(57)【要約】ミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素または造血系プロスタグランジンＤ合成酵素によるそれぞれのプロスタグランジン生成物を産生する活性を、化合物または薬剤が低下させる能力を評価するために新規で有用な方法を、ここに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）および造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）からなるグループから選ばれるプロスタグランジン合成酵素が基質と反応しプロスタグランジン生成物を産生する活性を、化合物または薬剤が低下させるかどうかを測定するための方法であって、
（ａ）該プロスタグランジン合成酵素と、基質、コファクターおよび化合物または薬剤とを、混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、該基質がプロスタグランジン生成物に自然変換することを防止する薬剤を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、蛍光標識したプロスタグランジン生成物および該プロスタグランジン生成物を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、蛍光標識が励起できる波長を有する平面偏光で照射し、ついで工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含み、
ここで、混合物（ｃ）の蛍光偏光測定値が対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きいという知見が、該化合物または薬剤が該プロスタグランジン合成酵素活性を低下させていることを示す、
上記方法。
【請求項２】
プロスタグランジン合成酵素が、ミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）、基質がプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）、コファクターがグルタチオン（ＧＳＨ）、そしてプロスタグランジン生成物がプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）である請求項１の方法。
【請求項３】
ミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を含んでいるヒトｍＰＧＥＳである、請求項２の方法。
【請求項４】
プロスタグランジン合成酵素が、造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）、基質がプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）、コファクターがグルタチオン（ＧＳＨ）、そしてプロスタグランジン生成物がプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）である請求項１の方法。
【請求項５】
造血系プロスタグランジンＤ合成酵素が、ヒト造血系プロスタグランジンＤ合成酵素であり、そして配列番号４のアミノ酸配列を含んでいる、請求項４の方法。
【請求項６】
停止溶液の薬剤がＦｅＣｌ2である、請求項１の方法。
【請求項７】
蛍光標識がフルオレセイン、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離のランタニド系列塩、キレート化ランタニド系列塩、ＢＯＤＩＰＹ、ＡＬＥＸＡまたはＣｙＤｙｅを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
蛍光標識がテキサスレッド（ＴＲ）である、請求項７の方法。
【請求項９】
停止溶液の薬剤がＦｅＣｌ2である、請求項２の方法。
【請求項１０】
インキュベートする工程（ｂ）の持続時間が少なくとも３０秒間であり、そして、インキュベートする工程（ｃ）の持続時間が少なくとも３分間である、請求項９の方法。
【請求項１１】
蛍光標識がフルオレセイン、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離のランタニド系列塩、キレート化ランタニド系列塩、ＢＯＤＩＰＹ、ＡＬＥＸＡまたはＣｙＤｙｅを含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
蛍光標識がテキサスレッド（ＴＲ）であり、そして、平面偏光励起光の波長が、５８０±２０ｎｍである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
停止溶液の薬剤がＦｅＣｌ2である、請求項４の方法。
【請求項１４】
蛍光標識がフルオレセイン、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離のランタニド系列塩、キレート化ランタニド系列塩、ＢＯＤＩＰＹ、ＡＬＥＸＡまたはＣｙＤｙｅを含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
蛍光標識がテキサスレッド（ＴＲ）であり、および、平面偏光励起光の波長が、５８０±２０ｎｍである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）およびミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）からなるグループから選ばれるプロスタグランジン合成酵素が基質と反応しプロスタグランジン生成物を産生する活性を、化合物または薬剤が低下させるかどうかを測定するための方法であって、
（ａ）該プロスタグランジン合成酵素と、基質、コファクターおよび化合物または薬剤とを、混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、未反応基質がプロスタグランジン生成物に自然変換することを防止する薬剤を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、テキサスレッドで標識したプロスタグランジン生成物および該プロスタグランジン生成物を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、５８０±２０ｎｍの波長の平面偏光で照射し、ついで工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を６２０±２０ｎｍで測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含み、
ここで、混合物（ｃ）の蛍光偏光測定の値が対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きいという知見が、該化合物または薬剤が該プロスタグランジン合成酵素活性を低下させていることを示す、
上記方法。
【請求項１７】
プロスタグランジン合成酵素が、配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトのミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）、基質がプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）、コファクターがグルタチオン、プロスタグランジン生成物がプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
停止溶液の薬剤がＦｅＣｌ2である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
テキサスレッドで標識されたプロスタグランジン生成物が、該プロスタグランジン生成物および該テキサスレッドが結合しているリンカー分子を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
リンカー分子が、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノカプリル酸、Ｆｍｏｃ−アミノカプロン酸、１個またはそれ以上のβ−アラニン、イソチ
オシアネート基、 スクシンイミジルエステル、スルホナルハライドまたはカルボジイミ
ドからなるグループから選ばれる、請求項１９の方法。
【請求項２１】
リンカー分子がカルボジイミドである、請求項２０の方法。
【請求項２２】
プロスタグランジン合成酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を含むヒト造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）、基質がプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）、コファクターがグルタチオン、プロスタグランジン生成物がプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）である、請求項１６の方法。
【請求項２３】
停止溶液の薬剤がＦｅＣｌ2である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
テキサスレッドで標識されたプロスタグランジン生成物が、該プロスタグランジン生成物および該テキサスレッドが結合ているリンカー分子を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
リンカー分子が、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノカプリル酸、Ｆｍｏｃ−アミノカプロン酸、１個またはそれ以上のβ−アラニン、イソチオシアネート基、 スクシンイミジルエステル、スルホナルハライドまたはカルボジイミドからなるグループから選ばれる、請求項２４の方法。
【請求項２６】
リンカー分子がカルボジイミドである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトのミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）がその基質であるプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）と反応しプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を産生する活性を、化合物または薬剤が低下させるかどうかを測するための方法であって、
（ａ）ｍＰＧＥＳと、ＰＧＨ2、グルタチオンおよび化合物または薬剤とを、混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、ＦｅＣｌ2を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、テキサスレッドで標識したＰＧＥ2およびＰＧＥ2を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、５８０±２０ｎｍの波長の平面偏光で照射し、ついで工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含み、
ここで、工程（ｃ）の混合物の蛍光偏光測定の値が、対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きいという知見が、該化合物または薬剤がｍＰＧＥＳ活性を低下させていることを示す、
上記方法。
【請求項２８】
配列番号４のアミノ酸配列を含むヒト造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）がその基質であるプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）と反応しプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）を産生する活性を、化合物または薬剤が低下させるかどうかを測定するための方法であって、
（ａ）ｈＰＧＤＳと、ＰＧＨ2、グルタチオンおよび化合物または薬剤とを、混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、ＦｅＣｌ2を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、テキサスレッドで標識したＰＧＤ2およびＰＧＤ2を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、５８０±２０ｎｍの波長の平面偏光
で照射し、ついで工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含み、
ここで、工程（ｃ）の混合物の蛍光偏光測定の値が、対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きいという知見が、該化合物または薬剤がｈＰＧＤＳ活性を低下させていることを示す、
上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物または薬剤が、プロスタグランジン合成酵素の活性を低下させる能力をアッセイするための新規で有用な方法に関する。特に、本発明はミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）または造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）の活性を、化合物または薬剤が低下させる能力をアッセイするための方法に関している。
【背景技術】
【０００２】
プロスタグランジンは、痛み、発熱 および炎症において重要な役割を果たしているエイコサノイド（eicosanoids）の一つのクラスである。これらは、インビボでアラキドン酸から合成され、アラキドン酸の炭素鎖の一部分を形成している炭素原子５員環を保持している。プロスタグランジンはホルモンではなく、局所、すなわち、それらが合成された場所に近いところで作用を及ぼす。
【０００３】
２つのプロスタグランジン、ＰＧＥ2およびＰＧＤ2は、特に発熱、痛みおよび炎症において重要な役割を果たしている。特に、抗原のチャレンジにより、気道のアレルギー性障害の主要なメディエーターであるＰＧＤ2のマスト細胞からの産生が増加する。それは、特に、様々な症状の中で、気管支収縮、気管支過敏症、鼻詰まり、ならびに、好酸球およびＴＨ2細胞の浸潤を引き起こす。ＰＧＥ2は、痛みのメディエーターであり、痛覚過敏、発熱、血管拡張、および浮腫を誘発する役割を果たすことが示されてきた。
【０００４】
インビボでの合成において、ホスホリパーゼＡ２はリン脂質をアラキドン酸（インビボではエステルの形態で見出される）に変換する。続いて、プロスタグランジン・エンドペルオキシド合成酵素はアラキドン酸をプロスタグランジンＧ2（ＰＧＧ2）に変換する。プロスタグランジン・エンドペルオキシド合成酵素はまたＰＧＧ2のペルオキシド基の還元を触媒してプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）を産生し、これがＰＧＥ2およびＰＧＤ2の前駆体である。ＰＧＥ2の産生の場合、コファクターのグルタチオン（ＧＳＨ）の存在下でプロスタグランジンＥ合成酵素（ＰＧＥＳ）がＰＧＨ2をＰＧＥ2に変換する。細胞質ＰＧＥＳ（ｃＰＧＥＳ）およびミクロソームＰＧＥＳ（ｍＰＧＥＳ）という、少なくとも２個のＰＧＥ2合成酵素が存在する。両方のＰＧＥＳとも多くの組織で広く重複して発現している。ｍＰＧＥＳは、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αのような炎症性刺激によって誘導することができ、他方、ｃＰＧＥＳは構成的に発現している。さらに、ｍＰＧＥＳはＣＯＸ−２活性と共役していることが示されている（Murakami等、 J. Biol. Chem. 275巻：32783頁（2000年））。
【０００５】
ＰＧＤ2は、プロスタグランジンＤ合成酵素（ＰＧＤＳ）がＰＧＨ2をＰＧＤ2へ変換する結果として産生される。２つのタイプのＰＧＤ2合成酵素が知られている。一つは主として中枢神経系でみられるリポカリン型ＰＧＤＳ（Ｌ−ＰＧＤＳ）であり、もう一つはもともと末梢組織でみられる造血系ＰＧＤＳ（ｈＰＧＤＳ）である。Ｌ−ＰＧＤＳはグルタチオン（ＧＳＨ）非依存性であり、他方、ｈＰＧＤＳはＧＳＴ活性を伴うＧＳＨ依存性である。さらに、Ｌ−ＰＧＤＳとｈＰＧＤＳとの間には構造上の類似性はほとんどない。
【０００６】
ＰＧＤ2およびＰＧＥ2は発熱、痛みおよび炎症において非常に重要な役割を果たすために、それらの産生を低下させるまたは阻害もできるような化合物のアッセイ方法を創出するために努力が続けられてきた。プロスタグランジン合成酵素活性を低下させまたは阻害
する化合物または薬剤の能力を測定することを目的として、特に、ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのような技術が、ＰＧＤ2およびＰＧＥ2の産生を定量化するために用いられてきた。しかしながら、そうした技術は固有の限界を有している。例えば、そうした方法は種々の洗浄工程、精製工程および／または放射性物質の使用を必要としている。また、そうした方法は多くの時間を必要とし、そして、一日当り数十（ＨＰＬＣ）から数百（ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ）個のデータポイントという処理能力（throughput）を有するだけである。したがって、そうした方法はハイスループットスクリーニングには適していない。
【０００７】
蛍光偏光（fluorescence polarization）は、分子間の相互作用を研究するために用いられる技術である。この技術の背景にある原理は、評価される分子の大きさに依存している。特に、蛍光分子が平面偏光（plane polarized light）により照射された場合は、分子中で基底状態にある電子が励起状態まで励起される。約４〜５ナノ秒後、これらの励起電子は基底状態まで減衰する。この減衰の間に分子は蛍光シグナルを放射する。蛍光偏光において、この蛍光放射は、分子が励起状態の間をとおして静止状態にあった場合のみ、同じ平面上で検出できる。もし、分子が励起状態の間、動いたり回転していたりすれば、その蛍光放射は、蛍光面の電子を励起させる偏光の蛍光放射とは異なった光平面にあることになる。その結果、蛍光放射は検出できない。分子が小さければそれだけその運動性および回転が大きくなることは、良く知られている。それゆえ、励起状態の間相対的に静止状態にある大きな分子より、小さな分子は実質的により小さなシグナルを発生するだろう。これが、蛍光偏光の基になっている分子の性質である。特に、リガンドの蛍光偏光アッセイにおいては、該リガンド、蛍光標識されたリガンドであるトレーサー、および、リガンドが結合する受容体が、溶液中に加えられる。このリガンドおよびトレーサーは受容体へ結合において互いに競合する。この溶液は次に平面偏光で照射され、次に、シグナルが検出される。もし溶液中にリガンドがそれほど多く存在しなければ、存在している受容体の大部分はトレーサーと結合するだろう。受容体は大きな分子（リガンドと比較すれば）なので、高度の蛍光偏光が得られる標識の蛍光から、シグナルが得られるだろう。対照的に、もし大量のリガンドが存在すれば、大部分の受容体はリガンドと結合するであろう。その結果、もし多少なりでも産生されれば、トレーサーのみから得られた蛍光偏光シグナルは、先に受容体に結合しているトレーサーによって得られたシグナルより、実質的に小さくなるであろう。それらのシグナルの間の差異から、当業者は、リガンドの存在の有無、およびその濃度を測定することができる。蛍光偏光はミリ偏光単位、すなわちｍＰ、で測定される。
【０００８】
それゆえに、蛍光偏光は、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣおよびＲＩＡのようなアッセイ方法より、ずっと簡単に効率的に実施することができる。さらに、それは、非常に短時間での大量の化合物または薬剤のハイスループットスクリーニングに、容易に適合させることができる。
【０００９】
したがって、必要なことは、プロスタグランジン合成酵素活性を低下させまたは阻害もする、化合物または薬剤の能力を評価する蛍光偏光法であり、とりわけ、薬剤または化合物が、ｍＰＧＥＳによるＰＧＥ2産生活性を低下させまたは阻害するかどうかを評価するため、および、薬剤または化合物が、ｈＰＧＤＳのＰＧＤ2産生活性を低下または阻害するかどうかを評価するための方法である。
【００１０】
さらに必要なことは、プロスタグランジン合成酵素、特にｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳの活性を低下させまたは阻害する、化合物または薬剤の能力を評価するハイスループットシステムである。造血系プロスタグランジンＤ2合成酵素（ｈＰＧＤＳ）または誘導性ミクロソームプロスタグランジンＥ2合成酵素（ｍＰＧＥＳ）の活性を低下またはさらに阻害する化合物は、例えば少し例を挙げれば、関節炎、喘息および鼻炎のような炎症およびアレルギー症状の治療に適用できるであろう。さらに、痛みおよび／または発熱もまたそうした化合物または薬剤で治療できるだろう。
【００１１】
ここでのいかなる参考文献の引用も、そうした参考文献が本願の「公知技術」として利用できると認めたものと解釈されるべきではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明により、ｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳがそれぞれのプロスタグランジン生成物を産生する活性を低下させるかさらには阻害する、化合物または薬剤の能力を評価するために、放射性同位元素を使用せず、多くの洗浄工程を必要とせず、さらに、インビトロで、エクスビボ(ex vivo)で、細胞をベースにしたやり方で、または単離された方法で実施できる、新規で有用な方法に関する。さらに、本発明の方法は容易に高い処理能力のやり方で実施することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、広義には化合物または薬剤が、プロスタグランジン合成酵素がその基質と反応してプロスタグランジン生成物を産生する活性を低下させるかどうか測定する方法に係り、該プロスタグランジン合成酵素はミクロソームプロスタグランジンＥ2合成酵素（ｍＰＧＥＳ）および造血系プロスタグランジンＤ2合成酵素（ｈＰＧＤＳ）からなる群から選ばれる。本発明の方法は、酵素反応を起こすために、プロスタグランジン合成酵素とその基質、コファクターおよび化合物または薬剤を混合する工程を含んでいる。この混合物は、次に、未反応の基質からプロスタグランジン生成物への自然変換を阻害する薬剤を含有する停止溶液と、インキュベートする。この混合物を、次に、蛍光標識したプロスタグランジン生成物（すなわち、トレーサー）および該プロスタグランジン生成物を免疫原とした抗体を含有する検出試薬と、インキュベートする。続いて、該混合物と、化合物または薬剤は含有しないということ以外は全く同一に処理された対照用混合物とを、蛍光標識が蛍光を発する波長を有する平面偏光で照射する。該混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し、次に比較する。対照用混合物の偏光測定値より大きな偏光測定値を有する混合物は、該化合物または薬剤がプロスタグランジン合成酵素活性を低下させたことを示している。その結果、そうした化合物または薬剤は、いくつかの例をあげれば、炎症、アレルギー、痛みおよび発熱、またはそれらの複合症に罹っている患者を治療するために、容易に適用できる。
【００１４】
さらに、本発明は、上記の方法を、プロスタグランジン合成酵素が誘導性のミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）、基質がプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）、コファクターがグルタチオン（ＧＳＨ）およびプロスタグランジン生成物がプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）である方法に係る。本発明の方法で用いるｍＰＧＥＳは、ウシ、ヒツジ、ネズミ類、ウマ、イヌ、ヒト、ネコ等のものでありうる。特定の実施態様では、ｍＰＧＥＳはヒトのものであり、図９Ｂおよび配列番号２のアミノ酸配列を有している。さらに、本発明の方法で用いられているｍＰＧＥＳは精製されたものである必要はない。
【００１５】
本発明は、さらに、化合物または薬剤により、プロスタグランジン合成酵素がその基質と反応しここで記載されたプロスタグランジン生成物を産生する活性を低下させるかどうかを測定する方法において、プロスタグランジン合成酵素が造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）であり、基質がプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）、コファクターがＧＳＨおよびプロスタグランジン生成物がプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）である方法にも係る。ｍＰＧＥＳと全く同様に、本発明の方法に適用できるｈＰＧＤＳは多くの材料から得ることができる。特定の実施態様では、ｈＰＧＤＳはヒトｈＰＧＤＳであり、図１０Ｂおよび配列番号４のアミノ酸配列を有している。さらに、本発明の方法で用いられているｈＰＧＥＳは精製されたものである必要はない。
【００１６】
上記で説明したように、本発明の方法において、停止溶液は、未反応基質からプロスタグランジン生成物への自然変換を抑制する薬剤を含有している。特に、上記の２つのプロスタグランジン合成酵素の基質、ＰＧＨ2、はペルオキシド基を含んでいる。それらの作用機構を説明することを義務づけられるものでなくまた、いかなる説明にも拘束されることを全く意図するものではないが、ｍＰＧＥＳおよびｈＰＧＤＳの両者は、ＰＧＨ2のペルオキシド基の酸素結合の開裂を触媒し、ＰＧＨ2をそれぞれＰＧＥ2およびＰＧＤ2へと変換すると信じられている。しかしながら、また、ＰＧＨ2はＰＧＥ2またはＰＧＤ2への自然変換をうける。この自然変換が、化合物または薬剤のｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳ活性を低下させる能力のアッセイに干渉し、結果を変えてしまう。そのために、本発明の方法では、混合物を、ＰＧＨ2をＰＧＥ2またはＰＧＤ2のいずれかへの自然変換を抑制する薬剤を含有する停止溶液と、インキュベートされる。特にそうした薬剤の例は約２０ｍＭ濃度のＦｅＣｌ2である。しかし、当業者は、この同時変換を抑制する他の薬剤を容易に理解できるだろうし、そしてそれらは本発明の方法に包含される。さらに、このインキュベーションの時間は変更できるが、それは全ての残存する未反応ＰＧＨ2のプロスタグランジン生成物への変換を抑制するために十分な長さの時間でなければならない。
【００１７】
さらに、本発明は、化合物または薬剤により、プロスタグランジン合成酵素、特にｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳがその基質と反応しプロスタグランジン生成物を産生する能力を低下させるかどうか測定する方法において、停止溶液とのインキュベーションの後、混合物が蛍光標識されたプロスタグランジン生成物および該プロスタグランジン生成物を免疫原に使用した抗体を含有する検出試薬とインキュベートする、方法にも関する。多くの当業者に周知の蛍光標識が本発明の方法に適用できる。そうした蛍光標識の例には、フルオレセイン、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離のランタニド系列塩、キレート化ランタニド系列塩、ＣｙＤｙｅ（Amersham Biochem）、ＢＯＤＩＰＹ（Molecular Probes）およびＡＬＥＸＡ（Molecular Probes）が、若干の例として挙げられる。特定の実施態様では、蛍光標識はテキサスレッドである。さらに、蛍光標識は直接プロスタグランジン生成物に結合させることができ、または別法としてリンカー分子に結合してその後プロスタグランジン生成物に結合させることができる。ここで適用できる特定のリンカー分子には、それらには決して限定されるものではないが、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノカプリル酸、Ｆｍｏｃ−アミノカプロン酸、１個またはそれ以上のアラニン、イソチオシアネート基、 スクシンイミジルエステル、スルホナルハライドまたはカルボジイミドが、若干の例として挙げられる。本発明の特定の具体例では、プロスタグランジン生成物はカルボジイミドリンカーに結合され、次いで、テキサスレッドのような蛍光標識に結合される。
【００１８】
さらに、本発明は、化合物または薬剤が、ミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）とそのプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）基質とがプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）を産生する反応を低下または阻害するかどうかを測定するために、以下の：
（ａ）ｍＰＧＥＳと、ＰＧＨ2、グルタチオン（ＧＳＨ）および化合物または薬剤とを、少なくとも３０秒間混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、ＦｅＣｌ2を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、テキサスレッドで標識したＰＧＥ2およびＰＧＥ2を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、５８０±２０ｎｍの波長の平面偏光で照射し、ついで工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含む方法に関する。
【００１９】
アッセイする化合物または薬剤を含有する混合物の蛍光偏光測定値が、対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きければ、それは該化合物または薬剤がｍＰＧＥＳ活性を抑制していることを示す。特定の実施態様では、該ｍＰＧＥＳは、図９Ｂおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトｍＰＧＥＳであり、カルボジイミドリンカーはＰＧＥ2とテキサスレッドに結合している。テキサスレッドが励起される波長は５８０ｎｍである。しかしこの波長は２０ｎｍから５８０ｎｍまで広げることができる。同様に、テキサスレッドの蛍光放射の波長は一般に６２０ｎｍであると信じられている。しかしこの波長は６２０ｎｍ±２０ｎｍの範囲まで変更可能である。そうした励起波長および放射波長の変更範囲は本発明に包含される。さらに、先に説明したように、該ｍＰＧＥＳは精製されたものである必要はない。
【００２０】
さらに、本発明は、化合物または薬剤が、造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）とそのプロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）基質がプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）を産生する反応を低下または阻害するかどうかを測定するために、
（ａ）ｈＰＧＤＳと、ＰＧＨ2、ＧＳＨおよび化合物または薬剤とを、少なくとも３０秒間混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、ＦｅＣｌ2を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、テキサスレッドで標識したＰＧＤ2およびＰＧＤ2を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、５８０±２０ｎｍの波長の平面偏光により照射し、そして工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含む方法に関する。
【００２１】
アッセイする化合物または薬剤を含有する混合物の蛍光偏光測定値が、対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きければ、それは該化合物または薬剤がｈＰＧＤＳ活性を抑制していることを示す。特定の実施態様では、該ｈＰＧＤＳは、図１０Ｂおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するヒトｍＰＧＥＳであり、テキサスレッドとＰＧＤ2はカルボジイミドリンカーを介して化学的に結合している。
【００２２】
さらに、本発明は、化合物または薬剤が、プロスタグランジン合成酵素、特にｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳがその基質と反応しプロスタグランジン生成物を産生する能力を低下させるかどうかを、ハイスループット方法で実施する方法に関する。
【００２３】
したがって、化合物または薬剤が、プロスタグランジン合成酵素、例えばｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳの活性を低下またはさらに阻害する能力を評価する方法を提供することが一つの局面である。その結果、本発明の方法により、当業者が、患者の痛み、炎症、発熱またはそれらの併合した症状を治療するために適用できる化合物または薬剤を同定することを可能にする。
【００２４】
本発明の他の局面は、化合物または薬剤がｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳの活性を低下させるかまたは阻害する能力を評価するための方法を提供することであり、そのような方法は洗浄工程も放射性同位元素の使用も必要としない。
【００２５】
本発明のさらに他の局面は、化合物または薬剤がｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳのような
プロスタグランジン合成酵素の活性を低下させるかまたは阻害する能力を評価するための方法を提供することであり、そのような方法はエクスビボ、インビトロ、細胞ベースまたは単離された方法で実施することができる。
【００２６】
本発明のさらに他の局面は、化合物または薬剤がプロスタグランジン合成酵素の活性を低下させるかまたは阻害する能力を評価するための、ハイスループット方式で実施できる方法を提供することである。
【００２７】
これらの、およびその他の、本発明の局面は、下記する図面および詳細な説明を参照してより良く理解できるだろう。
【００２８】
図１は、基質ＰＧＨ2からＰＧＥ2への酵素変換およびＰＧＨ2からＰＧＤ2またはＰＧＥ2いずれかのプロスタグランジン生成物への自然変換との間の競合を示す模式的図面であり、用いる酵素はｍＰＧＥＳであり、自然変換の阻害はＦｅＣｌ2によるものである。
【００２９】
図２は、プロスタグランジン合成酵素がｍＰＧＥＳであり、プロスタグランジン生成物がＰＧＥ2である、本発明の方法の模式的図面である。
【００３０】
図３は、基質ＰＧＨ2からＰＧＤ2への酵素変換およびＰＧＨ2からＰＧＤ2またはＰＧＥ2いずれかのプロスタグランジン生成物への自然変換との間の競合を示す模式的図面であり、用いる酵素はｈＰＧＤＳであり、自然変換の阻害はＦｅＣｌ2によるものである。
【００３１】
図４は、プロスタグランジン合成酵素がｈＰＧＤＳであり、プロスタグランジン生成物がＰＧＤ2である、本発明の方法の模式的図面である。
【００３２】
図５は、化合物または薬剤がプロスタグランジン合成酵素活性を抑制または阻害するかどうかを測定するために、本発明の方法が使用できることを証明するために用いられる公知のｍＰＧＥＳ阻害剤である、ＭＫ−８８６の化学構造を示す。
【００３３】
図６は、プロスタグランジン合成酵素ｍＰＧＥＳおよび公知の阻害剤ＭＫ−８８６を用いた、本発明の方法の濃度反応曲線のグラフ図面である。ＩＣ５０＝２７．５μＭ。これらの結果は、当業者が、本発明の方法により化合物または薬剤がプロスタグランジン合成酵素、この場合はｍＰＧＥＳ活性を、低下できるかどうか測定できることを示している。
【００３４】
図７は、ＨＱＬ７９の化学構造を示す。
【００３５】
図８は、ＨＱＬ７９によるｈＰＧＤＳ活性の低下が本発明の方法により検出できることを表す棒グラフを示す。
【００３６】
図９Ａおよび９Ｂは、下記の実施例１で用いられるヒトｍＰＧＥＳの塩基配列およびアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号１および２）。
【００３７】
図１０Ａおよび１０Ｂは、ヒトＨ−ＰＧＤＳの塩基配列およびアミノ酸配列を示す（それぞれ配列番号３および４）。
【００３８】
本発明は、蛍光偏光が、プロスタグランジン合成酵素、例えば、ｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳが、プロスタグランジン、例えば、ＰＧＤ2またはＰＧＥ2を産生する活性を低下させる化合物または薬剤の同定に用いることができるという、驚くべきまた予想もしていなかった発見を基にしている。そのためより広義では、本発明は、化合物または薬剤が、ｍＰＧＥＳおよびｈＰＧＤＳからなる群から選ばれるプロスタグランジン合成酵素とその基
質とが反応してプロスタグランジン生成物を産生する活性を低下させるかどうかを測定するために、以下の：
（ａ）該プロスタグランジン合成酵素と、その基質、コファクターおよび化合物または薬剤とを、混合し；
（ｂ）工程（ａ）の混合物と、基質からプロスタグランジン生成物への自然変換を抑制する薬剤を含有する停止溶液とを、インキュベートし；
（ｃ）工程（ｂ）の混合物と、蛍光標識したプロスタグランジン生成物および該プロスタグランジン生成物を免疫原とした抗体を含有する検出試薬とを、インキュベートし；
（ｄ）工程（ｃ）の混合物および対照用混合物を、該蛍光標識が発光する波長の直線偏光で照射し、ついで工程（ｃ）の混合物および対照用混合物の蛍光偏光を測定し；そして
（ｅ）工程（ｄ）の測定値を比較する、
工程を含む方法に関する。
【００３９】
ここで、工程（ｄ）の混合物の蛍光偏光測定値が対照用混合物の蛍光偏光測定値より大きければ、それは該化合物または薬剤が該プロスタグランジン合成酵素活性を低下させていることを示す。
【００４０】
本明細書および付属する請求項を通して用いられている多くの用語または成句は以下に定義される。すなわち：
ここで用いられている「化合物」または「薬剤」という用語は、現在知られているまたは今後発見される全ての組成物を意味する。ここで適用している化合物または薬剤の例には、有機化合物（例えば、人工のまたは天然由来の）、ペプチド（人工のまたは天然由来の）、炭水化物、核酸分子等を含む。
【００４１】
ここで用いられている「酵素」という用語は、特異的な化学反応を触媒するタンパク質またはＲＮＡのような生体分子を意味する。これは触媒された反応の平衡には影響しない。むしろ、酵素は活性エネルギーを減少させて反応速度を促進する。
【００４２】
ここで用いられている「プロスタグランジン合成酵素」という用語は、プロスタグランジンＨ2（ＰＧＨ2）からプロスタグランジン生成物への変換を触媒する酵素を意味する。特に本発明での適用を有するプロスタグランジン合成酵素の例には、コファクターのグルタチオン（ＧＳＨ）存在下でプロスタグランジンＨ2をプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）へ変換する誘導性のミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）が含まれる。他の例は、コファクターのＧＳＨ存在下でプロスタグランジンＨ2をプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）へ変換する造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）である。
【００４３】
ここで用いられている「基質」という用語は、酵素が生成物を産生するために作用する化合物を意味する。ここで適用される基質の例はＰＧＨ2である。
【００４４】
ここで用いられている「コファクター」という用語は、酵素活性に必要な有機分子、無機分子、ペプチド、またはタンパク質を意味する。特に本発明の実施態様では、プロスタグランジン合成酵素はｍＰＧＥＳまたはｈＰＧＤＳであり、コファクターはグルタチオン（ＧＳＨ）である。
【００４５】
ここで用いられている「プロスタグランジン生成物」という用語は、プロスタグランジン合成酵素が該プロスタグランジン合成酵素の基質に作用する結果産生する生成物を意味する。すなわち、ｍＰＧＥＳでは該プロスタグランジン生成物はＰＧＥ2であり、ｈＰＧＤＳでは該プロスタグランジン生成物はＰＧＤ2である。
【００４６】
ここで用いられている「蛍光標識」という用語は、特定の波長の光を照射されたとき蛍光を発し、問題とする化合物に直接結合するか、または代わりに、問題とする化合物に結合するリンカーに結合する物質を意味する。本発明で適用される蛍光標識の例は、それには限定されないが、フルオレセイン、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、遊離のランタニド系列塩、キレート化ランタニド系列塩、ＢＯＤＩＰＹ、ＡＬＥＸＡ、ＣｙＤｙｅ等が含まれる。特に本発明で適用される蛍光標識は、テキサスレッドである。
【００４７】
ここで用いられている「リンカー」および「リンカー分子」という用語は、交換可能で用いられ、蛍光標識およびプロスタグランジン生成物が結合している化学成分を意味する。本発明で適用されるリンカー分子の特定の例には、アミノ酪酸、アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノカプリル酸、Ｆｍｏｃ−アミノカプロン酸、１個またはそれ以上のβ−アラニン、イソチオシアネート基、 スクシンイミジルエステル、スルホナルハライドまたはカルボジイミドが、若干の例として挙げられる。本発明で適用される特定の例では、リンカーはカルボジイミド基である。
【００４８】
ここで用いられている「対照用混合物」という用語は、アッセイする化合物または薬剤を含有している混合物と、同一の試薬、化合物、細胞等を等量含有しており、そしてアッセイすべき化合物または薬剤を含有していない他は、アッセイする化合物または薬剤を含有している混合物と同様の方法で処理された混合物を意味する。
【００４９】
抗体
上記で説明したように、本発明の方法は、免疫原としてＰＧＤ2またはＰＧＥ2のようなプロスタグランジン生成物を有する、抗体を利用する。そうした抗体は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、またはキメラ抗体であってもいい。当該分野で公知の種々の方法を、ＰＧＥ2またはＰＧＤ2に対するポリクロナール抗体の製造のために用いることができる。抗体の製造のために、種々の動物をプロスタグランジン生成物の注射で免疫感作することができ、それには限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が用いられる。特定の実施態様では、ＰＧＥ2またはＰＧＤ2は免疫原性担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキイホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役させることもできる。宿主になる動物種によって、種々のアジュバントを、免疫反応を増強するために用いることができ、その例には、フロインドのアジュバント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのような鉱質ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キイホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ＢＣＧ（カルメット−ゲランバシラス菌、bacille Calmette-Guerin）またはコリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）が挙げられる。
【００５０】
プロスタグランジン生成物に対するモノクロナール抗体を製造するためには、連続的な細胞株培養により抗体分子の製造を提供するどのような技術でも使用できる。そうした技術には、それに限定されないが、ケーラー＆ミルシュタインが最初に開発したハイブリドーマ技術（Nature 256巻：495-497頁(1975年)）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor等、Immunology Today 4巻：72頁(1983年)； Cote等、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80巻：2026-2030頁(1983年)）、および、ヒト型モノクロナール抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、77-96頁(1985年)）が含まれている。さらに、モノクロナール抗体は、PCT/US90/02545に記載された無菌動物利用技術で製造することもできる。プロスタグランジン生成物に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のあるヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に切り出してきて、「キメラ抗体」を製造するために開発された技術（Morrison等、J. Bacterial 159巻：870頁(1984年)； Neuberger等、Nature 312巻：604-608頁(1984年)； Takeda等、Nature 314巻：452- 454頁(1985年)）も用いることができる。
【００５１】
条件
上記で説明したように、本発明の方法は、エクスビボ、インビボ、または、全ての試薬、酵素、基質等があらかじめ分離され、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳもしくはリン酸緩衝液のような緩衝溶液中に保持されているような、単離された形態で、または、細胞をベースとした方法で実施することができる。さらに、本発明の方法では、プロスタグランジン合成酵素は精製されている必要がない。
細胞をベースとしたアッセイ方法では、本発明の方法は、アッセイされる化合物または薬剤が細胞からのプロスタグランジン生成物の分泌を阻害または抑制できるかどうか測定するために使用され、他方、インビトロの方法では、化合物または薬剤を細胞内媒質中で評価できるように本発明の方法の実施の前に、細胞を溶解させることもできる。
【００５２】
プロスタグランジン合成酵素活性を低下または阻害する化合物または薬剤の候補物質のためのライブラリーの探索
従来、有用な性質を有する新規な化学物質は、ある望ましい性質または活性を有する化合物（「リード化合物」とよばれる）を同定し、該リード化合物の誘導体を創製し、ついでそれらの誘導体化合物の性質および活性を評価することによって作成されてきた。しかし、最近の傾向は創薬の全ての局面で時間スケールを短縮することである。大きな数を迅速にかつ効率的に試験できる能力のために、従来のリード化合物同定方法がハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法へと置き換えられている。
【００５３】
特定の実施態様では、ハイスループットスクリーニング法は、多数の可能性のある治療用化合物（候補化合物）を含有するコレクションを提供することを含んでいる。次に、そうした「歴史的に蓄積された化学物質のコレクション（historic chemical collections）」を本発明の方法でスクリーニングし、望ましい特徴のある活性を示すそうしたコレクション（特定の化学種またはサブクラス）のメンバーを同定する。こうして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として用いることができ、またはそれ自体を可能性のあるもしくは実際の治療剤として用いることができる。
【００５４】
コンビナトリアルケミカルライブラリー
コンビナトリアルケミカルライブラリー（combinatorial chemical libraries）は、新規なリード化合物の創製を助けるための好ましい手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物的合成のいずれかにより、試薬類のような多数の化学「構築用ブロック（building blocks）」を結合させて作成された、多種多様な化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリーのような線形のコンビナトリアルケミカルライブラリーは、所与の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）の範囲内で、あらゆる可能なやり方で、アミノ酸とよばれる一組の化学構築用ブロックを結合させることで、作成される。化学構築用ブロックをそうしたコンビナトリアルな方法で組み合わせることによって、数百万の化合物を合成することができる。例えば、一人のコメンテーターは、１００個の交換可能な化学構築用ブロックを系統的にコンビナトリアル的に混合することによって、理論的には１億個の４量体化合物から１００億個の５量体化合物が得られるという意見を述べている（Gallop等、Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery 2. Combinatorial Organic Synthesis, Library Screening Strategies and Future Directions, J. Med. Chem. (1994年) 37巻 (9号): 1233-1251頁）。
【００５５】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの作成は、当該分野の当業者には周知である。そうしたコンビナトリアルケミカルライブラリーは、それに限定されないが、ペプチドラ
イブラリー（例えば、ＵＳ特許5,010,175； Furka (1991年) Int. J. Pept. Prot.Res., 37巻：487-493頁； Houghton等、(1991年) Nature, 354巻: 84-88頁）を含んでいる。ペプチド合成が、本発明の使用のための、想定され意図される唯一のアプローチではない。他の、化学的に多様なライブラリーを創製するための化学方法もまた使用できる。そうした化学方法には、それに限定されないが、ペプトイド（peptoids）（PCT公開WO 91/19735、1991年12月26日）、コード化されたペプチド（PCT 公開WO 93/20242、1993年10月14日）、ランダムバイオオリゴマー（PCT公開WO 92/00091、1992年1月9日）、ベンゾジアゼピン（米国特許5,288,514）、ヒダントインのようなディバーソマー（diversomer）、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Hobbs等、(1993年) Proc.Nat. Acad. Sci. USA 90巻：6909-6913頁）、ビニロガスポリペプチド（vinylogous polypeptides）（Hagihara 等、(1992年) J. Amer. Chem. Soc. 114巻：6568頁）、ベータＤグルコースの足場（scaffolding）を伴った非ペプチド性ペプチドミメティクス（nonpeptidal peptidomimetics）（Hirschmann等、(1992年) J. Amer. Chem. Soc. 114巻：9217-9218頁）、小化合物ライブラリーの類似有機合成（analogous organic syntheses）（Chen等、(1994年) J. Amer. Chem. Soc. 116巻：2661頁）、オリゴカルバメート（Cho等、(1993年) Science 261巻：1303頁）、および／または、ペプチド性ホスホネート（Campbell等、(1994年) J. Org Chem. 59巻：658頁が挙げられる。一般にはGordon等、(1994年) J. Med. Chem. 37巻：1385頁、核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、ＵＳ特許5,539,083参照）、抗体ライブラリー（例えば、Vaughn等、(1996年) Nature Biotechnology、14巻(3号)：309-314頁）、およびPCT/US96/10287）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liang等、(1996年) Science, 274巻：1520-1522頁、および,ＵＳ特許5,593,853参照）、および小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum (1993年) C & EN, 1月18日、33頁；  イソプレノイド、ＵＳ特許5,569,588； チアゾリジノンおよびメタチアザノン、ＵＳ特許5,549,974；ピロリジン、ＵＳ特許5,525,735および5,519,134；モルホリノ化合物、ＵＳ特許5,506,337； ベンゾジアゼピン、ＵＳ特許5,288,514、等）がある。
【００５６】
コンビナトリアルライブラリーの作成のための器具は市販のものを利用できる（例えば、357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin,  Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA参照）。
【００５７】
溶液位相化学（solution phase chemistries）のために、多くの周知のロボットシステムもまた開発されてきた。これらのシステムは、武田薬品工業（大阪、日本）が開発した自動合成機器、および、化学者の行うマニュアルの合成手法を模倣したロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.；Orca, HewlettPackard, Palo Alto,Calif.）のような自動化されたワークステーションを含んでいる。上記の機器のいずれもが本発明の使用に適している。これらの機器をここで論じたように操作するために、改良の特性およびその実施法は（あるとして）、当該分野の当業者には明らかである。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリーは、それ自体、購入して利用できる（例えば、ComGenex, Princeton, N. J.；Asinex, Moscow, Ru；Tripos, Inc., St. Louis, MO；Chem Star, Ltd, Moscow, RU；3D Pharmaceuticals, Exton, PA； Martek Biosciences, Columbia, MD等を参照のこと）。
【００５８】
ケミカルライブラリーのハイスループットアッセイ法
蛍光偏光を用いる本発明の方法は、そのままで、容易にハイスループットスクリーニングに適用可能である。ハイスループットスクリーニングシステムは購入して利用することが可能である（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industriees, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA等を参照）。これらのシステムは、典型的には、全てのサンプルおよび試薬のピペット操作、液体の分配、時間の設定されたインキュベーション、およびアッセイに適合した測定機の上のマイクロプレートでの最後の読み取りまでの操作全体が自動化されている。これらの構成可能なシステムは、ハイスループットおよび迅速な立ち上がりならびに高度の柔軟性およびカスタム化を提供する。そうしたシステムの製造者は、種々のハイスループットのための詳細なプロトコールを提供する。例えば、Zymark Corp.は、遺伝子転写の変調、リガンドの結合およびそれに類したものを検出するたのスクリーニングシステムを記載した技術紀要を提供している。
【００５９】
本発明の例示のために提供される以下の非限定的な実施例を参照することによって、本発明はより良く理解できる。以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより詳細に説明するために提供される。しかしながら、これらは決して本発明の広い範囲を制限するものと解釈するべきではない。
【００６０】
実施例１
誘導性ミクロソームプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）の蛍光偏光アッセイ
プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）は、炎症および痛みに関連する主要なメディエーターである。ミクロソームのプロスタグランジンＥ合成酵素（ｍＰＧＥＳ）は、グルタチオンの存在下で、ＰＧＨ2からＰＧＥ2への変換を触媒する。したがって、ｍＰＧＥＳ活性を低下または阻害する化合物は、若干の疾患または障害を挙げるとすると、炎症、痛み、発熱またはそれらの併合症、に関する有効な治療剤になる可能性がある。
【００６１】
アッセイ方法が、誘導性ミクロソームＰＧＥ2合成酵素によるＰＧＨ2からＰＧＥ2への変換を測定するために開発された。このアッセイ方法は蛍光偏光原理を基にして構成される。該酵素と、ＰＧＨ2、グルタチオン、および評価される化合物または薬剤とを、インキュベートする。短時間（少なくとも３０秒）のインキュベーションの後、それがあった場合はＰＧＤ2またはＰＧＥ2への自然変換が起こり、ＰＧＤ2またはＰＧＥ2への酵素変換の定量化を妨害する全ての残余のＰＧＨ2をクエンチするために、ＦｅＣｌ2およびクエン酸を含有する停止溶液を加える（図１）。次に、ＰＧＥ2の産生に逆比例する特異的なシグナルを生成するために、蛍光標識（テキサスレッド）トレーサー（ＰＧＥ2）および抗ＰＧＥ2抗体を含有する検出溶液を加える（図２）。該酵素反応から産生されたＰＧＥ2は、該抗体に対して特異的に競合し、蛍光標識したトレーサーを放出する。ＰＧＥ2合成酵素活性の阻害は、ＦＰ値の増加をもたらすだろう。
【００６２】
材料
グルタチオン（ＧＳＨ）：
Sigmaから入手できる（カタログ番号G-6529）
ＰＧＨ2：
Cayman Chemicals, Inc.から入手できる（カタログ番号17020）
ＰＧＥ2モノクローナル抗体：
Assay Designs, Inc.から入手できる（カタログ番号915-057）
ＰＧＥ2：
Cayman Chemicals, Inc.から入手できる（カタログ番号14010）
【００６３】
ヒトｍＰＧＥＳ酵素の発現
ヒトｍＰＧＥＳ酵素は、Jakobsson, P.等“Identification of human prostaglandin E
synthase: a microsomal glutathione-dependent, inducible Enzyme, Constituting a Potential Novel Drug Target.”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96巻: 7220-7225頁（1999年6月）に記載された細菌の発現系および方法を用いて発現した。本実施例で使用したｍＰＧＥＳは、精製されたものではなく、むしろ該ｍＰＧＥＳを発現するために用いた細菌から得られた膜画分に含有されていた。本実施例で使用されているヒトｍＰＧＥＳをコードするＤＮＡ配列は、図９Ａおよび配列番号１に記載されている。本実施例で使用されて
いるヒトｍＰＧＥＳのアミノ酸配列は、図９Ｂおよび配列番号２に記載されている。
【００６４】
蛍光標識したプロスタグランジン生成物ＰＧＥ2
上記で説明したように、多くの蛍光標識が本発明の方法で適用できる。特定の実施態様では、蛍光標識テキサスレッドはリンカーを介してプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）に結合している。この実施態様において、テキサスレッドで標識されたＰＧＥ2はコンビニックス（Combinix）（San Mateo, CA）を用いて合成した。そうした成分（moiety）の作成のための手順を以下に記載する：
【化１】
2006511789.tif 000002
【００６５】
この合成において、テキサスレッド カダバリン（Cadavarine）（Molecular Probes）を、プロスタグランジンＥ2（Cayman Chemicals）の乾燥塩化メチレン溶液に加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（Sigma- Aldrich）を加え、窒素下、暗所で、２４時間、攪拌しながら反応させた。逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによる精製を、０．０５％ＴＦＡをモディファイアーとして含んでいる水／アセトニトリル勾配を用いて行った。この合成で用いたリンカーは変更することができる。
【００６６】
方法
最初に、酵素を含有する膜画分を、Ｋ2ＨＰＯ4およびＫＨ2ＰＯ4を含有する反応緩衝液で希釈し、リン酸緩衝化酵素溶液を作成した。アッセイすべき化合物または薬剤を次に酵素溶液に加えた。場合によっては、この溶液は次にインキュベートできる。この特定の実
施例では、該溶液を約３０分間インキュベートした。基質ＰＧＨ2のアセトン溶液およびコファクターＧＳＨを次に４℃で別々の容器に入れた。次に反応を開始させるために、該酵素溶液をＰＧＨ2を含む容器に入れた。この混合液を、約３０秒間インキュベートした。次に、全ての残余のＰＧＨ2からＰＧＥ2への自然変換を阻止するために、２０ｍＭのＦｅＣｌ2を含有する停止溶液を混合液の中に混ぜた。次に、抗−ＰＧＥ2抗体およびＰＧＥ2−テキサスレッドトレーサーを含有する検出溶液を該混合液に加え、混合液全体をインキュベートした。この特定の実施例では、インキュベーション時間は約１２０分だった。しかし、当業者は、この実施例に記載されたインキュベーション時間を如何ようにも変更して、なお有用な結果を得ることができる。化合物または薬剤を含まない他はこの混合液と同一の対照混合物を、同様に処理した；すなわち、同じ試薬、同じインキュベーション時間等で処理した。次に、該混合物全体および対照混合物を５８０ｎｍの波長の平面偏光で照射し、該混合物全体および対照混合物の蛍光偏光を、励起波長５８０ｎｍ、および放射波長６２０ｎｍにて、蛍光フィルターを用いて測定した。測定は、測定機器をＦＰモードにして行った。次に、これら２つの測定値を、化合物または薬剤を含有する混合液の蛍光偏光測定値が、対照混合液の蛍光測定値より大きいかどうか決定するために比較した。対照混合液の測定値より大きい混合液の測定値は、該化合物または薬剤がｍＰＧＥＳ活性を抑制していることを示している。
【００６７】
結果
上記のアッセイをｍＰＧＥＳの公知の阻害剤を用いて妥当性確認（validate）を行った。この阻害剤、ＭＫ−８８６は、Biomol Research Laboratories, Inc.（Plymouth Meeting, PA, カタログ番号ＥＩ−２６６）から購入可能であり、ＣＡＳ番号は１１８４１４−８２−7である。その構造式は図５に記載されている。この実験の結果は図６に記載されている。これらの結果は該ｍＰＧＥＳアッセイの濃度反応曲線で示され、明らかに本方法が、化合物または薬剤のｍＰＧＥＳ活性を抑制またはさらに阻害する能力をアッセイするために適用できることを示している。
【００６８】
実施例II
造血系プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）の蛍光偏光アッセイ
抗原のチャレンジは、気道のアレルギー性障害におけるＰＧＤ2の産生を増加させる。ＰＧＤ2は、プロスタグランジンＤ合成酵素（ｈＰＧＤＳ）による、ＰＧＨ2からＰＧＤ2への変換により産生され、Ｄ型プロスタグランジン受容体（ＤＰ）およびＴｈ２細胞のケモカイン受容体（ＣＲＴＨ２）の両方に結合し、気管支収縮、血管拡張、および鼻粘膜拡張を増加させる。結果として発症する気管支過敏症、鼻つまり、ならびに好酸球およびＴｈ２細胞の浸潤はアレルギー性反応をもたらす。その結果、ｈＰＧＤＳ活性を低下または阻害する化合物または薬剤は、容易に治療薬として適用できる。
【００６９】
ｈＰＧＤＳ活性を測定する蛍光偏光（ＦＰ）アッセイもまた開発されてきた（図３および４）。このアッセイは蛍光偏光の原理に基礎をおいて構成されている。ｈＰＧＤＳを、ＰＧＨ2、グルタチオン、および評価される化合物または薬剤と混合した。短時間（約３０秒）の後、ＦｅＣｌ2（２０ｍＭ）を含有する停止溶液を、ＰＧＨ2からＰＧＤ2への酵素変換の定量化を妨害するＰＧＤ2およびＰＧＥ2の混合物へと自然に変換する全ての残余のＰＧＨ2をクエンチするために加えた（図３）。次に、蛍光標識（テキサスレッド）トレーサー（ＰＧＤ2）および抗−ＰＧＤ2抗体を、ＰＧＤ2の生成に逆比例する特異的シグナルを産生させるために加えた（図４）。酵素反応により産生したＰＧＤ2は該抗体に対して特異的に競合し、蛍光標識トレーサーを遊離した。上記で論じた理由により、ＰＧＤ2合成酵素活性の低下または阻害は、蛍光偏光（ＦＰ）値の増加をもたらす。
【００７０】
材料
ｈＰＧＤＳの発現
ヒト造血系ＰＧＤ2合成酵素は、Kanaoka等（Structure and Chromosomal Localization
of Human and Mouse Genes for Hematopoietic Prostaglandin D Synthase. Eur. J. Biochem. 267巻: 3315-3322頁 (2000年)）に記載された方法に従って、細菌性発現系を用いて発現させた。該酵素をコードする塩基配列は、図１０Ａおよび配列番号３に記載されている。コードしている塩基配列を増幅し、次にｐＴ７−７に挿入し、それにより大腸菌ＦＬ２１（ＤＥ３）系の細胞を形質転換した。次に、形質転換細胞にヒトｈＰＧＤＳ酵素の産生させるために、最終濃度０．６ｍＭのチオ-β-Ｄ−ガラクトシダーゼを加えた。ヒトｈＰＧＤＳをＧＳＨ−セファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーで精製した。本実施例で使用したヒトｈＰＧＤＳのアミノ酸配列は、図１０Ｂおよび配列番号４に記載されている。
【００７１】
ＧＳＨ：
Sigmaから入手できる（カタログ番号G-6529）
ＰＧＨ2：
Cayman Chemicals, Inc.（Ann Arbor, Michigan）からカタログ番号17020として入手できる。
抗ＰＧＤ2抗体：
抗ＰＧＤ2モノクロナール抗体は、パスツール研究所からカタログ番号0465328として入手できる。
ＰＧＤ2：
Cayman Chemicals, Inc.（Ann Arbor, Michigan）から入手できた（カタログ番号12010）。
【００７２】
蛍光標識したプロスタグランジン生成物ＰＧＤ2：
上記の実施例１のとおり、テキサスレッドを蛍光標識で用いた。テキサスレッドで標識したプロスタグランジンＤ2（ＰＧＤ2）は、Combinix（San Mateo, CA）によっても製造されている。それらの成分を作成する手順を以下に記載する：
【化２】
2006511789.tif 000003
【００７３】
この合成において、テキサスレッド カダバリン（Molecular Probes）を、プロスタグランジンＤ2（Cayman Chemicals）の乾燥塩化メチレン溶液に加えた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（Sigma- Aldrich）を加え、窒素下、暗所で、２４時間、攪拌しながら反応させた。逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製を、０．０５％ＴＦＡをモディファイアーとして加えた水／アセトニトリル勾配を用いて行った。この合成で用いたリンカーは変更することができる。
【００７４】
方法
この方法は、使用した酵素がｈＰＧＤＳおよびプロスタグランジン生成物がＰＧＤ2である他は、実施例Ｉと同様に行った。上記で説明したように、最初に、酵素およびＧＳＨ、Ｋ2ＨＰＯ4およびＫＨ2ＰＯ4を含有する反応緩衝液で希釈し、酵素溶液を作成した。次に、アッセイする化合物または薬剤をこのリン酸緩衝化酵素溶液に加えた。場合によっては、この溶液は次にインキュベートできる。このインキュベーション時間は数分から1時間を超えるまで変更できる。この特定の実施例では、該酵素溶液は約３０分間インキュベートした。
【００７５】
基質ＰＧＨ2のアセトン溶液を４℃で別の容器に入れた。次に反応を開始させるために、該酵素溶液をＰＧＨ2を含む容器に加えた。この混合液を、約３０秒間インキュベートした。次に、２０ｍＭのＦｅＣｌ2およびクエン酸を含有する停止溶液を、全ての残余のＰＧＨ2からＰＧＤ2またはＰＧＥ2への自然変換を防止するために、混合液の中に混ぜた。次に、ＰＧＤ2を免疫原として有する抗体およびテキサスレッド標識ＰＧＤ2（トレーサー）を含有する検出溶液を、該混合液に加え、混合液全体をインキュベートした。この特定の実施例では、インキュベーション時間は約１２０分だった。しかし、この実施例に記載されたインキュベーション時間および他のインキュベーション時間は、試薬の濃度に応じて変更できる。
【００７６】
対照混合物は、酵素を含有している混合物と同じように調製され、該対照混合物は酵素を含有している混合物と同様の方法；すなわち、同じインキュベーション時間等で処理された。しかし、該対照混合物は、評価する化合物または薬剤は含まない。次に、該混合物全体および対照混合物を５８０ｎｍの波長（テキサスレッドが励起する波長）の平面偏光で照射し、該混合物および対照混合物の蛍光偏光を、励起波長５８０ｎｍおよび放射波長６２０ｎｍにて蛍光フィルターを用いて測定した。この蛍光偏光測定は、測定機器をＦＰモードにして行った。通常は、用いた波長は方法で用いた蛍光標識に依存するだろう。これら２つのＦＰ測定値を、次に、化合物または薬剤を含有する混合液の蛍光偏光測定値が、対照混合液の蛍光測定値より大きいかどうか決定するために比較した。対照混合液の測定値より大きい混合液の測定値は、該化合物または薬剤がｈＰＧＤＳ活性を低下させていることを示している。
【００７７】
結果
上記のアッセイをｈＰＧＤＳの公知の阻害剤であるＨＱＬ７９を用いて妥当性確認（validate）を行った。ＨＱＬ７９は、WO 95/01350に記載されている。ＨＱＬ７９の構造式は図７に記載されている。この実験の結果は図８に記載されている。これらの結果は、明らかに本発明の方法により、ＨＱＬ７９がｈＰＧＤＳ活性を低下させることが検出されたことを示している。
【００７８】
結論
実施例ＩおよびIIは、本発明の方法が簡便で、多数回の洗浄や放射性同位元素を必要とせず、化合物または薬剤が、プロスタグランジン合成酵素、特にｈＰＧＤＳまたはｍＰＧＥＳの活性を低下または阻害するかどうか測定するために、容易にハイスループット法に適用できることを、明白に証明している。
【００７９】
本発明は、ここに記載された特定の実施態様に限定されない。実際、ここで記載されたものに加えてさらに種々の本発明の修正が可能なことは、上記の記載および以下の図から、当業者には明らかである。そうした修正は、付随する特許請求項の範囲に含まれるであろう。
【００８０】
ここで引用された種々の文献の開示は、全体で、参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】基質ＰＧＨ2からＰＧＥ2への酵素変換およびＰＧＨ2からＰＧＤ2またはＰＧＥ2いずれかのプロスタグランジン生成物への自然変換との間の競合を示す模式的図面であり、用いる酵素はｍＰＧＥＳであり、自然変換の阻害はＦｅＣｌ2によるものである。
【図２】プロスタグランジン合成酵素がｍＰＧＥＳであり、プロスタグランジン生成物がＰＧＥ2である、本発明の方法の模式的図面である。
【図３】基質ＰＧＨ2からＰＧＤ2への酵素変換およびＰＧＨ2からＰＧＤ2またはＰＧＥ2いずれかのプロスタグランジン生成物への自然変換との間の競合を示す模式的図面であり、用いる酵素はｈＰＧＤＳであり、自然変換の阻害はＦｅＣｌ2によるものである。
【図４】プロスタグランジン合成酵素がｈＰＧＤＳであり、プロスタグランジン生成物がＰＧＤ2である、本発明の方法の模式的図面である。
【図５】化合物または薬剤がプロスタグランジン合成酵素活性を抑制または阻害するかどうかを測定するために、本発明の方法が使用できることを証明するために用いられる公知のｍＰＧＥＳ阻害剤である、ＭＫ−８８６の化学構造を示す。
【図６】プロスタグランジン合成酵素ｍＰＧＥＳおよび公知の阻害剤ＭＫ−８８６を用いた、本発明の方法の濃度反応曲線のグラフ図面である。ＩＣ５０＝２７．５μＭ。これらの結果は、当業者が、本発明の方法により化合物または薬剤がプロスタグランジン合成酵素、この場合はｍＰＧＥＳ活性を、低下できるかどうか測定できることを示している。
【図７】ＨＱＬ７９の化学構造を示す。
【図８】ＨＱＬ７９によるｈＰＧＤＳ活性の低下が本発明の方法により検出できることを表す棒グラフを示す。
【図９Ａ】実施例１で用いられるヒトｍＰＧＥＳの塩基配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図９Ｂ】実施例１で用いられるヒトｍＰＧＥＳの塩基配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【図１０Ａ】ヒトＨ−ＰＧＤＳの塩基配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号３）。
【図１０Ｂ】ヒトＨ−ＰＧＤＳの塩基配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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