(57)【要約】クローニングステップを必要とせずに、外来遺伝因子を細菌染色体内に組み込むための１つの方法が提供される。この方法は、組換えやすい細菌宿主内の、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系の存在に依存する。少なくとも２つの直鎖状組み換え因子、もしくはコンストラクトが、相同的組み換えによって細菌染色体での配向補正でアセンブルされる、組換えやすい宿主へと同時形質転換される。形質転換体の選択に用いる選択マーカーは、後に部位特異的組み換えの作用によって切断される。
2006510374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択マーカーを欠いた発現可能なＤＮＡフラグメントを細菌染色体に指向性組込み（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）するための方法であって、
ａ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−３’
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基で構成される第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基で構成される第２の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第１の組み換え因子を提供し、
ｂ）５’から３’方向への一般構造が
Ｘ−ＲＲ３
（式中、（ｉ）Ｘは、第２の組み換え領域に相同性を有する発現可能なＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基で構成される第３の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第２の組み換え因子を提供し、
ｃ）（ｉ）前記第１の組み換え領域に相同性を有する第１の染色体領域と、
（ｉｉ）前記第３の組み換え領域に相同性を有する第２の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）細菌宿主を提供し、
ｄ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−Ｘ−ＲＲ３
であるコンストラクトを形成しながら、第１および第２の組み換え因子を第１の染色体領域と第２の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
ｆ）選択マーカーを染色体から切断することで、選択マーカーを欠いた状態で発現可能なＤＮＡフラグメントを細菌染色体に挿入する、（ｅ）の単離された宿主で、部位特異的リコンビナーゼを発現させること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
選択マーカーを欠いた発現可能なＤＮＡフラグメントを細菌染色体に指向性組込みするための方法であって、
ａ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−３’
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基で構成される第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、
（ｉｖ）Ｙは、第１の発現可能なＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基で構成される第２の組み換え領域である）
である、少なくとも１つの第１の組み換え因子を提供し、
ｂ）５’から３’方向への一般構造が
５’−Ｘ−ＲＲ３−３’
（式中、（ｉ）Ｘは、第２の組み換え領域に相同性を有する、第２の発現可能なＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基で構成される第３の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第２の組み換え因子を提供し、
ｃ）（ｉ）前記第１の組み換え領域に相同性を有する第１の染色体領域と、
（ｉｉ）前記第３の組み換え領域に相同性を有する第２の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
ｄ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−Ｘ−ＲＲ３
であるコンストラクトを形成しながら、第１および第２の組み換え因子を第１の染色体領域と第２の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
ｆ）選択マーカーを染色体から切断することで、選択マーカーを欠いた状態で第１および第２の発現可能なＤＮＡフラグメントを細菌染色体に挿入する、（ｅ）の単離された宿主で、部位特異的リコンビナーゼを発現させること、
を含んでなる方法。
【請求項３】
第１の発現可能なＤＮＡフラグメントと第２の発現可能なＤＮＡフラグメントのいずれかが、調節因子、プロモーター、遺伝子、コード配列、およびオープンリーディングフレームよりなる群から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
部位特異的リコンビナーゼが、プラスミド上に存在する遺伝子によって発現される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の染色体領域が、細菌プロモーターの上流にある、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の染色体領域が、オペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発現可能なＤＮＡフラグメントが、細菌プロモーターおよびファージプロモーターよりなる群から選択されるプロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーターが、調節回路を制御するためのポジティブな調節部位とネガティブな調節部位とを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記調節領域がｌａｃオペレーター部位を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーター、ファージＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーターよりなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択マーカーが、抗生物質耐性マーカー、酵素マーカー、およびアミノ酸生合成酵素よりなる群から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、前記組換えやすい宿主が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換え部位が、ｌｏｘ、ｆｒｔ、ｄｉｆ、およびａｔｔよりなる群から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記部位特異的リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｘｅｒ、およびＩｎｔよりなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換え因子がＰＣＲによって生成される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み換え因子が、約２５塩基〜約４０００塩基である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えやすい宿主細胞の細菌染色体プロモーターに代えて外来プロモーターを組み込みむための方法であって、
ａ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−３’
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基で構成される第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基で構成される第２の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第１の組み換え因子を提供し、
ｂ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＦＰ−ＲＲ３−３’
（式中、（ｉ）ＦＰは、第２の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基で構成される第３の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第２の組み換え因子を提供し、
ｃ）（ｉ）前記第１の組み換え領域に相同性を有する細菌プロモーターの上流にある、第１の染色体領域と、
（ｉｉ）前記第３の組み換え領域に相同性を有する前記細菌プロモーターの下流にある、第２の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
ｄ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−ＦＰ−ＲＲ３
であるコンストラクトを形成しながら、第１および第２の組み換え因子を第１の染色体領域と第２の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
ｆ）選択マーカーを染色体から切断することで、細菌プロモーターに代えて外来プロモーターを細菌染色体に挿入すること、
を含んでなる方法。
【請求項１８】
連鎖していない外来プロモーターと外来のオープンリーディングフレームとを組換えやすい宿主細胞の細菌染色体に組み込むための方法であって、
ａ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＰ−ＲＲ２−３’
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基で構成される第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、
（ｉｖ）ＦＰは、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基で構成される第２の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第１の組み換え因子を提供し、
ｂ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＦＯ−ＲＲ３−３’
（式中、（ｉ）ＦＯは、第２の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基で構成される第３の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第２の組み換え因子を提供し、
ｃ）（ｉ）前記第１の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第１の染色体領域と、
（ｉｉ）前記第３の組み換え領域に相同性を有する、前記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第２の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
ｄ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＰ−ＲＲ２−ＦＯ−ＲＲ３
であるコンストラクトを形成しながら、第１および第２の組み換え因子を第１の染色体領域と第２の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
ｆ）選択マーカーを染色体から切断することで外来プロモーターと外来のオープンリーディングフレームとを細菌染色体に挿入すること、
を含んでなる方法。
【請求項１９】
調節領域と外来のオープンリーディングフレームとを含んでなる外来遺伝子を、組換えやすい宿主細胞の細菌染色体に組み込むための方法であって、
ａ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＧ−ＲＲ２−３’
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基で構成される第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、
（ｉｖ）ＦＧは、組換えやすい宿主細胞にとって外来の、調製領域を含んでなる遺伝子であり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基で構成される第２の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第１の組み換え因子を提供し、
ｂ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＦＯ−ＲＲ３−３’
（式中、（ｉ）ＦＯは、第２の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基で構成される第３の組み換え領域である）である、少なくとも１つの第２の組み換え因子を提供し、
ｃ）（ｉ）前記第１の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第１の染色体領域と、
（ｉｉ）前記第３の組み換え領域に相同性を有する、前記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第２の染色体領域と、
を含む細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を提供し、
ｄ）５’から３’方向への一般構造が
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＧ−ＲＲ２−ＦＯ−ＲＲ３
であるコンストラクトを形成しながら、第１および第２の組み換え因子を第１の染色体領域と第２の染色体領域との間で細菌染色体に組み込む、これら両因子で前記組換えやすい宿主を形質転換し、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択して単離し、
ｆ）選択マーカーを染色体から切断することで外来プロモーターと外来のオープンリーディングフレームとを細菌染色体に挿入すること、
を含んでなる方法。
【請求項２０】
部位特異的リコンビナーゼが、プラスミド上に存在する遺伝子によって発現される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーターが、細菌プロモーターおよびファージプロモーターよりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロモーターが、調節回路を制御するためのポジティブな調節部位とネガティブな調節部位とを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記調節領域がｌａｃオペレーター部位を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーター、ファージＴ７プロモーター、およびｌａｃプロモーターよりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、前記組換えやすい宿主が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）および、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組み換え部位が、ｌｏｘ、ｆｒｔ、ｄｉｆ、およびａｔｔよりなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記部位特異的リコンビナーゼが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、Ｘｅｒ、およびＩｎｔよりなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組み換え因子がＰＣＲによって生成される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組み換え因子が、約２５塩基〜約４０００塩基である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｄ）〜（ｆ）を１回もしくはそれ以上繰り返す、請求項１、２、１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００２年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／４３４，６０２号明細書の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は細菌学分野に関する。特に、本発明は生体内での染色体操作に関連した方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細菌の全ゲノム配列を利用でき、かつ、その代謝経路が解明されたことで、工業的に関心が持たれている化合物の製造目的で微生物を操作するための知識を活用できるようになっている。細菌に工業用化合物を産生させるには、生物ゲノムに起こる変化を効率よく操作できる必要がある。遺伝因子の追加、欠如、修飾といった変化を操作することが、時間のかかる難題であることが立証されることも多かった。そのような修飾の１つに、代謝経路にあるしかるべき遺伝子の発現を遺伝的に操作して修飾することがあげられる。
【０００４】
遺伝子の発現を調節するには、さまざまな方法がある。細菌の代謝操作では、一般に、優勢または条件付きのプロモーターの制御下で多コピー型ベクターを用いて所定の遺伝子を発現させる。この工業用途での代謝操作法には欠点がいくつかある。分離が不安定であるがゆえにベクターを保持しにくいことがある。また、ベクターの負担が原因で、細胞の生存や成長に対する悪影響が認められることがある。ベクター上で所望の遺伝子の最適な発現レベルを制御することも困難である。多コピー型ベクターの使用に伴って望ましくない影響がおよぶのを避けるために、バクテリオファージλ、トランスポゾン、もしくは所定の遺伝子を含む他の適当なベクターの単独挿入による相同的組み換えを用いる染色体組み込みのアプローチがとられている。しかしながらこの方法にも、組み換えに先んじて所定の遺伝子を適当なベクターに入れるために、複数のクローニングステップを用いなければならないなどの欠点がある。もう１つの欠点は、挿入後の遺伝子が切断時に失われてしまう可能性があるという不安定性にある。最後に、この方法では、挿入できる数の点で限度がある上、染色体上にて挿入部位の位置を制御できない。
【０００５】
最近になって、λ−Ｒｅｄ組換え系を用いて染色体遺伝子をＰＣＲで不活性化することについての説明がなされている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら（上掲、１９９８）は、λ−Ｒｅｄ系を使用することと、それが細菌染色体と、エレクトロポレーションによって取り込まれた直鎖状２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子との組み換えをどのように促進するのかを明らかにした。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）や、腸管病原性大腸菌および腸管出血性大腸菌ををはじめとする細菌のいくつかの菌株は、この系を用いて首尾よく形質転換された（ポテーテ（Ｐｏｔｅｅｔｅ），Ａ．、上掲、２００１）。しかしながら、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら（上掲、１９９８）の方法では、組み換えの効率を最大にするのに、相同的にオーバーラップしている数百もの塩基を用いた。
【０００７】
スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（特許文献１）は、細菌リコンビナーゼ、すなわちＲｅｃＥＴおよび／またはλ−Ｒｅｄ系を用いて、標的のＤＮＡフラグメントをベクターにクローニング、かつサブクローニングすることについて教示している。この標的ＤＮＡには、ベクター上の対応するホモロジーアームと相同性が共通の末端が含まれる。この標的ＤＮＡをベクターに付加するにはリコンビナーゼによる相同的組み換えを利用する。特許文献１に記載されたこれらの方法は、標的ＤＮＡをベクターに付加することに限定されている。特許文献１には、２つのフラグメントを用いる染色体操作法について何ら教示されておらず、プロモーターと調節領域とを染色体的に操作して生合成経路にある所望の遺伝子および／またはオペロンの発現レベルを人為的に制御するのに有用な方法も教示されていない。シャベロシュ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ）ら（上掲）による同様のアプローチでは、後に糸状菌のアスペリルスニドゥラス（Ａｓｐｅｒｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｓ）ゲノムの相同的組み換えによる形質転換に用いられるコスミドの修飾に、λ−Ｒｅｄ系を利用している。どちらの例も、λ−Ｒｅｄ（または機能的に同等の）系を用いて、後に宿主のゲノムとの相同的組み換え、もしくは染色体上の形質転換に用いられるベクターを遺伝子修飾することについて使用を明らかにしている。
【０００８】
スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（特許文献２）は、ＲｅｃＥＴおよび／またはλ−Ｒｅｄ系遺伝子産物を用いて、２つのＤＮＡ分子（相同または「ホモロジーアーム」の２つの領域）間の相同的組み換えを触媒することについて教示している。特許文献２には、３回の相同的組み換え（２つの直鎖状ＤＮＡ分子と細菌染色体との間の組み換え）に基づく方法は教示されておらず、宿主細菌の生合成経路を染色体的に操作するのに適した方法も教示されていない。スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）らの両特許に記載された方法では、発現可能なＤＮＡフラグメントを選択マーカーと共に一斉に宿主細胞の染色体に組み込むために、相同的組み換えの前に１つもしくはそれ以上のクローニングステップがさらに必要になろう。
【０００９】
ザン（Ｚｈａｎｇ）ら（非特許文献８）は、ｓｂｃＡ陽性大腸菌株でのＲｅｃＥＴリコンビナーゼ系を用いることについて教示し、標的のＤＮＡフラグメントをベクターにクローニングおよびサブクローニングするための相同的組み換えを促進できることを明らかにした。ザン（Ｚｈａｎｇ）らは、λ−Ｒｅｄに関するデータを何ら提示していない上、事前のクローニングステップを必要とせずに、プロモーターもしくは遺伝子を選択マーカーと共にワンステップで組み込めるようにする、３回の相同的組み換え（２つのＤＮＡフラグメントでの方法）を用いた染色体操作の方法も教示していない。
【００１０】
マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら（上掲、２０００）は、λ−Ｒｅｄ系を大腸菌で用いることについて教示しており、事前のクローニングステップを必要としない、遺伝子ノックアウトの作出時におけるこの系の有用性を明らかにしている。λ−Ｒｅｄ系大腸菌のを組換えやすい菌株と比較したところ、組み換え率が約１０〜１００倍高くなる、はるかに効率的なものであることが明らかになった。しかしながら、当該文献に記載の方法で効率的な形質転換を行うには、１つの直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントの各末端に約１０００ｂｐの相同な塩基対を使用する必要があった。さらに、当該文献に記載の方法の目的は、遺伝子ノックアウトによるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の機能的分析にあり、医薬品開発用の重要な未知の遺伝子を同定できはしたが、これはプロモーターおよび／または遺伝子の染色体組み込み用のものではなかった。
【００１１】
パティ（Ｐａｔｉ）ら（特許文献３）は、目的とする相同的組み換えを用いて、遺伝子配列を生体内で変化させることについて教示している。彼らの複雑な多段階的方法は、精製された大腸菌ＲｅｃＡタンパク質によって生体外でコートされた２つの１本鎖ポリヌクレオチドを使用することに立脚するものである。パティ（Ｐａｔｉ）らの方法による組み換えに好ましい標的は、ＲｅｃＡ／１本鎖ＤＮＡに仲介された生体外で起こる反応を伴う、プラスミドまたは他のベクターなどの染色体上の配列である。この修飾後のベクターを処理し、標的を宿主細胞に導入する前にＲｅｃＡタンパク質を取り除く。本発明の方法は、上記の方法よりも簡便かつ時間もかからずに、直接宿主細胞のゲノムを標的とするものである。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，３５５，４１２号明細書
【特許文献２】米国特許第６，５０９，１５６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０７４，８５３号明細書
【非特許文献１】遺伝子（Ｇｅｎｅ）、第２４６号、３２１〜３３０ページ、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、（２０００）
【非特許文献２】Ｊ．バクテリオル（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）、第１８０号、２０６３〜２０７１ページ、マーフィー、Ｋ．（Ｍｕｒｐｈｙ  Ｋ．）、（１９９８）
【非特許文献３】Ｊ．バクテリオル（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）、第１８２号、２３３６〜２３４０ページ、ポテーテ（Ｐｏｔｅｅｔｅ）とフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）、（２０００）
【非特許文献４】ヨーロッパ微生物学会連盟（ＦＥＭＳ）、マイクロバイオロジー、書簡（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．）、第２０１号、９〜１４ページ、ポテーテ、Ａ．（Ｐｏｔｅｅｔｅ，Ａ．）、（２００１）
【非特許文献５】米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９７号、６６４０〜６６４５ページ、ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、（２０００）
【非特許文献６】米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ）、第９７号、５９７８〜５９８３ページ、ユ（Ｙｕ）ら、（２０００）
【非特許文献７】核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｓｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２８号、第９７版、１〜６ページ、シャベロシュ（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ）ら、（２０００）
【非特許文献８】ネイチャージェネティクス（Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．）、第２０号、１２３〜１２８ページ、ザン（Ｚｈａｎｇ）ら、（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、解決すべき課題は、大腸菌などの細菌のプロモーターおよび遺伝子を生体内で染色体操作する、手軽なワンステップの方法に有用な方法および材料を提供することである。相同的組み換えを用いて、染色体遺伝子、プロモーター、他の核酸調節因子を直接修飾できるようにする簡単なワンステップの機序は存在しない。
【００１４】
本発明は、大腸菌染色体の任意の標的遺伝子の前に位置する、任意のプロモーター／調節領域を安定的に組み込んで遺伝子の発現制御を可能にする、簡単で効率的なワンステップの方法（従来の方法で用いられているクローニングのステップを含まない）を提供するものである。さらに、本発明の方法は、ＰＣＲで生成された２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントと宿主細胞の染色体との間で起こる３回の相同的組み換えによる、機能的ＤＮＡ分子の目的とする付加および／または除去を利用して宿主細胞内の生化学的経路を生成および／または操作する目的で染色体修飾のサイクルを繰り返すことも可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
細菌の生合成経路を操作するにあたって本発明の染色体組み込み方法が有用であることを、イソプレノイド／カロテノイド生合成を一例として用いて示す。イソプレノイド経路に関与する律速酵素をコードする鍵遺伝子のプロモーターを、本発明の方法で操作する。この遺伝子修飾によって、β−カロテンの産生量が増加した。大腸菌内では通常見られない、カロテノイドの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子も、本発明の方法で強力なプロモーターの制御下で宿主染色体上の特定の位置に付加される。この方法を用いることで、大腸菌内で複数の染色体を修飾することができるが、このことは生合成経路を工業的な目的で操作する際に時に重要である。このように、本発明の方法を、生合成経路の操作において有用な複数の染色体修飾に使用することができる。ＰＣＲで生成された２つの直鎖状フラグメントを用いた、ファージλ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系の存在下での相同的組み換えの方法を、図１で説明する。この方法はまた、部位特異的リコンビナーゼを利用して選択マーカーを除去し、容易かつ効率的な生体内での染色体操作を可能にすることについても含む。
【００１６】
したがって、本発明は、選択マーカーを欠いた発現可能なＤＮＡフラグメントの、細菌染色体への指向性組込みのための方法であって、
ａ）５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第１の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基の第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基の第２の組み換え領域である）
ｂ）５’から３’方向に、
Ｘ−ＲＲ３
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第２の組み換え因子を調達することであり、
（式中、（ｉ）Ｘは、第２の組み換え領域に相同性を有する発現可能なＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基の第３の組み換え領域である）
ｃ）細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
（ｉ）上記第１の組み換え領域に相同性を有する第１の染色体領域と、
（ｉｉ）上記第３の組み換え領域に相同性を有する第２の染色体領域と、
を含んでなり、
ｄ）第１、および第２の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−Ｘ−ＲＲ３
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第１と第２の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
ｆ）（ｅ）の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより発現可能なＤＮＡフラグメントが、選択マーカーを欠いて、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
同様に、本発明は、選択マーカーを欠いた発現可能なＤＮＡフラグメントの、細菌染色体への指向性組込みのための方法であって、
ａ）５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第１の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基の第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、
（ｉｖ）Ｙは、第１の発現可能なＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基の第２の組み換え領域である）
ｂ）５’から３’方向に、
５’−Ｘ−ＲＲ３−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第２の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）Ｘは、第２の組み換え領域に相同性を有する、第２の発現可能なＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基の第３の組み換え領域である）
ｃ）λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を内在させ、かつ細菌染色体を有している、組換えやすい細菌宿主を調達し、
（ｉ）上記第１の組み換え領域に相同性を有する第１の染色体領域と、
（ｉｉ）上記第３の組み換え領域に相同性を有する第２の染色体領域と、
を含んでなり、
ｄ）第１、および第２の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−Ｙ−ＲＲ２−Ｘ−ＲＲ３
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第１と第２の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
ｆ）（ｅ）の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより第１、および第２の発現可能なＤＮＡフラグメントは、選択マーカーを欠いて、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
【００１８】
他の一実施形態では、本発明は、細菌染色体プロモーターに代わる外来のプロモーターの、組換えやすい宿主細胞内での組み込みのための方法であって、
ａ）５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第１の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基の第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基の第２の組み換え領域である）
ｂ）５’から３’方向に、
５’−ＦＰ−ＲＲ３−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第２の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＦＰは、第２の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基の第３の組み換え領域である）
ｃ）細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
（ｉ）上記第１の組み換え領域に相同性を有する細菌プロモーターの上流にある、第１の染色体領域と、
（ｉｉ）上記第３の組み換え領域に相同性を有する上記細菌プロモーターの下流にある、第２の染色体領域と、
を含んでなり、
ｄ）第１、および第２の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＲＲ２−ＦＰ−ＲＲ３
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第１と第２の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
ｆ）（ｅ）の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させ、選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーターが細菌プロモーターに代わって、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、連鎖していない外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームの、組換えやすい宿主細胞内にある細菌染色体への組み込みのための方法であって、
ａ）５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＰ−ＲＲ２−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第１の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基の第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、
（ｉｖ）ＦＰは、組換えやすい宿主細胞にとって外来のプロモーターであり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基の第２の組み換え領域である）
ｂ）５’から３’方向に、
５’−ＦＯ−ＲＲ３−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第２の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＦＯは、第２の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基の第３の組み換え領域である）
ｃ）細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
（ｉ）上記第１の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第１の染色体領域と、
（ｉｉ）上記第３の組み換え領域に相同性を有する、上記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第２の染色体領域と、
を含んでなり、
ｄ）第１、および第２の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＰ−ＲＲ２−ＦＯ−ＲＲ３
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第１と第２の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
ｆ）（ｅ）の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームが、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、調節領域、および外来のオープンリーディングフレームを含んでなる外来遺伝子の、組換えやすい宿主細胞内にある細菌染色体への組み込みのための方法であって、
ａ）５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＧ−ＲＲ２−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第１の組み換え因子を調達し、
（式中、（ｉ）ＲＲ１は、約１０〜５０塩基の第１の組み換え領域であり、
（ｉｉ）ＲＳは、部位特異的リコンビナーゼに応答する組み換え部位であり、
（ｉｉｉ）ＳＭは、選択マーカーをコードするＤＮＡフラグメントであり、
（ｉｖ）ＦＧは、組換えやすい宿主細胞にとって外来の、調製領域を含んでなる遺伝子であり、かつ
（ｉｖ）ＲＲ２は、約１０〜５０塩基の第２の組み換え領域である）
ｂ）５’から３’方向に、
５’−ＦＯ−ＲＲ３−３’
の一般的な構造を有する、少なくとも１つの第２の組み換え因子を調達することであり、
（式中、（ｉ）ＦＯは、第２の組み換え領域に相同性を有する、組換えやすい宿主細胞にとって外来のオープンリーディングフレームであり、かつ
（ｉｉ）ＲＲ３は、約１０〜５０塩基の第３の組み換え領域である）
ｃ）細菌染色体を有し、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ、組換えやすい細菌宿主を調達し、
（ｉ）上記第１の組み換え領域に相同性を有する、細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の上流にある、第１の染色体領域と、
（ｉｉ）上記第３の組み換え領域に相同性を有する、上記細菌のオペロン間の染色体組み込み部位の下流にある、第２の染色体領域と、
を含んでなり、
ｄ）第１、および第２の組み換え因子で、上記組換えやすい宿主を形質転換し、
５’から３’方向に、
５’−ＲＲ１−ＲＳ−ＳＭ−ＲＳ−ＦＧ−ＲＲ２−ＦＯ−ＲＲ３
の一般的な構造を有するコンストラクトを形成しながら、第１と第２の染色体領域間の細菌染色体に、両因子が組み込まれ、
ｅ）選択マーカーに基づいて、（ｄ）のコンストラクトを有する形質転換宿主を選択、かつ単離し、
ｆ）（ｅ）の単離された宿主内で、部位特異的リコンビナーゼを発現させることであり、
選択マーカーが染色体から切断され、それにより外来プロモーター、および外来のオープンリーディングフレームが、細菌染色体内へ挿入されること、
を含んでなる方法を提供する。
【００２１】
本件出願の一部をなす以下の詳細な説明ならびに添付の配列の説明から、本発明についてなお一層深く理解することができよう。
【００２２】
下記の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１条〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）、欧州特許庁（ＥＰＯ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の配列表要件（施行規則第５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびに実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に従ったものである。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のデータに用いる記号ならびに形式は、米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に準拠する。
【００２３】
配列の説明と生物学的寄託物
配列番号１は、「Ｔ１（ｄｘｓ）」と表される、カナマイシン耐性遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＫＤ４（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４３）からＰＣＲで増幅するのに用いられる、２つのプライマー配列の第１の配列であり、ｉｓｐＡ終止コドンの上流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ１」と表されるホモロジーアームを含む（図２）。
【００２４】
配列番号２は、「Ｂ１（Ｔ５）」と表される、カナマイシン耐性遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＫＤ４からＰＣＲで増幅するのに用いられる、２つのプライマー配列の第２の配列であり、ファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）のＤＮＡフラグメントの５’−末端領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ２」と表されるホモロジーアームを含む（図２）。
【００２５】
配列番号３は、「Ｔ２（Ｔ５）」と表される、−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるＰＴ５プロモーターを含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））からＰＣＲで増幅するのに用いられる、２つのプライマー配列の第１の配列である（図２）。このプライマーは、後に、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターのｄｘｓ遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅によって検証するのに用いられる（図６）。
【００２６】
配列番号４は、「Ｂ２（ｄｘｓ）」と表される、−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるＰＴ５プロモーターを含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、ｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））からＰＣＲで増幅するのに用いられる、２つのプライマー配列の第２の配列であり、ｄｘｓ開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ３」と表されるホモロジーアームを含む（図２）。
【００２７】
配列番号５は、「Ｔ１」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターのｄｘｓ遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅によって検証するのに用いられるプライマーである（図６）。
【００２８】
配列番号６は、「Ｔ２」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターのｄｘｓ遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅によって検証するのに用いられるプライマーである（図６）。
【００２９】
配列番号７は、「Ｔ３」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターのｄｘｓ遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅によって検証するのに用いられるプライマーである（図６）。
【００３０】
配列番号８は、「Ｔ４」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターのｄｘｓ遺伝子上流への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅によって検証するのに用いられるプライマーである（図６）。
【００３１】
配列番号９は、「Ｔ（ｉｄｉ）」と表される、カナマイシン耐性選択マーカーを含むＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＫＤ４からＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第１のプライマーであり、ｙｇｆＵ終止コドンの上流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ４」と表されるホモロジーアームを含む（図８）。
【００３２】
配列番号１０は、「Ｂ（ｉｄｉ）」と表される、−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）、リボソーム結合部位を含んでなるＰＴ５プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、ｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））からＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第２のプライマーであり、ｉｄｉ開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ５」と表されるホモロジーアームを含む（図８）。
【００３３】
配列番号１１は、「Ｔ５」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターの、ｉｄｉ遺伝子上流への染色体組み込みを確認する、ＰＣＲ分析のために用いられるプライマーである（図９）。
【００３４】
配列番号１２は、「Ｔ６」と表される、カナマイシン選択マーカーおよびＰＴ５プロモーターの、ｉｄｉ遺伝子上流への染色体組み込みを確認する、ＰＣＲ分析のために用いられるプライマーである（図９）。
【００３５】
配列番号１３は、「Ｔｔ５」と表される、−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃＯ、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるＰＴ５プロモーター因子を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））からＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第１のプライマーである。
【００３６】
配列番号１４は、「Ｂｔ５」と表される、−１０および−３５コンセンサス配列、ｌａｃＯ、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるＰＴ５プロモーター因子を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．））からＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第２のプライマーである。
【００３７】
配列番号１５は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸への縮合を触媒する、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ由来のＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）酵素をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号１６は、「Ｔ１（ｄｘｓ１６ａ）」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、ｐＳＵＨ５からＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第１のプライマーであり、大腸菌染色体の３０．９分に位置する遺伝子間領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ６」と表されるホモロジーアームを含む（図１１）。
【００３９】
配列番号１７は、「Ｂ１（ｄｘｓ１６ａ）」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、ｐＳＵＨ５からＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第２のプライマーであり、ｄｘｓ（１６ａ）開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ７」と表されるホモロジーアームを含む（図１１）。
【００４０】
配列番号１８は、「Ｔ２（ｄｘｓ１６ａ）」と表される、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  ｄｘｓ（１６ａ）遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第１のプライマーであり、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターの３’−末端領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ８」と表されるホモロジーアームを含む（図１１）。
【００４１】
配列番号１９は、「Ｂ２（ｄｘｓ１６ａ）」と表される、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  ｄｘｓ（１６ａ）遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅するのに用いられる、１つのプライマー対の第２のプライマーであり、大腸菌染色体の３０．９分に位置する遺伝子間領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ９」と表されるホモロジーアームを含む（図１１）。
【００４２】
配列番号２０は、「Ｔ７」と表される、融合ｋａｎ−ＰＴ５プロモーターとｄｘｓ（１６ａ）遺伝子の染色体組み込みを確認するＰＣＲ分析のために用いられるプライマーである（図１２）。
【００４３】
配列番号２１は、「Ｔ８」と表される、融合ｋａｎ−ＰＴ５プロモーターとｄｘｓ（１６ａ）遺伝子の染色体組み込みを確認するＰＣＲ分析のために用いられるプライマーである（図１２）。
【００４４】
配列番号２２は、「Ｔ９」と表される、融合ｋａｎ−ＰＴ５プロモーターとｄｘｓ（１６ａ）遺伝子の染色体組み込みを確認するＰＣＲ分析のために用いられるプライマーである（図１２）。
【００４５】
配列番号２３は、「Ｔ１（ｃｒｔＥ）」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターを含むＤＮＡフラグメントをｐＳＵＨ５からＰＣＲで増幅するのに用いられる１つのプライマー対の第１のプライマーであり、大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ１０」と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００４６】
配列番号２４は、「Ｂ１（ｃｒｔＥ）」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを、ｐＳＵＨ５からＰＣＲで増幅するのに用いられる１つのプライマー対の第２のプライマーであり、ｃｒｔＥ開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ１１」と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００４７】
配列番号２５は、「Ｔ２（ｃｒｔＥ）」と表される、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＰＣＢ１５（図５）からＰＣＲで増幅するのに用いられる１つのプライマー対の第１のプライマーであり、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターの３’−末端領域にある配列に適合するように選らばれた「ｈ８」と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００４８】
配列番号２６は、「Ｂ２（ｃｒｔＥ）」と表される、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、ｐＰＣＢ１５からＰＣＲで増幅するのに用いられる１つのプライマー対の第２のプライマーであり、大腸菌染色体上の８１．２分に位置するオペロン間領域にある配列に適合するように選らばれた「ｈ１２」と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００４９】
配列番号２７は、「Ｔ１０」と表される、融合カナマイシンマーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子の組み込み部位の上流領域にある１６２塩基に相当するプライマー配列（２６ｂｐ）を含むＤＮＡフラグメントを、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥからＰＣＲで増幅するのに用いられるプライマーである（図１３）。
【００５０】
配列番号２８は、「Ｂ１（ｃｒｔＩＢ）」と表される、融合カナマイシンマーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子を、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥから増幅するのに用いる、１つのプライマー対の第２のプライマーで、ｃｒｔＩ開始コドンの下流領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ１３」と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００５１】
配列番号２９は、「Ｔ２（ｃｒｔＩＢ）」と表される、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢに結合した遺伝子対を、プラスミドｐＰＣＢ１５からＰＣＲで増幅するのに用いる、１つのプライマー対の第１のプライマーであり、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥのＤＮＡフラグメントの３’−末端領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ１４」と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００５２】
配列番号３０は、「Ｂ２（ｃｒｔＩＢ）」と表される、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢに結合した遺伝子対を、プラスミドｐＰＣＢ１５からＰＣＲで増幅するのに用いる、１つのプライマー対の第２のプライマーであり、大腸菌染色体上の８１．２分に位置するオペロン間領域にある配列にマッチするように選択された「ｈ１２」（「Ｂ２（ｃｒｔＥ）」プライマーに使われたアームと同じ）と表されるホモロジーアームを含む（図１３）。
【００５３】
配列番号３１は、「Ｔ１１」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢオペロンの、大腸菌染色体上の８１．２分に位置するオペロン間領域への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅で確認するのに用いるプライマーである（図１４）。
【００５４】
配列番号３２は、「Ｔ１２」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢオペロンの、大腸菌染色体上の８１．２分に位置するオペロン間領域への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅で確認するのに用いるプライマーである（図１４）。
【００５５】
配列番号３３は、「Ｔ１３」と表される、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢオペロンの、大腸菌染色体上の８１．２分に位置するオペロン間領域への組み込みの染色体コンストラクトを、ＰＣＲ増幅で確認するのに用いるプライマーである（図１４）。
【００５６】
配列番号３４は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４３を有し、ＦＲＴ部位特異的リコンビナーゼ認識配列によって隣接されたカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを増殖するためのＰＣＲテンプレートとして用いられた、プラスミドｐＫＤ４（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のヌクレオチド配列である。
【００５７】
配列番号３５は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４６を有する、プラスミドｐＫＤ４６（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のヌクレオチド配列である。プラスミドｐＫＤ４６は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系の構成要素を発現する。
【００５８】
配列番号３６は、融合カナマイシン耐性遺伝子−ＰＴ５プロモーターのＰＣＲ増殖のためのテンプレートとして用いられた、プラスミドｐＳＵＨ５のヌクレオチド配列である。
【００５９】
配列番号３７は、カロテノイド生合成に関与するいくつかの遺伝子を含むレポータープラスミドコンストラクトとして、またｃｒｔＥおよびｃｒｔＩＢ遺伝子のＰＣＲ増殖のためのテンプレートとして用いられた、プラスミドｐＰＣＢ１５のヌクレオチド配列である。
【００６０】
出願人らは、「特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条件の下、下記の生物学的寄託を行った。
【００６１】
【表１】
2006510374.tif 000003
【００６２】
本願明細書で使用する場合、「ＡＴＣＣ」とは、アメリカ合衆国、バージニア州２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティーブールバード１０８０１（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）のＡＴＣＣに所在する米国菌株保存機関の国際寄託当局（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）を意味する。「国際寄託の表示」（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）は、ＡＴＣＣでの寄託培養の受入番号である。  
【００６３】
リストに載った寄託物は、指示された国際受託者のもとで、少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与に基づいて、一般に公開されるであろう。寄託物の可用性は、政府の措置により付与される特許権の特例において、主たる発明を実行することの許諾を構成するものではない。
【００６４】
本発明は、プロモーターおよび／または発現可能なＤＮＡフラグメントの、細菌染色体内への、１つのステップによる指向性組込みのための方法に関する。この方法は、プロモーター、外来遺伝子、もしくはオープンリーディングフレームといった、染色体組み込みされる、さまざまな、発現可能なＤＮＡ因子を運ぶ、少なくとも２つの直鎖状２本鎖（ｄｓ）の組み換え因子、もしくはコンストラクトを用いる。各々の組み換え因子は、他の組み換え因子、もしくは細菌染色体の部分のどちらか一方と相同な領域を有する組み換え領域を含んでなる。本発明の方法の類ない１つの特徴は、プロモーター、外来遺伝子、もしくはオープンリーディングフレームといった、さまざまな発現可能なＤＮＡ因子を、マーカーがもはや必要でない場合の簡単な切断を可能にする部位特異的組み換え部位に囲まれた他の組み換え因子上にある１つの選択マーカーと組み合わせて、１つの組み換え因子上に染色体組み込みするための、少なくとも２つの直鎖状２本鎖（ｄｓ）組み換え因子の使用である。本発明の方法のもう１つの特徴は、組換えやすい宿主内での、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系の使用である。λ−Ｒｅｄ系は、直鎖状組み換え因子と、比較的小さな相同領域上の染色体との間の効果的な組み換えを容易にすることによって、この方法の有用性を高める。本発明の方法は、未変性の細菌染色体プロモーターの、外来、もしくは人工プロモーターとの置換を容易にする。プロモーターの付加および／または置換は、外来遺伝子を調節プロモーターの制御化に置くことによる調節可能な発現のための、外来遺伝子の染色体組み込みと併用され得る。
【００６５】
本発明の方法は、１つもしくはそれ以上の外来遺伝子の染色体組み込みを含む、プロモーターの置換以外の付加的な染色体修飾を実施するために使用され得る。これら修飾の機能的な発現は、β−カロテン（オレンジ色）産生量の増加、もしくはリコピン（ピンク色）の産生量によって測定された。
【００６６】
この開示の中では、多数の専門用語と略語を使用する。これを以下のとおり定義する。
【００６７】
「オープンリーディングフレーム」をＯＲＦと省略する。
【００６８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」をＰＣＲと省略する。
【００６９】
「指向性組込み」、もしくは「標的組込み」という用語は、発現可能なＤＮＡフラグメントの、細菌染色体への組み込みを意味し、それによって、発現可能なＤＮＡおよび染色体を含んでなるカセット上の相当する相同的領域により組み込みが達成される。
【００７０】
「発現可能なＤＮＡフラグメント」という用語は、宿主細胞の形質変化に影響を与える任意のＤＮＡを意味する。すべての「発現可能なＤＮＡフラグメント」には、例えば調節因子を含んでなるＤＮＡ、単離プロモーター、オープンリーディングフレーム、遺伝子またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００７１】
「組み換え因子」という用語は、組換えやすい細菌宿主の形質転換に有用な、直鎖状の核酸コンストラクトを意味する。本発明の組み換え因子は、選択マーカー、発現可能なＤＮＡフラグメントおよび細菌染色体上もしくは他の組み換え因子上の領域に相同性を有する組み換え領域といった、さまざまな遺伝因子を含んでもよい。
【００７２】
「組み換え領域」および「ホモロジーアーム」という用語は、同義的に使われ、２つの異なる核酸の特定の領域にある、実質的には同じヌクレオチド配列を有する２つの核酸間の相同的組み換えを可能にするヌクレオチド配列を意味する。ホモロジーアームのヌクレオチド配列の好ましいサイズの範囲は、約１０〜約５０ヌクレオチドである。
【００７３】
「リコンビナーゼ」という用語は、相同的組み換えを刺激するために、単独で、もしくは共同で働く、１つもしくはそれ以上の酵素を意味する。「λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ」、「λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系」および「λ−Ｒｅｄ系」は、バクテリオファージλ遺伝子のｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍによってコードされる酵素群を説明するのに同義的に使われる。この３つの遺伝子によってコードされる酵素は、通常、また直鎖状の組み換え因子を使用する場合は特に、比較的低い相同的組み換え率を有すると見なされる生物である大腸菌での相同的組み換え率を高めるために共に働く。
【００７４】
「部位特異的リコンビナーゼ系」という用語は、特異的ヌクレオチド配列（組み換えの標的部位）を認識し、組み換えの標的部位間の組み換えを触媒する、１つもしくはそれ以上の酵素を含んでなる系を説明するのに使用される。部位特異的組み換えは、外来性ＤＮＡの再配列、削除、もしくは導入の方法を提供する。部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連した組み換え標的部位の例は、いくつか名前を挙げると、フリッパーゼ（ＦＬＰ）／ＦＲＴ、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔである。本発明は、選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼの使用を説明する。ＦＲＴ組み換え標的部位によって両端が隣接されている抗生物質耐性マーカーは、ＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼの発現により除去される。選択マーカーを除去するための部位特異的リコンビナーゼの使用は、微生物経路の操作に必要な複数の染色体修飾を可能にし、入手可能な選択マーカーの数に制限されない（ヒュアン（Ｈｕａｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７９巻（第１９号）、６０７６ページ〜６０８３ページ、（１９９７年））。
【００７５】
「選択マーカー」という用語は、その存在下で、人が特定の細胞型を同定して優先的に増殖させるのを可能にする遺伝子産物を意味する。
【００７６】
「組換えやすい細菌宿主」という用語は、機能的組み換え系を含み、遺伝子操作に有用な度合いの相同的組み換えが可能な細菌宿主を説明するのに使用される。
【００７７】
組み換え領域および細菌染色体上の相当する領域に適用した「相同」という用語は、同一の、もしくはほとんど同一の配列を共有するヌクレオチド配列を意味する。細菌染色体上の領域と組み換え領域間の相補的配列は、リコンビナーゼ系の存在下で、共同して相同的組み換えを経験することができる。好ましい組み換え領域、もしくはホモロジーアームは、細菌染色体上の相当する領域と同一の配列を有する領域で、約１０〜約５０ｂｐの長さである。
【００７８】
本願明細書で使用する場合、「上流」という用語は、ＤＮＡの領域に関して使用されるとき、特定の遺伝子、もしくはヌクレオチドの配列の５’側を意味する。
【００７９】
本願明細書で使用する場合、「下流」という用語は、ＤＮＡの領域に関して使用されるとき、特定の遺伝子、もしくはヌクレオチドの配列の３’側を意味する。
【００８０】
「オペロン間染色体組み込み部位」という用語は、この最新の発明を用いる外来性ＤＮＡの組み込みを目的とし、また外来性ＤＮＡの組み込みが、宿主内の内在性オペロン、もしくは遺伝子の機能性を破壊しない場所である、染色体の部位を意味する。
【００８１】
「調節回路」という用語は、転写を増加、もしくは減少させるために物質（信号伝達分子）と相互に作用することができる、機能的に組み込まれたＤＮＡを意味する。例えば、その物質は、オペレーター部位（プロモーターのＲＮＡポリメラーゼ結合部位に近接した、もしくはそれと重複した特異的なＤＮＡ配列）と結合したリプレッサータンパク質であり得る。リプレッサーの結合は、関連した遺伝子の転写を妨げ、あるいは阻止する。逆に言えば、その物質は、ＲＮＡポリメラーゼ結合を促進する特異的なＤＮＡ配列と結合し、関連した遺伝子の転写を「活性化させ」、もしくは増加させる活性化タンパク質であってもよい。本発明では、「ポジティブな調節部位」という用語は、（単独で、もしくは物質との相互作用に呼応して）関連するコード配列の転写を増進させる、機能的に組み込まれたＤＮＡを意味する。「ネガティブな調節部位」という用語は、（単独で、もしくは物質との相互作用に呼応して）関連するコード配列の転写を減少、もしくは阻止する、機能的に組み込まれたＤＮＡを意味する。
【００８２】
本願明細書で使用する場合、「単離された核酸フラグメント」は、自然ではない、もしくは変性された合成のヌクレオチド塩基を場合により含む、１本鎖、もしくは２本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマーの形をとる単離された核酸フラグメントは、１つもしくはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくは合成ＤＮＡのセグメントを含んでなるかもしれない。
【００８３】
「イソプレノイド」、もしくは「テルペノイド」という用語は、炭素数１０のテルペノイド類ならびに、カロテノイド、キサントフィルといったそれらの派生物を含む、イソプレノイド経路由来の組成物および任意の分子を意味する。
【００８４】
「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ株」および「メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ」（ＡＴＣＣ、ＰＴＡ−２４０２、２０００年８月２２日に寄託された）という用語は同義的に使われ、メタンを基質として利用するそれらの能力で類のない、メタノトローフとして知られる生理学的な細菌群の細菌を意味する。
【００８５】
「メタノトローフ」という用語は、メタンを基質として利用することが可能な原核生物を意味する。メタンの、二酸化炭素への完全な酸化は、好気性分解の経路によってもたらされる。メタノトローフの典型的な例は、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコックス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）を含むが、この属に限定されるものではない。
【００８６】
「ｄｘｓ」という用語は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸への縮合の触媒となる大腸菌ｄｘｓ遺伝子によってコードされる、酵素のＤ−１−デオキシキシルロース５−リン酸を意味する。
【００８７】
「ｄｘｓ（１６ａ）」という用語は、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸の、Ｄ−１−デオキシキシルロース５−リン酸への縮合の触媒となるメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ株ｄｘｓ遺伝子によりコードされる、酵素のＤ−１−デオキシキシルロース５−リン酸を意味する。
【００８８】
「ｉｄｉ」という用語は、イソペンテニル二リン酸をジメチルアリール二リン酸に転換する大腸菌ｉｄｉ遺伝子によりコードされる、酵素のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼを意味する。
【００８９】
本発明中の「３回の相同的組み換え」という用語は、２つの直鎖状核酸フラグメントの標的染色体への染色体組み込みという結果をもたらす、２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントと標的染色体との間の、それらの相同的配列を通しての遺伝子組み換えを意味する。
【００９０】
「ｐＰＣＢ１５」という用語は、本発明の方法を通して遺伝子的に操作される大腸菌内での、β−カロテンの産生を監視するレポータープラスミドとして用いられる、β−カロテン合成遺伝子、パントエアｃｒｔＥＸＹＩＢを含むプラスミドを意味する。
【００９１】
「ｐＳＵＨ５」という用語は、ファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）領域を、ｐＫＤ４（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングすることにより作成されたプラスミドを意味する。それは、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター直鎖状ＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅のためのテンプレートプラスミドとして用いられた。
【００９２】
「ＰＴ５プロモーター」および「ファージＴ５プロモーター」という用語は、ファージＴ５由来の−１０および−３５コンセンサス配列、ラクトースオペレーター（ｌａｃＯ）、ｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｋ．））由来のリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を含んでなるヌクレオチド配列を意味する。
【００９３】
「ヘルパープラスミド」という用語は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系をコードするｐＫＤ４６、もしくはＦＬＰ部位特異的リコンビナーゼ（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）をコードするｐＣＰ２０を意味する。
【００９４】
「大腸菌」という用語は、大腸菌Ｋ−１２の派生物に適用する場合には、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ  ５３３３８）株を意味する。
【００９５】
「パントエアステワルティ亜種ステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）」という用語は、「パントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）」（ＡＴＣＣ  ８１９９）と省略され、エルウィニアステワルティ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（メルゲール（Ｍｅｒｇａｅｒｔ）ら、Ｉｎｔ  Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第４３号、１６２〜１７３ページ（１９９３））という用語と同義的に使われる。
【００９６】
「パントエアｃｒｔＥＸＹＩＢクラスター」という用語は、パントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ＡＴＣＣ  ８１９９から増幅されたカロテノイド合成遺伝子、ｃｒｔＥＸＹＩＢを含む遺伝子クラスターを意味する。この遺伝子クラスターは、遺伝子ｃｒｔＥ、ｃｒｔＸ、ｃｒｔＹ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢを含む。このクラスターはまた、ｃｒｔＢ遺伝子に隣接し、反対の方向に組織化されているｃｒｔＺ遺伝子を含む。本発明中では、この遺伝子クラスターは、レポータープラスミドｐＰＣＢ１５上に位置し、さまざまな染色体修飾のβ−カロテン産生への効果を監視するのに用いられる。
【００９７】
「ＣｒｔＥ」という用語は、トランス−トランス−ファルネシル二リン酸＋イソペンテニル二リン酸をピロリン酸＋ゲラニルゲラニル二リン酸へ転換するｃｒｔＥ遺伝子によってコードされる、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ酵素を意味する。
【００９８】
「ＣｒｔＹ」という用語は、リコピンをβ−カロテンへ転換するｃｒｔＹ遺伝子によってコードされる、リコピンシクラーゼ酵素を意味する。
【００９９】
ＣｒｔＩ」という用語は、４つの二重結合の導入により、フィトフルエン、ζ−カロテン、ヌロスポレンの中間体を通して、フィトエンをリコピンへ転換するｃｒｔＩ遺伝子によりコードされる、フィトエンデヒドロゲナーゼ酵素を意味する。
【０１００】
「ＣｒｔＢ」という用語は、プレフィトエン二リン酸（ゲラニルゲラニルピロリン酸）からフィトエンへの反応を触媒するｃｒｔＢ遺伝子によってコードされる、フィトエンシンターゼ酵素を意味する。
【０１０１】
「ＣｒｔＸ」という用語は、ゼアキサンチンをゼアキサンチン−β−ジグルコシドへと転換するｃｒｔＸ遺伝子によってコードされる、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素を意味する。
【０１０２】
「ＣｒｔＺ」という用語は、β−カロテンからゼアキサンチンへの水酸化反応、もしくはカンタキサンチンからアスタキサンチンへの水酸化反応両方を触媒するｃｒｔＺ遺伝子によってコードされる、β−カロテンヒドロキシラーゼ酵素を意味する。
【０１０３】
「カロテノイド生合成酵素」という用語は、ｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスターによってコードされる任意かつすべての酵素を意味する、包括的な用語である。これらの酵素は、ＣｒｔＥ、ＣｒｔＹ、ＣｒｔＩ、ＣｒｔＢ、ＣｒｔＸを含む。
【０１０４】
「コドン縮退」という用語は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響をあたえることなく、ヌクレオチド配列を変えることのできる遺伝コードの特性を意味する。所定のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用時に、特異的宿主細胞によって示される「コドンバイアス」に関して、当業者は十分理解している。したがって、宿主細胞での発現を亢進した遺伝子を合成するにあたり、コドン使用頻度がその宿主細胞での好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計すると望ましい。
【０１０５】
「合成遺伝子」は、当業者間で周知の手段を用いて化学的に合成される、オリゴヌクレオチドのビルディングブロックからアセンブル可能なものである。これらのビルディングブロックをライゲートおよびアニール処理して遺伝しセグメントを構成し、続いてこれを酵素的にアセンブルして完全な遺伝子を構築する。ＤＮＡの配列に関して、「化学的に合成される」とは、構成要素であるヌクレオチドが生体外でアセンブルされたものであることを意味する。この場合、十分に確立された手順を用いてＤＮＡの化学的合成を手作業で行ってもよいし、さまざまな市販の装置類のうちのいずれかを使って自動化学的合成を行うことも可能である。したがって、ヌクレオチド配列の最適化を踏まえた最適な遺伝子発現に遺伝子の方を合わせ、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることが可能である。当業者であれば、コドンの使用が宿主の好むコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する尤度を知ることができよう。好ましいコドンについては、配列情報を得られる宿主細胞に由来する遺伝子についての調査を行い、その結果に基づいて判断することが可能である。
【０１０６】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列を含む、ある特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ、自然界に見られるような遺伝子である。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含んでなる、あらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、それぞれ異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含んでなるものであってもよいし、同一起源由来ではあるが、自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含んでなるものであってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムにおいて本来の位置にある天然遺伝子を意味する。「外来遺伝子」もしくは「外来性遺伝子」とは、宿主生物に通常は見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子には、自然界には存在しない生物に挿入された天然遺伝子あるいはキメラ遺伝子を含む場合がある。「導入遺伝子」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子である。
【０１０７】
細菌ＤＮＡの「オペロン」とは、多シストロン性ｍＲＮＡをもたらす１つのプロモーターから転写された、隣接する遺伝子のクラスターである。
【０１０８】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「好適な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列の範囲内もしくはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、あるいは翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を意味する。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造があげられる。
【０１０９】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を意味する。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来するさまざまな因子から構成されるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件または生理学的条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型で、ほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、長さの異なるＤＮＡフラグメントが同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。本願明細書で使用する場合、「外来プロモーター」とは、そのプロモーターが使用される細胞以外の起源に由来するプロモーターを意味する。本発明の目的のために、本発明の微生物系で用いられる外来プロモーターは、植物細胞および哺乳動物細胞などの真核生物の起源のみならず、細菌、イースト、真菌などの他の微生物に由来するものであってもよい。
【０１１０】
「ＲＮＡ転写産物」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を意味する。そのＲＮＡ転写産物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写産物と呼び、一次転写産物の転写後プロセッシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡと相補であり、それに由来する２本鎖ＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、それゆえに、細胞によるタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写産物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の一次転写産物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補であり、標的遺伝子の発現を阻止する、ＲＮＡ転写産物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列またはコード配列など、特定の遺伝子転写産物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに影響を与える他のＲＮＡを意味する。
【０１１１】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸フラグメント上に存在する、核酸配列のつながりを意味する。例えばプロモーターであれば、コード配列の発現に影響を与えることが可能な場合、そのプロモーターはそのコード配列に作動的に結合している（すなわち、そのコード配列はプロモーターによる転写制御下にある）という。コード配列は、センスまたはアンチセンスの配向で制御配列への作動的な結合が可能なものである。
【０１１２】
本願明細書で使用する場合、「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を意味する。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味することもある。
【０１１３】
「形質転換」とは、核酸フラグメントが宿主生物のゲノムへに導入され、遺伝的に安定した遺伝継承がなされることを意味する。形質転換された核酸フラグメントを含む宿主生物を「トランスジェニック」または「組み換え」もしくは「形質転換された」生物と呼ぶ。
【０１１４】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、通常は環状２本鎖ＤＮＡフラグメントの形で、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を持っていることの多い特別な染色体因子を示す。このような因子としては、あらゆるソースに由来する自律複製配列、ゲノム組込配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状で一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが可能であり、この場合、複数のヌクレオチド配列が連結または組換えられて、選択された遺伝子産物に対するプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞に導入できる独特の構成となっている。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する、特定のベクターを意味する。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を増すことのできる因子を有する、特定のベクターを意味する。
【０１１５】
本発明は、発現可能なＤＮＡの、細菌染色体への指向性組込みのための方法に関する。ＤＮＡは、そのＤＮＡを含んでなるカセット上の相同領域と、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を持つ組換えやすい細菌宿主内の染色体との間の相同的組み換えによって、細菌染色体へと導かれる。少なくとも２つの直鎖状カセット、もしくは組み換え因子が用いられる。通常、１つの組み換え因子は、部位特異的リコンビナーゼ部位によって囲まれた１つの選択マーカーを含んでなる。組み換え部位に向かう５’および３’の両方は、細菌染色体の部分、もしくは別の組み換え因子に相同性を有する組み換え領域（「ホモロジーアーム」）である。さらに、組み換え因子は、プロモーター、もしくは外来遺伝子、もしくはオープンリーディングフレームといった発現可能なＤＮＡも含んでなるかもしれない。第２の組み換え因子は、通常、組み換え標的部位（部位特異的リコンビナーゼによって認識される）に囲まれた選択マーカーを除く、多くの第１の因子と同じ因子を含むだろう。
【０１１６】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系
本発明で用いられたλ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系は、ヘルパープラスミド（ｐＫＤ４６）上に含まれ、欠くことのできない３つの遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍを含んでなる（図４）（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）。ｅｘｏ遺伝子は、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの５’末端鎖を発展的に分解し、３’の１本鎖オーバーハングを作り出す、λ−エキソヌクレアーゼをコードする。Ｂｅｔは、λ−エキソヌクレアーゼと複合体をなし、上記１本鎖ＤＮＡと結合して相補鎖の復元を促進し、交換反応を仲介することが可能なタンパク質をコードする。Ｇａｍは、エンドヌクレアーゼ活性を抑制している、大腸菌ＲｅｃＢＣＤ複合体と結合するタンパク質をコードする。
【０１１７】
大腸菌での相同的組み換えは、非常に低い頻度で起こり、通常広範な相同領域を必要とするため、本発明ではλ−Ｒｅｄ系が用いられる。λ−Ｒｅｄ系は、相同的組み換えのための直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントに隣接している短い相同領域（１０〜５０ｂｐ）を利用する能力を手助けする。さらに、普通大腸菌内で発現されるＲｅｃＢＣＤ複合体は、その複合体のエキソヌクレアーゼ活性が効果的に直鎖状ｄｓＤＮＡを分解して、直鎖状ｄｓＤＮＡの形質転換への使用を妨げる。ｇａｍによるＲｅｃＢＣＤ複合体エンドヌクレアーゼ活性の抑制は、直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントを用いた効果的な相同的組み換えに、欠くことのできないものである。
【０１１８】
本発明の１つの重要な態様は、ＰＣＲで生成された２つの直鎖状２本鎖ＤＮＡフラグメントを用いる、選択マーカーと組んでの染色体プロモーターの置換である。本発明は、ＰＣＲで生成された２つのフラグメントと大腸菌染色体との間の、３回の相同的組み換え現象の使用を含む（図１）。本発明の方法は、３回の相同的組み換えを通した、別個のクローニングステップの必要性がない、導かれた染色体操作を可能にする。本発明の適用範囲は、機能的ＤＮＡ分子（プロモーター、遺伝子、調節因子、オペロン、その他）の指向性組込みを可能にする。本発明の方法は、染色体組み込み部位および数に関して制限を持たない。したがって、この方法は、生合成経路の再設計、代謝の流れの最適化および新規の経路の作成に適している。
【０１１９】
本発明の方法の別の態様は、抗生物質耐性のような選択マーカーの、２つの直鎖状２本鎖ＤＮＡフラグメントの１つへの取り込みである。抗生物質耐性に影響を与えるような選択マーカーが、本発明を用いた３回の相同的組み換えを経験したコロニーを選択するために使用される。しかしながら、細菌の生合成経路を操作する際には、複数の染色体操作が必要となる。これを成し遂げるために、この方法は、選択マーカーに隣接した部位特異的組み換え配列の使用を含む。選択マーカーを取り除くための、このような部位特異的リコンビナーゼの使用は、当該分野で既知となっている（ボルゲス（Ｂｏｒｇｅｓ）ら、国際公開第０１／１８２２２  Ａ１号パンフレット；ブーハッシラ（Ｂｏｕｈａｓｓｉｒａ）ら、国際公開第００／６３４１０号パンフレット；およびマルチネス・モラレス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１８１号、７１４３〜７１４８ページ（１９９９））。本発明でのフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼの使用のような、部位特異的リコンビナーゼ類は、特異的組み換え配列（すなわち、ＦＲＴ配列）を認識し、選択マーカーの切断を可能にする。本発明のこの態様は、複数の染色体修飾のための、本発明の方法の反復的使用を可能にする。本発明は、ＦＬＰ−ＦＲＴリコンビナーゼ系に限られたものではなく、部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの関連した特異的認識配列のいくつかの例が当該分野で既知となっている。その他の適当な部位特異的リコンビナーゼおよびそれらの相当する認識配列の例は、これらに限られるものではないが、Ｃｒｅ／ｌｏｘ、Ｘｅｒ／ｄｉｆ、Ｉｎｔ／ａｔｔを含む。
【０１２０】
本発明の別の態様は、続いて起こる遺伝子の組み込みによる、細菌染色体上でのオペロン組み立ての際の、その使用に関する。原核生物のオペロンは、本発明を用いて作成され得る。この態様の１つの例は、実施例１３で説明されており、そこでは、３つのカロテノイド生合成遺伝子が、３回の相同的組み換えを通して１つの調節因子（図１３）の制御下で、細菌染色体に組み込まれる。
【０１２１】
本発明の方法は、大腸菌染色体中の任意の標的遺伝子前の、任意のプロモーター／調節領域の安定的な染色体組み込みを可能にするため、そのような遺伝子の発現が制御され得る。この方法はまた、生合成経路のカスタムデザインで、プロモーターに加えて、さまざまな遺伝因子を操作するのに使用され得る。このアプローチは、単に増加された特定の１つの遺伝子の発現よりは、むしろ産業的に有用な微生物株の構築に適している。代謝的なバランス、生産性、コントロール、安定性および特定の経路にある遺伝子の最良の発現という点では、組み換えベクターによるアプローチに基づく代謝操作と比較した場合、このアプローチは多くの利点および利益を持っている。この方法は、例として大腸菌を用いて説明される。しかし、この方法は、他の細菌株でも同様に有用であることを証明すべきである（ポテーテ、Ａ．（Ｐｏｔｅｅｔｅ，Ａ．）、上掲、２００１）。本発明を用いて遺伝子的に操作され得る、他の産業的に有用な株の例は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）を含む。
【０１２２】
カロテノイド生合成
大腸菌レポーター株でのβ−カロテン（カロテノイド）産生の増加操作によって、いくつかの例を用いながら、本発明の方法の有用性が説明される。カロテノイドは、自然の至るところにユビキタスに存在し、酸素を導き出すすべての光合成生物によって、また従属栄養性の成長する細菌および真菌で合成される色素である。カロテノイドの産業的用途は、いくつかを挙げると、医薬品、食品サプリメント、電気光学的適用、動物飼料添加物、化粧品中の顔料を含む。
【０１２３】
動物は、カロテノイドを新たに合成することはできないため、彼らは食事と言う手段でそれらを得なければならない。そこで、植物、もしくは細菌でのカロテノイドの産生および組成の操作は、カロテノイドのための、新たな、もしくは改良されたソースを提供できる。
【０１２４】
カロテノイドは、多くの異なった形態および化学的構造を呈してできあがる。最も自然に生じるカロテノイドは、８個のＣ５イソプレン単位（ＩＰＰ）の連続的な縮合から誘導された、メチル基が枝分かれしたＣ４０の炭化水素骨格を含む、疎水性のテトラテルペノイドである。さらに、より長い、もしくは短い骨格を有する新規のカロテノイドが、いくつかの非光合成細菌種で生じている。「カロテノイド」という用語は、実際にカロテンとキサントフィルとの両方を含む。ひとつの「カロテン」とは、炭化水素カロテノイドを意味する。ヒドロキシ、メトキシ、オキソ、エポキシ、カルボキシもしくはアルデヒド官能基の形をとるか、またはグリコシド、グリコシドエステルもしくは硫酸塩の中の、１つもしくはそれ以上の酸素原子を含むカロテン誘導体は、集合的に「キサントフィル」として知られている。カロテノイドはさらに、炭化水素骨格の末端が脂肪族構造または環式リング構造（Ｇ．アームストロング（Ｇ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）、（１９９９）、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中、エルゼビア出版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ）、第２巻、３２１〜３５２ページ）となるように環化されているかどうかにより、非環式、単環式もしくは二環式、と表される。
【０１２５】
大腸菌は、イソプレノイド生合成経路に遺伝子を含む（図３）。イソプレノイド生合成は、ｄｘｓ遺伝子にコードされた酵素を通してデオキシ−Ｄ−キシルロースを形成するための、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ））を伴うピルビン酸の縮合によって始まる。次に、追加的酵素の宿主が、デオキシ−Ｄ−キシロースを、最終的なＣ５イソプレン生成物であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）に転換する、後に続く順次的反応で用いられる。ＩＰＰは、ｉｄｉ遺伝子によってコードされる酵素を通して、異性体であるジメチルアリールピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に転換される。ＩＰＰは、ＤＭＡＰＰを伴って縮合され、Ｃ１０ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を形成し、次にこのＧＰＰは伸長してＣ１５ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）となる。
【０１２６】
ＦＰＰ合成は、カロテノジェニックおよびノンカロテノジェニックな細菌内の両方で共通である。大腸菌は普通、ＦＰＰのβ−カロテンへの転換に必要な遺伝子を含まない（図３）。このため、出願人は、β−カロテン産生に必要な付加的遺伝子を持つ、レポータープラスミドのｐＰＣＢ１５を含む大腸菌株を用いた（図５）。ＦＰＰ前駆体からカロテノイド色素を生成するのに使われる、結果的に生じるカロテノイド経路にある酵素は、２つの種類に分けられる。すなわち、カロテン骨格の合成酵素および後発的な修飾酵素である。カロテン骨格の合成酵素は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＣｒｔＥ）、フィトエンシンターゼ、（ＣｒｔＢ）、フィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣｒｔＩ）、リコピンシクラーゼ（ＣｒｔＹ／Ｌ）、その他を含む。修飾酵素は、ケトラーゼ、ヒドロキソラーゼ、デヒドラターゼ、グリコシラーゼ、その他を含む。
【０１２７】
カロテノイド色素の生合成の遺伝的特性は周知となっている（アームストロング（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、第１７６号、４７９５〜４８０２ページ（１９９４）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第５１号、６２９〜６５９ページ（１９９７））。この経路は、以前はエルウィニア属として知られていたパントエア属のグラム陰性の着色された細菌内で、非常によく研究されている。Ｅ．ヘルビコラ（ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＥＨＯ−１０（ＡＴＣＣ  ３９３６８）およびＥ．ウレドボラ（ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）２０Ｄ３（ＡＴＣＣ  １９３２１）の両内で、ｃｒｔ遺伝子は２つのオペロン、ｃｒｔ  Ｚとｃｒｔ  ＥＸＹＩＢに集団化される（米国特許第５，６５６，４７２号明細書、米国特許第５，５５４５，８１６号明細書、米国特許第５，５３０，１８９号明細書、米国特許第５，５３０，１８８号明細書および米国特許第５，４２９，９３９号明細書）。オペロン構造の類似点にもかかわらず、Ｅ．ウレドボラ（ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）のＤＮＡ配列とＥ．ヘルビコラ（ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）  ｃｒｔ遺伝子は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションで何の相同性も示さない（米国特許第５，４２９，９３９号明細書）。
【０１２８】
大腸菌ｄｘｓおよびｉｄｉ遺伝子は、イソプレノイド生合成経路内で、律速のステップであると考えられる酵素をコードする（図３）。これら遺伝子の染色体コピーは、野生型大腸菌では、非常に低い発現レベルを有する。本発明の有用性は、結果としてイソプレノイド経路の流動性を高める、ファージＴ５強力プロモーター（ＰＴ５）をｄｘｓもしくはｉｄｉ遺伝子の前に組み込むことによって説明される。高められた流動性の結果は、β−カロテン産生の測定可能な増加として検出される（図７）。
【０１２９】
組み換え因子
本発明で用いられているように、「組み換え因子」とは、ＰＣＲを用いて作成された、直鎖状２本鎖ＤＮＡフラグメント、もしくは「カセット」である。通常、組み換え因子は約２５塩基〜約４０００塩基に及ぶ。本発明の方法は、生体内での細菌染色体操作のために２つの組み換え因子を用いる。その直鎖状因子は、もし選択マーカーの事例のように後で取り除かれるとしたら、場合により部位特異的組み換え配列に隣接された、機能性ＤＮＡ（調節因子、プロモーター、コード配列、遺伝子）を含む。組み換え因子の５’および３’末端は、組み換え領域（ホモロジーアーム）を含んでなる。一般に、約１０〜５０塩基対長のホモロジーアームは、細菌染色体上の特異的配列、もしくは別の組み換え因子上の特異的配列のどちらか一方に相同性を有するように選択される。
【０１３０】
本発明は、２つの組み換え因子の使用を説明する。図１で説明されているように、「第１」の組み換え因子の５’末端は、細菌染色体上の標的とされる配列に配列相同性を有する、組み換え領域（「ＲＲ１」）を含む。第１の因子の３’末端はまた、「第２」の組み換え因子の５’末端に配列相同性を有する、組み換え領域（「ＲＲ２」）を含む。第２の組み換え因子（「ＲＲ３」）の３’末端は、細菌染色体上の標的とされる配列と相同性を共有する。λ−Ｒｅｄが相同的組み換えを仲介する間に、その２つの因子は結合され、ホモロジーアームの配列に基づいて、細菌染色体上の特異的部位に挿入される。トリプルな相同的組み換えの実際の配列は、さまざまであってもよい。
【０１３１】
ホモロジーアームの好ましい長さは、約１０〜約５０塩基対長である。相同的組み換えのために本発明で用いられた比較的短いホモロジーアームを与えられた場合、人は、効果的な組み換えのために受け入れられるミスマッチな配列のレベルは、好ましくは相同的組み換えのための標的とされる配列と同一の配列を用いて、絶対最小値に留められるべきだと予想するだろう。相同の２０〜４０塩基対で、相同的組み換えの効率に、４オーダーの上昇がみられる（ユ（Ｙｕ）ら、ＰＮＡＳ、第９７巻、５９７８〜５９８３ページ、（２０００））。したがって、ホモロジーアームのうちの複数のミスマッチングは、相同的組み換えの効率を低めるかもしれない。大きいサイズ（約４０Ｋ塩基対まで）の組み換え因子は、マスターアンプ（ＭａｓｔｅｒＡｍｐ）（商標）エクストラロングＰＣＲ酵素（Ｅｘｔｒａ−ｌｏｎｇ  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ）（エピセントレ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））などのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより、ＰＣＲで正確に生成され得る。
【０１３２】
本発明は、２つの組み換え因子のうちの１つにある、発現可能なＤＮＡとしての選択マーカー（図１の「ＳＭ」）の使用を説明する。マーカーは、部位特異的リコンビナーゼ認識配列に隣接される（図１で「ＲＳ」と表示されている認識標的配列）。このマーカーを含む組み換え因子は、通常「第２」の組み換え因子と同時に正しい方向へ挿入されることなしに、細菌染色体には組み込まれない。遺伝子修飾された細菌内の選択マーカーの発現は、３回の相同的組み換え現象がおそらくは起こったことを示すものである。選択と構成の確認後、部位特異的リコンビナーゼが、マーカーを取り除くために使用される。そして、付加的な生体内での染色体修飾とともに、本発明のステップが繰り返され得る。選択マーカーの使用は、当該分野で既知となっており、限定されるものではないが、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性マーカーを含むことができる。選択マーカーはまた、アミノ酸生合成酵素（普通は、所定のアミノ酸の外的供給を求める栄養素要求株の選択のために）およびｌａｃ−細菌内のβ−ガラクトシダーゼ（Ｘｇａｌの、容易に識別可能な青色色素への転換を触媒する）のような、外観の可視的変化を触媒する酵素を含んでもよい。
【０１３３】
組換えやすい宿主
組換えやすい宿主とは、機能的組み換え系を含み、相同的組み換えによって、効果的に形質転換されることが可能な宿主である。ある好ましい実施形態では、相同的組み換えを通した形質転換は、細菌染色体を標的とする。別の好ましい実施形態では、形質転換プロセスの間に使用されたＤＮＡは、ＰＣＲで生成された２本鎖ＤＮＡである。一般に、相同的組み換えを通しての効果的な形質転換を、当然ながら経験しないと考えられている宿主の大腸菌は、組換えやすい宿主とするために改造される。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を含むヘルパープラスミドを用いる形質転換は、相同的組み換え率を数オーダー上昇させる。λ−Ｒｅｄ系もまた、宿主内に染色体組み込み可能である。このλ−Ｒｅｄ系は、通常は組み換えに不完全である大腸菌を、組換えやすい宿主に変える、３つの遺伝子（ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍ）を含む。
【０１３４】
通常、大腸菌は自身のＲｅｃＢＣＤエンドヌクレアーゼを通して、直鎖状ｄｓＤＮＡを効率よく分解する。このことは、形質転換の効率性は染色体操作にとって有用ではないという結果を示す。Ｇａｍは大腸菌ＲｅｃＢＣＤ複合体と結合し、この複合体のエンドヌクレアーゼ活性を阻害するタンパク質をコードする。ｅｘｏ遺伝子は、２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの５’末端の鎖を発展的に分解し、３’の１本鎖オーバーハングを作成する、λ−エキソヌクレアーゼをコードする。ｂｅｔ遺伝子にコードされたタンパク質は、λ−エキソヌクレアーゼと複合体を成し、１本鎖ＤＮＡのオーバーハングと結合して相補鎖の再生を促進し、さらに交換反応の仲介が可能である。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系は、通常相同的組み換えによる形質転換が困難と考えられる大腸菌などの宿主における生体内での染色体操作の道具として、相同的組み換えを個人が用いることを可能にする。λ−Ｒｅｄ系は、他の細菌内でも働く（ポテーテ、Ａ．（Ｐｏｔｅｅｔｅ，Ａ．）、上掲、２００１）。大腸菌は、普通に使用される工業生産用宿主であるために、λ−Ｒｅｄの主要な焦点である。λ−Ｒｅｄ系が、工業生産に一般に使用される他の宿主に適用可能であってはならないということの証拠はない。これらの付加的宿主は、限定されるものではないが、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）を含む。
【０１３５】
形質転換および選択
本発明において説明する、クローニングを回避した簡単な方法では、細菌宿主で生体内での染色体操作を実施するができる。この方法では、標的とする染色体を繰返して修飾できるため、生合成経路の操作が可能になる。形質転換のプロセスは、いくつかの異なるステップに分けられる。
【０１３６】
最初に、組み換え因子は、これまでに説明したように、ＰＣＲで生成される。１組のｄｓＤＮＡ組み換え因子は、組換えやすい細菌宿主内へエレクトロポレートされる。本発明では、宿主は、アラビノース誘導型プロモーターの制御下で、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を含むヘルパープラスミドｐＫＤ４６を内在させている、大腸菌ＭＣ１０６１である。エレクトロポレーションの後、宿主細胞は、アラビノースの存在下で培養される。λ−Ｒｅｄ遺伝子が発現され、３回の相同的組み換えが、２つの組み換え因子と細菌染色体との間で起こる。２つの染色体組み込みされた組み換え因子のうちの１つは、選択マーカー（ｋａｎＲ、もしくはｋａｎと表示される、カナマイシン耐性）を含む。
【０１３７】
一定時間の後、３回の相同的組み換えを経験した細胞を選択する化合物（すなわち、本発明ではカナマイシン）を含む培地で、宿主細胞が選択される。本発明では、第２の耐性マーカーが、クロラムフェニコール耐性（ＣａｍＲ）遺伝子を含むｐＰＣＢ１５レポータープラスミドの存在を確認するために用いられた。選択培地の存在下で成長するコロニーは、通常、コンストラクトを確認するためのＰＣＲフラグメントの分析によって配列決定、もしくは分析される。
【０１３８】
コンストラクトの確認が起こった後、第２のヘルパープラスミドが宿主細胞にトランスフェクトされる。この第２の「ヘルパー」プラスミドは、染色体組み込みされた選択マーカーに隣接する部位特異的リコンビナーゼの標的配列（ＦＲＴ）を認識する、部位特異的リコンビナーゼ（Ｆｌｐ）を含む。本発明では、両方のヘルパープラスミド上に発現された構成要素は、条件付のプロモーターの制御下で、宿主細胞への染色体組み込みが可能なものである。本発明では、部位特異的リコンビナーゼ、Ｆｌｐ（フリッパーゼ）が発現され、選択マーカーは切断される。選択マーカーを失ったコロニーを同定するために、選択化合物の存在／不在の下、コロニーが培養される。これらコロニーのコンストラクトは、配列分析、もしくはＰＣＲフラグメント分析、または両方の組み合わせによって確認される。第２のヘルパープラスミドは、温度感受性複製開始点を用いて宿主から取り除かれる。上記に説明したプロセスは、産業的に有用な産生宿主の作成で繰り返されて、目的とする細菌経路の操作を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３９】
細菌を用いた生体内での染色体操作の簡単なワンステップの方法は、ＰＣＲで生成された２つの直鎖状２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡフラグメントを用いることで発達してきた。そのフラグメントは、フラグメントと宿主（大腸菌）染色体上の標的部位との間の相同性を持つ、短いフランキング領域を含むようにデザインされた。
【０１４０】
アラビノース誘導型プロモーターの制御下で、ヘルパープラスミドｐＫＤ４６（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４６；配列番号３５；図４）上で発現したファージλ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を用いた結果、制御可能で効率的な、生体内での３回の相同的組み換えが起こった。組み換え中に用いられたＰＣＲで生成された２つの直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントの少なくとも１つは、部位特異的リコンビナーゼ配列（ＦＲＴ）（実施例１）に隣接された選択マーカー（カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ））を含むようにデザインされた。マーカーは、所望の組み換え現象を起こした細胞の同定と選択を可能にした。配列分析、もしくはＰＣＲフラグメントの分析によって、いったん選択組み換え体のコンストラクトが検証されると、選択マーカーはλファージのＰＲプロモーターの制御下で、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドによって切断された（実施例３および４）。
【０１４１】
一実施形態では、この方法は細菌プロモーターの操作のために用いられた。ひとつの強力プロモーター（ファージＰＴ５）は、ＰＣＲで生成された２つの直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントと標的染色体のＤＮＡとの間で起こる、３回の相同的組み換えを通して、大腸菌標的遺伝子ｄｘｓ（実施例２）、もしくはｉｄｉ（実施例６）どちらか一方の上流に置かれた（図２および８）。それぞれの実施例で、２つのフラグメントのうちの１つは、部位特異的ＦＲＴリコンビナーゼ配列に隣接されたカナマイシン抵抗マーカーを含んでいた。部位特異的リコンビナーゼ配列に隣接しているのは、短い（およそ１０〜５０ｂｐ）相同性領域を含むホモロジーアームだった。図２で説明されているように、第１の組み換え領域（「ｈ１」）は、第１のフラグメントの５’−末端に連結していた。第２の組み換え領域（「ｈ２」）は、第１のフラグメントの３’−末端に連結していた。第２のＰＣＲで生成された直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントは、ＰＴ５強力プロモーターを含んでいた。第３の組み換え領域（「ｈ３」）は、第２のフラグメントの３’−末端に連結していた。第１の組み換え領域（「ｈ１」）は、置換を目的とした未変性の細菌染色体プロモーターの上流部分に相同性を有していた。第１のフラグメントの３’−末端上に位置する第２の組み換え領域（「ｈ２」）は、第２のフラグメントの５’−末端部分に相同性を有していた。第３の組み換え領域（「ｈ３」）は、置換を目的とした未変性の細菌染色体プロモーターの下流部分に相同性を有していた（図２）。
【０１４２】
ヘルパープラスミドｐＫＤ４６（図４）上にλ−Ｒｅｄ組み換え系を含んでいる大腸菌宿主は、ＰＣＲで生成された２つのフラグメントで形質転換され、その結果、標的の未変性プロモーターと、第１のフラグメントのカナマイシン選択マーカーおよび第２のフラグメント上のＰＴ５強力プロモーターを含むコンストラクトとの間で、染色体の置換が生じた（実施例４および７、図２および８）。このプロモーターの置換の結果、導入された変性プロモーターと作動的に結合した、増強された大腸菌染色体遺伝子（ｄｘｓ、もしくはｉｄｉ遺伝子のどちらか一方）が形成された。所望の組み換え現象を経験したこの細菌宿主細胞は、選択マーカーの発現、選択された媒体内でのそれらの成長力にしたがって選択された。その後選択された組み換え体は、選択マーカーを切断したフリッパーゼ（Ｆｌｐ）部位特異的リコンビナーゼを発現している第２のヘルパープラスミド、ｐＣＰ２０（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、受託番号ＰＴＡ−４４５５；ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）で形質転換された（図２および８、実施例３および６）。コンストラクトは、ＰＣＲフラグメントの分析を通して確認された（図６および９、実施例４および７）。増強された遺伝子（ｄｘｓ、もしくはｉｄｉのどちらか一方）およびカロテノイドレポータープラスミド（ｐＰＣＢ１５；配列番号３７）を含む組み換え細菌宿主細胞は、その後β−カロテンの増産を試験された。ＰＴ５強力プロモーターの制御下で、通常は非常に低いレベルで発現する、大腸菌ｄｘｓ、もしくはｉｄｉ遺伝子どちらか一方の置換の結果、β−カロテン産生の大幅な増加となった（実施例５、図７）。
【０１４３】
別の実施形態では、大腸菌レポーター株が、β−カロテン産生をアッセイするために作成された。つまり、その大腸菌レポーター株は、パントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）由来の遺伝子クラスターｃｒｔＥＸＹＩＢを、後に大腸菌宿主株を形質転換するのに用いられるヘルパープラスミド（ｐＰＣＢ１５）内にクローニングすることによって生成される（図５）。レポータープラスミドを含む宿主細胞の同定および選択は、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）（ｐＰＣＢ１５はクロラムフェニコール抵抗遺伝子、ＣａｍＲを含む）中で細胞を培養して成し遂げられる。上記クラスターは、通常形質転換された大腸菌内で産生されるβ−カロテンを有する、カロテノイドの合成に必要な遺伝子の多くを含んでいる（図７）。ｃｒｔＺ遺伝子（β−カロテンヒドロキシラーゼ）が上記遺伝子クラスターに含まれていたことは注目すべきことである。しかしながら、ｃｒｔＺ遺伝子（ｃｒｔＢ遺伝子に隣接して、反対の方向に組織化している）を発現するプロモーターが存在しなかったために、ゼアキサンチン（ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）は産生されなかった。このように、ゼアキサンチングルコシルトランスフェラーゼ酵素（遺伝子クラスター内に位置するｃｒｔＸ遺伝子によってコードされている）は、反応のための基質を持っていなかった。β−カロテンの産生増加は、対照株の産生に比例した増加として報告された（図７）。
【０１４４】
この一般的な方法は、ＰＣＲで生成された２つのフラグメント上に含まれた遺伝子情報に基づく、さまざまな染色体修飾に使用され得る。別の実施形態では、この方法は、外来遺伝子およびプロモーターを同時に加えるのに用いられた。ＰＣＲで生成された２つのフラグメントの第１のフラグメントは、選択マーカー（カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ））およびプロモーター（ＰＴ５）の融合産物を含むようにデザインされた（実施例８、図１０および１１）。第２のＰＣＲで生成されたフラグメントは、「ｄｘｓ（１６ａ）」と表示される外来遺伝子、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ株ｄｘｓ遺伝子を含んでいた。再度、ホモロジーアームは宿主の細菌染色体内への正確な取り入れが可能になるようにデザインされた。所定の遺伝子は、使用する選択ホモロジーアームに依存して、標的の天然遺伝子を置換するために、簡単に付加、もしくは使用され得る。所望の組み換え体は、すでに説明された方法によって選択された。そして選択マーカーは、すでに説明されたように、部位特異的リコンビナーゼによって除去された（図１１、実施例９）。組み換えコンストラクトは、ＰＣＲフラグメントの分析によって確認された（図１２、実施例１０）。形質転換された大腸菌レポーター株内でのβ−カロテン産生への効果は、すでに説明された方法で測定された。ＰＴ５強力プロモーターの制御下で、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ株ｄｘｓ遺伝子（大腸菌ｄｘｓ遺伝子と相同）を含む細胞は、β−カロテンの産生で大幅な増加を示した（図７）。相同的組み換えを用いる本発明のワンステップの方法は、外来プロモーターおよび遺伝子の同時付加に有用であった。最終的な結果が所望の産物の増産となるように、必要に応じて細菌の生合成経路を操作するには、プロセスの繰り返しを可能にする、後で行う選択マーカーの除去が必要とされる。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明の方法の適用性が、大腸菌オペロンの作成によって説明された。作成された原核生物のオペロンは、１つの強力プロモーター（ＰＴ５）に作動的に結合した３つのパントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）カロテノイド生合成遺伝子（ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩ、ｃｒｔＢ遺伝子）を含んでなるものだった。第１のＰＣＲで生成された直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントは、カナマイシン選択マーカー、ＰＴ５強力プロモーター、ＰＴ５プロモーターに作動的に結合した所定の遺伝子（パントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ）間の融合産物を含んでなるものだった（ｋａｎ−ＰＴ５−ｃｒｔＥ、図１３）。カナマイシン選択マーカーは、すでに説明されているように、後で行う除去のための、部位特異的リコンビナーゼの部位に隣接されていた。第１のフラグメントは、５’および３’−末端で適当なホモロジーアームに隣接されていた。第２のＰＣＲで生成された直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメントは、合成されて外来のＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢ遺伝子を含み、さらに適当な３’−末端ホモロジーアームを含んだ（図１３、実施例１２）。すでに説明されたように起こった３回の相同的組み換えは、染色体の組み込みおよび第１のフラグメントのｃｒｔＥ遺伝子を含むオペロンの形成という結果をもたらした。上記オペロンは、第２のフラグメントのｃｒｔＩＢ遺伝子に密接に関連し、これらすべての遺伝子を第１のフラグメント上のＰＴ５プロモーターに作動的に結合させていた。再度、マーカーはすでに説明されているように適当な媒体内で選択の後で除去された。コンストラクトは、ＰＣＲフラグメントの分析で確認された（図１４、実施例１３）。機能的に発現したｃｒｔＥＩＢオペロンを含む形質転換された大腸菌株は、すでに例示されているようにｐＰＣＢ１５レポータープラスミドを含んでいなかった。ｐＰＣＢ１５レポータープラスミドはまた、リコピン（ピンク色）をβ−カロテン（オレンジ色）に転換する原因となった、機能的に発現したｃｒｔＹ遺伝子（リコピンシクラーゼ）を含んでいたことは注目すべきことである。形質転換された大腸菌株での、ｐＰＣＢ１５ヘルパープラスミドを欠いたｃｒｔＥＩＢオペロンの発現は、ピンク色のコロニーの蓄積（リコピン蓄積を表示している）によって確認された（実施例１３）。
【０１４６】
別の実施形態では、細菌宿主株は、所望の最終的な産物の産生効率を上昇させるための、複数のプロモーターおよび遺伝子の付加もしくは置換といった複数の染色体修飾を含むように操作され得る。好ましい実施形態では、組み込まれた、もしくは増強された染色体遺伝子は、カロテノイドの産生に有用な酵素をコードする。さらに好ましい実施形態では、遺伝子の複数のコピーは、染色体操作されて、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。
【０１４７】
本発明のワンステップの方法は、さまざまな、目標とされる生体内での細菌染色体の修飾に使用され得る。ＰＣＲで生成された２つのｄｓＤＮＡフラグメント内（およびそれらが結合しているホモロジーアーム）に入れられた遺伝子情報は、所望の染色体修飾のタイプおよび位置を決定する。これまでの形質転換の方法で用いられたクローニングステップの除外により、実験室での多くの時間とそれに関連する経費を取り除いた。部位特異的リコンビナーゼを用いる選択マーカーの除去は、個人が、生合成経路の操作および産業的に有用な材料の産生を最適化するのに必要とされる複数の染色体修飾を実施することを可能にする。
【実施例】
【０１４８】
下記の実施例において本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、あくまでも一例にすぎない点を理解されたい。当業者であれば、上記の説明ならびにこれらの実施例から、本発明の本質的な特徴を解明し、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明をさまざまに変更および改変し、さまざまな用途と条件に適合させることができる。
【０１４９】
一般的方法
実施例で用いた、標準的な組み換えＤＮＡおよび分子のクローニング技術は、当該分野で周知となっており、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）による、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）のコールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）から出版された「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）による、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）にあるコールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）での「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」（１９８４）および、オースベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）らによる、グリーンパブリッシングアソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリーインターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）から出版された「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）で説明されている。
【０１５０】
細菌培養菌のメンテナンスと増殖に適した材料および方法は、当該分野で周知となっている。下記の実施例での使用に適した技術は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（フィリップ  ジェルハード（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスティロー（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリエ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、Ｇ．ブリッグ  フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編集、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、１９９４）の中で、もしくはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）により、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）のシナウェアアソシエイツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）から出版された「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９）の中に記載したように見出され得る。細菌細胞の増殖とメンテナンスのために用いたすべての試薬、制限酵素、材料は、特に定めのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）のアルドリッチケミカルス（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ミシガン州デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）のディフコラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、メリーランド州ガイツェルスバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、もしくはミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）より入手した。
【０１５１】
遺伝子配列の操作は、ジェネティクスコンピューターグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）より入手可能なプログラム一式（ウィスコンシンパッケージバージョン９．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、ジェネティクスコンピューターグループ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いて達成した。ＧＣＧのプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」を使用した場所では、ギャップ作成デフォルト値１２とギャップ延長デフォルト値４を使用した。ＣＧＣのプログラム「ギャップ（Ｇａｐ）」、もしくは「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」を使用した場所では、デフォルトギャップ作成ペナルティー５０とデフォルトギャップ延長ペナルティー３を使用した。スミスウォーターマンアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｗ．Ｒ．ペアーソン、（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、コンピューターメソッズゲノムリサーチ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、「Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．」（１９９４）、会合日１９９２年、１１１−２０、編集者：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンドール（Ｓａｎｄｏｒ）、出版社：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））を取り入れたプログラム、ファスタ（ＦＡＳＴＡ）を使用して複数のアラインメントを作成した。プログラムパラメーターが指示されなかった場合はどこでも、これらのプログラムもしくは他のいかなるプログラム内であっても、デフォルト値を使用した。
【０１５２】
略語の意味は下記のとおりである。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｒｐｍ」は毎分の回転数を意味する。
【０１５３】
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼプラスミド系
本発明で用いられたプラスミド（ｐＫＤ４、ｐＫＤ４６、ｐＣＰ２０）は、これまでに文献（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）の中で説明されている。λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系の構成要素の配列は、ヘルパープラスミドｐＤＫ４６（配列番号３５、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４６）に含まれている。本発明で用いられた、Ｆｌｐ／ＦＲＴ部位特異的リコンビナーゼヘルパープラスミドは、ｐＣＰ２０（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−４４５５）であった。プラスミドｐＫＤ４（配列番号３４、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＹ０４８７４３）を、ＦＲＴに隣接されたカナマイシン抵抗マーカーのＰＣＲ増幅のテンプレート分子として用いた。
【０１５４】
実施例１
大腸菌染色体上のｄｘｓ遺伝子のプロモーター操作に用いられた、ＰＣＲで生成された２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントの合成
部位特異的リコンビナーゼ標的配列（ＦＲＴ）に隣接されたカナマイシン選択マーカーを含む直鎖状ＤＮＡフラグメント（１４８９ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ１（ｄｘｓ）（５’−ＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＧＴＡＡＴＡＡＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号１）を用いて、プラスミドｐＫＤ４（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）からＰＣＲによって合成した。上記Ｔ１（ｄｘｓ）は、ｉｓｐＡ終止コドン、プライマー配列（２０ｂｐ）およびＢ１（Ｔ５）（５’−ＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’）（配列番号２）の上流領域にある配列にマッチするように選択されたｈ１ホモロジーアーム（下線部の４１ｂｐ）を含む。上記Ｂ１（Ｔ５）は、プロモーターＤＮＡフラグメントおよびプライマー配列（２０ｂｐ）の５’−末端にある配列にマッチするように選択されたｈ２ホモロジーアーム（下線部の５０ｂｐ）を含む（図２）。−１０および−３５コンセンサス配列と、ｌａｃオペレーター（ｌａｃＯ）とリボソーム結合部位（ｒｂｓ）とを含んでなるファージプロモーター（ＰＴ５）を含む第２の直鎖状ＤＮＡフラグメント（１５４ｂｐ）を、プライマー配列（３２ｂｐ）およびＢ２（ｄｘｓ）（５’−ＧＧＡＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＧＧＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＡＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧ−３’）（配列番号４）を含むプライマー対、Ｔ２（Ｔ５）（５’−ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号３）を用いて、プラスミドｐＱＥ３０（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ））からＰＣＲによって合成した。上記Ｂ２（ｄｘｓ）は、ｄｘｓ開始コドンおよびプライマー配列（２２ｂｐ）の下流領域にある配列にマッチするように選択されたｈ３ホモロジーアーム（下線部の４８ｂｐ）を含む（図２）。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、ＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡ上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる２つのＰＣＲフラグメントは、図２に示すように、ホモロジーアーム（ｈ１およびｈ２）を含むカナマイシン選択マーカーと、ホモロジーアーム（ｈ３）を含むＰＴ５プロモーターであった。アンプリタックゴールド（登録商標）ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のアプライドバイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）を用いて直鎖状ＤＮＡフラグメントを増幅するためにとられた標準的ＰＣＲの条件は、下記のとおりである。
【０１５５】
【表２】
2006510374.tif 000004
【０１５６】
ＰＣＲ反応を終えた後、ＱＩＡクイックゲルエクストラクションキット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（商標）（カタログ＃２８７０４、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を用いて、ＰＣＲ産物を精製した。簡単に説明すると、それぞれ５０μＬずつのＰＣＲ反応混合物を、１％アガロースゲル上に流した。増幅されたＤＮＡフラグメントを含むバンドを、清潔で切れ味のよいスカルペルで、アガロースゲルから切り取った。ゲルスライスを無色のプラスチック管に入れて秤量した。１容量のゲルに３容量のバッファーＱＧを加えた後、その管を５０℃で１０分間（またはゲルスライスが完全に溶解するまで）インキュベートした。ゲルスライスが完全に溶解した後、試料にゲル容量と同量のイソプロパノールを加え、管を数回転倒混和した。ＤＮＡを結合させるため、試料をＱＩＡクイックゲル抽出カラムに加えて、１分間遠心分離機にかけた。７５０μＬのバッファーＰＥをカラムに加え洗浄した。１分間遠心分離機にかけ洗浄バッファーを取り除いた後、試料を１分間静置して１分間遠心分離機にかけ、ＰＣＲによるＤＮＡ産物を蒸留水（ｄＨ２Ｏ）１０μＬで溶出させた。ＤＮＡクリーンアンドコンセントレーター（ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（商標）（ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、カリフォルニア州オレンジ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））を用いて、ＰＣＲによるＤＮＡ試料をさらに精製した。それぞれの量のＤＮＡ試料に、２容量のＤＮＡ結合バッファーを加えた後、それら試料をザイモスピンカラム（Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ）（ザイモリサーチ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））に仕込み、最高速度（＞１０，０００ｇ）で５〜１０秒間遠心分離機にかけた。カラム内に残留したＰＣＲによるＤＮＡ試料を、最高速度で５〜１０秒間遠心分離機にかけながら、２００μＬの洗浄バッファーで２回洗浄した。最高速度で２回、回転を行いながら、６〜８μＬの蒸留水でＤＮＡを溶出した。ＰＣＲによるＤＮＡ試料の濃度は、約０．５〜１．０μｇ／μＬであった。
【０１５７】
実施例２
ＰＣＲで生成された２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントの、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼを発現している大腸菌株へのエレクトロトランスフォーメーション
λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミド（図４）およびレポータープラスミド（図５）の両方を保有する大腸菌ＭＣ１０６１を、ＰＣＲフラグメントの形質転換のための宿主株として用いた。上記の株は、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドのｐＫＤ４６（ａｍｐＲ）（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）（図４）およびβ−カロテン生合成発現プラスミドのｐＰＣＢ１５（ｃａｍＲ）（図５）を用いて、大腸菌株ＭＣ１０６１に同時形質転換することで作成した。プラスミドｐＰＣＢ１５は、パントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ８１９９）由来のカロテノイド遺伝子クラスター（ｃｒｔＥＸＹＩＢ）を含む。ｐＫＤ４６中のλ−Ｒｅｄリコンビナーゼは、アラビノース誘導型プロモーターの制御下で発現した３つの遺伝子、ｅｘｏ、ｂｅｔ、ｇａｍを含んでなる。形質転換体は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えたＬＢプレート上、３０℃で選択した。
【０１５８】
ｐＫＤ４６およびｐＰＣＢ１５を保有する大腸菌ＭＣ１０６１株の、エレクトロコンピテントセルを、下記のように調製した。ｐＫＤ４６およびｐＰＣＢ１５を保有する大腸菌ＭＣ１０６１細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと、１ｍＭのＬ−アラビノースとの入ったＳＯＢ培地で、光学密度０．５ＯＤ６００まで３０℃で成長させた後、氷上で２０分間冷やした。ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＴ７プラス（ＲＴ７  ＰＬＵＳ）（ケンドロラボラトリープロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、コネチカット州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ））を用いて、細菌細胞を４，５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離機にかけた。上清をデカントした後、ペレットを氷水に再懸濁させ、再び遠心分離機にかけた。これを２度繰り返し、細胞ペレットを１／１００容量の１０％グリセロール氷水に再懸濁させた。
【０１５９】
カナマイシンマーカーのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）およびファージＰＴ５プロモーターのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）の両方を、５０μＬのコンピテントセルと混合し、氷上で予冷したエレクトロポレーション用キュベット（０．１ｃｍ）にピペットで入れた。バイオラッドジーンパルサーセット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｓｅｔ）（１．８ｋＶ、２５μＦ）を、抵抗２００オームのパルス制御装置とともに使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの後、ＳＯＣ培地（１ｍＬ）を加えた。細胞を３７℃で１時間インキュベートした。ダブルの抗生物質耐性形質転換体を選択するために、およそ半分の細胞を、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールの両方を含むＬＢプレート上に広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、ダブルの抗生物質耐性形質転換体を１つ選択した。
【０１６０】
実施例３
ＦＬＰリコンビナーゼ発現プラスミドを用いた抗生物質選択マーカーの除去
温度感受性複製開始点を有するＦｌｐリコンビナーゼ発現プラスミドｐＣＰ２０（ａｍｐＲ）を、エレクトロポレーションで、カナマイシン耐性形質転換体へと一時的に形質転換した。バイオラッドジーンパルサー（バイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））セット（１．８ｋｖ、２５μＦ）を、パルス制御装置（抵抗２００オーム）とともに用いて、エレクトロトランスフォーメーションを行った。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えたＬＢプレートに細胞を広げ、３０℃で１日培養した。コロニーを採取し、アンピシリン抗生物質を含有しない、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを加えたＬＢプレート上にストリークして、４３℃で一晩インキュベートした（プラスミドｐＣＰ２０は、温度感受性複製起点を持ち、４３℃で細胞を培養することで宿主細胞から取り除かれた）。ｐＣＰ２０およびカナマイシン選択マーカーの損失を試験するために、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢプレート、もしくは２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢプレート上にコロニーをストリークして、コロニーのアンピシリンおよびカナマイシン耐性を試験した。カナマイシン選択マーカーは、温度感受性複製開始点上にあるＦｌｐ発現プラスミドの一時的な形質転換による、ＦＲＴサイト内のＦｌｐ組み換えによって除去された。
【０１６１】
実施例４
ＰＣＲ分析による、ファージＰＴ５プロモーターのｄｘｓ遺伝子前での染色体組み込みの確認
ＰＣＲ分析にしたがって、カナマイシン選択マーカーおよびファージＰＴ５プロモーター両方の、大腸菌染色体上のｄｘｓ遺伝子前部での染色体組み込みを実施した。形質転換体のコロニーは、２００μＭのｄＮＴＰｓ、２．５Ｕのアンプリタックゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ）（登録商標）（アプライドバイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））および０．４μＭの異なるプライマー対を含む５０μＬのＰＣＲ反応混合物中で再懸濁した。上記異なるプライマー対は、Ｔ１（５’−ＣＧＣＣＡＧＴＣＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡ−３’）（配列番号５）とＴ２（５’−ＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴ−３’）（配列番号６）、Ｔ３（５’−ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ−３’）（配列番号７）とＴ４（５’−ＴＧＧＣＡＡＣＡＧＴＣＧＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧ−３’）（配列番号８）、Ｔ２（Ｔ５）とＴ４、Ｔ１とＴ４だった。テストプライマーを選択し、組み込み領域周辺、もしくはカナマイシンおよびファージＰＴ５プロモーター領域内のどちらかに位置する領域を増幅した（図６）。Ｔ１とＴ２、Ｔ３とＴ４、Ｔ２（Ｔ５）とＴ４、Ｔ１とＴ４のプライマー対を用いたＰＣＲ試験を行ったところ、１％アガロースゲル上に、６８２ｂｐ、１１１６ｂｐ、２２９ｂｐ、１８８７ｂｐという予想通りのサイズであることが明らかとなった（図６）。カナマイシン選択マーカーを除去した上で再度ＰＣＲ分析を行ったところ、Ｔ１とＴ２、Ｔ３とＴ４でＰＣＲ産物は示されず、Ｔ２（Ｔ５）とＴ４、Ｔ１とＴ４では、それぞれ２２９ｂｐおよび４９４ｂｐの予想通りのサイズであることが明らかとなった（図６）。これらのＰＣＲの結果から、染色体ｄｘｓ遺伝子の前にＰＴ５プロモーターフラグメントが正しく組み込まれ、大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓを産生していることが分かった。
【０１６２】
実施例５
大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓ内のβ−カロテン産生の測定
レポータープラスミドｐＰＣＢ１５を含む大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓのβ−カロテン産生量を、同じくｐＰＣＢ１５を含む大腸菌対照株とともに測定することで、ｄｘｓ遺伝子の前へのＰＴ５プロモーターの染色体組み込みをさらに特徴付けた。大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓと大腸菌対照株を２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む５ｍＬのＬＢで２４時間、３７℃で培養した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけて収集した。細胞ペレットを、１ｍＬのアセトン中で１分間ボルテックスして再懸濁させ、ロッキングプラットフォーム２００（Ｒｏｃｋｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ２００）（ＶＷＲインターナショナル（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ペンシルバニア州ウェストチェスター（Ｗｅｓｔ  Ｃｅｓｔｅｒ，ＰＡ））を用いて試料を室温で１時間振とうさせ、β−カロテン色素を抽出した。試料を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機にかけた後、β−カロテンを含むアセトン層の吸光スペクトラムを、ウルトロスペック３０００（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００）分光光度計（アマーシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を用いて、λ４５０ｎｍで測定した。大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓ中のβ−カロテン産生量は、対照株の約３倍多かった（図７）。これらの結果から、大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓでβ−カロテンの産生量が増えたのは、強力ＰＴ５プロモーターの制御下でｄｘｓ遺伝子の発現が増したのに起因することが分かる。ＰＣＲ分析だけでなく、対照株との比較で大腸菌ＰＴ５−ｄｓｘのβ−カロテンを測定することでその機能を試験し、大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓの構成が正しいことを示した。
【０１６３】
実施例６
大腸菌染色体上のｉｄｉ遺伝子のプロモーター操作−（ＰＣＲで生成された）２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントの調製、エレクトロトランスフォーメーション、抗生物質選択マーカーの除去
本発明を染色体プロモーターの置換に汎用的に適用することについて、大腸菌染色体上のｉｄｉ遺伝子のプロモーターを操作することでさらに検討した。この大腸菌染色体の６５．３分に位置するｉｄｉ遺伝子に作動的に結合した内在性のプロモーターを、ＰＣＲで生成された２つのＤＮＡフラグメントを用いてＰＴ５強力プロモーターと置換した。異なるプライマーを用いたこと以外は実施例１に記載したように、ＰＣＲでＤＮＡフラグメントを合成した。ＦＲＴ配列に隣接されたカナマイシン選択マーカーを含む直鎖状ＤＮＡフラグメント（１４８９ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ（ｉｄｉ）（５’−ＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＡＴＡＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号９）を用いて、プラスミドｐＫＤ４（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）からＰＣＲで合成した。上記Ｔ（ｉｄｉ）は、ｙｇｆＵ終止コドンの上流領域にある配列と、プライマー配列（２０ｂｐ）と、プロモーターＤＮＡフラグメントの５’−末端領域にある配列およびプライマー配列（２０ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ２ホモロジーアーム（下線部の５０ｂｐ）を含むＢ１（Ｔ５）とにマッチするように選択された、ｈ４ホモロジーアーム（下線部の４５ｂｐ）を含む（図８）。ＰＴ５プロモーターを含む第２の直鎖状ＤＮＡフラグメント（１５４ｂｐ）を、プライマー対、Ｔ２（Ｔ５）（５’−ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号３）を用いて、ｐＱＥ３０（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．））からＰＣＲで合成した。上記Ｔ２（Ｔ５）は、プライマー配列（３２ｂｐ）およびｉｄｉ開始コドンとプライマー配列（２２ｂｐ）の下流領域にある配列にマッチするように選択されたｈ５ホモロジーアーム（下線部の４６ｂｐ）を含むＢ（ｉｄｉ）（５’−ＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧ−３’）（配列番号１０）を含む（図８）。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、ＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡ上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる２つのＰＣＲフラグメントは、図８に示すように、ホモロジーアーム（ｈ２およびｈ４）を含むカナマイシン選択マーカーと、ホモロジーアーム（ｈ５）を含むＰＴ５プロモーターであった。
【０１６４】
ＰＣＲ反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションを、実施例１および２に記載したように実施した。精製されたカナマイシンをカセットしたＰＣＲ産物（１〜５μｇ）およびＰＴ５プロモーターのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼを発現している大腸菌に同時形質転換した。実施例１に記載したように、細胞をプレートし、かつスクリーニングして、抗生物質耐性形質転換体を得た。ｋａｎＲとｃａｍＲのダブル耐性の形質転換体を１４選択した。カナマイシン選択マーカーを、実施例３に記載した方法で除去した。
【０１６５】
実施例７
ｉｄｉ遺伝子前部でのＰＴ５プロモーターの染色体組み込みの確認
１４のダブルの抗生物質耐性形質転換体の内の、５つの形質転換体を任意で選択し、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、Ｔ５（５’−ＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１１）とＴ２、Ｔ２（Ｔ５）とＴ６（５’−ＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＡＴＣＣ−３’）（配列番号１２）、Ｔ５とＴ６を用いてＰＣＲで分析した（図９）。実施例４に記載したように、ＰＣＲ反応を実施した。テストプライマーを、組み込み領域の付近、もしくはカナマイシンおよびＰＴ５プロモーター領域のどちらか一方に位置している配列を増幅するために選んだ。５つの形質転換体すべてに対する、Ｔ５とＴ２、Ｔ２（Ｔ５）とＴ６、Ｔ５とＴ６のプライマー対を用いたＰＣＲ試験では、それぞれ１％アガロースゲル上で予想通りのサイズ６２７ｂｐ、２７４ｂｐ、１８７７ｂｐが得られた。実施例３に記載したようにカナマイシン選択マーカーを除去した後、Ｔ５およびＴ２を用いてＰＣＲ分析を行ったところ、ＰＣＲ産物は認められなかった。一方、Ｔ２（Ｔ５）とＴ６、Ｔ５とＴ６のプライマー対を用いて再度ＰＣＲ分析を行ったところ、予想通りのサイズすなわちそれぞれ２７４ｂｐと４８４ｂｐのＰＣＲ産物が認められた。これらの結果から、カナマイシン選択マーカーとＰＴ５プロモーターフラグメントとが、染色体ｉｄｉ遺伝子の前に正しく組み込まれ、大腸菌ＰＴ５−ｉｄｉを産生していることが分かった。
【０１６６】
実施例５に記載したように、ｉｄｉ遺伝子の前へのＰＴ５プロモーターの染色体組み込みを、対照株に対する大腸菌ＰＴ５−ｉｄｉのβ−カロテン産生量を定量化することでさらに確認した。それの未変性のプロモーターと結合しているｉｄｉ遺伝子を含む対照株と比較した場合、大腸菌ＰＴ５−ｉｄｉがβ−カロテン産生量の１．５倍増加した（図７）。
【０１６７】
実施例８
融合した抗生物質選択マーカーとプロモーターとを保有するテンプレートプラスミドの作出
染色体操作を容易にするために、融合したカナマイシン選択マーカーとＰＴ５プロモーターとを保有するプラスミドを作出した。ＰＴ５強力プロモーター領域をｐＫＤ４のＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にクローニングして、融合したカナマイシン選択マーカーとＰＴ５プロモーターを含むプラスミドを作出した（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）とワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲）（図１０）。最初に、−１０および−３５コンセンサス配列とｌａｃＯとｒｂｓとを含んでなるＰＴ５プロモーター因子（１５４ｂｐ）を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマー対、ＴＴ５（５’−ＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ−３’）（配列番号１３）およびＢＴ５（５’−ＧＡＴＧＣＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧ−３’）（配列番号１４）を用いて、ｐＱＥ３０（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）からＰＣＲで合成した。プライマー内の下線部の配列は、ＮｄｅＩ部位の配列を表している。ＰＣＲ反応の条件については、実施例１に記載したものと同じとした。このようにして得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩで消化し、ＮｄｅＩで消化したｐＫＤ４にクローニングして、ｐＳＵＨ５（配列番号３６、図１０）を産生した。融合カナマイシン選択マーカー−ファージＰＴ５プロモーターを含む直鎖状ＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントを生成するテンプレートとして、プラスミドｐＳＵＨ５を利用した。ｐＳＵＨ５の構成については、ＤＮＡ塩基配列決定法（デュポンＣＲアンドＤ、ＤＮＡシーケンスファシリティー（ＤｕＰｏｎｔ  ＣＲ＆Ｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））で確認した。
【０１６８】
実施例９
メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６Ａ  ｄｘｓ遺伝子の大腸菌での染色体組み込み−２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントの調製：（１）融合抗生物質選択マーカー−プロモーター、（２）外来遺伝子、エレクトロトランスフォーメーション、抗生物質選択マーカーの除去
本発明の適用性は、外来遺伝子を大腸菌へ組み込む、染色体組み込みへとさらに広がった。この実施例は、大腸菌染色体、２つの直鎖状ＤＮＡフラグメント、融合カナマイシン選択マーカー−ファージＰＴ５プロモーターおよびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓ遺伝子（本発明では、「ｄｘｓ（１６ａ）」と表示される。配列番号１５）間の相同的組み換えによって、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓ遺伝子を、大腸菌染色体の３０．９分に位置する遺伝子間領域に組み込む、染色体組み込みについて説明する。ｄｘｓ遺伝子は、大腸菌ｄｘｓ遺伝子のメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２４０２）相同物である。相同的組み換えによる、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓ遺伝子の染色体組み込みのスキームを、図１１に示す。
【０１６９】
融合カナマイシン選択マーカー−ファージＰＴ５プロモーターを含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマー対、Ｔ１（ｄｘｓ１６ａ）（５’−ＣＡＣＴＡＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＡＴＴＧＣＴＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＴＴＣＧＣＡＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号１６）を用いて、ｐＳＵＨ５からＰＣＲによって合成した。上記Ｔ１（ｄｘｓ１６ａ）は、大腸菌染色体の３０．９分に位置する遺伝子間領域にある配列、プライマー配列（２０ｂｐ）およびＢ１（ｄｘｓ１６ａ）（５’−ＡＧＴＡＧＡＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧ−３’）（配列番号１７）にマッチするように選択されたｈ６ホモロジーアーム（下線部の４５ｂｐ）を含む。上記Ｂ１（ｄｘｓ１６ａ）は、ｄｘｓ（１６ａ）開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列（２２ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ７ホモロジーアーム（下線部の２９ｂｐ）を含む（図１１）。メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓ遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマー対、Ｔ２（ｄｘｓ１６ａ）（５’−ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＡＧＡＣ  ＴＴＣＣＣＴＣ−３’）（配列番号１８）を用いて、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ（（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２４０２）ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって合成した。上記Ｔ２（ｄｘｓ１６ａ）は、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターの３’−末端領域にある配列、プライマー配列（２５ｂｐ）およびＢ２（ｄｘｓ１６ａ）（５’−ＡＧＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＴＴＡＴＣＡＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＡＴＡＧＣＣＴＣＧＡＡＴＴＡＴＣＡＡＧＣＧＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＧＡＴＧ−３’）（配列番号１９）にマッチするように選択されたｈ８ホモロジーアーム（下線部の３０ｂｐ）を含む。上記Ｂ２（ｄｘｓ１６ａ）は、大腸菌染色体の３０．９分に位置する遺伝子間領域にある配列およびプライマー配列（２２ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ９ホモロジーアーム（下線部の４６ｂｐ）を含む（図１１）。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、ＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡ上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。こうして得られる２つのＰＣＲフラグメントは、図１１に示すように、ホモロジーアーム（ｈ６およびｈ７）を含むカナマイシン選択マーカーとホモロジーアーム（ｈ８およびｈ９）を含むｄｘｓ（１６ａ）遺伝子であった。
【０１７０】
ＰＣＲ反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションについては、実施例１および２で記載したように実施した。融合カナマイシン−ファージＰＴ５プロモーターのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）とメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）の両方を、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を発現している大腸菌宿主細胞に同時形質転換した。形質転換体を上述したようにして選択し、７つのｋａｎＲおよびｃａｍＲのダブル耐性の形質転換体を選択した。カナマイシン選択マーカーを、実施例３に記載した方法で除去した。
【０１７１】
実施例１０
融合抗生物質選択マーカー−プロモーターおよびメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６Ａ由来の外来ｄｘｓ遺伝子の染色体組み込みの確認
７つのダブルの抗生物質耐性形質転換体すべてを、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、Ｔ７（５’−ＡＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴＣ−３’）（配列番号２０）とＴ２、Ｔ７とＴ８（５’−ＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＴＡＧＣ−３’）（配列番号２１）、Ｔ２（Ｔ５）とＴ９（５’−ＧＣＧＡＴＡＴＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＡ−３’）（配列番号２２）、Ｔ７とＴ９を用いて、ＰＣＲで分析した（図１２）。テストプライマーを選び、図１２に示すように、カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター領域の組み込み領域付近、もしくはメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓ遺伝子付近のどちらかに位置する配列を増幅した。ＰＣＲ反応を、実施例４に記載したように実施した。Ｔ７とＴ２、Ｔ７とＴ８、Ｔ２（Ｔ５）とＴ９、Ｔ７とＴ９の対を用いたＰＣＲ分析から、７つの内２つの形質転換体が、１％アガロースゲル上で、それぞれ６４３ｂｐ、１９０８ｂｐ、２１８４ｂｐ、３８０３ｂｐという予想通りのサイズであった。これらの結果から、２つの形質転換体では、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターフラグメントとメチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）  １６ａ  ｄｘｓ遺伝子が大腸菌染色体の３０．９分に位置する遺伝子間領域にの正しく組み込まれていることが分かった。カナマイシン選択マーカーを除去した後、Ｔ７とＴ２のプライマー対を用いてＰＣＲ分析を行ったところ、ＰＣＲ産物は認められなかった。Ｔ７とＴ８、Ｔ２（Ｔ５）とＴ９、Ｔ７とＴ９のプライマー対を用いたＰＣＲ分析では、１％アガロースゲル上に、それぞれ５１５ｂｐ、２１８４ｂｐ、２４１０ｂｐという予想通りのサイズのフラグメントが示された。このようにして得られた大腸菌ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）の形質転換を、実施例５に記載したように、そのβ−カロテン産生について試験したところ、β−カロテン産生量が対照株よりも３．３倍高かった（図７）。
【０１７２】
実施例１１
Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子の大腸菌での染色体組み込み−２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントの調製：（１）融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターおよび（２）Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子
この実施例は、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥおよびＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢの組み込みによる、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥおよびｃｒｔＩＢ遺伝子の、大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域への染色体組み込みを説明する（図１３）。ｃｒｔＥ、ｃｒｔＩおよびｃｒｔＢ遺伝子は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ、フィトエンデヒドロゲナーゼ、フィトネンシンターゼをそれぞれコードする。これらの遺伝子は、カロテノイド生合成経路の部分である（図３）。
【０１７３】
融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターを含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマー対、Ｔ１（ｃｒｔＥ）（５’−ＡＧＣＣＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＣＴＣＧＡＣＣＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＧ−３’）（配列番号２３）を用いて、ｐＳＵＨ５からＰＣＲによって合成する。上記Ｔ１（ｃｒｔＥ）は、大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域にある配列、プライマー配列（２０ｂｐ）およびＢ１（ｃｒｔＥ）（５’−ＴＧＡＡＣＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＧＣＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＡＡＴＧ−３’）（配列番号２４）にマッチするように選択されたｈ１０ホモロジーアーム（下線部の４５ｂｐ）を含む。上記Ｂ１（ｃｒｔＥ）は、ｃｒｔＥ開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列（２２ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ１１ホモロジーアーム（下線部の２９ｂｐ）を含む（図１３）。Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマー対、Ｔ２（ｃｒｔＥ）（５’−ＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＣＴＡＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＡＣＧ−３’）（配列番号２５）を用いて、ｐＰＣＢ１５（図５）からＰＣＲで合成した。上記Ｔ２（ｃｒｔＥ）は、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターの３’−末端領域にある配列、プライマー配列（２５ｂｐ）およびＢ２（ｃｒｔＥ）（５’−ＡＧＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＴ−３’）（配列番号２６）にマッチするように選択されたｈ８ホモロジーアーム（下線部の３０ｂｐ）を含む。上記Ｂ２（ｃｒｔＥ）は、大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域にある配列およびプライマー配列（２０ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ１２ホモロジーアーム（下線部の４５ｂｐ）を含む（図１３）。下線部の配列は、それぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分はＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡ上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。２つの結果として生じたＰＣＲフラグメントは、図１３で説明されているように、ホモロジーアーム（ｈ１０およびｈ１１）を含む融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターおよびホモロジーアーム（ｈ８およびｈ１２）を含むＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子であった。
【０１７４】
レポータープラスミドｐＰＣＢ１５の大腸菌株への形質転換を省略した以外は実施例２に記載したように、ＰＣＲ反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションを実施した。上述したように、プラスミドｐＰＣＢ１５は、パントエアステワルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（ＡＴＣＣ受託番号８１９９）ｃｒｔＥＸＹＩＢ遺伝子クラスターを含む。実施例１２および１３に記載したような染色体操作で大腸菌に組み込まれた遺伝子の機能的な発現を測定するには、レポータープラスミドを取り除く必要があった。融合カナマイシンマーカー−ＰＴ５プロモーターのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）およびＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）の両方を、上述したようなレポータープラスミドを除外したこと以外は、実施例２で上述したようなエレクトロポレーションで、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を発現している大腸菌宿主株（ＭＣ１０６１）に同時形質転換した。形質転換体を、３７℃で、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢプレート上で選択した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、２つのｋａｎＲ耐性形質転換体を選択した。
【０１７５】
２つのｋａｎＲ耐性形質転換体を、Ｔ１０（５’−ＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧ−３’）（配列番号２７）およびＴ１３（５’−ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＣＣＣＴＡＡＣＧ−３’）（配列番号３３）のプライマー対を用いて、ＰＣＲで分析した（図１４）。実施例４に記載したＰＣＲ反応の条件と同様の条件下で、ＰＣＲ分析を実施した。Ｔ１０／Ｔ１３を用いた、２つの形質転換体についてのＰＣＲ試験では、１％アガロースゲル上に、予想通りのサイズである２８８３ｂｐが示された。この結果から、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーターのＤＮＡフラグメントが、Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子とともに、大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域に正しく組み込まれ、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥを産生していることが分かった。
【０１７６】
実施例１２
ＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢを作成するための、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥでのＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢ遺伝子の染色体組み込み−２つの直鎖状ＤＮＡフラグメントの調製：（１）融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子、（２）Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢ遺伝子、エレクトロトランスフォーメーションおよび抗生物質選択マーカーの除去
融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子を含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥ遺伝子のゲノムＤＮＡから、プライマー対、Ｔ１０（配列番号２７）を用いてＰＣＲによって合成した。上記Ｔ１０は、大腸菌内の、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−ｃｒｔＥ遺伝子の組み込み部位の上流領域にある１６２塩基に相当するプライマー配列（２６ｂｐ）およびＢ１（ｃｒｔＩＢ）（５’−ＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＣ−３’）（配列番号２８）を含む。上記Ｂ１（ｃｒｔＩＢ）は、ｃｒｔＩ開始コドンの下流領域にある配列およびプライマー配列（２７ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ１４ホモロジーアーム（下線部の２９ｂｐ）を含む（図１３）。Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢを含む直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマー対、Ｔ２（ｃｒｔＩＢ）（５’−ＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＧＣＴＴＡＡＴＧＣＴＧ−３’）（配列番号２９）を用いて、ｐＰＣＢ１５（図５）からＰＣＲで合成した。上記Ｔ２（ｃｒｔＩＢ）は、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−ｃｒｔＥ遺伝子の３’−末端にある配列、プライマー配列（２４ｂｐ）およびＢ２（ｃｒｔＩＢ）（５’−ＡＧＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＧＧＧＣＴＡＧＡＴＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡ−３’）（配列番号３０）にマッチするように選択されたｈ１４ホモロジーアーム（下線部の３０ｂｐ）を含む。上記Ｂ２（ｃｒｔＩＢ）は、大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域にある配列およびプライマー配列（２０ｂｐ）にマッチするように選択されたｈ１２ホモロジーアーム（下線部の４５ｂｐ）を含む（図５および１３）。下線部の配列はそれぞれのホモロジーアームを示し、残りの部分は、ＰＣＲ反応のためのテンプレートＤＮＡ上にある相補的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるためのプライマー配列である。このようにして得られる２つのＰＣＲフラグメントは、図１３に示すように、５’−末端の相同領域（１６２ｂｐ）とホモロジーアーム（ｈ１３）とを含む融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子およびホモロジーアーム（ｈ１４およびｈ１２）を含むＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢ遺伝子であった。
【０１７７】
実施例１１に記載したように、レポータープラスミドｐＰＣＢ１５を用いて宿主細胞を形質転換するステップを省略した以外は、実施例２に記載したように、ＰＣＲ反応、精製、エレクトロトランスフォーメーションを実施した。融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子のＰＣＲ産物（１〜５μｇ）およびＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢのＰＣＲ産物（１〜５μｇ）を、実施例２で上述したように、エレクトロポレーションによって、λ−Ｒｅｄリコンビナーゼ系を発現している大腸菌宿主細胞に同時形質転換した。形質転換体を、３７℃で、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢプレート上で選択した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした後、ｋａｎＲ耐性形質転換体を１つ選択した。実施例３に記載した方法で、カナマイシン選択マーカーを除去した。
【０１７８】
実施例１３
大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢ内のＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥおよびｃｒｔＩＢ遺伝子の、染色体組み込みの確認
選択したｋａｎＲ耐性形質転換体を、特異的プライマー対の異なった組み合わせ、Ｔ１０とＴ２、Ｔ２（Ｔ５）とＴ１２（５’−ＣＴＡＧＡＴＣＧＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号３２）、Ｔ１１（５’−ＡＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣＴＴＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴＣＧ−３’）（配列番号３１）とＴ１３、Ｔ１０とＴ１３を用いて、ＰＣＲで分析した（図１４）。テストプライマーを選び、カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−ｃｔｒＥフラグメントの組み込み領域付近、もしくはｃｒｔＩＢ遺伝子付近のどちらか一方に位置する配列を増幅した（図１４）。実施例４に記載したＰＣＲ反応の条件と同様の条件下で、ＰＣＲ分析を実施した。Ｔ１０とＴ２、Ｔ２（Ｔ５）とＴ１２、Ｔ１１とＴ１３、Ｔ１０とＴ１３を用いたＰＣＲ試験では、それぞれ６７６ｂｐ、３４７２ｂｐ、３４７８ｂｐ、５２８８ｂｐという予想通りのサイズが１％アガロースゲル上で示された。カナマイシン選択マーカーが除去されていることを、ＰＣＲフラグメントの分析で確認した（図１４）。プライマー対Ｔ１０とＴ２を用いたＰＣＲフラグメントの分析では、予想通り、産物が形成されている旨は示されなかった。プライマー対Ｔ２（Ｔ５）とＴ１２、Ｔ１１とＴ１３、Ｔ１０とＴ１３を用いたＰＣＲ分析では、それぞれ３４７２ｂｐ、３４７８ｂｐ、３８９５ｂｐという予想通りのサイズのＰＣＲ産物が１％アガロースゲル上に示された。これらの結果から、融合カナマイシン選択マーカー−ＰＴ５プロモーター−Ｐ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥ遺伝子のＤＮＡフラグメントとＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＩＢ遺伝子が大腸菌染色体の８１．２分に位置するオペロン間領域に正しく組み込まれ、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢを産生していることが分かった。
【０１７９】
ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＣｒｔＥ）、フィトエンシンターゼ（ＣｒｔＢ）およびフィトエンデヒドロゲナーゼ（ＣｒｔＩ）の各酵素の大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢにおける機能的な発現を、ピンク色の色素が生成されることを利用するリコピンの合成によって確認した。実施例５に記載したように、リコピンをアセトンで抽出した後、大腸菌ＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢによるリコピン産生を、リコピン特有の数値である４４４、４７０および５０２ｎｍのλｍａｘピークを認めることで、分光光度的に確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】生体内での細菌のさまざまな染色体修飾のために本発明で用いる一般的な方法を示す。
【図２】カナマイシン選択マーカーおよびファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）を用いた、ｄｘｓ遺伝子の染色体プロモーター操作の方法を示す。
【図３】イソプレノイド／カロテノイド生合成経路を示す。
【図４】λ−Ｒｅｄヘルパープラスミド、ｐＫＤ４６（ダツェンコ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびワーナー（Ｗａｎｎｅｒ）、上掲、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受託番号ＡＹ０４８７４６）を示す。
【図５】カロテノイドの生合成に関連したいくつかの遺伝子を含むｐＰＣＢ１５レポータープラスミドコンストラクトを示す。
【図６】操作された染色体プロモーターコンストラクトと、ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓおよびＰＴ５−ｄｘｓコンストラクトを示すＰＣＲフラグメントの分析について示す。
【図７】ファージＴ５プロモーター（ＰＴ５）を、いくつかのイソプレノイド遺伝子の上流に導入することによるβ−カロテン産生への影響を示す。
【図８】ＰＴ５プロモーターをｉｄｉ遺伝子上流に導入し抗生物質選択マーカーを除去するための方法を示す。
【図９】ｋａｎ−ＰＴ５−ｉｄｉおよびＰＴ５−ｉｄｉコンストラクトを示すＰＣＲフラグメント分析について示す。
【図１０】融合抗生物質マーカー−ＰＴ５プロモーター（ｋａｎ−ＰＴ５）のＰＣＲ生成ＤＮＡフラグメントの調製に用いるｐＳＵＨ５プラスミドのプラスミドマップである。
【図１１】融合抗生物質マーカーであるｋａｎ−ＰＴ５プロモーターおよびメチロモナスｓｐ．１６ａ  ｄｘｓ遺伝子を大腸菌染色体に導入し、抗生物質選択マーカーを除去するための方法を示す。
【図１２】ｋａｎ−ＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）およびＰＴ５−ｄｘｓ（１６ａ）コンストラクトを示すＰＣＲフラグメント分析について示す。
【図１３】融合抗生物質マーカーであるｋａｎ−ＰＴ５プロモーターおよびＰ．ステワルティ（ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）  ｃｒｔＥＩＢ遺伝子を大腸菌染色体に導入するための方法を示す。
【図１４】ｋａｎ−ＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢおよびＰＴ５−ｃｒｔＥＩＢコンストラクトを示すＰＣＲフラグメント分析について示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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