(57)【要約】本発明は、チップを読み取り、これを解析するために用いる装置に関する。本発明による装置は、少なくとも１つのサンプルを特性決定することを目的とするチップ（１２）を受容するためのテーブル（１１）、他の分子と反応させた後にチップの分子または細胞を励起させる手段、および励起状態にある分子を読み取り、これを解析する手段（１４）を含む。本発明は、その装置が前記テーブルの温度を制御するための、そのテーブル表面の異なるスロットの向い側に配置された複数のペルチェ加熱／冷却素子で構成されているモジュール（１１１）と連結されている制御ユニット（１５）、および前記制御ユニットとも連結されている少なくとも１つのテーブル温度センサー（１１２）をさらに含むことを特徴とする。本発明はまた、その関連方法にも関する。
2006511798.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チップの読み取りおよび解析のための装置であって、
・少なくとも１つのサンプルを特性決定することを目的とするチップを受容するためのテーブルと、
・他の分子と反応させた後に、チップの分子または細胞を励起させる手段と、
・励起状態にある分子を読み取り、これを解析する手段と
を含んでなり、
・前記テーブルの温度を制御するためのユニットであって、該制御ユニットが、テーブル表面の種々のスポットの向い側に配置された複数のペルチェ加熱／冷却素子で構成されているモジュール（１１１）に連結されてなるものと、
・前記制御ユニットにも連結されている少なくとも１つのテーブル温度センサー（１１２）と
をさらに含んでなることを特徴とする、装置。
【請求項２】
前記励起手段が広域スペクトルランプと、少なくとも１つのレーザーとを含んでなるものである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記レーザーが、その照射光が６３５ｎｍ程度の波長を中心とするレーザーである、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
リーダーがいくつかのレーザーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
それらのレーザーが同じ波長を中心とするものである、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
励起手段が、解析対象とする分子を励起させるためにそのビームをスキャニングするためのモジュールを搭載した少なくとも１つのレーザーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項７】
リーダーが２つのレーザーを含み、かつ、それら２つのレーザーをスキャニングするためのモジュールが分子の２つの各スキャンを直交する２つの方向に制御する、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
励起手段が、その照射光が光ファイバーにより導かれるレーザーを含む少なくとも１つのレーザーアセンブリーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
励起手段が２つの同一のレーザーアセンブリーを含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
励起手段が、そのビームを直列に設置された２つの連続するミラーアセンブリーに向ける固定レーザー（１３２”）を含み、かつ、該ミラーアセンブリーの動作が異なる２方向に沿って制御される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
２つのミラーアセンブリーの動作が、チップ上で所望の順序に進み得るビームを作り出すように制御される、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
励起手段がランプおよびレーザーを含み、これら２つの照射光のうちの一方がチップに向けられるように２つの位置間で軸（１３００）を中心に回転可能なスウィングミラー（１３０）によって、それらの照射光が同じ光学経路を通る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
光学系がランプと励起させようとする分子との間に置かれ、レーザー励起が分子の直接照明により行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記光学系が、狭帯域励起光フィルターおよび狭帯域発光フィルター、ならびにビーム分離器を含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
リーダーが、その機能を制御するために各励起手段と連結されている励起制御ユニットをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記励起制御ユニットが、ランプと少なくとも１つのレーザーによる分子の同時もしくは連続照明、またはランプと少なくとも１つのレーザーによる分子の個別励起を選択的に制御しうるものである、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
チップの読み取りおよび解析のための装置であって、
・少なくとも１つのサンプルを特性決定することを目的とするチップを受容するためのテーブルと、
・他の分子または細胞と反応させた後に、チップの細胞または分子を励起させる手段と、
・励起状態にある分子または細胞を読み取る手段と
を含んでなり、このリーダーが温度制御ユニットをさらに含んでなることを特徴とする、装置。
【請求項１８】
テーブルが、前記温度制御ユニットと連結されている温度センサーを含む、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
リーダーが、テーブルに設置された、その温度を制御することを目的とする加熱／冷却モジュールを含み、該加熱／冷却モジュールが温度制御ユニットと連結されている、請求項１７または１８に記載の装置。
【請求項２０】
リーダーが、マイクロプロセッサーを含む、温度制御ユニットおよび読み取り手段に連結された処理手段をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
リーダーが、励起手段に対する分子のマッチおよびミスマッチ応答の温度関数としての参照曲線を記憶する手段を含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
記憶手段が、分子のマッチおよびミスマッチに関する融解温度を前記参照曲線から決定するための手段と連結されている、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
温度制御ユニットが、予め準備された、分子のマッチおよびミスマッチ応答の温度関数としての参照曲線を利用して設定温度が決定され、その設定温度が前記温度制御ユニットにより伝達され、前記テーブルの温度が制御されるという「静的」モードにより、リーダーの機能を制御しうるものである、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
温度制御ユニットが、該温度制御ユニットによりテーブル上での所定の温度変化が制御され、かつ、この温度変化の間：
・読み取り手段により、チップ上の種々のスポットと結合した分子の、励起手段による励起に対する応答がリアルタイムで収集され、前記応答が処理手段（１８）へと伝達され、
・記憶手段により、チップ上の各スポットについて、分子の応答変化が温度関数として記憶される
という「動的」モードにより、リーダーの機能を制御しうるものである、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
リーダーが、各分子について、前記応答変化の記憶終了時に、分子の状態の診断を確立しうる処理手段を含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
状態の前記診断がマッチ／ミスマッチ診断である、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のリーダーを用いて実施することができる、チップのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション方法であって、
・標的核酸に対応する核酸プローブを一本鎖ＤＮＡ断片を含む生物学的サンプルと接触させて、二本鎖の形成により特定プローブとサンプルの前記一本鎖ＤＮＡ断片との選択的ハイブリダイゼーションを実施する工程、
・このようにして形成された二本鎖を読み取る工程
を含んでなり、
・「マッチ」構造の各標的核酸の融解温度、および
・「ミスマッチ」構造の各標的核酸の融解温度
の自動決定からなる工程をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２８】
前記決定が、マッチおよびミスマッチの各々に該当する二本鎖を読み取ることにより得られるシグナルの変化を温度の関数として示した参照曲線を用いて「静的」モードで実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
マッチとミスマッチとの最適な区別点に相当する温度でハイブリダイゼーションが実施されるように温度を制御することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
読み取り工程より前の工程中に前記参照曲線を作成することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記参照曲線を記憶することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記決定が、サンプルの所定の温度変化を制御することにより「動的」モードで実施されることができ、かつ、この温度変化の間に、
・チップ上の種々のスポットと結合した二本鎖の、励起手段による励起に対する応答のリアルタイム収集、
・各二本鎖についての、応答変化の温度関数としての記憶
が実施される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
各二本鎖について、前記応答変化の記憶終了時に、二本鎖のマッチ／ミスマッチ診断を確立することを含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
概要
本発明は、一般に、チップの読み取りおよび解釈に関するものであり、より詳細には、蛍光体などのシグナル発生分子で標識された、これらのチップを構成する分子と生体もしくは化学サンプル由来の分子または細胞とで形成されるハイブリッドの検出に関するものである。
【０００２】
従って、本発明の第一の態様によれば、チップの読み取りおよび解析のための装置（またはチップリーダー）であって、
・少なくとも１つのサンプルを特性決定することを目的とするチップを受容するためのテーブルと、
・他の分子と反応させた後に、チップの分子または細胞を励起させる手段と、
・励起状態にある分子を読み取り、これを解析する手段と
を含んでなる装置が提供される。
【０００３】
より詳細には、本発明によれば、チップの温度を制御する手段も提供されるため、チップの温度変化を伴う用途の開発が可能となる。
【０００４】
特定の用途では、チップがＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドチップであり、温度制御によって、前記チップ上でのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション温度を正確に規定することが可能になる。
【０００５】
また、本発明によれば、このようなリーダーを、特に、遺伝子変異を検出するために使用する方法が提供される。
【０００６】
定義
本発明の目的および特徴を提示する前に、本明細書において使用する特定用語をまず定義する。
【０００７】
本発明において同様に用いられる「アレイ」、「マイクロアレイ」、「チップ」は、固相支持体上、特定のスポットに並べられた細胞のアレイまたは生体分子もしくは化学分子のアレイ（例えば、マトリックスを形成している）を定義することを意図した用語である。
【０００８】
分子または細胞は、一般に、ポリマーでコーティングされた固相支持体上の各スポットと接着されており、これらのスポットの各々が他のスポットの分子／細胞との関係において特異性を示す分子／細胞と結合する種類のものとなるように並べられている。
【０００９】
アレイが核酸またはペプチドなどの生体分子を含む場合には、バイオチップと呼ぶ。
【００１０】
より正確に言えば、アレイがデオキシリボヌクレオチドで構成されている場合には、ＤＮＡチップまたはオリゴヌクレオチドチップと呼ぶ。
【００１１】
固相支持体は、ガラス、プラスチック、ナイロン（登録商標）、ケブラー（登録商標）、シリコン、珪素、あるいは、セルロースなどの多糖類またはポリ（ヘテロ糖類）から作製された固相支持体から選択される。
【００１２】
固相支持体はガラスであることが好ましい。この支持体はいかなる形態（平面スライド、マイクロビーズなど）であってもよいが、好ましい実施態様によれば、支持体が平面であり、平面ガラススライドを含む。
【００１３】
チップを好適な条件下でサンプルと接触させると、サンプルの特定の成分は、チップの１以上の分子／細胞と選択的に反応する（特に、結合する）ことが可能である。
【００１４】
さらに、これらの成分は標識（通常、一般に「蛍光体」と呼ばれる蛍光色素または分子）を含んでおり、この標識によって、サンプルをチップと接触させた後にその成分の存在を検出することが可能になる。この検出では、蛍光体の場合、制御された波長の光によりチップを励起させる必要がある。
【００１５】
本明細書において「分子」は、化学分子および生体分子を包含する用語である。
【００１６】
生物学的用途では、「生体分子」は、好ましくは核酸、より好ましくは一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００１７】
化学的用途では、それらが生体分子の化学リガンドであってもよい。
【００１８】
本明細書において同様に用いられる「核酸」、「核酸プローブ」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド配列」は、修飾または非修飾ヌクレオチドの正確な鎖を示すことを意図した用語であり、それらの用語によって、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有していない核酸の断片または領域を定義することが可能になり、同様に、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ（「ペプチド核酸」の場合）またはＬＮＡ（「ロックト核酸」の場合）、およびＲＮＡなどの前記ＤＮＡの転写産物を表すことができる。
【００１９】
本明細書において「プローブ」、「オリゴヌクレオチドプローブ」または「オリゴヌクレオチド」は、固相支持体上に置かれ（または「スポットされ」）、固相支持体と直接的にまたはスポットレベルでスペーサー化合物を介して間接的に共有結合することにより接着される機能性または非機能性オリゴヌクレオチドを示すことを意図した用語である。
【００２０】
このようにしてスポットされたオリゴヌクレオチドは、サンプル中に存在する相補配列（すなわち、相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）の標的核酸と、１以上の種類の化学結合を利用して、通常、水素結合を形成する相補的塩基対合により結合することが可能である。
【００２１】
好ましくは、前記プローブは一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり、その大きさは１０〜７０００塩基（ｂ）の間、好ましくは、１０〜１０００ｂの間、１０〜５００ｂの間、１０〜２５０ｂの間、１０〜１００ｂの間、１０〜５０ｂの間または１０〜３５ｂの間である。
【００２２】
スポットするオリゴヌクレオチドプローブは、化学合成してもよいし、生体サンプルから精製してもよいし、より一般には、組換えＤＮＡ技術により天然および／または精製ポリヌクレオチドから作製してもよい。
【００２３】
例えば、これらのプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるか、またはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応）により作製することができる。
【００２４】
「スポット」とは、分子が接着されるチップ上の部位に相当する。
【００２５】
１スポットに同じ分子のいくつかのコピーが存在することが好ましい。
【００２６】
スポットは、チップ上の基準点に対するそれらのｘおよびｙ座標により定義される。
【００２７】
スポットは、例えば、平面の所定のゾーンにスポットされる溶液の１滴の容量に応じた直径を有する円形であってもよいし、またはウェルであってもよいし、あるいは、ゲルの平行六面体形パッド（ゲルパッドと呼ばれる）であってもよい。
【００２８】
「サンプル」とは、特定の性質を特性決定することが望まれる生体分子、生化学分子もしくは化学分子の溶液、または細胞群に相当する。
【００２９】
本発明の好ましい適用では、サンプルは、生物源から得られた少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する溶液である。
【００３０】
サンプルは、種々の組織または細胞から得られる、生きている、または死んでいる供給源に由来するものであってよい。
【００３１】
生物学的サンプルの例としては、血液（特に、白血球）、尿、唾液、精液または膣分泌物などの体液、皮膚、そして、毛根濾胞細胞、正常内部組織由来の細胞または病的内部組織、特に、腫瘍を起源とする細胞、絨毛膜組織由来の細胞、羊膜細胞、胎盤細胞、胎児細胞および臍帯細胞などの細胞も含まれる。
【００３２】
「標識」または「シグナル発生標識」は、サンプルの生体分子、生化学分子または化学分子を、後に本発明によるリーダーのものなどの読み取り手段を使用して検出するために、その分子と直接または間接的に結合することができる標識を示すことを意図した用語である。
【００３３】
シグナル発生標識は、好ましくは、酵素、色素、ハプテン、もしくはビオチン、アビジン、ストレプトアビジンもしくはジゴキシゲニンなどのリガンド、または発光剤から選択される。
【００３４】
好ましくは、本発明によるシグナル発生標識は、励起エネルギー源に応じて放射線発光、化学発光、生物発光およびホトルミネセンス（蛍光発光および燐光発光を含む）に分類される発光剤とされる。
【００３５】
好ましくは、本発明によるシグナル発生標識は蛍光剤である。
【００３６】
「蛍光性」は、一般に、励起波長と呼ばれる所定の波長の光源により励起させたときに光を発し、蛍光波長と呼ばれる、より高い波長で発光する、蛍光体などの物質の特性を意味する用語であり、その特性は光子センサーを使用して検出することができ、組み合わせた場合に、チップのハイブリダイゼーションシグナル画像を構成することを可能にするシグナルを提供する。
【００３７】
本発明で使用する蛍光体のうち、以下のものについて非網羅的に述べる：
・フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）［最大吸収波長：４９４ｎｍ／最大蛍光波長：５１７ｎｍ］；
・テキサスレッド（ＴＲ）［最大吸収波長：５９３ｎｍ／最大蛍光波長：６１３ｎｍ］；
・シアニン３（Ｃｙ３）［最大吸収波長：５５４ｎｍ／最大蛍光波長：５６８ｎｍ］；
・シアニン５（Ｃｙ５）［最大吸収波長：６５２ｎｍ／最大蛍光波長：６７０ｎｍ］；
・シアニン５．５（Ｃｙ５．５）［最大吸収波長：６７５ｎｍ／最大蛍光波長：６９４ｎｍ］；
・シアニン７（Ｃｙ７）［最大吸収波長：７４３ｎｍ／最大蛍光波長：７６７ｎｍ］；
・Ｂｏｐｉｄｙ  ６３０／６５０［最大吸収波長：６３２ｎｍ／最大蛍光波長：６５８ｎｍ］；
・Ａｌｅｘａ  ４８８（４９５／５１９）；
・Ａｌｅｘａ  ３５０（３４７／４２２）；
・ローダミンレッド色素（５７０／５９０）。
【００３８】
「反応」は、チップ上のスポットと結合している分子とサンプルの分子との間で行われる化学反応または生物学的反応（例えば、ハイブリダイゼーション）を示す用語である。
【００３９】
「ハイブリダイゼーション」は、置かれた（またはスポットされた）オリゴヌクレオチドと生体サンプル由来の標的配列との相補的塩基対合による結合を意味する反応を示す用語である。
【００４０】
ハイブリダイゼーションの結果として得られるハイブリッドまたは二本鎖は、ハイブリダイゼーション複合体またはハイブリダイゼーション二本鎖と呼ばれる。
【００４１】
ハイブリダイゼーション複合体は、相補的複合体である場合もあるし、またはミスマッチングを有する複合体である場合もある。
【００４２】
よって、相補的複合体は、スポットされたオリゴヌクレオチドとサンプルの標的配列との間にミスマッチングが全く存在しないハイブリダイゼーション複合体である。
【００４３】
ミスマッチングを有する複合体は、スポットされたオリゴヌクレオチドとサンプルの標的配列との間に少なくとも１つのミスマッチが存在するハイブリダイゼーション複合体である。
【００４４】
「特異的ハイブリダイゼーション」は、ストリンジェントな条件下で、かつ、配列が複雑なＤＮＡまたはＲＮＡ環境に存在する場合における、特定のヌクレオチド配列のみとの、結合、二本鎖の形成、または核酸分子のハイブリダイゼーションを意味する用語である。
【００４５】
「相補的オリゴヌクレオチド」は、その配列が特定の標的配列と完全に相補的なプローブである（本明細書において、「マッチ」は、このような完全な対合を示すのに用いられる用語である）。
【００４６】
「ミスマッチ」を示すプローブとは、その配列が特定の標的配列と完全に相補的ではないプローブを意味する。
【００４７】
ミスマッチを示すプローブでは、ミスマッチはどこかに存在していればよいが、末端のミスマッチは、標的配列とのハイブリダイゼーションへの影響が少ないため、あまり望ましいものではない。
【００４８】
そのため、このプローブでは、ミスマッチがハイブリダイゼーション条件下で標的配列との二本鎖を不安定化するより大きな変化となるように、ミスマッチがプローブの中心に、またはプローブの中心の両側に位置することが多い。
【００４９】
「二本鎖」または「ハイブリッド」は、二本鎖ＤＮＡ断片に相当する用語である。このような二本鎖は、オリゴヌクレオチド（チップ上のスポットに配置された分子）と、特性決定したいサンプルの一本鎖断片とのハイブリダイゼーションにより得られることが分かるであろう。
【００５０】
「読み取り」は、一般に、標識の検出に関して、反応後の分子の応答を１以上の好適なセンサーを用いて収集することを含む工程を示す用語である。
【００５１】
この読み取りは、特に、光学的な読み取りとすることができるが、それに代わる方法として、放射線などのシグナルを収集することによる読み取りがある。
【００５２】
本明細書において、チップ「リーダー」の定義は、「読み取られた」シグナルの解析も含むため、この単なる読み取り工程の範囲を超えていることに留意すべきである。
【００５３】
解決すべき課題および発明の概要
「光源」についての態様
上記タイプのチップリーダーは、すでに知られている。
【００５４】
このようなリーダーにより、チップの分子をサンプルの分子と反応させた後に、特定の励起に対する前記分子の応答を収集することが可能になる。
【００５５】
この応答を収集することにより、特に、特定の波長を中心とする照明（光による励起）である前記励起に対して特異的に反応する標識を確認することが可能になる。
【００５６】
好ましくは、平面形態であるチップは、チップ上の種々のスポット（またはスポットサブセット）において励起照射を連続して受け、観察手段にこれらの種々のスポットを提示するように、縦軸、横軸および垂直軸に相当するｘ、ｙおよびｚの３軸に沿って移動可能なテーブル上に配置される。
【００５７】
チップは、テーブル上に直接配置されてもよいし、あるいは、テーブルに取り付けられている処置チャンバー（例えば、ハイブリダイゼーションチャンバー）内に配置されてもよい。
【００５８】
あるいは、テーブルを固定してもよい（チップのウェルをスキャニングするために移動する励起および観察手段の場合）。
【００５９】
これらのリーダーは、シグナル発生標識、好ましくは蛍光標識、が分子と結合した状態で必要な励起を起こすように、一般に、制御波長のスペクトルによってチップの分子または細胞を照明することを可能にする光源（数百平方ミクロン〜数平方ミリメートルのオーダーの光源）の形態である励起手段を含む。
【００６０】
これらの照明手段は、一般に、ランプ（通常、キセノンまたは水銀ランプ）の形態または１以上のレーザーダイオードの形態である。
【００６１】
キセノンランプは、通常使用される標識の多くの励起波長の範囲をカバーする連続スペクトルを提供する。
【００６２】
しかしながら、これらのランプの制限は、種々の標識に対し、励起ラインに関するエネルギーレベルが低すぎて所望のラインの十分な励起が生じ得ないことである。
【００６３】
水銀ランプに関しては、それらは特定波長のライン（最大エネルギー）を示すスペクトルを提供する。
【００６４】
よって、このようなランプにより、これらのラインに相当する波長で励起可能な蛍光標識を十分に励起させることが可能になる。
【００６５】
しかしながら、水銀ランプの励起ラインは、特に、これらのリーダーの適用において一般的に使用されている蛍光体（Ｃｙ５もしくはＣｙ７タイプのものまたは広域スペクトルランプによって効果的に励起され得ない別の蛍光体であることもある）を励起させるための波長は含んでいない。これが水銀ランプの考慮すべき制限となっている。
【００６６】
ランプの代用として、リーダーの照明手段を特定波長の１以上のレーザーとして実現することは知られていることである。
【００６７】
よって、非常によく使われる、あまり高価ではない「赤色」レーザーが、シアニン５またはシアニン７などの標識を励起させるための現実的で利用しやすい解決策となる。しかしながら、紫外線光の青色内または青色領域の近くにある波長においてよく反応する標識を励起させたい場合には（例えば、ＦＩＴＣタイプの標識を励起させる場合には）、あまり一般的ではないタイプのレーザーを使用しなければならず、この際、コストに関して考慮すべき不都合が生じる。
【００６８】
このように、リーダーの照明手段を実現するための公知の解決方法には制限があるように思われる。
【００６９】
本発明の目的は、照明手段に関するこれらの制限の回避を可能にすることである。
【００７０】
「温度制御」についての態様
さらに、例えば、チップ上でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応または酵素反応などの多くの適用においては、リーダーを用いて、これらの反応のパラメーターをチップの温度の関数としてモニタリングすることが有利である。
【００７１】
このように、温度制御されるリーダーテーブルを提供することは知られていることである。このようなリーダーの例は、米国特許第６３２９６６１号明細書に見出される。
【００７２】
よって、温度制御テーブルをチップリーダーと組み合わせることによって、特定の情報を送信することによりテーブルの温度を制御することを可能とすることができる。
【００７３】
本発明の他の目的は、この装置を改良することである。
【００７４】
特に、本発明の目的は、所望のパラメーターの観察に最適な温度条件下でチップの自動読み取りを可能にすることである。
【００７５】
上記の目的を達成するため、本発明の第一の態様によれば、チップの読み取りおよび解析のための装置であって、
・少なくとも１つのサンプルを特性決定することを目的とするチップを受容するためのテーブルと、
・他の分子と反応させた後に、チップの分子または細胞を励起させる手段と、
・励起状態にある分子を読み取り、これを解析する手段と
を含んでなり、
・前記テーブルの温度を制御するためのユニットであって、該制御ユニットが、テーブル表面の種々のスポットの向い側に配置された複数のペルチェ加熱／冷却素子で構成されているモジュール（１１１）に連結されてなるものと、
・前記制御ユニットにも連結されている少なくとも１つのテーブル温度センサー（１１２）と
をさらに含んでなることを特徴とする装置が提供される。
【００７６】
この装置の好ましい態様は、限定されるものではないが、以下のとおりである：
・ランプが水銀ランプであり、
・レーザーが、その照射光が６３５ｎｍ程度の波長を中心とするレーザーであり、
・リーダーがいくつかのレーザーを含み、
・それらのレーザーが同じ波長を中心とするものであり、
・励起手段が、解析の対象とする分子を励起させるためにそのビームをスキャニングするためのモジュールを搭載した少なくとも１つのレーザーを含み、
・リーダーが２つのレーザーを含み、かつ、それら２つのレーザーをスキャニングするためのモジュールが分子の２つの各スキャンを直交する２つの方向に制御し、
・励起手段が、その照射光が光ファイバーにより導かれるレーザーを含む少なくとも１つのレーザーアセンブリーを含み、
・励起手段が２つの同一のレーザーアセンブリーを含み、
・励起手段が、そのビームを直列に設置された２つの連続するミラーアセンブリーに向ける固定レーザーを含み、かつ、該ミラーアセンブリーの動作が異なる２方向に沿って制御され、
・２つのミラーアセンブリーの動作が、チップ上で所望の順序に進み得るビームを作り出すように制御され、
・励起手段がランプおよびレーザーを含み、これら２つの照射光のうちの一方がチップに向けられるように２つの位置間で軸を中心に回転可能なスウィングミラーによって、それらの照射光が同じ光学経路を通り、
・光学系がランプと励起させようとする分子との間に置かれ、レーザー励起が分子の直接照明により行われ、
・前記光学系が、狭帯域励起光フィルターおよび狭帯域発光フィルター、ならびにビーム分離器を含み、
・リーダーが、その機能を制御するために各励起手段と連結されている励起制御ユニットをさらに含み、あるいは、
・前記励起制御ユニットが、ランプと少なくとも１つのレーザーによる分子の同時もしくは連続照明、またはランプと少なくとも１つのレーザーによる分子の個別励起を選択的に制御しうるものである。
【００７７】
また、本発明によれば、チップの読み取りおよび解析のための装置であって、
・少なくとも１つのサンプルを特性決定することを目的とするチップを受容するためのテーブルと、
・他の分子または細胞と反応させた後に、チップの細胞または分子を励起させる手段と、
・励起状態にある分子または細胞を読み取る手段と
を含んでなり、このリーダーが温度制御ユニットをさらに含んでなることを特徴とする装置も提供される。
【００７８】
この装置の好ましい態様は、限定されるものではないが、以下のとおりである：
・テーブルが、前記温度制御ユニットと連結されている温度センサーを含む。
・リーダーが、テーブルに設置された、その温度を制御することを目的とする加熱／冷却モジュールを含み、該加熱／冷却モジュールが温度制御ユニットと連結されている。
・リーダーが、マイクロプロセッサーを含む、温度制御ユニットおよび読み取り手段に連結された処理手段をさらに含む。
・リーダーが、励起手段に対する分子のマッチおよびミスマッチ応答の温度関数としての参照曲線を記憶する手段を含む。
・記憶手段が、分子のマッチおよびミスマッチに関する融解温度を前記参照曲線から決定するための手段と連結されている。
・温度制御ユニットが、予め準備された、分子のマッチおよびミスマッチ応答の温度関数としての参照曲線を利用して設定温度が決定され、その設定温度が前記温度制御ユニットにより伝達され、前記テーブルの温度が制御されるという「静的」モードにより、リーダーの機能を制御しうるものである。
・温度制御ユニットが、該温度制御ユニットによりテーブル上での所定の温度変化が制御され、かつ、この温度変化の間：
・読み取り手段により、チップ上の種々のスポットと結合した分子の、励起手段による励起に対する応答がリアルタイムで収集され、前記応答が処理手段へと伝達され、
・記憶手段により、チップ上の各スポットについて、分子の応答変化が温度関数として記憶される
という「動的」モードにより、リーダーの機能を制御しうるものである。
・リーダーが、各分子について、前記応答変化の記憶終了時に、分子の状態の診断を確立しうる処理手段を含む。あるいは、
・状態の前記診断がマッチ／ミスマッチ診断である。
【００７９】
さらに、本発明はまた、チップを読み取るためにこのような装置を使用する方法に関する。
【００８０】
このような方法は、特に、上記態様のいずれか１つのリーダーを用いて実施することができる、チップのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション方法とすることができ、該方法は、
・標的核酸に対応する核酸プローブを一本鎖ＤＮＡ断片を含む生物学的サンプルと接触させて、二本鎖の形成により特定プローブとサンプルの前記一本鎖ＤＮＡ断片との選択的ハイブリダイゼーションを実施する工程、
・このようにして形成された二本鎖を読み取る工程
を含んでなり、
・「マッチ」構造の各標的核酸の融解温度、および
・「ミスマッチ」構造の各標的核酸の融解温度
の自動決定からなる工程をさらに含んでなることを特徴とする。
【００８１】
このような方法の好ましい態様は、限定されるものではないが、以下のとおりである：
・前記決定が、マッチおよびミスマッチの各々に該当する二本鎖を読み取ることにより得られるシグナルの変化を温度の関数として示した参照曲線を用いて「静的」モードで実施され、
・前記方法が、マッチとミスマッチとの最適な区別点に相当する温度でハイブリダイゼーションが実施されるように温度を制御することを含み、
・前記方法が、読み取り工程より前の工程中に前記参照曲線を作成することを含み、
・前記方法が、前記参照曲線を記憶することを含み、
・前記決定が、サンプルの所定の温度変化を制御することにより「動的」モードで実施されることができ、かつ、この温度変化の間に、以下のこと：
・チップ上の種々のスポットと結合した二本鎖の、励起手段による励起に対する応答のリアルタイム収集、
・各二本鎖についての、応答変化の温度関数としての記憶
が実施され、あるいは、
・前記方法が、各二本鎖について、前記応答変化の記憶終了時に、二本鎖のマッチ／ミスマッチ診断を確立することを含む。
【００８２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の説明、ならびに、実施例および図面から明らかになる。実施例および図面の説明を以下に示す。
【００８３】
発明の具体的説明
図１には、本発明によるリーダー１０が図示されている。
リーダー１０は：
・チップ１２を受容するためのテーブル１１、
・励起手段１３、
・読み取り手段１４（すなわち、特に、手段１３による照射により励起を受けたチップの分子を観察する手段）、
・命令および制御手段
を含む。
【００８４】
テーブル１１
テーブル１１は、図２の上部に詳細に示している。
【００８５】
このテーブルは、通常、チップ１２を保持するための手段１１０を含む。
【００８６】
これらの手段は、チャンバー、例えば、ハイブリダイゼーションチャンバーを含んでなってもよい。
【００８７】
テーブル１１には、テーブルの温度を制御することが可能な加熱／冷却モジュール１１１が取り付けられている。
【００８８】
より正確に言えば、モジュール１１１は、複数のペルチェ効果加熱／冷却素子で構成されている。これらのペルチェ素子はテーブル１１の厚みの部分に組み込まれている。
【００８９】
これらペルチェ素子の各々は、テーブル１１表面のスポットの向い側に配置され、従って、テーブルによって保持されたチップ１２上のスポットの向い側に配置されている。
【００９０】
前記スポットは互いに隣接しており、これらの組合せは、チップの表面全体に及んでいる。
【００９１】
これらのスポットは、プローブを受容するチップ上のスポットに対応させることが有利でありうる（本明細書中に後述する説明を参照）。
【００９２】
さらに、モジュール１１１は、温度制御ユニット１５と連結されており、モジュールが観察される物理化学現象に応じた温度変位率によって、しかるべく、テーブルの温度を調整するように、温度制御ユニットが設定温度を作り出し、それをモジュール１１１に伝達する。
【００９３】
より正確に言えば、制御ユニットは、モジュール１１１の各ペルチェ素子についての各設定温度を作り出す。
【００９４】
これらのペルチェ素子は極めて正確であり、一般に、０．０１℃程度の精度で設定温度を提供する。
【００９５】
これらのペルチェ素子の組合せによって形成されたモジュール１１１は、テーブル１１の加熱／冷却を可能にするために、熱交換モジュールと連結している。
【００９６】
この熱交換モジュールは、空気循環または流体循環によって機能を果たし得る。
【００９７】
従って、テーブル上のいかなるスポットにおいても温度を微細に制御することができる。
【００９８】
このようにして、特に、テーブル１１上の全てのスポットにおいて、厳密に同じ温度を確実に実現することができる。
【００９９】
このことは、ペルチェ素子が設定温度の変化（上昇または下降）に対して非常に敏感であるという事実によってさらに裏づけられる。
【０１００】
ゆえに、これらの素子は、急激な温度変化を正確に（一般に、０．０１℃程度の精度で、かつ、１秒間当たり数℃の変化率で）与えることができる。
【０１０１】
そのため、「急激な」温度変化、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応の頭字語）タイプの反応に用いられるような、１秒間当たり数℃程度の変化を行うことが望まれることがある。
【０１０２】
また、「緩慢な」変化（例えば、ＤＮＡ鎖融合タイプの反応にその解離を目的として用いられるような、１分間当たり数℃程度の変化）を行うことが望まれることもある。
【０１０３】
これらの種々のタイプの変化を用いることができるように、少なくとも１つの対応テーブルが、ユニット１５によってアクセス可能な装置の記憶装置（例えば、記載するコンピューター１７の記憶装置）に記憶されている。
【０１０４】
変化率は、想定される反応のタイプだけでなく、使用するプローブのタイプおよび特性決定したいサンプルによって異なることに留意すべきである。
【０１０５】
この点において、対応テーブルでは、これらのパラメーターも計算に入れられる。
【０１０６】
さらに、これを受けて、装置のユーザーは、ユニット１５および／またはコンピューター１７と連結された好適なインターフェイス（キーボードなど）に、対応テーブルを備えたプログラムがモジュール１１１へと伝達される設定温度変化を自動選択するための関数であるパラメーター（特に、反応のタイプ、プローブ、サンプル）を入力する。
【０１０７】
さらに、テーブルには温度センサー１１２が組み込まれ、そのセンサーがその有効温度を読み取り、その温度をこのセンサーが連結されている温度制御ユニット１５に伝達する。
【０１０８】
このようにして、チップ上のスポットの温度が温度制御ユニット１５によって制御され、さらに、温度制御ユニットによって、チップ上のスポットのそのときの温度がリアルタイムで分かる。
【０１０９】
さらに、いくつかの温度センサー１１２を、スポット群の向い側に、場合によってはチップ上の各スポットそれぞれの向い側に配置することができる。
【０１１０】
（単数または複数の）センサー１１２は、テーブル１１に組み込まれている。
【０１１１】
さらに、本明細書中に後述する説明によってより詳細に分かるように（特に、動的モードに関して）、この（これらの）温度センサーによって、装置の機能に関連した温度パラメーターを読み取ること、さらに、この機能を調節することも可能になる。
【０１１２】
励起手段１３
励起手段１３は、２つのタイプの光源：
・広域スペクトルランプ１３１−好ましくは、水銀ランプ、
・少なくとも１つのレーザー１３２
を含む。
【０１１３】
このレーザーは、通常使用される標識を励起させることを可能にし、かつ、その励起スペクトルがランプ１３１の蛍光スペクトルと一致していない波長で放射する。
【０１１４】
ランプがＣｙ５標識を励起させることのできない水銀ランプである好ましい実施態様では、レーザーは、６３５ｎｍを中心とするライン付近で放射する従来の赤色レーザーまたはＣｙ５分子の励起を可能にする他のレーザーとされる。
【０１１５】
このように、励起手段１３によって、通常使用される全ての発光標識を励起させることができる。
【０１１６】
さらに、このタイプのレーザーは非常によく使われており、安価であるため、レーザーを使用することによりリーダーのコスト価格がここで大幅に上昇することはない。
【０１１７】
励起手段１３はまた、各種光源に対するそれぞれの電源１３１０、１３２０も含む。
【０１１８】
この手段１３はさらに、ランプ１３１とテーブルとの間に置かれた（それゆえ、ランプとチップの分子との間に置かれる）光学系１３１１も含む。
【０１１９】
図３ａに示したように、この光学系は励起フィルター１３１１１とビーム分離器１３１１２を含み、このビーム分離器は、
・ランプとフィルター１３１１１からの照射光がチップに向けられること、
・およびランプ（または励起手段のレーザー）から受けた励起に応じてチップからもたらされるシグナルを読み取り手段１４に直接送ること
を可能にする。
【０１２０】
前記光学系が狭帯域励起光フィルターおよび狭帯域発光フィルター（少なくとも２個〜最大８個）、ならびにビーム分離器を含む場合もあることも明示される。
【０１２１】
チップに向かう照射光および、このチップから発生する照射光は、対物レンズ１３４も通過する。
【０１２２】
励起手段１３はまた、フィルター１３１１１とフィルター制御手段１６とに連結される干渉フィルター変更手段１３１２（図１に示す）も含む。
【０１２３】
よって、当然のことながら、ランプからの照射光によるチップの分子の励起は光学系を介して起こる。
【０１２４】
レーザーからの照射光によるチップの分子の励起に関しては、レーザーとチップとの間には素子が置かれていないため、それが直接起こる。
【０１２５】
さらに詳しく言えば、図３ａに例示されている態様では、励起手段が２つのレーザー１３２１および１３２２を含む。これらの２つのレーザーは同一のものである。
【０１２６】
各レーザーは、バイオチップをスキャニングするためのモジュール（示していない）を搭載している。
【０１２７】
リーダーが１つのレーザーしか含んでいない場合には、このレーザー自体がパラメトラブル幾何学のビームによりこの機能を果たすモジュールも搭載している。
【０１２８】
特性決定することが望まれるチップ上のスポットに対応する視界を効果的にカバーし、レーザーによりこの視界を一様に照明するために、２つのスキャニングモジュールによって、分子の２つのスキャンのそれぞれが直交する２つの方向で行われる。
【０１２９】
このタイプのスキャニングについては、図３ａの下部に例示されている。
【０１３０】
２つのバンド１３２１０および１３２２０は、２つのレーザー１３２１および１３２２のそれぞれのビームを表している。
【０１３１】
これら２つのビームの断面は細長く、２つのビームは直交する方向に伸びている。
【０１３２】
これらの方向はそれぞれ、チップ上のスポット（これらのスポットは、一般に、矩形行列をなしている）の配列２方向のうちの一方の方向に合わせる。
【０１３３】
各ビームは、その関連するレーザーのスキャニングモジュールにより、視界１２０全体を、ビームの伸びる方向に対して直交する方向に移動する。
【０１３４】
図３ｂは、励起手段１３のレーザーの第二の実施態様を示している。これらのレーザーは、レーザー１３２１および１３２２の代わりに使用することを意図したものである。
【０１３５】
この態様では、２つのビーム１３２１０’および１３２２０’のそれぞれを発する２つの同一アセンブリー１３２１’および１３２２’により、レーザー励起がチップ１２に向けられる。
【０１３６】
これらのアセンブリーの１つ（１３２１’と示した）を図３ｂの上部に示している。
【０１３７】
このアセンブリーは、レーザーからのフラックスを光ファイバー１３２１３’へと導く出力レンズ１３２１２’の付いたレーザー１３２１１’を含む。
【０１３８】
このファイバーは、照射光を、チップに対して相対的に固定設置された、ビーム１３２１０’をチップへ方向づける１３２１４’と記される別のレンズへと送る。
【０１３９】
図３ａの下部は、２つのビーム１３２１０’および１３２２０’によるチップ上およびこのように定義された照明１３２０の領域への効果を示している。
【０１４０】
このように、これらのレーザーは中心を外れることもある。
【０１４１】
図３ｃは、少なくとも１つの固定レーザー１３２”がそのビームを、直列に設置された、１３２１”および１３２２”と記される２つの連続するミラーアセンブリーに向けるというレーザーシステムの第三の態様を示している。
【０１４２】
これらのミラーアセンブリーはそれぞれ、その位置が圧電アクチュエーター１３２１０”、１３２２０”によって個々に制御されるミラーを含む。
【０１４３】
よって、より正確に言えば、各ミラーは、チップ１２の主軸Ｘ、Ｙの一方に対応する各軸に沿って動作する。
【０１４４】
従って、２つのミラーから誘導されるビーム１３２０”は、チップ上で、Ｘ、Ｙに沿って所望の順序に進むことのできる経路１３２０１”をたどる。
【０１４５】
ここでは、また、このレーザーシステムを、図３ａのレーザー１３２１、１３２２の代わりに使用してもよい。
【０１４６】
最後に、図３ｄは、図３ａで示した手段の代案となる、励起手段１３の他の実施態様を例示している。
【０１４７】
この図３ｄは、水銀ランプ１３１とレーザー１３２を示している。
【０１４８】
レーザーとランプにはそれぞれ、個々に出力レンズが付いている。
【０１４９】
この態様では、レーザーからの照射光とランプからの照射光はそれぞれ、照射光を光学系１３４とチップ１２に導くためにこれら２つの照射光のうちの一方が一連のレンズ１３０１とリターンミラー１３０２に向けられるように２つの位置間で軸１３００を中心に回転可能なスウィングミラー１３０によって、同じ光学経路を通る。
【０１５０】
ミラー１３０の回転を制御する手段は、あらゆる順序を制御することができ、例えばその２つの位置間で所望の頻度で回転させることによって、２つのタイプの照射光（レーザーとランプ）によりチップを照明することを可能にする。
【０１５１】
上記に示した全ての態様において、励起手段が１つのレーザーを含む場合もあり、またはいくつかの同一レーザーを含む場合もあることも明示される。
【０１５２】
読み取り手段１４
読み取り手段１４は、チップ１２の領域１２０の画像を取得するための光学系１４１を含み、さらに、テーブル１１の制御された動作によりこのチップをリーダーの残部に対して移動させることが可能である。
【０１５３】
この趣旨で、読み取り手段はまた、テーブル１１の動作を調整するための記録手段も含む。
【０１５４】
従って、光学系１４１は、第一の取得光学系１４１１と、この第一の光学系とＣＣＤカメラ１４２との間に挿入されるフィルター１４１２を含む。
【０１５５】
光学系１４１はまた、フィルター１４１２とフィルター制御手段１６とに連結されるフィルター変更手段１４１２０（図１に示す）も含む。
【０１５６】
制御および命令手段
リーダーを制御し、それに命令するための手段は、すでに述べた温度制御ユニット１５およびフィルター制御手段１６の他に、リーダーの全構成要素の機能を管理するコンピューター１７を含む。
【０１５７】
コンピューターは、機能的指示をそれらに伝達し、および／またはそれらから情報を受け取るように以下の要素と接続される：
・電源１３１０および１３２０−この点において、コンピューターは励起制御ユニットの機能を実行する。コンピューターが選択的に制御する場合もあることも明示される：
・ランプおよび少なくとも１つのレーザーによるチップの分子の同時照明、
・またはランプおよび少なくとも１つのレーザーによる分子の個別励起、
・温度制御ユニット１５、
・フィルター制御手段１６、
・ならびにその後の他の制御および命令要素。
【０１５８】
よって、リーダーを制御し、それに命令するための手段は、
・テーブル１１の動作を制御するための、このテーブルとコンピューター１７とに連結されているユニット１８、
・カメラ１４２、そして動的現象を追跡するためのリアルタイムモードを含む可変モードによるか、または極弱強度のスポット（ハイブリダイゼーションシグナル）に関する画像のシグナル対ノイズ比を高めるためのポーズ時間を用いたこのカメラによる画像の取得を制御するためのユニット１９
も含む。
【０１５９】
リーダーの機能
本発明によるリーダーの構造は、以上で詳細に記述してきた。その機能の特定の態様は、特に、チップの分子の励起に関して取り上げてきたが、ここでは、このリーダーの機能を温度制御に関して詳細に記述する。
【０１６０】
より正確に言えば、この機能を本発明の好ましい適用、すなわち、チップのオリゴヌクレオチドと生体サンプル由来の一本鎖ＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーションに基づいて記述する。
【０１６１】
しかしながら、本発明によるリーダーを他の用途で、例えば、酵素反応（特に、リガーゼ、ＰＣＲ、単純オリゴヌクレオチド伸長などのタイプの）の実施、リガンドのスクリーニングなどに用いる場合もあることも明示される。
【０１６２】
ハイブリダイゼーション適用に戻れば、例えば、患者由来の生体サンプルを調べ、その中の特定の遺伝的特徴を検出する。例えば、得ようとする特徴は、例えばＣＦＴＲ遺伝子などの特定の核酸配列に変異が存在する可能性である。
【０１６３】
この方法は、通常、標的核酸に対応するヌクレオチドを用いて構成される核酸プローブを、チップの種々のスポットに構成することによりチップを調製することから始める。
【０１６４】
これらのプローブは、一本鎖ＤＮＡ断片を含有するサンプルとハイブリダイズすることを目的とするものである。
【０１６５】
さらに、一本鎖ＤＮＡ断片を、既知の方法により、特に、ＰＣＲ増幅により得る。これらの断片をチップのプローブとハイブリダイゼーションさせた後、それらをリーダーの読み取り手段によって検出できるように、これらの断片を標識と結合させる。
【０１６６】
次いで、特定のプローブとサンプルの前記一本鎖ＤＮＡ断片との選択的ハイブリダイゼーションを行って二本鎖を構成させるように、前記プローブをサンプルと接触させる。
【０１６７】
全てのプローブがサンプルのＤＮＡ鎖とハイブリダイズするとは限らないことも明示される。
【０１６８】
実際には、核酸プローブは各々、その標的核酸と選択的にハイブリダイズする。
【０１６９】
さらに、特定のプローブが、上述のように、変異のない核酸に対応するのに対し、他のものは特定の変異を含む核酸に対応するものとする。
【０１７０】
このハイブリダイゼーション工程中に、有効にハイブリダイズされたプローブについて二本鎖が形成する。
【０１７１】
プローブが正確にハイブリダイズするという事実は、サンプルが前記プローブの標的核酸に対応する一本鎖ＤＮＡ断片を含むことを意味している。
【０１７２】
よって、このようにしてハイブリダイズするプローブは、ハイブリダイゼーション工程後の「マッチ」タイプの二本鎖に相当する。
【０１７３】
さらに、サンプルの一本鎖ＤＮＡ断片とハイブリダイズしないプローブまたはサンプルの一本鎖ＤＮＡ断片とハイブリダイズしにくいプローブは、ハイブリダイゼーション工程後の「ミスマッチ」タイプの二本鎖またはハイブリダイズしていない一本鎖に相当する。
【０１７４】
温度はこのハイブリダイゼーション工程の重要なパラメーターである。
【０１７５】
標的核酸のそれぞれに、
・「ミスマッチ」構造の二本鎖の融解温度Ｔｍ１と
・「マッチ」構造の二本鎖の融解温度Ｔｍ２
とが存在するためである。
【０１７６】
融解温度は、二本鎖の半分の２本の鎖がそれぞれに分離する温度に相当する。
【０１７７】
図４ａに示したように、Ｔｍ１はＴｍ２よりも低い。
【０１７８】
さらに、目的の標的核酸では、マッチとミスマッチとの最適な区別点に相当する温度でハイブリダイゼーション工程を実施することが望ましい。
【０１７９】
「マッチ」および「ミスマッチ」二本鎖は、上述のように、実際には、チップリーダーの読み取り手段によって選択的に視覚化することができる。
【０１８０】
この望ましい温度はＴｍ１とＴｍ２との間である。
【０１８１】
一般に知られているハイブリダイゼーション法の場合、この望ましい温度に近い温度を得るためにハイブリダイゼーションを複数回繰り返すことが一般に必要である。
【０１８２】
本発明の場合、温度制御ユニット１５による温度制御によって、この欠点を回避することが可能になる。
【０１８３】
より正確に言えば、本発明では、２つのモード：「静的」モードおよび「動的」モードによりこの適用が行われる。
これらの２つのモードでは、以下の：
・「マッチ」構造の各標的核酸の融解温度、および
・「ミスマッチ」構造の各標的核酸の融解温度
が自動決定される。
【０１８４】
静的モード
このモードは、プローブが同じ標的核酸に対応するものであるか、または類似した融解温度を有する標的核酸に対応するものであるチップの場合に非常に適している。
【０１８５】
このモードでは、特性決定を行う前に融解温度が分かるように、これらの融解温度の前記決定が事前に行われる。
【０１８６】
この特性決定を実施し、その結果を受けて、設定温度値を装置に（コンピューター１７に連結されたインターフェイスを用いて、または直接ユニット１５に）入力するオペレーターがこれらの温度を知っていてもよい。
【０１８７】
また、これらの温度はリーダーの記憶装置（前記ユニット１５に連結されている）に記憶させることもできる。
【０１８８】
上述のように、チップの温度は、マッチとミスマッチとの最適な区別点に相当する温度でハイブリダイゼーションを実施するために制御される。  融解温度はまた、リーダーによって決定され（動的モード、下記の説明を参照）、静的モードの実施用に記憶される場合もあることも明示される。
【０１８９】
事前の、融解温度のこのような決定中に、図４ａのものと同等の参照曲線が作成される。
【０１９０】
よって、参照曲線は、読み取り工程より前の工程中に作成することができる。
【０１９１】
この場合、リーダーは、温度がユニット１５の制御の影響下で連続的に変化するときの、既知の種類の一本鎖断片（変異のない標的核酸に対応する断片および変異を有する標的核酸に対応する断片）に対するプローブの応答を記録するために使用される。
【０１９２】
さらに、これらの曲線は、例えば、コンピューター１７に記憶される。
【０１９３】
動的モード
このモードは、特に、プローブが、その「マッチ」構造が全く異なる融解温度を有する標的核酸に対応するものであるチップの場合に大変適している。
【０１９４】
このモードでは、チップの温度の変化（例えば、一定上昇または一定下降）が種々のプローブの種々の標的核酸との融解温度を通過するように制御される。
【０１９５】
この変化は、ユニット１５からの適切な情報をテーブルに連結されたモジュール１１１のペルチェ素子に送ることによって得られる。
【０１９６】
この温度変化の間に：
・読み取り手段１４により、チップ上の種々のスポットと結合した二本鎖の、励起手段１３による励起に対する応答がリアルタイムで収集され、前記応答がコンピューター１８へと伝達され、
・チップ上の各スポットについて、二本鎖の応答の発生が温度関数としてコンピューター１８の記憶装置により記憶される。
【０１９７】
さらに、テーブル内に少なくとも１つの温度センサー１１２が存在することにより、
・変化を通して、一連の温度値（これは種々のセンサー１１２が配列されているテーブル上（それゆえチップ上となる）の種々の位置で行われる）を読み取ること（このことにより、二本鎖の応答変化を温度関数として特性決定することが可能になる）、
・テーブルの表面上の温度を制御すること（この点に関し、センサー１１２によって、加熱素子への設定温度の伝達に不服のない単純「ブラインド」制御に勝る温度の正確な調節が可能になる）
が可能になる。
【０１９８】
ペルチェ素子は反応性が非常に高く、急激な温度変化を可能にすることから、ＰＣＲタイプの適用も考えられることに留意すべきである。
【０１９９】
それゆえ、さらに、個別ペルチェ加熱／冷却素子を少なくとも１つの温度センサーと組み合わせることにより、
・テーブル上（それゆえ、チップ上）の全てのスポットにおける温度分布を微細に制御すること、
・および単純制御に勝る正確な調節を行うこと
が可能になる。
【０２００】
こうして、コンピューターは、チップ上の各スポットについて、図４ｂに示したように、プローブの応答変化を温度関数として示す曲線を構成する。図４ｂでは、４スポットチップの極めて簡単なケース（曲線１、２、３および４）を例示している。
【０２０１】
プローブは対で分布し、その対の一方のプローブは変異のない標的核酸に対応したものであり、もう一方のプローブは変異を含む同じ標的核酸に対応したものである。
【０２０２】
そのため、各対の２つのプローブの応答は、図４ａの２つの参照曲線と類似した２つの曲線となる。
【０２０３】
さらに、各プローブ対についての曲線を解析することによって、「マッチ」プローブと「ミスマッチ」プローブとを判定することが可能である。
【０２０４】
この趣旨で、コンピューターは、チップ上の各スポットについて、応答の前記変化を一旦記憶すれば、このスポットと結合したプローブの状態の診断を確立することができるプログラムを含む。
【０２０５】
実施例
本発明によるチップリーダーは、ＤＮＡチップの読み取りを可能にするものである。そのため、本発明の目的は、特に、ヒトＣＦＴＲ遺伝子（嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子）の野生型または変異型遺伝子の断片に対応しているか、あるいはそれらを含む数多くのオリゴヌクレオチド（またはプローブ）からなるＤＮＡチップを提供することでもある。このようなチップは、特に、ヒトＣＦＴＲ遺伝子における変異を検出し、嚢胞性繊維症を診断するのに有用である。
【０２０６】
嚢胞性繊維症は、北米では２０００人の出生数に約１人の割合で影響を及ぼしているという、白人集団で最も一般的な常染色体劣性疾患の１つである(Boat et al., The metabolic basis of inherited disease, 6th Ed. pp 26491680, McGraw Hill, New York, 1889)。
【０２０７】
嚢胞性繊維症は、２５０ｋｂに及び、２７個のエクソンを含むＣＦＴＲ遺伝子における変異と関係している。１９８９年に遺伝子が同定されて以来、この遺伝子の変異スペクトルを定義するために、多くの遺伝子分析が行われてきた。前記変異は多種多様であり、そのため、８５０を超える変異が同定された。しかしながら、患者の５０％に存在すると判明したのは１つの変異だけであり、それがデルタＦ５０８変異である。他の変異も存在しているが、患者における発生率が低いことが多い（１〜５％）。
【０２０８】
この観察結果は、利用可能な診断検査の開発の複雑性を明白にしている。例えば、ある診断検査では、試験管内連結反応を利用して約３０個の異なる変異の検出を可能としている(OLA, Perkin Elmer)。
【０２０９】
ヒトＣＦＴＲ遺伝子における変異を同定するために、ＤＮＡチップ技術に関連した他のアプローチが開発された。例えば、米国特許第６，０２７，８８０号；同第５，８３７，８３２号；同第５，９７２，６１８号および同第５，９８１，１７８号の明細書を参照されたい。しかしながら、今日まで、単純で、迅速で、効率よく、かつ信頼性のある方法によりＣＦＴＲ遺伝子において最も一般的な変異を検出することが可能な検査はない。これが問題であるが、本発明は、本発明によるリーダーに用いることができる、ヒトＣＦＴＲ遺伝子における変異を検出するためのＤＮＡチップを開発することによって、この問題を解決することも提案している。
【０２１０】
ＣＦＴＲチップの特徴
よって、本発明は、ヒトＣＦＴＲ遺伝子における変異を検出するためのオリゴヌクレオチドのアレイまたはＤＮＡチップ（ＣＦＴＲチップ）を提供する。このアレイは、複数の異なるオリゴヌクレオチド（プローブ）が、前記オリゴヌクレオチドが相補的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと（すなわち、調べようとする生体サンプルに存在するか、あるいはそれら由来の標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと）有効にハイブリダイズするように、そして、異なる核酸配列を有する前記オリゴヌクレオチドが前記固相支持体と個別スポットで結合し、その結果として、特定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドが前記固相支持体上の特定の位置にある相補的標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと有効にハイブリダイズするように結合されている固相支持体を含む。
【０２１１】
前記アレイは、オリゴヌクレオチドの各対が野生型（ｗｔ）ＣＦＴＲ遺伝子のオリゴヌクレオチド断片に対応しているか、またはそれらを含むオリゴヌクレオチド、および変異型（ｍｕｔ）ＣＦＴＲ遺伝子のオリゴヌクレオチド断片に対応しているか、またはそれらを含むオリゴヌクレオチド、ならびに変異型ＣＦＴＲ遺伝子および野生型ＣＦＴＲ遺伝子のいずれとも「ミスマッチ」二本鎖を形成する負の対照オリゴヌクレオチド（ｃｏｎｔ）からなる、少なくとも１対、少なくとも２対、少なくとも３対、少なくとも４対、少なくとも５対のオリゴヌクレオチド、少なくとも６対、少なくとも７対、少なくとも８対、少なくとも９対、少なくとも１０対、少なくとも１５対のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするものである。
【０２１２】
２セットのプローブ、約２０ｎｔ長（塩基組成によって異なる）と１５ｎｔ長、を作製する。
【０２１３】
好ましくは、前記セット（野生型／変異型／対照）は、以下のものからなる群から選択する：
セット番号１：（このセットでは対照プローブはなし）
ＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴＴ（配列番号１）２４量体
ＣＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴ（配列番号２）２４量体
セット番号２：
ＡＧＧＡＡＡＡＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＧ（配列番号３）２１量体
ＡＧＧＡＡＡＡＣＴＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＧ（配列番号４）２１量体
ＡＧＧＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＡＣＡＧＡＡＴＧ（配列番号５）２１量体
セット番号３：
ＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号６）／２２量体
ＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号７）２２量体
ＡＣＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＴＧ（配列番号８）２２量体
セット番号４：
ＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号９）／１７量体
ＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号１０）１７量体
ＴＴＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号１１）１７量体
セット番号５：
ＴＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＡ（配列番号１２）／１７量体
ＴＣＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＣＡ（配列番号１３）１７量体
ＴＣＧＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡ（配列番号１４）１７量体
セット番号６
ＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣ（配列番号１５）／１５量体
ＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣ（配列番号１６）１５量体
ＡＣＣＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣ（配列番号１７）１５量体
セット番号７：
ＣＴＴＧＣＴＣＧＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号１８）／１５量体
ＣＴＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号１９）１５量体
ＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号２０）１５量体
セット番号８：
ＴＣＧＴＴＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴ（配列番号２１）／１５量体
ＴＣＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴ（配列番号２２）１５量体
ＴＣＧＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＣＴ（配列番号２３）１５量体
【０２１４】
対番号１により、ＣＦＴＲ遺伝子における最も一般的な変異である、第１０エクソンに位置するデルタＦ５０８変異を検出することが可能になる。この変異は、３塩基対（ＡＧＡコドン）の欠失に相当し、この結果として、ＣＦＴＲタンパク質の５０８番目のアミノ酸の欠失をもたらす。
【０２１５】
セット番号２により、ＣＦＴＲ遺伝子の第１０エクソンにある変異Ｑ４９３Ｘを検出することが可能になる。この変異は、４９３位のＧ→Ａ置換に相当し、この結果として、ナンセンス変異が出現することとなる。
【０２１６】
セット番号３および６により、ＣＦＴＲ遺伝子の第１１エクソンにある変異Ｇ５４２Ｘを検出することが可能になる。この変異は、５４２位のＣ→Ａ置換に相当し、この結果として、ナンセンス変異が出現することとなる。
【０２１７】
セット番号４および７により、ＣＦＴＲ遺伝子の第１１エクソンにある変異Ｒ５５３Ｘを検出することが可能になる。この変異は、５５３位のＧ→Ａ置換に相当し、この結果として、ナンセンス変異が出現することとなる。
【０２１８】
セット番号５および８により、ＣＦＴＲ遺伝子の第１１エクソンにある変異Ｇ５５１Ｄを検出することが可能になる。この変異は、５５１位のＣ→Ｔ置換に相当し、この結果として、５５１位でアスパラギン酸のグリシンへの置換が起こる。
【０２１９】
好ましくは、本ＣＦＴＲチップは、上記５対のオリゴヌクレオチドを少なくとも全て含む。本発明によるＣＦＴＲチップは、それを構成するオリゴヌクレオチドが、それらが二本鎖形態である場合に、類似した、好ましくは、約５５〜８５℃の間約６５〜７５℃の間、好ましくは、約７０℃前後の融解温度（Ｔｍ）（１Ｍ  ＮａＣｌ中）を有していることを特徴とする。よって、配列のオリゴヌクレオチド：
【０２２０】
所望により、本発明によるＣＦＴＲチップはまた、負の対照オリゴヌクレオチド、すなわち、検査対象の全標的との間でミスマッチを有するハイブリッドを形成するプローブも含んでもよい。
【０２２１】
固体表面に固定されるオリゴヌクレオチドの配列の選択は、ミスマッチを含むハイブリッドとミスマッチを含まないハイブリッドとをうまく識別するという意味において極めて重要である。このように、重要なパラメーターの１つは、固定化プローブによる二次分子内構造形成の可能性、さらに、分子間複合体形成の可能性を回避する（これらの構造では標的のプローブとのハイブリダイゼーションの有効性が大幅に低下し、ミスマッチを含むハイブリッドとミスマッチを含まないハイブリッドとを識別しにくくなるため）ように、プローブを設計することにある。従って、オリゴヌクレオチドの特徴に関する要件は、オリゴヌクレオチドの核酸配列、特に、その長さおよびその塩基組成の選択を通じて、ならびに／またはＴｍまたは分子内構造形成および分子間複合体形成の可能性を改変するためのさらなるヌクレオチドの付加を通じて達成される。満足させることが難しいこれらの要件により、本発明の進歩性が裏づけられる。
【０２２２】
本発明によるＣＦＴＲチップは、オリゴヌクレオチドプローブ対でコーティングされ、前記オリゴヌクレオチドプローブが平均直径２０μｍ〜５００μｍ、好ましくは、５０μｍ〜２００μｍのスポットとして置かれることを特徴とする。
【０２２３】
オリゴヌクレオチドプローブの各スポットの中心間平均距離は可変で、チップによって異なるが、隣り合った２つのスポットでのハイブリダイゼーション反応に影響を及ぼさないようにスポットが規定される。しかしながら、この距離は、好ましくは、５０μｍ〜８０μｍ、１０００μｍ〜２５００μｍ、または１００μｍ〜５００μｍである。各スポットには、同じオリゴヌクレオチドの複数のコピーが置かれることが好ましい。従って、各スポットは、好ましくは、同じオリゴヌクレオチドを少なくとも１個、少なくとも２個、または、多くの場合、少なくとも１６個を含む。
【０２２４】
本発明によるチップ上のスポット数は可変で、固体表面にスポットされるオリゴヌクレオチド対の数に応じる。好ましくは、中密度アレイ、すなわち、限られた数のスポットによるアレイである。従って、前記スポットの数は、１ｃｍ２当たり少なくとも２個、１ｃｍ２当たり少なくとも４個、１ｃｍ２当たり少なくとも６個、１ｃｍ２当たり少なくとも８個、１ｃｍ２当たり少なくとも１０個、１ｃｍ２当たり少なくとも５０個、１ｃｍ２当たり少なくとも１００個、１ｃｍ２当たり少なくとも５００個、１ｃｍ２当たり少なくとも１０００個、１ｃｍ２当たり少なくとも１００００個、１ｃｍ２当たり少なくとも５００００個、または１ｃｍ２当たり少なくとも１０００００個である。
【０２２５】
本発明によるＣＦＴＲチップの固相支持体は、ガラス、プラスチック、ナイロン（登録商標）、ケブラー（登録商標）、シリコン、珪素または多糖類から作製された固相支持体から選択される。好ましくは、固相支持体はガラススライドであり、より好ましくは、顕微鏡用ガラススライドである。
【０２２６】
好ましくは、固相支持体はアルデヒドで修飾されたスライドである。市販の２Ｄガラススライドの一例として。本発明によるチップは、好ましくは、２Ｄ−マイクロアレイまたは３Ｄマイクロアレイタイプから選択される。第一の実施態様によれば、チップは、当業者に公知の方法に従ってプローブがアミノおよびアルデヒド化学によって結合されていることが好ましい２Ｄ−チップである。よって、非修飾ＤＮＡおよびアミノ修飾ＤＮＡは、それぞれ、共有結合することによりこれらの支持体上でハイブリダイズし得る。
【０２２７】
アミノ修飾ＤＮＡの固定化用のスーパーアルデヒド支持体タイプのスライドまたは非修飾ＤＮＡの固定化用のスーパーアミン支持体タイプのスライド（例えば、TeleChem Array It slides−登録商標）について言及する。
【０２２８】
アミノ修飾ＤＮＡの市販のアルデヒド修飾スライドへの固定化の一般的原理を図５に例示している。
【０２２９】
図６および７は、高湿度（水を半分まで入れた容積約７００ｃｍ３の密閉プラスチック皿中での湿度）下でＤＮＡのスーパーアルデヒド表面とのカップリングを行うためのプロトコール改変効果を例示している。
【０２３０】
この改変により固定化効率およびシグナル／ノイズ比を高めることが可能である。
【０２３１】
第二の実施態様によれば、チップは、ヒドロゲルベースの３Ｄ−チップ、例えば、（ｉ）プローブ固定化効率がより高く、それゆえ、ハイブリダイゼーションシグナル強度がより向上しており；（ii）ミスマッチを含む、またはミスマッチを含まないハイブリッド間での識別性がより優れているという利点がある3D-link activated slides（商標）(Motorola)である(Livshits and Mirzabekov, 1996, Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucleotides. Biophys. J. Nov.; 71(5) 2795-2801)。
【０２３２】
好ましくは、上記ＣＦＴＲチップのオリゴヌクレオチドは固体表面にスポットされ、そこにオリゴヌクレオチドの一方の末端により一本鎖ＤＮＡ形態で結合される。好ましくは、その末端が３’末端である。
【０２３３】
ＣＦＴＲチップの使用
手順
材料と方法：ハイブリダイゼーション条件
オリゴヌクレオチドとチップとのハイブリダイゼーション
以下の：
・Ｃｙ３蛍光体で標識した非変異型（野生型またはｗｔ）オリゴヌクレオチドと
・Ｃｙ５蛍光体で標識した変異型（またはｍｕｔ）オリゴヌクレオチド
の混合物から調製したサンプルをチップ上でハイブリダイズさせた：
ＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡ−Ｃｙ３（ΔＦ５０８−ｗｔ）
ＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧ−Ｃｙ５（ΔＦ５０８−ｍｕｔ）
ＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴ−Ｃｙ３（Ｑ４９３Ｘ−ｗｔ）
ＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴ−Ｃｙ５（Ｑ４９３Ｘ−ｍｕｔ）
ＡＡＴＡＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴ−Ｃｙ３（Ｇ５４２Ｘ−ｗｔ）
ＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＴＴ−Ｃｙ５（Ｇ５４２Ｘ−ｍｕｔ）
ＡＧＧＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡ−Ｃｙ３（Ｒ５５２Ｘ−ｗｔ）
ＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡ−Ｃｙ５（Ｒ５５２Ｘ−ｍｕｔ）
ＴＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＣＡＡＣＧＡ−Ｃｙ３（Ｇ５５１Ｄ−ｗｔ）
ＴＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＣＧＡ−Ｃｙ５（Ｇ５５１Ｄ−ｍｕｔ）
【０２３４】
図８では、オリゴヌクレオチドΔＦ５０８−ｗｔ、ΔＦ５０８−ｍｕｔ、Ｑ４９３−ｗｔおよびＱ４９３Ｘ−ｍｕｔのチップ上でのハイブリダイゼーションに対応するハイブリダイゼーション画像を示している。
【０２３５】
マッチ／ミスマッチの差異は５つ全ての変異で観察される。
【０２３６】
材料と方法：ハイブリダイゼーション条件
Metabion社の３’末端標識オリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドの品質は、変性条件下、２０％ポリアクリルアミドゲルで確認した。
【０２３７】
蛍光体標識したオリゴヌクレオチドのチップ上でのハイブリダイゼーションを、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡタイプの溶液中、周囲温度にて１２時間行った。ハイブリダイゼーションチャンバーの容量は１８０μｌであり、各オリゴヌクレオチドの濃度は０．１μＭであった。
【０２３８】
次いで、チップのハイブリダイゼーション後の洗浄を、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの溶液中、周囲温度にて１分間行った。
【０２３９】
さらに、TeleChemプロトコールに従って、チップを５００×ｇにて１分間の遠心分離により乾燥させた後、読み取った。
【０２４０】
一般に、本発明のこの適用では、患者のＣＦＴＲ遺伝子の配列中に変異が存在する可能性を、好ましくは、本発明によるリーダーを用いて検出するための本発明によるＣＦＴＲチップの使用を含む。
【０２４１】
この方法の基本工程は以下のとおりである：
・標的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの調製：
当業者が一般的に使用している方法により、生体サンプルからゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ、もしくはその断片を抽出する。組換えＤＮＡ技術を利用して、所望により、ＲＮＡをｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）に変換する。続いて、このように単離されたＤＮＡを断片にし、および／またはＰＣＲによる増幅に付してオリゴヌクレオチド断片を作製する。後者のものを、事前、その間、または事後、従来の方法によりシグナル発生標識で標識する。好ましい実施態様によれば、このように単離されたＤＮＡを、標識または修飾ヌクレオチドを利用し、調べるＣＦＴＲ遺伝子の領域に対して特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅する。続いて、このようにして標識したＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを変性させて一本鎖分子を得る。
【０２４２】
・ｓｓＰＣＲ産物の蛍光標識
第１０エクソン  ｓｓＰＣＲ産物（約４００ｎｔ長）を、以下のようにＣｙ３またはＣｙ５蛍光標識を用いて３’末端標識した：
−１００ｐｍｏｌのｓｓＰＣＲ産物を２５μｌの溶液（１×ＴｄＴバッファー、水中４００ｐｍｏｌのＣｙ３−ＵＴＰ（またはＣｙ５−ＵＴＰ））に溶かし、
−１０単位のＴｄＴを添加した。
【０２４３】
反応は３７℃にて１時間行った。結合していない標識を、Qiagenプロトコールに従い、Qiagen（登録商標）DyeEx（商標）スピンキットカラムを用いて除去した。
【０２４４】
・標的ＤＮＡとチップのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション：
続いて、このようにして標識し、変性させたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡをチップ上にスポットし、必要に応じて、所定のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でのオリゴヌクレオチドプローブとの特異的ハイブリダイゼーションにより、そこに結合させる。過剰の標識ＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくはＲＮＡおよび／または非特異的にハイブリダイズされたものを除去するための洗浄を行った後、本発明によるリーダーを使用して、形成された二本鎖を検出する。
【０２４５】
蛍光体で標識した単一タイプの標的オリゴヌクレオチドを使用して、ＣＦＴＲバイオチップ上の、野生型（ｗｔ）および／または変異型標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションシグナルの強度を比較することからなる第１の方法により、ＣＦＴＲ遺伝子中の変異の解析を行うことができる。第２のアプローチでは、ＣＦＴＲチップ上での、異なるシグナル発生標識で標識した少なくとも２つの異なる標的オリゴヌクレオチド（一方のオリゴヌクレオチドは調べようとするサンプル由来のものであり、もう一方は参照オリゴヌクレオチド（一般に、野生型配列に相当するオリゴヌクレオチド）である）のハイブリダイゼーションを使用する。
【０２４６】
ハイブリダイゼーション
前記標的オリゴヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションを、以下に規定する、ホルムアミドを含まないハイブリダイゼーションバッファー中、約２０℃の温度で行う。使用するハイブリダイゼーション培地がホルムアミドを含有している場合、当業者はこれらのハイブリダイゼーション条件を調整する必要がある。好ましくは、本発明の前記ＣＦＴＲチップ用のハイブリダイゼーション培地は、少なくとも６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム、そして、所望により、０．２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む。当業者は、所望により、これらの条件をハイブリダイゼーションバッファー中で類似した機能を果たす化合物により変更してもよい。例えば、ウシ血清アルブミンをゼラチンとし、またはＳＳＣバッファーをＳＳＰＥバッファー（５×ＳＳＰＥは７５０Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で構成されている）とする置換が考えられる。
【０２４７】
「標的核酸の前記オリゴヌクレオチドプローブとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件」とは、好ましくは、特に、以下に規定する高ストリンジェンシー条件を指す。「ストリンジェントな」条件とは、プローブがその標的配列に対してハイブリダイズするが、他の配列に対してはハイブリダイズしないという条件である。ストリンジェンシー条件は配列に依存しており、場合によって異なる。種々の因子がハイブリダイゼーションストリンジェンシーに影響を及ぼすが、これらのうち、塩基組成、相補鎖の大きさ、有機溶媒の存在および塩基ミスマッチの長さに言及する。ハイブリダイゼーションに影響を及ぼす一般的な因子に関する考察については、例えば、ＷＯ  ９３／０２２１６またはAusubel et al.(Current Protocol in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley and Sons, Inc.)を参照すればよい。一般に、ストリンジェンシー条件は、温度が所定のイオン強度およびｐＨでの特異的配列の融点（Ｔｍ）より５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（イオン強度、ｐＨおよび核酸濃度についての所定の条件下で）標的配列と相補的であるプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。通常、ストリンジェンシー条件としては、ｐＨ７．０〜最大８．３、および小型プローブ（１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃の温度において、ナトリウムまたは他の塩の濃度の場合少なくとも約０．０１Ｍ〜最大１Ｍの塩濃度という条件が挙げられる。また、ストリンジェンシー条件をホルムアミドまたはテトラアルキルアンモニウム塩などの不安定化を添加することによって得てもよい。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸Ｎａ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）および、２５℃〜３０℃の温度のストリンジェンシー条件が、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションで通常使用される条件である。
【０２４８】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションとは、温度およびイオン強度の条件が、２つの相補的ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ断片間でのハイブリダイゼーションを維持させるように選択されていることを意味する。例として、上記のハイブリダイゼーション条件を定義する目的においては、ハイブリダイゼーション工程に関して高ストリンジェンシー条件が以下のとおり有利である：ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２段階：（１）５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート溶液、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃にて３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）本質的に、プローブの大きさに応じた温度（すなわち、プローブの大きさが１００ヌクレオチドより大きい場合には４２℃）にて２０時間のハイブリダイゼーション、で行い、それに続いて、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳでの２０℃にて２０分の洗浄２回と０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳでの２０℃にて２０分の洗浄１回を行う。プローブの大きさが１００ヌクレオチドより大きい場合には、最終洗浄を０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで６０℃にて３０分間行う。当業者ならば、上記の、特定の大きさのポリヌクレオチドでの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を、Sambrook et al.(1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の教示に従って、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに対する条件へと調整することができる。
【０２４９】
最後に、ハイブリダイゼーションは高湿潤または低湿潤雰囲気で実施してもよい。低湿度または高湿度ハイブリダイゼーション条件により、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化することが可能になる。
【０２５０】
ストリンジェンシーは、ストリンジェンシー条件を徐々に上げることにより、例えば、所望の特異性レベルが得られるまで塩濃度を高めることにより、または温度を上げることにより、実験的に決定することができる。このように、本発明により、温度の上昇を正確に制御することでストリンジェンシー条件を高めることが可能になる。
【０２５１】
本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドアレイまたはＣＦＴＲチップを含む、嚢胞性繊維症を診断するためのキットを提供する。サンプル中のヒトＣＦＴＲ遺伝子における変異を検出するか、またはサンプル中のヒトＣＦＴＲ遺伝子を遺伝子型決定するためのキットまたはパックは、本発明によるＣＦＴＲチップ、そして、所望により、標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを標識するのに必要な試薬を含む。それゆえ、本発明の目的は、個体における嚢胞性繊維症を診断するための、本発明によるオリゴヌクレオチドアレイまたはＣＦＴＲチップの使用である。
【０２５２】
本発明の対象はさらに、サンプル由来のＣＦＴＲ遺伝子における変異を検出するための方法であって、
ａ）変異が存在する可能性を検出することが求められているヒトＣＦＴＲ遺伝子由来の標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含有するサンプルを、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブでコーティングされているチップ上に、これらの標的オリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドと前記オリゴヌクレオチドプローブとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でスポットする工程；
ｂ）必要に応じて、ハイブリダイゼーションにより捕捉されなかったサンプルの核酸を除去するために、工程ａ）で得られたチップを好適な条件下で洗浄する工程；および
ｃ）所望により、本発明によるリーダーを用いて、ハイブリダイゼーションによりチップ上に捕捉された核酸を検出する工程
を含む方法である。
【０２５３】
本発明の目的の１つは、個体における嚢胞性繊維症を診断するためのin vitro法であって、
（ａ）個体のＣＦＴＲ遺伝子由来の少なくとも１つのＤＮＡ断片を準備する工程；
（ｂ）前記断片をシグナル発生標識により標識し；所望により、前記断片を変性させて一本鎖断片を得る工程；
（ｃ）前記標識断片を、本発明によるオリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせる工程；
（ｄ）前記アレイの１以上のオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡ断片を検出する工程；
（ｅ）所望により、前記個体においてＣＦＴＲ遺伝子中に変異が存在することを決定する工程
を含む方法を提供することでもある。
【０２５４】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記断片は、工程（ｂ）において本発明によるシグナル発生標識で直接または間接的に標識される；好ましくは、その標識は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ、テキサスレッド（ローダミン）、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ３５０などからなる群から選択される蛍光標識である。
【０２５５】
第１の実施態様によれば、シグナル発生標識で標識した単一の標的核酸を前記ＣＦＴＲチップ上でハイブリダイズさせる。
【０２５６】
第二の実施態様によれば、シグナル発生標識で標識した少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０種の標的核酸を前記ＣＦＴＲチップ上でハイブリダイズさせる。
【０２５７】
実際には、本発明によるリーダーにより、異なるマーカーで標識したハイブリッドまたは二本鎖を同時にまたは順次検出することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】図１は、本発明によるリーダーの原理を示す図である。
【図２】図２は、その上段において、温度制御手段を詳述する、本発明によるリーダーのテーブルの原理図を示し、その下段において、温度の起こり得る変化を表すグラフ（特に、本発明による装置によって−２．３℃／ｓ程度の−温度の急激な変化が起こり得ることも示す）を示す。
【図３ａ】図３ａから３ｄまでは、上記のリーダーの励起光手段の全部または一部について４つの異なる実施態様を示す図である。図３ａには、励起手段の光源によるチップのスキャニングも例示する。
【図３ｂ】図３ａから３ｄまでは、上記のリーダーの励起光手段の全部または一部について４つの異なる実施態様を示す図である。
【図３ｃ】図３ａから３ｄまでは、上記のリーダーの励起光手段の全部または一部について４つの異なる実施態様を示す図である。
【図３ｄ】図３ａから３ｄまでは、上記のリーダーの励起光手段の全部または一部について４つの異なる実施態様を示す図である。    ：
【図４ａ】図４ａおよび４ｂは、本発明の分子ハイブリダイゼーションへの適用に関するグラフである。図４ａは、マッチ構造およびミスマッチ構造の同じＤＮＡ配列について、読み取り手段によって受け取った、チップのあらゆる点でのシグナルの変化を温度関数として示す参照曲線である。
【図４ｂ】図４ａおよび４ｂは、本発明の分子ハイブリダイゼーションへの適用に関するグラフである。図４ｂは、図４ａの参照曲線のタイプの曲線がいくつかのＤＮＡ配列について構成されている、本発明の実施の「動的」モードを例示する。
【図５】図５は、アルデヒド官能基を有するスライド（TeleChem社製スーパーアルデヒドスライド）へのプローブの固定についての反応図である。アルデヒド基がバイオチップのガラス支持体（長方形）に共有結合している。ＤＮＡ分子のＮＨ２官能基がアルデヒド基を攻撃して、共有結合を形成する（中央の図）。結合は、脱水反応（弱湿潤雰囲気中で乾燥）によりシッフ塩基を形成し、安定化する。
【図６】図６は、種々の濃度（５０、１００および２００μＭ）でスポットした後、種々の条件（低および高湿度）で固定化した対応プローブを含むバイオチップ上での野生型オリゴヌクレオチドＱ４９３Ｘ−Ｃｙ３と変異型オリゴヌクレオチドＱ４９３Ｘ−Ｃｙ５の混合物のハイブリダイゼーションにおけるＣｙ３蛍光画像を示す。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、周囲温度にて１２時間実施する。オリゴヌクレオチドの濃度は０．５μＭである。ハイブリダイゼーション後のバイオチップの洗浄は、６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳにより、周囲温度にて５分間、続いて、２×ＳＳＣにより、周囲温度にて２分間実施する。
【図７】図７は、種々の条件（低および高湿度）下で固定化した、種々の濃度（５０、１００および２００μＭ）のプローブを含むチップに関する、オリゴヌクレオチドｗｔＱ４９３Ｘ−Ｃｙ３とｍｕｔＱ４９３Ｘ−Ｃｙ５の溶液のハイブリダイゼーションに対応する蛍光シグナル強度およびノイズ／シグナル比を示す。
【図８】図８は、Ｃｙ３標識野生型オリゴヌクレオチドΔＦ−５０８とＣｙ５標識突然変異型オリゴヌクレオチドＱ４９３Ｘとのハイブリダイゼーションに対応する蛍光画像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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