(57)【要約】【課題】本発明は、ヌクレオチドおよびセルのワクチン構成の新規な組み合わせに関し、また薬剤の組成およびその使用にも関し、癌、感染病、アレルギー、自己免疫疾患、血液疾患等の病気の予防及び／または治療に使用可能なものに関する。【解決手段】抗原分子をコード化するヌクレオチド配列、そして、樹状細胞が好ましいがこれに制限されない組換抗原提示細胞で構成されるワクチンを組成する。したがって、造血系のプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）APCは好ましくは混合する。そしてAPCは免疫を調整する分子を表すために変更される。本発明のワクチン構成を備えた免疫化は、本発明の目的において、本発明のワクチン構成を備えた免疫化は、ホスト免疫系を引き起こし、効率的な免疫に応答、生成し、何らかの存在する疾病あるいはその病気からホストを保護する。
2006523688.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原をコード化するヌクレオチド配列、及び
免疫反応調節分子の発現のために組換えられた抗原提示細胞
から構成されるヌクレオチド・ワクチン組成。
【請求項２】
抗原をコード化するヌクレオチド配列、及び
細胞生存調節分子の発現のために組換えられた抗原提示細胞
から構成されるヌクレオチド・ワクチン組成
【請求項３】
前記細胞生存調節分子がアポトーシス誘導分子である、請求項2に記載のワクチン組成。
【請求項４】
前記ワクチン組成が、前記ヌクレオチド配列及び前記組換抗原提示細胞の混合物として供給される、請求項1から3のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項５】
前記ワクチン組成が、前記ヌクレオチド配列及び前記組換抗原提示細胞の前培養混合物として供給される、請求項4に記載のワクチン組成。
【請求項６】
前記抗原提示細胞がプロフェッショナル抗原提示細胞である、請求項1から5に記載のワクチン組成。
【請求項７】
前記プロフェッショナル抗原提示細胞が樹状細胞ある、請求項に記載のワクチン組成。
【請求項８】
前記樹状細胞が有効な抗原処理及び抗原提示細胞である、請求項7に記載のワクチン組成。
【請求項９】
前記樹状細胞が形質細胞様樹状細胞である、請求項7または8に記載のワクチン組成。
【請求項１０】
前記抗原処理細胞が、マウス体内でCD8a、B220、CD11C及びB7分子を発現する樹状細胞のサブクラスのヒトにおける対応物である、請求項1から9のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項１１】
前記抗原提示細胞がトール様受容体9を発現する、請求項1から10のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項１２】
前記抗原提示細胞がP2X7を発現する、請求項1から11のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項１３】
前記抗原提示細胞がI型インターフェロンα及び／またはインターフェロンβ産出を誘導されることが可能な、請求項1から12のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞が、微生物と相互作用することにより、前記I型インターフェロンα及び／またはインターフェロンβを産出する、請求項13に記載のワクチン組成。
【請求項１５】
前記抗原提示細胞が、対象の体内で自然及び適応免疫反応間におけるリンカーとして機能する、請求項1から5のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項１６】
前記抗原提示細胞が、
樹状細胞
形質細胞様樹状細胞
インターフェロン産出細胞
天然型インターフェロン産出細胞、
単核白血球、
マクロファージ、
骨髄由来細胞、
幹細胞から分化した細胞、
Ｂ細胞、
T細胞、及び
肥満細胞
の少なくとも一つから選択される、請求項1から9のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項１７】
前記免疫反応調節分子が、前記抗原提示細胞に組換えられたヌクレオチド配列によってコード化され、前記遺伝子配列が
サイトカイン遺伝子、
インターロイキン遺伝子、
接着分子遺伝子、
インターフェロン遺伝子、ならびに
ケモカイン及びケモカイン受容体遺伝子
の少なくとも一つから選択される、請求項1に記載のワクチン組成。
【請求項１８】
前記免疫反応調節分子がCD40リガンド及びGM-CSFから選択される、請求項17に記載のワクチン組成。
【請求項１９】
前記細胞生存調節分子が、前記抗原提示細胞に組換えられたヌクレオチド配列にコード化され、前記遺伝子配列が
抗アポトーシス遺伝子、及び
アポトーシス誘導遺伝子 
の少なくとも一つから選択される、請求項2または3に記載のワクチン組成。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド配列が
ウイルスベクター、
非ウイルスベクター、
プラスミド、
微生物由来ベクター、
リポソーム、及び
小分子運搬体
の少なくとも一つから選択されたベクターに供給されている、請求項1から19のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項２１】
前記ベクターが免疫反応調整ヌクレオチド配列から成る、請求項20に記載のワクチン組成。
【請求項２２】
前記免疫反応調整ヌクレオチド配列が非メチル化シチジンリン酸塩グアノシン(CpG)配列である、請求項21に記載のワクチン組成。
【請求項２３】
前記抗原が、SEQ ID NO: 5のアミノ酸配列として定義されるe1a2融合ペプチドから成る、請求項1から22のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項２４】
前記抗原が、SEQ ID NO: 3のミニe1a2融合遺伝子のヌクレオチド配列から成る、請求項1から22のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項２５】
前記抗原が、SEQ ID NO:4のミニe1a2融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列から成る、請求項1から22のいずれかに記載のワクチン組成。
【請求項２６】
抗原をコード化するヌクレオチド配列を供給するステップ、
免疫反応調節分子の発現のために組換えられた抗原提示細胞を供給するステップ、ならびに
前記抗原をコード化するヌクレオチド配列及び前記組換抗原提示細胞を混合するステップ
を有する、ヌクレオチド及び細胞ワクチン組成の産出方法。
【請求項２７】
請求項26に記載の方法であって、更に、互いの結合を強化するために前記ヌクレオチド配列を前記抗原提示細胞と培養するステップを有する方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド配列供給ステップが、
MHC結合抗原タンパクまたはペプチドを供給するステップ、
前記抗原タンパクまたは前記抗原ペプチドをコード化する前記ヌクレオチド配列を前記ベクターにクローンするステップ、及び
増殖システムにて前記ベクターを増殖するステップ
を有する、請求項26または27に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原提示細胞供給ステップが、
対象から抗原提示細胞を隔離するステップ、
前記免疫反応調節分子を発現するために抗原提示細胞を組換えるステップ
を有する、請求項26から28のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記隔離ステップが、トール様受容体9を発現し、またインターフェロンα及び／またはインターフェロンβを産出する能力を持つ樹状細胞のサブクラスを隔離するステップを有する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記樹状細胞のサブクラスが対象の自然及び獲得免疫反応において重要な役割を担う、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記樹状細胞のサブクラスが形質細胞様樹状細胞である、請求項30または31に記載の方法。
【請求項３３】
薬物として使用する、請求項1または2に記載のワクチン組成。
【請求項３４】
感染病の治療または予防用の薬物製造における、請求項1または2に記載のワクチン組成使用であって、前記ヌクレオチド配列が前記感染病に関与する感染因子に関係する抗原をコード化するワクチン組成使用。
【請求項３５】
癌の治療または予防用の薬物製造における、請求項1または2に記載のワクチン組成使用であって、前記ヌクレオチド配列が癌で発現する腫瘍関連抗原をコード化するワクチン組成使用。
【請求項３６】
対象に請求項1または2に記載のワクチン組成を投与するステップを有する、免疫反応産出方法。
【請求項３７】
対象に請求項1または2に記載のワクチン組成を投与するステップを有する、前記対象の疾患の治療または予防方法であって、前記抗原は前記疾患に関与する因子に関係する方法。
【請求項３８】
前記抗原提示細胞が、前記対象の免疫反応の細胞に少なくとも前記抗原の断片を提示するために適合される、請求項36または37に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が哺乳類対象である、請求項36から38のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳類対象がヒト対象である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患が
感染病、
癌、
白血病、
リンパ腫、
自己免疫疾患／障害、
炎症、
血液疾患、
アレルギー
遺伝病、
移植を要する疾患、及び
糖尿病
の少なくとも一つから選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項４２】
抗原をコード化するヌクレオチド配列、及び
免疫反応調節分子の発現のために組換えられた抗原提示細胞
から成るキット。
【請求項４３】
前記ヌクレオチド配列及び前記組換抗原提示細胞が混合物として供給される、請求項42に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にワクチン組成を言及し、特にヌクレオチド配列及び遺伝子組換抗原提示細胞を含むワクチン組成及びその使用を言及する。
【背景技術】
【０００２】
DNAあるいはRNA配列などのヌクレオチド配列を使用するワクチン接種の取り組みは、過去10年の間で発展してきた。DNAワクチンは構築しやすく、生産するには安定していて費用効率が高い。DNAワクチンは有意なベクター特異的免疫反応を発生させる事なく反復投与することが可能である。裸のプラスミドDNAがマウスの皮膚に投与されると、DNAは周辺の細胞によって取り込まれる。これらの非リンパ系組織はプラスミドにコードされたタンパク質を発現し、そして抗原ペプチドは主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）クラスIまたはII分子と関連してＴ細胞に提示される（Annu. Rev. Immunel. 2000, 18: 927）。動物モデルにおいてDNA免疫法は様々な伝染性病原体及び悪性腫瘍に対して研究されている。（Annu. Rev. Immunol.
1997, 15: 617-648）。DNAワクチンは自己免疫疾患を抑制し、アレルギー反応を阻止することが認められている（Nat. Med. 1996-2:899-905, Nat. Med.
1996, 2: 540-544）。近年のDNAワクチンの研究はマラリア感染及びヒトにおけるHIVペプチドに対する細胞性免疫反応の発生を証明した（Science 1998, 282: 476-480, Lancet 1998, 351: 1320-1325）。
【０００３】
一般的に、プラスミドDNAベクターは２つの主要な構成単位、（１）アジュバントを運ぶプラスミドのバックボーン及び（２）総合してタンパク質合成に導くプロモーター遺伝子、抗原ヌクレオチド配列、ポリアデニル化付加配列から成る転写の構成単位を有する。
今日に存在しているDNAワクチンに対する大きな問題は、DNAワクチンが期待するほど効果がないことである。進行中の臨床前研究及び臨床試験の不本意な結果によりDNAワクチンの使用に対する重大な疑問が生じてしまった。したがって、ワクチン効果の改善はDNAワクチンの開発において重大な目標となった。
【０００４】
樹状細胞（DC）は造血系のプロフェッショナル抗原提示細胞（APC）である。すべてのDCは共通抗原（Ag）処理及びＴ細胞の活性機に関連する特性を共有するが、DCは多くの機能を持つ多系統の細胞型を代表する。
【０００５】
腫瘍は、癌免疫療法の診療に対して潜在的標的を与えるＴ細胞によって確認できる多くのタンパク抗原を発現する。樹状細胞（DC）の抗原をＴ細胞に提示する能力は他に類を見ない。この特性は治療用癌ワクチンの開発に使用されている。非ホジキンリンパ腫及びメラノーマに対するDCワクチンの臨床試験において、抗腫瘍免疫反応の誘発及び腫瘍の退縮が認められた（Annu. Rev. Med. 1999, 50: 507-529）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新種ワクチン組成を提供することが本発明の総体的な目的である。
ワクチン構成を作出する方法を提供することが本発明の目的である。
薬学的組成を提供することが本発明の他の目的である。
抗原分子をコード化するヌクレオチド配列、そして、樹状細胞が好ましいがこれに制限されない組換抗原提示細胞で構成されるワクチンを組成することが本発明のさらなる目的である。
癌、感染病、アルツハイマー病、アレルギー、自己免疫疾患、血液疾患の予防あるいは治療に使用可能なワクチンを組成することが本発明の特別な目的である。
樹状細胞のサブタイプ、すなわち免疫調節分子を発現するために遺伝子組換えが行われている形質細胞様樹状細胞（pDC）／インターフェロン産出細胞（IPC）から成るワクチンを組成することが本発明のもう一つの具体的な目的である。
これら及びその他の目的は添付の特許請求の範囲に定義されているとおり、本発明によって達成された。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
つまり、本発明は、ヌクレオチド配列及び遺伝子組換え抗原提示細胞（APC）の望ましくは前培養した混合物として供給された抗原分子及び遺伝子組換えAPCをコード化するヌクレオチド配列から成る新種ワクチンを提供するものである。
【０００８】
抗原をコード化するヌクレオチド配列は裸のDNAあるいはRNA配列である場合がある。さらに、抗原をコード化するヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列がプロモーター遺伝子、エンハンサー、またはその他の調節塩基配列の転写調節下で提供されるベクターに挿入され含まれることが好ましい。本発明のベクターは抗原をコード化する遺伝子を含むプラスミドDNAベクターであることが好ましい。また、好ましくは、ベクターはワクチン組成を受ける対象（好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトの対象）の宿主免疫反応の調節、規制が可能な他のヌクレオチド配列も含んでもよい。このような配列を調節する免疫反応は、非メチル化シチジンリン酸塩グアノシン（CpG）モチーフ、あるいは対象の免疫反応の調節に関与する異種分子（タンパク質／ペプチド）に対してコード化する遺伝子配列である場合がある。
【０００９】
本ワクチン組成に使用されたAPCは抗原を処理し、他の細胞、特に免疫システムのCD４+及びCD８+Ｔ細胞へ提示するよう適応された細胞型である。好ましいAPCの例としてDC、IPC、マクロファージ、単核白血球、Ｂ細胞などのプロフェッショナルAPCがある。特に好ましいAPCの細胞型は、特にトール様受容体９（TLR９）及びP2X7受容体の発現、サイトカインの分泌、細菌の刺激による大量のI型IFN-α及びIFN-βの産出、免疫システムにおける効果細胞の刺激というpDC／IPCの特性及び機能を有する細胞である。
【００１０】
さらに、APCは分子を調節する免疫反応を発現するために遺伝子組換え、あるいは操作されている。かかる分子は、抗原提示の増加、Th１あるいはTh２サイトカイン分泌の刺激、APC、ランゲルハンス細胞、効果細胞の活性化、または、免疫反応の強化によって対象の免疫システムを強化することができる場合がある。また、特に自己免疫疾患及びアレルギーに関しては、分子を調節する免疫反応は免疫反応の抑制または対象の免疫寛容もしくはアネルギー誘発に一役を担う場合がある。APCの組換えの使用に適した遺伝子には、例として、サイトカイン遺伝子、インターロイキン、接着分子、インターフェロン遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、熱ショックタンパク質に対してコード化する遺伝子、腫瘍壊死因子（TNF）、抗アポトーシス剤、アポトーシス誘導分子、増殖因子、薬学的に認められた運搬体がある。
【００１１】
本発明のワクチン接種構成は、ヌクレオチド配列及びAPCだけではなく追加分子を含んでもよい。このような追加分子は対象の免疫反応を強化あるいは抑制し、Th１またはTh２サイトカイン分泌の刺激、APC、ランゲルハンス細胞、効果細胞の活性化、または、APCの免疫機能を規制してAPCの抗原提示を増加する場合がある。
【００１２】
現在、本発明の最も好ましいワクチン組成は遺伝子組換pDCあるいはI型インターフェロン産出細胞（IPC）及びＭＨＣ結合抗原をコード化しCpGモチーフを有するプラスミドDNAを含む。
【００１３】
本発明は、また、必要としている対象（好ましくは哺乳類、さらに好ましくはヒトの対象）に本発明のワクチン組成を投与することによって障害もしくは疾患を治療、または、予防する方法を言及する。本発明は、好ましくは病原性抗原分子をコード化するヌクレオチド配列を含む。例として、感染病において、ヌクレオチド配列は、ウイルス性、細菌性、菌類性原虫あるいは寄生性ペプチドまたはタンパク質などの疾患に関与する感染性細菌に由来するタンパク質またはペプチドをコードすることが好ましい。対象（好ましくはヒトの対象及び動物の対象）へ組換APCとともに感染性細菌のタンパク質／ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を投与することは、コード化している抗原タンパク質／ペプチドに対して特定の免疫反応を引き起こす。
【００１４】
癌は、変化した、あるいは異常細胞の発現をともなう疾患である。異常なレベルで発現した癌細胞中のタンパク質は、Ｔ細胞認識の標的として使用することが可能である。腫瘍関連の抗原をコード化するヌクレオチド配列を、本発明のワクチン組成に含むことが好ましい。
【００１５】
本発明はまた、本発明のワクチン組成を作出する方法も言及する。この方法は、ワクチン組成によって治療あるいは予防される疾患や障害に関係するＭＨＣ結合抗原分子の識別によって構成される。好ましい実施例において、この識別された抗原分子をコード化するヌクレオチド配列はプラスミドDNAベクター、好ましくは非メチル化CpGモチーフをともなうプラスミドベクターに挿入される。APCは、望ましくは対象（または受容者）からの自己APCから隔離される。APCは望ましくはpDC型及び（天然型）インターフェロン産出細胞型（NIPC）のような樹状細胞の独特な型で、プラスミドDNAなどに刺激されるとI型インターフェロンを産出する能力がある。APCは次に、規制APCが機能し、免疫効果細胞を刺激する免疫共刺激分子をコード化する、1つまたは複数の遺伝子によって遺伝子組換えが行われる。最後に、抗原をコード化するヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCは混合、培養されて方法が完了し、本発明のワクチン組成の好ましい実施例に終結する。
【００１６】
したがって、肯定的な結果を得るための本発明による主要な特性は、抗原をコード化するヌクレオチド配列と遺伝子組換APCを共に使用することにある。本発明のさらなる好ましい特性は、投与に先立つ、本ワクチン組成の二つの主要構成要素を前培養することである。
【００１７】
この前培養によりAPCはヌクレオチド配列を取り込むことが可能となり、APC中に内在化した後、CpGモチーフがTLR９などの異なる受容体と結合する一方、抗原配列はAPCによって処理及び提示され、結果、APCが活性化され、I型IFN及びサイトカインなどの免疫調節分子が産出される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は以下の利点を提供する。
‐  担癌マウスにおける、従来技術のDNAワクチン組成よりも優れた抗腫瘍効果
‐  本発明のワクチン組成を使用する癌治療は、ヌクレオチド配列あるいは抗原をコード化するプラスミドベクター単体から成るワクチン組成を使用するより5倍の効果がある。
‐  生体内で腫瘍特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）をプライミングすることは、抗原をコード化するヌクレオチド配列を有するプラスミドDNA、あるいは腫瘍ペプチドまたは空のプラスミドベクターのどちらかをそれぞれワクチンとして使用するより、本発明のワクチン組成に対して8倍の効果がある。
‐  生体内で腫瘍特異的CTLをプライミングすることは、ＭＨＣクラスのI結合抗原ペプチドを有する遺伝子組換えAPCのみをもつワクチンを使用する場合より、本発明のワクチン組成に対して２倍の効果がある。
‐  本発明のワクチン組成を使用する免疫法は、ワクチン組成に存在する腫瘍ペプチドを認識する腫瘍特異的CTLをプライミングし、誘発する。
‐  腫瘍ペプチド特異的CTLは、腫瘍ペプチドをコード化するプラスミドDNAで処理されたマウスを比較して、本発明のワクチンで処理された担癌マウスにおいて8倍頻繁に誘発される。
‐  弱力化あるいは不活化した病原体に基づくワクチン組成と比較すると、完全に不活化していない病原体を取り組む危険性を排除する。
‐  ワクチンは、自己抗原の寛容を破壊するための異種のヌクレオチド配列を構成し、対象の自己抗原に対して免疫反応を誘発する可能性がある。
‐  単に抗原をコード化するヌクレオチド配列を交換することによって広範囲の疾患や障害を治療または、もしくは予防するために有効である。
‐  ワクチン組成の抗原提示細胞を遺伝子組換えすることによって、免疫調節分子の取り込みを可能にする。
【００１９】
本発明によって提供されるその他の利点は、本発明の実施例に関する下記の説明を読めば高く評価されることになる。更なる目的を伴う本発明及びその利点は、添付の図面に加え以下の説明を言及することによって最も理解されかも知れない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
別段の記載がない限り、本文で使用されているすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する分野に精通する人物によって共通して理解される意味を持つ。以下の参考文献は本発明で使用される多くの用語の一般定義を記載している。Singleton P及びSainsbury D、Dictionary of microbiology and molecular
biology、第3版、2002年；Walker、Cambridge
dictionary of science and technology、1988年発行；Rieger Rら編集、Glossary of genetics、第5版、1991年；Hale WG及びMarham JP、Harper Colloins dictionary of biology、1991年；Abbas Aら、Cellular and Molecular Immunology、2003年；Blood：1：587-600、2001年。本発明を明確にするため、本文には以下の定義が使用されている。
【００２１】
「ヌクレオチド配列」という用語は、別段に特定されていない限り、２本鎖及び１本鎖DNA、オリゴヌクレオチド、DNA及びRNAを含む。また、DNA-RNA、DNA-DNAなどの交配種もこの用語に含まれる。ヌクレオチド配列あるいは核酸配列も、当技術分野に精通する人物に知られている自然発生的な構造変異種及び自然発生的ではない人工の相似器官に関連性のある修飾塩基を含む。
【００２２】
「免疫反応」は免疫システムの細胞及び分子が介在する個人にある異物の取り込みに対する結合した、及び組織的反応を言う。
【００２３】
「免疫システム」は異物に対する免疫あるいは防御を与えるために集合的に機能する分子、細胞、組織及び器官を言う。
【００２４】
「CpGモチーフ」は細菌性、イースト、昆虫または、もしくはneomatode DNAなどにある非メチル化「CpGジヌクレオチド」あるいは「CpGモチーフ」を言及する。CpGモチーフは多くの細菌性プラスミドで認められており、DNAワクチン接種において潜在的アジュバントとしての役割を果たす（Immunol.
Today 1998, 19: 89-97）。CpG-DNAはペプチドあるいはタンパク質に対するMHCクラス１に制限されたCTL反応の「クロスプライミング」を刺激するだけではなく、Th-1介在抗体反応を引き起こす強力なTh-1のようなアジュバントであることが現在知られている（Immunity. 2001 04: 499-502）。一方、CpGジヌクレオチドがないDNA配列には免疫システム上で抑制効果がある（Arthritis and rheumatism. 2003, 48:
1701-1707）。
【００２５】
「P2受容体」は細胞外ヌクレオチドに対する受容体を言及する。P2受容体は２種のサブファミリー、Gタンパク質共役型（P2Y）及びリガンド依存性イオンチャンネル（P2X）に分けられる（Curr
Opin Cell Biol. 1996, 8: 474-483）。
【００２６】
「抗原提示細胞（APC）」は抗原処理及び抗原提示能力を持つ細胞を言う。これらのAPCはMHC分子に関連して蛋白抗原のペプチド断片を表面に示し、抗原特異性Ｔ細胞を始動させる。ペプチドMHC複合の表示に加え、APCはT細胞の最善の活性化に対する共刺激分子も発現する。特に、APCはプロフェッショナルAPCを言い、DC、IPC、NIPS、単核白血球、マクロファージ、Ｔ細胞、B細胞、さらに好ましくはpDC、IPC、NIPC、及びpDC/IPC/NIPCの特性及び機能、例えば、TLR9の発現、I型インターフェロンの産出あるいは分泌、好ましくは微生物による刺激を受けたあとのTNF-αの分泌として定義されるような特性及び機能を持つプロフェッショナルAPCを含む。
【００２７】
「組換えAPC」はウイルスベクターまたは非ウイルスベクター操作のどちらかによる設計あるいは操作によって受ける遺伝に関する情報あるいはプロテオオーム情報を必要とする抗原提示細胞を言う。（遺伝的）組換えの結果、遺伝的あるいはプロテオオームの物質は抗原提示細胞に取り込まれる、あるいは組み込まれ、そこで発現する。
【００２８】
本発明の１つの側面により、抗原分子及び遺伝子組換え抗原提示細胞（APC）に対してコード化する孤立した、あるいは実質的に精製した異種ヌクレオチド配列あるいは核酸配列を構成するワクチンが組成された。
【００２９】
ワクチン組成は好ましくはヌクレオチド配列及びAPCの混合物として供給される。すなわち、ヌクレオチド配列及びAPCは対象へ投与に先立ち、事前混合、及び前培養される。この新種のワクチン組成は従来技術のDNAワクチンと比較して、特に既存の癌細胞の排除及び腫瘍細胞の再発から宿主防衛することにおいて、直ちに強い免疫反応、優れた治療及び防御効果を得る。
【００３０】
本発明によるヌクレオチド配列は、抗原性分子、RNA、あるいは好ましくは対象に取り込まれた際抗原に対して免疫反応を発現させるMHC結合抗原ペプチド／タンパク質をコード化する。抗原は、好ましくは、免疫原性タンパク質、ペプチドあるいはRNA分子またはその断片などの分子の免疫原性断片である免疫原性分子である。
【００３１】
本発明のヌクレオチドベースワクチンは一価または多価のワクチンであってよい。一価ワクチン形成物では、ヌクレオチド配列は１つの抗原をコード化するが、多価ワクチン組成形成物では、ヌクレオチド配列には少なくとも１つの多重抗原（異種抗原と同属抗原のどちらか）をコード化する異種遺伝子が含まれる。したがって、多価ワクチンでは、対象に投与するといくつかの抗原が取り込まれ提示され、異なる抗原を確認する抗原特異性Ｔ細胞の活性化を引き起こす。それはまた、１つの抗原配列をいくつも複製（例として２重にも、３重にも）することが可能である。
【００３２】
ワクチン組成のヌクレオチド配列には、免疫反応調節作用をもつ（タンパク質あるいはペプチド）分子に対してコード化する遺伝子配列などのその他の免疫相互刺激あるいは調節配列もある。また、非メチル化CpGモチーフなどの相互刺激DNA配列も、ヌクレオチド配列に含まれることがある。
【００３３】
本発明のヌクレオチド配列は、好ましくは混合物として、遺伝子組換APCとともに投与される裸のDNAあるいはRNAを含むことが望ましいが、これらに限定されない。RNA配列としては、ヌクレオチド配列は対象（受容者）の細胞内でヌクレオチド配列の翻訳を可能にするモチーフを含む。同様に、DNAとしては、ヌクレオチド配列はプロモーター、可能な限りエンハンサーまたは、もしくはヌクレオチド配列の転写及び翻訳を規制するその他の成分などのモチーフを含む。
【００３４】
しかしながら、抗原に対してコード化するヌクレオチド配列は、好ましくは、プロモーターの転写コントロール下のベクター、例えば、発現コントロール配列を有するベクターの発現カセットに含まれる。さらに、ベクターあるいはベクターの発現コントロール配列はポリアデニル化配列、転写配列及びエンハンサーなどを含むがこれらに限定されないヌクレオチド配列の効果的転写／翻訳に必要不可欠なその他の調節塩基配列を構成することが好ましい。ベクターに含まれるプロモーターまたはエンハンサーは細胞型特異性あるいは組織特異性を有する場合がある。プロモーターは実験計画法あるいはワクチン構築によって、誘導可能であるか、選択的に活性化されるものであってよい。ヒトの対象のワクチン接種に適するプロモーターの例には、ウイルスプロモーター、例えば、サイトロメガウイルス（CMV）プロモーターがある。本発明に含まれるベクターは微生物由来のベクターあるいは非微生物由来のべクターであってよい。
【００３５】
本発明に従って使用可能なベクターの例として、リポソームがある。様々な陽イオン性脂質設計は細胞へのDNA運搬に使用されている。脂質膜あるいはリポソームへのポリエチレングリコール誘導は静脈投与の後、リポソームの循環半減期を増加することが可能である。
【００３６】
活発に研究されている人工ベクターのもう１つのクラスは、カチオン性ポリマーである。一般原則は正荷電ポリマーと負荷電DNA分子との間の複合体形成に基づく。陽イオン性脂質と比較して、カチオン性ポリマーはDNA濃縮においてより効果的である。遺伝子運搬において評価されたポリマーの例として、ポリ-D-リシン、ポリエチレンイミン（PEI）、ポリグルコサミン及びポリ脂質がある。
【００３７】
また、ナノ粒子などの小粒子は本発明によってベクターとして使用されることが可能である。
【００３８】
本発明の現在の好ましいベクターは、MHC結合抗原をコード化するDNAプラスミドベクターである。プラスミドのバックボーンは、免疫調節配列あるいはマイトジェン活性を有するアジュバントを含むことが好ましい。注目すべきは、裸のDNA、あるいはリポソーム、カチオン性ポリマーもしくは小粒子に組み込まれた形のいずれかとして、本発明による細菌性DNAプラスミドベクターを使用することによって、さらなる利点が生じることである。これらのプラスミドDNAベクターは免疫活性化CpGヌクレオチド配列を含んでもよい。したがって、対象体内で本発明の抗原運搬あるいは発現を可能にすることに加え、プラスミドベクターは対象の免疫反応を刺激することもある。
【００３９】
あるいは、ウイルスシステムは本発明の抗原性あるいは免疫調節分子の運搬及びそれに続く産出に使用されることも可能である。ウイルスは、ホスト細胞に侵入し遺伝子を発現する特異的で効果的な手段を進化させているので、ヌクレオチド配列の運搬には魅惑的な媒体である。ウイルスベクターの開発における主な挑戦は安全の問題である。複製欠損ウイルスベクターあるいは複製ウイルスベクターは、双方とも今日の遺伝子治療で使用される。ウイルスベクターを使用する遺伝子運搬は形質導入と称される。今日まで、臨床試験において少なくとも４種類のウイルスベクター、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノ関連性ウイルスが存在する。調査中のその他のウイルスとして、ポックスウイルス、レオウイルス、レンチブウイルス、ニューカッスル病ウイルス、アルファウイルス、口内炎ウイルスがあり、これらもまた本発明におけるベクターとして使用されてよい。
【００４０】
本発明のAPCは抗原を免疫システムへと処理し提示することに特化した細胞型である。本発明のAPCはDC、IPC、NIPC、マクロファージ、単核白血球、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、肥満細胞、Ｔ細胞、骨髄由来細胞、幹細胞から分化した細胞、血管内皮細胞または上皮及び間葉細胞等を含むがこれに限定されないプロフェッショナルAPCであることが好ましい。また、少なくとも２種類のAPCの混合物は、本発明において使用可能である。現在最も好ましいAPC型はpDC、IPC、NIPS、またはpDC/IPC/NIPCの特性、好ましくはTRL9の発現及びI型IFNの誘導産出によって定義される特性を有する細胞である。これらの細胞は微生物に対する防御において重要な役割を担い、また対象のＴ細胞をクロスプライムし、自然及び適応免疫反応間のつなぎのような働きをする。
【００４１】
本発明による樹状細胞の好ましいサブタイプであるpDC/IPCは、MHC結合抗原を処理及び提示する能力が高く、ウイルスDNAもしくは細菌性DNAをロードした場合、高レベルのI型IFNを産出し、P2X7受容体及び、例えばTLR9などのトール様受容体を発現する。
【００４２】
TLRは感染に対する宿主防衛における重要な役割を果たす。TLRは病原体関連分子及び宿主防衛システムの活性化に関与するシグナルを認識し、特に炎症性サイトカインを認識する。CpG-DNAへの細胞応答がTLR9を介するので、TLR9は本発明にとって特別重要である。TLR9は樹状細胞（DC）及びマクロファージの小胞体（ER）に限局される。TLR9はCpG-DNAのエンドサイトーシスを引き起こすことはないが、エンドサイトーシスのDC下流を活性化する。
【００４３】
したがって、本発明のAPCは、かかるpDCあるいは上記の特性や機能性を有するAPCから選択されることが好ましい。
【００４４】
本発明におけるクチン組成のAPCは（遺伝子）組換えAPCである。したがって、APCは調節する、すなわち、設計法やワクチン接種法により、免疫反応の寛容あるいはアレルギーを強化、抑制または誘導し、アポトーシス及び／またはその他の細胞生存調節反応を誘導する分子を発現するように組換えられている。APCは抗原処理及び提示を増加、APCの活性化及び／または効果細胞の免疫機能を強化するために組換えられても良い。したがって、遺伝物質は、APCの宿主ゲノムと統合する場合や安定した染色体外成分として提供される場合、エピソーム部位からの一時的発現あるいは安定発現のどちらかに対してAPCに取り込まれ、あるいは導入されている。APC組換えのための使用に適した遺伝子には、薬学的に認められた運搬体の他にも、サイトカイン遺伝子、インターロイキン遺伝子、接着分子、インターフェロン遺伝子（例としてI型IFN-α及びIFN-β）、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、異なる免疫共刺激分子をコード化する遺伝子、免疫調整分子、リガンド（例としてCD40L）及び受容体がある。
【００４５】
例えば、CD40リガンドは適応免疫反応に関与する重要な役割を果たす。CD40はＢ細胞、単核白血球及びDCの機能に対する主要シグナルであることが明らかとなっている。CD40L（CD154）は、抗原性刺激及びDCとの相互刺激後に活性化したＴ細胞を発現する。CD40-CD40Lの相互作用はDCの活性化及び分化を誘導する。CD40-CD40Lの活性化により、CD4+Ｔ細胞をTh1タイプに偏向させ、CD8+の増殖を強化し、NK細胞を活性化する高レベルのサイトカインIL-12産出を誘導する能力をDCは得た。したがって、CD40-CD40Lの相互作用は適応免疫反応において共刺激分子の発現及び効果的なＴ細胞の活性化の誘因として機能する。したがって、CD40及び／またはCD40Lを効果的に発現させるため、本発明のAPCを遺伝子的に組換えることが可能である。
【００４６】
APCを組換えるために適した遺伝子運搬プロトコルは、ウイルス及び非ウイルス法などを含むがこれらに限定されるわけではない。有効なウイルスベクターの例はレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、ワクチンウイルス、単純ヘルペスウイルス、lentウイルスを含むがこれらに限定されない。遺伝子のAPCへの非ウイルス運搬は、プラスミドDNAトランスフェクション、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微生物由来ベクター及び微生物からの毒素由来ベクターを含むがこれらに限定されるわけではない。
【００４７】
さらに、APCはそれにはＴ細胞及び他種の免疫細胞の効果的な活性化に必要な接着分子及び刺激分子を含むがこれらに限定されないその他の細胞表面分子も発現することが好ましい。また、本発明のAPCはケモカイン、ケモカイン受容体及びFLIt3リガンドを発現することが好ましい。
【００４８】
1つの実施例では、本発明のAPCはある対象（好ましくはワクチン組成が投与される、同対象であるが、これに限定されない）から取得することが出来る、すなわち自系APCが使用される。P17, 25あるいは、同種異系APCまたは同種同系APC（対象の一卵性双生児から）が誘導されてもよい。
【００４９】
もう1つの実施例では、APCは当技術分野で周知の方法によって、随意的に濃縮あるいは精製され、または、もしくは体外は体内へ拡大することがある。例として、サイトカインが存在する場合では、APCは末梢血、臍帯血、骨髄由来の幹細胞及び前駆細胞の活性化及び分化によって得ることが可能である。
【００５０】
さらなる実施例では、ワクチン組成は外来抗原をコード化するヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCを構成する前処理した混合物として投与される。
【００５１】
APCがヌクレオチド配列を吸収または取り込んだ後で、ヌクレオチド配列が処理される。ヌクレオチド配列に含まれることが好ましいCpGモチーフはAPC内でトール様受容体の経路を活性化し、I型IFN-α及びIFN-βの産出を刺激し、コード化された抗原を提示する。この事象はワクチン組成の投与前に行うヌクレオチド配列及び組換えAPCの培養時に生じてもよい。したがって、前培養の後、MHC結合抗原を提示し、免疫共刺激分子を発現、分泌する組換えAPCはワクチン投与した対象のナイーブAPCを直接的あるいは間接的に活性化することができる。本発明で使用される組換えAPCはその後リンパ器官へ転移する場合があり、ナイーブＴ細胞、Ｂ細胞及びDCを直接的あるいは間接的に先導することがあり、その結果、外来抗原に対するより速い、増強された、より効果的な治療的及び保護的な免疫反応を得ることとなる。
【００５２】
したがって、本発明のヌクレオチド配列及び組換えAPCの混合は、ワクチン組成の高い効果を得ることにおいて、好ましく、また新しいステップなのである。
【００５３】
さらに、一度対象に投与すると、ヌクレオチド配列あるいはヌクレオチド配列構成のベクターは対象の細胞に吸収され、そこで発現する。その後、人工抗原分子はサイトゾル中でプロテアソームによって処理され、ペプチドとなる。
【００５４】
さらに、ワクチン投与後、プロフェッショナルAPCは直接抗原を得るか、あるいはその他のトランスフェクト細胞から放出された抗原を吸収する。ベクターでトランスフェクトされた細胞のリーシスあるいは本発明のヌクレオチド配列は、APCによって吸収されたコード化した抗原の放出を誘導する。
【００５５】
抗原分子をコード化するヌクレオチド配列及びワクチン組成の（遺伝的）組換えAPCは等張液（好ましくは緩衝液）あるいは対象（好ましくはヒトの対象）への投与で使用に適した薬学的に許容された液体、ゲルで投与される。このような液の例として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）がある。
【００５６】
本発明のワクチン液はヌクレオチド配列及びAPC以外の、追加分子から構成されてもよい。このような追加分子に含まれる分子は対象の免疫反応を調節（強化あるいは抑制）し、APCの抗原提示を増加させ、Th1またはTh2サイトカインの分泌を刺激し、APC、ランゲルハンス細胞、効果細胞を活性化し、及び／またはAPCの免疫機能を強化する。含まれるのは、インターロイキン-1（IL-1）、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TNFα、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、IFN-γ、I型IFN-α、I型IFN-β、熱ショックタンパク質（hsp）70、hsp90、gp96、gp95、CD40L、B7、運搬体及びアジュバントなどのサイトカイン、接着分子、熱ショックタンパク質及びケモカインである。
【００５７】
溶液はまた、免疫反応を調節、抗原提示を増加、免疫システムへワクチンを再誘導及び／または細胞へのDNA侵入を促すアジュバントあるいは運搬体から構成されてよい。アジュバントは、ミネラルソルトアジュバントあるいはミネラルソルトゲルアジュバント、粒子アジュバント、毒素、微粒子アジュバント、粘膜アジュバント及び免疫刺激アジュバントを含むがこれらに限定されるわけではない。アジュバントの例として、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバント、細菌性超抗原、スクアレンあるいはスクアレン水中油型アジュバンド形成、生分解性及び生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイド配糖体あるいはサポニン、N-アセチル-L-トレオニル-D-イソグルタミン、LPS、モノホスホリル脂質Ａ及び不活性微生物がある。
【００５８】
本発明のもう1つの目的は、対象で免疫反応を産出するためのワクチン組成の使用である。このような場合、免疫反応の誘導が望まれている抗原分子をコード化するヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCから構成されるワクチン組成が対象に投与される（好ましくは哺乳類の対象、さらに好ましくはヒトの対象）。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、投与が必要である対象（好ましくは哺乳類の対象。さらに好ましくはヒトの対象）へ本発明によるワクチン組成の効果的用量を投与し、対象が有する疾患を治療または、もしくは予防する方法である。
【００６０】
本発明はまた、薬物として使用するための、抗原をコード化するヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCから構成されるワクチン組成を言及している。もう1つの実施例では、本発明は、感染疾患の治療または予防用の薬物製造におけるワクチン組成の使用であって、ヌクレオチド配列が疾患に関与する感染因子に関係する抗原をコード化するワクチン組成の使用を教示する。さらに、もう1つの実施例は、癌の治療または予防用の薬物製造におけるワクチン組成使用であって、ヌクレオチド配列が癌で発現する腫瘍関連抗原をコード化するワクチン組成使用に関連する。
【００６１】
本発明のワクチン組成の使用によって治療や予防される感染病は、ウイルス、細菌、菌類、原虫、寄生虫などの病原菌によって引き起こされるがこれらに限定されるわけではない。どちらにしても、ワクチン組成のヌクレオチド配列は、疾患を引き起こす、あるいは関与する病原性微生物と関係のある抗原分子コードしている。さらに、この抗原性分子はワクチン接種される対象の免疫システムによって異物と認識されることが好ましい。
【００６２】
本発明のワクチンによって治療あるいは予防できる可能性があるウイルス疾患には、アデノウイルス、アルボウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、ハンタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスIウイルス、単純ヘルペスIIウイルス、オーエスキー病ウイルス（ADV）、ヒト免疫不全ウイルスタイプI及びII（HIV envタンパク質は抗原分子として使用されることがある）、インフルエンザ（NP抗原は抗原分子として使用されることがある）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、牛疫、ロタウイルス、風疹ウイルス、水疱瘡によって引き起こされる疾患がある。
【００６３】
レジオネラ菌、ミコバクテリア（hsp65の抗原はヒト結核菌の抗原分子として使用されることがある）、マイコプラズマ、ナイセリア、リケッチア細菌によって引き起こされる感染病の例は、本発明のワクチン組成によって予防または、もしくは治療できる可能性がある。
【００６４】
本発明のワクチン組成によって治療できる可能性がある原虫によって引き起こされる疾患は、kokzidioa、リーシュマニア、トリパノソーマによって引き起こされる疾患である。一方、類似の寄生虫症は、クラミジア、マラリア原虫、リケッチア及びリーシュマニアの主要なマウス感染（抗原分子はLACK抗原であることがある）によって引き起こされることがある。
【００６５】
本発明のワクチン組成はまた、癌の予防及び／または治療においての使用によく適応する。ワクチン組成のヌクレオチド配列は、特定の癌の種類において腫瘍関連の抗原分子をコード化する。
【００６６】
いくつかの癌は癌細胞内の遺伝子あるいは染色体の転位によって特徴付けられる。このような転位により、２つあるいはそれ以上のコード配列及びその一部が結合し、実質的にハイブリッドまたは融合タンパク質またはポリペプチドが生じることがある。結果として生じたハイブリッドタンパク質は患者の免疫システムによって異物として認識されることがあり、したがって、抗原の特性を持つことがあり得る。転位が腫瘍遺伝子を作出することにおいて最もよく特徴付けられた例の一つは、慢性骨髄性白血病（CML）及び急性リンパ芽球性白血病（ALL）の患者に提示されたフィラデルフィア（PH1）染色体転位によるものである。染色体22及び染色体9の間の転位はbcr-abl融合転写物を合成するフィラデルフィア染色体を作出する。ALLでは、bcr遺伝子の切断点は第１イントロンで生じ、e1a2融合遺伝子を発生させ、発癌活動のある185kDaチロシンキナーゼを産出する。
【００６７】
さらに、多くの癌はある種の遺伝子及び遺伝子産物の異常発現によって特徴付けられる。腫瘍関連遺伝子は腫瘍細胞だけではなく正常な宿主組織によっても発現する。P21,26効果的な抗腫瘍免疫反応を誘導するには、ワクチン接種が自己抗原の免疫寛容を克服しなければならない。本発明のある代替アプローチは、対応する自己抗原の寛容を区切り、腫瘍免疫を誘導するために、例えば、腫瘍関連抗原をコード化するヌクレオチド配列が供給されているDNAプラスミドベクターなどの抗原の異種発生起源を使用することである。さらに、免疫システムには発達段階で免疫レパートリーから必ずしも消滅しているとは限らない自己反応性T及びＢ細胞がある。自己反応性リンパ球は種の間での交差反応によって引き起こされる場合がある。マウス自己抗原への交差反応免疫は、異種DNA免疫付与に続き対応するヒトタンパク質の免疫認識によって誘導されることがある。したがって、対象の体内で免疫反応を得るために、自己抗原をコード化するヌクレオチド配列は、異種配列、異種性遺伝子配列、外来遺伝子配列から構成される異種DNAプラスミドベクターなどの異種ベクターにおいて供給されていることが好ましく、また、自己抗原の寛容を区切るために異種タンパク質及びペプチドをコード化することが好ましい。
【００６８】
腫瘍特異性あるいは腫瘍関連抗原（そのコード配列は本発明のワクチン組成において使用される可能性がある）の限定されない例として、KS1/4全癌腫抗原、卵巣癌（CA125）、前立腺酸性リン酸塩、前立腺特異性抗原、メラノーマ関連抗原p97、メラノーマ抗原gp75、高分子メラノーマ抗原、抗原のMAGE系、Ｔ細胞受容体γ鎖代替読み枠蛋白質（TARP）、前立腺特異性粘膜抗原、e1a2融合蛋白質抗原、bcr/abl融合蛋白質がある。
【００６９】
メラノーマ、膵臓癌、乳癌及び前立腺癌の治療用の癌ワクチンは現在、臨床試験において使用されている。本発明のワクチン組成は、これらの癌の種類に対して使用され、現在の先行技術の癌ワクチンと比較して優秀な結果を出す可能性がある。本発明のワクチン組成の使用によって治療及び／または予防できると考えられる癌の種類のさらなる限定されない例としては、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、endotheliosarcoma、リンパ管肉腫、lymphangioendothelisarcoma、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立線癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫、白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、骨髄単球性、単球性、erytholeukemia）、慢性白血病（慢性骨髄白血病、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ球性白血病細胞）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病及びウイルス誘導癌等がある。
【００７０】
本発明のワクチン組成は既存の腫瘍や病原体の排除、癌や感染症の治療のために使用される。しかし、ワクチン組成はそれとともに、あるいはその代替として、対象（好ましくは哺乳類の対象、さらに好ましくは人の対象）を疾患の遭遇から保護、あるいは腫瘍の発病や再発または病原性感染体（微生物）から保護するために使用される。そのような場合、予防特性を有するワクチンは、例えば癌あるいは感染病の予防に使用される。
【００７１】
本発明によって、抗原をコード化するベクターのヌクレオチド配列を使用して、異なる形のアレルギーあるいは過敏症を治療することができる。当技術分野に精通する者は、アレルギーの特有の種類により、使用する配列を選択することができる。例えば、ピーナツアレルギーでは、ベクターはArah2抗原をコード化するヌクレオチド配列を含むことがある。
【００７２】
本発明のワクチン組成は、タイプI糖尿病を治療するように組み換えることができ、それにはインシュリンをコード化するヌクレオチド配列あるいはその一部が無制限に含まれる。ワクチン組成はまた、アルツハイマー病、血液疾患、遺伝病、移植関連あるいはそれに伴う疾患、先天性及び後天性免疫不全症の患者の治療に適用される。
【００７３】
本発明のワクチン組成は、臨床的に認められた適したワクチン接種経路を使用して対象（好ましくは哺乳類の対象、さらに好ましくは人の対象）に投与することができ、それらの経路には制限なく、皮下、筋肉注射、経動脈、経静脈、経脈管、経口、経皮、腹腔内、リンパ節及び腫瘍内への直接投与が含まれる。抗原分子をコード化するヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCは、好ましくは、投与前に混合される。すなわち、本発明のワクチン組成の2つの構成成分の混合物を投与する。
【００７４】
このワクチンは従来の方法で投与することができ、これには注射器、トロカール、カテーテル、エレクトロポレーション、針なし投与等が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
投与する用量は、多くの場合、治療またはワクチン接種を行う対象の状態や大きさ、投与するワクチン組成の量、投与回数、投与経路、療法の種類すなわち治療／予防、治療あるいはワクチン接種を行う理由となる疾患の種類に依存する。部位、用量、回数等、継続する治療に対する投与計画は対象の最初の反応及び臨床的判断によって決定される。しかし、癌治療に関しては、好ましくは少なくとも3回の反復ワクチン接種が行われる。使用されるワクチン組成の量は当技術分野では周知の方法により、動物に対する用量−反応実験で決定することができる。
本発明の更なる側面は、本発明のワクチン接種法の使用に対して供給されるキットである。第一の実施例では、キットは、抗原分子をコード化するヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCの混合物を含む容器を備える。抗原分子は、好ましくは対象（好ましくは哺乳類の対象、さらに好ましくは人の対象）へキットの内容物を投与することにより治療及び予防される、感染病あるいは癌等の疾患と関連する。
【００７６】
もう1つの実施例では、キットは抗原分子をコードするヌクレオチド配列の調製物を含む第1容器及び遺伝子組換えAPCの調製物を含む第2容器から構成される。対象への投与前に、第1及び第2容器の内容物を混合、すなわち、第1容器の内容物を第2容器へ加える、第2容器の内容物を第１容器へ加える、あるいは第1及び第2容器の内容物をそれぞれ第3の混合容器へ加えるなどの方法で混合することが好ましい。その後混合物は、対象（好ましくは哺乳類の対象、さらに好ましくは人の対象）への投与前に一緒に培養されてよい。
【００７７】
本発明のキットは、ワクチン組成、つまり感染病、癌、自己免疫疾患、アレルギーまたは糖尿病などの疾患や障害を治療及び／または予防する薬学的組成を備える。キットの少なくとも１つの容器（好ましくは遺伝子組換えAPCを有する容器）には、対象の免疫反応に影響し、APCの抗原提示を増加させ、APCを活性化し、及び／またはAPCの免疫機能を強化する追加物質及びアジュバントが含まれてよい。
【００７８】
本発明のさらなる目的は、ワクチン組成の産出法を提供することである。図１のフロー図を参照すると、ステップS1では、抗原分子（免疫反応の誘導が希望されている抗原分子）をコード化するヌクレオチド配列が供給されている。ステップS2では、DC、pDC、IPC、マクロファージ、単核白血球及び／またはB細胞などの遺伝子組換えAPCが供給されている。ステップS3では、ヌクレオチド配列及び遺伝子組換えAPCが混合され、方法は完結し、結果、本発明のワクチン組成が産出される。
【００７９】
図2は図1のヌクレオチド配列供給ステップS1の好ましい実施例を詳細に示す。任意ステップS11において、ワクチン組成によって治療あるいは予防される病気や疾患に関係する抗原分子をコード化するヌクレオチド配列が特定され、隔離される。特定は、少なくとも部分的に、当技術分野で周知されているMHC結合ペプチドモチーフ検査によって行うことが出来る。DNA配列の化学合成及びPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）などの、当技術分野で周知のいかなる方法も同等のヌクレオチド配列を得るために用いることが出来る。そして、ステップS12では、特定され隔離されたヌクレオチド配列は、適したベクターへとクローン化されることが好ましい。ベクターは対象への取り込み、及び一度対象へ取り込まれたらヌクレオチド配列を有効にするために適応するよう選択され、その後、結果として好ましい抗原分子をもたらす。得られたベクターはステップS13において、宿主細胞内、生体外等で、増殖する。
【００８０】
図１のAPC供給ステップS2の詳細を図3に示す。ステップS21では、APCは好ましくは、後にワクチン組成を受ける対象、あるいは前述において論じた他の起源から隔離される。このステップS21では、DCあるいはDCサブクラスなどのAPCの特に有利なサブクラスが選択され隔離されることがある。APCはステップ22において（遺伝的に）操作される。このような場合、免疫反応を調節する分子に対してコード化するCD40Lなどの１つあるいは複数の遺伝子は、染色体外の成分として、あるいはAPCのゲノムにおいて組み込まれたものとして抗原提示細胞に取り込まれる。
【００８１】
図4のさらなるステップS31では、追加物質はベクターとAPC混合物に加えられる。かかる物質は、サイトカイン、接着分子、ケモカイン、熱ショックタンパク質及びワクチン組成を受ける対象の免疫反応及び免疫細胞を総体的に調節し、及び／または効果細胞及びAPCの免疫機能を強化する前述のアジュバントのうち少なくとも一つを含むことがある。ヌクレオチド配列及び組換えAPC、そして可能な場合には追加物質の混合物は、その後、ステップS32において好ましくはワクチンとしての使用前に培養される。培養の物理的条件は、当技術分野に精通した人物が非発明的に決定することが可能である。しかしながら、ヌクレオチド配列の取り込みを強化するため、培養は最低5分継続することが好ましく、最低数時間は継続することがさらに好ましい。上限の培養時間は通常、培養温度など、その他の物理的要因によって決定する。一般的に、一晩、すなわち最大24時間が培養時間の上限として適しているが、これに制限するわけではない。培養中の温度は最低摂氏４度が好ましく、室温（約摂氏20から25度）あるいは摂氏約37度がさらに好ましい。培養液のpHは好ましくは中性、あるいはやや酸性である。取り込みを強化するために、ヌクレオチド配列（プラスミド）及びAPCは、相互の遠心分離を使用して合わせられる。または、あるいは加えて、リポフェクション等、その他の技術も使用されてよい。
【００８２】
次に、本発明のワクチン組成の例を急性白血病の種類に対するワクチンの参照とともに例示する。したがって、ヌクレオチド配列によってコード化される抗原分子はその種の癌と関係がある。しかし、当技術分野に精通している人物が理解している通り、本発明は、この特定例の疾患及び抗原に制限されているわけではなく、上記で論じられたいかなる疾患及び傷害の治療及び／または予防のために使用可能である。
【実施例】
【００８３】
本発明のワクチン組成を抗原ペプチド及び抗原ペプチドをコード化するプラスミドDNAのワクチン接種を含むその他の様々なアプローチと比較した。
【００８４】
細胞株
A20（H-2d）は本発明の研究においてCTL標的として使用したBALB/cマウス由来のB細胞リンパ腫細胞株である。A20細胞はB220、MHC-I、MHC-II及びCD19分子を発現する。
【００８５】
腫瘍細胞（BM185wt、H-2d）はマウス急性白血病細胞株（pre-B ALL）であり、ヒト185-kDa
bcr/abl癌タンパク（Cell  1995, 82: 981-988）をコード化するレトロウイルスベクターとともに形質導入するBALB/cマウスの骨髄細胞から確立した。BM185wt細胞はB220、CD19及びMHC-I分子を細胞の表面で発現する。
【００８６】
D2SC/wt細胞（あるいはD2SC/1）はPaola Paglia博士からご提供いただいた。本発明で使用したD2SC/wt（H-2d）はBAL/c脾臓からの樹枝状細部のレトロウイルス不死化によって得た（J. Immunel. Methods 1994, 174: 269-279）。D2SC/wt細胞は、MHCクラスII分子（低）の構造性の発現、共刺激分子B7/BB1、耐熱性Ag及びICAM-1などの未熟DCの形態学的、免疫表現型、機能的特性のほとんどを表し、効果的なAg提示能力を有する（J. Immunol. 1999, 162(7): 3757-3760）。
【００８７】
RMA-SはTAP-2欠乏腫瘍細胞株で、B6起源のラウシャー白血病ウイルス誘導マウスT細胞リンパ腫から確立した（Nature
(London) 1986, 319: 675-678）。
【００８８】
細胞培養
DCは10％加熱不活性化ウシ胎仔血清（FCS）（GibcoBRL、Life Technology Ltd.、スコットランド、UK）、2 mM L-グルタミン、100 IU/ml  ペニシリン／ストレプトマイシン、10 mM  hepes及び5x10-5 M 2-メルカプトエタノールを添加したIMDM培地で培養された。細胞を7％CO2の湿気のある環境において摂氏37度で培養した。
【００８９】
腫瘍細胞は10％加熱不活性化FCS（GibcoBRL、Life Technology
Ltd.、スコットランド、UK）、2 mM L-グルタミン、100 IU/ml  ペニシリン／ストレプトマイシン、10 mM  hepes、0.1 mMピルビン酸ナトリウム、5x10-5 M 2-メルカプトエタノール及び10 mM可欠アミノ酸を添加したRPMI-1640培地（ICN BiochemicalsLtd.、コスタメサ、カリフォルニア）で培養された。細胞は5％CO2の湿気のある環境において摂氏37度で培養された。
【００９０】
MHC I-結合ペプチドモチーフ検査及び合成
ALL特異性e1a2融合タンパク質のアミノ酸配列はマウスMHC-I抗原（H-2Kd）への結合をスクリーニングするために使用された。（表１）（Kenneth Parker博士の調査に由来するHLAペプチド結合予測プログラム、http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind）。e1a2融合タンパク質の接合部に位置する9アミノ酸配列、AFHGDAEALは（表１及び図10）、マウスH-2Ldへの高得点融合を有することを示した。e1a2ミニタンパク質を被うペプチドは標準法で合成され、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）によって精製された。実験で使用したペプチドは、高得点結合ペプチド（AFHGDAEAL、SEQ ID NO: 5を参照。e1a2ペプチドと言う）及び低得点結合ペプチド（HGDAEALQR、SEQ ID NO: 6を参照。ペプチド８と言う）である。H-2Ldと結合しないペプチドK（ATGFKQSSK、SEQ ID NO: 7を参照）は対照ペプチドとして使用された。
【００９１】
以下の表１はペプチド結合予測プログラムを使用したHLAペプチドモチーフ検査からの結果を示しており、使用したユーザーパラメーター、得点500以上を非常に高得点な結合とみなす。
【表１】
2006523688.tif 000003
DCの遺伝子組換え
レトロウイルスに基づく遺伝子導入系が開発された。すべてのgag、pol、env遺伝子を除去し、3’-及び5’-LTRを保持するために、レトロウイルスを操作した。欠損レトロウイルスベクターはパッケージング細胞株からの上清において産出された。
【００９２】
本発明では、MFG-mGMCSF（米国ハーバード大学医学部小児科医院Richard Mulligan博士提供）のパッケージング細胞株から得たレトロウイルスベクター（図5を参照）及びMoloneyマウス白血病ウイルスベクター（MoMLV）、PG1a.muDC40L（米国ベイラー医科大学M. Brenner博士提供）をDC組換えのために使用した。
【００９３】
本発明で使用したDCは、細胞表面上でGM-CSFを分泌あるいはCD40Lを発現させるように操作された。CD40L遺伝子あるいはGM-CSFはmuCD40Lレトロウイルスベクターを使用してDCへ導入された。D2SC/wt細胞はポリブレン（10μg /ml、Sigma）の存在下で遠心を遺伝子導入中に反復して行い形質導入した。つまりは、105細胞を0.5 mlのウイルス上清及びプロブレンに懸濁した。細胞及びウイルスは室温で60分間、10,000 rpmで相互遠心分離させた。遠心分離後、上清を排出し、細胞を未使用の媒体上に懸濁し、2回目の感染の前に7％CO2の湿気のある環境において摂氏37度で24時間培養した。DCの形成導入効果は反復遠心分離によって著しく強化された。形成導入が数回行われ、その、CD40Lを発現する細胞の対応の割合を図6に示す。
【００９４】
反復遠心分離後、約70-80％のDCがCD40Lトランス遺伝子を発現した。D2SC/CD40L細胞はトランス遺伝子発現のためにさらに分類され、約96％のDCがCD40L遺伝子産物を発現した。CD40L遺伝子発現は何年も安定したままの状態で、繰り返し凍結、解凍を行った後でも安定した状態であった。DCは細胞表面上で直ちにCD40Lを発現する。図6の下方の図表を参照のこと。
【００９５】
DCを導入したD2SC/wt、CD40L及びGM-CSFの細胞培養上清を採取し、IL-12、GM-CSF、IFN-γ産出をELISAにて製造業者からの指示（Sytoscreen（商標）、免疫検査キット、Biosource Int.、カリフォルニア、米国、BD Bioscience、米国）に従って評価した。D2SC/GM-CSF細胞の細胞培養上清におけるGM-CSF分泌は11370 ph/ml/106細胞/24時間であった。
【００９６】
腫瘍細胞（D2SC/wt、D2SC/CS40L、D2SC/GM-CSF遺伝子組換えDC）の免疫表現型の特徴付け
細胞を表面分子のパネルに対するマウス単クローン抗体（2x105細胞/0.5μg mAbs、BD、Pharmingen、サンディエゴ、カリフォルニア）と培養した。使用したmAbsは次の通りである：CD40-FITC（フルオレセインイソチオシアネート複合mAB）、CD40L-PE（R-フィコエリトリン）、I-A-FITC、H2Kd-FITC、B7.1-FITC、B7.2-PE、CD11c-FITC、CD8α-PE、B220-FITC、B220-PE、Thy1.2-FITC、Thy1.1-PE、IgG1-FITC、IgG2-PE。表現型分析をFACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）で行った。
【００９７】
腫瘍細胞（BM185/wt）の表現型を図７Aに示す。BM185は細胞表面上でB220、CD19、MHC-I及びI-A分子を発現する。しかし、BM185細胞は共刺激分子及びCD40の発現を欠く（データ非表示）。
【００９８】
D2SC/wt上のB220分子の発現を図７Bに示す。したがって、D2SC/wt細胞はマーカー、DCのサブクラス（マウスの形質細胞様樹状細胞（pDC））の特徴マーカーとして知られているCD8a+、CD11c+（図8参照）、及びB220+を発現する。
【００９９】
親D2SC/wt細胞及び遺伝子組換え樹状細胞（D2SC/CD40L）の免疫表現型を比較し、結果を図8に示した。親D2SC/wt細胞は図で示されているように、未熟DC表現型を提示し、細胞表面上でMHC-1、I-A、CD8α、B7.1及びB7.2を発現するが、CD40リガンド発現を欠く。比較において、CD40Lの発現はD2SC/CD40L細胞内ですぐに認められた。しかしながら、IL-12分泌はD2SC/CD40L細胞で検出されなかった。D2SC/CD40L細胞の生体内成長機構はそれらの親細胞と同様であった（データ非表示）。
【０１００】
ウエスタンブロット
DCを製造業者の指示（Sigma）に従い、１％NP40、0.1％SDS、TBS及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むリーシス緩衝液で溶解した。続いて、細胞を摂氏４度のリーシス緩衝液で超音波分解した。摂氏4℃で5分間、5,000 rpmで遠心分離した後、可溶性タンパク質をウエスタンブロット法で収集し分析した。タンパク質を製造業者の指示（BioRad、米国、Amercham
Bioscience、ウプサラ、スウェーデン）に従い、12％SDSポリアクリルアミドゲルで分離させ、PVDFフィルターに移した。第1多クローン抗体であるウサギ抗マウスTLR（Cat. No IMG-431、Imgenex、サンディエゴ、米国）をTBS緩衝液（10 mM Tris-CI及び150 mM NaCI、pH8.0）で1：1,000に希釈して使用した。第2抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）に結合したヤギ抗ウサギ抗体である。本発明のDCは図9で示されるマウスTL-R9受容体を発現する。
【０１０１】
D2SC/wt細胞は脾臓から隔離された十分機能性のある未熟樹状細胞である。D2SC/wt細胞は、CD11c+、B220+、CD8α+、MHC-IIlow、DCのサブクラスであるpDCにおいて認められるTLR9+などの有名なマーカーを発現することが示された。さらに、D2SC/wt細胞は、ウイルス、細菌性DNA及びCpG-DNAと相互作用すると、大量のI型IFN-α及びIFN-βを分泌する。またD2SC/wt細胞は、インシトゥハイブリデーション法によって検出されたように、非常に高いコピー数のI型インターフェロンmRNAを発現する（Scand. J. Immunol. 1997, 46: 235-41; Eloranta ML他 未公表データ）。したがって、D2SC細胞はマウスにおける推定ヒト天然インターフェロン産出細胞であり、樹状細胞のpDC/IPCサブクラスであると結論付けられた。
【０１０２】
プラスミドDNAベクター
近年の研究によって、空プラスミドpcDNA3はベクターのバックボーンに多くの非メチル化CpGモチーフを有することが明らかとなった（Science 1996, 273: 352-354）。高レベルのIFN-α及びプラスミドpcDNA3を有する細胞を培養することによって、ブタ白血球で大量のIL-6産出が誘導される。pcDNA3のCpGジヌクレオチドにある全てにシチジンのメチル化により、IFN-α誘導能力が消滅した（Vet
Immunol Immunopathol. 2000, 78: 45-56）。
【０１０３】
pVAX-1（著作権表示  ○中にＣ）はFDA（Invitrogen、カリフォルニア、米国）による推奨にしたがってpcDNA3.1ベクターを組換えることにより構築された。pVAX-1（著作権表示  ○中にＣ）はヒトにおける癌ワクチン開発での使用のため設計された3.0 kbプラスミドベクターである。
【０１０４】
e1a2のペプチドをコード化するミニ遺伝子はCpGモチーフを含むプラスミドベクターにクローン化する
PCRプライマーは予測MHCクラスI結合e1a2融合ペプチドに対してコード化するヌクレオチド配列を増幅するよう設計された。ミニ遺伝子の産出は次の重複プライマーを使用したフィルイン反応（Pharmacia）で開始した：5’-TGCTAGCATGATCTGGCCCAACGACGGCGAGGGCGCCTTCCACGGCGACGCCGAGGCCCTGCAGCGC-3’（SEQ ID NO: 1を参照）及び5’-AATCGATCACAGGCCCTGGGGCTCGAAGTCGCTGGCCACGGGGCGCTGCAGGGC-3’（SEQ ID NO: 2を参照）。上記の2つのプライマーに加え、反応混合物にはまた、製造業者の推奨に従って、クレノウ断片（E. coli DNAポリメラーゼI）、dNTP及び酵素緩衝液を含めた。反応は室温で1時間行われ、その後、PCR反応を同プライマーを使用してPCR緩衝液、Taq DNAポリメラーゼ、dNTPを加えて摂氏95度で1分間行い、そして摂氏95度で30秒、摂氏65度で30秒、摂氏72度で30秒を35サイクル行った。得られたPCR断片を隔離し、Nte I/クラスIサイトで、まずpUC19プラスミドベクター（New England BioLabs）にクローン化した。そして、Nte I/クラスI断片をpBK-CMVベクターへ挿入した（Stratagene）。pBK-CMV内のe1a2融合ミニ遺伝子で構成されるNhe
I/Kpn I断片を、最終的にpVAX-1ベクターのNhe1及びKpn1サイトにクローン化した（Invitrogen、カリフォルニア、米国）。一度ベクターへ取り込まれたら、e1a2ミニ融合遺伝子はCMVプロモーターに制御される。PVAX-e1a2構築はDNA分解及びDNA塩基配列決定によって確認された。製造業者の指示に従ってQuagen EndoFree Plasmid Magaキット（Qiagen、サンタスクラリタ、カリフォルニア、米国）を使用し、プラスミドを増幅した。プラスミドDNAの純度は紫外分光光度法及びアガロースゲル電気泳動法によって判定した。OD260 nm/OD280 nm吸光度比が1.9を超える精製DNAを使用した。
【０１０５】
空pVAX-1ベクター及びミニe1a2融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を持つベクター、pVAX-e1a2の図表を図10に示す。ミニe1a2融合遺伝子配列及び対応のリペプチド配列はそれぞれSEQ ID NO: 3及びSEQ ID NO: 4に示されている。
【０１０６】
pVAX-e1a2プラスミド構築を生体外転写結合翻訳検査によて正確なサイズの産物の産出に関して検査した（TNT、Promega）。約１μgのプラスミドDNAは、25μlウサギ網状赤血球溶血液、2μlのTNT反応緩衝液、１μlのTNT T7 RNAポリメラーゼ、１μlの1 mMメチオニンを除くアミノ酸混合物、4μlの10 mCi/mlでの（35S）メチオニン及び１μlの40 U/μlでのRNA  RNAasin  リボヌクレアーゼ阻害剤を混合したもの50μlで、摂氏30度で2時間培養した。反応物3μを16％SDSポリアクリルアミドゲルへロードした。乾燥させた後、ゲルをオートラジオグラフィーフィルムへ露光した。結果を図10に示す。結果で、空pVAX-1中ではなくpVAX-e1a2中にe1a2融合タンパク質の存在を示している。さらに、pVAX- e1a2の転写は、リポフェクチンの存在下でのトランスフェクション後に、COS-7細胞株において検出された（データ非表示）。これらをふまえると、e1a2遺伝子の融合部を貫通する96
bpヌクレオチド配列を含むpVAX-e1a2プラスミドDNAは、トランスフェクト細胞によって転写、発現する。
【０１０７】
ナイーブT細胞の活性化
脾臓からの単個細胞浮遊液を調製した。T細胞はBALB/cマウス及びC57BL/6Jマウスの脾臓から隔離した。C57BL/6Jマウスの脾臓からのパーコール勾配強化T細胞を異質遺伝子型T細胞の起源として使用した。BALB/cマウスからのCD4+あるいはCD8+ T細胞を、製造業者の指示に従い、MACS CD4あるいはCD8
microBeadsを使用して精製した（Miltenyi
Biotec、ドイツ）。スティミュレーター（DC）に放射線を浴びせ（50 Gy、137Csから）、96-well丸底マイクロタイタープレート（Becton、Dickinson）に入れた応答細胞（脾臓細胞あるいはT細胞、2x105細胞/well）へ段階的な用量にて加えた。実験は最終量200μl/wellにて3度行った。増殖は、ガラス繊維ろ紙に採集する3日前に6時間加えた[3H]-チミジン（1μCi/well）(Amersham International、Amersham、英国)の取り込みによって測定し、シンチレーション計数を行った（Beta Counter、Pharmacia）。
【０１０８】
遺伝子組換えによって未熟DCの能力が上がり、T細胞を刺激する
未熟DCの型として、非組換えD2SC/wt細胞は弱いT細胞スティミュレーターである。したがって、D2SC/wt及びD2SC/CD40Lの、同種異系ナイーブT細胞の増殖を誘発する能力を比較した。図11Aで示されているように、非組換え親DC（D2SC/wt）と比較して、CD40L遺伝子組換えDC(D2SC/CD40L)で刺激すると同種異系T細胞の増殖は8倍多くなる。
【０１０９】
D2SC/wt及びD2SC/CD40Lの、自系ナイーブT細胞の増殖を誘導する能力を比較した。自系T細胞の増殖は、図11Bに示されているように、非組換え親DCと比較して、遺伝子組換えDCで刺激すると4倍多くなる。GM-CSF（D2SC/GM-CSF）を分泌するよう操作されたDCも、より強力に同種異系及び自系T細胞の増殖を誘導した（データ非表示）。したがって、DC上のCD40リガンドの発現は機能的に活性で、T細胞の刺激に関与している。注目すべきは、D2SC/CD40L細胞は投与後に生体内でプライミング中自系T細胞を誘導する能力を得た可能性がある。また、皮下投与後にDCは脾臓及びリンパ液に入り込むことも明らかとなった（データ非表示）。
【０１１０】
腫瘍抗原調製
自己腫瘍溶解物をBM185/wt細胞から調製した。腫瘍細胞の凍結（液体窒素）、解凍（摂氏37度の湯浴）を数回繰り返した。腫瘍細胞溶解物をさらに摂氏4度で30分間超音波分解した。細胞残屑を摂氏4度で10分間、2,500 rpmの遠心分離によって除去した。可溶性タンパク質を収集し、タンパク質濃度をブラッドフォード法（Protein Assy、Bio-Rad、カリフォルニア、米国）によって測定した。
【０１１１】
腫瘍抗原あるいは腫瘍抗原ペプチドでのDCパルス処理
DCを腫瘍溶解物（100 μg/106細胞）とともに、一晩7％CO2の湿気のある環境において摂氏37度で前培養した。DCをPBS/5 mM EDTA液で培養瓶から分離し、マウスへ投与する前に慎重にp35,29洗浄した。ペプチドパルス実験では、摂氏37度、5％CO2で、106細胞を10 μMのペプチドでFCSを含まない媒体において2時間パルスした。
【０１１２】
ワクチン組成による免疫法
6-8週齢のBALB/c（H-2d）の雌マウスをM&B（デンマーク）から購入し、ウプサラ大学の動物施設において標準状況下で飼育した。動物実験は全て、動物愛護委員会（ref. nr. 63/97, 36/1）に準じて行われた。
【０１１３】
腫瘍性研究では、生存BM185/wt細胞を、用量を増加させながら免疫応答性同種同系マウスに皮下投与（s.c.）した。6〜8週齢のマウスに500細胞を投与すると、3〜4週間以内で死亡率が100％に達した（図14の上部を参照）。本研究では、致死量の投与（800腫瘍細胞／マウス）を全般的に使用した。
【０１１４】
腫瘍増生の効果的な排除に必要な遺伝子組換えDCの最小量を求めた。DCに免疫法の前日、一晩、腫瘍溶解物をロードした。106 D2SC/CD40L細胞の単回ワクチン接種が、腫瘍ができているマウスにおける治療上の処置として十分であることが明らかとなった（図12Aを参照）。
【０１１５】
担癌マウスは腫瘍溶解物パルスしたD2SC/CD40L（p<0.001）あるいはD2SC/GM-CSF細胞（p<0.001）で一度処理した（腫瘍部位あるいは異なる部位のどちらかで）。DC40LあるいはGM-CSF遺伝子組換えDCでの免疫法は効果的な抗腫瘍免疫反応を誘導する。既存の腫瘍細胞を絶滅させるためには単回ワクチン接種で十分であり、図12Bで示されているように、処理を受けたマウス全てから腫瘍が消えた（100％）。結果は4回の反復実験の1つを表す。
【０１１６】
誘導した抗腫瘍免疫反応は、腫瘍特異性細胞毒性T細胞（CTL）の生体内発生に関係する。生体内拡大CTLは、同種同系の腫瘍細胞株であるA20（図13B）ではなく、特に親腫瘍細胞であるBM185細胞（図13A）を殺す。
【０１１７】
これらの研究は遺伝子的に操作されたDCであるD2SC/CD40L細胞は担癌マウスにおいて有効な治療的免疫反応を刺激する能力を持つことが明らかとなった。
【０１１８】
本発明で用いられた治療及び予防的ワクチン接種に対する担癌マウスモデルの例を図14に示す。
【０１１９】
プラスミドDNA及びDCの前培養
プラスミドのDCとの結合を強化するため、及びプラスミドDNAのDCへの取り込みを可能にするため、相互遠心分離法が確立された。要するに、細胞培養瓶の中で最適な濃度で生育させた遺伝子組換えDCをPBS/5ｍM EDTA液P37,5により摂氏37度で20分間分離した。DCを収集しPBSで洗浄し（Ca+、Mg+なし）、PBSに懸濁した。プラスミドDNA（1mg/ml）を107DC/mlに加え、室温で30分間10,000 rpmで相互遠心分離した。遠心分離後、マウスへの投与前にプラスミドDNA／DC混合物を摂氏37度でさらに3時間（7％CO２）培養した。
【０１２０】
CTL検査
ワクチン接種治療後に生体内の細胞毒性Y細胞（CTL）の発現を調査するため、正常あるいはワクチン接種したマウスのいずれかから脾臓及びリンパ節（LN）を隔離した。T細胞はパーコール勾配法、または製造業者の指示（Miltenyi Biotec、ドイツ）に従ってMACS
CD4あるいはCD8 MicroBeadsを使用した磁気細胞分類によって精製した。T細胞はrhIL-2（10 ng/ml）の存在下でBM185/wt（200 Gy、137Csγ-放射）あるいはBM185/CD40L(200 Gy)によって5-7日間再刺激した。死細胞は除去し、生存細胞を標準４h51Cr放出細胞毒性検査においてエフェクターとして使用した。要するに、標的細胞は摂氏37度で2時間51Cr（25μCi/106細胞）で事前標識した。生存エフェクター細胞は事前標識した標的細胞とともに4時間培養した。エフェクターと標的の割合は様々なものを用意した。細胞溶解は51Crの媒体への放出によって測定し、結果は3度実施された例を表す。特異的溶解物の割合は次の式によって算出した。
特異的溶解物割合＝100×実験溶解物−自然溶解物／最大溶解物−自然溶解物
【０１２１】
Con A活性T細胞ブラスト
対照実験において、正常マウスからの脾臓細胞は、ペニシリン／ストレプトマイシン、10％FCS、10 mM Hepes、3x10-5M2-メルカプトエタノール及び３μg/ml Con A（Sigma）を添加したRPMII640媒体において2x106細胞/mlで48時間培養した。Con A活性T細胞ブラストは腫瘍細胞（陰性コントロール）に対するエフェクター細胞として使用した。
【０１２２】
統計分析
すべての動物実験は1グループにつき最低5あるいは10匹の動物で行われた。すべての試験は少なくとも3回繰り返し、結果は類似していた。生存差は、実験グループ間の有意差を解釈するため、カイ二乗検定によって分析した。
【０１２３】
DNA及びDCワクチン効率の調査
生存親BM185/wt腫瘍細胞の致死量を0日目に各マウス（5匹／グループ）の右脇腹に皮下投与（s.c.）した。7、14、21日目に、マウスを(1)PBS、(2)空pVAX-1ベクター（100μg／1匹）、(3)pVAX- e1a2（100μg／1匹）、(4)抗原をロードしないD2SC/CD40Lのみ、(5) pVAX-2プラスミドDNAと培養したD2SC/CD40L細胞（106細胞／100μgプラスミドDNA／1匹）によって腫瘍部位に免疫した。腫瘍の大きさを週に2回観察した。腫瘍が検出可能となった時、マウスは死に近いと見なし、検死解剖に使用した。
【０１２４】
プラスミドベクターのバックボーンでCpGモチーフを刺激すると考えられる免疫の存在にも関わらず、担癌マウスの空pVAX-1ベクターあるいはpVAX-e1a2のみによる治療では既存の腫瘍を消滅されることができなかった。腫瘍抗原の非存在下では、担癌マウスのD2SC/CD40L細胞による処置ではマウスの腫瘍を消すことはできなかった。反対に、pVAX-e1a2とD2SC/CD40L細胞の共投与は優れた抗腫瘍効果を示した。pVAX-e1a2及びD2SC/CD40L細胞のワクチン接種は処置マウス全匹においてで既存の腫瘍細胞を排除する結果となり、効率100％（p<0.01）であった。親腫瘍細胞の再攻撃からマウスを保護する誘導抗腫瘍免疫反応の能力をさらに調査した。最終ワクチン接種の1週間後、親腫瘍細胞の致死量を非担癌マウスの異なる部位に投与した。図15は、pVAX-e1a2及びD2SC/CD40Lによって繰り返し処置した担癌マウスが腫瘍細胞の再攻撃に対してマウスを保護するに十分効果的な抗腫瘍免疫を発達させ、約80％のマウスが保護され非担癌の状態を保った（結果は3回の反復実験のうち1つを示す）ことを示している。
【０１２５】
本発明のワクチンによる免疫において、pVAX-e1a2及びD2SC/CD40Lは腫瘍細胞を消す生体内の腫瘍特異性T細胞を発生させた。非担癌マウスのT細胞を分析した。生体内で培養されたCTLは特に親BM185腫瘍細胞を消す。これらの腫瘍特異性CTLはRMA-s細胞についた低い親和性MHCクラスI結合ペプチド8ではなくe1a2ペプチドを認識する（図16）。
【０１２６】
異なるワクチン組成の比較
本発明のワクチン組成の効果を、既にbcr/abl陽性腫瘍を有するマウスを治療し、かつ親腫瘍細胞の再攻撃からマウスを保護する能力があるその他のワクチン接種法と比較した。
【０１２７】
0日目にマウス（5匹／グループ）の右脇腹に生きたBM185wt腫瘍細胞の致死量を皮下接種した。7、14、21日目に、（a）PBS、(b) pVAX-e1a2（100μg／1匹）、(c) e1a2ペプチド（AFHGDAEAL、10 μM／1匹、SEQ ID NO: 5）、(d) e1a2ペプチドによってパルスしたD2SC/wt細胞（106細胞／10 μM／1匹）、（e）e1a2ペプチドによってパルスしたD2SC/CD40L細胞（106細胞／10 μMペプチド／1匹）、(f) 低いMHC結合ペプチドによってパルスされたD2SC/CD40L細胞（HGDARALQR、106細胞／10 μM／1匹）、(g)BM185細胞から得た腫瘍溶解物によってパルスされたD2SC/CD40L細胞、(h) pVAX-e1a2プラスミドDNAと前培養したD2SC/CD40L細胞（106細胞／10 μM／1匹）によって腫瘍部位に免疫した。免疫保護研究のために、最終ワクチン接種の1週間後に非担癌マウスの左脇腹に親BM185wt生腫瘍細胞の致死量を再投与した。腫瘍の大きさを週に2回観察した。腫瘍が検出可能となった時、マウスは死に近いと見なされ、検死解剖に使用された。実験を3回繰り返し、結果はそれらの実験のうち1つを示している。
【０１２８】
本発明のワクチン組成（pVAX-e1a2と前培養したD2SC/CD40L、黒丸（●）p40, 1）は、既存の腫瘍を排除する最も効果的な治療戦略（p<0.01）で、処置を受けたマウスは全匹非担癌となった（100％）。ワクチン接種によって引き起こされた、腫瘍の攻撃から宿主を保護する免疫反応の効果及び能力を調査した。非担癌マウスのワクチン接種部位から離れた部位に生親腫瘍細胞の致死量を投与すると、これらのマウスの80％が腫瘍攻撃（p<0.01）から数ヶ月たっても保護されており、非担癌の状態が保たれた（図17を参照）。
【０１２９】
前研究と一致して、pVAX-e1a2、e1a2ペプチドあるいはMHC-Iに対して低い親和性を有するペプチドによってパルスされたD2SC/CD40L細胞は、マウスの既存腫瘍を根絶することはできなかった。
【０１３０】
D2SC/CD40L細胞上のMHCクラスI結合ペプチドをパルスすることによって腫瘍抗原提示は明らかに強化された。e1a2ペプチドをロードしたD2SC/CD40Lによる担癌マウスの治療は抗腫瘍免疫を含む。しかしながら、この方法は本発明のワクチンを使用する治療に比べ、半分の効果しかない。
【０１３１】
pVAX-e1a2及びD2SC/CD40Lの本ワクチン組成の優れた効果は本ワクチン組成における重要な成分の1つを強調しているかも知れない。抗原に加えて、pVAX-e1a2プラスミドDNAはCpGモチーフを含む。CpGモチーフはTLR9を介してDCを刺激及び活性化し、結果、I型インターフェロンを産出することで知られている。D2SC/wt及びD2SC/CD40L細胞にはTLR9が存在することが明らかとなった。初期の研究ではD2SC/wt細胞はウイルス及び細菌による刺激の後、I型IFN-α及びIFN-βを分泌することが示されている。
【０１３２】
したがって、担癌マウスの治療とDC/CD40Lパルスの腫瘍抗原ペプチドの比較において、生体内でのI型IFN産出の可能性及びプラスミドバックボーンにおけるCpGモチーフによる刺激免疫反応が本ワクチン組成の優れた効果に貢献している可能性がある（図17）。
【０１３３】
腫瘍特異性及び腫瘍抗原ペプチド特異性CTLは様々なワクチン接種法の後に発生する。
本発明のワクチンによる免疫は腫瘍細胞を消す能力を持つ生体内の腫瘍特異性及びe1a2ペプチド特異性T細胞を発生させる。生体外のT細胞の刺激において、DCあるいは腫瘍細胞はまずe1a2ペプチドによってパルスされ、次に照射され、スティミュレーターとして使用された。腫瘍攻撃後の非担癌マウスからのT細胞はこれらのDCあるいは腫瘍細胞と、7-10日間、相互刺激させた。細胞培養上清を収集し、サイトカイン分泌の分析用に摂氏マイナス80度で保存した。生存細胞（>80％CD8+ T細胞）をCTL検査用にエフェクター細胞として使用した。
【０１３４】
生体外で発生したCTLの腫瘍細胞の溶解する能力を検査した。担癌マウスは（a）PBS、(b) e1a2ペプチド、(c)
pVAX-e1a2、(d) e1a2ペプチドによってパルスしたD2SC/CD40L細胞、（e）腫瘍溶解物によってパルスしたD2SC/CD40L細胞、(f) pVAX-e1a2プラスミドDNAと前培養したD2SC/CD40L細胞、によって処置した。T細胞は親腫瘍細胞攻撃後のマウスから得た。抗腫瘍免疫は、腫瘍抗原（溶解物あるいはe1a2ペプチド）をロードしたDC/CD40LあるいはpVAX-e1a2と前培養したD2/CD40Lのどちらかで治療した非担癌マウスにおいて引き起こされた（図18A）。尚、IFN-γの分泌物はCTL培養の上清で検出された（6日目）（表２を参照）。
【表２】
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腫瘍ペプチドまたはプラスミドを有する腫瘍ペプチドによるマウス処置はいずれも、腫瘍特異性CTLを誘導しない。反対にpVAX-e1a2プラスミドDNAベクター及びDC/CD40Lの反復ワクチン接種は、治療的反応と同等の強力な腫瘍特異性CTL反応を誘発した。
【０１３５】
腫瘍特異性CTLは本発明のワクチン組成によって提示された腫瘍ペプチドを認識する。
腫瘍特異性CTLの、ペプチドパルスの標的細胞を殺す能力を調査した。TAP欠乏RMA-S細胞にはe1a2ペプチドをロードした。RMA-S細胞は自らのMHCクラスIをロードする能力に欠ける。したがって、e1a2ペプチドによってパルスされたRMA-S細胞にとって、存在するペプチドはe1a2ペプチドのみである。RMA-S細胞上のe1a2ペプチドの提示は、腫瘍抗原（腫瘍溶解物あるいはe1a2ペプチド）を入れたDC/CD40L及びpVAX-e1a2と培養したDC/CD40Lのワクチン接種後の非担癌マウスにおいて発生したCTLによって認識される（図18B）。ペプチド特異性CTLは親RMA-S細胞を殺さない（ペプチドをロードしない場合、データ非表示）。ワクチン接種による生体内発生の抗腫瘍免疫は腫瘍抗原特異性であり、親BC185細胞に向かっていくことが結論付けられた。
【０１３６】
ワクチン接種後に発生したe1a2ペプチド特異性の出現率
e1a2ペプチド特異性CTLの拡大は、rhIL-2（25 ng/ml、R&D、イギリス）の存在下で、精製されたT細胞とe1a2ペプチド（500 Gy）によってパルスされたD2SC/CD40L細胞（CD8+細胞、90％及びCD4+、10％を含む）の相互刺激から得た。7日間の刺激の後、得られたT細胞の約85％がCD8+ T細胞であった（図19）。
【０１３７】
腫瘍ペプチド、e1a2ペプチド、特異性CD8+ T細胞生体外出現率を、DimerXペプチド提示法（BD  Bioscience、米国）によって調べた。要するに、H-2Ld;Igを、160モル過剰のペプチド（e1a2ペプチドあるいはペプチド8）と摂氏37度で一晩混合する。CD8+ T細胞は50 μlにつき106細胞の濃度で懸濁する。ペプチドをロードしたH-2Ld;Ig複合タンパク質2 μgをT細胞に加え、摂氏4度で60分間培養する。PE抱合ラット抗マウスIgG1抗体は、複合タンパク質結合をフローサイトメーターで検出するために使用した。腫瘍細胞および標的細胞をパルスするela2ペプチドを認識するela2ペプチド特異性CD8+ T細胞は、H-2Ld:Ig複合をロードしたela2ペプチドに結合する（図20）。CTL検査分析と同様に、DC/CD40LおよびpVAX-ela2で処理したマウスでは、pVAX-ela2のみで処置したマウスの8倍以上のela2ペプチド特異性CTLが発生し、ela2をロードしたDC/CD40Lで処理したものと比較すると約2倍以上のela2ペプチド特異性CTLが発生した。
【０１３８】
要するに、既存のbcr/abl細胞に対する抗腫瘍免疫を強化する新種のワクチン接種および戦略が提示されている。この戦略において、DCの遺伝子組換えサブクラス、pDC/IPC、及びela2腫瘍特異性ペプチドをコード化する遺伝子を構成するプラスミドベクターを含むCpGが使用された。DC/CD40Lワクチンの反復接種およびCpG基調含有pVAX-ela2で処置した担癌マウスは、腫瘍特異性およびela2ペプチド特異性T細胞の反応を誘発した。生体内で誘発されたela2ペプチド特異性CTLは、CTL検査においてを認識し、また、これらのT細胞の表面にあるela2ペプチドの間接免疫蛍光染色によって特定されたela2ペプチドを認識することが証明された。明らかに、ワクチン接種は腫瘍細胞を認識し、原位置で殺すela2特異性T細胞を誘発する。新しく発生するela2特異性T細胞は、親腫瘍の再攻撃から宿主を保護することにおいて重大な役割を果たすかもしれない。本発明のワクチン組成は、既存のbcr / abl陽性腫瘍の排除、および生存する親腫瘍の攻撃から動物を保護することにおいて効果的である。したがって、本ワクチン組成はフィラデルフィア染色体陽性腫瘍に対する治療的及び薬学的組成としてよく適合している。
【０１３９】
ワクチン組成の提案メカニズム
本発明で提示された実験および腫瘍免疫学の分野の人々による研究を基に、本発明の成功に貢献する可能なメカニズムおよび主要な要因の仮説を下記に、また図21と関連して提示する。
【０１４０】
実施後、腫瘍ペプチド（CpG-DNA-e2a2）をコード化するプラスミドDNAはDCに結合する。ほとんどのCpG-DNA-e2a2プラスミドDNAが取り込まれる可能性があり、その後MHC分子上に提示される。続いてプラスミドDNAのCpGモチーフはTLR9と結合し、DCのトール様受容体の経路を活性化する。
【０１４１】
TLR9経路の活性化は、タイプI IFN-αおよびIFN-βの分泌を導く場合がある。この事象はCpG-DNA-e2a2およびDCの培養中に起こることがある。したがって、前培養の前後及び／または最中に、例えば相互の遠心分離などによってプラスミドDNAのDCへの結合を強化することが好ましい。
【０１４２】
DC細胞はCD40Lを発現するように遺伝子組換えされている。したがって、DCは２つの最も重要なT細胞の活性化信号であるB7及びCD40Lを発現する。CD40L、B7およびI型インターフェロンの存在下で、遺伝子組換えDCは、CD40-CD40Lの相互作用を介してナイーブT細胞及び活性ナイーブDCなどの免疫細胞に腫瘍ペプチドを提示する。生体内において、DCは結合していない抗原あるいはCpG-DNA-e2a2を取り込み、提示することがある。両種の樹枝状細胞、pDCs/IPCs/CD40L/B及び腫瘍抗原を持つ活性DCは、リンパ系組織及びナイーブT細胞、B細胞及びDCを含む活性免疫細胞に移動する。宿主の免疫システムのクロスプライミングおよび直接プライミングは同時に生じてよく、同じ組織に存在してよい。IL12、IL15、IFN-γ、I型TNF-αなどのサイトカイン、及びその他のThlサイトカインの生産が生じることがある。B7分子を発現するCD40L組換えpDCは、腫瘍ペプチドをナイーブCD8+ T細胞に直接提示し、腫瘍特異性CTLを活性化することが出来、その結果、より速い、増加した、さらに効果のある治療的および保護用の免疫反応を得ることになる。本発明によるワクチン接種の最終成果は、ela2特異性CTLの発生、及び既存腫瘍の排除である。生体内で誘発される抗腫瘍免疫は、腫瘍の攻撃から宿主を保護する。
【０１４３】
したがって、我々の新種のワクチン戦略は、自然免疫及び適応免疫を活性化させる独特な組み合わせを強調している。本新種ワクチン組成は、人及び動物の疾患の治療または予防を目的とする薬学的ワクチン組成の設計に適している。
【０１４４】
当技術分野に精通する人物には、添付の特許請求の範囲で定義されている請求の範囲から逸脱することなく、様々な変形及び変更を本発明に加えてもよいことが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】本発明によるワクチン組成の産出及び調製方法を示すフロー図である。
【図２】図１のワクチン産出法のヌクレオチド供給ステップを示すフロー図である。
【図３】図１のワクチン産出法のAPC供給ステップを示すフロー図である。
【図４】図１のワクチン産出法の追加ステップのフロー図である。
【図５】マウスCD40リガンド（CD40L）遺伝子（RVV-ｍCD40L）を有するMoloneyマウス白血病ウイルスベクターを示す概略図である。
【図６】RVV-ｍCD40Lを有するDCの形質導入を示す。反復形質導入と選択の間に、DCは直ちに表面にCD40Lを発現し、96％以上のDCがCD40Lを発現する。これらの細胞は本発明のワクチン組成の例において使用される。
【図７】Ａは親BM185wt腫瘍細胞における免疫反応刺激分子の発現を示し、ＢはDCにおけるB220の発現を示す。
【図８】D2SC/wt、遺伝子組換D2SC/CD40L及びD2SC/GM-CSF細胞におけるCD8α、CD11ｃ、ＭＨＣクラスII（I-A）、B7.1、B7.2及びCD40L分子の発現を示す。
【図９】ウエスタンブロットによって検出されたDCにおけるTLR９タンパク質の発現を示す。
【図１０】ヒトe1a2の融合領域にかかるミニ遺伝子配列を構成する空pVAX-1ベクターの一部及びpVAX-e1a2の一部を概要的に示す。さらに、図はプラスミドpVAX-1及びpVAX-e1a2の生体内の転写と連動した翻訳検査によるミニ遺伝子配列のタンパク質産出の検出を示す。
【図１１】ＡはD2SC/wt及びD2SC/CD40Lの同種異系Ｔ細胞の増殖を誘発する能力を示し（組換えられていない親DCと比較して、8倍強力な同種異系Ｔ細胞の増殖が遺伝子組換えDCによって誘発される。）、Ｂは組換えられていない親DCと比較して、4倍強力な自系Ｔ細胞の増殖は遺伝子組換えDCによって誘発される結果となる、D2SC/wt及びD2SC/CD40Lの自系Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を示す。
【図１２】Ａは投与前にDCに腫瘍溶解物をロードしたワクチン接種に対して使用された遺伝子組換えDCの至適用量の滴定を示し、Ｂは腫瘍溶解物の抗原でパルスした遺伝子組換えDCの単回ワクチン接種による担癌マウスの治療を示す。
【図１３】担癌マウスにおける、腫瘍溶解物のみ、あるいは腫瘍溶解物でパルスした遺伝子組換えDCによる単回処理後の腫瘍特異的CTLの誘導を示す。（A）D2SC／CD40LあるいはD2SC／GM-CSF細胞をロードした腫瘍溶解物の単回ワクチン接種は特に親BM185wt腫瘍細胞を殺す腫瘍CTLを誘導する。（B）注目すべきは、腫瘍CTLは同系Ａ20リンパ腫を殺さない。
【図１４】本発明で使用されたマウスのワクチン接種モデルの例を概要的に示す。
【図１５】既にbcr/abl陽性腫瘍を有しているマウスに異なるワクチン組成を投与した後の非担癌マウスの割合を示す。誘発した免疫防御の効果及び特異性を確認するため、生きた親腫瘍細胞を使用して非担癌マウスでさらに再攻撃した。
【図１６】pVAX-e1a2及びDC/CD40Lのワクチン接種によって誘発した腫瘍特異性及びe1a2特異性のCD8+Ｔ細胞の誘発を示す。
【図１７】既にbcr/abl陽性腫瘍を有するマウスの治療における本発明のワクチン組成及び他のワクチン組成の比較を示す。
【図１８】Ａは異なるワクチン法を使用した予防接種後の腫瘍特異性Ｔ細胞の生体内誘発を示し（非担癌マウスから生じたCTLは、特に親腫瘍細胞であるBM185細胞に対して向かって行く。）、Ｂは異なるワクチン組成の後の生体内発生した腫瘍の抗原特異性Ｔ細胞の反応を示す（TAP欠乏のRMA-S細胞にロードしたe1a2ペプチドを認識した生体外で培養された非担癌マウスからのCTL）。
【図１９】生体外のＴ細胞の拡大後に発生したCD8+CTLの割合を示す。
【図２０】e1a2ペプチド特異性CD8+Ｔ細胞はH-2Ld:Ig複合をロードしたe1a2ペプチドを認識するということを示す。
【図２１】本発明の効果を決定する可能性があるメカニズムに関する提案された仮説を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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