(57)【要約】本発明は、ワクチン、特に経口コレラワクチンの分野に関する。本発明の技術的目的は、コレラ菌全細胞不活化ワクチンの錠剤剤形の製造である。本発明は、ワクチン製品の処方を記述するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．コレラ菌の不活化細胞
ｂ．凝着剤
ｃ．潤滑剤
ｄ．被覆剤
ｅ．充填剤
ｆ．崩壊剤
から構成されるコレラ用のワクチン組成物。
【請求項２】
コレラ菌の弱毒株からなる不活化細胞を含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
血清群Ｏ１３９に属する不活化細胞を含む請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
血清群Ｏ１に属する不活化細胞を含む請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
エルトール型又は古典型の細胞を含む請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記不活化細胞がオガワ又はイナバ血清型に属する請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記不活化細胞がコレラ菌の野性株からなる請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記不活化細胞が血清群Ｏ１３９に属する請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記不活化細胞が血清群Ｏ１に属する請求項８に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
エルトール生物型又は古典生物型の細胞を含む請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
オガワ又はイナバ血清型細胞を含む請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
１錠剤あたり５×１０９から１０１１個の間の細胞を含有する請求項１から１１までに記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
凝着剤として、ポビドン、ゼラチン又はカルボキシメチルセルロースを含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記凝着剤が、錠剤の総質量の１から５％の間の濃度で見出される請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
潤滑剤として、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素又はタルクを含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記潤滑剤が、錠剤の総質量の０．２５から１．５％の間の濃度で見出される請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
被覆剤として、アセトフタレートセルロース、ジエチルフタル酸セルロース、１０％のラッカー又は二酸化チタンを含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記被覆剤が、錠剤の総質量の１から２％の間の濃度で見出される請求項１７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
充填剤として、乳糖又はトウモロコシデンプンを含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２０】
前記充填剤が、錠剤の総質量の６５から８０％の間の濃度で見出される請求項１９に記載のワクチン組成物。
【請求項２１】
崩壊剤としてクロスカラメロース（ｃｒｏｓｃａｒａｍｅｌｏｓｅ）ナトリウム、トウモロコシデンプン又はマイクロクリスタリンセルロースを含む請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記崩壊剤が、錠剤の総質量の１から６％の間の濃度で見出される請求項２１に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、予防接種技術の分野において、具体的には、コレラ感染に対する経口投与ワクチンとしての用途を有する。
【０００２】
本発明は、新たなワクチン処方とその療法的適用を開示する。より具体的には、提示される発明は、錠剤状で経口投与することが可能なコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）に対して反応性の不活化ワクチン処方からなる。
【背景技術】
【０００３】
コレラは、その最も注目すべき症状が、液状の糞便の突然且つ大量の排出を特徴とする急性の下痢であるところの感染症である。その下痢は、かなり重度になることもあり、もし患者が適切な治療を受けないと、症状の開始後の５時間以内に死を招くことさえある。コレラは、汚染された食物又は液体から、経口的に獲得される。今日までに７回の流行が報告されており、全てが高い指標の罹患率及び死亡率という結果になった。この感染症は、衛生上劣悪な状態をもたらす自然災害、戦争や他の破壊的な出来事に見舞われた未開発地区又は地域に居住する人々のあいだで最も起きやすい。このような影響を受けた訪問先を持つ旅行者も該感染症にかかりやすい（ＣＤＣ／ＮＣＩＤ．Ｏｒｇａｎｉｚａｃｉｏｎ  Ｐａｎａｍｅｒｉｃａｎａ  ｄｅ  ｌａ  Ｓａｌｕｄ．Ｍｅｔｏｄｏｓ  ｄｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  ｐａｒａ  ｅｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｏ  ｄｅ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ．Ｅｎ：Ｐｒｏｇｒａｍａ  ｅｓｐｅｃｉａｌ  ｄｅ  ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ．Ｅｄ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｅｓｔａｄｏｓ  Ｕｎｉｄｏｓ  １９９４年）。
【０００４】
抗生物質と水和塩による処置が効果的であるが、該疾患の急速な影響に対応するためには徹底的で且つ一貫した治療が必要とされる。一方では、該感染症は、人間の防御の表れとして、血清中の殺ビブリオ菌性抗体の存在に関連がある特定の免疫性防御を誘導することが示されている（Ｇｌａｓｓ，Ｒ．Ｉ．、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．、Ｓｔｏｌｌ，Ｂ．Ｊ．、Ｋｈａｎ，Ｍ．Ｒ．、Ｈｏｓｓａｉｎ，Ｋ．Ｍ．、Ｈｕｑ，Ｍ．Ｉ．、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．、１９８３年、母乳摂取児における母乳中の抗体によるコレラに対する防御（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ−ｆｅｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｍｉｌｋ）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０８：１３８９〜１３９２頁、及びＪｅｒｔｂｏｒｎ，Ｍ．、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．、１９９３年、スウェーデン人ボランティアにおける経口Ｂサブユニットワクチンのための種々の免疫化スケジュールの評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｓｗｅｄｉｓｈ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）、Ｖａｃｃｉｎｅ．１０：１３０−２）。これは、不活化された全細胞又は弱毒化された生細胞に由来する種々のクラスのコレラワクチンの開発につながった。フェノールで不活化された全細胞に由来する非経口的に投与されるワクチンは、その防御が短寿命（３から６カ月）であり、低レベル（３０から６０％）であること、並びに、その反応の発生率（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）が高レベルであって、紅斑、局所痛、硬結、発熱及び頭痛（ｃｅｐｈａｌｉａ）につながることが理由で、市場から引き上げられた（ＯＭＳ．、１９９１年、Ｒｅｕｎｉｏｎ  ｓｏｂｒｅ  ｌａ  ｖａｃｕｎａ  ｃｏｎｔｒａ  ｅｌ  ｃｏｌｅｒａ．Ｉｎｆｏｒｍｅ  ｆｉｎａｌ．ワシントンＤ．Ｃ．）。
【０００５】
代替品が、胆汁で不活化された全細胞において見出される（ｔｈｅ  Ｂｉｌｉｖａｃｃｉｎｅｓ）。この経口投与されるワクチンは、中程度のレベルの防御を提供するが、未だ産業的に開発されていない（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．とＨｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．、１９８６年、経口組合せＢサブユニット−全細胞コレラワクチン（Ｏｒａｌ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ−ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｊ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  Ａ．Ｌｉｎｄｂｅｒｇ及びＲ．Ｍｏｌｌｂｙ（編）。下痢に対するワクチンと薬剤の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉａｒｒｈｅａ）、１１ｔｈ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、ストックホルム、１９８５年、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｌｉｔｔｅｒａｔｕｒ、スウェーデン国ルンド、３３〜４３頁）。
【０００６】
熱とホルムアルデヒドで不活化された全細胞は、コレラ毒素のＢサブユニット（Ｂ−ＷＣ）と組み合わせると、投与されて３年後に中程度のレベルの防御（６０％のレベル）を提供することが示されている（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．、Ｌｏｎｒｏｔｈ，Ｉ．、Ｆａｌｌ−Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．、Ｍａｒｋｈａｍ，Ｂ．及びＬｕｎｄｂａｃｋ，Ｈ．、１９７７年、サブユニットトキソイドに基づく改良されたコレラワクチンの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｔｏｘｏｉｄ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２６９：６０２〜６０４頁）が、このワクチンの生産は、コレラ毒素のＢサブユニットを入手して精製する必要性のために、極めて高価で複雑である（Ｔａｙｏｔ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．、Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ｌ．、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｍ．、Ｔａｒｄｙ，Ｍ．、１９８１年、リゾＧＭＩガグリオシドで誘導体化されたシリカビーズ上でのコレラ毒素の大規模な受容体特異的精製（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ｏｎ  ｓｉｌｉｃａ  ｂｅａｄｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｙｓｏ−ＧＭＩ  ｇａｇｌｉｏｓｉｄｅ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１３：２４９〜２５８頁）。
【０００７】
組換え法（ｒＢ−ＷＣ）で入手したコレラ毒素のＢサブユニットを用いた上記代替品の変異体は、信頼の置けるものであることが判明しているが、投与後３年でたかだか６０％のレベルの防御を提供するだけであるうえに、面倒な調製プロセスを伴う。該ワクチンは、２つの多層エンベロープ内に調製され、一方は粉状の塩の混合物を含有し、他方はコレラ菌の凍結乾燥株を含有する。投与時に、第１のエンベロープを水に再懸濁せねばならず、第２のエンベロープは、水と塩の溶液中に再懸濁せねばならない。そして、該塩を含有する溶液を経口で投与せねばならず、その後に続いて、上記株を含有する懸濁液を１５分後に同じ方法で投与するのである（Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｊ．Ｌ．、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．、１９８９年、ワクチン開発の基礎としてのコレラ菌におけるコレラ毒素のＢサブユニットの過剰発現のための組換え系（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ａｓ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、８６：４８１〜４８５頁）。
【０００８】
不活化された全細胞に由来するもう一つの最新技術のワクチンは、上記ワクチンに似ており、コレラ菌カイロ５０株（古典型、オガワ）を５６９Ｂ株（エルトール型、イナバ）に置き換える。該ワクチンは、投与された後８〜１０カ月まで容認可能レベルの防御（６６％のレベル）を提供する。それは、コレラ菌の種々の血清型及び生物型の株の混合物であり、上記懸濁された株を含有する瓶と塩の混合物を含有するエンベロープとに調製されている（Ｔｒａｃｈ，Ｄ．Ｄ．、Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｋｅ，Ｎ．Ｔ．、Ｔｈｕｙ，Ｈ．Ｔ．、Ｓｏｎ，Ｎ．Ｄ．、Ｃａｎｈ，Ｄ．Ｇ．、Ｈａｎｇ，Ｐ．Ｖ．Ｄ、Ｒａｏ，Ｍ．Ｒ．、１９９７年、ベトナムにおける現地生産の死菌経口コレラワクチンのフィールド試行（Ｆｉｅｌｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ，ｋｉｌｌｅｄ，ｏｒａｌ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｖｉｅｔｎａｍ）、Ｌａｎｃｅｔ、３４９：２３１〜２３５頁）。上記したワクチンでは、その適用には、塩の混合物を水に溶解して経口投与すること、及び、上記細胞株を含有する瓶の内容物を１５分後に投与することが必要なので、時間並びに適任者を要する緩慢で注意深い手順が助長され、該プロセスが一層高価なものになる。
【０００９】
ＣＶＤ１０３  ＨｇＲワクチンは、ＣＶＤ１０３株に基づいており、その流行株を分化させるために該株内に付加的に挿入した水銀抵抗性遺伝子によって補われたものだが、安全な投与法を伴い、ボランティアに対して行った試行において良好なレベルの防御を結果として得た。ただし、該ワクチンは、実質的な免疫原性応答を得るためには高用量で投与されねばならない（ＯＭＳ、１９９１年、Ｒｅｕｎｉｏｎ  ｓｏｂｒｅ  ｌａ  ｖａｃｕｎａ  ｃｏｎｔｒａ  ｅｌ  ｃｏｌｅｒａ．Ｉｎｆｏｒｍｅ  ｆｉｎａｌ．ワシントンＤ．Ｃ．、並びに、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ｊ．及びＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，Ａ．Ｍ．、１９９９年、下痢疾患に対するワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｉａｒｒｈｅａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、Ｐｅｒｌｍａｎｎ，Ｐ．及びＷｉｇｚｅｌｌ，Ｈ．［編］、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．２９０〜３２８頁にて）。この株の生産は、全面的な閉鎖系を要求し（Ｃｒｙｚ，Ｓ．Ｊ．及びＧｌｕｃｋ，Ｒ．、１９９７年、弱毒化細菌及びウイルス生ワクチンの大規模生産（Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）、新世代ワクチン（Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ）、第２版、編：Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｍ．、Ｗｏｏｄｒｏｗ，Ｇ．Ｃ．、Ｋａｐｅｒ，Ｊ．Ｂ．及びＣｏｂｏｎ，Ｇ．Ｓ．、国会図書館。出版データにおける目録、ニューヨーク、１１５３〜１１６３頁にて）、そして、先に記したワクチンと同じ態様で調製され、投与時には同じ難点を示した。
【００１０】
６３８株に基づき、Ｃ７２５８流行株に由来するする弱毒化生ワクチンは、ＣＴＸφ病原性ファージを排除するように且つプロテアーゼ血球凝集素を分類するｈａｐ遺伝子におけるワクチンマーカーｃｅｌＡを含むように処置されたものであるが、適用時に信頼性できるものであることが判明し、結果として、適切な免疫応答が得られた（Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ｊ．Ａ．、Ｇａｒｃｉａ  Ｌ．、Ｓｉｌｖａ  Ａ．、Ｇａｒｃｉａ，Ｈ．、Ｆａｎｄｏ，Ｒ．、Ｃｅｄｒｅ，Ｂ．、Ｐｅｒｅｚ，Ａ．、Ｃａｍｐｏｓ，Ｊ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｂ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｌ．、Ｂａｌｍａｓｅｄａ，Ｔ．、Ｐｅｒｅｚ，Ｏ．、Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｍ．、Ｌｅｄｏｎ，Ｔ．、Ｄｉａｚ，Ｍ．、Ｂｒａｖｏ，Ｌ．及びＳｉｅｒｒａ，Ｇ．、１９９９年、コレラワクチンの候補としての新たなＣＴＸφ陰性血球凝集素／プロテアーゼ欠損エルトール株の安全性及び免疫原性の予備アセスメント（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ＣＴＸ（−ｎｅｇａｔｉｖｅ，ｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ／ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｅｌ  Ｔｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  ａｓ  ａ  ｃｈｏｌｅｒａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ）、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５３９〜５４５頁）。しかし、上記したものに似た調製プロセスのために、それは、先に考慮したワクチンと関連がある難点の全てを提示する。
【００１１】
免疫原性応答を提供するもののＰｅｒｕ−３、Ｂａｈ−３及びＢａｎｇ−３のような株を利用した、コレラ菌株の弱毒化に基づくワクチンは、容認し難いほどに反応の発生率が高いことが判明した（Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｎ、Ｋｉｌｌｅｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｈａｃｋ，Ｄ．Ｃ＞、Ｋｅｎｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．、Ｃｏｓｔｅｒ，Ｔ．Ｓ．、Ｂｅａｔｌｅ，Ｄ．Ｔ．、Ｅｚｚｅｌｌ，Ｊ．、Ｈｙｍａｎ，Ｔ．、Ｔｒｏｐａ，Ａ．、Ｓｊｏｇｒｅｍ，Ｍ．Ｈ．、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ，Ａ．、Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．、Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．、１９９４年、エルトール型コレラに対する経口弱毒化生ワクチンの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｌｉｖｅ，ｏｒａｌ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｌ  Ｔｏｒ  ｃｈｏｌｅｒａ）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７０：１５１８〜１５２３頁）。
【００１２】
Ｐｅｒｕ１５株を使用し、Ｐｅｒｕ−３株に基づいたワクチンは、安全な適用方法を持ち、ボランティアに対して行った試行において良好なレベルの防御をもたらした（Ｋｅｎｅｒ，Ｊ．Ｒ．、Ｃｏｓｔｅｒ，Ｔ．Ｓ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｎ．、Ｔｒｏｆｆａ，Ａ．Ｆ．、Ｂａｒｒｅｒａ−Ｏｒｏ，Ｍ．、Ｈｙｍａｎ，Ｔ．、Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｍ．、Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｄ．Ｔ．、Ｋｉｌｌｅｅｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｓｐｒｉｇｇｓ，Ｄ．Ｒ．、Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．、Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．、１９９５年、Ｐｅｒｕ−１５、コレラ菌Ｏ１のための改良され且つ弱毒化された経口ワクチン候補（Ｐｅｒｕ−１５，ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ１）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．７２：１１２６〜１１２９頁）。しかしながら、臨床調査はまだ全く実行されておらず、該ワクチンは、上記したものと同じ難点を提示する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、錠剤剤形の最終製剤のために使用されるコレラ菌の不活化全細胞、凝着剤、潤滑剤、被覆剤、充填剤及び崩壊剤を含む新たなワクチン処方からなり、その様々な成分を安定状態に維持するとともに、それらが互いに干渉することを防止するものである。
【００１４】
最終製品が、該処方の活性複合体を構成する不活化細胞と似た抗原性及び免疫原性効果を示すことを見出したのは驚くべきことであった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、天然又は弱毒株を利用した、血清群Ｏ１３９に、又は血清群Ｏ１に、及び古典、エルトール、オガワ若しくはイナバ生物又は血清型に属するコレラ菌の不活化細胞で構成されるワクチンを提供する。ここに提示されるワクチン処方は、コレラ菌の不活化細胞、好ましくは、１錠剤あたり１０９〜１０１１個の間の不活化細菌を含有する。それは、凝着剤：錠剤の総質量に対して１から５％の濃度で見出されねばならないポビドン、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース；潤滑剤：錠剤の総質量に対して０．２５〜１．５％の濃度で用いられるカルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素及びタルク；被覆剤：錠剤の総質量に対して１〜２％の濃度で用いられるセルロースアセトフタレート、ジエチルフタル酸セルロース、１０％濃度のラッカー、及び二酸化チタン；充填剤：錠剤の総質量に対して６５〜８０％の濃度で見出されねばならない乳糖及びトウモロコシデンプン；並びに、崩壊剤：錠剤の総質量に対して５〜１５％の間の濃度で用いられるクロスカラメロース（ｃｒｏｓｃａｒａｍｅｌｏｓｅ）ナトリウム、トウモロコシデンプン及びマイクロクリスタリンセルロース、を含有するように作ることができる。
【００１６】
今日までのところ、予防接種の最新技術方法中に本錠剤処方の前例は全くない。また、本処方は、使用されている技術に特徴的な化学的及び物理的ストレスに耐え、それによってその活性複合体の主要な免疫学的特性に影響を与えることのない製剤において合成化合物を生物学的材料、特に細胞と組み合わせた初めての処方であることも指摘すべきである。
【００１７】
本発明の目的を、下記の実施例を通じて説明する。
【実施例１】
【００１８】
コレラ菌のＬＰＳ評価に用いたＥＬＩＳＡ試験中に起こり得る錠剤内の賦形剤の干渉に関する研究。
この実施例に関して、不活化細胞、上記様々な賦形剤のそれぞれを含むこれらの細胞の混合物、及び賦形剤の個別の溶液を調査した。不活化細胞をポジティブコントロール群として使用した。用いた賦形剤は、カルボキシメチルデンプンナトリウム、クロスカラメロースナトリウム、ポビドン、タルク、ステアリン酸マグネシウム、二酸化チタン、コロイド状二酸化ケイ素、トウモロコシデンプン及び乳糖であった。
【００１９】
ＥＬＩＳＡ手法は、下記の段階からなっていた。
１．ポリスチレンプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、デンマーク）をＰＢＳに溶解した細胞混合物−賦形剤１００μＬ／穴で覆う。湿潤チャンバーにおいて４℃で一晩インキュベートする。
２．該免疫酵素法の段階のそれぞれの間にプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有水で洗浄する。
３．濃度１％の脱脂乳ＰＢＳ１５０μＬ／穴でプレートをブロックする。湿潤チャンバーにおいて３７℃で１時間インキュベートする。
４．１００μＬ／穴の抗ＬＰＳモノクローナル抗体を加える。
５．１％脱脂乳及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに希釈したタイプＶＩ西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）と結合した、マウス由来の抗ＩｇＧ抗体を１００μＬ／穴の割合で加える。湿潤チャンバーにおいて室温で２時間インキュベートする。
６．Ｈ２Ｏ２０．０１％を含有するｐＨ４．５の０．１Ｍのクエン酸緩衝液中の濃度０．４ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）１００μＬ／穴を用いて反応を行う。
７．Ｈ２ＳＯ４の２．５Ｍの溶液５０μＬ／穴とともに基質を与えた後の３０分後に反応を止め、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの波長でプレートを読み取る。
【００２０】
結果は、図１に示すように、使用した賦形剤と分析プロセスの成分との間には干渉は起こらないことを実証した。図１では、賦形剤と不活化細胞との混合物は、不活化細胞のみの値に似た値を示し、一方で、混合しない賦形剤はそれよりもかなり低い値を提供した。
【実施例２】
【００２１】
賦形剤とワクチン活性複合体との間に起こり得る干渉の決定。
不活化コレラ菌細胞の懸濁液と用いられた種々の賦形剤とを含有する混合物の抗原性を、（実施例１に説明したような）ＥＬＩＳＡ手法を用いて、該混合物を等しい２つの部分に分け、一方を４℃で他方を２８℃でインキュベートして、決定した。該調査は、インキュベーションの時刻０と３０日後とで実行した。この実施例で用いた賦形剤は、乳糖、デンプン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、クロスカラメロース、ポビドン、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び二酸化チタンであった。結果は、不活化細胞のリポ多糖の抗原性は、上記種々の賦形剤の存在によって影響されないことを指し示した。ＥＬＩＳＡ値は、４℃で行った試行及び２８℃で行ったものの両方において、インキュベーションの３０日間を通じて維持された（図２）。
【実施例３】
【００２２】
ワクチンの抗原性。
ワクチンの抗原性を、錠剤中のコレラ菌のリポ多糖（ＬＰＳ）を検出することを狙ったＥＬＩＳＡ抑制試験で決定した。
【００２３】
錠剤、コレラ菌のＬＰＳオガワ、コレラ菌のＬＰＳ  Ｏ１３９の溶液、エルトール且つオガワ株のコレラ菌生細胞の懸濁液、不活化細胞の懸濁液を、該試験の試料として用いた。
【００２４】
ＥＬＩＳＡ試験は下記の段階からなる：
ポリスチレンプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、デンマーク）をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した２５μｇ／ｍＬの濃度のコレラ菌のＬＰＳオガワ１００μＬ／穴で覆う。湿潤チャンバーにおいて４℃で一晩インキュベートする。
該免疫酵素法の段階のそれぞれの間にプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有水で洗浄する。
濃度１％の脱脂乳ＰＢＳ１５０μＬ／穴でプレートをブロックする。湿潤チャンバーにおいて３７℃で１時間インキュベートする。
ＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に上記試料と抗ＬＰＳオガワモノクローナル抗体とを濃度比１：２で溶解して最終濃度２５μｇ／ｍｌとした溶液中で予め室温で１時間インキュベートした試料１００μＬを加える。湿潤チャンバーにおいて室温で２時間インキュベートする。
脱脂乳１％濃度を含むＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に希釈したタイプＶＩ西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）と結合した、種特異的抗ＩｇＧ抗体を１００μｌ／穴の割合で加える。湿潤チャンバーにおいて室温で２時間インキュベートする。
Ｈ２Ｏ２０．０１％を含有するｐＨ４．５の０．１Ｍクエン酸緩衝液中の最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）の溶液１００μｌ／穴を用いて反応を行う。
３０分後に該反応を止める。Ｈ２ＳＯ４の２．５Ｍの溶液５０μＬ／穴とともに基質を加えた後、Ｔｉｔｅｒｋｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｐｌｕｓマイクロプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）で４９２ｎｍの波長でプレートを読み取る。
【００２５】
結果は、錠剤懸濁液を利用したときに高レベルの抑制を示し、その値は、生細胞、不活化細胞及びＬＰＳオガワを用いたときに得られた値に類似していた。ＬＰＳ  Ｏ１３９が関与した場合においては、抑制は観察されなかった（図３）。これは、不活化細胞の抗原性活性が、最終の錠剤処方において影響されずに残ることを実証する。
【実施例４】
【００２６】
ワクチンの免疫原性
ワクチンの免疫原性を、課題試料のウサギの十二指腸内接種を通じて調査した。血清（ｓｅｒｉｃ）中の抗体動態をＥＬＩＳＡ及び殺ビブリオ菌手法を用いて評価した。錠剤処方、及びエルトール且つオガワ株コレラ菌の不活化細胞を含有する懸濁液を、課題試料として使用した。
【００２７】
開腹術を実行して、十二指腸を露出させ、十二指腸の管腔に、５ｍＬの再懸濁錠剤を、ワクチン株の不活化培養物を、又は塩水を接種した。抗体の血清動態を、ＥＬＩＳＡ及び殺ビブリオ菌手法を用いて決定した。
【００２８】
ＩｇＧ抗リポ多糖抗体の動態を決定するためのＥＬＩＳＡ手法：
１．Ｎｕｎｃ又はＭａｘｉｓｏｒｐ９６穴ポリスチレンプレートを濃度２５μｇ／ｍＬの純粋なＬＰＳで覆う。４℃で一晩又は３７℃で２時間インキュベートする。
２．水中の濃度０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有水で３回洗浄する。
３．濃度２％の脱脂乳ＰＢＳ  １５０μＬ／穴で、３７℃で１時間ブロックする。
４．３回洗浄する。
５．ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ０．０５％で課題血清の段階的溶液を作る。２時間室温でインキュベートする。
６．前のように３回洗浄する。
７．１％乳汁含有ＰＢＳ−Ｔ中に希釈した結合抗ＩｇＧ−ＨＲＰ種を加え、室温で１時間インキュベートする。
８．６回洗浄する。
９．ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液中の濃度１ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミン及び濃度３０％のＨ２Ｏ２で発色させる。
１０．４９２ｎｍの波長で吸光度を読み取る。
【００２９】
殺菌性抗体を試験するための殺ビブリオ菌手法：
平底無菌プレートを用いた。
１．５０μＬの課題血清を第１穴に加える。２５μＬの塩水を残りの穴に加える。
２．段階的溶液を作り、最後の２５μＬを捨てる。
３．２５μＬの補体−細菌混合物を加え（プレートあたり２．５ｍｌ）、３７℃で１時間インキュベートする。
４．ＢＨＩ培養液を加える（１２５μＬのブロモクレゾールパープルと１０ｍｌのグルコースを培養液１００ｍｌに対して用いる。グルコースの１０ｍｌは、培養液から差し引かねばならない。）
５．プレートを手作業でモノジナイズし、３７℃で３時間インキュベートする。
６．力価は、細菌の生育を抑制することができる血清の最高希釈として定義するが、これは、培養液の色の変化がないことで決定される。
【００３０】
補体−細菌の混合物の調製：
１．２つのＢＨＩ寒天ウェッジ又はプレートに、保存されたコレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）を播き、２つの播種していないウェッジとともに、３７℃の温度で１８から２４時間のあいだの任意の時間インキュベートさせる。
２．プレート内の単離コロニー、又はウェッジ内でクック（ｃｏｏｋ）されたそれらのいくつかを取り出し、前加熱したウェッジ内に入れる。これらを、３７℃で４時間インキュベートさせる。
３．ウェッジ内に見られる生育物を、無菌塩水ｐＨ７で洗い、洗浄物をＤ．Ｏ＝０．９〜０．９５に調整する。
４．調整された不活化細胞を１：１０の比で希釈する。
５．補体−細菌混合物を調製するが、ここで：
・補体（モルモット又はヒト血清、殺ビブリオ菌性抗体の無いもの）を冷たい無菌塩水に１：５の比で希釈する。
・等量の不活化細胞と希釈補体とを混ぜる。
【００３１】
結果は、ＥＬＩＳＡ手法（図４Ａ）及び殺ビブリオ菌性抗体（図４Ｂ）を用いて評価された、ウサギにおいて抗リポ多糖抗体を誘導する免疫原性能力において、錠剤処方と不活化細胞との間で何も相違点を提示しない。実施例１、２及び３は、本発明に記載される錠剤処方が、該処方に含められる前の不活化細胞自体と同じようにモデル動物において抗原的であり且つ免疫原的あることを実証し、このことは、最終錠剤処方における抗原の存在と、その殺ビブリオ菌性抗体の誘導能力との両方によって実証される。
【００３２】
提案された解決法の利点
提案された解決法は、遺伝子操作された生ワクチンに関連する潜在的な危険性も、従前の不活化ワクチンで提示された製品の投与時に伴う難点も全く伴うことなく、簡便に投与することが可能な（抗リポ多糖抗体と殺ビブリオ菌性抗体の両方を誘導する能力について）高度に免疫原性の製品であるので、従前のワクチン処方よりも優れている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】コレラ菌のＬＰＳを評価するためにＥＬＩＳＡ手法を用いた、錠剤賦形剤のありうる干渉についての調査。Ｃ０１からＣ０９まで：賦形剤の不活化細胞との混合物。Ｃ１０からＣ１８：賦形剤のみ。Ｃ１９：不活化細胞のみ。該試料のそれぞれで用いた賦形剤：Ｃ０１とＣ１０：デンプン；Ｃ０２とＣ１１：カルボキシメチルデンプンナトリウム；Ｃ０３とＣ１２：クロスカラメロース；Ｃ０４とＣ１３：ポビドン；Ｃ０５とＣ１４：タルク；Ｃ０６とＣ１５：ステアリン酸マグネシウム；Ｃ０７とＣ１６：二酸化チタン；Ｃ０８とＣ１７：二酸化ケイ素；Ｃ０９とＣ１８：デンプン１５００；Ｃ１９：不活化細胞。
【図２】ワクチン活性複合体の抗原性に対する賦形剤のありうる影響を決定。グラフは、３０日間インキュベートした試料についての平均ＥＬＩＳＡ試験結果値の、同じ試料について時刻０で評価したＥＬＩＳＡ試験結果値に対する百分率を表す。４℃でインキュベート（図２Ａ）及び２６から２８℃の間の温度でインキュベート（図２Ｂ）。この実施例で評価した賦形剤は：１．・乳糖、２．・デンプン、３．・カルボキシメチルデンプンナトリウム、４．・クロスカラメロース、５．・ポビドン、６．・タルク、７．・ステアリン酸マグネシウム、８．・二酸化チタン、９．・不活化細胞であった。
【図３】最終錠剤処方におけるコレラ菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の抗原性を、ＥＬＩＳＡモノクローナル抗体抗ＬＰＳ抑制試験を通じて決定。
【図４】不活化細胞を又はワクチンの錠剤処方を接種したウサギの血清力価。ＥＬＩＳＡを通じて検出されたコレラ菌Ｏ１オガワの抗リポ多糖力価を図４Ａに示す。殺ビブリオ菌力価を図４Ｂに示す。
【図１】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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