(57)【要約】本発明は、細胞、組織、身体全体をフリーラジカルの過剰産生から抗酸化保護するための医薬組成物に関する。本発明の化合物は、主要作用成分の形態になった少なくとも1つの抗酸化剤を有効な量含んでいる。この抗酸化剤の選択は、ぺルオキシレドキシン、その断片、ジヒドロリポ酸、これらを許容可能な医薬用添加剤と組み合わせたものからなるグループの中から行なう。哺乳動物の疾患を予防または治療するための本発明による方法は、有効な量の化合物を、哺乳動物の組織、臓器、身体全体のいずれかと接触させる。この化合物は毒性が低いため、生物に対する多因子作用（例えば災害や火災の結果としての放射線、熱傷、化学的熱傷、外傷、怪我）の治療効率を高めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、組織、身体全体をフリーラジカルの過剰生成から抗酸化保護するための医薬組成物であって、ぺルオキシレドキシンポリペプチド、ぺルオキシレドキシンポリペプチド断片、ジヒドロリポ酸からなるグループに属する少なくとも１つの物質の有効量と、薬理学的に許容可能な添加剤とを以下の質量％で含む医薬組成物：
i）ぺルオキシレドキシンが10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤である；あるいは
ii）ぺルオキシレドキシンとジヒドロリポ酸の合計が10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤であるが、ジヒドロリポ酸に対するぺルオキシレドキシンの比は１〜50(w/w)である；あるいは
iii）ぺルオキシレドキシン断片が10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤である；あるいは
iv）ぺルオキシレドキシン断片とジヒドロリポ酸の合計が10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤であるが、ジヒドロリポ酸に対するぺルオキシレドキシン断片の比は１〜50(w/w)である；あるいは
v）ぺルオキシレドキシンが5.0〜45.0であり、ぺルオキシレドキシン断片が5.0〜45.0であり、残りが医薬用添加剤である；あるいは
vi）ぺルオキシレドキシンが5.0〜45.0であり、ぺルオキシレドキシン断片が5.0〜45.0であり、ジヒドロリポ酸が1.0〜50.0であるが、これらの合計は90.0までになっていて、残りが医薬用添加剤であるが、ジヒドロリポ酸に対するぺルオキシレドキシン+ぺルオキシレドキシン断片の比は１〜50(w/w)である。
【請求項２】
上記ぺルオキシレドキシンがPrx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V、Prx VIからなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
ヒト・ぺルオキシレドキシンPrx VIhumが使用されていることを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
病気を誘導する外来性因子および／または内在性因子からの抗酸化保護を哺乳動物において促進する方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物の組織、臓器、身体全体の細胞間スペースと接触させることを特徴とする方法。
【請求項５】
上記組成物と組織、臓器、身体全体の細胞間スペースとの接触を、塗布、スプレー、注射を利用した非経口または脊柱管内投与、輸液を利用した非経口投与、吸入、ドレーンへの導入、舌下、膣、直腸への導入、鼻または目への液滴による受動的または能動的な拡散を通じて実現することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ぺルオキシレドキシンをベースとした上記組成物の使用前、使用と同時、使用後のいずれかに治療薬をさらに使用することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項７】
上記治療薬を、i）抗菌用、抗ウイルス用、抗真菌用、抗ヒスタミン用の調製物、ii）フリーラジカルからさらに保護する高分子酵素、iii）細胞内のフリーラジカルのレベルをさらに低下させる低分子化合物、iv）臓器の移植または低温保護に使用する調製物、v）生物学的に活性なタンパク質、vi）ホルモン類、vii）ビタミン類、viii）サイトカイン類からなる群より選択することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
抗酸化特性を有する請求項１記載のポリペプチドを産生させるため、組み換えプラスミドDNAを作るための核酸分子を選択し、プラスミドで形質転換した細胞系を、上記ポリペプチドおよび／またはその断片を産生させる条件下で培養した後、そのポリペプチドを細胞培養物から単離する操作を含む方法において、上記核酸分子が、天然のヒトぺルオキシレドキシンPrx VIhumタンパク質の配列（配列ID番号1）、またはそれと同様の抗酸化活性を持つが、サイズがより小さくて細胞間スペースへの侵入可能性がより大きいポリペプチドをコードするぺルオキシレドキシンのN末端DNA断片の配列ΔPrx VIhum（配列ID番号2）を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
上記核酸分子が、抗酸化特性を有するタンパク質をコードしており、DNAまたはRNAであり、天然のヒトぺルオキシレドキシンPrx VIhumタンパク質（配列ID番号1）のアミノ酸配列に対応していて長さが224a.b.であるヌクレオチド配列、またはぺルオキシレドキシンのN末端DNA断片ΔPrx VIhum（配列ID番号2）であって長さが177a.b.のもの、またはぺルオキシレドキシンのN末端DNA断片ΔPrx VIhumであって長さが178a.b.〜223a.b.の範囲のものを含んでいることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記組み換えプラスミドDNAが、天然のヒト・ぺルオキシレドキシンPrx VIhumタンパク質または、ぺルオキシレドキシンの断片ΔPrx VIhumを産生させるためのDNAであり、そのDNAを適合性のある宿主細胞内で発現させる調節配列と機能的にリンクしているヌクレオチド配列（配列ID番号1）または（配列ID番号2）を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
組み換えプラスミドDNAによって形質転換されていて、完全長組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumまたはぺルオキシレドキシン断片ΔPrx VIhumを産生させる、菌株または細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、バイオテクノロジー、遺伝子工学の分野に関するものであり、哺乳動物の体内における酸化プロセスと還元プロセスの間のバランスの乱れに部分的あるいは全面的に起因する病気の予防および／または治療を目的とした酸化医薬組成物の成分として抗酸化調製物ぺルオキシレドキシンとその断片を製造するのに利用できる。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物に存在する抗酸化保護システムは、生体の細胞と体液（例えば血液やリンパ球）の組成の動的定常性を維持する上で重要である。細胞内抗酸化酵素系は、酸化ストレスに応答して活性酸素を中和する。呼吸器において有効に内部抗酸化保護を行なう呼吸器官はこの点に関して重要な位置にある（Bauer V.他、1999年）。
【０００３】
細胞は酸化ストレス下で調節機能を失い、その結果として酵素、タンパク質、リボ核酸の機能特性に影響が及ぶ。すると最終的に細胞死に向かうなだれ状のプロセスが発生する可能性がある。
【０００４】
活性酸素の形成と抗酸化保護のバランスは、多数の疾患の結果として乱される、あるいは生体の内在性因子および／または外来性因子の作用によって乱される。バランスの乱れは、a）細菌またはウイルスの感染、b）熱因子および／または化学的因子（熱傷、凍傷）の作用、c）物理的な損傷（外傷、骨折、脳震盪）、d）イオン化および非イオン化放射線への曝露によって誘導される。
【０００５】
フリーラジカルの過剰生成に伴う疾患の予防または治療に寄与する効果的な薬の開発は、薬理学における重要な仕事である。
【０００６】
通常は、“抗酸化剤”という用語は、活性ラジカルまたは活性酸素のレベルを低下させたり形成を防止したりする物質を表わすのに用いる。
【０００７】
多彩な疾患において抗酸化調製物が有効であることが確認されている（Babish J.G.他、PCT出願WO 02/30419、2002年）。そのような疾患としては、a）肺疾患、b）肝臓疾患、c）腎臓疾患、d）腸管の疾患、e）免疫系の疾患、f）神経系の疾患、g）眼科疾患、h）炎症プロセス、i）心臓疾患、j）ウイルス感染（例えばエイズなど）がある。
【０００８】
外来性因子と内在性因子の両方によって誘導される疾患の治療または予防の効果を増大させる抗酸化剤を探す方法がいくつか存在している。
【０００９】
低分子親水性抗酸化剤と低分子疎水性抗酸化剤（例えばα-トコフェロール、ユビキノン、N-アセチルシステイン、グルタチオン）を用いることが知られている（Gillissen A.他、1998年；Kelly F.J.、1999年；Tabot O.他、アメリカ合衆国特許第6,187,743号、2001年）。抗酸化活性を有する低分子ペプチドを用いることが知られている（McLean他、アメリカ合衆国特許第5,683,982号）。低分子抗酸化剤を利用するときの共通の欠点は、比較的小さな抗酸化活性しか持たず、重い病気には有効でないことである。
【００１０】
別の方法は、抗酸化活性の大きい酸化剤を使用することと関係している。
【００１１】
治療している肺上皮細胞の中で細胞性抗酸化剤MnSODの合成を誘導するチオレドキシンを使用すること（White K.他、アメリカ合衆国特許第5,985,261号、1999年）または肺疾患を予防するために組み換えSODを使用すること（Davis J.M.他、1993年）が知られている。公知の高分子酵素を使用することに共通する欠点は、その作用範囲が狭いことである。低分子抗酸化剤と高分子抗酸化剤を組み合わせて適用した具体例は、フリーラジカルの作用から細胞を保護する場合（Hellstrand K.他、2001年）や、特定の疾患（例えば血管疾患）を治療する場合（Vita J.A.他、2001年）に知られている。
【００１２】
広く使われている抗酸化剤（例えばα-トコフェロール、カロテノイド、フラボノイド、プロブコール）は、細胞膜の疎水性領域とリポタンパク質に局在しているラジカルと主に相互作用することを指摘しておく必要がある。それと同時に、炎症性疾患の第1段階におけるフリーラジカルの過剰生成は、活性酸素の親水性インターセプタが最大活性を示す水相に局在する。
【００１３】
現在、自然に生まれる抗酸化剤の新しいクラスが発見されている。それは、水に容易に溶け、広範な抗酸化活性を特徴とし、実験的に試験管内で調べられてきたものである。このようなクラスには、無機化合物と有機化合物の両方を広範な濃度で中和できるチオール特異的抗酸化剤またはぺルオキシレドキシンが属する（Chae H.Z.他、1994年；McConigle S.他、1998年）。試験管内での実験から、ぺルオキシレドキシンの多くが細胞増殖プロセスに関与していることがわかっている（Prosperi M.T.他、1993年；Pesenko I.V.他、1998年；Novoselov S.V.他、1999年）。
【００１４】
細胞中のぺルオキシレドキシンの研究を、アテローム性動脈硬化症（Butterfield L.H.、1999年）、がん（Chung Y.M.他、2001年；Kinnula V.L.他、2002年）、神経疾患（Kim S.H.他、2001年）、肺疾患（Das K.C.他、2001年；Kim H.S.他、2002年）、腎臓疾患（Fujii T.、2001年）、皮膚疾患（Lee S.C.他、2000年）、イオン化放射線（Park S.H.他、2000年）によって機能不全になった細胞で行なった論文が知られている。
【００１５】
これら論文の著者は、酸化ストレスに応答して細胞内で起こるぺルオキシレドキシン合成の重要な役割を指摘し、細胞内におけるいろいろなタイプのぺルオキシレドキシンの量を増やすことを提案した。
【００１６】
遺伝子工学の助けを借りて細胞内のぺルオキシレドキシンのレベルを高めることに基づいた治療法が知られている。この目的で、遺伝子工学の方法で作ったベクターを利用して動物細胞を形質転換する。ぺルオキシレドキシンの配列をコードしている1個の遺伝子を蠕虫から単離してベクターに導入する（Chandrashekar R.他、アメリカ合衆国特許第6,352,836号、2002年）。発明者は、ベクターを用いるのと同時に、動物の免疫系を刺激する手段としてタンパク質を用いることをさらに提案している。遺伝子療法を利用した哺乳動物の治療はコストがかかり、しかも多数の副作用が明らかになっているため、急速に発展しているわけではないことに注意する必要がある。
【００１７】
自然に生まれるぺルオキシレドキシンPrx VIを直接用いてラットの呼吸器の化学的熱傷を治療する実験が知られている（Novoselov V.I.他、2000年）。このような方法の1つの欠点は、天然のぺルオキシレドキシンを得るのに大きなコストがかかったことである。
【００１８】
エイズ（HIV-1）の治療法は公知である（Lynn R.G.、Walker B.D.、PCT出願WO 02/077294、2002年）。その方法によると、組み換えぺルオキシレドキシンを薬成分として使用する。主要な治療法として、生物サンプル（例えば血液、血漿、血清、唾液など）を精製するシステムを利用することが提案されている。この精製システムでは、感染した細胞同士を接触させ、サンプルとぺルオキシレドキシンからなる組成物中に入れる。ぺルオキシレドキシンは、ウイルス粒子の作用を抑制して生物の機能を回復させるのに必要な期間にわたって少なくとも5μg/mlの濃度になっている。
【００１９】
哺乳動物でこれまでに知られているすべてのぺルオキシレドキシンは、アミノ酸配列の相同性と免疫学的親和性に関し、Prx I〜Prx IV、Prx V、Prx VIというグループに分類することができる。同じグループに属するタンパク質の相同性は90％を超える。ぺルオキシレドキシンPrx I〜Prx IVは、2-Cysチオール特異的抗酸化剤のグループに属する。Prx VとPrx VIは数がわずかで1-Cysぺルオキシレドキシンと表わされ、他のグループとは大きく異なっていて、アミノ酸配列が他のグループのぺルオキシレドキシンとほんの20〜40％しか共通していない。
【００２０】
ぺルオキシレドキシン・ファミリーはよく保存されていることが特徴であり、その代表的なものは、細菌からヒトに至るほとんどすべての生物のゲノムで検出されている。光学顕微鏡とインサイチュ・ハイブリダイゼーションを利用して得られた免疫組織学的研究のデータによれば、ぺルオキシレドキシンVIは動物のほとんどすべての組織で検出される。しかしその最大濃度は、大気と直接接触する組織、すなわち嗅上皮、気道、肺気管支、皮膚、表皮、毛包において多く見られることが明らかになっている（Novoselov S.V.他、1999年）。電子顕微鏡を利用した免疫組織学的研究により、現在のところPrx VIが、同定された唯一の分泌ぺルオキシレドキシンであることがわかった。それは、特殊化された細胞（気道上皮の杯細胞と、嗅上皮の支持細胞）で合成される。ラットにおける直接的な生化学的研究と免疫学的研究により、気道、肺気管支、嗅上皮では、活性酸素中和へのPrx VIの寄与が70〜80％であることがわかった。例えば気道上皮の粘膜組成中でのPrx VIの濃度は、タンパク質1mgにつき少なくとも15μgである。
【００２１】
天然のぺルオキシレドキシンを得る方法は公知である（Pesenko I.V.他、1998年；Novoselov S.V.他、1999年）。この方法は、哺乳動物の臓器から組織を単離し、それを集めて均質化し、標的タンパク質を抽出し、さらには連続した3段階のクロマトグラフィによって調製物を分画する操作を含んでいる。天然の供給源からPrx VIを得ることの主な欠点として、動物の組織を集める必要があること、純粋な調製物の最終収率が小さいこと（動物1匹につき0.01mg）、ヒトの治療に外来タンパク質を使用するとアレルギー反応が発生する可能性があることが挙げられる。
【００２２】
組み換えタンパク質Prx VIは、さまざまな発現系を用いて得ることができる（Sang W.K.他、1998年；Chen J.W.他、2000年；Pesenko I.V.他、2001年）。
【００２３】
原核生物である大腸菌株BL21で組み換えタンパク質Prx VIを得る方法が知られている（Chen J.W.他、2000年）。この目的で、Prx VIhum HA0683 cDNA（GenBank（登録商標）D14662）の断片を採取した。この断片は長さが1653bpあり、Prx VIhumのためのオープン・リーディング・フレームを含んでいる。出発材料となる断片の主要部（長さが1044bp）を発現ベクターpET28cのHindIII制限部位に沿って挿入した。得られた構造体は組み換えタンパク質を産生させたが、その組み換えタンパク質は、Prx VIhumのアミノ酸配列に加え、42個のアミノ酸残基（その中にはタンパク質のポリペプチド鎖のN末端における6個のヒスチジン残基が含まれる）を含んでいた。論文の著者は、同じPrx VIhumの断片をベースとしてNdeI制限酵素とXhoI制限酵素の認識部位を人工的に導入し、コード領域を増幅した。得られた断片をこれら部位に沿ってクローニングし、発現ベクターpET21bに導入した。その結果、このプラスミドによって生合成が決められる組み換えタンパク質は、生成物のポリペプチド鎖上の6個にあるヒスチジン残基以外に2つの追加アミノ酸残基を含んでいた。得られたDNAで大腸菌を形質転換し、イソプロピルチオガラクトシド（IPTG）によって遺伝子の発現を誘導した後、細胞を6時間にわたって増殖させ、破壊した。タンパク質調製物をクロマトグラフィ法で連続的に精製した。追加ヒスチジン残基をポリペプチド鎖組成物に導入することで組み換えタンパク質の単離が非常に簡単になるとはいえ、そのような修飾によってタンパク質生成物の等電位点が天然のタンパク質と比べて顕著にシフトし、その結果として、そのタンパク質生成物の静電的な微小環境が変化する。
【００２４】
真核細胞における組み換えPrx VIの発現法は公知である（Fujii T.他、2001年）。この目的で、ラットのさまざまな組織からmRNAの混合物を単離し、それを用いて相補的DNA鎖を逆ポリメラーゼ反応によって合成した。次に、このcDNAをサブクローニングしてバキュロウイルス・シャトル・ベクターpVL1392に入れた。得られた構造体は、感染性真核細胞Sf21の中でラットの完全長Prx VIを産生させた。この方法は、細菌系と比べた場合、調製物の産生に時間がかかること、高価な栄養培地を使う必要があること、標的生成物の収率が低いことといった欠点から逃れられず、医薬組成物の中にラットのPrx VIを用いるとアレルギー性副作用が発生する可能性があるという欠点も有する。
【００２５】
エイズを治療するため、アミノ酸配列に置換や欠失のあるタンパク質を含むぺルオキシレドキシンの断片またはその修飾体を薬の成分として使用することが提案されたことが知られている（Lynn R.G.、Walker B.D.、PCT出願WO 02/077294、2002年）。この提案は、選択したタンパク質断片がウイルス性疾患以外の疾患を治療するのに有効な活性を持つという具体例に裏付けられていない。さらに、選択した断片は、2-cysぺルオキシレドキシン配列のN末端領域とC末端領域に位置する保存された部分に関する。これは、本発明の出願時には問題になっていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、細胞、組織、身体全体をフリーラジカルの過剰生成から抗酸化保護するための医薬組成物であって、主要活性化合物として、i）ぺルオキシレドキシン、ii）ぺルオキシレドキシンの断片、iii）ジヒドロリポ酸、iv）組み合わせi）とii）、組み合わせi）とiii）、組み合わせii）とiii）、組み合わせi）とii）とiii）、からなるグループに属する少なくとも1つの抗酸化剤の有効量と、薬理学的に許容可能な添加剤とを含む医薬組成物に関する。この医薬組成物は、Prx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V、Prx VIからなるグループの中から選択したぺルオキシレドキシンを、治療薬とは別に、あるいは治療薬と組み合わせて含むことができる。治療薬の選択は、i）抗菌用、抗ウイルス用、抗真菌用、抗ヒスタミン用の調製物、ii）フリーラジカルからさらに保護するための高分子酵素、iii）細胞内のフリーラジカルのレベルをさらに低下させる低分子化合物、iv）臓器の移植または低温保護に使用する調製物、v）生物学的に活性なタンパク質、vi）ホルモン類、vii）ビタミン類からなるグループの中から行なう。
【００２７】
本発明の別の目的は、哺乳動物の細胞、組織、身体全体の抗酸化保護を促進する方法である。この方法によると、医薬組成物に含まれる有効な量のぺルオキシレドキシンおよび／またはその断片を細胞間スペースと接触させる。組織、臓器、身体全体と細胞間スペースの接触は、塗布、液滴、スプレー、舌下投与、膣投与、直腸投与を通じた受動的または能動的な拡散によって、あるいは注射を利用した非経口または脊柱管内投与によって実現する。病気を誘導する外来性因子および／または内在性因子からの抗酸化保護は、病気になる前、および／または病気が進行している間、および／または回復期間中に実施する。
【００２８】
本発明のさらに別の目的は、天然のヒト・ぺルオキシレドキシン・タンパク質Prx VIhum、またはそれと同様の抗酸化活性を持つが、サイズがより小さくて細胞間スペースへの侵入可能性がより大きいぺルオキシレドキシンのN末端断片ΔPrx VIhumの製造方法である。この方法によれば、タンパク質をコードしている核酸分子の断片を選択し、細胞を形質転換するための発現ベクターを作り、細胞を形質転換し、細胞の培養を、そのタンパク質および／またはその断片が産生される条件下で行なった後、細胞培養物からのタンパク質の単離を行なう。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、抗酸化特性を有するタンパク質をコードしている核酸分子に関する。この核酸分子はDNAまたはRNAであり、天然のヒト・ぺルオキシレドキシン・タンパク質Prx VIhum（配列ID番号1）のアミノ酸配列に対応していて長さが224a.b.であるヌクレオチド配列、またはぺルオキシレドキシンのN末端にあるDNA断片ΔPrx VIhum（配列ID番号2）で長さが177a.b.のもの、またはぺルオキシレドキシンのN末端にあるDNA断片ΔPrx VIhumで長さが178a.b.〜223a.b.の範囲のものを含んでいる。
【００３０】
本発明のさらに別の目的は、天然のヒト・ぺルオキシレドキシン・タンパク質Prx VIhum、またはぺルオキシレドキシンの断片ΔPrx VIhumを産生させるための組み換えプラスミドである。このプラスミドはファージT7プロモータの制御下にあり、オープン・リーディング・フレームには、開始コドンATGと、ヒト・ぺルオキシレドキシンのcDNAまたはぺルオキシレドキシン断片のcDNAと、停止コドンとが含まれていて、ぺルオキシレドキシンまたはその断片を適合性のある宿主細胞中で発現させる。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、ベクターによる細胞の形質転換を通じて作り出され、天然のヒト・ぺルオキシレドキシン・タンパク質Prx VIhum、またはぺルオキシレドキシンの断片ΔPrx VIhumを産生させる菌株または細胞系に関係する。細胞は、原核細胞と真核細胞からなるグループの中から選択する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、主要活性化合物として、i）ぺルオキシレドキシン、ii）ぺルオキシレドキシンの断片、iii）ジヒドロリポ酸、iv）組み合わせi）とii）、組み合わせi）とiii）、組み合わせii）とiii）、組み合わせi）とii）とiii）、からなるグループに属する少なくとも１つの抗酸化剤を含む医薬組成物を用い、哺乳動物の細胞または体内における酸化プロセスと還元プロセスの間のバランスの乱れに起因する疾患を治療または予防する方法に関する。この医薬組成物は、Prx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V、Prx VIからなるグループの中から選択したぺルオキシレドキシンを含むことができる。
【００３３】
本発明の要点を裏付ける一例として、ヒト・ぺルオキシレドキシンPrx VIhumの遺伝子を骨髄芽細胞から単離してヒト・ぺルオキシレドキシンPrx VIhumを調製する方法が挙げられるが、具体例はこれだけに限られない（Nagase T.他、1995年、EMB/GenBank D14662、HA0683）。ぺルオキシレドキシンPrx VIhum DNA（配列ID番号1）の断片のサイズは672bpである。ポリペプチドをコードしている核酸の長さは224アミノ酸塩基である。実施例2では、完全長ぺルオキシレドキシンPrx VIhumをコードしている組み換えプラスミドpET23-a-Prx VIhumのDNAを構成する別の方法を考える。
【００３４】
本発明を裏付ける別の例は、ヒト・ぺルオキシレドキシンの少なくとも1つのタイプの断片ΔPrx VIhumを産生させる方法に関するが、方法はこれだけに限られない。この断片は核酸断片のN末端に関係し、その長さは177〜224 a.b. の範囲から選択する。実施例３では、組み換えプラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumのDNAを構成する別の方法を考える。このDNAは、長さが177 a.b. で分子量が19691.61Daのヒト・ぺルオキシレドキシンのN末端断片ΔPrx VIhum（配列ID番号2）をコードしており、EcoRI-NdelIを含んでいる。つまりこのDNAは、プラスミドpET23-a(+)の断片にΔPrx VIhumが加わった長さが552bpのDNAであり、プラスミドpET23-a(+)の断片には、RNAポリメラーゼ・ファージ・プロモータT7と、複製起点（ori）と、プラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumによって形質転換された大腸菌細胞のアンピシリンに対する抵抗性を決めている唯一の遺伝子マーカー（Ap）と、制限ヌクレアーゼによる独自の認識部位群NdeI-790、EcoRI-192、PvuII-1531、NdeI-EcoRIとが含まれている。組み換えプラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumのDNAはサイズが4210bpである。提案したこの構造体の利点は、この構造体に入るΔPrx VIhum断片が、Prx VIhumよりも短いが天然のタンパク質の抗酸化活性を保持したポリペプチドをコードしていることにある。そのため、第１に、クロマトグラフィによるΔPrx VIhumの精製が簡単になり；第２に、組織内により浸透しやすくなるために医薬組成物の中でΔPrx VIhumをより使用しやすくなり；第３に、産生用菌株の全バイオマス中に占める標的生成物の割合が大きくなるため最終生成物の価格低下に結びつく。
【００３５】
本発明の範囲において、実施例４では、機能的に活性な完全長組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhum、またはそのN末端断片ΔPrx VIhumを産生させる方法を考える。この方法は、プラスミドによって形質転換された菌株または細胞系を、問題のタンパク質またはその断片を産生させる条件下で培養した後、その細胞培養物から組み換えタンパク質を単離する操作を含んでいる。菌株または細胞系として用いる細胞は、原核細胞（例えば大腸菌の培養物）と真核細胞（例えば酵母細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞）からなるグループの中から選択する。
【００３６】
本発明の方法に従って合成した組み換えPrx VIhumは、ラットの嗅上皮から単離したPrx VIratの抗酸化特性と似た抗酸化特性を有する。
【００３７】
天然のぺルオキシレドキシンPrx VIratも組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumも、生きた多数のL929細胞系に対して何らかの効果を及ぼし、ぺルオキシレドキシンの存在下でコンカナバリンAを用いて刺激したTリンパ球の増殖レベルは、コンカナバリンAだけを用いて刺激した細胞の増殖レベルの約２倍に増大した（実施例７を参照のこと）。したがって、テストした化合物の毒性は低いことが結論される。
【００３８】
ぺルオキシレドキシンは、イソチオシアン酸フルオレセインで標識した組み換えPrx VIhumを含む組成物を製剤として静脈内投与した後に体内のさまざまな組織に分布していることがわかっている（実施例９を参照のこと）。ぺルオキシレドキシンPrx VIhumを含む組成物をラットの静脈に注射した15分後、この組成物は、脳も含めてラットの身体全体に均一に分布する。したがって組み換えPrx VIhumを静脈内投与するという方法により、生物のほぼ全組織におけるその物質の含有量を増大させることが可能である。
【００３９】
ぺルオキシレドキシンを有効な抗酸化剤として多くの用途に使用できることは、外来性因子と内在性因子の両方によって起こる哺乳動物の疾患を治療するいろいろな具体例によって示される。なお因子は、a）イオン化放射線、b）化学的火傷、（c）急性炎症プロセス、d）傷からなるグループに分けられる。提示する具体例には、予防および／または治療のためのぺルオキシレドキシンの他の用途も含まれる。
【００４０】
Prx VIhumタイプのぺルオキシレドキシンは大きな抗酸化活性を有するぺルオキシレドキシンであり、薬の製造に使用することができる。
【００４１】
ぺルオキシレドキシンの放射線保護特性
【００４２】
Prx VIhumの抗酸化特性は、試験管内（ヘモグロビン溶液を調べる）と生体内（動物で調べる）の両方で調べられている。ヘモグロビン溶液に放射線を照射すると（実施例10を参照のこと）、構造に大きな変化が起こる（635nmにピークが現われ、光散乱が増大する）。これは、オキシヘモグロビンがメトヘモグロビンに変換された後にそれが凝集したことを示している。照射前にヘモグロビン溶液にPrx VIhumを添加して約50μg/mlの濃度にすると、形成される酸化形態のヘモグロビンが大きく減少し、その濃度がほぼゼロになる。
【００４３】
生体内実験におけるぺルオキシレドキシンの放射線保護特性は、致死線量より小さい6Gyという強度のγ線照射の作用から動物が保護されるケースについて調べる。ぺルオキシレドキシンPrx VIの放射線保護特性を支持するデータを表1と実施例13に示す。照射30分前に組み換えPrx VIを静脈に1回直接注射すると、生き延びる動物の数を対照と比べて顕著に増やすとともに、照射に伴う悪性新生物の数を減らすことができた。
【００４４】
表１。照射前にPrx VIhumを投与したラットの生存数。６匹のラットからなる複数のグループに6Gyという線量のγ線を同時に照射した。各グループで表示した期間を生き延びたラットの数を表に示してある。
【００４５】
【表１】
2006505290.tif 000002
【００４６】
放射線保護物質としてのぺルオキシレドキシンは、広範な疾患を予防または治療するための医薬組成物の一成分として使用することができる。これらの疾患が起こる原因として考えられるのは、a）イオン化放射線（最も多いのは、放射線治療、健康診断、放射線源を操作する職員の場合）、b）特に宇宙飛行士やパイロットに影響を与える宇宙空間の放射線、c）放射性核種で汚染された食物、水、空気を取り込むことによって起こる放射性核種汚染、d）非イオン化放射線の作用（例えばトモグラフィ検査）、e）紫外線照射源が生物に及ぼす作用（太陽光、溶接、パルス式光源、ディスプレイ）である。フリーラジカルの過剰生成の効果を阻止する、あるいは低下させるためには、ぺルオキシレドキシンを含む解毒剤を使用することが可能である。解毒剤は、装置の修理、緊急修復手術、災害後の修復手術を行なう必要のある場所に存在する外来タイプの作用で使用する必要がある。
【００４７】
外来性因子によって起こる炎症プロセスの治療
【００４８】
化学的火傷を外来性因子の一例として選択した。化学的火傷の作用は、実施例14に従ってシミュレーションした。より効果的な治療法を開発するため、火傷後の病気の進行段階を調べた。
【００４９】
第１段階では、塩酸の蒸気による火傷後のラットの気道上皮細胞における好中球と抗酸化酵素のレベルの動的変化を調べた。活性な好中球の数が急激に増大する２つの期間が観察された。それは、火傷の40分後と６時間後である。活性な好中球の数の急激な増大は火傷の程度に依存する。というのも、好中球は過酸化水素を放出するからである。
【００５０】
生化学的検査（実施例9を参照のこと）により、上皮細胞におけるぺルオキシレドキシンPrx VIratの活性レベルが火傷の直後に約２倍になることがわかった。それと同時に、生体内の主な抗酸化酵素であるスーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンぺルオキシダーゼの活性が気道粘液中で約30％低下する。24時間後、これらすべての酵素の活性レベルが、ぺルオキシレドキシンPrx VIratも含めて低下した。
【００５１】
組織化学的検査により、火傷の40分後に気道上皮と気管支の線毛上皮細胞が死に向かうプロセスが始まり、それがのちになだれ式になることがわかった。上部気道粘膜の上皮細胞の死の最大値は火傷から24時間後に観察される。気道と気管支における粘膜毛様体輸送に重要な役割を果たしている線毛上皮細胞のほぼ完全な死が起こる。上皮のこの状態を、火傷の程度と治療の効果を比較評価するための対照として採用した。
【００５２】
化学的火傷によって起こる炎症プロセスは、化学的火傷後の2つの病気進行期間によって特徴づけられる。（化学的火傷後24時間までの）第１の期間は、上皮の火傷が進行する期間であり、（化学的火傷後最初の24時間が過ぎてからの）第２の期間は、非常にゆっくりと上皮が回復する期間である。治療なしだと、30日間で気道粘膜上皮の部分的な回復が観察される。
【００５３】
上部気道の化学的火傷後の哺乳動物を治療する別の１つの方法（火傷の場所に薬を届ける別の方法も含まれる）として、ラットの上部気道にぺルオキシレドキシンPrx VIhumを含む溶液を塗布した。図７に、毎日５回Prx VIhumを塗布した火傷後14日目のラット気道上皮の断片を示してある。気道粘膜でほぼ完全な上皮が観察される。これは、線毛上皮細胞がほぼ完全に回復したことを示している。ムチンの諸成分が存在していてその中で食細胞が同定されたということは、気道に炎症プロセスが残っていることを示している。
【００５４】
内在性因子によって起こる炎症プロセスの治療
【００５５】
炎症の別のモデルとして、細菌性の毒素（リポ多糖類（LPS））によって起こる気道上皮の炎症プロセスを調べた。リポ多糖類は、たいていのグラム陰性細菌の膜の外壁を構成する一成分である（実施例15を参照のこと）。
【００５６】
急性炎症反応を引き起こすリポ多糖類を哺乳動物の気道に塗布した後、ラットの気道上皮細胞における好中球、TNF-α、ぺルオキシレドキシンPrx VIratのレベルの動的変化を調べた。この治療法の特徴を明らかにするため、好中球と抗酸化剤のレベルの動的変化を調べるとともに、炎症プロセスが哺乳動物の身体に及ぼす効果の生化学的検査と組織化学的検査を行なった。
【００５７】
LPSを投与した１時間後に活性な好中球の数の急激な増大が観察された。活性な好中球の数の急激な増大は、火傷の程度に依存する。というのも、好中球は過酸化水素を放出するからである。
【００５８】
生化学的検査により、上皮細胞におけるぺルオキシレドキシンPrx VIratの活性レベルがリポ多糖類を塗布した１時間後に約２倍になることがわかった。
【００５９】
組織化学的検査のデータからは、LPSの濃度を1匹につき10-7mgとした場合に気道の壁面に好中球が大量に蓄積し、浮腫が進展し、その後粘膜が剥離して気道の内腔に入り込み、3時間後に死ぬことがわかる（実施例15、図８を参照のこと）。
【００６０】
免疫組織学的検査により、ぺルオキシレドキシンPrx VIratを分泌する細胞の大量死が1時間後にはすでに気道上皮の多くの領域で観察されることがわかる。これは、気道のこれら領域を覆う粘膜にPrx VIratが存在していないことを意味する。上皮のこの状態は、炎症反応の程度と治療の効果を比較評価するための対照として採用した。
【００６１】
リポ多糖類の塗布後すぐに組み換えPrx VIhumをラットの気道に１回だけ直接入れると、2週間後には上皮組織がほぼ完全に回復した（図９を参照のこと）が、LPSの塗布後に治療を行なわなかった対照群では、線毛上皮細胞がほとんど回復しなかった。
【００６２】
Prx VIhumを上皮細胞の損傷領域に導入すると、二次的な別の疾患の進展が予防され、そのことによって病理学的な変化の範囲が制限される。活性酸素を中和すると、細胞増殖プロセスが回復し、損傷した上皮が急速に再生し、損傷領域で感染合併症の起こるリスクが低下する。
【００６３】
別の抗酸化剤（例えばグルタチオン）を用いた場合には、有意な効果はなかった（表２を参照のこと）。
【００６４】
【表２】
2006505290.tif 000003
【００６５】
傷の治療
【００６６】
傷の治療では（実施例16を参照のこと）、0.5μg/mlのぺルオキシレドキシンPrx VIhumおよび／または1.5μg/mlのその断片ΔPrx VIhumを含む組成物を損傷領域の細胞内スペースに投与するためのさまざまな方法を利用することができる。しかし組成物を従来のように薄い層にして塗布し、および／または損傷部位に塗布し、Prx VIhumおよび／またはΔPrx VIhum分子を細胞内スペースに受動的に拡散させる場合でも、傷は従来よりも早く完全に治癒する。ぺルオキシレドキシンを塗布した傷の奇妙な特徴は、傷の治癒プロセスが、文献のデータによれば感染によって起こるはずの長い炎症相に入らなかったことである。ぺルオキシレドキシンを塗布することで、感染部が傷の中の好中球とマクロファージによって囲まれる速度が速まり、したがって傷を治癒させる速度が速まる原因となった。われわれの組織学的検査により、両方のぺルオキシレドキシンを傷に塗布すると殺菌膏薬を塗布した場合よりも瘢痕が明らかに小さくなることがわかった。外科的な切開を行なった８日後の瘢痕の細胞組成を比較すると、両方のぺルオキシレドキシンを塗布すると、傷が再生する炎症相に典型的な好中球、マクロファージ、血小板、リンパ球の数が顕著に減少することがわかった。さらに、ぺルオキシレドキシンを塗布すると瘢痕の若い線維芽細胞が実質的に少なくなった。ぺルオキシレドキシンまたはその断片を傷に塗布することの効果を、殺菌膏薬で傷を治療した場合と比較して図10に示してある。
【００６７】
フリーラジカルの過剰生成によって起こる疾患を予防または治療する方法
【００６８】
動物の身体に対する外来性効果と内在性効果のシミュレーション実験の途中で、体液（例えば血液、リンパ球）および／または組織、臓器、身体全体の細胞間スペースに、少なくとも1種類のぺルオキシレドキシンを含む医薬組成物を導入すると、フリーラジカルの過剰生成に伴う多数の疾患の予防および／または治療に大きな効果のあることが見いだされた。
【００６９】
一般に、哺乳動物の組織、臓器、身体全体におけるフリーラジカルの過剰生成を補償するのが有効である疾患治療法は、細胞、組織、身体全体の細胞間スペースに、主要活性化合物として、i）ぺルオキシレドキシン、ii）ぺルオキシレドキシンの断片、iii）ジヒドロリポ酸、iv）組み合わせi）とii）、組み合わせi）とiii）、組み合わせii）とiii）、組み合わせi）とii）とiii）、からなるグループに属する少なくとも1つの抗酸化剤の有効量と、薬理学的に許容可能な添加剤とを含む組成物を導入することからなる。この医薬組成物は、Prx I、Prx II、Prx III、Prx IV、Prx V、Prx VIからなるグループの中から選択したぺルオキシレドキシンを、治療薬とは別に、あるいは治療薬と組み合わせて含むことができる。哺乳動物の細胞、組織、身体全体の細胞間スペースにこの組成物を導入するには、塗布や注射といった方法、あるいは生物学的に活性なペプチドを利用する医学で公知の他の方法が用いられる。
【００７０】
ここで提案した方法は、哺乳動物の組織、臓器、身体全体の予防または治療を行なうさまざまな方法に関する。その中に含まれるのは、
A）i）（例えばがんの治療中、高い上空を飛行中、宇宙空間を飛行中の）イオン化放射線、ii）災害からの救出中や消火作業中の熱傷および／または化学的火傷の効果、iii）i）とii）に示した因子の組み合わせによって起こるフリーラジカルの過剰生成から生体、個々の臓器、正常な組織の個々の領域を予防的に保護する方法；
B）移植のため、または低温保存の可能性を改善するために臓器を保護する方法；
C）外傷、薬の注射、外科手術の結果として皮膚や組織が物理的に傷つくことによって起こる炎症プロセスから臓器を保護する方法である。
【００７１】
ぺルオキシレドキシンを含む薬の投与期間と投与量は、治療または予防の種類がどのようなものであるかによって決まる。咳やかゆみに対する対症療法では、1回分の投与量を投与するだけで十分である。疾患のメカニズムを抑制するための病原療法では、疾患の治療中にラジカルの過剰生成を抑制する調製物を投与する必要がある。哺乳動物の体内で特定の臓器が病気になったために酸化-還元のバランスが乱れると、変換療法が必要とされる。この療法は、その臓器の機能を補償し回復させるのに十分な投与量の抗酸化剤（ぺルオキシレドキシン）を必要とする。原因療法では、生体から毒物またはそれ以外の外来性物質を除去する間にぺルオキシレドキシンを含む薬を例えば点滴注入器を通じて投与する。複合療法を実施するにはぺルオキシレドキシンを含む組成物や薬を使用するのが非常に好ましい。近年は、広く見られる心血管疾患、免疫系の異常、エイズの治療、アルコールや薬物への依存に関連して、支持療法においてぺルオキシレドキシンをベースとした調製物を他の長期投与調製物とともに使用することができる。
【００７２】
治療の方法の選択・決定は、組織、臓器、身体全体の状態を調べた結果から判断して、a）医薬組成物または薬の溶液を損傷した領域に１回または繰り返して塗布またはスプレーする、b）医薬組成物または薬の溶液を1回または繰り返して注射する、c）錠剤、粉末、液体を舌下に1回または繰り返して入れる、あるいはダスト、ペースト、座薬、軟膏、ゲルを皮膚や上皮表面に塗布する、あるいはこれらの方法を組み合わせる、からなるグループの中から行なう。
【００７３】
活性なぺルオキシレドキシン成分を組織、臓器、身体全体の細胞間スペースに運ぶには、塗布またはスプレーの際に受動的または能動的な拡散の助けを借りて運ぶか、Prx VIhumまたはΔPrx VIhumまたはこれらの組み合わせをアクチベータとともに、血液、血液成分（血漿、血清）、代用血液（例えばパーフトラン）、リンパ球のいずれかを通じて運ぶ。
【００７４】
組成物は、さまざまな方法で組織、臓器、身体全体の細胞間スペースに導入することができる。ぺルオキシレドキシンは胃腸管を通過するときに分解されて生物活性を失いやすいため、主な導入方法は、非経口投与である。非経口投与では、注射、輸液、吸入、ドレーンへの導入が利用される。注射用溶液は、筋肉内、静脈内（ショック量の投与または時間をかけた輸液）、動脈内；硬膜下腔内、脳室内、脊柱管内に導入する。舌下投与では、溶液、粉末、錠剤の形態を利用できる。場合によっては、調製物を膣や直腸に投与する必要がある。組成物を液滴として鼻または目に導入すること、あるいは洗浄液または浣腸とともに導入することができる。
【００７５】
組成物を上皮組織の炎症箇所に到達させるための方法をこの明細書にいくつか記載したが、生物学的に活性なポリペプチドを炎症または損傷の箇所に到達させる他の公知の方法が使用できないわけではない。
【００７６】
炎症プロセスの治療を始める前に、損傷した組織または生物における好中球のレベルおよび／または抗酸化剤の濃度を調べておくことが好ましい。この目的で、組み換えぺルオキシレドキシンに対するウサギのポリクローナル抗体を用いて生物サンプル中のぺルオキシレドキシンの濃度を測定する方法を利用する（実施例11を参照のこと）。得られたデータに基づき、治療法として、組成物を1回だけまたは繰り返して組織または臓器の炎症領域と接触させる方法を選択し、組成物の塗布期間を選択する。
【００７７】
医薬組成物の最少有効量を決定し、炎症プロセスの治療を行なう。
【００７８】
例えば上部気道の炎症プロセスを治療する場合、ぺルオキシレドキシン含有組成物を鼻および／または気道および／または肺気管支に導入する。塗布するには、組成物の溶液を用いるか、組成物を空気と液滴の混合物に変換するため溶液をあらかじめ噴霧化するか、細かく分散させた乾燥粉末の形態の組成物を用いるか、組成物を固定化して細かく分散させた直径が0.1〜7000nmの顆粒またはナノ粒子（例えばEsenaliev、2000年を参照のこと）を用いるか、組成物をリポソームの中に固定化したもの（例えばThibeault D.W.、1991年を参照のこと）を用いる。
【００７９】
皮膚の怪我を治療するときには、組成物を薄い層にして塗布する、および／または怪我をした場所に塗布する。組成物を上皮組織の炎症箇所に到達させるための方法をこの明細書にいくつか記載したが、生物学的に活性なポリペプチドを炎症または損傷の箇所に到達させる他の公知の方法が使用できないわけではない。
【００８０】
イオン化照射線または非イオン化照射線に伴う疾患を予防または治療するとき、少なくとも1種類のぺルオキシレドキシンの濃度は、哺乳動物のパラメータ（体重、年齢、身体の状態）を考慮し、イオン化照射線または非イオン化照射線の強度に基づいて選択する。治療または予防を行なうときには、生物とイオン化照射線または非イオン化照射線の相互作用が起こる前または後に、選択した組成物を製剤の形態にしたものを一度に、または繰り返して導入する。
【００８１】
イオン化照射線および／または熱傷および／または化学的熱傷および／または放射性核種で汚染された食物、水、空気の取り込みによる生体の汚染が同時に作用することによって起こるフリーラジカルの過剰生成を予防および／または治療するとき、ぺルオキシレドキシンの投与と同時に静脈内注射と損傷箇所への塗布を行なう複合法を用いる。すると生体の中毒を減らし、制御できない細胞死を防ぐことが可能になる。
【００８２】
医薬組成物中では、さまざまなタイプのぺルオキシレドキシン（Prx〜Prx VI）を用いることができる。というのもタイプの異なるぺルオキシレドキシンの濃度分布は組織または臓器によって異なるからである（Knoops B.他、1999年）。異なるタイプの組成物を形成するには、個々の臓器または組織における最大濃度が異なるいくつかのタイプのぺルオキシレドキシンを組み合わせて用いるのが好ましい。生物活性とアレルギー反応を誘導しない能力に関して植物または動物に由来する細胞のテストを行なった後、その細胞が産生した組み換えぺルオキシレドキシンを用いることもできる。例えば上皮組織における炎症プロセスを治療するには、タイプI〜Vのぺルオキシレドキシンよりも強力な抗酸化特性を有する組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumおよび／またはΔPrx VIhumを用いるほうが好ましい。
【００８３】
炎症プロセスを治療するため、ぺルオキシレドキシンPrx VIhumおよび／またはΔPrx VIhumの最少濃度を決定する。そのためには、まず最初に、試験管内で活性酸素から生体巨大分子を保護するのに必要なぺルオキシレドキシンPrxの有効濃度を決定し、第2に、健康な組織内でのぺルオキシレドキシンPrx VIの濃度を決定する。
【００８４】
炎症プロセスの程度と選択した治療法が何であるかに応じ、薬または医薬組成物に含まれるぺルオキシレドキシンPrx VIhumおよび／またはΔPrx VIhumの濃度を0.01〜10.0mg/mlの範囲から選択することができる。
【００８５】
例えばラットの呼吸器が多糖類溶液で損傷した場合や化学的火傷の場合には、経験的に得られたぺルオキシレドキシンPrx VIの濃度は、その溶液20〜50μlを気道に直接塗布したときには0.5〜1.0mg/mlであった。これは、ラット１匹につきぺルオキシレドキシンが10〜50μgに相当していた。ラットの気道の面積を考慮すると、これは、損傷した組織1cm2につきぺルオキシレドキシンPrx VIを５〜10μg塗布することに相当する。あらゆる哺乳動物（ヒトも含む）の損傷した組織に塗布するとき、この量のぺルオキシレドキシンPrx VIを用いることができる。
【００８６】
ぺルオキシレドキシンを抗酸化保護剤として用いる場合には、照射前に生体に導入するぺルオキシレドキシンPrx VIhumまたはΔPrx VIhumの量は、動物の体重1kg当たり１〜10mgにすることができるが、この値は照射パワーによって異なる。致死線量より少ないγ線照射を行なう場合には、ぺルオキシレドキシン溶液1mlを静脈に注射するときの経験的に得られたぺルオキシレドキシンの量は、動物の体重1kg当たり２〜５mgであった。ぺルオキシレドキシンのこの量は、ヒトも含めてあらゆる哺乳動物で用いることができる。
【００８７】
ぺルオキシレドキシンPrx VIhumとその断片ΔPrx VIhumは容易に溶けるタンパク質であるため、塗布するための溶液として、生理的溶液、リンゲル溶液、平衡させた他の塩溶液を用いることができる（Dawson R.M.他、1986年）。単糖類または多糖類をベースとした他の溶液（例えばグルコースおよび／またはビタミンを含む溶媒）も用いることができる。同じ溶媒を用いて空気と液滴の形態（例えばスプレー）になった組成物を調製することができる。
【００８８】
細菌類または他の因子によって起こる病気の治療にぺルオキシレドキシンおよび／またはその断片を用いる場合には、組成物の効果はぺルオキシレドキシン・アクチベータを添加することによって非常に増大する。というのも生体自体が有するぺルオキシレドキシン・アクチベータは限られているからである。さらに、ぺルオキシレドキシンを外部から投与するとアクチベータが不足するのは明らかである。ぺルオキシレドキシンに対する昔からあるアクチベータはジチオトレイトールである（Novoselov S.V.他、1999年）。しかしジチオトレイトールは毒性を持つ酸であるため、投与形態で使用することはできない。ぺルオキシレドキシンVIの天然のアクチベータの１つは毒性のないジヒドロリポ酸であり、このジヒドロリポ酸は、医学で広く使用されているαリポ酸（1,2-ジチオラン-3-ペンタン酸）のS-S結合を回復することによって調製できる（Sang W.K.他、1998年）。ぺルオキシレドキシンのアクチベータとしてのジヒドロリポ酸は、（Pesenko I.V.、Shichi H.、2001年）によって試験管内の実験で調べられている。ぺルオキシレドキシンのアクチベータとしてのジヒドロリポ酸の生体内での効果は、実施例８に示す。
【００８９】
組成物中のジヒドロリポ酸の濃度は、ぺルオキシレドキシンの濃度に応じて0.01〜10mgの範囲で選択する（図11を参照のこと）。
【００９０】
ぺルオキシレドキシンと、ジヒドロリポ酸の形態になった天然のアクチベータとを利用すると、組成物中のそのポリペプチドとアクチベータの濃度を下げ、生物の体内でアレルギー・プロセスが発生する確率を小さくすることができる。
【００９１】
炎症プロセスが広がって（例えば敗血症が起こったとき）いくつかの臓器および／または系が関与するようになると、医薬製剤の中に、ぺルオキシレドキシンおよび／またはぺルオキシレドキシン断片および／またはジヒドロリポ酸と組み合わせて抗生剤および／またはグルココルチコイドが含まれるようにし、複合療法を実施することが好ましい。
【００９２】
医薬組成物
【００９３】
一般に、細胞、組織、身体全体をフリーラジカルの過剰生成から抗酸化保護するための医薬組成物は、ぺルオキシレドキシン、ぺルオキシレドキシン断片、ジヒドロリポ酸からなるグループに属する少なくとも1つの物質の有効量と、薬理学的に許容可能な添加剤とを以下の質量％で含んでいる：
i）ぺルオキシレドキシンが10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤である；あるいは
ii）ぺルオキシレドキシンとジヒドロリポ酸の合計が10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤であるが、ジヒドロリポ酸に対するぺルオキシレドキシンの比は１〜50(w/w)である；あるいは
iii）ぺルオキシレドキシン断片が10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤である；あるいは
iv）ぺルオキシレドキシン断片とジヒドロリポ酸の合計が10.0〜90.0であり、残りが医薬用添加剤であるが、ジヒドロリポ酸に対するぺルオキシレドキシン断片の比は１〜50(w/w)である；あるいは
v）ぺルオキシレドキシンが5.0〜45.0であり、ぺルオキシレドキシン断片が5.0〜45.0であり、残りが医薬用添加剤である；あるいは
vi）ぺルオキシレドキシンが5.0〜45.0であり、ぺルオキシレドキシン断片が5.0〜45.0であり、ジヒドロリポ酸が1.0〜50.0であるが、これらの合計は90.0までになっていて、残りが医薬用添加剤であるが、ジヒドロリポ酸に対するぺルオキシレドキシン+ぺルオキシレドキシン断片の比は１〜50(w/w)である。
【００９４】
医薬用添加剤としては、組成物を安定化させた後に凍結乾燥させるのに用いられる単糖類、多糖類、アミノ酸、低分子量タンパク質を使用することができる。
【００９５】
内部投与のための溶液形態になった医薬組成物は、主要活性物質を0.01〜0.5％、好ましくは0.01〜0.1％含んでいる。傷の表面を治療する形態、あるいは直腸または膣内に投与する軟膏または座薬の形態の医薬組成物は、主要活性物質を0.1〜1.0％含んでいる。点眼溶液の形態の医薬組成物は、主要活性物質を0.1〜0.3％含んでいる。
【００９６】
液体媒体を調製するには、溶媒を使用する。その溶媒は、a）平衡させた塩溶液と、b）平衡させた塩溶液に濃度が0.001％〜1.0％(w/w)のぺルオキシレドキシン・アクチベータを加えたものの中から選択する。
【００９７】
凍結乾燥した形態にするには、単糖類および／または多糖類を使用する。単糖類および／または多糖類は、薬理学で生物学的に活性なポリペプチドを安定化させることが知られている。凍結乾燥した形態は、注射溶液、輸液溶液を調製するための粉末、吸入用の粉末、軟膏、ゲル、懸濁液で使用する粉末、錠剤を調製するための粉末からなるグループの中から選択した粉末を調製するのに使用できる。
【００９８】
粉末製剤中のぺルオキシレドキシンの濃度は、0.1％〜90％である。舌下で使用する錠剤では、ぺルオキシレドキシンの濃度を0.01％〜1.0％にすることができる。
【００９９】
ぺルオキシレドキシンおよび／またはぺルオキシレドキシン断片および／またはアクチベータを含む組成物を、少なくとも1つの広スペクトル治療薬の使用と同時または使用後に投与する場合には、集学的治療法を利用することができる。
【０１００】
治療薬の選択は、i）抗菌用、抗ウイルス用、抗真菌用、抗ヒスタミン用の調製物、ii）フリーラジカルからさらに保護するための高分子酵素（スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンぺルオキシダーゼ）、iii）細胞内のフリーラジカルのレベルをさらに低下させる低分子化合物（トコフェロール、グルタチオン、ユビキノン）、iv）臓器の移植または低温保護に使用する調製物、v）生物学的に活性なタンパク質、vi）ホルモン類、vii）ビタミン類、viii）サイトカイン類からなるグループの中から行なう。
【０１０１】
ぺルオキシレドキシンとともに使用される治療薬は、酵素としてのぺルオキシレドキシンの生物活性を抑制してはならない。
【０１０２】
組成物の上記形態とその使用法においては、抗酸化療法を行なうときに医学または獣医学の分野で知られている他の形態のものや方法も使用できる。本発明に従う変形例、当業者にとって明らかな変形例は、本発明の範囲に含まれると考えるべきである。
【０１０３】
ぺルオキシレドキシンとその断片を産生させるための材料と方法
【０１０４】
組成物の有効性をチェックし、天然のぺルオキシレドキシンと組み換えぺルオキシレドキシンの性質を明らかにするため、哺乳動物の臓器から天然タンパク質を単離する方法を利用する（Pesenko I.V.他、1998年）か、あるいは原核細胞発現系を用いて組み換えタンパク質および／またはその断片を取得した（Merkulova他、2002年）。組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumとその断片ΔPrx VIhumの調製法を実施例で考察するが、その実施例には他のタイプのぺルオキシレドキシンも含まれ、そのようなぺルオキシレドキシンの使用が制限されることはない。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
ラットの天然ぺルオキシレドキシンPrx VIratの調製
【０１０６】
天然のPrx VIratを以下の手続きに従って調製した。ぺルオキシレドキシンPrx VIratをウィスター系ラットの嗅上皮から単離した。嗅上皮にはこのタンパク質が最も多く含まれている。単離した嗅上皮を生理的溶液の中で２回洗浄し、その中で均質化した。このホモジェネートを500×gで５分間にわたって遠心分離し、上清を20000×gで再び２回遠心分離し、溶液Ａに対して12時間にわたって透析した。溶液Aは、12mMのトリス／HCl（pH7.8）、１mMのMgCl2、１mMのジチオトレイトールを含んでいる。透析後、抽出液を、DEAE-セファロース・ゲル（DEAE-セファロース、ファルマシア社）とあらかじめ平衡させた溶液Ａを充填したクロマトグラフィのカラム（305×12.5mm）に入れた。溶液A中にNaClが０mM〜500mMの線形勾配になったものを用いて17℃にてタンパク質を溶離させた。溶液の体積は750mlであり、溶離速度は0.7ml/分であった。分画について抗酸化活性を分析した。Prx VIratを含む分画を濃縮した後、セファクリルS-200ゲル（820×16mm）を充填したカラムでクロマトグラフィを行なった。緩衝液Bを用いてカラムで溶離させた。緩衝液Ｂは、25mMのトリス／HCl（pH7.8）、100mMのNaCl、１mMのMgCl2、１mMのジチオトレイトールを含んでいる。溶離速度は4℃にて0.6ml/分であった。Prx VIratを含む分画を回収し、濃縮し、生理的溶液に対して透析し、続く実験で使用した。ラットのPrx VIの一次構造（Andreeva S.G.他、1998年）は、223個のアミノ酸を含んでおり、分子量の計算値は24630Daであった（EMBL/GenBank、Y17295）。
【０１０７】
実施例２
完全長Prx VIhumをコードしている組み換えプラスミドpET23-a(+)Prx VIhumのDNAの構成法
【０１０８】
ヒト・ぺルオキシレドキシンPrx VIhumをコードしている相補的DNA（配列ID番号1）を、オリゴヌクレオチド・プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法（Taylor G.、1994年）によってクローンHA0683（Nagase T.他、1995年、GenBank D14662）から単離した。プライマー配列において、作り出す対応する制限部位に点置換を行なった。順プライマーとしては、配列5'-ATCACCCGTCCATATGCCCGGAGG-3'（配列ID番号3）（NdeI制限酵素の認識部位に下線を引いてある）を使用し、逆プライマーとしては、配列5'-CCAGAATTCTTAAGGCTGGGGTGTG-3'（配列ID番号4）（EcoRI制限酵素の認識部位に下線を引いてある）を使用した。
【０１０９】
PCRを実施するための反応混合物は、（50μlの容積の中に）１nlのプラスミドDNA、20μMの各プライマー、５μlのPCR用10倍緩衝液（プロメガ社）、200μMの各dNTP、５単位のタック-ポリメラーゼを含んでいる。反応は、94℃にて５分間という予備DNA変性段階から始め、次いでPCRサイクルを30回実施する。そのときの温度サイクルのパラメータは、変性が94℃にて30秒間、プライマーを用いたアニーリングが60℃にて30秒間、伸長が72℃にて45秒間である。その後、72℃にて５分間にわたってインキュベーションを行なう。反応生成物を対応する制限酵素で処理した後、ぺルオキシレドキシンのDNAをクローニングしてプラスミドpET23-a(+)の中にNdeI-EcoRI制限部位とともに入れる。そのとき、MBIフェルメンタス制限酵素（Studier, F.W.、Moffatt B.A.、1986年）の助けを借りる。組み換えプラスミドpET23-a(+)Prx VIhumの物理的地図を図1に示してある。
【０１１０】
実施例３
ヒトPrx VIのN末端断片をコードしている組み換えプラスミドDNA pET23-a(+)ΔPrx VIhumの構成法
【０１１１】
ポリペプチド断片ΔPrx VIhumをコードしているDNA断片の新しい配列を構成するための最初のプラスミドは、完全長組み換えPrx VIhumの発現を決めるプラスミドpET23-a(+)Prx VIhumであり、これをPCRのためのマトリックスとして用いる。短いDNA断片の変異体の１つとして、長さが177a.b.のN末端断片ΔPrx VI（配列ID番号2）を選択する。順プライマーとしては、配列5'-GCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3'（配列ID番号5）（ベクターpET23-a(+)ΔPrx VIhumのプロモータ領域と相補的）を用いる。逆プライマーとしては、配列5'-CCATCCTTCGAATTCAACTTAGGTGGC-3'（配列ID番号6）（EcoRI制限酵素部位に下線を引いてある）を用いる。
【０１１２】
反応混合物は、（50μlの容積の中に）１ngのプラスミドDNA、20ピコモルの各プライマー、５μlのPCR用10倍緩衝液（プロメガ社、アメリカ合衆国）、200μMの各dNTP、５単位のタック-ポリメラーゼを含んでいる。反応は、94℃にて３分間という予備DNA変性段階から始め、次いでPCRサイクルを10回実施する。そのときの温度サイクルのパラメータは、変性が94℃にて30秒間、プライマーを用いたアニーリングが62℃にて30秒間、伸長が72℃にて45秒間である。その後、72℃にて５分間にわたってインキュベーションを行なう。反応生成物を対応する制限酵素で処理した後、ファージT4のDNAリガーゼを用いてΔPrx VIhum断片をプラスミドpET23-a(+)のNdeI-EcoRI断片と連結させる。構造体の組み立ての正確さは、得られた挿入体を、Sanger（Sanger F.他、1997年）の方法を改変した制限分析法とシークエンシング法によって評価する。組み換えプラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumの物理的地図を図２に示してある。
【０１１３】
実施例４
Prx VIhumのcDNAとΔPrx VIhum断片のcDNAを大腸菌株の中で発現させる方法
【０１１４】
ぺルオキシレドキシンPrx VIhumのcDNAまたはぺルオキシレドキシン断片ΔPrx VIhumのcDNAを発現させるため、誘導lacプロモータの制御下にあるバクテリオファージT7 RNA遺伝子を染色体に含む大腸菌BL-21（DE-3）株（Studier, F.W.、Moffatt B.A.、1986年）を宿主株として選択した。
【０１１５】
大腸菌BL-21（DE-3）のコンピテント細胞の形質転換は、塩化カルシウムを用いた化学的方法（Sambrook J.他、1989年）により実施する。その結果、完全長ぺルオキシレドキシンを産生するための大腸菌BL21/DE3/pET23-a-Prx VIhumと、ぺルオキシレドキシン断片を産生するための大腸菌BL21/DE3/pET23-a(+)ΔPrx VIhumが得られるが、これらは以下の主要な特徴を有する。形態的特徴：細胞が小さく、桿状であり、グラム陰性、胞子を発生させず、1×3.5μm、可動。培養物の特徴：寒天培地LB上で増殖したコロニーは滑らかで半透明であり、光沢があり、灰色をしている。縁部は滑らかで、コロニーの直径は１〜３mm、コンシステンシーはペースト状である。液体培地（LB、グルコースを含む最少培地）中での増殖は、不透明さが均一で、沈殿が容易であることを特徴とする。物理的生物学的特徴：細胞は４〜42℃で増殖し、最適pHは6.8〜7.6である。窒素源としては窒素塩と有機化合物（アミノ酸、ペプトン、トリプトン、酵母抽出液）の両方を用いる。炭素源としては、最少培地上で増殖させる場合には、グリシン、炭水化物、アミノ酸を用いる。抗生物質に対する抵抗力：産生用菌株の細胞は、プラスミドの中にβ-ラクタマーゼ遺伝子（bla）が存在しているという条件でアンピシリン（300mg/mlまで）に対する抵抗力を示す。
【０１１６】
ぺルオキシレドキシンPrx VIhumまたはぺルオキシレドキシンΔPrx VIhumという組み換えタンパク質を産生させるため、液体培養物中の吸収値A600が0.6に達するまで細胞を37℃にて増殖させる。次に、上記タンパク質の発現を誘導するため、lac-誘導因子IPTGを添加して最終濃度を0.4mMにし、培養をさらに４〜５時間にわたって続ける。その後、細胞懸濁液を4℃にて4000×gで20分間にわたって遠心分離する。産生用菌株の細胞を含む沈殿物を超音波で破壊し、再び遠心分離する。標的生成物を含むタンパク質分画を飽和(NH4)2SO4溶液を用いて沈殿させ、12mMのトリス-HCl緩衝液（pH7.8）に対して透析する。この緩衝液は、1mMのMgCl2と1mMのDTTを含んでいる。塩化ナトリウム勾配中のDEAE-セファロース上でタンパク質混合物のクロマトグラフィを行なう。セファクリル-200上でのゲル濾過によって標的ポリペプチドを含む分画をさらに精製し、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって分析する。
【０１１７】
実施例５
ΔPrx VI産生用菌株の生産性の測定
【０１１８】
構成したプラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumを含む大腸菌BL21/DE3の個々のコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含む5mlの液体培地LBの中に導入する。液体培養物中の吸収値A600が0.6に達するまで、コロニーを180rpmにしたロッカー上で37℃にて2.5時間にわたって増殖させる。次にIPTGを添加して濃度を0.4mMにし、同じ条件下で6時間にわたって培養を続ける。サンプルを1ml採取し、6000rpmで遠心分離した後、細胞を緩衝液100μlの中に懸濁させる。緩衝液は、125mMのトリス-HCl（pH6.8）、20％のグリシン、3％のドデシル硫酸ナトリウム、0.01％のブロモフェノールブルーを含んでいる。細胞懸濁液を沸騰水浴上で10分間にわたって温める。サンプルを2.5μl、5μl、7.5μl、10μl、15μl採取し、ドデシル硫酸ナトリウムを0.1％含む15％アクリルアミド・ゲル中の電気泳動によって分析する（Laemmli U.K.、1970年）。ゲルをクーマシーR-250で染色し、ウルトラスキャンXLレーザー密度計上で走査する。走査データによると、ポリペプチドΔPrx VIhumが全細胞タンパク質の30％を占めていた。これは、細胞培養物中の純粋な最終タンパク質生成物が30mg/lの収量であることに対応する。
【０１１９】
天然ぺルオキシレドキシンと組み換えぺルオキシレドキシンならびにその断片の性質
【０１２０】
実施例６
試験管内のモデル酸化系において大腸菌のグルタミンシンテターゼが不活化しないよう保護することに関し、組み換え完全長Prx VIhumの保護特性と、ラットの天然Prx VIratの保護特性と、N末端ΔPrx VIhumの保護特性を比較する実験
【０１２１】
さまざまなタイプのぺルオキシレドキシンの活性を調べるため、それらぺルオキシレドキシンがDTT/Fe3+/O2酸化系からグルタミンシンテターゼを保護する能力を測定した。グルタミンシンテターゼは、大腸菌DH5α株（Streicher S.L.、Tyler B.、1980年）から単離したものであり、Fe3+/O2酸化系とぺルオキシレドキシン・アクチベータの存在下（つまりフリーラジカルを発生させるモデル酸化系の中）で不活化する（Kim K.他、1988年）。培養混合物60μlを使用し、37℃にて10分間にわたって培養する。この培養混合物には、5μgのグルタミンシンテターゼ、3mMのアクチベータ、3μMのFe3+、50mMのヘペス（pH7.3）が含まれている。天然のラットPrx VIratのアクチベータとしてDTTを使用する。組み換えPrx VIhumのアクチベータとしてジヒドロリポ酸を使用する。サンプルに反応混合物200μlを添加することによってグルタミンシンテターゼの残留活性を評価する。この反応混合物は、0.4mMのADP；150mMのグルタミン；10mMのK-AsO4；20mMのNH2OH；0.4mMのMnCl2；100mMのヘペス（pH7.4）を含んでいる。37℃にて10分間にわたって培養した後、菌株100μlをサンプルに添加する。菌株は、H2O100mlにつき5.5gのFeCl3・6H2O、2gのTCA、2.1mlの濃HCl（38％）を含んでいる。大腸菌のグルタミンシンテターゼが不活化しないようにするぺルオキシレドキシンの保護特性は、さまざまな濃度のぺルオキシレドキシンの存在下で不活化させた後のこの酵素の残留活性を、不活化していないグルタミンシンテターゼの活性で割った比の値として決まる。テスト結果から、組み換え完全長Prx VIhumの抗酸化特性がラットの天然ぺルオキシレドキシンPrx VIratの抗酸化特性と近いことがわかる。N末端ΔPrx VIhumの抗酸化特性のほうは、組み換え完全長Prx VIhumの抗酸化特性と近い（図３を参照のこと）。
【０１２２】
実施例７
ぺルオキシレドキシンの細胞毒性の測定
【０１２３】
細胞毒性は、組み換えPrx VIhumまたはラットの天然Prx VIratが、ヒト・リンパ芽球腫L929系細胞の増殖レベルと、コンカナバリンAで刺激したラットのNRRI系の脾臓に由来するTリンパ球の増殖レベルに及ぼす影響から決定される。
【０１２４】
２つの細胞系を培地１mlにつき細胞104個の濃度にし、５％ウシ胎仔血清を含むRPMI1640の中で培養した。Ｔリンパ球への刺激は、0.1μg/mlの濃度のコンカナバリンを用いて与えた。Ｔリンパ球の場合には、3H-チミジンが取り込まれる量から増殖レベルを決定した。生きたL929系細胞の数は、96ウエル・プレートの中でトリパン染色した後、マルチスキャン・マルチチャネル光度計（LKB社、スウェーデン）で走査して測定した。
【０１２５】
天然のぺルオキシレドキシンPrx VIratと組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhum（濃度は0.1〜10μg/ml）は生きた多数のL929細胞系に何ら影響を与えなかった（図４を参照のこと）。コンカナバリンＡで刺激したＴリンパ球の場合には、細胞の増殖レベルが、天然または組み換えのPrx VIhum（濃度は0.1〜1.0mg/ml）の存在下ではコンカナバリンＡだけで刺激した細胞と比べて約２倍になった。
【０１２６】
実施例８
ぺルオキシレドキシン・アクチベータの特性比較
【０１２７】
ジチオトレイトールまたはジヒドロリポ酸（天然のアクチベータ）を用いたぺルオキシレドキシンの活性化効果を調べるため、ぺルオキシレドキシンがグルタミンシンテターゼを金属触媒酸化系によって起こる不活化から保護する能力を利用する。
【０１２８】
培養混合物60μlを37℃にて10分間にわたって培養した。この培養混合物には、５μgのグルタミンシンテターゼ、50μgのぺルオキシレドキシンPrx VI、３mMのアクチベータ、３μMのFe3+、50mMのヘペス（pH7.3）、さまざまな濃度のジチオトレイトールまたはジヒドロリポ酸が含まれている。サンプルに反応混合物200μlを添加することによってグルタミンシンテターゼの残留活性を評価する。この反応混合物は、0.4mMのADP；150mMのグルタミン；10mMのK-AsO4；20mMのNH2OH；0.4mMのMnCl2；100mMのヘペス（pH7.4）を含んでいる。37℃にて10分間にわたって培養した後、菌株100μlをサンプルに添加する。菌株は、H2O100mlにつき5.5gのFeCl3・6H2O、2gのTCA、2.1mlの濃HCl（38％）を含んでいる。ぺルオキシレドキシンの活性は、グルタミンシンテターゼの活性が50％保持されていることが観察されるときのこのタンパク質の濃度から決定する。
【０１２９】
グルタミンシンテターゼが保護される程度をチオールの濃度の関数として描いたグラフを図11に示す。このグラフからわかるように、ジヒドロリポ酸の抗酸化性は、ジチオトレイトールとほぼ同じであり、リポ酸の効果を実質的に上回っている。
【０１３０】
実施例９
ぺルオキシレドキシンPrx VIを動物の体内に注射した後のぺルオキシレドキシンPrx VIの分布
【０１３１】
生物のいろいろな組織における外来性ぺルオキシレドキシンPrx VIの分布を検出するため、イソシアン酸フルオレセインで標識した組み換えPrx VIhumをラットの静脈に1匹につき10mgの量導入した。所定の期間が経過した後、ラットを安楽死させ、さまざまな臓器の組織を単離し、得られたサンプルの分析を行なった。得られたデータから、標識したPrx VIが、注射した15分後にラットの脳も含むすべての臓器に均一に分布することがわかった。例外は骨髄であり、そこでは他の組織と比べて外来性ぺルオキシレドキシンPrx VIの量が少なかった。したがって静脈内注射によってぺルオキシレドキシンPrx VIを導入する方法を利用すると、生物のほぼすべての組織においてぺルオキシレドキシンPrx VIの量を増やすことができる。
【０１３２】
試験管内と生体内におけるぺルオキシレドキシンの性質の分析
【０１３３】
実施例１０
ぺルオキシレドキシンPrx VIを用いてイオン化放射線の作用からオキシヘモグロビンを保護する方法
【０１３４】
イオン化放射線によって起こる破壊から生体巨大分子をぺルオキシレドキシンで保護する可能性を調べるため、照射されたオキシヘモグロビンの性質を、対照においてと、ぺルオキシレドキシンの存在下において調べた。対照では、0.1Mのトリス-HCl（pH7.0）にオキシヘモグロビン（540nmで0.16D）が含まれた溶液を用い、GUBE装置の中で照射を合計で10Gy行なった。放射線保護剤としてさまざまな濃度（５〜100μg/ml）のぺルオキシレドキシンPrx VIhumを50μMのジチオトレイトールの存在下で使用した。酸化形態のオキシヘモグロビン（メトヘモグロビン）の形成が635nmで記録され、メトヘモグロビンの凝集が700nmで記録された。
【０１３５】
実施例１１
生物サンプル中でのぺルオキシレドキシンPrx VIの評価
【０１３６】
動物に組み換えヒト・ぺルオキシレドキシンを二重免疫するという標準的な方法によって組み換えぺルオキシレドキシンに対するウサギのポリクローナル抗体を調製した。得られた抗体の力価は、ELISAによると1：10000であり、免疫ブロット法によると1：2000であった。抗体の特異性は、ヒト気道の水溶性抽出液を用いた免疫ブロット法と、ヒト肺のパラフィン切片を用いた免疫組織化学的方法で調べた。その結果、得られた抗体には高い特異性のあることがわかった。
【０１３７】
硫酸アンモニウムを用いて血清を沈殿させた後、DEAEセルロース上でのクロマトグラフィを行なうことにより、精製したウサギ抗体を調製した。WilsonとNakaneに従い、従来の過ヨウ化物酸化法により、免疫グロブリンとぺルオキシダーゼのモル比を１：３にして、抗体と架橋したセイヨウワサビのぺルオキシダーゼの共役体を調製した。
【０１３８】
ヒト・ぺルオキシレドキシンに対するこの共役体の力価は、ELISAによると1：1000であり、免疫ブロット法と免疫組織化学的方法によると1：500であった。共役体の特異性は、IgGの調製に使用した血清の特異性に対応していた。
【０１３９】
生物サンプルに含まれるぺルオキシレドキシンPrx VIの酵素イムノアッセイを行なうためのプロトコル：
1．免疫グロブリンG溶液200μlをプレートの細胞に注いでヒト組み換えぺルオキシレドキシン（1：1000に希釈）と反応させ、室温にて30分間にわたって培養する。
2．プレートを生理的溶液で洗浄し（3×5分間）、1％粉ミルクを用いて室温にて30分間にわたって反応を阻止する。
3．調べるサンプル200μlをプレートの細胞に注ぎ、室温にて1時間にわたって培養する。
4．0.1％トゥイーン40を含む生理的溶液でプレートの細胞を洗浄する（3×5分間）。
5．共役体溶液200μl（1：500に希釈）をプレートの細胞に注ぎ、室温にて30分間にわたって培養する。
6．0.1％トゥイーン40を含む生理的溶液でプレートを洗浄する（3×5分間）。
7．ABTS溶液（25mlのクエン酸緩衝液（pH4.0）+40μlの3％過酸化物の中に25mgのABTS）をプレートの細胞に注ぐ。
8．プレートをマルチスキャン上で405nmにて走査する。
【０１４０】
系の感度は、サンプル1ml当たり数十ナノグラムである（Chuchalin A.G.他、2003年）。
【０１４１】
実施例１２
ヒトの組織におけるぺルオキシレドキシンPrx VIの免疫組織化学的検出
【０１４２】
単離した組織を、0.15MのNaClを含む20mMのリン酸緩衝液に4％ホルムアルデヒドと0.25％グルタルアルデヒドが含まれたものの中で固定した。固定は37℃にて12時間にわたって実施した。組織を生理的溶液で1時間の間に4回洗浄した。濃度を次第に増加させたエチルアルコール（40〜100％）の中を順番に通過させることによって組織を脱水した。組織をキシレン-アルコール溶液（1：1）で1時間にわたって洗浄し、キシレンとキシレン-パラフィン溶液（1：1）で12時間にわたって洗浄した。組織をパラフィンの中に閉じ込め、5μmの切片をミクロトームで作製した。キシレンと濃度を次第に小さくした複数のアルコールを用いて切片からパラフィンを除去した。次に、切片を生理的溶液で洗浄し、５％胎仔血清で反応を阻止し、内在性ぺルオキシダーゼを0.3％過酸化水素で抑制し、共役体とともに１時間にわたって培養し、生理的溶液で３回洗浄し、ジアミノベンジジンで染色した（10mlの50mMトリス-HCl緩衝液（pH7.6）+200μlの３％過酸化水素に対して６mg）。
【０１４３】
ぺルオキシレドキシンの治療特性と保護特性
【０１４４】
本発明の明細書には実施態様を示す特別な実施例が含まれているが、それが本発明の利用分野を制限すると考えてはならない。本発明から得られる当業者には明白な変形例は、本発明の範囲に含まれるものと見なされる。
【０１４５】
実施例１３
イオン化放射線の傷害作用に対する注射したぺルオキシレドキシンPrx VIの保護効果
【０１４６】
GUBE装置の上ですべての動物（体重200gのウィスター系ラット）に同時に照射した。被曝線量は６Gyであった。ラットを２つのグループに分けた。第１のグループ（n=6）は対照として使用した。第２のグループ（n=6）には照射の30〜60分前にぺルオキシレドキシンPrx VIを1mg静脈内投与した（濃度が1μg/mlの生理的溶液を１ml）。照射後、ラットに十分な量の餌、照明、換気を提供するという一般的な条件を維持した。組織学的検査を行なうため、それぞれのグループから全体的な状態が悪化した症状を有するラットを選択した。
【０１４７】
各グループにおける照射後のラットの死亡データを表１に示してある。この表からわかるように、照射前にぺルオキシレドキシンPrx VIを投与したラットの死亡数は、対照群よりもはるかに少ない。照射後１年間生き延びたラットの全体的な状態は顕著に異なっており、対照群よりも第２のグループが優れていた。第１のグループのラットでは（図5A）、第２のグループのラット（図5C）と比べて、体重が大きく低下し（悪液質）（体重が180〜200g）、多毛症が少なく、活動量が少なく、腫瘍プロセスが存在していた。
【０１４８】
実施例１４
化学的熱傷後のラットの上部気道を治療する際の組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumの治療特性
【０１４９】
熱傷24時間後のラットの上部気道を治療する際の組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumの治療特性を、体重が150〜200gの４匹のウィスター系ラットのグループで調べた。ラットに鎮痛剤アナルギン（体重1kgにつき100mg）を投与し、HCl蒸気で飽和した乾燥装置の中に10分間入れた（乾燥装置の容積は10リットルであり、ラットを20匹使用した）。化学的熱傷の後、ラットを所定の期間（40分、6時間、1日、2日、14日、30日）にわたって飼育した後、ヘキセナール（体重１kgにつき300mg）で麻酔し、気道上皮組織のサンプルを単離した。組織化学的検査のため、単離したサンプルを、２％ホルムアルデヒドと0.5％グルタルアルデヒドを含む固定溶液の中に入れた。濃度を次第に増加させたエチルアルコール（40〜100％）の中を順番に通過させることによって組織を脱水した。組織をLR白色樹脂の中に埋包した。樹脂を室温にて重合させた。厚さ0.5μmの切片をLKBウルトラトーム（スウェーデン）上でガラス・ナイフを用いて作製した。切片をヘマトキシリン-エオシンを用いて染色し、光学顕微鏡で分析した。
【０１５０】
図6Bは、火傷24時間後の気道上皮の切片、図7Bは、火傷14日後の同じものを示している。上皮の最大損傷は火傷の24時間後に観察され、気道内に粘液流を供給する線毛細胞ほとんど存在していない。2週間後、線毛細胞の部分的な回復が観察される。Prx VIhum溶液の塗布は、ぺルオキシレドキシンの保護効果を評価するときは火傷の1時間後に開始し、ぺルオキシレドキシンの治療効果を評価するときは化学的火傷から24時間経過して気道粘膜の上皮が最も損傷しているときに開始する。後者の場合、塗布は１日１回、５日間にわたって行なった。腹腔内にヘキセナール（70mg/kg）を導入することによってラットをあらかじめ麻酔し、ラットを手術台の上に固定し、双眼鏡で見ながら直径が１mmのカテーテルを通じて20〜100μlのぺルオキシレドキシン溶液を気道に導入した。ぺルオキシレドキシンの濃度は、0.5〜5.0mg/mlの範囲から選択した。0.9％NaCl溶液を溶媒として使用した。
【０１５１】
実施例１５
LPS溶液を作用させた直後にラットの上部気道を治療する際のぺルオキシレドキシンPrx VIの治療特性
【０１５２】
LPSを塗布した直後にラットの上部気道を治療する際のぺルオキシレドキシンPrx VIの治療特性を、体重が150〜200gの４匹のウィスター系ラットのグループで調べた。LPSの塗布は、次のようにして行なった。ヘキセナールを用いてラットに麻酔をかけ、100μlのリポ多糖類溶液をカテーテルを通じて導入した（リポ多糖類の濃度は10-9〜10-11mg/mlであり、使用したラットの合計数は20匹であった）。リポ多糖類を塗布した後、ラットを所定の期間（1時間、3時間、6時間、7時間、9時間）にわたって飼育した後、ヘキセナール（体重1kgにつき300mg）で麻酔し、気道上皮組織のサンプルを単離した。組織化学的検査のため、単離したサンプルを、２％ホルムアルデヒドと0.5％グルタルアルデヒドを含む固定溶液の中に入れた。濃度を増加させたエチルアルコール（40〜100％）の中を順番に通過させることによって組織を脱水した。組織をLR白色樹脂の中に埋包した。樹脂を室温にて重合させた。厚さ0.5μmの切片をLKBウルトラトーム（スウェーデン）上でガラス・ナイフを用いて作製した。切片をヘマトキシリン-エオシンを用いて染色し、光学顕微鏡で分析した。
【０１５３】
図8Cには、リポ多糖類を塗布した3時間後のラットの気道上皮の切片を示してある。組織学的検査により、LPSを1匹につき10-7mg用いた場合に気道の壁面に大量の好中球が蓄積し、浮腫が進展し、その後粘膜が剥離して気道の内腔に入り込み、３時間後に死ぬことが観察された。
【０１５４】
免疫組織学的検査により、ぺルオキシレドキシンPrx VIratを分泌する細胞の大量死がすでに１時間後には気道上皮の多くの領域で観察されることがわかった。その結果、気道のこれら領域を覆う粘膜にPrx VIratが存在しなくなった。
【０１５５】
生化学的検査を行なうため、薄いへらで上皮を剥ぎ取り、生理的溶液を用いて洗浄することによりへらからその上皮をはがし、10000×gで15分間にわたって遠心分離した。過酸化水素の濃度はルミネッセンス法で測定した。LPSをラットの気道に導入した後のぺルオキシレドキシンPrx VIとTNF-αの活性の動的変化ならびに呼吸器での好中球のバーストから、ぺルオキシレドキシンの最大発現値がLPSを塗布した１時間後に観察されたのに対し、TNF-αの最大発現値は3時間経ってから観察され、呼吸器での好中球のバーストは６時間後に観察されることがわかった。LPSのあとにぺルオキシレドキシンPrx VIをベースとした組成物の溶液を気道に導入した。腹腔内にヘキセナール（70mg/kg）を導入することによってラットをあらかじめ麻酔し、ラットを手術台の上に固定し、双眼鏡で見ながら直径が１mmのカテーテルを通じてぺルオキシレドキシン溶液（20〜100μl）を気道に導入した。ぺルオキシレドキシンの濃度は、0.5〜5.0mg/mlの範囲から選択した。0.9％NaCl溶液を溶媒として使用した。組成物溶液の塗布は、LPSの塗布後に１回行なった。純粋な溶媒、血清アルブミンの溶液（10mg/ml）、グルタチオン（10mM）を対照として塗布した。
【０１５６】
LPSを塗布した24時間後に気道の組織学的検査を行なった。
【０１５７】
図9Aには、LPSを塗布するが組み換えPrx VIの塗布なしの場合にLPSを塗布してから24時間後のラットの気道上皮の切片を示してある。図9Bには、LPSを塗布した直後にぺルオキシレドキシンを塗布した場合にLPSを塗布してから24時間後のラットの気道上皮の切片を示してある。上皮が完全に保護されていることが観察される。無傷の気道との唯一の違いは、マクロファージとマスト細胞の数が増大していることである。写真からわかるように、気道上皮がほぼ完全に保護されている、あるいは回復していることが観察された。
【０１５８】
実施例１６
傷を治療する際のぺルオキシレドキシンPrx VIの治療特性
【０１５９】
腹腔内にヘキセナール（70mg/kg）を導入することによってラットをあらかじめ麻酔した。ラットを手術台の上に固定した後、かみそりの刃を用いて深さ２〜３mm、長さ１cmの切れ込みを両方の前足の皮膚に入れた。対照としての切れ込みに生理的溶液を入れ、殺菌膏薬を塗布した。ぺルオキシレドキシンを使用する場合には、0.15MのNaClの中に組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumまたはその断片ΔPrx VIhumが0.5mg/mlの濃度で含まれる溶液を傷に入れた。ガーゼの包帯を１日に１回交換した。ぺルオキシレドキシンが作用した結果を図10に示す。図10Bと図10Cの写真からわかるように、組み換えぺルオキシレドキシンPrx VIhumまたはその断片ΔPrx VIhumを使用した場合には、対照とは違って５日後に傷がほぼ完全に治癒していることが観察された。組織学的検査から、ぺルオキシレドキシンPrx VIを用いる場合には切り傷が実質的により小さいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
少なくとも１種類のぺルオキシレドキシンを含む医薬組成物は、フリーラジカルの過剰生成に伴う多くの疾患の予防および／または治療に使用できる。ぺルオキシレドキシンをベースとした組成物は公知の抗酸化剤よりも効果が大きいため、効果を高めること、そして治療期間を短縮することができる。この医薬組成物で使用する主成分はヒト組み換えぺルオキシレドキシンであるため、この組成物は非毒性であり、哺乳動物（ヒトも含む）の身体との適合性がある。この組成物は毒性が低いため、この組成物を塗布したり静脈内注射したりして生体の局所的な領域または身体全体に同時に複合作用を及ぼすことで治療効果を高めることができる。これは、生体に対する多くの因子からの作用（例えば災害や火災の間に生じる放射線、熱、化学的熱傷、傷、衝撃の作用）を治療するときに特に重要である。この組成物は、溶解度が大きく、生体の細胞間スペースに素早く浸透するという特徴があるため、ほとんどすべての臓器の疾患を治療することができる。この組成物は、酵素の生物活性を低下させない薬理学的に適切なあらゆるビヒクルと適合性がある。
【０１６１】
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【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】プラスミドpET23-a-Prx VIhumの物理的地図である。上部には、ぺルオキシレドキシンPrx VIhumのcDNAの位置とポリリンカー内の唯一の制限部位の位置が示してある。
【図２】プラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumの物理的地図である。エンドヌクレアーゼ制限部位を示してある。Oriはプラスミドの複製開始点である。APは遺伝子マーカーであり、プラスミドpET23-a(+)ΔPrx VIhumで形質転換した大腸菌細胞のアンピシリンに対する抵抗性を決めている。
【図３】試験管内のモデル酸化系において大腸菌グルタミンシンテターゼが不活化しないよう保護することに関し、天然のラットPrx VIrat（1で示す）、組み換えPrx VIhum（2で示す）、そのN末端断片ΔPrx VIhum（3で示す）の保護特性を相互に比較した図である。
【図４】Prx VIhumの存在下においてコンカナバリンAで刺激したネズミ類のリンパ細胞に3H-チミジンを組み込んだ状態を示している。1は培地、2はコンカナバリンAによる刺激なしのT細胞、3はコンカナバリンAで刺激したT細胞、4はPrx VIhumの存在下におけるT細胞、5はPrx VIhumの存在下においてコンカナバリンAで刺激したT細胞である。
【図５】γ線照射（600レントゲン単位）を行なってから12ヶ月後のラットの外観である。、Aは対照；Bは照射前に組み換えPrx VIhumを投与したラットである。
【図６】ラットに酸の蒸気で火傷させた後、ラットの天然Prx VIratまたは組み換えPrx VIhumを塗布した気道上皮を示している。Aは対照；Bは化学的火傷の24時間後の上皮；Cは化学的火傷の1時間後にPrx VIhumを塗布した場合の化学的火傷24時間後の上皮；Eは気道上皮、BMは基底膜である。すべての上皮細胞がほぼ完全に保護されていることが観察される。
【図７】塩酸の蒸気による火傷から14日後のラットの気道上皮細胞の回復状態を示している。Aは対照；Bは化学的火傷から14日後の上皮；CはPrx VIhumを塗布した場合の化学的火傷から14日後の上皮；Eは気道上皮、BMは基底膜、Fは食細胞である。治療は、火傷の24時間後から5日間にわたって行なった。組み換えPrx VIhumをベースとした医薬組成物の溶液を1日に1回塗布した。
【図８】リポ多糖類を塗布した後のラットの気道上皮である。Aは基準、Bは塗布の1時間後、Cは塗布の3時間後、Eは気道上皮、BMは基底膜、Fは食細胞である。かなり多くの上皮細胞の死と、多数の食細胞の出現が観察される。
【図９】リポ多糖類を塗布した後、組み換えPrx VIhumを塗布したときのラットの気道上皮である。AはPrx VIhumを使用していない対照、Bはリポ多糖類を塗布した後にPrx VIhumを用いた場合の結果、Eは気道上皮、BMは基底膜、Fは食細胞である。Prx VIhumは、リポ多糖類を塗布した直後に塗布した。
【図１０】ぺルオキシレドキシンPrx VIhumまたはその断片ΔPrx VIhumを使用した傷の治療を示している。Aは殺菌膏薬を治療に使用した場合、Bは傷にPrx VIhumを塗布した場合、Cは傷にΔPrx VIhumを塗布した場合である。
【図１１】1．ジチオトレイトール、2．リポ酸、3．ジヒドロリポ酸の抗酸化特性を比較した図である。抗酸化活性は、金属触媒酸化系に対してグルタミンシンテターゼが保護される程度から決定した。チオールの抗酸化性は、グルタミンシンテターゼの50％が保護されるモル濃度とした。
【図１】
2006505290.tif 000004
【図２】
2006505290.tif 000005
【図３】
2006505290.tif 000006
【図４】
2006505290.tif 000007
【図５】
2006505290.tif 000008
【図６】
2006505290.tif 000009
【図７】
2006505290.tif 000010
【図８】
2006505290.tif 000011
【図９】
2006505290.tif 000012
【図１０】
2006505290.tif 000013
【図１１】
2006505290.tif 000014
【配列表】
2006505290000001.app
【国際調査報告】
2006505290.tif 000015
2006505290.tif 000016