(57)【要約】本発明は概して、細胞を活性化および拡大する方法に関し、より詳細に述べると、劇的に高い密度を実現するために、そのような細胞の拡大を最大化する細胞を活性化および／または刺激する新規方法に関する。様々な態様において、細胞は、短期間に非常に高密度に活性化および拡大される。ある態様において、細胞は、短期間で非常に多数の細胞へ活性化および拡大される。本明細書の方法により活性化および拡大された細胞の組成物が更に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面部分の連結によりT細胞集団を活性化および拡大する方法であって、
a.少なくともそれらの一部がT細胞を含む細胞集団を提供する工程；
b.細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで表面が、T細胞の第一のT細胞表面部分を連結する第一の物質をそれらに付着し、かつこの同表面および第二の表面が、T細胞の第二の部分に連結する第二の物質をそれらに付着し、ここで第一および第二の物質による連結が、該T細胞の増殖を誘導し、かつここで表面が、抗原特異的T細胞の少なくともひとつの集団が、約8日間に少なくとも約10倍拡大するような該表面の該細胞に対する比で存在する工程を含む、方法。
【請求項２】
比が、約1:1〜約1:100である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
比が、約1:5である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記または第三の表面が、T細胞の第三の部分に連結する第三の物質をそれらに付着し、ここで第一、第二、および第三の物質による連結が、T細胞の増殖を誘導する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第三の物質が、抗体またはそれらの抗体断片である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
第三の物質が、抗4-1BB抗体またはそれらの抗体断片である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1種の物質が、抗体または抗体断片である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第一の物質が抗体またはそれらの断片であり、および第二の物質が抗体またはそれらの断片である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
第一および第二の物質が、異なる抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
第一の物質が、抗CD3抗体、抗CD2抗体、または抗CD3抗体もしくは抗CD2抗体の抗体断片である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
第二の物質が、抗CD28抗体またはそれらの抗体断片である、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
第一の物質が抗CD3抗体であり、および第二の物質が抗CD28抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
抗CD3抗体および抗CD28抗体が、約1:1から約1:100の比で存在する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
第一の物質が抗CD3抗体であり、および第二の物質がCD28のリガンドである、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
リガンドが、CD28の天然型のリガンドである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
天然型のリガンドがB7である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか1項記載の方法により生成されたT細胞集団。
【請求項１８】
請求項17記載のT細胞集団を患者に投与することを含む、癌の治療法。
【請求項１９】
癌が、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞増加症、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、子宮癌、膵臓癌、食道癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、胃癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性リンパ球性白血病(CLL)からなる群より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
癌が、多発性骨髄腫を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
癌が、CLLを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
細胞表面部分連結により調節性T細胞集団を活性化および拡大する方法であって、
a.少なくともそれらの一部が調節性T細胞を含む細胞集団を提供する工程；
b.細胞集団を、表面と接触する工程であって、ここで表面が、調節性T細胞の第一のT細胞表面部分を連結する第一の物質をそれらに付着し、およびこの同表面または第二の表面が、調節性T細胞の第二の部分を連結する第二の物質をそれらに付着し、ここで第一および第二の物質による連結が、調節性T細胞の増殖を誘導する工程を含む、方法。
【請求項２３】
第一の物質が抗CD3抗体であり、および第二の物質が抗CD28抗体である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
下記工程の方法により活性化および拡大されたT細胞集団を含有する組成物：
a.少なくともそれらの一部がT細胞を含む細胞集団を提供する工程；
b.細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで表面が、T細胞の第一のT細胞表面部分に連結する第一の物質をそれらに付着し、およびこの同表面または第二の表面が、T細胞の第二の部分に連結する第二の物質をそれらに付着し、ここで第一および第二の物質による連結が、該T細胞の増殖を誘導し、これにより該T細胞集団を活性化および拡大する工程であって；
ここで、(a)の該細胞集団が、個体の癌治療に関して遅れた時点で使用するために、健常個体から収集される、工程。
【請求項２５】
少なくともそれらの一部がT細胞を含有する細胞集団が、個体の癌治療に関して後の時点で使用するために、健常個体から収集される、請求項1〜16および22のいずれか1項記載のT細胞集団を含有する組成物。
【請求項２６】
癌が、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞増加症、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、子宮癌、膵臓癌、食道癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、胃癌、食道癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性リンパ球性白血病(CLL)からなる群より選択される、請求項24〜25のいずれか1項記載の組成物。
【請求項２７】
癌が、多発性骨髄腫を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
癌が、CLLを含む、請求項26記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、細胞を刺激および活性化する方法に関し、より詳細に述べると、細胞を非常に高密度に活性化および拡大し、並びに細胞を非常に多数に拡大する方法に関する。本発明は、高濃度に活性化および拡大された並びに非常に多数に拡大されたT細胞を含む細胞の組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
T細胞抗原受容体(TCR)は、CD3複合体と会合し、および抗原提示細胞(APC)の表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIおよびIIタンパク質により提示されたペプチドに結合する多サブユニット免疫認識受容体である。TCRのAPC上の抗原性ペプチドへの結合は、T細胞活性化の中心となる現象であり、これはT細胞とAPCの間の接触点の免疫シナプスに生じる。
【０００３】
T細胞活性化を持続するために、Tリンパ球は、典型的には第二の共刺激シグナルを必要とする。共刺激は、典型的にはTヘルパー細胞が、クローン性拡大を誘導するのに十分なサイトカインレベルを産生するのに必要である。Bretscher, Immunol Today, 13:74,1992；June et al., Immunol. Today, 15:321,1994。主な共刺激シグナルは、活性化された抗原提示細胞(APC)上の多くのB7ファミリーリガンド(CD80(B7.1)またはCD86(B7.2))が、T細胞上のCD28に結合する場合に発生する。
【０００４】
T細胞のあるサブセットの拡大を刺激する方法は、免疫療法において有用である様々なT細胞組成物を作成する可能性を有している。免疫療法の成功は、効率的刺激によるT細胞の反応性および量の増加に助けられる。
【０００５】
ヒトT細胞の拡大に使用可能な様々な技術は、主にアクセサリー細胞および／またはインターロイキン-2(IL-2)のような外因性増殖因子の使用に頼っている。IL-2は、抗CD3抗体と一緒に使用され、T細胞増殖を刺激し、主にT細胞のCD8+亜集団を拡大する。両方のAPCシグナルは、T細胞の再注入時の最適なT細胞活性化、拡大および長期生存に必要であると考えられる。MHCが一致したAPCのアクセサリー細胞としての必要性は、APCは比較的短い生存であるので、長期培養システムに関する重大な問題点を提示している。従って長期培養システムにおいて、APCは、供給源から引き続いて入手され、補充されなければならない。アクセサリー細胞の再生可能な供給の必要性は、アクセサリー細胞が影響を受けるような免疫不全症の治療にとって問題が多い。加えてウイルス感染症を治療する場合、アクセサリー細胞がウイルスを保持している場合には、この細胞は、長期培養時に全てのT細胞集団を汚染することがある。
【０００６】
外因性増殖因子またはアクセサリー細胞が存在しない場合、共刺激シグナルは、例えばこれらの細胞を、ビーズのような固相表面に付着したCD3リガンドおよびCD28リガンドに曝すことにより、T細胞集団に送達することができる。C. Juneらの米国特許第5,858,358号；C. JuneらのWO 99/953823を参照のこと。これらの方法は、治療に有用なT細胞集団を実現することが可能であるが、T細胞調製における増大した強固さおよび容易さについては、依然として理想的とは言えない。
【０００７】
加えて、現在当技術分野において使用可能であるこれらの方法は、T細胞の短期拡大またはより強固なT細胞集団の獲得およびそれらの有益な結果には焦点を当てていない。更に、拡大されたT細胞の適用可能性は、わずかな病態のみに限定されている。インビボにおける有効性を最大化するためには、治療上エキソビボまたはインビボにおいて生成され活性化されたT細胞集団は、癌、感染症、または他の病態に対する免疫応答と最大に共調することができる状態でなければならない。本発明は、他の拡大方法よりもより健康かつ自然であるように見える表面受容体およびサイトカイン産生特性を有する増加した数のより高度に活性化されおよびより純粋なT細胞を作出する方法を提供する。
【０００８】
加えて、本発明は、T細胞集団およびこれを生成するパラメーターを含み、更に他の関連する利点を提供する、いずれかの標的細胞の細胞集団の組成物を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な概要
本発明は、細胞表面部分連結によりT細胞集団を活性化および拡大する方法であって、
a)少なくともそれらの一部はT細胞を含む細胞集団を提供する工程；
b)該細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで該表面が、少なくともT細胞の一部の細胞表面部分に連結する1種または複数の物質をそれらに付着し、および該T細胞を刺激し、並びにここで該T細胞が、約2週間以内に、濃度約6x106個細胞/ml〜約90x106個細胞/mlの範囲に拡大される工程を含む方法を提供する。ひとつの態様において、T細胞は、一個体から入手し、このT細胞は、約2週間以内に、出発細胞数約100-500x106個から、総計約100-500x109個細胞に拡大する。請求項1記載の方法では、該T細胞は、約2週間以内に、濃度約50x106個細胞/mlに達する。ひとつの態様において、T細胞は、約7日目〜約12日目までに、濃度約40-60x106個細胞/mlに達する。更なる態様において、T細胞は、約5日目から約12日目までに、約24時間内に少なくとも約1.5倍に拡大する。別の態様において、T細胞集団は、約0.1L容量から約200L容量までを有する培養容器に播種される。関連した態様において、培養容器は、少なくとも1個の入口フィルターおよび1個の出口フィルターを備える。更に別の態様において、T細胞集団は、最初の密度約0.2x106個細胞/mlから約5x106個細胞/mlで播種される。
【００１０】
ひとつの態様において、本発明の細胞の拡大は、閉鎖システムにおいて生じる。ひとつの態様において、閉鎖システムは、少なくとも1個の入口フィルター、1個の出口フィルター、および試料採取ポートを備える容器を含む。別の態様において、培養培地は、閉鎖システムを通じて灌流される。ある態様において、灌流は、ほぼ4日目〜8日目に、速度約0.5ml/分〜約3ml/分で開始される。培地の例は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20を含むが、これらに限定されるものではない。更なる態様において、培地は、IL-2、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ、およびTNF-αなどのサイトカイン、またはビタミンを含むことができる。更なる態様において、この培地は、界面活性剤、抗体、プラスマネートまたは還元剤(例えば、N-アセチル-システイン、2-メルカプトエタノール)を含有する。
【００１１】
更なる態様において、本発明の閉鎖システムは、揺動が可能なプラットフォーム上に配置されたバイオリアクター培養容器を含む。ある態様において、揺動プラットフォームの速度および角度は変更可能である。更なる態様において、該プラットフォームの揺動は、約3日目に約5〜15回/分で開始される。更に別の態様において、プラットフォームは更に、様々な加熱構成要素、磁石、および気体マニホルドを備える。ある態様において、この閉鎖システムは更に、該閉鎖システムへのおよびそこからの無菌的移動を制御するために、シリンジポンプおよび制御を備える。
【００１２】
更なる態様において、本発明の方法は、T細胞の第一のT細胞表面部分に連結する第一の物質をそれらへ付着した表面を提供し、かつ前記表面および第二の表面は、該T細胞の第二の部分に連結する第二の物質をそれらに付着し、ここで第一および第二の物質による該連結は、該T細胞の増殖を誘導している。関連した態様において、前記または第三の表面は、該T細胞の第三の部分に連結する第三の物質をそれらに付着し、ここで第一、第二、および第三の物質による該連結は、該T細胞の増殖を誘導する。ある態様において、少なくとも1種の物質は、抗体または抗体断片である。別の態様において、第一の物質は、抗体またはそれらの断片であり、および第二の物質は、抗体またはそれらの断片である。更に別の態様において、第一および第二の物質は異なる抗体である。ある態様において、第一の物質は、抗CD3抗体、抗CD2抗体、または抗CD3抗体もしくは抗CD2抗体の抗体断片であり、並びに第二に、第二の物質は、抗CD28抗体またはそれらの抗体断片である。別の態様において、第一の物質は、抗CD3抗体であり、および第二の物質は、抗CD28抗体である。更なる態様において、抗CD3抗体および抗CD28抗体は、約1:1〜約1:100の比 で存在する。ある態様において、第一の物質は抗CD3抗体であり、および第二の物質は、CD28のリガンド、例えば天然型のリガンドB7である。更なる態様において、第三の物質は、抗体またはそれらの抗体断片である。別の態様において、第三の物質は、抗4-1BB抗体またはそれらの抗体断片である。
【００１３】
本発明は、本明細書に説明された方法により生成されたT細胞集団も提供する。
【００１４】
本発明のひとつの局面は、少なくとも1個の出口フィルターおよび1個の入口フィルターを備える閉鎖培養容器を含み；該閉鎖培養容器は、密度約6x106個細胞/ml〜約90x106個細胞/mlに拡大されたT細胞を含む培養培地の容積を内部に有する装置を提供する。ある態様において、拡大されたT細胞は、密度が約10〜50x106個細胞/mlである。更なる態様において、この装置の培地は、表面は、T細胞の第一の細胞表面部分を連結する第一の物質をそれらに付着し、および前記または第二の表面は、該T細胞の第二の部分を連結する第二の物質をそれらに付着しているような表面を更に備える。
【００１５】
本発明のひとつの局面は、一個体に由来する活性化されおよび拡大されたT細胞を総数100x109個含有する組成物を提供する。
【００１６】
別の本発明の局面は、細胞集団を提供する工程；該細胞集団を、表面と接触する工程であって、ここで該表面は、細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結しおよび該細胞を刺激する1種もしくは複数の物質をそれらに付着し、並びにここで該細胞は、約2週間以内に、約6x106個細胞/ml〜約90x106個細胞/mlの間の濃度に拡大する工程を含む、細胞表面部分連結により細胞集団を拡大する方法を提供する。これらの方法のある態様において、少なくとも該細胞集団の一部は、B細胞、NK細胞、樹状細胞、幹細胞、肝細胞、神経細胞、間葉細胞、LAK細胞、または肺細胞を含む。
【００１７】
別の本発明の局面は、少なくともそれらの一部はT細胞を含む細胞集団を提供する工程；該細胞集団を表面と接触し、ここで該表面は、T細胞の第一の細胞表面部分を連結する第一の物質をそれらに付着し、かつ前記または第二の表面は、該T細胞の第二の部分を連結する第二の物質をそれに付着し、ここで第一および第二の物質による該連結は、該T細胞の増殖を誘導する工程；該表面との、約0〜5日間の接触後に、少なくとも1個の入口フィルターおよび1個の出口フィルターを備える使い捨てバイオリアクターバッグを含む閉鎖システム中に、該細胞集団を濃度約0.2x106〜5.0x106個細胞/mlで播種する工程；培地を、該閉鎖システムを通し、約1ml/分で灌流する工程；該バイオリアクターバッグを、揺動プラットフォーム上で、約5-15回/分で揺動する工程；並びに、ここで該T細胞は、約2週間以内に、濃度約6x106個細胞/ml〜約90x106個細胞/mlに拡大する工程を含む、細胞表面部分連結によりT細胞集団を拡大する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、T細胞が増殖し、かつ集団が濃度約6x106個細胞/ml〜約90x106個細胞/mlであるような、T細胞集団も提供する。ひとつの態様において、T細胞集団は、2週間未満の培養において、総細胞数約100x109〜約500x109個に達する。
【００１９】
本発明は、少なくともそれらの一部はT細胞を含む細胞集団を提供する工程、該細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで該表面は、T細胞の少なくとも一部の細胞表面部分を連結する1種または複数の物質をそれらに付着し、および該T細胞を刺激し、ここで該表面は、抗原特異的T細胞の少なくともひとつの集団が、約8日間に少なくとも約10倍拡大されるような、該表面の該細胞に対する比で存在する工程を含む、細胞表面部分連結により、T細胞集団を活性化および拡大する方法を更に提供する。ひとつの態様において、この比は、約1:1〜約1:10である。更なる態様において、この比は、約1:5である。
【００２０】
本発明のひとつの局面は、少なくともそれらの一部はT細胞を含む細胞集団を提供する工程；該細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで該表面は、T細胞の第一のT細胞表面部分に連結する第一の物質をそれらに付着し、並びに前記または第二の表面は、該T細胞の第二の部分を連結する第二の物質をそれらに付着しており、ここで第一および第二の物質による該連結は、該T細胞の増殖を誘導し、並びに抗原特異的T細胞の少なくともひとつの集団は、約8日間に少なくとも約10倍拡大されるような、該表面の該細胞に対する比で存在する工程を含む、細胞表面部分連結によりT細胞集団を活性化および拡大する方法を提供する。ひとつの態様において、この比は、約1:1〜約1:100、およびその間の全ての整数である。別の態様において、この比は、約1:5〜約1:6、1:7、1:8、1:9、または1:10である。
【００２１】
更なる態様において、前記または第三の表面は、該T細胞の第三の部分に連結する第三の物質をそれらに付着し、ここで第一、第二、および第三の物質による該連結は、該T細胞の増殖を誘導する。追加の態様において、第三の物質は、抗体またはそれらの抗体断片である。更に別の態様において、第三の物質は、抗4-1BB抗体またはそれらの抗体断片である。別の態様において、少なくとも1種の物質は、抗体または抗体断片である。更なる態様において、第一の物質は、抗体またはそれらの断片であり、並びに第二の物質は、抗体またはそれらの断片であり、ある種の態様において、第一および第二の物質は、異なる抗体である。第一の物質は、抗CD3抗体、抗CD2抗体、または抗CD3抗体もしくは抗CD2抗体の抗体断片であってよい。第二の物質は、抗CD28抗体またはそれらの抗体断片であってよい。更なる態様において、第一の物質は抗CD3抗体であり、および第二の物質は抗CD28抗体である。別の態様において、抗CD3抗体および抗CD28抗体は、約1:1〜約1:100の比で存在する。より更なる態様において、第一の物質は抗CD3抗体であり、および第二の物質はCD28のリガンドである。ある種の態様において、リガンドは、B7のような、CD28の天然型のリガンドである。
【００２２】
別の本発明の局面は、本明細書において説明された方法のいずれかにより生成されたT細胞集団を提供する。更なる態様は、本明細書に説明された方法によりT細胞集団を患者に投与することを含む癌治療法を提供する。治療することができる癌は、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞増加症、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、子宮癌、膵臓癌、食道癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、胃癌、食道癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性リンパ球性白血病(CLL)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の別の局面は、少なくともそれらの一部は調節性T細胞を含む細胞集団を提供する工程；該細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで該表面は、調節性T細胞の第一のT細胞表面部分を連結する第一の物質をそれらに付着し、および前記または第二の表面は、該調節性T細胞の第二の部分を連結する第二の物質をそれらに付着し、ここで第一および第二の物質による該連結は、該調節性T細胞の増殖を誘導する工程を含む、細胞表面部分連結により調節性T細胞集団を活性化および拡大する方法を提供する。ひとつの態様において、第一の物質は抗CD3抗体であり、および第二の物質は抗CD28抗体である。
【００２４】
本発明の更なる局面は、下記の工程の方法により活性化されおよび拡大されたT細胞集団を含有する組成物を提供する：少なくともそれらの一部は、T細胞を含む細胞集団を提供する工程；該細胞集団を表面と接触する工程であって、ここで該表面は、T細胞の第一のT細胞表面部分に連結する第一の物質をそれらに付着し、および前記または第二の表面は、該T細胞の第二の部分に連結する第二の物質をそれらに付着し、ここで第一および第二の物質による該連結は、該T細胞の増殖を誘導し、これによりT細胞の該集団は活性化および拡大する工程；ここで、(a)の該細胞集団は、該個体において、癌、または活性化されおよび拡大されたT細胞が有益である他の疾患の治療に関して後で使用するために、健常個体から収集される工程。
【００２５】
本発明の別の局面は、請求項1〜16および22のいずれか1項に記載のT細胞集団を含有する組成物を提供し、ここで少なくともそれらの一部はT細胞を含む該細胞集団は、健常個体から、後で該個体の癌の治療に使用するために、収集される。これに関して、癌は、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞増加症、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、子宮癌、膵臓癌、食道癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、胃癌、食道癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性リンパ球性白血病(CLL)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の局面は、下記の詳細な説明および添付図面を参照し明らかになると思われる。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明に関して説明する前に、以下において使用される特定の用語の定義を示すことは、それらの理解を助けると思われる。
【００２８】
本明細書において使用される「生体適合性」という用語は、生存細胞に対して主として無毒である特性を意味する。
【００２９】
本明細書において使用される「刺激」という用語は、細胞表面部分の連結により誘導された一次反応を意味する。例えば受容体との関連で、このような刺激は、受容体の連結および引き続きのシグナル伝達現象を包含している。T細胞の刺激に関し、このような刺激は、ひとつの態様においてTCR/CD3複合体との結合のような、シグナル伝達現象を引き続き誘導する、T細胞表面部分の連結を意味する。更に、刺激現象は、細胞を活性化し、およびTGF-βの下方制御のように、分子の発現もしくは分泌を上方制御もしくは下方制御してもよい。従って細胞表面部分の連結は、例え直接のシグナル伝達現象が存在しなくとも、細胞骨格構造の再構築を、または細胞表面部分の癒合を生じることができ、これらは各々、引き続きのT細胞反応を増強、修飾または改変するために使用することができる。
【００３０】
本明細書において使用される「活性化」という用語は、注目に値する生化学的または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分連結後の細胞の状態を意味する。T細胞との関連で、このような活性化は、細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたT細胞の状態を意味する。T細胞の活性化は、サイトカイン産生および調節性もしくは細胞傷害性のエフェクター機能の能力を誘導することもできる。他の細胞との関連において、この用語は、特定の物理化学的プロセスの上方制御もしくは下方制御を暗示する。
【００３１】
本明細書において使用される「力」という用語は、細胞表面部分に結合する物質により細胞性濃縮(cellular concentration)および細胞の濃縮(concentration of cells)を誘導する刺激されるべき細胞に加えられた人工的な力または外力を意味する。例えば、「力」という用語は、細胞濃縮および／または細胞表面部分の凝集を誘導する、重力より大きいいずれかの力(すなわち、重力に加えて、および単なる重力でない)を含む。このような力は、膜を介して発生する圧力、例えば濾過、水圧、電気力、音響力、遠心力、磁力などを含む。理想的には、使用される力は、細胞表面部分と連結する物質により、関心のある標的細胞の濃縮を駆動する。様々な状況において、力は、パルス化、すなわち印加および再印加される(例えば、磁力はオンオフされ、常磁性粒子との組合せにより細胞集団をパルス化する。)。
【００３２】
本明細書において使用される「同時に存在する」という用語は、本質的に濃縮時に、細胞を有する表面にぽて、それらに付着した表面部分結合物質は、互いにおよびその表面、従ってリガンド(すなわち物質)との、細胞の濃縮を生じるという事実を意味する。しかし「同時に存在する」という用語の使用は、濃縮としての、標的細胞の、それらに付着した細胞表面部分結合物質を有する表面との先行する結合、更にはリガンド結合が、濃縮表面において同時に生じることは排除しない。例えばT細胞活性化の状況において、T細胞は、それらに付着した抗CD3および抗CD28抗体を有する常磁性ビーズなどの表面に曝露され、その後磁場により濃縮されてよい。従ってこの状況において、細胞およびビーズは予め接触および連結されるが、それにも関わらず細胞の濃縮時に、追加の連結が生じる。
【００３３】
本明細書において使用される「標的細胞」という用語は、細胞表面部分連結により刺激されることが意図されたいずれかの細胞を意味する。
【００３４】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、霊長類化された（primatized）(例えば、ヒト化された)；マウス；マウス-ヒト；マウス-霊長類のポリクローナルおよびモノクローナルの両抗体；並びに、キメラ抗体を含み；並びに、未変化の分子、それらの断片(例えば、scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'およびF(ab)'2断片)、または未変化の分子および／もしくは断片の多量体もしくは凝集物であってもよく；並びに、天然であるか、または例えば免疫処置、合成もしくは遺伝子操作により作製されてよく；本明細書において使用される「抗体断片」という用語は、抗原に結合しおよび一部の態様においては例えばガラクトース残基の取込みにより、クリアランスおよび取込みを促進する構造的特徴を発揮するように誘導体化され得る、抗体に由来したもしくは抗体に関係した断片を意味する。これは、例えばF(ab)、F(ab)'2、scFv、軽鎖可変領域(VL)、重鎖可変領域(VH)、およびそれらの組合せを含む。
【００３５】
本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを含み；並びに、未変化の分子、それらの断片、または未変化の分子および／または断片の多量体もしくは凝集物であってよく；並びに、天然であるか、または例えば合成(化学的および／または酵素的を含む)または遺伝子操作により作製されてよい。
【００３６】
本明細書において使用される「物質」、「リガンド」または「細胞表面部分に結合する物質」という用語は、定義された細胞集団に結合する分子を意味する。この物質は、受容体、抗原決定基、または標的細胞集団上に存在する他の結合部位のような、いずれかの細胞表面部分に結合する。この物質は、タンパク質、ペプチド、それらの抗体および抗体断片、融合タンパク質、合成分子、有機分子(例えば、小型分子)などであってよい。本明細書においておよびT細胞刺激との関連で、抗体は、このような物質の基本的例として使用される。
【００３７】
本明細書において使用される「細胞表面部分と結合する物質」および「細胞表面部分」という用語は、リガンド/抗リガンド対の状況で使用される。従って、これらの分子は、一般に比較的高親和性(親和性定数Kaは約106M-1)の、特異的結合を示す分子の相補的/抗相補的セットとして見られるはずである。
【００３８】
本明細書において使用される「共刺激シグナル」は、TCR/CD3連結のように、一次シグナルとの組合せがT細胞増殖につながるシグナルを意味する。
【００３９】
本明細書において使用される「リガンド/抗リガンド対」は、一般に比較的高親和性(親和性定数Kaは約106M-1)の、特異的結合を示す分子の相補的/抗相補的セットを意味する。リガンド/抗リガンドの例は、酵素/阻害剤、ハプテン/抗体、レクチン/炭水化物、リガンド/受容体、およびビオチン/アビジンまたはストレプトアビジンの対である。本明細書の状況において、受容体および他の細胞表面部分は抗リガンドであるが、それらと反応性である物質(例えば、抗体および抗体断片)は、リガンドとみなされる。
【００４０】
本明細書において使用される「分離」は、ひとつの成分を他の成分から(例えば、濾過または磁気吸引により)実質的に精製するいずれかの手段を有する。
【００４１】
本明細書において使用される「静止期」は、細胞が活発に増殖していないような細胞の状態を意味する。
【００４２】
本明細書において使用される「表面」は、それらに付着された物質を有することが可能であるいずれかの表面を意味し、かつ金属、ガラス、プラスチック、コポリマー、コロイド、脂質、細胞表面などを含むが、これらに限定されるものではない。本質的にあらゆる表面は、それらに結合または付着した物質を保持することが可能である。ここにおいて使用される表面の基本的例は、ビーズのような粒子である。
【００４３】
本発明のひとつの局面は、細胞の濃縮、細胞表面部分の連結を誘導する力と、揺動する閉鎖システムにおける細胞培養の組合せは、これらの細胞の活性化および拡大の著しい増強を生じるという驚くべき知見に関する。本明細書に説明した基本的例においては、T細胞が使用される。しかし当業者は、本発明は、細胞表面部分の連結または凝集が望ましいあらゆる細胞型またはそのような結合がその後の細胞シグナル伝達現象につながるあらゆる細胞型(例えば、受容体)に広範に使用可能であることを容易に結論付けると思われる。理論に結びつけられることを欲するものではないが、本発明は、脂質ラフト化および／または受容体極性化に関連した現象を利用することにより、機能し得る。この現象は、それらが、細胞表面部分を含む脂質ラフトの凝集によるシグナル伝達の開始/増強、または細胞のひとつの部分でもしくは更には複数の部分での受容体の局在化(すなわち、極性化)に起因した増強されたシグナル伝達のいずれかを示唆する点で類似している。従って、そのような細胞表面部分連結は、予想外の強固な細胞活性化およびT細胞の増殖につながるのみではなく、多くの細胞型のシグナル伝達現象の増大にも適用することができる。加えて、同じく理論に結びつけられることを欲するものではないが、本発明は、細胞を拡大するために最適な通気を提供することにより機能することができる。従って揺動および灌流された培地による通気と組合わせた細胞表面部分連結は、予想外に高い密度および絶対数までのT細胞の予想外の強固な細胞活性化および拡大につながる。従ってT細胞との関連で、本発明は、様々な予想外の利点を提供し、第一にこれは、「被覆されない」粒子を使用する個別の単球枯渇工程の必要性を排除し、より少ない細胞の移動およびより少ない試薬、活性化プロセス時の増加したレベルのT細胞活性化を必要とすることにより、T細胞の拡大を単純化し、細胞療法に適した細胞数を実現する時間を著しく短縮し、細胞のプロセシングに関連した時間と労力を削減し、製造コストを削減し、並びに患者のプロセシングおよび注入するスケジュールの弾力性を増大する。
【００４４】
本発明の追加の局面において、第一および第二またはより多くの表面が、それらに結合したリガンド/物質を伴いまたは伴わずに使用される。この態様において様々な表面は、標的細胞の細胞表面部分に結合するためにそれらに付着した同じまたは異なる物質を有してよい。例えば常磁性ビーズは、標的細胞上の受容体の抗体をそれらに付着することができ、並びにそのようなビーズは、標的細胞を含有する細胞集団と混合することができる。更にこの細胞集団は、それらに付着された同じまたは異なる細胞表面部分結合物質を伴う第二のまたはより多くのビーズと混合してもよい。力が濃縮を誘導した場合、これらのビーズおよび細胞は、一緒により小さい容積となり、その結果シグナル伝達が増大される。別の例において、それらに付着した炭水化物またはその他の非受容体細胞表面部分に特異的な物質を有する常磁性ビーズは、標的細胞を含む細胞集団と混合される。その後磁場を用い、ビーズが付着した細胞を、それらに付着した受容体連結物質を有する別の表面に吸引する。その結果シグナル伝達を誘導する物質が、第二の表面上に存在する。更に別の例において、標的細胞の細胞表面部分に結合する物質は、それ自身がそれらに付着されたリガンドを有するメッシュまたはフィルター中に保持されるのに十分大きい粒子に付着され得る。
【００４５】
前記のように、本発明は、その集団中の細胞の表面上の部分に結合することにより、細胞集団を刺激する方法を提供する。細胞集団と細胞表面部分に結合する物質(例えばリガンド)との接触は、その細胞集団を刺激することができる。このリガンドは、溶液中に存在するが、表面に付着してもよい。受容体のような、細胞表面部分の連結は、概して特定のシグナル伝達経路を誘導することができる。最近の研究は、シグナル伝達の発生のためには、必須の受容体を含む脂質ラフトの臨界濃度は、凝集しなければならないことを示唆している。例として、ラフト凝集は、インビボまたはインビトロにおいて、特定の細胞表面部分についてのリガンドを常磁性粒子に付着し、リガンド保有する粒子をこれらの細胞に曝露し、およびその直後または同時に磁場のような力を印加し、連結された部分(例えば受容体)の極性化および小さい容積での細胞の濃縮を補助することにより、促進され得る。磁力の印加は、細胞を濃縮することに加え、細胞表面部分に連結するそれらに付着した物質を有する表面を伴う細胞を濃縮し、これにより細胞のリガンドとのより大きい接触をもたらし、加速されかつより強力な活性化を生じる。多くの本発明の適用が可能であり、例えば、細胞は少数の受容体および／または機能不全の受容体を有する場合、本方法は、脂質ラフト中においてこのような受容体を十分に濃縮し、そのような欠点を克服しおよび適切なシグナル伝達活性を可能にすることができる。そのような細胞表面レパートリー補正のひとつの例は、ある型の白血病患者であり、この場合は抗CD3および抗CD28抗体のような物質による細胞表面部分刺激の前に、CD3/TCR複合体のような、いくつかの正常な細胞表面マーカーは、通常少ない。これらの細胞集団を、抗CD3および抗CD28抗体のような物質で刺激することにより、これらの細胞の細胞表面マーカーは、正常と見えるレベルに戻り、従って患者へ戻した場合に、より強力かつより迅速な免疫応答をもたらす癌療法のためのより強固な免疫療法剤を提供することができる。更に本発明の別の適用において、細胞は、効果的に濃縮および活性化され、これは受容体極性化の誘導を含み、これにより受容体シグナル伝達現象が最大化される。このような適用は、受容体に方向付けられたスクリーニングアッセイ法の使用、または腫瘍細胞におけるFasまたは同様の分子の連結によるアポトーシス誘導のような活性化を誘導するための細胞表面上の細胞ラフトの収集によるものを含む広範な利用性がある。
【００４６】
このようなスクリーニングアッセイ法の一例において、G-タンパク質共役型受容体を保有する細胞を使用することができ、これらをそれらに結合する物質と接触させ、これらの物質は、力が誘導した濃縮を可能にする表面に結合される。従って一緒の受容体ラフトとして、シグナル伝達現象が増幅される。これは、典型的実験においては非常に低いレベルのシグナル伝達現象の研究において、従って薬物化合物がそのようなシグナル伝達現象を阻害または若干修飾することのスクリーニングにおいて重要と考えられる。
【００４７】
細胞集団の刺激
本発明の方法は、細胞部分に結合するリガンドまたは物質を導入し、細胞現象を誘導することによる、標的細胞の刺激に関連している。このリガンドまたは物質の細胞への結合は、シグナル伝達経路により起動され、次に細胞における特定の表現型の変化または生物学的変化が活性化される。本明細書に説明されたように細胞部分に結合するリガンドまたは物質の導入による標的細胞の刺激は、その細胞の特定の表現型の変化または生物学的変化につながるいくつかの細胞プロセスを上方制御または下方制御することができる。この細胞の活性化は、正常な細胞機能を増強するか、もしくは異常な細胞中において正常な細胞機能を開始することができる。本明細書に説明された方法は、細胞表面部分に結合するリガンドまたは物質と一緒の細胞の濃縮を強制することにより刺激を提供する。細胞の刺激は増強されるか、または特定の細胞現象は、第二の細胞表面部分に連結する第二の物質またはリガンドを導入することにより刺激され得る。この方法は、細胞表面部分の連結がシグナル伝達現象につながるいずれかの細胞へ適用することができる。本発明は更に、刺激された細胞を選択または培養する手段を提供する。説明された基本的例は、T細胞の刺激であるが、当業者はこの方法は他の細胞型に適用することができることを容易に理解すると思われる。例として、刺激されかつ選択され得る細胞型は、線維芽細胞、神経芽細胞、肺細胞、造血幹細胞および造血前駆細胞(CD34+細胞)、間葉幹細胞、間葉前駆細胞、神経および肝の前駆細胞および幹細胞、樹状細胞、細胞溶解性T細胞(CD8+細胞)、B細胞、NK細胞、他の白血球集団、多能性幹細胞、多能性幹細胞、島細胞などを含む。従って本発明は、この方法から生じる細胞集団に加え、特異的表現型特性を伴うT細胞を含む、個別の表現型特性を有する細胞集団も提供する。
【００４８】
前記のように、様々な細胞型を、本発明との関連で使用することができる。例えば、B細胞、T細胞、NK細胞、他の血液細胞、神経細胞、肺細胞、腺(内分泌腺)細胞、骨形成細胞(破骨細胞など)、生殖細胞(例えば卵母細胞)、再生臓器の裏層である上皮細胞、およびその他のような細胞型を使用することができる。細胞表面部分-リガンドの対は、以下を含む(しかし他を排するものではない)：T細胞抗原受容体(TCR)と抗CD3 mAb、TCRと主要組織適合遺伝子複合体(MHC)+抗原、TCRとペプチド-MHCテトラマー、TCRとスーパー抗原(例えば、ブドウ球菌腸毒素B(SEB)、中毒性ショック症候群毒素(TSST)など)、B細胞抗原受容体(BCR)と抗Ig、BCRとLPS、BCRと特異的抗原(一価または多価)、NK受容体と抗NK受容体抗体、FAS(CD95)受容体とFASリガンド、FAS受容体と抗FAS抗体、CD54と抗CD54抗体、CD2と抗CD2抗体、CD2とLFA-3(抗原-3に関連したリンパ球機能)、サイトカイン受容体とそれらの各サイトカイン、サイトカイン受容体と抗サイトカイン受容体抗体、TNF-R(腫瘍壊死因子-受容体)ファミリーメンバーとそれらに対する抗体、TNF-Rファミリーメンバーとそれらの各リガンド、接着/ホーミング受容体とそれらのリガンド、接着/ホーミング受容体とそれらに対する抗体、卵母細胞または不稔性卵母細胞の受容体とそれらのリガンド、卵母細胞または不稔性卵母細胞の受容体とそれらに対する抗体、子宮内膜層上の受容体とそれらのリガンド、ホルモン受容体とそれらの各ホルモン、ホルモン受容体とそれらに対する抗体など。
【００４９】
リガンドによる受容体の結合の性質は、受容体の多量体化、または受容体の凝集/配向のいずれかを生じ、その結果シグナル伝達または細胞反応は、細胞分裂、サイトカイン分泌、細胞移動、増加した細胞-細胞相互作用などの特定の恩恵を付与するように、上方制御されるか、下方制御されるか、促進されるか、改善されるか、さもなければ改変されると考えられる。
【００５０】
細胞表面部分の多量体化、凝集、または制御された再配向などがいかに実用上有益であるかを例証するふたつの例を以下に示す。
【００５１】
ひとつの例において、抗原および抗原提示細胞による正常なT細胞活性化は、通常TCRラフトの凝集、細胞骨格再構築、「活性化」シグナルの極性化および細胞分裂などを生じる。本明細書に説明される方法のような人工的方法を用い、「正常な」インビボ T細胞活性化の非存在下で、特に、TCRとCD28の促進され制御されかつ空間的に配向された連結を介して、前記の機能を促進、改善、またはさもなければ影響を及ぼすことができる。インビトロにおける改善された細胞拡大という恩恵は、治療的適用のためのより多い数の注入可能なおよびより強固な細胞を生じる。特に本発明は、T細胞を非常に高密度(6x106個細胞/ml〜90x106個細胞/ml)の範囲に活性化および拡大する方法を提供し、非常に多数の細胞(8000億個もの細胞が、一個体由来の出発細胞数約0.5x109個細胞から拡大される。)の生成を生じる。他の恩恵は、細胞表面上の正常よりも低いTCR密度のような、欠損を伴う細胞の受容体」凝集」を改善する。同様に、インビボ適用は、腫瘍部位で、腫瘍特異的T細胞のような活性化される特異的T細胞集団が必要である場合に有益である。改善された受容体凝集および配向は、そうでなければ機能的に容認されたT細胞を得ることが難しい活性化シグナルを提供することができる。更にこのような活性化は、抗原特異的T細胞の状況で使用することができる。これに関連して、腫瘍由来のT細胞は、単離されおよび拡大され、かつ患者へ注入される。同様に、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて抗原へ曝露されたT細胞は、本方法により拡大され得る。
【００５２】
別の例において、細胞死の改善された誘導は、FAS経路により生じる。FASの多量体化を促進する能力、標的細胞表面上の「活性化された」FASを空間的に配向する能力、またはそうでなければ達成不可能な累積的なFAS連結を促進する能力は、インビボにおいて、特に癌、自己免疫応答、または移植対宿主疾患の治療において重大な恩恵を提供することができる。例えば腫瘍細胞は、インビボにおいてFASを低レベルで発現し、宿主は、腫瘍部位でFAS-Lを低レベルで発現することができる(抑制性サイトカインのためなど)。これらの低レベルのために、適切なFASシグナルが形成されず、腫瘍の生存および成長を可能にする。このFAS/FAS-リガンド欠損を克服するひとつの可能性のある方法は、腫瘍/腫瘍部位を、常磁性粒子に結合したFASの一価または多価のリガンド(FAS-L、抗体など)で標的化することである。腫瘍部位(例えば、メラノーマ、カポジ肉腫、頚部扁平上皮癌など)で本発明を使用する強力な磁場の適用は、受容体活性化並びに／またはT細胞活性化および拡大に適合された、腫瘍細胞上のFAS結合した粒子として、腫瘍部位の常磁性粒子の空間的配向を提供することができる。シグナル極性化を伴なう増加したFAS凝集は、腫瘍細胞における細胞死をその時誘導する適当なシグナルを提供することができる。
【００５３】
本発明のひとつの特定の態様において、T細胞集団は、T細胞の同時の濃縮および表面連結により刺激することができる。本発明のひとつの局面において、CD3およびCD28に対する抗体は、表面上に共固定される。このような固定にとって好ましい表面は粒子を含み、ある局面において例えば常磁性ビーズのようなビーズである。別の本発明の局面において、TCR/CD3複合体に結合しおよび一次刺激シグナルを開始するいずれかのリガンドは、表面に固定された一次活性化物質として使用することができる。CD28に結合しかつCD28シグナル伝達経路を開始し、その結果その細胞のCD3リガンドによる共刺激を引き起こしおよびT細胞集団の活性化を増強するようなリガンドは、CD28リガンドであり、従って本発明の状況において共刺激物質である。更なる本発明の局面において、T細胞並びに抗CD3および抗CD28複合した表面の混合物に力が加えられ、T細胞が濃縮され、結果的にT細胞表面連結が最大化される。ひとつの特定の態様において、濃縮力は、抗CD3および抗CD28被覆した表面が常磁性ビーズであるような場所へ適用された磁力であるが、別の手段は、細胞およびリガンドを一緒に濃縮された様式で、当技術分野において使用可能とする。T細胞集団を刺激するこのような方法は、T細胞の驚くほど大きい活性化および／または増殖を誘導する著しいビーズ-細胞および／または細胞-細胞接触を提供する。更に本発明の方法は、細胞表面マーカープロファイルを改変し、ここで活性化されたT細胞は、疾患を伴う対象から最初に単離されたT細胞のプロファイルと比較し、より正常な表現型およびより変動性の少ない最終産物を示す細胞表面マーカーを発現する。
【００５４】
一次シグナル
エキソビボのT細胞刺激に寄与する生化学現象を以下に簡単に説明する。TCR/CD3複合体と抗原提示細胞上のMHCクラスIまたはクラスII分子のいずれかと複合されて提示された抗原の間の相互作用は、抗原特異的T細胞活性化と称される一連の生化学現象を開始する。従ってT細胞の活性化は、T細胞TCR/CD3複合体の刺激によるか、またはCD2表面タンパク質の刺激により、実現することができる。抗CD3モノクローナル抗体を使用し、TCR/CD3複合体を介し、T細胞集団を活性化することができる。多くの抗ヒトCD3モノクローナル抗体が市販されており、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から得られるハイブリドーマ細胞から調製されたOKT3、およびモノクローナル抗体G19-4がある。同様に、抗CD2抗体の刺激型が公知であり使用可能である。抗CD2抗体によるCD2を通じた刺激は、典型的には少なくとも2種の異なる抗CD2抗体の組合せを用いて実現される。説明されている抗CD2抗体の刺激の組合せは、以下を含む：T11.1またはT11.2抗体と組合せるT11.3抗体(Meuer et al., Cell, 36:897-906,1984)、および9-1抗体と組合せた9.6抗体(前記エピトープをT11.1として認識する)(Yang et al., J Immunol. 137:1097-1100,1986)。前記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。追加の抗体、または抗体の組合せは、標準技術により調製および同定することができる。
【００５５】
一次活性化シグナルは、他の機構によってもT細胞へ送達され得る。例えば、使用することができる組合せは、プロテインキナーゼC(PKC)アクチベーター、例えばホルボールエステル(例えば、ミリスチン酸酢酸ホルボール)、およびカルシウムイオノホア(例えば、細胞質カルシウム濃縮を生じるイオノマイシン)などを含む。このような物質の使用は、TCR/CD3複合体を迂回するが、刺激シグナルはT細胞へ送達する。一次シグナルとして活性化する他の物質は、天然型および合成のリガンドを含んでよい。天然型のリガンドは、提示されたペプチドを伴うまたは伴わないMHCを含んでよい。他のリガンドは、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、例えばPHA、または他のスーパー抗原、ペプチド-MHC四量体(Altman, et al., Science. 1996 Oct 4;274(5284):94-6)および可溶性MHC二量体(Dal Porto, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1993 Jul 15;90)を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の状況において、濃縮および刺激の使用は、T細胞の増殖の誘導に二次シグナルが不要であるような高い受容体極性化を生じることができる。
【００５６】
別の態様において、あらゆる種類のシグナル伝達現象は、本発明を使用し増大または分析することができる。例えば、Gタンパク質共役型受容体は、本発明の濃縮方法を用い刺激されかつ測定され得る。
【００５７】
二次シグナル
TCR/CD3複合体またはCD2分子の刺激は、T細胞における一次活性化シグナルの送達に必要であるように見えるが、アクセサリー分子または共刺激分子と称されるT細胞表面上の多くの分子は、休止しているT細胞の芽球トランスフェクションへの移行、並びに引き続きの増殖および分化を調節することに関係している。従って、T細胞反応の誘導は、一次活性化シグナルに加え、二次共刺激シグナルを必要とする。このような共刺激またはアクセサリー分子のひとつであるCD28は、TCR複合体により刺激されることから識別されるシグナル伝達経路を開始または調節すると考えられる。
【００５８】
従って、外因性増殖因子またはアクセサリー細胞の非存在下でT細胞集団の活性化および増殖を増強するために、CD28のようなT細胞表面上のアクセサリー分子は、このアクセサリー分子に結合するリガンドにより刺激される。ひとつの態様において、アクセサリー分子CD28の刺激およびT細胞活性化は、T細胞集団を、CD3に結合するリガンドおよびCD28に結合するリガンドが付着された表面と接触することにより、同時に起こる。T細胞の例えば抗CD3抗体による活性化、およびCD28アクセサリー分子の刺激は、CD4+ T細胞の選択的増殖を生じる。
【００５９】
従って、当業者は、抗CD28抗体またはCD28分子への架橋が可能であるそれらの断片、またはCD28の天然型のリガンドを含む、いずれかの物質を使用し、T細胞を刺激することができることを認めると思われる。本発明の状況において有用である抗CD28抗体またはそれらの断片の例は、モノクローナル抗体9.3(IgG2a)(Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ)、モノクローナル抗体KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)、およびEX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)を含む。天然型のリガンドの例は、タンパク質のB7ファミリー、例えばB7-1(CD80)およびB7-2(CD86)を含む
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。加えて、天然型のリガンドの結合相同体は、未変性のまたは化学的もしくは組換え技術により合成されたかにかかわらず、同じく本発明に従い使用することができる。二次シグナルとして作用する他の物質は、天然型および合成のリガンドを含むことができる。物質は、他の抗体またはそれらの断片、ペプチド、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、糖ペプチド、可溶性受容体、ステロイド、ホルモン、マイトジェン、例えばPHA、または他のスーパー抗原を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の更なる態様において、T細胞集団の活性化は、他のT細胞内在膜タンパク質の共刺激により増強することができる。例えば、T細胞インテグリンLFA-1のその天然型のリガンドICAM-1への結合は、細胞の活性化を増強し得る。T細胞の共刺激因子として作用し得る別の細胞表面分子は、T細胞上のvery-late-antigen-4(VLA-4)に結合するVCAM-1(CD106)である。活性化されT細胞上に発現された共刺激受容体である4-1BBの連結も、本発明の状況で、T細胞媒介した免疫を増幅するために、有用である。
【００６１】
当業者は、T細胞以外の細胞は、細胞表面部分を連結しおよびその部分の凝集を誘導する物質の結合により刺激され得、このことは次にシグナル伝達経路の活性化を生じることを理解すると思われる。他のそのような細胞表面部分は、GPI-アンカー葉酸受容体(CD59)、ヒトIgE受容体(FcεRi受容体)、BCR、EGF受容体、インスリン受容体、エフリンB1受容体、ニュートロフィン、グリア細胞由来の好中球因子(GNDF)、ヘッジホッグおよび他のコレステロール連結したおよびパルミチン酸化されたタンパク質、H-Ras、インテグリン、内皮型NO産生酵素(eNOS)、FAS、TNF受容体ファミリーのメンバー、GPI-アンカータンパク質、二重アシル化されたタンパク質、例えばSrc-ファミリーキナーゼなど、ヘテロ三量体Gタンパク質のα-サブユニット、および細胞骨格タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。 
【００６２】
T細胞集団の拡大
本発明のひとつの局面において、エキソビボにおけるT細胞拡大は、T細胞の単離および引き続きの刺激により行うことができる。本発明のひとつの態様において、T細胞は、単独の物質により刺激することができる。別の態様において、T細胞は、ふたつの物質により刺激され、第一のものは一次シグナルを誘導し、第二のものは共刺激シグナルである。単独のシグナルの刺激、または一次シグナルおよび二次シグナルを刺激するアクセサリー分子の刺激に有用なリガンドは、可溶型で使用されるか、細胞表面に付着されるか、または本明細書に説明されたように表面に固定され得る。表面に付着されたリガンドまたは物質は、「代理」抗原提示細胞(APC)として役立つ。好ましい態様において、一次物質および二次物質の両方は、表面上に共固定される。ひとつの態様において、CD3リガンドのような一次活性化シグナルを提供する分子、およびCD28リガンドのような共刺激分子は、例えば粒子のような同じ表面に結合される。更に前記のように、1種、2種またはそれよりも多い刺激分子を、同じ表面または異なる表面上で使用することができる。
【００６３】
拡大の前に、T細胞の供給源が対象から得られる。「対象」という用語は、免疫応答が誘起され得る生物(例えば、哺乳類)を含むことを意図している。対象の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種を含む。T細胞は、多くの供給源から得ることができ、これは末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、脾臓組織、および腫瘍を含む。本発明のある態様において、当技術分野において使用可能なかなり多数のT細胞株を使用することができる。本発明のある態様において、T細胞は、フィコール分離のような、当業者に公知のかなり多数の技術を使用し対象から収集された血液ユニットから得られる。ひとつの好ましい態様において、個体の循環血由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出により得られる。アフェレーシス産物は、典型的にはT細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。ひとつの態様において、アフェレーシスにより収集された細胞は洗浄され、血漿画分を除去し、引き続きのプロセシング工程のために、これらの細胞を適当な緩衝液または培地中に配置する。本発明のひとつの態様において、これらの細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。代わりの態様において、この洗浄溶液は、カルシウムを含まず、およびマグネシウムを含まないか、または全てではないが多くの二価のカチオンを含まなくともよい。重ねて驚くべきことに、最初のカルシウム非存在下での活性化工程は、増大された活性化につながる。当業者が容易に理解するように、洗浄工程は、製造業者の指示に従い半自動化された「フロースルー」遠心分離(例えば、Cobe 2991細胞プロセッサーなど)の使用などの、当技術分野において公知の方法により実現することができる。洗浄後、これらの細胞は、例えばCa非含有、Mg非含有PBSのような、様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁することができる。あるいはアフェレーシス試料の望ましくない成分は除去し、これらの細胞を直接培養培地中に再懸濁する。
【００６４】
別の態様において、T細胞は、赤血球を溶解し、および例えばPERCOLL(商標)勾配での遠心分離により単球を枯渇することにより、末梢血リンパ球から単離される。CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、およびCD45RO+T細胞のような特定のT細胞亜集団は、更に陽性または陰性選択技術により単離され得る。例えば、ひとつの好ましい態様において、T細胞は、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような、抗CD3/抗CD28(すなわち、3x28)複合ビーズと一緒の、所望のT細胞の陽性選択に十分な期間のインキュベーションにより単離される。ひとつの態様において、この期間は、約30分間である。更なる態様においてこの期間は、30分から36時間またはそれよりも長く、およびそれらの間の全ての整数値である。更なる態様において、期間は、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間である。更に別の好ましい態様においてこの期間は、10〜24時間である。ひとつの好ましい態様において、インキュベーション期間は、24時間である。T細胞を白血病患者から単離するために、24時間のような比較的長いインキュベーション時間で、細胞収量を増加することができる。比較的長いインキュベーション時間を用い、腫瘍組織または免疫無防備状態の個体からの腫瘍内浸潤リンパ球(TIL)の単離におけるように、他の細胞型と比較してわずかなT細胞が存在する状況においてT細胞を単離することができる。更に比較的長いインキュベーション時間の使用は、CD8+ T細胞の捕獲効率を増大することができる。従って、単純にこの時間を短縮または延長することにより、T細胞はCD3/CD28ビーズへの結合が可能になるか、および／またはビーズのT細胞に対する比を増加もしくは減少することにより(本明細書において更に説明される)、T細胞亜集団は、培養開始時もしくはこのプロセス時の他の時点で、これについてもしくはこれに対して優先的に選択され得る。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗CD3および／または抗CD28抗体の比を増加または減少することにより、T細胞亜集団は、培養開始時もしくは他の望ましい時点で、これについてまたはこれに対して優先的に選択される。当業者は、本発明の状況において複数回の選択を使用することができることを認めると思われる。ある態様において、この選択手法を実行し、およびXCELLERATE(商標)プロセスにおいて「選択されない」細胞を使用することが望ましことがある。「選択されない」細胞には、更に選択を施すこともできる。
【００６５】
陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞への独自の表面マーカーに対する抗体の組合せにより実行することができる。好ましい方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体カクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するためのモノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。ある態様において、典型的にはCD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、およびFoxP3+を発現する調節性T細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましいことがある。
【００６６】
陽性または陰性選択により望ましい細胞集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズのような粒子)の濃縮は変動することができる。ある態様において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容積の著しい減少(すなわち、細胞の濃度の増加)が望ましいことがある。例えばひとつの態様において、20億個細胞/mlの濃度が使用される。ひとつの態様において、10億個細胞/mlの濃度が使用される。更なる態様において、10000万個細胞/mlよりも多くが使用される。更なる態様において、細胞濃度1000万個細胞/ml、1500万個細胞/ml、2000万個細胞/ml、2500万個細胞/ml、3000万個細胞/ml、3500万個細胞/ml、4000万個細胞/ml、4500万個細胞/mlまたは5000万個細胞/mlが使用される。更に別の態様において、7500万個細胞/ml、8000万個細胞/ml、8500万個細胞/ml、9000万個細胞/ml、9500万個細胞/ml、または10000万個細胞/mlからの細胞濃度が使用される。更なる態様において、濃度12500万個細胞/mlまたは15000万個細胞/mlを使用することができる。高濃度の使用は、増加した細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大を生じることができる。更に、高い細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞のような、または多くの腫瘍細胞が存在する試料(すなわち、白血病血、腫瘍組織など)からの、関心のある標的抗原を弱く発現する細胞の捕獲効率を高めることができる。このような細胞集団は、治療的価値があり、かつ得ることが望ましい。例えば、高い濃度の細胞の使用は、通常弱くCD28を発現するCD8+ T細胞をより効率的に選択することを可能にする。
【００６７】
関連した態様において、より低い濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。T細胞および表面(例えばビーズのような粒子)の混合物の有意な希釈により、粒子と細胞間の相互作用は最小化される。これは、これらの粒子に結合される所望の抗原を大量発現する細胞を選択する。例えば、CD4+ T細胞は、より高いレベルのCD28を発現し、および希釈した濃度でCD8+ T細胞よりもより効率的に捕獲される。ひとつの態様において、使用される細胞濃度は、5x106個/mlである。別の態様において、使用される濃度は、約1x105個/ml〜1x106個/ml、およびその間のいずれかの整数であることができる。
【００６８】
望ましいまたは必要である場合には、単球集団(すなわち、CD14+細胞)は、抗CD14被覆したビーズもしくはカラム、または除去を促進するためのこれらの細胞の貪食活性の利用を含む、様々な方法により、エキソビボで拡大する前に、血液調製物から枯渇され得る。従ってひとつの態様において、本発明は、貪食性単球により貪食されるのに十分なサイズの常磁性粒子を使用する。ある態様において、常磁性粒子は、例えば、Dynal ASよりDynabeads（商標）で製造されたもののような、市販のビーズである。これに関するDynabeads(商標)の例は、M-280、M-450、およびM-500である。ひとつの局面において、他の非特異的細胞は、「無関係の」タンパク質(例えば血清タンパク質または抗体)により、常磁性粒子を被覆することにより除去される。無関係のタンパク質および抗体は、拡大されるべきT細胞を特異的に標的化しないそのようなタンパク質および抗体またはそれらの断片を含む。ある態様において、無関係のビーズは、ヒツジ抗マウス抗体、ヤギ抗マウス抗体、およびヒト血清アルブミンにより被覆されたビーズを含む。
【００６９】
簡単に述べると、このような単球の枯渇は、全血またはアフェレーシスした末梢血から単離したPBMCを、1種または複数の無関係の種類または非抗体と結合した常磁性粒子と一緒に、単球の除去を可能にする量(およそ20:1のビーズ:細胞比)で、約30分間から2時間、22℃〜37℃で予めインキュベーションし、その後常磁性粒子に付着したまたは貪食された細胞を磁気除去することにより行われる。このような分離は、当技術分野において使用可能な標準方法を用いて行うことができる。例えば、市販の様々なものを含む、磁気分離法のいずれかを使用することができる(例えば、DYNAL(登録商標) Magnetic Particle Concentrator (DYNAL MPC(登録商標)))。必要な枯渇を確実にするために、該枯渇の前後の、CD14陽性細胞のフローサイトメトリー分析を含む、当業者に公知の様々な方法によりモニタリングすることができる。
【００７０】
刺激のためのT細胞は、洗浄工程後に凍結することもでき、この場合は単球除去工程を必要としない。理論に結びつけることを意図するものではないが、凍結工程およびそれに続く解凍工程は、細胞集団中の顆粒球およびある程度の単球を除去することによりより均一な生成物を提供する。血漿および血小板を除去する洗浄工程後、これらの細胞は、凍結液中に懸濁されてもよい。多くの凍結液およびパラメーターが当技術分野において公知であり、かつこの状況において有用であるが、ひとつの方法は、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミンを含有するPBS、または他の適当な細胞凍結培地の使用に関連しており、その後これらの細胞は、1分間に1℃の速度で-80℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンク内で気相中に貯蔵される。その他の制御された凍結法に加え、即時-20℃または液体窒素中の制御されない凍結を使用しても良い。
【００７１】
本発明の状況において、本明細書に説明されたような拡大された細胞が必要となる以前の期間に、対象由来の血液試料または白血球搬出生成物の収集も企図される。従って拡大される細胞の供給源は、必要な時点で収集することができ、およびT細胞のような望ましい細胞は、本明細書に説明されたもののような、T細胞療法から恩恵を受けるかなり多数の疾患または状態に関するT細胞療法において後で使用するために、単離されかつ凍結される。ひとつの態様において、血液試料または白血球搬出は、全般的に健常な対象から採取される。ある態様において、血液試料または白血球搬出は、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない全般的に健常な対象から採取され、関心のある細胞が、後での使用のために単離および凍結される。ある態様において、T細胞は、拡大され、凍結され、および後で使用される。ある態様において、試料は、本明細書に説明されたような特定疾患の診断後間もなく、何らかの治療前に、患者から収集される。更なる態様において、これらの細胞は、抗ウイルス剤、化学療法、放射線療法、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびFK506などの免疫抑制剤、抗体、または他の免疫アブレーション物質、例えばCAMPATH、抗CD3抗体、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、および照射などによる治療を含むが、これらに限定されるものではないかなり多数の関連治療様式の前に、対象由来の血液試料または白血球搬出から単離される。これらの薬物は、カルシウム依存性リン酸カルシニューリン(シクロスポリンおよびFK506)を阻害するか、または増殖因子誘導したシグナル伝達に重要なp70S6キナーゼ(ラパマイシン)を阻害する(Liu et al., Cell, 66:807-815,1991；Henderson et al., Immun., 73:316-321,1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun., 5:763-773,1993；Isoniemi(前記))。更なる態様において、これらの細胞は、患者のために単離され、骨髄移植、フルダラビンのような、化学療法薬のいずれかを使用するT細胞アブレーション療法、外部ビーム照射療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体と(例えば、前、同時または後に)組合せて、後で使用するために凍結される。別の態様において、これらの細胞は、CD20と反応する物質、例えばリツキサン（Rituxan）などの、B細胞アブレーション療法後の治療のために、後で使用するために、予め単離され凍結される。
【００７２】
本発明の更なる態様において、T細胞は、治療後直接患者から得られる。これに関して、ある種の癌治療、特に免疫系を損傷する薬剤による治療の後、患者が治療から通常回復する期間の治療後間もなく、得られたT細胞の品質は、それらのエキソビボ拡大能に関して最適化または改善されることが観察された。同様に本明細書に説明した方法を使用するエキソビボ操作後に、これらの細胞は、増強された生着(engraftment)およびインビボ拡大にとって好ましい状態とされる。従って、本発明の状況において、この回復相の間に、T細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む、血液細胞の収集が企図される。更にある態様において、動員(例えば、GM-CSFによる動員)様式および馴化様式を用い、特にその後の療法時の規定された時間枠内の特定の細胞型の再集団化、再循環、再生、および／または拡大が好ましいような対象における状態を作出することができる。細胞型の例は、T細胞、B細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞を含む。
【００７３】
この細胞集団は、表面上に固定された抗CD3抗体または抗CD2抗体との接触によるか、またはカルシウムイオノホアと一緒にしたプロテインキナーゼCアクチベーター(例えばブリオスタチン)との接触により、本明細書に説明されたように刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激に関して、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、CD4+細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触することができる。同様に、CD8+ T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体B-T3、XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)を、当技術分野において公知の他の方法
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を使用するように、使用することができる。
【００７４】
T細胞のための一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する物質は、溶液中か、または表面に結合される。表面に結合される場合、これらの物質は、同一表面(すなわち、「シス」フォーメーション)または個別の表面(すなわち、「トランス」フォーメーション)に結合することができる。あるいは、ひとつの物質は、溶液中の表面および他の物質に結合され得る。ひとつの態様において、共刺激シグナルを提供する物質は、細胞表面に結合され、および一次活性化シグナルを提供する物質は、溶液中に存在するか、または表面に結合される。ある態様においては、両方の物質が溶液中に存在することができる。別の態様において、これらの物質は可溶型であり、従ってFc受容体を発現している細胞または抗体またはこれらの物質に結合する他の結合物質のように、表面へ架橋結合される。好ましい態様において、2種の物質が、同じビーズに、すなわち「シス」、または個別のビーズに、すなわち「トランス」で、ビーズ上に固定される。例として、一次活性化シグナルを提供する物質は、抗CD3抗体であり、および共刺激シグナルを提供する物質は、抗CD28抗体であり；および、両方の物質は、等モル量で同じビーズに共固定される。ひとつの態様において、CD4+ T細胞拡大およびT細胞成長のためにビーズに結合した各抗体の比1:1が使用される。本発明のある局面において、ビーズに結合した抗CD3:CD28抗体の比は、比1:1を用いて観察された拡大と比べて、T細胞拡大の増加が認められるようなものが使用される。ひとつの態様において、比1:1を用いて観察される拡大と比べて、約0.5〜約3倍の増加が観察される。ひとつの態様において、ビーズに結合したCD3:CD28抗体の比は、100:1〜1:100の範囲、およびそれらの間の全ての整数である。本発明のひとつの局面において、抗CD3抗体よりもより多くの抗CD28抗体が、これらの粒子に結合され、すなわちCD3:CD28の比は1未満である。本発明のある態様において、ビーズに結合した抗CD28抗体の抗CD3抗体に対する比は、2:1よりも大きい。ひとつの特定の態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比1:100が使用される。別の態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比1:75が使用される。更なる態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比1:50が使用される。別の態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比1:30が使用される。ひとつの好ましい態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比1:10が使用される。別の態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比1:3が使用される。更に別の態様において、ビーズに結合した抗体のCD3:CD28比3:1が使用される。
【００７５】
粒子の細胞に対する比1:500〜500:1およびその間のいずれかの整数値を用い、T細胞または他の標的細胞を刺激することができる。当業者が容易に理解するように、粒子の細胞に対する比は、標的細胞に対する粒子サイズにより左右される。例えば、小さいサイズのビーズは、2、3の細胞にのみ結合されるのに対し、より大きいビーズは多く結合する。ある態様において、細胞の粒子に対する比は、1:100〜100:1の範囲およびその間のいずれかの整数値であり、更なる態様において、この比は、1:9〜9:1およびその間のいずれかの整数値を含み、これをT細胞を刺激するために使用することもできる。抗CD3結合および抗CD28結合した粒子のT細胞刺激を生じるT細胞に対する比は、前記のように変動することができるが、しかしある好ましい値は、少なくとも1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、および15:1であり、ある好ましい比は、T細胞1個につき粒子が少なくとも1:1である。ひとつの態様において、粒子の細胞に対する比は、1:1またはそれ未満が使用される。ひとつの特定の態様において、好ましい粒子:細胞比は1:5である。更なる態様において、粒子の細胞に対する比は、刺激の日に応じて変動することができる。例えばひとつの態様において、粒子の細胞に対する比は、第1日目に1:1〜10:1であり、追加の粒子が、その後最大10日間、毎日または1日おきに細胞へ添加され、最終比は1:1〜1:10である(添加の日の細胞カウントを基に)。ひとつの特定の態様において、粒子の細胞に対する比は、刺激の第1日目に1:1であり、刺激の第3日および第5日目に1:5に調節される。別の態様において、粒子は、毎日または1日おきに添加され、第1日目に最終比1:1、および刺激の第3および第5日目に1:5である。別の態様において、粒子の細胞に対する比は、刺激の第1日目に2:1であり、刺激の第3および第5日目に1:10に調節される。別の態様において、粒子は、毎日または1日おきに添加され、第1日目の最終比1:1、および刺激の第3および第5日目の1:10に調節される。当業者は、様々な他の比が、本発明における使用に適していることを理解すると思われる。特に比は、粒子サイズ並びに細胞サイズおよび型に応じて変動すると考えられる。
【００７６】
本発明のひとつの局面は、異なるビーズ:細胞比の使用は、抗原特異的T細胞の拡大に関する異なる転帰につながり得るという驚くべき知見に由来する。特に、ビーズ:細胞比は、抗原特異的(記憶)T細胞を選択的に拡大または欠失するように変動することができる。ひとつの態様において、使用される特定のビーズ:細胞比は、抗原特異的T細胞を選択的に欠失する。更なる態様において、使用される特定のビーズ:細胞比は、抗原特異的T細胞を選択的に拡大する。当業者は、望ましい拡大または欠失が生じる限りは、あらゆる比を使用することができることを容易に理解すると思われる。従って、本明細書に説明された組成物および方法を、本明細書において説明された様々な免疫療法の設定において使用するために、特異的T細胞集団を拡大するか、または特異的T細胞集団を欠失するために使用することができる。
【００７７】
ある方法を使用し、約12〜約14日間の後、T細胞を刺激から分離することにより、最初の活性化および刺激に続けてT細胞集団の長期刺激を維持することが利点となる。T細胞増殖の速度は、例えば、Coulter Counterなどにより、T細胞のサイズを試験するか、もしくは容積を測定することにより、定期的に(例えば毎日)モニタリングされる。これに関して、休止しているT細胞は、平均直径約6.8μmを有し、並びに最初の活性化および刺激時に、刺激リガンドの存在下で、T細胞平均直径は、4日目までに12μmを超えて増え、約6日目までに減少し始めると考えられる。平均T細胞直径がおよそ8μmに減少する場合、これらのT細胞は、再活性化されおよび再刺激され、T細胞の更なる増殖を誘導する。あるいは、T細胞増殖速度およびT細胞再刺激の時間は、活性化されたT細胞上で誘導されるCD154、CD54、CD25、CD137、CD134のような、細胞表面分子の存在のアッセイ法によりモニタリングすることができる。
【００７８】
ひとつの態様において、T細胞刺激は、ビーズ(3x28ビーズ)上に共固定された抗CD3および抗CD28抗体により、これらの細胞が静止状態(増殖は低いかまたはなし)に戻るのに十分な期間行われる(初回刺激後およそ8〜14日間)。その後刺激シグナルが細胞から除去され、これらの細胞は洗浄され、患者へ注入により戻される。実施例において明らかにされるように、刺激相の最後にこれらの細胞は、それらの抗原に反応する能力およびこれらの細胞の記憶様表現型を明らかにする能力により示されるように、本発明の方法により、「超誘導」とされる。従って注入後インビボにおける外因性または抗原による再刺激時に、活性化されたT細胞は、持続されたCD154発現および増加したサイトカイン産生のような、独自の表現型特性により特徴付けられる強固な反応を明らかにする。
【００７９】
本発明の更なる態様において、T細胞のような細胞は、物質被覆されたビーズと一緒にされ、これらのビーズおよび細胞は引き続き分離され、その後これらの細胞は培養される。別の態様において、培養前に、物質被覆されたビーズおよび細胞は分離されず、並びに一緒に培養される。更なる態様において、これらのビーズおよび細胞は、力の印加により最初に濃縮され、細胞表面部分連結を生じ、これにより細胞刺激を誘導する。
【００８０】
例として、T細胞が標的細胞集団である場合、細胞表面部分は、抗CD3および抗CD28がT細胞に接触するように付着された常磁性ビーズ(3x28ビーズ)により連結され得る。ひとつの態様において、これらの細胞(例えば、104〜109個T細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ、比1:1)、緩衝液中、好ましくはPBS(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオンを伴わない)中で一緒にされる。当業者は、あらゆる細胞濃度を使用することができることも容易に理解することができる。例えば、標的細胞は、試料中には非常に稀であり、試料のわずかに0.01％を構成するか、または全試料(すなわち100％)が、関心のある標的細胞を含んでもよい。従ってあらゆる細胞数が本発明の状況内である。ある態様において、粒子および細胞が一緒に混合される容積は、著しく減少し(すなわち、細胞の濃度が増加する)、細胞と粒子の最大接着を確実にすることが望ましい。例えばひとつの態様において、濃度約20億個細胞/mlが使用される。別の態様において、10000万個細胞/mlよりも多くが使用される。更なる態様において、細胞の濃度1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、または5000万個細胞/mlが使用される。更に別の態様において、細胞の濃度は、7500、8000、8500、9000、9500または10000万個細胞/mlが使用される。更なる態様において、濃度12500〜15000万個細胞/mlが使用される。高濃度の使用は、増加した細胞収量、細胞活性化、および細胞拡大を生じる。更に、高い細胞濃度の使用は、CD28陰性T細胞のような、関心のある標的抗原を弱く発現する細胞のより効率的捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値があり、得ることが望ましいと思われる。例えば高濃度の細胞を使用し、通常比較的弱いCD28発現を有するCD8+ T細胞のより効率的な選択を可能にする。
【００８１】
関連した態様において、比較的低い濃度の細胞を使用することが望ましいことがある。T細胞および粒子の混合物の著しい希釈により、粒子と細胞間の相互作用は最小化される。このことは、粒子に結合した多量の望ましい抗原を発現する細胞を選択する。例えば、CD4+ T細胞は、より高いレベルのCD28を発現し、薄い濃度のCD8+ T細胞よりも、より効率的に捕獲および刺激される。ひとつの態様において、使用される細胞の濃度は、約5x106/mlである。別の態様において、使用される濃度は、約1x105/ml〜約1x106/ml、およびその範囲のいずれかの整数値である。
【００８２】
細胞が懸濁される緩衝液は、特定の細胞型にとって適したものであってよい。ある種の細胞型を使用する場合、緩衝液は、このプロセス時に細胞の完全性を維持するために必要である、他の成分、例えば1〜5％血清を含有することができる。別の態様において、これらの細胞およびビーズは、細胞培養培地内で一緒にすることができる。これらの細胞およびビーズは、1分間から数時間までの時間範囲の、例えば、回転、攪拌またはいずれかの混合手段により、混合することができる。その後ビーズおよび細胞の容器は、磁場に配置されるなど、力により濃縮される。培地および未結合の細胞が除去され、ビーズに付着した細胞が、例えば蠕動ポンプによるポンプ輸送により、洗浄され、その後細胞培養に適した培地中に再懸濁される。 
【００８３】
本発明のひとつの態様において、この混合物は、数時間(約3時間)〜約14日間、またはその間の時間の整数値の間培養される。別の態様において、混合物は、21日間培養される。本発明のひとつの態様において、ビーズおよびT細胞は、約8日間培養される。別の態様において、ビーズおよびT細胞は、一緒に2〜3日間培養される。数回の刺激サイクルも望ましく、その結果T細胞培養時間は、60日間またはそれよりも長くなる。T細胞培養に適した条件は、血清(例えばウシ胎仔またはヒトの血清)、インターロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGFβ、およびTNF-α、または当業者に公知の細胞の成長のための他の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含有することができる適当な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640または、X-vivo 15(BioWhittaker))を含む。細胞の成長のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネート、および還元剤、例えばN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールを含むが、これらに限定されるものではない。培地は、RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15、およびX-Vivo 20を、添加されたアミノ酸およびビタミン、血清非含有または適量の血清(または血漿)の補充のいずれか、ホルモンの規定されたセット、および／またはT細胞の成長および拡大に十分なサイトカイン量と共に含む。例えばペニシリンおよびストレプトマイシンのような抗生物質は、実験培養のみに含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。これらの標的細胞は、成長の支持に必要な条件下、例えば適温(例えば、37℃)および大気(例えば、空気＋5％C02)で維持される。
【００８４】
濃縮する力として磁場を使用する場合、細胞培養前に細胞に加えられる磁場の強度は、磁石表面上に200ガウス〜12,000ガウスの範囲であってよい。磁石の形状およびサイズは、混合容器もしくは細胞培養容器のサイズおよび形状、または細胞と細胞の接触および細胞の濃縮を促進もしくは増大する他のパラメーターに適合される。磁力は、磁石と細胞との混合物中に含まれる常磁性ビーズの間に、緩衝液またはスペーサーとして作用する材料を配置することにより拡散されてもよい。強力な磁力は一般に表面で少なくとも7500ガウスであると考えられる一方で、弱い磁力は、表面で2000〜2500ガウスの範囲であると考えられる。磁石により常磁性ビーズに加えられる適当な磁力は、下記式に従い、常磁性ビーズの容積および磁場強度により左右される。
2006516197.tif 000004
ここで、Fmagは磁力と等しく、νは常磁性ビーズの容積と等しく、Ψは常磁性ビーズの磁気感受性と等しく(製造業者により与えられた値)、Bは磁場強度と等しく、および(dB/dx)は、磁界強度勾配と等しい。当業者は、右辺の因子を入手または測定し、加えられる磁力を産出することができることを理解すると思われる。
【００８５】
本発明の方法により刺激された細胞は、シグナル伝達の誘導、細胞表面マーカーの発現および／または増殖により示されたように活性化される。T細胞に適当なこのようなマーカーのひとつは、重要な免疫調節分子であるCD154である。CD154の発現は、免疫応答の増幅において、極めて有益である。CD154は、多くのB細胞、樹状細胞、単球、および一部の内皮細胞上に発現されたCD40分子と相互作用する。従って、この予想外の驚くべきCD154発現の増加は、恐らくより有効なT細胞組成物につながると思われる。本明細書に説明されたCD3+細胞の刺激は、刺激後1日目、2日目、3日目または4日目のCD154発現のような、ある種の細胞表面マーカーのレベルを1.1〜20倍増加し発現するT細胞を提供する(実施例V、表2および図4参照)。T細胞上別の細胞表面マーカーCD25の発現も、濃縮および刺激後、培養前の細胞または他の方法で刺激された細胞よりも、より大きい(表2参照)。
【００８６】
当業者は、細胞表面部分連結により刺激され得る標的細胞は、物質被覆された表面、例えばビーズと一緒にされることを理解すると思われる。更に物質被覆された表面、例えばビーズは、培養前に、培養のいずれかの時点で、または培養の終了時に細胞から分離することができる。加えて標的細胞に連結された物質被覆された表面は、培養前に非結合細胞から分離することができ、または他の細胞が、培養物中に存在し続けることもできる。ひとつの態様において、培養前に、物質被覆されたビーズおよび標的細胞は分離されないが、一緒に培養される。更なる態様において、ビーズおよび標的細胞は、力を加えることにより最初に濃縮され、細胞表面部分連結を生じ、これにより刺激および引き続きの活性化を誘導する。
【００８７】
本発明により、標的細胞、例えば一次および二次刺激分子により被覆された表面に結合したT細胞画分の濃度を増加する他の手段も企図される。磁力の印加に加え、例えば、遠心力、膜を介して発生する圧力、および水力であるが、これらに限定されるものではない、重力よりも大きい他の力が加えられてもよい。濃縮は、ろ過によっても達成される。 
【００８８】
当業者は、物質被覆されたビーズと刺激される細胞の間の接触は、他の力を使用する濃縮により増加され得ることを、容易に理解すると思われる。従って細胞表面部分結合リガンドにより細胞を濃縮する手段は、濃縮が重力または拡散を超える様式で細胞と物質を一緒にする限りは、十分であると思われる。
【００８９】
様々な態様において、この物質被覆された表面は、細胞と混合されおよび磁場において小さい容積に濃縮されたビーズのような、粒子であり、従って規定されおよび濃縮された領域に、全ての粒子および粒子に結合した細胞を引きつけることは理解されなければならない。ある態様において、標的細胞に曝露されている物質被覆された表面は、30秒から4時間以内に力により一緒に引きつけることができる。別の態様において、この時間は、1分から2時間、またはその範囲内の全ての整数である。少なくとも1種の細胞表面リガンドが付着されている表面と混合されている受容体を保有する細胞を伴う細胞集団への力の印加は、細胞受容体極性化、細胞表面分子の凝集を誘導することができる。細胞表面極性化を誘導するこの手段は、脂質ラフトを含む細胞表面分子の凝集により、細胞内のシグナル伝達を増強する。このような凝集は、シグナル経路を誘導することができ、これは細胞現象の下方制御または抑制につながり得る。あるいは、細胞表面分子の凝集は、細胞現象の上方制御または活性化につながり得る。
【００９０】
細胞現象は、例えば、アポトーシス経路を含む、特定経路を誘導または抑制するか、またはタンパク質のリン酸化を誘導するか、または成長シグナルを刺激もしくは抑制する受容体媒介したシグナル伝達を含む。ひとつの態様において、これらの細胞は、リンパ球、特にT細胞であり、並びに細胞表面リガンドは、表面、例えば、粒子に付着された抗CD3抗体であることができる。この粒子は、常磁性ビーズであってよく、その力は磁力を印加する。リンパ球および常磁性ビーズの抗CD3被覆された表面の混合物に対する磁力の適用は、外力の非存在下で生じるものに比べ、T細胞のCD3受容体のより迅速な極性化を引き起こし得る。このT細胞刺激の方法は、T細胞免疫応答経路のより迅速な活性化および細胞の増殖を促進する。
【００９１】
本発明のひとつの態様において、ビーズ:細胞比は、望ましいT細胞表現型を得るために仕立てることができる。ひとつの特定の態様において、ビーズ:細胞比は、抗原特異的(記憶)T細胞の選択的拡大または欠失のために変動することができる。ひとつの態様において、使用される特定のビーズ:細胞比は、抗原特異的T細胞を選択的に欠失する。更なる態様において、使用される特定のビーズ:細胞比は、抗原特異的T細胞を選択的に拡大する。当業者は、抗原特異的T細胞の望ましい拡大または欠失が生じる限りは、あらゆる比を使用することができることを容易に理解すると思われる。従って本明細書に説明された組成物および方法を使用し、本明細書に説明された様々な免疫療法設定を使用するために、特異的T細胞集団を拡大するか、または特異的T細胞集団を欠失することができる。 
【００９２】
別の態様において、望ましいT細胞表現型を得るために、抗CD3/抗CD28(すなわち、3x28)被覆されたビーズのような刺激物質への曝露時間は、変更されるかまたは仕立てられる。あるいは、望ましいT細胞集団は、刺激前に、かなり多数の選択技術を用いて選択され得る。CD8+細胞傷害性または調節性T細胞ではなく、ヘルパーT細胞(TH)、典型的にはCD4+のより大きい集団が望ましく、その理由は、TH細胞の拡大は、全般的免疫応答性の改善または回復ができるからである。多くの特異的免疫応答は、標的細胞を直接溶解または殺傷するCD8+抗原特異的T細胞により媒介されるが、ほとんどの免疫応答は、重要な免疫調節分子、例えばGM-CSF、CD40L、およびIL-2などを発現するCD4+ T細胞の補助を必要とする。CD4-媒介型補助が、好ましい場合には、CD4:CD8比を保存または増大する、本明細書に説明されたような方法は、重要な恩恵があると思われる。増加した数のCD4+ T細胞は、患者に導入された細胞発現したCD40Lの量を増加することができ、場合によっては、標的細胞生存力を改善する(改善されたAPC機能)る。同様の作用が、注入されたGM-CSF、またはIL-2を発現している細胞の数の増加により認められ、これらは全て優先的にCD4+ T細胞により発現される。あるいは、CD4補助が余り必要でなくかつCD8+ T細胞の増加した数が望まれるような状況において、本明細書に説明された例えば、刺激および／または培養前のCD8+細胞の予備選択による、XCELLERATEアプローチも使用することができる。このような状況は、増加したレベルのIFN-γまたは増加した標的細胞の細胞溶解が好ましい場合に存在し得る。更なる態様において、XCELLERATE(商標)プロセスは、T細胞の、関心のある特定部位、例えばリンパ節もしくは炎症部位、または骨髄などへのホーミングを促進するように修飾または仕立てることができる。加えてある態様において、本明細書に説明されたXCELLERATE(商標)アプローチは、炎症疾患、自己免疫、および外来移植片受容の場合の特異的免疫抑制のため、または調節性T細胞が望ましいようないずれか他の疾患状況のためのT調節性細胞の作成に使用することができる。古典的には、T調節性細胞は、CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+、およびFoxP3+表現型を有する
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。調節性T細胞は、本発明の方法を用い作成および拡大することができる。調節性T細胞は、抗原特異的および／またはポリクローナル性である。調節性T細胞は、例えば、Woo, et al.；Shevach, E. M.；Stephens, et al.；Salomon, et al.；および、Sakaguchi, et al.の前記に説明されたような、当技術分野において認められた技術を用い、作成することもできる。
【００９３】
異なるT細胞集団の単離を達成するために、これらの粒子に対する曝露時間は変動することができる。例えば、ひとつの好ましい態様において、T細胞は、Dynabeads M-450のような3x28ビーズと、所望のT細胞の陽性選択に十分な時間インキュベーションすることにより単離される。ひとつの態様において、この時間は約30分間である。更なる態様において、時間は、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間または6時間である。更に別の好ましい態様において、この時間は、10〜24時間またはそれよりも長い。ひとつの好ましい態様において、インキュベーション時間は24時間である。T細胞の癌患者からの単離のために、24時間のような比較的長いインキュベーション時間を使用し、細胞収量を増加することができる。
【００９４】
異なるT細胞集団の単離を達成するために、濃縮力への曝露時間は、変動するかまたはパルス化されてよい。例えば、このような力が磁石である場合、磁石または磁場強度への曝露は変動することができ、および／または拡大時間は、関心のある特異的表現型を得るために変動することができる。様々な表現型マーカーの発現は、経時的に変化し；その結果、特定の時点で、特異的T細胞集団を得るように選択され得る。従って刺激される細胞型に応じて、刺激および／または拡大時間は、10週間またはそれ以下、8週間またはそれ以下、4週間またはそれ以下、2週間またはそれ以下、10日間またはそれ以下、もしくは8日間またはそれ以下(4週間またはそれ以下は、4週間から1日(24時間)までの全ての時間範囲またはこれらの数値の間のいずれかの値を含む)。一部の態様において、例えば、限定希釈または細胞ソーティングを使用する、T細胞のクローニングが望ましいことがあり、この場合比較的長い刺激時間が必要である。一部の態様において、刺激および拡大は、6日間またはそれ以下、4日間またはそれ以下、2日間またはそれ以下、または別の態様において、24時間またはそれ以下と短期で、および好ましくは4-6時間またはそれ以下(これらの範囲は、その間のいずれかの整数値を含む)で実行することができる。T細胞の刺激が比較的短い期間実行される場合、T細胞集団は、数は劇的には増加しないが、この集団は、インビボにおいて増殖を継続することができるより強固かつ健常な活性化されたT細胞および天然型のエフェクターT細胞プールにより密に似ているT細胞を提供すると思われる。T細胞補助の適用可能性は、タンパク質抗原に対する抗体反応における制限因子であることが多いので、CD4+リッチなT細胞集団を選択的に拡大または対象へ選択的に注入する能力は、極めて有用である。このような濃縮された集団の更なる恩恵は、Bリンパ球により提示された抗原を認識する活性化されたヘルパーT細胞は、物理的接触およびサイトカイン産生の2種類の刺激を送達し、これらはB細胞の増殖および分化を生じる点で、容易に明らかであると思われる。
【００９５】
変動する刺激時間曝露されたT細胞は、異なる特性を示すことができる。例えば、典型的血液またはアフェレーシスした末梢血単核細胞生成物は、細胞傷害性または抑制性T細胞集団(Tc, CD8+)よりもより多くのヘルパーT細胞集団(TH, CD4+)を生じる。CD3およびCD28受容体を刺激することによるT細胞のエキソビボ拡大は、約8〜9日目に主にTH細胞からなるT細胞集団を生じ、約8〜9日目以降、これらのT細胞集団は、漸増するTC細胞集団を含む。従って、治療目的に応じて、対象を主にTH細胞で構成されるT細胞集団で注入することは、有利であることができる。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離される場合、このサブセットをより大きく拡大することは有益である。
【００９６】
更に、CD4およびCD8マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞拡大プロセス時に著しく変動するが、大部分は再現性があるように変動する。従ってこのような再現性は、具体的な目的のために活性化されたT細胞生成物を仕立てる能力を可能にする。
【００９７】
ひとつのこのような例において、経時的に再現性をもって変動する重要な表現型マーカーは中でも高親和性IL-2受容体(CD25)、CD40リガンド(CD154)、およびCD45RO(TCRと優先的に会合する分子は、抗原結合に対するTCRの感度を増加することができる)である。当業者は容易に理解するように、このような分子は、様々な理由で重要である。例えば、CD25は、迅速なT細胞分化を可能にするオートクリンループの重要な部分を構成する。CD154は、抗原提示樹状細胞の成熟の刺激；抗体産生のためのB細胞の活性化；TH細胞増殖の調節；TC細胞分化の増強；TH細胞および抗原提示細胞の両方におけるサイトカイン分泌の調節；並びに、CD80、CD86、およびCD154を含む共刺激リガンドの発現の刺激において重要な役割を果たすことが示されている。
【００９８】
サイトカイン産生は、エキソビボ拡大プロセスの最初の数日間にピークとなる。従ってサイトカインは、T細胞の活性化および機能に加え免疫応答調節を媒介することにおいて重要であることは分かっているので、そのようなサイトカインは、治療用T細胞製品の開発において恐らく重要であり、これは追加の抗原負荷物（antigen challenge）との接触時に再活性化を受けることができる。これに関して重要なサイトカインは、IL-2、IL-4、TNF-α、およびIFN-γを含むが、これらに限定されるものではない。従ってこれらの細胞の拡大および対象への注入の最初の数日間にT細胞集団を得ることにより、追加のT細胞の活性化および拡大がインビボで生じる治療的恩恵が生じ得る。
【００９９】
先に考察したサイトカインおよびマーカーに加え、T細胞活性化および免疫応答調節の媒介に重要であることがわかっている接着分子の発現は、エキソビボ拡大プロセスの過程にわたり、劇的に変化するが、再現性はない。例えば、CD62Lは、T細胞のリンパ組織へのホーミングおよびT細胞の炎症部位への移動(traffic)に重要である。疾患および損傷のある状況下で、これらの部位の活性化されたT細胞の存在は不利益である。CD62Lの下方制御は、活性化に続けて早期に生じるので、これらのT細胞は、より短い期間に拡大され得る。対照的により長い期間の培養は、比較的高いレベルのCD62Lを伴い、その結果他の好ましい条件下で活性化されたT細胞をこれらの部位に標的化するより高い能力を有するT細胞集団を作成すると考えられる。発現が経時的に変動するポリペプチドの別の例は、CD49dであり、これはリンパ球の血液から炎症部位の組織間隙への移動に関連した接着分子である。CD49dリガンドのCD49dへの結合も、VCAM-1またはフィブロネクチンリガンドによる結合を介した活性化および増殖のための共刺激シグナルをT細胞が受け取ることを可能にする。T細胞-APCおよびT細胞-T細胞相互作用に加え炎症部位へのホーミングに関連した接着分子CD54の発現も、拡大の過程にわたり変更する。従ってT細胞は、関心のあるマーカープロファイルと同時に選択された期間刺激され、並びに引き続き収集および注入される。従ってT細胞集団は、治療される適応に関して最も治療的恩恵を提供すると考えられるマーカーを発現するように仕立てることができる。
【０１００】
様々な態様において、当業者は、これらの細胞からの刺激シグナルの除去は、使用される表面型に左右される理解する。例えば常磁性ビーズが使用される場合、その結果磁気分離が実行可能な選択肢である。分離技術は、常磁性ビーズの製造業者(例えば、DYNAL Inc.、オスロ、ノルウェイ)の使用説明書に詳細に説明されている。更にその表面が細胞から分離されるのに十分に大きいビーズである場合は、ろ過を使用することができる。加えて様々な輸液用フィルターが市販されており、これは20μm〜80μmの輸液用フィルター(Baxter)を含む。従ってビーズがフィルターのメッシュサイズよりも大きい場合、このようなろ過は非常に効率的である。関連した態様において、これらのビーズは、フィルターを通過するが、細胞は残留し、従って分離が可能になる。ひとつの具体的態様において、使用される生体適合性表面は、曝露期間中に培養物中で分解する(すなわち生分解性)。
【０１０１】
当業者は、本明細書に説明された細胞刺激法は、様々な環境(すなわち、容器)において実行することができることを容易に理解すると思われる。例えば、このような容器は、培養フラスコ、培養バッグ、または好ましくは無菌環境で、細胞を保持することが可能である容器のいずれかであってよい。ひとつの本発明の態様において、バイオリアクターも有用である。例えば、いくつかの製造業者は、現在細胞の成長に使用することができ、および本発明の方法と組合せて使用される装置を製造している。例えば、Celdyne Corp.、ヒューストン、TX；Unisyn Technologies、ホプキントン、MA；Synthecon, Inc.、ヒューストン、TX；Aastrom Biosciences, Inc.、アンナーバー、MI；Wave Biotech LLC、ベッドミンスター、NJ。更にこのようなバイオリアクターを対象とする特許は、米国特許第6,096,532号；同第5,985,653号；同第5,888,807号；同第5,190,878号があり、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【０１０２】
ひとつの態様において、本発明の細胞の同時刺激および濃縮に使用される磁石は、「The Wave」(Wave Biotech LLC、ベッドミンスター、NJ)のような、バイオリアクター装置の揺動基部プラットフォームに組み込むことができる。磁石または磁化できる構成要素も、円筒形アプリケーションユニットのような、標準のバイオリアクター容器に入れることができる。このビルトイン型磁化構成要素は、細胞培養手法の様々な時点で望ましいように、オン・オフスイッチされることが可能である。この一体化された磁石、または磁化できる構成要素は、培養容器を通過するために、それらから磁場が生じるように配置される。ある種の態様において、磁石または磁化できる構成要素は、壁に組込まれるか、あるいは培養容器の本体内にある。更なる態様において、これらの細胞は、磁気により濃縮および／または活性化さ、培養時の望ましい時点で、磁力により分離または単離され、細胞を異なる培養または磁石分離ユニットに移すことは不要である。このようなビルトイン型磁気構成要素の使用は、細胞または遺伝子を用いる療法における患者への免疫療法的注入についての特異的機能的細胞集団の拡大および仕立てることが可能であるように、培養、刺激および濃縮、並びに分離プロセスを促進することができる。更にこの装置は、細胞内およびそれらの細胞外への分泌の両方における分子の特異的生成のための改善された手段を提供する。 
【０１０３】
前記のような一体化された磁気または磁化できる装置を使用し、培養物から磁石粒子を除去するか、それらを培養容器中に残すか、さもなければ培養培地中に存在する望ましい細胞および／または望ましい分子が除去される。あるいは、細胞および／または望ましい分子は、所望の細胞および／または分子に結合する本明細書に説明されたような特異的分子で被覆された磁気粒子と相互作用することにより、培養バッグ、または他の適当な培養容器中に特異的に維持される。ビルトイン型磁石または磁化できる装置は、特異的粒子を伴う細胞の磁気による固定/濃縮、並びにバッグを通る培地および／または他の溶液流れにより、細胞集団の洗浄および細胞培養バッグ中の培地の交換が可能である。この装置は、完全に一体化されたシステムを提供し、これにより工程所要時間およびチューブ状のコネクターの手作業による操作を減少し、プロセシングに使用される容器の数を減少し、並びに必要なチューブおよび容器の連結の数による夾雑の可能性を減少することにより、個別の磁気分離装置の必要性を効果的に排除する。この一体化された磁気または磁化できる装置培養システムも、培養のプロセシングおよび配合に必要な容量を低下する。
【０１０４】
前記のように、本発明のひとつの局面は、細胞の濃縮を誘導する力、細胞表面部分の連結、および揺動している閉鎖システムにおける細胞の培養の組合せは、これらの細胞の活性化および拡大の甚大な増強を生じるという驚くべき知見に関する。従ってひとつの態様において、例えば「The Wave」(Wave Biotech LLC、ベッドミンスター、NJ)のような、揺動速度の変動および様々な揺動角度を可能にする、揺動基部プラットフォームを備えるバイオリアクターが使用される。当業者は、細胞の最適な拡大について適当な運動を可能にするあらゆるプラットフォームは、本発明に関連していることを認識すると考えられる。ある態様において、本発明の刺激および拡大の方法は、1分間に1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回または20回の揺動で、培養プロセス時の培養容器の揺動を提供する。
【０１０５】
ある態様において、バイオリアクター容器の容量は、培地約0.1Lから約200Lの範囲である。当業者は、培養に使用される容量は、出発細胞の数および望ましい細胞の最終数に応じて変動することを容易に認めると思われる。特定の態様において、T細胞のような本発明の細胞は、約0.2x106個細胞/ml〜約5x106個細胞/ml、およびそれらの間のいずれかの濃度で播種される。ひとつの具体的態様において、これらの細胞は、最初に静的環境において培養され、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間またはそれよりも長い日数培養した後、揺動プラットフォーム上のバイオリアクターに移すことができる。関連のある態様において、刺激、活性化および拡大の全プロセスは、前記のように、揺動プラットフォームおよび一体型の磁石を備えるバイオリアクターにおいて行われる。例証的バイオリアクターは、「The Wave」を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
ひとつの特定の態様において、本発明の細胞刺激法は、約0.1ml/分〜約3ml/分のような、変動する速度で培地の灌流を可能にするバイオリアクターのような、閉鎖システムにおいて実行される。従ってある態様において、このような閉鎖システムの容器は、閉鎖システムからの無菌移動のための出口フィルター、入口フィルター、および試料採取ポートを含む。別の態様において、このような閉鎖システムの容器は、閉鎖システムへのおよびそこからの無菌移動のための、シリンジポンプおよび制御を備える。更なる態様は、バイオリアクター容器の質量を連続してモニタリングすることにより、培地のインプットおよびアウトプットを制御する、負荷細胞のような機構を提供する。ひとつの態様において、このシステムは、気体マニホルドを備える。別の態様において、本発明のバイオリアクターは、バイオリアクター容器に周囲大気およびC02の混合物を供給しおよび容器を陽圧に維持するC02ガス混合ラックを備える。別の態様において、本発明のバイオリアクターは、可変の加熱構成要素を備える。
【０１０７】
ひとつの態様において、培地は、望ましい最終容量が達成されるまで、1日に約0.5〜5.0Lで、2日、3日、4日、5日または6日の開始時に容器に入れることができる。ひとつの好ましい態様において、培地は、容量が10Lに到達するまで、4日目の開始時に、容器に2L/日で入れる。一旦望ましい容量が達成された場合には、培地の灌流を開始することができる。ある態様において、このシステムを通る培地の灌流は、培養の約2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目または12日目に開始される。ひとつの態様において、培地の容量が約0.1L〜約200Lである時点で、灌流が開始される。ひとつの具体的な態様において、最終容量が4L、5L、6L、7L、8L、9L、10Lまたは20Lである時点で、灌流が開始される。
【０１０８】
本発明の更なる態様において、T細胞などの細胞は、閉鎖した静的システムにおいて最大5日間培養され、その後変動する速度で培養容器の揺動を可能にする揺動構成要素を備える閉鎖システムに移される。
【０１０９】
ある局面において、本発明の方法は、約2週間未満の約6x106細胞/mlから約90x106個細胞/mlまでの間の濃度への、T細胞のような細胞の拡大を提供する。特に本明細書の方法は、濃度約10x106個細胞/ml、15x106個細胞/ml、20x106個細胞/ml、25x106個細胞/ml、30x106個細胞/ml、35x106個細胞/ml、40x106個細胞/ml、45x106個細胞/ml、50x106個細胞/ml、55x106個細胞/ml、60x106個細胞/ml、65x106個細胞/ml、70x106個細胞/ml、75x106個細胞/ml、80x106個細胞/ml、または85x106個細胞/mlおよびその中の全ての濃度までのT細胞の拡大を提供する。ある態様において、これらの細胞は、培養の約5日目、6日目、7日目、8日目、9日目、10日目、11日目または12日目までに、前記のような望ましい濃度に到達する。ひとつの態様において、T細胞は、培養の約4日目〜約12日目までに、約24時間以内に少なくとも約1.5倍拡大する。ひとつの態様において、T細胞のような細胞は、約2週間未満に細胞の出発数約100x106細胞から合計約500x109細胞まで拡大する。更なる態様において、T細胞は、約2週間以内に、細胞の出発数約500x106細胞から合計約500x109細胞まで拡大する。関連する態様において、細胞は、出発数約100〜500x106細胞から合計約200x109細胞、300x109細胞または400x109細胞まで、約2週間以内に拡大する。
【０１１０】
本発明の更なる態様において、本明細書に説明された細胞の活性化および拡大の方法およびこれらの方法を用いて作成される馴化培地は、エキソソームの生成に使用することができる。細胞において、小胞は、その区画の管腔へのエンドソーム膜の出芽により形成することができ；このプロセスは、多胞体(MVB)の形成を生じる。MVBの形質膜との融合は、小さい内部小胞の分泌を生じ、これはエキソソームと称される。馴化培地は、他のT細胞の培養および他の種類の細胞の培養のために使用することができる。 
【０１１１】
本明細書において説明された方法において使用される抗体は、ATCCなどの公の供給源から容易に得ることができるが、T細胞アクセサリー分子およびCD3複合体に対する抗体は、標準技術により産生される。本発明の方法において使用するための抗体産生法は、当技術分野において周知であり、かつ本明細書においてより詳細に考察される。
【０１１２】
表面上のリガンド固定
前記のように、本発明の方法は、好ましくは表面に結合したリガンドを使用する。この表面は、それらに結合したまたはそれらと一体化されたリガンドを有することが可能であるいずれかの表面であり、すなわち刺激される標的細胞にとって実質的に無毒である。生体適合性表面は、生分解性であるかまたはそうではなくてよい。この表面は、天然または合成であってよく、合成の表面はポリマーであってよい。この表面は、コラーゲン、精製タンパク質、精製ペプチド、多糖、グリコサミドグリカン、または細胞外マトリックス組成物を含んでよい。多糖は、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、またはアルギン酸を含む。他のポリマーは、ポリエステル、ポリエーテル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリビニルアセテート、ブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、またはポリウレタンを含む。このポリマーは、乳酸またはコポリマーを含んでもよい。コポリマーは、乳酸およびグリコール酸(PLGA)を含むことができる。非生分解性の表面は、ポリ(ジメチルシロキサン)およびポリ(エチレン-酢酸ビニル)などのポリマーを含むことができる。生分解性表面は、例えばガラス(例えばバイオガラス)、コラーゲン、金属、ヒドロキシアパタイト、アルミン酸塩、バイオセラミック材料、ヒアルロン酸ポリマー、アルギン酸、アクリル酸エステルポリマー、乳酸ポリマー、グリコール酸ポリマー、乳酸/グリコール酸ポリマー、精製タンパク質、精製ペプチド、または細胞外マトリックス組成物を含むことができる。表面を含む他のポリマーは、ガラス、シリカ、ケイ素、ヒドロキシアパタイト、ヒドロゲル、コラーゲン、アクロレイン、ポリアクリルアミド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、またはかなり多数のプラスチックもしくは合成有機ポリマーなどである。この表面は、リポソームまたは細胞などの、生物学的構造を含むことができる。この表面は、脂質、プレート、バッグ、ペレット、ファイバー、メッシュ、または粒子の形であってよい。粒子は、コロイド状粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、ビーズなどを含む。様々な態様において、ビーズまたは他の粒子のような市販の表面が有用である(例えば、Miltenyi Particles、Miltenyi Biotec、独国；Sepharose beads, Pharmacia Fine Chemicals, Sweden；DYNABEADS(商標)、Dynal Inc., New York；PURABEADS(商標), Prometic Biosciences)。
【０１１３】
ビーズが使用される場合、このビーズは、標的細胞刺激を達成するサイズであってよい。ひとつの態様において、ビーズは、好ましくは約5nm〜約500μmのサイズである。従ってビーズサイズの選択は、ビーズが使用される特定の使用に左右される。例えば、ビーズが単球枯渇に使用される場合は、単球摂取(ingestion)を促進するために小さいサイズが選択される(例えば、ナノメーターサイズのような、直径または貪食されるいずれかのサイズで、2.8μm〜4.5μm)；しかし、ろ過によるビーズの分離が望ましい場合、50μmを超えないビーズサイズが典型的には使用される。更に、常磁性ビーズを使用する場合、これらのビーズは典型的には、約2.8μm〜約500μmの範囲のサイズ、およびより好ましくは約2.8μm〜約50μmである。最後に約10-5nmと小さいスーパー常磁性ナノ粒子の使用を選択することができる。従って、前記の考察から容易に理解されるように、事実上あらゆる粒子サイズを使用することができる。
【０１１４】
この物質は、様々な当技術分野において公知または使用可能な方法により、表面へ付着もしくは結合、または一体化することができる。この物質は、天然型のリガンド、タンパク質リガンド、または合成リガンドであることができる。この付着は、共有的または非共有的、静電気的、もしくは疎水性であり、または例えば、化学的、機械的、酵素的、静電気的またはリガンドが細胞を刺激することが可能であるような他の手段を含む、様々な付着手段により実現され得る。例えばリガンドに対する抗体は、最初に表面に付着されるか、またはアビジンもしくはストレプトアビジンは、生合成されたリガンドへの結合のための表面に付着することができる。リガンドに対する抗体は、抗イディオタイプ抗体により表面に付着される。別の例は、プロテインAもしくはタンパク質Gまたは他の非特異的抗体結合分子は、表面に付着し、抗体に結合する。あるいはリガンドは、表面に、市販の架橋剤(Pierce, Rockford, IL)または他の手段を使用する表面への架橋などの化学的手段により付着され得る。ある態様において、これらのリガンドは、表面に共有結合されている。更にひとつの態様において、市販のトシル活性化されたDYNABEADS(商標)またはエポキシ表面反応基を伴うDYNABEADS(商標)は、製造業者の指示に従い、関心のあるポリペプチドリガンドと共にインキュベーションされる。簡単に述べると、このような条件は、典型的にはpH4〜pH9.5のリン酸緩衝液中、温度範囲4〜37℃でインキュベーションされる。
【０１１５】
ひとつの局面において、ある種のリガンドのような物質は、単独の起源または複数の起源であることができ、および抗体またはそれらの断片であることができるが、別の局面において、T細胞を使用する場合、この共刺激リガンドはB7分子(例えば、B7-1、B7-2)である。これらのリガンドは、前記の様々な付着手段のいずれかにより、表面に結合される。この表面に結合されるB7分子は、共刺激分子を発現している細胞から単離されるか、または本明細書に説明された共刺激分子の生成および単離を可能にする標準の組換えDNA技術および発現システムを用いて得られる。細胞表面に結合した場合に、T細胞における共刺激シグナルの引き金を引く能力を保持するB7分子の断片、変異体、または変種も使用することができる。更に当業者は、T細胞サブセットの活性化および増殖の誘導において有用であるリガンドは、ビーズまたは培養容器表面もしくはいずれかの表面上に固定され得ることを認めると思われる。加えて、リガンドの表面への共有結合は、ひとつの好ましい方法であるが、二次モノクローナル抗体による吸着または捕獲も使用することができる。表面に付着した特定のリガンドの量は、表面がビーズのそれである場合は、フローサイトメトリー分析により容易に決定することができ、または表面が例えば組織培養皿、メッシュ、ファイバー、バッグなどである場合は、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)により決定することができる。
【０１１６】
特定の態様において、B7分子または抗CD28抗体またはそれらの断片の刺激因子型は、抗CD3抗体などの、TCR/CD3複合体を刺激する物質として、同じ固相表面に付着される。追加の態様において、4-1BB分子または抗4-1BB抗体またはそれらの断片の刺激因子型は、抗CD3抗体などの、TCR/CD3複合体を刺激する物質として、同じ固相表面に付着される。抗CD3抗体に加え、抗原シグナルを模倣する受容体に結合する他の抗体を使用してもよい。例えば、これらのビーズまたは他の表面は、抗CD2抗体およびB7分子の組合せ、並びに特に抗CD3抗体および抗CD28抗体の組合せで被覆することができる。更なる態様において、これらの表面は、3種またはそれよりも多い物質、例えば本明細書において説明された物質、例えば抗CD3抗体、抗CD28抗体、および抗4-1BB抗体などのいずれかの組合せにより被覆され得る。
【０１１７】
表面に結合された場合、これらの物質は、同じ表面(すなわち「シス」型)または別の表面(すなわち「トランス」型)に結合することができる。あるいは、一方の物質は、表面に結合することができ、および他方の物質は溶液中に存在することができる。ひとつの態様において、共刺激シグナルを提供する物質は、細胞表面に結合され、および一次活性化シグナルを提供する物質は、溶液中に存在するかまたは表面に結合される。好ましい態様において、2種の物質は、同じビーズ、すなわち「シス」または別のビーズ、すなわち「トランス」のいずれかでビーズ上に固定される。例として、一次活性化シグナルを提供する物質は、抗CD3抗体であり、および共刺激シグナルを提供する物質は、抗CD28抗体であり；並びに、両方の物質は、等モル量で同じビーズへ共固定される。ひとつの態様において、CD4+ T細胞拡大およびT細胞成長のためのビーズに結合した各抗体の比1:1が使用される。本発明のある局面において、1:1の比を使用し観察される拡大に比べて、T細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合した抗CD3:CD28抗体の比が使用される。ひとつの特定の態様において、1:1の比を使用し観察される拡大と比べて、約0.5〜約3倍の増加が観察される。ひとつの態様において、ビーズに結合したCD3:CD28抗体の比は、100:1〜1:100の範囲およびその間の全ての整数値である。本発明のひとつの局面において、抗CD3抗体よりもより多くの抗CD28抗体が、これらの粒子に結合され、すなわちCD3:CD28の比は1未満である。本発明のある態様において、ビーズに結合した抗CD28抗体の抗CD3抗体に対する比は、2:1よりも大きい。ひとつの特定の態様において、1:100のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。別の態様において、1:75のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。更なる態様において、1:50のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。別の態様において、1:30のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。ひとつの好ましい態様において、1:10のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。別の態様において、1:3のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。更に別の態様において、3:1のビーズに結合したCD3:CD28抗体の比が使用される。
【０１１８】
本発明のある局面において、3種またはそれよりも多い物質が、表面に結合される。ある態様において、これらの物質は、同じ表面に結合される(すなわち「シス」型)か、または別の表面に結合される(すなわち「トランス」型)。あるいは、1種または複数の物質は、表面に結合され、他の1種または複数の物質は溶液中に存在することができる。
【０１１９】
物質
本発明により企図された物質は、タンパク質リガンド、天然型のリガンド、および合成のリガンドを含む。細胞表面部分に結合することができ、かつある条件下でシグナル伝達につながる連結および凝集を引き起こす物質は、レクチン(例えば、PHA、レンチルレクチン(lentil lectins)、コンカナバリンA)、抗体、抗体断片、ペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、受容体、B細胞受容体およびT細胞受容体リガンド、細胞外マトリックス成分、ステロイド、ホルモン(例えば、成長ホルモン、コルチコステロイド、プロスタグランジン、テトライオドサイロニン)、細菌部分(例えばリポ多糖)、マイトジェン、抗原、スーパー抗原およびそれらの誘導体、増殖因子、サイトカイン、ウイルスタンパク質(例えば、HIV gp-120)、接着分子(例えば、L-セレクチン、LFA-3、CD54、LFA-1)、ケモカイン、および小型分子を含むが、これらに限定されるものではない。これらの物質は、細胞、血液製剤、および組織などの天然型の供給源から単離されるか、またはインビトロにおいて増大された細胞から、もしくは組換え的に調製された細胞から、または当業者に公知の他の方法により単離される。
【０１２０】
本発明のひとつの局面において、T細胞を刺激することが望ましい場合、有用な物質は、CD3/TCR複合体、CD2、および／またはCD28に結合し、および各々活性化または増殖を開始することが可能であるリガンドを含む。従ってリガンドという用語は、細胞表面タンパク質について「天然型の」リガンドであるタンパク質、例えばCD28のB7分子、更には細胞表面タンパク質に対する抗体のような人工のリガンドを含む。このような抗体およびそれらの断片は、ハイブリドーマ法並びに組換えDNAおよびタンパク質発現技術などの従来の技術に従い作成され得る。有用な抗体および断片は、ヒトを含むいずれかの種に由来するか、またはこれは1種よりも多い種由来の配列を使用するキメラタンパク質として形成され得る。
【０１２１】
当技術分野において周知の方法を用い、リガンドに特異的である抗体、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体を作成することができる。抗体は、所望の特性を有するようにデザインされた遺伝子操作された免疫グロブリン(Ig)またはIg断片としても作成され得る。例えば、例ではあるが限定ではない抗体は、第一の哺乳類種由来の少なくとも1種の可変(V)領域ドメイン並びに第二の別の哺乳類種由来の少なくとも1種の定常領域ドメインを有するキメラ融合タンパク質である組換えIgGを含んでよい。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス可変領域配列およびヒト定常領域配列を有する。このようなマウス/ヒトキメラ免疫グロブリンは、相補性決定領域(CDR)の移植により「ヒト化され」、これはヒト由来のV領域のフレームワーク領域へのマウス抗体およびヒト由来の定常領域に由来した、抗原に関する結合特異性を付与する。これらの分子の断片は、タンパク質分解性消化により、または任意にタンパク質分解性消化、それに続くジスルフィド結合の穏やかな還元およびアルキル化により、または組換え遺伝子操作技術により作成され得る。
【０１２２】
抗体は、リガンドに特異的に結合する場合には、親和性定数Kaが、約104 M-1よりも大きいまたは等しい、好ましくは約105 M-1よりも大きいまたは等しい、より好ましくは約106 M-1よりも大きいまたは等しい、並びに更により好ましくは約107 M-1よりも大きいまたは等しい、「免疫特異性」であると定義される。結合のパートナーまたは抗体の親和性は、例えば、Scatchardらの論文に説明されたもの(Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660,1949)または表面プラスモン共鳴(BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ)例えばWolff et al., Cancer Res., 53:2560-2565,1993参照)などの従来の技術を用い、容易に決定することができる。
【０１２３】
抗体は、一般に当業者に公知の様々な技術のいずれかにより調製され得る(例えば、Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory参照)。このような技術のひとつにおいて、動物は、抗原としてのリガンドにより免疫処置され、ポリクローナル抗血清を生成する。適当な動物は、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、畜牛であり、並びにマウス、ラットおよびハムスターなどの比較的小さい哺乳類種を含んでもよい。
【０１２４】
免疫原は、リガンド、精製されたまたは部分的に精製されたリガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片、またはリガンドペプチドを発現する細胞で構成される。リガンドペプチドは、タンパク質分解性切断により生成するか、または化学合成することができる。宿主動物において抗原反応を作成する可能性の高いアミノ酸を決定するために、当業者に公知の方法によりリガンドの一次、二次または三次構造を分析することにより、免疫処置用のペプチドを選択することができる(例えば、Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207,1991；Berzoksky, Science 229:932-40,1985参照)。
【０１２５】
免疫原の調製は、リガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片、または別の免疫原性タンパク質、例えばキーホールリムペットヘモシアニンもしくはウシ血清アルブミンに対するペプチドとの共有結合を含む。加えて、ペプチド、ポリペプチド、または細胞は、アジュバント中に乳化することができる(Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory参照)。一般に初回注射後、動物は、動物種に関する好ましいスケジュールに従い、1回または複数回のブースター免疫処置を受ける。免疫応答は、動物の定期的採血、血清分離、およびOuchterlonyアッセイ法のようなイムノアッセイ法における血清の分析によりモニタリングし、特異的抗体力価を評価することができる。一旦抗体力価が確立された場合には、動物は、定期的に採血され、ポリクローナル抗血清が蓄積される。その後リガンドポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体は、このような抗血清から、例えばプロテインAを使用するまたは適当な固相支持体に結合したリガンドポリペプチドもしくはペプチドを使用する、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製することができる。
【０１２６】
リガンドポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変種に特異的に結合するモノクローナル抗体を、例えば、KohlerおよびMilsteinの技術(Nature, 256:495-497,1975；Eur. J. Immunol. 6:511-519,1976)およびそれらの改良を用い、調製することができる。リガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片に対する所望の特異性を有する抗体を産生する、不死化された真核細胞株であるハイブリドーマを作成することができる。動物-例えば、ラット、ハムスター、または好ましくはマウスは、前記の調製されたリガンド免疫原により免疫処置される。免疫処置した動物から得られたリンパ球系細胞、最も一般的には脾臓細胞は、薬物感受性骨髄細胞融合パートナー、好ましくは免疫処置した動物と同系のものとの融合により、不死化することができる。脾臓細胞および骨髄細胞は、膜融合促進物質、例えばポリエチレングリコールまたは非イオン系界面活性剤などと、数分間一緒にし、その後ハイブリドーマ細胞の成長を支持するが、骨髄細胞の成長は支持しない選択培地上に低密度で配置することができる。好ましい選択培地は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)である。通常約1〜2週間の十分な時間の経過後、細胞コロニーが得られる。1個のコロニーを単離し、これらの細胞により産生された抗体を、リガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片に対する結合活性について試験することができる。リガンド抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマが好ましい。リガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが、本発明により企図される。
【０１２７】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物の上清から単離され得る。マウスモノクローナル抗体を産生する代替法は、このハイブリドーマ細胞を同系マウスの腹腔に注射する。このマウスは、モノクローナル抗体を含有する腹水を産生する。夾雑物は、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈殿または抽出などの、従来の技術により抗体から除去される。
【０１２８】
ヒトモノクローナル抗体は、かなり多数の技術により作成され得る。方法は、ヒト末梢血細胞のエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)形質転換(米国特許第4,464,456号)、ヒトB細胞のインビトロ免疫処置(例えば、Boerner et al., J Immunol. 147:86-95,1991参照)、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持する免疫処置されたトランスジェニックマウスからの脾臓細胞の融合、および酵母人工染色体(YAC)に挿入された免疫グロブリン遺伝子を保持する免疫処置されたトランスジェニックマウスからの脾臓細胞の融合(例えば、米国特許第5,877,397号；Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58,1997；Jakobovits et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35,1995参照)、またはヒト免疫グロブリンV領域ファージライブラリーからの単離を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
本発明において使用するために、キメラ抗体およびヒト化抗体を作成することができる。キメラ抗体は、第一の哺乳類種由来の少なくとも1種の定常領域ドメインおよび第二の別の哺乳類種由来の少なくとも1種の可変領域ドメインを有する(例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55,1984参照)。最も一般的には、キメラ抗体は、マウス、ラット、またはハムスターモノクローナル抗体由来の可変領域のような、非ヒトモノクローナル抗体由来の少なくとも1種の可変領域ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列を、少なくとも1種のヒト定常領域をコードしている配列を含むベクターへクローニングすることにより構築され得る(例えば、Shin et al., Methods Enzymol. 178:459-76,1989；Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29,1993参照)。選択されたヒト定常領域は、特定の抗体に望ましいエフェクター機能によって決まる。キメラ抗体を作出する当技術分野において公知の別法は、相同組換えである(米国特許第5,482,856号)。好ましくは、これらのベクターは、キメラ抗体の安定した発現のために真核細胞にトランスフェクションされると考えられる。
【０１３０】
非ヒト/ヒトキメラ抗体は更に、遺伝子操作し、「ヒト化」抗体を作成することができる。このような抗体は、非ヒト哺乳類種の免疫グロブリン、少なくとも1種のヒト可変フレームワーク領域、および少なくとも1種のヒト免疫グロブリン定常領域に由来する複数のCDRを有する。ヒト化は、非ヒトモノクローナル抗体またはキメラ抗体と比較した場合に、減少した結合親和性を有する抗体を生じることができる。従って当業者は、1種または複数の戦略を使用し、ヒト化抗体をデザインする。
【０１３１】
ある態様において、抗体の抗原結合断片の使用が好ましいことがある。このような断片は、Fab断片またはF(ab')2断片を含み、これらは各々、パパインまたはペプシンによりタンパク質分解性に消化され得る。抗原結合断片は、Fc断片から、例えば、固定されたプロテインAまたは固定されたリガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片を使用する、アフィニティークロマトグラフィーにより分離され得る。Fab断片を作成する代替法は、F(ab')2断片の穏やかな還元、その後のアルキル化である(例えば、Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston参照)。
【０１３２】
前記のIg分子のいずれかの非ヒト、ヒト、またはヒト化重鎖および軽鎖可変領域は、単鎖Fv(sFv)断片(単鎖抗体)として構築され得る。例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883,1988参照のこと。多機能融合タンパク質は、sFvをインフレームでコードしているポリヌクレオチド配列の、様々なエフェクタータンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列との連結により作成することができる。これらの方法は当技術分野において公知であり、例えば、EP-B1-0318554、米国特許第5,132,405号、米国特許第5,091,513号、および米国特許第5,476,786号に開示されている。
【０１３３】
リガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片に特異的に結合する抗体を選択する追加の方法は、ファージディスプレーによる(例えば、Winter et al., Annul. Rev. Immunol. 12:433-55,1994；Burton et al., Adv. Immunol. 57:191-280,1994参照)。ヒトまたはマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子のコンビナトリアルライブラリーは、リガンドポリペプチドまたはそれらの変種もしくは断片に特異的に結合するIg断片(Fab、Fv、sFv、またはそれらの多量体)を選択するためにスクリーニングすることができるファージベクターにおいて作成することができる
2006516197.tif 000006
。
【０１３４】
細胞集団
前記のように、本発明は、連結が望ましいものである細胞表面部分を有するあらゆる細胞型に対する広範な適用可能性を有する。これに関して、多くの細胞シグナル伝達現象を、本発明の方法により増強することができる。このような方法は、患者に注入するための細胞を活性化および刺激するために、エキソビボ設定において治療的に使用することができるか、または標的細胞集団上で細胞のシグナル伝達現象を誘導するために、インビボにおいて使用することができる。しかし、同じく先に記したように、本明細書に提供された基本的例は、T細胞に対するものであるが、これらに限定されない。
【０１３５】
T細胞に関して、本明細書に説明された様々な拡大法から生じるT細胞集団は、使用される条件に応じて、様々な特異的表現型特性を有する。このような表現型の特性は、CD25、CD154、IFN-γおよびGM-CSFの増強された発現に加え、CD137、CD134、CD62L、およびCD49dの変更された発現を含む。これらの部分の発現を示差的に制御する能力は、非常に重要である。例えば、抗原提示細胞(例えば樹状細胞、単球、および更には白血病B細胞またはリンパ腫など)上に発現されたCD40分子との接触を通して「仕立てられたT細胞」上のCD154のより高いレベルの表面発現は、抗原提示および免疫機能を増強すると考えられる。このような戦略は、CD40を抗体または組換えCD40Lを介して連結するために、様々な会社により、現在使用されている。本明細書に説明されたアプローチは、この同じシグナルがより生理的様式で、例えば、T細胞により送達されることを可能にする。T細胞活性化(XCELLERATE)プロセスを仕立てることによるIFN-γ分泌を増加する能力は、抗腫瘍反応および抗ウイルス反応に重要である、TH1型免疫応答の作成の促進を補助する。CD154のように、GM-CSFの増加した発現は、特にAPC前駆体の樹状細胞のようなより機能的なコンピテントAPCへの成熟を促進するその作用により、APC機能の増強を助けることができる。CD137およびCD134の発現の変更は、アポトーシスシグナルに対し抵抗するかまたは影響を受けやすいT細胞の能力に作用することができる。CD62Lおよび／またはCD49dのような、接着受容体/ホーミング受容体の発現の制御は、注入されたT細胞の、リンパ器官、感染部位または腫瘍部位へホーミングする能力を決定することができる。
【０１３６】
本発明の追加の局面は、拡大前にCD8+またはCD4+細胞を枯渇しているT細胞集団または組成物を提供する。ひとつの態様において、CD8+細胞は、CD8+マーカーに対する抗体により枯渇される。当業者は、CD8+またはCD4+細胞の試料を枯渇するかまたは逆にCD4+またはCD8+細胞含量を濃縮する様々な特定の方法を容易に同定することができると思われる。CD4+細胞の濃縮に関して、本発明のひとつの局面は、T細胞集団の刺激時の極めて強固なCD154発現プロファイルの同定に焦点を当てており、ここでTc(CD8+)細胞は枯渇されている。先に示したように、CD154は、その発現は免疫応答の増幅において極めて有益である重要な免疫調節分子である。従ってCD154発現の増加は、恐らくより効果的なT細胞組成物につながると考えられる。
【０１３７】
本発明の追加の局面は、拡大前の、CD62L、CD45RAまたはCD45RO、サイトカイン(例えば、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10)、サイトカイン受容体(例えば、CD25)、パーフォリン、接着分子(例えば、VLA-1、VLA-2、VLA-4、LPAM-1、LFA-1)、および／またはホーミング分子(例えば、L-セレクチン)などの、様々なマーカーを発現する細胞の集団に関する枯渇されるかまたは濃縮されるT細胞集団または組成物を提供する。ひとつの態様において、これらのマーカーを発現する細胞は枯渇されるかまたはこのマーカーに対する抗体もしくは他のリガンド物質/結合物質により陽性選択される。当業者は、所望のマーカーを発現する細胞の試料を枯渇するかまたは陽性選択する様々な特定の方法を容易に同定することができると思われる。
【０１３８】
本発明のT細胞集団の表現型は、当業者に公知の標準のフローサイトメトリー法およびELISA法を含む様々な方法によりモニタリングすることができる。
【０１３９】
使用法
一般に、本明細書に説明された方法により刺激および／または活性化された細胞は、癌、感染症、自己免疫疾患、加齢に関係する免疫機能不全、またはこのような細胞が治療に望ましいいずれか他の病態の治療および予防に使用することができる。
【０１４０】
先に説明した方法に加え、本明細書に説明された方法により刺激および／または活性化された細胞を、様々な状況において使用することができる。T細胞の基本的例に関して、本明細書に説明された方法を用い、感染症、癌の治療および免疫療法において、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、またはCD45RO+ T細胞集団を選択的に拡大することができる。結果的に抗原反応性に関してポリクローナルであるが、CD4+またはCD8+のいずれかに関して本質的に相同である、表現型が独自のT細胞集団を作成することができる。加えて、これらの方法は、個体の総CD4+またはCD8+ T細胞集団を再構築するのに十分な数にT細胞集団を拡大することが可能である(個体のリンパ球集団は約3〜5x1011個である)。得られたT細胞集団は、遺伝的に形質導入することおよび免疫療法に使用することもでき、または感染性物質のインビトロ分析法において使用することができる。例えば、腫瘍浸潤するリンパ球の集団は、癌に罹患した個体および十分な数に増殖するように刺激されたT細胞から得ることができる。得られるT細胞集団は、遺伝的に形質導入され、腫瘍壊死因子(TNF)または他のタンパク質(例えば、かなり多数のサイトカイン、アポトーシス阻害剤(例えば、Bcl-2)、RevM10またはインターロイキンのような細胞をHIV感染症から保護する遺伝子など、標的化分子、接着分子および／またはホーミング分子および様々な抗体もしくはそれらの断片(例えば、Scfv))を発現し、および個体に投与することができる。
【０１４１】
本発明のCD4+ T細胞集団の具体的用途は、個体におけるHIV感染症の治療である。HIVによる長期感染症は、最終的には、CD4+ Tリンパ球数の顕著な減少を生じる。この減少は次に、免疫不全症の明らかな状態を引き起こし、その患者を生命を脅かす数々の日和見感染症に罹患しやすくする。正常レベルにCD4+ T細胞の数を補充することは、免疫機能を有意な程度に回復することが期待される。従って本明細書に説明された方法は、CD4+ T細胞をHIV感染した患者においてこの集団を再構築するのに十分な数に選択的に拡大する手段を提供する。これは、長期刺激の間にT細胞の感染を避けることが必要であるか、またはT細胞を永久にHIV感染症に対して抵抗性とすることが望ましい。T細胞を、HIV感染症に対して抵抗性または感染した個体にT細胞を回復させる前にウイルス産生不能のいずれかとする技術はたくさんある。例えば、1種または複数種の抗レトロウイルス性物質は、HIV複製またはウイルス産生を阻害するために、拡大前にCD4+ T細胞と共に培養することができる(例えば、逆転写酵素および／またはウイルス機構の他の成分を標的とする薬剤、例えばChow et al. Nature, 361:650-653,1993参照)。
【０１４２】
いくつかの方法を用いて、T細胞を遺伝的に形質導入し、HIV感染症または複製を阻害する分子を産生することができる。例えば、様々な態様において、T細胞は、遺伝的に形質導入され、トランスドミナントな阻害剤、「分子デコイ」、アンチセンス分子、インターロイキン、または毒素を生成することができる。このような方法は、米国特許出願第08/253,751号、同第08/253,964号およびWO 95/33823に更に詳細に説明されており、これらはその全体が本明細書に参照として組入れられている。 
【０１４３】
抗原特異的T細胞集団を刺激および拡大する方法は、対象へT細胞を投与した時点で、免疫応答を上方制御する(例えば、反応を誘導または現存する反応を増強する)ことが望ましい治療的状況において有用である。例えばこの方法を用い、腫瘍関連抗原に対するT細胞反応を増強することができる。対象由来の腫瘍細胞は、典型的には腫瘍関連抗原を発現するが、T細胞において共刺激シグナルを刺激することはできない(例えば、これらは共刺激分子の発現を欠いている)。従って腫瘍細胞は、インビトロにおいて対象由来のT細胞と接触し、並びに本発明の方法により拡大された抗原特異的T細胞およびT細胞を対象に戻すことができる。
【０１４４】
従ってひとつの態様において、非ホジキンリンパ腫(NHL)およびB細胞慢性リンパ球性白血病(B-CLL)のような悪性疾患を治療することができる。拡大されたT細胞を使用する最初の試験において、NHLが治療され(Liebowitz et al., Curr. Opin. Onc., 10:533-541,1998)、本発明のT細胞集団は、増強された生着(恐らくCD28シグナルの刺激により供給される)を提供することにより、免疫療法の成功および反応性を劇的に増強することができる独自の表現型の特徴を示す。しかしB-CLL患者は、特に困難であり、これは全身のT細胞免疫抑制が随伴し、末梢血中の高い白血球負荷を伴う、相対的に低いT細胞数を含む。本発明のT細胞集団は、本疾患の治療において、特に幹細胞移植療法と組合せた場合に、劇的に改善された効率を提供することができる。従って抗CD3 x 抗CD28が共固定されたビーズによるT細胞機能および抗CLL T細胞活性の増加は、有益である。
【０１４５】
例えばCD154の発現を欠損する場合には、B-CLL患者のT細胞上の、CD40のリガンドは、この疾患の主要な免疫学的欠損として列挙され、再注入時に持続性の高レベルのCD154発現を提供する本発明のT細胞集団は、その治療を補助する。研究者は、CLL患者は、T細胞のCD154を発現する能力に加え、白血病性B細胞のCD80およびCD86を発現する能力を欠損していることを報告している。CD28のリガンドを適切に発現するCLLにおける白血病性B細胞の不全は、完全に活性化した腫瘍反応性T細胞を生じることができ、従ってT細胞の明らかな耐性状態の基礎となる機構を表すことができる。可溶性抗CD40抗体によるかまたはCD154形質導入された白血病性B細胞のいずれかによりCD40がCLLのB細胞上に結合されていることの研究は、CD80およびCD86発現の欠損の補正、およびMHC表面発現の上方制御を明らかにしている。Kato et al., J. Clin. Invest., 101:1133-1141,1998；Ranheim and Kipps, J Exp. Med, 177:925-935,1993。この方法で処理された細胞は、特異的T細胞抗腫瘍反応を刺激することができる。
【０１４６】
本発明のT細胞集団の表面上のCD154の増強された発現により、このようなT細胞は、自家B-CLL細胞と相互作用することが期待され、その結果MHC、CD80、およびCD86の発現を起動することにより、腫瘍の免疫原性を増加すると考えられる。次にこれは、強力な抗腫瘍反応につながる。更に当業者は、本発明のエキソビボ拡大されたT細胞による患者の治療は、化学療法のような、伝統的癌療法と一緒にすることができることを容易に理解すると思われる。これに関して、例えば、患者は、FludarabineまたはCampath(Berlex Laboratories, Montville, NJ, USA)のような物質によるか、引き続き本発明のT細胞集団の注入によるか、または両方により、治療することができる。
【０１４７】
本発明は更に、混合されたT細胞集団から特異的T細胞亜集団を選択的に拡大するための方法を提供する。特に本発明は、かなり高い比のCD4+およびCD8+二重陽性T細胞を有する特異的に濃縮されたT細胞集団を提供する。
【０１４８】
別の本発明の態様は、CD4+ T細胞集団からTH1細胞集団を選択的に拡大する方法を提供する。この方法において、CD4+ T細胞は、モノクローナル抗体9.3などの抗CD28抗体により共刺激され、IFN-γを含む、TH1特異的サイトカインの分泌を誘導し、TH2細胞に勝るTH1細胞の濃縮を生じる。
【０１４９】
拡大プロセス時に活性化されたT細胞の表現型の素質は、経時的に変動するという本明細書の知見は、T細胞は数時間内に活性化されることが示されているという事実と組合せられる(Iezzi et al., Immunity, 8:89-95,1998)。従って、本明細書に説明された方法と組合せて、これは短期間にテーラーメイドのT細胞集団のサブセットを拡大する能力を提供する。ひとつの態様において、この技術は、腎透析の使用同様、対象の臨床、外来患者モダリティ、または対象の自宅において使用することができる。例えば方法または装置は、T細胞が活性化シグナル(例えば、抗CD3および抗CD28抗体など)と接触してインキュベーションされ、連続フローにおいてまたは数時間の拡大後、患者へ迅速に戻されるものである。ひとつの局面において、このような拡大の技術は、フィルター構成要素を伴う分離されたチャンバーを使用し、3x28ビーズまたは同様に被覆された微粒子は、血液/濃縮された細胞の連続フローと混合される。別の態様において、装置内の固形表面は、抗体またはT細胞の活性化および拡大を刺激する他の成分により、直接的(共有結合を含む)か、もしくは間接的に(例えば、ストレプトアビジン/ビオチンなど)、被覆または複合される。例えば、2種またはそれよりも多い固定された抗体(例えば、抗CD3および抗CD28)または対象へ細胞が戻される前にT細胞活性化に必要な受容体を刺激する他の成分を含む、血液/細胞収集装置および／または使い捨て装置を通る患者からの連続フロー経路を使用することができる(プラスチック表面上または分離可能な微粒子上に固定された)。このようなシステムは、現存する製造業者の使い捨てセットに無菌でドッキングした使い捨てセットを備える、白血球搬出装置に関連しているか、またはその製造業者の使い捨てセットに適合されている(例えば、抗体/活性化成分が固定された/含まれた表面プラットフォームは、アフェレーシス時の末梢血単核細胞の収集のためのバッグ/容器内である)。更に固形表面/表面プラットフォームは、装置チャンバーの一方に差し込まれた取り外し可能なインサートの一部であるか、または使い捨て構成要素のひとつの中に物理的に存在する。前記の連続フロー局面の別の態様において、このシステムは、血液収集装置内のチャンバーまたは患者への連続するフロー経路中に設定されたインキュベーションチャンバーを用い、細胞を活性化成分と室温または生理的温度で接触することを含む。
【０１５０】
別の例において、血液は、2種またはそれよりも多い固定された抗体(例えば、抗CD3および抗CD28)または細胞が対象へ投与される前のT細胞活性化に必要な受容体を刺激する他の成分(例えば、プラスチック表面上にまたは分離可能な微粒子上に固定された)を含む独立型の使い捨て装置へ患者から直接採取される。ひとつの態様において、この使い捨て装置は、注射器と無菌のドッキング装置の連結/ドッキングに適した適当な管状継手を備える容器(例えば、プラスチックバッグ、またはフラスコ)を備える。この装置は、T細胞活性化成分(例えば、抗CD3および抗CD28抗体)の固定のための固形表面を含むと考えられる。これらは、容器それ自身またはインサートの表面であってよく、典型的には平らな表面、蝕刻された平らな表面、不規則な表面、多孔質パッド、ファイバー、臨床的に許容できる/安全な強磁性流体、ビーズなどである。)。加えて、独立型装置を使用する場合、対象は、この装置に接触され続けるか、またはこの装置は患者から分離することができる。更にこの装置は、室温で使用され得るか、または携帯型インキュベーターを用い生理的温度でインキュベーションされる。
【０１５１】
血液および血液製剤を収集およびプロセシングする装置および方法は周知であるので、当業者は、本明細書に提供された所定の技術を容易に認め、前記の要件を満たす様々な装置を、容易にデザインするかまたは現存の装置を改良すると思われる。従って、このような装置および方法は、本明細書に説明された具体的態様に限定されず、無菌状態を維持することが可能であり、かつ血液を補体活性化が低下される流体型で維持し、およびT細胞活性化に必要な成分(例えば、抗CD3および抗CD28抗体またはそれらへのリガンド)は、対象への投与前に血液または血液製剤から固定または分離されるような装置または方法を含むと思われる。更に、当業者は容易に理解することができるように、様々な血液製剤を、本明細書に説明された装置および方法と組合せて使用することができる。例えばこれらの方法および装置を用い、解凍時または対象投与前に、低温保存した全血、末梢血単核細胞、他の低温保存した血液由来の細胞、または低温保存したT細胞株から、迅速なT細胞の活性化を提供することができる。別の例において、これらの方法および装置を使用し、対象へ投与される前に、予めエキソビボで拡大されたT細胞製品またはT細胞株の活性を強化する(boost)ことができ、その結果高度に活性化されたT細胞製品を提供する。最後に、容易に理解されるように、前記方法および装置は、対象およびドナーで同時に自家または同種異系の細胞療法に使用してもよい。
【０１５２】
本発明の方法は、抗原の反応性を増強しおよびインビボ作用を増強するために、ワクチンと共に使用することもできる。更に本発明により拡大されたT細胞が体内で比較的長期の半減期を有する場合には、これらの細胞は、関心のある望ましい核酸配列を運搬しおよび癌、疾患、または感染症の部位へ潜在的にホーミングすることにより、遺伝子治療のための完全なビヒクルとして作用することができる。従って本発明により拡大された細胞は、ワクチン、1種または複数のサイトカイン、1種または複数の治療用抗体などと一緒に患者へ送達されてよい。より強固なT細胞集団により事実上有益である療法は、本明細書に説明された使用法の範囲内である。
【０１５３】
ある態様において、本発明に説明された方法、またはT細胞は治療的レベルにまで刺激および拡大される他の当技術分野において公知の方法を用い、刺激および拡大された細胞を使用し、感染性生物により引き起こされた疾患を予防または治療することができる。T細胞は、本明細書に説明されたようにまたはT細胞は治療的レベルにまで刺激および拡大される他の当技術分野において公知の方法を用い、刺激および拡大され、ウイルス、細菌、寄生体および真菌などの、感染性生物に対する反応性を誘導または増強する。感染性生物は、ウイルス(例えば、RNAウイルス、DNAウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型、B型およびC型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、ヒトパピローマウイルス(HPV))、寄生体(例えば、原虫および後生動物病原体、例えばプラスモジウム属、リーシュマニア属、住血吸虫種、トリパノソーマ属)、細菌(例えば、ミコバクテリア、特に結核菌、サルモネラ菌、連鎖球菌、大腸菌、ブドウ球菌)、真菌(例えば、カンジダ種、アスペルギルス種)、ニューモシスチス・カリニ、およびプリオン(スクレイピー、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性性疾患に加え、ウシ海綿状脳症(BSE)もしくは「狂牛病」、並びにネコ海綿状脳症を引き起こすプリオン感染動物として公知である)を含むことができる。ヒトに影響を及ぼすことがわかっている4種のプリオン疾患は、(1)クールー病、(2)クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、(3)ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー病(GSS)、および(4)致命的家族性不眠症(FFI)である。本明細書において使用される「プリオン」という用語は、これらの疾患または使用される他の動物--特にヒトおよび家畜における他のものの全てもしくはいずれかを引き起こすプリオンの全ての形を含む。 
【０１５４】
T細胞は、本明細書に説明されたようにまたはT細胞は治療的レベルに刺激および拡大され、様々な癌の予防または治療のために対象の免疫反応を誘導または増強する当技術分野において公知の他の方法を用い、刺激および拡大することができる。本発明のT細胞は、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞増加症、肉腫、神経膠腫、胸腺腫、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、子宮癌、膵臓癌、食道癌、脳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、胃癌、食道癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、および慢性リンパ球性白血病(CLL)または他の癌を予防または治療するために有用である。
【０１５５】
ある態様において、本発明の方法またはT細胞は治療的レベルに刺激および拡大される当技術分野において公知の他の方法を用い刺激および活性化されたT細胞は、リンパ節の生じる疾患の治療に有用であることができる。これに関して、このような疾患は、本明細書に説明されたような様々な癌および感染症を含む。病態の例は、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、血管免疫芽球性リンパ節症および慢性リンパ球性白血病を含むが、これらに限定されるものではない。感染症の例は、トキソプラズマ症、ヒストプラズマ症、CMV、EBV、コクシジオイデス真菌症、結核、HIVなどを含むが、これらに限定されるものではない。類肉腫症のようなリンパ節に関係する非感染症も、本明細書に説明された細胞による治療から恩恵を受ける。標的の癌は、原発部位からリンパ節に転移したおよび全身に播種された固形腫瘍を含む(例えば、本明細書に説明されたかなり多数の癌由来の固形腫瘍)。ある態様において、治療は、CTスキャンなどの標準技術により立証された疾患を伴う患者、またはリンパ節疾患を有するリスクが高いことがわかっている患者についてである。ある態様において、本発明の方法またはT細胞は治療的レベルに刺激および拡大される当技術分野において公知の他の方法を用い刺激または活性化されたT細胞は、(標的)リンパ節にホーミングする物質と一緒に与えられる。ある態様において、ワクチン、アジュバント、または樹状細胞が、リンパ節近傍またはリンパ節内に投与され、引き続きT細胞が投与される。追加の態様において、T細胞は、送達物質のリンパ節への担体として使用される(例えば、DNA、RNA、タンパク質、毒素、化学療法剤など)。
【０１５６】
ある態様において、本発明の方法またはT細胞は治療的レベルに刺激および拡大される当技術分野において公知の他の方法を用い刺激または活性化されたT細胞を、関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病、アジソン病、セリアック病、慢性疲労症候群、炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、線維筋痛症、全身紅斑狼瘡、乾癬、シェーグレン病、高サイロキシン血症/グレーブス病、甲状腺機能低下症/橋本病、インスリン依存型糖尿病(1型)、重症筋無力症、子宮内膜症、強皮症、悪性貧血、グッドバスチャー症候群、ヴェーゲナー症、糸球体腎炎、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、骨髄異形成症候群、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、エバンス症候群、第VIII因子阻害剤症候群、全身性血管炎、皮膚筋炎、多発性禁煙およびリウマチ熱などであるが、これらに限定されるものではない、自己免疫疾患の治療に使用することができる。  
【０１５７】
薬学的組成物
本発明のT細胞集団のような標的細胞集団は、単独で、または希釈剤および／または他の成分、例えばIL-2もしくは他のサイトカインまたは細胞集団と組合せた薬学的組成物として投与することができる。簡単に述べると、本発明の薬学的組成物は、本明細書に説明されたような標的細胞集団を、1種または複数の薬学的または生理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組合せて含有する。このような組成物は、中性に緩衝された生理食塩水、リン酸緩衝された生理食塩水などのような緩衝液；ブドウ糖、マンノース、ショ糖またはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸；酸化防止剤；EDTAまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；並びに保存剤を含有してもよい。本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤されることが好ましい。
【０１５８】
本発明の薬学的組成物は、治療(または予防)される疾患に適した方法で投与することができる。投与量および投与回数は、患者の状態、並びに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適量は臨床医により決定され得る。
【０１５９】
本明細書に説明された方法またはT細胞が治療的レベルに刺激および拡大される当技術分野において公知の他の方法を用いて刺激および活性化されたT細胞を投与することにより対象において誘導された免疫応答は、腫瘍細胞および感染細胞を殺傷することが可能である細胞傷害性T細胞、調節性T細胞、およびヘルパーT細胞の反応により媒介された細胞性免疫応答を含むことができる。B細胞を活性化することが可能であり、従って抗体産生につながるヘルパーT細胞により主に媒介された液性免疫応答も誘導され得る。様々な技術を、本発明の組成物により誘導された免疫応答の種類の分析に使用することができ、これは当技術分野において十分に説明されている；例えば、Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)。
【０１６０】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍的有効量」、「腫瘍阻害的有効量」、または「治療的量」が指示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、および患者(対象)の状態の個体差を考慮し、医師が決定することができる。一般に本明細書に説明されたT細胞を含有する薬学的組成物は、用量104〜107個細胞/kg体重、好ましくは105〜106個細胞/kg体重であり、これらの範囲の全ての整数値を含む用量で投与することができる。T細胞組成物は、これらの用量で反復投与することもできる。これらの細胞は、免疫療法において通常知られている注入技術を用い、投与することができる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676,1988参照)。特定の患者に関する適量および治療様式は、疾患の徴候について患者をモニタリングしおよび適宜治療を調節することにより、医薬技術者により容易に決定することができる。
【０１６１】
典型的には、養子免疫療法試験において、抗原特異的T細胞は、約2x109〜2x1011個細胞で患者へ投与される。(例えば、米国特許第5,057,423号参照)。本発明の一部の局面、特に同種または異種細胞の使用において、より少ない数の細胞、106個/kg(106〜1011個/患者)の範囲が投与されてよい。ある態様において、T細胞は、1x105個細胞、1x106個細胞、1x107個細胞、1x108個細胞、2x108個細胞、2x109個細胞、1x1010個細胞、2x1010個細胞、1x1011個細胞、5x1011個細胞、または1x1012個細胞で対象へ投与される。T細胞組成物は、これらの範囲内の用量で反復投与されてもよい。これらの細胞は、療法を受ける患者にとって自己または非自己であってよい。望ましい場合には、この治療は、免疫応答の誘導を増強するために本明細書に説明されたようなマイトジェン(例えばPHA)またはリンホカイン、サイトカイン、および／またはケモカイン(例えば、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1αなど)の投与も含み得る。
【０１６２】
対象組成物の投与は、エアゾール吸引、注射、経口摂取、輸液、埋植または移植を含む、いずれかの都合の良い様式で実行することができる。本明細書に説明された組成物は、患者へ、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内(intramdullary)、筋肉内、静脈内(i.v.)注射、または腹腔内へ、投与することができる。ひとつの態様において、本発明のT細胞組成物は、患者へ、皮内または皮下注射により投与される。別の態様において、本発明のT細胞組成物は、好ましくは静脈内注射により投与される。T細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位へ直接注射されてもよい。
【０１６３】
更に別の態様において、この薬学的組成物は、徐放システムにおいて送達することができる。ひとつの態様において、ポンプが使用される(Langer, 1990, Science, 249:1527-1533；Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201；Buchwald et al., 1980；Surgery, 88:507；Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。別の態様においては、ポリマー材料が使用される
2006516197.tif 000007
。更に別の態様において、徐放システムは、治療標的の近傍に配置され、その結果全身投与量の一部のみが必要とされる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, 1984, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., vol.2, pp.115-138参照)。
【０１６４】
本発明のT細胞組成物は、かなり多数のマトリックスを使用し投与してもよい。マトリックスは、組織工学の状況において長年使用されている(例えば、Principles of Tissue Engineering (Lanza, Langer, and Chick (eds.), 1997参照)。本発明は、典型的にはT細胞の調節を介して、免疫系を支援、維持、または調節する人工のリンパ器官として作用する新たな状況内で、このようなマトリックスを使用する。従って本発明は、組織工学における有用性が明らかにされているこれらのマトリックス組成物および製剤を使用することができる。従って本発明の組成物、装置および方法において使用することができるマトリックスの種類は、事実上制限が無く、生物学的マトリックスおよび合成マトリックスの両方を含んでよい。ひとつの具体例において、米国特許第5,980,889号；同第5,913,998号；同第5,902,745号；同第5,843,069号；同第5,787,900号；または、同第5,626,561号に開示された組成物および装置が使用される。マトリックスは、一般に哺乳類宿主に投与される場合に生体適合性であることに関連した特徴を含む。マトリックスは、天然材料および合成材料の両方から形成されてよい。マトリックスは、インプラントのように、動物の体内に永久の構造物または除去可能な構造物を残存することが望ましい場合には非生分解性であり；もしくは、生分解性であってよい。マトリックスは、スポンジ、インプラント、チューブ、テルハーパッド、ファイバー、中空ファイバー、凍結乾燥された成分、ゲル、粉末、多孔質組成物、またはナノ粒子の形をとることができる。加えてマトリックスは、播種された細胞または産生されたサイトカインまたは他の活性物質の持続放出を可能にするようにデザインすることができる。ある態様において、本発明のマトリックスは、柔軟性および弾性があり、無機塩、水溶液および酸素などの溶存した気体物質のような物質が透過性である半固形の足場として説明されることがある。
【０１６５】
マトリックスは、生体適合性物質の例として本明細書において使用される。しかし本発明は、マトリックスに制限されず、従ってマトリックス(複数を含む)という用語がこれらの用語を表す限りは、細胞保持もしくは細胞移動を可能にし、生体適合性であり、並びに物質それ自身が半透膜であるように物質を通じて直接的に、または特定の半透性物質と組合わせて使用され、巨大分子が移動することを可能にするかのいずれかのような装置および他の物質を含むように読みとられなければならない。
【０１６６】
本発明のある態様において、本明細書において説明された方法またはT細胞が治療的レベルに刺激および拡大される当技術分野において公知の他の方法を用い活性化および拡大された細胞は、抗ウイルス剤、化学療法、放射線療法、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATHのような他の免疫アブレーション剤、、抗CD3抗体または他の抗体療法、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および放射線照射を含むが、これらに限定されるものではないかなり多数の関連のある治療モダリティと組合せて(例えば、以前、同時または引き続き)、患者へ投与される。これらの薬物は、カルシウム依存型ホスファターゼのカルシニューリンを阻害するか(シクロスポリンおよびFK506)または増殖因子が誘導したシグナル伝達に重要であるp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)かのいずれかである(Liu et al., Cell, 66:807-815,1991；Henderson et al., Immun., 73:316-321,1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773,1993；Isoniemi(前記))。更なる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤または外部ビーム照射(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用するT細胞アブレーション療法と組合わせて(例えば、以前、同時または引き続き)、患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、例えばリツキサンのような、CD20と反応する物質などのB細胞アブレーション療法に続けて投与される。例えばひとつの態様において、対象は、高用量の化学療法剤に続けて、末梢血幹細胞移植を伴う標準治療を受けることができる。ある態様においては、この移植後、対象は、本発明の拡大された免疫細胞の注入を受け取る。追加の態様において、拡大された細胞は、術前または術後に投与される。
【０１６７】
患者に投与される前記の治療量は、治療される状態および治療のレシピエントの正確な性質と共に変動すると考えられる。ヒトへの投与に関する用量増減は、当技術分野において許容された実践に従い行うことができる。例えばCAMPATH投与量は、一般に成人患者について1〜約100mgの範囲であり、通常1〜30日間毎日投与される。好ましい一日量は、1〜10mg/日であるが、場合によっては最大40mg/日の比較的多い量を使用することができる(米国特許第6,120,766号に開示)。
【０１６８】
更なる態様において、本明細書において説明された方法またはT細胞が治療的レベルに刺激および拡大される当技術分野において公知の他の方法を用い刺激および活性化されたT細胞を含有する細胞組成物は、自家幹細胞移植(例えば小型移植の設定)または臓器移植と組合わせて、患者に投与される。理論と結びつけられるものではないが、このようなT細胞は、生着および抗腫瘍作用を増強および促進することができる。これらのT細胞は、使用されるはるかに毒性の低下したおよび無毒の移植片馴化様式を可能にするような作用および抗腫瘍作用を促進するよう幹細胞移植片を増強することができる。
【０１６９】
本文内で参照された全ての参考文献は、それらの全体が本明細書に参照として組入れられている。更に本明細書において使用される全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数値を明白に含み、並びにこの範囲内の具体的数値の選択は、特定の用途に応じて企図されるものである。更に以下の実施例は、例証のために提供されるものであり、限定するものではない。
【０１７０】
実施例
実施例I
T細胞刺激
本明細書に説明されたある実験において、XCELLERATE I(商標)と称されるプロセスが使用された。簡単に述べるとこのプロセスにおいて、XCELLERATED(商標)T細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)アフェレーシス産物から製造される。臨床において患者から収集後にPBMCアフェレーシスは洗浄され、次に「被覆されない」DYNABEADS(登録商標)M-450 エポキシ Tと共にインキュベーションされる。この間に、単球のような食細胞は、このビーズを摂取する。インキュベーション後、これらの細胞およびビーズは、ビーズおよびビーズに付着したあらゆる単球性細胞/食細胞を除去するために、MaxSep Magnetic Separator上で処理される。この単球枯渇工程の後、合計5x108個のCD3+ T細胞を含む容量を採取し、およびXCELLERATE(商標)プロセス(ビーズ対T細胞はおよそ3:1)を開始するために、1.5x109個のDYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tと共にセットアップされる。その後細胞およびDYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tの混合物を、37℃、5％CO2で約8日間インキュベーションし、1回目の注入のためのXcellerated T細胞を作成した。残余の単球枯渇したPBMCを、2回目または更なる細胞生成物の拡大(約21日後)まで低温乾燥し、この時点でこれらを解凍し、洗浄し、次に合計5x108個CD3+ T細胞を含む容量を採取し、および2回目の注入のためのXCELLERATEプロセスを開始するために、1.5x109個DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tと共にセットアップした。37℃、5％CO2で最大約8日のインキュベーション期間中に、これらのCD3+ T細胞は活性化および拡大する。使用される抗CD3 mAbはBC3(XR-CD3；Fred Hutchinson Cancer Research Center, シアトル, WA)であり、抗CD28 mAb(B-T3、XR-CD28)は、Diaclone(Besancon, フランス)から入手した。
【０１７１】
XCELLERATE II(商標)と称される改変されたプロセスにより、先に説明されたプロセスは、個別の単球枯渇工程を使用せず、およびあるプロセスにおいてこれらの細胞は、ビーズとの最初の接触前には凍結しない点を若干改変して使用し、並びに更なる濃縮および刺激を行った(図5Aおよび5B参照)。このプロセスのひとつのバージョンにおいて、T細胞は、アフェレーシスによりドナーまたは患者の循環血から入手した。アフェレーシス産物の成分は、典型的にはリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核細胞(白血球)、赤血球、および血小板を含む。典型的アフェレーシス産物は、1〜2x1010個の有核細胞を含む。これらの細胞は、カルシウム非含有、マグネシウム非含有のリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、血漿タンパク質および血小板を除去した。洗浄工程は、細胞の遠心、および上清の廃棄により行い、上清は次にPBSで置き換えた。このプロセスは、半自動化された「フロースルー」遠心(COBE 2991システム, Baxter)を用い実現した。これらの細胞は、それらが処理される閉鎖システムにおいて維持した。
【０１７２】
これらの細胞は、単球を含む非結合細胞の枯渇(活性化された細胞の濃縮)、並びにその後の刺激の連続により、更に処理した。あるいは洗浄した細胞は、凍結し、貯蔵し、後で処理することができ、これは本明細書において増殖の強固さを増強することに加え顆粒球を枯渇することを明らかにしている。一例において、細胞を凍結するために、細胞浮遊液35mlを、250mlのCryocyte凍結バッグに、凍結液35mlと共に入れた。細胞浮遊液35mlは、典型的にはPBS中に、3.5x109〜5.0x109個の細胞を含む。等容量の凍結液(PBS中の20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン)を添加した。これらの細胞を、最終濃度50x106個細胞/mlとした。Cryocyteバッグは、30〜70mlの範囲の容量を含み、その細胞濃度は10〜200x106個細胞/mlの範囲である。一旦Cryocyteバッグが細胞および凍結液で満たされた場合には、このバッグを、制御された速度のフリーザー内に配置し、これらの細胞は、-80℃まで1分間に1℃の低下で凍結した。その後凍結細胞は、必要になるまで、液体窒素貯蔵システム中に配置した。
【０１７３】
これらの細胞を、液体窒素貯蔵システムから取り出し、37℃で解凍した。DMSOを除去するために、解凍した細胞を次にカルシウム非含有、マグネシウム非含有PBSで、COBE 2991システム上で洗浄した。洗浄した細胞を次に、80μmメッシュフィルターを通した。
【０１７４】
約0.5x109個CD3+細胞である解凍した細胞を、カルシウム非含有、マグネシウム非含有PBSを100ml含むプラスチック製1LのLifecellバッグ中に入れた。このPBSは、1％〜5％ヒト血清を含む。1.5x109個の3x28ビーズ(DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T)も、このバッグ中に、細胞と共に配置した(3:1 DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T : CD3+ T細胞)。これらのビーズおよび細胞は、室温で〜1 RPM(end-over-end rotation)で約30分間混合した。ビーズおよび細胞を含むバッグを、MaxSep Magnetic Separator (Nexell Therapeutics, Irvine, CAb)上に配置した。バッグとMaxSepの間に、プラスチック製のスペーサー(厚さ約6mm)を配置した。(磁気強度を増加するためには、スペーサーを除去する。)これらのビーズおよびビーズに付着されたあらゆる細胞は磁石上に維持される一方で、PBSおよび未結合の細胞はポンプにより除去される。
【０１７５】
3x28ビーズおよびビーズに結合した濃縮された細胞は、3LのLifecell培養バッグへと、細胞培養培地(1L、X-Vivo 15, BioWhittaker；熱で失活されたプールされたヒト血清50ml、1M Hepes 20ml、200mM L-グルタミン10ml、約100,000 IUのIL-2の有無を含有)によりすすいだ。3x28ビーズおよびLifecellバッグへと陽性選択された細胞を移した後、このバッグが1000mlを含むまで、培養培地を添加した。細胞を含有するバッグは、インキュベーターに配置し(37℃および5％CO2)、細胞は拡大させた。
【０１７６】
細胞は、3および5日目に各々、1〜4に分割した。T細胞活性化および増殖は、培養の3日後および8日後に細胞を回収することにより測定した。T細胞の活性化は、細胞サイズ、細胞表面マーカーの発現レベル、特に培養3日目のCD25およびCD154の発現レベルを測定することにより評価した。8日目に、細胞は、MaxSep磁石上を重力下で流し(約150ml/分)、磁気粒子を除去し、およびこれらの細胞を、前記COBE装置を用い、洗浄および濃縮し、並びにPlasma-Lyte A(登録商標)(Baxter-Healthcare)のような、静脈内投与に適するように平衡とした電解液中に再懸濁した。
【０１７７】
本明細書に説明したように、XCELLERATE I(商標)は、刺激および濃縮は行われず、並びに単球枯渇は刺激前に行われること以外は、前記に類似した条件を意味する。
【０１７８】
XCELLERATE I(商標)およびII(商標)プロセスを両方とも行い、T細胞増殖は8日間培養後測定した。拡大されたT細胞の収量は、細胞培養前にCD3+細胞が濃縮された場合により大きかった(表1参照)。加えて、細胞集団は90％よりも多いCD3+細胞を有した。
【０１７９】
（表１）拡大8日目のT細胞収量
2006516197.tif 000008
【０１８０】
これに関して更なる実験を行い、CD3+濃縮なしで刺激された細胞の9個のバッチおよびCD3+濃縮を伴い刺激された細胞の5個のバッチの、拡大された細胞の総数に加え拡大倍率を示した(図1および2参照)。
【０１８１】
培養前の磁力の印加による細胞の濃縮は、CD154レベルの増加に加え、CD3+細胞の純度を効果的に増加する(表2、図3および4は、CD154レベルを図示している)。更にT細胞集団が異なる強度の磁石に曝されるT細胞増殖を比べ、より強力な磁石は、CD3+細胞のより大きい収量を生じることが示された(表2)。
【０１８２】
（表２）弱いおよび強い磁石を使用する濃縮後のT細胞増殖および細胞表面マーカーの比較
2006516197.tif 000009
2006516197.tif 000010
【０１８３】
5種の追加実験を行い、XCELLERATE I(商標)プロセスを、XCELLERATE II(商標)プロセスと比較した。これらふたつのプロセスに従い活性化されおよび培養拡大された細胞について、培養の3および8日目の細胞活性化マーカー(細胞サイズ、CD25発現、およびCD154発現)を、下記表3および図6-7に示した。
【０１８４】
（表３）3日目の細胞活性化マーカー
2006516197.tif 000011
2006516197.tif 000012
【０１８５】
表3および図6-7のデータは、XCELLERATE II(商標)プロセスは、3日目の細胞サイズおよびCD25発現活性化マーカーが平均に類似しているが、典型的にはより高く、および刺激後高くあり続ける細胞を作成したことを示している。しかしXCELLERATE II(商標)プロセスからのT細胞について、3日目のCD154活性化マーカーは、XCELLERATE I(商標)プロセス由来のT細胞のものよりも、はるかに高かった。更に先に明らかにされたように、XCELLERATE II(商標)プロセスは、他の方法よりも1ドナーにつき一貫してより高いCD25およびCD154レベルを生じた。
【０１８６】
XCELLERATE II(商標)プロセスの3日目のCD154の発現は、実際にXCELLERATE I(商標)よりもはるかに高い。この知見は、T細胞は、XCELLERATE II(商標)プロセス時に、XCELLERATE I(商標)プロセスよりも活性化のより高い状態にあることを示唆している。これはインビボ投与された場合により効果的な生成物に翻訳され得ることが推定される。
【０１８７】
培養3日目のCD3+細胞純度、CD4細胞/CD8細胞比、および細胞生存率も、5名の患者試料について決定した。XCELLERATE I(商標)プロセスおよびXCELLERATE II(商標)プロセスを施した使用した細胞の表現型および生存率は、フローサイトメトリーまたはトリパンブルー染色により測定し、下記表4に示した。
【０１８８】
（表４）
2006516197.tif 000013
*＝XCELLERATE Iプロセスの単球枯渇後またはXCELLERATE IIプロセスの磁気濃縮後0日目のCD3+ T細胞純度
Ψ＝XCELLERATE Iプロセスの単球枯渇後またはXCELLERATE IIプロセスの磁気濃縮後0日目のCD4+:CD8+ T細胞の比
【０１８９】
実施例II
CD3+ T細胞濃縮、単球枯渇および顆粒球枯渇の効率
この試験のために、Xcyte Therapies Development実験室での受領時に、入手したPBMCアフェレーシス産物は、洗浄し、分割し、以下のように処理した。
1. XCELLERATE Iプロセスのために、単球枯渇工程を行い、CD14+ 単球枯渇したPBMCを、低温保存しおよび液体窒素(LN2)フリーザーの気相中で貯蔵した(実施例I記載のように)。XCELLERATE Iプロセスのセットアップ日に、CD14+単球枯渇したPBMCを解凍し、XCELLERATEプロセスを、実施例Iに詳述したように、DYNABEADS M-450 CD3/CD28 Tにより開始した。これらの初回工程におけるN=5ドナーのCD3+ T細胞濃縮、CD14+単球枯渇および顆粒球枯渇の平均細胞組成および平均効率を、表5.1に示し、各個体ドナーのデータを表5.2に示した。
2. XCELLERATE IIプロセスのために、PBMCアフェレーシス産物細胞は、低温保存しおよびLN2フリーザーの気相中で貯蔵した。XCELLERATE IIプロセスのセットアップ日に、低温保存したPBMCアフェレーシス産物細胞を解凍し、CD3+ T細胞を磁気により濃縮し、並びにXCELLERATE IIプロセスを、実施例Iに詳述したように、DYNABEADS M-450 CD3/CD28 Tにより開始した。これらの初回工程におけるN=5ドナーのCD3+ T細胞濃縮、CD14+単球枯渇および顆粒球枯渇の平均細胞組成および平均効率を、表5.1に示し、各個体ドナーのデータを表5.2に示した。
【０１９０】
表5.1および5.2に示したように、PBMCアフェレーシス産物の凍結/解凍、それに続くXCELLERATE IIプロセス構成における解凍したPBMCアフェレーシス産物から直接のCD3+ T細胞の磁気濃縮の組合せは、CD14+単球および顆粒球の効率的除去を生じる(表5.1および表5.2)。XCELLERATE IIプロセスにおけるCD14+単球および顆粒球の除去効率は、XCELLERATE Iプロセスと同じ位良好であり、追加の「被覆されない」DYNABEADS M-450 T試薬を使用し、一貫してより高いCD4/CD8比につながる個別の枯渇工程が必要ないという恩恵を伴った。
【０１９１】
（表５．１）XCELLERATE IおよびXCELLERATE IIプロセス構成の初期工程におけるCD3+ T細胞濃縮、CD14+単球枯渇および顆粒球枯渇の平均(N=5)効率
2006516197.tif 000014
細胞組成は、標準のプロトコールに従うフローサイトメトリーにより決定した。
【０１９２】
（表５．２）XCELLERATE IおよびXCELLERATE IIプロセス構成の初回工程におけるCD3+ T細胞濃縮、CD14+単球枯渇および顆粒球枯渇の効率の比較
2006516197.tif 000015
細胞組成は、標準のプロトコールに従うフローサイトメトリーにより決定した。
【０１９３】
CD14+単球枯渇工程および関連試薬を除くことによるこのプロセスの簡略化および合理化に加え、XCELLERATE II(商標)プロセスにおける磁気濃縮工程も、T細胞活性化の開始時に、CD3+ T細胞のより高い純度およびCD3+ CD4+ T細胞:CD3+ CD8+ T細胞のより高い比を提供する(表5.1および表5.2)。
【０１９４】
XCELLERATE I(商標)プロセスおよびXCELLERATE II(商標)プロセスの8日目の回収前活性化されたCD3+ T細胞の収量、純度、生存率および組成も、比較した。
【０１９５】
表5.3に示されたように、8日目の回収前のCD3+ T細胞の平均収量、純度および生存率は、典型的にはXCELLERATE I(商標)プロセスと比べ、XCELLERATE IIについて改善された。
【０１９６】
（表５．３）XCELLERATE I(商標)プロセスおよびXCELLERATE II(商標)プロセスの8日目の回収前活性化されたCD3+ T細胞の収量、純度、生存率および組成
2006516197.tif 000016
*＝CD3+ CD4+ T細胞:CD3+ CD8+ T細胞の比
【０１９７】
同じく表5.3に示されるように、XCELLERATE II(商標)プロセスは、CD3+ CD4+ T細胞:CD3+ CD8+ T細胞のより高い比を維持する。これは、磁気濃縮工程時のCD3+ CD4+細胞の優先的濃縮に起因すると考えられる(表5.1および5.2)。
【０１９８】
「入手する」は、新鮮な洗浄された入手するアフェレーシス細胞を意味する。XCELLERATE I(商標)プロセスに関して表5.2に列記した出発細胞は、洗浄され、単球枯渇され、および／または凍結/解凍されたアフェレーシス細胞であった。XCELLERATE II(商標)プロセスに関して表5.2に列記した出発細胞は、洗浄されおよび凍結/解凍されたアフェレーシス細胞であった。
*＝CD3+ CD4+ T細胞:CD3+ CD8+ T細胞の比
【０１９９】
表5.3は、XCELLERATE II(商標)プロセスは、XCELLERATE I(商標)プロセス由来の細胞生成物よりも、より純粋な細胞生成物を生じる(％CD3+細胞に関して)ことを示す。すなわち、XCELLERATE II(商標)プロセス由来の生成細胞は、96％±1％の平均(±標準偏差)CD3+細胞純度を有する一方で、XCELLERATE I(商標)プロセス由来の細胞は、93％±2％の純度を有した。
【０２００】
同じく表5.3に示されたように、XCELLERATE II(商標)プロセスはCD4/CD8細胞の高い比を有した。これらの入手する細胞は、平均CD4/CD8細胞比2.2を有し、XCELLERATE II(商標)プロセス由来の生成T細胞は、CD4/CD8比1.8を有するのに対し、XCELLERATE I(商標)プロセス由来の生成細胞は、CD4/CD8比1.2を有する。
【０２０１】
同じく表5.3のデータは、XCELLERATE II(商標)プロセスは、平均生存率98％を伴う生成細胞を生じるが、XCELLERATE I(商標)プロセスは、平均生存率97％の生成細胞を生じることを示している。
【０２０２】
実施例III
単球枯渇
単球(CD14+食細胞)は、様々な「無関係の」(すなわち、非抗体で被覆されたまたは非標的抗体で被覆された)Dynalビーズを用いる磁力枯渇により、T細胞調製物から除去した。枯渇は、フィコール分離後の全血またはアフェレーシス末梢血のいずれかを、Dynalヒツジ抗マウスM-450ビーズ、もしくはDynalヒト血清アルブミン被覆されたビーズ(M-450)との、またはDynal エポキシ (M-450)ビーズと、大雑把に2:1のビーズの細胞に対する比でプレインキュベーションすることにより行った。これらの細胞およびビーズは、1〜2時間、22〜37℃でインキュベーションし、引き続きビーズに付着した細胞またはビーズを貪食した細胞を磁気除去した。残存する細胞は、未操作の細胞と一緒に培養物に配置した。細胞は、枯渇の前後に細胞表現型についてフローサイトメトリーにより特徴決定した。
【０２０３】
実施例IV
フローサイトメトリー設定
収集し提示した全てのデータについて、Becton Dickinson FACSCALIBURサイトメーターを使用した。同一のデータを得るように、3色分析を行うことができるいずれかのフローサイトメーターを、経験を積んだ操作者が使用した。例えば、FACSCAN、Vantage Cell Sorter、または他のBD製品を作動し、類似データを収集した。同じくCoulter製品、例えばCoulter Epic Sorterも作動すると考えられる。
【０２０４】
以下に示した設定の機器を、これらの試験の実施に際しデータを収集するための機器形態の一般的指針として使用することができる。これらの設定を、本明細書において提供された実施例に使用した。しかし、これらの設定は改変することができ、かつ経験を積んだ機器の操作者により補償電圧および検出器電圧を適切に調節することにより改変されなければならない。同じく、異なる蛍光タグを付けた異なる検出抗体の使用は、他のチャンネル(例えば、補償)への最低の「ブリーディングオーバー」を伴う最適なシグナル分離(電圧)を提供するために、具体的機器への独自の調節を必要とする。補償対照、アイソタイプ対照の使用において良く精通し、並びにT細胞の生物学を全般的に理解している熟練した流量操作者は、以下に提示したいずれのデータも再現することができなければならない。
【０２０５】
更に様々な設定、特に電圧設定は、機器レーザーの効率に応じて変動し得ることは注意されなければならない。例えば、比較的旧型のレーザーは、新型のレーザーと同等のシグナルを発生するために、より多くの電圧が必要である。しかし、より多くまたはより少ない電圧のいずれかにより得られたデータは、生物学における同様のパターンを反映するはずである。
【０２０６】
FACSCALIBUR(商標)(Becton Dickinson)において使用される設定：
検出器/増幅器：
2006516197.tif 000017
【０２０７】
パラメーター電圧は一般に一定であるが、P3、P4およびP5は、最大シグナル分離を実現するために、わずかに上下に調節される一方で、対数モードのシグナル強度の最初のデケード(0-10)内またはその近傍に陰性対照シグナルを維持する。
【０２０８】
閾値：
一次パラメーター：FSC(前方散乱)
値：52
二次パラメーター：なし
2006516197.tif 000018
【０２０９】
提供された設定は、以下に提示されたデータのほとんどを収集するために使用された設定に近似しているが、これらの設定は変更することができ、および刺激されたT細胞に関するほぼ同等のデータが作成されるはずである。先に列記された電圧の補償に関し一般に許容される範囲を、以下に示す。
2006516197.tif 000019
【０２１０】
特定の補償値または電圧値の決定は、以下を目標とし、経験を積んだ流量操作者が行う。
1)電圧：陽性シグナルと陰性シグナルの間のシグナル分離の最大化(例えば、表面抗原マーカー陰性、対、低レベルの表面抗原、対、高レベルの表面抗原)。
2)補償：補償対照の使用による、チャンネル間干渉(ブリードオーバー)の最小化。
【０２１１】
電圧設定が変化するように、補償設定も変化する。
【０２１２】
実施例V
細胞増殖および生存率アッセイ法
細胞増殖および生存率は、標準のトリパンブルー染色、および血球計算機を使用する細胞カウントにより測定した。図5A-5B参照のこと。
【０２１３】
実施例VI
活性化マーカーアッセイ法
CD154は、一時的様式で活性化されたT細胞上に発現され、APC上のCD40によるT細胞相互作用における重要な構成要素であることが示されている。これらのふたつの受容体の相互作用の阻止は、免疫応答を効果的に変更することができ、これを遮断することさえできる。3x28常磁性ビーズによる濃縮により刺激されたT細胞のアリコートを、3日目、5日目および8日目に細胞培養物から除去し、CD154発現レベルについて分析した。CD154発現レベルは、単球が枯渇されたが3x28常磁性ビーズと共にインキュベーションされないT細胞(すなわちこれらのT細胞は、培養開始時に磁気により濃縮されない)と比較した。抗CD3および抗CD28ビーズによる磁気濃縮により刺激されたT細胞の有意な活性化は、培養開始時に同様に刺激されない細胞と比較して、培養3日目にCD154発現レベルが3倍増大することが示された(図4および7参照)。同様の方法で測定されたCD25レベル(図6)は、より高い活性化の動向を示す。
【０２１４】
一般に、マーカー発現を様々な時点にわたりモニタリングした。これに関して、細胞は、抗ヒトCD4(Immunotech, フラートン, CA)、FITC結合した抗ヒトCD11a(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD26(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD49d(Coulter)、FITC結合した抗ヒトCD54(PharmingenおよびBecton Dickinson)、FITC結合した抗ヒトCD95(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD134(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD25 Ab(Becton Dickinson, フラートン, CA)、FITC結合した抗ヒトCD69 Ab(Becton Dickinson)、FITCもしくはPE結合した抗ヒトCD154 Ab(Becton Dickinson)、またはFITCもしくはPE結合したIgG1アイソタイプ対照Abにより標識した。2x105個の細胞は、最終容量30μl中、各抗体2μlと共に、20分間4℃で標識し、洗浄し、および1％パラホルムアルデヒド(parformaldehyde)(Sigma, St. Louis, MO)中に再懸濁した。
【０２１５】
細胞表面マーカー分子発現レベルの比較は、様々な方法により行うことができ、その結果絶対値は異なる。しかしふたつの値を比較した場合、相対倍率は容易に計算することができる。例えば、異なる「活性化」法により作成されたT細胞上のCD154発現レベルは、フローサイトメトリー手段により相対精度で測定することができる。Becton Dickinsonの抗CD154-PE複合体(カタログ番号340477)のような試薬を用い、T細胞を休止状態または活性化状態で染色し、このマーカーの発現レベルを計測することができる(または別に、経験を積んだフローサイトメーター操作者には周知の手段により)。本明細書に説明された方法は、CD4+およびCD8+の両方のT細胞上のCD154の増加した発現を提供する。本明細書に説明されたように、培養開始時にT細胞を同時に刺激および濃縮することにより、発現レベルは、フローサイトメトリーを使用する平均蛍光強度(MFI)により測定し(BD FACSCaliburおよび先に説明された抗体)、標準3x28活性化により得られた値を超えて、レベルで20％の桁から100％を超え増加するよう引き上げられる。例えば未刺激のCD4+ T細胞は、CD154について陰性であり、その結果1〜10のMFI値を生じると考えられる。XCELLERATE I(商標)による活性化時には、活性化の3日後に、CD4+ T細胞上のCD154に関するMFI値は、20〜40の範囲であるが、XCELLERATE IIプロセスは、CD154のMFI値60〜200を生じる。これらはT細胞上に発現されたCD154分子の数に関する絶対値ではないが、増加した発現の相対レベルを決定するには十分である。従ってXCELLERATE I（商標）プロセスと比較し、活性化後1〜4日の間のCD154レベルのおよそ1.1〜20倍の増加が、XCELLERATE II(商標)プロセスにより示されることを明らかにすることができる。
【０２１６】
実施例VII
サイトカインアッセイ法
細胞は、前記のように調製する。様々な時点で刺激された細胞由来の上清に、製造業者(Biosource International, Sunnyvale, CA)の指示に従い、IL-2、IL-4、INF-γまたはTNF-αのELISAを施した。
【０２１７】
代替のアッセイ法において、IL-2は、フローサイトメトリーを使用する、CD4 T細胞の細胞内染色により測定した。IL-2またはIFN-γの細胞内標識について、細胞はアッセイ前に、最初に1μml Monensin(Calbiochem)と共に4時間インキュベーションした。引き続きこれらの細胞を、先に説明したように表面タンパク質について染色し、Becton Dickinson細胞内染色キットを用い固定および透過させ、PE結合した抗ヒトIL-2 AbおよびFITC結合した抗ヒトIFN-γAbまたは対応する対照Abで、製造業者の説明に従い標識した。データ獲得およびフローサイトメトリー分析は、製造業者(Becton Dickinson)のプロトコールに従い、Cellquestソフトウェアを用い、Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメーター上で行った。
【０２１８】
IFN-γ濃度は、XCELLERATE I(商標)(データは示さず)に対し、XCELLERATE II(商標)法を使用した場合、3日目に約2倍、3倍、4倍であり、場合によっては5倍より高かった。更にTNF-αレベルも、XCELLERATE I(商標)と比べ、刺激後最大5日目まで、著しく高かった(1.5〜3倍よりも高い)(データは示さず)。
【０２１９】
実施例VIII
再刺激後の表現型の細胞分析
再刺激分析に関して、約5x106個細胞を、最終日に培養物から採取した。いくつかの例において、最終日は、培養8日目であった。これらの細胞を、6ウェルプレートの1ウェル中に、前記のように、血清を伴い、およびIL-2を伴うまたは伴わない5mLのX-vivo 15培地中に配置した。約5x106個のDynabeads M-450 CD3/CD28 Tビーズを細胞を含むウェルに入れ、並びに細胞およびビーズを、37℃、5％CO2のインキュベーター内に配置した。2日後、これらの試料を除去し、生存率について試験し、FACSにより分析し、細胞サイズ、並びに細胞マーカーおよび／またはサイトカイン発現レベル、例えばCD25発現レベル、CD154発現レベルを決定した。表6は、XCELLERATE I(商標)およびXCELLERATE II(商標)プロセスが施された患者5名の試料に関する結果を示している。
【０２２０】
（表６）XCELLERATE I(商標)プロセスおよびXCELLERATE II(商標)プロセスを用い作成されたxCELLERATED T細胞に関する再刺激アッセイ法の結果
2006516197.tif 000020
【０２２１】
実施例IX
代替細胞収集および培養プロトコールXCELLERATE(商標)
ヒト血液から単離された細胞は、X-vivo培地(Biowhittaker Inc., Walkersville, MD)において増殖され、用途に応じて20U/ml IL-2(Boehringer Mannheim, インディアナポリス, IN)が補充されるかまたはされず、かつ5％ヒト血清(Biowhittaker)、2mMグルタミン(Life Technologies, ロックビル, MD)および20mM HEPES(Life Technology)が補充された。Jurkat E6-1細胞(ATCC, マナサス, VA)は、10％FBS(Biowhittaker)、2mMグルタミン(Life Technologies)、2mMペニシリン(Life Technologies)、および2mMストレプトマイシン(Life Technologies)を補充したRPMI 1640(Life Technologies)において増殖した。
【０２２２】
健常なヒト志願者ドナー由来のバッフィーコートを得た(American Red Cross, ポートランド, OR)。リンパ球分離培地(ICN Pharmaceuticals, コスタメサ, CA)を製造業者の指示に従い使用し、末梢血単核細胞(PBMC)を得た。
【０２２３】
末梢血リンパ球(PBL)は、培養フラスコ(Costar, ピッツバーグ, PA)中で、未被覆のDynabeads(Dynal, オスロ, ノルウェイ)、108個細胞/ml、2ビーズ/細胞と共に、2時間37℃でインキュベーションすることにより、PBMC画分から得た。単球およびマクロファージは、培養フラスコへの接着により除去することができる。あるいは、これらは、常磁性ビーズの貪食作用、その後の製造業者(Dynal)の指示に従う磁気細胞分離によるこれらの細胞の枯渇により、除去することができる。CD4+細胞は、10μg/mlのCD8に対するモノクローナル抗体(クローンG10-1)、CD20に対するモノクローナル抗体(クローンIF5)、CD14に対するモノクローナル抗体(クローンF13)およびCD16に対するモノクローナル抗体(Coulter)、108個細胞/mlと一緒に、4℃で20分間インキュベーションすることにより、PBL画分から精製される。洗浄後、細胞を、ヒツジ抗マウスIg結合したDynabeads(106個細胞/ml、6ビーズ/細胞、4℃で20分間)により処理し、次に磁気細胞分離により2回枯渇した。フローサイトメトリーで測定したCD4+細胞の純度は、通常91〜95％である。
【０２２４】
樹状細胞は、PBMCの培養フラスコ(Costar)への、108個細胞/ml、37℃で2時間(Dynabeads非存在)での最初の接着により生じる。過度に洗浄した後、接着細胞を、500U/ml GM-CSF(Boehringer Mannheim)および12.5U/ml IL-4(Boehringer Mannheim)を含有する培地において7日間培養する。得られる細胞集団は、弱く接着し、樹状細胞を特徴とする表面マーカーを発現している(例えば、HLA-DR、CD86、CD83、CD11cを発現し、およびCD4の発現を欠いている。)。(全ての抗体はBecton Dickinson, サンノゼ, CAから入手した)。
【０２２５】
別の技術は、組織培養プレートおよび／または組織培養フラスコ(Baxterバッグ)中で、またはRPMI、X-Vivo 15、またはいくつかの他のT細胞培養培地で構成される培地中の他の一般的培養容器中でインキュベーションされたT細胞を含有するヒト末梢血リンパ球を使用することができる。T細胞の活性化および成長は不要であるが、グルタミンおよびHEPESは、この培養培地に添加される。ウシ胎仔血清(最終10％)、ヒトA/B血清(5％)、または自家ヒト血清(5％)を、培養培地に添加する。この血清の割合は、T細胞生物学および培養結果に大きな影響を及ぼさないよう、変更することができる。場合によっては、組換えヒトIL-2が培養物に添加される。場合によっては、貪食性CD14+細胞および他の貪食性細胞は、以下に説明されたように、磁気枯渇により除去される。それらの表面上に共固定された抗CD3および抗CD28を有するビーズ(3x28ビーズ)を、ビーズ:細胞比3:1で添加する。場合によっては、3x28ビーズは、ビーズ:細胞比1:1で添加する。別の場合には、3x28ビーズを、培養の最初の5日間にわたり逐次添加し、1日目の最終比1:1、3および5日目の比1:5である。培養は、5〜7％CO2下、37℃で維持する。細胞を、14日間にわたり数回取り出し、細胞濃度(細胞数)、細胞サイズ、および様々な表面抗原のフローサイトメトリー分析により測定される細胞表面表現型を決定する。上清も培養物から収集し、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-αを含むが、これらに限定されるものではないサイトカイン分泌プロファイルを決定する。活性化された細胞は成長および分裂するので、培養物は、0.2〜2x106個CD3+ T細胞/mlで維持される。T細胞密度がおおまかに1.5x106/mlを超えた時点で、培養物を分割し、新鮮な培地を供給し、細胞密度を0.2〜1.4x106/mlの範囲とする。初回刺激後ほぼ2時間〜約14日の間に、活性化されたT細胞がより多く静止期にはいるのが認められる場合(例えば、CD25レベルが消滅し、前方散乱光により決定された細胞サイズが消滅し、細胞分裂速度が遅くなる)、細胞は、対象へ注入されるか、または下記の刺激のひとつにより再刺激される。
1)非刺激
2)フィトヘマグルチニン(PHA)2μg/ml
3)(3x28ビーズ)ビーズ/細胞比1:1
【０２２６】
細胞は再度経時的に、細胞表現型および活性化/機能状態について分析する。上清は再度、分泌されたサイトカイン分析のために収集する。
【０２２７】
細胞は異なる方法で3回刺激した：1)製造業者(Dynal)の指示に従い抗CD3抗体(OKT-3)および抗CD28(9.3)抗体(3x28ビーズ)に共有結合した、DYNABEAD(M-450)、3ビーズ/細胞、2)イオノマイシン(Calbiochem, ラホヤ, CA)(100ng/ml)およびホルボール12-ミリスチン酸-13-酢酸(PMA)(Calbiochem)(10ng/ml)、3)自家樹状細胞(25,000個樹状細胞/200,000 CD4細胞)。全ての細胞は、濃度106個細胞/mlで刺激した。増殖アッセイ法を、96ウェル平底プレートにおいて4通りで実行した。細胞は、最終容量200μl中106個細胞/mlで刺激した。増殖は、MTTアッセイ法(MTTアッセイ法キット, Chemicon International Inc., テメキュラ, CA)により3日目(刺激法1および2)または6日目(刺激法3)に測定し、結果を4通りの平均値で表した。PBL培養物または精製したCD4+細胞培養物を、3x28ビーズ、イオノマイシン/PMA、または自家樹状細胞で刺激した。
【０２２８】
図8A-8Bに示されたように、細胞数(Coulterカウンター)は、PHA、ヒツジ抗マウス(SAM)を介しビーズに付着された3x28ビーズ(ビーズ上に共固定された抗CD3および抗CD28)、ビーズに共有的に付着された抗体を伴う3x28ビーズ、またはプレートに単独もしくは二重に固定された抗体による刺激後、劇的に増加した。図9も、ビーズ上に共有的に固定された抗CD3および抗CD28、+/-単球枯渇、および+/-20UのIL-2による刺激後の細胞数の増加を明らかにしている。
【０２２９】
実施例X
磁気枯渇による単球枯渇
単球(CD14+貪食性細胞)は、T細胞調製物から、様々な「無関係」の(すなわち、非抗体で被覆されたまたは非標的抗体で被覆された)Dynalビーズを用いる磁気枯渇により除去される。枯渇は、フィコール処理した(ficolled)全血、またはアフェレーシス処理した末梢血により、ほぼ2:1のビーズ対細胞比のDynalヒツジ抗マウスM-450ビーズ、またはDynalヒト血清アルブミン被覆されたビーズ(M-450)、またはDynal エポキシ(M-450)ビーズと一緒の、22〜37℃で1〜2時間のプレインキュベーション、それに続くビーズへ付着またはビーズを貪食した細胞の磁気による除去により行った。残留する細胞は、操作していない細胞と共に培養物に配置した。細胞は、枯渇の前後に、細胞表現型について、フローサイトメトリーにより特徴決定した。図9は、単球非存在下での増加した増殖を示している。
【０２３０】
実施例XI
活性化前および活性化後の動態の経時的試験
全血またはアフェレーシス処理した末梢血のいずれかから単離されたヒトT細胞を、様々な条件下で培養した一連の実験を行った。これらの条件は以下を含む。
1)非刺激
2)フィトヘマグルチニン(PHA)2μg/mlによる刺激
3)3x28 Dynabeadsによる刺激(それらに複合した抗CD3および抗C28ビーズを有するビーズ)ビーズ対T細胞比は3:1または1:1
4)体外から投与された10U/mlの組換えヒトIL-2(5ng/ml)の存在または非存在下での刺激または培養
5)単球(CD14+貪食性細胞)の存在下での培養、または様々な「無関係」のDynabeadsを使用する前記細胞の磁気枯渇による除去後の培養。枯渇は実施例IIに例示されたように行った。
【０２３１】
以下の細胞表面マーカーを、フローサイトメトリーにより分析し、細胞表現型および活性化状態を決定した：CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD25、CD45RA、CD45RO、CD54、CD62L、CDw137(41BB)、CD154。細胞サイズも、フローサイトメトリーを介した前方散乱光プロファイルにより試験し決定した。
【０２３２】
CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD45RA、CD45ROなどのマーカーを使用し、T細胞、B細胞、および単球系統および亜集団を決定する一方、前方散乱光、CD25、CD62L、CD54、CD137、CD154を使用し、細胞の活性化状態および機能特性を決定した。
【０２３３】
T細胞を含有するヒト末梢血リンパ球を、実施例IXに説明したように調製した。細胞は、経時的に、細胞表現型および活性化/機能状態について分析した。分泌されたサイトカイン分析のために、上清を収集した。図8および9は、3x28ビーズ+/-組換えヒトIL-2(10μ/ml)、および+/-単球枯渇による活性化後の、ヒトT細胞の一般的成長特性を明らかにしている。全ての細胞は、Baxter Lifecellフラスコ(300ml)で培養した。「スケールアップ」と記したひとつのプロットは、Baxter Lifecell 3Lフラスコにまで拡大された300mlのフラスコ培養(IL-2/単球枯渇なし)を意味している。このグラフは、ヒトT細胞の、様々な条件下でのほぼ2〜4対数倍の拡大を示している。
【０２３４】
図10は、前方散乱光フローサイトメトリープロファイルにより経時的に決定された細胞サイズの動態分析を示している。T細胞は、活性化後短期間にサイズが増加し、その後サイズが減少するように見え、14日目にはそれらはより小さい前方散乱光プロファイルを示し、これはより静止状態にあることを示している。
【０２３５】
図11は、3x28ビーズ刺激後の経時的IL-2受容体(CD25)発現を示している。CD4+およびCD8+の両T細胞は、受容体レベルの早期の増加を示す。14日目までに、CD25発現レベルは大半のT細胞において大きく低下され、これはより静止状態にあることを示している。
【０２３６】
3x28刺激したT細胞は、より静止状態となる場合(低いCD25、低い前方散乱光)、これらは下記のように再刺激された。
1)非刺激
2)PHA 2μg/ml
3)1ビーズ/CD3+ T細胞での、3x28(Xcellerate)ビーズ刺激
【０２３７】
その後細胞サイズ(前方散乱光)、表面表現型、活性化マーカー発現、およびサイトカイン分泌の動態分析を行った。図12は、一次および二次刺激後の、前方散乱光(細胞サイズ)動態を示している。図13は、一次および二次刺激後の、CD25(IL-2-受容体)発現動態を示している。図16は、二次刺激後の、CD4+ T細胞(A)およびCD8+ T細胞(B)上のCD54(I-CAM)発現を示し、ここで一次刺激は、PHAまたは3x28ビーズのいずれかであり、再刺激はしないか、またはPHAもしくは3x28ビーズのいずれかによる。同じくCD4およびCD8陽性細胞間で線引きするマーカーを使用し、3x28抗体ビーズ活性化時のそれらの相対割合を決定した(図19および22)。
【０２３８】
実施例XII
共刺激したT細胞のサイトカイン発現パターンの分析
IL-2、IFN-γ、TNF-αおよびIL-4を含む様々なサイトカインは、T細胞の維持、拡大、および分化に関係するので、これらの役割は集中的に研究されている。注目すべきことに、IL-2はT細胞の維持および拡大を支持することが示されている。IFN-γは、T細胞のTH1型免疫応答個体への分化を駆動することに関与しているのに対し、IL-4は、T細胞のTH2型応答個体への駆動に関与している。PHAまたは3x28ビーズのいずれかにより活性化された初代ヒトT細胞におけるサイトカイン放出レベルは、一次刺激に対する反応および二次刺激に対する反応の動態試験を含む、実施例IXのようなT細胞の刺激により分析した。このデータは、図18A-Cおよび図23-24に示され、これらは3x28ビーズ刺激の独自の特徴を明らかにしている。初回刺激後2日目と4日目の間に(1日目は評価せず)、極めて高レベルのIL-2およびIFN-γの両方が認められた。分泌されたIL-2絶対レベルのほぼ5倍の増加が、PHAで刺激した細胞について認められたレベルと比べて、3x28ビーズ刺激したT細胞について認められた。3x28刺激したT細胞において、それらのPHA対応物と比べ、IFN-γレベルのほぼ7倍の増加も認められた。IL-4の場合、この増加は、一次刺激について劇的ではない。興味深いことに、そして恐らく大きい意義があることに、一次刺激に続けて細胞が静止し始めた後(最早分裂も前記の3種のサイトカインの分泌もしない)、これらは3x28ビーズ、PHAのいずれかにより再刺激するか、または刺激せずに放置した。3x28ビーズにより最初の活性化/拡大シグナルを受け取ったT細胞は、一次刺激後に認められたものよりもより高いレベルのIFN-γさえ分泌した。対照的に、PHAにより最初に刺激された細胞は、それらの3x28対応物について認められるものよりもはるかに低いIFN-γレベルを分泌した。同様の差異が、IL-4レベルについても認められた。
【０２３９】
これらのデータは、3x28ビーズが媒介した活性化/拡大後に得られた細胞は、PHAのような他の拡大手段から得られたものとは、機能的に異なることを示唆している。得られた細胞は、変更されたサイトカイン分泌反応を有するように見え、これはTH1およびTH2両サイトカインを非常に高いレベルに促進し、恐らくTH1型プロファイル(IFN-γ)が好ましいと思われる。培養物中のこれらのサイトカインのこのような高レベルの分泌は、多くの作用を有することができ、これは以下を含む：T細胞の抗腫瘍反応および抗ウイルス反応にとって好ましいTH1分化経路への駆動；並びに、同じく得られたT細胞の基本的機能の変更による(活性化閾値の低下、およびプログラムされた細胞死経路の阻害など)。
【０２４０】
実施例XIII
共刺激したT細胞のCD54発現の分析
図16は、二次刺激後のCD4+ T細胞(A)およびCD8+ T細胞(B)上のCD54(I-CAM)発現を示し、ここで一次刺激は、PHAまたは3x28ビーズのいずれかであり、および再刺激はしないか、またはPHAもしくは3x28ビーズのいずれかで刺激した。
【０２４１】
実施例XIV
短期間活性化マーカーアッセイ法
実施例IXに説明したように、マーカー発現を、T細胞の刺激後様々な時点でモニタリングした。これに関して、細胞は、抗ヒトCD4(Immunotech, フラートン, CA)、FITC結合した抗ヒトCD11a(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD26(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD49d(Coulter)、FITC結合した抗ヒトCD54(PharmingenおよびBecton Dickinson)、FITC結合した抗ヒトCD95(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD134(Pharmingen)、FITC結合した抗ヒトCD25 Ab(Becton Dickinson, フラートン, CA)、FITC結合した抗ヒトCD69 Ab(Becton Dickinson)、FITC結合もしくはPE結合した抗ヒトCD154 Ab(Becton Dickinson)、またはFITC結合もしくはPE結合したIgG1アイソタイプ対照Abにより標識した。2x105個の細胞は、最終容量30μl中、各抗体2μlと共に20分間4℃で標識し、洗浄し、および1％パラホルムアルデヒド(Sigma, セントルイス, MO)中に再懸濁した。図21-22、および26A-26Lを参照し、これらの図は、CD4+細胞およびCD8+細胞の間に加え、活性化の時間にわたっても、有意差が認められることを明らかにしている。
【０２４２】
実施例XV
CD3:CD28比の変動を用いるT細胞拡大
3x28 DYNABEADS(登録商標)M-450上のCD3:CD28比の変動する濃度を用い、T細胞拡大を評価した。本明細書に説明された実験において、XCELLERATE II(商標)と称されるプロセスを、実施例Iに説明したように使用した。図27に示したように、驚くべきことに、ビーズ上のCD3:CD28比の1:10で、培養の8日後に約68倍の拡大が認められた。ビーズ上のCD3:CD28比の1:3で、培養の8日後にT細胞の35倍の拡大が認められた。1:1の比で、約24倍の拡大が認められた。
【０２４３】
実施例XVI
陽性選択のための変動するビーズ:T細胞比、それに続く変動量のビーズの逐次添加を使用するT細胞拡大
本実施例は、最初の10日間の刺激による陽性選択および最適なT細胞拡大のための、最も効率的なビーズ:T細胞比を決定するための、EXCELLERATE II(商標)プロセス(実施例I参照)の改変を説明する。
【０２４４】
第一の実験において、3x28ビーズ:細胞の比1:1で陽性選択され、並びに最初の10日間の刺激において逐次添加された3x28ビーズの変動する比で刺激された細胞の比較を行った。細胞は、3x28 DYNABEADS(登録商標)M-450により、ビーズ:T細胞の比3:1および1:1で陽性選択した。 3:1の比に関して、20x106個の細胞(50〜60％T細胞と推定される)を単離し、1ml PBS＋5％ヒト血清中に再懸濁した。30x106個の洗浄したビーズを、総容積2mlに添加した。1:1の比について、10x106個の洗浄したビーズを、合計10x106個の細胞に添加した。これらの細胞を、T-25フラスコにおいて培養し、3日目に計測し、容量5mlの6ウェルプレートに分割した。5日目に、全てのウェルを、1.25x106個細胞/ウェルに分割した。3、4および6-9日目に、全てのウェルを、2.5x106個細胞/ウェルに分割した。その後3x28ビーズを、これらの陽性選択された細胞に1:1のビーズ:細胞比で逐次添加した。表7にまとめたように、最終比0.2:1での3、4および5日目のビーズの逐次添加により、細胞は10日目に最高の収量を得た。
【０２４５】
（表７）変動する逐次3x28ビーズ添加後の10日目の細胞収量
陽性選択比(ビーズ:細胞)、逐次添加されたビーズ比(ビーズ:細胞)、10日目の細胞収量(x106)
2006516197.tif 000021
【０２４６】
第二の実験において、陽性選択の時間は0.5〜1.0時間を変動し、かつビーズ:細胞比は3:1から1:1へ変動した。表8にまとめたように、10日目の最高の細胞収量が、1:1のビーズ:細胞比で60分間の選択、並びに3および5日目の0.2:1の比でのビーズの逐次添加により得られた。しかし、ビーズ:細胞比の3:1での30分間の選択は、最高の陽性選択収量を生じることは注意しなければならない。
【０２４７】
（表８）様々な陽性選択比、時間、および逐次3x28ビーズ添加後の10日目の細胞収量
2006516197.tif 000022
【０２４８】
実施例XVII
XCELLERATE IIおよびWave Bioreactorを使用するT細胞拡大
本実施例は、XCELLERATE IIbプロセス、それに続くWave Bioreactorへの細胞の播種を用いるT細胞拡大を説明している。
【０２４９】
Xcellerateプロセスの0日目−本質的に実施例Iに説明されたようなXcellerateプロセスの1日目に、必要な数の低温保存したCryocte(商標)容器を、貯蔵用フリーザーから取り出し、解凍、洗浄および濾過した。
【０２５０】
0日目−その後0.5x109個CD3+細胞を含むある容量の細胞を、Dynabeads M-450 CD3/CD28 Tと、3:1のDynabeads M-450 CD3/CD28 T細胞：CD3+ T細胞の比で混合し、回転しながらインキュベーションした。インキュベーション後、CD3+ T細胞を磁気により濃縮し、同時に活性化した。このCD3+ T細胞を次に、LifeCell細胞培養バッグ中の完全培地中に再懸濁した。この細胞およびビーズを含むバッグを次に、患者専用の(dedicated)インキュベーター(37℃、5％CO2)中に入れた。
【０２５１】
3日目またはその前後−CD3+細胞を、最大3日間培養拡大し、この時点で1個のバッグの内容物を、4個の新規Lifecellバッグに分割した。次にこれらの4個のバッグを、患者専用のインキュベーター(37℃、5％CO2)に戻した。
【０２５２】
5日目またはその前後−CD3+細胞を、更に最大2日間培養拡大し、この時点で培養バッグ中の内容物を、10Lの容量の培地を含む20L Wave Bioreactorに播種した。次にこれらの細胞を、揺動は15回/分および灌流は1ml/分で、37℃、5％CO2で培養した。
【０２５３】
細胞数は、毎日決定し、かつ静的Xcellerate IIプロセスを用い刺激および拡大した細胞と比較した。図28に示したように、拡大は、細胞をWave Bioreactorにおいて培養した場合に劇的に改善した。更に細胞密度は、静的Xcellerate IIプロセスにおいて観察された最大細胞濃度5x106個と比べ、Wave Bioreactorにおいて50x106個細胞/mlと高かった。総細胞数約8000億が、Wave Bioreactorを用い、出発細胞数約0.5x109個胞から12日間の培養で実現された。
【０２５４】
従って、Wave Bioreactorは、この拡大プロセスに予想外の劇的改善を提供する。更にWave Bioreactorを用い、これまで観察されない細胞密度および最終の絶対細胞収量が達成された。
【０２５５】
実施例XVIII
Wave Bioreactorを使用するT細胞拡大の代替プロトコール
Wave Bioreactorまたは同等のバイオリアクターシステムを用いる代替のT細胞の刺激/活性化および拡大戦略が、高い細胞密度および高い最終の細胞収量を実現するために開発されている。
【０２５６】
ひとつの戦略において、細胞は解凍され、洗浄され、およびXcellerate IIプロセスにおいて説明されたように陽性選択が開始される。陽性選択された細胞は、Rockerプラットフォーム上の2LのWaveバッグ中に移される。この容量は、完全培地を出口チューブからバッグ内に導入することにより、1Lに増加される。次にこのバッグは、Waveプラットフォーム上で、揺動することなく、37℃、5％CO2でインキュベーションされる。3日目に、緩やかな揺動(5〜10回/分)が開始される。4〜5日目に、その内容物が、20LのWaveバッグに移され、その容量は4Lに増加される。液体送達システムは、バッグの容量を1日に2L増加するように設定される。7〜8日目に、約0.5〜3ml/分で灌流が開始され、出口ポンプは、10Lのバッグ容量を維持するように設定される。9日目から12日目に、細胞は回収される。液体送達システムは遮断され、上清5Lが出口ポンプを通り除去される。角型磁石(angular magnet)は、出力ラインに取付けられる。拡大された細胞生成物は、20Lバッグからトランスファーパックへ流れ出ることができる。ビーズ除去した拡大された細胞生成物は、処理され、低温保存される。
【０２５７】
代替の戦略において、細胞は解凍および洗浄され、Xcellerate IIプロセスに説明されるように、しかし細胞およびビーズ濃度は2倍で、陽性選択される。陽性選択された細胞は、rockerプラットフォーム上の20LのWaveバッグに移される。この容量は、出口チューブを介したバッグへの完全培地の導入により、2Lへ増加される。その後このバッグは、Waveプラットフォーム上で、揺動することなく、37℃、5％CO2でインキュベーションされる。3日目に、緩やかな揺動(5〜10回/分)が開始され、容量は6Lに増加される。4日目に、液体送達システムが、バッグの容量を1日に2L増加するように設定される。6日目に、約0.5〜3ml/分で灌流が開始され、出口ポンプは、10Lのバッグ容量を維持するように設定される。9日目から12日目に、細胞は回収される。液体送達システムは遮断され、上清5Lが出口ポンプを通り除去される。角型磁石は、出力ラインに取付けられる。拡大された細胞生成物は、20Lバッグからトランスファーパックへ流れ出ることができる。ビーズ除去した拡大された細胞生成物は、処理され、低温保存される。
【０２５８】
実施例XIX
変動するビーズ:細胞比は記憶CD8 T細胞を選択的拡大または欠損することができる
本実施例は、ビーズ:細胞比が、様々なT細胞集団の拡大に対し際だった作用を有し得ることを示している。特に高いビーズ:細胞比(3:1〜10:1)は、抗原特異的T細胞の死を誘導する傾向があるのに対し、低いビーズ:細胞比(1:1〜1:10)は、抗原特異的T細胞の拡大につながる。更に以下に説明されたデータは、低いビーズ:細胞比は、更にポリクローナル細胞集団の改善された細胞拡大にもつながることを説明している。従って本実施例は、低いビーズ:細胞比が全般的細胞拡大を改善することを示している。
【０２５９】
細胞は、本質的に実施例Iに説明されたように、調製し、XCELLERATE I(商標)プロセスを用い刺激した。播種および培養の前に、下記表9にまとめたように、単球枯渇した細胞を、30分間、変動量のビーズと共に回転することにより混合した。本実施例において使用したビーズは、ビーズに結合したCD3:CD28抗体比が1:1である、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tを含んだ。
【０２６０】
（表９）変動するビーズ:細胞比は記憶CD8 T細胞を選択的に拡大または欠損する
ビーズ:細胞比、増加倍率
2006516197.tif 000023
【０２６１】
表9にまとめおよび図29に図示した結果は、抗原特異的T細胞は、高いビーズ:細胞比を使用することにより選択的に欠損し、並びに低いビーズ:細胞比を使用し拡大することができることを明らかにしている。理論に結びつけられるものではないが、抗原特異的T細胞は更なる刺激に対し感受性があると考えられる。高いビーズ:細胞比による刺激は、抗体を刺激し、抗原特異的T細胞の過剰刺激につながり、アポトーシスまたは他の機構のいずれかによりそれらを死滅する高い濃度を提供する。低いビーズ:細胞比の使用は、過剰刺激しないが、むしろこれらの細胞の迅速な増殖を誘導する抗原特異的T細胞に対する刺激シグナルを提供する。低いビーズ:細胞比を使用する増殖の増加は、T細胞のポリクローナル集団においても認められる。特にこれらの結果は、1:1のビーズ:細胞比は、ポリクローナルT細胞拡大にとって最適であることを示している。
【０２６２】
従って、本実施例において、望ましい結果に応じた異なるビーズ:細胞比の使用を支持する証拠が提供される。抗原特異的T細胞の拡大に関しては、低いビーズ:細胞比が好ましい。高いビーズ:細胞比は、抗原特異的T細胞の欠損が望ましい結果である場合に、好ましい。
【０２６３】
実施例XX
XCELLERATE(商標)IIIプロセス
本実施例は、XCELLERATE(商標)IIIプロセスと称されるものを用いて実行された更なる定量試験を説明する。このプロセスは、本質的に、実施例XVIIおよびXVIIIにおいて説明される。簡単に述べると、PBMC白血球搬出生成物は、XCELLERATE(商標)IIプロセスについて説明されたように処理される。しかし、磁気により濃縮されたCD3+ T細胞は、組換えIL-2の存在下、X-VIVO(商標)15(フェノールレッド非含有およびゲンタマイシン非含有)培地中、揺動プラットフォーム(Wave Bioreactor(商標)20XEプラットフォーム, Wave Biotech, ブリッジウォーター, NJなど)の上の、20Lの培養バッグ(20L Cellbag(商標), Wave Biotech, ブリッジウォーター, NJなど)に移される。T細胞は、揺動運動および灌流しながら、37℃で10日間を超えて、活性化および拡大する。その後Xcyte(商標)Dynabeads(登録商標)を除去し、XCELLERATED(商標)T細胞を回収し、製剤し、低温保存する。
【０２６４】
XCELLERATE(商標)IIIプロセスは、健常なドナー由来のPBMCアフェレーシス生成物を用いて、開発した。GMP製造作業において使用するための開発およびその後の適格性評価時に、健常なドナーにより、XCELLERATE(商標)IIIプロセスを、静的XCELLERATE(商標)IIプロセスと比較した。表10に示したように、異なるプロセスにより生成された最終XCELLERATED(商標)T細胞製品の純度および生存率は、非常に類似していた。しかしXCELLERATE(商標)IIIプロセスにより活性化された細胞密度は、XCELLERATE(商標)IIプロセスにおけるものよりも5倍高く、10Lの容量において収量188±50x109個のXCELLERATED(商標)T細胞を生じたのに対し、60Lの容量において223.2±47.4x109個のXCELLERATED(商標)T細胞を生じた。XCELLERATE(商標)IIIプロセスによる小さい容量中のXCELLERATED(商標)T細胞の高い収量は、(a)過剰な労役の減少；(b)60個から1個への、必要な培養容器数の減少；(c)無菌の継手の数の減少、および(d)60Lから10Lへの、プロセス容量の減少を含む一方、(a)4倍またはそれ以上の、最終細胞濃度の増加、および(b)2倍の設備処理能力の増加を含む、多くの有効性を可能にする。加えて商品コストの著しい低下も存在する。
【０２６５】
（表１０）健常なドナーを使用する静的XCELLERATE(商標)IIプロセスおよびWave Bioreactorを用いるXCELLERATE(商標)IIIプロセスにより生成されたXCELLERATED(商標)T細胞の収量、純度および生存率の比較
2006516197.tif 000024
XCELLERATED(商標)T細胞は、XCELLERATE(商標)IIプロセスまたはXCELLERATE(商標)IIIプロセスのいずれかを用い、健常なドナーのPBMCから製造した(n=10)。回収前に、培養物を、細胞数、生存率、およびCD3+ T細胞の純度について評価した。CD3+ T細胞の密度および収量は、これらの値から算出した。
【０２６６】
エキソビボにおけるXCELLERATE(商標)プロセスでの活性化時に、T細胞は、リンパ節におけるナイーブ休止T細胞の初回刺激および活性化時に認められるものに匹敵している、生理的、生物学的および表現型の変更を受ける。これらの特徴は、エキソビボ XCELLERATE(商標)プロセス時のT細胞の活性化をモニタリングする有用な工程内の道具を提供する。図30および31に示されるように、細胞サイズ、CD25発現、CD154発現およびサイトカイン発現により決定されるXCELLERATE(商標)IIIプロセスにおけるT細胞の活性化は、XCELLERATE(商標)IIプロセスにおけるものと非常に類似している。図32および33に示されるように、臨床試験のためにGMP製造時に多発性骨髄腫患者について観察された工程内動態および活性化の大きさは、本質的に同じである。最終生成物の組成に関して、純度、生存率およびCD4+ヘルパーT細胞:CD8+細胞傷害性T細胞の比は、異なるプロセスを用いて製造されたXCELLERATED(商標)T細胞に密に類似している。
【０２６７】
活性化されたT細胞の再刺激は、効果的免疫応答時の天然の生物学的現象であるので、再刺激アッセイ法を用い、XCELLERATED(商標)T細胞のインビトロ生物学的活性を評価した。このアッセイ法において、XCELLERATED(商標)T細胞は、XR-CD3およびXR-CD28により再刺激されるか、またはホルボールミリスチン酸酢酸(PMA)/イオノマイシンにより刺激されるにのいずれかであり、並びにサイトカイン分泌の上方制御、CD25発現およびCD154発現を測定した。図34の結果は、驚くべきことに、再刺激時に、バイオリアクターを用いるXCELLERATE(商標)IIIプロセスにおいて生成されたXCELLERATED(商標)T細胞は、静的XCELLERATE(商標)IIプロセスにおいて生成されたものよりも、より高いレベルのサイトカイン分泌、並びにより大きいCD154およびCD25の上方制御/誘導をもたらすことを示している。加えて、XCELLERATE(商標)IIIプロセスを用いて製造されたXCELLERATED(商標)T細胞のインビトロ生物学的活性の増大は、多発性骨髄腫患者への注入後の増加したインビボ生物学的作用と相関するように見える(図35)。
【０２６８】
T細胞表面に発現されたT細胞受容体の多様性の減少が、多くの疾患の患者末梢血において認められ、これは癌
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、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(Gorochov G, et al., Nature Med, 1998:4;215-221)、および自己免疫疾患
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を含む。このT細胞受容体のスペクトルの縮小は、T細胞の広範な抗原の認識能を狭め、このことは、癌および感染症に反応するおよびこれらを排除する患者の能力を低下する。XCELLERATE(商標)技術の狭いT細胞レパートリーの多様性を広げる能力は、先に慢性リンパ球性白血病(CLL)患者において明らかにされている(例えば、米国特許出願第10/360507号参照)。XCELLERATE(商標)IIプロセスおよびXCELLERATE(商標)IIIプロセスの両方が、本臨床試験において今日までに処理されたほとんど全ての多発性骨髄腫患者に関して、出発PBMCの特徴である狭い歪曲されたパターンから、広範なT細胞受容体レパートリーを回復している。
【０２６９】
今日までに、いずれかのプロセスにより製造されたXCELLERATED(商標)T細胞の多発性骨髄腫患者への注入は、良く許容されており、重篤な有害現象または毒性はない。先の臨床試験は、高用量の化学療法および自家幹細胞移植(T細胞注入なし)後の14日目またはそれ以前の末梢血リンパ球数の≧500/mm3の回復は、生存の増加に相関することを示した。図35に示したように、XCELLERATED(商標)T細胞の注入は、化学療法および自家幹細胞移植後4〜5日目までの(XCELLERATED(商標)T細胞の注入後1〜2日)、末梢血リンパ球の＞500/mm3の非常に迅速な回復につながり、これは長期間維持される。
【０２７０】
驚くべきことに、図35のデータは、末梢血リンパ球数の回復は、事実上、XCELLERATE(商標)IIIプロセスを用いて製造されたXCELLERATED(商標)T細胞の注入後(今日までn=10の患者に注入された)の方が、XCELLERATE(商標)IIプロセスを用い製造されたもの(n=18の患者に注入された)と比べ、より迅速であることを示している。これらのデータは、XCELLERATE(商標)IIIプロセスの開発および適格性評価時に健常なドナーについて認められたより高いインビトロ生物学的活性と相関し、かつWave Bioreactor(商標)を用いて製造されたXCELLERATED(商標)T細胞は、改善された生物学的活性を有し得ることを示唆している。
【０２７１】
本明細書において参照され、および／または出願データシートに列記された、前記米国特許、米国特許出願公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献は全て、それらの全体が本明細書に参照として組入れられており、これらは以下を含むが、これらに限定されるものではない。2001年9月20日に出願された米国特許出願第09/960,264号；これは2001年2月26日に出願された米国特許出願第09/794,230号の一部係属出願であり；これは2000年2月24日に出願された米国特許仮出願第60/184,788号、および2000年11月17日に出願された同第60/249,902号の恩恵を主張するものである。
【０２７２】
前記のことから、本発明の具体的態様は例証を目的として説明されており、本発明の精神および範囲を逸脱しない限りは、様々な修飾を行うことができることは理解されると思われる。従って本発明は、添付された「特許請求の範囲」以外に、限定されるものではない。先に引用された全ての参考文献、特許、特許出願などは、それらの全体が本明細書に参照として組入れられている。更に本明細書において引用された全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数を明確に含む。
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】出発時約0.5x109個T細胞の、8日目に測定された、磁気濃縮および刺激の存在(XCELLERATE II(商標))または非存在(XCELLERATE I(商標))で、活性化されおよび拡大されたT細胞の総数を比較する、プロットである。
【図２】8日目に測定された、磁気濃縮および刺激の存在(XCELLERATE II(商標))または非存在(XCELLERATE I(商標))で、活性化されおよび拡大されたT細胞の拡大倍率を比較するプロットである。
【図３】磁気濃縮および刺激(XCELLERATE II(商標))後または磁気濃縮および刺激の非存在下(XCELLERATE I(商標))で、8日間予め培養したT細胞の再刺激を比較する、CD154発現のフローサイトメトリー分析を表すプロットである。
【図４】磁気濃縮および刺激(XCELLERATE II(商標))を、磁気濃縮および刺激の非存在下(XCELLERATE I(商標))で活性化された細胞と比較する、3日間培養した後の、CD154発現のフローサイトメトリー分析を表すプロットである。
【図５】XCELLERATE I(商標)プロセスを開始するために、XCELLERATE I(商標)PBMC(5A)または凍結解凍されたPBMC(5B)による、T細胞の活性化および拡大を示すプロットである。
【図６】XCELLERATE IまたはII(商標)プロセス時の1種のドナー試料(PC071)におけるT細胞活性化後のCD25発現の経時分析を示すプロットである。インビボ活性化をシミュレーションするために、8日目時点(mark)で再刺激を行った。図6Aは、CD4+細胞上のCD25発現を示すのに対し、図6Bは、CD8+細胞上のCD25発現を示している。
【図７】XCELLERATE IまたはII(商標)プロセス時の、1種のドナー試料(PC071)におけるT細胞活性化後のCD154発現の経時変化分析を示すプロットである。インビボ活性化をシミュレーションするために、8日目時点で再刺激を行った。図7Aは、CD4+細胞上のCD154発現を示すのに対し、図7Bは、CD8+細胞上のCD154発現を示している。
【図８】実施例IXに示したプロセスを使用する、抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる刺激後の、ヒト末梢血T細胞の増殖を図示するプロットである。
【図９】+/-組換えヒトIL-2の10u/ml、および+/-単球枯渇で、抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズで刺激した後の、ヒト末梢血T細胞の成長を図示するプロットである。全ての細胞は、Baxter Lifecellフラスコ(300ml)中で培養した。スケールアップは、最大Baxter Lifecell 3Lフラスコに拡大した300mlフラスコ培養(IL-2/単球枯渇なし)を意味する。
【図１０】経時的前方散乱光フローサイトメトリープロファイルにより決定された細胞サイズの動態分析を明らかにするプロットである。
【図１１】抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる初回刺激後の経時的CD25発現を示すプロットである。図11Aは、CD4+細胞上のCD25発現プロファイルを示すのに対し、図11Bは、CD8+細胞上のCD25発現を示している。
【図１２】一次および二次刺激後の経時的前方散乱光フローサイトメトリープロファイルにより決定された細胞サイズの変化を 図示するプロットである。
【図１３】一次および二次刺激後の経時的CD25発現を表すプロットである。図13Aは、CD4+細胞上のCD25発現プロファイルを示すのに対し、図13Bは、CD8+細胞上のCD25発現を示している。
【図１４】二次刺激後のCD154発現を表すフローサイトメトリーデータのプロットであり、ここで一次および二次刺激源は様々であった。図14Aは、CD4+細胞上のCD154発現プロファイルを示すのに対し、図14Bは、CD8+細胞上のCD154発現を示している。
【図１５】二次刺激後の試料中の全ての拡大されたT細胞上のCD137発現を表す、フローサイトメトリーデータのプロットである。
【図１６】二次刺激後のCD54発現を表すフローサイトメトリーデータのプロットであり、ここで二次刺激供給源は様々であった。図16Aは、CD4+細胞上のCD54発現プロファイルを示すのに対し、図16Bは、CD8+細胞上のCD54発現を示している。
【図１７】細胞表現型に加え、B細胞慢性リンパ球性白血病の患者から得たT細胞の抗CD3および抗CD28結合したビーズによる二次刺激後のCD154およびCD137発現を表すフローサイトメトリーデータのプロットである。図17Aおよび17Bは、抗CD3および抗CD28結合したビーズによる刺激後13日の(17A)、並びに抗CD3および抗CD28結合したビーズによる一次刺激後18日および二次刺激後7日の(17B)試料中に存在するCD4+およびCD8+細胞を表す。図17Cおよび17Dは、B細胞慢性リンパ球性白血病の患者から得た細胞の二次刺激後のCD154およびCD137発現を表すフローサイトメトリーデータのプロットである。
【図１８】健常ドナー由来のT細胞の一次および二次刺激後の、IL-2(18A)、インターフェロンγ(IFN-γ)(18B)、およびIL-4(18C)の経時的発現を表すプロットである。
【図１９】抗CD3および抗CD28結合したビーズによる刺激後のCD62Lの経時的発現を表すプロットである。
【図２０】抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる刺激後のCD4またはCD8細胞の割合を示すプロットである。
【図２１】各々、抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる刺激、並びに実施例IXのプロセスを使用する+/-再刺激後の、CD25およびCD154発現の平均蛍光強度の関数としての、フローサイトメトリーデータを表すプロットである。
【図２２】抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズ刺激の前の、CD4およびCD8の両亜集団(22A)またはCD4濃縮集団(22B)を伴う細胞におけるCD154染色、対、対照染色(例えば、バックグランド)のフローサイトメトリー分析を表すプロットである。
【図２３】抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる末梢血リンパ球の刺激後の、培地中のTNF-α(23A)およびIFN-γ(23B)のELISA分析を表すプロットである。
【図２４】抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる末梢血リンパ球の刺激後の、培地中のIL-4(24A)およびIL-2(24B)のELISA分析を表すプロットである。
【図２５】抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる末梢血リンパ球の刺激後の、前方散乱光分析を用いる、T細胞サイズの増加を示すプロットである。
【図２６】CD62L(平均蛍光強度、MFI)(26A)、CD49d(MFI)(26B)、CD25(MFI)(26C)、CD69(MFI)(26D)、CD154(MFI)(26E)の発現、前方光散乱(サイズ)(26F)、生存率(％生存ゲート)(26G)のフローサイトメトリーデータを表す棒グラフである；全て、抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる刺激、並びに8日目の前記による再刺激後である。図26H-26Lは、各々、刺激後4および18時間の、CD62L、CD69、CD49d、CD154、およびCD25を示す。
【図２７】変動するCD3:CD28の比での、抗CD3および抗CD28が共固定されたビーズによる刺激後の、経時的T細胞の増加倍率を示すグラフである。
【図２８】静的システムにおけるT細胞の拡大を、Wave Bioreactor中のT細胞の拡大と比較するグラフである。
【図２９】変動するビーズ:細胞比を使用する、ポリクローン性T細胞の増加倍率を、CMV pp65 A2-テトラマー+(抗原特異的)T細胞の増加倍率と比較するグラフである。黒色棒は、ポリクローン性T細胞を表す。縦線棒は、CMV特異的T細胞を表す。
【図３０】静的XCELLERATE(商標)IIプロセスおよびWave Bioreactorを用いるXCELLERATE(商標)IIIプロセス時の工程内におけるT細胞活性化マーカーの比較を示すグラフである。
【図３１】静的XCELLERATE(商標)II プロセスおよびWave Bioreactorを用いるXCELLERATE(商標)IIIプロセス時の工程内可溶性サイトカイン濃度の比較を示すグラフである。
【図３２】静的XCELLERATE(商標)IIプロセスおよびWave Bioreactorを用いるXCELLERATE(商標)IIIプロセスを使用する多発性骨髄腫患者への注入のためのXCELLERATED(商標)T細胞の製造時の、工程内のT細胞活性化の比較を示すグラフである。
【図３３】多発性骨髄腫患者の治療のため、Xcellerate IIプロセスおよびXcellerate IIIプロセスを使用する、XcellerateされたT細胞の製造時の、工程内可溶性サイトカイン濃度の比較を示すグラフである。
【図３４】インビトロ再刺激後の、静的Xcellerate IIプロセス(n=3)およびWave Bioreactorを用いるXcellerate IIIプロセス(n=5)を使用し製造されたXcellerated T細胞の生物学的活性の比較を示す棒グラフである。
【図３５】Xcellerated T細胞の単回注入を伴う(Xcellerate IIプロセスまたはXcellerate IIIプロセス)または伴わない(対照)高用量化学療法、自家幹細胞移植後の、多発性骨髄腫(nyeloma)患者におけるリンパ球回復を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
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【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
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【図２６Ｉ】
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【図２６Ｊ】
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【図２６Ｋ】
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【図２６Ｌ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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