(57)【要約】本発明は、スキャフォールドである第１の成分；アジュバント、好ましくはＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および抗原である第３の成分を含む生成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スキャフォールドである第１の成分；
アジュバントである第２の成分；および
抗原である第３の成分
を含む生成物。
【請求項２】
前記第２の成分が、ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチドである、請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
前記第３の成分がポリペプチド抗原である、請求項１または２に記載の生成物。
【請求項４】
前記第３の成分が非ポリペプチド抗原である、請求項１または２に記載の生成物。
【請求項５】
前記スキャフォールドおよび抗原が同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の生成物。
【請求項６】
前記スキャフォールドおよび抗原がウイルスコートタンパク質である、請求項５に記載の生成物。
【請求項７】
前記ウイルスコートタンパク質がＢ型肝炎表面抗原である、請求項６に記載の生成物。
【請求項８】
前記スキャフォールドおよびアジュバントが同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の生成物。
【請求項９】
前記スキャフォールドおよびアジュバントがＣ４ｂｐコアタンパク質である、請求項８に記載の生成物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の生成物を薬剤として許容される担体または希釈剤と一緒に含む、薬剤組成物。
【請求項１１】
対象に請求項１から１０のいずれか一項に記載の生成物を有効量投与することを含む、抗原に対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項１２】
ポリペプチドスキャフォールドである第１の成分；
ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および
ポリペプチド抗原である第３の成分
を含む生成物を作製する方法であって、
前記３つの成分をコードする核酸を融合タンパク質の形態で発現すること、および前記生成物を回収することを含む前記方法。
【請求項１３】
ポリペプチドスキャフォールドである第１の成分；
ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および
非ポリペプチド抗原である第３の成分
を含む生成物を作製する方法であって、
前記第１および第２の成分をコードする核酸を融合タンパク質の形態で発現すること、前記融合タンパク質と前記第３の成分を連結すること、ならびに前記生成物を回収することを含む前記方法。
【請求項１４】
前記核酸が原核宿主細胞中で発現される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が多量体形態で回収される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換えタンパク質が細胞培養物あたり少なくとも２ｍｇ/ｌの濃度で存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主原核細胞が大腸菌である、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドスキャフォールドである第１の成分；
ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および、場合により、ポリペプチド抗原である第３の成分
の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、
宿主細胞中で機能するプロモーターに機能しうる態様で連結した発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８の発現ベクターを用いて形質転換した細菌宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１８の発現ベクターを用いて形質転換した真核宿主細胞。
【請求項２１】
ヒトまたは動物の身体を治療する方法における請求項２０の発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原に対して抗原単独と比較して高い免疫応答を誘発する、アジュバントおよび抗原を含む、融合タンパク質などの高分子アセンブリに関する。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは抗原に対する免疫応答を高め、したがってワクチンにおいて有用である。しかし、限られた数のアジュバントしかヒトへの使用に認可されておらず、またより強力なアジュバントが動物の研究によって知られているため、人間への使用が安全なより強力な免疫アジュバントが明らかに必要である。最近の報告については、「Advances in vaccine adjuvants」（Nature Biotechnology、1999年、17巻、1075〜1081頁）を参照のこと。人間への広範にわたる使用に関する任意のアジュバントの重要な特徴は、特に非常に多数の健康な人々の通常の予防に使用する場合に非常に安全であるべきことである。
【０００３】
補体系は、外来抗原に対する免疫系の応答に重要な１組の血清タンパク質からなる。補体系は、その主要な成分が切断されると活性化され、その生成物は、単独または他のタンパク質と一緒に、タンパク質分解カスケードをもたらす別の補体タンパク質を活性化する。補体系の活性化は、血管透過性の増大、食細胞の走化性、炎症細胞の活性化、異物のオプソニン作用、細胞の直接致死および組織の損傷を含む種々の応答をもたらす。
【０００４】
補体系の活性化は、抗原−抗体複合体によって誘発され（従来経路）、または通常の緩徐な活性化は、細菌およびウイルスなどの侵入生物の細胞壁の存在下で増幅され得る（代替経路）。補体系は、古典的経路および選択的経路の両方の中心をなすタンパク質であるＣ３が関与する特定の経路を介して細胞免疫系と相互作用する。Ｃ３のタンパク質分解活性化により、大きなフラグメント（Ｃ３ｂ）が生じ、侵入生物または異種細胞の細胞表面タンパク質などの外部求核原子と共有結合的に反応できる化学的反応性内部チオールエステル結合が露出される。その結果、潜在抗原はＣ３ｂによって「標識」され、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ,ｇに対してさらにタンパク質分解を受けるのでそのタンパク質と結合したままである。後者のフラグメントは、それぞれ、補体受容体ＣＲ３およびＣＲ２（ＣＲ２はＣＤ２１とも称される）に対するリガンドである。したがって、Ｃ３ｂによる抗原の標識の結果、これらの受容体をもつ免疫系の細胞に対するターゲティング機構を得ることができる。
【０００５】
このようなターゲティングは、免疫応答の増強に重要であり、それは、マウスから循環Ｃ３を奪い、次いで抗原（ヒツジ赤血球）で攻撃した実験によって最初に示されている。Ｃ３の除去により、この抗原への抗体応答が減少した（M. B. Pepys、J. Exp. Med.、140、126〜145頁、1975年）。Ｃ３の役割は、Ｃ３またはＣ３ｂを生成する補体カスケードの上流成分、すなわちＣ２およびＣ４を遺伝的に欠く動物の研究によって確認された（J. M. AhearnおよびD. T. Fearon、Adv. Immunol.、46、183〜219頁、1989年）。つい最近、ネズミＣ３ｄフラグメント配列の３個以上の複製を含むモデル抗原を線状に結合すると、未改変抗原対照と比較してマウスの抗体応答が極めて（１０００〜１００００倍）増大したことが示されている（P. W. Dempseyら、Science、271、348〜350頁、1996年；国際公開ＷＯ  ９６／１７６２５、ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２８５１）。この増大は、ヒトに使用するには毒性が強すぎるフロイント完全アジュバントなどの従来のアジュバントを使用せずに達成することができる。この注目すべき効果の機構は、多価Ｃ３ｄ構築体とＢ細胞上のＣＲ２との高親和性結合と、それに続くＢ細胞核に対してシグナルを生成するためのＣＲ２と別のＢ細胞膜タンパク質、ＣＤ１９および膜結合免疫グロブリンとの共連結であることが実証された。
【０００６】
しかし、Ｃ３ｄの３個の複製を含む大量の相同組換えタンパク質を生成するのは困難であることが証明されている。主要な問題は：
ｉ）（３個の）反復配列を含む構築体の遺伝的不安定性および
ii）大腸菌（Escherichia coli）中で形成した封入体由来の組換えタンパク質のフォールディング（または可溶化およびリフォールディング）
である。
【０００７】
Ｃ３ｄ遺伝子の繰返し複製を含む構築体の遺伝的不安定性を最小化するための１つの手法が、国際公開ＷＯ  ９９／３５２６０およびＷＯ  ０１／７７３２４に記載されている。これらの出願中に記載されている技術は、Ｃ３ｄの繰返しをコードするＤＮＡの同一でない配列を使用することである。
【０００８】
国際公開ＷＯ  ００／６９９０７およびＷＯ  ００／６９８８６（これらの内容は参照により本明細書に組み込むものとする）、多量体形態にアセンブリ可能なポリペプチド単量体について記載されている。この単量体は、シャペロンタンパク質、特にＧｒｏＥＳまたはＣｐｎ１０ファミリーメンバー由来である。
【０００９】
補体４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）を用いた多量体化システムは、国際公開ＷＯ  ９１／１１４６１に記載されている。ヒトＣ４ｂ−結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）は、７個の同一のα鎖および単一のβ鎖からなるクモ様構造を有する高分子量（５７０ｋＤａ）の血漿糖タンパク質である。Ｃ４ｂｐα鎖は、分子の多量体へのアセンブリを引き起こすＣ末端コア領域を有する。標準モデルによれば、１個のＣ４ｂｐ単量体の＋４９８位置にあるシステインは、別の単量体の＋５１０位置にあるシステインとジスルフィド結合を形成する。７個のα鎖しか含まない少数の形態もヒト血漿中で発見されている。この血漿糖タンパク質の自然機能は、補体活性化の従来経路を阻害することである。
【００１０】
国際公開ＷＯ  ９１／１１４６１は、Ｃ４ｂｐタンパク質の多量体化する能力を使用して、Ｃ４ｂｐおよび重要な生物学的タンパク質のすべてまたは一部を含む融合タンパク質を作製できることを提案している。この融合タンパク質は、前記タンパク質が高い血清半減期およびその標的に対する高い親和性またはアビディティを有する、重要なタンパク質のためのプラットフォームをもたらす多量体を形成することになる。Ｃ４ｂｐの融合タンパク質は、国際公開ＷＯ  ９１／１１４６１中に記載の治療薬の新規な送達および輸送システムの対象として標的となった。
【００１１】
Ｃ４ｂｐのα鎖のほとんどが、補体制御タンパク質（ＣＣＰ）繰返しとして周知の長さの約６０アミノ酸からなる８個の直列配列ドメインから構成されている。１種または複数のこれらのドメインの封入は、国際公開ＷＯ  ９１／１１４６１に記載の融合タンパク質で好ましかったが、多量体化を防止せずにすべてのＣＣＰを除去できる（Ｃ末端５７アミノ酸だけ残して）ことが実証されている（Libyh M. T.ら、（1997年）Blood、90、3978〜3983頁）。Ｃ４ｂｐのこのＣ末端領域は、Ｃ４ｂｐコアと称される。
【００１２】
Libyhら、（1997年）は、Ｃ４ｂｐのα鎖のＣ末端部分に基づいたタンパク質多量体化システムについて記載している。Ｃ４ｂｐのＣ末端部分は、補体活性化の従来経路を阻害する能力を欠くが、Ｃ４ｂｐを生成するＣＨＯ細胞の細胞質中でのＣ４ｂｐの重合を引き起こす。Libyhらは、関連する抗体フラグメントの自発的多量体化を誘発して、Ｃ４ｂｐフラグメントを用いてｓｃＦｖフラグメントのホモ多量体を得ることができた。使用したＣ４ｂｐのＣ末端部分は、場合によってはＭＹＣタグによって間隔を空けてｓｃＦｖ配列のＣ末端側に置いた。
【００１３】
Ｃ４ｂｐの使用は、Oudinら（2000年、Journal of Immunology、164巻：1505頁）およびChristiansenら（2000年、Journal of Virology、74巻：4672頁）にも記載されている。自己アセンブリ多量体可溶性ＣＤ４−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質は、融合タンパク質がヒト２９３細胞系で発現されたShinyaら（1999年、Biomed & Pharmacother、53巻：471頁）でも実証されている。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、
スキャフォールドである第１の成分；
アジュバントである第２の成分、好ましくはＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチド；および
抗原である第３の成分
を含む生成物を提供する。
【００１５】
第１の成分により、複数コピーの第２の成分が１コピー以上の抗原と結合しているような、多成分生成物中に複数コピーの第２の成分のアセンブリがもたらされる。
【００１６】
好ましい態様では、本発明は、
ポリペプチドスキャフォールドである第１の成分；
ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および
抗原である第３の成分
を提供する。
【００１７】
第１および第２の成分は、融合タンパク質の形態であってよい。第３の成分もポリペプチドである場合、３つの成分は、融合タンパク質として存在する。あるいは、第３の成分は、最初の２つの成分が融合したものと共有結合している。
【００１８】
場合によっては、第１の成分自体が抗原である場合、第１および第３の成分は、同じ分子であってよい。
【００１９】
疑いを回避するために、「第１」、「第２」および「第３」の成分の呼称は、３つの成分の生成物における具体的な直線的順序を意味するものでも、示唆するものではない。この３つの成分は、任意の順序で連結していてよい。
【００２０】
したがって、３つすべての成分がポリペプチドであり、その生成物を融合タンパク質として作製した場合、この３つの成分のＮからＣ末端順序は、任意の順列であってよい。さらに、以下に示すように、場合によっては第１の成分は、１種または他の第２および第３の成分によって置換できるループ領域を含んでいてよい。
【００２１】
本発明の生成物は、免疫促進性の第２の成分を多成分生成物に形成し、タンデム型反復配列を有するＤＮＡ配列を用いる必要なく組換えＤＮＡ技術を用いて発現させる。
【００２２】
本発明はさらに、前記第１および第２の成分の融合タンパク質をコードする核酸、ならびに前記第３の成分がポリペプチドの場合、３つすべての成分をコードする核酸を提供する。本発明はまた、前記核酸を含むベクターおよび前記ベクターを保有する宿主細胞を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、
ポリペプチドスキャフォールドである第１の成分；
ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞上の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および
ポリペプチド抗原である第３の成分
を含む生成物を作製する方法であって、
融合タンパク質の形態で３つの成分をコードする核酸を発現すること、および生成物を回収することを含む前記方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、
ポリペプチドスキャフォールドである第１の成分；
ＣＤ２１に対するリガンドあるいはＢ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞の細胞表面分子であるポリペプチドである第２の成分；および
非ポリペプチド抗原である第３の成分
を含む生成物を作製する方法であって、
第１および第２の成分をコードする核酸を融合タンパク質の形態で発現すること、前記融合タンパク質と第３の成分を連結すること、ならびに生成物を回収することを含む前記方法を提供する。
【００２５】
生成物を作製する方法は、真核または原核細胞で行うことができる。
【００２６】
本発明はまた、対象に有効量の本発明による生成物を投与することを含む、抗原に対して免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、人体または動物体を治療する方法、特に免疫応答を誘発する方法のための本発明の生成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、本発明の生成物を薬剤として許容される担体または希釈剤と結合させて含む薬剤組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
スキャフォールド
これは、第２および第３の成分が結合できるスキャフォールドになり得る任意の高分子アセンブリを意味する。これは、タンパク質または他の高分子（例えば糖から構成される）あるいは原核または真核細胞壁あるいはウイルスであってよい。細胞壁、またはウイルスまたはタンパク質は、不完全であってよく、すなわちそれが認められる生物中に通常存在する成分を欠いており、本発明の重要な特徴は、スキャフォールドが、２種以上のアジュバント分子および２種以上の抗原分子を単一アセンブリに一体化させ得ることである。
【００３０】
本明細書により詳細に記載したように、２つの主なクラスのスキャフォールドが企図されている。第１は、その上に複数コピーの第２の成分、および該当する場合は第３の成分が、別々に、または第２および第３の成分の融合体として結合した、ウイルスまたは細胞を含む複合高分子生成物である。あるいは、スキャフォールドは、第２の成分に対して１：１の比で存在する。生成物が融合タンパク質の形の場合、第３の成分も第２および第１の成分に対して１：１：１の比で存在する。
【００３１】
細胞壁またはウイルススキャフォールドは、他の目的で当技術分野で周知である。原核（Samuelsonら、2002年、J. Biotechnol 96、129〜154頁；Lang H.、2001年、Nat. Biotechnol.、19、75〜78頁）または真核細胞壁（Shusta E. V.ら、1999年、J. Mol. Biol. 292、949〜956頁）あるいはバクテリオファージなどのウイルス（Sidhu S. S.、2001年、Biomol. Eng.、18、57〜63頁）上のタンパク質の表面提示が記載されている。本発明のこの態様の特徴は、細胞壁に提示されているものが、抗原と同時に存在するアジュバント分子の２コピー以上を含むことである。この抗原は、アジュバント（Ｃ３ｄなど）と直接融合できるが、必ずしもその必要はない。
【００３２】
したがって、一実施形態では、細菌などの細胞の表面が、スキャフォールドとなり得る。アジュバントを通常細菌の表面上に発現される第２の成分と遺伝的に融合すると、そのアジュバントの複数コピーが細菌の表面上に提示される。これは、細菌が宿主に感染した場合に、細菌に対して向上した免疫応答を誘発させる効果がある。抗原は、細菌の細胞壁であってよく、または細菌の表面上に別々に、ただし同時に発現されていてよい。感染は、改変した細菌を宿主へ投与することにより、計画的であってよい。細菌は、死滅させた後、または生きているが弱毒化した形態で投与することができる。
【００３３】
同様に、真核細胞をスキャフォールドとして使用してもよい。このような場合には、２コピー以上のアジュバントを提示している細胞表面を使用して、他の（正常または異常な）細胞表面成分に対して免疫応答を誘発させることができる。
【００３４】
国際公開ＷＯ９６／１７６２５、（ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２８５１）に記載されている融合タンパク質とは対照的に、抗原とアジュバントの間には共有結合の必要が全くないか、あるいは共有結合は間接的にスキャフォールドによって仲介されているに過ぎない。さらに、国際公開ＷＯ  ９６／１７６２５では、Ｃ３ｄタンパク質の単一複製と抗原との融合により、その抗原に対する免疫応答が低減することが教示されている。本発明では、正反対に、アジュバントの複数の単一（単量体）コピーの提示、あるいはその後スキャフォールドと融合させる抗原の単一コピーとアジュバントの単一コピーを融合したものにより、抗原に対する免疫応答が増大する。
【００３５】
抗原は、細胞壁自体または第２のタンパク質または糖タンパク質であってよい。肺炎球菌（pneumococci）の場合のように、防御抗原が莢膜である生物の場合、アジュバントの２種以上の複製の提示により、莢膜抗原に対する免疫応答が改善される。
【００３６】
ウイルスの場合、抗原は、ウイルス自体であってよく、したがってそれは同時に抗原およびスキャフォールドとして作用する。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の例が示されている。組換えＨＢｓＡｇワクチンを調製する方法が米国特許第４７６９２３８号に記載されている。この組換えＨＢｓＡｇは、極めて有効なワクチンであるが、「反応性の低い応答者（poor responder）」である相当な数のワクチンレシピエントが残っている。この既存のワクチンに新しいアジュバントを加えると、こうした反応性の低い応答者のワクチン接種、およびこのウイルスの慢性保因者の感染後のワクチン接種が可能になる。このワクチンにアジュバントを加えることを想定した一方法は、アジュバントタンパク質、例えばおよび好ましくはヒトＣ３ｄタンパク質をコードする配列と、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質である２２６アミノ酸残基タンパク質をコードする遺伝子のＣ末端との遺伝的融合である。前記の米国特許第４７６９２３８号に記載されているプラスミドに存在するＳタンパク質コード配列を含み、好ましくは酵母中での高レベル発現に適したコドンを有する、アジュバントのコード配列を加えることができる。Ｓタンパク質の配列は、「逃避変異体（escape mutants）」として知られている変異体配列（Cooreman M. P.ら、2001年、J. Biomed. Sci. 8、237〜247頁）またはＢ型肝炎ワクチンで通常見られない抗原（Fomsgaard A.ら、1998年、Scand. J. Immunol.、47、289〜295頁）を含むように改変することができる。前記論文に記載されているように、Ｃ３ｄアジュバントを含む改変したワクチンは、免疫応答を得るためにＤＮＡとして投与することができる。
【００３７】
したがって別の実施形態では、ポリペプチドスキャフォールド自体が抗原であってよい。したがって、オリゴマー構造にアセンブリするＢ型肝炎ウイルスの表面抗原は、同時に本発明の第１および第３の成分であってよい。１９５６年（FHC Crick、JD Watson、Nature、177、473頁）に初めて述べられたように、ウイルスの核酸含有量は限られているので、ウイルスがコードできるアミノ酸の数が厳しく制限される。結果として、タンパク質膜は、極めて多数の異なるタンパク質分子から構築することはできない。その代わりに、規則的な状態に配列したいくつかの同一の小さなサブユニットから構築しなければならない。したがってほとんどのウイルスは、同時に本発明の第１および第３の成分の両方であり得る。
【００３８】
ポリペプチドスキャフォールドは、その機能がタンパク質自体または関連するタンパク質もしくは他の分子のグループの構造を決定することであるタンパク質、またはその一部である。したがってポリペプチドスキャフォールドは、アセンブリした場合に定義した三次元構造を有し、前記構造中または構造上に分子またはポリペプチドを支持する容量を有する。有利には、スキャフォールドは、スキャフォールドの三次元構造および／またはポリペプチドの挿入部位に関して種々の有効な幾何学的配置を想定する能力を有する。
【００３９】
別の実施形態では、スキャフォールドは、アジュバントとして働くことができ、すなわち第１および第２の成分が同一になる。アジュバントであるスキャフォールドは、本明細書でさらに詳細に記載したＣ４ｂｐコアタンパク質またはＣ４ｂｐα鎖のフラグメントであってよい。
【００４０】
一実施形態では、スキャフォールドは、コシャペロニンＣｐｎ１０／Ｈｓｐ１０スキャフォールドである。Ｃｐｎ１０は、Ｃｐｎ６０／Ｃｐｎ１０シャペロニン系の広範な成分である。Ｃｐｎ１０の例には、ヒトミトコンドリアＣｐｎ１０、細菌ＧｒｏＥＳおよびバクテリオファージＴ４  Ｇｐ３１がある。Ｃｐｎ１０ファミリーの他のメンバーは、当業者に周知である。
【００４１】
本発明はさらに、天然に存在するスキャフォールドの誘導体の使用を含む。スキャフォールドの誘導体（Ｃｐｎ１０および６０ファミリーのスキャフォールドを含む）は、本明細書に記載の「オリゴマー化」特性の維持の対象になる、アミノ酸欠失、付加または置換（特にＧｐ３１中のＣｙｓ残基の置換）、Ｃｐｎ１０またはＣｐｎ６０ファミリーの異なるメンバーおよび／または円順列タンパク質スキャフォールドの融合によって形成したハイブリッドを含んでいてもよいその変異体を含む。
【００４２】
ポリペプチドスキャフォールドは、アセンブリして多量体生成物を形成する。本発明において、多量体生成物は任意の形状であってよく、任意の数の個別のスキャフォールドユニットを含んでいてよい。
【００４３】
多量体生成物は、好ましくは２〜２０スキャフォールドユニット、有利には５〜１５ユニット、理想的には約１０ユニットを含む。Ｃｐｎ１０ファミリーメンバーのスキャフォールドは、７員環または環形の形状の７タンパク質ユニットを含む。したがって、多量体生成物は、７員環であると有利である。
【００４４】
Ｃｐｎ１０サブユニットは、それらの構造内に「可動ループ」をもつことが知られている。可動ループは、大腸菌ＧｒｏＥＳの配列のアミノ酸１５〜３４、好ましくはアミノ酸１６〜３３、およびＣｐｎ１０ファミリーの他のメンバー上の同じ位置に配置されている。Ｔ４  Ｇｐ３１の可動ループは、残基２２〜４５、有利には２３〜４４に配置されている。第２または第３の成分のポリペプチド配列は、Ｃｐｎ１０ファミリーポリペプチドの可動ループのすべてまたは一部を置換することによって挿入することができる。
【００４５】
ポリペプチドスキャフォールドがＣｐｎ１０ファミリーポリペプチドの場合、第２または第３の成分のポリペプチドはさらに、そのＮまたはＣ末端（その末端は天然または改変ＮまたはＣ末端であってよい）で、あるいはＣｐｎ１０ファミリーペプチドのルーフβヘアピンに相当する位置に取り込まれる。この位置は、バクテリオファージＴ４  Ｇｐ３１の位置５４〜６７、有利には５５〜６６、好ましくは５９〜６１または大腸菌ＧｒｏＥＳの位置４３〜６３、好ましくは４４〜６２、有利には５６〜５７に配置されている。
【００４６】
別の実施形態では、ポリペプチドスキャフォールドは、Ｃ４ｂｐタンパク質またはＣ４ｂｐコアタンパク質領域を保持するその一部であってよい。
【００４７】
ヒトＣ４結合タンパク質（ｈＣ４ｂｐ）は、生理活性分子の送達担体として多くの魅力的な特徴をもつ分子である。ヒトＣ４ｂｐは、ヒト補体系−その機能が侵入細胞の溶解、食細胞の活性化および系からの異物の除去の促進を含む免疫系タンパク質のグループに関与している。これは、この系のタンパク質、特にＣ４タンパク質の活性を調節する。構造的に、ｈＣ４ｂｐは、長い血清半減期および標的であるリンパ節に生理活性分子を送達する能力を有することが予想される、フレキシブルなジスルフィド結合された分子である。血清形態のｈＣ４ｂｐの分子量は、約５９０ｋＤである。還元ＳＤＳゲルでは、ｈＣ４ｂｐは、ジスルフィド結合した多量体タンパク質を示唆する約７０ｋＤにおける強いバンドが生成する。
【００４８】
Ｃ４ｂｐ単量体をコードするｃＤＮＡは、クローン化および特性決定されている［L. P. Chungら、（1985年）「Molecular Cloning and Characterization of the cDNA Coding for C4b-Binding Protein of the Classical Pathway of the Human Complement System」、Biochem. J.、230、133〜141頁］。Chungらは、ｈＣ４ｂｐを５４９アミノ酸のポリペプチドと称している。ＤＮＡ配列から予測したポリペプチドの分子量は、還元ＳＤＳゲルで実際に測定した７０ｋＤではなく、約６１．５ｋＤである。分子量の差は明らかに、血清形態のポリペプチドのグリコシル化によるものである。Chungらの配列のＮ末端から最初の４９１アミノ酸は、それぞれ約６０アミノ酸の短いコンセンサス反復領域（ＳＣＲ）と呼ばれる８個のドメインに分割することができる。これらの領域は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＳＣＲ８〜ＳＣＲ１と名付けられている。ＳＣＲドメインは、以下のように定義される。ＳＣＲ８−＋１〜＋６１；ＳＣＲ７−＋６２〜＋１２３；ＳＣＲ６−＋１２４〜＋１８７；ＳＣＲ５−＋１８８〜＋２４７；ＳＣＲ４−＋２４８〜＋３１３；ＳＣＲ３−＋３１４〜＋３７４；ＳＣＲ２−＋３７５〜＋４３２；ＳＣＲ１−＋４３３〜＋４９１。顕著な配列相同性を共有するこれらのドメインは、それぞれ４個の同様の位置にあるシステイン残基を含む。これらのシステイン残基は、規則的なパターンでドメイン内ジスルフィド結合を形成する［J. Janatovaら、（1989年）「Disulfide Bonds Are Localized Within the Short Consensus Repeat Units of Complement Regulatory Proteins：C4b-Binding Protein」、Biochemistry、28、4754〜4761頁］。各ＳＣＲドメイン内では、第１のシステイン基は第３と結合し、第２のシステイン残基は第４と結合して、二重ループアミノ酸配列を形成する。したがって、ＳＣＲは、糸状のビーズのように結合している。このドメイン内ジスルフィド結合のパターンが、Ｃ４ｂｐ単量体の立体構造の柔軟性をもたらす。８個のＳＣＲドメインの他に、ｈＣ４ｂｐはまた、Ｃ末端における５７アミノ酸配列、タンパク質のその他の領域に対して相同性がないＣ４ｂｐコアを有する。この領域は、分子の多量体へのアセンブリをもたらす。
【００４９】
したがってポリペプチドスキャフォールドは、Ｃ４ｂｐコアおよび任意選択でコアと融合した１種または複数のＳＣＲであってよい。
【００５０】
特に好ましい実施形態では、ポリペプチドスキャフォールドは、Ｃ４ｂｐα鎖のコアタンパク質である。
【００５１】
ポリペプチドスキャフォールドは、（Ｇｌｙｍ−Ｓｅｒ）ｎ（式中、ｍおよびｎは１〜４である）などフレキシブルなリンカーなどのＮまたはＣ末端延長部をさらに含んでいてよい。これらは、タンパク質ドメイン（特に抗体Ｖドメイン）を互いに結合するために当技術分野で使用されている。したがって第１の成分は、このようなリンカーによって第２および／または第３の成分と結合させることができる。
【００５２】
第１の成分は、Ｃ４ｂｐα鎖のコアタンパク質がスキャフォールドの場合に生成物のＣ末端にあることが好ましい。
【００５３】
Ｃ４ｂｐα鎖のコアタンパク質
これは、本明細書で「Ｃ４ｂｐコアタンパク質」または「コアタンパク質」、あるいは「Ｃ４ｂｐスキャフォールド」と称される。これらの用語は、同義で用いている。このタンパク質は、哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質または多量体を形成できるそのフラグメント、あるいは多量体を形成できるその合成変異体であってよい。
【００５４】
いくつかの哺乳動物Ｃ４ｂｐタンパク質の配列は、利用可能である。これらには、ヒトＣ４ｂｐコアタンパク質（配列番号１）がある。当技術分野で利用可能なヒトＣ４ｂｐコアタンパク質のいくつかの相同体がある。２種類の相同体：オルトログ（orthologue）およびパラログ（paralogue）がある。オルトログは、異なる生物の相同遺伝子として定義されており、すなわち遺伝子がそれらを生成した種分化事象と同時に発生した共通の祖先を共有する。パラログは、遺伝子、染色体またはゲノム重複に由来する同じ生物の相同遺伝子として定義されており、すなわち遺伝子の共通の祖先が最後の種分化事象に続いて生じている。
【００５５】
例えば、ＧｅｎＢａｎｋの調査から、ウサギ、ラット、マウスおよびウシ起源（それぞれ配列番号２〜５）を含む種の哺乳動物Ｃ４ｂｐコア相同体タンパク質が示唆される。パラログは、ブタ（ＡｐｏＲ）、モルモット（ＡＭ６７）およびマウス（ＺＰ３）で確認されており；それぞれ配列番号６〜８として示す。
【００５６】
配列番号１〜８の配列を図１に示す。８個すべての配列は高度の類似性を有しているが、Ｃ末端でより大きな程度の変異があることが見られる。他のＣ４ｂｐコアタンパク質は、ＢＬＡＳＴなどの一般に利用可能な調査プログラムを用いて、ＤＮＡまたはタンパク質配列のデータベースを調査することによって確認することができる。
【００５７】
所望の哺乳動物供給源由来のＣ４ｂｐタンパク質がデータベースで利用可能ではない場合、当技術分野でよく確立されている通常のクローニング方法を用いて得ることができる。基本的に、こうした技術は、重要な他の種由来のＣ４ｂｐコアタンパク質の配列を回収および決定するためのプローブとして利用可能なＣ４ｂｐコアタンパク質の１種をコードする核酸を用いることを含む。多種多様な技術、例えばｍＲＮＡの適当な供給源（例えば胚または活発に分裂している分化細胞または腫瘍細胞由来）を用いた、あるいは哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリ、例えば前述の供給源の１つからのｃＤＮＡライブラリを得ること、中〜高ストリンジェンシーの条件（例えば約５０℃〜約６０℃で０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）下での既知のＣ４ｂｐ核酸を用いた前記ライブラリのブロービング、およびその哺乳動物のＣ４ｂｐタンパク質のすべてまたは一部をコードするｃＤＮＡを回収することを含む方法による、遺伝子のＰＣＲ増幅およびクローニングがこれに利用可能である。部分ｃＤＮＡを得る場合、完全長コード配列は、プライマー延長技術によって決定することができる。
【００５８】
多量体を形成できるＣ４ｂｐコアタンパク質のフラグメントは、少なくとも４７アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含むことができる。多量体を形成するためのフラグメントの能力は、本発明による原核宿主細胞中でフラグメントを発現すること、および全５７アミノ酸Ｃ４ｂｐコアの多量体化をもたらす条件化でＣ４ｂｐフラグメントを回収すること、および多量体も形成するかどうか決定することによって試験することができる。Ｃ４ｂｐコアのフラグメントは、少なくとも配列番号１の残基６〜５２またはその相同体の対応する残基を含むことが望ましい。
【００５９】
配列番号１のヒトＣ４ｂｐコアタンパク質は、完全長Ｃ４ｂｐタンパク質配列のアミノ酸＋４９３〜＋５４９に対応する。多量体を形成するためのこの周知の当技術分野のフラグメントは、Ｃ４ｂｐコアタンパク質のアミノ酸＋４９８〜＋５４９に対応する。
【００６０】
（フラグメントについて上記に記載したように決定できる）多量体を形成する能力を同様に保持する、Ｃ４ｂｐコアおよび多量体を形成できるフラグメントの変異体も使用することができる。変異体は、野生型哺乳動物Ｃ４ｂｐコアまたはその多量体形成フラグメントに対して、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％または最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するはずである。一態様では、Ｃ４ｂｐコアは、配列番号１〜３および５〜８の位置６および１８に現れる２個のシステイン残基を含むコアであるはずである。変異体は、これら２個の残基の間に相対的なスペーシングを保持することが望ましい。
【００６１】
上記で特定した同一性の程度は、配列番号１〜８またはその多量体形成フラグメントのいずれか１つに対してである。
【００６２】
特定した同一性の程度が、配列番号１またはその多量体形成フラグメントに対してであることが最も好ましい。
【００６３】
配列同一性の程度は、アルゴリズムＧＡＰ、当技術分野で広く使用されておりＡｃｃｅｌｒｙｓ（旧Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から入手可能なアルゴリズムの「Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ｐａｃｋａｇｅ」の一部によって決定することができる。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて、２つの完全配列を、適合数が最大になり、ギャップ数が最少になる方法で整列させる。ＧＡＰは、長さがよく似た短い密接に関係する配列の整列化に有用であり、したがって配列が上記の同一性レベルを満たす場合の決定に適している。ＧＡＰは、デフォルトパラメーターを用いて使用することができる。
【００６４】
哺乳動物Ｃ４ｂｐコアタンパク質の合成変異体には、ＣまたはＮ末端への１種または複数のアミノ酸置換、欠失または挿入または付加があるものが含まれる。置換が特に想定される。置換には、保存的置換が含まれる。保存的置換の例には、以下の表に示すものがあり、２列目の同じブロック、好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸が互いに置換され得る。
【表１】
2006505252.tif 000002
【００６５】
作製でき、多量体を形成するそれらの能力について試験できるＣ４ｂｐコアタンパク質のフラグメントおよび変異体の例には、このように以下の表１に示す配列番号９〜１６がある。
【表２】
2006505252.tif 000003
【００６６】
ＮまたはＣ末端切断の他に配列の欠失ができる場合、これらは、隣接または非隣接し得る１以下、２または３つの欠失に制限されるはずである。
【００６７】
挿入、またはコアタンパク質配列へのＮもしくはＣ末端延長が行われる場合、これらも、コアタンパク質のサイズは、野生型配列の長さを２０アミノ酸超、好ましくは１５アミノ酸超、より好ましくは１０アミノ酸超でないように、制限されることが望ましいだろう。したがって配列番号１の場合、コアタンパク質を挿入または伸長によって改変すると、長さが７７アミノ酸以下になることが望ましい。
【００６８】
第２の成分
本発明の生成物は、直接または間接的に第２の成分と、かつ第３の成分と結合した上記のスキャフォールドを含む。
【００６９】
第２の成分は、その内容が参照によりここに取り込まれているUS-A-6238670、および国際公開ＷＯ  ９９／３５２６０に記載のように、ＣＤ２１またはＣＤ１９に対する任意のリガンドであってよい。第２の成分はまた、Ｂ細胞、Ｔ細胞、瀘胞樹状または他の抗原提示細胞の細胞表面分子であってもよい。
【００７０】
第２の成分は、Ｃ３ｄ、特にヒトＣ３ｄであることが好ましい。
【００７１】
マウスＣ３ｄのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列は、Domdeyら（1982年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：7619〜7623頁およびFeyら（1983年）Ann. N.Y. Acad. Sci. 421：307〜312頁）に開示されている。ヒトＣ３ｄのヌクレオチド配列および予想アミノ酸配列は、de BruijnおよびFey（1985年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：708〜712頁に開示されている。他の種由来のＣ３ｄをコードする核酸は、ヒトまたはマウス配列情報を用いて単離して、標準ハイブリダイゼーション法で使用する１種または複数のプローブを調製することができる。Ｃ３ｄを本発明で使用し、対象に投与すべき場合、Ｃ３ｄを免疫感作させる種と適合させることができる（例えばマウスＣ３ｄをマウス、ヒトＣ３ｄをヒトに使用するなど）。さらに、選択したコドンも、例えば哺乳動物宿主で効率的に翻訳されるコドンを用いて、免疫感作させる種に対して最適化することができる。
【００７２】
第２の成分が第１および／または第３の成分とペプチドリンカーによって結合している場合、リンカーは、上記の柔軟なリンカーであってよい。
【００７３】
好ましい実施形態では、スキャフォールドがＣ４ｂｐコアタンパク質の場合第２の成分は、第１の成分に対するＮ末端であり、抗原に対するＣ末端である（この場合抗原はポリペプチドである）。ポリペプチドが抗原でない場合、抗原は、第１または第２の成分のどちらかと共有結合していてよい。
【００７４】
抗原
抗原は、予防有用性がある任意の生成物であってよく；それらはワクチン接種に有用な可能性がある。本発明は、ヌクレオチド配列から多価形態のアジュバントに結合した組換え抗原の生成への急速な進行を可能にする。
【００７５】
細菌免疫原、寄生虫免疫原およびウイルス免疫原は、ワクチンとして有用な多量体または異種多量体Ｃ４ｂｐ融合タンパク質を作成するためのポリペプチド部分として有用である。
【００７６】
これらの免疫原の細菌供給源には、細菌性肺炎、ニューモシスティス肺炎、髄膜炎、コレラ、破傷風、結核およびライ病を引き起こすものが含まれる。  
寄生虫供給源には、プラスモディウム（Plasmodium）などのマラリア原虫が含まれる。
【００７７】
ウイルス供給源には、ポックスウイルス、例えば、牛痘ウイルスおよびオルフウイルス；ヘルペスウイルス、例えば、単純疱疹ウイルス１型および２型、Ｂ−ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、およびエプスタイン−バーウイルス；アデノウイルス、例えば、マストアデノウイルス；パポバウイルス、例えば、ＨＰＶ１６などの乳頭腫ウイルス、およびＢＫおよびＪＣウイルスなどのポリオーマウイルス；パルボウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルス；レオウイルス、例えば、レオウイルス１、２および３；オルビウイルス、例えば、コロラドダニ熱；ロタウイルス、例えば、ヒトロタウイルス；アルファウイルス、例えば、東部脳炎ウイルスおよびベネズエラ脳炎ウイルス；ルビウイルス、例えば、風疹；フラビウイルス、例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス；コロナウイルス、例えば、ヒトコロナウイルス；パラミクソウイルス、例えば、パラインフルエンザ１、２、３および４ならびに流行性耳下腺炎；麻疹ウイルス、例えば、麻疹ウイルス；肺炎ウイルス、例えば、呼吸合包体ウイルス；ベシクロウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルス；リッサウイルス、例えば、狂犬病ウイルス；オルソミクソウイルス、例えば、インフルエンザＡ型およびＢ型；ブンヤウイルス、例えば、ラクロスウイルス；フレボウイルス、例えば、リフトバレー熱ウイルス；ナイロウイルス、例えば、コンゴ出血熱ウイルス；ヘパドナウイルス科、例えば、Ｂ型肝炎；アレナウイルス、例えば、１ｃｍウイルス、ラッソウイルス、およびフニンウイルス；レトロウイルス、例えば、ＨＴＬＶ  Ｉ、ＨＴＬＶ  II、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２；エンテロウイルス、例えば、ポリオウイルス１、２および３、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ヒトエンテロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、およびノーウォーク−ウイルス；ライノウイルス、例えば、ヒトライノウイルス；およびフィロウイルス科、例えば、マールブルグ（病）ウイルスおよびエボラウイルスが含まれる。
【００７８】
これらの細菌、ウイルスおよび寄生虫供給源由来の抗原は、ワクチンとして有用な多量体タンパク質の生成に使用することができる。多量体は、異なる抗原を保有する単量体の混合物を含んでいてよい。
【００７９】
研究または治療目的のヒトタンパク質に対する免疫原を作製することができる。これらは、ワクチン接種だけでなく研究に対しても多くの応用例がある。例えば、ヒトゲノム計画によるヒト遺伝子配列情報の生成により、新しいポリペプチドによく反応する抗血清の生成が緊急の要件となっている。同じ要件が、細菌などの原核、および真菌を含む他の真核遺伝子生成物に適用される。
【００８０】
非ポリペプチド免疫原は、例えば、炭水化物または核酸であってよい。ナイセリア（Neisseria）種または肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）種の多糖類外皮は、本発明において使用できる炭水化物の例である。
【００８１】
抗原は、ワクチンに関して当技術分野で通常の小さいポリペプチドからより大きいタンパク質の間の任意のサイズであってよい。本発明の性質により、１００ｋＤａ以下、より好ましくは５０ｋＤａ以下、例えば３０ｋＤａ以下のサイズの抗原が好ましい。
【００８２】
非ポリペプチド免疫原が本発明の生成物の一部である場合、免疫原は、通常の合成方法を用いて生成物の第１および第２の成分と共有結合させることができる。一般に、免疫原は、第１および第２の成分を含む融合タンパク質のＮもしくはＣ末端のいずれか、またはアミノ酸側鎖基（例えばリジンのε−アミノ基）、またはその組合せと結合させることができる。融合タンパク質１個当り２種以上の免疫原を加えることができる。カップリングを容易にするために、例えばＣ末端としてシステイン残基を融合タンパク質に加えてもよい。
【００８３】
本発明には、免疫応答の生成において多くの利点がある。例えば、多量体の使用により、いくつかの抗原の免疫系への提示が同時に可能になる。このことにより、単一生物またはいくつかの異なる生物で存在し得る２種以上のエピトープに対して免疫応答を生じ得る多価ワクチンの調製が可能になる。したがって、本発明によって形成したワクチンは、２種以上の疾患に対する同時ワクチン接種、または所与の病原体上の複数のエピトープを同時に標的にするために使用することができる。エピトープは、単一単量体ユニットで、または異種多量体をもたらすために合わせた異なる単量体ユニット上で存在することができる。
【００８４】
ヒトＣ４ｂｐコア融合タンパク質またはヒトＣｐｎ１０融合タンパク質は特に、コアタンパク質およびヒトＣｐｎ１０が免疫化のレシピエントの血清または血漿中に通常存在するだけでなく、さらにそれら自体が免疫応答を誘発しないため、免疫化において有用である。Ｃ４ｂｐタンパク質は、いくつかの哺乳動物種で周知であり、哺乳動物種に適切な相同体は、標準的な遺伝子クローニング技術を用いて当業者によって発見され得る。
【００８５】
核酸
本発明の生成物は、タンパク質をコードする核酸構築体を用いて、原核または真核宿主細胞中で少なくとも第１および第２の成分の融合タンパク質を発現させることによって生成することができる。第３の成分がポリペプチドの場合、核酸配列からの３つすべての成分の発現を利用して本発明の生成物を生成することができる。
【００８６】
したがって本発明は、本発明の生成物をコードする核酸構築体、一般にＤＮＡまたはＲＮＡを提供する。
【００８７】
一般に構築体は、タンパク質をコードする配列が、所望の宿主細胞におけるタンパク質の発現に適したプロモーターに機能しうる態様で連結した、複製可能なベクターの形態である。
【００８８】
ベクターは、複製開始点および場合によってプロモーターの制御因子を含んでいてよい。ベクターは、１種または複数の選択マーカー遺伝子を含有していてよい。当技術分野でそのように知られている原核および真核発現ベクターが多種多様にあり、本発明は、当業者の個々の選択による任意のベクターを利用することができる。
【００８９】
多種多様な原核宿主細胞を本発明の方法で使用することができる。これらの宿主には、エシェリヒア（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、バチルス（Bacillus）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、好熱性細菌（Thermophilus）、サルモネラ（Salmonella）、腸内細菌（Enterobacteriacae）またはストレプトマイセス（Streptomyces）の菌株が含まれる。例えば、エシェリヒア属の大腸菌（E. coli）を本発明の方法で使用する場合、使用するのに好ましいこの細菌の菌株には、国際公開ＷＯ  ９８／０２５５９に記載されており、かつ利用可能である、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＣ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）またはＣＯ２１４（ＤＥ３）を含むそれらの誘導体が含まれる。
【００９０】
さらにより好ましくは、プロモーターがＴ７プロモーターでない場合、プロファージＤＥ３を欠くこれらの菌株の誘導体を使用することができる。
【００９１】
原核ベクターには、ベクター細菌プラスミド、例えば、ＣｏｌＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９を含む大腸菌由来のプラスミド、およびそれらの誘導体、より広い宿主域プラスミド、例えば、ＲＰ４；ファージＤＮＡ、例えば、ファージＡの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、ならびに他のＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３および線状１本鎖ＤＮＡファージがある。これらおよび他のベクターは、プロモーターと動作可能に連結した本発明の核酸を導入するために標準的な組換えＤＮＡ法を用いて操作することができる。
【００９２】
プロモーターは、誘発性プロモーターであってよい。適当なプロモーターには、Ｔ７プロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λプロモーターＰＬまたはＰＲおよび当業者によく知られている他のプロモーターがある。
【００９３】
例えば酵母、昆虫および哺乳動物細胞を含む多種多様な真核宿主細胞を使用することもできる。哺乳動物細胞には、ＣＨＯおよびマウス細胞、ＣＯＳ−１などのアフリカミドリザル細胞、およびヒト細胞が含まれる。
【００９４】
タンパク質の発現に適した多くの真核ベクターが知られている。これらのベクターは、真核細胞ゲノム中に染色体が組み込まれるように、または染色体外に維持されるように、または真核細胞中で一過的にだけ維持されるように設計することができる。核酸は、ＣＭＶプロモーターを含む強力なウイルスプロモーター、およびＳＶ４０  Ｔ抗原プロモーターまたはレトロウイルスＬＴＲなどの適当なプロモーターと動作可能に連結させることができる。
【００９５】
本発明の生成物を得るために、本発明のベクターを保有する宿主細胞は、タンパク質の発現に適した条件下で培養し、タンパク質を培地中の細胞から回収することができる。
【００９６】
組成物
本発明による生成物は、薬剤組成物の形態で調製することができる。生成物は、１種または複数の薬剤として許容される担体または希釈剤と一緒に存在することになる。組成物は、生成物の所定の使用および投与経路に基づいて調製することになる。したがって、本発明は、多量体形態の本発明の生成物を１種または複数の薬剤として許容される担体または希釈剤と一緒に含む組成物およびヒトまたは動物対象を治療または予防するための免疫療法におけるこのような組成物の使用を提供する。
【００９７】
薬剤として許容される担体または希釈剤には、経口、直腸、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）投与に適した製剤で使用するものが含まれる。製剤は、好適には単位剤形で存在することができ、薬学の分野でよく知られている方法のいずれかによって調製することができる。
【００９８】
薬剤として投与可能な液体組成物は、例えば、本発明の融合タンパク質および任意選択の薬剤アジュバントを、例えば、水、ブドウ糖添加生理食塩水、グリセリン、エタノールなどの担体中に溶解、分散などをさせて、液剤または懸濁剤とすることにより調製することができる。必要に応じて、投与すべき組成物に、ｐＨ緩衝剤などの物質を付加してもよい。こうした剤形を調製する実際の方法は、当業者に周知であるか、または明らかなはずである；例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、第19版、1995年を参照のこと。
【００９９】
投与すべき組成物または製剤は、いずれにしても、ある量の活性化合物を、治療対象の症状を緩和するのに有効な量で含有することになる。無毒性担体から構成したバランスで有効成分を０．２５〜９５％の範囲で含有する剤形または組成物を調製することができる。
【０１００】
非経口投与は、皮下、筋肉内または静脈内注射によって一般に特徴付けられる。注射剤は、液状の液剤または懸濁剤、注射前に液体に溶かす液剤または懸濁剤に適した固形形態、あるいは乳剤として、従来形態で調製することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどである。つい最近考案された非経口投与の手法は、一定レベルの投与量が維持されるような、緩徐な放出または徐放システムの埋め込みを行う。例えば、米国特許第３７１０７９５号を参照のこと。
【０１０１】
生成物の投与量は、抗原の性質によって決まるはずであり、従来のワクチン製剤中の抗原を投与するための現在の方法によって決定することができる。
【０１０２】
ＤＮＡワクチン
別の態様では、本発明は、ヒトまたは動物の身体の治療に使用するための、本発明の三成分生成物を含む組換え融合タンパク質をコードする核酸配列を含む真核発現ベクターを提供する。
【０１０３】
こうした治療は、免疫応答を高める目的における抗原をコードする核酸配列の導入によって、その治療効果を得るはずである。核酸の送達は、プラスミドベクター（「裸」または調製形態の）または組換え発現ベクターを用いて実現することができる。プラスミドベクターを用いて本発明をどのようにして実施するのかを例示するためには、Green T.D、ら、2001年、in Vaccine 20、242〜248頁の刊行物が例となる。これらの著者らは、麻疹赤血球凝集素タンパク質と３コピーのＣ３ｄの融合体を発現するＤＮＡワクチンを用いて、中和抗体の抗体価が増大したことを示した。本発明では、Ｃ３ｄの第２および第３のコピーは、Ｃ４ｂｐα鎖コアをコードする配列と置換し、オリゴマー抗原−アジュバント融合タンパク質をもたらすことになる。このプラスミドは、サイズがより小さく（コアコード配列がＣ３ｄの２個の複製をコードするものよりもはるかに短いため）、反復配列がないためより安定である。
【０１０４】
遺伝子送達に利用できる様々なウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアまたはレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスがある。レトロウイルスベクターは、ネズミまたはトリレトロウイルスの誘導体であってよい。単一外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、それだけには限らないが：モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーネズミ肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）がある。対象がヒトの場合、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）などのベクターを利用することができる。
【０１０５】
ベクターには、転写制御配列、特にＲＮＡ合成の開始を指示するに足るプロモーター領域が含まれるはずである。適当な真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Hamerら、1982年、J. Molec. Appl. Genet. 1：273頁）；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（McKnight、1982年、Cell 31：355頁）；ＳＶ４０初期プロモーター（Benoistら、1981年、Nature 290：304頁）；ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Gormanら、1982年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79：6777頁）；およびサイトメガロウイルスプロモーター（Foeckingら、1980年、Gene 45：101頁）がある。
【０１０６】
プラスミドベクターまたはウイルスベクターの一部としての本発明のこの態様のベクターの対象への投与は、多くの異なる経路によって影響を与えることができる。プラスミドＤＮＡは、「裸」または陽イオン性および中性脂質（リポソーム）を用いて調製でき、あるいは直接または間接送達のためにマイクロカプセル化することができる。ＤＮＡ配列は、直接または間接送達に使用できるウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）ベクター内に含めることもできる。送達経路には、それだけには限らないが、筋肉内、皮内（Sato、Y.ら、1996年、Science 273：352〜354頁）、静脈内、動脈内、髄腔内、肝臓内、吸入、膣内点滴注入（Bagarazziら、1997年、J Med. Primatol. 26：27頁）、直腸内、腫瘍内または腹膜内がある。
【０１０７】
したがって本発明は、治療用ポリペプチドが発現され、治療効果を有することになるように、すなわち抗原に対して免疫応答を誘発するために、本明細書に記載のベクターを、ＤＮＡベクターを用いたいくつかの細胞のトランスフェクションを可能にするのに有用な薬剤組成物として含む。本発明による薬剤組成物は、溶媒、担体、送達系、賦形剤、および添加剤または佐剤を用いて、本発明による構築体を対象への投与に適した形にすることによって調製する。しばしば使用される溶媒には、滅菌水および生理食塩水（緩衝したまたはしていない）がある。１種の担体は、微粒子銃（すなわち、ガス圧下）で送達する金粒子を含む。しばしば使用される他の担体または送達系には、送達カプセル内に封入、または食品中に取り込んだ、液剤として投与できる陽イオン性リポソーム、コキレート（cochleate）およびマイクロカプセルがある。
【０１０８】
遺伝子送達ベクターを投与するための代替製剤にはリポソームが必要である。リポソームカプセル化により、ポリヌクレオチドおよび発現ベクターを投与するための代替製剤が得られる。リポソームは、水性コンパートメントを包んでいる１種または複数の脂質二重層からなる微細な小胞である。一般に、Bakker-Woudenbergら、1993年、Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12（増刊1）：S61頁、およびKim、1993年、Drugs 46：618頁を参照のこと。リポソームは、組成が細胞性膜と類似しており、その結果、リポソームは、安全に投与でき、生分解性である。調製方法に応じて、リポソームは、単層または多重膜であってよく、リポソームは、直径０．０２μＭ〜１０μＭ超でサイズが異なっていてよい。例えば、Machyら、1987年、LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY（John Libbey）、およびOstroら、1989年、American J. Hosp. Phann. 46：1576頁を参照のこと。
【０１０９】
発現ベクターは、標準的な方法を用いてリポソーム内にカプセル化することができる。合成するための種々の異なるリポソーム組成物および方法は、当業者に周知である。例えば、すべてが参照によりここに取り込まれるUS-A-4844904、US-A5000959、US-A-4863740、US-A-5589466、US-A-5580859、およびUS-A-4975282、を参照のこと。
【０１１０】
一般に、投与したリポソームカプセル化ベクターの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な病状およびこれまでの病歴などの要因によってことなる。特定の製剤の用量範囲は、適当な動物モデルを用いることによって決定することができる。
【０１１１】
細胞培養
本発明による融合タンパク質をコードするプラスミドは、従来の形質転換技術を用いて宿主細胞中に導入でき、この細胞を融合タンパク質の生成を容易にするための条件下で培養することができる。誘発性プロモーターを使用する場合、細胞を最初に誘導物質の不在下で培養し、次いで細胞がより高密度で増殖した後、誘導物質を加えてタンパク質の回収を最大にすることができる。
【０１１２】
細胞培養条件は、当技術分野で広く知られており、そのように周知の手順によって使用することができる。
【０１１３】
特定の態様では、第１の成分がＣ４ｂｐコアタンパク質の場合、少なくとも最初に２つの成分、および該当する場合、３つすべての成分の融合が原核生物発現系で発現され得る。これまで、Ｃ４ｂｐコアタンパク質に基づく融合タンパク質は、真核細胞中で発現されてきた。真核細胞からの融合タンパク質の収量は、培養上清１ミリリットル当り２マイクログラムにめったに到達せず（Oudinら、前掲書）、何回もの遺伝子増幅後に初めて達成できる。このレベルは、治療用途のための大量の多くの融合タンパク質を経済的に生成させるためには低すぎる。
【０１１４】
国際公開ＷＯ  ９１／００５６７では、原核宿主細胞がＣ４ｂｐ系タンパク質の生成に使用できることが示唆されているが、任意のこうした生成の実験的実証はない。しかし、いくつかの考察から、原核生物系の使用が不利であることが示唆されている。特に、多くの真核生物タンパク質は、大腸菌などの細胞中で発現されると、それらの活性な折りたたみ構造の一部または全部を失う。他の真核生物タンパク質は、原核細胞で発現されると変性するか、または完全に不活性である。
【０１１５】
Ｃ４ｂｐは、哺乳動物中の分泌タンパク質であり、これらは原核生物中で正確に折りたたまれた形態で生成するのが特に困難であることが当技術分野で周知である。ジスルフィド架橋を有するタンパク質は、オリゴマー化を必要とするものと同様に特に問題である。ジスルフィド結合は、細菌細胞質の還元環境では通常生成されず、それらが形成できる場合、それらはタンパク質の誤って折りたたまれたまたは凝集した形態を安定化させることができる。
【０１１６】
通常、原核生物中で発現される組換えタンパク質は、宿主原核細胞内の封入体の内部で凝集している。これらは、別々の粒子または通常凝集または不活性形態の発現タンパク質を含む残りの細胞から分離した小球である。封入体中に発現タンパク質が存在すると、必要なリフォールディング技術が非効率で高価なので、活性可溶性形態のタンパク質を回収するのが難しくなる。封入体から精製したタンパク質は、比較的不十分な収量で活性な機能性タンパク質を得るのに、苦労して操作し、変性し、かつリフォールドしなければならない。
【０１１７】
原核細胞中でＣ４ｂｐコア融合タンパク質を発現させることについて、他の考察も考慮に入れなければならない。第１に、各コア単量体は、２個のシステイン残基を保持し、当技術分野で許容されるＣ４ｂｐ多量体のモデルに基づいて、これらのシステインは、多量体のアセンブリ中に分子間ジスルフィド結合を形成する必要がある。細菌細胞質ゾルなどの原核細胞質ゾルの還元環境は、これらのジスルフィド結合を還元することによってＣ４ｂｐコア多量体の形成を抑制することが予想される。
【０１１８】
第２に、多量体は、原核生物中で利用できない方法（例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼおよび特異的なシャペロンの存在）でタンパク質フォールディングを助けることが知られている真核生物分泌装置を通過中にアセンブリする。第３に、真核細胞で比較的少ない収量（１ミリリットル当り数マイクログラム）が得られた条件下でも、この分泌経路は、相同タンパク質を生成することができない。
【０１１９】
さらに、発明者らは、原核生物発現系で生成したＣ４ｂｐコアと融合したタンパク質は、それらの機能活性を保持していることも見出した。したがって、本発明は、Ｃ４ｂｐα鎖のＣ末端コアタンパク質のスキャフォールドおよび第２の成分、および任意選択で第３の成分を含む、原核宿主細胞の細胞質ゾル中で可溶性形態の多量体を形成できる組換え融合タンパク質を得る方法であって、前記組換え融合タンパク質は,、原核宿主細胞の細胞質ゾル中で多量体を可溶性形態で形成することができ、
（ｉ）前記原核細胞中で機能的なプロモーターと動作可能に連結した前記組換えタンパク質をコードする核酸を保有する原核宿主細胞を得るステップ；
（ii）前記組換えタンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養するステップ；および
（iii）前記タンパク質が多量体形態で回収される組換えタンパク質を回収するステップ
を含む方法を提供する。
【０１２０】
本発明者らは、本発明の細胞培養物中のタンパク質の収量が、比較的高い、例えば培養物５ｍｇ／ｌを超えるなど培養物２ｍｇ／ｌ超、好ましくは培養物２０ｍｇ／ｌを超えるなど培養物１０ｍｇ／ｌ超、さらにより好ましくは培養物１００ｍｇ／ｌ超となりうることを見出した。
【０１２１】
本発明のＣ４ｂｐコア融合タンパク質は、本発明のその他の成分の１つとＮまたはＣ末端で融合したＣ４ｂｐコアタンパク質配列を含む。好ましい配列では、融合タンパク質のＮからＣ末端の成分の順序は、Ｎ−第３の成分−第２の成分−第１の成分−Ｃである。
【０１２２】
本発明者らは、上記定義に含まれるタンパク質は、スキャフォールドリフォールディングの必要なしに多量体形態の細菌発現系で発現され、かつそれらから回収できることを見出した。本発明者らは、Ｃ４ｂｐコアを含み、抗原および単量体質量が約３０ｋＤａ以下の第２の成分を保有できるタンパク質を発現させた。したがって、本発明は、このサイズ範囲のタンパク質、より一般には約１００ｋＤａ以下、より好ましくは約５０ｋＤａのタンパク質を発現するのに使用することができる。
【０１２３】
この系によって大腸菌中での可溶性タンパク質の生成が可能になるという事実は、それを用いて、折りたたまれた可溶性タンパク質のように、それらのＣ末端および／またはＮ末端での束縛がないことによって単独で発現された場合に折りたたまれないタンパク質のドメインまたはフラグメントの生成を可能にする。特定の切断部位の操作により、所定の独立したドメインの生成が可能になる。同様に束縛する対象のペプチドのＮ末端および／またはＣ末端は、リフォールディングプロセス中は有益であり得る。さらに、オリゴマー化構造が変性および分解に対して極めて強いので、挿入タンパク質の変性中に安定であるはずである。したがって、リフォールディング中、等量の対象のタンパク質では、遊離タンパク質の実際の濃度は、オリゴマー化数と同じ数の逆数だけ減少するはずである。タンパク質技術における多くの方法がタンパク質、特に極めて低分子量のペプチドと働くように最適化されていないので、オリゴマー化はまた、精製の目的でも有益であり得る。
【０１２４】
培養物からのタンパク質の回収
細胞を増殖させてタンパク質の産生を可能にした後、タンパク質を細胞から回収することができる。驚くべきことに、本発明者らは、タンパク質が可溶性のままであることを見出したので、細胞は、通常、遠心され、例えば、タンパク質画分を可溶性なままにし、さらなるより高速（例えば１時間１５，０００ｒｐｍ）の遠心分離の後にこの画分が上清中に留まるようにする超音波処理によって溶解させる。
【０１２５】
上清タンパク質画分中の融合タンパク質は、標準的なタンパク質クロマトグラフィー技術の任意の適当な組合せによってさらに精製することができる。本発明者らは、イオン交換クロマトグラフィー、続いてゲルろ過クロマトグラフィーを使用した。親和性クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフ技術も使用することができる。
【０１２６】
一実施形態では、本発明者らは、溶解物の遠心分離後またはその他の精製ステップのいずれかの後に上清試料を加熱すると、タンパク質の回収が助けられることを見出した。試料は、約７０〜８０℃まで約１０〜３０分間加熱することができるが、第２の成分がＣ３ｄの場合には、この実施形態は好ましくない。
【０１２７】
タンパク質の所定の使用に応じて、タンパク質をさらなる精製ステップ、例えば透析、または濃縮ステップ、例えば凍結乾燥にかけることができる。
【実施例】
【０１２８】
本発明を以下の実施例によって例示する。
【０１２９】
実施例１−エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質
この実施例は、エピトープ（ヒトＣｐｎ１０のアミノ酸８〜２２番目を含む）と、それ自体がヒトＣ４ｂｐコアタンパク質のＮ末端に融合しているヒトＣ３ｄとの融合を例示する。この融合タンパク質は、細菌株Ｃ４１（ＤＥ３）中で発現させ、それから精製した。このタンパク質は、ゲルろ過においてオリゴマーとして作用した。
【０１３０】
この実施例で例示した方法は、例えばＣｐｎ１０エピトープを以下に記載した構築体の他の抗原コードＤＮＡと置換することによって、本発明の３つの成分生成物を生成することにも適用できる。あるいは、回収したタンパク質は、他の手段によって得た抗原と共有結合させてもよい。
【０１３１】
クローニング
ｐＡＶＤ９５（以下の実施例２のＣ３ｄ７（１）用の発現構築体）由来の９７５ｂｐのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（Ｔ７リボソーム結合部位、ヒトＣｐｎ１０の残基８〜２２（エピトープ）およびヒトＣ３ｄの残基９９５〜１２８７をコードしている）を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩであらかじめ消化したｐＡＶＤ７７（ｐＲＳＥＴａ−Ｄｂ−Ｃ４ｂｐ）に連結した。これは、ヒトＣｐｎ１０およびＣ３ｄタンパク質フラグメントをヒトＣ４ｂｐのα鎖のＣ末端５７残基と融合した。このｐＡＶＤ９４と呼ばれる構築体を、ＰＣＲおよび二重消化によってチェックした。
【０１３２】
この構築体の融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下の通りである：
MKFLPLFDRV LVERSAGSVD AERLKHLIVT PSGSGEQNMI GMTPTVIAVH 
YLDETEQWEK FGLEKRQGAL ELIKKGYTQQ LAFRQPSSAF AAFVKRAPST 
WLTAYVVKVF SLAVNLIAID SQVLCGAVKW LILEKQKPDG VFQEDAPVIH 
QEMIGGLRNN NEKDMALTAF VLISLQEARD ICEEQVNSLP GSITKAGDFL 
EANYMNLQRS YTVAIAGYAL AQMGRLKGPL LNKFLTTAKD KNRWEDPGKQ 
LYNVEATSYA LLALLQLKDF DFVPPVVRWL NEQRYYGGGY GSTQATFMVF 
QALAQYQKDA PGSETPEGCE QVLTGKRLMQ CLPNPEDVKM ALEVYKLSLE 
IEQLELQRDS ARQSTLDKEL（配列番号１７）。
【０１３３】
配列番号１７の残基２〜１６はヒトＣｐｎ１０（エピトープ）の残基８〜２２に、配列番号１７の残基１９〜３１１はヒトＣ３ｄ残基９９５〜１２８７に、配列番号１７の残基３１４〜３７０はヒトＣ４ｂｐコアタンパク質の５７個の残基に対応する。上記の配列で太字のＧＳリンカー配列は、３つの成分の間に現れる。
【０１３４】
このタンパク質は、推定分子量が４１，４８５ダルトン、理論上のｐＩが５．５１、かつ推定消衰係数が４５０９０Ｍ−１ｃｍ−１である。これに基づき、濃度を計算するために、Ａｂｓ  ０，１％（＝１ｇ／ｌ）＝１．０８７を使用する。
【０１３５】
発現
エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐコアタンパク質をコードするプラスミドｐＡＶＤ９４を大腸菌株Ｃ４１（ＤＥ３）中で発現させた。誘導せずに２５℃で終夜増殖させた後、タンパク質は十分に発現した。フレンチプレスを用いて２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８／１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で細胞溶解した後、タンパク質のほぼ半分が上清中に存在することが判明した。
【０１３６】
Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐの精製
３つの精製ステップ：陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラムおよびゲルろ過カラムを用いて、エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐの可溶性画分を培養物１リットルから精製した。
【０１３７】
陰イオンカラム（Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １６／１０）
このカラムは、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８／１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で平衡化した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８／１００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）から２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８／１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の２０倍カラム容積の勾配を用いてタンパク質を溶出した。タンパク質は、約３５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
【０１３８】
エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐを含むＭｏｎｏ  Ｑ画分を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７／１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析してから陽イオンカラムに導入した。
【０１３９】
陽イオンカラム（Ｍｏｎｏ  Ｓ  ＨＲ  １０／１０）
エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐを含むカラムＭｏｎｏ  Ｑ後の画分を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７／１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて平衡化した陽イオンカラム（Ｍｏｎｏ  Ｓ  ＨＲ   １０／１０）に導入した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７／１００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ａ）から２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７／１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）の２０カラム体積の勾配を用いてタンパク質を溶出した。タンパク質は、約３５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
【０１４０】
主要な混入物（＞６６Ｋｄａ）を含まないエピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐを含む画分をプールし、濃縮しゲルろ過カラムに導入した。
【０１４１】
ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０調製グレード）
エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐを含むＭｏｎｏ  Ｓカラムから得た画分を、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ  ｐＨ７．４／１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０調製グレード）に導入した。タンパク質を緩衝液１５２．６９ｍｌで溶出したところ、きれいな対称ピークが得られた。この溶出体積は、タンパク質がオリゴマーであることを示す。カラム後、タンパク質濃度は、０．４５ｍｇ／ｍｌであった。タンパク質を１．５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１０％グリセリンを用いて−７０℃で保存した。タンパク質は、少なくとも９０％純粋であった。
【０１４２】
実施例２−ヒトＣｐｎ１０の可動ループへのヒトＣ３ｄ分子の挿入（Ｃ３ｄ７）
この実施例は、３つの類似したＣ３ｄ７構築体の可溶性部分の精製および２５℃におけるそれらの発現について記載する。
【０１４３】
Ｃ３ｄ７（１）
ヒトＣｐｎ１０の可動ループ（そのＮ末端で切断されている）と置換したヒトＣ３ｄおよびＣ末端ｍｙｃタグエピトープをアミノ酸配列配列番号１８と一緒に含む、４２．８５ｋＤａの３部からなる融合タンパク質を、２５℃で大腸菌株Ｃ４１（ＤＥ３）中のプラスミドｐＡＶＤ９５から発現させた。
【０１４４】
MKFLPLFDRV LVERSAGSVD AERLKHLIVT PSGSGEQNMI GMTPTVIAVH 
YLDETEQWEK FGLEKRQGAL ELIKKGYTQQ LAFRQPSSAF AAFVKRAPST 
WLTAYVVKVF SLAVNLIAID SQVLCGAVKW LILEKQKPDG VFQEDAPVIH 
QEMIGGLRNN NEKDMALTAF VLISLQEAKD ICEEQVNSLP GSITKAGDFL 
EANYMNLQRS YTVAIAGYAL AQMGRLKGPL LNKFLTTAKD KNRWEDPGKQ 
LYNVEATSYA LLALLQLKDF DFVPPVVRWL NEQRYYGGGY GSTQATFMVF 
QALAQYQKDA PGSGKVLQAT VVAVGSGSKG KGGEIQPVSV KVGDKVLLPE 
YGGTKVVLDD KDYFLFRDGD ILGKYVDeqk liseedl（配列番号１８）
配列番号１８のヒトＣｐｎ１０アミノ酸配列は、残基１〜１６および３１１〜３７７である。ヒトＣ３ｄアミノ酸配列は、配列番号１８の１７〜３１０由来であり、ｍｙｃ−タグエピトープアミノ酸配列は、３７８〜３８７由来である。
【０１４５】
この融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメント）を、ｐＲＳＥＴ由来プラスミドのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でクローン化し、Ｔ７プロモーターの制御下にコード配列を置いた。
【０１４６】
Ｃ３ｄ７（２）
ヒトＣｐｎ１０の可動ループの代わりのヒトＣ３ｄ挿入の位置だけ異なる第２の融合タンパク質を、同様に構築した。これは、配列番号１９の配列を有する：
MKFLPLFDRV LVERSAGETV TVDAERLKHL IVTPSGSGEQ NMIGMTPTVI  
AVHYLDETEQ WEKFGLEKRQ GALELIKKGY TQQLAFRQPS SAFAAFVKRA 
PSTWLTAYVV KVFSLAVNLI AIDSQVLCGA VKWLILEKQK PDGVFQEDAP  
VIHQEMIGGL RNNNEKDMAL TAFVLISLQE AKDICEEQVN SLPGSITKAG 
DFLEANYMNL QRSYTVAIAG YALAQMGRLK GPLLNKFLTT AKDKNRWEDP  
GKQLYNVEAT SYALLALLQL KDFDFVPPVV RWLNEQRYYG GGYGSTQATF 
MVFQALAQYQ KDAPGKVLQA TVVAVGSGSK GKGGEIQPVS VKVGDKVLLP  
EYGGTKVVLD DKDYFLFRDG DILGKYVDeq kliseedl（配列番号１９）
アミノ酸残基１〜２０および３１５〜３７８は、ヒトＣｐｎ１０由来であり、ヒトＣ３ｄアミノ酸配列に隣接する。ｍｙｃ−タグエピトープアミノ酸配列は、３７９〜３８８由来である。
【０１４７】
Ｃ３ｄ７（３）
同様に、以下のアミノ酸配列を含むＣ３ｄ７（３）と称する第３の融合タンパク質も作製した：
MKFLPLFDRV LVERSAGETV DAERLKHLIV TPSGSGEQNM IGMTPTVIAV  
HYLDETEQWE KFGLEKRQGA LELIKKGYTQ QLAFRQPSSA FAAFVKRAPS  
TWLTAYVVKV FSLAVNLIAI DSQVLCGAVK WLILEKQKPD GVFQEDAPVI  
HQEMIGGLRN NNEKDMALTA FVLISLQEAK DICEEQVNSL PGSITKAGDF 
LEANYMNLQR SYTVAIAGYA LAQMGRLKGP LLNKFLTTAK DKNRWEDPGK  
QLYNVEATSY ALLALLQLKD FDFVPPVVRW LNEQRYYGGG YGSTQATFMV 
FQALAQYQKD APLQATVVAV GSGSKGKGGE IQPVSVKVGD KVLLPEYGGT  
KVVLDDKDYF LFRDGDILGK YVDeqklise edl（配列番号２０）
ヒトＣｐｎ１０アミノ酸配列は、ヒトＣ３ｄアミノ酸配列に隣接する１〜１８および３１３〜３７３であり、ｍｙｃ−タグエピトープアミノ酸配列は、３７４〜３８３である。
【０１４８】
Ｃ３ｄ７（１）の発現
このタンパク質を可溶性形態で得るために、本発明者らは、２５℃で大腸菌株Ｃ４１（ＤＥ３）中でｐＡＶＤ９５を発現させた。０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて２５℃で終夜誘導後、タンパク質は発現され、タンパク質のほぼ半分が上清中に存在することが判明した。
【０１４９】
精製
Ｃ３ｄ７（１）の可溶性画分を、２つの精製ステップ、すなわち陰イオンカラムとそれに続くゲルろ過カラムを用いて精製した。
【０１５０】
陰イオンカラム（Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ  １６／１０）
このカラムは、２０ｍＭトリスｐＨ８中で平衡化した。２０ｍＭトリスｐＨ８から２０ｍＭトリスｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌの２０カラム体積の勾配を用いてタンパク質を溶出した。タンパク質は、一画分（Ｅ３）５ｍｌ中で約３５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて溶出した。
【０１５１】
ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０調製グレード）
カラムＭｏｎｏ  Ｑの画分Ｅ３を、５０ｍＭ  リン酸Ｎａ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０調製グレード）に導入した。タンパク質を緩衝液１５０ｍｌで溶出した。同じカラムのオボアルブミンの溶出容積（ＭＷ＝４３Ｋｄ）は、１６７ｍｌであった。これは、タンパク質がオリゴマーであることを示唆する。
【０１５２】
円偏光二色性
遠紫外円偏光二色性によるタンパク質の分析から、２次構造の存在が示唆された。スペクトルの逆重畳積分から、α−へリックスのパーセント値が約４９％であることが示された。このパーセント値は、モデリングによって決定したパーセント値（α−へリックスの４８％）と一致している。これは、タンパク質が正確に折りたたまれているという良好な指標である。
【０１５３】
タンパク質を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１．２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０１５４】
実施例３−Ｃ３ｄ７（１）およびエピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐのＣＲ２結合活性
ＥＬＩＳＡアッセイ法
実施例１のように調製したエピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐ分子および実施例２のように調製したＣ３ｄ７（１）を、５００ｎＭ〜０．０１ｎＭの範囲の濃度にわたって分析し、ヒトＣ３ｄ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および国際公開ＷＯ  ９９／３５２６０に記載のように構築し調製したＣ３ｄ３またはＡＰＴ２０２９と称されるヒトＣ３ｄ線状三量体と比較した。この結果を図２および４に示す。
【０１５５】
簡単に述べると、アッセイ法は、以下の通りである。
【０１５６】
ＩｇＧ定常部−ＣＤ２１融合タンパク質を組織培養細胞中で発現させ、精製し、精製したタンパク質を使用してＥＬＩＳＡプレートのウェルをコートした。これらのウェルに様々なＣ３ｄ分子をある範囲の濃度で加え、インキュベートした。インキュベーション後、ウェルを大規模に洗浄してからビオチン化抗Ｃ３ｄモノクローナル抗体を加えた。インキュベーションおよび洗浄の後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ビオチン抗体を加えた。さらなるインキュベーションおよび洗浄ステップに続いて、ＨＲＰ用の基質を加え、ＨＲＰによる基質からの着色生成物の生成を４５０ナノメートルの吸光度で測定した。このアッセイを図３にイラストとして示す。
【０１５７】
明らかに、エピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐ分子は、図２に示すようにいくつかの濃度において単量体Ｃ３ｄよりもはるかに良好に、かつさらに線状三量体Ｃ３ｄ３よりも良好に、Ｃ３ｄ受容体ＣＤ２１と結合する。
【０１５８】
Ｃ３ｄ７（１）を用いてこのアッセイを３回繰り返し、各応答の勾配を平均化し、比較した。図４に、これらのアッセイの１つの結果を示す。
【０１５９】
Ｃ３ｄ７（１）とＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃ３ｄ（単量体形態である）の間の結果を比較すると、Ｃ３ｄ７（１）のＡｂｓ４５０が単量体Ｃ３ｄよりも低濃度で増大する。これは、Ｃ３ｄが多量体形態であることを示唆する。
【０１６０】
実施例４−Ｃ３ｄ７（１）、（２）＆（３）のＣＲ２結合活性
実施例３の第２の結合実験を、すべて実施例２で前述したように調製したＣ３ｄ７（１）、（２）および（３）を用いて実施例３に記載のように繰り返した。
【０１６１】
ＥＬＩＳＡアッセイにおけるこれら３つのタンパク質の結合を、図５のように示す。このデータは、Ｃ３ｄ７（１）、Ｃ３ｄ７（２）およびＣ３ｄ７（３）が最終的にすべてＣＲ２と結合することを示す。単量体Ｃ３ｄ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍより供給）とＡＰＴ２０２９と称されるＣ３ｄ３の線状三量体の間の勾配が３．４倍増大したことによって示されるように、結合曲線の直線部の勾配から、タンパク質の多量体化の指標が得られる。３つのＣ３ｄ７構築体の直線部の勾配から、それらがすべて多量体化していることが示唆される。
【０１６２】
実施例５−免疫蛍光フローサイトメトリーによる分析
不死化ヒトＣＤ２１＋  Rajiリンパ芽球腫細胞系およびヒトＣＤ２０＋／ＣＤ４−／ＣＤ８−末梢血リンパ球に対するＣ３ｄ７構築体のＣＲ２結合活性を試験した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリー分析を実施し；１０，０００事象を獲得した。
【０１６３】
不死化Raji（Ｂ細胞）およびJurkat（Ｔ細胞）細胞をＰＢＳで洗浄し、最適化したＦＩＴＣ接合抗ヒト、ＣＤ３（汎Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ２０（汎Ｂ細胞マーカー）およびＣＤ２１（ＣＲ２マーカー）（ＤＡＫＯ）モノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）の希釈溶液と一緒にインキュベートした。これは、Raji細胞はＣＤ２１＋、ＣＤ２０＋であるが、Jurkat細胞はＣＤ２１ｄｉｍ、ＣＤ３＋であることを証明した。
【０１６４】
Ｃ３ｄ７（１〜３）の結合は、Raji（ＣＤ２１＋／ＣＤ２０＋）細胞では検出されるが、Jurkat（ＣＤ３＋／ＣＤ２１ｄｉｍ）細胞では検出されない。
【０１６５】
単一染色免疫蛍光アッセイフォーマットを用いて、洗浄したRajiおよびJurkat細胞（１×１０６／ｍｌ）を１００ｎＭ（最終希釈度）のＣ３ｄ７（１）、Ｃ３ｄ７（２）、Ｃ３ｄ７（３）、ヒト単量体Ｃ３ｄ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびヒト線状三量体Ｃ３ｄ３（ＡＰＴ２０２９）と一緒に室温で３０分間インキュベートし、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、次いで最適化したＣｙ３（ピンク色蛍光体）接合抗ヒトＣ３ｄモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の希釈溶液と一緒に暗所中４℃で３０分間インキュベートし、再度洗浄し、氷冷ＰＢＳ  ０．５ｍｌ中に再懸濁した。図６に、この分析の結果を示す。
【０１６６】
Ｃ３ｄ７（１）およびＣ３ｄ７（２）は、ＣＤ２１＋細胞と最終的に結合し、ＣＤ３＋／ＣＤ２１ｄｉｍ細胞とは結合しない。シグナル強度の増大により、Ｃ３ｄ３（ＡＰＴ２０２９）における６．４倍の増大と比較したそれぞれＣ３ｄ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、Ｃ３ｄ７（１）およびＣ３ｄ７（２）の間の７および９倍のシグナル強度増大によって示される多量体化の指標が得られる。
【０１６７】
ＣＤ２０＋／ＣＤ４−／ＣＤ８−ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の表面上のＣ３ｄ７（１）の結合
この実験は、二重染色免疫蛍光アッセイフォーマットを用いて行った。Ｆｉｃｏｌｌによる密度勾配遠心分離によってヒトＰＢＬを血液から単離した。混入した赤血球を溶解により除去した。洗浄した１×１０６／ｍｌのＰＢＬを２００ｎＭ（最終希釈度）Ｃ３ｄ７（１）またはヒト線状三量体Ｃ３ｄ３（ＡＰＴ２０２９）と一緒に室温で３０分間インキュベートし、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、次いで最適化したＣｙ３抗ヒトＣ３ｄ  ＭａｂおよびＦＩＴＣ抗ＣＤ４（Ｔｈ細胞マーカー）、抗ＣＤ８（ＣＴＬマーカー）抗ＣＤ２０（Ｂ細胞マーカー）Ｍａｂ（ＤＡＫＯ）の希釈溶液と一緒に暗所中４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、氷冷ＰＢＳ  ０．３ｍｌ中に再懸濁してからフローサイトメトリー分析を行い、５，０００の事象を獲得した。
【０１６８】
このデータの分析から、ＡＰＴ２０２９と称される線状三量体ヒトＣ３ｄ３で見られるのと同じように、Ｃ３ｄ７（１）がＰＢＬ  Ｂ（ＣＤ２０＋）細胞集団（ＣＤ２１＋と推定される）と最終的に結合することが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】Ｃ４ｂｐコアタンパク質の配列を示す図である。
【図２】単量体Ｃ３ｄおよびＣ３ｄ３と称される線状三量体型のＣ３ｄと比較した、ＣＲ２（ＣＤ２１としても知られている）に対するエピトープ−Ｃ３ｄ−Ｃ４ｂｐ融合タンパク質およびＣ３ｄ７（１）の結合を示す図である。
【図３】ＣＲ２結合アッセイのフォーマットを表すイラストである。
【図４】単量体Ｃ３ｄおよびＣ３ｄ３と称される線状三量体型のＣ３ｄと比較した、ＣＲ２（ＣＤ２１）に対するＣ３ｄ７（１）の結合を示す図である。
【図５】単量体Ｃ３ｄおよびＣ３ｄ３と称される線状三量体型のＣ３ｄと比較した、ＣＲ２（ＣＤ２１）に対するＣ３ｄ７（１）、（２）および（３）の結合を示す図である。
【図６】RajiおよびJurkat細胞と結合しているＣ３ｄ７（１）、Ｃ３ｄ７（２）およびＣ３ｄ７（３）のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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