(57)【要約】本治療法は、アポトーシス誘導剤による治療に適した癌等の増殖性の疾病の治療のための、ＩＬ−６に向けられる抗体の（特定の使用量や特定の変形を含む）使用方法であって、少なくとも一つのインターロイキン−６（ＩＬ−６、別名インターフェロンβ２）タンパク質またはそのフラグメントとステロイドとの組み合わせに特異的な方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシス誘導剤による治療に適した増殖性の疾病の治療が必要な哺乳類における、当該疾病の治療方法であって、ステロイドとＩＬ−６アンタゴニストとを組み合わせて投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−６アンタゴニストが、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体またはフラグメントがＩＬ−６と結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントまたはその誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、ヒトＩＬ−６との結合について、モノクローナル抗体ｃＣＬＢ８と競争する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、静脈投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、体重に対し０．０１〜１２．０ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、当該抗体の大量投与とそれに続く点滴で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類がヒトの患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロイドが、酢酸コルチゾン、デキサメサゾン、酢酸メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾンおよびプレドニゾロンからなる群から選ばれたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖性の疾病が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾病が、癌転移、多発性骨髄腫、脂漏性皮膚炎、座瘡および関節炎からなる群から選ばれた疾病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍の成長を抑制することの必要な哺乳類における当該腫瘍の成長抑制方法であって、コルチコステロイドによる治療と共に、膜結合受容体を介するＩＬ−６によるシグナル伝達の活性化を防止するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを、当該腫瘍の成長を抑制するのに有効な量、哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項１４】
哺乳類における転移の防止方法であって、コルチコステロイドによる治療と共に、膜結合受容体を介するＩＬ−６によるシグナル伝達の活性化を防止するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを、当該哺乳類における転移を防止するのに有効な量、哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項１５】
哺乳類における脳浮腫の治療方法であって、当該哺乳類に対し、当該哺乳類の脳浮腫を治療するのに有効な量のＩＬ−６アンタゴニストと共にコルチコステロイドを投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ｃＣＬＢ８またはそのフラグメントである、請求項１，１２，１３，１４または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシスのプロセスを促進することによる、癌等の増殖性の疾病に関連する病理的過程を治療する抗体の使用方法に関する。本発明は、より具体的には、アポトーシス誘導剤による治療に適した癌等の増殖性の疾病の治療のための、ＩＬ−６に向けられる抗体の（特定の使用量や特定の変形を含む）使用方法であって、少なくとも一つのインターロイキン−６（ＩＬ−６、別名インターフェロンβ２）タンパク質またはそのフラグメントとステロイドとの組み合わせに特異的な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性の疾病を治療するための、より効果的でより毒性の少ない治療法を開発するニーズが癌研究の主要な関心事になってきている。腫瘍細胞によって産生されるかまたは腫瘍生育環境で存在するサイトカイン等の特定の因子が、腫瘍の成長と標準的な治療法に対する耐性との両方に対し寄与し得る。これらの因子または、腫瘍細胞によって発現した特定の受容体に対しモノクローナル抗体を使用する標的療法は、癌を治療する最も有効な方法かも知れない。モノクローナル抗体は、癌を含む多種多様なヒトの疾病を治療するための最も迅速に拡大しつつある医薬品群となってきている。抗体は、癌を治療するという究極のゴールに到達してはいないが、抗体をベースとする療法の効能を改善する態勢の整った革新的なアプローチが多くある（非特許文献１参照）
【０００３】
サイトカインＩＬ−６
ＩＬ−６（インターロイキン６）は、従来は、単核細胞由来のヒトのＢ細胞成長因子、Ｂ細胞刺激因子２、ＢＳＦ−２、インターフェロンβ−２およびハイブリドーマ成長因子として知られていた、成長促進活性と炎症誘導活性とを有する２２−２７ｋＤａの分泌糖たん白質である（非特許文献２参照。）。
【０００４】
ＩＬ−６は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体向神経因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロピン−１（ＣＴ−１）、ＩＬ−１およびＩＬ−１１を含む、顆粒球菌コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および骨髄単球性成長因子（ＭＧＦ）の系統群に属している。ＩＬ−６は、種々の細胞タイプ、最も顕著には、抗原提示細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞、によって産生される。ＩＬ−６型サイトカインは、全て、一般的なシグナル変換タンパク質であるｇｐ１３０（以前はＩＬ−６Ｒβと呼ばれていた）を含む受容体複合体を介して作用する。しかしながら、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＣＴ−１およびＣＮＴＦは、まず、特定の受容体タンパク質と結合し、ついで、ｇｐ１３０と結合し、ＬＩＦとＯＳＭは、ＬＩＦ−Ｒとｇｐｌ８０の複合体に直接結合する。特定のＩＬ−６受容体（ｌＬ−６ＲまたはＩＬ−６α、ｇｐ８０またはＣＤ１２６）は、膜に結合した形態または可溶の形態（ｓＩＬ−６Ｒ、５５ｋＤ形態）のいずれかで存在する。これらは、両方とも、ｇｐ１３０を活性化する能力を有する。
【０００５】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＦＮα、オンコスタチンおよびＬＰＳ等のＩＬ−６の発現を誘導することが知られている薬剤がいくつかある。ＩＬ−６は、Ｂ細胞とＴ細胞の活性化、造血、破骨細胞の活動、角質細胞の成長、急性期タンパク質の合成、ニューロンの成長および肝細胞活性化等の多様な活動に関与している（非特許文献３参照。）。
【０００６】
ＩＬ−６は多くの経路に関係するが、ＩＬ−６ノックアウトマウスは、正常な表現型を持ち、生存能力および繁殖力を有し、組織の損傷に対し、Ｔ細胞の若干の減少と急性期タンパク質反応の減少を示す（非特許文献４参照。）。これとは対照的に、大脳のＩＬ−６を過剰発現させるトランスジェニックマウスは、神経変性、星状細胞増加症、大脳の脈管形成等の神経系疾患を呈し、これらのマウスは、血液脳関門を発現しない（非特許文献５参照。）。
【０００７】
癌におけるＩＬ−６の役割
ＩＬ−６は、いくつかの悪性疾患の病態生理に対し、種々の機構により関与している。ＩＬ−６は、無力症、悪液質および骨吸収等の癌関連の病態における原因因子であると仮定されている。ＩＬ−６ノックアウトマウスでは、腫瘍によって誘導された悪液質（非特許文献６参照。）、骨吸収および関連高カルシウム血症が減少することが判明した（Ｓａｎｄｈｕ等，１９９９年）。癌に関連した欝状態と脳腫瘍の際に二次的に生じる脳浮腫も、高レベルのＩＬ−６と関係していた（非特許文献７参照。）
【０００８】
種々のヒトの癌についての多くのインビトロおよびインビボのモデルからの実験結果から、ＩＬ−６が抑制作用の治療標的であることが証明された。ＩＬ−６は、腫瘍細胞の増殖、分化および生存を誘導し、アポトーシスを促進し、（非特許文献８参照。）、化学療法への耐性を誘導し得る（非特許文献９参照。）。
【０００９】
多発性骨髄腫は、形質細胞が関与する悪性腫瘍である。ＩＬ−６は、悪性細胞のアポトーシスの抑制を含むオートクリンまたはパラクリン機構を介して、多発性骨髄腫（ＭＭ）における悪性形質細胞の増殖、分化および生存を増強することが知られている。従って、ＩＬ−６の遮断は効果的療法であると仮定されてきた（非特許文献１０参照。）。これまで、インビトロの実験（非特許文献１１参照。）および臨床試験（非特許文献１２，１３参照。）の両方が行われてきており、それらの結果は、ＩＬ−６の遮断が、癌細胞増殖の上に明白な効果を持つことを示している。
【００１０】
腫瘍細胞によって産生されるかまたは腫瘍生育環境で存在するサイトカイン等の特定の因子は、腫瘍の成長と標準的な療法への耐性に関与し得る。細胞表面受容体と結合し、免疫反応を調節するか死亡シグナル伝達ドメインのいくつかを抑制する、ＩＬ−６等のサイトカインは、ステロイドまたは化学療法で誘導された細胞死に対して細胞に耐性を与える（非特許文献１４参照。）。
【００１１】
ステロイドによって誘導されるアポトーシス
アポトーシスは、炎症性反応を生ぜずに組織および器官からの細胞の選択的除去を必要とする多数の発育上および生理上の条件下で生じるプログラムされた細胞死の形態である。アポトーシスの開始は、細胞によって感知される、生と死のシグナルの間のバランスによって制御される。死の刺激を感知する細胞によるアポトーシス反応には、細胞体積の減少、細胞内小器官の凝集、クロマチン凝集および、分解した細胞成分を含むアポトーシス体の生成が含まれる。この死のモードは、細胞の中味を周囲の環境に放出する溶解機構とは対照的である。アポトーシス体は、しばしば、近隣の細胞またはマクロファージによって吸収され、死につつある細胞の領域における炎症性反応の発生が防止される。
【００１２】
デキサメサゾン（ステロイド剤）は、アポトーシスプロセスを開始し、齧歯類とヒトのリンパ球にグルココルチコイド誘導性のアポトーシスと呼ばれる現象を引き起こす、代謝のエフェクター分子である。デキサメサゾンに対するこれらの細胞の反応は、細胞発育停止、クロマチン凝集、細胞収縮ならびに、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の選択的な分解を伴う。この反応は、機能性グルココルチコイド受容体の存在に依存し、遺伝子発現を必要とする。ＤＮＡの断片化とその関連細胞の収縮は、細胞死への過程を不可逆的なものにする（非特許文献１５参照。）。
【００１３】
ＩＬ−６に対するモノクローナル抗体
ＩＬ−６に対するマウスモノクロナール抗体は、たとえば、特許文献１に示されているように公知である。特許文献２には、マウスのモノクロナール抗体ＳＫ２に由来する、ヒトのＩＬ−６に対し再構築されたヒトの抗体であって、マウスのモノクロナール抗体ＳＫ２の可変領域からの相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）が、ヒトの抗体の可変領域に移植され、ヒトの抗体の定常領域に結合されたヒトの抗体について開示されている。
【００１４】
受容体シグナル伝達を抑制することができる、ＣＬＢ−６／８と呼ばれる、もう一つのマウスＩＬ−６モノクローナル抗体が報告されている（非特許文献１６参照。）。ｃＣＬＢ８と呼ばれるこの抗体のキメラ化した形態が構築され、（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、ペンシルベニア州、Ｍａｌｖｅｒｎ）、多発性骨髄腫患者に与えられた（非特許文献１３参照。）。このキメラ化した抗体とマウス抗原結合ドメインからこの抗体を造る方法は、参照により本明細書に包含される本出願人の特許文献３に完全に記載されている。
【００１５】
ｃＣＬＢ８の投与前後における患者の血清サンプルの分析から、これらの患者のｓＩＬ−６Ｒとｓｇｐ１３０の両方の血中レベルが高く、血清ＩＬ−６活性の完全な遮断にもかかわらず、治療中不変のままであることが示された（非特許文献１７参照。）。
【００１６】
Ｂ−Ｅ８は、フランスのＤｉａｃｌｏｎｅによって製造され、臨床評価も経た、ＩＬ−６に対するマウスｍＡｂである。Ｂ−Ｅ８  ｍＡｂは、Ｂリンパ増殖性疾患（Ｈａｄｄａｔ等、２００１年）の治療に有効であった。ＡＩＤＳ関連のリンパ腫では、この抗ＩＬ−６  ｍＡｂは、リンパ腫関連の発熱および悪液質による体重減の低減に明確な効果を有しており、これによって、これらの患者の生活の質の指標を改善できた（非特許文献１８参照。）。Ｂ−Ｅ８は、腎癌患者にも使用されてきた。転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）は、高レベルのＩＬ−６と関係することが多く、腫瘍随伴症状を伴う。Ｂ−Ｅ８治療により、３人のＲＣＣ患者で、腫瘍随伴症候群の有意な減少が示された（非特許文献１９参照。）。出版されたもう一つの臨床試験では、ＲＣＣの６人の患者が、Ｂ−Ｅ８で治療された（非特許文献２０参照。）。治療を受けた患者全員について、Ｂ−Ｅ８治療の後、一般的にＩＬ−６の過剰産生に帰因し得る症状の消失が示された。
【００１７】
抗ＩＬ−６  Ｍａｂｓに関するこれまでの臨床体験は少ない。しかしながら、抗ＩＬ−６  Ｍａｂｓが、ヒト脳腫瘍細胞（非特許文献２１参照。）または腫瘍（Ｍａｕｒａｙ等、２０００年）、ヒトの腎癌腫瘍および血清カルシウム濃縮（非特許文献２２参照。）、ならびに、ヒトの耐ホルモン性前立腺腫瘍の異種移植片（非特許文献２３参照。）、の成長を抑制することを含め、腫瘍細胞の生存と疾病の進行に強い影響を与えるポテンシャルを有することを証明するのに、ヒトの種々の腫瘍についてのいくつかのインビトロモデルとマウスモデルとが使用された。ある報告（非特許文献２４参照。）の場合には、細胞毒性化学療法（ＶＡＤ法）での治療が不成功に終わった形質細胞性白血病患者が、推定される免疫付与の影響を制限するために、抗ＩＬ−６療法による治療とその後のデキサメサゾンでの治療を受けた。抗ＩＬ−６  Ｍａｂｓは、インビボで、４５日間、ミエローマ細胞の増殖を遮断した。
【００１８】
これらを要約すると、ＩＬ−６は、いくつかの機構を通じて悪性疾患の異常発生過程を促進することができる多面的サイトカインである。前臨床データから、ＩＬ−６が、腎癌と前立腺癌を含む数種類の腫瘍の生存、増殖および分化の因子であることが示された。ＩＬ−６は、また、悪液質、骨吸収および欝状態等の癌関連の病状の発現に主要な役割を果たし、ＭＤＲＩ遺伝子形質発現を誘導することによって化学療法に対する耐性を引き起こし得る。臨床データによれば、高レベルのＩＬ−６が、いくつかの疾病で悪性プロセスに貢献することが示されており、予備的な臨床試験では、抗ＩＬ−６  Ｍａｂｓに、疾病を軽減する活性がある場合もあることが示された。
【００１９】
腫瘍細胞、特に腎癌と耐ホルモン性前立腺癌腫の、成長、生存および転移の可能性を制限することのできる薬剤へのニーズがある。アポトーシスとは、組織から生育可能な細胞を除去する特定の連続した事象のことである。それゆえ、癌関連の副作用に貢献する腫瘍由来の毒素の放出を防止しつつ、腫瘍量を減少させられる限り、腫瘍組織中でのアポトーシスの誘導は好ましい。ステロイド剤がアポトーシスを促進する一方、ＩＬ−６は、癌細胞について特異的にアポトーシスに対抗する保護を与える。
【００２０】
それゆえ、無力症、悪液質および骨吸収等の、内発的に産生された過剰なＩＬ−６のホストに対する付帯的で有害な影響を改善すると同時に、悪性細胞等の好ましくない病原性細胞にアポトーシスを誘導し、腫瘍の成長およびアポトーシスやその他の化学療法剤への耐性に対する過剰なＩＬ−６の好ましくない影響を防止する癌治療法は、非常に好ましいと言えよう。
【特許文献１】米国特許第５，６１８，７００号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８５６，１３５号明細書
【特許文献３】米国同時係属出願、出願番号第６０／３３２，７４３号
【特許文献４】米国特許第５，７２３，１２０号明細書
【非特許文献１】カーター（Ｃａｒｔｅｒ），「Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ」，２００１年，第（１）巻，ｐ．１１８−２９
【非特許文献２】平野等，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，１９８６年，第３２４巻，ｐ．７３−７６
【非特許文献３】平野等，「Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ」，１９９８年，第１６（３−４）巻，ｐ．２４９−８４
【非特許文献４】コプフ・エム（Ｋｏｐｆ  Ｍ）等，「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，１９９４年，第３６８巻，ｐ．３３９−４２
【非特許文献５】キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）等，「ＰＮＡＳ  ９０」，１９９３年，ｐ．１００６１−１００６５
【非特許文献６】カーリン（Ｃａｈｌｉｎ）等，「（２０００）癌レビュー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）」，第６０（１９）巻，ｐ．５４８８−９
【非特許文献７】ムッセルマン（Ｍｕｓｓｅｌｍａｎ）等，「Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ」，２００１年，第１５８（８）巻，ｐ．１２５２−７
【非特許文献８】ジー（Ｊｅｅ）等，「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」，２００１年，第２０巻，ｐ．１９８−２０８
【非特許文献９】コンゼ（Ｃｏｎｚｅ）等，「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ」，２００１年，第６１巻，ｐ．８８５１−８８５８
【非特許文献１０】アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）等，「血液学（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）」,２０００年，ｐ．１４７−１６５
【非特許文献１１】タッソネ・ピー（Ｔａｓｓｏｎｅ，Ｐ）等，「Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．」，２００２年，第２１（４）巻，ｐ．８６７−８７３
【非特許文献１２】バタイユ（Ｂａｔａｉｌｌｅ）等，「血液（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９５年，第８６（２）巻，ｐ．６８５−９１
【非特許文献１３】ヴァン・ザーネン（Ｖａｎ  Ｚａａｎｅｎ）等，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ」，１９９６年，第９８巻，ｐ．１４４１−１４４８
【非特許文献１４】フェーニガー（Ｆｅｈｎｉｇｅｒ）等，「サイトカイン成長因子レビュー（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ）」，２００２年，第１３巻，ｐ．１６９−８３
【非特許文献１５】シドロウスキー（Ｃｉｄｌｏｗｓｋｉ）等，「Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ」，１９９６年，第５１巻，ｐ．４５７−９０
【非特許文献１６】ブラーケンホフ（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ）等，「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９０年，１４５：５６１
【非特許文献１７】ヴァン・ザーネン（Ｖａｎ  Ｚａａｎｅｎ）等，「白血病リンパ腫（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ）」，１９９８年，第３１（５０６）巻，ｐ．５５１−５５８
【非特許文献１８】エミリー（Ｅｍｉｌｉｅ）等，「血液（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９４年，第８４（８）巻，ｐ．２４７２−９
【非特許文献１９】ブレイ（Ｂｌａｙ）等，「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ」，１９９７年，第７２（３）巻，ｐ．４２４−３０
【非特許文献２０】レグーフ（Ｌｅｇｏｕｆｆｅ）等，「Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９４年，第９８（２）巻，ｐ．３２３−９
【非特許文献２１】ゴスワミ（Ｇｏｓｗａｍｉ）等，「Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ」，１９９８年，第７１巻，ｐ．１８３７−１８４５
【非特許文献２２】ワイスグラス（Ｗｅｉｓｇｌａｓｓ）等，「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」，１９９５年，第１３８（５）巻，ｐ．１８７９−８
【非特許文献２３】スミス（Ｓｍｉｔｈ）等，「Ｐｒｏｓｔａｔｅ」，２００１年，第４８（１）巻，ｐ．４７−５３
【非特許文献２４】ビー・クライン（Ｂ．Ｋｌｅｉｎ）等，「血液（Ｂｌｏｏｄ）」，１９９１年，第７８巻，ｐ．１１９８−１２０４
【非特許文献２５】マーキン・ジー（Ｍａｋｉｎ，  Ｇ．），「Ｅｘｐｅｒｔｓ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ」，２００２年，第６（１）巻，ｐ．７３−８４
【非特許文献２６】チョーハン・ディー（Ｃｈａｕｈａｎ，  Ｄ．）等，「Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．」，２０００年，第２７５（３６）巻，ｐ．２７８４５−２７８５０
【非特許文献２７】マーキン（Ｍａｋｉｎ），「Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ」，２００２年，第６（６）巻，ｐ．７３−８４，
【非特許文献２８】ル・グーイル（Ｌｅ  Ｇｏｕｉｌｌ）等，「Ｌｅｕｋｅｍｉａ」，２００２年，第（１６）巻，ｐ．１６６４−７
【非特許文献２９】レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ），「薬学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，１９８５年
【非特許文献３０】ガブリエリ（Ｇａｖｒｉｅｌｉ）等，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｖｉａ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，１９９２年，第１１９巻，ｐ．４９３−５０１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、アポトーシス誘導剤による治療に適した増殖性の疾病の治療が必要な患者における、そのような疾病の治療方法であって、アポトーシスを誘導する能力を有する薬剤とＩＬ−６アンタゴニストとを組み合わせて投与することを含む方法である。好ましい形態では、アポトーシス剤がコルチコステロイドであり、最も好ましくはデキサメサゾンである。ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６に対し特異的なモノクロナール抗体である。
【００２２】
ある態様では、ＩＬ−６アンタゴニストが抗ＩＬ−６抗体である。この観点からは、本発明は、コルチコステロイド療法の治療効果を増進するための、ＩＬ−６に向けられる抗体の（特定の使用量や特定の変形を含む）使用方法であって、少なくとも一つのインターロイキン−６（ＩＬ−６、別名インターフェロンβ２とも呼ばれる）タンパク質またはそのフラグメントに特異的な方法に関する。このような抗ＩＬ−６抗体は、腫瘍細胞の生存、腫瘍の成長および転移の拡大を高めることに繋がる事象等の癌組織の開始と進行とに関連する事象を防止するやり方でＩＬ−６と膜結合受容体との相互作用を防止する能力により作用し得る。特定の形態では、ステロイドと共に使用される抗ＩＬ−６抗体が、ＩＬ−６と特異的に結合し、全身的および局所的にその作用を防止する抗体である。この抗体は、正常な循環機構を介して複合体がアクセスし得る組織ならどのような組織であっても、ＩＬ−６と結合し、ｇｐ１３０等の膜結合受容体を活性化することのできない長寿命の複合体を造り得る。本発明の方法は、このように、ヒトやヒト以外の患者における種々の形態の癌に関連する転移性の疾病状態の治療上の処置および防止措置にとって理想的な、好ましい中和性を有する抗体を採用する。
【００２３】
従って、本発明は、要素として、悪性細胞等の好ましくない細胞タイプの長期の生存を含む、疾病または容態の治療の必要な患者における、そのような治療方法であって、アポトーシスを増強するために、患者に、ある量の中和用ＩＬ−６抗体を投与することを含む方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
コルチコステロイドとアンドロゲンの二つのタイプのステロイドホルモンが副腎皮質で合成される。コルチコステロイド（グルココルチコイドとミネラルコルチコイド）は、異化ステロイドであり、アンドロゲンは、通常、アナボリックステロイドである。ヒドロコルチゾンによって代表されるグルココルチコイドの名前は、炭水化物代謝を調節する役割に由来するものである。アルドステロンによって代表されるミネラルコルチコイドは、電解質バランスを調節する。これらの機能に加えて、コルチコステロイドは、個体（ヒトまたは動物）に、ストレスの多い環境条件または有害な刺激に対処する能力を与える。副腎によるコルチコステロイドの一日の産生量は、ストレスに応答する場合には１０倍もの量に上昇し得る。従って、コルチコステロイド類似体である薬剤は、代謝プロセスの天然のレギュレーターの生理的なプロセスの副作用である治療効果を有する。たとえば、コルチコステロイドの抗炎症作用と免疫抑制作用とは、プレドニゾンまたはデキサメサゾン等のグルココルチコイドを模倣する医薬品の主要な治療用途の一つである。ここで理解されるように、用語「ステロイド」とは、グルココルチコイドまたはグルココルチコイドの類似体あるいは模倣体である治療薬を意味する。
【００２５】
ステロイドの上昇または外因性のステロイドに応じた、ある状況におけるリンパ球減少症および他の状況におけるリンパ組織の産生の増大に至る全ての相互作用の理解は未だ不完全である。しかしながら、リンパ系の悪性病変の治療中にステロイドを投与することは一般的なやり方である。同様に、炎症の抑制は、種々の場合において、ステロイドの免疫抑制効果と同様、非常に大きな臨床的な利益である。ステロイドは、プロスタグランジンおよびロイコトリエンならびに、炎症性のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦα）ならびに、マクロファージと単核細胞、血管内皮細胞および線維芽細胞とからの急性期反応物質、の産生および放出を遮断しまたは抑制する。さらに、ステロイドは、血管内皮細胞上の表面付着分子の同化作用、好塩基球によるヒスタミンの放出および、リンパ球からの更なるサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−３とＩＦＮγ）の放出を低減させ、成長因子により誘導された線維芽細胞の増殖を抑制する。
【００２６】
コルチコステロイドは、種々の誘因剤に対する炎症反応を抑制し、恐らく、快復を遅延させる。コルチコステロイドは、一時的に、浮腫、線維素沈着、毛細血管の拡張、白血球移動、毛細血管の増殖、線維芽細胞増殖、コラーゲンの沈着および、炎症に関連した瘢痕形成を抑制する。眼のコルチコステロイドの作用機構については、一般的に認められた説明はない。しかしながら、コルチコステロイドは、（集合的にリポコルチンと呼ばれている）ホスホリパーゼＡ２抑制タンパク質の誘導によって作用すると考えられている。これらのタンパク質は、これらに共通の前駆体アラキドン酸の放出を抑制することにより、プロスタグランジンやロイコトリエン等の炎症の強力なメディエーターの生合成を支配すると考えられている。アラキドン酸は、ホスホリパーゼＡ２によって膜リン脂質から放出される。コルチコステロイドは、眼圧の増大を引き起こし得る。
【００２７】
視床下部−下垂体−副腎軸（ＨＰＡ軸）は、実質的に、免疫系と情報伝達を行っており、ステロイドの作用が、激しい感染、外傷または癌を伴い得るサイトカイン「ストーム」の命に関わる活動から保護することであることが示唆されている。このように、ステロイドとＩＬ−６とは、平衡的な作用の対極に位置している。
【００２８】
ステロイドの使用は非毒性ではない。治療へのステロイドの使用における毒作用は、二つのカテゴリーに分けられる。ホルモンの生理的レベルを超える使用に起因するものと、これらの正常を超えるレベルの効果からの離脱に起因するものである。これら両方のタイプの副作用は、潜在的に非常に危険である。治療が長引くと、体液および電解質の異常、高血圧、高血糖、感染への感受性の増大、骨粗鬆症、ミオパシー、行動障害、白内障、成長阻止ならびに脂肪の再分布および多毛症を含む生理的な変化に至り得る。
【００２９】
骨とカルシウム分布についてのステロイドの効果は、骨芽細胞の活性の減少、腸におけるＣａ2+吸収の減少およびＰＴＨ産生の増大によるものである。これらの効果は、実際には、高カルシウム血症、従って血栓症事象のリスクを持つＰＴＨの放出および、破骨細胞の活性を促進するＩＬ−６の効果と複合したものである。
【００３０】
ステロイド療法からの離脱で最も頻繁な問題は、移植の場合におけるグラフト拒絶等の、内在する病状の再発である。その他の合併症としては、ＨＰＡ軸の抑制の結果としての急性腎不全がある。ステロイドの離脱からの回復は、数週間から１年以上になる場合もある。
【００３１】
副腎不全症候群と閉経期後のエストロゲン消失、卵巣摘出または子宮全摘出によるエストロゲン消失の治療の他に、免疫介在疾患であり、または、リウマチ疾患、腎臟病、アレルギー疾患、気管支喘息、眼の疾病、皮膚病、胃腸疾患、肝疾病、悪性腫瘍、（寄生物または新生物による）脳浮腫、溶血性貧血および発作と脊髄損傷等の炎症性メディエーターの制御を必要とする非内分泌障害を治療するためにステロイド療法を施す場合がある。
【００３２】
ステロイド療法が用いられるその他の容態または疾病としては、副腎過形成、副腎皮質不全、先天性脱毛症、後天的な血性貧血、（先天的な）再生不良性貧血、強直性脊椎炎、痛風性関節炎と乾癬性関節炎、ベリリウム中毒症、気管支喘息、滑液嚢炎、アレルギー結膜炎と春期結膜炎、脳性麻痺、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、膠原病、アレルギー性結膜炎と角膜辺縁潰瘍、アトピー性皮膚炎と接触皮膚炎、疱疹状水疱性皮膚炎、脂漏症、紅班性狼瘡による浮腫、ループス腎炎、脳浮腫、限局性腸炎、上顆炎、赤芽球減少症、環状肉芽腫、眼部帯状疱疹、虹彩毛様体炎等の眼の炎症、虹彩炎、ケロイド、角膜炎、咽喉浮腫、扁平苔癬、慢性単純性苔癬、レフラー症候群、円盤状紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、髄膜炎、結核性髄膜炎、筋炎、菌状息肉腫、糖尿病性リポイド類壊死症、ネフローゼ症候群／腎炎症候群、抗糸球体基底膜腎炎、眼炎、視神経炎、骨関節炎の滑膜炎、天疱瘡、乾癬、特発性血小板減少性紫斑病、リウマチ性心臓炎、関節リウマチ、慢性鼻炎、サルコイドーシス、強皮症、血清病、ショック、スティーヴンズ‐ジョンソン症候群、腱鞘炎、高安動脈炎、ヴェグナー肉芽腫症、急性非特異的血小板減少症、甲状腺炎、心筋が関与するる旋毛虫症、神経の関与する旋毛虫症、結核、じんま疹、ブドウ膜炎を例示できるが、これらに制限されるわけではない。
【００３３】
ステロイド療法は、また、骨髄移植または多臓器移植等の、器官または組織の移植と共に使用され得る。本発明のある態様では、ステロイドが、高用量でおよび／または長期に投与される。
【００３４】
免疫細胞異常に起因する癌は、一般に、ステロイド剤で治療される。これらには、多発性骨髄腫等の骨髄癌および、骨髄性白血病（ＣＭＬ）ならびに、リンパ性白血病（ＣＬＬおよびＡＬＬ）およびリンパ腫、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）が含まれる。前立腺癌および乳癌等の充実性腫瘍を形成するその他の癌は、本発明の方法で治療することができ、毒性が最小限であることから、他の薬剤と組合せて使用し、また、放射線療法等の補助的な治療形態を行う場合に使用することができる。
【００３５】
その他の「充実性腫瘍」を形成する癌には、線維肉腫等の肉腫や癌腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルム腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜種、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、膵腺癌または胃腺癌、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）関連の頚部上皮内癌および肝癌が含まれるが、これらに限られる訳ではない。
【００３６】
二次性の腫瘍（転移）は、体内の原発性部位で発生し、遠くにある器官にまで広がった腫瘍である。転移の一般的な経路は、隣接構造への直接の成長、血管系またはリンパ系を通る伝播および、たとえば、腹水または脳脊髄液による組織面と体腔に沿った経路である。二次性の肝癌は、癌患者の死因のうちもっとも一般的なものの一つであり、肝腫瘍のはるかに最も一般的な形式である。実際上、どのような悪性腫瘍も肝臓に転移し得るが、もっとも肝臓にまで拡大し易い腫瘍には、胃、結腸および膵臓の癌；メラノーマ；肺、中咽頭および膀胱の腫瘍；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫；乳房、卵巣および前立腺の腫瘍がある。二次性の肺、脳および骨の腫瘍は、乳房、前立腺および肺のかなり進行した段階の癌の場合に普通に起こる。どんな癌でも骨に転移し得るが、癌腫からの転移が最も一般的であり、特に、乳房、肺、前立腺、腎臓および甲状腺から転移が生じる。肺の癌腫には、肝臓、脳、副腎および骨への血行性転移拡大が伴うのが極めて一般的であり、初期に起こり得、明らかな肺の症状の前にそれらの部位で症状が見出される。肺への転移は、乳房、結腸、前立腺、腎臓、甲状腺、胃、頚部、直腸、精巣および骨の原発性の癌およびメラノーマからのものが一般的である。上記のそれぞれの二次性腫瘍は、本発明の抗体によって治療し得る。
【００３７】
骨の消失
骨の消失は、癌患者の血中ＩＬ−６が高レベルである場合のステロイド療法に関連しおよび／または起因する。加齢とエストロゲン欠失のための骨の消失に加え、あらゆる年齢の男女両方で、全ての人種を含む患者が、ステロイドによって誘導される骨の消失に対し感受性を有する。グルココルチコイドとステロイドとの投与は、骨粗鬆症の三番目に大きな原因である。ステロイドによって誘導される骨の消失は、通常、軸骨格の皮質骨および網状骨に影響を及ぼす。６ヶ月より長くステロイドを服用した個体の３０〜５０％が骨粗鬆症を引き起こす。骨の消失速度は、治療の初年度では非常に大きく、骨の２０％もが初年度に失われる。プレドニゾンの投与量が７．５ｍｇ／日を上回ると、大抵の人で、骨梁に有意な損失が生じる。
【００３８】
マウスに投与されたグルココルチコイドの研究では、ステロイドによって誘導される骨の消失が、アポトーシスを起こした／死んだ破骨細胞と骨芽細胞の数がより高いことから生じる骨形成の減少によることが示唆されている。グルココルチコイドによって誘導される骨疾患で見られる変化は、これらの細胞数がより少なくなることで説明できよう。死亡／アポトーシスによる骨芽細胞と骨細胞の数の減少も、グルココルチコイドによって誘導される骨粗鬆症の患者で見出された（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ等、１９９８年）。
【００３９】
この領域における現時点での理解とかなりの量の研究にも拘わらず、骨の消失と骨粗鬆症とは、重要な医学的および経済的課題としてとどまっている。従って、たとえば骨細胞と骨芽細胞とのアポトーシスを減少させ、あるいは防止することによって、骨の消失を減少させ、あるいは防止する方法は、本技術分野において重要な進歩であると言えよう。
【００４０】
かくて、本発明の特に有利な態様によれば、骨吸収およびそれと同時の高カルシウム血症等の骨に対する影響を防止しまたは改善しつつ、ステロイド療法で疾病を治療することが可能である。
【００４１】
アポトーシス活性の評価方法
アポトーシスのプロセス中に、細胞がアポトーシスを受けるかどうかおよび／またはアポトーシスの程度を決定するために評価できる多くの事象が起こる。アポトーシス中に、核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ）が分離し、可溶化することが示された。アポトーシスを起こした細胞核中に見られる形態上の変化の理由はこのことにより説明できるように思われる。従って、ラミン等の一以上のＮＭＰの（特に分解した状態における）放出の検出を、アポトーシスの分析に使用できる。アポトーシスの他のマーカーとしては、核構造の消失および染色体の個々の球体への凝縮に関連した形態学的測定がある。ＤＮＡの分解により、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動によってＤＮＡラダーとして視覚化できる１８０〜２００ｂｐのフラグメントが生じる。これらのヌクレオソームフラグメントは、放射能により、蛍光により、または色を生み出す反応を触媒し得る酵素により、ラベリングすることもできる。フリーの３’ヒドロキシル基を有するフラグメントは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用してラベリングでき、末端３’ヒドロキシル基を持たないフラグメントは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用してラベリングできる。
【００４２】
核の変化に加えて、アポトーシスの初期に、原形質膜とミトコンドリア膜に混乱が生じる。正常細胞では原形質膜二重層の内部表面に限られているホスファチジルセリンが、外側の原形質に外面化される。原形質膜の外面上のホスファチジルセリンは、ホスファチジルセリンに高い親和性を有するアネキシン（Ｍａｒｔｉｎ等、１９９５年）または抗ホスファチジルセリン抗体によって検出することができる。さらに、トリパンブルーおよびヨウ化プロピジウム等の、生存能力を有する細胞からは排除されるある種の染料により、これらの膜の混乱によるアポトーシス細胞が染色される。
【００４３】
染料、ＭＴＴ（［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］）への電子移動を測定すること等による、乳酸デヒドロゲナーゼ等のサイトゾル酵素の放出またはミトコンドリア機能の消失は分光測光法で測定することができる。
【００４４】
アポトーシスをモニターするのに現在使用されている分析法の中で最も一般的なものには、細胞の形態を決定するための光学顕微鏡検査や電子顕微鏡検査等の視覚法、生体染色色素の排除、ヨウ化プロピジウム、アクリジンオレンジ、ビスベンズイミド（ヘキスト３３２５８および３３３４２）および緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光染料による核染色、蛍光によりラベリングされた細胞の蛍光活性細胞分離法（ＦＡＣＳ）等の間接的な方法、サイトゾル酵素乳酸デヒドロゲナーゼの放出の分析、ＭＴＴ／ＸＴＴアッセイ、アネキシンＶまたは抗ホスファチジルセリン抗体の結合の検出、ＤＮＡの断片化の検出、核マトリックスタンパク質Ａ等の可溶性核マトリックスタンパク質の細胞からの放出の検出、核外膜からのラミンの消失の検出およびフリーのヌクレオソームの検出がある。さらに、ある種の例では、アネキシンＶまたは抗ホスファチジルセリン抗体の結合の決定とヨウ化プロピジウム等の染料排除との組合せのように、これらの分析法が組み合わされて使用される。ＦＩＴＣまたはビオチンでラベリングされたアネキシンＶおよびモノクローナル抗ホスファチジルセリン抗体が利用できる。これらのＤＮＡフラグメント、核マトリックスタンパク質に対する四つのモノクローナル抗体のラベリングと検出用のキットおよび、可溶性核マトリックスタンパク質、抗ラミニン抗体検出用のキットが、フリーのヌクレオソーム検出用のキットと同様、利用可能である。これらの試薬の多くは、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）から商業的に入手可能である。
【００４５】
ステロイド組成物
グルココルチコイドの合成類似体またはヒドロコルチゾンの製剤が、酢酸コルチゾン、デキサメサゾン、酢酸メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾンまたはプレドニゾロンの名前で商業的に入手可能である。これらの活性成分を含む製剤は、種々の供給元から入手可能であり、一般的に、静脈内にまたは錠剤として経口的に癌患者に投与される。トリアムシノロンアセトニドは、トリアムシノロン（Ｍｕｒｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の誘導体で、炎症の動物モデルでは、プレドニゾンより約８倍の薬効を有し、鼻腔内噴霧剤として利用されている。ロテプレドノールエタボネートは、構造的に他のコルチコステロイドと類似しているが、第２０位のケトン基がなく、視覚上の徴候について優先的に使用される。メドリゾンは、局所的な抗炎症活性および抗アレルギー活性を有する合成コルチコステロイドである。ジプロピオン酸アルクロメタゾン、ベータメサゾン、モメタゾンフロエート、プロピオン酸ハロベタゾール、フルオシノロンアセトニドおよびフルランドレノリドは、合成コルチコステロイド（典型的にはフッ素化誘導体）であり、局所的に投与できる皮膚科の用途に特に好ましい。上記の活性薬剤のいずれかを含む組成物は本発明の範疇に属する。
【００４６】
ＩＬ−６アンタゴニスト
ここで用いられる用語「ＩＬ−６アンタゴニスト」は、ＩＬ−６の脈管形成活性を抑制または中和する物質を意味する。このようなアンタゴニストは、さまざまな方法でこの効果を達成する。ある種のＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６の脈管形成効果を中和する十分な親和性と特異性とを持つＩＬ−６タンパク質と結合する。この分子の群に属するものには、抗体および抗体フラグメント（たとえば、Ｆ（ａｂ）またはＦ（ａｂ’）2分子）がある。ＩＬ−６アンタゴニストのもう一つの群は、ＩＬ−６に結合し、これにより、ＩＬ−６の脈管形成活性を抑制する、ＩＬ−６タンパク質のフラグメント、突然変異タンパク質または小有機分子（すなわちペプチド模倣体）である。ＩＬ−６アンタゴニストは、ＩＬ−６の脈管形成活性を抑制する物質である限り、これらのどの群のものであってもよい。ＩＬ−６アンタゴニストには、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体、抗ｇｐ１３０抗体またはアンタゴニスト、特許文献４に開示されているような改質ＩＬ−６、アンチセンスＩＬ−６ＲおよびＩＬ−６またはＩＬ−６Ｒの部分ペプチドが含まれる。
【００４７】
抗ＩＬ−６抗体および薬剤
本発明の方法には、本技術分野で公知のどのような抗ＩＬ−６抗体も使用することができる。たとえば、特許文献１から知られているような、ＩＬ−６に対するマウスモノクローナル抗体がある。または、受容体のシグナル伝達を抑制することができる、Ｂ−Ｅ８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、フランス）として知られる抗体またはＣＬＢ−６／８と呼ばれる抗体（非特許文献１６）を使用することができる。抗体の治療作用に悪影響を及ぼし、抗体の治療作用をなくす原因となる、抗体への免疫反応を避けるためには、ヒトの抗体または人に近い抗体スカフォールドを投与することが好ましい。特許文献２は、マウスモノクローナル抗体ＳＫ２に由来する、ヒトのＩＬ−６に対し再構築された抗体であって、マウス抗体ＳＫ２の可変領域からの相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ）が、ヒトの抗体の可変領域に移植され、ヒトの抗体の定常領域に結合されたものについて開示している。ｃＣＬＢ８と呼ばれる、ＣＬＢ−６／８マウス抗体のキメラ化された形態のマウスＩＬ−６モノクローナルが造られ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、オランダ、Ｌｅｉｄｅｎ）、多発性骨髄腫患者に与えられた（非特許文献１３参照。）。マウス抗原結合ドメインから目的とする抗体を作製する方法は、参照により本出願に包含される本出願人の同時係属出願、ＵＳＳＮ  １０／２８０，７１６に完全に記載されている。
【００４８】
その抗体製品が、同族の受容体または受容体複合体との相互作用による目標の細胞中でのＩＬ−６のシグナル伝達を防止する能力を維持するのであれば、非ヒトの種で育てられた抗体をヒト化しまたは霊長類化するその他のプロセスも本発明の抗体を構築するのに適する。
【００４９】
ＩＬ−６受容体アンタゴニスト、Ｓａｎｔ７（非特許文献１１参照。）等のＩＬ−６の減少に影響するその他の薬剤も採用することができる。
【００５０】
ステロイドと抗ＩＬ−６薬剤との抗アポトーシス的組合せ
本発明の好ましい組合せでは、中和用抗ＩＬ−６モノクロナール抗体と組み合わせて患者に投与される、デキサメサゾン等の標準の静脈内または経口投与のステロイド製剤が使用される。
【００５１】
ここで説明する中和用抗ＩＬ−６モノクローナル抗体は、天然に産生されるコルチコステロイドまたはステロイド剤療法と組み合わせてアポトーシスを増進、促進し、それによって腫瘍の成長を防止または弱め、転移を防止または抑制するために使用することができる。さらに、上記モノクローナル抗体を、そのような治療に適した疾病におけるステロイド剤の消炎作用を増強するのに使用することができる。
【００５２】
抗ＩＬ−６モノクローナル抗体とステロイドとの組合せの有益な効果は、腫瘍反応、原発性腫瘍の成長の局所的制御および転移の拡大の発生率または速度の低下に見られる。第二に、この応答は、これら二つの薬剤のいずれかを単独で使用するよりもより効果的である。この組合せは、原発性脳腫瘍に対し二次的に発生する多発性骨髄腫および浮腫または、有効な治療が未開発である脳転移等の広範な疾病で使用できる。抗ＩＬ−６とデキサメサゾンとを組み合わせることは、ステロイド療法に対する耐性を克服でき、疾病の進行と関連症状とを抑制するのに必要なプロセスであるステロイドの漸減プロセスを最小限にするのに必須の効果を達成するために必要なステロイドの投与量を減少するのにも役立ち得る。最後に、化学療法と共に使用されるときには、この組合せによりステロイドへの耐性を低下できる。さらに、この組合せ治療により、脳浮腫にプラスの影響を及ぼすことができる。現在、脳浮腫の治療にステロイドが使用されている。ステロイドの効果を高め、ステロイドの漸減の間に観察される副作用を減少させるために、抗ＩＬ−６療法を使用できよう。
【００５３】
現在、アポトーシスプロセスの開始を活性化する刺激に至るシグナル伝達経路はいくつかあると考えられている。これらの経路を活性化する刺激には、グルココルチコイドまたはその類似体に加えて、電離放射線およびセラミドを含む多様な受容体（ＪＮＫ、ＦＡＳおよびステロイド受容体）が使用される（非特許文献２５参照。）。他方、ＩＬ−６によって活性化される生存シグナルには、ＲＡＦＴＫを遮断するＳＨＰ２が含まれることが証明されている。ＲＡＦＴＫは、グルココルチコイドによって誘導されるシグナル開始アポトーシスのために必要である（非特許文献２６参照。）。ステロイドによって媒介されるアポトーシスのＩＬ−６アンタゴニズムの少なくとも一つの機構の細胞内の生化学基礎は、このようにして理解することができる。
【００５４】
最も広い意味では、その他の薬剤の組合せも本発明に含まれる。たとえば、アポトーシスを誘導するいくつかの化学療法剤が知られている。これらには、ドキソルビシン、三酸化ヒ素、レチノイド、スタウロスポリン、エトポシド、５−フルオロウラシル、パクリタクセル、ＳＴ１５７１（グリーベック）、フラボプリド（Ｆｌａｖｏｐｒｉｄ）、電離放射線、トレイル（Ｔｒａｉｌ）、ＢＣＬ−２アンチセンスおよび阻害物質（非特許文献２７参照。）が含まれる。ファルネシルトランスフェラーゼ抑制剤（非特許文献２８参照。）は、毒性プロフィールが許容でき、かつ相加的でない限り、アポトーシス誘導剤とうまく組み合わせることができる。
【００５５】
治療される個体はどのような哺乳類でもよいが、好ましくは、霊長類、哺乳類である伴侶動物および、最も好ましくはヒトの患者である。投与されるモノクローナル抗体の量は、使用される目的と投与の方法とによって異なる。
【００５６】
本発明の抗ＩＬ−６抗体は、グルココルチコイドによって誘導されるアポトーシスを増強することが望まれる組織に効果を生じる方法ならどのような数の方法によって投与してもよい。さらに、本発明の抗ＩＬ−６抗体は、ＩＬ−６を含む液体の体内区分に対するアクセスが可能な場所ならどこにでも投与できる。炎症を起こしたか、悪性であるか、またはその他の障害が生じた組織の場合、これらの方法には、抗体を含有する製剤の直接の適用が含まれ得る。このような方法には、液状組成物の静脈内投与、液体または固形の製剤の皮膚投与、経口投与、局所性投与または、間質または手術間の投与が含まれる。投与は、たとえば、血管のステントのように、主機能がドラッグデリバリーの媒介物としてのものではないデバイスのインプラントによって影響を受け得る。
【００５７】
投与は、腫瘍または組織への経口または局所的注入でもよいが、モノクローナル抗体は、一般的には静脈内に投与される。投与量は、通常、約０．０１〜約１２．０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。これは、マイクロプロセッサで制御されたプログラム可能なポンプデバイスによって制御することができる、大量注入またはゆっくりとしたあるいは連続した点滴であり得る。
【００５８】
あるいは、好ましくは上記モノクローナル抗体のフラグメントをコード化しているＤＮＡをハイブリドーマ細胞から分離し、哺乳類に投与することができる。ＤＮＡは、裸の形態で投与しても、あるいは、患者の細胞中にＤＮＡが形質発現し、抗体がデリベリされるようになるやり方で、組換えベクター（たとえばワクシニアウイルス）中に挿入してもよい。
【００５９】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体は、たとえば、非特許文献２９に記載されたように、薬剤組成物を調製する確立した方法であればどのような方法によって調製してもよい。投与の容易さのために、モノクローナル抗体は、一般的に、薬学上許容できるキャリアと組み合わされる。そのようなキャリアには、水、生理食塩水または油が含まれる。
【００６０】
非経口の投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬および、製剤を意図された服用者の血液と等浸透圧にする溶質を含み得る、水性および非水性の滅菌注射溶液ならびに、懸濁剤と増粘剤とを含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。従来の媒体は、活性成分とその意図された用途とに不適合である場合を除いて、どのような組成でもその使用を考慮することができる。
【００６１】
本製剤は、たとえば、密封アンプルおよび密封ビン等の、一回服用量の容器で提供しても多数回服用量の容器で提供してもよく、使用の直前に、滅菌された液状キャリア、（たとえば注射用の水）の添加のみを必要とするフリーズドライの（凍結された）条件で保存してもよい。
【００６２】
略号
Ａｂｓ：抗体、ポリクローナルまたはモノクローナル
ａＶ：インテグリンサブユニットαＶ
ｂ３：インテグリンサブユニットβ３
ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞成長因子
ＩＦＮ：インターフェロン
Ｉｇ：免疫グロブリン
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＬ：インターロイキン
ＩＬ−６：インターロイキン６
ＩＬ−６Ｒ：インターロイキン６受容体
ｓＩＬ−６Ｒ：可溶性インターロイキン６受容体
Ｍａｂ：モノクローナル抗体
ＶＥＧＦ：血管内皮成長因子
【００６３】
これまで、本発明を一般的用語で記述したが、以下の例では、本発明の形態をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００６４】
多発性骨髄腫細胞中でデキサメサゾンにより誘導されたアポトーシス：抗ＩＬ−６抗体を使用する、ＩＬ−６により媒介される抑制作用の軽減
【００６５】
多発性骨髄腫は、従来の療法に耐性を有する悪性の形質細胞疾患である。ＩＬ−６が骨髄腫細胞の成長および分化因子であることは公知である。デキサメサゾンは、多発性骨髄腫用の標準の療法の一部であるグルココルチコイドである。デキサメサゾンは、アポトーシスの誘導により多発性骨髄腫細胞および細胞系にアポトーシスを誘導することが報告されている。
【００６６】
材料と方法
細胞系ＲＰＭＩ  ８２２６（ヒト多発性骨髄腫細胞系）を、ＡＴＣＣ（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉ１ｌｅ）から購入した。細胞を生育し、ＡＴＣＣの指示書に従い、１０％のＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ、１％のＬ−グルタミンおよび１％のピルビン酸ナトリウムを含有する完全なＲＰＭＩ媒体中に保持した。
【００６７】
分析では、キメラＣＬＢ８（ｃＣＬＢ８）（ペンシルバニア州、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ）を、三つの相異なる濃度で使用した。Ｃｅｎｔｏｃｏｒで開発されたもう一つのキメラ・ヒト−マウスＩｇＧ（ｃ１７１Ａ）を、陰性対照抗体として使用した。
【００６８】
デキサメサゾンにより誘導されたアポトーシス
ＲＰＭＩ  ８２２６細胞（１×１０6／ｍＬ）を、５％ＣＯ2培養器中で、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）、デキサメサゾン（１μＭ）、ｃ１７１Ａ対照用抗体（１μｇ／ｍＬ）または、三つの濃度（１μｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬまたは１０ｎｇ／ｍＬ）のＣＮＴＯ  ３２８を使用しまたは使用しないＲＰＭＩ完全媒体中、３７℃で４８時間培養した。培養後、細胞を回収し、非特許文献３０に開示されたＴｕｎｅｌアッセイ（Ｔｄｔによって媒介されるｄＵＴＰ−ＦＩＴＣニックエンドラベリング）を若干変えて、アポトーシスの測定に使用した。要約すれば、上記の４８時間の培養の後、約１０6個の細胞を回収し、二回洗浄し、１％のパラホルムアルデヒドで１５分間固定した。洗浄後、細胞を、５分間、０．１％のトリトン（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）で浸透し、二回洗浄した。０．３ｎＭのＦＩＴＣ−１２−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、インディアナ州、インディアナポリス、マンハイム）、２．５ｍＭのＣｏＣｌ2、１２．５ＵのＴｄｔおよび５μＬの５Ｘ  Ｔｄｔ緩衝剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、マンハイム）（全体積は５０μＬ）を使用して、加熱ブロック中３７℃で１時間ラベリング反応を行った。細胞は、フローサイトメトリーによって分析した。
【００６９】
Ｔｕｎｅｌアッセイを完了した後、細胞を二回洗浄し、１５ｍＷの空冷式の４８８ｎｍアルゴンレーザーを備えたＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）で分析した。デブリを除去するためのゲーティングは、前方散乱（ＦＳＣ）と側方散乱（ＳＳＣ）の減少に基づいた。１サンプル当たり最低１０，０００の事象を収集し、全ての分析を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、サンノゼ）で実行した。
【００７０】
結果
これらの結果から、細胞のアポトーシスを促進する点で、デキサメサゾンとｃＣＬＢ８の組合せが、どちらか一方の薬剤のみでの処理より優れていることが証明される。
【００７１】
１μＭのデキサメサゾンは、４８時間後にＲＰＭＩ  ８２２６中にアポトーシスを誘導した（図１−Ａ）。デキサメサゾンは、細胞の４５％にアポトーシスを誘導した。１００ｎｇ／ｍＬを超える濃度では、ＩＬ−６が、デキサメサゾンによって誘導されるアポトーシスを抑制した。ＩＬ−６の存在下におけるデキサメサゾンは、細胞の２０％にアポトーシスを誘導しただけであった（図１−Ｂ）。ＩＬ−６とｃＣＬＢ８の両方がある場合には、デキサメサゾンが、細胞の６０％にアポトーシスを誘導した（図１−Ｃ）。
【００７２】
表１は、種々の培養条件を経由したＲＰＭＩ  ８２２６細胞によって示されたアポトーシスの量を示している。ｃＣＬＢ８は、投与量に依存する仕方（Ｐ＜０．０２）で、デキサメサゾンによって誘導されるアポトーシスに対するＩＬ−６の抑制効果を中和した。本表に示されたデータは、三つの実験の代表値であり、Ｐ値は学生用Ｔ検定を使用して計算した。
【表１】
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【００７３】
要約
上記実験は、ｇｐ１３０を含む受容体複合体を介するＩＬ−６のシグナル伝達を防止する特定のモノクローナル抗体によって、アポトーシスに対するＩＬ−６の影響を減少できることを証明するものである。これらのデータは、ＩＬ−６が、多発性骨髄腫細胞中でデキサメサゾンによって誘導されるアポトーシスを抑制することを証明するものである。本報告は、デキサメサゾンによって誘導されるアポトーシスへのＩＬ−６の抑制作用に対するｃＣＬＢ８の中和効果が、グルココルチコイドによって誘導されるアポトーシスを増強することにより、腫瘍細胞の生存を著しく抑制することができ、これらの薬剤のいずれかを単独で使用しても同レベルのアポトーシスを達成できないことを示す最初の報告である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１−Ａ】デキサメサゾンで治療されたときにアポトーシスを積極的に受けている細胞である、（末端デオキシヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼによって媒介されたｄＵＴＰ−ＦＩＴＣニックエンドでラベリングされた）Ｔｄｔ＋  ＲＰＭＩ  ８２２６細胞のデータ点を示す散布図であり、デキサメサゾンで処理された細胞の代表的実験におけるアポトーシスのレベル（４５％）を示している。
【図１−Ｂ】図１−Ａと同様の散布図であり、図１−Ａと同じ濃度のデキサメサゾンで処理された細胞にＩＬ−６を加えたときのアポトーシスのレベル（２０％）を示す散布図である。
【図１−Ｃ】図１−Ａと同様の散布図であり、図１−Ｂと同様、デキサメサゾンとＩＬ−６で処理し、かつ、抗ＩＬ−６抗体も存在した場合の細胞におけるアポトーシスのレベル（６０％）を示す散布図である。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｃ】
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【国際調査報告】
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