(57)【要約】メゾテリンは免疫療法の標的として用いることが可能であり、細胞溶解性T細胞応答を誘導する。そのような応答を誘導するメゾテリンの部分を同定する。ワクチンはポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかに基づいたものでありうる。細胞溶解性T細胞応答を高めるための担体には細菌およびウイルスが含まれる。ワクチンならびに他の抗腫瘍療法および予防法を試験するためのマウスモデルは、強力にメゾテリンを発現する、形質転換された腹腔細胞株を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリン（mesothelin）を過剰発現する腫瘍へのT細胞応答の誘導法：
該腫瘍を有する、または該腫瘍を切除した患者に、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドを含むワクチン（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）を投与する段階。
【請求項２】
腫瘍が卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、および扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が膵臓癌である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が卵巣癌である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
エピトープが下記からなる群より選択される、請求項1記載の方法：
2006521090.tif 000026
【請求項６】
ポリペプチドが成熟メゾテリンである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドがメゾテリンの一次翻訳産物である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドの混合物を投与する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ポリペプチドがMHCクラスI分子の複数の対立形質体に結合する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドがMHCクラスI分子の単一の対立形質体に結合する、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが1つのアルゴリズムを用いてMHCクラスI結合エピトープであるように選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが2つのアルゴリズムを用いてMHCクラスI結合エピトープであるように選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
T細胞応答が特異的CD8+ T細胞の誘導である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ワクチンが無細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
ワクチンがフレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される細菌を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍の退行を誘導するのに十分な量でワクチンを投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍切除後に患者を腫瘍のない状態に維持するのに十分な量でワクチンを投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
下記の段階を含む、腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍へのT細胞応答の誘導法：
該腫瘍を有する、または該腫瘍を切除した患者に、メゾテリンのMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含むワクチン（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）を投与する段階。
【請求項１９】
下記の段階を含む、腫瘍細胞の由来元である正常細胞に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍細胞へのT細胞応答の誘導法：
メゾテリンを過剰発現する腫瘍発生のリスクが高い患者に、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープまたはメゾテリンのMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含むワクチン（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）を投与する段階。
【請求項２０】
患者が腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍を誘導することが知られている発癌物質に曝露された、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
発癌物質がアスベストである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
下記の段階を含む、腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍へのT細胞応答の誘導法：
該腫瘍を有する、または該腫瘍を切除した患者に、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド含むワクチン（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）を投与する段階を含む方法。
【請求項２３】
腫瘍が卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、および扁平上皮癌からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍が膵臓癌である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍が卵巣癌である、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
エピトープが下記からなる群より選択される、請求項22記載の方法：
2006521090.tif 000027
【請求項２７】
ポリペプチドが成熟メゾテリンである、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドがメゾテリンの一次翻訳産物である、請求項22記載の方法。
【請求項２９】
ワクチンがポリペプチドの混合物をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドを含む、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドがMHCクラスI分子の複数の対立形質体に結合する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
ポリペプチドがMHCクラスI分子の単一の対立形質体に結合する、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドが1つのアルゴリズムを用いてMHCクラスI結合エピトープであるように選択される、請求項22記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドが2つのアルゴリズムを用いてMHCクラスI結合エピトープであるように選択される、請求項22記載の方法。
【請求項３４】
T細胞応答が特異的CD8+ T細胞の誘導である、請求項22記載の方法。
【請求項３５】
ワクチンが無細胞である、請求項22記載の方法。
【請求項３６】
ワクチンがフレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される細菌を含む、請求項22記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍の退行を誘導するのに十分な量でワクチンを投与する、請求項22記載の方法。
【請求項３８】
腫瘍切除後に患者を腫瘍のない状態に維持するのに十分な量でワクチンを投与する、請求項22記載の方法。
【請求項３９】
下記の段階を含む、腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍へのT細胞応答の誘導法：
該腫瘍を有する、または該腫瘍を切除した患者に、メゾテリンのMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチン（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）を投与する段階。
【請求項４０】
下記の段階を含む、腫瘍細胞の由来元である正常細胞に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍細胞へのT細胞応答の誘導法：
メゾテリンを過剰発現する腫瘍発生のリスクが高い患者に、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープまたはメゾテリンのMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチン（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）を投与する段階。
【請求項４１】
患者が腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍を誘導することが知られている発癌物質に曝露された、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
発癌物質がアスベストである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
下記の段階を含む、抗腫瘍ワクチンの候補として有用な免疫原の同定法：
腫瘍によって発現され、腫瘍由来元の正常組織によって最小限に発現される、または発現されないタンパク質を選択する段階；
該タンパク質を含むワクチンを接種したヒトのリンパ球を試験して、該リンパ球が該タンパク質に特異的なCD8+ T細胞またはCD4+ T細胞（該CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞の存在は、タンパク質が抗腫瘍ワクチンとして用いるための候補であることを示す)を含むかどうかを調べる段階。
【請求項４４】
ヒトが抗腫瘍免疫応答を示している、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
ワクチンが全腫瘍細胞を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
抗腫瘍免疫応答が、ワクチン接種を受けていない類似の個体群に比べて、外科的腫瘍切除後の無疾患生存の延長を引き起こす、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
抗腫瘍免疫応答が腫瘍の退行を引き起こす、請求項44記載の方法。
【請求項４８】
抗腫瘍免疫応答が生存期間の延長を引き起こす、請求項44記載の方法。
【請求項４９】
抗腫瘍免疫応答が自己腫瘍細胞に対する遅延型過敏である、請求項44記載の方法。
【請求項５０】
リンパ球を試験して、それらがワクチンによって発現されない抗原に特異的なCD8+ T細胞またはCD4+ T細胞を含むかどうかも調べる、請求項43記載の方法。
【請求項５１】
ヒトをそのワクチンへの応答に基づいて第1群は応答者を含み、第2群は非応答者を含む2群に分割し、前記CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞が非応答者よりも応答者でより高頻度に認められる場合、タンパク質は抗腫瘍ワクチンにおいて有用である可能性が高いと同定される、請求項43記載の方法。
【請求項５２】
応答者は自己腫瘍細胞へのDTH応答を示すが、非応答者は応答を示さない、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
応答者は非応答者よりも無疾患生存の期間が長い、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
下記の段階を含む、腫瘍ワクチン接種を受けた患者における、少なくとも一つのメゾテリンのT細胞エピトープを含む腫瘍ワクチンへの将来の応答の予測法：
患者のリンパ球を試験して、リンパ球がメゾテリンに特異的なCD8+ T細胞またはCD4+ T細胞（該CD8+ T細胞またはCD4+ T細胞の存在により、該CD8+ T細胞がない場合よりも長い生存期間が予測される）を含むかどうかを調べる段階。
【請求項５５】
ワクチンが全腫瘍細胞を含む、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
ワクチンが膵臓腫瘍細胞を含み、抗原がメゾテリンである、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
ワクチンが卵巣腫瘍細胞を含み、抗原がメゾテリンである、請求項54記載の方法。
【請求項５８】
ワクチンが中皮腫細胞を含み、抗原がメゾテリンである、請求項54記載の方法。
【請求項５９】
下記を含む、CD8+T細胞またはCD4+T細胞応答を誘導するワクチン：
メゾテリンのMHCクラスIまたはクラスII結合エピトープを含むポリペプチド（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのCD8+T細胞またはCD4+T細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）；および
CD8+T細胞またはCD4+T細胞免疫応答を刺激するための担体。
【請求項６０】
ポリペプチドがMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項59記載のワクチン。
【請求項６１】
ポリペプチドが6から20の間のアミノ酸残基を含む、請求項59記載のワクチン。
【請求項６２】
ポリペプチドが下記からなる群より選択されるエピトープを含む、請求項59記載のワクチン：
2006521090.tif 000028
【請求項６３】
担体がCD40/CD40リガンドである、請求項59記載のワクチン。
【請求項６４】
担体がOX-40/OX-40リガンドである、請求項59記載のワクチン。
【請求項６５】
担体がCTLA-4アンタゴニストである、請求項59記載のワクチン。
【請求項６６】
担体がGM-CSFである、請求項59記載のワクチン。
【請求項６７】
下記を含む、CD8+T細胞またはCD4+T細胞応答を誘導するワクチン：
メゾテリンのMHCクラスIまたはクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合し、それによりメゾテリンへのCD8+T細胞またはCD4+T細胞応答が誘導され、ワクチンは全腫瘍細胞を含まない）；および
CD8+T細胞またはCD4+T細胞免疫応答を刺激するための担体。
【請求項６８】
担体がCD40/CD40リガンドである、請求項67記載のワクチン。
【請求項６９】
担体がOX-40/OX-40リガンドである、請求項67記載のワクチン。
【請求項７０】
担体がCTLA-4アンタゴニストである、請求項67記載のワクチン。
【請求項７１】
担体がGM-CSFである、請求項67記載のワクチン。
【請求項７２】
ポリペプチドが下記からなる群より選択されるエピトープを含む、請求項67記載のワクチン：
2006521090.tif 000029
【請求項７３】
細菌を含む、請求項59記載のワクチン。
【請求項７４】
細菌を含む、請求項67記載のワクチン。
【請求項７５】
細菌がフレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項73記載のワクチン。
【請求項７６】
細菌がフレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項74記載のワクチン。
【請求項７７】
下記からなる群より選択されエピトープを含む、9から25アミノ酸残基の単離ポリペプチド：
2006521090.tif 000030
【請求項７８】
第1の部分が下記からなる群より選択されエピトープを含む9から25アミノ酸残基のポリペプチドを含み：
2006521090.tif 000031
第2の部分が少なくとも6アミノ酸残基のセグメントを含む（第2の部分の配列はメゾテリンではない）、第1および第2の部分を含む融合タンパク質。
【請求項７９】
下記からなる群より選択されエピトープを含む、9から25アミノ酸残基のポリペプチドをコードする発現ベクター：
2006521090.tif 000032
【請求項８０】
請求項79記載の発現ベクターを含む細菌。
【請求項８１】
フレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項80記載の細菌。
【請求項８２】
請求項78記載の融合タンパク質をコードする発現ベクター。
【請求項８３】
請求項82記載の発現ベクターを含む細菌。
【請求項８４】
フレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、およびマイコバクテリウムからなる群より選択される、請求項83記載の細菌。
【請求項８５】
下記からなる群より選択されるエピトープに結合する単離抗体：
2006521090.tif 000033
【請求項８６】
下記からなる群より選択されるエピトープに結合するT細胞株：
2006521090.tif 000034
【請求項８７】
MHCクラスI分子に結合する、請求項77記載のポリペプチド。
【請求項８８】
MHCクラスI分子に結合する、請求項78記載の融合タンパク質。
【請求項８９】
担体がMHCクラスI分子である、請求項59記載のワクチン。
【請求項９０】
MHCクラスI分子が樹状細胞上にある、請求項87記載のポリペプチド。
【請求項９１】
MHCクラスI分子が樹状細胞上にある、請求項88記載の融合タンパク質。
【請求項９２】
MHCクラスI分子が樹状細胞上にある、請求項89記載のワクチン。
【請求項９３】
MHCクラスI分子が抗原提示細胞上にある、請求項87記載のポリペプチド。
【請求項９４】
MHCクラスI分子が抗原提示細胞上にある、請求項88記載のポリペプチド。
【請求項９５】
MHCクラスI分子が抗原提示細胞上にある、請求項89記載のワクチン。
【請求項９６】
下記の段階を含む、ワクチン接種を受けた患者における腫瘍ワクチンへの将来の応答の予測法：
患者を試験して、患者がメゾテリンへの遅延型過敏（DTH）応答（該応答の存在により、該応答がない場合よりも長い生存期間が予測される）を有するかどうかを調べる段階。
【請求項９７】
ワクチンが全腫瘍細胞を含む、請求項96記載の方法。
【請求項９８】
ワクチンが膵臓腫瘍細胞を含む、請求項96記載の方法。
【請求項９９】
ワクチンが卵巣腫瘍細胞を含む、請求項96記載の方法。
【請求項１００】
ワクチンが中皮腫細胞を含む、請求項96記載の方法。
【請求項１０１】
HPV-16 E6およびE7ならびに活性化癌遺伝子によって形質転換された腹腔細胞を含む組換えマウス細胞株であって、免疫適格マウスへの腹腔内注入により腹水および腫瘍を生成することが可能である細胞株。
【請求項１０２】
活性化癌遺伝子が活性化c-Ha-rasである、請求項101記載の組換えマウス細胞株。
【請求項１０３】
メゾテリンを発現する、請求項101記載の組換えマウス細胞株。
【請求項１０４】
WF-3である、請求項101記載の組換えマウス細胞株。
【請求項１０５】
請求項101記載の組換えマウス細胞株を注入されたマウスを含む、マウスモデル。
【請求項１０６】
免疫適格である、請求項105記載のマウスモデル。
【請求項１０７】
下記の段階を含む、物質が卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、および扁平上皮癌からなる群より選択される癌を治療する可能性のある薬物であるかどうかを調べるための試験法：
請求項105記載のマウスモデルを試験物質と接触させる段階；および
試験物質がマウスモデルの腫瘍の退行、マウスモデルの腹水量の減少、またはマウスモデルの生存期間の延長を引き起こすかどうかを評価する段階。
【請求項１０８】
下記の段階を含む、物質が卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、および扁平上皮癌からなる群より選択される癌を治療する可能性のある薬物であるかどうかを調べるための試験法：
マウスを試験物質と接触させる段階；
マウスに請求項101記載の組換え細胞株を注入する段階；
試験物質がマウスの腫瘍の退行、マウスの腹水量の減少、またはマウスの生存期間の延長を引き起こすかどうかを評価する段階。
【請求項１０９】
ポリペプチドがメゾテリンである、請求項59記載のワクチン。
【請求項１１０】
ポリペプチドがメゾテリンである、請求項1記載の方法。
【請求項１１１】
ポリペプチドがメゾテリンである、請求項22記載の方法。
【請求項１１２】
ポリペプチドがメゾテリンである、請求項67記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
下記の各出願の内容は特に本明細書に組み込まれる：2002年7月12日出願の米国特許仮出願第60/395,556号、2002年7月24日出願の第60/398,217号、2002年9月30日出願の第60/414,931号、および2003年6月5日出願の第60/475,783号。
【０００２】
本発明は米国政府からの基金を用いて行った。助成金NCI CA62924、NCI RO1 CA72631、NCI RO1 CA71806、U19 CA72108-02、およびNCDDG RFA CA-95-020の条件は、米国政府が本発明において特定の権利を有することを定めている。
【０００３】
本特許文書の開示の一部は、著作権保護下の内容を含む。著作権所有者は、これは特許および特許商標庁の特許ファイルまたは記録に記載されるため、特許文書または特許開示のいずれによる複写再生にも異論はないが、それ以外は何があってもすべての著作権を所有する。
【０００４】
発明の分野
本発明は、癌の治療法、癌の予後、および抗癌剤開発の分野に関する。いくつかの局面において、本発明は治療標的としてのメゾテリン（mesothelin）に関する。もう一つの局面において、本発明は他の治療標的の開発に関する。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
正常から悪性細胞への形質転換は、多数の遺伝子に影響をおよぼす複雑な遺伝的および後成的変化を含む（1、2）。これらの変化した遺伝子の多くは、免疫拒絶の標的候補となりうる新しい、変化した、または過剰発現されたタンパク質に翻訳される。腫瘍細胞から単離されたcDNAライブラリのT細胞スクリーニング、主要組織適合複合体（MHC）結合抗原の生化学的溶出および精製、ならびにファージディスプレイライブラリの抗体スクリーニング（SEREX法）は、腫瘍抗原、特に悪性黒色腫により発現されるものの同定をおおいに促進した（3〜13）。その結果、いくつかの抗原特異的ワクチンアプローチがこの疾患に対して臨床開発中である（3〜6、14）。残念なことに、これらの抗原同定アプローチは、多くの他の一般的な癌により発現される抗原の同定には成功していない。主な制限は、免疫関連腫瘍標的を同定するために用いることができる患者由来T細胞株およびクローンの生成ができないことであった。さらに、特異的ヒト腫瘍抗原に対するT細胞応答は免疫療法後の臨床応答と相関付けられていない。
【０００６】
ヒト組織内の遺伝子発現を定量することができる高処理量技術の最近の発展は、腫瘍由来元の正常組織に比べて腫瘍で差次的に発現される多数の遺伝子の同定につながった（15〜18）。これらの遺伝子発現データベースは、免疫による機能的スクリーニング法を適用する最初のフィルターとして用いることができる（19）。連続的遺伝子発現解析（serial analysis of gene expression（SAGE））法を用いて膵腺癌で差次的に発現されることが明らかにされた、徐々に増えつつある遺伝子が表にまとめられ、報告されている（20〜22）。しかし、これらの差次的に発現される遺伝子のどれが抗腫瘍応答に免疫学的に関連しているのかは不明である。当技術分野において、腫瘍および正常組織で差次的に発現されるタンパク質のうち、免疫学的に関連するタンパク質を同定する方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
第一の態様において、腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍へのT細胞応答の誘導法が提供される。腫瘍は、例えば、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、または扁平上皮癌でありうる。メゾテリンのMHCクラスIまたはクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含むワクチンを、前記腫瘍を有する、または前記腫瘍を切除した患者に投与する。患者はそのような腫瘍発生の高リスク患者であってもよい。エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIまたはMHCクラスIIの対立形質体に結合する。それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導される。ワクチンは全腫瘍細胞を含まない。ポリペプチドは選択的にメゾテリンである。T細胞応答はCD4+T細胞応答および/またはCD8+T細胞応答でありうる。
【０００８】
第二の態様において、腫瘍の由来元である正常組織に比べてメゾテリンを過剰発現する腫瘍へのT細胞応答の誘導法が提供される。腫瘍は、例えば、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、または扁平上皮癌でありうる。メゾテリンのMHCクラスIまたはクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを、前記腫瘍を有する、または前記腫瘍を切除した患者に投与する。患者はそのような腫瘍発生の高リスク患者であってもよい。エピトープは、患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合する。それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導される。ワクチンは全腫瘍細胞を含まない。ワクチンのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは選択的にメゾテリンである。T細胞応答はCD4+T細胞応答および/またはCD8+T細胞応答でありうる。
【０００９】
第三の態様において、抗腫瘍ワクチンの候補として有用な免疫原の同定法が提供される。腫瘍によって発現され、腫瘍由来元の正常組織によって最小限に発現される、または発現されないタンパク質を選択する。好ましくは、タンパク質は、一つの腫瘍タイプで試験した腫瘍単離物の10％よりも多くで発現される。タンパク質を発現するワクチンを接種したヒトのリンパ球を試験して、リンパ球がそのタンパク質に特異的なCD8+T細胞またはCD4+T細胞を含むかどうかを調べる。このCD8+T細胞またはCD4+T細胞の存在は、タンパク質が抗腫瘍ワクチンとして用いるための候補であることを示す。
【００１０】
本発明の第四の態様は、腫瘍ワクチン接種を受けた患者における腫瘍ワクチンへの将来の応答の予測法を提供する。患者のリンパ球を試験して、リンパ球がワクチン中の抗原に特異的なCD8+T細胞またはCD4+T細胞を含むかどうかを調べる。このCD8+T細胞またはCD4+T細胞の存在により、CD8+T細胞またはCD4+T細胞がない場合よりも長い生存期間が予測される。
【００１１】
本発明の第五の態様は、CD8+T細胞またはCD4+T細胞応答を誘導するワクチンを提供する。このワクチンはメゾテリンのMHCクラスIまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む。エピトープは患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合する。それによりメゾテリンへのT細胞応答が誘導される。ワクチンは全腫瘍細胞を含まない。ワクチンはT細胞免疫応答を刺激するための担体をさらに含む。ポリペプチドは選択的にメゾテリンである。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、CD8+T細胞またはCD4+T細胞応答を誘導するもう一つのワクチンを提供する。このワクチンはメゾテリンのMHCクラスIまたはMHCクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。エピトープは患者によって発現されるMHCクラスIまたはクラスIIの対立形質体に結合する。それによりメゾテリンへのCD8+T細胞またはCD4+T細胞応答が誘導される。ワクチンは全腫瘍細胞を含まない。ワクチンはT細胞免疫応答を刺激するための担体をさらに含む。ワクチンのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは選択的にメゾテリンである。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、9から25アミノ酸残基の単離ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは下記からなる群より選択されるエピトープを含む：
2006521090.tif 000002
【００１４】
本発明のさらにもう一つの態様は、下記からなる群より選択されるエピトープに結合する抗体を提供する：
2006521090.tif 000003
【００１５】
本発明のさらにもう一つの態様は、ペプチドが下記からなる群より選択されるエピトープを含む、MHCクラスIペプチド複合体に結合するCD8+T細胞またはCD4+T細胞株を提供する：
2006521090.tif 000004
【００１６】
本発明の第十の態様は、ワクチン接種を受けた患者における腫瘍ワクチンへの将来の応答の予測法を提供する。腫瘍ワクチンは少なくとも一つのメゾテリンのT細胞エピトープを含む。患者を試験して、患者がメゾテリンへの遅延型過敏（DTH）応答を有するかどうかを調べる。この応答の存在により、この応答がない場合よりも長い生存期間が予測される。
【００１７】
本発明の第十一の態様は、HPV-16遺伝子E6およびE7ならびに活性化癌遺伝子によって形質転換された腹腔細胞を含む組換えマウス細胞株を提供する。この細胞株は免疫適格マウスへの腹腔内注入により腹水および腫瘍を生成することが可能である。
【００１８】
同じく、組換えマウス細胞株を注入されたマウスを含むマウスモデルも提供される。組換えマウス細胞株はHPV-16遺伝子E6およびE7ならびに活性化癌遺伝子によって形質移入された腹腔細胞を含む。前者の遺伝子は不死化し、後者は形質転換する。この細胞株は免疫適格マウスへの腹腔内注入により腹水および腫瘍を生成することが可能である。
【００１９】
本発明のもう一つの局面は、物質が癌を治療する可能性のある薬物であるかどうかを調べるための試験法である。癌は、例えば、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、または扁平上皮癌でありうる。試験物質をマウスモデルと接触させる。マウスモデルは、組換えマウス細胞株を注入したマウスを含む。注入は、試験物質をマウスと接触させる前または後に実施することができる。組換えマウス細胞株はHPV-16遺伝子E6およびE7ならびに活性化癌遺伝子によって形質移入された腹腔細胞を含む。この細胞株は免疫適格マウスへの腹腔内注入により腹水および腫瘍を生成することが可能である。試験物質が、マウスモデルの腫瘍形成の遅延もしくは腫瘍の退行、マウスモデルの腹水量の減少、またはマウスモデルの生存期間の延長を引き起こすかどうかを評価する。これらの効果のいずれも、試験物質が癌を治療する可能性のある薬物であることを示している。
【００２０】
発明の詳細な説明
遺伝子発現を定量する高処理量技術の最近の発展は、ヒトの癌で差次的に発現される多くの遺伝子の同定につながった。しかし、差次的発現は、それ自体では、抗原が治療標的であることを示すものではない。したがって、免疫学的に関連する腫瘍抗原を同定するために、機能的免疫学的スクリーンをSAGE遺伝子発現データベースに適用した。発明者らは以前、膵臓腫瘍ワクチン接種を受けている患者14名のうち3名で、無疾患生存の延長および抗腫瘍免疫のインビボ誘導が合わせて見られることを報告した。ここで、発明者らはメゾテリンが、これらのワクチン接種を受けた患者から単離された未培養CD8+ T細胞によって認識される腫瘍抗原であることを同定する。さらに、同じワクチン接種を受けたが、再発した11名の他の患者では、メゾテリン特異的T細胞の誘導は見られなかった。腫瘍抗原としてのメゾテリンの有効性を確認するために、発明者らはもう一つの差次的に発現された遺伝子産物、前立腺幹細胞抗原に対して、患者は一名も応答しないことを示す。これらのデータは、メゾテリンが臨床抗癌応答に相関するワクチン誘導性免疫応答のインビトロマーカーであることを同定するものである。発明者らは、他の免疫学的に関連するヒト腫瘍抗原を同定および有効性確認するための、機能的ゲノムアプローチについても記載する。
【００２１】
本発明のワクチンは、T細胞の細胞溶解応答を誘導するために当技術分野において公知のいかなる手段によっても投与することができる。これらの手段には、経口投与、静脈注射、経皮乱切、皮下注射、筋肉内注射、および鼻腔内投与が含まれる。ワクチンは、遺伝子銃によって皮内投与することもできる。DNAでコーティングした金粒子を遺伝子銃で用いてもよい。当技術分野において公知の他の接種経路も用いることができる。
【００２２】
細胞溶解T細胞応答を高めるのに有益な他の物質も用いることができる。そのような物質は本明細書において担体と呼ばれる。これらには、B7同時刺激分子、インターロイキン-2、インターフェロン-γ、GM-CSF、CTLA-4アンタゴニスト、OX-40/OX-40リガンド、CD40/CD40リガンド、サルグラモスティム、レバミゾール、ワクチニアウイルス、カルメット-ゲラン杆菌（BCG）、リポソーム、ミョウバン、フロイント完全または不完全アジュバント、解毒エンドトキシン、鉱油、リポレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、および油などの界面活性物質、または炭化水素乳剤が含まれるが、これらに限定されることはない。抗体応答に対して細胞溶解T細胞応答を優先的に刺激するT細胞免疫応答を誘導するための担体が好ましいが、両方のタイプの応答を刺激するものも用いることができる。物質がポリペプチドである場合、ポリペプチド自体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することができる。担体は抗原提示細胞（APC）または樹状細胞などの細胞であってもよい。抗原提示細胞にはマクロファージ、樹状細胞およびB細胞などの細胞型が含まれる。他のプロフェッショナル抗原提示細胞には、単球、帯域クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、嵌合樹状細胞、濾胞樹状細胞、およびT細胞が含まれる。条件的（facultative）抗原提示細胞も用いることができる。任意抗原提示細胞の例には、星状細胞、濾胞細胞、内皮および線維芽細胞が含まれる。担体は、ポリペプチドを発現するため、または後にワクチン接種された個人の細胞内で発現されるポリヌクレオチドを送達するために形質転換される細菌細胞であってもよい。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアジュバントを加えて、ワクチンが免疫応答を誘発、増強、または延長する能力を高めることもできる。サイトカイン、ケモカイン、およびCpGのような細菌核酸配列などの他の材料もアジュバントである可能性がある。アジュバントの他の典型例には、キラヤの樹皮から精製した均質サポニンを含む合成アジュバントQS-21およびコリネバクテリウム-パルブムが含まれる（McCuneら、Cancer, 1979; 43:1619）。アジュバントを最適化にかけることは理解されると思われる。すなわち、当業者であれば、用いるのに最良のアジュバントを決定するための日常的実験に携わることができる。
【００２３】
保存剤、安定化剤、アジュバント、抗生物質、および他の物質などのさらなる添加物も用いることができる。チメロサールまたは2-フェノキシエタノールなどの保存剤を、不注意による混入、特に複数回使用または用量を意図したワクチンバイアルで起こりうる混入による細菌または真菌の増殖を遅延または停止させるために加えることもできる。乳糖またはグルタミン酸ナトリウム（MSG）などの安定化剤を、温度の変動または凍結乾燥工程などの様々な条件に対してワクチン製剤を安定化させるために加えることもできる。
【００２４】
メゾテリンエピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与するために、ウイルスベクターを用いることができる。そのようなウイルスベクターには、ワクチニアウイルスおよびニューカッスル病ウイルスなどのトリウイルスが含まれる。当技術分野において公知の他のものも用いることができる。
【００２５】
ポリペプチドワクチンを投与するための一つの特定の方法は、ポリペプチドをAPCまたは樹状細胞上にインビトロで適用することによる。ポリペプチドはAPCまたは樹状細胞の表面でMHC分子に結合する。APCまたは樹状細胞のインターフェロン-γによる事前処置を用いて、APCまたは樹状細胞上のMHC分子の数を増やすことができる。次いで、適用した細胞をポリペプチドの担体として投与することができる。ペプチド適用はMeleroら、Gene Therapy 7:1167(2000)において教示されている。
【００２６】
裸のDNAを宿主に直接注入して、免疫応答を生じさせることができる。そのような裸のDNAワクチンをヒト筋肉組織中に筋肉内注入してもよく、または典型的にはバイオリスティックによる遺伝子導入（すなわち遺伝子銃）を用いたワクチンDNAの経皮もしくは皮内送達によって投与してもよい。DNA免疫化のための遺伝子銃および筋肉注入送達戦略について記載している最近の総説には、Tuting, Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1: 216-25、Robinson, Int. J. Mol. Med. (1999) 4:549-55、ならびにMumperおよびLedbur, Mol. Biotechnol. (2001) 19: 79-95が含まれる。他の可能なプラスミドDNA送達法には、電気穿孔法およびイオン導入法が含まれる。
【００２７】
もう一つの可能な遺伝子送達系は、DNAとポリカチオンリポソームとの間で生成したイオン複合体を含む（例えば、 Caplenら(1995) Nature Med. 1: 39参照）。静電相互作用によって結合しているため、これらの複合体は生体液中の高分子電解質の電荷遮蔽効果により分解することもある。強塩基性脂質組成物は複合体を安定化することができるが、そのような脂質は細胞毒性でありうる。他の可能なDNA送達法には、電気穿孔法およびイオン導入法が含まれる。
【００２８】
DNAワクチンにおける細胞内および細胞間ターゲティング戦略の使用は、メゾテリン特異的抗腫瘍効果をさらに増強する可能性がある。以前は、細胞内ターゲティング戦略および細胞間拡散戦略を用いて、抗原のMHCクラスIまたはMHCクラスII提示を促進し、それぞれ強力なCD8+またはCD4+ T細胞仲介性抗腫瘍免疫を得ていた。例えば、DNAワクチンの場合に、モデル抗原HPV-16 E7のMHCクラスI提示が、結核菌熱ショックタンパク質70（HSP70）（Chenら、(2000), Cancer Research, 60: 1035-1042）、カルレチキュリン（Chengら、(2001) J Clin Invest, 108:669-678）または緑膿菌外毒素A（ETA(dII)）の転座ドメイン（ドメインII）（Hungら、(2001) Cancer Research, 61: 3698-3703）のE7への連結を用いて促進された。MHCクラスII抗原処理を促進するために、リソソーム膜タンパク質（LAMP-1）の局在化シグナル（sorting signal）をE7抗原に連結し、Sig/E7/LAMP-1キメラが作成されている（Jiら、(1999), Human Gene Therapy, 10: 2727-2740）。裸のDNAワクチンの効力をさらに増強するために、細胞間の抗原の拡散を促進する細胞間戦略を用いることができる。これは、細胞間輸送の顕著な性質を示し、タンパク質を多くの周辺細胞に分配することができる単純疱疹ウイルス（HSV-1）外被タンパク質、HSV-1 VP22を用いて明らかにされているとおり、DNAワクチンの効力を改善する（Elliotら、(1997) Cell, 88: 223-233）。そのような連結タンパク質の細胞間拡散の促進は、抗原特異的CD8+ T細胞仲介性免疫応答および抗腫瘍効果を増強することになる。メゾテリン発現腫瘍に対するDNAワクチンの効力を増強するために、いかなるそのような方法を用いることもできる。
【００２９】
メゾテリンは、卵巣癌、膵臓癌、中皮腫、ならびに食道、肺、および子宮頸部の扁平上皮癌で発現されることが知られている。したがって、本発明のワクチンは少なくともこれらの型の腫瘍を治療するために有用である。メゾテリンを発現する他の腫瘍も同様に治療することができる。
【００３０】
一つの態様において、本発明のワクチンは、少なくとも一つのメゾテリンのMHCクラスI結合エピトープまたは少なくとも一つのメゾテリンのクラスII結合エピトープを含むポリペプチドを含む。または、本発明のワクチンは、少なくとも一つのメゾテリンのMHCクラスI結合エピトープまたは少なくとも一つのメゾテリンのクラスII結合エピトープを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択的に含む。選択的に、ワクチンのポリペプチド（またはワクチンのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド）は、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープおよび/またはメゾテリンのクラスII結合エピトープの複数を含む。ポリペプチドの複数のエピトープは、同じまたは異なるMHC対立形質分子に結合することができる。一つの態様において、ポリペプチドのエピトープは広範なMHC対立形質分子に結合する。
【００３１】
MHCクラスI結合エピトープは本発明の実施において有効であるが、MHCクラスII結合エピトープも用いることができる。前者はCD8+ T細胞を活性化するのに有用であり、後者はCD4+ T細胞を活性化するのに有用である。公に利用可能なアルゴリズムを用いて、MHCクラスIおよび/またはクラスII分子に結合するエピトープを選択することができる。例えば、予測アルゴリズム「BIMAS」は、ペプチド/HLA複合体の分離予測半減時間により可能性のあるHLA結合エピトープを評価する（23）。「SYFPEITHI」アルゴリズムは、一次および二次HLA結合アンカー残基の有無によるスコアでペプチドを評価する（25）。これらのコンピューターによるアルゴリズムはいずれも、所与のタンパク質内の過去に発表されているHLA結合エピトープと類似の結合モティーフを有するアミノ酸配列に基づいて候補エピトープを評価する。さらなる生物学的試験の候補を同定するために、他のアルゴリズムも用いることができる。
【００３２】
細胞溶解T細胞応答を高めるための免疫化用ポリペプチドは、選択的に8から25アミノ酸残基の長さである。9量体を本明細書において特に開示するが、9量体のいかなる8つの近接アミノ酸も同様に用いることができる。ポリペプチドを他のそのようなエピトープポリペプチドに融合することもでき、またはB-7、インターロイキン-2、もしくはインターフェロン-γなどの担体に融合することもできる。融合ポリペプチドは組換え産生によって作成することもでき、または化学結合により、例えば、ヘテロ二価性結合試薬を用いて作成することもできる。ポリペプチドの混合物を用いることができる。これらはMHC分子の単一の対立形質型のエピトープ混合物であってもよく、または様々な対立形質型のエピトープ混合物であってもよい。ポリペプチドはエピトープ配列の一連の繰り返しを含むこともでき、または一連の配列中に異なるエピトープ配列を含むこともできる。
【００３３】
メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープまたはメゾテリンのMHCクラスII結合エピトープのワクチン中の免疫原としての有効性は、エピトープを含むペプチドが抗原提示細胞上のMHC分子に結合し、適当な条件下でTリンパ球を活性化するのに十分な時間接触した場合、メゾテリンを過剰発現（腫瘍由来元の正常組織に比べて）する腫瘍に対してうまく免疫応答を示している個人からのTリンパ球を活性化することができるかどうかを査定することにより評価することができる。そのような査定の具体例を下記の実施例1〜4に例示する。
【００３４】
複数のグループがメゾテリンをコードするcDNAをクローニングし、cDNAクローンの配列、ならびにコードされるメゾテリンポリペプチドの配列が米国特許第6,153,430号、ChangおよびPastan、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:136-140 (1996)、Kojimaら、J. Biol. Chem., 270:21984-21990 (1995)、ならびに米国特許第5,723,318号に報告されている。これらの引用文献は、メゾテリンをコードする核酸、対応するメゾテリンポリペプチド、およびその中に記載されている断片の配列を含め、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。メゾテリンcDNAは分子量約69kDのタンパク質、すなわち一次翻訳産物をコードする。メゾテリンの69kD体はタンパク分解処理により、膜に結合する40kDの成熟メゾテリンタンパク質を生成する（ChangおよびPastan (1996)）。本明細書において用いられる「メゾテリン」なる用語は、タンパク質が発現される細胞または組織には関係なく、メゾテリンのすべての天然変異体を含む。一つの態様において、メゾテリンタンパク質は一つまたは複数の下記のアミノ酸配列を含む：
2006521090.tif 000005
例えば、メゾテリンタンパク質は1、2、3、4、または5つのこれらのエピトープを選択的に含む。もう一つの態様において、メゾテリンタンパク質は下記のアミノ酸配列のそれぞれを含む：
2006521090.tif 000006
【００３５】
本発明のワクチンは、メゾテリンまたはメゾテリンをコードするポリヌクレオチドを選択的に含む。例えば、ワクチンはメゾテリンの成熟体、メゾテリン遺伝子の一次翻訳産物、または全長翻訳産物を含むか、またはコードしてもよい。一つの態様において、ワクチンはメゾテリンのcDNAを含む。メゾテリンの天然体（または天然体をコードするポリヌクレオチド）の使用に加え、メゾテリンの断片を含むポリペプチド、またはメゾテリンの断片をコードするポリヌクレオチドもワクチンで用いることができる。ワクチン中、またはワクチンのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、メゾテリンと選択的に少なくとも約95％、少なくとも約90％、少なくとも約85％、少なくとも約80％、少なくとも約75％、少なくとも約70％、少なくとも約65％、少なくとも約60％、少なくとも約55％、または少なくとも約50％同一である。
【００３６】
本発明のもう一つの態様において、ワクチンのポリペプチドまたはワクチンのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは成熟メゾテリンタンパク質、メゾテリンの一次翻訳産物、または成熟巨核球増強因子などの天然メゾテリンタンパク質ではない。
【００３７】
一つの態様において、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープは、長さ15未満のアミノ酸、14未満のアミノ酸、13未満のアミノ酸、12未満のアミノ酸、または11未満のアミノ酸を含む。もう一つの態様において、メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープは、下記からなる群より選択されるペプチド中に存在する少なくとも7つまたは少なくとも8つの近接アミノ酸を含む：
2006521090.tif 000007
メゾテリンのMHCクラスI結合エピトープは長さが少なくとも7アミノ酸、長さが少なくとも8アミノ酸、または長さが少なくとも9アミノ酸である。
【００３８】
加えて、本発明のワクチンで用いられるメゾテリンのMHCクラスI結合エピトープおよびメゾテリンのMHCクラスII結合エピトープは、メゾテリン内の天然エピトープ配列と配列が必ずしも同一でなくてもよい。天然エピトープ配列は、必ずしもCTL応答を刺激するための最適ペプチドではない。例えば、（Parkhurst, M. R.ら、J. Immunol., 157:2539-2548, (1996)；Rosenberg, S. A.ら、Nat. Med., 4:321-327, (1998)）。したがって、CTL応答をより容易に誘導するようにエピトープを修飾することは有用でありうる。一般に、エピトープは2種類の位置で修飾することができる。エピトープはMHC分子と相互作用することが予測されるアミノ酸残基で修飾してもよく、この場合、ゴールは親エピトープよりも高いMHC分子への親和性を有するペプチド配列を作ることである。エピトープはCTL上のT細胞受容体と相互作用することが予測されるアミノ酸残基で修飾することもでき、この場合、ゴールは親エピトープよりも高いT細胞受容体への親和性を有するペプチド配列を作ることである。これらの種類の修飾はいずれも、親エピトープに関連するが、親エピトープよりも良好にCTL応答を誘導することができる変異エピトープを生成することができる。
【００３９】
したがって、下記の実施例で同定されたメゾテリンのMHCクラスI結合エピトープ（SEQ ID NO：1〜6）、または本発明の方法の適用により同定されたもの、および本発明の方法の適用により同定されたメゾテリンのMHCクラスII結合エピトープは、エピトープ配列内の異なる、おそらくは選択的部位での一つまたは複数の残基の置換により修飾することができる。そのような置換は、保存的性質、例えば、疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸で置換するなどの、一つのアミノ酸を類似の構造および特徴のアミノ酸で置換する性質のものでありうる。さらにより保存的置換は、ロイシンをイソロイシンで置換するなどの、同じまたは類似のサイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然同種タンパク質のファミリーにおける配列変動の研究において、特定のアミノ酸置換は他のものよりも耐容される頻度が高く、これらは元のアミノ酸とその置換体との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性と相関を示すことが多く、これは「保存的置換」を定義するための基礎である。
【００４０】
本明細書において保存的置換は下記の5群の一つの中での交換と定義される：1群--小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基（Ala、Ser、Thr、Pro、Gly）；2群--極性で負に荷電した残基およびそれらのアミド（Asp、Asn、Glu、Gln）；3群--極性で正に荷電した残基（His、Arg、Lys）；4群--大きい脂肪族の非極性残基（Met、Leu、lie、Val、Cys）；および5群--大きい芳香族残基（Phe、Tyr、Trp）。酸性アミノ酸は異なる酸性アミノ酸によって置換されてもよく、または塩基性（すなわちアルカリ性）アミノ酸は異なる塩基性アミノ酸によって置換されてもよい。保存性がより低い置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、一つのアミノ酸が類似の特徴を有するが、サイズが幾分異なるもう一つのアミノ酸で置換されることを含むと考えられる。
【００４１】
プラスミドおよびウイルスベクターは、例えば、宿主細胞中で腫瘍抗原タンパク質を発現するために用いることができる。したがって、例えば、全長タンパク質のすべてまたは選択された部分をコードする、メゾテリンタンパク質のクローニング由来のヌクレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞プロセスを介してメゾテリンポリペプチドの組換え体を産生することができる。コード配列をベクター中にライゲーションすることができ、負荷ベクターを用いて真核（例えば、酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核（細菌）細胞いずれかの宿主を形質転換または形質移入するために用いることができる。そのような技術は当技術分野において公知の標準的方法を含む。
【００４２】
典型的には、インビボまたはインビトロでポリペプチドを発現するために用いる発現ベクターは、少なくとも一つの転写調節配列に操作可能に連結された、抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む。調節配列は当技術分野において認められており、所望の様式（時間および場所）で目的のタンパク質の発現を誘導するために選択することができる。転写調節配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ(1990)に記載されている。
【００４３】
HLA結合エピトープを含むポリペプチドの発現に適したベクターには次のタイプのプラスミドが含まれる：大腸菌などの原核細胞における発現のためのpBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pBTac由来プラスミドおよびpUC由来プラスミド。哺乳類発現ベクターは、細菌中のベクターの伝播を促進するために原核細胞および真核細胞両方の配列と、真核細胞中で発現されうる一つまたは複数の真核細胞転写ユニットを含んでいてもよい。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo、およびpHyg由来ベクターは真核細胞の転写に適した哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核細胞および真核細胞両方における複製および選択を容易にするために、pBR322などの細菌プラスミドからの配列で修飾されている。または、ウシパピローマウイルス（BPV-1）、もしくはエプスタイン-バーウイルス（pHEBo、pREP由来、およびp205）などのウイルスの誘導体を、真核細胞中のタンパク質の一過性発現のために用いることができる。ワクチニアおよびトリウイルスベクターも用いることができる。ベクターの調製および宿主生物の形質転換において用いることができる方法は、当技術分野において公知である。原核細胞および真核細胞両方に適した他の発現系、ならびに一般的組換え法については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Sambrook, Fritsch、およびManiatis編 (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) 第16および17章を参照されたい。
【００４４】
他のタイプの発現カセットも用いることができる。例えば、下記の引用文献はウイルス、細菌、および酵母ベクターに関して、本発明において用いることができるその他の発現ベクターを例示している。
【００４５】
本発明のもう一つの態様において、本明細書に記載のポリペプチド、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、酵母を含む免疫原性組成物中で宿主生物に送達される。抗原送達のための生酵母DNAワクチンベクターの使用が最近再検討され、マウスモデルで腫瘍またはHIV-1抗原を発現する全組換えサッカロミセス-セレビジエ酵母を用いて有効であると報告されている（Stubbsら(2001) Nature Medicine 7: 625-29参照）。
【００４６】
生酵母ワクチンベクターの使用は当技術分野において公知である。さらに、米国特許第5,830,463号（その内容は参照として本明細書に組み込まれる）は、本発明において用いるのに特に有用なベクターおよび系を記載している。酵母はその他のアジュバントの必要なく細胞性免疫を誘発すると考えられるため、酵母送達系の使用は、本発明の腫瘍/癌ワクチン法および製剤における使用に特に有効であると思われる。特に好ましい酵母ワクチン送達系は、免疫応答を調節することができる少なくとも一つの組換え発現系を有する、非病原性酵母である。
【００４７】
細菌も、本発明のエピトープのための担体として用いることができる。典型的には、用いる細菌は突然変異体または組換え体である。細菌は選択的に弱毒化する。例えば、フレキシネル菌、大腸菌、リステリア菌、エンテロコリチカ菌、ネズミチフス菌、チフス菌、またはマイコバクテリウムを含むが、これらに限定されることはない、いくつかの細菌属菌がワクチンとして用いるために開発されており、本発明において用いることができる。免疫原性組成物において用いられる細菌ベクターは、条件的細胞内細菌ベクターであってもよい。細菌は、本明細書に記載のポリペプチドを宿主生物中の抗原提示細胞に送達するために用いることもできる。抗原送達のための生細菌ワクチンベクターの使用が最近再検討されている（MedinaおよびGuzman (2001) Vaccine 19: 1573-1580；WeissおよびKrusch, (2001) Biol. Chem. 382: 533-41；ならびにDarjiら(2000) FEMS Immunol and Medical Microbiology 27: 341-9）。さらに、米国特許第6,261,568号および第6,488,926号（その内容は参照として本明細書に組み込まれる）は癌ワクチンのために有用な系を記載している。
【００４８】
細菌による遺伝子導入は、プラスミドの筋肉内、皮内、または経口投与による遺伝子ワクチン接種において特に有用であり、そのようなワクチン接種はワクチン被接種者における抗原発現を引き起こす。さらに、細菌はアジュバント効果および免疫系の誘導部位を標的とする能力を提供することができる。さらに、細菌ワクチンベクターはほとんど無制限のコーディング能力を有する。細菌担体の使用は、直接粘膜または経口送達の可能性などの、さらに他の著しい利点を伴うことが多い。用いることができる他の直接粘膜送達系（生ウイルスまたは細菌ワクチン担体の他に）には、粘膜アジュバント、ウイルス粒子、ISCOM、リポソーム、および微小粒子が含まれる。
【００４９】
弱毒および共生微生物はいずれもワクチン抗原の担体としてうまく用いられている。本発明において用いることができる弱毒粘膜病原体には下記が含まれる：リステリア菌、サルモネラ属菌、コレラ菌、シゲラ属菌、マイコバクテリウム、エンテロコリチカ菌、および炭疽菌。本発明において用いることができる共生菌株には下記が含まれる：S.ゴルドニー、ラクトバチルス属菌、およびブドウ球菌属菌。製剤中で用いられる担体菌株の遺伝的背景、弱毒化を行うために選択された突然変異のタイプ、および免疫原の固有の性質は、誘発される免疫応答の程度および質を最適化するために調節することができる。細菌担体によって刺激される免疫応答を最適化するために考慮すべき一般的因子には下記が含まれる：担体の選択；特定の背景菌株、弱毒突然変異および弱毒化のレベル；弱毒表現型の安定化ならびに最適用量の確立。考えるべき他の抗原関連因子には下記が含まれる：抗原の固有の性質；発現系、抗原提示型および組換え表現型の安定化；調節分子の同時発現ならびにワクチン接種計画。
【００５０】
本発明の免疫原性組成物における細菌ベクターとしてネズミチフス菌を用いることができる。ワクチンのための有効なベクターとしてのこの細菌の使用が当技術分野において示されている。例えば、経口体細胞導入遺伝子ワクチン接種のための弱毒ベクターとしてのネズミチフス菌の使用が記載されている（Darjiら(1997) Cell 91: 765-775；およびDarjiら(2000) FEMS Immun and Medical Microbiology 27: 341-9参照）。事実、細菌による遺伝子導入のほとんどの知識は、弱毒ネズミチフス菌を担体として用いて得られている。用いられてきた2つの代謝的に弱毒化された菌株には、芳香族アミノ酸を合成することができないネズミチフス菌aroA、およびプリン代謝が欠損しているネズミチフス菌22-11が含まれる。いくつかの抗原がこれらの担体を用いて発現されている：最初は、リステリオライシンおよびactA（リステリア菌の2つのビルレンス因子）ならびに大腸菌のベータ-ガラクトシダーゼ（β-gal）がうまく試験された。組換えサルモネラの1回用量を経口適用した後に、細胞毒性およびヘルパーT細胞ならびに特異的抗体をこれらの抗原に対して検出することができた。加えて、リステリオライシンをコードする発現プラスミドを有するサルモネラで免疫化すると、リステリア菌による致死的攻撃に対する防御応答が誘発された。経口導入遺伝子ワクチン接種法は、現在、粘膜レベルで検出される細胞性免疫応答を伴う、単純ヘルペスウイルス2およびB型肝炎感染モデルにおける防御応答を含むよう拡大されている。
【００５１】
代理腫瘍抗原としてβ-galを用いる腫瘍モデルにおいて、β-galをコードするプラスミドを有するサルモネラを経口投与することにより、進行性線維肉腫に対する部分防御免疫が誘導された（Pagliaら(1998) Blood 92: 3172-76参照）。マウス腎細胞癌系統RENCAのβ-gal発現形質移入体を用いた類似の実験で、ZoellerおよびChrist（Wooら(2001) Vaccine 19: 2945-2954）は、裸のDNAを用いるのに対して、抗原をコードするプラスミドを細菌担体中で送達した場合に優れた有効性を示した。興味深いことに、サルモネラを、マウス黒色腫B16に対する腫瘍増殖遅延応答を誘導するために用いることができ；このサルモネラはユビキチンに融合した自己腫瘍抗原gp100およびTRP2のエピトープをコードするミニ遺伝子を有する。これは、そのような環境においては、自己抗原に対する末梢性寛容を克服しうることを示唆している。このことは、同じグループにより、マウス神経芽細胞腫系で自己抗原としてチロシンヒドロキシラーゼのエピトープの類似の構築物を用いて確認された（Lodeら(2000) Med Ped Oncol 35: 641-646。さらに、これらの知見は最近、完全ヒト発癌性抗原（hCEA）の膜結合型をコードするプラスミドを用いて、hCEAに対して遺伝子導入された免疫化マウスによって拡大された。この場合に、hCEA発現結腸癌系を試験し、腫瘍による致死的攻撃に対する防御を、作動相の間にアジュバントとしてインターロイキン2（IL-2）を全身適用することにより改善することができた（Xiangら(2001) Clin Cancer Res 7: 856s-864s参照）。
【００５２】
本明細書に記載の免疫原性組成物において用いることができるもう一つの細菌ベクターはチフス菌である。免疫化によく用いられるチフス菌株−Ty21a galE−は細胞壁合成に必要な成分を欠いている。最近開発された改善菌株には、guaBAの突然変異により弱毒化されたものが含まれ、これはグアニン生合成経路の必須酵素をコードする（Pasettiら、Infect. Immun. (2002) 70:4009-18；Wangら、Infect. Immun. (2001) 69:4734-41；Pasettiら、Clin. Immunol. (1999) 92:76-89）。DNAワクチンの送達ベクターとしてのチフス菌および/または他のサルモネラ菌株の使用について記載しているその他の引用文献には下記が含まれる：Lundin, Infect. Immun. (2002) 70:5622-7；Devicoら、Vaccine, (2002) 20:1968-74；Weissら、Biol. Chem. (2001) 382:533-41；およびBumannら、FEMS Immunol. Med. Microbiol. (2000) 27:357-64。
【００５３】
本発明のワクチンおよび免疫原性組成物は、送達媒体としてフレキシネル菌を用いることができる。フレキシネル菌は宿主細胞の液胞から細胞質ゾルへ逃れるため、細菌DNA導入媒体の原型である。フレキシネル菌のいくつかの弱毒突然変異体を用いて、インビトロでDNAを細胞系統に導入することに成功している。栄養要求性菌株は細胞壁合成（Sizemoreら(1995) Science 270: 299-302およびCourvalinら(1995) C R Acad Sci Ser III, 318: 1207-12）、芳香族アミノ酸の合成（Powellら(1996) Vaccines 96: Molecular Approaches to the Control of Infectious Disease; Cold Spring Harbor Laboratory Press）またはグアニンヌクレオチドの合成（Andersonら(2000) Vaccine 18: 2193-2202）に欠陥があった。
【００５４】
本発明のワクチンおよび免疫原性組成物はリステリア菌を含むことができる（Portnoyら、Journal of Cell Biology, 158:409-414 (2002)；Glomskiら、Journal of Cell Biology, 156:1029-1038 (2002)）。リステリア菌のワクチンベクターとして役立つ能力についての総説が、Wesikirchら、Immunol. Rev. 158:159-169 (1997)に記載されている。リステリア菌の菌株は最近、癌（米国特許第6,051,237号；Gunnら、J. Of Immunology, 167:6471-6479 (2001)；Liauら、Cancer Research, 62: 2287-2293 (2002)；米国特許第6,099,848号；国際公開公報第99/25376号；および国際公開公報第96/14087号）およびHIV（米国特許第5,830,702号）などの、病原物質を注入することができない臨床状態に対する免疫応答を誘導するための免疫系に抗原を送達する、異種タンパク質の有効な細胞内送達媒体として開発された。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）抗原を発現する組換えリステリア菌ワクチンも、抗原に対する細胞性防御免疫を誘導することが明らかにされている（Shenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:3987-3991 (1995)。
【００５５】
条件的細胞内細菌として、リステリア菌は液性および細胞性両方の免疫応答を誘発する。リステリア菌は宿主生物の細胞内に入った後、それが貪食宿主細胞のファゴリソソームからその細胞の細胞質ゾルへ逃れるのを可能にする、リステリア特異的タンパク質を産生する。ここで、リステリア菌は、生存に必要なタンパク質を発現するが、同時にリステリアプロモーターに操作可能に連結された異種遺伝子も発現して、増殖する。貪食細胞表面上でのMHCタンパク質によるこれらの異種タンパク質のペプチドの提示により、T細胞応答の発現が可能になる。ワクチンとして用いるために異種遺伝子を細菌に導入するのに有用な2つの組み込みベクターは、Lauerら、Journal of Bacteriology, 184: 4177-4186 (2002)に記載されているｐL1およびｐL2を含む。
【００５６】
加えて、免疫原性組成物において有用なリステリア菌の弱毒体が生成されている。リステリア菌のActAタンパク質は、細胞内運動を担うアクチン漸増および重合事象を促進するのに十分である。ヒト安全性試験で、成人でリステリア菌のactA/plcB欠失弱毒体を経口投与しても重篤な続発症は起こらないことが報告された（Angelakopoulosら、Infection and Immunity, 70:3592-3601 (2002)）。リステリア菌の他のタイプの弱毒体も記載されている（例えば、異種抗原を発現するリステリアの栄養要求性弱毒菌株について記載している、国際公開公報第99/25376号および米国特許第6,099,848号参照）。
【００５７】
エンテロコリチカ菌は、本発明の免疫原性組成物における細菌ベクターとして選択的に用いることができるもう一つの細胞内細菌である。エンテロコリチカ菌の弱毒菌株のワクチンベクターとしての使用は、PCT国際公開公報第02/077249号に記載されている。
【００５８】
本発明のさらなる態様において、本発明の免疫原性組成物はカルメット-ゲラン杆菌（BCG）などのマイコバクテリウムを含む。カルメット-ゲラン杆菌はマウスモデルにおけるワクチンベクターとして用いられている（Gicquelら、Dev. Biol. Stand 82:171-8 (1994)）。Stoverら、Nature 351: 456-460 (1991)も参照されたい。
【００５９】
または、ウイルスベクターも用いることができる。ウイルスベクターは典型的には高度に弱毒化された、非複製型ウイルスを含むことになる。ウイルスベクターには、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどのトリウイルス、ワクチニアウイルスなどのポックスウイルス、およびアデノ関連ウイルスを含むパルボウイルスに基づくものなどのDNAウイルスベクター；ならびにレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されることはないRNAウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されることはない。免疫化プロトコルにおいて有用なワクチニアベクターおよび方法が米国特許第4,722,848号に記載されている。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスなどのレンチウイルスが含まれる。Naldiniら(1996) Science 272:263-267。本発明のポリヌクレオチドをレトロウイルスゲノムの一部として有する複製欠陥レトロウイルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは詳細に報告されている（Millerら(1990) Mol. Cell Biol. 10:4239；Kolberg, R. (1992) J. NIH Res. 4:43；Cornettaら(1991) Hum. Gene Therapy 2:215）。
【００６０】
本発明において有用なアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターは、当技術分野においてすでに教示されている方法に従って調製することができる。（例えば、Karlssonら(1986) EMBO 5:2377；Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzcyzka (1992) Current Top. Microbiol. Immunol. 158:97-129；Gene Targeting: A Practical Approach (1992) A. L. Joyner編、Oxford University Press, NY）。いくつかの異なるアプローチが可能である。
【００６１】
ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルス、セムリキ森林ウイルス（SFV）およびシンドビスウイルスベクターなどのアルファウイルスベクターを、効率的な遺伝子送達のために用いることができる。複製欠陥ベクターが利用可能である。そのようなベクターは、例えば、鼻腔内または腫瘍内などの、当技術分野において公知のいかなる様々な手段によっても投与することができる。Lundstrom, Curr. Gene Ther. 2001 1:19-29を参照されたい。
【００６２】
本発明の方法において用いることができるウイルスベクターを記載しているその他の引用文献には下記が含まれる：Fields, B.ら（編）Virology、第2巻、Raven Press New YorkのHorwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, pp. 1679-1721, 1990)；Graham, F.ら、Methods in Molecular Biology、第7巻のpp. 109-128: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E.（編）、Humana Press、ニュージャージー州クリフトン(1991)；Millerら(1995) FASEB Journal 9:190-199、Schreier (1994) Pharmaceutica Acta Helvetiae 68:145-159；SchneiderおよびFrench (1993) Circulation 88:1937-1942；Curielら(1992) Human Gene Therapy 3:147-154；国際公開公報第95/00655号；国際公開公報第95/16772号；国際公開公報第95/23867号；国際公開公報第94/26914号；国際公開公報第95/02697号（1995年1月26日）；および国際公開公報第95/25071号。
【００６３】
ワクチンのもう一つの形において、DNAをリポソームまたは細胞表面受容体を標的とすることが多いリガンドと複合体形成させる。複合体は、DNAの分解からの保護を助け、プラスミドを特定の組織に向けるのを助けるため、有用である。複合体は典型的には静脈内または筋肉内に注射する。
【００６４】
ワクチンとして用いられるポリヌクレオチドは、コロイド分散系の複合体で用いることができる。コロイド系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質を基にした系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合またはリポソーム製剤DNAである。前者のアプローチにおいて、DNAを例えば脂質と製剤する前に、所望のDNA構築物を有する導入遺伝子を含むプラスミドをまず実験的に発現のために最適化してもよい（例えば、5'未翻訳領域中のイントロンの包含および不必要な配列の除去（Felgnerら、Ann NY Acad Sci 126-139,1995）。次いで、DNAの例えば様々な脂質またはリポソーム材料との製剤を公知の方法および材料を用いて行い、受容哺乳動物に送達してもよい。例えば、Canonicoら、Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994；Tsanら、Am J Physiol 268；Altonら、Nat Genet. 5:135-142, 1993および米国特許第5,679,647号を参照されたい。
【００６５】
加えて、複合体コアセルベーションは、反対に荷電した2つの多価電解質を水溶液中で混合した時に起こる、自発的相分離過程である。二種の高分子の間の静電相互作用は、上清（重合体が少ない相）からのコアセルベート（重合体を多く含む相）の分離を引き起こす。この現象を用いて、ミクロスフェアを形成し、様々な化合物をカプセル化することができる。カプセル化過程は完全に水溶液中、低温で実施することができ、したがって、カプセル化物の生物活性を保存する確率が高い。注射用制御放出系の開発において、いくつかの薬物およびタンパク質をカプセル化するためのゼラチンおよび硫酸コンドロイチンの複合体コアセルベーションが開発され（Truongら(1995) Drug Delivery 2: 166参照）、癌ワクチン接種のためにサイトカインがこれらのミクロスフェア中にカプセル化された（Golumbekら(1993) Cancer Res 53: 5841参照）。抗炎症薬も、骨関節炎を治療するための関節への関節内送達に組み込まれている（Brownら(1994) 331: 290）。米国特許第6,193,970号、第5,861,159、および第5,759,582号は、本発明のDNAワクチン送達系として用いるための、複合体コアセルベートの組成物および使用法を記載している。特に、米国特許第6,475,995号（その内容は参照として本明細書に組み込まれる）は、経口投与した場合に有効なワクチンとして役立つ、核酸およびポリカチオンのナノ粒子コアソルベートを用いたDNAワクチン送達系を教示している。
【００６６】
メゾテリンの特定のMHCクラスII結合エピトープのクラスIに対して特異的な抗体を単離することができる。これらの抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。これらは、ワクチンとして用いるためのポリペプチドを単離および精製するために、特に用いることができる。メゾテリンの特定のMHCクラスII結合エピトープのクラスIを含むMHCクラスIまたはクラスIIペプチド複合体に結合するT細胞株は、T細胞アジュバントおよび免疫応答増強物質をスクリーニングするために有用である。そのような細胞株は、メゾテリン含有ワクチンで免疫化され、メゾテリンに対する有効なT細胞応答を有する患者から単離することができる。
【００６７】
マウスモデルで癌ワクチン候補を試験するために、所望の腫瘍抗原を含むワクチン候補を、本発明の腫瘍細胞株で攻撃する前または後のいずれかにマウス群に投与することができる。したがって、マウスモデルを用いて治療および予防両方の効果について試験することができる。ワクチン候補によるワクチン接種を、ワクチン接種していない、媒体単独でワクチン接種された、または無関係の抗原を発現するワクチンで接種された対照個体群と比較することができる。ワクチンが組み替え微生物である場合、その相対的有効性を、ゲノムが抗原を発現するように修飾されていない微生物群と比較することができる。ワクチン候補の有効性を、腫瘍もしくは腹水の量に対する効果について、または生存率について評価することができる。ワクチン候補でワクチン接種したマウスにおける腫瘍または腹水の量は、ワクチン接種していない、または媒体もしくは無関係の抗原を発現するワクチンで接種されたマウスにおける腫瘍の量よりも約5％、約10％、約25％、約50％、約75％、約90％、または約100％少ない可能性がある。腫瘍または腹水の量の差を、腫瘍細胞のマウスへの移植から少なくとも約10日、少なくとも約17日、または少なくとも約24日後に観察してもよい。核酸修飾微生物でワクチン接種したマウスにおける生存率中央値は、例えば、ワクチン接種していない、または媒体もしくは無関係の抗原を発現するワクチンで接種されたマウスよりも少なくとも約2日、少なくとも約5日、少なくとも約7日、または少なくとも約10日長い可能性がある。
【００６８】
マウスモデルを用いて当技術分野において公知のいかなる種類の癌治療も試験することができる。これらは通常の医薬品でも相補的医薬品でもよい。これらは免疫学的薬剤でも細胞毒性薬剤でもよい。例えば、癌治療法候補は放射線療法、化学療法、または手術であってもよい。癌治療法候補は、抗癌剤、抗腫瘍ワクチン、放射線療法、化学療法、および手術を含むが、これらに限定されることはない、複数の治療法または予防法の組み合わせであってもよい。
【００６９】
マウスモデルを作成するための腹腔または中皮細胞株を作るために、当技術分野において公知のいかなる癌遺伝子も用いることができる。そのような癌遺伝子にはKi-ras、Erb-B2、N-ras、N-myc、L-myc、C-myc、ABL1、EGFR、Fos、Jun、c-Ha-ras、およびSRCが含まれるが、これらに限定されることはない。
【００７０】
本発明のワクチン、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、およびウイルスは、ヒトまたは他の哺乳動物のいずれにも投与することができる。他の哺乳動物は、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、およびヒツジなどの家畜でもよく、イヌ、ウサギおよびネコなどのペットでもよい。他の哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、サル、またはロバなどの実験対象物であってもよい。
【００７１】
本発明の治療法において用いる試薬は、薬学的組成物中に存在する。薬学的組成物は典型的には、無菌性、等張性、安定性、および非発熱原性についての工業基準に適合し、用いる用量および濃度で受容者にとって非毒性である、薬学的に許容される担体を含む。用いる特定の担体は、組成物中の治療薬の種類および濃度、ならびに意図される投与経路に依存する。望まれる場合には、安定化化合物を含むこともできる。薬学的組成物の製剤はよく知られており、例えば、米国特許第5,580,561号および第5,891,725号に記載されている。
【００７２】
治療上有効な用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。治療上有効な量とは、治療上有効な量が存在しない場合に比べて抗腫瘍性細胞溶解T細胞の活性を高める、活性成分の量を意味する。
【００７３】
いかなる物質についても、治療上有効な用量は最初は細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタのいずれかにおいて推定することができる。動物モデルは、適当な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用いることができる。次いで、そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
【００７４】
治療の有効性および毒性、例えば、ED50（個体群の50％で治療が有効な用量）およびLD50（個体群の50％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比は治療指数で、これはLD50/ED50の比で表すことができる。
【００７５】
大きい治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験で得たデータを、ヒトに使用する用量範囲の算出に用いる。そのような組成物に含まれる用量は、好ましくは、毒性がほとんど、または全くなく、ED50を含む範囲内の循環濃度である。用量は、用いる剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。
【００７６】
正確な用量は医師により、治療を必要とする対象者に関係する因子に照らして決定されることになる。用量および投与は、十分なレベルの活性成分を提供する、または所望の効果を維持するために調節する。考慮に入れることができる因子には、疾患状態の重症度、対象者の全般的健康、対象者の年齢、体重、および性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、ならびに治療に対する耐容性/応答が含まれる。長時間作用性の薬学的組成物を、特定の製剤の半減期およびクリアランスに応じて、3から4日毎、毎週、または2週間に1回投与することもできる。
【００７７】
通常の用量は、投与経路に応じて、0.1から100,000マイクログラム、合計用量約1gまでで変動してもよい。特定の用量および送達法に関しての指標が文献に記載されており、当業者には一般に入手可能である。当業者であれば、ヌクレオチドについては、タンパク質またはその阻害剤とは異なる製剤を用いることになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの有効なインビボ用量は、約100ngから約200ng、約500ngから約50mg、約1μgから約2mg、約5μgから約500μg、および約20μgから約100μgの範囲である。
【００７８】
抗腫瘍ワクチンとして用いるための望ましい免疫原は、腫瘍とそれらの対応する正常組織との間で高度に差次的に発現されるものである。発現の差は、好ましくは、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、または10倍でさえある。発現は、SAGE、マイクロアレイ、ノーザンブロット、およびウェスタンブロットを含むが、これらに限定されることはない、当技術分野において公知のいかなる手段によっても測定することができる。免疫原としてのそのようなタンパク質における興味は、ヒトがタンパク質（またはそれをコードする遺伝子）による免疫化に対して、そのタンパク質により特異的に活性化されるCD4またはCD8 T細胞を生成することによって応答することを調べることにより増強される。そのような活性化についての試験は、特に、MHC複合体中の可能性がある抗原を提示するために、ヒトT2細胞株などのTAP欠損細胞株を用いることによって行うことができる。活性化は当技術分野において公知のいかなるアッセイによっても測定することができる。一つのそのようなアッセイはELISPOTアッセイである。引用文献33〜35を参照されたい。
【００７９】
腫瘍ワクチンに対する将来の応答を、CD8+およびまたはCD4+ T細胞の応答に基づいて予測することができる。腫瘍ワクチンがメゾテリンまたは少なくとも一つのメゾテリンのT細胞エピトープを含む場合、メゾテリンに対するCD8+および/またはCD4+応答をモニタリングすることで有用な予後情報が得られる。強いCD8+および/またはCD4+応答は、患者が有効な免疫応答を獲得しており、そのような応答を獲得していない者よりも有意に長く生存するであろうことを示している。腫瘍ワクチンは全腫瘍細胞、特に膵、卵巣または中皮細胞を含んでいてもよい。腫瘍ワクチンは腫瘍細胞および樹状細胞のポリエチレングリコール融合物を含んでいてもよい。腫瘍ワクチンは、樹状細胞と共にインキュベートしたアポトーシスまたは壊死性腫瘍細胞を含んでいてもよい。腫瘍ワクチンは、樹状細胞と共にインキュベートしたmRNAまたは全RNAを含んでいてもよい。メゾテリンに対するT細胞応答は、ELISPOTアッセイを含む、当技術分野において公知のいかなるアッセイによっても測定することができる。または、そのような腫瘍ワクチンに対する将来の応答を、メゾテリンに対する遅延型過敏応答についてアッセイすることによりモニターすることができる。そのような応答は、正の予後指標として認められている。
【００８０】
薬物または免疫増強剤の可能性があるものとしての使用について試験することができる試験物質は、当技術分野において公知のいかなる物質でもありうる。物質は別の目的のために以前から公知のものであってもよく、またはいかなる目的のためにも知られていないものであってもよい。物質は単一のタンパク質、核酸、または低分子などの精製された化合物であってもよく、天然原料からの抽出物などの混合物であってもよい。物質は天然物でも、合成生成物でもよい。物質はこの目的のために特別に意図して合成することもでき、スクリーニング可能な化合物ライブラリ中の物質であってもよい。
【００８１】
本発明を、現時点で好ましい本発明の実施様式を含む特定の例について説明してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に示す本発明の精神および範囲内に入る、前述の系および技術の多くの変種および置換物があることを理解すると思われる。
【００８２】
実施例
実施例1
大多数の膵腺癌患者のための免疫標的として役立ちうる遺伝子を同定するために、発明者らは突然変異しておらず、大多数の膵臓癌患者によって過剰に発現され、かつワクチン細胞株によって過剰発現される遺伝子だけに焦点を合わせた。このリストの一番上にある一つの遺伝子はメゾテリンであった（20、21）。比較および確認のために、発明者らは前立腺幹細胞抗原（PSCA）も観察した。SAGEデータより、PSCAが膵腫瘍によりメゾテリンとほぼ同等のレベルで発現されることが明らかとなった（22）。
【００８３】
発明者らは、三つの一般的なヒト白血球抗原（HLA）-クラスI分子に結合するペプチド九量体を予測するために、2つの公共用コンピューターアルゴリズム（23〜25）の組み合わせを用いた。同種GM-CSFワクチンで治療した14名の患者は全員、これらのHLA-クラスI分子の少なくとも一つを発現する（表2）。予測アルゴリズム「BIMAS」は、ペプチド/HLA複合体の分離予測半減時間により可能性のあるHLA結合エピトープを評価する（23）。「SYFPEITHI」アルゴリズムは、一次および二次HLA結合アンカー残基の有無によるスコアでペプチドを評価する（25）。これらのコンピューターによるアルゴリズムはいずれも、所与のタンパク質内の過去に発表されているHLA結合エピトープと類似の結合モティーフを有するアミノ酸配列に基づいて候補エピトープを評価する。発明者らのワクチン試験で治療した14名の患者によってこれら三つのHLAクラスI分子の少なくとも一つが発現される（表2）ため、発明者らは、HLA-A2、HLA-A3、およびHLA-A24については上位2つのメゾテリンエピトープ、ならびに両方のアルゴリズムで支持された各MHC分子については上位6つのPSCAエピトープを合成した（表1）。
【００８４】
（表１）HLA A2、A3、およびA24に結合すると予測されるメゾテリンペプチド
2006521090.tif 000008
【００８５】
3つのペプチド、HIV-gag A277-85（SLYNTVATL）（48）、HIV-NEF A394-103（QVPLRPMTYK）（49）、およびチロシナーゼA24206-214（AFLPWHRLF）（50）は過去に発表されたエピトープで、それぞれHLA-A2、A3、およびA24結合の対照ペプチドとして用いた。メゾテリンAl309-318結合エピトープ（EIDESLIFY）はすべての結合試験で陰性対照ペプチドとして用いた。MIペプチド（GILGFVFTL）58-66（Gotchら1988)はすべてのHLA-A2試験で陽性対照として用いた。
【００８６】
（表２）同種GM-CSF分泌膵腫瘍ワクチンで治療した14名の患者の選択した特徴
2006521090.tif 000009
略語：Pt＝患者、＃＝番号、T＝手術時の腫瘍サイズ、LN＝陽性リンパ節数/採取したリンパ節総数、HLA＝ヒト白血球抗原、DTH＝遅延型過敏試験、Auto＝自己由来、N/A＝DTH細胞試薬が得られなかったため評価していない、＋＝引き続き生存かつ無疾患。
1HLA型の決定を血清学的に行い、分子的に確認した。
2自己腫瘍細胞に対する遅延型過敏反応を、継代していない自己腫瘍細胞を用いて評価した。ワクチン接種前と、ワクチン接種後28日の時点で、106の自己腫瘍細胞を配置した。報告値は細胞配置の48時間後に観察された硬結の垂直直径（mm）の積におけるワクチン接種後の変化である。
【００８７】
これらのエピトープのそれぞれのHLAクラスI分子への結合を、対応するHLAクラスI分子を発現したTAP欠損T2細胞（T2-A2、T2-A3、またはT2-A24細胞）を適用することにより試験した。図1Aに示すとおり、HLA-A2への結合が予測される2つのメゾテリン由来エピトープの適用により、フローサイトメトリーと、続いてHLAクラスI特異的抗体、W6/32での染色を行って、T2-A2細胞の細胞表面上のHLA-A2を検出することができる。これとは対照的に、非適用T2細胞またはHLA-A1への結合が予測されるメゾテリンエピトープは同じ抗体で染色されない。2つのメゾテリン由来HLA-A3エピトープ候補および2つのメゾテリン由来HLA-A24エピトープ候補を適用したT2細胞の結合を、それぞれ図1Bおよび1Cに示す。類似の結合実験を、PSCA由来ペプチドでHLA-A2、HLA-A3、およびHLA-A24について行った（図1D、1E、および1F）。
【００８８】
材料および方法：遺伝子候補の同定およびエピトープ選択
以前に報告されているとおり（20、21）、SAGEを用いて膵臓癌細胞株および新鮮組織で過剰発現される遺伝子の一つとしてのメゾテリンを同定した。公共利用可能でインターネットからアクセスできる2つのコンピューターアルゴリズムを用いて、HLA A2、A3、およびA24分子に結合するペプチドを予測した。最も一般的なHLAクラスI分子型について最適な結合を調べる「BIMAS」は、K. C. Parkerらhttp://bimas.dcrt.nih.gov/（NIH）により開発された（23）。「SYFPEITHI」はRammenseeらによって開発され、一次および二次MHC結合アンカー残基の有無を考慮するスコアによりペプチドを評価するhttp://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi（24）。
【００８９】
材料および方法：ペプチドおよびT2細胞株
ペプチドは、下記の既発表の配列に従い、Macromolecular Resources（コロラド州フォートコリンズ）が合成した：インフルエンザマトリクスタンパク質由来のM1ペプチドGILGFVFTL（SEQ ID NO：10）（アミノ酸58〜66位）、表1に示すメゾテリンA2ペプチドおよびPSCA A2ペプチドは利用可能なデータベースを用いて同定し、HIV-gag A2ペプチドSLYNTVATL（SEQ ID NO：7）（アミノ酸75〜83位）（29）はHLA-A2結合モティーフを含む。メゾテリンA3ペプチドおよびPSCA A3ペプチドならびにHIV-NEF A3ペプチドQVPLRPMTYK（SEQ ID NO：8）（アミノ酸94〜103位）（20）はHLA-A3結合モティーフを含む。メゾテリンA24ペプチドおよびPSCA A24ペプチドならびにチロシナーゼペプチドAFLPWHRLF（SEQ ID NO：9）（アミノ酸206〜214位）（31）はHLA-A24結合モティーフを含む。各ペプチドの保存溶液（1mg/ml）を10％DMSO（JTBaker、ニュージャージー州フィリップスバーグ）中で調製し、細胞培養培地中でさらに希釈して、各アッセイについて最終ペプチド濃度10ng/mlとした。対照M1ペプチドは、同じ保存溶液および最終濃度を用いて、まず100％DMSOに溶解し、細胞培養培地中でさらに希釈した。T2細胞は、HLA-A*0201対立遺伝子だけを発現するヒトBおよびTリンパ芽球ハイブリッドである（26）。ヒトT2細胞株はTAP欠損細胞株で、新しく消化されたHLAクラスI結合エピトープを細胞質ゾルから、これらのエピトープが通常は新生HLA分子に結合し、細胞表面上での発現のためにそれらを安定化させる小胞体に移行させることができない（26）。T2-A3は、HLA-A301対立遺伝子を発現するよう遺伝子修飾されたT2細胞で、Walter Storkus博士（University of Pittsburgh）から御供与いただいた（32）。T2-A24は、HLA-A24対立遺伝子を発現するよう遺伝子修飾されたT2細胞である。HLA-A24遺伝子はPaul Robbins博士（米国国立癌センター、外科部門）から御供与いただいた（31）。T2細胞を200μM L-グルタミン（Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）、50ユニット-μg/ml Pen/Strep（Gibco）、1％NEAA（Gibco）、および1％ピルビン酸ナトリウム（Gibco）を補足したRPMI-1640（Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド）、10％血清（Hyclone、ユタ州ローガン）中の懸濁培養で増殖させた。
【００９０】
材料および方法：ペプチド/MHC結合アッセイ
目的のHLA分子を発現するT2細胞をAimV無血清培地（Gibco）中に、2.5×105細胞/mlまで再懸濁し、100〜200マイクログラムのペプチドを室温で終夜適用した。室温での適用により、各エピトープの結合に利用可能な空のHLA分子の数を最適化することができる（30）。細胞を洗浄し、1×105細胞/mlで再懸濁した。ペプチド結合をFACS（Beckon Dickenson、カリフォルニア州サンホセ）分析で評価した。
【００９１】
実施例2
メゾテリンおよびPSCAがCD8+ T細胞によって認識されるかどうかを調べるために、発明者らは、同種GM-CSF分泌膵臓腫瘍ワクチン接種を受けた患者からのCD8+ T細胞を多く含むPBLで抗原適用T2細胞をスクリーニングした。発明者らは以前、最高の二段階の用量でワクチン接種を受けた8名中3名の患者で、インビボでの自己腫瘍に対するワクチン接種後遅延型過敏（DTH）応答の関与を報告した。診断後4年以上経過して臨床上膵臓癌を再発していない患者はこれらの「DTH応答者」（それぞれ一次外科切除時には予後指標が悪かった（27）のみである（（27）、表2）。ワクチン接種後および最初のワクチン接種の28日後に得たPBLをまず分析した。2つのA3結合エピトープを適用したT2-A3細胞を、患者10（非DTH応答者で、診断後9ヶ月で再発）および13（DTH応答者で、再発していない）の末梢血から単離した、CD8+ T細胞を多く含むリンパ球と共に終夜インキュベートし、ガンマインターフェロン（IFN-γ）ELISPOTアッセイを用いて分析した。ELISPOTアッセイは比較的少ないリンパ球しか必要とせず、抗原特異的T細胞を定量するための最も感度の高いインビトロアッセイの一つであり、かつ抗原特異的T細胞の数を機能（サイトカイン発現）に相関させるため、このアッセイを選択した（33〜35）。2名の患者の末梢血中、ワクチン接種前と最初のワクチン接種の28日後に、2つのHLA-A3結合メゾテリンペプチドに応答して検出されたCD8+ T陽性細胞1×105個あたりのIFN-γスポットの数を図2Aに示す。
【００９２】
メゾテリン特異的T細胞の誘導が、患者13（DTH応答者）でワクチン接種の28日後に検出されたが、患者10（非DTH応答者）では検出されなかった。同様に、A2（図2B）およびA24（図2C）結合エピトープをそれぞれ適用したT2-A2およびT2-A24細胞で試験した場合、メゾテリン特異的CD8+ T細胞のワクチン接種後誘導が、他の2名の無疾患DTH応答者（患者8および患者14）で観察されたが、他の2名の非DTH応答者では観察されなかった。本試験で最初のワクチン接種後のメゾテリン特異的CD8+ T細胞誘導のために、同種ワクチンで治療した全14名の患者を分析したELISPOTの結果を、図2Dに示す。これらのデータは、本臨床試験において観察されたワクチン接種後の自己腫瘍に対するインビボDTH応答、長期無疾患生存、およびメゾテリン特異的T細胞応答のワクチン接種後誘導の間に直接の相関性があることを示している。特に、3名の各DTH応答者は、それぞれのHLA型に適合する全てのメゾテリンペプチドに対するT細胞応答においてワクチン接種後誘導を示したが、11名のDTH非応答者では、ワクチン接種後のメゾテリン特異的T細胞応答の増大を示したのは1名のみで、単一のペプチドに対するものでしかなかった。したがって、メゾテリン特異的T細胞応答のインビトロ測定は、どの患者がこのワクチン療法に応答するかを予測するための、新しいインビトロ免疫マーカー候補である。
【００９３】
材料および方法：末梢血リンパ球（PBL）および供血者
末梢血（100cc、ワクチン接種前および各ワクチン接種の28日後）を、以前に報告した第I相ワクチン試験（27）の一部として同種GM-CSF分泌膵臓腫瘍ワクチンの接種を受けた14名の患者全員から採取した。患者の試験登録時に、本抗原同定試験に用いるためのリンパ球を保存することについて告知に基づく同意を得た。ワクチン前および後のPBLを、フィコール-ハイパーク（Pharmacia、スウェーデン、ウプサラ）を用いた密度勾配遠心法により単離した。細胞を無血清RPMI-1640で2回洗浄した。PBLを10％DMSOを含む90％AIM-V培地中、-180℃で凍結保存した。
【００９４】
材料および方法：CD8+ T細胞のためのPBLの強化
CD8+ T細胞を解凍PBLから、Magnetic Cell Sorting of Human Leukocytesを製造者（MACS, Miltenyi Biotec、カリフォルニア州オーバーン）の指示通りに用いて単離した。細胞をCD8-PE抗体（Becton Dickenson、カリフォルニア州サンホセ）で染色して、陽性集団がCD8+ T細胞を含むことを確認し、フローサイトメトリーで分析した。この方法により一貫して＞95％のCD8+ T細胞純度を得た。
【００９５】
材料および方法：ELISPOTアッセイ
マルチスクリーンの96穴ろ過プレート（Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード）を60μl/ウェルの10μg/ml抗hIFN-γマウスモノクローナル抗体（Mab）1-D1K（Mabtech、スウェーデン、ナッカ）により4℃で終夜コーティングした。次いで、ウェルを1×PBSで各3回洗浄し、T細胞培地で2時間ブロックした。ELISPOTプレート上で6つずつ重複して、T細胞培地100μl中のペプチド（10ng/ml）を適用した1×105 T2細胞を、T細胞培地100μl中のCD8+ T細胞を選択するために精製される1×105解凍PBLと共に終夜インキュベートした。プレートを5％CO2中、37℃で終夜インキュベートした。PBS＋0.05％トゥイーン20（Sigma、ミズーリ州セントルイス）で6回洗浄することにより、ELISPOTプレートから細胞を除去した。ウェルを5％CO2中、37℃で2時間、60μl/ウェルの2μg/mlビオチン化Mab抗hIFNガンマ7-B6-1（Mabtech、スウェーデン、ナッカ）を用いてインキュベートした。PBS/トゥイーン0.05％で6回洗浄した後、アビジンペルオキシダーゼ複合体（Vectastain ELITE ABC kit、Vetcor Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム）を100μl/ウェルで加え、室温で1時間インキュベートした。AEC-基質溶液（3-アミノ-9-エチルカルバゾール）を100μl/ウェルで加え、室温で4〜12分間インキュベートした。水道水で洗浄することにより発色を停止した。プレートを室温で終夜乾燥し、着色スポットを自動画像システムELISPOT読み取り器（Axioplan2、Carl Zeiss Microimaging Inc.、ニューヨーク州トムウッド）を用いて計数した。
【００９６】
実施例3
前述のデータは、自己腫瘍に対するインビボDTH応答および長期無疾患生存のメゾテリン特異的CD8+ T細胞応答のワクチン接種後誘導との相関を明らかに示している。しかし、この相関は、無疾患のまま推移しているDTH応答患者におけるメゾテリンへのT細胞応答のワクチン特異的誘導ではなく、一般化された免疫抑制（自己腫瘍に対するワクチン接種後DTH応答を示すことができなかった患者、および疾患の進行が認められた患者において）を示している可能性もある。メゾテリン特異的CD8+ T細胞のワクチン接種後誘導が腫瘍抗原特異的であることを示すために、発明者らは各HLA-A2陽性患者をHLA-A2-結合インフルエンザマトリクスペプチド、M1（28）に対するT細胞応答について評価した。ワクチン試験中のほとんどの患者は登録前のある時点でインフルエンザワクチン接種を受けていたため、発明者らはインフルエンザM1ペプチドを選択した。図3に示すとおり、HLA-A2陽性患者は全員、同様のM1ペプチドに対するワクチン接種前および接種後T細胞応答を示した。ワクチン接種前応答は105の全CD8+ T細胞あたり19から50のIFN-γスポットの範囲であり、ワクチン接種後応答はそれぞれの患者でほぼ同じままであった（図3）。HLA-A3およびA24陽性患者については、これらのHLA分子に結合することが知られているインフルエンザM1エピトープは発表されていないため、同様の試験は行わなかった。
【００９７】
発明者らは、同じ14名の患者からのリンパ球を、第二の過剰発現される抗原、PSCAに対するCD8+ Tリンパ球のワクチン接種後誘導について評価した。メゾテリンとは対照的に、PSCAは3名のDTH応答者で免疫応答を誘発しなかった。ここでも、発明者らは両方のアルゴリズムで支持されたHLA-A2、HLA-A3、およびHLA-A24の上位2つのエピトープを合成し、これらをメゾテリン実験で用いたものと同じプロトコルに従って分析した。発明者らは、どの患者でもPSCA特異的T細胞のいかなるワクチン接種後誘導も認めず、したがって、免疫原エピトープを失っていないことを確認するために、各HLAクラスI分子についてさらに4つのPSCAペプチドを合成した。これらのペプチドの分析でも、PSCA特異的CD8+ T細胞応答のワクチン接種後誘導を示すことはできなかった（それぞれ図4A、4B、および4C）。PSCA特異的応答は8名の非応答者でも示すことはできなかった（図4d）。この結果は、SAGE分析においてPSCAは膵臓癌で同様に過剰発現されるが、PSCAに対するワクチン誘導性免疫応答は認められなかったことから、メゾテリンが適切な膵臓腫瘍抗原であることをさらに裏付けている。加えて、PSCAデータは、腫瘍におけるタンパク質の過剰発現はタンパク質のワクチン標的としての有用性を予測するのに十分であることを示している。
【００９８】
2つの同種ワクチン細胞株によるメゾテリンおよびPSCA発現のフローサイトメトリー分析を図5に示す。興味深いことに、メゾテリンは両方のワクチン細胞株によって同等に発現されるが、PSCAはワクチン細胞株の一方（Panc 6.03）によってのみ発現される。
【００９９】
材料および方法：CD8+ M1特異的T細胞株
M1特異的T細胞株を、HLA-A201陽性PBLをまず放射線照射自己樹状細胞と、続いて放射線照射自己エプスタイン-バーウイルス（EBV）転換B細胞（いずれもHLA-A201制限エピトープを適用した）により反復インビトロ刺激して生成させた。この細胞株を、10μgペプチド/mlのそれぞれのペプチドを37℃で2時間適用した自己EBV細胞を用いて2週間に1回刺激し、RPMI-1640で2回洗浄し、10,000ラドで放射線照射した。T細胞を、20 cetusユニットIL-2/ウェルおよび10ng/ウェルIL-7を補足したT細胞培地（200μM  L-グルタミン、50ユニット-μg/ml Pen/Strep、1％NEAA、および1％ピルビン酸Naを含むRPMI-1640、10％ヒト血清（Johns Hopkins Hemapheresis Unitで採取した保存血清））中、T細胞：EBV細胞比1：2で刺激した。この株をすべてのアッセイで陽性対照T細胞株として用いた。
【０１００】
材料および方法：フローサイトメトリー
ワクチン株におけるメゾテリンおよびPSCAの発現をフローサイトメトリー分析で評価した。ワクチン株を2回洗浄し、「FACS」緩衝液（1％PBS、2％FBS、および0.2％アジ化ナトリウムを補足したHBSS）中に再懸濁し、次いでFACScan分析器（BD Immunocytometry Systems）でのフロー分析のために、マウスモノクローナルメゾテリン（CAK1）（Signet Laboratories、マサチューセッツ州デダム）またはPSCAに対するマウスモノクローナル（クローン１G8、R.E.R.から入手）と、続いてFITC-標識ヤギ抗マウスIgG（BD PharMingen、カリフォルニア州サンホセ）で染色した。
【０１０１】
これらのデータは、メゾテリン特異的CD8+ T細胞はDTH応答者では同種GM-CSF分泌腫瘍ワクチンによる1回接種後に検出されるが、非DTH応答者では検出されないことを示している。既発表のワクチン試験で治療した患者は、膵十二指腸切除の8〜10週間後で、6ヶ月クールのアジュバント化学療法を受ける4週間前に、最初のワクチン接種を受けた（27）。これらの患者のうち6名は6ヶ月終了時に無疾患のままで、1ヶ月おきにさらに3回までのワクチン接種を受けた。複数回のワクチン治療後にこれら6名の患者から採取した一連のCD8+ T細胞強化PBL試料で、反復ELISPOT試験を行い、メゾテリン特異的T細胞応答に対する化学放射線照射および複数回ワクチン接種の効果を評価した。
【０１０２】
図6に示すとおり、3名のDTH応答者のうちの2名は、2回目のワクチン接種後にメゾテリン特異的T細胞応答の低下を示した。どちらの患者でも、メゾテリン特異的T細胞応答は4回目のワクチン接種までに初回接種後に得られたレベルまで戻った。2回目のワクチン接種後に観察されたメゾテリン特異的T細胞応答の抑制は、各患者が1回目と2回目の接種の間に受けた化学療法の結果であると考えられる。興味深いことに、3名の患者のうちの1名は1回目および2回目のワクチン接種後に同様のメゾテリン特異的T細胞応答を示した。このDTH応答者は引き続いてマイトマイシン-Cが原因の遅発型自己免疫抗体仲介性合併症を発症し、医学的介入とワクチン試験の中止を必要としたため、ワクチン接種は2回しか受けなかった。これとは対照的に、初回ワクチン接種後に初期のメゾテリン特異的T細胞応答を示さなかった患者では、反復ワクチン接種をしてもメゾテリン特異的T細胞応答を誘導することはできなかった（図6）。
【０１０３】
同種GM-CSF-分泌膵臓腫瘍ワクチンにより誘導されたCD8+ T細胞応答について記載しているこれらのデータは、以下の結論を支持するものである。第一に、メゾテリンはワクチンにより誘導された免疫応答のインビトロ生物マーカーとして役立ち、これは膵腺癌患者におけるインビボ応答に相関している。第二に、臨床応答に関連してインビボ免疫応答の証拠を示す、患者からの未培養ワクチン接種後CD8+ T細胞により、メゾテリンは認識され、もう一つの過剰発現遺伝子産物であるPSCAは認識されないことで、CD8+ T細胞の免疫関連腫瘍標的を同定するための迅速で機能的なゲノムによるアプローチとしてのこの抗原同定アプローチの有効性が確認される。
【０１０４】
メゾテリンはほとんどの膵腺癌により発現されるメゾテリン/巨核球増強因子ファミリーの40キロダルトンの膜貫通糖タンパク質メンバーである（36）、（37〜39）。また、メゾテリンは卵巣癌、中皮腫、およびいくつかの扁平上皮癌によって発現されるとの報告もある（37〜39）。メゾテリンはグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞膜に結合することが知られており、細胞接着において機能するとの仮説が立てられている（36）。メゾテリンおよびその遺伝子ファミリーの他のメンバーは、限定された正常組織発現を示す。したがって、膵腺癌およびメゾテリンを過剰発現する他の腫瘍タイプの患者に対する将来の抗原によるワクチンの開発において、免疫原として使用する際に非常に好都合な3つの重要な基準に適合している。すなわち、ほとんどの膵臓および卵巣癌が広く共有しており、正常組織では限定された発現を示し、この抗原を発現する腫瘍細胞でのワクチン接種後にCD8+ T細胞応答を誘導する。
【０１０５】
共有された、生物学的に関連する腫瘍抗原の同定により、現行の全細胞ワクチンよりも抗腫瘍免疫を誘導する際に有効である可能性を有する抗原によるワクチンを設計する機会が得られる。加えて、組換え抗原によるアプローチの規模拡大は、現在用いられている全腫瘍細胞ワクチンよりも技術的に可能である。しかし、組換え抗原によるワクチンは、患者により広く発現され、免疫原性である抗原の同定が必要である。これまでのところ、cDNAライブラリのT細胞スクリーニング、ファージディスプレイライブラリの抗体スクリーニング、またはMHCに結合した抗原の生化学的溶離および精製によって、大多数の公知の腫瘍抗原が同定されており、その多くは正常組織に比べて腫瘍細胞で過剰発現されるか、または再活性化される、共有、非突然変異遺伝子由来であると考えられる（3〜13）。残念ながら、T細胞によって認識される腫瘍関連抗原のこの拡大しつつあるリストは、他の型の癌のワクチン接種患者からのT細胞株およびクローンの単離および増殖が技術的に困難であるため、ほとんどが黒色腫に限定されている。本明細書に開示されている腫瘍抗原同定アプローチは、所与の腫瘍内で差次的に発現された遺伝子のデータベース、およびワクチン接種患者からの保存未培養バルクPBLしか必要としないため、実行可能である。したがって、この抗原同定アプローチは迅速で、ほとんどの型の癌に一般化することができる。加えて、長期間培養されたT細胞株およびクローンではなく、未培養リンパ球の使用により、新しい生物学的に関連する免疫標的を同定する利点がある。
【０１０６】
PSCAは発明者らのSAGE膵臓遺伝子発現データベースで過剰発現されることが明らかとなった第二の遺伝子産物である。事実、PSCAはメゾテリンと比べても、より高いレベルで過剰発現されることが見いだされている。しかし、ワクチン接種PSCA特異的T細胞応答は、DTH応答患者およびDTH非応答患者において検出されなかった。この時点では、なぜGM-CSF分泌同種ワクチンが一つの過剰発現される抗原に対しては応答を誘導し、第二の同様に過剰発現される抗原に対しては誘導しないのかは不明である。これら2つの抗原が最初の初回抗原刺激中に異なる処理を受け、提示されている可能性もある（58）。
【０１０７】
本試験において、発明者らはメゾテリン特異的T細胞が3つの異なるHLA-A遺伝子座の対立遺伝子により提示される、少なくとも6つの異なるペプチドに対して誘導されうることも示している。この知見は、メゾテリンが共有抗原として役立ちうることをさらに支持するものである。本試験において、それらのモティーフに基づき最良のHLA-A対立遺伝子結合エピトープであると予測される最高順位の抗原エピトープは、それぞれのHLA対立遺伝子に結合し、メゾテリン特異的T細胞によって認識もされた。他の腫瘍抗原を分析している報告は、最高順位のエピトープが必ずしもT細胞による最適な認識と相関していないことを明らかにしている（25）。発明者らは2つの黒色腫抗原、チロシナーゼおよびMAGE 1においてもコンピューターアルゴリズムを実施して、それらの既発表のHLA-A2結合ペプチドがこの方法によりいかに評価されるかを調べた。発明者らは、我々のHLA-A2結合メゾテリンエピトープが公知のチロシナーゼおよびMAGE 1 HLA-A2結合エピトープとほぼ同等のスコアを与えられていることを見いだした。これは、我々の分析で対照抗原として用いた、既発表のHLA-A2 HIV GAGおよびHLA-A3 HIV NEFエピトープについてもあてはまった。両方のアルゴリズムにより高い順位のエピトープを選択することは、それぞれのHLA分子に対する結合の確立の重要な予測因子であると考えられる。
【０１０８】
発明者らは、膵臓腫瘍抗原候補を同定する機能的ゲノムアプローチを開発した。この抗原同定へのアプローチは、生物学的に関連する免疫標的である他のヒト癌抗原の同定を容易にする。インビトロT細胞応答と、応答のインビボ尺度との相関性は、このアプローチの生物学的重要性を確認するものである。このアプローチは迅速かつ実行可能で、他の型の癌によって発現される抗原を同定するために容易に適応させることができる。これはまた、ほとんどのヒト癌治療のための組換え抗原によるワクチンの開発を加速させると思われる。
【０１０９】
発明の背景および実施例1〜4の引用文献
2006521090.tif 000010
2006521090.tif 000011
2006521090.tif 000012
2006521090.tif 000013
2006521090.tif 000014
2006521090.tif 000015
2006521090.tif 000016
2006521090.tif 000017
【０１１０】
実施例5
HPV-16 E6およびE7ならびに活性化ras癌遺伝子での同時形質転換によるマウス腫瘍細胞の構築
C57BL/6マウスの初代培養腹腔細胞をHPV-16 E6およびE7で不死化し、次いでpEJB発現活性化ヒトc-Ha-ras遺伝子で形質転換した。この同時形質転換により腫瘍発生性細胞株が得られた。
【０１１１】
C57BL/6マウス腹腔細胞を採取し、1×HBSSで洗浄した。初代培養単一細胞懸濁液を、10％ウシ胎仔血清、50ユニット/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、および2mM可欠アミノ酸を補足したRPMI1640中、37℃および5％CO2で増殖させて、インビトロ培養した。HPV-16 E6およびE7遺伝子の初代培養腹腔細胞への形質導入を、Denise A. Galloway（Fred Hutchinson Cancer Research Center、ワシントン州シアトル）から御提供いただいたLXSN16E6E7レトロウイルスベクターを用いて実施した（Halbertら、(1991) J Virol, 65:473-478）。HPV-16 E6-およびE7-含有LXSN16E6E7を用いて、CRIP細胞を感染させ、広い宿主範囲の組換えウイルスを生成した。初代培養腹腔細胞は以前に記載されているとおりに（Halbertら、(1991) J Virol, 65:473-478）形質導入により不死化した。形質導入後、レトロウイルス上清を除去し、細胞をG418（0.4mg/ml）培地中でさらに3日間培養し、組換えレトロウイルス遺伝子の挿入および発現を可能にした。次いで、不死化肺（E6+E7+）細胞を、Chi V. Dang（The John Hopkins Hospital、メリーランド州バルチモア）から御提供いただいた、活性化ヒトc-Ha-ras遺伝子を発現するpVEJBで形質導入し、G418（0.4mg/ml）およびハイグロマイシン（0.2mg/ml）で選択した。
【０１１２】
実施例6
WF-3の組織学的および病理学的特徴の分析
5×104 WF-3腫瘍細胞をC57BL/6マウスに腹腔内注入した。4週間後、マウスを屠殺して腹水も予備腫瘍の形成を調べた。摘出臓器を4％緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、組織検査用切片を調製した後、通常のヘマトキシリン-エオシン染色を行った。スライドを光学顕微鏡下で観察した。
【０１１３】
マウスに5×104 WF-3腫瘍細胞を腹腔内注入し、4週間後に屠殺した。この細胞株は腫瘍細胞で腹腔内攻撃したマウスで腹水を生成することができた（図7A参照）。形態学的に、WF-3腫瘍細胞はヒト卵巣/腹腔で見いだされる漿液性腫瘍に似た乳頭状構造を示した（図1B）。さらに、腫瘍は高レベルの有糸分裂活性、多態性核、異常有糸分裂、および高い核/細胞質の比を示し、これは高度悪性新生物に一致している（図7C参照）。
【０１１４】
図7は、腹水生成卵巣腫瘍細胞株（WF-3）の生成および特徴付けを示す。WF-3腫瘍細胞をC57BL/6マウスに1×105細胞/マウスの用量で腹腔内注入した。腫瘍攻撃の4週間後にマウスを安楽死させた（図7A参照）。マウスにおける腹水生成を示す典型的肉眼図。注：腫瘍攻撃の4週間後にマウスは腹囲の増加を伴う著しい腹水を生じた。図7Bは外植腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色を100×の倍率で示している。腫瘍は乳頭状の形状を示し、腹腔または卵巣由来の腫瘍に形態上一致していた。図7Cは腫瘍を400×の倍率で示している。挿入図はWF-3腫瘍細胞の特徴を詳細に示している。
【０１１５】
実施例7
WF-3腫瘍細胞のMHCクラスIおよびクラスII提示
WF-3腫瘍細胞を回収し、フローサイトメトリー分析のために調製した。WF-3腫瘍細胞におけるMHCクラスIおよびクラスII発現の検出のために、抗H-2Kb/H-2Dbモノクローナル抗体または抗I-Abモノクローナル抗体を加えた。
【０１１６】
WF-3腫瘍細胞を回収し、トリプシン処理し、洗浄し、FACScan緩衝液中に再懸濁した。抗H-2Kb/H-2Dbモノクローナル抗体（クローン28-8-6、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）または抗I-Abモノクローナル抗体（クローン25-9-17、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）を加え、氷上で30分間インキュベートした。FACScan緩衝液中で2回洗浄した後、FITC結合ヤギ抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Lab. Inc.、ペンシルヴァニア州ウェストグローブ）を加え、氷上で20分間インキュベートした。試料をFACScan緩衝液に再懸濁した。分析をCELLQuestソフトウェアを用いてBecton Dickinson FACScan（Becton Dickinson Immunocytometry System、カリフォルニア州マウンテンビュー）で行った。
【０１１７】
発明者らのデータは、WF-3はMHCクラスI発現については陽性である（図8A）が、MHCクラスII発現については陰性である（図8B）ことを示している。特に、図8は、WF-3腫瘍細胞上のMHCクラスIおよびII提示を示している。WF-3腫瘍細胞を回収し、トリプシン処理し、洗浄し、FACSCAN緩衝液中に再懸濁した。抗H2Kb/H-2Dモノクローナル抗体または抗I-Abモノクローナル抗体を加え、続いてフローサイトメトリー分析を行って、WF-3腫瘍細胞上のMHCクラスIおよびクラスIIの発現を検出した。図8Aは、MHCクラスI陰性対照（細い線）に比べてMHCクラスI提示陽性であった（太い線）WF-3腫瘍細胞を示している。図8Bは、MHCクラスII提示については陰性であったWF-3腫瘍細胞を示している。細い線はMHCクラスII陰性対照の染色を示している。
【０１１８】
実施例8
致死的腹水の生成をきたすWF-3腫瘍細胞の最低腫瘍供与量の定量
WF-3腫瘍細胞をC57BL/6マウスに様々な供与量（1×104、5×104、1×105、および1×106細胞/マウス）で腹腔内注入した。マウスを1週間に2回、腹水および腫瘍の生成についてモニターし、90日後に屠殺した。腫瘍攻撃後の生存については、マウスに様々な供与量のWF-3（1×104、5×104、1×105、および1×106細胞/マウス）で腹腔内攻撃し、腫瘍攻撃後のそれらの生存をモニターした。
【０１１９】
図9Aに示すとおり、5×104、1×105、および1×106細胞を腹腔内注入したマウスはすべて30日以内に腹水を生成した。一方、1×104/マウスを注入したマウスの20％は、腫瘍攻撃の90日後に腫瘍はなく、腹水生成も見られなかった。5×104腫瘍細胞以上の供与量を注入したマウスはすべて、腫瘍攻撃から50日以内に死亡した（図9B）。これらのデータは、WF-3腫瘍細胞がマウスの腹腔内で腹水および固形腫瘍の生成を引き起こすことができ、特定の腫瘍攻撃供与量でついには注入したマウスを死亡させることを示唆している。
【０１２０】
実施例9
メゾテリンはWF-3前臨床卵巣癌モデルにおいて高度に発現される。発明者らは、pre-WF0に比べてWF-3の遺伝子発現プロファイルを特徴付けるために、マイクロアレイ分析（Incyte Genomics Corporation、カリフォルニア州パロアルト）を行った。pre-WF0細胞株は、以前に報告された方法（Linら、(1996) Cancer Research, 56:21-26）を用いてマウス初代培養腹腔細胞をHPV-16 E6およびE7遺伝子を有するレトロウイルスベクターで不死化することにより生成した。発明者らは、卵巣癌後期における腫瘍発生性に関連するWF-3の遺伝子を同定するために、pre-WF0を基準細胞株として選択した。表4（下記）はpre-WF0に比べてWF-3に存在する高度に発現される遺伝子をまとめている。下記の表4に示すとおり、メゾテリンはWF-3においてアップレギュレートされる遺伝子の上位10個の1つで、WF-3は卵巣癌に対するメゾテリン特異的癌免疫療法を開発するための適当な前臨床モデルであることが示唆される。
【０１２１】
（表４）WF-3において特異的に発現される遺伝子のまとめ
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【０１２２】
実施例10
WF-3腫瘍細胞におけるメゾテリンmRNAおよびタンパク質の発現
発明者らは、RT-PCRを用いてWF-3細胞株によるメゾテリンの発現をさらに確認した。
【０１２３】
RNAをWF-3腫瘍細胞から、RNAzol（Gibco BRL、メリーランド州ゲイザースバーグ）を製造者の指示に従って用いて抽出した。RNA濃度を測定し、全細胞RNA 1mgを、プライマーとしてオリゴ(dT)およびSuperscript逆転写酵素（Gibco BRL）を用い、20ml量に逆転写した。cDNA 1mlを一組のプライマー（
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それぞれSEQ ID NO：11および12）を用いてPCRにより増幅した。プライマーは既発表のマウスメゾテリンcDNA配列由来であった（Kojimaら、(1995) J Biol Chem, 270:21984-21990）。PCRは250mMの各dNTP、100nMのプライマー、5mlの10×緩衝液（New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー）、および1UのVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）の反応混合物50ml中、30サイクル（94℃、1分間の変性；55℃、1分間のアニーリング；および72℃、2分間の伸長）を用いて実施した。反応混合物（試料10ml）を、0.2mg/mlの臭化エチジウムを含むTAE緩衝液中のアガロースゲル電気泳動（1％）を用いて分析した。
【０１２４】
マウスメゾテリンタンパク質はヒトメゾテリンタンパク質と65％の類似性を共有している。図10に示すとおり、発明者らはRT-PCRによりWF-3腫瘍におけるマウスメゾテリンのmRNA発現を検出することができた（レーン2）が、対照B-16腫瘍細胞では検出できなかった（レーン3）。ウェスタンブロット分析を実施して、WF-3腫瘍細胞におけるメゾテリンタンパク質の発現を評価した。腫瘍細胞を抗メゾテリンマウスポリクローナル抗体で染色した。ウェスタンブロット分析の結果より、WF-3はメゾテリンタンパク質について陽性であるが、B16黒色腫細胞はメゾテリン陰性である（データは示していない）ことが確認された。したがって、発明者らの結果は、WF-3細胞がメゾテリンmRNAおよびタンパク質を発現することを示している。
【０１２５】
図10は、RT-PCRおよびゲル電気泳動で示されたWF-3腫瘍細胞におけるマウスメゾテリンの発現を示している。ウェスタンブロット分析も実施して、発現を確認した（示していない）。図10に示すとおり、RT-PCRをSuperscript One-Step RT-PCR Kit（Gibco、BRL）および次の一組のプライマーを用いて実施した：
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（それぞれSEQ ID NO：11および12）。ウェスタンブロット分析も用いて、WF-3腫瘍細胞におけるメゾテリンタンパク質の発現を示した。腫瘍細胞を抗メゾテリンマウスポリクローナル抗体と、続いてFITC結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体（データは示していない）で染色した。
【０１２６】
実施例11
メゾテリンDNA癌ワクチン免疫療法
前述の腹腔腫瘍モデルを用いて、発明者らはメゾテリンをコードするDNAワクチンの、メゾテリン特異的細胞毒性Tリンパ球応答および空のプラスミドDNAよりも大きい抗腫瘍効果を生じさせる能力を示した。これらのデータは、メゾテリンを標的とするDNA腫瘍ワクチンを、卵巣癌および他のメゾテリンが高度に発現される癌の治療または制御において用いうることを示している。
【０１２７】
プラスミドDNA構築
メゾテリンン発現腫瘍細胞株のWF-3が利用可能であるため、発明者らはメゾテリンをコードするDNAワクチンを作成して、C57BL/6マウスのWF-3に対するそれらの抗腫瘍効果を試験した。発明者らは、マウス全長メゾテリンタンパク質（全長：625アミノ酸）をコードするDNAワクチンを作成するために、哺乳動物細胞発現ベクターを用いた。
【０１２８】
pcDNA3-メゾテリンの構築のために、まずメゾテリンをコードするDNA断片をWF-3抽出RNAおよび一組のプライマー（
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それぞれSEQ ID NO：11および12）から、Superscript One-Step RT-PCR Kit（Gibco、BRL）を用いてのRT-PCRにより増幅し、pcDNA3のEcoRI/BamHI部位にクローニングした。プライマーは既発表のマウスメゾテリンcDNA配列由来であった（11）。DNA構築物の正確度をDNA配列決定法により確認した。
【０１２９】
メゾテリンタンパク質をコードするDNAワクチンの接種はメゾテリン発現卵巣腫瘍による攻撃に対して防御する。発明者らは、このpcDNA3-メゾテリンDNAワクチンの、WF-3細胞による攻撃に対して防御する能力を試験した。DNAコーティング金粒子の調製およびヘリウム推進遺伝子銃（Bio-rad、カリフォルニア州ハーキュリース）を、以前に記載されたプロトコル（Chenら、(2000) Cancer Research, 60: 1035-1042に従って実施した。DNAコーティング金粒子（1mg DNA/弾丸）をC57BL/6マウスの剃毛した腹部に、ヘリウム推進遺伝子銃（Bio-rad、カリフォルニア州ハーキュリース）を発射圧400p.s.iで用いて送達した。
【０１３０】
腫瘍防御実験のために、マウス（各群10匹）を2mgのpcDNA3-メゾテリンDNAで皮内にワクチン接種した。1週間後、マウスに同用量の追加免疫を行った。追加免疫の1週間後に、致死量の5×104 WF-3腫瘍細胞の腹腔内注入によりマウスを攻撃した。1週間に2回、マウスを触診および視診により腹水生成の徴候についてモニターし、第90日に屠殺した。各ワクチン接種群の腹水を生じていないマウスの割合を求めた。
【０１３１】
発明者らのデータは、pcDNA3-メゾテリンはWF-3腫瘍攻撃に対し高度の防御（60％）を提供することを示していた。対照群はpcDNA3ベクター単独（0％）でワクチン接種したか、または接種を行わなかった（0％）。図11は、メゾテリン特異的DNAワクチンを用いた、WF-3腫瘍増殖に対するインビボ腫瘍防御実験を示している。
【０１３２】
実施例12
pcDNA3-メゾテリンによるワクチン接種はメゾテリン特異的細胞毒性免疫応答を生じる。CD8+ Tリンパ球は、抗腫瘍免疫を仲介するための重要な効果細胞である。細胞毒性Tリンパ球（CTL）アッセイを実施して、pcDNA3-メゾテリンDNAワクチンにより生成したメゾテリン特異的CD8+ T細胞の細胞毒性効果を調べた。ワクチン接種したマウスからの脾細胞を、メゾテリンタンパク質を含む細胞溶解物と共に培養した後、効果細胞として用いた。WF-3腫瘍細胞を標的細胞として用いた。
【０１３３】
形質移入した293 Db,Kb細胞からのメゾテリン含有細胞溶解物の生成
CTLアッセイのための脾細胞に適用するメゾテリン含有細胞溶解物を生成するために、合計20mgのpcDNA3-メゾテリンまたは空のプラスミドDNAを、lipofectamine 2000（Life  Technologies）を製造者のプロトコルに従って用いて、5×106 Db,Kb細胞に形質移入した。形質移入した293 Db,Kb細胞を移入の40〜44時間後に回収し、次いで凍結-解凍を3回繰り返して処理した。タンパク質濃度をBio-Radタンパク質アッセイ（Bio-rad、カリフォルニア州ハーキュリース）を製造者のプロトコルに従って用いて定量した。以下に記載するとおり、メゾテリン含有細胞溶解物を用いて、様々なワクチン接種マウスから得た脾細胞に適用した。
【０１３４】
細胞毒性Tリンパ球（CTL）アッセイ
細胞溶解を、CytoTox96非放射性細胞毒性アッセイキット（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を製造者のプロトコルに従って用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の定量的測定により評価した。要するに、ワクチン接種したマウス（各群5匹）から脾細胞を採取し、最後のワクチン接種後1週間プールした。脾細胞を効果細胞として、24穴組織培養プレートで、10（vol/vol）ウシ胎仔血清、50ユニット/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM可欠アミノ酸を補足した全量2mlのRPMI 1640中、20mgの細胞溶解物を6日間適用した。WF-3腫瘍細胞を標的細胞として用いた。WF-3細胞を脾細胞と、様々な効果細胞/標的細胞（E：T）比で混合した。37℃で5時間インキュベートした後、培地50μlを回収して、製造者のプロトコルに従い、培地中のLDHの量を評価した。溶解物の割合を次の式から計算した：100×(A-B)/(C-D)（式中、Aは効果細胞シグナルの実験値、Bは効果細胞の自然バックグラウンドシグナル値、Cは標的細胞からのシグナル最高値、Dは標的細胞の自然バックグラウンドシグナル値である）。
【０１３５】
統計解析
統計学的評価を、スチューデント t-検定を用いて行った。両側P値をすべての実験で示し、有意性をP＜0.05と定めた。統計学的評価から除外したマウスはなかった。
【０１３６】
図12に示すとおり、pcDNA3-メゾテリンによるワクチン接種は、pcDNA3によるワクチン接種またはワクチン接種なしの場合に比べて、有意な割合の特異的溶解を引き起こした（P＜0.001、一元配置ANOVA）。これらの結果は、pcDNA3-メゾテリンDNAによるワクチン接種がメゾテリン特異的T細胞仲介性のWF-3の特異的溶解を引き起こしうることを示している。
【０１３７】
メゾテリン特異的DNAワクチンでのワクチン接種により誘導された特異的溶解を示す細胞毒性Tリンパ球（CTL）アッセイ
マウス（各群5匹）を様々なDNAワクチンで皮内に免疫化した。1週間後に同じ用量で追加免疫を行った。マウスからの脾細胞をワクチン接種後14日間プールした。細胞毒性アッセイを行うために、脾細胞をメゾテリンタンパク質と共に6日間培養し、効果細胞として用いた。WF-3腫瘍細胞を標的細胞とした。WF-3細胞を脾細胞と様々なE：T比で混合した。細胞溶解をLDHの定量的測定により評価した。注：pcDNA3-メゾテリンDNAワクチンにより、他のDNAワクチンよりも有意に高い割合で特異的溶解が認められた（p＜0.001）。この図で示したデータは2つ行ったうちの一つの典型的実験からのものである。
【０１３８】
実施例13
この実施例では、発明者らは経口遺伝子免疫のための媒体として、ネズミチフス菌の弱毒株を用いる。メゾテリンのmyc標識版を発現するpcDNA3.1/myc-His(-)ベクターを構築した。メゾテリン発現ベクターを有する組換えネズミチフス菌aroA株による免疫化の後、発明者らはイムノアッセイにより抗myc抗体を用いてメゾテリン/myc融合タンパク質の高レベルの発現を検出することができる。ネズミチフス菌栄養要求性aroA株のSL7202ネズミチフス菌2337-65誘導株hisG46、DEL407［aroA::Tn10(Tc-s)])を、これらのインビボ試験のための担体として用いる（Darjiら(1997) Cell 91: 761-775；Darjiら(2000) FEMS Immunology and Medical Microbiology 27: 341-9参照）。次いで、このネズミチフス菌によるメゾテリンDNAワクチン送達系を用いて、このワクチンが発明者らのWF-3腫瘍モデル系を用いた卵巣癌細胞攻撃を防御しうるかどうかを試験する。
【０１３９】
実施例5〜13の引用文献
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2006521090.tif 000023
2006521090.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
（図１）図1Aから1Fは、HLA-A2、A3、およびA24分子に結合するメゾテリンおよびPSCAタンパク質由来エピトープを同定するT2結合アッセイを示す図である。フローサイトメトリー分析前に、T2細胞に100〜400マイクログラムのペプチドを室温で終夜適用した。図1A  HLA-A2を発現するT2細胞に次のいずれかを適用：無ペプチド（黒線）、メゾテリンA1309〜318結合ペプチド（緑線）、メゾテリンA220〜29（ピンク線）、およびメゾテリンA2530〜539（青線）。ペプチド適用細胞を非標識マウス抗HLAクラスI分子モノクローナル抗体W6/32およびヤギ抗マウスFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。図1B  A3を発現するよう遺伝子修飾されたT2細胞に次のいずれかを適用：無ペプチド（黒線）、メゾテリンA1309〜318結合ペプチド（緑線）、メゾテリンA383〜92（ピンク線）、およびメゾテリンA3225〜235（青線）。ペプチド適用細胞を非標識マウス抗ヒトHLA-A3特異的モノクローナル抗体GAPA3およびFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。図1C  A24を発現するよう遺伝子修飾されたT2細胞に次のいずれかを適用：無ペプチド（黒線）、メゾテリンA1309〜318結合ペプチド（緑線）、メゾテリンA24435〜444（ピンク線）、およびメゾテリンA24475〜484（青線）。ペプチド適用細胞を非標識汎HLA抗体W6/32およびFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。図1D  HLA-A2を発現するT2細胞に次のいずれかを適用：メゾテリンA1309〜318結合ペプチド（緑線）、PSCA A25〜13（ピンク線）、PSCA A214〜22（青線）、PSCA A2108〜116（橙線）およびPSCA A243〜51（赤線）。ペプチド適用細胞を非標識マウス抗HLAクラスI分子モノクローナル抗体W6/32およびヤギ抗マウスFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。図1E  A3を発現するよう遺伝子修飾されたT2細胞に次のいずれかを適用：メゾテリンA1309〜318結合ペプチド（緑線）、PSCA A399〜107（ピンク線）、A35〜13（青線）、A314〜22（橙線）、A3109〜117（紫線）、A343〜51（赤線）、およびPSCA A320〜28（黄線）。ペプチド適用細胞を非標識マウス抗HLA-A3特異的モノクローナル抗体GAPA3およびFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。図1F  A24を発現するよう遺伝子修飾されたT2細胞に次のいずれかを適用：メゾテリンA1309〜318ペプチド（緑線）、PSCA A2476〜84（ピンク線）、PSCA A24108〜116（青線）、PSCA A2499〜107（橙線）、PSCA A24109〜117（紫線）、およびPSCA A2477〜85（赤線）。ペプチド適用細胞を非標識汎HLA抗体W6/32およびFITC標識IgG2a二次抗体で染色した。
（図２）図2Aから2Dは、PBMC由来CD8+ T細胞のELISPOT分析を示す図であり、膵臓癌に対する同種GM-CSF-分泌腫瘍ワクチン接種を受けたDTH応答者3名ではメゾテリン特異的T細胞のワクチン接種後誘導を示すが、非DTH応答者11名では誘導を示さない。図2A  HLA-A3陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図2B  HLA-A2およびHLA-A3陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図2C  HLA-A24陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図2D  ELISPOT分析を第I相同種GM-CSF分泌膵臓腫瘍ワクチン試験で治療した患者14名全員からのPBLで実施した（28）。IFN-γ-発現細胞のELISPOT分析を、ワクチン接種前日または第1回ワクチン接種の28日後に単離したPBMCを用いて行った。リンパ球をフィコール-ハイパーク分離法により単離し、アッセイ日まで液体窒素中で凍結保存した。CD8+ T細胞濃縮を分析前に行った。T2-A3細胞に2つのメゾテリン由来エピトープMesoA3（83〜92）（白四角）、MesoA3（225〜234）（黒丸）、およびHIV-NEFA3（94〜103）（白三角）を適用した。T2-A2細胞に2つのメゾテリン由来エピトープMesoA2（20〜29）（黒四角）、MesoA2（530〜539）（白丸）、およびHIV-GAG（77〜85）（黒三角）を適用した。T2-A24細胞に2つのメゾテリン由来エピトープMesoA24（435〜444）（白菱形）、MesoA24（475〜484）（黒菱形）、およびチロシナーゼA24（206〜214）（星形）を適用した。すべてのDTH応答者は赤線で表し、DTH非応答者は黒線で表す。非特異的バックグラウンドの検出のために、無関係な対照ペプチドに特異的なCD8+ T細胞についてIFN-γスポットの数を計数した。HLA-A2結合HIV-GAGタンパク質由来エピトープ（SLYNTVATL；SEQ ID NO：7）、HLA-A3結合HIV-NEFタンパク質由来エピトープ（QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8）、およびHLA-A24結合チロシナーゼタンパク質由来エピトープ（AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9）をこれらのアッセイにおいて陰性対照ペプチドとして用いた。データは三重にアッセイした各状態の平均を表し、標準偏差は5％未満であった。プロットはCD8+ T細胞105個あたりのヒトインターフェロンガンマ（hIFNg）スポットの数である。各患者のPBLの分析を少なくとも2回行った。
（図３）HLA-A2陽性であった試験上の患者5名（非DTH応答者4名およびDTH応答者1名）全員からのPBLに対するインフルエンザマトリクスタンパク質HLA-A2結合エピトープM1（GILGFVFTL；SEQ ID NO：10）の認識を評価するために行ったELISPOT分析を示す図である。この分析は前述の図2Aから2Dについて記載した同じPBL試料に対して行った。DTH応答者は赤線で表し、DTH非応答者は黒線で表す。非特異的バックグラウンドの検出のために、無関係な対照ペプチドに特異的なCD8+ T細胞についてIFN-γスポットの数を計数した。HLA-A2結合HIV-GAGタンパク質由来エピトープ（SLYNTVATL；SEQ ID NO：7）、HLA-A3結合HIV-NEFタンパク質由来エピトープ（QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8）、およびHLA-A24結合黒色腫チロシナーゼタンパク質由来エピトープ（AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9）をこれらのアッセイにおいて陰性対照ペプチドとして用いた。データは三重にアッセイした各状態の平均を表し、標準偏差は5％未満であった。プロットはCD8+ T細胞105個あたりのヒトインターフェロンガンマ（hIFNg）スポットの数である。各患者のPBLの分析を少なくとも2回行い、すべてのELISPOTアッセイは盲検様式で実施した。
（図４）図4Aから4DはPBMC由来CD8+ T細胞のELISPOT分析を示す図である。膵臓癌に対する同種GM-CSF-分泌腫瘍ワクチン接種を受けたDTH応答者でも、非DTH応答者でも、PSCA特異的T細胞のワクチン接種後誘導は観察されなかった。図4A  HLA-A3陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図4B  HLA-A2およびHLA-A3陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図4C  HLA-A24陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図4D  非応答者であった患者8名からのPBLのELISPOT分析。IFN-γ-発現細胞のELISPOT分析を、ワクチン接種前日または各ワクチン接種の28日後に単離したPBMCを用いて行った。リンパ球をフィコール-ハイパーク分離法により単離し、アッセイ日まで液体窒素中で凍結保存した。CD8+ T細胞濃縮を分析前に行った。T2-A3細胞に次の6つのPSCA由来エピトープを適用した：PSCAA3（7〜15）（黒四角）、PSCAA3（52〜60）（黒菱形）、PSCAA3（109〜117）（黒三角）、PSCAA3（43〜51）（白四角）、PSCAA3（20〜28）（白菱形）、およびPSCAA3（99〜107）（白三角）。陰性HIV-NEFA3（94〜103）の値を差し引いた。T2-A2細胞に次の三つのPSCA由来エピトープを適用した：PSCAA2（5〜13）（黒四角）、PSCAA2（14〜22）（黒菱形）、PSCAA2（108〜116）（黒三角）。陰性HIV-GAG（77〜85）の値を差し引いた。T2-A24細胞に次の5つのPSCA由来エピトープを適用した：PSCAA24（76〜84）（黒菱形）、PSCAA24（77〜85）（星形）、PSCAA24（109〜117）（黒三角）、PSCAA24（108〜116）（黒丸）、およびPSCAA24（99〜107）（白三角）。陰性チロシナーゼA24（206〜214）の値を差し引いた。すべてのDTH応答者は赤線で表し、DTH非応答者は黒線で表す。非特異的バックグラウンドの検出のために、無関係な対照ペプチドに特異的なCD8+ T細胞についてIFN-γスポットの数を計数した。HLA-A2結合HIV-GAGタンパク質由来エピトープ（SLYNTVATL；SEQ ID NO：7）、HLA-A3結合HIV-NEFタンパク質由来エピトープ（QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8）、およびHLA-A24結合チロシナーゼタンパク質由来エピトープ（AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9）をこれらのアッセイにおいて陰性対照ペプチドとして用いた。データは三重にアッセイした各状態の平均を表し、標準偏差は5％未満であった。CD8+ T細胞105個あたりのヒトインターフェロンガンマ（hIFNg）スポットの数をプロットする。各患者のPBLの分析を少なくとも2回行った。
（図５）Panc 6.03およびPanc 10.05ワクチン系統における表面メゾテリンおよびPSCAの発現を示す図である。膵臓腫瘍ワクチン系統Panc 6.03（上の2つの図）およびPanc 10.05（下の2つの図）を、フローサイトメトリーで一次抗体としてメゾテリン特異的モノクローナル抗体CAK1（左図）およびPSCA特異的モノクローナル抗体1G8（右図）と、二次抗体としてヤギ抗マウスIgG FITCを用い、表面メゾテリンおよびPSCAのレベルについて分析した。実線はアイソタイプ対照を表し、緑の網がけ部分はメゾテリン染色を表し、ピンクの網がけ部分はPSCA染色を表す。
（図６）図6Aから6Cは、メゾテリン特異的CD8+ T細胞は、DTH応答者において同種GM-CSF分泌腫瘍ワクチンを複数回接種した後に検出されるが、非DTH応答者では検出されないことを示す図である。図6A  HLA-A3陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図6B  HLA-A2およびHLA-A3陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。図6C  HLA-A24陽性であった患者2名からのPBLのELISPOT分析。IFN-γ-発現細胞のELISPOT分析を、図2Aから2Dに記載のとおり、ワクチン接種前日または各ワクチン接種の28日後に単離したPBMCを用いて行った。各ペプチドは図2Aから2Dに記載のものと同じ記号を有する。DTH応答者は赤線で表し、DTH非応答者は黒線で表す。非特異的バックグラウンドの検出のために、無関係な対照ペプチドに特異的なCD8+ T細胞についてIFN-γスポットの数を計数した。HLA-A2結合HIV-GAGタンパク質由来エピトープ（SLYNTVATL；SEQ ID NO：7）、HLA-A3結合HIV-NEFタンパク質由来エピトープ（QVPLRPMTYK；SEQ ID NO：8）、およびHLA-A24結合黒色腫チロシナーゼタンパク質由来エピトープ（AFLPWHRLF；SEQ ID NO：9）をこれらのアッセイにおいて陰性対照ペプチドとして用いた。データは三重にアッセイした各状態の平均を表し、標準偏差は5％未満であった。プロットはCD8+ T細胞105個あたりのヒトインターフェロンガンマ（hIFNg）スポットの数である。各患者のPBLの分析を少なくとも2回行った。
（図７）図7Aから7Cは、マウスにおける腹水生成卵巣腫瘍細胞株（WF-3）の生成および特徴付けを示す図である。WF-3腫瘍細胞をC57BL/6マウスに1×105細胞/マウスの用量で腹腔内注入した。腫瘍攻撃の4週間後にマウスを安楽死させた。（7A）マウスにおける腹水生成を示す典型的肉眼図。注：腫瘍攻撃の4週間後にマウスは腹囲の増加を伴う著しい腹水を生じた。（7B）90倍で観察した外植腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色。腫瘍は乳頭状の形状を示し、腹腔または卵巣由来の腫瘍に形態上一致していた。400倍で観察した腫瘍。挿入図はWF-3腫瘍細胞の特徴を詳細に示している。
（図８）図8Aおよび8Bは、マウスWF-3腫瘍細胞上のMHCクラスI（図8A）およびMHCクラスII（図8B）提示を示す図である。WF-3腫瘍細胞を回収し、トリプシン処理し、洗浄し、FACSCAN緩衝液中に再懸濁した。抗H2Kb/H-2Dモノクローナル抗体または抗I-Abモノクローナル抗体を加え、続いてフローサイトメトリー分析を行って、WF-3腫瘍細胞上のMHCクラスIおよびクラスIIの発現を検出した。（8A）WF-3腫瘍細胞はMHCクラスI陰性対照（細い線）に比べてMHCクラスI提示陽性であった（太い線）。（8B）WF-3腫瘍細胞はMHCクラスII提示については陰性であった。細い線はMHCクラスII陰性対照の染色を示している。
（図９）図9Aおよび9Bは、図9Aおよび3Bに示す2つの独立した試験において、腹水生成に対するWF-3腫瘍供与量の影響を示す図である。WF-3腫瘍細胞をC57BL/6マウスに様々な供与量（1×104、5×104、1×105、および1×106細胞/マウス）で腹腔内注入した。マウスを1週間に2回、腹水生成および腫瘍増殖についてモニターした。5×104、1×105、および1×106細胞を腹腔内注入したマウスはすべて30日以内に腹水生成および腫瘍増殖を示した。1×104細胞を注入したマウスの20％は、腫瘍注入の90日後に腫瘍はなく、腹水生成も見られなかった。データは2つ行ったうちの一つの典型的実験からのものである。
（図１０）RT-PCRおよびゲル電気泳動で示されたWF-3腫瘍細胞におけるマウスメゾテリンの発現を示す図である。図10  RT-PCR。RT-PCRはSuperscript One-Step.RT-PCR Kit（Gibco、BRL）および次の一組のプライマーを用いて実施した：
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レーン1：サイズマーカー。レーン2：W-3細胞からのRNA、およびレーン3：メゾテリン陰性B16腫瘍細胞からのRNA。特異的増幅（矢印で示す）がレーン2（WF-3細胞）で観察されたが、レーン3（B16細胞）では見られなかった。
（図１１）メゾテリン特異的DNAワクチンを用いた、WF-3腫瘍増殖に対するインビボ腫瘍防御実験を示す図である。マウスに1週間後に同じ用量で追加免疫を行い、続いて1週間後、5×104WF-3細胞/マウスで腹腔内攻撃した。マウスの腹水生成を触診および視診によりモニターした。マウスを第90日に屠殺した。注：pcDNA3-メゾテリンDNAでのワクチン接種により、他のDNAでのワクチン接種よりも有意に高い割合で腫瘍のないマウスが認められた。（p＜0.001）。ここで示した結果は2つ行ったうちの一つの典型的実験からのものである。
（図１２）メゾテリン特異的DNAワクチンでのワクチン接種により誘導された特異的溶解を示すCTLアッセイを示す図である。マウス（各群5匹）を様々なDNAワクチンで皮内に免疫化した。1週間後に同じ用量で追加免疫を行った。マウスからの脾細胞をワクチン接種後14日間プールした。細胞毒性アッセイを行うために、脾細胞をメゾテリンタンパク質と共に6日間培養し、効果細胞として用いた。WF-3腫瘍細胞を標的細胞とした。WF-3細胞を脾細胞と様々なE：T比で混合した。細胞溶解をLDHの定量的測定により評価した。注：pcDNA3-メゾテリンDNAワクチンにより、他のDNAワクチンよりも有意に高い割合で特異的溶解が認められた（p＜0.001）。この図で示したデータは2つ行ったうちの一つの典型的実験からのものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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