(57)【要約】支持構造に化学結合した、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を含む複合体が記載される。本複合体は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節およびさまざまな症状の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持構造に化学結合した、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を含む複合体。
【請求項２】
分子支持構造に化学結合した、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を含む複合体。
【請求項３】
支持構造が約５００ないし約１００，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１または請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
支持構造が約１０００ないし約５０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
支持構造が高分子材料を含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項６】
高分子材料がポリエチレングリコールまたはその残基を含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
高分子材料が分枝鎖ポリエチレングリコールポリマーまたはその残基を含む、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子がリンカー部分を介して支持構造に結合している、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項９】
リンカーが、酸、塩基、アルデヒド、エーテル、またはエステル反応基またはその残基を含む、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
リンカー部分がプロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、炭酸ベンゾトリアゾール、プロピオンアルデヒド、マレイミドまたは分枝マレイミド、ビオチン、ビニル誘導体、またはリン脂質である、請求項９に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を、化学的に架橋した形で含む複合体。
【請求項１２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも３個の調節因子を含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも４個の調節因子を含む、任意の請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも５個の調節因子を含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１０個の調節因子を含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも２０個の調節因子を含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも３０個の調節因子を含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することができる物質である、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、Ｎｏｔｃｈリガンドまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄタンパク質またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１８】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインの一部および免疫グロブリンＦｃ部分を含む融合タンパク質を含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、ＤＳＬまたはＥＧＦ様ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも２つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも３つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２３】
本質的に下記の成分；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）１〜５かつ５個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
から成るＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２４】
本質的に下記の成分；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜４かつ４個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
から成るＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２５】
本質的に下記の成分；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜３かつ３個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
から成るＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２６】
本質的に下記の成分；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
から成るＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２７】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）１〜５個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２８】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜４個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項２９】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項３０】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列
を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む、請求項１から２２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項３１】
ＤｅｌｔａＤＳＬまたはＥＧＦドメインを含む、請求項１から３０のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項３２】
ヒトＤｅｌｔａＤＳＬまたはＥＧＦドメインを含む、請求項１から３１のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項３３】
下記の配列に対してその全長にわたって、少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドを含む、請求項１から３２のうちいずれか１つに記載の複合体；
【化１】
2006513260.tif 000036
【請求項３４】
請求項３３の配列に対してその全長にわたって、少なくとも７０%のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドを含む、請求項３３に記載の複合体。
【請求項３５】
請求項３３の配列に対してその全長にわたって、少なくとも９０%のアミノ酸配列類似性を有するポリペプチドを含む、請求項３３に記載の複合体。
【請求項３６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子が抗体を含む、請求項１から３５のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項３７】
ＰＯＬ（−Ｒ）ｎ 
の式を有し、
式中、ＰＯＬは高分子支持構造であり；個々のＲはＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（それぞれが同一でありうるかまたは異なりうる）を表し；ｎは少なくとも２である整数である複合体。
【請求項３８】
ＰＯＬ（−Ｌ−Ｒ）ｎ
の式を有し、
式中、ＰＯＬは高分子支持構造であり；個々のＲは独立してＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（それぞれが同一でありうるかまたは異なりうる）を表し；個々のＬは、独立に、任意のリンカー部分または残基（そのそれぞれは同一でありうるかまたは異なりうる）または結合を表し；ｎは少なくとも２である整数である複合体。
【請求項３９】
ｎが少なくとも５である、請求項３７または３８に記載の複合体。
【請求項４０】
ｎが少なくとも２０である、請求項３９に記載の複合体。
【請求項４１】
ＰＯＬが水溶性ポリマーである、請求項３７から４０のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項４２】
ＰＯＬが任意に誘導体化または活性化された多糖ポリマーである、請求項３７から４１のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項４３】
ＰＯＬが任意に誘導体化または活性化されたデキストランポリマーである、請求項４２に記載の複合体。
【請求項４４】
ＰＯＬが任意に誘導体化または活性化されたＰＥＧポリマーである、請求項３７から４２のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項４５】
個々のＬが、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１から８個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含む、同一のまたは異なるタンパク質またはポリペプチドである、請求項３７から４４のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項４６】
薬物としての使用のための、前記請求項のうちいずれか１つに記載の複合体。
【請求項４７】
免疫反応の調節のための薬物の製造における、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項４８】
免疫反応のダウンレギュレーションのための薬物の製造における、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項４９】
請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を投与することによる、哺乳類において免疫反応を調節する方法。
【請求項５０】
請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を投与することによる、哺乳類において免疫反応をダウンレギュレートする方法。
【請求項５１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を高分子支持構造と結合することによる、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を調製する方法。
【請求項５２】
ｉ）高分子支持構造を提供すること；および
ｉｉ）高分子支持構造を複数のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子と反応させること
：による、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を調製する方法。
【請求項５３】
ｉ）高分子支持構造を提供すること；
ｉｉ）高分子支持構造を活性化すること；および
ｉｉｉ）活性化された高分子支持構造を複数のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子と反応させること
：による、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を調製する方法。
【請求項５４】
ｉ） 請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体； および
ｉｉ）抗原もしくは抗原決定基または抗原もしくは抗原決定基をコードするポリヌクレオチド；
を含む、免疫系の調節のための同時、同時期、別々、または連続使用のための組み合わせ調製品としての産物。
【請求項５５】
抗原または抗原決定基が自己抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、自己抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の産物。
【請求項５６】
抗原または抗原決定基が、アレルゲンもしくはその抗原決定基であるかまたは、アレルゲンもしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の産物。
【請求項５７】
抗原または抗原決定基は、移植抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、移植抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の産物。
【請求項５８】
抗原または抗原決定基が、腫瘍抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、腫瘍抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の産物。
【請求項５９】
抗原または抗原決定基が、病原体抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、病原体抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドである、請求項５４に記載の産物。
【請求項６０】
ｉ）請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体； および
ｉｉ）病原体抗原もしくはその抗原決定基、または病原体抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
：を含む病原体ワクチン組成物。
【請求項６１】
ｉ）請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体； および
ｉｉ）がん抗原もしくはその抗原決定基、またはがん抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
：を含むがんワクチン組成物。
【請求項６２】
ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現の調節のための薬物の製造のための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。 
【請求項６３】
ＩＬ−１０発現増加のための薬物の製造のための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を含む構造の使用。
【請求項６４】
ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現減少のための薬物の製造のための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項６５】
ＩＬ−１０発現増加およびＩＬ−５発現減少を伴う免疫調節因子サイトカインプロファイルを生じるための薬物の製造のための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項６６】
ＩＬ−１０発現増加および、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−α発現減少を伴う免疫調節因子サイトカインプロファイルを生じるための薬物の製造のための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項６７】
請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項６８】
医薬品として許容されるキャリヤーを含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
治療において細胞分化を改変するための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項７０】
治療において細胞分化を阻害するための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項７１】
治療において細胞分化を促進するための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【請求項７２】
がんの治療のための、請求項１から４５のうちいずれか１つに記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第９８／２０１４２号パンフレット(特許文献１)は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の操作を、免疫療法にならびにＴ細胞媒介性疾患の予防および／または治療に用いる方法を記載する。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、腫瘍によって誘導されたＴ細胞系の異常、および感染症を標的とすることができる。
【０００３】
また、抗原特異的寛容を他のＴ細胞へ伝達することができる調節Ｔ細胞の一種を生じることが可能であることも示されており、伝染性寛容と呼ばれる過程である（特許文献１）。これらの細胞の機能活性は、それらの細胞表面上の、または抗原提示細胞の表面上の、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質の過剰発現によって模倣することができる。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の説明およびそれによって影響される条件は、たとえば、下記の我々の公開されたＰＣＴ出願に見出すことができる；
ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８(特許文献２)（出願日１９９７年１１月６日；出願日１９９６年１１月７日の英国特許第９６２３２３６．８号(特許文献３)、出願日１９９７年７月２４日の英国特許第９７１５６７４．９号(特許文献４)、および出願日１９９７年９月１１日の英国特許第９７１９３５０．２号(特許文献５)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３(特許文献６)（出願日１９９９年１２月１５日；出願日１９９９年１２月１５日の英国特許第９８２７６０４．１号明細書(特許文献７)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１(特許文献８)（出願日２０００年１１月１７日；出願日１９９９年１１月１８日の英国特許第９９２７３２８．６号明細書(特許文献９)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３５０３(特許文献１０)（出願日２００１年８月３日；出願日２０００年８月４日の英国特許第００１９２４２．７号明細書(特許文献１１)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２４３８(特許文献１２)（出願日２００２年５月２４日、；出願日２００１年５月２５日の英国特許第０１１２８１８．０号明細書(特許文献１３)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３８１(特許文献１４)（出願日２００２年７月２５日；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５５．１号明細書(特許文献１５)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３９７(特許文献１６)（出願日２００２年７月２５日；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５３．６号明細書(特許文献１７)、出願日２００２年４月５日の英国特許第０２０７９３０．９号明細書(特許文献１８)、出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８２．８号明細書(特許文献１９)および出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８３．６号明細書(特許文献２０)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６(特許文献２１)（出願日２００２年７月２５日；出願日２００１年７月２５日の英国特許第０１１８１５３．６号明細書(特許文献２２)、出願日２００２年４月５日の英国特許第０２０７９３０．９号明細書(特許文献２３)、出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８２．８号明細書(特許文献２４)および出願日２００２年５月２８日の英国特許第０２１２２８３．６号明細書(特許文献２５)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４３９０(特許文献２６)（出願日２００２年９月２７日；出願日２００１年９月２８日の英国特許第０１２３３７９．０号明細書(特許文献２７)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３７(特許文献２８)（出願日２００２年１１月１３日；出願日２００１年１１月１４日の英国特許第０１２７２６７．３号明細書(特許文献２９)、出願日２００２年７月２５日のＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６号パンフレット(特許文献３０)、出願日２００２年９月７日の英国特許第０２２０８４９．４号明細書(特許文献３１)、出願日２００２年９月１０日の英国特許第０２２０９１３．８号明細書(特許文献３２)および出願日２００２年９月２７日のＰＣＴ／ＧＢ０２／００４３９０号(特許文献３３)の優先権を主張）；
ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３３(特許文献３４)（出願日２００２年１１月１３日；出願日２００１年１１月１４日の英国特許第０１２７２７１．５号明細書(特許文献３５)および出願日２００２年９月１０日の英国特許第０２２０９１３．８号明細書(特許文献３６)の優先権を主張）。
【０００５】
特許文献２、特許文献６、特許文献８、特許文献１０、特許文献１２、特許文献１４、特許文献１６、特許文献２１、特許文献２６、特許文献２８、および特許文献３４のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【０００６】
非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４もまた参照される；そのそれぞれもまた参照により本開示に含まれる。
【０００７】
本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を調節するための、および、特に、（しかし限定せず）免疫反応を調節するためのさらなる手段および方法を提供することを目指す。本発明はまた、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を調節する（および、特に、活性化する）ための、より高い生物学的または治療的効果を有する物質を提供することも目指す。
【０００８】
たとえば、本発明は、改善された活性、特に改善されたＮｏｔｃｈシグナル伝達作用因子活性を有する活性物質を提供することを目指す。
【特許文献１】国際公開第９８／２０１４２号パンフレット
【特許文献２】ＰＣＴ／ＧＢ９７／０３０５８（出願日１９９７年１１月６日、国際公開第９８／２０１４２号）
【特許文献３】英国特許第９６２３２３６．８号
【特許文献４】英国特許第９７１５６７４．９号
【特許文献５】英国特許第９７１９３５０．２号
【特許文献６】ＰＣＴ／ＧＢ９９／０４２３３（出願日１９９９年１２月１５日、国際公開第００／３６０８９号）
【特許文献７】英国特許第９８２７６０４．１号明細書
【特許文献８】ＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１（出願日２０００年１１月１７日、国際公開第０１３５９９０号）
【特許文献９】英国特許第９９２７３２８．６号明細書
【特許文献１０】ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３５０３（出願日２００１年８月３日、国際公開第０２／１２８９０号）
【特許文献１１】英国特許第００１９２４２．７号明細書
【特許文献１２】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０２４３８（出願日２００２年５月２４日、国際公開第０２／０９６９５２号）
【特許文献１３】英国特許第０１１２８１８．０号明細書
【特許文献１４】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３８１（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１２１１１号）
【特許文献１５】英国特許第０１１８１５５．１号明細書
【特許文献１６】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３３９７（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１２４４１号）
【特許文献１７】英国特許第０１１８１５３．６号明細書
【特許文献１８】英国特許第０２０７９３０．９号明細書
【特許文献１９】英国特許第０２１２２８２．８号明細書
【特許文献２０】英国特許第０２１２２８３．６号明細書
【特許文献２１】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６（出願日２００２年７月２５日、国際公開第０３／０１１３１７号）
【特許文献２２】英国特許第０１１８１５３．６号明細書
【特許文献２３】英国特許第０２０７９３０．９号明細書
【特許文献２４】英国特許第０２１２２８２．８号明細書
【特許文献２５】英国特許第０２１２２８３．６号明細書
【特許文献２６】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４３９０（出願日２００２年９月２７日、国際公開第０３／０２９２９３号）
【特許文献２７】英国特許第０１２３３７９．０号明細書
【特許文献２８】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３７（出願日２００２年１１月１３日、国際公開第０３／０４１７３５号）
【特許文献２９】英国特許第０１２７２６７．３号明細書
【特許文献３０】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０３４２６号パンフレット
【特許文献３１】英国特許第０２２０８４９．４号明細書
【特許文献３２】英国特許第０２２０９１３．８号明細書
【特許文献３３】ＰＣＴ／ＧＢ０２／００４３９０号
【特許文献３４】ＰＣＴ／ＧＢ０２／０５１３３（出願日２００２年１１月１３日、国際公開第０３／０４２２４６号）
【特許文献３５】英国特許第０１２７２７１．５号明細書
【特許文献３６】英国特許第０２２０９１３．８号明細書
【非特許文献１】Ｈｏｙｎｅ Ｇ．Ｆ． ｅｔ ａｌ （１９９９） Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１８；１２２−１２４
【非特許文献２】Ｈｏｙｎｅ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １００；２８１−２８８
【非特許文献３】Ｈｏｙｎｅ Ｇ．Ｆ． ｅｔ ａｌ （２０００） Ｉｎｔｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２；１７７−１８５
【非特許文献４】Ｈｏｙｎｅ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １８２；２１５−２２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の最初の一態様によると、支持構造に結合した、好ましくは化学結合した、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子（好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５）を含む複合体が提供される。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の個々の調節因子は、複合体中の別のＮｏｔｃｈシグナル伝達の一または複数の調節因子と同一でありうるかまたは異なりうることが理解される。
【００１０】
本発明の別の一態様によると、分子支持構造に化学結合した、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を含む複合体が提供される。ここで用いられる「分子」の語は一般的に、支持構造が実質的に単一の分子を構成することを意味すると理解される。これは好ましくは、たとえば、ビーズ、粒子、繊維、などといった固相不活性支持体とは異なることが理解される。
【００１１】
加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の支持構造への化学（共有）結合は好ましいが、一部の実施形態では化学結合でない結合を使用しうることが理解される。たとえば、一部の実施形態では、吸着カップリング（たとえば静電相互作用または疎水性相互作用を用いる）または親和性カップリング（たとえば抗体を用いる）を使用しうる。
【００１２】
適切な支持構造は、約５００ないし約１０，０００，０００Ｄａ、たとえば約５，０００ないし約５，０００，０００Ｄａ、たとえば約５００ないし約５００，０００Ｄａ、またはたとえば約５００ないし１００，０００Ｄａ、たとえば約１０００ないし約５０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００１３】
適切な支持構造は、高分子材料（たとえばポリエチレングリコール）またはその残基を含む。一実施形態では、高分子材料はたとえば分枝鎖ポリエチレングリコールポリマーまたはその残基を含みうる。
【００１４】
好ましくは、支持構造は、タンパク質またはペプチド材料ではない。適切な支持構造は、実質的に非免疫原性である。
【００１５】
必要に応じて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、リンカー部分を介して支持構造に結合することができる。そのようなリンカーは、たとえば、酸、塩基、アルデヒド、エーテル、またはエステル反応基またはその残基といった任意の適当な基を含みうる。適切なリンカー部分は、たとえば、プロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸またはヘキサン酸スクシンイミジル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、炭酸ベンゾトリアゾール、プロピオンアルデヒド、マレイミドまたは分枝マレイミド、ビオチン、ビニル誘導体、またはリン脂質を含みうる。
【００１６】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を、化学的に架橋した形で含む複合体が提供される。
【００１７】
本発明の別の一態様によると、多数の結合または連鎖したＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含む構造の、免疫細胞活性の調節のための薬物の製造における用途が提供される。好ましくは免疫細胞は、造血細胞でなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＡＰＣ（抗原提示細胞）といった末梢免疫細胞である。
【００１８】
一実施形態では免疫系の調節は、Ｔ細胞活性の低下を含む。たとえば、免疫系の調節は、エフェクターＴ細胞活性の低下、たとえばヘルパー（ＴＨ）および／または細胞毒性（ＴＣ）Ｔ細胞活性の低下を含みうる。適切な免疫系の調節は、Ｔｈ１および／またはまたはＴｈ２免疫反応の低下を含みうる。
【００１９】
ここで用いられる「複数」の語は、少なくとも２、および好ましくは少なくとも５、適切には少なくとも１０、少なくとも２０、たとえば約５０以上である数を意味する。
【００２０】
ここで用いられる「多数」の語は、少なくとも３、および好ましくは少なくとも５、適切には少なくとも１０、たとえば少なくとも２０、たとえば約少なくとも５０または１００以上である数を意味する。
【００２１】
適切な複合体は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも３個の調節因子、たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも４個の調節因子、たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも５個の調節因子を含む。別の実施形態では複合体は少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０または少なくとも約５０または１００以上のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含みうる。
【００２２】
典型的には、たとえば、複合体は約１０ないし約１００、たとえば約２０ないし約８０、たとえば約３０ないし約７０、たとえば約４０ないし約６０、たとえば約５０以上のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を含むことができ、その個々は同一でありうるかまたは異なりうる。
【００２３】
好ましくはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体、特にヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４といったヒトＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈタンパク質）を活性化することができる物質である。そのような物質は、「Ｎｏｔｃｈ活性化因子」、「Ｎｏｔｃｈ作用因子」または「Ｎｏｔｃｈ受容体作用因子」ということができる。好ましくはその物質は、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＡＰＣといった免疫細胞においてＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができる。
【００２４】
たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することができるＮｏｔｃｈリガンドまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含みうる。
【００２５】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄタンパク質またはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含む。
【００２６】
一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインの一部および免疫グロブリンＦｃ部分を含む融合タンパク質を含む。そのような融合タンパク質は、たとえば、国際公開第９８／２０１４２号パンフレット（実施例２）の記載通りに調製することができる。
【００２７】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、ＤＳＬまたはＥＧＦ様ドメインまたはその断片、誘導体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体を含むタンパク質またはポリペプチドを含む。
【００２８】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび少なくとも１、好ましくは少なくとも２、たとえば少なくとも３ないし８個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含む。
【００２９】
Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することができる他の物質、たとえば本発明の複合体中のＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができるペプチドミメティック（特に天然に存在するＮｏｔｃｈリガンドのミメティック）、抗体および小さい（たとえば合成）有機分子もまた、Ｎｏｔｃｈの活性化因子と考えられる。
【００３０】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、ここで用いられる「ミメティック」の語は、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化合物を含む。
【００３１】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび好ましくは最大２０、適切には最大１６、たとえば少なくとも３ないし８のＥＧＦ反復モチーフを含む。適切なＤＳＬおよびＥＧＦ配列は、哺乳類配列であるかまたはそれに一致する。好ましい配列はヒト配列を含む。
【００３２】
別の一実施形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、抗体、たとえば抗Ｎｏｔｃｈ抗体、適切な抗ヒトＮｏｔｃｈ抗体（たとえばヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４に結合する抗体）を含む。
【００３３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド調節因子は、典型的にはポリマーの反応基または活性化ポリマーと、たとえば炭素−窒素（Ｃ−Ｎ）結合、炭素−酸素（Ｃ−Ｏ）結合、または炭素−硫黄（Ｃ−Ｓ）結合の形成によって、任意にリンカーを介して結合しうる。
【００３４】
たとえば、一実施形態では複合体は下記の式を有しうる； 
ＰＯＬ（−Ｒ）ｎ 
ここでＰＯＬは高分子支持構造であり、ＲはＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（それぞれが同一でありうるかまたは異なりうる）を表し、ｎは少なくとも２である整数、たとえば少なくとも５、たとえば、少なくとも１０、たとえば約２ないし２００以上の整数、たとえば約２ないし２０、たとえば約８ないし１６、または約１０ないし１００、たとえば３０ないし８０である。個々のＲは、同一の複合体中の他のＲ部分と同一でありうるかまたは異なりうる。
【００３５】
高分子支持構造は、必要に応じて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子を高分子支持構造に結合するためのリンカー要素を含みうることが理解されるこの場合、複合体はまた、たとえば、下記のように表すことができる；
ＰＯＬ（−Ｌ−Ｒ）ｎ
ここでＰＯＬは高分子支持構造であり、個々のＲは独立してＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（それぞれが同一でありうるかまたは異なりうる）を表す；個々のＬは、独立に、任意のリンカー部分または残基（そのそれぞれは同一でありうるかまたは異なりうる）または結合を表す；ｎは上記で定義された通りの整数である。
【００３６】
複合体中に存在するＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の数が示されている場合、これらは複合体の調製物、収集物、または集団にも適用されると理解され、その場合与えられた数字は、調製物、収集物、または集団の複合体当たりのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の平均的な数、適切には平均数に関係しうる。たとえば、複合体が、Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達に対するある範囲の数の調節因子を有すると記載される場合、これは複合体の調製物、収集物、または集団に関して同一の範囲で平均的な（たとえば平均）数を有すると考えられることが理解される。
【００３７】
本発明の別の一態様によると、薬物としての用途のための上記で定義された通りの複合体が提供される。
【００３８】
本発明の別の一態様によると、免疫療法における用途のための上記で定義された通りの複合体が提供される。
【００３９】
本発明の別の一態様によると、免疫反応の調節（上昇または低下）のための薬物の製造における、上記で定義された通りの複合体の用途が提供される。
【００４０】
本発明の別の一態様によると、上記で定義される複合体を投与することによる、哺乳類において免疫反応を調節（上昇または低下）する方法が提供される。
【００４１】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を支持構造と、任意にリンカーの使用により、化学的に結合することによって上記で定義される複合体を調製する方法が提供される。
【００４２】
好ましくは免疫系の調節は免疫療法を含む。
【００４３】
好ましくは免疫系の調節は、Ｔ細胞活性、適切には末梢Ｔ細胞活性の調節（上昇または低下）を含む。
【００４４】
好ましくは 免疫系の調節は、抗原または抗原決定基に対する免疫反応の調節（上昇または低下）を含む。
【００４５】
選択的に、または加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、Ｎｏｔｃｈもしくはその断片、誘導体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体、またはＮｏｔｃｈもしくはその断片、誘導体、ホモログ、アナログもしくは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
【００４６】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、本質的に下記の成分から成る、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）１〜５かつ５個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００４７】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、本質的に下記の成分から成る、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜４かつ４個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００４８】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、本質的に下記の成分から成る、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜３かつ３個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００４９】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、本質的に下記の成分から成る、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００５０】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、下記を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）１〜５個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００５１】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、下記を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜８個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００５２】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、下記を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）２〜５個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００５３】
適切なＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、下記を含む、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチドの形の調節因子を含む；
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン；
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン；
ｉｉｉ）任意に全部または一部のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン；および
ｉｖ）任意に１つ以上の異種アミノ酸配列。
【００５４】
適切なドメインは、ＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄ ＤＳＬまたはＥＧＦドメインを含む。
【００５５】
適切なドメインは、ヒトＤｅｌｔａ ＤＳＬまたはＥＧＦドメインを含む。
【００５６】
適切な少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、下記の配列に対してその全長にわたって、少なくとも５０%（適切には少なくとも７０%、適切には少なくとも９０%）のアミノ酸配列類似性または同一性を有するポリペプチドを含む；
【化１】
2006513260.tif 000002
【００５７】
一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の少なくとも１つの調節因子は、抗体、抗体断片または抗体誘導体を含む。
【００５８】
本発明の別の一態様によると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の複数の調節因子を高分子支持構造と結合させることによって上記の通りの複合体を調製するための方法が提供される。
【００５９】
本発明の別の一態様によると、
ｉ）高分子支持構造を提供すること；および
ｉｉ）高分子支持構造を複数のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子と反応させること
：によって上記の通りの複合体を調製するための方法が提供される。
【００６０】
本発明の別の一態様によると、
ｉ）高分子支持構造を提供すること；
ｉｉ）高分子支持構造を活性化すること；および
ｉｉｉ）活性化された高分子支持構造を複数のＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子と反応させること
：によって上記の通りの複合体を調製するための方法が提供される。
【００６１】
本発明の別の一態様によると、免疫系の調節のための同時、同時期、別々、または連続使用のための組み合わせ調製品として、
ｉ）上記の通りの複合体；および
ｉｉ）抗原もしくは抗原決定基または抗原もしくは抗原決定基をコードするポリヌクレオチド；
を含む産物が提供される。
【００６２】
本発明の別の一態様によると、抗原または抗原決定基が自己抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、自己抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドである、上記の産物が提供される。
【００６３】
そのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、アレルゲンもしくはその抗原決定基であるかまたは、アレルゲンもしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００６４】
別のそのような一実施形態では、抗原または抗原決定基は、移植抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、移植抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００６５】
別の一実施形態では、抗原または抗原決定基は、腫瘍抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、腫瘍抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００６６】
別の一実施形態では、抗原または抗原決定基は、病原体抗原もしくはその抗原決定基であるかまたは、病原体抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチドでありうる。
【００６７】
本発明の別の一態様によると、
ｉ）上記の複合体；および
ｉｉ）病原体抗原もしくはその抗原決定基、または病原体抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
：を含む病原体ワクチン組成物が提供される。
【００６８】
本発明の別の一態様によると、 
ｉ）上記の複合体；および
ｉｉ）がん抗原もしくはその抗原決定基、またはがん抗原もしくはその抗原決定基をコードするポリヌクレオチド
：を含むがんワクチン組成物が提供される。
【００６９】
本発明の別の一態様によると、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現の調節のための薬物の製造のための上記の複合体の用途が提供される。
【００７０】
本発明の別の一態様によると、ＩＬ−１０発現増加のための薬物の製造のための上記の複合体の用途が提供される。
【００７１】
本発明の別の一態様によると、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１３から選択されるサイトカインの発現減少のための薬物の製造のための上記の複合体の用途が提供される。
【００７２】
本発明の別の一態様によると、ＩＬ−１０発現増加およびＩＬ−５発現減少を伴う免疫調節因子サイトカインプロファイルを生じるための薬物の製造のための上記の複合体の用途が提供される。
【００７３】
本発明の別の一態様によると、ＩＬ−１０発現増加および、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−α発現減少を伴う免疫調節因子サイトカインプロファイルを生じるための薬物の製造のための上記の複合体の用途が提供される。
【００７４】
本発明の別の一態様によると、上記の複合体を含む上記の医薬組成物に記載される複合体の用途が提供される。
【００７５】
本発明の別の一態様によると、上記の複合体および医薬品として許容されるキャリヤーを含む医薬組成物が提供される。
【００７６】
ここで用いられる「生物学的または治療的効果の促進」の語は、たとえば、親和性の増大、効力の増大、有効性の増大、毒性の低下、活性または作用期間の改善、副作用の減少、バイオアベイラビリティの向上、薬物動態の改善、活性スペクトルの改善、などを含む。 
【００７７】
ここで用いられる「本質的に〜から成るもの」または「本質的に〜から成る」の語は、その構造が当該の同定された配列およびドメインを含むが、他の配列またはドメインを実質的に含まない、特に他のどのようなＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンド配列またはドメインも実質的に含まないことを意味する。
【００７８】
疑いを避けるために、「含む」の語は任意の別の特性または成分が存在しうることを意味する。
【００７９】
「調節する」、「調節」および「調節している」などの語は、関係する効果またはシグナル伝達を増加および減少させることの両方を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８０】
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態を、非限定的な実施例を用いて、および添付の図を参照して、より詳細に説明する；
【００８１】
支持構造
好ましくは複合体に用いられる支持構造は、好ましくは医薬品として許容されるポリマーである高分子構造である。好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどといった水溶性ポリマーである。他の適当なポリマーは、たとえば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、（ホモ重合体またはランダム共重合体）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモ重合体（ＰＰＧ）および他のポリアルキレンオキサイド、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（たとえば、グリセロール）およびその他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、コロン酸またはその他の炭水化物ポリマー、フィコールまたはデキストラン、およびその混合物を含む。ポリマーはまた、活性化型、機能化型、または誘導体化型で使用されうると理解される。
【００８２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、支持構造と、分子内のランダムな位置で、または分子内の規定の位置で結合することができ、また１、２、３またはそれより多くの化学部分に結合しうる。
【００８３】
ポリマーはホモ重合体または共重合体、たとえばランダム共重合体のいずれかであることができ、また直鎖または分枝鎖のいずれかでありうる。
【００８４】
一部の実施形態では、ポリマーはハイドロゲルの形で用いることができる。「ハイドロゲル」の語は、たとえば反対電荷の小イオンまたはポリマーによって、または化学的架橋によって、ゲル状態に変換された、ゾルともいうポリマーの溶液を含む。
【００８５】
適当なポリマーはまた、たとえばダウ・ケミカル社（米国ミシガン州ミドランド）（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｍｉｄｌａｎｄ， ＭＩ， ＵＳ））から市販されている「スターバースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）」（登録商標）デンドリマーを含む、医薬品として許容されるデンドリマーを含む。たとえば、そのようなデンドリマーは米国特許第６１７７４１４号（ダウ・ケミカル社）に記載されている。それに記載の通り、スターバーストポリマーは、放射相称の規則的な樹状分枝によって特徴づけられる分子構造を示す。これらの放射相称な分子のことを、「スターバースト位相」を有するという。これらのポリマーは、開始核の周りに同心状の樹状層を与えることのできる方法で作られる。スターバースト位相は、開始核周囲の同心上の樹状層中の、有機反復単位の規則正しい集合によって達成される；これはいくつかの分子生成を通じた幾何的に累積的な形で多数および自己複製（各層内で）を導入することによって達成される。結果として生じる高度に機能化された分子は、その分枝（枝様）構造およびそのオリゴマー的性質に関連して、「デンドリマー」と呼ばれている。
【００８６】
適切なポリマーは、グルカンのような多糖ポリマー、たとえばデキストランまたは、アミノデキストランといったデキストラン誘導体でありうる。
【００８７】
使用される場合、ポリマーは任意の分子量であることができ、分枝型または非分枝型でありうる。ポリエチレングリコールが用いられる場合、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａないし約５００ｋＤａである（「約」の語は、たとえばポリエチレングリコールの調製物において、表記の分子量よりも一部の分子が重く、一部は軽いことを示す）。目的の治療プロファイル（たとえば、治療用タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの、もしあれば生物学的活性に対する影響、取り扱いの容易さ、抗原性の程度またはその不在、およびその他の既知の効果）に応じて、他の大きさを用いることができる。たとえば、当該ポリマーは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００Ｄａの平均分子量を有しうる。
【００８８】
デキストランのような炭水化物ポリマーが用いられる場合は、それらは約１ｋＤａないし約１０，０００ｋＤａ、たとえば約１０ｋＤａないし約５，０００ｋＤａ、たとえば約１００ｋＤａないし約３，０００ｋＤａ、適切には約１００ｋＤａないし約１，０００ｋＤａ、たとえば約５００ｋＤａの平均分子量を有しうる。
【００８９】
分子量の数字がポリマーについて与えられている場合、これらはまたポリマー／複合体の調製物、収集物、または集団に適用されると理解され、その場合、与えられた数字は、たとえば調製物、収集物、または集団の平均的な分子量、適切には平均分子量と関連しうる。たとえば、ポリマー分子が所定の範囲の分子量を有すると記載されている場合、これはまたポリマー分子の調製物、収集物、または集団に関して同一の範囲の平均分子量を有すると考えられると理解される。
【００９０】
使用される場合、ポリマーは、必要に応じて、分枝構造を有しうる。たとえば、分枝ポリエチレングリコールは、たとえば、米国特許第５，６４３，５７５号；モーパーゴ（Ｍｏｒｐｕｒｇｏ）他， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５６；５９−７２ （１９９６）； ボロブイェフ（Ｖｏｒｏｂｊｅｖ）他， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８；２７４５−２７５０ （１９９９）；およびカリセッチ（Ｃａｌｉｃｅｔｉ）他， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １０；６３８−６４６ （１９９９）に記載され、それぞれの開示は参照により本開示に含まれる。
【００９１】
Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達の調節因子がタンパク質である場合、当該タンパク質は好ましくは、当該タンパク質の機能性ドメインまたは抗原性 ドメインに対する影響を考慮して、支持構造と結合すべきである。当業者が利用可能ないくつかの結合方法が存在し、たとえば、欧州特許第０ ４０１ ３８４号明細書は参照により本開示に含まれ（ＰＥＧをＧ−ＣＳＦへ結合）、またマリク（Ｍａｌｉｋ）他， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０；１０２８−１０３５ （１９９２） （塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのＰＥＧ化を報告）を参照。たとえば、ポリエチレングリコールといったポリマーは、遊離のアミノまたはカルボキシル基といった反応基によって、アミノ酸残基を介して共有結合しうる。反応基は、ポリエチレングリコール分子といった活性化ポリマーが結合することができるものである。遊離アミノ基を持つアミノ酸残基は、たとえば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含みうる；遊離カルボキシル基を持つアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基を含みうる。システイン残基由来のスルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子といったポリマーを結合するための反応基として用いることができる。たとえば、結合はＮ末端またはリジン基での結合のようなアミノ基にて、または、たとえばＣ末端システイン基のようなシステイン基にて起こりうる。
【００９２】
ポリエチレングリコールといったポリマーは、タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基の任意の数との結合を介して、タンパク質およびポリペプチドに結合しうる。たとえば、ポリエチレングリコールいったポリマーは、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基との共有結合を介してタンパク質と結合させることができる。１つ以上の反応化学を、ポリエチレングリコールいったポリマーをタンパク質の特定のアミノ酸残基（たとえば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）またはタンパク質の二種類以上のアミノ酸残基（たとえば、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、およびその組み合わせ）と結合するために用いることができる。
【００９３】
一部の場合には、Ｎ末端を介して支持構造と結合しているタンパク質を持つことが望ましい可能性がある。たとえば、ポリエチレングリコールを例にすると、いろいろな種類のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝、などによって）から、反応混合物中のポリエチレングリコール分子のタンパク質（またはペプチド）分子に対する比率、実施するＰＥＧ化反応の種類、およびＮ末端でｐｅｇ化されたタンパク質を得る方法を選択することができる。Ｎ末端でｐｅｇ化された調製物を得る方法（すなわち、必要に応じてこの部分を他のモノｐｅｇ化された部分から分離すること）は、ｐｅｇ化されたタンパク質分子の集団からのＮ末端でｐｅｇ化された物質の精製によることができる。Ｎ末端で化学修飾された選択的タンパク質修飾は、特定のタンパク質中で誘導体化に利用可能な、異なる型の第一アミン基（リジン対Ｎ末端）の異なる反応性を利用する還元的アルキル化によって達成することができる。適当な反応条件下では、カルボニル基を含むポリマーとの、タンパク質のＮ末端での実質的に選択的な誘導体化を達成することができる。
【００９４】
最適な方向を提供するために適切には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、適切に与えられた末端残基、たとえば末端リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン残基といったＣ末端残基を介して支持構造と結合することができ、それらの残基は、結合するタンパク質またはペプチド中にすでに存在しない場合は遺伝子操作技術によって容易に生成または露出することができる。末端残基、またはタンパク質／ペプチド末端（好ましくはＣ末端）に近い位置での結合は、典型的には受容体の結合および／または活性化のための、リガンドのより良好な提示を提供する。
【００９５】
たとえば、本発明の好ましい一形では、多数のタンパク質／ペプチドＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（たとえば、ＤＳＬドメインおよび１〜５個、たとえば３個のＥＧＦドメインを含むＮｏｔｃｈリガンド構造）が、多糖、たとえばデキストランといった水溶性高分子支持体に、Ｃ末端残基（たとえばシステイン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸）によって、スルホスクシンイミジル４−[Ｎ−マレイミドメチル]−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）などといったリンカーを介して結合している。
【００９６】
炭水化物／多糖 複合体
本発明の一実施形態では支持構造は炭水化物ポリマー、好ましくは多糖ポリマーであることができる。好ましくはそのような多糖は水溶性である。
【００９７】
よく知られている通り、多糖は一般的に、典型的には１−４または１−６結合といったグリコシド結合によって結びついた多数の単糖単位で構成される。適切な単糖単位は、たとえば、アルドース（たとえばトリオース、エリトロースまたはトレオースといったテトロース；リボース、アラビノース、キシロース、またはリキソースといったペントース；アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、またはツロースといったヘキソース、またはヘプトースでありうる）；またはケトース（たとえば、ケトトリオース、エリトルロース（ｅｒｙｔｈｕｌｏｓｅ）といったケトテトロース；リブロースまたはキシルロースといったケトペントース；フルクトース、プシコース、タガトース、またはソルボースといったケトヘキソース、またはケトヘプトースでありうる）でありうる。単位はＤ−またはＬ−形のいずれかでありうるが、Ｄ形が一般的に好ましい（たとえばＤ−グルコース）。同様に、単糖単位はαまたはβ形のいずれかであることができ、たとえばα−Ｄ−グルコースである。多糖中の単糖は実質的に同一であることができ（すなわちホモ多糖を与える）、または単位の組み合わせを用いることができる（すなわちヘテロ多糖を与える）。数十、数百、または数千の単糖単位がそのようなポリマー中に存在することができ、分枝は普通に存在する。
【００９８】
適当な炭水化物ポリマーは、たとえば、アミノデキストランおよびカルボキシメチルデキストランを含むデキストランといったグルカン、ヘパリン、セルロース（および、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースといったその誘導体）、キトサンおよびキトサンの加水分解物、デンプン（および、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンといったその誘導体）、グリコーゲン、ヘパリン、アルギン酸、アガロース、およびその誘導体および活性化型、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、およびアルギン酸加水分解物、およびその誘導体および活性化型を含む。
【００９９】
たとえば、デキストラン複合体化の総説が、メーバー（Ｍｅｈｖａｒ）によってＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｖｏｌ ６９ （２０００）１〜２５ページで提供されている。
【０１００】
上記の通り、そのようなポリマーの誘導体（「誘導体化ポリマー」）もまた本発明で用いることができる。そのような誘導体化 ポリマーは、典型的には たとえば下記に示す活性化過程の結果として生じうる。
【０１０１】
ポリマーの活性化
必要に応じて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子（たとえばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、または「小分子」といったそのミメティック）を、ポリマー支持体材料と複合体化するために、ポリマー上のいくつかの基を、複合体化を促進するより反応性の高い官能基に変換することができる。この処理はしばしば「活性化」と呼ばれ、産物は「活性化」または「機能化」ポリマーと呼ばれる。
【０１０２】
特に、支持体として用いられるポリマー分子がそれ自身で活性でない（または十分活性でないと考えられる）場合、ポリマー分枝は好ましくは適当な方法の使用によって活性化される。
【０１０３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、好ましくは化学的方法を用いてポリマーまたは活性化ポリマーに共有結合している（直接に、またはリンカーを介して）。そのような結合を結果として生じる反応化学は本分野でよく知られており、たとえば、下記に示すような、相補的な官能基（たとえばリンカー、ポリマーおよび／またはＮｏｔｃｈシグナル伝達調節因子の上の）の使用を含むことができる；
第一の反応基             第二の反応基                   結合
カルボキシル              アミン                        アミド
ハロゲン化スルホニル      アミン                        スルホンアミド
ヒドロキシル              ハロゲン化アルキル／アリール  エーテル
ヒドロキシル              イソシアネート                ウレタン
アミン                    エポキシド                    ベータ−ヒドロキシアミン
アミン                    ハロゲン化アルキル／アリール  アルキルアミン
ヒドロキシル              カルボキシル                  エステル
アミン                    アルデヒド                    アミド／アミン
チオール／スルフヒドリル  マレイミド                    −
アミン                    スクシンイミド                −  
【０１０４】
たとえば米国特許第６３０３７５２号明細書（ノボザイム社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ））に示されるように、ポリマー分子の活性化のためおよびタンパク質，ポリペプチドおよびペプチドの複合体化のための方法および化学は文献によく説明されている。たとえば、ポリマーの活性化のための広く用いられる方法は、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビスエポキシド（ｂｉｅｐｏｘｉｄｅｓ）、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどを用いた官能基の活性化を含む（Ｒ． Ｆ．テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）（１９９１）、『タンパク質固定化、基礎および応用』， マーセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク； Ｓ． Ｓ．ワング（Ｗｏｎｇ）， （１９９２）、『タンパク質複合体化および架橋化の化学』（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）， ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ），米国ボーカラトーン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）； Ｇ． Ｔ．ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）他， （１９９３）、『固定化アフィニティリガンド技術』（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）， アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨークおよびハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）（１９９５）『生物複合体技術』（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）， アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク、を参照）。これらの方法の一部は、不溶性ポリマーの活性化に関するが、たとえば過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニルスルホン、カルボジイミドなど、可溶性ポリマーの活性化にも適用可能である。ポリマー上の官能基と、タンパク質上の選択された結合基は、典型的にはｉ）ポリマーの活性化、ｉｉ）複合体化、およびｉｉｉ）必要に応じて、残存活性基のブロッキングを含みうる活性化および複合体化化学を選択する際に考慮しなければならない。
【０１０５】
たとえば、ポリマー分子をポリペプチドの遊離アミノ基と結合させることは、たとえば、ジイミドおよびたとえばアミノ−ＰＥＧまたはヒドラジノ−ＰＥＧ （ポラック（Ｐｏｌｌａｋ）他， （１９７６）， Ｊ． Ａｍｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ９８， ２８９−２９１）またはジアゾ酢酸／アミド （ワング（Ｗｏｎｇ）他， （１９９２），『タンパク質複合体化および架橋化の化学』（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）， ＣＲＣプレス社（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ））を用いて実施することができる。 
【０１０６】
遊離スルフヒドリル基（たとえばタンパク質またはポリペプチド中のシステイン残基）との結合は、たとえばマレイミドまたはオルト−ピリジルジスルフィドのような基を用いて達成することができる。またビニルスルホン（米国特許第５，４１４，１３５号明細書（１９９５）、スノー（Ｓｎｏｗ）ら）はスルフヒドリル基に対して選択性を有する。
【０１０７】
ポリペプチド鎖の中の接近可能なアルギニン残基は、２つの近接したカルボニル基から成る基によって適切に標的化されうる。
【０１０８】
求電子的に活性化されたＰＥＧといったポリマーを、リジンといった残基のアミノ基と結合することを含む方法もまた有用でありうる。アルコールについての通常の離脱基の多くがアミン結合を生じる。たとえば、トレシル酸 （ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）他， （１９８４）、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １０４， ジャコビー（Ｊａｃｏｂｙ）， Ｗ． Ｂ．， 編， アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；米国オーランド（Ｏｒｌａｎｄｏ）、 ｐ． ５６−６６； ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ） 他， （１９８７）、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １３５； モスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ）， Ｋ．， 編； アカデミックプレス社； オーランド， ｐｐ． ６５−７９；スカウテン（Ｓｃｏｕｔｅｎ）他， （１９８７）、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １３５， モスバッハ， Ｋ．，編， アカデミックプレス社； オーランド， １９８７； ｐｐ ７９−８４；クロスランド（Ｃｒｏｓｓｌａｎｄ）他， （１９７１）、 Ｊ． Ａｍｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９７１， ９３， ｐｐ． ４２１７−４２１９）、メシル酸（ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）， （１９８５）、前出；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他， （１９８４）、 Ｊ． Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍ． Ｃｈｅｍ． Ｅｄ． ２２， ｐｐ ３４１−３５２）といったアルキルスルホン酸、トシル酸のようなアリールスルホン酸、およびパラニトロベンゼンスルホン酸を用いることができる。
【０１０９】
有機塩化スルホニル、たとえば塩化トレシルは、いくつかのポリマー、たとえばＰＥＧ中の水酸基を、タンパク質またはポリペプチド中のアミノ基のような求核剤と反応した場合にポリマーとポリペプチドとの間に安定な結合を形成させる良好な離脱基（スルホン酸）に効果的に変換する。高い複合体化収率に加えて、反応条件は一般に穏やかである（変性を避けるため、および活性の破壊をわずかまたは全く無くするため、中性またはわずかにアルカリ性のｐＨ）。エポキシドもまた、アミン結合を生成するために用いることができる。
【０１１０】
ホスゲンを用いてＰＥＧをクロロギ酸に変換することは、リジンへのカルバメート結合を促進しうる。多数の変法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（米国特許第５，１２２，６１４号明細書（１９９２）；ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）他， （１９９２）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １５， ｐ． １００−１１４；モンファルジニ（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ）他， （１９９５）， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ６， ６２−６９）、イミダゾール（アレン（Ａｌｌｅｎ）他， （１９９１）、 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， ２１３， ｐｐ ３０９−３１９）、パラニトロフェノール、 ＤＭＡＰ （欧州特許第６３２ ０８２ Ａ１号明細書（１９９３）、ローゼ（Ｌｏｏｚｅ， Ｙ．）） などで塩素を置換することを含む。本誘導体は典型的には、たとえばクロロギ酸を目的の離脱基と反応させることによって作られる。これらのすべての基は、ペプチドとのカルバメート結合を生じる。代替として、イソシアネートおよびイソチオシアネートを用いてそれぞれ尿素およびチオ尿素を生じることができる。
【０１１１】
別の結合方法では、ウレタン（カルバメート）結合をアミノ酸のアミノ基（たとえばリジン、ヒスチジン、Ｎ末端残基）と活性化ポリマーとの間に形成することができる。適切には、そのようなウレタン結合は、炭酸スクシンイミジル基といった末端オキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド基を用いて形成される。別の活性化基は、Ｎ−スクシンイミド、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、およびＮ−ノルボレン−２，３−ジカルボキシドを含む。これらのウレタン形成基はたとえば米国特許第５，１２２，６１４号明細書に記載され、その開示は参照により本開示に含まれる。この特許はまた、アミノ基標的（たとえば リジン）とウレタン結合を形成することもまたできるポリエチレングリコールを含むポリアルキレンオキサイドの炭酸Ｎ−スクシンイミド誘導体の形成を開示する。 
【０１１２】
本発明の複合体を調製するための適当な開始材料および試薬は、アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）、バーケム社（Ｂａｃｈｅｍ）（米国カリフォルニア州トランス）、エムカ・ケミー（Ｅｍｋａ−Ｃｈｅｍｉｅ）またはシグマ社（Ｓｉｇｍａ）（米国ミズーリ州セントルイス）、ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）（米国イリノイ州ロックフォード）、モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ）（米国オレゴン州ユージーン）またはアマシャム・ファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（米国リトル・チャルフォント（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ）および米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））といった販売者から市販されているか；またはフィーザーおよびフィーザー（Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ）の『有機合成のための試薬』（Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）１〜１５巻 （ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）， １９９１）； ロッド（Ｒｏｄｄ）の『炭素化合物の化学』（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）１〜５巻および付録（エルゼビア・サイエンス出版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）， １９８９）、『有機反応』（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）１〜４０巻（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９１）、 Ｍａｒｃｈの『先端的有機化学』（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社， 第４版）、およびラロック（Ｌａｒｏｃｋ）の『有機変換の総括』（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）（ＶＣＨ出版（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．）， １９８９）といった参考文献に示された手順に従って、当業者に既知である方法によって調製される。 
【０１１３】
加えて、ある種の官能基が望ましくない反応を経験することを防ぐために、従来の保護基が必要である可能性があることが理解される。特定の官能基のための適当な保護基の選択、および保護および脱保護のための適当な条件は本分野でよく知られている。たとえば、数々の保護基、およびそれらの導入および除去は、Ｔ． Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびＧ． Ｍ．ワッツ（Ｗｕｔｓ）『有機合成における保護基』（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）第二版、ワイリー社（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク、１９９１年、およびその中の参考文献に記載されている。
【０１１４】
好ましくは本発明で使用するためのリンカー試薬は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子との反応のための基（たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達のタンパク質またはポリペプチド調節因子との反応のための）およびポリマー支持構造との反応のための基を有する二官能性試薬であることができる。反応後、リンカー試薬は典型的には、結果として生じる複合体中に、リンカー試薬残基（これはたとえば、「リンカー」ともいうことができる）として残りうる。
【０１１５】
幅広いリンカー 試薬がたとえばピアス・ケミカル社（米国イリノイ州ロックフォード）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）から入手可能であり（たとえばピアス・ケミカル社、架橋技術部門、『ピアス・ライフサイエンスおよび分析化学製品カタログおよびハンドブック』１９９４年版（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｓｅｃｔｉｏｎ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， １９９４）を参照）、たとえば下記の通り；
ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）
３−（[２−アミノエチル]ジチオ）−プロピオン酸（ＡＥＤＰ）
Ｎ−α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）
Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンジルオキシスクシンイミドＡＮＢ−ＮＯＳ）
Ｎ−（４−[ｐ−アジドサリチルアミド]−ブチル）−３’（２’ピリジルチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）
ｐ−アジドフェニルグリオキサル一水和物（ＡＰＧ）
４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチルアミン（ＡＳＢＡ）
Ｂｉｓ（ベータ−[４−アジドサリチルアミド]−エチル）ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）
１，４−Ｂｉｓ−マレイミドブタン（ＢＭＢ）
１，４−Ｂｉｓ−マレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）
１，６−Ｂｉｓ−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）
Ｂｉｓ−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）
Ｎ−ベータ−マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＡ）
１，８−Ｂｉｓ−マレイミドトリエチレングリコール（ＢＭ[ＰＥＯ]３）
１，１１−Ｂｉｓ−マレイミドテトラエチレングリコールＢＭ[ＰＥＯ]４
Ｎ−（ベータ−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド．ＴＦＡ（ＢＭＰＨ）
Ｎ−（ベータ−マレイミジプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）
Ｂｉｓ（２−[スクシンイミドオキシ−カルボニルオキシ]エチル）スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）
スベリン酸Ｂｉｓ（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ３）
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）
アジポイミド酸ジメチル（ａｄｉｐｉｍｉｄｉａｔｅ）（ＤＭＡ）
スベルイミド酸ジメチル（ＤＭＳ）
１，４−ジ−（３’−[２’ピリジルチオ]−プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）
グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）
ジチオｂｉｓ（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）
スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）
酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）
３，３’−ジチオｂｉｓ−プロピオンイミド酸ジメチル（ＤＴＢＰ）
ジチオ−ｂｉｓ−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）
３，３’−ジチオｂｉｓ（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（ＤＴＳＳＰ）
エチレングリコールｂｉｓ（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）
Ｎ−ε−マレイミドカプロン酸（ＥＣＭＡ）
Ｎ−ε−（マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）
Ｎ−γ−マレイミド酪酸オキシ−スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）
１，６−ヘキサン−ｂｉｓ−ビニルスルホン（ＨＢＶＳ）
Ｎ−κ−マレイミドウンデカン酸（ＫＭＵＡ）
スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−カプロン酸アミド）（ＬＣ−ＳＭＣＣ）
６−（３’−[２−ピリジル−ジチオ]プロピオンアミド）ヘキサン酸スクシンイミジル（ＬＣ−ＳＰＤＰ）
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）
４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド（Ｍ２Ｃ２Ｈ）
３−マレイミドフェニルボロン酸（ＭＰＢＡ）
４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）
Ｎ−スクシンイミジルアジピン酸メチル（ＭＳＡ）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸（ＮＨＳ−ＡＳＡ）
３−（２−ピリジルチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）
Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）
（４’アジド−フェニル）１，３’−ジチオプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＡＤＰ）
スルホスクシンイミジル−２−[７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド]エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＥＤ）
スルホスクシンイミジル−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）
６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＡＮＰＡＨ）
スルホスクシンイミジル２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル１，３−ジチオプロピオネート（ＳＡＳＤ）
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）
スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）
スルホスクシンイミジル（ペルフルオロアジドベンズアミド）エチル１，３’−ジチオプロピオネート（ＳＦＡＤ）
ヨード酢酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＩＡ）
（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＩＡＢ）
スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）
４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸スクシンイミジル（ＳＭＰＢ）
スクシンイミジル−６−（ベータ−マレイミド−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）
４−スクシンイミジルオキシ−カルボニル−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）
スクシンイミジル−（４−ソラレン−８−イルオキシ）ブチラート（ＳＰＢ）
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）
Ｂｉｓ（２−[スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ]エチル）スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）
酒石酸スルホジスクシンイミジル（スルホ−ＤＳＴ）
エチレングリコールｂｉｓ（スルホ−スクシンイミジル）スクシネート（スルホ−ＥＧＳ）
Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）
Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）
Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）−スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）
スルホスクシンイミジル６−（３−[２−ピリジルジチオ]−プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）
ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）
スルホスクシンイミジル（４−アジド−サリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＡＳＡ）
スルホスクシンイミジル（４−アジドフェニルジチオ）プロピオネート（スルホ−ＳＡＤＰ）
スルホスクシンイミジル６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）−ヘキサノエート（スルホ−ＳＡＮＰＡＨ）
スルホ−ＮＨＳ−２−（６−[ビオチンアミド]−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネート（スルホ−ＢＥＤ；三官能性）
スルホスクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）
スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）
スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）
スルホスクシンイミジル６−（α−メチル（ｍａｔｈｙｌ）−α−[２−ピリジルジチオ]−トルアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）
Ｎ−スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）
トリス−（２−マレイミドエチル）アミン（ＴＭＥＡ；三官能性）
トリス−（スクシンイミジルアミノ−トリアセテート（ＴＳＡＴ；三官能性）。
【０１１６】
使用する適切なリンカーは、ヘテロ二官能性試薬といった二官能性試薬になる（ホモ二官能性試薬もまた使用することができることが理解される）。必要に応じて、三官能性およびより高い試薬もまた使用することができる。
【０１１７】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体との結合および／またはその活性化に適当な方向でポリマー上に提示される。
【０１１８】
ＰＥＧ複合体
上記の通り、本発明における使用のためのポリマーの１つの好ましい形は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体である。１つの形では、ＰＥＧはたとえば、各末端が水酸基で終わる直鎖ポリマーであり（たとえば、米国特許第６，３６２，２５４号明細書に記載の通り）、たとえば； 
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
このポリマーは短縮形でＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができ、ここで−ＰＥＧ−の記号は下記の構造単位を表す；
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
典型的な形ではｎは約１０ないし約２０００の整数である。
【０１１９】
ＰＥＧはメトキシ ＰＥＧ−−ＯＨとして広く用いられ、短縮形ではｍＰＥＧであるが、その末端の１つは相対的に不活性なメトキシ基であり、一方、もう１つの末端は速やかな化学修飾の対象となる水酸基である。
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２ Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ −ＯＨ      （ｍＰＥＧ）
【０１２０】
ＰＥＧはまた、グリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールといったさまざまなポリオールへのエチレンオキサイドの付加によって調製することができる、分枝型で広く用いられる。たとえば、ペンタエリスリトールから調製される４本腕の分枝ＰＥＧを下記に示す；
【化２】
2006513260.tif 000003
（ｎは約１０ないし約２０００の整数である）
【０１２１】
分枝ＰＥＧはＲ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｎとして一般形で表すことができ、ここでＲはグリセロールまたはペンタエリスリトールといった中心の「核」分子を表し、ｎは「腕」の数を表す。
【０１２２】
２つのＰＥＧ「腕」が、他の分子と結合することができる１つの官能基を持つ中心結合部分に結合している分枝ＰＥＧもまた調製することができる；たとえば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ 他， （Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， ７７３， １９８０）は２つのＰＥＧを中心の塩化シアヌル部分に結合している。
【０１２３】
典型的な分枝鎖（または「多腕」）ＰＥＧはたとえば下記の構造を有しうる；
【化３】
2006513260.tif 000004
ここで各ＰＥＧ要素は、同一でありうるかまたは異なりうるが、上記で定義された通りであって、ｍは典型的には０ないし１００、たとえば０ないし５０、たとえば４ないし２０、たとえば６ないし１６の整数である。
【０１２４】
ＰＥＧはよく知られたポリマーであって、水および多数の有機溶媒への溶解性、毒性がない、および免疫原性がないという特性を持つ。ＰＥＧの１つの用途は、そのポリマーに不溶性分子を共有結合させ、結果として生じるＰＥＧ−分子「複合体」を可溶性にすることである。 たとえば、水に不溶性の薬物パクリタキセルはＰＥＧと結合させた場合に水溶性となることが示されている。グリーンバルト（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ）他， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ６０；３３１−３３６ （１９９５）。 
【０１２５】
関連する研究では、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デービス（Ｄａｖｉｓ） 他）は、ＰＥＧと結合させたタンパク質は腎クリアランス速度の低下および免疫原性の低下のために、より長い血液循環寿命を有することを開示する。これらおよびその他の用途はまた、『ポリエチレングリコール化学のバイオ医学的およびバイオ技術的用途』（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）Ｊ． Ｍ． ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）編、プレナム社（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（１９９２）、および『ポリ（エチレングリコール）化学および生物学的用途』（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）Ｊ． Ｍ．ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）およびＳ．ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）編， ＡＣＳ， ワシントンＤＣ （１９９７）にも記載され、その内容は参照により本開示に含まれる。
【０１２６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の支持構造との反応は、多数の方法によって達成することができる。たとえば、調節因子がタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドである場合、ポリエチレングリコールは直接にまたは介在するリンカーによってタンパク質ポリペプチドまたはペプチドと結合することができる。ポリエチレングリコールをタンパク質と結合するためのリンカーを用いない系はデルガド（Ｄｅｌｇａｄｏ）他， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ． ９；２４９−３０４ （１９９２）；フランシス（Ｆｒａｎｃｉｓ）他， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ． ６８；１−１８ （１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号明細書； 米国特許第５，３４９，０５２号明細書； 国際公開第９５／０６０５８号パンフレット；および国際公開第９８／３２４６６号パンフレットに記載され、そのそれぞれの開示は参照により本開示に含まれる。
【０１２７】
ポリエチレングリコールを、介在するリンカーを使用せずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接結合するための１つの系は、トレシル化ＭＰＥＧを使用し、これは塩化トレシル（ＣｌＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を用いたモノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）の修飾によって作製される。タンパク質のトレシル化ＭＰＥＧとの反応に際して、ポリエチレングリコールはタンパク質のアミン基に直接結合する。このように、本発明はタンパク質を、２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子を反応させることによって作製されたタンパク質−ポリエチレングリコール複合体を含む。
【０１２８】
ポリエチレングリコールといったポリマーはまた、いくつかの異なる介在リンカーを用いて、タンパク質と結合することもできる。たとえば、その内容が参照により本開示に含まれる米国特許第５，６１２，４６０号明細書は、ポリエチレングリコールをタンパク質と結合するためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコールがリンカーによってタンパク質と結合しているタンパク質−ポリエチレングリコール複合体もまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネート、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロフェノールカルボネート、およびさまざまなＭＰＥＧ−スクシネート誘導体といった化合物とのタンパク質の反応によって作製することができる。いくつかの他のポリエチレングリコール誘導体およびポリエチレングリコールをタンパク質と結合するための反応化学が国際公開第９８／３２４６６号パンフレットに記載され、その内容は参照により本開示に含まれる。
【０１２９】
そのような活性化ＰＥＧ誘導体の一例は、スクシンイミジルスクシネート「活性エステル」である；
ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ２Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２ −ＣＯ２−ＮＳ 
ここでＮＳは下記の構造を有する；
【化４】
2006513260.tif 000005
スクシンイミジル活性エステルは、タンパク質および他の分子上のアミノ基と迅速に反応してアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）を生じるため、有用なリンカーである。たとえば、米国特許第４，１７９，３３７号明細書（デービス（Ｄａｖｉｓ） 他）はこの誘導体のタンパク質（ＰＲＯ−ＮＨ２と表す）との結合を記載する；
【化５】
2006513260.tif 000006
【０１３０】
他の適当な「活性化」ＰＥＧは、たとえばＰＥＧスクシンイミジルプロピオネートおよびスクシンイミジルブタノエート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ベンゾトリアゾールカルボネート、プロピオンアルデヒド、マレイミド、および分枝マレイミド、ビオチン、ビニル誘導体、およびリン脂質を含む。
【０１３１】
そのようなＰＥＧおよび「活性化」ＰＥＧは、たとえば、米国アラバマ州ハンツビルのシアウォーター社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）から入手可能である。
【０１３２】
直鎖ポリマーの両端に活性基を有する二官能性ＰＥＧもまた、架橋化不溶性網状構造の形成を目的とする場合には有用な化合物である。多数のそのような二官能性ＰＥＧが本分野で知られている。たとえば、リー（Ｒｈｅｅ）他の米国特許第５，１６２，４３０号明細書はコラーゲンを架橋するためにそのような二官能性ＰＥＧを用いることを開示する。
【０１３３】
いくつかの活性官能基がポリマーの骨格に沿って配置された反応性ＰＥＧもまた合成されている。たとえば、いくつかの活性化された基がポリマーの骨格に沿って配置されている、リジン−ＰＥＧ複合体が本分野で調製されている。ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）他 Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４；５４−６２ （１９９３）。 
【０１３４】
このように、一実施形態では本発明に記載の複合体は、たとえば、下記の構造を有しうる；
【化６】
2006513260.tif 000007
ここで各ＰＥＧ要素は、同一でありうるかまたは異なりうるが、上記で定義された通りである；各Ｘは、同一でありうるかまたは異なりうるが、独立して、上記で考察された通りの結合またはリンカー部分である；ｍは、適切には０ないし１００、たとえば０ないし５０、たとえば０ないし５０、たとえば４ないし２０、たとえば６ないし１６、たとえば約５ないし約１０の整数である；および各Ｒは、同一でありうるかまたは異なりうるが、独立して、ここで定義される通りのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子、または−ＯＨ、−ＣＨ３、または−ＯＣＨ３といった末端基（任意に置換された）である。
【０１３５】
一般的技術
本発明の実施は、別に指示されない限り、当業者の能力の範囲内にある分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献に説明されている。たとえば、Ｊ． サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）， Ｅ． Ｆ． フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）， およびＴ．マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）， １９８９，『分子クローニング；実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第二版、１〜３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）， Ｆ． Ｍ． 他 （１９９５および定期補遺；『分子生物学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）９， １３，および１６章，ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ニューヨーク州ニューヨーク； Ｂ．ロー（Ｒｏｅ）， Ｊ．クラブツリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）およびＡ．カーン（Ｋａｈｎ）， １９９６， 『ＤＮＡ単離および配列決定；基幹技術』（ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ； Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社； Ｊ． Ｍ．ポラック（Ｐｏｌａｋ）およびジェームスＯ’Ｄ．マクジー（Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ． ＭｃＧｅｅ）， １９９０， 『Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；原理と実践』（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）；オックスフォード大学出版会； Ｍ． Ｊ．ゲイト（Ｇａｉｔ）（編集）、 １９８４，『オリゴヌクレオチド合成；実践的手法』（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）Ｉｒｌ出版（Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ）；  Ｄ． Ｍ． Ｊ．リリー（Ｌｉｌｌｅｙ）およびＪ． Ｅ．ダールベルク（Ｄａｈｌｂｅｒｇ）， １９９２， 『酵素学の方法；ＤＮＡ構造パートＡ；ＤＮＡの合成および物理分析』（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ； ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ； Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）； およびＪ． Ｅ．コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）， Ａ． Ｍ．クルイスビーク（Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ）， Ｄ． Ｈ．マーグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）， Ｅ． Ｍ．シェバッハ（Ｓｈｅｖａｃｈ）およびＷ． ストロバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）（１９９２ および定期補遺；『免疫学最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）， ニューヨーク・ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク州ニューヨーク）を参照。これらの一般的文献のそれぞれは参照により本開示に含まれる。
【０１３６】
疑いを避けるため、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および脊椎動物名は互いに交換可能に用いられ、すべてのホモログは本発明の範囲内に含まれる。
【０１３７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路またはその標的シグナル伝達経路の生物学的活性における変化をいう。「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の拮抗因子または阻害因子、すなわちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、阻害する化合物をいうことができる。都合良く、そのような化合物は阻害因子または拮抗因子ということができる。代わりに、「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子」の語は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の作用因子、すなわちＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の正常な生物学的活性を、少なくともある程度、刺激またはアップレギュレートする化合物をいうことができる。都合良く、そのような化合物はアップレギュレーターまたは作用因子ということができる。好ましくは、調節因子はＮｏｔｃｈシグナル伝達の作用因子であり、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体の作用因子である（たとえば、好ましくはヒトＮｏｔｃｈ受容体である、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４受容体の作用因子）。好ましくはそのような作用因子（「Ｎｏｔｃｈの活性化因子」）は、好ましくはヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４といったヒトＮｏｔｃｈ受容体を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体と結合しそれを活性化する。Ｎｏｔｃｈ受容体との結合および／またはその活性化は、たとえばここに記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ結合測定法および活性測定法を含む本分野で既知のさまざまな技術によって評価することができる。
【０１３８】
たとえば、任意の特定の物質がＮｏｔｃｈシグナル伝達を活性化するかどうか（たとえばＮｏｔｃｈの活性化因子またはＮｏｔｃｈ作用因子である）は、任意の適当な測定法の使用によって、たとえばここで実施例６に記載された型のＨＥＳ−１レポーター測定の使用によって、容易に決定することができる。逆に、拮抗因子活性は、たとえば、ここで実施例６に記載されたような、ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞といった既知のＮｏｔｃｈシグナル伝達作用因子によるシグナル伝達を低下させることにおけるその物質の何らかの効果を監視することによって容易に決定することができる（すなわちいわゆる「拮抗因子」測定法で）。
【０１３９】
一実施形態では、調節因子は有機化合物またはその他の化学物質でありうる。たとえば、調節因子は二つ以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物でありうる。ここで、「ヒドロカルビル基」の語は、少なくともＣおよびＨを含みまた任意に１つ以上の他の適当な置換基を含みうる基を意味する。そのような置換基の例は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環状基などを含みうる。置換基が環状基である可能性に加えて、置換基の組み合わせは環状基を形成しうる。ヒドロカルビル基が二個以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、少なくとも２個の炭素は、適当な元素または基を介して結合することができる。このように、ヒドロカルビル基はヘテロ原子を含むことができる。適当なヘテロ原子は当業者に明らかとなり、たとえば、硫黄、窒素、および酸素を含む。調節因子候補は少なくとも１つの環状基を含む。環状基は、非融合型多環基といった多環基であることができる。一部の用途のためには、本物質は、別のヒドロカルビル基と結合した、前記環状基のうち少なくとも１つを含む。
【０１４０】
好ましい一実施形態では、調節因子はアミノ酸配列またはその化学誘導体、またはその組み合わせを含む。調節因子はまた抗体であることができる。
【０１４１】
「抗体」の語は、完全な分子および、抗原決定基と結合することができるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖといったその断片を含む。これらの抗体断片はその抗原または受容体と選択的に結合する能力の一部を保持し、たとえば下記を含む；
（ｉ） Ｆａｂは、抗体 分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、酵素パパインを用いての完全な抗体の消化によって作製することができ、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を生じる； 
（ｉｉ）Ｆａｂ’は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元して、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を生じることによって得ることができる；抗体分子あたり２個のＦａｂ’断片が得られる；
（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２は、抗体分子の断片であり、完全な抗体をペプシンで処理し、その後還元しないことによって得ることができる；Ｆ（ａｂ’）２は２本のジスルフィド結合によって結びついた２個のＦａｂ’断片の二量体である；
（ｉｖ） ｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖の可変領域を融合した一本鎖分子として含む、遺伝子操作された断片を含む；および
（ｖ） たとえば各重鎖および軽鎖の１つの定常領域および１つの可変領域からの自己組織化によって構築された、いわゆる「組み合わせ抗体」。
（たとえば、参照により本開示に含まれるハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ），『抗体；実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）， ニューヨーク（１９８８）を参照）。
【０１４２】
調節因子は合成化合物または天然の単離された化合物でありうる。
【０１４３】
本発明の複合体は、必要に応じて、医薬品として許容される塩の形で提供することができる。たとえば、複合体はアミノ基および／またはカルボキシル基またはそれに類似した基の存在のために、酸性塩および／または塩基性塩を形成することができる可能性がある。
【０１４４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達
ここで用いられる通り、「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達」という表現は「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路」という表現と同義であり、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化を結果として生じる、またはその結果として起こる、（およびそれを含む）任意の１つ以上の上流または下流の現象をいう。
【０１４５】
好ましくは、「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達」によって我々は、Ｎｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用の活性化または阻害、ＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンド発現または活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、および、たとえばＮｏｔｃｈのタンパク質分解による切断およびＲａｓ−Ｊｎｋシグナル伝達経路のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを含むＮｏｔｃｈシグナル伝達のおよび活性化または阻害を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体活性化または阻害の直接上流または下流の任意の現象をいう。
【０１４６】
したがって、「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達」によって我々は、遺伝子的におよび／または分子的に、Ｎｏｔｃｈ受容体タンパク質と相互作用する要素を含むシグナル送受経路としてのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路をいう。たとえば、分子的および遺伝子的基礎の両方においてＮｏｔｃｈタンパク質と相互作用する要素は、単に例示目的のみで、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、およびＤｅｌｔｅｘである。Ｎｏｔｃｈタンパク質と遺伝子的に相互作用する要素は、単に例示目的のみで、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｓｕ（Ｈ）、およびＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎである。
【０１４７】
本発明の好ましい一態様では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、細胞外でまたは細胞膜で起こるシグナル伝達現象を意味する。別の一態様では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はまた、たとえば細胞質内、または細胞核内のような、細胞内で起こるシグナル伝達現象も含むことができる。
【０１４８】
１つの形態では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の調節因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのタンパク質でありうる。
【０１４９】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のためのタンパク質とは、Ｎｏｔｃｈの活性化、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流現象、下流標的遺伝子の転写調節、および他の非転写下流現象（たとえば既存タンパク質の翻訳後修飾）を含む、Ｎｏｔｃｈ受容体を介するシグナル伝達に関与する分子を意味する。好ましくは、当該タンパク質は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子の活性化を可能にするドメインを含む。
【０１５０】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の非常に重要な成分は、Ｎｏｔｃｈ受容体／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用である。本発明の好ましい一形態では、シグナル伝達は特異的シグナル伝達であることができ、これはそのシグナルが、サイトカインシグナル伝達といった何らかの他の顕著な緩衝するかまたは競合する原因でなく、実質的に、または少なくとも主に、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路から、および好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用から結果として生じることを意味する。したがって、好ましい一実施形態では、ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈシグナル伝達」の語は、サイトカインシグナル伝達を除外する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を下記により詳細に説明する。
【０１５１】
Ｎｏｔｃｈ依存性転写活性化の主要な標的は、Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ複合体遺伝子（Ｅ[ｓｐｌ]）である。さらにこれらの遺伝子は、Ｓｕ（Ｈ）タンパク質による結合の直接の標的であること、およびＮｏｔｃｈシグナル伝達に反応して転写活性化されることが示されている。哺乳類Ｓｕ（Ｈ）ホモログＣＢＦ１と相互作用してそれを転写抑制因子から転写活性化因子へ変換するウイルスコアクチベータータンパク質であるＥＢＮＡ２との類推によって、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインは、おそらく他のタンパク質と共同して、Ｓｕ（Ｈ）／ＣＢＦ１と結合してＳｕ（Ｈ）／ＣＢＦ１がＥ（ｓｐｌ）および他の標的遺伝子の転写を活性化することを可能にする活性化ドメインに寄与しうる。Ｓｕ（Ｈ）／ＣＢＦ１はすべてのＮｏｔｃｈ依存性の決定に必要ではないこともまた注目すべきであり、これは、Ｎｏｔｃｈが他のＤＮＡ結合性転写因子と結合することによって、または細胞外シグナルを伝達する他の機構を用いることによって、一部の細胞運命選択を媒介することを示す。
【０１５２】
本発明の一態様によると、活性物質はＮｏｔｃｈ タンパク質またはＮｏｔｃｈ タンパク質のアナログを含みうる。
【０１５３】
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈのアナログ」の語は、Ｎｏｔｃｈのシグナル伝達能力を保持しているその変異体を含む。「アナログ」には、Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達 能力を持つが、一般的にＮｏｔｃｈとは異なる進化的起源を有するタンパク質を含める。Ｎｏｔｃｈのアナログは、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０、またはＬＭＰ２Ａといった、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質を含む。
【０１５４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのタンパク質で、我々はＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の任意の１つ以上の成分を活性化することができる分子を意味する。
【０１５５】
好ましい一実施形態では、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子は、Ｎｏｔｃｈリガンドの全部または一部、または、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードするポリヌクレオチドを含みうる。本発明における用途のＮｏｔｃｈリガンドは、典型的には、さまざまな哺乳類細胞、たとえば造血幹細胞およびＴ細胞、の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドと結合することができる内因性（天然に存在する）Ｎｏｔｃｈリガンドを含む。
【０１５６】
ここで用いられる「Ｎｏｔｃｈリガンド」の語は、Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して生物学的効果を生じることができる物質を意味する。ここで用いられるその語はしたがって、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ（たとえば哺乳類リガンドＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２およびホモログ）といった天然に存在するタンパク質リガンド（たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、脊椎動物、哺乳類由来）およびその生物学的に活性な断片およびＮｏｔｃｈ受容体に対する抗体、およびペプチドミメティック、天然リガンドに対して対応する生物学的効果を有する抗体および小分子を含む。好ましくはＮｏｔｃｈリガンドはＮｏｔｃｈ受容体と結合によって相互作用する。
【０１５７】
現在までに同定された哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの具体例は、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａまたはＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ１（たとえばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））；Ｄｅｌｔａ−３（たとえばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））および Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））（たとえばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ_０１６９４１−ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ））および米国特許第６１２１０４５（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）；Ｄｅｌｔａ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０４３８９４およびＡＦ２５３４６８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））；およびＳｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１およびＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７３４号パンフレット）；Ｊａｇｇｅｄ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ７３９３６−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））およびＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＬＡＧ−２を含む。ファミリーメンバーのホモロジーは大きい。ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３、Ｄｅｌｔａ４、Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２の配列は本文書の図に示す。
【０１５８】
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
Ｎｏｔｃｈリガンドはいくつかの特徴的なドメインを含む。さまざまな天然に存在するヒトＮｏｔｃｈリガンドについての一部の予想／候補ドメイン位置（前駆タンパク質中のアミノ酸番号付けに基づく）を下記に示す；
【表１】
2006513260.tif 000008
【表２】
2006513260.tif 000009
【表３】
2006513260.tif 000010
【表４】
2006513260.tif 000011
【表５】
2006513260.tif 000012
【０１５９】
ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、下記の共通アミノ酸配列（配列ＩＤ番号；１）の大部分または全部を含みうる；
【化７】
2006513260.tif 000013
【０１６０】
好ましくはＤＳＬドメインは下記の共通アミノ酸配列（配列ＩＤ番号；２）の大部分または全部を含みうる；
【化８】
2006513260.tif 000014
ここで；
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはヒスチジンといった芳香族アミノ酸残基である；
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシンまたはバリンといった非極性アミノ酸残基である；
ＢＡＳは、アルギニンまたはリジンといった塩基性アミノ酸残基である；および
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンといった酸またはアミドアミノ酸残基である。
【０１６１】
好ましくはＤＳＬドメインは下記の共通アミノ酸配列（配列ＩＤ番号；３）の大部分または全部を含みうる；
【化９】
2006513260.tif 000015
（ここでＸａａは任意のアミノ酸であることができ、Ａｓｘはアスパラギン酸またはアスパラギンのどちらかである）。
【０１６２】
さまざまなな起源に由来するＮｏｔｃｈリガンドからのＤＳＬドメインの整列を図３に示す。
【０１６３】
使用するＤＳＬドメインは、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０１６４】
したがって、たとえば、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、適切には少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６５】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６６】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６７】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６８】
代替として、本発明における用途のためのＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１６９】
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、血液凝固カスケードに関与するものを含む、さまざまなタンパク質、およびＥＧＦおよびＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドで見つかっている（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ， １９８８， Ｃｅｌｌ ５３； ５０５−５１８）。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸおよびＸといった細胞外タンパク質で（リーズ（Ｒｅｅｓ）他， １９８８， ＥＭＢＯ Ｊ． ７；２０５３−２０６１；フュリーおよびフュリー（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ）， １９８８， Ｃｅｌｌ ５３； ５０５−５１８）、他のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子で（クヌースト（Ｋｎｕｓｔ）他， １９８７ ＥＭＢＯ Ｊ． ７６１−７６６；ロスバーグ（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ）他， １９８８， Ｃｅｌｌ ５５；１０４７−１０５９）、およびトロンボモジュリン（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）他， １９８７， ＥＭＢＯ Ｊ． ６；１８９１−１８９７）およびＬＤＬ受容体（ズドホフ（Ｓｕｄｈｏｆ）他， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８；８１５−８２２）といった一部の細胞表面受容体タンパク質で見つかっている。タンパク質結合部位が、トロンボモジュリンおよびウロキナーゼ中のＥＧＦ反復ドメインにマッピングされている（クロサワ（Ｋｕｒｏｓａｗａ）他， １９８８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６３；５９９３−５９９６；アペラ（Ａｐｐｅｌｌａ）他， １９８７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２；４４３７−４４４０）。
【０１７０】
ＰＲＯＳＩＴＥによって報告された通り、ＥＧＦドメインは典型的には、（ＥＧＦにおいて）ジスルフィド結合に関与すると示されている６個のシステイン残基を含む。主構造は、二本鎖のβ−シートに続くループとその後のＣ末端の短い二本鎖のシートであると提案されているが必ずしも必要ではない。保存されたシステインの間のサブドメインは、典型的なＥＧＦ様ドメインの下記の略図に示す通り、長さが大きく異なる；
【化１０】
2006513260.tif 000016
ここで；
’Ｃ’；ジスルフィド結合に関与する保存されたシステイン。
’Ｇ’；しばしば保存されたグリシン
’ａ’；しばしば保存された芳香族アミノ酸
’ｘ’；任意の残基
５番目と６番目のシステインの間の領域は、２個の保存されたグリシンを含み、そのうち少なくとも１個は通常は大部分のＥＧＦ様ドメイン中に存在する。
【０１７１】
使用するＥＧＦ様ドメインは、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ラット、マウスまたはヒトを含む任意の適当な生物種に由来することができる。好ましくはＥＧＦ様ドメイン、脊椎動物、好ましくは哺乳類、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０１７２】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７３】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７４】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７５】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７６】
代替として、本発明における用途のためのＥＧＦ様ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１７７】
実際問題として、任意の特定のアミノ酸配列が別の配列と少なくともＸ%同一であるかどうかは、従来は既知のコンピュータープログラムを用いて決定することができる。たとえば、クエリー配列と対象配列との間の最良の全体の一致は、全体配列整列ともいうが、ブルトラグ（Ｂｒｕｔｌａｇ）他 （Ｃｏｍｐ． Ａｐｐ． Ｂｉｏｓｃｉ． （１９９０） ６；２３７−２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムといったプログラムを用いて決定することができる。配列整列では、クエリー配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは、両方ともアミノ酸配列である。全体配列整列の結果は、パーセント同一性として与えられる。ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムを用いて得られた整列スコアもまた、たとえばデフォルト設定と共に用いることができる（たとえばヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｄ．， トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）Ｊ．， ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）Ｔ．トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）Ｊ．Ｄ．， ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）Ｄ．Ｇ．， ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）Ｔ．Ｊ．（１９９４）．
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ；配列重み付け、位置特異的ギャップ失点および重みマトリクス選択による漸進的な複数配列整列の感度向上（ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ； ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ．）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２２；４６７３−４６８０を参照）。 
【０１７８】
「ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン」の語は、Ｎｏｔｃｈリガンド配列の、Ｎ末端からＤＳＬドメインの開始までの部分を意味する。この語は配列変異体、断片、誘導体、および天然に存在するドメインに対応する活性を有するミメティックを含むことが理解される。
【０１７９】
適切には、たとえば、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８０】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８１】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ１のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８２】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ３のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８３】
代替として、本発明における用途のためのＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインは、たとえば、ヒトＤｅｌｔａ４のＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインに対して、少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%、好ましくは少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、好ましくは少なくとも９５%のアミノ酸配列同一性を有しうる。
【０１８４】
ここで用いられる「異種アミノ酸配列」または「異種ヌクレオチド配列」の語は、天然の配列またはそのコード配列には見出されない配列を意味する（たとえばＮｏｔｃｈリガンド配列の場合には、天然のＮｏｔｃｈリガンド配列には見出されない）。典型的には、たとえば、そのような配列は、ＩｇＦｃドメイン、またはＶ５Ｈｉｓタグといったタグでありうる。
【０１８５】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化のためのポリペプチドとは、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として発現する任意のポリペプチド、およびそのようなポリペプチドの発現に関与する任意のポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも意味する。
【０１８６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害のためのタンパク質またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドで、我々はＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の任意の１つ以上の成分、を阻害することができる分子を意味する。
【０１８７】
一実施形態ではＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はＮｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節することができる分子でありうる。ある分子は、好ましくは治療的有効性を提供するのに十分な程度に、リガンドとのＮｏｔｃｈの相互作用を阻害することができる場合、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を調節すると考えられる。 
【０１８８】
任意の１つ以上の適当な標的−たとえばアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列−は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を調節することができる化合物を同定するために、さまざまな医薬スクリーニング技術の任意のものにおいて、用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液中で遊離しているか、固体担体上に付加されているか、細胞表面上に保持されているか、または細胞内に位置することができる。
【０１８９】
医薬スクリーニングのための技術は、Ｇｅｙｓｅｎの１９８４年９月１３日公開の欧州特許第０１３８８５５号明細書に記載の方法に基づくことができる。要約すると、多数の異なる小ペプチド候補調節因子または標的化分子が、プラスチックピンまたは何らかの他の表面といった固体基材上に合成される。ペプチド被験化合物を適当な標的またはその断片と反応させ洗浄する。結合物をその後に、たとえば本分野でよく知られた方法を適当に当てはめることによって、検出する。精製された標的はまた、医薬スクリーニング技術における使用のために、プレート上に直接被覆することができる。高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）用に役に立つプレートは、好ましくは９６、３８４、または３８４を超えるウェル／プレートを有するマルチウェルプレートとなる。細胞はまた、「芝生状」として広げることができる。代替として、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉して固体担体上に固定化することができる。高処理量スクリーニングを、合成化合物について上述したように、有機候補調節因子および標的化分子を同定するために用いることができる。
【０１９０】
本発明はまた、標的と結合することができる中和抗体が、標的との結合について特異的に被験化合物と競合する、競合医薬スクリーニング分析も考慮する。
【０１９１】
Ｎｏｔｃｈ受容体といったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の成分と結合することができる抗体、ペプチドミメティックおよび小有機分子といった物質のスクリーニングおよび開発のための技術はよく知られている。これらは、シグナル伝達タンパク質を発現するためのファージディスプレイ系の使用、およびトランスフェクションした大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）またはその他の微生物の培養を用いて結合化合物候補の結合試験のためのタンパク質を産生することを含む（たとえば、Ｇ．セサリーニ（Ｃｅｓａｒｉｎｉ）， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３０７（１）；６６−７０ （Ｊｕｌｙ １９９２）； Ｈ． グラム（Ｇｒａｍ）他， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １６１；１６９−１７６ （１９９３）； およびＣ．サマー（Ｓｕｍｍｅｒ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ８９；３７５６−３７６０ （１９９２年５月）を参照）。他のライブラリおよびスクリーニング技術は、たとえば、米国特許第６２８１３４４号明細書（ファイロス（Ｐｈｙｌｏｓ））に記載されている。
【０１９２】
Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達 およびＮｏｔｃｈ 受容体 活性化
Ｎｏｔｃｈはショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で、二つの異なるリガンドＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅについての受容体として機能する膜貫通タンパク質として最初に記載された。脊椎動物は複数のＮｏｔｃｈ受容体およびリガンドを発現する（下記で考察）。少なくとも４種類のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１，Ｎｏｔｃｈ−２，Ｎｏｔｃｈ−３、およびＮｏｔｃｈ−４）が現在までにヒト細胞で同定されている（たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３０８６０２，ＡＦ３０８６０１およびＵ９５２９９−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を参照）。たとえば、ヒトＮｏｔｃｈ１およびＮｏｔｃｈ２の配列を本文書の図に示す。
【０１９３】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は単一のポリペプチド前駆体として合成され、フリン様転換酵素による切断を受けて２つのポリペプチド鎖を生じ、それがさらにプロセシングされて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体は２つのＮｏｔｃｈタンパク質分解産物のヘテロダイマーを含み、一方は細胞外ドメインの一部から成るＮ末端断片、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化する、Ｎｏｔｃｈのタンパク質分解による切断段階は、ゴルジ装置で起こり、フリン様転換酵素によって媒介される。
【０１９４】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、最大３６個の上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復[Ｎｏｔｃｈ１／２＝３６、Ｎｏｔｃｈ３＝３４、およびＮｏｔｃｈ４＝２９]、３個のシステインリッチ反復（Ｌｉｎ−Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）反復）および細胞質ドメインを含む１個の膜貫通サブユニットを含む細胞外ドメインを含むヘテロ二量体分子として膜に付着している。Ｎｏｔｃｈの細胞質ドメインは６個のアンキリン様反復、１個のポリグルタミン鎖（ＯＰＡ）および１個のＰＥＳＴ配列を含む。ＲＡＭ２３という別の１個のドメインがアンキリン反復の近位側に存在し、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではＨａｉｒｌｅｓｓ抑制因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ）[Ｓｕ（Ｈ）]、脊椎動物ではＣＢＦ１として知られる転写因子との結合に関与している（タムラ（Ｔａｍｕｒａ）Ｋ， 他 （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ５；１４１６−１４２３ （Ｔａｍｕｒａ））。Ｎｏｔｃｈリガンドはまた、複数のＥＧＦ様反復を細胞外ドメイン中に、すべてのＮｏｔｃｈリガンドに特徴的であるシステインに富むＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ Ｌａｇ２）ドメインと共に示す（アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８；２２５−２３２， アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４；７７０−７７６）。
【０１９５】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、ＤｅｌｔａおよびＳｅｒｒａｔｅといった細胞外リガンドの、Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインのＥＧＦ様反復との血業によって活性化される。Ｄｅｌｔａは活性化のために時に切断を必要としうる。ＤｅｌｔａをＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼであるクズバニアン（Ｋｕｚｂａｎｉａｎ）によって細胞表面で切断することができ、その切断現象はＤｅｌｔａの可溶性の活性型を放出する。ヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発がん性変異体、別名ＴＡＮ−１は、短縮された細胞外ドメインを持つが、構成的に活性であり、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
【０１９６】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内−ドメイン反復は、細胞内シグナル伝達タンパク質との物理的相互作用を媒介する。非常に顕著なことに、ｃｄｃ１０／アンキリン反復は、Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｈａｉｒｌｅｓｓ[Ｓｕ（Ｈ）]と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｂ細胞のエプスタイン・バーウイルス誘導性不死化に関与する哺乳類ＤＮＡ結合タンパク質であるＣ−プロモーター結合因子−１[ＣＢＦ−１]のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホモログである。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）はｃｄｃ１０／アンキリン反復と細胞質中で結合し、Ｎｏｔｃｈ受容体と隣接する細胞上のリガンドであるＤｅｌｔａとの相互作用の際に、核へ移動することが示されている。Ｓｕ（Ｈ）はいくつかの遺伝子のプロモーター中に見出される応答配列を含み、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路において重要な下流タンパク質であることが見出されている。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Ｈａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている。
【０１９７】
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）はまた、直接の核機能を有する（Ｌｉｅｂｅｒ他 （１９９３） Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ ７（１０）；１９４９−６５ （Ｌｉｅｂｅｒ））。近年の研究は実際に、Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６個のｃｄｃ１０／アンキリン反復が核に到達し転写活性化に参加することを必要とすることを示している。Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部のタンパク質分解切断部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間と同定されている（部位３、またはＳ３という）（シュレーター（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）， Ｅ．Ｈ． 他 （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８３）；３８２−６ （Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ））。核への進入のためにｃｄｃ１０／アンキリン反復を放出するタンパク質分解切断段階は、プレセニリン（Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）活性に依存すると考えられている。
【０１９８】
細胞内ドメインは核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリータンパク質であるＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ， Ｓｕ（Ｈ）、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）ではＬａｇ−２）と転写活性化因子複合体を形成することが示されている（シュレーター（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）；シュトルール（Ｓｔｒｕｈｌ）， Ｇ． 他 （１９９８） Ｃｅｌｌ ９３（４）；６４９−６０ （Ｓｔｒｕｈｌ））。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体はその後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｋｅ）１および５といった標的遺伝子を活性化する（ワインマスター（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）Ｇ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． １０；３６３−３６９ （Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ））。このＮｏｔｃｈの核機能はまた、哺乳類Ｎｏｔｃｈホモログについても示されている（ルー（Ｌｕ）， Ｆ． Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３（１１）；５６６３−７ （Ｌｕ））。
【０１９９】
Ｓ３プロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に反応してのみ生じる。初期のＮｏｔｃｈ受容体のゴルジにおける翻訳後修飾（ムンロー（Ｍｕｎｒｏ）Ｓ， フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）Ｍ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １０；８１３−８２０ （Ｍｕｎｒｏ）；ユー（Ｊｕ）ＢＪ， 他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０５；１９１−１９５ （Ｊｕ））は、少なくとも部分的に、２種類のリガンドのどちらが細胞表面上に発現されるかを調節するように見える。Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｌｉｎ／Ｎｏｔｃｈモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるフリンジ（Ｆｒｉｎｇｅ）によって細胞外ドメインで修飾される。Ｆｒｉｎｇｅは、Ｏ−結合型フコース基をＥＧＦ様反復に付加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）ＤＪ， 他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６；３６９−３７５ （Ｍｏｌｏｎｅｙ）、ブルッカー（Ｂｒｕｃｋｅｒ）Ｋ， 他 （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６；４１１−４１５ （Ｂｒｕｃｋｅｒ））。Ｆｒｉｎｇｅによるこの修飾はリガンド結合を妨げないが、リガンドに誘導されるＮｏｔｃｈにおける立体構造変化に影響しうる。さらに、近年の研究は、Ｆｒｉｎｇｅの作用はＮｏｔｃｈを修飾してＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドと機能性に相互作用することを妨げるが、優先的にＤｅｌｔａと結合することを可能にすることを示唆する（パニン（Ｐａｎｉｎ）ＶＭ， 他 （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７；９０８−９１２ （Ｐａｎｉｎ）、ヒックス（Ｈｉｃｋｓ）Ｃ， 他 （２０００） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２；５１５−５２０ （Ｈｉｃｋｓ））。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）は単一のＦｒｉｎｇｅ遺伝子を持つが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Ｒａｄｉｃａｌ， ＭａｎｉｃおよびＬｕｎａｔｉｃ Ｆｒｉｎｇｅｓ） （アーヴィン（Ｉｒｖｉｎｅ）ＫＤ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌ． ９；４３４−４４１ （Ｉｒｖｉｎｅ））。
【０２００】
Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル伝達は、２つの異なる経路を介して起こりうる（たとえば図１を参照）。よりよく定義された経路は、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）のタンパク質分解切断を含み、ＮｏｔｃｈＩＣは核へ移動して、ＣＳＬファミリータンパク質のＣＢＦ１（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ではｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ ｈａｉｒｌｅｓｓ， Ｓｕ（Ｈ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ではＬａｇ−２）と転写活性化因子複合体を形成する。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体はその後、ｂＨＬＨタンパク質であるＨＥＳ（ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ｓｐｌｉｔ ｌｉｋｅ）１および５といった標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈはまた、タンパク質Ｄｅｌｔｅｘを含む細胞質亜鉛フィンガーが関与するＣＢＦ１−非依存的な方法でシグナル伝達することができる。ＣＢＦ１とは異なり、ＤｅｌｔｅｘはＮｏｔｃｈ活性化後に核へ移動しないが、Ｇｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節することができる。
【０２０１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の標的遺伝子は、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓファミリーの遺伝子（特にＨｅｓ−１）、Ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ [Ｅ（ｓｐｌ）]複合体遺伝子、ＩＬ−１０、ＣＤ−２３、ＣＤ−４およびＤｌｌ−１を含む。
【０２０２】
Ｄｅｌｔｅｘは、細胞内 ドッキングタンパク質であり、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部との相互作用部位から離れる際にＳｕ（Ｈ）と置き換わる。Ｄｅｌｔｅｘは亜鉛フィンガーを含む細胞質タンパク質である（アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他 （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８；２２５−２３２； アルタバニス・ツァコマス（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ）他 （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４；７７０−７７６； オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）Ｂ， ミーレ（Ｍｉｅｌｅ）Ｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１；６５３−６６３ （Ｏｓｂｏｒｎｅ））。ＤｅｌｔｅｘはＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアンキリン反復と相互作用する。ＤｅｌｔｅｘはＧｒｂ２と相互作用してＲａｓ−ＪＮＫシグナル伝達経路を調節することにより、Ｎｏｔｃｈ経路活性化を促進することを研究が示している（マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）他 （１９９５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１（８）；２６３３−４４；マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）Ｋ， 他 （１９９８） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９；７４−７８）。Ｄｅｌｔｅｘはまた、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部と結合することを妨げるドッキングタンパク質として作用する（マツノ（Ｍａｔｓｕｎｏ））。このように、Ｓｕ（Ｈ）は核内へ放出され、そこで転写調節因子として作用する。近年の証拠はまた、脊椎動物Ｂ細胞系において、Ｓｕ（Ｈ）ホモログのＣＢＦ１でなくＤｅｌｔｅｘが、Ｅ４７機能の阻害を担っていることを示唆する（オルデントリッヒ（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ）他 （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８；２２３０−２２３９ （Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ））。Ｄｅｌｔｅｘの発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として、正のフィードバックループによってアップレギュレートされる。ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｄｅｌｔｅｘ（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５３７００に見出される。
【０２０３】
Ｈｅｓ−１ （Ｈａｉｒｙ−ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｓｐｌｉｔ−１） （タケバヤシ（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ）Ｋ． 他 （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（７）；１５０−６ （Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ））は、へリックス−ループ−へリックスの基本構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１はＣＤ４サイレンサー中の重要な機能部位と結合し、ＣＤ４遺伝子発現の抑制に結びつく。このように、Ｈｅｓ−１はＴ細胞運命の決定に強力に関与している。Ｈｅｓファミリーからの他の遺伝子は、Ｎｏｔｃｈ活性化によって発現がアップレギュレートされるＨｅｓ−５（Ｓｐｌｉｔホモログの哺乳類エンハンサー）、およびＨｅｓ−３を含む。Ｈｅｓ−１の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｈｅｓ−１の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１６４６４に見出される。
【０２０４】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体[Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ]（ライマイスター（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ）Ｃ． 他 （１９９９） Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ８５（１−２）；１７３−７ （Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ））は７個の遺伝子を含み、そのうちＥ（ｓｐｌ）およびＧｒｏｕｃｈｏだけが突然変異により目に見える表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）はＳｐｌｉｔ突然変異を促進する能力に因んで命名され、ＳｐｌｉｔはＮｏｔｃｈの別名である。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子はａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体遺伝子発現の調節を介してＤｅｌｔａを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。
【０２０５】
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン産生を抑制することができる、Ｔｈ２細胞によって産生される因子としてマウスで最初に特徴づけられた。その後、ＩＬ−１０はマクロファージ、ケラチノサイト、Ｂ細胞、Ｔｈ０細胞、およびＴｈ１細胞を含む多数の他の細胞型によって産生されることが示された。ＩＬ−１０は、現在はウイルスＩＬ−１０と表されるエプスタイン−バーｂｃｒｆ１遺伝子と大きなホモロジーを示す。いくつかの免疫刺激効果が報告されているが、ＩＬ−１０は主に免疫抑制性サイトカインと考えられている。Ｔ細胞応答のＩＬ−１０による阻害は、抗原提示細胞の付帯機能の低下を通じて主に媒介される。ＩＬ−１０は特に、マクロファージによる数々の炎症促進性サイトカインの産生を抑制すること、および共刺激分子およびＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害することが報告されている。ＩＬ−１０はまた、好中球および好酸球といった他の骨髄細胞に対して抗炎症作用を発揮する。Ｂ細胞に対しては、ＩＬ−１０はアイソタイプ転換および増殖に影響する。より近年に、ＩＬ−１０は調節Ｔ細胞の誘導において、およびその抑制作用の可能な媒介因子として、役割を果たすことが報告された。ＩＬ−１０がＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の直接の下流の標的かどうかは不明であるが、その発現はＮｏｔｃｈ活性化と一致して強くアップレギュレートされることが見出されている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋ整理番号ＧＩ１０４１８１２に見出される。
【０２０６】
ＣＤ−２３は、Ｂ細胞活性化および増殖の重要な分子であるヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）である。ＣＤ−２３はＩｇＥに対する低親和性受容体である。さらに、短縮型分子を分泌することができ、その後、強力な細胞分裂誘起性増殖因子として機能する。ＣＤ−２３の配列はＧｅｎＢａｎｋ整理番号ＧＩ１７８３３４４に見出される。
【０２０７】
ＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球活性化タンパク質４）は、Ｔ細胞の表面上に見出される付属分子であり、気道炎症細胞動員の調節およびアレルゲン吸入後のＴヘルパー細胞分化に役割を果たすと考えられている。ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子のプロモーター領域はＣＢＦ１応答配列を有し、その発現はＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ４の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１５００６に見出される。
【０２０８】
Ｄｌｘ−１（ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ−１）（マクギネス（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ）Ｔ． 他 （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅｓ ３５（３）；４７３−８５ （ＭｃＧｕｉｎｅｓｓ））発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。Ｄｌｘ遺伝子の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１０００〜３に見出される。
【０２０９】
ＣＤ−４発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。ＣＤ−４抗原の配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ００６９６６に見出される。
【０２１０】
Ｎｕｍｂ、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、およびＤｓｈといったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与する他の遺伝子、およびＮｏｔｃｈ活性化によって発現が調節されるすべての遺伝子は、本発明の範囲に含まれる。
【０２１１】
上記の通り、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーは、Ｔ細胞運命決定に影響する細胞−細胞シグナル伝達現象に関与する。このシグナル伝達において、ＮｏｔｃｈＩＣは核に局在化し、活性化された受容体として機能する。哺乳類ＮｏｔｃｈＩＣは転写抑制因子ＣＢＦ１と相互作用する。ＮｏｔｃｈＩＣ ｃｄｃ１０／アンキリン反復はこの相互作用に必須であると提案されている。シェ（Ｈｓｉｅｈ）ら（Ｈｓｉｅｈ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６（３）；９５２−９５９）は、マウスＮｏｔｃｈＩＣのＮ末端１１４アミノ酸領域はＣＢＦ１相互作用ドメインを含むとさらに示している。また、ＮｏｔｃｈＩＣは核内のＤＮＡに結合したＣＢＦ１を標的にし、抑制ドメインの遮蔽によりＣＢＦ１媒介抑制を止めることによって作用すると提案されている。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）不死化タンパク質ＥＢＮＡもまた、ＣＢＦ１拘束および抑制の遮蔽を利用して、ＣＢＦ１に抑制されたＢ細胞遺伝子の発現をアップレギュレートすることが知られている。このように、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の模倣が、ＥＢＶに導かれる不死化に関与する。ストローブル（Ｓｔｒｏｂｌ）ら（Ｓｔｒｏｂｌ ｅｔ ａｌ （２０００） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４（４）；１７２７−３５）は、同様に「ＥＢＮＡ２はしたがって、活性化されたＮｏｔｃｈ受容体の機能的同等物とみなしうる」ことを報告する。このカテゴリに入る他のＥＢＶタンパク質は、ＢＡＲＦ０（クサノ（Ｋｕｓａｎｏ）およびラーブ・トルアブ（Ｒａａｂ−Ｔｒｕａｂ）（２００１） Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５（１）；３８４−３９５ （Ｋｕｓａｎｏ ａｎｄ Ｒａａｂ−Ｔｒａｕｂ））およびＬＭＰ２Ａを含む。
【０２１２】
Ｎｏｔｃｈリガンドおよびホモログ
上記の通り、現在までに同定された哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンドの例は、Ｄｅｌｔａファミリー、たとえばＤｅｌｔａ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０８４５７６−ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））およびＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ３（マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｓｅｒｒａｔｅファミリー、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１およびＳｅｒｒａｔｅ−２（国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレットおよび国際公開第９２／１９７３４号パンフレット）、Ｊａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２９７７８−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、およびＬＡＧ−２を含む。ファミリーメンバー間のホモロジーは大きい。
【０２１３】
「ホモログ」によって、たとえば上述のような既知のＮｏｔｃｈ リガンドのうち任意の１つと、アミノ酸または核酸配列ホモロジーのどちらかである配列ホモロジーを示す遺伝子産物を意味する。典型的には、既知のＮｏｔｃｈリガンドのホモログは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個、好ましくは少なくとも５０個、適切には少なくとも１００個のアミノ酸、またはＮｏｔｃｈリガンドの全長の配列にわたって、少なくとも２０%、好ましくは少なくとも３０%、対応する既知のＮｏｔｃｈリガンドとアミノ酸レベルで同一である。二つ以上の アミノ酸または核酸 配列の間の配列ホモロジーを計算するための技術およびソフトウェアは本分野でよく知られている（たとえば ｈｔｔｐ；／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖおよびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，『分子生物学の最新プロトコル』（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９９５）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）を参照）。
【０２１４】
上記の通り、現在までに同定されたＮｏｔｃｈリガンドは、タンパク質のアミノ末端に２０ないし２２アミノ酸を含む診断的なＤＳＬドメインを（Ｄ＝Ｄｅｌｔａ、Ｓ＝Ｓｅｒｒａｔｅ、Ｌ＝Ｌａｇ２）、および細胞外表面上に１４まで、またはそれ以上のＥＧＦ様反復を有する。したがって、Ｎｏｔｃｈリガンドのホモログはまた、Ｎ末端にＤＳＬドメインを、および細胞外表面上に１４まで、またはそれ以上のＥＧＦ様反復を含むことが好ましい。
【０２１５】
加えて、適当なホモログは好ましくはＮｏｔｃｈ受容体と結合する能力がある。結合は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合測定法を含む、本分野で既知であるさまざまな技術によって評価することができ、また受容体の活性化（作用因子または部分作用因子の場合）は、たとえば、本文書の実施例および、本文が参照により本開示に含まれる国際公開第０３／０１２４４１号パンフレット（ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ））に記載された通りのレポーター測定法の使用によって測定することができる。
【０２１６】
Ｎｏｔｃｈリガンドのホモログは、いくつかの方法によって、たとえばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリを、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする核酸のすべてまたは一部を含むプローブを用いて、中等度または高度に厳密な条件下で（たとえば０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０oＣないし約６０oＣにて）プロービングすることによって同定することができる。代替として、ホモログはまた、保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログの中の配列を標的とするように設計されたプライマーを一般的に使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。そのプライマーは１つ以上の縮重位置を含み、既知の配列に対して単一の配列プライマーを用いた配列クローニングに使用されるよりも低い厳密条件下で用いられる。
【０２１７】
ポリペプチド物質は、哺乳類細胞から精製するか、適当な宿主細胞における組み換え発現によって得るか、または購入することができる。代替として、当該ポリペプチドをコードする核酸構造を用いることができる。別の一例として、ＤｅｌｔａまたはＳｅｒｒａｔｅといったＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンドの過剰発現は、ＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａ遺伝子といった内因性遺伝子を活性化することができる核酸構造の導入によって引き起こすことができる。特に、遺伝子活性化は、標的細胞のゲノム中のＳｅｒｒａｔｅまたはＤｅｌｔａプロモーターといった天然プロモーターの代わりに異種プロモーターを挿入する、相同組み換えの利用によって達成することができる。
【０２１８】
本発明の分子を活性化することは、別の一実施形態では、Ｎｏｔｃｈ−タンパク質発現または細胞膜上の提示またはシグナル伝達経路を修飾することができる可能性がある。標的細胞表面上の完全に機能するＮｏｔｃｈ−タンパク質の提示を促進する物質は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＫｕｚｂａｎｉａｎ遺伝子の産物といったマトリクスメタロプロテイナーゼ（ドクツ（Ｄｋｕｚ）他 （１９９７） Ｃｅｌｌ ９０； ２７１−２８０ （Ｄｋｕｚ））および他のＡＤＡＭＡＬＹＳＩＮ遺伝子ファミリーメンバーを含む。
【０２１９】
ポリペプチド、タンパク質、およびアミノ酸配列
ここで用いられる「アミノ酸配列」の語は、「ポリペプチド」の語および／または「タンパク質」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「ペプチド」の語と同義である。一部の場合には、「アミノ酸配列」の語は「タンパク質」の語と同義である。
【０２２０】
「ペプチド」は通常、アミノ酸１０個ないし４０個の長さ、好ましくはアミノ酸１０個ないし３５個の、短いアミノ酸配列をいう。
【０２２１】
アミノ酸配列は適当な起源から調製および単離することができ、または合成によって作製することができ、または組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。
【０２２２】
本発明で有用な「タンパク質」の定義内で、問題のタンパク質がその内因性機能の少なくとも１つを保持するような方法で、特定のアミノ酸残基を修飾することができ、そのような修飾タンパク質を「変異体」という。変異体タンパク質は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも一個のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって修飾されうる。
【０２２３】
典型的には、修飾された配列が、必要な標的活性を、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する能力を保持するという条件で、アミノ酸置換を、たとえば１、２または３ないし１０または２０個の置換を行うことができる。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を含みうる。
【０２２４】
本発明で有用であるタンパク質はまた、サイレント変異を生じおよび機能的に等価のタンパク質を結果として生じる、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有しうる。標的または調節機能が保持される限り、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または残基の両親媒的性質における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行いうる。たとえば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む；正に荷電したアミノ酸はリジンおよびアルギニンを含む；および、同様の親水性値を有する、非荷電の極性頭部基を持つアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。
【０２２５】
参照を簡略にするために、天然に存在するアミノ酸の１文字記号および３文字記号（およびその対応するコドン）を下記に示す； 
【表６】
2006513260.tif 000017
【０２２６】
保存的置換は、たとえば下記の表に従って行うことができる。２列目で同一区分にあり、および好ましくは３列目で同一行にあるアミノ酸は互いに置換が可能である；
【表７】
2006513260.tif 000018
【０２２７】
ここで用いられる「タンパク質」の語は、一本鎖ポリペプチド分子、および個々の構成ポリペプチドが共有または非共有的方法によって結合している複数ポリペプチド複合体を含む。ここで用いられる「ポリペプチド」および「ペプチド」の語は、モノマーがアミノ酸であってペプチドまたはジスルフィド結合を介して結びついているポリマーをいう。サブユニットおよびドメインの語はまた、生物学的機能を有するポリペプチドおよびペプチドをいうことができる。本発明で有用なペプチドは、少なくとも標的またはシグナル伝達調節能力を有する。「断片」はまた変異体でありその語は典型的には、結合測定法で対象であり、その結合相手が既知であるかまたは測定可能な、タンパク質の選択された領域をいう。「断片」はしたがって、完全長ポリペプチドの一部、たとえば長さが約８ないし約１５００アミノ酸、典型的には長さが約８ないし約７４５アミノ酸、好ましくは約８ないし約３００、より好ましくは約８ないし約２００アミノ酸、およびさらにより好ましくは長さが約１０ないし約５０または１００アミノ酸であるアミノ酸配列をいう。「ペプチド」は好ましくはアミノ酸１０個ないし４０個の長さ、好ましくはアミノ酸１０個ないし３５個の、短いアミノ酸配列をいう。
【０２２８】
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発といった標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。挿入を行う場合は、挿入部位の両側に天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域と共に挿入部をコードする合成ＤＮＡ。配列を適当な酵素を用いて切断することができ、合成ＤＮＡを切断部に繋ぐことができるように、隣接領域は、天然に存在する配列中の部位に対応する便利な制限部位を含む。コードされたタンパク質を作製するために、ＤＮＡをその後に本発明にしたがって発現させる。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について本分野で既知である数々の標準技術の単なる例であり、他の既知の技術もまた用いることができる。
【０２２９】
ヌクレオチド配列の変異体もまた作製することができる。そのような変異体は好ましくはコドンが最適化された配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡ安定性、および、したがって遺伝子発現を増大させる方法として本分野で既知である。遺伝子コードの冗長性は、いくつかの異なるコドンが同一のアミノ酸をコードする可能性があることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、およびセリンはそれぞれ、６種類の異なるコドンによってコードされる。異なる生物はその異なるコドンの使用に優先性を示す。たとえば、ＨＩＶといったウイルスは、多数の稀なコドンを用いる。稀なコドンが対応する一般的に用いられる哺乳類コドンで置換されるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳類標的細胞における当該配列の発現増加を達成することができる。哺乳類細胞およびさまざまな他の生物について、コドン用法表は本分野で既知である。
【０２３０】
タンパク質またはポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形でありうるかまたは、融合タンパク質または前駆体といった、より大きいタンパク質の一部でありうる。たとえば、精製の助けとなる、分泌配列またはリーダー配列または前配列を含む追加のアミノ酸配列（ＨＩＳオリゴマー、免疫グロブリンＦｃ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＦＬＡＧなどといった）を含めることはしばしば有利である。同様にそのような追加の配列は、組み換え産生の際に追加の安定性を与えるために時に望ましい可能性がある。そのような場合には、追加の配列を切断（たとえば化学的にまたは酵素的に）して最終産物を生じることができる。一部の場合には、しかし、追加の配列はまた望ましい薬理プロファイルも与える可能性があり（ＩｇＦｃ融合タンパク質の場合のように）、その場合は追加の配列が投与の際に最終産物中に存在するように、除去しないことが好ましい可能性がある。
【０２３１】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子または抗原／抗原決定基がヌクレオチド配列を含む場合、それは適切には、哺乳類細胞における発現のために最適化されたコドンでありうる。好ましい一実施形態では、そのような配列は全体が最適化されている。
【０２３２】
核酸およびポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも長さ１０塩基で最大１０，０００塩基以上のヌクレオチドの高分子型で、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはどちらかの種類のヌクレオチドの修飾形をいう。その語はＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖型、およびタンパク質核酸（ＰＮＡ）といった誘導体化型も含む。
【０２３３】
これらは標準的な組み換えＤＮＡ方法論を用いて構築することができる。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであることができ、好ましくはＤＮＡである。ＲＮＡである場合は、操作はｃＤＮＡ中間体を用いて実施することができる。一般的に、第一の領域をコードする核酸配列が調製され、適当な制限部位が５’および／または３’末端に与えられる。便利に配列はｐＢＲ３２２またはｐＵＣ１９を基礎とするプラスミドベクターといった標準の実験ベクター中で操作される（下記参照）。適当な技術の正確な詳細については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他著の『分子クローニング』（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８９）または同様の標準的参考書を参照することができる。
【０２３４】
第二の領域をコードする核酸は同様に、類似のベクター系において提供することができる。
【０２３５】
核酸の起源は、公表文献または、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータバンクへの参照によって確認することができる。目的の第一または第二の配列をコードする核酸は、起源が材料を提供してくれる場合は学術的起源または商業起源から、または配列データのみが利用可能である場合は合成または適当な配列をクローニングすることによって、入手することができる。一般的にこれは問題の遺伝子のクローニングを記載する文献情報源を参照することによって行うことができる。
【０２３６】
代替として、利用可能な配列データが限られている場合、または、既知の核酸と相同であるか、でなければ関連した核酸を発現したい場合は、本分野で既知である核酸配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列として、典型的な核酸を特徴づけることができる。
【０２３７】
数々の異なるヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の結果として、本発明に用いられる同一のタンパク質をコードすることができることが当業者に理解される。加えて、当業者は、通常の技術を用いて、本発明のヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質に影響しないヌクレオチド置換を行って、標的タンパク質または本発明のＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質が発現される任意の特定の宿主生物のコドン用法を反映することができることが理解される。
【０２３８】
一般的に、本発明で用いられるヌクレオチド配列に関する「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」の語は、結果として生じるヌクレオチド配列がＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子をコードするという条件で、当該配列からまたは当該配列への一個（以上）の核酸の、任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または付加を含む。
【０２３９】
上記に示す通り、配列ホモロジーに関して、好ましくは参照配列に対して少なくとも４０%、好ましくは少なくとも７０%、好ましくは少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%のホモロジーが存在する。より好ましくは少なくとも９５%、より好ましくは少なくとも９８%のホモロジーが存在する。ヌクレオチドホモロジー比較は上記の通り実施することができる。好ましい配列比較プログラムは上記のＧＣＧウィスコンシン・ベストフィット（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔ）プログラムである。初期設定のスコアリングマトリクスは同一のヌクレオチドごとに１０、およびミスマッチごとに−９の一致値を有する。初期設定のギャップ生成失点は−５０であり、初期設定のギャップ延長失点はヌクレオチド当たり−３である。
【０２４０】
本発明はまた、選択的に参照配列、またはその任意の変異体、断片または誘導体、または上記のいずれかの相補鎖とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも長さが１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも長さが２０、３０、４０または５０ヌクレオチドである。
【０２４１】
ここで用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、「それによって、核酸鎖が相補鎖と塩基対形成により結びつく過程」およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実施される増幅の過程を含むものとする。
【０２４２】
ここに示すヌクレオチド配列と、またはその相補鎖と、選択的にハイブリダイズすることができる、本発明で有用であるヌクレオチド配列は、一般的に、ここに示す対応するヌクレオチド配列と、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２５または３０、たとえば少なくとも４０、６０または１００以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも７５%、好ましくは少なくとも８５または９０%、およびより好ましくは少なくとも９５%または９８%相同である。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、好ましくはそのヌクレオチド配列と少なくとも８０または９０%およびより好ましくは少なくとも９５%相同である、そのヌクレオチド配列と相同な領域を含む。
【０２４３】
「選択的にハイブリダイズ可能な」の語は、プローブとして用いられるヌクレオチド配列が、本発明の標的ヌクレオチド配列がバックグラウンドより有意に高いレベルでプローブとハイブリダイズすることが見出されている条件下で用いられることを意味する。バックグラウンドのハイブリダイゼーションは、たとえば、スクリーニングされているｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ中に存在する他のヌクレオチド配列のために起こりうる。この現象において、バックグラウンドとは、プローブとライブラリの非特異的ＤＮＡメンバーとの間の相互作用によって生じる、標的ＤＮＡとで観察される特異的相互作用よりも強度が１０倍小さい、好ましくは１００倍小さいシグナルのレベルを意味する。相互作用の強度は、たとえば３２Ｐを用いてプローブを放射性標識することによってたとえば測定することができる。
【０２４４】
ハイブリダイゼーション条件は、ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）およびキンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）（１９８７， 『分子クローニング技術の手引き』（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １５２， アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に示された通り、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、下記に説明する「厳密性」を与える。
【０２４５】
最大の厳密性は典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下）で生じる；高い厳密性はＴｍの約５℃ないし１０℃下で；中等度の厳密性はＴｍの約１０℃ないし２０℃下で；および低い厳密性はＴｍの約２０℃ないし２５℃下で生じる。当業者によって理解される通り、最大厳密性のハイブリダイゼーションを用いて同一のヌクレオチド配列を同定または検出することができる一方、中等度（または低）厳密性ハイブリダイゼーションを用いて類似または関連ポリヌクレオチド配列を同定または検出することができる。
【０２４６】
好ましい一態様では、本発明は、厳密条件下で（たとえば６５℃および０．１ｘＳＳＣ{１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０）本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む。本発明のヌクレオチド配列が二本鎖である場合は、二重鎖の両方の鎖が、個別にまたは組み合わせで、本発明に包含される。ヌクレオチド配列が一本鎖である場合、そのヌクレオチド配列の相補配列もまた本発明の範囲内に含まれることが理解される。
【０２４７】
ヌクレオチド配列はいくつかの方法で得ることができる。ここに記載された配列の変異体は、たとえばある範囲の起源から作製されたＤＮＡライブラリをプロービングすることによって得ることができる。加えて、他のウイルス／細菌または細胞ホモログ、特に哺乳類細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、および霊長類細胞）で見出される細胞ホモログを得ることができ、そのようなホモログおよびその断片は一般的に、ここで配列一覧中に示された配列と選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種に由来するゲノムＤＮＡライブラリまたはそれから作製されたｃＤＮＡライブラリをプロービングし、そのようなライブラリを、参照ヌクレオチド配列の全部または一部を含むプローブを用いて、中等度ないし高厳密性の条件下でプロービングすることによって得ることができる。同様の検討が、本発明で有用なアミノ酸および／またはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子変異体を得ることに適用される。
【０２４８】
変異体および系統／種ホモログはまた、本発明の配列内の保存されたアミノ酸配列をコードする変異体およびホモログ内の配列を標的とするように設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存された配列は、たとえば、いくつかの変異体／ホモログに由来するアミノ酸配列を整列させることによって予測することができる。配列の整列は、本分野で既知であるソフトウェアを用いて実施することができる。たとえばＧＣＧウィスコンシン・パイルアップ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐ）プログラムは広く用いられている。縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つ以上の縮重部位を含み、既知の配列に対する単一の配列プライマーを使用する配列クローニングに用いられるよりも低い厳密性条件で用いられる。
【０２４９】
代替として、そのようなヌクレオチド配列は、特徴的な配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえば、ヌクレオチド配列が発現されている特定の宿主細胞についてコドン優先性を最適化するため、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である。制限酵素認識部位を導入するため、またはヌクレオチド配列によってコードされるＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の活性を変化させるため、他の配列変化が望まれる可能性がある。
【０２５０】
本発明で有用であるＤＮＡポリヌクレオチドといったヌクレオチド配列は、組み換えによって、合成によって、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製することができる。配列はまた標準的技術によってクローニングすることができる。一般的に、プライマーは、目的の核酸配列の、一度にヌクレオチド一個の段階的製法を含む合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は本分野で容易に利用可能である。
【０２５１】
より長いヌクレオチド配列は、一般的に組み換え手段を用いて、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて作製される。これは、クローニングを望む標的配列の領域に隣接する一対のプライマー（たとえば約１５ないし３０ヌクレオチドの）を作製し、プライマーを動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させ、目的領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、増幅された断片を単離し（たとえばアガロースゲル上で反応混合物を精製することによって）、増幅されたＤＮＡを回収することを含む。増幅されたＤＮＡを適当なクローニングベクターへクローニングすることができるように、プライマーは適当な制限酵素認識部位を含むように設計することができる。より大きな遺伝子については、この方法で一部を別々にクローニングし、その後に繋いで完全な配列を形成することができる。
【０２５２】
タンパク質およびポリペプチド発現
組み換え産生のためには、宿主細胞を遺伝子操作して発現系または本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、デービス（Ｄａｖｉｓ）らおよびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らといった多数の標準的な実験手引書に記載された通りの、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、および感染といった方法によって実施することができる。そのような方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで薬物送達系として使用することもできることが理解される。
【０２５３】
適当な宿主の代表的な例は、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞といった細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞といった真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞といった昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞といった動物細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞といったＴ細胞株；Ａ２０細胞といったＢ細胞株；および植物細胞を含む。
【０２５４】
本発明で有用なポリペプチドを産生するためには、幅広い発現系を用いることができる。そのようなベクターは、中でも、染色体由来、エピソーム由来、およびウイルス由来ベクター、たとえば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入配列由来、酵母染色体配列由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０といったパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、オーエスキー病ウイルスおよびレトロウイルスといったウイルス由来のベクター、およびコスミドおよびファージミドといったプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子に由来するもののようなその組み合わせに由来するベクターを含む。発現系構造は、発現を調節すると共に引き起こす調節領域を含むことができる。一般的に、ポリヌクレオチドを維持、増殖、または発現するためにおよび／または宿主においてポリペプチドを発現するために適当な任意の系またはベクターを、この際に発現のために用いることができる。適当なＤＮＡ配列は、たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らに示されたもののような幅広い既知で通常の技術のうち任意のものによって発現系に挿入することができる。
【０２５５】
翻訳されたタンパク質の、小胞体内腔へ、細胞膜周辺腔へ、または細胞外環境への分泌のために、適当な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であることができ、または異種シグナルであることができる。
【０２５６】
本発明における使用のための活性物質は、組み換え細胞培養から、硫安またはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むよく知られた方法によって回収および精製することができる。非常に好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリペプチド単離および／または精製の間に変性する場合は、タンパク質再折りたたみのための技術を用いて活性立体構造を再生することができる。
【０２５７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害のための物質
適切にはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の阻害因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体またはＮｏｔｃｈリガンドと相互作用し、好ましくは結合して、内因性Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用（「Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用」ともいう）に干渉するが受容体を活性化しない、または活性化するが内因性Ｎｏｔｃｈリガンドよりも程度が低い物質でありうる。そのような物質は、「Ｎｏｔｃｈ拮抗因子」または「Ｎｏｔｃｈ受容体拮抗因子」ということができる。好ましくはその阻害因子はリンパ球およびＡＰＣといった免疫細胞で、好ましくはリンパ球で、好ましくはＴ細胞で、Ｎｏｔｃｈリガンド−受容体相互作用を阻害する。
【０２５８】
適切には、たとえば、一実施形態では、本発明の複合体への組み込みのためのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、１個のＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインおよび１個以上のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。
【０２５９】
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のそのような阻害因子は、下記を含みうる；
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３またはＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、および、ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３またはＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有する少なくとも１つのＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド。
【０２６０】
適切には、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、下記を含みうる；
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３またはＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、および、ヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３またはＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有する０、１、または２個の、しかし２個までの、ＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチド。
【０２６１】
代替として、たとえば、本発明に記載の複合体における用途のためのＮｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、リガンド結合に関与するＮｏｔｃｈ細胞外ドメインの全部または一部、たとえば、ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４のＥＧＦドメインに対して好ましくは少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%のアミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。好ましくは少なくとも２個以上のそのようなＥＧＦドメインが存在する。このような物質は、内因性Ｎｏｔｃｈリガンドに結合することができ、それによってそのようなリガンドによるＮｏｔｃｈ活性化を阻害する。
【０２６２】
たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のそのような阻害因子は、ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１１に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%アミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメイン、および、ヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４のＥＧＦ１２に対して少なくとも３０%、好ましくは少なくとも５０%アミノ酸配列類似性または同一性を有するＮｏｔｃｈＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。
【０２６３】
たとえば、ＩｇＦｃドメインと融合したＮｏｔｃｈタンパク質の細胞外ドメインを含むさまざまな融合タンパク質／キメラが、たとえばＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能であり、たとえば下記の通り；Ｎｏｔｃｈ−１ラット組み換えラットＮｏｔｃｈ−１／Ｆｃキメラ、（カタログ番号１０５７−ＴＫ−０５０）；Ｎｏｔｃｈ−２組み換えラットＮｏｔｃｈ−２／Ｆｃキメラ、（カタログ番号１１９０−ＮＴ−０５０）；および
Ｎｏｔｃｈ−３マウス組み換えマウスＮｏｔｃｈ−３／Ｆｃキメラ、（カタログ番号１３０８−ＮＴ−０５０）。
【０２６４】
他のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路拮抗因子／阻害因子は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の成分間の相互作用を阻害する抗体、たとえばＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈタンパク質）またはＮｏｔｃｈリガンドに対する抗体を含む。
【０２６５】
したがって、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、Ｎｏｔｃｈ受容体を活性化することなくＮｏｔｃｈ受容体と結合する抗体、適切にはヒトＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３および／またはＮｏｔｃｈ４と結合する抗体であって、それによって正常なＮｏｔｃｈ−リガンド相互作用に干渉することで、内因性Ｎｏｔｃｈリガンドによる結合した受容体の活性化を低下させるかまたは阻害する抗体でありうる。
【０２６６】
代替として、たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子は、Ｎｏｔｃｈリガンドと結合する抗体、適切にはヒトＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３および／またはＤｅｌｔａ４またはヒトＪａｇｇｅｄ１および／またはＪａｇｇｅｄ２と結合する抗体であって、それによって正常なＮｏｔｃｈ−リガンド相互作用に干渉することで、結合したリガンドの内因性Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用を低下させるかまたは阻害する抗体でありうる。
【０２６７】
たとえば、ＮｏｔｃｈおよびＮｏｔｃｈリガンドに対する抗体は、米国特許第５６４８４６４号明細書、米国特許第５８４９８６９号明細書、および米国特許第６００４９２４号明細書（エール大学／インペリアル・キャンサー・テクノロジー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））に記載されており、その本文は参照により本開示に含まれる。
【０２６８】
Ｎｏｔｃｈ受容体に対して作製された抗体もまた、国際公開第００２０５７６号パンフレット（その本文は参照により本開示に含まれる）に記載されている。たとえば、この文書はヒトＮｏｔｃｈ−１ ＥＧＦ様反復１１および１２に対する抗体の作製を開示する。たとえば、特定の実施形態で、国際公開第００２０５７６号パンフレットは、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５４を有しＡ６で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５６を有しＣｌｌで表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体、およびＡＴＣＣ登録番号ＨＢ１２６５５を有しＦ３で表されるハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体を開示する。
【０２６９】
抗ヒト−Ｊａｇｇｅｄ１抗体はＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ）から整理番号ＭＡＢ１２７７１（クローン１８８３２３）として入手可能である。
【０２７０】
ＮｏｔｃｈとＮｏｔｃｈリガンドとの間の相互作用を低下させるために用いることができる他の物質は、外因性ＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンドまたはその機能性誘導体である。そのようなＮｏｔｃｈリガンド誘導体は、好ましくはＮ末端にＤＳＬドメインを、および好ましくは約１６個までまたはそれ以上、たとえば約１ないし８、好ましくは３ないし８個のＥＧＦ様反復を細胞外表面上に有する。ｈＪａｇｇｅｄ１のＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ＬＡＧ−２ドメインに対応するペプチド、および、ｈＪａｇｇｅｄ１の細胞外部分の可溶性型を発現しているＣＯＳ細胞由来の上清は、Ｎｏｔｃｈ１の阻害においてＪａｇｇｅｄ１の作用を模倣することが見出された（Ｌｉ）。
【０２７１】
測定法
ある物質を、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド発現を調節するのに用いることができるかどうかは、適当なスクリーニング測定法を用いて測定することができる。
【０２７２】
たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に適当なＨＥＳ−１／ルシフェラーゼレポーター測定法は、たとえば、バーナム・フィニー（Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ）他， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３， ４３１３−４３１８ （２０００）およびたとえば本文書の実施例６に記載されている。
【０２７３】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はまた、タンパク質測定法によって、または核酸測定法によって監視することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解切断、および細胞核へのその移動に繋がる。ここでいう「検出可能なシグナル」は、Ｎｏｔｃｈの切断された細胞内ドメインの存在に帰することができる任意の検出可能な徴候であることができる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、切断されたＮｏｔｃｈドメインの細胞内濃度を測定することによって、タンパク質レベルで評価することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化はまた、一連の下流の反応を触媒し、ある種の明確な遺伝子の発現のレベルの変化に繋がる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、たとえば特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することによって、核酸レベルで評価することができる。本発明の好ましい一実施形態では、測定法はタンパク質測定法である。本発明の別の好ましい一実施形態では、測定法は核酸測定法である。
【０２７４】
核酸測定法を用いることの利点は、核酸測定法は高感度であり少量の試料を分析することができることである。
【０２７５】
任意の時間に測定された、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、対応する遺伝子のその時点での発現レベルを反映する。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、免疫系のＴ細胞の間接的測定によって測定することができる。特に、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１および／またはＩＬ−１０ ｍＲＮＡのレベルの上昇はたとえば誘導された免疫反応不顕性を示しうる一方、Ｄｌｌ−１またはＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのレベルまたはＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３といったサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルの上昇は反応性の改善を示しうる。
【０２７６】
さまざまな核酸測定法が既知である。既知であるかまたは後に開示される任意の従来の技術を用いることができる。適当な核酸測定法の例は下記に示され、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ブロッティング、分光分析、レポーター遺伝子測定法、遺伝子チップアレイおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
【０２７７】
特に、遺伝子の存在、増幅および／または発現は、試料中で直接に、たとえば、従来のｍＲＮＡの転写を定量するサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、適当に標識化されたプローブを用いて測定することができる。当業者は必要に応じて、これらの方法をどのように改変しうるかを容易に考えることができる。
【０２７８】
ＰＣＲは最初は、不純な試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。その技術は、反応溶液を繰り返し加熱および冷却してプライマーを標的配列とアニーリングさせる温度サイクル、および複製娘鎖の形成のためのそれらのプライマーの伸長に基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いた最初のｃＤＮＡ鎖の生成に、ＲＮＡテンプレートを用いる。ｃＤＮＡはその後、標準のＰＣＲ手順に従って増幅する。合成および変性の繰り返しサイクルの結果として、生じる標的ＤＮＡのコピー数の指数的増加が起こる。しかし、反応成分が限られてくるにつれ、増幅の速度は低下して停滞状態に達し、その後はＰＣＲ産物の正味の増加はほとんどまたは全く無い。核酸標的の開始コピー数が多いほど、この「終点（エンドポイント）」に到達するのは早い。
【０２７９】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグまたは蛍光色素で標識化されたプローブを用い、一定数のサイクル後の産物蓄積の測定のためでなく、蓄積していくＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量測定のためのエンドポイントＰＣＲとは異なる。反応は、標的配列の増幅が蛍光の有意な増加によって最初に検出される際のサイクル反応中の時点によって特徴づけられる。
【０２８０】
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮａｓｅ保護）測定法は、溶液中の特定のＲＮＡの定量のための極めて高感度な技術である。リボヌクレアーゼ保護測定法は、標的として細胞ＲＮＡ全体またはポリ（Ａ）−選択されたｍＲＮＡについて実施することができる。リボヌクレアーゼ保護測定法の感度は、高い比活性で放射性標識された相補ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物プローブの使用に由来する。プローブおよび標的ＲＮＡは溶液中でハイブリダイズされ、その後、混合物は希釈されてリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理され、残っている一本鎖ＲＮＡすべてが分解される。プローブのハイブリダイズした部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動とその後のオートラジオグラフィーによって可視化することができる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるため、リボヌクレアーゼ保護測定法を用いてｍＲＮＡ特性を正確にマッピングすることができる。プローブが標的ＲＮＡに関して過剰なモル数でハイブリダイズされるならば、結果として生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。
【０２８１】
遺伝子発現はまた、レポーター系を用いて検出することができる。そのようなレポーター系は、発現系、たとえば監視される遺伝子の調節下にある、容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出および選別が可能である蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰおよびルシフェラーゼである。別の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカー、すなわち細胞表面上に発現されしたがって容易に同定可能であるタンパク質である。
【０２８２】
一般的に、レポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナル伝達を検出するために有用なレポーター構造は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら（１９８９）の一般的教示に従って構築することができる。典型的には、本発明に記載の構造は、目的の遺伝子によるプロモーター、およびたとえばＧＦＰまたはルシフェラーゼのような目的のレポーター構造をコードするコード配列を含む。ＧＦＰおよびルシフェラーゼをコードするベクターは本分野で既知でありまた市販されている。
【０２８３】
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上記に例示された通り、本分野で既知である任意の技術によって実施することができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによって選別することができる。全般的参考には、『フローサイトメトリーおよびセルソーティング；実験の手引き』（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９９２）Ａ．ラドブルーフ（Ｒａｄｂｒｕｃｈ）（編）、スプリンガー・ラボラトリー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、を参照。
【０２８４】
フローサイトメトリーは、細胞を研究および精製するための強力な方法である。フローサイトメトリーは特に免疫学および細胞生物学で幅広い用途を見出している；しかし、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多数の分野で応用することができる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（蛍光活性化細胞選別）を表し、「フローサイトメトリー」と相互に交換可能に用いられる。ＦＡＣＳの原理は、液体の細流中にある個々の細胞に一種類以上のレーザー光線を通過させると、光の散乱が起こり蛍光色素がさまざまな周波数で光を放出することである。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気シグナルに変換し、電気シグナルはソフトウェアで処理されて、当該細胞についてのデータを生成する。明確な特徴を持つ細胞の部分集団を特定して、懸濁液から非常に高純度で（〜１００%）自動的に選別することができる。
【０２８５】
ＦＡＣＳを用いて、ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡをトランスフェクションした細胞における遺伝子発現を測定することができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接的に、または、当該構造中のレポーター遺伝子を用いることによって間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例はβ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼ活性はＦＡＣＳによって、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）といった蛍光基質を用いて検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、酵素によって切断されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕捉される。１つの酵素がしたがって大量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰ構造を発現している細胞は基質の添加無しで蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが同一のチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの突然変異体が入手可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置では、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって２種類のトランスフェクションを同時に測定することができる。
【０２８６】
細胞選別の別の方法もまた使用することができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現している細胞を個別に同定することができ、そのため細胞をその後に手作業でまたはＦＡＣＳ選別を用いて選別することができる。ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブは、上記に示す教示に従って、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら （１９８９）によって記載された一般的手順を用いて調製することができる。
【０２８７】
好ましい一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な、ＦＡＣＳ細胞選別に使用することができる蛍光団と結合した、アンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０２８８】
遺伝子発現および同一性についての情報を、いわゆる遺伝子チップアレイまたは高密度ＤＮＡアレイを用いて得るための方法もまた記載されている（Ｃｈｅｅ）。これらの高密度アレイは、診断および予測診断目的に特に有用である。Ｉｎ Ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）もまた利用することができる（カミリ（Ｃａｍｉｌｌｉ））。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較して、たとえば治療または疾患の際にアップレギュレートされる遺伝子を特定する。
【０２８９】
タンパク質測定法を用いることの利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる測定法技術は当業者によく知られている。そのような測定法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、ＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡ測定法を含む。
【０２９０】
上述の通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はまた、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第００／３６０８９号パンフレットに記載されるように、容易に調製することができる。
【０２９１】
初回抗原刺激を受けたＡＰＣおよびリンパ球の調製
本発明の一態様によると、免疫細胞を用いて抗原またはアレルゲンを提示することができるおよび／または免疫細胞を処理してＮｏｔｃｈ、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、ＤＭＥＭまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清の存在下で、培養することができる。サイトカインは、存在する場合は、典型的には最大１０００Ｕ／ｍｌが添加される。最適濃度は滴定によって決定することができる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる１つ以上の物質を、その後、典型的には目的の抗原と共に培地に添加する。抗原は、当該物質の前、後、またはそれと実質的に同時に、添加することができる。細胞は典型的には、当該物質および抗原と共に、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、３７℃にて培養する。必要に応じて、細胞の少量を、標的遺伝子発現の調節について上記の通り試験することができる。代替として、国際公開第９８／２０１４２号パンフレットに記載の通り、細胞活性はＴ細胞活性化の阻害によって、表面マーカー、サイトカイン分泌または増殖を監視することで測定することができる。たとえばＳｅｒｒａｔｅの発現を指令する核酸構造をトランスフェクションしたＡＰＣを対照として用いることができる。
【０２９２】
上で考察した通り、ＡＰＣ中でポリペプチドの発現を可能にする条件下でポリペプチドをコードする核酸構造／ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をＡＰＣへ投与することができる。同様に、抗原をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってＡＰＣへ導入することができる。結果として生じる、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のレベル上昇を示すＡＰＣがこれで使用可能な状態である。 
【０２９３】
下記の技術はＴ細胞に関して説明されているが、Ｂ細胞にも等しく適用可能である。使用した技術は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されること以外は、ＡＰＣ単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたＡＰＣをまず作製し、次いでそれをＴ細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、それを沈澱させＰＢＳで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。代替として、Ｔ細胞をＮｏｔｃｈシグナル伝達を調節する第一の物質（または物質の組）とインキュベートし、洗浄し、再懸濁し、次いでＡＰＣを調節するために用いられた物質およびＴ細胞を調節するために用いられた物質の両方の非存在下で、初回抗原刺激を受けたＡＰＣとインキュベートすることができる。または、抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）といったＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）と共にまたはそれ無しで、Ｔ細胞をＡＰＣの非存在下で培養して初回抗原刺激することができ、またはＴ細胞をＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば四量体）で活性化することができる。
【０２９４】
インキュベートは典型的には少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３または６時間、適当な培地中で３７℃にとなる。免疫反応／寛容の変化は、続いてＴ細胞に抗原を負荷し、ＡＰＣに曝露されていない対照細胞と比較してサイトカイン（たとえばＩＬ−２）産生を測定することによって測定することができる。
【０２９５】
この方法で初回抗原刺激を受けたＴ細胞またはＢ細胞は、本発明にしたがって、他のＴ細胞またはＢ細胞における免疫反応／寛容を変化させるのに用いることができる。
【０２９６】
治療的用途
Ａ．本発明の免疫学的用途
好ましい一実施形態では、本発明の構造はヒトのような哺乳類の免疫系における免疫反応を修飾するのに用いることができる。好ましくは免疫系のそのような調節は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、好ましくは末梢Ｔ細胞、活性の調節によって達成される。
【０２９７】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の詳細な説明およびそれに影響される症状は、我々の国際公開第９８／２０１４２号パンフレット、国際公開第００／３６０８９号パンフレット、およびＰＣＴ／ＧＢ００／０４３９１に見出される。
【０２９８】
Ｔ細胞によって媒介されると説明されうる疾患状態または感染状態は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、自己免疫、腫瘍に誘発されるＴ細胞系の異常、および、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）の種、ミクロフィラリア、蠕虫、マイコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュードモナス、トキソプラズマ、エキノコッカス、Ｂ型インフルエンザ（ヘモフィルス・インフルエンザＢ型）、麻疹、Ｃ型肝炎または回虫によって引き起こされるものといった感染症のいずれか１つ以上を含むがこれらに限定されない。このように、治療または予防されうる、Ｔ細胞によって媒介される特定の症状は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、および糖尿病を含む。本発明はまた、臓器移植術または骨髄移植術に用いることができる。
【０２９９】
上記に示す通り、本発明は、自己免疫疾患といった免疫疾患、または、同種異系移植片拒絶といった移植片拒絶の治療に有用である。
【０３００】
自己免疫疾患
治療されうる疾患の例は、一般に自己免疫疾患と呼ばれる一群を含む。自己免疫疾患の範囲は、臓器特異的疾患（たとえば甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アジソン病、重症筋無力症）から、慢性関節リウマチまたはエリテマトーデスのような全身性疾患にわたる。他の疾患は、アレルギー反応のような免疫過敏性を含む。
【０３０１】
より詳細には；臓器特異的自己免疫疾患は、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、いくつかの型の貧血（再生不良性、溶血性）、自己免疫肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）を含む。
【０３０２】
全身性自己免疫疾患は；慢性関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症および全身性硬化症、シェーグレン症候群、分類不能結合組織症候群、抗リン脂質症候群、さまざまな型の血管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓性血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛、本態性（混合）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬および乾癬性関節炎、好酸球性または非好酸球性びまん性筋膜炎、多発性筋炎および他の特発性炎症性筋疾患、再発性脂肪織炎、再発性多発性軟骨炎、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、さまざまな型の炎症性皮膚炎を含む。
【０３０３】
疾患のより広範囲のリストは；慢性関節リウマチを含む関節炎を含む不必要な免疫反応および炎症、過敏性、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の自己免疫疾患に伴う炎症、アテローム性硬化症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性疾患、呼吸窮迫症候群または他の心肺疾患に伴う炎症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎および消化管の他の疾患に伴う炎症、肝線維症、肝硬変または他の肝疾患、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の腎および泌尿器疾患、耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患、歯周疾患または他の歯科疾患、精巣炎または精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷または他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣流産、子癇、子癇前症および他の免疫および／または炎症性関連婦人科疾患、後部ブドウ膜、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜強膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、変性眼底疾患の免疫および炎症性要素、眼外傷の炎症性要素、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、たとえば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕、眼インプラントに対する免疫および／または炎症反応、および他の免疫および炎症性関連眼疾患、自己免疫疾患または症状に伴う炎症、または、中枢神経系（ＣＮＳ）または任意の他の臓器の両方で、免疫および／または炎症抑制が有益である疾患、パーキンソン病、パーキンソン病の治療に由来する合併症および／または副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆症候群、ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、症状、またはＣＮＳ疾患、脳卒中（ｓｔｏｋｅｓ）の炎症性要素、ポリオ後症候群、精神 疾患の免疫 および 炎症性 要素、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性 神経障害、亜急性 神経障害、慢性 神経障害、ギラン・バレー症候群、シデナム舞踏病（ｃｈｏｒａ）、重症筋無力症、特発性頭蓋内圧亢進症、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染の炎症性要素、筋萎縮症および筋ジストロフィーの炎症性要素、および、中枢および末梢神経系の免疫および炎症性関連疾患、症状または疾患、外傷後炎症、敗血性ショック、感染症、手術または臓器の炎症性合併症または副作用、遺伝子治療のたとえばウイルスキャリヤーの感染による炎症性および／または免疫合併症および副作用、または体液性および／または細胞性免疫反応を抑制または阻害するための、ＡＩＤＳに関連する炎症、単球または白血球増殖性疾患、たとえば白血病を、単球またはリンパ球の量を減らすことによって治療または改善すること、角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織といった天然または人工細胞、組織、および臓器の移植術の場合に移植片拒絶の防止および／または治療のため、を含む。
【０３０４】
移植拒絶
本発明は、たとえば、臓器移植（たとえば腎臓、心臓、肺、肝臓または膵臓移植）、組織移植（たとえば皮膚移植片）または細胞移植（たとえば骨髄移植または輸血）の処置に用いることができる。
【０３０５】
最も一般的な種類の臓器および組織移植の短い概観を下記に示す。
【０３０６】
ｉ）腎臓移植；
腎臓は最も普通に移植されている臓器である。腎臓は死亡者および生きたドナーの両方が提供することができ、腎臓移植は数々の臨床徴候（糖尿病、さまざまな型の腎炎および腎不全を含む）を治療するのに用いることができる。腎臓移植術のための外科的手順は相対的に単純である。しかし、血液型および組織適合型を一致させることが、移植片拒絶を避けるために望ましい。最初の移植を拒絶後に多くの患者が「感作」されうるため、移植片が受容されることは実際に重要である。感作の結果として、腎臓抗原に対する抗体の形成および細胞機構の活性化が生じる。したがって、最初の移植片と共通する抗原を含むその後の移植片はどれも拒絶される可能性が高い。結果として、多数の腎臓移植患者はその後の生涯にわたって何らかの形の免疫抑制治療を受け続けなければならず、感染および代謝性骨疾患といった合併症の原因となる。
【０３０７】
ｉｉ）心臓移植術
心臓移植術は非常に複雑で高リスクの手続である。ドナー心臓は、レシピエントに入れられた際に拍動を始めるような方法で維持しなければならず、したがって、限られた期間、非常に限定された条件下でのみ生存可能に保たれる。ドナー心臓はまた、脳死ドナーからのみ取ることができる。心臓移植を用いて、さまざまな型の心臓疾患および／または損傷を治療することができる。ＨＬＡ適合は明らかに望ましいが、心臓の供給が限られていることおよび手続の緊急性のために、しばしば不可能である。
【０３０８】
ｉｉｉ）肺移植術
肺移植術は、（単独でまたは心臓移植術と組み合わせて）嚢胞性線維症および肺への急性損傷（たとえば煙の吸入によって生じた）といった疾患の治療に用いられる。移植に用いられる肺は通常は脳死ドナーから回収される。
【０３０９】
ｉｖ）膵臓移植術
膵臓移植術は主に、膵臓中のインシュリンを産生する膵島細胞の機能異常によって引き起こされる疾患である糖尿病を治療するために用いられる。移植術用の臓器は、死亡者からしか回収できないが、調節された方法でインシュリンを産生するのに必要な機能を再生するためには膵臓全体の移植術は必要ないことに注意すべきである。実際、膵島細胞の移植術だけで十分でありうる。腎不全が進行型糖尿病の高頻度な合併症であるため、腎臓と膵臓の移植はしばしば同時に実施される。
【０３１０】
ｖ）皮膚移植
大部分の皮膚移植は自家組織を用いて行われる。しかし、重度の火傷（たとえば）の場合には、外来組織の移植片が必要である可能性がある（が、移植片は宿主上では増殖せず、一定期間で交換しなければならないため、これらの移植片は一般的に生物学的包帯剤として用いられることに注意すべきである。）。真の同種異系皮膚移植の場合には、拒絶は免疫抑制療法の使用によって防ぐことができる。しかし、これは感染のより高いリスクに結びつき、したがって火傷患者の主な障害である。
【０３１１】
ｖｉ）肝臓移植術
肝臓移植は、肝炎といったウイルス疾患によって、または有害化学物質への曝露によって（たとえば慢性アルコール症によって）引き起こされた臓器障害を治療するために用いられる。肝臓移植はまた、先天性異常を治療するために用いられる。肝臓は大きく複雑な臓器であり、これは移植術に最初は技術的な問題があったことを意味する。しかし、大部分の移植（６５%）は現在１年以上生存し、また、一人のドナーに由来する肝臓を分割して二人のレシピエントに与えることができることが見出されている。肝臓移植患者による移植片拒絶の率は相対的に低いが、、ドナー臓器内の抗血液型抗体と共に白血球は、血液型不一致が存在する場合、レシピエント赤血球の抗体依存性溶血を媒介しうる。加えて、ドナーとレシピエントが血液型適合である場合でさえ、ＧＶＨＤの顕在化が肝臓移植で起こっている。
【０３１２】
ワクチンおよびがんワクチン
本発明の構造はまた、がんおよび病原体ワクチンといったワクチン組成物に用いることができる。
【０３１３】
ワクチン組成物
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する、本発明に記載の複合体を、疾患に感受性であるかまたは疾患に罹患している哺乳類を保護または治療するためのワクチン組成物（たとえば病原体またはがんワクチン）に、前記ワクチンを経口／口内／腸管／膣／直腸／経鼻といった粘膜経路を介して投与することによって用いることができる。そのような投与はたとえば小滴、スプレー、または乾燥粉末剤形であることができる。噴霧またはエアロゾル化ワクチン処方もまた適当な場合に用いることができる。
【０３１４】
経口投与用の胃で溶けないカプセルまたは顆粒といった腸溶処方、直腸または膣投与用の坐剤もまた用いることができる。本発明はまた、たとえば皮内または経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）送達によって、皮膚に投与される抗原の免疫原性を高めるために用いることができる。加えて、本発明のアジュバントは、たとえば筋肉内または皮下投与によって、非経口的に送達することができる。
【０３１５】
投与経路に応じて、さまざまな投与器具を用いることができる。たとえば、経鼻投与には市販のアキュスプレー（ベクトン・ディッキンソン社）（Ａｃｃｕｓｐｒａｙ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））のような噴霧器を用いることができる。
【０３１６】
経鼻使用のための好ましい噴霧器は、器具の性能が、使用者が与える圧に依存しない器具である。これらの器具は閾圧器具として知られている。閾圧に達した時だけに液体がノズルから放出される。これらの器具は、一定の小滴径を有する噴霧を達成するのを容易にする。本発明での使用に適した閾圧器具は本分野で既知であり、たとえば国際公開第９１／１３２８１号パンフレットおよび欧州特許第３１１８６３Ｂ号明細書に記載されている。そのような器具はファイファー株式会社（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ＧｍｂＨ）から市販されている。
【０３１７】
ある種のワクチン処方には、他のワクチン成分を処方に含めることができる。たとえば本発明のアジュバント処方はまた、胆汁酸、またはコール酸の誘導体を含むことができる。コール酸の適切な誘導体は、その塩、たとえばそのナトリウム塩である。胆汁酸の例は、コール酸自体、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、タウロデオキシコール酸ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、および上記の胆汁酸のグリコ−、タウロ−、アミドプロピル−１−プロパンスルホン−およびアミドプロピル−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン−誘導体またはＮ，Ｎ−ｂｉｓ（３Ｄグルコノアミドプロピル）デオキシコールアミドのような誘導体を含む。
【０３１８】
適切には、本発明のアジュバント処方は水溶液または非小胞型の懸濁液の形であることができる。そのような処方は、製造するのに、また滅菌するのに（たとえば４５０または２２０ｎｍ孔径の膜を通す最後の濾過による）便利である。
【０３１９】
適切には、投与経路は、皮膚を介して、筋肉内、または鼻粘膜のような粘膜表面を介してであることができる。鼻粘膜経由で混合物を投与する場合、混合物はたとえばスプレーとして投与することができる。免疫反応を増大させる方法は、ワクチンの初回抗原刺激または追加免疫投与のいずれかでありうる。
【０３２０】
ここで用いられる「アジュバント」の語は、抗原または抗原決定基に対する、脊椎動物対象の免疫系の免疫反応を増大させる能力を有する物質を含む。
【０３２１】
「免疫反応」の語は、対象の免疫系による抗原または抗原決定基への何らかの反応を含む。免疫反応は、たとえば体液性免疫反応（たとえば抗原特異的抗体の産生）および細胞媒介性免疫反応（たとえばリンパ球増殖）を含む。
【０３２２】
「細胞媒介性免疫反応」の語は、Ｔ細胞リンパ球によってその犠牲になる細胞の近くに来た際に提供される防御のような、リンパ球によって提供される免疫防御を含む。
【０３２３】
「リンパ球増殖」を測定する場合は、リンパ球が特異的抗原に反応して増殖する能力を測定することができる。リンパ球増殖は、Ｂ細胞、Ｔ−ヘルパー細胞またはＣＴＬ細胞増殖を含む。
【０３２４】
本発明の組成物は、幅広い起源に由来する抗原を含むワクチンを処方するのに用いることができる。たとえば、抗原は、ヒト、細菌、またはウイルス核酸、病原体由来抗原または抗原性調製物、ＧｎＲＨおよびＩｇＥペプチド、組み換えによって産生されたタンパク質またはペプチド、およびキメラ融合タンパク質を含む宿主由来抗原を含みうる。
【０３２５】
好ましくは本発明のワクチン処方は、ヒト病原体に対する免疫反応を導くことができる抗原または抗原性組成物を含む。抗原または抗原は、たとえば、ペプチド／タンパク質、多糖および脂質であることができ、下記のようなウイルス、細菌、および寄生虫／真菌といった病原体に由来しうる；
【０３２６】
ウイルス抗原
ウイルス抗原または抗原決定基は、たとえば、下記に由来しうる；
サイトメガロウイルス（特にヒト、たとえばｇＢまたはその誘導体）；エプスタイン・バーウイルス（たとえばｇｐ３５０）；フラビウイルス（たとえば黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）；肝炎ウイルス、たとえばＢ型肝炎ウイルス（たとえば欧州特許第Ａ−４１４３７４号明細書；欧州特許第Ａ−０３０４５７８号明細書、および欧州特許第Ａ−１９８４７４号明細書に記載されたＰｒｅＳｌ、ＰｒｅＳ２およびＳ抗原といったＢ型肝炎表面抗原）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎；ＨＩＶ−１、（たとえばｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐｌ２０またはｇｐｌ６０）；ヒトヘルペスウイルス、たとえばｇＤまたはその誘導体またはＩＣＰ２７といったＨＳＶ１またはＨＳＶ２由来の最初期タンパク質；ヒトパピローマウイルス（たとえばＨＰＶ６、１１、１６、１８）；インフルエンザウイルス（卵またはＭＤＣＫ細胞またはベロ細胞で増殖させた、完全な生きたウイルスまたは不活性化ウイルス、切断したインフルエンザウイルス、完全なインフルエンザ人工ウイルス粒子（グリュック（Ｇｌｕｃｋ），Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９２，１０，９１５−９２０に記載の通り）またはその精製または組み換えタンパク質、たとえばＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、またはＭタンパク質）；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；パラインフルエンザウイルス；狂犬病ウイルス；呼吸器多核体ウイルス（たとえばＦおよびＧタンパク質）；ロタウイルス（生きた弱毒化ウイルスを含む）；天然痘ウイルス；水痘−帯状疱疹ウイルス（たとえばｇｐＩ、ＩＩおよびＩＥ６３）；および子宮頸部がんを引き起こすＨＰＶウイルス（たとえばＨＰＶ１６由来の、Ｄタンパク質キャリヤーと融合してタンパク質Ｄ−Ｅ６またはＥ７融合体を形成する初期タンパク質Ｅ６またはＥ７、またはその組み合わせ；またはＥ６またはＥ７のＬ２との組み合わせ（たとえば国際公開第９６／２６２７７号パンフレットを参照）。
【０３２７】
細菌抗原
細菌抗原または抗原決定基は、たとえば、下記に由来しうる；
炭疸菌（Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（たとえばボツリヌス毒素）； 百日咳菌（Ｂ． ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を含むボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ）（たとえばパータクチン、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、線毛）；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ガリニ（Ｂ． ｇａｒｉｎｉｉ）（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂ． ａｆｚｅｌｉｉ）（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アンダーソニイ（Ｂ． ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）（たとえばＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ ヘルムシイ（Ｂ． ｈｅｒｍｓｉｉ）を含むボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ）（たとえば毒素、アドヘシン、およびインベイシン）およびカンピロバクター・コリ（Ｃ． ｃｏｌｉ）を含むカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）； 
クラミジア・トラコーマチス（Ｃ． ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（たとえばＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃ． ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）（たとえばＭＯＭＰ、ヘパリン結合性タンパク質）、クラミジア・シッタシ（Ｃ． ｐｓｉｔｔａｃｉ）を含むクラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）；破傷風菌（Ｃ． ｔｅｔａｎｉ）（たとえば破傷風毒素）、ボツリヌス菌（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）（たとえばボツリヌス毒素）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（たとえばクロストリジウム毒素ＡまたはＢ）を含むクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）；ジフテリア菌（Ｃ． ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（たとえばジフテリア毒素）を含むコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）；ウマ・エーリキア（Ｅ． ｅｑｕｉ）およびヒト顆粒球性エーリキア症の病原体を含むエーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｓｐｐ．）；， ロッキー山紅斑熱リケッチア（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）を含むリケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｐｐ）； エンテロコッカス・フェーカリス（Ｅ． ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・ファシウム（Ｅ． ｆａｅｃｉｕｍ）を含むエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）；腸管毒素性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ）（たとえば ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ， ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｔｏｘｉｎ ｏｒ 誘導体 ｔｈｅｒｅｏｆ， ｏｒ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ ｔｏｘｉｎ）、腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒａｇｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ）、腸管病原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ）（たとえば志賀毒素様毒素）を含むエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ）；ヘモフィルスインフルエンザＢ型菌（たとえばＰＲＰ）、型分類不能ヘモフィルスインフルエンザ、たとえばＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、Ｄタンパク質およびＤリポタンパク質、およびフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（たとえば米国特許第５，８４３，４６４号明細書を参照）を含むヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）；ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）（たとえば ウレアーゼ、カタラーゼ、細胞空胞化致死毒素）を含むヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）；緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ）； レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ． ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）を含むレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）；レプトスピラ・インタロガンス（Ｌ． ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）を含むレプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）； リステリア・モノサイトゲネス（Ｌ． ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含むリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｐｐ．）；モラクセラ・カタラーリス（Ｍ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、別名ブランハメラ・カタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（たとえば高および低分子量アドヘシンおよびインベイシン）を含むモラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｓｐｐ）； モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ Ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（その外膜小胞およびＯＭＰ１０６を含む（たとえばＷ０９７／４１７３１を参照））；結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（たとえばＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂまたは−Ｃ）、ウシ結核菌（Ｍ． ｂｏｖｉｓ）、らい菌（Ｍ． ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ． ａｖｉｕｍ）、ヨーネ菌（Ｍ． ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、スメグマ菌（Ｍ． ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を含むマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）；淋菌（Ｎ． ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）および髄膜炎菌（Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（たとえば莢膜多糖およびその複合体、トランスフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含むナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ）； Ｂ群髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ）（その外膜小胞およびＮｓｐＡを含む（たとえば 国際公開第 ９６／２９４１２号パンフレットを参照）；チフス菌（Ｓ． ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓ． ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・コレラシス（Ｓ． ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、腸炎菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）を含むサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ）；赤痢菌Ｄ群（Ｓ． ｓｏｎｎｅｉ）、赤痢菌Ａ群（Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、赤痢菌Ｂ群（Ｓ． ｆｌｅｘｎｅｒｉｉ）を含むシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ）；黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含むスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）； 肺炎連鎖球菌（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）を含むストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）（たとえば莢膜多糖およびその複合体、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合性タンパク質）およびタンパク質抗原ニューモリジン（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９８９，６７，１００７； ルビンス（Ｒｕｂｉｎｓ）他， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ， ２５，３３７−３４２）、およびその突然変異無毒化誘導体（たとえば国際公開第９０／０６９５１号パンフレット；国際公開第９９／０３８８４号パンフレットを参照）；梅毒トレポネーマ（Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍ）（たとえば外膜タンパク質）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔ． ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、豚赤痢菌（Ｔ． ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）を含むトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．）；コレラ菌（Ｖ． ｃｈｏｌｅｒａ）（たとえばコレラ毒素）を含むビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ）；および、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙ． ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）（たとえばＹｏｐタンパク質）、ペスト菌（Ｙ． ｐｅｓｔｉｓ）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙ． ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ）。
【０３２８】
寄生虫／真菌抗原
寄生虫／真菌抗原または抗原決定基は、たとえば、下記に由来しうる；
ネズミバベシア（Ｂ． ｍｉｃｒｏｔｉ）を含むバベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）；カンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．）；クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ． ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）を含むクリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）； Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｓｐｐ．， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ赤痢アメーバ（Ｅ． ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）を含むエントアメーバ属；ランブル鞭毛虫（Ｇ． ｌａｍｂｌｉａ）を含むジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．）；大形リーシュマニア（Ｌ． ｍａｊｏｒ）を含むリーシュマニア属（Ｌｅｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．）；マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ． Ｆａｃｉｐａｒｕｍ）（ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、シークエストリン（Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ）、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰｌ、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓｌ６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびプラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．）のそのアナログ）；ニューモシスチス・カリニ（Ｐ． ｃａｒｉｎｉｉ）を含むニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．）；マンソン住血吸虫（Ｓ． ｍａｎｓｏｎｉ）を含むシストソーマ属（Ｓｃｈｉｓｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．）；膣トリコモナス（Ｔ． ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を含むトリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）；トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔ． ｇｏｎｄｉｉ）を含むトキソプラズマ属（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）（たとえば ＳＡＧ２， ＳＡＧ３， Ｔｇ３４）；クルーズトリパノソーマ（Ｔ． ｃｒｕｚｉ）を含むトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．）。
【０３２９】
承認／認可されたワクチンは、たとえば、炭疽ワクチン、たとえばバイオスラックス（バイオポート社）（Ｂｉｏｔｈｒａｘ （ＢｉｏＰｏｒｔ Ｃｏｒｐ））；結核（ＢＣＧ）ワクチン、たとえばＴＩＣＥ ＢＣＧ（オルガノン・テクニカ社）（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ）およびカオコバクス（アベンティス・パスツール社）（Ｍｙｃｏｂａｘ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｌｔｄ））；ジフテリアおよび破傷風トキソイドおよび無菌体百日咳（ＤＴＰ）ワクチン、たとえばトリペディア（アベンティス・パスツール社）（Ｔｒｉｐｅｄｉａ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｉｎｃ））、インファンリクス（グラクソスミスクライン）（Ｉｎｆａｎｒｉｘ （ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））、およびダプタセル（アベンティス・パスツール社）（ＤＡＰＴＡＣＥＬ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｌｔｄ））； ヘモフィルスＢ型複合ワクチン（たとえばアメリカン・サイアナミッド社レダリー研部門（Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂ Ｄｉｖ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏ）からのＨｉｂＴＩＴＥＲのようなジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質複合体；メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ）からのＰｅｄｖａｘＨＩＢのような髄膜炎菌タンパク質複合体；およびアベンティス・パスツール社（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， ＳＡ）からのＡｃｔＨＩＢのような破傷風トキソイド複合体）；ハブリクス（グラクソスミスクライン）（Ｈａｖｒｉｘ （ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））および ＶＡＱＴＡ（メルク社）（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ）のようなＡ型肝炎ワクチン； ツインリクス（グラクソスミスクライン）（Ｔｗｉｎｒｉｘ （ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））のようなＡ型肝炎およびＢ型肝炎複合（組み換え）ワクチン；リコンビバクスＨＢ（メルク社）（Ｒｅｃｏｍｂｉｖａｘ ＨＢ （Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ））およびエンゲリクスＢ（グラクソスミスクライン）（Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂ （ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））のような組み換えＢ型肝炎ワクチン；フルビリン（エバンス・ワクチン）（Ｆｌｕｖｉｒｉｎ （Ｅｖａｎｓ Ｖａｃｃｉｎｅ）、フルシールド（ワイス・ラボラトリーズ社）（ＦｌｕＳｈｉｅｌｄ （Ｗｙｅｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ））およびフルゾン（アベンティス・パスツール社）（Ｆｌｕｚｏｎｅ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｉｎｃ））のようなインフルエンザウイルスワクチン；ＪＥ−Ｖａｘ（財団法人 阪大微生物病研究会）のような日本脳炎ウイルスワクチン；アテニュバクス（メルク社）（Ａｔｔｅｎｕｖａｘ （Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ））のような麻疹ウイルスワクチン；Ｍ−Ｍ−Ｖａｘ（メルク社）（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ）のような麻疹およびムンプスウイルスワクチン；Ｍ−Ｍ−Ｒ ＩＩ（メルク社）（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ）のような麻疹、ムンプス、および風疹ウイルスワクチン；メノミューン（Ｍｅｎｏｍｕｎｅ）−Ａ／Ｃ／Ｙ／Ｗ−１３５（アベンティス・パスツール社）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｉｎｃ）のような髄膜炎菌多糖ワクチン（Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５群混合）；ムンプスバクス（メルク社）（Ｍｕｍｐｓｖａｘ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃ��，Ｉｎｃ））のようなムンプスウイルスワクチン；ニューモバクス（メルク社）（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ  （Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ））およびニューイミューン（アメリカン・サイアナミッド社レダリー研部門）（Ｐｎｕ−Ｉｍｕｎｅ （Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂ Ｄｉｖ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏ））のような肺炎球菌ワクチン；肺炎球菌７価複合ワクチン （たとえばアメリカン・サイアナミッド社レダリー研部門（Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂ Ｄｉｖ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏ）からのプレブナール（Ｐｒｅｖｎａｒ）のようなジフテリアＣＲＭ１９７タンパク質複合体）；ポリオバクス（アベンティス・パスツール社）（Ｐｏｌｉｏｖａｘ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｌｔｄ））のようなポリオウイルスワクチン；ＩＰＯＬ（アベンティス・パスツール社）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， ＳＡ）のようなポリオウイルスワクチン；イモバクス（アベンティス・パスツール社）（Ｉｍｏｖａｘ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， ＳＡ））およびラブアバート（カイロン・ベーリング社）（ＲａｂＡｖｅｒｔ （Ｃｈｉｒｏｎ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ））のような狂犬病ワクチン；メルバクスＩＩ（メルク社）（Ｍｅｒｕｖａｘ ＩＩ （Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ））のような風疹ウイルスワクチン；タイフィムＶｉ（アベンティス・パスツール社）（ＴＹＰＨＩＭ Ｖｉ （Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， ＳＡ））のようなチフスＶｉ多糖ワクチン；バリバクス（メルク社）（Ｖａｒｉｖａｘ （Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ， Ｉｎｃ））のような水痘ウイルスワクチンおよびＹＦ−Ｖａｘ（アベンティス・パスツール社）（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ， Ｉｎｃ）のような黄熱ワクチンを含む。
【０３３０】
がん／腫瘍抗原
ここで用いられる「がん抗原または抗原決定基」または「腫瘍抗原または抗原決定基」の語は、好ましくは、がん細胞上に存在する（または付随する）が典型的には正常な細胞上には存在しない抗原または抗原決定基、またはがん細胞上に正常な（非がん）細胞上よりも多量に存在する抗原または抗原決定基、またはがん細胞上には正常な（非がん）細胞上に見出されるのとは異なる形で存在する抗原または抗原決定基を意味する。
【０３３１】
がん抗原は、たとえば（しかし制限無く）下記を含む；
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβ鎖（ｈＣＧベータ）抗原、がん胎児性抗原、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原、ＧｌｏｂｏＨ抗原、ＧＭ２抗原、ＧＰ１００抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、ＫＳＡ抗原、Ｌｅ（ｙ）抗原、ＭＵＣＩ抗原、ＭＡＧＥ１抗原、ＭＡＧＥ２抗原、ＭＵＣ２抗原、ＭＵＣ３抗原、ＭＵＣ４抗原、ＭＵＣ５ＡＣ抗原、ＭＵＣ５Ｂ抗原、ＭＵＣ７抗原、ＰＳＡ抗原、ＰＳＣＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、トンプソン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原（ＴＦ）、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、ＴＲＰ１抗原、ＴＲＰ２抗原、腫瘍特異的免疫グロブリン可変領域およびチロシナーゼ抗原。
【０３３２】
本発明のこの態様に基づいて、抗原および抗原決定基は多数の異なる形で用いることができることが理解される。たとえば、抗原または抗原決定基は、単離されたタンパク質またはペプチドとして（たとえばいわゆる「サブユニットワクチン」に）または、たとえば、細胞関連またはウイルス関連抗原または抗原決定基として（たとえば生きたまたは死んだ病原体株に）存在することができる。生きている病原体は、好ましくは既知の方法で弱毒化する。代替として、抗原または抗原決定基は、抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチドを用いて、対象においてｉｎ ｓｉｔｕで生成される（いわゆる「ＤＮＡワクチン接種」のように、しかし、この手法で用いられるポリヌクレオチドはＤＮＡに限られず、ＲＮＡおよび修飾されたポリヌクレオチドもまた上述の通り含みうることが理解される）。
【０３３３】
Ｂ．本発明の非免疫学的用途
細胞運命／がん適応
しかし、本発明の構造はまた、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子として、たとえば本文が参照により本開示に含まれる国際公開第９２／０７４７４号パンフレット、国際公開第９６／２７６１０号パンフレット、国際公開第９７／０１５７１号パンフレット、米国特許第５６４８４６４号明細書、米国特許第５８４９８６９号明細書および米国特許第６００４９２４号明細書（エール大学／インペリアル・キャンサー・テクノロジー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））に記載の通り、部分的にまたは完全に非免疫学的な作用様式によって（たとえば全般的な細胞運命、分化または増殖を変化させることによって）、細胞におけるＮｏｔｃｈ経路機能を変化させることで、細胞、組織または器官型の運命を変えるために用いることができることが理解される。
【０３３４】
このように、本発明の複合体はまた、細胞におけるＮｏｔｃｈ経路機能を変化させることによって任意の細胞、組織または器官型の運命を変化させるための方法にも有用である。したがって、たとえば、本構造はまた、たとえば免疫機構でなく増殖抑制機構による、悪性および新生物発生前疾患の治療にも用途がある。たとえば、がん分野では本発明の複合体は、特に腺がん、たとえば小細胞肺がん、および腎臓、子宮、前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、膀胱、卵巣、大腸および乳房のがんに関して有用である。たとえば、本発明に基づいて治療可能な悪性腫瘍は、急性および慢性白血病、リンパ腫、骨髄腫、肉腫たとえば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸がん、卵巣、前立腺がん、膵臓がん、乳（ｂｒｅａｓｙ）がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、絨毛がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、精上皮腫、胎児性がん、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫（ｎｅｕｏｍａ）、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫（ｎｅｕｔｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）および網膜芽細胞腫を含む。
【０３３５】
本発明はまた、神経系疾患の治療にも用途を有しうる。本発明に基づいて治療されうる神経系疾患は、物理的損傷の結果として生じる外傷性障害；虚血性障害；悪性病変；ＨＩＶ、帯状疱疹ウイルスまたは単純ヘルペスウイルス、ライム病、結核または梅毒によって引き起こされるもののような感染性病変；変性病変および疾患および脱髄病変を含む神経病変を含む。
【０３３６】
本発明は、たとえば、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺を含む）、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄症、横断性脊髄症またはさまざまな病因、進行性多病巣性白質脳症、橋中心髄鞘崩壊症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脳梗塞または脳虚血、脊髄梗塞または脊髄虚血、進行性脊髄性筋萎縮症、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、乳児および若年性筋萎縮症、小児期進行性球麻痺（ファチオ・ロンド（Ｆａｚｉｏ−Ｌｏｎｄｅ）症候群）、灰白髄炎およびポリオ後症候群、および遺伝性体性感覚神経障害（シャルコー・マリー・ツース（Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ）病）を治療するのに用いることができる。
【０３３７】
本発明はさらに、たとえば分化過程の修飾による、組織再生および修復の促進に有用である可能性がある。本発明はまた、したがって、たとえば、肝硬変、肥厚性瘢痕形成、および乾癬といった、たとえば組織修復および再生の障害に伴う疾患の治療に用いることができる。本発明はまた、好中球減少症または貧血の治療に、および臓器再生および組織光学および幹細胞治療の技術に有用である可能性がある。
【０３３８】
医薬組成物
好ましくは本発明の活性物質（たとえば複合体および構造）は医薬組成物の形で投与される。当該医薬組成物は、ヒトおよび動物医学においてヒトまたは動物用途向けであることができ、また、１つ以上の活性物質に加えて、典型的には任意の１つ以上の、医薬品として許容される希釈剤、キャリヤー、または賦形剤を含む。治療的用途のための許容されるキャリヤーまたは希釈剤は医薬分野でよく知られており、たとえば、『レミントンの医薬科学』（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（Ａ． Ｒ．ジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、１９８５）に記載されている。医薬キャリヤー、賦形剤または希釈剤の選択は、予定の投与経路および標準的な医療行為に関して選ぶことができる。医薬組成物は、キャリヤー、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。保存料、安定剤、色素および香料さえ、そのような医薬組成物中に提供することができる。保存料の例は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤および懸濁剤もまた用いることができる。
【０３３９】
投与
典型的には、医師は個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。下記の投与量は、平均的な例の典型である。もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありうる。
【０３４０】
一実施形態では、本発明に用いられる治療剤を、患者に直接ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。代替としてまたは加えて、当該治療剤を細胞（たとえばＴ細胞および／またはＡＰＣまたは幹細胞または組織細胞）にｅｘ ｖｉｖｏの方法で投与することができる。たとえば、Ｔ細胞またはＡＰＣといった白血球を、患者またはドナーから既知の方法で得て、本発明の方法でｅｘ ｖｉｖｏで処理／インキュベートし、その後、患者に投与することができる。
【０３４１】
一般的に、治療的に有効な一日量は、たとえば０．０１ないし５００ｍｇ／ｋｇ、たとえば０．０１ないし５０ｍｇ／治療される対象の体重ｋｇ、たとえば０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇの範囲になりうる。本発明の複合体はまた、たとえば０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲である可能性が高い用量で、静脈輸液によって投与することができる。
【０３４２】
熟練した医師は、任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができる。好ましくは医薬組成物は単位用量剤形である。
【０３４３】
本発明の物質は、たとえば、経口、直腸内、経鼻、局所（皮内、経皮、エアロゾル、口内および舌下を含む）、膣内および非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与経路を含むがそれに限定されない、任意の適当な手段によって投与することができる。
【０３４４】
適切には活性物質は、上記の「医薬組成物」の見出しの下に記載の通りの、医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤と組み合わせて投与される。医薬品として許容されるキャリヤーまたは希釈剤は、たとえば、滅菌等張生理食塩水溶液、またはリン酸緩衝生理食塩水のような他の等張溶液であることができる。本発明の複合体は、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤と適切に混合することができる。
【０３４５】
一実施形態では、化合物を経口的に活性な形に処方することが望ましい可能性がある。このように、一部の用途については、活性物質は、デンプンまたは乳糖といった賦形剤を含む錠剤の形で、または、カプセル剤または胚珠状で単独でまたは賦形剤と混合して、または、香料または着色料を含むエリキシル剤、液剤または懸濁剤の形で、経口投与することができる。複合体を含む錠剤またはカプセル剤のような用量は、必要に応じて一度に１つずつまたは二個以上投与することができる。複合体を徐放性処方で投与することもまた可能である。
【０３４６】
代替としてまたは加えて、活性物質は吸入によって、経鼻的にまたはエアロゾルの形で、または坐剤またはペッサリーの形で投与することができ、または活性物質はローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に投与することができる。経皮投与の１つの選択手段は、皮膚パッチを用いることである。たとえば、皮膚パッチはポリエチレングリコールまたは液体パラフィンの水系エマルジョンから成るクリームに取り入れることができる。皮膚パッチはまた、たとえば重量で１ないし１０%の濃度で、白ロウまたは白色軟質パラフィン基剤と共に必要に応じて安定剤および保存料から成る軟膏に取り入れることができる。
【０３４７】
ポリヌクレオチドおよびタンパク質／ポリペプチドといった活性物質もまた、ウイルス技術または非ウイルス技術によって投与することができる。ウイルス送達機構は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むがそれらに限定されない。非ウイルス送達機構は、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性化合物（ＣＦＡｓ）およびその組み合わせを含む。そのような送達機構のための経路は、粘膜、経鼻、経口、非経口、消化管、局所、または舌下経路を含むがそれらに限定されない。活性物質はまた、表皮または真皮またはその他の粘膜表面のような部位への送達のための粒子の弾丸送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｒｉｖｅｒｙ）といった、針を用いない系によって投与することができる。
【０３４８】
活性物質はまた、非経口的に、たとえば海綿体内に、静脈内に、筋肉内にまたは皮下に注射することができる。
【０３４９】
非経口投与のためには、活性物質はたとえば、溶液を血液と等張にするための十分な塩または単糖といった他の物質を含みうるような、無菌水溶液の形で用いることができる。
【０３５０】
口内または舌下投与のためには、物質はたとえば、従来の方法で所要することができる錠剤またはトローチ剤の形で投与することができる。
【０３５１】
対象（たとえば患者）への経口、非経口、口内および舌下投与のためには、活性物質およびその医薬品として許容される塩および溶媒和物の投与量レベルは、典型的には１０ないし５００ｍｇでありうる（一回または分割用量で）。このように、および例として、錠剤またはカプセル剤は、必要に応じて一度に１つずつまたは二つ以上の投与について、５ないし１００ｍｇの活性物質を含みうる。上記に示す通り、医師は個別の対象について最適となる実際の投与量を決定し、そして投与量はその特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上記の投与量は平均的な例の典型である一方、もちろん、より高いまたは低い用量範囲に値する個別の場合がありえ、そのような用量範囲は本発明の範囲内であることに注意する。
【０３５２】
当業者は任意の特定の患者について、たとえば、その患者の年齢、体重、および症状に応じて、最適な投与経路および投与量を容易に決定することができるため、記載の投与経路および投与量は単に指針として意図される。
【０３５３】
ここで用いられる治療または療法の語は、診断および予防用途を包含すると考える。
【０３５４】
本発明の治療は、ヒトの用途および獣医学用途の両方を含む。
【０３５５】
本発明の活性物質は、たとえば、免疫抑制剤、ステロイドまたは抗がん剤のような、他の活性物質と共に投与することができる。
【０３５６】
ｅｘ−ｖｉｖｏで処理される場合、本発明の修飾細胞は好ましくは患者のリンパ節への直接注射によって宿主へ投与される。典型的には１０４ないし１０８個の処理細胞、好ましくは１０５ないし１０７個の細胞、より好ましくは約１０６個の細胞が患者に投与される。好ましくは、細胞は濃縮された細胞集団から採取される。
【０３５７】
ここで用いられる「濃縮された」の語は、本発明の細胞集団に用いられるとき、天然に共存する他の細胞がより少ない、細胞のより均一な集団をいう。濃縮された細胞の集団は、本分野で既知であるいくつかの方法によって達成することができる。たとえば、Ｔ細胞の濃縮された集団は、Ｔ細胞上だけに見出される決定基に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティクロマトグラフィーを用いて得ることができる。
【０３５８】
濃縮された集団はまた、混合細胞懸濁液から、ポジティブ選択（目的の細胞だけを回収する）またはネガティブ選択（望ましくない細胞を除去する）によって得ることができる。特異的な細胞をアフィニティ材料上に捕捉するための技術は本分野でよく知られている（ウィグゼル（Ｗｉｇｚｅｌ）他， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １２８；２３， １９６９；メイジ（Ｍａｇｅ）他， Ｊ． Ｉｍｎｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， １５；４７， １９７７； ウィスコッキ（Ｗｙｓｏｃｋｉ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７５；２８４４， １９７８； シュレンプ・デッカー（Ｓｃｈｒｅｍｐｆ−Ｄｅｃｋｅｒ）他， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．， ３２；２８５， １９８０；ミュラー・ジーブルク（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ）他， Ｃｅｌｌ， ４４；６５３， １９８６）。 
【０３５９】
成熟分化細胞に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体が、望ましくない細胞を除去するさまざまなネガティブ選択、たとえば、Ｔ細胞または悪性細胞をそれぞれ同種異系または自家骨髄移植片から除去するために用いられている（ジー（Ｇｅｅ）他， Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ． ８０；１５４， １９８８）。モノクローナル抗体および免疫磁気マイクロスフィアを用いたネガティブ選択によるヒト造血細胞の精製は、複数のモノクローナル抗体を用いて達成することができる（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）他， Ｂｌｏｏｄ， ６３；９０４， １９８４）。 
【０３６０】
細胞の分離のための手順は、抗体被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィー、たとえば、補体およびサイトトキシンのような、モノクローナル抗体と結合させたかまたはモノクローナル抗体と組み合わせて用いる細胞毒性物質、および、たとえば、プレートのような固体マトリクスに結合させた抗体を用いる「パンニング（濃縮）」、または他の便利な技術を含むことができる。正確な分離を提供する技術は、蛍光活性化セルソーターを含み、これはたとえば、複数の色チャンネル、低角度および鈍光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネル、などといったさまざまな程度の高度機能を持つことができる。
【０３６１】
併用治療
本発明の活性物質が、他の活性物質、抗原または抗原決定基と共に投与される併用治療もまた本発明本発明の範囲内にある。
【０３６２】
「同時に」によって、活性物質が実質的に同一の時に、および好ましくは同一の処方中で一緒に、投与されることを意味する。 
【０３６３】
「同時期に」によって、活性物質が近い時間に投与されることを意味し、たとえば、１つの物質がもう１つの物質の前または後約１分間以内から約１日以内に投与される。任意の同時期の時間が有用である。しかし、同時に投与されない場合、物質は約１分間以内から約８時間以内、および好ましくは約１ないし約４時間より短い間に投与される場合が多い。同時期に投与される場合、物質は好ましくは動物の同一の部位に投与される。「同一の部位」の語は正確な位置を含むが、しかし約０．５ないし約１５センチメートル、好ましくは約０．５ないし約５センチメートル以内であることができる。
【０３６４】
ここで用いられる「別々に」の語は、物質が、間隔を置いて、たとえば約１日ないし数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性物質はどちらの順序でも投与することができる。
【０３６５】
ここで用いられる「順次に」の語は、物質が順番に、たとえば分、時間、日、または週間隔で投与されることを意味する。必要に応じて、活性物質は規則的な反復サイクルで投与することができる。
【０３６６】
一実施形態では本発明に用いられる治療剤は、直接的に患者にｉｎ ｖｉｖｏで投与することができることが理解される。代替として、または加えて、当該物質はＴ細胞および／またはＡＰＣのような細胞にｅｘ ｖｉｖｏの方法で投与することができる。たとえば、Ｔ細胞またはＡＰＣのような白血球を、患者またはドナーから既知の方法で入手し、ｅｘ ｖｉｖｏで本発明の方法で処理／インキュベートし、その後患者に投与することができる。加えて、投与経路の組み合わせを必要に応じて用いることができることが理解される。たとえば、適切な場合には、１成分（たとえばＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子）をｅｘ−ｖｉｖｏ で投与することができ、他方をｉｎ ｖｉｖｏで投与することができ、また逆も可能である。
【０３６７】
化学的架橋化
化学的に結合した（架橋した）配列を、個別のタンパク質配列から調製し既知の化学結合技術を用いて結合させることができる。複合体は、たとえば従来の溶液相または固相ペプチド合成法を用いて組み立てることができ、末端アミノ基だけが脱保護された反応性形である完全に保護された前駆体が得られる。この官能基は次いでＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその適当な反応性誘導体と直接反応させることができる。代替として、このアミノ基を、カーゴ部分またはリンカーを有する、反応に適した別の官能基に変換することができる。このように、たとえば無水コハク酸とのアミノ基の反応は選択的に指定可能なカルボキシル基を与え、一方、システイン誘導体を用いたさらなるペプチド鎖伸長は、選択的に指定可能なチオール基を結果として生じる。適当な選択的に指定可能な官能基が送達ベクター前駆体中に一旦導入されると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはその誘導体を、たとえばアミド、エステル、またはジスルフィド結合形成を介して結合することができる。利用することができる架橋化試薬は、たとえば、ミーンズ（Ｍｅａｎｓ）， Ｇ．Ｅ．およびフィーニー（Ｆｅｅｎｅｙ）， Ｒ．Ｅ．， 『タンパク質の化学修飾』（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ホールデン・デイ社（Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）， １９７４， ｐｐ． ３９−４３で考察されている。
【０３６８】
上記の通り、ポリマーとＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質またはポリペプチドとは、直接的に、または適切なリンカー部分を介して間接的に、結合することができる。直接結合は、チオール、ヒドロキシ、カルボキシまたはアミノ期といった、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質上の任意の便利な官能基を介して起こりうる。しばしば好ましい可能性がある間接結合は、連結部分を介して起こる。適当な連結部分は、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドプロピオン酸誘導体およびスクシンイミド誘導体のような、二官能性および多官能性アルキル、アリール、アラルキルまたはペプチド部分、アルキル、アリールまたはアラルキルアルデヒド酸エステルおよび無水物、スルフヒドリルまたはカルボキシル基を含み、また臭化または塩化シアヌル、カルボニルジイミダゾール、スクシンイミジルエステルまたはハロゲン化スルホンなどに由来することができる。一方でリンカーとＮｏｔｃｈシグナル伝達調節のためのタンパク質との、同様に他方でリンカーとポリマーとの間の共有結合に用いられる、リンカー部分上の官能基は、二つ以上の、たとえば、アミノ、ヒドラジノ、ヒドロキシル、チオール、マレイミド、カルボニル、およびカルボキシル基、などでありうる。リンカー部分は、リンカー部分が標的タンパク質に結合するシステイン残基を任意に含む、たとえば１ないし４アミノ酸残基の短い配列を含むことができる。
【０３６９】
修飾／ヒト化抗体
好ましくは、ヒト患者を治療するための用途向けの抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。抗体「ヒト化」技術は本分野でよく知られている。これらの技術は典型的には、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための、組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。
【０３７０】
ＵＳ５８５９２０５に記載された通り、モノクローナル 抗体 （Ｍａｂｓ）をヒト化するための初期の方法は、１つの抗体の完全な可変領域を含む抗原結合部位が、別の抗体に由来する定常領域と結合している、キメラ抗体の産生を含んだ。そのようなキメラ化手順は欧州特許第Ａ−０１２０６９４号明細書（セルテック社（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ））、 欧州特許第Ａ−０１２５０２３号明細書（（ジェネテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）およびシティ・オブ・ホープ（Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ））、欧州特許第Ａ−０ １７１４９６号明細書（Ｒｅｓ． Ｄｅｖ． Ｃｏｒｐ． Ｊａｐａｎ）、欧州特許第Ａ−０ １７３ ４９４号明細書（スタンフォード大学）、および国際公開第８６／０１５３３号パンフレット（セルテック社）に記載されている。たとえば、国際公開第８６／０１５３３号パンフレットは、マウスＭＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体分子を調製するための製法を開示する。
【０３７１】
欧州特許第Ａ−０２３９４００号明細書（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ））に記載された別の手法では、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）がヒト免疫グロブリンの可変領域の骨格領域に、部位特異的突然変異誘発によって長オリゴヌクレオチドを用いて移植される。そのようなＣＤＲ移植されたヒト化抗体は、ヒト化キメラ抗体よりも、それらが含む非ヒトアミノ酸配列の大幅に低い比率の点から、抗−抗体反応を生じる可能性が大幅に低い。リゾチームを認識するマウスＭＡｂおよびヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットＭＡｂがＣＤＲ移植によってヒト化された例が、ヴェルヘイエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）他 （Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９， １５３４−１５３６， １９８８）およびリーヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）他 （Ｎａｔｕｒｅ， ３３２， ３２３−３２４， １９８８）によってそれぞれ記載されている。ヒトＴ細胞上の抗原に対するＣＤＲ移植抗体の作製もまた、国際公開第８９／０７４５２号パンフレット（英国医療審議会）に記載されている。
【０３７２】
国際公開第９０／０７８６１号パンフレットにおいて、クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らはヒト化免疫グロブリンを設計するための４つの基準を提示している。第一の基準は、ヒトアクセプターとして、ヒト化する非ヒトドナー免疫グロブリンと著しく相同である特定のヒト免疫グロブリンに由来する骨格を用いるか、または多数のヒト抗体に由来する共通骨格を用いることである。第二の基準は、ヒト配列について骨格の特定残基でヒトアクセプター残基が稀であってドナー残基が典型的である場合は、アクセプターでなくドナーアミノ酸を用いることである。第三の基準は、ＣＤＲｓに直に隣接する位置では、アクセプターでなくドナーアミノ酸を用いることである。第四の基準は、アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルでＣＤＲｓの約３Ａ以内に側鎖原子を有し、抗原またはヒト化免疫グロブリンのＣＤＲｓと相互作用が可能であると予測される場合は、その骨格位置でドナー骨格アミノ酸残基を用いることである。基準２、３、４は基準１に加えて、またはその代替として適用することができ、また１つずつでまたは任意の組み合わせで適用することができる。
【０３７３】
抗原およびアレルゲン
一実施形態では、本発明の複合体は、抗原または抗原決定基（またはそれをコードするポリヌクレオチド）と同時，別々または順次の組み合わせで投与することができ、そのような抗原または抗原決定基への免疫反応を修飾（上昇または低下）することができる。
【０３７４】
本発明での用途に適した抗原は、免疫系によって認識されうる、また一般的に抗原受容体によって認識される、任意の物質であることができる。好ましくは本発明に用いられる抗原は免疫原である。宿主が、以前に遭遇した抗原に再曝露される時、アレルギー反応が起こる。
【０３７５】
抗原に対する免疫反応は一般的に細胞性（Ｔ細胞媒介殺菌）または体液性（完全な抗原の認識を介した抗体産生）のどちらかである。免疫反応に関与するＴＨ細胞によるサイトカイン産生のパターンは、これらの反応型のどちらが優位になるかに影響を与えることができる；細胞性免疫（ＴＨ１）は高いＩＬ−２およびＩＦＮｇとしかし低いＩＬ−４産生で特徴づけられる一方、体液性免疫（ＴＨ２）ではパターンは低いＩＬ−２およびＩＦＮｇとしかし高いＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３である。分泌パターンは二次リンパ器官または細胞のレベルで調節されるため、特定のＴＨサイトカインパターンの薬理学的操作は、生じる免疫反応の種類および程度に影響を与えることができる。
【０３７６】
ＴＨ１−ＴＨ２バランスは、２つの異なる型のヘルパーＴ細胞の相対的な発現量をいう。２つの型は免疫系に対して大規模かつ相反する作用を有する。ある免疫反応がＴＨ１細胞を優先する場合、それらの細胞は細胞応答を推進し、一方でＴＨ２細胞は抗体に支配される応答を推進する。一部のアレルギー反応を担う種類の抗体はＴＨ２細胞によって誘導される。
【０３７７】
本発明に用いられる抗原またはアレルゲン（またはその抗原決定基）は、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、タンパク質、糖タンパク質、または、タンパク質複合体、細胞−膜調製物、完全な細胞（生存可能なまたは生存不能な細胞）、細菌細胞またはウイルス／ウイルス成分のような、複数の抗原性エピトープを含むより複雑な材料であることができる。特に、ミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症に関連）、コラーゲン（慢性関節リウマチに関連）、およびインシュリン（糖尿病）、またはＭＨＣ抗原またはその抗原決定基のような非自己組織の拒絶に関連する抗原、といった自己免疫疾患に関連することが知られている抗原を用いることが好ましい。初回抗原刺激を受けた本発明のＡＰＣおよび／またはＴ細胞が組織移植術手続に用いられる場合、抗原は組織ドナーから得ることができる。ポリヌクレオチド対象において発現される可能性がある抗原または抗原決定基をコードするポリヌクレオチドもまた用いることができる。
【０３７８】
抗原またはアレルゲン部分は、たとえば合成ＭＨＣ−ペプチド複合体、すなわち抗原の要素を保持する抗原結合窩を持つＭＨＣ分子の断片のような、誘導体または複合体として存在しうる。そのような複合体はアルトマン（Ａｌｔｍａｎ）他， １９９６に記載されている。
【０３７９】
測定法
ある物質を、Ｎｏｔｃｈ−Ｎｏｔｃｈリガンド発現を調節するために用いることができるかどうかは、たとえば、英国特許第０１１８１５３．６号の優先権を主張する我々の同時出願中の国際出願（現在国際公開第０３／０１２４４１号として公開）に記載されたような、またはたとえば本文書の実施例に記載されたような、適当なスクリーニング測定法を用いて決定することができる。
【０３８０】
たとえば、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、タンパク質測定法によって、または核酸測定法によって監視することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化は、その細胞質ドメインのタンパク質分解切断、および細胞核へのその移動に繋がる。ここでいう「検出可能なシグナル」は、Ｎｏｔｃｈの切断された細胞内ドメインの存在に帰することができる任意の検出可能な徴候であることができる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、切断されたＮｏｔｃｈドメインの細胞内濃度を測定することによって、タンパク質レベルで評価することができる。Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化はまた、一連の下流の反応を触媒し、ある種の明確な遺伝子の発現のレベルの変化に繋がる。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の増加は、たとえば特定のｍＲＮＡの細胞内濃度を測定することによって、核酸レベルで評価することができる。本発明の好ましい一実施形態では、測定法はタンパク質測定法である。本発明の別の好ましい一実施形態では、測定法は核酸測定法である。
【０３８１】
核酸測定法を用いることの利点は、核酸測定法は高感度であり少量の試料を分析することができることである。
【０３８２】
任意の時間に測定された、特定のｍＲＮＡの細胞内濃度は、対応する遺伝子のその時点での発現レベルを反映する。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の下流標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、免疫系のＴ細胞の間接的測定によって測定することができる。特に、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓ−１および／またはＩＬ−１０ ｍＲＮＡのレベルの上昇はたとえば誘導された免疫反応不顕性を示しうる一方、Ｄｌｌ−１またはＩＦＮ−γ ｍＲＮＡのレベルまたはＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−１３といったサイトカインをコードするｍＲＮＡのレベルの上昇は反応性の改善を示しうる。
【０３８３】
さまざまな核酸測定法が既知である。既知であるかまたは後に開示される任意の従来の技術を用いることができる。適当な核酸測定法の例は下記に示され、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ブロッティング、分光分析、レポーター遺伝子測定法、遺伝子チップアレイおよび他のハイブリダイゼーション法を含む。
【０３８４】
特に、遺伝子の存在、増幅および／または発現は、試料中で直接に、たとえば、従来のｍＲＮＡの転写を定量するサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ分析）、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、適当に標識化されたプローブを用いて測定することができる。当業者は必要に応じて、これらの方法をどのように改変しうるかを容易に考えることができる。
【０３８５】
ＰＣＲは最初は、不純な試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。その技術は、反応溶液を繰り返し加熱および冷却してプライマーを標的配列とアニーリングさせる温度サイクル、および複製娘鎖の形成のためのそれらのプライマーの伸長に基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素を用いた最初のｃＤＮＡ鎖の生成に、ＲＮＡテンプレートを用いる。ｃＤＮＡはその後、標準のＰＣＲ手順に従って増幅する。合成および変性の繰り返しサイクルの結果として、生じる標的ＤＮＡのコピー数の指数的増加が起こる。しかし、反応成分が限られてくるにつれ、増幅の速度は低下して停滞状態に達し、その後はＰＣＲ産物の正味の増加はほとんどまたは全く無い。核酸標的の開始コピー数が多いほど、この「終点（エンドポイント）」に到達するのは早い。
【０３８６】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグまたは蛍光色素で標識化されたプローブを用い、一定数のサイクル後の産物蓄積の測定のためでなく、蓄積していくＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量測定のためのエンドポイントＰＣＲとは異なる。反応は、標的配列の増幅が蛍光の有意な増加によって最初に検出される際のサイクル反応中の時点によって特徴づけられる。
【０３８７】
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮａｓｅ保護）測定法は、溶液中の特定のＲＮＡの定量のための極めて高感度な技術である。リボヌクレアーゼ保護測定法は、標的として細胞ＲＮＡ全体またはポリ（Ａ）−選択されたｍＲＮＡについて実施することができる。リボヌクレアーゼ保護測定法の感度は、高い比活性で放射性標識された相補ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物プローブの使用に由来する。プローブおよび標的ＲＮＡは溶液中でハイブリダイズされ、その後、混合物は希釈されてリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理され、残っている一本鎖ＲＮＡすべてが分解される。プローブのハイブリダイズした部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動とその後のオートラジオグラフィーによって可視化することができる。保護された断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるため、リボヌクレアーゼ保護測定法を用いてｍＲＮＡ特性を正確にマッピングすることができる。プローブが標的ＲＮＡに関して過剰なモル数でハイブリダイズされるならば、結果として生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。
【０３８８】
遺伝子発現はまた、レポーター系を用いて検出することができる。そのようなレポーター系は、発現系、たとえば監視される遺伝子の調節下にある、容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出および選別が可能である蛍光マーカーが好ましい。特に好ましいのはＧＦＰおよびルシフェラーゼである。別の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカー、すなわち細胞表面上に発現されしたがって容易に同定可能であるタンパク質である。
【０３８９】
一般的に、レポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナル伝達を検出するために有用なレポーター構造は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら（１９８９）の一般的教示に従って構築することができる。典型的には、本発明に記載の構造は、目的の遺伝子によるプロモーター、およびたとえばＧＦＰまたはルシフェラーゼのような目的のレポーター構造をコードするコード配列を含む。ＧＦＰおよびルシフェラーゼをコードするベクターは本分野で既知でありまた市販されている。
【０３９０】
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上記に例示された通り、本分野で既知である任意の技術によって実施することができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリーまたはＦＡＣＳによって選別することができる。全般的参考には、『フローサイトメトリーおよびセルソーティング；実験の手引き』（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９９２）Ａ．ラドブルーフ（Ｒａｄｂｒｕｃｈ）（編）、スプリンガー・ラボラトリー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、を参照。
【０３９１】
フローサイトメトリーは、細胞を研究および精製するための強力な方法である。フローサイトメトリーは特に免疫学および細胞生物学で幅広い用途を見出している；しかし、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多数の分野で応用することができる。頭文字のＦ．Ａ．Ｃ．Ｓ．はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（蛍光活性化細胞選別）を表し、「フローサイトメトリー」と相互に交換可能に用いられる。ＦＡＣＳの原理は、液体の細流中にある個々の細胞に一種類以上のレーザー光線を通過させると、光の散乱が起こり蛍光色素がさまざまな周波数で光を放出することである。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気シグナルに変換し、電気シグナルはソフトウェアで処理されて、当該細胞についてのデータを生成する。明確な特徴を持つ細胞の部分集団を特定して、懸濁液から非常に高純度で（~１００%）自動的に選別することができる。
【０３９２】
ＦＡＣＳを用いて、ポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡをトランスフェクションした細胞における遺伝子発現を測定することができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接的に、または、当該構造中のレポーター遺伝子を用いることによって間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例はβ−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼ活性はＦＡＣＳによって、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）といった蛍光基質を用いて検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、酵素によって切断されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕捉される。１つの酵素がしたがって大量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰ構造を発現している細胞は基質の添加無しで蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが同一のチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの突然変異体が入手可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置では、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって２種類のトランスフェクションを同時に測定することができる。
【０３９３】
細胞選別の別の方法もまた使用することができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブを用いて、ポリペプチドを発現している細胞を個別に同定することができ、そのため細胞をその後に手作業でまたはＦＡＣＳ選別を用いて選別することができる。ｍＲＮＡと相補的な核酸プローブは、上記に示す教示に従って、前出のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ） ら（１９８９）によって記載された一般的手順を用いて調製することができる。
【０３９４】
好ましい一実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡと相補的な、ＦＡＣＳ細胞選別に使用することができる蛍光団と結合した、アンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０３９５】
遺伝子発現および同一性についての情報を、いわゆる遺伝子チップアレイまたは高密度ＤＮＡアレイを用いて得るための方法もまた記載されている（チー（Ｃｈｅｅ）Ｍ． 他 （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４；６０１−６１４ （Ｃｈｅｅ））。これらの高密度アレイは、診断および予測診断目的に特に有用である。Ｉｎ Ｖｉｖｏ発現技術（ＩＶＥＴ）もまた利用することができる（カミリ（Ｃａｍｉｌｌｉ）他 （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１；２６３４−２６３８ （Ｃａｍｉｌｌｉ））。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較して、たとえば治療または疾患の際にアップレギュレートされる遺伝子を特定する。
【０３９６】
タンパク質測定法を用いることの利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを測定するために用いることができる測定法技術は当業者によく知られている。そのような測定法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合測定法、ウェスタンブロット分析、抗体サンドイッチ測定法、抗体検出、ＦＡＣＳ、およびＥＬＩＳＡ測定法を含む。
【０３９７】
上述の通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子はまた、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、またはＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の発現または相互作用を調節するように処理された免疫細胞であることができる。そのような細胞は、たとえば、本文が参照により本開示に含まれるロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）の名義の国際公開第００／３６０８９号パンフレットに記載されるように、容易に調製することができる。
【０３９８】
免疫系の細胞
抗原提示細胞
状況によっては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は「専門の」抗原提示細胞である可能性があり、または抗原をＴ細胞へ提示するように誘導されうる別の細胞である可能性がある。代替として、培養条件下で分化するかまたは活性化されてＡＰＣを生じるＡＰＣ前駆細胞を用いることができる。本発明のｅｘ ｖｉｖｏの方法に用いられるＡＰＣは、典型的には患者の体内で見出される腫瘍または末梢血から単離される。好ましくはＡＰＣまたは前駆細胞はヒト起源である。しかし、適当な 核酸 配列を同定および試験するための予備ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング手続にＡＰＣが用いられる場合は、たとえば健康な被験者といった任意の適当な起源に由来するＡＰＣを用いることができる。
【０３９９】
ＡＰＣは、表面上にＭＨＣ分子（クラスＩまたはＩＩ）を発現するように活性化されたかまたはトランスフェクションによって操作された、指状嵌入（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ）ＤＣまたは濾胞ＤＣといった樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、または他の、上皮細胞、線維芽細胞または内皮細胞のような細胞型を含む。ＡＰＣの前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞、単球、線維芽細胞および内皮細胞を含む。ＡＰＣまたは前駆細胞は、培養条件によって修飾することができ、または、たとえば抗原提示に関与するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子および／または免疫増強作用を促進する選択されたサイトカイン遺伝子（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−g、ＴＮＦ−a、ＩＬ−１８など）との組み合わせのトランスフェクションによって、遺伝子操作することができる。そのようなタンパク質は、ＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＣＤ４０を含む。非常に好ましくはＤＣまたはＤＣ前駆細胞がＡＰＣの起源として含まれる。
【０４００】
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの方法で単離／調製することができ、たとえばＤＣは末梢血から直接精製することができ、または、たとえばＧＭ−ＣＳＦを用いた処理による末梢血への移行後に、または骨髄から直接、ＣＤ３４＋前駆細胞から発生させることができる。末梢血から、接着性の前駆細胞をＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（イナバ（Ｉｎａｂａ）Ｋ， 他 （１９９２） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５； １１５７−１１６７ （Ｉｎａｂａ））、または骨髄から、非接着性のＣＤ３４＋細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａで処理することができる（コー（Ｃａｕｘ）Ｃ， 他 （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３６０； ２５８−２６１ （Ｃａｕｘ））。ＤＣはまた、サルスト（Ｓａｌｌｕｓｔｏ）およびランザベキア（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ）の方法（Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ ａｎｄ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９； １１０９−１１１８）と同様に、精製末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて接着性細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で２時間処理して、ヒト提供者の末梢血から定型的に調製することができる。必要に応じて、ＤＣから磁気ビーズを用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３＋、ＣＤ２＋Ｔ細胞を除去することができる（コフィン（Ｃｏｆｆｉｎ）ＲＳ， 他 （１９９８） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５； ７１８−７２２ （Ｃｏｆｆｉｎ））。培養条件は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−４のような他のサイトカインを、樹状細胞または他の抗原提示細胞の維持および／または活性のために含むことができる。
【０４０１】
このように、ここで用いられる「抗原提示細胞など」の語は、ＡＰＣに限られないことが意図されると理解される。当業者は、Ｔ細胞集団に提示することができる任意の媒介物を用いることができることを理解し、便宜上ＡＰＣの語がこれらすべてをいうのに用いられる。上記に示す通り、適当なＡＰＣの好ましい例は、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞または脂質膜のような合成ＡＰＣを含む。
【０４０２】
Ｔ細胞
状況によっては、健常被験者といった任意の適当な起源由来のＴ細胞を、用いることができ、血液または他の起源（たとえばリンパ節、脾臓、または骨髄）から得ることができる。Ｔ細胞は任意に、標準的手順によって濃縮されるかまたは精製される。Ｔ細胞は、同一のまたは別の個体から得られた、他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。代替として、全血を、または白血球が濃縮された血液または精製白血球を、Ｔ細胞および他の細胞型の起源として用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）を用いることが特に好ましい。代替として、ＣＤ８＋細胞のような他のＴ細胞を用いることができる。また、Ｔ細胞ハイブリドーマのような細胞株を用いることも便利である。
【０４０３】
ＡＰＣおよび細胞への物質の曝露
Ｔ細胞／ＡＰＣは上記の通り培養することができる。ＡＰＣ／Ｔ細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を調節することができる物質とインキュベート／曝露することができる。たとえば、それらは患者への投与のために調製することができ、またはＴ細胞と共にｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）でインキュベートすることができる。
【０４０４】
ＡＰＣおよびＴ細胞への核酸配列の導入
上記の通りのＴ細胞およびＡＰＣは、ＤＭＥＭまたは他の明確な培地のような適当な培地中で、任意にウシ胎仔血清の存在下で、培養することができる。
【０４０５】
Ｔ細胞および／またはＡＰＣ中でポリペプチドの発現を可能にする条件下でポリペプチドをコードする核酸構造／ウイルスベクターを細胞へ導入することによって、ポリペプチド物質をＴ細胞および／またはＡＰＣへ投与することができる。同様に、アンチセンス構造をコードする核酸構造を、トランスフェクション、ウイルス感染またはウイルス形質導入によってＴ細胞および／またはＡＰＣへ導入することができる。
【０４０６】
好ましい一実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む調節配列に、調節可能に結合している。「調節可能に結合」の語は、記載の成分が、意図された方法でそれらが機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列と「調節可能に結合」した調節配列は、好ましくはコード配列の発現が対照配列と一致する条件下で達成されるような方法で繋げられている。
【０４０７】
プロモーターは典型的には、哺乳類細胞中で機能するプロモーターから選択されるが、原核プロモーターおよび、他の真核細胞中で機能するプロモーターを用いることができる。プロモーターは典型的にはウイルス遺伝子または真核遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、発現が起こる細胞のゲノムに由来するプロモーターであることができる。真核プロモーターについては、遍在的な形で（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターのように）または、代替として、組織特異的な形で（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターのように）機能するプロモーターであることができる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、および眼内の上皮細胞に特異的である、組織特異的プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、ｋｅｒａｔｉｎ１４、Ｗｎｔ−１およびロドプシンプロモーターである。好ましくは上皮細胞プロモーターＳＰＣが用いられる。また、たとえばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターのように、特定の刺激に反応するプロモーターであることができる。たとえばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターといった、ウイルスプロモーターもまた用いることができる。
【０４０８】
異種遺伝子の発現のレベルを、細胞の生涯の間に調節することができるように、プロモーターは誘導性であることもまた有利でありうる。誘導性とは、当該プロモーターを用いて得られた発現のレベルを調節することができることを意味する。
【０４０９】
上記のプロモーターのうち任意のものを、別の調節配列、たとえばエンハンサー配列の付加によって修飾することができる。二つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターもまた用いることができる。
【０４１０】
代替として（または加えて）、調節配列は、目的の遺伝子が本発明で有用な細胞でだけ発現されるように、細胞特異的であることができる。そのような細胞は、たとえば、ＡＰＣおよびＴ細胞を含む。
【０４１１】
必要に応じて、細胞の少量の一部を上記の通りＮｏｔｃｈシグナル伝達活性のアップレギュレーションについて試験することができる。細胞は、患者への投与のために調製、またはＴ細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏ （ｅｘ ｖｉｖｏ）でインキュベートすることができる。
【０４１２】
免疫反応および寛容化の測定法
上に記載された測定法（「測定法」を参照）のうち任意のものを、免疫細胞における反応性低下および寛容化を測定または検出し、および、免疫反応の抑制および増大を臨床用途での使用のために検出するのに用いることができる。
【０４１３】
免疫細胞活性は、当業者に既知である任意の適当な方法によって監視することができる。たとえば、細胞毒性活性を監視することができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は活性化後に細胞毒性活性の増大を示す。したがって細胞毒性の何らかの低下または安定化は、反応性の低下の徴候となる。
【０４１４】
一旦活性化されると、白血球はさまざまな新しい細胞表面抗原を発現する。ＮＫ細胞は、たとえば、トランスフェリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ２５ ＩＬ−２受容体を活性化後に発現する。反応性低下はしたがってこれらの抗原の発現を監視することによって測定することができる。
【０４１５】
ハラ（Ｈａｒａ）他『ヒトＴ細胞活性化；ＩＩＩ，１２−０−テトラデカノイルホルボール−１３−酢酸、マイトジェンおよび抗原によるリン酸化２８ｋＤ／３２ｋＤジスルフィド結合初期活性化抗原（ＥＡ−１）の迅速誘導』（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ； ＩＩＩ， Ｒａｐｉｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ２８ ｋＤ／３２ｋＤ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｌｉｎｋｅｄ Ｅａｒｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＥＡ−１） ｂｙ １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ， Ｍｉｔｏｇｅｎｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６４；１９８８ （１９８６）、およびコスリッヒ（Ｃｏｓｕｌｉｃｈ）他『Ｔ細胞活性化の初期段階に関与する抗原（ＭＬＲ３）の機能的特徴づけ』（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｇｅｎ （ＭＬＲ３） Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｎ Ｅａｒｌｙ Ｓｔｅｐ ｏｆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）， ＰＮＡＳ， ８４；４２０５ （１９８７）は、活性化の直後にＴ細胞上に発現される細胞表面抗原を記載している。これらの抗原，それぞれＥＡ−１およびＭＬＲ３は、２８ｋＤおよび３２ｋＤの主要成分を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１およびＭＬＲ３はＨＬＡクラスＩＩ抗原ではなく、ＭＬＲ３ ＭａｂはＩＬ−１結合を遮断する。これらの抗原は、活性化されたＴ細胞上に１８時間以内に出現し、したがって免疫細胞反応性を監視するために用いることができる。
【０４１６】
加えて、白血球反応性は、参照により本開示に含まれる欧州特許第０３２５４８９号明細書に記載の方法で監視することができる。要約すると、これは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９６２７で表されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に認識される細胞性抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「抗Ｌｅｕ２３」）を用いて達成される。
【０４１７】
抗Ｌｅｕ２３は、活性化されたおよび抗原刺激された白血球上の細胞表面抗原を認識する。活性化ＮＫ細胞上では、その抗原Ｌｅｕ２３は活性化後４時間以内に発現され、活性化後７２時間まで発現され続ける。Ｌｅｕ２３は、少なくとも２個のＮ結合型糖鎖を有する２４ｋＤサブユニットから構成されるジスルフィド結合ホモ二量体である。
【０４１８】
Ｌｅｕ２３のＮＫ細胞上での出現が細胞毒性の発生と相関するため、およびＬｅｕ２３のある種のＴ細胞上での出現がＴ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、抗Ｌｅｕ２３は白血球の反応性を監視するのに有用である。
【０４１９】
免疫細胞反応性の監視のための技術のさらなる詳細は、参照により本開示に含まれる；『ナチュラルキラー細胞』（Ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ）ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ｃ． Ｅ． およびＪ． Ｏ’Ｄ．マクジー（ＭｃＧｅｅ）１９９２． オックスフォード大学出版会； トリンチエリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）Ｇ．『ナチュラルキラー細胞の生物学』（Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８９ ｖｏｌ ４７ ｐｐ１８７−３７６；『免疫反応遺伝子ハンドブック』（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｇｅｎｅｓ）の７章『免疫反応のサイトカイン』（Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ）マク（Ｍａｋ）Ｔ．Ｗ． およびＪ．Ｊ．Ｌ．シマード（Ｓｉｍａｒｄ）１９９８に見出される。
【０４２０】
調節Ｔ細胞（およびＢ細胞）のｅｘ ｖｉｖｏ調製
下記の技術はＴ細胞に関して説明されているが、Ｂ細胞に等しく適用可能である。使用した技術は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されること以外は、ＡＰＣ単独について記載されたものと本質的に同一である。しかし、初回抗原刺激を受けたＡＰＣをまず作製し、次いでそれをＴ細胞とインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、それを沈澱させＰＢＳで洗浄してから新しい培地に再懸濁することができる。このことは、たとえば、Ｔ細胞を異なる物質で処理したい場合、Ｔ細胞はＡＰＣに用いた別の物質と接触させられることがないという利点を有する。初回抗原刺激を受けたＡＰＣが一旦作製されると、初回抗原刺激を受けたＡＰＣはそれ自体が免疫反応を調節するかまたは免疫寛容を誘導することができ、おそらく初回抗原刺激を受けたＡＰＣとＴ細胞との間のＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を介してＴ細胞におけるＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンド発現の増加に繋がるため、Ｔ細胞に何らかの物質を投与することは必ずしも常に必要でない。
【０４２１】
インキュベートは典型的には少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３、６、１２、２４、４８時間または３６時間以上、適当な培地中で３７℃にてとなる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の進行は、上記の方法を用いて細胞の少量の一部について測定することができる。たとえばＤｅｌｔａの発現を指示する核酸構造をトランスフェクションしたしたＴ細胞をを対照として用いることができる。免疫反応／寛容の調節は、たとえば、続いてＴ細胞に抗原を負荷し、ＡＰＣに曝露されていない対照細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって測定することができる。
【０４２２】
初回抗原刺激を受けたＴ細胞またはＢ細胞はまた、ＡＰＣの非存在下で同様の培養技術およびインキュベート時間を用いて、他のＴ細胞またはＢ細胞において免疫寛容を誘導するのに用いることができる。 
【０４２３】
代替として、抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）といったＡＰＣ代替物を用いて、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）と共にまたはそれ無しで、Ｔ細胞をＡＰＣの非存在下で培養して初回抗原刺激することができ、またはＴ細胞をＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば四量体）で活性化することができる。
【０４２４】
免疫寛容の誘導は、その後にＴ細胞に抗原を負荷し、ＡＰＣに曝露していない対照細胞と比較してＩＬ−２産生を測ることによって測定することができる。
【０４２５】
この方法で初回抗原刺激されているＴ細胞またはＢ細胞を、本発明にしたがって、別のＴ細胞またはＢ細胞において免疫寛容を促進または上昇させるのに用いることができる。
【０４２６】
本発明のさまざまな好ましい特性および実施形態をここで、非限定的な実施例を用いて、より詳細に説明する。 
【実施例】
【０４２７】
[実施例１]
Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達の調節因子 （ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ 融合 タンパク質）の調製
ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインと融合したヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインを含む融合タンパク質（"ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ"）を、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（たとえばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２を参照）を発現ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス社（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国スラウ（Ｓｌｏｕｇｈ））に挿入し結果として生じる構造をＣＨＯ細胞で発現することによって調製した。
【０４２８】
ｉ）クローニング
ヒトＤｅｌｔａ様リガンド１の１６２２ｂｐの細胞外（ＥＣ）断片（ｈＥＣＤＬＬ−１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２を参照）を、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。断片をその後、ｐＣＲブラント（ｐＣＲＢｌｕｎｔ）クローニングベクター（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、英国）にライゲーションし、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで切断してＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩおよびＡｐａＩ部位を除去した
【０４２９】
ライゲーションでＤＨ５ａ細胞を形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ）プレート上に播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。コロニーをプレートから３ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（３０ｕｇｍｌ−１）に取り、３７℃にて一夜生育させた。プラスミドＤＮＡを培養からキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック・スピン・ミニプレップ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（品番２７１０６）を用いて取扱説明書に従って精製し、次いで診断的にＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。クローンを選択し、ＬＢ＋カナマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ）プレート上に改変ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ｈＥＣＤＬＬ−１のグリセロールストックと共に播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。このプレートからコロニーを６０ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（３０ｕｇ／ｍｌ）に取り、３７℃にて一夜インキュベートした。培養をクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヌクレオボンド・マキシ（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ）キット（品番Ｋ３００３−２）を用いて取扱説明書に従ってマキシプレップ処理し、最終のＤＮＡ沈澱を３００ｕｌのｄＨ２Ｏに再懸濁し、−２０℃にて保存した。
【０４３０】
５ｕｇの改変ｐＣＲＢｌｕｎｔ-ｈＥＣＤＬＬ−１ベクターを、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて直鎖化し、ＡｐａＩで部分消化した。１６２２ｂｐのｈＥＣＤＬＬ−１断片を次いでクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヌクレオスピン（登録商標）（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）抽出キット（Ｋ３０５１−１）を用いて取扱説明書に従ってゲル精製した。ＤＮＡを次いで別のクローンテック・ヌクレオスピンカラムに通し、ＰＣＲ手順からの単離後、試料の濃度をライゲーションに備えてアガロースゲル分析で確認した。
【０４３１】
プラスミドｐｃｏｎｇ（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩで切断し、下記のオリゴをライゲーションした；
【化１１】
2006513260.tif 000019
（配列ＩＤ番号；４および５）
【０４３２】
ライゲーション産物でＤＨ５ａ細胞を形質転換し、２００ｕｌの形質転換細胞をＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｕｇ／ｍｌ）プレートに播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。翌日、１２個のクローンを２ｘＹＴ＋アンピシリン（１００ｕｇｍｌ−１）に取り、３７℃にて一日生育させた。プラスミドＤＮＡを培養からキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック・スピン・ミニプレップ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（品番２７１０６）を用いて精製し、診断的にＮｏｔＩを用いて消化した。クローン（「ｐＤｅｖ４１」で表す）が選択され、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｕｇ／ｍｌ）プレートにｐＤｅｖ４１のグリセロールストックを播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。翌日、１つのクローンをこのプレートから６０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｕｇ／ｍｌ）に取り、振とうしながら３７℃にて一夜インキュベートした。クローンをクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヌクレオボンド・マキシ（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ）キット（品番Ｋ３００３−２）を用いて取扱説明書に従ってマキシプレップ処理し、−２０℃にて保存した。ｐＤｅｖ４１クローン５マキシプレップを次いでＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ＩｇＧ４Ｆｃ断片（１６２４ｂｐ）を生じた。消化物を１%アガロースゲルで精製し、主バンドを切り出して、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヌクレオスピン（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ）抽出キット（Ｋ３０５１−１）を用いて精製した。
【０４３３】
ポリヌクレオチドを次いでｐＥＥ１４．４（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）のポリリンカー領域にクローニングした。ｐＥＥ１４．４のマキシプレップ５ｕｇをＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、産物をゲル抽出して、アルカリ・ホスファターゼで処理した。
【０４３４】
ｉｉ）発現構造の作製
３断片ライゲーションを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ切断ｐＥＥ、改変ｐＣＲＢｌｕｎｔ（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ）由来のＥＣＤＬＬ−１およびｐＤｅｖ４１から切断したＩｇＧ４Ｆｃ断片（ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ）を用いて作製した。これを用いてＤＨ５ａ細胞を形質転換し、２００ｕｌの形質転換細胞をＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｕｇ／ｍｌ）プレートに播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。翌日、１２個のクローンを２ｘＹＴ＋Ａｍｐ（１００ｕｇ／ｍｌ）に取り、ミニプレップを３７°Ｃにて一日生育させた。プラスミドＤＮＡをプレップからキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック・スピン・ミニプレップ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（カタログ番号２７１０６）を用いて精製し、診断的に消化し（ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで）、１つのクローン（クローン８；「ｐＤｅｖ４４」で表す）をマキシプレップ用に選択した。ｐＤｅｖ４４クローン８のグリセロールストックをＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｕｇｍｌ−１）プレートに播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。翌日、１個のコロニーを取って６０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００ｕｇｍｌ−１）液体培地に入れ、３７℃にて一夜インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヌクレオボンド・マキシプレップ（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ）キット（品番Ｋ３００３−２）を用いて単離した。
【０４３５】
ｉｉｉ）最適ＫＯＺＡＫ配列の付加
コザック（Ｋｏｚａｋ）配列を下記の通り発現構造に挿入した。オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理しアニーリングして下記の配列を生じた；
【化１２】
2006513260.tif 000020
（配列ＩＤ番号；６および７）
【化１３】
2006513260.tif 000021
（配列ＩＤ番号；８および９）
【０４３６】
ｐＤｅｖ４４をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＢＩで消化し、ゲル精製し、アルカリ・ホスファターゼで処理した。消化物をそのオリゴとライゲーションし、ＤＨ５α細胞へ熱ショックによって形質転換した。各形質転換細胞の２００ｕｌをＬＢ＋Ａｍｐプレート（１００ｕｇ／ｍｌ）に播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。ミニプレップを３ｍｌの２ｘＹＴ＋アンピシリン（１００ｕｇｍｌ−１）で生育させた。プラスミドＤＮＡをミニプレップからキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック・スピン・ミニプレップ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（カタログ番号２７１０６）を用いて精製し、ＮｃｏＩを用いて診断的に消化した。１個のクローン（ｐＤｅｖ４６）が選択され、配列が確認された。グリセロールストックを播種し、液体培地で生育させ、プラスミドをマキシプレップ処理した。 
【０４３７】
ｉｖ）トランスフェクション 
約１００ｕｇのｐＤｅｖ４６クローン１ＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩで直鎖化した。
結果として生じるＤＮＡ調製物を、フェノール／クロロホルム／ＩＡＡ抽出とその後のエタノール洗浄および沈澱で精製した。沈澱を滅菌水に再懸濁し、直鎖化および定量をアガロースゲル電気泳動およびＵＶ分光測光法で確認した。
【０４３８】
４０ｕｇの直鎖化ＤＮＡ（ｐＤｅｖ４６クローン１）および１ｘ１０７個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を無血清ＤＭＥＭ中で、４ｍｍキュベット中で室温にて混合した。細胞を次いで９７５ｕＦ２８０ボルトでエレクトロポレーションし、非選択ＤＭＥＭに洗い込み、希釈して９６ウェルプレートへ入れ、インキュベートした。２４時間後、培地を除去し、選択培地（２５ｕＭＬ−ＭＳＸ）と交換した。６週間後、培地を除去し、ＩｇＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。選択培地を交換した。陽性クローンを特定し、選択培地の２５ｕｍのＬ−ＭＳＸに継代した。
【０４３９】
ｖ）発現
細胞は選択ＤＭＥＭ（２５ｕｍＬ−ＭＳＸ）中で半集密まで増殖させた。次いで培地を無血清培地（ＵｌｔｒａＣＨＯ）と交換し、３〜５日間置いた。タンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質）を、結果として生じる培地からＦＰＬＣ（プロテインＡカラム）によって精製した。
【０４４０】
結果として生じる発現された融合タンパク質のアミノ酸配列は下記の通りであった（配列ＩＤ番号；１０）；
【化１４】
2006513260.tif 000022
ここで、第一の下線の配列はシグナルペプチド（成熟タンパク質から切断される）であり、第二の下線の配列はＩｇＧ４Ｆｃ配列である。本タンパク質は通常は、システインジスルフィド結合によって結合した二量体として存在する（たとえば図６の略図を参照）。
【０４４１】
融合タンパク質は、上記の通り、ＰＥＧのようなポリマー成分と結合させ、最終複合体を与える。
[実施例２]
【０４４２】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子の調製；短縮ヒトＪａｇｇｅｄ１融合タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＆２−ＩｇＧ４Ｆｃ）
ＷＯに記載の通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子として作用することができる、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに融合しているＥＧＦ２の終わりまでのヒトｊａｇｇｅｄ１配列（リーダー配列、アミノ末端、ＤＳＬ、ＥＧＦ１＋２）（「ｈＪａｇｇｅｄ１（ＥＧＦ１＋２）−ＩｇＧ４Ｆｃ」）を含む融合タンパク質が、ＡＴＧから第２のＥＧＦ反復（ＥＧＦ２）の終わりまでのヒトＪａｇｇｅｄ１をコードするヌクレオチド配列を、発現ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国スラウ（Ｓｌｏｕｇｈ））に挿入してＩｇＧ４Ｆｃタグを加えることによって調製された。完全な融合タンパク質を次いでグルタミン合成酵素（ＧＳ）選択系ベクターｐＥＥ１４．４（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））に入れた。結果として生じる構造を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）にトランスフェクションして発現させた。 
【０４４３】
１．クローニング
ｉ）ＤＮＡ-ｐＤＥＶ４７およびｐＤＥＶ２０の調製
ヒトＪａｇｇｅｄ１をｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングし、プラスミドｐＬＯＲ４７を生じた。
ｐＬＯＲ４７由来のＪａｇｇｅｄ１配列を、完全長ヒトｊａｇｇｅｄ１（ＧｅｎＢａｎｋＵ６１２７６）に対して整列させたところ、見かけ上サイレントな変化を少数しか有しないことが見出された。
【０４４４】
後のクローニングを容易にするため、プラスミドｐＬＯＲ４７を次いで改変し、２つのＤｒａＩＩＩ部位の一方を除去し（完全な細胞外ｈＪａｇｇｅｄ１のためのアミノ酸配列を維持および置換しながら）および１つのＢｓｉＷＩ部位を後に加えた。結果として生じるプラスミドをｐＤＥＶ２０と命名した。
【０４４５】
プラスミドｐＬＯＲ４７をＤｒａＩＩＩで切断した。このことは、ｈＪａｇｇｅｄ１の細胞外、膜貫通および細胞内領域の３’末端およびベクター配列の一部を含む１．７ｋｂの断片を除去し、ベクターの主骨格およびｈＪａｇｇｅｄ１の細胞外領域（ＥＣ）のほぼ全体の、より大きい７．３ｋｂｐの断片が残った。切断されたＤＮＡをアガロースゲルに流し、大きい方の断片を切り出してキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。
【０４４６】
一対のオリゴヌクレオチドを、合わせてライゲーションした場合に５’末端にＤｒａＩＩＩ用の適合する粘着末端を有し、元の制限部位を再生する、ＤＮＡの二本鎖を与えるように配置した。この配列の後にＢｓｉＷＩ部位が続き、次いで制限部位を再生しないもう１つの別のＤｒａＩＩＩ用の適合する粘着末端が３’末端に続く。
すなわち
【化１５】
2006513260.tif 000023
（配列ＩＤ番号；１１および１２）
【０４４７】
このオリゴ対を次いでＤｒａＩＩで切断したｐＬＯＲ４７にライゲーションし、それによって５’ＤｒａＩＩＩ部位を維持し、ＢｓｉＷＩを挿入し、３’ＤｒａＩＩＩ部位を除去する。結果として生じるプラスミドをｐＤＥＶ２０と命名した。
【０４４８】
ｉｉ）ｈＪａｇｇｅｄ１ＩｇＧ４ＦＣ融合ＤＮＡの調製；
改変５’Ｋｏｚａｋ配列および３’末端の修復と共に５’末端修復を加えて、完全なｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣ配列を再び組み立てるために、３断片ライゲーションが必要であった。
【０４４９】
断片１； ＥＣ ｈＪａｇｇｅｄ配列；
ｐＤｅｖ ２０をＲｓｒＩＩ-ＤｒａＩＩＩで切断し、３断片を生じた；１２７０＋２４５９＋３６２１ｂｐ。断片をアガロースゲルに流し、２４５９ｂｐのバンドを切り出してＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。これはｈＪａｇｇｅｄ１配列を含み、３’配列の喪失（ＲｓｒＩＩ部位まで）およびＥＣ領域の終わりの一部の５’配列の喪失があった。
【０４５０】
断片２；改変Ｋｏｚａｋ配列；
ｐＵＣ１９（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を改変して、新しい制限酵素部位を挿入し、また５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列を持つ改変Ｋｏｚａｋを導入した。新しいプラスミドをｐＬＯＲ４９と命名した。ｐＬＯＲ４９は、ｐＵＣ１９ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ ＥｃｏＲＩで切断し、４つのオリゴヌクレオチド（２つのオリゴ対）をライゲーションすることによって作製された。１対はＨｉｎｄＩＩＩ付着末端とそれに続く最適Ｋｏｚａｃおよび５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列とそれに続くＲｓｒＩＩ付着末端を有する。
すなわち
【化１６】
2006513260.tif 000024
（配列ＩＤ番号；１３および１４）
もう一対は、ＲｓｒＩＩ付着末端、次いでＤｒａＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＢｓｉＷＩ部位、その後にＥｃｏＲＩ付着部位を有する。
すなわち
【化１７】
2006513260.tif 000025
（配列ＩＤ番号； １５および１６）
【０４５１】
ｐＬＯＲ４９はこのように、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とそれに続く最適Ｋｏｚａｃおよび５’ｈＪａｇｇｅｄ１配列を有し、独自のＲｓｒＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＢｓｉＷＩ部位を再生するＥｃｏｒＩ部位の前に導入された、ｐＵＣ１９骨格である。
【０４５２】
プラスミドｐＬＯＲ４９を次いでＲｓｒＩＩ-ＢｓｉＷＩで切断して、２．７ｋｂｐのベクター骨格断片を生じ、アガロースゲルに流し、バンドを切り出してＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。
【０４５３】
断片３；ＢｓｉＷＩ部位ＰＣＲ断片を有する３’ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣの作製；
ｐＬＯＲ４７をＰＣＲの鋳型として使用し、ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣを増幅して３’ＢｓｉＷＩ部位を加えた。
ｈＪａｇｇｅｄＩのＲｓｒＩＩ部位由来の５’プライマー
３’に付加されたＢｓｉＷＩ部位を持つｈＪａｇｇｅｄ１ＥＣの終わりまでの３’部位
結果として生じる断片をＤｒａＩＩＩおよびＢｓｉＷＩで切断し、約６００ｂｐの断片を生じた。これをアガロースゲルに流し、バンドを切り出してＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。 
【０４５４】
上記の３つの断片；
１）ＲｓｒＩＩ-ＤｒａＩＩＩで切断したｐＤｅｖ２０由来の２４５９ｂｐのｈＪａｇｇｅｄ１断片
２）ＲｓｒＩＩ-ＢｓｉＷＩで切断したＬｏｒ４９由来の２．７ｋｂｐの最適化Ｋｏｚａｋおよび５’ｈＪａｇｇｅｄ１
３）ＤｒａＩＩＩ−ＢｓｉＷＩで切断した６００ｂｐの３’ＥＣｈＪａｇｇｅｄ１ＰＣＲ断片
をその後にライゲーションで繋ぎ、プラスミドｐＤＥＶ２１を生じた。
【０４５５】
ｉｉｉ）その後のライゲーション（ｐＤＥＶ１０）；
無関係な配列をすべて除去するため、さらに３断片ライゲーションを実施し、ベクターｐＣＯＮγ４（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国スラウ（Ｓｌｏｕｇｈ））に直接加えた。
【０４５６】
断片１；プラスミドｐＤＥＶ２１−４をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩで切断し、４９５８ｂｐ＋８９９ｂｐの断片を生じた。これらをアガロースゲルに流し、小さい方の８８９ｂｐ断片バンドを切り出してＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。
【０４５７】
断片２；ｐＣＯＮγ４（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））をＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩで切断し、６６０２ｂｐのベクター断片（ＩｇＧ４ＦＣの最初の５個のアミノ酸を失っている）を生じた。断片のバンドを切り出してＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。 
【０４５８】
断片 ３； ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ２の終わりとＩｇＧ４ＦＣの３’開始との間に密着した結合を生じ、余分のアミノ酸が導入されないように、一対のリンカーオリゴヌクレオチドを配置した。
すなわち
【化１８】
2006513260.tif 000026
（配列ＩＤ番号；１７および１８）
【０４５９】
上記の３つの断片；
１．ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩで切断されたｐＤＥＶ２１−４の８９９ｂｐのｈＪａｇｇｅｄ１断片
２．ＨｉｎｄＩＩＩ ＡｐａＩで切断された６６０２ｂｐのｐＣｏｎγベクター骨格
３．オリゴリンカーＢｇｌＩＩ−ＡｐａＩ
をライゲーションで繋ぎ、プラスミドｐＤＥＶ１０を生じた。
【０４６０】
ライゲーションしたＤＮＡでコンピテントＤＨ５α（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を形質転換し、ＬＢａｍｐプレートに播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。対照と挿入を含むベクターを加えたプレートとの間に良好な比率が明らかであり、したがって８個のコロニーだけを取って１０ｍｌのＬＢａｍｐ液体培地に入れ、３７℃にて一夜インキュベートした。グリセロール液体培地を作製し、細菌沈澱を−２０℃にて冷凍した。後にプラスミドＤＮＡを、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）ミニプレップ・スピン（ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｓｐｉｎ）キットを用いて抽出し、ＳｃａＩを用いて診断的に消化した。クローン２、４、および５が正しく見えたので、クローン２をＬＢＡｍｐプレートに播種し、１／１００を１２０ｍｌのＬＢ＋ａｍｐ液体培地に接種した。プレートおよび液体培地を３７℃にて一夜インキュベートした。液体培地からグリセロール液体培地を作製し、沈澱を後日のマキシプレップ処理のために冷凍した。プラスミドＤＮＡをクローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）マキシプレップ（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）で抽出し、ＳｃａＩを用いて診断的消化を行い、ＵＶ分光測光法による定量および品質検査のためにＤＮＡを希釈した。
【０４６１】
ｉｖ）ｐＤｅｖ１１クローニング；
ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ融合体のコード配列を、ｐＣＯＮγ４（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））から、ｐＥＥ１４．４（ロンザ・バイオロジックス）へ、ｈＣＭＶプロモーター領域（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の下流かつＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの上流へ入れ替え、安定な細胞株をＧＳ系（ロンザ・バイオロジックス）を用いて選択可能にした。
【０４６２】
ｖ）挿入部；
ｐＤＥＶ１０クローン２をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断し、２つの断片５０２６ｂｐ＋２４９７ｂｐを生じた。２４９７ｂｐはｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ融合のコード配列を含んだので、アガロースゲルから切り出してＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。
【０４６３】
ｖｉ）ベクター；
ｐＥＥ１４．４（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ））をＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで切断してＩｇＧ４ＦＣ配列を除去し、２つの断片５０２６ｂｐ＋１５９３ｂｐを生じた。大きい方の５０２６ｂｐ断片をアガロースゲルから切り出して、ＤＮＡをキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（登録商標）（ＱＩＡｑｕｉｃｋ）ゲル抽出キット（品番２８７０６）を用いて、取扱説明書に従ってゲル精製した。ｐＥＥ１４．４ベクター骨格およびｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ融合挿入部をライゲーションして最終トランスフェクションプラスミドｐＤＥＶ１１を生じた。
【０４６４】
ライゲーション産物でＤＨ５ａ細胞を形質転換し、ＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレートに播種し、３７℃にて一夜インキュベートした。コロニーをプレートから７ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）に取り、振とうしながら３７℃にて一夜生育させた。グリセロール液体培地を作製し、プラスミドＤＮＡを培養からキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック・スピン・ミニプレップ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キット（品番２７１０６）を用いて取扱説明書に従って精製した。ＤＮＡは次いでＳａｐＩを用いて診断的に消化した。
【０４６５】
ｖｉｉ）トランスフェクション用マキシプレップ；
正しいクローン（クローン１）が選択され、１００ｕｌのグリセロールストックを１００ｍｌのＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）に接種し、またＬＢ＋アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）プレートに播種した。プレートと液体培地の両方を３７℃にて一夜インキュベートした。
プレートは 純増殖を示した； したがって、クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ヌクレオボンド・マキシ（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ）キット（品番Ｋ３００３−２）を用いて取扱説明書に従って培養をマキシプレップ処理した。最終ＤＮＡ沈澱を５００ｕｌのｄＨ２Ｏに再懸濁した。
【０４６６】
ｐＬＯＲ１１クローン１ＤＮＡの試料を次いで希釈し、ＤＮＡの濃度および品質をＵＶ分光測光法によって評価した。試料をまたＳａｐＩで診断的に消化し、正しい大きさのバンドを生じた。
【０４６７】
ｖｉｉｉ）ＤＮＡの直鎖化；
約１００ｕｇのｐＤｅｖ１１クローン１ＤＮＡを、制限酵素ＰｖｕＩを用いて直鎖化した。
結果として生じるＤＮＡ調製物を、層流フード内でフェノール／クロロホルム／ＩＡＡ抽出とその後のエタノール洗浄および沈澱を用いて精製した。沈澱を滅菌水に再懸濁した。直鎖化をアガロースゲル電気泳動によって確認する一方、定量および品質を２６０および２８０ｎｍでのＵＶ分光測光法によって評価した。
【０４６８】
２．トランスフェクション
４０ｕｇの直鎖化ＤＮＡ（ｐＤｅｖ１１クローン１）および１ｘ１０７個のＣＨＯ−Ｋ１細胞（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を５００ｕｌの無血清ＤＭＥＭ中で、４ｍｍキュベット中で室温にて混合した。細胞を次いで９７５ｕＦ２８０ボルトでエレクトロポレーションし、６０ｍｌの非選択ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ｇｌｕｔ／１０%ＦＣＳ）に洗い込んだ。この希釈液から６ｘ９６ウェルプレートに、ウェル当たり５０ｕｌを接種した。原ストックの1/4希釈液を作製し、これから８ｘ９６ウェルプレートに、ウェル当たり５０ｕｌを接種した。さらに１／１０希釈液を第二のストックから作製し、これから１２ｘ９６ウェルプレートに、ウェル当たり５０ｕｌを接種した。プレートを３７℃、５%ＣＯ２にて一夜インキュベートした。２４時間後、培地を除去しての選択培地（２５ｕＭＬ−ＭＳＸ）に交換した。
トランスフェクション後４〜６週の間に、ＩｇＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡによる分析のためにプレートから培地を取った。選択培地を交換した。陽性クローンを特定し、選択培地２５ｕｍＬ−ＭＳＸに継代し増殖させた。
【０４６９】
３．発現
細胞を選択ＤＭＥＭ（２５ｕｍ Ｌ−ＭＳＸ）中で半集密まで増殖させた。培地を次いで無血清培地（ＵｌｔｒａＣＨＯ；バイオ・ホイッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））で交換し３〜５日間置いた。タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質）を、結果として生じる培地からＦＰＬＣによって精製した。
【０４７０】
発現された融合タンパク質（ｈＪａｇｇｅｄ１ＥＧＦ１＋２ＩｇＧ４ＦＣ）のアミノ酸配列；
【化１９】
2006513260.tif 000027
（配列ＩＤ番号； １９）
太字＝ｈＪａｇｇｅｄ１細胞外ドメインリーダー配列、アミノ末端領域、ＤＳＬ、およびＥＧＦ１＋２、下線＝ＩｇＧ４Ｆｃ配列。
【０４７１】
本タンパク質は、シグナルペプチドの切断によって、システインジスルフィド結合によって結合した二量体として存在すると考えられている。
【０４７２】
本融合タンパク質は、上記の通り、デキストランまたはＰＥＧのようなポリマー成分と結合させ、最終複合体を与える。
[実施例３]
【０４７３】
さまざまな数のＥＧＦ反復を含むヒトＤｅｌｔａ１を基礎とする、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を調節するための一連の短縮配列を、下記の通り調製した；
【０４７４】
Ａ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦ反復１〜２
ＤＳＬドメインおよび天然に存在するＥＧＦ反復のうち最初の２つだけ（すなわちＥＧＦ反復３から８までが脱落している）をコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失を、ＰＣＲによってＤＬＬ−１細胞外（ＥＣ）ドメイン／Ｖ５ＨｉｓクローンヒトＤＬＬ−１ＥＣドメインの配列については、図および、たとえば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２を参照）から、下記のプライマー対を用いて作製した；
DLacl3: CACCAT GGGCAG TCGGTG CGCGCT GG  （配列ＩＤ番号；２０）； 
および
DLL1d3-8: GTAGTT CAGGTC CTGGTT GCAG （配列ＩＤ番号；２１）
【０４７５】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９５℃／３分間；
１８サイクルの（９５℃／１分間、６０℃／１分間、７２℃／２分間）；および
１サイクルの７２℃／２分間。
【０４７６】
ＤＮＡを次いで１ｘＵ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧバイオテック、ドイツ・エーベルスベルク（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ））中の１%アガロースゲルから単離し、下記のプライマーを用いたＰＣＲのテンプレートとして使用した；
FcDL.4: CACCAT GGGCAG TCGGTG CGCGCT GG  （配列ＩＤ番号；２２）；
および
FcDLLd3-8: 
GGATAT GGGCCC TTGGTG GAAGCG TAGTTC AGGTCC TGGTTG  CAG  （配列ＩＤ番号；２３）
【０４７７】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９４℃／３分間；
１８サイクルの（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／２分間）；および
１サイクルの７２℃／１０分間。
【０４７８】
断片をｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩ．ＴＯＰＯ（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン社）でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物の同一性を配列決定によって確認した。
【０４７９】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでエビ由来アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて処理し、ゲル精製した。
【０４８０】
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩでクローニングしたＤＬＬ−１欠失をＨｉｎｄＩＩＩ（および目的のＤＮＡ産物の選択を後で助けるためにＥｃｏＲＶ）で切断し、続いてＡｐａＩ部分制限処理を行った。配列を次いでゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞へクローニングした。
【０４８１】
プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製した。
【０４８２】
結果として生じる構造（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−２）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされるＩｇＧＦｃドメインに融合した下記のＤＬＬ−１アミノ酸配列をコードした。
【化２０】
2006513260.tif 000028
（配列ＩＤ番号；２４）
（ここで、配列の一本下線の太字部分はＤＳＬドメインであり、配列の二本下線の太字部分はそれぞれＥＧＦ反復１と２である）。
【０４８３】
Ｂ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦ反復１〜３
ＤＳＬドメインおよび天然に存在するＥＧＦ反復のうち最初の３つだけ（すなわちＥＧＦ反復４から８までが脱落している）をコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失を、ＰＣＲによってＤＬＬ−１ ＤＳＬ＋ＥＧＦ反復１〜４クローンから、下記のプライマー対を用いて作製した；
DLacl3: CACCATGGGCAGTCGGTGCGCGCTGG     （配列ＩＤ番号；２５）； および
FcDLLd4-8: GGA TAT GGG CCC TTG GTG GAA GCC TCG TCA ATC CCC AGC TCG CAG   （配列ＩＤ番号；２６）
【０４８４】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９４℃／３分間；
１８サイクルの（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／２．５分間）；および
１サイクルの７２℃／１０分間
【０４８５】
ＤＮＡを次いで１ｘＵ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧバイオテック、ドイツ・エーベルスベルク（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ））中の１%アガロースゲルから単離し、ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩ．ＴＯＰＯにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン社）でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物の同一性を配列決定によって確認した。
【０４８６】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでエビ由来アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて処理し、ゲル精製した。
【０４８７】
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩでクローニングしたＤＬＬ−１欠失をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、続いてＡｐａＩ部分制限処理を行った。配列を次いでゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞へクローニングした。
【０４８８】
プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物の同一性を配列決定によって確認した。
【０４８９】
結果として生じる構造（ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−３）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされるＩｇＧＦｃドメインに融合した下記のＤＬＬ−１配列をコードした。
【化２１】
2006513260.tif 000029
（配列ＩＤ番号；２７）
（ここで、配列の一本下線の太字部分はＤＳＬドメインであり、配列の二本下線の太字部分はそれぞれＥＧＦ反復１ないし３である）。
【０４９０】
Ｃ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦ反復１〜４
ＤＳＬドメインおよび天然に存在するＥＧＦ反復のうち最初の４つだけ（すなわちＥＧＦ反復５から８までが脱落している）をコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失を、ＰＣＲによってＤＬＬ−１ＥＣドメイン／Ｖ５Ｈｉｓクローンから、下記のプライマー対を用いて作製した；
DLacl3: CACCAT GGGCAG TCGGTG CGCGCT GG  （配列ＩＤ番号；２８）
および
DLL1d5-8: GGTCAT GGCACT CAATTC ACAG   （配列ＩＤ番号；２９）
【０４９１】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９５℃／３分間；
１８サイクルの（９５℃／１分間、６０℃／１分間、７２℃／２．５分間）；および
１サイクルの７２℃／１０分間。
【０４９２】
ＤＮＡを次いで１ｘＵ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧバイオテック、ドイツ・エーベルスベルク（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ））中の１%アガロースゲルから単離し、下記のプライマーを用いたＰＣＲのテンプレートとして使用した；
FcDL.4: 
CACCAT GGGCAG TCGGTG CGCGCT GG  （配列ＩＤ番号；３０）；および
FcDLLd5-8: 
GGATAT GGGCCC TTGGTG GAAGCG GTCATG GCACTC AATTCA CAG
（配列ＩＤ番号；３１）
【０４９３】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９４℃／３分間；
１８サイクルの（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／２．５分間）；および
１サイクルの７２℃／１０分間。
【０４９４】
断片をｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩ．ＴＯＰＯにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン社）でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物の同一性を配列決定によって確認した。
【０４９５】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでエビ由来アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて処理し、ゲル精製した。
【０４９６】
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩでクローニングしたＤＬＬ−１欠失をＨｉｎｄＩＩＩ（および目的のＤＮＡ産物の選択を後で助けるためにＥｃｏＲＶ）で切断し、続いてＡｐａＩ部分制限処理を行った。配列を次いでゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞へクローニングした。
【０４９７】
プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物の同一性を配列決定によって確認した。
【０４９８】
結果として生じる構造（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−４）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされるＩｇＧＦｃドメインに融合した下記のＤＬＬ−１配列をコードした。
【化２２】
2006513260.tif 000030
（配列ＩＤ番号；３２）
（ここで、配列の一本下線の太字部分はＤＳＬドメインであり、配列の二本下線の太字部分はそれぞれＥＧＦ反復１ないし４である）。
【０４９９】
Ｄ）Ｄｅｌｔａ１ＤＳＬドメイン＋ＥＧＦ反復１〜７
ＤＳＬドメインおよび天然に存在するＥＧＦ反復のうち最初の７つ（すなわちＥＧＦ反復８が脱落している）をコードするヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１）欠失を、ＰＣＲによってＤＬＬ−１ ＥＣドメイン／Ｖ５Ｈｉｓクローンから、下記のプライマー対を用いて作製した；
DLacl3: CACCAT GGGCAG TCGGTG CGCGCT GG  （配列ＩＤ番号；３３）
および
DLL1d8:     CCTGCT GACGGG GGCACT GCAGTT C   （配列ＩＤ番号；３４）
【０５００】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９５℃／３分間；
１８サイクルの（９５℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／３分間）；および
１サイクルの７２℃／１０分間。
【０５０１】
ＤＮＡを次いで１ｘＵ／Ｖ−ＳａｆｅＴＡＥ（トリス／酢酸／ＥＤＴＡ）緩衝液（ＭＷＧバイオテック、ドイツ・エーベルスベルク（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ））中の１%アガロースゲルから単離し、下記のプライマーを用いたＰＣＲのテンプレートとして使用した；
FcDL.4: CACCAT GGGCAG TCGGTG CGCGCT GG  （配列ＩＤ番号；３５）
および
FCDLLd8:
GGATAT GGGCCC TTGGTG GAAGCC CTGCTG ACGGGG GCACTG CAGTTC
（配列ＩＤ番号；３６）
【０５０２】
ＰＣＲ条件は下記の通りであった；
１サイクルの９４℃／３分間；
１８サイクルの（９４℃／１分間、６８℃／１分間、７２℃／３分間）；および
１サイクルの７２℃／１０分間。
【０５０３】
断片をｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩ．ＴＯＰＯにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン社）でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物の同一性を配列決定によって確認した。
【０５０４】
ＩｇＦｃ融合ベクターｐＣＯＮγ（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでエビ由来アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて処理し、ゲル精製した。
【０５０５】
ｐＣＲｂｌｕｎｔＩＩでクローニングしたＤＬＬ−１欠失をＨｉｎｄＩＩＩ（および目的のＤＮＡ産物の選択を後で助けるためにＥｃｏＲＶ）で切断し、続いてＡｐａＩ部分制限処理を行った。配列を次いでゲル精製し、ｐＣＯＮγベクターにライゲーションし、ＴＯＰ１０細胞へクローニングした。
【０５０６】
プラスミドＤＮＡを、キアゲン・ミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｐｒｅｐ）キット（キアプレップ（登録商標）（ＱＩＡｐｒｅｐ））を用いて取扱説明書に従って作製し、ＰＣＲ産物を配列決定した。
【０５０７】
結果として生じる構造（ｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ＥＧＦ１−７）は、ｐＣＯＮγベクターによってコードされるＩｇＧＦｃドメインに融合した下記のＤＬＬ−１配列をコードした。
【化２３】
2006513260.tif 000031
（配列ＩＤ番号；３７）
（ここで、配列の一本下線の太字部分はＤＳＬドメインであり、配列の二本下線の太字部分はそれぞれＥＧＦ反復１ないし７である）。
【０５０８】
Ｅ）トランスフェクションおよび発現
ｉ）構造Ａ、Ｃ、およびＤの構造のトランスフェクションおよび発現
Ｃｏｓ１細胞を、上記のＡ、Ｃ、およびＤ（すなわちｐＣＯＮγｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−２、ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−４、ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−７）に由来する発現構造のそれぞれおよびｐＣＯＮγ対照を用いて、下記の通り、別々にトランスフェクションした；
【０５０９】
それぞれの場合において、３ｘ１０６個の細胞を、１０ｃｍシャーレのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０%ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中に播種し、細胞を一夜放置してプレートに接着させた。細胞単層を５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞に８ｍｌのオプティメム（登録商標）（ＯＰＴＩＭＥＭ）培地（ギブコ／インビトロゲン社（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加えた。１２μｇの当該構造ＤＮＡを８１０μｌのオプティメム培地で希釈し、１４μｌのリポフェクトアミン２０００（登録商標）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（インビトロゲン社）を８１０μｌのオプティメム培地で希釈した。ＤＮＡ含有溶液およびリポフェクトアミン２０００試薬含有溶液を次いで混合して室温にて最小限２０分間インキュベートし、その後、トランスフェクション混合物のシャーレ内での均一な分布を確実にしながら、細胞に加えた。細胞をトランスフェクション試薬と共に６時間インキュベートしてから、培地を除去して２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０%ＦＣＳで交換した。分泌されたタンパク質を含む上清を細胞から５日後に回収し、上清中に浮遊した死細胞を遠心分離（４，５００ｒｐｍ、５分間）によって除去した。結果として生じる発現産物は；ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−２ Ｆｃ （ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−２由来）、ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−４ Ｆｃ （ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−４由来）、およびｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−７ Ｆｃ （ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−７由来）で表した。
【０５１０】
Ｆｃ融合タンパク質の発現はウェスタンブロットによって評価した。上清１０μｌ中のタンパク質を１２%ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、セミドライ式装置によってハイボンド−ＥＣＬ（登録商標）（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））ニトロセルロース膜上にブロットした（１７Ｖ、２８分間）。Ｆｃ融合タンパク質の存在は、１；５００にブロッキング溶液（５%スキムミルクを含む、ツィーン２０界面活性剤含有トリス緩衝生理食塩水；ＴＢＳ−Ｔ）で希釈したＪＤＣ１４抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いたウェスタンブロットによって検出した。ブロットをこの溶液中で１時間インキュベートしてから、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。３回、各５分間洗浄後、マウス抗ヒトＩｇＧ４抗体の存在を、１；１０，０００にブロッキング溶液で希釈した抗マウスＩｇＧ−ＨＰＲＴ複合体抗血清を用いて検出した。ブロットをこの溶液中で１時間インキュベートしてから、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した（３回洗浄、各５分間）。Ｆｃ融合タンパク質の存在を、次いでＥＣＬＴＭ検出試薬（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社）を用いて可視化した。
【０５１１】
１０ｍｌの上清中に存在するタンパク質の量を、１０ｎｇ（７）、３０ｎｇ（８）、および１００ｎｇ（９）のタンパク質を含むΚ鎖標準品と比較することによって評価した。
【０５１２】
ｉｉ）構造Ｂの構造のトランスフェクションおよび発現
Ｃｏｓ１細胞を、上記のＢ（すなわちｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−３）に由来する発現構造を用いて下記の通りトランスフェクションした；
【０５１３】
７．１ｘ１０５個の細胞を、Ｔ２５フラスコのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０%＋１０%ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中に播種し、細胞を一夜放置してプレートに接着させた。細胞単層を５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞に１．１４ｍｌのオプティメム（登録商標）（ＯＰＴＩＭＥＭ）培地（ギブコ／インビトロゲン社（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を加えた。２．８５μｇの当該構造ＤＮＡを１４３μｌのオプティメム培地で希釈し、１４．３μｌのリポフェクトアミン２０００（登録商標）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）陽イオン性脂質トランスフェクション試薬（インビトロゲン社）を１２９μｌのオプティメム培地で希釈し、室温にて４５分間インキュベートした。ＤＮＡ含有溶液およびリポフェクトアミン２０００試薬含有溶液を次いで混合して室温にて１５分間インキュベートし、その後、トランスフェクション混合物のフラスコ内での均一な分布を確実にしながら、細胞に加えた。細胞をトランスフェクション試薬と共に１８時間インキュベートしてから、培地を除去して３ｍｌのＤＭＥＭ＋１０%ＦＣＳで交換した。分泌されたタンパク質を含む上清を細胞から４日後に回収し、上清中に浮遊した死細胞を遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分間）によって除去した。結果として生じる発現産物は；ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−３ Ｆｃ（ｐＣＯＮγ ｈＤＬＬ１ ＥＧＦ１−３由来）で表した。
【０５１４】
これらの融合タンパク質は、上記の通り、デキストランまたはＰＥＧのようなポリマーと結合させ、最終複合体を与える。 
[実施例４]
【０５１５】
ｉ）ポリマー結合のための遊離システイン尾部を有するＮｏｔｃｈリガンド細胞外ドメイン断片の形のＮｏｔｃｈシグナル伝達調節因子の調製
ヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１；配列についてはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ００３５２２を参照）のアミノ酸１から３３２（すなわちＤＳＬドメイン＋最初の３つのＥＧＦ反復を含む）を含み遊離システイン残基（「Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ」）で終わるタンパク質断片を下記の通り調製した；
【０５１６】
ヒトＤＬＬ−１の細胞外（ＥＣ）ドメインのコード配列全体（２個のサイレント突然変異を有する）を含むテンプレートを、ＰＣＲクローニング戦略によって、胎盤ポリＡ＋ＲＮＡ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；カタログ番号６５１８−１）から作製した胎盤ｃＤＮＡライブラリから調製し、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、英国）中でＣ末端Ｖ５ＨＩＳタグと結合させた。そのテンプレートをＨｉｎｄＩＩＩとＰｍｅＩで切断し、ＥＣドメインをコードする断片を得て、これを下記のプライマーを用いるＰＣＲのためのテンプレートとして使用した；
５’−プライマー； ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＴＣＧ ＧＴＧ ＣＧＣ ＧＣＴ ＧＧ   （配列ＩＤ番号；３８）
３’−プライマー； ＧＴＣ ＴＡＣ ＧＴＴ ＴＡＡ ＡＣＴ ＴＡＡ ＣＡＣ ＴＣＧ ＴＣＡ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＧＣ  ＴＣＧ ＣＡＧ  ＧＴＧ   （配列ＩＤ番号；３９）
【０５１７】
ＰＣＲはＰｆｕターボ（ｔｕｒｂｏ）ポリメラーゼ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ（ＬａＪｏｌｌａ））を用いて、下記のサイクリング条件で実施した；９５℃５分間、９５℃１分間・４５〜６９℃１分間・７２℃１分間を２５サイクル、７２℃１０分間。
【０５１８】
５８℃、６２℃、および６７℃での産物を、１%アガロースゲルを含む１ｘＴＡＥからキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用いて取扱説明書に従って精製し、ｐＣＲＩＩｂｌｕｎｔベクター（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔキット）へライゲーションし、次いでＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン）を形質転換した。結果として生じるクローン配列を検証したところ、親クローン中に存在が見出されたのは元の２個のサイレント突然変異だけであった。
【０５１９】
「Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ」をコードする、結果として生じる配列を、ＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出し、１%アガロースゲル、１ｘＴＡＥでキアゲン・ゲル抽出キットを用いて精製し、ｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５ＨＩＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のＰｍｅＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にライゲーションし、それによってＶ５ＨＩＳ配列を消去した。結果として生じるＤＮＡでＴＯＰ１０細胞を形質転換した。結果として生じるクローン配列を３’−ライゲーション部位で検証した。
【０５２０】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓをコードする断片をｐＣＤＮＡ３．１プラスミドから、ＰｍｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切り出した。ｐＥＥ１４．４ベクタープラスミド（ロンザ・バイオロジックス（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、英国）を次いでＥｃｏＲＩを用いて制限処理し、５’−オーバーハングをクレノー断片ポリメラーゼを用いて埋めた。ベクターＤＮＡをキアゲンＰＣＲ精製カラムで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限処理し、次いでエビ由来アルカリ性ホスファターゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて処理した。ｐＥＥ１４．４ベクターおよびＤ１Ｅ３ｃｙｓ断片は、プラスミドｐＥＥ１４．４ ＤＬＬΔ４−８ｃｙｓを生じるライゲーション（Ｔ４リガーゼ）の前に、１%アガロースゲルを含む１ｘＴＡＥで、キアゲン・ゲル抽出キットを用いて精製した。結果として生じるクローン配列を検証した。
【０５２１】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓコード配列は下記の通りである（配列ＩＤ番号；４０）；
【化２４】
2006513260.tif 000032
【０５２２】
本ＤＮＡは、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）エンドフリー・マキシプレップ（ｅｎｄｏｆｒｅｅ ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ）キットを用いて、ロンザＧＳ系における安定な細胞株トランスフェクション／選択のために調製された。
【０５２３】
ｉｉ）Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓの発現
ＤＮＡの直鎖化
上記（ｉ）に由来するｐＥＥ１４．４ ＤＬＬΔ４−８ｃｙｓプラスミドＤＮＡを、ＰｖｕＩを用いた制限酵素消化によって直鎖化し、次いでフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（ＩＡＡ）、およびそれに続くエタノール沈澱を用いて精製した。プラスミドＤＮＡをアガロースゲル上で直鎖化について確認し、調製物の量および品質について２６０／２８０ｎｍにて分光測定した。
【０５２４】
トランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を６ウェルに、ウェル当たり３ｍｌの培地（ＤＭＥＭ１０%ＦＣＳ）に細胞７．５ｘ１０５個で、トランスフェクションの２４時間前に播種して、トランスフェクション当日に９５%集密を生じた。
５ｕｇの直鎖化ＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクションするのに、リポフェクトアミン２０００を使用した。トランスフェクション混合物を細胞シート上に５1/2時間放置してから、一夜インキュベートのために３ｍｌの半選択培地（ＤＭＥＭ、０%ｄＦＣＳ、ＧＳ）で交換した。
トランスフェクション後２４時間で、培地を全選択培地（ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、１０%ｄＦＣＳ（ウシ胎仔血清）、ＧＳ（グルタミン合成酵素）、２５ｕＭＬ−ＭＳＸ（メチオニンスルホキシミン））に交換しさらにインキュベートした。
【０５２５】
トランスフェクション後４日目および１５日目に、ウェル当たり細胞１０５個で細胞を９６ウェルに播種した。
【０５２６】
クローン播種の２週間後に、９６ウェルプレートを増殖に関して顕微鏡下でスクリーニングした。単コロニーを確認し、%集密について採点した。コロニーの大きさが３０%より大であった場合は、培地を取り、抗ヒト−Ｄｅｌｔａ−１抗血清に対するドットブロットによって、発現に関してスクリーニングした。培地のＰＡＧＥウェスタンブロットにおいて、抗ヒト−Ｄｅｌｔａ−１抗血清と反応する３６ｋＤａのバンドの存在によって高い陽性が確認された。
【０５２７】
細胞は、冷凍前に、９６ウェルから６ウェルへ、さらにＴ２５フラスコへ継代することによって増殖させた。
最も生育が速い陽性クローン（ＬＣ０９０００１）を、タンパク質発現のために増殖させた。
【０５２８】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ発現および精製
Ｔ５００フラスコに１ｘ１０７個の細胞を、８０ｍｌの選択培地中に播種した。４日間のインキュベート後、培地を除去し、細胞シートをＤＰＢＳで洗浄して、ＧＳを添加した３２５培地１５０ｍｌを各フラスコに加えた。フラスコをさらに７日間インキュベートしてから採集した。冷凍する前に、採集した培地を０．６５〜０．４５ｕｍフィルターを通して濾過した。冷凍した採集物はＦＰＬＣによって下記の通り精製した；
【０５２９】
冷凍した採集物を融解して濾過した。１７ｍｌのＱセファロースカラムを０．１ＭトリスｐＨ８緩衝液で、カラム容積の１０倍で平衡化した。採集物を、３ｍｌ／ｍｉｎに設定したＰ１ポンプを用いてカラムに負荷し、非吸着画分を別々の容器に回収した（これは逆精製である-多量のＢＳＡ夾雑物がＱセファロースＦＦに結合し、我々の標的タンパク質は結合せず、ゆえに非吸着画分中に残る）。非吸着画分を、１０ｋＤａカットオフ・フィルターカートリッジを用いてＴＦＦ ｒｉｇで濃縮し、濃縮中に０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液を用いて３回洗浄した。５００ｍｌを濃縮して３５ｍｌとし、終濃度３ｍｇ／ｍｌとした。
【０５３０】
試料を還元および非還元ＳＤＳＰＡＧＥに流した（ゲルは図１１に示す）。
【０５３１】
結果として生じる、発現されたＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質のアミノ酸配列は下記の通りであった（配列ＩＤ番号；４１）；
【化２５】
2006513260.tif 000033
（ここで、斜体の配列はリーダーペプチドであり、下線の配列はＤＳＬドメインであり、太字の配列は３つのＥＧＦ反復であり、末端Ｃｙｓ残基は下線付き太字で示す）。
【０５３２】
ｉｉｉ）Ｄ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質の還元
上記（ｉｉ）に由来するＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質４０μｇを、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０および５ｍＭ ＥＤＴＡを含むように１００μｌとした。２倍容量の固定化ＴＣＥＰ（トリス[２−カルボキシエチル]ホスフィン塩酸塩；ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、カタログ番号；７７７１２；予め１ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で３回洗浄）を添加し、混合物を回転しながら３０分間室温にてインキュベートした。
【０５３３】
樹脂を室温にて微量遠心（１３，０００回転／分、５分間）で沈澱し、上清を清浄なエッペンドルフチューブに移し氷上に保存した。タンパク質濃度をワールブルク−クリスチャン（Ｗａｒｂｕｒｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ）法によって測定した。
【０５３４】
この断片は、上記の通り、デキストランまたはＰＥＧのようなポリマーと結合させ、最終複合体を与える。
[実施例５]
【０５３５】
複合体を与えるためのＤ１Ｅ３ｃｙｓのアミノデキストランへの結合
ｉ）発現されたＤ１Ｅ３ＣｙｓのＨＩＣによる精製
上記の実施例４に由来する採集物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製し、遠心濃縮機を用いて取扱説明書に従って、溶出液を次いで濃縮して緩衝液を交換した。産物の純度はＳＤＳＰＡＧＥによって測定した。試料ゲルを図１２に示し、試料ゲルおよび精製追跡を図１３に示す。
【０５３６】
ｉｉ）アミノデキストランのマレイミド置換（ポリマー活性化）
分子量５００，０００Ｄａのアミノデキストラン（デキストラン、アミノ、アミン９８モル／モル；モレキュラー・プローブズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、品番Ｄ−７１４４）３．２ ｍｇ／ｍｌを、スルホＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−[Ｎ−マレイミドメチル]−シクロヘキサン−１−カルボキシレート；ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、品番２２３２２）を用いて、アミノデキストラン１モル当たりスルホＳＭＣＣ７３モルで、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８．０中で１時間、２２℃にて誘導体化／活性化した。
【０５３７】
デキストランのアミノ含量およびマレイミド置換のレベルは、ニンヒドリン測定法を用いて測定した。デキストラン誘導体の部分標本またはＢ−アラニン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、Ａ−７７５２）を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で５０μｌとし、水で２５０μｌに希釈した。ニンヒドリン試薬溶液（シグマ社、Ｎ１６３２）１容を加え、試料を１００℃、１５分間加熱した。氷上で冷却後、１容の５０%エタノールを加え、混合して、溶液を遠心分離によって清澄化した。吸光度を５７０ｎｍにて記録した。
【０５３８】
結果として生じるマレイミド−デキストランを、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）６ｍｌ濃縮機（ビバサイエンス社（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ）、ＶＳ０６１２）および３ｘ５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を用いて、緩衝液交換によって精製し濃縮した。
【０５３９】
デキストランの濃度は、エタノール沈澱／濁度測定法を用いて測定した。デキストラン誘導体の部分標本を、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で５０μｌとした。水を加えて終容量５００μｌとし、１容の無水エタノールの添加によってデキストランを沈澱し、吸光度を６００ｎｍにて記録した。
【０５４０】
ｉｉｉ）Ｄ１Ｅ３ｃｙｓの部分還元
１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０中に１ｍｇ／ｍｌのＤ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質（上記（ｉ）で精製）を、ＴＣＥＰ．ＨＣｌ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、２０４９０）を用いて、還元剤の１０倍モル過剰にて１時間、２２℃で還元した。タンパク質を、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５、ＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１７−０８５１−０１）を用いた１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０への緩衝液交換と、それに続くビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）６ｍｌ濃縮機での濃縮によって精製した。タンパク質濃度は、ワールブルク−クリスチャン（Ｗａｒｂｕｒｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ）Ａ２８０／Ａ２６０法を用いて推定した。
【０５４１】
還元効率は、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）の測定法を用いて推定することができる。供給されたＤ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質は遊離のチオール基を持たない一方、部分還元されたＤ１Ｅ３ｃｙｓはタンパク質１モル当たり１個の遊離チオール基を持つと予測される。９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、Ｄ１Ｅ３ｃｙｓタンパク質の部分標本またはＬ−システイン塩酸塩（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、Ｃ−１２７６）を１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で１９６ｕｌとし、４ｕｌの４ｍｇ／ｍｌエルマン試薬（１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０溶液）を加えた。反応を１５分間、２２℃でインキュベートし、吸光度を４０５ｎｍにて記録した。
【０５４２】
ｉｖ）還元されたＤ１Ｅ３ｃｙｓのマレイミド−デキストランとの結合
誘導体化されたマレイミド−デキストランを、濃縮され還元されたＤ１Ｅ３ｃｙｓに下記の通り加えた。Ｄ１Ｅ３ｃｙｓを１に対してデキストランのモル比７５。１８時間、４℃にて結合を進行。
【０５４３】
結果として生じるＤ１Ｅ３ｃｙｓ−デキストランポリマー（Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ−デキストラン複合体；多数のＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質とＳＭＣＣリンカーを介してそれぞれが結合しているアミノデキストランを含む）を、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１７−１０４３−１０）カラムをＡＫＴＡ精製ＦＰＬＣ（アマシャム・バイオサイエンス社）に接続して用い、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０でゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した。流速１ｍｌ／分にて、１ｍｌ画分を回収した。タンパク質複合体を次いでビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）６ｍｌ濃縮機で濃縮し、タンパク質濃度をワールブルグ−クリスチャン（Ｗａｒｂｕｒｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ）Ａ２８０／Ａ２６０法を用いて測定した。
【０５４４】
複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ ゲルで分析し、下記の通りｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの活性測定の前にエンドトキシン混入についてスクリーニングした。
[実施例６]
【０５４５】
ＣＨＯ−Ｎ２（Ｎ２７）ルシフェラーゼレポーター測定法
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ（ｐＬＯＲ９１）の構築
国際公開第０３／０１２４４１号パンフレットに記載の通り、ＢｇｌＩＩ付着末端およびＨｉｎｄＩＩＩ付着末端を有するアデノウイルス主要後期プロモーターＴＡＴＡボックスモチーフを下記の通り作製した；
【化２６】
2006513260.tif 000034
（配列ＩＤ番号；４２および４３）
【０５４６】
これをプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））のＢｇｉＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングし、プラスミドｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡを作製した。
【０５４７】
ＢａｍＨ１付着末端およびＢｇｌＩＩ付着末端を有するＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１；２つのＣＢＦ１反復に相当）を下記の通り作製した；
【化２７】
2006513260.tif 000035
（配列ＩＤ番号；４４および４５）
【０５４８】
この配列を、ＢｇｌＩＩ部位への反復挿入により五量体化し、結果として生じるＴＰ１五量体（１０個のＣＢＦ１反復に相当）をｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡへＢｇｌＩＩ部位に挿入し、プラスミドｐＬＯＲ９１を作製した。
【０５４９】
Ｂ）完全長Ｎｏｔｃｈ２および１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃレポーターカセットを発現している安定なＣＨＯ細胞レポーター細胞株の作製
ヒトＮｏｔｃｈ２遺伝子（たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３１５３５６を参照）の完全なコード配列にわたるｃＤＮＡクローンを下記の通り構築した。細胞内ドメイン全体および細胞外ドメインの一部をコードする３’ｃＤＮＡ断片をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ（オリジーン・テクノロジー社（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．）、米国）から、ＰＣＲを基礎とするスクリーニング戦略を用いて単離した。残りの５’コード配列を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）戦略を用いて単離し、既存の３’断片と、両方の断片に共通する独特の制限部位（ＣｌａＩ）を用いてライゲーションした。結果として生じる完全長ｃＤＮＡを次いで哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に終止コドン無しでクローニングし、プラスミドｐＬＯＲ９２を作製した。哺乳類細胞で発現された場合、ｐＬＯＲ９２はしたがって、Ｖ５およびＨｉｓタグを細胞内ドメインの３’末端に有する完全長ヒトＮｏｔｃｈ２タンパク質を発現する。
【０５５０】
野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（たとえばＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１を参照） を、ｐＬＯＲ９２ （ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＮｏｔｃｈ２−Ｖ５−Ｈｉｓ）でリポフェクトアミン２０００（登録商標）（Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）（インビトロゲン社）を用いてトランスフェクションし、完全長ヒトＮｏｔｃｈ２（Ｎ２）を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを作製した。トランスフェクションクローンを、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０%熱不活化ウシ胎仔血清（（ＨＩ）ＦＣＳ）＋グルタミン＋ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）＋１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ゲネチシン（登録商標）（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）-インビトロゲン社）中で９６ウェルプレートで限界希釈法を用いて選択した。個々のコロニーをＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．５ ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で増殖させた。クローンをＮ２の発現について、抗Ｖ５モノクローナル抗体（インビトロゲン社）を用いる細胞溶解液のウェスタンブロットによって試験した。陽性クローンを次いで、レポーターベクターｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）を用いた一時的トランスフェクション、および完全長ヒトｄｅｌｔａ様リガンド１（ＤＬＬ１；たとえばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１９６５７１を参照）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ）との共培養によって試験した。ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞はＣＨＯＮｏｔｃｈ２クローンと同様な方法で調製したが、Ｎｏｔｃｈ２の代わりにヒトＤＬＬ１を用いた。抗Ｖ５ｍＡｂを用いた細胞溶解液のウェスタンブロットによって強陽性クローンを選択した。
【０５５１】
１つのＣＨＯ−Ｎ２安定クローンであるＮ２７は、ｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）を一時的トランスフェクションし、完全長ヒトＤＬＬ１（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ１）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローンと共培養した場合に、高レベルの誘導を生じることが見出された。ハイグロマイシン遺伝子カセット（インビトロゲン社のｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏから入手可能）をｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）へＢａｍＨ１およびＳａｌ１を用いて挿入し、このベクター（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ−ｈｙｇｒｏ）をＣＨＯ−Ｎ２安定クローン（Ｎ２７）へリポフェクトアミン２０００（インビトロゲン社）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションクローンを、ＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．４ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（インビトロゲン社）＋０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（インビトロゲン）中で９６ウェルプレートで限界希釈法を用いて選択した。個々のコロニーをＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ＋０．５ ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。
【０５５２】
クローンはＣＨＯ Ｄｅｌｔａ （完全長ヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ１）を発現する）との共培養によって試験した。３つの安定レポーター細胞株Ｎ２７#１１、Ｎ２７#１７、およびＮ２７#３６が生じた。以降の使用のためにＮ２７#１１を、Ｎｏｔｃｈ シグナル伝達の非存在下でのバックグラウンドシグナルが低いこと、およびしたがってシグナル伝達が開始された場合の誘導倍率が高いことを理由に選択した。測定はウェル当たり１００μｌのＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓにウェル当たり２ｘ１０４個のＮ２７#１１細胞を入れた９６ウェルプレートで実施した。
【０５５３】
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞（上記の通り）はＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ＋０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で維持した。使用直前に細胞をＴ８０フラスコから０．０２%ＥＤＴＡ溶液（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いて採取し、遠沈して１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。１０μｌの細胞を計数し、新しいＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓを用いて細胞密度を５．０ｘ１０５細胞／ｍｌに調整した。
【０５５４】
ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ測定を行うには、Ｎ２７#１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を０．０２%ＥＤＴＡ溶液（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いて採取し、遠沈して１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓに再懸濁した。１０μｌの細胞を計数し、新しいＤＭＥＭ＋１０%（ＨＩ）ＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓを用いて細胞密度を２．０ｘ１０５細胞／ｍｌに調整した。レポーター細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１００μｌ（すなわちウェル当たり２ｘ１０４細胞）で播種し、インキュベーター内に静置して少なくとも３０分間沈澱させた。
【０５５５】
上記の通り調製したＤ１Ｅ３Ｃｙｓ複合体をＰＢＳ（２０ｕｇ／ｍｌ）で希釈し、たとえば９６ウェルプレートのＮ２７#１１細胞１００μｌに加えた。プレートは３７℃にてインキュベーター内に、適切には一夜置いた。
【０５５６】
翌日、１５０μｌの上清をすべてのウェルから取り、１００μｌのステディグロー（登録商標）（ＳｔｅａｄｙＧｌｏ）ルシフェラーゼ測定法試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加え、結果として生じる混合物を室温にて５分間放置した。混合物を次いでピペットで２回吸引吐出して細胞溶解を確実にし、各ウェルからの内容物を白色９６ウェルプレート（ヌンク社（Ｎｕｎｃ））へ移す。発光を次いでトップカウント（ＴｏｐＣｏｕｎｔ）（パッカード社（（Ｐａｃｋａｒｄ））計測器で読み取る。対照と比較した発光の増加はＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性化（すなわち活性複合体）を示す。
【０５５７】
上記の変法として、（プレート結合を可能にするため）デキストラン−Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ複合体を細胞負荷前のプレートに、ＰＢＳ中に最大２５０ｕｇ／ｍｌの濃度で添加し（前添加）、混合物を一夜インキュベートしてから、上記の通りルシフェラーゼ測定を実施した。
【０５５８】
完全長ヒトＤｅｌｔａ１を発現しているＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞；ロランティス社（Ｌｏｒａｎｔｉｓ Ｌｔｄ）名義の国際公開第０３／０１０２４４１号パンフレットに記載の通り調製； たとえばその実施例８を参照）および未変化のＣＨＯ細胞を、レポーター細胞との細胞比１；１にて対照として用いた。
【０５５９】
結果を図１４〜１８に、対応するＣＨＯ／ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ対照と並べて示す。図１４および１５は複合体のプレートへの前添加無しで得られた結果を示し（すなわち複合体は細胞／ＦＣＳと同時に添加した）、図１６から１８は複合体をプレートへ前添加して得られた結果を示す（すなわち、プレートへの複合体の結合を促進するため、複合体は細胞／ＦＣＳの前日にプレートに添加した）。
[実施例７]
【０５６０】
免疫細胞測定法
ｉ）ＣＤ４＋細胞精製
脾臓をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週）から取り出し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ Ｄ （べーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を用いて無添加ＲＰＭＩ培地中で４０分間処理した。組織を７０ｕｍ細胞ストレーナー（ファルコン社（Ｆａｌｃｏｎ））に通して２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地[Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）カタログ番号２２４０９）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５ｘ１０−５Ｍ β−メルカプトエタノール、および１０%ウシ胎仔血清]に入れた。細胞懸濁液を遠心分離して（１１４０ｒｐｍ、６分間）培地を除去した。
【０５６１】
細胞を次いで室温にて５分間、脾臓１個当たり５ｍＬのＡＣＫ細胞溶解緩衝液（０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、１．０Ｍ ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡの二回蒸留水溶液）と共にインキュベートして、赤血球を溶解した。細胞をＲ１０Ｆ培地で１回洗浄して計数した。ＣＤ４＋細胞を懸濁液から、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）カタログ番号１３０−０４９−２０１）を用いる磁気セルソーター（ＭＡＣＳ）カラム（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、英国ビズリー（Ｂｉｓｌｅｙ）、カタログ番号１３０−０４２−４０１）でのポジティブ選択によって、取扱説明書に従って精製した。
【０５６２】
ｉｉ）抗体被覆化
９６ウェル平底組織培養プレートを抗体で被覆するために、下記の手順を用いた；
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）＋１μｇ／ｍＬ抗ハムスターＩｇＧ（ファーミンジェン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、米国サンディエゴ；カタログ番号５５４００７）＋／−１μｇ／ｍＬ抗ヒトＩｇＧ４（ファーミンジェン社；カタログ番号５５５８７８）をウェル当たり１００μＬ添加した。プレートを３〜６時間３７℃にて培養し、次いでＤＰＢＳで洗浄した。各ウェルに次いで１００μＬのＤＰＢＳ＋０．１〜１μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３（ファーミンジェン社カタログ番号５５３０５８，クローン番号１４５−２Ｃ１１）＋／−Ｎｏｔｃｈリガンド（ｈＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４またはＤ１Ｅ３Ｃｙｓ）または対照タンパク質（ｈｕＩｇＧ４、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）；カタログ番号Ｉ−４６３９）を加えた。
【０５６３】
プレートは４℃にて一夜インキュベートし、次いでＤＰＢＳを用いて再び洗浄した。
【０５６４】
一部の場合には、細胞（上記の通り調製）を加える前に、プレートを１〜５%ウシ胎仔血清＋５０ｕｇ／ｍＬアミノデキストランを含むＤＰＢＳ２００ｕＬの添加によって３〜６時間３７℃にてブロックし、ＤＰＢＳで洗浄した。
【０５６５】
ｉｉｉ）初回ポリクローナル刺激およびサイトカイン ＥＬＩＳＡ
ＣＤ４＋細胞を、上記の通り前被覆した９６ウェル平底組織プレートで培養した。細胞を計数後に２ｘ１０６／ｍＬとしてＲ１０Ｆ培地＋４μｇ／ｍＬ ＣＤ２８抗体（ファーミンジェン社、カタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）に再懸濁し、ウェル当たり１００μＬの懸濁液を加えた。Ｎｏｔｃｈリガンドと多量体化したデキストラン（Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ−デキストラン複合体；上記の実施例５より）を１００ｕＬのＲＰＭＩ培地へ、終濃度１〜２５０ｕｇ／ｍＬを与え、ウェル当たり２００μＬの終容量を与えるような適当な濃度で添加した（２ｘ１０５細胞／ウェル、抗ＣＤ２８終濃度２μｇ／ｍＬ）。プレートを次いで３７℃にて７２時間インキュベートした。
【０５６６】
１７０μＬの上清を次いで各ウェルから採取し、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、およびＩＬ−４についてＲ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（英国アビンドン（Ａｂｉｎｇｄｏｎ））の抗体対を用いてＥＬＩＳＡによって試験するまで、−２０℃にて保存した。結果（表示の通りブロックしたかまたはブロックされていないプレートを用いた）を図１９から２１に示す。
[実施例８]
【０５６７】
ＫＬＨビーズおよびデキストラン−Ｄ１Ｅ３ｃｙｓ複合体のｉｎ ｖｉｖｏ同時投与
ｉ）ＫＬＨを用いたビーズの被覆化
イムジェクト（登録商標）（Ｉｍｊｅｃｔ）海産スカシ貝（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ｍｃＫＬＨ）含有ＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳから凍結乾燥）２０ｍｇ（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）品番７７６００）を、２．０ｍｌのｄＨ２Ｏを用いて再構成し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）およびメーカー独自の安定剤を含む１０ｍｇ／ｍｌの溶液とした。 
【０５６８】
界面活性剤を含まない白色アルデヒド／硫酸ラテックスビーズ（インターフェイシャル・ダイナミクス社（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｃｏｒｐ）、ポートランドまたは米国、バッチ番号１８１３）濃度５．８ｘ１０８ビーズ／ｍｌをＰＢＳで３回洗浄した（１０分間１３，０００回転で遠沈）。ビーズを次いで２ｘ１０８ビーズ／ｍｌとして５００μｇ／ｍｌのｍｃＫＬＨのＰＢＳ溶液に再懸濁し、３７℃にて一夜水平回転振とうした。ビーズをその後再びをＰＢＳで３回洗浄し（１０分間１３，０００回転で遠沈）、必要な濃度でＰＢＳに再懸濁した。ビーズの被覆化の成功は、抗ＫＬＨ抗血清を中和する能力によってＥＬＩＳＡ系で確認した。
【０５６９】
ｉｉ）Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ／デキストラン複合体とのｉｎ ｖｉｖｏ投与
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１匹当たり２ｘ１０６個のＫＬＨ被覆ビーズ（上記（ｉ）の通りに調製）を尾の基部に皮下注射した。上記の実施例５からのデキストラン−Ｄ１Ｅ３ｃｙｓ複合体（１匹当たり２５０、５０、または１０μｇ）、Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ単独（対照）またはデキストラン単独（対照）を、尾の基部近くの別々の部位に皮下注射した（すべての物質は水溶液として投与した；１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７）。
【０５７０】
マウスに７日後に、右耳に２０μｇのＫＬＨを負荷した。耳の腫脹の増大（右耳−左耳）を以後４日間、デジタル式ノギスを用いて測定した。
【０５７１】
結果を図２２および２３に示す。これらの図から理解できる通り、対照群（ＫＬＨビーズ、ＫＬＨビーズ＋デキストラン単独、およびＫＬＨビーズ＋可溶性Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ単独）は２４時間および４８時間めに同程度の反応を示した。ＫＬＨビーズ＋Ｄ１Ｅ３ｃｙｓ／デキストラン複合体２５０μｇは、２４時間および４８時間めに、有意に低下したＤＴＨ反応を示した（ＫＬＨビーズ＋デキストラン単独に対してｐ<０．００１）。
参考文献（参照により本開示に含まれる）
Ａｌｔｍａｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６ ２７４； ９４−６．
Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８；２２５−２３２．
Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４；７７０−７７６．
Ｂｒｕｃｋｅｒ Ｋ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６；４１１−４１５．
Ｃａｍｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１；２６３４−２６３８．
Ｃｈｅｅ Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４；６０１−６１４．
Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ （１９９７） Ｃｅｌｌ ８８；１３−１７．
Ｈｉｃｋｓ Ｃ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２；５１５−５２０．
Ｉｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ＰＮＡＳ ９５；９３３７−９３４５．
Ｉｒｖｉｎｅ ＫＤ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌ． ９；４３４−４４１．
Ｊｕ ＢＪ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０５；１９１−１９５．
Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ ８５（１−２）；１７３−７．
Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８（１）；４３−５５．
Ｌｉｅｂｅｒ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ７（１０）；１９４９−６５．
Ｌｕ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９３（１１）；５６６３−７． 
Ｍａｔｓｕｎｏ Ｋ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． １９；７４−７８．
Ｍａｔｓｕｎｏ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１（８）；２６３３−４４．
Ｍｅｄｈｚｈｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８８；３９４−３９７．
Ｍｅｕｅｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ （２０００） Ｒａｐｉｄ Ｃｙｃｌｅ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．
Ｍｏｌｏｎｅｙ ＤＪ， ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６；３６９−３７５．
Ｍｕｎｒｏ Ｓ， Ｆｒｅｅｍａｎ Ｍ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １０；８１３−８２０．
Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８；２２３０−２２３９．
Ｏｓｂｏｒｎｅ Ｂ， Ｍｉｅｌｅ Ｌ． （１９９９） Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１；６５３−６６３．
Ｐａｎｉｎ ＶＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ ３８７；９０８−９１２．
Ｓａｓａｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７９；７７９−７９０．
Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ＥＨ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３；３８２−３８６．
Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ， Ｅ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８３）；３８２−６．
Ｓｔｒｕｈｌ Ｇ， Ａｄａｃｈｉ Ａ． （１９９８） Ｃｅｌｌ ９３；６４９−６６０．
Ｓｔｒｕｈｌ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃｅｌｌ ９３（４）；６４９−６０．
Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９（７）；１５０−６．
Ｔａｍｕｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ５；１４１６−１４２３．
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １５；６０７７−６０８４．
Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ Ｇ． （２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． １０；３６３−３６９．
Ｗｉｌｓｏｎ ａｎｄ Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ （１９９７） Ｎｅｕｒｏｎ １８；６９９−７１０．
Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５５；３９０４−３９１１．
【図面の簡単な説明】
【０５７２】
【図１】図１はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の略図を示す。
【図２】図２はＮｏｔｃｈリガンドＪａｇｇｅｄおよびＤｅｌｔａの略図を示す。
【図３】図３はさまざまなショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および哺乳類Ｎｏｔｃｈリガンド由来のＤＳＬドメインのアミノ酸配列の整列を示す。
【図４】図４はヒトＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３およびＤｅｌｔａ−４のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５はヒトＪａｇｇｅｄ−１およびＪａｇｇｅｄ−２のアミノ酸配列を示す。
【図６】図６はヒトＮｏｔｃｈ１のアミノ酸配列を示す。
【図７】図７はヒトＮｏｔｃｈ２のアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は本発明においてＮｏｔｃｈシグナル伝達の調節因子として使用することができるさまざまなＮｏｔｃｈリガンド融合タンパク質の略図を示す。
【図９】図９は本発明の特定の一実施形態に記載のデキストラン−マレイミド−Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質複合体の構造の小さな一部分を示す。簡略化のために当該構造の一部のみを示す；デキストラン骨格は典型的にはここに示す（"・・・．"で示す通り）より遥かに長いこと、また通常は示した種類のマレイミドリンカーを介して、３より大、適切には２０より大、または約５０以上のＮｏｔｃｈリガンドに、そのような１つのタンパク質／ポリペプチドについてここで示すのと同様の方法で結合することが理解される。リンカーはまた、グルコース（単量体）環中の、示した物とは別の炭素原子位置で、デキストランに結合しうる。
【図１０】図１０は本発明の一実施形態に記載のデキストラン複合体の構造の略図を示す。ここでも、簡略化のために、当該構造の小さな一部のみを示す；デキストラン骨格は典型的にはここに示す（"・・・．"で示す通り）より遥かに長いこと、また通常は、１０より大、適切には２０より大、または約５０以上のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質／ポリペプチドに、ここで示すのと一般的に同様の方法で結合することが理解される。
【図１１】図１１は実施例４からの結果を示す。
【図１２】図１２は実施例５（ｉ）からの結果を示す。
【図１３】図１３は実施例５（ｉ）からの結果を示す。
【図１４】図１４は実施例６からの結果を示す。
【図１５】図１５は実施例６からの結果を示す。
【図１６】図１６は実施例６からの結果を示す。
【図１７】図１７は実施例６からの結果を示す。
【図１８】図１８は実施例６からの結果を示す。
【図１９】図１９は実施例７からの結果を示す。
【図２０】図２０は実施例７からの結果を示す。
【図２１】図２１は実施例７からの結果を示す。
【図２２】図２２は実施例８からの結果を示す。
【図２３】図２３は実施例８からの結果を示す。
【図１】
2006513260.tif 000037
【図２】
2006513260.tif 000038
【図３】
2006513260.tif 000039
【図４】
2006513260.tif 000040
【図５】
2006513260.tif 000041
【図６】
2006513260.tif 000042
【図７】
2006513260.tif 000043
【図８】
2006513260.tif 000044
【図９】
2006513260.tif 000045
【図１０】
2006513260.tif 000046
【図１１】
2006513260.tif 000047
【図１２】
2006513260.tif 000048
【図１３】
2006513260.tif 000049
【図１４】
2006513260.tif 000050
【図１５】
2006513260.tif 000051
【図１６】
2006513260.tif 000052
【図１７】
2006513260.tif 000053
【図１８】
2006513260.tif 000054
【図１９】
2006513260.tif 000055
【図２０】
2006513260.tif 000056
【図２１】
2006513260.tif 000057
【図２２】
2006513260.tif 000058
【図２３】
2006513260.tif 000059
【国際調査報告】
2006513260.tif 000060
2006513260.tif 000061
2006513260.tif 000062
2006513260.tif 000063
2006513260.tif 000064
2006513260.tif 000065