(57)【要約】  PTPRK蛋白から単離された免疫原性ペプチドは、ＣＤ４+Ｔ細胞によって認識された新規なＨＬＡ II制限エピトープを表し、癌の免疫学的治療又は診断に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のPTPRKGly677→Arg682免疫原性ペプチド。
【請求項２】
請求項１のペプチドに選択的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体又はそれらの活性フラグメント。
【請求項３】
請求項１のペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項４】
請求項３の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含むホストセル。
【請求項６】
ＨＬＡ−クラスII分子関連の配列番号１のペプチドを選択的に認識し、結合することができる単離ＣＤ４+Ｔリンパ球。
【請求項７】
ペプチド／ＨＬＡ−ＤＲβ１*1001複合体を選択的に認識し、結合する請求項６のＴリンパ球。
【請求項８】
ＨＬＡ−ＤＲβ1 * 1001分子に結合する配列番号１のペプチドを備える抗原提示細胞。
【請求項９】
配列番号１のペプチド又はそれをコードする核酸分子を含有し、医薬的に許容される賦形剤と混合物における医薬組成物。
【請求項１０】
ワクチンの形態の請求項９の医薬組成物。
【請求項１１】
癌の予防、治療的措置のための医薬を製造するための、配列番号１、それをコードする核酸分子、請求項８のＡＰＣ又は請求項６又は７のＴリンパ球の使用。
【請求項１２】
メラノーマ発現PTPRKGly677→Arg682の予防又は治療的処置ための請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
診断組成物の製造のための、配列番号１又はそれをコードする核酸分子の使用。
【請求項１４】
診断組成物を、メラノーマ発現PTPRKGly677→Arg682の特徴づけに用いる請求項１３の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白ＰＴＰＲＫ（受容体様プロテイン・チロシン・ホスホターゼ・カッパ）から単離された免疫原性ペプチド及び腫瘍の診断及び予防又は治療上の処置におけるそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、ＣＤ４+Ｔ細胞によって認識される新規なＨＬＡ−クラスII制限エピトープ及びメラノーマ発現ＰＴＰＲＫを有する患者の診断、予防又は免疫治療におけるその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
特異抗腫瘍Ｔ細胞応答の誘発を可能する腫瘍関連抗原の同定は、腫瘍の治療のための新規な免疫学的アプローチを提供している。ウィルス感染ならびに癌において、実質的な免疫応答の発現及び維持のため、ＨＬＡ−クラスII抗原を認識するＣＤ４+Ｔ細胞が決定的な役割を果たすにもかかわらず、現在までに明示された腫瘍関連抗原の大多数は、ＨＬＡ−クラスＩ制限細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される。Ｔ細胞媒介ヘルパ
ー応答及びＨＬＡ−クラスＩ制限腫瘍関連抗原を誘発することができる腫瘍特異エピトープの欠損は、癌患者におけるワクチン接種の試みの治療上の効力を制限する主な因子を構成する。従って、新規なＭＨＣクラスII制限腫瘍特異抗原の特徴づけは、新規でより有効なペプチドベースのワクチンを提供するために最重要と思われる。
【０００３】
クラスIIＭＨＣ抗原処理（processing）／提示経路のメカニズムはかなり複雑であり、完全に理解されていないようである。技術的な困難性のために、クラスIIのＨＬＡ−制限腫瘍抗原の発見が阻害されており、よって、ヒトの腫瘍のなかで最も免疫原性であるメラノーマに対する公知の腫瘍特異ヘルパーエピトープの有効性が制限される。
【０００４】
ＰＴＰＲＫは、受容体様プラズマメンブレン−スパンニング（spanning）ＰＴＰ分子のファミリーに属し、フィブロネクチンタイプIII反復、免疫グロブリン及びメプリン／Ａ５／μ（ＭＡＭ）ドメインのその細胞外部位に存在することによって特徴付けられる（３０、３１）。ＰＴＰＲＫは、すい臓、前立腺、卵巣及びケラチン生成細胞の表皮細胞系のような正常組織において発現するが、ＰＢＬ及び血液細胞系では発現しない（２４）。ＰＴＰＲＫの正確な生理学的役割はまだ明らかではないが、その構造的な特徴、及びＰＴＰＲＫの発現が細胞密度によって誘発されるという観察とともに、細胞間での同種親和性相互作用を媒介する能力は、細胞−細胞接触形成の調整においてこの蛋白の決定的な役割を強く示唆している（３０）。さらに、最近、ヒトにおいてＰＴＰＲＫが共局在し（co-localize）、かつ隣接する細胞の細胞−細胞接触領域でβ−及びγ−カテニンと関連することが示されている（２５）。これらの発見は、細胞接合部においてチロシンキナーゼ誘発事象の作用を、おそらくβ−及びγ−カテニンの脱リン酸化によって、負に調節することにおいて、この蛋白の関与を強力に支持する。これらの機能的な役割、及びヒトＰＴＰＲＫ遺伝子が想定される腫瘍サプレッサー遺伝子領域6q22.2-q22. 3（それはしばしばメラノーマにおいて削除される（３３，３４））にマッピングされているという所見（３１、３２）は、発現の欠損ならびにＰＴＰＲＫ蛋白の機能的ドメインにおいて発生する突然変異が、正常成長細胞の表現型に直接影響し得、腫瘍における形質変換及び進行において役割を果たし得るという仮説を総合的に支持する。
【発明の開示】
【０００５】
ＨＬＡ−クラスIIメラノーマ抗原を同定することを目的として、われわれは、リンパ節転移の外科切除術後９年無病であった好調な予後診断を経験したメラノーマ患者におけるＣＤ４+抗腫瘍応答を研究した。この見通しの明るい臨床上の進化論は、分化抗原ｇｐｌOO及びＴＲＰ−２に対して指向する強力かつ持続的なＣＤ８媒介抗抗腫瘍応答と関連していた。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ８Ｔ細胞の発現及び維持のために必須であることが知られているため、われわれは、患者が腫瘍特異ＣＤ４媒介応答もまた発現した可能性を調査した。
【０００６】
腫瘍浸潤リンパ節から得られたＴリンパ球を、インビトロにおいて、自己腫瘍で繰り返し刺激し、Ｔ細胞クローンを制限希釈によって発生させた。ＨＬＡ−ＤＲ制限型における自己腫瘍を認識するＣＤ４+Ｔ細胞クローンを得、それらの鋭い特異性のためにインビトロで特徴付けし、認識した抗原の分子特性の定義づけを意図する遺伝学的アプローチにおける細胞プローブとして使用した。自己メラノーマのＲＮＡのテンプレートとして用いる、構築されたｃＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングは、ＣＤ４+メラノーマ特異クローンによって認識された抗原をコードするようなチロシン・リン酸受容体Ｋ遺伝子（Ｒ−ＰＴＰ−Ｋ）の同定を導いた。メラノーマ細胞によってクローン化されたＲ−ＰＴＰ−Ｋ ｍＲＮＡは、蛋白の第４フィブロネクチンIII様ドメインにおける非保存的Ｇｌｙ→Ａｒｇ突然変異を含む。このアミノ酸変化は、腫瘍ｃＤＮＡサイブラリをクリーニングするために用いられたＣＤ４Ｔ細胞クローンによって、ならびに同じ患者の腫瘍浸潤リンパ節から単離された５つの異なるクローンのすべてによって認識されるＨＬＡ−ＤＲβ１＊１００１によって提示されたＴ細胞エピトープを発生させる。抗原性エピトープは、ＰＴＰＲＫGly677→Arg682の領域６６７−６８２において同定され、それは配列ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰ (配列番号１)を有する。
【０００７】
本発明の第１の観点は、配列番号１の免疫原性ペプチド、ならびに診断又は治療上の適用、特に、腫瘍発現ＰＴＰＲＫGly677→Arg682の診断、予防又は免疫治療のためのその使用、抗体及び／又はＴヘルパー又は細胞傷害性細胞の発生における、より一般的には、腫瘍特異免疫応答の誘発におけるその使用に指向する。
【０００８】
本発明のペプチドは、以下の種々の手順で調製することができる。例えば、従来の技術に従って又は自動合成装置を用いて、溶液又は固相中で合成することができる。ペプチド合成の理論及び実施は、いずれかの当業者に知られており、例えば、Stewart及びYoung (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. , Pierce Chemical Co.；Tam ら、J. Am. Chem. Soc., (1983) 105: 6442；Merrifield, The Peptides, Gross and Meinenhofer eds. Academic Press (1979) New York, pp. 1-284を参照のこと（ここに参照として組み込む）。
【０００９】
治療における使用について、そのペプチドは医薬的に許容される賦形剤とともに適切に製剤化されるであろう。予防又は治療上の処置のための適切な製剤化によって、経口又は非経口で、好ましくは皮下又は筋肉内に投与することができ、それらは、ペプチドの有効量を含むであろう。その量は、腫瘍に対して指向される体液又は細胞媒介免疫応答を誘発させることができるにちがいなく、患者の一般症状、疾患の進行及び他の因子に依存して変化するであろう。
【００１０】
好ましくは、本発明のペプチドは、メラノーマ感受性個人の予防処理のため又はメラノーマ患者の治療的処置のためのいずれかにワクチンの形態で投与される。そのワクチンは、免疫応答を維持又は高めるように、単回又は多数回投与計画に従って、適切な用量でかつ種々の時間間隔で投与することができる。ペプチド免疫原性は、免疫原担体との架橋又は結合によって、あるいは適切なアジュバントを用いることによって、増強させることができる。さらに、ペプチドは、バイオアベイラビリティ又はＨＬＡ分子との親和性を増加させるために、脂質、グルコシド残基又は他のペプチド結合してもよい。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１のペプチドを認識し、結合することができる、Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦｖのような、多クローン性又は単クローン性抗体、フラグメント又はそれらの誘導体を提供する。単離された抗体は、腫瘍発現ＰＴＰＲＫGly677→Arg682の定義づけのために、腫瘍免疫治療又は免疫診断技術に用いることができる。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明は、腫瘍発現ＰＴＰＲＫGly677→Arg682を特異的に認識する単離ＣＤ４+Ｔ細胞を提供し、そのような腫瘍に対する細胞媒介免疫応答を誘発するためのそれらの使用を提供する。これらの細胞は、治療に付される患者から得られたＲＢＭＣから単離することができ、それらは、任意にサイトカインの存在下で、又はペプチドで負荷されたＡＰＣ（抗原提示細胞）発現アレルＨＬＡ−ＤＲβ１＊１００１のような、ＨＬＡ−クラスII分子に関連するペプチドを有する細胞を用いて、配列番号１のペプチドとともにインビトロで活性化することができる。ＡＰＣは、特異アレルＨＬＡ又はペプチドもしくはそれらの前駆体を発現するために、例えば、ウィルス又はレトロウイルス・ベクターにトランスフェクションすることによって一般に修飾することができる。修飾ＨＬＡ細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかで、Ｔ細胞を活性化するために使用することができる。インビトロにおいて活性化されたＴ細胞は、発症を防止するために、その後患者に再導入することができ、成長を抑制させ、あるいは腫瘍細胞の量を低減させる。患者へ再導入される前に、リンパ球は、例えば、ＣＤ４に対して指向する抗体又は他のマーカーを用いて、アフィニティーカラムによって精製してもよい。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、ここで示したＰＴＰＲＫGly677→Arg682のエピトープをコードする単離核酸分子、好ましくは、配列ＣＣＧＴＡＴＴＡＣＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡＡＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴ（配列番号２）ならびにその配列を含むベクター及びホストセルを提供する。ペプチド−コード配列又はそれらの一部を含むＤＮＡ分子、及びそれらの遺伝子構成物を、腫瘍、特にメラノーマの発生の危険にある患者又は癌患者のワクチン接種において使用することができる。ＤＮＡ免疫化は、公知の技術にしたがって行うことができる（Donnelly J. J. ら、1994, The Immunologist 2: 1）。筋肉内投与経路が好ましいが、非経口及び粘膜経路も利用することができる（pnas 1986, 83,9551 ; WO90/11092）。さらに、ＤＮＡは、遺伝子銃装置（biolistic）を用いた皮下投与のために金粒子に吸着させることができる（Johnston, 1992 Nature, 356,152）。
【００１４】
上述した治療上の使用に加えて、ペプチドコード配列又はそれらの一部を含む核酸分子ならびにペプチド自体を、例えば、ＰＣＲ分析又はエピトープ特異抗体を用いたイムノアッセイによって、メラノーマ発現ＰＴＰＲＫGly677→Arg682の診断に用いることができる。さらに、配列番号１のペプチドとＨＬＡ−ＤＲβ1 * 1001細胞との複合体を、インビトロ又はエキスビボにおいて、ペプチドを用いたワクチン投与された被験者の免疫応答をモニタリングするために用いることができる。
【００１５】
図面の説明
図１
抗メラノーマＴリンパ球クローンTB515の機能的特性。（Ａ）TB515クローンによる51Ｃｒ-標識Mel5392及びLCL15392細胞の溶解感受性：51Ｃｒ放出を５時間後に測定した。アッセイを抗-ＨＬＡ−ＤＲAb,L243の不存在下（黒四角）又は抗-ＨＬＡ−ＤＲAb,L243の存在下（黒三角）で行った。（Ｂ）サイトカイン放出アッセイ：TB515クローンを、自己腫瘍又は15392LCLとともに、L243の存在下又は非存在下で、１：１の細胞比で一晩インキュベートした。上清を採取し、ＩＮＦ-γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ-α及びＩＬ−２の含量を、市販のＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。Ｓ． Ｄ．≦５％。
【００１６】
図２
クローン#11の相補ＤＮＡはTB515認識抗原をコードする。（Ａ）CIITA+293をそれぞれ、pEAK8.5-Ii単独又はpcDNA3.1-DRB 1 *0102もしくはpcDNA3.1-DRB1*1001とともに、cDNA#11にトランスフェクトした。CIITA+293は単独でpcDNA3.1DRB1*0102又はpcDNA3-DRB1*1001にトランスフェクトされ、CIITA+293は、緑蛍光プロテイン（ＧＦＰ）をコードする組換えpcDNA3にコトランスフェクトされ、pcDNA3.1- DRB1*1001を陰性コントロールとして用いた。（Ｂ）cDNA#11をpcDNA3.1にサブクローンし、 CIITA+293においてpcDNA3.1-DRB 1 * 1001にコトランスフェクトした。クローンTB515 (１×１０5リンパ球／ウェル)を各トランスフェクタントに加え、２４時間後、上清を採取し、ＩＦＮ-γ含量をＥＬＩＳＡによって評価した。双方のパネルにおいて、Mel5392を陽性コントロールとして用いた。トランスフェクタントをすべて、TB515によるＩＦＮ-γ放出を誘発する能力について評価した。
【００１７】
図３
（Ａ）Me15392細胞でのＰＴＰＲＫ ｍＲＮＡ発現。Mel5392から得られた10μgのポリ（Ａ）+ｍＲＮＡをノーザンブロット法により分析した。ハイブリダイゼーションを、ＰＴＰＲＫ ｃＤＮＡの細胞外、膜貫通及び細胞内領域をスパンする３種の32Ｐ標識プローブの等モル混合物を用いて行った（材料及び方法の説明参照）。レーンを、β−アクチンハウスキーピング遺伝子ハイブリダイゼーションによってチェックしたように、ｍＲＮＡの同程度の量で負荷した（データは示さず）。サンプル；Mel5392、培養15392メラノーマ細胞から得たｍＲＮＡ ；ＰＢＬ、４人の健常ドナーからのｍＲＮＡのプール；A431、類表皮腫瘍細胞系からのｍＲＮＡ。
【００１８】
（Ｂ）ＰＴＰＲＫ ｍＲＮＡ発現プロファイルのＲＴ−ＰＣＲ分析。細胞内ホスファターゼドメインをスパンする領域を、650bpの特異増幅帯を発生させるプライマーＦ３／Ｒδによって増幅した。反応条件は、ＤＮＡ増幅の線形範囲内に設定した。テンプレートの量をβ−アクチンの同程度のレベルを得るために調節し、よって、試験サンプルにおいて増幅ＰＴＰＲＫの直接比較を可能にした。実施例に示したように、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＰＴＰＲＫ発現の評価が、試験した１０のメラノーマ細胞系のうち５つについて報告された。４つの転移（Mel5392、Me335、Me337及びMe349）及び１つの初期（Me366）のメラノーマ細胞系である。４人の健常ドナーのＰＢＬプール（ＰＢＬ）及び正常なメラノサイト（FM2093）も含む。
図は、３種の独立した実験の結果である。
【００１９】
図４
cDNA＃11の特徴付け。cDNA＃11及び関連ミニ遺伝子を、ＰＴＰＲＫ蛋白の概略構造に位置合わせしたボックスとして示す。各ミニ遺伝子中の黒四角は、全長遺伝子（ゲンバンクNM002844）の開始ＡＴＧでフレームされた（in frame with）ＡＴＧコドンの位置を示す。2249位で発生した当然変異ヌクレオチド（ｇ→ａ）を示す。ミニ遺伝子を、下流突然変異(EPR1、EPR2、EPR2WT及びEPR3逆プライマー、→で示す)をマッピングする、種々のネスト化された逆プライマーに結合した同一の正プライマー（Ｆ２）を用いてcDNA＃11のＰＣＲ増幅によって合成した。ミニ遺伝子を、発現ベクターpcDNA3/TOPOにクローン化し、次いで、pcDNA3-DRB1 * 1001又はpcDNA3-DRBl*0102でCIITA+-293細胞にコトランスフェクトした。クローンTB515（１×１０5細胞／ウェル）を各トランスフェクタントに加え、２４時間後、上清について、ELISAによってＩＦＮ−γ量を測定した。表中、＋はTB515による陽性認識；−はTB515による認識なしである。EP2wtミニ遺伝子は、非突然変異（ｇ）ヌクレオチドを含んでいた。図の下におけるアミノ酸配列を、cDNA＃11の配列から推定した。図中の略号：LSはリーダ配列、MAMはメプリン/A5/R-PTPμモチーフ、Igはイムノグロブリン様ドメイン、FNIIIは、フィブロネクチンタイプIII様ドメイン、TMは膜貫通型、PTPはプロテイン−チロシンホスファターゼドメイン、Rはヌクレオチドｇ→ａ突然変異体から誘導されたアルギニンである。
【００２０】
図５
TB515エピトープの同定。（Ａ、Ｂ、Ｃ）種々の濃度の合成ペプチドを２時間３７℃で適用（pulsed）されたLCL15392細胞(５．０×１０3細胞／ウェル)をTB515 Ｔリンパ球を刺激するために用いた。TB515(５×１０3細胞／ウェル)を加え、１８時間後、メディウムを採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることにより得られた（図示せず）。（Ｄ） ５×１０3のLCL15392細胞を１５分間、種々の濃度の競合ペプチドとインキュベートした。競合ペプチドは、ＰＹＧＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰ（３位が修飾）、野生型ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＧＮＬＰＥＰ及び陰性コントロールとして用いたＨＬＡ-Ａ３結合ペプチドＩＬＲＧＳＶＡＨＫを含む。次いで、ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰペプチドを１００ｎＭで加えた。３７℃でのさらなるインキュベーションの１時間後、TB515(５×１０3細胞／ウェル)を加え、１８時間後、メディウムを採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることによって得られた。突然変異アミノ酸を太字、置換アミノ酸を下線で表す。
【００２１】
図６
Ｔリンパ球クローンTB48のペプチド特異性。種々の濃度の合成ペプチドを２時間３７℃適用されたLCL15392細胞 (５．０×１０3細胞／ウェル)を、TB48を刺激するために用いた。TB48クローン (５×１０3細胞／ウェル)を加え、１８時間後、メディウムを採取し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ-γを測定した。同一の結果が、ptl5392とDRB*1001のみを共有するLCL3700を用いることによって得られた。
【００２２】
図７
pt15392のＰＢＭＣにおけるＰＴＰＲＫエピトープ特異免疫。術後１２ヶ月の無病期間中に得られたptl5392のＰＢＭＣをインビトロで、突然変異ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰエピトープで刺激した。培養３週間の終わりに、発生したＴ細胞系を、抗ＨＬＡ−ＤＲ Ab L243の存在下又は不存在下で、ペプチド又は自己腫瘍刺激に対する応答におけるＩＦＮ−γの放出能について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価した。Ｔ細胞を、（１）メディウム、（２）LCL15392、(３)４μｇのＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰが適用されたLCL15392、(４)４μｇのＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰが適用され、かつ１０μｇ／ｍｌの抗-ＨＬＡ−ＤＲ L243 AbでインキュベートされたLCL15392、(５)２μｇのＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰが適用されたCL15392、(６)２μｇのＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰでが適用され、かつ１０μｇ／ｍｌの抗-ＨＬＡ−ＤＲ Ab L243でインキュベートされたLCL 15392、(７)４μｇの野生型ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＧＮＬＰＥＰペプチドが適用されたLCL15392、(８)自己Mel5392、(９)抗-ＨＬＡ−ＤＲ Ab L243とインキュベートされた自己Me15392とともにインキュベートした。
【００２３】
略号：ptl5392は患者15392；LNはリンパ節；gp100はグリコプロテイン100；TRP-2はチロシナーゼ放出プロテイン２；PTPRKは受容体様プロテインチロシンホスファターゼカッパ；RT-PCRは逆転写遺伝子ポリメラーゼ連鎖反応；CIITAはクラスII トランスアクチベータ；liは不変鎖；GFPは遺伝子蛍光プロテイン；LCLはリンパ芽球様ＥＢＶ-形質転換Ｂ細胞系；MTSはメラノーマ移行シグナル；MAMはメプリン／Ａ５／ＰＴＰＲモチーフ；Eは効果細胞；Tは標的細胞；TCRはＴ細胞受容体である。
【００２４】
材料及び方法
細胞系。患者（pt）15392(ＨＬＡ-A*0301、B*40012、B*1402、C*0602、C*8002、DRB1*0102、DRB1*1001)の臨床経過及びメラノーマ細胞系Mel5392のインビトロでの安定化はすでに示した（１６）。細胞表面の分析によって、Mel5392細胞が、クラスＩＨＬＡ陽性であり、ＤＱクラスII ＨＬＡではなく、本質的にＤＲ、ＤＰを発現することを示した。LCL15392及びLCL3700は、それぞれ、ptl5392及び健常ドナーの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から得られたＥＢＶ-形質転換Ｂ細胞系である。LCL3700は、ptl5392とDRB1*1001のみを共有する。293-ＥＢＮＡ細胞(wt293) (インビトロゲン、カリフォルニア9200、米国)及びクラスII トランスアクチベータ+ 293-ＥＢＮＡ細胞(CIITA+293) を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭメディウム(ユーロクローン、ヨーロッパ、TQ4 5NDデボン、英国)で保持した。CIITA+293細胞を、wt293細胞をCIITA-コードレトロウィルスベクターに導入することによって得た。CIITA+293細胞を、L243、ＨＬＡ−ＤＲアレル特異的mAbを用いて、免疫的選択した。
【００２５】
腫瘍特異Ｔ細胞クローンの発生。1991におけるptl5392から外科的に取り出したリンパ節転移障害から採取した、腫瘍浸潤Ｔリンパ球(ＴＩＬ)を、密度勾配遠心法により単離した。Ｔ細胞を、インビトロで、300 IU/mL組換えヒトIL-2 (ユーロセタス、アムステルダム、オランダ)及び10 %のプールされたヒトＡＢ血清が添加されたＰＲＭＩメディウムにおいて自己腫瘍細胞にさらすことによって、２回刺激した。インビトロでの培養の３週間後、Ｔ細胞を限界希釈法によってクローン化し、そのクローンを１５日間で成長をスクリーニングした。成長Ｔ細胞クローンの特異性を、51Ｃｒ-放出アッセイで分析した。１４０の独立クローンが、自己腫瘍に対するＴＣＲ媒介溶解活性を示した。４０クローンが自己腫瘍のＨＬＡ−ＤＲ制限認識を示し、さらなる分析のために選択された。クローナリティ（clonality）を確認するため及び同一ＴＣＲ特異性を有するクローンを分類するために、各クローンのＴＣＲレパートリーを、先に述べたような（１７）、TCR AVのパネル及びTCRBV特異プライマーを用いて、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲによって試験した。
【００２６】
サイトカイン放出アッセイ。リンパ球に、Ｕ底プレートの９６ウェルで、１０4／ウェルのメラノーマ細胞又は種々のペプチド用量で２時間３７℃適用された５×１０3の自己ＬＣＬを接種し、１０％のプールされたヒト血清（ＰＨＳ）が添加されたRPMI1640の０．２ｍLの最終容量とした。一晩、３７℃でインキュベートした後、上清を採取し、サイトカイン含量をＥＲＩＳＡ(エンドーゲン、ボバーン、マサチューセッツ、01801、米国)によって評価した。
【００２７】
細胞障害アッセイ。標的セルの溶解に対する感受性を、種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で、標準51Ｃｒ-放出細胞障害アッセイによって評価した。51Ｃｒ-放出アッセイを先に述べたように行った（１６）。
【００２８】
ＨＬＡ−ＤＲB1*0102及びDRB1*1001クローニング。ptl5392のｃＤＮＡクローンコードＨＬＡ−ＤＲB1*0102及びDRB1*1001鎖を、15392LCL から調製したポリ（Ａ）+RNAから開始するＲＴ−ＰＣＲによって得た。増幅を、ＤＲβ１鎖(正5'-ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧ-3'；逆5'-ＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＴ-3')の保存5'及び3'領域に対して特異的なプライマーを用いて行い、ＰＣＲ生成物を、pcDNA3. 1/V5-His ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン）にクローン化した。
【００２９】
腫瘍誘発ｃＤＮＡライブラリの構築及びスクリーニング。ＦＡＳＴＲＡＣＫキット（インビトロゲン）を用いてMel5392細胞から単離したポリ（Ａ）+ＲＮＡを、スーパースクリプト・チョイス・システム（ライフ・テクノロジーズ）で、XbaI 部位（下線）を含有するオリゴ（ｄＴ）プライマー[5'- ｐＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣ(Ｔ)15-3']を用いて、ｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡをEcoRI-BstxIアダプター（ストラタジーン）に結紮し、XbaIで消化し、発現ベクターpEAK8. 5/Iiにおいて、不変鎖ｃＤＮＡインサート（li、アミノ酸1-80）の３’末端に位置するポリリンカーのXbaI及びBstxI部位に挿入し、よって、Ii/腫瘍誘発融合ｃＤＮＡライブラリを作製した。E. Coli DH5α細胞を、電気穿孔法により、組換えプラスミドで形質転換し、アンピシリン（0.1 g/l）で選択した。そのライブラリを、それぞれ約100ｃＤＮＡ組換えクローンの1400プールに分割した。プールは、ＬＢメディウム＋アンピシリン (0.1g/l)中で一晩成長させ、プラスミドＤＮＡをQIAprep96プラスミドキット（クアゲン）を用いて抽出した。
【００３０】
平底９６マイクロウェル中に接種したCIITA+293細胞(５×１０4細胞／ウェル)を、リポフェクトアミン（インビトロゲン）を用いて、ｃＤＮＡライブラリの１プールの150ng及びＨＬＡ−ＤＲB1又はＨＬＡ−ＤＲB10のいずれかを含有するプラスミドの150ngでコトランスフェクトした。２４時間後、ＣＤ４+Ｔクローン TB515を各マイクロ培地に１×１０4細胞／ウェルで添加した。２４時間後、上清100μｌを採取し、ＩＮＦ-γ生成物をＥＲＩＳＡ分析により測定した。
【００３１】
ミニ遺伝子の構築及びスクリーニング。cDNA＃11のシーケンシングを、インサート (正5'-ＡＣＣＴＣＧＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴ-3'、逆5'-ＡＴＴＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＴ-3')をフランキングするpEAK8. 5/Ii ベクターの領域にマッピングするプライマーで行った。非保存的ポイント突然変異体(ｇ→ａ)を、逆転写Mel5392ポリ（Ａ）+ＲＮＡ (正プライマーF2 5'-ＧＴＧＣＴＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＣＴＴＡＴ-3'、逆プライマーR2 5'-ＧＣＧＴＡＣＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＴＴ-3')又はMel5392ゲノムＤＮＡ(正プライマー5'-ＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＡ-3'、逆プライマー5'-ＣＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴ-3')のいずれかからの増幅生成物の両ＤＮＡストランドをシーケンシングすることによって確認した。
【００３２】
ミニ遺伝子を、異なる長さのＰＣＲ増幅生成物としてcDNA#11から調製した。全てのアンプリコンを、４つの異なるアンチセンスプライマー、EPR1 5'- ＣＣＧＡＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡ-3'、EPR2 5'-ＧＧＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡ-3'、EPR3 5'-ＣＴＣＧＧＧＧＧＧＡＧＴＴＣＴ-3'及びEPR2WT 5'- ＧＧＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧ-3'と結合した同じセンスプライマーF2を用いて得た。後者は、野生型ヌクレオチド（EPR2WT プライマー中に下線）を含有するEP2wtミニ遺伝子の調製のために用いた。ＰＣＲ生成物をpcDNA3.1/V5-His ＴＯＰＯベクターにクローン化した。
【００３３】
Ii-EP2wt融合ミニ遺伝子を、AscI及びXbaI酵素で、ＴＯＰＯベクターからのEP2wtミニ遺伝子の摘出によって得、その後、pEAK8.5/IiベクターのAscI及びXbaI部位への挿入物をクローン化した。この反応は、インフレーム融合構築物を生じさせた。
【００３４】
Ｒ−ＰＴＰＫ発現のノーザンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析
Mel5392からのポリ（Ａ）+RNA、同種メラノーマ及びＰＢＬ系を、上述したように単離した。ＲＮＡの総量を、ＲＮＡクエオス（RNAqueous：商標）−４ＰＣＲキット（アンビオン、オースチン、テキサス、78744、米国）を用いることによって単離した。ノーザンブロット実験のために、それぞれＲＮＡサンプルの10μｇを、１％ホルムアルデヒドアガロースゲル中で電気泳動に付し、ナイロン膜 (ハイボンド-N+、アマーシャムバイオサイエンシスインク、ピスカタウェイ、ニージャージ、08855-1327、米国)に転写した。プローブを、ランダムプライマー法（アマーシャム・バイオサイエンシス）により[アルファ-32Ｐ]ＣＴＰで標識し、プレ−ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを、ハイボンド-N+文献のガイドラインに従って行った。膜を、連続的なＳＳＣの希釈溶液(0.03Mから 0.0015M)で４回洗浄した。プローブＡ及びＣを、特異プライマーを用いてMel5392ポリ(A)+RNAのＰＣＲ増幅によって得た。遺伝子(遺伝子の241-1110塩基)の5'領域に対して特異的なプローブＡを、プライマー正Ｆ１(5'-ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴ-3')及び逆R1 (5'-ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＴＣＴＴ-3')で合成した。２つの細胞内ホスファターゼドメイン(遺伝子の2925-4547塩基)をコードする領域に対して特異的なプローブＣを、プライマー正F3 (5'-ＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＡＧＣＴＡＡＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴＡ-3')及び逆ＳＴＯＰ (5'-ＣＣＡＡＣＴＡＡＧＡＴＧＡＴＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＡＡ-3')で誘導した。全ての増幅生成物を、プローブとして用いる前にシーケンシングした。ＤＮＡクローン#11（遺伝子の2084-2751塩基）をプローブＢとして用いた。
【００３５】
正常及び腫瘍細胞系のＰＴＰＲＫ発現プロファイルのＲＴ−ＰＣＲ分析を、以下の条件下に、正プライマーF3及び逆プライマーRδ(5'-ＣＡＣＣＣＴＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＡＴ-3')で行った；2'94℃、２４サイクル（1'94℃、2'54℃、3'72℃からなる）及び最終10'72℃。条件は、線形ＤＮＡ増幅を得るために設定した。増幅ＤＮＡは、アガロースゲルに負荷され、臭化エチジウムで染色し、専用ソフトウェア（イメージマスターVDL-CS、アマーシャム・ファルマシア・バイオサイエンシス）で分析した。標準偏差は三重試験において５％以下であった。各サンプルの発現レベルを、β−アクリン遺伝子の発現レベルを考慮して、ＲＮＡ完全性のために標準化した（反応条件： 4'94℃、２１サイクル（1' 94℃、2'68℃、2'72℃からなる）、最終10'72℃、線形ＤＮＡ増幅に対応）。
【００３６】
ペプチド合成。ペプチドを、一時的にNH2−末端保護のためのFmocを用いて、従来の固相ペプチド合成によって合成し、マススペクトル法により特徴づけされた。用いられた全てのペプチドは９５％より純粋であった（ネオシステム、ストランスボーグ、フランス）。ペプチドを、使用直前に、ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍLで溶解し、−２０℃で保存し、１０％ヒト血清が添加されたＲＰＭＩメディウムで希釈した。
【００３７】
エピトープ再構築分析。ペプチド認識を分析するため、５×１０3LCL15392又はLCL3700 細胞を、100μｌのＲＰＭＩ1640-10% PHS中で、９６マイクロウェルに接種し、次いで、適当なペプチドを異なる濃度で適用した。ペプチドを、効果細胞を添加する前に、２時間３７℃で負荷し、最終１：１のE:T比にした。上清を１８時間後に採取し、ＩＦＮ−γ量をＥＲＩＳＡにより測定した（マブテックAB、ストックホルム、スウェーデン）。100ｎMでＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰペプチドを添加する前に、１５分間、種々の濃度の競合ペプチドと５×１０3LCL15392又は５×１０3LCL3700をインキュベートすることにより、競合実験を行った。３７℃でのさらなるインキュベートの１時間後、Ｔ細胞クローンを採集濃度１：１で添加した。
【００３８】
ptl5392 ＰＢＭＣからのＰＴＰＲＫ特異Ｔ細胞の発生。術後１２ヶ月で得たptl5392のＰＢＭＣ（フォローアップの無病期間中）を、インビトロで、上述した（１５）ように、ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰペプチドで刺激した。簡単に言えば、ＰＢＭＣ(２×１０6/ウェル)を、自己ペプチド−適用単細胞で毎週刺激した。各刺激の終わりに、ペプチド特異反応性をエリスポット分析によりモニターした。
【００３９】
ＩＦＮ−γエリスポットアッセイ。９６ウェルのニトロセルロースウェル（ミリリットル、ミリポア、ブレッドフォード、マサチューセッツ）を一晩、５０μｌ／ウェルの８μｇ／ｍｌ抗−ヒトＩＦＮ−γｍAb（マブテック）で被覆した。次いで、ウェルを洗浄し、アイスコブ（Iscove's）修飾ＤＭＥＭ（バイオウィッタカー）及び１０％ヒトＡＢ−血清で、２時間３７℃でブロックした。Ｔ細胞(２×１０3又は２×１０4)を１．５×１０4ペプチド−適用自己ＬＣＬ細胞と混合し、９６プレコートウェルに接種した。それぞれ、Ｔ細胞をメディウムのみと又はヤマゴボウマイトジェンとインキュベートした（それぞれ、陰性又は陽性コントロールとしての役割を果たす）。３７℃、５％ＣＯ2でのインキュベーションの２４時間後、次いで、エリスポットを製造者の指示に従って行った。簡単に言えば、プレートを、ＰＢＳ + 0.05% トゥウィーン２０で６回洗浄した。ウェルを２時間３７℃にて、50μl/ウェルのビオチニル化マウス抗ヒトＩＦＮ−γｍAb（マブテック）とともに、2.5μｇ／ｍｌの濃度で、インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄した後、１／１０００に希釈された１００μｌのストレプトアビジン−アルカリホスホターゼ（１５０μｇ／ｍｌ）を室温で２時間添加した。ＰＢＳでの別の洗浄工程の後、１００μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（バイオラッド、カリフォルニア、94547、米国）を各ウェルに１０から２０分間添加した。色発現を流水下で洗浄することにより停止させた。室温で乾燥した後、ＩＦＮ−γ分泌Ｔ細胞を、自動イメージ分析システムエリスポットリーダー（ＡＩＤ、ストラスブルグ、ドイツ）を用いて計数した。各実験を３重で行った。
【００４０】
結果
腫瘍特異的ＣＤ４+Ｔ細胞クローン。４０の腫瘍特異ＣＤ４+Ｔ細胞クローン (15392CD4+T)を、ptl5392のＬＮ転移から単離したＴＩＬの限界希釈クローニングによって得、インビトロにおいて、２週間、自己腫瘍で刺激した。ＲＴ−ＰＣＲによるＴＣＲ分析は、全てのクローンがTCRAV及びTCRBVコンビネーション（表）にしたがった５つの異なるサブセットにおいて分類することができたことを示す。各サブセットを代表する単一のＴ細胞クローンにおいて、機能研究を行った。全てのクローンが、腫瘍刺激に対する応答において同一の機能活性を示すことが認められた。図１に報告したデータはクローンTB515で得られ、試験された全てのＴ細胞クローンを表わす。51Cr放出アッセイによって検出された溶解は、L243、ＨＬＡ−ＤＲの単形性の決定子に指向されたmAb の存在において強力に阻害されたため、自己メラノーマでの刺激において、全てのクローンが、Mel5392細胞に対してＨＬＡ−ＤＲ制限的溶解活性を発揮した（図１Ａ）。さらに、腫瘍刺激において、腫瘍特異CD4+Ｔ細胞クローンは、また、IL-4及びTGFβではなく、ＩＮＦ-γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ-α及びＩＬ−２を含むＴｈ１プロファイルに適合性のあるサイトカインカクテルを放出した（図１Ｂ）。
【００４１】
突然変異PTPRK遺伝子はTB515エピトープをコードする。インビトロでのその成長能のために、TB515は、さらに選択され、メラノーマ特異抗原を分子的に特徴付けるために用いられた。この目的のために用いられた遺伝学的アプローチは、腫瘍抗原の同定のために使用された最近報告された方法論の最適化として開発された（１８から２０）。安定にCIITA cDNA (CIITA+293)でトランスフェクトされた293- EBNA1細胞を、ｃＤＮＡ腫瘍ライブラリのレシピエントとして用いた。抗-ＨＬＡ−ＤＲ AbでのＦＡＣＳ分析は、CIITA+293細胞におけるクラスII ＨＬＡの発現における顕著な増加を示した（図示せず）。腫瘍誘発プロテインのクラスIIＨＬＡへの経過経路のエントランスを強いるために、このように、一時的にわれわれのスクリーニング方法の感受性を改善し、われわれは、キメラ不変鎖（Ii）／腫瘍ｃＤＮＡライブラリを構築した（２２）。プールに分割されたｃＤＮＡライブラリを、次いで、同じ患者からクローン化されたDRB1*0102 又はDRB1*1001を含むプラスミド100ｎｇとともに、CIITA+293 細胞にトランスフェクトした。
【００４２】
トランスフェクタントのスクリーニングは、DRB1*0102アレルでトランスフェクトされた場合(CIITA+-DRB1+293) でなく、CIITA+293にDRB1*1001 (CIITA+-DRB 10+293)でコトランスフェクトされた場合、TB515Ｔ細胞によって認識される一つの陽性ｃＤＮＡクローン（cDNA#11）の単離を導く（図２Ａ）。cDNA#11及びDRB1*1001が293にトランスフェクトされ、CIITA (wt293)によって修飾されない場合、認識は生じず、よって、さらにTB515活性に対する活性クラス11-ＨＬＡ処理機構の必要性を確認する。
【００４３】
ＤＮＡシーケンシング分析は、cDNA#11が受容体様プロテイン−チロシンホスホターゼカッパ（PTPRK, ゲンバンクNM002844）の一部の領域に相同であり、タイプIIチロシンホスホターゼ（PTPs）は、膜貫通型レセプター様ＰＴＰの５つのサブファミリーの一つであることを示す（２３）。腫瘍誘導cDNA#11は、公表されたNM002844 PTPRK cDNA配列の2084bp から2751 bpに伸張し、第４のＣ−モスト細胞内フィブロネクチンIII様ドメイン、全膜貫通型ドメイン及びまさに初期の細胞内配列をコードする領域を包含する。クローンは、遺伝子(NM-002844)の第４のフィブロネクチンIII様ドメインにおけるヌクレオチド２２４９での非保存的ｇ→ａポイント突然変異を示し、これは、対応蛋白におけるグリシンからアルギニンへの置換（Ｇ→Ｒ）を導いた（Mel5392から誘導されたPTPRKｃDNAの配列のゲンバンク受け入れ番号はAF533875である）。
【００４４】
このアミノ酸変化が単一のヌクレオチド多形でないことを確認するために（しかし、腫瘍組織で発生する体性突然変異を表す）、突然変異を包含する領域は増幅され、ptl5392の ＰＢＬ及びＬＣＬの双方から得られたゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡのいずれかから開始するシーケンスが行われた。分析されたサンプルは、いずれもｇ→ａへの転移を示さず、野生型配列においてのみ認められた（図示せず）。さらに、１０の追加メラノーマ細胞系から誘導されたＤＮＡ及びｃＤＮＡを、同様に分析したが、それらのいずれもヌクレオチド2249にいかなる突然変異も表さなかった。
【００４５】
不変の鎖配列は、Ｒ−ＰＴＰＫ誘導エピトープのＨＬＡ-クラスII提示に必要でない。cDNAクローン#11を含む組換えスラスミドの配列分析は、Ii鎖翻訳がＰＴＰＲＫ蛋白の適当な翻訳に対応するフレームに関連してシフトしたことを示す。したがって、われわれは、さらなる内部ＡＴＧによって指向される追加のオープンリードフレームの組換えプラスミドにおける存在を仮定した。CDNA#11の配列を分析することによって、われわれは、ＡＴＧ（ゲンバンクNM002844配列における2165位）がＰＴＰＲＫ遺伝子のメチオニンからまず開始する真性でフレームされていたコザック様配列（(g/a) nnatgg）を見出した。この内部ＡＴＧコドンの自給充足的翻訳能を検証するためにcDNA#11をpEAK8.5/Iiベクターから切除し、Ii欠損発現ベクターpcDNA3.1に挿入した。次いで、新たな組換えプラスミドを、DRB1*1001 とともにCIITA+293細胞にトランスフェクトした場合、TB515活性化を引き起こす能力について評価した（図２Ｂ）。予想したように、cDNA#11は、特異DRB1*1001-拘束型においてTB515クローンによってIi鎖誘導ＩＮＦ−γの不存在下でクローン化した。認識は、pEAK8.5/Iiベクター又はMel5392腫瘍において、cDNA#11のそれと同じくらい有効であった（図２Ｂ）ことは、Ii開始コドンの不存在下において、cDNC#11はその自体の内部ＡＴＧから翻訳され得、cDNA#11は、自然に処理することができ、本質的にIi鎖媒介細胞内再指向を必要とせずに、ＨＬＡ−クラスII経路において提示したことを示す。
【００４６】
Ｒ−ＰＴＰＫ ｍＲＮＡの発現パターン。Mel5392におけるＰＴＰＲＫ特異転写についてのより多くの情報を得るため、ノーザンブロット分析を行った（図３）。全ＰＴＰＲＫｍＲＮＡを包含するために、ＰＴＰＲＫ遺伝子の種々の領域にマッピングした３種の特異プローブの等モル混合物を用いてハイブリダイゼーションを行った。また、試験したサンプルは、ＰＢＬポリ（Ａ）+ＲＮＡをＰＴＰＲＫ発現の陰性コントロールとして含み、形質変換え表皮性細胞系A431を全長転写の陽性コントロールとして含んだ（この細胞系は、PTPRK遺伝子発現の高レベルを有することが知られていたため（２４））。十分なＲＮＡがインビトロの成長細胞から得られなかったため、メラニン細胞は、分析することができなかった。予想したように、ＰＢＬにおいて、十分なハイブリダイゼーションバンドが観察されず、よって、先のデータ（２４）を確認し、一方、A431 及びMe15392ポリ（Ａ）+RNAの双方が、かなり複雑なパターンを生じさせた（図３Ａ）。1800ｂｐ及び1000bp周辺のさらなる特異バンドが明確に検出可能であり、両サンプルは、全長転写に対応する5600bp付近に強度のシグナルを現した。これらの結果の全てはともに、Me15392が完全なＰＴＰＲＫ蛋白を発現するかもしれず、一方、一部のｍＲＮＡ転写の生物学的重要性が扱われるべきまま残ることを示す。
【００４７】
他の腫瘍及び非腫瘍細胞におけるＰＴＰＲＫｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲによって研究した。ＲＴ−ＰＣＲ増幅を、細胞内でマッピングするプライマーペアF3／Rδ、Ｎモストホスファターゼドメイン（増幅生成物長650bp）を用いて、総ＲＮＡから行った。ＰＴＰＲＫ遺伝子に高い特異性となるようにプライマーを設計した。それらの特性を、実験的に確認し、異なる細胞系から得られた増幅産物をシーケンシングし、ＰＴＰＲＫにのみ応答することを示し、一方、他のＲ−ＰＴＰ又はＰＴＰ遺伝子の配列は（これらはＰＴＰＲＫに高い相同性を有するものであるが）、認められなかった。反応条件を、線形ＤＮＡ増幅を有するように設定し、ｍＲＮＡの同程度の量を、β−アクチン増幅によって評価されたように各細胞系から用いた。メラニン細胞（FM2093細胞系）において明確に検出可能である一方、ＰＴＰＲＫは試験した１０のメラノーマ細胞系において異なって発現し、その５つはＰＢＬ（これはノーザンブロットにおいて陰性であった（図３Ａ））から得られたそれと比較して、わずかに検出可能バンドを示すのみであった。いくつかの代表的な例を図３Ｂに示す。
【００４８】
TB515に対するエピトープを再構築するＰＴＰＲＫ誘導ペプチドの同定
Ｔ細胞認識のためのＧ→Ｒ突然変異の重要性を評価するために、cDNA#11の野生型（突然変異していない）異形をＰＣＲ反応によって合成し、CIITA+293細胞にDRB1*1001cDNAでコトランスフェクトした。腫瘍特異15392CD４+Tクローンによる野生型配列の認識は観察されなかった（データは示さない）。よって、エピトープ形成において突然変異アミノ酸の直接的な役割を示唆する。さらにcDNA#11のエピトープコード領域を際立たせるために、ミニ遺伝子の列を、突然変異の下流をマッピングする種々のネスト化逆プライマーに結合した同一の正プライマー（F2）を用いて、ｃDNA#11のPCR反応によって合成した（図４）ｃDNA#11のＡＴＧ開始コドンを全て含むミニ遺伝子を発現ベクターpcDNA3/ＴＯＰＯ (インビトロゲン)にクローン化し、DRB1*0102又はDRB1*1001のいずれかを発現するCIITA+ 293にトランスフェクトし、最終的に、TB515認識を評価した。EP2ミニ遺伝子は、認識された最も短い構成であった。予想したように、EP2ミニ遺伝子（EP2WT）の野生型異形は、野生型ヌクレオチド（ａ／ｇミスマッチ）を有する逆プライマーEPR2WTを用いて得られるが、不変鎖を有するまたは不変鎖なしに発現ベクターにクローン化した場合、TB515リンパ球によって認識されなかった。
【００４９】
これらのトランスフェクション実験を、図４に示したように、突然変異を含む２６アミノ酸−長ペプチドに対して部分的に免疫原性のアミノ酸領域を際立たせた。TB515エピトープを同定するために、同定した２６のアミノ酸領域に及ぶ、ペプチドをオーバーラップするいくつかのヘキサデカマーを合成した。ペプチドを、抗メラノーマTB515クローンによる認識に対してインビトロでの自己ＬＣＬを感作するその能力について、種々の用量で評価した。試験したヘキサデカマーペプチドのうち、ＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰ (ＰＴＰＲＫ (667-682))（それは蛋白のアミノ酸667から682に伸張し、突然変異体を含む（図５、太字））がTB515クローンによる強力なＩＮＦ−γ放出を生じさせる一つであった。実際、滴定実験では、このペプチドを、10ｎMのような低い濃度でTB515細胞によって検出することができ、100ｎMでその半値作用に達することを示す（図５Ａ）。突然変異したアルギニン残基の免疫原性ペプチドにおける野生型グリシンでの置換（図５Ａ）は、促進能を完全に無効にし、よって、Ｔ細胞媒介認識に対する突然変異の関与度を明確に示す。さらに、5'又は3'末端のいずれかにおいてアミノ酸残基を徐々に欠損するペプチドでの実験（図５Ｂ及び５Ｃ）は、最小のエピトープコア又は候補アンカーアミノ酸の双方の同定に照準を向けた。特に、Y669 (図５Ｂ)又はL679及びN678 (図５Ｃ)の直接関与しないアミノ酸の欠損又は置換は、ＰＴＰＲＫ (667-682)ペプチドのTB515クローンを刺激する能力に強力に影響を与え、よって、ＨＬＡ−ＤＲ10/ペプチド/ＴＣＲ複合体の形成における３、１１及び１２位でのこれらアミノ酸の役割を示唆する。競合アッセイにおいて、それらは、クローンTB515によってＰＴＰＲＫ (667-682)ペプチドの認識を有効に阻害した (図５Ｄ)ので、野生型ペプチドＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＧＮＬＰＥＰ及びＧによって置換されたY669を有するＰＴＰＲＫ (667-682) は、双方ともＨＬＡ−ＤＲ10を結合することができた。
【００５０】
異なるＴＣＲを有するとして説明された他の４つのＴ細胞クロ−ンは、現に、同じエピトープに対して指向し、それらは野生型ペプチドを認識せず、及びそれらの全ては、TB515について観察された（データは示さない）ような突然変異ペプチドに対する同様の親和性を示した。さらに、残基Y669で置換基を有するＰＴＰＲＫ (667-682)ペプチドは、TB48クローンによって有効に認識され、Y669（TB515媒介認識にとって必須ではないが）が、ＨＬＡ−ＤＲ10にＰＴＰＲＫ (667-682)ペプチドの結合能の決定的な影響を与えなかった（図６）。
【００５１】
Ptl5392は、誘導されたPTPRKに対する全身性免疫性を発生し、ＨＬＡ−ＤＲ100はエピトープを提示した。ptl5392も全身性エピトープ特異性Ｔ細胞免疫性を発現したかどうかを確認するために、リンパ節転移の切除術後１２ヶ月で得たＰＢＭＣをインビトロで１μＭでのＰＹＹＦＡＡＥＬＰＰＲＮＬＰＥＰペプチドとともに培養した。インビトロでのペプチドパルス自己単細胞での刺激の３週間後、培養Ｔ細胞は、エリスポットアッセイによって検出されたようにペプチド特異性反応性を示し、ペプチド特異Ｔ細胞の末梢血中での存在を示す（図７）。これらの細胞は、また、ＨＬＡ−ＤＲ拘束型において自己腫瘍を認識し得た。逆に、DRB1*1001陽性の健康なドナーから得たＰＢＭＣにおいては、特異反応性は検出されなかった。
【００５２】
機能的特徴づけ及び腫瘍特異ＣＤ４+ＴクローンのＴＣＡ発現
【００５３】
【表１】
2006506064.tif 000002
a ４０の抗メラノーマ15392CD４+Ｔ細胞クローンが、２週間、自己メラノーマを用いて、インビボで刺激された15392CD4+TILの限界希釈によって発生した。15392CD４+Ｔクローンは、種々のTCRAV及びTCRBVを発現する５の明確なサブセット（T1からT5）に分類された。
【００５４】
b 各サブセットに対する腫瘍特異性クローン（さらに培養し、インビトロで伸張）を示す。
【００５５】
c ＴＣＲの分析を、TCR Vαのパネル及Vβ特異的プライマー（材料及び方法参照）を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって行った。
【００５６】
d示されたクローンの自己腫瘍の溶解能を、E:T比３０：１での５時間の51Ｃｒ-放出アッセイで試験した。データを溶解％で示す。丸カッコ中の数字は１０μｇ／ｍｌの最終濃度で用いたモノクローナル抗-ＨＬＡ−ＤＲ L343 mAbの存在下で行った溶解％である。
【００５７】
e サイトカイン放出アッセイを、示されたＴ細胞クローンの自己腫瘍を認識する能力を評価するために行った（詳しくは材料と方法参照）。１０μｇ／ｍｌの最終濃度で用いたL343の不存在下または存在下（丸カッコ中の値）において腫瘍刺激の後のＩＦＮ−γ放出量を、pg/mlで表す。
【００５８】
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【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】抗メラノーマＴリンパ球クローンTB515の機能的特性を示すグラフである。
【図２】クローン#11の相補ＤＮＡのTB515認識抗原コードを示すグラフである。
【図３】Me15392細胞でのＰＴＰＲＫ ｍＲＮＡ発現及びＰＴＰＲＫ ｍＲＮＡ発現プロファイルのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図４】cDNA＃11の特徴付けを示す図である。
【図５】TB515エピトープの同定を示すグラフである。
【図６】Ｔリンパ球クローンTB48のペプチド特異性を示すグラフである。
【図７】pt15392のＰＢＭＣにおけるＰＴＰＲＫエピトープ特異免疫を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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