(57)【要約】本発明は分析される試料内のリガンド（２）の濃度を決定する方法に関する。坦体（３）上にはリガンド（２）と特異的結合ができるレセプタ（４）が固定される。少なくとも１つの面分布センサ（１２）により、レセプタ（４）を有する坦体（３）の表面の面分布のための少なくとも１つの測定値が検出される。その後、試料はレセプタ（４）と接触される。少なくとも１つの検出器（１１）により、リガンド（２）とレセプタ（４）との間の結合頻度を表す測定値が検出される。面分布及びリガンド−レセプタ−結合の頻度の測定値に基づき、試料内のリガンド（２）の濃度が決定される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド(2)と特異的結合ができるレセプタ(4)が少なくとも１つの坦体(3)上に固定され、試料がレセプタ(4)と接触され、リガンド(2)とレセプタ(4)との間の結合頻度を表す少なくとも１つの測定値が検出され、この測定値に基づき試料内のリガンド(2)の濃度が決定される、分析される試料内に含まれるリガンド(2)の濃度を決定する方法において、レセプタ(4)を有する坦体(3)の表面の面分布の測定値が検出され、リガンド(2)の濃度が、面分布及び結合頻度の測定値により決定されることを特徴とする、分析される試料内に含まれるリガンドの濃度を決定する方法。
【請求項２】
レセプタ(4)は、面分布の測定中はリガンド(2)と結合されず、レセプタ(4)を有する坦体(3)の表面の面分布が検出された後で、試料はレセプタ(4)と接触されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
面分布の測定値の決定のため、坦体(3)の表面上でレセプタ(4)の固定後、坦体(3)の表面で電気インピーダンスが測定され、その後、試料はレセプタ(4)と接触され、結合頻度のための少なくとも１つの測定値が決定されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
面分布の測定値の決定のため、坦体(3)の表面上でレセプタ(4)の固定後、坦体(3)の表面で電界強度が測定され、その後、試料はレセプタ（４）と接触され、結合頻度のための少なくとも１つの測定値が決定されることを特徴とする請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
リガンド(2)とレセプタとの接触の場合に特異的結合をするレセプタ(4)が表面で固定される坦体(3)と、リガンド−レセプタ結合の頻度を表す少なくとも１つの測定値を検出する少なくとも１つの検出器(11)とを備える、分析される試料内に含まれるリガンド(2)の濃度を決定する装置(1)において、装置(1)は、レセプタ(4)を有する坦体(3)の表面の面分布を測定する少なくとも１つの面分布センサ(12)を有し、面分布センサ(12)と検出器(11)は、試料内のリガンド(2)の濃度を決定するため評価装置(13)と連結されることを特徴とする、分析される試料内に含まれるリガンドの濃度を決定する装置。
【請求項６】
少なくとも１つの面分布センサ(12)はインピーダンスセンサであることを特徴とする請求項５記載の装置(1)。
【請求項７】
少なくとも１つの面分布センサ(12)は電界効果トランジスタであり、坦体(3)は、特に、内部で電界効果トランジスタと一体化される半導体基板を有することを特徴とする請求項５又は６記載の装置(1)。
【請求項８】
レセプタ(4)でのリガンド(2)の結合により、発光ビーム(14)の放射を励起するため、放射範囲内にレセプタ(4)が配置される少なくとも１つの光線源を有し、発光ビーム(14)の検出のための少なくとも１つの検出器(11)は、特に、坦体(3)の半導体基板に一体化されるビーム受信器として構成されることを特徴とする請求項５ないし７いずれか１項に記載の装置(1)。
【請求項９】
複数の検出器(11)は半導体基板内でマトリックス形状に一体化され、複数の面分布センサ(12)は、このマトリックスを介して分配して配置され、特に、検出器(11)の間で配置されることを特徴とする請求項５ないし８いずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドと特異的結合ができるレセプタが少なくとも１つの坦体上で固定され、試料がレセプタと接触され、リガンドとレセプタとの間の結合頻度を表す測定値が検出され、この測定値により、試料内のリガンドの濃度が決定される、分析される試料内に含まれるリガンドの濃度を決定する方法に関する。更に、本発明は、レセプタとリガンドとの接触の場合に特異的結合をするレセプタが表面で固定される坦体と、リガンド−レセプタ−結合の頻度を表す少なくとも１つの測定値を検出する検出器とを備える、分析される試料内に含まれるリガンドの濃度を決定する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種の方法及びこの種の装置は、Chris A.Rowe-Taitt他著、バイオセンサ＆バイオエレクロニクス15(2000)、第579−589頁から周知である。この装置は坦体としてＣＣＤ−センサを有し、そのセンサセル上で抗体が固定される。抗体は、試料内に含まれるリガンドとの接触の際に、それ自体がリガンドと結合するレセプタとして役立ち、それにより、リガンドはＣＣＤ−センサ上でリガンド−レセプタ錯体の形状で固定される。抗体はリガンドに特有のものであり、即ち、試料内に含まれる他のバイオ分子はレセプタとの接触に際して、レセプタと抗体は結合しないように選択される。バイオ分子は、核酸、その誘導体（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラズミド、染色体）、ペプチド、タンパク質（酵素、タンパク質、オリゴペプチド、細胞受容体タンパク質及びその錯体、ペプチドホルモン、抗体及びそのフラグメント）、炭水化物及びその誘導体、特に、グリコールタンパク質、グリコシド、脂肪、脂肪酸及び／又は脂質を含むことができる。試料がレセプタと接触し、リガンドがレセプタに結合された後、発光物質で標識を付された抗体を含む液体がＣＣＤ−センサに塗布される。抗体はリガンドに結合し、それによって、抗体は発光物質により標識を付される。別の手段では、レセプタに結合しない発光物質で標識を付された抗体をセンサ表面から除去するために、センサ表面は、そこに固定するレセプタ−リガンド−錯体により洗浄される。その後、発光物質は、発光ビームの放射励起のために光励起ビームで照射される。その際、放出される発光ビームはＣＣＤ−センサの光検出器により測定される。発光ビームは、リガンド−レセプタ−結合の頻度の測量、それで、試料内のリガンドの濃度の測量を示す。
【０００３】
試料内のリガンドについての濃度の量的な決定を可能にするため、この装置は校正されなければならない。実際に周知な校正方法では、このため、最初に複数の校正試料を有する希釈列が調製され、校正試料は異なる既知濃度内でリガンドを含む。これは、例えば、リガンドは計量され、続いて、周知な液体量と混合され、混合物から異なる希釈が調製されるようにして行われる。校正測定の実施のために、リガンドの濃度決定のための複数の校正試料に対応する最初に述べた装置が準備され、その際、これらの装置は、相互に同一であり、実際の濃度測定に使用される装置と一致することから始まる。この装置により校正試料は分析され、その際個々の校正試料のために、それぞれ発光ビームの強度の測定値が検出される。このようにして、各校正試料のために、それぞれの校正試料内のリガンドの既知濃度と、この濃度のために測定される発光ビームの強度とから成る対の値を得る。この対の値により校正曲線がプロットされ、校正曲線のための補間節点を形成する。
【０００４】
この校正は、複数の校正試料に対応する複数の装置が必要とされ、それらは、続いて分析される試料の測定には、もはや使用できないという欠点を有する。従って、この装置の校正は費用がかかり、高価となる。校正曲線には、補間節点のみの測定値があり、例えば、補挿により支持個所間の校正曲線の経過を見積もらなければならず、不十分である。しかしながら、結局、レセプタはまた不安定となり、これは、坦体上で固定するレセプタの濃度が時間により変化することとなり、問題となる。よって、この校正測定及び分析される試料での測定は、できる限り同時に行わなければ成らず、従って、余分な費用が生じる。
【０００５】
ドイツ国特許公開第19736641号公報から、最初に述べた種類の方法も周知であり、この方法では、最初にダミー測定が実施され、シラン化ガラス坦体上で固定されるレセプタは分析されることなく過酸化物分解酵素と接触される。ダミー測定では複数の結合現象のための測定値が決定される。過酸化物分解酵素トレーサはレセプタより大きい分子量を有するので、この測定値は、明らかに、坦体上で固定するレセプタの数より少ない。更に、全体の測定範囲を含む、異なる濃度校正溶液が調製される。この校正溶液により校正測定値が測定され、校正測定値から、ダミー測定の測定値により校正曲線がプロットされる。その後、装置は再生され、その再生において坦体上で固定するレセプタは酸性溶液と接触され、レセプタと過酸化物分解酵素トレーサとの間の結合を分解する。その後、レセプタは試料と接触し、リガンドとレセプタとの間の結合頻度の測定値が検出される。この測定値と校正曲線とにより、試料内のリガンドの濃度が決定される。この方法は、レセプタが酸性溶液と接触することにより損傷され、それにより測定誤差が生じるという欠点がある。更に、校正の場合、レセプタと過酸化物分解酵素トレーサとの間の結合が構成されるまで待機されねばならないので、この方法は比較的に時間がかかり、更に、装置は再生されねばならないので、不十分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それで、この課題は、簡単な仕方で分析される試料内に含まれるリガンドの濃度を決定できる最初に述べた種類の方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、方法に関して、レセプタを有する坦体の表面の面分布のための測定値が検出され、リガンドの濃度は面分布及び結合頻度の測定値により決定されることにより解決される。
【０００８】
この装置に関して、前記の課題は、装置がレセプタを有する坦体の表面における面分布のための少なくとも１つの面分布センサを有し、面分布センサ及び試料内のリガンドの濃度を決定する検出器が評価装置と連結されることにより解決される。
【０００９】
有利な仕方では、それにより、質量作用の法則の対応する使用において、試料内のリガンド濃度を次のような簡単な仕方で計算することができる。
【００１０】
【数１】
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【００１１】
ここで、Ｍはリガンドと坦体上で固定するレセプタとの間の結合頻度の測定値、又は換言すると、坦体上で固定するレセプタ−リガンド−錯体の濃度の測定値を意味する。Ｆはレセプタを有する坦体の表面における面分布の測定値を意味し、Ｋは例えば、実験により検出できる結合定数を意味する。その際、面分布により、坦体の表面ユニット当たり、坦体上で固定されるレセプタ数が理解される。レセプタを有する坦体の表面における面分布の測定値検出は、特に、分析される試料がレセプタと接触する直前に行われる。それで、不安定なレセプタの場合も、試料内のリガンドの濃度は、測定値の検出時点又はリガンドとレセプタとの間における結合頻度の測定値の検出時点に対し、それぞれ、実際に坦体上にある面分布に基づき、高い精度で決定できる。本発明による方法及び、本発明による装置は、つまり、費用がかかることなく、煩わしい調整をすることなく、希釈列の分析をすることなく試料内のリガンドの濃度を測定することができる。ダミー値測定と異なり、面分布の測定では、面当りの結合現象の数ではなく、面当りのレセプタ数が測定される。装置の感度のための測定量が検出される。面分布は、とりわけ、測定の原動力にとって重要である。面分布の増加、即ち、レセプタの密度の増加とともに、リガンドがレセプタに結合する確率は上昇することを示した。このことは、リガンドがレセプタの間近に達する時にだけ、結合現象が起こることと関連している。
【００１２】
この方法の適切な構成では、レセプタは面分布の測定中にリガンドと結合されず、レセプタを有する坦体の表面の面分布が検出された後、最初に試料がレセプタと接触される。それにより、面分布を高い精度で決定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の有利な実施例では、少なくとも１つの面分布センサはインピーダンスセンサである。坦体の表面上でのレセプタの固定後、最初に、面分布における測定値の決定のために、坦体の表面での電気インピーダンスが測定される。その後、試料はレセプタと接触され、結合頻度のための少なくとも１つの測定値が決定される。インピーダンスセンサは、特に、コンデンサとして構成でき、その電極間に電磁交番電界が印加される。その際、レセプタは誘導体として作用し、その存在はコンデンサの電気容量に影響する。コンデンサは共振回路の部分にでき、その共振周波数又は振動周波数は坦体における面分布の決定のため、適切な測定装置で検出される。
【００１４】
本発明の好適な実施例では、面分布センサは電界効果トランジスタであり、坦体は、特に、電界効果トランジスタと一体化される半導体基板を有する。つまり、坦体は半導体チップとして構成され、半導体チップ内には少なくとも１つの面分布センサと、必要な場合、リガンド−レセプタ結合体の頻度を表す測定値の検出のための少なくとも１つの検出器とが安価に一体化できる。坦体の表面上でレセプタの固定後、最初に、面分布の測定値を決定するために坦体の表面での電界強度が測定される。その後、試料はレセプタと接触され、結合頻度のための少なくとも１つの測定値が決定される。
【００１５】
本発明の好適な実施例では、レセプタでのリガンドの結合により発光ビームの放射を励起する装置は、少なくとも１つの光ビーム源を有し、その放射範囲内にレセプタが配置され、発光ビームを検出する少なくとも１つの検出器はビーム受信器として構成され、ビーム受信器は、特に、坦体の半導体基板内で一体化される。坦体の表面で固定するレセプタ−リガンド−錯体は、それから、抗体又は同様のバイオ分子を介して直接的又は間接的に発光物質で標識を付される。しかし、リガンド自体が発光ビームの放射のためにビーム源により励起されることも考えられる。最後に、しかし、レセプタとリガンドの非接触中及び／又は非接触後に、競争体がレセプタと接触し、競争体は発光物質により直接的又は間接的に標識を付され、発光ビームは少なくとも１つの検出器で測定されることにより、レセプタ−リガンド−錯体の濃度又は頻度を決定できる。
【００１６】
複数の検出器が半導体基板内でマトリックス形状に一体化され、複数の面分布センサがこのマトリックスを介して配置され、特に、検出器の間に配置されることが好適である。その際、特に、検出器と面分布センサを坦体の表面に交互に配置することができる。それから、この装置は試料内の濃度の場所分析測定を可能にする。
【００１７】
続いて、本発明の実施例を図面に基づいて詳細に説明する。部分的に強調して図式化により説明する。
【００１８】
分析される試料内に含まれるリガンド２の濃度を決定する全体として１で示される装置は、表面にレセプタ４として生物抗体が固定される坦体３を有し、レセプタは坦体上で単一位置を形成する。例えば、レセプタ４の固定はシラン化により達成できるか、坦体３の表面に配置され、上にレセプタを付着するポリイミド層により達成できる。レセプタ４は坦体３上又は坦体上にあるポリイミド層上にプリントできる。図１で分かるように、坦体３の表面には、レセプタ４を持つ複数の離間した測定点が形成される。
【００１９】
坦体３は貫流室の壁範囲により形成され、貫流室は入口６を備えた内部空洞５と、試料のための出口７とを有する。図１で分かるように、レセプタ４は、内部空洞５に向いて坦体３の内側に配置される。試料内のリガンド２の濃度を決定するため、試料は供給装置により、入口６を通り測定室の内部空洞５内にもたらされる。その際、リガンド２はレセプタ４と接触する。
【００２０】
リガンド２は、レセプタ４と接触する場合にレセプタと特異的結合をするエピトープを有する。その際、図２、図３において概略で示すように、リガンド２はレセプタ−リガンド−錯体の形状で坦体３の上で固定される。
【００２１】
発光物質９で標識を付された２次抗体８がリガンド２と接触する。２次抗体８はリガンド２のエピトープと結合し、それにより、レセプタ−リガンド−錯体は発光物質９で標識を付される。しかし、レセプタ−リガンド−錯体は、例えば、化学発光に基づき、それ自体で発光されることも考えられる。この場合、発光物質９によるレセプタ−リガンド−錯体の標識は、場合により、不要にできる。
【００２２】
別の手段では、坦体３はレセプタ４に結合しない試料成分の除去のために洗浄される。これは、例えば、入口６を通り噴射流体が内部空洞に取り入れられるようにして行うことができ、それにより、坦体上で固定する試料の成分は出口７を経て内部空洞５から洗い落とされる。
【００２３】
その後、更にレセプタ４に結合する発光物質８は、図面では詳細に示さない噴射源により、励起ビーム１０で照射される。励起ビーム１０のスペクトルは、少なくとも、発光物質９が発光ビーム１４の放射のために励起される励起波長を有する。
【００２４】
坦体３は検出器１１が一体化される半導体基板を有し、検出器は発光ビーム１４の測定のため、光ビーム受信器として構成され、例えば、ホトダイオードとして構成される。検出器８は複数の列と行でマトリックス状に配置される。検出器８により、そこで分析される測定値が検出され、測定値は坦体３の面当りレセプタ−リガンド−錯体の数量を示す。
【００２５】
レセプタ４を有する坦体３の表面の面分布を測定するため、坦体３の半導体基板内に面分布センサ１２が一体化される。面分布センサ１２は電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）として構成され、坦体３上に固定されるレセプタ４がゲートと電気的に接触するように、レセプタ４を検出するゲートは坦体３の表面又は表面に近い坦体３の層内に配置される。図１において、面分布センサ１２及び検出器８は互いに交互に並列して配置され、各々のためにレセプタ範囲で形成される測定点は、それぞれ、少なくとも１つの面分布センサ１２と少なくとも１つの検出器８が設けられていることが分かる。レセプタ４を有する坦体表面の面分布の測定は、特に、試料がレセプタ４と接触する直前に行われる。その際、この測定とレセプタ−リガンド−錯体の頻度又は濃度の決定との間の面分布は、発光ビーム１４の測定により変化しないか、わずかだけ変化することから由来する。面分布の測定は坦体表面当りのレセプタ４の割合を示す。
【００２６】
試料内におけるリガンド２の濃度決定のため、面分布センサ１２と検出器８は、図１の実施例では坦体３内で一体化される評価装置１３と連結される。評価装置１３により、リガンド２の濃度はレセプタ−リガンド−錯体の頻度を表す測定値Ｍと、レセプタ４を有する坦体３における表面の面分布のための測定値Ｆと、結合定数Ｋとから次のようにして決定される。
【００２７】
【数２】
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【００２８】
その際、更に、リガンド２の濃度は個々の測定点又は複数の測定点におけるグループのために別々に検出でき、全体として、場所で分析される１次元又は更に２次元の濃度測定が生じる。
【００２９】
評価装置１３は、上に配置された表示ユニット及び／又は評価ユニットとの連結のための図面では概略のみを示すインターフェイス装置を有し、例えば、マイクロコンピュータを有する。表示により、面分布、発光ビーム１４のための測定値及び／又はそれから計算されるリガンド２の濃度は、グラフで示すことができる。
【００３０】
分析される試料内に含まれるリガンド２の濃度を決定する方法において、つまり、リガンド２により特異的結合をすることができるレセプタ４が坦体３の上で固定される。少なくとも１つの面分布センサ１２により、坦体３の表面における面分布の少なくとも１つの測定値が検出できる。その後、試料はレセプタ４と接触される。少なくとも１つの検出器１１により、リガンド２とレセプタ４との間の結合頻度を表す少なくとも１つの測定値が検出される。面分布及びレセプタ−リガンド−錯体の頻度のための測定値に基づき、試料内のリガンド２の濃度が決定される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、分析される試料内に含まれるリガンドの濃度を決定する装置の断面を示し、装置は流動セルを有する。
【図２】図２は、流動セルの壁範囲の部分断面を示し、壁範囲は、壁範囲の表面にあるレセプタ−リガンド−錯体を検出する検出器と、レセプタによりカバーされる壁範囲の表面における測定のための面分布とを有する。
【図３】図３は、図２と類似し、レセプタ−リガンド−錯体発光物質で標識を付され、発光物質は発光ビームを放射するために励起ビームにより励起される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2006505772.tif 000011
2006505772.tif 000012
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