(57)【要約】本発明は、過増殖性疾患状態のような疾患状態における免疫毒素の作用機序への識見をさらに提供するものである。本発明は、免疫毒素療法によって調節される遺伝子を同定するために、免疫毒素及び遺伝子発現プロファイリングを用いて疾患を治療する新規な方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫毒素治療に応答する１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を同定する方法であって、前記方法が、免疫毒素を細胞に投与するステップと、その発現が免疫毒素治療に応答して上方制御または下方制御される１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を決定するステップとで構成される方法。
【請求項２】
前記細胞が、罹患状態にあることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、過増殖性細胞であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記過増殖性細胞が、癌細胞またはアテローム性動脈硬化症細胞であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞が、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸部、大腸、食道、胃腸、歯肉、頭部及び頸部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮の細胞であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳動物体内にあることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、ヒトであることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、細胞培養内にあることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を同定する方法が、免疫毒素を細胞に投与する前及び後の両方において、１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現を評価するステップで構成されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、前記方法が、
（ａ）上記免疫毒素を患者または細胞に投与するステップと；そして、
（ｂ）免疫毒素投与に応答して上方制御または下方制御される１つ以上の免疫毒素制御遺伝子または遺伝子産物を同定するステップと；
でさらに構成されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、トポイソメラーゼIIであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、スペルミン・シンターゼであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、表２に挙げられた遺伝子で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、E-セレクチンであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、サイトカインA2であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、TNF-α誘導蛋白質３であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、NFκB阻害因子アルファであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、表３に挙げられた遺伝子で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１９】
免疫毒素治療の患者への投与が、全身性静脈内注射、血液またはリンパ液供給を介した局所投与によって、または患部へ直接行なわれることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、過増殖性細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
前記過増殖性細胞が、癌細胞またはアテローム性動脈硬化症細胞であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
免疫毒素治療を補完する治療剤または治療処方を同定するステップでさらに構成される請求項１記載の方法において、前記治療処方が、
（ａ）免疫毒素治療に応答して前記免疫毒素治療を受ける患者体内で上方制御または下方制御される１つ以上の制御遺伝子または遺伝子産物を同定するステップと；そして、
（ｂ）１つ以上の免疫毒素制御遺伝子のさらなる上方制御または下方制御を促進する１つ以上の第２の薬剤または治療を同定するステップと；
で構成される方法。
【請求項２３】
前記第２の薬剤または治療を患者に投与するステップでさらに構成される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
下方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、表２に挙げられた遺伝子で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、トポイソメラーゼIIであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の薬剤が、トポイソメラーゼIIの阻害剤であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記トポイソメラーゼIIの阻害剤が、エトポシドまたはドキソルビシンであることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記トポイソメラーゼIIの阻害剤が、トポイソメラーゼ遺伝子発現及び活性、及びその細胞生成物の下方制御をさらに促進することを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、スペルミン・シンターゼであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の薬剤が、スペルミン・シンターゼの阻害剤であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
前記スペルミン・シンターゼの阻害剤が、ポリアミン阻害剤であることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリアミン阻害剤が、N-(3-アミノプロピル)シクロヘキシルアミン（APCHA）、N-シクロヘキシル-1,3-ジアミノプロパン（C-DAP）、N-(n-ブチル)-1,3-ジアミノプロパン、S-アデノシル-1,12-ジアミノ-3-チオ-9-アザドデカン（AdoDatad）、ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）、メチル・グリオキサール・ビス・グアニルヒドラゾン（MGBG）、またはメチル・グリオキサール・ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）MGBCPであることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記スペルミン・シンターゼの阻害剤が、スペルミン・シンターゼ発現及び活性、及びその細胞生成物の下方制御をさらに促進することを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、表３に挙げられた遺伝子で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項３５】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、E-セレクチンであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の薬剤が、E-セレクチンの誘導因子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項３７】
前記E-セレクチンの誘導因子が、TNF、リポ多糖体、リンフォトキシン、またはIL-1であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記E-セレクチンの誘導因子が、E-セレクチンの発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進することを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、サイトカインA2であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の薬剤が、サイトカインA2の誘導因子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項４１】
前記サイトカインA2の誘導因子が、ヘム、リソホスファチジルコリン、インターフェロン-ガンマ、IL-17、TNFまたはIL-4であることを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記サイトカインA2の誘導因子が、サイトカインA2の発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進することを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、TNF-α誘導蛋白質３であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の薬剤が、TNF-α誘導蛋白質３の誘導因子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項４５】
前記TNF-α誘導蛋白質３（TNFAIP3）の誘導因子が、TRAIL、Fas、CD40、PMA、UV、EBV、IL-1またはLPSであることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記TNF-α誘導蛋白質３の誘導因子が、TNF-α誘導蛋白質３の発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進することを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された前記遺伝子または遺伝子産物が、NFκB阻害因子アルファであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項４８】
前記第２の薬剤が、NFκB阻害因子アルファの誘導因子であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項４９】
前記NFκB阻害因子アルファの誘導因子が、蛋白質REIA、V-RELまたはデオキシコール酸塩（DOC）であることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記NFκB阻害因子アルファの誘導因子が、NFκB阻害因子アルファの発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進することを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記治療剤が、免疫毒素、融合蛋白質またはその免疫接合体であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項５２】
前記治療剤が、蛋白質または核酸発現コンストラクトであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項５３】
前記治療剤が、アンチセンス・コンストラクト、または低分子有機または無機分子、または有機医薬品であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項５４】
前記治療剤が、DNA損傷剤、アルキル化剤または抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項５５】
前記治療処方が、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法または遺伝子治療であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項５６】
過増殖性疾患または状態を有する患者を治療する方法であって、上記方法が、
（ａ）免疫毒素治療に反応的な疾患を治療するのに効果的な量の免疫毒素を患者に投与するステップと；そして
（ｂ）遺伝子発現の変化に基づいた免疫毒素から選択される治療剤または治療処方を効果的な量で患者に投与するステップと；
で構成される方法。
【請求項５７】
前記治療剤及び治療処方が、請求項１の実施を通じて選択されることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記治療剤が、トポイソメラーゼIIの阻害剤であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項５９】
前記トポイソメラーゼIIの阻害剤が、エトポシドまたはドキソルビシンであることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記治療剤が、スペルミン・シンターゼ阻害剤であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６１】
前記スペルミン・シンターゼの阻害剤が、ポリアミン阻害剤であることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリアミン阻害剤が、N-(3-アミノプロピル)シクロヘキシルアミン（APCHA）、N-シクロヘキシル-1,3-ジアミノプロパン（C-DAP）、N-(n-ブチル)-1,3-ジアミノプロパン、S-アデノシル-1,12-ジアミノ-3-チオ-9-アザドデカン（AdoDatad）、ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）、メチル・グリオキサール・ビス・グアニルヒドラゾン（MGBG）、又はメチル・グリオキサール・ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）MGBCPであることを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記治療剤が、E-セレクチンの誘導因子であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６４】
前記E-セレクチンの誘導因子が、リポ多糖体、リンフォトキシン、またはIL-1であることを特徴とする請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記治療剤が、サイトカインA2の誘導因子であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６６】
前記サイトカインA2の誘導因子が、ヘム、リソホスファチジルコリン、インターフェロン・ガンマ、IL-17、TNFまたはIL-4であることを特徴とする請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記治療剤が、TNF-α誘導蛋白質３の誘導因子であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項６８】
前記TNF-α誘導蛋白質３の誘導因子が、TRAIL、Fas、CD40、PMA、UV、EBV、IL-1またはLPSであることを特徴とする請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記治療剤が、NFκB阻害因子アルファの誘導因子であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７０】
前記NFκB阻害因子アルファの誘導因子が、蛋白質REIA、V-RELまたはデオキシコール酸塩（DOC）であることを特徴とする請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記治療剤が、スペルミン・シンターゼ発現および活性を下方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７２】
前記治療剤が、トポイソメラーゼII発現および活性を下方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７３】
前記治療剤が、表２に挙げられた遺伝子で構成される群から選択される1つの遺伝子を下方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７４】
前記治療剤が、E-セレクチンの発現及び活性を上方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７５】
前記治療剤が、サイトカインA2の発現及び活性を上方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７６】
前記治療剤が、TNF-α誘導蛋白質３の発現及び活性を上方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７７】
前記治療剤が、NFκB阻害因子アルファの発現及び活性を上方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７８】
前記治療剤が、表３に挙げられた遺伝子で構成される群から選択される1つの遺伝子を上方制御することによって疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項７９】
前記治療剤が、免疫毒素、融合蛋白質またはその免疫接合体であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８０】
前記治療剤が、蛋白質または核酸発現コンストラクトであることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８１】
前記治療剤が、アンチセンス・コンストラクト、または低分子有機または無機分子、または有機医薬品であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８２】
前記治療剤が、DNA損傷剤、アルキル化剤または抗癌剤であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８３】
前記治療処方が、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法、または遺伝子治療であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８４】
免疫毒素治療及び／又は治療剤の投与が、全身性静脈内注射、血液またはリンパ液供給を介した局所投与によって、または患部へ直接行なわれることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８５】
前記過増殖性疾患が、癌であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項８６】
前記癌が、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸部、大腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮の癌であることを特徴とする請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記過増殖性疾患又は状態が、アテローム性動脈硬化症であることを特徴とする請求項５６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分子生物学、癌生物学及び治療、及び毒理学に関するものである。より具体的には、本発明は、遺伝子プロファイリング、癌または過形成のような過増殖性疾患の治療に関与する遺伝子の同定、及び過増殖性疾患の治療に関連するあらゆる疾患に関するものである。
【０００２】
また、本出願は、2002年６月12日に提出された同時係属の米国仮特許出願第60/388,133号への優先権を主張するものである。上に引用された開示の本文全体が、ディスクレーマーなしに引用によって本明細書に具体的に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
現在の定説では、免疫毒素は、蛋白質合成の阻害によって細胞を殺すことが示されている。研究によって、免疫毒素接合体または融解物蛋白質が細胞に対して細胞毒性を持つことが示されてきた（Atkinson et al., 2001, Bolognesi et al., 2000; Rosenblum et al., 1999; Pagliaro et al., 1998 and Kaneta et al., 1998）。しかし、ゲロニンのような免疫毒素の作用機序に関する更なる詳細は依然として解明されていない。
【０００４】
ジフテリア毒素（DT）、緑膿菌毒素Ａ、アブリン、リシン、ヤドリギ、モデオクシン(modeoccin)及び赤痢菌毒素のようなバクテリア及び植物毒素は、重要な細胞機能を破壊するそれらの能力のゆえに、強力な細胞破壊性物質である。例えば、DT及びリシンは、それぞれ伸長因子２の不活性化及びリボソーム60sサブユニットの不活性化によって細胞蛋白質合成を阻害する（Jelajaszewicz and Wadstrom, 1978）。これらの毒素は酵素であり、化学量論的ではなく触媒的に作用するため、これらの毒素は極めて強力である。これらの毒素の分子は、通例鎖または断片『Ａ』と称される、触媒的に活性なポリペプチド鎖または断片で構成され；上記鎖または断片『Ａ』は、上記分子を細胞表面に結合して、鎖Ａがその作用部位すなわち細胞質ゾルに到達して、その破壊機能を実行することを可能にする、通例、鎖または断片『Ｂ』と呼ばれる、１つ以上のポリペプチド鎖または断片に結合されている。細胞質ゾルへのアクセスは、『内部移行』、『中毒』または『転座』と呼ばれる。これらの蛋白質毒素は、鎖Ａ及び鎖Ｂと称される２本の鎖を持つ種類に属する。鎖Ｂは、殆どすべての細胞に結合する能力を持つが、細胞毒性活性は鎖Ａによって示される。鎖Ａを活性化するため、多くの場合ジスルフィド結合の減少によって、鎖Ａは鎖Ｂから適時に遊離しなければならないと考えられる。これらの天然毒素は、それら鎖Ｂが、種々の細胞上に存在するレセプターを認識し、結合するために、一般に任意の細胞または組織タイプに対して選択的ではない。
【０００５】
単独で投与される場合、種々の細胞に対して細胞毒性を持たない毒素分子の利用可能性は限定的であった。それ自体では細胞表面レセプターに結合せず、従って、細胞によって通常内部移行されないいくつかの天然に生じる単鎖毒素分子を用いることによって、単独で投与された場合に、すべてではないにしても、殆どの細胞に対して比較的毒性のない毒素分子が提供されている。これまでに知られているそうした天然に生じる単鎖毒素分子には、ヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質（Ramakrishnan and Houston, 1984）；サポニン（Thorpe, et al., 1985）；及びゲロニン（Stirpe et al., 1980）などがある。これらの蛋白質は、遊離型では細胞に対して毒性を持たないが、一旦それらが細胞内に入り込むと、蛋白質合成を阻害することが可能である。しかし、実質的に純粋型であるこれらの単鎖毒素は、それらが比較的少量しか存在せずに、植物内の毒素濃度の再生産性が植物成長条件及び植物収穫条件に左右される植物資源から精製しなければならないことから、限定的である。その他のそうした毒素には、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルス蛋白質、ゲロニン、シュードモナス外毒素Ａジフテリア毒素、及びアルファ・サルシンなどがある。
【発明の開示】
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、疾患状態に関与する遺伝子を同定し、免疫毒素治療を用い、そして、遺伝子発現を評価することによって疾患を治療する新規な方法及びその治療剤を提供することによって本技術分野の欠陥を克服する。従って、本発明は、免疫毒素を細胞に投与するステップと、免疫毒素治療に応答してその発現が上方制御または下方制御される１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を決定するステップとで構成される免疫毒素治療に応答する１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を同定する方法を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、免疫毒素を細胞に投与する前及び後の両方において１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現を評価するステップで構成される１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を同定する方法を提供する。
【０００８】
本発明はまた、免疫毒素治療に応答して上方制御または下方制御される遺伝子を同定する方法において、その方法がさらに：（ａ）上記免疫毒素を患者または細胞に投与するステップと；そして、（ｂ）免疫毒素投与に応答して上方制御または下方制御される１つ以上の免疫毒素制御遺伝子及び遺伝子産物を同定するステップと；で構成されることを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、免疫毒素治療を補完する治療剤または治療処方を同定する方法において、上記方法が：（ａ）免疫毒素治療を受ける患者において免疫毒素投与に応答して上方制御または下方制御される１つ以上の制御遺伝子及び遺伝子産物を同定するステップと；そして、（ｂ）１つ以上の免疫毒素制御遺伝子のさらなる上方制御または下方制御を促進する１つ以上の第２の薬剤または治療を同定するステップと；で構成される方法を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、過増殖性疾患または状態を有する患者を治療する方法において、上記方法が：（ａ）そうした免疫毒素治療に反応的な疾患を治療するのに効果的な量の免疫毒素を患者に投与するステップと；そして、（ｂ）遺伝子発現の変化に基づいた免疫毒素から選択される治療剤または治療処方を患者に投与するステップと；で構成される方法を提供する。上記治療剤または治療処方は、免疫毒素を細胞に投与するステップと、その発現が免疫毒素治療に応答して上方制御または下方制御される１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を決定するステップとで構成される、免疫毒素治療に応答する１つ以上の遺伝子または遺伝子産物を同定する方法の実施を通じて選択することができる。
【００１１】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物は、表２に挙げられた遺伝子で構成される群から選択することができるが、それだけに限られない。本発明の研究における免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物の１つの例は、DNAらせんの両方のストランドの一時的な切断及び再連結によってスーパーコイル化されたDNAの弛緩を触媒することに関与するトポイソメラーゼIIである。従って、本発明による方法に従って、エトポシド及びドキソルビシンのようなトポイソメラーゼIIの阻害剤が同定され、トポイソメラーゼ遺伝子発現及び活性及びその細胞生成物の下方制御をさらに促進する治療剤として用いることができる。その結果、これらの治療剤は、トポイソメラーゼ遺伝子発現及び活性及びその細胞生成物を下方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１２】
本発明の研究における免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物の別の例は、スペルミン・シンターゼである。スペルミンは、細胞の増殖、分化及び形質転換にとって不可欠であって、しばしばヒトの腫瘍に多く見られる、ポリアミンのグループに属する。従って、本発明による方法に従って、ポリアミン阻害剤N-(3-アミノプロピル)シクロヘキシルアミン（APCHA）、N-シクロヘキシル-1,3-ジアミノプロパン（C-DAP）、N-(n-ブチル)-1,3-ジアミノプロパン、S-アデノシル-1,12-ジアミノ-3-チオ-9-アザドデカン（AdoDatad）、ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）、メチル・グリオキサール・ビス・グアニルヒドラゾン（MGBG）、及びメチル・グリオキサール・ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）MGBCPのようなスペルミン・シンターゼの阻害剤が同定され、スペルミン・シンターゼ遺伝子発現及び活性、及びその細胞生成物の下方制御をさらに促進する治療剤として用いることができる。これらの治療剤は、本発明による方法に従って、スペルミン・シンターゼ遺伝子発現及び活性を下方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１３】
免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物は、表２に挙げられた遺伝子で構成される群から選択することができるが、それだけに限られない。本発明の研究における免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物の１つの例は、E-セレクチンである。E-セレクチン（内皮白血球接着分子１）は、サイトカイン刺激内皮細胞によって発現する。これらの蛋白質は、細胞接着分子のセレクチン・ファミリーの一部であり、細胞の血管内層への接着を媒介することによって炎症部位で血中白血球の集積を引き起こすと考えられる。接着分子は、白血球と内皮細胞の間の相互作用に関与し、アテローム性動脈硬化症の病因に関与すると見られる。従って、本発明による方法に従って、TNF、リポ多糖体（LPS）、リンフォトキシン、またはIL-1のようなE-セレクチンの誘導因子が同定され、E-セレクチンの発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進する治療剤として用いることができる。これらの治療剤は、本発明による方法に従って、E-セレクチン発現及び活性を上方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１４】
本発明の研究における免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物のさらに別の例は、SCYA2またはMCP-1としても知られるサイトカインA2である。この遺伝子は、17番染色体の長腕上にクラスター形成されるいくつかのサイトカイン遺伝子のひとつである。サイトカインは、免疫調整及び炎症プロセスに関与する分泌蛋白質のファミリーである。このサイトカインは、単核白血球及び好塩基球に対する化学走化性活性を示すが、好中球または好酸球に対しては示さない。上記サイトカインは、乾癬、慢性関節リウマチ及びアテローム性動脈硬化症のように、単球性湿潤物によって特徴づけられる疾患の病因に関与している。従って、本発明による方法に従って、ヘム、リソホスファチジルコリン、インターフェロン・ガンマ、IL-17、TNF及びIL-4のようなサイトカインA2の誘導因子が同定され、サイトカインA2の発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進する治療剤として用いることができる。これらの治療剤は、本発明による方法に従って、サイトカインA2発現及び活性を上方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１５】
本発明の研究における免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物のさらに別の例は、TNF-α誘導蛋白質３である。この遺伝子は、その発現が腫瘍壊死因子（TNF）によって速やかに誘導される遺伝子として同定された。この遺伝子によってコードされる蛋白質はジンクフィンガー蛋白質であり、NFκB活性及びTNF媒介アポトーシスを阻害することが示されてきた。ノックアウト・マウスでの同様な遺伝子の研究によって、この遺伝子は、TNF誘導NFκB応答を終了させることによって炎症を限定するために重要であることが示唆された。従って、本発明による方法に従って、TRAIL、Fas、CD40、ホルボール・ミリスチン酸塩・アセテート（PMA）、UV、EBV、IL-1またはLPSのようなTNF-α誘導蛋白質３の誘導因子が同定され、TNF-α誘導蛋白質３の発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進する治療剤として用いることができる。これらの治療剤は、本発明による方法に従って、TNF-α誘導蛋白質３の発現及び活性を上方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１６】
さらにまた別の例で、本発明の研究における免疫毒素治療によって上方制御されていると同定された遺伝子または遺伝子産物は、IκBAまたはNFκBIAとしても知られるNFκB阻害因子アルファである。NFκB1はREL、RELA又はRELBに結合し、NFκB複合体を形成する。この複合体は、細胞質トラッピングによってNFκBを不活性化するIKB蛋白質（例えば、NFκBIA）によって阻害される。活性化されたNFκB複合体は核に転座し、κB結合モチーフでDNAに結合し、遺伝子発現を活性化する。これまでの研究によって、NFκBの不適切な活性化は、自己免疫性関節炎、喘息、敗血性ショック、肺繊維症、アテローム性動脈硬化症及びAIDSに関連する炎症性イベントに関連づけられることが示されてきた。対照的に、NFκBの完全で永続的な阻害は、アポトーシス、不適切な免疫細胞の発生、及び細胞成長の遅れに直接関連づけられてきた。従って、本発明による方法に従って、REIA、V-RELまたはデオキシコール酸塩（DOC）のようなNFκB阻害因子アルファの誘導因子が同定され、NFκB阻害因子アルファの発現及び活性、及びその細胞生成物の上方制御をさらに促進する治療剤として用いることができる。これらの治療剤は、本発明による方法に従って、NFκB阻害因子アルファの発現及び活性を上方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１７】
従って、上記治療剤は、表２に挙げられた遺伝子で構成される群から選択される遺伝子を下方制御することによって、または表３に挙げられた遺伝子で構成される群から選択される遺伝子を上方制御することによって、疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【００１８】
本発明による治療剤は、免疫毒素、融合蛋白質またはその免疫接合体、蛋白質またはアンチセンス・コンストラクトのような核酸発現コンストラクト；あるいは低分子または有機医薬品でもよい。本発明による治療剤は、DNA損傷剤、アルキル化剤または抗癌剤でもよいが、そうしたものに限られない。本発明は、放射線治療、免疫療法、ホルモン療法または遺伝子治療のような治療処方を用いることもできる。
【００１９】
免疫毒素治療及び／又は治療剤の投与は、全身性静脈内注射、血液またはリンパ液供給を介した局所投与によって、または患部へ直接でもよい。
【００２０】
本発明において、上記細胞は疾患状態にある細胞でもよい。そのような細胞は、癌細胞またはアテローム性動脈硬化症細胞のような過増殖性細胞でもよいが、そうしたものに限られない。上記細胞は、ヒトのような哺乳動物の体内に、または細胞培養内に存在することができる。
【００２１】
本発明はまた、過増殖性疾患またはその他関連する不調のように、免疫毒素治療が利用可能なあらゆる疾患の治療の方法を提供する。免疫毒素治療を用いることができるそのような過増殖性疾患の１つは癌である。治療することができる癌には、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸部、大腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮の癌などがある。本発明によるいくつかの実施の形態で、免疫毒素治療を用いて治療される過増殖性疾患または状態は、アテローム性動脈硬化症である。
【００２２】
『１つの』または『ある』という語が、本請求項及び／又は本明細書で『構成される』という用語と併せて用いられる場合、『１つ』を意味することができるが、『１つ以上』、『少なくとも１つ』及び『１つまたは１つ以上』という意味でも矛盾しない。
【００２３】
本明細書で開示される方法及び組成物のいずれも、本明細書に述べられるその他すべての方法及び組成物に適用することができる。
【００２４】
本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲内で種々の変更及び変形が、この詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明及び具体的な例は、本発明の具体的な実施の形態を示しながら、説明のためだけに提供されることが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
Ｉ．本発明
本発明は、疾患状態に関与する遺伝子を同定するために、免疫毒素治療及び遺伝子発現プロファイリングを用いて疾患を治療するための新規な方法を提供する。本発明は、過増殖性疾患などのような疾患の治療のための治療剤を同定する新規な方法も提供する。免疫毒素治療に応答して上方制御又は下方制御される遺伝子の同定によって、本発明は、免疫毒素制御遺伝子の阻害又は誘導をさらに促進する治療剤を同定する。本発明は、治療剤と組み合わせる免疫毒素治療を用いた、患者を治療する方法をさらに提供する。
【００２６】
II．免疫毒素
ゲロニンは、約28,000-30,000 kdの分子量を有する、植物Gelonium multiforumの種子から単離される単鎖ポリペプチドである。ゲロニンは、等電点が約8.15の塩基性糖蛋白であり、マンノース及びグルコサミン残基を含有する（Falasca, et al., 1982）。ゲロニンは、タイプIリボソーム不活性化蛋白質であり、その他周知の毒素リシンと同様に、蛋白質合成のきわめて強力な阻害因子である。タイプIの毒素は、蛋白質合成の阻害に必要な触媒Ａ鎖を有するが、リシンのようなタイプIIの毒素に特徴的であるＢ鎖は欠いている。ゲロニンは、リシン残基を含んでいる258アミノ酸であり、トリコサンチン及びリシンＡ鎖と相同性を有する（Rosenblum et al., 1995）。
【００２７】
その他の植物及びバクテリア毒素と対照的に、この蛋白質は、細胞に対してそれ自体では毒性を持たないが、担体を介して細胞へ送達されると、60sリボソーム・サブユニットに損傷を与える。in vivo及びin vitroの生物学的データにより、ゲロニンはその他の植物毒素と同等または優位にあることが示唆されている。ゲロニン接合体をin vivo及びin vitroでその他のＡ鎖接合体と比較した研究によって、ゲロニンは、同様な効能、より良好な選択性、より良好な腫瘍局在性、及びより有効な治療効果を有することが示された（Sivan, et al., 1987）。しかし、ゲロニンの再生産可能で、容易に入手できる供給の自然源からの利用可能性は限られている。加えて、植物源からのゲロニンの精製は困難であり、その収率は非常に低い。
【００２８】
ゲロニンそれ自体は、マウスに流産を起こさせることが示されており、抗体依存細胞毒性を増強する（Yeung, et al., 1988）。いくつかの研究では、ゲロニンを、モノクローナル抗体またはペプチド・ホルモン細胞標的リガンドに化学的に付着した細胞毒性剤として用いてきた（Atkinson et al., 2001; Bolognesi et al., 2000; Rosenblum et al., 1999; Pagliaro et al., 1998 and Kaneta et al., 1998）。
【００２９】
遺伝子組み換え型ゲロニンは、それぞれ引用によって本明細書に組み込まれる米国特許RE37,642号明細書及びRosenblum et al., 1995に述べられているような本発明での利用のために産生することもできる。いくつかの例で、遺伝子組み換え型ゲロニンは、ゲロニンのcDNAを用いて産生することができる。本発明による遺伝子組み換え体は、突然変異を分子に導入することによって産生することができる。遺伝子組み換え型ゲロニンは、部位定方向突然変異誘発によって産生され、天然の分子よりも大きな毒性活性を有することが可能であり；いったんモノクローナル抗体または標的リガンドのような担体によって細胞表面に結合されると、より効果的に内部移行されて、リソソーム分解に抵抗し、従って、毒性画分としてより安定であり、より長く作用する。遺伝子組み換え型ゲロニンは、融合産物を組み換えることによって産生することもでき、その他の機能モダリティを有して、酵素、サイトカイン（TNFまたはIFN）のような細胞、またはジフテリア毒素のような第２の毒素を殺し、そのようにして『超毒素』または多機能の作用を持つ毒素をつくりだす。融合蛋白質は、ゲロニンで組み換えて、化学療法剤のような薬剤を輸送することが可能である。ゲロニン・ペプチドは、人工妊娠中絶薬、免疫抑制剤、抗癌剤及び抗ウイルス剤としての用途を有する。
【００３０】
Ａ．免疫毒素抗体
本発明による毒素は、細胞毒性治療剤の成分として用いるために特に適している。細胞毒性剤をつくりだすために、本発明による免疫毒素性毒素は、キメラ及びCDR移植抗体などのモノクローナル抗体、及び抗体領域／断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、単鎖抗体、及びFvまたは単一の可変領域）に接合することができる。免疫毒素は、免疫接合体ではなく融合蛋白質で構成されてもよく、毒素などの免疫接合体は免疫毒素として述べることができる。
【００３１】
遊離システイン残基を含むように遺伝子組み換えされたモノクローナル抗体に接合された免疫毒素も、本発明の範囲内にある。本発明で有用なFab'、F(ab')2断片の例は、引用によって本明細書に組み込まれるWO 89/00999号国際公開パンフレッドに述べられている。あるいは、上記免疫毒素性毒素は、ヒト化された、またはヒトの組み換え抗体に接合または融合することができる。そのようなヒト化された抗体は、マウス抗体可変領域から作成することができる。
【００３２】
１．抗体領域
免疫グロブリン・ファミリーの種々のメンバーからの領域は、本発明によって包含される。相補性決定領域(CDR)など特定の抗体からの可変領域は、本発明の範囲内に含まれると共に、Fc領域のようなエフェクター分子に結合する領域などの抗体中和領域も本発明の範囲内に含まれる。IgGs、IgMsまたはIgAsからの可変領域のような、抗体からの抗原特異的コード領域は、抗原中和領域と組み合わせてpIgR結合領域と共に、または本明細書に述べられる治療化合物と共に用いることができる。
【００３３】
特定の実施の形態で、本発明は単鎖抗体で構成されることができる。単鎖抗体を生成するための方法は、当業者に十分周知である。当業者は、そうした方法について米国特許第5,359,046号明細書（引用によって本明細書に組み込まれる）を参照することができる。単鎖抗体は、短ペプチド・リンカーを用いて重鎖及び軽鎖の可変領域を融合することによってつくられ、それによって、単一分子上の抗原結合部位を再構成する。
【００３４】
１つの可変領域のＣ末端が、他方のＮ末端に15から25のアミノ酸ペプチドを介して繋ぎ止められる単鎖抗体可変断片（scFvs）が、抗原結合またはその結合の特異性を著しく損なうことなく、つくりだされてきた（Bedzyk et al., 1990; Chaudhary et al., 1990）。これらのFvsは、未変性抗原の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Fc）を欠いている。単鎖抗体を用いる免疫毒素は、引用によって具体的に組み込まれる米国特許第6,099,342号明細書に述べられている。
【００３５】
癌遺伝子、腫瘍関連抗原、サイトカイン、成長因子、ホルモン、酵素、転写因子またはレセプターのように、多種多様な分子に対する抗体が検討される。また、血清に対する標的とされる分泌抗体、血管形成因子（VEGF/VPF； βFGF；αFGF；など）、凝固因子、及び血管形成に必要な内皮抗原（すなわち、V3インテグリン）も検討される。また、形質転換成長因子、繊維芽細胞成長因子、及び血小板由来増殖因子（PDGF）及びPDGFファミリー・メンバーも検討される。
【００３６】
本発明で免疫毒素の一部として用いられる抗体は、いずれの抗原への標的とされてもよい。上記抗原は、ある有機体、細胞タイプ、疾患または健康状態に特異的でもよい。典型的な抗原には、例えば、腫瘍関連抗原、ウイルス蛋白、微生物蛋白、転写後修飾または炭水化物、及びレセプターなどの細胞表面細胞蛋白質などがある。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリル・ルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン・レセプター、ラミニン・レセプター、erb B及びp155などがある。
【００３７】
III．免疫毒素制御遺伝子の同定
本発明は、種々の実施の形態で、免疫毒素制御遺伝子を同定するステップを含んでいる。当業者に周知のように、遺伝子発現を評価するための多種多様な方法があり、その殆どは、ハイブリダイゼーション分析に依拠する。特定の実施の形態で、テンプレートに基づく増幅方法が用いられて、（量的に）検出可能な量の遺伝子産物を生成し、それは種々の方法で評価される。
【００３８】
免疫毒素制御遺伝子を同定する１つの方法は、固体の基質上で固定される種々の１本鎖DNAプローブにハイブリダイズするそれらの能力について大量のDNA試料を迅速にスクリーニングする方法を提供する、DNAまたはcDNAアレイ技術を用いることができる。特に検討されるのは、cDNAマイクロアレイ技術である。多くの核酸種の同時計量を可能にするハイブリダイゼーションに基づくプロセスであるマイクロアレイ技術について記述されている（Schena et al., 1995 and 1996; DeRisi et al., 1996）。この技術は、少量の個別の純粋な核酸種のガラス表面上でのロボット・スポッティング、多数の蛍光標識核酸でのこのアレイのハイブリダイゼーション、及びその結果生じる蛍光標識化ハイブリッドのスキャンニング共焦点顕微鏡を用いた検出及び計量を組み合わせる。転写物を検出するために用いられる場合、特定のRNA転写物（mRNA）がDNA（cDNA）に複製され、転写物のこの複製された型が、ガラス表面上に固定される。特定の細胞タイプに存在する転写物mRNAの補体全体が細胞から抽出され、その後、抽出されたmRNAの蛍光標識化cDNA表示が、逆転写と呼ばれる酵素反応によってin vitroでつくられる。異なる色の光を発光する蛍光でそれぞれ標識化された、いくつかの細胞タイプからのmRNAの蛍光標識化表示は、cDNAのアレイにハイブリダイズされ、その後、固定された各cDNAの部位における蛍光発光が計量される。この分析方式の種々の特徴によって、上記方式は、２つの細胞タイプに存在するmRNAの存在量を直接比較するために特に有用になる。そうした比較の目視検査は、発現の速度が非常に大きく異なる遺伝子を見つけるのに十分である。
【００３９】
IV．アンチセンス・コンストラクト
本発明は、特定の遺伝子を下方修正することを対象とするアンチセンス・コンストラクトをさらに用いることができる。『アンチセンス核酸』という用語は、DNA及びRNAの塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを意味することが意図される。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、標的細胞に導入される場合、それらの標的核酸に特異的に結合し、転写、RNAプロセシング、輸送及び／又は翻訳に干渉する。２本鎖(ds)DNAをオリゴヌクレオチドで標的にすると、三重らせんの形成に至り、RNAを標的にすると、二重らせんの形成に至るであろう。
【００４０】
アンチセンス・コンストラクトは、当業者に周知のように、プロモータ及びその他の制御領域、エクソン、イントロンまたは遺伝子のエクソンとイントロンの境界にも結合するように設計することができる。アンチセンスRNAコンストラクト、またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAは、宿主細胞内での遺伝子転写または翻訳またはその両方を、in vitroか、またはヒトの被験者などの宿主動物の体内のようなin vivoのいずれかで阻害するために用いることができる。『相補ヌクレオチド』で構成される核酸配列は、標準Watson-Crick相補規則による塩基の対合が可能な核酸配列である。すなわち、より大きなプリンは、より小さなピリミジンと塩基対をつくって、シトシンと対を成すグアニン（G:C）と、DNAの場合にはチミンと対を成すアデニン（A:T）との、またはRNAの場合にはウラシルと対を成すアデニン（A:U）との組み合わせのみを形成する。
【００４１】
本明細書で用いられるように、『相補的』または『アンチセンス配列』という用語は、それらの全長にわたって実質的に相補的であり、塩基の不一致がきわめて少ない核酸配列を意味する。例えば、全長が15塩基の核酸配列同士は、それらが13または14の位置で不一致が１つまたは２つしかない相補ヌクレオチドを有する場合に、相補的であると称される。当然のことながら、『完全に相補的』な核酸配列とは、それらの全長にわたって完全に相補的であって、塩基の不一致がない核酸配列である。
【００４２】
遺伝子配列の全体または一部は、アンチセンス・コンストラクトとの関連で用いることができるが、統計的には、17塩基長のいずれの配列もヒトゲノム中に１度しか現れず、従って、ただ１つの標的配列を特定するのに十分である。より短いオリゴマーは、作成がより簡単で、in vivoでの利用可能性を増大させるものの、ハイブリダイゼーションの特異性を判定する上で、その他多くの要因が関与する。オリゴヌクレオチドのその相補的標的に対する結合親和性及び配列特異性の両方が、全長が長くなるにつれて増加する。８、９、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上の塩基対のオリゴヌクレオチドを用いることが検討される。内在性遺伝子の機能が影響されるかどうか、あるいは相補的配列を有する関連遺伝子の発現が影響されるかどうかを判定するためにコンストラクトをin vivoで単にテストすることによって、対応する宿主細胞遺伝子の標的化に任意のアンチセンス核酸が有効かどうか容易に判定することが可能である。
【００４３】
いくつかの実施の形態で、例えば、C-5プロピン・ピリミジンを含んでいる成分など、その他の要素を含んでいるアンチセンス・コンストラクトが用いられてもよい。ウリジン及びシチジンのC-5プロピン類縁物質を含んでいるオリゴヌクレオチドは、高い親和性でRNAに結合し、遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害因子であることが示されている（Wagner et al., 1993）。
【００４４】
標的アンチセンス送達の代替として、標的リボザイムを用いることができる。『リボザイム』という用語は、癌遺伝子DNA及びRNAにおいて特定の塩基配列を標的化及び切断することができるRNAからつくられた酵素を意味する。リボザイムは、リボザイム配列を組み込んだRNAオリゴヌクレオチドの形状で細胞に直接標的化されるか、または望まれるリボザイムRNAをコードする発現コンストラクトとして細胞に導入されることのいずれかが可能である。リボザイムは、アンチセンス核酸について述べられたのとほぼ同様の方法で利用、適用することができる。
【００４５】
Ｖ．組み合わせ療法
本発明による組成物及び方法を用いて、多種多様な健康状態または疾患を治療することが検討される。癌のような過増殖性疾患または不調が特に検討される。本発明で治療することが可能な癌には、血液癌、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄芽球性白血病、リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、毛様細胞性白血病、及び急性リンパ性白血病などの血液悪性腫瘍がある。治療することが可能な固形細胞腫瘍及び癌には、脳（グリア芽腫、髄芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、上衣細胞腫）、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、膵臓、結腸、胃、胸部、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭部及び頸部、食道、膀胱の腫瘍などがある。気管支原性燕麦細胞癌、非小細胞肺癌、網膜芽腫、神経芽細胞腫、菌状息肉腫、ウィルムス腫、ホジキン病、骨原性肉腫、軟組織肉腫、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫のようなその他の癌及び腫瘍も、本発明による組成物及び方法を用いて治療することができる。さらに、その癌は、前癌、転移性及び／又は非転移性癌でもよい。
【００４６】
本発明による免疫毒素治療を、過増殖性疾患又は不調のような疾患の治療に有効な薬剤と組み合わせることが望ましい。いくつかの実施の形態で、薬理学的治療剤、外科的治療剤（例えば、外科的処置）、またはそれらの組み合わせなど従来の治療または薬剤が、遺伝子標的を対象とする治療と組み合わせることが検討される。いくつかの実施の形態で、本発明による治療法は、１つ以上の追加的な治療剤と組み合わせて遺伝子の発現を増加または減少させるステップで構成することができる。
【００４７】
このプロセスには、細胞を、薬剤及び免疫毒素に同時に、または一定時間内に接触させるステップが含まれてもよく、そこで、免疫毒素と薬剤の細胞、組織または有機体への個別の投与によって、望まれる治療上の利点が生じる。『接触される』及び『さらされる』という用語は、細胞、組織または有機体に適用される場合、免疫毒素及び／又は治療剤が細胞、組織または有機体へ送達されるか、標的の細胞、組織または有機体に並置されるプロセスについて述べるために本明細書で用いられる。上記細胞、組織または有機体は、免疫毒素及び１つ以上の薬剤の両方を含んでいる単一の組成物または薬理学的製剤に（例えば、投与によって）接触させるか、または上記細胞に、１つの組成物が免疫毒素を含んでおり、別の組成物が１つ以上の薬剤を含んでいる、２つ以上の別個の組成物または製剤を接触させることができる。
【００４８】
上記免疫毒素は、分単位から週単位の範囲の間隔で別の薬剤に先行、同時進行及び／又は後行することができる。免疫毒素及び別の薬剤が細胞、組織または有機体に別々に適用される実施の形態で、免疫毒素と薬剤は、細胞、組織または有機体に好適に組み合わされた効果をその時点でなお発揮することが可能なように、各送達時間の間に著しい経過時間が経たないことが確実にされる。例えば、そのような例において、細胞、組織または有機体を、２、３、４またはそれ以上のモダリティに実質的に同時に（例えば、約１分以内に）免疫毒素として接触させることが検討される。別の態様で、１つ以上の薬剤は、実質的に同時、約１分、約５分、約10分、約20分、約30分、約45分、約60分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、約48時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６７日、約14日、約21日、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約10ヶ月、約11ヶ月、約12ヶ月以内、及びそれらから導き出せるあらゆる時間の範囲内に、免疫毒素を投与する前及び／又は後に投与することができる。
【００４９】
その他の化学療法剤または免疫毒素のいずれかの１回以上の投与が、完全な癌の治癒を達成するために必要であるということも考えられる。第２の治療剤または免疫毒素のいずれか、または本発明によるいずれかの薬剤の１回以上の投与が、治療モダリティとして必要な量投与されるということも考えられる。本明細書で用いられる『効果的な量』とは、特定の遺伝子を誘導または阻害し、さらに疾患を縮小、阻害、さもなければ排除する薬剤の量として定義される。
【００５０】
免疫毒素を構成する組成物を『Ａ』、そして第２の薬剤を『Ｂ』とする、種々の治療の組み合わせを用いることができる：
A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B
B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A
B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A
【００５１】
その他の組み合わせも検討される。各薬剤の正確な投薬量及び処方は、当業者によって適切に変更することが可能である。特定の実施の形態で、本発明による免疫毒素は、第２の薬剤またはその他の治療の前、後または同時に投与することができる。
【００５２】
Ａ．治療剤
治療剤及び投与の方法、投与量などは当業者に十分周知であり（例えば、関連部分において引用によって本明細書に組み込まれる"Physicians Desk Reference", Goodman & Gilman's "The Pharmacological Basis of Therapeutics", "Remington's Pharmaceutical Sciences" 及び "The Merck Index, Eleventh Edition" を参照されたい）、本明細書での開示を踏まえて本発明と組み合わせることができる。投与量のいくつかの変動が、治療を受けている被験者の状態に応じて必然的に生じる。投与の担当者は、いずれにしても、個々の被験者にとって適切な投与量を決定し、そのような個々の決定は、当業者の技能の範囲内である。
【００５３】
Ｂ．過増殖性疾患の治療剤
過増殖性疾患には癌などがあり、そのために抗癌剤または外科処置のように多種多様な治療処方が存在する。『抗癌』剤は、例えば、癌細胞を殺す、癌細胞にアポトーシスを誘導する、癌細胞の成長速度を小さくする、発生率または転移の数を減らす、腫瘍の大きさを小さくする、腫瘍成長を阻害する、腫瘍または癌細胞への血液供給を減らす、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進する、癌の進行を抑制または阻害する、あるいは、癌に罹患した被験者の寿命を延ばすことによって、被験者の癌に負の影響を与えることが可能である。
【００５４】
抗癌剤には、生物剤（生物療法）、化学療法剤及び放射線治療剤などがある。より一般的には、これらその他の組成物は、上記細胞の増殖を停止または阻害するのに十分な組み合わされた量で提供されるであろう。このプロセスには、上記細胞を、発現コンストラクト及び薬剤または複数の因子に同時に接触させるステップが含まれてもよい。これは、同時に、上記細胞を、両方の薬剤を含んでいる単一の組成物または医薬品製剤に接触させることによって、あるいは、上記細胞を、２つの別個の組成物または製剤に接触させることによって達成することができ、そこで、１つの組成物は発現コンストラクトを含んでおり、他方の組成物は第２の薬剤を含んでいる。
【００５５】
化学療法剤及び放射線治療剤に対する腫瘍細胞の抵抗性は、臨床腫瘍学における主要な問題である。現在の癌研究の１つの目的は、化学療法及び放射線治療の効果を、それを遺伝子治療と組み合わせることによって向上させる方法を見いだすことである。例えば、単純ヘルペス・チミジン・キナーゼ（HS-tK）遺伝子は、レトロウイルス・ベクター系によって脳腫瘍に送達される場合、抗ウイルス剤ガンシクロビルへの感受性を誘導することに成功した（Culver, et al., 1992）。本発明に関連して、免疫毒素を用いる治療は、化学療法、放射線治療、免疫療法またはその他生物学的干渉、加えて、その他アポトーシス促進性または細胞周期調整剤と併せて同様に用いることが可能なことが検討される。
【００５６】
１．化学療法剤
多種多様な化学療法剤は、本発明による免疫毒素と組み合わせて用いることができる。『化学療法』という用語は、癌を治療するための薬物の利用を意味する。『化学療法剤』とは、癌の治療において投与される化合物または組成物を意味するために用いられる。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性の形態によって分類される。薬剤は、直接DNAに架橋する、DNAにインターカレートする、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体及び分裂の異常を誘導する、その能力に基づいて特徴づけることができる。薬剤は、遺伝子発現を誘導または阻害するその能力によって特徴づけることもできる。
【００５７】
殆どの化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイド・ホルモン、分裂抑制剤、及びニトロソウレアという分類に該当するが、これらの分類に限られるものではない。免疫毒素は、本発明による１つ以上のこれらの薬剤と組み合わされて使用可能であることが検討される。
【００５８】
ａ．アルキル化剤
アルキル化剤は、ゲノムDNAと直接相互作用して、癌細胞が増殖するのを防ぐ薬物であり、本発明と組み合わせて用いることができる。この分類の化学療法剤は、細胞周期のすべての期に影響を及ぼす、すなわち、それらは周期に特異的ではない薬剤である。アルキル化剤は、慢性白血病、非ホジキン・リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び胸部、肺及び卵巣の特定の癌を治療するために使用することが可能である。アルキル化剤には、ブスルファン（ミレラン）、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド（サイトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、メクロレタミン（マスタージェン）、及びメルファラン（アルケラン、L-フェニルアラニン・マスタード、フェニルアラニン・マスタード、L−PAMまたはL−サクロリシンとしても周知である）などがある。免疫毒素は、これらアルキル化剤、または類縁物質またはそれらの誘導体のいずれか１つ以上と組み合わせて癌を治療するために用いることが可能である。
【００５９】
ｂ．代謝拮抗剤
代謝拮抗剤は、DNA及びRNA合成を破壊するものであり、本発明と組み合わせて用いることもできる。アルキル化剤と異なり、代謝拮抗剤はＳ期の細胞周期に特異的に影響を及ぼす。代謝拮抗剤は、胸部、卵巣及び消化管の腫瘍に加えて、慢性白血病を治療するために用いられてきた。代謝拮抗剤には、5-フルオロウラシル（5-FU）、シタラビン（Ara-C）、フルダラビン、ゲムシタビン、及びメトトレキサート、または類縁物質またはそれらの誘導体などがある。
【００６０】
ｃ．抗腫瘍抗生物質
抗腫瘍抗生物質は、抗菌活性及び細胞毒性活性の両方を持ち、本発明と組み合わせて用いることもできる。これらの薬物は、化学的に酵素及び分裂を阻害することによって、または細胞膜を変化させることによってDNAにも干渉する。これらの薬剤は、細胞周期の期に特異的ではなく、細胞周期のすべての期に働く。従って、上記薬剤は、種々の癌に対して広範に用いられる。抗腫瘍抗生物質の例には、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ（ダクチノマイシン）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、マイトマイシン（ミトマイシン及び／又はマイトマイシン-Cとしても周知である）、プリコマイシン、及びイダルビシン、アントラサイクリン及びアントラサイクリノンまたは類縁物質またはそれらの誘導体などがある。
【００６１】
ｄ．コルチコステロイド・ホルモン
コルチコステロイド・ホルモンは、いくつかのタイプの癌（リンパ腫、白血病及び多発性骨髄腫）を治療する上で有用であり、本発明と組み合わせて用いることもできる。これらのホルモンは、多くの非癌状態の治療に用いられてきたが、それらは、癌細胞の成長を停止または減速させるために使用される場合、化学療法薬とみなされる。コルチコステロイド・ホルモンには、プレドニゾン及びデキサメタゾンまたは類縁物質またはそれらの誘導体などがある。
【００６２】
ｅ．分裂抑制剤
分裂抑制剤には、植物アルカロイド、及び細胞分裂に必要な蛋白質合成または有糸分裂のいずれかを阻害することができるその他の天然薬剤などがある。分裂抑制剤は細胞周期の特定の期に働く。分裂抑制剤は、ドセタキセル、エトポシド（VP16）、パクリタキセル、タクソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビン(vinorelbine)または類縁物質またはそれらの誘導体で構成される。これらの抑制剤は、本発明と組み合わせて治療モダリティとして用いることもできる。
【００６３】
ｆ．ニトロソウレア
ニトロソウレアは、アルキル化剤と同様に、DNA修復蛋白質を阻害する。ニトロソウレアは、脳腫瘍に加えて、非ホジキン・リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性黒色腫を治療するために用いられる。ニトロソウレアの例には、カルムスチン及びロムスチン、または類縁物質またはそれらの誘導体などがある。
【００６４】
ｇ．その他の薬剤
癌の組み合わせ治療に用いるために本発明と共に用いることができると考えられるその他の化学療法剤には、アムサクリン、L-アスパラギナーゼ、トレチノインのようなレチノイド、及び腫瘍壊死因子（TNF）、または類縁物質またはそれらの誘導体などがある。
【００６５】
２．補助的治療
その他の薬剤または治療は、本発明と組み合わせて用いることもできる。これらには、放射線治療、免疫療法、遺伝子治療及びホルモン療法などがある。
【００６６】
ａ．放射線治療
DNA損傷を引き起こし、広範囲に用いられてきたその他の因子には、γ線、X線、及び／又は放射性同位体の腫瘍細胞を対象とする送達などがある。超音波及びUV照射のようなDNA損傷因子のその他の形式も検討される。これらの因子のすべてが、多様な損傷をDNAに、DNA前駆物質に、DNAの複製及び修復に、及び染色体の構築及び維持に引き起こす。X線の照射量の範囲は、長期（３週間から４週間）の場合の１日あたり50から200レントゲンから、単回照射の場合の2000から6000レントゲンの範囲である。放射性同位体の照射量の範囲は広範囲に及んでさまざまであり、同位体の半減期、照射される放射線の強度及びタイプ、及び腫瘍性細胞による取り込みによって決まる。
【００６７】
ｂ．免疫療法
免疫療法剤は、一般に、癌細胞を向標、破壊するための免疫エフェクター細胞または分子の利用に依拠する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体でもよい。上記抗体は単独で治療のエフェクターの役割を果たしてもよく、または細胞を実際に殺すために他の細胞を動員してもよい。上記抗体は、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に接合し、単に標的剤としての役割を果たすこともできる。あるいは、上記エフェクターは、直接または間接に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びNK細胞などがある。
【００６８】
組み合わせ治療の一般的な方法について以下に検討する。１つの態様で、免疫療法は、腫瘍細胞を向標するために用いることが可能である。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちいずれもが、本発明との関連で向標するために好適である。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児性抗原、前立腺特異抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン・レセプター、ラミニン・レセプター、erb B及びp155などがある。代替的な免疫刺激分子も存在し：インターロイキン１（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-インターフェロン、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、Flk2/Fkt3リガンド、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、及び腫瘍壊死因子（TNF）、MIP-1、MCP-1のようなケモカイン、及びFLT3リガンドのような成長因子などのサイトカインなどがある。蛋白質として、または本発明の免疫毒素に基づく組み合わせ療法と組み合わせた遺伝子送達を用いることのいずれかで、免疫刺激分子を組み合わせることによって、抗腫瘍効果が高められることになる。
【００６９】
ｃ．受動免疫療法
癌の受動免疫療法について数多くの異なる方法が存在する。それらは、概ね以下に分類することができる：抗体単独での注入；毒素または化学療法剤と合わせた抗体の注入；放射性同位体と合わせた抗体の注入；抗イディオタイプ抗体の注入；そして最後に、腫瘍細胞の骨髄での瀉下。
【００７０】
ｄ．能動免疫療法
能動免疫療法では、抗原性ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質、あるいは自己または同種腫瘍細胞組成物または『ワクチン』が、一般に別個のバクテリア免疫賦活剤と共に投与される（Ravindranath and Morton, 1991; Morton and Ravindranath, 1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993）。
ｅ．養子免疫療法
養子免疫療法では、循環している患者のリンパ球、または腫瘍が浸潤したリンパ球をin vitroで単離し、IL-2のようなリンフォカインで活性化するか、または腫瘍壊死のための遺伝子を形質導入し、そして再投与する（Rosenberg et al., 1988; 1989）。これを達成するため、活性化されたリンパ球は、本明細書で述べられたような免疫賦活剤組込み抗原ペプチド組成物と組み合わせて免疫学的に有効な量を動物またはヒトの患者に投与されるであろう。活性化されたリンパ球は、血液または腫瘍試料から事前に単離されてin vitroで活性化（または拡大）された患者自身の細胞であることがもっとも好ましい。
【００７１】
３．遺伝子治療
特定の実施の形態で、二次的な治療は、本発明による免疫毒素が検討される遺伝子治療である。種々の蛋白質が本発明の範囲内に含まれ、それには、細胞増殖の阻害因子及びプログラム細胞死の制御因子などがある。下の表１に、本発明と組み合わせた何らかの形の遺伝子治療のために標的にすることができる種々の遺伝子を挙げる。
【００７２】
ａ．細胞増殖の阻害因子
腫瘍サプレッサは、過度の細胞増殖を阻害するためにはたらく。これら遺伝子の不活性化により、それらの阻害活性は破壊され、無秩序な増殖に至る。従って、本発明は、p53、p16及びC-CAMのような腫瘍サプレッサと組み合わせることが検討される。
【００７３】
本発明によって用いることができるその他の遺伝子には、Rb、APC、mda-7、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓遺伝子（例えば、COX-1、TFPI）、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fins、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管形成に関与する遺伝子（例えば、VEGF、PGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはそれらのレセプター）及びMCCなどがある。
【００７４】
ｂ．プログラム細胞死の制御因子
蛋白質及びICE様プロテアーゼのBcl-2ファミリーは、その他の系でも重要な制御因子及びエフェクターであることが示されてきた。Bcl-2蛋白質は、種々の多様なアポトーシス刺激に応答してアポトーシスを制御し、細胞の生存を増強する上で重要な役割を果たす（Bakhshi et al., 1985; Cleary and Sklar, 1985; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto and Croce, 1986）。従って、Bcl-2及び抗アポトーシス蛋白質のBcl-2ファミリー（例えば、BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1）、またはアポトーシス促進性蛋白質のBcl-2ファミリー（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri）が本発明と共に使用できることが検討される。
【００７５】
ｃ．成長因子
その他の実施の形態で、本発明は、成長因子またはリガンドを用いることができる。その例には、VEGF/VPF、FGF、TGFβ、TIEに結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチン・イソ型、散乱因子、肝細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板因子（PF4）、PDGF、KITリガンド（KL）、コロニー刺激因子（CSFs）、LIF及びTIMPなどがある。
【００７６】
【表１】
2006506964.tif 000002
2006506964.tif 000003
2006506964.tif 000004
2006506964.tif 000005
４．その他の薬剤
その他の薬剤が本発明と組み合わせて用いられて、処置の治療効果を向上させることが検討される。これらの追加的な薬剤には、免疫調整剤、細胞表面及びGAP接合部の上方制御に影響を及ぼす薬剤、細胞増殖抑止剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導因子に対する過増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、またはその他の生物剤などがある。免疫調整剤には、腫瘍壊死因子；及びその他のサイトカイン；F42K及びその他のサイトカイン類縁物質；またはMIP-1、MIP-1ベータ、MCP-1、RANTES、及びその他のケモカインなどがある。細胞表面レセプター、またはFas/Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAIL（Apo-2リガンド）のようなそれらのリガンドの上方制御は、過増殖性細胞への自己分泌またはパラ分泌効果の確立によって、本発明の抗癌能力を増強することが、さらに検討される。GAP接合部の数を増やすことなどによる細胞間シグナルの増加によって、隣接する過増殖性細胞集団に対する抗過増殖性効果は増大するであろう。その他の実施の形態で、細胞増殖抑止剤及び分化剤は本発明と組み合わせて用いられて、治療の抗過増殖性効果を向上させることが可能である。細胞接着阻害剤は、本発明の効果を向上させるために検討される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（FAK）阻害剤及びロバスタチンである。抗体c225のような、アポトーシスに対する過増殖性細胞の感受性を増加させるその他の薬剤が本発明と組み合わせて用いられて、治療の抗過増殖性効果を向上させるであろうことがさらに検討される。
【００７７】
細胞毒性化学療法薬の導入を受けて癌治療に多くの進展があった。しかし、化学療法の結果の１つは、薬物耐性表現型の発生／獲得及び多剤耐性の発生である。薬剤耐性の発生は、今でもそのような腫瘍の治療における主要な障害であり、従って、遺伝子治療のような代替的アプローチに対する明らかなニーズがある。
【００７８】
多くの研究者の研究によって、TRAILに耐性を持つ腫瘍細胞は、薬剤／サイトカインの準毒性濃縮によって増感させることが可能であり、増感腫瘍細胞はTRAILによって顕著に死に至ることが示されている（Bonavida et al., 1999; Bonavid et al., 2000; Gliniak et al., 1999; Keane et al., 1999）。さらに、CPT-11またはドキソルビシンのような化学療法剤をTRAILと組み合わせることによっても、抗腫瘍活性が増強され、アポトーシスが増加する。これらの効果の一部は、TRAILまたは同族レセプターの上方制御を介して媒介することができるが、その他の効果は媒介することができない。
【００７９】
化学療法、放射線治療または生物学的治療と併せて用いるための治療の別の形式には、患者の組織を高温（最高106 oFまで）にさらす処置である温熱療法などがある。外部または内部加熱装置が、局部、局所または全身温熱療法の適用に必要とされてもよい。局部温熱療法には、腫瘍のような狭い面積への加熱を含む。熱は、体外の装置から腫瘍を向標する高周波を使って外部から発生させることができる。内部の熱は、加熱された細いワイヤーまたは温水を満たした中空管などの殺菌したプローブ、埋め込まれたマイクロ波アンテナ、またはラジオ波電極を使用してもよい。
【００８０】
患者の臓器または手足は局所療法のために加熱され、その局所療法は、磁石のような高エネルギーを発生する装置を用いて達成される。あるいは、患者の血液の一部を採血、加熱し、その後、内部的に加熱される領域に潅流させることができる。全身の加熱は、癌が身体全体に広がっている場合に実施することもできる。温水毛布、熱いワックス、誘導コイル及び保温チェンバーは、この目的のために用いることができる。
【００８１】
ホルモン療法は、本発明と併せて、または先に述べられたその他いずれかの癌療法と組み合わせて用いることもできる。ホルモンの利用は、胸部、前立腺、卵巣または子宮頸部の癌のような特定の癌の治療に用いられて、テストステロンまたはエストロゲンのような特定のホルモンのレベルを低下させるか、または上記ホルモンの効果を妨げることができる。この治療は、多くの場合、治療のオプションとして、または転移のリスクを減らすため、少なくとも１つのその他の癌療法と組み合わせて用いられる。ロテノンのような反応性オキシジェン(oxyen)種の誘導因子は、本発明による免疫毒素と組み合わせて用いることもできる。
【００８２】
５．外科処置
癌患者の約60％は何らかのタイプの外科処置を受けることになり、それには、予防的、診断的または病期決定的、治癒的及び苦痛緩和的な外科処置などがある。治癒的外科処置は、本発明による治療、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法及び／又は代替療法のような、その他の療法と組み合わせて用いることができる。
【００８３】
治癒的外科処置には、癌性組織の全部または一部が物理的に除去、摘出及び／又は破壊される切除などがある。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を意味する。腫瘍切除に加えて、外科処置による治療には、レーザー手術、凍結外科、電気外科、及び微視的に制御される外科処置（モース外科手術）などがある。本発明は、表層癌、前癌、または正常組織の付随的な量の除去と併せて用いることができることがさらに検討される。
【００８４】
癌性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部の切除の結果、窩洞が身体に形成される場合がある。治療は、潅流、直接注入、または上記領域の局部的処置によって追加的な抗癌療法で達成することができる。そうした治療は、例えば、１、２、３、４、５、６または７日ごと、または１、２、３、４及び５週ごと、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12ヶ月ごとに繰り返すことができる。これらの治療では投薬量が変化してもよい。
【００８５】
VI．実施例
以下の実施例は、本発明の特定の実施の形態を示すために挙げられる。当業者であれば、以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見いだされた技術を代表しており、従って、その実施のための形態を構成するとみなすことができることを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて多くの変更が、開示される特定の実施の形態においてなされ、それでもなお本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解すべきである。
【実施例１】
【００８６】
cDNA発現マイクロアレイのための試料調製
ヒト黒色腫A375-M細胞をscFvMEK/rGelでIC50濃度（10 nM）で24時間処理し、未処理細胞をコントロールとして用いた。約1 x 107個の細胞を5 mlのTRIzol試薬（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）を加えることによって直接溶解した。1 mlに等分した溶解物を、200μlのクロロホルムを含んでいるチューブに加えた。その試料を振動し、遠心分離にかけた（15分、10,000 xg）。上部相を取り出し、0.5 mlのイソプロピル・アルコールを含んでいる清潔なチューブ内に入れ、室温で10分間培養し、その後10,000 xgで10分間遠心分離にかけた。RNAペレットを75%エタノールで洗浄し、リボヌクレアーゼを含まない水に溶解した。RNAの量を、ホルムアルデヒド／アガロース・ゲル電気泳動によって変性させることによって評価した。マイクロアレイ実験及び分析は、Cancer Genomics Core Lab of M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TXによって行なった。
【実施例２】
【００８７】
マイクロアレイ・データ処理及び分析
アレイの概要−試料情報
スライドは、4800スポットを有するCG4.1アレイ・デザインであった。各アレイは、２回複製された2304個の遺伝子、グリッドあたり48個の正のコントロール・スポット、グリッドあたり48個の負のコントロール・スポット、及び96個の空のスポットを有した。
【００８８】
信号対雑音（S/N）比の評価
画像の信号対雑音を評価して、何個のスポットが、雑音を上回る十分なシグナル強度を有するかという点からアレイの量を判定した。quantification software (Array Vision) によって提供される信号対雑音の測定は、以下のように定義される；スポット密度からバックグラウンド密度を差し引き、バックグラウンド密度の標準偏差（SD）で除する。
【００８９】
このセットのアレイでは、S/N＞2.0を、何個のスポットが適切なシグナルを発したか評価するための基準として用いた（シグナル強度とバックグラウンド強度の差は、ローカル・バックグラウンドの標準偏差の２倍よりも大きくなければならない）。
2006506964.tif 000006
【００９０】
正規化及び閾値
各アレイについてバックグラウンド補正済みスポット強度を正規化し、発現した遺伝子の中央値に対する代理値として、75thパーセンタイル値を1000とした。データ・セットを正規化した後、その正規化された強度レベルが閾値150よりも小さいあらゆるスポットが、閾値で置き換えた値を有した。その後、バックグラウンド補正済みの正規化されたシグナル強度をさらなるデータ分析のために対数変換した（底は２）。対数比率は：
ｌｏｇ２（ＩＣｙ５／ＩＣｙ３）
として、すなわち、Cy5チャネル上の遺伝子対Cy3チャネル上の遺伝子の比率の対数として計算される。
【００９１】
データ処理
『平滑t-統計量』と称される統計的手法を、各アレイ上の遺伝子発現プロファイルを正確に判定するために適用した。『平滑t-統計量』は、『スチューデント化された対数比率』、すなわち、観察された変動性を説明するために再測定された試料間の遺伝子発現レベルの対数比の推定値として解釈することも可能である。この方法によって、チャネル内のスポットの平均対数強度と標準偏差の両方が推定される。実際、標準偏差は、平均値の関数として変動するので、これらの推定値は、標準偏差を表す平滑関数に適合させるために用いられた。上記2つのチャネルからの標準偏差のこれらの推定値をプールした後、t-統計量を各遺伝子ごとに計算し、それを、独立的に遺伝子毎に基づいた標準偏差の未加工推定値を用いることによって得られる推定値から識別した。マイクロアレイからのすべての計算された平滑t-統計量のセットをt-スコアと称する。
【００９２】
『識別的に発現する遺伝子』の判定
第1のステップは、（アレイ上の複製対スポットに基づいた）任意のアレイ上の不十分にしか再現可能でない遺伝子にフラグを立てることである。不十分にしか再現可能でない遺伝子にフラグを立てるために用いられる基準は以下のとおりである：複製された遺伝子の対数強度の差が、ばらつきの平滑推定値の４倍を超える場合には、その複製された遺伝子は、『不十分にしか再現可能でないスポット』とみなされ、フラグが立てられる。
【００９３】
次に、『識別的に発現する遺伝子』を、t-スコアのカットオフ値に基づいて判定した。両方のアレイについて、Cy3に対して｜t-スコア｜＞３、及びCy5に対して｜t-スコア｜＞4.0の場合に、遺伝子が識別的に発現したと認められた。t-スコアが正の値をとる場合、それは、Cy3チャネルにおける発現レベルがCy5チャネルにおけるよりも高いことを意味する。それが負の値をとる場合、発現レベルは逆方向である。
【実施例３】
【００９４】
A375黒色腫細胞のマイクロアレイ分析
１つのスライドを、scFvMEL/rGelで処理したA375黒色腫細胞で分析した。コントロール細胞をCy5で、A375 ZR24をCy3で標識付けした。表は、アレイ上のスポットの位置、シグナルがどの程度良好かを示す平均対数強度値（底は２）、識別的に発現する遺伝子を判定するために用いられる平滑化Tスコア、Cy5/Cy3またはCy3/Cy5比率及び遺伝子の概要を示す。負の平滑Ｔ値は、阻害されると考えられる遺伝子を表す。正の平滑Ｔ値は、誘導されると考えられる遺伝子を表す
【００９５】
【表２】
2006506964.tif 000007
2006506964.tif 000008
【実施例４】
【００９６】
内皮細胞のマイクロアレイ分析
上に述べられたように、スライドを、VEGF/rGelで処理したヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）で分析した。コントロール細胞をCy5で、HUVEC ZR24をCy3で標識付けした。表は、アレイ上のスポットの位置、シグナルがどの程度良好かを示す平均対数強度値（底は２）、識別的に発現する遺伝子を判定するために用いられる平滑化Tスコア、Cy5/Cy3またはCy3/Cy5比率及び遺伝子の概要を示す。負の平滑Ｔ値は、下方制御された遺伝子を表す。正の平滑Ｔ値は、上方制御された遺伝子を表す（表３）。
【００９７】
【表３】
2006506964.tif 000009
2006506964.tif 000010
【実施例５】
【００９８】
HUVEC細胞処理免疫毒素における治療剤の同定
HUVEC細胞における免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された遺伝子の１例は、トポイソメラーゼII（表２）であり、それは、DNAらせんの両方のストランドの一時的な切断及び再連結によってスーパーコイル化されたDNAの弛緩を触媒することに関与する。本発明による方法によって、エトポシドと、ドキソルビシンのようなアンスラシルシンとのようなトポイソメラーゼIIの阻害剤が、トポイソメラーゼ遺伝子発現及び活性及びその細胞生成物の下方制御をさらに促進する治療剤として同定される。本発明による方法によって、これらの治療剤が、トポイソメラーゼII遺伝子発現及び活性及びその細胞生成物を下方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するために免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することが提案される。
【００９９】
HUVEC細胞（表２）における免疫毒素治療によって下方制御されていると同定された遺伝子の別の例は、スペルミン・シンターゼである。スペルミンは、細胞の増殖、分化及び形質転換に不可欠なポリアミンのグループに属し、しばしばヒト腫瘍に多く見られる。従って、本発明による方法に従って、ポリアミン阻害剤N-(3-アミノプロピル)シクロヘキシルアミン（APCHA）、N-シクロヘキシル-1,3-ジアミノプロパン（C-DAP）、N-(n-ブチル)-1,3-ジアミノプロパン、S-アデノシル-1,12-ジアミノ-3-チオ-9-アザドデカン（AdoDatad）、ジフルオロメチルオルニチン（DFMO）、メチル・グリオキサール・ビス・グアニルヒドラゾン（MGBG）、及びメチル・グリオキサール・ビス（シクロペンチルアミジノヒドラゾン）MGBCPのようなスペルミン・シンターゼの阻害剤が、スペルミン・シンターゼ遺伝子発現及び活性、及びその細胞生成物の下方制御をさらに促進する治療剤として同定される。これらの治療剤は、本発明による方法に従って、スペルミン・シンターゼ発現及び活性を下方制御することによって、過増殖性疾患のような疾患を治療するための免疫毒素治療と組み合わせて患者に投与することができる。
【実施例６】
【０１００】
高レベルの誘導を有する遺伝子のマイクロアレイ・データの分析
上の実施例４に述べられたように、スライドを、VEGF/rGelで処理したヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）で分析した。表３は識別的に発現した遺伝子を示す。上方制御された遺伝子のこれまでの所見を確かめるために、最高レベルの誘導を示した遺伝子、すなわち；E-セレクチン（ＳELE）、サイトカインA2（SCYA2）、腫瘍壊死因子アルファ誘導蛋白質３（TNFAIP3）、及びNFKB阻害因子アルファ（NFKBIA）についてRT-PCR分析を行なった。
【０１０１】
プライマーを、マイクロアレイからの受入れ番号及びBlast（NCBI）を用いた相同性の確認に基づいて設計した。GAPDHプライマーをコントロールとして作成した。そのプライマーは以下のとおりであった：SELE正方向  5' GGTTTGGTGAGGTGTGCTC（配列識別番号No：１）、SELE逆方向5'TGATCTTTCCCGGAACTGC（配列識別番号No：２）、SCYA2正方向5'TCTGTGCCTGCTGCTCATAG（配列識別番号No：３）、SCYA2逆方向5'TGGAATCCTGAACCCACTTC（配列識別番号No：４）、TNFAIP3正方向5'ATGCACCGATACACACTGGA（配列識別番号No：５）、TNFAIP3逆方向5'CGCCTTCCTCAGTACCAAGT（配列識別番号No：６）、NFKBIA正方向5'AACCTGCAGCAGACTCCACT（配列識別番号No：７）、NFKBIA逆方向5'GACACGTGTGGCCATTGTAG（配列識別番号No：８）、GAPDH正方向5'GTCTTCACCACCATGGAG（配列識別番号No：９）、GAPDH逆方向5'CCACCCTGTTGCTGTAGC（配列識別番号No：10）。
【０１０２】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を10 cmの培養皿で成長させ、未処理のまま放置、またはIC50線量VEGF121/rGelで４時間及び24時間処理のいずれかを行なった。実施例１で述べられたように、上記細胞を回収し、すべてのRNAをTRIzol試薬（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）を用いて単離した。RNAの完全性をアガロース・ゲル電気泳動及びUV吸収度によって検証した。第１ストランドcDNAを、Superscript First Strand Synthesis System（Invitrogen）の製造業者によって述べられたように合成した。RT-PCRをMinicycler PCR machine（MJ Research, Inc.）を使って行なった。
【０１０３】
すべてのPCR生成物は予想されたサイズであった。GAPDHのために正規化されて、４つのPCR生成物のすべてがVEGF121/rGelでの処理で増加を示し、元のマイクロアレイに見られる結果を実証した。上記結果は以下を示唆した：１）マイクアレイ分析で得られた結果は信頼性がある、そして、２）HUVECのVEGF121/rGelでの処理は、中間代謝及び炎症経路に関与するいくつかの遺伝子のRNAレベルの増加をもたらす。
【０１０４】
本明細書で開示され、特許請求される組成物及び方法のすべては、本発明の開示を踏まえて過度の実験を行なうことなく作成、実施することが可能である。本発明の組成物及び方法は、実施の形態という形で述べられてきたが、当業者には、上記組成物及び方法に、そして、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなしに本明細書で述べられた、上記方法のステップまたは一連のステップにおいて、変形が適用できることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び物理的の両方に関連する特定の薬剤は、同一または類似の結果が達成されると共に、本明細書で述べられた薬剤に置き換えられることが明らかであろう。当業者に明らかなそうした置換え及び変形のすべては、添付請求項によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【０１０５】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書で述べられた参考文献を補足する典型的な手順またはその他の詳細を提供する程度において、引用によって本明細書に具体的に組み込まれる。
米国特許RE37,462号明細書
米国特許5,359,046号明細書
米国特許6,099,842号明細書
WO 89/00999号国際公開パンフレッド
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【配列表】
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