(57)【要約】本発明は生物学の分野に関する。特に、それは、免疫原性の増大を提供するためのマルチエピトープ核酸及びペプチドワクチン及びかかるワクチンの設計方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープpol５６２、pol７４５、env３３２、pol５３０、pol３８８、env２４９、env３５９、pol６４０、env３３５、env１８３、env３１３、core１１７、core１９、core１８、core４１９、pol３９２、pol５３１、pol４１５、pol４７、pol４５５、core１４１、pol４２９、env２３６、pol１６６、pol５３８、core１０１、pol３５４及びcore１３７（すなわち、各々表７中の関連配列から成るＨＢＶ ＣＴＬ）をコードする核酸を含むマルチエピトープ構築体、ここで当該複数の核酸は同じ読取り枠内で互いに直接的又は間接的に接合されている；
（ｂ）  （ａ）のＣＴＬエピトープ核酸に対して同じ読取り枠内で直接的又は間接的に接合された、ＨＢＶ ＣＴＬエピトープpol６６５（すなわち表７中のpol６６５エピトープ）をコードする核酸をさらに含む、（ａ）のマルチエピトープ構築体；
（ｃ）  Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープpol１４９、core１８、pol５６２、pol５３８、pol４５５、env１８３、core１４１、pol６６５、env３３５、env３１３、pol３５４、pol６２９、core１９、pol１５０、pol４７、pol３８８、pol５３１及びpol６４２をコードする核酸を含むマルチエピトープ構築体、ここで当該複数の核酸は同じ読取り枠内で互いに直接的又は間接的に接合されている；
（ｄ）  ＣＴＬエピトープ核酸に対し同じ読取り枠内で直接的又は間接的に接合された１又は複数のスペーサ核酸をさらに含む、（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）のマルチエピトープ構築体；
（ｅ）  （ａ）の複数のＣＴＬエピトープ核酸の間、（ａ）及び（ｂ）のＣＴＬエピトープ核酸の間、（ａ）及び（ｂ）のＣＴＬエピトープ核酸並びに（ａ）のＣＴＬエピトープ核酸及び（ｃ）のＣＴＬエピトープ核酸の間、又は（ｃ）の複数のＣＴＬエピトープ核酸の間に１又は複数のスペーサ核酸が位置づけされている、（ｄ）のマルチエピトープ構築体；
（ｆ）  スペーサ核酸が長さ１〜８残基のアミノ酸配列をコードする、（ｄ）又は（ｅ）のマルチエピトープ構築体；
（ｇ）  スペーサ核酸のうち２つ以上のものが異なる（すなわち同一でない）アミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｈ）  スペーサ核酸のうちの２つ以上のものがその他のスペーサ核酸によりコードされたアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｉ）  スペーサ核酸のうちの２つ以上のものが同一のアミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｈ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｊ）  スペーサ核酸のうちの１又は複数のものが３つ連続するアラニン（Ａｌａ）残基を含む又はこれらの残基から成るアミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｉ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｋ）  ＣＴＬエピトープ核酸及び／又はスペーサ核酸に対し同じ読取り枠内で直接的又は間接的に接合されたＨＴＬエピトープをコードする１又は複数の核酸をさらに含む、（ａ）〜（ｊ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｌ）  ＨＴＬエピトープがＰＡＤＲＥ（登録商標）エピトープである、（ｋ）のマルチエピトープ構築体；
（ｍ）  ＨＴＬエピトープがＨＢＶ  ＨＴＬエピトープである、（ｋ）のマルチエピトープ構築体；
（ｎ）  （ｍ）のマルチエピトープ構築体、ここでＨＢＶ  ＨＴＬエピトープはpol７７４、pol６９４、pol１４５、core５０、pol３８５、pol５２３、env３３９、pol５０１、pol４２０、pol４１２、env１８０、core１２０、pol９６、pol６１８、pol７６７、及びpol６６４から成るグループの中から選択される（すなわちＨＢＶ  ＨＴＬエピトープは各々表１１内の関連する配列で構成されている）；
（ｏ）  ＣＴＬエピトープとＨＴＬエピトープの間又は複数のＨＴＬエピトープの間に１又は複数のスペーサ核酸をさらに含む、（ｋ）〜（ｎ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｐ）  さらに１又は複数のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩターゲティング核酸を含む、（ａ）〜（ｏ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｑ）  （Ｐ）のマルチエピトープ構築体、ここでターゲティング核酸はＩｇカッパシグナル配列、組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、インシュリンシグナル配列、小胞体シグナル配列、ＬＡＭＰ−１リソゾームターゲティング配列、ＬＡＭＰ−２リソゾームターゲティング配列、ＨＬＡ−ＤＭリソゾームターゲティング配列、ＨＬＡ−ＤＯのＨＬＡ−ＤＭ−会合配列、Ｉｇ−α細胞質ドメイン、Ｉｇ−β細胞質ドメイン、Ｉｉタンパク質、インフルエンザマトリクスタンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原及び酵母Ｔｙタンパク質から成るグループの中から選択されたターゲティング配列をコードする；
（ｒ）  ＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトーププロセシングのために最適化されている（ａ）〜（ｑ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｓ）  ＣＴＬ核酸がＣＴＬ及び／又はＨＴＬ接合部エピトープの数を最小限におさえるようにえり分けされている（ａ）〜（ｒ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｔ）  ＨＴＬ核酸がＣＴＬ及び／又はＨＴＬ接合部エピトープの数を最小限におさえるようにえり分けされている、（ｋ）〜（ｓ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｕ）  １又は複数の隣接アミノ酸残基をコードする１又は複数の核酸を含む、（ａ）〜（ｔ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｖ）  １又は複数の隣接アミノ酸残基がＣＴＬエピトープ核酸のＣ＋１位置においてＫ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ及びＴから成るグループの中から選択されている、（Ｕ）のマルチエピトープ構築体；
（ｗ）  ＨＢＶ ＣＴＬ核酸が図２７Ａに示されている順序で接合されている、（ａ）〜（ｖ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｘ）  ＨＢＶ  ＨＴＬ 核酸が図２８Ａに示されている順序で接合されている、（ｎ）〜（ｗ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｙ）  ＨＢＶ ＣＴＬ核酸が図３４に示されている順序で接合されている、（ｃ）〜（ｖ）又は（ｘ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｚ）  図２４Ｂ又は表１３、１４、１８又は１９に示されているアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されているペプチドをコードする、（ａ）〜（ｘ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ａａ）  表１３のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜１２４８、表１４のヌクレオチド配列の＋１〜１０３２、図２４Ｃの内のヌクレオチド配列、表１８内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２９２、及び表１９のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２３２から成るグループの中から選択された核酸配列を含む（ｚ）のマルチエピトープ構築体；
（ｂｂ）  表２３又は２４に示されたアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されているペプチドをコードする（ｃ）〜（ｖ）又は（ｘ）又は（ｙ）又は（ｚ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｃｃ）  表２３内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜６１８、又は表２４内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜６５７から成るグループの中から選択された核酸配列を含んで成る（ｂｂ）のマルチエピトープ構築体；
（ｄｄ）  （ａ）〜（ｃｃ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数の調節配列；
（ｅｅ）  （ａ）〜（ｄｄ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数のＩＲＥＳ；
（ｆｆ）  （ａ）〜（ｅｅ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数のプロモータ；
（ｇｇ）  （ａ）〜（ｆｆ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数のＣＭＶプロモータ；
（ｈｈ）  （ａ）〜（ｇｇ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び２つ以上のＣＭＶプロモータ；
（ｉｉ）  （ａ）〜（ｈｈ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及びベクター；
（ｊｊ）  ベクターが発現ベクターである（ｉｉ）のマルチエピトープ構築体；
（ｋｋ）  図２９Ａ（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）内に示されたマルチエピトープ構築体の構造を有する、（ａ）〜（ｊｊ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、を含んで成るポリヌクレオチド。
【請求項２】
２つのマルチエピトープ構築体を含むポリヌクレオチドにおいて、第１のマルチエピトープ構築体が（ａ）〜（ｋｋ）のいずれかの中のＨＢＶマルチエピトープ構築体を含み、第２のマルチエピトープ構築体が（ｎ）にあるＨＢＶ  ＨＴＬエピトープを含み、第１及び第２のマルチエピトープ構築体が直接接合されておらずかつ／又は同じ枠内で接合されていないポリヌクレオチド。
【請求項３】
第１及び第２のマルチエピトープ構築体が調節配列に作用可能式にリンクされている、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
第１及び第２のマルチエピトープ構築体が、少なくとも１つのプロモータ及び少なくとも１つのＩＲＥＳ、１つのプロモータ及び１つのＩＲＥＳ、２つのプロモータ又は２つ以上のプロモータ及び／又はＩＲＥＳから成るグループの中から選択された少なくとも１つの調節配列に作用可能式にリンクされている、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
プロモータがＣＭＶプロモータである、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
２つのマルチエピトープ構築体が図２９Ａ（ｉ）又は（ｉｉ）に示された構造を有する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
第２のマルチエピトープ構築体が、図２４Ｃ又は表１４に示されたアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されているペプチドをコードする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
第２のマルチエピトープ構築体が図２４Ｃ内のヌクレオチド配列及び表１４のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜１０３２の中から選択された核酸配列を含んで成る、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
表１３内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜１２４８、表１８内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２９２、表１９内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２３２、表２３のヌクレオチド＋１〜６１８、及び表２４のヌクレオチド＋１〜６５７から成るグループの中から選択された核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
図２９Ａ（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）中に示されているベクターの構造をもつ、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１３】
図２４Ｂ又は表１３、１４、１８、１９、２３又は２４中に示されているアミノ酸配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１０又は１１に記載のベクター又は請求項１２又は１３に記載のポリペプチド、又はそれらの組合せを含んで成る組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１０又は１１に記載のベクター又は請求項１２又は１３に記載のポリペプチドを含む細胞。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１０又は１１に記載のベクター、請求項１２又は１３に記載のポリペプチド、請求項１４に記載の組成物又は請求項１５に記載の細胞を、それを必要としている個体に対し投与する段階を含む、該個体の体内でＢ型肝炎（ＨＢＶ）に対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１０又は１１に記載のベクター、請求項１２又は１３に記載のポリペプチド、請求項１４に記載の組成物又は請求項１５に記載の細胞を作る方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学の分野に関する。特に、本発明は、免疫原性の増大を提供するためのマルチエピトープ核酸ワクチン及びかかるワクチンの設計方法に関する。
【０００２】
背景
マルチエピトープ（「ミニ遺伝子」例えば「エピ遺伝子」ワクチン）に関連する技術が発達しつつある。複数の独立した研究により、多数のエピトープに対する同時免疫応答の誘発が達成可能であることが実証されてきた。例えば、多数のＴ細胞特異性に対する応答を誘発しかつ検出することが可能である。自然の状況下で、Doolan et al（Immunity, Vol. ７巻（１）；９７〜１１２（１９９７））は、単一の供与体からのＰＢＭＣを用いて１７個もの異なるP. falciparumエピトープに対する再生Ｔ細胞応答を同時に検出した。同様にして、Bertoni及び共同研究者ら（J Clin Invest, Vol. １００巻（３）：５０３−１３，（１９９７））は、単一の供与体内の１２の異なるＨＢＶ由来のエピトープに対する同時ＣＴＬ応答を検出した。マルチエピトープ核酸ワクチンによる免疫に関しては、多数のＴ細胞応答が誘発された複数の例が報告されてきている。例えば、全てのエピトープが免疫原性及び／又は抗原性をもっていた約１０個のＭＨＣクラスＩエピトープから成るミニ遺伝子ワクチンが報告されてきた。特定的には、９個のＥＢＶ（Thomson et al., Proc Natl Acad Sci ＵＳＡ，Vol. ２（１３）；５８４５〜９（１９９５））、７個のＨＩＶ（Woodberry et al., J Virol, Vol.７３（７）：５３２０〜５（１９９９））、１０個のマウス（Thomson et al., J. Immunol, Vol.１６０（４）；１７１７〜２３（１９９８））及び１０個の腫瘍由来（Mateo et al., J.Immunol, Vol.１６３（７）：４０５８−６３（１９９９））エピトープから成るミニ遺伝子ワクチンが活性であることが示されてきた。ＨＢＶ及びＨＩＶから誘導された９個の異なるＨＬＡ−Ａ２、１−及びＡ１１−制限型エピトープをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミドが、全てのエピトープに対するＣＴＬを誘発するということも同様に示されてきた（Ishioka et al., J. Immunol, Vol. １６２巻１６２（７）；３９１５−２５（１９９９））。
【０００３】
かくして、多数のＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ（すなわちＣＴＬ及びＨＴＬ）エピトープを含有するミニ遺伝子ワクチンを設計することが可能であり、全てのエピトープについて提示及び認識を得ることができる。しかしながら、マルチエピトープ構築体の免疫原性は、今までのところその数はわかっていない多数の変数により強い影響を受けるものと思われる。例えば、異なるワクチン構築体という情況下で発現された同じエピトープの免疫原性（又は抗原性）は数ケタ規模で変動し得る。かくして、マルチエピトープワクチン構築体を最適化するための戦略を同定する必要性が存在している。かかる最適化は、強い免疫応答の誘発に関して、又究極的には臨床的有効性にとって重要である。従って、本発明は、多数のエピトープを包含するマルチエピトープワクチンの抗原性及び免疫原性を最適化するための戦略、及びこれらの戦略に従って生成された最適化されたマルチエピトープワクチン、特にミニ遺伝子ワクチンを提供している。
【０００４】
以下の段落では、ミニ遺伝子免疫原性、エピトーププロセシング、及びクラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子と会合状態にある抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の提示に影響を及ぼす可能性のある主たる変数のいくつかが簡単に再考されている。
【０００５】
免疫優性
複合外来性病原体によりコードされる何万もの考えられるペプチドのうち、ＭＨＣクラスＩ抗原に結合しかくしてＴ細胞により認識される能力をもつペプチド形態を最終的にとるのは、ごくわずかな画分でしかないマルチエピトープワクチンの開発に対し明らかに潜在的影響をもつこの現象は、免疫優性として知られている（Yewdell et al., Annu Rev Immunol, １７：５１−８８（１９９９））。複数の主要な変数が免疫優性に寄与する。本書では、細胞内プロセシングの結果として質的にも量的にも適切なペプチドの生成に影響を及ぼす変数について記述する。
【０００６】
接合部エピトープ
接合部エピトープは、２つのその他のエピトープの並置に起因して作り出されるエピトープとして定義される。新しいエピトープは、第１のエピトープから誘導されたＣ末端区分と第２のエピトープから誘導されたＮ末端区分で構成される。接合部エピトープの創造は、次のような理由で、クラスＩ及びクラスＩＩ制限型エピトープの両方について、マルチエピトープミニ遺伝子ワクチンの設計における潜在的問題点となっている。まず第１に、ＨＬＡ遺伝子導入実験動物において免疫原性について標準的にテストされるヒトエピトープから成る又はこれを含有するミニ遺伝子を開発する場合、マウスのエピトープの創造は、望ましくない免疫優性効果を生み出す可能性がある。第２に、ヒトＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ分子のための新しい意図せぬエピトープの創造は、ワクチン受容体の体内で、誘発されたＴ細胞応答の標的である感染した細胞又は腫瘍によって発現されない新しいＴ細胞特異性を惹起する可能性がある。これらの応答は、明らかに無意味で有効でなく、さらには望ましくない免疫優性効果を作り出すことによって、逆効果でさえあり得る。
【０００７】
接合部エピトープの存在については、さまざまな異なる実験状況において立証されてきた。Gefter及び共同研究者らは、まず第１に、２つの異なるクラスＩＩ制限型エピトープが並置され同一線形順序に並んで合成された１つの系における効果を実証した（Perkins et al., J. Immunol, 第１４６巻（７）：２１３７−４４（１９９１）。効果は非常に著しいものであったため、該エピトープの免疫系認識を、これら２つの接合部エピトープによって完全に「沈黙」させることができた（Wang et al., Cell Immunol, 第１４３巻（２）；２８４−９７（１９９２））。接合部エピトープに対して導かれたヘルパーＴ細胞も同様に、ＨＬＡ−Ａ２制限型 ＨＢＶ由来免疫優性ＣＴＬエピトープ及び万能破傷風トキソイドＨＴＬエピトープから成る合成リポペプチドでの免疫化の結果として、人間の体内に観察された（Livingston et al., J.Immunol 第１５９巻（３）：１３８３−９２（１９９７））。かくして、接合部エピトープの創造は、マルチエピトープ構築体の設計における主要な考慮事項である。
【０００８】
本発明は、この問題に対処し接合部エピトープの出現を回避するか又は最小限にする方法を提供する。
【０００９】
隣接領域  クラスＩ制限型エピトープは、複雑なプロセスによって生成される（Yew dell et al., Annu Rev Immunol, １７：５１〜８８（１９９９））。エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる潜在的トリミングが関与する制限されたタンパク質分解の後には、抗原プロセシング分子と会合させられたトランスポータ（ＴＡＰ）による小胞体（ＥＲ）膜を横断した転座が続く。抗原性ペプチド及びそれらの前駆物質の生成に関与する主要細胞質ゾルプロテアーゼ複合体は、プロテアソームである（Niedermann et al., Immunity, 第２巻（３）：２８９−９９（１９９５））であるが、ＣＴＬ前駆物質のＥＲトリミングも同様に実証されてきた（Paz et al., Immunity 第１１巻（２）；２４１−５１（１９９９））。エピトープのＣ及びＮ末端に直接隣接する残基がエピトープ生成の効率に影響を及ぼすか否かは、長い間議論されてきた。
【００１０】
プロセシングされたエピトープの収量及び利用可能性は、免疫原性を決定する上での主な変数として関係するとみなされてきており、かくして、免疫応答の規模がＭＨＣにより接合されＴ細胞認識について表示されたエピトープの量と正比例しうるという点において、ミニ遺伝子の効力全体に対し明らかに大きい影響を有することができた。実際にこのことがあてはまるという証拠は、複数の研究により提供された。例えば、基本的にエピトープ密度に正比例するウイルス特異的ＣＴＬの誘発（Wherry et al., J Immunol, Vol.１６３（７）：３７３５〜４５（１９９９））が観察されてきた。さらに、全長タンパク質で天然に観察されるものよりも高いレベルのエピトープ発現を誘発するために、予備プロセシングされた最適なエピトープをコードする組換え型ミニ遺伝子が使用されてきた（Anton et al, J Immunol, 第１５８巻（６）：２５３５−４２（１９９７））。一般に、ミニ遺伝子初回免疫は、いくつかの例外が指摘されはしたものの（Iwasaki et al., Vaccine, Vol.１７（１５−１６）：２０８１−８（１９９９））全抗原での初回免疫よりもさらに効果的であることが示されてきた（Restifo et al., J Immunol, Vol.１５４（９）：４４１４−２２（１９９５）；Ishioka et al., J Immunol, Vol.１６２（７）：３９１５−２５（１９９９））。
【００１１】
初期の研究から、エピトープ内部の残基が主として免疫原性を調節するという結論が下された（Hahn et al., J  Exp Med, Vol.１７６（５）：１３３５−４１（１９９２））。大部分が無関係の遺伝子内の又は同じ遺伝子であるものの異なる場所でのエピトープの移植に基づいているその他の研究により、類似の結論が得られた（Chimini et al., J Exp Med, Vol. １６９（１）：２９７−３０２（１９８９）；Hahn et al., J Exp Med, Vol.１７４（３）：７３３−６（１９９１））。しかしながら、その他の実験（Del Val et al., Cell, Vol.６６（６）：１１４５−５３（１９９１）；Hahn et al., J Exp Med, Vol. １７６（５）：１３３５−４１（１９９２）は、ＣＴＬエピトープに直接隣接して局在化された残基が直接認識に影響を及ぼし得るということを示唆した（Couillin et al., J Exp Med, Vol.１８０（３）：１１２９−３４（１９９４）；Bergmann et al., J Virol. Vol.６８（８）：５３０６−１０（１９９４））。ミニ遺伝子ワクチンとの関連で、論議は再び開始された。Shastri及び協力者（Shastri et al., J Immunol, Vol. １５５（９）：４３３９−４６（１９９５））は、Ｔ細胞応答がＮ末端隣接残基を変動させることによって著しく影響されないものの、単一のＣ末端隣接残基を添加することによって阻害されるということを発見した。最も劇的な阻害は、Ｃ末端隣接残基としてのイソロイシン、ロイシン、システイン及びプロリンで観察された。これとは対照的に、Gileadi（Gileadi et al., Eur J Immunol, Vol.２９（７）：２２１３−２２（１９９９））は、マウスインフルエンザウイルスエピトープのＮ末端にある残基の一つの機能としての計り知れない効果を報告した。Bergmann及び協力者は、芳香族、塩基性及びアラニン残基が効率の良いエピトープ認識を支援した一方で、Ｇ及びＰ残基は強い阻害を示すということを発見した（Bergmann et al., J Immunol, Vol. １５７（８）：３２４２−９（１９９６））。対照的に、Lippolis（Lippolis et al., J Virol, Vol. ６９（５）：３１３４−４６（１９９５））は、隣接残基を置換すると認識が行われないという結論を下した。しかしながら、プロテアソーム特異性に影響を及ぼす確率の低いむしろ保存的置換のみがテストされた。
【００１２】
これらの効果のそして一般的にはエピトープの特異性は、おおよそプロテアソーム特異性と相関関係をもつように思われる。例えばプロテアソーム特異性は、塩基性アミノ酸の後の分割を伴って、部分的にトリプシン様である（Niedermann et al., Immunity, Vol.２（３）：２８９−９９（１９９５）。それでも、疎水性及び酸性残基のカルボキシル側の効率の良い分割も同様に可能である。これらの特異性と一貫しているのは、ｐ５３エピトープのＣ末端の後の位置におけるＲからＨへの突然変異がタンパク質のプロテアソーム媒介型プロセシングに影響を及ぼすということを発見したSherman及び協力者の研究である（Theobald et al., J Exp Med, Vol.１８８（６）：１０１７−２８（１９９８））。いくつかのその他の研究（Hanke et al., J Gen Virol, Vol.７９（Pt１）：８３−９０（１９９８）；Thomson et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol.９２（１３）：５８４５−９（１９９５））は、最小限のエピトープを用いてミニ遺伝子を構築できること、そして隣接領域を用いたさらなる最適化も同じく認められているもののこれらの隣接配列が必要とされていないように思われることを示した。
【００１３】
要約すると、ＨＬＡクラスＩのエピトープについては、ＣＴＬエピトープのプロセシング及び提示に対する隣接領域の効果は、今までのところ不明確である。ミニ遺伝子ワクチンについては、これまで隣接領域の変調の効果の系統的分析が実施されていない。従って、一般にヒトクラスＩによって制限されたエピトープをコードするミニ遺伝子ワクチンを利用した分析が必要とされている。本発明はこのような分析を提供しており、従って、免疫原性及び抗原性について最適化されたマルチエピトープワクチン構築体及びかかる構築体を設計する方法を提供する。
【００１４】
ＨＬＡクラスＩＩペプチド複合体も同様に、ＨＬＡクラスＩプロセシングとは全く異なる複雑な一連の事象の結果として生成される。プロセシング経路には、不変鎖（Ｉｉ）との会合、特殊化された区画へのその輸送、ＩｉからＣＬＩＰへの分解及びＣＬＩＰのＨＬＡ−ＤＭを触媒とした除去（再考のためには（Blum et al., Crit Rev Immunol, Vol.１７（５−６）：４１１−７（１９９７）；Arndt et al., Immunol Res, Vol.１６（３）：２６１−７２（１９９７））を参照のこと）。さらに、さまざまなカテプシン全般、そして特にカテプシンＳ及びＬには、Ｉｉ分解における潜在的にきわめて重大な役割がある（Nakagawa et al., Immunity, Vol.１０（２）：２０７−１７（１９９９））。しかしながら機能的エピトープの生成に関しては、プロセスは幾分か選択性が低いと思われ（Chapman H.A. Curr Opin Immunol, Vol.１０（１）：９３−１０２（１９９８））、数多くのサイズのペプチドがＭＨＣクラスＩＩに結合し得る（Hunt et al., Science, Vol.２５６（５０６５）：１８１７−２０（１９９２））。考えられるペプチドの大部分又は全てが生成されるように思われる（Moudgil et al., J Immunol, Vol. １５９（６）：２５７４−９（１９９７）；及びThomson et al., J Virol, Vol.７２（３）２２４６−５２（１９９８））。かくして、隣接領域の問題に比べて、特定の実施形態においては、接合部エピトープの創造がより重要な関心事であり得る。
発明の要約
【００１５】
本発明は、複数のＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトープをコードするマルチエピトープ核酸構築体及び（好ましくは核酸構築体によりコードされる）複数のＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトープを含むポリペプチド構築体、ならびにこのような核酸構築体及び／又はポリペプチド構築体を含む細胞、かかる核酸構築体及び／又はポリペプチド構築体及び／又はかかる細胞を含む組成物、及びかかる核酸構築体及び／又はポリペプチド構築体及び／又は組成物及び／又は細胞を利用して免疫応答を刺激するための方法（例えば治療方法）を提供している。
【００１６】
一部の実施形態において、本発明は、（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープpol５６２、pol７４５、env３３２、pol５３０、pol３８８、env２４９、env３５９、pol６４０、env３３５、env１８３、env３１３、core１１７、core１９、core１８、core４１９、pol３９２、pol５３１、pol４１５、pol４７、pol４５５、core１４１、pol４２９、env２３６、pol１６６、pol５３８、core１０１、pol３５４及びcore１３７（すなわち、各々表７中の関連配列から成るＨＢＶ ＣＴＬ）をコードする核酸を含むマルチエピトープ構築体（例えばミニ遺伝子）、ここで複数の当該核酸は同じ読取り枠内で互いに直接的又は間接的に接合されている、；
（ｂ）  （ａ）のＣＴＬエピトープ核酸に対して同じ読取り枠内で直接的又は間接的に接合された、ＨＢＶ ＣＴＬエピトープpol６６５（すなわち表７中のpol６６５エピトープ）をコードする核酸をさらに含む、（ａ）のマルチエピトープ構築体；
（ｃ）  核酸が同じ読取り枠内で互いに直接的又は間接的に接合されている、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープpol１４９、core１８、pol５６２、pol５３８、pol４５５、env１８３、core１４１、pol６６５、env３３５、env３１３、pol３５４、pol６２９、core１９、pol１５０、pol４７、pol３８８、pol５３１及びpol６４２をコードする核酸を含むマルチエピトープ構築体；
（ｄ）  ＣＴＬエピトープ核酸に対し同じ読取り枠内で直接的又は間接的に接合された１又は複数のスペーサ核酸をさらに含む、（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）のマルチエピトープ構築体；
（ｅ）  （ａ）の複数のＣＴＬエピトープ核酸の間、（ａ）及び（ｂ）のＣＴＬエピトープ核酸の間、（ａ）及び（ｂ）のＣＴＬエピトープ核酸及び（ａ）のＣＴＬエピトープ核酸及び（ｃ）のＣＴＬエピトープ核酸の間、又は（ｃ）の複数のＣＴＬエピトープ核酸の間に１又は複数のスペーサ核酸が位置づけされている、（ｄ）のマルチエピトープ構築体；
（ｆ）  スペーサ核酸が長さ１〜８残基のアミノ酸配列をコードする、（ｄ）又は（ｅ）のマルチエピトープ構築体；
（ｇ）  スペーサ核酸のうち２つ以上のものが異なる（すなわち同一でない）アミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｈ）  スペーサ核酸のうちの２つ以上のものがその他のスペーサ核酸によりコードされたアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｉ）  スペーサ核酸のうちの２つ以上のものが同一のアミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｈ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｊ）  スペーサ核酸のうちの１又は複数のものが３つ連続するアラニン（Ａｌａ）残基を含む又はこれらの残基から成るアミノ酸配列をコードする、（ｄ）〜（ｉ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｋ）  ＣＴＬエピトープ核酸及び／又はスペーサ核酸に対し同じ読取り枠内で直接的又は間接的に接合されたＨＴＬエピトープをコードする１又は複数の核酸をさらに含む、（ａ）〜（ｊ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｌ）  ＨＴＬエピトープがＰＡＤＲＥ（登録商標）エピトープである、（ｋ）のマルチエピトープ構築体；
（ｍ）  ＨＴＬエピトープがＨＢＶ  ＨＴＬエピトープである、（ｋ）のマルチエピトープ構築体；
（ｎ）  ＨＢＶ  ＨＴＬエピトープがpol７７４、pol６９４、pol１４５、core５０、pol３８５、pol５２３、env３３９、pol５０１、pol４２０、pol４１２、env１８０、core１２０、pol９６、pol６１８、pol７６７、及びpol６６４から成るグループの中から選択される（すなわちＨＢＶ  ＨＴＬエピトープは各々表１１内の関連する配列で構成されている）、（ｍ）のマルチエピトープ構築体；
（ｏ）  ＣＴＬエピトープとＨＴＬエピトープの間又はＨＴＬエピトープの間に１又は複数のスペーサ核酸をさらに含む、（ｋ）〜（ｎ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｐ）  さらに１又は複数のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩターゲティング核酸を含む、（ａ）〜（ｏ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｑ）  ターゲティング核酸が、Ｉｇカッパシグナル配列、組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、インシュリンシグナル配列、小胞体シグナル配列、ＬＡＭＰ−１リソゾームターゲティング配列、ＬＡＭＰ−２リソゾームターゲティング配列、ＨＬＡ−ＤＭリソゾームターゲティング配列、ＨＬＡ−ＤＯのＨＬＡ−ＤＭ−会合配列、Ｉｇ−α細胞質ドメイン、Ｉｇ−β細胞質ドメイン、Ｉｉタンパク質、インフルエンザマトリクスタンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原及び酵母Ｔｙタンパク質から成るグループの中から選択されたターゲティング配列をコードする、（Ｐ）のマルチエピトープ構築体；
（ｒ）  ＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトーププロセシングのために最適化されている（ａ）〜（ｑ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｓ）  ＣＴＬ核酸がＣＴＬ及び／又はＨＴＬ接合部エピトープの数を最小限におさえるようにえり分けされている（ａ）〜（ｒ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｔ）  ＨＴＬ核酸がＣＴＬ及び／又はＨＴＬ接合部エピトープの数を最小限におさえるようにえり分けされている、（ｋ）〜（ｓ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｕ）  １又は複数の隣接アミノ酸残基をコードする１又は複数の核酸を含む、（ａ）〜（ｔ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｖ）  １又は複数の隣接アミノ酸残基がＣＴＬエピトープ核酸のＣ＋１位置においてＫ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ及びＴから成るグループの中から選択されている、（Ｕ）のマルチエピトープ構築体；
（ｗ）  ＨＢＶ  ＣＴＬ核酸が図２７Ａに示されている順序で接合されている、（ａ）〜（ｖ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｘ）  ＨＢＶ  ＨＴＬ 核酸が図２８Ａに示されている順序で接合されている、（ｎ）〜（ｗ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｙ）  ＨＢＶ  ＣＴＬ核酸が図３４に示されている順序で接合されている、（ｃ）〜（ｖ）又は（ｘ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｚ）  図２４Ｂ又は表１３、１４、１８又は１９に示されているアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されているペプチドをコードする、（ａ）〜（ｘ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ａａ）  表１３のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜１２４８、表１４のヌクレオチド配列の＋１〜１０３２、図２４Ｃの内のヌクレオチド配列、表１８内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２９２、及び表１９のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２３２から成るグループの中から選択された核酸配列を含む（ｚ）のマルチエピトープ構築体；
（ｂｂ）  表２３又は２４に示されたアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されているペプチドをコードする（ｃ）〜（ｖ）又は（ｘ）又は（ｙ）又は（ｚ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｃｃ）  表２３内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜６１８、又は表２４内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜６５７から成るグループの中から選択された核酸配列を含んで成る（ｂｂ）のマルチエピトープ構築体；
（ｄｄ）  （ａ）〜（ｃｃ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数の調節配列；
（ｅｅ）  （ａ）〜（ｄｄ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数のＩＲＥＳ；
（ｆｆ）  （ａ）〜（ｅｅ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数のプロモータ；
（ｇｇ）  （ａ）〜（ｆｆ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び１又は複数のＣＭＶプロモータ；
（ｈｈ）  （ａ）〜（ｇｇ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及び２つ以上のＣＭＶプロモータ；
（ｉｉ）  （ａ）〜（ｈｈ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、及びベクター；
（ｊｊ）  ベクターが発現ベクターである（ｉｉ）のマルチエピトープ構築体；
（ｋｋ）  図２９Ａ（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）内に示されたマルチエピトープ構築体の構造を有する、（ａ）〜（ｊｊ）のいずれかのマルチエピトープ構築体、を含んで成るか又は代替的にはこれらで構成されたポリヌクレオチドを提供している。
【００１７】
一部の実施形態においては、（ａ）〜（ｋｋ）のポリヌクレオチドは図２９Ａ（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）に示されたベクターの構造を有する。
【００１８】
一部の実施形態においては、本発明は、２つのマルチエピトープ構築体を含むポリヌクレオチドにおいて、第１のマルチエピトープ構築体が（ａ）〜（ｋｋ）のいずれかの中のＨＢＶマルチエピトープ構築体を含み、第２のマルチエピトープ構築体が（ｎ）にあるもののようなＨＢＶ  ＨＴＬエピトープを含み、第１及び第２のマルチエピトープ構築体が直接接合されておらずかつ／又は同じ枠内で接合されていないポリヌクレオチドを提供している。各々の第１及び第２のマルチエピトープ構築体は、プロモータ又はＩＲＥＳといった調節配列に作用可能式にリンクされている。第１及び第２のマルチエピトープ構築体を含むポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも１つのプロモータ及び少なくとも１つのＩＲＥＳ、１つのプロモータ及び１つのＩＲＥＳ、２つのプロモータ又は２つ以上のプロモータ及び／又はＩＲＥＳを含むことができる。プロモータは、ＣＭＶプロモータ又は本書に記述されているか又は当該技術分野において既知のその他のプロモータであり得る。好ましい実施形態においては、２つのマルチエピトープ構築体は、図２９Ａ（ｉ）又は（ｉｉ）に示された構造を有する。第２のマルチエピトープ構築体は、図２４Ｃ又は表１４に示されたアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されているペプチドをコードすることができる。第２のマルチエピトープ構築体は、図２４Ｃ内のヌクレオチド配列及び表１４のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜１０３２の中から選択された核酸配列を含み得る。
【００１９】
もう一つの実施形態においては、本発明は、以上で記述されているポリヌクレオチドによってコードさせるべきペプチド、例えば、
（ａ）互いに直接的又は間接的に接合されている、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープpol５６２、pol７４５、env３３２、pol５３０、pol３８８、env２４９、env３５９、pol６４０、env３３５、env１８３、env３１３、core１１７、core１９、core１８、core４１９、pol３９２、pol５３１、pol４１５、pol４７、pol４５５、core１４１、pol４２９、env２３６、pol１６６、pol５３８、core１０１、pol３５４及びcore１３７（すなわち、表７中の配列から成る図２７ＡのＣＴＬエピトープを含むマルチエピトープ構築体（ミニ遺伝子）；
（ｂ）  （ａ）のＣＴＬエピトープに対して直接的又は間接的に接合された、ＨＢＶＣＴＬエピトープpol６６５をさらに含む、（ａ）のマルチエピトープ構築体；
（ｃ）  互いに直接的又は間接的に接合されている、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープpol１４９、core１８、pol５６２、pol５３８、pol４５５、env１８３、core１４１、pol６６５、env３３５、env３１３、pol３５４、pol６２９、core１９、pol１５０、pol４７、pol３８８、pol５３１及びpol６４２を含むマルチエピトープ構築体；
（ｄ）  ＣＴＬエピトープに対し直接的又は間接的に接合された１又は複数のスペーサをさらに含む、（ａ）又は（ｂ）又は（ｃ）のマルチエピトープ構築体；
（ｅ）  （ａ）のＣＴＬエピトープの間、（ａ）及び（ｂ）のＣＴＬエピトープの間、（ａ）及び（ｂ）のＣＴＬエピトープ及び（ａ）のＣＴＬエピトープ及び（ｃ）のＣＴＬエピトープの間、又は（ｃ）のＣＴＬエピトープの間に１又は複数のスペーサが位置づけされている、（ｄ）のマルチエピトープ構築体；
（ｆ）  スペーサの長さが１〜８アミノ酸配列残基である、（ｄ）又は（ｅ）のマルチエピトープ構築体；
（ｇ）  スペーサのうち２つ以上のものが異なる（すなわち同一でない）アミノ酸配列を含むかそれで構成されている、（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｈ）  スペーサのうちの２つ以上のものがその他のスペーサのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されている、（ｄ）〜（ｇ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｉ）  スペーサのうちの２つ以上のものが同一のアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されている、（ｄ）〜（ｈ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｊ）  スペーサのうちの１又は複数のものが３つ連続するアラニン（Ａｌａ）残基を含む又はこれらの残基から成る、（ｄ）〜（ｉ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｋ）  ＣＴＬエピトープ及び／又はスペーサに対し直接的又は間接的に接合された１又は複数のＨＴＬエピトープをさらに含む、（ａ）〜（ｊ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｌ）  １又は複数のＨＴＬエピトープがＰＡＤＲＥ（登録商標）エピトープである、（ｋ）のマルチエピトープ構築体；
（ｍ）  １又は複数のＨＴＬエピトープがＨＢＶ  ＨＴＬエピトープである、（ｋ）のマルチエピトープ構築体；
（ｎ）  １又は複数ののＨＴＬエピトープがpol７７４、pol６９４、pol１４５、core５０、pol３８５、env３３９、pol５０１、pol４２０、pol４１２、env１８０、core１２０、pol９６、pol６１８、pol７６７、及びpol６６４から成るグループの中から選択されている、（ｍ）のマルチエピトープ構築体；
（ｏ）  ＣＴＬエピトープとＨＴＬエピトープの間又はＨＴＬエピトープの間に１又は複数のスペーサをさらに含む、（ｋ）〜（ｎ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｐ）  さらに１又は複数のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列を含む、（ａ）〜（ｏ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｑ）  １又は複数のターゲティング配列が、Ｉｇカッパシグナル配列、組織プラスミノーゲン活性化因子シグナル配列、インシュリンシグナル配列、小胞体シグナル配列、及びＬＡＭＰ−１リソゾームターゲティング配列、ＬＡＭＰ−２リソゾームターゲティング配列、ＨＬＡ−ＤＭリソゾームターゲティング配列、ＨＬＡ−ＤＯのＨＬＡ−ＤＭ−会合配列、Ｉｇ−α細胞質ドメイン、Ｉｇ−β細胞質ドメイン、Ｉｉタンパク質、インフルエンザマトリクスタンパク質、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原及び酵母Ｔｙタンパク質から成るグループの中から選択されている、（Ｐ）のマルチエピトープ構築体；
（ｒ）  ＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトーププロセッシングのために最適化されている（ａ）〜（ｑ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｓ）  ＣＴＬエピトープがＣＴＬ及び／又はＨＴＬ接合部エピトープの数を最小限におさえるようにえり分けされている（ａ）〜（ｒ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｔ）  ＨＴＬエピトープがＣＴＬ及び／又はＨＴＬ接合部エピトープの数を最小限におさえるようにえり分けされている、（ｋ）〜（ｓ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｕ）  １又は複数の隣接アミノ酸残基を含む、（ａ）〜（ｔ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｖ）  １又は複数の隣接アミノ酸残基がＣＴＬエピトープのＣ＋１位置においてＫ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｃ及びＴから成るグループの中から選択されている、（Ｕ）のマルチエピトープ構築体；
（ｗ）  ＨＢＶ  ＣＴＬエピトープが図２７Ａに示されている順序で接合されている、（ａ）〜（ｖ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｘ）  ＨＢＶ  ＨＴＬエピトープが図２８Ａに示されている順序で接合されている、（ｎ）〜（ｗ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｙ）  ＨＢＶ  ＣＴＬ核酸が図３４に示されている順序で接合されている、（ｃ）〜（ｖ）又は（ｘ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｚ）  図２４Ｂ又は表１３、１４、１８又は１９に示されているアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されている、（ａ）〜（ｘ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ａａ）  表１３のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜１２４８、表１４のヌクレオチド配列の＋１〜１０３２、図２４Ｃの内のヌクレオチド配列、表１８内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２９２、及び表１９のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜２２３２から成るグループの中から選択された核酸配列によりコードされている（ｚ）のマルチエピトープ構築体；
（ｂｂ）  表２３又は２４に示されたアミノ酸配列を含むか又はそれらで構成されている（ｃ）〜（ｖ）又は（ｘ）又は（ｙ）のいずれかのマルチエピトープ構築体；
（ｃｃ）  表２３内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜６１８、又は表２４内のヌクレオチド配列のヌクレオチド＋１〜６５７から成るグループの中から選択された核酸配列によりコードされる（ｂｂ）のマルチエピトープ構築体、
含むか又はそれらで構成されているぺプチドを提供する。
【００２０】
その他の実施形態においては、本発明は、上述のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを含む細胞；ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド及び／又は細胞を含む組成物；これらのポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞及び組成物を作るための方法；及びこれらのポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド及び／又は細胞及び／又は組成物を利用する免疫応答刺激方法（例えば治療的及び／又は予防的方法）を提供している。本発明については以下でさらに詳細に記述されている。
【００２１】
定義
以下の定義は、当業者が本書に開示されている本発明の好ましい実施形態のいくつかを理解できるようにするために提供される。しかしながら、これらの定義は、単なる一例であり、請求の範囲に記されている本発明の範囲を制限するために使用されるべきものではない。当業者であれば、以下の定義に対するわずかな修正を加え、本書に開示された発明を理解し実践するためにかかる修正された定義を利用することができるであろう。当業者にとっては明白となる、以下に記されたクレームに対し適用可能でありうるこのような修正は、本発明の範囲内に入るものとみなされる。
【００２２】
この開示全体を通して、「結合データ」は、「ＩＣ50」の形で表現されている。ＩＣ50は、基準ペプチドの結合の５０％の阻害が観察される結合検定におけるペプチド濃度のことである。検定が行なわれる条件（すなわち制限的ＨＬＡタンパク質及び標識されたペプチドの濃度）を考慮すると、これらの値はＫD値に近い。結合を決定するための検定については、例えばＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／２０１２７及びＷＯ９４／０３２０５において詳細に記述されている。検定条件が変動させられた場合、そして使用される特定の試薬（例えばＨＬＡ調製物など）に応じて、ＩＣ50値は往々にして劇的に変化し得るということに留意すべきである。例えば、ＨＬＡ分子の濃度が過剰であると、一定の与えられたリガンドの見かけの測定上のＩＣ50を増大させることになる。代替的には、結合は基準ペプチドとの関係において表現される。特定の検定の感度が増減するにつれて、テスト対象のペプチドのＩＣ50は幾分か変化しうるものの、基準ペプチドとの関係における結合は著しく変化しない。例えば、基準ペプチドのＩＣ50が１０倍増大するような条件下で行なわれた検定においては、テストペプチドのＩＣ50値も同様におよそ１０倍シフトすることになる。従ってあいまいさを避けるため、ペプチドが、良、中間、弱又は負のいずれの結合剤であるかの査定は一般に、標準ペプチドのＩＣ50との関係におけるそのＩＣ50に基づいている。結合は同様に、生きた細胞（例えばCeppellini et al., Nature ３３９：３９２，１９８９；Christnick et al., Nature ３５２：６７，１９９１；Busch et al., Int. Immunol. ２：４４３，１９９９０；Hill et al., J. Immunol. １４７：１８９，１９９１；del Guercio et al., J. Immunol. １５４：６８５，１９９５）、洗浄剤溶解物を用いた無細胞系（例えばCerundolo et al., J. Immunol. ２１：２０６９，１９９１），固定化された精製済みＭＨＣ（例えばHill et al., J. Immunol.１５２，２８９０，１９９４；Marshall et al., J. Immunol.１５２：４９４６，１９９４）、ＥＬＩＳＡシステム（例えばReay et al., ＥＭＢＯ J.１１：２８２９，１９９２）、表面プラズモン共鳴（例えばKhilko et al., J. Biol. Chem. ２６８：１５４２５，１９９３）；ハイフラックス可溶相検定（Hammer et al., J. Exp. Med. １８０：２３５３，１９９４）、及びクラスＩＭＨＣ安定化又はアセンブリの測定（例えばLjunggren et al., Nature ３４６：４７６，１９９０；Schumacher et al., Cell ６２：５６３，１９９０；Townsend et al., Cell ６２：２８５，１９９０；Parker et al., J. Immunol. １４９：１８９６，１９９２）を用いたものを含めたその他の検出システムを用いて決定可能である。
【００２３】
「カルボキシ末端」又は「カルボキシ末端位置」といったエピトープ中の残基の位置の呼称は、以下に定義する通りの従来の命名法を用いて呼称されるペプチドのカルボキシル末端に最も近いエピトープの端部にある残基位置を意味している。「Ｃ＋１」は、エピトープのＣ末端残基のすぐ後の残基又は位置すなわちエピトープのＣ末端に隣接する残基を意味している。マルチエピトープ構築体のカルボキシル端部で発生するエピトープの「カルボキシル末端位置」は、ポリペプチドのカルボキシル末端端部に実際に対応していてもいなくてもよい。好ましい実施形態においては、最適化されたマルチエピトープ構築体内で利用されるエピトープは、モチーフ担持エピトープであり、エピトープのカルボキシル末端は、特定のモチーフに対応する一次アンカー残基との関係において定義づけされる。
【００２４】
「アミノ末端」又は「アミノ末端位置」といったエピトープの中の残基の位置の呼称は、以下に定義する通りの従来の命名法を用いて呼称されるペプチドのアミノ末端に最も近いエピトープの端部にある残基位置を意味している。「Ｎ−１」は、１つのエピトープのアミノ末端端部（位置番号１）においてエピトープにすぐ隣接する残基又は位置を意味している。マルチエピトープ構築体のアミノ端部で発生するエピトープの「アミノ末端位置」は、ポリペプチドのアミノ末端端部に実際に対応していてもいなくてもよい。好ましい実施形態においては、最適化されたマルチエピトープ構築体内で利用されるエピトープは、モチーフ担持エピトープであり、エピトープのアミノ末端は、特定のモチーフに対応する一次アンカー残基との関係において定義づけされる。
【００２５】
「コンピュータ」又は「コンピュータシステム」というのは一般に、プロセッサ；例えばハードドライブ、ディスクドライブ又はテープドライブといったような少なくとも１つの情報記憶／検索装置；例えばキーボード、マウス、タッチスクリーン又はマイクロホンといったような少なくとも１つの入力装置及び表示構造を含む。さらに、コンピュータには、本書で開示されているマルチエピトープ構築体最適化機能を実施するべく遠隔ユーザーがネットワークを介してコンピュータと通信できるようにネットワークと通信状態にある通信チャンネルが含まれていてよい。このようなコンピュータには、以上でリストアップされているもの以上のもの又は以下のものが含まれる可能性もある。ネットワークは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）又はワールドワイドウェブ（例えばインターネット）といったようなグローバルネットワークであってよい。
【００２６】
本書で使用されている「構築体」という語は、一般に、自然には発生しない組成物を表わしている。構築体は、「ポリヌクレオチド構築体」であっても「ポリペプチド構築体」であってもよい。構築体は、核酸及びアミノ酸及びペプチド及びポリペプチドのための化学的合成技術又は例えば組換え型ＤＮＡ調製及び発現といった合成技術によっても生産可能である。構築体は、その結果がその形態では自然界で発見されないような形で、１つの材料ともう１つの材料の付加又は親和によっても生産可能である。
【００２７】
核酸及びポリヌクレオチドを意味する場合「マルチエピトープ構築体」という語は、「ミニ遺伝子」及び「マルチエピトープ核酸ワクチン」及びその他の同等の語句と互換的に使用することが可能であり、好ましくはクラスＩ  ＨＬＡ及びＴ細胞レセプタ又はクラスＩＩ  ＨＬＡ及びＴ−細胞レセプタである免疫系内で機能する分子に結合し得るあらゆる長さのペプチドエピトープをコードする多数のエピトープ核酸を含む。マルチエピトープ構築体内のエピトープ核酸は、クラスＩ  ＨＬＡエピトープ及び／又はクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをコードすることができる。クラスＩ  ＨＬＡコーディングエピトープ核酸は、ＣＴＬエピトープ核酸と呼ばれ、クラスＩＩ  ＨＬＡコーディングエピトープ核酸は、ＨＴＬエピトープ核酸と呼ばれる。一部のマルチエピトープ構築体は、クラスＩ  ＨＬＡエピトープをコードするマルチエピトープ核酸のサブセット及びクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをコードするマルチエピトープ核酸のもう１つのサブセットを有することができる。ＣＴＬエピトープ核酸は好ましくは、長さが約１５残基未満又は約１３アミノ酸未満、又は約１１アミノ酸未満、好ましくは長さ約８〜約１３アミノ酸より好ましくは長さ約８〜約１１アミノ酸（例えば８、９、１０、又は１１）そして最も好ましくは長さ約９又は１０アミノ酸のエピトープペプチドをコードする。ＨＴＬエピトープ核酸は、長さ約５０残基未満のエピトープペプチドをコードすることができ、通常は約６〜約３０個の残基、より普通には約１２〜２５、往々にして約１５〜２０個の残基で構成され、好ましくは約７〜約２３、好ましくは約７〜約１７、より好ましくは約１１〜約１５（例えば１１、１２、１３、１４、又は１５）そして最も好ましくは約１３個のアミノ酸の長さを有する。本書で記述されているマルチエピトープ構築体は好ましくは、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、又は２５個以上のエピトープ核酸を内含している。マルチエピトープ構築体内のエピトープ核酸は全て、１つの生体に由来するものであってよく（例えば全てのエピトープ核酸のヌクレオチド配列はＨＢＶ又はＨＩＶ菌株の中に存在し得る）、そうでなければマルチエピトープ構築体は、２つ以上の異なる生体内に存在するエピトープ核酸配列を内含していてよい（例えば、ＨＢＶに由来するいくつかのエピトープコーティング核酸配列及びＨＩＶに由来するいくつか及び／又はＨＣＶに由来するいくつかのもののヌクレオチド配列）。「エピ遺伝子」という語は、ここでは、或る種のマルチエピトープ構築体を意味するために使用される。以下で記述するように、マルチエピトープ構築体の中の１又は複数のエピトープ核酸は、同じく本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野で既知であるスペーサ核酸及び／又はその他の核酸により隣接されていてよい。
【００２８】
ポリペプチドを意味する場合の「マルチエピトープ構築体」という語は、「ミニ遺伝子構築体」、「マルチエピトープワクチン」という語及びその他の同等の語句と互換的に使用可能であり、好ましくはクラスＩ  ＨＬＡ及びＴ細胞レセプタ又はクラスＩＩ  ＨＬＡ及びＴ−細胞レセプタである免疫系内で機能する分子に結合しうるあらゆる長さの多数のペプチドエピトープを含む。マルチエピトープ構築体中のエピトープは、クラスＩ  ＨＬＡエピトープ及び／又はクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープであり得る。
【００２９】
クラスＩ  ＨＬＡエピトープは、ＣＴＬエピトープと呼ばれ、クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープは、ＨＴＬエピトープと呼ばれる。一部のマルチエピトープ構築体は、クラスＩ  ＨＬＡエピトープのサブセット及びクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープのもう１つのサブセットを有することができる。ＨＴＬエピトープは好ましくは、長さが約１５残基未満又は約１３残基未満、又は約１１アミノ酸未満、好ましくは約８〜約１３アミノ酸より好ましくは約８〜約１１アミノ酸（例えば８、９、１０、又は１１）そして最も好ましくは約９アミノ酸である。ＨＴＬエピトープは、長さが約５０残基未満であり、通常は約６〜約３０個の残基、より普通には約１２〜２５、往々にして約１５〜２０個の残基で構成され、好ましくは約７〜約２３、好ましくは約７〜約１７、より好ましくは約１１〜約１５（例えば１１、１２、１３、１４、又は１５）そして最も好ましくは約１３個のアミノ酸の長さを有する。本書で記述されているマルチエピトープ構築体は好ましくは、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、又は２５個以上のエピトープを内含している。マルチエピトープ構築体内のエピトープは全て、１つの生体に由来するものであってよく（例えば全てのエピトープはＨＢＶ又はＨＩＶ菌株の中に存在し得る）、そうでなければマルチエピトープ構築体は、２つ以上の異なる生体内に存在するエピトープを内含していてよい（例えば、ＨＢＶに由来するいくつかのエピトープ及びＨＩＶに由来するいくつか及び／又はＨＣＶに由来するいくつかのエピトープ）。「エピ遺伝子」という語は、ここでは、或る種のマルチエピトープ構築体を意味するために使用される。以下で記述するように、マルチエピトープ構築体の中の１又は複数のエピトープは、同じく本書で記述されているか又はその他の形で当該技術分野において既知であるスペーサ核酸及び／又はその他の核酸により隣接されていてよい。
【００３０】
「ポリエピトープワクチン」と同義である「マルチエピトープワクチン」は、多数のエピトープを含むワクチンである。
【００３１】
「交叉反応性結合」は、複数のＨＬＡ分子によりペプチドが結合されていることを表わしている。同義語は「縮合結合」である。
【００３２】
「暗号エピトープ」は、単離されたペプチドでの免疫化による応答を惹起するが、該応答は、エピトープを含む無欠の全タンパク質が抗原として用いられる場合、in vitroで交叉反応性をもたない。
【００３３】
「優性エピトープ」は、全未変性抗原での免疫化の時点で免疫応答を誘発するエピトープである（例えばSercare et al.,Arnu.Rev. Immunol.１１：７２９−７６６，１９９３を参照のこと）。かかる応答は、単離されたペプチドエピトープとin vitroで交叉反応性を有する。
【００３４】
特定のアミノ酸配列に関しては、「エピトープ」は特定の免疫グロブリンによる認識に関与する１組のアミノ酸残基であるか又は、Ｔ細胞について言うと、Ｔ細胞レセプタタンパク質及び／又は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）レセプタによる認識のために必要な残基である。In vitro又はin vivoでの免疫系という環境においては、エピトープは、免疫グロブリンにより認識される部位を共に形成する一次、二次及び三次ペプチド構造といったような分子の集合的フィーチャである。この開示全体を通して、エピトープ及びペプチドは往々にして互換的に使用されている。しかしながら、本発明のエピトープ以上の大きさの単離された又は精製されたタンパク質又はペプチド分子もなお本発明の範囲内に入るということを認識すべきである。
【００３５】
「隣接残基」は、エピトープの次に位置づけされている残基である。隣接残基は、エピトープのＮ末端又はＣ末端に隣接する位置で導入又は挿入され得る。
【００３６】
「免疫原性ペプチド」又は「ペプチドエピトープ」というのは、ＨＬＡ分子を結合しＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を誘発することになるような形で対立遺伝子特異的モチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドである。かくして、本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、その後免疫原性ペプチドが由来した抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞応答又はヘルパーＴ細胞応答を誘発する能力をもつ。
【００３７】
「ヘテロクリティック類似体」は、ここでは、一定の与えられた用量に対する応答増加又は同じ応答を達成するために必要な量の削減によって測定されるような、特異的Ｔ細胞に対する効力が増大したペプチドとして定義づけされる。ヘテロクリティック類似体の利点としては、エピトープがさらに効力の高い又はさらに経済的な（同じ効果を達成するのに必要な量が少ないため）ものであり得るという点が含まれる。さらに、修飾されたエピトープは、抗原特異的Ｔ細胞の無応答性を克服することができる（Ｔ細胞寛容性）。
【００３８】
「ヒトリンパ球抗原」又は「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Stites, et al. Immunology第３版、Lange Publishing, Los Altos, CA（１９９４））。
【００３９】
本書で使用される通りの「ＨＬＡスーパータイプ又はＨＬＡファミリー」は、共有されるペプチド結合特異性に基づいて分類されたＨＬＡ分子セットを記述するものである。或る種のアミノ酸モチーフを担持するペプチドに対する類似の結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、このようなＨＬＡスーパータイプに分類される。ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡファミリー及びＨＬＡｘｘ様分子（なおここでｘｘは特定のＨＬＡタイプを表わす）という語は、同義語である。
【００４０】
本書で使用される通り、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高親和性」は、５０ｎＭ以下のＩＣ50又はＫD値をもつ結合として定義づけされる；ＨＬＡクラスＩ分子に関する「中間親和性」は約５０〜約５００ｎＭの間のＩＣ50又はＫD値をもつ結合として定義づけされる。ＨＬＡクラスＩＩ分子に対する結合に関する「高親和性」は、１００ｎＭ以下のＩＣ50又はＫD値をもつ結合として定義づけされる。ＨＬＡクラスＩＩ分子に対する結合に関する「中間親和性」は、約１００〜約１０００ｎＭの間のＩＣ50又はＫD値をもつ結合として定義づけされる。
【００４１】
「ＩＣ50」は、基準ペプチドの結合の５０％阻害が見られる結合検定内でのペプチド濃度である。検定が行なわれる条件（すなわち、制限的ＨＬＡタンパク質及び標識されたペプチドの濃度）に応じて、これらの値は、ＫD値を近似する可能性がある。
【００４２】
２つ以上のペプチド配列という状況下での「同一の」又は「同一性」百分率という語は、配列比較アルゴリズムを用いて又は手動式アライメント及び目視によって測定されるように比較ウィンドウ上での最大の対応について比較されアライメントされた場合に、同じであるか又は同じ特定のアミノ酸残基百分率を有する２つ以上の配列を意味している。
【００４３】
マルチエピトープ構築体中の特定の位置、例えばエピトープのＣ末端に対しＣ末端側で隣接する位置においてアミノ酸残基を「導入する」ことには、所望の残基が特定の位置例えばエピトープに隣接する位置にあるように、又は有害な残基がエピトープのＣ末端に隣接しないように多数のエピトープを立体配置することが包含される。この語には同様に、特定の位置にアミノ酸残基、好ましくは好ましい又は中間のアミノ酸残基を挿入することも含まれている。１つのアミノ酸残基をもう１つのアミノ酸残基と置換することによって配列内にアミノ酸残基を導入することも同様に可能である。好ましくは、かかる置換は、例えば９９年３月１日に提出された同時係属Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２６０，７１４号及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４の中で記述されている類似体化原理に従って作られる。
【００４４】
「単離された」又は「生物学的に純粋な」という語は、その未変性状態で発見されたままでの材料に通常は随伴している成分を実質的に又は基本的に含まない材料を意味している。かくして、本発明に従った単離されたペプチドは、好ましくは、in situ環境下でペプチドに通常付随する材料を含有していない。
【００４５】
「リンクする」又は「接合する」という語は、制限的な意味なく、組換え型融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合、及び静電結合を含む、ペプチドを機能的に連結するための既知のあらゆる方法を意味している。
【００４６】
「主要組織適合複合体」又は「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において１つの役割を果たす遺伝子クラスタである。人間においては、ＭＨＣ複合体は同様に、ＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ及びＨＬＡ複合体の詳細な説明については、Paul, Fundamental Immunology，第３版、Raven Press, New York,１９９３を参照のこと。
【００４７】
本書で使用されている「ペプチドの中央」というのは、アミノ末端でもカルボキシル末端でもないペプチド内の位置のことである。
【００４８】
本書で使用されている「接合部エピトープの最小数」というのは、任意選択基準を用いた場合に作り出されると思われるものよりも低い接合部エピトープの数を意味する。
【００４９】
「モチーフ」という語は、特定のＨＬＡ分子により認識される、規定の長さのペプチド、通常はクラスＩ  ＨＬＡモチーフについては約８〜約１３個のアミノ酸そしてクラスＩＩ  ＨＬＡモチーフについては約６〜約２５個のアミノ酸のペプチドの中の残基パターンを意味する。ペプチドモチーフは、標準的には、各々のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各々のタンパク質について異なっており、かつ一次又は二次アンカー残基のパターンが異なっている。
【００５０】
「負の結合残基」又は「有害な残基」というのは、ペプチドエピトープ内の或る位置（標準的には一次アンカ位置ではない）に存在している場合に、そのペプチドの対応するＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性を減少させる結果となるアミノ酸である。
【００５１】
「作用可能式にリンクされた」という語は、１つのヌクレオチド配列が、配列（単複）の機能を改変する能力をもつような形でもう１つのヌクレオチド配列（単複）に連結されているリンケージを意味する。例えば、プロモータ／オペレータといったような調節配列に作用可能式にリンクされている核酸又はマルチエピトープ核酸構築体は、調節配列の影響又は制御下に核酸又は構築体の発現を置く。２つのヌクレオチド配列（例えばタンパク質コーディング配列及びコーディング配列の５′末端にリンクされたプロモータ領域配列）は、プロモータ機能の誘発の結果タンパク質コーディング配列 ｍＲＮＡの転写がもたらされる場合、及び２つのヌクレオチド配列間のリンケージの性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を結果としてもたらしたり又は（２）発現調節配列がｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を導くのを防いだりしないものである場合に、作用可能式にリンクされていると言われる。かくして、プロモータ領域は、プロモータがそのヌクレオチド配列の転写をもたらす能力を有していた場合に、ヌクレオチド配列に対し作用可能式にリンクされていることになる。
【００５２】
「最適化する」というのは、接合部エピトープの発生を最小限におさえるべくエピトープをえり分けること、エピトープのＣ末端又はＮ−末端を隣接する隣接残基を挿入すること、及び接合部エピトープの発生をさらに防止するか又は隣接残基を提供するべくスペーサ残基を挿入することによって少なくとも１つのエピトープ対をもつマルチエピトープ構築体の免疫原性又は抗原性を増大させることを意味する。最適化されたマルチエピトープ構築体の免疫原性又は抗原性の増加は、最適化パラメータに基づいて構築されておらずかつ、例えばＨＬＡ遺伝子導入マウスにおける免疫原性の査定、ＥＬＩＳＰＯＴ、インタフェロン−ガンマ放出検定、四量体染色、クロム遊離検定及び樹状細胞上の提示といった当該技術分野において既知の検定を用いているマルチエピトープ構築体との関係において測定される。
【００５３】
「ペプチド」という語は、当該明細書においては、標準的には隣接するアミノ酸のα−アミノ及びカルボキシ基の間のペプチド結合によって、互いに連結された標準的にはＬ−アミノ酸である一連の残基を呼称するべく、「オリゴペプチド」と互換的に使用されている。本発明のＣＴＬ誘発ペプチドは、長さが約１５残基未満、好ましくは１３残基以下であり、好ましくは長さが約８〜１３アミノ酸、より好ましくは約８〜約１１ アミノ酸（例えば８、９、１０又は１１）、そして最も好ましくは約９個のアミノ酸である。好ましいＨＴＬ−誘発オリゴペプチドは、長さが約５０残基未満で、通常は、約６〜約３０個の残基、より普通には約１２〜２５、往々にして約１５〜２０個の残基で構成されており、約７〜約２３、好ましくは約７〜約１７、より好ましくは約１１〜約１５（例えば１１、１２、１３、１４又は１５）そして最も好ましくは約１３個のアミノ酸の長さをもつエピトープペプチドをコードすることができる。本書で記述されているマルチエピトープ構築体は、好ましくは、５以上、１０以上、１５以上、２０以上又は２５以上のエピトープ核酸を内含する。
【００５４】
ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質化合物を記述するために用いられる命名法は、アミノ基が各アミノ酸残基の左（Ｎ末端）に提示され、カルボキシル基が右側（Ｃ末端）に提示される従来の実践方法に従っている。アミノ酸残基の位置に言及する場合、これらは、位置１がエピトープ又はそれが一部を成しているペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ末端端部に最も近い位置であるものとしてアミノからカルボキシへの方向に番号づけされる。本発明の選択された特異的実施形態を表わす構造式においては、アミノ及びカルボキシル末端基は、特定的に示されていないものの、相反する規定のないかぎり生理学的ｐＨ値でそれらがとると思われる形態をしている。アミノ酸構造式において、各々の残基は一般的に標準的な３文字及び１文字呼称によって表わされている。アミノ酸残基のＬ形態は、単一の大文字又は３文字記号の最初の大文字で表わされ、Ｄ形態を有するこれらのアミノ酸についてのＤ形態は、単一の小文字又は３つの小文字記号により表わされる。グリシンは、非対称炭素原子を全くもたず、単純に「Gly」又はＧとして言及される。アミノ酸の記号が以下に示されている。
【表１】
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【００５５】
アミノ酸の「化学的特性」は、芳香族（Ｆ、Ｗ、Ｙ）；脂肪族−疎水性（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）；小極性（Ｓ、Ｔ、Ｃ）；大極性（Ｑ、Ｎ）；酸性（Ｄ、Ｅ）；塩基性（Ｒ、Ｈ、Ｋ）；プロリン；アラニン；及びグリシンとして定義される。
【００５６】
「ＰanＤＲ結合ペプチド」、「ＰanＤＲ結合エピトープ」、「ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド」及び「ＰＡＤＲＥ（登録商標）エピトープ」という語は、複数のＨＬＡクラスＩＩ ＤＲ分子を結合する分子ファミリーの一員であるＨＴＬペプチド１つのタイプを意味する。ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチドは、大部分のＨＬＡ−ＤＲ分子に結合し、in vitro及びin vivoでヒトヘルパ−Ｔリンパ球（ＨＴＬ）応答を刺激する。ＰＡＤＲＥ（登録商標）分子ファミリーを定義するパターンは、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフと考えることができる。例えばＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチドは、ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号１）という構造式を含むことができ、ここで「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン又はチロシンのいずれかであり、「ａ」はＤ−アラニン又はＬ−アラニンのいずれかであり、大部分のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そのＨＬＡタイプの如何に関わらず大部分の個体からのＴヘルパーリンパ球の反応を刺激することがわかっている。ＰＡＤＲＥ（登録商標） エピトープの１変形形態には、例えばマルチエピトープ構築体内でエピトープをコードする核酸の形及びペプチド／ポリペプチドの形で提供され得る全ての「Ｌ」天然アミノ酸が含まれる。ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチドの特定的例も又本書で開示されている。
【００５７】
「薬学的に受容可能な」という語は、一般に非毒性で不活性かつ／又は生理学的な適合性をもつ組成物を意味する。
【００５８】
「ＨＬＡクラスＩプロセシング経路に提示された」というのは、マルチエピトープ構築体が、ＨＬＡクラスＩプロセシング経路により大部分プロセシングされるように１つの細胞内に導入されることを意味している。標準的には、マルチエピトープ構築体が、そのマルチエピトープ構築体をコードする発現ベクターを用いて細胞内に導入される。かかるマルチエピトープ構築体によりコードされたＨＬＡクラスＩＩエピトープも同様にクラスＩＩ分子上で提示されるが、クラスＩＩプロセシング経路内へのエピトープの進入メカニズムは確立されていない。
【００５９】
「一次アンカー残基」又は「一次ＭＨＣアンカー」というのは、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子の間の接点を提供するものと理解されているペプチド配列に沿った特定の位置にあるアミノ酸のことである。規定の長さのペプチドの内部の、１〜３個、通常２つの一次アンカー残基が、一般に免疫原性ペプチドのための「モチーフ」を画定する。これらの残基は、その領域が結合溝自体の特異的ポケット内に埋込まれた状態で、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝と密に接触するようにはめ込まれていると理解されている。１つの実施形態においては、例えば、ＨＬＡクラスＩエピトープの一次アンカー残基は（アミノ末端位置から）位置２のところ、そして本発明に従った９残基ペプチドエピトープのカルボキシ末端位置に位置設定されている。各モチーフ及びスーパーモチーフのための一次アンカー位置は、例えばＰＣＴ／ＵＳ００／２７７６６又はＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４の表Ｉ及びＩＩＩの中で記述されている。大部分のクラスＩＩエピトープについてアンカーの場合と同様に役立つことのできる好ましいアミノ酸は、位置１のＭ及びＦ、そして位置６のＶ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ及びＣから成る。大部分のクラスＩＩのエピトープについてこれらの位置を占め得る許容されたアミノ酸は、位置１のＬ、Ｉ、Ｖ、Ｗ、及びＹ、そして位置６のＰ、Ｌ及びＩから成る。クラスＩＩのエピトープの中の位置１及び６のこれらのアミノ酸の存在は、ＨＬＡ−ＤＲＩ，４，７スーパーモチーフと定義づけている。ＨＬＡ−ＤＲ３結合モチーフは、位置１におけるＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＡならびに位置４のＤ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ及び位置６のＫ、Ｒ及びＨのグループからの好ましいアミノ酸によって定義づけされる。その他のアミノ酸は、これらの位置で許容され得るが、好ましいわけではない。
【００６０】
さらに、これらの一次アンカー位置における特定の残基の有無を変える、すなわちそれを置換することによって、類似体ペプチドを作り出すことができる。このような類似体は、特定のモチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を変調させるために用いられる。
【００６１】
「無差別認識」は、全く異なるペプチドがさまざまなＨＬＡ分子の状況下で同じＴ細胞クローンによって認識された場合に発生する。無差別認識又は結合は、交叉反応結合と同義である。
【００６２】
「防御免疫応答」又は「治療的免疫応答」というのは、何らかの形で疾病の症候、副作用又は進行を予防するか又は少なくとも部分的に阻止する、感染性因子又は腫瘍抗原に由来する抗原に対するＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を意味する。この免疫応答には同様に、ヘルパーＴ細胞の刺激により容易になった抗体応答も含まれる可能性がある。
【００６３】
「調節配列」というのは、特定の宿主生体内の作用可能式に会合された核酸又は核酸構築体の発現に寄与するか又はそのために必要であるＰヌクレオチド配列を意味している。例えば原核生物に適した調節配列としては、プロモータ、任意にはオペレータ配列及び内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）が含まれる。真核生物はプロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサを利用することがわかっている。プロモータは、ＣＭＶプロモータ又は本書に記述している又は当該技術分野において既知のその他のプロモータであり得る。調節配列には、ＩＲＥＳが含まれる。調節配列のその他の特定的例については、本書で記述されており、その他の形で当該技術分野において既知である。
【００６４】
「残基」という語は、アミド結合又はアミド結合模倣物によりペプチド又はタンパク質中に取込まれたアミノ酸又はアミノ酸ミメティックを意味する。
【００６５】
「二次アンカー残基」というのは、ペプチド結合に影響を及ぼし得るペプチド内の一次アンカー位置以外の位置にあるアミノ酸である。二次アンカー残基は、１つの位置におけるアミノ酸の無作為分布の場合に予想されるよりも著しく高い頻度で、結合したペプチド間で発生する。二次残基は「二次アンカー位置」で発生すると言われている。二次アンカー残基は、高又は中間親和性の結合ペプチドの間でより高い頻度で存在する残基、又は高又は中間親和性結合に他の形で付随する残基として同定され得る。例えば、類似体ペプチドは、これらの二次アンカー位置で特定の残基の有無を変えることすなわちこの特定の残基を置換することにより作り上げることができる。かかる類似体は、特定のモチーフ又はスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を微変調させるために使用される。「固定されたペプチド」という用語は、時として１つの類似体ペプチドを意味するために使用される。
【００６６】
「エピトープをえり分ける」というのは、マルチエピトープ構築体内のエピトープの順序を決定又は設計することを意味する。
【００６７】
「スペーサ」というのは、接合部エピトープの発生を防止しかつ／又はプロセシングの効率を増大させるためのマルチエピトープ構築体内の２つのエピトープ間に挿入される配列を意味する。マルチエピトープ構築体は、１又は複数のスペーサ核酸を有していてよい。スペーサ核酸は、構築体内の各々のエピトープ核酸を隣接していてよく、そうでなければ、スペーサ核酸対エピトープ核酸の比は、約２対１０、約５対１０、約６対１０、約７対１０、約８対１０又は約９対１０であり得、ここで８対１０の比が一部の構築体にとって有利な結果を生み出すことが見極められている。
【００６８】
スペーサ核酸は１又は複数のアミノ酸をコードすることができる。マルチエピトープ構築体内でクラスＩ  ＨＬＡエピトープを隣接するスペーサ核酸は、好ましくは、１〜約８個のアミノ酸という長さを有する。マルチエピトープ構築体内でクラスＩＩ  ＨＬＡエピトープを隣接するスペーサ核酸は、好ましくは５、６、７個又はそれ以上のアミノ酸、より好ましくは５又は６個のアミノ酸という長さを有する。
【００６９】
構築体内のスペーサの数、スペーサ内のアミノ酸の数そしてスペーサのアミノ酸の組成は、エピトーププロセッシングを最適化しかつ／又は接合部エピトープを最小限にするように選択可能である。エピトーププロセッシング及び接合部モチーフを同時に最適化することによってスペーサを選択することが好ましい。エピトーププロセッシングを最適化するための適切なアミノ酸が本書に記述されている。同様に構築体内の接合部エピトープの数を最小限にするための適切なアミノ酸間隔どりが、ここで、クラスＩ及びクラスＩＩのＨＬＡについて記述されている。例えば、クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをフランキンするスペーサは、好ましくは、一次アンカー残基であることが一般に知られていないことを理由として、Ｇ、Ｐ及び／又はＮ残基を含む（例えばＰＣＴ／ＵＳＯＯ／１９７７４を参照のこと）。クラスＩＩ  ＨＬＡエピトープをフランキンするための特に好ましいスペーサとしては、ｎが１と１０の間の整数、好ましくは２又は約２であり、かかるスペーサの特異的例がＧＰＧＰＧ（配列番号２）であるものとして、例えば（ＧＰ）n、（ＰＧ）n、（ＧＰ）nＧ、（ＰＧ）nＰなどといった交番するＧ及びＰ残基が含まれる。特にクラスＩ  ＨＬＡ エピトープにとって好ましいスペーサには、０、２、３個又はそれ以上の連続的アラニン（Ａ）残基が含まれる（例えば３つの連続的アラニン残基をもつスペーサを描いている図２３Ａを参照のこと）。
【００７０】
一部のマルチエピトープ構築体内では、各スペーサ核酸が同じアミノ酸配列をコードするだけで充分である。同じアミノ酸配列をコードする２つのスペーサ核酸を有するマルチエピトープ構築体においては、これらのスペーサをコードするスペーサ核酸は同じ又は異なるヌクレオチド配列を有することができ、ここで、マルチエピトープ構築体が細胞内に挿入される場合、意図されていない組換え事象の確率を低くするため、異なるヌクレオチド配列が好まれるかもしれない。
【００７１】
その他のマルチエピトープ構築体においては、スペーサ核酸のうち１又は複数のものが異なるアミノ酸配列をコードし得る。スペーサ核酸の多くがマルチエピトープ構築体内で同じアミノ酸配列をコードし得るものの、１、２、３、４、５個又はそれ以上のスペーサ核酸が異なるアミノ酸配列をコードする可能性があり、マルチエピトープ構築体内のスペーサ核酸の全てが異なるアミノ酸配列をコードすることが可能である。スペーサ核酸は、本書で記述されているようにスペーサ配列がエピトーププロセッシングを最大限にしかつ／又は接合部エピトープを最小限にすることになるか否かを見極めることにより、それらがフランキンするエピトープ核酸に関して最適化され得る。
【００７２】
１つの構築体内のスペーサがもう１つの構築体に比べてエピトーププロセッシングを最適化するか又は接合部エピトープを最小限にするかに従って、マルチエピトープ構築体を互いに区別することができ、又好ましくは、１つの構築体がもう１つの構築体に比べてエピトーププロセッシング及び接合部エピトープについて同時に最適化されている場合に、複数の構築体を区別することができる。構築体がエピトーププロセッシング及び接合部モチーフについて最適化されているか否かを決定するためのコンピュータ援用方法及びin vitro及びin vivo実験室方法が、本書で記述されている。
【００７３】
「亜優性エピトープ」というのは、そのエピトープを含む全抗原での免疫化の時点でほとんど又は全く応答をひき起こさないものの、単離されたエピトープでの免疫化によりそれについての応答を得ることができかつ（暗号エピトープの場合と異なり）in vitro又はin vivoでの応答を撤回するために全タンパク質が用いられる場合にこの応答が検出されるエピトープである。
【００７４】
「スーパーモチーフ」というのは、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子が共有する結合特異性を提供するペプチドのためのアミノ酸配列である。好ましくは、スーパーモチーフ担持ペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原による高又は中間親和性（本書で定義されているもの）で認識される。
【００７５】
「合成ペプチド」というのは、天然には発生せず、化学的合成又は組換え型ＤＮＡ技術といった方法を用いた人造のものであるペプチドを意味する。
【００７６】
「ＴＣＲ接触残基」又は「Ｔ細胞レセプタ接触残基」というのは、Ｔ細胞レセプタにより結合されるものとして理解されているエピトープ内のアミノ酸残基である。これらは本書では、一次ＭＨＣアンカーではないものとして定義されている。Ｔ細胞レセプタ接触残基は、テスト対象の全ての類似体が、野生型ペプチドで誘発されるものとの関係においてＴ細胞認識を誘発するペプチド内の位置（単複）として定義される。
【００７７】
本書で使用される「相同性」という語は、２つのヌクレオチド配列間の相補性の度合を意味する。「同一性」という言葉は、１つの核酸がもう１つの核酸と同じヌクレオチド配列を有する場合に「相同性」という言葉に置換わることができる。配列相同性及び配列同一性は同様に、高い緊縮性及び／又は低い緊縮性の下でのハイブリダイゼーション研究によっても決定でき、本書で開示されているのは低緊縮性又は高緊縮性の下でマルチエピトープ構築体にハイブリッド形成する核酸である。同様に、配列相同性及び配列同一性は、当該技術分野において既知のアルゴリズム及びコンピュータプログラムを用いて配列を分析することによって決定できる。かかる方法は、１つの核酸が本書で開示されているマルチエピトープ構築体に対し同一又は相同であるか否かを査定するのに用いられる。本発明は、一部には、本書で開示されるマルチエピトープ構築体のヌクレオチド配列に対する８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性をもつヌクレオチド配列に関する。
【００７８】
本書で使用される「緊縮性条件」というのは、開示されているマルチエピトープ構築体のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。適切な緊縮性条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液中の塩又はホルムアミドの濃度によって、又はハイブリダイゼーション温度によって定義され得、当該技術分野において周知である。特に、緊縮性は、塩濃度を削減すること、ホルムアミド濃度を増大させること又はハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増加させることができる。例えば、高緊縮条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２℃で約５０％のホルムアミドの中で発生し得る。特にハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミド５×ＳＳＰＥ、０.３％のＳＤＳ及び２００μｇ／mlのせん断された変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で、又は５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０μｇ／mlの変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で高緊縮性条件下で発生し得、その後、約６５℃で０.１×ＳＳＣ中でフィルターが洗浄される。ハイブリダイゼーションは、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％のホルムアミドの中で低緊縮性条件下で起こり得る。例えば、低緊縮性条件は３５％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ及び２００μｇ／mlのせん断された変性サケ精子ＤＮＡ中で３５℃で発生し得る。特定の緊縮性レベルに対応する温度範囲は、問題の核酸のプリン；ピリミジン比を計算しそれに応じて温度を調整することによって、さらに狭めることができる。上述の範囲及び条件についての変動は、当該技術分野において周知のことである。
【００７９】
配列同一性又は配列相同性を査定するためにハイブリダイゼーション研究を利用することに加えて、特定の核酸が本書で開示されているマルチエピトープ構築体と相同であるか否かを決定するために既知のコンピュータプログラムを使用することができる。かかるプログラムの一例はBestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix用バージョン８、Genetics Computer Group, University Research Park, ５７５ Science Drive, Madison, ＷＩ５３７１１）であり、その他の配列アライメントプログラムも当該技術分野において既知であり、２つ以上のヌクレオチド配列が相同であるか否かを決定するためにこれらを利用することができる。Bestfitは、２つの配列の間の最良の相同性セグメントを見い出すため、Smith及びWaterman, 応用数学の進歩（Advances in Applied Mathematics）２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いている。特定の配列が例えば基準配列と９５％の同一性を有するか否かを決定するためにBestfit又はその他のいずれかの配列アライメントプログラムを用いている場合、同一性百分率が基準ヌクレオチド配列の全長全体にわたり計算され基準配列内の合計ヌクレオチド数の最高５％の相同性のギャップが許容されるような形でパラメータをセットすることができる。
【００８０】
本書で使用される頭字語は以下のとおりである：
ＡＰＣ：  抗原提示細胞
ＣＤ３：  汎Ｔ細胞マーカー
ＣＤ４：  ヘルパーＴリンパ球マーカー
ＣＤ８：  細胞毒性Ｔリンパ球マーカー
ＣＥＡ：  ガン胎児性抗原
ＣＦＡ：  完全フロインドアジュバンド
ＣＭＶ：  ヒトサイトメガロウイルス
ＣＴＬ：  細胞毒性Ｔリンパ球
ＣＴＸ：  局所的筋破壊をひき起こす天然６０アミノ酸ペプチド（タンパク質キナーゼＣ阻害物質）
ＤＣ：  樹状細胞。ＤＣは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）から誘導されたモデルペプチドに特異的であったＣＴＬ系統からのサイトカイン放出を刺激することにより、強力な抗原提示細胞として機能した。ＨＢＶペプチドエピトープでex vivoでパルス処理されたＤＣを用いたin vitro実験は、実験未使用のマウスに対する送達の後in vitroでＣＴＬ免疫応答を刺激した。
ＤＭＳＯ：  ジメチルスルフォキシド
ＤＮＡ：  デオキシリボ核酸
ＥＢＶ：  エプシュタインバールウイルス
ＥＬＩＳＡ：  酵素結合免疫吸着検定法
ＥＬＩＳＰＯＴ：  培養膜上の全く異なるスポットとしてプローブ探索されたサイトカインを分泌する個々の細胞を検出するＥＬＩＳＡ様の手順。
エピゾーン：  マルチエピトープＤＮＡ構築体
Ｅ：Ｔ  ：  エフェクタ：標的比
ＦＡＣＳ：  蛍光活性化セルソーター
ＦＣＳ：  ウシ胎児血清
Ｇ−ＣＳＦ：  顆粒球コロニー刺激因子
ＧＭ−ＣＳＦ：  顆粒球−マイクロファージ（単球）−コロニー刺激因子
ＨＢＶ：  Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＥＲ２／Ｎeu：  ｃ−erbＢ−２
ＨＩＶ：  ヒト免疫不全ウイルス
ＨＬＡ：  ヒト白血球抗原
ＨＬＡ−ＤＲ：  ヒト白血球抗原クラスＩＩ
ＨＰＬＣ：  高性能液体クロマトグラフィ
ＨＴＣ：  ヘルパーＴ細胞
ＨＴＬ：  ヘルパーＴリンパ球
ＩＤ：  同一性
ＩＦＡ：  不完全フロインドアジュバント
ＩＦＮγ：  インタフェロンガンマ
ＩＬ４：  インタロイキン−４サイトカイン
ＩＲＥＳ：  内部リボソーム進入部位
ＩＶ：  静脈内
ＬＵ30%：  １００：１（Ｅ：Ｔ）比において３０％の溶解を達成するのに必要とされる細胞毒性活性
ＭＡｂ：  モノクローナル抗体
ＭＡＧＥ：  メラノーマ抗原
ＭＨＣ：  主要組織適合複合体
ＭＬＲ：  混合リンパ球反応
ＭＮＣ：  単核細胞
ＰＡＤＲＥTM：  汎ＤＲ結合ペプチド
ＰＡＴＲ：  汎トログロダイト
ＰＢ：  末梢血
ＰＢＬ：  末梢血リンパ球
ＰＢＭＣ：  末梢血単核細胞
ＳＣ：  皮下
ＳＤＳ：  ドデシル硫酸ナトリウム
Ｓ.Ｅ.Ｍ：  標準誤差
ＳＵ：  分泌単位
ＱＤ：  一日一回服用
ＴＡＡ：  腫瘍関連抗原
ＴＣＲ：  Ｔ細胞レセプタ
ＴＮＦ：  腫瘍壊死因子
ＷＢＣ：  白血球
【００８１】
本出願は、現在放棄された９３年３月５日付け０８／０２７，１４６号のＣＩＰである、現在放棄された９３年６月４日付け０８／０７３，２０５号のＣＩＰである、現在放棄された９３年１１月２９日付け０８／１５９，１８４号のＣＩＰである、９４年３月４日付け  Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／２０５，７１３号のＣＩＰである９８年１１月１０日付けＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１８９．７０２号に関連するものであり得る。本出願は、同様に、現在放棄されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／０１３，１１３号の利益を請求するＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／８１５，３９６号のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２２６，７７５にも関係する。さらに、本出願は、放棄されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／５８９，１０８号のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／０１７，７３５；Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／７５３，６２２，Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／８２２，３８２，放棄されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／０１３，９８０号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／４５４，０３３号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１１６，４２４号及びＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／３４９，１７７号に関係するものである。本出願は同様に、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／０１７，５２４号，Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／８２１，７３９号、現在放棄されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０１３，８３３，Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／７５８，４０９号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／５８９，１０７号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／４５１，９１３号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８号／１８６，２６６号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１１６，０６１号及び現在放棄されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９２６，６６６号のＣＩＰである、現在放棄されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／１０３，３９６号のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／１５９，３３９のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／３４７，６１０号にも関係している。本出願は同様にＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／０１７，７４３号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／７５３，６１５号；Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／５９０，２９８号、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／１１５，４００号、及び、現在放棄されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２７８，６３４号のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／３４４，８２４号のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０８／４５２，８４３号にも関連し得る。本出願は同様に、仮Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／０８７，１９２号及び、現在放棄されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０３６，７１３号及び現在放棄されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／０３７，４３２号のＣＩＰであるＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／００９，９５３にも関係している。さらに、本出願は、Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／０９８，５８４号、及びＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２３９，０４３号にも関連し得る。本出願は、同様に、２０００年５月３０日付けの同時係属Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／５８３，２００号、９９年３月１日付けのＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２６０，７１４号及び２０００年１０月６日付け米国仮出願第６０／２３９，００８号、及び９９年１１月１８日付け米国仮出願第６０／１６６，５２９号にも関連し得る。さらに、本出願は、同様に現在放棄された２０００年１０月６日付けの米国仮出願第６０／２３９，００８号；２００１年５月２５日にＷＯ ０１／３６４５２として公示された２０００年１１月２０日付けのＰＣＴ／ＵＳ００／３１８５６の米国国内段階出願である同時係属米国出願第１０／１３０，５４８号及び２００２年４月５日付け同時係属米国出願第１０／１１６，１１８号とも関連し得���。上述の出願は全て、本書に参考として内含されている。
【００８２】
発明の詳細な説明
以下では図を参考にしながら、本発明について詳述するが、ここで同じ要素には全体を通して同じ数字が付いている。
【００８３】
本発明は、好ましくは接合部エピトープの数を最小にしてマルチエピトープワクチンの免疫原性及び／又は抗原性を最大にするか又は少なくとも増大させるべく、マルチエピトープワクチンの効能を最適化するための方法及びシステムを提供している。本発明は同様に複数のＣＴＬ及び／又はＨＴＬエピトープをコードするマルチエピトープ核酸構築体及びかかる構築体によりコードされたポリペプチドならびにかかる構築体及び／又はポリペプチドを含む細胞、かかる構築体及び／又は細胞を含む組成物、及びかかる構築体及び／又はポリペプチド及び細胞を利用した免疫応答刺激方法（例えば治療的方法）をも提供している。
【００８４】
本発明の１実施形態においては、多数のエピトープを有するマルチエピトープ構築体を設計するためのコンピュータ化された方法には、複数のエピトープ、接合部エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入及び各挿入のための少なくとも１つの増強重み値を内含する複数の入力パラメータをコンピュータシステムのメモリ内に記憶する段階；複数のエピトープからエピトープ対のリストを生成する段階；各々のエピトープ対について、少なくとも１つのモチーフ、複数の挿入及び各挿入についての少なくとも１つの増強重み値に基づいてアミノ酸挿入の少なくとも１つの最適な組合せを決定する段階；及び複数のエピトープの少なくとも１つの最適な配置を同定する段階が含まれ、ここでアミノ酸挿入の少なくとも１つの最適な組合せのうちのそれぞれの組合せが、最適化されたマルチエピトープ構築体を提供するべく２つのエピトープのそれぞれの接合部で挿入される。好ましい実施形態においては、エピトープの少なくとも１つの最適な配置を同定する段階は、複数のエピトープの配置の全ての順列が評価される全数探索又は、複数のエピトープの配置の全ての順列のサブセットのみが評価される確率的探索のいずれかを実施することによって達成可能である。
【００８５】
さらなる実施形態においては、該方法は、各エピトープ対について考えられる各々の挿入組合せについて関数値（Ｆ）を計算することによってアミノ酸挿入の少なくとも１つの最適な組合せを各々のエピトープ対に関して決定し、ここで１つの組合せ内の挿入の数はユーザーにより入力された０から最大数までの挿入（Max Insertions）値の範囲内にあり得、該関数値は、Ｊ＞０である場合等式Ｆ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊに従って、又Ｊ＝０である場合Ｆ＝２（Ｃ＋Ｎ）に従って計算され、これらの式中、ＣはＣ＋１隣接アミノ酸の増強重み値に等しく、Ｎは、Ｎ−１隣接アミノ酸の増強重み値に等しく、Ｊは前記少なくとも１つのモチーフに基づきエピトープ対内の挿入の各々それぞれの組合せについて検出された接合部エピトープの数に等しい。
【００８６】
本発明のもう１つの実施形態においては、多数のエピトープを有するマルチエピトープ構築体を設計するためのコンピュータシステムには、複数のエピトープ、接合部エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入及び各挿入についての少なくとも１つの増強重み値を記憶するためのメモリ；メモリから入力パラメータを検索し複数のエピトープからエピトープリストを生成するためのプロセッサ〔ここで該プロセッサは、該少なくとも１つのモチーフ、該複数の挿入及び各挿入のための該少なくとも１つの増強重み値に基づいて、アミノ酸挿入の少なくとも１つの最適な組合せを各エピトープ対について決定し、プロセッサはさらに、複数のエピトープの少なくとも１つの最適な配置を同定し、ここでアミノ酸挿入の最適な組合せのうちのそれぞれの組合せが、最適化されたマルチエピトープ構築体を提供するべく２つのエピトープのそれぞれの接合部で挿入する〕；及びユーザーに対し複数のエピトープの少なくとも１つの最適な配置を表示するための、プロセッサに連結された表示モニターが含まれる。
【００８７】
さらなる実施形態においては、本発明は、多数のエピトープを有するマルチエピトープ構築体を設計するためのコンピュータプログラムを記憶するデータ記憶デバイスにおいて、該コンピュータプログラムは、コンピュータシステムによって実行された時点で、例えば複数のエピトープ、接合部エピトープを同定するための少なくとも１つのモチーフ、複数のアミノ酸挿入及び各挿入のための少なくとも１つの増強重み値を内含する複数の入力パラメータをコンピュータシステムのメモリから検索する段階；複数のエピトープからエピトープ対のリストを生成する段階；各々のエピトープ対について、少なくとも１つのモチーフ、複数の挿入及び各挿入についての少なくとも１つの増強重み値に基づいてアミノ酸挿入の少なくとも１つの最適な組合せを決定する段階；及び複数のエピトープの少なくとも１つの最適な配置を同定する段階が含まれ、ここでアミノ酸挿入の少なくとも１つの最適な組合せのうちのそれぞれの組合せが、最適化されたマルチエピトープ構築体を提供するべく２つのエピトープのそれぞれの接合部で挿入されるプロセスを実施する。
【００８８】
もう１つの実施形態においては、本発明は、多数のエピトープを含むマルチエピトープ構築体を設計するための方法及びシステムを提供する。該方法は、（ｉ）接合部エピトープの数を最小限にするべく多数のエピトープをえり分ける段階；マルチエピトープ構築体の中に内含されるべきエピトープのＣ＋１位置において隣接アミノ酸残基を導入する段階；（ｉｉｉ）接合部エピトープの発生を防止する１又は複数のアミノ酸スペーサ残基をマルチエピトープ構築体の２つのエピトープの間に導入する段階、及び（ｉｖ）最少数の接合部エピトープ、最少数のアミノ酸スペーサ残基及び最大数の隣接アミノ酸残基を各エピトープとの関係においてＣ＋１の位置に有する１又は複数のマルチエピトープ構築体を選択する段階、を含んで成る。一部の実施形態においては、スペーサ残基は、既知のＨＬＡクラスＩＩ一次アンカー残基でない残基の中から独立して選択される。特定の実施形態においては、スペーサ残基を導入することにより、ＨＴＬエピトープの発生が妨げられる。かかるスペーサは往々にして、Ｇ、Ｐ及びＮから成るグループの中から独立して選択された少なくとも５つのアミノ酸残基を含む。一部の実施形態においては、スペーサはＧＰＧＰＧ（配列番号２）である。
【００８９】
一部の実施形態においては、スペーサ残基を導入することによってＣＴＬエピトープの発生が妨げられ、さらにここでスペーサは、Ａ及びＧから成るグループの中から独立して選択された１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基である。往々にして、隣接残基は、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位置で導入され、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｇ及びＡから成るグループの中から選択されている。一部の実施形態においては、隣接残基は、スペーサ配列に隣接している。本発明の方法は同様に、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｇ及びＡから成るグループの中から選択された残基で、マルチエピトープ構築体内部の隣接するエピトープのＣ末端に隣接するエピトープのＮ末端残基を置換する段階をも内含し得る。
【００９０】
一部の実施形態においては、本発明の方法は同様に、マルチエピトープ構築体の構造を予測する段階、そしてさらには、最大の構造をもつすなわち該構築体に含まれるエピトープの全てを産生するべくＨＬＡプロセシング経路によりプロセシングされる１又は複数の構築体を選択する段階を含み得る。一部の実施形態においては、マルチエピトープ構築体は、図９内に記された通りのＥＰ−ＨＩＶ−１０９０、図９に記された通りのＨＩＶ−ＣＰＴ又は図９に記されている通りのＨＩＶ−ＴＣをコードする。
【００９１】
本発明のもう１つの実施形態においては、マルチエピトープ構築体を最適化するためのシステムには、プロセッサ（例えば中央処理ユニット）及び、プロセッサにより実行された命令及びプロセッサにより操作（すなわち処理）されるべきデータを記憶するためにプロセッサに連結された少なくとも１つのメモリを有するコンピュータシステムが含まれる。コンピュータシステムはさらにプロセッサによりアクセスされるべき所望のパラメータ及び情報をユーザーが入力できるようにするため、プロセッサ及び少なくとも１つのメモリに連結された入力デバイス（例えばキーボード）を内含する。プロセッサは、単一の集積回路チップ上に統合された複数の異なる処理デバイス／回路又は単一のＣＰＵであり得る。代替的には、プロセッサは、直接的電線／導線接続を介してか又はデータ母線を介して互いに選択的に連結された離散的な処理デバイス／回路の集合体であってもよい。同様にして、該少なくとも１つのメモリは、大型メモリーデバイス（例えばＥＰＲＯＭ）、又はデータ及び／又はプログラム情報（すなわちプロセッサにより実行される命令）を選択的に記憶するため互いに選択的に連結されている複数の離散的メモリーデバイス（例えばＥＥＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＲＡＭ、ＤＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、フラッシュなど）の集合体であり得る。当業者であれば、本書で開示されているオペレーション及び機能を実施するために、所望のコンピュータシステムアーキテクチャを容易に実現することができるだろう。
【００９２】
１つの実施形態においては、コンピュータシステムは、情報、命令、画像、グラフィクスなどを表示するための表示モニターを内含している。コンピュータシステムは、キーボードを介してユーザー入力を受信する。これらのユーザー入力パラメータには、例えば、挿入（すなわち隣接残基及びスペーサ残基）の数、プロセシングされるべきペプチド、各アミノ酸についてのＣ＋１及びＮ−１重みづけ値及び接合部エピトープを検索するために使用すべきモチーフが含まれる。これらの入力値／パラメータに基づいて、コンピュータシステムは、各ペプチド対について接合部エピトープの数を自動的に決定し、各ペプチド対の接合部において挿入することのできるスペーサ及び隣接残基の各々の組合せについての「増強」値をも計算する。このとき、Junctional Analyzerプログラムの結果は、最小数の接合部エピトープ及び最大の関数（例えば免疫原性）値を有する、マルチエピトープポリペプチド又は核酸を作り上げるため、全ペプチドセットの「最適な」組合せ又はリンケージを決定する全数又は確率的探索プログラムのいずれかにおいて使用される。
【００９３】
１実施形態においては、コンピュータシステムによりプロセシングされるべきペプチドの数が１４未満である場合、「最良の」又は「最適な」関数値をもつ順列を見い出すべく、ポリペプチドを構成するペプチドの全ての順列を検査するコンピュータシステムによって全数探索プログラムが実行される。１実施形態においては、該関数値は、Ｊが０より大きい場合には等式（Ｃｅ＋Ｎｅ）／Ｊを用いて、そしてＪがゼロに等しい場合には２*（Ｃｅ＋Ｎｅ）を用いて計算され、式中、ＣｅはペプチドのＣ＋１位置におけるアミノ酸の増強「重み」値であり、ＮｅはペプチドのＮ−１位置におけるアミノ酸の増強「重み」値であり、Ｊはマルチエピトープ核酸配列によりコードされるポリペプチド内に含まれる接合部エピトープの数である。かくして、この関数値を最大限にすることにより、最小数の接合部エピトープ及び隣接残基についての最大増強重み値を有するペプチド対が同定されることになる。プロセシングすべきペプチドの数が１４以上ある場合、コンピュータシステムは、最適なペプチド配置（例えば最大関数値を有するもの）の最高の推定値を見い出すための、順列空間の数多くの領域を検査するため「モンテカルロ」技術を使用する確率的探索プログラムを実行する。
【００９４】
さらなる実施形態においては、コンピュータシステムは、ユーザーが、全数又は確率的探索プログラムの出力結果をフォーマットするか又は制限するパラメータ値をユーザーが入力できるようにする。例えば、ユーザーは、探索の結果として生成される順列の数を制限するべく同じ関数値をもつ結果の最大数（「Max Duplicate Functions Value＝Ｘ」）を入力することができる。探索プログラムが同じ関数値を与える数多くの配置を見い出すことが可能であるため、出力ファイルが多数の同等の解により満たされないようにすることが望ましいかもしれない。この制限にひとたび到達したならば、それ以降はより大きい又は「より優れた」関数値が発見されるまで結果は報告されない。もう１つの例としては、ユーザーは、確率的探索プロセス中１つのプローブあたりの「ヒット」の最大数を入力することができる。このパラメータは、確率的探索プログラムが単一のプローブ上で必要以上に多い出力を生成させるのを妨げる。好ましい実施形態においては、単一のプローブ内で検査される順列の数は、複数の因子すなわち、入力テキストファイル内で各プローブについて設定された時間数；コンピュータの速度、及びパラメータ「Max Hits Per Probe」及び「Max Duplicate Function Values」の値によって制限される。分析用順列を生成し選択するために用いられるアルゴリズムは、数多くのコンピュータ科学教本に見られる周知の再帰アルゴリズムに従ったものであり得る。例えば、一度に３つずつ取られる３つの物の順序は、ＡＢＣ；ＡＣＢ；ＢＡＣ；ＢＣＡ；ＣＢＡ；ＣＡＢというシーケンスで生成されることになる。入力パラメータのさらなる一例として、ユーザーは、確率的探索の実施方法、例えば無作為、統計的又はその他の方法といったどのような方法で実施されるか；各プローブに許された最大時間（例えば５分）；及び実施すべきプローブの数を入力することができる。
【００９５】
本書で同様に開示されているのは、以上及び以下で記述される方法によって設計されるマルチエピトープ構築体である。該マルチエピトープ構築体は、エピトープ核酸のサブセット又はエピトープ核酸全ての間にスペーサ核酸を内含している。スペーサ核酸のうちの１又は複数のものは、エピトーププロセシングを最適化し接合部エピトープの存在を最小にするべくその他のスペーサ核酸によりコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードすることができる。
【００９６】
本発明は、最適化された免疫原性をもつマルチエピトープワクチンを設計する方法及びシステムに関する。好ましい実施形態においては、ワクチンはＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを含む。本発明に従ったワクチンは、有意な、非民族的に偏向された母集団カバレッジを許容し、好ましくは、異なるウイルス又はその他の抗原分離株の間に保存されたエピトープに焦点をあてることができる。本書に開示された方法及びシステムを用いて、応答の規模及び広さに関してワクチンを最適化することができ、ワクチンは、最も単純なエピトープ立体配置を許容することができる。最終的に、人間におけるマルチエピトープワクチンの免疫原性を評価するための一般的な方法が提供される。
【００９７】
本発明の方法は、本書で同定されている原理に基づきマルチエピトープ構築体を設計することを含んで成る。１つの態様では、本発明は、単一プロモータマルチエピトープ構築体を用いて、特異的なＣＴＬ及びＨＴＬエピトープに対する応答の同時誘発を提供する。かかる構築体は、数多く、好ましくは１０以上、往々にして２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０又はそれ以上の異なるエピトープを含有することができる。
【００９８】
好ましい実施形態においては、コンピュータシステムは、以下の関数及び／又は分析を実施することによって１又は複数の最適なマルチエピトープ構築体を同定する。
【００９９】
（ｉ）  マルチエピトープ構築体内に取込まれるべきエピトープは、形成される接合部エピトープを最小限にする順序を提供するべくえり分けされる。このえり分け手順のより詳細な論述は、図１１及び１２を参照しながら以下で提供されている。好ましくは、エピトープを順序づけする上での二次的考慮事項として、エピトープは、ＣＴＬ免疫原性を促進するエピトープのＮ末端にある残基かもう１つのＣＴＬエピトープのＣ末端に並置されるような形で位置づけされる。
【０１００】
（ｉｉ）  免疫原性を増強させる隣接残基を、エピトープの隣接位置で挿入することができる。特定の実施形態においては、隣接残基は、ＣＴＬエピトープのＣ＋１位置に挿入される。
【０１０１】
（ｉｉｉ）  接合部エピトープの発生を妨げるべくエピトープの間にスペーサ配列を挿入することができる。特定の実施形態においては、スペーサ配列は同様に、残基がＣＴＬエピトープのＣ末端に隣接するような形でリンカーのＮ末端に免疫原性を促進する残基を内含することもできる。
【０１０２】
ＨＴＬ接合部エピトープを防止するための特定の実施形態においては、いずれかの既知のＨＬＡクラスＩＩアンカー残基に対応しないアミノ酸残基から成るスペーサが使用され、例えば交互のＧ及びＰ残基（ＧＰスペーサ）が２つのＨＴＬエピトープの間に内含されている。
【０１０３】
本発明のもう１つの態様（上述の考慮事項（ｉｉ））には、エピトープを隣接する位置例えばエピトープのＣ末端に直ぐ隣接する位置において特定のアミノ酸残基の導入又は置換が関与しており、かくしてその部位で導入された又は置換された特定の残基を含有しない構築体すなわち最適化されていないマルチエピトープ構築体に比べ増強した抗原性及び免疫原性を伴うマルチエピトープ構築体が生成されることになる。マルチエピトープ構築体を最適化する方法には、隣接残基好ましくはＫ、Ｎ、Ｇ、Ｒ又はＡをエピトープのＣ＋１位置すなわちエピトープのＣ末端に直ぐ隣接する位置に導入する段階が含まれる。代替的実施形態においては、免疫原性の低下に寄与する残基すなわち負に荷電された残基例えばＤ、脂肪族残基（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）又は芳香族非トリトファン残基が置換される。隣接残基は、有利な隣接残基を提供するべく適切なエピトープを位置づけするか又は特異的残基を挿入することにより導入され得る。
【０１０４】
背景の部で指摘された通り、最高１０個のエピトープをコードするマルチエピトープ構築体（ミニ遺伝子）が、一定数の異なるエピトープに対する応答を誘発するために使用されてきた。実験的マルチエピトープ構築体ｐＭｉｎ.１に関するデータが公開されてきた（Isioka et al., J.Immunol, 第１６２巻（７）：３９１５−２５（１９９９））。本書に開示されているのは、問題の無数の疾病の適応に対処する最適化する免疫原性を伴うマルチエピトープ構築体を設計し評価するためのパラメータである。
【０１０５】
設計パラメータは、数多くの研究に基づいて同定された。マルチエピトープ構築体の予備的評価においては、各々２０〜２５の異なるＣＴＬエピトープを取込んだ３つの異なるマルチエピトープ構築体上のデータが提示されている（図１）。１つの構築体は、ＨＩＶ由来のエピトープに基づいており（ＨＩＶ−１）、他の２つは、ＨＣＶ由来のエピトープ（それぞれＨＣＶ１及びＨＣＶ２）を取込んでいる。これらの異なるマルチエピトープ構築体の免疫原性は、Ａ２又はＡ１１ ＨＬＡ遺伝子導入マウスのいずれかにおいて測定された（Ａ１、Ａ２４及びＢ７の制限されたエピトープは評価されなかった）。
【０１０６】
かくして、単一のｉ．ｍ．（筋内）ＤＮＡワクチン注射から１１日後に、ＣＴＬ活性（本書に記述されているように、クロム放出又はin situＩＦＮ産生のいずれか）を測定するための検定を用いて、一回の６日間in vitro再刺激に続いて、８〜１４個の異なる代表的エピトープに対する応答を評価した。それぞれＨＩＶ−１、ＨＣＶ−１及びＨＣＶ２のケースにおいてテスト対象のエピトープの６／８（７５％）、１０／１４（７２％）及び１３／１４（９３％）についてエピトープ特異的ＣＴＬの初回免疫を実証することができた。かくして、多数のエピトープに対するＣＴＬ応答を同時に初回免疫する能力をもつマルチエピトープ構築体を容易に設計することができる。しかしながら、一部のエピトープについてのＣＴＬ初回免疫が検出されず、考慮対象の３６のケースのうちのいくつかにおいて応答は頻繁でないか又は少なくとも３ケタ規模（１０００倍）で有意に変動したということを強調しておくべきである。これらの結果は、マルチエピトープ構築体のより入念な分析及び最適化が必要とされることを強く示唆していた。
【０１０７】
或る種のエピトープについての初回免疫の次善の実施がマルチエピトープ構築体のサイズに関連し得る可能性も、同様に検討された。実際、公開された報告書の大部分は、最高１０個のエピトープのマルチエピトープ構築体について、記述しており、２０エピトープ構築体が報告されたわずかなケースにおいて、２つ又は３つだけのエピトープに対して導かれた活性が測定された。この可能性に対処するため、各々１０個のエピトープを包含しＨＩＶ−１エピ遺伝子構築体の１半分に対する２つのより小さいエピ遺伝子構築体（ＨＩＶ−１、１及びＨＩＶ−１、２）が合成されテストされた。４つの代表的エピトープに対する応答が測定された。
表１．免疫原性はエピ遺伝子構築体サイズとは無関係であると思われる。
【表２】
2006501827.tif 000003
１）陽性応答を生成する独立した培養の画分を表わす。
２）溶解単位（ＬＵ）
３）該当せず
【０１０８】
より小さいエピ遺伝子構築体によって誘発された応答は比較可能なものであり、どちらかと言えば、２０−エピトープ構築体により誘発されたものよりも低いものであるということがわかった（表１）。従って、エピ遺伝子構築体サイズに関係する因子が或る種のエピトープに対する次善の初回免疫が観察されたことの説明となる可能性は低く、かくして本書で開示されているその他のパラメータが有効なマルチエピトープ構築体を設計するために使用される。
【０１０９】
接合部モチーフの最小化
マルチエピトープ構築体を設計する上での考慮事項の１つは、エピトープを互いに隣接して置いた場合に接合部エピトープが不用意に作り出されるということにある。マルチエピトープ構築体内でのこのようなエピトープの存在は、性能に著しい影響を及ぼす可能性がある。この望ましくない効果から保護するための戦略が、マルチエピトープワクチンの開発に対する適用のため、本書に開示されている。まず最初に、接合部エピトープの数が最小化される順序を同定するべくエピトープをえり分けることによって、接合部エピトープを最小限にすることができる。かかるえり分けは、必要とあらばコンピュータを用いてか又は眼で、或いは又マルチエピトープ構築体内に内含されるべきエピトープの数に応じて、実施可能である。
【０１１０】
例えば、Pro VUE Development, Huntington Beach, California U.S.A, 製のPanoramaといったパターンを見い出すコンピュータプログラムを、本発明の１実施形態に従って使用することができる。特定のマルチエピトープ構築体を設計する上で、数多くの異なるエピトープ配置を考慮することが可能である。コンピュータプログラムは、入力として、考慮対象の特定のエピトープセット及び走査すべきモチーフを、これらのモチーフを担持する何らかの接合部エピトープが存在するか否かを評価する目的で受容する。例えば、１つのプログラムはマルチエピトープ構築体の構築をシミュレートし、発見的計算アルゴリズムにおいてエピトープ対を検査して接合部モチーフの発生を回避又は最小限にすることができる。プログラムは、例えば、６×１０5（約５０万）マルチエピトープ構築体立体配置／秒を評価できる。
【０１１１】
先行する段落において記述した通りのコンピュータプログラムを用いた１０−エピトープ構築体の完全な分析は、１０階乗≒３.６×１０6の組合せの検査を必要とし、６秒で完了され得る。１４エピトープ構築体は、２〜３日で完全に分析可能である。かくして、考慮される構築体が大きくなればなるほど、分析時間は急速に上昇する。しかしながら、完全な分析はつねに必要とされるわけではなく、あらゆる所望の長さの時間だけプログラムを実行することが可能である。いずれの場合でも、本発明のコンピュータシステムは、最少数の接合部エピトープをもつ少なくとも１つの立体配置を同定し提供する。
【０１１２】
このタイプのアプローチの結果の一例が表２に提示されている。２５エピトープを取込んでいる２日間のコンピュータ分析の結果であるＨＣＶ１エピ遺伝子内に含まれる同じエピトープの１０個の異なる無作為組合せ内の接合部モチーフの数がこの表の中に提示されている。最適化されていない組合せの中に、約２５〜３８、平均３１の多数のＨＬＡ−Ａ２、Ａ１１及びＫbモチーフが発見された。比較すると、ＨＣＶ１エピ遺伝子構築体組合せの中にはこのような接合部モチーフは２つしか存在しない。結論としては、マルチエピトープ構築体内に存在する接合部モチーフの数を有効に最小化するために、コンピュータプログラムを利用することができる。
【表３】
2006501827.tif 000004
【０１１３】
クラスＩＩの接合部エピトープを削除しクラスＩＩの制限応答をin vivoでテストする。
接合部エピトープを除去するためのさらなる要素として、並置された場合に接合部エピトープを作り上げる２つのエピトープ間にスペーサ配列を挿入することができる。
【０１１４】
１つの実施形態においては、ＨＴＬエピトープのための接合部エピトープの問題を補正するため、例えば長さ５アミノ酸のスペーサが２つのエピトープ間に挿入される。かかるスペーサの中に取込まれるアミノ酸残基は、好ましくは、ＨＬＡクラスＩＩ結合モチーフいずれかのための一次アンカー残基であるものとして知られていないアミノ酸残基である。かかる残基には、Ｇ、Ｐ及びＮが含まれる。好ましい実施形態においては、配列ＧＰＧＰＧ（配列番号２）を伴うスペーサが２つのエピトープ間に挿入される。以前の研究作業は、ＧＰスペーサがクラスＩＩ結合相互作用を分断する上で特に有効であることを実証した（Sette et al., J, Immunol., １４３：１２６８−７３（１９８９））。全ての既知のヒト−クラスＩＩ結合モチーフ及びマウスＩＡb（ＨＬＡ遺伝子導入マウスにより発現されたクラスＩＩ）は、４つの残基分離隔されている主アンカー位置にてＧ又はＰのいずれも寛容しない。このアプローチは、事実上、いかなるクラスＩＩ制限されたエピトープも接合部エピトープとして形成され得ないということを保証する。
【０１１５】
この設計考慮事項の正当性を立証する例において、我々は、ＨＩＶ−由来のＨＴＬエピトープを取込んだポリペプチドを合成した。これらのエピトープは、広く交叉反応性をもつＨＬＡ ＤＲ結合エピトープである。このとき、これらのエピトープが同様にマウスＩＡbクラスＩＩ分子を同じく効果的に結合させるということが決定された。考慮対象の２つの異なる合成ポリペプチドを例示するダイヤグラムが図２ａに示されている。
【０１１６】
第１の構築体は、線形的に配置された４つの異なるエピトープを取込んでおり、一方第２の構築体はＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサを取込んでいる。３つの潜在的接合部エピトープに対応する合成ペプチドも同様に合成された。
【０１１７】
ＩＡb陽性マウスの体内でさまざまなエピトープに対する増殖性応答を初回免疫させる２ナノモルのこれらの異なる構築体の能力をテストし、同じペプチドのプールの等モル量（各ペプチド３マイクログラム）により誘発された応答と比較した。特定的には、３匹のマウスのグループにＣＦＡエマルジョン内のペプチドを注射し、注射から１１日後にそのリンパ節細胞をin vitroでさらに３日間培養し、最後の２４時間の培養においてチミジンの取込みを測定した。それらの高い親和性ＩＡb結合能力に基づいて予想される通り、４つのエピトープ全てが優れた増殖応答を誘発することが発見された（図２ｂ）。これらのペプチドをプール内で注射した場合、４.９〜１７.９の範囲内の刺激指数（ＳＩ）値が観察された。しかしながら、同じエピトープを取込んだ線形ポリペプチドをテストした場合、Pol３３５に対して導かれた応答は失なわれた。これは、Gag１７１及びPol３３５にまたがる接合部エピトープに対して導かれた応答の出現に関連づけされた。ＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサを使用すると、おそらくは接合部エピトープを破壊することによって、この問題が無くなり、Pol３３５応答は回復した。観察された応答は、単離されたペプチドのプールで観察されたものと類似した規模のものであった。
【０１１８】
これらの結果は、多数のＨＩＶ由来のクラスＩＩエピトープに対する応答が同時に誘発され得ることを実証しており、又同様にＨＴＬエピトープを取込んださまざまな構築体の免疫原性を調査するためＩＡb／ＤＲ交叉反応性をいかに利用できるかについても例示している。最後に、これらは、そうでなければ有効なワクチン免疫原性と干渉することになるクラスＩＩ接合部エピトープを有効に分断するべく適切なスペーサを利用できるということを実証している。
【０１１９】
クラスＩ制限応答の場合、自然に発生する接合部エピトープ及びその後のエピトープ特異的応答の阻害という１つのケースがMcMichael及びその協同研究者により提示された（Tussey et al., Immunity, 第３巻（１）：６５−７７（１９９５））。クラスＩについての接合部エピトープの問題に対処するため類似の分析を実施することができる。例えば、選択されたマウスモチーフ及び大部分の一般的なヒトクラスＩ  ＨＬＡ  Ａ及びＢモチーフについてスクリーニングすることにより、潜在的なクラスＩ制限接合部エピトープを同定するために特定のコンピュータプログラムが利用される。
【０１２０】
ＣＴＬ接合部エピトープを防止するため、スペーサ配列を同様の要領で利用することも可能である。往々にして、Ａ又はＧといったような非常に小さい残基が好ましいスペーサ残基である。Ｇは同様に、比較的低い頻度でＨＬＡクラスＩ結合モチーフの好ましい一次アンカー残基として発生する（例えばＰＣＴ／ＵＳ００／２４８０２を参照のこと）。これらのスペーサは、長さが変動でき、例えばスペーサ配列は標準的に１、２、３、４、５、６、７又は８個のアミノ酸残基という長さを有し、時としてそれ以上に長い。マルチエピトープ構築体を産生するにあたっての物理的制約条件のため、往々にしてさらに小さい長さが好まれる。
【０１２１】
ＣＴＬマルチエピトープ構築体に対する隣接領域の影響
マルチエピトープ構築体を設計する上で考慮すべきもう１つの要因は、ＣＴＬエピトープのＣ末端を隣接する位置において免疫原性に有利に作用する残基を挿入することにある。
【０１２２】
本書で開示されているのは、免疫原性を増大させる残基、従って免疫原性を最適化するべくマルチエピトープ構築体内に挿入される残基を同定する研究である。
【０１２３】
エピトープが発現された分子状況は、往々にしてＨＬＡ遺伝子導入マウス内のそのエピトープについて特異的なＣＴＬの初回免疫の頻度及び／又は規模に劇的に影響を及ぼした。２つの例が表３に示されている。
表３．異なるエピ遺伝子構築体内の特異的エピトープについてのＴ細胞初回免疫の有効性の差異
【表４】
2006501827.tif 000005
【０１２４】
ｐＭin５エピ遺伝子構築体内で発現されたＨＢＶ Core１８エピトープの免疫原性は、ｐＭin１エピ遺伝子構築体の場合に観察されたものに比べ規模がおよそ２００分の１小さいものであった。同様にして、ＨＣＶ１エピ遺伝子構築体の状況下で発現されたＨＣＶ Core１３２エピトープの免疫原性は、わずかなものであり、有意なＴ細胞初回免疫は、実施された１２の異なる独立したＣＴＬ実験／培養のうちわずか２つにおいて実証可能であった。これらの２つの陽性実験は、約１００ＳＵのＩＦＮγという応答を生成した。しかしながら、ＨＣＶ２エピ遺伝子構築体の状況下で発現された場合、１８ケースのうち１７ケースにおいて陽性応答が観察され、平均的規模は約５倍大きいものであった。
【０１２５】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋｂ遺伝子導入マウスの体内でのＨＩＶ−ＦＴの免疫原性
ＨＩＶマルチエピトープ ＤＮＡワクチン、ＨＩＶ−ＦＴ（図３ａ）は、２０のＨＩＶ由来のＣＴＬエピトープをコードする。これら２０のエピトープのうち、８つがＨＬＡ−Ａ*０２０１により制限され、９個がＨＬＡ−Ａ*１１０１により、３個のＨＬＡ−Ｂ*０７０２により制限されている。全てのエピトープはその関連する制限要素を高又は中位の親和性で結合させた。ＨＬＡ−Ａ*０２０１制限されたエピトープは全て、大体同じ親和性で、精製済みＨＬＡ−Ａ*０２０１分子を結合させ、ＩＣ50値は１９〜１９２ｎＭの範囲内にあった（図３ａ）。ＨＩＶ−ＦＴ内に内含するために選択されたＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープは、ＨＩＶ−１に感染した個体の体内で認識され、同じく、ＩＦＡで乳化された場合にＣＴＬ再生応答用の初回免疫においてもきわめて有効であり、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウスを初回免疫するために利用された。構築体は、間に何らかのスペーサ配列が介入することなく逐次的にエピトープをコードするように設計され、小胞体内へのコードされた抗原の輸送を容易にするため構築体の５′末端にコンセンサスＩｇκシグナル配列が融合された（Isioka et al., J.Immunol, １６２：３９１５−３９２５，１９９９）。
【０１２６】
in vivoでＣＴＬ再生応答を初回免疫させるＨＩＶ−ＦＴの能力は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウスの筋内免疫化によって評価された。１００μｇのＨＩＶ；ＦＴプラスミドＤＮＡで免疫化された動物からの脾細胞が、ＨＩＶ−ＦＴ内でコードされたＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの各々で刺激され、６日間の培養後ペプチド特異的ＣＴＬ活性について検定された。ＨＩＶ−ＦＴ内のエピトープのうちの３つに対する代表的ＣＴＬ応答が図４ａに示されている。異なる実験からの結果をより都合良くコンパイルするため、各々の脾細胞培養についての細胞毒性百分率値が溶解単位で表現された（Vitiello et al., J. Clin. Invest９５：３４１−３４９，１９９５）。ＨＩＶ−ＦＴ内でコードされた８つのＨＬＡ−Ａ*０２０１制限されたエピトープのうち、Pol４９８、Env１３４、Pol４４８、Vpr６２、Nef２２１及びGag２７１が、ＤＮＡ免疫化の後、ＣＴＬ応答について初回免疫した（図４ｂ）。ＣＴＬ応答の規模は、１０倍の範囲より大きい範囲にわたり、Pol ４９８に対するほぼ５０ＬＵという高い値からNef２２１及びGag２７１に対する４ＬＵという低い値まで変動した。同様にして、ＣＴＬ再生応答の頻度は、エピトープ間で変動し、Pol ４９８エピトープは実験の９４％において応答を誘発し、一方Gag２７１に対するＣＴＬ応答は、実験のわずか３１％において検出されただけであった。結論としては、いかなるスペーサアミノ酸も無く逐次的にエピトープをコードするＨＩＶ−ＦＴでのＤＮＡ免疫化は、分析対象のエピトープの大部分に対してＣＴＬ再生応答を誘発した。しかしながら、応答の規模及び頻度は、エピトープ間で大幅に変動した。
【０１２７】
トランスフェクションを受けた細胞系統内でのＨＩＶ−ＦＴエピトープの提示レベルとエピトープ免疫原性の間の相関関係
ここで、ＨＩＶ−ＦＴ内のＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープの免疫原性の差が次に査定された。エピトープの全てが高い親和性でＨＬＡ−Ａ*０２０１を結合させたことから、ＭＨＣ結合親和性差を除外することができた（図３ａ）。さらに、ＩＦＡ中で乳化された最適な予めプロセシング済みのペプチドでＨＬＡ遺伝子導入マウスを免疫化した後全てのエピトープが比較可能なＣＴＬ応答を生成したことから、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウス内のＴＣＲ特異性の適切なレパートリの欠如を除外することができた。Ｔ細胞認識のために提示された各エピトープの相対的量の変動により、エピトープ免疫原性の差異を説明することができる。
【０１２８】
これをテストするために、ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子を発現するヒトＴ細胞系統（Vitiello et al., J. Exp. Med. １７３，１００７−１０１５，１９９１）であるジャーカット細胞が、エピソームベクター内で発現されたＨＩＶ−ＦＴでトランスフェクションされた。ヒトとマウスの間のプロセシング能力の潜在的差異と関連づけることのできるあらゆる可能な人為的影響を無くするために使用するべく、ヒト細胞系統が選択された。このトランスフェクションを受けた細胞系統は、ヒトＭＨＣ提示をヒト抗原プロセシング能力と整合させ、ヒトの体内で使用するためのＣＴＬエピトープベースのＤＮＡワクチンのその後の開発についての裏づけを提供する。
【０１２９】
ペプチド特異的ＣＴＬ系統は、ＨＩＶ−ＦＴ内でコードされたＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープのうちの４つのもの、すなわちPol４９８、Ｅnv１３４、Pol４４８及びNef２２１のトランスフェクションを受けた標的内での提示を検出した。これらのエピトープのうちの各々が産生され提示されたレベルを定量するため、さまざまなエピトープに特異的なＣＴＬ系統は、トランスフェクションを受けていない標的及び可変量の各エピトープ又はペプチドと共にインキュベートされた。これらのＣＴＬ用量応答曲線は、ＨＩＶ−ＦＴでのトランスフェクションを受けた標的細胞に応答して観察されたものと同等のＩＦＮγ分泌レベルを誘発するペプチド濃度を決定するための標準曲線として利用された。この値は、「ペプチド等価用量」と呼ばれ、トランスフェクションを受けた細胞上で提示されたエピトープの量の相対的尺度と考えられる。
【０１３０】
表４は、ＨＩＶ−ＦＴ内でコードされたＨＬＡ−Ａ*０２０１エピトープのうちの８つのものについてのこの分析の発見事実を要約している。ペプチド等価用量は、Ｎef２２１についての３３.３ng／mlという高値からエピトープ Ｇag２７１、Ｇag３８６及びPol７７４についての０.４ng／ml未満のペプチド当量まで変動した。累積的にこれらの結果は、ＨＩＶ−ＦＴでのトランスフェクションを受けたヒト細胞系統内には、異なるＨＬＡ−Ａ*０２０１制限済みエピトープの提示レベルに少なくとも１００倍の変動が存在することを表わしている。抗原性検定において検出可能なレベルで提示されたエピトープは全て、同様にin vivo免疫原性であった。免疫原性があり抗原性が無かった唯一のエピトープはＧag２７１であった。この場合、ＨＩＶ−ＦＴでのＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋｂ遺伝子導入マウスの免疫化は、テスト対象の培養の３分の１未満で弱いＣＴＬ応答を誘発した。抗原性分析の感度限界以下で提示されたその他の２つのエピトープ、Ｇag３８６及びpol７７４は、非免疫原性であった。結論として、これらの結果は、ＨＩＶ−ＦＴ免疫化により誘発されたＣＴＬ応答の不均一性が、少なくとも部分的に次善のエピトープ提示のせいであるとすることができる、ということを示唆している。
表４：  ＨＩＶ−ＦＴ免疫原性及び抗原性の比較
【表５】
2006501827.tif 000006
１．ＬＵ（基準）として表わされた規模：ペプチド当量との関係における相関関係Ｒ＋０．４４
２．陽性培養の頻度（培養数＞２ＬＵ／テスト対象合計）：ペプチド当量との関係における相関係数  Ｒ＋０．８
３．ng／mlで表現された規模
４．独立した実験の数
隣接アミノ酸は、ワクチン接種後のin vivoでのＣＴＬエピトープ免疫原性に影響を及ぼす。
【０１３１】
本書で記述されているように、個々のＣＴＬエピトープを隣接する特定のアミノ酸は、タンパク質分解分割に対する抗原の感受性を改変することにより、エピトープがプロセシングされる効率に影響を及ぼすか又はこれを増強させる。エピトープ免疫原性に対する隣接アミノ酸の影響を検査するため、配列に介入することなく最小限のＣＴＬエピトープをコードする一定数の無関係の実験用マルチエピトープ ＤＮＡ構築体で免疫化されたＨＬＡ−Ａ*０２０１、−Ａ*１１０１及び−Ｂ*０７０１遺伝子導入マウスから、免疫原性データが得られた。エピトープ免疫原性に対する直接隣接するアミノ酸の影響を決定するため、９４の異なるエピトープ／隣接残基を表わすデータベースがコンパイルされた。冗長性を理由とする分析の人為的なスキューを防止するため、一度だけ、一定の与えられたエピトープ及び隣接アミノ酸の組合せが内含された。ＨＬＡ遺伝子導入動物中のエピトープ免疫原性は、測定された培養の少なくとも３０％において１００ＳＵ又は２０ＬＵより大きい場合に、最適とみなされた。ＣＴＬ応答が、次の４つのカテゴリのうちの１つに標準的に評定された：すなわち（＋＋＋）、優＝２００ＬＵ又は１０００ＳＵを超える；（＋＋）、良＝２０〜２００ＬＵ又は１００〜１０００ＳＵ；（＋）、中間＝２〜２０ＬＵ、又は１０〜１００ＳＵ；及び（＋／−）弱又は陰性＝−２ＬＵ又は１０ＳＵ未満、最適対次善の応答数は、隣接位置内のアミノ酸の化学的タイプに基づいて分類され、差異の有意性は、カイ二乗検定を用いて決定された。
【０１３２】
この分析からは、エピトープのアミノ末端に存在するアミノ酸のタイプと免疫原性の間にいかなる関連性も見い出せなかった。しかしながら、カルボキシ末端隣接残基、Ｃ＋１残基の有意な効果が同定された。正に荷電したアミノ酸、Ｋ又はＲは、最も頻繁には、最適なＣＴＬ応答と結びつけられることが最も多く、頻度は６８％（図５）であった。Ｃ＋１残基におけるアミノ酸Ｎ及びＱの存在は同様に、検査されたケースの５５.５％において強いＣＴＬ応答と結びつけられた。エピトープがＮによってＣ＋１位置で隣接されていた場合、これらは４ケースのうち３ケースにおいて最適なＣＴＬを誘発した。一般に、Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ及びＳといったような小さい残基が、分析に利用可能な組合せの５４％において強い応答を誘発する中間ＣＴＬ応答を促進した。換言すると、芳香族及び脂肪族アミノ酸により隣接されたエピトープは、それぞれわずか３６％及び１７％のケースで最適なin vivo応答を誘発したにすぎなかった。負に荷電した残基Ｄは、次善のＣＴＬ応答を生成した。エピトープ免疫原性に対するＣ＋１アミノ酸の影響は、カイ二乗検定を用いて統計的に有意であることがわかった（Ｐ＜０．０３）。Ｃ＋１位置よりもさらに遠隔なＣ末端残基について類似の分析が実施された時点で、エピトープ免疫原性に対する有意な影響は全く指摘されなかった。
【０１３３】
エピトープ免疫原性に対するＣ１残基の効果の直接的評価
Ｃ＋１隣接位置におけるアミノ酸の好ましいタイプ対有害なタイプの効果を直接評価するために、ＨＢＶ.１及びＨＢＶ.２（図３ｂ）と呼ばれる２つのマルチエピトープ構築体が評価された。ＨＩＶ−ＦＴの場合と同様に、これらのＨＢＶ構築体はスペーサに介入することなく逐次的にエピトープをコードする。ＨＢＶ.１及びＨＢＶ.２エピ遺伝子は、（類似のＨＢＶ由来のエピトープで以前に特徴づけされた（Ishioka, 前出）実験用マルチエピトープ構築体である）ｐＭin１内でＨＩＶ−１エピトープを置換することにより生成された。
【０１３４】
ＨＢＶ．１用としては、高い免疫原性のＨＢＶ Core１８エピトープに直接後続するＨＩＶ−１ エピトープは、ＨＢＶ Pol５６２エピトープで置換された。こうしてＣ＋１残基は、ＫからＦへと改変された。第２の構築体ＨＢＶ.２は、付加的なエピトープ、ＨＢＶ Pol６２９をＨＢＶ Core１８とPol５６２エピトープの間に挿入すること（これはＣ＋１ アミノ酸をＫ残基で置換した変更である）によって産生された。これらの異なる状況下で提示されたCore１８エピトープの免疫原性がＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウス内で評価された場合、Core１８エピトープがＨＢＶ.１内で事実上免疫原性を示さないものの、ＨＢＶ.２において強い免疫原性を示すことが見極められた（図６ａ）。このエピトープについてのin vivo免疫原性の減少は、我々の以前の分析によって予測されたと思われる通りであった。
【０１３５】
ＣＴＬ エピトープの免疫原性に対するＣ＋１ 隣接アミノ酸の効果をさらにテストするため、Core１８エピトープ（図３ｂ）との関係においてＣ＋１位置での単一アミノ酸の挿入によってＨＢＶ.１と異なっている１組の構築体が評価された。Ｃ＋１位置でＷ、Ｙ又はＬにより隣接された場合、Core１８エピトープに対しＣＴＬ応答はほとんど又は全く観察されなかった（図６ｂ）。これとは対照的に、単一Ｋ残基の挿入は、Core１８に対するＣＴＬ応答を劇的に増大させた。応答は、Core１８エピトープかPol６２９エピトープにより隣接されている（Pol６２９はＮ末端でＫを有する）ＨＢＶ.２において観察されたものと匹敵するものであった。Core１８ＣＴＬ応答の増強は、同様に、Ｒ．C．Ｎ又はＧの挿入に対しても見られた。これらの挿入の効果は、これらの構築体内部のその他のエピトープの免疫原性がＣＴＬ応答における有意な変化を示さなかったことから（データ示さず）、特異的である。結論としては、これらのデータは、Ｃ＋１ アミノ酸がエピトープの免疫原性に劇的な影響を及ぼしうるということを表わしている。
【０１３６】
ＣＴＬエピトープの免疫原性における変動が提示された量と相関される
異なるＣ＋１残基に結びつけられたCore１８の免疫原性の変動が、タンパク質分解分割に対する感応性の差の結果であったならば、エピトープ提示レベルの大きな差異が異なる構築体内で検出可能であるはずである。これをテストするため、遺伝子導入マウス内で発現された同じＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子を発現するジャーカット細胞が、ＨＢＶ.１又はＨＢＶ.１Ｋのいずれかを発現するエピソームベクターのトランスフェクションに付された。Core１８エピトープは、同じ位置でのＦの存在に比べて、ＫがＣ＋１位置にあった場合、１０5以上高いレベルで提示された（図７）。Core１８の提示のこの差異が標的細胞系統間の遺伝子発現の差のせいであるというのは、Pol４５５の提示の変動が１０倍未満であったことから、考えにくい。これらのデータは、Ｃ＋１位置にあるアミノ酸が、マルチエピトープ ＤＮＡワクチン内でのエピトープ提示の効率に対して及ぼし得る特筆すべき効果を実証している。かくして、これらのデータは、ＤＮＡワクチン内のＣＴＬエピトープの免疫原性が、エピトープ提示レベルに影響を及ぼす設計上の考慮事項を通して最適化され得る、ということを示している。効果は、抗原が転写され翻訳された後に及ぼされることから、このタイプの最適化は、ウイルスベクターならびに当業者にとって既知のその他の発現ベクターといったようなその他のフォーマットを用いて送達されるエピトープベースのワクチンに対して適用可能である。
【０１３７】
要約すると、隣接残基については、Ａ、Ｃ又はＧといったような非常に小さい残基又は、Ｑ、Ｗ、Ｋ又はＲといったような大きな残基のいずれかが、一般に良又は優の応答に結びつけらえることがわかった。マルチエピトープ構築体内の停止コドンによるＣ＋１残基の欠如又はＳ又はＴといった中間サイズの残基の存在は、より中間的な応答パターと結びつけられた。最後に、負に荷電した残基、Ｄ；脂肪族（Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ）又は芳香族非トリプトファン残基（Ｙ、Ｆ）の場合、比較的低い応答が観察された。これらの結果は、エピトープのＣ末端を隣接する特定の残基が応答の頻度及び規模に劇的な影響を及ぼすことができるということを示している。Ｃ＋１の位置にある隣接残基は同様に、スペーサ配列と組合せた形で導入され得る。かくして、免疫原性に有利に作用する残基、好ましくはＫ、Ｒ、Ｎ、Ａ又はＧがスペーサの隣接残基として内含される。
【０１３８】
マルチエピトープ構築体のえり分け及び最適化
本発明を用いたマルチエピトープ構築体の開発を目的として、マルチエピトープ構築体内への内含のためのエピトープを、本書に定義されたパラメータを用いてえり分けし最適化する。えり分け及び最適化は、コンピュータを用いてか又はさらに数の少ないエピトープについてはコンピュータを用いずに実施可能である。
【０１３９】
コンピュータ化された最適化は、標準的には以下の通りに実施可能である。以下では、例えば最少数の接合部エピトープ及び最大数の隣接残基、エピトープ組合せを提供する、同定及び最適化を行なうコンピュータ化されたシステムの一例を提供している。図１０は、本発明の１実施形態に従ったマルチエピトープ構築体の最適化を実施するためのコンピュータシステム１００を例示している。コンピュータシステム１００は、今日コンピュータ内に標準的に見い出される処理回路、例えば中央処理ユニット（ＣＰＵ）、メモリ、例えばハードディスクドライブ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、キャッシュ、及びその他のコンポーネント、デバイス及び回路（図示せず）を内含する従来型のコンピュータであり得る。好ましい実施形態においては、コンピュータシステム１００は、その他のコンポーネント及びデバイスの中でも、秒あたり６００，０００〜７００，０００の順列を探索する能力をもつマッキントッシュＧ３の３３３ＭＨｚプロセッサ、６ギガバイト（ＧＢ）ハードドライブ、９６メガバイトのＲＡＭ及び５１２キラバイト（ＫＢのキャッシュメモリを内含する。コンピュータシステム１００はさらに、ユーザーに対しテキスト、グラフィクス及びその他の情報を表示するためのモニター１０２及び、ユーザーがコンピュータシステムに対しデータ、指令、及びその他の情報を入力できるようにするキーボード１０４を内含する。
【０１４０】
図１０に示されているように、１つの実施形態において、コンピュータシステム１００は、遠隔場所にいる登録されたユーザーが遠隔コンピュータ１５０にログオンし必要とされるパスワード又はユーザー同定を供給することにより本書に記述された接合部分析及びマルチエピトープ構築体最適化を実施できるような形で、コンピュータネットワーク１６０を通して１又は複数の遠隔コンピュータ１５０と通信することができる。コンピュータネットワーク１６０は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、又はワールドワイドウェブ（すなわちインターネット）であり得る。これらのタイプのネットワークは、当該技術分野において周知であり、従って、これらのネットワーク及びその通信プロトコルの論述は、ここでは提供しない。
【０１４１】
好ましい実施形態においては、コンピュータシステム１００は、ソフトウェアプログラム例えばオブジェクトコードをコンピュータシステム１００のハードドライブメモリ内に記憶している。このオブジェクトコードは、本書で記述されている関数を実施するため、ＣＰＵにより実行される。ソフトウェアプログラムの１つのコンポーネント又はモジュールは、マルチエピトープ核酸構築体によってコードされるポリペプチドのペプチド接合部において接合部エピトープを分析し同定し、かつこれらの接合部におけるスペーサ及び隣接残基の組合せを評価する機能を果たす。このソフトウェアモジュールは、本書では「Junctional Analyzer」モジュール又はプログラムと呼ばれている。好ましい実施形態においては、このJunctional Analyzerは、以下で記述するその他の基準、データ及び演算パラメータに従ってユーザーにより入力されたペプチドを分析し処理する。
【０１４２】
図１１Ａ−Ｂ（以下図１１と呼ぶ）は、本発明の１実施形態に従ってJunctional Analyzerプログラムにより使用される、ユーザー入力データ及びパラメータを含む入力テキストファイル２００の一例を例示している。図１１に示されているように、さまざまなタイプの入力データがプログラムに提供される。まず最初に、ユーザーはプロセシングのための一組のペプチド又はエピトープ２０２を入力することができる。Ｃ＋１及びＮ−１位置に現われる場合の各アミノ酸のための重みセット２０４が、同様にユーザーによりテキストファイル内に入力される。１つの実施形態においては、重み値は、１つのポリペプチドのＣ＋１又はＮ−１位置に置かれた場合の各アミノ酸の免疫原性又は抗原性「増強」効果を反映する実験結果の統計的又は経験的分析によって決定される。しかしながら各アミノ酸についての重み値の割当ては、その重み値を決定するのに使用される所望の基準に応じて、当業者には明らかとなるin vitro及びin vivo研究を含めた任意の数の方法により実施できる。かかる実験又は研究のいくつかの例が以下でさらに詳細に記述されている。
【０１４３】
好ましい実施形態においては、異なるエピトープ／隣接残基の組合せを含むデータベースがエピトープ免疫原性に基づいて層化され、最適な応答対次善の応答の数がえり分けされてアミノ酸が格付けされ増強重み値が割当てられる。テキストファイルは同様に、接合部エピトープを検出する上で使用するためのモチーフセット２０６をも含んでいる。好ましい実施形態においては、ユーザーは同様に、スペーサ及び／又は隣接残基として機能するように各ペプチド対（Max Insertions）２０８の間に挿入すべきアミノ酸（スペーサ及び隣接）の最大数を入力することもできる。プログラムのオペレーションを制御するためのその他のパラメータ、値又は指令（本書では集合的に「パラメータ」と呼ばれている）、例えば「Output To Screen（Ｙ／Ｎ）、２１０；Output To File（Ｙ／Ｎ）」２１２；有効な結果として受諾すべき最小関数値（「Minimum Accepted」）２１４；  同じ関数値を有する結果の最大数（「Max Duplicate Function Value」）２１６；分単位の１回の探索に許容された最大時間（「Search Time」）２１８；全数探索が望まれているか否か（「Exhaustive＝Ｙ／Ｎ」）２２０；確率的探索プローブの数（「Num Stochastic Probes」）２２２；確率的探索中に１つの単一プローブあたりに許容されたヒット最大数（「Max Hitsper Probe」）２２４；及び各プローブの開始がランダムであるべきかその他であるべきか（「Random Probe Start（Ｙ／Ｎ）」）２２６、も入力可能である。これらのパラメータは、例示のみを目的として提供されている。当業者には明らかとなるようにプログラムのオペレーション及び出力フォーマットを制御するためのその他のパラメータを、入力することができる。
【０１４４】
テキストファイル２００内のモチーフ２０６は、接合部エピトープを同定するための「マスク」又は構造モデルを提供する。図１１に示されている例えば第１のモチーフ２０６ａ、ＸＸＸＸ（Ｆ又はＹ）ＸＸ（Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＶ）は、長さがアミノ酸８個であるエピトープを規定する。値「Ｘ」は、あらゆるアミノ酸がエピトープのその位置にあり得ることを表わしている。値「（Ｆ又はＹ）」は、Ｆアミノ酸又はＹアミノ酸のいずれでもエピトープの第５位置にあり得ることを表わしている。同様にして、（Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＶ）は、列挙されたアミノ酸、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＶのいずれでもエピトープの第８位置にあり得ることを表わしている。従って、２つのペプチドの接合部にまたがる８つのアミノ酸の配列が上述のモチーフ基準を満たす場合、それは接合部エピトープとして同定される。
【０１４５】
図１２は、Junctional Analyzerプログラムの１実施形態の流れ図を例示する。ステップ３０１では、プログラムは、接合部分析オペレーションを実施するためのユーザー入力及び命令を受信する。好ましい実施形態においては、プログラムは、パラメータ２０２−２２６を入力するために、図１１に示された通りの入力テキストファイル２００を使用する。当該技術分野において周知であるように、かかるテキストファイルは、例えば、そのオペレーションのための所望の入力パラメータ（例えばエピトーフ、モチーフ、隣接残基重み値、最大ヒット数、最大探索時間など）を特定するべく、Microsoft ExcelTMスプレッドシートファイル又はドキュメントから誘導され得る。ステップ３０３では、Junctional Analyzerプログラムは、全エピトープ対のリストを生成する。例えば、１０個のＥＰターゲティング配列がユーザーにより入力された場合、合計９０（１０×９）のエピトープ（ペプチド）対が存在することになる。次に、ステップ３０５では、各々のペプチド又はエピトープ対について、プログラムは、最小数の接合部エピトープ及び／又はスペーシング残基のＣ＋１及びＮ−１寄与からの最大の効果を結果としてもたらす挿入セットを決定する。この決定を行なうためには、プログラムは、各ペプチド対のためのスペーサの各々の可能な組合せについての関数値を計算するが、ここでスペーサの数は０からMax Insertions２０８（図１１）までの範囲内であり得、既知の又は予め特定されたアミノ酸のあらゆる配置を考慮することが可能である。好ましい実施形態においては、関数値は、次の等式：すなわち  Ｆ＝（Ｃ＋Ｎ）／Ｊ、を用いて計算される。なお式中Ｃは、１つのエピトープのＣ＋１位置に位置づけされた隣接アミノ酸のための増強重み値であり、Ｎは、１つのエピトープのＮ−１位置に位置設定された隣接アミノ酸のための増強重み値であり、Ｊは、存在する接合部エピトープの数である。ペプチド対の１つの接合部で多数のモチーフを満足たすことができるため、Ｊは１より大きい数であり得る。Ｊ＝０である場合、Ｆ＝２（Ｃ＋Ｎ）である。この第２の等式は、（Ｃ＋Ｎ）の固定値について、Ｊが２から１に変化するとき関数値Ｆは２倍になり、Ｊが１からゼロに変化するとき再び２倍にあることから、選択されたものである。しかしながら、上述の等式が単なる一例であり、ペプチド対を評価するためのその他の等式もあらゆる時点でプログラムに容易に付加できるということを理解すべきである。強調又は評価のための所望の基準に応じた上述の等式に対する修正又は変更が、当業者には容易に明らかとなることだろう。ステップ３０７で、プログラムは、各々のペプチド対についての挿入（スペーシング及び／又は隣接残基）及び各々のペプチド対についての最大関数値の最適な組合せを出力する。好ましい実施形態においては、ステップ３０７で、このプログラムからの出力は、各々のペプチド対について最大関数結果を生み出す挿入を列挙する出力テキストファイルとして生成される。
【０１４６】
図１３Ａ−Ｄ（以下図１３と呼ぶ）は、各ペプチド対について最大関数値を有するスペーサ組合せを列挙する出力テキストファイル例４００を示している。図１３に示されている例においては、Ａ−Ｋ２０２（図１１）と標識された１１のペプチドがプロセシングされ、接合部エピトープを検出するためにMotifs２０６が使用され、各々の潜在的隣接残基２０４のための増強重み値が使用され、Max Insertion２０８は４にセットされた。Junctional Analyzerプログラムのオペレーション及びフォーマットを制御するためのその他のパラメータが、パラメータ設定値４０２により例示されている通りにセットされた。便宜上、好ましい実施形態においては、これらの入力パラメータは出力テキストファイル４００の中でくり返されている（図１２）。出力テーブル４０４の第１欄（Col.１）は、１つの対の最初のペプチドを表わしている。出力テーブルの第２欄（Col.２）は、スペーサ及びＣ＋１隣接アミノ酸として共に機能する第１のアミノ酸挿入を列挙している。第３欄は、第２のスペーサアミノ酸を列挙している。第４欄は、第３のスペーサアミノ酸を列挙する。第５欄は、同様に第６欄に列挙されている対の第２のペプチドのためのＮ−１隣接アミノ酸である第４のスペーサアミノ酸を列挙している。第７欄は、第２欄内に列挙されたＣ＋１隣接アミノ酸の増強重み値を列挙している。第８欄は、第６欄４１２の中に列挙されているＮ−１隣接アミノ酸の増強重み値を列挙している。第９欄は、Ｃ＋１及びＮ−１増強重み値の合計を列挙している。第１０欄は、ペプチド対内に見い出される接合部エピトープの数を列挙しており、第１１欄は、以上で列挙された等式に基づくペプチド対についての最大関数値を列挙している。例えば、出力テーブル４０４の第１行は、ペプチドＶＬＡＥＡＭＳＱＶ（配列番号７）−ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号８）に対応するペプチド対Ａ−Ｂについて、３つのアミノ酸、ＣＡＬのスペーサ組合せは、全ての接合部エピトープを無くし、８．８０という最大関数値を提供する、ということを示している。しかしながら、本発明に従うと、その他の出力オプションも実現可能であることが理解される。例えば、出力テーブル４０４は、ユーザーが望む詳細及び／又は分析のレベルに応じて、各ペプチド対についてトップの３２の結果を示してもよいし、又評価された順序で可能な全ての挿入についての全ての結果を示してもよいし、又は大きい出力ファイルを生成するべくモチーフ探索プロセスをトレースしてもよい。
【０１４７】
好ましい実施形態においては、出力テーブル４０４内に含まれている情報を用いて、最適なスペーサ組合せを含む１１のペプチド全てをリンクするポリペプチド構築体を同定するべく「全数Ｊ探索」又は「確率的Ｊ探索」のいずれかを実施することができる。例えば１１のペプチドについて、１０個の接合部が存在することになる。従って、１０の接合部全てを考慮に入れて最大の関数値和を生成する順列が、マルチエピトープ構築体の「最適な」順列（単複）として同定される。１つの実施形態においては、ユーザーの便宜上、出力テキストファイル４００は同じく、ペプチド／エピトープの当初のリスト２０２、使用される重み値２０４、使用されるモチーフ２０６及びMax Insertion値２０８、ならびに図１１の入力テキストファイル２００内に入力されたその他のパラメータ設定値４０２をも含むことになる。
【０１４８】
「全数Ｊ探索」は、ペプチドの全ての順列を調べ、最大の関数和をもつものを選択する。しかしながら、順列の階乗性に起因して、プロセシングすべきペプチドの数が増大するにつれて「全数Ｊ探索」を完了するのに必要な時間はほぼ指数関数的に増大する。例えば、標準的マッキントッシュ３３３ＭＨｚコンピュータを用いて、１３のペプチドについての推定実行時間は、約２.９時間であり、１４のペプチドについては約４０時間となる。「全数Ｊ探索」は、順列空間全体ではなくむしろ順序シーケンスの多くの部域を探索し、それが発見する最高の関数和を報告するように設計されている。現行の最大関数合計に合う又はこれを超える順列のみを報告することにより、順列シーケンスのはるかに広い部域を探索することが可能である。この技術は、２０ものペプチドの場合において成功してきた。２０個のペプチドの全数探索を実施するための時間は、およそ１.３×１０5年であると推定されている。
【０１４９】
ここで再度図１２を参照すると、ステップ３０９で、プログラムは、出力テキストファイル４００からのポリペプチドの考えられる順列の「全数Ｊ探索」又は「確率的Ｊ探索」のいずれを実施すべきかを決定する。好ましい１実施形態においては、ステップ３０９における決定は、入力パラメータExhaustive（Ｙ／Ｎ）２２０（図１１）によって例示されるように、該探索が全数となるか確率的となるかを入力するユーザーにより行なわれる。その他の実施形態においては、プログラムは、プロセシングすべきペプチドの数に応じて確率的探索又は全数探索のいずれかを自動的に選択することができる。例えば、１４個未満のエピトープが内含されるべきである場合、全数Ｊ探索ルーチンがプログラムにより自動的に選択される。全数探索プログラムは、全てのエピトープ対についての最適化関数の和のための最良値をもつもの（単複）を発見するためにマルチエピトープ構築体を構成するエピトープの全ての順列を探索する。このことは、全てが検査されることから「最良の」順列（単複）を発見するために、保証されている。１４以上のエピトープがマルチエピトープ構築体内に内含されるべきである場合、「確率的Ｊ探索」が使用される。好ましい実施形態においては、「確率的Ｊ探索」は、ペプチドの最適な配置の最良の推定を見い出すための順列空間の数多くの領域を検査するべく当業者にとって既知のモンテカルロ技術を使用する。しかしながら、本発明に従うと、その他の確率的探索方法を実施してもよい。例えば、各々の確率的プローブについて出発順列を無作為に選定するのではなく、プログラムは、ユーザーにより入力されたペプチドのうちの異なる１つのもので始まる順列で各プローブが開始することを要求し得る。例えば単に３つのペプチドＡ、Ｂ及びＣだけが存在した場合、３つのプローブは例えばＡＢＣ、ＢＡＣ及びＣＢＡで始まることになる。この方法は、可能な順列のかなり均一なカバレッジを提供する。
【０１５０】
「確率的Ｊ探索」が選択された場合、次にステップ３１１で、プログラムはプローブを開始することにより確率的探索を始める。次に、ステップ３１３で、プログラムは、１プローブあたりの最大探索時間を超過したか否かを決定する。最大探索時間に達していなかった場合には、次にステップ３１５で、プログラムは単一プローブが、１プローブあたりの最大ヒット数に到達したか又はそれを超過したか否かを決定する。１実施形態においては、１つの順列の関数値が以前に分析された１又は複数の順列について以前に登録された最大関数和と同じか又はそれを上回る場合に、プローブヒットが登録される。プローブあたりの最大ヒット数に到達しなかった場合には、ステップ３１７で現行の確率的プローブが次の順列又は順列セットを評価し、プロセスはステップ３１３に戻る。ステップ３１５で、プローブあたりの最大ヒット数に到達した又はこれを超えたことが決定された場合には、プログラムはステップ３１９に進み、ここでプログラムは、最大プローブ数がすでに実行されたか否かを決定する。同様に、ステップ３１３で、プローブあたりの最大時間限界に到達した又はこれを超えたことが決定された場合、プログラムは、最大プローブ数が完了したか否かを決定するべくステップ３１９まで進む。ステップ３１９において、最大プローブ数が達成されていないことが決定された場合、プローブはステップ３１１まで戻り、新しい探索プローブが開始される。ステップ３１９で最大プローブ数が実行されたことが決定された場合には、プログラムはステップ３２３まで進み、ここでその時点までに同定された最適な順列の最良のセットを出力する。この「最良のセット」は、最高の関数和をもつ順列のみから成っていてもよいし、或いは又代替的には例えばトップ３の最高関数和をもつ順列、又はユーザーが所望するその他のあらゆる出力基準から成っていてもよい。
【０１５１】
好ましい１実施形態においては、１プローブあたりの特定された最大ヒット数をプローブが受けとった場合、そのプローブのために使用されなかった時間は全て、残りのプローブの各々に対しどれぐらいの時間を割当てるべきかを判定するために残りのプローブにより分割される。換言すると、過度に多いヒットを見い出したことを理由としてプローブが早期に終了した場合には、残りのプローブにはより多くの時間が割当てられる。この機能性は、コンピュータプログラミング技術における当業者であれば容易に実現することができる。
【０１５２】
ステップ３０９で全数探索が選択された場合には、ステップ３２１で、上述の通り全ての順列を分析する全数探索が開始される。全数探索の完了時点でプログラムはステップ３２３まで進み、ここでそれは、発見された最適な順列の「最良セット」を出力する。上述のように、この「最良セット」は、最高和関数値又はトップ３の最高和関数値を伴う順列、又はユーザーにより特定された任意の所望の基準を満たす順列（例えば最高関数値を伴うトップ３０の順列）を内含し得る。
【０１５３】
上述の判定又は決定ステップの各々について（例えばステップ３１３、３１５及び３１９）、プログラムは、定期的間隔で（例えば５秒毎）問合せを実施するようにセットされてもよいし、又代替的には、特定数の順列（例えば５）が分析された後又は全ての順列が分析された後問合せを実施するようにセットされてもよい。これらのオペレーション及びタイミングプロトコルのいずれもが容易に実現され、当業者によって調整される。
【０１５４】
プログラム出力は、エピトープの最良の配置のリストを提供する。数多くの順列が評価関数の同じ値を有し得ることから、最適な配置を選択する上でその他の因子が考慮され得るように、複数のものが生成される。上述のコンピュータ化された技術を用いて生成されたマルチエピトープ構築体の例が、図９に示されている。本発明の方法及びシステムによって実現されるプロセスフローの一例が以上で提供されている。当業者にとっては容易に明らかとなるように、電荷分布、疎水性／親水性領域分析又は折畳み予測といったようなその他の因子も同様に、マルチエピトープ構築体をさらに最適化するべく評価関数内に取込むことができるだろう。さらに、マルチエピトープ構築体は同じ又は類似のプロセスを通して１又は複数の付加的回数、プロセスによりすでに最適化されたマルチエピトープ構築体をプロセシングすることによって、さらに最適化され得る。その後の処理ラウンドにおいては、最初の最適化ラウンドで用いられたパラメータに比べて１又は複数のパラメータを修正することが可能である。２ラウンドで最適化されたマルチエピトープ構築体の一例は、ＨＢＶ−３０ＣＬ構築体である。
【０１５５】
マルチエピトープ構築体は同様に、結果としての巨大分子構造を考慮することによっても最適化され得る。ポリペプチド構造といったような巨大分子構造は、さまざまな組織化レベルの形で記述することができる。この組織化の一般的論述については、例えば、Alberts et al., 細胞の分子生物学（１９９４年第３版）及びCantor及びSchimmel, 生物物理化学第Ｉ部：生物学的巨大分子の立体配座（１９８０）を参照のこと。「一次構造」というのは、特定のペプチドのアミノ酸配列のことである。「二次構造」というのは、ポリペプチド内部での局所的に秩序立った３次元構造のことである。これらの構造は普通ドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな機能単位を形成するポリペプチドの一部分である。標準的ドメインは、二次構造の組合せ（例えばβ−シート及びα−らせん）により形成される。「三次構造」というのは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造を意味する。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有会合により形成された３次元構造のことである。
【０１５６】
当業者にとっては既知の配列分析を用いて、電荷分布、疎水性／親水性領域分析又は折畳み予測といったような構造的予測を実施することができる（例えばKyte & Doolittle, J. Mol. Biol. １５７：１０５〜１３２（１９８２）及びStryer, 生化学（第３版、１９８８，を参照のこと；又同様に、dot. imgen, bcm. tmc. edu.で見い出されるもののようなインターネットベースの一定数の配列分析のいずれかも参照のこと）。
【０１５７】
マルチエピトープ構築体の３次元構造モデルも同様に生成可能である。これは一般に、１つのモデルを生成できる予測的コンピュータシステム内に分析すべきアミノ酸配列を入力することによって実施される。アミノ酸配列は、タンパク質の構造的情報をコードするタンパク質の一次配列又はサブ配列を表わす。タンパク質の３次元構造モデルはこのとき、当業者にとって既知のソフトウェアを用いて、コンピュータシステムの相互作用によって生成される。
【０１５８】
アミノ酸配列は、問題のタンパク質の二次、三次及び四次構造を形成するのに必要な情報をコードする一次構造を表わす。ソフトウェアは、構造モデルを生成するために一次配列によりコードされたいくつかのパラメータを調べる。これらのパラメータは「エネルギー項」と呼ばれ、主として静電電位、疎水性電位、溶媒アクセス可能表面、及び水素結合を内含する。二次エネルギー項には、ファンデルワールス電位が含まれる。生物学的分子は、エネルギー項を累積的に最小化する構造を形成する。従ってコンピュータプログラムは、二次構造モデルを作り出すため、一次構造又はアミノ酸配列によりコードされるこれらの項を使用している。二次構造によりコードされるタンパク質の三次構造はこのとき、二次構造のエネルギー項に基づいて形成される。ユーザーは、タンパク質が膜結合されているか又は可溶であるか、体内でのその場所及びその細胞場所例えば細胞質、表面又は核、といったような付加的変数を入力することができる。これらの変数は、二次構造のエネルギー項と共に、三次構造のモデルを形成するために使用される。三次構造をモデリングするにあたり、コンピュータプログラムは、二次構造の疎水性面を類似のものと、そして二次構造の親水性面を類似のものと整合させる。このとき、ＨＬＡプロセシング装置に最も容易にアクセス可能であるマルチエピトープ構築体が選択される。
マルチエピトープワクチンの免疫原性の査定
【０１５９】
マルチエピトープ構築体の開発は、ＭＨＣに対するペプチド結合の種特異性のため、無類の挑戦である。異なる種由来の異なるＭＨＣタイプが異なるペプチドセットを結合させる傾向にある（Rammensee et al., Immunogenetics, Vol.４１（４）：１７８−２２８（１９９５））。その結果として、ヒトエピトープから成る構築体を正規の実験動物の体内でテストすることは不可能である。この制限を克服するための代替案が一般に利用可能である。これらには、１）非ヒトＭＨＣにより制限されたエピトープを取込んだ類似の構築体をテストすること；２）非ヒトＭＨＣにより制限された対照エピトープに依存すること；３）ヒト及び非ヒトＭＨＣ間の交叉反応性に依存すること；４）ＨＬＡ遺伝子導入動物を使用すること；及び５）in vivoでヒト細胞を利用する抗原性検定、が含まれる。以下に記すのは、抗原性及び免疫原性を分析するための技術の開発の簡単な概観である。
クラスＩ  ＨＬＡ遺伝子導入マウス
【０１６０】
エピトープ同定（Sette et al., J Immunol, Vol. １５３（１２）：５５８６−９２（１９９４）；Wentworth et al., Int Immunol, Vol.８（５）：６５１−９（１９９６）；Engelhard et al., J Immunol, Vol.１４６（４）：１２２６−３２（１９９１）；Man et al., Int Immunol, Vol. ７（４）：５９７−６０５（１９９５）；Shirai et al., J Immunol, Vol. １５４（６）：２７３３−４２（１９９５））、及びワクチン開発（Ishioka et al., J Immunol, Vol. １６２（７）：３９１５−２５（１９９９））を目的としたＨＬＡ遺伝子導入マウスの有用性は、立証されてきている。公開された報告書の大部分が、ＨＬＡ  Ａ２.１／Ｋbマウスの使用について調査していたが、Ｂ*２７及びＢ*３５０１マウスも同様に利用可能であることも指摘しておくべきである。さらに、ＨＬＡ  Ａ*１１／Ｋbマウス（Alexander et al., J. Immunol, Vol.１、１５９（１０）：４７５３〜６１（１９９７））及びＨＬＡ Ｂ７／Ｋb及びＨＬＡ  Ａｌ／Ｋbマウスも同様に生成されていた。
【０１６１】
Ａ２.１／Ｋb−遺伝子導入マウスのＡ２.１制限されたＣＴＬレパートリ及びＡ２.１＋ヒトの間の重複レベルを決定するために、３８の異なる潜在的エピトープからのデータが分析された（Wentworth et al., Eur Immunol, Vol.２６（１）：９７−１０１（１９９６））。ヒト及びマウスの両方において、約５００ｎＭのＭＨＣペプチド結合親和性閾値が、in vivoでＣＴＬ応答を惹起するペプチドの能力と相関関係を有している。In vivoでのヒトデータとin vivoでのマウスデータの間の高い一致レベルが、高結合ペプチドの８５％、中間結合剤の５８％及び低／負結合剤の８３％について観察された。ＨＬＡ  Ａ１１及びＨＬＡ Ｂ７ 遺伝子導入マウスでも、類似の結果が得られた（Alexander et al., J Immunol, Vol.１５９（１０）：４７５３−６１（１９９７））。かくして、ヒトＣＴＬとＨＬＡ遺伝子導入マウスのＴ細胞レセプタレパートリの間に存在する広範な重複のため、遺伝子導入マウスは、本書で記述されているマルチエピトープ構築体の免疫原性を査定するのに貴重である。
【０１６２】
ＨＬＡ  Ａ１１マウスに関連するようなＴＡＰ輸送の異なる特異性は、免疫原性の評価用ＨＬＡ−Ａ１１遺伝子導入マウスの使用を妨げるものではない。マウス及びヒトの両方のＴＡＰが疎水性末端をもつペプチドを効率良く輸送するものの、ヒトＴＡＰのみが、Ａ３、Ａ１１そしてＡ３スーパータイプのその他の成員により結合されたものといったような正に荷電したＣ末端をもつペプチドを効率良く輸送することが報告されてきた。この問題は、マウス及びヒトの両方のＴＡＰが同等にＡ２、Ｂ７又はＡ１により結合されたペプチドを輸送する能力を有するはずであることから、Ａ２、Ａ１又はＢ７にあてはまらない。この理解と一貫して、Vitiello (Vitiello et al., J Exp Med, Vol.１７３（４）：１００７−１５（１９９１））及びRotzschke（Rotzschke O, Falk K, Curr Opin Immunol, Vol.６（１）：４５−５１（１９９４））は、マウス及びヒトの細胞内でプロセシングが類似していると示唆したのに対し、Cerundolo（Rotzschke O, Falk K, Curr Opin Immunol, Vol.６（１）：４５−５１（１９９４））は、共にＨＬＡ Ｈ３分子を発現するマウスの細胞とヒトの細胞の差異を示唆した。しかしながら、ＨＬＡ  Ａ１１遺伝子導入動物を用いて、in vivoでのＴ及びＢ細胞上のＨＬＡ分子の発現が観察され、報告されたマウスＴＡＰの不利な特異性がin vivoでのＡ１１／Ｋb分子の安定化及び輸送を防止しなかったことを示唆した（Alexander et al., J Immunol, Vol.１５９（１０）：４７５３−６１（１９９７））。これらのデータは、荷電されたＣ末端を伴うペプチドが、Ａ１１分子でのトランスフェクションを受けたマウスの細胞から溶出され得たという以前の観察事実と一致している（Maier et al., Immunogenetics；Vol.４０（４）：３０６−８（１９９４））。インフルエンザといったような複合抗原に対する、そして最も重要なのはマルチエピトープ構築体によりコードされたＡ１１制限されたエピトープに対するＨＬＡ  Ａ１１マウス体内の応答（Ishioka et al., J Immunol, Vol. １６２（７）：３９１５−２５（１９９９））も検出されてきた。かくして、ＴＡＰの問題は、遺伝子導入マウスの場合、わずかしか関係しないように思われる。
【０１６３】
ＨＬＡ遺伝子導入マウスの使用と潜在的に関連性をもつもう１つの問題は、ＨＬＡの発現及び結合特異性に対して、β−ミクログロブリンが影響する可能性にある。ヒトβ２が、マウスβ２ミクログロブリンに比べ高い親和性及び安定性でヒト及びマウスの両方のＭＨＣを結合させるということは周知である（Shields et al., Mol Immunol Vol. ３５（１４−１５）：９１９−２８（１９９８））。ＭＨＣ重鎖及びβ２のより安定した複合体がＭＨＣクラスＩの外因性負荷を容易にするということも周知である（Vitiello et al., Science, Vol.２５０（４９８６）：１４２３−６（１９９０））。我々は、ＨＬＡ／Ｋb及びヒトβ２についての二重遺伝子導入動物であるマウスを生成することによってこの変数の潜在的効果を検査した。ヒトβ２の発現は、ＨＬＡ Ｂ７／Ｋbマウスのケースで有益であり、ＨＬＡ  Ａ１遺伝子導入マウスの場合に良好な発現レベルを達成するには絶対不可欠であった。従って、ＨＬＡ／Ｋb及びβ２二重遺伝子導入マウスは、現在そして日常的に繁殖され、当該発明人により利用される。かくして、４つの主要ＨＬＡ特異性（すなわちＡ２、Ａ１１、Ｂ７及びＡ１）のＨＬＡ制限された認識をモデリングするために、ＨＬＡ遺伝子導入マウスを使用でき、免疫原性の評価のための適切なモデルとしてその他のＨＬＡ特異性のために遺伝子導入マウスを開発することができる。
クラスＩ エピトープのための抗原性試験
【０１６４】
複数の独立した実験系統により、細胞表面上のクラスＩ／ペプチド複合体の密度がＴ細胞初回免疫レベルと相関関係を有しうるということが示されている。かくして、エピトープが生成されＡＰＣの表面上に提示されるレベルを測定することで、in vitroにてヒトの細胞内でマルチエピトープ核酸ワクチンの効能を間接的に評価するための手段が提供される。ＨＬＡクラスＩ遺伝子導入マウスの使用に対する補足として、このアプローチは、ヒト細胞内のプロセシングを検査するという利点を有する（Ishioka et al., J Immunol, Vol. １６２（７）：３９１５−２５（１９９９））。
【０１６５】
プロセシングされたペプチドを実験的に定量するためにいくつかの考えられるアプローチを利用することができる。細胞表面上のペプチドの量は、ＡＰＣ表面から溶出されたペプチドの量を測定することによって定量可能である（Sijts et al., J Immunol, Vol.１５６（２）：６８３−９２（１９９６）；Demotz et al., Nature, Vol.３４２（６２５０）：６８２−４（１９８９））。代替的には、感染した又はトランスフェクションを受けた標的細胞により誘発された溶解又はリンフォカイン放出の量を測定し、その後同等の溶解又はリンフォカイン放出レベルを得るのに必要なペプチド濃度を決定することにより、ペプチド−ＭＨＣ複合体の数を推定することができる（Kageyama et al., J Immunol, Vol. １５４（２）：５６７−７６（１９９５））。
【０１６６】
マルチエピトープ核酸でのトランスフェクションを受けた細胞系統内でのエピトープ提示を測定するために、類似のアプローチも使用されてきた。特定的には、ＨＬＡ遺伝子導入マウス体内で免疫原性であるマルチエピトープ構築体も同様に、同じ構築体でのトランスフェクションを受けたヒト細胞によって最適なエピトープへとプロセシングされ、遺伝子導入マウス内で見られる応答の規模は、マルチエピトープ構築体を受けたヒト標的細胞で見られた抗原性と相関関係をもつ（Ishioka et al., J Immunol, Vol. １６２（７）：３９１５−２５（１９９９））。
【０１６７】
抗原性検定を用いて、エピトープの順序又は隣接残基が異なる一定数の関係する構築体をＡＰＣへとトランスフェクションすることができ、エピトープ提示に対する前述の変数の影響を評価することが可能である。これは、比較的多数の異なる構築体を評価する必要のある試験のための好ましいシステムであり得る。これは多数のエピトープ特異的ＣＴＬを必要とするものの、感度の高いＣＴＬ系統の生成（Alexander-Miller et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol.９３（９）：４１０２−７（１９９６））と同時にそれを多数に拡大すること（Greenberg P.D., Riddell S.R., Science, Vol.２８５（５４２７）：５４６−５１（１９９９））をも可能にするプロトコルが、この潜在的問題に対処するために開発されてきた。
【０１６８】
トランスフェクションのために選択された細胞がin vivoでＡＰＣ機能を実施する細胞を反映するものでない場合、誤解を招くような結果が得られる可能性があるということも念頭に置いておくべきである。「プロフェッショナル」ＡＰＣとして知られているＢ細胞系譜の細胞がトランスフェクション受容体として標準的に利用されている。このタイプのトランスフェクションを受けたＢ細胞の使用は、この分野では受入れられた実践方法である。その上、本書でより詳しく記述されているようにトランスフェクションを受けたヒトＢ細胞を利用したin vitroデータとＨＬＡ遺伝子導入マウスを用いたin vivo結果の間には、良好な相関関係がすでに指摘されてきた。
ＨＴＬ応答の測定
【０１６９】
好ましい実施形態においては、ワクチン構築体がクラスＩＩ制限型免疫応答を誘発するために最適化されている。クラスＩＩエピトープを内含するマルチエピトープ構築体を評価する１つの方法は、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子導入マウスを使用することである。複数のグループがＨＬＡ−ＤＲ遺伝子導入マウスを産生し、特徴づけした（Taneja V., David C.S., Immunol Rev, Vol. １６９：６７−７９（１９９９））。
【０１７０】
或る種のヒトＭＨＣ分子と実験動物により発現された特定のＭＨＣ分子の間の交叉反応性に依存する代替案も同じく存在している。Bertoni及び共同研究者ら（Bertoni et al., J Immunol, Vol.１６１（８）：４４４７−５５（１９９８））は、或る種のＨＬＡクラスＩスーパータイプとチンパンジーにより発現された或る種のＰＡＴＲ分子の間でかなりの交叉反応性が実証され得るということを指摘した。クラスＩＩ（Geluk et al., J Exp Med, Vol.１７７（４）：９７９−８７（１９９３））及びクラスＩＩ分子（Dzuris et al., J. Immunol., July １９９９）のレベルでのヒトとマカクザルの間の交叉反応性も指摘されてきた。最後に、ヒトＨＬＡ  Ｂ７スーパータイプにより認識されたモチーフが基本的にマウスクラスＩＬdにより認識されたモチーフと同じであることも指摘することができる（Rammensee et al., Immunogenetics, Vol.４１（４）：１７８−２２８（１９９５））。マウス体内のＨＬＡ ＤＲ制限型エピトープの試験と関連して、Wall, et al（Wall et al., J. Immunol.,１５２：４５２６−３６（１９９４））により、ＤＲ１とＩＡbのモチーフには類似性が存在することが示されてきた。我々は、この思いがけない類似性を利用するように、我々の遺伝子導入マウスを日常的に飼育している。その上、我々は同様に、我々のポリペプチドの大部分がＩＡbに結合することをも示してきており、従ってこれらのマウスをＣＴＬ及びＨＴＬ免疫原性の研究のために使用する。
臨床標本からの免疫応答の測定及び定量
【０１７１】
ワクチン性能を査定するための決定的な要素は、免疫応答をin vivoで誘発するその能力を評価することにある。免疫原に対するならびに一般的な再生抗原に対するＣＴＬ及びＨＴＬ応答の分析が一般に使用され、当該技術分野において既知である。利用される検定には、クロム放出、リンフォカイン分泌及びリンパ増殖検定が含まれていた。
【０１７２】
ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色及び四量体染色といったようなより感度の高い技術が、当該技術分野において利用可能となった。従来の方法はin vitroで増殖し得るＴ細胞のサブセットのみを測定し、実際、メモリーＴ細胞区画の一画分しか代表し得ないことから（Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol.１０（４）：３９３−６（１９９８））、これらのより新しい方法が一般的なＣＴＬ及びＨＴＬ検定に比べて１０倍〜１００倍感度が高いと推定されている（Murali-Krishna et al., Immunity, Vol.８（２）：１７７−８７（１９９８））。特定的には、ＨＩＶの場合、これらの技術は、先行技術では検出不能であったはずの患者の抗原特異的ＣＴＬ応答を測定するために使用されてきた（Ogg et al., Sience, Vol.２７９（５３５９）：２１０３−６（１９９８）；Gray et al., J Immunol, Vol. １６２（３）：１７８０−８（１９９９）；Ogg et al., J Virol, Vol.７３（１１）：９１５３−６０（１９９９）；Kalams et al., J Virol, Vol.７３（８）：６７２１−８（１９９９）；Larsson et al., ＡＩＤＳ，Vol.１３（７）：７６７−７７（１９９９）；Corne et al., J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol, Vol.２０（５）：４４２−７（１９９９））。
【０１７３】
比較的わずかな例外はあるものの、単離されたばかりの細胞の直接的活性は、従来の検定を用いては実証が難しい（Ogg G.S., McMichael A. J., Curr Opin Immunol, Vol.１０（４）：３９３−６（１９９８））。しかしながらより新しい技術の感度の増大により、研究者達は、感染したヒト又は実験動物から単離されたばかりの細胞から応答を検出することができるようになった（Murali-Krishna et al., Immunity, Vol.８（２）：１７７−８７（１９９８）；Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol.１０（４）：３９３−６（１９９８））。In vitro再刺激ステップに依存しないこれらの感度の高い検定の利用可能性は、自然感染及び癌におけるＣＴＬ機能の研究を大幅に容易にした。これとは対照的に、実験的ワクチンの有効性を判断するための評価項目として利用された検定は、通常１又は複数のin vitro再刺激ステップと併用して実施される（Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol.１０（４）：３９３−６（１９９８））。実際、わずかな例外はあるものの（Hanke et al., Vaccine, Vol.１６（４）：４２６−３５（１９９８））、単離されたばかりのクラスＩ制限型ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＴＬ応答を惹起するように設計された実験用ワクチンでの免疫化に応答して実証することが困難であった。ＥＬＩＳＰＯＴ又はin situ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡといった感度の高い検定の使用は、最大の感度を達成するべく再刺激ステップと組合わされてきた；ＭＨＣ四量体も同じくこの目的で使用される。
【０１７４】
ＭＨＣ四量体は、１９９６年に初めてAltman及び共同研究者らによって記述された。これらは、蛍光マーカーでタグ付けされた四量体へと合わせて複合されたＣＴＬエピトープを含有するＨＩＶ特異的ペプチドで折畳まれた可溶性ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子を産生した。これらは、エピトープを認識するＨＩＶ感染した個体からのＴ細胞の母集団を標識するために使用される（Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol.１０（４）：３９３−６（１９９８））。これらの細胞は次に、フローサイトメトリにより定量され、エピトープに特異的なＴ細胞についての周波数測定を提供する。この技術は、ＨＩＶ研究ならびにその他の感染性疾患においても非常に高い評判を得ている。（Ogg G.S., McMichael A.J., Curr Opin Immunol, Vol.１０（４）：３９３−６（１９９８）；Ogg et al., Science, Vol.２７９（５３５９）：２１０３−６（１９９８）；Gray et al., J Immunol, Vol.１６２（３）：１７８０−８（１９９９）；Ogg et al., J Virol, Vol.７３（１１）：９１５３−６０（１９９９）；Kalams et al., J Virol, Vol. ７３（８）：６７２１−８（１９９９））。しかしながらＨＬＡの多形性は、四量体技術が定義済みのＨＬＡ／ペプチド組合せに依存しているという点で、この技術の一般的応用可能性を制限し得る。しかし、ＨＩＶ由来のペプチドを含めさまざまなペプチドがＡ２、Ａ３及びＢ７スーパータイプの異なる成員という状況下でペプチド特異的ＣＴＬ系統により認識されることが示されてきた（Threlkeld et al., J Immunol, Vol.１５９（４）：１６４８−５７（１９９７）；Bertoni et al., J Clin Invest, Vol.１００（３）：５０３−１３（１９９７））。これらの観察事実を合わせて考慮すると、一定の与えられたＭＨＣ／ペプチド組合せのためのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が同じスーパータイプからの異なるＭＨＣ分子により提示された同じペプチドに対する検出可能な親和性を有し得るということが立証される。
【０１７５】
予防用ワクチンの有効性が主として長く持続する記憶応答の誘発と相関されるような状況においては、再刺激検定は、ワクチンで誘発された免疫応答を監視するための最も適切で感度の高い措置であり得る。換言すると、治療的ワクチンの場合、活性との主要な免疫学的相関は、一次検定によって最も適切に測定されるエフェクタＴ細胞機能の誘発であり得る。かくして、感度の高い検定の使用は、ワクチンの有効性の免疫学的監視のための最も適切な試験戦略を可能にする。
トランスフェクションを受けたヒトＡＰＣ内のマルチエピトープ構築体の抗原性
【０１７６】
抗原性検定が、ヒト細胞中のエピトーププロセシング及び提示を評価する目的で実施される。マルチエピトープ核酸ワクチンでヒト標的細胞を効率良くトランスフェクションするためのエピソームベクターが、このような分析の実施に用いられる。
【０１７７】
例えば、２２１ Ａ２Ｋb標的細胞はＨＩＶ−１エピ遺伝子ワクチンでのトランスフェクションを受けた。２２１ Ａ２Ｋb標的細胞は、ＨＬＡ遺伝子導入マウス内で発現されるＡ２Ｋb遺伝子を発現するが、いかなる内因性クラスＩも発現しない（Shimizu Y, DeMars R., J Immunol, Vol.１４２（９）：３３２０−８（１９８９））。これらのトランスフェクションを受けた細胞は、ＨＬＡ遺伝子導入マウスから誘導されさまざまなＨＩＶ由来ＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬ系統に対して抗原を提示するその能力について検定された。異なるＣＴＬ系統の抗原感度の差を補正するため、ＡＰＣとして未トランスフェクション細胞を用いたペプチド用量滴定が並行して実施された。代表的データは図８に示されている。ＨＩＶ Pol４９８特異的ＣＴＬの場合、トランスフェクションを受けた標的細胞は３７８pg／mlのＩＦＮ γの放出を誘発した。ペプチド用量応答の綿密な調査により、類似のＩＦＮγ放出レベルを達成するには、４８ng／mlの体外付加ペプチドが必要であったことが明らかになっている。これらの結果は、トランスフェクションを受けた細胞により、４８ng／mlの体外付加ペプチドと同等の比較的大量のPol４９８エピトープが提示されるということを実証している。
表５．ＨＩＶ−１ミニ遺伝子の、トランスフェクションを受けたヒト細胞内の抗原性とＨＬＡ遺伝子導入マウス内の免疫原性の間の比較
【表６】
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１）ng／ml；  ２）独立した実験の数；  ３）陽性結果をもたらすＣＴＬ培養の％；４）溶解単位
【０１７８】
比較すると、Gag２７１エピトープに特異的なＣＴＬを利用して２５pg／ml未満のＩＦＮγが検出された。トランスフェクションを受けていない標的細胞での対照ペプチド滴定は、０.２pg／mlといったわずかな「ペプチド当量」（ＰＥ）しか検出され得なかったため、この陰性結果が使用された特定のＣＴＬ系統の低い感度に原因があるとすることはできないということを明らかにした。かくして、Gag２７１エピトープは、ＨＩＶ−１でのトランスフェクションを受けた標的細胞内で効率良くプロセシングされ提示されないと思われる。プロセシング効率のおおよその定量として「ペプチド当量」図を用いて、Pol４９８エピトープと比べて少なくとも２００分の１のGag２７１が、トランスフェクションを受けた標的により提示されるということを推定することができる。
【０１７９】
ＨＩＶ−ＦＴ内部に含まれた４つの異なるエピトープについてのさまざまな独立した決定の結果が表１に編集されている。ＨＬＶ−ＦＴでのトランスフェクションを受けた細胞から産生された各々のエピトープの量は、Pol４９８についての３０.５ＰＥからGag２７１についての０.２ＰＥ未満という低い値までの範囲にあった。２つのエピトープＥnＶ１３４及びＮef２２１は、それぞれ６.１及び２.１ＰＥという中間値と結びつけられた。
【０１８０】
これらの結果は次に、ＨＩＶ−ＦＴ構築体での免疫化後各々のエピトープについて観察されたin vivo免疫原性と相関された。予測されたと思われる通りに、Pol４９８エピトープは同様に、最も高い免疫原性を有していた。In vivoで中間の免疫原性が観察されたEnv１３４及びNef２２１エピトープは同様に、トランスフェクションを受けたヒト細胞のより中間の効率でin vitroでプロセシングされた。最終的に、検出可能なin vitro プロセシングが全く観察されなかったGag２７１も同様に、頻度及び規模の両方において次善であるin vivo免疫原性と結びつけられた。
【０１８１】
これらのデータはいくつかの重要な意味合いを含んでいる。まず第１に、これらは、一定の与えられた構築体の内部に含有された異なるエピトープを異なる効率でプロセシングさせ提示させ得るということを示唆している。第２に、これらは、免疫原性が、生成されたプロセシング済みエピトープの量に正比例することを示唆している。最後に、これらの結果は、ヒトの用途に向けられたマルチエピトープワクチンの最適化を目的とした遺伝子導入マウスの使用の重要な確証を提供している。
ＩＩＩ．マルチエピトープ構築体の調製
【０１８２】
トランスフェクション内に含み入れるためのエピトープは、例えばＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ００／２７７６６又はＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４で記述されているように、標準的にＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ結合モチーフを担持している。マルチエピトープ構築体は、例えばIshioka et al., J. Immunol.（１９９９）１６２（７）；３９１５−３９２５内で記されている方法に従って調製可能である。
【０１８３】
マルチエピトープ構築体内に存在する多数のＨＬＡクラスＩＩ又はクラスＩエピトープは、同じ抗原からでも異なる抗原からでも誘導され得る。例えば、マルチエピトープ構築体は、同じウイルスの２つの異なる抗原から又は異なるウイルスの２つの異なる抗原から誘導され得る１又は複数のＨＬＡエピトープを含有することができる。マルチエピトープ構築体内への内含のためのエピトープは、例えばＨＬＡ対立遺伝子特異的モチーフ又はスーパーモチーフを含むエピトープを選択するべくコンピュータを用いることにより、当業者により選択され得る。本発明のマルチエピトープ構築体は同様に、１又は複数の広範に交叉反応性結合する、又は汎用のＨＬＡクラスＩＩエピトープ例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）エピトープ（Epimmune, San Diego, ＣＡ）（例えば米国特許第５，７３６，１４２号；６，４１３，９３５号；及び５，６７９，６４０号に記述されているもの）又はＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー分子をコードすることもできる。
【０１８４】
汎用ＨＬＡクラスＩＩエピトープは有利には、一定の与えられた抗原に応答して活性化される細胞の数を増大させＨＬＡ−反応性対立遺伝子のより広い母集団カバレッジを提供するため、その他のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのエピトープと組合わせることができる。かくして、本発明のマルチエピトープ構築体は、１つの抗原に特異的なＨＬＡエピトープ、汎用ＨＬＡクラスＩＩエピトープ又は特異的ＨＬＡエピトープと少なくとも１つの汎用ＨＬＡクラスＩＩエピトープの組合せを内含し得る。
【０１８５】
ＨＬＡクラスＩエピトープは一般に長さが約１５残基未満、好ましくは１３残基未満、そして好ましくは約８〜約１３アミノ酸、より好ましくは約８〜約１１アミノ酸（例えば８、９、１０又は１１）、そして最も好ましくは約９アミノ酸である。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは一般に長さが約５０残基未満で、普通は約６〜約３０の残基、より普通には約１２〜２５、往々にして約１５〜２０の残基から成り、長さが約７〜約２３、好ましくは約７〜約１７、より好ましくは約１１〜約１５（例えば１１、１２、１３、１４又は１５）そして最も好ましくは約１３個のアミノ酸のエピトープペプチドをコードすることができる。ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩエピトープは、問題のあらゆる所望の抗原から誘導され得る。問題の抗原は、免疫応答が望まれるウイルス抗原、表面レセプタ、腫瘍抗原、腫瘍遺伝子、酵素又はあらゆる病原体、細胞又は分子であり得る。エピトープは１又は複数のＨＬＡ対立遺伝子を結合するそれらの能力に基づいて選択可能である。天然に発生する配列の類似体であるエピトープも同様に、本書で記述されているマルチエピトープ構築体内に内含させることができる。このような類似体ペプチドは、例えばＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３７７８号、ＰＣＴ／ＵＳ００／１９７７４号及び９１年３月１日付けの同時係属Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／２６０，７１４号の中で記述されている。
【０１８６】
エピトープ立体配置及びエピトープ間のスペーサを最適化するための本書中に記述されている方法から、当業者は、本書に記述されているマルチエピトープ構築体の中に任意のＨＬＡエピトープを内含させることができる。図２、３、９、１７、１８Ａ−１８Ｎ、２７Ａ、２８Ａ、２９Ａ及び表１３、１４、１８及び１９は、図１９Ａ−１９Ｅに列挙されたエピトープを用いたマルチエピトープ構築体の例を描いている。構築体の例は同様に、図２０Ｂ、２０Ｄ、２０Ｅ及び２０Ｆ（図２０Ａにエピトープが列挙されている）；図２１Ｂ、２１Ｄ及び２１Ｅ（図２１Ａにエピトープが列挙されている）；図２２Ｂ、２２Ｄ及び２２Ｅ（２２Ａにエピトープが列挙されている）；図２３Ｃ；及び図２４Ｂ及び２４Ｃ（図２４Ａにエピトープが列挙されている）にも記されている。マルチエピトープ構築体は、図１９Ａ−１９Ｅ、２０Ａ、２１Ａ、２２Ａ及び２４Ａに記されているエピトープのうち５個以上又は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５又は３０個以上を内含することができる。これらのエピトープの任意の組合せを内含するマルチエピトープ構築体は、本書に記された手順を用いて最適化され得、スペーサも同様に最適化され得る。
【０１８７】
マルチエピトープ構築体は、当該技術分野において周知の方法を用いて生成可能である。例えばマルチエピトープ構築体を含むポリペプチドを合成しリンクすることができる。標準的にマルチエピトープ構築体は、組換え型ＤＮＡ技術を用いて構築される。
ＩＶ．マルチエピトープ構築体の発現ベクタ及び構築
【０１８８】
本発明のマルチエピトープ構築体は標準的に、マルチエピトープポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターとして提供される。かかる発現ベクターの構築は例えばＰＣＴ／ＵＳ９９／１０６４６の中で記述されている。発現ベクターは、抗原が発現され適切なＨＬＡ分子にターゲティングされるように１つの生体の適切な細胞の中で核酸をコードする転写単位を発現する能力をもつ少なくとも１つのプロモータ要素を含有する。例えば、ヒトへの投与のためには、ヒト細胞内で機能するプロモータ要素が発現ベクター内に取込まれる。
【０１８９】
好ましい実施形態においては、本発明は、組換え型遺伝子学の分野の日常的技術を利用する。本発明で使用する一般的方法を開示する基本的文献としては、Sambrook et al.,分子クローニング；実験室マニュアル（第２版、１９８９）；Kriegler, 遺伝子の導入と発現；実験室マニュアル（１９９０）；及び分子生物学の現行プロトコル（Ausubel et al., eds, １９９４）；オリゴヌクレオチド合成：実践的アプローチ（Gait, ed., １９８４）；Kuijpers, 核酸研究１８（１７）：５１９７（１９９４）；Dueholm, J. Org. Chem.５９：５７６７−５７７３（１９９４）；分子生物学における方法、第２０巻（Agrawal, ed.）及び Tijssen, 生化学及び分子生物学における実験室技術−核酸プローブとのハイブリッド形成、例えば第Ｉ部、第２章「ハイブリダイゼーション原理の概観と核酸プローブ検定の戦略」（１９９３））が含まれる。
【０１９０】
エピトープをコードする核酸は、標準的技術に従って構築体の中で組立てられる。一般に、マルチエピトープポリペプチドをコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチドプライマを用いた増幅技術を用いて単離されるか又は、化学的に合成される。該当する場合には、組換え型クローニング技術も同様に使用可能である。（構築体を組立てるのにＰＣＲを用いる場合には）所望のエピトープを増幅するか、又は（構築体を組立てるのに合成オリゴヌクレオチドを用いる場合には）それをコードする、オリゴヌクレオチド配列が選択される。
【０１９１】
プライマを用いた増幅技術は標準的には、ＤＮＡ又はＲＮＡから選択されたエピトープをコードする配列を増幅し単離するために用いられる（米国特許第４，６８３，１９５号及び４，６８３，２０２号；ＰＣＲプロトコル；方法及び応用ガイド（Innis et al.,編、１９９０））。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）といったような方法を、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックライブラリ又はｃＤＮＡライブラリから直接エピトープ核酸配列を増幅するために使用することが可能である。プライマ内に制限エンドヌクレアーゼ部位を取込むことができる。アガロースゲルからＰＣＲ反応によって増幅されたマルチエピトープ構築体を精製し適切なベクター内にクローニングすることができる。
【０１９２】
マルチエピトープ構築体を構築するために合成オリゴヌクレオチドを用いることも同様に可能である。この方法は、遺伝子のセンス及び非センスストランドの両方を表わす一連の重複オリゴヌクレオチドを用いて実施される。これらのＤＮＡフラグメントはこのときアニールされ、連結され、クローニングされる。市販されていないオリゴヌクレオチドは、Van Devanter et al., Nucleic Acids Res.１２：６１５９−６１６８（１９８４）中に記述されているように、自動合成装置を用いてBeaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. ２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって最初に記述された固相ホスホルアミダイトトリエステル方法に従って化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動法か又はPearson & Reanier, J.Chrom. ２５５：１３７−１４９（１９８３）の中で記述されるようなアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる。
【０１９３】
マルチエピトープ構築体のエピトープは標準的には、転写を導くための強いプロモータならびにエンハンサ及びポリアデニル化部位といったようなその他の調節配列を含有する発現ベクターの中にサブクローニングされる。適切なプロモータが当該技術分野において周知であり、例えばSambrook et al 及び Ausubel et al.中で記述されている。哺乳動物のための真核型発現系が当該技術分野において周知であり、市販されている。このようなプロモータ要素には例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列（ＲＳＶ ＬＴＲ）及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）が含まれる。
【０１９４】
発現ベクターは標準的に、宿主細胞中のマルチエピトープ構築体の発現のために必要とされる全ての付加的要素を含有する転写単位又は発現カセットを含有している。かくして標準的発現カセットは、写しの効率の良いポリアデニル化に必要とされるシグナル及びマルチエピトープ構築体に作用可能式にリンクされたプロモータを含有している。カセットの付加的な要素は、機能的スプライスドナー及びアクセプタ部位を伴うイントロン及びエンハンサを内含し得る。
【０１９５】
プロモータ配列に加えて、発現カセットは、効率の良い終端を提供するため構造遺伝子の下流側に写し終端領域をも含有することができる。終端領域は、プロモータ配列と同じ遺伝子から得ることもできるし、又異なる遺伝子から得ることもできる。
【０１９６】
細胞内に遺伝子情報を輸送するのに用いられる特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞内の発現のために用いられた従来のベクターのいずれを使用してもよい。例えばＳＶ４０ベクター、ＣＭＶベクター、乳頭腫ウイルスベクター及びエプシュタインバールウイルス由来のベクターといったような、真核型ウイルスからの調節要素を含有する発現ベクターが標準的に真核型発現ベクターとして用いられる。
【０１９７】
本発明のマルチエピトープ構築体は、プラスミドベクターならびにウイルス又は細菌ベクターを含むさまざまなベクターから発現され得る。ウイルス発現ベクターの例としては、ワクシニア又は鶏痘といったような弱毒化されたウイルス宿主が含まれる。このアプローチの一例として、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして、ワクシニアウイルスが用いられる。腫瘍をもつ宿主の体内への導入の時点で、組換え型ワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、かくして宿主ＣＴＬ及び／又はＨＴＬ応答を惹起する。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクター及び方法については、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記述されている。
【０１９８】
治療的投与又は免疫化のために有用なさまざまなその他のベクター、例えばアデノ及びアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン悍菌）といった非ウイルスベクター、チフス菌ベクター、解毒済み炭疽毒素ベクターなどが、当業者には明らかとなることだろう。
【０１９９】
マルチエピトープ構築体の免疫原性及び抗原性が、本書に記述されている通りに評価される。
【０２００】
ターゲティング配列
本発明の発現ベクターは、ＭＨＣターゲティング配列に対し作用可能式にリンクされた１又は複数のＭＨＣエピトープをコードすることができ、本書では「ターゲティング核酸」又は「ターゲティング配列」と呼ばれている。ＭＨＣ ターゲティング配列の使用は、ＭＨＣ分子の組立て及び細胞表面への輸送の部位に対しペプチドエピトープを導くことによって、抗原単独の送達に比べ抗原に対する免疫応答を増強し、かくしてＴ細胞への結合及びＴ細胞の活性化に利用可能なＭＨＣ分子−ペプチドエピトープ複合体の数を増大させる。
【０２０１】
例えば、細胞質ゾル経路又は小胞体に対しＭＨＣクラスＩエピトープペプチドをターゲティングするような配列といったＭＨＣクラスＩ ターゲティング配列を本発明において使用することが可能である（例えば、Rammensee et al., Immunogenetics ４１：１７８−２２８（１９９５）を参照のこと）。例えば細胞質ゾル経路は、細胞の内側で発現される内因性抗原を有している。いかなる特定の理論によっても束縛されるつもりはないが、細胞質ゾルタンパク質は、プロテアゾームのエンドペプチダーゼ活性により少なくとも部分的に分解され、その後ＴＡＰ分子（プロセシングに付随するトランスポータ）により小胞体まで輸送されると考えられている。小胞体内では、抗原はＭＨＣクラスＩ分子に結合する。小胞体シグナル配列は、細胞質ゾルプロセシング経路を迂回し、内因性抗原を小胞体に直接ターゲティングさせ、ここでペプチドフラグメントへのタンパク質分解が起こる。このようなＭＨＣクラスＩ ターゲティング配列は、当該技術分野において周知であり、例えばＩｇカッパ、組織プラスミノゲン活性化因子又はインシュリン由来のものといったようなシグナル配列を含む。好ましいシグナルペプチドは、ヒトＩｇカッパ連鎖配列である。ＭＨＣクラスＩ分子組立ての部位である小胞体にＭＨＣクラスＩエピトープをターゲティングするのに、小胞体シグナル配列を使用することもできる。例えばエンドサイト−シス経路にペプチドをターゲィテングするものといったＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列も同じく本発明において使用可能である。これらのターゲティング配列は、標準的に細胞外抗原をエンドサイト−シス経路内に入るように導き、その結果抗原はリソソーム区画まで移送され、そこでこの抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するため抗原ペプチドへとタンパク質分解によって分割される。外因性抗原の通常のプロセシングの場合のように、ＭＨＣクラスＩＩエピトープをエンドサイトーシス経路のエンドソームそして／又はその後リソソーム（ここでＭＨＣクラスＩＩエピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができる）に導く配列が、ＭＨＣクラスＩＩ ターゲティング配列である。例えば、本発明において有用なＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列は、ポリペプチドをリソソームに局在化させるリソソームターゲティング配列である。ＭＨＣクラスＩＩ分子は標準的にリソソーム内のエンドサイト−シスを受けた抗原のタンパク質分析プロセシングから誘導された抗原ペプチドに結合することから、リソソームターゲティング配列はＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列として機能することができる。リソソームターゲティング配列は当該技術分野において周知であり、本書に参考として内含されているAugust et al.（１９９７年５月２７日付け米国特許第５，６３３，３２４号）によって記述された通りリソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１及びＬＡＭＰ−２の中に見い出される配列を内含する。
【０２０２】
リソソームターゲティング配列を含有するその他のリソソームタンパク質にはＨＬＡ−ＤＭが含まれる。ＨＬＡ−ＤＭは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する抗原ペプチドの結合を容易にする上で機能するエンドソーム／リソソームタンパク質である。リソソーム内に位置設定されていることから、ＨＬＡ−ＤＭは、ＭＨＣクラスＩＩ分子ターゲティング配列として機能できるリソソームターゲティング配列を有する（本書に参考として内含されているCopier et al., J. Immunol. １５７：１０１７−１０２７（１９９６））。
【０２０３】
常在性リソソームタンパク質ＨＬＡ−ＤＯは同様にリソソームターゲティング配列としても機能し得る。タンパク質をリソソームにターゲィテングする特異的Ｔｙｒ含有モチーフをコードする常在性リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１及びＨＬＡ−ＤＭとは対照的に、ＨＬＡ−ＤＯは、ＨＬＡ−ＤＭとの会合によりリソソームに対しターゲィテングされる（本書に参考として内含されている（Liljedahl et al.,ＥＭＢＯ J. １５：４８１７−４８２４（１９９６））。従って、ＨＬＡ−ＤＭとの会合ひいてはリソソームに対するＨＬＡ−ＤＯの転座をひき起こすＨＬＡ−ＤＯの配列は、ＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列として使用され得る。同様にして、ＨＬＡ−ＤＯのマウス相同体Ｈ２−ＤＯは、ＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列を誘導するために使用可能である。ＭＨＣクラスＩＩエピトープをＨＬＡ−ＤＯ又はＨ２−ＤＯに融合し、リソソームにターゲィテングすることができる。
【０２０４】
もう１つの例では、Ｂ細胞レセプタサブユニットＩｇ−α及びＩｇ−βの細胞質ドメインは、抗原の内在化を仲介し、例えば、Bonnerot et al., Immunity ３：３３５−３４７（１９９５）に記述されている通り抗原提示効率を増大させる。従って、Ｉｇ−α及びＩｇ−βタンパク質の細胞質ドメインは、プロセシング及びＭＨＣクラスＩＩ分子への結合のためエンドサイト−シス経路にＭＨＣクラスＩＩエピトープをターゲィテングするＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列として機能することができる。
【０２０５】
エンドサイト−シス経路にＭＨＣクラスＩＩエピトープを導くＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列のもう１つの例は、分泌されるべくポリペプチドを導く配列であり、ここでこのポリペプチドは、エンドソーム経路内に入ることができる。分泌されるべくポリペプチドを導くこれらのＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列は、外因性細胞外抗原をＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドへとプロセシングする通常の経路を模倣する。小胞体を通って究極的には分泌されるべくポリペプチドを導くように機能するいかなるシグナル配列でも、分泌されたポリペプチドがエンドソーム／リソソーム経路内に進入しＭＨＣクラスＩＩ分子に結合しうるペプチドへと分割され得るかぎりにおいて、ＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列として機能できる。
【０２０６】
もう１つの例においては、Ｉｉタンパク質は、小胞体内でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、そこで、これは小胞体内に存在するペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するのを防ぐように機能する。従って、Ｉｉタンパク質へのＭＨＣクラスＩＩエピトープの融合がＭＨＣクラスＩＩエピトープを小胞体及びＭＨＣクラスＩＩ分子にターゲティングする。例えば、Ｉｉタンパク質のＣＬＰ配列は、ＭＨＣクラスＩＩエピトープが小胞体に導かれここでＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するような形で除去されＭＨＣクラスＩＩＥＰターゲティング配列と置換され得る。
【０２０７】
一部のケースにおいては、抗原自体はＭＨＣクラスＩＩ又はＩターゲティング配列として役立つことができ、免疫応答を刺激するために汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合され得る。細胞質ウイルス抗原は一般にプロセシングされてＭＨＣクラスＩ分子との複合体として提供されるものの、インフルエンザマトリクスタンパク質といったような長寿命細胞質タンパク質は、例えばGueguen & Long, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：１４６９２−１４６９７（１９９６）内に記述されているようにＭＨＣクラスＩＩ分子プロセシング経路内に入ることができる。従って、長寿命細胞質タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩＴＳＧとして機能することができる。例えば、有利には、汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合されたインフルエンザマトリクスタンパク質をコードする発現ベクターを使用して、インフルエンザに対する免疫応答を刺激するためＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ経路に汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープ及びインフルエンザ抗原をターゲティングすることができる。
【０２０８】
ＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列として機能する抗原のその他の例としては、自然発生的に粒子を形成するポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは、それらを産生する細胞から分泌され、自然発生的に粒子を形成し、これらの粒子はレセプタ媒介型エンドサイト−シスといったようなエンドサイト−シスによって抗原提示細胞内に取上げられるか、又は、食作用により飲み込まれる。粒子は、エンドソーム／リソソーム経路に入った後、抗原ペプチド内にタンパク質分解により分割される。
【０２０９】
自然発生的に粒子を形成する１つのこのようなポリペプチドは、例えばDiminsky et al., Vaccine １５：６３７−６４７（１９９７）又はLe Borgne et al., Virology ２４０：３０４−３１５（１９９８）などの中に記述されているようなＨＢＶ表面抗原（ＨＢＶ−Ｓ）である。自然発生的に粒子を形成するもう１つのポリペプチドは、例えばKuhrober et al., International Immunol.９：１２０３−１２１２（１９９７）の中で記述されている通りのＨＢＶコア抗原である。自然発生的に粒子形成するさらにもう１つのポリペプチドは、Weber et al., Vaccine １３：８３１−８３４（１９９５）内で記述されているような酵母Ｔｙタンパク質である。例えば、有利には、汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープに融合されたＨＢＶ−Ｓ抗原を含有する発現ベクターを用いて、ＨＢＶに対する免疫応答を刺激するためＭＨＣクラスＩＩ経路に汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープ及びＨＢＶ−Ｓ抗原をターゲティングすることができる。
【０２１０】
In vivoでの投与
本発明は同様に、本発明の発現ベクターを１つの個体に投与することによって、免疫応答を刺激するための方法をも提供している。免疫応答を刺激するための本発明の発現ベクターの投与は、本発明の発現ベクターがＭＨＣエピトープをＭＨＣ分子にターゲティングし、かくして発現ベクターによりコードされた抗原により活性化されたＣＴＬ及びＨＴＬの数を増大させることから有利である。
【０２１１】
当初、本発明の発現ベクターは、所望の免疫応答を刺激する上で最適の活性をもつ発現ベクターを決定するべくマウスの体内でスクリーニングされる。従って可能な場合、ＭＨＣターゲティング配列のマウス遺伝子を用いて、初期研究が実施される。本発明の発現ベクターの活性を決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、以下の例ＩＩ及びＩＩＩで記述されているように、Ｔ細胞の活性を測定するための3Ｈ−チミジンの測定及びＣＴＬ活性を測定するための51Ｃｒの放出が含まれる。例ＩＶに記述されているものと類似の実験が、免疫応答を刺激するにあたり活性を有する発現ベクターを決定するために実施される。活性を有する発現ベクターは、人間においてさらに試験される。コードされたマウス配列に対する潜在的な不利な免疫応答を回避するため、活性を有する発現ベクターは、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列がヒト遺伝子から誘導されるような形で修飾される。例えば、さまざまなＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列を含有する遺伝子のヒト相同体の類似の領域の置換が、本発明の発現ベクターへと置換される。以下の例Ｉに記述されているもののようなヒトＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩターゲティング配列を含有する発現ベクターが、人間の体内での免疫応答を刺激する上での活性について試験される。
【０２１２】
本発明は同様に、本発明の発現ベクター及び薬学的に受容可能な担体を含む薬学組成物にも関する。薬学的に受容可能な担体は、当該技術分野において周知であり、生理緩衝食塩水、アルコール／水溶液又はグリコール、グリセロールといったようなその他の溶媒又はビヒクル、オリーブ油といった油、又は注射用有機エステルを含めた、水性又は非水性溶液、懸濁液及びエマルジョンを内含する。
【０２１３】
薬学的に受容可能担体は、例えば、発現ベクターを安定化させるか又は発現ベクターの吸収を増大させるように作用する生理学的に受容可能な化合物を含有し得る。このような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、グルコース、スクロース又はデキストランといったような炭水化物、アスコルビン酸又はグルタチオンといった酸化防止剤、キレート化剤、低分子量ポリペプチド、抗菌剤、不活性ガス又は安定化剤又は賦形剤が含まれる。発現ベクターは、さらに、ペプチド、ポリペプチド及び炭水化物といったようなその他の成分と複合され得る。発現ベクターは同様に、例えばワクチンガンを用いて、個体に投与可能な粒子又はビーズにも複合され得る。当業者であれば、ここで、生理学的に受容可能な化合物を含めて薬学的に受容可能な担体の選択が例えば発現ベクターの投与経路などによって左右されるということがわかるだろう。
【０２１４】
本発明はさらに、免疫応答を刺激するために本発明の発現ベクターを含む薬学組成物を投与する方法にも関する。発現ベクターは、例えばDonnelly et al.（Ann. Rev. Immunol.１５：６１７−６４８（１９９７））；Felgner et al.（１９９６年１２月３日付け米国特許第５，５８０，８５９号）；Felgner（１９９７年１２月３０日付け米国特許第５，７０３，０５５号；及びCarson et al.（１９７７年１０月２１日付け米国特許第５，６７９，６４７号）の中で記述されているような周知の方法によって投与される。１つの実施形態においては、マルチエピトープ構築体は、裸の核酸として投与される。
【０２１５】
本発明の発現ベクターを含む薬学組成物を、例えば経口、膣内、直腸内又は非経口例えば静脈内、筋内、皮下、眼窩内、関節包内、腹腔内、大槽内を含めたさまざまな経路によって、又は例えばそれぞれ皮ふパッチ又は経皮イオン導入法といったものを用いて皮ふを通した受動的又は円滑な吸収によって、被験者の体内で免疫応答を刺激するべく投与することができる。さらに、該組成物は、注射、挿管又は局所施用により投与され得、このうち最後のものは、例えば軟こう又は粉末の直接的塗布による受動的なものでも、又例えば鼻腔用スプレー又は吸入剤を用いた能動的なものでもあり得る。発現ベクターは同様に、局所スプレーとしても投与され得、この場合、組成物の１つの成分は適切な高圧ガスである。望ましい場合、Felgner et al., 米国特許第５，７０３，０５５；Gregoriadis, Liposome Technology, Vols.Ｉ〜ＩＩＩ（第２版、１９９３）の中で記述されているようにリポソーム、ミクロスフィア又はその他の重合体マトリクスの中に、薬学組成物を取込むことも可能である。例えばリン脂質又はその他の脂質から成るリポソームは、毒性をもたず、比較的製造及び投与が簡単である生理学的に受容可能で代謝可能な担体である。
【０２１６】
本発明の発現ベクターは、例えばFelgner et al., 米国特許第５，５８０，８５９号及び５，７０３，０５５号の中で記述されているような動物の間質腔に送達可能である。筋肉に対する本発明の発現ベクターの投与は、皮内及び皮下注射及び経皮投与を含め、特に有効な投与方法である。イオン導入によるものといったような経皮投与も同様に、本発明の発現ベクターを筋肉に送達するための有効な方法である。本発明の発現ベクターの表皮投与も同様に利用可能である。表皮投与には、刺激物に対する免疫応答を促すため表皮の最も外側の層を機械的又は化学的に刺激することが関与する（Carson et al.,米国特許第５，６７９，６４７号）。
【０２１７】
免疫応答を刺激するための本発明の発現ベクターを投与するその他の有効な方法は、例えばCarson et al.,米国特許第５，６７９，６４７号に記述されているような粘膜投与が含まれる。粘膜投与として最も有効な投与方法には、発現ベクター及び薬学組成物を含有する適切なエアゾルの鼻腔内投与が含まれる。生殖器、膣及び眼の部位の粘膜組織に対する発現ベクターの送達のためには、座薬及び局所的調製物も有効である。さらに、発現ベクターは、粒子と複合させることができ、ワクチンガンによって投与できる。
【０２１８】
投与されるべき投薬量は投与方法によって左右され、一般に約０.１μｇから最高約２００μｇまでとなる。例えば、投薬量は、体重１kgにつき約０.０５μｇ〜約５０mg、特に約０.００５〜５mgであり得る。有効用量は、例えば、発現ベクターの投与後の免疫応答を測定することによって決定可能である。例えば、発現ベクターによりコードされたＭＨＣクラスＩＩエピトープ又は薬学的に受容可能エピトープに特異的な抗体の産生は、ＥＬＩＳＡ又はその他の免疫学的検定を含めた当該技術分野において周知の方法によって測定可能である。さらに、Ｔヘルパー細胞又はＣＴＬ応答の活性化は、例えば、Ｔ細胞活性化を測定するための3Ｈ−チミジンの摂取及びＣＴＬ活性を測定するための51Ｃｒの放出を含めた当該技術分野において周知の方法により測定可能である（以下の例ＩＩ及びＩＩＩを参照のこと）。
【０２１９】
本発明の発現ベクターを含む薬学組成物は、予防又は治療を目的として哺乳動物、特にヒトに投与することができる。本発明の発現ベクターを用いて、治療又は予防できる疾病の例としては、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ及びＣＭＶでの感染ならびに前立腺癌、腎癌、頸癌、リンパ腫、尖圭コンジローム、及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が含まれる。
【０２２０】
治療的利用分野では、本発明の発現ベクターは、癌自己免疫疾患をすでに患っている個体又はウイルスに感染した個体に投与される。疾病の潜伏期又は急性期にある個体は、適宜その他の治療と併用してか又は別々に、全ての汎用ＭＨＣクラスＩＩエピトープを発現するものを含めた本発明の発現ベクターで治療することができる。
【０２２１】
治療的及び予防的利用分野において、本発明の発現ベクターを含む薬学組成物は、１つの抗原に対する有効な免疫応答を惹起し疾病の徴候又は症候を改善するのに充分な量で、患者に対し投与される。１つの疾病の徴候又は症候を改善するのに充分である投与すべき発現ベクターの量は、治療上有効な用量と呼ばれる。治療上有効な用量を達成するのに充分な発現ベクターの量は、本発明の発現ベクターを含む薬学組成物、投与方法、治療対象の疾病の状態及び重症度、患者の体重及び全身健康状態及び処方医師の判断によって左右されることになる。
【０２２２】
実施例
以下の例は、請求対象の発明を制限するためではなくそれを例示するために提供されるものである。本書に記述されている例及び実施形態は、例示のみを目的とし、当業者にはそれに照らしたさまざまな修正又は変更が示唆され、それらは本出願の精神及び視野及び添付クレームの範囲内に含み入れられるべきものであると理解される。
【０２２３】
例１〜９は、マルチエピトープ構築体の免疫原性及び抗原性を評価するための検定の例を提供している。
【０２２４】
例１
抗原性検定
ＤＮＡ、ペプチド／ＩＦＡ又はリポペプチドで初回免疫された遺伝子導入マウスの脾細胞から、高親和性ペプチド特異的ＣＴＬ系統を生成することができる。簡単に言うと、遺伝子導入マウスからの脾細胞を、０.１μｇ／mlのペプチド及びＬＰＳ芽細胞で刺激する。初期刺激から１０日後、そしてその後一週間毎に、細胞を、０.１μｇ／mlのペプチドで１時間パルス処理されたＬＰＳ芽細胞で再刺激する。上述の通り in situ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ内で再刺激してから５日後にＣＴＬ系統を検定する。代替的には、例えばターゲティングされた病原体での感染を受けた患者又は癌といったターゲティングされた疾病を有する患者から誘導されたＣＴＬ系統を使用することができる。遺伝子導入マウスからも患者からも入手不可能な特異的ＣＴＬ系統を、当該技術分野の専門知識に頼って正常なドナーのＰＢＭＣから生成する。
【０２２５】
これらの検定において使用すべき標的細胞は、遺伝子導入マウスから誘導されたＣＴＬ系統についてＡ２．１／Ｋb、Ａ１１／Ｋb、Ａ１／Ｋb、又はＢ７／Ｋbでのトランスフェクションを受けたジャーカット又は．２２１細胞である。これらの細胞系統は全て、現在我々が入手できるものである（Epimmune Inc, San Diego, CA）。ヒトＣＴＬ系統の場合、適切なヒトＨＬＡ対立遺伝子でのトランスフェクションを受けた．２２１細胞を利用する。我々は現在、Ａ２及びＡ１でのトランスフェクションを受けた．２２１細胞を有し、Ａ１１、Ａ２４及びＢ７のトランスフェクタントを生成している。１変形実施形態においては、標的細胞に関して予測不能な問題が発生した場合、ＬＰＳ芽細胞及びＥＢＶ形質転換された系統がそれぞれ、マウス及びヒトＣＴＬ系統のために利用される。
【０２２６】
抗原性について検定するためには、階段希釈されたＣＴＬを、１０5個の標的細胞及び１〜１０-6μｇ／mlの範囲内の多数のペプチド濃度を用いてインキュベートさせる。さらに、ＣＴＬも又、問題のマルチエピトープ構築体を含有するエピソームベクターでのトランスフェクションを受けた標的細胞とインキュベートさせる。エピソームベクターは、当該技術分野において既知である。
【０２２７】
マルチエピトープ核酸でのトランスフェクションを受けたＡＰＣ内部での天然プロセシングによって生成されたペプチドの相対量を以下の通り定量する。トランスフェクションを受けた標的細胞の認識時点でＣＴＬ系統により生成されたＩＦＮγの量を記録する。同量のＩＦＮγを生成するのに必要な合成ペプチドの量を、同じＣＴＬ系統が既知の濃度のペプチドと並行してインキュベートされた場合に生成される標準曲線から内挿する。
【０２２８】
例２
マウス、免疫化及び細胞培養
本研究において用いられるＨＬＡ−Ａ２.１／Ｋb（Vitiello et al., J Exp Med. Vol.１７３（４）：１００７−１５（１９９１））及びＡ１１／Ｋb（Alexander et al., J Immunol, Vol.１５９（１０）：４７５３−６１（１９９７））遺伝子導入マウスの誘導が記述されてきた。ＨＬＡ Ｂ７Ｋb遺伝子導入マウスは社内で入手可能である（Epimmune Inc., San Diego, CA）。ＨＬＡ ＤＲ２，ＤＲ３及びＤＲ４遺伝子導入マウスは、C.David（Mayo Clinic）から得られる。非遺伝子導入Ｈ−２bマウスは、Charles River Laboratories及びその他の商業的サプライヤから購入する。免疫化は（Ishioka et al., J Immunol, Vol.１６２（７）：３９１５−２５（１９９９））内で記述されている通りに実施される。全ての細胞は、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭの２−ＭＥ、０.５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μｇ／mlのストレプトマイシン及び１００Ｕ／mlのペニシリンで補足されたＨＥＰＥＳ（Gibco Life Technologies）を伴うＲＰＭＩ１６４０培地から成る培地の中で成長させる。
【０２２９】
試験及び最適化ＣＴＬ応答を目的として、ＨＬＡ遺伝子導入マウス及び抗原性検定を使用する。ＨＴＬ応答を試験するためにＨＬＡ−ＤＲとＩＡbの間の天然の交叉反応性も同様に活用することができる。この評価は、マルチエピトープ構築体の抗原性及び免疫原性の査定を提供する。
【０２３０】
例３
増殖検定
免疫応答を誘発するＨＴＬエピトープの能力を査定するためには、往々にして増殖検定といったような検定が実施される。例えばマウスＣＤ４Ｔリンパ球を、DynaBeads Mouse ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）（Dynal）を用いて脾臓単細胞から免疫磁気的に単離させる。簡単に言うと、４℃で４０分間、５.６×１０7の磁気ビーズと共に２×１０7個の脾細胞をインキュベートさせる。DetachaBead MouseＣＤ４（Dynal）を用いて磁気ビーズを離脱させる。単離したＣＤ４ Ｔリンパ球（２×１０5細胞／ウェル）を、平底９６ウェルマイクロタイタープレート内でトリプリケートで５×１０5個の照射（３５００ラド）された同系脾細胞と共に培養する。２０、１、０.０５及び０μｇ／mlの最終濃度でウェルに精製済みペプチドを添加し、合計４日間細胞を培養する。収獲より約１４時間前に、各ウェルに１μＣｉの3Ｈ−チミジン（ＩＣＮ）を添加する。Filtermate Harvester（Packard）を用いてUnifilter ＧＦ／Ｂ平板（Packard）上にウェルを収獲する。Top CountTMマイクロプレートシンチレーションカウンタ（Packard）を用いて計数する液体シンチレーションにより3Ｈ−チミジンの取込みを決定する。
【０２３１】
例４
51クロム放出検定
ＣＴＬ活性を測定するためのこの検定は、当該技術分野において周知である。該検定は、51Ｃｒ−標識された標的母集団から放出された51Ｃｒ百分率を測定することによってＴ細胞母集団の溶解活性を定量する（Brunner et al, Immunology, Vol.１４（２）：１８１−９６（１９６８））。クロム放出検定から誘導されたデータは通常ＣＴＬ頻度／１０6細胞（制限的希釈分析、ＬＤＡ；免疫学における現行プロトコル、第１巻、John Wiley & Sons, Inc., ＵＳＡ１９９１、第３章；  臨床検査免疫学マニュアル、第５版、ＡＳＭプレス、１９９７、セクションＲ）としてか又はバルクＣＴＬ活性の比較的わずらわしさの少なく定量査定（溶解単位；ＬＵ検定）によって表現される。ＬＵ検定では、51Ｃｒ−放出検定において生成された標準的なＥ：Ｔ比対細胞毒性百分率データ曲線が、１０6個のエフェクタ細胞あたりの溶解単位（ＬＵ）数に換算され、ここで１ＬＵは、標的細胞の３０％の溶解を達成するのに必要とされる溶解活性として定義づけされている（Wunderlick, J., Shearer, G.,及び Livingston, A. J. Coligan, A. Kruisbeek, D. Margulies, E. Shevach及びW.Strober(Eds.)中、免疫学における現行プロトコル、第１巻、「Ｔ細胞機能検定：細胞毒性Ｔリンパ球活性の誘発と測定」John Wiley & Sons, Inc., USA, p.３.１１.８）。ＬＵ計算は、応答を定量し、かくして異なる実験値を容易にすることを可能にする。
【０２３２】
例５
In situ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ
in situＩＦＮγ ＥＬＩＳＡ検定が、単離されたばかりの脾細胞及びペプチド再刺激された脾細胞の両方について開発され最適化されてきた（例えばMcKinney et al., J. Immunol. Meth. ２３７（１−２）：１０５−１１７（２０００）を参照のこと）。この検定はＥＬＩＳＰＯＴ検定に基づいているが、可溶性クロマゲンを利用し、それを高生産性分析に容易に適合できるようにしている。一次検定及び再刺激検定の両方において、この技術は、従来の上清ＥＬＩＳＡ又は51Ｃｒ−放出検定では検出できない応答がin situ ＥＬＩＳＡで観察されるという点で、これらのその他の検定のいずれよりもさらに感度が高いものである。細胞１個のベースで、in situ ＥＬＩＳＡの感度は、１０4の平板固定された細胞あたりおよそ１つのＩＦＮγ分泌細胞である。
【０２３３】
９６−ウェルのＥＬＩＳＡ平板を４℃で一晩、抗ＩＦＮγ（ラット抗マウスＩＦＮα ＭＡｂ、クローンＲ４−６Ａ２、Pharmingen）でコーティングし、その後２時間ＰＢＳ中の１０％のＦＢＳで室温で遮断する。段階希釈した一次脾細胞又はＣＴＬを５％のＣＯ2と共に３７℃で１ウェルあたり１０5のジャーカットＡ２.１／Ｋb細胞及びペプチドと共に２０時間培養させる。翌日、細胞を洗い出し、ウェル内に分泌されたＩＦＮγの量を、ビオチニル化されたα−ＩＦＮγ（ラット抗マウスＩＦＮγｍＡｂ、クローンＸＭＧ１、２、Pharmingen）を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡ内で検出して、分泌されたＩＦＮγを検出する。着色についてメーカーの指示事項に従って、ＨＲＰカップリングされたストレプアビジン（Zymed）及びＴＭＢ（Immuno Pure（登録商標） ＴＭＢ基質キット、Pierce）を使用する。Labsystems Multiskan ＲＣ ＥＬＩＳＡ平板読取り装置上で４５０ｎｍで吸光度を読取る。in situ ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡデータを、ペプチドの不在下でのＩＦＮのバックグラウンド量について補正された、特定のペプチドに応答して１００ｐｇのＩＦＮγを分泌する細胞の数に基づいて、分泌単位（ＳＵ）で評価する。
【０２３４】
例６
ＥＬＩＳＰＯＴ検定
ＥＬＩＳＰＯＴ検定は、通常はＩＦＮγである特異的リンフォカインを産生しかつ放出するように誘発されるべき個々の細胞の能力を測定することにより、一定の与えられたペプチドに特異的なＴ細胞の頻度を定量する。ＥＬＩＳＰＯＴ検定の感度の増大により、治験責任医師は、感染したヒト又は実験動物から単離されたばかりの細胞から応答を検出することができてきた（Murali-krishna et al., Immunity, Vol.８（２）：１７７−８７（１９９８）；Ogg et al., Science, Vol.２７９（５３５９）：２１０３−６（１９９８））。ＥＬＩＳＰＯＴ検定は、ＨＲＰ−ストレプアビジンの代りにExtrAvidin−ＡＰ（Sigma, １：５００希釈）を用いて、最終ステップまでＩＦＮγＥＬＩＳＡについて以上で記述した通りに行なう。メーカーの指示に従って基質５−ＢＣＩＰ（BioRad）を用いて着色する。位相差顕微鏡を用いてスポットを計数する。代替的には、Zeiss 核酸 ＥＬＩＳＰＯＴ読取り装置を利用してスポットを計数する。この場合、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Zymed）基質が用いられる。
【０２３５】
ＥＬＩＳＰＯＴ検定は、免疫応答を定量するために日常的に利用されている。スポットは手作業で計数できるが、好ましい態様においては、スポットを認識し計数するように特定的に設計されたソフトウェアを伴う顕微鏡ベースのシステムが使用される。
【０２３６】
例７
四量体染色
四量体染色は、ペプチドエピトープ、クラスＩ抗原及び該エピトープに特異的なＴ細胞レセプタの間の相互作用に基づいてエピトープ特異的ヒトＣＤ8+Ｔリンパ球を検出するフローサイトメトリ技術である。この検定は、単離されたばかりの血液標本中のエピトープ特異的ヒトＣＤ8+Ｔ−リンパ球の高速定量を可能にする。さまざまなＨＩＶペプチド／ＨＬＡの組合せのためのＭＨＣ四量体を、例えばＮＩＨリポジトリから得ることができる（Tetramer Core Facility: http://www.miaid.nih.gov/reposit/tetramer/index.html）。エピトープ特異的細胞を標識するためには、１００μｌの体積での１×１０6個のＰＢＭＣを、５μｇ／mlの適切な四量体プラスヒトＣＤ３及びＣＤ８を認識するモノクローナル抗体（PharMingen, San Diego, CA or BioSource, Camarillo, CAを含めた商業的供給源から異なる蛍光色素接合型形態で入手可能）と共に４０分間暗所にてインキュベートする。細胞を洗浄し、ＦＡＣ San又はＦＡＣＳ Caliburフローサイトメータ（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA）を用いて、分析に先立ちパラホルムアルデヒドで定着させる。Cell Questソフトウェアを用いて標本データを分析する。
【０２３７】
例８
臨床標本からの検定
患者又はボランティアからの凍結ＰＢＭＣ標本内の特異的ＣＤ８+ＣＴＬ活性を評価するためのさまざまな検定を使用することができる。例えばマウス及び／又は霊長類由来のものといったさまざまな実験モデルからの応答を評価するには、ＥＬＩＳＰＯＴ、クロム放出、in situ ＩＦＮγ放出、増殖及び四量体検定が全て有用である。
【０２３８】
これらの検定のマウスバージョンのための実験方法が以上で記述されており、これらを、記述されている通りに（Livingston et al., J Immunol, Vol.１５９（３）：１３８３−９２（１９９７）；Heathcote et al., Hepatology, Vol.３０（２）：５３１−６（１９９９）；Livingston et al., J Immunol, Vol. １６２（５）：３０８８−９５（１９９９））ヒト系に適合させ、当業者により認められる通りにさらに適合させることができる。検定を完了するのに必要な凍結ＰＢＭＣ標本の量についての計算も同じく、例１４にさらに詳細に記述されている。
【０２３９】
例９
遺伝子導入動物
１０〜１００μｌの体積中最高１００μｇのＤＮＡ又はペプチドの用量で尾の基部内に皮下で又は前頸骨筋内で、遺伝子導入マウス（ＨＬＡ−Ａ２.１／Ｋb、ＨＬＡ−Ａ１１／Ｋb；ＨＬＡ−Ｂ７／Ｋb）を筋内免疫化させる。塩水中でＤＮＡを処方し、ＩＦＡ中でペプチドを処方する。１１〜２１日後、ＣＯ2窒息を用いて動物を屠殺し、その脾臓を取り出し、ＣＴＬ機能のin vitro決定のための細胞源としてこれを使用する。標準的には、実験グループあたり３〜６匹のマウスを使用する。さらに、ＣＴＬ培養の再刺激のためのＡＰＣ供給源として、免疫化されていないマウスからの脾臓を使用する。生後８〜１２週目の雄及び雌の両方を使用する。
【０２４０】
例１０
多数のＣＴＬ及びＨＴＬエピトープに対する応答の同時誘発の実証
ＣＴＬエピトープストリングの構築及び試験
この例は、多数のＣＴＬ及びＨＴＬエピトープの試験例を提供している。例えば、単一プロモータの制御下で１０〜１２の異なるＣＴＬエピトープを包含するエピトープストリングを合成し、標準プラスミド、ｐｃＤＮＡ３.１（Invitrogen, San Diego）内に取込む。これらの構築体は、標準シグナル配列及び汎用ＨＴＬエピトープ、ＰＡＤＲＥ（登録商標）エピトープを内含する。各エピトープセットは、平衡化された母集団カバレッジを可能にするように選択される。試験及び最適化を容易にするためには、遺伝子導入マウス内で免疫原性をもちかつ／又はヒトの体内で抗原性をもつことが示されてきたエピトープの平衡化された代表が内含される。
【０２４１】
これらのＣＴＬエピトープの特定的順序は、本書で記述されている通り、コンピュータプログラムを用いてクラスＩ接合部モチーフを最小限にするように選択される。順序最適化に関し最大限の努力を払ったにもかかわらず潜在的接合部エピトープがなおも本発明に従った構築体の中に存在する場合、ＨＬＡ遺伝子導入マウス内のこのようなエピトープに対するＣＴＬ応答を監視するように、対応するペプチドが合成される。一般に、接合部モチーフの最小化は成功し適切である。しかしながら、いずれかの接合部エピトープに対する応答が検出された場合、これらの接合部エピトープは、先行する節内で論述された予想上のタンパク質分解による分割による選好性を相容れるＫ、ＡＫ、ＫＡ、ＫＫ又はＡといったような短かい１〜２残基スペーサの使用により分断される。
【０２４２】
最適化された構築体の最終用途は、ヒトワクチンであることから、最適化されたヒトコドンが利用される。同様にして、かかる構築体が細菌内又はＳ１９細胞内で発現されるべきであるとすると、コドン利用は、これらの系内で発現を提供するように修飾され得るであろう。しかしながら、ＨＬＡ遺伝子導入マウス内の最適化プロセスを容易にするべく、可能なかぎりいつでも、マウスにとっても最適であるヒトコドンを選択するよう注意が払われる。ヒト及びマウスコドンの使用法は、きわめて類似している。例えば表２１及び２２を参照のこと。
【０２４３】
ＨＬＡ遺伝子導入マウス内でのin vivo試験と並行して行なわれる抗原性検定においては、さまざまなマルチエピトープ核酸ワクチン構築体でのトランスフェクションを受けたヒト細胞を使用することができる。異なるコドン使用法に起因してマルチエピトープワクチンの有効性の間にみられうる潜在的不一致は、これら２つの検定システムの利用可能性によって対処される。
【０２４４】
標準的には、プラスミド構築体の抗原性及び免疫原性試験が並行して行なわれる。遺伝子導入マウスにおけるin vivo試験を、Ａ２、Ａ１１及びＢ７ＨＬＡ遺伝子導入マウスについて実施する。我々の研究所で充分に立証されたプロトコルに従って、心臓毒で前処理されたマウスに、筋内（ｉ、ｍ）で、各プラスミドを１００μｇずつ注射し、１１日後に応答を評価する（Isioka et al., J Immunol, Vol.１６２（７）：３９１５−２５（１９９９））。検定には、単離されたばかりの細胞からのＥＬＩＳＰＯＴ、ならびに再刺激された細胞培養からのインタフェロンガンマ放出及び細胞毒性クロム放出検定が含まれることになる。上述の技術は全て、当該技術分野において充分確立されたものである。エピトープに対する応答の同時測定は、これらのＨＬＡタイプについてすでに「社内で」大きい遺伝子導入マウスコロニーが確立されていることから、むずかしいことではない。多数の読出し検定において、６〜１０個の異なるエピトープに対する応答を測定するのに、４〜６匹のマウスのグループが適切である。ＨＬＡ Ａ２遺伝子導入マウスにおけるＨＬＡ Ａ２制限されたＨＩＶ由来のエピトープの試験が標準的に利用される。しかしながら、万一問題に遭遇した場合、代替的戦略としてヒトＡＰＣを用いた抗原性試験を使用することができ、そうでなければこれを用いて遺伝子導入マウス研究を補完することもできる。
【０２４５】
本書で報告された研究の中で指摘されているように遺伝子導入動物内の免疫原性と抗原性の間の相関関係を拡張する目的で、社内で高親和性ＣＴＬ系統がすでに利用可能であるPol４９８，Env１３４、Nef２２１、Gag２７１といったようなエピトープに対する応答を評価するために、抗原性試験が使用される。付加的な適切なＣＴＬ系統を生成する目的で、本書に記述されているように、アジュバントの中で乳化されたペプチド又はリポペプチドでのＨＬＡ遺伝子導入マウスの直接的免疫化が利用され、我々の研究所内で、抗原性検定内で使用するための系統を生成するために日常的に応用されている。
【０２４６】
in vivo最適化実験が実現可能でないエピトープについての一次的読出しとして、抗原性検定も同様に使用される。これらのエピトープには、Ａ２４そして可能な場合にはＡ１制限されたエピトープならびにＨＬＡ遺伝子導入マウス内で免疫原性でないあらゆるエピトープが含まれる。あらゆるこのようなケースにおいて、我々は病原体に露呈された個体から生成されたヒトＣＴＬ系統を使用する。代替的には、我々は、ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−４由来の樹状細胞及び末梢血リンパ球を用いて、in vitro ＣＴＬ誘発のためのＣＴＬ系統を生成する（Celis et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol.９１（６）：２１０５−９（１９９４））。
【０２４７】
マルチエピトープ構築体をコードするエピゾームベクターが生成され、標的細胞を生成するため適切なヒト細胞系統の中にトランスフェクションされる。例えば、ヒトＴ細胞系統ジャーカットを使用することができるが、リンパ芽球様細胞系統も同じく成功裡に利用されてきた。ヒト由来のＣＴＬ系統を利用した実験のためには、精製されたＭＨＣの供給源として及び標的細胞としてＥＢＶ細胞系統が一般的に用いられ、マルチエピトープ核酸トランスフェクションの受容体として使用される。ＨＬＡ遺伝子導入マウス由来のＣＴＬ系統を利用する実験のためには、整合するＨＬＡ／Ｋbキメラ構築体でのトランスフェクションを受けたクラスＩ陰性、ＥＢＶ形質転換済みの突然変異体細胞系統 ．２２１のコレクションが、マルチエピトープ核酸トランスフェクションの受容体として用いられる（Shimizu Y, DeMars R, J Immunol, Vol. １４２（９）：３３２０−８（１９８９））。このような細胞は、ＣＴＬ系統に対して有効にペプチド抗原を提示する（Celis et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol.９１（６）：２１０５−９（１９９４））。
【０２４８】
ＨＴＬエピトープストリングの構築及び試験
単一プロモータの制御下で３〜２０個の異なるＨＴＬエピトープを包含するエピトープストリングを合成し、標準プラスミドｐｃＤＮＡ３.１（Invitrogen, San Diego）を取込む。試験及び最適化を容易にするため、一定の与えられた構築体のための各々のエピトープセットが、ＩＡbマウス内で免疫原性をもつことがすでにわかっているエピトープの均衡のとれた代表を提供する目的で選択される。さらに、接合部に対応する全てのペプチドが合成され、ＩＡbに対する結合、そして最も重要なことには世界中の最も一般的なＤＲ対立遺伝子を代表する１４の異なるＤＲ分子のパネルに対する結合についてテストされる（Southwood et al., J Immunol, Vol.１６０（７）：３３６３−７３（１９９８））。かくして、問題の抗原に向けられていないＨＴＬエピトープは、これらのプラスミドの内部では作り出されない。しかしながら、万一良好なＤＲ結合潜在性（ひいてはin vivoでの潜在的ＤＲ制御免疫原性）をもつ接合部領域が検出された場合、これらを除去するためにＧＰＧ ＰＧ（配列番号２）といったようなスペーサが導入される。全ての構築体において、クラスＩの接合部モチーフの数も又、本書に記述される通りに最小限になる。
【０２４９】
ＨＬＡ ＤＲ遺伝子導入マウス及び／又はＨ２ｂハプロタイプのマウスを用いて、実験的ワクチンプラスミドを免疫原性についてテストする。増殖及び／又はサイトカイン産生を測定する（ＩＬ５、ＩＦＮγ）。標準的プロトコルにおいて、心臓毒処理されたマウスに１００μｇの各プラスミドを筋内注射し、１１日後に免疫応答を評価する（Ishioka et al., J Immunol, Vol.１６２（７）：３９１５−２５（１９９９））。
【０２５０】
ＣＴＬ及びＨＴＬエピトープ間の相互作用についての試験
上述の活性は、分析可能な全てのエピトープに対する同時応答／抗原性を実証するために利用される小さな機能的エピトープブロックを生成する。これらのブロックは、次の例で記述するように、さらなる最適化を受ける。これらの同じ構築体を用いて、免疫優性が査定される。特定的に言うと、全てのＣＴＬエピトープ構築体が混合されるか又は全てのＨＴＬエピトープ構築体が混合される。構築体のプールで得られた結果は次に、別に注射された同じ構築体で得られた結果と比較される。
【０２５１】
これらの構築体は同様に、ＣＴＬエピトープに対する応答に及ぼすＨＴＬエピトープの効果を決定するのにも使用される。特定的に言うと、ＨＴＬ及びＣＴＬ含有プラスミドをプールし、マウス体内に注射し、選択されたエピトープに対するＣＴＬ及びＨＴＬ応答を、本書で記述されている通りに測定する。往々にして、例えば標的抗原から誘導されたＨＴＬエピトープの存在が、ＣＴＬエピトープ構築体内で例えばＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド又はＰＡＤＲＥ（登録商標）ファミリー分子といった汎ＤＲ結合エピトープを含有するプラスミドを使用して達成される応答レベルを超えて、ＣＴＬ応答を増強させるか否かが決定される。標準的には、ＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチドが標的抗原由来のＨＴＬエピトープに対する応答を阻害するか又は増大するか、又逆に問題の抗原から誘導されたＨＴＬエピトープがＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチドに対する応答を阻害するか又は増大させるかも又決定される。
【０２５２】
多数のエピトープに対する応答は、この方法を用いて達成可能である。構築体をプールすることが、より弱いエピトープの一部に対する応答を阻害し得るということが考えられる。この場合、プール実験は、最適化の後に反復される。
【０２５３】
例１１
ＣＴＬ及びＨＴＬマルチエピトープ構築体の最適化
この例は、例１０に記述されているＣＴＬ及びＨＴＬ構築体の最適化について記述している。抗原性及び免疫原性に対する隣接残基の潜在的影響も同様に、ミニゲン構築体を最適化する上で査定される。これらの研究には、有効なプロセシングを容易にするように設計されてきた「スペーサ」と同義語である隣接残基の内含が関与している。
【０２５４】
このような分析は、以下の通りに実施可能である。まず第１に、例１０に記述されているＣＴＬマルチエピトープ構築体の試験の結果が、エピトープのＮ及びＣ末端に隣接する３つの残基における特異的残基の存在と活性の間の相関関係及び傾向について分析される。次善のＣＴＬ初回免疫が指摘されている、応答規模に関して次善のエピトープが、隣接領域最適化の標的である。１０〜１２の異なるＣＴＬエピトープをコードするＣＴＬマルチエピトープ核酸ワクチンの各々について、最適化された立体配置をもつ「第２世代」のマルチエピトープ核酸ワクチンが生産される。
【０２５５】
１つの実施形態においては、第１の最適化設計は、次善の実績に結びつけられる全てのエピトープについて位置Ｃ＋１においてアラニン（Ａ）又はリジン（Ｋ）残基のいずれかを導入することにある。第２の最適化設計は、Ｃ＋１位置に、抗原性と結びつけられた例えばＨＩＶといった標的抗原内に天然に発生する残基を導入することにある。
【０２５６】
選択されたエピトープについては、付加的な修飾も導入される。特定的には、エピトープのＣ及びＮ末端においてその他の残基スペーサを導入することの効果も同様に調査される。例１０に記述されたマルチエピトープ核酸ワクチンの分析の結果に応じて、調査対象の残基にはさらに、例えばＧ、Ｑ、Ｗ、Ｓ及びＴも内含される可能性がある。これらの修飾により接合部エピトープが作り出される場合には、接合部エピトープを除去するため、本書に記述されている通り、代替的エピトープ順序が合理的に設計される。全ての第２世代の構築体が、本書に記述されている通り、抗原性及び免疫原性についてテストされる。
【０２５７】
これらの修飾の結果として、マルチエピトープ構築体の特定の修飾に対応する活性変動が同定される。一般的で有益な効果をもつ或る種の修飾が発見される。これを確認するため、全てのエピトープ（受容可能な抗原性及び免疫原性を表したものも）が同じ修飾を受ける付加的なマルチエピトープ核酸ワクチンの生成及び試験が行なわれる。いくつかのケースでは、一部のエピトープについては活性の増加が指摘されるが、その他のものについては見られず、又さほど望ましくないものの、或る種の修飾は、一部のエピトープの活性を増大させるがその他のエピトープの活性を減少させる。このようなケースでは、有害であるか又は効果がないということが証明された改変を除外しながら、有益な修飾を保持するべく、付加的なマルチエピトープ核酸ワクチンが設計され、テストされる。
【０２５８】
ａ）最小限の予測された接合部エピトープが存在するように、及びｂ）以前のマルチエピトープ核酸ワクチンでは機能的でなかったエピトープが今やより有効な状況下にあるように、これらのマルチエピトープ核酸ワクチンが指定される。
【０２５９】
ＨＴＬマルチエピトープ構築体については、「第１世代」構築体から得たデータは、接合部エピトープ及び構築体内部のエピトープの位置、及び例えばＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサといったスペーサへの近接性に関する傾向について調べられる。特定の傾向が検出された場合には、これらの傾向に基づいて第２世代の構築体が設計される。代替的には、次善の活性を生成するマルチエピトープ構築体の場合、Ｉｉ及びＬＡＭＰに基づくものといったようなその他のターゲティング戦略の潜在的有効性が再評価され、ターゲティング無し及び、単一のリーダー配列のターゲティングと比較される。
【０２６０】
本節に記述したＣＴＬ又はＨＴＬのいずれかのマルチエピトープ構築体の活性において大きな変動が検出された場合、結果は、構築体の活性に影響を及ぼす立体配座の又は「長期的」効果といった影響と一貫性を有する。これらの変数は、現行の分子及び細胞生物学技術を用いて分析可能である。例えば、さまざまなマルチエピトープ構築体でのトランスフェクションを受けた細胞系統は、ｍＲＮＡ発現レベル及び安定性について、ノーザン分析又はプライマ伸長検定（分子生物学における現行プロトコル、第３巻、John Wiley & Sons, Inc. USA １９９９）により分析可能と思われる。
【０２６１】
全てのマルチエピトープ核酸ワクチンにおいて、ＭＹＣ／hisといったような抗体タグも内含可能である。このタグは、タンパク質発現レベルの試験を可能にする。ＭＹＣ／hisタグの内含（Manstein et al., Gene, Vol.１６２（１）；１２９−３４（１９９５））は同様に、パルス・チェイス実験による、発現された産物の安定性の決定をも可能にする。このとき、これらの検定の結果を、抗原性及び免疫原性実験の結果と比較することができる。結果は、検討された異なる変数間の関係、傾向及び一般的法則の存在について調べられる。
【０２６２】
例１２
選択されたエピトープの有効な送達能力をもつ最も単純なプラスミド立体配置の決定
例１１及び１２に記述された実験は、マルチエピトープ核酸ワクチンの設計に関する変数に対処するべく設計されている。理想的には、ヒトにおいて用いることのできるベクターがプログラム全体を通して用いられるが、ワクチンエピトープ最適化研究のための１つのＤＮＡワクチンプラスミドを使用し次にヒト用途に適したベクターへと切換えることが可能である。現在のベクター選択は、複数の変数によって左右される。例えば、National Gene Vector Laboratory（ミシガン大学）といったような信頼できる供給源を通してヒト用途に適したベクタが入手可能であることが、１つの因子である。
【０２６３】
この例では、最適化された構築体は同様に、より大きいエピトープブロックを形成するために連結される。全ての構築体は、好ましくは、ＣＴＬマルチエピトープ構築体の場合にＰＡＤＲＥ（登録商標）ペプチド及びリーダー配列ターゲティングを包含するように設計される。特定的には、１０〜１２個のＣＴＬエピトープ構築体が２対連結されて２つの２０〜２４ＣＴＬエピトープマルチエピトープ構築体を生成する。エピトープの連結が、より小さい構築体に比べて次善の（減少した）活性を生み出す場合には、代替的な組合せ及び連結順序が調査される。このとき、最適な活性を生成する２０〜２４ＣＴＬエピトープ構築体の特異的対が連結され、全てのＣＴＬエピトープを包含する結果として得られた構築体が活性について評価される。ここでも又、最高２つの代替的配向が調査される。この構築体のサイズが比較的大きいことから、大きいサイズの構築体はユビキチンシグナルによって最も効果的にターゲティングされ得る一方でリーダー配列のターゲティングが小さなサイズの構築体上でより効果的である可能性があるため、ターゲティング 配列の特異的効果は確認される。特定的には、特異的ターゲティング 配列を全くもたない１つの構築体が生成され、ユビキチン分子の添加による分解についてターゲティングされる構築体に比較される。
【０２６４】
類似の戦略がＨＴＬについても用いられる。３〜５ＨＴＬエピトープ構築体２対が連結されて２つの７〜９ＨＴＬエピトープ構築体を生成する。ここでも又、これらのエピトープの連結が次善の（減少した）活性を生み出す状況においては、代替的な組合せ及び連結順序が調査される。最適な活性を生み出す７〜９ＣＴＬエピトープ構築体の特定的対を連結し、全てのＨＴＬエピトープを包含する結果としての構築体を活性について評価する。ここでも又最高２つの代替的配向が調査される。
【０２６５】
これらの結果に基づいて、例えばＨＴＬエピトープのパネルの有効な送達能力をもつ最適化されたプラスミド立体配置が、臨床試験評価のために選択される。当然のことながら、問題のあらゆる（感染性又は疾病関連）抗原からのエピトープを単独で又は組合わせて使用することが可能である。この立体配置は、１又は複数のＨＴＬエピトープ及び１又は複数のＣＴＬエピトープ構築体を引き起こすことになる。全てのコードされたエピトープを有効に送達する能力をもつ１つの長いＣＴＬ及び１つの長いＨＴＬエピトープ構築体の組合せは、ワクチンのさらなる臨床的開発を容易にすることから、最も好適である。同時注射された時点で２つの構築体間に望ましくない相互作用が見られた場合には、同じ動物の体内での、ただし異なる注射部位での又は異なる時点での異なるプラスミドの注射を検査することができる。代替的には、全ての所望のエピトープをコードする単一のＣＴＬ構築体及びＨＴＬ構築体が同定されない場合、構築体プールがさらなる開発のために考慮される。
【０２６６】
例１３
ＣＤ８＋リンパ球応答の評価及び特徴づけが、マルチエピトープワクチンでの後続する免疫化を誘発する。
大部分の場合、ＥＬＩＳＰＯＴ技術を援用してＣＤ８＋リンパ球応答を測定した。ＥＬＩＳＰＯＴ検定は、当該技術分野において既知であり、我々の研究所では恒常的に使用されている。本書で記述するように、自動式 Zeiss ＥＬＩＳＰＯＴ読取り装置も同様に使用される。ＣＤ８＋応答を測定するために利用された検定は、主として、単離されたばかりの細胞ならびにペプチドでin vitroで再刺激された細胞である。さらに、選択されたケースでは、クロム放出検定も利用される。結果を、ＥＬＩＳＰＯＴ検定の場合に見られたものと相関させた。選択されたペプチド／ＭＨＣ組合せ上の四量体染色も同様に実施した。
【０２６７】
臨床検定は開発され認定された。この活性のタイミングは、臨床ワクチンエピ遺伝子構築体の選択に後続しかつ臨床試験に登録された個体からの実際の標本の利用可能性に先行する時限と一致している。ＣＴＬ評価のための検定を、当該技術分野における実験、例えば実験的ＨＢＶワクチンの第Ｉ期及び第ＩＩ期試行においてＣＴＬ評価のための検定を確立する上での実験に基づいて、確立することができる（Livingston et al., J Immunol, Vol.１５９（３）：１３８３−９２（１９９７）；Heathcote et al., Hepatology, Vol.３０（２）：５３１−６（１９９９）；Livingston et al., J Immunol, Vol.１６２（５）：３０８８−９５（１９９９））。特定的には、正常な被験者ならびに例えばワクチン接種を受けていないボランティアに由来するフィコール精製されたＰＢＭＣを使用することができる。以上で指摘した通り、本発明に従ってその他の抗原性標的（単複）を使用することが可能である。
【０２６８】
例１４
最適化されたマルチエピトープＤＮＡベースのワクチン構築体の設計
接合部エピトープの形成を最小限におさえると同時にＣ＋１プロセシング効率を最適化する上述のコンピュータ援用方法を用いて、最適化された構築体を設計した。接合部最小化のためには以下のモチーフを利用した：マウスＫb（ＸＸＸＸ（Ｆ又はＹ）Ｘ2-3（Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＶ））；Ｄb（ＸＸＸＸＮＸ2-3Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＶ））；ヒトＡ２（Ｘ（Ｌ又はＭ）Ｘ6-7Ｖ）；ヒトＡ３／Ａ１１（Ｘ（Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＶ）Ｘ6-7（Ｋ、Ｒ又はＹ））；及びhuman Ｂ７（ＸＰＸ6-7（Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ又はＦ））。Ｃ＋１性向値は、図６に示されているデータから計算され、以下の通りである：  Ｋ＝２.２；Ｎ＝２；Ｇ＝１.８；Ｔ＝１.５；Ａ、Ｆ、Ｓ＝１.３３；Ｗ、Ｑ＝１.２；Ｒ＝１.７；Ｍ、Ｙ＝１；Ｉ＝０.８６；Ｌ＝０.７６；Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｅ、Ｐ＝０。最高４個のアミノ酸の挿入が許容された。この手順及び本書に記されているその他の手順により設計された構築体の例は、図１８に描かれている。一定数のこれらの構築体は、以下で記すin vitro及びin vivo免疫原性研究において特徴づけされた。図１９は、マルチエピトープ構築体内のいくつかの核酸配列によりコードされたアミノ酸エピトープターゲティング配列を列挙している。
【０２６９】
例１５
マルチエピトープＣＴＬエピトープの免疫原性試験及び隣接アミノ酸の影響
異なるマルチエピトープ構築体の免疫原性試験のためにＨＬＡ遺伝子導入マウスを使用した。１つのマウスグループを、前頸骨筋内に左右対称に１０μＭの心臓毒を５０μｌ注射することで前処置し、４〜５日後にＰＢＳ中で希釈したＤＮＡ構築体１００μｇを同じ筋肉に投与した。もう１つのグループでは、各マウスにＣＦＡ中に乳化させたペプチドを注射したが、ここでこのペプチドは、ＤＮＡ注射グループ内のマウスに投与されたＤＮＡ構築体内部の１つのエピトープに対応している。免疫化から１１〜１４日後に、ＤＮＡワクチン接種を受けた動物及びペプチドワクチン接種を受けた動物からの脾細胞を回収し、標準的51Ｃｒ−放出検定、ペプチドエピトープ特異的再刺激無しのＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によるγ−ＩＦＮ産生を測定したＥＬＩＳＰＯＴ検定及びペプチドエピトープでのin vitroエピトープ特異的再刺激ステップを内含していたin situ ＥＬＩＳＡを含めた複数の検定のうちの１つにおいてＣＴＬ活性を測定した。ペプチドエピトープでの刺激時点でＥＰ−ＨＩＶ−１０９０構築体により誘発されたＣＴＬ活性の例は、図１４Ａに示されており、ペプチドエピトープでの刺激時点でＰｆＣＴＬ.１、ＰｆＣＴＬ.２及びＰＦＣＴＬ.３構築体により誘発されたＣＴＬ活性は、図１４Ｂに示されている。
【０２７０】
Ｃ＋１隣接位置における異なるアミノ酸の効果は、ＨＢＶ.１構築体内のCore１８エピトープとの関係においてＣ＋１の位置に異なるアミノ酸を挿入することによって直接評価された。免疫原性データは、Ｃ＋１位置でＷ、Ｙ又はＬにより隣接された場合のCore１８の免疫原性の低下を明らかに実証している（図６ｂ）。これとは対照的に、単一Ｋ残基の挿入はCore１８に対するＣＴＬ応答を劇的に増大させた。Ｃ＋１位置でＲ、Ｃ、Ｎ又はＧを用いて、ＣＴＬ応答の増強も観察された。これらのデータは、Ｃ＋１ プロセシングの最適化がマルチエピトープ構築体の設計を改善できるということを明らかに実証している。
【０２７１】
例１６
マルチエピトープ ＨＴＬ構築体の免疫原性試験及びスペーサ配列の影響
ＨＴＬエピトープを分離し、かくして接合部エピトープを分断するために、ＧＰＧＰＧ（配列番号２）から成る汎用スペーサが開発された。このスペーサの設計の背後にある論理は、Ｇ又はＰのいずれも、既知のいずれのマウス又はヒトＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子によって、ＨＴＬペプチドエピトープのコア領域内の位置１及び６の一次アンカーとして使用されないということである。このスペーサにより導入された５つのアミノ酸のギャップは隣接するエピトープを分離し、従って２つのエピトープのアミノ酸は１及び６の位置において物理的にアンカーとして役立つことはできない。ＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサの有用性は、マウス１Ａbを結合させるものとして知られている、１つは３つのスペーサをもちもう１つはスペーサが欠如している４つのＨＩＶ−１エピトープから成る合成ペプチドを用いてテストされた。ＨＩＶ７５merは、３つのＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサをもつ構築体であり、ＨＩＶ６０merは３つのスペーサが欠如した構築体であった。スペーサの不在下で、ＣＦＡ内のペプチドでのＣＢ６Ｆ１マウスの免疫化は、エピトープの４つのうち３つに対するＨＴＬ応答を誘発したが、スペーサが存在した場合全てのエピトープが免疫原性であった（図１５）。この証拠は、スペーサがマルチエピトープ構築体の性能を改善できることを実証している。
【０２７２】
マルチエピトープ ＨＴＬ ＤＮＡベースの構築体のin vivoでＨＴＬ応答を誘発する能力は、ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築体でのＨ２b×dマウスの筋内免疫化により評価された。ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築体は、図１８に記されており、ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築体とＥＰ−ＨＩＶ−１０４３の間の差は、前者がＣ末端ＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサとそれに続くＰＡＤＲＥ（登録商標）配列ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１）を内含するという点にある。免疫化から１１時間後に、いかなる追加抗原免疫化も投与されず、脾臓からＣＤ４Ｔ細胞が精製され、一次γ−ＩＦＮＥＬＩＳＰＯＴ検定においてペプチド特異的ＨＴＬ応答が測定された。ＨＩＶエピトープをコードする構築体により誘発されたＨＴＬ活性の例が、図１６に示されている。全体として、マルチエピトープＨＩＶ ＨＴＬ構築体でのＤＮＡ免疫化により誘発されたＨＴＬ応答は、一般にペプチド免疫化により誘発された応答に比べて等しい又はそれ以上の規模のものであった。
【０２７３】
例１７
エピトープベースのＨＢＶ免疫療法ワクチンの開発
１．序
ウイルス浄化の自然相関
急性ＨＢＶ感染の自然浄化に付随する細胞免疫応答は、広くかつ多特異性のものである。この応答には、多数のウイルス遺伝子産物からのエピトープに対して導かれたＣＴＬ及びＨＴＬの両方が含まれる（Chisari, F.V. and Ferrari, C.Annu. Rev. Immunol. １３：２９−６０（１９９５））。慢性ＨＢＶ感染が、免疫系により消散されることは稀であるが、これが起こった場合、ウイルス浄化は、ＣＴＬ活性の増大、ＡＬＴの激発及びウイルス負荷の減少に結びつけられる（Guidotti, L.G. and Chisari, F.V., Annu. Rev. Immunol. １９：６５−９１（２００１））。ウイルス浄化は同様に、ＩＦＮ−α処理を受ける個体の有意な割合（１０〜１５％）においても誘発され得、自然発生的浄化と類似して、効果は細胞免疫応答と相関関係をもつ。
【０２７４】
ＨＢＶ感染の制御に付随する細胞免疫応答の規模は、複数の研究において調査された。比較を目的として、以下の値（平均及び範囲）は、１００万のＣＤ８＋細胞あたりの抗原特異的細胞の数を表わしている。Lohr及び共同研究者らは、感染急性期の間の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）内で検出されたＨＢＶ−特異的応答を定量するために、ＥＬＩＳＰＯＴ検定を利用した（Lohr, H.F. et al., Liver１８：４０５−４１３（１９９８））。彼らは、ＨＢＶコア１８−２７に応答する４００〜２８００の範囲のスポット形成細胞（ＳＦＣ）（平均１４００）を報告した。Maini et al., は、ＥＬＩＳ−ＰＯＴ検定よりも約４倍感度が高いものと報告されている四量体染色を使用し（Tan, L.C. et al., J.Immunol. １６２：１８２７−１８３５（１９９９））、４０００を平均として、８０〜１４，０００というコア１８−２７エピトープについての四量体陽性細胞範囲を決定した（Maini, M.K. et al., Gastroenterology １１７：１３８６−１３９６（１９９９））。検定の感度差を考慮に入れて、これは、１０００の特異的細胞を平均として２０〜３５００というＥＬＩＳＰＯＴ陽性細胞推定範囲という形で表わされる。
【０２７５】
同じ検定を用いて、Webster et al.,は、コア１８−２７エピトープについて７０００の四量体陽性細胞（１７５０ＥＬＩＳＰＯＴ陽性細胞）、env３３５について２００の細胞（５０のＥＬＩＳＰＯＴ陽性細胞）そして、pol５６２エピトープについて１２００（３００のＥＬＩＳＰＯＴ陽性細胞）を報告した（Webster, G.J. et al., Hepatology. ３２：１１１７−１１２４（２０００））。分析された２つの他のエピトープの場合、env３３５について平均２００の四量体陽性細胞（８０〜６０００の範囲）、そしてpol５６２エピトープについて平均２２０の細胞（８０〜３２００の範囲）が観察された（Maini, M.K. et al., Gastroenterology １１７：１３８６−１３９６（１９９９））。ＥＬＩＳＰＯＴ細胞に関するこれらの応答のおおよその推定値は、env３３５については平均５０のＳＦＣ（２０〜１５００の範囲）、pol５６２については平均５５のＳＦＣ（２０〜８００の範囲）である。これらのデータは、ＥＬＩＳＰＯＴ検定の約４０〜５０分の１の感度をもつＬＤＡ検定を用いて得たデータに匹敵する（Murali-Krishna, K et al., Adv. Exp. Med Biol.４５２：１２３−１４２（１９９８））。例えば、Rehermann 及び共同研究者らは、１５個の細胞がenv３３５に特異的であり、１８個の細胞がpol４４５に特異的であると推定した（Rehermann, B. et al., J. Clin. Invest. ９７：１６５５−１６６５（１９９６））。検定の４５倍の感度差を仮定すると、これらの値は、それぞれ６７５及び８１０のエピトープ特異的ＥＬＩＳＰＯＴ陽性細胞に対応する。付加的なデータは、ウイルス洗浄を結果としてもたらしたＩＦＮ−α処置に応答した患者におけるＨＢＶ特異的応答を定量するためにＥＬＩＳＰＯＴ検定を使用したLohr et al.に由来するものである（Lohr, H.F. et al., Liver１８：４０５−４１３（１９９８））。この研究では、ＨＢＶコア１８〜２７に特異的な平均６００のＳＦＣが報告された。
【０２７６】
要約すると、さまざまなＨＢＶエピトープに特異的なＣＴＬが、ＨＢＶウイルスの浄化中にＰＢＬ中で検出される。ＥＬＩＳＰＯＴにより検出される機能的細胞の頻度は、百万のＣＤ８＋細胞あたり２０〜４００細胞（低）から８２０〜３５００ＳＦＣ（高）の範囲内にあり、平均的応答は５０〜１０００ＳＦＣの間であった。
【０２７７】
ＨＢＶ特異的ＣＴＬの重要性は、ＨＢＶ遺伝子導入マウスを用いて直接実証された。特定的には、env、core及びpol抗原を含めた異なるウイルス抗原に特異的でかつマウスＭＨＣ分子によって制限されるクローニングされたＣＴＬの養子免疫細胞移入は、ウイルス抗原の発現の除去を導いた（Tsui, L.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ９２：１２３９８−１２４０２（１９９５）；Guidotti, L.G. et al., Immunity ４：２５−３６（１９９６））。これらのデータは、ＨＢＶ感染の制御に対するＣＴＬ応答の重要性を明らかに立証している。
【０２７８】
ＨＢＶ感染中のＨＴＬ応答の規模は、一般に、ＣＴＬの場合より低い。全抗原及びＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いて、Lohr et al.は、ＩＦＮ−α処置に応答する患者において百万のＣＤ４＋細胞あたり４７±５．２ＳＦＣ、そして急性感染中の百万個のＣＤ４＋細胞あたり４２±１２ＳＦＣという全体的頻度を観察した（Lohr H.F. et al., Liver１８：４−５−４１３（１９９８））。Webster et al.は、百万のＣＤ４＋細胞あたり２，９００の四量体陽性細胞が、感染から１０週後の患者におけるコア抗原に対して検出されることを報告した（Webster, G.J. et al., Hepatology.３２：１１１７−１１２４（２０００））。
【０２７９】
結論としては、これらのデータは、ＣＴＬ応答を誘発するために設計された治療用ＨＢＶワクチンについて免疫原性レベルを確立する手段を提供している。
Ｂ．免疫寛容が慢性ＨＢＶ感染に結びつけられる。
【０２８０】
ＨＢＶエピトープ特異的免疫寛容が、慢性ＨＢＶ感染に結びつけられる（Chisari, F.V.及びFerrari, C. Annu. Rev.Immunol. １３：２９−６０（１９９５）；Alexander, J. et al., Immunol. Res. １８：７９−９２（１９９８）；Milich, D.R., Can. J. Gastroenterol.１４：７８１−７８７（２０００）；Hilleman, M.R. et al., Vaccine. １９：１８３７−１８４８（２００１）；Jung, M.C. et al., Lancet Infect. Dis.２：４３−５０（２００２））。感染を受けた個体において、高レベルのウイルス血症がこの免疫寛容状態の原因であると考えられる。この効果は、きわめて著立ったものであるため全身的なＴｈ１／Ｔｈ２不均衡及び一般的末梢寛容を導き得るものであるが、それが結果としてＨＢＶ特異的ＣＴＬ前駆体の欠失をもたらすことはない（Rossol, S. et al., B.J. Clin. Invest. ９９：３０２５−３０３３（１９９７）；Chen et al., Immunity,１２：８３−９３（２０００）；Sette, A.D. et al., J.Immunol. １６６：１３８９−１３９７（２００１））。実際、エピトープベースのワクチン及び非病原体由来の最適化されたＨＴＬエピトープを使用することにより、寛容が「破断」されうることを実証するために、ＨＢＶ−遺伝子導入マウスにおける研究が使用された（Livingston, B.D. et al., J. Immunol. １５９：１３８３−１３９２（１９９７）；Alexander, J. et al., Immunol. Res.１８：７９−９２（１９９８）；Sette, A.D. et al., J Immunol. １６６：１３８９−１３９７（２００１））。ＨＢＶ感染の自然発生的な消散の間及びＩＦＮ−α処置に対する応答の間に得られた患者標本を用いて生成されたデータは同様に、この欠点が可逆的であることを示唆している。この仮定を裏づける付加的データが、以下に論述する通り抗ウイルス薬ラミブジンを用いた研究において誘導された。
【０２８１】
以前のＨＢＶ免疫療法臨床試験
無差別のＨＴＬエピトープ及びＨＢＶコア１８ＣＴＬエピトープから成るリポペプチドワクチンを用いた臨床研究が、正常なボランティアにおける個々のエピトープの免疫原性を実証するためのデータを提供した（Livingston, B.D. et al., Hum. Immunl. ６０：１０１３−１０１７（１９９９）；Livingston, B.D.et al., J. Immunol. １５９：１３８３−１３９２（１９９７）；Vitiello, A. et al.,J Clin. Invest. ９５：３４１−３４９（１９９５））。健康な被験者の体内で誘発されたＣＴＬのレベルは、自然発生的にか又は、ＩＦＮ−α処置の結果としてウイルスを浄化する急性感染を受けた個体において測定されたものに匹敵するものであった。しかしながら慢性ＨＢＶ患者におけるその後の試行は失望させるものであった。すなわち、これらの患者において誘発されたＣＴＬのレベルは、正常な被験者で見られたレベルよりも著しく低く、ウイルス負荷の減少は全く見られなかった。重要なことに、これらの臨床試験の時点で、抗ウイルス薬療法は利用可能ではなかった。かくして、免疫寛容に付随するウイルス血症を低減させる方法は全く存在しなかった。
【０２８２】
Ｄ．ＨＢＶ複製、組込み及び免疫系寛容に対する抗ウイルス薬療法の効果
平均的全身負担と同等である血清３リットルあたり約２.２×１０11のウイルス粒子を平均とする高レベルのウイルス血症と、慢性ＨＢＶ感染が結びつけられている（Nowak, M.A. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA.９３：４３９８−４４０２（１９９６））。血清中に多数存在するウイルス粒子は、少なくとも部分的に、慢性ＨＢＶ患者において検出された免疫寛容の原因であると考えられている（Schlaak, J.F. et al., J. Hepatology ３０：３５３−３５８（１９９９））。ヌクレオシド類似体ラミブジン（Epivir-HBV）（GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC２７７０９）は、もともとＨＩＶの治療のために開発された逆転写酵素阻害物質である。それは、慢性ＨＢＶ感染の治療用にも同様に承認されており、ＨＢＶ複製に対する強力な阻害効果を有するものとして知られ、患者における新しい感染性ウイルス粒子の産生を急速に低減させる（Nowak, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.９３：４３９８−４４０２（１９９６））。多数の研究において、ＨＢＶ ＤＮＡは、大部分の患者の体内でラミブジン処置の間検出不可能となる（Dienstag, J.L. et al., Hepatology ３０：１０８２−１０８７（１９９９）；Boni, C. et al., Hepatology. ３３：９６３−９７１（２００１））。処置の最初の数ヵ月以内に、ウイルス血症レベルの大幅な減少が見られ、これは、さらに長期にわたる処置でも続いている。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇレベルは、大部分の患者において経時的に減少するが、速度及び規模は、ウイルス粒子について見られたものよりは低いものである。肝酵素も又、６ヵ月以上のラミブジン療法を受けた患者の大部分においてほぼ正常レベルまで降下している（Dienstag, J.L. et al., Hepatology ３０：１０８２−１０８７（１９９９）；Boni, C. et al., Hepatology. ３３：９６３−９７１（２００１））。ラミブジンは、共有結合により閉鎖された環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）及び組込まれたＨＢＶ ＤＮＡが長時間にわたる一部のウイルスタンパク質の生産を支援することになるため、ウイルスタンパク質の産生を完全に抑制するわけではない。
【０２８３】
さらに、慢性ＨＢＣ感染に典型的であるＨＢＶ特異的ＣＴＬ及びＨＴＬの低応答性は、ラミブジン処置により克服されるか又は少なくとも低減されると思われる（Boni, C. et al., B. J. Clin. Invest. １０２：９６８−９７５（１９９８）；Boni, C. et al., Hepatology. ３３：９６３−９７１（２００１））。興味深いことに、Ｔ細胞活性の跳返り現象は、ウイルス血症の初期の急激な減少の後ラミブジン療法の開始から１ヵ月後に早くも出現する。しかしながら、ラミブジン処置を中断した場合、処置の持続時間に応じて、１週間といった短かい時間でウイルス複製の跳返りが起る（Dienstag, J.L. et al., N.Eng. J.Med. ３３３：１６５７−１６６１（１９９５）；Dienstag, J.L. et al., Hepatology ３０：１０８２−１０８７（１９９９））。同様に、薬学耐性ＨＢＶ突然変異体の急速な出現も報告されてきた。かくして、ラミブジン単独では、慢性ＨＢＶ感染のための療法としての有用性に限界がある。
【０２８４】
Ｅ．免疫療法用ワクチン設計
ＨＢＶ複製を制御し究極的にはウイルス浄化を媒介するのに必要とされる規模の細胞免疫応答を誘発する能力をもつ治療用ワクチンの設計及び評価は、臨床的にきわめて重要である。ＨＢＶ特異的ＣＴＬ及びＨＴＬ応答を両方共誘発するようにワクチンが設計され、健康なボランティア及び慢性的に感染した患者の両方において臨床的にテストされる。後者のグループは、患者は、最低６ヵ月間ラミブジン又は類似の抗ウイルス薬での処置に成功した患者に制限される。
【０２８５】
エピトープの選択
ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３及び−Ｂ７スーパータイプファミリからのＣＴＬエピトープ
ＨＬＡクラスＩ分子の大部分は、その重複するものの独立しているペプチド結合レパートリの特性によってグループ化された場合、比較的少ない主要ＨＬＡクラスＩスーパータイプに分類され得る（表６Ａ−Ｂ）。一定の与えられたスーパータイプ内のＨＬＡ分子の大部分又は全てを結合する能力をもつエピトープを選択することにより、有効なマルチエピトープワクチンを産生するために必要とされるエピトープの数を制限することが可能である。最も一般的なＨＬＡスーパータイプの選択により、ＨＢＶ感染した個体の治療用のワクチンの設計は容易になる（Bertoni, R., J. et al., J. Clin.Invest.１００：５０３−５１３（１９９７）；Sette, A. et al., Immunogenetics. ５０：２０１−２１２（１９９９）；Sette, A. et al., Curr. Opin. Immunol. １０：４７８−４８２（１９９８））。
【表７】
2006501827.tif 000008
【０２８６】
多数のＨＬＡスーパータイプ対立遺伝子に結合するＨＢＶ由来のＣＴＬエピトープセットが同定されてきた（表７）。
【表８】
2006501827.tif 000009
１．  ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ及びａｙｗ分離株を含めたＨＢＶの２０菌株のおける配列同一性
２．  それぞれのスーパータイプについてのプロトタイプ対立遺伝子はＡ２：Ａ*０２０１、Ａ３：Ａ*０３０１／Ａ*１１０１、Ｂ７：Ｂ*０７０２である。
３．  結合されたスーパータイプ対立遺伝子の数≦５００ｎＭ
４．  慢性又は活性ＨＢＶ感染を患う患者における再生ＣＴＬ応答
５．  ＩＦＡ内で乳化されたペプチドでの免疫化後のＨＬＡ−遺伝子導入マウスの体内で誘発されたＣＴＬ応答。
*  それぞれＨＬＡ−Ａ*０３０１及び−Ａ*１１０１に対する結合
【０２８７】
ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３及び−Ｂ７スーパータイプエピトープの各々６個ずつを、ワクチン開発に使用するために選択した。考慮された結合親和性のカットオフは、この結合親和性レベルがＣＴＬ免疫原性及び抗原性と相関関係を有することから、５００ｎＭであった。（Sette, A. et al., J.Immunol.１５３：５５８６−５５９２（１９９４）。これらのエピトープは全て、大部分の一般的なＨＢＶ菌株において保存されている。コア１８エピトープは、検査されたＨＢＶ配列の比較的穏当な４５％において保存されているが、この特定のエピトープを含まない配列の大部分は、エピトープのＣ末端において、保存された置換（ロイシンに対するイソロイシン）を含有する変異体をコードする。１８の選択されたエピトープのうち１つを除くすべてが、一定の与えられたスーパータイプの最も一般的な５つの成員のうちの少なくとも３つを結合する。これらのエピトープは、多数のウイルス抗原に対して向けられた免疫応答を生成しかくしてＨＢＶの自然の浄化を模倣するという我々の最終目的と一貫性をもつenv、pol及びcore抗原に由来するものであった。
【０２８８】
これらのエピトープのヒト免疫系認識は、急性又は慢性のいずれかの感染を伴う個体からのＰＢＬ及び再生ＣＴＬ検定を用いて実証された（Bertoni, R., J. et al., J. Clin.Invest. １００：５０３−５１３（１９９７））。ＰＢＬによるこれらのエピトープの免疫認識は、エピトープが自然のＨＢＶ感染の間に産生されたこと及びヒトレパートリ内に適切なＴＣＲが存在することを実証する。３つのＨＬＡ−Ｂ７制限されたエピトープを除いて、ワクチンエピトープの全セットは、ＨＢＶ患者から得たＣＤ８＋Ｔ−リンパ球によって認識された（表７）。
【０２８９】
ＨＬＡ−遺伝子導入動物を用いてＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３及び−Ｂ７エピトープを同様に、免疫原性についてもテストした。合成ペプチド乳化ＩＦＡでの免疫化に続いて、in situＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ検定を用いてＣＴＬ応答を測定した（Vitiello, A. et al., J.Clin. Invest.９５：３４１−３４９（１９９５））。この検定で得たデータを評価のため分泌単位（ＳＵ）に換算した（McKinney, D.M. et al., J. Immunol. Methods. ２３７：１０５−１１７（２０００））。ＳＵというのは、ペプチドの不在下で産生されたＩＦＮ−γの背景量について補正された特定のペプチドに応答して１００ｐｇのＩＦＮ−γを分泌する細胞の数である。表７の最後の欄に示されているデータはこれらの実験の発見事実を要約している。これらのエピトープの大部分がＨＬＡ−遺伝子導入マウスの中で免疫原性であるという事実は、小動物モデルを用いたマルチエピトープワクチンの効力を評価する１つの手段を提供することから、関連性のあることである。
【０２９０】
結論としては、エピトープベースのワクチン内に内含するのに適し３つの一般的ＨＬＡクラスＩスーパータイプにより制限されているエピトープセットをワクチン開発のために利用することができる。
ＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４スーパータイプからのＣＴＬエピトープ
【０２９１】
ワクチンにより提供される患者治療の目的でかつ我々のエピトープパッケージ内に含有される多数の決定因子を増大させるために、ＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４スーパータイプの多数の成員に結合するエピトープを同定した（表８）。
【表９】
2006501827.tif 000010
１．  adr、adw、ayr及びayw分離株を含めたＨＢＶの２０の菌株内の配列同一性
２．  それぞれのスーパータイプについてのプロトタイプ対立遺伝子は、Ａ１：Ａ*０１０１、Ａ２４；  Ａ*２４０２である。
３．  結合されたスーパータイプ対立遺伝子の数≦５００ｎＭ
【０２９２】
同定された１００を超えるモチーフ陽性ペプチドのうち、２４のペプチドが、精製済みＨＬＡ−Ａ１又は−Ａ２４及び関係するスーパータイプ分子に対するそれらの結合特性に基づいてさらなる研究のために選択され、ＨＬＡ−Ａ１又はＨＬＡ−Ａ２４に制限された各々６つずつがワクチンとして選択され、３つの関係する対立遺伝子がＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４スーパータイプファミリーを規定するために用いられた。これらのエピトープのうち、コア１１７及びpol７４５が、ＨＢＶ感染した個体からＣＴＬにより認識されているものとして独立して報告された（Sobao, Y. et al., J. Hepatol. ３４：９２２−９２９（２００１））。
【０２９３】
選択されたエピトープはヒトＣＤ８＋Ｔ−リンパ球により認識可能であることを示すさらなる証拠を提供するために、我々は感染を受けていない正常なドナーから得られたＰＢＬを用いて、一次ＣＴＬ応答を誘発した。このin vitro一次ＣＴＬ誘発検定は、ＨＬＡ−Ａ１又は−Ａ２４陽性の雄及び雌ドナーからの白血球搬出によって得られたＰＢＬを利用する。ＰＢＬは、樹状細胞（ＤＣ）、抗原提示細胞及びＣＤ８＋Ｔ−リンパ球の供給源として用いられた（Keogh, E. et al., J.Immunol, １６７：７８７−７９６（２００１））。前駆体ＣＴＬから成熟細胞への拡張を誘発するために、精製済みのＣＤ＋細胞が、１０ng／mlの組換え型ヒトＩＬ−７の存在下でサイトカインで産生されペプチドでパルス処理されたＤＣと同時培養された。この培養ステップは、前駆体ＣＴＬの活性化及び初期成熟を誘発したが、テストのためのそれらの数を拡張させるためには再刺激及び長期培養が必要であった。再刺激は、ペプチドでパルス処理された付着性単球を用いて７日目と１４日目に行なわれた。２回目の再刺激から７日目に、in situＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＰＯＴ検定のいずれかを用いて、ＣＴＬ活性について培養を検定した。測定された応答が、無関係のペプチドを用いて決定された発現背景レベルの少なくとも２倍でありかつ≧５０ｐｇ／ウェルである場合に、培養は陽性であるとみなされた。陽性応答は、ヒトの体内での適切なＴＣＲの存在を実証している。
【０２９４】
ＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４エピトープを用いて得られたデータの編集が表９に提供されている。
【表１０】
2006501827.tif 000011
１．  試験対象のドナーの合計数のうちの陽性ＣＴＬ応答を有するドナーの数
２．  試験対象の合計培養数のうちの陽性ＣＴＬ応答を有する培養の数
３．  ペプチドを伴うＩＦＮ−γ分泌／ペプチド無しのＩＦＮ−γ分泌として計算されたＣＴＬ応答の平均刺激指数
【０２９５】
データは、試験対象の合計ウェル数のうちの陽性ウェルの数、陽性培養の平均刺激指数及び陽性培養の正味ＩＦＮ−γ放出として表わされている。現行のＨＢＶワクチン研究内に含まれるＨＬＡ−Ａ２４ エピトープの４／６について及びＨＬＡ−Ａ１制限ＥＴＰの全てについて、有意なＣＴＬ応答が誘発された。
【０２９６】
ＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４遺伝子導入マウスは、現在入手不能である。しかしながら、ＨＬＡ−Ａ２４エピトープとマウスクラスＩＫdの結合モチーフの間には、有意な類似性度が存在する。従って我々は、in vitroで精製済みＫd分子を結合させるそれらの能力についてワクチンＨＬＡ−Ａ２４エピトープのうちの４つをテストし免疫原性を査定した。我々は、これらのエピトープのうちの１つがＨ２b×dマウスの体内で免疫原性を有していることを発見した（表１０）。その他の２つのエピトープは結合についてテストされなかったが、ペプチド／ＩＦＡエマルジョンでの免疫化の後Ｈ２b×dマウスの体内でテストされた時点で免疫原性をもつことが証明された。in vitro再刺激後のＩＦＮ−γ応答は、１５８.７から３３９.６ＳＵまでの範囲であった。この活性レベルは、既知の対照Ｋd制限されたエピトープで観察されたレベルと類似していた（Romero, et al., Nature３４１：３２３.（１９８９））。かくして、ＨＬＡ−Ａ２４遺伝子導入マウスが不在の場合にはＨ２b×dを使用することができる。
【表１１】
2006501827.tif 000012
１．  ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、及びａｙｗ分離株を含めたＨＢＶの２０菌株内の配列同一性。
２．  Ｈ２b×dマウスペプチド／ＩＦＡ免疫化の後のin situＥＬＩＳＡ検定（Makinney et al. ２０００）内で測定されたＣＴＬ応答。
３．  対照Ａ２４エピトープ（Romero et al, １９９１）。
ＮＴ：テストされず
ＮＡ：該当せず
【０２９７】
Ｃ．ＣＴＬエピトープから成るワクチンの予測された母集団カバレッジ
選択されたエピトープから成るワクチンの母集団カバレッジは、ＨＬＡワークショップにより規定されたＨＬＡタイプの表現型頻度及びエピトープの結合特性に基づいて決定された。（Gjerston, D.W.及びTerasaki, P.I. HLA. 米国組織適合性及び免疫遺伝学学会、Lenexa, Kans（１９９８））。
【０２９８】
５つの選択されたＨＬＡクラスＩスーパータイプの各々の内部に含まれる最も一般的な分子及びそれらの一般的民族集団内での分布が表６Ａに示されている。指示された数のクラスＩ制限エピトープを結合する能力をもつＨＬＡタイプを有する個体の計算上の表現型頻度及び選択されたエピトープに対し免疫学的に応答する能力を遺伝学的に有するものと予測された個体の累積的頻度は、図２５Ａ−２５Ｂに示されている。平均的ＨＬＡ頻度を伴う理想化された複合母集団の中で、平均１１．１のエピトープ−ＨＬＡ組合せが認識できた（図２５Ａ）。主要な民族集団内の予測された母集団カバレッジの分析は、明らかな民族的偏向を全く実証しなかった（図２５Ｂ）。
【０２９９】
Ｄ．  ＨＴＬエピトープの選択
ＨＬＡ−ＤＲタイプを、ＨＬＡ−ＤＲ−１、４、７及び−ＤＲ３スーパータイプとして規定されるエピトープ−ペプチド結合に基づいて２つの主要スーパータイプにグループ化することができる。（Wilson, C.C. et al., J. Virol. ７５：４１９５−４２０７（２００１）；Doolan, D.L. et al., J.Immunol. １６５：１１２３−１１３７（２０００）；Southwood, S. et al., J. Immunol. １６０：３３６３−３３７３（１９９８））。ＣＴＬ エピトープを同定するために使用されるものと類似したプロセスを用いて、ＨＢＶ由来のＨＬＡ−ＤＲスーパータイプエピトープセットを同定し、結合特性に基づいて６個を選択した（表１１）。
【表１２】
2006501827.tif 000013
１．  ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、及びａｙｗ分離株を含めたＨＢＶの２０の菌株内の配列同一性。
２．  ＩＣ５０で結合されたＤＲ対立遺伝子の数≦１０００ｎＭ
【０３００】
ワクチンＨＴＬエピトープの免疫原性は、ＨＢＶ患者及びマウスの両方において評価された（表１２）。
【表１３】
2006501827.tif 000014
１．  慢性又は活性ＨＢＶ感染を患う患者における再生ＣＴＬ応答
２．  ペプチド／ＣＦＡエマルジョンでの免疫化後のＨ２b×dマウスにおいて誘発されたＨＴＬ応答。
【０３０１】
２つのＨＬＡ−ＤＲ３エピトープを除いて、全てのエピトープは、ＨＢＶに感染したヒトの体内で認識される。ＨＴＬエピトープの免疫原性も同様に、Ｈ２b×dマウスを用いて特徴づけされた。エピトープ−ペプチド結合選好性は、ＨＬＡ−ＤＲ１及びＩＡbについて類似しており、非遺伝子導入マウスにおける比較試験を可能にする（Wall, K.A. et al., J. Immunol. １５２：４５２６−４５３６（１９９４））。２５μｇの精製された合成ペプチドでの免疫化から１１〜１４日後に実施された新鮮なＥＬＩＳＰＯＴ検定により判断されるように（表１２），これらのマウスの中で１２のＨＴＬエピトープが免疫原性であった。
【０３０２】
結論としては、これらのデータは、ＨＢＶワクチン構築体内に内含するのに適したＨＴＬエピトープセットを同定する。
ＨＴＬエピトープレベルでの予測された母集団カバレッジ
【０３０３】
選択されたＨＴＬエピトープは、core、pol及びenv抗原から誘導されたものであり、かくして、免疫化された個体の体内で多特異性応答を生成する機会を提供した。これらのエピトープは同様に、最も一般的な民族集団を横断して高レベルの予測母集団カバレッジを提供する。表６Ｂでは、分析に内含されたＨＬＡタイプ及び一般的民族集団におけるそれらの分布を要約している。指示された数のクラスＩＩ制限エピトープを結合する能力をもつＨＬＡタイプを有する個体の計算上の表現型頻度及び選択されたエピトープに対し免疫学的に応答する能力を遺伝学的に有するものと予測された個体の累積的頻度は、図２６Ａ−２６Ｂに示されている。我々は、主要な民族集団内で観察された平均ＨＬＡ頻度から成る理想化された母集団の中で、平均１７.２のエピトープ−ＨＬＡ組合せが認識できたと予測している（図２６Ａ）。認識される可能性のあるエピトープ−組合せの平均数は、エピトープの異型接合性及びきわめて縮退した結合能力のため、１６（エピトープ合計数）よりも多い。主要な民族集団の分析は、非常に広い母集団カバレッジを実証した（図２６Ｂ）。
【０３０４】
３．ミニ遺伝子構築体設計
背景
我々の研究の焦点は、多数のエピトープから成るワクチン構築体の開発にある。「ビーズのストリング」の要領でエピトープを次々とストリング化することによってマルチエピトープ構築体を立体配置できるということを、異なる数多くの研究所からの研究が実証した。しかしながら、このタイプの構築体内の個々のＣＴＬエピトープの免疫原性は、往々にしてきわめて可変的である。変動は、エピトープを生成する細胞プロセシングの効率の差のせいであるとすることができる。我々は、効率の良いプロテオソーム分割を確保するための適切なアミノ酸スペーサの使用が、平衡のとれたエピトーププロセシング及び免疫原性を結果としてもたらすことを発見した。（Velders, M.P. et al., J.Immunol. １６６：５３６６−５３７３（２００１）；Livingston, B.D. et al., Vaccine. １９：４６５２−４６６０（２００１））。
【０３０５】
「接合部エピトープ」と呼ばれる人工エピトープを作り上げる可能性が考慮されてきた。接合部エピトープは不適切な形で応答を支配するか又は再誘導する可能性がありかつ／又はヒト（自己）配列と相同でかくして抗自己応答を誘発する可能性がある。各々のエピトープ対についてプロテオソーム分割を最適化しスペーサとしての付加的なアミノ酸の付加を通してエピトープモチープの発生を最小限におさえるスペーサ組成物を選択するコンピュータプログラムが設計されてきた。かくして、我々のエピ遺伝子構築体設計ソフトウェアは、異なるエピトープ配置を評価し、最適な予測されたプロテオソーム分割及び最小の接合部モチーフ発生率をもつものを選択する。
【０３０６】
プロテオソーム分割のためのＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープの最適化は、接合部エピトープを回避することが主要な設計考慮事項であり続けているものの、当面の問題と関連するものではない。ＨＬＡクラスＩＩ分子によって認識されるモチーフは、より広く定義されていることから、我々は、ＧＰＧＰＧ（配列番号２）から成る汎用スペーサの使用に基づく戦略を設計した；（Livingston et al., J. Immunol. １６８：５４９９−５５０９（２００２））。このスペーサは、それがヒト及びマウスのクラスＩＩの結合モチーフの大部分と相容性が低いために、最も一般的なＨＬＡ−ＤＲタイプの全てとはいわないまでも大部分に対する結合を分断する能力を有する（Livingston, B. et al., J. Immunol. １６８：５４９９−５５０９（２００２））。
【０３０７】
エピ遺伝子ＣＴＬ構築体のＮ末端は、配列ＭＧＭＱＶＱＩＱＳＬＦＬＬＬＬＷＶＰＧＳＲＧ（例えば配列番号７２のアミノ酸１〜２２）を内含する。これは、Ｉｇカッパ分泌シグナルに基づき、かつポリペプチド産物のＭＨＣクラスＩターゲティングを補助するために内含されているコンセンサス配列である。
【０３０８】
ワクチン設計戦略のもう１つの重要な要素は、汎用ＨＴＬエピトープの内含にある（Alexander, J. et al., Immunity １：７５１−７６１（１９９４））。この非天然エピトープは、ＴＣＲ接触残基を最大限にすることにより最適な免疫原性を得るためそして高い親和性をもつ最も一般的なＨＬＡ分子に結合するように設計された。このＨＴＬエピトープは、ＣＴＬ応答の誘発及び増大を支援するべくＨＴＬ応答を誘発することができる（Alexander, J. et al., Immunity １：７５１−７６１（１９９４））；Alexander, J. et al., Immunol. Res. １８：７９−９２（１９９８））。非−ＨＢＶ由来のＨＴＬエピトープの利用は、ＨＢＶ特異的ＨＴＬ応答が慢性感染と結びつけられた寛容により部分的に損なわれ得ることから、慢性という設定におけるＣＴＬ誘発のための支援に関し独特の利点を提供する可能性がある。実際、このＨＴＬエピトープは、ＨＢＶ抗原を発現する遺伝子導入マウスにおいて免疫系がＨＢＣ特異的Ｔ細胞寛容を克服できるようにするということが実証されてきた（Livingston, B.D. et al., Hum. Immunol. ６０：１０１３−１０１７（１９９９）；Livingston, B.D. et al., J. Immunol. １６２：３０８８−３０９５（１９９９）；Alexander, J. et al., Immunol. Res. １８：７９−９２（１９９８）；Sette, A.D. et al., J. Immunol. １６６：１３８９−１３９７（２００１））。このＨＴＬエピトープは同様に、その他のＨＴＬエピトープにより誘発された応答を増強させることから、ＨＴＬワクチン構築体の中に内含される。この「ヘルパーに対する補助」という概念は、樹状細胞上のアクセサリ分子のＨＴＬにより誘発されたアップレギュレーションとして定義される樹状細胞ライセンシングがＨＴＬ応答にも同様にあてはまり得るということを示唆するＣＤ４０系内の最近公表された観察事実と一貫性をもつものである（Gerloni, M.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ９７：１３２６９−１３２７４（２０００）；van Mierlo, G.J. et al., Proc. Acad. Sci. USA.９９：５５６１−５５６６（２００２））。
【０３０９】
Ｂ．ＨＢＶ由来のＣＴＬエピトープをコードするミニ遺伝子構築体の設計
最初のプロトタイプワクチン構築体ＨＢＶ１は、１７のＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３及び−Ｂ７エピトープを内含し、アミノ酸スペーサが欠如していた。この構築体は、適切なスペーサを取込み、一定数の成分エピトープの免疫原性を増大させるように修正された（ＨＢＶ２）。ＨＢＶ２は、一般にＩＦＡ内で乳化されたペプチドでの免疫化により誘発されたものに一般に匹敵する広範囲のエピトープに対するＣＴＬ応答を誘発した（データ示さず）。このタイプの検査により、我々はあらゆるプロセシング制約条件が無い場合に各々の特定のエピトープについて検出可能な活性を推定することができるようになり、かくして、前臨床評価のために利用されるマウスのさまざまな菌株内のエピトープ特異的ＴＣＲレパートリのサイズ及び利用可能性といった因子の規格化が可能となる。
【０３１０】
より大きい母集団カバレッジを提供するべく、ＨＬＡ−Ａ１及び−Ａ２４エピトープを内含するように、一定数の新しいエピ遺伝子構築体が設計された。２１及び３０のＣＴＬエピトープを取込んだ４つのエピ遺伝子構築体が構築され、ＨＬＡ−Ａ２エピトープに焦点をあてて、免疫原性についてテストされた。４つの構築体の全てが、広く強力なＣＴＬ応答を誘発した（データ示さず）。３０のエピトープ構築体は、予定患者母集団内でのエピトープカバレッジのより大きな冗長性を提供するはずであったため、付加的な研究は、これらのより大きなエピ遺伝子構築体を中心にしていた。１つの特定の３０エピトープ構築体、ＨＢＶ３０Ｃは、ＨＬＡ−Ａ３及び−Ａ２４エピトープの両方において強いＣＴＬ応答を誘発した（後者はＨ２b×dマウスを用いて測定された）。ＨＬＡ−Ａ２エピトープの２つすなわち core１８及びenv１８３はこの構築体内での免疫原性が低いものであったが、さらなるスペーサ最適化はこれらのエピトープの免疫原性を回復した。ＣＴＬワクチンＨＢＶ３０Ｋの概略図及びアミノ酸配列が図２７Ａと表１３に示されている。ＨＢＶ３０Ｋをコードするポリヌクレオチド配列の一例は表１３に示されている。
【０３１１】
ＨＬＡ−Ａ２及び−Ａ１１遺伝子導入マウス内のＨＢＶ３０Ｋの免疫原性は図２７Ｂに示されている。１つの比較手段として、強力なＨＢＶ２プロトタイプ構築体ならびにペプチド／ＩＦＡでの免疫化の後に誘発されたＣＴＬ活性も同様に示されている。全体に、ＨＢＶ３０ＫはＨＢＶ２と同じ位活発なＣＴＬ応答を惹起した。実際、ＨＢＶ３０Ｋは、ＨＬＡ 遺伝子導入動物の体内で免疫原性をもつ全ての成分エピトープに対するＣＴＬ応答を誘発し、標準的にこれらのＣＴＬ応答は、ペプチド免疫化の後に誘発される応答に匹敵するものであった。このデータは、先導的なＣＴＬワクチンとしてのＨＢＶ３０Ｋの選択を導く。
【表１４】
2006501827.tif 000015
【０３１２】
Ｃ．ＨＢＶ由来のＨＴＬエピトープをコードするミニ遺伝子構築体の設計
ＧＰＧＰＧ（配列番号２）汎用スペーサを取込んで、１６のＨＴＬエピトープをコードする単一のエピ遺伝子構築体が設計された。このＨＢＶ ＨＴＬ構築体の概略図及びアミノ酸配列が図２８Ａと表２４に示されている。ＨＢＶ ＨＴＬ構築体をコードするポリヌクレオチド配列の一例が表１４に示されている。この構築体は、ＥＬＩＳ−ＰＯＴ検定を用いてＣＤ４＋Ｔリンパ球により産生されたＩＦＮ−γを測定して、Ｈ２b×dマウス内の免疫原性についてテストされた（図２８Ｂ）。応答は、試験対象のエピトープの５０％（６／１２）についてＣＦＡ内で乳化されたペプチドにより誘発されたものと同じ位活発であった。残りの６つのエピトープのうち、２つのエピトープのみが、ＨＴＬワクチン構築体での免疫の後に応答を誘発できなかった。
【表１５】
2006501827.tif 000016
【０３１３】
接合部エピトープ含有量の有効な最小化
ＣＴＬ及びＨＴＬワクチン構築体のためのエピ遺伝子構築体を定義づけした後、我々は、より深い特徴づけに着手した。まず第１に我々は、コンピュータベースのエピ遺伝子構築体設計努力が、実際に接合部エピトープの存在を最小限にしたということを確認した。ＣＴＬ及びＨＴＬ成分の接合部エピトープ含有量は、モチーフ走査を用いて決定され、同じＣＴＬ及びＨＴＬエピトープの無作為組合せ２組と比較された。結果は表１５に示されている。
表１５．ワクチン構成体中の接合部エピトープの最小化例
【表１６】
2006501827.tif 000017
１．  ワクチンＣＴＬ及びＨＴＬエピ遺伝子構築体。
２．  プロセシングのために最適化されたＣＴＬエピトープの無作為配置。
３．  スペーサ無しのＨＴＬエピ遺伝子構築体。
４．  ＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、−Ａ２４又はＢ７モチーフを担持する接合部エピトープの数
【０３１４】
最適に設計されたＣＴＬエピトープワクチン内に存在する接合部エピトープの数は、無作為配置と比べて約１００分の１である。ＨＴＬ成分は、接合部ＣＴＬエピトープの存在について特異的に最小化されなかったものの、ＨＢＶ特異的ＨＴＬエピトープのストリング内部のＨＴＬ機能的エピトープを除去するためのＧＰＧＰＧスペーサ（配列番号２）の使用は、まさに、接合部ＣＴＬエピトープの存在を約４分の１に削減させた。接合部ＨＴＬエピトープは、かかるエピトープのＣＴＬエピ遺伝子構築体内の存在が上述の汎用ＨＴＬエピトープとかなり同じ要領で非特異的補助を刺激するためのみに役立つべきであることから、ＣＴＬエピトープストリングの分析においては考慮されなかった。（Alexander, J. et al., Immunity １：７５１−７６１（１９９４））。
【０３１５】
ＨＢＶ ＣＴＬ及びＨＴＬエピ遺伝子構築体内の接合部領域の相同性についての潜在性を評価するため、ＢＬＡＳＴ探索を実施した。入力配列として、我々は、１つのエピトープの４つのＣ末端残基、存在する場合にはスペーサ配列自体、そして後続するエピトープの４つのＮ末端残基から成る４７の配列の各々を考慮した。ＢＬＡＳＴ探索パラメータについては、我々は、探索オプション「short nearly exact matches（短かくほぼ正確な整合」を使用した。最低緊縮性基準で探索を実行するため、我々は、ウェブページに存在するデフォルト設定値を用いた（２００００での予想値及び２に設定されたワードサイズ）。生体フィールドはホモサピエンスに制限された。表１６が結果を列挙している。
【０３１６】
いかなる接合部領域も、いずれかのヒト配列に対して１００％相同ではなかった。最高の相同性は７８％であり、最低は５４％であった（平均６３±７.４）。比較のため、７つのＣＴＬ及び４つのＨＴＬ ＨＢＶ エピトープの無作為標本について、同一の相同性探索が実行された（表１７）。
検出された最良の相同性は６７％であり、最低は３０％であった（平均５４±１３）。
【０３１７】
表１６．エピ遺伝子構成体接合部エピトープに基づくヒト相同性探索の結果
【表１７】
2006501827.tif 000018
【０３１８】
【表１８】
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【０３１９】
【表１９】
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【０３２０】
【表２０】
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【０３２１】
【表２１】
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１．  隣接するエピトープからの４つの隣接残基を伴うスペーサグループが問合せ配列として利用された。
２．  ＢＬＡＳＴ探索パラメータ：
期待値２００００、ワードサイズ２、マトリクスＰＡＭ３０、アライメント数２５０
３．  結果としての最低Ｅ値との配列整合が最初に提示されている。
・  同定された配列無しは１未満のＥ値を有する。
４．  付加的な配列がより大きな相同性を伴って同定された場合、それらも同様に提示される。
５．  アスタリスク（*）は、非整合残基を表わす：正の符号（＋）は、類似の化学的組成物の残基を表わす。
結論としては、ヒト配列に対するワクチン接合部領域の相同性度は、免疫系により非自己としてみなされ自己免疫徴候と結びつけられないＨＢＶエピトープ自体といったようなその他の配列とは類似していなかった。
【０３２２】
Ｅ．抗原プロセシング及びエピトープ提示の有効な最適化
最適化されたエピ遺伝子構築体が免疫系に対するエピトープの送達のために効率が良いものであったことを実証するために、ヒトリンパ芽球様細胞系統がワクチン構築体でのトランスフェクションに付され、次にこれは抗原性検定においてＡＰＣとして使用された（Livingston, B.D. et al., Vaccine.１９：４６５２−４６６０（２００１））。これらの検定は、プロセシングの結果として産生されたエピトープの相対的量を決定するための１つの手段を提供する。これらの検定を用いて、Livingstonは、スペーサ最適化が３０倍も特異的エピトープの収量を増強させ得るということを実証した（Livingston, B.D. et al., Vaccine.１９：４６５２−４６６０（２００１））。トランスフェクタントは、全ＨＢＶ遺伝子に基づいた構築体として、ＧＣＲ−５８３５を含むさまざまなワクチン構築体（以下参照）で生成される。これらの結果は、特異的スペーサ残基に基づくプロセシング最適化のアプローチがきわめて有効であることを実証している。その上、トランスフェクションに使用される細胞系統はヒト由来のものであるため、これらのデータは、ＨＬＡ−遺伝子導入マウス内で得られた上述の結果のヒト系における重要な確証を提供している。
【０３２３】
４．ワクチンの立体配置、処方及び送達
ＨＴＬ及びＣＴＬエピ遺伝子構築体が設計され、独立して最適化された。しかしながら、単一のＤＮＡワクチン内のＨＴＬ及びＣＴＬ成分の同時送達が最適であると考えられている。３つのワクチン代替案としては、（１）２つの別々のＣＭＶプロモータの使用；（２）ＩＲＥＳと併用したＣＭＶプロモータの使用及び（３）単一読取り枠内でＣＴＬ＋ＨＴＬ成分をコードする構築体（図２９Ａ）が含まれる。第３の代替案の例については、表１８及び１９を参照のこと（例えばＧＣＲ−５８３５及びＧＣＲ−３６９７）。これらの異なる戦略の免疫原性は、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスを利用して評価された。結果は図２９Ｂに示されている。各々の立体配置が、全てのＨＬＡ−Ａ２エピトープに対する全体として比較可能なＣＴＬ応答を誘発したということは明白である。全体に、融合された構築体は、その他のワクチン立体配置と同じ位か又はそれよりも良い性能を示しており、それは単純さに起因して現在第１級のワクチン立体配置としてみなされている。
【０３２４】
ヒト用途により適したワクチンを作り上げ潜在的に免疫原性を増大させるために、ＧＣＲ−５８３５（表１８）のヌクレオチド配列は、ヒトコドン頻度を整合させ、ｍＲＮＡ安定性を増大させｍＲＮＡ二次構造を減少させるように修飾された。ＧＣＲ−３６９７（表１９）と呼ばれる修飾された構築体の免疫原性は、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス内のＧＣＲ−５８３５のものと比較された。５μｇ又は５０μｇのヒト最適化済みＧＣＲ−３６９７又はＧＣＲ−５８３５のいずれかで動物を筋内で免疫化し、一次ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いてＣＴＬ応答を測定した（図３０）。５０μｇの用量では、ＧＣＲ−３６９７で免疫化された動物においてエピトープ core１８、env１８３及びpol５３８に対するＣＴＬ応答の規模に平均５倍の増加がみられた。２つの構築体によって誘発されたＨＴＬ応答は、全体として同等であった（データ示さず）。ＧＣＲ−３６９７ワクチン構築体は、ＣＴＬ免疫原性に関してより高い効能を有するものと思われ、ヒトの体内で免疫原性を増強することになる属性を有し得ることから、一次ワクチンとしてその選択は正当化されている。
【表２２】
2006501827.tif 000023
【表２３】
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【０３２５】
ワクチン処方
裸ＤＮＡワクチンは、ヒトの体内でワクチン免疫原を送達するために最適であるとは証明されていない（Wang, et al., Science ２８２：４７６（１９９８））。従って我々は、重合体表面活性剤ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の使用に基づく代替的な処方を選択した。これは、ＤＮＡの組織分布を増大させ、ＤＮＡを分解から保護し、細胞による摂取を増大させるように設計された非凝縮性送達系である。ＰＶＰは、無毒でヒトの臨床用途のために承認された一般的に使用されている薬学処方賦形剤である。ＰＶＰの特性及び作用メカズムは、非イオンブロック共重合体ＣＲＬ１００５に非常に類似していると思われる。ＨＩＶ−１ワクチンプログラムのための使用を裏づけるために、安全性、毒性及び生体内分布／浄化試験が完了された。データは、該処方の安全性を裏づけるばかりでなく、ＤＮＡの細胞摂取は、裸ＤＮＡとの比較に基づくと１ログ以上増大するように思われる。かくして、この送達系の使用は、利用可能なデータによって裏づけされ得る。
【０３２６】
我々は、ＨＩＶ−１ワクチン及びＨＢＶワクチン構築体のうちの複数のものを用いて、ＣＴＬ及びＨＴＬエピトープの免疫原性に対するＰＶＰの効果を評価した。ＨＩＶ−１エピトープをコードするエピ遺伝子構築体を用いて得られたデータは、ＰＶＰが、裸ＤＮＡワクチン内で送達されたとき低い免疫原性しかもたなかったエピトープの免疫原性を増大させるということを実証した（データ示さず）。ＧＣＲ−５８３５の免疫原性は、３つの異なる処方、つまりＰＶＰ、裸ＤＮＡ及び心臓毒（ＣＴ）予備初回免疫の状況下で評価された。ＣＴ前処理は、裸ＤＮＡ注射の有効性を増強させるべく実験動物において一般的に利用される実験アプローチである。ＣＴは、その後再生するにつれてＤＮＡを取上げる筋肉繊維を破壊する（Davis, H.L. et al., Mol. Genet, ２：１８４７−１８５１（１９９３））。結果は図３１に示されている。ＣＴ前処理は、大規模応答を初回免疫させるにあたり最も有効であったが、このアプローチは臨床的に応用不可能である。ＰＶＰ処方のＤＮＡは、裸ＤＮＡに比べた場合測定された６つのエピトープのうちの５つについて陽性応答の頻度はより高いものであったものの、６つのエピトープのうちの２つについて応答の規模を増大させた。このデータは、ＰＶＰ処方が裸ＤＮＡの送達に比べ、ワクチンの効能を増大させるということを立証している。
【０３２７】
ワクチン投与及び送達経路
ＰＶＰ処方されたＤＮＡプラスミドワクチンは筋内（ｉ．ｍ．）で送達可能である。筋内投与経路は一般にＤＮＡワクチンについて使用される。予備実験においては、我々は、さまざまなＤＮＡ送達経路を評価するために、ＨＢＶプロトタイプエピ遺伝子構築体ｐＭｉｎ１を利用した（表２０）。これらの実験においては、筋内針送達がBiojectorを介したＰＶＰ処方されたＤＮＡの無針送達及びPowderJectを介した全粒子／ＤＮＡの弾道送達と比較された。全体に、筋内張り送達は、試験対象のその他の送達方法と同様の又はそれ以上の性能を示したが、その他の送達方法も使用可能である。
【０３２８】
裸ＤＮＡワクチン技術に対する改善
裸ＤＮＡワクチンは、ヒト以外の霊長類及びヒトにおいて比較的弱い免疫原であることが証明されたが、これまでに完了した研究はスペーサ最適化の無いエピトープ又は全長タンパク質をコードする無傷の遺伝子の送達に基づくものであった。その比較的穏やかなヒト免疫原性にもかかわらず、裸ＤＮＡ免疫化はまさに、ＣＴＬ応答を「初回免疫する」上で著しく有効であると思われる（Ramshaw, J. A. and Ramsay, A.J., Immunol. Today ２１：１６３−１６５（２０００））。
【０３２９】
ＤＮＡ摂取を増大させるためにエピ遺伝子構築体設計及びＰＶＰ付加が利用される。エピ遺伝子構築体は、より大きな臨床試験済み構築体との関係においてＤＮＡの細胞摂政を増強させることのできる小さいワクチンインサート及び小さいプラスミドＤＮＡバックボーンを内含し得る。
【０３３０】
表２０  ＣＴＬ応答の誘発のためのＤＮＡ送達の経路比較
【表２４】
2006501827.tif 000025
１．  異なる送達経路を用いたＨＬＡ−Ａ２中のｐＭin１の免疫原性。ＣＴＬ応答は、in situ ＥＬＩＳＡ検定を用いて測定された（Mc-Kinney, D.M. et al., J. Immunol Methods ２３７：１０５〜１１７（２０００））。
２．  針ＩＭ又は遺伝子ガン免疫化ＣＴＬ応答を用いたＨＬＡ−Ａ２中のｐMin１の免疫原性が、一次ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを用いて測定された。
【０３３１】
まずはＤＮＡワクチンをそして応答を促進するためにタンパク質又はウイルスベクターのいずれかを使用する異種初回免疫−追加抗原投与計画は、現在のところ遺伝子ワクチンのために最も免疫原性の高いものであるとみなされている（Ramshaw, J. A. and Ramsay, A.J., Immunol. Today ２１：１６３−１６５（２０００））。異種初回免疫−追加抗原投与アプローチは、ＨＢＶワクチン送達の一構成要素として利用可能である。
５．ワクチンの効能と特徴づけ
Ａ．適切な免疫原性レベルが、ＨＬＡ−遺伝子導入マウス内で得られる。
【０３３２】
ＧＣＲ−５８３５ワクチンを用いた応答の規模は、ＨＬＡ−Ａ２−遺伝子導入マウス内で評価され、実験的リポペプチドワクチンＣＹ−１８９９での免疫化の後に誘発された応答と比較された。Core１８エピトープが両方のワクチン構築体内に存在しＣＹ−１８９９は健康なヒトの体内で強力なＣＴＬ応答を惹起することがわかっていることから、この評価のためにリポペプチドワクチンが選択された（Livingston, B.D. et al., J., Immunol. １５９：１３８３−１３９２（１９９７））。マウス体内で誘発された応答は、図３２で示されている。ＧＣＲ−５８３５構築体で免疫化されたマウスからの脾細胞が、ＥＬＩＳＰＯＴ検定によって測定される、該構築体内でコードされた６つのＨＬＡ−Ａ２制限されたエピトープ全てに対するＩＦＮ−γ応答を産生した（図３２Ａ）。ＣＹ−１８９９内のコア１８エピトープに対する応答も同様に観察されたが、規模は、ＧＣＲ−５８３５ワクチン構築体を用いて誘発されたcore１８エピトープ応答よりも著しく低いものであった。しかしながら、ペプチドでの６日間の再刺激の後、これら２つの異なるフォーマットのワクチンにより誘発されるcore１８応答は、極めて類似したものであった（図３２Ｂ）。
【０３３３】
その他のＡ２制限されたエピトープについて得られた応答の規模は、ＨＢＶ感染の浄化を媒介するものとして知られるものに匹敵することがわかった。我々は、本１Ａ節で詳述されているような急性感染において検出されたその他の応答の範囲内に充分入る約１００ＳＦＣ／１０6ＣＤ８＋細胞（env３３５）から３００ＳＦＣ／１０6ＣＤ８＋細胞（env１８３）以上までに至る範囲内の一次ＥＬＩＳ−ＰＯＴ応答を観察した。
Ｂ．応答の質
【０３３４】
ＨＢＶの浄化は、特に組込まれたウイルスを宿すものといった感染細胞の直接的溶解ならびに間接的なリンホカイン媒介型効果を含めた複合した一連の分子事象によって媒介される。これまで記述された全ての実験においてＩＦＮ−γの産生が測定されており、これはこのリンホカインがＨＢＶ感染の浄化に関与することから適切なことである。（Chisari, F.V. and Ferrari, C. Annu. Rev. Immunol. １３：２９−６０（１９９５）；Guidotti, L.G. et al., Immunity. ４：２５−３６（１９９６））。ＤＮＡ免疫化は、溶解活性能力をもつＣＴＬを誘発することが示されてきた（Ishioka, G.Y. et al., J. Immunol. １６２：３９１５−３９２５（１９９９））。ＨＬＡ−遺伝子導入マウスは同様に、ＧＣＲ−５８３５及び／又はＧＣＲ−３６９７で免疫化することもできる。
【０３３５】
提示された免疫学的検定の結果は、一般に、３〜６匹のマウスからの脾臓のプールされた調製物を用いて誘導された。多数のエピトープに対する応答が個々の動物の中で誘発されたか否かを決定するために、付加的な実験が実施された。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスは、ＰＶＰ中で処方されたＧＣＲ−５８３５で、１週間隔で１回又は２回免疫化された。個々の動物からの脾臓は別々に収獲され、ワクチン内でコードされた６つのＨＬＡ−Ａ２ エピトープペプチドのプールで再刺激された。その後、ＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いて、個々のペプチドに応答して、ＩＦＮ−γ分泌を測定した。１回目の免疫化後、全てのマウスは少なくとも１つのエピトープに対し応答し、平均応答率はマウス１匹あたり４.２±２.０であった（図３３Ａ）。２回目の免疫化後、認識されたエピトープの平均数は、５.６±０.５まで増大した（図．３３Ｂ）。これらのデータは、免疫優性に関する最近のデータに照らして特に当面の問題と関連性があるものであり（Rodriguez, F. et al., J. Virol. ７６：４２５１−４２５９（２００２））、免疫優性の結果としてもたらされた応答の狭さを埋め合わせるために免疫原最適化及び反復的免疫化を使用することができるということを表わしている（Chen, M. et al., J. Virol. ７４：７５８７−７５９９（２０００）；Yewdell, J.W. et al., Annu. Rev. Immunol. １７：５１−８８（１９９９））。
【０３３６】
６．まとめと結論
マルチエピトープＣＴＬ／ＨＴＬエピ遺伝子構築体は、慢性ＨＢＶ感染の免疫療法のために有効であり、抗ウイルス処置された慢性感染した個体の治療において用いることができる。
【０３３７】
ワクチンの設計において使用するのに適したＣＴＬ及びＨＴＬエピトープを同定するために用いられるプロセスが以上に記述されている。異なる民族的背景においてこれらのエピトープセットにより提供される予測された母集団カバレッジ及び免疫応答の冗長性は、ＨＢＶ感染の消散に自然に付随する応答の広さ及び多重特異性と一貫性のあるものである。マルチエピトープ構築体を組立てるのに利用されたワクチン設計方法は、プロテオソーム分割の最適化（ＣＴＬエピトープ）及び接合部モチーフの最小化（ＨＴＬエピトープ）を必要とした。
【０３３８】
評価されたエピトープの大部分又は全てに対するＨＬＡ−遺伝子導入マウス体内での強力なＣＴＬ応答を誘発する特異的ワクチン構築体が生産された。このワクチン構築体は、ヒトにおいては免疫原性があることがわかっているＣＹ−１８９９ワクチンを用いて誘発された応答に規模的に類似しておりかつＨＢＶ感染の消散中にヒトにおいて見られるＣＴＬ応答のレベルに類似しているＨＢＶエピトープ特異的ＣＴＬレベルを遺伝子導入マウス内で誘発する。
【０３３９】
さらに、我々は、ＣＴＬ及びＨＴＬエピトープの同時送達のために異なるワクチン立体配置がいかに有効であるかを示した。エピ遺伝子構築体は、単一の遺伝的インサートから共直線的に合成されるＨＴＬ及びＣＴＬエピトープを含有することができ、かくしてワクチンは容易に製造され安定している。
【０３４０】
裸ＤＮＡと比べさらに増大した活性が、ＰＶＰベースのＤＮＡ処方に付随する。同様にして、筋内送達は、調査対象の系内で最も実用的であると思われ、少なくともその他の送達方法（Biojector又は遺伝子ガン）と同じ位良い活性が付随する。ＰＶＰ内で処方された最適化済みのエピ遺伝子構築体での初回免疫とそれに続くウイルスベクターでの追加抗原投与の組合せも同じく使用可能である。
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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表２２：  マウス遺伝子（Mus musculus）についてのコドン利用表
【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【０３４１】
例１８
in vitroでのＢ型肝炎ウイルスポリエピトープ遺伝子産物のプロテオソームプロセシング
序
慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対するワクチンの設計に対するＣＴＬエピトープベースのアプローチがとられた。タンパク質分解プロセシングを増強させるように設計されたアミノ酸スペーサによってエピトープが分離されている一連の１６エピトープをコードする合成遺伝子が作られた。ヒトの細胞系統内でのこのＨＢＶポリエピトープミニ遺伝子のin vitro翻訳ならびに過渡的発現は、プロテアソーム活性に対し不安定な遺伝子産物について予想されるように、ポリタンパク質の急速な分解を結果としてもたらす。このＨＢＶポリエピトープ（ＡＯＳＩｂ）は、検出を容易にするため蛍光タンパク質に直接融合された。トランスフェクションを受けた培養に対するプロテアソーム特異的阻害物質の添加は、ＦＡＣＳ分析、蛍光顕微鏡及びウエスタンブロットによって判断される通り、細胞内に存在する融合タンパク質の量の顕著な増加を示した。ポリエピトープ遺伝子産物のプロセシングを遮断するプロテアソーム阻害物質の能力は、ＤＮＡプラスミド内の病原体特異的エピトープに対するin vivo免疫原性と組合わされて、アミノ酸スペーサがクラスＩのプロセシングを確保する上で有効であったことを示している。プロテアソームプロセシングを改善するものと予想される複数のアミノ酸添加を取込んだ後続するＨＢＶポリエピトープ構築体（ＡＯＳ Ｉｂ.２）が作られた。結果は、このＨＢＶポリエピトーププラスミド内で用いられたスペーサ配列が、発現されたポリペプチドのプロテアソームプロセシング及び効率の良いＣＴＬエピトープ提示を促進できるということを示している。
【０３４２】
２．実験的アプローチ
in vitroでのタンパク質検出及び定量を容易にするべく蛍光マーカーに対してＨＢＶポリエピトープストリングが融合されたＤＮＡ発現カセットが設計された。細胞内エピトープのプロセシングにおける潜在的改善を評価するため、１つの構築体に対しさまざまな組成のスペーサが付加された。細胞質ゾルタンパク質のプロテアソーム分解を予防するため、プラスミドでのトランスフェクションを受けた細胞にプロテアソーム阻害物質が添加された。融合タンパク質の存在は、ＦＡＣＳ、蛍光顕微鏡法又はウエスタンブロット法を介して蛍光マーカー検出により監視された。細胞内に捕捉された蛍光の量は、ポリタンパク質のプロセシングの変化を探すために定量された。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス内のin vivo免疫原性に対する効果も同様に、アミノ酸スペーサが有益な効果を有していたか否かを見極めるべく両方のプラスミドについて測定された。
【０３４３】
３．ＨＢＶポリエピトープ構築体の組成
ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ及びＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２は、最適化されているウイルス特異的エピトープを担持する。該構築体は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３及びＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプエピトープつまり合計１６のエピトープをコードする。ＨＢＶ ＡＯＳＩｂが付加的な残基を全くもたないのに対し、ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２構築体は、プロテアソームプロセシングを増強する目的で付加された付加的アミノ酸を有する。ＣＴＬ構築体ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ及びＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２の概略図及びアミノ酸配列は、図３４及び表２３〜２４に示されている。ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ及びＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２をコードするポリヌクレオチド配列の一例が表２３〜２４に示されている。
【表３１】
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【表３２】
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【０３４４】
４．In vitro タンパク質発現及び検出方法
ヒト２９３細胞系統の過渡的トランスフェクションが、蛍光接合型ポリエピトープＨＢＶ ＡＯＳＩｂ又はＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２をコードするプラスミド又はエピトープ無しの蛍光リポータプラスミドを用いて実施された。トランスフェクションから２４時間後に、５μＭの不可逆的プロテアソーム阻害物質ＭＧ１３２を添加した。プロテアソーム阻害物質の添加から２４時間以内にフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）又は蛍光顕微鏡のいずれかにより、生きた細胞内で蛍光を検出した。プロテアソーム阻害物質の存在又は不在下でプラスミドＨＢＶ ＡＯＳＩｂでのトランスフェクションを受けた蛍光細胞の数の増加を、阻害物質とのインキュベーション時間の関数として、図３５Ａに示されている通りに測定した。図３８は、３つの異なるプラスミドでのトランスフェクションを受けた細胞について阻害物質と共に２４時間インキュベートした後（ＦＡＣＳにより）検出された蛍光細胞の数の比較を示している。スペーサ最適化されたプラスミドＨＢＶ ＡＯＳＩｂ.２について、より深遠な効果が見られた。さまざまな蛍光融合タンパク質を発現する細胞の数は同様に、図３９に示されているように生きた細胞の蛍光顕微鏡法により測定された。トランスフェクションを受けた細胞から全細胞溶解物を調製し、ゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、ブロッティング用膜に移し、融合パートナタンパク質に対する抗体でタンパク質を検出することによって、ウエスタンブロット検出を実施した。次に、プロテアソーム阻害物質ラクタシスチン（２５μＭ）又はＭＧ１３２（５μＭ）の添加時点で検出可能なタンパク質の量の増大を決定した。結果は、図３６に示されている。
【０３４５】
５．マウス免疫原性検定方法
遺伝子導入ＨＬＡ−Ａ２マウスに、ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ又はＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２ポリエピトープをコードするプラスミド１００μｇを筋内で注射した。１４日後にマウスを屠殺し、その脾臓を均質化してＴリンパ球及びＡＰＣを収集した。細胞を培養内で、さまざまなＨＢＶエピトープに対応するペプチドで刺激した。分泌単位を検出するため修正ＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ−γの分泌を測定した。結果は、表２５にまとめられている。
表２５．  プラスミドＡＯＳＩｂ及びＡＯＳＩｂ２についてのＨＬＡ−Ａ２Ｔｇマウス免疫原性
【表３３】
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【０３４６】
６．結果のまとめ
ＨＢＶ ＤＮＡ構築体は、ＣＴＬ応答を惹起できる最適化されたカセット内にウイルス特異的エピトープを担持しており、プロテオソームプロセシングひいては抗原のクラスＩ提示を潜在的に増強するため１つの構築体のエピトープ間に付加的なアミノ酸が導入された。
【０３４７】
ＨＢＶ蛍光タンパク質融合は両方共、蛍光タンパク質単独よりもさらに不安定であり、ＨＢＶポリエピトープが容易に分解され全融合産物の分解を駆動することを示唆していた。プロテアソーム阻害物質がより大量の蛍光融合産物の検出を可能にするものの、単独で発現された場合融合パートナに対しいかなる効果ももたず、これが確かにポリエピトープにより増強された細胞質体プロテアソーム活性であることを表わしている。プロテアソーム阻害物質の効果は、ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ融合タンパク質の場合よりもスペーサ最適化されたＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２産物についてより顕著であり、このことは、ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２分子に付加されたプロセシング部位が、そのプロセシング可能性を増大させる所望の効果を有していたことを表わしている。ＨＬＡ−Ａ２における研究は、ＨＢＶ ＡＯＳＩｂに比べた、「最適化された」ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２プラスミドについての複数のエピトープの免疫原性の改善を示した。
【０３４８】
例１９
ＧＣＲ−３６９７で免疫化されたＨＬＡ遺伝子導入マウスの中で測定されたエピトープ特異的Ｔ細胞応答
エピトープ特異的Ｔ細胞応答を、免疫化から１１〜１４日後に得た脾細胞を用いてＧＣＲ−３６９７で免疫化したＨＬＡ遺伝子導入マウス内で測定した（図３７）。６〜９匹のＨＬＡ−遺伝子導入マウスのグループを、前脛骨筋中で１００μｇのＤＮＡで左右対称に免疫化した。ＤＮＡは、ＰＢＳ又はＰＶＰの処方中で送達させた；ＰＢＳ処方の場合、注射部位は、心臓毒性注射で前処理した。ＰＶＰベースの処方で免疫化されるマウスは、４日の周期で１００μｇのＤＮＡで２回免疫化した。
【０３４９】
ＩＦＮ−γの産生に基づいてin situ ＥＬＩＳＡ検定を用いてＣＴＬ応答を測定した。５％のＣＯ2内で３７℃で６日間ＲＰＭＩ培地内で照射済みリポ多糖類（ＬＰＳ）で活性化された脾細胞（１０7）及びペプチド（１μｇ／ml）と共に脾細胞（２.５×１０7）を培養することにより、検定を実施した。６日間の刺激の後、ペプチド（１μｇ／ml）及び１０5のＨＬＡ整合されたジャーカット標的細胞及びペプチド（１μｇ／ml）を伴って及びこれを伴なわずに、２０時間、階段希釈された脾細胞を培養した。マウスＩＦＮ−γ（クローンＲＡ−６Ａ２、ＢＤ Biosciences／Pharmingen）に特異的なラットモノクローナル抗体で予めコーティングされたＥＬＩＳＡ平板（Costar, Corning, NY）上で検定を実施した。翌日、０.０５％のTween−２０を伴うＰＢＳで平板を洗浄することによって細胞を除去し、サンドイッチフォーマットのＥＬＩＳＡを用いて分泌されたＩＦＮ−γの量を測定した。捕捉されたＩＦＮ−γを検出するために、ビオチニル化したラットモノクローナル抗体（クローンＸＭＧ１.２、BD Biosciences／Pharmingen）を使用した。着色のためメーカーの指示に従って、ホースラディッシュペルオキシダーゼでカップリングされたストレプアビジン（Zymed）及び３．３′、５、５′テトラメチルベンチジン及びＨ2Ｏ2（Immuno Pure ＴＭＢ基質キット、Pierce）を使用した。Labsystems Mulfiskan ＲＣＥＬＩＳＡ平板読取り装置上で４５０ｎｍで吸光度を読取った。In situ ＥＬＩＳＡデータを、評価のため分泌単位（ＳＵ）に換算した（McKinney et al., ２０００）。
【０３５０】
全体に、ＧＣＲ−３６９７は、さまざまなＨＬＡ−スーパータイプにより制限された多数のエピトープに対するＣＴＬ応答を誘発した。誘発された応答の規模及び広さは、治療的価値をもつものと一般にみなされている免疫応答の性質と一貫性をもつものである。
【０３５１】
背景技術、定義づけ、詳細な説明及び実施例の中で引用された各々の文書の全開示（特許、特許出願、学術論文、要約書、実験室マニュアル、書籍、配列データベース内の入力又はその他の開示）は、本書に参考として内含される。
【０３５２】
当業者であれば、単に日常的な実験のみを用いて、本書に記述された発明の特定的実施形態の数多くの等価物を知ること又はそれを確認できることであろう。これらの等価物は、以下のクレームに包含されるものと意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３５３】
【図１】各々２０〜２５個の異なるＣＴＬエピトープを取り込んでいる３つの異なるマルチエピトープ構築体についてのデータを例示している。
【０３５４】
【図２Ａ】第１の構築体が、線形的に同時合成された４つの異なるエピトープを取込んでおり、第２の構築体がＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサを取込んでいる、２つの異なる合成ポリペプチド（図２Ａ）を例示している。
【図２Ｂ】同じペプチドのプールの等モル量（各ペプチド３マイクログラムずつ）によって誘発された応答に比べた、ＩＡb陽性マウス内のさまざまなエピトープに対する増殖性応答用に初回免疫するこれらの異なる構築体２ナノモルの能力を例示している。
【０３５５】
【図３Ａ】マルチエピトープＤＮＡ構築体の構造を描いている。各エピトープの上にＨＬＡ制限が示され、Ａ*０２０１エピトープは太字で表わされている。ＨＬＡ結合親和性（ＩＣ50ｎＭ）は、各エピトープの下に提供されている。（ａ）コードされたエピトープの順序を例示するＨＩＶ−ＦＴの図式である。（ｂ）ＨＢＶ特異的構築体のtheの図式である。Core１８に関係するＣ＋１アミノ酸は矢印を伴って示されている。Core１８のＣ1位置に単一アミノ酸の挿入を伴うＨＢＶ特異的構築体は、ＨＢＶ．１Ｘとして例示されている。
【図３Ｂ】図３Ａの続き。
【０３５６】
【図４Ａ】ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウスにおけるＨＩＶ−ＦＴ内のＨＬＡ−Ａ*０２０１ エピトープの免疫原性を例示している。（ａ）エピトープ Pol４９８（丸）、Ｖpr６２（三角）、Gag３８６（四角）に対する代表的ＣＴＬ。各ペプチドの存在下（黒色記号）又は不在下（白色記号）でのJurkat−ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb標的細胞に対する51Ｃｒ放出検定において細胞毒性を検定した。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウスにおけるＨＩＶ−ＦＴの免疫原性ＣＴＬ応答のまとめ。棒は、陽性培養の幾何平均ＣＴＬ応答を表わしている。陽性ＣＴＬ培養の頻度も同様に示されている。
【図４Ｂ】図４Ａの続き。
【０３５７】
【図５】エピトープ免疫原性上のＣ＋１ アミノ酸の影響を示す。９４のエピトープ／Ｃ＋１ アミノ酸の組合せを表わすさまざまなマルチエピトープ構築体からのＣＴＬ応答を取込んだデータベースを分析して、特定の組合せが最適なＣＴＬ応答と結びつけられたケースの頻度（％）を決定した。ＣＴＬ応答は、測定された培養の少なくとも３０％において１００ＳＵ又は２０ＬＵより大きい場合に、最適とみなされた。一定の与えられたエピトープ／Ｃ＋１ アミノ酸組合せが観察された回数も同様に提供されている。
【０３５８】
【図６Ａ】ＨＢＶ−特異的構築体に対するＣＴＬ応答を示す。（ａ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウスのＤＮＡ免疫化の後のCore１８エピトープに対するＣＴＬ応答。（ｂ）Core１８のＣ＋１位置での１つの単一アミノ酸挿入だけ変動している構築体でのＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋb遺伝子導入マウスのＤＮＡ免疫化の後のＨＢＶ Core１８に対するＣＴＬ応答。
【図６Ｂ】図６Ａの続き。
【０３５９】
【図７】ＨＢＶ．１（陰影入り棒）及びＨＢＶ．１Ｋ（斜線入り棒）のトランスフェクションを受けた細胞系統におけるＨＢＶ Core１８提示レベルを示している。エピトープ提示は、ペプチド特異的ＣＴＬラインを用いて数量化された。ＨＢＶ Ｐol４５５の提示は、比較目的で示されている。
【０３６０】
【図８】ＨＩＶ−ＦＴエピ遺伝子構築体でのトランスフェクションを受けた２２１Ａ２Ｋb標的細胞についてのデータを描いている。これらのトランスフェクションを受けた細胞は、さまざまなＨＩＶ誘導されたＣＴＬエピトープに特異的でＨＬＡ遺伝子導入マウスに由来するＣＴＬ系統にエピトープを提示するその能力について検定された。異なるＣＴＬ系統の抗原感度の差異を補正するため、ＡＰＣといったトランスフェクションを受けていない細胞を用いたペプチド用量滴定が並行して実施された。
【０３６１】
【図９Ａ】本発明の方法を用いて最適化されたＨＩＶマルチエピトープ構築体を示す。
【図９Ｂ】図９Ａの続き。
【図９Ｃ】図９Ｂの続き。
【０３６２】
【図１０】本発明の１実施形態に従ったマルチエピトープ構築体の自動的最適化を実施するためのコンピュータシステムを例示している。
【０３６３】
【図１１Ａ】本発明の１実施形態に従った、Junctional Analyzer（接合部アナライザ）プログラムを実行するために使用されるユーザー入力パラメータを含有する入力テキストファイル例を示している。
【図１１Ｂ】本発明の１実施形態に従った、Junctional Analyzer（接合部アナライザ）プログラムを実行するために使用されるユーザー入力パラメータを含有する入力テキストファイル例を示している。
【０３６４】
【図１２】本発明の１実施形態に従った、最適なマルチエピトープ構築体を同定するためのソフトウェアプログラムの流れ図を例示する。
【０３６５】
【図１３Ａ】本発明の１実施形態に従った、Junctional Analyzerプログラムの出力結果を含有する出力テキストファイル例を例示している。
【０３６６】
【図１３Ｂ】図１３Ａの続き。
【０３６７】
【図１３Ｃ】図１３Ｂの続き。
【０３６８】
【図１３Ｄ】図１３Ｃの続き。
【０３６９】
【図１４Ａ】ＩＦＡ内の個々のペプチドとの関係においてＥＰ−ＨＩＶ−９０により誘発されるＣＴＬ応答を描いている。
【図１４Ｂ−１】個々のペプチドとの関係におけるＰｆＣＴＬ．１、ＰｆＣＴＬ．２及びＰｆＣＴＬ．３によって誘発されるＣＴＬ応答を描いている。
【図１４Ｂ−２】図１４Ｂ−１の続き。
【図１４Ｂ−３】図１４Ｂ−２の続き。
【０３７０】
【図１５】特定のエピトープに対するＨＴＬ応答に対するクラスＩＩ  エピトープ構築体ＨＩＶ７５mer及びＨＩＶ６０mer内のＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサの効果を示す。
【０３７１】
【図１６】ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築体内に存在する特定のエピトープに対するＨＴＬ応答を描いている。
【０３７２】
【図１７】ＨＩＶ７５mer、 ＥＰ−ＨＩＶ−１０４３、及びＥＰ−ＨＩＶ−１０４３−ＰＡＤＲＥ（登録商標）構築体内に存在するエピトープを描いた概略図である。
【０３７３】
【図１８Ａ−Ｎ】或る種のマルチエピトープ構築体のアミノ酸配列及び核酸配列を示している。
【０３７４】
【図１９Ａ】或る種のマルチエピトープ構築体内に存在するエピトープについてのアミノ酸配列を示している。
【０３７５】
【図１９Ｂ】或る種のマルチエピトープ構築体内に存在するエピトープについてのアミノ酸配列を示している。
【０３７６】
【図１９Ｃ】或る種のマルチエピトープ構築体内に存在するエピトープについてのアミノ酸配列を示している。
【０３７７】
【図１９Ｄ】或る種のマルチエピトープ構築体内に存在するエピトープについてのアミノ酸配列を示している。
【０３７８】
【図１９Ｅ】或る種のマルチエピトープ構築体内に存在するエピトープについてのアミノ酸配列を示している。
【０３７９】
【図２０Ａ】３つの関係するエピ遺伝子構築体ＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２Ａ及びＨＢＶ−２Ｂを構築するために用いられるＨＢＶＣＴＬエピトープ、エピ遺伝子構築体内にエピトープの順序、ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ３／１１遺伝子導入マウス内で誘発される免疫応答及びエピ遺伝子構築体のアミノ酸及び核酸配列を示している。図２０Ｂでは、ＨＢＶ−２、ＨＢＶ−２Ａ及びＨＢＶ−２Ｂ内のシグナル配列はＩｇカッパコンセンサスシグナル配列であるが、その他のシグナル配列を利用することも可能である。
【０３８０】
【図２０Ｂ】図２０Ａの続き。
【０３８１】
【図２０Ｃ】図２０Ｂの続き。
【０３８２】
【図２０Ｄ】図２０Ｃの続き。
【０３８３】
【図２０Ｅ】図２０Ｄの続き。
【０３８４】
【図２０Ｆ】図２０Ｅの続き。
【０３８５】
【図２１Ａ】２つの２１ＣＴＬエピトープエピ遺伝子構築体ＨＢＶ−２１Ａ及びＨＢＶ−２１Ｂを構築するために用いられるＨＢＶＣＴＬエピトープ、エピ遺伝子構築体内のエピトープの順序、ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ３／１１遺伝子導入マウス内で誘発される免疫応答及びエピ遺伝子構築体のアミノ酸及び核酸配列を示している。
【０３８６】
【図２１Ｂ】図２１Ａの続き。
【０３８７】
【図２１Ｃ】図２１Ｂの続き。
【０３８８】
【図２１Ｄ】図２１Ｃの続き。
【０３８９】
【図２１Ｅ】図２１Ｄの続き。
【０３９０】
【図２２Ａ】２つの３０ＣＴＬエピトープエピ遺伝子構築体ＨＢＶ−３０Ｂ及びＨＢＶ−３０Ｃを構築するために用いられるＨＢＶＣＴＬエピトープ、エピ遺伝子構築体内のエピトープの順序、ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ３／１１遺伝子導入マウス内で誘発される免疫応答及びエピ遺伝子構築体のアミノ酸及び核酸配列を示している。
【０３９１】
【図２２Ｂ】図２２Ａの続き。
【０３９２】
【図２２Ｃ】図２２Ｂの続き。
【０３９３】
【図２２Ｄ】図２２Ｃの続き。
【０３９４】
【図２２Ｅ】図２２Ｄの続き。
【０３９５】
【図２３Ａ】ＨＢＶ−３０Ｃエピ遺伝子構築体内の２つのＨＬＡ−Ａ２制限されたＣＴＬエピトープを隣接するスペーサに対して行なわれた修飾を示している。修飾は、プロセシング及びその後の提示の効率を増大させかくしてエピトープの免疫原性を増大させるように設計された。ＨＬＡ−Ａ２又はＨＬＡ−Ａ３／１１遺伝子導入マウスを用いて免疫原性が測定され、エピ遺伝子構築体のアミノ酸及び核酸配列が書留められた。図２３Ａでは、ＨＢＶ−３０Ｃ内のCore１８エピトープをフランキンするリジン（Ｋ）スペーサは、ＨＢＶ−３０ＣＬ内に３つのアラニン残基（ＡＡＡ）を内含させるように修飾された。同様にＨＢＶ−３０Ｃ内のenv１８３エピトープをフランキンする１つのアスパラギン（Ｎ）がＨＢＶ−３０ＣＬ内に３つのアラニン残基（ＡＡＡ）を内含させるように修飾された。
【０３９６】
【図２３Ｂ】図２３Ａの続き。
【０３９７】
【図２３Ｃ】図２３Ｂの続き。
【０３９８】
【図２４Ａ】ＧＰＧＰＧ（配列番号２）アミノ酸スペーサにより分離されたＨＴＬエピトープを含むマルチエピトープワクチンを構築するように使用される、ＨＴＬエピトープ及び選択されたＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に対するその結合親和性を示している。マルチエピトープワクチンの核酸配列及び核酸によりコードされたアミノ酸配列は図２４Ｃに示されている。
【０３９９】
【図２４Ｂ】図２４Ａの続き。
【０４００】
【図２４Ｃ】図２４Ｂの続き。
【０４０１】
【図２５Ａ】ＧＣＲ−５８３５内に含有されたＣＴＬエピトープについての母集団カバレッジを示す。図２５Ａは、アジア人種、黒色人種、欧州白色人種及び北米白色人種母集団における遺伝子頻度から誘導された複合母集団内のＨＬＡ−Ａ／Ｂエピトープ組合せの指示された数を提示するように予測された個体の百分率（黒色棒）同じく右側軸上に示されているのは、母集団カバレッジ百分率の累積プロットである（白色円）。
【０４０２】
【図２５Ｂ】ＨＬＡ対立遺伝子により結合されたエピトープの数の一関数としてのアジア人種、黒色人種、欧州白色人種及び北米白色人種母集団内の予測された母集団カバレッジ累積百分率のまとめである。
【０４０３】
【図２６Ａ】リスト中に含まれているエピトープについての母集団カバレッジを示す。図２６Ａは、アジア人種、黒色人種、欧州白色人種及び北米白色人種母集団における遺伝子頻度から誘導された複合母集団内のＨＬＡ−ＤＲエピトープ組合せの指示された数を提示するように予測された個体の百分率（黒色棒）同じく右側軸上に示されているのは、母集団カバレッジ百分率の累積プロットである（白色円）。
【０４０４】
【図２６Ｂ】ＨＬＡ対立遺伝子により結合されたエピトープの数の一関数としてのアジア人種、黒色人種、欧州白色人種及び北米白色人種母集団内の予測された母集団カバレッジ累積百分率のまとめである。
【０４０５】
【図２７Ａ】（Ａ）ＨＢＶ３０Ｋの概略図及び（Ｂ）成分エピトープのＨＬＡスーパータイプ制限を示す。ＨＬＡ−Ａ２又は−Ａ１１遺伝子導入マウスを、１００μｇのワクチンＨＢＶエピ遺伝子プラスミドＨＢＶ３０Ｋ又はプロトタイプＨＢＶワクチンＨＢＶ２で筋内にて免疫化した。免疫化から１１日後に、脾細胞をin vitroでワクチン内でコートされたエピトープを用いて刺激した。培養状態で６日の後、エピトープ特異的ＣＴＬ応答は、in situ ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ検定を用いて測定された。
【０４０６】
【図２７Ｂ】図２７Ａの続き。
【０４０７】
【図２８Ａ】ＨＢＶ  ＨＴＬワクチン構築体の概略図及びその免疫原性を示す。図２８Ａ。エピトープ間に導入されたＧＰＧＰＧ（配列番号２）スペーサが示されている。
【図２８Ｂ】Ｈ２b×dマウスを、１００μｇのワクチンＨＢＶ  ＨＴＬエピ遺伝子構築体又はＣＦＡ中で乳化させた個々のペプチドで筋内にて免疫化した。免疫化から１１日後に、ＣＤ４Ｔ細胞を脾細胞から精製し、一次ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いてＨＴＬ応答を測定した。
【０４０８】
【図２９Ａ】ＨＢＶワクチンプラスミド立体配置及びその相対的免疫原性を示す。図２９Ａ。概略図（ｉ）２重ＣＭＶプロモータプラスミド；（ｉｉ）ＩＲＥＳ含有プラスミド；（ｉｉｉ）ＣＴＬ＋ＨＴＬエピ遺伝子構築体融合。
【図２９Ｂ】異なるワクチン立体配置の相対的免疫原性。１００μｇのＨＢＶ３０Ｋ（ＣＴＬエピ遺伝子構築体対照）、ＨＢＶ３０Ｋ、Ｈ１（２重ＣＭＶプロモータプラスミド）、ＨＢＫ３０Ｋ．Ｈ３（ＩＲＥＳ含有プラスミド）又はＨＢＶ３０Ｋ／ＨＴＬ（ＧＣＲ−５８３５；ＣＴＬ＋ＨＴＬエピ遺伝子構築体融合）で、筋内にてＨＬＡ−Ａ２−遺伝子導入マウスを免疫化した。免疫化から１１日後に、脾細胞を、ワクチン内でコードされたエピトープでin vitroにて刺激した。培養状態で６日後に、エピトープ特異的ＣＴＬ応答を、in situＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ検定を用いて測定した。
【０４０９】
【図３０】ＧＣＲ−５８３５及びＧＣＲ−３６９７の相対的免疫原性を示す。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスを５０μｇか又は５μｇのＧＣＲ−５８３５又はＧＣＲ−３６７７で筋内にて免疫化した。免疫化から１１日後に、ＣＤ８+細胞を脾細胞から単離し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いてエピトープ特異的ＣＴＬ応答を測定した。
【０４１０】
【図３１】ＰＶＰ処方された、裸の及びＣＴＧＣＲ−５８３５の比較を示す。ＨＬＡ−Ａ２.１／Ｋb遺伝子導入マウスを、１００μｇのＰＶＰ中で処方された、又は裸の又は心臓毒（ＣＴ）で前処理済み動物の体内で裸にされたＧＣＲ５８３５で一回免疫化した。In vivoでの１１日の後、脾細胞をin vitroで指示されたペプチドを用いて再度刺激した。６日後に、in situ ＥＬＩＳＡ検定においてペプチドに応答してＩＦＮ−γを測定した。データは、陽性培養についての分泌単位（ＳＵ）の幾何平均×１、標準偏差として提示されている。テストされた合計培養のうちの陽性培養の頻度が各々の棒の上に示されている。
【０４１１】
【図３２Ａ】ＧＣＲ−５８３５とリポペプチドワクチンの比較を示す。ＨＬＡ−Ａ２.１／Ｋb遺伝子導入マウスを心臓毒（ＣＴ）で前処理された動物中の１００μｇのＧＣＲ−５８３５か又は１００μｇのリポペプチドワクチンのいずれかで免疫化した。In vivoで１１日の後、ＣＤ８+脾細胞を単離し、ＩＦＮ−γをＥＬＩＳＰＯＴ検定において指示されたペプチドに応答して測定した（Ａ）。データは、平板固定された１０6個の脾細胞あたり平均斑点形成細胞（ＳＦＣ）として提示されている。代替的には、脾細胞を、指示されたペプチドでin vitroで再刺激した。６日後、in situ ＥＬＩＳＡ検定（Ｂ）においてペプチドに応答してＩＦＮ−γを測定した。テーマは、陽性培養についての分泌単位（ＳＵ）の幾何平均±標準偏差として提示されている。
【図３２Ｂ】図３２Ａの続き。
【０４１２】
【図３３Ａ】個々のマウスからの免疫原性データのまとめを示している。ＨＬＡ−Ａ２.１／Ｋb遺伝子導入マウスは、（Ａ）免疫化されていないか又は一回の免疫化において１００μｇのＰＶＰ処方されたＧＣＲ−５８３５で免疫化されているか、或いは（Ｂ）７日の間隔で２回免疫されているか、のいずれかであった。最終的免疫化から１１日後に、各マウスからの脾細胞を、指示されたペプチドのプールでin vitroで再刺激した。６日後、ＥＬＩＳＰＯＴ検定における個々のペプチドならびに全ペプチドプールに応答して、ＩＦＮ−γを測定した。データは、平板固定された１０6の脾細胞あたりの平均斑点形成細胞（ＳＦＣ）として提示されている。
【０４１３】
【図３３Ｂ】図３３Ａの続き。
【０４１４】
【図３４】ＨＢＶ ＡＯＳＩ６及びＨＢＶ ＡＯＳＩ６２構築体の概略図を示す。ＨＢＶ ＡＯＳＩｂ構築体が付加残基を全くもたないのに対してＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２構築体は、プロテアゾーム処理を増強するべく付加された（概略図の上に矢印で指示されている）付加的アミノ酸を有している。
【０４１５】
【図３５Ａ−１】プロテアゾーム阻害物質ＭＧ１３２の存在下又は不在下でのヒト６９３細胞の過渡的トランスフェクション後の結果を示している。プロテアゾーム阻害物質ＭＧ１３２は、トランスフェクションの２４時間後に５μＭで付加された。生きた細胞内の蛍光を、フローサイトメトリ及び蛍光顕微鏡によりプロテアゾーム阻害物質の添加から２４時間後に（相反する指摘のないかぎり）検出した。（Ａ）プラスミドＡＯＳ Ｉｂでのトランスフェクションを受けた細胞の経時変化についてのフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）結果。
【図３５Ａ−２】図３５Ａ−１の続き。
【図３５Ａ−３】図３５Ａ−２の続き。
【図３５Ａ−４】図３５Ａ−３の続き。
【図３５Ａ−５】図３５Ａ−４の続き。
【図３５Ａ−６】図３５Ａ−５の続き。
【図３５Ｂ−１】プラスミＨＢＶ  ＡＯＳ Ｉｂでのトランスフェクションを受けた細胞についての２４時間後のフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）結果。
【図３５Ｂ−２】図３５Ｂ−１の続き。
【図３５Ｃ−１】プラスミドＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２でのトランスフェクションを受けた細胞についての２４時間後のフローサイトメトリ（ＦＡＣＳ）結果。
【図３５Ｃ−２】図３５Ｃ−１の続き。
【図３５Ｄ】スペーサ核酸データは蛍光強度の比較としてグラフにより提示されている。
【図３５Ｅ】ＨＢＶ  ＨＴＬエピトープ蛍光強度の相対的増加は、上述の実験について、対照プラスミド、ＨＢＶ、ＡＯＳＩｂ及びＨＢＶ ＡＯＳＩｂ２の間で比較される。
【０４１６】
【図３６】プロテアゾーム阻害物質ラクタシスチン（２５μＭ）又はＭＧ１３２（５μＭ）の添加時点で検出可能なタンパク質の量を示している。トランスフェクションを受けた細胞から全細胞溶解物を調製し、ブロッティング膜に移した。融合パート＋タンパク質に対する抗体を用いてタンパク質を検出した。矢印は、全長融合タンパク質の予想サイズを表わしている。
【０４１７】
【図３７Ａ】免疫化から１１〜１４日後に得られた脾リンパ球を用いてＧＣＲ−３６９７で免疫化されたＨＬＡ 遺伝子導入マウスにおいて測定されたエピトープ特異的Ｔ細胞応答を示す。６〜９匹のＨＬＡ−遺伝子導入マウスのグループを前脛骨筋内で１００μｇのＤＮＡで左右対称に免疫化した。ＰＢＳ又はＰＶＰ処方のいずれかの中でＤＮＡを送達した。ＰＢＳ処方の場合、注入部位を心臓毒注入で前処置した。
【０４１８】
【図３７Ｂ】図３７Ａの続き。
【０４１９】
【図３８】エピトープ構築体無し（蛍光タンパク質のみ）、蛍光接合されたポリエピトープＨＢＶ  ＡＯＳＩｂ、又は蛍光接合されたポリエピトープＨＢＶ  ＡＯＳＩｂ２といった３つのプラスミドについてのＦＡＣＳ分析によって測定された蛍光強度の比較を示す。ヒト２９３細胞は、プラスミドでのトランスフェクションを受け、プロテアゾーム阻害物質ＭＧ１３２をトランスフェクションから２４時間後に５μＭで加えた。プロテアゾーム阻害物質の添加から２４時間後にＦＡＣＳにより、生きた細胞内の蛍光を検出した。
【０４２０】
【図３９】エピトープ構築体無し（蛍光タンパク質のみ）、蛍光接合されたポリエピトープＨＢＶ  ＡＯＳＩｂ又は蛍光接合されたポリエピトープＨＢＶ  ＡＯＳＩｂ２と共に培養された細胞についての蛍光顕微鏡画像を示している。ヒト２９３細胞をプラスミドでのトランスフェクションに付し、トランスフェクションから２４時間後にプロテアゾーム阻害物質ＭＧ１３２を５μＭで添加した。生きた細胞内の蛍光をプロテアゾーム阻害物質の添加から２４時間後に蛍光顕微鏡によって検出した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ｂ】
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2006501827.tif 000099
【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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2006501827.tif 000102
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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2006501827.tif 000111
【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５Ａ−１】
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【図３５Ａ−２】
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【図３５Ａ−３】
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【図３５Ａ−４】
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【図３５Ａ−５】
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【図３５Ａ−６】
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【図３５Ｂ−１】
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【図３５Ｂ−２】
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【図３５Ｃ−１】
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【図３５Ｃ−２】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
2006501827000001.app
【国際調査報告】
2006501827.tif 000137
2006501827.tif 000138