(57)【要約】細菌ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）において、新規のチロシンアンモニアリアーゼ酵素が同定された。この酵素は、フェニルアラニンに対してよりもチロシンに対してより高い活性を有し、チロシンから直接パラ−ヒドロキシケイ皮酸を生成するために有用である。この酵素をコードする遺伝子が、ゲノムＤＮＡを用いる直接的増幅によってクローン化され、大腸菌中で発現された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
ｂ）以下のハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子：０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃、および２×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、それに続く０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄；あるいは
（ａ）または（ｂ）に相補的な単離された核酸分子、よりなる群から選択される、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号２に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合に、アラインメントのスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）法に基づいて同一性が少なくとも５６％であり、かつチロシンアンモニアリアーゼ活性を有する少なくとも５２６アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項７】
適切な制御配列に作動可能に連結された、請求項１または２に記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌、藻類、および緑色植物よりなる群から選択される、請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、およびアルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）よりなる群から選択される請求項９に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１１】
宿主細胞が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）よりなる群から選択される請求項８に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、コショウ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、イネ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科野菜（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｏｕｓ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ラッカセイ、ブドウ、グラスシード作物（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、および飼料牧草よりなる群から選択される、請求項８の形質転換宿主細胞。
【請求項１３】
ａ）請求項１または２のいずれか一項に記載の核酸分子を含むゲノムライブラリを探索し、
ｂ）請求項１または２のいずれか一項に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定することを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片がチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１４】
ａ）配列番号２に記載の配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、クローニングベクター内に存在するインサートを増幅することを含んでなり、
増幅されたインサートがチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法の生成物。
【請求項１６】
（ａ）適切な制御配列に作動可能に連結された請求項１または２に記載の単離された核酸分子を含んでなる組換え宿主細胞を、発酵性炭素基質と接触させ、
（ｂ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸を生じるのに十分な時間、前記組換え細胞を増殖させ、
（ｃ）前記パラ−ヒドロキシケイ皮酸を場合により回収することを含んでなる、パラ−ヒドロキシケイ皮酸生成のための方法。
【請求項１７】
前記発酵性炭素基質が、単糖、少糖、多糖、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート（ｆｏｒｍａｔｅ）、および炭素含有アミンよりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵性炭素基質がグルコースである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換え宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌、藻類、および植物細胞よりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記組換え宿主細胞が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換え宿主細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、モロコシ、イネ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ラッカセイ、ブドウ、グラスシード作物（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、および飼料牧草よりなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする前記遺伝子が、配列番号３に記載のペプチドをコードする請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子が、ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得られる請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）の生成のために使用される、細菌ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得られる新規のチロシンアンモニアリアーゼ酵素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関する。
【０００２】
本願は、２００２年７月２３日に出願された米国仮出願第６０／３９７，８２０号明細書の特典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）を生成するためのモノマーとして使用することができる、高価値の芳香族化合物である。ＬＣＰは、ガラス転移温度と等方性液体への転移温度との間で中間体または中間相を示す、あるいはある種の範囲の濃度および温度に対して少なくとも１つの中間相を有するポリマーである。これらの中間相における分子は、液体のようにふるまい、流動するだけでなく、結晶の異方性特性も示す。ＬＣＰは、液晶ディスプレイに、また、電子、電気通信、および航空宇宙分野のための高速コネクタおよびフレキシブル回路に使用される。滅菌照射に対するその耐性ならびに高い酸素および水蒸気バリア特性のため、ＬＣＰは、医療装置や薬品および食品の包装にも使用される。
【０００４】
高価値の芳香族化合物としてのその重要性のおかげで、ｐＨＣＡの化学合成は、知られている。しかし、合成に必要とされる高エネルギー、および必要とされる大規模な生成物精製が原因で、この化学合成は、費用がかかる。ｐＨＣＡの生物学的生成は、この問題に、低コストの簡単な解決法を提供する。
【０００５】
酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）（ＥＣ  ４．３．１．５）およびＰ４５０酵素を使用する、植物によるｐＨＣＡの生成は、よく知られている。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、植物に広く分布するが（非特許文献１）、菌・カビ類（非特許文献２）、酵母（非特許文献３）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（非特許文献４）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や哺乳類の細胞には見られない（非特許文献５）。ＰＡＬは、フェニルプロパノイド代謝の第１の酵素であり、Ｌ−フェニルアラニンからの（ｐｒｏ−３Ｓ）−水素および−ＮＨ３＋の除去を触媒してトランス−ケイ皮酸を生成する。トランス−ケイ皮酸は、Ｐ４５０酵素システムの存在下で、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）に転換されることが可能であり、これは、リグニンおよびイソフラボノイドなどの種々の第２の代謝産物の生成のための、植物における共通の中間体として働く。しかし、微生物では、ｐＨＣＡではなくケイ皮酸が、第２の代謝産物生成物のための前駆体として働く。シンナマートヒドロキシラーゼ酵素は今まで、微生物起源からは特徴付けられていない。植物におけるＰＡＬ酵素は、リグニン、イソフラボノイド、および他のフェニルプロパノイドの生合成における調節酵素であると考えられている（非特許文献６）。しかし、レッドイースト（ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ）、ロドトルラ  グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）（ロドスポリジウム  トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ））では、このリアーゼは、異化作用としてフェニルアラニンを分解し、この酵素の作用によって生じたシンナマートは、ベンゾアートおよび他の細胞材料に転換される。
【０００６】
ＰＡＬをコードする遺伝子は、当技術分野で知られており、いくつかは、植物と微生物起源の両方から配列決定されている（例えば、特許文献１［ロドスポリジウム  トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）］；特許文献２［グランディスユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）およびラジアータマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ）］；特許文献３［ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）］；特許文献４［エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）］；特許文献５［ジャガイモ、イネ］；ならびに例えばＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ０１０１４３およびＸ７５９６７を参照のこと）。様々な起源からのＰＡＬ遺伝子は、酵母、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、および昆虫細胞培養株において、活性なＰＡＬ酵素として過剰発現されている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。
【０００７】
いくつかのＰＡＬ遺伝子は、フェニルアラニンをシンナマートに転換するその能力の他に、基質としてチロシンを受け入れることができる。こうした反応では、酵素活性は、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と呼ばれる。ＴＡＬによるチロシンの転換は、シンナマートという中間段階無しに、チロシンからｐＨＣＡを直接生じさせる。しかし、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ触媒活性が著しく高い酵素をコードする遺伝子の、非常に最近の報告が１つだけ存在している（非特許文献１０）。この遺伝子は、細菌ロドバクター  カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）から単離され、ＰＡＬに対しての触媒効率の約１５０倍のＴＡＬ触媒効率をもつ酵素をコードしている。このＴＡＬタンパク質は、酵母のＰＡＬ配列に対してよりも、植物のＰＡＬタンパク質と相同性が高い（例えばテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）のＰＡＬ配列と３２％の同一性）ことが報告された。他の全ての天然のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は、その基質としてチロシンよりもフェニルアラニンを使用することを優先する。酵母ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）由来の野生型のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は、チロシンに比べてフェニルアラニンに対する優先度が低く、ＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比は、わずか０．５８である（非特許文献１１に報告されている）。ちなみに、他の生物において研究されたＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は通常、ＰＡＬ／ＴＡＬ比が１５以上である。サリアスラーニ（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ）ら、（特許文献６）は、酵母トリコスポロン  クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）から単離された誘導性のＴＡＬ酵素を記載している。この酵素は、ＰＡＬ活性よりもＴＡＬ活性が高く、ＰＡＬ／ＴＡＬ活性比が０．７３である。
【０００８】
特許文献７は、ｐＨＣＡの生物学的生成のためのいくつかの方法を開示している。これには、酵母ロドトルラ  グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来の野生型ＰＡＬの、大腸菌への組み込みおよびこの野生型ＰＡＬの、チロシンをｐＨＣＡに転換する能力の利用；フェニルアラニンをケイ皮酸に、その後ｐＨＣＡに転換するための、酵母ロドトルラ  グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）由来の野生型ＰＡＬ＋植物シトクロムＰ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼの、大腸菌への組み込み；ならびにＴＡＬ活性が増強された酵素をコードする突然変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子の開発が含まれる。この突然変異遺伝子は、野生型ロドスポリジウム  トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＰＡＬの突然変異誘発によって単離され、ＴＡＬ／ＰＡＬ比が１．７の酵素をコードしていた。この遺伝子を使用して、チロシンの直接的転換によってＰＨＣＡを生成した。ＴＡＬ活性が増強された酵素をコードするいくつかの他の突然変異型ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子の開発は、特許文献８中でタン（Ｔａｎｇ）によって開示されている。これらの突然変異遺伝子から、７．２までのＴＡＬ／ＰＡＬ比は、報告されている。しかし、ＰＣＨＡの経済的生成のために、より高いＴＡＬ活性をもつ他の酵素が必要とされている。
【０００９】
【特許文献１】ＥＰ  ３２１４８８
【特許文献２】国際公開第９８１１２０５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９７３２０２３号パンフレット
【特許文献４】ＪＰ  ０５１５３９７８
【特許文献５】国際公開第９３０７２７９号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願第６０／３８３２３２号明細書
【特許文献７】米国特許第６，３６８，８３７号明細書
【特許文献８】米国特許第６，５２１，７４８号明細書
【非特許文献１】クコール（Ｋｏｕｋｏｌ）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２３６：２６９２〜２６９８（１９６１年）
【非特許文献２】バンドニー（Ｂａｎｄｏｎｉ）ら、「植物化学（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」７：２０５〜２０７（１９６８年）
【非特許文献３】オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、「Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」３１：２００〜２０６（１９６７年）
【非特許文献４】エメス（Ｅｍｅｓ）ら、「Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」４８：６１３〜６２２（１９７０年）
【非特許文献５】ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびヘイバー（Ｈａｖｉｒ）、「酵素（Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）」、第３版；ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ），Ｐ．編；アカデミック社（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９６７年；７５〜１６７ページ
【非特許文献６】ハーブルク（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ）ら、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」４０：３４７〜３６９（１９８９年）
【非特許文献７】フォルクナー（Ｆａｕｌｋｎｅｒ）ら、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」１４３：１３〜２０（１９９４年）
【非特許文献８】ランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら、「生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７年）
【非特許文献９】マクケグニー（ＭｃＫｅｇｎｅｙ）ら、「植物化学（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」４１：１２５９〜１２６３（１９９６年）
【非特許文献１０】キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」５１２：２４０〜２４４（２００２年）
【非特許文献１１】ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）およびヘイバー（Ｈａｖｉｒ）、「植物の生化学（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」内；アカデミック社（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８１；Ｖｏｌ．７、５７７〜６２５ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、解決されるべき課題は、チロシンのｐＨＣＡへの直接的転換のために使用され、より効率のよいＴＡＬ酵素を生成するために将来の酵素工学のための手段として働く、ＴＡＬ活性がＰＡＬ活性よりも高い天然に存在する酵素を得ることである。本出願人等は、ＴＡＬ触媒活性がＰＡＬ活性よりも高い細菌ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から酵素を単離することによって、ここに述べた課題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
ａ）配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
ｂ）以下のハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子：０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃、および２×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、それに続く０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄、あるいは
（ａ）または（ｂ）に相補的な単離された核酸分子よりなる群から選択される、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、ならびにこれを含有する遺伝的にキメラな宿主細胞および形質転換宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）本発明の核酸分子を含むゲノムライブラリを探索し、
ｂ）本発明の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定することを含んでなり、配列決定されたゲノム断片がチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００１４】
同様に、本発明は、
ａ）配列番号２に記載の配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、クローニングベクター内に存在するインサートを増幅することを含んでなり、
増幅されたインサートがチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明は、
（ａ）適切な制御配列に作動可能に連結された本発明の単離された核酸分子を含んでなる組換え宿主細胞を、発酵性炭素基質と接触させ、
（ｂ）ｐＨＣＡを生じるのに十分な時間、前記組換え細胞を増殖させ、
（ｃ）前記ｐＨＣＡを場合により回収することを含んでなる、ｐＨＣＡの生成のための方法を提供する。
【００１６】
本発明は、本出願の一部を成す以下の詳細な説明、図、および添付の配列説明から、より十分に理解することができる。
【００１７】
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願に関する要件−配列の基準（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、また、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準（Ｓｔａｎｄａｒｄ）ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（ルール（Ｒｕｌｅ）５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、およびアドミニストレイティブ・インストラクション（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）のセクション２０８および付録Ｃ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載された規則に従う。
【００１８】
配列番号１は、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）から得られるＴＡＬのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号２は、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得られるＴＡＬ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号３は、配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされるロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得られるＴＡＬの推定されるアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号４〜７は、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ｔａｌのクローニングのために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、細菌ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のアンモニアリアーゼ酵素をコードする新規のＤＮＡ配列を提供する。この酵素は、基質としてチロシンが用いられた場合に、フェニルアラニンと比較してより高い特異的活性をもつ、唯一の報告された第２の天然に存在する細菌ＴＡＬ酵素である。このＴＡＬ酵素は、チロシンから直接ｐＨＣＡを生成するために使用することができる。
【００２３】
定義
以下の略語および定義を、本明細書および特許請求の範囲の説明のために使用する。
【００２４】
「フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ」は、ＰＡＬと略される。
【００２５】
「チロシンアンモニア−リアーゼ」は、ＴＡＬと略される。
【００２６】
「ヒスチジンアンモニアリアーゼ」は、ＨＡＬと略される。
【００２７】
「パラ−ヒドロキシケイ皮酸」は、ｐＨＣＡと略される。
【００２８】
「シンナマート４−ヒドロキシラーゼ」は、Ｃ４Ｈと略される。
【００２９】
本明細書では、用語「ケイ皮酸」および「シンナマート」は、交換可能に使用され、ＣＡと略される。
【００３０】
用語「ＴＡＬ活性」は、タンパク質がチロシンのｐＨＣＡへの直接的転換を触媒する能力を意味する。
【００３１】
用語「ＰＡＬ活性」は、タンパク質がフェニルアラニンのケイ皮酸への転換を触媒する能力を意味する。
【００３２】
「ｐａｌ」は、ＰＡＬ活性をもつ酵素をコードする遺伝子を表す。
【００３３】
「ｔａｌ」は、ＴＡＬ活性をもつ酵素をコードする遺伝子を表す。
【００３４】
「ＲｓＴＡＬ」は、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＴＡＬ酵素を表す。
【００３５】
用語「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼシステム」は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの触媒的転換を担うタンパク質システムを意味する。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼシステムは、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ機能を果たす、当技術分野で知られたいくつかの酵素または酵素システムの一つである。本明細書では、用語「シンナマート４−ヒドロキシラーゼ」は、ケイ皮酸をｐＨＣＡに転換させる一般的な酵素活性を意味ものとするのに対し、用語「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼシステム」は、シンナマート４−ヒドロキシラーゼ活性をもつ特異的な二成分タンパク質システムを意味するものとする。
【００３６】
用語「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」は、ＰＡＬ活性とＴＡＬ活性の両方を含むタンパク質を意味する。こうしたタンパク質は、酵素の基質としてのチロシンとフェニルアラニンの両方に対して少なくとも若干の特異性を有する。
【００３７】
用語「ＴＡＬ／ＰＡＬ比」は、ＰＡＬ活性に対するＴＡＬ活性の比を意味する。
【００３８】
用語「触媒効率」は、酵素のｋｃａｔ／Ｋｍと定義されることとなる。「触媒効率」は、基質に対する酵素の特異性を定量化するために使用されることとなる。
【００３９】
用語「ｋｃａｔ」はしばしば、「ターンオーバー数」と呼ばれる。用語「ｋｃａｔ」は、単位時間あたりの、活性部位あたりの、生成物に転換された基質分子の最大数、または、単位時間あたりに酵素がターンオーバーする回数と定義される。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［Ｅ］であり、［Ｅ］は、酵素濃度である（ファーシュト（Ｆｅｒｓｔ）「酵素の構造および機構（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」、第２版；Ｗ．Ｈ．フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）：ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８５年；９８〜１２０ページ）。
【００４０】
用語「芳香族アミノ酸生合成」は、芳香族アミノ酸の生成に必要とされる、細胞の内部の生物学的プロセスおよび酵素経路を意味する。
【００４１】
用語「発酵性炭素基質」は、本発明の宿主生物によって代謝されることが可能な炭素源、具体的には単糖、少糖、多糖、一炭素（ｏｎｅ−ｃａｒｂｏｎ）基質および／またはそれらの混合物よりなる群から選択される炭素源を意味する。
【００４２】
本明細書では、「単離された核酸フラグメント」は、合成の、非天然の、あるいは改変されたヌクレオチド塩基を場合により含有する、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなる可能性がある。
【００４３】
核酸分子は、一本鎖の形の核酸分子が、温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子とアニール可能な場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子などの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、よく知られており、サムブルック、Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ、Ｅ，Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、およびマニアティス、Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９年）、具体的には第１１章およびその中の表１１．１（その全体を参照により本明細書に組み込む）に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似したフラグメント（遠い関係の生物からの相同な配列など）ないし高度に類似したフラグメント（近い関係の生物からの機能酵素を再現する（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）遺伝子など）をスクリーニングするために調節することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。一連の好ましい条件は、室温で１５分間の６×  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで開始し、次いで４５℃で３０分間の２×  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで繰り返し、次いで５０℃で３０分間の、０．２×  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳを２回繰り返すという一連の洗浄を使用する。より好ましい一連のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、その場合、０．２×  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中での最後の２回の３０分の洗浄の温度が６０℃に上げられること以外は、洗浄は、上の洗浄と同じである。別の好ましい一連の非常にストリンジェントな条件は、６５℃での０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での最後の２回の洗浄を使用する。さらなる一連のストリンジェントな条件は、例えば、０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、それに続く０．１×  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄を含む。
【００４４】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が、相補的な配列を含有することを必要とする。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、すなわち当技術分野でよく知られた変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなる程、このような配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より大きなＴｍに相当する）は、次の順に減少する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチド超であるハイブリッドについては、Ｔｍを算出するための方程式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前掲、９．５０〜９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前掲、１１．７〜１１．８参照）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも約２０ヌクレオチドであることがより好ましく、長さが少なくとも３０ヌクレオチドであることが最も好ましい。さらに、当分野の技術者であれば、温度および洗浄液の塩濃度を、プローブの長さなどの因子に従って、必要に応じて調節できることを理解するであろう。
【００４５】
用語「同一性（％）」は、当技術分野で知られている通り、配列を比較することによって決定されるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当技術分野では、「同一性」はまた、場合により、こうした配列のストリング間のマッチによって決定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度を意味する。「同一性」および「類似性」は、それだけには限らないが、以下に記載されている既知の方法によって容易に算出することができる。「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（レスク、Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編）オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８８年）；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（スミス、Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編）アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９９３年）；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」（グリフィン、Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン、Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編）ヒュマーナ出版（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（ＮＪ）（１９９４年）；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（フォン  ハイヤネ、Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）編）アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８７年）；および「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（グリブスコフ、Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデヴェルー、Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編）ストックトン出版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９９１年）。同一性を求めるための好ましい方法は、試験される配列間の最高のマッチを示すように設計される。同一性および類似性を求めるための方法は、一般公開されているコンピュータプログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性（％）の計算は、レーザージーンバイオインフォマティクスコンピューティングセット（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）のメグアライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラム（ディーエヌエースター株式会社（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））を用いて実施することができる。配列の（マルチプルアラインメントは、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、（ギャップ伸長ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いるアラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）方法（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９年）「ＣＡＢＩＯＳ．」５：１５１〜１５３）を用いて実施することができる。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）方法を用いるペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）アラインメントのデフォルトパラメ���タは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。
【００４６】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当分野の技術者による配列の手作業の評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；アルトシュール、Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）などのアルゴリズムを用いるコンピュータにより自動化された配列比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するのに十分な、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなる部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を、相同ないし既知のタンパク質または遺伝子であると推定的に同定するために、１０種もしくはそれ以上の連続したアミノ酸または３０種もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列については、遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌のコロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の、配列依存的な方法において、２０〜３０個の連続したヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。さらに、これらのプライマーを含んでなる特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用することができる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、この配列を含んでなる核酸フラグメントを特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含んでなる。本明細書は、１つもしくはそれ以上の特定の微生物のタンパク質をコードする部分的または完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当分野の技術者は、本明細書で報告された通りの配列の利益を享受し、当分野の技術者であれば知ることのできる目的のために、開示された配列のすべてまたは実質的な部分を使用することができる。したがって、本発明は、添付の配列表に報告した通りの完全な配列、ならびに上で定義した通りの配列の実質的な部分を含んでなる。
【００４７】
所与の部位で化学的に等価なアミノ酸を生じるが、コードされたタンパク質の機能特性には影響しない、遺伝子の改変が、一般的であることは、当技術分野でよく知られているので、本発明はが包含するものは、単に特定の例示的な配列だけではない。本発明の目的のために、以下の５つのグループ内の１つで、交換される物としての代替を定義する。
１．脂肪族の、非極性またはわずかに極性の小さな残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性の、負電荷をもつ残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の、正電荷をもつ残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．脂肪族の非極性の大きな残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および
５．芳香族の大きな残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
したがって、疎水性のアミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンは、より疎水性の弱い別の残基（グリシンなど）またはより疎水性の強い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換することができる。同様に、機能的に等価な生成物を生じるために、負電荷をもつある残基の別の残基からの（例えばアスパラギン酸のグルタミン酸からの）、あるいは正電荷をもつある残基の別の残基からの（例えばリジンのアルギニンからの）置換をもたらす変化も考えられる。多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変化は、タンパク質の活性を変えるとは考えられない。
【００４８】
用語「相補的な」は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンは、チミンと相補的であり、シトシンは、グアニンと相補的である。したがって、本発明は、添付の配列表に報告した通りの完全な配列、および実質上類似した核酸配列と相補的な、単離された核酸フラグメントも含む。
【００４９】
適当な核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書に報告されたアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されたアミノ酸配列と約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されたアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいものは、本明細書に報告されたアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントである。適当な核酸フラグメントは、上記の相同性をもつだけでなく、少なくとも５０のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２００のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０のアミノ酸を有するポリペプチドを通常コードする。
【００５０】
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えずにヌクレオチド配列の変更が可能である遺伝暗号の性質を意味する。したがって、本発明は、配列番号３に記載の本発明の微生物のポリペプチドをコードするアミノ酸配列のすべてまたは実質的な部分をコードするどんな核酸フラグメントにも関する。当分野の技術者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス（ｃｏｄｏｎ−ｂｉａｓ）」を十分に知っている。したがって、宿主細胞における発現の向上のための遺伝子を合成する場合、コドン使用の頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましい。
【００５１】
「合成遺伝子」は、当分野の技術者に知られた手順を用いて化学的に合成されたオリゴヌクレオチド単位から構築できる。これらの単位を連結およびアニールして、遺伝子セグメントを形成し、その後これを酵素によって構築して、完全な遺伝子を構築する。「化学的に合成された」は、ＤＮＡの配列に関する場合、成分ヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されることを意味する。十分に確立された手順を用いてＤＮＡの手作業による化学合成を行うこともできるし、またはいくつかの一般に販売されている機械のうちの１つを用いて自動化された化学合成を実施することもできる。したがって、宿主細胞のコドンバイアスを反映するために、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために遺伝子を誂えることができる。コドン使用が、宿主が好むコドンに対して偏りがある場合、当分野の技術者であれば、成功裡の遺伝子発現の可能性を理解する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手できる宿主細胞から得られる遺伝子の見通しに基づく可能性がある。
【００５２】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを意味し、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の制御配列を含む。「ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）遺伝子」は、独自の制御配列をもつ、天然に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、共に天然には見られない制御配列およびコード配列を含んでなる、天然の遺伝子ではないどんな遺伝子も意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源から得られた制御配列およびコード配列、または同じ起源から得られるが、天然に見られるのとは異なる様式で配列された制御配列およびコード配列を含んでなる可能性がある。「内在遺伝子」は、生物のゲノム内の本来の位置にあるネイティブ遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、宿主生物中に通常は見られないが、遺伝子移入によって宿主生物に導入される遺伝子を意味する。外来遺伝子は、ネイティブでない生物に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなる可能性がある。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。
【００５３】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。「適当な制御配列」は、転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性、あるいは関連するコード配列の翻訳に影響を与え、コード配列の、上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を意味する。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含む可能性がある。
【００５４】
「プロモーター」は、機能性ＲＮＡのコード配列の発現を制御する能力があるＤＮＡ配列を意味する。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体をネイティブ遺伝子から得ることもできるし、天然に見られる異なるプロモーターから得られる異なる因子から構成されてもよいし、または、合成のＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞種において、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境的または生理的条件に応じて、遺伝子の発現を導く可能性があることが、当分野の技術者には理解されよう。最多数の細胞種において多くの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、通常「構成的プロモーター」と呼ばれる。多くの場合、制御配列の正確な境界は、完全には定められないので、異なる長さのＤＮＡフラグメントが、同じプロモーター活性をもつ可能性があることが、さらに理解される。
【００５５】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置し、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を与えることが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含むＤＮＡ配列を意味する。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を与えるという特徴がある。
【００５６】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列の、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される転写から得られる産物を意味する。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全な相補的なコピーである場合、これは、一次転写物と呼ばれる、あるいは、これは、一次転写物の転写後プロセシングから得られるＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンが無く、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡから得られ、ｍＲＮＡに対して相補的である二本鎖のＤＮＡを意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、したがって、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡのすべてまたは一部に対して相補的であり、かつ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のいずれの部分と、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列であってもよい。「機能性ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはまだ翻訳されず、細胞の作用に対する影響力をもつ他のＲＮＡを意味する。
【００５７】
用語「作動可能に連結された」は、あるものの作用が、別のものによって影響を受けるような、単一の核酸フラグメント上での核酸配列の関連を意味する。例えば、プロモーターは、これが、そのコード配列の発現に影響を与えることが可能である（すなわち、このコード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合に、コード配列と作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で、制御配列に作動可能に連結することができる。
【００５８】
用語「発現」は、本明細書では、本発明の核酸フラグメントから得られるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を意味する。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する可能性もある。
【００５９】
「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制する能力があるアンチセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する。
【００６０】
「過剰発現」は、通常または形質転換されていない生物における生成のレベルを上回る、トランスジェニック生物における遺伝子産物の生成を意味する。
【００６１】
「共抑制」は、同一または実質上類似した外来または内在遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の生成を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６２】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、核酸フラグメントの、宿主生物のゲノムへの移入を意味する。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００６３】
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中枢代謝（ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の一部ではなく、通常環状二本鎖ＤＮＡフラグメントの形の遺伝子を多くの場合持っている染色体の因子を意味する。こうした因子は、任意の起源から得られた、自己複製配列、ゲノム組み込み（ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、適切な３’非翻訳配列と共に、選択された遺伝子産物のためのプロモーターフラグメントおよびＤＮＡ配列を細胞に導入する能力がある独特の構築物に、いくつかのヌクレオチド配列が連結または組換えされている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする、外来遺伝子以外の因子を有する特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来宿主中でこの遺伝子の増強された発現を可能にする、外来遺伝子以外の因子を有する特定のベクターを意味する。
【００６４】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを意味する。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものであってもそれぞれ独自に開発したものであってもよい。通常の配列分析ソフトウェアには、それだけには限らないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＣＧ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）（ウィスコンシンパッケージバージョン９．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年）、およびディーエヌエースター（ＤＮＡＳＴＡＲ）（ディーエヌエースター株式会社（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）、１２２８  サウスパークストリート（Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．）マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ）５３７１５  アメリカ合衆国（ＵＳＡ））、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．」、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、開催日（Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ）１９９２年、１１１〜２０、編集：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンドール（Ｓａｎｄｏｒ）、出版：プリーナム社（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ニューヨーク（ＮＹ））を組み込んだＦＡＳＴＡプログラムが含まれることとなる。本出願においては、特定しない限り、配列分析ソフトウェアが分析のために使用される場合、分析の結果は、プログラム基準の「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書では、「デフォルト値」は、最初に初期設定を行うときにソフトウェアに最初に書き込む一連の値またはパラメータを意味することとなる。
【００６５】
ここで用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、サムブルック、Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ、Ｅ，Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、およびマニアティス、Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）による、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８９年）（以下「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；また、シルハベイ、Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン、Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクウィスト、Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）による、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）  コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８４年）；また、アウスベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）らによる、グリーンパブリッシングアソシエイツアンドワイリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）によって出版された、「分子生物学  最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８７年）に記載されている。
【００６６】
ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）におけるｐＨＣＡ生成に使用される遺伝子
本発明のＴＡＬ活性をコードする遺伝子は、細菌ロドバクタースフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から同定および単離された。ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）は、光センサーとして働く光活動性のイエロープロテイン（ｙｅｌｌｏｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含有する紅色光合成細菌（ｐｕｒｐｌｅ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）のグループに属する。ｐＨＣＡは、この光活動性のイエロープロテインのための発色団である。この光活動性のイエロープロテインをコードする遺伝子は、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から単離されている（コルト（Ｋｏｒｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３８５：１〜６（１９９８年））。ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）種のＴＡＬは、チロシンから直接ｐＨＣＡの生成を触媒すると考えられている。その後、ｐＨＣＡは、光活動性のイエローアポ−タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ａｐｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合するための特異的なリガーゼによって活性化される（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」５１２：２４０〜２４４（２００２年））。
【００６７】
配列同定
この発明のＴＡＬ酵素をコードするロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）において同定されたヌクレオチド配列を、配列番号２として示す。このヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸（配列番号３）配列を、公のデータベースと比較すると、最も類似した既知の配列は、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．」、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、開催日１９９２年、１１１〜２０、編集：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンドール（Ｓａｎｄｏｒ）、出版：プリーナム社（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ニューヨーク州（ＮＹ））を用いると、ここで報告される５２６アミノ酸の長さのアミノ酸配列と約５６％同一であることが示される。より好ましいアミノ酸フラグメントは、ここの配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、約８０％〜９０％が好ましい。最も好ましいものは、ここで報告されるアミノ酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるアミノ酸フラグメントである。同様に、当該の配列に相当する核酸配列をコードする好ましいＴＡＬは、活性なタンパク質をコードし、ここで報告される核酸配列と少なくとも８０％同一であるものである。最も好ましいｔａｌ核酸フラグメントは、ここの配列と少なくとも９０％同一である。最も好ましいものは、ここで報告される核酸フラグメントと少なくとも９５％同一であるｔａｌ核酸フラグメントである。
【００６８】
相同体の単離
本発明の核酸フラグメントは、同じまたは別の微生物の種から、相同のタンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用することができる。配列依存性のプロトコルを用いる、相同遺伝子の単離は、当技術分野でよく知られている。配列依存性のプロトコルの例には、それだけには限らないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、テイバー（Ｔａｂｏｒ）、Ｓ．他、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８２、１０７４、（１９８５年）；または鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、８９：３９２、（１９９２年））の様々な使用によって例示されるような、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が含まれる。
【００６９】
例えば、当分野の技術者によく知られている方法論を用いて任意の所望の細菌からライブラリをスクリーニングするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして当該の核酸フラグメントのすべてまたは一部を用いることによって、本発明のものと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を、直接単離できるであろう。当該の核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で知られた方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前掲）によって、設計および合成することができる。さらに、この完全な配列を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、または末端標識技術、あるいは利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムを用いるＲＮＡプローブなどの、当分野の技術者に知られた方法によってＤＮＡプローブを合成することができる。さらに、当該の配列の一部または全長を増幅するために、特定のプライマーを設計および使用することができる。得られた増幅産物は、増幅反応の間に直接標識し、あるいは増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシー条件下で全長のＤＮＡフラグメントを単離するために、プローブとして使用することができる。
【００７０】
通常、ＰＣＲ−タイプの増幅技術では、これらのプライマーは、異なる配列を有し、互いに相補的ではない。標的核酸の効率的かつ信頼度の高い複製を提供するするために、所望の試験条件に応じて、プライマーの配列を設計するべきである。ＰＣＲプライマー設計の方法は、一般的であり、当技術分野でよく知られている（タイン（Ｔｈｅｉｎ）およびワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」内、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、Ｋ．Ｅ．デービス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６年）３３〜５０ページ  ＩＲＬ出版（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、ヴァージニア州（Ｖｉｒｇｉｎｉａ））；リフリーク、Ｗ．（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）（１９９３年）、ホワイト、Ｂ．Ａ．（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」内、Ｖｏｌ．１５、３１〜３９ページ、ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ヒューマニア  プレス社（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ））。
【００７１】
一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントを増幅するために、当該の配列の２つの短いセグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルに使用することができる。片方のプライマーの配列が、当該の核酸フラグメントから得られ、もう片方のプライマーの配列が、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の存在を利用するポリメラーゼ連鎖反応を、クローン化された核酸フラグメントのライブラリに対して実施することもできる。
【００７２】
あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから得られた配列に基づく可能性がある。例えば、当分野の技術者であれば、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８５：８９９８（１９８８年））に従い、ＰＣＲを用いて、転写物のある一点と、３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅することによってｃＤＮＡを産生することができる。３’および５’方向のプライマーは、当該の配列から設計することができる。市販品として利用できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ））を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５６７３（１９８９年）；ロー（Ｌｏｈ）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」２４３：２１７（１９８９年））。
【００７３】
あるいは、当該の配列を、相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いることができる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成要素には、プローブ、問題とする遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑われる試料、および特定のハイブリダイゼーション方法が含まれる。本発明のプローブは通常、検出されるべき核酸配列に対して相補的な一本鎖の核酸配列である。プローブは、検出されるべき核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５塩基から数万塩基まで変動する可能性があり、行われる特定の試験に依存することとなる。通常、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適当である。プローブ分子の一部のみが、検出されるべき核酸配列に対して相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は、完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズされる領域内の塩基のある部分が、適切な相補的な塩基とは対にならないという結果を伴うが、不完全に相補的な分子間にも確かに起こる。
【００７４】
ハイブリダイゼーション方法は、十分に定義されている。通常、プローブと試料は、核酸ハイブリダイゼーションが可能となるであろう条件下で混合しなければならない。これは、無機または有機塩の存在下で、適切な濃度および温度条件下で、プローブと試料を接触させることを含む。プローブと試料核酸は、プローブと試料核酸との間の起こり得るどんなハイブリダイゼーションが起こるのにも十分な長い時間接触させる必要がある。混合物中のプローブまたは標的の濃度により、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決定されることとなる。プローブまたは標的の濃度が高くなる程、必要なハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を加えることもできる。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を抑制することによって、核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温での短いオリゴヌクレオチドプローブの反応性が高くかつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（ファン  ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１９：５１４３〜５１５１（１９９１年））。適当なカオトロピック剤には、特に、塩化グアニジウム、グアニジンチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムがある。通常、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在することとなる。所望される場合、ハイブリダイゼーション混合物に、ホルムアミドを、通常３０〜５０％（ｖ／ｖ）加えることもできる。
【００７５】
様々なハイブリダイゼーション溶液を使用することができる。通常、これらは、約２０から６０％体積、好ましくは３０％の極性の有機溶媒を含んでなる。通常のハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖ  ホルムアミド、約０．１５から１Ｍ  塩化ナトリウム、約０．０５から０．１Ｍ  バッファー（クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）など）、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５から０．２％  洗剤または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）（ファルマシア株式会社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン（ｋＤ））、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋＤ）、および血清アルブミンを使用する。典型的なハイブリダイゼーション溶液中には、約０．１から５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、例えば仔牛胸腺またはサケ精子ＤＮＡなどの断片的な核のＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および場合により約０．５から２％ｗｔ．／ｖｏｌ．のグリシンも含まれることとなる。ポリエチレングリコール、アニオン性ポリマー（ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなど）、およびアニオン性の糖ポリマー（硫酸デキストランなど）などの様々な極性の水溶性または水膨潤性の薬剤を含む体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）など、他の添加剤も含まれ得る。
【００７６】
核酸ハイブリダイゼーションは、様々な分析フォーマットに適合可能である。最も適当なものの一つは、サンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、未変性条件下のハイブリダイゼーションに対して特に適合可能である。サンドイッチタイプのアッセイの第一の構成要素は、固体支持体である。固体支持体は、未標識かつ配列の一部に相補的な核酸プローブを固定化したものに吸収されている、あるいは、これに共有結合されている。
【００７７】
組換え発現−微生物
当該の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞中で、特に微生物宿主の細胞中で産生することができる。
【００７８】
微生物の発現システムおよび外来タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する発現ベクターは、当分野の技術者によく知られている。これらのうちのいずれかを使用して、当該の配列の遺伝子産物の生成のためのキメラ遺伝子を構築することができた。その後、これらのキメラ遺伝子を、形質転換を介して適切な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供できた。
【００７９】
したがって、例えば、適切なプロモーターの制御下で当該の微生物の酵素をコードするキメラ遺伝子を導入することにより、ｐＨＣＡの生成の増加が示されるであろうことが期待される。天然の宿主細胞と異種宿主内の両方で、当該の遺伝子を発現することが有用となるであろうことが予想される。本発明の遺伝子のネイティブ宿主への導入は、ｐＨＣＡの現在の生成のレベルを上昇させることとなる。さらに、当該の遺伝子は、ネイティブでない宿主細菌（当該の遺伝子が直接単離される生物中には存在しない、ｐＨＣＡ生成を操作するための利点が存在する）に導入することもできる。
【００８０】
適当な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当技術分野でよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、該当する遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適当なベクターは、転写開始制御の場である遺伝子の領域５’、および転写停止を制御するＤＮＡフラグメントの領域３’を含んでなる。両方の制御領域が、形質転換される宿主細胞と相同の遺伝子から得られることが最も好ましいが、こうした制御領域が、生成宿主として選択された特定の種に対してネイティブである遺伝子から得られる必要がないことを理解するべきである。
【００８１】
所望の宿主細胞中で当該のＴＡＬ遺伝子の発現を導くのに有用な開始制御領域またはプロモーターは、非常に多数あり、当分野の技術者はよく知っている。実質的には、この遺伝子を導く能力があるどんなプロモーターも、本発明に適しており、それだけには限らないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；ならびにｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用な種々のファージプロモーターが含まれる。
【００８２】
停止制御領域はまた、好ましい宿主に対してネイティブな種々の遺伝子から得ることもできる。場合により、停止部位は、不必要である可能性があるが、含まれることが最も好ましい。
【００８３】
当該の遺伝子および核酸フラグメントの発現のための好ましい異種宿主細胞は、菌・カビ性のまたは細菌ファミリー内に広く見つけることができ、かつ広範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性で増殖する微生物宿主である。例えば、どんな細菌、酵母、および糸状菌も、本発明の核酸フラグメントの発現に適した宿主であろうことが予想される。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は、細胞の供給材料（ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）とは無関係であるので、機能遺伝子は、細胞のバイオマスを産生するために使用される炭素供給材料とは無関係に発現される。大規模な微生物の増殖および機能遺伝子発現は、光合成または化学合成独立栄養宿主の場合、広範囲の単純または複雑な炭水化物、有機酸、およびアルコール、および／またはメタンまたは二酸化炭素などの飽和炭化水素を利用する可能性がある。しかし、機能遺伝子は、特定の増殖条件（窒素、リン、硫黄、酸素、炭素、または小さな無機イオンを含めた任意の微量の（ｔｒａｃｅ）微量元素の形および量を含む可能性がある）によって調節される、抑制される、または低下する可能性がある。さらに、機能遺伝子の調節は、培養物に加えられるが、一般には栄養分またはエネルギー源とはみなされない特定の調節分子の存在または非存在によって実現することができる。増殖速度はまた、遺伝子発現における重要な調節因子であり得る。
【００８４】
宿主株の例には、それだけには限らないが、腸内細菌（例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ）などの細菌；ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）およびシネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）などのシアノ細菌；サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、およびトルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）などの酵母；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびアルトロボトリス（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ）などの糸状菌；ならびにスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ヘモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびデュナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの藻類が含まれる。工業用の大量のｐＨＣＡを調製するために、本発明のＴＡＬ遺伝子を、これらの微生物および他の微生物宿主中で生じることができる。
【００８５】
経路工学
ＴＡＬ遺伝子の配列の理解は、こうした経路をもつどんな生物におけるｐＨＣＡ生合成経路を操作するのにも有用となる。さらに、チロシンを生じる外因性または遺伝子操作された能力をもつ任意の生物に、ＴＡＬ遺伝子を導入することは、グルコースなどの炭素源からのＰＣＨＡ生成を可能にするであろう。遺伝経路を操作する方法は、一般的であり、当技術分野でよく知られている。特に、経路における選択された遺伝子は、様々な方法によって、上方調節または下方調節することができる。さらに、生物における競合（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）経路は、遺伝子破壊および類似の技術によって排除または昇華することができる。
【００８６】
主要な遺伝経路が同定および配列決定されたら、この経路の出力を上げるために、特定の遺伝子を上方調節することができる。例えば、標的にされる遺伝子のさらなるコピーを、ｐＢＲ３２２などの多コピープラスミドの宿主細胞に導入することができる。あるいは、標的遺伝子を、ネイティブでないプロモーターの制御下であるように改変することができる。細胞周期における特定の点で、あるいは発酵実行中に経路を操作することが所望される場合、標的遺伝子のネイティブプロモーターを置き換えるために、調節または誘導性プロモーターを使用することができる。同様に、場合により、ネイティブまたは内在性のプロモーターを、遺伝子発現を増大させるために、改変することができる。例えば、内在性プロモーターは、突然変異、欠失、および／または置換によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変することができる（クミーク（Ｋｍｉｅｃ）、米国特許第５，５６５，３５０号明細書；ツァーリンク（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／米国特許出願第９３／０３８６８号明細書参照）。
【００８７】
あるいは、標的経路において、あるいはエネルギーまたは炭素のための競合シンク（ｓｉｎｋ）として働く可能性がある競合経路において、ある種の遺伝子の発現を低下または排除する必要があるかもしれない。この目的のために遺伝子を下方調節する方法が、探求されている。破壊されるべき遺伝子の配列が既知である場合、遺伝子下方調節のための最も有効な方法のうちの１つは、転写を断つように外来ＤＮＡを、構造遺伝子に挿入する、標的遺伝子破壊である。これは、破壊されるべき遺伝子の１部分に対して高い程度の相同性を有する配列と隣接した、挿入されるＤＮＡ（多くの場合遺伝マーカー）を含んでなる遺伝カセットの作成によって達成することができる。宿主細胞にこのカセットを導入することにより、細胞のネイティブＤＮＡ複製機構を介して、構造遺伝子への外来ＤＮＡの挿入がもたらされる（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１７１：４６１７〜４６２２（１９８９年）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」１３６：２１１〜２１３（１９９３年）；グエルデンナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」２４：２５１９〜２５２４（１９９６年）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：２７０〜２７７（１９９６年）を参照のこと）。
【００８８】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が既知である場合に遺伝子を下方調節する別の方法である。これを行うために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローン化し、ＲＮＡのアンチセンス鎖が、転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。その後、この構築物を、宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成させる。アンチセンスＲＮＡは、当該のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることによって、遺伝子発現を抑制する。当分野の技術者であれば、特定の遺伝子の発現を抑えるために、アンチセンス技術の使用には、特別な配慮が関係することが分かるであろう。例えば、アンチセンス遺伝子の適切なレベルの発現は、当分野の技術者に知られた異なる調節因子を利用する異なるキメラ遺伝子の使用を必要とする可能性がある。
【００８９】
配列が既知である場合、標的遺伝子破壊およびアンチセンス技術が、遺伝子を下方調節する有効な手段を提供するが、配列に基づかない他の特異性がより低い方法論も、開発されている。例えば、細胞を、ＵＶ放射にかけ、その後、所望の表現型をスクリーニングすることができる。化学薬品を用いる突然変異誘発も、突然変異体の産生に有効であり、通常使用される物質には、ＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなどの、複製していないＤＮＡに影響を与える化学物質、ならびにフレームシフト突然変異を引き起こすので有名なアクリジン染料などの、複製しているＤＮＡに影響を与える薬剤が含まれる。放射線または化学薬品を用いる、突然変異体を作成するための具体的な方法は、当技術分野で十分に実証されている。例えば、トーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年）シナウアーアソシエイツ株式会社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）、またはデシュパンデ、ムクンド  Ｖ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ）、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、３６：２２７（１９９２年）を参照のこと。
【００９０】
遺伝子破壊の別の非特異的な方法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡにランダムに挿入しても、挿入がどこで起きているかを決定するための配列に基づいて、後で回収することができる遺伝因子である。ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方の転位方法が知られている。どちらの方法も、トランスポザーゼ酵素と組み合わせた、転移因子の使用を含む。転移因子またはトランスポゾンを、トランスポザーゼの存在下で、核酸フラグメントと接触させる場合、転移因子は、この核酸フラグメントにランダムに挿入されることとなる。破壊された遺伝子は、転移因子の配列に基づいて同定することができるので、この技術は、ランダムな突然変異誘発に、また遺伝子単離に有用である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転位のためのキットは、市販されている（例えば、酵母Ｔｙ１因子に基づいた、パーキンエルマーアプライドバイオシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ブランチバーグ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ）、ニュージャージー州（ＮＪ）から入手できるプライマーアイランドトランスポジションキット（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）；バクテリアトランスポゾン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）Ｔｎ７に基づいた、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）から入手できるゲノムプライミングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）；およびＴｎ５細菌転位因子（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）に基づいた、エピセンターテクノロジー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ）から入手できるＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システム（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を参照のこと）。
【００９１】
本発明においては、上で述べた方法のいずれか１つによって、ｐＨＣＡ生成酵素経路の発現を調節することが有用である可能性がある。例えば、フェニルアラニンの生成など、競合経路を下方調節することによって、グルコースからのチロシンの生成を最大限にすることが好都合であろう。
【００９２】
工業的生成
ｐＨＣＡの生成が所望される場合、様々な培養方法論を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子産物の大規模生成は、バッチまたは連続培養方法論によって生成することができる。
【００９３】
古典的なバッチ培養方法は、培地の組成が、培養の最初に設定され、培養プロセス中に人為的変更を施さない場合の密閉システムである。したがって、培養プロセスの最初に、培地に、所望の１種もしくはそれ以上の生物を接種し、システムに何も加えずに増殖または代謝活性を起こさせる。しかし通常、「バッチ」培養は、炭素源の添加に関してのバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御する試みは、しばしばなされる。バッチシステムでは、このシステムの代謝産物およびバイオマス組成は、培養が、停止される時まで常に変化する。バッチ培養物内では、細胞は、増殖速度が弱まるまたは停止する場合、静的な誘導期を通って高度な増殖の対数期まで、最後に定常期まで減速する。処理を施さない場合は、定常期の細胞は、最終的には死ぬであろう。あるシステムでは、対数期の細胞がしばしば、最終産物または中間産物の大量の生成の原因である。他のシステムでは、定常期または指数期後（ｐｏｓｔ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）の生成物を得ることができる。
【００９４】
標準のバッチシステムの変形は、流加（Ｆｅｄ  Ｂａｔｃｈ）システムである。流加培養プロセスはまた、本発明に適しており、培養進行状況としての増分に応じて基質が加えられるということを除いて通常のバッチシステムを含んでなる。流加システムは、カタボライト抑制により細胞の代謝が抑制されやすい場合に、また培地内に限られた量の基質を含むことが望ましい場合に有用である。流加システムにおける実際の基質濃度の測定は、困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加培養法は、一般的であり、当技術分野でよく知られており、その例は、トーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９年）シナウアーアソシエイツ株式会社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）、またはデシュパンデ、ムクンド  Ｖ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ）、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、３６：２２７（１９９２年）（参照により本明細書に組み込む）に出ている。
【００９５】
ｐＨＣＡの商業的生成は、連続培養を用いて実現することができる。連続培養は、合成培地が、バイオリアクターに連続的に加えられ、かつ等量の調整培地が、処理のために同時に除去される、開放システムである。連続培養は一般に、細胞が、主として対数期増殖であるところのコンスタントに高い液相密度に細胞を維持する。あるいは、炭素および栄養分が連続的に加えられ、かつ価値ある生成物、副生成物、または廃棄物が、細胞集団から連続的に除去される連続培養を、固定化された細胞を用いて行うことができる。細胞の固定化は、天然および／または合成材料からなる広範囲の固体支持体を用いて実施することができる。
【００９６】
連続または半連続培養では、細胞増殖または最終産物濃度に影響を与える１因子またはいくつかの因子の調節が可能である。例えば、ある方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限栄養を固定速度に保ち、他のすべてのパラメータを加減することが可能である。他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を、一定に保つ一方で、増殖に影響を与えるいくつかの因子を、連続的に変えることができる。連続システムでは、定常状態の増殖条件を維持したいので、培養物における細胞増殖速度に対して、培地を抜き取ることによる細胞の損失を釣り合わせなければならない。連続培養プロセスのための栄養および成長因子を調節する方法、ならびに生成物生成の速度を最大にするするための技術は、工業微生物学の分野でよく知られており、様々な方法は、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、前掲によって詳述されている
【００９７】
本発明の発酵培地は、適当な炭素基質を含有しなければならない。適当な基質には、それだけには限らないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、ラクトースまたはスクロースなどの少糖、デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物などの多糖、ならびにチーズホエー浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ  ｍｏｌａｓｓｅｓ）、およびオオムギ麦芽などの再生可能原料から得られる未精製の混合物が含まれ得る。さらに、炭素基質は、主要な生化学的中間体への代謝転換が実証されている、二酸化炭素、メタン、またはメタノールなどの一炭素基質であってもよい。メチロトローフ生物はまた、一および二炭素基質の他に、メチルアミン、グルコサミン、およびの代謝活動ための様々なアミノ酸などのいくつかの他の炭素含有化合物を利用することが知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンからの炭素を利用してトレハロースまたはグリセロールを生じることが知られている（ベリオン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、「Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．」、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、第７版（１９９３年）、４１５〜３２、編集：マーレル、Ｊ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）；ケリー、ドン  Ｐ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．）出版：インターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）、アンドーバー（Ａｎｄｏｖｅｒ）、英国（ＵＫ））。同様に、様々な種のカンジダは、アラニンまたはオレイン酸を代謝することとなる（スルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、「Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」１５３：４８５〜４８９（１９９０年））。したがって、本発明に利用される炭素源は、非常に様々な炭素含有基質を包含し、生物の選択によってのみ限定されることとなることが考えられる。
【００９８】
組換え発現−植物
あるいは、本発明は、ＴＡＬ遺伝子を含有する植物細胞におけるｐＨＣＡの生成を提供する。本発明の核酸フラグメントを用いて、ｐＨＣＡを生成するために、微生物の遺伝子を発現する能力をもつトランスジェニック植物を作成することができる。好ましい植物宿主は、ｐＨＣＡまたはｐＨＣＡ−グルコシド複合体の高い生成レベルを補助する任意の種となる。適当な緑色植物には、それだけには限らないが、以下が含まれることとなる：ダイズ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、コショウ、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、オートムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ、アブラナ科野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ラッカセイ、ブドウ、グラスシード作物（ｇｒａｓｓ  ｓｅｅｄ  ｃｒｏｐ）、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹、針葉樹、および飼料牧草（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓ）。成長の所望の段階での所望の組織における遺伝子の発現を導くことができるプロモーターにコード領域が作動可能に連結された本発明のキメラ遺伝子を最初に構築することによって、ｐＨＣＡの過剰発現を実現することができる。便宜上、キメラ遺伝子は、同じ遺伝子から得られたプロモーター配列と翻訳リーダー配列を含んでなることが可能である。転写停止シグナルをコードする３’非コード配列も提供されなければならない。当該のキメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を容易にするために、１つもしくはそれ以上のイントロンもを含んでなることが可能である。
【００９９】
キメラ遺伝子配列には、コード領域の発現を誘導する能力がある任意のプロモーターと任意のターミネーターのどんな組み合わせも、用いることができる。プロモーターおよびターミネーターの適当な例には、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）、およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子から得られるものが含まれる。用いることのできる効率的な植物プロモーターの１種は、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と作動可能に連結するこうしたプロモーターは、本発明の遺伝子産物の発現を促進する能力がなければならない。この発明に用いることのできる高レベル植物プロモーターには、例えば、ダイズからのリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、１：４８３〜４９８  １９８２年））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが含まれる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが知られている（例えば、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，  ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」Ａ．キャッシュモーア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、プリーナム社（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８３年）、２９〜３８ページ；コルッツィ、Ｇ．（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．）ら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２５８：１３９９（１９８３年）、およびダンスミア、Ｐ．（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．）ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、２：２８５（１９８３年）を参照のこと）。
【０１００】
その後、当該のキメラ遺伝子を含んでなるプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するために用いられることとなる方法に応じて変わる。当分野の技術者であれば、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裡に形質転換、選択、および増殖するためにプラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝因子を十分に知っている。当分野の技術者はまた、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらす（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、「ＥＭＢＯ  Ｊ．」４：２４１１〜２４１８（１９８５年）；デ  アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、「Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」２１８：７８〜８６（１９８９年））ので、所望の発現レベルおよびパターンを示す線（ｌｉｎｅ）を得るためには、複数の事象が、スクリーニングされる必要があることも理解するであろう。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」９８、５０３、（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロチェック、Ｊ．（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．）「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．」、６１８（１〜２）１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析によって実現することができる。
【０１０１】
ある種の適用例については、当該のタンパク質を異なる細胞区画に割り当てることが有用となる。したがって、既に存在する標的配列を加えられた、かつ／または既に存在する標的配列を取り除かれた、トランジット配列（キーグストラ、Ｋ．（Ｋｅｅｇｓｔｒａ，Ｋ．）、「Ｃｅｌｌ」５６：２４７〜２５３（１９８９年））、シグナル配列または小胞体局在化をコードする配列（クリスピールズ、Ｊ．Ｊ．（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｊ．Ｊ．）、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」４２：２１〜５３（１９９１年））、または核局在化シグナル（ライケール、Ｎ．（Ｒａｉｋｈｅｌ，Ｎ．）「Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．」１００：１６２７〜１６３２（１９９２年））などの適切な細胞内の標的配列を用いて、酵素をコードするようにコード配列を改変することによって、上で述べたキメラ遺伝子を、さらに補うことが目論まれる。引用された参考文献は、これらのそれぞれの例を示すが、このリストは、網羅的ではなく、本発明に有用なより照準的なシグナルは、将来発見される可能性がある。
【０１０２】
タンパク質工学
本発明のヌクレオチドを用いて、活性が増強または改変された遺伝子産物を生成することができることが予想される。それだけには限らないが、エラープローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」２７（４）：１０５６〜１０６２（１９９９年））；部位特異的変異（クームス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（１９９８年）、２５９〜３１１、図版１（１  ｐｌａｔｅ）、編集：アンジェレッティ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ）、ルース  ホーグ（Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ）、出版：アカデミック社（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））、および「遺伝子シャッフリング」（米国特許第５，６０５，７９３号明細書；米国特許第５，８１１，２３８号明細書；米国特許第５，８３０，７２１号明細書；および米国特許第５，８３７，４５８号明細書（参照により本明細書に組み込む））を含めて、ネイティブ遺伝子配列を突然変異させて、活性が改変または増強された遺伝子産物を生成するための様々な方法が知られている。
【０１０３】
遺伝子シャッフリングの方法は、その実行のし易さ、および突然変異誘発の速度の速さ、およびスクリーニングの容易さのおかげで、特に魅力的である。遺伝子シャッフリングのプロセスは、当該の遺伝子と類似の、または異なる追加の集合のＤＮＡ領域の存在下で、当該の遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼ切断して特定のサイズのフラグメントにすることを含む。その後、フラグメントのこのプールを、変性および再アニールして、変異遺伝子を作成することとなる。次いで、この変異遺伝子を、活性の変化についてスクリーニングする。
【０１０４】
本発明の当該の微生物配列は、この方法によって、活性を改変または増強するために突然変異およびスクリーニングすることができる。配列は、二本鎖でなければならず、５０ｂｐから１０ｋｂの範囲の様々な長さであり得る。この配列を、当技術分野でよく知られた制限エンドヌクレアーゼ（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前掲）を用いて、ランダムに消化して約１０ｂｐから１０００ｂｐの範囲のフラグメントにすることができる。当該の微生物配列に加えて、微生物の配列のすべてまたは一部分にハイブリダイズ可能なフラグメントの集合を、加えることができる。同様に、当該の配列にハイブリダイズ可能ではないフラグメントの集合も、加えることができる。通常、これらの追加のフラグメント集合は、核酸総量に対して約１０から２０倍増しの重量で加えられる。一般に、このプロセスに従う場合、混合物中の異なる個々の核酸フラグメントの数は、約１００から約１０００となる。混合されたランダムな核酸フラグメントの集合を、変性させて一本鎖の核酸フラグメントを形成し、その後、再アニールする。他の一本鎖の核酸フラグメントと相同の領域を有する一本鎖の核酸フラグメントのみ、再アニールすることとなる。ランダムな核酸フラグメントは、加熱によって変性させることができる。当分野の技術者であれば、二本鎖の核酸を完全に変性させるのに必要な条件を決定することができるであろう。温度は、８０℃から１００℃であることが好ましい。この核酸フラグメントは、冷却によって再アニールすることができる。その温度は、２０℃から７５℃であることが好ましい。再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を加えることによって加速することができる。適当な塩濃度は、０ｍＭから２００ｍＭの範囲であり得る。その後、アニールされた核酸フラグメントを、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートする。核酸ポリメラーゼは、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｔａｑポリメラーゼ、または当技術分野で知られた任意の他のＤＮＡポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、アニーリング前に、アニーリングと同時に、またはアニーリング後に、ランダムな核酸フラグメントに加えることができる。変性、再生、およびポリメラーゼの存在下でのインキュベートというサイクルは、適切な回数繰り返される。このサイクルは、２から５０回繰り返されることが好ましく、１０から４０回繰り返されることがより好ましい。得られる核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂの範囲の、より大きい二本鎖のポリヌクレオチドであり、標準のクローニングおよび発現プロトコル（マニアティス（Ｍａｎａｔｉｓ）、前掲）によって、発現および活性の変化についてスクリーニングすることができる。
【０１０５】
さらに、遺伝子シャッフリング（エキソンシャッフリング）法（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」９４：１０６９〜１０７３（１９９７年））を用いる機能ドメインの融合によって、ハイブリッドタンパク質を構築することができる。当該の遺伝子の機能ドメインを、他の遺伝子の機能ドメインと合わせて、所望の触媒作用をもつ新規の酵素を作成することができる。ＰＣＲオーバーラップエクステンション（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法を用いて、ハイブリッド酵素を構築し、当分野の技術者によく知られている技術を用いて種々の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１０６】
好ましい実施形態の説明
本発明は、チロシンから直接ｐＨＣＡを生成するために使用することができる酵素を提供する。この発明の当該の遺伝子は、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性をもつタンパク質をコードする。ＴＡＬ活性は、中間のステップ無しで、以下のスキームに従って、チロシンを直接ｐＨＣＡに転換することとなる。
【０１０７】
【化１】
2006501819.tif 000002
【０１０８】
本発明のＴＡＬ遺伝子は、進行中のロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノム配列決定プロジェクト（ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ｏｒｇａｎｉｓｍ＝Ｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得られるロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）の、利用できる翻訳されたゲノム配列を求めるために、トリコスポロン  クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）（配列番号１）（サリアスラーニ（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ）ら、米国特許出願第６０／３８３２３２号明細書）から単離された、ＴＡＬのアミノ酸配列を用いることによって同定された。２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＴＡＬ配列と高い相同性をもつことが判明した。これらのＯＲＦのうちの１つは、ロドバクター  カプスラティス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｉｓ）（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」５１２：２４０〜２４４（２００２年））から得られた最近同定されたＴＡＬとより密接に相関していると判明したので、ＴＡＬ遺伝子であると結論づけられた。本発明のＴＡＬタンパク質配列（配列番号３）は、ロドバクター  カプスラティス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｉｓ）から得られたＴＡＬのタンパク質配列と、５６％の同一性を有していた。鋳型としてのゲノムＤＮＡのダイレクト（ｄｉｒｅｃｔ）ＰＣＲ増幅を用いて、ＴＡＬ遺伝子をクローン化し、大腸菌中で発現させた。大腸菌中での発現の後、パーフュージョン（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーを用いてＲｓＴＡＬ酵素を精製し、反応速度分析を用いて特徴付けた。ＲｓＴＡＬは、ＴＡＬ／ＰＡＬ比が１９であることが判明し、これは、ＲｓＴＡＬが、フェニルアラニンを用いた場合よりも、基質としてチロシンを用いた場合に著しく高い活性を有することを示していた。
【実施例】
【０１０９】
本発明を、以下の実施例でさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示目的でのみ示されることを理解するべきである。上の論考およびこれらの実施例から、当分野の技術者は、この発明の本質的特性を確認することができ、これを様々な使用および条件に適合させるために、その趣旨および範囲から逸脱せずに、本発明の様々な変形および改変を行うことができる。
【０１１０】
一般的な方法
実施例で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野でよく知られており、サムブルック、Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチ、Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）、およびマニアティス、Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）によって、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；  コールドスプリングハーバー研究所出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、（１９８９年）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））、また、Ｔ．Ｊ．シルハベイ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクウィスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）によって、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）（１９８４年）、また、アウスベル、Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）らによる、グリーンパブリッシングアソシエイツアンドワイリーインターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）によって出版された、「分子生物学  最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９８７年）に記載されている。
【０１１１】
細菌培養株の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野でよく知られている。以下の実施例における使用に適した技術は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（フィリップ  ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス  Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル  Ｒ．クリーク（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス  フィリップス（Ｇ．  Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４年））、または、トーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）による「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、シナウアーアソシエイツ株式会社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）（１９８９年）で見ることができる。細菌細胞の増殖および維持のために用いられる試薬、制限酵素、および材料はすべて、別段の指定がない限り、アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））、ＢＤダイアグノスティックス  システム（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）、メリーランド州（ＭＤ））、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ））、またはシグマ  ケミカル  カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（セントルイス、ミズーリ州（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手した。
【０１１２】
略語の意味は、次の通りである。「ｓ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」は、時間を意味し、「ｐｓｉ」は、平方インチあたりのポンドを意味し、「ｎｍ」は、ナノメートルを意味し、「ｄ」は、日を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「ｍｍ」は、ミリメートルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」は、モル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌｅ」は、マイクロモルを意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し、「Ｕ」は、ユニットを意味し、「ｍＵ」は、ミリユニットを意味し、「Ｕｍｇ−１」は、ｍｇあたりのユニットを意味し、「ＯＤ」は、光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は、６００ｎｍの波長で測定される光学密度を意味し、「ｐｐｍ」は、百万分率を意味し、「ｋＤ」は、キロダルトンを意味し、「ｒｐｍ」は、毎分回転数を意味する。
【０１１３】
実施例１
ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）におけるＴＡＬ遺伝子の同定
この実施例の目的は、チロシンアンモニアリアーゼ酵素をコードするロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）の遺伝子を同定することであった。
【０１１４】
Ｂｌａｓｔ分析
トリコスポロン  クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ）から得られるＴＡＬのアミノ酸配列は、配列番号１（サリアスラーニ（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ）ら、米国特許出願第６０／３８３２３２号明細書）として示され、進行中のロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノム配列決定プロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｓｃ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌ／ｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ｏｒｇａｎｉｓｍ＝Ｒｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）から得られるロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）の翻訳されたゲノム配列を求めるために用いられる。
【０１１５】
Ｂｌａｓｔの結果は、ＴＡＬ配列とのかなりの相同性をもつ２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が目下存在することを示した。これらの配列のうちの１つは、コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）２０４上にあり、これは、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＴＡＬ配列と比較した場合、２ｅ−４６の期待値（Ｅ）を有する。期待値は、マッチの統計的有意性を推定し、このサイズのデータベースの探索において全く偶然期待されるマッチの数を、所与のスコアを伴って、明らかにする。２つ目の配列は、コンティグ２３０上にあり、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＴＡＬ配列と比較した場合、４ｅ−４２のＥ値を有する。いくつかのフェニルアラニン、チロシン、およびヒスチジンアンモニアリアーゼの、これらの配列との比較により、コンティグ２０４上のＯＲＦが、ヒスチジンアンモニアリアーゼと最も密接に相関しているのに対し、コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）２３０上のＯＲＦが、ロドバクター  カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（キント（Ｋｙｎｄｔ）ら、「ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ」５１２：２４０〜２４４（２００２年））由来の最近同定されたチロシンアンモニアリアーゼとより密接に相関していることが示された。したがって、この後者のＯＲＦが、ＴＡＬ遺伝子であると結論づけられた。このＴＡＬ遺伝子のＤＮＡ配列を、配列番号２として示す。この配列は、コード領域全体プラス５’フランキング領域の１４６塩基および３’フランキング領域の１２３塩基を含む。ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＴＡＬ（ＲｓＴＡＬ）の翻訳されたタンパク質配列は、配列番号３と呼ばれ、５２６アミノ酸長である。
【０１１６】
ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＴＡＬ（配列番号３）に関して得られたアミノ酸配列を、公に利用可能なすべてのタンパク質配列との類似性について分析した。これは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いて、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｓ．Ｆ．他、（１９９３年）「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照のこと）サーチを実施することによって、ＢＬＡＳＴ「ｐ」データベース（非冗長ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳの翻訳配列、三次元構造のＢｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク由来の配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースをすべて含んでなる）に含まれる配列との類似性について行った。Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）からのＴＡＬアミノ酸配列も、比較のために含められた。
【０１１７】
ＢＬＡＳＴ比較の結果を、表１に示す。これは、期待値について報告された値を用いるＢＬＡＳＴＸｐアルゴリズムに基づくデータを示す。これらの結果は、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からのＴＡＬが、他のＴＡＬ、ＰＡＬ、およびＨＡＬ酵素に対して高度の類似性を有することを示す。ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）からのＴＡＬとロドバクター  カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）からのＴＡＬは、アミノ酸レベルで５６％の同一性を有する。
【０１１８】
【表１】
2006501819.tif 000003
【０１１９】
実施例２
大腸菌中での、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＴＡＬ遺伝子の発現
この実施例の目的は、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＴＡＬ酵素をコードする遺伝子をクローン化し、また、その活性を確認し、また、それを特徴付けるために、この遺伝子を大腸菌中で発現させることであった。
【０１２０】
ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）配列決定プロジェクトから同定されたＴＡＬ遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いるダイレクトＰＣＲ増幅によるＰＣＲクローニングのために、表２に列挙するプライマーを設計した。アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州（ＶＡ））からロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノムＤＮＡを購入し、使用前に水で１０倍に希釈した。ＴＡＬ遺伝子のコード領域を、ＰＣＲによって増幅し、ｐＫＫ２２３−３またはｐＴｒｉｃＨｉｓＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州（ＣＡ））にクローン化した。
【０１２１】
【表２】
2006501819.tif 000004
【０１２２】
ベクターｐＫＫ２２３−３に対して、プライマーＲＳ−ＴＡＬ−ＦおよびＲＳ−ＴＡＬ−Ｒ（配列番号：４および５）を用いて、ＧＴＧ開始コドンで開始し、終止コドンの後の７３塩基対で終わる、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ｔａｌのコード領域を増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノムＤＮＡ（１：１０希釈）、それぞれ１μＬの２種のプライマー（２０μＭ）、１０μＬの１０Ｘ  ＰＣＲバッファー（クロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）、パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））、１０μＬの５Ｍ  Ｇ−Ｃメルト（Ｇ−Ｃ  ｍｅｌｔ）（クロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ））、８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１８μＬのＨ２Ｏ、および１μＬのアドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）Ｇ−Ｃポリメラーゼミックス（クロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ））を含有していた。この反応混合物を、２．５分間９４℃に加熱し、次いで以下のようなサイクルにかけた。９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル。これらのサイクルに続いて、７２℃で７分インキュベーションを行った。
【０１２３】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用いて、メーカーのプロトコルに従って、ＰＣＲ産物（全長１６７４塩基対）を精製した。精製されたＰＣＲ産物およびベクターｐＫＫ２２３−３を、ＳｍａＩで別々に消化した。この反応混合物は、５０μＬのＰＣＲ産物（約１５μｇのＤＮＡ）または５０μＬのｐＫＫ２２３−３（約１０μｇ）、１０μＬのＮＥ  バッファー４（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））、３６μＬの水および４μＬのＳｍａＩ（２０ユニット／μＬ、（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）、ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））を含有していた。室温で４時間のインキュベートの後、消化されたＤＮＡ試料を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩを用いてこのＤＮＡ試料を消化した。この反応混合物は、５０μＬのＳｍａＩで消化したＤＮＡ（ＰＣＲ産物については約１５μｇ、またはｐＫＫ２２３−３については１０μｇ）、１０μＬのＮＥ  バッファー２（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））、４μＬのＨｉｎｄＩＩＩ（２０ユニット／μＬ、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））、および３６μＬの水を含有していた。この反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。消化されたＤＮＡ試料を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて再び精製した。次いで、このＰＣＲ産物を、Ｔ４リガーゼを用いてベクターと連結した。この反応混合物は、それぞれ２μＬの消化されたｐＫＫ２２３−３とＰＣＲ産物、２μＬの１０Ｘリガーゼバッファー（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））、１３μＬの水、および１μＬのＴ４リガーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））を含有していた。室温で終夜インキュベートした後、このライゲーションミックスを用いて、トップ（Ｔｏｐ）１０  大腸菌コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を形質転換した。形質転換された細胞を、１％  バクト−トリプトン、０．５％  バクト−酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンを添加した２％バクト−寒天からなるＬＢプレートに蒔いた。
【０１２４】
この形質転換プレートから得た１５のコロニーを用いて、１％  バクト−トリプトン、０．５％  バクト−酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンからなるそれぞれ別の２ｍＬのＬＢ液体培地に接種した。これらの培養物を終夜インキュベートした。キアゲンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って、これらの培養物から、プラスミドＤＮＡを精製した。ＥｃｏＲＩを用いた制限消化では、１５プラスミドのうちの６種が、ｔａｌインサートを含有していることが示された。
【０１２５】
ベクターｐＴｒｉｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）に対して、プライマーＲＳ−ＴＡＬ−Ｆ１およびＲＳ−ＴＡＬ−Ｒ（配列番号：６および５）を使用して、１６６４塩基対のＤＮＡフラグメントを増幅した。反応混合物は、１μＬのロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノムＤＮＡ（１：１０希釈）、それぞれ１μＬの２種のプライマー（２０μＭ）、１０μＬの１０Ｘ  ＰＣＲバッファー、１０μＬの５Ｍ  Ｇ−メルト、８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１８μＬのＨ２Ｏ、および１μＬの優位（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）Ｇ−Ｃポリメラーゼミックス（クロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ））を含有していた。この反応混合物を、２．５分間９４℃に加熱し、次いで以下のようなサイクルにかけた。９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３０サイクル。これらのサイクルに続いて、７２℃で７分インキュベーションを行った。
【０１２６】
このＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ））を用いて精製し、ｐＴｒｉｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に直接連結した。この反応混合物は、１μＬの精製されたＰＣＲ産物、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキットから得られる１μＬの塩類溶液、３μＬの水、および１μＬのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクターミックスを含有していた。室温で１０分インキュベートした後、このライゲーションミックスを用いて、トップ１０  大腸菌コンピテント細胞を形質転換した。この形質転換ミックスを、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢプレートに蒔いた。
【０１２７】
この形質転換プレートから得られた１５のコロニーを用いて、１％  バクト−トリプトン、０．５％  バクト−酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンからなるそれぞれ別の２ｍＬのＬＢ液体培地に接種した。これらの培養物を、終夜インキュベートした。キアゲンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って、これらの培養物から、プラスミドＤＮＡを精製した。ＥｃｏＲＩを用いた制限消化では、１５プラスミドのうちの６種が、ｔａｌインサートを含有していることが示された。
【０１２８】
１２の正しいクローンを用いて、１％  バクト−トリプトン、０．５％  バクト−酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００μｇ／ｍＬ  アンピシリンからなるそれぞれ別の２ｍＬのＬＢ液体培地に接種した。これらの培養物を、３７℃で終夜インキュベートし、エッペンドルフマイクロフュージ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）（ブリンクマンインストゥルメント（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、ニューヨーク州（ＮＹ））を用いて１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。各培養物からの上清をリン酸を用いて酸性化し、０．４５ミクロンフィルターを通して濾過し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析して、増殖培地内のｐＨＣＡおよびＣＡの濃度を求めた。
【０１２９】
オートサンプラーおよびダイオードアレイ紫外可視（ＵＶ／ｖｉｓ）検出器を備えるヒューレットパッカードモデル（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍｏｄｅｌ）１０９０Ｌ  ＨＰＬＣシステムを、マックモッドアナリティカル社（ＭＡＣ−ＭＯＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）（チャッズフォード（Ｃｈａｄｄｓ  Ｆｏｒｄ）、ペンシルバニア州（ＰＡ））によって供給される逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）と共に使用した。表３に示された溶媒グラジエントである溶媒Ａ（メタノール）および溶媒Ｂ（水中０．２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））を用い、１．０ｍＬ／分の流速を使用した。カラム温度は、４０℃に維持した。ＵＶ検出器を、波長２５０、２３０、２７０、２９０、および３１０ｎｍでの溶離液をモニターするように設定した。
【０１３０】
【表３】
2006501819.tif 000005
【０１３１】
表４に示す通り、ｐＴｒｉｃＨｉｓ２に基づくクローンのうちの３種は、かなりの濃度のｐＨＣＡを生成した。さらに、ｐＫＫ２２３−３に基づくクローンのうちの２種はまた、少量であるが検出可能な量のｐＨＣＡを生成した。すべての場合において、生成されたＣＡの濃度は、無視できる量であった。これらの結果は、配列番号２によってコードされる酵素が、確かにＴＡＬであることを実証する。いくつかのクローンが、ｐＨＣＡを全く生成しない理由は、ＰＣＲによって生じるされる突然変異が原因で、あるいは、この実験における非誘導条件下での発現の欠如が原因であろう。
【０１３２】
【表４】
2006501819.tif 000006
【０１３３】
実施例３
ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ＴＡＬ酵素（ＲｓＴＡＬ）の発現、精製、および反応速度研究
この実施例の目的は、ＲｓＴＡＬの過剰発現、精製、および反応速度の特徴付けのために、培地コピー（ｍｅｄｉｕｍ  ｃｏｐｙ）発現ベクターに、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の、ＴＡＬ酵素をコードする遺伝子をクローニングすることであった。
【０１３４】
大腸菌中でのＲｓＴＡＬの発現
ＲｓＴＡＬタンパク質の高レベル発現のための強力なＰｔｒｃプロモーターを含有する、中コピー発現ベクターｐＫＫ２３３．ＲｓＴＡＬ２を、以下の通りに調製した。ＴＡＬ遺伝子を、配列番号７として示したプライマーと、配列番号５として示した（実施例２に述べた）ＲＳ−ＴＡＬ−Ｒプライマーを用いるＰＣＲによって、ロドバクター  スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）ゲノムＤＮＡから増幅し、ベクターｐＫＫ２３３−２（アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州（ＮＪ））に連結し、これを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、ｐＫＫ２３３．ＲｓＴＡＬ２を得た。ｐＫＫ２３３．ＲｓＴＡＬ２で形質転換された大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰコドンプラス（ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ）株（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））中でＲｓＴＡＬの発現を実施した。大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰ（ｐＫＫ２３３．ＲｓＴＡＬ２）と呼ばれるこの形質転換された細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地に接種し、対数期中間（ｍｉｄ  ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）（ＯＤ６００＝０．４）まで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオグルコピラノシド）によって誘導し、３７℃の振盪機内で終夜（１８ｈ）インキュベートした。その培養上清を、実施例２で述べた通り、ｐＨＣＡ生成についてＨＰＬＣによって分析した。これらの結果を、表５に示す。
【０１３５】
形質転換された細胞の懸濁液の超音波処理、それに続く遠心分離によって、未精製の細胞抽出液を作成した。この未精製の細胞抽出液のＴＡＬ酵素活性を、未精製の細胞抽出液４０μｇを、１ｍＭ  チロシンを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５バッファーに入れたものを用いる酵素アッセイによって求めた。生成されたｐＨＣＡのＯＤは、３１５ｎｍで、１０，０００ｃｍ−１の消衰係数とした。ＴＡＬ酵素アッセイの結果を、活性ユニットについて表５に示す。ユニット（Ｕ）は、次の通りに定義される。１分あたり１μｍｏｌのチロシンをｐＨＣＡに脱アミノする活性が１ユニット。表５に示された結果は、大腸菌におけるＲｓＴＡＬ酵素の成功裡の発現を実証する。
【０１３６】
【表５】
2006501819.tif 000007
【０１３７】
未精製の細胞抽出液の可溶性と不溶性の両分画を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。約５５ｋＤの分子量に相当するバンドによって示される通り、ＲｓＴＡＬの発現が、図１に示す通り、可溶性と不溶性の両分画において検出された。この図では、レーン１および２は、それぞれ、ＩＰＴＧ誘導無し（−）および有り（＋）の不溶性分画に相当する。レーン３および４は、それぞれ、ＩＰＴＧ誘導無し（−）および有り（＋）の可溶性分画に相当する。この図の左の最第一のレーンは、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）（カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州（ＣＡ））から入手したマーク（Ｍａｒｋ）１２（商標）分子量スタンダードである。
【０１３８】
ＲｓＴＡＬの精製および反応速度分析
大腸菌  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰ（ｐＫＫ２３３．ＲｓＴＡＬ２）株の５００ｍＬ培養物を、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢブロス（Ｂｒｏｔｈ）中で、対数期中間まで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、３７℃の振盪機中で終夜（１８ｈ）インキュベートした。これらの細胞を、遠心分離し、１錠半のＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害タブレット（ロシュアプライドサイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、インディアナ州（ＩＮ））を含有する１０ｍＬのバッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５のバッファー、５ｍＭ  ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、および１ｍＭ  チロシン）に再懸濁した。その後、これらの細胞を、フレンチプレス細胞破壊機（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ  Ｃｅｌｌ）を２回通過させ、２０分間１８０００ｒｐｍで遠心分離した。この培養上清に、３０％飽和の硫酸アンモニウムを加え、得られた沈殿を、遠心分離によって除去した。次いで、この第１の分画からの上清を、５０％飽和の硫酸アンモニウムで処理した。第２の硫酸アンモニウム分画から得られたペレットを、３ｍＬのバッファーＡに再溶解し、得られた溶液を、ＨＱ陰イオン交換パーフュージョンクロマトグラフィーカラム（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ（Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ）、カリフォルニア（ＣＡ））に装入した。このカラムを、１０ｍＬのバッファーＡで洗浄し、０から１Ｍ  ＮａＣｌのグラジエントのバッファーＡを用いて溶離した。この溶離された分画を、ＴＡＬ活性について分析し、ＴＡＬ活性をもつする分画をプールし、５０％飽和の硫酸アンモニウムを用いて再び沈殿させ、３ｍＬ脱塩カラム（バイオ−ラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用いて脱塩した。脱塩されたタンパク質試料を、上に述べた通りのＨＱパーフュージョンクロマトグラフィーによってさらに精製した。フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）分画においてＴＡＬ活性を検出した。こうした分画は、図２に示したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によって示された通り、精製されたほぼ均質なＲｓＴＡＬタンパク質を含有していた。この図では、レーン１は、マーク（Ｍａｒｋ）１２（商標）分子量スタンダードであり、レーン２は、精製されたＲｓＴＡＬタンパク質である。
【０１３９】
ＲｓＴＡＬ酵素の反応速度パラメータを、上で述べたＴＡＬ酵素アッセイを用いて特徴付けた。酵素反応の初速度を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５バッファー中で、０．０１から１０ｍＭのチロシン濃度で測定した。ラインウィーバー−バーク（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ）分析を用いて、チロシンとフェニルアラニンの両方についてのＲｓＴＡＬ酵素のｋｃａｔおよびＫｍの値を求め、その結果を表６に示した。
【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
表６のデータから分かるように、ＲｓＴＡＬ酵素は、ＴＡＬ／ＰＡＬ比が１９であり、フェニルアラニンを用いた場合よりも基質としてチロシンを用いた場合に著しく高い活性を有することが示される。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】大腸菌におけるＲｓＴＡＬ発現の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のゲル画像である。
【図２】精製されたＲｓＴＡＬ酵素のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のゲル画像である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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