(57)【要約】本発明は、動物の所有者または動物性食品の生産者が、難なく動物がワクチン接種された状態を確立できる方法を提供する。より具体的には、本発明は、免疫原でワクチン接種された動物を同定する方法であって、免疫原および大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンの実質的に非毒性な変異体の組換え体（ｒｍＬＴ）を含むワクチン組成物を作り；動物対象にワクチン組成物を投与し；そして、免疫原での動物の以前のワクチン接種の指標として、ｒｍＬＴに対する特異的な抗体または免疫細胞の動物内での存在を検出することによる、前記方法を提供する。本発明は、免疫原および実質的に非毒性なｒｍＬＴを含むワクチン組成物でワクチン接種されたか否かを同定する方法であって、動物が、免疫原での動物の以前のワクチン接種の指標として、ｒｍＬＴに特異的な抗体または免疫原の動物内での存在を検出することによる、前記方法を提供する。さらに、本発明は、ワクチン組成物をマークするまたは同定する方法であって、ワクチン組成物に実質的に非毒性なｒｍＬＴを含ませ、そのようなワクチン組成物を投与された動物内の抗体または免疫細胞の存在の検出することによる、前記方法を提供する。そのうえ、本発明は、ワクチン組成物において免疫原の免疫防御的効果を増進する方法であって、ワクチン組成物に実質的に非毒性なｒｍＬＴを含むことによる、前記方法を提供する。免疫原、実質的に非毒性なｒｍＬＴおよびＡＭＰＨＩＧＥＮ（アンフィゲン）（登録商標）のような水中油型乳剤アジュバントを含有するワクチン組成物も、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原でワクチン接種された動物を同定する方法であって、
ａ．前記免疫原、および実質的に非毒性な大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンの変異体である組換え体（ｒｍＬＴ）を含むワクチン組成物を提供し；
ｂ．動物対象に前記ワクチン組成物を投与し；そして
ｃ．前記動物における前記ｒｍＬＴに特異的な抗体または免疫細胞の存在を検出し、それにより前記ワクチン調製液でワクチン接種された前記動物を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
免疫原および実質的に非毒性なｒｍＬＴを含むワクチン組成物でワクチン接種された動物を同定する方法であって、前記動物において、前記ｒｍＬＴに特異的な抗体または免疫細胞の存在の検出することを含む、前記方法
【請求項３】
免疫原を含有するワクチン組成物をマークしまたは同定する方法であって、
ａ．前記ワクチン組成物に、実質的に非毒性なｒｍＬＴを添加し；
ｂ．動物に前記ワクチン組成物を投与し；そして
ｃ．前記動物における前記ｒｍＬＴに特異的な抗体または免疫細胞の存在を検出し、それにより前記ワクチン組成物を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４】
前記動物が、ウシ、ヒツジ、ブタおよび鳥類からなる群より選択された食用動物である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫原が、不活性化された全体または一部のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の細胞調製液を含んでなる、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原である、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｒｍＬＴが、１９２番目のアミノ酸部位でのＧｌｙのＡｒｇへの置換、または２１１番目のアミノ酸部位でのＡｌａのＬｅｕへの置換を少なくとも１つを含む、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｒｍＬＴに特異的な前記抗体が、前記動物の血液もしくはミルク中、または処理後の前記動物からの肉汁中に検出される、請求項１−３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、前記ｒｍＬＴのＡサブユニットのペプチド断片を使用した免疫アッセイで検出され、前記ペプチド断片が、配列番号１−９のいずれか１つから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
動物への投与のための、ワクチン組成物中の免疫原の免疫防御的効果を増強する方法であって、前記ワクチン組成物に実質的に非毒性なｒｍＬＴを添加することを含んでなる、方法。
【請求項１０】
水中油型乳剤のアジュバントがワクチン組成物にさらに追加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記水中油型乳剤のアジュバントがアンフィゲン（ＡＭＰＨＩＧＥＮ）（登録商標）である、請求項１０に記載の方法
【請求項１２】
前記免疫原が、不活性化された全体または一部のマイコプラズマ・ハイオニューモニエの細胞調製液を含んでなる、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｒｍＬＴが、１９２番目のアミノ酸部位でのＧｌｙのＡｒｇへの置換、または２１１番目のアミノ酸部位でのＡｌａのＬｅｕへの置換を少なくとも１つを含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
免疫原、実質的に非毒性なｒｍＬＴ、および水中油型乳剤のアジュバント含んでなる、動物に投与するためのワクチン組成物。
【請求項１５】
前記免疫原が、不活性化された全体または一部のマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細胞調製液を含んでなる、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原であり、前記ｒｍＬＴが、１９２番目のアミノ酸部位でのＧｌｙのＡｒｇへの置換、または２１１番目のアミノ酸部位でのＡｌａのＬｅｕへの置換を少なくとも１つを含んでなり、前記水中油型乳剤のアジュバントがアンフィゲン（ＡＭＰＨＩＧＥＮ）（登録商標）である、請求項１４のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンのためのマーカー抗原として、大腸菌の熱不安定なエンテロトキシンの、実質的に非毒性な変異体の使用に関する。本発明は、さらに大腸菌の熱不安定なエンテロトキシンの非毒性な変異体、および免疫原の免疫防御的効果を増進するために、ワクチンにアジュバントとしてのアンフィゲン（ＡＭＰＨＩＧＥＮ）（登録商標）の使用に関する。免疫原、実質的に非毒性なｒｍＬＴ、およびアジュバント（アンフィゲン（登録商標）のような）を含むワクチンの組成物も、本発明により提供される。
【背景技術】
【０００２】
微生物が原因となる感染からウシやブタなどの有用な動物を守るため、多くのワクチンが、近年開発され販売されている。しかしながら、動物のワクチン接種歴は、常に動物の付属文書に記録されるとは限られない。免疫原への動物特異的な抗体の存在の検出は、動物が、製品ラベルの指示、規定された指針または指令書、および取扱説明書に従ってワクチン接種されたか否かを同定することにしばし決定的ではない。それゆえに、そこには動物のワクチン摂取状況を同定するため方法を開発する必要性が存在する。
【０００３】
腸管毒素産生大腸菌株は、エンテロトキシンの産生を通じて下痢および腸の障害を引き起こす。これらの毒素は２種類あり、そのうちの１つは１００℃での処理で生き残るので、熱耐性毒素（ＳＴ）と言われている。二つ目の毒素は熱に不安定（ＬＴ）で、コレラ毒素に非常に類似する。ＬＴは１つのＡサブユニットと、５つの同一のＢサブユニットからなる。Ａサブユニットは毒素の生物学的および酵素的な活性に重要であるが、その標的受容体に単独では結合できない。Ｂサブユニットは腸上皮細胞に結合しすることで作用し、それによりＡサブユニットの侵入を促進する。Ａサブユニットは細胞膜に侵入し、ＧＴＰ結合タンパクのＮＡＤ依存的ＡＤＰリボース化によるアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こす。この作用の臨床的効果は、腸内への大量の液体の分泌を引き起こす。
【０００４】
ＬＴのバクテリア染色体型は、Ｐｉｃｋｅｔｔ  Ｃ．Ｌ．らにより同定され配列が決められた（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９，  ５１８０−５１８７，  （１９８７））。努力により、腸管毒素原性バクテリアに対して防御的免疫応答の誘導ができる無毒化したＬＴ毒素の開発がされた。Ｈａｒｆｏｒｄら（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８３：  ３１１，  １９８９）は、ブタの病原性ＬＴのＡサブユニットにおける、Ｓｅｒ−６１−Ｐｈｅ置換、およびＧｌｙ−７９−Ｌｙｓ置換を含有する、トキソイドの産生を記載した。Ｔｓｕｊｉら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５：  ２２５２０，  １９９０）は、毒性に影響を及ぼすが、タンパク質の免疫原性が変化しない、Ｇｌｕ−１１２−Ｌｙｓの単一置換をＡサブユニット中に含有する変異体ＬＴを記載する。Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  の米国特許６，０１９，９８２は、Ａサブユニット中に、Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ、単一置換を含有する、実質的に非毒性な変異体ＬＴを記載する。Ｃｌｅｍｅｎｔｓに対する米国特許６，０３３，６７３は、Ａサブユニットの、Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙの置換、およびＬｅｕ−２１１−Ａｌａの置換を含有する、実質的に非毒性な変異体ＬＴを記載する。Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉらに対する米国特許６，１４９，９１９においては、Ａｒｇ−７、Ａｓｐ−９、Ａｒｇ−１１、Ｈｉｓ−４４、Ａｒｇ−５４、Ｓｅｒ−６１、Ｈｉｓ−７０、Ｈｉｓ−１０７、Ｇｌｕ−１１０、Ｇｌｕ−１１２、Ｓｅｒ−１１４、Ｔｒｐ−１２７、Ａｒｇ−１４６、またはＡｒｇ−１９２の１つまたはそれより多くの置換を含有する、無毒化された、免疫原性のある変異体ＬＴタンパクを記載する。
【０００５】
免疫原であることに加えて、ＬＴはアジュバント活性を持つことも報告された。Ｔｕｍｕｒａらの米国特許５，１８２，１０９号は、鼻腔内に投与されたＬＴは、共に投与した抗原に対する抗体の力価を増強したことを記載する。Ｃｌｅｍｅｎｔｓらは、また無関係な抗原と経口的に投与した時の、ＬＴのアジュバント活性も実証した（Ｖａｃｃｉｎｅ  ６：  ２６９−２７７，  １９８８；  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  Ｂ９１，  ８８ｔｈ  Ａｎｎ．  Ｍｅｅｔ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １９８８）。米国特許６，０１９，９８２および米国特許６，０３３，６７３はいずれも、無関係な抗原と経口的に投与したとき、実質的には非毒性であるが野生型ＬＴのアジュバント活性を保持する、変異体ＬＴタンパク質を記載する。
【０００６】
本発明以前は、ワクチンのマーカー抗原として、またはアンフィゲン（登録商標）のような水中油型乳剤と共同的なアジュバントとしての、実質的に非毒性な変異体ＬＴの使用の報告はされていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
１つの態様において、本発明は、免疫原でワクチン接種された動物を同定する方法であって、免疫原および大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンの実質的に非毒性な変異体の組換え体（ｒｍＬＴ）を含むワクチン組成物を形成し；動物対象へワクチン組成物を投与し；そして、免疫原での以前の動物のワクチン接種の指標として、ｒｍＬＴに対する特異的な抗体または免疫細胞の動物内での存在を検出する工程を含む前記方法を提供する。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、動物が免疫原および実質的に非毒性なｒｍＬＴの組換え体を含むワクチン組成物でワクチン接種されたか否かを同定する方法であって、そのワクチン組成物での以前の動物のワクチン接種の指標として、ｒｍＬＴに対する特異的な抗体または免疫細胞の動物内での存在の検出することによる、前記方法を提供する。
【０００９】
さらにもう１つの態様において、本発明は、免疫原を含有するワクチン組成物をマークするまたは同定するための方法であって、ワクチン組成物にマーカー抗原として実質的に非毒性なｒｍＬＴを含み、そして、次いでワクチン組成物でワクチン接種された動物におけるｒｍＬＴ特異的な抗体または免疫細胞の存在を検出することによる、前記方法を提供する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、ワクチン組成物にアジュバントとして実質的に非毒性なｒｍＬＴを含むことにより、ワクチン組成物中の免疫原の免疫防御的効果を増強する方法を提供する。好ましくは、ワクチン組成物は、アンフィゲン（登録商標）などの水中油型乳剤のアジュバントを含む。
【００１１】
免疫原、実質的に非毒性なｒｍＬＴ、およびアンフィゲン（登録商標）などのアジュバントを含むワクチン組成物も、また、本発明によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、動物の所有者または動物性食品生産者が、容易に動物のワクチン接種された状態を確立し、動物が製品ラベルの指示、規定された指針または指令書、および取扱説明書に従ってワクチン接種されたか否かを同定することができる方法を提供する。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、免疫原でワクチン接種された動物を同定する方法を提供する。そのような方法は、免疫原および大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンの実質的に無毒な変異体の組換え体（ｒｍＬＴ）を含むワクチン組成物を提供し；動物対象へのワクチン組成物の投与し；そして、免疫原での動物の以前のワクチン接種の指標として、ｒｍＬＴに対して特異的な抗体または免疫細胞の動物内での存在を検出する、工程を含む。
【００１４】
もう１つの態様において、本発明は、動物が免疫原および実質的に無毒なｒｍＬＴの変異体を含むワクチン組成物でワクチン接種されたか否かを同定する方法を提供する。その同定は、そのワクチン組成物での動物の以前のワクチン接種の指標として、ｒｍＬＴに対して特異的な抗体または免疫細胞の動物内での存在の検出に基づく。
【００１５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、免疫原を含有するワクチン組成物をマークするまたは同定するための方法であって、ワクチン組成物にマーカー抗原として実質的に非毒性なｒｍＬＴを含ませ、そして、次いでワクチン組成物でワクチン接種された動物におけるｒｍＬＴ特異的な抗体または免疫細胞の存在を検出することによる、前記方法を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、ワクチン組成物にアジュバントとして実質的に非毒性なｒｍＬＴを含むことにより、ワクチン組成物の免疫原の免疫防御的効果を増強する方法を提供する。好ましくは、ワクチン組成物は、またアンフィゲン（登録商標）などの水中油型乳剤のアジュバントを含む。
【００１７】
免疫原、実質的に非毒性なｒｍＬＴ、およびアンフィゲン（登録商標）などのアジュバントを含むワクチン組成物もまた、本発明によって提供される。
明瞭な開示のために、限定の手段ではないが、発明の詳細な説明は、発明の特定の特徴、態様、または応用を記載しまたは説明する、続くサブセクションに分割する。
【００１８】
定義および略称
本明細書で使用される「動物」および「動物対象」の用語は、ウシ、ヒツジ、ブタ、および鳥類などの食用動物を含む、すべての非ヒト動物を言う。
【００１９】
本明細書で使用される「ウシ」の用語は、非限定的に去勢牛（ｓｔｅｅｒ）、雄牛（ｂｕｌｌｓ）、雌牛（ｃｏｗｓ）および仔牛（ｃａｌｖｅｓ）を含む、ウシ属動物を言う。
本明細書で使用される「ＬＴ」の用語は、大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンを言う。ＬＴは、１つのＡサブユニットと５つの同一のＢサブユニットからなる。Ｂサブユニットは、腸上皮細胞への結合し、それによりＡサブユニットの侵入を促進する。Ａサブユニットは、細胞膜に侵入し、そしてＧＴＰ結合タンパクのＮＡＤ依存的ＡＤＰリボース化によるアデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こす。ＡおよびＢサブユニットは、ＬＴ遺伝子にコードされ、ＬＴ遺伝子中でＢサブユニットをコードする部分は、Ａサブユニットをコードする部分に近接し、そして下流にあたる。
【００２０】
「野生型ＬＴ」の用語は、自然に発生する毒性の大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンを言う。ある動物種に対して病原性があり、そしてその動物種から単離された大腸菌により作らた野生型ＬＴは、他の動物種に病原性があり、そしてその他の種の動物から単離された大腸菌により作られた、他の野生型のＬＴとアミノ酸配列でわずかに異なる場合がある。Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉらの米国特許６，１４９，９１９を参照されたい。
【００２１】
「ｍＬＴ」の用語は、自然発生したＬＴの変異体型で、一般に遺伝子工学により作製されたものを言う。
「ｒｍＬＴ」の用語は、自然発生したＬＴの組換えにより作製された変異体型を言う。
【００２２】
ｒｍＬＴに関連して使われる「実質的に非毒性」の用語は、野生型のものと比べて実質的により低い毒性を意味する。「実質的に低い」によっては、ｒｍＬＴは、野生型ＬＴに比べて２％以下、望ましくは１％、さらに望ましく０．１％の毒性を持つことを意味する。毒性は、Ｙ１細胞または野生型ＬＴの影響を受けやすい他の細胞種および細胞株の誘導された形態変化の評価で測定されることが可能である。Ｙ１細胞は、ＬＴを含む溶液で処理すると顕著に丸くなる副腎腫瘍上皮細胞である（Ｙａｓａｍｕｒｅら  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ．  ２６：  ５２９−５３５，  １９６６）。あるいは、毒性は、Ｃｌｅｍｅｎｔｓへの米国特許６，０１９，９８２に記載されるように、実験マウスにおいてｒｍＬＴにより誘導される体液分泌を評価することにより評定することもできる。
【００２３】
「ワクチン組成物のマークするまたは同定する」は、ワクチン組成物が、成分として実質的に非毒性のｒｍＬＴを有することにより同定可能にでき、結果としてそのワクチン組成物を投与された動物は、血清中におけるその動物のｒｍＬＴに特異的な抗体または免疫細胞の存在の検出することにより、同定されることが可能であることを意味する。
【００２４】
本明細書で使用される「免疫細胞」の用語は、免疫応答の開始および指揮に関与する動物の免疫系の細胞を言い、特にＴ細胞およびＢ細胞を含む。
抗体または免疫細胞と関連して使われる「ｒｍＬＴに特異的」の用語は、ｒｍＬＴまたはｒｍＬＴの一部もしくは断片を認識し反応するが、ワクチン組成物の無関係な抗原もしくは免疫原、またはそのような免疫原もしくは無関係な抗原の一部は認識し反応しない、抗体および免疫細胞を意味する。
【００２５】
タンパク質またはポリペプチドと関連して使われる「一部」および「断片」の用語は、少なくとも７または８アミノ酸の長さのポリペプチド配列を言う。
本明細書で使用される「免疫原」の語は、動物における免疫原性のＬＴまたはｒｍＬＴに無関係の抗原または組成物のいずれかを言う。
【００２６】
免疫原または組成物に関連して使われる「免疫原性」の用語は、動物における免疫原および組成物（または組成物の成分）への免疫応答を引き起こす、免疫原または組成物の能力を意味する。免疫応答は、主として細胞障害性Ｔ細胞により仲介される細胞性免疫応答、または主としてヘルパーＴ細胞を仲介し、次にそのヘルパーＴ細胞がＢ細胞を活性化して抗体産生に至る体液性免疫応答であってよい。
【００２７】
「免疫原の免疫防御的効果の増強する」は、免疫原により誘導される防御的免疫応答が大きさにおいて（たとえば、抗体産生の増加）、持続時間において（たとえば、検出できる抗体が存在する総時間）、または種類において（たとえば、新たな抗体のアイソタイプまたはサブタイプの産生）のいずれかで増進されることを意味する。免疫原により誘導される免疫応答における増強は、当業者により難なく同定される。
【００２８】
ｒｍＬＴの調製
本発明の方法およびワクチン組成物の使用に適したｒｍＬＴは、実質的に非毒性、すなわち野生型ＬＴと比較して実質的に低い毒性を示すが、野生型ＬＴの免疫学的特性（免疫原性およびアジュバント活性など）を保持したものを含む。実質的により低い毒性とは、ワクチン組成物に使用されるｒｍＬＴが下痢などの重大な副作用を招くことなく、十分に低いものであるべきである。「実質的により低い」は、ｒｍＬＴが野生型ＬＴの２％、または好ましくは１％、またはさらに好ましくは０．１％以下の毒性を有することを意味する。
【００２９】
変異体ＬＴ（ｍＬＴ）は、野生型ＬＴ遺伝子配列中に１つまたはそれより多くのヌクレオチド変化を導入することで作製され、その結果ＡまたはＢサブユニットのアミノ酸の１つまたはそれより多くの置換、欠失、フレームシフト変異体、または切断が生じる。野生型ＬＴの配列が当該技術分野で知られている。たとえば、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉらの米国特許６，１４９，９１９を参照されたい。ランダムな突然変異誘発または部位特異的突然変異誘発のいずれかによる、遺伝子配列のヌクレオチド変化を導入する方法もまた、当該技術分野でよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、に一般的に記載されている。
【００３０】
好ましくは、変異体Ａサブユニットを作製するために、１つまたはそれより多くのヌクレオチド変化が、Ａサブユニットをコードする配列に導入される。本発明において、Ａサブユニットの好ましい変異体型は以下のアミノ酸部位に１つまたはそれより多くの置換を含む：Ａｒｇ−７、Ａｓｐ−９、Ａｒｇ−１１、Ｈｉｓ−４４、Ａｒｇ−５４、Ｓｅｒ−６１、Ｈｉｓ−７０、Ｈｉｓ−１０７、Ｇｌｕ−１１０、Ｇｌｕ−１１２、Ｓｅｒ−１１４、Ｔｒｐ−１２７、Ａｒｇ−１４６、およびＡｒｇ−１９２。アミノ酸部位は、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉらの米国特許６，１４９，９１９に開示されるＡサブユニット、ＬＴ１−１Ａ、のアミノ酸配列に基づいて数えられる。とりわけ好ましい変異体Ａサブユニットは、Ｃｌｅｍｅｎｔｓの米国特許６，０１９，９８２に記載されるように、たとえばＡｒｇ−１９２−Ｇｌｙなどの、Ａｒｇ−１９２の置換を含む。もう１つの好ましい変異型ＡサブユニットはＡｒｇ−１９２の置換、並びにたとえばＬｅｕ−２１１などのもう１つのアミノ酸部位の置換を含む。そのような二重の変異体の例は、Ｃｌｅｍｅｎｔｓの米国特許６，０３３，６７３に記載されているような、Ｒ１９２Ｇ−Ｌ２２１Ａである。
【００３１】
望ましい変異体を含有するＬＴ遺伝子配列は、大腸菌株のような適切な宿主細胞において変異体ＬＴの組換え発現をできるベクターに置かれる。高レベルの発現を達成するために、強力なプロモーターが、ＬＴ遺伝子の天然のプロモーターの代わりに使用可能である。たとえば、米国特許６，０１９，９８２は、天然のＬＴプロモーターの制御下で野生型ＬＴを発現する組換えプラスミド、ｐＤＦ８２、およびｌａｃプロモーター下でｒｍＬＴ  Ｒ１９２Ｇを発現する組換えプラスミド、ｐＢＤ９５（ＡＴＣＣ寄託番号６９６８３）を記載する。産生された組換え変異体タンパク質は、次いで任意の周知な精製手順を使用して精製可能である。
【００３２】
ｒｍＬＴの非毒性は、たとえばＣｌｅｍｅｎｔｓの米国特許６，０１９，９８２に記載されているように、そのＹ１細胞の形態変化の誘導を欠くこと、またはその実験マウスの最終的な液体分泌の誘導を欠くことにより立証可能である。
【００３３】
マーカー抗原としてのｒｍＬＴの使用
１つの態様において、本発明は、免疫原でワクチン接種された動物を同定する方法であって、免疫原および実質的に非毒性なｒｍＬＴの両方を含むワクチン組成物を提供し；動物対象にワクチン組成物を投与し；そして、免疫原でワクチン接種された動物の指標として、動物においてｒｍＬＴに特異的な抗体および免疫細胞の存在を検出する方法を提供することによる、前記方法を提供する。
【００３４】
もう1つの態様において、本発明は、動物が免疫原および実質的に非毒性なｒｍＬＴを含有するワクチン組成物でワクチン接種されたか否かを同定する方法であって、ワクチン組成物でワクチン接種された動物の指標として、動物においてｒｍＬＴ特異的な抗体または免疫細胞の存在を検出することによる、前記方法を提供する。
【００３５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、免疫原を含有するワクチン組成物をマークするまたは同定するための方法であって、マーカー抗原としてワクチン組成物に実質的に非毒性なｒｍＬＴを含むことによって、そして次いでワクチン組成物を投与された動物におけるｒｍＬＴ特異的な抗原または免疫細胞の存在を検出することによる、前記方法を提供する。
【００３６】
本発明の使用に適切な免疫原は、以下のものから調製された抗原を含む；マイコプラズマ  ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ヘモフィルス  ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、ヘモフィルス  パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ボルデテラ  ブロンチセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、アクチノバチルス  プレウロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）、パスツレラ  ムルトシーダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マンヘミア  ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、マイコプラズマ  ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）、マイコプラズマ  ガラナシウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌａｎａｃｉｅｕｍ）、マイコバクテリウム  ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム  パラツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス  ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、ストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エリシペロトリックス  ルソパトイエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｏｐａｔｈｉａｅ）、カンピロバクター属の種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｏｒ  ｓｐｐ．）、フソバクテリウム  ネクロフィラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ  エンテリカ  セロバルス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒｓ）、レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）などの病原性バクテリア；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）などの菌類；クロプトスポリジウム  パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ネオスポラ  カニウム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｕｍ）、トキソプラズマ  ゴンデイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、アイメリア属の種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）などの原生動物；オステルタジア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、捻転胃虫属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ファスキオラ属（Ｆａｓｃｉｏｌａ）の蠕虫、の不活性化された全体もしくは一部の細胞調製液の形で、または遺伝子組換え技術もしくは化学合成により得られる抗原性の分子の形のいずれかのもの。さらなる免疫原は、ウシヘルペスウイルス−１，３，６、ウシウイルス性下痢ウイルスタイプ１および２、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、脚および口疾患ウイルス、狂犬病ウイルス、豚疫ウイルス、アフリカ豚疫ウイルス、ブタパルボウイルス、ＰＲＲＳウイルス、ブタサーコウイルス、インフルエンザウイルス、ブタ水疱性疾患ウイルス、テクネ熱ウイルス（Ｔｅｃｈｅｎ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、偽性狂犬病ウイルス、の不活性化された全体もしくは一部のウイル��調製液の形で、または遺伝子組換え技術もしくは化学合成により得られる抗原性分子の形のいずれか、などの病原性ウイルスを含む。
【００３７】
好ましい免疫原はマイコプラズマ  ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（あるいはＭ．ｈｙｏ）免疫原であり、即ち動物において抗原に対する免疫反応を誘導できる、Ｍ．ｈｙｏから調製された抗原である。
【００３８】
本発明で使用可能であるＭ．ｈｙｏ免疫原は、たとえば不活性化された全体もしくは一部のＭ．ｈｙｏ調製液、1つもしくはそれより多くのＭ．ｈｙｏ由来ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫原性断片、または１つもしくはそれより多くのＭ．ｈｙｏ由来ポリペプチドをコードする１つもしくはそれより多くのＭ．ｈｙｏ核酸、またはその免疫原性断片を含んでもよく、ここで核酸は動物内のｉｎ  ｖｉｖｏで発現することができる。
【００３９】
本発明の方法の使用に好ましいＭ．ｈｙｏ免疫原は、Ｍ．ｈｙｏバクテリンである。
Ｍ．ｈｙｏバクテリンは、Ｍ．ｈｙｏ分離株から調製できる。多くのＭ．ｈｙｏ分離株が当業者に知られており、たとえばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、ヴァージニア州マナッサス  ２０１１０−２２０９  から入手できる。これらはたとえば：ＡＴＴＣ  ＮＯ．２５０９５、２５６１７、２５９３４、２７７１４、および２７７１５を含む。Ｍ．ｈｙｏ分離株は、また知られた技術を使用して自然にまたは実験的に肺病変に感染した動物（たとえば、ブタ）から直接入手可能である。Ｍ．ｈｙｏバクテリンを入手するために、Ｍ．ｈｙｏ分離株の細胞は、たとえば米国特許５，５６５，２０５に記載の二元エチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）、あるいはホルマリン、熱、ベータプロプリオラクトン（ＢＰＬ）、照射またはグルタルアルデヒドのような多くの知られた方法を使用して不活性化可能である。
【００４０】
本発明の方法に免疫原としての使用に適したＭ．ｈｙｏバクテリンは、また多くの商業的ソースを通じて入手可能である。そのようなソースは、限定されないが、ＲＥＳＰＩＦＥＮＤ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＨＹＯＲＥＳＰ（Ｍｅｒｉａｌ  Ｌｔｄ）、Ｍ＋ＰＡＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ＰＲＯＳＹＳＴＥＭ  Ｍ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）、ＩＮＧＬＥＶＡＣ  Ｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ  ＯＮＥＴＭ、ＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＯＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）を含む。
【００４１】
本発明の方法の使用に好ましいＭ．ｈｙｏバクテリンのソースは、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ  ＯＮＥＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＯＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）である。
【００４２】
本発明の方法の使用に特に好ましいＭ．ｈｙｏバクテリンのソースは、好ましくはＢＥＩ処理により不活性化された、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、米国、から入手された、Ｐ−５７２２−３（ＮＬ１  ０４２）株を含有するＲＥＳＰＩＳＵＲＥ  ＯＮＥＴＭ  （Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）である。
【００４３】
本発明に本方法の使用に適したＭ．ｈｙｏ免疫原はまた、限定はされないが、Ｐ４６，Ｐ６５，Ｐ９７，Ｐ１０２，Ｐ７０，Ｐ５０およびＰ４４などのＭ．ｈｙｏポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫原性断片を含む。好ましくは、Ｍ．ｈｙｏポリペプチドの免疫原性断片は、少なくとも７または８、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも５０アミノ酸の連続した部分のポリペプチドを含む。
【００４４】
あるいは、Ｍ．ｈｙｏ免疫原は、限定はされないが、Ｐ４６，Ｐ６５，Ｐ９７，Ｐ１０２，Ｐ７０，Ｐ５０およびＰ４４などのＭ．ｈｙｏポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫原性断片をコードする核酸分子を含む。
【００４５】
本発明において、免疫原およびｒｍＬＴマーカー抗原は、ワクチン組成物を作るために獣医学的に許容できる担体と組み合わされる。「獣医学的に許容できる担体」の用語は、溶媒、分散媒、コート剤、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存料、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などのいずれかおよびすべてを含む。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールおよび同種のものを含んでよい。等張剤は、特に塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含んでもよい。安定剤は、特にアルブミンを含む。
【００４６】
本発明における使用に適したアジュバントは、限定されないが、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、コレステロール、アンフィゲン（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，米国）などの水中油型乳剤；たとえばフロイント完全および不完全アジュバントなどの油中水型乳剤；ブロック共ポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州アトランタ）；ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州エメリービル）；たとえばＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，アラバマ州バーミンガム）または他のサポニン画分のようなサポニン；モノホスホイノシチド脂質Ａ；アブリディン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質アミンアジュバント；コレラ毒素；またはムラミールジペプチドなど、を含む。
【００４７】
本発明のワクチン組成物の使用に好ましいアジュバントは、水中油型乳剤、特にアンフィゲン（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，米国）である。
免疫原、ｒｍＬＴマーカー抗原および獣医学的に許容できる担体は、たとえば混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収などによって、ワクチン組成物を作るための簡便で実用的ないずれかの方法で組み合わせることが可能であり、注射、移植、吸入、摂取などに適した錠剤、カプセル、粉末、シロップや、懸濁剤のような処方に製造可能である。適切な場合、本発明の製薬の組成物はよく知られた手順で無菌的に製造されるべきである。
【００４８】
ワクチン組成物のｒｍＬＴの量は、免疫するのに効果的にすべきであり、一般的に投与量あたり１−５００μｇの幅で、好ましくは投与量あたり２０−２００μｇの幅で、そしてより好ましくは投与量あたりおよそ１００μｇにすべきである。
【００４９】
ワクチン組成物の免疫原の量は、動物において防御的免疫反応を誘導するのに効果的にすべきであり、免疫原の性質に依存する。一般的に言えば、免疫原として効果的なＭ．ｈｙｏバクテリンの量は、投与量当たりおよそ１ｘ１０６からおよそ５ｘ１０１０の呈色変化単位（ＣＣＵ）、好ましくはおよそ５ｘ１０８から５ｘ１０１０ＣＣＵ／投与量を含有する。Ｍ．ｈｙｏポリペプチドまたは免疫原として効果的なそのようなポリペプチドの免疫原性断片の量は、一般的に投与量当たりおよそ０．０１μｇからおよそ２００μｇの範囲内にしてもよい。Ｍ．ｈｙｏポリペプチドまたは免疫原として効果的なそのようなポリペプチドの免疫原性断片をコードする核酸分子の量は、一般的に投与量当たりおよそ０．０１μｇからおよそ２００μｇの範囲内にしてもよい。
【００５０】
本発明において、ワクチン組成物は、経口、鼻腔内、粘膜局所、経皮、および非経口（たとえば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋内）を含むよく知られた経路によって動物に投与可能である。投与は、また針のない運搬システムを使用して実現してもよい。投与は、たとえば非経口の経路を使用した第一投与、およびそれに続く粘膜経路を使用した投与のような、経路の組み合わせを使用して実現してもよい。投与の好ましい経路は筋内投与である。
【００５１】
動物におけるｒｍＬＴに特異的な抗体または免疫細胞の存在を同定するために、試料がその動物から採取される。特異的抗体を検出するために使用可能な試料は、動物の血液、血液の血清画分、ミルク、胆汁および他の体液を含む。あるいは、屠殺された動物からの肉汁も使用可能である。特異的な免疫細胞、特にＴリンパ球を検出するために使用可能な試料は、血液、リンパ節、脾臓または全身中のその他のリンパ組織を含む。
【００５２】
ＬＴのＡサブユニット抗原またはＬＴを産生する大腸菌株は、普通の家畜管理において、食物連鎖ではなく、ワクチンまたは薬剤としては至らず、それに対する抗体や免疫細胞が動物において自然に作られないことは留意すべきである。従って、好ましい態様において、本方法の検出段階は、ＬＴのＡサブユニット特異的な抗体または免疫細胞の検出を含む。
【００５３】
特異的な抗体の検出は、ＤＩＰＳＴＩＣＫ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＲＩＡ（放射性免疫アッセイ）、ウエスタンブロット解析、免疫組織学染色などの、酵素免疫学的または免疫化学的検出方法を使用することによって実行可能である。使用したアッセイに依存して、抗原または抗体は、酵素、蛍光体または放射性同位元素によりラベルしてもよい。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク州ニューヨーク（１９９４）；およびＦｒｙｅら  Ｏｎｃｏｇｅｎ  ４：１１５３−１１５７、１９８７を参照されたい。好ましくは、検出はＤＩＰＳＴＩＣＫを使用して実行され、ここで標識された抗原は試験スティック上に固定され、当該スティックを屠殺された動物から自然に放出された肉汁などの動物からの体液の試料中に浸ける。
【００５４】
抗体の検出において使用可能な抗原は、野生型もしくは変異体ＬＴのＡサブユニットもしくはＢサブユニット、または野生型もしくは変異体ＬＴのＡサブユニットもしくはＢサブユニットの抗原性断片であってよい。抗原性断片は一般的に、少なくとも７または８アミノ酸のＡまたはＢサブユニットの連続断片を含む。
【００５５】
本発明によると、ＬＴのＡサブユニット抗原に対する抗体の検出に使用の好ましい抗原は、ＬＴのＡサブユニットのペプチド断片を含む。より好ましくは、検出に使用される抗原は、配列番号１−９のいずれか１つに示したような配列を有する。２またはそれより多くの抗原の組み合わせは検出のために採用可能である。
【００５６】
たとえばリンパ球のような特定の免疫細胞の検出は、全細胞アッセイ、細胞の活性化マーカー発現、遺伝子活性化マーカー発現、サイトカインおよびホルモンの放出、結合アッセイ（たとえば４量体）、遅延型過敏性（皮膚反応試験）、抗原特異的免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリーの技術により実行可能である。
【００５７】
アジュバントとしてのｒｍＬＴの使用
もう一つの態様において、本発明は、実質的に非毒性なｒｍＬＴをワクチン組成物に含むことにより、ワクチン組成物において免疫原の免疫防御的効果を増強する方法を提供する。
【００５８】
本発明において、多様な免疫原の免疫防御的効果は、ｒｍＬＴにより増進可能であり、そのような免疫原は以下から調製された抗原を含む；マイコプラズマ  ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、ヘモフィルス  ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、ヘモフィルス  パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、ボルデテラ  ブロンチセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、アクチノバチルス  プレウロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）、パスツレラ  ムルトシーダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マンヘミア  ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、マイコプラズマ  ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）、マイコプラズマ  ガラナシウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌａｎａｃｉｅｕｍ）、マイコバクテリウム  ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム  パラツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クロストリジウム属の種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｓｐｐ．）、ストレプトコッカス  ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、ストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エリシペロトリックス  ルソパトイエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｏｐａｔｈｉａｅ）、カンピロバクター属の種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｏｒ  ｓｐｐ．）、フソバクテリウム  ネクロフィラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ  エンテリカ  セロバルス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒｓ）、レプトスピラ属の種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）のような病原性バクテリア；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）などの菌類；クロプトスポリジウム  パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、ネオスポラ  カニウム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ  ｃａｎｉｕｍ）、トキソプラズマ  ゴンデイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、アイメリア属の種（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｓｐｐ．）などの原生動物；オステルタジア属（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、捻転胃虫属（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、ファスキオラ属（Ｆａｓｃｉｏｌａ）の蠕虫、の不活性化された全体もしくは一部の細胞調製液の形で、または遺伝子組換え技術もしくは化学合成により得られる抗原性の分子の形のいずれかのもの。さらなる免疫原は、ウシヘルペスウイルス−１，３，６、ウシウイルス性下痢ウイルスタイプ１および２、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、脚および口疾患ウイルス、狂犬病ウイルス、豚疫ウイルス、アフリカ豚疫ウイルス、ブタパルボウイルス、ＰＲＲＳウイルス、ブタサーコウイルス、インフルエンザウイルス、ブタ水疱性疾患ウイルス、テクネ熱ウイルス（Ｔｅｃｈｅｎ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）��偽性狂犬病ウイルス、の不活性化された全体もしくは一部のウイルス調製液の形で、または遺伝子組換え技術もしくは化学合成により得られる抗原性分子の形のいずれか、などの病原性ウイルスを含む。
【００５９】
好ましい態様において、実質的に非毒性なｒｍＬＴは、Ｍ．ｈｙｏ免疫原、即ち動物において抗原に対する免疫反応を誘導できるＭ．ｈｙｏから調製された抗原、の免疫防御的効果を増進するために使用される。そのようなＭ．ｈｙｏ免疫原は、たとえば不活性化された全体または一部のＭ．ｈｙｏ細胞調製液、１つもしくはそれより多くのＭ．ｈｙｏ由来ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドの免疫原性断片、または１つもしくはそれより多くのＭ．ｈｙｏ由来ポリペプチドをコードする１つもしくはそれより多くのＭ．ｈｙｏ核酸、またはその免疫原性断片、および動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで発現できる核酸を含んでもよい。
【００６０】
さらに好ましい態様において、Ｍ．ｈｙｏ免疫原は、本明細書で以上に記載したように入手可能なＭ．ｈｙｏバクテリンで、たとえばＲＥＳＰＩＦＥＮＤ（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＨＹＯＲＥＳＰ（Ｍｅｒｉａｌ  Ｌｔｄ）、Ｍ＋ＰＡＣ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ＰＲＯＳＹＳＴＥＭ  Ｍ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ）、ＩＮＧＬＥＶＥＣ  Ｍ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ  ＯＮＥＴＭ、ＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＯＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）のような市販のものを含む。
【００６１】
本発明の方法の使用に好ましいＭ．ｈｙｏバクテリンソースはＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＲＥＳＰＩＳＵＲＥ  ＯＮＥＴＭ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、ＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）、およびＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ  ＯＮＥＴＭ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）である。
【００６２】
本発明において、免疫原とｒｍＬＴは、ワクチン組成物を作るために獣医学的に許容できる担体と組み合わされる。適した獣医学的に許容できる担体は、本明細書で上述し、溶媒、分散媒、コート剤、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存料、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などのいずれかおよびすべてを含む。
【００６３】
本発明のワクチン組成物の使用に適したアジュバントも、本明細書で上述した。好ましいアジュバントは、水中油型乳剤アジュバント、アンフィゲン（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，米国）である。
【００６４】
免疫原、ｒｍＬＴ抗原および獣医学的に許容できる担体は、混合、溶解、懸濁、乳化、カプセル化、吸収などによって、ワクチン組成物を作るための簡便で実用的ないずれかの方法で組み合わせ可能であり、注射、移植、吸入、摂取などに適した錠剤、カプセル、粉末、シロップや、懸濁剤のような処方に製造可能である。
【００６５】
ワクチン組成物のｒｍＬＴの量は、一般的に投与量あたり１−５００μｇの範囲内で；好ましくは投与量あたり２０−２００μｇの範囲内で；より好ましくは投与量あたりおよそ１００μｇにすべきである。
【００６６】
ワクチン組成物の免疫原の量は、動物において防御的免疫反応の誘導に効果的にすべきであり、免疫原の性質に依存する。一般的に言えば、免疫原として効果的なＭ．ｈｙｏバクテリンの量は、投与量当たりおよそ１ｘ１０６からおよそ５ｘ１０１０の呈色変化単位（ＣＣＵ）、好ましくはおよそ５ｘ１０８からおよそ５ｘ１０１０ＣＣＵ／投与量を含有する。Ｍ．ｈｙｏポリペプチドまたは免疫原として効果的なそのようなポリペプチドの免疫原性断片の量は、一般的に投与量当たりおよそ０．０１μｇからおよそ２００μｇの範囲内であってよい。Ｍ．ｈｙｏポリペプチドまたは免疫原として効果的なそのようなポリペプチドの免疫原性断片をコードする核酸分子の量は、一般的に投与量当たりおよそ０．０１μｇからおよそ２００μｇの範囲内であってよい。
【００６７】
本発明と合致して、ワクチン組成物は、本明細書で上述したような公知の経路により動物に投与可能である。投与に好ましい経路は、筋内投与である。
免疫原、大腸菌の熱不安定性エンテロトキシンの実質的に無毒な変異体およびアンフィゲン（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，米国）などの水中油型乳剤アジュバントを含むワクチン組成物もまた、本発明で提供される。
【００６８】
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに説明される。
【実施例】
【００６９】
実施例１
Ｍ．ｈｙｏバクテリンの調製
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ産生培養培地は、続く製法および手順に従って調製した：
クリスタルバイオレットなしのｐｐＬｏブロス          ８１．００％±２％
塩酸システイン                                      ０．０１％±０．００５％
酵母エキス                                          ６．２５％±０．２％
デキストロース（技術的または分析的グレード）          １．００％±０．２％
放射線照射、熱処理されたブタ血清                    １０．００％±１％
ｐｐＬｏブロスのｐＨは７．０±０．４に調整され、そして０．２ミクロンフィルターを使用してフィルター滅菌した。酵母エキスおよびｐｐＬｏブロスは、最小限の１２１℃で１５から６０分加熱滅菌され、そして６０℃未満まで冷却させた。上述の他の成分は、滅菌添加物として加えた。
【００７０】
抗原産生培養は、産生培地中にマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌のストックの冷凍バイアルを溶かすことにより始めた。すべての培養物は３７±２℃でインキュベートした。はじめの培養物の拡大はフラスコ中（１リットルまで）で実行し、そして次いでその後は、およそ７．０に調節されたｐＨおよび最高の２５％の溶存酸素下で、発酵容器中で実行した。培養物はおよそ１８００リットルまで拡大した。不活性化の前に、培養物を位相差顕微鏡下で特徴的な形態を検査し、そしてグラム染色した調製物でコンタミネーションの存在を検査した。
【００７１】
培養物にはコンタミネーションがなく、そして呈色変化単位滴定により決定されたおよそ５ｘ１０９ＣＣＵ／ｍＬの抗原濃度を生じた。増殖期間の終わりに、発酵槽中または保持容器中で培養物を不活性化した。培養物のｐＨは７．８±０．２まで上昇し、そしてこの範囲内で１時間、ｐＨは維持された。この時に、２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）のフィルター滅菌された水溶液を、およそ４．０ｍＭの最終濃度で加えた。高められたｐＨの存在下で、ＢＥＡは使用する二元エチレンイミン（ＢＥＩ）に化学変化する。培養物は３７±２℃で、一定の振動で２４時間、インキュベートした。２４時間のインキュベーション後、過剰なＢＥＩを中和するためにチオ硫酸ナトリウムのフィルター滅菌された水溶液をおよそ４ｍＭの最終濃度で加えた。培養物は、一定の振動でさらに２４時間、３７±２℃でインキュベートした。
【００７２】
不活性化された培養物は滅菌保存容器に移され、そして２−８℃で集合するまで保存した。
実施例２
ｒｍＬＴ抗原の調製
プラスミドｐＵＫ２１は、ｒｍＬＴ  Ｒ１９２Ｇの組換え体産生のために以下のように生成された。プラスミドｐＣＳ９５はＬＴ遺伝子の天然調節要素を含有し、そして大腸菌宿主でタンパク質ｒｍＬＴ  Ｒ１９２Ｇを構成的に発現する。このプラスミドはｐＵＣに基づいたベクター中に構築され、そのベクターはアンピシリン耐性マーカーを持つ。天然調節配列を含むｒｍＬＴ遺伝子はｐＣＳ９５プラスミドから切り出され、そしてもう一つのｐＵＣに基づくカナマイシン耐性ベクター、ｐＵＫ２１、の中にクローニングし、コンストラクトｐＵＫ２１／ｒｍＬＴを生じた。プラスミドｐＵＫ２１／ｒｍＬＴは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，  ヴァージニア州マナッサス  ２０１１０−２２０９に２００３年９月１８日に寄託され、そして寄託番号、ＡＴＣＣ＃ＰＴＡ−５５４６を割り当てられた。
【００７３】
プラスミドｐＵＫ２１／ｒｍＬＴは、大腸菌宿主株ＪＭ８３（遺伝子型Ｆ−φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ａｒａ  ｒｐｓＬ）の中に形質転換した。２つのトリプトース大豆寒天プレートは、形質転換体（ＪＭ８３／ｐＵＫ２１／ｒｍＬＴ）の密集的増殖のためにストリークし、そして３７℃で１８時間インキュベートした。１つのプレートは１０ｍｌのエバンス培地中に回収し、そしてこの回収物は滅菌された１０リットル発酵容器に植菌するために使用した。エバンス培地は以下を含有する（リットル基準毎）：
カザミノ酸−２０ｇｍ
酵母エキス−６ｇｍ
ＮａＣｌ−２．５ｇｍ
Ｋ２ＨＰＯ４−８．７ｇｍ
微量元素塩溶液−１ｍｌ
５０％グルコース−１０ｍｌ
微量元素塩溶液は、５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏおよび０．５％  ＦｅＣＬ３・６Ｈ２Ｏ（すべて質量／体積）を含有した。培地はリットル毎に１００μｇの硫酸カナマイシンも含有した。発酵培養は３７℃で１８時間、穏やかなエアレーションで維持した。細胞集団は、ウエストファリア（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）遠心分離機を使用した遠心分離により除去された。アフィニティークロマトグラフィーによる精製の前に、濃縮液を０．２μｍのデプスフィルターにより浄化した。粗製ｒｍＬＴ画分を精製し、そしてα−Ｄ−ガラクトース樹脂のアフィニティークロマトグラフィーにより効果的に濃縮した。ＴＥＡＮ溶出緩衝液（ｐＨ＝７．５）は以下であった：
０．０５Ｍ  トリス
０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ
０．００３Ｍ  アジ化ナトリウム
０．２Ｍ  ＮａＣｌ
溶出されたｒｍＬＴは、アザイドを除去するために、ＴＥＮ緩衝液に対する１０Ｋ  Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈ  ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｆｉｌｔｅｒでダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をした。ＴＥＮ緩衝液（ｐＨ＝７．３５）は以下であった：
０．０５Ｍ  トリス
０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ
０．２Ｍ  ＮａＣｌ
ダイアフィルトレートは０．２μｍフィルターを通じてろ過した。ラクトースを５％（質量／体積）まで加え、そして調製物を凍結乾燥した。ワクチン中に処方されるまで、凍結乾燥された原料は室温で保存された。
【００７４】
実施例３
アジュバントの油層は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）ベース（４０％大豆レシチン、６０％ミネラル油）、ドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ）（１００％ミネラル油）、並びに２種の界面活性剤スパン８０（Ｓｐａｎ８０）およびトゥイーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０）からなった。体積で２５％のアンフィゲン（登録商標）と７５％のドラケオールを用いて、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）ベースをドラケオールと混和した。体積で、これら２つの油はワクチンの最終体積の５±０．５％を含んでなった。Ｓｐａｎ８０は最終連続体積の１．２±０．３％で加えた。Ｔｗｅｅｎ８０は最終連続体積の２．８±０．３％で加えた。産物（乳化を経由）の水層を添加する前に、油層は２時間、３７±２℃で混ぜたままにした。ワクチンの水層は、実施例１で調製された塊のＭ．ハイオニューモニエ抗原を含んだ。塊のＭ．ハイオニューモニエ抗原をＰＢＳに加えた。油層への添加の前に、十分なｒｍＬＴタンパク質を水層に加え、ワクチンの用量毎に１０，２０または５０μｇの最終濃度になるようした。ワクチンの処方は：
ｒｍＬＴあり／なしのＰＢＳ−８３．７５％
塊のＭ．ハイオニューモニエ抗原−１１．２５％
オイルアジュバント−５．００％
水性成分を暖かい油層に加え、そして高速混合により乳化した。
【００７５】
実施例４
ｒｍＬＴ複合体のＡサブユニットに対する血清抗体の検出は、ウエスタン免疫ブロットの手順により達成した。これは、ＡおよびＢサブユニットに特異的なモノクローナル抗体の使用により促進した。サブユニットはポリアクリルアミドゲル電気泳動クロマトグラフィーにより分離した。３０μｇのｒｍＬＴは、１０％ポリアクリルアミドビストリスＳＤＳゲルの上に、適した分子量の単量体標準品と共にロードした。ゲルは、４５分間１５０Ｖで電気泳動した。ゲルからニトロセルロース膜へのｒｍＬＴタンパク質の転写は、電気化学的勾配を使用して達成した。膜をすすぎ、そしてＴＢＳ中の５％無脂肪乾燥ミルクで２時間ブロッキングし、続いてもう１回すすいだ。試験される血清試料は５％無脂肪乾燥ミルク／ＴＢＳで１：８００で希釈し、そして続いてバイオラッド＠マルチスクリーン装置（Ｂｉｏｒａｄ＠ｍｕｌｔｉ−ｓｃｒｅｅｎ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して膜の上にロードし、そして穏やかな振動で一晩インキュベートした。３１１および３０として同定された試料は、それぞれ正および負のコントロールとして使用された。次いで膜をすすぎ、そして抗ブタ−ＡＰ結合体は５％無脂肪乾燥ミルク／ＴＢＳで１：２０００で希釈した。２時間のインキュベーション後、膜をすすぎ、そして発色団で発色し抗体により認識されたタンパク質の可視化をした。この場合、もしＡサブユニットの抗体が血清試料中に存在したならば、バンドが染色として観察された。もし適切な発色の後にＡサブユニットバンドが見えるならば、血清サンプルは陽性と考えられた。
【００７６】
実施例５
Ｍ．ハイオニューモニエ抗原に対する抗体の検出は、慣用の間接ＥＬＩＳＡ試験を使用して達成した。抗原は界面活性剤（リン酸で緩衝された生理食塩水中のＴｗｅｅｎ２０）により洗浄されたＭ．ハイオニューモニエ細胞から抽出した。抽出された抗原は使用するまで−７０℃で保存した。抗原は９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｎｏｌ２，Ｂｉｏｔｅｋなど）のウェルに加えた。試験の結果は、正のコントロール試料シグナルに対する未知の試験試料に由来するシグナルの比率として記録した。負の試験および希釈されたウェルも、このアッセイの負のコントロールとして使用した。
【００７７】
実施例６
動物
およそ１２から１６日齢のＭ．ハイオニューモニエが原因の病歴または同じ生物に対するワクチン歴のない、外見上健康な５０頭の交雑種のブタ（それぞれ１０頭のブタの１１群）は、クリスタル  リーン  牧場（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｌｅａｎ  Ｆａｒｍｓ）、ミネソタ州ヴィラードより入手した。研究の開始の前に、動物に同一の連続数で２つ耳にタグを付けた。ファイザーバイオメトリクスおよびデータマネージメントにより提供されたランダムな処理割り振り計画に従って、ブタに処理と檻を割り振った。ブタを、ブロッキング因子として体重を使用して、任意抽出の完全ブロックデザインに従った処理群に任意抽出し、そして檻のなかでブロックにより飼育された。
【００７８】
テレホート（Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｔｅ）に到着時、ストレプトコッカス  スイスなどのストレスに関係する感染を予防し、そしてヘモフィルス  パラスイスの発生率を減らすために、ブタに標識の指示に従ってセフチオフルナトリウム（ＮａｘｃｅｌＴＭ）を３日間連続して腿の筋肉の筋肉内に処理した。研究の開始前に、ブタを最低５日間慣らした。ブタにはいずれか公知の汚染物または殺虫剤のない濃縮された薬用飼料を与え、そして水に自由にアクセスをさせた。チャレンジの前のおよそ２週間、ブタを濃縮された非薬用飼料に転換した。
【００７９】
ワクチン接種
本研究で使用される実験ワクチンを下の表１に示す。
【００８０】
【表１】
2006506615.tif 000002
【００８１】
ブタがおよそ３週齢の時である０日目（右首の筋肉）に、およびブタがおよそ５週齢の時である１４日目（左首の筋肉）に、動物を筋肉内の経路により２ｍｌの適切なワクチンまたは偽薬で２回ワクチン接種した。
【００８２】
血液サンプリング
−１または０、１３または１４、２８、４２、６２または６３および９１日目に、血液試料（血清分離チューブ中のおよそ１０ｍＬ）はすべてのブタから近位大静脈／頸静脈の刺し傷によって収集した。９１日目に、深い麻酔を与えた後に、血液試料を腋窩血管から回収した。Ｍ．ハイオニューモニエおよびｒｍＬＴ抗原への抗体活性が評価されるまで、それぞれの血液試料からの血清は、−２０℃で保存された。
【００８３】
攻撃
処理群０６、０７および０８のブタを下に記載されているように攻撃した。
２回目のワクチン接種に続くおよそ７週目（６３日目）に、ブタを経鼻投与の経路により攻撃した。３日間連続して、５ｍＬのＭ．ハイオニューモニエ接種材料で、鼻孔毎には２．５ｍＬで、ブタを経鼻で攻撃した。攻撃の前に、ｋｇ毎に４．４ｍｇのキシラジン並びにｋｇ毎に４．４ｍｇのチレタミンおよびゾラゼパン（Ｔｅｌａｚｏｌ（登録商標）、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．；  アイオワ州フォートダッジ）の筋肉内注射により、ブタを麻酔した。
【００８４】
攻撃接種材料は、肺ホモジェネート中のＭ．ハイオニューモニエ懸濁液（Ｍ．ハイオニューモニエ株１１の誘導体を含有する）であった。接種材料は滅菌フリス（Ｆｒｉｉｓ）マイコプラズマ培地で希釈し、１：５０希釈を達成し、それはｍＬ毎におよそ１０５呈色変化単位（ＣＣＵ）を含有した。接種材料の攻撃に続いて、すべてのブタを毎日観察し、そしていくらかの異常を記録した。
【００８５】
検視
攻撃後およそ４週目（９１日目）、すべての残った動物を、致死のペントバルビタールナトリウム（３−１０ｍｌ）の静脈注射で安楽死させ、そして両方の腋窩動脈を切断することにより放血した。中枢神経系を除くすべての主要器官を獣医師または有資格者により十分に検査し、そしてすべての検視所見を記録した。肺を除去し、そしてＭ．ハイオニューモニエ感染に起因する特徴的損傷を十分に評価した。損傷は標準な肺の図表上にスケッチした。
【００８６】
血清学
血清学的力価データは、それぞれの時点でｒｍＬＴマーカーに対する抗体の正または負の検出に従って分類した。時点までのマーカーの正／負の状態の発生は処理により要約された。実験ワクチンのＭ．ハイオニューモニエ成分への血清学的反応は、試験の固相としてのＴｗｅｅｎ２０で抽出された抗原調製物を使用したＥＬＩＳＡにより決定した。反応の指標が生み出され、それは周知の正のまたは負のコントロール血清と比べた抗体反応を示唆する。
【００８７】
ウエスタンブロット解析
組換え体ｒｍＬＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして電気泳動的にナイロン膜に転写した。ブロットは、これらの研究からの抗血清とともにモノクローナル抗体で探査し（ｐｒｏｂｅ）、ＡおよびＢ両方のサブユニット特異的な抗体活性の証拠を提供した。
【００８８】
損傷のある全肺のパーセンテージ
それぞれの肺葉毎の全体関与のパーセントを要約し、そして次いで全肺質量に対する個々の肺葉の続く比率を使用して重さを量った：左頭方部  １０％、左中間部  １０％、左尾側部  ２５％、右頭方部  １０％、右中間部  １０％、右尾側部  ２５％、および副肺１０％。次いで重さを量った肺葉の値を肺葉にわたって合計し、損傷のある全肺のパーセンテージを生じた。解析の前に、アークサイン平方根変換を損傷のある全肺のパーセンテージに適用した。損傷のある全肺のパーセンテージを、ブロックおよび処理の効果を含んだ混合線形モデル（ｍｉｘｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅｌ）を使用して解析した。パラメーター推定の一次結合（モデルから得られる）は、偽薬（Ｔ０８）およびワクチン接種の平均（Ｔ０４−Ｔ０７）の間の有意差（Ｐ≦０．０５、片側検定）を試験した後に、事前対比（ｐｒｉｏｒｉ  ｃｏｎｔｒａｓｔｓ）において使用した。比較を処理群間で行った。５％レベルの有意（Ｐ≦０．０５、片側検定）を使用して、統計学上の差異を評価した。逆の変換された（Ｂａｃｋ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）損傷のある全肺の平均パーセンテージを、アークサイン平方根（損傷のある全肺％）の最小二乗平均から計算した。
【００８９】
【表２】
2006506615.tif 000003
【００９０】
結果
血清学的結果を図１および図２に表わした。処理群０６および０７のウエスタン免疫ブロットは図３に示した。これらのデータは、ｒｍＬＴタンパク質はＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）処方中で抗原性があり、そしてタンパク質のＡサブユニットに対する抗体を恒常的に刺激することを示唆する。加えて、マイコプラズマ抗原に対する抗体反応は損なわれていない。
【００９１】
肉眼で見える肺損傷のスコアを表２に要約した。これらの結果は、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバントと共のｒｍＬＴマーカータンパク質およびＭ．ハイオニューモニエ抗原の組み合わせは、相乗的で深い防御に帰着することを明確に示唆した。
【００９２】
【表３】
2006506615.tif 000004
【００９３】
実施例７
ワクチン接種
マウス（１２週齢のＣＦ−１メス）を、０日目および１４日目に０．２ｍｌの実験ワクチンを皮下に２回ワクチン接種した。血清を２１日目に回収した。本研究で使用した実験ワクチンを下の表３に示す。
【００９４】
【表４】
2006506615.tif 000005
【００９５】
血清学
血清学的力価データは、２１日目に回収された血清中のｒｍＬＴマーカーに対する抗体の正または負の検出に従って分類した。図４からわかるように、ｒｍＬＴのＡサブユニットに対する抗体の産生により、マウスはＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）ワクチン処方中のｒｍＬＴにも反応する。
【００９６】
実施例８
ｒｍＬＴＡサブユニットのエピトープを同定するために、ペプチド毎に５アミノ酸を重複した完全なｒｍＬＴのサブユニット配列をスキャンした一連のペプチド（１５マー）を構築した。たとえば、ペプチド１はアミノ酸数１から１５の連続配列であり；そしてペプチド２はアミノ酸数１０から２５の連続配列であった。このパターンを続け、ｒｍＬＴの完全な一次配列をカバーした。ペプチドを樹脂のピンに共有的に結合した。切断できないピンを支持枠に固定し、９６ウェル中へのピンの沈降を促進した。こうして、ピン上のそれぞれのペプチドは、ＥＬＩＺＡアッセイの固相となり、試験されたモノクローナル抗体の結合を評価した。ピンのセットを、ブタの免疫付与前および免疫付与後からの血清並びに選択したモノクローナル抗体に対して試験した。結果を図５Ａ−５Ｃに示した。
【００９７】
図５Ａ−５Ｂに示すように、ペプチド９、１２、１５、２７、３１および３７および５０が、ｒｍＬＴ配列からのマーカーペプチドとして使用することができるエピトープであることを表す。これらのペプチドの配列は以下である：
９−ＭＰＲＧＨＮＥＹＦＤＲＧＴＱＭ（配列番号１）
１２−ＮＩＮＬＹＤＨＡＲＧＴＱＴＧＦ（配列番号２）
１５−ＶＲＹＤＤＧＹＶＳＴＳＬＳＬＲ（配列番号３）
２７−ＶＳＡＬＧＧＩＰＹＳＱＩＹＧＷ（配列番号４）
３１−ＧＶＩＤＥＲＬＨＲＮＲＥＹＲＤ（配列番号５）
３６−ＧＹＲＬＡＧＦＰＰＤ（配列番号６）
３７−ＰＰＤＨＱＡＷＲＥＥ（配列番号７）
３６／３７ハイブリッド−ＧＹＲＬＡＧＦＰＰＤＨＱＡＷＲＥＥ（配列番号８）
５０−ＹＱＳＥＶＤＩＹＮＲＩＲＮＥＬ（配列番号９）
実施例９
１７３の研究からの結果
これは、Ａサブユニットに対する正の血清学的反応を確認した、以上に例証されたはじめのブタの研究の反復である。図６および表４のデータは、ｒｍＬＴマーカー抗原は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエからの肺炎の予防のためのＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）の有効性または血清学的反応を干渉せず、そして平均肺損傷スコアがＲＥＳＰＩＳＵＲＥ（登録商標）単独で観察されたものよりも低い追加のアジュバント効果を有することを実証した。
【００９８】
【表６】
2006506615.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清学的結果。処理群４、５および６はｒｍＬＴマーカーを伴うワクチンを受けた。処理群１−３もマイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチンを受けた。
【図１Ｂ】マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清学的結果。処理群４、５および６はｒｍＬＴマーカーを伴うワクチンを受けた。処理群１−３もマイコプラズマ・ハイオニューモニエのワクチンを受けた。
【図２】処理群６および７よりの血清試料の応答を％で表したウエスタン・ブロット解析。
【図３Ａ】図２の処理群６および７の実際のウェスタン・ブロット。
【図３Ｂ】図２の処理群６および７の実際のウェスタン・ブロット。
【図４】マウス血清のウェスタン・ブロット解析。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡによる、免疫付与前および後の血清またはモノクローナル抗体でのｒｍＬＴペプチドの反応性。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡによる、免疫付与前および後の血清またはモノクローナル抗体でのｒｍＬＴペプチドの反応性。
【図５Ｃ】ＥＬＩＳＡによる、免疫付与前および後の血清またはモノクローナル抗体でのｒｍＬＴペプチドの反応性。
【図６】０または１４日に異なったマイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチンまたは偽薬でワクチン接種されたブタの平均ｒｍＬＴ  Ｓ／Ｐ比。Ｓ／Ｐ比＞０．３６４は陽性とみなされる。結果はＴ０１、Ｔ０２、Ｔ３およびＴ０６のみを示す。
【配列表】
2006506615.tif 000007
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【図１Ａ】
2006506615.tif 000010
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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