(57)【要約】本発明は、血管透過性亢進に関連する障害を減少または阻害する方法、および透過性、血管形成に影響を及ぼし、密着結合を安定化する化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明の1つの局面において、血管透過性亢進の治療を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法が提供される。この方法は、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、 アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の抗血管形成化合物を個体に投与する段階を含む。他の抗血管形成化合物が本明細書で開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、血管透過性亢進の減少または阻害を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法:
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項２】
血管透過性が、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患からなる群より選択される疾患の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の段階を含む、血管からの天然血管形成阻害剤の漏出の減少または阻害を必要とする個体において、血管からの天然血管形成阻害剤の漏出を減少または阻害する方法:
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項４】
以下の段階を含む、非増殖性糖尿病性網膜症の治療および/または予防を必要する個体において、非増殖性糖尿病性網膜症を治療および/または予防する方法:
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項５】
以下の段階を含む、血管透過性亢進の治療を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法:
密着結合複合体を安定化することができる有効量の化合物を個体に投与する段階。
【請求項６】
密着結合タンパク質を安定化することができる化合物が、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の段階を含む、密着結合複合体を安定化する化合物をスクリーニングする方法:
a)試験化合物の存在下で内皮細胞を培養する段階;
b)該培養内皮細胞をインキュベートして、密着結合タンパク質を発現させる段階;および
c)試験化合物が密着結合複合体を安定化したかどうか評価する段階。
【請求項８】
密着結合タンパク質が、内在性膜タンパク質、細胞質タンパク質、および密着結合関連タンパク質からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
密着結合タンパク質が、オクルディン、クローディン、閉鎖帯(ZO)-1、-2、-3、カテニン、シングリン、およびp130からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
密着結合複合体を安定化する化合物が透過抑制性および/または抗血管形成性の化合物である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、血管透過性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法:
a)透過性支持層の上で内皮細胞をアッセイする段階;
b)アッセイしたものと試験化合物を接触させる段階;
c)アッセイしたものをマーカーおよび透過誘導剤で処理する段階;ならびに
d)対照と比較してマーカーの拡散速度を測定する段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する方法:
a)抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、ヒスタミンの皮内注射を該患者に投与し、ヒスタミン誘導性局所浮腫を測定する段階;
b)抗血管形成化合物を用いて患者を治療する段階;および
c)抗血管形成化合物を用いて患者を治療した後に、ヒスタミンの皮内注射を該患者に投与し、ヒスタミン誘導性局所浮腫を測定する段階であって、抗血管形成化合物を用いた治療前に見られたヒスタミン誘導性局所浮腫の測定値と比較した測定値の減少が、化合物が生物学的に有効であることを示す、段階。
【請求項１３】
以下の段階を含む、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する方法:
a)抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、患者の体液中のタンパク質濃度を測定する段階;
b)抗血管形成化合物を用いて患者を治療する段階;
c)抗血管形成化合物を用いて患者を治療した後に、患者の体液中のタンパク質濃度を測定する段階であって、体液中のタンパク質濃度の減少が、化合物が生物学的に有効であることを示す、段階。
【請求項１４】
体液が尿、末梢血、または血漿である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
包装材料および該包装材料の中に入れられた薬学的薬剤を含む製造物であって、該包装材料が、血管透過性に関連した疾患の治療および/または予防に有効な量で十分な期間、該薬学的薬剤を投与できることを示すラベルを含み、該薬学的薬剤が、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される化合物を含む、製造物。
【請求項１６】
血管透過性に関連した疾患が、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、黄斑変性、乾癬、肺高血圧、インターロイキン治療の副作用、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患からなる群より選択される、請求項15記載の製造物。
【請求項１７】
以下の段階を含む、血管透過性亢進の減少または阻害を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法:
タキサンおよびその誘導体;α、β、またはγインターフェロン;IL-12;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤;Cox-2阻害剤;PDGFR阻害剤;EGFR1阻害剤、ならびにビスホスホネートからなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項１８】
血管透過性が、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患からなる群より選択される疾患の結果である、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府資金
本発明は、米国立衛生研究所から授与されたCA45548により政府助成を受けた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、血管透過性亢進に関連した傷害を減少または阻害する方法、および透過性、血管形成に影響を及ぼし、密着結合を安定化する化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管透過性亢進は、糖尿病の血管合併症、肺高血圧、および様々な浮腫を含む非常に多くの異常に関係し、内因性血管形成阻害剤を尿に排出させるために抗癌治療の効力を下げる原因とされるようになった。例えば、糖尿病合併症である糖尿病性網膜症は、推定1600万人の糖尿病米国人のうち約25％が冒される失明の主な原因の1つである。糖尿病性網膜症は、高血糖の結果として網膜の低酸素により誘導されると考えられている。
【０００４】
糖尿病性網膜症の程度は糖尿病の持続期間と高度に相関関係がある。2種類の糖尿病性網膜症がある。第1の非増殖性網膜症は疾患の初期段階であり、毛細血管透過性の増大、毛細血管瘤、出血、滲出物、および浮腫を特徴とする。この段階のほとんどの視覚消失は黄斑(網膜の中心部)に蓄積する液体によるものである。この液体蓄積は黄斑浮腫と呼ばれ、一過的または恒常的な視覚低下を引き起こすことがある。糖尿病性網膜症の第2のカテゴリーは増殖性網膜症と呼ばれ、硝子体表面に増殖するか、または硝子体腔まで伸びる異常な新血管形成を特徴とする。新生血管形成は、眼内出血、網膜瘢痕組織、糖尿病性網膜剥離、または緑内障を引き起こし、どれも視覚低下または失明を引き起こす可能性があるので非常に有害であり得る。
【０００５】
現在の非増殖性網膜症治療には、さらなる疾患進行を遅らせるために正常な血糖濃度にする集中インシュリン療法が含まれるのに対して、現在の増殖性網膜症治療には汎網膜光凝固および硝子体切除が含まれる。非増殖性網膜症の治療は理論的には妥当であるが、実際にはほとんど有効でない。なぜなら、通常、非増殖性網膜症治療は患者のライフスタイルの大幅な変更を必要とし、多くの患者が、疾患進行を遅延および後退するのに十分な期間、正常に近い血糖濃度を維持するのは非常に困難であると知るからである。従って、現在の非増殖性網膜症治療は疾患進行を遅らせるだけあり、治療を必要とする全ての患者に有効に適用することができない。
【０００６】
別の糖尿病合併症である糖尿病性腎症は腎臓の機能不全であり、米国における末期腎臓病の最も一般的な原因である。糖尿病性腎症は、腎臓の糸球体毛細血管を冒し、腎臓の濾過能力を低下させる血管合併症である。腎症の最初の徴候は、過剰濾過の発生、次いで、ミクロアルブミン尿症の発生である。末期腎臓病の前には、重篤なタンパク尿症および進行性の腎機能低下が生じる。高血糖によって、メサンギウム細胞増殖および基質拡大および血管内皮損傷の原因となり得る糸球体タンパク質のグリコシル化が引き起こされると考えられている。一般的に、腎症の徴候が現れる前に、通常、網膜症と診断される。
【０００７】
腎症の早期治療によって疾患進行を遅らせることができる。現在、タンパク質ナトリウムリン制限食、集中血糖管理、ACE阻害剤(例えば、カプトプリル)、および/または非ジヒドロピリジンカルシウムチャンネル阻害剤(ジルチアゼムおよびベラパミル)を含む積極的な治療が示されており、C-ペプチドおよびソマトスタチンも用いられている。食事制限および血糖制限を含む初期腎症の治療法は、患者の合併症に関連した困難のために実際には理論より効果がない。糖尿病のために、末期腎臓病患者には通常、腎臓移植が推奨される。移植を受けた患者の5年生存率は約60％であるのに対して、透析を受けた患者の5年生存率は2％しかない。腎臓同種移植生存率は2年で85％を超える。
【０００８】
血管透過性亢進はネフローゼ症候群合併症において重要な役割を果たしている。ネフローゼ症候群は、広範囲に及ぶ浮腫(液体の蓄積)、重篤なタンパク尿症(タンパク質が尿に含まれる)、低アルブミン血症(血液に含まれるタンパク質の濃度が低い)、および感染に対する感受性を特徴とする状態である。ネフローゼ症候群は腎臓糸球体の損傷によって起こる。糸球体は、血液から老廃物および過剰な水を濾過する小さな血管である。損傷を受けた糸球体は透過性亢進の特徴を示す。ネフローゼ症候群は、糸球体腎炎、糖尿病、またはアミロイドーシスにより引き起こされることがある。現在、ネフローゼ症候群の予防は、これらの疾患の管理に頼っている。
【０００９】
ネフローゼ症候群の重篤な合併症の1つが血栓症(血液凝固)(特に、脳内での血栓症)である。ネフローゼ症候群患者では糸球体の透過性亢進のために血漿タンパク質が消失し、抗トロンビンIII(ATIII)濃度が低下する。ATIIIは凝固系の最も重要な調節因子の1つである。血液中のATIII濃度が低いことは、血栓性合併症(特に、脳内の血液凝固)のリスクが大きく、かなり確立していることを意味する。糸球体透過性を減少させれば、血栓症が妨げられるだろう。
【００１０】
血管透過性亢進はまた、ヒト原発性糸球体腎炎における腎炎性浮腫(例えば、特発性ネフローゼ症候群(INS))の病態生理に役割を果たすことが分かっている。腎炎性浮腫における血管透過性亢進は、免疫細胞による血管透過性因子および他のサイトカインの放出と関連すると考えられている。Rostokerら、Nephron 85:194-200(2000)を参照のこと。
【００１１】
肺高血圧は、肺動脈(心臓から肺に続く血管)の圧力が正常レベルより上昇し、生命を脅かす可能性のあるまれな肺血管障害である。歴史的に、肺高血圧は慢性であり、生存率が悪い難病である。最近のデータから生存期間は改善し続けており、患者の中には、15〜20年またはそれ以上この障害を管理できているものもいることが分かる。
【００１２】
肺高血圧は、十分に灌流された肺胞の局所的で不適切な換気、または肺胞換気の全般的な低下に起因する肺胞低酸素により引き起こされる。肺高血圧の治療は、通常、連続的な酸素の使用を伴う。肺血管拡張剤(例えば、ヒドララジン、カルシウム阻害剤、亜酸化窒素、プロスタサイクリン)は有効であることが判明していない。一般的に、治療に反応しない患者には肺移植が推奨される。
【００１３】
血管内皮増殖因子(VEGF)ファミリーのメンバーは血管透過性を誘導することがよく知られている。VEGF活性を阻害するように設計された化合物(抗VEGF抗体、抗VEGF受容体アンタゴニスト、および受容体型チロシンキナーゼ活性を阻害する低分子を含む)も、VEGF誘導性の血管透過性を阻害するはずである。しかしながら、これらの化合物は、VEGF非依存性の血管透過性に対して効果がない。VEGF非依存性血管透過性およびVEGF依存性血管透過性を両方とも阻害する方法を有することが望ましく、従って、病理が血管透過性亢進と関連する障害(例えば、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、肺高血圧、および様々な浮腫)の別の治療法を提供することが望ましい。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明の1つの局面では、血管透過性亢進の治療を必要とする個体において、血管透過性亢進を減少または阻害する方法が提供される。この方法は、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の抗血管形成化合物を個体に投与する段階を含む。他の抗血管形成化合物は本明細書で開示される。
【００１５】
本明細書で使用する「抗血管形成化合物」は血管形成を阻害することができる化合物である。本発明を用いて治療される、血管透過性に関連した疾患として、糖尿病の血管合併症(例えば、非増殖性糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症)、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患が挙げられる。本発明の方法は、天然の血管形成阻害剤が血管から漏出しないようにするために使用することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の局面では、血管透過性亢進に関連した疾患の治療を必要とする個体において、血管透過性亢進に関連した疾患を治療および/または予防する方法が提供される。この方法は、密着結合複合体を安定化し、基底膜との接触を増強することによって細胞間接触を増強することができる有効量の化合物を個体に投与する段階を含む。有効な化合物は、例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470である。ある特定の態様では、抗血管形成剤とポリマーを結合させることが望ましい場合がある。HPMAコポリマーが好ましい。
【００１７】
本発明のさらなる局面において、密着結合複合体を安定化する化合物をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、試験化合物の存在下で内皮細胞を培養する段階、培養内皮細胞をインキュベートして、密着結合タンパク質を発現させる段階、および試験化合物が密着結合複合体を安定したかどうか評価する段階を含む。密着結合タンパク質の安定化の評価は、密着結合タンパク質を免疫染色し、蛍光顕微鏡で視覚化することによって容易に実施することができる。細胞の境界が濃く染色されれば、化合物は密着結合タンパク質を安定化し、従って、透過抑制活性および/または抗血管形成活性を有することが分かる。化合物は、このような活性についてさらに試験することができる。本発明により意図される密着結合タンパク質として、内在性膜タンパク質、細胞質タンパク質、および密着結合関連タンパク質が挙げられる。さらに詳細には、密着結合タンパク質として、オクルディン、クローディン、閉鎖帯（zonula occludens）(ZO)-1、-2、-3、カテニン、VEカドヘリン、シングリン（cingulin）、およびp130が挙げられる。
【００１８】
本発明のさらなる局面では、血管透過性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、透過性支持層(例えば、コラーゲンでコーティングされた「トランスウェル(Transwell)」インサート)の上で内皮細胞をアッセイする段階、アッセイしたものと試験化合物を接触させる段階、アッセイしたものをマーカー(例えば、FITC標識)および透過誘導剤(例えば、特に、血管内皮増殖因子(VEGF)および血小板活性化因子(PAF))の混合物で処理する段階、ならびにマーカーが支持層を通って移動した量を測定する段階を含む。透過抑制性の試験化合物があれば、マーカーは対照および透過誘導剤と比較してゆっくりと拡散するだろう。
【００１９】
本発明の別の局面では、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する方法が提供される。この方法は、抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、ヒスタミンの皮内注射/皮下注射を患者に投与し、ヒスタミン誘導性局所浮腫を測定する段階を含む。その後に、抗血管形成化合物を用いて患者を治療し、抗血管形成化合物を用いて患者を治療した後に、ヒスタミンの皮内注射/皮下注射を患者に再投与し、ヒスタミン誘導性局所浮腫を測定する。抗血管形成化合物を用いた治療前に見られたヒスタミン誘導性局所浮腫の測定値と比較して測定値が減少すれば、化合物が生物学的に有効であることが分かる。
【００２０】
本発明はまた、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する別の方法を提供する。この方法は、抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、患者の体液(例えば、血液または尿)に含まれるタンパク質濃度を測定する段階、次いで、抗血管形成化合物を用いて患者を治療する段階、および患者の体液に含まれるタンパク質濃度を測定する段階を含む。体液中のタンパク質濃度が治療前の濃度と比較して減少すれば、化合物は血管透過性を阻害し、生物学的に有効であることが分かる。
【００２１】
最後に、本発明は、包装材料および包装材料の中に入れられた薬学的薬剤を含む製造物を提供する。包装材料は、血管透過性に関連した疾患の治療および/または予防に有効な量で十分な期間、薬学的薬剤を投与できることを示すラベルを含む。薬学的薬剤は、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される。血管透過性に関連した疾患として、糖尿病の血管合併症(例えば、非増殖性糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症)、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患が挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
特に定めのない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に説明する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は参照として組み入れられる。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を目的としない。抵触の場合、定義を含む本明細書は調整する。
【００２３】
詳細な説明
本発明者らは、マウスモデルにおいてエンドスタチン処置をすると、透過誘導剤(例えば、VEGFおよび血小板活性化因子(PAF))を皮内注射した後の毛細血管漏出が生理食塩水処置マウスと比較して有意に低下することを証明した。これらの結果は、エンドスタチンの抗腫瘍活性がその抗血管透過活性によって部分的に説明できることを示唆している。血管透過性は、癌の他に、糖尿病の血管合併症(例えば、糖尿病性網膜症および腎症)、ネフローゼ症候群、血管高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患などの他の疾患と関連している。従って、エンドスタチンなどの抗血管形成活性を示す分子は、抗癌治療での使用に加えて、異常な血管透過性亢進を予防および治療するのに使用することができる。このような分子はまた、内因性血管形成阻害剤または化学療法剤が尿に排出されないように使用することができ、従って、癌を含む異常な血管形成を伴う疾患または障害の治療に有用である。
【００２４】
本発明の1つの局面では、血管透過性亢進の治療を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法が提供される。この方法は、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の抗血管形成化合物を個体に投与する段階を含む。好ましくは、ポリマーはHPMAコポリマーである。
【００２５】
本発明において有用な他の血管形成阻害剤として、タキサンおよびその誘導体;インターフェロンα、β、およびγ;IL-12;マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)阻害剤(例えば、COL3、マリマスタット(Marimastat)、バチマスタット(Batimastat));EMD121974(シレンギチド(Cilengitide));ビタキシン(Vitaxin);スクアラミン(Squalamin);Cox2阻害剤;PDGFR阻害剤(例えば、グリーベック(Gleevec));EGFR1阻害剤(例えば、ZD1839(イレッサ(Iressa))、DSI774、SI1033、PKI166、IMC225など);NM3;2-ME2;ビスホスホネート(例えば、ゾレドロネート(Zoledronate))が挙げられる。
【００２６】
タキサン(パクリタキセル)誘導体は国際公開公報第01017508号に開示され、この開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【００２７】
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例として、テトラサイクリン誘導体および他の非ペプチド阻害剤(例えば、AG3340(アゴウロン(Agouron))、BAY 12-9566(バイエル(Bayer))、BMS-275291(ブリストールマイヤーズスクイブ(Bristol-Myers Squibb))、およびCGS 27023A(ノバルティス(Novartis))、またはペプチド模倣物であるマリマスタットおよびバチマスタット (ブリティッシュバイオテク(British Biotech))、ならびにMMP-3(ストロメライシン-1)阻害剤Ac-RCGVPD-NH2(カルビオケム(Calbiochem)(San Diego、CA)から入手可能)が挙げられるが、これに限定されない。癌治療におけるMMP阻害剤の概説については、Hidalgoら、2001.J.Natl.Can.Inst.93:178-93を参照のこと。
【００２８】
本明細書で使用する用語「COX-2阻害剤」は、相対的にCOX-1より酵素COX-2を阻害する非ステロイド薬物を意味する。COX-2阻害剤の好ましい例として、セレコキシブ(celecoxib)、パレコキシブ(parecoxib)、ロフェコキシブ(rofecoxib)、バルデコキシブ(valdecoxib)、メロキシカム(meloxicam)、およびエトリコキシブ(etoricoxib)が挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
本発明によれば、TNP-470以外のフマギリン(fumagilin)類似体も使用することができる。このような類似体として、米国特許第5,180,738号および同第4,954,496号に開示されるものが挙げられる。
【００３０】
抗血管形成剤は、100Da〜800kDの分子量を有する水溶性ポリマーに連結されてもよい。ポリマーバックボーンの成分は、アクリル酸ポリマー、アルケンポリマー、ウレタンポリマー、アミドポリマー、ポリイミン、多糖、およびエステルポリマーを含んでもよい。好ましくは、ポリマーは、天然ポリマーまたはその誘導体ではなく合成ポリマーである。好ましくは、バックボーン成分は、誘導体化されたポリエチレングリコールおよびポリ(ヒドロキシアルキル(alk)アクリルアミド)を含み、最も好ましくは、アミン誘導体化ポリエチレングリコールまたはヒドロキシプロピル(メタ)アクリルアミド-メタクリル酸コポリマーまたはその誘導体を含む。好ましい分子量の範囲は15〜40kDである。
【００３１】
抗血管形成剤およびポリマーはリンカー(好ましくは、切断可能なペプチド結合)によって結合される。最も好ましくは、ペプチド結合は、予め選択された細胞酵素によって切断することができる。または、酸加水分解性リンカーはエステル結合またはアミド結合を含んでもよく、例えば、cis-アコニチル結合でもよい。pH感受性リンカーも使用することができる。
【００３２】
結合体のリンカーが切断されると、活性のある抗血管形成剤が放出される。従って、薬剤の活性を変えない方法で、抗血管形成剤とポリマーを結合しなければならない。リンカーは、好ましくは、少なくとも1つの切断可能なペプチド結合を含む。好ましくは、リンカーは、酵素によって切断可能なオリゴペプチド結合であり、好ましくは、特異的結合および選択された細胞酵素による切断に十分なアミノ酸単位を含む。リンカーは、好ましくは少なくとも2アミノ酸長であり、より好ましくは少なくとも3アミノ酸長である。
【００３３】
本発明での使用に好ましいポリマーは、メタクリル酸とのHPMAコポリマーであり、オリゴペプチドペンダント基が、活性化カルボキシル末端基(例えば、パラニトロフェニル誘導体)を有するメタクリル酸にペプチド結合によって結合されている。
【００３４】
好ましい態様において、ポリマーバックボーンはヒドロキシアルキル(alk)アクリルアミドメタクリルアミドコポリマーを含み、最も好ましくは、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)コポリマーのコポリマーを含む。このようなポリマーおよび結合方法は国際公開公報第01/36002号に開示される。
【００３５】
本発明を用いて治療される血管透過性に関連した疾患として、糖尿病の血管合併症(例えば、非増殖性糖尿病性網膜症および腎症)、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患が挙げられる。
【００３６】
密着結合は内皮細胞透過性を調節し、膜内拡散防壁を生じる。密着結合は、隣接する細胞の外側原形質膜の間に別個の融合部位を形成する。密着結合は、密着結合を構築する分子、密着結合に関連した分子、または密着結合機能を調節する分子の複合体である。密着結合は、3つの領域:内在性膜タンパク質(オクルディンおよびクローディンを含むが、これに限定されない);細胞質タンパク質(閉鎖帯(ZO)-l、-2、-3を含むが、これに限定されない);ならびに密着結合関連タンパク質(カテニン、シングリン、およびp130を含むが、これに限定されない)からなる。最近の研究から、VEGFは、密着結合タンパク質オクルディンおよびZO-1の急速なリン酸化を誘導して、これらのタンパク質を細胞膜から移動させることによって密着結合の集合を妨げることが分かっている。VEGFはまたオクルディンの発現を低下させることが示された。本発明者らは、以下の実施例において、密着結合タンパク質の妨害または不安定化が血管透過性を高め、最終的に透過性亢進を引き起こすことを示している。従って、インビトロで内皮細胞の増殖および移動を阻害する化合物または腫瘍増殖を抑制する化合物を用いた密着結合タンパク質の安定化は、血管透過性亢進に関連した疾患の治療または予防に有用であろう。
【００３７】
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびTNP-470などの化合物は広く市販されている。市販されていない化合物は、当技術分野において周知の有機合成法を用いて容易に調製することができる。
【００３８】
本発明によれば、特定の化合物が透過性亢進に関連する疾患を治療または予防できるかどうかは、以下の実施例に示したマウスモデルでの作用によって確かめることができる。非増殖性糖尿病性網膜症を予防または治療することができる化合物は、内皮細胞増殖のインビトロ試験によって、および他の糖尿病性網膜症モデル(例えば、ストレプトゾトシン)において試験することができる。さらに、眼異常における薬物作用を評価するのに、カラードップラー画像法(color Doppler imaging)を使用することができる(Valliら、Ophthalmologica 209(13):115-121(1995))。カラードップラー画像法は超音波検査の最近の進歩であり、構造の二次元画像化および血流の評価を同時に行うことができる。従って、網膜症はこのような技術を用いて分析することができる。
【００３９】
本発明の予防法および治療法に有用な化合物は、本発明の方法に従って、任意の適切な経路によって投与することができる。適切な投与経路として全身経路(例えば、経口もしくは注射)または局所経路が挙げられる。治療化合物の投与方法は、部分的には、血管透過性亢進に関連する疾患(非増殖性網膜症を含む)の処置が予防的処置であるか、または治療的処置であるかによって決まる。網膜症処置のための治療化合物の投与方法は、部分的には、網膜症の原因によって決まる。詳細に述べると、網膜症の主な原因が糖尿病であれば、有効化合物は、前糖尿病網膜症状態が検出されたらすぐに予防投与することができる。
【００４０】
従って、糖尿病に起因し得る非増殖性網膜症を予防するために、有効化合物は、好ましくは、全身に(例えば、経口または注射によって)投与される。非増殖性糖尿病性網膜症を治療するために、有効化合物は全身に(例えば、経口もしくは注射によって)または眼内に投与することができる。眼周囲経路(例えば、テノン嚢下経路))、結膜下経路、網膜下経路、脈絡膜上経路、および眼球後経路などの他の経路も本発明の方法において使用することができる。有効化合物は、好ましくは、個体が網膜症のリスクがあると確かめられたらできる限り早く投与される(予防的処置)、または個体が網膜症を発症し始めたことが確かめられたらできる限り早く投与される(治療的処置)。処置は、部分的に、使用される特定の有効化合物、有効化合物の投与量、投与経路、認められた網膜症がもしあればその原因および程度によって決まる。
【００４１】
当業者は、本発明の方法において有用な、有効化合物を投与する適切な方法が利用できることを理解するだろう。有効化合物を投与するために複数の経路を使用することができるが、ある特定の経路によって、別の経路より速やかな、かつ有効な反応を得ることができる。従って、記載の投与経路は単なる例示であり、いかようにも限定しない。
【００４２】
本発明によって個体(特に、ヒト)に投与される有効化合物の用量は、妥当な時間枠にわたって動物において望ましい反応をもたらすのに十分でなければならない。当業者は、投与量が、使用される特定の化合物の強さ、個体の年齢、状態、または疾患状態(例えば、網膜症になろうとしている網膜の量もしくは網膜症に実際になっている網膜の量)、および体重を含む様々な要因によって決まることを理解するだろう。用量のサイズはまた、投与の経路、タイミング、および頻度、ならびに特定の化合物の投与に付随する可能性のある任意の副作用の存在、種類、および程度、ならびに望ましい生理学的効果によって決定される。様々な状態または疾患状態(特に、慢性の状態または疾患状態)には、複数回の投与を伴う長期間の処置が必要な場合があることが当業者に理解されるだろう。
【００４３】
適切な用量および投与計画は、当業者に周知の従来の範囲発見法によって決定することができる。一般的に、処置は、化合物の最適量より少ない少量の投与量を用いて始められる。その後、その状況の下で最適の効果に達するまで、投与量を少しずつ増やす。本発明の方法は、一般的に、全身投与の場合、約1mg/kg/日〜約500mg/kg/日、好ましくは、約10mg/kg/日〜約200mg/kg/日の投与を伴う。眼内投与は、一般的に、合計約0.1mg〜合計約5mg、好ましくは、合計約0.5mg〜合計約1mgの投与を伴う。
【００４４】
本発明の方法に用いられる組成物は、好ましくは、薬学的に許容される担体、ならびに血管透過性亢進に関連する疾患および非増殖性網膜症を治療または予防するのに十分な量の化合物を含む。担体は、従来より用いられる任意のものでよく、物理化学的な考慮すべき事項(例えば、溶解度、および化合物と反応しないこと、ならびに投与経路)によってのみ限定される。以下に説明される薬学的組成物に加えて、本発明の方法に用いられる化合物は、ポリマー組成物、封入複合体(inclusion complex)(例えば、シクロデキストリン封入複合体)、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロカプセルなどとして処方できることが当業者に理解されるだろう(例えば、米国特許第4,997,652号、同第5,185,152号、および同第5,718,922号を参照のこと)。
【００４５】
本発明に用いられる有効化合物は、薬学的に許容される酸添加塩として処方することができる。薬学的組成物に用いられる薬学的に許容される酸添加塩の例として、無機酸(例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸)、ならびに有機酸(例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、およびアリールスルホン酸(例えば、p-トルエンスルホン酸))に由来する酸添加塩が挙げられる。
【００４６】
本明細書に記載の薬学的に許容される賦形剤(例えば、ビヒクル、佐剤、担体、または希釈剤)は当業者に周知であり、一般の人々が容易に入手することができる。薬学的に許容される担体は、使用される化合物に対して化学的に不活性のもの、および使用条件下で有害な副作用も毒性も無いものが好ましい。
【００４７】
賦形剤の選択は、部分的に、特定の化合物、ならびに組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。従って、本発明の薬学的組成物の多種多様な適切な製剤が存在する。以下の製剤は単なる例示であり、いかようにも限定しない。
【００４８】
本発明の方法に好ましいものの中に注射製剤がある。注射製剤用の薬学的に有効な担体に必要な条件は当業者に周知である(Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B.Lippincott Co., Philadelphia,Pa.,BankerおよびChalmers編,238-250頁(1982)、ならびにASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,622-630頁(1986)を参照のこと)。このような注射製剤は、筋肉内、静脈内、または腹腔内に投与されることが好ましい。
【００４９】
局所製剤は当業者に周知である。このような製剤は、皮膚に適用する本発明の状況において適している。パッチ、角膜シールド(corneal shield)(例えば、米国特許第5,185,152号を参照のこと)、および眼科用点眼液(例えば、米国特許第5,710,182号を参照のこと)、ならびに軟膏(例えば、点眼薬)の使用も当技術の範囲内である。
【００５０】
経口投与に適した製剤は、(a)液体溶液(例えば、有効量の化合物を希釈剤(例えば、水、生理食塩水、またはオレンジジュース)に溶解したもの);(b)カプセル、小袋(sachet)、錠剤、ロゼンジ、およびトローチ剤(それぞれ、固体または顆粒として所定量の活性成分を含む);(c)散剤;(d)適切な液体による懸濁液;ならびに(e)適切なエマルジョンからなってもよい。液体製剤は、薬学的に許容される界面活性剤、懸濁剤、または乳化剤が添加された、または添加されていない、希釈剤(例えば、水およびアルコール(例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコール))を含んでもよい。カプセル剤形は、例えば、界面活性剤、潤滑剤、および不活性増量剤(例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびトウモロコシデンプン)を含む、通常の硬ゼラチンタイプまたは軟ゼラチンタイプのものでもよい。錠剤剤形は、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ガーゴム、コロイド二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、着香剤、および薬理学的に適合する賦形剤の1つまたはそれ以上を含んでもよい。ロゼンジ剤形は、フレーバー(通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム)の中に活性成分を含んでもよく、ならびに香錠は不活性主成分(例えば、ゼラチンおよびグリセリン)の中に活性成分を含み、または活性成分の他にスクロースおよびアラビアゴム、エマルジョン、ゲルなどを含んでもよい。このような賦形剤は当技術分野において周知である。
【００５１】
非経口投与に適した製剤として、水性および非水性の等張滅菌注射液(酸化防止剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい)、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液(懸濁剤、可溶化剤、粘稠化薬、安定剤、および防腐剤を含んでもよい)が挙げられる。本発明の方法に用いられる有効化合物は、薬学的担体の中で、生理学的に許容される希釈剤(例えば、水、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連する糖溶液、アルコール(例えば、エタノール、イソプロパノール、もしくはヘキサデシルアルコール)、グリコール(例えば、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール)、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール(例えば、2,2-ジメチル-1,3-ジオキソラン-4-メタノール)、エーテル(例えば、ポリ(エチレングリコール)400)、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含む、滅菌した液体または液体の混合物)に溶解して、薬学的に許容される界面活性剤(例えば、石鹸もしくは洗剤)、懸濁剤(例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース)、または乳化剤および他の薬学的佐剤と共に、または伴わずに投与することができる。非経口製剤として使用することができる油として、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。油の特定の例として、ラッカセイ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、石油、および鉱油が挙げられる。
【００５２】
非経口製剤での使用に適した脂肪酸として、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルが適切な脂肪酸エステルの例である。
【００５３】
非経口製剤での使用に適切した石鹸として、脂肪のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な洗剤として、(a)陽イオン洗剤(例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物およびジアルキルピリジニウムハロゲン化物)、(b)陰イオン洗剤(例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホコハク酸塩)、(c)非イオン洗剤(例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー)、(d)両性洗剤(例えば、アルキル-p-アミノプロピオネートおよび2-アルキル-イミダゾリン第四アンモニウム塩)、ならびに(e)その混合物が挙げられる。
【００５４】
非経口製剤は、一般的に、溶液中に約0.5重量％〜約25重量％の活性成分を含む。防腐剤および緩衝液を使用してもよい。注射部位での刺激を最小限にするために、または刺激を無くすために、このような組成物は、親水親油バランス(HLB)が約12〜約17の1種類またはそれ以上の種類の非イオン界面活性剤を含んでもよい。
【００５５】
このような製剤中の界面活性剤の量は、一般的に、約5重量％〜約15重量％である。適切な界面活性剤として、ポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル(例えば、ソルビタンモノオレエート)、ならびに酸化エチレンと疎水性主成分との高分子量付加体(酸化プロピレンとプロピレングリコールの縮合によって形成される)が挙げられる。非経口製剤は、単回量または複数回の用量で密閉容器(例えば、アンプルおよびバイアル)に入れ、フリーズドライ(凍結乾燥)した状態で保存することができ、これは、滅菌した液体賦形剤(例えば、注射の場合には水)の使用直前の添加しか必要としない。必要に応じて調合される注射用溶液および懸濁液は、以前に説明された種類の滅菌した散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。このような組成物は、眼内製剤、徐放性製剤または装置(例えば、米国特許第5,378,475号を参照のこと)として処方することができる。徐放性製剤を処方するために、例えば、ゼラチン(gelantin)、コンドロイチン硫酸、ポリホスホエステル(例えば、bis-2-ヒドロキシエチル-テレフタレート(BHET))、または(様々な比率の)ポリ乳酸グリコール酸を使用することができる。移植片(例えば、米国特許第5,443,505号、同第4,853,224号、および同第4,997,652号を参照のこと)、装置(例えば、米国特許第5,554,187号、同第4,863,457号、同第5,098,443号、および同第5,725,493号を参照のこと)(例えば、移植可能な装置、例えば、機械リザーバ、眼内装置、もしくは眼内導管(例えば、直径100mu〜1mm)を備える眼球外装置)、または前記のポリマー組成物からなる移植片もしくは装置を使用することができる。
【００５６】
本発明の方法はまた、他の薬学的に活性な化合物の同時投与を含んでもよい。「同時投与」は、前記の有効化合物を投与する前に投与すること、有効化合物と同時に(例えば、同じ製剤もしくは別個の製剤で有効化合物と共に)投与すること、または有効化合物を投与した後に投与することを意味する。例えば、コルチコステロイド抗炎症化合物(例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、もしくはトリアムシナロンアセトニド(triamcinalone acetinide))、または非コルチコステロイド抗炎症化合物(例えば、イブプロフェンまたはフルビプロベン)を同時投与することができる。同様に、ビタミンおよび無機質(例えば、亜鉛)、酸化防止剤(例えば、カロテノイド(例えば、ゼアキサンチンまたはルテインのようなキサントフィルカロテノイド))、および微量元素を同時投与することができる。同時投与可能な他の様々な化合物として、スルホニル尿素経口血糖降下薬(例えば、グリクラジド(非インシュリン依存性糖尿病))、ハロメチルケトン、抗脂肪血症剤(例えば、エトフィブレート、クロルプロマジン、およびスピンゴシン(spinghosine))、アルドース還元酵素阻害剤(例えば、トレスタット、ソルビニル、または酸素)、ならびにレチノイン酸およびその類似体が挙げられる(Burkeら、Drugs of the Future 17(2):119-131(1992);およびTomlinsonら、Pharmac.Ther.54:151-194(1992))。さらに、全身性液体貯留(例えば、心臓血管疾患または腎疾患による全身性液体貯留)および重篤な全身性高血圧を示す患者は、利尿剤、透析、強心剤、および抗高血圧剤によって治療することができる。
【００５７】
さらに別の本発明の局面では、密着結合タンパク質を安定化する化合物をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、試験化合物の存在下で内皮細胞を培養する段階、培養内皮細胞と密着結合タンパク質を接触させる段階、および試験化合物が密着結合タンパク質を安定化したかどうか評価する段階を含む。密着結合タンパク質を安定化する化合物は、透過抑制化合物および/または抗血管形成化合物を示す。本発明により意図される密着結合タンパク質として、内在性膜タンパク質、細胞質タンパク質、および密着結合に関連したタンパク質が挙げられる。さらに詳細に説明すると、密着結合タンパク質として、オクルディン、クローディン、閉鎖帯(ZO)-1、-2、-3、カテニン、シングリン、およびp130が挙げられる。密着結合タンパク質を安定化する化合物をスクリーニングする方法の1つの態様は、以下の実施例の項で説明される。
【００５８】
本発明のさらなる局面では、血管透過性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、透過性支持層(例えば、コラーゲンでコーティングされた「トランスウェル」インサート)の上で内皮細胞をアッセイする段階、アッセイしたものと試験化合物(例えば、エンドスタチンなどの抗血管形成化合物)を接触させる段階、アッセイしたものをマーカー(例えば、FITC標識)および透過誘導剤(例えば、特に、血管内皮増殖因子(VEGF)および血小板活性化因子(PAF))で処理する段階、ならびに対照と比較してマーカーの拡散速度を測定する段階を含み、この1つの態様が以下の本願の実施例の項で説明される。血管透過性に影響を及ぼすことが分かった化合物は、既存の方法を用いて抗腫瘍活性についてさらに試験することができる。
【００５９】
本発明の別の局面では、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する方法が提供される。この方法は、抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、ヒスタミンの皮内注射を患者に投与する段階、およびヒスタミン誘導性局所浮腫を測定する段階を含む。その後に、抗血管形成化合物を用いて患者を治療し、抗血管形成化合物を用いて患者を治療した後に、ヒスタミンの皮内注射を患者に再投与し、ヒスタミン誘導性局所浮腫を測定する。ヒスタミン誘導性局所浮腫の測定値が、抗血管形成化合物を用いた治療の前に見られたヒスタミン誘導性局所浮腫の測定値と比較して減少すれば、化合物は生物学的に有効であることが分かる。
【００６０】
本発明はまた、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する別の方法を提供する。血管透過性亢進に関連する疾患に罹患した患者の尿中タンパク質濃度は、対照群と比較して高いことが観察されている。この方法は、抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、患者の体液(例えば、血液または尿)に含まれるタンパク質の濃度を測定する段階、次いで、抗血管形成化合物を用いて患者を治療する段階、および患者の体液に含まれるタンパク質の濃度を測定する段階を含む。体液に含まれるタンパク質の濃度が治療前の濃度と比較して減少すれば、化合物は血管透過性を阻害し、生物学的に有効であることが分かる。
【００６１】
最後に、本発明は、包装材料および包装材料の中に入れられた薬学的薬剤を含む製造物を提供する。包装材料は、血管透過性に関連した疾患の治療および/または予防に有効な量で十分な期間、薬学的薬剤を投与できることを示すラベルを含む。薬学的薬剤は、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される。血管透過性に関連した疾患として、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患が挙げられるが、これに限定されない。
【００６２】
本発明は、本発明の例示を目的とした以下の実施例によりさらに特徴付けられる。
【００６３】
実施例
実施例1
血管透過性および透過性亢進に対するエンドスタチンの作用:
抗血管形成因子(エンドスタチン)をFVB/NJマウスに4日間、腹腔内注射した。最後の注射の直後に、マウスに麻酔をかけ、エバンスブルー色素(PBSに溶解した1％溶液)100μlを静脈内注射した。その後に、異なる量のVEGF165、VEGF121、または生理食塩水を皮内注射した。20分後、マウスを屠殺し、背中から皮弁を取り除き、写真を撮影した。注射部位から皮膚試料を切除し、色素を抽出するためにホルムアミド中で5日間インキュベートし、O.D.を620nmで測定した。対照マウスからの皮弁の顕微鏡検査によって、VEGF注射部位でエバンスブルー色素が広範囲に血管外遊出していることが分かった。VEGF121はVEGF165より強い透過性亢進活性を有し、25ng/ml VEGF165と50ng/ml VEGF165の間には大きな差はなかった。抗血管形成因子で処置されたマウスでは色素漏出は対照より全体的に少なく、VEGF注射による透過性亢進はほとんど誘導されなかった。エバンスブルー色素血管外遊出の定量分析(図1)によって、抗血管形成因子処置マウスの皮膚毛細血管透過性は低いことが確かめられ、これらのマウスにおけるVEGFの透過誘導作用は弱いことが分かった。これらの結果は、抗血管形成因子が全身的な抗血管透過作用を有し、VEGFにより誘導される透過性亢進を阻害する可能性があることを示唆している。
【００６４】
血管透過性に対する抗血管形成因子(エンドスタチン)の作用がVEGF特異的であるかどうか試験するために、本発明者らは、前記のように、抗血管形成因子が予め注射されたヌードマウスおよび対照マウスにおける血小板活性化因子(PAF)皮内注射の影響を試験した。皮弁の顕微鏡検査によって、抗血管形成因子は血管透過性を阻害することが確かめられた。抗血管形成因子はまたPAFにより誘導される血管透過性も抑制した。エバンスブルー色素血管外遊出の定量分析(図2)によって、抗血管形成因子処置マウスの皮膚毛細血管透過性は対照と比較して低く、これらのマウスでは、PAFにより誘導される透過性亢進が無いことが確かめられた。従って、抗血管形成因子の抗血管透過性亢進作用は、VEGFにより誘導される透過性に限定されず、PAFなどの他の血管透過性媒介物質に影響を及ぼすように思われる。
【００６５】
血管透過性を阻害するための、抗血管形成因子への曝露の期間:
血管透過性を抑制するのに抗血管形成因子(エンドスタチン)への連続曝露が必要かどうか試験するために、マウス(SCID)に麻酔をかけ、抗血管形成因子または生理食塩水が入れられた「アルツェット(Alzet)」ポンプを腹腔内に移植した。ポンプは、1時間当たり1μlの抗血管形成因子を放出する。前記のように、エバンスブルー色素を用いた皮膚血管透過を行った。ポンプを移植した2日後、3日後、および4日後に、前記のように、生理食塩水処置マウスおよび抗血管形成因子処置マウスを調べた(図3)。2日目では、生理食塩水処置マウスと抗血管形成因子処置マウスの間で、PAF注射に反応した血管透過性には有意な差はなかった。両群において、PAF注射は生理食塩水注射より高い血管透過性を誘導した。対照的に、3日目および4日目では、生理食塩水処置マウスにおける生理食塩水注射およびPAF注射は、抗血管形成因子処置マウスより有意に高い血管透過性を誘導した。しかしながら、両群において、PAF注射は生理食塩水注射より高い血管透過性を誘導した。これらの結果から、皮膚血管透過性の低下には、少なくとも3日の抗血管形成因子処置が必要であったことがわかる。ひとまとめにして考えると、これらの結果から、抗血管形成因子への脈管構造の連続曝露は血管透過性亢進および周囲組織への血漿タンパク質の漏出を阻止する可能性があることが示唆される。腫瘍血管は連続的に透過され、腫瘍内に含まれる血漿タンパク質は腫瘍の血管新生を支援するので、抗血管形成因子の透過抑制作用によって、その抗腫瘍活性のための可能な機構が得られる。
【００６６】
エンドスタチンはインビトロで内皮細胞単層を通る拡散を阻害する:
血管透過性を模倣するように設計されたインビトロ拡散モデルにおいて、インビボでの皮膚血管透過性に対する抗血管形成因子(エンドスタチン)の作用を試験した。ウシ毛細血管内皮細胞(BCE)を、コラーゲンでコーティングされた「トランスウェル」インサートに播種し、コンフルエントになるまで増殖させた。抗血管形成因子を24時間毎に添加した。4日後、インサートをBCE培地で洗浄し、以下のトレーサーおよび透過性調節物質をインサートに添加した。インサートの半分に5mg/ml FITC標識デキストラン10kDaを加え、もう半分に、5mg/ml FITC標識デキストラン70kDaを加えた。さらに、一部のインサートには50ng/ml VEGF165または100nM PAFを加えた。対照インサートには、蛍光トレーサーしか含まないBCE培地を加えた。下部ウェルの蛍光を、10分後、20分後、30分後、45分後、および60分後に、インサートを新しいウェルに移すことによって測定した。60分にわたる蛍光カウントの合計から、VEGF165処理細胞およびPAF処理細胞の値は対照細胞と比較して高いことが分かった(図4)。VEGF165処理細胞およびPAF処理細胞のカウント数が、10kDaおよび70kDaデキストランを用いて観察された。抗血管形成因子で予め処理された細胞は、両デキストランサイズにおいて、対照、VEGF165処理細胞、およびPAF処理細胞より有意に低い蛍光カウントを示した。抗血管形成因子で予め処理された細胞の蛍光カウント低下は、10kDaデキストランの拡散と比較して70kDaデキストランの拡散において顕著であった。これらの結果から、このインビトロ拡散系は、VEGFおよびPAFなどの透過誘導因子に確かに反応することが分かる。
【００６７】
さらに、結果から、抗血管形成因子処理は、EC単層を通る大きな分子の拡散を有意に低下させることが分かる。拡散プロセスの反応速度を追跡するために、トレーサーの流れを、1分当たりの蛍光カウントとして計算した(図5および6)。10kDaデキストランを使用した場合(図5)、PAFは20分まで流れを漸増させ、次いで、流れは低下し、対照細胞と同様のレベルに達した。VEGF165は同様の作用を示したが、45分で最大の流れに達し、流れはPAF処理細胞より少なかった。対照的に、対照細胞における流れは一定であり、PAF処理細胞およびVEGF165処理細胞において観察されたものより少なかった。70kDaデキストランを使用した時に、VEGF165処理がPAF処理より大きな流れをもたらしたことを除けば、70kDaデキストランを用いて得られた結果(図6)は10kDaデキストランを用いて得られた結果と同じであった。抗血管形成因子の前処理によって、10kDaデキストランおよび70kDaデキストランの流れが著しく低下した。
【００６８】
対照細胞と同様に、抗血管形成因子処理細胞の流れは、60分間、一定であった。抗血管形成因子処理細胞における流れは対照細胞の流れより少なかった。ひとまとめにして考えると、これらの結果から、抗血管形成因子処理によって、EC単層を通る拡散が遅くなることが分かる。これらの結果は、大きな分子の拡散に対する抗血管形成因子の作用によって、抗血管形成因子の血管透過阻害の説明がつくかもしれないことを示唆している。さらに、このインビトロ拡散系は、血管透過性に対する抗血管形成分子および他の分子の作用を試験するのに使用することができる。
【００６９】
エンドスタチンは肺組織の膨張を阻害する
肺組織の拡大は、肺機能不全および肺高血圧発症の原因となることがある。マイクロカプセルに入れられたVEGF産生細胞(約0.5×106細胞/マウス)を注射したマウスは、注射の5日後に肺実質肥厚を発症した。本発明者らは、さらに高い倍率で、肺胞間にいくつかの細胞層が生じているのを観察した。それに対して、マイクロカプセルに入れられた対照細胞を注射したマウスまたはマイクロカプセルに入れられたエンドスタチン産生細胞(エンドスト(Endost))を注射したマウスの細胞層は1つであった。さらに、本発明者らは、VEGF処置マウスの肺組織において細胞外マトリックス(通常、H＆E染色によってピンク色に染色される)の蓄積を観察した。このことは、高濃度の循環VEGFが、肺組織への血漿タンパク質の漏出を誘導する可能性があることを示唆している。対照的に、VEGF産生細胞とエンドスタチン産生細胞(それぞれ、0.5×106のマイクロカプセルに入れられた細胞)を与えたマウスの肺は、対照細胞を注射したマウスの肺と同じように見え、細胞層は少なく、細胞外マトリックスは蓄積しなかった。これらの結果から、エンドスタチンは、血漿タンパク質の肺組織への漏出および肺組織における細胞外マトリックスの蓄積を阻止する可能性があることが分かる。さらに、エンドスタチン処置は肺胞間の細胞層の数を減らし、エンドスタチン処置されたマウスの肺は対照マウスと同じように見えた。従って、エンドスタチンは肺組織の膨張をブロックするように思われ、肺高血圧の治療に使用できるかもしれない。
【００７０】
エンドスタチンは密着結合タンパク質の集合を増大させる:
ウシ毛細血管内皮細胞(BCE)を、0.2、0.5、および2μg/mlヒトエンドスタチンの存在下で3日間培養した。細胞を固定し、抗β-カテニン抗体、抗オクルディン抗体、および抗ZO-1抗体(ザイメッドラボラトリーズ(Zymed Laboratories),CA)を用いて免疫染色した。FITC結合二次抗体を用いて染色を発色させ、蛍光顕微鏡で視覚化した。β-カテニンの免疫染色は細胞境界をはっきりと示し、2個の細胞が互いに接触している時に非常に濃かった。細胞境界β-カテニン染色は0.2μg/mlエンドスタチンの存在下で強まり、0.5μg/mlエンドスタチンの存在下でさらに強まった。0.5μg/mlエンドスタチン存在下のβ-カテニン染色と2.0μg/mlエンドスタチン存在下のβ-カテニン染色には違いがなかった。オクルディン免疫染色はエンドスタチン非存在下では細胞境界区画を全く示さず、反対に、細胞核が染色された。しかしながら、0.5μg/mlおよび2.0μg/mlエンドスタチンの存在下では、主に、2個の細胞が互いに接触している時に、細胞境界が観察された。同様の結果がZO-1免疫染色で得られた。細胞境界は、0.2〜2.0μg/mlエンドスタチンの存在下でしか目に見えなかった。これらの結果から、密着結合タンパク質の免疫染色はエンドスタチン存在下で強められることが分かり、エンドスタチンは密着結合の集合および安定化を支援している可能性があることが示唆される。これは、エンドスタチンが密着結合に作用するという初めての実証であり、エンドスタチン抗血管形成活性機構の部分的な説明となるかもしれない。同様の実験を行った。この実験では、BCEを、0.5μg/mlエンドスタチンの存在下および非存在下で3日間インキュベートした後に、PAFで20分間刺激した。前記のように、細胞を固定し、抗β-カテニン抗体、抗オクルディン抗体、および抗ZO-1抗体(ザイメッドラボラトリーズ,CA)を用いて免疫染色した。PAF処理によって、抗β-カテニン抗体、抗オクルディン抗体、および抗ZO-1抗体の染色強度は対照細胞でしか有意に低下せず、エンドスタチン処理細胞では低下しなかった。これらの結果は、密着結合タンパク質が透過抑制および抗癌治療アプローチの可能性のある標的であることを示唆している。
【００７１】
抗血管形成治療の活性を試験するためのヒスタミン誘導性膨疹潮紅アッセイの使用:
最近、抗血管形成治療の臨床試験が始まっている。第1相臨床試験および第2相臨床試験において試験された分子として、エンドスタチン、アンギオスタチン、TNP-470、サリドマイド、抗VEGF抗体、PTK787、SU-5416、SU-6668などが挙げられる。エンドスタチン処置によって皮膚血管透過性が低下することを示した本発明者らの結果は、ヒト患者でのエンドスタチン(および他の抗血管形成剤)処置の効率を確かめるために、この試験を使用できることを裏付けている。エンドスタチンを数日間与えたマウスは、皮内VEGFおよびPAF注射に反応した皮膚毛細血管からのエバンスブルー拡散が正常マウスと比較して低下した。この既存の皮膚におけるヒスタミン誘導性膨疹潮紅アッセイ試験は、エンドスタチンおよび他の抗血管形成因子の生理活性を試験するのに使用することができる。ヒスタミン皮内注射は、その血管透過性亢進によって局所浮腫(潮紅)を生じさせる。エンドスタチンおよび他の抗血管形成因子を与えたヒトは、その透過抑制活性のために浮腫部分が減少するだろう。この試験は、エンドスタチンおよび他の抗血管形成因子の生理活性の初期代用マーカーとして機能し、個々の患者における治療効率を確かめるのに役立つだろう。
【００７２】
実施例2
HPMAコポリマー-TNP-470結合体の合成:
TNP-470とHPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミンを、塩素を放出するTNP-470のα-カルボニルでの求核攻撃によって結合させた。簡単に述べると、HPMAコポリマー-Gly-Phe-Leu-Gly-エチレンジアミン(100mg)をDMF(1.0ml)に溶解した。次いで、TNP-470(100mg)をDMF 1.0mlに溶解し、溶液に添加した。混合物を4℃で12時間暗所で攪拌した。DMFを蒸発させ、生成物HPMAコポリマー-TNP-470結合体を水に再溶解し、遊離TNP-470および他の低分子量汚染物質を取り除くために水に対して透析し(10kDa MWCO)、凍結乾燥し、-20℃で保存した。結合体を特徴付けるために、C18カラムを用いた逆相HPLC分析を使用した。
【００７３】
BCE増殖アッセイ:
ウシ副腎毛細血管内皮細胞をゼラチン化プレートに播種した(15,000/ウェル)。24時間のインキュベーション後、遊離TNP-470および結合TNP-470を用いて細胞を攻撃し、bFGF(1ng/ml)を培地に添加した。72時間後に細胞を計数した。
【００７４】
ニワトリ大動脈輪アッセイ:
大動脈弓を14日齢ニワトリ胚から解剖し、横断面の断片に切断し、裏返して内皮を曝露し、マトリゲル(Matrigel)の中に外植した。内皮細胞は無血清MCDB-131培地において培養されると増殖し、2〜48時間以内に3次元血管チャンネル(vascular channel)が形成した。遊離TNP-470および結合TNP-470を培養物に添加した。
【００７５】
マイルズアッセイ(Miles Assay):
血管形成依存性疾患に関する問題の1つは、浮腫およびタンパク質消失をもたらす、(高濃度のVPFによる)血管透過性の増大である。血管透過性の減少は、これらの疾患において有益である。本発明者らは、マイルズアッセイ(Claffeyら、Cancer Res,56:172-181(1996))を用いて、遊離TNP-470および結合TNP-470が透過性をブロックすることを発見した。簡単に述べると、色素エバンスブルー(PBSに溶解した1％溶液)を、麻酔したマウスに静脈内注射した。10分後、ヒト組換えVEGF165 (50ng/50μl)を背中皮膚の皮内に注射した。タンパク質結合色素の漏出が、注射部位を取り囲む背中皮膚の下面に青色の点として検出された。20分後に、マウスを安楽死させた、次いで、皮膚を切除し、抽出のためにホルムアミドの中に5日間入れ、溶液を620nmで測定した。遊離TNP-470および結合TNP-470などの推定血管形成阻害剤を、VEGF攻撃の前に3日間毎日注射した(30mg/kg/日)。腫瘍血管透過性に対する血管形成阻害剤の作用を評価するために、同じことを腫瘍保持マウスにおいて繰り返した。
【００７６】
肝切除:
イソフロウラン(isoflourane)を用いた全身麻酔の後、雄C57ブラックマウスの肝臓を正中切開によって2/3切除した。遊離TNP-470および結合TNP-470(30mg/kg)を、外科手術から8日間、1日おきに皮下投与した。肝臓を8日目に採取し、秤量し、組織学について分析した。
【００７７】
結果:
HPMAコポリマー-TNP-470結合体を合成し、精製し、HPLCによって特徴付けた。遊離TNP-470は13.0分の保持時間でピークを示したのに対して、結合体は10.0分で幅広いピークを示した。遊離薬物は精製後に検出されなかった。
【００７８】
TNP-470は水溶性でないが、HPMAコポリマーとの結合後に可溶性になった。HPMA-TNP-470の生物学的活性を評価するために、以下のアッセイを行った。
【００７９】
BCE増殖:BCE細胞増殖は、bFGFで攻撃された時に、TNP-470およびHPMAコポリマー-TNP-470によって同様に阻害された(データは示さず)。
【００８０】
大動脈輪アッセイ:遊離TNP-470および結合TNP-470は血管の芽(vascular sprout)の数および長さを減少させ、50pg/mlで効力を示し、100pg/mlで成長を完全に阻害した。未処理大動脈輪は多数の芽形成を示す。
【００８１】
肝切除:2/3肝切除の後、対照マウスは、切除された肝臓の重量を手術後8日目までに手術前のレベル(約1.2g)まで回復させた。遊離TNP-470または様々な用量のTNP-470-ポリマー結合体で処置されたマウスは肝臓再生を阻害し、手術後8日目に、肝臓を平均0.7gのサイズに保った。HPMA-TNP-470結合体は、肝切除の日に一回しか投与されていない場合でも同様の作用を示した。このことから、HPMA-TNP-470結合体は循環時間が長いこと、増殖性内皮細胞の部位でポリマーから徐放されることが分かる。肝臓再生は内皮細胞増殖によって調節されるので、同じ作用が腫瘍組織内の増殖性内皮細胞に及ぶと予想される。
【００８２】
マイルズアッセイ:本発明者らは、マイルズアッセイにおいて遊離TNP-470および結合TNP-470と他の血管形成阻害剤を比較した。本発明者らは、対照群および間接的血管形成阻害剤(例えば、ハーセプチンおよびサリドマイド)とは対照的に、遊離TNP-470およびHPMAコポリマー-TNP-470が、VEGFにより誘導された血管透過性に対して同様の阻害作用を有することを発見した。遊離TNP-470および結合TNP-470(30mg/kg/日、3日間)はまたA2058ヒト黒色腫保持マウスにおいて腫瘍血管透過性を減少させた(図10)。
【００８３】
結論:
HPMAコポリマー-TNP-470は、インビトロでBCE細胞およびニワトリ大動脈輪の増殖を阻害した。インビボでは、結合体は、肝切除後の肝臓再生に対して遊離TNP-470と同様の作用を示した。これは、結合体が、増殖性内皮細胞におけるテトラペプチド(Gly-Phe-Leu-Gly)リンカーのリソソーム酵素切断によってポリマー結合体から放出された時に阻害活性を保っていたことを示唆している。
【００８４】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および変化を加えることができることは当業者に明らかであろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内にあれば本発明の変更および変化を含むことが意図される(図10)。
【００８５】
参考文献:
以下に引用され、本願を通じて組み入れられる参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【００８６】
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部を構成する添付の図面は本発明の態様を例示し、説明と共に本発明の目的、利点、および原理を説明する。
【図１】抗血管形成因子処置マウスの皮膚毛細血管透過性は低く、これらのマウスではVEGFの透過誘導作用は弱いことを示す、エバンスブルー色素血管外遊出の定量分析である。
【図２】対照と比較してエンドスタチン処置マウスの皮膚毛細血管透過性は低く、これらのマウスではPAFにより誘導される透過性亢進は無いことを示す、エバンスブルー色素血管外遊出の定量分析である。
【図３】連続した期間で生理食塩水処置されたマウスおよびエンドスタチン処置されたマウスの皮膚血管透過性ならびにPAF注射に反応した皮膚血管透過性の定量分析である。
【図４】エンドスタチン処置によって、内皮細胞単層を通過する大きな分子の拡散が有意に低下することを示す。
【図５】10kDaデキストランを用いた拡散プロセスの動態を示す。
【図６】70kDaデキストランを用いた拡散プロセスの動態を示す。
【図７】対照と比較した、肝切除後の肝臓再生に対する結合TNP-470および遊離TNP-470の作用を示す。
【図８】マイルズアッセイにおいて、遊離TNP-470およびポリマー結合TNP-470が、VEGF、PAF、およびヒスタミンにより誘導される血管漏出を対照と比較して阻止することを示す。
【図９】「間接的」血管形成阻害剤であるサリドマイドおよびハーセプチンは血管透過性に作用しないことを示す。
【図１０】マイルズアッセイの前にアンギオスタチン、TNP-470、ポリマー結合TNP-470で3〜5日間処置されたA2058ヒト黒色腫保持SCIDマウスにおける透過作用を示す。
【図１１】TNP-470で3日間処理され、密着結合タンパク質ZO-1に対する抗体で染色されたウシ毛細血管内皮(BCE)細胞を示す。
【図１２】IL-2筋肉内投与により浮腫を誘導した後の対照肺および対照正常肺と比較した、TNP-470で3日間処置した後の肺の相対重量を示す。グラフに示されるように、TNP-470は肺浮腫を減少させる。
【図１３】エンドスタチンで5日間処置されたA2058ヒト黒色腫保持SCIDマウスにおけるマイルズアッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月16日(2004.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、血管透過性亢進の減少または阻害を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法:
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項２】
血管透過性が、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患からなる群より選択される疾患の結果である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の段階を含む、血管からの天然血管形成阻害剤の漏出の減少または阻害を必要とする個体において、血管からの天然血管形成阻害剤の漏出を減少または阻害する方法:
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項４】
以下の段階を含む、非増殖性糖尿病性網膜症の治療および/または予防を必要する個体において、非増殖性糖尿病性網膜症を治療および/または予防する方法:
エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項５】
以下の段階を含む、血管透過性亢進の治療を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法:
密着結合複合体を安定化することができる有効量の化合物を個体に投与する段階。
【請求項６】
密着結合タンパク質を安定化することができる化合物が、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
以下の段階を含む、密着結合複合体を安定化する化合物をスクリーニングする方法:
a)試験化合物の存在下で内皮細胞を培養する段階;
b)該培養内皮細胞をインキュベートして、密着結合タンパク質を発現させる段階;および
c)試験化合物が密着結合複合体を安定化したかどうか評価する段階。
【請求項８】
密着結合タンパク質が、内在性膜タンパク質、細胞質タンパク質、および密着結合関連タンパク質からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項９】
密着結合タンパク質が、オクルディン、クローディン、閉鎖帯(ZO)-1、-2、-3、カテニン、シングリン、およびp130からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
密着結合複合体を安定化する化合物が透過抑制性および/または抗血管形成性の化合物である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、血管透過性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする方法:
a)透過性支持層の上で内皮細胞をアッセイする段階;
b)アッセイしたものと試験化合物を接触させる段階;
c)アッセイしたものをマーカーおよび透過誘導剤で処理する段階;ならびに
d)対照と比較してマーカーの拡散速度を測定する段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、抗血管形成化合物を用いて治療された患者における抗血管形成化合物の生物学的有効性を評価する方法:
a)抗血管形成化合物を用いて患者を治療する前に、患者の体液中のタンパク質濃度を測定する段階;
b)抗血管形成化合物を用いて患者を治療する段階;
c)抗血管形成化合物を用いて患者を治療した後に、患者の体液中のタンパク質濃度を測定する段階であって、体液中のタンパク質濃度の減少が、化合物が生物学的に有効であることを示す、段階。
【請求項１３】
体液が尿、末梢血、または血漿である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
包装材料および該包装材料の中に入れられた薬学的薬剤を含む製造物であって、該包装材料が、血管透過性に関連した疾患の治療および/または予防に有効な量で十分な期間、該薬学的薬剤を投与できることを示すラベルを含み、該薬学的薬剤が、エンドスタチン、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、タムスタチン、アレスチン、組換えEPO、およびポリマー結合TNP-470からなる群より選択される化合物を含む、製造物。
【請求項１５】
血管透過性に関連した疾患が、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、黄斑変性、乾癬、肺高血圧、インターロイキン治療の副作用、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患からなる群より選択される、請求項14記載の製造物。
【請求項１６】
以下の段階を含む、血管透過性亢進の減少または阻害を必要とする個体において血管透過性亢進を減少または阻害する方法:
タキサンおよびその誘導体;α、β、またはγインターフェロン;IL-12;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤;Cox-2阻害剤;PDGFR阻害剤;EGFR1阻害剤、ならびにビスホスホネートからなる群より選択される有効量の化合物を該個体に投与する段階。
【請求項１７】
血管透過性が、非増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群、肺高血圧、熱傷浮腫、腫瘍浮腫、脳腫瘍浮腫、IL-2治療に関連した浮腫、および他の浮腫関連疾患からなる群より選択される疾患の結果である、請求項16記載の方法。
【国際調査報告】
2006506321.tif 000018
2006506321.tif 000019