(57)【要約】本発明は、熱ショックタンパク質結合性タンパク質として、天然および組換えのp95形態および断片を使用するための組成物および方法に関する。本発明は、一部には、p95を組換えにより発現させることができるという本発明者らの発見に基づいている。本発明はまた、少なくともp95と、CD91のドメインII、IIIおよびIVからの追加の連続配列とを含むCD91ポリペプチド断片に関する。本発明は、CD91ポリペプチド断片またはその類似体、誘導体もしくは擬似体をコードする核酸分子、CD91ポリペプチド断片またはその類似体、誘導体もしくは擬似体、CD91ポリペプチド断片をコードする核酸分子を含有するベクター、CD91ポリペプチド断片をコードする核酸分子を含有する発現ベクター、CD91ポリペプチド断片を組換えにより発現する真核および原核細胞、CD91ポリペプチド断片と相互作用する化合物またはCD91ポリペプチド断片とCD91リガンドとの相互作用を同定する方法、本発明の組成物および方法により免疫応答をモジュレートする方法、ならびに本明細書に記述する組成物および方法を用いた治療方法を提供する。
2006516091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、該ヌクレオチド配列は天然のCD91ヌクレオチド配列中で配列番号1に隣接する配列によってその両側を挟まれていない、上記核酸分子。
【請求項２】
配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項３】
1) 配列番号1のヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件下で全長にわたってハイブリダイズし、かつ2) (i) 組換え的に産生されて培地中に分泌され、(ii) 熱ショックタンパク質と結合する能力を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項４】
1) 配列番号1、14、15、16または17の核酸配列とストリンジェントな洗浄条件下で全長にわたってハイブリダイズし、かつ2) (i) 組換え的に産生されて培地中に分泌され、(ii) 熱ショックタンパク質と結合する能力を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項５】
配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、該ポリペプチドが熱ショックタンパク質と相互作用する、上記核酸分子。
【請求項６】
異種ヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子を含有する発現ベクターであって、そのヌクレオチド配列が宿主細胞内での該ヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節配列と機能的に連結されている、上記発現ベクター。
【請求項９】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸分子を含有する遺伝子操作された宿主細胞であって、そのヌクレオチド配列が宿主細胞内での該ヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節配列と機能的に連結されている、上記遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項１０】
請求項8に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、該アミノ酸配列は天然のCD91ポリペプチド配列中でそれぞれ配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12に隣接する配列によってその両側を挟まれていない、上記ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号11のアミノ酸残基852-4420の1個以上連続したアミノ酸に融合された、配列番号11のアミノ酸残基1-851からなる連続したアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号1、14、15、16または17の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドであって、熱ショックタンパク質と結合する上記ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号2、6、8、10、11または12のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドであって、熱ショックタンパク質と結合する上記ポリペプチド。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質がgp96、hsp 90、hsp 70、およびカルレティキュリンからなる群より選択される、請求項13または14に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
熱ショックタンパク質がgp96である、請求項15に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列および異種アミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項12〜17のいずれか1項に記載のポリペプチドを製造するための方法であって、以下のステップ：
(a)  請求項11〜17のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含有する細胞を、該ポリペプチドが該細胞により発現される条件下で培養すること、
(b)  発現されたポリペプチドを該細胞培養物から回収すること、
を含んでなる上記方法。
【請求項１９】
配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列を含むCD91ポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはキメラ抗体である、請求項19に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントがFabフラグメントである、請求項20に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項２２】
請求項19に記載の抗体またはフラグメントと結合する抗イディオタイプ抗体。
【請求項２３】
請求項19に記載の抗体と、該抗体を用いてCD91ポリペプチド断片を検出するための使用説明書とを含んでなるキット。
【請求項２４】
CD91に関連した疾患または障害を治療するための方法であって、かかる治療が必要な哺乳動物に、請求項11〜17のいずれか1項に記載のポリペプチドを、該疾患または障害を治療するのに有効な量で投与することを含んでなる上記方法。
【請求項２５】
前記疾患または障害が自己免疫疾患、抗原提示またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患または障害、サイトカインのクリアランスまたは炎症に関係する疾患または障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患または他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、または骨粗鬆症である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
HSP-CD91介在プロセスをモジュレートする化合物を同定するための方法であって、
(a)  試験化合物を、CD91リガンドに結合するCD91ポリペプチド断片および熱ショックタンパク質に接触させること、
(b)  CD91ポリペプチド断片の活性または発現のレベルを測定すること、
を含んでなり、結果的に、(b)で測定された活性または発現のレベルが、熱ショックタンパク質の存在下で、しかし試験化合物の非存在下で測定されたCD91ポリペプチド断片の活性または発現のレベルと相違する場合に、HSP-CD91介在プロセスをモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項２７】
同定される化合物が熱ショックタンパク質とCD91ポリペプチド断片との相互作用を妨げるアンタゴニストである、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物が小分子またはペプチドである、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
ペプチドがCD91ポリペプチド断片の少なくとも5個連続したアミノ酸を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
HSP-CD91介在プロセスが自己免疫疾患、抗原提示またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患または障害、サイトカインのクリアランスまたは炎症に関係する疾患または障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患または他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、または骨粗鬆症に影響を及ぼす、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
熱ショックタンパク質のCD91への結合をモジュレートする化合物を同定するための方法であって、
(a)  熱ショックタンパク質と、CD91リガンドに結合するCD91ポリペプチド断片またはその誘導体とを、試験化合物の存在下に、結合に導く条件下で接触させること、
(b)  CD91ポリペプチド断片またはその類似体、誘導体もしくは擬似体に結合した熱ショックタンパク質のレベルを測定すること、
を含んでなり、結果的に、(b)で測定された熱ショックタンパク質の結合レベルが、前記条件下で試験化合物の非存在下に測定されたCD91ポリペプチド断片またはその類似体、誘導体もしくは擬似体に結合した熱ショックタンパク質のレベルと相違する場合に、HSPのCD91ポリペプチド断片への結合をモジュレートする化合物が同定される、上記方法。
【請求項３２】
CD91ポリペプチド断片またはその誘導体が固相支持体に固定される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
固相支持体がマイクロタイターディッシュである、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
熱ショックタンパク質の結合レベルが熱ショックタンパク質特異的抗体を用いて測定される、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
熱ショックタンパク質が標識されており、熱ショックタンパク質の結合レベルが該標識を検出することにより測定される、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
熱ショックタンパク質が蛍光標識で標識されている、請求項35に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  序
本発明は、熱ショックタンパク質に結合するCD91ポリペプチド断片を使用するための組成物および方法に関するものである。特に、本発明は、CD91の特定のドメインのアミノ酸残基を含む、CD91の熱ショックタンパク質結合性断片を使用するための組成物および方法に関するものである。本発明は、核酸分子、CD91ポリペプチド断片、CD91断片を発現する細胞、ならびに、CD91ポリペプチド断片およびCD91ポリペプチド断片-HSP複合体に結合する抗体および他の分子を包含する。さらに、本発明は、HSPとCD91ポリペプチド断片との相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびに、免疫疾患、増殖性疾患および感染性疾患を診断し治療するための、前記化合物の使用方法、およびCD91ポリペプチド断片を含む組成物の使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
2.1.  熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（HSP）は、ストレスタンパク質とも呼ばれており、初めは、細胞が熱ショックに応答して合成するタンパク質として同定されたものである。HSPは分子量に基づいて5つのファミリーに分類されており、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60およびsHSPがある。その後、これらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレス刺激、例えば、栄養欠乏、代謝破壊、酸素ラジカル、細胞内病原体による感染などに応答して誘導されることが見出された（Welch, 1993, Sci. Am. 268: 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8: 401-420; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gethingら, 1992, Nature 355: 33-45; およびLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genetics 22: 631-677を参照のこと）。
【０００３】
熱ショックタンパク質は既存のタンパク質のうちで最も高度に保存されたタンパク質に入る。例えば、大腸菌由来のHSP70であるDnaKは、擦過傷(excoriates)からのHSP70タンパク質に対して約50％のアミノ酸配列同一性を有する(Bardwellら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852)。HSP60およびHSP90ファミリーも同様に高いレベルのファミリー内保存を示す(Hickeyら, 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 2279-2283)。さらに、HSP60、HSP70およびHSP90ファミリーは、配列の点ではストレスタンパク質に関係しているタンパク質（例えば、35％を超えるアミノ酸同一性を有する）を含むが、それらの発現レベルはストレスによって変化しないことが見いだされている。
【０００４】
熱ショックや他の生理的ストレスに対する細胞性応答の研究から、HSPはこうした不利な状態から細胞を保護することに関わっているだけでなく、ストレスを受けていない細胞においても必須の生化学的および免疫学的プロセスに関係していることが明らかにされた。HSPはさまざまな種類のシャペロン機能を果たしている。例えば、HSP70ファミリーのメンバーは、細胞質、核、ミトコンドリア、または小胞体に存在し(Lindquist ら, 1988, Ann. Rev. Genetics 22: 631-677)、免疫系の細胞への抗原提示に関与しており、さらに、正常細胞においてはタンパク質の転移、折りたたみおよび組み立てにも関係している。HSPはタンパク質またはペプチドと結合し、その結合したタンパク質またはペプチドをアデノシン三リン酸(ATP)または低pHの存在下で放出することができる。
【０００５】
2.2.  HSP-ペプチド複合体の免疫原性
Srivastavaらは、メチルコラントレンで誘発させた近交マウスの肉腫に対する免疫応答を検証した(1988, Immunol. Today 9:78-83)。これらの研究において、腫瘍の個々に異なる免疫原性に応答可能な分子は96kDaの糖タンパク質(gp96)と84〜86kDaの細胞内タンパク質(p84/p86)であることが判明した(Srivastavaら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3407-3411; Ullrichら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3121-3125)。特定の腫瘍から単離されたgp96またはp84/86でマウスを免疫すると、マウスはその特定の腫瘍に対して免疫を獲得するが、抗原的に区別される腫瘍に対しては免疫が生じない。gp96およびp84/86をコードする遺伝子を単離して特性決定を行なったところ、それらの間には有意な相同性が見られ、しかもgp96とp84/86は同一の熱ショックタンパク質のそれぞれ小胞体と細胞質にある同等物であることが示された(Srivastavaら, 1988, Immunogenetics 28: 205-207; Srivastavaら, 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167: 109-123)。さらに、HSP70はそれが単離された腫瘍に対する免疫を誘導するが、抗原的に異なった腫瘍に対しては免疫を誘導しないことが示された。しかしながら、ペプチドを枯渇させたHSP70はその免疫原活性を失うことが見出された(UdonoおよびSrivastava, 1993, J. Exp. Med. 178: 1391-1396)。これらの観察から、熱ショックタンパク質はそれ自体に免疫原性があるのではなく、抗原ペプチドと非共有結合の複合体を形成して、その複合体が抗原ペプチドに特異的な免疫を引き出すことができると提案された(Srivastava, 1993, Adv. Cancer Res. 62: 153-177; Udonoら, 1994, J. Immunol., 152: 5398-5403; Sutoら, 1995, Science, 269: 1585-1588)。
【０００６】
HSPとペプチドとの非共有結合複合体（癌細胞から精製されたもの）は、癌の治療および予防に使用することができ、1996年4月11日付けのPCT国際公開WO 96/10411および1997年3月20日付けのWO 97/10001（1999年11月16日発行の米国特許第5,985,270号参照）に記載されている。 
2.3.  CD91
CD91はα(2)マクログロブリン（α2M）受容体としても知られており、最初は低密度リポタンパク質（LDL）受容体に関連したタンパク質として同定され、LDL受容体関連タンパク質（LDL Receptor Related Protein: LRP）とも称される（Stricklandら, 1990, J. Biol. Chem. 265: 17401-17404; Kristensenら, 1990, FEBS Lett. 276: 151-155）。このタンパク質は420kDaのαサブユニット、85kDaのβサブユニット、および39kDaの堅く結合した分子(RAP)から成っている。αおよびβサブユニットは約15Kbの大きさの単一の転写産物によりコードされる (Van Leuvenら, 1993, Biochim. Biophys. Acta. 1173: 71-74)。この受容体は単球系統の細胞と肝細胞、繊維芽細胞および角質細胞に存在することが示されている。これまでに、CD91は、さまざまなエンドプロテイナーゼに結合してそれらを阻害する血漿糖タンパク質α2Mの活性型と結合することが分かっている。CD91はまた、その他のリガンド、例えば、トランスフォーミング増殖因子(O'Connor-McCourtら, 1987, J. Biol. Chem. 262: 14090-14099)、血小板由来増殖因子(Huangら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 342-346)、および繊維芽細胞増殖因子(Dennisら, 1989, J. Biol. Chem. 264: 7210-7216)にも結合する。α2M受容体は多様なリガンドのエンドサイトーシスにおいてある役割を果たしている。α2Mに加えて、他のCD91リガンドとして、リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、アポリポタンパク質E (ApoE)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)、および外毒素が挙げられる。こうして、CD91は各種の細胞プロセスにおいて役割を担っており、かかる細胞プロセスには、エンドサイトーシス、抗原提示、コレステロール調節、ApoE含有リポタンパク質のクリアランス、およびキロミクロン残存物の除去が含まれる。したがって、α2Mはその各種リガンドの活性を調節している（特に低下させる）と考えられる。これらの各種リガンドとの複合体を形成すると、α2Mは細胞表面上のCD91と結合して、受容体介在エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。かくして、α2Mと複合体化したリガンドの取込みがCD91の主な機能であると以前には考えられていたが、脂質代謝におけるCD91の役割も想定される。α2M以外のCD91リガンドとして、例えば、組織特異的プラスミノーゲン活性化因子-インヒビター複合体(Orthら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 7422-7426)、およびウロキナーゼ-PAI1複合体(Nykjaerら, 1992, J. Biol. Chem. 267: 14543-14546)が同定されている。これらのリガンドは、ある範囲の細胞外血漿産物のクリアランスにおけるCD91の役割を証明している。リポタンパク質複合体、ラクトフェリン、組織型プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(uPA)、外毒素のようなリガンドは一般的に、CD91に結合すると、細胞によってエンドサイトーシスされる。
【０００７】
CD91（本明細書では相互に交換可能にα(2)マクログロブリン受容体、「α2MR」、「α2M受容体」、またはLDL（低密度リポタンパク質）受容体関連タンパク質（「LRP」）とも称される）は、主に肝臓、脳および胎盤で発現される。このヒト受容体の細胞外ドメインは、6個の50アミノ酸EGFリピートと31個の約40〜42アミノ酸の補体リピートを含む。補体リピートは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、2、8、10および11個のリピートのクラスターに組織化されており、クラスターI、II、IIIおよびIVと呼ばれている(Herzら, 1988, EMBO J. 7:4119-4127)。クラスターIはp80断片のヌクレオチド配列を含み、熱ショックタンパク質と結合することが示された(Binderら, 2000, Nature Immunology, 1: 151-155)。別の研究は、この受容体の主要なリガンド結合部分として補体リピート3-10（CR3-10）を含むクラスターII（Cl-II）に向けられている(Hornら, 1997, J. Biol. Chem. 272:13608-13613)。
【０００８】
多くのCD91リガンドは、図4に示すように、この受容体分子の既知のドメインおよび領域に結合し、かつ／またはそれと相互作用する。こうしたリガンドには、HSP（クラスタードメインI領域に結合する）、ApoE、α2M、tPA、プロウロキナーゼ、tPA:PAI-1、uPA:PAI-1、TFPI、ラクトフェリン、LPL、およびVIII因子（クラスタードメインII領域と結合または相互作用する）が含まれる。ApoEはクラスタードメインIII領域とも結合または相互作用する。ApoE、α2M、tPA、プロウロキナーゼ、tPA:PAI-l、uPA:PAI-l、組織因子経路インヒビター(TFPI)、ラクトフェリン、LPL、VIII因子、シュードモナス外毒素AはすべてIV領域と結合または相互作用する。CD91と結合または相互作用することが知られているその他のリガンドとしては、肝リパーゼ、Ixa因子、VIIa因子、MMP-13、MMP-9、スフィンゴ脂質活性化タンパク質(SAP)、妊娠ゾーンタンパク質（pregnancy zone protein）、補体C3、C1インヒビター、アンチトロンビンIII、ヘパリン補因子II、α1-アンチトリプシン、トロンボスポンジン-1、トロンボスポンジン-2、ライノウイルス、およびHIV-Tatが挙げられる。
【０００９】
ヒトα2Mは1474アミノ酸からなる前駆体として合成され、その最初の23アミノ酸はシグナル配列として機能するもので、開裂されて1451アミノ酸からなる成熟タンパク質をもたらす(Kanら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:2282-2286)。組換えタンパク質を用いた実験において、α2Mのカルボキシ末端の138アミノ酸（成熟タンパク質のアミノ酸1314-1451に相当）が該受容体と結合することが分かった。このドメインはRBD（受容体結合ドメイン）と呼ばれている(Salvesentら, 1992, FEBS Lett. 313:198-202; Holtetら, 1994, FEBS Lett. 344:242-246)。追加の15アミノ末端残基を含むα2Mのタンパク質加水分解断片（成熟タンパク質のアミノ酸1314-1451に相当）であるRBD変異体(RBDv)は、α2Mプロテイナーゼとほぼ同じ親和性でもって該受容体と結合する(Holtetら, 1994, FEBS Lett. 344:242-246)。
【００１０】
α2MRリガンドのアライメントから、αマクログロブリンのRBDに存在する保存ドメインが同定された。この保存配列はヒトα2Mのアミノ酸1366-1392にわたっている。このドメイン内の保存残基はPhe1366、Leu1369、Lys1370、Val1373、Lys1374、Glu1377、Val1382、Arg1384である(Nielsenら, 1996, J. Biol. Chem. 271:12909-12912)。これらのうち、Lys1370とLys1374は受容体結合にとって極めて重要であることが見出された(Nielsenら, 1996, J. Biol. Chem. 271:12909-12912)。
【００１１】
リガンドとCD91との結合（α2MとCD91との結合を含む）はCD91結合タンパク質（RAP）によって阻害される。RAPは小胞体の中にあってCD91の正しいプロセッシングに必要とされる39kDaのフォールディング（高次構造形成）シャペロンである。RAPは試験したすべてのCD91のCD91リガンドへの結合を競合的に阻害する能力を有する。ある研究は、RAPがCD91のクラスターII（Cl-II）中の補体リピートC5-C7と結合することを示している(Hornら, 1997, J. Biol. Chem. 272:13608-13613)。また、別の研究は、RAPがC9-C10モジュールを除くCl-II中のすべての２補体リピートモジュールと結合することを示している(Andersenら, J. Biol. Chem., Mar. 24, 2000, PMID: 10747921；印刷の前に電子発表)。RAPには３つの構造ドメイン1、2および3が確認されており、それぞれアミノ酸残基18-112、113-218および219-323からなる。組換えRAPドメインのリガンド競合タイトレーションは、試験リガンドの阻害のための決定基がドメイン1および3のC末端領域にあることを示す(Ellgaardら, 1997, Eur. J. Biochem. 244:544-51)。
【００１２】
2.4.  抗原提示
主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子は抗原提示細胞の細胞表面に抗原を提示する。次に細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）がMHC分子およびその結合ペプチドを認識して、標的細胞を殺す。抗原はその起源が細胞内にあるか細胞外にあるかに応じて２つの異なった抗原プロセッシング経路によりプロセッシングされる。細胞内つまり内因性のタンパク質抗原（すなわち、抗原提示細胞内で合成された抗原）は、MHCクラスI（MHC I）分子によってCD8+細胞傷害性Ｔリンパ球に提示される。一方、細胞外つまり外因的に合成された抗原決定基は、「特殊化」または「専門化」された抗原提示細胞(APC)（例えば、マクロファージ）の細胞表面上でMHCクラスII分子によってCD4+Ｔ細胞に提示される（一般的には、Fundamental Immunology, W.E. Paul(編), New York: Raven Press, 1984を参照のこと）。この抗原プロセッシング経路の区画分離は、さもなくば近隣細胞のMHC I抗原の放出の結果として免疫応答中に起こりうる組織破壊を防止するのに重要である。
【００１３】
熱ショックタンパク質gp96は、gp96が単離される起源に応じて、広範なアレイのペプチドに対してシャペロンの機能をもつ（Srivastavaら, 1998, Immunity 8:657-665; Srivastava, 2002, Nat Rev immunol. 2(3): 185-94を参照のこと）。腫瘍由来のgp96は腫瘍抗原ペプチドを担い(Ishiiら, 1999, J. Immunology 162:1303-1309)、ウイルス感染細胞からのgp96調製物はウイルスのエピトープを担い(SutoおよびSrivastava, 1995, Science 269:1585-1588; Nielandら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1800-1805)、そしてオボアルブミンまたはβ-ガラクトシダーゼのようなモデル抗原でトランスフェクトされた細胞からのgp96調製物は対応するエピトープを伴っている(Arnoldら, 1995, J. Exp. Med. 182:885-889; Breloerら, 1998, Eur. J. Immunol. 28:1016-1021)。gp96とペプチドとの会合はin vivoで起こる(MenoretおよびSrivastava, 1999, Biochem. Biophys. Research Commun. 262:813-818)。gp96-ペプチド複合体は、細胞から単離されようと(Tamuraら, 1997, Science 278:117-120)、in vitroで再構成されようと(Blachereら, 1997, J. Exp. Med. 186:1183-1406)、優れた免疫原であり、gp96シャペロン化抗原ペプチドに特異的なCD8+Ｔ細胞応答を引き出すために広く使用されている。
【００１４】
gp96-ペプチド複合体が免疫応答を引き出す能力は、抗原提示細胞のMHCクラスＩ分子への該ペプチドの移行に依存している(SutoおよびSrivastava, 1995, 前掲)。小胞体[ER]中のgp96によりシャペロン化された内因的に合成された抗原は抗原特異的CD8+Ｔ細胞（またはMHC I-制限CTL）をin vivoで感作することができ、このCD8+Ｔ細胞の感作はマクロファージを必要とする。しかし、外因的に導入されたgp96-ペプチド複合体が抗原特異的CD8+Ｔ細胞応答を引き出すプロセスは完全には理解されていない。なぜならば、細胞外抗原をクラスＩ提示機構へ移行させるための経路が確立されていないからである。だが、HSPと会合された細胞外起源の抗原ペプチドはなんとかマクロファージにより救出され、内因経路に向けられ、そしてCD8+リンパ球により認識されるMHC I分子により提示される(SutoおよびSrivastava, 1995, 前掲；Blachereら, 1997, J. Exp. Med. 186:1315-22)。
【００１５】
2.5.  HSP-CD91相互作用
Basuらにより報告された研究は、熱ショックタンパク質gp96、hsp90、hsp70、およびカルレティキュリンがCD91のさらなるリガンドであることを示している (Basuら, 2001, Immunity 14(3): 303-13)。gp96は、p80断片と命名されたアミノ末端断片中に存在するCD91の領域と関係している (Bindeら, 2000, Nature immunology, 1:151-155; WO 01/92474)。ヒトgp96をコードする遺伝子は以前に本発明者らにより第12染色体(q24.2 q24.3)にマッピングされた (Makiら, 1993, Somatic Cell Mol. Gen. 19: 73-81)。これに関して、CD91遺伝子が同じ染色体に、しかもそれほど離れていない位置(ql3ql4)にマッピングされたということは興味深いことである (Hillikerら. Genomics 13: 472-474)。gp96はα2Mのような他のリガンドを介さずに直接CD91に結合するようである。gp96の均一な調製物は、溶解状態または固相マトリックスに架橋された状態で、CD91に結合する。現に、CD91の主要なリガンドであるα2Mは、gp96とCD91との相互作用を促進するどころか、それを実際に阻害する。このことは、gp96がCD91の直接のリガンドであるという証拠を提供する。gp96と結合することが示された、80kDaのタンパク質であるp80は、明らかにCD91のαサブユニットのアミノ末端分解産物である (Binderら, 2000, Nature Immunology, 1: 151-155)。このサイズ範囲のCD91の分解産物は、以前の研究においても観察されており (Jensenら, 1989, Biochem. Arch. 5: 171-176)、これらはタンパク質加水分解切断に特に感受性でありうるCD91中の異なった細胞外ドメインの存在を示している。
【００１６】
α2マクログロブリンおよび抗CD91抗体が4種類のHSPのそれぞれの再提示を完全に阻害するというBasuらの観察は、CD91が4種類のHSPの取込みに関与する唯一の主な受容体であることを示している (Basuら, 2001, 前掲)。HSPが先天性免疫応答(Basuら, 2000, Int. hnunol. 12(11): 1539-1546)および適応免疫応答において担っている役割（次第に明らかになってきている）を考慮すると、この観察はやや反直感的である。しかしながら、2つの無関係な手段による完全な阻害に関するデータはまったく注目せずにはいられない (2001年12月6日付けのPCT国際公開WO 01/92474)。Binderは、hsp70とhsp90/gp96の間にはgp96受容体結合について競合する能力に有意な差があると報告した (Binderら, 2000, J. Immunol. 165: 2582-2587)。別のグループもgp96とhsp70の間に同様の差があることを観察した (Arnold-Schildら, 1999, J. Immunol. 162: 3757-3760)。これらの差は、4種類のHSPに対して単一の受容体を示しているBasuらの報告と矛盾しない。彼らは単純に、各種のHSPはかなり異なる親和性でもって単一の受容体と相互作用すると提唱している。
【００１７】
Binderらにより示されるように、熱ショックタンパク質-CD91相互作用は、CD91またはその断片の新しいタイプの機能であるセンサー機能（これまでに知られていた血漿リガンドを含む細胞外環境のセンサーだけでなく、細胞内環境のセンサー）をもたらす。gp96のようなHSPは絶対細胞内分子であり、壊死的な細胞死（アポトーシスによる細胞死ではない）の条件下でのみ細胞外環境に放出される (2001年12月6日付けのPCT国際公開WO 01/92474)。こうして、CD91は壊死的な細胞死のセンサーとして働くことができ、まさにスカベンジャー受容体CD36と最近になって同定されたホスファチジルセリン結合タンパク質とがアポトーシス細胞死のセンサーおよびアポトーシス細胞の受容体として働くのと同様である (Savillら, 1992, J. Clin. Invest. 90: 1513-1522; Fadokら, 2000, Nature 405: 85-90)。マクロファージとアポトーシス細胞との相互作用はTNFのような炎症性サイトカインのダウンレギュレーションへと至らせ(Fadokら, 2000, 前掲)、一方gp96-APC相互作用は、APCのMHC I分子によるgp96シャペロン化ペプチドの再提示と、これに続く抗原特異的T細胞の刺激(SutoおよびSrivastava, 1995, 前掲)、さらにはTNF、GM-CSF、IL-12などの前炎症性サイトカインの分泌へと至らせる。興味深いことに、CD91の独立したリガンドであるα2Mは、マクロファージによるgp96シャペロン化ペプチドの再提示を阻害する。Binderによるこの観察は、gp96シャペロン化ペプチドの再提示が血中では生理的に生じないが、局在化された壊死的細胞死の結果として組織内でのみ生じうることを示唆している。このことは、試験した全ての条件下で血中にgp96または他のHSPが全く存在しないことと一致する。総合すると、Binderの観察は、重大な組織の損傷および溶解の結果としての血中へのHSPの放出が全身的かつ致死的な前炎症性サイトカインのカスケードへと導かない作用機構が存在しうるという方向へ向かわせる。
【００１８】
したがって、CD91は、APCが(i)α2Mや他の血漿リガンドを介して血液の細胞外環境をサンプリングすること、および(ii)HSP（特に、gp96ファミリーのもの）を介して細胞内環境をサンプリングすること、を可能にすると考えられる。前者はAPCがそれらの原始的な食細胞機能を果たすことを可能にする一方で、後者はAPCがその先天性および適応性免疫機能を遂行することを可能にする。別の視点から見ると、CD36またはホスファチジルセリンを介したAPCによるアポトーシス細胞の認識は抗炎症性のシグナルをもたらすが、CD91を介したAPCと壊死細胞との相互作用は前炎症性の先天性および適応性免疫応答をもたらす (Srivastavaら, 1998, Immunity 8: 657-665を参照のこと)。
【００１９】
文献の引用または考察は、それが本発明の先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
【発明の開示】
【００２０】
3.  発明の概要
本発明は、HSPに結合する天然および組換えのCD91断片、そのようなCD91断片を使用するための組成物および方法、ならびに熱ショックタンパク質結合性タンパク質としてのその使用に関するものである。本発明は、一部には、細胞内で組換え的に発現させて該細胞から分泌させることができる、HSPに結合するCD91の断片を本発明者らが発見したことに基づいている。特に、本発明者らは、CD91のエピトープタグ付きp95およびp110断片、ならびに他のCD91ポリペプチドを真核および原核細胞において組換え的に発現させることができることを見いだした。本発明はまた、CD91のドメインIとドメインIIの追加の連続配列とを含むCD91ポリペプチド断片を使用するための組成物および方法、天然および組換えのポリペプチド形態および断片、ならびに熱ショックタンパク質結合性タンパク質としてのその使用に関するものである。
【００２１】
本発明は、HSPに結合することができるCD91断片タンパク質およびその誘導体（本明細書では「本発明のCD91ポリペプチド断片」という）を包含する。本発明はまた、本発明のCD91ポリペプチド断片またはその誘導体をコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、CD91ポリペプチド断片をコードする核酸分子を含有するベクター、発現ベクター、ならびに本発明のCD91ポリペプチド断片を組換え的に発現する真核および原核細胞を包含する。さらに、本発明はCD91ポリペプチド断片を作製する方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が天然のCD91ヌクレオチド配列中で配列番号1に隣接する配列によってその両側を挟まれていない、上記核酸分子を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、1) 配列番号1のヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件下で全長にわたってハイブリダイズし、かつ2) (i) 組換え的に産生されて培地中に分泌され、(ii) 熱ショックタンパク質に結合する能力を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を提供する。
【００２５】
本発明はさらに、1) 配列番号1、14、15、16または17の核酸配列とストリンジェントな洗浄条件下で全長にわたってハイブリダイズし、かつ2) (i) 組換え的に産生されて培地中に分泌され、(ii) 熱ショックタンパク質に結合する能力を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子であって、該ポリペプチドが熱ショックタンパク質と相互作用する、上記核酸分子を提供する。一実施形態において、本発明の単離された核酸分子は異種ヌクレオチド配列をさらに含んでなる。
【００２７】
本発明はさらに、上記のような本発明の核酸分子を含有するベクターを提供する。
【００２８】
一つの態様において、本発明は、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列が宿主細胞内での該ヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節配列と機能的に連結されている、上記発現ベクターを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含有する遺伝子操作された宿主細胞であって、該ヌクレオチド配列が宿主細胞内での該ヌクレオチド配列の発現を制御するヌクレオチド調節配列と機能的に連結されている、上記遺伝子操作された宿主細胞を提供する。本発明はまた、上記のような本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドであって、該アミノ酸配列が天然のCD91ポリペプチド配列中でそれぞれ配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12に隣接する配列によってその両側を挟まれていない、上記ポリペプチドを提供する。
【００３１】
本発明はまた、配列番号11のアミノ酸残基852-4420の1個以上連続したアミノ酸に融合された、配列番号11のアミノ酸残基1-851からなる連続したアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明はさらに、配列番号1、14、15、16または17の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドであって、熱ショックタンパク質に結合する上記ポリペプチドを提供する。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号2、6、8、10、11または12のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドであって、熱ショックタンパク質に結合する上記ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質がgp96、hsp 90、hsp 70、およびカルレティキュリンからなる群より選択される。一実施形態では、熱ショックタンパク質がgp96である。
【００３４】
本発明はまた、配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列および異種アミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチドを提供する。
【００３５】
本発明はまた、1つ以上の容器に本発明のCD91ポリペプチド断片を含んでなるキットを提供する。一実施形態では、本発明のCD91ポリペプチド断片、本発明のCD91ポリペプチド断片をコードする核酸、または本発明のCD91ポリペプチド断片を発現する細胞を含んでなる、1つ以上の容器にパッケージされたキットを提供する。一実施形態では、本発明のCD91ポリペプチド断片、本発明のCD91ポリペプチド断片をコードする核酸、または本発明のCD91ポリペプチド断片を発現する細胞が精製されている。別の実施形態では、前記キットは自己免疫疾患、感染性疾患または増殖性疾患の治療に使用するための使用説明書をさらに含む。
【００３６】
本発明の別の態様によると、本発明は、本発明のポリペプチドを製造するための方法を提供し、この方法は、(a)本発明のポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含有する細胞を、該ポリペプチドが該細胞により発現される条件下で培養すること、および(b)発現されたポリペプチドを該細胞培養物から回収すること、を含んでなる。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号2、3、6、7、8、9、10、11または12のアミノ酸配列を含みかつHSPに結合するCD91ポリペプチド断片と免疫特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。各種の実施形態では、前記抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、またはキメラ抗体である。別の実施形態では、前記抗体またはそのフラグメントがFabフラグメントである。本発明は、上記の抗体またはフラグメントと結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
【００３８】
本発明は、1つ以上の容器に、上記の本発明の抗体と、場合により、該抗体を用いてCD91ポリペプチド断片を検出するための使用説明書と、を含んでなるキットを提供する。
【００３９】
本発明はまた、CD91に関連した疾患または障害を治療するための方法を提供し、この方法は、かかる治療が必要な哺乳動物に、上記のポリペプチドを、該疾患または障害を治療するのに有効な量で投与することを含んでなる。特定の実施形態では、前記疾患または障害が自己免疫疾患、抗原提示またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患または障害、サイトカインのクリアランスまたは炎症に関係する疾患または障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患または他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、または骨粗鬆症である。
【００４０】
本発明はまた、免疫応答をモジュレートするための方法を提供し、この方法は、かかる治療が必要な哺乳動物に、本発明のCD91ポリペプチド断片、本発明の方法により同定された化合物、または本発明のCD91ポリペプチド断片とHSPとの複合体を、免疫応答をモジュレートするのに有効な量で投与することを含んでなる。特定の実施形態では、免疫応答が刺激される。他の特定の実施形態では、免疫応答が抑制または遮断される。
【００４１】
本発明はまた、哺乳動物に、CD91リガンド（例：熱ショックタンパク質）とCD91との相互作用をモジュレートする、本発明の方法により同定され精製された化合物を投与することを含んでなる、免疫応答をモジュレートするための方法を提供する。一実施形態では、前記化合物がCD91リガンド（例：熱ショックタンパク質）とCD91との相互作用を増強するアゴニストである。この方法の別の実施形態では、前記化合物がCD91リガンド（例：熱ショックタンパク質）とCD91との相互作用を妨げるアンタゴニストである。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、HSP-CD91介在プロセスをモジュレートする化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、(a)試験化合物を、CD91リガンドに結合するCD91ポリペプチド断片および熱ショックタンパク質に接触させること、および(b)CD91ポリペプチド断片の活性または発現のレベルを測定すること、を含んでなり、その際、(b)で測定された活性または発現のレベルが、熱ショックタンパク質の存在下で、しかし試験化合物の非存在下で測定されたCD91ポリペプチド断片の活性または発現のレベルと相違する場合に、HSP-CD91介在プロセスをモジュレートする化合物が同定される。特定の実施形態では、同定される化合物が熱ショックタンパク質とCD91ポリペプチド断片との相互作用を妨げるアンタゴニストである。特定の実施形態では、試験化合物が小分子またはペプチドである。特定の実施形態では、前記ペプチドがCD91ポリペプチド断片の少なくとも5個連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、HSP-CD91介在プロセスが自己免疫疾患、抗原提示またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患または障害、サイトカインのクリアランスまたは炎症に関係する疾患または障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患または他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、または骨粗鬆症に影響を及ぼす。
【００４３】
本発明はさらに、熱ショックタンパク質のCD91への結合をモジュレートする化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、(a)熱ショックタンパク質と、CD91リガンドに結合するCD91ポリペプチド断片またはその誘導体とを、試験化合物の存在下に、結合に導く条件下で接触させること、および(b)CD91ポリペプチド断片またはその誘導体に結合した熱ショックタンパク質のレベルを測定すること、を含んでなり、その際、(b)で測定された熱ショックタンパク質の結合レベルが、前記条件下で試験化合物の非存在下に測定されたCD91ポリペプチド断片またはその誘導体に結合した熱ショックタンパク質のレベルと相違する場合に、HSPのCD91ポリペプチド断片への結合をモジュレートする化合物が同定される。特定の一実施形態では、CD91ポリペプチド断片またはその誘導体が固相支持体に固定される。別の特定の実施形態では、固相支持体がマイクロタイターディッシュである。別の特定の実施形態では、熱ショックタンパク質の結合レベルが熱ショックタンパク質特異的抗体を用いて測定される。別の特定の実施形態では、熱ショックタンパク質が標識されており、熱ショックタンパク質の結合レベルが該標識を検出することにより測定される。別の特定の実施形態では、熱ショックタンパク質が蛍光標識で標識されている。
【００４４】
本発明のCD91ポリペプチド断片は、CD91の少なくともドメインI（p95）を含む（しかし全長のCD91ではない）CD91のポリペプチド断片である。特定の実施形態では、CD91ポリペプチド断片はCD91のドメインII、IIIまたはIVに延びる追加の連続したアミノ酸を含む。
【００４５】
各種の実施形態において、CD91ポリペプチド断片のリガンドはgp96または別の熱ショックタンパク質である。
【００４６】
本明細書中で用いる「HSP-CD91相互作用」という用語は、HSPとCD91タンパク質との相互作用に直接的または間接的に依存するおよび／または応答するプロセスをさす。こうしたプロセスには、CD91タンパク質の発現、合成および／または活性（例えば、各種のCD91リガンド（HSPを含むが、これに限らない）の結合に関係するエンドサイトーシス活性）の異常なレベルから生じるプロセスが含まれる。かかるプロセスとしては、限定するものではないが、エンドサイトーシス、抗原提示、コレステロール調節、apoE含有リポタンパク質のクリアランス、およびキロミクロン残存物の除去が挙げられる。
【００４７】
本明細書中で用いる「HSP-CD91障害」および「HSP-CD91関連状態」という用語は、それぞれHSP-CD91タンパク質相互作用に関係する障害および状態をさす。こうした障害および状態は、例えば、CD91タンパク質がHSPと相互作用する異常な能力が原因であると考えられ、おそらく、HSPおよび／またはCD91タンパク質の発現、合成および／または活性のレベルが、罹患しておらず障害のない正常な個体に見られるレベル、臨床的に正常な個体に見られるレベル、および／またはベースラインの平均HSPおよび／またはCD91タンパク質レベルを示す集団に見られるレベルと比べて異常であることに起因するのであろう。かかる障害には、限定するものではないが、自己免疫疾患、抗原提示および／またはエンドサイトーシスの破壊に関係する疾患および障害、サイトカインのクリアランスおよび／または炎症に関係する疾患および障害、増殖性疾患、ウイルス性疾患および他の感染性疾患、高コレステロール血症、アルツハイマー病、糖尿病、および骨粗鬆症が含まれる。
【００４８】
本明細書中で用いる「CD91リガンド」という用語は、CD91タンパク質またはCD91ポリペプチド断片に結合する能力がある分子をさす。そのようなCD91リガンドには、限定するものではないが、CD91タンパク質複合体（CD91と別の分子との複合体）、熱ショックタンパク質、および熱ショックタンパク質複合体（熱ショックタンパク質と別の分子との複合体）が含まれる。さらに、CD91リガンドには、当技術分野で周知の標準的な結合アッセイを用いてCD91リガンドと容易に同定しうる分子も含まれる。そのようなCD91リガンドは、典型的には、CD91タンパク質に結合すると細胞によってエンドサイトーシスにより取り込まれる。
【００４９】
4.  図面の説明
図1.  マルチリガンド受容体であるCD91の絵図。
【００５０】
図2A〜C.  組換えヒトCD91-p95断片の発現および抗HA Mabアフィニティー精製による精製。(1A) HAアフィニティーから溶出されたp95エピトープタグ付きタンパク質をクーマシーブリリアントブルーによる染色で可視化した。(1C) 溶出物中にエピトープタグ付きタンパク質が存在することを示す抗CD91抗体(8G1)ウェスタンブロット。(1B) 組換えヒトCD91タンパク質断片の一段階精製のための抗HAアフィニティー樹脂に溶出物をアプライした。
【００５１】
図3.  マウスCD91-p80タンパク質の構造モチーフ（配列番号4）。残基25-66はCR1に相当し、残基70-110はCR2に相当し、残基111-149はEGF様#1ドメインに相当し、残基150-189はEGF様#2ドメインに相当し、残基190-473はYWTDβプロペラー（propeller）#1領域に相当し、残基474-520はEGF様#3ドメインに相当し、残基521-799はYWTDβプロペラー#2に相当し、そして残基800-843はEGF様#4に相当する。
【００５２】
図4.  ヒトCD91タンパク質の構造モチーフ（配列番号5）GenBank登録番号S02392。ドメインI〜IVのアミノ酸残基は、残基番号により確認されるリピートおよびβプロペラー領域で示される。膜貫通ドメインはアミノ酸残基4421-4444に確認され、細胞内ドメインは残基4445-4544に確認される。膜貫通ドメインを含まない残りのコード配列は残基1-4420（配列番号11）である。
【００５３】
図5.  p95（第1のレーン）およびp110（第2のレーン）のNi NTA精製された組換えCD91断片のアクリルアミドゲルの写真を示す。
【００５４】
5.  発明の詳細な説明
本発明は、CD91ポリペプチド断片を使用するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、リガンド結合ドメインを含むCD91ポリペプチド断片を含有する組成物、CD91ポリペプチド断片をコードする単離された核酸分子、本発明の核酸およびタンパク質分子を発現する単離されたおよび／または組換え細胞、CD91ポリペプチド断片に対する抗体、CD91ポリペプチド断片とCD91リガンド（例えば、HSP）との相互作用をモジュレートする分子および化合物を提供する。本発明はさらに、熱ショックタンパク質受容体CD91のドミナントネガティブ阻害剤としてのリガンド結合性CD91ポリペプチド断片の使用方法を包含する。本発明はさらに、CD91ポリペプチド断片とHSPまたは他のCD91リガンドとの相互作用をモジュレートする化合物を同定するためのスクリーニングアッセイ、ならびに、免疫疾患、増殖性疾患および感染性疾患の診断および治療のためのこれら分子および複合体の使用方法を包含する。
【００５５】
本発明のCD91ポリペプチド断片はCD91のリガンド結合性断片である。本明細書中で用いる「CD91リガンド」という用語は、CD91に結合する能力がある分子をさす。そのようなCD91リガンドには、限定するものではないが、熱ショックタンパク質および熱ショックタンパク質複合体が含まれる。さらに、かかるリガンドには、当技術分野で周知の標準的な結合アッセイを用いてCD91リガンドと容易に同定しうる分子も含まれる。そのようなCD91リガンドは、典型的には、CD91タンパク質に結合すると細胞によってエンドサイトーシスにより取り込まれる。
【００５６】
本発明の実施において有用なHSPは、次の判断基準を満たす細胞性タンパク質の中から選択することができる：細胞がストレス刺激に暴露されると、HSPの細胞内濃度が増加する；HSPが他のタンパク質もしくはペプチドと結合し、その結合したタンパク質もしくはペプチドをアデノシン三リン酸(ATP)の存在もしくは低いpHの条件下で放出することができる；または、HSPが上記の性質のいずれかを有する細胞性タンパク質と少なくとも35%の相同性を有する。好ましくは、本発明の組成物および方法で用いるHSPには、限定するものではないが、HSP90、gp96、BiP、HSP70、HSP110、grp170、DnaK、Hsc70、カルレティキュリン、またはsmallHSP(sHSP)が含まれ、単独でも組み合わせでもよい。好ましい実施形態においては、HSPは哺乳動物(例えば、マウス、ラット、霊長類、飼い慣らされた動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ)のHSPであり、最も好ましくはヒトのものである。
【００５７】
本発明の実施に有用なHSPとしては、限定するものではないが、HSP60ファミリー、HSP70ファミリー、HSP90ファミリー、HSP100ファミリー、sHSPファミリーのメンバー、カルレティキュリン、および、チオレドキシン様ドメイン（例えば、限定するものではないが、ERp72およびERp61など）を含有している小胞体中の他のタンパク質が含まれる。
【００５８】
HSP類似体、突然変異タンパク質、誘導体および断片もまた、本発明でHSPの代わりに用いることができる。本発明で使用するためのHSPペプチド結合性「断片」とは、あるペプチドと非共有結合で会合してCD91介在免疫応答をモジュレートしうる複合体を形成することのできるHSPペプチド結合性ドメインを含むポリペプチドを意味する。一実施形態においては、HSPペプチド結合性断片は、約100〜200アミノ酸からなるHSPペプチド結合性ドメインを含むポリペプチドである。
【００５９】
データベースを用いて検索してクエリー配列と様々な程度の類似性を有する配列を同定することができ、それにはFASTAおよびBLASTなどのプログラムが用いられ、それらのプログラムはアライメントスコアおよび統計解析によって類似配列をランク付けする。本発明の方法で用いるHSPの調製のために使用しうるHSPの非限定的な例のヌクレオチド配列は次のものが挙げられる：ヒトHSP70、Genbank登録番号NM 005345、Sargentら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:1968-1972; ヒトHSP90、Genbank登録番号X15183、Yamazakiら, Nucl. Acids Res. 17:7108; ヒトgp96、Genbank登録番号X15187、Makiら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5658-5562; ヒトBiP、Genbank登録番号M19645、Tingら, 1988, DNA 7:275-286; ヒトHSP27、Genbank登録番号M24743、Hickeyら, 1986, Nucleic Acids Res. 14:4127-45; マウスHSP70、Genbank登録番号M35021、Huntら, 1990, Gene. 87:199-204; マウスgp96、Genbank登録番号M16370、Srivastavaら, 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:3807-3811; およびマウスBiP、Genbank登録番号U16277、Haasら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2250-2254。本明細書で用いる「HSP配列」という用語は、遺伝暗号の縮重のため、天然のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のみならずHSPをコードする他の縮重配列全てを含む。
【００６０】
前述のHSPファミリーには、配列がHSPと関連性のあるタンパク質も含まれ、例えば、35％を超えるアミノ酸同一性を有するが、その発現レベルがストレスによって変わらないものが含まれる。したがって、本明細書で用いる熱ショックタンパク質もしくはストレスタンパク質の定義には、これらのファミリーのメンバーと少なくとも35%〜55%、好ましくは55%〜75%、最も好ましくは75%、85%、90%、95%もしくは98%のアミノ酸同一性を有し、それらの細胞内での発現レベルがストレス刺激に応答して増強される他のタンパク質、それらの突然変異体、類似体および変異体が含まれる。2つの配列間の同一性パーセントは数学的アルゴリズムを用いて決定することができる。2つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例としては、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268に記載のアルゴリズムを、さらにKarlinおよびAltschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877に記載のように改変したものが挙げられる。そのようなアルゴリズムは、Altschulら, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410に示されているNBLASTやXBLASTプログラム中に組み入れられる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索はNBLASTプログラムを用い、スコア＝100、ワード長さ＝12で行った。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索はXBLASTプログラムを用い、スコア＝50、ワード長さ＝3で行った。比較を行う目的でギャップを入れたアライメントを得るために、Altschulら, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようにGapped BLASTを用いることができる。あるいはまた、分子間の遠い関連性を検出する反復検索を行うためにPSI-Blastを用いることができる(Altshulら, 1997, 前掲)。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI-Blastプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを用いることができる(http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照)。配列の比較のために用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な別の例としては、MyersおよびMiller, 1988, CABIOS 4:11-17に記載のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムはALIGNプログラム(バージョン2.0)中に組み込まれているが、そのプログラムはGCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを用いる際には、PAM120加重残基表(weight residue table)、ギャップ長さペナルティー12、ギャップペナルティー4を用いることができる。
【００６１】
本発明の単離されたCD91ポリペプチド断片には、リガンド結合ドメインを含むCD91断片はどれも含まれる。このようなCD91ポリペプチド断片は哺乳動物における免疫応答をモジュレートする（すなわち、抑制または増強する）ことができる。
【００６２】
本発明で用いるためのCD91ポリペプチド断片は天然源から精製したもの、化学合成によるもの、組換えにより産生されたものでありうる。本発明で用いるためのHSPおよび／または抗原分子は天然源から精製したもの、化学合成によるもの、組換えにより産生されたものでありうる。HSPは患者に対して同種異型のものであってもよいが、好ましい実施形態おいて、HSPは投与されることとなる患者自身のものである。
【００６３】
5.1  本発明の組成物
本発明は、CD91とCD91リガンド（例えばHSP）との相互作用をモジュレートするのにCD91ポリペプチド断片を用いるための組成物を提供する。そのような組成物は免疫応答をモジュレートするための方法において用いることができる。そのような組成物としては、CD91ポリペプチド断片、CD91ポリペプチド断片をコードする核酸、HSP-CD91ポリペプチド断片複合体を特異的に認識するかまたはCD91のHSP結合ドメインを特異的に認識する抗体、CD91ポリペプチド断片を発現する単離された組換え細胞または遺伝子操作細胞、HSP-CD91ポリペプチド断片複合体、組換えCD91ポリペプチド断片および／またはHSP配列を含む単離された細胞および組換え細胞が含まれる。さらに、本発明の種々の方法においては、CD91ポリペプチド断片およびHSPをコードする配列が免疫療法に用いられる。他の実施形態では、本発明のCD91ポリペプチド断片およびCD91-HSP複合体が免疫療法に用いられる。そのような組成物は、例えば、増殖性疾患、感染性疾患、その他のHSP-CD91関連疾患に対する免疫療法に用いることができる。そのような組成物を合成および製造するための方法を本明細書に記載する。
【００６４】
5.1.1  本発明の核酸
本発明のCD91ポリペプチド断片をコードする核酸には以下のものが含まれる：
(a)  p95のDNA配列からなる核酸分子（配列番号1、ヒトCD91-p95 DNA配列）；
(b)  p95タンパク質産物をコードする核酸分子（配列番号2および3）；
(c)  配列番号5の少なくともアミノ酸残基1-851を含み、配列番号5のさらなる連続した配列を含むことができるが、この受容体タンパク質全体を含むことはないCD91断片タンパク質産物をコードする核酸分子；
(d)  異種ポリペプチドに融合された本発明のCD91ポリペプチド断片を含む融合タンパク質をコードする核酸分子；
(e)  1) 配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする第2の核酸分子とストリンジェントな洗浄条件下で全長にわたってハイブリダイズし、かつ2) 組換え的に産生されて培地中に分泌され、熱ショックタンパク質と結合する能力を有するポリペプチドをコードする核酸分子；
(f)  1) 配列番号2、6、8または10のヌクレオチド配列からなる第2の核酸分子とストリンジェントな洗浄条件下で全長にわたってハイブリダイズし、かつ2) 組換え的に産生されて培地中に分泌され、熱ショックタンパク質と結合する能力を有するポリペプチドをコードする核酸分子；および
(g)  上記(a)〜(f)のヌクレオチド配列に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％またはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する、長さが20、30、40、50、60、70、80、90、100塩基対またはそれ以上の核酸分子であって、(a) 熱ショックタンパク質と結合する能力があり、(b) 組換え的に発現されて細胞から放出され得る遺伝子産物をコードするもの。
【００６５】
本明細書中で用いる「全長にわたってハイブリダイズする」核酸分子とは、ハイブリダイゼーション後に形成された二本鎖がイントロンなどのDNAの一本鎖領域の介在配列を含まないように、実質的に同じ長さの特定された核酸分子とハイブリダイズする核酸分子をさす。
【００６６】
本明細書中で用いる、特定された核酸分子に対して「異種」の核酸分子とは、特定された核酸分子の由来となる生物とは異なる生物に由来する核酸分子をさす。
【００６７】
CD91ポリペプチド断片をコードする核酸分子の例としては、限定するものではないが、ヒトCD91-p95 DNA配列 (配列番号1); ヒトCD91-pl10 DNA配列 (配列番号14); ヒトCD91-p282 DNA配列 (配列番号15); ヒトCD91-p373 DNA配列 (配列番号16); ヒトCD91-p494 DNA配列 (配列番号17); および膜貫通ドメインを含まないヒトCD91断片 (配列番号18)が含まれる。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の上記核酸分子は単離される。
【００６９】
本発明の核酸分子には、さらに、(a) 熱ショックタンパク質と結合する能力があり、(b) 組換え的に発現されて細胞から放出され得る上記(a)〜(d)のp95およびCD91ポリペプチド断片ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含まれる。
【００７０】
2つの核酸の2つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較目的のために配列をアライメントする（例えば、第2のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第1のアミノ酸または核酸配列にギャップを導入しうる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列の1つの位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合には、それらの分子はその位置で同一となる。2つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一のオーバーラップ位置の数／オーバーラップ位置の総数×100）。一実施形態において、2つの配列は同じ長さである。
【００７１】
2つの配列間の同一性パーセントは、上記セクション5に記載したような数学的アルゴリズムを使って決定することができる。
【００７２】
2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを導入してまたは導入しないで、上記の技法と同様の技法を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算するには、一般的に、正確に一致したものだけを数える。
【００７３】
本発明の核酸分子には、以下のものがさらに含まれる：(a) 上記(a)〜(e)に記載の本発明のCD91断片核酸分子とストリンジェントな条件下（例えば、6x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中約45℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーションと、その後の0.2xSSC/0.1% SDS中約50〜65℃での1回以上の洗浄）でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または(b) 高度にストリンジェントな条件下（例えば、6xSSC中約45℃でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーションと、その後の0.1xSSC/0.2% SDS中約68℃での1回以上の洗浄）、もしくは当業者には明白なその他のハイブリダイゼーション条件下（例えば、Ausubel F. M.ら編, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Associates, Inc.、ならびにJohn Wiley & sons, Inc., New York, pp. 6.3. 1-6.3.6および2.10.3を参照のこと)でハイブリダイズするヌクレオチド配列。好ましくは、上記(a)および(b)に記載した条件下でハイブリダイズするCD91断片核酸分子は、CD91断片タンパク質産物をコードする核酸分子の相補鎖を含むものである。好ましい実施形態において、上記(a)および(b)の条件下でハイブリダイズする核酸分子は、タンパク質産物をコードするものであり、例えば、CD91断片タンパク質産物と機能的に同等のタンパク質産物をコードする。好ましくは、本発明の核酸はヒトCD91タンパク質断片をコードする。
【００７４】
機能的に同等のCD91断片タンパク質産物には、同一のまたは異なる生物種およびその変異体中に存在するCD91の天然に存在するCD91ポリペプチド断片が含まれる。また、機能的に同等のCD91断片タンパク質産物には、CD91断片タンパク質産物の少なくとも1つの生物学的活性を保持し、かつ／またはCD91断片タンパク質産物に対する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）により認識されてそれと結合するタンパク質産物が含まれる。
【００７５】
本発明の核酸分子の中の一つに、高度にストリンジェントな条件またはストリンジェントな条件下で、CD91ポリペプチド断片をコードする上記の核酸分子とハイブリダイズするデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）がある。一般的に、長さが14〜70ヌクレオチドのプローブの場合、融解温度(Tm)は次式を用いて計算する：Tm (℃) = 81.5 + 16.6 (log [1価カチオン(モル)]) + 0.41 (% G+C) - (500/N) (ここで、Nはプローブの長さである）。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液中で行なわれる場合は、次式を用いて融解温度を計算する：Tm (℃) = 81.5 + 16.6 (log [1価カチオン(モル)]) + 0.41 (% G+C) - (0.61%ホルムアミド) - (500/N) (ここで、Nはプローブの長さである）。一般的には、Tmより約20〜25℃低い（DNA-DNAハイブリッドの場合）またはTmより約10〜15℃低い（RNA-DNAハイブリッドの場合）温度でハイブリダイゼーションを実施する。
【００７６】
高度にストリンジェントな条件とは、例えば、6xSSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中37℃（約14塩基のオリゴの場合）、48℃（約17塩基のオリゴの場合）、55℃（約20塩基のオリゴの場合）、および60℃（約23塩基のオリゴの場合）での洗浄をさす。
【００７７】
本発明の核酸分子にはさらに、上記核酸の相補体が含まれる。このような分子は、例えば、CD91核酸の調節に有用なアンチセンス分子として、および／またはCD91核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして作用しうる。
【００７８】
CD91断片タンパク質産物をコードする本発明の核酸配列またはその相補体は、リボザイムおよび／または三重らせん配列（これらもCD91核酸の調節に有用である）の部分として使用することができる。
【００７９】
さらに、本発明の核酸分子は、例えばCD91関連疾患またはHSP-CD91関連疾患（増殖性細胞疾患、自己免疫疾患、または感染性疾患など）に関与する特定のCD91断片ヌクレオチド配列の存在を検出するための、診断法の成分としても使用することができる。
【００８０】
p95断片核酸分子とは、長さが少なくとも10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050個またはそれ以上連続したヌクレオチドでありうるp95核酸配列をさす。あるいはまた、前記断片は、p95断片タンパク質産物の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80個またはそれ以上連続したアミノ酸残基をコードする配列を含みうる。一実施形態において、p95断片核酸分子は対応するCD91タンパク質産物の生物学的活性を少なくとも1つ示す遺伝子産物をコードする。断片はまた、成熟p95断片タンパク質産物のドメインまたは成熟p95断片タンパク質産物をコードするp95ポリペプチド断片コード領域の部分をさすことがある。
【００８１】
CD91断片核酸配列の変異体または多形に関して、CD91断片の天然の対立遺伝子変異の結果である任意のおよび全てのヌクレオチド変異および得られるアミノ酸多形または変異は、本発明の範囲内に含まれるものとする。対立遺伝子変異体または多形には、限定するものではないが、CD91断片タンパク質産物の機能活性を変更するものが含まれる。
【００８２】
ヒトCD91断片核酸ならびに他の生物種由来のホモログおよびオーソログのさらなる対立遺伝子変異体のクローニングに関しては、本明細書に記載する単離されたCD91断片核酸配列を標識して、これを用いて対象の生物に由来する適切な細胞または組織から得られたmRNAより構築したcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション条件は、cDNAライブラリーが標識配列の起源となる生物の種類と異なる生物に由来する場合には、一般により低いストリンジェンシーとすべきであるが、かかる条件は、例えば標的生物と参照生物との相対的な類縁性に基づいて、ルーチンに決定することができる。
【００８３】
あるいはまた、標識した断片を用いて、対象の生物から誘導されたゲノムライブラリーを、この場合も適切にストリンジェントな条件を用いて、スクリーニングすることができる。適切なストリンジェンシー条件は、上述したように当業者には周知であり、ライブラリーおよび標識配列が誘導される特定の生物に応じて、予測可能に変化するであろう。このような条件に関する指針としては、例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; および Ausubelら, 1989-1999, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照されたい（両文献ともその全体を参照により本明細書に組み入れるものとする）。
【００８４】
さらに、CD91対立遺伝子変異体のCD91断片核酸分子は、本明細書に記載するCD91断片タンパク質産物内のアミノ酸配列に基づいて設計された2つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行なうことにより、例えばヒト核酸から、単離することができる。この反応の鋳型は、例えば、CD91対立遺伝子の野生型または突然変異型CD91断片核酸を発現することが知られているかまたは発現すると予想されるヒトまたは非ヒト細胞株または組織から作製された、mRNAの逆転写により得られるcDNAでありうる。一実施形態において、対立遺伝子変異体はCD91介在疾患またはHSP-CD91関連疾患を有する個体から単離される。
【００８５】
PCR産物は、サブクローニングおよび配列決定を行って、増幅された配列がCD91断片核酸配列の配列に相当することを確かめることができる。その後、PCR断片を使って、種々の方法により全長cDNAクローンを単離することができる。例えば、増幅された断片を標識し、これを用いてバクテリオファージcDNAをスクリーニングする。あるいはまた、標識した断片を用いて、ゲノムライブラリーのスクリーニングによりゲノムクローンを単離することも可能である。
【００８６】
CD91断片核酸の対立遺伝子変異体（例えば、突然変異体）のcDNAは、例えば、当業者には周知の技法であるPCRを用いることにより、単離することができる。この場合には、第一鎖のcDNAを合成するために、突然変異CD91断片配列を担うと推定される個体において発現することが知られているかまたは発現すると予想される組織から単離されたmRNAにオリゴdTオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いて新しい鎖を伸長させる。次いで、正常な遺伝子の5’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、第二鎖のcDNAを合成する。その後、これら2つのプライマーを用いて、産物をPCRで増幅し、適当なベクターにクローニングし、そして当業者に周知の方法によるDNA配列解析に供する。突然変異CD91断片配列と正常なCD91断片配列のDNA配列同士を比較することにより、突然変異CD91断片タンパク質産物の機能の低下または変化に関与する突然変異を確かめることができる。
【００８７】
あるいはまた、突然変異CD91断片配列を担うと予想されるかまたは担うことが知られている個体から得られるDNAを用いてゲノムライブラリーを構築したり、突然変異CD91断片配列を発現することが知られているかまたは発現すると予想される組織からのRNAを用いてcDNAライブラリーを構築することができる。その後、損なわれていないCD91断片核酸またはその適切な断片を標識し、プローブとして用いて、そのようなライブラリー中の対応する突然変異CD91断片配列を同定することができる。次に、突然変異CD91断片核酸配列を含むクローンを精製して、当業者に周知の方法による配列解析に供する。
【００８８】
さらに、発現ライブラリーは、例えば、突然変異CD91対立遺伝子を担うと予想されるかまたは担うことが知られている個体においてそのような突然変異対立遺伝子を発現することが知られたまたは予想された組織より単離されたRNAから合成された、cDNAを用いて構築することができる。この方法では、推定上の突然変異組織により作られた遺伝子産物を発現させて、正常なCD91遺伝子産物に対する抗体を用いる標準的な抗体スクリーニング法によりスクリーニングすることができる（スクリーニング法については、例えば、HarlowおよびLane編, 1988, "Antibodies : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harborを参照されたい）。
【００８９】
CD91断片配列中の突然変異が（例えば、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異の結果として）機能の改変された発現タンパク質産物をもたらす場合には、抗CD91断片タンパク質産物抗体のポリクローナルなセットは突然変異CD91断片タンパク質産物と交差反応しそうである。そのような標識抗体との反応により検出されたライブラリークローンは、当業者に周知の方法により精製して配列解析に供することができる。
【００９０】
CD91断片の突然変異または多形はさらに、PCR増幅法を用いて検出することが可能である。全CD91断片配列のオーバーラップ領域を増幅するためのプライマーはルーチンに設計することができる。
【００９１】
本発明はまた、先の段落に記載したヌクレオチド配列の相補体である核酸分子、好ましくはDNA分子を包含する。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明の核酸分子は異種（例えば、ベクター、発現ベクター、または融合タンパク質）配列を含むまたはコードする核酸配列を含有する核酸分子の一部として存在する。
【００９３】
5.1.2  本発明のアミノ酸およびポリペプチド
本発明は、HSPに結合することができるCD91ポリペプチド断片ならびにその類似体、誘導体および擬似体を包含する。CD91ポリペプチド断片の例としては、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ヒトCD91-p95アミノ酸配列 (配列番号2); 可溶性の組換えエピトープタグ付きヒトCD91-p95アミノ酸配列 (配列番号3); ドメインIに相当する残基1-851およびアミノ酸残基851に続く5.2kDタグを有するヒトCD91-p95アミノ酸配列 (配列番号13); ドメインIに相当するアミノ酸残基1-851およびドメインIIに相当する残基852-2517およびアミノ酸残基2517に続く5.2kDタグを有するヒトCD91-p282タンパク質アミノ酸配列 (配列番号6); ドメインIに相当する残基1-851、ドメインIIに相当する残基852-2517およびドメインIIIに相当する残基2518-3330、およびアミノ酸残基3330に続く5.2kDタグを有するヒトCD91-p373タンパク質アミノ酸配列 (配列番号8); ならびにドメインIに相当する残基1-851、ドメインIIに相当する残基852-2517、ドメインIIIに相当する残基2518-3330およびドメインIVに相当する残基3330-4420、およびアミノ酸残基4420に続く5.2kDタグを有するヒトCD91-p494タンパク質アミノ酸配列 (配列番号10)。CD91ポリペプチド断片の他の例には、組換えCD91-"LRP25"が含まれるが、これに限らない。一実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はLRP25ではない。本発明のCD91ポリペプチド断片の例には、限定するものではないが、マウスCD91アミノ酸配列(GenBank番号109553)の断片、ヒトCD91アミノ酸配列 (GenBank番号88083)の断片、またはニワトリCD91アミノ酸配列 (GenBank番号1079416)の断片が含まれる。このような断片は図4に示すCD91ドメインに対応するドメインまたはその断片を1つ以上含む。一実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片は全長CD91ではない。一実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はCD91膜貫通ドメイン（例えば、図4に示す膜貫通ドメインを含むがこれに限らない）を含まない。
【００９４】
CD91ポリペプチド断片は様々な用途で使用するために調製される。例えば、そのような遺伝子産物は、抗体の作製や診断アッセイに使用され、また、HSP-CD91関連疾患（例えば癌）、感染性疾患もしくは自己免疫疾患の調節に関与する細胞内または細胞外遺伝子産物のマッピングおよび同定のために使用される。
【００９５】
本発明の「CD91ポリペプチド断片」には、上記セクション5.1に記載したCD91断片核酸配列によりコードされるポリペプチドが含まれる。さらに、本発明のCD91ポリペプチド断片は、機能的に同等な（定義に関してはセクション5.1を参照）遺伝子産物に相当するタンパク質を含みうる。そのような機能的に同等なCD91ポリペプチド断片は、上記セクション5.1に記載したCD91ポリペプチド断片をコードする遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列の内部および／または近隣のアミノ酸残基の欠失（内部欠失を含む）、付加（融合タンパク質をもたらす付加を含む）、または置換を含んでいてもよいが、かかる変化はCD91遺伝子の断片によりコードされる機能的に同等な産物をもたらすという点で「サイレント」な変化をもたらすものである。アミノ酸置換は含まれる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行なうことができる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれ；負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【００９６】
あるいはまた、機能の変化が望まれる場合には、遺伝子操作により欠失または非保存的変化を導入して、改変されたCD91ポリペプチド断片を得ることができる。そのような改変は、例えば、CD91ポリペプチド断片の1以上の生物学的機能を改変しうる。さらに、そのような改変は、所定の宿主細胞における発現、スケールアップなどに一層適合するCD91ポリペプチド断片をもたらすように選択することも可能である。例えば、ジスルフィド架橋を除くためにシステイン残基を欠失させたり、他のアミノ酸残基で置換したりすることができる。
【００９７】
また、CD91ポリペプチド断片の1以上のドメインに相当するペプチドおよび／またはタンパク質、ならびにCD91ポリペプチド断片またはCD91ポリペプチド断片の部分（例えば、トランケートされたCD91ポリペプチド断片またはペプチドまたはドメイン）が無関係のタンパク質に融合されている融合タンパク質も本発明の範囲内に含まれる。関係のあるタンパク質が、例えば、異なる生物に由来するCD91ポリペプチドからのドメインまたはCD91の連続してないドメインに融合されていてもよい。そのようなタンパク質およびペプチドは、上記セクション5.1に記載したCD91断片ヌクレオチド配列および／またはこのセクションに記載したCD91ポリペプチド断片アミノ酸配列に基づいて設計することができる。融合タンパク質には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：CD91ポリペプチド断片を安定化してin vivoでの半減期を長くするIgFc融合体；融合タンパク質を細胞膜に固定させる任意のアミノ酸配列への融合体；CD91ポリペプチド断片ドメインの、酵素、蛍光タンパク質、発光タンパク質またはマーカー機能を与えるflagエピトープタンパク質もしくはペプチドへの融合体。
【００９８】
本発明のp95ポリペプチドは配列番号5の残基1-851を含む。P95ポリペプチド配列はまた、cDNA配列の少なくとも1つのエキソンによりコードされるドメインまたはその断片を含みうる。かかるドメインとしては、限定するものではないが、例えば、HSP結合ドメイン、βプロペラー#1ドメイン、βプロペラー#2ドメイン、CR1ドメイン、CR2ドメイン、EGF様ドメイン#1、EGF様ドメイン#2、EGF様ドメイン#3、およびEGF様ドメイン#4（図3のp80のマウスアミノ酸配列中に示される）が挙げられる。
【００９９】
本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はCD91タンパク質のドメインIおよびドメインIIの少なくとも一部に相当するアミノ酸残基を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はヒトCD91タンパク質のアミノ酸残基1-852を少なくとも含む。他の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片は、ヒトCD91タンパク質の1から853、890、894、931、935、971、975、1011、1014、1051、1061、1097、1103、1140、1143、1182、1184、1221、1226、1261、1268、1531、1539、1578、1582、1846、1849、1886、1932、2151、2154、2194、2198、2473、2481、または2517までのアミノ酸を含む。
【０１００】
本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はCD91タンパク質のドメインI、ドメインII、およびドメインIIIの少なくとも一部に相当するアミノ酸残基を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はヒトCD91タンパク質のアミノ酸残基1-2518を少なくとも含む。他の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片は、ヒトCD91タンパク質の1から2523、2561、2565、2600、2604、2639、2651、2688、2695、2730、2733、2769、2773、2812、2817、2853、2857、2897、2903、2939、2943、2980、2985、3021、3028、3284、3293、または3330までのアミノ酸を含む。
【０１０１】
本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はCD91タンパク質のドメインI、ドメインII、ドメインIII、およびドメインIVの少なくとも一部に相当するアミノ酸残基を含む。本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片はヒトCD91タンパク質のアミノ酸残基1-3331を少なくとも含む。他の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片は、ヒトCD91タンパク質の1から3333、3369、3373、3408、3412、3448、3452、3489、3493、3531、3535、3570、3574、3609、3612、3647、3653、3690、3694、3731、3740、3776、3784、3822、3827、3843、3860、3867、4075、1425、4142、4150、4182、4199、4231、4235、4267、4271、4278、4303、4307、4339、4343、4374、4376、4408、または4420までのアミノ酸を含む。
【０１０２】
好ましい実施形態において、CD91ポリペプチド断片は配列番号5のアミノ酸残基1-986 (p110)またはアミノ酸残基1-2517 (p282)を含む。他の好ましい実施形態では、CD91ポリペプチド断片は受容体CD91（α(2)マクログロブリン受容体）のドメインIおよびIIを構成するアミノ酸残基を含む。特定の好ましい実施形態では、前記受容体が哺乳動物由来である。さらに他の好ましい実施形態では、CD91ポリペプチド断片は非ヒト由来の受容体であるCD91のドメインIおよび連続した補体リピートを構成するアミノ酸残基を含む。そのような補体リピートまたは他の領域は、ドメインIを越えてヒトCD91のCR3（アミノ酸残基854-890）、ヒトCD91のCR4（アミノ酸残基895-931）、ヒトCD91のCR5（アミノ酸残基936-971）、またはヒトCD91のCR6（アミノ酸残基976-1011）に相当する補体リピートまで延ばすことができる。他の実施形態において、CD91ポリペプチド断片はCD91のドメインIに相当するアミノ酸配列とこれに続くCD91のドメインIIの5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、または150個連続したアミノ酸を含む。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態において、本発明のCD91ポリペプチド断片は、ヒトCD91タンパク質のアミノ酸残基1-851および以下のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1つの特定された領域を含む：854-890、895-931、936-971、976-1011、1015-1051、1062-1097、1104-1140、1145-1182、1185-1221、1227-1261、1269-1531、1540-1578、1583-1846、1850-1886、1934-2151、2159-2194、2199-2473、2482-2517、2524-2561、2566-2600、2605-2639、2652-2688、2696-2730、2734-2769、2774-2812、2818-2853、2858-2897、2904-2939、2944-2980、2986-3021、3029-3284、3294-3330、3334-3369、3374-3408、3413-3448、3453-3489、3494-3531、3536-3570、3575-3609、3613-3647、3654-3690、3695-3731、3741-3776、3785-3822、3828-3860、3868-4142、4151-4182、4200-4231、4236-4267、4272-4303、4308-4339、4344-4374、4377-4408、4421-4444、および4445-4544。
【０１０４】
他の実施形態において、CD91ポリペプチド断片は、アミノ酸残基1から少なくとも以下のアミノ酸残基までを含むCD91ポリペプチド配列をさす：アミノ酸残基851、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995、1000、1005、1010、1015、1020、1025、1030、1035、1040、1045、1050、1055、1060、1065、1070、1075、1080、1085、1090、1095、1100、1105、1110、1115、1120、1125、1130、1135、1140、1145、1150、1155、1160、1165、1170、1175、1180、1185、1190、1195、1200、1205、1210、1215、1220、1225、1230、1235、1240、1245、1250、1255、1260、1265、1270、1275、1280、1285、1290、1295、1300、1305、1310、1315、1320、1325、1330、1335、1340、1345、1350、1355、1360、1365、1370、1375、1380、1385、1390、1395、1400、1405、1410、1415、1420、1425、1430、1435、1440、1445、1450、1455、1460、1465、1470、1475、1480、1485、1490、1495、1500、1505、1510、1515、1520、1525、1530、1535、1540、1545、1550、1555、1560、1565、1570、1575、1580、1585、1590、1595、1600、1605、1610、1615、1620、1625、1630、1635、1640、1645、1650、1655、1660、1665、1670、1675、1680、1685、1690、1695、1700、1705、1710、1715、1720、1725、1730、1735、1740、1745、1750、1755、1760、1765、1770、1775、1780、1785、1790、1795、1800、1805、1810、1815、1820、1825、1830、1835、1840、1845、1850、1855、1860、1865、1870、1875、1880、1885、1890、1895、1900、1905、1910、1915、1920、1925、1930、1935、1940、1945、1950、1955、1960、1965、1970、1975、1980、1985、1990、1995、2000、2005、2010、2015、2020、2025、2030、2035、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2105、2110、2115、2120、2125、2130、2135、2140、2145、2150、2155、2160、2165、2170、2175、2180、2185、2190、2195、2200、2205、2210、2215、2220、2225、2230、2235、2240、2245、2250、2255、2260、2265、2270、2275、2280、2285、2290、2295、2300、2305、2310、2315、2320、2325、2330、2335、2340、2345、2350、2355、2360、2365、2370、2375、2380、2385、2390、2395、2400、2405、2410、2415、2420、2425、2430、2435、2440、2445、2450、2455、2460、2465、2470、2475、2480、2485、2490、2495、2500、2505、2510、2515、2520、2525、2530、2535、2540、2545、2550、2555、2560、2565、2570、2575、2580、2585、2590、2595、2600、2605、2610、2615、2620、2625、2630、2635、2640、2645、2650、2655、2660、2665、2670、2675、2680、2685、2690、2695、2700、2705、2710、2715、2720、2725、2730、2735、2740、2745、2750、2755、2760、2765、2770、2775、2780、2785、2790、2795、2800、2805、2810、2815、2820、2825、2830、2835、2840、2845、2850、2855、2860、2865、2870、2875、2880、2885、2890、2895、2900、2905、2910、2915、2920、2925、2930、2935、2940、2945、2950、2955、2960、2965、2970、2975、2980、2985、2990、2995、3000、3005、3010、3015、3020、3025、3030、3035、3040、3045、3050、3055、3060、3065、3070、3075、3080、3085、3090、3095、3100、3105、3110、3115、3120、3125、3130、3135、3140、3145、3150、3155、3160、3165、3170、3175、3180、3185、3190、3195、3200、3205、3210、3215、3220、3225、3230、3235、3240、3245、3250、3255、3260、3265、3270、3275、3280、3285、3290、3295、3300、3305、3310、3315、3320、3325、3330、3335、3340、3345、3350、3355、3360、3365、3370、3375、3380、3385、3390、3395、3400、3405、3410、3415、3420、3425、3430、3435、3440、3445、3450、3455、3460、3465、3470、3475、3480、3485、3490、3495、3500、3505、3510、3515、3520、3525、3530、3535、3540、3545、3550、3555、3560、3565、3570、3575、3580、3585、3590、3595、3600、3605、3610、3615、3620、3625、3630、3635、3640、3645���3650、3655、3660、3665、3670、3675、3680、3685、3690、3695、3700、3705、3710、3715、3720、3725、3730、3735、3740、3745、3750、3755、3760、3765、3770、3775、3780、3785、3790、3795、3800、3805、3810、3815、3820、3825、3830、3835、3840、3845、3850、3855、3860、3865、3870、3875、3880、3885、3890、3895、3900、3905、3910、3915、3920、3925、3930、3935、3940、3945、3950、3955、3960、3965、3970、3975、3980、3985、3990、3995、4000、4005、4010、4015、4020、4025、4030、4035、4040、4045、4050、4055、4060、4065、4070、4075、4080、4085、4090、4095、4100、4105、4110、4115、4120、4125、4130、4135、4140、4145、4150、4155、4160、4165、4170、4175、4180、4185、4190、4195、4200、4205、4210、4215、4220、4225、4230、4235、4240、4245、4250、4255、4260、4265、4270、4275、4280、4285、4290、4295、4300、4305、4310、4315、4320、4325、4330、4335、4340、4345、4350、4355、4360、4365、4370、4375、4380、4385、4390、4395、4400、4405、4410、4415、4420、4425、4430、4435、4440、4445、4450、4455、4460、4465、4470、4475、4480、4485、4490、4495、4500、4505、4510、4515、4520、4525、4530、4535、または4540。
【０１０５】
本発明のCD91ポリペプチド断片はさらに、グリコシル化、アセチル化、ミリスチル化、リン酸化を含むがこれらに限らない翻訳後修飾を含むことができる。天然のCD91ポリペプチド断片がそのような修飾を可能にする認識モチーフをもたない場合、酵素認識シグナルのようなモチーフをコードするヌクレオチド配列を遺伝子に導入して、修飾されたCD91断片遺伝子産物を生成するようにすることは当業者の常套手段である。
【０１０６】
CD91ポリペプチド断片およびその融合タンパク質は、当技術分野で周知の技法を用いる組換えDNA技術により製造することができる。それゆえ、CD91遺伝子配列を含む核酸を発現させることにより本発明のCD91断片ポリペプチド、ペプチド、融合ペプチドおよび融合ポリペプチドを製造する方法を本明細書に記載する。当業者に周知の方法を用いて、CD91ポリペプチド断片産物のコード配列および適切な転写・翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。こうした方法として、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えがある。例えば、Sambrookら, 1989, 前掲およびAusubelら, 1989, 前掲に記載される技法を参照されたい。あるいはまた、CD91断片遺伝子産物配列をコードしうるRNAを、例えば合成装置を使って、化学的に合成することもできる。例えば、"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait編, IRL Press, Oxfordに記載される技法を参照されたい。
【０１０７】
5.1.2.1  CD91ポリペプチド断片の変異体、誘導体および類似体
CD91ポリペプチド断片の誘導体は、機能的に同等な分子を与える置換、付加または欠失により、CD91ポリペプチド断片のコード配列を改変することにより作製することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のため、CD91ポリペプチド断片をコードする核酸と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を本発明の実施に使用することができる。これらには、限定するものではないが、配列内の機能的に同等なアミノ酸残基をコードする別のコドンで置換することにより改変された（したがって、サイレント変化をもたらす）CD91ポリペプチド断片をコードする核酸の全部またはCD91ポリペプチド断片結合部分を含むヌクレオチド配列が含まれる。同様に、本発明のCD91ポリペプチド断片の誘導体には、限定するものではないが、配列内のアミノ酸残基が機能的に同等なアミノ酸残基で置換されてサイレント変化をもたらすように改変された配列を含む、一次アミノ酸配列として、CD91ポリペプチド断片のアミノ酸配列の全部またはCD91ポリペプチド断片結合部分を含むものが含まれる。本発明の特定の実施形態において、CD91ポリペプチド断片の誘導体は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、または400個のアミノ酸置換を含む。
【０１０８】
例えば、ペプチドのC末端にある1個以上のアミノ酸残基またはN末端保護基を置換することができる。アミノ酸残基は機能的に同等なものとして作用してサイレント変化をもたらす同様の極性をもつ別のアミノ酸で置換しうる。配列内のアミノ酸に代わる置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してよい。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。さらに、D-アミノ酸を使用してもよい。本明細書中で用いる「D-アミノ酸」とは、D-立体配置を有するアミノ酸をさす。D-アミノ酸は天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、特殊な性質を伝えるためにD-アミノ酸、D-アミノ酸とL-アミノ酸の組合せ、および各種の「デザイナー」アミノ酸（例えば、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸など）を含みうる。合成アミノ酸には、リシンに対するオルニチン、フェニルアラニンに対するフルオロフェニルアラニン、ロイシンまたはイソロイシンに対するノルロイシンが含まれる。置換はまた、アミノ酸のリン類似体（例えば、α-アミノホスホン酸およびα-アミノホスフィン酸）、または非ペプチド結合を有するアミノ酸、核酸、核酸類似体（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸(PNA)）、ホルモン、抗原、合成または天然の薬物、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、スクロース、グルコース、ラクトース、およびガラクトースを用いて行なうこともできる。
【０１０９】
本発明のCD91ポリペプチド断片の誘導体および類似体は、当分野で公知の多様な方法で製造することができる。それらの製造をもたらす操作は核酸またはタンパク質レベルで行なうことができる。例えば、クローン化したCD91断片核酸配列を当分野で公知の多数のストラテジーのいずれかにより改変しうる（Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York）。制限エンドヌクレアーゼにより配列を適切な部位で切断し、続いて所望によりさらなる酵素的修飾を行い、単離し、in vitroで連結させることができる。CD91ポリペプチド断片の誘導体または類似体をコードする核酸の製造においては、改変された遺伝子が依然としてCD91断片と同じ翻訳読み枠内にあって、目的のCD91ポリペプチド断片活性がコードされる領域において翻訳停止シグナルによって絶対に中断されないように注意すべきである。
【０１１０】
また、CD91ポリペプチド断片配列の操作は、タンパク質レベルで行なうこともできる。翻訳中または翻訳後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質加水分解切断、抗体分子または細胞性リガンドへの結合などにより、異なって修飾されたCD91ポリペプチド断片またの誘導体もしくは類似体も本発明の範囲内に含まれる。いずれの化学的修飾も公知の技法により行なうことができ、かかる技法には、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的な化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝的合成などが含まれる。
【０１１１】
5.1.3  組換えによる発現
本発明の種々の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドをコードする配列が、組換え細胞内での増殖と発現のために発現ベクター中に挿入される。したがって、一実施形態においては、CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドのコード領域は、組換え細胞内での発現のために非天然のプロモーターと連結される。
【０１１２】
可溶性の組換えヒトCD91のアミノ酸配列は配列番号3に相当する。本発明およびHSPが免疫応答においてある役割を担っているという知識に基づけば、CD91ポリペプチド断片とHSPとの相互作用のアゴニストおよびアンタゴニストを含む組成物は免疫応答をモジュレートするために用いることができる。こうして、組換えCD91ポリペプチド断片、CD91ポリペプチド断片とHSPの複合体、もしくはHSP-抗原性ペプチド複合体、ならびにCD91ポリペプチド断片もしくはCD91ポリペプチド断片と抗原性ペプチドからなる複合体を発現している組換え細胞は、本明細書に記載の免疫療法および診断方法に用いることができる。
【０１１３】
本発明の種々の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片、および/または熱ショックタンパク質もしくはその断片をコードする配列は、組換え細胞内での増殖と発現のために発現ベクター中に挿入される。本明細書中で用いる発現構築物とは、例えばCD91ポリペプチド断片またはHSPなどの特定の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が、適切な宿主細胞中でのコードされた遺伝子産物の発現を可能とする1つ以上の調節領域と機能的に結合されたものを意味する。「機能的に結合された」とは、調節領域と発現される遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列とが、転写および最終的には翻訳をも可能にするように連結され位置づけられていることを意味する。本明細書に記載するいずれの実施形態においても、CD91ポリペプチド断片を組換え的に発現する細胞は内在性CD91の発現を抑制または阻害するように遺伝子操作されてもよい。
【０１１４】
あるいはまた、CD91を欠損しているかまたは突然変異型のもしくは非機能的なCD91を有する細胞株を利用することができる。CD91ポリペプチド断片をコードする核酸を用いてCD91の活性または発現を改変することも可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1種の修飾塩基成分を含んでいてもよく、かかる修飾塩基は、限定するものではないが、以下の群から選択される：5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、ならびに2,6-ジアミノプリン。
【０１１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1つの修飾糖鎖成分を含んでいてもよく、かかる修飾糖鎖は、限定するものではないが、以下の群から選択される：アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０１１６】
さらに別の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾ホスフェート骨格を含んでいてもよく、かかる修飾ホスフェートは、以下の群から選択される：ホスホロチオエート(S-ODN)、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびそのオルムアセタールまたは類似体。
【０１１７】
さらに他の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α-アノマーオリゴヌクレオチドである。α-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的RNAと共に特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、このハイブリッドでは、通常のβ-ユニットとは対照的に、鎖が互いに平行に延びている（Gautierら, 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6625-6641）。オリゴヌクレオチドは、2'-0-メチルリボヌクレオチド（Inoueら, 1987, Nucl. Acids Res. 15, 6131-6148）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoueら, 1987, FEBS Lett. 215, 327-330）である。
【０１１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知である標準的な方法によって、例えば自動DNA合成装置（BiosearchやApplied Biosystemsなどから市販されているもの）を用いて、合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Steinらの方法（1988, Nucl.Acids Res. 16, 3209）によって合成することができる。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された細孔ガラスポリマー支持体（controlled pore glass polymer support）（Sarinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451）などを用いて調製することができる。
【０１１９】
標的遺伝子コード領域の配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを用いることができるが、転写される非翻訳領域に相補的なものが最も好ましい。
【０１２０】
DNAは、配列データベースからの既知の配列から当業界で公知の標準的な方法を用いてDNA増幅を行うことによって得ることができ、または組織、細胞培養物、もしくはクローン化されたDNA(例えば、DNA「ライブラリー」)から直接的に分子クローニングを行うことによって得ることができる。HSP遺伝子のコード領域を得るためにはその核酸の起源としていかなる真核細胞も用いることができる。HSPをコードする核酸配列は、脊椎動物、哺乳動物、ならびにヒトを含む霊長類起源から単離することができる。ゲノムDNA由来のクローンはコード領域のほかに調節領域およびイントロンDNA領域を含んでいる可能性がある。cDNA由来のクローンはエキソン配列のみを含んでいることとなる。起源がどうであれ、HSP遺伝子は増殖のためには適切なベクター中にクローン化されなければならない。
【０１２１】
大腸菌(E. coli)に基づいたベクターは最も一般的であり、外来性タンパク質の高レベル発現に多目的に使用できる系である(Makrides, 1996, Microbiol Rev., 60:512-538)。大腸菌中での発現に用いることのできる調節領域の非限定的な例としては、lac、trp、lpp、phoA、recA、tac、λPL、ならびにファージT3およびT7プロモーターが含まれる(Makrides, 1996, Microbiol Rev., 60:512-538)。原核生物由来の発現ベクターの非限定的な例としては、λgt11などのλgtベクター系列(Huynhら, 1984, "DNA Cloning Techniques", Vol.I: A Practical Approach (D. Glover編), pp.49-78, IRL Press, Oxford)およびpETベクター系列(Studierら, 1990, Methods Enzymol. 185:60-89)が挙げられる。しかし、原核生物の宿主-ベクター系の欠点は、哺乳動物細胞で行われるような翻訳後プロセッシングの多くを行うことができないことである。したがって、真核生物の宿主-ベクター系が好ましく、哺乳動物の宿主-ベクター系がより好ましく、ヒト宿主-ベクター系が最も好ましい。
【０１２２】
CD91断片配列の転写に必要な調節領域は、例えば、その発現ベクターで提供することができる。翻訳開始コドン(ATG)も、開始コドンを欠いたCD91ポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列を発現させるために提供することができる。適合しうる宿主-構築物系においては、転写に必要な細胞性タンパク質、例えばRNAポリメラーゼおよび転写因子などは、宿主生物体中でCD91断片配列の転写を行なうために、発現構築物上の調節領域に結合するだろう。遺伝子の発現に必要とされる調節領域の詳しい性質は宿主細胞の種類ごとに異なる。一般的には、プロモーターが必要とされ、プロモーターはRNAポリメラーゼと結合して、それと機能的に連結された核酸配列の転写を開始させることができる。そのような調節領域としては、転写および翻訳の開始と関係した5'非コード配列、例えばTATAボックス、キャップ部位、CAATボックスなどが含まれる。コード配列の3'側の非コード配列には転写終結調節配列、例えばターミネーターおよびポリアデニル化部位が含まれる。
【０１２３】
CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドの発現には、構成的および誘導的の双方の調節領域を用いることができる。組換え細胞の増殖に最適な条件と遺伝子産物の高レベルでの発現のための条件が異なる場合には、誘導的プロモーターを用いることが望ましい。有用な調節領域の例を以下のセクションに示す。
【０１２４】
哺乳動物細胞中でのCD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンド遺伝子産物の発現には、種々の調節領域を用いることができ、そのようなものとしては例えば、SV40初期および後期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルスのロング・ターミナル・リピート(RSV-LTR)プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞で有用と考えられる誘導的プロモーターとしては、限定するものではないが、メタロチオネインII遺伝子、マウス乳癌ウイルスのグルココルチコイド応答性ロング・ターミナル・リピート(MMTV-LTR)、β-インターフェロン遺伝子、およびHSP70遺伝子と結合しているものが含まれる(Williamsら, 1989, Cancer Res. 49:2735-42; Taylorら, 1990, Mol. Cell Biol. 10:165-75)。組換え宿主細胞中でのCD91断片の発現を駆動するためには、熱ショックプロモーターもしくはストレスプロモーターを用いることが有利でありうる。
【０１２５】
下記の動物制御領域、それらは組織特異性を示しトランスジェニック動物で用いられてきたものであるが、そのような領域も特定の組織型の腫瘍細胞中で用いることができる：膵臓の腺房細胞で活動性のエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら, 1984, Cell 38:639-646; Ornitzら, 1986. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)；膵臓のβ細胞で活動性のインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)；リンパ細胞で活動性の免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら, 1984, Cell 38:647-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)；精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞で活動性のマウス乳癌ウイルス制御領域(Lederら, 1986, Cell 45:485-495)；肝臓で活動性のアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276)；肝臓で活動性のα-フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら, 1985. Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Sciencc 235:53-58)；肝臓で活動性のα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171)；骨髄細胞で活動性のβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogramら, 1985, Nature 315:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94)；脳の希突起神経膠細胞で活動性のミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら, 1987, Cell 48:703-712)；骨格筋で活動性のミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283-286)；および視床下部で活動性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら, 1986, Science 234:1372-1378)。
【０１２６】
宿主細胞内でのCD91断片の発現効率は、SV40ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、β-アクチン内に見出されるものなどの適切な転写エンハンサーエレメントを発現ベクター中に含ませることによって増強することができる(Bittnerら, 1987, Methods in Eazymol. 153:516-544; Gorman, 1990, Curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47)。
【０１２７】
発現ベクターはまた、2以上の宿主細胞型でのベクターの維持と複製を可能にするか、もしくは宿主の染色体へのベクターの組み込みを可能にする配列をも含むことができる。そのような配列としては、限定するものではないが、複製起点、自律複製配列(ARS)、セントロメアDNA、およびテロメアDNAが含まれる。また、少なくとも2つの宿主細胞型中で複製し維持されうるシャトルベクターを用いることも有利である。
【０１２８】
さらに、発現ベクターは、CD91ポリペプチド断片をコードするDNAを含んでいる宿主細胞を最初に単離もしくは同定するための選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことができる。CD91ポリペプチド断片の長期にわたる高収率の産生のためには、哺乳動物細胞における安定した発現が好ましい。哺乳動物細胞では多数の選択系を用いることができ、そのようなものとしては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら, 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(SzybalskiとSzybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら, 1980, Cell 22:817)の遺伝子をそれぞれtk-、hgprt-、もしくはaprt-細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質耐性も次のものの選択に用いることができる：ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)、この酵素はメトトレキセートに対する耐性を付与する(Wiglerら, 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hareら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；gpt、これはミコフェノール酸への耐性を付与する(MulliganとBerg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)、これはアミノグリコシドG-418に対する耐性を付与する(Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hyg)、これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する(Santerreら, 1984, Gene 30:147)。他の選択マーカー、例えば、限定するものではないが、ヒスチジノールおよびZeocinTMも用いることができる。
【０１２９】
CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドをコードするDNA配列をベクターのクローニング部位に挿入するためには、調節機能を有するDNA配列（例えばプロモーター）を、CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドをそれぞれコードするDNA配列に結合させる必要がある。これを行うためには、当業界でよく知られた技法を用いて、適切な制限酵素切断部位を提供するリンカーもしくはアダプターを、CD91ポリペプチド断片をコードするcDNAもしくは合成DNAの末端に連結させる(Wuら, 1987, Methods in Enzymol. 152:343-349)。制限酵素を用いた切断を行った後、連結前に、一本鎖のDNA末端を消化するかフィルインすることによって平滑末端が作られるように改変する。あるいはまた、所望の制限酵素切断部位は、所望の制限酵素切断部位を含んでいるプライマーを用いたPCRによってそのDNAを増幅させて、DNAの断片中に導入することができる。
【０１３０】
ある実施形態においては、調節領域と機能的に連結されたCD91ポリペプチド断片配列を含む発現構築物を、それ以上クローニングすることなく、CD91ポリペプチド断片の発現および産生に適した宿主細胞中に直接的に導入することができる(例えば、米国特許第5,580,859号を参照)。発現構築物にはまた、CD91断片配列の宿主細胞ゲノム中への組み込み（例えば相同組換えによる）を容易にするDNA配列を含ませることができる。この場合には、宿主細胞中でのCD91ポリペプチド断片の増殖と発現のために、宿主細胞に適した複製起点を含む発現ベクターを用いる必要がない。
【０１３１】
CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはその他のCD91リガンドをコードするクローン化されたヌクレオチド配列を含む発現構築物を、当業界では公知の種々の技法によって宿主細胞内に導入することができ、そのような技法としては、限定するものではないが、原核細胞に対しては細菌の形質転換(Hanahan, 1985, "DNA cloning, A practical Approach", 1:109-136)、および真核細胞に対してはリン酸カルシウム介在トランスフェクション(Wiglerら, 1977, Cell 11:223-232)、リポソーム介在トランスフェクション(Schaefer-Ridderら, 1982, Science 215:166-168)、エレクトロポレーション(Wolffら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344)、およびマイクロインジェクション(Cappechi, 1980, Cell 22:479-488)が含まれる。
【０１３２】
適切にプロセッシングされたCD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドの長期にわたる高収率の産生には、哺乳動物細胞中での安定した発現が好ましい。CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンド、またはCD91ポリペプチド断片-ペプチド複合体を安定に発現する細胞系は、選択マーカーを含有するベクターを用いて操作することができる。限定としてではなく例示としては、発現構築物の導入後、操作された細胞を1〜2日間、栄養分に富む培地中で増殖させ、次いで選択培地に交換する。発現構築物中の選択マーカーは、その選択に対する耐性を付与し、最適な形で細胞が安定にその発現構築物を染色体中に組み込み、培養下で増殖して細胞株へと増えることを可能にする。そのような細胞は長期間の培養が可能である一方で、目的の遺伝子産物を連続的に発現し続ける。
【０１３３】
組換え細胞は、標準的な温度、インキュベーション時間、光学密度、および培地組成の条件下で培養することができる。あるいはまた、組換え抗原性細胞は、癌細胞もしくは感染細胞の栄養要求性および生理的要求性に匹敵する条件下で培養することができる。しかし、組換え細胞の増殖条件はCD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンド、または抗原ペプチドの発現のための条件とは異なる可能性がある。
【０１３４】
5.1.4  ペプチド合成
HSP、CD91ポリペプチド断片、もしくはCD91リガンドの配列を含むペプチドおよびポリペプチドを調製するための、組換え技法とは異なる方法にはペプチド合成がある。例えば、受容体結合ドメインを含むHSPもしくはCD91ポリペプチド断片の一部分に対応するペプチド（これは本明細書で述べる治療方法においてアンタゴニストとして用いることができる）は、ペプチド合成機を用いて合成することができる。本明細書で述べた治療方法に有用なCD91ポリペプチド断片配列に対応する合成ペプチドも合成によって調製することができる。従来のペプチド合成法もしくはその他の当業界ではよく知られた合成プロトコルを用いることができる。
【０１３５】
例えば、CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンド、またはそれらの類似体、突然変異体、断片、もしくは誘導体のアミノ酸配列を有するペプチドは、Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149に述べられている方法と類似の方法を用いて固相ペプチド合成で合成することができる。合成の際に、側鎖を保護したN-α-保護アミノ酸を、C末端で不溶性のポリマー支持体（例えばポリスチレンビーズ）に連結された、成長しつつあるポリペプチド鎖に段階的に添加することができる。ペプチドは、N-α-脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させて活性化させたN-α-保護アミノ酸のα-カルボキシル基と連結させることによって合成される。活性化されたカルボキシル基へ遊離アミノ基が結合することによってペプチド結合が形成される。最も一般的に用いられるN-α-保護基としては、酸に対して不安定なBoc、および塩基に対して不安定なFmocが含まれる。適切な化学反応法、樹脂、保護基、保護アミノ酸、および試薬の詳細については当業界でよく知られており、本明細書中では詳述しない(Athertonら、1989, "Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach", IRL Press、およびBodanszky, 1993, "Peptide Chemistry, A Practical Textbook", 第2版, Springer-Verlagを参照のこと)。
【０１３６】
この結果得られたCD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドペプチドの精製は、従来法、例えばゲル透過を用いた調製的HPLC、分配および/またはイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて行われる。適切なマトリックスおよびバッファーの選択は当業界ではよく知られており、本明細書では詳述しない。
【０１３７】
さらに、CD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドタンパク質の類似体および誘導体は化学的に合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸もしくは化学的アミノ酸類似体をCD91ポリペプチド断片、HSP、もしくはCD91リガンドの配列中に置換もしくは付加するものとして導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定するものではないが、通常のアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、および一般にアミノ酸類似体とされるものが含まれる。
【０１３８】
5.1.5  CD91ポリペプチド断片およびCD91ポリペプチド断片-HSP複合体に特異的な抗体
CD91ポリペプチド断片のエピトープ、HSP-CD91ポリペプチド断片複合体のエピトープ、または該受容体もしくは該受容体複合体の保存された変異体もしくはペプチド断片のエピトープを特異的に認識することのできる抗体を産生する方法をここに記載する。そのような抗体は本発明の治療方法および診断方法において使用するためのCD91のHSP結合ドメインを認識するのに有用である。
【０１３９】
そのような抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAb)、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体、および上述の抗体のいずれかのエピトープ結合性フラグメントが含まれる。そのような抗体は、例えば、生物学的サンプル中のCD91ポリペプチド断片もしくはHSP-CD91ポリペプチド断片複合体の検出に用いることができる。そのような抗体はまた、例えば、試験化合物がHSPとCD91ポリペプチド断片との相互作用に及ぼす影響を評価するための、セクション5.2で後述するような、化合物スクリーニング計画と共に用いることができる。HSPとCD91断片タンパク質との相互作用は両者の免疫特異的結合でありうる。
【０１４０】
抗CD91断片タンパク質複合体抗体は、さらに、異常なCD91産物活性を阻害する方法として使用することができる。こうして、そのような抗体はHSP-CD91関連疾患（例えば、自己免疫疾患）の治療方法の一環として利用することができる。
【０１４１】
CD91断片タンパク質もしくはそのペプチド複合体に対する抗体の産生には、種々の宿主動物にCD91断片タンパク質もしくはHSP-CD91断片タンパク質複合体またはその一部分を注射することによって、該動物を免疫する。CD91断片タンパク質もしくはHSP-CD91断片タンパク質複合体の抗原性を示す部分は当業界で公知のアルゴリズムによって容易に予測することができる。特定の実施形態においては、抗CD91ポリペプチド断片抗体が、p95、p110、p282、p373またはp494などを含むがこれらに限定されない特定のCD91ポリペプチド断片に対して生成される。そのような抗体はHSP-CD91関連疾患のための本発明の治療方法の一環として利用することができる。
【０１４２】
宿主動物としては、限定するものではないが、2,3の例を挙げると、ウサギ、マウス、およびラットを挙げることができる。宿主の動物種の如何によって、種々のアジュバントを、免疫応答を増強させるために用いることができ、そのようなものとしては、限定するものではないが、フロイント(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および有効である可能性のあるヒトアジュバント、例えばBCG(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumが含まれる。
【０１４３】
ポリクローナル抗体とは、ある抗原（例えばCD91ポリペプチド断片タンパク質もしくはHSP-CD91ポリペプチド断片タンパク質複合体）またはその抗原性機能を有する誘導体で免疫した動物の血清に由来する抗体分子の多様な集団である。ポリクローナル抗体の産生には、上述のような宿主動物にCD91ポリペプチド断片タンパク質もしくはHSP-CD91ポリペプチド断片タンパク質複合体またはその一部分を、上述のアジュバントを補充して、注射することによって、該動物を免疫する。
【０１４４】
モノクローナル抗体はある特定の抗原に対する抗体の一様な集団であり、それは培養下の連続細胞株によって抗体分子の産生を行ういかなる技法によっても得ることができる。そのような技法としては、限定するものではないが、KohlerとMilstein(1975, Nature 256:495-497; および米国特許第4,376,110号)のハイブリドーマ技法、ヒトB細胞ハイブリドーマ技法(Kosborら, 1983, Immunology Today 4:72; Coleら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、ならびにEBV-ハイブリドーマ技法(Coleら, 1985, "Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp.77-96)が含まれる。そのような抗体は免疫グロブリンのどのクラスのものであってもよく、かかるクラスとしてはIgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびそれらのサブクラスが含まれる。本発明のmAbを産生するハイブリドーマはin vitroもしくはin vivoで培養することができる。in vivoでの高力価のmAbの産生を行うことが産生方法として好ましい。
【０１４５】
さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技法を用いることができ(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314:452-454)、それは、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子とスプライスすることによるものである。キメラ抗体とは、この分子の異なる部分が異なる動物種に由来するものであり、例えば、マウスmAb由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などである(例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号；およびBossら, 米国特許第4,816,397号を参照のこと；これらはその全体を参照により本明細書中に組み入れる)。
【０１４６】
本発明の別の実施形態においては、モノクローナル抗体は無菌動物で産生させることができる(PCT国際公開番号WO 89/12690, 1989年12月12日公開を参照)。本発明では、ヒト抗体を用いることができ、これはヒトハイブリドーマを用いて得ることができ(Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030)、またin vitroでEBVウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換することによっても得ることができる(Coleら, 1985, "Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp.77-96)。CD91ポリペプチド断片タンパク質-HSP複合体に特異的なマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子とスプライスすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技法を用いることができ(Morrisonら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855; Neubergerら, 1984, Nature 312:604-608; Takedaら, 1985, Nature, 314:452-454)、このような抗体は本発明の範囲内にある。
【０１４７】
ヒト化抗体も提供される(Winterによる米国特許第5,225,539号を参照)。免疫グロブリンの軽鎖もしくは重鎖の可変領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる3カ所の超可変領域が介在する「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびCDRの長さは正確に定められている("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.ら, U.S. Department of Health and Human Services (1983)を参照のこと)。簡潔に記せば、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物種由来の1個以上のCDRおよびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、ヒト以外の動物種由来の抗体分子である。このようなCDRをグラフトした抗体を種々の抗原に対して構築することが成功を収めており、例えばQueenら(1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029)が報告しているIL-2受容体に対する抗体；Riechmannら(1988, Nature 332:323)が報告している細胞表面受容体CAMPATHに対する抗体；Coら(1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869)が報告しているB型肝炎に対する抗体；ならびにTempestら(1991, Bio-Technology 9:267)が報告しているRSウイルスのウイルス抗原に対する抗体が挙げられる。ヒト化抗体はヒトの治療に用いるのに最も好ましい。
【０１４８】
あるいはまた、一本鎖抗体の産生のために報告されている技法(米国特許第4,946,778号; Bird, 1988, Science 242:423-426; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; およびWardら, 1989, Nature 334:544-546)を、CD91ポリペプチド断片タンパク質もしくはHSP-CD91ポリペプチド断片タンパク質複合体またはそれらの部分に対する一本鎖抗体を産生させるために適応させることができる。一本鎖抗体はFv領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントをアミノ酸架橋を介して連結させることによって形成され、その結果一本鎖のポリペプチドが得られる。
【０１４９】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の方法によって作製することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定するものではないが：抗体分子のペプシン消化によって得られるF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド結合を還元して生成されるFabフラグメントが含まれる。あるいはまた、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を行いうるようにFab発現ライブラリーを構築することができる(Huseら, 1989, Science, 246:1275-1381)。
【０１５０】
CD91ポリペプチド断片に対する抗体は、今度はCD91ポリペプチド断片を「模倣した」抗イディオタイプ抗体を、当業者にはよく知られた技法を用いて作製するために利用することができる(例えば、GreenspanとBona, 1993, FASEB J 7(5):437-444; およびNissinoff, 1991, J.Immunol. 147(8):2429-2438を参照のこと)。例えば、CD91ポリペプチド断片と結合して、HSPのCD91ポリペプチド断片への結合を競合的に阻害する抗体は、ECDを「模倣し」、それゆえにHSPと結合してそれを中和する抗イディオタイプ抗体を作製するために用いることができる。そのような、中和能のある抗イディオタイプ抗体もしくはその抗イディオタイプ抗体のFabフラグメントは、天然のリガンドを中和し、HSP-CD91関連疾患、例えば免疫疾患、増殖性疾患、および感染性疾患などの治療を行う治療計画において用いることができる。
【０１５１】
あるいはまた、CD91ポリペプチド断片活性またはCD91活性のアゴニストとして作用しうるCD91ポリペプチド断片に対する抗体を作製することができる。そのような抗体はCD91ポリペプチド断片およびCD91に結合し、CD91のシグナル伝達活性を活性化することとなる。CD91の活性化は癌のような増殖性疾患および感染性疾患の治療に特に有用であると思われる。さらに、CD91ポリペプチド断片活性のアンタゴニストとして作用する抗体、すなわちCD91の活性化を阻害する抗体は、自己免疫疾患の治療に特に有用なものとなろう。そのようなアゴニストおよびアンタゴニストをアッセイするための方法は下記のセクション5.2に詳述する。
【０１５２】
5.2  CD91ポリペプチド断片と相互作用する化合物を同定するためのアッセイ法
CD91ポリペプチド断片と相互作用するか、またはCD91ポリペプチド断片の機能を増強もしくは阻止する化合物を同定する方法は本発明に包含される。本発明は下記のサブセクションに述べるin vitroおよびin vivoアッセイ系を提供し、それらの系は、CD91ポリペプチド断片と相互作用するか、またはCD91ポリペプチド断片の活性およびCD91ポリペプチド断片とHSPもしくはHSP-ペプチド複合体との相互作用をモジュレートする化合物もしくは組成物を同定するために用いることができる。
【０１５３】
本発明はCD91ポリペプチド断片と相互作用するか、またはHSPとCD91ポリペプチド断片との相互作用をモジュレートする小分子、タンパク質、およびその他の化合物の同定に有用なスクリーニング方法を提供する。そのような化合物はCD91ポリペプチド断片遺伝子もしくは遺伝子産物と種々の親和性で結合して、in vivoで受容体活性の調節物質として働くことができ、免疫応答をモジュレートするという有用な治療用途を有する。例えば、受容体機能を抑制するある種の化合物は、HSPの細胞からの放出によって引き起こされる破壊的な免疫応答をダウンレギュレートするために患者に用いることができる。ある実施形態では、その化合物は熱ショックタンパク質とCD91ポリペプチド断片との相互作用を増強するアゴニストである。上記方法の別の実施形態では、その化合物は熱ショックタンパク質とCD91ポリペプチド断片との相互作用を妨害するアンタゴニストである。
【０１５４】
候補薬剤を、CD91ポリペプチド断片と相互作用する能力、もしくはCD91ポリペプチド断片の発現および活性をモジュレートする能力についてスクリーニングする方法は、本発明者らが上記受容体およびHSPもしくはHSP-ペプチド複合体の結合および認識におけるその役割を発見したことに基づいて設計することができる。CD91ポリペプチド断片、核酸、および誘導体は、CD91もしくはHSPタンパク質、誘導体、または核酸と特異的に結合し、それゆえにCD91-HSP相互作用をモジュレートし、それにより免疫応答をモジュレートするために使用しうる分子を検出するためのスクリーニングアッセイ法で用いることができる。好ましい実施形態においては、そのようなアッセイ法は、抗自己免疫疾患薬、抗癌剤、抗感染薬(抗ウイルス薬および抗生物質)、免疫調節剤、または創薬のためのリード化合物としての有用性をもちうる分子をスクリーニングするために行われる。例えば、CD91断片核酸を発現する組換え細胞は、これらのアッセイ法でHSPのCD91ポリペプチド断片への結合を妨げる分子をスクリーニングするために、CD91ポリペプチド断片を組換え的に産生させるために用いることができる。同様の方法を、CD91ポリペプチド断片の誘導体もしくはコード化核酸に結合する分子をスクリーニングするために用いることができる。上述のことを行うために用いることのできる方法は当業界では一般的に知られている。
【０１５５】
CD91ポリペプチド断片タンパク質と特異的に結合することのできる化合物は免疫療法に有用なものとなりうる。一実施形態においては、CD91ポリペプチド断片タンパク質と特異的に結合する化合物を同定するためのアッセイ法が開示され、その方法は、(a)CD91ポリペプチド断片タンパク質を1つ以上の試験化合物と、結合を起こさせる条件下で接触させ；(b)CD91ポリペプチド断片タンパク質と特異的に結合する能力のある化合物が免疫療法に有用な化合物として同定されるように、CD91ポリペプチド断片と特異的に結合する1つ以上の試験化合物を同定する、ことを含んでなる。
【０１５６】
免疫療法に有用な化合物を同定するための、本発明に包含される別の方法では、CD91ポリペプチド断片リガンドのCD91ポリペプチド断片への結合をモジュレートする化合物を同定することを含む。本明細書で用いている「CD91ポリペプチド断片リガンド」という用語は、CD91ポリペプチド断片と結合することのできる分子を意味する。そのようなCD91ポリペプチド断片リガンドには、限定するものではないが、熱ショックタンパク質および熱ショックタンパク質複合体が含まれる。
【０１５７】
その方法は、(a)1種以上の試験化合物の存在下で、CD91ポリペプチド断片をCD91ポリペプチド断片リガンド、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体と接触させ；(b)CD91ポリペプチド断片と結合したCD91ポリペプチド断片リガンド、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体の量を測定する；各ステップを含んでなり、その際、ステップ(b)で測定したCD91ポリペプチド断片リガンドの結合量が、試験化合物の不在下で測定したCD91ポリペプチド断片リガンドの結合量とは異なっている場合には、CD91ポリペプチド断片に対するCD91ポリペプチド断片リガンドの結合をモジュレートする、免疫療法に有用な化合物が同定されることとなる。
【０１５８】
別の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片とCD91ポリペプチド断片リガンドとの間の相互作用をモジュレートする、免疫療法に有用な化合物を同定するための方法が本発明によって提供される。その方法は、(a)CD91ポリペプチド断片を1種以上の試験化合物と接触させ；(b)CD91ポリペプチド断片の活性もしくは発現のレベルを測定する；各ステップを含んでなり、その際、ステップ(b)で測定した活性もしくは発現のレベルが1種以上の試験化合物の不在下でのCD91ポリペプチド断片の活性のレベルとは異なる場合には、CD91ポリペプチド断片とCD91ポリペプチド断片リガンドとの間の相互作用をモジュレートする化合物が同定されることとなる。
【０１５９】
別の実施形態においては、HSP-CD91ポリペプチド断片が介在するプロセスをモジュレートする化合物を同定するためのアッセイ法が開示される。そのアッセイ法は、(a)試験化合物をHSPおよびCD91ポリペプチド断片と接触させ；(b)CD91ポリペプチド断片の活性もしくは発現のレベルを測定する；各ステップを含んでなり、その際、ステップ(b)で測定した活性もしくは発現のレベルが試験化合物の不在下でのCD91ポリペプチド断片の活性のレベルとは異なる場合には、HSP-CD91ポリペプチド断片介在プロセスをモジュレートする化合物が同定されることとなる。同定された化合物がHSPとCD91ポリペプチド断片との相互作用を妨害するアンタゴニストであるような別の実施形態においては、該方法は、前記レベルがHSPとCD91ポリペプチド断片との相互作用を妨害するかどうかを調べるステップをさらに含んでなる。
【０１６０】
別の実施形態においては、HSP-CD91ポリペプチド断片介在プロセスをモジュレートする化合物を同定するための、細胞に基づく方法が開示される。この方法は、(a)試験化合物を熱ショックタンパク質およびCD91ポリペプチド断片を発現する細胞と接触させ：(b)その細胞内でのCD91ポリペプチド断片の活性もしくは発現のレベルを測定する；各ステップを含んでなり、その際、ステップ(b)で測定した活性もしくは発現のレベルが試験化合物の不在下でのCD91ポリペプチド断片の活性のレベルとは異なる場合には、HSP-CD91ポリペプチド断片介在プロセスをモジュレートする化合物が同定されることとなる。
【０１６１】
別の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片と相互作用する化合物、またはHSPのCD91への結合をモジュレートする化合物を同定するための受容体-リガンド結合アッセイが提供される。そのような1つの方法は、(a)HSPをCD91ポリペプチド断片、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体と試験化合物の存在下で接触させ；(b)CD91ポリペプチド断片、またはその類似体、誘導体、もしくは擬似体と結合している熱ショックタンパク質の量を測定する；各ステップを含んでなり、その際、ステップ(b)で測定した熱ショックタンパク質の結合量が試験化合物の不在下で測定した熱ショックタンパク質の結合量とは異なる場合には、HSPのCD91ポリペプチド断片への結合をモジュレートする化合物が同定されることとなる。
【０１６２】
本発明のアッセイ法はまず小スケール(すなわち、試験管内)で最適化し、その後スケールアップしてハイスループットのアッセイ法とすることができる。種々の実施形態において、本発明のin vitroスクリーニングアッセイ法は精製された成分もしくは細胞溶解物を用いて行うことができる。他の実施形態においては、該スクリーニングアッセイ法を培養下のまたはモデル動物中のインタクトな細胞で行うことができる。本発明では、本明細書に記載したin vitroでCD91ポリペプチド断片の活性をモジュレートすることが示された試験化合物は、さらにin vivoでアッセイされることとなり、そのようなアッセイには、その試験化合物が内在性のCD91との相互作用によりin vivoでも同様の効果を有するかを調べるための、また、試験化合物が抗原提示、サイトカイン放出、細胞内Ca++の放出、T細胞の細胞傷害性、腫瘍の進行、正もしくは負の調節物質の蓄積または分解、細胞増殖などに及ぼす影響を調べるための、培養細胞および動物モデルが含まれる。
【０１６３】
CD91ポリペプチド断片と相互作用すると同定されたタンパク質は、本発明の方法で使用するためにさらに同定して配列決定を行うことができる。さらなる同定は、アフィニティークロマトグラフィーにより同定されたタンパク質を、SDS-PAGEで分析し、さらにクーマシーブルーで染色するか、またはPVDF膜に移してクーマシーブルーで染色することができる（全てケラチンを含まない条件下で行う）。その後、かみそりでゲルまたは膜からタンパク質バンドを切り出す。80kDaのかすかなクーマシーバンドからトリプシンペプチドを、50％アセトニトリル、5％ギ酸で抽出し、乾燥し、75m 10cmの逆相C18マイクロキャピラリーカラム（体積3μl）上に載せ、オンラインマイクロキャピラリー液体クロマトグラフィー-タンデム型質量分析法によりトリプシンペプチドを分離した後、以前に記載されたように、SEQUESTプログラムを用いてデータベース検索を行う（Gatlinら, 2000, Anal. Chem. 72:757-63; Linkら, 1999, Nat. Biotechnol. 17:676-82）。Finnigan LCQイオントラップ質量分析計を用いて、データ依存型自動MS/MS様式で分析を行うことができる。
【０１６４】
5.2.1  CD91ポリペプチド断片-リガンド結合アッセイ
本明細書に記載したスクリーニングアッセイ法は、CD91ポリペプチド断片と相互作用するか、もしくはHSPとCD91ポリペプチド断片との相互作用をモジュレートする、ペプチドおよび非タンパク質有機分子をはじめとする化合物および組成物を同定するために用いることができる。組換え化合物、合成化合物、もしくはその他の外因性化合物は結合能を有している可能性があり、それゆえ、医薬品の候補となりうる。あるいはまた、タンパク質および化合物には、同定された遺伝子およびタンパク質とin vivoで相互作用するような内因性の細胞成分が含まれる。そのような内因性成分は医薬的および治療的介入のための新たな標的を提供することができる。
【０１６５】
したがって、好ましい実施形態においては、天然および/または合成の化合物(例えば、小分子もしくはペプチドのライブラリー)は双方とも、CD91ポリペプチド断片との相互作用について、および/またはCD91ポリペプチド断片の活性のモジュレーションについてスクリーニングすることができる。別の一連の実施形態においては、細胞溶解物もしくは組織ホモジネートを、正常もしくは突然変異型のCD91断片核酸およびCD91ポリペプチド断片の1種と結合するタンパク質もしくはその他の化合物についてスクリーニングすることができる。
【０１６６】
本明細書に記述するスクリーニングアッセイ法は、CD91ポリペプチド断片と相互作用する、および/またはCD91ポリペプチド断片とHSPとの相互作用をモジュレートする小分子、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体、類似体、もしくは断片を同定するために用いることができる。そのような化合物は、CD91リガンド（例えば、HSPおよびHSP複合体など）の細胞表面受容体による取り込みに対するアゴニストもしくはアンタゴニストとして用いることができる。例えば、CD91ポリペプチド断片-リガンド相互作用をモジュレートする化合物としては、限定するものではないが、CD91ポリペプチド断片に結合し、そのことによってリガンド（例えばHSPおよびHSP複合体など）のその受容体への結合を阻害する(アンタゴニスト)もしくは増強する(アゴニスト)化合物、ならびに、リガンド（例えばHSPなど）に結合し、そのことによってリガンドの受容体への結合を妨げるかもしくは増強する化合物が含まれる。CD91断片DNAの発現に影響を及ぼすことにより、CD91断片DNA活性に影響を及ぼす化合物も本発明のスクリーニングで同定することができ、そのような化合物としては、例えば、CD91断片の発現がモジュレートされるように、転写に影響を与えるかもしくはスプライシングを妨害する分子、例えばタンパク質もしくは小さな有機分子が含まれる。
【０１６７】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイ法は、HSP-CD91ポリペプチド断片相互作用を含めて、リガンド-CD91ポリペプチド断片相互作用をモジュレートする、すなわち妨害もしくは増強する化合物を検出するために設計されている。下記に詳述するとおり、そのようなアッセイ法は、ハイスループットスクリーニング法に適応させることのできる、結合アッセイなどの機能的アッセイ法である。
【０１６８】
結合アッセイ法は、リガンド（例えばHSP）とCD91ポリペプチド断片との相互作用をモジュレートする化合物を同定するために用いることができる。本発明の一態様においては、該スクリーニング法はCD91ポリペプチド断片とリガンド（例えば、HSPもしくはHSP由来のペプチド、もしくは別のCD91リガンドなど）との相互作用を破壊する化合物を同定するように設計することができる。そのような化合物は、HSP-CD91関連疾患および状態、例えば免疫疾患、増殖性疾患、および感染性疾患などのアンタゴニストを作るためのリード化合物として有用なものとなろう。
【０１６９】
結合アッセイは直接的結合アッセイもしくは競合的結合アッセイのいずれかで行うことができる。直接的結合アッセイでは、試験化合物はCD91ポリペプチド断片との結合、またはCD91リガンド（例えばHSPなど）との結合について試験される。その後、第2のステップでその試験化合物はリガンド-CD91ポリペプチド断片相互作用をモジュレートする能力があるかを試験される。他方、競合的結合アッセイでは、CD91ポリペプチド断片との結合について、リガンド（すなわちHSP）と競合する試験化合物の能力が評価される。
【０１７０】
直接的結合アッセイにおいては、リガンドおよび/またはCD91ポリペプチド断片のいずれかを試験化合物と、リガンドもしくは受容体への試験化合物の結合を可能にする条件下で接触させる。その結合は溶液中もしくは固相表面上で起こすことができる。その試験化合物はあらかじめ検出用に標識されていることが好ましい。標識には検出可能な化合物であればどのようなものでも用いることができ、例えば、限定するものではないが、発光物質、蛍光物質、または放射性同位体もしくはそれを含有する基、または酵素や色素などの非同位体標識が挙げられる。結合が起こるのに十分な時間インキュベートした後、その反応液を、過剰のもしくは非特異的に結合した試験化合物を除去する条件および操作に付す。典型的には、そのような操作としては適切なバッファーでの洗浄が含まれる。最後に、リガンド-試験化合物(例えば、HSP-試験化合物)もしくはCD91ポリペプチド断片-試験化合物複合体の存在を検出する。
【０１７１】
競合的結合アッセイでは、試験化合物を、リガンド(例えばHSP)とCD91ポリペプチド断片との結合を破壊もしくは増強するその能力についてアッセイする。標識したリガンド(例えばHSP)をCD91ポリペプチド断片またはその誘導体と混合し、試験化合物を添加してあるいは添加しないで、それらの間の相互作用が通常は起こると考えられる条件下に置く。CD91ポリペプチド断片と結合する標識リガンド(例えばHSP)の量を、試験化合物の存在下もしくは不在下での結合の量と比較する。
【０１７２】
好ましい実施形態においては、複合体の形成および検出を容易にするために、結合アッセイは固相表面上に固定化された1種以上の成分を用いて行われる。種々の実施形態においては、固相支持体は、限定するものではないが、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミド、およびアガロースとすることができる。支持体の形状としてはビーズ、膜、微粒子、またはマイクロタイタープレート、試験管、もしくはその他の反応容器のような反応容器の内表面が含まれる。CD91ポリペプチド断片もしくはその他の成分の固定化は、共有結合または非共有結合を介して行うことができる。一実施形態においては、その結合は間接的なもの、すなわち、結合した抗体を介するものとすることができる。別の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片および陰性対照を、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)などのエピトープでタグ付けして、固相表面への結合が、抗GST(Santa Cruz Biotechnology)のような市販の抗体によって媒介されうるようにする。
【０１７３】
例えば、そのようなアフィニティー結合アッセイは固相支持体上に固定化したCD91ポリペプチド断片を用いて行うことができる。典型的には、結合反応の非固定化成分、この場合はリガンド(例えばHSP)もしくは試験化合物のいずれか、は検出が行えるように標識される。種々の標識法が利用可能であり、例えば、発光物質、発色団、蛍光物質、または放射性同位体もしくはそれを含有する基、ならびに酵素や色素などの非同位体による標識を用いることができる。好ましい実施形態においては、試験化合物を、フルオレセインイソチオシアネート(FITC、Sigma Chemicals (St. Louis)から入手できる)などの蛍光団で標識する。
【０１７４】
その後、標識された試験化合物、もしくはリガンド(例えばHSP)＋試験化合物は、固相支持体と、特異的な結合が起こるような条件下で接触させる。結合反応が起こった後、未結合の試験化合物と非特異的に結合した試験化合物を、表面を洗浄することによって分離する。結合パートナーの固相への結合は、当業者には公知の種々の方法で行うことができ、そのような方法としては、限定するものではないが、化学的架橋、プラスチック表面への非特異的付着、固相表面に結合させた抗体との相互作用、結合パートナーに結合させたリガンド(例えばビオチン)と固相に結合させたリガンド結合性タンパク質(例えばアビジンもしくはストレプトアビジン)との間の相互作用、などが含まれる。
【０１７５】
最後に、固相表面上に残存する標識は、当業界では公知の検出方法によって検出することができる。例えば、試験化合物が蛍光団で標識されていれば、複合体の検出にはフルオリメーターを用いることができる。
【０１７６】
好ましくは、CD91ポリペプチド断片は、結合アッセイに添加する際には、CD91ポリペプチド断片を発現しているインタクトな細胞の形、もしくはCD91ポリペプチド断片を含有している単離された膜の形態で添加される。従ってCD91ポリペプチド断片との直接的結合もしくはリガンド-CD91ポリペプチド断片複合体(例えば、HSP-CD91ポリペプチド断片複合体)をモジュレートする試験化合物の能力は、培養下のインタクトな細胞もしくは動物モデルにおいて試験化合物の存在下もしくは不在下でアッセイすることができる。標識リガンド(例えば、HSP)を、CD91ポリペプチド断片を発現している細胞と混合するか、もしくはそのような細胞から得られた粗抽出物中で混合し、試験化合物を添加することができる。単離した膜を使用してCD91ポリペプチド断片と相互作用する化合物を同定することもできる。例えば、単離膜を用いた典型的な実験では、CD91ポリペプチド断片を発現するように細胞を遺伝子操作することができる。膜を標準的な技法によって採取し、in vitro結合アッセイで用いることができる。標識リガンド(例えば、125I-標識HSP)を膜に結合させ、その比活性を測定する；特異的結合は過剰の非標識(コールド)リガンドの存在下で行った結合アッセイの結果と比較して測定する。
【０１７７】
あるいはまた、可溶性CD91ポリペプチド断片を組換え的に発現させて、CD91ポリペプチド断片と結合する化合物を同定する無細胞系のアッセイ法において用いることができる。組換えにより発現させたCD91ポリペプチド断片ポリペプチド、またはCD91ポリペプチド断片の細胞外ドメイン(ECD)もしくはその誘導体を含む融合タンパク質は、無細胞系のスクリーニングアッセイ法で用いることができる。無細胞系のアッセイ法においては、組換えにより発現させたCD91ポリペプチド断片を、固相支持体、例えば試験管、マイクロタイタープレートのウエル、もしくはカラムに、当業界ではよく知られた方法を用いて結合させる(Ausubelらの上述の文献を参照のこと)。次いで試験化合物をそのCD91ポリペプチド断片への結合能についてアッセイする。
【０１７８】
あるいはまた、結合反応は溶液中で行うことができる。このアッセイ法では、標識成分をその結合パートナーと溶液中で相互作用させる。標識成分とその結合パートナーとのサイズ差によって分離が可能であるならば、そのような分離は、結合反応の産物を、結合しなかった標識成分は通過するが結合パートナーもしくはそのパートナーと結合している標識成分は通過し得ないような孔径を有する限外ろ過膜を通過させることによって、行うことができる。分離はまた、標識成分の結合パートナーを溶液から捕捉することのできる何らかの試薬、例えばその結合パートナーに対する抗体、リガンド結合性タンパク質（結合パートナーにあらかじめ結合させたリガンドと相互作用しうるもの）などを用いても行うことができる。
【０１７９】
一つの実施形態においては、例えば、連続的ファージディスプレイライブラリーから得たファージを、プラスチックビーズなどの固相に連結された精製CD91ポリペプチド断片またはその誘導体、類似体、断片もしくはドメインを含有するカラムを通過させることによって、ファージライブラリーをスクリーニングすることができる。洗浄バッファーのストリンジェンシーを変えることによって、CD91ポリペプチド断片に高い親和性を有するペプチドを発現するファージを濃縮することができる。カラムから単離されたファージをクローン化し、短いペプチドの親和性を直接的に測定することができる。2個以上のオリゴヌクレオチドの配列を組み合わせて、CD91ポリペプチド断片に対する結合親和性がより高いものを調べることができる。どのアミノ酸配列がCD91ポリペプチド断片に対する最も強い結合を与えるかが分かれば、コンピューターモデルを使用してCD91ポリペプチド断片と試験化合物との間の分子的接触を同定することができる。これによって、そのような接触を模倣することのできる非タンパク質性化合物の設計が行えるようになろう。そのような化合物は、おそらく該ペプチドと同じ活性を示して治療に用いることができ、製造効率がよく費用もあまりかからないという利点を有するだろう。
【０１８０】
本発明のこの態様の別の特別な実施形態においては、固相支持体はマイクロタイターディッシュに結合させたCD91ポリペプチド断片を含有する膜である。試験化合物、例えばライブラリーのメンバーを発現している細胞を、マイクロタイターディッシュ中で、ライブラリーのメンバーの発現を可能にする条件下で培養する。該タンパク質(または核酸もしくは誘導体)と結合するライブラリーのメンバーを回収する。そのような方法は、例えばParmleyとSmith, 1988, Gene 73:305-318; Fowlkesら, 1992, BioTechniques 13:422-427; PCT公開番号WO 94/18318; およびそこで引用されている文献に報告されている。
【０１８１】
本発明の別の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片もしくはリガンド(例えば、HSP)と試験化合物との相互作用はin vitroでアッセイすることができる。既知のもしくは未知の分子を、CD91断片の核酸、タンパク質、もしくは誘導体への特異的結合について、結合を起こさせる条件下でアッセイし、次いでCD91ポリペプチド断片と特異的に結合する分子を同定する。2種の成分の測定は種々の方法で行うことができる。1つのアプローチとしては、それらの成分うちの1種に容易に検出可能な標識を付し、それを試験化合物と共に結合を起こさせる条件下に置き、結合した標識成分を未結合の標識成分から分離させる分離ステップを行い、その後結合した成分の量を測定する。一実施形態においては、CD91ポリペプチド断片を標識し、結合を起こさせる条件下で試験薬剤に添加することができる。試験薬剤の結合は、ポリアクリルアミドゲルによる分析を行い、試験薬剤の存在下および不在下で形成される複合体を比較することによって測定することができる。
【０１８２】
別の実施形態においては、抗原特異的応答アッセイを、CD91リガンド（例えばHSPもしくはHSP複合体）による抗原性分子の提示に及ぼす候補化合物の影響を検出するために用いることができる。そのようなアッセイはin vitroでもin vivoでも行なうことができ、例えば、限定するものではないが、本発明の方法により同定された化合物によるCD91もしくはHSP活性のモジュレーションを検出するための腫瘍攻撃または拒絶アッセイ、または抗原提示アッセイを含みうる。例えば、抗原提示アッセイは、CD91ポリペプチド断片の活性を調べるため、またはin vivoでCD91ポリペプチド断片と相互作用する能力のある複合体（例えばHSP-抗原性分子複合体）の、CD91ポリペプチド断片を発現している細胞による取り込みに及ぼす化合物の影響を調べるために行うことができる。そのような提示アッセイは当業界では公知であり、すでに報告されている(SutoおよびSrivastava, 1995, Science 269:1585-1588)。例えば、一実施形態においては、抗原提示細胞、例えばマクロファージ細胞株(例えばRAW264.7)などを抗原特異的T細胞と、各タイプの細胞を約10,000個、約1:1の比率で用いて培地中で混合する。HSP(10μg/mL)とペプチド抗原の複合体、ならびに試験化合物をその細胞に添加し、その培養物を約20時間インキュベートする。次いで試験化合物の存在下および不在下でのT細胞の刺激を測定することができる。
【０１８３】
別の実施形態においては、抗原特異的T細胞の刺激をアッセイすることができる。ある実施形態においては、IFN-γ放出アッセイを用いることができる。洗浄後、細胞を固定し、透過性とし、ヒトIFN-γに反応性の色素標識抗体(PE-抗IFN-γ)と反応させる。サンプルを、標準的な技法を用いてフローサイトメトリーで分析する。あるいはまた、フィルターイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着定量法)、もしくは酵素結合免疫スポットアッセイ(ELISPOT)を、活性化T細胞によって産生される特定のサイトカインの検出に用いることができる。一実施形態においては、例えば、ニトロセルロースで裏打ちしたマイクロタイタープレートを精製サイトカイン特異的一次抗体、すなわち抗IFN-γでコーティングし、他のタンパク質の非特異的結合によるバックグラウンドを避けるためにそのプレートをブロッキングする。抗原で刺激されたAPC細胞のサンプルをマイクロタイタープレートのウエル上に希釈して入れる。例えばビオチン標識などで標識した二次抗サイトカイン抗体を添加する。次いで、抗体-サイトカイン複合体を、酵素コンジュゲートストレプトアビジンによって検出することができる。サイトカイン分泌細胞は肉眼的、顕微鏡的、もしくは電子顕微鏡的検出法で「スポット」として出現するだろう。別の一実施形態においては、「四量体染色」アッセイ(Altmanら, 1996, Science 274:94-96)を抗原特異的T細胞の同定に用いることができる。例えば、特定のペプチド抗原（例えば腫瘍特異的抗原など）を含有しているMHC分子を多量体化して可溶性のペプチド四量体を作り、例えばストレプトアビジンと複合体化することによって標識する。次いでMHC-ペプチド抗原複合体を刺激されたT細胞の集団と混合する。次いで、MHC-抗原複合体を認識しそれと結合するT細胞を染色するためにビオチンを用いる。
【０１８４】
5.2.2  本発明に従ってスクリーニングすることのできる化合物
本明細書に記述するスクリーニングアッセイ法は、CD91ポリペプチド断片と相互作用する、もしくはリガンド(例えば、HSP)とCD91ポリペプチド断片との相互作用をモジュレートする小分子、ペプチドもしくはタンパク質、またはそれらの誘導体、類似体、もしくは断片を同定するために用いることができる。本発明でスクリーニングすることのできる化合物としては、限定するものではないが、CD91ポリペプチド断片と結合して、天然のリガンドによって誘発される活性を阻害する(すなわちアンタゴニスト)か、もしくは天然のリガンドによって誘発される活性を模倣する(すなわちアゴニスト)ような小分子、ペプチド、抗体およびそのフラグメント、ならびにその他の有機化合物(例えば、ペプチド模倣体(peptidomimetic))が挙げられる。一実施形態においては、そのような化合物には、CD91ポリペプチド断片の活性部位と結合してその活性をブロックすることのできる、HSP配列などのリガンド配列が含まれる。
【０１８５】
スクリーニングに用いることのできる化合物としては、限定するものではないが、ペプチド、例えば可溶性のペプチド［例えば、ランダムペプチドライブラリーのメンバー(例えば、Lamら, 1991, Nature 354:82-84; Houghtenら, 1991, Nature 354:84-86を参照)、Dおよび/またはL配置のアミノ酸からなるコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリーのメンバーを含むが、これらに限らない］、リンペプチド［ランダムなもしくは部分的に縮重のある、指向性リンペプチドライブラリーのメンバーを含むが、これらに限らない；例えばSongyangら, 1993, Cell 72:767-778を参照］、抗体［ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、または一本鎖抗体、ならびにFab、F(ab')2、およびFab発現ライブラリーフラグメント、およびそれらのエピトープ結合性フラグメントを含むが、これらに限らない］、ならびに小さな有機もしくは無機分子が挙げられる。
【０１８６】
本発明の一実施形態においては、ペプチドライブラリーは、HSP-CD91ポリペプチド断片の相互作用などのCD91ポリペプチド断片相互作用のモジュレーターのスクリーニングに用いることのできる試験化合物の供給源として用いられる。ランダムもしくはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様性ライブラリーを、CD91ポリペプチド断片と特異的に結合する分子を探すためにスクリーニングすることができる。当業界で公知の多数のライブラリーを用いることができ、そのようなものとしては例えば、化学的に合成したライブラリー、組換え(例えばファージディスプレイライブラリー)、およびin vitroでの翻訳に基づくライブラリーが挙げられる。
【０１８７】
化学的に合成したライブラリーの例は、Fodorら, 1991, Science 251:767-773; Houghtenら, 1991, Nature, 354:84-86; Lamら, 1991, Nature 354:82-84; Medynski, 1994, Bio/Technology 12:709-710; Gallopら, 1994, J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyerら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghtenら, 1992, Biotechniques 13:412; Jayawickremeら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmonら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT公開番号WO 93/20242; ならびにBrennerおよびLerner, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383に述べられている。
【０１８８】
ファージディスプレイライブラリーの例は、ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-390; Devlinら, 1990, Science, 249:404-406; Christianら, 1992, J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, 1992, J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kayら, 1993,Gene 128:59-65; およびPCT公開番号WO 94/18318(1994年8月18日付)に述べられている。
【０１８９】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー(例えば、Buninら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712を参照せよ)を改作して用いることができる。ペプトイドライブラリー(Simonら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371)も用いることができる。化学的に変換させたコンビナトリアルライブラリーを作製するためにペプチド中のアミド官能性が過メチル化されているような、用いることができるライブラリーの別の一例は、Ostreshら(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142)によって報告されている。
【０１９０】
ライブラリーをスクリーニングすることは一般的に知られている種々の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、下記のペプチドライブラリーのスクリーニングについて開示している文献を参照されたい：ParmleyおよびSmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251 :215-218; ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkesら, 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburgら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yuら, 1994, Cell 76:933-945; Staudtら, 1988, Science 241:577-580; Bockら, 1992, Nature 355:564-566; Tuerkら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellingtonら, 1992, Nature 355:850-852; 米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、および米国特許第5,198,346号(これらの特許は全てLadnerらに与えられたもの); RebarおよびPabo, 1993, Science 263:671-673; ならびにPCT公開番号WO 94/18318。
【０１９１】
本発明の別の一実施形態においては、スクリーニングは標識したリガンド(例えば、HSP)をin vitro翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物(RRL)系などに添加し、次いでin vitroプライミング反応を進めることによって行うことができる。in vitroでの翻訳に基づくライブラリーには、限定するものではないが、PCT公開番号WO 91/05058(1991年4月18日付); およびMattheakisら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026に述べられているものが含まれる。
【０１９２】
本明細書に記述する方法で試験し同定することのできる化合物には、限定するものではないが、商業的供給元から得られる化合物が含まれ、そのような商業的供給元としては、Aldrich (Milwaukee, WI 53233)、Sigma Chemical (St. Louis, MO)、 Fluka Chemie AG(Buchs, Switzerland)、 Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY)、Eastman Chemical Company, Fine Chemicals (Kingsport, TN)、Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany)、 Takasago (Rockleigh, NJ)、SST Corporation (Clifton, NJ)、Ferro (Zachary, LA 70791)、Riedel-deHaen Aktiengesellschaft (Seelze, Germany)、PPG Industries Inc., Fine Chemicals (Pittsburgh, PA 15272)が挙げられる。さらに天然物のいかなる種類のものも本発明の方法を用いてスクリーニングすることができ、そのような天然物としては、微生物、真菌、植物、もしくは動物の抽出物が挙げられる。
【０１９３】
さらに、小分子の試験化合物を含む試験化合物の多様性ライブラリーを用いることができる。典型的には、小分子は約400〜10,000ダルトンまでの分子量範囲のものである。例えば、ライブラリーは、Specs and BioSpecs B.V. (Rijswijk, The Netherlands)、Chembridge Corporation (San Diego, CA)、Contract Service Company (Dolgoprudny, Moscow Region, Russia)、 Comgenex USA Inc. (Princeton, NJ)、Maybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, United Kingdom)、およびAsinex (Moscow, Russia)から市販されているものを入手できる。
【０１９４】
さらにまた、当業界で公知のコンビナトリアルライブラリーを用いることができ、そのようなものとしては、限定するものではないが、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス指定可能な並行固相もしくは液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィーでの選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、もしくは小分子の化合物ライブラリーに適用可能である(Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145)。小分子の試験化合物を含む試験化合物のコンビナトリアルライブラリーを用いることができ、例えば、EichlerおよびHoughten, 1995, Mol. Med. Today 1:174-180; Dolle, 1997, Mol. Divers. 2:223-236; およびLam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145-167に開示されるように作製することができる。
【０１９５】
分子ライブラリーの合成方法の例は当業界で見出すことができ、例えば、DeWittら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erbら, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermannら, 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Choら, 1993, Science 261:1303; Carrellら, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carellら, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:206l; およびGallopら, 1994. J. Med. Chem. 37:1233中に記載されている。
【０１９６】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten, 1992, BioTechniques 13:412-421)、またはビーズ(Lam, 1991, Nature 354:82-84)、チップ(Fodor, 1993, Nature 364:555-556)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号; 第5,403,484号; および第5,223,409号)、プラスミド(Cullら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)、もしくはファージ(ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirlaら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; およびFelici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310)上に提示することができる。
【０１９７】
ライブラリーのスクリーニングは、一般的に知られている種々の方法のいずれかによって達成することができる。例えば、下記のペプチドライブラリーのスクリーニングについて開示している文献を参照されたい：ParmleyおよびSmith, 1989, Adv. Exp. Med. Biol. 251 :215-218; ScottおよびSmith, 1990, Science 249:386-390; Fowlkesら, 1992; BioTechniques 13:422-427; Oldenburgら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yuら, 1994, Cell 76:933-945; Staudtら, 1988, Science 241:577-580; Bockら, 1992, Nature 355:564-566; Tuerkら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellingtonら, 1992, Nature 355:850-852; 米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、および米国特許第5,198,346号(これらの特許は全てLadnerらに与えられたもの); RebarおよびPabo, 1993, Science 263:671-673; ならびにPCT公開番号WO 94/18318。
【０１９８】
5.3  治療的使用
本発明はさらに、免疫応答をモジュレートする方法を包含する。CD91は、抗原性分子を免疫系の細胞に提示して免疫応答を引き出す目的で、抗原性ペプチド複合体(例えば、HSP-抗原性ペプチド複合体)を認識し、輸送する。従って、本発明のCD91ポリペプチド断片組成物および方法は、自己免疫疾患、癌、および感染性疾患などのHSP-CD91に関連する疾患および状態の治療的処置に用いることができる。特に、下記に詳述するとおり、CD91ポリペプチド断片を含む組換え細胞、抗体、およびCD9と相互作用するかまたはCD91とそのリガンド（例えばHSP）との相互作用をモジュレートする他の化合物、ならびにHSP-CD91が介在するプロセスをモジュレートする他の化合物は、免疫応答を引き出してまたはブロックして、上述のようなHSP-CD91関連疾患および状態を治療するために用いることができる。CD91ポリペプチド断片を含む組換え細胞、抗体、およびCD9と相互作用するかまたはCD91とそのリガンド（例えばHSP）との相互作用をモジュレートする他の化合物、ならびにHSP-CD91介在プロセスをモジュレートする他の化合物はまた、他のCD91リガンドの結合に影響を及ぼして、それにより脂質代謝に影響を与えるために使用することができる。
【０１９９】
CD91リガンド-CD91ポリペプチド断片相互作用をモジュレートする、本明細書で提供されたスクリーニング法によって同定されたものなどの化合物は、治療薬として有用なものとなりうる。そのような化合物としては、限定するものではないが、アゴニスト、アンタゴニスト、例えば抗体、アンチセンスRNA、およびリボザイムが挙げられる。リガンド(例えばHSP)-CD91ポリペプチド断片相互作用を妨害する化合物は、免疫応答をモジュレートする（すなわち、増強または抑制する）ために用いることができ、自己免疫応答および状態の治療に用いることができる。他の抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、アンチセンスRNA、リボザイムは、リガンド(例えばHSP)-CD91ポリペプチド断片相互作用、活性、もしくは発現をアップレギュレートすることができ、抗原複合体(例えばHSP-抗原複合体)の取り込みを抑制または増大させると考えられ、従ってワクチンの投与に先立って、もしくは投与と同時に宿主の免疫系を刺激することにおいて有用なものとなろう。下記には、免疫疾患、増殖性疾患、および感染性疾患などのHSP-CD91関連疾患の治療において上述のような化合物を使用するための方法と組成物が記載される。
【０２００】
一実施形態においては、CD91ポリペプチド断片-リガンド相互作用のアンタゴニストが免疫応答をブロックするために用いられる。そのようなアンタゴニストとしては、リガンド(例えば、HSP)とCD91のCD91ポリペプチド断片部分との結合を、CD91、そのリガンド、またはリガンド-ペプチド複合体との結合について競合することによって妨害する化合物が挙げられる。
【０２０１】
一実施形態においては、アンタゴニストはCD91ポリペプチド断片に特異的な抗体、またはHSPリガンド結合部位を含むそのフラグメントである。別の実施形態においては、アンタゴニストはHSPが受容体と結合するのを妨害するHSPに特異的な抗体である。
【０２０２】
別の実施形態においては、アンタゴニストはHSP配列の少なくとも連続した10アミノ酸を含むペプチドである。そのようなペプチドは、CD91ポリペプチド断片のリガンド結合部位と結合して、HSPもしくはHSP複合体の相互作用をブロックすることができる。
【０２０３】
そのようなペプチドは合成的に、または標準的な分子生物学的技法を用いて製造することができる。天然のCD91リガンド(例えばHSP)のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、通常、GenBankなどの配列データベースにおいて入手可能である。そのデータベースを閲覧し、登録番号によって目的のアミノ酸配列および遺伝的配列データを検索するために、Entrezなどのコンピュータープログラムを用いることができる。
【０２０４】
さらに、上述のセクション5.2に記載した技法などによって同定されるような、CD91ポリペプチド断片-リガンド相互作用をモジュレートすることのできる化合物は、当業者には周知の標準的な方法を用いて投与することができる。
【０２０５】
5.3.1  標的となる自己免疫疾患
CD91ポリペプチド断片または本発明の方法によって同定される化合物により治療することができる自己免疫疾患には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：インスリン依存型糖尿病（すなわちIDDMまたは自己免疫性糖尿病）、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、硬皮症、多発性筋炎、慢性活動性肝炎、混合結合組織病、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、自己免疫性甲状腺炎、特発性アディソン病、白斑、グルテン過敏性腸疾患、グレーヴズ病、重症筋無力症、自己免液性好中球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、肝硬変、尋常性天疱瘡、自己免疫性不妊症、グッドパスチャー病、水疱性類天疱瘡、円板状狼瘡、潰瘍性大腸炎、およびdense deposit病。本明細書中で記述する、上記疾患には、このような疾患の動物モデル（例えばIDDMの非肥満型糖尿病（NOD）マウス、および多発性硬化症の実験用自己免疫性脳脊髄炎（EAE）マウスなど）により示されるものが含まれる。
【０２０６】
本発明の方法により同定される化合物および方法を用いて、患者自身（自己）の組織への免疫反応を低減または排除することにより、あるいは自己免疫反応によりダメージを受けた自己の組織もしくは器官の代わりに移植された組織もしくは器官に対する既存の自己免疫反応を軽減または排除することにより、このような自己免疫疾患を治療することができる。
【０２０７】
5.3.2  標的となる感染性疾患
本発明の方法、CD91ポリペプチド断片、および本発明の方法により同定される化合物を用いて治療または予防することができる感染性疾患には、ウイルス、細菌、原生動物および細胞内寄生虫などの細胞内病原体によって引き起こされるものが挙げられる。ウイルスには、限定するものではないが、以下のものが含まれる：B型肝炎ウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルスやサイトメガロウイルスなど）、パポバウイルス（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、およびSV40など）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスI型（HSV-I）、単純ヘルペスウイルスII型（HSV-II）およびエプスタイン-バーウイルスなど）、ポックスウイルス（天然痘（痘瘡）およびワクシニアウイルスなど）、RNAウイルス（ヒト免疫不全ウイルスI型（HIV-I）、ヒト免疫不全ウイルスII型（HIV-II）、ヒトT細胞白血病ウイルスI型（HTLV-I）およびヒトT細胞白血病ウイルスII型（HTLV-II）を含むがこれらに限定されない）、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルスなど）、レオウイルス、トガウイルス（風疹ウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスなど）、アルボウイルス、ならびにA型肝炎ウイルスにより引き起こされるウイルス性疾患。
【０２０８】
他の実施形態においては、以下に挙げる病原性細菌（ただしこれらに限定されない）により引き起こされる疾患など（ただしこれらに限定されない）の細菌感染症を治療または予防することができる：化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、淋菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウェルチ菌、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、臭鼻菌(Klebsiella ozaenae)、鼻硬腫菌(Klebsiella rhinoscleromotis)、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、牛カンピロバクター症菌（Campylobacter (Vibrio) fetus）、カンピロバクター・ジェジュニ、アエロモナス・ヒドロフィラ、バシラス・セレウス、エドワードシエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、エルジニア・エンテロコリチカ、ペスト菌、偽結核エルジニア菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ソンネ赤痢菌、ネズミチフス菌、腸チフス菌、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポネーマ、ピンタ・トレポネーマ（Treponema caraterum）、ヴァンサンボレリア（Borrelia vincentii）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorferi）、黄疸出血症レプトスピラ、ヒト型結核菌、トキソプラスマ（Toxoplasma gondii）、ニューモシスティス・カリニ、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、マイコプラスマ属に属する種、発疹チフスリケッチア、ツツガムシ病リケッチア、クラミジア属に属する種、およびヘリコバクター・ピロリ。
【０２０９】
他の好適な実施形態においては、これらの方法を用いて、以下に挙げる病原性原生動物（ただしこれらに限定されない）により引き起こされる感染症を治療または予防するために使用することができる：赤痢アメーバ（Entomoeba histolytica）、口腔トリコモナス（Trichomonas tenas）、腸トリコモナス、腟トリコモナス、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、肺炎ニューモシスティス（Pneumocystis pneumonia）、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、および四日熱マラリア原虫。
【０２１０】
5.3.3  標的となる増殖性細胞疾患
HSP-α2M受容体活性に関係する特定の増殖性および腫瘍性疾患に関して、上述の方法、CD91ポリペプチド断片、または本発明の方法により同定される化合物によって治療または予防することができる疾患には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：ヒト肉腫および癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛上皮腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌腫、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫など；白血病、例えば急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびＨ鎖病。
【０２１１】
細胞増殖に欠陥のある、または治療もしくは予防のために細胞増殖が望まれる疾患および障害であって、例えば創傷の治癒を促進するため、または変性した、損傷した、もしくは負傷した組織等の再生を促進するために、α2M受容体の機能を阻害することにより治療もしくは予防することができる疾患および障害には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：変性疾患、成長不良、低増殖性疾患、物理的外傷、損傷、および創傷。
【０２１２】
5.3.4  ドミナントネガティブ突然変異体としてのCD91ポリペプチド断片の使用
本発明の他の実施形態においては、ドミナントネガティブ突然変異体（「ドミナントネガティブ体」）を治療に用いて、HSP-抗原複合体に対する免疫反応を阻害する、例えば自己免疫疾患を治療することができる。一般に、このようなドミナントネガティブ体は、発現された時にリガンド（すなわちHSP-抗原性分子複合体）と相互作用するが、正常なCD91のエンドサイトーシス機能および/またはシグナル伝達機能の１つ以上の機能を喪失している突然変異体である。このような突然変異体は、例えば野生型受容体からのHSP-ペプチド複合体のタイトレーション（titration）により、同じ細胞内または異なる細胞内の正常なCD91の機能を妨げる。このような突然変異は、例えば、α（2）マクログロブリン受容体の515 kDaサブユニットの細胞外ドメイン、または85 kDaサブユニットの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインもしくは細胞内ドメインのいずれかに1つ以上の点突然変異、欠失、挿入または他の突然変異が存在しうる（CD91サブユニットの立体配置については、KriegerおよびHerz, 1994, Annu. Rev. Biochem 63:601-637を参照されたい）。しかし、いずれのサブユニットにおいてもドミナントネガティブ突然変異を構築する際には、515 kDaサブユニットがプロセシングされて細胞表面上に提示されるように、切断ドメイン（CD91の前駆体のアミノ酸3525と3526との間での切断をシグナル伝達する）がインタクトのままとなるように注意を払わなければならない。さらに、2つのサブユニットをつなぐドメインも確実に機能を維持するように注意しなければならない。例えば、特定の実施形態においては、85 kDaサブユニットのC末端の細胞内ドメインがトランケートされる。他の実施形態においては、N末端の515 kDaサブユニット上の点突然変異はエンドサイトーシスを阻害するが、リガンドの結合は阻害しない。他の実施形態において、N末端の515 kDaサブユニットは融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質のC末端は、別のタイプIの1回膜貫通受容体の膜貫通ドメインおよび場合によっては細胞内ドメインである。
【０２１３】
細胞内でのこのようなドミナントネガティブ突然変異の発現は、利用可能なリガンドの量をタイトレーションすることにより、同一の細胞または近隣の細胞における正常な機能的受容体によるリガンドの取り込みを阻害することができる。したがって、このようなドミナントネガティブ体を発現する組換え抗原提示細胞は、自己免疫疾患の治療が必要な患者に投与した時に、HSP-抗原性分子複合体をタイトレーションするために用いることができる。
【０２１４】
CD91ポリペプチド断片
本発明の一実施形態においては、HSP-CD91競合的アンタゴニストは、HSPと結合することができ、従ってHSPの天然の（例えば、全長CD91）受容体への結合を競合的に阻害または抑制することのできるCD91ポリペプチド、好ましくは可溶性ペプチドである。
【０２１５】
CD91ポリペプチド断片のHSP結合性部分の機能的発現は、好ましくはCR8ドメインについてHuangら, 1999, J. Biol. Chem. 274:14130-14136に記載されているとおりに行われる。簡単に述べると、適切なフォールディングを維持するために、タンパク質をGST融合物として発現させ、組換えにより発現させて、そのGST部分を切断し、未切断のタンパク質をGSH-Sepharoseで除去し、切断されたタンパク質をリフォールディングさせる。補体リピートはカルシウムと結合するので、適切なフォールディングはリフォールディングされたタンパク質のカルシウムへの結合を測定することによってアッセイする。
【０２１６】
この実施形態の特定の様式においては、CD91ポリペプチド断片のHSP結合性部分は、少なくとも1つの補体リピート（最も好ましくはCR3〜CR10から選択される）から成るか、またはそれを含んでなる。この実施形態の別の特定の様式では、CD91ポリペプチド断片のHSP結合性部分は補体リピートのクラスター、最も好ましくはCl-IIを含んでなる。この実施形態の他の様式では、HSP結合性部分は、少なくとも10個、より好ましくは少なくとも20個、さらにより好ましくは少なくとも30個、なおいっそう好ましくは少なくとも40個、最も好ましくは少なくとも80個(連続した)アミノ酸からなる。この実施形態の他の特定の様式では、そのような断片は40〜45アミノ酸より大きくはない。この実施形態の他の特定の様式では、そのような断片は80〜90アミノ酸よりも大きくはない。代表的な好ましいペプチドとしては、限定するものではないが、ヒトp95の配列番号2または3のアミノ酸からなるものが挙げられる。
【０２１７】
また、CD91ポリペプチド断片のHSP結合性部分の誘導体もしくは類似体も、HSP-CD91ポリペプチド断片複合体の競合的アンタゴニストとして考えられる。そのような誘導体もしくは類似体としては、限定するものではないが、CD91ポリペプチド断片の細胞外ドメインもしくはその断片と実質的に相同な領域(例えば、種々の実施形態において、同一のサイズを有するアミノ酸配列にわたって、または、当業界で公知のコンピューターホモロジープログラムでアライメントを行なった配列と比較したとき、少なくとも60%、70%、80%、90%または95%の同一性を有する領域)を含む分子、またはその領域をコードする核酸がHSPと結合するCD91ポリペプチド断片をコードする配列と、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、もしくは非ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる、そのような領域を含む分子が挙げられる。ある特定の実施形態においては、CD91ポリペプチド断片の誘導体は、そのアミノ末端もしくはカルボキシ末端でペプチド結合を介して異なるタンパク質のアミノ酸配列と連結されたCD91ポリペプチド断片のHSP結合性部分(好ましくは、少なくとも1つのCl-IIの補体リピートからなるもの)を含んでなる、キメラタンパク質もしくは融合タンパク質である。そのようなキメラタンパク質は、切断再精製ステップを省くことにより、上述のように組換え的に製造することができる。
【０２１８】
他のHSP結合性CD91ポリペプチド断片誘導体は、CD91ポリペプチド断片コード配列を、機能的に同等の分子を提供するような置換、付加、もしくは欠失によって改変することにより作製することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のため、HSP結合性CD91ポリペプチド断片コード配列もしくはその断片と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を本発明の実施に用いることができる。HSP結合性CD91ポリペプチド断片誘導体の適切な改変および製造の選択は、上述したものと同じ原理をCD91ポリペプチド断片誘導体に適用し、セクション5.1.2および5.1.3で述べた一般的な方法を用いて行うことができる。
【０２１９】
HSPペプチド
この実施形態の別の様式においては、アンタゴニストはHSP配列の少なくとも10個連続したアミノ酸を含むペプチドである。そのようなペプチドは、CD91ポリペプチド断片のリガンド結合部位と結合して、HSPもしくはHSP複合体の相互作用をブロックすることができる。かかるペプチドは合成的にまたは標準的な分子生物学的技法を用いて製造することができる。天然のHSPのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、通常、GenBankなどの配列データベースから入手可能である。そのデータベースを閲覧し、登録番号によって目的のアミノ酸配列および遺伝的配列データを検索するために、Entrezなどのコンピュータープログラムを用いることができる。そのようなペプチドの組換えおよび合成による製造方法については、セクション5.1.2および5.1.3に記載される。
【０２２０】
さらに、上述のセクション5.2に記載した技法などによって同定されたものなどの、CD91ポリペプチド断片の活性をモジュレートすることのできる化合物は、当業者に周知の標準的な技法を用いて投与することができる。
【０２２１】
RAP
本発明の一実施形態においては、HSP-CD91ポリペプチド断片競合的アンタゴニストは、α2MR結合タンパク質(α2MR-associated protein：RAP)(GenBank登録番号A39875)もしくはそのCD91ポリペプチド断片結合性部分である。この実施形態の特定の様式では、RAPのCD91ポリペプチド断片結合性部分は、少なくとも10個(連続した)アミノ酸からなるRAP RBDの断片からなるか、またはその断片を含んでなる。この実施形態の他の様式では、その断片は、RBDの少なくとも20、30、40、50、75、もしくは100アミノ酸からなる。この実施形態の特定の様式においては、そのような断片は28、50、もしくは100アミノ酸より大きくない。この実施形態の他の特定の様式においては、RAPのp95結合性部分は、例えばNielsenら、前掲、図3、グループDもしくはEに示されているような、ドメイン1または3のCD91ポリペプチド断片結合性部分を含んでなる。組換えRAPまたはそのCD91ポリペプチド断片結合性部分の発現は、好ましくはAndersenらの米国特許第5,399,349号に記載されているように行なう。
【実施例】
【０２２２】
6.  実施例：  p95およびp110のクローニング、発現および精製
6.1  はじめに
本明細書中に提供する実施例は、マクロファージおよび樹状細胞中に存在するCD91とgp96、hsp90、hsp70およびカルレティキュリンとの相互作用を首尾よく同定したことについて記載する。ここに提供する実験は、p95もしくはp110ポリペプチドまたはその断片、あるいはその類似体、誘導体もしくは擬似体の精製のための、ならびに本発明のスクリーニング法および治療法のための基礎を成すものである。
【０２２３】
6.2  材料および方法
HSPの精製  HSPは、Srivastava, P.K., 1997, Methods: A companion to Methods in Enzymology 12:165-171; BasuおよびSrivastava, 1999, J. Exp. Med. 189(5):797-802に記載されるように精製した。精製に用いた全てのバッファーは、内毒素フリーの水（Nanopure Infinity UV/UF, Barnstead/Thermolyne, Dubuque, IA）を用いて調製し、また、精製に用いた全てのガラス器具類は内毒素フリーの水で洗浄し、400iFのオーブン（Gruenberg, Wlliamsport, PA）で焼いた。HSP含有画分はイムノブロットによって同定した。
【０２２４】
FITCへのタンパク質の結合および細胞の染色  FluoroTag FITCコンジュゲーションキット（SIGMA）を用いて製造業者のプロトコルに従い、精製したタンパク質をFITCに結合させた。かかる結合は、SDS-PAGEによる分子量の2 kDa増加および抗FITCモノクローナル抗体を用いたイムノブロットによって確認した。示した量のFITCタグ付きタンパク質と細胞を、1％脱脂粉乳（Carnation(登録商標)）含有PBSの存在下で4℃にて20分間インキュベートした。繰返し洗浄した後、フローサイトメトリー（Becton Dickenson, La Jolla, California）により細胞を分析した。また、FACScan分析の直前に、細胞をヨウ化プロピジウムでも標識した。ヨウ化プロピジウムについて陽性に染色される細胞をイベントから除外した。プリスタン処理マウスまたは非プリスタン処理マウス由来のMac-1+細胞へのHSPの結合において差異は見られなかった。固定されたまたは固定されていない細胞をFITCタグ付きHSPで上記のように標識した。Zeiss LSM共焦点顕微鏡を用いて標識細胞を可視化した。
【０２２５】
アフィニティークロマトグラフィー  容量2ml中のタンパク質（1mg）を、還元剤（NaCNBH3）を加えた平衡化AminoLinkビーズ含有PBS（2ml）と一緒に、１時間インキュベートした。カラムを徹底的に洗浄することにより未結合のタンパク質を除去し、未反応基をクエンチングさせた。固定化の収率は、一般には、タンパク質の出発量の92％を超えていた。カラムは使用するまで4℃で保存した。このようなカラムは、本明細書に記載する抗体（Srivastavaら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 83:3407-3411に記載されたように精製した）およびアルブミンを用いて作製した。
【０２２６】
組換えヒトCD91-p95またはp110断片の精製  可溶性のエピトープタグ付きCD91-p95またはp110タンパク質を発現しかつ輸送する構築物を遺伝子工学的に作製した。この構築物は、トロンビンプロテアーゼの認識および切断部位、トロンビン、モノクローナル抗体エピトープ、HA(赤血球凝集素)(12CA5)エピトープ、ビオチン-リガーゼ認識配列(AviTag Biotin Ligase)、および遺伝子操作により導入された停止コドンの直前の6X-Hisヘキサヒスチジン精製配列をコードする合成オリゴヌクレオチドに機能的に連結されたヒトCD91のp95またはp110 cDNA断片（それぞれ配列番号1または12）を含んでいた。発現プラスミドDNAをHEK-293にトランスフェクトした。薬剤耐性により選択した後、組換えエピトープタグ付きヒトCD91-p95またはp110タンパク質を高レベルで分泌する細胞クローンからの上清を、組換えヒトCD91-p95またはp110タンパク質の一段階精製のための抗HAアフィニティー樹脂にアプライした。タグ付きタンパク質断片上のエピトープと結合する抗HA抗体およびHRPコンジュゲート抗ペンタHis抗体を用いてELISAアッセイを行なってタンパク質断片の存在を確認した。タグ付きタンパク質断片上のエピトープと結合する抗CD91(8G1)抗体およびHRPコンジュゲート抗HA抗体を用いてELISAアッセイを行ない、タンパク質断片の存在を確認した。薬剤耐性により選択した後、組換えエピトープタグ付きヒトCD91-p95またはp110タンパク質を高レベルで分泌する細胞クローンからの上清を、組換えヒトCD91-p95またはp110タンパク質の一段階精製のためのNi-NTAアフィニティー樹脂にアプライすることもできる。
【０２２７】
6.3  結果
p80の発現
RT-PCR反応においてランダムデカマー（random decamer）を用いて全ヒト肝臓RNAからcDNAを合成した（2001年4月）。CD91遺伝子（LDL受容体関連タンパク質のヒトmRNA；GenBank登録番号#X13916）の特定した断片に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーは、このcDNAから予想された2.35kBの産物を増幅した。そのアンプリコンをクローン化して配列決定を行った。プライマーは、CD91の最初の728アミノ酸をコードするこの配列の領域を増幅するように選択した。このCD91の728アミノ酸N末端部分からの翻訳タンパク質の分子量は約80kDである。
【０２２８】
可溶性のエピトープタグ付きCD91-p80タンパク質を発現しかつ輸送する構築物を遺伝子工学的に作製した。「タグ」配列は、トロンビン、HA(赤血球凝集素)(12CA5)エピトープ、ビオチン-リガーゼ認識配列(AviTag Biotin Ligase)、および遺伝子操作により導入された停止コドンの直前の6X-Hisヘキサヒスチジン精製配列をコードするCD91-p80 PCR産物の末端にインフレームで付加させた。この構築物を哺乳動物発現ベクターpCDNA3 (Invitrogen)にクローン化して種々の哺乳動物細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクション上清中に分泌された組換えCD91-p80を検出するのに失敗した後、抗HA-FITCを用いてトランスフェクト細胞に対してIFAを行なった。IFAは個々の細胞が抗HA-FITCを明るく染色することをはっきりと示した。これらの細胞はCD91断片に連結されたHAペプチドを非生産的に発現する。しかし、この組換えCD91-p80は誤ってフォールディングされているらしく、小胞体内に隔離されていた。
【０２２９】
したがって、可溶性のエピトープタグ付きCD91-p80発現タンパク質を発現しかつ輸送するように作製されたp80構築物は、細胞内コンパートメントに保持されたタンパク質を生産したにすぎなかった。
【０２３０】
p95およびp110の発現
本発明者らは、CD91の三次構造（最も顕著には、6個のYWTDのβプロペラーモチーフ）の重要性と、その三次構造が分泌型の機能性組換えタンパク質の発現に及ぼす影響について認識していた。CD91-p80構築物はβプロペラーモチーフを破壊する位置で終結している。この問題を解消するためにCD91-p80クローンの伸長を設計した。この伸長は、p95をコードするcDNAをもたらすCD91の追加の123アミノ酸をコードして、明確に定められた三次構造を保存する領域で終結するように設計された。追加された伸長により、翻訳された組換えタンパク質の分子量は約95kD（CD91のN末端から851アミノ酸）となる。得られたCD91断片はp95（配列番号2）と命名した。
【０２３１】
p110の場合には、CD91のさらなる135アミノ酸が追加された。追加された伸長により、翻訳された組換えタンパク質の分子量は約110kD（CD91のN末端から986アミノ酸）となり、得られたCD91断片はp110（配列番号12および13）と命名した。
【０２３２】
p95伸長部分は、ヒトCD91 RNAの5'末端の3.3kBクローン化領域を鋳型として用いたPCRにより生成させた。この伸長部分を既存のCD91-p80クローンにインフレームでクローン化したが、これはC末端の「タグ」配列をすべて維持している。
【０２３３】
可溶性のエピトープタグ付きCD91-p95タンパク質は成功裏に発現され、この構築物により輸送された。発現されたタンパク質はp95断片、トロンビン、HAエピトープ(12CA5)、AviTag Biotin Ligase、および6X-Hisから成っていた（配列番号3）。pcDNA3 (Invitrogen)およびpcDNA5/FRT/TO (Invitrogen)発現ベクターにクローン化した該構築物でトランスフェクトされた細胞は、抗HAおよび抗CD91(8G1)により認識される100kD範囲のタンパク質を分泌することがELISAによって示された。HAアフィニティーカラムから溶出されたp95エピトープタグ付きタンパク質はクーマシーブリリアントブルーによる染色で可視化した（図2）。CD91のp80断片の場合には細胞内コンパートメントに制限されたが、この発現タンパク質は制限されなかった。
【０２３４】
同様に、p110発現構築物を作製し、発現されたタンパク質はNi-NTAを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した（図5）。
【０２３５】
これらの方法はまた、CD91のドメインII領域まで伸長しているアミノ酸配列からなる本発明のCD91ポリペプチド断片を組換え的に発現させるためにも用いられる。他の実施形態では、CD91断片はp95に加えて、CD91のドメインIII領域まで伸長している追加のアミノ酸配列を含んでなる。さらに他の実施形態では、CD91断片は、CD91のドメインIV領域まで伸長している追加のアミノ酸配列を含んでなる。さらに他の実施形態では、CD91断片は、上記のセクション5.2に記載するような特定のアミノ酸残基の断片を含んでなる。
【０２３６】
p282の発現
cDNAのp282 CD91断片は、4つの追加のYWTDβプロペラー構造モチーフをコードしており、この断片はCD91配列（配列番号2）のアミノ酸残基2517まで伸長している（図4参照（配列番号7））。特に、p282断片は、p110よりもさらに4つのプロペラー領域（それぞれ配列番号2のアミノ酸残基l269-1531、1583-1846、1934-2151および2199-2473に対応する）をコードするアミノ酸残基を含んでなる。追加のアミノ酸への伸長は、組換え発現に必要な、明確に定められた三次構造を保存する。追加された伸長により、翻訳された組換えタンパク質の分子量は約282kD（CD91のN末端から2517アミノ酸）となる。得られたCD91断片をp282（配列番号7）と命名する。
【０２３７】
p282伸長部分は、ヒトCD91 RNAのクローン化領域を鋳型として用いたPCRにより生成させる。この伸長部分を既存のCD91-p80クローンにインフレームでクローン化するが、これはC末端の「タグ」配列をすべて保持する。
【０２３８】
可溶性のエピトープタグ付きCD91-p282タンパク質は成功裏に発現され、この構築物により輸送される。発現されたタンパク質はp282断片、トロンビン、HAエピトープ(12CA5)、AviTag Biotin Ligase、および6X-Hisから成る（配列番号6）。pcDNA3 (Invitrogen)およびpcDNA5/FRT/TO (Invitrogen)発現ベクターにクローン化した該構築物でトランスフェクトされた細胞は、抗HAおよび抗CD91により認識される290kD範囲のタンパク質を分泌することをELISAによって確認する。HAアフィニティーカラムから溶出されるp282エピトープタグ付きタンパク質はクーマシーブリリアントブルーによる染色で可視化する。CD91のp80断片の場合には細胞内コンパートメントに制限されたが、この発現タンパク質は制限されない。p282発現タンパク質はNi-NTAを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【０２３９】
p373の発現
cDNAのp373 CD91断片は、追加の完全なYWTDβプロペラー構造モチーフをコードしており、この断片はCD91配列（配列番号2）のアミノ酸残基3330まで伸長している（図4参照（配列番号9））。特に、p373断片は、p282よりもさらに1つのプロペラー領域（配列番号2のアミノ酸残基3019-3284に対応する）をコードするアミノ酸残基を含んでなる。追加のアミノ酸への伸長は、組換え発現に必要な、明確に定められた三次構造を保存する。追加された伸長により、翻訳された組換えタンパク質の分子量は約373kD（CD91のN末端から3330アミノ酸）となる。得られたCD91断片をp373（配列番号9）と命名する。
【０２４０】
p373伸長部分は、ヒトCD91 RNAのクローン化領域を鋳型として用いたPCRにより生成させる。この伸長部分を既存のCD91-p80クローンにインフレームでクローン化するが、これはC末端の「タグ」配列をすべて保持する。
【０２４１】
可溶性のエピトープタグ付きCD91-p373タンパク質は成功裏に発現され、この構築物により輸送される。発現タンパク質はp373断片、トロンビン、HAエピトープ(12CA5)、AviTag Biotin Ligase、および6X-Hisから成る（配列番号8）。pcDNA3 (Invitrogen)およびpcDNA5/FRT/TO (Invitrogen)発現ベクターにクローン化した該構築物でトランスフェクトされた細胞が、抗HAおよび抗CD91により認識される380kD範囲のタンパク質を分泌することをELISAによって確認する。HAアフィニティーカラムから溶出されるp373エピトープタグ付きタンパク質はクーマシーブリリアントブルーによる染色で可視化する。CD91のp80断片の場合には細胞内コンパートメントに制限されたが、この発現タンパク質は制限されない。p373発現タンパク質はNi-NTAを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【０２４２】
p494の発現
cDNAのp494 CD91断片は、追加のYWTDβプロペラー構造モチーフをコードしており、この断片はCD91配列（配列番号2）のアミノ酸残基4420まで伸長している（図4参照（配列番号11））。特に、p494断片は、p373よりもさらに1つのプロペラー領域（配列番号2のアミノ酸残基3828-4142に対応する）をコードするアミノ酸残基を含んでなる。p494断片はまた、配列番号2の残基3943にフューリン(furin)切断部位をコードするアミノ酸残基と、配列番号2の残基4075および4125にCHO側基をも含んでなる。本発明者らは、p95によりコードされるCD91三次構造（最も顕著には、6個のYWTDのβプロペラーモチーフ）の重要性と、その三次構造が分泌型の機能性組換えタンパク質の発現に及ぼす影響について認識していた。追加のアミノ酸への伸長は、組換え発現に必要な、明確に定められた三次構造を保存する。追加された伸長により、翻訳された組換えタンパク質の分子量は約494kD（CD91のN末端から4420アミノ酸）となる。得られたCD91断片をp494（配列番号11）と命名する。
【０２４３】
p494伸長部分は、ヒトCD91 RNAのクローン化領域を鋳型として用いたPCRにより生成させる。この伸長部分を既存のCD91-p80クローンにインフレームでクローン化するが、これはC末端の「タグ」配列をすべて保持する。
【０２４４】
可溶性のエピトープタグ付きCD91-p494タンパク質は成功裏に発現され、この構築物により輸送される。発現タンパク質はp494断片、トロンビン、HAエピトープ(12CA5)、AviTag Biotin Ligase、および6X-Hisから成る（配列番号10）。pcDNA3 (Invitrogen)およびpcDNA5/FRT/TO (Invitrogen)発現ベクターにクローン化した該構築物でトランスフェクトされた細胞が、抗HAおよび抗CD91により認識される500kD範囲のタンパク質を分泌することをELISAによって確認する。HAアフィニティーカラムから溶出されたp494エピトープタグ付きタンパク質をクーマシーブリリアントブルーによる染色で可視化する。CD91のp80断片の場合には細胞内コンパートメントに制限されたが、この発現タンパク質は制限されない。p494発現タンパク質はNi-NTAを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製する。
【０２４５】
本発明は、本発明の個々の態様を１つずつ例示するものである具体的な実施形態によってその範囲を限定されるものではなく、機能的に同等な方法および構成要素は、本発明の範囲内に含まれる。実際に、本明細書中に示され記載されたもの以外にも、これまでの説明および添付した図面を見れば、当業者には本発明の様々な改変が自明となろう。このような改変は、本発明の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【０２４６】
本明細書中に引用された全ての参考文献（特許出願、特許および他の刊行物を含む）は、あらゆる目的のために、本明細書中に参照によりその全体が組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２４７】
【図１】マルチリガンド受容体であるCD91を示した図である。
【図２】組換えヒトCD91-p95断片の発現および抗HA Mabアフィニティーカラムによる精製を示した図である
【図３】マウスCD91-p80タンパク質の構造モチーフ（配列番号4）を示した図である。
【図４】ヒトCD91タンパク質の構造モチーフ（配列番号5）を示した図である。
【図５】p95（第1のレーン）およびp110（第2のレーン）のNi-NTA精製された組換えCD91断片のアクリルアミドゲルの写真を示した図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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