してＥＬＩＳＡ（これは、実質的に実施例４に記載されるように実施した）によって分析した（図６）。可溶性低分子量オリゴマー（▲）、アミロイドペプチド凝集体（○）およびＡ４０ペプチド（■）を、各アミロイド型について分析した。アミロイドペプチド凝集体のみが抗オリゴマーによって認識され、可溶性低分子量オリゴマーおよび原線維はバックグラウンド値のみを与える。アミロイドの型を図６中の各パネルの上部に示す。
【０１５７】
これらの結果は、抗オリゴマーは、アミロイドペプチド凝集体中のポリペプチド骨格独自の共通な立体配座的構造特徴を認識し、かつ独自のアミノ酸一次配列によって規定されないことを示す。
【０１５８】
実施例８
細胞培養物における抗オリゴマー抗体の神経毒性を阻害する能力を試験した。
抗オリゴマー抗体によるアミロイドペプチド凝集体の細胞傷害性の阻害を、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＭＴＴ低減およびＬＤＨ放出毒性アッセイを用いて測定する。
【０１５９】
ＭＴＴ低減アッセイについて、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０％ウシ胎仔血清、４ｍＭグルタミン、ペニシリン（２００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ中において、５％ＣＯ２中、及び３７℃で保存した。培地を２日毎に交換した。使用前にＮ２供給および１×１０−５Ｍの全トランス型レチノイン酸を含む無血清ＤＭＥＭ培地中で細胞を分化させた。細胞を９６ウェルのプレート中に１０，０００細胞／ウェルでプレートし、一晩増殖させた。培地を除去し、試験されるアミロイド形態を、フェノールレッドを含まない８０μｌの新たな培地に添加した。３７℃で４時間の定温放置後、ＭＴＴ毒物学キット（Ｔｏｘ−１、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を製造業者の指示に従って使用することにより、これらの細胞を分析した。
【０１６０】
ＬＤＨ放出アッセイについて、上記のようにＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を調製してアミロイド形態で処理した。３７℃で８時間の後、ＬＤＨ毒物学キット（Ｔｏｘ−７、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を製造業者の指示に従って使用してＬＤＨアッセイを実施した。
【０１６１】
図７は、Ａ４０およびＡ４２オリゴマー中間体の毒性、ならびにＡ４０およびＡ４２原線維について、ＭＴＴ低減を利用した抗オリゴマーによる毒性の阻害を示す。サンプルを、過剰量の親和性精製された抗オリゴマー抗体の存在下（白棒）、非存在下（黒棒）、または同量の非免疫ウサギＩｇＧの存在下（斜線の棒）で３０分間にわたり予め定温放置し、次いで２．５ｍＭの最終濃度で細胞傷害性について分析した。抗オリゴマーは、オリゴマー中間体（オリゴ）の毒性を実質的に低減するのに有効である。原線維形態は、最初は実質的に非毒性であり、かつ抗オリゴマーによって実質的に影響を受けない。
【０１６２】
−シヌクレイン、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、ポリグルタミン、リゾチーム、ヒトインスリンおよびヒトプリオンペプチド１０６〜１２６由来のアミロイドペプチド凝集体を含む他のアミロイドペプチド凝集体の毒性のＭＴＴ低減を利用した抗オリゴマーによる阻害を図８に示す。図８はまた、試験した全てのアミロイド型についての総平均測定値において、可溶性低分子量オリゴマーおよび原線維（Ａｌｌ  Ｓｏｌ．およびＡｌｌ  Ｆｉｂ．）についての細胞毒性の測定値および抗オリゴマーによるその低減を示す。
【０１６３】
Ａ４０、Ａ４２、−シヌクレイン、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、ポリグルタミン、リゾチーム、ヒトインスリンおよびヒトプリオンペプチド１０６〜１２６のアミロイドペプチド凝集体について、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＬＤＨ放出アッセイを使用して測定した場合の抗オリゴマー抗体による毒性の阻害を図９ａおよび９ｂに示す。可溶性オリゴマーサンプルを、過剰量の親和性精製された抗オリゴマー抗体の存在下（白棒）、非存在下（黒棒）、または同量の非免疫ウサギＩｇＧの存在下（斜線の棒）で３０分間にわたり予め定温放置し、次いで２．５ｍＭの最終濃度で細胞傷害性について分析した。図９ａおよび９ｂはまた、試験した全てのアミロイド型についての総平均測定値において、可溶性低分子量オリゴマーおよび原線維（Ａｌｌ  Ｓｏｌ．およびＡｌｌ  Ｆｉｂ．）についての細胞毒性の測定値および抗オリゴマーによるその低減を示す。図９ｂは明確な目的を含み、図９ｂ中に示された白棒および黒棒を示す。
【０１６４】
このデータから、試験した各アミロイドペプチド凝集体型で抗オリゴマー抗体による毒性の阻害が生じることが明らかである。
試験した全てのアミロイドのアミロイドペプチド凝集体が有意な毒性を示し、かつこの毒性が抗オリゴマーによって除去されるということは、アミロイドペプチド凝集体が、共通の機構によって毒性を媒介し得る共通の構造を共有することを示す。また、抗オリゴマーは一般的なクラスのアミロイドオリゴマー中間体に結合し、かつその毒性を低減させるために有効な抗体であることが示される。
【０１６５】
実施例９
抗オリゴマーの特異性をドットブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。
【０１６６】
ドットブロット分析：
可溶性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞溶解物（２．８μｇ）を、０ｎｇ、６ｎｇ、１２ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇまたは１００ｎｇのＡ４２アミロイドペプチド凝集体と混合した。これらのサンプルを、実質的に実施例４に記載されるように実施したドットブロットアッセイによって試験した（図１０）。
【０１６７】
添加したアミロイドペプチド凝集体の非存在下において、抗オリゴマーの免疫反応性は細胞溶解物で観察されない。上列：プロテアーゼインヒビターカクテルの非存在下で細胞溶解物と共に定温放置されたアミロイドペプチド凝集体。下列：プロテアーゼインヒビターカクテルの存在下で細胞溶解物と共に定温放置されたアミロイドペプチド凝集体。プロテアーゼインヒビターの存在下で、検出可能なアミロイドペプチド凝集体における顕著な増大が存在する。
【０１６８】
ＥＬＩＳＡアッセイ：
可溶性ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞溶解物（２０μｇ）を、量が増大するＡ４２、Ａ４０および−シヌクレインのアミロイドペプチド凝集体と混合し、実質的に実施例４に記載されるように実施したＥＬＩＳＡアッセイに供した（図１１）。アミロイドペプチド凝集体の非存在下での細胞溶解物のバックグラウンドを上回る０．７５ｎｇほどの少なさのアミロイドペプチド凝集体が検出される。
【０１６９】
このドットブロット分析におけるように、細胞溶解物と混合された場合の添加された可溶性オリゴマーの検出は、プロテアーゼインヒビターの存在に依存する。これは、可溶性アミロイドペプチド凝集体が、既に報告されているように（ウォルシュら（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  第４１６巻、５３５〜５３９頁）タンパク質分解に感受性であることを示している。
【０１７０】
この分子模倣物での反復免疫に応答して産生された未画分の血清は、アミロイド形成ペプチドの病理学的ミセル立体配座に顕著に特異的である。これは、Ａを使用したワクチン接種について観察された所望されない炎症性副作用を回避するワクチンの開発のための手段を提供し得ることを示唆する。なぜなら、このワクチンは、モノマーＡβまたは原線維沈着に対する反応性を有さずに中間体を特異的に狙うからである（ハーディ（Ｈａｒｄｙ）、ディー、ジェイ  セルコー（Ｄ．Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅ）（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２９７巻、３５３〜３５６頁）。試験した全てのアミロイドの可溶性オリゴマーがこの抗体によって全て認識されるという結果は、このエピトープに対するワクチンが、広範囲のアミロイド疾患のための有効な治療的アプローチであり得ることを示唆する。
【０１７１】
実施例１０
ＥＬＩＳＡアッセイを使用した診断方法：
脳脊髄液サンプルを、コーティング緩衝液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）中に、２倍希釈で連続的に希釈する。１００μｌのサンプルを９６ウェルのマイクロプレートのウェルに添加し、３７℃で２時間定温放置し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いで３％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔを用いて３７℃で２時間ブロックする。使用されるＢＳＡはＩｇＧフリー（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））である。次いで、これらのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００μｌの抗オリゴマー（３％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００希釈）を添加し、３７℃で１時間定温放置する。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００μｌのホースラディシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）３％ＢＳＡ  ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０，０００希釈）を添加し、３７℃で１時間定温放置する。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ケーピーエル社（ＫＰＬ）、メリーランド州ゲイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ）所在）を使用して発色させる。この反応を１００μＬの１Ｍ  ＨＣｌで停止させ、これらのプレートを４５０ｎｍで読み取る。ＥＬＩＳＡプレートのウェルに対する抗オリゴマーの結合は、アミロイドオリゴマー中間体の存在を示す。
【０１７２】
実施例１１
治療方法の効力を評価するための方法：
オリゴマー特異的抗体は、アミロイドオリゴマー中間体の形成を阻害するか、またはこのようなオリゴマー中間体の分解もしくは解離を引き起こす薬物および治療的薬剤についてのスクリーニングにおいて利用され得る。アミロイドオリゴマー中間体形成を阻害する薬物についてスクリーニングするために、試験化合物または薬物を、アミロイドオリゴマー中間体が任意の阻害効果の非存在下で形成する条件下で、アミロイドペプチドと共に定温放置する。この混合物を、実質的に実施例４に記載されるように、形成されたアミロイドオリゴマー中間体の量を決定するＥＬＩＳＡプレートによって分析する。オリゴマー中間体を分解または解離させる化合物について試験するために、予め形成されたオリゴマー中間体を試験薬物または化合物と混合し、この混合物を存在するオリゴマー中間体の量を決定するＥＬＩＳＡによって分析する。阻害化合物は、より低い量のアミロイドオリゴマーを生じ、アミロイドオリゴマーは、この分析において抗オリゴマー抗体によって検出される。
【０１７３】
上記の発明は、理解を明確にする目的のために詳細に記載されているが、特定の変更が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。本明細書中に引用される全ての刊行物および特許文献は、各々が個々に示されるのと同程度に、全ての目的についてその全体が本明細書中で参考により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】本発明の合成抗原の集合を示す図。
【図２】Ａβ低分子量オリゴマー、Ａβ高分子量オリゴマーおよびＡβ原線維をニトロセルロースメンブレンにスポットし、抗オリゴマー抗体および６Ｅ１０でプローブしたドットブロットアッセイの結果を示す図。
【図３】Ａβ低分子量オリゴマー、Ａβ高分子量オリゴマーおよびＡβ原線維を抗オリゴマー特異性について分析したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図。
【図４】各々経時的に、Ａβ低分子量オリゴマーからのＡβ高分子量オリゴマーの形成と、それに続くＡβ高分子量オリゴマーからのＡβ原線維の形成とを実証するドットブロットアッセイの結果を示す図。
【図５】ゲル濾過カラムから溶出した画分のドットブロット分析によって経時的に決定した場合の異なる溶液において産生されたＡβ集合の分子サイジングを示す図。
【図６】種々の低分子量アミロイド凝集体、高分子量アミロイド凝集体およびアミロイド原線維を抗オリゴマー特異性について分析したＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図。
【図７】ＭＴＴ低減アッセイを使用した抗オリゴマー抗体によるＡ４０およびＡ４２原線維（Ｆｉｂ．）ならびにＡ４０およびＡ４２高分子量凝集体（オリゴ）の細胞毒性における低減を示す図。
【図８】ＭＴＴ低減アッセイを使用した抗オリゴマー抗体によるＡ４０、Ａ２、−シヌクレイン、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、ポリグルタミン、リゾチーム、ヒトインスリンおよびヒトプリオンペプチド１０６〜１２６の低分子量凝集体（Ｓｏｌ．）、高分子量凝集体および原線維（Ｆｉｂ．）の細胞毒性における低減を示す図。
【図９ａ】ＬＤＨ放出アッセイを使用した抗オリゴマー抗体によるＡ４０、Ａ４２、−シヌクレイン、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、ポリグルタミン、リゾチーム、ヒトインスリンおよびヒトプリオンペプチド１０６〜１２６の低分子量凝集体（Ｓｏｌ．）、高分子量凝集体および原線維（Ｆｉｂ．）の細胞毒性における低減を示す図。
【図９ｂ】ＬＤＨ放出アッセイを使用した抗オリゴマー抗体によるＡ４０、Ａ４２、−シヌクレイン、島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）、ポリグルタミン、リゾチーム、ヒトインスリンおよびヒトプリオンペプチド１０６〜１２６の低分子量凝集体（Ｓｏｌ．）、高分子量凝集体および原線維（Ｆｉｂ．）の細胞毒性における低減を示す図。
【図１０】細胞抽出物における抗オリゴマー抗体の特異性を実証するドットブロット分析を示す図。
【図１１】細胞抽出物における抗オリゴマー抗体の特異性を実証するＥＬＩＳＡアッセイを示す図。
【図１】
2006516535.tif 000003
【図２】
2006516535.tif 000004
【図３】
2006516535.tif 000005
【図４】
2006516535.tif 000006
【図５】
2006516535.tif 000007
【図６】
2006516535.tif 000008
【図７】
2006516535.tif 000009
【図８】
2006516535.tif 000010
【図９ａ】
2006516535.tif 000011
【図９ｂ】
2006516535.tif 000012
【図１０】
2006516535.tif 000013
【図１１】
2006516535.tif 000014
【配列表】
2006516535000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月20日(2005.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
始原原線維凝集体の立体配座エピトープを含む単離された組成物であって、該始原原線維凝集体はａ）ヒトまたは動物において形成し、かつｂ）アミロイド原線維形成に寄与する組成物。
【請求項２】
前記組成物はペプチドを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が立体配座的に拘束されている請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９およびこれらの混合からなる群から選択される請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記エピトープが、湾曲した、または平坦な表面上で拘束されている請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記表面がａ）タンパク質、ｂ）プリーツシートを含むタンパク質、ｃ）粒子およびシートから選択される請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が支持体表面に結合している請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、金、亜鉛、カドミウム、錫、チタン、銀、セレン、ガリウム、インジウム、砒素、ケイ素、これらの混合物およびこれらの組合せから選択される材料を含む支持体上で拘束されている請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記始原原線維凝集体が約１ｋＤａから約１００，０００，０００ｋＤａの範囲内の分子量を有する請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、５個以上のモノマーを含む始原原線維凝集体の立体配座エピトープを含む請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が始原原線維凝集体の毒性種の立体配座エピトープを含む請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
アミロイド疾病もしくはアミロイド疾患の予防、治療または診断のための製剤、またはヒトもしくは動物の患者において、アミロイド疾病のために前もって施された治療の有効性または非有効性を決定するための製剤の製造時に請求項１から１１のいずれか一項に記載の有効量の組成物を使用する方法。
【請求項１３】
前記製剤は、アルツハイマー病、ダウン症候群に関連する早期発症型アルツハイマー病、ＳＡＡアミロイドーシス、遺伝性アイスランド症候群、多発性骨髄腫、ならびに狂牛病、ヒツジ・スクレイピーおよびミンク海綿状脳症を含む海綿状脳症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、クールー病、致死性家族性不眠症、慢性消耗症候群、家族性アミロイド多発性神経症、前頭側頭型痴呆、ＩＩ型糖尿病、全身性アミロイドーシス、血清アミロイドーシス、イギリス家族性痴呆、デンマーク家族性痴呆、黄斑変性および脳血管アミロイドーシスの群から選択されるアミロイド疾病の治療のためのものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記製剤がワクチンを含む請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、診断目的のための製剤の製造で行われ、
前記立体配座エピトープに結合する抗体を形成するために前記組成物を使用する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記製剤は、前記立体配座エピトープが患者由来の組織または流体中に存在する場合、アミロイド疾病の原因となる始原原線維凝集体の立体配座エピトープに前記抗体が結合するように前記組織または流体に混合されるものであり、前記抗体の結合または非結合によって、前記患者におけるアミロイド疾病またはアミロイド疾患の存在もしくはそれらの進行の可能性を診断するのに有効な請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法は、前記患者に前もって施されているアミロイド疾患のための治療の有効性または非有効性を決定するための製剤の製造で行われ、前記立体配座エピトープに結合する抗体を形成するために前記組成物を使用する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記製剤は、
Ａ．前記患者の組織または流体中に存在する前記立体配座エピトープに特異的な抗体の治療前のベースライン量を決定する工程；
Ｂ．前記患者に前記治療を施す工程；
Ｃ．前記患者の組織または流体中に存在する前記立体配座エピトープに特異的な抗体の治療後の量を決定する工程；及び
Ｄ．前記抗体の治療前のベースライン量を前記抗体の治療後の量と比較する工程によって使用される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アミロイド沈着によって特徴付けられる疾病を検出するのに有用な診断キットであって、該キットは、請求項１に記載の立体配座エピトープに結合する抗体を含むキット。
【請求項２０】
前記立体配座エピトープが寄与する前記アミロイド原繊維が前記エピトープを実質的に含まない請求項１９に記載の診断キット。