(57)【要約】癌を予防および治療するために化学療法剤または放射線療法剤と併用してCD26を含む組成物を投与する工程を含む治療法を提供する。また、CD26を含む組成物を投与する工程を含む、免疫応答を増強する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の増殖を阻害するために有効な用量で以下のものを細胞に接触させる工程を含む、細胞の増殖を阻害する方法：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤。
【請求項２】
CD26組成物がジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）活性を示す、請求項1記載の方法。
【請求項３】
CD26組成物と化学療法剤および／または放射線療法剤とを同時に細胞に接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項４】
細胞に化学療法剤および／または放射線療法剤を接触させる前にCD26組成物に接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項５】
細胞に化学療法剤および／または放射線療法剤を接触させた後にCD26組成物に接触させる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
化学療法剤がトポイソメラーゼII阻害剤である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
トポイソメラーゼII阻害剤が、アントラサイクリン系抗生物質、アムサクリン、エリプチシン、エピポドフィロトキシン、ミトキサントロン、合成トポイソメラーゼ阻害剤、または前述の任意の誘導体である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
トポイソメラーゼII阻害剤が、ドキソルビシン、エトポシド、ダウノルビシン、テニポシド、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、および／またはその誘導体および／または類似体および／またはリポソーム製剤である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
合成トポイソメラーゼII阻害剤が低分子である、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
CD26組成物がターゲティング物質に結合している、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
ターゲティング物質が、抗体、サイトカイン、受容体-リガンド、または他の任意の腫瘍ターゲティング分子である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
ターゲティング物質が抗体である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、放射線療法剤、毒素、または他の癌治療物質にさらに結合している、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
CD26組成物が、細胞において活性なプロモーターの制御下で、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：34、配列番号：36、またはその断片、イソ型、変異、もしくは変種をコードするDNAセグメントを含む発現構築物を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
発現構築物が、少なくともアミノ酸配列Gly-Trp-Ser-Tyr-Gly（配列番号：42）をコードする核酸を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
プロモーターが異種である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導型プロモーター、または非誘導型プロモーターである、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
発現構築物がウイルス発現構築物である、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
ウイルス発現構築物が、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、レンチウイルス、およびワクシニアウイルスからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
発現構築物が非ウイルス発現構築物である、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
非ウイルス発現構築物が裸のDNAとして投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
非ウイルス発現構築物がリポソーム製剤として投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
CD26組成物が、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37、またはその断片、変異、イソ型、もしくは生物学的機能的同等物のアミノ酸配列を含むCD26ペプチドまたはタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
CD26ペプチドまたはタンパク質が、配列番号：2の少なくともアミノ酸628〜632位をコードするアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
CD26ペプチドまたはタンパク質が、可溶性CD26タンパク質もしくはペプチド、組み換えによって産生されたCD26ペプチドもしくはタンパク質、CD26融合ペプチドもしくはタンパク質、実質的に精製されたCD26ペプチドもしくはタンパク質、部分精製されたCD26ペプチドもしくはタンパク質、天然に存在するCD26ペプチドもしくはタンパク質、天然に存在するCD26ペプチドもしくはタンパク質のイソ型、または変異体CD26ペプチドもしくはタンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
細胞が癌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
癌細胞が、血液系の癌細胞、膀胱癌細胞、血液癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳癌細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、リンパ系癌細胞、皮膚癌細胞、脳癌細胞、骨癌細胞、軟組織癌細胞である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
細胞がヒト被験者に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
CD26組成物が全身投与される、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
CD26組成物が、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、腫瘍内、筋肉内、皮下、関節内、髄腔内、経口、皮膚、鼻腔、口腔、直腸、または膣内経路によって投与される、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
CD26組成物が腫瘍に局所投与される、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
直接腫瘍内注射または腫瘍血管への注射による、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
細胞において細胞周期停止を誘導するために有効な用量で以下のものを細胞に接触させる工程を含む、細胞において細胞周期停止を誘導する方法：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤。
【請求項３４】
細胞が癌細胞である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
癌細胞を殺すために有効な用量で以下のものを細胞に接触させる工程を含む、癌細胞を殺す方法：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤。
【請求項３６】
CD26組成物と化学療法剤および／または放射線療法剤とを腫瘍細胞に接触させる工程を含む、腫瘍細胞に及ぼす化学療法剤および／または放射線療法剤の影響を増強する方法。
【請求項３７】
癌細胞のアポトーシスを誘導またはアポトーシスを増強するために有効な用量で以下のものを細胞に接触させる工程を含む、癌細胞のアポトーシスを誘導またはアポトーシスを増強する方法：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤。
【請求項３８】
以下のものをヒト患者に投与する工程を含む、ヒト患者における癌を治療する方法であって：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤、
ここで、CD26組成物の用量は、化学療法剤および／または放射線療法剤の投与と併用した場合、癌を治療するために有効である。
【請求項３９】
DNA損傷剤がトポイソメラーゼII阻害剤である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコードする核酸、化学療法剤、免疫療法剤、サイトカイン、ケモカイン、活性化剤、または生体反応修飾剤である、別の抗癌剤によって患者を治療する工程をさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
他の抗癌剤が、CD26組成物と化学療法剤および／または放射線療法剤と同時に投与される、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
他の抗癌剤が、CD26組成物と化学療法剤および／または放射線療法剤とは異なる時期に投与される、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
腫瘍の退縮を引き起こすために有効な用量で以下のものを、それを必要とする患者に投与する工程を含む、腫瘍の退縮を誘導する方法：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤。
【請求項４４】
腫瘍の壊死を誘導するために有効な用量で以下のものを、それを必要とする患者に投与する工程を含む、腫瘍の壊死を誘導する方法：
a）CD26組成物；ならびに
b）化学療法剤および／または放射線療法剤。
【請求項４５】
癌細胞においてCD26発現を誘導する工程と、化学療法剤および／または放射線療法剤を患者に投与する工程であって、CD26の発現によって化学療法剤および／または放射線療法剤に対する癌細胞の感受性を増強させる工程とを含む、癌を有する患者を治療する方法。
【請求項４６】
化学療法剤がトポイソメラーゼII阻害剤である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
癌細胞におけるCD26発現の誘導が、細胞に生体因子を接触させることによって行われる、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
生体因子が、サイトカイン、ケモカイン、レチノイド、インターフェロン、化学療法剤、抗体、または抗原である、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
癌細胞におけるCD26発現の誘導が、細胞に化学物質を接触させることによって行われる、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
細胞にCD26組成物を接触させる工程を含む、細胞におけるトポイソメラーゼII発現を増加させる方法。
【請求項５１】
CD26組成物が、CD26またはその断片をコードするDNAセグメントを含む発現構築物を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
CD26組成物がCD26ペプチドまたはタンパク質を含む、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
トポイソメラーゼIIがトポイソメラーゼIIαである、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
細胞にCD26組成物を提供する工程を含む、抗原提示細胞を活性化する方法。
【請求項５５】
抗原提示細胞に抗原性組成物を提供する工程をさらに含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
抗原性組成物が、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
CD26組成物を提供することによって、動物の抗原提示細胞を活性化する工程を含む、動物の免疫応答を増強する方法。
【請求項５８】
抗原提示細胞に抗原性組成物を提供する工程をさらに含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
抗原性組成物が、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、真菌抗原を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
CD26組成物が、細胞において活性なプロモーターの制御下で、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：34、配列番号：36、またはその断片、イソ型、変異、もしくは変種をコードするDNAセグメントを含む発現構築物を含む、請求項57記載の方法。
【請求項６１】
CD26組成物が、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37、またはその断片、変異、イソ型、もしくは生物学的機能的同等物のアミノ酸配列を含むCD26ペプチドまたはタンパク質である、請求項57記載の方法。
【請求項６２】
動物がヒトである、請求項57記載の方法。
【請求項６３】
ヒトが免疫抑制されている、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
ヒトが癌を有する、請求項62記載の方法。
【請求項６５】
ヒトが感染症を有する、請求項62記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、2002年5月17日に提出された米国特許仮出願第60/381,606号に対する優先権を主張する。上記参照出願の内容全体は、権利を放棄することなく、参照として本明細書に組み入れられる。政府は、国立衛生研究所の助成金番号第AR33713号により本発明に権利を保有する。
【０００２】
1．発明の分野
本発明は、全般的には癌および免疫学の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、化学療法剤と併用したCD26の遺伝子に基づくおよび／またはタンパク質に基づく治療を含む、癌の治療におけるCD26の治療的使用に関する。感染症に対する免疫応答を増強する方法、ならびにCD26に基づく治療を用いて免疫抑制を治療および予防する方法についても記述する。
【背景技術】
【０００３】
2．関連技術の説明
癌は、西欧世界における死因の第一位となり、これに次ぐのは心疾患である。現在の概算では、米国の3人に1人が癌を発症するであろうこと、そして5人に1人が癌のために死亡するであろうと予測される。現在、癌の治療にはいくつかの有効な選択肢がある。放射線治療および化学療法は、一般的に癌の治療のために用いられる。しかし、癌細胞はしばしば、放射線および化学療法の双方に対して抵抗性となる。さらに、化学療法は典型的に多数の副作用に関連している。
【０００４】
免疫調節の様々な局面に関係することが知られているCD26と呼ばれる分子も同様に、特定のヒト腫瘍の発生に関係することが知られている。その多様な機能において、CD26はまた、細胞外ペプチダーゼとしても作用し、その酵素活性によりジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）として知られている。CD26は特定のタイプの癌に関連することが知られている。例えば、DPPIV陽性である、またはCD26を発現する癌には、ほとんどの肺腺癌（Asadaら、1993）、分化型甲状腺癌（Tanakaら、1995）、B慢性リンパ性白血病細胞（Bauvoisら、1999）、T細胞リンパ芽球性リンパ腫／急性リンパ芽球性白血病（LBL/ALL）、およびT細胞CD30+未分化型大細胞リンパ腫（Carboneら、1995；Carboneら、1994）が含まれる。
【０００５】
CD26はまた、メラニン細胞の悪性形質転換と共にその発現が失われることから、黒色腫の発生において役割を有するようである（Morrisonら、1993；Wesleyら、1999）。CD26発現増強後のG1停止が、黒色腫細胞において認められている（Wesleyら、1999）。しかしCD26は、特定の癌の特性を分析するための診断ツールとして用いられているものの、現状では癌におけるその作用機序に関する研究は行われていない。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
癌研究の現在の目標のいくつかは、関連する副作用を減少させるために最小限の用量を用いて、利用できる化学療法剤の作用を増強する方法を発見することである。癌細胞を化学療法剤／放射線療法剤に対してより感受性にする方法と共に、化学療法剤を正常細胞より癌細胞に対して選択的に作用させる方法が望ましい。
【０００７】
本発明の一つの局面は、CD26ペプチドまたはタンパク質の発現によって、化学療法剤および／または放射線療法剤に対する癌細胞の感受性が増強されることを証明することによって、これらの目標に取り組む。
【０００８】
したがって本発明は、細胞の増殖を阻害するために有効な用量のa）CD26組成物、ならびにb）化学療法剤および／または放射線療法剤を、細胞に接触させることを含む、細胞の増殖を阻害する方法を提供する。これらの方法の特定の態様において、CD26組成物は、ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）活性を示す。
【０００９】
いくつかの態様において、細胞は、CD26組成物と化学療法剤および／または放射線療法剤とに同時に接触させる。他の態様において、細胞は、化学療法剤および／または放射線療法剤に接触させる前にCD26組成物に接触させる。なお他の態様において、細胞は、化学療法剤および／または放射線療法剤に接触させた後にCD26組成物に接触させる。
【００１０】
癌治療にとって有効な如何なる化学療法剤も本発明の実践において用いてもよい。いくつかの非制限的な例としては、マイトマイシン、アクチノマイシンD、ブレオマイシン、プリコマイシン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、カルムスチン、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、ロムスチン、ビスプラチン、腫瘍壊死因子、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトテシン、イフォスファミド、ニトロソウレア、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合物質、ゲンシタビン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、メソトレキセート、テマゾロミド（DTICの水溶液型）、カンプトテシン、マイトマイシンC、アドリアマイシン、ドキソルビシン、ベラパミール、エトポシド、ポドフィロトキシンおよび／または前述の任意の類似体および／または誘導体および／または変種および／またはリポソーム製剤が挙げられる。
【００１１】
いくつかの態様において、化学療法剤はDNA損傷剤である。他の特定の態様において、化学療法剤は、DNAとクロスリンクする物質、DNAをアルキル化する物質、DNAとインターカレートする物質、核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体および分裂異常を引き起こす物質、DNA複製、分裂、もしくは染色体分離に影響を及ぼす物質、またはトポイソメラーゼ阻害剤である。
【００１２】
いくつかの態様において、化学療法剤は、トポイソメラーゼII阻害剤であり、アントラサイクリン系抗生物質、アムサクリン、エリプチシン、エピポドフィロトキシン、ミトキサントロン、その合成阻害剤または誘導体である。
【００１３】
トポイソメラーゼII阻害剤の一定の具体的な例としては、ドキソルビシン、エトポシド、ダウノルビシン、テニポシド、ミトキサントロン、ならびにその誘導体およびリポソーム製剤が挙げられる。さらに、低分子のような合成トポイソメラーゼII阻害剤も同様に企図される。
【００１４】
用いてもよい放射線療法剤としては、γ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放出、放射線同位元素等が挙げられる。
【００１５】
いくつかの態様において、CD26組成物は標的化物質に結合させる。そのような態様において、CD26組成物を特定の癌細胞タイプにターゲティングすることができるターゲティング物質を、CD26組成物を癌細胞にターゲティングするためにCD26組成物に結合してもよい。例としての物質には、腫瘍細胞マーカー、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、毒素に対して特異的な抗体、または標的細胞上で特定の分子を認識する他のリガンド／分子が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で既知の腫瘍マーカーの非制限的な例としては、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、尿中の腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbB、neu、およびp155が挙げられ、そのような腫瘍マーカーに対する抗体は、そのような腫瘍マーカーを発現する癌細胞に対してCD26組成物をターゲティングするためのターゲティング物質であると企図される。リガンドの非制限的な例は、上皮細胞増殖因子等のような癌細胞において異なるように発現されている受容体に結合するリガンドである。
【００１６】
さらに他の態様において、免疫治療抗体またはターゲティング抗体をCD26組成物（ペプチド／タンパク質またはCD26をコードする発現ベクター）に結合させてもよく、さらに、放射線療法剤、毒素、またはもう一つの抗癌剤に結合させてもよい。
【００１７】
いくつかの態様において、CD26組成物は、細胞において活性なプロモーターの制御下で、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：34、配列番号：36、またはその断片、イソ型、変異、もしくは変種をコードするDNAセグメントを含む発現構築物を含む。いくつかの特定の態様において、CD26発現構築物は、少なくともアミノ酸配列Gly-Trp-Ser-Tyr-Gly（配列番号：42）をコードする核酸を含む。さらに他の特異的局面において、CD26発現構築物は、DPPIV酵素活性を示すアミノ酸をコードする核酸を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、発現構築物のプロモーターは、異種プロモーターである。プロモーターは構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導型プロモーター、または非誘導型プロモーターであってもよい。癌細胞特異的プロモーターも同様に企図される。
【００１９】
他の態様において、発現構築物は、ウイルス発現構築物であり、レトロウイルス構築物、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、ポリオーマウイルス構築物、ワクシニアウイルス構築物またはレンチウイルス構築物であってもよい。
【００２０】
または、発現構築物は非ウイルス発現構築物であってもよい。非ウイルス発現構築物は裸のDNAまたはリポソーム製剤として投与してもよい。
【００２１】
他の態様において、CD26組成物は、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37のアミノ酸配列、またはその断片、変異、イソ型、もしくは生物学的機能的同等物を含むCD26ペプチドもしくはタンパク質である。いくつかの特異的局面において、CD26ペプチドまたはタンパク質は、配列番号：2の少なくともアミノ酸628〜632位をコードするアミノ酸配列を含む。
【００２２】
さらに他の態様において、CD26ペプチドまたはタンパク質は、可溶性CD26タンパク質もしくはペプチド、組み換えによって産生されたCD26ペプチドもしくはタンパク質、実質的に精製されたCD26ペプチドもしくはタンパク質、部分精製CD26ペプチドもしくはタンパク質、天然に存在するCD26ペプチドもしくはタンパク質、天然に存在するCD26ペプチドもしくはタンパク質のイソ型、または変異体CD26ペプチドもしくはタンパク質であってもよい。
【００２３】
方法のなお他の態様において、細胞は、癌細胞であり、血液癌細胞、膀胱癌細胞、血液癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、胃癌細胞、精巣癌細胞、脳癌細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、リンパ系癌細胞、皮膚癌細胞、脳癌細胞、骨癌細胞、軟組織癌細胞を含む如何なる癌細胞であってもよい。
【００２４】
他の態様において、細胞はヒト被験者に存在する。そのような態様において、CD26組成物は全身投与してもよい。静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、腫瘍内、筋肉内、皮下、関節内（intraarthricular）、髄腔内、経口、皮膚、鼻腔内、口腔内、または膣内経路による投与が企図される。さらに他の態様において、CD26組成物は、腫瘍に局所投与され、これは直接の腫瘍内注射によって、または腫瘍血管への注射によって行ってもよい。これらの投与法は全て当業者に既知である。
【００２５】
本発明はまた、細胞において細胞周期停止を誘導するために有効な量のa）CD26組成物；ならびにb）化学療法剤および／または放射線療法剤を、細胞に接触させることを含む、細胞における細胞周期停止を誘導する方法を提供する。そのような方法において、細胞は癌細胞であってもよい。
【００２６】
本発明はまた、癌細胞を殺すために有効な量のa）CD26組成物；ならびにb）化学療法剤および／または放射線療法剤を、細胞に接触させることを含む、癌細胞を殺す方法を提供する。
【００２７】
さらに、腫瘍細胞にCD26組成物およびDNA損傷剤を接触させることを含む、腫瘍細胞に対する化学療法剤および／または放射線療法剤の作用を増強する方法が提供される。
【００２８】
このように本発明は、化学療法剤および／または放射線療法剤と併用した場合のCD26組成物の用量が癌を治療するために有効である、a）CD26組成物；ならびにb）化学療法剤および／または放射線療法剤をヒト患者に投与することを含む、ヒト患者における癌を治療する方法を提供する。
【００２９】
これらの方法の特定の態様において、CD26組成物は、CD26ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸であり、ウイルスベクターである。そのような態様において、ウイルスベクターの用量は、約103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013 pfuおよびそれ以上である。または、用量はウイルス粒子単位（vp）で表記してもよい；このように、「pfu」で示した上記の数値は、「vp」単位または「ウイルス粒子」の単位で表記してもよい。約103〜1015、約105〜1012、または約107〜約1010ウイルス粒子を患者に投与してもよいと企図される。
【００３０】
本発明の方法には、発現構築物、ベクター、およびカセットを患者に投与するために薬理学的に許容される溶液に分散させることが含まれる。薬理学的に許容される溶液は、緩衝液、溶媒、希釈剤であってよく、脂質を含んでもよい。本発明の一つの態様において、CD26ポリペプチドをコードする核酸をリポソームにおいて投与する。これらの核酸分子は、患者に静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡によって、病変内、経皮、皮下、局所、または直接注入もしくは還流によって投与してもよい。治療法は、多数回投与を含んでもよいことがさらに企図される。本発明の核酸は注射によって投与してもよい。他の態様には、多数回注射によって核酸を投与することが含まれる。
【００３１】
他の態様において、可溶性型、部分精製、実質的に精製、組み換えによって産生された、人工合成型を含むCD26のタンパク質／ペプチド組成物を患者に投与することが企図される。そのようなペプチドまたはタンパク質のリポソーム製剤も同様に企図される。
【００３２】
いくつかの局面において、化学療法剤はトポイソメラーゼII阻害剤である。本発明の方法は、他の化学療法剤が治療ポリペプチド、治療ポリペプチドをコードする核酸、免疫治療物質、サイトカイン、ケモカイン、活性化物質、または生体反応改変剤である、もう一つの化学療法剤によって患者を治療することをさらに含む。他の抗癌剤は、CD26組成物およびDNA損傷剤と同時に投与してもよい。または、他の抗癌剤は、CD26組成物およびDNA損傷剤とは異なる時期に投与してもよい。
【００３３】
本発明はまた、腫瘍の退縮を引き起こすために有効な量のa）CD26組成物；ならびにb）化学療法剤および／または放射線療法剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍の退縮を誘導する方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、腫瘍の壊死を引き起こすために有効な量のa）CD26組成物；ならびにb）化学療法剤および／または放射線療法剤を、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍の壊死を誘導する方法を提供する。
【００３５】
さらに本発明は、CD26の発現が化学療法剤および／または放射線療法剤に対する癌細胞の感受性を増強する、癌の細胞においてCD26発現を誘導すること、ならびに化学療法剤および／または放射線療法剤を患者に投与することを含む、癌を有する患者を治療する方法を提供する。いくつかの非制限的な例において、化学療法剤はトポイソメラーゼII阻害剤である。他の態様において、癌の細胞におけるCD26発現の誘導は、細胞を生体因子に接触させることによって行われる。CD26発現を誘導することができる生体因子の例は、サイトカイン、ケモカイン、レチノイド、インターフェロン、化学療法剤、抗体、または抗原性分子である。または、癌細胞におけるCD26発現の誘導は、細胞を化学物質に接触させることによって行ってもよい。
【００３６】
本発明はまた、細胞にCD26組成物を接触させることを含む、細胞におけるトポイソメラーゼII発現を増加させる方法を提供する。いくつかの特定の態様において、トポイソメラーゼIIは、トポイソメラーゼIIαである。
【００３７】
細胞をCD26組成物に接触させることによって、アポトーシスに対する感受性を増加させる方法も同様に提供される。この局面のいくつかの態様において、アポトーシスに対する感受性は、細胞におけるCD26組成物によって引き起こされるトポイソメラーゼII発現の増加によって増強される。さらに他の特定の態様において、トポイソメラーゼIIはトポイソメラーゼIIαである。他の態様において、本発明は、CD26組成物を細胞に投与することを含む、アポトーシスを誘導する方法を提供する。
【００３８】
本発明は、CD26が抗原提示細胞（APC）に直接影響を及ぼすことを示し、抗原提示細胞は一度活性化されると、T細胞に抗原を提示して、T細胞の活性化を引き起こし、その後活性化T細胞の増殖を引き起こすことを示した。細胞障害性Tリンパ球（CTL）およびT-ヘルパー細胞はいずれも、APCによって活性化され、免疫系のアップレギュレーションを引き起こす。CD26、可溶性CD26タンパク質と共に本明細書に記述の他のタンパク質／ペプチド組成物をコードする発現ベクターを含むCD26組成物は、APCを活性化して、それによって免疫応答を増強する。
【００３９】
したがって本発明はまた、細胞にCD26組成物を提供することを含む、抗原提示細胞（APC）を活性化する方法も提供する。樹状細胞、マクロファージ、内皮細胞、グリア細胞等のような如何なるタイプの抗原提示細胞も用いてもよい。
【００４０】
いくつかの態様において、CD26組成物を抗原提示細胞にターゲティングすることができるターゲティング物質に、CD26組成物をさらに結合させる。例としての物質には、APC細胞表面特異的タンパク質に対して特異的な抗体またはリガンドが含まれるがこれらに限定されない。CD26組成物を輸送する方法を本明細書において記述する。
【００４１】
いくつかの態様において、方法はさらに、抗原提示細胞に抗原を提供することを含む。抗原は、抗原をコードするウイルスおよび非ウイルスベクターを含む核酸発現ベクターの形で提供してもよい。あるいは、抗原性タンパク質またはペプチドを細胞に提供してもよい。発現ベクターを用いる場合、それらは適したプロモーターの制御下におかれる。本明細書は、発現ベクターおよびプロモーターに関する詳細な説明を提供する。いくつかの態様において、プロモーターは、APC細胞特異的プロモーターであってもよい。免疫応答を強化するために当技術分野において一般的に用いられるアジュバントおよび他の物質を用いることも同様に企図される。様々なタイプの抗原を提供してもよく、これらには、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、および真菌抗原が含まれる。ウイルスベクターを抗原提示細胞に特異的に輸送するいくつかの方法は当技術分野で既知である。例えば、米国特許第6,300,090号は、プロセシングおよびT細胞に提示するために、抗原を樹状細胞に輸送するためにウイルスベクターを用いることを教示する。
【００４２】
CD26および選択的に一つまたはそれ以上の抗原を発現する抗原提示細胞は、Tヘルパー細胞を刺激すると共にCTLを刺激し、いずれの事象によっても免疫応答の増強が起こる。当技術分野において周知であるように、Tヘルパー細胞の活性化によって、サイトカイン、インターフェロンの放出、細胞間相互作用、B細胞の活性化およびCTLの活性化さえ含む広範囲の免疫調節活性が起こる。
【００４３】
一つの局面において、CD26および選択的に一つまたはそれ以上の抗原を発現する抗原提示細胞を用いて、エクスビボまたはインビボの双方において細胞障害性Tリンパ球（CTL）増殖を刺激することができる。エクスビボで増殖させたCTLは、養子免疫移入の方法においてヒト患者に投与することができる。
【００４４】
さらに本発明は、CD26組成物を動物に投与することによって、動物の抗原提示細胞を活性化することを含む、動物の免疫応答を増強する方法を提供する。いくつかの局面において、これらの方法は、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、および／または真菌抗原のような抗原を動物の抗原提示細胞に提供することをさらに含んでもよい。いくつかの態様において、動物はヒトであってもよい。ヒトは免疫抑制されていてもよく、および／または癌に罹患していてもよく、および／またはウイルス、細菌、もしくは真菌病原体によって引き起こされた感染症に罹患していてもよい。免疫応答を増強する方法は、他の抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍物質および治療を含むそのような病態を治療するために一般的に用いられる他の治療と共に用いてもよい。当業者はこのことおよび本発明の方法を用いて免疫応答を増強するための他のシナリオを認識するであろう。
【００４５】
本明細書において用いられるように、「一つ（a, an）」とは、一つまたはそれ以上を意味しうる。本明細書の請求の範囲において用いられるように、「含む」という用語に関連して用いられる場合、「一つ（a, an）」という用語は、一つまたは一つより多いことを意味しうる。本明細書において用いられるように、「もう一つの」とは、少なくとも第二のまたはそれ以上を意味しうる。
【００４６】
本発明の他の目的、特徴、および長所は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、様々な変更および改変が本発明の趣旨および範囲に含まれることは、この詳細な説明から当業者に明らかとなるであろうことから、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい態様を示しているが、説明するために限って提供されることを理解しなければならない。
【００４７】
以下の図面は本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書に提示した特定の態様に関する詳細な説明と共にこれらの図面の一つまたはそれ以上を参照することによって、よりよく理解されるであろう。
【００４８】
例となる態様の説明
癌治療の分野は、必ずしも全てのタイプの癌細胞が化学療法剤または放射線療法剤に対して感受性があるわけではないという事実によって妨害されている。さらに、一つまたはそれ以上の化学療法剤／放射線療法剤が特定の癌に対して有効である場合であっても、それらはいくつかの副作用を引き起こす。そのため、癌細胞の化学療法剤／放射線療法剤に対する感受性を増加させる方法および／または化学療法剤／放射線療法剤の低用量の有効利用を可能にする方法が実際に必要である。
【００４９】
本発明は、CD26ペプチドもしくはタンパク質を輸送する、または細胞におけるCD26ペプチドもしくはタンパク質の発現を増加させ、それによって化学療法DNA損傷剤および／または放射線療法剤に対する細胞の感受性を増加させる治療法を提供する。癌細胞対正常細胞においてCD26ペプチドまたはタンパク質を選択的に発現させる方法も同様に提供する。本発明者らは、化学療法剤による処置後の癌細胞においてCD26が発現されれば、細胞周期事象を破壊、細胞周期停止を誘導し、そして癌細胞の増殖阻害を引き起こすことを示した。したがって、本発明の方法は、癌の治療に関する既存の方法の有効性を有意に増加させる。
【００５０】
CD26の発現および／またはその酵素的DPPIV活性の一つの効果は、トポイソメラーゼIIの発現の増加であり、これによってトポイソメラーゼIIを阻害または減少させる化学療法剤に対する細胞の感受性が増加する。トポイソメラーゼ阻害剤は当技術分野で周知であり、癌を治療するために広く用いられている。化学療法剤に対する癌細胞の感受性の増強に関するCD26の他の作用も同様に企図される。CD26タンパク質は、多様な機能的局面に関係することが知られているが、CD26の発現後の細胞においてトポイソメラーゼII発現が増加したことは、CD26とトポイソメラーゼとのあいだに機能的関連があることを初めて証明している。
【００５１】
本発明はまた、細胞におけるCD26の発現またはCD26タンパク質の存在がアポトーシスに対する細胞の感受性を増加させることも証明した。いくつかの態様において、アポトーシスに対するこの感受性の増強は、CD26タンパク質によって引き起こされたトポイソメラーゼII発現の増加による。このように本発明はまた、アポトーシスを誘導する方法のみならず、a）CD26の発現を誘導した後に、および／またはb）組み換え型CD26を発現した後に、および／または3）細胞にCD26タンパク質組成物を提供した後に、癌細胞においてアポトーシスを増強する方法を提供する。
【００５２】
本発明はまた、CD26が抗原提示細胞（APC）に直接影響を及ぼすことによって、抗原に対するT細胞免疫応答を増強することも証明した。したがって、癌に対する有効な治療を提供する他に、本発明者らは、APCを活性化することによって、免疫応答を増強するためのCD26の治療的有用性を企図する。したがって、感染症、腫瘍、および免疫抑制病態の治療のためにCD26を用いることも同様に提供される。
【００５３】
A．CD26
CD26は、上皮細胞および白血球サブセットを含む多様な組織において発現される多様な機能的特性のアレイを有する110kdの表面糖タンパク質である（MorimotoおよびSchlossman、1998；von Boninら、1998）。CD26タンパク質は、その細胞外ドメインにおいてジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）活性を有し、最後から2番目の位置でL-プロリンまたはL-アラニンのいずれかを有するポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを切断することができる膜会合エクトペプチダーゼである。
【００５４】
過去10年間の研究から、CD26が基礎ヒトT細胞生理学において多くの機能を有する分子であることが示されている。例えば、CD26は、T細胞および単球機能に関与する特定のケモカインを切断する（Oraveczら、1997；Proostら、1998）。他の研究から、アデノシンデアミナーゼ（ADA）表面発現を調節するADA結合タンパク質としてCD26が同定された。CD26/ADA複合体は、免疫系の機能を調節するために局所アデノシンを触媒的に除去するために重要な役割を果たすと考えられている（Dangら、1996；Kameokaら、1993；Morrisonら、1993）。
【００５５】
CD26は肝臓、腸、および腎臓において構成的に発現されているが、CD26発現レベルは、T細胞において厳密に調節されており、その密度は、T細胞活性化後顕著に増強される。静止期T細胞において、CD26は、CD4+メモリーT細胞のサブセットにおいて発現されており、このCD4+CD26高T細胞集団は、リコール抗原に対して最大限に反応することが示されている。実際に、CD26そのものが、特定の実験条件においてT細胞のシグナル伝達プロセスに関係している。固定したモノクローナル抗体（mAb）にCD26およびCD3をクロスリンクすると、T細胞活性化およびIL-2産生を誘導することができる。T細胞の抗CD-26抗体処置によって、抗CD3または抗CD2刺激に対する増殖反応が増強される。その上、1F7のような抗CD26 mAbによってCD26分子をライゲーションすると、CD3ζおよびp561ckのようなシグナル伝達分子のチロシン燐酸化の増加を誘導するが、可溶性の抗CD26 mAbおよび他のDPPIV阻害剤は、特定の場合においてT細胞増殖および機能を抑制する。
【００５６】
さらに、様々な刺激によってT細胞が活性化されると、CD26表面発現が増加して、このようにCD26はしばしばT細胞活性化マーカーとして用いられる（Foxら、1984；Morimotoら、1989）。CD26はまた、T細胞活性化のCD3およびCD2経路に関係する共刺激表面分子でもある。
【００５７】
CD26の活性化シグナル媒介能が機能的CD3/TcR複合体に依存することを示す報告もあるが（von Boninら、1998；Dangら、1990）、本発明者らは、CD26が、機能的CD3/TcR複合体の非存在下でT細胞生体反応の変化を引き起こすシグナルを伝達することができることを示した（Hoら、2001）。正常なT細胞において、CD26の関与によって、CD26およびCD45の物理的会合を通して部分的に媒介されるT細胞シグナル伝達に関与するタンパク質燐酸化の増加が起こる（Hegenら、1997；Torimotoら、1991）。
【００５８】
本発明の一つの局面は、CD26が、抗原提示細胞（APC）に直接影響を及ぼすことによって、抗原に対するT細胞免疫応答を増強することを証明している。本発明者らによるこれまでの研究では、リコール抗原である破傷風トキソイド（TT）によって誘導されるT-リンパ球の増殖を可溶性CD26が増強することを証明した（Tanakaら、1994）。本発明者らは、現在、CD26が共刺激分子CD86の発現をアップレギュレートするが、単球上のCD80またはHLA-DR Agの発現をアップレギュレートしないことを示した。このように、本発明は、特に感染症および免疫抑制病態の際に、免疫応答を増強するためのCD26の治療的利用を提供する。
【００５９】
免疫調節におけるその関与の他に、CD26は、特定のヒト腫瘍の発達において役割を有する可能性がある。ほとんどの肺腺癌は、DPPIV陽性であるが、他の組織学タイプの肺癌はDPPIV陰性である（Asadaら、1993）。さらに、CD26発現は、分化型甲状腺癌において高いが、良性の甲状腺疾患には存在しない（Tanakaら、1995）。慢性Bリンパ球白血病細胞および活性化B細胞では、正常な休止期B細胞と比較すると、高レベルのCD26タンパク質発現およびmRNA転写物が認められる（Bauvoisら、1999）。一方、T細胞悪性疾患でのCD26発現は、T細胞リンパ芽球性リンパ腫／急性リンパ芽球性白血病（LBL/ALL）およびT細胞CD30+未分化大細胞リンパ腫のような進行性の病態に限定されるようであり、菌状息肉症のような無痛性の疾患では小さい割合で検出されるに過ぎない。重要なことは、T細胞LBL/ALLサブセットにおいて、CD26発現は、予後不良患者の独立マーカーである（Carboneら、1995；Carboneら、1994）。CD26発現はメラニン細胞の悪性形質転換と共に失われることから、CD26はまた、黒色腫の発達において役割を有するようである（Morrisonら、1993；Wesleyら、1999）。CD26発現の増強は、黒色腫細胞においてG1停止を誘導することが示された（Wesleyら、1999）。しかし、本発明は、CD26の発現が、化学療法剤に対する癌細胞の感受性を増加させることを初めて証明する。
【００６０】
B．トポイソメラーゼおよびトポイソメラーゼ阻害剤
本発明は、細胞においてCD26を発現する一つの作用が、トポイソメラーゼIIの発現の増加であることを証明する。したがって、細胞においてCD26が発現されれば、トポイソメラーゼIIの阻害剤に対する細胞の感受性を引き起こす。
【００６１】
トポイソメラーゼは、DNAの複製、DNA修復、遺伝子組み換え、およびDNA転写において重要であることが知られている一群の酵素である。それらは、DNAにおけるスーパーコイルの導入および巻き戻しを触媒する。いくつかのタイプのトポイソメラーゼが既知である。例えば、トポイソメラーゼI酵素は、エネルギー的に自然に起こるプロセスであるスーパーコイルDNAを巻き戻させる。ジャイレースとしても知られるトポイソメラーゼIIは、エネルギーを必要とし、ATP依存的な負のスーパーコイルのツイストのDNAへの導入を触媒する。DNA複製において、トポイソメラーゼIおよびIIは、ヘリカーゼの作用によって複製フォークの前に導入される正のスーパーコイルを巻き戻させる機能を有する。さらに、ジャイレースは、負のツイストをDNAのセグメントに導入し、これによって一本鎖領域が出現する。このように、スーパーコイル形成／巻き戻し、結び目形成／解除、およびカテネーション／デカテネーションのようなDNAのトポロジー異性化反応は、トポイソメラーゼによって行われる。
【００６２】
細胞の複製、DNA修復、組み換えおよび転写におけるその役割の結果として、トポイソメラーゼは、抗癌化学療法剤の標的として考えられている。このように、トポイソメラーゼ活性を阻害する化合物であるトポイソメラーゼ阻害剤は、重要な分類の抗癌剤である。
【００６３】
トポイソメラーゼI阻害剤の例は、抗腫瘍アルカロイドであるカンプトテシンである。カンプトテシンならびにその類似体であるトポテカンおよびイリノテカンは、臨床での使用が承認されている。他のトポイソメラーゼI阻害剤も同様に用いてもよい。
【００６４】
エピポドフィロトキシン、アントラサイクリン、アクリジン、アントラセンジオン、エリプチシン、およびミトロキサントン（mitroxantones）を含む多様なグループの抗腫瘍剤がDNAトポイソメラーゼIIを標的とする（MacDonaldら、1991、参照として本明細書に組み入れられる）。そのような阻害薬の影響下において、トポイソメラーゼIIは、DNAを切断すると同時に、二本鎖DNAの切断された鎖と共有的会合を形成する。そのような阻害剤、DNAおよびトポイソメラーゼII酵素の「切断複合体」の形成は、酵素の切断-再閉鎖配列における共有結合したDNA結合触媒中間体の阻害剤による安定化のためである。
【００６５】
エトポシドはエピポドフィロトキシンの一例であり、哺乳類のDNAトポイソメラーゼIIイソ酵素を阻害する広く用いられている抗新生物薬である（Drakeら、1989；WattおよびHickson、1994；ならびにPommier、1993）。抗腫瘍活性、薬剤耐性細胞に対する細胞障害性、および薬剤特徴を改善するために、4'-O-デメチルエピポドフィロトキシン（ZhangおよびLee、1994、参照として本明細書に組み入れられる）を含む様々なエトポシド誘導体も同様に開発されている。様々な他のトポイソメラーゼII阻害剤の例は、プロシアニジン（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,156,791号に記述）；アザトキシンおよびその誘導体（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,747,520号に記述）；コルヒチン誘導体（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,639,793号に記述）によって示される。トポイソメラーゼIとトポイソメラーゼIIの双方の阻害剤のなお別の例は、これも参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,207,673号に記述される。
【００６６】
しかし、必ずしも全てのトポイソメラーゼ阻害剤がトポイソメラーゼタイプ特異的ではない。例えば、7-H-ベンゾピリド-(4,3-β)-インドール誘導体（イノトプリシン）は、トポイソメラーゼIおよびIIの双方を同時に阻害し、いくつかのトポイソメラーゼ媒介薬剤耐性メカニズムを回避する（Podderinら、1993）。
【００６７】
さらに、トポイソメラーゼの多数の低分子阻害剤が最近、合成および同定されている。いくつかの例は、キセノバリサーチ（Xenova Research、イギリス）が製造した、固形腫瘍の治療のためにデザインされた二重トポイソメラーゼ阻害剤であるXR11576（角度のあるベンゾフェナジン；Vickerら、2002；Mistryら、2002）およびXR5944（Stewartら、2001）である。他のいくつかの第二世代および第三世代低分子阻害剤が知られており、本発明は、方法においてそのような化合物を用いることを企図する。
【００６８】
さらに、化学療法剤の容易な取り込みのためにデザインされるリポソーム製剤および他の製剤もまた、特に有用であると企図される。
【００６９】
本発明は、CD26の発現および／またはDPPIV酵素活性を示すことが化学療法剤に対する細胞の感受性を増強することを提供する。トポイソメラーゼ阻害剤は化学療法剤の重要なクラスであることから、CD26に関連してこれを用いることを本明細書において述べる。その上、CD26は、トポイソメラーゼIIαのレベルを特異的に増加することが知られていることから、トポイソメラーゼII阻害剤を用いることも提供する。しかし、本発明は、本明細書において考察した特定のトポイソメラーゼ阻害剤を用いることに限定されず、トポイソメラーゼ酵素の他の任意の阻害剤も同様に本発明の実践において用いてもよいことは当業者によって認識されるであろう。さらに、本発明は、単なるトポイソメラーゼの阻害剤である化学療法剤を用いることに限定されない。トポイソメラーゼIIレベルの増加はCD26の多様な作用の単なる一つに過ぎない。したがって、他のクラスの化学療法剤も同様に用いてもよい。他のタイプの化学療法剤に関する考察を下記の章に示す。
【００７０】
C．他の化学療法剤
本発明は、CD26ペプチドまたはタンパク質の発現が化学療法剤に対する癌細胞の感受性を増強することを提供する。化学療法剤は、DNAを損傷する分子である。これらは、例えばDNAに直接クロスリンクする物質、DNAにインターカレートする物質、核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体および分裂異常を引き起こす物質となりうる。DNAを損傷する物質にはまた、DNA複製、分裂、および染色体分離を妨害する化合物が含まれる。
【００７１】
本発明の実践にとって有用であると企図される化学療法剤の例には、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（ミュタマイシンおよび／またはマイトマイシン-Cとしても知られる）、アクチノマイシンD（ダクチノマイシン）、ブレオマイシン、プリコマイシンのような抗生物質化学療法剤；タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチンのような植物アルカロイド；カルムスチン、メルファラン（アルケランとしても知られる、L-フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、L-PAM、またはL-サルコシンはナイトロジェン・マスタードのフェニルアラニン誘導体である）、シクロフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン（ミレランとしても知られる）、ロムスチンのようなアルキル化剤；およびビスプラチン、エトポシド（VP16）、腫瘍壊死因子、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、カンプトテシン、イフォスファミド、ニトロソウレア、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、ゲンシタビエン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、メソトレキセート、テマゾロミド（DTICの水溶性型）のようなその他の物質、または前述の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれる。さらに、リポソーム製剤および化学療法剤の取り込みを容易にするためにデザインされた他の製剤は、特に有用であると企図される。
【００７２】
D．放射線療法剤
本発明の方法は、CD26組成物による癌の治療が放射線療法剤に対する細胞の感受性を増加させることを提供する。放射線療法剤には、DNAの損傷を誘導する放射線および波動、例えばγ線照射、X線、UV照射、マイクロ波、電子放射、放射性同位元素等が含まれる。治療は、上記の型の放射線によって局所腫瘍部位を照射することによって行ってもよい。これらの因子は全て、損傷DNA、DNA前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持という広い範囲に影響を及ぼす可能性が最も高い。
【００７３】
X線の用量範囲は、1日量50〜200レントゲンの長期間（3〜4週間）照射から2000〜6000レントゲンの1回照射に及ぶ。放射性同位元素の用量範囲は広く異なり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００７４】
本発明の方法において、放射線療法剤は、ターゲティング剤および／またはCD26組成物にさらに結合させてもよいと考えられる。この一つの態様において、本発明は、CD26組成物のみならず放射線療法剤に結合する、腫瘍を標的とすることができる生体分子、例えば腫瘍マーカーに対する抗体、増殖因子に結合するリガンド、または腫瘍細胞によって異なるように発現されている他の受容体分子等を提供する。
【００７５】
E．CD26およびその断片の発現のためのベクター
特定の態様において、発現構築物（発現ベクターとも呼ばれる）を用いてCD26ペプチドまたはタンパク質産物を発現する。いくつかの態様において、発現ベクターは、DPPIV活性を示すCD26の酵素的に活性な断片をコードする。特に、本発明の発現ベクター／構築物は、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：20、配列番号：21、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：24、配列番号：25、配列番号：26、配列番号：27、配列番号：28、配列番号：29、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：32、配列番号：34、配列番号：36、および／またはGenBankアクセッション番号M74777、NM_001935、AH005372、XM_02930、BC133029、NM_010074、AH003239、AF461806（参照として本明細書に組み入れられるGenBankアクセッション番号）および／またはその任意の断片、変種、イソ型、変異、または生物学的機能的同等物、および／または任意の他のCD26配列によってコードされるDNA配列をコードしてもよいと企図される。本発明の発現ベクター／構築物は、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37を有するペプチドまたはタンパク質をコードしてもよく、および／またはGenBankアクセッション番号M74777、NM_001935、AH005372、XM_02930、BC133029、NM_010074、AH003239、AF461806および／またはその任意の断片、変種、イソ型、変異、生物学的機能的同等物、または模倣体によってコードされてもよい。
【００７６】
特定の核酸配列に基づいて様々な核酸セグメントをデザインしてもよく、それらは如何なる長さであってもよい。配列に番号を割付することによって、例えば最初の残基を1、2番目の残基を2などとすることによって、全ての核酸セグメントを定義するアルゴリズムを作製することができる：
nからn＋y
式中、nは1から配列の最後の数までの整数であり、yは核酸セグメントマイナス1の長さであり、n＋yは配列の最後の数を超えない。このように、10量体の場合、核酸セグメントは、塩基1〜10位、2〜11位、3〜12位等に対応する。15量体の場合、核酸セグメントは塩基1〜15位、2〜16位、3〜17位等に対応する。20量体の場合、核酸セグメントは、塩基1〜20位、2〜21位、3〜22位等に対応する。
【００７７】
本発明の状況において、CD26コード核酸は、その配列自身の長さにかかわらず、一つまたはそれ以上の核酸構築物を作製するために、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位、制限酵素部位、多クローニング部位、コードセグメント等を含むがこれらに限定されない他の核酸配列と組み合わせてもよい。全体的な長さは核酸構築物のあいだでかなり変動してもよい。このように、ほぼ如何なる長さの核酸セグメントも用いてもよいが、全長は好ましくは、意図する組み換え核酸プロトコールにおいて調製または使用する容易さによって限定される。
【００７８】
非制限的な例において、配列番号：1または上記の他の任意の配列と同一または相補的なヌクレオチドの連続した枝を含む一つまたはそれ以上の核酸構築物を調製してもよい。そのようなヌクレオチドの枝または核酸構築物は、長さが約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130、約135、約140、約145、約150、約155、約160、約165、約170、約175、約180、約185、約190、約195、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290、約300、約310、約320、約330、約340、約350、約360、約370、約380、約390、約400、約410、約420、約430、約440、約450、約460、約470、約480、約490、約500、約510、約520、約530、約540、約550、約560、約570、約580、約590、約600、約610、約620、約630、約640、約650、約660、約670、約680、約690、約700、約710、約720、約730、約740、約750、約760、約770、約780、約790、約800、約810、約820、約830、約840、約850、約860、約480、約880、約890、約900、約910、約920、約930、約940、約950、約960、約970、約980、約990、約1000、約1010、約1020、約1030、約1040、約1050、約1060、約1070、約1080、約1090、約1100、約1110、約1120、約1130、約1140、約1150、約1160、約1170、約1180、約1190、約1200、1210、約1220、約1230、約1240、約1250、約1260、約1270、約1280、約1290、約2000、約2100、約2200、約2300〜約2311ヌクレオチドであってもよいと共に、酵母人工染色体のような核酸構築物の出現が当業者に既知であることを考慮すれば、染色体の大きさまでおよびそれを含む（全ての中間の長さおよび中間の範囲を含む）大きさがより大きい構築物であってもよい。本明細書において用いられるように「中間の長さ」および「中間の範囲」は、与えられた値を含むまたはそのあいだ（すなわち、そのような値を含むおよびそのあいだの全ての整数）の如何なる長さまたは範囲も意味することは容易に理解されるであろう。
【００７９】
生物学的機能的同等物は、類似または改善された特徴を有する分子を得ながら、ポリヌクレオチドおよび／または分子をコードするタンパク質の構造に改変および／または変更を行ってもよい分子である。核酸をコードするベクターの状況において、生物学的機能的同等物は、異なる配列を含むが、同時に「野生型」または標準的なタンパク質のコード能を保持しているように操作されているポリヌクレオチドを含んでもよい。これは、遺伝子コードの縮重、すなわち同じアミノ酸をコードする多数のコドンの存在によって行うことができる。そのような同等物を調製する方法は、当技術分野において周知である。
【００８０】
発現には、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、これには、宿主細胞において対象となる遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳類起源の両者からのエンハンサー／プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーRNAの安定性および翻訳性を最適にするようにデザインされた要素も同様に定義される。産物を発現する永続的な安定な細胞クローンを確立するための多数の主要な薬剤選択マーカーを用いるための条件も同様に、薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に連結させる要素と共に提供される。
【００８１】
（i）調節要素
本出願を通して、「発現構築物」、または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが、ポリペプチド産物に転写および翻訳されうる、遺伝子産物をコードする核酸を含む如何なるタイプの遺伝子構築物も含むという意味である。発現構築物において遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」は、細胞の合成機構、または遺伝子の特異的転写を開始するために必要な導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。「転写制御下」という句は、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、プロモーターが、核酸に関連して正確な位置および方向に存在することを意味する。
【００８２】
プロモーターという用語は、本明細書においてRNAポリメラーゼIIの開始部位周辺に集合する転写制御モジュール群を指すために用いられる。プロモーターをどのように構築すべきかに関する検討の多くは、HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位のプロモーターを含むいくつかのウイルスプロモーターの分析から得られる。より最近の研究によって強調されたこれらの研究は、プロモーターが、それぞれがDNA約7〜20 bpからなり、転写活性化またはリプレッサータンパク質の一つまたはそれ以上の制限部位を含む不連続な機能的モジュールからなることを示している。
【００８３】
それぞれのプロモーターにおける少なくとも一つのモジュールは、RNA合成の開始部位を配置するように機能する。これに関して既知の最もよい例は、TATAボックスであるが、哺乳類のターミナルジデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターのような、TATAボックスを欠損するいくつかのプロモーターでは、開始部位そのものに重なり合う不連続な要素が開始位置を固定するために役立つ。
【００８４】
さらなるプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは開始部位の上流の30〜110 bpに存在するが、多くのプロモーターが同様に、開始部位の下流の機能的要素を含むことが最近示されている。プロモーター要素間の距離は、要素が互いに対して逆になるまたは移動した場合でもプロモーター機能が保存されるように柔軟である。tkプロモーターにおいて、プロモーター要素間の距離は、活性が減少し始める50 bp離れるまで増加させることができる。プロモーターに応じて、個々の要素は、協調してまたは独立して転写を活性化するように機能することができるように思われる。
【００８５】
特定の態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-燐酸デヒドロゲナーゼを用いると、対象となるコード配列の高レベル発現を得ることができる。対象となるコード配列の発現を得るために当技術分野で周知である他のウイルスまたは哺乳類細胞またはバクテリオファージプロモーターを用いることも、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り、同様に企図される。
【００８６】
周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換後の対象となるタンパク質の発現レベルおよびパターンを最適にすることができる。さらに、特異的生理的シグナルに反応して調節されるプロモーターを選択することによって、遺伝子産物の誘導可能な発現を可能にすることができる。表2および3は、本発明の意味において対象となる遺伝子の発現を調節するために用いてもよいいくつかの調節要素を記載する。このリストは、遺伝子発現の促進に関与する全ての可能性がある要素を網羅することを意図しておらず、単なる一例である。
【００８７】
エンハンサーは、DNAの同じ分子上の離れた位置に存在するプロモーターからの転写を増加させる遺伝子要素である。エンハンサーは、プロモーターと同様に構築される。すなわち、それらは多くの個々の要素からなり、そのそれぞれは、一つまたはそれ以上の転写タンパク質に結合する。
【００８８】
エンハンサーとプロモーターの基本的な相違は、操作性である。エンハンサー領域は全体として、離れて転写を刺激することができなければならない；これは、プロモーター領域またはその成分要素に必ずしも当てはまる必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位および特定の方向にRNA合成の開始を指示する一つまたはそれ以上の要素を有しなければならないが、一方エンハンサーはこれらの特異性を欠損する。プロモーターとエンハンサーは、しばしば重なり合って隣接し、しばしば非常に類似のモジュール構築を有するように思われる。
【００８９】
下記に、発現構築物において対象となる遺伝子をコードする核酸と共に用いることができるウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーおよび誘導型プロモーター／エンハンサーの一覧を記す（表1および表2）。さらに、如何なるプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核細胞プロモーターデータベースEPDBによる）もまた、遺伝子の発現を促進するために用いることができるであろう。真核細胞は、適当な細菌ポリメラーゼが提供されれば、輸送複合体の一部としてまたはさらなる遺伝子発現構築物として、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
【００９０】
（表１）プロモーターおよび／またはエンハンサー
2006510615.tif 000002
2006510615.tif 000003
【００９１】
（表２）誘導性要素
2006510615.tif 000004
【００９２】
cDNAインサートを用いる場合、典型的に、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含めることが望ましいであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルのようなそのような如何なる配列も用いてもよい。同様に、発現カセットの要素として企図されるのはターミネーターである。これらの要素は、メッセージレベルを増強してカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用することができる。
【００９３】
（ii）選択マーカー
本発明の特定の態様において、細胞は本発明の核酸構築物を含み、細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、それによって発現構築物を含む細胞を容易に同定することができるであろう。通常、薬物選択マーカーを含めることは形質転換体のクローニングおよび選択に役立ち、例えばネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、DHFR、GPT、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）のような酵素を用いてもよい。免疫マーカーも同様に用いてもよい。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【００９４】
（iii）ポリアデニル化シグナル
発現において、転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含めるであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、および／またはそのような如何なる配列を用いてもよい。好ましい態様には、様々な標的細胞において十分に機能するために簡便であるおよび／または機能することが既知である、SV40ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが含まれる。発現カセットの要素として同様に企図されるのは転写終了部位である。これらの要素は、メッセージレベルを増強するおよび／またはカセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするために役立ちうる。
【００９５】
（iv）ベクター
「ベクター」という用語は、それを複製することができる細胞に導入されるためにその中に核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すために用いられる。核酸配列は「外因性」となりえて、このことはベクターが導入される細胞に対して異物であること、または配列が細胞における配列と同種であるが、配列が当初認められない宿主細胞核酸内の位置に存在することを意味する。ベクターには、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）ならびに人工染色体（例えば、YAC）が含まれる。当業者は、その両者が参照として本明細書に組み入れられる、Sambrookら（1989）およびAusubelら（1994）に記述される標準的な組み換え技術を通して、ベクターを構築するために十分に必要な知識を有するであろう。
【００９６】
「発現ベクター」という用語は、転写することができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。いくつかの場合において、次にRNA分子をタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳する。他の場合において、これらの配列は例えばアンチセンス分子またはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物において機能的に結合したコード配列の転写およびおそらく翻訳にとって必要な核酸配列を意味する多様な「制御配列」を含みうる。転写および翻訳を支配する制御配列の他に、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能の役割を有する核酸配列も同様に含んでもよく、これを下記に説明する。
【００９７】
（v）発現ベクターの輸送
発現ベクターを細胞に導入してもよい多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルスまたはウイルスゲノムに由来する遺伝子操作された構築物を含む。特定のウイルスが受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることから、それらは、外来遺伝子を哺乳類細胞に移入するための魅力的な候補となった（Ridgeway、1988；NicolasおよびRubenstein、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Temin、1986）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス40、ウシ乳頭腫ウイルスおよびポリオーマ）（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986）、およびアデノウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986）を含むDNAウイルスであった。これらは、外来DNA配列に対する許容量が比較的小さく、限定された宿主スペクトルを有する。さらに、許容される細胞におけるその腫瘍発生能および細胞変性作用は、安全性に関する懸念を生じる。それらは、8 kBまでの外来遺伝子材料に適合できるに過ぎないが、多様な細胞株および実験動物に容易に導入することができる（NicolasおよびRubenstein、1988；Temin、1986）。
【００９８】
アデノウイルス
一つのインビボ輸送法は、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。「アデノウイルス発現ベクター」には、（a）構築物のパッケージングを支持するため、および（b）その中にクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチドを発現させるために十分なアデノウイルス配列を含む構築物が含まれることを意味する。この意味において、発現は遺伝子産物が合成される必要はない。
【００９９】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が判明していることから、すなわち36 kBの直線状の二本鎖DNAウイルスであることが判明していることから、アデノウイルスDNAの大きい断片を7 kBまでの外来配列に置換できる（GrunhausおよびHorwitz、1992）。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、遺伝子毒性の可能性がないエピソームによって複製することができることから、宿主細胞にアデノウイルスが感染しても、染色体の組み込みが起こらない。同様に、アデノウイルスは、構造的に安定であり、十分な増幅後にゲノムの再配列は検出されない。アデノウイルスは、その細胞周期段階にかかわらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまで、アデノウイルス感染症は、ヒトにおいて急性呼吸器疾患のような軽度の疾患のみに関連するように思われる。
【０１００】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲、および高い感染性のために遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの双方の末端は、100〜200塩基対の逆方向反復配列（ITR）を含み、これはウイルスDNA複製およびパッケージングにとって必要なcis要素である。ゲノムの初期（E）および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現によって、ウイルスDNA複製に関するタンパク質の合成が得られる。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現および宿主細胞のシャットオフに関係している（Renan、1990）。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子産物は、主要な後期プロモーター（MLP）によって生じる単一の主要な転写物の有意なプロセシング後に限って発現される。MLP（16.8 m.u.に存在する）は、感染症の後期相のあいだ特に有効であり、このプロモーターから生じた全てのmRNAは、5'-三裂リーダー（TPL）配列を有し、これによってそれらは翻訳のために好ましいmRNAとなる。
【０１０１】
現在の系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターおよびプロウイルスベクターとの相同的組み換えから生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの起こりうる組み換えにより、野生型アデノウイルスをこのプロセスから生成してもよい。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが肝要である。
【０１０２】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの作製および増殖は、293と命名される独自のヘルパー細胞株に依存し、これはAd5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する（Grahamら、1977）。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって不要であることから（JonesおよびShenk、1978）、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の助けを借りて、外来DNAをE1、D3、または双方の領域のいずれかに外来DNAを有する（GrahamおよびPrevec、1991）。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約105％をパッケージすることができ（Ghosh-Choudhuryら、1987）、DNAのさらに約2 kbの保持能を提供する。E1およびE3領域において置換可能なDNAの約5.5 kbと併せると、現在のアデノウイルスベクターの最大保持能は7.5 kbより小さく、またはベクターの全長の約15％である。アデノウイルスゲノムの80％以上がベクター骨格に残り、ベクター媒介細胞障害性の起源となる。同様に、E1欠失ウイルスの複製欠損は不完全である。例えば、現在利用可能なベクターでは、高い感染多重度（MOI）でウイルス遺伝子発現の漏出が認められている（Mulligan、1993）。
【０１０３】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉もしくは上皮細胞のようなヒト細胞に由来してもよい。または、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳類種の細胞に由来してもよい。そのような細胞には、例えばVero細胞または他のサル胎児間葉もしくは上皮細胞が含まれる。先に述べたとおり、好ましいヘルパー細胞株は293である。
【０１０４】
Racherら（1995）は、293細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つのフォーマットにおいて、個々の細胞を、培地100〜200 mlを含む1 Lのシリコン化スピナーフラスコ（Techne、ケンブリッジ、イギリス）に接種することによって、天然の細胞凝集物を増殖させる。40 rpmで攪拌した後、細胞の生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つのフォーマットにおいて、Fibra-Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin、ストーン、イギリス）（5 g/l）を以下のように用いる。培地5 mlに再浮遊させた細胞接種物を、250 mlのアーレンマイヤーフラスコにおいて担体（50 ml）に加えて、静置して、時に攪拌しながら1〜4時間放置した。次に、培地を新鮮な培地50 mlに交換して振とうを開始した。ウイルス産生のために、細胞を約80％コンフルエンスまで増殖させて、その後培地を交換して（最終容積の25％）、アデノウイルスをMOI 0.05で加えた。培養物を一晩静置した後、容積を100％に増加して、振とうをさらに72時間行った。
【０１０５】
アデノウイルスベクターが複製欠損、または少なくとも条件的に欠損であるという必要条件以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、異なる既知の血清型またはサブグループA〜F 42個のいずれであってもよい。サブグループCの5型アデノウイルスは、本発明において用いるための条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、5型アデノウイルスがヒトアデノウイルスであるためであり、それに関して膨大な生化学および遺伝子情報が既知であり、これまでベクターとしてアデノウイルスを用いるほとんどの構築に用いられているためである。
【０１０６】
上記のように、本発明に従う典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウジE1領域を有しない。このように、そこからE1コード領域が除去されている位置で、対象となる遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便であろう。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は本発明にとって重要ではない。対象となる遺伝子をコードするポリヌクレオチドを同様に、Karlssonら（1986）によって記述されるように、E3置換ベクターにおける欠失したE3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補足するE4領域の代わりに挿入してもよい。
【０１０７】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価、例えば109〜1012プラーク形成単位/mlで得ることができ、それらは非常に感染性が高い。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって輸送される外来遺伝子はエピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスのワクチン接種研究において副作用は報告されておらず（Couchら、1963；Topら、1971）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明している。
【０１０８】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Levreroら、1991；Gomez-Foixら、1992）およびワクチン開発（GrunhausおよびHorwitz、1992；GrahamおよびPrevec、1991）において用いられている。最近、組み換え型アデノウイルスを遺伝子治療に用いることができることが、動物試験によって示唆された（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、1991；Stratford-Perricaudetら、1990；Richら、1993）。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管内点滴注入（Rosenfeldら、1991；Rosenfeldら、1992）、筋肉注射（Ragotら、1993）、末梢静脈内注射（HerzおよびGerard、1993）、および脳内定位接種（Le Gal La Salleら、1993）が含まれる。
【０１０９】
レトロウイルス
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのRNAを二本鎖DNAに変換できる能力を特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である（Coffin、1990）。次に、得られたDNAはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする三つの遺伝子、gag、pol、およびenvを含む。gag遺伝子の上流に認められる配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのシグナルを含む。二つの長末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要がある（Coffin、1990）。
【０１１０】
レトロウイルスベクターを構築するために、対象となる遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、gag、pol、およびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を欠損するパッケージング細胞株を構築する（Mannら、1983）。cDNAを含む組み換え型プラスミドを、レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にこの細胞株に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組み換え型プラスミドのRNA転写物をウイルス粒子にパッケージングさせて、次にこれが培養培地に分泌される（NicolasおよびRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、選択的に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは、広く多様な細胞タイプに感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。
【０１１１】
ウイルスエンベロープに対する乳糖残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的改変に基づいて、レトロウイルスベクターを特異的にターゲティングさせるようにデザインされた新規アプローチが最近開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質受容体による肝細胞の特異的感染を許容できるであろう。
【０１１２】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン結合抗体を用いる、組み換え型レトロウイルスをターゲティングする異なるアプローチがデザインされた。ストレプトアビジンを用いることによって、抗体をビオチン成分によってカップリングさせた（Rouxら、1989）。主要組織適合抗原複合体クラスIおよびクラスII抗原に対する抗体を用いて、彼らは、それらの表面抗原を有する多様なヒト細胞がインビトロで異所ウイルスに感染することを証明した（Rouxら、1989）。
【０１１３】
本発明の全ての局面においてレトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおける無作為な部位に組み入れられる。これによって、宿主遺伝子の中断を通して、または隣接する遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって、挿入変異誘発が起こりうる（Varmusら、1981）。欠損レトロウイルスベクターを用いるもう一つの懸念は、パッケージング細胞における野生型複製コンピテントウイルスの出現が起こりうることである。これは、gag、pol、env配列の上流の組み換え型ウイルスインサートからの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因で起こりうる。しかし、現在では組み換えの可能性を大きく減少させる新しいパッケージング細胞株が利用可能である（Markowitzら、1988；Hersdorfferら、1990）。
【０１１４】
アデノ随伴ウイルス
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、哺乳類被験者に外来遺伝子を輸送するために魅力的なウイルスである（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；HermonatおよびMuzycska、1984）。AAVは、約4700塩基対の直線状の一本鎖DNAを利用する。逆方向末端反復配列はゲノムに隣接する。ゲノムには二つの遺伝子が存在し、異なる多くの遺伝子産物を生じる。最初のcap遺伝子は、VP-1、VP-2、およびVP-3と命名される異なる三つのビリオンタンパク質（VP）を産生する。第二のrep遺伝子は、四つの非構造タンパク質（NS）をコードする。これらのrep遺伝子産物の一つまたはそれ以上は、AAV転写のトランス活性化に関与している。AAVの配列は、米国特許第5,252,479号（その全文が参照として特に本明細書に組み入れられる）によって提供される。
【０１１５】
AAVにおける三つのプロモーターは、ゲノムのマップ単位におけるその位置によって示される。これらは左から右にp5、p19、およびp40である。転写は、6個の転写物を生じ、二つは、三つのプロモーターのそれぞれで始まり、それぞれの対の一つはスプライシングされる。マップ単位42〜46に由来するスプライス部位は、それぞれの転写物について同じである。四つの非構造タンパク質は明らかに、転写物のより長いほうに由来し、三つのビリオンタンパク質は全て最も小さい転写物から生じる。
【０１１６】
AAVは、ヒトにおいて如何なる病的状態にも関連しない。興味深いことに、効率的に複製するために、AAVは、単純ヘルペスウイルスIおよびII、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、および当然アデノウイルスのようなウイルスからの「補助」機能を必要とする。最も特徴が調べられているヘルパーは、アデノウイルスであり、このウイルスに関する多くの「初期」機能が、AAV複製を補助することが示されている。AAV repタンパク質の低レベル発現は、AAV構造の発現を抑制するためであると考えられており、ヘルパーウイルス感染症はこのブロックを除去すると考えられている。
【０１１７】
本発明のAAVベクターの末端反復は、AAV、または改変されたAAVゲノムを含むp201のようなプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化によって得ることができる（Samulskiら、1987）。または、末端反復配列は、AAVの公表された配列に基づく末端反復配列の化学的または酵素的合成を含むがこれらに限定されない当業者に既知の他の方法によって得てもよい。当業者は、欠失分析のような周知の方法によって、機能させるために、すなわち安定で部位特異的な組み込みのために必要なAAV ITRの最小の配列または一部を決定することができる。当業者はまた、末端反復配列が安定な部位特異的組み込みを指示する能力を維持しながら、配列のどの軽微な改変が認容されうるかを決定することができる。
【０１１８】
他のウイルス
本発明において発現構築物として他のウイルスベクターを用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988）、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは、様々な哺乳類細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989；Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988；Horwichら、1990）。
【０１１９】
欠損B型肝炎ウイルスの最近の認識により、異なるウイルス配列の構造-機能関連に新しい洞察が得られた。インビトロ試験は、ウイルスが、そのゲノムの80％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存的パッケージングおよび逆転写能を保持しうることを示した（Horwichら、1990）。このことは、ゲノムの大きい部分が、外来遺伝子材料に置換されうるであろうことを示唆した。肝指向性および残存（組み込み）は肝指向性遺伝子移入にとって特異に魅力的な特性であった。Changらは、最近、ポリメラーゼ、表面、および前表面コード配列の代わりに、アヒルB型肝炎ウイルスゲノムにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を導入した。トリ肝腫細胞株に野生型ウイルスを同時トランスフェクトした。高い力価の組み換え型ウイルスを含む培養培地を用いて、初代培養子ガモ肝細胞を感染させた。安定なCAT遺伝子発現は、トランスフェクション後少なくとも24日間検出された（Changら、1991）。
【０１２０】
非ウイルス法
哺乳類細胞に発現構築物を移入するためのいくつかの非ウイルス法も同様に、本発明によって企図される。これらには、DEAE-デキストラン（Gopal、1985）、電気穿孔（Tur-Kaspaら、1986；Potterら、1984）、直接マイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub、1985）、リポフェクタミン-DNA複合体、細胞超音波処理（Fechheimerら、1987）、および受容体媒介トランスフェクション（WuおよびWu、1987；WuおよびWu、1988）が含まれる。
【０１２１】
本発明のさらにもう一つの態様において、発現構築物は、単純に裸の組み換え型DNAまたはプラスミドからなってもよい。構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記の如何なる方法によって行ってもよい。これは、インビトロで移入するために特に適応可能であるが、インビボでの使用にも適用してもよい。Dubenskyら（1984）は、成体および新生児マウスの肝臓および脾臓に燐酸カルシウム沈殿物の形でポリオーマウイルスDNAの注入に成功し、活性なウイルス複製および急性感染症を証明した。BenvenistyおよびNeshif（1986）も同様に、燐酸カルシウム沈殿プラスミドの腹腔内直接注射によって、トランスフェクトされた遺伝子の発現が起こることを証明した。対象となる遺伝子をコードするDNAも同様に、インビボで類似のようにトランスフェクトさせて、遺伝子産物を発現させてもよいと想像される。
【０１２２】
リポソーム
本発明のさらなる態様において、CD26ペプチドまたはタンパク質をコードする発現構築物をリポソームの中に捕獲してもよい。リポソームは、燐脂質二重層膜と内部の水溶性媒体を特徴とする小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた多数の脂質層を有する。それらは、燐脂質を過剰量の水溶液に懸濁すると自然に形成する。脂質成分は、自己再配列を受けてから、閉環構造を形成し、水を捕獲して、脂質二重層のあいだに溶質を溶存させる（GhoshおよびBachhawat、1991）。リポフェクタミン-DNA複合体も同様に企図される。
【０１２３】
外来遺伝子のインビトロでのリポソーム媒介核酸輸送および発現は、非常に成功している。Wongら（1980）は、培養ニワトリ胚、HeLaおよび肝腫細胞における外来DNAのリポソーム媒介輸送および発現の実現可能性を証明した。Nicolauら（1987）は、静脈内注射後のラットにおけるリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。
【０１２４】
本発明の特定の態様において、リポソームは、血液凝集ウイルス（HVJ）と複合体を形成してもよい。これは、細胞膜との融合を促進して、リポソーム捕獲DNAの細胞流入を促進することが示されている（Kanedaら、1989）。他の態様において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体を形成してもよく、またはそれと共に用いてもよい（Katoら、1991）。なおさらなる態様において、リポソームは、HVJおよびHMG-1の双方と複合体を形成してもよく、それらと共に用いてもよい。そのような構築物がインビトロおよびインビボで核酸の移入および発現において首尾よく用いられている場合、それらは本発明に応用可能である。細菌プロモーターをDNA構築物において用いる場合、リポソーム内に適当な細菌プロモーターを含めることも同様に望ましいであろう。
【０１２５】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞に輸送するために用いることができる他の発現構築物は、受容体媒介輸送媒体である。これらは、ほとんど全ての真核細胞において受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞特異的分布のために、輸送は非常に特異的となりうる（WuおよびWu、1993）。
【０１２６】
受容体媒介遺伝子ターゲティング小胞は一般的に、二つの成分からなる：細胞受容体特異的リガンドおよびDNA結合剤。いくつかのリガンドが受容体媒介遺伝子移入のために用いられている。最も広く特徴が調べられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）（WuおよびWu、1987）およびトランスフェリン（Wagnerら、1990）である。最近、ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子輸送媒体として用いられており（Ferkolら、1993；Peralesら、1994）、上皮細胞増殖因子（EGF）も同様に扁平上皮癌細胞に遺伝子を輸送するために用いられている（Myers、EPO 0 273 085号）。
【０１２７】
他の態様において、輸送媒体は、リガンドおよびリポソームを含んでもよい。例えば、Nicolauら（1987）は、リポソームに組み入れられたラクトシル-セラミド、ガラクトースターミナルアシアロガングリオシドを用い、肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増加を認めた。このように、特定の遺伝子をコードする核酸はまた、リポソームを用いて、またはリポソームを用いないで如何なる数の受容体-リガンドシステムによっても細胞タイプに特異的に輸送されることが可能である。例えば、上皮細胞増殖因子（EGF）は、EGF受容体のアップレギュレーションを示す細胞への核酸の媒介輸送のための受容体として用いてもよい。マンノースは、肝細胞においてマンノース受容体をターゲティングするために用いることができる。
【０１２８】
F．CD26ペプチドおよびタンパク質
CD26ペプチドおよび／またはタンパク質は、本発明の治療法に従って癌細胞またはAPCのような免疫細胞に直接提供してもよい。いくつかの態様において、完全長または実質的に完全長、または断片のCD26ポリペプチドを用いてもよい。「完全長」という用語は、配列番号：2（アミノ酸766個）；配列番号：4；配列番号：33（アミノ酸688個）；配列番号：35；配列番号：37；および／またはGenBankアクセッション番号M74777、NM_001935、AH005372、XM_02930、BC133029、NM_010074、AH003239またはAF461806（参照として本明細書に組み入れられるGenBank番号）の全てのアミノ酸によってコードされるような完全なCD26タンパク質、および／またはその任意の変種、イソ型、または変異をコードするCD26ポリペプチドを指す。または、CD26タンパク質またはペプチドは、配列番号：2；配列番号：4；配列番号：33；配列番号：35；配列番号：37；および／またはGenBankアクセッション番号M74777、NM_001935、AH005372、XM_02930、BC133029、NM_010074、AH003239またはAF461806によってコードされるアミノ酸配列の如何なる断片、ドメイン、変種、または変異であってもよい。酵素DPPIV活性を示す能力を有するCD26タンパク質および断片の可溶性型も同様に、有用であると企図される。
【０１２９】
本発明はまた、CD26タンパク質またはペプチドの生物学的機能的同等物を用いることを企図する。「CD26タンパク質」、「CD26ペプチド」、または「CD26ポリペプチド」という用語は、それが天然に存在するか否か、実質的に精製されているか、部分的に精製されているか、または組み換えDNA法、融合タンパク質法、タンパク質合成法等によって産生されているか、または生物学的機能的同等物、その模倣体もしくは誘導体であるか否かによらず、CD26タンパク質またはペプチドを指す。
【０１３０】
「生物学的機能的同等体」という用語は、当技術分野において十分に理解され、本明細書においてさらに詳細に定義する。したがって、上記の一つのようなCD26コードアミノ酸配列のアミノ酸と同一または機能的に同等であるアミノ酸を、約70％〜約80％有する、またはより好ましくは約81％〜約90％、またはさらにより好ましくは約91％〜約99％有する配列は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの生物活性が維持される限り、これらの配列において「本質的に先に説明したとおり」である配列であろう。
【０１３１】
「機能的に同等なコドン」という用語は、本明細書においてアルギニンおよびセリンの6個のコドンのような同じアミノ酸をコードするコドンを指すために用いられ、同様に生物学的に同等なアミノ酸をコードするコドンを指す（表5を参照されたい）。
【０１３２】
イントロンおよび隣接領域を除き、遺伝子コードの縮重を考慮すると、先に述べたCD26配列のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの約70％〜約79％、より好ましくは約80％〜約89％、またはさらにより詳しくは約90％〜約99％を有する核酸配列は、これらのCD26配列において「本質的に先に説明したとおり」である核酸配列であろう。
【０１３３】
本発明は、上記のCD26の特定の核酸およびアミノ酸配列に限定されないこともまた理解されるであろう。したがって、組み換え型ベクターおよび単離された核酸セグメントには、これらのコード領域そのもの、基本コード領域に選択された変更または改変を有するコード領域が含まれ、それらは、それにもかかわらず、そのようなコード領域が含まれるより大きいポリペプチドまたはペプチドをコードしてもよく、または変種アミノ酸配列を有する生物学的機能的に同等なタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードしてもよい。
【０１３４】
本発明の核酸は、CD26タンパク質またはペプチドの生物学的機能的同等物を含む。そのような配列は、核酸配列、またはこのようにコードされたタンパク質もしくはペプチドにおいて天然に起こることが知られているコドンの冗長性または機能的同等性の結果生じる可能性がある。または、機能的に同等なタンパク質またはペプチドは、変更すべきアミノ酸の特性の検討に基づいて、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド構造の変化を操作する組み換えDNA技術の適用によって作製してもよい。組み換えによる変化は、例えば、タンパク質もしくはペプチドの抗原性に対する改善もしくは変化を導入するために、またはCD26タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド活性を分子レベルで調べるために変異体を試験するために、例えば、本明細書において下記に考察する部位特異的変異誘発技術の適用を通して導入してもよい。
【０１３５】
例えばCD26コード領域が、所望の機能を有する他のタンパク質またはペプチドと同じ発現単位において並列化されている、融合タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを調製してもよい。発現配列のそのような所望の機能の非制限的な例には、付加された発現配列、例えばコード領域のアフィニティクロマトグラフィーもしくは酵素標識によって精製してもよい蛋白質様組成物の精製、免疫学的検出、または標的認識目的でさえ含まれ、またはそのような細胞を認識して結合する分子との融合体を作製することによる癌または免疫細胞へのターゲティングが含まれる。
【０１３６】
（i）断片
本発明はまた、その抗腫瘍または免疫増強特性を保持する可能性があるCD26ポリペプチドの断片を提供する。そのような断片は、酵素的DPPIVドメイン、または他の任意のドメインによって例示されてもよく、コード領域内での翻訳停止部位の遺伝子操作によって作製してもよい（下記に考察）。または、CD26分子を、プロテアーゼとして知られるタンパク質分解酵素によって処置すると、多様なN末端、C末端、および内部断片を生じることができる。断片の例には、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：33、配列番号：35、配列番号：37および／またはGenBankアクセッション番号M74777、NM_001935、AH005372、XM_02930、BC133029、AH003239、およびAF461806に示されるCD26配列の連続した残基で、長さがアミノ酸5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、688、700、725、750、766、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000個またはそれ以上である断片が含まれてもよい。中間の長さも同様に企図され、アミノ酸110、209、306、555個によって示される。これらの断片は、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（イムノアフィニティクロマトグラフィーを含む）、または様々なサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）のような既知の方法によって精製してもよい。
【０１３７】
（ii）CD26の変種および変異体
CD26のアミノ酸配列変種も同様に、本発明に含まれる。ポリペプチドのアミノ酸配列変種は置換、導入、または欠失変種となりうる。欠失変種は、機能または免疫原活性にとって必須ではない天然のタンパク質の一つまたはそれ以上の残基を欠損し、例として膜貫通配列を欠損する変種が示される。CD26の可溶性型は、CD26と同程度に有用であると企図され、膜貫通ドメインを欠損する膜タンパク質変種が企図される。もう一つの一般的なタイプの欠失変種は、分泌シグナル配列または細胞の特定の部分に結合するようにタンパク質を指示するシグナル配列を欠損する変種である。挿入変異体は、典型的にポリペプチドにおける末端以外の点で材料の付加を含む。これには、免疫反応性エピトープまたは単純な一残基の挿入が含まれてもよい。融合タンパク質と呼ばれる末端の付加については下記に考察する。
【０１３８】
置換変種は典型的に、タンパク質内の一つまたはそれ以上の部位で一つのアミノ酸のもう一つのアミノ酸への交換を含み、他の機能または特性を失うことなく、タンパク質溶解切断に対する安定性のような、ポリペプチドの一つまたはそれ以上の特性を調節するようにデザインしてもよい。この種の置換は、好ましくは保存的であり、すなわち一つのアミノ酸が類似の形状および電荷のアミノ酸に置換される。保存的置換は当技術分野で周知であり、例えば、以下の変化が含まれる：アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパルテートからグルタメート；シスセインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタメートからアスパルテート；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン；セリンからトレオニン；トレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【０１３９】
以下は、同等の、改善さえされた第二世代の分子を作製するために、タンパク質のアミノ酸を変化させることに基づく考察である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能を認識可能に失うことなく、例えば、特定のアミノ酸をタンパク質構造における他のアミノ酸に置換してもよい。タンパク質の生物学的機能的活性を決定するのはタンパク質の相互作用能および特性であることから、特定のアミノ酸置換をタンパク質配列、およびその基礎となるDNAコード配列に行うことができ、それにもかかわらず同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。このように、下記のようにその生物学的有用性または活性を認識可能に失うことなく、遺伝子のDNA配列に様々な変更を行ってもよいと企図される。表3は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。
【０１４０】
（表３）コドン表
2006510615.tif 000005
【０１４１】
そのような変化を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー（hydropathic）指数を検討してもよい。タンパク質に相互作用生物機能を付与する場合のハイドロパシー指数の重要性は、一般的に当技術分野において理解される（KyteおよびDoolittle、1982）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特徴は、得られたタンパク質の二次構造に関与し、次に、これがタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原等との相互作用を明確に示すことが認められている。
【０１４２】
それぞれのアミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいてハイドロパシー指数を割付られており（KyteおよびDoolittle、1982）、これらはイソロイシン（+4.5）、バリン（+4.2）、ロイシン（+3.8）、フェニルアラニン（+2.8）、システイン／シスチン（+2.5）、メチオニン（+1.9）、アラニン（+1.8）、グリシン（-0.4）、トレオニン（-0.7）、セリン（-0.8）、トリプトファン（-0.9）、チロシン（-1.3）、プロリン（-1.6）、ヒスチジン（-3.2）、グルタメート（-3.5）、グルタミン（-3.5）、アスパルテート（-3.5）、アスパラギン（-3.5）、リジン（-3.9）、およびアルギニン（-4.5）である。
【０１４３】
特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換してもよく、それでもなお類似の生物活性を有するタンパク質が得られ、すなわち生物学的機能的に同等のタンパク質が得られることは、当技術分野で既知である。そのような変化を作製する場合、そのハイドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、±0.5以内であるアミノ酸の置換はさらにより特に好ましい。
【０１４４】
類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に行うことができることもまた、当技術分野において理解される。参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるように、タンパク質の最大の局所平均疎水性が、タンパク質の生物特性に相関することを示している。米国特許第4,554,101号に詳細に説明されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割付されている：アルギニン（+3.0）、リジン（+3.0）、アスパルテート（+3.0±1）、グルタメート（+3.0±1）、セリン（+0.3）、アスパラギン（+0.2）、グルタミン（+0.2）、グリシン（0）、トレオニン（-0.4）、プロリン（-0.5±1）、アラニン（-0.5）、ヒスチジン（-0.5）、システイン（-1.0）、メチオニン（-1.3）、バリン（-1.5）、ロイシン（-1.8）、イソロイシン（-1.8）、チロシン（-2.3）、フェニルアラニン（-2.5）、トリプトファン（-3.4）。
【０１４５】
アミノ酸は、類似の親水性値を有するもう一つのアミノ酸に置換することができ、それでもなお生物学的に同等で免疫学的に同等のタンパク質が得られると理解される。そのような変化において、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるアミノ酸が特に好ましく、±0.5以内であるアミノ酸はさらにより特に好ましい。
【０１４６】
上記のように、アミノ酸置換は一般的にアミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。前述の様々な特徴を考慮に入れる例としての置換は、当業者に周知であり、これには：アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシンが含まれる。
【０１４７】
本発明に従うポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、Johnsonら（1993）を参照されたい。ペプチド模倣体を用いることの背景にある基礎となる原理は、タンパク質のペプチド骨格が主に抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を向けることである。ペプチド模倣体は天然の分子と類似の分子相互作用を許容すると期待される。これらの原理は、上記の原理と共に、CD26の天然の特性の多くを有するが、特徴の変化および改善さえ有する第二世代分子を操作するために用いてもよい。
【０１４８】
（iii）融合タンパク質
挿入変種の特定の種類は融合タンパク質である。この分子は一般的に、NまたはC末端で第二のポリペプチドの全てまたは一部に結合した天然の分子の全てまたは実質的な部分を有する。例えば、融合は典型的に、異種宿主におけるタンパク質の組み換え発現を許容するために他の種からのリーダー配列を用いる。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために抗体エピトープのような免疫学的に活性なドメインの付加が含まれる。融合接合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後の外来性ポリペプチドの除去が容易となるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、または細胞ターゲティングシグナルのような機能的ドメインを結合させることが含まれる。CD26タンパク質またはペプチドを癌細胞または免疫細胞にターゲティングするための細胞ターゲティングシグナルは、本発明の重要な局面である。さらに、基質-CD26複合体の精製のために用いることができるポリペプチドとの融合は、同定および分析のための基質を単離するために役立つであろう。
【０１４９】
そのような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）系（Pharmacia、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、マルトース結合タンパク質系（NEB、ビバリー、マサチューセッツ州）、FLAG系（IBI、ニューヘブン、コネチカット州）、および6×His系（Qiagen、チャッツワース、カリフォルニア州）である。
【０１５０】
これらの系のいくつかは、組み換え型ポリペプチドの抗原能に影響を及ぼす可能性が低い、ごく少数のさらなるアミノ酸を有する組み換え型ポリペプチドを生じる。例えば、FLAG系と6×His系はいずれも短い配列のみを付加して、そのいずれもが抗原性が低いことがわかっており、ポリペプチドをその本来の構造に折りたたむ際に有害な影響を及ぼさない。
【０１５１】
他の態様において、癌細胞または免疫細胞のような特定の部位または細胞へのCD26関連組成物のターゲティングを増強するであろう融合構築物を作製することができる。例えば、CD26またはCD26型のタンパク質をリガンドに融合させることは、そのようなリガンドの受容体を発現する部位に組成物をターゲティングするための有効な手段であろう。このようにして、CD26またはCD26関連組成物を、受容体媒介輸送によって細胞に輸送してもよい。CD26は、リガンドに共有結合または融合することができる。これは、細胞への輸送機構として用いることができる。次に、CD26が結合したリガンドは、受容体を有する細胞によってインターナライズされる可能性がある。
【０１５２】
他の融合系は、所望のポリペプチドからの融合パートナーを切除することが望ましいポリペプチドハイブリッドを産生する。一つの態様において、融合パートナーは、プロテアーゼに関して特異的認識配列を含むペプチド配列によって組み換え型CD26癌ポリペプチドに結合する。適した配列の例は、タバコ腐食ウイルスプロテアーゼ（Life Technologies、ガイサースバーグ、メリーランド州）または第Xa因子（New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州）によって認識される配列である。
【０１５３】
CD26は膜貫通配列であることから、組み換え型蛋白質を多くの発現系において、例えば大腸菌において合成する場合にしばしば有害であり、タンパク質の本来の構造に再生することが難しい不溶性の凝集体が産生される。膜貫通配列の欠失は、典型的に、残っているタンパク質構造の構造を有意に変化させない。発現のために用いられる遺伝子からの膜貫通コード配列の欠失は、標準的な技術によって行うことができる。例えば、不規則に配置された制限酵素部位を用いて所望の遺伝子断片を切除することができ、またはPCR型の増幅を用いて、遺伝子の所望の一部のみを増幅することができる。このようにすると、可溶性型のCD26タンパク質またはペプチドが得られる可能性がある。
【０１５４】
（iv）合成ペプチド
本発明はまた、本発明の様々な態様において用いるためのより小さいCD26関連ペプチドについて記述する。そのようなペプチドは一般的に長さがアミノ酸少なくとも5または6個でなければならず、約35〜50残基等までを含んでもよい。その大きさが比較的小さいために、本発明のペプチドはまた、通常の技術に従って溶液中または固相支持体上で合成することができる。
【０１５５】
様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、StewartおよびYoung（1984）；Tamら（1983）；Merrifield（1986）；ならびにBaranyおよびMerrifield（1979）を参照されたい。通常、本明細書に記述の選択された領域に対応するアミノ酸約6個〜約35〜50個までの短いペプチド配列、または重なり合うペプチドのライブラリは、容易に合成することができ、反応性ペプチドを同定するようにデザインされたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングすることができる。または組み換えDNA技術を用いてもよく、この場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞において形質転換またはトランスフェクトされて、発現にとって適した条件で培養される。
【０１５６】
米国特許第4,554,101号（Hopp、参照として本明細書に組み入れられる）も同様に、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。Hoppが開示した方法によって、当業者は、本明細書に開示の任意のDNA配列によってコードされる任意のアミノ酸配列内からのエピトープを同定することができるであろう。
【０１５７】
（v）組み換え型蛋白質の発現
CD26の完全長、非改変タンパク質、変種、融合タンパク質、またはペプチドを用いるか否かによらず、組み換え型ベクターは明らかに、本発明のさらに重要な局面である。
【０１５８】
ベクターは一般的に、完全長のタンパク質またはより小さいペプチドをコードするか否かによらず、プロモーターの制御下で配置されたDNAセグメントのコード部分を有するであろう。プロモーターは、例えば組み換えクローニングおよび／またはPCR技術を用いて、コードセグメントまたはエキソンの上流に存在する非コード配列を単離することによって得られるように（PCR技術は、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号に開示されている）、例えば黒色腫、膠芽腫、星状細胞腫、ならびに乳腺、胃、結腸、膵臓、腎臓、卵巣、肺、前立腺、肝臓、および肺の癌、ならびに造血癌細胞を含む多様な癌細胞において、CD26遺伝子に本来会合するプロモーターの形であってもよい。
【０１５９】
他の態様において、組み換え型または異種プロモーターの制御下にコードDNAセグメントを配置することによって、特定の長所が得られると企図される。本明細書において用いられるように、組み換え型または異種プロモーターは、その天然の環境においてCD26遺伝子に通常関連しないプロモーターを指すと意図される。そのようなプロモーターには、他の遺伝子に通常関連する組織プロモーター、および／または他の任意の細菌、ウイルス、真核細胞、または哺乳類細胞から単離されたプロモーターが含まれてもよい。
【０１６０】
当然、発現のために選択される細胞タイプ、生物、または動物においてさえもDNAセグメントの発現を有効に指示するプロモーターを用いることが重要であろう。タンパク質発現のためにプロモーターおよび細胞タイプの組み合わせを用いることは、一般的に分子生物学の当業者に既知であり、例えばSambrookら（2001）を参照されたい。用いるプロモーターは、構成的または誘導型であってもよく、組み換え型蛋白質またはペプチドの大規模産生に都合がよいように、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指示する適当な条件で用いることができる。
【０１６１】
原核細胞系または真核細胞系において用いるために発現ベクターの調製および操作は、当業者に周知である。実質的に如何なる発現ベクターおよび系も、本発明の一つまたはそれ以上の抗原の発現において用いてもよいと考えられる。
【０１６２】
宿主細胞は一般的に、ゲノム転写物を処理して、タンパク質に翻訳するための機能的mRNAを生成することから、cDNAおよびゲノム配列はいずれも真核細胞発現にとって適している。一般的に言って、遺伝子のcDNA型を組み換え型遺伝子として用いるほうがより都合がよいかも知れない。cDNA型を用いることは、遺伝子の大きさが一般的により小さく、典型的にcDNA遺伝子より大きさが1次数まで大きいゲノム遺伝子と比較すると標的化細胞をトランスフェクトするために容易に用いられるという点において長所を提供するであろうと考えられる。しかし、本発明は、望ましければ特定の遺伝子のゲノム型を用いる可能性を除外しない。
【０１６３】
本明細書において用いられるように、「操作された」および「組み換え型」細胞という用語は、cDNAまたはCD26をコードする遺伝子のような、外因性のDNAセグメントまたは遺伝子が導入されている細胞を指すことを意図する。したがって、操作された細胞は、組み換えによって導入された外因性のDNAセグメントまたは遺伝子を含まない天然に存在する細胞と区別することができる。操作された細胞はこのように、人の手を通して導入された遺伝子または複数の遺伝子を有する細胞である。組み換え型細胞には、導入されたcDNAまたはゲノム遺伝子を有する細胞が含まれ、同様に、特定の導入された遺伝子に通常関連しないプロモーターに隣接して配置された遺伝子が含まれる。
【０１６４】
本発明に従って組み換え型CD26を発現するために、一つまたはそれ以上のプロモーターの制御下でコードする核酸を含む発現ベクターを調製するであろう。コード配列を「プロモーターの制御下」に置くために、一般的に、選択したプロモーターの約1〜約50ヌクレオチド「下流」（すなわち3）の転写読み取り枠の転写開始部位の5末端に配置する。「上流の」プロモーターは、DNAの転写を刺激して、コードされた組み換え型蛋白質の発現を促進する。これが、この状況における「組み換え型発現」の意味である。
【０１６５】
多様な宿主発現系におけるタンパク質またはペプチドの発現を得るために、適当な核酸と転写／翻訳制御配列とを含む発現ベクターを構築するために多くの標準的な技術が利用可能である。発現のために利用できる細胞タイプには、組み換え型バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターによって形質転換した大腸菌および枯草菌（B. subtilis）のような細菌が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６６】
原核細胞宿主の特定の例は大腸菌株RR1、大腸菌LE392、大腸菌B、大腸菌X1776（ATCC 31537）と共に大腸菌W3110（F-、ラムダ-、原栄養性、ATCC 273325）；枯草菌のような桿菌；およびネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、および様々なシュードモナス（Pseudomonas）種のような他の腸内細菌である。
【０１６７】
一般的に、宿主細胞と適合性である種に由来するレプリコンと制御配列とを含むプラスミドベクターを、これらの宿主に関連して用いる。ベクターは通常、複製部位を有すると共に、形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーカー配列を有する。例えば、大腸菌はしばしば、大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、このように形質転換細胞を同定する容易な手段を提供する。pBRプラスミド、または他の微生物プラスミドもしくはファージはまた、自身のタンパク質を発現するために微生物が用いることができるプロモーターを含まなければならない、または含むように改変しなければならない。
【０１６８】
さらに、宿主微生物と適合性であるレプリコンと制御配列とを含むファージベクターを、これらの宿主に関連した形質転換ベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌LE392のような宿主細胞を形質転換するために用いることができる組み換え型ファージベクターを作製するために、ファージラムダGEM（登録商標）-11を利用してもよい。
【０１６９】
さらに有用なベクターには、pINベクター（Inoueら、1985）、ならびに後に精製および分離または切断するためのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）可溶性融合タンパク質を産生するために用いられるpGEXベクターが含まれる。その他の適した融合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ、ユビキチン等との融合タンパク質である。
【０１７０】
組み換えDNA構築において最も一般的に用いられるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（trp）プロモーター系が含まれる。これらは最も一般的に用いられるが、他の細菌プロモーターが開発および利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されていて、当業者はそれらをプラスミドベクターに機能的にライゲーションすることができる。
【０１７１】
酵母菌（Saccharomyces）において発現させる場合、例えばプラスミドYRp7が一般的に用いられる（Stinchcombら、1979；Kingsmanら、1979；Tschemperら、1980）。このプラスミドは既に、トリプトファン中での増殖能を欠損する酵母の変異体株、例えばATCC 44076またはPEP4-1（Jones、1977）の選択マーカーを提供するtrp1遺伝子を含む。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてtrp1病変が存在することは、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【０１７２】
酵母ベクターにおける適した促進配列には、3-ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、1980）、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-燐酸イソメラーゼ、30ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような他の解糖酵素（Hessら、1968；Hollandら、1978）のプロモーターが含まれる。適した発現プラスミドを構築する場合、これらの遺伝子に関連した終了配列も同様に、発現ベクターにおいてmRNAのポリアデニル化および終了を提供するように発現されることが望ましい配列の3にライゲーションする。
【０１７３】
増殖条件によって制御される転写のさらなる長所を有する他の適したプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および上記のグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域が含まれる。
【０１７４】
微生物の他に、多細胞生物に由来する細胞の培養物も同様に宿主として用いてもよい。原則的に、脊椎動物細胞培養であれ、無脊椎動物細胞培養であれ、そのような如何なる細胞培養も利用できる。哺乳類細胞の他に、これらには、組み換え型ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；および組み換え型ウイルス発現ベクターを感染させた（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）植物細胞系、または一つもしくはそれ以上のコード配列を含む組み換え型プラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）によって形質転換した植物細胞系が含まれる。
【０１７５】
有用な昆虫系において、外来遺伝子を発現させるためのベクターとしてオートグラファ核多角体ウイルス（AcNPV）を用いる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞において増殖する。CD26コード配列を、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングして、AcNPVプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置く。コード配列の挿入の成功によって、ポリヘドリン遺伝子の不活化が起こり、非閉鎖組み換え型ウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされる蛋白質様外皮を欠損するウイルス）が産生される。次に、これらの組み換え型ウイルスを用いて、スポドプテラ・フルギペルダ細胞に感染させ、その中で挿入された遺伝子を発現させる（例えば、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,215,051号を参照されたい）。有用な例としてのバキュロウイルスベクタは、pBlueBacベクター（インビトロジェン、ソレント、カリフォルニア州）である。
【０１７６】
有用な哺乳類宿主細胞株の例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RINおよびMDCK細胞株である。さらに、挿入された配列の発現を調節して、望ましい特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要となる可能性があり、細胞メカニズムが時間および条件の変化に反応して転移関連遺伝子を調節すると仮定することは妥当である。
【０１７７】
異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変に関して特徴的で特異的なメカニズムを有する。発現される外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確保するために、アポトーシス細胞株または宿主系を選択することができる。この目的に関しては、真核宿主細胞がしばしば好ましいであろう。
【０１７８】
そのような細胞において用いられる発現ベクターには、通常、複製開始点（必要であれば）、発現される遺伝子の前に存在するプロモーター、と共に任意の必要なリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列が含まれる。複製開始点は、SV40もしくは他のウイルス起源（例えば、ポリオーマ、アデノ、VSV、BPV）に由来してもよい外因性起源を含むようにベクターを構築することによって提供してもよく、または宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供してもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組み入れられる場合、後者はしばしば十分である。
【０１７９】
プロモーターは、哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、枠リニアウイルス7.5 Kプロモーター）に由来してもよい。さらに、そのような制御配列が宿主細胞系と適合性である限り、所望のCD26癌遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、望ましいかも知れない。
【０１８０】
多くのウイルスに基づく発現系を利用してもよく、例えば一般的に用いられるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス2に由来し、シミアンウイルス40（SV40）に由来することが最も多い。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、いずれもSV40ウイルスの複製開始点を同様に含む断片としてウイルスから容易に得られることから特に有用である。ウイルスの複製開始点に存在するBglI部位に向けてHindIII部位から伸長する約250 bpの配列が含まれる限り、より小さいまたはより大きいSV40断片も同様に用いてもよい。
【０１８１】
アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三裂リーダー配列にライゲーションしてもよい。次に、インビトロまたはインビボ組み換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）における挿入によって、生存して、感染宿主においてCD26タンパク質またはペプチドを発現することができる組み換え型ウイルスが得られるであろう。
【０１８２】
CD26ペプチドまたはタンパク質を有効に翻訳するためには、特異的開始シグナルもまた必要であるかも知れない。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを、さらに提供する必要があるかも知れない。当業者は、容易にこれを決定して必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、完全なインサートの翻訳を確実にするために所望のコード配列の読み取り枠とフレームが一致（または相が一致）しなければならないことは周知である。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の双方の多様な起源となりうる。発現効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターを含めることによって増強される可能性がある（Bittnerら、1987）。
【０１８３】
真核細胞の発現の場合、当初のクローニングしたセグメント内に適当なポリアデニル化部位（例えば、5-AATAAA-3）含まれなければ、転写単位にこれを組み入れることが典型的に望ましいであろう。典型的に、転写終了前の位置でタンパク質の終了部位の約30〜2000ヌクレオチド「下流」に、ポリA付加部位を配置する。
【０１８４】
組み換え型CD26ペプチドまたはタンパク質を長期間、高い収率で産生するためには、安定な発現が好ましい。例えば、CD26ペプチドまたはタンパク質をコードする構築物を安定に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルスの複製開始点を含む発現ベクターを用いるより、宿主細胞は、適当な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）と選択マーカーとによって制御されるベクターによって形質転換することができる。外来DNAの導入後、操作された細胞を栄養に富む培地において1〜2日間増殖させてから、選択培地に切り替えてもよい。組み換え型プラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、それによって細胞は染色体にプラスミドを安定に組み入れることができ、増殖してコロニーを形成し、これをクローニングして細胞株に拡大させることができる。
【０１８５】
tk-、hgprt-、またはaprt-細胞においてそれぞれ、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977）、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalskaら、1962）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら、1980）を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、メソトレキセートに対する耐性を付与するdhfr（Wiglerら、1980；O'Hareら、1981）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulliganら、1981）、アミノグリコシドG418に対する耐性を付与するneo（Colberre-Garapinら、1981）、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerreら、1984）の選択に基づいて抗代謝耐性を用いることができる。
【０１８６】
（vi）タンパク質精製
さらに、精製CD26ペプチドまたはタンパク質は本発明の方法において有用であることから、以下はタンパク質精製技術に関する考察である。これらの技術は、当業者に周知であり、一レベルで細胞環境をポリペプチドおよび非ポリペプチド分画までおおまかに分画することを含む。ポリペプチドを他のタンパク質と分離した後、対象となるポリペプチドをクロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製して、部分的または完全な精製を得てもよい（または均一になるまで精製）。純粋なペプチドの分離に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたはHPLCである。
【０１８７】
本発明の特定の局面は、CD26タンパク質またはペプチドの精製、部分精製に関し、特定の態様において、実質的な精製に関する。本明細書において用いられる「精製されたタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド」または「部分的に精製されたタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドがその天然に得ることができる状態と比較して任意の程度まで精製されている、他の成分から単離可能な組成物を指すことを意図する。したがって、精製タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、それが天然に存在する可能性がある環境から離れたタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを指す。
【０１８８】
一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画され、組成物がその発現された生物活性を実質的に保持する、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを含む組成物を指すであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この命名は、タンパク質またはペプチドが組成物におけるタンパク質の約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、またはそれ以上を構成する場合のように、組成物の主要な成分を形成する組成物を指すであろう。本明細書に開示の組成物を記述するために用いる場合の「単離された」という用語は、その天然の環境の成分から同定され、分離および／または回収されているタンパク質を意味する。その天然の環境の混入成分は、タンパク質の予防的または治療的利用を妨害する材料であり、これには他の蛋白質または非蛋白質溶質が含まれうる。「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいてタンパク質の重量で少なくとも約90％、好ましくは少なくとも約95％を占める組成物を意味する。「本質的に均一な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて、タンパク質の重量で少なくとも約99％を占める組成物を意味する。
【０１８９】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知であろう。これらには、例えば活性分画の特異的活性を決定すること、またはSDS/PAGE分析によって分画内のポリペプチドの量を評価することが含まれる。分画の純度を評価する好ましい方法は、分画の特異的活性を計算して、これを最初の抽出物の特異的活性と比較して、このように、本明細書において「精製倍率」として表記される純度の程度を計算することである。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、当然、精製後に選択された特定のアッセイ技術およびタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。本発明において、CD26ペプチドまたはポリペプチドは、抗体を用いることによって、またはそのDPPIV酵素活性によって検出することができる。そのような酵素活性ならびにIF7および5F8のような抗体を、「実施例」と呼ぶ章において下記に記述する。
【０１９０】
タンパク質を精製する他の技術には、例えば硫酸アンモニウム、PEG、抗体等による沈殿、または熱変性後の遠心；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにそのようなおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野において一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は変更してもよく、特定の段階を省略してもよいと考えられ、それでもなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製にとって適した方法が得られると考えられる。
【０１９１】
一般的に、タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供される必要はない。実際に、実質的により精製されていない産物が特定の態様において有用性を有すると企図される。部分精製は、「部分的に精製されたタンパク質」を得るために、より少ない精製段階を組み合わせて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を利用することによって、行ってもよい。例えば、HPLC装置を利用して行った陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧のクロマトグラフィー系を利用する同じ技術より高い精製「倍率」が得られるであろう。低い程度の相対的精製を示す方法は、タンパク質産物の全回収において、または発現されたタンパク質の活性を維持するために長所を有する可能性がある。
【０１９２】
ポリペプチドの移動は、SDS/PAGEの異なる条件によっては時に有意に変動しうることが知られている（Capaldiら、1977）。したがって、異なる電気泳動条件下で、精製または部分精製発現産物の見かけの分子量は、異なる可能性があると認識されるであろう。
【０１９３】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）およびFPLCは、ピークの驚くべき分解能を有する非常に迅速な分離を特徴とする。これは、適当な流速を維持するために非常に細かい粒子と高圧を用いることによって得られる。分離は、何分のレベルまたは多くても1時間で行うことができる。その上、粒子は非常に小さく、密に充填されているため空隙容量は吸着床容積の非常に小さい分画であることから、試料は非常にごく少量が必要であるに過ぎない。同様に、バンドは非常に狭く試料の希釈はほとんどないことから試料の濃度はあまり高い必要はない。
【０１９４】
ゲルクロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーは、分子の大きさに基づく特殊なタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーの基礎となる理論は、小さい孔を含む不活性物質の小さい粒子によって調製されるカラムが、分子が孔の中または周囲を通過する際に、大きさに応じてより大きい分子をより小さい分子から分離することである。粒子を作製する材料が分子を吸着しない限り、流速を決定する唯一の要因は大きさである。したがって、形状が比較的一定である限り、分子は大きい順にカラムから溶出する。ゲルクロマトグラフィーは、分離が、pH、イオン強度、温度等のような他の全ての要因に依存しないことから、異なる大きさの分子を分離するために最善である。同様に、吸着はほとんどなく、ゾーンの広がりは少なく、溶出容積は単に分子量に関連する。
【０１９５】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質とそれに対して特異的に結合する物質との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは受容体-リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有結合によってカップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着することができる。結合が起こらない条件（pH、イオン強度、温度等）に条件を変更すると、溶出が起こる。
【０１９６】
糖質含有化合物の精製において有用な特定のタイプのアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンアフィニティクロマトグラフィーである。レクチンは、多様な多糖類および糖タンパク質に結合する物質のクラスである。レクチンは通常、臭化シアンによってアガロースにカップリングする。セファロースにカップリングしたコンカナバリンAは、用いられるこの種の第一の材料であり、多糖類および糖タンパク質の単離に広く用いられており、他のレクチンには、レンチルレクチン、N-アセチルグルコサミニル残基の精製において有用であるコムギ胚芽アグルチニン、およびヘリックス・ポマチア（Helix pomatia）のレクチンが含まれる。レクチンそのものは、糖質リガンドとのアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製する。レクチンをヒマの実およびピーナッツから精製するために乳糖が用いられている；マルトースは、レンズマメおよびタチナタマメからレクチンを抽出するために有用である；N-アセチル-D-ガラクトサミンは、大豆からレクチンを精製するために用いられる；N-アセチルグルコサミニルは、コムギ胚芽のレクチンに結合する；D-ガラクトサミンは、ハマグリからのレクチンを得るために用いられている、そしてL-果糖は、ハスからのレクチンに結合するであろう。
【０１９７】
マトリクスは、それ自身は、如何なる有意な程度にも分子を吸着せず、広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドは、その結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドはまた、比較的堅固な結合を提供しなければならない。試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することが可能でなければならない。アフィニティクロマトグラフィーの最も一般的な形は、免疫アフィニティクロマトグラフィーである。
【０１９８】
G．治療法
（i）タンパク質療法
癌を予防および／または治療する一つの方法は、化学療法剤および／または放射線療法剤と組み合わせてCD26分子をコードするペプチドまたはポリペプチドを被験者に提供することである。本発明のもう一つの治療法は、感染症、癌、または免疫抑制のような病態の際の免疫応答を増強するために、個体にCD26ペプチドまたはポリペプチドを提供することである。そのようなポリペプチドは、全CD26分子またはCD26の断片をコードしてもよい。例えば、断片は、酵素の触媒活性断片をコードしてもよい。ポリペプチドはさらに、CD26の野生型、イソ型、変異体、融合体、または任意の生物学的機能的に同等な分子をコードしてもよい。
【０１９９】
または、本明細書に記述の治療ポリペプチドは、合成ペプチド、またはその模倣体もしくは他の任意の類似体となりうる。ポリペプチドは、組み換え発現手段によって産生してもよく、または十分に小さければ、自動ペプチドシンセサイザーによって生成してもよい。ポリペプチドはまた、上記の方法によって実質的または部分的に精製してもよい。製剤は、リポソーム製剤および古典的な薬学的製剤を含むがこれらに限定されない投与経路および目的に基づいて選択されるであろう。
【０２００】
（ii）遺伝子治療
本発明によって企図される治療態様のもう一つの組は、癌細胞においてCD26ポリペプチドおよび／またはDPPIV活性を発現する発現構築物を、化学療法剤および／または放射線療法剤と共に癌細胞に提供することである。本発明のもう一つの局面は、CD26ペプチドまたはポリペプチドをコードする発現ベクターを個体に提供することによって、感染症、癌、または免疫抑制のような病態の際の免疫応答を増強する治療法である。
【０２０１】
ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、霊長類、およびイヌの遺伝子のあいだの配列相同性のために、これらの動物の同等のCD26遺伝子によってコードされる核酸の如何なるものも、CD26または生物学的に同等のポリペプチドをコードするであろう任意の遺伝子配列変種と同様に、ヒト治療において用いることができる。先に考察した発現ベクターの長さおよびそこで用いられる遺伝子要素は、参照としてこの章に組み入れられる。特に好ましい発現ベクターはウイルスベクターである。
【０２０２】
当業者は、インビボおよびエクスビボ状況に遺伝子輸送を適用する方法を十分に承知している。ウイルスベクターの場合、一般的にウイルスベクター保存液を調製するであろう。ウイルスの種類および得ることができる力価に応じて、感染粒子1〜100、10〜50、100〜1000個または1×104個、1×105個、1×106個、1×107個、1×108個、1×109個、1×1010個、1×1011個、または1×1012個までを輸送するであろう。相対的な取り込み効率を比較することによって、類似の数値をリポソームまたは他の非ウイルス製剤に外挿してもよい。薬学的に許容される組成物としての製剤を下記に考察する。
【０２０３】
様々な輸送経路が企図される。ベクターは、全身または局所および限局アプローチによって炎症部位に直接輸送してもよい。本発明のいくつかの態様において、被験者をウイルスベクターに曝露して、被験者を発現構築物に基づく毒性に関してモニターするが、そのような毒性には、中でも被験者にとって有害である病態を引き起こすことが含まれでもよい。
【０２０４】
H．治療レジメ
本発明によって治療されうる癌には、固形細胞腫瘍が含まれるがこれらに限定されず、治療することができる癌には：脳（膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠芽細胞腫、上衣細胞腫）、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵臓、結腸、胃、乳腺、骨、内分泌腺、子宮内膜、前立腺、精巣、甲状腺、卵巣、皮膚、頭頚部、食道の腫瘍、およびB細胞白血病、T細胞白血病、血液癌、骨髄性白血病、単球性白血病、骨髄球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、ヘアリーセル白血病を含む血液の悪性疾患が含まれる。さらに、癌は前癌、転移性および／または非転移性癌であってもよい。
【０２０５】
本発明は、1）CD26組成物および2）化学療法剤および／または放射線療法剤の有効量を用いる癌の治療を提供する。「有効量」は、併用して癌細胞の増殖を減少、低下、阻害、またはそうでなければ停止させる、細胞増殖を停止させる、アポトーシスを誘導する、転移を阻害する、腫瘍の壊死を誘導する、細胞を殺す、または細胞に細胞障害性を誘導するそれぞれの物質の量であると定義される。
【０２０６】
二つの物質を用いる場合、それらは、同時または異なる時期に投与してもよい。例えば、化学療法剤および／または放射線療法剤の前に、または化学療法剤／放射線療法剤の治療後にCD26組成物を提供してもよい。化学療法剤および／または放射線療法剤の投与は、数分から数日〜数週間の範囲の間隔でCD26組成物の投与の前または後であってもよい。化学療法剤および／または放射線療法剤とCD26組成物とが共に投与される態様において、一般的にそれぞれの輸送時間のあいだに有意な時間が経過しないように保証するであろう。そのような場合、双方の様相を互いに約12〜24時間以内に、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に患者に投与すると企図され、時間のずれは約12時間に過ぎないことが最も好ましい。状況によっては、それぞれの投与のあいだに数日（2、3、4、5、6または7日）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8週間）が経過する場合には、治療期間を有意に延長することが望ましいかも知れない。
【０２０７】
同様に、完全な癌治療を得るために、化学療法剤および／または放射線療法剤およびCD26組成物のいずれかの1回より多い投与が必要であろうと想像できる。下記に例を示すように、化学療法剤および／または放射線療法剤が「A」であって、CD26組成物が「B」である様々な組み合わせを用いてもよい：
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他の組み合わせも同様に企図される。それぞれの物質の正確な用量およびレジメは、当業者によって適切に変更することができる。
【０２０８】
癌関連治療のみを本明細書において記述するが、この章はまた、免疫疾患の治療にも応用可能であり、CD26組成物を抗原提示細胞（APC）または他の免疫細胞に提供することによって、感染症、免疫抑制状態、癌等の際に免疫応答を増強する本発明の方法において有用である。上記の併用治療スキームにおいて、抗生物質、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、および／または他の免疫エフェクターのような免疫病態を治療するために用いられる他の物質を「B」と表し、CD26製剤を「A」と表す。
【０２０９】
下記に、癌の治療において有効であり、本発明の方法と組み合わせて用いてもよい他のいくつかの物質および補助治療を説明する。
【０２１０】
I．補助的癌治療
癌治療の有効性をさらに増強するために、癌を治療するために用いられる他の治療の使用も同様に、本発明の方法と共に企図される。このように、手術、もう一つの遺伝子治療物質、もう一つのタンパク質／ペプチド／ポリペプチド治療物質、免疫治療物質等のようなもう一つの治療物質を用いてもよい。そのような物質は当技術分野において周知である。
【０２１１】
（i）手術
癌患者の約60％が何らかのタイプの手術を受けるが、これには予防的、診断的または進行期決定、治癒および待期的手術が含まれる。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫治療、および／または代替治療のような他の治療と併用して用いてもよい癌治療である。
【０２１２】
治癒的手術には、癌様組織の全てまたは一部が物理的に除去される、切除される、および／または破壊される切除が含まれる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除の他に、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡制御手術（Mohs'手術）が含まれる。本発明は、表層癌、前癌、または正常組織の付随する量の切除と共に用いてもよいとさらに企図される。
【０２１３】
癌様組織、組織、または腫瘍の一部または全ての切除後、体に腔が形成される可能性がある。さらなる抗癌治療による、その領域の還流、直接注入、または局所適用によって治療を行ってもよい。そのような治療は例えば、1、2、3、4、5、6、または7日ごと、1、2、3、4、および5週間毎、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月毎に繰り返してもよい。これらの治療は同様に、用量を変化させてもよい。
【０２１４】
（ii）免疫療法
免疫療法は一般的に、癌細胞を標的として破壊するために免疫エフェクター細胞および分子を用いることに依存する。他の免疫エフェクターは、例えば腫瘍細胞の表面上のマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。この抗体自身は、治療のエフェクターとして作用してもよく、または実際に細胞障害を引き起こすために他の細胞を動員してもよい。そのような治療抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素）に結合させてもよく、単にターゲティング剤として作用してもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞障害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０２１５】
一つの局面において、免疫治療は腫瘍細胞を標的とするために用いることができる。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらの如何なるものも、本発明の状況においてターゲティングに適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、尿細胞関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbBおよびp155が含まれる。IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNのようなサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8のようなケモカイン、およびFLT3リガンドのような増殖因子を含む、他の免疫刺激分子も同様に存在する。本発明のCD26に基づく治療と併用して、タンパク質として、または遺伝子輸送を用いて免疫刺激分子と併用すると、抗腫瘍効果を増強するであろう。
【０２１６】
さらに他の局面において、免疫治療抗体またはターゲティング抗体をCD26製剤（ペプチド／タンパク質またはCD26を含む発現ベクター）に結合させてもよく、同様に放射線療法剤またはもう一つの抗癌剤に結合させてもよい。
【０２１７】
（a）受動免疫療法
癌の受動免疫療法に関して多数の異なるアプローチが存在する。それらは広く以下のように分類されるであろう：抗体単独の注射；毒素または化学療法剤にカップリングさせた抗体の注射；放射活性同位元素にカップリングさせた抗体の注射；抗イディオタイプ抗体の注射；および最後に骨髄における腫瘍細胞の追放。
【０２１８】
（b）能動的免疫療法
能動的免疫療法では、抗原性ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または自己もしくは同種異系腫瘍細胞組成物もしくは「ワクチン」を、一般的に明確な細菌アジュバント（RavindranathおよびMorton、1991；Mortonら、1993）と共に投与する。
【０２１９】
（c）養子免疫療法
養子免疫療法において、患者の循環中のリンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球をインビトロで単離して、IL-2のようなリンフォカインによって活性化する、または腫瘍壊死の遺伝子を形質導入して、再投与する（Rosenbergら、1988；1989）。これを行うために、本明細書に記述のアジュバントを組み入れた抗原性ペプチド組成物と共に活性化リンパ球の免疫学的有効量を動物またはヒト患者に投与するであろう。活性化リンパ球は、最も好ましくは血液または腫瘍試料から初期に単離して、インビトロで活性化された（または「増殖した」）患者自身の細胞であろう。
【０２２０】
（iii）遺伝子治療
さらにもう一つの態様において、本発明に記述のCD26に基づく治療と併用した遺伝子治療が企図される。多様な核酸および核酸によってコードされるタンパク質が本発明に含まれ、そのいくつかを下記に示す。表4は、本発明と併用されるいくつかの形の遺伝子治療のために標的とされる可能性がある様々な遺伝子を記載する。
【０２２１】
（表４）
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【０２２２】
（iv）その他の物質
治療の治療的有効性を改善するために、その他の物質を本発明と共に用いてもよいと企図される。化学療法と組み合わせて用いるための一つの型の治療には、温熱療法が含まれ、これは患者の組織を高温（106゜Fまで）に曝露する技法である。外部または内部加熱装置は、局所、限局、または全身温熱療法を適用する際に用いてもよい。局所温熱療法は、腫瘍のような小さい面積に熱を適用することを含む。熱は、体外の装置から腫瘍をターゲティングする高周波波長によって外部から産生してもよい。内部の熱は、薄い、加熱したワイヤもしくは温水を満たした中空管を含む滅菌プローブ、埋め込み型マイクロ波アンテナ、または高周波電極を含んでもよい。
【０２２３】
患者の臓器または脚を限局治療のために加熱し、これは磁石のような高エネルギーを産生する装置を用いて行われる。または、患者の血液の一部を採取して、加熱してから内部加熱する領域に還流する。全身の加熱もまた、癌が全身に広がった場合に行ってもよい。この目的のために、温水毛布、ホットワックス、誘導コイル、および熱チャンバーを用いてもよい。
【０２２４】
ホルモン療法も同様に本発明と共に用いてもよい。ホルモンの利用は、テストステロンまたはエストロゲンのような特定のホルモンのレベルを低下させるまたは作用を遮断するために、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頚癌のような特定の癌の治療において用いてもよく、これは転移のリスクをしばしば減少させる。
【０２２５】
J．CD26またはそれをコードするベクターを投与するためのキット
本発明はまた、治療キットを提供する。いくつかの態様において、そのようなキットは、一般的にCD26ペプチドもしくはポリペプチドをコードするベクターもしくは複数のベクターを含むCD26組成物、および／またはCD26タンパク質もしくはポリペプチド製剤の薬学的に許容される製剤を、被験者への投与に適した形で、適した容器手段に含むであろう。キットはまた、緩衝液、または遺伝子の取り込みもしくは発現またはタンパク質の取り込みを増加させる物質のような他の薬学的に許容される製剤を含んでもよい。
【０２２６】
キットは、投与に適した形でタンパク質／ペプチドまたは発現構築物を含む単一の容器手段を含んでもよく、またはキットは、異なる別個の容器に入った緩衝剤または希釈剤と共に保存に安定な形状を有してもよい。例えば、キットの成分が一つまたはそれ以上の脂質溶液において提供される場合、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの成分は乾燥粉末として提供してもよい。試薬または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適した溶媒を付加することによって溶解することができる。溶媒はまた、もう一つの容器手段に提供してもよいと想像される。
【０２２７】
キットの容器手段にはまた、CD26タンパク質／ペプチドまたは発現構築物の投与のために少なくとも一つの手段が含まれてもよい。例えば、シリンジまたはインヘラーが含まれてもよい。いくつかの態様において、CD26タンパク質／ペプチドまたは発現構築物を予め混合して、単位投与剤形に少量ずつ分けて、そのような装置にローディングしてもよい。キットは、反復投与または1人より多い被験者に投与するための多数の装置を含んでもよい。
【０２２８】
本発明のキットにはまた典型的に、例えば所望のバイアルおよび他の装置が配置および保持される射出もしくは吹込み成形プラスチック容器のような、発送、保存、または商業的販売のための閉鎖環境においてバイアル、装置等を含む手段が含まれる。キットはまた、自己投与を含む投与のための説明書を含んでもよい。
【０２２９】
K．薬学的組成物
臨床応用を企図する場合、治療タンパク質および／または治療核酸および／または治療抗体および／または発現ベクターおよび／またはウイルス保存液および／または薬物を含む薬学的組成物を、意図する応用にとって適した形状で調製する必要がある。一般的に、これは、発熱物質のみならず、ヒトまたは動物にとって有害となりうる他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
【０２３０】
一般的に、適当な塩および緩衝剤を用いることが望ましいであろう。緩衝剤はまた、組み換え型細胞を患者に導入するために用いられるであろう。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体において溶解または分散させたタンパク質、ベクター、または薬物の患者に対する有効量を含む。そのような組成物はまた、接種物と呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与した場合に、有害な、アレルギー、または他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および物質の使用は、当技術分野で周知である。如何なる通常の媒体または物質も、本発明のベクターまたは細胞と非適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分も同様に、組成物に組み入れることができる。
【０２３１】
本発明に従うこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路によって利用できる限り、如何なる一般的な経路によっても行われるであろう。これには、経口、鼻腔、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によって行ってもよい。
【０２３２】
遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合した水において調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存および使用条件では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。
【０２３３】
注射可能な使用に適した薬学剤形には、滅菌水溶液または分散液、または滅菌注射用溶液または分散液の即時調合調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易な注入操作性が存在する程度に流動性でなければならない。製剤は、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル等によって得ることができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることによって得ることができる。
【０２３４】
滅菌注射用溶液は、上記の他の様々な成分と共に適当な溶媒に必要量の活性化合物を組み入れて、必要に応じて濾過滅菌を行うことによって調製される。一般的に、分散剤は、基礎分散媒体と先に列挙した物質からの必要な他の成分とを含む滅菌媒体に、様々な滅菌活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末をその予め濾過滅菌した溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥技法である。
【０２３５】
経口投与の場合、本発明のポリペプチドは、賦形剤を組み入れて、摂取されないマウスウオッシュおよび歯磨き剤の形で用いてもよい。マウスウォッシュは、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）のような適当な溶媒中に必要量の活性成分を組み入れることによって調製してもよい。または、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む抗敗血症洗浄剤に組み入れてもよい。活性成分はまた、ゲル、ペースト、粉末およびスラリーを含む歯磨き剤に分散させてもよい。活性成分はまた、水、結合剤、研磨剤、着香料、発泡剤、および湿潤剤が含まれてもよい歯磨きペーストに、治療的有効量で加えてもよい。
【０２３６】
本発明の組成物は、中性または塩の形で調製してもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基によって形成される）、および例えば塩酸または燐酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成される塩が含まれる。遊離のカルボキシル基によって形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来しうる。
【０２３７】
組成物は、「単位用量」として調製してもよい。例えば、1単位用量は、等張NaCl溶液1 mlに溶解して、皮下注入液1000 mlに加えるか、または提唱される注入部位に注入される（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照されたい）。治療すべき被験者の病態に応じて、用量の何らかの変更が必ず起こるであろう。投与責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトの投与に関して、調製物は、FDA生物製剤標準局によって必要とされる滅菌性、発熱原性、全般的安全性、および純度標準を満たさなければならない。
【０２３８】
I．投与経路
投与経路は、本来、癌または免疫細胞の位置および特性によって変化して、例えば、皮内、髄腔内、関節内、経皮、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、腫瘍内、潅流、洗浄、直接注入、局所応用、および経口投与が含まれるであろう。腫瘍内注射または腫瘍血管への注入は、不連続で固形の近づきやすい腫瘍に関して特に企図される。局所、限局、または全身投与も同様に適当である可能性がある。外科的介入の場合、本発明は、残留または転移性疾患を治療するために、術前、術中、および／または術後に使用してもよい。例えば、切除された腫瘍床に、CD26製剤を含む製剤を注入または潅流してもよく、その後化学療法剤による治療を行ってもよい。潅流は、例えば手術部位にカテーテルを埋め込んで留置することによって切除後も継続してもよい。定期的な術後治療も同様に考慮される。
【０２３９】
連続投与はまた、適当であれば、例えば腫瘍が切除されて、残っている顕微鏡的疾患を消失させるために、腫瘍床を治療する場合に適用してもよい。輸送は、シリンジまたはカテーテル挿入によって行ってもよい。そのような連続潅流は、治療の開始後約1〜2時間から、約2〜6時間まで、約6〜12時間まで、約12〜24時間まで、約1〜2日まで、約1〜2週間またはそれ以上まで行ってもよい。一般的に、連続潅流による治療的組成物の用量は、1回または多数回注射によって投与された用量と同等であり、これは潅流が起こっている期間にわたって調節されるであろう。脚の潅流は、特に黒色腫および肉腫の治療において、本発明の治療的組成物を投与するために用いてもよいとさらに企図される。
【０２４０】
治療レジメも同様に変更してもよく、しばしば腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、疾患の進行、ならびに患者の健康および年齢に依存してもよい。明らかに、特定のタイプの腫瘍はより積極的な治療を必要とするが、同時に特定の患者は、より負担の重いプロトコールに耐えることができない。臨床医は、治療製剤の既知の有効性および毒性（もしあれば）に基づいてそのような決定を下すために最も適しているであろう。
【０２４１】
癌の治療の他に、本発明はまた、CD26製剤は、単独でまたは個体の免疫系を増強するために抗原と共に用いてもよいことを提供する。そのような局面において、抗原提示細胞をCD26組成物に接触させる。APCはまた、選択的に、腫瘍もしくは病原性抗原に接触させてもよく、または腫瘍もしくは病原性抗原を発現するように誘導してもよい。または、ヒトにCD26組成物を投与して、APCを活性化してもよく、選択的に抗原性組成物を投与してもよい。本明細書に記載の投与法および投与経路は、これらの方法に同様に当てはまる。
【０２４２】
いくつかの態様において、CD26組成物を含むリポソーム製剤が企図される。薬学的物質のリポソーム封入は、従来の薬物輸送系と比較してその半減期を延長させる。より大量を保護的に封入することができるため、これによって、物質の用量-強度を細胞にそのように輸送する機会が得られる。
【０２４３】
「リポソーム」は、封入された脂質二重層の作製によって形成された多様な単層または多層脂質小胞を含む一般的用語である。燐脂質は、本発明に従うリポソームを調製するために用いられ、真の陽電荷、真の陰電荷を有しうる、または中性である。ジセチルホスフェートは、リポソームに陰電荷を付与するために用いることができ、ステアリルアミンは、リポソームに陽電荷を付与するために用いることができる。リポソームは、脂質二重層膜と内部の水性媒体とを特徴とする。多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた多層の脂質層を有する。燐脂質を過剰量の水溶液に浮遊させると、リポソームが自然に形成される。脂質成分は自己再配列を受けてから、封入構造を形成して水を捕獲し、脂質二重層のあいだ溶質を溶存させる（GhoshおよびBachhawat、1991）。リポフェクタミン-核酸複合体のような陽イオン脂質-核酸複合体も同様に企図される。
【０２４４】
M．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の本実施例に開示の技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明の発明者らによって発見された技術を表し、そのため、その実践のための好ましい様式を構成すると見なすことができることは、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様に多くの変更を行うことができ、それでもなお同様または類似の結果を得ることができ、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれることを認識しなければならない。
【０２４５】
実施例1
CD26の発現およびその関連するジペプチジルペプチダーゼIV酵素活性は、G2/Mチェックポイントでのドキソルビシンによる細胞周期停止に対する感受性を増強する
材料および方法
細胞および試薬
ヒトT細胞白血病Jurkatの安定なトランスフェクタントは、Dongら、1996；Dongら、1997；Tanakaら、1993に記述されている。Jurkat細胞株には：（a）野生型CD26トランスフェクトJurkat細胞株（wtCD26）；（b）630位の推定の触媒セリン残基でアラニンを含む変異体CD26をトランスフェクトさせたJurkat細胞株、その結果変異体CD26陽性/DPPIV陰性Jurkatトランスフェクタント（S630A）が得られる；（c）ADA結合部位残基340〜343位で、アミノ酸L340、V341、A342、およびR343がアミノ酸P340、S341、E342およびQ343に置換される点突然変異を含む変異体CD26をトランスフェクトさせたJurkat細胞株、それによってADA（340〜4）に結合することができない変異体CD26陽性/DPPIV陽性Jurkatトランスフェクタントが得られる；（d）ベクターのみのJurkatトランスフェクタント（neo）；および（e）非トランスフェクト対照Jurkat細胞（対照）が含まれる。Jurkatトランスフェクタントは、10％FCS、ペニシリン（100単位/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、およびG418（0.25 mg/ml；Life Technologies, Inc.（ライフテクノロジーズインク））を添加したRPMI 1640からなる培養培地において維持された。非トランスフェクト対照Jurkat細胞は、G418を含まない同じ培養培地において維持した。Jiyoye細胞は、20％FCSを添加した同じ培地において維持したが、Namalwa細胞は、7.5％FCSを添加した培養培地において維持した。抗p34cdc2、抗cdc25C、および抗サイクリンB1は、サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、カリフォルニア州））から得て、抗アクチンは、シグマケミカル（Sigma Chemical Co.）から得た。テトラゾリウム塩MTT（シグマケミカル）を、室温で滅菌PBSにおいて5 mg/mlの濃度で溶解して、溶液を濾過滅菌して、暗所で4℃で保存した。抽出緩衝液は以下のように調製した：20％w/v SDSを37℃で各50％のN,N-ジメチルホルムアミド（シグマケミカル）溶液および蒸留水に溶解して、1 M HClを加えてpHを4.7に調節した。sDPPIVは、既に記述されているとおり（Ikushimaら、2000）、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生された。ドキソルビシンは、カルビオケム（Calbiochem）から購入して、滅菌PBSに溶解した。
【０２４６】
MTTアッセイ
細胞増殖アッセイは既に記述されているとおりに行った（Hansenら、1989）。細胞を培養培地単独、培養培地とsDPPIV（50μg/ml）、培養培地とドキソルビシンの表記の濃度、または培養培地、sDPPIV（50μg/ml）、およびドキソルビシンの表記の濃度の存在下でマイクロプレートにおいて全量100μl（細胞50,000個/ウェル）でインキュベートした。37℃で48時間インキュベートした後、MTT 25μlを最終濃度1 mg/mlとなるようにウェルに加えた。マイクロプレートを37℃で2時間インキュベートした後、抽出緩衝液100μlを加えた。37℃で一晩インキュベートした後、570 nmでのA570/nm測定を行い、1試料あたりウェル3個ずつの標準誤差は、15％未満であった。
【０２４７】
細胞障害指数は、以下のように計算した：
2006510615.tif 000011
【０２４８】
細胞周期分析
細胞は培養培地単独、または培養培地とドキソルビシン（0.05μM）において37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、PBSによって2回洗浄し、10μg/mlヨウ化プロピジウム、0.5％ツイーン20、および0.1％RNアーゼを含むPBSにおいて室温で30分間再浮遊させた。次に、試料のDNA含有量を分析した（FACScan；Becton Dickinson）。細胞の破片および固定のアーチファクトはゲートの設定によって除去して、G0/G1、S、およびG2-M集団をCellQuestおよびModFit LTプログラムを用いて定量した。
【０２４９】
SDS-PAGEおよびイムノブロッティング
培養培地および表記の濃度のドキソルビシンにおいて37℃で24時間インキュベートした後、細胞をウェルから回収して、PBSによって洗浄し、1％Brij 97、5 mM EDTA、0.02 M HEPES（pH 7.3）、0.15 M NaCl、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、0.5 mM NaF、10μg/mlアプロチニン、および0.2 mMオルトバナジン酸ナトリウムからなる溶解緩衝液に溶解した。氷中で15分間インキュベートした後、核を遠心によって除去して上清を回収した。20％グリセロール、4.6％SDS、0.125 Mトリス（pH 6.8）、および0.1％ブロモフェノールブルーからなる試料緩衝液（2×）を上清の適当な少量に加えた。沸騰させた後、タンパク質試料に、ミニ-Protean IIシステム（Bio-Rad（バイオラド））を用いて標準的な条件で8％ゲル上でSDS-PAGEを行った。イムノブロッティングの場合、タンパク質をニトロセルロース（Immobilon-P、ミリポア）に転写した。0.1％ツイーン20および5％BSAのトリス緩衝生理食塩液溶液からなるブロッキング溶液において4℃で一晩ブロックした後、メンブレンを、ブロッキング溶液において希釈した適当な一次抗体によって室温で1時間ブロッティングした。次に、メンブレンをブロッキング溶液によって洗浄して、ブロッキング溶液において希釈した適当な二次抗体を室温で1時間適用した。二次抗体はヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（Dako）であった。次に、メンブレンをブロッキング溶液によって洗浄して、その後タンパク質を化学発光（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）によって検出した。
【０２５０】
キナーゼアッセイ
細胞を表記の濃度のドキソルビシンによって24時間処置して、細胞抽出物を溶解緩衝液において上記のように調製した。総蛋白質（320μg）をHB緩衝液[20 mM HEPES（pH 7.7）、75 mM NaCl、2.5 mM EDTA（pH 8.0）、0.05％トライトンX-100、20 mMβ-グリセロホスフェート、0.5 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1 mM DTT、2μg/mlロイペプチン、および1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド]において1 mg/mlタンパク質濃度に希釈して、抗p-34cdc2モノクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジー）およびプロテインA-セファロースビーズによって3〜4時間免疫沈殿させた。免疫沈殿物をHB緩衝液によって2回洗浄して、キナーゼ緩衝液[25 mM HEPES（pH 7.6）、20 mM MgCl2、および20 mMβグリセロホスフェート]によって2回洗浄した。キナーゼアッセイは、ヒストンH1（ライフテクノロジーズインク）1μgの存在下で冷ATP（50μM）および[γ-32P]ATP（5μCi）によって室温で30分間行い、Laemmli緩衝液において沸騰させることによって反応を停止した。試料を、標準的な条件で12％ゲル上でのSDS-PAGEに供し、バンドをオートラジオグラフィーによって可視化した。
【０２５１】
DPPIV酵素活性の検出
DPPIV酵素活性は、既に記述されているように（Torimotoら、1992）、基質Ala-Pro-7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンをカップリングさせた酵素重層膜システム（エンザイムシステムズプロダクツ、ダブリン、カリフォルニア州）を用いて検出した。培地単独またはドキソルビシンと共に37℃で24時間インキュベートした後、細胞溶解物を調製して、20％グリセロール、4.6％SDS、0.125 Mトリス（pH 6.8）、0.1％ブロモフェノールブルー、および2％2-メルカプトエタノールからなる試料緩衝液を室温で加えた。次に、標準的な条件で8％ゲルにおいて試料にSDS-PAGEを行った。酵素重層膜を0.5 Mトリス-塩酸（pH 7.8）において湿らせて、ゲルの表面に置き、湿潤大気中で37℃で40分間インキュベートした。次に、膜をゲルから取り出して、長波長UV灯ボックスの上に置き、蛍光原性7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンからジペプチドAla-Proが除去されることを含み、膜上に蛍光バンドが出現する酵素反応をモニターした。
【０２５２】
免疫沈殿分析
免疫沈殿分析は、既に記述されているとおりに（Dongら、1996；Kameokaら、1993）実施した。簡単に説明すると、Jurkatトランスフェクタントまたは対照非トランスフェクトJurkat細胞をラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素添加によって標識した。溶解物を抗CD26抗体（1F7）2μgと共にインキュベートしてから、Affi-Gel（バイオラド）にカップリングさせたヤギ抗マウス抗体によって沈殿させた。免疫複合体を十分に洗浄して、SDS試料緩衝液50μlにおいて5分間沸騰させて溶出させた後、SDS-PAGEによる分析を行った。
【０２５３】
結果
Jurkat細胞のドキソルビシン媒介増殖阻害およびG2-Mチェックポイントでの細胞周期停止に及ぼすCD26/DPPIV発現の影響
安定なJurkatトランスフェクタントを用いて、ドキソルビシンに対する感受性に及ぼすCD26発現の影響をMTTアッセイによって調べた。図1は、野生型CD26トランスフェクタント（wtCD26）が親（対照）またはベクターのみ（neo）のJurkat細胞と比較して、ドキソルビシンに対する顕著な感受性の増加を示したことを示している。DPPIV触媒部位（S630A）で変異させたCD26トランスフェクタントは、ドキソルビシンに対する感受性がより低かった。一方、ADA結合部位で変異させたが、なおもDPPIV活性（340-4）を保持しているCD26をトランスフェクトさせたJurkat細胞は、ドキソルビシン感受性がより大きく、wtCD26トランスフェクタントと類似であった。これらのデータは、CD26の存在、特にその関連するDPPIV酵素活性の存在によって、抗新生物剤であるドキソルビシンによって媒介されるDNA損傷に対する感受性が増加したことを示している。
【０２５４】
ヨウ化プロピジウム染色による細胞周期分析から、wtCD26トランスフェクタントにおいて認められるドキソルビシン感受性の増強が、G2-Mで停止する細胞の割合の増加に帰因したことが証明された（図2；表5）。この場合も、S630A CD26変異体におけるG2-Mブロックは、対照の親Jurkat細胞と区別できなかったが、wtCD26および340-4細胞は、ドキソルビシン処置後にG2-M停止の増強を示したことから、DPPIV酵素活性は、ドキソルビシンに対する感受性の増加にとって必要であった。一方、トランスフェクト細胞におけるCD26およびその変異体誘導体の発現は、免疫沈殿分析のみならず、既に記述されているように（Dongら、1996；Dongら、1997）125Iによって表面標識して、抗CD26モノクローナル抗体によって免疫沈殿した細胞を用いる免疫蛍光試験によっても確認した。
【０２５５】
（表５）CD26/DPPIV発現に関連したドキソルビシン誘導G2/M停止の増強a
2006510615.tif 000012
a 図2からの数値データ。CD26 Jurkatトランスフェクタントを、ドキソルビシンを含む培地において37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、「材料および方法」に記述するように細胞周期分析を行った。データは三つの異なる試験を表す。
【０２５６】
Jurkatトランスフェクタントに及ぼすDPPIV酵素活性
次に、本発明者らは、ドキソルビシンによる処置後のJurkatトランスフェクタントに及ぼすDPPIV酵素活性を決定した。Jurkat細胞を培地単独または0.01μMもしくは0.1μMのドキソルビシンと共に37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収してDPPIV酵素活性アッセイを行った。wtCD26トランスフェクタントは、ドキソルビシンとのインキュベーション後もDPPIV酵素活性を保持したが、S630Aトランスフェクタントは対照非トランスフェクトJurkat細胞と共にDPPIV酵素活性を示さなかった。したがって、これらのデータは、これらの様々なJurkatトランスフェクタントにおいて認められたドキソルビシン感受性の差がDPPIV酵素活性の差に関連していることを示した。
【０２５７】
Jurkat細胞のドキソルビシン処置後のp34cdc2、サイクリンB1、およびcdc25Cに及ぼすCD26/DPPIV発現の影響
p34cdc2は、G2-Mへの細胞周期進行の重要な調節物質である（Kingら、1994）。ドキソルビシンによる処置は、G2-Mチェックポイントでの細胞周期停止に関連するp34cdc2キナーゼ活性を減少させた（Lingら、1996；Siuら、1999）。p34cdc2キナーゼの活性をJurkat細胞においてドキソルビシン処置後に評価した。このため、Jurkat細胞を、表記の用量のドキソルビシンを含む培地と共に37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収した後、キナーゼアッセイおよびイムノブロット試験を上記のように行った。溶解物を調製して、p34cdc2キナーゼ活性を、基質としてヒストンH1を用いる免疫複合体キナーゼアッセイによって測定した。ホスホイメージャーによる定量の後、無処置細胞のp34cdc2キナーゼ活性に任意の値1を与え、他の活性をこの値と比較して測定した。p34cdc2のタンパク質レベルは、抗p34cdc2によるイムノブロッティング試験によって調べた。cdc25cのタンパク質レベルは、抗cdc25Cによるイムノブロッティング試験によって調べた。セリン216位での燐酸化の差を反映する二つの主要な電気泳動型が検出された。ホスホイメージャーによる定量後、無処置細胞のcdc25C-Pバンドの強度に任意の値1を与え、他の活性をこの値と比較して測定した。サイクリンB1のタンパク質レベルは、抗サイクリンB1によるイムノブロッティング試験によって調べ、アクチンのタンパク質レベルは、抗アクチンによるイムノブロッティング試験によって調べた。p34cdc2キナーゼ活性の阻害は、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントでは対照の非トランスフェクタントまたはS630Aトランスフェクタントと比較してドキソルビシンのより低濃度で起こった。したがって、P34cdc2酵素活性は、ドキソルビシン誘導DNA損傷後のこれらのJurkat細胞株において認められるG2-M停止に対する感受性の差と相関した。
【０２５８】
これまでの研究（Siuら、1999；Dunphy、1994；Poonら、1997）は、ドキソルビシン誘導DNA損傷後の阻害性残基Thr14Tyr15でのp34cdc2の過剰燐酸化がp34cdc2キナーゼ活性の阻害と相関することを確立した。ウェスタンブロット分析によって評価すると、ドキソルビシン処置wtCD26 Jurkatトランスフェクタントは、ドキソルビシンのより高い用量で燐酸化p34cdc2のレベルのわずかな増強を示したに過ぎない非トランスフェクタントJurkat対照細胞およびS630Aトランスフェクタントと比較して、特により低いドキソルビシン用量でより高レベルの過剰燐酸化p34cdc2を有した。したがって、データは、ドキソルビシン媒介G2-M停止に対するCD26 Jurkatトランスフェクタントの相対的感受性は、相対的キナーゼ活性およびp34cdc2の燐酸化レベルと相関し、p34cdc2過剰燐酸化の増加は、p34cdc2キナーゼ活性の減少およびG2-M停止の増強に関連することを示した。
【０２５９】
cdc25Cタンパク質ホスファターゼは、p34cdc2Thr14/Tyr15残基を脱燐酸化することによって、p34cdc2燐酸化状態およびキナーゼ活性の重要な調節物質である（Dunphy、1994；Poonら、1997；NilssonおよびHoffman、2000）。NH2末端のセリンおよびトレオニン残基でのcdc25Cの過剰燐酸化は、その内因性のホスファターゼ活性を増加させ（LewおよびKornbluth、1996）、残基セリン216位での燐酸化によって、14-3-3タンパク質結合が起こり、cdc25Cとp34cdc2との相互作用を防止することによってcdc25Cホスファターゼ活性を負に調節する（Pengら、1997）。同調せずに増殖するJurkat細胞は、cdc25Cの二つの主要な電気泳動型を発現することが示されており、これはセリン216位での燐酸化状態の差を反映する（Pengら、1997）。これまでの知見と一致して、本発明者らはまた、親Jurkat細胞からの溶解物が、cdc25Cの二つの主要な電気泳動型を含むことを発見した。野生型CD26 JurkatトランスフェクタントおよびS630Aトランスフェクタントからの溶解物も同様に、セリン216位の燐酸化が異なる二つの型のcdc25Cを含む。重要なことは、wtCD26トランスフェクタントは一貫して、ドキソルビシンによって処置した場合に、S630Aトランスフェクタントおよび非トランスフェクト対照細胞と比較してcdc25Cセリン216位の燐酸化の検出可能な増強を示した。したがって、これらの結果は、cdc25Cセリン216位の燐酸化の増加が、非トランスフェクタントまたはS630Aトランスフェクタントと比較すると、ドキソルビシン処置wtCD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるp34cdc2燐酸化の増加およびそれに伴うそのキナーゼ活性の減少と一致することを示した。
【０２６０】
次に、本発明者らは、p34cdc2/サイクリンB1複合体がG2-Mチェックポイントで細胞周期進行の調節において重要な役割を有するという事実を考慮して、様々なCD26 JurkatトランスフェクタントにおけるサイクリンB1発現に及ぼすドキソルビシン処置の影響を調べた。サイクリンB1レベルは、ドキソルビシンによる処置後の非トランスフェクタントまたはS630Aトランスフェクタントと比較して、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントではより高かった。いくつかの実験において、本発明者らは、無処置wtCD26 JurkatトランスフェクタントにおけるサイクリンB1のレベルは、無処置非トランスフェクタントまたはS630Aトランスフェクタントについて認められたレベルよりわずかに高かったことを認めた。有意に、調べた全ての症例において、無処置細胞と比較してドキソルビシンによって処置した細胞におけるサイクリンB1レベルの相対的な増加は、親細胞またはS630Aトランスフェクタントの場合よりwtCD26トランスフェクタントにおいて大きかった。ドキソルビシン処置によって、マウス白血病P388細胞においてサイクリンB1が蓄積されたことを示すこれまでの研究と一致して（Lingら、1996）、データはこのように、Jurkat細胞におけるドキソルビシン処置によって、サイクリンB1発現の調節の変化が起こり、それによってサイクリンB1蓄積が起こることを示した。重要なことは、p34cdc2燐酸化状態およびキナーゼ活性の場合のみならずcdc25Cセリン216位燐酸化の場合と同様に、本発明者らは、相対的サイクリンB1発現レベルがドキソルビシンに対するCD26 Jurkatトランスフェクタントの相対的感受性と相関することを発見した点である。
【０２６１】
内因性sDPPIVによるドキソルビシンに対するJurkat細胞の感受性の増加
DPPIV酵素活性の存在がドキソルビシン感受性にとって重要であることが、データから示されたことから、本発明者らは次に、ドキソルビシン処置CD26 Jurkatトランスフェクタントに及ぼす外因性sDPPIVの影響を調べた。これらの研究に関して、低用量のドキソルビシンを用いて、ドキソルビシン感受性に対する外因性sDPPIVについて可能性がある作用を最適に検出した。sDPPIVはそれ自身、培地単独においてインキュベートした細胞においてMTT取り込みに影響を及ぼさなかったが、本発明者らは、外因性sDPPIVの存在によって、ドキソルビシンに対する感受性が有意に増強されることを発見した（図3A、3Bおよび3C）。これらのデータは、DPPIV酵素活性が、ドキソルビシンに対するJurkat細胞の相対的感受性において重要な役割を有するという結論をさらに支持した。
【０２６２】
外因性sDPPIVによるドキソルビシンに対する細胞株の感受性の増強
DPPIV活性の存在によって、ドキソルビシンに対するJurkat細胞の感受性が増強されるという事実を考慮して、本発明者らは、他のリンパ様細胞株のドキソルビシン媒介増殖阻害に及ぼすsDPPIVの影響を調べた。図4Aおよび4Bにおいて認められるように、sDPPIVの付加はまた、B細胞株NamalwaおよびJiyoyeにおけるドキソルビシンの増殖阻害作用を増強した。データはこのように、ドキソルビシンに対する感受性のDPPIVによる増強がJurkat細胞株のみに限定されず、他のリンパ様細胞株に応用可能であることを証明した。
【０２６３】
実施例2
トポイソメラーゼIIαの発現およびトポイソメラーゼII阻害剤に対する細胞感受性に及ぼすCD26/ジペプチジルペプチダーゼIVの影響
材料および方法
細胞および試薬
ヒトT細胞白血病Jurkatの安定なトランスフェクタントが記述されている（Tanakaら、1993；Aytacら、2001）。Jurkat細胞株には：1）野生型CD26-トランスフェクトJurkat細胞株（wtCD26）；2）630位で推定の触媒的セリン残基でアラニンを含む変異体CD26をトランスフェクトしたJurkat細胞株、それによって変異体CD26陽性/DPPIV陰性Jurkatトランスフェクタント（S630A）が得られる；および3）非トランスフェクト親Jurkat細胞（親）。Jurkatトランスフェクタントは、10％FCS、ペニシリン（100単位/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、およびG418（0.25 mg/ml）（ギブコBRL）を含むRPMI 1640からなる培養培地において維持された。非トランスフェクト親Jurkat細胞は、G418を含まない同じ培養培地において維持した。特定の実験において、RPMI 1640および10％FCSを含む培養培地ではなくて、AIM V無血清培地（ギブコ）を用いた。AIM V無血清培地を含む実験では、細胞を滅菌PBSによって十分に洗浄した後、血清の混入を防止するために、AIM V含有培養培地において37℃で24時間プレインキュベートした。プレインキュベーションの後、細胞を滅菌PBSによって洗浄してから、表記の濃度の化学療法剤の存在下または非存在下でAIM V含有培養培地においてさらにインキュベートした。抗p34cdc2、抗cdc25C、抗サイクリンB1はサンタクルズ（カリフォルニア州）から、抗トポイソメラーゼIIαはベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）から、抗アクチンはシグマから得て、そして抗CD26抗体1F7は、既に記述されているマウス抗体であった（Morimotoら、1989）。テトラゾリウム塩MTT（3,(4,5-ジメチルチアゾル-2-イル)2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（シグマ）を、室温で滅菌PBSに5 mg/mlの濃度で溶解して、溶液を濾過滅菌して4℃の暗所で保存した。抽出緩衝液は以下のように調製した：20％w/v SDSを、各50％のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）（シグマ）および蒸留水の溶液に37℃で溶解して、1 M HClを加えることによってpHを4.7に調節した。エトポシドおよびドキソルビシンは、カルビオケムから購入して、滅菌PBSにおいて溶解した。
【０２６４】
MTTアッセイ
細胞増殖アッセイは、既に記述されているとおりに実施した（Aytacら、2001）。細胞を培養培地単独、培養培地と表記の濃度のドキソルビシンまたはエトポシドとの存在下で全量を100μl（細胞50,000個/ウェル）としてマイクロプレートにおいてインキュベートした。37℃で36〜48時間のインキュベーションの後、MTT 25μlを最終濃度1 mg/mlとなるようにウェルに加えた。マイクロプレートを37℃で2時間インキュベートしてから、抽出緩衝液100μlを加えた。37℃で一晩インキュベートした後、570 nmでのOD測定を行い、1試料あたりウェル3個の平均値の標準誤差は15％未満であった。細胞障害指数は以下のように計算した：
2006510615.tif 000013
【０２６５】
細胞周期分析
細胞を培養培地単独、培養培地と表記の濃度のドキソルビシンまたはエトポシドと共に37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、PBSによって2回洗浄し、10μg/mlヨウ化プロピジウム、0.5％ツイーン20、および0.1％RNアーゼを含むPBSに室温で30分間再浮遊させた。次に、試料のDNA含有量を分析した（FACScan、ベクトンディッキンソン）。細胞の破片および固定アーチファクトはゲートによって除去して、G0-G1、S、およびG2-M集団をCellQuestおよびModFit LTプログラムを用いて定量した。
【０２６６】
SDS-PAGEおよびイムノブロッティング
培養培地および表記の濃度のドキソルビシンまたはエトポシドと共に37℃で24時間インキュベートした後、細胞をウェルから回収して、PBSによって洗浄し、1％Brij 97、5 mM EDTA、0.02 M HEPES pH 7.3、0.15 M NaCl、1 mM PMSF、0.5 mM NaF、10μg/mlアプロチニン、および0.2 mMオルトバナジン酸ナトリウムからなる溶解緩衝液において溶解した。氷中で15分間インキュベートした後、核を遠心によって除去して、上清を回収した。20％グリセロール、4.6％SDS、0.125 Mトリス pH 6.8、および0.1％ブロモフェノールブルーからなる2×試料緩衝液を適当な少量の上清に加えた。沸騰させた後、ミニ-Protean IIシステム（バイオラド）を用いて標準的な条件で8％ゲルにおいてタンパク質試料にSDS-PAGE分析を行った。イムノブロッティングの場合、タンパク質をニトロセルロース（Immobilon-P、ミリポア）に転写した。0.1％ツイーン20および5％ウシ血清アルブミンのTBS溶液からなるブロッキング溶液において4℃で一晩ブロッキングした後、メンブレンを、ブロッキング溶液において希釈した適当な一次抗体によって室温で1時間ブロットした。次に、メンブレンをブロッキング溶液によって洗浄して、ブロッキング溶液において希釈した適当な二次抗体を室温で1時間適用した。二次抗体は、ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギHRP結合体（ダコ、カリフォルニア州）であった。メンブレンをブロッキング溶液によって洗浄して、その後タンパク質を化学発光（アマシャムファルマシアバイオテック）によって検出した。
【０２６７】
DPPIV酵素活性の検出
ジペプチジルペプチダーゼIV（DPPIV）酵素活性は、既に記述されているように（Aytacら、2001）、それに対して基質Ala-Pro-AFC（7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン）がカップリングしている酵素重層膜システム（EOM、エンザイムシステムズプロダクツ、ダブリン、カリフォルニア州）を用いて検出した。37℃で培地単独またはエトポシドを含む培地と共に24時間インキュベートした後、細胞溶解物を調製して、20％グリセロール、4.6％SDS、0.125 Mトリス pH 6.8、0.1％ブロモフェノールブルーおよび2％2-メルカプトエタノールからなる試料緩衝液を室温で加えた。次に、試料に標準的な条件で8％ゲル上でSDS-PAGE分析を行った。EOMを、0.5 Mトリス塩酸、pH 7.8に湿らせ、ゲルの表面上に置き、湿潤大気中で37℃で40分間インキュベートした。メンブレンをゲルから採取して、長波長紫外線灯ボックスの上部に置いて、蛍光原性AFCからジペプチドAla-Proが除去されることを含み、メンブレン上に蛍光バンドが出現する酵素反応をモニターした。
【０２６８】
免疫蛍光
技法は全て、4℃で行い、既に記述されているように（Dangら、1990）フローサイトメトリー分析を行った（FACScan、ベクトン・ディッキンソン）。細胞を抗CD26抗体によって染色して、PBSによって2回洗浄してから、ヤギ抗マウスIgG FITC（コールター（Coulter））によって染色した。細胞をPBSによって2回洗浄してから、フローサイトメトリー分析を行った。陰性対照は、二次抗体のみによって染色した。
【０２６９】
トポイソメラーゼIIαの検出のための核抽出物の調製
イムノブロッティングによるトポイソメラーゼIIαの検出のために、Jurkat細胞からの核分画の単離は、以下のように調製した。簡単に説明すると、細胞10×106個を回収して、氷中で細胞質抽出緩衝液（10 mM HEPES、10 mM KCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1 mM DTT、1 mM PMSF、2μg/mlロイペプチン、2μg/mlアプロチニン、および0.5 mg/mlベンズアミジン）において15分間膨張させた。次に、NP-40（最終濃度0.3％）を細胞浮遊液に加えて、10秒間ボルテックスミキサーによって攪拌した。16000×Gで1分間遠心した後、上清を除去した。沈殿物を核抽出緩衝液（20 mM HEPES、400 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT、0.5 mM PMSF、2μg/mlロイペプチン、2μg/mlアプロチニン、および0.5 mg/mlベンズアミジン）と共に氷中で時折攪拌しながら30分間インキュベートした。浮遊液を16000×Gで5分間遠心した後、上清を核抽出物とした。SDS-PAGEおよびイムノブロッティングを核抽出物に行った。それぞれのレーンには、タンパク質15μgを等しくローディングした。
【０２７０】
結果
Jurkat細胞のエトポシド媒介増殖阻害およびG2-Mチェックポイントでの細胞周期停止に及ぼすCD26/DPPIV発現の影響
トポイソメラーゼIIエトポシドに対する感受性に及ぼすCD26/DPPIVの影響を、Jurkat T白血病細胞株の安定なCD26トランスフェクタントを用いて調べた。図5は、MTT取り込みアッセイによってモニターしたところ、野生型CD26トランスフェクタント（wtCD26）が、親細胞と比較してエトポシドに対する感受性の有意な増加を示したことを示している。ベクターのみのJurkatトランスフェクタントも同様に、親細胞と同程度の薬物感受性を示した。有意に、DPPIV触媒部位（S630A）で変異させたCD26トランスフェクタントも同様に、wtCD26トランスフェクタントよりエトポシドに対する感受性が低かった。これらのデータは、CD26の存在が、抗新生物剤であるエトポシドによって媒介されるDNA損傷に対する感受性を増強することを示している。
【０２７１】
PI染色による細胞周期分析から、親Jurkat細胞と比較してwtCD26トランスフェクタントについて認められたエトポシド感受性の増強が、G2-Mで停止した細胞の割合の増加に起因したことが証明された（表6）。この場合も、S630A CD26変異体におけるG2-Mブロックが、wtCD26トランスフェクタントについて認められたブロックより有意に小さかったことから、エトポシドに対する薬物の感受性を最大限にするためにはDPPIV酵素活性が必要であった。
【０２７２】
JurkatトランスフェクタントにおけるCD26発現とDPPIV酵素活性
図2からのデータは、CD26がwtCD26およびS630A Jurkatトランスフェクタントの表面上に発現されるが、親Jurkat細胞には発現されないことを示した。同様に、wtCD26 JurkatトランスフェクタントのみがDPPIV酵素活性を発現するが、これはエトポシドによる処置後にもなおも残っていることが示された。このため、Jurkar細胞を、培地単独、または0.10μMもしくは0.50μMのエトポシドと共に37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、DPPIV酵素活性アッセイを行った。一方、S630Aトランスフェクタントと共に親Jurkat細胞は、DPPIV酵素活性を示さなかった。これらのデータは、これらの様々なCD26 Jurkatトランスフェクタントにおいて認められたエトポシド感受性の差が、DPPIV酵素活性の差に関連することを示した。
【０２７３】
Jurkat細胞のエトポシド処置後のp34cdc2、サイクリンB1、およびcdc25Cに及ぼすCD26/DPPIV発現の影響
エトポシド誘発G2-M停止におけるCD26/DPPIV関連増強に関与するメカニズムを解明するために、このチェックポイントの重要な調節物質の状況を調べた。Jurkat細胞を表記の用量のエトポシドを含む培地と共に37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、適当な抗体によってイムノブロッティング試験を行った。p34cdc2はエトポシド処置後に阻害性残基Thr14/Tyr15で過剰燐酸化を受け、それによってG2-M停止に関連したキナーゼ活性の減少が起こることが認められた（Kingら、1994；Poonら、1997；Aytacら、2001）。ウェスタンブロット分析によって評価したところ、エトポシド処置wtCD26 Jurkatトランスフェクタントは、より高用量のエトポシドで燐酸化p34cdc2レベルのわずかな増強を示したに過ぎない親Jurkat細胞およびS630Aトランスフェクタントと比較して、より高レベルの過剰燐酸化p34cdc2を示した。
【０２７４】
cdc25Cタンパク質ホスファターゼは、p34cdc2 Thr14/Tyr15残基の脱燐酸化によってp34cdc2燐酸化を調節して、キナーゼ活性を調節する（Poonら、1997）。そのアミノ末端におけるセリンおよびトレオニン残基の燐酸化は、cdc25Cの内因性ホスファターゼ活性を増加させるが（LewおよびKornbluth、1996）、残基セリン216位での燐酸化によって14-3-3タンパク質とcdc25Cとの相互作用が起こり、p34cdc2に対するcdc25Cの結合を防止して（Pengら、1997；Dalalら、1999）、cdc25Cによるp34cdc2の阻害性残基の脱燐酸化を有効に阻害する。既に証明されているように（Pengら、1997；Aytacら、2001）、非同調増殖Jurkat細胞からの溶解物は、セリン216位での燐酸化が異なるcdc25Cの二つの主要な電気泳動型を含んだ。試験は一貫して、wtCD26トランスフェクタントが、エトポシドによって処置した場合に、S630Aトランスフェクタントおよび親細胞と比較してcdc25Cの全体的な発現の増加およびセリン216位の燐酸化の増強を示すことを示した。したがって、cdc25Cセリン216位燐酸化の増加は、親細胞またはS630Aトランスフェクタントと比較して、エトポシド処置wtCD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるp34cdc2阻害性燐酸化の増強と一致した。
【０２７５】
試験はまた、G2-Mチェックポイントでの細胞周期進行を調節する重要な複合体の一部としてp34cdc2に関連するサイクリンB1のレベルが、エトポシド処置後の親細胞またはS630Aトランスフェクタントのレベルと比較して、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントにおいて高いことを示した。サイクリンB1レベルは、無処置の親細胞またはS630Aトランスフェクタントと比較して、無処置のwtCD26 Jurkatトランスフェクタントにおいてわずかに高いことが判明した（Aytacら、2001）。それにもかかわらず、エトポシドによる処置は一貫して、wtCD26トランスフェクタントにおいてサイクリンB1レベルの有意な上昇を示し、親Jurkat細胞またはS630Aトランスフェクタントの場合に認められたレベルと比較して、有意に大きかった。したがって、相対的サイクリンB1発現レベルは、p34cdc2燐酸化状態およびcdc25Cセリン216位の燐酸化において認められた場合と同様に、エトポシドに対するCD26 Jurkatトランスフェクタントの相対的感受性と相関した。
【０２７６】
薬物感受性に及ぼすCD26発現の影響は血清とは無関係であった
CD26は、その生理的機能を変化させるためにそのDPPIV活性を通して最後から2番目の位置でのL-プロリンまたはL-アラニンのいずれかによって生体因子からアミノ末端のジペプチドを切断することができる（Oraveczら、1997；Proostら、1998）。薬物感受性のCD26関連増強における血清由来因子の可能性がある役割を評価するために、wtCD26トランスフェクタントまたは親Jurkat細胞をAIM V無血清培地においてインキュベートして、ドキソルビシンまたはエトポシド処置後に上記と類似の実験を行った。MTT取り込みアッセイ（図7Aおよび7B）および細胞周期分析（表7）によって評価したところ、CD26の存在によって、無血清培地における薬物誘導G2-M停止に対する感受性の増強が認められた。同様に、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントは、エトポシドまたはドキソルビシンによって処置した場合に、親Jurkat細胞と比較すると、より大きいp34cdc2燐酸化、cdc25Cの全体的な発現、およびセリン216位での燐酸化、およびサイクリンB1レベルを示した。無血清培地における薬物処置後のG2/Mチェックポイント調節因子に及ぼすCD26発現の影響は、以下のような試験であった：AIM V無血清培地によって37℃で24時間プレインキュベートした後、wtCD26および親Jurkat細胞をエトポシドまたはドキソルビシンを含む無血清培地において37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、適当な抗体を用いてイムノブロッティング試験を行った。したがって、これらの知見から、CD26 JurkatトランスフェクタントにおけるCD26/DPPIV発現に関連した薬物感受性の増強は、血清由来因子との相互作用よりむしろ細胞由来プロセスに及ぼすその作用によることが示唆された。
【０２７７】
CD26/DPPIV発現は、トポイソメラーゼIIαレベルの増強に関連する
血液学的悪性疾患の治療において重要な役割を有する抗新生物剤として、ドキソルビシンとエトポシドはいずれもトポイソメラーゼIIαを標的とする。薬物感受性におけるCD26/DPPIV関連増強の可能性があるメカニズムをさらに調べるために、CD26 JurkatトランスフェクタントにおいてトポイソメラーゼIIα発現を調べた。このため、Jurkat細胞を通常の培養培地においてインキュベートして、核抽出物をイムノブロッティング試験のために回収した。wtCD26 Jurkatトランスフェクタントは、親Jurkat細胞またはS630Aトランスフェクタントと比較して、トポイソメラーゼIIαのより高いレベルを発現し、CD26/DPPIVを発現するJurkat細胞における薬物感受性の増加は、トポイソメラーゼIIαレベルの増強に関連することを示した。
【０２７８】
（表６）CD26/DPPIVに関連したエトポシド誘発G2/M停止の増強
2006510615.tif 000014
CD26 Jurkatトランスフェクタントおよび親細胞を、エトポシドを含む培地において37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、PI染色によって細胞周期分析を行った。データは異なる3回の実験を表す。
【０２７９】
（表７）無血清培地におけるエトポシドおよびドキソルビシンに対する感受性の増強
2006510615.tif 000015
AIM V無血清培地によって37℃で24時間前処置した後、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントおよび親細胞をエトポシドまたはドキソルビシンを含む無血清培地において37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、PI染色による細胞周期分析を行った。データは異なる3回の実験を表す。
【０２８０】
実施例3
CD26/ジペプチジルペプチダーゼは、トポイソメラーゼII阻害剤の誘導によってアポトーシスに対する感受性を増強させる
CD26/DPPIV発現が、トポイソメラーゼII阻害剤によって誘発されたG2/M細胞周期停止および他のDNA損傷剤に対するJurkatトランスフェクタントの感受性を増強するという知見の他に、本発明者らは、CD26/DPPIVが、ドキソルビシンおよびエトポシドのようなDNA損傷剤によって誘発されたアポトーシスに対するCD26 Jurkatトランスフェクタントの感受性を増強することを発見した。特に、CD26/DPPIVは、ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ（PARP）、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-9、Bcl-xl、ならびにApaf-1の切断の増強と共に、デス受容体5（DR5）の発現の増加によって報告されるように、アポトーシスのミトコンドリア経路に対する感受性の増強に関連する。本発明者らはまた、カスパーゼ-9特異的阻害剤z-LEHD-fmkが、CD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるエトポシド媒介アポトーシスを阻害して、それによってPARPおよびカスパーゼ-3切断の減少ならびにDR5発現の減少が起こることも示す。このように、CD26 JurkatトランスフェクタントにおけるトポイソメラーゼII阻害剤に対する細胞感受性の増強は、DPPIV活性に関連したトポイソメラーゼIIα発現の増加によるものである。同様に、可溶性CD26を添加すると、トポイソメラーゼIIα発現を増強し、ドキソルビシン誘導アポトーシスに対する感受性を増強する。これらの知見は、CD26とトポイソメラーゼIIαとの機能的相互作用を暗示し、生体プロセスにおいてCD26によって示される重要な役割のさらなる証拠を示す。
【０２８１】
トポイソメラーゼII阻害剤は、固形腫瘍および血液系の悪性疾患の治療において広く用いられている物質である（Froelich-AmmonおよびOsheroff、1995）。これらの薬物は、DNA切断部位の頻度および期間を増加させることによってトポイソメラーゼIIαの触媒活性を選択的に活用して、それによって未成熟な二本鎖切断によってDNA損傷を引き起こす（Kellnerら、2002；Beckら、1999）。これまでの知見は、トポイソメラーゼII阻害剤によって媒介されるDNA損傷は、特にチトクロームc放出（Liuら、1996；Kluckら、1997；Gradら、2001；Yangら、1997）、チトクロームcおよびdADPとの結合によって活性化されるApaf-1の関与（Kuida、2000；Lauberら、2001；Perkinsら、2000）そしてカスパーゼ-9のその後の活性化（Mowら、2001）を通して、アポトーシスを誘導する（Beckら、1999；Kaufmann、1998；Mowら、2001）ことを示した。本発明者らは、CD26/DPPIVの表面発現が、トポイソメラーゼII阻害剤ドキソルビシンによって媒介されるG2/M停止に対するCD26 Jurkat T細胞トランスフェクタントの感受性を増強することを示した（実施例2およびAytacら、2001を参照されたい）。本実施例において、CD26/DPPIVの表面発現は、Apaf-1、プロ-カスパーゼ-9、プロ-カスパーゼ-3、およびPARPの切断の増加に関連して、トポイソメラーゼII阻害剤によって誘導されるアポトーシスに対するCD26 Jurkat T細胞トランスフェクタントの感受性を増強することが証明される。さらに、CD26 Jurkatトランスフェクタントは、薬物処置後のBcl-xl切断の増強およびDR5の発現の増加を示す。一方、カスパーゼ-9特異的阻害剤であるz-LEHD-fmkによる前処置は、エトポシド媒介アポトーシス事象を有意に減少させる。
【０２８２】
このように、これらのトランスフェクタントにおけるトポイソメラーゼII阻害剤に対する感受性のCD26関連増強は、標的酵素トポイソメラーゼIIαの発現の増強に関連する。CD26/DPPIVとトポイソメラーゼIIαとの関連に関するさらなる証拠は、CD26 JurkatトランスフェクタントにおいてトポイソメラーゼIIαの発現を減少させるDPPIV化学的阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）による処置から得られる。可溶性CD26分子を加えても、トポイソメラーゼIIαレベルが増強し、その結果ドキソルビシン媒介アポトーシスに対する感受性が増加する。これらの知見は、生体プロセスにおける多面的なCD26/DPPIV分子のますます重要な役割を強調するが、癌の治療をデザインするために、CD26/DPPIVとトポイソメラーゼIIαとの機能的関連を利用してもよい。
【０２８３】
細胞および試薬
ヒトCD26 Jurkat T細胞白血病の安定なトランスフェクタントは記述されており、CD26表面発現および関連するDPPIV酵素活性に関して既に特徴が調べられている（Dongら、1996；Aytacら、2001；Dongら、1997；Tanakaら、1993）。Jurkat細胞株には：（a）野生型CD26トランスフェクトJurkat細胞株（wtCD26）；（b）630位の推定の触媒セリン残基でアラニンを含む変異体CD26をトランスフェクトさせたJurkat細胞株、その結果変異体CD26陽性/DPPIV陰性Jurkatトランスフェクタント（S630A）が得られる；（c）ADA結合部位残基340〜343位で、アミノ酸L340、V341、A342、およびR343がアミノ酸P340、S341、E342およびQ343に置換される点突然変異を含む変異体CD26をトランスフェクトさせたJurkat細胞株、それによってADA（340〜4）に結合することができない変異体CD26陽性/DPPIV陽性Jurkatトランスフェクタントが得られる；および（d）非トランスフェクト対照Jurkat細胞（親）が含まれる。Jurkatトランスフェクタントは、10％FCS、ペニシリン（100単位/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、およびG418（0.25 mg/ml；ライフテクノロジーズインク）を添加したRPMI 1640からなる培養培地において維持した。非トランスフェクタント対照Jurkat細胞は、G418を含まない同じ培養培地において維持した。アネキシンV-FITCは、BCファーミンゲン（PharMingen）から購入した。抗PARP、チトクロームc、およびカスパーゼ3 Abは、BDファーミンゲンから購入した；抗アクチンはシグマケミカルから購入し、抗カスパーゼ-9は、ケイマン（Cayman）から購入した。抗DR5 Abは、ケイマンから購入した。抗Bcl-xlおよびApaf-1 Abは、BDトランスダクションラボラトリーズ（BD Transduction Laboratories）から購入した。抗トポイソメラーゼIIαは、ロシュ（Roche）より購入した。カスパーゼ-9阻害剤（z-LEHD-fmk）は、BDファーミンゲンから購入した。ジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）は、シグマから得た。DPPIVの基質であるGly-Pro-p-ニトロアニリド-トシレート（GPNT）は、ワコウ（Wako、日本）から購入した。エトポシドは、シグマから購入して、滅菌DMSOに溶解した。ドキソルビシンは、カルビオケムから購入して、滅菌PBSに溶解した。可溶性CD26分子は、既に記述されているように、チャイニーズハムスター卵巣細胞から産生させて精製した（Tanakaら、1994）。
【０２８４】
アネキシン/PIアッセイ
ホスファチジルセリン残基の露出は、既に記述されているように（Vermesら、1995；RaynalおよびPollard、1994；Martinら、1995）表面のアネキシンV染色によって定量した。簡単に説明すると、細胞を結合緩衝液（10 mM HEPES、pH 7.4、2.5 mM CaCl2、140 mM NaCl）において洗浄して、100μlに再浮遊させて、0.5μl/mlアネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）および2.5μg/mlヨウ化プロピジウム（PI）と共に暗所で15分間インキュベートした。細胞を再度洗浄して、結合緩衝液400μlに再浮遊させて、フローサイトメトリー（FACScan、ベクトン・ディッキンソン）を行った。CellQuestソフトウェアを用いて、1試料あたり細胞1万個を獲得して、Paint-a-gateソフトウェア（ベクトン・ディッキンソン）を用いてデータを分析した。
【０２８５】
SDS-PAGEとイムノブロッティング
培養培地と表記の濃度および期間のエトポシドまたはドキソルビシンと共に37℃でインキュベートした後、細胞をウェルから回収して、PBSによって洗浄し、1％NP-40、0.5％デオキシコレート、0.1％SDS、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、1 mMベンズアミジン、10μg/mlアプロチニン、50μg/mlロイペプチン、10μg/ml大豆トリプシン阻害剤および1μg/mlペプスタチンからなる溶解緩衝液において溶解した。氷中で5分間インキュベートした後、遠心によって核を除去して、上清を全細胞溶解物として回収した。20％グリセロール、4.6％SDS、0.5 Mトリス（pH 6.8）、4％β-メルカプトエタノール、および0.2％ブロモフェノールブルーからなる試料緩衝液（4×）を適当な少量の上清に加えた。沸騰後、タンパク質試料に、ミニ-Protean IIシステム（バイオラド）を用いて標準的な条件で8％ゲルにおいてSDS-PAGE分析を行った。イムノブロッティングに関して、タンパク質をニトロセルロース（Immobilon-P；ミリポア）に転写した。0.1％ツイーン20および5％BSAのトリス緩衝生理食塩液溶液からなるブロッキング溶液において4℃で一晩ブロッキングした後、メンブレンをブロッキング溶液において希釈した適当な一次抗体によって室温で1時間ブロッティングした。次に、メンブレンをブロッキング溶液によって洗浄して、ブロッキング溶液において希釈した適当な二次抗体を室温で1時間適用した。二次抗体はヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ダコ）であった。膜をブロッキング溶液によって洗浄して、その後タンパク質を化学発光（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）によって検出した。
【０２８６】
DPPIV酵素活性アッセイ
既に記述されているように（Kajiyamaら、2002）、DPPIV酵素活性は、DPPIVの基質であるGly-Pro-p-ニトロアニリドトシレート（GPNT）を用いて分光測光法によって測定した。1×PBSによって洗浄した全細胞浮遊液を調製して、細胞5×105個を96ウェルプレートにおいてPBS 200μlに浮遊させて、GPNTを最終濃度0.24 mMで加えた。吸光度は、マイクロプレート分光光度計（バイオテックインストルメンツインク（BIO-TEK Instruments, Inc.））を用いて405 nmで2回、基質を加える直前と、37℃で60分間インキュベート後に測定した。DPPIV酵素活性は、0分から60分までの吸光度の増加から計算した。
【０２８７】
DPPIV酵素活性の阻害
既に記述されているように（Kajiyamaら、2002；Koreedaら、2001）、DFPを阻害アッセイのDPPIV化学阻害剤として用いた。DFPに対する連続的な曝露の影響を調べるために、wtCD26トランスフェクタントまたは親Jurkat細胞を培養培地単独（DFP-）、100μM DFPを含む培養培地（DFP+）と共に2時間または6時間インキュベートした。それぞれの処置条件を反映する細胞の代表的な例をDPPIV酵素活性アッセイのために、またはトポイソメラーゼIIα発現を調べるために得た。または、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントを培養培地、もしくは100μM DFPを含む培養培地と共に4時間インキュベートするか、またはそれらを100μM DFPと共に培養培地において4時間インキュベートしてからPBSによって2回洗浄し、DFPを確実に除去した後培養培地において2もしくは8時間インキュベートした。それぞれの処置条件を反映する細胞の代表的な例を、DPPIV酵素活性アッセイのために、またはトポイソメラーゼIIα発現を調べるために得た。全ての処置条件に関して、トリパンブルー取り込みアッセイは一貫して、＞90％の細胞生存率を示した（データは示していない）。
【０２８８】
サイトソル分画の調製
既に記述されているように（Haridasら、2001；Nishimuraら、2001）、Jurkat細胞（4.0×107個）を蔗糖緩衝液（250 mM蔗糖の30 mMトリス塩酸、pH 7.4溶液）1 mlに浮遊させて、N2空洞形成室（PARRインストルメンツ（PARR Instruments）、モリン、イリノイ州）に入れた。製造元の説明書に従って、細胞にN2空洞化（250 psiを5分間）を行った。これらの条件では、細胞膜のほとんどが破壊されたが、ミトコンドリア呼吸活性に変化を認めなかった。次に、DNAおよび核分画を遠心（1,500×gで2分間）によって除去した。上清をさらに遠心して（16,000×gで10分間）、上清をサイトソル分画として用いた。
【０２８９】
核抽出物の調製
細胞10×106個を採取して、氷中で細胞質抽出緩衝液（10 mM HEPES、10 mM KCl、0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、1 mM DTT、1 mM PMSF、2μg/mlロイペプチン、2μg/mlアプロチニン、および0.5 mg/mlベンズアミジン）において15分間膨張させた。次に、NP-40（最終濃度0.3％）を細胞浮遊液に加えて、10秒間ボルテックスミキサーによって攪拌した。16000×Gで2分間遠心した後、上清を除去した。沈殿物を核抽出緩衝液（20 mM HEPES、400 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM DTT、0.5 mM PMSF、2μg/mlロイペプチン、2μg/mlアプロチニン、および0.5 mg/mlベンズアミジン）と共に氷中で時折攪拌しながら30分間インキュベートした。浮遊液を16000×Gで6分間遠心した後、上清を核抽出物とした。
【０２９０】
トポイソメラーゼII阻害剤によって媒介されるJurkat細胞のアポトーシスに及ぼすCD26/DPPIV発現の影響
安定なJurkatトランスフェクタントを用いて、エトポシドおよびドキソルビシンに対する感受性に及ぼすCD26発現の影響を調べた。アネキシンV/PIアッセイは、wtCD26トランスフェクタントが、S630Aまたは親対照Jurkat細胞よりエトポシドのアポトーシス作用に対して感受性があることを示している。一方、340-4トランスフェクタント（340-4）は、wtCD26トランスフェクタントと類似のより高レベルの薬物誘導アポトーシスを示す（図15A）。さらに、wtCD26および340-4細胞は、ドキソルビシンによって処置した場合に親またはS630A Jurkat細胞と比較するとより大きいアポトーシスを示す（図15B）。同様に、wtCD26および340-4 Jurkatトランスフェクタントはいずれも、親細胞およびS630Aトランスフェクタントと比較して、エトポシド媒介PARP切断に対してより感受性が高い（GaoおよびDou、2000；Fuldaら、2001；Ariumiら、1998）（図16）。細胞をドキソルビシンによって処置した場合にも、類似の結果が認められる。これらのデータは、CD26、特にその関連するDPPIV酵素活性の存在によって、トポイソメラーゼII阻害剤によって媒介されるアポトーシスが増強されることを示している。
【０２９１】
エトポシドによって誘導されるアポトーシスのミトコンドリア経路に及ぼすCD26/DPPIV表面発現の影響
これまでの研究は、トポイソメラーゼII阻害剤によって媒介されるDNA損傷が、ミトコンドリア経路を通してアポトーシスを誘導し、それによってその後カスパーゼ-9およびPARP切断の活性化が起こることを証明した（Beckら、1999；Kaufmann、1998；Mowら、2001；Liuら、1996；Kluckら、1997；Gradら、2001；Yangら、1997；GaoおよびDou、2000a；GaoおよびDou、2000b；Wenら、2000）。経時的変化の分析（図17）は、エトポシド処置によってPARPおよびプロカスパーゼ-3の切断の増強が起こり、それによってS630Aおよび親Jurkat細胞と比較して、wtCD26トランスフェクタントにおいて切断された17kDaのカスパーゼ-3バンドのレベルが増加することを示している。その上、エトポシド処置によって、S630Aおよび親対照Jurkatと比較してwtCD26細胞ではプロカスパーゼ-9の有意により大きい切断が起こる。Apaf-1がアポトーシスのミトコンドリア経路の重要な調節物質であることを示すこれまでの報告と一致して（Kuida、2000；Lauberら、2001；Perkinsら、2000）、エトポシド処置wtCD26 Jurkatトランスフェクタントでは、親の対照またはS630A Jurkatと比較して、Apaf-1の130kDaプロ型のより大きい切断を認めることが本明細書において証明されている。さらに、wtCD26トランスフェクタントにおけるエトポシド誘発アポトーシスに対する感受性の増加は、本明細書において、完全長の抗アポトーシス分子Bcl-xlのより大きい切断を伴うこと（Fujitaら、1998；Wangら、2001；Basanezら、2001）、そして切断された18kDaのバンドがその結果上昇することが示される。併せると、これらの結果は、CD26/DPPIVが、カスパーゼ-9プロセシングとミトコンドリア経路を含むプロセスのみならず、bcl-2関連分子のプロセシングを含むプロセスを含む、薬物媒介アポトーシスに関係することが知られている細胞プロセスに影響を及ぼすことによってJurkat細胞のエトポシド媒介アポトーシスを増強することを示している。
【０２９２】
CD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるエトポシド誘発アポトーシスに及ぼすカスパーゼ-9阻害剤z-LEHD-fmkの影響
CD26がカスパーゼ-9関連事象を通してエトポシド誘発アポトーシスに影響を及ぼすという知見をさらに確認するために、本発明者らは、このプロセスに及ぼすカスパーゼ-9阻害剤z-LEHD-fmkの影響を評価した。ウェスタンブロット分析から、z-LEHD-fmkによる前処置が、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントに及ぼすエトポシドの影響を有意に消失させることが示される。図18に示すように、プロ-カスパーゼ-9のエトポシド媒介切断は、z-LEHD-fmkによって用量依存的に阻害される。さらに、カスパーゼ-9プロセシングの下流の事象であるプロカスパーゼ-3とPARPの切断は、カスパーゼ-9阻害剤による前処置後に有意に減少する。したがって、このデータは、CD26が、CD26 Jurkatトランスフェクタントにおいてカスパーゼ-9関連事象を通してエトポシド誘発アポトーシスを増強することを示している。
【０２９３】
トポイソメラーゼIIα発現に及ぼすDPPIV酵素阻害剤ジイソプロピルフルオロホスフェートの影響
CD26の作用、特にトポイソメラーゼII阻害剤によって誘発されるアポトーシスに及ぼすその内因性DPIIV酵素活性を考慮して、CD26 JurkatトランスフェクタントにおけるトポイソメラーゼIIα発現を調べた。wtCD26 JurkatトランスフェクタントにおけるトポイソメラーゼIIαレベルは、S630Aトランスフェクタントまたは親Jurkatの場合より一貫して高いことが証明されている（図19A）。さらに、トポイソメラーゼIIα発現に及ぼすDPPIV化学阻害剤であるジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）（Kajiyamaら、2002；Koreedaら、2001）の影響を調べた。DFPによる連続的な処置によって、これらの細胞におけるトポイソメラーゼIIαの発現の減少に関連して（図19C）、wtCD26 JurkatトランスフェクタントにおけるDPPIV酵素活性の阻害が起こる（図19B）ことが示されている。一方、親Jurkat細胞におけるトポイソメラーゼIIαの発現は、予想されたようにDFPに対する連続的な曝露によって有意な影響を受けない。さらに、DFP処置後のDPPIV酵素活性の状態およびトポイソメラーゼIIα発現も同様に調べた。この目的のために、DFPによる処置後、wtCD26細胞を洗浄して、培養培地において表記の期間インキュベートした。DPPIV酵素活性の回復は、トポイソメラーゼII発現の回復に関連することが証明される（図19Dおよび図19E）。これらの結果によって、本発明者らは、CD26 JurkatトランスフェクタントにおけるトポイソメラーゼIIα発現におけるDPPIV酵素活性の重要性に関する初期の知見を確証する。
【０２９４】
トポイソメラーゼIIα発現とドキソルビシンに対する感受性に及ぼす可溶性CD26分子の影響
JurkatトランスフェクタントにおけるCD26の表面発現、特にその内因性DPPIV酵素活性によって、トポイソメラーゼIIαレベルの増強が起こるという知見を拡大するために、トポイソメラーゼIIα発現に及ぼす可溶性CD26（sCD26）分子の影響を調べた。図20に示すように、sCD26分子とのインキュベーションによって、親対照Jurkat細胞においてトポイソメラーゼIIαタンパク質発現が有意に増加する。トポイソメラーゼIIα発現の増加と共に、親Jurkat細胞をsCD26分子と共にインキュベートすると、同様にドキソルビシン誘発PARP切断の増強も起こる（図21）。これらの知見は、CD26/DPPIVの存在がトポイソメラーゼIIα発現を増強して、それによって結果的にトポイソメラーゼII阻害剤に対する感受性が増加することを示している。
【０２９５】
CD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるエトポシド誘発アポトーシスにおけるDR5のカスパーゼ-9依存的関与
TRAIL（腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）ファミリーのメンバーであるデス受容体5（DR5）の発現は、ドキソルビシンおよびエトポシドのようなDNA損傷剤による処置後にアップレギュレートされる（Wenら、2000；Naganeら、2001；Gibsonら、2000；Jazirehiら、2001）。本発明者らは本明細書において、S630Aまたは親Jurkat細胞と比較して、wtCD26トランスフェクタントではエトポシド処置によって58kDaのDR5レベルが大きく増加することを証明する（図22A）。興味深いことに、抗DR5mAbによるウェスタンブロッティング分析も同様に、エトポシド処置によってより小さい32kDaバンドの発現を検出し、そのレベルは、S630Aまたは親細胞よりwtCD26トランスフェクタントにおいて有意に高かった。経時的変化を調べる試験において、32kDaバンドの出現は、58kDaバンドの発現レベルについて認められた増加より一貫して先に起こる。
【０２９６】
本発明者らは、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるエトポシド誘発アポトーシスがカスパーゼ-9プロセシングを含むことを既に証明した。エトポシド処置wtCD26 JurkatにおいてDR5発現の増強がカスパーゼ-9関連事象に依存的であるか否かを調べるために、カスパーゼ-9阻害剤z-LEHD-fmkと共にプレインキュベートした後のエトポシド処置細胞におけるDR5発現を調べた。図22Bに示すように、エトポシド処置wtCD26細胞において認められた58kDaバンドの増加は、細胞をz-LEHD-fmkと共にプレインキュベートすると、有意に減少する。同様に、エトポシドによって誘導された32kDaバンドは、z-LEHD-fmkのプレインキュベーションによってもはや検出されない。
【０２９７】
このように、JurkatトランスフェクタントにおけるCD26の存在、特にその内因性DPPIV酵素活性によって、トポイソメラーゼII阻害剤であるドキソルビシンおよびエトポシドによって誘導されるアポトーシスに対する感受性が増強されることが示される。重要なことに、薬物感受性のこのような増強は、標的酵素トポイソメラーゼIIαの発現の増加に関連する。一方、DPPIV酵素活性の化学的阻害がトポイソメラーゼIIα発現の減少に関連するという知見は、wtCD26 JurkatトランスフェクタントがS630Aまたは親Jurkat細胞より高レベルのトポイソメラーゼIIαを有することを示すデータと共に、トポイソメラーゼIIα発現においてDPPIVによって示される重要な役割および結果としてのトポイソメラーゼII阻害剤に対する感受性に関するさらなる証拠を提供する。この結論は、可溶性CD26分子と共に細胞をインキュベートした後の、トポイソメラーゼIIα発現の増加および薬物感受性の増加を示すデータによってさらに確証される。
【０２９８】
実施例4
可溶性CD26/ジペプチジルペプチダーゼIVは、APCに及ぼすCD86アップレギュレーションを通してT細胞増殖を誘導する
材料および方法
ヒトリンパ球集団の単離と活性化
献血前2年以内にTTを免疫した健康な成人ボランティアから採取したヒトPBMCをフィコール/パック（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）上での遠心によって単離した。PBMCは、経時的変化を調べる試験に直接使用した。再構成試験の場合、PBMCをT細胞分画およびAPC分画にさらに精製した。高度精製T細胞集団を得るために、PBMCをEロゼット陽性（E+）集団に分離して、純度が＞95％であるFITC-標識抗CD3 mAb（BDファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いるフローサイトメトリー分析（FACSCalibur；日本BDバイオサイエンシズ（Nippon BD Biosciences）、東京、日本）によって決定した休止期T細胞として用いた。APCを得るために、Eロゼット陰性（E-）集団をプラスチックプレートに37℃で4時間接着させて、接着細胞をAPCとして用いた。単球はPE-標識抗CD14 mAb（BDファーミンゲン）方向パラメータに基づくフローサイトメトリーによって精製するか、または純度が＞95％である抗CD3、CD7、CD19、CD45RA、CD56、およびIgE mAb（ミルテニイバイオテック（Miltenyi Biotec）、オバーン、カリフォルニア州）をコーティングした免疫磁気ビーズを用いることによって負の選択を行うことによって精製した。PBMCは、10％FCS、100 U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（ライフテクノロジーズ）および異なる濃度のTT（カルビオケム、ラホヤ、カリフォルニア州）を添加したRPMI 1640培地（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク州）において16時間培養した後、様々な時間間隔でsCD26パルスを行った。T細胞も同様に、sCD26の存在下または非存在下で、標準的な培地（ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む10％FCS-RPMI1640）において培養した。単球は、異なる濃度のTTと共に標準的な培地において16時間インキュベートした後、異なる時間で培養培地にsCD26を添加した。混入による単球の非特異的活性化による干渉を防止するために、APC/単球試験に用いる全ての培地および試薬に、硫酸ポリミキシンB（20 IU/ml；シグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、セントルイス、ミズーリ州）を加えた。
【０２９９】
細胞は全て、標準的な培地において24時間プレインキュベートして、ヒト血清に存在するsCD26による可能性がある干渉のリスクを最小限にした（Tanakaら、1993）。これらの試験において、細胞を96ウェルプレート（200μl/ウェル；ファルコン（Falcon）、フランクリンレークス、ニュージャージー州）においてインキュベートした。経時的変化を調べる研究に関して、PBMC 1.0×105個を0.5μg/ml TTと共に16時間インキュベートした。次に、0.5μg/ml sCD26をウェルに加えて、0、6、12、24、48、72、および96時間インキュベートした。最初のsCD26を培養ウェルに加えた日を培養0日目として定義した。増殖実験におけるアッセイは全て、細胞を37℃の5％CO2湿潤大気中でインキュベートした後、培養7日目で行った。再構成試験の場合、単層0.5×106個を異なる濃度のsCD26と共に濃度0.5μg/mlのTTと共に24時間プレインキュベートした。単層をPBSによって洗浄した後、プレインキュベートした単球1×104個/ウェルを、調製した単球と同じドナーからの精製T細胞1×105個/ウェルと共にアッセイに供した。固定試験の場合、前固定刺激試験の場合と同様に、0.05％グルタルアルデヒドによって室温で30秒間処置した後、PBSによって3回洗浄し、単球0.5×106個を濃度0.5μg/mlのTTおよび0.5μg/ml sCD26と共にインキュベートした。後固定刺激試験の場合、単球0.5×106個を最初に濃度0.5μg/mlのTTおよび0.5μg/mlのsCD26と共にインキュベートした。その後、プレインキュベートした単球を0.05％グルタルアルデヒドによって室温で30秒間処置した後、PBSによって3回洗浄した。単球（1.0×104個/ウェル）を、調製した単球と同じドナーに由来する精製T細胞1.0×105個/ウェルと共にアッセイに供した。
【０３００】
sCD26の調製
DPPIVを有するsCD26（sCD26/DPPIV+）は、既に記述されている方法（Manickasinghamら、1998）に従って産生した。簡単に説明すると、CD26のアミノ酸3〜9 位のコード配列の欠失を含む発現ベクターRcSRα-26 days 3-9を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を提供するpMT-2と共に、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株DXB-11に電気穿孔によってトランスフェクトした。DPPIVを有しない変異体sCD26（sCD26/DPPIV-）は、オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発によってRcSRα-26d3-9をさらに改変して、DPPIV酵素の活性部位で点突然変異（Ser630がAlaに置換されている）を含むRcSRα-26d3-9 S630Aを生じたことを除き、同じ方法において産生した。sCD26または変異体sCD26のいずれかを産生するトランスフェクトされたCHO細胞を、1μMメソトレキセート（シグマ-アルドリッチ）を含む無血清CHO-S-SFM II培地（ライフテクノロジーズ）において培養した。培養上清を回収して既に記述された方法に従ってアデノシンデアミナーゼ-セファロース上でのアフィニティクロマトグラフィーを行った（Ikushimaら、2000）。
【０３０１】
mAbと試薬
フローサイトメトリーの一次抗体として用いたmAbの起源および実験濃度は以下の通りである：PE結合抗CD3（UCHT1、マウスIgG1；10μg/ml；BDファーミンゲン）、抗CD14（Mo-2、マウスIgM；10μg/ml；ベックマンコールター（Beckman Coulter）、マイアミ、フロリダ州）、抗CD19（HIB19、マウスIgG1；10μg/ml；BDファーミンゲン）、および抗CD56（NKH1、マウスIgG1；10μg/ml；ベックマンコールター）；FITC標識抗CD80（BB1、マウスIgM；10μg/ml；BDファーミンゲン）、抗CD86（IT2.2、マウスIgG2；10μg/ml；BDファーミンゲン）;および抗HLA-DR（L243、マウスIgG2；10μg/ml；BDファーミンゲン）。オレゴングリーン結合sCD26（sCD26-OG）は、フルオレポーターオレゴングリーンタンパク質標識キット（モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州）によって製造元の説明書に従って作製した。これらのオレゴングリーン結合タンパク質は、濃度1μg/mlで用いた。ビオチン結合抗CD14（Mo-2；IgM；10μg/ml）は、ベックマンコールターから購入した。ブロッキングアッセイのためのmAbは、以下のように得た：CD80（BB-1）、CD86（IT2.2）、およびHLA-DR（L243）はBDファーミンゲンから得た；ヒトCTLA-4とマウスIgとのキメラタンパク質（CTLA-4 Ig）および関連する対照マウスIgは、アンセル（Ancell、ベイポート、ミネソタ州）から購入し、マウス抗ヒトM6P/IGFIIR mAbは、V. Horcjsi博士（チェコ共和国科学アカデミー、プラハ、チェコ共和国）から寄贈された。テキサスレッド結合抗ヒトM6P/IGF-IIR mAb（M6P/IGF-IIR-レッド）は、フルオレポーターテキサスレッドタンパク質標識キット（モレキュラープローブス）によって製造元の説明書に従って作製した。全ての実験において、同じIgアイソタイプの関連する対照mAbを含めた（IgG1（MOPC-21）、IgG2（G155-178）、およびIgM（G155-228）はBDファーミンゲンから購入した）。卵白ライソザイムは、和光純薬（大阪、日本）から購入して、オレゴングリーンを結合させた。
【０３０２】
T細胞増殖アッセイ
APCによって誘導されたT細胞増殖は、[3H]TdR（ICNラジオケミカルズ（ICN Radiochemicals）、アーバイン、カリフォルニア州）の取り込みによって測定した。7日間インキュベートした細胞に1μCi/ウェルの[3H]TdRを8時間パルスしてからグラス繊維フィルター（ワラック（Wallac）、チュルク、フィンランド）上に回収して、取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター（ワラック）によって定量した。
【０３０３】
フローサイトメトリー分析
sCD26-OGを構成するPBMC集団の評価は、PE結合抗CD3、抗CD14、抗CD19、および抗CD56 mAb（10μg/ml）によって行った。これらの実験に関してPBMC 1×106個/ウェルを、sCD26-OGを含む標準的な培地において、TTとプレインキュベートを行って、またはプレインキュベートを行わずに24時間インキュベートした。細胞を氷冷PBSによって2回洗浄した後、酸性PBS（pH 3.0）において2分間インキュベートして、細胞表面に結合した如何なるsCD26-OGも除去した。次に、細胞を氷冷PBSによって洗浄して、マウスIgアイソタイプ（1μg/ml）と共にインキュベートして非特異的結合をブロックした；この後、PE結合mAbとの反応を行った。
【０３０４】
精製単球（単球0.5×106個/ウェル）上でのCD80、CD86、およびHLA-DRの発現を評価する試験において、単球をTT（0.5μg/ml）の存在下、または非存在下で16時間プレインキュベートした。sCD26（0.5μg/ml）と共に24時間インキュベートした後、FITC結合CD80、CD86、およびHLA-DR mAb（10μg/ml）を、PE結合抗CD14（10μg/ml）と共に用いて、単球集団のみを通過させるようにゲートを設定した。sCD26の細胞取り込みに及ぼすM6Pの作用を評価する実験において、精製単球（単球0.5×106個/ウェル）を、標準的な培地においてsCD26-OGの存在下または非存在下で適当な濃度のM6Pと共に24時間インキュベートした。細胞を氷冷PBSによって2回洗浄した後、酸性PBS（pH 3.0）において2分間インキュベートして、細胞表面に結合した如何なるsCD26-OGも除去した。細胞を氷冷PBSにおいて洗浄して、マウスIgアイソタイプ（1μg/ml）と共にインキュベートして、非特異的結合をブロックした；この後、PE結合CD14（10μg/ml）との反応を行い、単球集団のみが得られるようにゲートを設定した。
【０３０５】
生存細胞10,000個のフローサイトメトリー分析を、FACSCalibur（BDバイオサイエンシズ（BD Biosciences）、マウンテンビュー、カリフォルニア州）によって行った。各実験は少なくとも3回繰り返して、結果を代表的な実験のヒストグラムの形で、または対照もしくは無処置細胞と比較した蛍光強度の増加平均％±SEの形で提供した。
【０３０６】
共焦点レーザー顕微鏡
単球によるsCD26の取り込みに関する蛍光顕微鏡試験に関して、精製単球をTT（0.5μg/ml）とのプレインキュベートを行って、またはプレインキュベートを行わずに、sCD26-OG（1μg/ml）と共にインキュベートした。次に、細胞を氷冷PBSによって2回洗浄して、酸性PBS（pH 3.0）においてインキュベートして、細胞表面に結合した如何なるsCD26-OGも除去した。細胞をマイクロスライドガラス（マツナミガラス（Matsunami Glass）、東京、日本）に結合させて、3％パラホルムアルデヒドのPBS溶液において室温で15分間固定した。細胞をマウスIgアイソタイプ（1μg/ml）によって4℃で30分間ブロックした後、ビオチン結合抗CD14（10μg/ml）と共に4℃で30分間インキュベートした後、氷冷PBSによって2回洗浄して、ストレプトアビジン結合テキサスレッド結合体（200倍希釈；ベックマンコールター）と共に4℃で30分間インキュベートした。単球上でのM6P/IGF-IIRによるsCD26の取り込みの試験において、精製単球をTTの存在下または非存在下で16時間インキュベートして、マウスIgアイソタイプ（1μg/ml）によって4℃で30分間ブロックした後、sCD26-OGおよびM6P/IGF-IIR-レッドを培養ウェルに加えた。細胞を4℃で30分間インキュベートした。細胞表面の共局在を検出するために、細胞を氷冷PBSによって2回洗浄して、マイクロスライドガラスに結合させ、3％パラホルムアルデヒドのPBS溶液によって室温で15分間固定した。細胞内取り込みの検出に関して、細胞を37℃で5％CO2湿潤大気中で24および36時間インキュベートした後、氷冷PBSによって2回洗浄し、酸性PBS（pH 3.0）においてインキュベートして、細胞表面に結合した如何なるsCD26-OGも除去した。細胞をマイクロスライドガラスに結合させて、3％パラホルムアルデヒドのPBS溶液において室温で15分間固定した。共焦点顕微鏡は、オリンパス（Olympus）IX70共焦点顕微鏡によって60対物レンズ（オリンパス、東京、日本）によって、496および568 nmでのレーザー励起を用いて行った。オレゴングリーンおよびテキサスレッドの放射チャンネルの幅は、特異性を最大限にするように設定した。
【０３０７】
相対的定量的RT-PCRアッセイ
CD86 mRNAの発現を評価する試験において、精製TT処置単球（単球0.5×106個/ウェル）をsCD26（0.5μg/ml）と共に適当な間隔でインキュベートした。次に、TRIzol試薬溶液を用いて、製造元の説明書（ライフテクノロジーズ）に従ってRNAを抽出した。オリゴ(dT)12-18プライマーによってThermo-Script II逆転写酵素（ライフテクノロジーズ）を用いてcDNAを作製した。mRNAの量は、β-アクチンのPCRを用いることによって等しく調節した。内部対照として、フォワードプライマーは
2006510615.tif 000016
（cDNAの位置746〜766位；配列番号：38）、およびリバースプライマーは
2006510615.tif 000017
（cDNAの位置1000〜1020位；配列番号：39）であった。CD86 mRNAは、CD86の全コード配列を増幅するようにデザインされたプライマーによって増幅した（フォワードプライマーは、
2006510615.tif 000018
（cDNA位置149〜181位およびリンカー；配列番号：40）およびリバースプライマーは
2006510615.tif 000019
（cDNA位置1090〜1120位およびリンカー；配列番号：41）であった）。PCRは、以下のように実施した：94℃で4分間の後、94℃で30秒間の変性、64℃で1分間のアニーリング、および72℃で30秒間の伸長を異なるサイクル行った後、最終伸長を72℃で5分間行った。増幅されたDNAを3％アガロースゲルにおいて電気泳動させて、エチジウムブロマイドによって染色した。
【０３０８】
mAbおよびヒトCTLA-4 Igによるブロッキングアッセイ
ブロッキング試験に関して、単球を様々な濃度のCD80、CD86、HLA-DR、またはCTLA-4 Igに対するmAbと共に15分間インキュベートした後T細胞に加えた。mAbまたはIgは全培養期間を通して加えたままであった。関連するmAbまたは対照マウスIgをアイソタイプ対照として用いた。T細胞増殖に対する阻害作用は、平行して実施したブロッキングmAbまたはIgを添加しない場合の対照培養の反応性の百分率として表記した。
【０３０９】
統計学
スチューデントt検定を用いて対照と試料との差が有意であるか否かを決定した（p＜0.05は有意である）。
【０３１０】
結果
sCD26は、リコール抗原に対する免疫応答の初期段階におけるT細胞増殖を増強する
sCD26によるTT-誘導T細胞増殖の増強に関係するメカニズムを調べるために、本発明者らはまず、sCD26をインビトロでTTによって刺激されたPBMC系に加えることによって経時的変化を調べる分析を行った。外来抗原に対する免疫応答の初期段階において、APCとT細胞との直接相互作用は不可欠である（Hathcockら、1994；Yi-qunら、1996；Hakamada-Taguchiら、1998）。しかし後期の段階において、直接のAPC-T細胞相互作用は必ずしも必要ではないが、IL-2のような分泌されたサイトカインは、反応を維持するために必須である（McAdamら、1998；Hathcockら、1994）。図8に示されるように、最初の48時間以内にsCD26を加えると、TTに対するT細胞増殖の増強が起こった。対照的に、48時間以降にsCD26を加えてもTT媒介活性化を増強せず、TTによるT細胞増殖の増強作用は、DPPIV欠損変異体sCD26による実験でも認められなかった。これらの結果は、sCD26がTTに対する免疫反応の初期段階に影響を及ぼすが、後期段階では認められうる作用を有しなかったことを示している。その上、これらのデータは、TTによるT細胞増殖の増強がDPPIV酵素活性にとって必要であることを示しているこれまでの試験と一致する（Tanakaら、1993）。
【０３１１】
sCD26とのインキュベートにより単球による取り込みが起こる
sCD26は、TTに対する免疫応答の初期段階に影響を及ぼしたことから、本発明者らは、次に、sCD26の標的細胞を決定しようと試みた。この目的に関して、本発明者らは、TTの存在下または非存在下でPBMCをsCD26-OGと共に24時間インキュベートした。表8に示すように、CD3、CD14、CD19、およびCD56のような白血球表現型は、TTの存在によって影響を受けなかった。さらに、sCD26は、CD14陽性単球によって主に取り込まれた（表8および図9）。対照的に、フローサイトメトリー分析では、T細胞（CD3+）、B細胞（CD19+）およびNK細胞（CD56+）が比較的低レベルのsCD26を示すことが示された。上記の知見はTTの存在下および非存在下の双方において認められること、そしてDPPIV欠損変異体sCD26（sCD26/DPPIV-）も同様にCD14陽性単球によって選択的に取り込まれることに注目しなければならない。sCD26が単球によって取り込まれるさらなる証拠は、共焦点顕微鏡を含む試験において認められた。表8および図9に示したデータと一致して、sCD26/DPPIV+はsCD26/DPPIV-と共に、単球によって明らかに取り込まれたことを示している。しかし、sCD26/DPPIV+、sCD26/DPPIV-、sCD26は、単球をsCD26と共にインキュベートした36時間後ではもはや細胞内に検出されなかった。単球による取り込み後のsCD26分子の消失は、フローサイトメトリー分析によっても認められた。単球によるsCD26のこのような取り込みはTTの存在によって影響を受けなかったことに注目すべきである。
【０３１２】
（表８）リンパ球亜集団によるSCD-26-OGの取り込みa
2006510615.tif 000020
a  新たに単離されたPBMC（1×106個/ウェル）を、24時間インキュベーション後、TTの存在下または非存在下で16時間インキュベートした後、sCD26/DPPIV+-OGを培養ウェルに加えた。sCD26-OGと共に24時間インキュベートした後、細胞を氷冷PBSによって洗浄して、細胞表面上でのsCD26-OGを除去するために、酸性緩衝液（pH 3 PBS）において洗浄した。次に、細胞を様々なPE結合Ab（CD3、CD14、CD19、およびCD56）と共に30分間インキュベートした。分析は、FACSCaliburによって行った。試験は、独立して行われる3回の試験から計算した平均値±SEを表す。様々なPE陽性細胞におけるsCD26-OG陽性細胞数の％割合。類似の試験は、DPPIV活性を欠損する変異体sCD26（sCD26/DPPIV-OG）を用いて行った。MFI、平均蛍光強度。
【０３１３】
sCD26の標的細胞は単球である
表8および図9に示されるように、PBMCにおける主要な標的細胞は単球であることから、本発明者らは次に、sCD26を取り込む単球によるTT誘導T細胞増殖の増強を確認しようと試みた。この目的のために、sCD26とのインキュベート時にT細胞と単球とを分離することによって再構成試験を行った。図10Aおよび10Bに示されるように、TT-誘導T細胞増殖の増強作用は、単球をTTおよびsCD26と共にプレインキュベートした場合に限って認められたが、T細胞では認められなかった（図10Aおよび10B）。重要なことに、これらの試験は再度、TT-誘導T細胞増殖のsCD26媒介増強がDPPIV酵素活性を必要とすることを確認した。TT-プライミング単球によるsCD26取り込みによってT細胞増殖の増強が起こることをさらに確認するために、本発明者らは、sCD26の異なる用量で再構成試験を行った。図10Aにおいて示されるように、TT-誘導T細胞増殖の程度は、外から加えたsCD26の濃度に依存した。したがって、これらの結果は、sCD26の主な標的細胞が単球を含むAPCであることを示している。
【０３１４】
sCD26の単球への取り込みは、M6P/IGF-IIRとの結合によって起こる
本発明者らは最近、M6P/IGF-IIRがCD26の結合タンパク質であること、そしてこれがCD26のライゲーション後T細胞へのCD26分子のインターナライズにおいて役割を果たしていることを示した（Ikushimaら、2000）。M6P/IGF-IIRがsCD26の単球の取り込みに関与しているか否かを調べるために、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、細胞内および細胞表面上でのsCD26-OGおよびM6P/IGF-IIRの単球の発現を最初に評価した。この目的のため、蛍光マウス抗ヒトM6P/IGF-IIR mAbをM6P/IGF-IIR-レッドに結合させた。sCD26-OGおよびM6P/IGF-IIRは、単球細胞表面に共局在することが示された。sCD26-OGおよびM6P/IGF-IIR-レッドの存在下で37℃で24時間インキュベートした後、これらのタンパク質の細胞内共局在を認めた。ライソザイムとM6P/IGF-IIRの共局在も同様に認められた。対照的に、sCD26-OGおよびテキサスレッド結合マウスIgG1とのインキュベート後では同時局在を認めず、FcγRに対する非特異的結合の可能性は除外された。sCD26取り込みがM6P/IGF-IIRに対するその結合に依存するか否かをさらに確認するために、本発明者らは、M6Pの過剰量の存在下で単球によるsCD26の取り込みを評価するために阻害アッセイを行った。図11Aおよび図11Bに示されるように、FACS分析から、培養系にM6P（0、0.1、1.0および10μM）を加えると、sCD26の単球への取り込みを阻害することが示された。sCD26取り込みの阻害の程度は、外から加えたM6Pの濃度に依存した（図11A）。これらの知見はまた、TTの非存在下でも認めた（図11B）。このように、これらの結果は、sCD26の単球への取り込みは、その結合タンパク質M6P/IGF-IIRとのsCD26の相互作用のためであったことを示した。sCD26の取り込み及ぼすM6Pのこの阻害作用は、sCD26/DPPIVについて行った実験において同様に認められた。
【０３１５】
sCD26によるTT誘導T細胞増殖の増強は、単球を固定前にsCD26と共にインキュベートした場合に認められる
単球取り込み後のTT媒介T細胞増殖のsCD26-誘導増強に関するもう一つの説明は、MHCクラスII結合ペプチドのトリミングである可能性があり、それによってAgに対する細胞の反応性を変化させる可能性がある。そのような現象は、CD13アミノペプチダーゼN（Tanakaら、1994）について既に記述されている。CD13は、APC表面上のMHCクラスII結合ペプチドのトリミングによってAgプロセシングに関与する。CD26は、CD13と同様に、エクトペプチダーゼであることから、APCの表面上のMHCクラスII結合ペプチドのトリミングの作用を有する可能性がある。この問題を評価するために、本発明者らは、sCD26と共にインキュベートした前後でTT-パルスした単球を固定して、その後T細胞活性化に及ぼすsCD26の増強作用を認めるか否かを調べた。図12Aおよび図12Bに示されるように、T細胞増殖の増強は、固定前に単球をsCD26/DPPIV+と共にインキュベートした場合に限って認められた。対照的に、固定後のsCD26と共にインキュベートした単球は、AgペプチドがMHC分子に結合した後に起こる免疫応答を変化させなかった。したがって、これらの結果は、sCD26によるTT誘導T細胞増殖の増強は、APCの表面上でのMHCクラスII結合ペプチドのトリミングに起因しないことを示唆した。むしろ、sCD26の単球へのインターナリゼーションは、単球とT細胞の相互作用に影響を及ぼす可能性がある。
【０３１６】
共刺激分子CD86の発現は、sCD26に暴露後の単球において増加する
本発明者らは次に、T細胞／単球相互作用において役割を果たすことが既に記述されている単球上のいくつかの表面分子の発現を分析した（Lenschowら、1996；Yokochiら、1982；Azumaら、1993；Freemanら、1993；McAdamら、1998；Chambers、2001；Hathcockら、1994；Yi-Qunら、1996；Hakamada-Taguchiら、1998；Manickasinghamら、1998）。この目的に関して、新たに単離した単球をTTの存在下または非存在下でsCD26と共にインキュベートして、単球上のCD80、CD86、およびHLA-DRの発現をフローサイトメトリー分析を用いて調べた。表9および図13に示されるように、単球上のCD86分子の発現は、TTおよびsCD26刺激後最初の48時間以内に増加した。しかし、CD86発現の増加は、sCD26インキュベーションの48時間後にはもはや認められなかった。対照的に、CD80およびHLA-DRの発現は、TTおよびsCD26の刺激によって影響を受けなかった（表8）。したがって、これらの結果は、単球をTTおよびsCD26によってパルスした場合に、単球へのsCD26の取り込みによって、CD86発現の増加が起こることを示した。さらに、これらの知見は、sCD26処置単球上のCD86発現の増強は、リコール抗原に対する免疫応答の初期段階においてTT誘導T細胞増殖を誘発するように関与することを示唆した。sCD26/DPPIV＋変異体のみがTT誘導T細胞増殖を増強して、sCD26/DPPIV-変異体は増強しなかったことを示すデータと一致して、sCD26/DPPIV-変異体は、単球上のCD86発現に影響を及ぼさなかったことに注目しなければならない（Tanakaら、1993；Manickasinghamら、1998）。
【０３１７】
TTおよびsCD26によって誘発される単球上のCD86の発現の増強は、mRNAの合成の増加に依存する
TTの存在下でsCD26と共に単球をインキュベートした後のCD86発現の増強が、タンパク質合成の増加に依存するか否かを決定するために、CD86をコードするmRNAレベルをRT-PCRによって定量した。新たに単離した単球を、標準培地単独において24時間インキュベートした後、TTの存在下または非存在下で16時間インキュベートして、その後sCD26（0.5μg/ml）を培養ウェルに加えた。sCD26と共に24時間インキュベートした後、材料および方法に記述したとおりに、細胞をRNA単離に関して処理した。単球をTTおよびsCD26/DPPIV+と共にインキュベートした場合に認められる表面CD86発現の増加も同様に、mRNAレベルの増加に関連し、タンパク質合成の増加は、CD86表面発現の増加に関して一つの可能性があるメカニズムであることを示唆している。重要なことは、TTおよびsCD26/DPPIV-と共にインキュベートした単球は、CD86 mRNAレベルの増強を示さず、この場合もこの相互作用におけるDPPIV活性の重要性を示しているという事実である。
【０３１８】
TTおよびsCD26によって誘発された単球によるT細胞増殖に及ぼすmAbおよびCTLA-4 Igの阻害作用
TT処置単球によって誘発されるT細胞増殖に及ぼす様々な表面分子の役割をさらに定義するために、単球をTTおよび／またはsCD26によってまず処置して、次に、CD80、CD86、HLA-DR、またはCTLA-4 Igに対するmAbと共に最終濃度5μg/mlで4℃で15分間インキュベートしてから培養を開始した。細胞を完全な培養期間のあいだ37℃でインキュベートした。図14Aに示すように、HLA-DRに対するmAbは、T細胞増殖を効率よく阻害したが、sCD26は、HLA-DR-媒介経路において作用を有しなかった。同様に、sCD26の存在下または非存在下において、抗CD80による単球の処置後では、TT誘導T細胞増殖において作用を認めなかった。対照的に、図14Aの下のパネルに示すように、T細胞の増殖がCD86分子およびCTLA-4 Igに対するmAbの存在によって阻害されるが、この阻害は、TT/sCD26（sCD26/DPPIV+）処置単球による培養ではより有意に強かった。抗CD86 AbおよびCTLA-4 Igのブロッキング作用は、ELISAによって液相において調べたところ、sCD26のDPPIV活性の阻害を通して発揮されなかった。上記の共刺激作用がCD86の誘導によって認められたか否かを確認するために、CD86 mAbおよびCTLA-4 Igを異なる濃度でTTおよび／またはsCD26刺激培養物に加えた。図14Bに示されるように、sCD26/DPPIV+によって増強されたTT媒介T細胞増殖は、CD86 mAbおよびCTLA-4 Igによって用量依存的に強く阻害された。CTLA-4 Igは、CD86 mAbよりTT媒介T細胞増殖に対して常により大きい阻害作用を発揮したことに注目しなければならない。図13において既に認めたように、TT/sCD26（DPPIV+）単球は、TTの存在下または非存在下でsCD26/DPPIV-分子と共にインキュベートした単球より高レベルのCD86を発現した。これらのデータは、TTおよびsCD26（DPPIV+）によって処置した単球上のCD86の表面発現の増加が、TT誘導T細胞増殖に及ぼすsCD26の増強作用にとって必須であることを強く示唆した。
【０３１９】
免疫系の増強におけるCD26の役割
本実施例は、CD26が、抗原提示細胞の活性化によってT細胞増殖に対して増強作用を有することを証明する。
【０３２０】
単球上での共刺激分子CD86の表面発現の増加は、sCD26の取り込み後に示された。CD26のこの免疫増強作用は、TT抗原の存在下でCD26による処置の最初の48時間以内に認められた。リコールAgに対するT細胞増殖反応のプロセスにおいて、APC、Th細胞、および選択されたサイトカインを含むいくつかの重要な因子が生体反応の維持に関与していることが示されている（Lenschowら、1996；Yokochiら、1982；Azumaら、1993；Freemanら、1993；McAdamら、1998；Chambers、2001；Hathcockら、1994；Yi-Qunら、1996；Hakamada-Taguchiら、1998；Manickasinghamら、1998）。最初に、APC-T細胞相互作用は、T細胞反応を誘発するために重要な役割を果たし、それによって最終的にT細胞生体プログラムの発現が起こる（Lenschowら、1996；McAdamら、1998；Chambers、2001）。本発明者らは、TT誘導T細胞増殖に及ぼすsCD26の増強作用が、免疫応答の初期段階において起こることを示す。その上、外から加えたsCD26によって影響を受けた細胞は、CD14陽性単球である。
【０３２１】
CD28は、T細胞上で構成的に発現され、B7分子CD80およびCD86と相互作用する（Cauxら、1994；Hathcockら、1994）。この相互作用によって、T細胞増殖、IL-2産生およびアポトーシスに対する抵抗性の増加が起こる（McAdamら、1998）。CD80およびCD86は、Igスーパーファミリーに属するタイプ1膜糖タンパク質である（Azumaら、1993；Freemanら、1993）。ヒトにおいて、その発現パターンは、APCの特性に従って異なる。CD86発現は、単球および樹状細胞において構成的であり、活性化後にアップレギュレートされる（Lenschowら、1996；McAdamら、1998）。対照的に、CD80は、APCにおいて低レベルで発現され、活性化後アップレギュレートされる（McAdamら、1998；Chambers、2001）。
【０３２２】
CD86は、非刺激T細胞のプライミングおよびメモリーT細胞の活性化において重要な役割を有する（Lenschowら、1996；McAdamら、1998；Saito、1998；Engelら、1994；Vyth-Dreeseら、1995；Yokozekiら、1996）。非刺激T細胞の活性化は、APCによって提供される強い刺激シグナルを必要とし（LiuおよびJaneway、1992）、最近活性化されたメモリーT細胞の活性化は、抗CD3 mAb単独によって誘発することができ（Van de Veldeら、1993）、ほとんどのメモリーT細胞はその活性化のためになおもCD28誘発に依存している（Yi-qunら、1996）。APCとT細胞との安定な相互作用は、TCRおよびそのリガンドに対する絶対的な親和性および特異性に依存するのみならず、相互作用部位での接触に利用できる分子の相対密度に依存する（Prakkenら、2000；Grakouiら、1999）。従って、免疫細胞集団におけるsCD26の取り込みまたはCD26の発現後に、単球上でのCD86のアップレギュレーションが起こるが、CD80のアップレギュレーションは起こらないという本発明の知見は、CD26が抗原提示細胞を活性化することを証明する。
【０３２３】
CD26/DPPIVは、特にT細胞において膜結合型によってその作用を発揮する可能性がある。同様に、CD26/DPPIVは、ヒト血清に実際に存在するという事実を考慮すると（Tanakaら、1994）、可溶性型でもその作用を発揮する可能性がある。したがって、非可溶性型のみならず双方のsCD26が重要である。
【０３２４】
サイトカインは、免疫反応の後期段階の維持において重要である（Lenschowら、1996；McAdamら、1998；Yi-Qunら、1996）。Ag提示の初期段階において、Ag提示能は、Ag捕獲およびローディングの効率、MHC分子密度および占有率、または変化した共刺激分子発現（Prakkenら、2000；Grakouiら、1999）を含むいくつかの非独占的メカニズムによって調節することができる。本実施例は、sCD26が単球によって取り込まれ、CD86発現のアップレギュレーションを通して単球のAg提示機能を変化させることによって、T細胞増殖に及ぼすその増強作用を発揮することを証明する。抗原提示細胞は、Tヘルパー細胞と共にCTLおよびB細胞の双方を活性化することから、CD26は、APCを通して免疫応答を増強するために重要なエフェクターであり、すばらしい治療的用途を有する。
【０３２５】
（表９）sCD26/DPPIV+と共にインキュベート後の単球上のCD86発現の増加a
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a 新たに単離した単球（0.5×106個/ウェル）を、24時間インキュベートした後、TTの存在下または非存在下で16時間インキュベートした後、sCD26（0.5μg/ml）を培養ウェルに加えた。異なる期間でインキュベートした後（0.6、24、48、72および96時間）、細胞を氷冷PBSにおいて洗浄して、FITC結合CD86、CD80、またはHLA-DRと共に氷中で30分間インキュベートした。PBSによって洗浄した後、細胞をFACSCaliburによって分析した。試験は、独立して行った三つの試験から計算した平均値±SEを表す。％、非sCD26処置単球のFITC強度と比較したFITC強度の％増加。
【０３２６】
実施例6
臨床試験
本章は、化学療法剤／放射線療法剤および選択的に他の抗癌治療剤と併用してCD26組成物を用いる抗癌療法のヒト治療プロトコールの開発に関する。他の癌関連治療を本明細書に記述するが、本実施例はまた、CD26がAPCによるT細胞への抗原の提示を増強して、それによって活性化T細胞の増殖を引き起こすことから、感染症、免疫抑制状態、癌等の際の免疫応答の増強のような、免疫疾患の治療に応用することができる。
【０３２７】
患者の治療およびモニタリングを含む臨床試験を行う様々な要素は、本開示に照らして当業者に既知であろう。以下の情報は、本明細書に記述のCD26に基づく治療のみまたは臨床試験における癌治療において一般的に用いられる他の補助治療と併用して確立するために用いられる一般的ガイドラインとして示される。
【０３２８】
フェーズ1臨床試験の候補物質は、全ての通常の治療が失敗した患者であろう。患者約100人を、最初に治療するであろう。その年齢は、16〜90歳（中央値65歳）の範囲であろう。年齢、人種、または民族群に対する偏りがなく、患者を治療され、試料を得る。この患者集団の約41％は女性であり、6％が黒人、13％がヒスパニック、および3％が他のマイノリティであろう。これらの推定値は、最近5年間のMDアンダーソン癌センターにおいて認められる一連の症例に基づく。
【０３２９】
選択的に、患者は、適切な骨髄機能（末梢の顆粒球の絶対数＞1,000個/mm3および血小板数100,000個/mm3（骨髄における腫瘍の関与により減少している場合を除く））、適切な肝機能（ビリルビン≦1.5 mg/dl、SGOT/SGPT＜4×正常値の上限）および適切な腎機能（クレアチニン≦1.5 mg/dl）を示すであろう。
【０３３０】
研究試料は、既存の承認されたプロジェクトおよびプロトコールの下で末梢血または骨髄から得られるであろう。研究材料のいくつかは、患者の治療の一部として採取した標本から得られるであろう。
【０３３１】
上記の化学療法剤／放射線療法剤と併用したCD26組成物および製剤は、暫定的に毎週、局所的または全身的に患者に投与されるであろう。典型的な治療経過は、7〜21日のあいだに約6回の投与を含んでもよい。臨床医による選択に基づいて、療法は、3週間毎に6回投与またはそれより少ないあいだ（毎月、2ヶ月に1回、四半期毎等）継続してもよい。当然、これらは治療の例としての回数に過ぎず、当業者は、多くの他の時間経過が可能であることを容易に認識するであろう。
【０３３２】
投与様式は、腫瘍内注射、および／または腫瘍血管への注射、気管内、髄腔内、内視鏡、皮下、および／または経皮を含む局所投与であってもよい。投与様式は、静脈内、動脈内、腹腔内、および／または経口投与を含む全身投与であってもよい。
【０３３３】
CD26組成物は、0.001μg/ml〜1 g/mlの範囲の最終用量が輸送されるように投与してもよいが、正確な有効用量はその後の試験に依存するであろう。いくつかの態様において、CD26組成物をリポソーム製剤として、またはおそらく他の人工担体によって投与する。例えば、CD26のリポソーム製剤を、0.001μg/ml〜1 mg/mlの範囲で静脈内投与または記述の他の経路によって投与する。CD26組成物はまた、CD26組成物を腫瘍細胞にターゲティングするターゲティング物質と共に投与してもよい。そのようなターゲティング法は、当技術分野で周知であり、下記に記述する。
【０３３４】
当然、当業者は、これらの用量範囲が有用なガイドラインを提供するが、疾患、性別、動作状況、年齢および他の全身健康状態において要因を決定する個々の患者の必要に応じて、患者に投与される際に、訓練を受けた医師によって用量の適当な調節がなされるであろうと理解するであろう。同じことが投与手段、投与経路についても当てはまる。
【０３３５】
疾患の過程をモニターして、癌の細胞障害を評価するために、患者を毎月適当な試験に関して調べるべきである。薬物の有効性を評価するために、医師は、癌／腫瘍のタイプに応じてモニターすべきパラメータを決定し、これは、例えばコンピューター断層撮影（CT）スキャン、PETスキャン、ガリウムスキャン、前立腺癌におけるPSA（前立腺特異抗原）、生殖腫瘍におけるHCG、結腸癌におけるCEA、卵巣癌におけるCA125、リンパ腫におけるLDHおよびB2ミクログロブリン等のような、細胞表面および血清中の腫瘍抗原の有無の検出によって、腫瘍塊の減少をモニターする方法を含むであろう。患者の進行および治療の有効性をモニターするために用いられる試験には、以下が含まれる：聴打診、X線、血液検査、骨髄検査、および他の臨床化学血液検査。フェーズ1試験において投与される用量は、標準的なフェーズ1臨床試験において行われる際に増加するであろう、すなわち、用量は、最大認容範囲に達するまで増加されるであろう。
【０３３６】
臨床反応は、許容される手段によって定義してもよい。例えば、完全な反応は、癌細胞の完全な消失によって定義してもよく、部分的反応は、癌細胞または腫瘍塊の50％減少によって定義してもよい。
【０３３７】
典型的な治療経過は、個々の患者および当業者に既知の方法で治療される疾患に応じて変化するであろう。例えば、結腸癌患者は4週間のサイクルで治療してもよい。治療期間は同様に変更してもよいが、患者に副作用を認めなければおそらくより長い期間を用いてもよく、患者が反応しない、または耐え難い毒性を示す場合には、より短い治療期間であってもよい。
【０３３８】
本明細書に開示および請求される組成物および／または方法は全て、本開示に照らして不当な実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物は、好ましい態様に関して記述してきたが、本明細書に記述の組成物および／または方法、および方法の段階または一連の段階に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは当業者に明らかであろう。より詳しく述べると、化学的および生理的双方に関連する特定の物質を、本明細書に記述の物質の代わりに用いてもよく、それでも同じまたは類似の結果が得られるであろうことは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換および改変は全て、添付の請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲および概念に含まれると考えられる。
【０３３９】
参考文献
以下の参考文献は、それらが例としての技法の詳細または本明細書に記載の内容を補足する他の詳細を提供する程度に、参照として特に本明細書に組み入れられる。
米国特許第4,554,101号
米国特許第4,682,195号
米国特許第4,683,202号
米国特許第5,252,479号
米国特許第5,639,793号
米国特許第5,747,520号
米国特許第6,156,791号
米国特許第6,207,673号
米国特許第6,300,090号
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【図面の簡単な説明】
【０３４０】
（図１）ドキソルビシン媒介増殖阻害に及ぼすCD26/DPPIVの影響。CD26 Jurkatトランスフェクタントを、培養培地のみまたは表記の濃度のドキソルビシンを含む培養培地において37℃でインキュベートして、「実施例」において記述される通りにMTT取り込みアッセイを行った。wtCD26、野生型CD26 Jurkatトランスフェクタント；S630A、CD26陽性／DPPIV陰性変異体CD26 Jurkatトランスフェクタント；対照、非トランスフェクトJurkat；340-4、CD26陽性／DPPIV陽性変異体CD26 Jurkatトランスフェクタント；neo、プラスミドのみのJurkatトランスフェクタント。データは3つの別個の実験の平均値を表す。細胞障害指数は以下のように計算した：
2006510615.tif 000033
（図２）G2-Mでのドキソルビシン媒介細胞周期停止に及ぼすCD26/DPPIV発現の影響。CD26 Jurkatトランスフェクタントを、ドキソルビシンを含む培地において37℃で24時間インキュベートした。細胞を回収して、「実施例」に記述されるとおりに細胞周期分析を行った。データは3つの別個の実験の代表的なものである。数値データを表5に示す。
（図３）Jurkat細胞のドキソルビシン媒介増殖阻害に及ぼす外因性のsDPPIVの影響。Jurkat細胞を培養培地のみ、表記の濃度のドキソルビシンのみを含む培養培地、sDPPIV（50μg/ml）のみを含む培養培地、および表記の濃度のドキソルビシンとsDPPIV（50μg/ml）を含む培養培地において37℃でインキュベートした。MTTアッセイを行った。データは、3つの別個の実験の平均値を表す。（図3A）、対照；（図3B）、wtCD26；（図3C）、S630A。細胞障害指数は以下のように計算した：
2006510615.tif 000034
（図４）Bリンパ様細胞株のドキソルビシン媒介増殖阻害に及ぼす外因性sDPPIVの影響。細胞を培養培地のみ、表記の濃度のドキソルビシン単独を含む培養培地、sDPPIV（50μg/ml）単独を含む培養培地、および表記の濃度のドキソルビシンとsDPPIV（50μg/ml）とを含む培養培地において37℃でインキュベートした。MTTアッセイを行った。データは、3つの別個の実験の平均値を表す。（図4A）Jiyoye；（図4B）Namalwa。細胞障害指数は以下のように計算した：
2006510615.tif 000035
（図５）エトポシド媒介増殖阻害に及ぼすCD26/DPPIV発現の影響。CD26 Jurkatトランスフェクタントおよび親細胞を、培養培地単独、または表記の濃度のエトポシドを含む培養培地において37℃でインキュベートして、MTT取り込みアッセイを行った。wtCD26、野生型CD26 Jurkatトランスフェクタント；S630A、CD26陽性／DPPIV陰性変異体CD26 Jurkatトランスフェクタント。データは3つの別個の実験の平均値を表す。細胞障害指数は以下のように計算した：
2006510615.tif 000036
（図６）Jurkatトランスフェクタントに及ぼすCD26発現およびDPPIV酵素活性。Jurkat細胞を、「実施例」に記述されるフローサイトメトリーによってCD26発現に関して評価した。パネル1：親Jurkat、パネル2：S630Aトランスフェクタント、パネル3：wtCD26トランスフェクタント、a：陰性対照、b：抗CD26抗体。
（図７）無血清培地におけるエトポシドおよびドキソルビシンに対するwtCD26の感受性の増強。AIM V無血清培地によって37℃で24時間前処置した後、wtCD26および親Jurkat細胞をエトポシド（図7A）またはドキソルビシン（図7B）を含む無血清培地において37℃で48時間インキュベートして、MTT取り込みアッセイを行った。データは3つの別個の実験の平均値を表す。細胞障害指数は以下のように計算した：
2006510615.tif 000037
（図８）sCD26によるPBMCに対する増殖作用。PBMC（1×105個）を、TTまたはsCD26の存在下または非存在下で培養培地においてインキュベートした。新たに単離したPBMCを標準的な培養培地において24時間培養した後、TT（0.5μg/ml）を培地に加えてさらに16時間インキュベートした。次に、sCD26（0.5μg/ml）をウェルに加えて、示すように様々な期間インキュベートした。細胞の増殖は、全ての場合において、最初のsCD26を加えた後培養7日目に、[3H]TdR取り込みを測定することによってモニターした。増殖の程度は、縦軸のcpmとして表記する。実験は、独立して行った3回の実験から計算した平均値±SEを表す。
（図９）sCD26を取り込むPBMC集団。新たに単離したPBMC（1×106個/ウェル）を、標準的な培地のみで24時間インキュベートした後、TTの存在下または非存在下で16時間インキュベートして、その後培養ウェルにsCD26-OGを加えた。sCD26-OGと共に24時間インキュベートした後、細胞をPBSおよび酸性緩衝液（pH 3のPBS）において洗浄して、細胞表面上の如何なるsCD26-OGも除去した。次に、細胞を様々なPE結合Abと共にインキュベートして、フローヒストグラムを得るためにsCD26-OGの強度を測定した。分析はFACSCaliburによって行った。類似の実験を、DPPIV活性を欠損する変異体sCD26についても実施した。
（図１０）sCD26の標的細胞を決定するための再構成試験。（図10A）。新たに単離した単球（0.5×106個/ウェル）を0.5μg/ml TTおよび異なる濃度のsCD26と共に24時間プレインキュベートして、PBSによって洗浄後、プレインキュベートした単球1.0×104個/ウェルを、精製T細胞1×105個/ウェルと共にアッセイに供した。（図10B）全体で精製T細胞1×105個/ウェルを0.5μg/ml TTおよび異なる濃度のsCD26と共に24時間プレインキュベートした。次に、細胞をPBSによって洗浄してアッセイを行った。細胞の増殖は、全ての場合において培養7日目での[3H]TdR取り込みを測定することによってモニターした。増殖の程度は、縦軸でのcpmとして表記する。実験は、独立して実施した3回の実験から計算した平均値±SEを表す。
（図１１）M6P/IGF-IIRはsCD26を単球に組み入れるために役割を有する。新たに単離した単球（0.5×106個/ウェル）を、標準的な培養培地のみにおいて24時間インキュベートした後、TTの存在下（図11A）または非存在下（図11B）で16時間インキュベートし、次にsCD26を様々な濃度のM6P（0、0.1、1.0、および10.0μM/ウェル）の存在下で培養ウェルに加えた。24時間インキュベートした後、細胞を氷冷PBSおよび酸性PBSにおいて洗浄して、細胞表面上での如何なるsCD26-PGも除去した。分析はFACSCaliburによって行った。sCD26-OGの強度をフローヒストグラムにおいて示す。変異体sCD26/DPPIV-を用いて類似の実験を行った。本研究におけるデータは独立して行った3回の実験のうち1回を表す。横座標は、蛍光強度（log10尺度）を表し、縦座標は各細胞数を表す。
（図１２）sCD26によるTT誘導T細胞増殖の増強作用は、単球上のMHC結合ペプチドのトリミングが原因ではなかった。新たに単離した単球（0.5×106個/ウェル）を0.5μg/ml TTと共に16時間プレインキュベートした後、0.05％グルタルアルデヒドによって室温で30秒間処置する前（図12A）または処置した後（図12B）に、異なる用量のsCD26と共に24時間インキュベートした。PBSによって洗浄した後、プレインキュベートした単球1×104個/ウェルを精製T細胞1×105個/ウェルによるアッセイに供した。類似の実験を変異体sCD26/DPPIV-についても実施した。細胞の増殖は全ての場合について、培養7日目での[3H]TdRの取り込みを測定することによってモニターした。増殖の程度は縦座標のcpmとして表記する。実験は、独立して行った3回の実験から計算した平均値±SEを表す。
（図１３）sCD26/DPPIVは、単球上の共刺激分子CD86のアップレギュレーションを誘導する。新たに単離した単球（0.5×106個/ウェル）を、標準的な培地のみにおいて24時間インキュベートした後に、TTの存在下または非存在下で16時間インキュベートした後、sCD26（0.5μg/ml）を培養培地に加えた。sCD26と共に異なる時間インキュベートした後、細胞をPBSによって洗浄し、FITC結合CD80、CD86、またはHLA-DR  Abと共にインキュベートして、FACSCaliburによって分析を行った。この図に示すヒストグラムは、TT処置後のsCD26/PPIV+と共に24時間培養した単球上のCD86-FITCの強度の増加である。この図に示されるCD86発現の単一のヒストグラムプロフィールは、三つの代表的な実験の一つである。横座標は蛍光強度（log10尺度）を表し、縦座標は各細胞数を表す。
（図１４）TT/sCD26処置単球によって誘導されたT細胞増殖に及ぼすCD86 mAbおよびCTLA-4 Igの阻害作用。（図14A）、新たに単離された単球（0.5×106個/ウェル）を、標準的な培地のみと共に24時間インキュベートした後にTTの存在下または非存在下で16時間インキュベートした後、sCD26（0.5μg/ml）を培養ウェルに加えた（TT/sCD26の有無は右の枠内に示す）。sCD26の存在下または非存在下で24時間インキュベートした後、単球を表記のmAb（5μg/ml）またはCTLA-4 Ig（5μg/ml）と共に4℃で15分間インキュベートしてから培養を開始した。T細胞増殖の阻害は、平行して行ったmAbを添加しない場合の対照培養または対照ヒトIgの反応率の百分率として表記した。（図14B）、TT/sCD26処置単球によって誘発されたT-シア棒増殖反応に及ぼすCD86 mAbおよびヒトCTLA-4 Ig（0.1〜20μg/ml）の用量依存的な阻害作用。結果はアイソタイプマッチ陰性対照または対照マウスIgの存在下で得た平均値の百分率として表記した。T細胞の増殖は全ての場合について、培養7日目での[3H]TdR取り込みを測定することによってモニターした。バーは、独立して行った3回の実験の阻害または増殖の百分率の平均値±SEを表す。
（図１５）トポイソメラーゼII阻害剤によって誘発されたアポトーシスに及ぼすCD26/DPPIV表面発現の増強作用。CD26 Jurkatトランスフェクタントを37℃で、培養培地単独または表記の濃度のエトポシドを含む培養培地において14時間（図15A）もしくはドキソルビシンを含む培養培地において16時間（図15B）インキュベートした。細胞を回収してアネキシンV/PIアッセイを実施例3に記載する通りに実施した。wtCD26：野生型CD26 Jurkatトランスフェクタント；S630A：630位での推定の触媒セリン残基でアラニンを含む変異体CD26をトランスフェクトさせ、それによって変異体CD26陽性/DPPIV陰性Jurkatトランスフェクタントが得られたJurkat細胞；対照：非トランスフェクト親Jurkat；340-4：340〜343位のADA結合部位で、アミノ酸L340、V341、A342およびR343がアミノ酸P340、S341、E342、およびQ343に置換されている点突然変異を含み、それによってADAに結合することができない変異体CD26陽性/DPPIV陽性変異体CD26 Jurkatトランスフェクタントが得られる、変異体CD26をトランスフェクトしたJurkat細胞。データは3つの別個の実験を表す。
（図１６）トポイソメラーゼII阻害剤によって誘導されたPARP切断におけるCD26/DPPIV関連増強。CD26 Jurkatトランスフェクタントを、37℃で表記の濃度のエトポシドを含む培地と共に16時間、またはドキソルビシンを含む培地と共に18時間インキュベートした。細胞を回収した後、全細胞溶解物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、PARPおよびβアクチンのイムノブロット試験を実施例3に記述したとおりに実施した。PARPの切断産物は〜85kDaで検出された。それぞれのレーンにはタンパク質30μgをローディングした。
（図１７）エトポシド誘発アポトーシスに及ぼすCD26/DPPIV表面発現の影響に関する経時変化試験。Jurkat細胞を、表記の用量のエトポシド（3μM）を含む培地と共に37℃で表記の時間インキュベートした。細胞を回収した後、サイトゾル分画を実施例3に記述した通りに得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、PARP、カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、Apaf-1、Bcl-xl、およびβ-アクチンに対する特異的抗体によるイムノブロット試験を、実施例3に記述するとおりに実施した。（*）：カスパーゼ-3切断産物；（**）：Bcl-xl切断産物。それぞれのレーンにはタンパク質30μgをローディングした。
（図１８）wtCD26 Jurkatトランスフェクタントにおけるエトポシド誘発アポトーシスに及ぼすカスパーゼ-9阻害剤z-LEHD-fmkの影響。wtCD26 Jurkatトランスフェクタントを、様々な用量のz-LEHD-fmkと共に37℃で2時間プレインキュベートした後、3μMエトポシドを16時間処置した。細胞を回収した後、実施例3に記述した通りに全細胞溶解物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、PARP、カスパーゼ-3、カスパーゼ-9、およびβ-アクチンに関するイムノブロット試験を、実施例3に記述するとおりに実施した。（*）：カスパーゼ-3切断産物。それぞれのレーンにはタンパク質30μgをローディングした。
（図１９）トポイソメラーゼIIα発現に及ぼすDPPIV活性の阻害の影響。（図19A）、Jurkat細胞を培養培地において37℃で24時間インキュベートした後、細胞を回収して、核抽出物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、トポイソメラーゼIIα、またはβ-アクチンに関するイムノブロット試験を実施例3に記述の通りに実施した。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。レーン1：wtCD26 Jurkatトランスフェクタント、レーン2：S630A変異体トランスフェクタント、レーン3：親Jurkat。（図19B）、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントまたは親Jurkatを培養培地単独（DFP-）、100μM DFPを含む培養培地において2時間または6時間（DFP+）インキュベートした。それぞれの処置条件を反映する細胞の代表的な試料を得て、DPPIV酵素活性アッセイを実施例3に記述するとおりに実施した。（図19C）wtCD26 Jurkatトランスフェクタント（レーン1〜3）、または親Jurkat（レーン4〜6）を培養培地単独（レーン1、3）、100μM DFPを含む培養培地と共に2時間（レーン2、5）、または6時間（レーン3、6）インキュベートした。細胞を回収して、核抽出物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、トポイソメラーゼIIα、またはβ-アクチンに関するイムノブロット試験を材料および方法に記述の通りに実施した。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。（図19D）、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントを培養培地（バーI）もしくは100μM DFPを含む培養培地において4時間（バーII）インキュベートするか、またはそれらを100μM DFPを含む倍溶培地において4時間インキュベートしてから、PBSにおいて2回洗浄してDFPを確実に除去した後、培養培地において2時間（バーIII）または8時間（バーIV）インキュベートした。それぞれの処置条件を反映する細胞の代表的な試料を得て、DPPIV酵素活性アッセイを行った。（図19E）、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントを培養培地（レーン1）、もしくは100μM DFPを含む培養培地（レーン2）において4時間インキュベートするか、またはそれらを100μM DFPを含む倍溶培地において4時間培養してから、PBSにおいて2回洗浄してDFPを確実に除去した後、培養培地において2時間（レーン3）もしくは8時間（レーン4）インキュベートした。細胞を回収して、核抽出物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、トポイソメラーゼIIαまたはβ-アクチンに関するイムノブロット試験を実施した。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。
（図２０）トポイソメラーゼIIα発現に及ぼす可溶性CD26分子の影響。親Jurkat細胞を培養培地単独（-）または可溶性CD26（sCD26）分子（300μg/ml）（+）を含む培養培地において37℃で一晩インキュベートした。細胞を回収して、核抽出物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、トポイソメラーゼIIαまたはβ-アクチンに関するイムノブロット研究を実施した。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。
（図２１）ドキソルビシン誘導PARP切断のsCD26関連増強。親Jurkat細胞を培養培地単独（-）または可溶性CD26（sCD26）分子（300μg/ml）（+）を含む培養培地において37℃で一晩インキュベートした後、表記の濃度のドキソルビシンと共に16時間インキュベートした。細胞を回収して、全細胞溶解物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、PARPまたはβ-アクチンに関するイムノブロット試験を実施した。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。
（図２２）エトポシド処置によって誘導されたDR5発現に及ぼすCD26/DPPIVの影響。（図22A）、Jurkat細胞を表記の濃度のエトポシド（3μM）を含む培養培地において37℃で表記の期間インキュベートした。細胞を回収して、全細胞溶解物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、DR5およびβ-アクチンに関するイムノブロット試験を実施した。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。抗DR5 mAbは、58kDaおよび32kDaの二つのバンドを検出する。（図22B）、様々な用量のz-LEHD-fmkと共に37℃で2時間プレインキュベートした後、wtCD26 Jurkatトランスフェクタントを3μMエトポシドによって48時間処置した。次に、細胞を回収して、全細胞溶解物を得た。溶解物のSDS-PAGEを行った後、DR5、カスパーゼ-9、およびβ-アクチンに関するイムノブロット試験を行った。各レーンにはタンパク質30μgをローディングした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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