(57)【要約】本発明は、新規な抗体ワクチン複合体と、同ワクチンを用いて細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）応答を誘導する方法とを提供するものである。ある具体的な実施態様では、本ワクチン複合体は、抗マンノース受容体（MR）抗体に連結させたヒト絨毛性性腺刺激ホルモン・ベータ・サブユニット（βhCG）抗原を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト抗原提示細胞（APC）に結合するモノクローナル抗体を、βヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βhCG)に連結させて含む分子複合体。
【請求項２】
前記抗体がヒト樹状細胞上に発現したＣ型レクチンに結合する、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項３】
前記抗体がヒトマンノース受容体に結合する、請求項１又は２に記載の分子複合体。
【請求項４】
前記抗体がヒト、ヒト化及びキメラ抗体から成る群より選択される、上記請求項のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項５】
前記抗体が、全抗体、Fabフラグメント及び一本鎖抗体から成る群より選択される、上記請求項のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項６】
前記複合体が組換え融合タンパク質である、請求項１に記載の分子複合体。
【請求項７】
前記抗体が、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4配列を含むヒト重鎖可変領域と、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4配列を含むヒト軽鎖可変領域とを含み、但しこの場合：
（ａ）前記ヒト重鎖可変領域CDR3配列が、配列番号 15及びその保存的改変を含み；そして
（ｂ）前記ヒト軽鎖可変領域CDR3配列が、配列番号18及びその保存的改変を含む、
上記請求項のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項８】
前記ヒト重鎖可変領域CDR2配列が配列番号14及びその保存的改変を含み；そして前記ヒト軽鎖可変領域CDR2配列が配列番号17及びその保存的改変を含む、請求項６に記載の分子複合体。
【請求項９】
前記ヒト重鎖可変領域CDR1配列が配列番号13及びその保存的改変を含み；そして前記ヒト軽鎖可変領域CDR1配列が配列番号16及びその保存的改変を含む、請求項７又は８に記載の分子複合体。
【請求項１０】
前記抗体が：
（ａ）ヒトVH5-51生殖細胞系配列（配列番号30）を由来とする重鎖可変領域；及び
（ｂ）ヒトVk-L15 (配列番号32)生殖細胞系配列を由来とする軽鎖可変領域、を含む、
請求項１に記載の分子複合体。
【請求項１１】
前記抗体が、それぞれ配列番号4及び配列番号8に示されたアミノ酸配列、又は、前記抗体がヒト樹状細胞への結合能を保持しているように配列番号4又は配列番号8に充分相同なアミノ酸配列、を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖可変領域を含む、上記請求項のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項１２】
いずれか又は両方の鎖をβhCGに連結させたヒト抗体重鎖及びヒト抗体軽鎖、を含む分子複合体。
【請求項１３】
前記重鎖がβhCGに連結してあると共に、配列番号2に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の分子複合体。
【請求項１４】
前記軽鎖が配列番号6に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１２又は１３に記載の分子複合体。
【請求項１５】
ヒト抗原提示細胞（APC）に結合するモノクローナル抗体をβヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βhCG）に連結させて含む分子複合体であって、但し前記抗体が：
（ａ）ヒトVH5-51生殖細胞系配列 (配列番号30)を由来とする重鎖可変領域；及び
（ｂ）ヒトVk-L15 (配列番号32)生殖細胞系配列を由来とする軽鎖可変領域、
を含む、分子複合体。
【請求項１６】
ヒト抗原提示細胞（APC）に結合するヒト一本鎖抗体を、βヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（βhCG)に連結させて含む分子複合体であって、配列番号12に示されたアミノ酸配列を含む、分子複合体。
【請求項１７】
Ｔ細胞媒介性免疫応答が抗原に対して生ずるように、APCにより内部移行してプロセッシングされる、上記請求項のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞応答が細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される、請求項１７に記載の分子複合体。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞応答がCD4＋及びCD8＋T細胞の両方により媒介される、請求項１７又は１８に記載の分子複合体。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞応答が、MHCクラスＩ及びMHCクラスＩＩ経路の両方を通じて誘導される、請求項１７乃至１９のいずれかに記載の分子複合体。
【請求項２１】
上記請求項のいずれかに記載の分子複合体と、薬学的に許容可能な担体とを、選択的にはアジュバントと組み合わせて含む組成物。
【請求項２２】
βhCGに対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘導又は亢進する方法であって、抗原に対するＴ細胞媒介性応答が誘導又は亢進される態様で前記抗原がプロセッシングされ、Ｔ細胞に提示されるように、上記請求項のいずれかに記載の分子複合体をAPCに接触させるステップを含む、方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞応答がCD4＋及びCD8＋T細胞の両方により媒介される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞応答が細胞傷害性Ｔ細胞及び／又はヘルパＴ細胞により媒介される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｔ細胞応答が、MHCクラスＩ及びMHCクラスＩＩ経路の両方を通じたＴ細胞への抗原の交差提示により誘導される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記βhCG抗原が腫瘍細胞により発現される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞が、結腸、肺、膵臓、乳房、卵巣、及び生殖細胞を由来とする腫瘍細胞から成る群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分子複合体を樹状細胞にin vivoで接触させる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記分子複合体を樹状細胞にex vivoで接触させる、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
樹状細胞の増殖を刺激するサイトカイン、選択的にGM-CSF又はFLT3-Lに、前記樹状細胞を接触させるステップを更に含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
免疫刺激性作用薬、選択的にはCTLA-4に対する抗体に、前記樹状細胞を接触させるステップを更に含む、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
上記請求項のいずれかに記載の分子複合体を、選択的にはアジュバント、樹状細胞の増殖を刺激するサイトカイン、及び／又は免疫刺激性作用薬と組み合わせて、投与するステップを含む、対象を免疫する方法。
【請求項３３】
抗原と、抗原提示細胞（APC）に結合するモノクローナル抗体との複合体を形成するステップと、
前記抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導又は亢進する態様で、前記抗原が内部移行し、プロセッシングされ、そしてＴ細胞に提示されるように、前記複合体をin vivo 又は ex vivo でAPCに接触させるステップと
を含む、抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導又は亢進する方法。
【請求項３４】
更に前記抗原に対するヘルパT細胞応答を誘導又は亢進する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記Ｔ細胞応答がCD4＋及びCD8＋T細胞の両方により媒介される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｔ細胞応答が、MHCクラスＩ及びMHCクラスＩＩ経路の両方を通じて誘導される、請求項３３乃至３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体が、ヒト樹状細胞上に発現したＣ型レクチンに結合する、請求項３３乃至３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体がヒトマンノース受容体に結合する、請求項３３乃至３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、ヒト、ヒト化及びキメラ抗体から成る群より選択される、請求項３３乃至３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が全抗体、Fabフラグメント及び一本鎖抗体から成る群より選択される、請求項３３乃至３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4配列を含むヒト重鎖可変領域と、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4配列を含むヒト軽鎖可変領域とを含み、但し：
（ａ）前記ヒト重鎖可変領域 CDR3配列が、配列番号 15及びその保存的改変を含み；そして
（ｂ）前記ヒト軽鎖可変領域CDR3配列が配列番号 18及びその保存的改変を含む、
請求項３３乃至４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記ヒト重鎖可変領域CDR2配列が配列番号14及びその保存的改変を含み、そして前記ヒト軽鎖可変領域CDR2配列が配列番号17及びその保存的改変を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒト重鎖可変領域CDR1配列が配列番号13及びその保存的改変を含み、そして前記ヒト軽鎖可変領域CDR1配列が配列番号16及びその保存的改変を含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体が、それぞれ配列番号4及び配列番号8に示されたアミノ酸配列、又は、前記抗体が樹状細胞への結合能を保持しているように配列番号4又は配列番号8に充分相同なアミノ酸配列、を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖可変領域を含む、請求項４１乃至４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記抗原が腫瘍細胞又は病原性生物により発現される、請求項３３乃至４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記抗原が、βhCG、Gp100、前立腺関連抗原及びPmel-17から成る群より選択される、請求項３３乃至４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
樹状細胞を、アジュバント、樹状細胞の増殖を刺激するサイトカイン、及び／又は免疫刺激性作用薬に接触させるステップを更に含む、請求項３３乃至４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記複合体が対象に in vivo 投与される、請求項３３乃至４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が前記抗原に対して免疫される、請求項４８に記載の方法
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年１月３１日に提出された米国仮特許出願60/443,979号に基づく優先権を主張するものである。前記の出願の内容全体を、引用をもってここに援用することとする。
【０００２】
発明の背景
免疫応答は、身体全体の組織に常在する樹状細胞（DC）及びマクロファージ（MG）を含む専門的な抗原提示細胞（APC）のレベルにより、惹起される。DCは、Ｔリンパ球と相互作用し、従って強力な免疫応答を誘導する、高レベルの細胞表面分子及び相補性受容体を発現する。更にDCは、免疫応答を惹起すると共に、細胞性免疫及び体液性免疫の両方の増幅で頂点に至るサイトカイン、ケモカイン及びプロテアーゼを分泌する。
【０００３】
DCはそれらの表面上に、抗原のフラグメントに結合する主要組織適合複合体（MHC）分子を発現する。このような抗原−MHC複合体を認識するＴ細胞受容体（TCR）を発現するＴ細胞が活性化して、免疫カスケードを開始する。一般的には、MHCクラスＩ及びMHCクラスＩＩ分子という２つの種類のMHC分子がある。MHCクラスＩ分子は抗原を特異的CD8+
T細胞に提示し、そしてMHCクラスＩＩ分子は抗原を特異的CD4+ T細胞に提示する。
【０００４】
数多くの疾患、特に癌、を効果的に治療するには、ワクチンは、細胞傷害性Ｔ細胞応答とも言及される強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答を惹起せねばならない。細胞傷害性Ｔ細胞には、主に、MHCクラスＩの関係で抗原を認識するCD8＋Ｔ細胞がある。MHCクラスＩ分子の関係での抗原のプロセッシングは、MHCクラスＩＩ分子のそれとは大きく異なる。APCに外因的に送達された抗原は、主にMHCクラスＩＩ分子との関連に向けてプロセッシングされる。対照的に、MHCクラスＩ分子の細胞内位置が原因で、APCに内因的に送達された抗原は、主にMHCクラスＩ分子との関連に向けてプロセッシングされる。これはAPCのみに当てはまるのではない。なぜなら、全ての有核細胞はMHCクラスＩ分子を発現し、MHCクラスＩ分子との関連から内因的に産生された抗原をそれらの表面上に継続的に提示しているからである。
【０００５】
この理由で、ウィルス又は腫瘍抗原が、MHCクラスＩ分子に結合したペプチドとして提示されていれば、ウィルス感染細胞や、又は、固有のタンパク質を発現している腫瘍細胞をCTLの標的にすることができる。しかしながら、DCは、特定の条件下では、外因性の抗原を、MHCクラスＩ分子への結合に向けた内部区画へ到達させるという固有の能力も有するため、これらはMHCクラスＩ及びクラスＩＩ経路の両方を通じてＴ細胞に提示される。このプロセスは交差刺激又は交差提示と呼ばれる。
【０００６】
従って、抗体媒介性応答は、特定の分泌性又は細胞表面抗原に向けられたときには、特定の疾患にとって印象的な防御的又は治療的効験を示したが、多くの疾患に対する最も効果的な免疫治療法は、Ｔ細胞媒介性免疫応答、特にCTL応答を必要とするようである。効果的なCTL応答は、細胞外抗原に限られないため、効果的な抗体ターゲットではない抗原ベースの治療用ワクチンを開発してしまう可能性が存在する。従って、疾患に関連する抗原に応答してCTLを生じさせる新しい方法に大きな関心が払われてきた。なぜならこれらの細胞は、一般的な数多くのワクチンの効験にとって重要であり、また大半の治療用癌ワクチンにとって必須であると考えられるからである。
【０００７】
今日までに検査されたワクチン法の１つは、抗原性ペプチドによる免疫処理を利用するものである。この免疫処理法は、抗原が取り込まれ、プロセッシングされる必要を回避し、当該ペプチドが、APCの表面上に既に発現したMHCクラスＩ分子に直接結合する能力に依拠するものである。この方法は、患者におけるCTL誘導の証拠を明確に示したが、この方法にはいくつかの制約がある。抗原性ペプチドは予め確立されておかねばならず、異なるペプチドが、異なるMHCハプロタイプを持つ個体に必要であり、ペプチドのin
vivoでの寿命は短い。
【０００８】
検査された別のアプローチは抗体−抗原複合体を利用するものである。Paul et
al. (62)は、ある抗原に特異的な抗体が、抗原に対する体液性免疫応答を高めることができたことをマウスで示したが、これはおそらく、APC上に発現したIgGに対するFc受容体（FcγR）に免疫複合体を送達することによる。Wernersson及び共同研究者
(63)は、免疫応答の亢進における個々のFcγRの役割を免疫複合体をin vivoで用いて研究した。彼らの研究では、FcγRIは、免疫応答の亢進を媒介するのに充分であることが実証された。しかしながら、このような免疫複合体は、抗原提示に関与していない数多くの細胞上のFc受容体にも結合するため、APCを特異的に標的とするものではなく、従って、抗原送達の効率を低下させてしまう。
【０００９】
その後の研究では、APC上の多種の受容体に抗原を選択的に狙わせるために抗体が用いられており、このような選択的な送達は、体液性応答を誘導することができることが実証された
(66, 67)。加えて、DC上のFcRに結合した免疫複合体はMHCクラスＩの関係でプロセッシング及び提示されることが示された (64, 65)。更に、数多くのこのようなFcR標的決定法には制約がある。なぜなら、FcRは血小板及び好中球など、数多くの非APC上で発現するからである。理想的には、APCを特異的に狙い、また効果的なMHCクラスＩＩ限定TH応答だけでなく、効果的なMHCクラスＩ限定CTL応答を誘導することのできるワクチンがあれば、いくつかの疾患を治療する上で優れた効験を上げるであろう。
【００１０】
同様に、マンノシル化抗原は体液性免疫応答、及び、CTL応答などのＴ細胞媒介性免疫応答を誘導することが示されている。しかしながら、マンノシル化抗原は、他のマンノース結合タンパク質が著しく豊富にあるために、APCを特異的には標的としない。更に、マンノシル化タンパク質は、マクロ飲食機序を通じて未熟DCにより内部移行する。従って、抗原のマンノシル化で生じる免疫応答の機序及び性質は、抗体を用いた抗原のマンノース受容体への特異的標的決定で生じるものとは、大きく異なる。
【００１１】
現在の方法は、APCを効率的かつ特異的に標的にするものではないため、数多くの治療用ワクチンでは、患者由来のDCを精製してから、抗原への曝露後に再輸注する必要がある。
【００１２】
従って、APCを効率的に標的決定することができると共に、抗原特異的CTL応答を含め、数多くの疾患の効果的な治療に必要な抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答を生じさせることのできる優れたワクチンが求められている。
【００１３】
発明の概要
本発明は、数多くの疾患の効果的な治療に必要な抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答を生じさせるための抗体ベースのワクチン及び方法を提供するものである。具体的には、強力な抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答が、抗原提示細胞（APC）上に発現した特定の受容体に結合する抗体を用いて、一種以上のタンパク質抗原をAPCの標的に決定することにより、誘導される。好適な受容体には、樹状細胞（DC）及びマクロファージの両方の上に発現するＣ-レクチン、特にヒトマンノース受容体、がある。本発明により実証されるように、抗体−抗原複合体を用いてマンノース受容体を標的に決定すると、MHCクラスＩ及びクラスＩＩ経路の両方を通じて、抗原のプロセッシングが起きる。このように、抗原特異的CTL（例えばCD8＋T細胞）や、ヘルパＴ細胞（例えばCD4＋T細胞）を含む他の重要な免疫エフェクタＴ細胞が誘導される。
【００１４】
従って、ある局面では、本発明は、例えばヒトAPC上に発現するヒトマンノース受容体に結合するモノクローナル抗体など、ヒトAPCに結合するモノクローナル抗体と抗原との複合体を形成することにより、該抗原に対するCTL応答を誘導又は亢進する方法を提供する。次に、該抗原に対するCTL応答（例えばCD8＋細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される応答など）を誘導又は亢進する態様で、該抗原が内部移行し、プロセッシングされ、T細胞に提示されるように、該複合体をin
vivo 又はex vivoのいずれかでAPCに接触させる。ある好適な実施態様では、これは、該抗原に対してヘルパT細胞応答（例えばCD4＋ヘルパT細胞により媒介される応答など）
を誘導する働きもする。このように、当該の免疫応答はMHCクラスＩ及びMHCクラスＩＩ経路の両方を通じて誘導される。更に、該APCを、アジュバントに接触させたり、樹状細胞の増殖を刺激するサイトカインに接触させたり、及び／又は、免疫応答を更に亢進するために免疫刺激性作用薬に接触させることができる。
【００１５】
いずれかの種（例えばヒト、マウス、ウサギ等）を由来とするもの、及び／又は、組換えにより操作及び発現させたもの（例えばキメラ、ヒト化及びヒト抗体など）を含め、しかしこれらに限らず、多種の適した抗体を本発明の複合体で用いることができる。好適な抗体にはヒトモノクローナル抗体がある。本発明で用いられる抗体には、更に、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、又はIgEなどのいずれの抗体アイソタイプを含めることもできるが、好適な抗体はIgGアイソタイプのものである。当該抗体は全抗体であっても、又は、例えばFab、F(ab')2、Fv及び一本鎖Fvフラグメントなどを含め、その抗原結合フラグメントであってもよい。
【００１６】
本発明での使用に好適な抗体には、ヒトマンノース受容体に結合するヒトモノクローナル抗体がある。ある実施態様では、本抗体は、それぞれ配列番号3及び配列番号7に記載された通りのヌクレオチド配列、又は、本抗体が樹状細胞への結合能を保持しているように配列番号3又は配列番号7に対して充分相同なヌクレオチド配列、をそれらの可変領域に、含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖核酸にコードされている。
【００１７】
更に他の好適なヒト抗体には、ヒトマンノース受容体に結合すると共に、それぞれ配列番号4及び配列番号8に記載された通りのアミノ酸配列、又は、本抗体が樹状細胞への結合能を保持しているように配列番号4又は配列番号8に対して充分相同なアミノ酸配列、を含むヒト重鎖及びヒトカッパ軽鎖可変領域を有することを特徴とするものがある。
【００１８】
本発明の更に他の具体的なヒト抗体には、ヒト重鎖及び軽鎖CDR1領域、ヒト重鎖及び軽鎖CDR2
領域、及びヒト重鎖及び軽鎖CDR3 領域を有する相補性決定領域 (CDR) ドメインを含むものがあり、但しこの場合、
(a)
前記ヒト重鎖領域の前記CDR1、CDR2、及びCDR3 は、図８（配列番号13、14、又は15）に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列及びその保存的配列改変から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、
(b)
前記ヒト軽鎖領域の前記CDR1、CDR2、及びCDR3は、図９（配列番号16、17、又は18）に示されたCDR1、CDR2、及びCDR3領域のアミノ酸配列及びその保存的配列改変から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
特定の生殖細胞系配列から得られる抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を持つトランスジェニック・マウスを免疫したり、あるいは、ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングするなどにより、ヒト免疫グロブリン配列を用いて、ある系から得られる抗体も、本発明に包含される。
【００２０】
本発明で用いるヒト抗体は、本抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含有するトランスフェクトーマ（例えば、不死化CHO細胞又はリンパ球細胞から成るトランスフェクトーマなど）などのホスト細胞で組換えにより産生させることも、あるいは、本抗体をコードするヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック・マウスなどの非ヒトトランスジェニック動物から得たＢ細胞を不死化細胞に融合させて含むものなど）本抗体を発現するハイブリドーマから直接、得ることもできる。ある具体的な実施態様では、本抗体を、それぞれ配列番号3及び7のヌクレオチド配列、及びその保存的改変を含むヒト重鎖及びヒト軽鎖核酸を含有する、ハイブリドーマか、又はホスト細胞（例えばCHO細胞）トランスフェクトーマで産生させる。
【００２１】
本発明で用いるために適した抗原には、多種の腫瘍及び感染性疾患抗原などを含め、対する防御的又は治療的免疫応答が好ましいようなあらゆる抗原又はその抗原性部分が包含される。具体的な抗原は、とりわけ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンベータ・サブユニット（βhCG）、Gp100、前立腺関連抗原(PSA)、Pmel-17、結腸、肺、膵臓、乳房、卵巣、及び生殖細胞を由来とする腫瘍細胞抗原、ウィルスタンパク質、細菌性タンパク質、糖、及び真菌性タンパク質から選択することができる。本発明に基づき、このような抗原を抗体に連結させて、効果の高い抗体ワクチン複合体を形成する。
【００２２】
別の局面では、本発明は、βhCGを、ヒトマンノース受容体に結合する抗体に連結させて含む、ある具体的な抗体ワクチン複合体を提供するものである。ある実施態様では、本複合体は、配列番号10に示されたアミノ酸配列を含む重鎖を有するここに解説されたB11-βhCG複合体など、βhCGに連結させたヒト重鎖を含む。配列番号12に示されたアミノ酸配列を含む、該B11-βhCG複合体の一本鎖型も提供されている。
【００２３】
更に本発明は、一種以上の本発明の抗体ワクチン複合体を含有する組成物（例えば医薬組成物）を提供するものである。
【００２４】
本組成物には、更に、一種以上のアジュバント、あるいは、免疫応答を亢進する、及び／又は、APCの活性を上昇させることが公知の他の作用薬を含めることができる。
【００２５】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な解説及び請求の範囲から明白であろう。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の細胞受容体を狙う抗体を用いて抗原を抗原提示細胞（APC）の標的に設定することにより、重要なＴ細胞媒介性免疫応答を生じさせることができるという発見に基づく。具体的には、癌及び感染性疾患など、数多くの疾患の効果的な治療のためには、ワクチンは、MHCクラスＩの関係で抗原を認識するCD8＋T細胞により主に媒介される、強力な抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答を惹起せねばならない。最適な免疫処理のためには、これには、好ましくは、MHCクラスＩＩ経路の関係で抗原を認識する、例えばCD4＋T細胞などの抗原特異的Ｔ細胞の誘導を含め、他の重要なエフェクタＴ細胞機能が伴っているとよい。このように、効果的なワクチンは、抗原特異的CTLを、好ましくは他のＴ細胞媒介性免疫応答と組み合わせて、複数のMHC経路を通じて誘導せねばならない。
【００２７】
従って、本発明は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）応答を誘導又は亢進するための新規な抗体ベースのワクチン複合体及び方法を提供するものである。本発明の治療法では、樹状細胞（DC）及びマクロファージなどの抗原提示細胞（APC）に結合する抗体を、抗原に連結させて含む分子複合体を利用する。
【００２８】
APCを標的とする抗体は当業で公知であるが、その中には、例えばAPC上のクラスＩ又はクラスＩＩ主要組織適合性（MHC）決定基を標的とする抗体がある(78,
79, 81, 83)。他の抗体には、APC上のFc受容体 (77、79、80、81、82、83)やＢ細胞上の表面免疫グロブリン (84)を標的とするものがある。
【００２９】
ここで例示した具体的な実施態様では、本分子複合体は、ヒトDC上のマンノース受容体（MR）に結合する抗体を、βhCG抗原に連結させて含む。このような複合体を、APCに
in vivo 又は ex vivo のいずれかで接触させると、所望のCTL応答を生じさせることができる。
【００３０】
本発明がより容易に理解されるように、いくつかの用語をまず定義しておく。更なる定義は詳細な説明全体を通じて記載されている。
【００３１】
ここで用いられる用語「抗原提示細胞（APC）」とは、免疫系に認識させることができる態様で、抗原性決定基が細胞表面上にMHC関連複合体として提示されるように、抗原を内部移行させてプロセッシングすることのできる免疫細胞のクラスを言う（例えばMHC
クラスＩ限定細胞傷害性Ｔリンパ球及び／又はMHCクラスＩＩ限定ヘルパＴリンパ球）。細胞がAPCとして機能することを可能にする２つの必要な特性は、細胞内に飲食された抗原のプロセッシング能と、MHC遺伝子産物の発現である。APCの例には、樹状細胞（DC)、単核性貪食細胞（例えばマクロファージ）、Ｂリンパ球、皮膚のランゲルハンス細胞、及び、ヒトにおける内皮細胞、がある。
【００３２】
用語「樹状細胞（DC）」は、ここで用いられる場合、未熟及び成熟DCや、分化してDC又は関連する抗原提示細胞（例えば単球及びマクロファージ）になることのできる関連する骨髄前駆細胞を包含する。DCは、Ｔリンパ球と相互作用する、高レベルの細胞表面分子及び相補性受容体（例えばＣ型レクチン、例えばマンノース受容体）を発現するため、強力な免疫応答を誘導することができる。DCはまた、免疫応答を惹起すると共に細胞性免疫及び体液性免疫の両方の増幅で蓄積するサイトカイン、ケモカイン及びプロテアーゼを分泌する。DCはまた、抗原の数フラグメントに結合する主要組織適合性複合体（MHC）分子をそれらの表面上に発現する。これらの抗原−MHC複合体を認識したＴ細胞は活性化して、免疫カスケードを開始する。ある好適な実施態様では、本発明の分子複合体の抗体部分が樹状細胞に結合すると、樹状細胞による本複合体の内部移行が起きる。
【００３３】
用語「マクロファージ・マンノース受容体」又は「MR」とは、細胞外部分の反復した糖認識ドメイン（CRD）と２つの推定クラスリン・ターゲティング配列を含有する短い細胞質側のテールとを特徴とするＣ型レクチン受容体ファミリの一メンバを言う(34,
35, 37)。加えて、MRはＮ末端のシステイン・リッチ・ドメイン及びフィブロネクチン・ドメインを含有する。マンノース受容体の様々なドメインは、リソソーム酵素、微生物、下垂体ホルモン、グリコソアミノグリカン（glycosoaminoglycan）及び硫酸化血液型抗原を含む多様なリガンドに対する特異的結合能を有する
(38-40)。
【００３４】
「MHC分子」には、MHCクラスＩ及びMHCクラスＩＩという２つの種類の分子がある。MHCクラスＩ分子は抗原を特異的CD8＋T細胞に提示し、MHCクラスＩＩ分子は抗原を特異的CD4＋T細胞に提示する。APCに外因的に送達された抗原は、主にMHCクラスＩＩとの関連でプロセッシングされる。対照的に、APCに内因的に送達された抗原は主にMHCクラスＩとの関連でプロセッシングされる。しかしながら、特定の条件下では、DCは、MHCクラスＩＩ分子に加え、MHCクラスＩ分子への結合に向けた内部区画に外因性抗原が到達できるようにする固有の能力を有する。このプロセスは「交差刺激」又は「交差提示」と呼ばれる。
【００３５】
ここで用いられる用語の抗原の「交差提示」とは、外因性のタンパク質抗原が、APC上のMHCクラスＩ及びクラスＩＩ分子を通じてＴ細胞に提示されることを言う。
【００３６】
ここで用いる用語「Ｔ細胞媒介性応答」とは、エフェクタＴ細胞（例えばCD8＋細胞）及びヘルパＴ細胞（例えばCD4＋細胞）を含むＴ細胞により媒介されるあらゆる応答を言う。Ｔ細胞媒介性応答には、例えば、Ｔ細胞の細胞傷害性及び増殖がある。
【００３７】
ここで用いる用語「細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)応答」とは、細胞傷害性Ｔ細胞により誘導される免疫応答を言う。CTL応答は、主にCD8＋T細胞により媒介される。
【００３８】
ここで用いる用語「抗体」には、全抗体、又は、例えばFab、F(ab')2、
Fv 及び一本鎖Fvフラグメントなどを含め、その抗原結合フラグメントが含まれる。適した抗体には、例えばマウス、ヒト、キメラ、又はヒト化などのあらゆる形の抗体や、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、又はIgEアイソタイプなど、あらゆる種類の抗体アイソタイプがある。ここで用いる「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子にコードされた抗体クラスを言う。
【００３９】
全抗体は、ジスルフィド結合で相互に接続された少なくとも２つの重（H）鎖及び２つの軽（L）鎖を含有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではHCVR又はVHと省略される）と重鎖定常領域とから成る。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3という３つのドメインから成る。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではLCVR又はVLと省略される）及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は一つのドメインCLから成る。VH及びVL領域はさらに、より保存されたフレームワーク領域（FR）と呼ばれる領域間に介在する相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変領域に小さく分割することができる。各VH及びVLは、以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端まで並んだ３つのCDR及び４つのFRから成る。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多種の細胞（例えばエフェクタ細胞）を含めホスト組織又は因子や、古典的な補体系の第一コンポーネント（C1q）に対する免疫グロブリンの結合を媒介していると考えられる。
【００４０】
本発明の好適な抗体には、例えばIgG1（例えばIgG1k）重鎖及びカッパ軽鎖を有するヒト抗体など、ヒト抗体がある。本発明の他の好適な抗体は、例えばヒトDC上のMRなど、ヒトDC上のＣ型レクチン受容体に結合する抗体など、ヒトDCに結合するものである。ある具体的な実施態様では、本抗体は、SDS-PAGEで測定したときにほぼ180kDの分子量を有するヒトマクロファージ・マンノース受容体（ここでは「ヒトB11抗原」とも言及される）に結合するヒトモノクローナル抗体である。このような抗体を作製するためのプロトコルは、その内容を引用をもってここに援用することとするWO
01/085798に解説されている。具体的なヒト抗体には、それぞれ配列番号2及び6に示された通りの重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列、又は、本抗体が樹状細胞への結合能を保持しているように、配列番号2又は配列番号6に対して充分相同なアミノ酸配列、を含むものがある。
【００４１】
ここで用いられる場合、ある抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば樹状細胞上の抗原）への特異的結合能を保持した、抗体のうちの一つ以上のフラグメントを言う。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のうちの数フラグメントに行わせることができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメントであるFabフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab'）2フラグメント；（ｉｉｉ）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の一本のアームのVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；（ｖ）VHドメインから成るdAbフラグメント(Ward
et al., (1989) Nature 341:544-546)；及び（ｖｉ）分離された相補性決定領域(CDR)、がある。さらに、Fvフラグメントの２つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、これらは、VL及びVH領域が対を成して一価の分子を形成しているような一個のタンパク質鎖に作製できるようにする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合することができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えば
Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 及び
Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものと、意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらのフラグメントは、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。
【００４２】
ここで用いられる用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変及び定常領域を有する抗体が含まれるものと、意図されている。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基が含まれていてもよい（例えばin vitroでのランダムもしくは部位特異的変異誘発法により導入された変異や、又はin vivoでの体細胞変異などで）。しかしながら、ここで用いる用語「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系を由来とするCDR配列がヒト・フレームワーク配列に移植されているような抗体が含まれるとは、意図されていない。
【００４３】
ここで用いられる用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成から成る抗体分子の製剤を言う。モノクローナル抗体組成物は単一の結合特異性及び親和性を特定のエピトープに対して示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、単一の結合特異性を示すと共に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変領域及定常領域を有するような抗体を言う。ある実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック・マウスなどの非ヒトトランスジェニック動物から得たＢ細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマにより産生される。
【００４４】
用語「組換えヒト抗体」は、ここで用いられる場合、組換え手段により調製された、発現した、創出された又は単離されたあらゆるヒト抗体を包含し、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック又はトランスクロモゾマルの動物（例えばマウス）から単離された、あるいは、それから調製されたハイブリドーマから単離された、抗体、（ｂ）例えばトランスフェクトーマなど、当該抗体を発現するように形質転換されたホスト細胞から単離された抗体、（ｃ）組換えの、コンビナトリアル・ヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングが関与するいずれかの他の手段により調製された、発現した、創出された又は単離された抗体、である。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変及び定常領域を有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、このような組換えヒト抗体に、in
vitro 変異誘発を行って（又はヒトIg配列についてトランスジェニックな動物を用いる場合は in vivo 体細胞変異誘発を行って）、組換え抗体のVH
及びVL 領域のアミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系VH 及びVL 配列を由来とすると共に関連しながらも、in
vivoヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然では存在しないであろう配列にすることができる。
【００４５】
ここで用いる「特異的結合」とは、所定の抗原への抗体の結合を言う。典型的には、本抗体は10 -7M以下の解離定数（KD）で結合し、そして所定の抗原に対しては、前記所定の抗原又は関係の近い抗原以外の非特異的な抗原（例えばBSA、カゼイン）に対する結合に関するそのKDよりも少なくとも２倍小さいKDで結合する。文言「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」はここでは用語「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に用いられている。
【００４６】
ここでIgG抗体に対して用いる用語「高親和性」とは、10-8
M 以下、より好ましくは10-9 M 以下、そして更により好ましくは10-10 M 以下のKDを有する抗体を言う。しかしながら、「高親和性」結合は他の抗体アイソタイプにとっては様々であろう。例えば、IgMアイソタイプに対する「高親和性」結合とは、10-7
M 以下、より好ましくは10-8 M 以下のKDを有する抗体を言う。
【００４７】
ここで用いる場合の用語「Kassoc」又は「Ka」とは、ある特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を言うものと意図されており、他方、ここで用いられる用語「Kdis」又は「Kd」とは、ある特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を言うものと意図されている。ここで用いられる場合の用語「KD」とは、Kd対Kaの比（即ちKd/Ka）から得られ、モル濃度（M）で表される解離定数を言うものと意図されている。
【００４８】
ここで用いられる用語「βhCG」とは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのベータ・サブユニットを言い、βhCG（配列番号20）を由来とする全抗原、その抗原性フラグメント、その対立遺伝子バリアント、及びあらゆる多型を包含する。βhCGは妊娠の成功を確立するために必要なホルモンである。妊娠の他には、この抗原の発現は、生殖細胞腫瘍や、数多くの腺腫に主に限られている。
【００４９】
ここで用いられる用語「核酸分子」は、DNA分子及びRNA分子を包含するものと、意図されている。核酸分子は一本鎖でも、又は二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
【００５０】
用語「単離された核酸分子」は、ここでは、本発明の分子複合体をコードする核酸又はその部分、例えば配列番号9及び11又はその部分、例えば抗原又は抗体部分（即ちVH、VL、又はCDR）など、に関して用いられている。単離された核酸分子とは、本分子複合体をコードするヌクレオチド配列が、他の混入ヌクレオチド配列、例えば本分子複合体のいずれの部分もコードしていないヌクレオチド配列など、を含まないような核酸分子を言う。
【００５１】
ここで開示及び請求されるように、配列番号1-28に記載された配列には、「保存的配列改変」、即ち、例えば当該のヌクレオチド配列にコードされた、又は、当該のアミノ酸配列を含有する、本コンストラクトの抗体部分の結合特性、又は、抗原部分の免疫原性特性など、本分子複合体の機能上の特徴に大きく影響しない又は変化させないようなヌクレオチド及びアミノ酸配列の改変、を含めることができる。このような保存的配列改変には、ヌクレオチド及びアミノ酸の置換、追加及び欠失がある。改変は、例えば部位指定変異誘発法及びPCR媒介変異誘発法など、当業で公知の標準的技術により、配列番号1-28に導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当業で定義されている。これらのファミリーには、塩基性の側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性の側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を持つアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、がある。このように、ヒト抗DC抗体の中で予測される重要でないアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基に置換することが好ましい。
【００５２】
代替的には、別の実施態様では、例えば飽和変異誘発法などにより、分子複合体コーディング配列の全部又は一部にわたって変異を無作為に導入することができ、その結果改変された分子複合体を適した機能上の活性についてスクリーニングすることができる。
【００５３】
従って、ここに開示されたヌクレオチド配列にコードされた、及び／又は、ここに開示されたアミノ酸配列を含有する、（即ち配列番号1-28）分子複合体には、保存的に改変された同様な配列にコードされた、又は、同様な配列を含有する、実質的に同様な複合体も含まれる。具体的には、実質的に同様な抗体を、部分的（即ち重鎖及び軽鎖可変領域）配列（配列番号3、4、7、及び8）に基づいて、本分子複合体で用いるためにどのように作製することができるかに関する議論を以下に提供する。
【００５４】
核酸の場合、用語「実質的な相同性」は、最適にアライメントして比較した場合の２つの核酸又はそのうちの指示した配列が、適当なヌクレオチド挿入又は欠失がありながらも、ヌクレオチドの少なくとも約80%、通常はヌクレオチドの少なくとも約90%乃至95%、そしてより好ましくは少なくとも約98%乃至99.5%において、同一であることを指すものである。代替的には、数セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で当該鎖の相補配列にハイブリダイズするときに、実質的な相同性が存在することとする。
【００５５】
二つの配列間のパーセント同一性は、これら二つの配列を最適にアライメントするのに導入せねばならないギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である（即ち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×100）。二つの配列間の配列の比較及びパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に解説するように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００５６】
二つのヌクレオチド間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる）のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMPマトリックスを用いて、ギャップ・ウェイトを40、50、60、70、又は80
にし、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして決定することができる。二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラム（バージョン2.0)に組み込まれた
E. マイヤース及びW. ミラーのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) を用い、PAM120
ウェイト残基表を用いて、ギャップ・レングス・ペナルティを12、そしてギャップ・ペナルティを4にして、決定することもできる。さらに、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる)のGAPプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ
(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを用い、Blossum 62 マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれかを用いて、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4にし、レングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして、決定することができる。
【００５７】
さらに本発明の核酸及びタンパク質の配列を「クエリー配列」として利用して、公開データベースの検索を行って、例えば関連する配列を同定することなどができる。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLAST 及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）を利用すれば行うことができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラムを用い、スコア=
100、ワード長= 12 にして行うと、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、 XBLASTプログラムを用い、スコア=
50、ワード長= 3にして行うと、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップのあるアライメントを行うには、Gapped
BLAST をAltschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402が解説するとおりに利用することができる。BLAST及びGapped
BLASTプログラムを利用する場合、各プログラム（例えばXBLAST 及びNBLAST)のデフォルト・パラメータを利用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００５８】
当該核酸は全細胞中にあっても、細胞ライセート中にあっても、又は部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形で存在してもよい。核酸は、アルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラム・クロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動法、及び当業で公知の他の技術を含む標準的な技術により、例えば他の細胞内核酸又はタンパク質などの他の細胞成分又は他の混入物質を取り除いて精製されている場合に、「単離されている」又は「実質的に純粋である」ことになる。
F. Ausubel, et al., ed. Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience,
New York (1987)を参照されたい。
【００５９】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれているときに「作動的に連結されている」ことになる。例えば、あるプロモータ又はエンハンサが、あるコーディング配列の転写を左右するのであれば、その配列に作動的に連結されていることになる。転写制御配列に関する場合、作動的に連結されたとは、連結しようとするDNA配列が連続していることを意味し、また２つのタンパク質コーディング領域を接合するために必要な場合には、連続し、かつ読み取り枠内にあることを意味する。スイッチ配列の場合には、作動的に連結された、とは、当該配列がスイッチ組換えを起こし得ることを指す。
【００６０】
ここで用いる用語「ベクタ」とは、連結された先の別の核酸を輸送することのできる核酸分子を言うものと、意図されている。ベクタの一種が、付加的なDNAセグメントを中に連結できる環状の二本鎖DNAループを言う「プラスミド」である。ベクタのもう一つの種類がウィルスベクタであり、この場合、付加的なDNAセグメントは、ウィルスゲノム内に連結させることができる。いくつかのベクタは導入された先のホスト細胞内で自律的複製が可能である（例えば細菌由来の複製開始点を有する細菌ベクタや、エピソームほ乳類ベクタなど）。他のベクタ（例えば非エピソームほ乳類ベクタなど）は、ホスト細胞に導入されるや、ホスト細胞のゲノムに組み込ませることができるため、ホストゲノムと一緒に複製される。さらに、いくつかのベクタは、作動的に連結された先の遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクタをここでは「組換え発現ベクタ」（又は単に「発現ベクタ」）と呼ぶ。一般的に、組換えDNA技術で実用性のある発現ベクタは、しばしばプラスミドの形である。本明細書では、プラスミドが最も普通に用いられている形のベクタであるため、「プラスミド」及び「ベクタ」を交換可能に用いている場合がある。しかしながら、本発明には、例えばウィルスベクタ（例えば複製欠陥レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルス）など、同等の機能を果たす他の形のこのような発現ベクタも包含されることが、意図されている。
【００６１】
ここで用いる用語「組換えホスト細胞（又は単に「ホスト細胞」）とは、組換え発現ベクタが導入された細胞を言うものと、意図されている。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も言うものと意図されていることは、理解されねばならない。突然変異又は環境による影響が原因で、特定の改変が継代に起きる場合があるため、このような後代は実際には親細胞と同一でないかも知れないが、それでも尚、ここで用いる用語「ホスト細胞」の範囲内に含まれる。組換えホスト細胞には、例えば、CHO細胞及びリンパ球性細胞がある。
【００６２】
ここで用いられる場合の用語「対象」には、あらゆるヒト又は非ヒトの動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、例えばヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類等、ほ乳類及び非ほ乳類などのあらゆる脊椎動物が含まれる。
【００６３】
本発明の多様な局面を、以下の小項で更に詳述する。
【００６４】
Ｉ．抗原
本発明で用いるのに適した抗原には、例えば、対する防御的又は治療的免疫応答が好ましいような感染性疾患抗原及び腫瘍抗原、例えば、腫瘍細胞又は病原性生物が発現する抗原や、又は、感染性疾患抗原など、がある。例えば、適した抗原には、癌の防止又は治療用の腫瘍関連抗原がある。腫瘍関連抗原の例には、限定はしないが、βhCG、gp100 又はPmel17、HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN
(gp250)、イディオタイプ、MAGE-1、MAGE-3、チロシナーゼ、テロメラーゼ、MUC-1 抗原、及び生殖細胞由来腫瘍抗原、がある。更に腫瘍関連抗原には、血液型抗原、例えばLea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2 抗原も含まれる。選択的には、２種以上の抗原を、本発明の抗原−抗体コンストラクトに含めることができる。例えば、MAGE抗原をメラニンA、チロシナーゼ、及びgp100などの他の抗原に、GM-CSF
又はIL-12などのアジュバントと一緒に組み合わせて、抗APC抗体に連結させることができる。
【００６５】
他の適した抗原には、ウィルス性疾患の防止又は治療のためのウィルス抗原がある。ウィルス抗原の例には、限定はしないが、HIV-1 gag、HIV-1 env、HIV-1 nef、HBV core、FAS、HSV-1、HSV-2、p17、ORF2 及びORF3抗原がある。細菌性抗原の例には、限定はしないが、トキソプラズマ-ゴンジ（Toxoplasma
gondii）又はトレポネーマ-パリダム（Treponema pallidum）がある。本発明の抗体−細菌性抗原複合体は、炭疽病、ボツリヌス中毒症、破傷風、クラミジア、コレラ、ジフテリア、ライム病、梅毒及び結核などの多種の細菌性疾患の治療又は防止の際にあってよい。
【００６６】
ここで例示した具体的な実施態様では、本発明は、βhCGを含む抗原を用いる。これには、βhCG配列（配列番号20）全体、又は、該配列のいずれかの免疫原性（例えばＴ細胞エピトープ含有）部分が含まれる。下に解説するように、このような免疫原性部分は、アルゴリズム及び公知のＴ細胞エピトープ・マッピング技術を含め、Ｔ細胞エピトープをマッピングするための当業で公知の技術を用いて特定することができる。βhCG由来の具体的な免疫原性ペプチドの例には、配列番号21、22、23、24、25、26、27、又は28を含むもの、及びこれらの保存的改変、がある。βhCG由来の更なる免疫原性ペプチド、及びこのようなペプチドを特定する方法は、引用をもってその内容をここに援用することとする米国特許第6,096,318号及び第6,146,633号に解説されている。
【００６７】
タンパク質の抗原性ペプチド（即ちＴ細胞エピトープを含有するもの）は、当業で公知の多種の態様で特定することができる。例えば、ウェブ・ベースの予想アルゴリズム(BIMAS & SYFPEITHI) を用いて当該タンパク質の配列を解析して、CTLによりこれまで定義された10,000種のよく特徴付けられたMHC結合ペプチドの内部データベースに合致する潜在的MHCクラスＩ及びＩＩ結合ペプチドを作製することにより、Ｔ細胞エピトープを予想することができる。スコアの高いペプチドに等級を付け、当該MHC分子に対する高親和性を基に「興味深い」として選抜することができる。図１０に示すように、そしてβhCG-B11複合体の配列（配列番号10）を用いて、両方のアルゴリズムを用いて、βhCG部分（マスタード）由来の抗原性ペプチドを特定し、この抗原性ペプチドから、合成バージョンを作製し、Ｔ細胞応答を惹起する能力についてin
vitroで検査することができた。このように、Ｔ細胞エピトープがHLA-A2、HLA-B7及びHLA-DR 分子への潜在的結合に関して見出された。いくつかのエピトープは、βhCG-B11複合体の抗体（B11）セグメントからも予測された（結果は図示せず）。更に、37個のアミノ酸長のＣ末端ペプチド（CTP）中ではＴ細胞エピトープは見出されなかった。
【００６８】
Ｔ細胞エピトープを含有する抗原性ペプチドを特定する別の方法は、当該タンパク質を所望の長さの重複のないペプチドに、又は、所望の長さの重複のあるペプチドに、分割する方法である。このようなペプチドは、組換えによっても、合成によっても、あるいは特定の限られた状況下では、当該タンパク質の化学的開裂によっても、合成することができ、そしてＴ細胞応答を惹起するなどの免疫原性の特性（即ち増殖又はリンホカイン分泌）について検査することができる。
【００６９】
微細マッピング技術などにより、当該タンパク質の精確なＴ細胞エピトープを判定するためには、Ｔ細胞刺激活性を有し、従ってＴ細胞生物学的技術により判定したときに少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含むようなペプチドを、このペプチドのアミノ又はカルボキシ末端で、アミノ酸残基を追加又は欠失させることで改変し、この改変後のペプチドに対するＴ細胞反応性の変化を判定する検査を行うことができる。天然タンパク質配列中で重複する区域を共有する二種以上のペプチドが、ヒトＴ細胞刺激活性を有すると、Ｔ細胞生物学的技術で判定されたら、このようなペプチドの全部又は一部分を含む付加的なペプチドを作製して、これらの付加的なペプチドを同様な手法により検査することができる。この技術後、ペプチドを選抜し、組換え又は合成により、作製する。ペプチドは、このペプチドに対するＴ細胞応答の強度（例えば刺激指数）を含め、様々な因子に基づいて選抜される。その後、これらの選抜されたペプチドの物理的及び化学的特性（例えば可溶性、安定性）を調べて、これらペプチドが、治療用組成物中に用いるのに適しているかどうか、あるいは、当該ペプチドに改変が必要かどうかを判定することができる。
【００７０】
ＩＩ．  抗体ワクチン複合体
本発明は、腫瘍もしくはウィルス抗原などの抗原を、マンノース受容体（MR）などを介してAPCに結合する抗体に連結させて含む多種の治療用ワクチン複合体を提供するものである。これにより、抗原をAPC（例えば樹状細胞）の標的に決定して、プロセッシング、提示、及び最終的には該抗原に対するCTL応答などの免疫応答を高めることができる。
【００７１】
本発明の抗体−抗原ワクチン複合体は、遺伝子的にも、又は化学的的にも作製することができる。いずれの場合でも、本複合体の抗体部分を、抗体全体から構成しても、あるいは、Fabフラグメント又は一本鎖Fvなどの抗体の一部分から構成してもよい。加えて、二種以上の抗原を単一の抗体コンストラクトに加えることができる。
【００７２】
遺伝子的に構築された抗樹状細胞抗体−抗原複合体（例えば単一の組換え融合タンパク質として発現させたもの）は、選択された抗原を抗体に多種の位置で連結することにより、作製することができる。本発明の具体的な遺伝子的に作製された複合体（融合コンストラクト）には、例えば、図２に示されたβhCG-B11コンストラクトがある。本βhCG-B11コンストラクトは、ヒト抗樹状細胞抗体B11を、腫瘍関連抗原の１つであるβhCGに融合させて含む。このコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を配列番号9に示す。
【００７３】
例えば、βhCG-B11遺伝子融合コンストラクトに示すように、βhCG抗原をヒト抗体重鎖のCH3ドメインの末端に融合させることができる。また該抗原をFab融合コンストラクト中の抗体重鎖のヒンジ領域に融合させたり、あるいは、一本鎖融合コンストラクト（ScFvコンストラクト）中の可変軽鎖及び重鎖（VH及びVL）の配列に融合させることもできる。選択的には、該抗原を、抗体重鎖の代わりに抗体軽鎖に融合させることができる。当該遺伝子融合コンストラクトがCTL応答を惹起できれば、抗原と抗体の間の他の融合点を用いることもできる。インタクトβhCG-B11コンストラクト及び一本鎖B11コンストラクト（pB11sfv-βhCG）の詳細なマップをそれぞれ表１及び２に示す。
【００７４】
【表１】
2006516637.tif 000002
【００７５】
【表２】
2006516637.tif 000003
【００７６】
化学的に構築された抗体−抗原複合体は、多種の公知、かつ、容易に入手可能な架橋試薬を用いて作製することができる。これらの架橋試薬は、当該抗樹状細胞抗体及び選択された抗原上の様々な反応性アミノ酸又は糖側鎖と共有結合を形成する、例えばSPDP、SATA、SMCC、DTNBなど、ホモ官能性化合物であっても、又はヘテロ官能性化合物であってもよい。
【００７７】
クローニング、発現又は精製の可能ないずれの抗原を、本発明での使用に向けて選択することができる。このような抗原を得るための技術は当業で公知である。例えば、腫瘍関連抗原を癌細胞から直接精製し、タンデム質量分析法などの生理化学的技術により、同定することができる。選択に応じては、腫瘍特異的Ｔ細胞クローンを、プラスミドDNAクローンをトランスフェクトされたことで抗原を獲得した抗原陰性細胞に対して検査して、この抗原を発現するクローンを単離することができる。その後、合成ペプチドを構築して、抗原性部位又はエピトープを精確に特定することができる。
【００７８】
ある具体的な実施態様では、ワクチン・コンストラクトの部分的抗体配列を用いてインタクト抗体を発現させることができる。本発明のワクチン複合体に包含される抗APC抗体（例えばB11）などの抗体は、標的抗原（例えばMRなどのＣ型レクチン受容体）と、主に、６番目の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基を通じて、相互作用する。これが理由で、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外の配列よりも、個々の抗体間でより多様になっている。CDR配列は大半の抗体−抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型抗体由来のCDR配列を、異なる特性を持つ異なる抗体由来のフレームワーク領域内に移植した形で含有する発現ベクタを構築することにより、特定の天然発生型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えばRiechmann,
L. et al., 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. et al.,
1986, Nature 321:522-525; 及び Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl.
Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033を参照されたい）。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベースから得ることができる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞成熟中のV(D)J接合により形成される、完全に集合した可変遺伝子を含まないこととなるため、成熟抗体遺伝子配列とは異なるであろう。生殖細胞系遺伝子配列はまた、高親和二次レパートリ抗体の配列からも、可変領域全体にわたって均一に、個々で異なるであろう。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域のアミノ末端部分ではあまり頻繁には起きない。例えば、体細胞変異は、フレームワーク領域1のアミノ末端部分と、フレームワーク領域4のカルボキシ末端部分では、あまり頻繁には起きない。さらに、多くの体細胞変異は、本抗体の結合特性を大きくは変化させない。この理由で、もとの抗体のものと同じ結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直すためにも、特定の抗体の全DNA配列を得る必要はない（全ての目的のために引用をもってここに援用されたWO
99/45962を参照されたい）。CDR領域にわたる部分的重鎖及び軽鎖配列があれば、この目的には充分であることが多い。この部分的配列を用いて、どの生殖細胞系可変及びジョイニング遺伝子セグメントが、組換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、この生殖細胞系配列を用いて、可変領域の消失部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダ配列は、タンパク質の成熟中に切断されるため、最終的な抗体の特性には寄与しない。これが理由で、発現コンストラクトのための対応する生殖細胞系リーダ配列を用いる必要がある。消失配列を加えるために、クローニングされたcDNA配列を合成オリゴヌクレオチドにライゲーション又はPCR増幅法により組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を、一組の短い、重複のあるオリゴヌクレオチドとして合成し、PCR増幅で組み合わせて、完全に合成の可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスは、消失又は含有又は特定の制限部位や、あるいは、特定のコドンの最適化など、いくつかの長所を有する。
【００７９】
ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を用いて、重複した組の合成オリゴヌクレオチドをデザインして、天然配列と同一のアミノ酸コーディング能を持つ合成V配列を作製する。合成の重鎖及びカッパ鎖配列は天然の配列と３つの方法で異ならせることができる：オリゴヌクレオチド合成及びPCR増幅が容易に行われるように、反復したヌクレオチド塩基部分に中断を入れる；最適な翻訳開始部位をコザックの法則に従って取り入れる
(Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870)；及びHindIII 部位を、該翻訳開始部位の上流に操作する。
【００８０】
重鎖及び軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコーディング及び対応する非コーディング鎖配列を、対応する非コーディング・オリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０乃至５０ヌクレオチドに分断する。このように、各鎖につき、当該のオリゴヌクレオチドを、１５０乃至４００ヌクレオチドから成るセグメントに渡る重複する二本鎖の組に組み立てることができる。次にこのプールをテンプレートとして用いて、１５０乃至４００ヌクレオチドから成るPCR増幅産物を作製する。典型的には、一個の可変領域オリゴヌクレオチドの組を２つのプールに分割し、これら２つのプールを別々に増幅して２つの重複するPCR産物を作製することになるであろう。次に、これらの重複する産物をPCR増幅により組み合わせて、完全な可変領域を形成する。さらに、このPCR増幅で、（カッパ軽鎖のBbsI部位、又は、ガンマ重鎖のAgeI部位を含む）重鎖又は軽鎖定常領域の重複するフラグメントを含有させて、発現ベクタ・コンストラクト内へ容易にクローニングすることのできるフラグメントを作製することも好ましいであろう。
【００８１】
次に、再構築された重鎖及び軽鎖可変領域を、クローニングされたプロモータ、翻訳開始、定常領域、3'側非翻訳、ポリアデニレーション、及び転写終了、配列に組み合わせて、発現ベクタ・コンストラクトを形成する。該重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは、組み合わせて単一のベクタにすることも、ホスト細胞に同時トランスフェクト、順次トランスフェクト、又は別々にトランスフェクトしてから、このホスト細胞を融合させて、両方の鎖を発現するホスト細胞を形成することもできる。
【００８２】
ヒトIgGκのための発現ベクタの構築に用いるプラスミドを以下に解説する。当該のプラスミドは、PCR増幅後のV重鎖及びVカッパ軽鎖cDNA配列を用いて完全な重鎖及び軽鎖最小遺伝子を再構築できるように構築された。これらのプラスミドを用いると、完全ヒトの、又はキメラの、IgG1κ又はIgG4κ抗体を発現させることができる。同様なプラスミドは、他の重鎖アイソタイプの発現のためにも、又は、ラムダ軽鎖を含む抗体の発現のためにも、構築することができる。
【００８３】
このように、本発明の別の局面では、B11など、ここで解説されたワクチン複合体の抗体部分の構造上の特徴を用いて、APCへの結合など、本発明のB11抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持した構造上関連する抗体を創出する。より具体的には、B11の１つ以上のCDR領域を、公知のヒト・フレームワーク領域及びCDRに組換えにより組み合わせて、本発明のワクチン複合体で用いるための、付加的な、組換え操作された抗APC抗体を創出することができる。
【００８４】
従って、別の実施態様では、本発明は、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRであって、前記ヒト重鎖CDRのうちの少なくとも１つが、図８（配列番号13、14、又は15）に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト重鎖フレームワーク領域及びヒト重鎖CDRと、（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRであって、前記ヒト軽鎖CDRのうちの少なくとも１つが、図９（配列番号16、17、又は18）に示されたCDRのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト軽鎖フレームワーク領域及びヒト軽鎖CDRと、を含む抗体であって、但し前記抗体がAPCへの結合能を保持している、抗体を調製するステップを含む、抗DC抗体を含むワクチン複合体を調製する方法を提供するものである。
【００８５】
本抗体のAPCへの結合能は、実施例に記載したものなど（例えばELISA）、標準的な結合検定法を用いて判定することができる。抗体の重鎖及び軽鎖CDR3ドメインは特に重要な役割を、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性において果たすことが当業で公知であるため、上述のように調製された本発明の組換え抗体は、好ましくは、B11の重鎖及び軽鎖CDR3を含むとよい。本抗体にさらにB11のCDR2を含めることもできる。本抗体にはさらにB11のCDR1を含めることもできる。従って、本発明は、更に、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、及びヒト重鎖CDR3領域であって、但し前記ヒト重鎖CDR3領域が図８（配列番号15）に示されたB11のCDR3である、ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖CDR1領域、ヒト重鎖CDR2領域、及びヒト重鎖CDR3領域と、（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、及びヒト軽鎖CDR3領域であって、但し前記ヒト軽鎖CDR3領域が図９（配列番号18）に示されたB11のCDR3である、ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖CDR1領域、ヒト軽鎖CDR2領域、及びヒト軽鎖CDR3領域と、を含む抗APC抗体であって、DCに結合する抗体、を提供するものである。前記抗体に、更に、B11の重鎖CDR2及び／又は軽鎖CDR2を含めてもよい。前記抗体に、更に、B11の重鎖CDR1及び／又は軽鎖CDR1を含めてもよい。
【００８６】
好ましくは、上述の操作された抗体のCDR1、2、及び／又は3が、ここに開示されたB11のものと全く同じアミノ酸配列を含むとよい。しかしながら、本抗体のDCへの結合能を事実上保持しながらも、B11の通りのCDR配列からの何らかの逸脱が可能であろうことは、当業者に理解されよう（例えば保存的置換など）。従って、別の実施態様では、当該の操作された抗体は、例えばB11の１つ以上のCDRに少なくとも90%、95%、98%又は99.5%同一な１つ以上のCDRから成っていてもよい。
【００８７】
単にAPCに結合することに加え、又は代替的に、上述したような操作された抗体を、例えば：
（１）APCに対する高親和結合；
（２）APC上の固有のエピトープへの結合（組み合わせて用いられた場合の補完的な活性を持つモノクローナル抗体が、同じエピトープへの結合をめぐって競合する可能性を無くすため）；
（３）抗原に対して生ずるＴ細胞媒介性免疫応答を誘導する；及び／又は
（４）CD4＋及びCD8＋Ｔ細胞媒介性応答の両方を含むＴ細胞応答を誘導する、
など、本発明の抗体の他の機能上の特性の保持に関して選抜してもよい。
【００８８】
別の実施態様では、βhCGなどの目的の抗原を発現する全細胞を形質転換して、抗MR抗体などの高APC抗体を発現するようにして、抗原及び抗体がこの細胞により同時に発現するようにする。これは、例えば、膜貫通ドメイン及び抗APC抗体を含有する融合タンパク質をコードする核酸を標的細胞にトランスフェクトすることにより、行わせることができる。こうして、本ワクチン複合体を発現する細胞を、DCなどのAPCの標的に設定してCTL応答を誘導するために用いることができる。
【００８９】
このような核酸、融合タンパク質、及びこのような融合タンパク質を発現する細胞、を作製する方法は、例えば、その全文をこの引用をもってここに援用することとする米国特許出願 09/203,958号に解説されている。
【００９０】
選択的には、本抗体を細胞又は病原体に、化学的リンカ、脂質タグ、又は他の関連する方法を用いて結合させることができる(deKruif, J. et al. (2000) Nat. Med. 6:223-227;
Nizard, P. et al. (1998) FEBS Lett. 433:83-88)。目的の抗原を発現すると共に、表面に抗体が繋がれているような細胞は、腫瘍細胞又は微生物病原体など、この細胞に対するCTL応答などの特異的免疫応答を誘導するために用いられよう。
【００９１】
ＩＩＩ．医薬組成物
別の局面では、本発明は、本発明のワクチン複合体の１つ又は組合せを、薬学的に許容可能な担体と一緒に調合された形で含有する医薬組成物などの治療用組成物を提供するものである。本発明のワクチン複合体は、対象のＴ細胞との相互作用に向けて、対象の血流に送達されるように投与される。このようなＴ細胞の標的決定は、本複合体を直接用いるか、あるいは、ワクチン複合体で予め標的決定された細胞を用いることにより、in vivo 又はex vivo のいずれでも達成することができる。
【００９２】
本発明の組成物には、更に、例えば他の抗体、細胞毒又は薬物（例えば免疫抑制剤）などの他の治療用試薬を含めることもでき、また単独で投与することも、あるいは放射線などの他の治療法と組み合わせて投与することもできる。例えば免疫刺激性サイトカインの放出など、樹状細胞の抗原提示細胞活性を高めるモノクローナル抗体と、APCにより急速に内部移行するようなワクチン複合体を組み合わせることができる。
【００９３】
ここで用いられる「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性あるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、当該の担体が静脈内、筋肉内、皮下、腸管外、脊髄もしくは表皮投与（例えば注射又は輸注により）に適しているとよい。投与経路によっては、本ワクチン複合体を、本化合物を失活させかねない酸の作用及び他の天然条件から本化合物を保護する物質で被覆してもよい。
【００９４】
「薬学的に許容可能な塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持しつつも、望ましくない毒性作用を与えないような塩を言う（例えばBerge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照されたい）。このような塩の例には、酸添加塩及び塩基添加塩がある。酸添加塩には、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸等から誘導されたものや、非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族の酸、脂肪族及び芳香族のスルホン酸等から誘導されたものがある。塩基添加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属から誘導されたものや、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性の有機アミンから誘導されたものがある。
【００９５】
本発明の組成物は、当業で公知の多種の方法で投与することができる。当業者であれば理解されるように、投与の経路及び／又は形態は、所望の結果に応じて様々であろう。当該活性化合物を、インプラント及びマイクロ封入送達系を含む制御放出調合物など、急速な放出から当該化合物を保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような調合物の調製法が数多く、特許付与されており、当業者に広く公知である。
例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【００９６】
特定の投与経路で本発明のワクチン複合体を投与するには、当該化合物の失活を防ぐ物質でそれを被覆するか、又は当該化合物と同時投与することが必要な場合がある。例えば本化合物を、適したリポソームなどの担体又は希釈剤に入れて対象に投与してもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性の緩衝液がある。リポソームには水中油中水CGFエマルジョンや、従来のリポソームがある(Strejan et al. (1984) J.
Neuroimmunol. 7:27)。
【００９７】
薬学的に許容可能な担体には無菌の水溶液又は分散液並びに、無菌の注射液又は分散液の即時調製用の無菌粉末がある。このような媒質及び薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は当業で公知である。従来の媒質又は薬剤が当該活性化合物にとって不適合でない限り、本発明の医薬組成物中のその使用は考察されたところである。補助的な活性化合物も、本組成物中に取り入れることができる。
【００９８】
治療用の組成物は典型的に無菌でなければならず、また製造及び保管条件下で安定でなければならない。本組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、マイクロ乳液、リポソーム、又は他の秩序ある構造として調合することができる。当該の担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適した流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸塩及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、可能である。
【００９９】
無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１つ又は組み合わせと一緒に        加えた後、滅菌マイクロ濾過を行うことにより、調製することができる。分散液は一般的には、塩基性の分散媒と、上に列挙したものの中で必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に当該活性化合物を加えることで、調製されている。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、その結果、活性成分及び付加的な所望の成分の粉末が、予め殺菌濾過されたその溶液から生じる。
【０１００】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療的応答）が得られるように調節される。例えば一個の巨丸剤を投与してもよく、複数に分割された用量を一定期間にわたって投与しても、又は、治療状況の緊急度を指標として用量を比例的に増減させてもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のためには、非経口用組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象にとって単位型の投薬量として調整された物理的に別個の単位を言う。各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、及び、達成しようとする特定の治療効果、並びに（ｂ）このような活性化合物を、個体の感受性の治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。
【０１０１】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には：（１）水溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロール、等；及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等がある。
【０１０２】
治療用組成物の場合、本発明の調合物には、経口及び／又は非経口投与に適したものが含まれる。当該調合物を、適宜、単位剤形で提供してもよく、製薬業で公知のいずれかの方法で調製してもよい。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療しようとする対象、及び特定の投与形態に応じて様々であろう。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物量となるであろう。概して、100パーセントのうちで、この量は約0.01パーセント乃至約99パーセントの活性成分、好ましくは約0.1パーセント乃至約70パーセント、最も好ましくは約1パーセント乃至約30パーセントの範囲であろう。
【０１０３】
ここで用いる文言「非経口投与」及び「非経口的に投与する」とは、通常は注射による、腸管内及び局所投与以外の投与形態を意味し、その中には、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び輸注、がある。
【０１０４】
本発明の医薬組成物中に用いてもよい適した水性及び非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、がある。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料を用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持することができる。
【０１０５】
これらの組成物には、更に、保存剤、湿潤剤、乳濁剤及び分散剤などのアジュバントを含有させてもよい。微生物の存在を防ぐには、上述の滅菌法と、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の多種の抗菌剤及び抗カビ剤の含有の両方を行うと、確実になるであろう。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることも好ましい場合がある。加えて、注射用の薬形の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を含めることにより、可能であろう。
【０１０６】
本発明の化合物を製薬としてヒト及び動物に投与する場合、これらを単独で与えることもできるが、又は、例えば0.01%乃至99.5%（より好ましくは0.1%乃至90%）の活性成分を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する医薬組成物としても、与えることができる。
【０１０７】
選択された投与経路に関係なく、適した水和型で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の常法により、薬学的に許容可能な剤形に調合される。
【０１０８】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与形態にとって、患者に毒性となることなく所望の治療応答を得るために有効量の活性成分が得られるように、変更してもよい。選択される投薬量レベルは、用いる本発明の特定の組成物又は、そのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与期間、用いる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物及び／又は物質、治療しようとする患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医療歴等、医業で公知の因子を含め、多種の薬物動態学的因子に依拠することとなろう。
【０１０９】
当業において通常の技術を有する医師又は獣医であれば、本医薬組成物の必要な有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、この医師又は獣医は、当該医薬組成物中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るのに必要なそれより少ないレベルで開始し、この投薬量を所望の効果が得られるまで次第に増加させていってもよいであろう。一般的には、本発明の組成物の適した一日当たりの用量は、治療効果を生むために有効な最も少ない用量である化合物量であろう。このような有効量は一般に、上で解説した因子に依拠するであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下によることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与するとよい。必要に応じ、治療用組成物の有効な一日分の用量を、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上の小分けした用量に分けて別々に、全日にわたって適当な間隔を置きながら、選択的には単位剤形で投与してもよい。本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、本化合物を医薬調合物（組成物）として投与することが好ましい。
【０１１０】
治療用組成物は当業で公知の医療器具を用いて投与することができる。例えばある好適な実施態様では、本発明の治療用組成物を、例えば米国特許第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；又は第4,596,556号に開示された器具などの無針皮下注射器具で投与することができる。本発明で有用な公知のインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で薬品を分配するインプラント可能なマイクロ輸注ポンプを開示する米国特許第4,487,603号；薬品を皮膚を透過させて投与する治療器具を開示する米国特許第4,486,194号；精確な輸注速度で医薬を送達する医療用輸注ポンプを開示する米国特許第4,447,233号；継続的な薬物送達のための可変流量式のインプラント可能な輸注装置を開示する米国特許第4,447,224号；多チャンバ・コンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,439,196号；及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,475,196号、がある。これらの特許を引用をもってここに援用することとする。数多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが当業者に公知である。
【０１１１】
治療用の組成物は典型的に無菌でなければならず、また製造及び保管条件下で安定でなければならない。本組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、マイクロ乳液、リポソーム、又は他の秩序ある構造として調合することができる。当該の担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適した流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持することができる。多くの場合、例えば糖類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、可能である。
【０１１２】
活性化合物が上述したように適切に保護されていれば、本化合物を、例えば不活性の希釈剤又は同和可能な食用担体などと一緒に経口投与してもよい。
【０１１３】
ＩＶ．  発明の用途及び方法
本発明のワクチン複合体は、多種の疾患及び状態を治療及び／又は防止（例えば免疫化）するために用いることができる。
【０１１４】
主な適応症の１つは癌である。これには、限定はしないが、結腸癌、黒色腫、リンパ腫、前立腺癌、膵臓癌、膀胱癌、線維肉腫、横紋筋肉腫、肥満細胞腫、乳腺腫、白血病、又はリウマチ様線維芽腫、がある。別の主な適応症は、限定はしないが、HIV、肝炎（例えばＡ型、Ｂ型、及びＣ型）、インフルエンザ、疱疹、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、スタフィロコッカス-アウレウス、シュードモナス-アエルギノーサを含む感染性疾患である。別の主な適応症は自己免疫疾患である。
【０１１５】
ある具体的な実施態様では、本ワクチン複合体を、システイン・ループ成長因子スーパーファミリの一メンバである、βhCG又はβhCG発現細胞により媒介される疾患及び状態を治療又は防止するために用いる。βhCGが、成長因子として、血管新生及び／又は転移促進作用物質として、あるいは、免疫機能の抑制物質として、癌の樹立又は進行において役割を果たしているとのエビデンスがある(73)。従って、本発明を、血管新生が関与する癌及び他の疾患の進行を治療するために用いることができる。更に本発明は、妊娠におけるβhCG及び／又はβhCG発現細胞の役割を阻害することにより、望まない妊娠を防止又は終了させるためにも利用することができる。
【０１１６】
治療で用いる場合、本発明のワクチン複合体を対象に直接（即ちin vivoで）投与することができる。代替的には、まず複合体を樹状細胞などのAPCと（例えば培養又はインキュベートにより）接触させてから、この細胞を対象に投与（即ちex
vivo）することにより、本複合体を対象に間接的に投与することもできる。本複合体をAPCに接触させ、送達することで、これらが投与前にAPCによりプロセッシング及び提示されるようにすることは、抗原又は細胞の「装備」とも呼ばれる。抗原をAPCに装備する技術は当業で公知であり、その中には、例えば、Gunzer
and Grabbe, Crit Rev Immunol 21 (1-3):133-45 (2001)及び Steinman, Exp Hematol
24(8): 859-62 (1996)がある。
【０１１７】
いずれの場合でも、本ワクチン複合体は、それらの所望の治療効果を発揮するために有効量、投与される。用語「有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するために必要又は充分な量を言う。例えば、有効量は、腫瘍、癌、又は細菌、ウィルスもしくは真菌感染を消失させるために必要な量かも知れない。いずれかの特定の用途にとっての有効量は、
治療しようとする疾患又は状態、投与される特定の複合体、対象の大きさ、又は当該疾患もしくは状態の重篤度などの因子に応じて様々であろう。当業者であれば、不要な実験を要せず、特定の多重特異的分子の有効量を経験的に決定することができる。
【０１１８】
本ワクチン複合体にとって好適な投与経路には、例えば、注射（例えば皮下、静脈内、非経口、腹腔内、鞘内）がある。注射は大量でも、又は継続的輸注であってもよい。他の投与経路には経口投与がある。
【０１１９】
本発明のワクチン複合体を、アジュバントや、免疫刺激性作用薬などの他の治療薬と同時投与することもできる。本複合体は、典型的に、薬学的に許容可能な担体単独中に、又は、このような作用薬と組み合わせて、調合される。このような担体の例には、溶液、溶媒、分散媒、遅延剤、エマルジョン等がある。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質の使用は当業で公知である。本分子と一緒に用いるのに適したいずれかの他の従来の担体も、本発明の範囲内にある。
【０１２０】
本ワクチン複合体との同時投与に適した作用薬には、他の抗体、細胞毒及び／又は薬物がある。ある実施態様では、該作用薬は、免疫応答を助ける又は誘導することが知られている抗CTLA-4抗体である。別の実施態様では、該作用薬は化学療法薬である。また本ワクチン複合体を放射線と組み合わせて投与することもできる。
【０１２１】
更に本発明を以下の実施例により描出することとするが、以下の実施例を更なる限定的なものと捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された全図面及び全参考文献、特許及び公開済み特許出願の内容を、引用をもってここに援用することを明示しておく。
【０１２２】
実施例
方法及び材料
全血及びロイコパックからのDCの作製：  ヘパリン処理済み全血又はアフェレーシス製剤のフィコール・ハイパックによる密度勾配遠心分離により、ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を得た。次に、プラスチック製培養皿への付着又は水簸法により単球を単離し、サイトカイン（10ng/ml GM-CSF及び2ng/ml
IL-4）の培養基への添加により、未熟DCに分化させた。DCを５日目から７日目までの間、採集し、フローサイトメトリで分析した。この方法で調製されたDCは、CD14−、HLA-DR＋、CD11c＋マンノース受容体＋であり、高レベルの MHC クラスＩ及びＩＩ、CD80 及びCD86を発現した。
【０１２３】
腫瘍抗原βhCGの選択：  βhCGは妊娠の成功の確立に必要なホルモンの１つであるヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのサブユニットである。この糖タンパク質サブユニットは、これを癌の免疫治療にとって魅力的な抗原としている数多くの特徴を有する（Triozzi
P.L. and Stevens V. (1999) Oncology Reports 6:7-17にレビュー）。第一に、妊娠の他には、この抗原の発現は、生殖細胞腫瘍や、数多くの腺癌に主に限られている（表３）。また、hCGは、システイン・ループ成長因子スーパーファミリの一メンバであり、成長因子として、血管新生及び／又は転移促進作用物質として、あるいは、免疫機能の抑制物質として、癌の樹立又は進行において役割を果たしていると思われる。従って、機能的hCGの発現を制限する免疫治療法は、更なる治療上の利益をもたらすであろう。
【０１２４】
【表３】
2006516637.tif 000004
【０１２５】
増殖検定法：  エフェクタＴ細胞（5×104個）を抗原（MDX-1307又は他のもの）を装備した自己由来DC（5×103個）と一緒に、９６ウェル平底マイクロプレートで最終容量0.2mlにして同時培養した。この混合物は３７℃で同時培養された。４日目に培養物に3H-チミジン（1μCi/ウェル）を適用し、１８時間後に細胞をフィルタ（ミリポア社）上に直接、採集した。フィルタを水で３回、洗浄した後、エタノールで１回、洗浄し、フード下で５乃至１０分間、乾燥させた。次に、シンチレーション液（パッカード社、20μl/ウェル）をこのフィルタに加えた。フィルタに結合した放射活性を、ウォラック・ベータ・カウンタで計数することにより、判定した。その結果は、抗原で刺激を受けた、対、抗原なしもしくはコントロール抗原で刺激を受けた、CTLのcpmの刺激指数（S.I.）値で表されている。MHC遮断分析に関しては、標識された標的を、全クラスＩを遮断するためにHLA-特異的mAbであるW6/32
と一緒に、そして全クラスＩＩHLA分子 (20μg/ml）を遮断するためにL243と一緒に、３０分間、室温でプレインキュベートした。結合しなかったmAbは遠心分離で取り除かれた。
【０１２６】
フローサイトメトリ：  ヒトDCを単球から、GM-CSF及びIL-4中での５日間の培養により調製した。DCを氷上で、10μg/mlのβhCG抗原／抗MR抗体ワクチン複合体又はアイソタイプ・コントロールと一緒にインキュベートした。ワクチン複合体は、FITCで直接標識されるか、あるいは、FITCで標識された抗βhCG二次モノクローナル抗体で検出された。この細胞に伴う蛍光を、LSRフローサイトメータを用いて判定した。
【０１２７】
細胞傷害性検定：  コントロール及び抗原を装備した（βhCG-B11）標的細胞（3×106個）を、RPMI 媒質中で２回、洗浄し、ペレットを200μlの媒質中に再懸濁させ、100μCi51Na2CrO4
fで６０分間、３７℃で標識した。標識された標的をRPMI媒質中で３回、洗浄し、ペレットを再懸濁させて、3×104細胞/mlの細胞濃度にした。抗原特異的CTLを96 ウェルＶ底プレートに滴定して、100:1 (エフェクタＴ細胞、E：対標的、T）乃至12.5:
1以下にした。一定数の標識済み標的を添加（100μl/ウェル又は3,000標的細胞/ウェル）し、プレートを低速（180×g）で遠心分離し、３７℃でインキュベートした。４時間後、100乃至120μlの上清を採集し、放出される放射活性をγ-カウンタ計数（パーキン・エルマ社、ウォラック・インスツルメンツ）で判定した。CTL活性を計算し、以下の等式：
特異的溶解（％）＝実験的放出（cpm）−自発的放出（cpm）×１００
最大放出（cpm）−自発的放出（cpm）
を用いて特異的溶解（致死）率で表した。但し式中、実験的（cpm）とは、CTL(E)及び標的(T）を含有するウェルからの放射活性（放出されるクロム）を言い；自発的（cpm）とは、0.1mlの媒質のみ（即ちCTLを添加せず）に入れた標的の入ったウェルからの放射活性を言い、最大放出とは、0.1mlの界面活性剤溶液(Igepal
CA 630；syn. NP-40；RPMI媒質に溶かした5%溶液）の存在下の標的の入ったウェルからの放射活性を言う。よく制御された実験条件下では、自発的な放出値は、最大放出の10%以下であるはずである。MHC遮断分析のために、標識された標的を、全クラスＩの遮断のためにHLA特異的mAbであるW6/32と、そして全クラスＩＩHLA分子の遮断のためにL243と（20μg/ml）、３０分間、室温でプレインキュベートした。結合しなかった
mAb を遠心分離で取り除き、mAbで被覆された標的をCTLに加えた。アイソタイプの一致するmAbをコントロールとして用いた。
【０１２８】
細胞媒介性免疫応答を観察する更に別の方法は、抗原で刺激されたＴ細胞の増殖能を調べる方法である。抗原の感作を受けたＴ細胞は、前に曝露された抗原がMHCクラスＩＩ、そして程度は小さいがクラスＩ分子の関係で提示されたときに優先的に増殖する傾向がある。このように、放射性トレーサの取り込みによる分裂細胞の計数は、刺激の尺度となる。
【０１２９】
実施例１  βhCG-B11の作製
ワクチン複合体のデザイン：  このコンストラクトは、樹状細胞上のヒトマクロファージマンノース受容体に結合する完全ヒト抗体であるB11にβhCG抗原を連結することにより、作製された。連結は、図３に示すように、遺伝子融合により、抗体の重鎖に抗原を共有結合させることにより、行われた。
【０１３０】
βhCG-B11ワクチン複合体の組換え発現：    図２に示すように、βhCGコーディング配列を、抗体B11に、その重鎖のCH3ドメイン（配列番号9及び10）に融合させて含有する、ネオマイシン及びジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含有するプラスミドを作製した。その結果得られたプラスミド・コンストラクトをCHO細胞に標準化されたプロトコル（カリフォルニア州バレンシア、キアジェン社）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、抗生物質G418を含有する培地で選抜した。また、細胞を次第に濃度を高くしたメトトレキセート中で成長させることにより、発現を更に増幅した。増幅後、限界希釈により細胞をクローニングし、安定なクローン株を用いて、その後の研究用の細胞バンクを作製した。βhCG-B11コンストラクトの発現を確認するために、還元条件下でSDS-PAGE上を泳動させたタンパク質のウェスタン・ブロット分析を行った。この融合タンパク質を観察して、予想通りの分子量であること、そして適正に集合していること（即ち、重鎖融合株及び軽鎖の両方を含有すること）を確認した。具体的には、本ワクチン複合体及び抗体のみを、SDS-PAGEにより変性条件を用いて分析し、ウェスタン・ブロット分析により検出した。次に、ブロットを、ヤギ抗ヒトIgG重鎖及び軽鎖を用いて、そしてβhCG
Ｃ末端ペプチドに特異的なmAb（シグマ社）を用いて別々にプローブした。その結果から、形質転換したCHO細胞がB11-βhCGワクチン複合体を特異的に発現したことが、融合産物の適切な大きさ及び組成を証左として、裏付けられた。
【０１３１】
実施例２  B11 scfv-βhCGの作製
ワクチン複合体のデザイン：  樹状細胞上のヒトマクロファージマンノース受容体に結合すると共に、完全ヒトB11抗体のVL及びVHフラグメントを含有する一本鎖抗体であるB11一本鎖融合体（ScFv）に、βhCG抗原を連結することにより、二番目のコンストラクトを作製した。連結は、図１に示すように、遺伝子融合により、B11
ScFvのカルボキシ末端に該抗原を共有結合させることによりなされた（ここではB11sfv-βhCGコンストラクトと呼ぶ）。
【０１３２】
B11sfv-βhCGワクチン複合体の組換え発現：  図１に示すように、B11sfv-βhCGコンストラクト（配列番号11及び12）を含有するプラスミドを作製した。その結果得られたプラスミド・コンストラクトを哺乳動物細胞に標準化されたプロトコル（カリフォルニア州バレンシア、キアジェン社）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を抗生物質G418を含有する媒質中で選抜した。ELISAを行って、B11sfv-βhCGコンストラクトの発現を確認した。
【０１３３】
実施例３  ワクチン複合体の機能特徴付け
抗体で標的決定されたワクチンの、APC表面上のそのコグネート受容体による認識は、この送達プラットフォームの最初のステップである。βhCG-B11及びB11sfv-βhCGコンストラクトが、MRを発現している培養ヒトDCに特異的に結合することを実証するために、フローサイトメトリ研究が用いられてきた（図４）。
【０１３４】
抗MR抗体をプローブとして用いて、ヒト真皮DC上のMRと、様々なヒト組織の切片中のマクロファージの in situ 染色を調べた。ヒト組織凍結切片を抗MRヒト抗体B11で染色した。皮膚の真皮層に存在するDCは、B11抗体ではっきりと標識された（データは図示せず）。皮膚の真皮層でDCへの結合があったことが注目される。更に、検査されたすべての組織中の抗MR
B11 HuMAb染色樹状細胞を用いて行われた免疫組織化学検査では、意外な交差反応性は見られなかった（結果は図示せず）。これらの研究をβhCG-B11で繰り返したが、結果は同一だった。
【０１３５】
実施例４  βhCG抗原／抗MR抗体ワクチン複合体のＴ細胞に対する交差提示
βhCG-B11コンストラクトがDCによるプロセッシングを受けて、DC上のMHCクラスＩ及びクラスＩＩ分子を介して（交差提示）βhCG抗原をＴ細胞に提示する能力を評価した。具体的には、ワクチンに曝露してあるDCと一緒に正常Ｔ細胞のプールを培養することにより、βhCG-B11コンストラクトを用いて、抗原特異的Ｔ細胞を惹起した。次に、その結果得られる「感作」Ｔ細胞を分析して、それらの活性（増殖及び致死）及び特異性を調べた。Ｔ細胞の特異性は、βhCG抗原を有する標的細胞に応答したＴ細胞活性を、抗原陰性コントロールに比較することにより、実証することができる。存在する場合の細胞傷害性Ｔ細胞（CTL）は、βhCG関連抗原を提示する標的のみを致死させ、抗原を欠くか、あるいは、無関係の抗原を提示しているコントロール標的は生かすはずである。CTL媒介性抗原認識は、常に、当該ペプチドを担持するMHC分子の関係でのみ、起きるため、MHC：ペプチド-CTL相互作用がMHC特異的mAbで遮断されれば、クラスＩ又はクラスＩＩの提示が裏付けられる。
【０１３６】
抗原特異的エフェクタＴ細胞の誘導：  接着性単球を25ng/mlの組換えヒトGM-CSF（ミネソタ州、Ｒ＆Ｄシステムズ社）及び100ng/mlの組換えヒトIL-4と一緒に５日間、培養することにより、正常なドナー末梢血単核細胞（PBMC）から樹状細胞を生じさせた。５日目にDCを採集し（未熟）、AIM-V（無血清）媒質中に再懸濁させた。βhCG-B11免疫複合体（20μg/ml）を1.2×106個のDCに加え、４５分間、３７℃でインキュベートした。抗原を装備したDCをCD40L（ニュージャージー州、ペプロテック社；20ng/ml）の存在下で少なくとも２４時間、成熟させた。成熟DC（1×106個）を１回洗浄し、予め24ウェル・プレートに1×106個の細胞/mlになるように接種してあるＴ細胞（2×107個；バルク）に加えた（DC:T細胞の比、20）。以下の培養条件を用いた：10 ng/ml IL-7 を０日目に添加、続いて10 ng/ml のIL-10 を１日目（２４時間目）に添加、そして20
U/ml のIL-2を２日目（４８時間目）に添加。再刺激を前の通りに７日目、１４日目、及び２１日目に行ったが、例外として、βhCG-B11濃度は半分（それぞれ10、5及び2.5μg/ml）にした。装備していない、又は、βhCG-B11、B11sfv-βhCG、もしくはB11で装備された51Cr標識済みDCに対する反応性（バルクで、又は精製済みＴ細胞下位集団で）についてＴ細胞を検査した。MHC特異性が、HLA特異的mAbの存在下で確認された。
【０１３７】
図５に示すように、βhCG-B11コンストラクトはβhCG特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。βhCGを提示しない標的と一緒にＴ細胞を培養した場合、致死は引き起こされなかった。これらの実験で用いられた標的細胞は、βhCG-B11コンストラクト又はコントロール抗原で処理されたHLA適合DCだった。抗MR
抗体（B11）のみで処理された標的細胞は、細胞傷害活性に対して感受性でなかったことから、ワクチンの抗原部分のみがCTL活性を惹起することができることが実証された。これらの結果は、βhCG-B11コンストラクトが効率的なCTL活性を誘導すること、そして具体的には、このCTL活性は、標的決定している抗体（B11）ではなく、βhCG抗原に向かうことを示している。
【０１３８】
更に、βhCG抗原を提示している標的の強力な致死が、精製済みのCD8＋T細胞で再現されたが、この致死は、抗MHCクラスＩ抗体の存在下では遮断された（図６）。具体的には、βhCG-B11コンストラクトを用いて、βhCG特異的Ｔ細胞を、２人のドナーの末梢血単核細胞から生じさせた。CD8＋及びCD4＋T細胞をバルク培養株から免疫磁気ビーズを用いて精製した。細胞傷害性検定を上述したように、エフェクタ：標的比を40:1に設定して行った。標的細胞（未熟DC）を処理しない（コントロール）か、あるいは、βhCG-B11コンストラクトで装備した。MHCクラスＩ特異性を実証するために、標的細胞の致死を、HLA特異抗体（W6/32）とのプレインキュベートにより、遮断した。
【０１３９】
まとめると、これらのデータ（図６及び７）は、強力なβhCG特異的CTLを誘導するβhCG-B11コンストラクトの能力を裏付けるものであり、そして更に、CTL活性はCD8＋T細胞によりHLA依存的に媒介されることも実証している。精製済みCD4＋T細胞では致死活性は何ら、観察されなかった。
【０１４０】
図７に示すように、βhCG-B11コンストラクトで惹起されたＴ細胞は、βhCG-B11コンストラクトで標的決定されたDCに応答して増殖する。具体的には、DCをβhCG-B11コンストラクトで処理して、βhCG特異的T細胞を末梢血単核細胞から生じさせた。バルク培養株（CD4＋及びCD8＋T細胞）由来のT細胞を、抗原刺激に応答した増殖に関して検査した。T細胞を、HLA遮断抗体を加えて、又は加えずに、未処理のDC
(コントロール）と一緒に、又は、βhCG-B11コンストラクト を装備したDCと一緒に、培養した。増殖を測定するために、DNA合成を培養から５日後に3H-チミジンを用いて分析した。データは、コントロールに対する、増殖の倍増（刺激指数）で表された。CTL活性で見られるように、T細胞をDCのみ（即ち抗原なし）で刺激した場合には、何の応答もみとめられなかった。複合体を形成させていない抗体（抗MR
B11 mAb）のみで標的決定されたDCは、βhCG-B11コンストラクトで惹起されるT細胞の増殖を誘導しなかった。T細胞の増殖能は、抗MHCクラスＩやクラスＩＩ特異的mAbの両方の存在下で著しく遮断されたことから、CD4＋及びCD8＋T細胞の両方が応答性であったことが実証された。これらのデータは、MHC区画とのMRの同時局在と一致して、DCによるβhCG-B11コンストラクトの取り込みにより、ワクチンがMHCクラスＩ及びクラスＩＩプロセッシング経路に到達可能になることを示している。
【０１４１】
実施例５  DCによる抗MR抗体B11の内部移行、対、DCによるマンノシル化抗原の内部移行（クラスリン媒介性内部移行の阻害）
未熟DCは、飲作用又は受容体媒介性飲食作用の機序により、可溶性抗原を取り込むことができる(55）。抗原内部移行の機序は、その細胞内での運命を決定すると共に、それに対する免疫応答の質に影響すると考えられる（54、55、56）。MRを通じた内部移行は、急速な、クラスリン媒介性内部移行事象だと解説されている
(57, 58)。MR自体はその細胞質側の尾内に２つの推定クラスリン標的決定配列を有し、マンノシル化金粒子の内部移行により、クラスリンで被覆された孔が電子顕微鏡により位置特定されている(58,
59)。クラスリン依存的飲食作用は、素早い高張ショック又はK＋枯渇により、特異的に破壊することができる (61)。マンノシル化抗原、又は、マンノース受容体に結合させたB11が、クラスリンで被覆された孔を通じて内部移行したのかどうかを判定するために、未熟DCをAIM5培地に入れた氷上で、400mMのショ糖と一緒に又は無しで、３０分間、B11
mAb又はマンノシル化BSAのいずれかの存在下でインキュベートした。次に細胞を３７℃まで温め、２０分間、内部移行させた。洗浄及び固定後、細胞を共焦点顕微鏡法（データは図示せず）で分析した。B11をMRに結合させた場合、その取り込みは高張ショックで阻害されたことから、その内部移行機序はクラスリンで被覆された孔を通じてであることが示された。対照的に、マンノシル化BSAの取り込みは高張ショックでは阻害されなかったことから、その内部移行機序は、クラスリンで被覆された孔の形成に依存していなかったことが示された。B11の濃度の２０倍高いそれでも、マンノシル化BSA
FITCによる表面染色は比較的に弱かった。その後の研究では、内部移行したマンノシル化 BSA FITC は非特異的な液相トレーサと同じ位置に特定されたが、他方、内部移行したB11を含有するベシクルには、この非特異的トレーサは含まれていなかった（データは図示せず）。B11-FITCとは対照的に、
マンノシル化BSA-FITC及び液相トレーサの両方の取り込みとも、PI3K阻害剤ワートマニンによる予備処理で概ね遮断された（データは図示せず）。これらの結果は、マンノシル化BSAの大半は未熟樹状細胞に非特異的マクロピノサイトーシス機序を通じて取り込まれたことを示しており、マンノシル化抗原に対する免疫応答の質は、MRに特異的に標的決定された抗原とは大きく異なることを示唆している。
【０１４２】
実施例６  B11sfv-βhCGのDCへの結合
単球由来DCを、３７℃のB11sfv-βhCG 又はβhCG-B11のいずれかのPBS-BSA緩衝液溶液に４５分間、曝露し、CD40Lの存在下で一晩、成熟させた。次に、採集されたDCを洗浄し、マウス抗βhCG
、続いてヤギ抗ヒトIgG (Fc）-PE 複合体で染色した。染色された細胞をフローサイトメータ（BD-LSR）で分析した。ほぼ10,000の事象を各試料について採集した。バックグラウンドの自発蛍光及びアイソタイプ適合抗体の染色をコントロールとして役立てた。平均蛍光強度（MFI）（データは図示せず）に基づくと、DC上に発現したMRへのB11sfv-βhCG
結合はβhCG-B11のそれと同様である。
【０１４３】
実施例７  βhCG-B11コンストラクトに特異的なCTLは、DCにより提示される、scFv型の抗原（B11sfv-βhCG）を認識する
DCにより提示されたβhCG-B11に対して生じたCTLを、βhCG-B11及びB11sfv-βhCGに曝露した自己由来DC標的に対して検査し、他方、未処理のDC又はB11に曝露したDCをコントロールとして役立てた。抗原曝露後、上清中の放射活性の放出を測定する４時間検定で、標的を51クロムで標識し、CTLと混合した。この実験において、βhCG-B11特異的T細胞は、MHCクラスＩ分子上に抗原を提示する４つの標的のうち２つを認識する。DCが抗原を欠いた場合、標的の致死は何らみとめられなかった（図１１）。このように、DCによるβhCG-B11の取り込みの結果、CTLにより認識されるβhCG由来T細胞エピトープが生ずると思われる。
【０１４４】
均等物
当業者であれば、慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【０１４５】
引用による援用
ここに引用した全特許、係属中特許出願及び他の公開文献の全文を、引用をもってここに援用することとする。
【０１４６】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、一本鎖B11抗体をβhCG抗原に連結させて含有する融合タンパク質（pB11sfv-βhCG）をコードする分子複合体（配列番号11及び12）のマップを示す。
【図２】図２は、全B11抗体をβhCG抗原に連結させて含有する融合タンパク質（βhCG-B11コンストラクト）をコードする分子複合体（配列番号9及び10）のマップを示す。
【図３】図３は、分子複合体の概略的図解である。当該の抗原は、インタクト抗体の重鎖に遺伝子的に融合されている。
【図４】図４は、MRを発現している培養ヒトDCに特異的に結合するβhCG-B11コンストラクトを示す、フローサイトメトリ研究に基づくグラフである。
【図５】図５は、βhCG-B11コンストラクトがβhCG特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図６】図６は、βhCG-B11コンストラクトがβhCG特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを示すグラフである。
【図７】図７は、βhCG-B11コンストラクトがＴヘルパ応答を誘導することを示す棒グラフである。
【図８】図８は、指定されたCDR領域（配列番号13、14、及び15）を持つヒトモノクローナル抗体B11の重鎖V領域のヌクレオチド配列（配列番号3）及び対応するアミノ酸配列（配列番号4）を示す。
【図９】図９は、指定されたCDR領域（配列番号16、17、及び18）を持つヒトモノクローナル抗体B11の軽（カッパ）鎖V領域のヌクレオチド配列（配列番号7）及び対応するアミノ酸配列（配列番号8）を示す。
【図１０】図１０は、ウェブ・ベースの予想アルゴリズム(BIMAS＆SYFPEITHI)を用いて分析されたβhCG-B11コンストラクトの予想上のT細胞エピトープを示す図である。T細胞エピトープはHLA-A2、HLA-B7及びHLA-DR分子への潜在的結合について見出された。いくつかのエピトープも、βhCG-B11のB11セグメントから予想された。37aa長のＣ末端ペプチドではT細胞エピトープは見つからなかった。
【図１１】図１１は、βhCG-B11コンストラクトに特異的なCTLが、DCにより提示されるscFv型の抗原であるB11sfv-βhCGを認識することを示すグラフである。
【図１２】図１２は、ヒトモノクローナル抗体B11の重鎖V領域のアミノ酸配列（配列番号4）を、生殖細胞系配列(配列番号30)、VH5-51生殖細胞系、に比較して示す。
【図１３】図１３は、ヒトモノクローナル抗体B11の重鎖V領域のヌクレオチド配列（配列番号3）を、生殖細胞系配列(配列番号29)、VH5-51生殖細胞系に比較して示す。
【図１４】図１４は、指定されたCDR領域を持つヒトモノクローナル抗体B11の軽（カッパ）鎖V領域のアミノ酸配列（配列番号8）を、生殖細胞系配列(配列番号32)、Vk-L15生殖細胞系に比較して示す。
【図１５】図１５は、指定されたCDR領域を持つヒトモノクローナル抗体B11の軽（カッパ）鎖V領域のヌクレオチド配列（配列番号7）を、生殖細胞系配列(配列番号31)、Vk-L15生殖細胞系に比較して示す。
【配列表】
2006516637.tif 000005
2006516637.tif 000006
2006516637.tif 000007
2006516637.tif 000008
2006516637.tif 000009
2006516637.tif 000010
2006516637.tif 000011
2006516637.tif 000012
2006516637.tif 000013
2006516637.tif 000014
2006516637.tif 000015
2006516637.tif 000016
【図１】
2006516637.tif 000017
【図２】
2006516637.tif 000018
【図３】
2006516637.tif 000019
【図４】
2006516637.tif 000020
【図５】
2006516637.tif 000021
【図６】
2006516637.tif 000022
【図７】
2006516637.tif 000023
【図８】
2006516637.tif 000024
【図９】
2006516637.tif 000025
【図１０】
2006516637.tif 000026
【図１１】
2006516637.tif 000027
【図１２】
2006516637.tif 000028
【図１３】
2006516637.tif 000029
【図１４】
2006516637.tif 000030
【図１５】
2006516637.tif 000031
【国際調査報告】
2006516637.tif 000032
2006516637.tif 000033