(57)【要約】本発明はナノ粒子複合体の製造方法を提供する。該方法は、既知数の二つ以上の置換基（一方の置換基は所望により脱保護後にナノ粒子に結合可能で、他方の置換基は分析又はその他の用途に関与可能である）を可撓性親水性ポリマーに導入することによって中間生成物分子を合成するためのプロトコルと；前記中間生成物分子を、既知数の中間生成物分子を各ナノ粒子に結合させるのに有効な時間及び条件下で，ナノ粒子と接触させてナノ粒子複合体を提供するプロトコルとを含む。
2006513175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子複合体の製造方法であって、
ａ）可撓性親水性ポリマーを含む第一の試薬を用意し；
ｂ）可撓性親水性ポリマーへの置換導入が可能な少なくとも１個の機能性分子を含む第二の試薬を用意し；
ｃ）ナノ粒子を含む第三の試薬を用意し；
ｄ）第一の試薬を、少なくとも１個の機能性分子を可撓性親水性ポリマーに置換導入するのに有効な時間及び条件下で第二の試薬と接触させ；
ｅ）ステップｄ）の前、最中及び／又は後に、可撓性親水性ポリマーに、ナノ粒子への結合が所望により脱保護後に可能な複数の置換基を供給して、少なくとも１個の機能性分子と、ナノ粒子への結合が所望により脱保護後に可能な複数の置換基とで置換された可撓性親水性ポリマーを含む中間生成物を用意し；
ｆ）必要であれば、ナノ粒子への結合が可能な複数の置換基を脱保護し；そして
ｇ）必要であれば脱保護されたステップｅ）の中間生成物を、必要であれば脱保護された中間生成物とナノ粒子とを結合させるのに有効な時間及び条件下で、第三の試薬と接触させてナノ粒子複合体を提供する
ことを含み、ここで最終ステップで１ナノ粒子あたりに複合体化される機能性分子の数が、
・ステップｄ）で、試薬及び反応条件の適切な選択によって、可撓性親水性ポリマーに置換導入される機能性分子の数を制御する；
・ステップｅ）で、試薬及び反応条件の適切な選択によって、可撓性親水性ポリマーに置換導入される、ナノ粒子に結合可能な、所望により保護された置換基の数を制御する；及び
・ステップｇ）で、試薬及び反応条件の適切な選択によって、ナノ粒子に結合する中間生成物分子の数を制御する
の少なくとも一つによって制御される方法。
【請求項２】
１ナノ粒子あたりの機能性分子の数の制御が、
・可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の相対サイズを選択して、ナノ粒子の表面に乗せられる、可撓性親水性ポリマーの分子の数、従って所望により脱保護された中間生成物の分子の数を制御する；
・ステップｄ）で第一及び第二の試薬の相対濃度を選択して、可撓性親水性ポリマーの各分子に置換導入される機能性分子の数を制御する；及び
・可撓性親水性ポリマー１分子あたりの、所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な置換基分子の数を選択する
の少なくとも一つによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｇ）で各ナノ粒子に結合される、必要であれば脱保護された中間生成物分子の所望の数を少なくとも大体決定し、可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の相対サイズを、各ナノ粒子の表面に乗せられる、必要であれば脱保護された中間生成物分子の数が所望の数と少なくとも大体一致するように選択することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｄ）で可撓性親水性ポリマーの各分子に置換導入される機能性分子の所望の数を少なくとも大体決定し、ステップｄ）で試薬濃度及び反応条件をそれに応じて選択することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップｅ）で可撓性親水性ポリマーの各分子に置換導入される、所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な置換基分子の所望の数を少なくとも大体決定し、ステップｅ）で試薬濃度及び反応条件をそれに応じて選択することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の相対サイズが、ステップｇ）で、制御された数の必要であれば脱保護された中間生成物分子をナノ粒子と結合させるのに効果的であるように選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ナノ粒子複合体の製造方法であって、
ｉ）所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な複数の置換基を有する可撓性親水性ポリマーを含む第一の試薬を用意し；
ii）所望により生物分子アッセイにおいて標的分子への結合に適切で、かつ可撓性親水性ポリマーへの置換導入が可能な、１個以上の機能性分子を含む第二の試薬を用意し；
iii）可撓性親水性ポリマーの複数の置換基への結合が可能なナノ粒子を含む第三の試薬を用意し；
iv）第一の試薬を、少なくとも１個の機能性分子の可撓性親水性ポリマーへの置換導入を可能にするのに有効な時間及び条件下で、第二の試薬と接触させ、少なくとも１個の機能性分子で置換された可撓性親水性ポリマーを含む中間生成物を用意し；そして
ｖ）ステップiv）の中間生成物を、中間生成物をナノ粒子と結合させるのに有効な時間及び条件下で、第三の試薬と接触させてナノ粒子複合体を提供する
ことを含む方法。
【請求項８】
中間生成物中の可撓性親水性ポリマーに置換導入される機能性分子の数が、中間生成物を第三の試薬と接触させるステップの前に決定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
中間生成物中の可撓性親水性ポリマー１分子あたりの機能性分子の数が、中間生成物を第三の試薬と接触させるステップの前に決定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ナノ粒子複合体でナノ粒子に結合される中間生成物分子の数を決定するステップを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ナノ粒子複合体中で１ナノ粒子あたりに結合される中間生成物分子の数を決定するステップを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ナノ粒子の平均サイズを少なくとも大体決定し、親水性可撓性ポリマーの総体的サイズを、ナノ粒子複合体が平均数ｚの可撓性親水性ポリマー分子をその表面の周りに乗せられるように（分子量、鎖長及び鎖分枝度の少なくとも一つ以上を考慮して）選択するステップを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ｚがナノ粒子複合体の意図する用途に従って選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ナノ粒子複合体の製造方法であって、
Ｉ）表面積ｘを有するナノ粒子を用意し；
II）ポリマー分子が適切に配置された場合に表面積ｘ／ｙを覆う能力を有するような鎖長及び分枝度を有する可撓性親水性ポリマーを用意し；
III）ポリマーを、ナノ粒子に結合できる複数の複合体化置換基、及び生物分子アッセイ又はその他の用途における機能をナノ粒子複合体に付与できる少なくとも１個の機能性分子で置換し；
IV）およそｙ個のポリマー分子を、前記複数の複合体化置換基を介してナノ粒子に複合体化させる
ことを含み、ここで、可撓性親水性ポリマーは、変数ｙに関して、ナノ粒子あたり少なくとも大体予定された数の可撓性親水性ポリマー分子を有するナノ粒子複合体を提供するように選択される、前記の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られるナノ粒子複合体。
【請求項１６】
平均して１分子の中間生成物が各ナノ粒子に複合体化されていることを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法から誘導可能なナノ粒子複合体。
【請求項１７】
ナノ粒子が金属性で、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｐｄ又はそれらのコンポジットから製造される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法から誘導可能なナノ粒子複合体。
【請求項１８】
ナノ粒子が半導体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法から誘導可能なナノ粒子複合体。
【請求項１９】
ナノ粒子が、選択されたバンドギャップエネルギーを有するコアと、コアより大きいバンドギャップエネルギーを有するシェルとを含む、コア−シェル量子ドットである、請求項１８に記載のナノ粒子複合体。
【請求項２０】
量子ドットのコアが式ＹＸを有し、ここでＹはＺｎ、Ｃｄ、Ｈｇ及びそれらの組合せから選ばれ、ＸはＳ、Ｓｅ、Ｔｅ及びそれらの組合せから選ばれ、量子ドットのシェルが式ＡＢを有し、ＡはＺｎ、Ｃｄ及びそれらの混合物から選ばれ、ＢはＳ、Ｓｅ、Ｔｅ及びそれらの混合物から選ばれ、ＡＢはＹＸと同一でないように選ばれ、ＡＢは量子ドットのコアより大きいバンドギャップエネルギーを有する、請求項１９に記載の半導体ナノ粒子複合体。
【請求項２１】
少なくとも１個の機能性分子をその上に有する可撓性親水性ポリマーに複合体化されたナノ粒子を含み、該複合体化は多数のメルカプト基によって提供される、請求項１〜１４のいずれか１個に記載の方法から誘導可能なナノ粒子複合体。
【請求項２２】
複数のメルカプト基を介して機能化可撓性親水性ポリマーに複合体化されたナノ粒子を含むナノ粒子複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ粒子複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、特に生物分子アッセイに有用なナノ粒子複合体、及びそれらの製造方法に関する。
ナノテクノロジーにおける最近の進歩は、ナノ粒子を、検出、診断、感知及びその他の用途に使用することの可能性を示唆している（論評記事：Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４０（２００１）４１２８−４１５８）。しかしながら、その際、ナノ粒子の品質は、これらの用途の感度及び信頼性に寄与するいくつかの因子の一つにすぎないことを覚えておくことは重要である。感度は、バックグラウンドとは区別できる最小のシグナルに左右されるので、これに寄与するあらゆる因子が感度を低下させる。生物分子アッセイにおいて、バックグラウンドの主たる発生源は非特異的吸着なので、どの複合体化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）方法もこれの最小限化を追求しなければならない。自由溶液中では、抗体とその対応抗原といった二つの結合分子間の反応は極めて速いので、どの複合体化方法にもさらに求められることは、できる限りこの反応を妨害すべきでないということである。ナノテクノロジーと分析化学の統合によって出現した最もエキサイティングなチャンスの一つは、ナノ粒子の光学的性質を微調整できる可能性である。その結果、二つ以上の被検体が同じサンプルで測定できる（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３（２００１）５１６４−５１６５）。しかし、信頼できる結果を得たいなら、複合体化分子が確実に一つの粒子を別の粒子に交換できないようにすることが重要である。
【０００２】
生物系と相互作用するナノ粒子複合体は、最近生物及び医学の分野で広く関心を集めている。これらの複合体は、感知（例えば画像化）及び治療目的（例えば薬物送達）の両方にとって新規血管内プローブとして有望であると考えられている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（２００２）１２６１７−１２６２１）。これらの複合体の要件は、多くの点で生物分子アッセイに使用されるものと同様であるが、更なる要件として、該複合体は生体適合性でなければならず、またインビボにおける用途の場合、生分解性であるか又は細網内皮系として知られる生物学的粒子フィルタを通過できなければならない。
【０００３】
ほとんどのタンパク質は、ある種のナノ粒子に強力に結合する化学基（−ＮＨ2、−ＳＨ2など）を含有している。しかし、必要であればそのような基の数は、例えば２−イミノチオランのようなチオール化試薬、又は遺伝子工学によって増やすことができる。タンパク質がナノ粒子に非特異的に結合するプロセスの詳細はよく分かっていないが、コンフォメーション変化を伴う一連の静電的及び化学的相互作用が関与していると考えられている。この方法で最も広く使用されているのは、抗体の金ナノ粒子への複合体化である（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３６（１９８８）４０１−４０７及びＢｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  ＆  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，７５（２００２）２０３−２４２）。少し過剰の抗体をナノ粒子とアルカリ条件下で短時間インキュベートする。次に非結合タンパク質を除去し、複合体をポリエチレングリコールのようなブロッキング剤で安定化させる。複合体化に必要なタンパク質の最適量は凝集アッセイの手段によって決定できる。電解質を不完全複合体化粒子に加えると凝集する。金ナノ粒子の凝集は、約５２０ｎｍにおけるプラズモン吸収バンドの減少及び／又はレッドシフトによってモニタできる。非特異的に複合体化したタンパク質は相互反発によってナノ粒子を安定化する。凝集を防止するのに必要なタンパク質の最少量は滴定によって決定され、ナノ粒子表面に結合した一重の単層に対応することが多い。その他のタンパク質も類似の方法によって複合体化され、オリゴヌクレオチド及びハプテンのような小分子は、適切な担体タンパク質への共有結合後、複合体化できる。これらの複合体化方法に伴う主な問題は、結合タンパク質は脱着することが知られていることである（Ｉｍｍｕｎｏ−ｇｏｌｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｖｅｒｋｌｅｉｊ及びＬｅｕｎｉｓｓｅｎ編］ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカラートン（１９８９）ｐｐ４９−６０；Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３９（１９９１）３７−３９）。
【０００４】
一価複合体化方法は、ナノ粒子を過剰の分子、すなわち粒子に結合する化学基と生物分子アッセイ又はその他の用途に関与できる結合部位とを含む分子とインキュベートすることを含む（図１に示すとおり）。非結合分子は、次の超遠心分離又はゲル排除クロマトグラフィーのような精製ステップで除去される。一価複合体化はより複雑なプロトコルにおける最初のステップでもあり得る。最近の学会報告には長鎖メルカプトアルコールの金ナノ粒子への複合体化が記載されていた（バイオエンジニアリングにおけるナノテクノロジー：検出、診断及び感知への応用学会(Nanotechnology in bioengineering:applications to detection,diagnostics and sensing conference) 、２００２年１１月７日、米国インジアナ州、でＶ．Ｈ．Ｐｅｒｅｚ−Ｌｕｎａにより発表）。次にアルコール基をエピクロロヒドリンで活性化し、デキストランの層に複合体化させた。カルボン酸基をブロモ酢酸を用いてデキストランに導入し、次いでビオチンに結合させた。これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ用の肉眼的サイズの金基質にイムノソルベント表面をかぶせるのに使用されるプロトコルの適応である（ＷＯ−Ａ−９０／０５３０３に詳述）。しかし、それをナノ粒子に使用すると、多数の化学的ステップ及び精製ステップの結果、低収率に終わる。
【０００５】
−ＳＨ及び−ＮＨ2のような複合体化置換基によってナノ粒子に複合体化された分子は、溶液中では非結合分子と平衡状態にある。確実に複合体合状態を保つにはそれらは強固に結合されなければならないが、金に結合したメルカプト化合物でさえ解離しうる（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１７（２００１）４８３６−４８４３）。この問題に対する一つの解決法は、分子を２個以上の複合体化置換基によって多価的に粒子に複合体化させることである。結合分子とそれらの対応解離生成物間に存在する平衡を図２に示す。一価複合体は、個々の複合体化置換基のナノ粒子に対する親和性に依存する単一の解離定数Ｋdによって特徴付けられるが、多価複合体は一連の解離定数（まとめてＫt）によって特徴付けられる。ジヒドロリポ酸のような二価分子に基づく複合体の報告がいくつかあり（図３）、その一つは抗体を金属ナノ粒子に複合体化させるのに三価のアミノトリチオレート（図４）の使用を記載している（詳細は米国特許第５，９４５，２９３号）。後者の化合物は、元はペプチドを肉眼的金基質に多価結合させるために合成された（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６１（１９９３）７３−７６）。その化合物は、１８０℃に７日間加熱してもこれらの基質に結合したままであった。
【０００６】
ナノ粒子に結合している複合体化置換基が同じナノ粒子への第二の複合体化置換基の結合を増強する程度は、該複合体化置換基が離れている距離、及びそれらを一緒に連結している化学構造による立体障害の量による。デキストランは、生物分子アッセイで非特異的吸着に抵抗し、迅速な動態を可能にすることが知られているグルコースの可撓性ポリマーである（Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｃｔｕａｔ．Ｂ−Ｃｈｅｍ．，５（１９９１）７８−８４；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１（２０００）９５７−９６６）。迅速な動態に好都合なのと同じ可撓性が、同じ多価分子中の複合体化置換基間の立体障害の量も削減する。第一級アミンをデキストランに置換導入すると、アミノデキストラン（ａｍｄｅｘ）生成物は金属及び半導体ナノ粒子と多価複合体を形成できる（米国特許第５，２４８，７７２号；５，５５２，０８６号及び５，９４５，２９３号、並びにＬａｎｇｍｕｉｒ，１６（２０００）３１０７−３１１８参照）。アミノデキストランは、ウワバインのような生物化学的に活性な分子を金ナノ粒子に複合体化させるのに使用されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４５（１９８７）２００−２０８；Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．＆  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，２６（１９８５）１００２−１０１３；Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０５（１９８７）２５８９−２６０１；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（１９８７）３５３１−３５３８）。
【０００７】
ナノ粒子複合体解離の問題は、そこから逃れられないシェル内に粒子を捕捉することによっても回避できる（図５）。金属及び半導体のナノ粒子は、メルカプトプロピルトリメトキシシランの重合によって形成されるシェルに捕捉することができる（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１３（１９９７）３９２１−３９２６；Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１４（２００２）２１１３−２１１９）。シェルはナノ粒子に安定性を付与し、他のシランとの更なる反応で、ビオチンのような結合分子に共有結合できる官能基が導入される（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１４（２００２）２１１３−２１１９）。ナノ粒子は、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋することによって捕捉することもできる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）１８６−１９１；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１（２０００）９４１−９４６）。第一級アミンは還元的アミノ化によってデキストランに導入でき、タンパク質に共有結合される。このようにして製造されたナノ粒子複合体は、非侵襲的磁気共鳴イメージング及びがん治療に使用されている。交互電荷を有する一連の高分子電解質溶液にナノ粒子を暴露すると、ナノ粒子はポリマーシェルに捕捉される。このシェルはコア粒子が溶解しても無傷のまま残るほど丈夫である。一価メルカプト化合物のアニオン層で被覆された金ナノ粒子は、その後ナトリウムポリ（スチレンスルホネート）及びポリ（ジアリルジメチルアンモニウム）クロリドの交互層に捕捉される（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０３（２００１）６８４６−６８５２）。このレイヤー・バイ・レイヤー（layer-by-layer、ＬｂＬ）アプローチはナノ粒子複合体の製造にはまだ使用されていないが、抗体をポリスチレンミクロビーズに複合体化させるのには使用されている（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，２３４（２００１）３５６−３６２）。
【０００８】
生物分子結合アッセイは、標識試薬の濃度が、１）被検体の濃度より高いか、２）被検体の濃度とほぼ同じ又は低いかどうかで二つのカテゴリーに分けることができる。前者の（１）は試薬過剰（ｅｘｃｅｓｓ）アッセイとして知られ、後者の（２）は試薬不足（ｌｉｍｉｔｅｄ）アッセイとして知られている。サンドイッチイムノアッセイは試薬過剰アッセイの例であり、競合イムノアッセイは試薬不足アッセイの例である。試薬過剰及び試薬不足アッセイ間のこの相違の重要性は長年認識されてきた。何の因子が最終的にアッセイの感度を制限することになるかを決めることは知られている（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第２版（１９９７）Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，ｐｐ１７３−２０７及びＣｈｅｍ．Ｅｄ．７６（１９９９）７６９−７８０）。試薬過剰イムノアッセイの感度は、例えば非特異的結合によって制限されるが、試薬不足イムノアッセイの感度はプローブの被検体に対する親和性（Ｋa値）によって制限される。平衡状態で生物分子結合分子と被検体との反応は以下の等式によって説明される。
【０００９】
【化１】
2006513175.tif 000003
【００１０】
Ｋaがプローブ分子の固有親和性として知られている場合、［ＰＡ］は被検体に結合したプローブ分子の濃度、［Ｐ］は遊離プローブ分子の濃度、及び［Ａ］は遊離被検体の濃度である。Ｋaは会合及び解離速度定数の比に等しい。会合速度定数（ｋa）を増加させる、又は解離速度定数（ｋd）を減少させるあらゆる因子は、プローブ分子の被検体に対する固有親和性（Ｋa）を増大することになる。ナノ粒子標識が興味深い一つの理由は、それらがｋaを増加及びｋdを減少させる方法を提供するからである。これをいかに実施できるかを議論する前に、機能的親和性(functional affinity)として知られる別の値を定義することが必要である。等式Ｉ及びIIは一価のプローブ分子と被検体間の平衡を説明しているが、多くのプローブ分子は二つ以上の結合部位を有している。イムノアッセイに最もよく使用される抗体は、例えば二価である。これは、１個の抗体が二つの結合部位によって同じ被検体分子に結合しうる場合もあることを意味する。これが起こった場合、平衡状態にある反応は以下の等式によって説明される。
【００１１】
【化２】
2006513175.tif 000004
【００１２】
式中、Ｋfはプローブ分子の機能的親和性として知られ、下付数字はプローブ分子と被検体との結合数を示している。Ｋfの値はＫaの値よりも桁違いに大きく、プローブ分子が被検体に、より強固に結合していることを示している。Ｋfの増加はｋdの値の減少のためである。
【００１３】
図７に溶液中の二つのナノ粒子複合体（ＮＰＣ）を対応する被検体の分子と共に示す。複合体Ａは、同じナノ粒子に複合体化した多数の同一のプローブ分子を有しているが、複合体Ｂは、ナノ粒子に複合体化した同じ種類のプローブ分子を１個しか持たない。複合体Ａのほうが被検体Ｘへの結合可能性がずっと高い。なぜならば、複合体Ｂの表面の大部分は結合部位を何ら持たないからである。複合体Ａのｋa値は複合体Ｂよりも高く、従ってＫfも高い。図８に、対応する被検体に結合した同じナノ粒子複合体Ａ及びＢを示す。しかしながら、この例では、１個の被検体Ｘ分子は二つ以上の結合部位に乗ることができ、従って、複合体Ｂではなく複合体Ａは多価結合に関与できる。多価結合は、先に説明したとおり、ｋdの値を減少するので、ここでも複合体Ａは複合体Ｂよりも高いＫf値を有する。これらの観察から、ＮＰＣのＫf値は、各粒子に複合体化するプローブ分子の数を調節することによって変更できることが示唆される。
【００１４】
いくつかのグループが、ナノ粒子に複合体化するプローブ分子の数の調節が生物分子の感度に及ぼす影響について研究している（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３（２００１）２２５４−２２６０；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２（１９９２）１２０−１２５；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３（１９９７）１１２−１２２；及びＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７２（１９９９）１６５−１７０）。Ｓｏｕｋｋａらは、試薬過剰イムノアッセイの感度は抗体の数が増加するにつれて直線的に増加することを見出した（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３（２００１）２２５４−２２６０）。彼らは、各ナノ粒子に複合体化する抗体の数がもはや感度の増加をもたらさなくなる上限を検出することはできなかった。それに対し、その他の研究は、各ナノ粒子に複合体化するプローブ分子の数が増加するに従って試薬過剰アッセイの感度は最大まで増加した後は減少することを見出している。より一層の研究が必要であるが、これらの報告から推測されるのは、試薬過剰アッセイにおける最大感度は、１個のナノ粒子あたりのプローブ分子の数が多い、又は少なくとも中程度に多い場合に対応するということである。
【００１５】
試薬不足アッセイにおける状況はさらに複雑である。なぜならば、感度は、各ナノ粒子に結合されるプローブ分子の数だけでなく分離相上の結合部位の密度にも影響されうるからである。ＴＮＴについて試薬不足イムノアッセイを実施する場合、Ｗｉｌｓｏｎらは、感度は二価の全抗体の代わりに一価のＦａｂフラグメントを使用することによって増加できることを見出した（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（２００３）４２４４−４２４９）。感度が増加したのは、Ｆａｂフラグメントが分離相に対して被検体と同様の機能的親和性を有していたためである。二価の全抗体は被検体よりも、分離相（高親和性ハプテニル化デキストラン表面）に対して、高い機能的親和性を有していた。従って、分離相に結合された二価抗体の数に測定可能な変化を生じさせるためには高濃度の被検体が必要であった。複数のプローブ分子に複合体化されたナノ粒子を使用する場合、分離相への多価結合の可能性（感度の低下を伴う）は、二価抗体を使用する場合よりも大きい。
【００１６】
試薬不足アッセイを考えた場合にさらに厄介なことは、１）ナノ粒子に複合体化されたプローブ分子、及び２）ナノ粒子に複合体化された被検体類似体、に基づいて２種類のフォーマットの可能性があることである。前者１）の例はナノ粒子が抗体に複合体化している場合であり、後者２）の例はハプテンがナノ粒子に複合体化している場合であろう。図９Ａ及びＢは、ナノ粒子がＡ）多い、及びＢ）少ない、数のプローブ分子に複合体化している状況を示している。複合体が被検体及び分離相に結合するｋa値はプローブ分子の数が増加するに従ってどちらも増加する。この増加は、分離相への多価結合が起こらなければ感度の増加を伴う。分離相への多価結合が起こる場合、分離相に結合された複合体の量に測定可能な変化を生じさせるには高濃度の被検体が必要となり、感度は低くなる。これは、Ｇｏｌｄｍａｎらが、平均〜３個の抗体に複合体化した半導体ナノ粒子を用いてＴＮＴの試薬不足イムノアッセイを実施したときに見出された（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４（２００２）８４１−８４７）。これらの観察から、感度は、ナノ粒子に複合体化されたプローブ分子の数と分離相上の結合分子の密度との間の関係の関数といえる。最大感度は、多価結合ができない最大数のプローブ分子が粒子に複合体化された場合に達成される。図９Ｂは、ナノ粒子がＡ）多い及びＢ）少ない数の被検体類似体に複合体化している状況を示している。ｋa値は、各粒子に複合体化された被検体類似体の数の増加に影響されず、従って感度の増加もない。しかしながら、多数の被検体分子に複合体化されたナノ粒子は、分離相への多価結合に関与できる。この種の試薬不足イムノアッセイにおける最大感度は、少数の被検体類似体が各ナノ粒子に複合体化している場合に達成される。
【００１７】
従って、ナノ粒子に複合体化されるプローブ分子の数を調節する能力は生物分子アッセイの感度に重要な意味を持っていることが明らかである。プローブ分子の数が調節された以前の研究では、数は最終複合体の段階で決定されている。この研究は、間違いを犯しやすい複雑な方法論とセンシティブな測定を必要とする。本明細書中に記載のハンド−イン−グローブ(hand-in-glove)法の特別の利点は、プローブ分子の数を複合体化前に決定できることである。プローブ分子を高分子量のデキストランに連結し、次いでそれを自己集合（セルフアセンブリ）プロセスによって粒子に複合体化させる。各粒子に複合体化されたプローブ分子の数は、デキストランの大きさとナノ粒子の直径との間の関係によって決定される。
【００１８】
ナノ粒子と生物分子の大きさが類似していることも、それらをインビボでの用途に適切なものとしている。これらのナノ粒子複合体の要件は多くの点で生物分子アッセイに使用されるものと同様であるが、分析プローブ分子を他の機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）分子と置き換えることだけが異なっている。デキストラン層に捕捉され、膜貫通ペプチドに複合体化された超常磁性金属酸化物のナノ粒子は、生細胞による細胞内取込みが可能である。該細胞はＮＭＲイメージングによって検出でき、磁気分離カラム上に保持されうる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）１８６−１９１）。より最近の研究では、肺標的ペプチドで被覆された半導体ナノ粒子複合体はマウスの肺に蓄積し、一方、二つのその他のペプチドは、複合体を腫瘍の血管又はリンパ管に特異的に向かわせることが示されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（２００２）１２６１７−１２６２１）。これらの結果は、疾患の感知、インビボ追跡及び薬物送達用の標的選択ナノ粒子複合体を製造することの可能性を示唆している。
【００１９】
ほとんどの先行技術の複合体化方法は、ナノ粒子に結合されたプローブ又は他の機能性分子の数を最終複合体のレベルで制御しようとしており、それらが低濃度で存在する場合、決定は粒子からの妨害を受けやすい。そこで、何個の結合分子が存在するかを調べるのに電気泳動のような間接的方法の使用が必要になってくる（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１（２００１）３２−３５）。
【００２０】
ナノ粒子に複合体化される機能性分子の数を従来の場合よりも直接的な分析技術によって測定できる、生物分子アッセイ及びその他の用途に使用するためのナノ粒子複合体を提供するのは有益であろう。また、これまでに知られているより高い感度及び／又は信頼性で測定できるナノ粒子複合体を提供するのも望ましいであろう。比較的安定な、好ましくは高度に安定な、容易に解離しないナノ粒子複合体を提供するのも有益であろう。また、粒子に複合体化される分子の数及び種類を従来の場合よりも正確に制御できる、生物分子アッセイ又はその他の用途に使用するためのナノ粒子複合体の製造方法を提供することも有益であろう。また、そのようなナノ粒子複合体の製造方法により、粒子に複合体化される分子の数及び種類をこれまでに知られているより正確に決定できれば、それも望ましいであろう。
【００２１】
本発明の目的は、そのようなナノ粒子複合体及びそれらの製造方法を提供することである。本発明の一つの特別な目的は、生物分子アッセイに使用した場合、非特異的結合に抵抗でき、迅速な動態を可能とし、及び／又は置換及び交換反応に抵抗するナノ粒子複合体を提供することである。本発明の別の目的は、制御された機能的親和性を有するナノ粒子複合体を提供することである。本発明のさらに別の目的は、生物分子アッセイの用途のために制御された数の結合分子を含むナノ粒子複合体を提供することである。
【００２２】
従って、本発明はナノ粒子複合体の製造方法を提供し、該方法は、
ａ）可撓性親水性ポリマーを含む第一の試薬を用意し；
ｂ）可撓性親水性ポリマーへの置換導入が可能な少なくとも１個の機能性分子を含む第二の試薬を用意し；
ｃ）ナノ粒子を含む第三の試薬を用意し；
ｄ）第一の試薬を、少なくとも１個の機能性分子を可撓性親水性ポリマーに置換導入するのに有効な時間及び条件下で、第二の試薬と接触させ；
ｅ）ステップｄ）の前、最中及び／又は後に、可撓性親水性ポリマーに、ナノ粒子への結合が所望により脱保護後に可能な複数の結合置換基を供給して、少なくとも１個の機能性分子と、ナノ粒子への結合が所望により脱保護後に可能な複数の結合置換基とで置換された可撓性親水性ポリマーを含む中間生成物を用意し；
ｆ）必要であれば、ナノ粒子への結合が可能な複数の複合体化置換基を脱保護し；そして
ｇ）必要であれば脱保護されたステップｅ）の中間生成物を、必要であれば脱保護された中間生成物とナノ粒子とを結合させるのに有効な時間及び条件下で、第三の試薬と接触させてナノ粒子複合体を提供する
ことを含み、ここで最終ステップで１ナノ粒子あたりに複合体化される機能性分子の数が、
・ステップｄ）で、試薬及び反応条件の適切な選択によって、可撓性親水性ポリマーに置換導入される機能性分子の数を制御する；
・ステップｅ）で、試薬及び反応条件の適切な選択によって、可撓性親水性ポリマーに置換導入される、ナノ粒子に結合可能な、所望により保護された置換基の数を制御する；及び
・ステップｇ）で、試薬及び反応条件の適切な選択によって、ナノ粒子に結合する中間生成物分子の数を制御する
の少なくとも一つによって制御される。
【００２３】
本発明の方法は、ナノ粒子複合体上の機能性分子の数がナノ粒子複合体の最終用途に応じて制御できるナノ粒子複合体の製造を可能にする。本発明の方法の標的最終製品は、１ナノ粒子あたり所望の数の機能性分子を有するナノ粒子複合体であり、本発明の方法は、所望の標的最終製品を得るための条件の選択を可能にする。１ナノ粒子あたりの機能性分子の所望数が小さければ、本発明の方法によって可能な制御の度合は厳密であり、該方法の操作者が、例えば、本発明の方法によって得られたナノ粒子複合体のサンプル中で、各ナノ粒子に結合された機能性分子の平均数を１種に確信できるほどである。従って、ナノ粒子複合体をある生物分子アッセイに使用しようとする場合、機能性分子がアッセイ分子になり得、１ナノ粒子複合体あたりのそのようなアッセイ分子の平均数はこの最終用途を念頭に制御される（おそらくは比較的小さい数）。しかしながら、機能性分子をある種の他のアッセイ用途又は薬物送達に使用しようとする場合、例えば、１ナノ粒子複合体あたりのそのようなアッセイ分子、薬物送達分子又は薬物分子の平均数はこの最終用途を念頭に制御される（おそらくは比較的大きい数）。こうした状況下での制御の度合はあまり厳密ではないが、操作者が、例えば多数の平均数の機能性分子がナノ粒子に複合体化していることを確信できるという点でなお意義深い。機能性分子は直接機能的であっても（例えばアッセイ分子のように）、あるいはそれらの機能性は、さらに他の機能性分子に結合できうるという点で間接的であってもよい。
【００２４】
所定のサンプルにおける１ナノ粒子あたりの機能性分子の平均数の制御は、好ましくは、以下の、
・可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の相対サイズ（可撓性親水性ポリマーにおける“サイズ”は、分子量、鎖長及び鎖分枝度の少なくとも一つの関数である）を選択して、ナノ粒子の表面に乗せられる、可撓性親水性ポリマーの分子の数、従って所望により脱保護された中間生成物の分子の数を制御する；
・ステップｄ）で第一及び第二の試薬の相対濃度を選択して、可撓性親水性ポリマーの各分子に置換導入される機能性分子の数を制御する；及び
・可撓性親水性ポリマー１分子あたりの、所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な置換基分子の数を選択する
の少なくとも一つによって達成される。
【００２５】
従って、本発明の方法は、ステップｇ）で各ナノ粒子に結合される、必要であれば脱保護された中間生成物分子の所望の平均数を少なくとも大体決定し、可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の相対サイズを、各ナノ粒子の表面に乗せられる必要であれば脱保護された中間生成物分子の平均数が所望の数と少なくとも大体一致するように選択することを含みうる。好ましくは、特に所望数が小さい場合（例えば約１０未満、約５未満、約１〜３又はわずかに１）、各ナノ粒子の表面に乗せられる必要であれば脱保護された中間生成物分子の数は少なくともほとんど正確に所望数と一致する。
【００２６】
本発明の方法はまた、ステップｄ）で可撓性親水性ポリマーの各分子に置換導入される機能性分子の所望の数を少なくとも大体決定し、ステップｄ）で試薬濃度及び反応条件をそれに応じて選択することも含みうる。
【００２７】
本発明の方法はまた、ステップｅ）で可撓性親水性ポリマーの各分子に置換導入される、所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な置換基分子の所望の数を少なくとも大体決定し、ステップｅ）で試薬濃度及び反応条件をそれに応じて選択することも含みうる。
【００２８】
好ましくは、可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の相対サイズは、ステップｇ）で、制御された数の必要であれば脱保護された中間生成物分子とナノ粒子とを結合させるのに有効であるように選択される。
【００２９】
本発明に従ってナノ粒子複合体の製造方法も提供され、該方法は、
ｉ．所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な複数の少なくとも１種類の複合体化置換基を有する可撓性親水性ポリマーを含む第一の試薬を用意し；
ii．所望により生物分子アッセイで標的分子への結合に適切で、かつ可撓性親水性ポリマーへの置換導入が可能な少なくとも１個の機能性分子を含む第二の試薬を用意し；
iii．可撓性親水性ポリマーの複合体化置換基への結合が可能なナノ粒子を含む第三の試薬を用意し；
iv．第一の試薬を、機能性分子を可撓性親水性ポリマーに結合させるのに有効な時間及び条件下で第二の試薬と接触させ、少なくとも１個の機能性分子で置換された可撓性親水性ポリマーを含む中間生成物を用意し；そして
ｖ．ステップiv）の中間生成物を、中間生成物をナノ粒子と結合させるのに有効な時間及び条件下で第三の試薬と接触させてナノ粒子複合体を提供する
ことを含む。
【００３０】
可撓性親水性ポリマーの各分子に結合する機能性分子の数は厳密に制御できるので（例えば第一及び第二の試薬の各々の濃度を選択することによって）、そしてナノ粒子と複合体化する中間生成物分子の数も厳密に制御できるので（例えば、可撓性親水性ポリマーとナノ粒子の各々のサイズを選択することにより、そして場合によっては中間生成物と第三の試薬の各々の濃度を制御することによって）、本発明の方法は、可撓性親水性ポリマー（従ってナノ粒子）が、１ナノ粒子複合体あたり既知の平均数の機能性分子で置換されている、ナノ粒子とナノ粒子に結合された可撓性親水性ポリマーとを含むナノ粒子複合体の製造を可能にする。
【００３１】
従って、本発明は、１個以上の機能性分子をナノ粒子に複合体化させるための方法を提供する。更に詳しくは、本発明はある場合には、平均数が既知の一つ以上の機能性分子を、ナノ粒子に結合可能な化学基を有する複合体化置換基でも置換されている可撓性親水性ポリマーに置換導入するための方法、及び既知数の置換ポリマー分子をナノ粒子に複合体化させるための方法に関する。従って、本発明は、ナノ粒子複合体製造後にその分析的測定をせずとも少なくとも大体既知である数の機能性分子を有するナノ粒子複合体の製造方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、ナノ粒子複合体の製造方法も提供し、該方法は、
Ｉ．表面積ｘを有するナノ粒子を用意し；
II．ポリマー分子が適切に配置された場合に表面積ｘ／ｙを覆う能力を有するような鎖長及び分枝度を有する可撓性親水性ポリマーを用意し；
III．ポリマーに、ナノ粒子に結合可能な複数の複合体化置換基、及び生物分子的機能又はその他の機能をナノ粒子複合体に付与できる少なくとも１個の機能性置換基を置換導入し；そして
IV．およそｙ個の置換ポリマー分子を、前記複数の複合体化置換基を介してナノ粒子に複合体化させる
ことを含み、ここで可撓性親水性ポリマーは、変数ｙに関して、１ナノ粒子あたり少なくとも大体予定された数の可撓性親水性ポリマー分子を有するナノ粒子複合体を提供するように選択される。本方法の一つの好適な適用において、ｙ＝ｘであり、ナノ粒子複合体は、例えば試薬不足生物分子アッセイ及び／又はＤＮＡ発現分析に使用される。本方法の他の好適な適用において、ｙはｘより大きく、場合によってはかなり大きく、ナノ粒子複合体は、例えば試薬過剰生物分子アッセイ及び薬物送達に使用される。
【００３３】
ナノ粒子ベースの生物分子アッセイの感度は一部はそれらの機能的親和性（１ナノ粒子あたりのアッセイ結合部位の数及び親和性）に依存する。本発明の一側面は、ナノ粒子複合体の機能的親和性を制御する方法を提供することである。
【００３４】
本発明の一つの好適な方法において、ナノ粒子に結合可能な複数の置換基は、メルカプト（−ＳＨ）基、又はその代わりに、脱保護されて最終的にはメルカプト基から誘導されるであろうのと同じ複合体化を提供できるジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）又はチオエステル（−ＣＯＳ−）基のいずれかを含む。メルカプト基は大部分のその他の化学基（例えばアミノ−ＮＨ2基）よりもある種のナノ粒子とさらに安定な複合体を形成するので、本発明の別の側面は、メルカプト置換可撓性親水性ポリマー、例えばメルカプトデキストランのナノ粒子への多価複合体化による安定なナノ粒子複合体を、好ましくは各ナノ粒子に複合体化される分子の数を制御する様式で、製造する方法を提供することである。
【００３５】
従って、本発明は、複数のメルカプト基を介して機能化可撓性親水性ポリマーに複合体化されたナノ粒子を含むナノ粒子複合体を提供する。本発明はまた、前述したそのようなナノ粒子の製造方法も提供する。
【００３６】
実際、本発明の方法は、複合体化によってナノ粒子複合体を形成する前に、該複合体の全表面を合成することを可能にする。このことは、表面を高濃度で構築する場合、表面に置換導入される機能性分子の数（ナノ粒子表面への複合体化前）を直接決定でき、従来技術を用いて任意の精製ステップを実施できるので高収率をもたらすという著しい利点を有する。
【００３７】
可撓性親水性ポリマーは、好ましくは、多糖類、ポリエチレングリコール類、ポリビニルアルコール類、ポリアクリル酸類、ポリアクリルアミド類、ポリアミド類（ポリアミノ酸類を含む）、ポリカルボキシル化ポリマー類（ポリアミノ酸類を含む）及びプソイドポリアミノ酸類から選ばれる。適切な多糖類の例は、デキストラン、フコイダン、アラビノガラクタン、コンドロイチン及びそのスルフェート類、デルマタン、ヘパリン、ヘパリチン、ヒアルロン酸、ケラタン、ポリガラクツロン酸、ポリグルクロン酸、ポリマンヌロン酸、イヌリン、ポリラクトース、ポリアクトサミン、ポリイノシン酸、ポリスクロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、グルカン、ニゲラン、プルラン、イリシン、アスパラゴシン、シニストリン、トリシチン、クリテシン、グラミニン、シトシン、リケニン、イソリケナン、ガラクタン、ガラクトカロロース、ルテオース、マンナン類、マンノカロロース、プスツラン（pustulan）、ラミナリン、キサンテン、キシラン及びコポリマー類、アラボキシラン、アラビノガラクタン、アラバン、ラエバン類（フルクトサン類）、テイキニン酸(teichinic acid)、グアラン、カルビン、アルファルファ、グルコマンナン類、ガラクトグルコマンナン類、ホスホマンナン類、フカン類、ペクチン類、シクロ−デキストリン類、アルギン酸、トラガカント及びその他のゴム、キチン、キトサン、寒天、フセララン、カラギーン、セルロース、セルロン酸、又はアラビン酸などの天然多糖類などである。さらに、これらのポリマーの化学的及び／又は酵素的に製造された誘導体も特許請求の範囲に含まれる。デキストラン及びその誘導体、例えばアミノデキストラン、カルボキシデキストラン及びカルボキシメチルデキストランが特に好適である。
【００３８】
所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な複数の複合体化置換基は、そのような結合を化学的に、静電気的に、疎水的に又はそれらの組合せによって実行しうる。可撓性親水性ポリマーは、好ましくはそのような能力を持つペンダント（ぶら下がり）置換基を備えている。そのような置換基は、好ましくは、スルフィド（−Ｓ−）、非対称又は対称ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、セレニド（−Ｓｅ−）、ジセレニド（−Ｓｅ−Ｓｅ−）、メルカプト（チオール、スルフヒドリル（sulphydryl）、−ＳＨ）、ニトリル（−ＣＮ）、イソニトリル、ニトロ（−ＮＯ2）、アミノ（ＮＨ2）、セレノール（−ＳｅＨ）、三価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸（−ＣＯＳＨ）又はジチオ酸（−ＣＳＳＨ）及びチオエステル（−ＣＯＳ−）から選ばれる複合体化基（ナノ粒子に複合体化するための）を含む。これに関して特に好適な結合基は、メルカプト（チオール、スルフヒドリル、−ＳＨ）及びジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）である。
【００３９】
所望により脱保護後にナノ粒子への結合が可能な置換基の、可撓性親水性ポリマー１分子あたりの数は、１より大、好ましくは２より大、さらに好ましくは約３より大、なお更に好ましくは約５より大、最も好ましくは約１０より大である。
【００４０】
機能性分子は、例えば、生物分子アッセイにおいて、生化学受容体を標的とするリガンドとして、又は治療薬もしくは薬理作用薬としての用途を見出しうる。適切な機能性分子の例は、キレート剤、抗原、ハプテン、天然又は合成ペプチド、天然又は合成タンパク質、プロテインＡ、プロテインＧ、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、モノクロナール及びポリクロナール抗体を含む抗体、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂフラグメント、酵素、酵素補因子、ステロイド、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質ホルモンを含むホルモン、特定の炭水化物、天然及び合成モノ−、オリゴ−及びポリサッカリド、遺伝子プローブ、天然及び合成ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド、レクチン、増殖因子、ビタミン、薬物、ホルモン、受容体分子、これらの分子の二つ以上から誘導されたキメラ又は融合分子などである。
【００４１】
ナノ粒子は、金属、例えばＡｕ、Ａｇ又はそれらのバイメタルコンポジットを含みうる。適切なナノ粒子材料のその他の例は、Ｚｎ、Ｃｄ、Ｐｂ、Ｓｎ、Ｈｇ、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ、Ｔｉ、Ｓｉ、Ａｇ、Ｆｅ、Ｆｅ、Ｎｉ及びＣａのスルフィド及びセレニドのような半導体などである。好適な半導体ナノ粒子は、ＣｄＳｅ、ＺｎＳｅ、ＣｄＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＰｂＳｅ、ＰｂＳ及びＣｄＳなどである。酸化鉄のような酸化金属ナノ粒子も使用できる。ナノ粒子はコア−シェル構造を有しうるが、その場合、シェルは金属、半導体又は酸化金属であり得、コアは、金属、半導体、酸化金属又は酸化半金属であり得る。場合によって、コア材料はナノ粒子複合体を磁場応答性にするように選ぶことができる。
【００４２】
一例のみとしての図面を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。
図１〜９は、先行技術に関連して既に記述及び解説した。
以下の解説では、便宜上、可撓性親水性ポリマーがデキストラン又はデキストラン誘導体であり、ナノ粒子に結合可能な複数の複合体化置換基がメルカプト置換基、又は脱保護によってメルカプト置換基によって提供されるであろうのと同じ型の複合体化を提供する保護置換基である、ナノ粒子複合体を参照する。しかしながら、本明細書中ではその他の種類の可撓性親水性ポリマー及びその他の種類の複合体化置換基のことも考慮しており、それらも本発明の範囲及び以下の解説に含まれるということは理解すべきである。
【００４３】
本明細書中に記載の複合体化方法は三つの主なステップに分けることができる（図１０）。第一のステップで、生物分子結合反応に関与できる機能性分子が活性化される。第二のステップで、活性化された分子及びジスルフィド結合を有する分子が置換基の数と種類を正確に決定できる条件下でデキストランに置換導入される。第三のステップで、置換デキストランが、メルカプト基の硫黄原子が粒子に化学結合する自己集合プロセスによってＮＰ（ナノ粒子）に複合体化される。この第三のステップは、各ＮＰに複合体化される置換デキストランの数が、デキストランのサイズ（分子量）と粒子の直径間の関係によって制御されるような方式で実施される。
【００４４】
本発明は、既知及び制御された数の機能性分子により表面ポリマーを複合体化前に高濃度で合成するための方法（図１０に要約）を提供する。この表面ポリマーは、複数のメルカプト基の硫黄原子がナノ粒子に化学結合される自己集合プロセスによってナノ粒子に複合体化される。各ナノ粒子に複合体化されるポリマー分子の数は、ポリマーのサイズ及びナノ粒子のサイズによって決定される。これは、既知数の機能性分子を有するポリマーが、複数の静電気的、疎水的又は化学的相互作用によって粒子に複合体化され、粒子あたりのポリマー分子の数がポリマーのサイズ及び粒子のサイズによって決まるようなナノ粒子複合体の製造方法の一例である。ナノ粒子の一つの利点は、それらが、表Ｉに示されているような、生物分子アッセイに使用される分子と類似した寸法を有していることである。
【００４５】
【表１】
2006513175.tif 000005
【００４６】
本発明は、生物分子（アッセイ）及びその他の用途に関与できる既知数の分子をナノ粒子に複合体化させる方法を提供する。一つのそのような方法では、該分子は、複数のペンダントメルカプト基でも置換されている多糖に共有結合される。該多糖は、メルカプト基の硫黄原子（複数）がナノ粒子に化学結合する多価方法によってナノ粒子に複合体化される。
【００４７】
本発明はその側面の一つにおいて、ナノ粒子複合体の３ステップ製造方法を提供する。方法の第一のステップで、機能性分子が活性化される。方法の第二のステップで、多糖は予め決められた数の２個以上の分子で置換される。その一つは機能性分子で、その一つはメルカプト基、又はメルカプト基に変換できる化学基を有する。第二のステップは、多糖に置換導入される分子の数及び種類を正確に決められる条件下で実施される。方法の第三のステップで、置換された多糖は、メルカプト基の硫黄原子が粒子に化学結合する自己集合プロセスによってナノ粒子に結合される。第二のステップは、各ナノ粒子に複合体化される置換多糖の数を多糖のサイズ及び粒子のサイズ間の関係によって制御するような方式で実施できる。
【００４８】
ここでは数と種類が既知の１個以上の機能性分子をナノ粒子に複合体化させる方法について記載する（図１０）。本発明の目的のために、ナノ粒子という用語は直径が好ましくは約１００ｎｍ未満の粒子のことをいう。方法の第二のパートで、前記機能性分子は、メルカプト基又は保護メルカプト基でも置換されている可撓性親水性デキストランポリマーに共有結合される。方法のこのパートは、好ましくは、ポリマーに置換導入される分子の数及び種類を正確に決められる条件下で実施される。方法の第三のパートで、置換ポリマーは、メルカプト基の硫黄原子が粒子に化学結合する自己集合プロセスによってナノ粒子に結合される。方法の第三のパートは、各ナノ粒子に複合体化されるポリマー分子の数をデキストランのサイズ及び粒子サイズ間の関係によって制御するような方式で実施される。
【００４９】
分子が置換導入される可撓性親水性ポリマーは、好ましくは置換基分子に共有結合できる第一級アミンで誘導体化される。該ポリマーは、好ましくはアミノ多糖及び好ましくはアミノデキストランである。デキストランという語は、反復単位の分枝点；すなわち１  ２、１  ３、１  ４など、にかかわらずＤ−グルコースの任意の分枝多糖のことをいう。アミノデキストランは、第一級アミン（ＮＨ2）基で誘導体化されているデキストランである。アミノデキストランの製造方法は、過ヨウ素酸酸化されたデキストランの還元的アミノ化（Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１１（１９９６）５７９−５９０）、活性化デキストランとモノ保護ジアミンとの反応とその後の保護基の除去（Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９２（１９９１）６７３−６７７）、及び過剰ジアミノアルカンと過ヨウ素酸酸化デキストランとの反応（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０（１９９９）１０９０−１１０６）を含む。
【００５０】
生物分子アッセイ及びその他の用途に使用できるナノ粒子複合体を製造するために、アミノデキストランは、前記用途に関与できる分子で直接的に、又は前記用途に関与できる分子に連結できる化学基を有する分子で間接的に、置換される。分子のアミノデキストランへの直接的置換導入は、好ましくは置換導入される分子又はその誘導体を反応性基で活性化することによって達成される。反応性基の例は、スクシンイミジル又はスルホスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート及びスルホニルクロリドである。活性化された分子の例は、スクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート、フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド−カプロン酸ＮＨＳ及びアトラジンＮＨＳエステル（Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，１２（１９９７）２７７−２８６）である。分子のアミノデキストランへの間接的置換導入は、第一級アミンを二官能性試薬で活性化することによって達成される。二官能性試薬の例は、スクシンイミジルヒドラジニウムニコチネート及び関連芳香族ヒドラジン類、Ｃ６−スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン及び関連芳香族ヒドラゾン類、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート及び関連芳香族アルデヒド類、スベリン酸ビス（ＮＨＳエステル）、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸ＮＨＳエステル、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、３−マレイミド安息香酸ＮＨＳ（ＭＢＳ）、γ−マレイミド酪酸ＮＨＳ（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸ＮＨＳ（ＥＭＣＳ）及びβ−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳ（ＢＭＰＳ）である。
【００５１】
分子をデキストランに置換導入するための方法がいくつか報告されているが（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）ｐｐ．６１８−６２９；ＷＯ９３／０１４９８；及びＷＯ９０／０５３０３）、すべてがＮＰ複合体の製造に適切というわけではない。ジチオール化学は、金属及び半導体表面との接触時に結合が切断されるので適切でない。マレイミド／チオール反応によって形成されるチオエーテル結合はＧＮＰとも結合を形成し、これは生物分子反応を妨害しうる（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１１（２００１）１９１９−１９２３）。アミド結合は安定なので、我々は低分子量の分子をデキストランに置換導入するのにＮＨＳエステル化学を使用した（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，（１９９８）２５４−２６１及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）ｐｐ．１３９−１４０）。ＮＨＳエステル化学は生物分子をデキストランに連結するのにあまり適切でない。なぜならば、活性化された分子は水溶液中で不安定だからである。この問題を克服するために、我々はＮＨＳエステル化学を用いてヒドラジド基をデキストランに置換導入した。ヒドラジドとアルデヒドとの反応はヒドラゾン結合の形成をもたらす。アシルヒドラゾンは加水分解を防止するために還元しなければならないが、強い還元体はプローブ分子を損傷する恐れがあり、一方弱い還元体のシアノ水素化ホウ素ナトリウムは極めて有毒である。我々は、６−ヒドラジノニコチンアミドを使用することによってこれらの問題を回避した。該化合物は還元の必要のない安定なヒドラゾン結合を形成する（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２（１９９１）３３３−３３６及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０（１９９９）８０８−８１４）。この選択の更なる利点は、活性化も置換もＵＶ／可視スペクトルによく特徴付けされた変化を伴うことである。そのため、複合体化に先立って生成物の特徴付けが可能になる。我々は、ＮＨＳエステル及び６−ヒドラジノニコチンアミド化学の組合せを使用することによって、ある範囲の低ＭＷ分子、オリゴヌクレオチド及びタンパク質をデキストランに置換導入した。生物複合体（バイオコンジュゲート）化学に精通した人であれば、この範囲を、ホルモン、ペプチド、酵素、ストレプトアビジン、抗体フラグメント、レクチン及び受容体特異的プローブを含む様々なその他の分子を包含するように容易に拡大できることは分かるであろう。
【００５２】
方法の第三のパートで置換デキストラン分子をナノ粒子に複合体化させるために、アミノデキストランは、メルカプト（チオール、スルフヒドリル、−ＳＨ）基又は保護基の除去によってメルカプト基に変換できる化学基でも置換される。メルカプトデキストランは、キレート剤として使用するため（Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ．Ｓｉｎｉｃａ，１１（１９９０）３６３−３６７）及び肉眼的金表面をデキストランで被覆するため（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２１（２０００）９５７−９６６及びＡｎａｌｙｓｔ，１２８（２００３）４８０−４８５）にこれまで製造されてきた。メルカプト基は、２−イミノチオランのような試薬との反応によってアミノデキストランに置換導入できる。保護基の除去によってメルカプト基に変換できる化学基は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドｓ−アセチルチオ酢酸（ＳＡＴＡ）及びＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸（ＳＡＭＳＡ）のような試薬を用いてアミノデキストランに置換導入できる。ＳＰＤＰはジチオトレイトール（ＤＴＴ）又はトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で脱保護でき、ＳＡＴＡ及びＳＡＭＳＡは、５０ｍＭのヒドロキシルアミンで脱保護できる。本発明の一部の発現において、ＳＡＴＡ及びＳＡＭＳＡは（ＳＰＤＰとは異なって）脱保護前にメルカプト基と反応しないことは重要である。二官能性試薬の更なる例は、Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ及びＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ［Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．］ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，フロリダ州ボカラートン（１９９１）のようなテキストに記載されている。
【００５３】
アミノデキストランへの分子の置換導入は、好ましくは前記分子の数及び種類を正確に決定できる条件下で実施する。この目的のために、分子が比較的高濃度のアミノデキストランに置換導入されれば、置換度がＵＶ／可視分光法のような単純な方法によって正確に決定できるので好都合である。正確な決定のために、ポリマーがナノ粒子からの妨害のない状態で製造されればそれも好都合である。比較的高濃度での製造は精製も容易にし、置換デキストラン生成物の収量も増加する。
【００５４】
方法の第二のパートで、方法の第一のパートで製造された置換メルカプトデキストランをナノ粒子に複合体化させる。本発明の状況において、ナノ粒子は、好ましくは直径約１００ｎｍ未満の金属、酸化金属又は半導体粒子を意味しうる。複合体化は、デキストラン中のメルカプト基又は保護ジスルフィド結合の硫黄原子がナノ粒子に化学結合する自己集合プロセスによって実施される。デキストランが保護ジスルフィド結合で置換されている場合、メルカプト基は、ナノ粒子との接触で前記結合の自然分裂（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４（２００２）５８１１−５８２１）、又は、ＤＴＴもしくはＴＣＥＰのような還元剤又はヒドロキシルアミンのような求核試薬によるジスルフィドの化学分裂（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３（１９７８）７２３−７３７；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２（１９８３）６８−７３）によって生じうる。メルカプト基をジスルフィド結合の化学分裂によって生じさせた場合、置換デキストランは、ナノ粒子に結合可能な小分子を除去するために複合体化前にゲル排除クロマトグラフィーで精製するのがよい。
【００５５】
本発明の別の利点は、各ナノ粒子に複合体化させる分子の数及び種類を精密に制御できることである。固定された数のナノ粒子を異なる量の所定のメルカプトデキストランで滴定する場合、ナノ粒子を安定化させるのに必要なメルカプトデキストラン分子の最小数は、メルカプトデキストラン分子のサイズ及びナノ粒子のサイズに左右される。メルカプトデキストラン分子のサイズでナノ粒子の表面積をどの程度覆えるかが決まる。サイズはデキストランの分子量（ＭＷ）に関連するが、ポリマーの分枝量、機能性分子の数と種類及びメルカプト基の数といったその他の因子も関与する。ナノ粒子のサイズがメルカプトデキストランのサイズとほぼ一致すると、各ナノ粒子が受け入れることのできるメルカプトデキストラン分子の数は１個に制限される。こうなった場合、各ナノ粒子に複合体化される機能性分子の数は、メルカプトデキストランの１分子中の機能性分子の数と等しくなる。ナノ粒子が２個以上のメルカプトデキストラン分子を受け入れられる場合、各粒子に複合体化される分子の数は、メルカプトデキストランの１分子中の機能性分子の数の倍数となろう。
【００５６】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００５７】
本実施例で、既知数のハプテンを有する保護メルカプトデキストラン（ＰＤＰデキストラン）の製造について記載する。１分子あたり平均約１個のハプテンを有する保護メルカプトデキストランを製造するために、６（２，４−ジニトロフェニルアミノ）−１−アミノヘキサン酸［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル］（ＤＮＰＡＨ−ＮＨＳ）及びＳＰＤＰを乾燥ＤＭＳＯ中に溶解し、それぞれ最終濃度を７．２ｍＭ及び０．１１６Ｍとした。この溶液（０．２ｍｌ）を、５０ｍＭ（ｐＨ未調整）の炭酸水素塩溶液５ｍｌに溶解した１０ｍｇのアミノデキストラン（ＭＷ  ７０，０００；Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９２（１９９１）６７３−６７７に記載のフタルアルデヒド法による測定で１分子あたり１６．２個の第一級アミン）に、撹拌しながら滴下添加した。４℃で暗所に一晩放置後、該溶液をＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に装填し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で溶離した。ＰＤ−１０カラムから溶離されたハプテニル化デキストランのＵＶ／可視スペクトルを図１１に示す。このスペクトルは、ジニトロフェノール及び２−ピリジルジスルフィド（ＰＤＰ）のスペクトルと密接に対応しているが、短波長側にデキストランの散乱による少量の吸光度が追加されている。３６０ｎｍにおける吸光度（１．７４×１０4Ｍ-1ｃｍ-1；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７（１９８９）３９２−３９５）及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）添加による３４３ｎｍにおける吸光度の増加（８．０８×１０3Ｍ-1ｃｍ-1；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３（１９７８）７２３−７３７）から、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）ハプテンの保護メルカプト基に対する比率は１６：１と決定された。これはデキストラン１分子あたり１個のハプテンと密接に対応する。提案されたハプテニル化デキストランの構造を図１２に示す。ＤＮＰ以外の分子の反応性誘導体で置換された保護メルカプトデキストランは類似の方法で合成でき、その延長線上で２個を超える既知量の分子（例えばＤＮＰ、ビオチン及びＰＤＰ）もアミノデキストランに置換導入できる。
【実施例２】
【００５８】
本実施例では、既知数のタンパク質を有する保護メルカプトデキストランの製造について記載する。複合体化されるタンパク質が適切なメルカプト基を含有していない場合、２−イミノチオランでチオール化するか、又はＳＰＤＰを用いてから、ジスルフィドの還元的脱保護及びゲル排除クロマトグラフィーを行う。後者のほうが好適である。なぜならば、そのほうがジスルフィド架橋の可能性を最小限にする上、各タンパク質分子に置換導入されるメルカプト基の平均数を、ＤＴＴによる還元時に放出されるピリジンジチオン発色団の量から決定できるからである。抗体へのメルカプト基の導入は、ＰＢＳ中１３．５ｍＭの２−イミノチオラン［ＨＣｌ塩］７５μｌを、２ｍｌのＰＢＳ中１０ｍｇの抗体（ＩｇＧ）の撹拌溶液に加えることによって実施される。室温で１時間傾斜回転した後、チオール化抗体をＰＢＳに対する透析、又はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上のゲル排除クロマトグラフィーによって精製する。単一の抗原結合部位を有するＦａｂ’フラグメントは、ナノ粒子複合体あたりの結合部位の数を１に限定するので、本発明の状況において特に有用である。Ｆａｂ’フラグメントは、ペプシンによる抗体のタンパク分解的切断とその後の２−メルカプトエチルアミンによる還元によって製造される（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２（１９８２）１４１３−１４２４）。それら（Ｆａｂ’フラグメント）は、単一の抗原結合部位から遠く離れたところに１個のメルカプト基を含有しているので、メルカプト基を化学的に導入する必要がない。デキストラン１分子あたり１個のマレイミド基を有する保護メルカプトデキストランは方法１と同様の方法によって製造されるが、ＤＮＰＡＨ−ＮＨＳの代わりにＳＭＣＣを使用し、ＳＰＤＰの代わりにＳＡＴＡを使用する。デキストラン中のマレイミド基に対するメルカプト基の比率は、保護メルカプトデキストランを脱保護フルオレセインＳＡＭＳＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，米国オレゴン州ユージーン）と反応させ、脱保護メルカプトデキストランを５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；１０１（１９８０）４４２−４４８）と反応させることによって測定される。マレイミド基の数は５２０ｎｍにおける蛍光から決定され、メルカプト基の数は４１０ｎｍにおける吸光度（１．３６×１０4Ｍ-1ｃｍ-1）から決定される。デキストラン１分子あたり確実にタンパク質１分子だけにするために、それを、ｐＨ６．０の０．１Ｍリン酸緩衝液中の過剰のチオール化タンパク質（デキストラン中のマレイミドのモル濃度の５倍）に滴下添加し、３０分間傾斜回転する。この時間の終了時に、デキストランタンパク質複合体をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ上で精製する。既知数のオリゴヌクレオチドを有する保護メルカプトデキストランは、類似の方法で製造されるが、チオール化タンパク質の代わりに末端メルカプト基を有するオリゴヌクレオチドを使用する。
【実施例３】
【００５９】
本実施例では、既知数のハプテンを有する金ナノ粒子複合体の製造について記載する。置換メルカプトデキストランをナノ粒子に複合体化するのに使用される自己集合プロセスを図１３に図式的に示す。保護メルカプトデキストラン（ＰＤＰデキストラン）は、ＤＴＴで還元して脱保護し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上でゲルろ過する。既知量のナノ粒子を、水に溶解した異なる量の脱保護メルカプトデキストランと混合し、次いでリン酸緩衝化塩化ナトリウムを加えてＰＢＳ（１５ｍＭ  リン酸Ｎａ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に等しい最終濃度とする。デキストランの量が少なすぎて粒子を安定化できない場合、粒子は図１４に示すようにＰＢＳを添加すると凝集する。粒子の安定化に必要なハプテニル化メルカプトデキストランの最小数は粒子の直径に依存する（実施例４参照）。メルカプトデキストラン分子１分子あたりのハプテンの数及び粒子あたりのメルカプトデキストランの数は既知なので、ナノ粒子複合体あたりのハプテンの数は計算できる。ここに示した実施例では、メルカプトデキストラン分子あたり平均１個のハプテンと、ナノ粒子あたり４個のメルカプトデキストラン分子が存在する。従って、ナノ粒子複合体あたりのハプテンの数は４である。粒子のサイズを変えることによって、ナノ粒子あたりのメルカプトデキストランの数、従ってナノ粒子複合体あたりのハプテンの数は、既知数の分子を各ナノ粒子に複合体化可能な方式で変動させることができる。
【実施例４】
【００６０】
本実施例では、デキストランの数とナノ粒子の直径間の関係を評価するために実施した実験について記載する。ＰＤＰデキストラン（保護メルカプトデキストラン）は、実施例１に記載のように合成したが、ＳＰＤＰのみを使用した（ＤＮＰＡＨ−ＮＨＳなし）。ＰＤＰが置換導入されたアミノデキストランは、ＭＷが１０、４０及び７０ｋＤａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）並びに１７０、５００及び２０００ｋＤａ（Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。それらを既知サイズ及び濃度の金ナノ粒子（ＧＮＰ）（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、英国カーディフ）に対して滴定し、ＰＢＳによる凝集を防止するのに必要な最少量を見出した。図１８は、凝集を防止するのに必要なＰＤＰデキストラン分子の最小数と粒径の二乗との間に直線関係があることを示している。複合体化前にデキストラン分子に連結されている機能性分子の数がわかれば、粒子あたりの機能性分子の数は算出できることが示唆される。
【実施例５】
【００６１】
本実施例では、生物分子アッセイにおけるメルカプトデキストランナノ粒子複合体の使用について記載する。ハプテニル化ナノ粒子複合体の、抗体被覆常磁性マイクロビーズへの生物分子反応を図１５にまとめた。ＤＮＰ−金ナノ粒子複合体（実施例３のように製造）を、対応する抗体（抗ＤＮＰ）で被覆された常磁性ビーズとＰＢＳ−トゥイーン（ＰＢＳ＋１ｍｇ・ｍｌ-1ＢＳＡ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中でゆっくり傾斜回転させた。１０分間の回転後、ビーズを磁気的に沈殿させ、上清のＵＶ／可視スペクトルを記録した。図１６に、ビーズの量の増加につれて吸光度スペクトルがいかに変化したかを示す。回転を１０μＭのＤＮＰの存在下で実施した場合、又は非特異的（抗マウス）抗体で被覆したビーズを使用した場合、対照実験に変化は観察されなかった。磁気的に沈殿させた抗体被覆ビーズを再懸濁し、１０μＭのＤＮＰとともに回転すると、結合ナノ粒子（ＮＰ）が溶液中に放出された。これらの結果は、ハプテニル化メルカプトデキストランで被覆された金ナノ粒子が対応する抗体に特異的に結合することを示している。結果はＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ−２０に影響されず、ハプテニル化メルカプトデキストランは粒子から追い出されなかったことを示した。図１７に示すようにピコモル量の抗体が検出された。
【実施例６】
【００６２】
本実施例では、ナノ粒子あたりのプローブ分子（機能性分子）の数を変動させることによって複合体の親和性を調節するために実施した実験について記載する。２５μｌのＤＭＳＯ中のビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）（０．８ｍｇ）を１ｍｌのＰＢＳ中２ｍｇの抗ＤＮＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）に加えた。該溶液を室温で１時間ゆっくり傾斜回転し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上で精製した。溶出液画分の吸光度は０．８９４で、これは抗体濃度４．９６μＭに対応する。ストレプトアビジン被覆ビーズ（直径０．５６μ；Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インジアナ州フィッシャーズ）をビオチニル化抗体（ビーズ１ｍｇあたり５０μｇの抗体）とともに１時間ゆっくり傾斜回転し、次いでビーズを洗浄溶液としてのＰＢＳ−トゥイーンとともに９０００ｇで分離した。ジニトロフェニル（ＤＮＰ）ハプテンで置換されたＰＤＰデキストランは以下のように合成した。すなわち、１２５μｌの６（２，４−ジニトロフェニルアミノ）−１−アミノヘキサン酸［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル］（ＤＭＳＯ中０．２５ｍｇ・ｍｌ-1）を、０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液１．６ｍｌ中、以下の量：１００ｍｇ、５０ｍｇ、２５ｍｇ、１０ｍｇ及び５ｍｇの２０００ｋＤａアミノデキストラン（Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の強撹拌溶液にゆっくり滴下添加した。１時間の撹拌及び４℃で一晩放置後、全ての溶液を１．６ｍｌの炭酸水素溶液中５ｍｇのデキストランの濃度に調整した。次に、１２．５ｍＭのＳＰＤＰを含有するエタノール０．４ｍｌを各撹拌溶液に加えた。一晩放置後、溶液を秤量し、水に対して透析し、再度秤量した。最終のデキストラン濃度は、透析中の希釈度（透析前の重量／透析後の重量）から計算した。図１９に、同一濃度に調整した溶液のＵＶ／可視スペクトルを示す。３６０ｎｍの吸光度ピークはＤＮＰによるもので、２３５及び２８２ｎｍのピークはＰＤＰによるものである。短波長側にデキストランによる少量の吸光度が認められる。デキストラン濃度及び３６０ｎｍにおける吸光度（１．７４×１０4Ｍ-1ｃｍ-1）から、２０００ｋＤａのデキストラン１分子あたり１．２、４．４、５．９、８．６及び１２．０個のジニトロフェニル（ＤＮＰ）ハプテンの存在が算出された。滴定から１５ｎｍのＧＮＰの凝集を防止するのに粒子あたり最低１個の２０００ｋＤａのＰＤＰデキストランが必要ということが示されている。従って、１５ｎｍの粒子に複合体化されたハプテンの平均数も１．２、４．４、５．９、８．６及び１２．０であった。異なる数のハプテンに複合体化された同じ数のＧＮＰを、抗ＤＮＰ被覆マイクロビーズとともに室温で１時間ゆっくり傾斜回転し、次いでビーズをＰＢＳ−トゥイーン中で３００ｇ（２回）及び水中で９０００ｇ（１回）で遠心分離した。最終ペレットを真空遠心機で蒸発乾固させ、２５μｌの水に再懸濁させた。次にそれらをインハウスマルチウェルプレートに移し、図２０に示すようにドキュメントスキャナで画像化した。これは、抗体によって結合されたＧＮＰの数は粒子あたりのハプテンの数が増加すると増加することを示している。各ウェルの色の数値データは、対応するグレースケール画像に変換後に得られた。これを図２１に示す。これらの結果は、本明細書中に記載の複合体化方法を用いれば、ナノ粒子に結合されるプローブ分子の数、従ってそれらの機能的親和性を制御された様式で調節できることを示している。このことは、ナノ粒子を基にした生物分子アッセイの感度に重要な意味を持つ。
【実施例７】
【００６３】
本実施例では、ＤＮＰについての試薬不足イムノアッセイが実施できるか否かを立証するために実施した実験について記載する。実施例６に記載のように、抗ＤＮＰ抗体をビオチニル化し、マイクロビーズをビオチニル化抗体で被覆した。イムノアッセイは、ＤＮＰ複合体（１５ｎｍの粒子あたり１２個のＤＮＰハプテン）を、抗ＤＮＰ被覆ビーズ及び異なる濃度のＰＢＳ−トゥイーン中ＤＮＰとともに室温で１時間ゆっくり傾斜回転することによって実施した。この時間の終了時、ビーズを洗浄し、マルチウェルプレート中で画像化した。図２２に、プレートの画像を対応するＤＮＰ値とともに示す。５及び１０ｐｐｂのＤＮＰが肉眼で識別可能であった。図２３に、ＤＮＰ濃度に対してプロットしたウェルの色濃度を示す。
【実施例８】
【００６４】
本実施例では、ＰＤＰデキストランがどのように金ナノ粒子に複合体化するかを示す。ＰＤＰ−デキストランの合成：３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ；Ｓｉｇｍａ）（０．１ｍｌの乾燥ＤＭＳＯ中１０ｍｇ）を４ｍｌのＰＢＳ中２ｍｇ・ｍｌ-1のアミノデキストラン（ＭＷ  ７０ｋＤａ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）と２時間反応させた。この時間の終了時、該溶液を４℃の水に対して透析した。該溶液を透析前後に秤量してデキストラン濃度を測定した。対応するＰＤＰ濃度はジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて測定した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３（１９７８）７２３−７３７）。金ナノ粒子の滴定：様々な量のＰＤＰデキストランを１ｍｌの１０ｎｍＧＮＰ（１ｍｌあたりの粒子数４．５×１０12）と混合し、次いで０．５ｍｌのＰＢＳ×３を加えた。次に該溶液を０．２μのＰＥＳフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、ろ液のＵＶ／可視スペクトルを記録した。７０ｋＤａのアミノデキストラン１分子あたりの第一級アミンの平均数は２１．５であり、そのうちの２０．８４がＰＤＰ（ピリジルジチオプロピオニル）で置換されていた。実施例３ではＰＤＰデキストランは複合体化前にメルカプトデキストランに変換されたが（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００３）１０８−１０９も参照）、ＰＤＰ中の−Ｓ−Ｓ−結合は金に接触すると切断されるのでこのステップは省略できる。この結合が切断されるときに放出されるピリジン−２−チオンもナノ粒子に結合すると思われるが、それでアッセイの性能が損なわれることはない。十分なＰＤＰデキストランがない状況下ではＰＢＳを加えると金ＮＰは凝集する。凝集した粒子は０．２μのＰＥＳフィルタで除去できる。図２４及び２５に、デキストラン濃度の変動がろ液の吸光度スペクトルに及ぼす影響を示す。デキストラン濃度及び１ｍｌあたりのＮＰ数がわかっているので、凝集防止に必要なデキストラン分子の最小数（本実施例では１０ｎｍの粒子あたり〜８．５）は、図２６に示すように決定できる。デキストランは凝集を防止するが、タンパク質への非特異的結合はまだ可能なので、ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ−２０をブロッキング剤として加える。硫黄と金の間の単配位共有結合のＫa値はおよそ１．５３×１０4Ｍ-1の値であり、これは弱い抗体−抗原反応のＫa値より小さい。ＰＤＰデキストラン分子中の全ての硫黄原子（〜２１）が同様の結合を形成すると、このデキストラン分子のＧＮＰとのＫa値はＫa21（Ｋaの２１乗＝７．６×１０87Ｍ-1）となり、これはあらゆる生物分子のＫa値より何桁も大きい。
【実施例９】
【００６５】
本実施例では、オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への複合体化とこれらの複合体の生物分子アッセイにおける使用について記載する。ＧＮＰに複合体化させたタンパク質は３０年以上にわたって使用に供されているが、オリゴヌクレオチド複合体は１９９６年に現れたばかりである。最初の複合体は溶液中でのＧＮＰのプログラムされた自己集合を媒介するために設計されたが（Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（１９９６）６０７−６０９）、すぐにＤＮＡの検出にも使えそうであることが認識された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０（１９９８）１９５９−１９６４及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（２０００）３７９５−３７９６）。この目的のためにはチオール化オリゴヌクレオチドをＧＮＰに結合させることによって２種類の異なるＮＰＣを製造する。標的ＤＮＡの存在下で、溶液は色を赤から紫に変える。より最近では、類似のＮＰＣも迅速試験装置でＰＣＲ産物（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（２００３）４１５５−４１６０）、及びマイクロアレイにハイブリダイズさせた標的分子（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６（２００２）１８３６−１８３８）を検出するのにも使用されている。これらの例はいずれも単一配位共有結合によってＧＮＰに複合体化されたオリゴヌクレオチドを基にしている。モノチオール化オリゴヌクレオチドと金との間の平衡のＫa値はおよそ４．８×１０5Ｍ-1である（Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ９１（２００２）２９−３６）。これは、モノチオール化オリゴヌクレオチドと金間の結合が二つの相補的２２量体（−ｍｅｒ）オリゴヌクレオチド間の結合（２０℃でＫa〜１×１０11Ｍ-1）よりも著しく弱いことを意味する（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７（１９９９）１７１９−１７２７）。明らかに、プローブ分子が標的分子からよりＮＰ標識から解離しやすいという状況は満足できるものではない。さらに、ＰＣＲ時に遭遇するような高めた温度及びイオン強度は解離プロセスを促進することがよく知られている。最近、オリゴヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２００２）１５５８−１５６２）及び抗体（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１１（２０００）５４９−５５６）の、それぞれ２個及び３個の硫黄原子によるＧＮＰへの結合が報告された。分子がｎ個の同一結合によってＮＰに結合される場合、１個の結合によって結合される分子のＫa値がｎ乗される。遊離分子及び結合分子間の平衡は、結合原子の濃度及びキレート効果の局所的増大によって、さらに結合分子に有利にシフトしうる。ここに記載の実施例は、オリゴヌクレオチドを最大１７個の硫黄原子によってＧＮＰに複合体化させることによってこれらの効果を生かしている。
【００６６】
マイクロビーズの製造：オリゴヌクレオチドビーズは、白色ストレプトアビジンビーズ（直径０．５６μ；Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インジアナ州フィッシャーズ）をＰＢＳ−トゥイーン中で５’−末端ビオチンを有するオリゴヌクレオチド［５’−ＡＣＣＧＣＧＴＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣ−３’］（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ケルン）で被覆することによって製造した。沈殿及び洗浄は、洗浄溶液を用い、遠心機で９０００ｇで実施した。ヒドラジド置換ＰＤＰ−デキストラン：２５ｍｇ・ｍｌ-1のＣ６−スクシンイミジル４−ヒドラジノニコチネートアセトンヒドラゾン（Ｃ６−ＳＡＮＨ）（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、カリフォルニア州サンジエゴ）の乾燥ＤＭＳＯ中溶液を用いてＳＰＤＰ−ＮＨＳの２５ｍｇ・ｍｌ-1溶液を製造した。この溶液（０．１６ｍｌ）をＰＢＳ中の２ｍｇ・ｍｌ-1アミノデキストラン（ＭＷ  ７０ｋＤａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）４ｍｌと室温で２時間反応させた。デキストランはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上で溶離液としてＡＢ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を用いて精製し（７０ｋＤａデキストラン）、ＰＤＰ及びヒドラジド基のモル濃度は、それぞれＤＴＴ及び４−ニトロベンズアルデヒドを用いて測定した。後者の測定は次のように実施した：ヒドラジド置換ＰＤＰデキストラン（１５０μｌのＭＥＳ（：０．１Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．７）中１５０μｇ）を、０．５ｍＭのニトロベンズアルデヒド（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、カリフォルニア州サンジエゴ）を含有する１５０  ＭＥＳに加えた。室温で２時間放置後、ヒドラジン濃度をε380＝２×１０4ｃｍ  ｍｏｌ-1  ｌ-1の値を用いて決定した。オリゴヌクレオチド複合体：５’末端アルデヒド基を有する過剰のオリゴヌクレオチド［５’−ＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＧＣＧＧＴ−３’］（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）をＡＢ（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５）中でヒドラジド置換ＰＤＰデキストラン（７０ｋＤａ）と４℃で一晩反応させた。この時間の終了時、非複合体化オリゴヌクレオチドは３０ｋＤａのＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて除去した。洗浄溶液は氷冷したＨＰＬＣ級水であった。ＰＢＳの存在下で凝集を防止する最少量のオリゴヌクレオチドＰＤＰデキストラン（滴定で見出した）を１０ｎｍのＧＮＰに複合体化させた。オリゴヌクレオチド被覆マイクロビーズへのハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション溶液（１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５ＭのＮａＣｌ、１ｍｇ・ｍｌ-1のＢＳＡ、１ｍｇ・ｍｌ-1のグルコース、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．０）中で過剰の複合体を２００μｇのビーズと室温で１時間ゆっくり傾斜回転して実施した。この時間の終了時、ビーズを洗浄溶液中３００ｇで１５分間（２回）及び水中９０００ｇ（１回）で遠心分離した。最終沈殿物は真空遠心機で蒸発乾固させ、２５μｌの水に再懸濁し、マルチウェルプレート中でドキュメントスキャナで画像化した。複合体化前、オリゴヌクレオチドはデキストラン分子に共有結合しており、デキストラン分子も複数のＰＤＰ基で置換されている。デキストラン中のＰＤＰ対ヒドラジドのモル比は４：１であった。図２７���、共有結合しなかったオリゴヌクレオチドをＭＷＣＯろ過で除去した後のデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示す。３６０ｎｍのピーク（ε360＝１．８×１０4ｃｍ  ｍｏｌ-1  ｌ-1の）は、デキストランとオリゴヌクレオチド間のヒドラゾン結合に対応する。２６０ｎｍにおけるほとんどの吸光度（約８７％）はオリゴヌクレオチド（ε260＝１．６３×１０5ｃｍ  ｍｏｌ-1  ｌ-1）によるものであるが、残りはＰＤＰによるものである。オリゴヌクレオチド置換ＰＤＰデキストランの構造を図２８に示す。ＧＮＰに接触するとＰＤＰ中のジチオール結合は切断され、デキストランと金の間に配位共有結合が形成される。１０ｎｍの金ＮＰの凝集防止には最低８．５個の７０ｋＤａデキストラン分子（図２６）が必要なので、１粒子あたり平均３４個のオリゴヌクレオチドが存在する。図２９は、異なる量の標的オリゴヌクレオチドで被覆されたマイクロビーズにハイブリダイズされた複合体の画像を示す。＜５００フェムトモルの標的が肉眼で識別可能である。
【実施例１０】
【００６７】
本実施例では、ビオチンの金ナノ粒子への複合体化とこれらの複合体の生物分子アッセイにおける使用について記載する。ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）間の高い親和性相互作用は、バイオコンジュゲーション化学で最も広く使用されている方法の一つである。アビジンのＧＮＰへの複合体化は１９８４年に初めて報告されたが（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３２（１９８４）１２４−１２８）、ビオチンのＧＮＰへの結合は４年前に報告されたばかりである。ビオチンをＧＮＰに複合体化するための２種類の異なる方法が報告されている。一つの方法は、モノチオール化オリゴヌクレオチドをＧＮＰに複合体化するために以前に報告された方法と類似しており（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０５（２００１）２２２２−２２２６）、もう一つの方法は疎水結合に基づいている（Ｃｏｌｌｏｉｄ．Ｓｕｒｆａｃｅ．Ａ  ２０５（２００２）１５−２０）。後者の方法では、ＧＮＰをまずオクタデカンチオールのシェルで被覆し、それからアルキルビオチンの第二のシェルを第一のシェルにアルキル鎖の相互嵌合によって疎水的に複合体化する。
【００６８】
ビオチニル化ＰＤＰ−デキストラン（２０００ｋＤａ）は、実施例９のヒドラジド置換ＰＤＰデキストランと同じような方法で製造した。ただし、２０００ｋＤａアミノデキストラン（Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、オレゴン州スプリングフィールド）を７０ｋＤａアミノデキストランの代わりに使用し、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ）をＣ６−ＳＡＮＨの代わりに使用した。ビオチンはＨＡＢＡで（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９４（１９６５）２３ｃ−２４ｃ）、ＰＤＰはＤＴＴで測定した。ＰＢＳの存在下で凝集を防止する最少量のビオチニル化ＰＤＰデキストラン（滴定により見出した）を、１５ｎｍのＧＮＰに複合体化させた。ＰＢＳ−トゥイーン中の複合体のアリコートを２００μｇのストレプトアビジン被覆ビーズとともに室温で１時間ゆっくり傾斜回転させた。この時間の終了時、ビーズを洗浄溶液中３００ｇで１５分間（２回）及び水中９０００ｇ（１回）で遠心分離した。最終沈殿物は真空遠心機で蒸発乾固させ、２５μｌの水に再懸濁し、マルチウェルプレート中でドキュメントスキャナで画像化した。対照実験は、メルカプトデキストランナノ粒子複合体（ビオチンで置換されていないＰＤＰデキストランに結合された金粒子）で実施した。この作業では、２０００ｋＤａアミノデキストラン１分子あたりの第一級アミンの平均数は３５１であり、デキストラン中のＰＤＰ対ビオチンのモル比は２４：１であった。図３０に、透析後のビオチン置換ＰＤＰデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示す。２３４及び２８０ｎｍにおけるピークはＰＤＰに由来する。ビオチンはスペクトルに著明な寄与をしないので、アビジンからＨＡＢＡを追い出すことによって測定した。ビオチニル化ＰＤＰデキストランの構造を図３１に示す。１５ｎｍの金ＮＰの凝集防止に粒子あたり最低約１分子のデキストランが必要なので、粒子あたり平均１４．６個のビオチンが存在したことになる。図３２に、ａ）ビオチン複合体及びｂ）メルカプトデキストラン複合体との回転後のビーズの画像を示す。スポットの色濃度はグレースケールに変換後に測定し、図３３に示すグラフにプロットした。濃度に対する吸光度のグラフが直線であっても、溶液中のコロイド金のグラフはまた、曲線である。ということは、このプロットの湾曲は、複合体によるビーズの飽和ではなくイメージングシステムによるものであることを示している。
【実施例１１】
【００６９】
本実施例では、抗体の金ナノ粒子への複合体化とこれらの複合体の生物分子アッセイにおける使用について記載する。抗体のＧＮＰへの複合体化は通常非特異的方法によって実施される。すなわち、負に帯電した金と正に帯電したタンパク質間のイオン性誘引、タンパク質と金表面間の疎水性誘引、及び金とタンパク質構造内の硫黄原子間の配位共有結合が関与すると考えられている（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）ｐｐ５９３−６０４）。複合体化の最適ｐＨは、抗体の等電点（ｐＫi）に近いが、異なる抗体は異なるｐＫi値を有しているのでそれぞれ別個に決定しなければならない。ポリクロナール抗体のｐＫi値には幅があるので、実際に複合体化される抗体は、元の溶液中の抗体範囲よりはむしろ条件を反映したものになる。モノクロナール抗体でさえ複合体化は困難と思われ、マウスのサブクラスＩｇＧ３は特に難しい。非特異的吸着の更なる欠点は、抗体はＧＮＰから解離することが知られていることで（Ｉｍｍｕｎｏ−ｇｏｌｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカラートン（１９８９）ｐｐ４９−６０及びＨｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３９（１９９１）３７−３９）、これは感度の低下につながる。最近、抗体をＧＮＰに共有結合させることがこれらの標識の可能性を最大限利用するために必要であろうと言われている（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４（２００２）１７９２−１７９７）。ここに記載の実施例では、非特異的吸着の問題は共有結合方法を使用することによって回避している。最初に、抗体を安定なヒドラゾン結合によってＰＤＰデキストランに共有結合的に連結し、次いで該デキストランをＮＰに自己集合プロセスによって複合体化させる（すなわち複数の硫黄原子が金と配位共有結合を形成する）。抗体複合体：２５μｌのＤＭＳＯ中の５倍モル過剰のスクシンイミジル４−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を、１ｍｌのＰＢＳ中の２ｍｇの抗ＤＮＰ（Ｓｉｇｍａ）と室温で２時間反応させた。アルデヒド置換抗体は、溶離液としてＡＢＳ（１５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．５）を用い、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上で精製した。抗体濃度はε280＝１８×１０4ｃｍ  ｍｏｌ-1  ｌ-1の値を用いて、アルデヒド濃度は以下のように２−ヒドラジノピリジンを用いて測定した。アルデヒド置換タンパク質（１５０μｌのＭＥＳ中１５０μｇ）を０．５ｍＭの２−ヒドラジノピリジン（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を含有する１５０μｌのＭＥＳに加えた。室温で２時間放置後、アルデヒド濃度をε360＝１．８×１０4ｃｍ  ｍｏｌ-1  ｌ-1の値を用いて測定した。過剰のヒドラジド置換ＰＤＰデキストラン（２０００ｋＤａ）をアルデヒド置換抗体と４℃で一晩反応させ、デキストランに連結しなかった抗体を３００ｋＤａのＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、ドイツ・ハノーバー）で除去した。洗浄溶液は氷冷したＴＢＳ（１５ｍＭのトリス、０．１５ＭのＮａＣｌ、１ｍｇ・ｍｌ-1のＢＳＡ、１ｍｇ・ｍｌ-1のグルコース、０．５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）であった。ＰＢＳの存在下で凝集を防止する最少量の���体置換ＰＤＰデキストラン（滴定により見出した）を３０ｎｍのＧＮＰに複合体化させた。試薬不足イムノアッセイは、担体タンパク質に複合体化させたＤＮＰの試薬バンドと、抗体結合タンパク質の試薬バンド（いずれも多孔性ストリップに固定されている）を含むラテラルフロー装置で実施した。ＤＮＰバンドに最も近いストリップ端を、異なる濃度のＤＮＰを含有する抗体複合体の５０μｌアリコートに浸漬した。浸漬は全ての複合体が両方の試薬バンドを伝って移動するまで続け（〜５分間）、次に該ストリップを乾燥させてドキュメントスキャナで画像化した。２０００ｋＤａデキストラン中のＰＤＰ対ヒドラジドの比率は２．９：１で、抗体１分子あたり平均１．４個のアルデヒドが存在した。図３４に、デキストランに連結しなかった抗体をＭＷＣＯろ過で除去した後の抗体置換ＰＤＰデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示す。抗体もＰＤＰも２８０ｎｍのピークに寄与しているが、ＰＤＰを別個に測定すると、この波長における吸光度の６３．９％は抗体によるものであることが示された。デキストラン中のＰＤＰ対抗体のモル比は１７．１：１であり、ヒドラジドの多くが抗体と反応しなかったことを示している。これは過剰のデキストランを使用したために予想されたことであるが、全ての未反応ヒドラジドをブロックするためにグルコースを加えることが重要である。抗体置換ＰＤＰデキストランの構造を図３５に示す。３０ｎｍのＧＮＰ（１ｍｌあたり１．７×１０11個の粒子）の凝集を防止するのに必要なデキストランの最少量は、７．３ｎＭの最終抗体濃度に対応する。従って、粒子あたり約２６個の抗体が存在していた。図３６に、ラテラルフロー装置で実施したＤＮＰについての一連の試薬不足イムノアッセイの結果を示す。＜５０ｐｐｂのＤＮＰが肉眼で識別可能である。
【実施例１２】
【００７０】
本実施例では、量子ドット（ＱＤ）ＤＮＰ複合体を製造するために実施した実験とこれらの複合体の生物分子アッセイにおける使用について記載する。半導体化合物（ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＰｂＳ）の小孤立粒子（約２〜１０ｎｍ）はしばしば量子ドット（ＱＤ）と呼ばれる（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１３（２００２）４０−４６及びＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔ．Ｍ．Ｓｃｉ．６（２００２）３６５−３７０）。それらは、最低エネルギー遷移より大きい波長で吸収するエネルギーのほとんどを、バンド端付近で発光に変換するという面白い性質を有している。従来の有機蛍光団と比べた場合、ＱＤはいくつかの利点を有する。すなわち、同一波長で多数の色を励起できる；サイズ調節可能な発光スペクトル；広く分離した励起及び発光スペクトル；光退色耐性；フルオレセインのような有機色素と比べて長い崩壊時間といった利点である。後ろ二つの性質は特に、それらを有機色素に代わる生物分子アッセイ及び細胞イメージングの標識として魅力的なものにしている。しかしながら、標識として使用できるようになるには、先にそれらを適切なプローブ分子に複合体化させなければならない。大部分のＱＤは、ＴＯＰＯ（トリオクチルホスフィンオキシド）のような何らかの疎水性リガンドの外層を持つように合成されている（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５（１９９３）８７０６−８７１５及びＪ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ−ＵＳ．１００（１９９６）４６８−４７１）。課題は、この外層をルミネセンス又はコロイド安定性を損なうことなく適切なプローブ分子で置き換えることである。ＴＯＰＯ及び類似のコーティングは、それらをメルカプト酢酸のようなメルカプト及びアミノリガンドに交換することによって置き換えることができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（１９９８）２０１６−２０１８）。これらの交換反応は、抗体及び類似分子の直接複合体化を妨げる非水性有機溶媒中で実施される。それらは迅速で再現可能であるが、生成物はリガンドの解離のために不安定である。交換反応を弱い水性条件下で実施し、分子を複数のメルカプト基によって量子ドットに複合体化させることでこれらの問題が解決できる。弱い水性条件下でのリガンド交換によるＱＤ複合体の製造を記載した報告はこれまでにないが、そのような反応は容易に実演できる。ＴＯＰＯでキャップされたコアシェル（ＣｄＳｅ／ＺｎＳ）ＱＤのトルエン中１００μｌアリコート（Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州トロイ）を、９０００ｇで１５分間１ｍｌの乾燥メタノール中で沈殿させた。さらに２回のメタノール中９０００ｇでの沈殿後、ＱＤを５０μｌのメタノール中に再懸濁させた。該懸濁液を１ｍｌの、１）５０ｍＭの炭酸水素塩溶液、及び２）５０ｍＭの炭酸水素塩溶液中１ｍＭのメルカプト酢酸（ＭＡ）に加えた。次にそれらをＰＴＦＥバイアル中で２４時間ゆっくり傾斜回転した。この時間の終了時、ＭＡとインキュベートしたＱＤは水に可溶であった。なぜならば、末端に親水性のカルボン酸基を持つチオアセチル分子が疎水性のＴＯＰＯと置き換わったからである。ＭＡがない場合、ＱＤはＰＴＦＥバイアルの壁に接着した。水溶性のＱＤはクロロホ��ムに移動できなかったことから、ＭＡはそれらに結合しており単にＴＯＰＯのアルキル鎖と相互嵌合しているのではないことを示している。これは重要な結果である。なぜならば、該交換反応が、水に不溶な及び／又は有機溶媒によって変性された分子のＱＤへの直接複合体化を可能にするような弱い水性条件下で実施できることを示しているからである。
【００７１】
抗ＤＮＰ被覆常磁性ビーズは実施例に記載のように製造したが、ビーズ（２．８μｍ；Ｄｙｎａｌ（ＵＫ）Ｌｔｄ．，Ｂｒｏｍｂｏｒｏｕｇｈ、英国ウィラル）はＭＰＣ−Ｓサンプル濃縮器（Ｄｙｎａｌ）を用いて磁気的に沈殿及び洗浄した。ハプテニル化メルカプトデキストランは、ＤＭＦ中２０ｍＭの６（２，４−ジニトロフェニルアミノ）−１−アミノヘキサン酸５０μｌを、５０ｍＭの炭酸水素塩溶液中２ｍｇ・ｍｌ-1の濃度の１７０ｋＤａアミノデキストラン（Ｈｅｌｉｘ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）５ｍｌに加えることによって合成した。室温で２時間撹拌後、２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ’ｓ試薬；Ｓｉｇｍａ）を加えて最終濃度５ｍＭにした。さらに２時間撹拌後、溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５上で精製した。デキストラン中のＤＮＰ基の濃度は３６０ｎｍで測定した（１．７４×１０4Ｍ-1  ｃｍ-1）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７７（１９８９）３９２−３９５）。メルカプト基の濃度は、還元及び精製したばかりのメルカプトデキストランをＥｌｌｍａｎ’ｓ試薬と反応させたときの４１２ｎｍにおける吸光度の増加から、システイン溶液を用いて製造した検量グラフを参照して測定した（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）ｐｐ１８−９０）。
【００７２】
メタノール中のＴＯＰＯ被覆ＱＤ（前述のように洗浄）５０μｌを、５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム溶液中３５０ｎＭの精製したばかりのハプテニル化メルカプトデキストラン０．９５ｍｌに加えた。該溶液を室温で２４時間ゆっくり傾斜回転した後、ＱＤを１５分間９０００ｇで沈殿させ、１ｍｌのＰＢＳ−トゥイーン中に再懸濁させた。さらに２回、９０００ｇでＰＢＳ−トゥイーン中で沈殿させた後、ＱＤ溶液の２００μｌアリコートを０．７ｍｌのＤＮＰ溶液と混合した。１００μｌの抗体被覆常磁性ビーズを加え、混合物を室温で１時間ゆっくり傾斜回転した。この時間の終了時、ビーズを磁気的に沈殿させ、ＰＢＳ−トゥイーンで３回洗浄した。最終沈殿物を真空遠心機で蒸発乾固させ、１０μｌの水に再懸濁させた。５００ｎｌのアリコートを非蛍光白色プレート上にスポットし、Ｌｅｉｃａ  ＬＭ  ＤＢ２顕微鏡（Ｏｐｔｉｖｉｓｉｏｎ）と接続したＳｐｏｔ２カメラ（Ｏｐｔｉｖｉｓｉｏｎ、Ｏｓｓｅｔｔ、英国ヨークシャー）で画像化した。ビーズはＵＶ光で励起され、カスタマイズされた６３０ｎｍフィルタブロック（Ｏｐｔｉｖｉｓｉｏｎ）によって検出された。提案されたメルカプトデキストランの構造を図３７に示す。メルカプトデキストランをＱＤとゆっくり傾斜回転すると、ＴＯＰＯは追い出され、複数のメルカプト基によってハプテニル化デキストランがＮＰに複合体化した。ＤＮＰ  ＱＤ複合体を、対応する抗体で被覆した常磁性ビーズとインキュベートすると、図３８に示すように、ビーズに結合された複合体の量はサンプル中のＤＮＰの濃度が増加するにつれて減少した。これらの結果から、ハプテニル化メルカプトデキストランは弱い水性条件下でＱＤに複合体化でき、得られた複合体は、ＢＳＡのようなブロッキング剤及びＴｗｅｅｎ−２０のような洗浄剤の存在下で激しい混合を必要とする生物分子アッセイに使用するのに適切であることがわかる。当業者であれば、抗体、オリゴヌクレオチド及びその他のＱＤ複合体も同様の方法で製造できることがわかるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】末端メルカプト基を有するオリゴヌクレオチドが金ナノ粒子に複合体化される一価複合体化方法を示す概略図である。
【図２】一価及び多価複合体の解離間の比較を示す図である。
【図３】ジヒドロリポ酸に基づく単純多価（二価）複合体化方法を示す概略図である（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（２０００）１２１４２−１２１５０）。複合体化後、複合体のＣＯＯＨ基がタンパク質分子（アビジン）に共有連結する。
【図４】抗体の金属ナノ粒子への多価（三価）複合体化に使用されたアミノトリチオレートの構造式を示す図である。この多価分子は銀ナノ粒子にとても強固に結合するので、複数の第一級アミン基によってナノ粒子に多価複合体化されたアミノデキストランは、それによって置換される（米国特許第５，９４５，２９３号（１９９９））。
【図５】メルカプトプロピルトリメトキシシランに基づく捕捉複合体化方法を示す概略図である。ステップＡで、メルカプト基はナノ粒子に結合し、アルコキシ基が外側に突き出している。ステップＢで、前記アルコキシ基は、互いに及びその他のシランとの架橋に利用可能である。この図では、ステップＣで、その他のシランは、抗体のような結合分子に共有連結できる第一級アミン基を有している。
【図６】ナノ粒子複合体Ａは、被検体Ｘと衝突する可能性がナノ粒子複合体Ｂより大きいことを示す図である。なぜならば、ナノ粒子複合体Ｂはそれらの表面のほとんどが非反応性だからである。従って、ナノ粒子複合体Ａは、ナノ粒子Ｂより高いｋa、従って高い機能的親和性を有している。
【図７】ナノ粒子複合体Ａは被検体Ｘに二つ以上の部位で結合しているが、ナノ粒子複合体Ｂは一つの部位でしか結合していないことを示す図である。従って、ナノ粒子Ａは、ナノ粒子Ｂより低いｋd、従って高い機能的親和性を有している。
【図８】ナノ粒子複合体Ａは、被検体Ｘ及び分離相に結合する可能性がＮＰＣ  Ｂより高いことを示す図である。なぜならば後者の表面のほとんどは非反応性だからである。従って、ＮＰＣ  Ａは、被検体及び分離相に対するｋa値がＮＰＣ  Ｂより高い。ＮＰＣ  Ａは、分離相上の二つ以上の部位に結合することもできるが、ＮＰＣ  Ｂは一つの部位にしか結合できない。従って、ＮＰＣ  Ａは、ＮＰＣ  Ｂよりｋd値も低い。
【図９】ＮＰＣ  Ａは、分離相に結合する可能性がＮＰＣ  Ｂより高いことを示す図である。ＮＰＣ  Ａは、分離相上の二つ以上の部位に結合することもできるが、ＮＰＣ  Ｂは一つの部位にしか結合できない。後者のことが起きると、ＮＰＣ  Ａは、被検体より分離相に対する機能的親和性のほうが高くなるが、ＮＰＣ  Ｂは、分離相及び被検体に対する機能的親和性が同じくらいである。
【図１０】ＰＤＰデキストランに連結されたプローブ分子をＮＰに複合体化させるのに用いられた方法を示す概略図である。符号の説明：１）プローブ分子（本例ではオリゴヌクレオチド）を活性化する；２）プローブ分子とＰＤＰをデキストランに連結する；３）デキストランを複数の配位共有結合によってＮＰに複合体化させる。
【図１１】ＤＮＰハプテンで置換された保護メルカプトデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示すグラフ図である。ＤＮＰハプテンの数は３６０ｎｍにおける吸光度から、メルカプト基の数はＤＴＴを加えたときの３４３ｎｍにおける吸光度の増加から決定できる。
【図１２】ハプテニル化メルカプトデキストラン分子のＤＴＴによる脱保護のステップを示す図である（ナノ粒子への複合体化前に、メルカプトデキストランはゲル排除クロマトグラフィーによって精製される）。
【図１３】ハプテニル化メルカプトデキストランの金ナノ粒子への自己集合を示す概略図である。
【図１４】異なる数のハプテニル化メルカプトデキストランが金ナノ粒子に複合体化した場合の効果を示すＵＶ／可視スペクトルを示すグラフ図である。スペクトル上の数字は粒子あたりのデキストランの数に対応する。デキストランが不十分な場合、５２０ｎｍにおける吸光度の減少が示すように、ＰＢＳの添加で粒子は凝集する。
【図１５】ＤＮＰ−金ナノ粒子複合体に対する常磁性マイクロビーズイムノアッセイの概略を示す図である。
【図１６】異なる量の常磁性マイクロビーズ結合抗体をナノ粒子複合体溶液とともに回転させたときに生じる吸光度の変化を示すＵＶ／可視スペクトルのグラフ図である。
【図１７】磁気沈殿によって添加及び除去された常磁性マイクロビーズに結合された抗体の量に対する金ナノ粒子複合体溶液の５２０ｎｍにおける吸光度を示すグラフ図である。
【図１８】ＧＮＰの凝集防止に必要な最小数のデキストランと粒径の二乗との間の直線関係を示すグラフである。符号の説明：  ＝１０ｋＤａ、  ＝４０ｋＤａ、  ＝７０ｋＤａ、  ＝１７０ｋＤａ、  ＝５００ｋＤａ、  ＝２０００ｋＤａ。
【図１９】異なる数のＤＮＰハプテンで置換されたＰＤＰデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示すグラフである。３６０ｎｍ（ＤＮＰ）における吸光度が減少する順にデキストラン１分子あたりのハプテンの平均数は１２、８．６、５．９、４．４及び１．２である。
【図２０】マイクロビーズに結合されたＧＮＰ複合体の量が、粒子あたりのプローブ分子の数が増加するにつれてどのように増加するかを示すマルチウェルプレートの画像である。結合された複合体の量はウェルの色濃度に比例している。
【図２１】図２０のマイクロビーズの色濃度が、粒子あたりのプローブ分子の数が増加するにつれてどのように増加するかを示すグラフである。相対複合体濃度に対する符号の説明：０．３５（実線）；０．７（破線）；１．４（鎖点線）。０−２５５のグレースケール上では高い色濃度は低い数値に対応することに注意する。
【図２２】ＤＮＰについての試薬不足（競合）イムノアッセイの結果を示すマルチウェルプレートの画像である。
【図２３】図２２のマイクロビーズの色濃度が、ＤＮＰの量が減少するにつれてどのように増加するかを示すグラフである。０−２５５のグレースケール上では高い色濃度は低い数値に対応することに注意する。
【図２４】異なる量の７０ｋＤａのＰＤＰデキストランで安定化された１０ｎｍ金ナノ粒子のＵＶ／可視スペクトルを示すグラフである。粒子あたりのデキストラン分子の数は吸光度が増加する順に、０、４．３、４．９、５．２、５．７及び７．１である。
【図２５】異なる量の７０ｋＤａのＰＤＰデキストランに複合体化された１０ｎｍ金ナノ粒子を示す画像である。数字はデキストラン分子の粒子に対する比率を示す。
【図２６】ナノ粒子あたりの７０ｋＤａのＰＤＰデキストランの比率が異なる場合、金ナノ粒子の最大吸光度がどのように変動するかを示すグラフである。あらゆる凝集を防止するのに必要な最少量が、最大吸光度に減少をもたらさない最低比率とみなされる。
【図２７】１９量体のオリゴヌクレオチドで置換された７０ｋＤａのＰＤＰデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示すグラフである。このスペクトルは光路長（ｐａｓｓｌｅｎｇｔｈ）３ｍｍの石英キュベットを用いて記録された。
【図２８】１９量体のオリゴヌクレオチドで置換された７０ｋＤａのＰＤＰデキストランの構造を示す図である。
【図２９】ポリマーマイクロビーズに結合された異なる量の相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドＧＮＰ複合体を示すマルチウェルプレートの画像である。その量はピコモルで与えてある。この画像は通常のドキュメントスキャナで得た。
【図３０】ビオチンカプロン酸で置換された２０００ｋＤａのＰＤＰデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示すグラフである。
【図３１】ビオチンカプロン酸で置換されたＰＤＰデキストランの提案された構造を示す図である。
【図３２】ストレプトアビジン被覆マイクロビーズに結合された異なる量のビオチン複合体を示すマルチウェルプレートの画像である。対照画像は、プローブ分子としてビオチンを持たない同量の複合体とインキュベートしたビーズを含有するマルチウェルプレートを示す。この画像は通常のドキュメントスキャナで得た。
【図３３】図３２のマイクロビーズに結合されたＧＮＰの量に対する色濃度を示すグラフである。符号の説明：  ＝ビオチン複合体；  ＝ビオチンを持たない複合体。
【図３４】抗体ＰＤＰデキストランのＵＶ／可視スペクトルを示すグラフである。このスペクトルは光路長３ｍｍの石英キュベットを用いて記録された。
【図３５】抗体連結ＰＤＰデキストランの提案された構造を示す図である。
【図３６】ラテラルフロー装置で実施した抗体複合体によるＤＮＰについての試薬不足イムノアッセイの結果を示す図である。
【図３７】ＱＤ複合体の製造に使用されるハプテニル化メルカプトデキストランの提案された構造を示す図である。
【図３８】ＱＤ  ＤＮＰ複合体によるＤＮＰについての試薬不足（競合）イムノアッセイの結果を示す画像である。
【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１７】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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