(57)【要約】本発明は、MDA-7を含む組成物および方法に関する。より詳しく述べると、本発明は、癌および他の血管新生関連障害の診断、予後、および治療的治療の組成物および治療法（抗血管新生療法）に向けられる。本発明はまた、MDA-7の精製法にも向けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
MDA-7タンパク質を含む細胞抽出物または上清にアフィニティクロマトグラフィーを行うことを含む、細胞からMDA-7タンパク質を精製する方法。
【請求項２】
MDA-7タンパク質が少なくとも20％均一まで精製され、活性である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
MDA-7タンパク質がグリコシル化され、タンパク質の分泌型である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
アフィニティクロマトグラフィーを行う前、あいだ、または後に抽出物または上清にタンパク質担体を加える段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
得られたMDA-7タンパク質が少なくとも30％均一まで精製され、活性である、アフィニティ精製MDA-7タンパク質に陰イオン交換クロマトグラフィーを行う段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
陰イオン交換クロマトグラフィーが濃度1.0 Mまでの塩の段階的勾配を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
MDA-7タンパク質が塩濃度約0.9〜1.0 Mの溶液において溶出される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
得られたタンパク質が50％〜70％均一まで精製される、請求項5記載の方法。
【請求項９】
得られたタンパク質が70％〜90％均一まで精製される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
得られたタンパク質が少なくとも90％均一まで精製される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
得られたタンパク質が少なくとも95％均一まで精製される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
アフィニティクロマトグラフィーが少なくとも一つの抗MDA-7ポリクローナル抗体を含むアフィニティ樹脂を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
アフィニティクロマトグラフィーが少なくとも一つの抗MDA-7モノクローナル抗体を含むアフィニティ樹脂を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
アフィニティクロマトグラフィーが、細胞抽出物または上清をアフィニティ樹脂に接触させること、樹脂を洗浄すること、およびMDA-7タンパク質を樹脂から溶出することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
MDA-7タンパク質が1 Mの塩およびpH 5.0未満を含む溶液から溶出される、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
溶出されたMDA-7タンパク質を緩衝液によって中和する段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
溶出されたMDA-7タンパク質をプロテインAと共にインキュベートする段階をさらに含む、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
プロテインAが非反応性材料に共役または結合される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
アフィニティクロマトグラフィー精製MDA-7タンパク質にサイズ分離精製を行う段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
サイズ分離精製が陰イオン交換クロマトグラフィーの前および／または後に行われる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
サイズ分離精製がタンパク質ゲルまたはサイズ排除カラムを含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
以下を含む細胞から活性な、グリコシル化された、分泌型MDA-7タンパク質を精製する方法：
a）分泌型MDA-7タンパク質を含む細胞抽出物または上清に、抗MDA-7抗体を含むアフィニティクロマトグラフィーを行う段階；
b）アフィニティクロマトグラフィー精製MDA-7タンパク質にサイズ分離精製を行う段階；および
c）サイズ分離精製MDA-7に陰イオン交換クロマトグラフィーを行う段階。
【請求項２３】
MDA-7タンパク質が少なくとも80％均一まで精製される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
活性である精製MDA-7タンパク質。
【請求項２５】
少なくとも約25％均一まで精製される、請求項24記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項２６】
少なくとも約40％均一まで精製される、請求項25記載のMDA-7タンパク質。
【請求項２７】
少なくとも約50％均一まで精製される、請求項26記載のMDA-7タンパク質。
【請求項２８】
少なくとも約60％均一まで精製される、請求項27記載のMDA-7タンパク質。
【請求項２９】
少なくとも約70％均一まで精製される、請求項28記載のMDA-7タンパク質。
【請求項３０】
少なくとも約80％均一まで精製される、請求項29記載のMDA-7タンパク質。
【請求項３１】
少なくとも約90％均一まで精製される、請求項30記載のMDA-7タンパク質。
【請求項３２】
少なくとも約95％均一まで精製される、請求項31記載のMDA-7タンパク質。
【請求項３３】
請求項24記載の精製された分泌型MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、癌患者を治療する方法。
【請求項３４】
MDA-7タンパク質が活性であって、組成物中のタンパク質に関して少なくとも約80％均一である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
患者に放射線療法または化学療法を行うことをさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
癌患者が上皮細胞癌を有する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
癌患者が黒色腫または膵臓癌を有する、請求項33記載の方法。
【請求項３８】
核酸が細胞において機能的なプロモーターの制御下に存在する、MDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターの有効量を細胞に投与することを含む、癌細胞を放射線増感する方法。
【請求項３９】
癌細胞が上皮細胞である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
アデノウイルスベクターの投与後72時間以内に癌細胞に放射線照射を行うことをさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
NF-κB阻害剤と、MDA-7タンパク質またはプロモーターの制御下でMDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターのいずれかを含む組成物とを患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項４２】
NF-κB阻害剤がスリンダクである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
配列番号：2のアミノ酸100〜206位および小胞体ターゲティング配列を含むタンパク質。
【請求項４４】
MDA-7が、癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する、MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する方法。
【請求項４５】
癌が黒色腫、肺の非小細胞、肺の小細胞、肺、肝癌、網膜芽種、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉、舌、白血病、神経芽腫、頭部、頚部、乳腺、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮種、頚部、消化管、リンパ腫、脳、結腸、または膀胱である、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
癌が肺癌である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
MDA-7タンパク質が癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する、MDA-7タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する方法。
【請求項４８】
MDA-7タンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現構築物を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
発現構築物が、プロモーターの制御下でMDA-7タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、請求項48記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
A．発明の分野
本発明は一般的に、分子生物学および遺伝子治療の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、診断、予後、および治療的治療組成物、ならびに癌および他の血管新生関連障害の治療法（抗血管新生治療）に向けられる。本発明はまた、MDA-7の精製法および精製MDA-7を含む組成物に向けられる。なお、本出願は、全て本出願と同じ名称で同じ出願人を有する、2003年3月3日に提出された米国特許出願第60/452,257号、2003年5月30日に提出された米国特許出願第60/474,529号、2003年6月4日に提出された米国特許出願第60/476,159号、2003年7月11日に提出された米国特許出願第60/486,862号、2003年10月29日に提出された米国特許出願第60/515,285号、および2003年12月10日に提出された米国特許出願第60/528,506号に対する優先権の利益を主張する。これらの出願のそれぞれはその全内容物が参照として本明細書に組み入れられる。また、米国政府は、国立癌研究所の助成金番号CA86587、R41 CA88421、P01 CA78778、P01 CA06294、CA70907、およびP30 CA16672号に従って、本発明において権利を保有する。
【背景技術】
【０００２】
B．関連技術に関する説明
1．血管新生
血管は二つのプロセスによって構築される：すなわち、それによって胚形成の際に多能性間葉系前駆細胞から原始血管ネットワークが確立される脈管新生；およびそれによって既存の血管が毛細管の新芽を送り出して新しい血管を形成する血管新生。内皮細胞はそれぞれのプロセスにおいて中心的に関与している。それらは遊走し、増殖した後、堅固な細胞-細胞結合によって管に構築され、血液を含む（Hanahan、1997）。血管新生は、内皮細胞によって放出された酵素および白血球が、内皮細胞を取り巻く基底膜を侵食し始める際に起こり、それによって内皮細胞は膜の中に侵入する。これらの内皮細胞は血管新生刺激に反応して遊走し始め、血管の枝分かれを形成し、枝分かれが互いに融合して新しい血管を形成するまで増殖し続ける。
【０００３】
通常、血管新生は、ヒトおよび動物において、胚の発達、創傷治癒、および黄体形成、子宮内膜、および胎盤のような非常に限られた状況において起こる。しかし、異常な血管新生は、腫瘍の転移を含む多数の障害に関連している。実際に、腫瘍の増殖は血管新生プロセスに依存すると一般的に考えられている。このように、血管新生の増加または減少能は、創傷治癒（例えば、移植片の生存）または癌の治療のような臨床状況においてそれぞれ重要な意味を有する。
【０００４】
いくつかの系統の直接的な証拠から、現在、血管新生は固形腫瘍およびその転移の増殖および持続にとって必須であることが示唆されている（Folkman、1989；Honら、1991；Kimら、1993；Millauerら、1994）。血管新生を刺激するために、腫瘍は、線維芽細胞増殖因子（FGFおよびDTCF）（Kandelら、1991）および血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（VEGF/VPP）を含む多様な血管新生因子の産生をアップレギュレートする。しかし、多くの悪性腫瘍はまた、アンジオスタチンおよびトロンボスポンジンを含む血管新生の阻害剤も産生する（Chenら、1995；Goodら、1990；O'Reillyら、1994）。血管新生表現型は、脈管形成に関するこれらの正のおよび負の調節因子の真のバランスの結果であると仮定されている（Goodら、1990；O'Reillyら、1994；Parangiら、1996；Rastineiadら、1989）。血管新生に関する内因性の阻害剤は他にもいくつか同定されているが、必ずしも全てが腫瘍の存在に関連しているわけではない。これらには、血小板因子4（Guptaら、1995；Maioneら、1990）、インターフェロン-α、インターロイキン-12および／またはインターフェロン-γによって誘導される（Voestら、1995）インターフェロン誘導タンパク質10（Angiolilloら、1995；Strieterら、1995）、gro-β（Caoら、1995）、およびプロラクチンの16 kDa N-末端断片（Clappら、1993）が含まれる。
【０００５】
2．血管新生関連疾患
本発明の方法は、内皮細胞関連疾患および障害を治療するために有用である。特に重要な内皮細胞プロセスは、上記のように血管新生、血管の形成である。血管新生関連疾患は、内皮細胞増殖を阻害するための本発明に記述の方法を用いて治療してもよい。血管新生関連疾患には、例えば固形癌、白血病のような血液癌、および腫瘍の転移を含む血管新生依存的癌；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および発熱性肉芽腫；リウマチ性関節炎；乾癬；眼の血管新生疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖、ルベオーシス；オスラー-ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；末梢血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；および創傷肉芽形成が含まれるがこれらに限定されない。本発明の内皮細胞増殖阻害法は、内皮細胞が過剰または異常に刺激された疾患の治療において有用である。これらの疾患には、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕、すなわちケロイドが含まれるがこれらに限定されない。それらはまた、ネコひっかき病（Rochele minalia quintosa）および潰瘍（ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori））のような病理的結果として血管新生を有する疾患の治療においても有用である。
【０００６】
3．癌
正常な組織の恒常性は、細胞増殖と細胞死の高度に調節されたプロセスである。細胞増殖または細胞死のいずれかの不均衡によって、癌様状態が起こりうる（Solyanikら、1995；Stokkeら、1997；Mumby and Walter、1991；Natoliら、1998；Magi-Galluzziら、1998）。例えば、子宮頚癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、および脳癌は起こりうる多くの癌の単なる数例に過ぎない（Erlandsson、1998；Kolmel、1998；Mangray and King、1998；Mouginら、1998）。実際に、癌の発生率は非常に高く、米国だけでも毎年500,000人を超える人が癌のために死亡している。
【０００７】
細胞増殖と細胞死の維持は、少なくとも部分的に癌原遺伝子によって調節される。癌原遺伝子は細胞増殖を誘導するタンパク質（例えば、sis、erbB、src、ras、およびmyc）、細胞増殖を阻害するタンパク質（例えば、Rb、p16、p19、p21、p53、NF1およびWT1）、またはプログラムされた細胞死を調節するタンパク質（例えば、bcl-2）（Ochiら、1998；Johnson and Hamdy、1998；Liebermannら、1998）をコードしうる。しかし、これらの癌原遺伝子に対する遺伝子再配列または変異によって、癌原遺伝子は強力な癌誘発腫瘍遺伝子へと変換する。癌原遺伝子が腫瘍遺伝子に形質転換するためにはしばしば、単突然変異で十分である。例えば、p53腫瘍抑制因子タンパク質における点突然変異によって、野生型p53機能の完全な喪失（Vogelstein and Kinzler、1992；Fulchiら、1998）および「優性な」腫瘍促進機能の獲得が起こる。
【０００８】
現在、多くの一般的な癌のタイプの治療には有効な選択肢がほとんどない。所定の個人に対する治療コースは、診断、疾患発症の進行期、ならびに患者の年齢、性別、および全身健康状態のような要因に依存する。癌治療の最も簡便な選択肢は、手術、放射線療法および化学療法である。手術は、癌の診断および治療において中心的な役割を有する。典型的に、外科的アプローチは生検のためおよび癌様増殖を切除するために必要である。しかし、癌が転移して広がっている場合には、手術によって治癒が得られる可能性は低く、別のアプローチをとらなければならない。放射線療法、化学療法、および免疫療法は、癌の外科治療の代用法である（Mayer、1998；Ohara、1998；Hoら、1998）。放射線療法は、癌細胞を破壊するために高エネルギー放射線の正確に照準を必要とし、手術の場合と同様に、転移していない局所癌細胞の治療において主に有効である。放射線療法の副作用には、皮膚の刺激、嚥下困難、口の渇き、悪心、下痢、脱毛、および気力の喪失が含まれる（Curran、1998；Brizel、1998）。
【０００９】
化学療法、すなわち抗癌剤による癌の治療は、もう一つの様式の癌治療である。所定の抗癌剤治療の有効性はしばしば、固形腫瘍全体に薬物を輸送することが難しいために制限される（el-Kareh and Secomb、1997）。化学療法戦略は腫瘍組織の増殖に基づき、この場合抗癌剤は急速に分裂する癌細胞を標的とする。ほとんどの化学療法アプローチには、一つより多い抗癌剤の併用が含まれ、これによって、多様な癌の反応率が増加することが証明されている（参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,824,348号；米国特許第5,633,016号；および米国特許第5,798,339号）。化学療法剤の主な副作用は、それらが正常組織にも影響を及ぼす点であり、急速に分裂する細胞（例えば、骨髄、消化管、生殖器および卵胞）は影響を受ける可能性が最も高い。化学療法剤のその他の毒性の副作用は、口の爛れ、嚥下困難、口の渇き、悪心、下痢、嘔吐、疲労、脱毛、および感染症である。
【００１０】
癌研究において急速に発展しつつある領域である免疫療法もまた、特定のタイプの癌治療のもう一つの選択肢である。例えば、免疫系は腫瘍細胞を異物であると同定して、このように、免疫系による破壊の標的となる。残念なことに、反応は典型的に、ほとんどの腫瘍の増殖を防止するほど十分ではない。しかし、最近、免疫療法の領域では、免疫系の天然の防御メカニズムを増強または補助する方法を開発することに注目が集まっている。現在治験中または使用されている免疫療法の例には、免疫アジュバント（例えば、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物）（米国特許第5,801,005号；米国特許第5,739,169号；Hui and Hashimoto、1998；Christodoulidesら、1998）、サイトカイン療法（例えば、インターフェロン）および（IL-1、GM-CSF、およびTNF）（Bukowskiら、1998；Davidsonら、1998；Hellstrandら、1998）、遺伝子治療（例えば、TNF、IL-1、IL-2、p53）（Qinら、1998；米国特許第5,830,880号および米国特許第5,846,945号）、およびモノクローナル抗体（例えば、抗ガングリオシドGM2、抗HER-2、抗p185）（Pietrasら、1998；Hanibuchiら、1998；米国特許第5,824,331号）である。
【００１１】
4．遺伝子治療
遺伝子治療は、患者の体細胞に治療的組換え型核酸を導入することによって疾患の治療に焦点を当てる生物医学研究の新しい領域である。遺伝子治療を用いる様々な臨床試験が開始されており、これらには様々な癌、AIDS、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠損、心血管疾患、ゴーシェ病、リウマチ性関節炎およびその他の治療が含まれる。現在、アデノウイルスが遺伝子治療物質の好ましい輸送媒体である。遺伝子治療物質としてアデノウイルスを用いる長所は、高い形質導入効率、非分裂細胞の感染、そのゲノムの容易な操作、および宿主ゲノムとの非相同的組換えの起こる確率が低いことである。
【００１２】
5．サイトカイン
IL-10は免疫系の細胞のみならずいくつかの腫瘍細胞によって産生される多面発現性のホモ二量体サイトカインである（Howardら、1992；Ekmekciogluら、1999）。その免疫抑制機能には、IFNγ、TNFα、およびIL-6を含む前炎症性サイトカイン合成の強力な阻害が含まれる（De Waal Malefytら、1991）。IL-10様サイトカインファミリーは、染色体1q32上で小さい195 kbの遺伝子クラスターにおいてコードされ、IL-10と構造的および配列相同性を有する多くの細胞タンパク質（IL-10、IL-19、IL-20、MDA-7）からなる（Mooreら、1990；Kotenkoら、2000；Gallagherら、2000；Blumbergら、2001；Dumoutierら、2000；Knappら、2000；Jiangら、1995a；Jiangら、1996）。MDA-7はIL-10ファミリーメンバーとして特徴が調べられ、IL-24としても知られる。
【００１３】
染色体上の位置、転写調節、マウスおよびラット相同体発現、および推定のタンパク質構造は全て、MDA-7がサイトカインであることを示唆している（Knappら、2000；Schaeferら、2000；Sooら、1999；Zhangら、2000）。その全てが迅速な分解のためにその3' UTRターゲティングmRNAにおいてAUに富む要素を含むGM-CSF、TNFα、およびIFNγ転写物と同様に、MDA-7は、その3' UTRに三つのAREsを有する（Wangら、2002）。MDA-7 mRNAは、ヒトPBMCにおいて同定されているが（Ekmekciogluら、2001）、ヒトMDA-7タンパク質のサイトカイン機能はこれまで報告されておらず、MDA-7は遺伝子およびタンパク質配列特徴（NCBIデータベースアクセッション番号XM_001405）に基づいてIL-24と呼ばれている。マウスMDA-7タンパク質相同体FISP（IL-4誘導分泌型タンパク質）は、Th2特異的サイトカインであると報告された（Schaeferら、2001）。FISPの転写は、ノックアウト研究によって証明されたように、TCRおよびIL-4受容体の関与ならびにその後のPKCおよびSTAT6活性化によって誘導される。FISPの発現は特徴が調べられているが、この推定のサイトカインの機能はまだ不明であった（Wangら、2002）。ラットMDA-7相同体C49a（Mob-5）は、mda-7遺伝子と78％相同であり、創傷治癒に関連している（Sooら、1999；Zhangら、2000）。Mob-5も同様に、分泌型タンパク質であることが示され、推定の細胞表面受容体がラット形質転換細胞において同定された（Zhangら、2000）。したがって、mda-7遺伝子の相同体および分泌型MDA-7タンパク質は、様々な種において発現および分泌されている。しかし、MDA-7がサイトカイン活性を有することを示したデータは現れていない。そのような活性は、治療的免疫応答を促進する、または抗原の免疫原性を増強することによって、広汎な疾患および感染症の治療に関す選択肢を有する。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明は、MDA-7を精製する方法および精製MDA-7に関すると共に、治療的および予防的治療のみならず診断アッセイにおけるMDA-7タンパク質、またはMDA-7をコードする核酸を含む方法および組成物に関する。
【００１５】
MDA-7を精製する多様な態様を本明細書において提供する。精製MDA-7はいくつかの態様においてヒトMDA-7であり、これは完全長であってもよく、またはその切断型もしくは断片であってもよい。他の態様において、MDA-7は、マウス、ラット、およびサルを含む別の哺乳動物のような他の種または起源に由来する。いくつかの態様において、MDA-7はグリコシル化されるが、他の態様においてMDA-7は非グリコシル化である。いくつかの場合において、MDA-7はそのシグナル配列を欠損するが、場合によっては異種シグナル配列を有する。これらのMDA-7ポリペプチドは全て、本発明の方法によって精製することができる。
【００１６】
本明細書において記述される精製法は、少なくとも約20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、および約100％均一になるまで精製されているMDA-7タンパク質を生じる。または、MDA-7タンパク質は、少なくとも、または多くて約20〜95％、30％〜90％、40％〜80％、50％〜75％、20％〜50％、50％〜70％、50％〜90％、70％〜90％およびそのあいだの範囲まで精製される。「均一性」という用語は、タンパク質精製に関する当業者にとってその平易な通常の意味に従って用いられ、特定のタンパク質の純度レベルを指すと理解される。百分率に関して用いる場合、この用語は、タンパク質の全量と比較した（分子で）MDA-7タンパク質の百分率を指すと理解される。「均一な」という用語は、均一性のレベルを示す形容詞である。「約」という用語はタンパク質の量を決定する場合の不正確さを指し、任意の特定のアッセイの場合、誤差の少なくとも1標準誤差、またはタンパク質濃度を測定する場合の較正が含まれると意図される。例えば、タンパク質濃度および均一性を、クーマシーゲル染色によるゲル電気泳動によって測定する場合、少なくとも約25％均一まで精製されているMDA-7とは、分子による総タンパク質濃度と比較した場合にゲル上の試料が、クーマシー色素によって染色したタンパク質ゲルに関して少なくとも25％MDA-7プラスマイナス標準偏差であることを意味する。
【００１７】
さらに、精製MDA-7の組成は、その20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％および約100％までが活性であるMDA-7タンパク質を有してもよいと企図される。
【００１８】
薬理学的または薬学的に許容される溶液または組成物の状況において、均一性に関してMDA-7の純度と言う場合、「混入タンパク質」が望ましくないまたは望まないタンパク質を指す任意の混入タンパク質のタンパク質濃度と比較して、溶液または組成物のどれほどの量がMDA-7であるかを指す。区別は、それに対してMDA-7が免疫応答を誘発するために用いられる免疫原性ポリペプチドのような、溶液または組成物中に意図的に加えられたタンパク質によるタンパク質濃度を除外することを意味する。
【００１９】
本発明の多くの態様において、精製MDA-7タンパク質は活性である。「活性」という用語は一般的に、精製MDA-7タンパク質がMDA-7の何らかの活性を有することを意味する。これは、百分率によって定義されてもよく、いくつかの態様において、精製MDA-7タンパク質は、任意の明記されたMDA-7活性に関するアッセイによって対照MDA-7ポリペプチドと少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％および約100％まで同程度に活性である。そのような活性は、以下の任意が含まれるがこれらに限定されない活性であると定義してもよい：結合活性、機能的活性（アポトーシスの誘導能、血管新生阻害能、または抗血管新生誘導能、IL-22結合能、STAT3活性化能、PKR調節能、および免疫応答誘導能が含まれるがこれらに限定されない）、翻訳後改変能（グリコシル化）、適当な三次構造形成能、適切な局在能。
【００２０】
MDA-7タンパク質の精製法は、個別に、または他と組み合わせて用いてもよい多くの段階を含む。MDA-7は組換え型MDA-7または非組換え型MDA-7（例えば、内因性のMDA-7発現ゲノム遺伝子から）を発現する細胞から精製することができる。組換え型MDA-7を発現する細胞の場合、宿主細胞タイプは、MDA-7が翻訳後改変されるか否かに関して役割を有するであろう。特定の態様において、MDA-7をグリコシル化させる真核細胞が、MDA-7タンパク質の宿主細胞または細胞源として用いられる。このように、細胞は、真核細胞または原核細胞であってもよく、特に、哺乳類、昆虫、細菌、ヒト、または真菌細胞であると企図される。いくつかの態様において、MDA-7タンパク質を含む細胞抽出物または上清を調製して、クロマトグラフィーを含む異なる精製段階を行う。
【００２１】
精製されるMDA-7は、タンパク質の分泌型であってもよく、これは配列番号：2として同定される完全長のタンパク質のアミノ酸49〜206位に対応する。または精製MDA-7は完全長であってもよく、または異種N-末端領域もしくは異種シグナル配列のような一つもしくはそれ以上の異種アミノ酸領域を有してもよい。その上、タンパク質はグリコシル化されてもよい。MDA-7のグリコシル化は、異なる位置および異なる程度で起こってもよい。精製MDA-7は均一にグリコシル化されなくてもよいと企図される。さらに、MDA-7は二量体のような複合体の一部として精製してもよいと企図される。
【００２２】
特定の態様において、アフィニティクロマトグラフィーを用いる。本発明の方法において、アフィニティクロマトグラフィーは抗MDA-7抗体を含む。MDA-7に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が特に企図される。一つより多いモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いてもよく、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方を同時に用いることも企図される。他の態様において、アフィニティクロマトグラフィーは、MDA-7とタンパク質配列に基づいていない他の分子との親和性を含む。本発明のいくつかの局面において、グリコシル化分子に結合するレクチンを用いる。MDA-7に対する親和性の基礎となる分子は、いくつかの場合において、セファロースのような非反応性材料となりうる樹脂と複合体を形成する。本発明のいくつかの態様に従って、アフィニティ樹脂のカラムを作製することができる。細胞抽出物または上清を本発明の一部として樹脂に通過させることができる。いくつかの態様において、抗体を含むアフィニティクロマトグラフィーの後、濃縮または精製タンパク質を、如何なる混入抗体にも結合するプロテインAに露出する。プロテインAは、これを濃縮または精製MDA-7からその後分離することができるように、カラムまたはビーズのような非反応性構造と複合体を形成するまたは結合させてもよい。
【００２３】
用いてもよい他のタイプのクロマトグラフィーは、イオン交換、特に陰イオン交換クロマトグラフィーである。さらに、クロマトグラフィーには、サイズ排除クロマトグラフィーのような非反応性精製プロセスが含まれる。サイズ排除には、ゲル電気泳動、サイズ排除カラムにおけるビーズの使用、または分子の大きさを区別するために任意の他のタイプの非反応性物理的構造が含まれるがこれらに限定されないと企図される。いくつかの場合において、少なくとも一つ、二つ、三つ、四つ、五つまたはそれ以上の異なるタイプの精製段階を用いる。MDA-7を精製するために、アフィニティクロマトグラフィーを陰イオン交換クロマトグラフィーと組み合わせることが特に企図される。さらなる態様において、サイズ排除クロマトグラフィーをさらに用いる。一つの態様において、試料にアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、次に陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。各クロマトグラフィー技法の後、タンパク質担体を試料に加えてもよく、および／または試料に透析またはサイズ排除技法に行ってもよい。用いる精製プロセスのタイプに応じて、いくつかの態様において、IL-22もしくはIL-20受容体またはPKRのような、MDA-7に結合するポリペプチドを含めるまたは排除するプロセスを選択する。このように、本発明の精製法は、MDA-7単量体、MDA-7複合体‐グリコシル化または非グリコシル化、およびMDA-7（単量体または複合体として）に直接または間接的に結合するタンパク質を精製するために用いることができると特に企図される。
【００２４】
特定の態様において、タンパク質担体は、クロマトグラフィーを行う前、あいだ、または後に添加される。タンパク質担体は、任意のクロマトグラフィーまたは他の濃縮段階の前に、細胞抽出物または上清に加えてもよい。場合によっては、MDA-7を安定化させるために、MDA-7をカラムから溶出した後に担体を添加する。特定の態様において、タンパク質担体はアルブミンである。アルブミンはヒトを含む多様な起源の一つに由来してもよい。いくつかの態様において、アルブミンはBSAである。さらに、タンパク質担体は、精製プロセスのその後の段階のあいだに除去してもよい。
【００２５】
陰イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技法の際に、塩勾配を用いてもよい。本発明のいくつかの態様において、濃度0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25 Mまたはそれ以上の塩溶液を用いてもよく、分画のあいだを約0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050、0.055、0.060、0.065、0.070、0.075、0.080、0.085、0.090、0.095、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 Mまたはそれ以上まで増加させてもよい。いくつかの態様において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、濃度1.0 Mまでの塩の段階的勾配を含む。さらなる態様において、MDA-7タンパク質は、塩濃度約0.9 M〜1.0 Mの溶液中でカラムまたは他の物理的構造から溶出される。用いられる塩は、本発明の特定の態様においてNaClである。
【００２６】
クロマトグラフィー技法の際に、一つまたはそれ以上の洗浄段階が存在してもよい。いくつかの場合において、MDA-7タンパク質を有する細胞抽出物または上清に樹脂を接触させた後、樹脂を洗浄する。洗浄溶液は緩衝液を含んでもよく、多くて約0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00 Mまたはそれより低い塩濃度を有する。洗浄段階の後、溶出段階を行ってもよい。いくつかの態様において、1 Mまたはそれ以上の塩濃度を有し、pHが5.0未満である溶液を用いる。溶出液のpHは多くて約5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、またはそれ未満であってもよい。
【００２７】
溶出後、本発明のいくつかの態様に従って中和段階を行うことができる。中和は特定の態様において緩衝液を含む。
【００２８】
本発明には、本発明の任意の方法に従って精製されているMDA-7タンパク質を含む組成物が含まれる。上記のように精製MDA-7タンパク質は、本発明の一部であると見なされる。
【００２９】
精製MDA-7を用いることも同様に本発明の一部として含まれる。いくつかの態様において、活性であって少なくとも約80％均一である精製MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における血管新生を阻害する方法が存在する。
【００３０】
他の態様において、活性であって少なくとも約80％均一である精製MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、癌患者を治療する方法が存在する。さらなる態様において、方法にはまた、患者に放射線療法または化学療法を行うことが含まれる。上皮癌細胞を含む癌を有する癌患者、または黒色腫を有する癌患者は、本発明の方法によって利益を受けることができると特に企図される。内皮細胞はMDA-7が結合する受容体を発現する。放射線療法とMDA-7投与とを併用すると、腫瘍関連内皮のアポトーシスが起こる。このように、ヒト腫瘍のMDA-7による治療は、その細胞がMDA-7受容体を発現する腫瘍に限定されない。さらに、その癌細胞がMDA-7の受容体を発現する白血病またはリンパ腫を有する患者も同様に、MDA-7の投与によって利益を受けることができる。
【００３１】
その上、本発明は、免疫原性分子と、活性であって少なくとも約80％均一である精製MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物とを患者に投与することを含む、患者における免疫原性分子に対する免疫応答を誘導する方法に関する。「均一な」という用語は、MDA-7タンパク質が均一になるまで精製されている程度を指す。上記のように、組成物は、それらがMDA-7の純度の程度に対する如何なる言及にも影響を及ぼさないように、望ましい、および望ましくない混入物である他のタンパク質を含んでもよい。本発明のさらなる態様において、患者においてそれに対する免疫応答が望ましい免疫原性分子は、ウイルス、細菌、真菌、または腫瘍抗原である。さらなる態様において、インターフェロンを患者に投与する。インターフェロンはIFN-α、IFNβ、IFN-γ、またはλIFNsであってもよい。さらなる態様において、サイトカインまたは他の免疫刺激分子を患者に投与する。
【００３２】
本発明のもう一つの方法は、腫瘍の抗血管新生を誘導するためにMDA-7タンパク質を用いることに関する。腫瘍は血管を形成するようになり、腫瘍の周囲に血管新生が誘導される。本発明は、MDA-7ポリペプチドを用いて抗血管新生を誘導することによって、そのプロセスを阻害または逆転させる。「抗血管新生を誘導する」という句は、脈管形成の逆転もしくは阻害、または既に始まっている血管新生の阻害を指す。いくつかの態様において、腫瘍を有する患者に、IL-22受容体陽性細胞上のIL-22受容体に結合して、腫瘍の抗血管新生を誘導するために有効な量のMDA-7ポリペプチドを投与する。IL-22受容体陽性細胞は、MDA-7に結合するIL-22受容体をその表面に発現する細胞である。このように、いくつかの態様において、患者のIL-22受容体陽性細胞にMDA-7の有効量を投与する。さらなる態様において、IL-22受容体陽性細胞は内皮細胞である。したがって、患者における内皮細胞にMDA-7ポリペプチドを投与してもよいと企図される。さらに、これらの細胞は、腫瘍または腫瘍細胞に隣接する（「隣接する」または「隣に存在する」）必要はない。それらは腫瘍に関して離れて（隣接しないで）もよいと企図される。その上、いくつかの態様において、MDA-7ポリペプチドは分泌型MDA-7であり、グリコシル化される。
【００３３】
本発明にはまた、腫瘍を有する患者を含む癌患者に対するMDA-7の時間的および／または空間的な多数回投与に関連する方法および組成物が含まれる。したがって、本発明のいくつかの態様において、腫瘍における第一の部位にi）MDA-7ポリペプチド、またはii）プロモーターの制御下で、MDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、のいずれかを含む薬学的に許容される組成物を注射すること；および腫瘍における第二の部位に組成物を注射することを含む、腫瘍を有する患者を治療する方法が存在する。患者には、MDA-7タンパク質またはMDA-7をコードする核酸を含む組成物を、少なくとも、多くとも、または以下の回数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回またはそれ以上投与してもよいと企図される。このように、その部位にMDA-7組成物（MDA-7タンパク質またはMDA-7タンパク質をコードする核酸を含む組成物を指す）を注射してもよい腫瘍内の少なくとも、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20カ所の注射部位が存在してもよい。「注射部位」とは、針または他の穿刺装置が患者に接触する点を指す。注射部位は、腫瘍の表面に沿って、または腫瘍の任意の平面に沿って、互いに
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ミリメートルまたはそれ以上の範囲内であってもよい。1カ所より多い注射を行う場合、2カ所またはそれ以上、または全ての注射は互いに関して均等に離れていてもよいと特に企図される。
【００３４】
MDA-7組成物はまた、末梢のような腫瘍外に注射してもよいと企図される。いくつかの態様において、組成物は、腫瘍の24、20、16、12、8、4、または2ミリメートル以内に注射される。
【００３５】
本発明のいくつかの態様において、注射は一回行われ、その後の注射は一回目を行った直後に行われる。または、注射の時間間隔があいてもよい。したがって、その後の注射は、前回の注射から少なくとも、または多くて
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の範囲内であってもよいと企図される。
【００３６】
さらに、本発明には、一つまたはそれ以上の化学療法、放射線療法、遺伝子治療、および／または免疫療法を用いることを含む、併用治療戦略が含まれる。
【００３７】
特に明記していない限り、精製MDA-7は、真核細胞または原核細胞から精製してもよいと理解されるであろう。場合によっては、MDA-7はMDA-7をコードする核酸をトランスフェクトした原核細胞から精製される。そのような状況において、MDA-7は、グリコシル化されるが、それでもなお本発明のいくつかの方法において利用することができる。他の態様において、MDA-7は真核細胞から精製され、場合によっては哺乳類細胞から精製されると特に企図される。特定の態様において、MDA-7は、マウス、ラット、サル、ハムスター、またはヒト細胞から精製される。MDA-7は、それらの細胞において内因性に産生される、または外因性に産生されてもよい。
【００３８】
本発明の他の方法には、過増殖性疾患、特に癌の治療として精製MDA-7を用いることが含まれる。このように、本発明のいくつかの態様において、特定の均一性まで精製されて活性である精製MDA-7を含む薬学的組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法が存在する。本発明の方法の一部として用いることができる均一性の百分率には、本明細書に記述の任意の百分率が含まれる。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、患者にはまた、放射線療法を行ってもよい。本発明には、特に細胞の放射線増感を含む方法が含まれる。「放射線増感」という用語は、細胞を放射線に対してより感受性にすることを含む。このように、放射線治療前に細胞の放射線増感を行うと、放射線治療前に放射線増感していない細胞より、放射線に対する細胞の感受性は増加する。このように、本発明のいくつかの態様において、MDA-7を用いて細胞を放射線増感する方法が存在する。
【００４０】
周知の癌治療である放射線療法は、精製MDA-7タンパク質の投与前または投与後に患者に行うことができる。患者に精製MDA-7タンパク質の用量を投与する時間の少なくとも、または多くとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分以内、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、86、84、90、96、102、108、114、120、126、130、136、142時間または1、2、3、4、5、6、7日または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週間またはそれ以上、またはその組み合わせの期間以内に、患者に放射線療法少なくとも1コースを行ってもよいと企図される。特定の態様において、患者に、精製MDA-7タンパク質療法の用量を投与する96時間以内に放射線療法を行う。放射線療法、MDA-7タンパク質、またはその双方に関する多数回の投与または治療コースを患者に行ってもよいと企図される。本明細書において考察した如何なる癌または癌細胞も、精製MDA-7タンパク質および／または放射線療法によって治療してもよいと企図される。特定の態様において、治療される癌は、膵臓起源の癌であるか、または癌は黒色腫である。精製MDA-7タンパク質は、癌または腫瘍細胞に隣接するまたは近傍に存在する非癌様細胞に投与してもよいと特に企図される。
【００４１】
特定の態様において、方法には、核酸が細胞において機能的なプロモーターの制御下に存在する、MDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターの有効量を細胞に投与することを含む、癌細胞を放射線増感することが含まれる。他のベクターも同様に用いてもよい。さらに、本発明の他の方法の場合と同様に、MDA-7ポリペプチドをコードする発現構築物の代わりに、精製MDA-7を投与してもよく、その逆を行ってもよい。癌細胞は上皮細胞であってもよく、または本明細書に記述の他の任意の癌細胞であってもよい。
【００４２】
本発明はさらに、プロタミンと併用したMDA-7コードポリヌクレオチド、発現構築物、またはベクターを含む方法に関する。プロタミンは、MDA-7核酸分子と共に組成物に存在しうる荷電分子であり、またはプロタミンはMDA-7核酸分子と複合体を形成することができる。
【００４３】
本発明の他の方法には、タモキシフェンと、精製MDA-7タンパク質またはプロモーターの制御下でMDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターのいずれかとを投与することによって、被験者または癌患者における癌細胞を治療する方法が含まれる。タモキシフェンは、MDA-7タンパク質またはアデノウイルスベクターと同時に投与してもよく、またはそれらの前もしくは後に投与してもよい。タモキシフェンは、患者に精製MDA-7タンパク質またはアデノウイルスベクターを投与する時間の少なくとも、または多くとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分以内、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、86、84、90、96、102、108、114、120、126、130、136、142時間または1、2、3、4、5、6、7日または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12週間またはそれ以上、またはその組み合わせの期間以内に患者に投与してもよいと企図される。
【００４４】
本発明のさらなる態様には、特定の百分率の均一性まで精製され、活性である精製MDA-7タンパク質の有効量を細胞に投与することを含む、細胞におけるSTAT3活性化を誘導する方法が含まれる。方法の一部として用いることができる均一性の百分率には、本明細書に記述の任意の百分率が含まれる。「STAT3活性化」という句は、STAT3ポリペプチドの活性を誘発することを指す。STAT3活性化は、本明細書の実施例に記載の方法を用いて検出することができる。
【００４５】
本発明の他の方法は、平滑筋細胞を阻害するためにMDA-7を用いることに関する。したがって、いくつかの態様において、精製MDA-7タンパク質またはプロモーターの制御下でMDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターのいずれかを含む組成物の有効量を細胞に投与することを含む、平滑筋細胞を阻害する方法が存在する。平滑筋細胞の阻害には、アポトーシスを受けるように細胞を誘導すること、または細胞の遊走を阻害することが含まれる。
【００４６】
本発明はさらに、NF-κB阻害剤と、精製MDA-7タンパク質またはプロモーターの制御下でMDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターのいずれかを含む組成物とを投与することを含む、患者における癌または癌細胞を治療する方法に関する。NF-κB阻害剤は、NF-κB阻害の発現または活性を阻害する物質を指す。いくつかの態様において、NF-κB阻害剤はスリンダクである。他の態様において、NF-κB阻害剤は、I-κBタンパク質またはI-κBをコードする核酸を含むベクターである。患者に、MDA-7とNF-κB阻害剤の双方をコードする単一のベクターを投与してもよく、または患者に異なるベクターを投与してもよいと特に企図される。同様に、患者に、一つまたはそれ以上のベクターおよび／または一つまたはそれ以上のタンパク質を含む単一の組成物を投与してもよい。
【００４７】
本発明の方法にはまた、荷電分子プロタミンを含む癌の治療が含まれる。いくつかの態様において、本発明は、（a）プロタミン分子；および（b）プロモーターの制御下でヒトMDA-7ポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物、を含むウイルス組成物の有効量を癌患者に投与することを含む、癌を治療する方法に関する。プロタミン分子は、本発明のいくつかの態様において発現構築物と複合体を形成すると企図される。ウイルス組成物は、ウイルス粒子約108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015個またはそれ以上対プロタミン約
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μgの比率を含んでもよい。特定の態様において、ウイルス組成物は、ウイルス粒子約1010または1011個対プロタミン約100 μgプロタミン、プロタミン約200 μg、またはプロタミン約300 μgの比率を含む。
【００４８】
本発明の方法および組成物において用いられるMDA-7ペプチドまたはポリペプチドは、配列番号：2の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200、または206隣接アミノ酸を含んでもよく、または配列番号：2の全てを含んでもよい。組換え型MDA-7ポリペプチドは、改変されてもよく、またはいずれかの末端で切断型であってもよい。いくつかの態様において、MDA-7ポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸49〜206位、75〜206位、または100〜206位を含む。MDA-7の分泌型は、配列番号：2のアミノ酸49〜206位を有するが、最初のアミノ酸48個は存在せず、分泌型は、「MDA-7ポリペプチド」としての資格を有し、本発明の任意の組成物または方法において用いてもよいと特に企図される。または、MDA-7アミノ酸配列には、分泌シグナルのような異種アミノ酸配列が含まれてもよい。いくつかの態様において、分泌シグナルは、疎水性のコアを有する陽性荷電N-末端領域である。他の態様において、分泌シグナルはMDA-7またはその切断型を小胞体またはミトコンドリアにターゲティングする。
【００４９】
発現構築物はウイルスまたは非ウイルスベクターであってもよい。本発明の一部であると見なされるウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、ポリオーマウイルス、またはワクシニアウイルスが含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
本発明の方法および組成物によって治療してもよい癌細胞には、膀胱、血液、骨髄、脳、乳腺、結腸、食道、消化管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮からの細胞が含まれる。さらに、癌は特に、以下の組織学的タイプの癌であってもよいがこれらに限定されない：新生物、悪性：癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛質性上皮腫；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；複合肝細胞癌胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；線腫様ポリープの腺癌；腺癌、家族性腺腫性ポリポーシス；固形癌；癌腫様腫瘍、悪性；気管支肺胞腺癌；乳頭状腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭濾胞状腺癌；非封入硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜様癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮腺癌；嚢胞腺癌；乳頭状濾胞腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；ページェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生随伴腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；男性胚細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；クロム親和性細胞腫；グロムス肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大性黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；混合腫瘍、悪性；ミューラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；癌肉腫；間葉細胞腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；phyllodes腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛上皮腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯性腫瘍、悪性；エナメル芽細胞歯牙肉腫；エナメル芽細胞腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；脳室上皮腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；原線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核球白血病；骨髄性肉腫；およびヘアリーセル白血病。
【００５１】
組成物は、細胞または被験者に静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所、局所、または吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続的注入、標的細胞を直接浴する局所潅流、カテーテルによって、洗浄によって、クリーム、または脂質組成物において投与してもよい。
【００５２】
本発明の他の局面は、診断または予後目的に役立つ。本発明には、（a）被験者から試料を得る段階；（b）過増殖組織の試料におけるMDA-7発現を測定する段階；（c）過増殖組織の試料におけるiNOS発現を測定する段階；および（d）MDA-7発現レベルをiNOS発現レベルと比較する段階、を含む癌を有すると診断された、または癌を有することが疑われる被験者における癌の進行を評価する方法が含まれる。実施例において示すように、iNOS発現は、MDA-7発現レベルが上昇している場合、または非黒色腫皮膚細胞のような正常細胞において一般的に認められるレベルで存在する場合のiNOSの発現レベルと比較して、MDA-7発現レベルが低いまたは存在しない場合にはより高い。特定の試料中のMDA-7発現レベルとiNOS発現レベルの相対比を、癌の評価または診断の一部として計算することができる。MDA-7またはiNOSの発現は、当業者に周知の技術に従って、タンパク質または転写物レベルに基づいて決定することができる。比率は、標準物質または非癌様細胞から得た対照と比較することができる。
【００５３】
さらに、MDA-7対iNOSの比またはレベルを用いて、癌治療に対する反応を評価することができる。iNOS発現の減少は治療の正の指標として役立つ。いくつかの態様において、MDA-7による治療をモニターする。したがって、（a）MDA-7の治療前後に被験者から試料を得る段階、および（b）試料中のiNOS発現レベルを比較する段階、を含む、被験者における癌の治療に対する反応を測定する方法が存在する。上記のように、MDA-7による治療は、精製および活性なMDA-7タンパク質、またはプロモーターの制御下でヒトMDA-7ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現カセットのいずれかの有効量を被験者に投与することを含みうる。
【００５４】
本発明の方法は、多様な癌について用いるために企図されるが、特定の態様において、これは転移性黒色腫癌を含む黒色腫の癌に適用される。患者は、患者の問診、既往、予備試験結果、または患者が癌を有するもしくは癌のリスクを有することを示唆する他の指標／要因に基づいて、癌を有することが疑われる患者であってもよい。
【００５５】
本発明は、卵巣癌を有する患者を治療する方法にも関する。本発明の特定の態様は、MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、卵巣癌を有する患者を治療する方法に関する。例えば、MDA-7タンパク質は、少なくとも約80％均一である活性な実質的に精製されたMDA-7タンパク質であってもよい。他の態様は、i）MDA-7ポリペプチド、またはii）プロモーターの制御下でMDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクター、のいずれかを含む薬学的に許容される組成物の有効量を腫瘍における第一の部位に注入すること、および腫瘍における第二の部位に組成物を注入することを含む、卵巣腫瘍を有する患者を治療する方法に関する。アデノウイルスベクターを用いることに関する方法は本明細書を通して開示される。考察される場合、これらの方法は、卵巣癌の治療のために用いられるMDA-7の組成物に適用される。
【００５６】
本発明の他の態様は、腫瘍におけるAPC発現を誘導する物質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、腫瘍を有する患者を治療する方法を含む。腫瘍においてAPCを誘導する任意の物質が本発明によって企図される。例えば、物質は、低分子、核酸、またはタンパク質様組成物となりうる。特定の態様において、物質はMDA-7、MDA-7ポリペプチド、またはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物である。発現構築物を用いることに関する方法は本明細書を通して考察される。当業者は、発現構築物を用いること、この点に関して利用できる広範な方法論を承知しているであろう。
【００５７】
APC発現を誘導する物質の如何なる投与方法も、本発明によって用いるために企図される。当業者は、患者に物質を輸送するために利用できる広範な手段を承知しているであろう。例えば、物質は、静脈内、腫瘍内、または経口投与することができる。本発明のいくつかの態様において、組成物は、腫瘍におけるβ-カテニン発現を減少させる組成物としてさらに定義される。腫瘍におけるβ-カテニン発現を測定する方法には、当業者に既知の任意の方法が含まれる。これらの方法の例は、本明細書において他所で考察されている。
【００５８】
本発明のいくつかの態様において、組成物は、被験者におけるβ-カテニン発現を減少させる。例えば、β-カテニン発現の減少は、被験者の腫瘍内に存在してもよい。
【００５９】
本発明の他の態様は、（1）候補物質を第一の癌細胞に接触させる段階；（2）第一の癌におけるAPC発現を測定する段階；および（3）第一の癌細胞におけるAPC発現を候補物質に接触していない第二の癌細胞と比較して、第一の癌細胞におけるAPC発現が増加すれば、候補物質が候補抗癌化合物であると同定される段階、を含む抗癌化合物をスクリーニングする方法を含む。これらの方法は、第一および第二の癌細胞におけるβ-カテニンを測定すること、およびβ-カテニン発現が第二の癌細胞と比較して第一の癌細胞において減少しているか否かを決定する段階を含んでも含まなくてもよい。β-カテニン発現の測定を含む段階は、APCの測定を含む段階に依存してもしなくてもよい。任意の候補物質が本発明によって企図され、当業者は、利用可能な広範なタイプの候補物質を周知しているであろう。例えば、候補物質は低分子、核酸、またはタンパク質様組成物であってもよく、β-カテニンリボザイム、siRNA、またはアンチセンス分子が含まれてもよい。
【００６０】
本発明にはまた、配列番号：2のアミノ酸175〜206位および小胞体ターゲティング配列を含むポリペプチドが含まれる。配列番号：2のアミノ酸配列は本明細書において他所で提供される。配列番号：2のアミノ酸残基175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、および206位を含むポリペプチドが特に企図される。配列番号：2のアミノ酸175〜206位は隣接アミノ酸残基であると企図される。
【００６１】
本発明の他の態様において、ポリペプチドには、配列番号：2のアミノ酸150〜206位および小胞体（ER）ターゲティング配列が含まれる。さらなる態様において、ポリペプチドには、配列番号：2のアミノ酸100〜206位および小胞体ターゲティング配列が含まれる。なおさらなる態様において、ポリペプチドには、配列番号：2のアミノ酸49〜206位および小胞体ターゲティング配列が含まれる。これらの態様のそれぞれにおいて、配列番号：2のアミノ酸は、隣接アミノ酸残基であると企図される。ERターゲティング配列は、本発明のいくつかの態様において、切断型MDA-7ポリペプチドのN-末端部分に機能的に結合している。本明細書において記述され、当業者に既知であるER-ターゲティング配列は、MDA-7ポリペプチドの状況において本発明の局面であると企図される。
【００６２】
本発明の態様は、ER残留シグナルを含んでも含まなくてもよい。当業者は、ERターゲティング配列および小胞体残留シグナルを周知しているであろう。
【００６３】
本発明はまた、上記のMDA-7配列をコードする核酸とERターゲティング配列とを含む発現カセットを企図する。発現カセットは、本明細書を通して考察され、発現カセットに関して考察する本明細書の章は、配列番号：2のアミノ酸をコードする核酸が含まれる発現カセットにも当てはまる。
【００６４】
さらに、本発明は、MDA-7タンパク質ならびにIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される一つまたはそれ以上のインターロイキンを含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、癌を有する患者を治療する方法に関する。さらに、MDA-7は、本発明の任意の方法において他のインターロイキンと併用して用いることができると企図される。
【００６５】
特定のインターロイキンは、サイトカイン活性を有することが証明されている。そのようなインターロイキンの例には、IL-19、IL-20、IL-22、およびIL-26が含まれる。サイトカイン活性を有するこれらのインターロイキンは、血管新生を阻害する方法および免疫応答を刺激する方法に関する本発明の方法において、MDA-7と置換することができると企図される。
【００６６】
本発明はまた、MDA-7が、癌の局所浸潤および／または転移を阻害または予防する、MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌の局所浸潤および／または転移を阻害または予防する方法にも関する。当業者に既知の如何なる投与法も本発明によって企図される。当業者は、癌の局所浸潤および／または転移が防止または阻害されたか否かを決定することができるであろう。
【００６７】
本発明は、任意のタイプの原発癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する方法を企図する。例えば、原発癌は、黒色腫、肺の非小細胞癌、肺の小細胞癌、肺癌、肝癌、網膜芽腫、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉、舌、白血病、神経芽腫、頭部、頚部、乳腺、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮種、頚部、消化管、リンパ腫、脳、結腸、または膀胱であってもよい。本発明の特定の態様において、原発癌は肺癌である。例えば、肺癌は肺の非小細胞癌であってもよい。
【００６８】
その上、本発明は、癌を予防する、または化生、異形成、および過形成を含む前癌もしくは前悪性細胞を治療するために用いることができる。同様に、扁平化生、異形成、良性前立腺過形成細胞、過形成病変等のような望ましくないが良性の細胞を阻害するために用いてもよい。癌または癌のいくつかの形への進行は、MDA-7ポリペプチドおよび本明細書において考察されるMDA-7コード核酸を含む発現構築物を含む本発明の方法によって、停止、破壊、または遅延される可能性がある。
【００６９】
MDA-7を調製または製剤化する如何なる方法も、本発明の方法に含まれると企図される。特定の態様において、MDA-7は本発明の本概要において先に述べた任意の方法に従って精製される。例えば、MDA-7は、MDA-7タンパク質を含む細胞抽出物または上清に、アフィニティクロマトグラフィーを行い、MDA-7が少なくとも20％均一となるまで精製されて活性である、上記の方法によって少なくとも20％均一となるまで細胞から精製してもよい。
【００７０】
本発明の他の局面は、癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止するMDA-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する方法を含む。特定の態様において、MDA-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現構築物に含まれる。例えば、発現構築物には、プロモーターの制御下でMDA-7ポリペプチドをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターが含まれてもよい。
【００７１】
本発明はまた、切除可能な腫瘍を有する患者を同定する段階、その腫瘍を切除する段階、およびMDA-7タンパク質、または真核細胞において機能的なプロモーターとポリヌクレオチドがプロモーターの転写制御下に存在するMDA-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターを腫瘍床に接触させる段階、を含む顕微鏡残留癌を治療する方法のような他の方法を含む。
【００７２】
本発明のさらなる方法は、腫瘍を外科的に露出する段階、腫瘍をMDA-7ポリペプチド、または真核細胞において機能的なプロモーターとポリヌクレオチドがプロモーターの転写制御下に存在するMDA-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターを腫瘍に接触させる段階を含む、腫瘍を有する被験者を治療する方法である。または、MDA-7ポリペプチド、またはMDA-7コード核酸の投与後、腫瘍の全てまたは一部を切除してもよい。この形のアジュバント治療は、本発明の一部であると特に企図される。
【００７３】
本発明は、MDA-7ポリペプチド、または真核細胞において機能的なプロモーターとポリヌクレオチドがプロモーターの転写制御下に存在するMDA-7ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現ベクターによって、腫瘍を長期間にわたって還流する段階を含む、腫瘍を有する被験者を治療する他の方法を含む。
【００７４】
MDA-7をアジュバント療法として用いることも同様に本発明の一部であると企図される。このアジュバント療法は、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、または遺伝子治療が含まれるがこれらに限定されない一つまたはそれ以上の他の癌治療と併用して用いてもよい。例には、手術と化学療法；手術と放射線療法；手術と免疫療法；放射線療法と化学療法；放射線療法と免疫療法；化学療法と免疫療法；手術、放射線療法、および化学療法；手術、化学療法および免疫療法等が含まれる。さらに、化学療法治療は、一つより多い化学療法剤を含んでもよいと企図される。本発明のいくつかの態様において、MDA-7（ポリペプチドまたはコード核酸）を、タキソテール、ハーセプチン、およびAd-mda7と併用して用いてもよいと特に企図される。これは、例えば乳癌を治療するためにかなり有効に用いることができる。上記のように、Ad-mda7も同様に、タモキシフェンと共に用いるために企図される。
【００７５】
（a）（i）手術、放射線療法、化学療法、または免疫療法による癌の前処置、および（ii）治療後の癌の再発、に基づいて患者を選択する段階、および（b）MDA-7ポリペプチド、または患者の癌細胞において活性なプロモーターの制御下であるMDA-7をコードする核酸セグメントを含み、癌細胞においてMDA-7を発現する発現構築物を患者に投与する段階を含む、癌の再発を有する患者を治療する方法が提供される。段階（b）の後に、患者に第二の放射線療法、化学療法、または免疫療法を投与し、それによってMDA-7が癌細胞を第二の放射線療法、化学療法、または免疫療法に対して感作して、それによって癌を治療するその後の段階（c）も同様に提供してもよい。
【００７６】
第一の癌治療および第二の癌治療は、同じまたは異なっていてもよい。患者はヒト以外の動物またはヒト患者であってもよい。第一および／または第二の放射線療法または化学療法は、ブスルファン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、メクロレタミン、メルファラン、5-FU、Ara-C、フルダラビン、ゲンシタビン、メソトレキセート、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンC、ドセタキセル、タキソール、エトポシド、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カンプトテシン、カルムスチン、またはロムスチンのような化学療法であってもよい。第一および／または第二の放射線療法または化学療法は、x-線、γ線、またはマイクロ波のような放射線療法であってもよい。第一および／または第二の放射線療法または化学療法は、DNA損傷療法という特徴を有してもよい。免疫療法は、ハーセプチン（トラスツズマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、エルビツクス（セツキシマブ）、ABX-EGF、ベクスサー、ザバリン、オンコリム、ミロターグ、リンフォシド、またはアレムツズマブのような、特定のタンパク質を標的とするモノクローナル抗体による治療を含んでもよい。
【００７７】
治療される癌は、脳癌、頭頚部癌、食道癌、気管癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮頚癌、子宮癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、皮膚癌、直腸癌、リンパ腫、または白血病であってもよい。
【００７８】
発現構築物は、レトロウイルス構築物、ヘルペスウイルス構築物、アデノウイルス構築物、アデノ随伴ウイルス構築物、またはワクシニアウイルス構築物のようなウイルス発現構築物であってもよい。ウイルス発現構築物は、複製コンピテントウイルスもしくはアデノウイルス、または複製欠損ウイルスもしくはアデノウイルスであってもよい。または、発現構築物は、脂質小胞内に含まれる構築物のような、非ウイルス発現構築物であってもよい。プロモーターは、CMV IE、RSV LTR、β-アクチン、Ad-E1、Ad-E2、またはAd-MLPであってもよい。当業者に既知の他の遺伝子治療ベクターおよびプロモーターも同様に利用してもよい。
【００７９】
段階（b）と（c）のあいだの期間は、約24時間、約2日、約3日、約7日、約14日、約1ヶ月、約2ヶ月、約3ヶ月、または約6ヶ月であってもよい。再発は、原発腫瘍部位または転移部位での再発であってもよい。被験者は、段階（b）の前に外科的切除を受けてもよく、および／または方法は段階（c）の後に外科的切除をさらに含んでもよい。段階（b）における投与は、腫瘍内、腫瘍の血管、腫瘍の局所、腫瘍に対して限局的に、または全身性であってもよい。段階（c）における投与は、腫瘍内、腫瘍血管に、腫瘍の局所、腫瘍に対して限局的に、または全身性であってもよい。
【００８０】
本発明にはさらに、MDA-7に対する免疫応答を誘発する方法および組成物が含まれる。したがって、本発明のいくつかの態様において、MDA-7ポリペプチドまたはこれをコードする核酸の全てまたは一部がワクチンとして被験者に提供される。このワクチンは、癌を含むMDA-7を含む任意の病態または疾患を予防または治療するために用いてもよい。
【００８１】
MDA-7に対する抗体、特にMDA-7活性を中和する抗体を用いることも、同様に本発明の方法および組成物に含まれ、これにはその受容体（IL-20RおよびIL-22Rのような）に対する結合を阻害する抗体が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と共にそのヒト化型を用いて、乾癬、炎症性腸疾患（IBD）、リウマチ性関節炎、および狼瘡を含む炎症疾患、自己免疫疾患および病態を治療することができる。本発明の方法には、MDA-7抗体（抗-MDA-7抗体とも呼ばれる）の有効量を患者に投与することによって行われ、それによって治療利益が付与される治療法が含まれる。治療利益には、症状の回数の減少、症状の重症度の減少、寛解の誘導、炎症または炎症の特徴の減少、疼痛の減少が含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
本発明の一つの態様に関して考察した如何なる制限も、本発明の他の態様に当てはまると特に企図される。さらに、本発明の如何なる組成物を本発明の如何なる方法において用いてもよく、および本発明の如何なる方法を用いて本発明の如何なる組成物を産生または利用してもよい。
【００８３】
請求の範囲において用いられる「または」という用語は、その代用物のみを指すと明確に示している場合を除き、または代用物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するが、開示は、代用物のみならびに「および／または」を指すという定義を支持する。
【００８４】
本明細書を通して、「一つ」または「一つ（an）」とは、そうでないと明らかに明記している場合を除き、一つまたはそれ以上を意味する可能性がある。本明細書において請求の範囲において用いられるように、「含む」という用語に関連して用いる場合、「一つ」または「一つ（an）」という用語は、一つまたは一つより多いことを意味する可能性がある。本明細書において用いられるように、「もう一つ」とは、少なくとも第二またはそれ以上を意味する可能性がある。
【００８５】
実例となる態様の説明
A．MDA-7
本発明の組成物および方法は、MDA-7ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸を用いる。MDA-7は、p53-野生型、p53-ヌル、およびp53-変異体である癌細胞の増殖を抑制することが示されているもう一つの推定の腫瘍抑制因子である。同様に、p53ヌル細胞におけるアポトーシス関連B遺伝子について認められたアップレギュレーションは、MDA-7が、癌細胞の破壊を誘導するためにp53非依存的メカニズムを用いることができることを示している。出願人らは、MDA-7のアデノウイルス媒介過剰発現によって、二本鎖RNA活性化セリントレオニンキナーゼ（PKR）の迅速な誘導および活性化、他のPKR標的基質であるeIF-2αのその後のリン酸化、およびアポトーシス誘導が起こることを認めた。肺癌細胞において2-アミノプリン（2-AP）によってPKRを特異的に阻害すると、Ad-mda7誘導PKR活性化、PKR基質標的リン酸化、およびアポトーシス誘導が消失する。PKRヌル線維芽細胞によって示されるように、Ad-mda7アポトーシスは機能的PKR経路に依存する。これらの特徴は、MDA-7が、PKRの誘導物質として、およびその結果誘導された免疫応答の増強物質として広い治療的、予後的および診断能を有することを示している。
【００８６】
PKRは、抗ウイルスおよび抗細胞機能を発揮して、細胞増殖および分化（米国特許第6,326,466号；Fengら、1992；Petryshynら、1988；Petryshynら、1984；Judwareら、1991）、腫瘍の抑制（Koromilasら、1992；Meursら、1993）およびシグナル伝達経路の調節（Kumarら、1994）を含む多くの生理的プロセスの調節に関係している。
【００８７】
PKRのアップレギュレーションによって、様々な癌細胞株においてアポトーシスが誘導される。さらに、骨髄異形成の場合、染色体5q上のIRF-1遺伝子の重要な腫瘍形成性欠失（Berettaら、1996）は、PKRレベルの減少に関連するように思われ、肺および結腸直腸癌の免疫組織化学分析から、PKR発現と生存の延長との関連が証明されている（Hainesら、1992）。PKRは、最終的に増殖阻害およびアポトーシス誘導に至る多数の伝達経路の活性化を通して抗腫瘍形成活性を媒介するように思われる。これらの経路の活性化は、潜在的な不活化ホモ二量体型が、活性化シグナルによってコンフォメーションの変化を受けるように誘導され、それによって自己リン酸化および活性化が起こった後に起こる（Vattemら、2001）。活性化されると、PKRは、様々な基質標的をリン酸化することができ、これは増殖の制御およびアポトーシスの誘導において重要である（Saelensら、2001；Sudhakarら、2000）。免疫系の刺激は、アポトーシスに連鎖している（Albertら、1998；Chenら、2001；Saif-Muthamaら、2000；Restifo、2001）。さらに、アポトーシスを人工的に誘導すると、アポトーシス細胞のトランスフェクションによって活性化されるようになる樹状細胞の刺激作用によりワクチンの免疫原性を増強することが証明されている（Sasakiら、2001；Chattergoonら、2000）。
【００８８】
mda-7 mRNAはヒトPBMCにおいて同定されているが（Ekmekciogluら、2001）、ヒトMDA-7タンパク質のサイトカイン機能は報告されなかった。MDA-7は遺伝子およびタンパク質配列の特徴（NCBIデータベースアクセッション番号XM_001405）に基づいてIL-24として命名されていた。マウスMDA-7タンパク質相同体FISP（IL-4誘導分泌型タンパク質）は、Th2特異的サイトカインとして報告された（Schaeferら、2001）。FISPの転写は、ノックアウト研究によって証明されるように、TCRおよびIL-4受容体の関与ならびにその後のPKCおよびSTAT6の活性化によって誘導される。FISPの発現は特徴が調べられているが、この推定のサイトカインの機能はまだ不明である17。ラットMDA-7相同体C49a（Mob-5）はmda-7遺伝子と78％相同であり、創傷治癒に関連している（Sooら、1999；Zhangら、2000）。Mob-5も同様に、分泌型タンパク質であることが示されており、推定の細胞表面受容体がras形質転換細胞上で同定された（Zhangら、2000）。したがって、mda-7遺伝子の相同体および分泌型MDA-7タンパク質は、様々な種において発現および分泌されている。しかし、MDA-7がサイトカイン活性を有することを示すデータは現れていない。そのような活性は、抗原の免疫原性を増強することによって、広汎な疾患および感染症の治療の選択肢を有する。
【００８９】
mda-7 cDNA（配列番号：1）は、アミノ酸206個（配列番号：2）の進化的に保存された新規タンパク質をコードし、予想される大きさは23.8 kDaである。推定アミノ酸配列は、シグナル配列の特徴を有するアミノ酸約26〜45個の疎水性の枝を含む。タンパク質配列は、インターロイキン10（IL-10）と54％同一であるアミノ酸42個の枝を例外として既知のタンパク質と有意な相同性を示さない。構造分析から、MDA-7（IL-BKW、またはIL-20）がサイトカインファミリーの構造的特徴を示すことが示された（参照として本明細書に組み入れられる、国際公開公報第98/28425号）。構造的特徴およびアミノ酸の小さい枝間の同一性が限られていることは、MDA-7が細胞外機能を有すること暗示している。MDA-7の発現は、原発性および転移性黒色腫と比較して正常なメラニン細胞においてmRNAレベルが増加していることと共に、ヌードマウスにおける管形成の増強に関して選択された初期の指数的増殖期の黒色腫細胞においてMDA-7発現が減少することによって証明されるように、黒色腫の進行と反比例する。MDA-7に関するさらなる情報およびデータは、その全ての全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、特許出願番号第09/615,154号、第10/017,472号、第60/404,932号、第60/370,335号、第60/361,755号、および2003年3月3日にSunil Chada、Abujiang Pataer、Abner Mhashilkar、Rajagopal Ramesh、Jack Roth、およびSteve Swisherの連名で提出された「Methods for Enhancing Immune Induction Involving MDA-7」と題する米国特許非暫定出願において認められうる。
【００９０】
さらなる研究から、MDA-7の発現の上昇は、インビトロで癌細胞の増殖を抑制し、ヒト乳癌細胞において選択的にアポトーシスを誘導すると共に、ヌードマウスにおいて腫瘍増殖を阻害することが示された（Jiangら、1996およびSuら、1998）。Jiangら（1996）は、mda-7が乳腺、中枢神経系、子宮頚部、結腸、前立腺、および結膜組織を含む多様な起源の癌細胞における強力な増殖抑制遺伝子であるという知見を報告している。コロニー阻害アッセイを用いて、MDA-7の発現の上昇がヒト子宮頚癌（HeLa）、ヒト乳癌（MCF-7およびT47D）、結腸癌（LS174TおよびSW480）、鼻咽頭癌（HONE-1）、前立腺癌（DU-145）、黒色腫（HO-1およびC8161）、多形性神経膠芽腫（GBM-18およびT98G）、および骨肉腫（Saos-2）における増殖阻害を増強したことが示された。正常細胞（HMECs、HBL-100、およびCREF-Trans6）においてmda-7が過剰発現されると、限定的な増殖阻害を示し、mda-7トランスジーンの効果が正常細胞では現れないことを示している。併せて考慮すると、データは、MDA-7の発現の上昇による増殖阻害は、正常細胞より癌細胞においてインビトロで有効であることを示している。
【００９１】
Suら（1998）は、それによってMDA-7が癌細胞の増殖を抑制するメカニズムに関する研究を報告した。研究は、乳癌細胞株MCF-7およびT47DにおけるMDA-7の異所発現が、細胞周期分析およびTUNELアッセイによって検出すると、アポトーシスを誘導するが、正常なHBL-100細胞には影響を及ぼさなかったと報告した。アデノウイルスmda-7（「Ad-mda7」）を感染させた細胞からの細胞溶解物のウェスタンブロット分析から、アポトーシス刺激タンパク質BAXのアップレギュレーションが示された。Ad-mda7感染は、MCF-7およびT47D細胞に限ってBAXタンパク質レベルを上昇させたが、正常なHBL-100またはHMEC細胞では上昇させなかった。これらのデータから、試験者は、MCF-7腫瘍細胞の異種移植片腫瘍形成に及ぼすエクスビボAd-mda7の影響を評価した。エクスビボ形質導入によって、腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍の形成および進行の阻害が得られた。
【００９２】
遺伝子治療を用いる癌の治療の主な様相は、アポトーシスの誘導である。これは、癌細胞を他の物質に感作するか、または細胞内経路を刺激することによってアポトーシスを直接誘導することによって行うことができる。他の癌治療は、増殖しつつある腫瘍に必要な栄養素を供給するために腫瘍が血管新生を誘導する必要があることを利用している。エンドスタチンおよびアンジオスタチンは、そのような二つの治療法の例である（国際公開公報第00/5356号および国際公開公報第00/26368号）。
【００９３】
出願人は、血管新生を阻害する方法を発見した。この新規方法は、ヒトmda-7をコードする核酸を投与することを含む。Ad-mda7は、インビトロで増殖しつつある内皮細胞に添加した場合に、内皮の分化の阻害能を有する。mda-7発現上昇の抗血管新生作用により、この分子は血管新生関連疾患、特に癌にとって理想的な遺伝子治療となる。ウイルスまたは非ウイルスベクターによって、mda-7をコードする核酸を、内皮細胞を含みうる抗血管新生標的細胞に投与するのみならず、腫瘍細胞に投与することが企図される。この併用治療によって、臨床医は、腫瘍細胞の直接形質導入に依存するのみならず、血管新生の阻害効果にも依存することができる。このように、異なる標的細胞集団に輸送してもよい二つの異なる様相を用いることによって腫瘍を枯渇させて攻撃する。
【００９４】
血管新生関連疾患には、例えば、固形腫瘍、白血病のような血液性の腫瘍、および腫瘍の転移を含む血管新生依存的癌；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および発熱性肉芽腫；リウマチ性関節炎；乾癬；眼の血管新生疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、後水晶体線維形成、ルベオーシス；オスラーウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク脈管新生；末梢血管拡張症；血友病関節；血管線維腫、および創傷肉芽腫が含まれるがこれらに限定されない。本発明の内皮細胞増殖阻害法は、内皮細胞の過剰または異常な刺激の疾患を治療するために有用である。これらの疾患には、腸管癒着、アテローム性動脈硬化症、強皮症、および肥厚性瘢痕、すなわちケロイドが含まれるがこれらに限定されない。それらはまた、ネコひっかき病および潰瘍（ヘリコバクターピロリ）のような病理的結果として血管新生を有する疾患の治療においても有用である。
【００９５】
本発明の方法は、内皮細胞関連疾患および障害を治療するために有用である。特に重要な内皮細胞プロセスは、上記のように血管新生、すなわち血管の形成である。血管新生関連疾患は、MDA-7の発現の上昇によって内皮細胞増殖を阻害するために本発明において記述された方法を用いて治療してもよい。
【００９６】
これらの構築物の機能性に関する特定の理論に固執するわけではないが、IL-10に対するmda-7の顕著なアミノ酸相同性が存在し、C-末端に存在し、受容体の結合に関係しているD-ヘリックス領域では種を超えて相同性が存在する。このように、好ましくはこのアミノ酸30〜35個の領域を含む分子が特に好ましい。
【００９７】
このように、本発明の一つの態様において、血管新生関連疾患の治療は、治療ペプチドまたはポリペプチドの投与を含む。もう一つの態様において、治療は、mda-7をコードする核酸発現構築物を、疾患細胞または内皮細胞を含む標的に投与することを含む。標的細胞は構築物を取り込み、核酸によってコードされる治療ポリペプチドを発現して、それによって標的細胞における分化を阻害すると企図される。次に、MDA-7を発現する細胞は、発現構築物によって形質導入されない、または感染しない隣接細胞と相互作用する可能性があるタンパク質を分泌することができる。このようにして、腫瘍の新しい血管を確立するために必要な複雑な相互作用が阻害され、腫瘍の治療が得られる。
【００９８】
本発明のもう一つの態様において、血管新生関連疾患は、MDA-7またはこれを発現する構築物によって治療してもよいと企図される。本発明において治療のために企図される血管新生関連疾患のいくつかは、乾癬、リウマチ性関節炎（RA）、炎症性腸疾患（IBD）、変形性関節炎（OA）、および肺の前新生物病変である。
【００９９】
さらにもう一つの態様において、広汎な癌様状態の治療は本発明の範囲内である。例えば、黒色腫、肺の非小細胞癌、小細胞癌、肺、肝癌、網膜芽種、星状細胞腫、神経膠芽腫、白血病、神経芽腫、頭部、頚部、乳腺、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、子宮頚部、消化管、リンパ腫、脳、結腸、または膀胱。さらにより好ましい態様において、該血管新生関連疾患は、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、変形性関節炎、平滑筋腫、腺腫、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉鎖、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、前新生物病変、上皮内癌、口腔毛状白斑、または乾癬であり、治療の主題であってもよい。
【０１００】
本発明の特定の態様において、mda-7は、MDA-7ポリペプチドを発現する核酸として提供される。特定の態様において、核酸分子はウイルスベクターであり、ウイルスベクターの用量は少なくとも103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、またはそれより高いpfuまたはウイルス粒子である。特定の態様において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。最も好ましくは、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。他の特定の態様において、核酸は非ウイルスベクターである。
【０１０１】
特定の態様において、ポリペプチドを発現する核酸はプロモーターに機能的に結合している。本発明にとって適したプロモーターの非制限的な例には、CMV IE、デクチン-1、デクチン-2、ヒトCD11c、F4/80、SM22、またはMHCクラスIIプロモーターが含まれるが、mda-7遺伝子または本明細書に記載の遺伝子のような本発明の免疫遺伝子の発現を促進するために有用な任意の他のプロモーターは、本発明の実践において適用可能であると考えられる。
【０１０２】
好ましくは、本発明の核酸は注射によって投与される。他の態様には、多数回注射によって核酸を投与することが含まれる。特定の態様において、注射は、腫瘍部位に対して局所、限局、または遠位に行う。いくつかの態様において、核酸の投与は、連続的注入、腫瘍内注射、腹腔内、または静脈内注射によって行う。他の態様において、核酸は腫瘍の切除前または後、または前および後の双方に腫瘍床に投与される。または、核酸は、化学療法、生物治療、免疫療法、手術、または放射線療法の前、あいだ、または後に患者に投与される。好ましくは、患者はヒトである。他の態様において、患者は癌患者である。
【０１０３】
B．核酸、ベクター、および調節シグナル
本発明は、mda-7遺伝子に関するポリヌクレオチドまたは核酸分子およびその遺伝子産物MDA-7に関する。さらに、本発明は、免疫原性分子に関するポリヌクレオチドまたは核酸分子に向けられる。これらのポリヌクレオチドまたは核酸分子は、哺乳類細胞から単離可能および精製可能である。単離および精製されたMDA-7核酸分子は、mda-7遺伝子産物に関連する核酸分子である分泌型または完全長型のいずれであれ、RNAまたはDNAの形であってもよいと企図される。同様に、免疫原性分子に関連する核酸分子は、RNAまたはDNAの形であってもよい。本明細書において用いられるように、「RNA転写物」という用語は、DNA核酸分子からの転写の産物であるRNA分子を指す。そのような転写物は、一つまたはそれ以上のポリペプチドをコードしてもよい。
【０１０４】
本出願において用いられるように、「ポリヌクレオチド」という用語は、全体的なゲノム核酸を含まずに単離されている核酸分子、RNA、またはDNAを指す。したがって、「MDA-7をコードするポリヌクレオチド」は、MDA-7コード配列を含むが、なおも総ゲノムDNAおよびタンパク質から単離されている、精製されている、またはそれらを含まない核酸セグメントを指す。本出願がMDA-7コードポリヌクレオチドまたは核酸の機能または活性について述べる場合、ポリヌクレオチドは、免疫応答の増強能を有する分子をコードすることを意味する。さらに、「免疫原をコードするポリヌクレオチド」は、免疫原コード配列を含むが、なおも総ゲノムDNAおよびタンパク質から単離されている、精製されている、またはそれらを含まない核酸セグメントを指す。本出願が免疫原をコードする免疫遺伝子の機能または活性について述べる場合、ポリヌクレオチドは、ヒトの体内で免疫応答の誘導能を有する免疫原性分子をコードすることを意味する。
【０１０５】
「cDNA」という用語は、鋳型としてRNAを用いて調製されたDNAを指す。ゲノムDNAまたはRNA転写物に対してcDNAを用いる長所は、安定性および組換えDNA技術を用いる配列の操作能である（Sambrook、2001；Ausubel、1996を参照されたい）。完全長または部分的ゲノム配列が都合がよい場合があるかも知れない。または、cDNAは、それがポリペプチドのコード領域を表し、イントロンおよび他の調節領域を含まないことから都合がよい可能性がある。
【０１０６】
所定のMDA-7コード核酸または所定の細胞からのmda-7遺伝子は、わずかに異なる核酸配列を有するが、それにもかかわらず、MDA-7ポリペプチドをコードする天然の変種または株によって表されてもよいと同様に企図される；ヒトMDA-7ポリペプチドは特定の態様である。その結果、本発明はまた、最小のアミノ酸変化を有するが、同じ活性を有するMDA-7の誘導体を含む。
【０１０７】
「遺伝子」という用語は、機能的タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドコード核酸単位を指すために単純にするために用いられる。当業者によって理解されるように、この機能的な用語には、ゲノム配列、cDNA配列、およびタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および変異体を発現する、または発現するように適合される可能性があるより小さい操作された遺伝子セグメントが含まれる。MDA-7または免疫原のようなもう一つの治療ポリペプチドをコードする核酸分子は、以下の長さ、または少なくとも以下の長さの隣接核酸配列を含んでもよい：
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またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基対。そのような配列は配列番号：1（MDA-7コード配列）と同一または相補的であってもよい。
【０１０８】
「他のコード配列から実質的に単離された」とは、対象遺伝子が核酸セグメントのコード領域の一部を形成すること、およびセグメントが、大きい染色体断片、他の機能的遺伝子、またはcDNAコード領域のような天然に存在するコード核酸の大きい部分を含まないことを意味する。当然、これは当初単離された核酸セグメントを指し、ヒトの操作によってセグメントに後に加えられた遺伝子またはコード領域を除外しない。
【０１０９】
特定の態様において、本発明は、「ヒトMDA-7」または「MDA-7ポリペプチド」と呼ばれるMDA-7に対応する、配列番号：2に従う、または本質的に配列番号：2の記載通りである隣接アミノ酸配列をそのアミノ酸配列の中に含むMDA-7タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするDNA配列を組み入れた単離DNAセグメントおよび組換え型ベクターに関する。
【０１１０】
「配列番号：2に本質的に記載どおりの配列」という用語は、配列が配列番号：2の一部に実質的に対応して、配列番号：2のアミノ酸と同一でない比較的少数のアミノ酸を有する配列、または配列番号：2のアミノ酸の生物学的機能的同等物を意味する。
【０１１１】
「生物学的に機能的に同等な」という用語は、当技術分野で十分に理解されており、本明細書においてさらに定義する。したがって、配列番号：2のアミノ酸と同一または機能的に同等であるアミノ酸の約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、または約99％、および例えば約70％〜約80％、およびより好ましくは約81％〜約90％、またはさらにより好ましくは約91％〜約99％のような、そこから誘導できる任意の範囲を有する配列は、タンパク質の生物活性が維持される限り、「配列番号：2に本質的に記載したとおり」である配列であろう。特定の態様において、MDA-7タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、またはその生物学的機能的同等物の生物活性は、免疫応答を増強することを含む。さらに、特定の態様において、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド、または生物学的に機能的同等物である免疫原性分子である免疫原の生物活性は、分子がヒトの体内で免疫応答を誘導できることを指す免疫原性を含む。特定の他の態様において、本発明は、その配列の中に本質的に配列番号：1に記載されたとおりの核酸配列を含む単離されたDNAセグメントおよび組換え型ベクターに関する。「配列番号：1に本質的に記載どおりの配列」という用語は、上記と同じ意味で用いられ、核酸配列は配列番号：1の一部に実質的に対応して、同一ではない比較的少数のコドンを含み、または配列番号：1のコドンに対して機能的に同等であることを意味する。この場合も、MDA-7活性を示すタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドDNAセグメントが最もよいであろう。
【０１１２】
特定の態様において、本発明は、そのアミノ酸配列の中にMDA-7ポリペプチドと一致する、または本質的に対応する隣接アミノ酸配列を含むMDA-7ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列を組み入れた単離核酸セグメントおよび組換え型ベクターに関する。他の態様において、本発明は、そのアミノ酸配列の中に、免疫原と一致する、または本質的に対応する隣接アミノ酸配列を含む免疫原、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするDNA配列を組み入れた単離核酸セグメントおよび組換え型ベクターに関する。
【０１１３】
本発明のベクターは、主に、調節された真核細胞プロモーター（すなわち、誘導型、抑制性、組織特異的）の制御下で治療的mda-7遺伝子によって細胞を形質転換するように設計される。同様に、ベクターは、他に理由がなければインビトロでの操作を容易にするために選択マーカーを含んでもよい。しかし、選択マーカーは、組換え型細胞の産生において重要な役割を果たす可能性がある。
【０１１４】
下記の表1および2は、本発明に従って用いられる多様な調節シグナルを記載する。
【０１１５】
（表１）誘導型要素
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【０１１６】
（表２）他のプロモーター／エンハンサー要素
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【０１１７】
真核細胞において遺伝子をコードするタンパク質の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、多数の遺伝子要素で構成される。細胞機構は、それぞれの要素によって伝達される調節情報を集めて統合することができ、それによって異なる遺伝子が別個のしばしば複雑な転写調節パターンに進化することができる。
【０１１８】
「プロモーター」という用語は、本明細書において、RNAポリメラーゼIIの開始部位周辺に集合する転写制御モジュールの群を指すために用いられる、プロモーターがどのように構築されるかに関する検討の多くは、HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位のプロモーターを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究から強められたこれらの試験から、プロモーターが、それぞれがDNA約7〜20 bpからなり、転写活性化タンパク質の一つまたはそれ以上の認識部位を含む、個別の機能的モジュールで構成されることが示された。
【０１１９】
各プロモーターにおける少なくとも一つまたはそれ以上の分子が、RNA合成開始部位を配置するように機能する。この最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、哺乳類のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターのようなTATAボックスを欠損するいくつかのプロモーターでは、開始部位そのものに重複する別個の要素が開始場所を固定するために役立つ。
【０１２０】
さらなるプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的に、これらは、開始部位の上流30〜110 bpの領域に存在するが、多くのプロモーターが、最近、開始部位の下流にも同様に機能的要素を含むことが示されている。要素間の空間は柔軟であり、それによってプロモーター機能は、要素が逆方向になっても、または互いに対して移動しても保存される。tkプロモーターでは、要素間の距離は、活性が減少し始めるまで50 bp離れるまで増加させることができる。プロモーターに応じて、個々の要素は、転写を活性化するために協力してまたは独立して機能することができるように思われる。
【０１２１】
エンハンサーは、DNAの同じ分子上の異なる位置に存在するプロモーターからの転写を増加させる遺伝子要素として当初検出された。これが長い距離にわたって作用できることは、原核細胞の転写調節に関する古典的な研究ではほとんど例を見なかった。その後の研究から、エンハンサー活性を有するDNAの領域はプロモーターのように構築されることが示された。すなわち、それらは、そのそれぞれが一つまたはそれ以上の転写タンパク質に結合する多くの個々の要素で構成される。
【０１２２】
エンハンサーとプロモーターのあいだの基本的な違いは機能性である。エンハンサー領域は全体として、距離の離れた転写を刺激することができなければならないが、これが、プロモーター領域またはその成分要素に当てはまる必要はない。一方、プロモーターは、特定の部位で特定の方向へのRNA合成の開始を指示する一つまたはそれ以上の要素を有しなければならないが、エンハンサーは、これらの特異性を欠損する。この機能的な相違を別にすれば、エンハンサーとプロモーターは非常に類似の実体である。
【０１２３】
プロモーターおよびエンハンサーは、細胞において転写を活性化するという同じ一般的な機能を有する。それらはしばしば重なり合って、隣接し、しばしば非常に類似のモジュール構築を有するように思われる。併せて考慮すると、これらの考察は、エンハンサーとプロモーターが相同な実体であること、そしてこれらの配列に結合した転写活性化タンパク質が基本的に同じように細胞転写機構と相互作用する可能性があることを示唆している。
【０１２４】
いくつかの態様において、本発明において用いられるプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターである。このプロモーターは、ベクターpcDNAIIIにおいてインビトロジェン（Invitrogen）社から販売されており、本発明において用いられる一つである。デクチン-1およびデクチン-2プロモーターも同様に本発明において有用であると企図される。
【０１２５】
下記に、本発明と併用して用いることができるさらなるウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーおよび誘導型プロモーター／エンハンサーの一覧を示す。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（真核細胞プロモーターデータベースEPDBによる）も同様に、オリゴ糖プロセシング酵素、タンパク質折りたたみ補助タンパク質、選択マーカータンパク質、または対象異種タンパク質をコードする構造遺伝子の発現を促進するために用いることができるであろう。
【０１２６】
有用であることが判明するかも知れないもう一つのシグナルは、ポリアデニル化シグナルである。そのようなシグナルは、ヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子、ウシ成長ホルモン（BGH）遺伝子、またはSV40から得てもよい。
【０１２７】
内部リボソーム結合部位（IRES）要素は、多重遺伝子、または多シストロン性mRNAを作製するために用いられる。IRES要素は、5-メチル化キャップ依存的翻訳のリボソームスキャンモデルを迂回することができ、内部部位で翻訳を開始する（Pelletier and Sonenberg、1988）。ピコナウイルス科（ポリオおよび脳心筋炎ウイルス）の二つのメンバーからのIRES要素と共に哺乳類メッセージからのIRES（Macejak and Sarnow、1991）が記述されている（Pelletier and Sonenberg、1988）。IRES要素は、異種オープンリーディングフレームに結合することができる。それぞれがIRESによって離れている多数のオープンリーディングフレームを共に転写して、多シストロン性mRNAを作製することができる。IRES要素によって、それぞれのオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに近づくことができる。単一のプロモーター／エンハンサーを用いて、多数の遺伝子を効率よく発現させて、単一のメッセージを転写することができる。
【０１２８】
いずれにせよ、プロモーターは、遺伝子の上流に機能的に配置した場合にその遺伝子を発現させるDNA要素である。本発明のほとんどのトランスジーン構築物は、プロモーター要素の下流に機能的に配置される。
【０１２９】
本発明の組成物および方法は、本発明の組成物を患者に投与するために提供される。
【０１３０】
1．ウイルスの形質転換
a．アデノウイルス感染
組換え型DNAを輸送する一つの方法は、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAへの組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって提供される遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（a）構築物のパッケージングを支持するために、および（b）そこからクローニングされる組換え型遺伝子構築物を最終的に発現させるために、十分なアデノウイルス配列を含む構築物が含まれることを意味する。
【０１３１】
アデノウイルスベクターは、複製欠損であってもよく、または少なくとも条件的に欠損であってもよく、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の血清型またはサブグループA〜Fの異なる42個のいずれであってもよい。サブグループCのアデノウイルス5型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るための開始材料である。この理由は、アデノウイルス5型がそれに関して大量の生化学および遺伝子情報が知られているヒトアデノウイルスであるためであり、これは歴史的にベクターとしてアデノウイルスを用いるほとんどの構築物に利用されている。
【０１３２】
先に述べたように、本発明に従う典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスE1領域を有しないであろう。このように、E1コード配列を除去した位置に形質転換構築物を導入することは最も簡便であろう。しかし、構築物をアデノウイルス配列に挿入する位置は、本発明にとって重要ではない。対象遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Karlssonら（1986）によって記述されるE3置換ベクターにおける欠失E3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損相補するE4領域に挿入してもよい。
【０１３３】
アデノウイルスの増殖および操作は当業者に既知であり、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価で、すなわち109〜1011プラーク形成単位/mlで得ることができ、非常に感染性が高い。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって輸送される外来遺伝子はエピソームであり、したがって宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスのワクチン接種試験では副作用は報告されておらず（Couchら、1963；Topら、1971）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明している。
【０１３４】
b．レトロウイルス感染
レトロウイルスは、感染した細胞において逆転写のプロセスによってそのRNAを二本鎖DNAに変換できることを特徴とする一本鎖RNAウイルスの群である（Coffin、1990）。得られたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによってレシピエント細胞およびその子孫にウイルス遺伝子配列が保持される。
【０１３５】
レトロウイルスベクターを構築する場合、対象核酸をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製する場合、gag、pol、およびenv遺伝子を含むがLTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Mannら、1983）。cDNAを含む組換え型プラスミドを、レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と共にこの細胞株に導入すると（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列によって、組換え型プラスミドのRNA転写物はウイルス粒子にパッケージングされることができ、これが培養培地に分泌される（Nicolas and Rubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。次に、組換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、選択的に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは、広い多様な細胞タイプに感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂を必要とする（Paskindら、1975）。
【０１３６】
c．AAV感染
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、高い組み込み効率を有し、非分裂細胞に感染できることから、本発明において用いるために魅力的なベクター系であり、これによって組織培養において哺乳類細胞に遺伝子を輸送するために有用である（Muzyczka、1992）。AAVは、広い宿主感染範囲を有し（Tratschinら、1984；Laughlinら、1986；Lebkowskiら、1988；McLaughlinら、1988）、このことは本発明に用いるために応用可能であることを意味する。rAAVベクターの作製および使用に関する詳細は、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,139,941号および米国特許第4,797,368号に記述されている。
【０１３７】
遺伝子輸送にAAVを用いることを示す研究には、LaFaceら（1988）；Zhouら（1993）；Flotteら（1993）；およびWalshら（1994）が含まれる。組換え型AAVベクターは、マーカー遺伝子（Kaplittら、1994；Lebkowskiら、1988；Samulskiら、1989；Shelling and Smith、1994；Yoderら、1994；Zhouら、1994；Hermonat and Muzyczka、1984；Tratschinら、1985；McLaughlinら、1988）およびヒト疾患に関係する遺伝子（Flotteら、1992；Ohiら、1990；Walshら、1994；Weiら、1994）をインビトロおよびインビボで形質導入するために首尾よく用いられている。最近、AAVベクターは、嚢胞性線維症の治療のためにフェーズIヒト臨床試験に関して承認されている。
【０１３８】
典型的に、組換え型AAV（rAAV）ウイルスは、二つのAAV末端反復配列が隣接する対象遺伝子を含むプラスミド（McLaughlinら、1988；Samulskiら、1989、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる）と、末端反復配列を含まない野生型AAVコード配列を含む発現プラスミド、例えばpIM45（McCartyら、1991、参照として本明細書に組み入れられる）とを同時トランスフェクトさせることによって作製される。細胞はまた、AAVヘルパー機能にとって必要なアデノウイルス遺伝子を有するアデノウイルスまたはプラスミドに感染またはトランスフェクトさせる。そのように調製されたrAAVウイルス保存液は、アデノウイルスが混入しており、これをrAAV粒子から物理的に分離しなければならない（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心によって）。または、AAVコード領域を含むアデノウイルスベクター、またはAAVコード領域を含む細胞株、および一部または全てのアデノウイルスヘルパー遺伝子を用いることができる（Yangら、1994a；Clarkら、1995）。組み込まれたプロウイルスとしてrAAV DNAを有する細胞株も同様に用いることができる（Flotteら、1995）。
【０１３９】
d．プロタミン
プロタミンも同様に、発現構築物と複合体を形成するために用いてもよい。そのような複合体は、細胞への投与に関して先に記述した脂質組成物と共に調製してもよい。プロタミンは、DNAに会合する低分子の非常に塩基性のヌクレオタンパク質である。核酸を輸送する場合にこれを用いることは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,187,260号に記述されている。ウイルスベクターとプロタミン分子とを複合体形成することによって、ウイルスベクターの形質導入効率を増加させる方法および組成物に関する米国特許出願第10/391,068号（2003年3月24日に提出）は、特に参照として本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
2．非ウイルス輸送
MDA-7タンパク質をコードする核酸のウイルス輸送の他に、以下は、所定の宿主細胞に組換え型遺伝子を輸送するさらなる方法であり、このように本発明において検討される。
【０１４１】
a．脂質媒介形質転換
本発明のさらなる態様において、遺伝子構築物をリポソームまたは脂質製剤に封入してもよい。リポソームは、リン脂質二重層膜と内側の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多ラメラリポソームは、水性媒体によって隔てられた多数の脂質層を有する。それらはリン脂質を過剰量の水溶液に懸濁させると自然に形成する。脂質成分は自己再配列を受けて封入構造を形成し、水を捕獲して、脂質二重層のあいだに溶質を溶解する（Ghosh and Bachhawat、1991）。リポフェクタミン（ギブコBRL（Gibco BRL））と複合体を形成した遺伝子構築物も同様に企図される。
【０１４２】
脂質製剤における最近の進歩によって、インビボでの遺伝子移入効率は改善した（Smyth-Templetonら、1997；国際公開公報第98/07408号）。1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン（DOTAP）とコレステロールの等モル比で構成される新規脂質製剤は、全身性のインビボ遺伝子移入を約150倍有意に増強する。DOTAP：コレステロール脂質製剤は、「サンドイッチリポソーム」と呼ばれる独自の構造を形成すると言われている。この製剤は、鞘状の二層または「花瓶」構造のあいだにDNAを「サンドイッチする」と報告されている。これらの脂質構造の有用な特徴には、コレステロールによる陽性コロイドの安定化、二次元DNAパッキング、および血清中の安定性の増加が含まれる。
【０１４３】
C．タンパク質、ペプチド、およびポリペプチド
1．生物学的機能的同等物
本発明は、MDA-7ポリペプチドの方法および組成物に向けられる。特定の態様において、MDA-ポリペプチドは、癌のような血管新生に関連した疾患を治療するために用いられる。特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは、直接提供される。特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは治療前に提供される。特異的態様において、MDA-7ポリペプチドは、免疫治療の目的で、抗原のような免疫原性分子の投与と同時に投与される。他の特異的態様において、MDA-7ポリペプチドは、治療後に提供され、場合によっては免疫応答の誘導を治療、診断、または予後する目的で免疫原性分子を提供した後に提供される。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【０１４４】
本発明のさらなる態様は、血管新生を阻害するために細胞または被験者に投与されるMDA-7タンパク質、MDA-7の切断型、およびMDA-7アミノ酸配列に由来するペプチドを含む精製タンパク質組成物を用いることを含む。MDA-7の切断型分子には、例えばMDA-7のアミノ酸残基おおよそ46〜49位から始まる分子およびさらにN-末端切断型が含まれる。残基
2006523227.tif 000010
位で始まって、残基206位で終了する分子が特に企図される。さらなる態様において、残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、および48位は、配列番号：2に示されるように、MDA-7の他の隣接残基と共に含まれる。
【０１４５】
当業者によって理解されるように、MDA-7ポリペプチドまたはペプチド、免疫原性分子、または免疫遺伝子産物の構造に改変および変更を行ってもよく、それでもなお類似の特徴またはそうでなければ望ましい特徴を有する分子を生じるであろう。例えば、抗体の抗原結合領域またはTatおよびRNAポリメラーゼIIのような分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能を認識可能に喪失することなく、タンパク質構造における特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してもよい。そのタンパク質の生物学的機能的活性を定義するのは、タンパク質の相互作用能および特性であることから、特定のアミノ酸配列置換をタンパク質配列（または当然、その基礎となるDNAコード配列）に行うことができ、それでも類似の（アゴニスト様）特性を有するタンパク質を得ることができる。このように、その生物学的有用性または活性を認識可能に喪失することなく、様々な変更をHIVポリペプチドまたはペプチド（または基礎となるDNA）の配列に行ってもよいと、本発明者らによって企図される。
【０１４６】
機能的同等性に関して、当業者はまた、生物学的に機能的に同等なタンパク質またはペプチドの定義における固有のものは、同等の生物活性の許容可能なレベルを有する分子がそれでも得られる、分子の明確な部分において行ってもよい変更の回数を制限するという考え方であることは当業者に十分に理解されるであろうことを理解する。このように、生物学的機能的同等なペプチドは、ほとんどまたは全てではない特定のアミノ酸を置換してもよいペプチドとして本明細書において定義される。特に、小さいペプチドに関する限り、より少ないアミノ酸を変更してもよい。当然、異なる置換を有する複数の個々のタンパク質／ペプチドを、本発明に従って容易に作成および使用してもよい。
【０１４７】
特定の残基、例えば酵素の活性部位、またはRNAポリメラーゼII結合領域における残基が、タンパク質またはペプチドの生物学的または構造的特性にとって特に重要であることが示される場合、そのような残基は一般的に交換してはならないことも同様に十分に理解される。これは、本発明の場合にも当てはまり、免疫応答を誘導するために必要であることが示された残基は一般的に変更してはならず、このことはMDA-7ポリペプチドおよび免疫遺伝子産物の双方について企図される。
【０１４８】
アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えばその疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。アミノ酸側鎖置換の大きさ、形状、およびタイプの分析から、アルギニン、リジン、およびヒスチジンは全て陽性荷電残基である；アラニン、グリシン、およびセリンは全て類似の大きさである；ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは全て一般的に類似の形状を有することが判明している。したがって、これらの検討に基づいて、以下のサブセットが本明細書において生物学的に機能的に同等であると定義される：アルギニン、リジン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。
【０１４９】
より定量的な変更を行うために、アミノ酸のハイドロパシー指数を検討してもよい。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および荷電特徴に基づいてハイドロパシー指数が割付されており、これらは：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタメート（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパルテート（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）である。
【０１５０】
タンパク質に相互作用的生物機能を付与するためのアミノ酸ハイドロパシー指数の重要性は、一般的に当技術分野において理解されている（Kyte & Doolittle、1982、参照として本明細書に組み入れられる）。特定のアミノ酸を、類似のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸に置換してもよく、それでもなお類似の生物活性を保持することは既知である。ハイドロパシー指数に基づいて変更を行う場合、そのハイドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、±0.5以内である置換はさらにより特に好ましい。
【０１５１】
類似のアミノ酸の置換は、特に生物学的に機能的に同等なタンパク質またはペプチドがそれによって作製される場合には、親水性に基づいて有効に行うことができ、本発明の場合のように免疫学的態様において用いるために意図されることも同様に当技術分野において理解される。参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,554,101号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるように、タンパク質の最大の局所平均親水性がその免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性に相関すると述べている。
【０１５２】
米国特許第4,554,101号において詳細に記述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割付されている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパルテート（+3.0±1）；グルタメート（+3.0±1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。
【０１５３】
類似の親水性値に基づいて変更を行う場合、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内である置換が特に好ましく、±0.5以内である置換はさらにより特に好ましい。
【０１５４】
アミノ酸の変更から生じる機能的同等なポリペプチドに重点を置いて考察してきたが、これらの変更は、遺伝子コードが縮重していること、および二つまたはそれ以上のコドンが同じアミノ酸をコードする可能性があることを考慮に入れて、コードDNAの改変によって行ってもよいと認識されるであろう。そのような態様において用いるためと共に、プローブおよびプライマー等の設計において用いるような他の用途のために、アミノ酸およびそのコドンの表を下記に示す。
【０１５５】
2．合成ペプチド
本発明の組成物には、生物学的に保護されるように改変されたペプチドが含まれてもよい。生物学的に保護されたペプチドは、ヒト被験者に投与した場合に保護されていないペプチドより特定の長所を有し、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,082,592号に開示されているように、保護されたペプチドはしばしば薬理活性の増加を示す。
【０１５６】
本発明において用いられる組成物はまた、全てのL-アミノ酸、全てのD-アミノ酸、またはその混合物を含むペプチドを含んでもよい。D-アミノ酸を用いることは、ヒトの体内で本来認められるプロテアーゼに対するさらなる抵抗性を付与する可能性があり、免疫原性がより低くなり、したがって、より長い生物学的半減期を有すると期待することができる。
【０１５７】
本発明は、本発明の様々な態様において用いるためにMDA-7ペプチドを記述する。例えば、特定のペプチドを抗血管新生反応の誘発能に関してアッセイする。ペプチドの大きさが比較的小さい特定の態様において、本発明のペプチドはまた、通常の技術に従って、溶液または固相支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、それぞれが参照として本明細書に組み入れられる、Stewart and Young（1984）；Tamら（1983）；Merrifield（1986）；およびBarany and Merrifield（1979）を参照されたい。本明細書に記述の選択された領域に対応する、通常、アミノ酸約6個〜約35〜50個の短いペプチド配列または重なり合うペプチドのライブラリは、容易に合成することができ、反応性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングすることができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入して、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトして、発現のために適した条件で培養する組換えDNA技術を用いてもよい。
【０１５８】
本発明の組成物には、生物学的に保護されるように改変されたペプチドが含まれてもよい。生物学的に保護されたペプチドは、ヒト被験者に投与した場合に保護されていないペプチドより特定の長所を有し、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,082,592号に開示されているように、保護されたペプチドはしばしば薬理活性の増加を示す。
【０１５９】
本発明において用いられる組成物はまた、全てのL-アミノ酸、全てのD-アミノ酸、またはその混合物が含まれるペプチドを含んでもよい。D-アミノ酸を用いることによって、ヒトの体内で本来認められるプロテアーゼに対するさらなる抵抗性を付与される可能性があり、免疫原性がより低く、したがって、より長い生物学的半減期を有すると期待することができる。
【０１６０】
3．インビトロタンパク質産生
実施例において提供した精製法の他に、一般的なインビトロタンパク質産生技法を検討する。本発明のいくつかの態様に従ってウイルスベクターを形質導入した後、初代哺乳類細胞培養を様々な方法で調製してもよい。細胞をインビトロで生存状態に維持して発現構築物に接触させるためには、細胞が酸素と二酸化炭素の正しい比率、および栄養素に接触して、微生物の混入に対して保護された状態で確実に維持される必要がある。細胞培養技術は、十分に報告されており、参照として本明細書において開示される（Freshney、1992）。
【０１６１】
前述の一つの態様は、タンパク質の産生および／または提示のために細胞を不死化するために遺伝子移入を用いることを含む。対象タンパク質の遺伝子を上記のように適当な宿主細胞に移入した後、適当な条件で細胞を培養してもよい。実質的に如何なるポリペプチドの遺伝子もこのようにして用いてもよい。組換え型発現ベクターの産生およびそこに含まれる要素は、先に考察されている。または、産生されるタンパク質は、試験される細胞によって通常合成されている内因性のタンパク質であってもよい。
【０１６２】
本発明のもう一つの態様は、自己Bリンパ球細胞株を用いて、これを免疫遺伝子産物、より詳しくは免疫原活性を有するタンパク質を発現するウイルスベクターにトランスフェクトさせる。哺乳類宿主細胞株の他の例には、VeroおよびHeLa細胞、CEM、721.221、H9、Jurkat、Raji等のような他のB-およびT-細胞株と共に、チャイニーズハムスター卵巣、WI38、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN、およびMDCK細胞が含まれる。さらに、挿入された配列の発現を調節する、または遺伝子産物を望ましい方法で改変および処理する宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要となる可能性がある。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変に関して特徴的かつ特異的メカニズムを有する。発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを保証するために適当な細胞株または宿主系を選択してもよい。
【０１６３】
tk-、hgprt-、またはaprt-細胞においてそれぞれ、HSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を選択の基礎として用いることができる：dhfr、に対する抵抗性を付与する；gpt、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する；neo、アミノグリコシドG418に対する抵抗性を付与する；およびhygro、ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与する。
【０１６４】
動物細胞を二つの様式でインビトロで増殖させることができる：培養物の大半が浮遊液において増殖する接着非依存細胞として、または増殖のために固相基質への結合を必要とする接着依存細胞として（すなわち、単層型の細胞増殖）。
【０１６５】
連続的な確立された細胞株からの接着非依存型または浮遊培養は、細胞および細胞産物を大規模に産生する最も広く用いられる手段である。しかし、浮遊培養細胞は、腫瘍形成能および接着細胞より低いタンパク質産生のような制限を有する。
【０１６６】
4．ER-ターゲティング配列
本発明のポリペプチドには、一つまたはそれ以上の小胞体ターゲティング配列が含まれる。細胞内のタンパク質の最終的な位置は、タンパク質の配列内にコードされるターゲティング配列に依存する。最も単純な例において、シグナルが欠損すれば、タンパク質は細胞質である既定の経路へと向けられる。ERに保持されるように目的地が定められたタンパク質は、ERにおいてタンパク質を保持するために特定のシグナルペプチドを有しなければならない。本発明のポリペプチドには、N-末端またはC-末端でさらなるアミノ酸残基が含まれても含まれなくてもよい。
【０１６７】
ERは、細胞質全体に核膜から伸長する、膜に封入された微小管および嚢（槽）のネットワークである。タンパク質の分泌経路は以下の通りである：粗面ER→ゴルジ体→分泌小胞→細胞外。
【０１６８】
タンパク質が分泌されるためには、タンパク質は、ERからゴルジ体に移動しなければならない。しかし、BiP、シグナルペプチダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのように、ER内で維持されなければならない特定のタンパク質がある。特定の局在シグナルは、タンパク質をERへとターゲティングする。
【０１６９】
特定のタンパク質は、カルボキシ末端にERターゲティング配列Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL、一文字コードで）が存在した結果としてER腔に保持される。この配列がタンパク質の一部ではない場合、タンパク質はその代わりにゴルジ体に輸送されて、細胞から分泌される。KDEL配列またはKKXX配列がカルボキシ末端に存在すると（KKXX配列）、タンパク質はERに保持される。これらの配列が存在すると、タンパク質が、これらの区画の膜における特異的リサイクル受容体に結合して、ERに選択的に戻される。
【０１７０】
ERからのタンパク質の輸送は、総体流によるのみならず、タンパク質のゴルジ体への選択的な輸送を媒介するターゲティングシグナルを特異的に認識する調節された経路によっても起こる。16または30残基ERシグナル配列が存在すると、リボソームはER膜に向かい、ER膜を超えてタンパク質の輸送を開始する。
【０１７１】
ERシグナル配列は通常、タンパク質のN-末端に存在する。これらのターゲティング配列はしばしば、一つまたはそれ以上の陽性荷電アミノ酸の後に連続した疎水性残基6〜12個を含む、シグナル配列は通常、タンパク質がリボソームにおいてなおも成長しているあいだにタンパク質から切断される。シグナル配列からの疎水性アミノ酸のいくつかの特異的欠失、またはそれらの一つが荷電アミノ酸に変異することによって、タンパク質はER膜を超えて内腔の中に移動することができない。無作為なN-末端アミノ酸配列を加えると、細胞質タンパク質のER腔への移動を引き起こし、このことは、疎水性残基がERターゲティングにとって重要である結合部位を形成することを示している。
【０１７２】
小胞体ターゲティング配列には、これらのアミノ酸残基がポリペプチドの目的地を小胞体に向ける限り、任意の数のアミノ酸残基が含まれてもよい。本発明のポリペプチドには、単一のERターゲティング配列、または一つより多いERターゲティング配列が含まれてもよい。ERターゲティングシグナルに関するさらなる情報は、その全内容物が参照として本明細書に組み入れられる、インターネット上のinvitrogen.com/content/sfs/manuals/pshooter_pef_man.pdfでインビトロジェンカタログ番号V890-20、V891-20、V892-20、およびV893-20、「pShooterベクターマニュアル I（pEF/myc vectors）」に認められうる。シグナル配列認識およびERへのタンパク質ターゲティングに関する論評は、同様に参照として本明細書に特に組み入れられる、Walter and Johnson、1994；Kochら、2003；およびKabatら、1987においても認められうる。
【０１７３】
5．抗体
本発明のもう一つの態様は、抗体、場合によってはMDA-7（配列番号：1）のポリペプチド配列と免疫反応性であるヒトモノクローナル抗体である。抗体は、MDA-7を阻害または調節するために用いることができると理解される。さらに、抗体は、癌の受動免疫療法においても有用となる可能性がある。該抗体ならびにそのように発見された任意の抗原またはエピトープ配列のそのような用途は全て、本発明の範囲に含まれる。以下の考察は、本発明の方法においてMDA-7に対する抗体を用いることに当てはまる。
【０１７４】
a．MDA-7抗原配列
被験者におけるMDA-7の調節を行うもう一つの方法として、本発明のMDA-7ポリペプチドの一つまたはそれ以上の抗原決定基に対応するペプチドはまた、MDA-7に対する免疫応答が上昇するように調製することができる。このように、MDA-7ペプチドまたはポリペプチドによるワクチン接種によって、動物の内因性のMDA-7タンパク質を特異的に認識する自己抗体のように、免疫した動物において自己免疫応答を産生する可能性がある。このワクチン接種技術は、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第6,027,727号、第5,785,970号、および第5,609,870号に示される。
【０１７５】
そのようなペプチドは一般的に、長さがアミノ酸残基少なくとも5または6個であり、好ましくは長さがアミノ酸残基約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、または約30個であり、約35〜50個までの残基を含んでもよい。例えば、これらのペプチドは、配列番号：2からの5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、および50個またはそれ以上の隣接アミノ酸のようなMDA-7アミノ酸配列を含んでもよい。合成ペプチドは一般的に長さが約35残基であり、これはアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州）から入手可能な機械のような自動ペプチド合成装置のほぼ上限の長さである。より長いペプチドはまた、例えば組換え手段によって調製してもよい。
【０１７６】
参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,554,101号は、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープの同定および調製を教示している。Hoppにおいて開示される方法によって、当業者は、本明細書において配列番号：2において開示されるMDA-7配列のようなアミノ酸配列においてエピトープを同定することができるであろう。
【０１７７】
多数の科学論文が、アミノ酸配列の分析から二次構造の予測、およびエピトープの同定を行っている（Chou & Fasman、1974a、b；1978a、b；1979）。望ましければ、米国特許第4,554,101号におけるHoppの教示を補足するためにこれらのいずれも用いてもよい。
【０１７８】
その上、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域の予測を補助するためにコンピュータープログラムが現在利用できる。例には、ジェームソン-ウルフ分析（Jameson & Wolf、1988；Wolfら、1988）に基づくプログラム、プログラムPepPlot（登録商標）（Brutlagら、1990；Weinbergerら、1985）、およびタンパク質の三次構造予測のための他の新規プログラム（Fetrow & Bryant、1993）が含まれる。そのような分析を行うことができるもう一つの市販のソフトウェアプログラムは、MacVector（IBI、ニューヘブン、コネチカット州）である。
【０１７９】
さらなる態様において、MDA-7ポリペプチドの主要な抗原決定基は、MDA-7ポリペプチドをコードする遺伝子の部分が組換え宿主において発現され、得られたタンパク質を免疫応答の誘発能に関して試験する経験的アプローチによって同定してもよい。例えば、PCR（商標）を用いて、タンパク質のC-末端の連続的により長い断片を欠損する広範なペプチドを調製することができる。免疫優性であるポリペプチドの断片またはドメインを同定するために、これらのペプチドのそれぞれの免疫反応性を決定する。ごく少数のアミノ酸がそれぞれの反復において除去されるその後の研究によって、ポリペプチドの抗原性決定基の位置をより正確に決定することができる。
【０１８０】
ポリペプチドの主要な抗原決定基を決定するためのもう一つの方法は、SPOTs（商標）システム（ジェノシスバイオテクノロジーズインク（Genosys Biotechnologies Inc.）、ウッドランズ、テキサス州）である。この方法において、重なり合うペプチドをセルロースメンブレン上で合成して、合成および脱保護後、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いてスクリーニングする。当初同定されたペプチドの抗原決定基は、より大きい重複を有するより小さいペプチドをその後合成して、免疫反応性ペプチドに沿ってそれぞれの位置での個々のアミノ酸を最終的に置換することによって、さらに位置を特定することができる。
【０１８１】
一つまたはそれ以上のそのような分析を行った後、一つまたはそれ以上の抗原決定基の少なくとも本質的な特徴を含むポリペプチドを調製する。次に、ポリペプチドに対する抗血清を作製するためにペプチドを用いる。これらの決定基をコードするミニ遺伝子または遺伝子融合体も同様に構築して、例えばPCR（商標）クローニング技術を用いる標準的な方法によって発現ベクターに挿入することができる。
【０１８２】
抗体産生またはワクチン接種のためにそのような小さいペプチドを用いることは、典型的に、B型肝炎表面抗原、キーホールリンペットヘモシアニン、またはウシ血清アルブミン、または上記の他のアジュバント（アジュバントペプチド）のような免疫原性担体タンパク質にペプチドを結合させる必要がある。ミョウバンは、ヒトにおいて用いて十分に非毒性であることが証明されたアジュバントである。この結合を行う方法は当技術分野で周知である。参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,980,912号に記述されるキトサンを含む多糖類のような他の免疫増強化合物も同様に、本発明の組成物と共に用いるために企図される。多数の（一つより多い）MDA-7エピトープを互いにクロスリンク（例えば、重合化）させてもよい。または、フォーチリンペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を、免疫応答を強化する核酸配列に結合してもよい。そのような融合タンパク質は、例えば細菌配列のような外来（非自己）タンパク質の一部または全てを含んでもよい。
【０１８３】
内因性のMDA-7に対する反応を得るために有効な抗体力価は、投与されたペプチドの配列と共に、ワクチン接種動物の種により変化するであろう。しかし、有効な力価は、例えば特異的抗原の用量を変化させて動物のパネルを試験して、誘導された自己抗体（または抗自己抗体）の力価をELISAアッセイのような既知の技術によって測定し、その後力価をMDA-7関連癌特徴、例えば腫瘍の増殖または大きさに相関させることによって、容易に決定される可能性がある。
【０１８４】
当業者は、MDA-7に対する免疫応答が産生されるか否かを決定するために様々なアッセイを承知しているであろう。「免疫応答」という句には、細胞性および液性免疫応答の双方が含まれる。ELISA、クロム放出アッセイのような細胞障害性Tリンパ球（CTL）アッセイ、末梢血リンパ球（PBL）を用いる増殖アッセイ、四量体アッセイ、およびサイトカイン産生アッセイのような様々なB-リンパ球およびTリンパ球アッセイが周知である。参照として本明細書に組み入れられる、Benjaminiら、1991を参照されたい。
【０１８５】
D.  MDA-7精製法
本発明は、MDA-7の精製法を提供する。以下の方法および当業者に既知の類似の方法を用いて、本明細書に開示のMDA-7の精製法を実践することができる。
【０１８６】
1．ゲル電気泳動
ゲル電気泳動は、精製技法において用いることができる周知の技術である。標準的な方法（Sambrookら、2001）を用いるアガロース、アガロース-アクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動は、精製プロセスにおいて利用することができる。
【０１８７】
2．クロマトグラフィー技法
または、クロマトグラフィー技法を用いて、MDA-7の単離および精製を行ってもよい。本発明において用いてもよい多くの種類のクロマトグラフィーが存在する：吸着、アフィニティ、分配、イオン交換および分子ふるい、ならびにカラム、ペーパー、薄層、およびガスクロマトグラフィーを含むそれらを用いるための多くの専門的な技術が存在する（Freifelder、1982）。
【０１８８】
3．免疫試薬
請求の本発明の特定の局面は、免疫試薬を用いることを含む。請求の本発明の特定の態様において、MDA-7の調製物の精製において免疫試薬を用いる。本得明細書において開示される抗体は、本発明と共に用いるために企図される。
【０１８９】
本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、広くIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEのような任意の免疫学的結合物質を指すと意図される。一般的に、IgGおよび／またはIgMは、生理的な状況において最も一般的な抗体であること、そして研究室の状況においても最も容易に産生されることから、好ましい。
【０１９０】
「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために用いられ、これにはFab'、Fab、F(ab')2、単ドメイン抗体（DABs）、Fv、scFv（一本鎖Fv）等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製するおよびその特徴を調べる手段も同様に当技術分野で周知である（例えば、「Antibodies：A Laboratory Manual」、コールドスプリングハーバー研究所、1988を参照されたい；参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１９１】
モノクローナル抗体（MAbs）は、特定の長所、例えば再現性および大規模産生を有すると認識されており、これを用いることは一般的に好ましい。本発明はこのように、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギ、およびニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。試薬の調製の容易さおよび入手が容易であるために、マウスモノクローナル抗体はしばしば好ましいであろう。
【０１９２】
しかし、ヒトの定常領域および／または可変領域ドメインを有するマウス、ラット、または他の種からのキメラ抗体、双特異的抗体、組換え型および操作された抗体およびその断片のような「ヒト化」抗体も同様に企図される。患者の歯の疾患に「合わせて作製した」抗体を開発する方法も同様に既知であり、そのような注文製の抗体も同様に企図される。
【０１９３】
モノクローナル抗体（MAbs）を作製する方法は、一般的にポリクローナル抗体を調製する方法と同じ道筋に沿って始まる。簡単に説明すると、本発明に従って動物をLEEまたはCEE組成物によって免疫して、免疫した動物から抗血清を回収することによってポリクローナル抗体を調製する。
【０１９４】
抗血清を産生するために広範な動物種を用いることができる。典型的に、抗血清を産生するために用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。動物の選択は、当業者に既知であるように、操作の容易さ、費用、または望ましい血清の量に基づいて決定される。
【０１９５】
ポリクローナル抗体産生のために用いられる免疫原組成物の量は、免疫原の性質と共に免疫のために用いられる動物に応じて変化する。皮下、筋肉内、皮内、上皮内、静脈内、および腹腔内が含まれるがこれらに限定されない多様な経路を用いて免疫原を投与することができる。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で免疫した動物から血液を採取することによってモニターしてもよい。
【０１９６】
第二の追加免疫（例えば、注射によって提供される）も同様に行ってもよい。追加免疫および力価測定プロセスは、適した力価が得られるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られれば、免疫した動物から採血して、血清を単離および保存して、および／または動物を用いてMAbsを作製することができる。
【０１９７】
ウサギポリクローナル抗体を産生するために、動物を尾静脈または心穿刺によって採血することができる。得られた血液を凝固させて、遠心し、全ての細胞および凝血から血清成分を分離する。血清は、様々な応用のために用いてもよく、または望ましい抗体分画を、もう一つの抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィー、固相マトリクスに結合させたペプチドのような周知の方法によって、または例えばプロテインAもしくはプロテインGクロマトグラフィーを用いることによって精製してもよい。
【０１９８】
MAbsは、参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第4,196,265号に例示されるような周知の技術を用いて容易に調製してもよい。典型的に、この技術は、野生型または変異体組成物であってもよい、選択された免疫原組成物、例えば精製もしくは部分精製タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはドメインによって適した動物を免疫することを含む。免疫組成物は抗体産生細胞を刺激するために有効な方法で投与される。
【０１９９】
モノクローナル抗体（MAbs）を作製する方法は一般的に、ポリクローナル抗体を調製する方法と同じ道筋に沿って始まる。マウスおよびラットのような齧歯類が好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、またはカエルの細胞を用いることも可能である。ラットを用いることは特定の長所を提供する可能性があるが（Goding、1986、60〜61頁）、マウスが好ましく、BALB/cマウスは最も普通に用いられ、一般的により高い割合の安定な融合体を生じることから、最も好ましい。
【０２００】
動物に、先に一般的に記述したように抗原、すなわちペプチド、ポリペプチドの一部、またはMDA-7のようなポリペプチド全体を注射する。抗原を、フロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバントと混合してもよい。同じ抗原または抗原をコードするDNAによる追加免疫は、約2週間の間隔で行われるであろう。
【０２０１】
免疫後、抗体産生能を有する体細胞、特にBリンパ球（B細胞）をMAb産生プロトコールにおいて用いるために選択する。これらの細胞は、生検によって得られた脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血試料から得てもよい。脾細胞および末梢血細胞が好ましく、前者は分裂する形質芽球の段階である抗体産生細胞に富む起源であることから、そして後者は末梢血が容易に入手できることから好ましい。
【０２０２】
しばしば、動物のパネルを免疫して最高の抗体力価を有する動物の脾臓を摘出し、シリンジによって脾臓をホモジナイズすることによって脾臓リンパ球を得る。典型的に、免疫したマウスからの脾臓は、リンパ球約5×107〜2×108個を含む。
【０２０３】
次に、免疫動物からの抗体産生Bリンパ球を、一般的に免疫した動物と同じ種の細胞である不死化骨髄腫細胞の細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生融合技法において用いるために適した骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生細胞であり、高い融合効率を有し、それらを所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地において増殖できないようにする酵素欠損を有する。
【０２０４】
当業者に既知であるように（Goding、65〜66頁、1986；Campbell、75〜83頁、1984）、多くの骨髄腫細胞の任意の一つを用いてもよい。例えば、免疫動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7、およびS194/5XX0 Bulを用いてもよく、ラットの場合、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F、および4B210を用いてもよく、ならびにU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、およびUC729-6は全てヒト細胞融合に関連して有用である。
【０２０５】
融合技法は通常、低い頻度、すなわち約1×10-6〜1×10-8で生存ハイブリッドを産生する。しかし、生存している融合ハイブリッドは、選択培地において培養することによって親の非融合細胞（特に、通常、無限に分裂し続けるであろう非融合骨髄腫細胞）と区別されることから、このことは問題にはならない。選択培地は、一般的に組織培養培地におけるヌクレオチドのデノボ合成を遮断する物質を含む培地である。例および好ましい物質は、アミノプテリン、メソトレキセート、およびアザセリンである。
【０２０６】
この培養によってハイブリドーマ集団が提供され、そこから特定のハイブリドーマが選択される。典型的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイターウェルにおける単コロニー希釈によって細胞を培養した後、個々のクローン上清（約2〜3週間後）を所望の反応性に関して試験することによって行われる。アッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞障害アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ等のように、感度がよく単純かつ迅速でなければならない。
【０２０７】
次に、選択されたハイブリドーマを連続希釈して個々の抗体産生細胞株にクローニングし、その後クローンを無限に増殖させてMAbsを提供する、細胞株は、二つの基本的な方法でMAb産生のために利用してもよい。第一の方法では、ハイブリドーマの試料を、当初の融合体の体細胞および骨髄細胞を提供するために用いられたタイプの組織適合性の動物（例えば、同系マウス）に注射することができる（しばしば腹腔）。選択的に、動物を炭化水素、特にプリスタン（テトラメチルペンタデカン）のような油によってプライミングした後注射する。注射された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。血清または腹水のような動物の体液を穿刺して高濃度のMAbsを得ることができる。第二の方法では、個々の細胞株をインビトロで培養することができ、この場合MAbsは培養培地に自然に分泌されて、そこから抗体を高濃度で容易に得ることができる。
【０２０８】
いずれかの手段によって産生されたMAbsは、望ましければ濾過、遠心、およびHPLCまたはアフィニティクロマトグラフィーのような様々なクロマトグラフィー法を用いてさらに精製してもよい。本発明のモノクローナル抗体の断片は、ペプシンまたはパパインのような酵素による消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断が含まれる方法によって、そのように産生されたモノクローナル抗体から得ることができる。または、本発明に含まれるモノクローナル抗体断片は、自動ペプチドシンセサイザーを用いて合成することができる。
【０２０９】
4．免疫検出法
なおさらなる態様において、本発明は、MDA-7発現メッセージ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのような生物成分を結合、精製、除去、定量および／またはそうでなければ一般的に検出する免疫検出法に関する。いくつかの免疫検出法には、例を挙げれば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウェスタンブロットが含まれる。様々な有用な免疫検出法の段階は、例えば参照として本明細書に組み入れられる、Doolittle MH and Ben-Zeev O、1999；Gulbis B and Galand P、1993；De Jager Rら、1993；およびNakamuraら、1987のような科学論文に記述されている。これらの技術は当業者に周知である。
【０２１０】
E．薬学的組成物と輸送
本発明の特定の態様において、MDA-7タンパク質をコードする発現構築物の輸送を含む方法が企図される。いくつかの態様において、方法は、免疫原をコードする発現構築物の輸送に向けられる。または、発現構築物は、MDA-7ポリペプチドと免疫原の双方をコードする配列を含む。免疫応答を含む疾患および病態の例には、ワクチンによって予防または治療される疾患が含まれる。肺癌、頭頚部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、子宮頚癌、消化器癌、リンパ腫、肺における前新生物病変、結腸癌、乳癌、膀胱癌、および、誘導された免疫応答を増強するためにMDA-7ポリペプチドを投与することによって治療される可能性がある免疫応答に関連した任意の他の疾患または病変が含まれる。
【０２１１】
薬学的組成物の「有効量」は、一般的に、記載の所望の結果を検出可能に繰り返し得るために、例えば疾患またはその症状の程度を改善する、減少する、最小限にする、または程度を制限するために十分な量であると定義される。疾患の消失、根治、または治癒を含むより厳密な定義を適用してもよい。
【０２１２】
1．投与
特定の特異的態様において、本発明の方法および組成物を用いて、細胞を殺す、細胞増殖を阻害する、転移を阻害する、腫瘍または組織の大きさを減少させる、およびそうでなければ腫瘍細胞の悪性表現型を逆転もしくは減少させる、免疫応答を誘導する、または血管新生を阻害することが望ましい。投与経路は、ターゲティングされる病変または部位の位置および性質によって当然変化して、これには例えば皮内、皮下、局所、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、全身、および経口投与および製剤が含まれる。
【０２１３】
直接注射、腫瘍内注射、または腫瘍の血管への注射は、不連続な、固形の、近づくことができる腫瘍または他の近づくことができる標的領域に関して特に企図される。局所、限局、または全身投与も同様に適当であるかも知れない。4 cmより大きい腫瘍の場合、投与容量は、約4〜10 ml（好ましくは10 ml）であるが、＜4 cmの腫瘍の場合、約1〜3 mlの容量が用いられるであろう（好ましくは3 ml）。
【０２１４】
1回投与として輸送される多部位注射は、容量約0.1〜約0.5 mlを含む。腫瘍または標的部位に約1 cmの間隔をあけて多数の部位に注射を行うことによって、ウイルス粒子を都合よく接触させてもよい。
【０２１５】
外科的介入の場合、本発明は、術前に、手術不能な腫瘍の被験者を切除可能にするために用いてもよい。または、本発明は、残留または転移疾患を治療するために、手術時、および／またはその後、用いてもよい。例えば、切除された腫瘍床に、免疫原性分子の存在下または非存在下でMDA-7またはMDA-7コード構築物を含む製剤を注射または潅流してもよい。潅流は、例えば手術時に埋め込んだカテーテルを残すことによって切除後も継続してもよい。定期的な術後の処置も同様に想像される。
【０２１６】
発現構築物またはウイルス構築物の持続的な潅流も同様に企図される。持続的潅流において輸送される構築物またはペプチドの量は、望ましい取り込み量によって決定することができる。
【０２１７】
持続的な投与はまた、適当であれば、例えば腫瘍または他の望ましくない罹患領域が切除されて、残留微小疾患を消失させるために腫瘍床または標的化部位を治療する場所に適用してもよい。シリンジまたはカテーテル挿入による輸送も考慮される。そのような持続的潅流は、治療開始後約1〜2時間、約2〜6時間、約6〜12時間、約12〜24時間、約1〜2日、約1〜2週間またはそれ以上の期間行ってもよい。一般的に、持続的潅流による治療組成物の用量は、潅流が起こる期間に対して補正した1回または多数部位注射によって投与した量と同等であろう。
【０２１８】
治療レジメも同様に変化してもよく、しばしば腫瘍のタイプ、腫瘍の位置、免疫状態、標的部位、疾患の進行、ならびに患者の健康および年齢に依存する。明らかに、特定のタイプの腫瘍は、より強い治療を必要とするが、同時に特定の患者はより負担の大きいプロトコールを認容できない。臨床医は、治療的製剤に関する既知の有効性および毒性（もしあれば）に基づいてそのような決定を下すために最も適格であろう。
【０２１９】
特定の態様において、治療される腫瘍または罹患領域は、少なくとも最初は切除可能でなくてもよい。治療的ウイルス構築物による治療によって、辺縁部の収縮または特定の特に浸潤性の部分の消失により、腫瘍の切除可能性が増加する可能性がある。治療後、切除が可能となることがある。切除後のさらなる治療は、腫瘍または標的部位での微小残留疾患を消失させるために役立つであろう。
【０２２０】
原発腫瘍または切除後の腫瘍床に対する典型的な治療コースは、多数回の投与を含むであろう。典型的な原発腫瘍の治療は、2週間のあいだに6回の投与を含む。2週間の治療を1、2、3、4、5、6回、またはそれ以上繰り返してもよい。治療コースのあいだ、計画された投与を完了する必要性を再評価してもよい。
【０２２１】
治療は、様々な「単位用量」を含んでもよい。単位用量は、治療組成物の規定量を含むとして定義される。投与される量、ならびに特定の経路および製剤は、臨床の当業者の範囲内である。単位用量は、1回投与として投与する必要はなく、一定期間での持続的注入を含んでもよい。本発明の単位用量は便宜上、ウイルス構築物のプラーク形成単位（pfu）またはウイルス粒子に関して記述される。単位用量は103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013 pfuまたはウイルス粒子（vp）およびそれ以上の範囲である。
【０２２２】
タンパク質は、以下の用量、または少なくとも以下の用量：0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000 ng/mlまたはそれ以上で患者に投与してもよい。
【０２２３】
2．注射可能組成物および製剤
いくつかの態様において、免疫原性分子、MDA-7タンパク質をコードする発現構築物、MDA-7タンパク質、および／または免疫原を輸送する方法は、全身投与によって行う。しかし、本明細書において開示される薬学的組成物は、または米国特許第5,543,158号；米国特許第5,641,515号、および米国特許第5,399,363号（それぞれの全内容物が参照として本明細書に特に組み入れられる）に記述されるように、非経口投与、皮下、直接、気管内、静脈内、皮内、筋肉内、または腹腔内投与してもよい。
【０２２４】
核酸構築物の注射は、発現構築物が注射のために必要な特定のゲージの針を通過することができる限り、シリンジまたは溶液の注射に用いられる任意の他の方法によって輸送してもよい。新規無針注射系が最近記述されており（米国特許第5,846,233号）、これは溶液を保持するアンプル室を定めるノズルと、溶液をノズルから輸送部位へと押し出すためのエネルギー装置とを有する。溶液の規定量を正確に任意の深さで多数回注射することができるシリンジ系も同様に、遺伝子治療において用いるために記述されている（米国特許第5,846,225号）。
【０２２５】
遊離の塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水において調製してもよい。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物、ならびに油における分散液も同様に調製してもよい。通常の保存および使用条件で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。注射での使用に適した薬学剤形には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時混合調製のための滅菌粉末（米国特許第5,466,468号、その全内容物が特に参照として本明細書に組み入れられる）が含まれる。全ての場合において、剤形は滅菌でなければならず、容易な注入操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体となりうる。例えばレシチンのようなコーティングを用いることによって、分散液の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持してもよい。微生物の作用に対する保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサル等によって得ることができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に用いることによって行うことができる。
【０２２６】
水溶液における非経口投与の場合、例えば、溶液は必要であれば適切に緩衝作用を有しなければならず、液体希釈剤は十分な生理食塩液またはグルコースによってまず等張にしなければならない。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内、および腹腔内投与のために特に適している。この場合、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に既知であろう。例えば、一つの用量を等張NaCl溶液1 mlに溶解して、皮下注入液1000 mlに加えるか、または提案される注入部位に注射してもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照されたい）。治療される被験者の状態に応じて、用量の何らかの変更が必要であろう。投与に携わる人は、いずれにせよ個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与の場合、調製物は、FDA生物製剤標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、全般的安全性および純度標準を満たさなければならない。
【０２２７】
滅菌注射用溶液は、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において必要量の活性成分を組み入れ、必要であればその後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は、基本分散媒体と先に列挙した必要な他の成分とを含む様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、いくつかの調製法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは予め濾過滅菌されたその溶液から、活性成分プラス任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０２２８】
本明細書に開示の組成物は、中性または塩の形で調製してもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基によって形成される）が含まれ、これらは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離のカルボキシル基によって形成される塩も同様に、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来しうる。調製されると、溶液は、投与剤形に適合する方法で、そして治療的に有効である量で投与されるであろう。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル等のような多様な投与剤形において容易に投与される。
【０２２９】
本明細書において用いられるように、「担体」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、媒体、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝剤、単体溶液、懸濁液、コロイド等が含まれる。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体および物質を用いることは、当技術分野で周知である。任意の通常の媒体または物質が活性成分と非適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。補助活性成分も同様に、組成物に組み入れることができる。
【０２３０】
「薬学的に許容される」という句は、ヒトに投与した場合にアレルギー性または類似の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野で十分に理解されている。典型的に、そのような組成物は注射用剤として、液体溶液または懸濁液として調製される；注射前の液体において、溶液または懸濁液のために適した固体剤形も同様に調製することができる。
【０２３１】
c．アジュバント
同様に当技術分野で周知であるように、免疫原性分子、免疫原またはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる免疫応答の非特異的刺激物質を用いることによって増強することができる。適したアジュバントには、サイトカイン、毒素、または合成組成物のような全ての許容される免疫刺激化合物が含まれる。本発明において、MDA-7ポリペプチドの有効量を投与することは、免疫応答を増強し、それによってアジュバントとして機能する。さらに、他の態様において、PKRの発現を増加させる分子は、免疫応答を増強させると考えられ、本発明において許容される免疫刺激化合物となりうる。
【０２３２】
しかし、MDA-7の他に他のアジュバントを用いてもよく、それらには、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、thur-MDPおよびnor-MDPのようなMDP化合物、CGP（MTP-PE）、リピッドAおよびモノホスホリルリピッドA（MPL）、細菌から抽出した三つの成分を含むRIBI、MPL、トレハロースジミコレート（TDM）および2％スクアレン／ツイーン80乳剤中の細胞壁骨格（CWS）が含まれる。MHC抗原も用いてもよい。
【０２３３】
例としてのアジュバントには、フロイントの完全アジュバント（結核菌（Mycobacterium tuberculosis）死菌を含む非特異的刺激物質）、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。
【０２３４】
MDA-7の他に、アジュバント活性を有する他の化合物を本発明の特定の局面において含めてもよいと企図される。アジュバント、機能、および輸送メカニズムは当技術分野で周知である。他のアジュバントの非制限的な例には、Adjumer（商標）（すなわち、PCPP塩；ポリホスファゼン）；Adju-Phos（すなわちリン酸アルミニウムゲル）；藻類のグルカン（すなわちb-グルカン；グルカン）；アルガムリン（Algammulin）（すなわちγインスリン／アラム複合アジュバント）；アルヒドロゲル（すなわち、水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン）；抗原製剤（すなわち、SPT、AF）；Avridine（登録商標）（すなわち、N,N-ジオクタデシル-N',N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミン；CP20,961）；BAY R1005（すなわち、N-(2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-b-D-グルコピラノシル)-N-オクタデシルドデカノイルアミドハイドロアセテート）；カルシトリオール（すなわち、1a,25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジ(OH)2D3；1,25-DHCC；1a,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール）；リン酸カルシウムゲル（すなわち、リン酸カルシウム）；コレラ完全毒素（CT）およびコレラ毒素Bサブユニット（CTB）（すなわち、CT；CTBサブユニット；CTB）；コレラ毒素A1-サブユニット-プロテインA D-断片融合タンパク質（すなわち、CTA1-DD遺伝子融合タンパク質）；CRL1005（すなわち、ブロックコポリマーP1205）；サイトカイン含有リポソーム（すなわち、サイトカイン含有脱水和再水和小胞）；DDA（すなわち、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；ジメチルジステアリルアンモニウムブロミド（CAS登録番号3700-67-2））；DHEA（すなわち、デヒドロエピアンドロステロン；アンドロステノロン；プラステロン）；DMPC（すなわち、ジミリストイルホスファチジルコリン；1,2-ジミリストイル-sn-3-ホスファチジルコリン；（CAS登録番号18194-24-6））；DMPG（すなわち、ジミリストイルホスファチジルグリセロール；sn-3-ホスファチジルグリセロール-1,2-ジミリストイルナトリウム塩（CAS登録番号67232-80-8））；DOC/ミョウバン複合体（すなわち、デオキシコール酸ナトリウム塩；DOC/Al(OH)3/無機質担体複合体）；フロイント完全アジュバント（すなわち、CIA；FCA）；フロイント不完全アジュバント（すなわち、IFA；FIA）；γインスリン；Gerbuアジュバント；GM-CSF（すなわち、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子；サルグラモスチム（酵母由来rh-GM-CSF））；GMDP（すなわち、N-アセチルグルコサミニル-(β1-4)-N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（CAS登録番号70280-03-4））；Imiquimod（すなわち、1-(2-メチルプロピル)-IH-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン；R-837；S26308）；ImmTher（商標）（すなわち、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルヌラミル-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-グリセロールジパルミテート；DTP-GDP）；共刺激分子に対する抗体を含むイムノリポソーム（すなわち、脱水和-再水和小胞（DRVs）から調製した免疫リポソーム）；インターフェロン-g（すなわち、Actimmune（登録商標）rhIFN-γ、ジェネンテックインク（Genentech Inc.）；免疫インターフェロン；IFN-γ；γ-インターフェロン）；インターロイキン-1β（すなわち、IL-10；IL-1；ヒトインターロイキン1β成・熟ポリペプチド117〜259）；インターロイキン-2（すなわち、IL-2；T-細胞増殖因子；アルデスロイキン（des-アラニル-1、セリン-125ヒトインターロイキン2）；Proleukin（登録商標）；Teceleukin（登録商標））；インターロイキン-7（すなわち、IL-7）；インターロイキン-12（すなわち、IL-12；ナチュラルキラー細胞刺激因子（NKSF）；細胞障害性リンパ球成熟因子（CLMF））；ISCOMs（商標）（すなわち、免疫刺激複合体）；Iscoprep 7.0.3（商標）リポソーム（すなわち、同時に封入されたインターロイキン-2、BisHOPまたはDOTMAを含むまたは含まない、タンパク質、またはTh-細胞および／またはB-細胞ペプチド、または微生物を含むリポソーム（L）；A、「L（抗原）」）；ロキソリビン（すなわち、7-アリル-8-オキソグアノシン）；LT-OAまたはLT経口アジュバント（すなわち、大腸菌不安定エンテロトキシンプロトキシン）；MF59；MONTANIDE ISA 51（すなわち精製IFA；フロイント不完全アジュバント）；MONTANIDE ISA 720（すなわち代謝可能な油アジュバント）；MPL（商標）（すなわち、3-Q-デスアシル-4'-モノホスホリルリピッドA；3D-MLA）；MTP-PE（すなわち、N-アセチル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-(ヒドロキシ-ホスホリルオキシ))エチルアミド、一ナトリウム塩）；MTP-PEリポソーム（すなわち、MTP-PE抗原提示リポソーム）；ムラメチド（すなわち、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3）；ムラパルミチン（すなわち、Nac-Mur-L-Thr-D-isoGln-sn-グリセロールジパルミトイル）；D-ムラパルミチン（すなわち、Nac-Mur-D-Ala-D-isoGln-sn-グリセロールジパルミトイル）；NAGO（すなわち、ノイラミニダーゼ-ガラクトースオキシダーゼ）；非イオン性界面活性剤小胞（すなわち、NISV）；プルーラン（すなわち、b-グルカン；グルカン）；PLGA、PGA、およびPLA（すなわち、乳酸とグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー；ラクチド／グリコリドポリマー；ポリ-ラクチド-コグリコリド）；プルロニックL121（すなわち、ポロキサマー401）；PMMA（すなわち、ポリメチルメタクリレート）；PODDS（商標）（すなわち、タンパク質様ミクロスフェア）；ポリrA；ポリrU（すなわち、ポリアデニル酸-ポリウリジン酸複合体）；ポリソルベート80（すなわち、ツイーン80；ソルビタンモノ-9-オクタデセノエートポリ(オキシ-1,2-エタネジル)誘導体）；蝸牛殻状タンパク質；QS-21（すなわち、Stimulon（商標）QS-21アジュバント）；Quil-A（すなわち、Quil-Aサポニン、キラヤサポニン）；リハイドラゲルHPA（すなわち、高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン）；リハイドラゲルLV（すなわち、低粘度水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン）；S-28463（すなわち、4-アミノ-otec,-ジメチル-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-エタノール）；SAF-1（すなわち、SAF-m；シンテックスアジュバント製剤）；Sclavoペプチド（すなわち、I L-1b 163-171ペプチド）；センダイプロテオリポソーム、センダイウイルス含有脂質マトリクス（すなわち、センダイウイルス糖タンパク質含有小胞；フソゲニックプロテオリポソーム；FPLs）；Span 85（すなわち、Arlacel 85、ソルビタントリオレエート）；Specol：スクアラン（すなわち、スピナカン；Robane（登録商標）；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチルテトラコサン）；スクアラン（スピナセン；スプラエン；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22テトラコサヘキサエン）；ステアリルチロシン（すなわち、オクタデシルチロシン塩酸塩）；Theramide（商標）（すなわち、N-アセチルグルコサミ���ル-N-アセチルイヌラミル-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-ジパルミトキシプロピルアミド（DTP-DPP））；トレオニル-MDP（すなわち、Termurtide（商標）；[thr1]-MDP；N-アセチルムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン）；Ty粒子（すなわち、Ty-VLPs（ウイルス様粒子））；ウォルターリードリポソーム（すなわち、水酸化アルミニウムに吸着させたリピッドAを含むリポソーム、[L(リピッドA＋抗原)＋ミョウバン]）が含まれる。
【０２３５】
アジュバントの他に、T細胞免疫をアップレギュレートするまたはサプレッサー細胞活性をダウンレギュレートすることが示されている生体反応修飾物質（BRM）を同時投与することが望ましいかも知れない。そのようなBRMsには、シメチジン（CIM；1200 mg/d）（スミスクライン（Smith/Kline）、ペンシルバニア州）、または低用量シクロホスファミド（CYP；300 mg/m2）（ジョンソン／ミード（Johnson/Mead）、ニュージャージー州）、およびγインターフェロン、IL-2、もしくはIL-12のようなサイトカイン、またはB-7のような免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３６】
3．ワクチン
本発明には、癌または前癌の発症を予防する方法および組成物が含まれる。そのため、本発明は、能動および受動免疫態様の双方において用いるためのワクチンを企図する。ワクチンとして用いるために適していることが提唱されている免疫原性組成物は、本明細書に開示のように調製した精製MDA-7から最も容易に直接調製される可能性がある。好ましくは、抗原性材料は、望ましくない低分子量の分子を除去するために十分に透析して、および／または所望の媒体により容易に調製するために凍結乾燥する。
【０２３７】
活性成分としてMDA-7配列を含むワクチンの調製は一般的に、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,958,895号、第6,004,799号、および第5,620,896号によって例示されるように、類推によって当業者に一般的に十分に理解される。典型的に、そのようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射用剤として調製される：注射前の液体において溶液または懸濁液にとって適した固体剤形も同様に調製してもよい。調製物はまた、乳化してもよい。活性免疫原性成分はしばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合性である賦形剤と混合される。適した賦形剤は、例えば水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組み合わせである。さらに、望ましければワクチンは、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような微量の補助物質を含んでもよい。
【０２３８】
ワクチンは通常、非経口投与、注射例えば皮下または筋肉内注射によって投与される可能性がある。他の投与様式に適したさらなる製剤には、坐剤および場合によっては経口製剤が含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤および担体には、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれてもよい；そのような坐剤は、活性成分を約0.5％〜約10％、好ましくは約1％〜約2％の範囲で含む混合物から形成してもよい。経口製剤には、例えば薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉剤の形であってもよく、活性成分を約10〜約95％、好ましくは約25％〜約70％含む。
【０２３９】
MDA-7タンパク質（またはその断片）またはMDA-7の全てまたは一部をコードする核酸は、中性または塩の形でワクチンに調製してもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基によって形成される）が含まれ、これらは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離のカルボキシル基によって形成される塩も同様に、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来してもよい。
【０２４０】
ワクチンは、投与製剤に適合する方法で、治療的に有効で免疫原性であるような量で投与される。投与量は、例えば個体の免疫系の抗体合成能および望ましい保護の程度を含む、治療される被験者に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に任せられる。しかし、適切な用量範囲は、活性成分数百マイクログラム／ワクチンの次数である。初回投与および追加免疫に適したレジメも同様に多様であるが、初回投与後にその後の接種または他の投与を行うことが典型的である。
【０２４１】
適用方法は広く異なってもよい。通常の投与法の如何なるものも適用可能である。これらは、固体の生理的に許容される基剤での経口適用、または生理学的に許容される分散液、非経口、注射等が含まれると考えられる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、宿主の体格に従って変化するであろう。
【０２４２】
ワクチンのアジュバント効果を得るための様々な方法には、一般的に約0.05〜約0.1％リン酸緩衝生理食塩液溶液として用いられる水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）のような物質を用いること、約0.25％溶液として用いられる合成糖ポリマー（Carbopol（登録商標））と共に混合すること、約70℃〜約101℃の範囲の温度で30秒〜2分間の熱処理によってワクチンにおけるタンパク質を凝集させることが含まれる。アルブミンに対するペプシン処理抗体（Fab）による再活性化による凝集、C. パルブム（C. parvum）のような細菌細胞またはグラム陰性菌のエンドトキシンもしくはリポ多糖類成分との混合物、マンニドモノ-オレエート（Aracel A）のような生理的に許容される油性媒体における乳剤、またはブロック代用物として用いられる20％ペルフルオロカーボン（Fluosol-DA（登録商標））溶液との乳剤も同様に用いてもよい。
【０２４３】
多くの場合、ワクチンを多数回投与すること、通常6回を超えないワクチン接種、より通常4回を超えないワクチン接種、および好ましくは1回またはそれ以上、通常少なくとも約3回のワクチン接種が望ましいであろう。ワクチン接種は通常2〜12週間の間隔で行われ、より通常3〜5週間の間隔で行われるであろう。抗体の保護レベルを維持するためには、1〜5年の間隔、通常3年間隔での定期的な追加免疫が望ましいであろう。免疫過程の後に、上清の抗原に対する抗体に関するアッセイを行ってもよい。アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光等のような通常の標識によって標識することによって行ってもよい。これらの技術は周知であり、これらのタイプのアッセイの実例として、米国特許第3,791,932号、第4,174,384号、および第3,949,064号のような広く多様な特許において認められるであろう。
【０２４４】
4．併用治療
特定の態様において、本発明の組成物および方法は、MDA-7の作用を増強する、またはMDA-7が用いられる任意の治療、診断、または予後効果を増加させる他の物質または組成物と併用して、MDA-7ポリペプチド、またはそれをコードする発現構築物を含む。これらの組成物は、所望の作用を得るために、例えば、癌細胞を殺す、または血管新生を阻害するために有効な併用量で提供されるであろう。このプロセスは、細胞を発現構築物および物質または多数の因子に同時に接触させることを含んでもよい。これは、単一の組成物、もしくは双方の物質を含む薬理学的組成物に細胞を接触させることによって、または一つの組成物が発現構築物を含み、もう一つの組成物が第二の物質を含む、二つの異なる組成物もしくは製剤を同時に細胞に接触させることによって行ってもよい。
【０２４５】
本発明の一つの態様において、mda-7遺伝子治療は、他のアポトーシス促進性、抗血管新生、抗癌、または細胞周期調節物質の他に、免疫治療介入と共に用いられると企図される。または、治療は、数分から数週間の間隔で他の物質治療の前または後であってもよい。他の物質および発現構築物が細胞に個別に適用される態様において、一般的に、物質と発現構築物とがなおも細胞に対して都合のよい併用効果を発揮できるように、それぞれの輸送時間のあいだに有意な時間が経過しないように確保されるであろう。そのような場合、双方の様相を互いに約12〜24時間以内に、より好ましくは互いに約6〜12時間以内に細胞に接触させてもよいと企図される。状況によっては、治療期間を有意に延長することが望ましい可能性があり、この場合それぞれの投与間隔は数日（2、3、4、5、6、または7日）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7、または8週間）である。
【０２４６】
例えば遺伝子治療が「A」であって、抗原のような免疫治療レジメの一部として投与される免疫原性分子が「B」である場合、以下のような様々な併用を用いてもよい。
2006523227.tif 000011
【０２４７】
本発明の治療的発現構築物を患者に投与する場合には、もしあればベクターの毒性を考慮に入れて、そのような化合物の投与に関する一般的プロトコールに従う。治療サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。同様に、様々な標準的な治療と共に外科的介入を記述の治療と併用して適用してもよいと企図される。
【０２４８】
特定の態様において、化学療法、放射線療法、免疫療法、または他の遺伝子治療のような抗癌治療が、本明細書に記述のMDA-7治療と併用して用いられると企図される。
【０２４９】
a．化学療法
化学療法には化学物質および放射線に基づく治療の双方の多様な併用療法が含まれる。併用化学療法には、例えば、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合物質、タキソール、ゲンシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、5-フルオロウラシル、ビンクリスチンおよびメソトレキセートまたは前述の任意の類似体もしくは誘導体変種が含まれる。
【０２５０】
b．放射線療法
DNA損傷を引き起こし、広く用いられている他の要因には、一般的にγ線として知られるもの、X-線、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接輸送が含まれる。マイクロ波、プロトンビーム放射線照射（米国特許第5,760,395号および米国特許第4,870,287号）およびUV照射のような、他の型のDNA損傷因子も同様に企図される。これらの要因の全ては、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に対して幅広い損傷を与える可能性が最も高い。X-線の線量は、持続的な期間（3〜4週間）での1日量50〜200レントゲンから、1回量2000〜6000レントゲンである。放射性同位元素の用量範囲は、広く異なり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０２５１】
細胞に適用した場合に「接触される」および「曝露される」という用語は、本明細書において治療構築物および化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に輸送される、または標的細胞の直接近位に留置されるプロセスを記述するために用いられる。殺細胞を得るために、例えば双方の物質を、細胞を殺すために、または細胞の分裂を阻止するために有効な併用量で細胞に輸送する。
【０２５２】
c．免疫療法
癌治療の状況において、免疫療法は、一般的に癌細胞を標的として破壊するために免疫エフェクター細胞および分子を用いることに依存する。トラスツズマブ（Herceptin（商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であってもよい。抗体単独が治療のエフェクターの役割を果たしてもよく、または殺細胞を実際に行うために他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に結合させてもよく、または単にターゲティング物質として作用してもよい。または、エフェクターは腫瘍細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞障害性T細胞およびNK細胞が含まれる。治療様相の併用、すなわち直接細胞障害活性とErbB2の阻害または減少は、ErbB2過剰発現癌の治療において治療利益を提供するであろう。
【０２５３】
もう一つの免疫療法も同様にMDA-7との併用治療の一部として用いることができるであろう。併用療法の一般的アプローチを下記に考察する。免疫療法の一つの局面において、腫瘍細胞は、ターゲティングを受ける、すなわち他の多数の細胞には存在しないいくつかのマーカーを有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらの如何なるものも本発明の状況においてターゲティングに適している可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児抗原、前立腺特異抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス抗原、MucA、MucB、PLAP、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、erbBおよびp155が含まれる。免疫療法のもう一つの局面は、抗癌作用を免疫刺激作用と併用することである。以下を含む免疫刺激分子も同様に存在する：IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNのようなサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8のようなケモカイン、およびFLT3リガンドのような増殖因子。タンパク質として、または遺伝子輸送を用いる免疫刺激分子を、MDA-7のような腫瘍抑制因子と併用することは、抗腫瘍効果を増強することが示されている（Juら、2000）。
【０２５４】
先に考察したように、現在治験が行われている、または用いられている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えばウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第5,801,005号；米国特許第5,739,169号；Hui and Hashimoto、1998；Christodoulidesら、1998）、サイトカイン療法、例えばインターフェロンα、β、およびγ、IL-1、GM-CSF、およびTNF（Bukowskiら、1998；Davidsonら、1998；Hellstrandら、1998）、遺伝子治療、例えばTNF、IL-1、IL-2、p53（Qinら、1998；Austin-Ward and Villaseca、1998；米国特許第5,830,880号、および米国特許第5,846,945号）ならびにモノクローナル抗体、例えば抗ガングリオシドGM2、抗HER-2、抗p185（Pietrasら、1998；Hanibuchiら、1998；米国特許第5,824,311号）。ハーセプチン（トラスツズマブ）は、HER2-neu受容体を遮断するキメラ（マウス-ヒト）モノクローナル抗体である。これは抗腫瘍活性を有し、悪性腫瘍の治療において用いるために承認されている（Dillman、1999）。本明細書に記述のMDA-7治療と共に、一つまたはそれ以上の抗癌治療を用いてもよいと企図される。
【０２５５】
癌の受動免疫療法に関する多くの異なるアプローチが存在する。それらは、以下の範疇に広く分類されるであろう：抗体単独の注射；毒素または化学療法剤と共役させた抗体の注射；放射活性同位元素と共役させた抗体の注射；抗イディオタイプ抗体の注射；および最後に骨髄における腫瘍細胞の追放。
【０２５６】
好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は、患者にほとんどまたは全く副作用を生じないことから、受動免疫療法において用いられる。しかし、抗体が少ないこと、そしてこれまで病変内に投与されたに過ぎないことから、それらの応用にはいくぶん限界がある。ガングリオシド抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、皮膚再発性黒色腫に苦しむ患者の病変内に投与されている（Irie and Morton、1986）。毎日または毎週の病変内注射後、患者10人中6人において退縮を認めた。もう一つの試験において、二つのヒトモノクローナル抗体の病変内注射によって中等度の成功が得られた（Irieら、1989）。
【０２５７】
二つの異なる抗原に対する一つより多いモノクローナル抗体、または多数の抗原特異性を有する抗体を投与することが好ましいかも知れない。治療プロトコールには、Bajorinら（1988）によって記述されるように、リンフォカインまたは他の免疫エンハンサーの投与が含まれてもよい。ヒトモノクローナル抗体の作製は、本明細書において他所でさらに詳細に記述される。
【０２５８】
能動的免疫治療において、抗原性ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質、または自己もしくは同種異系腫瘍細胞組成物または「ワクチン」を、一般的に異なる細菌アジュバントと共に投与する（Ravindranath and Morton、1991；Mortonら、1992；Mitchellら、1990；Mitchellら、1993）。黒色腫の免疫療法において、高いIgM反応を誘発する患者はしばしば、IgM抗体を全く誘発しないまたはIgM抗体が少ない患者より長く生存する（Mortonら、1992）。IgM抗体はしばしば一過性の抗体であり、この法則に対する例外は、抗ガングリオシドまたは抗炭化水素抗体であるように思われる。
【０２５９】
養子免疫療法において、患者の循環中のリンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球をインビトロで単離してIL-2のようなリンフォカインによって活性化するか、または腫瘍壊死因子遺伝子を形質導入して、再投与する（Rosenbergら、1988；1989）。これを行うために、動物またはヒト患者に免疫学的有効量の活性化リンパ球を、本明細書に記述のアジュバントを組み入れた抗原性ペプチド組成物と共に投与する。活性化リンパ球は、最も好ましくは予め血液または腫瘍試料から単離してインビトロで活性化（または「増殖」）された患者自身の細胞であろう。このタイプの免疫療法は、数例において黒色腫および腎癌の退縮を生じたが、反応しなかった人と比較して反応者の割合は低かった。
【０２６０】
d．遺伝子治療
さらにもう一つの態様において、併用治療は、治療的ポリヌクレオチドがMDA-7ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の前、後、または同時に投与される遺伝子治療を含む。MDA-7ポリペプチドまたはコード核酸を、以下の遺伝子産物の一つをコードするベクターと共に輸送すると、標的組織に対して併用治療効果を有する可能性がある。多様なタンパク質が本発明に含まれ、そのいくつかを下記に説明する。表3は、本発明と併用して何らかの形で遺伝子治療のためにターゲティングされる様々な遺伝子を記載する。
【０２６１】
i）細胞増殖誘導物質
細胞増殖を誘導するタンパク質はさらに、機能に応じて様々な範疇に分類される。これらのタンパク質の全てに共通することは、それらが細胞増殖を調節できることである。例えば、sis腫瘍遺伝子であるある種のPDGFは、分泌型の増殖因子である。腫瘍遺伝子が増殖因子をコードする遺伝子に由来することはまれであり、現在では、sisは天然に存在する唯一の既知の腫瘍遺伝子増殖因子である。本発明の一つの態様において、細胞増殖の特定の誘導物質に向けられるアンチセンスmRNAまたはsiRNAは、細胞増殖の誘導物質の発現を防止するために用いられると企図される。
【０２６２】
タンパク質FMSおよびErbAは、ErbBのような増殖因子受容体である。これらの受容体に対する変異によって調節可能な機能の喪失が起こる。例えば、Neu受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響を及ぼす点突然変異によって、neu腫瘍遺伝子が得られる。erbA腫瘍遺伝子は甲状腺ホルモンの細胞内受容体に由来する。改変腫瘍遺伝子ErbA受容体は、内因性の甲状腺ホルモン受容体と競合して、制御されない増殖を引き起こすと考えられている。
【０２６３】
最大のクラスの腫瘍遺伝子には、シグナル伝達タンパク質（例えば、Src、Abl、およびRas）が含まれる。タンパク質Srcは、細胞質タンパク質チロシンキナーゼであり、何らかの場合にその癌原遺伝子から腫瘍遺伝子への形質転換が起こると、527位のチロシン残基に変異が起こる。対照的に、GTPアーゼタンパク質rasが癌原遺伝子から腫瘍遺伝子への形質転換によって、一例において、配列における12位のアミノ酸でのバリンからグリシンへの変異が起こり、ras GTP活性は減少する。
【０２６４】
タンパク質Jun、Fos、およびMycは、転写因子として核の機能にその作用を直接発揮するタンパク質である。
【０２６５】
ii）細胞増殖の阻害剤
腫瘍抑制性腫瘍遺伝子は、過度の細胞増殖を阻害するように機能する。これらの遺伝子が不活化されると、その阻害活性が破壊され、それによって調節されない増殖が起こる。腫瘍抑制因子p53、mda-7、FHIT、p16、およびC-CAMを用いることができる。
【０２６６】
p53の他に、もう一つの細胞増殖阻害剤がp16である。真核生物の細胞周期の主要な移行は、サイクリン依存的キナーゼ、またはCDKsによって誘発される。一つのCDK、サイクリン依存的キナーゼ4（CDK4）は、G1への進行を調節する。この酵素の活性はG1後期においてRbをリン酸化することである可能性がある。CDK4の活性は、活性化サブユニットD-型サイクリンおよび阻害性サブユニットによって制御され、p16INK4はCDK4に特異的に結合してこれを阻害するタンパク質であると生化学的に特徴が調べられており、このようにRbリン酸化を調節する可能性がある（Serranoら、1993；Serranoら、1995）。p16INK4タンパク質はCDK4阻害剤であることから（Serrano、1993）、この遺伝子が欠失すると、CDK4の活性が増加して、Rbタンパク質の過リン酸化が起こる可能性がある。p16はまた、CDK6の機能を調節することが知られている。
【０２６７】
p16INK4は、同様にp16B、p19、p21WAF1、およびp27KIP1が含まれるCDK阻害性タンパク質の新しく記述されたクラスに属する。p16INK4遺伝子は、9p21にマップされ、これは多くの腫瘍タイプにおいてしばしば欠失している染色体領域である。p16INK4遺伝子のホモ接合欠失および変異は、ヒトの腫瘍細胞株においてしばしば認められる。この証拠は、p16INK4遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。しかし、p16INK4遺伝子変化の頻度は培養細胞株より初代の非培養腫瘍でははるかに低いという知見から、この解釈は疑われている（Caldasら、1994；Chengら、1994；Hussussianら、1994；Kambら、1994；Kambら、1994；Moriら、1994；Okamotoら、1994；Noboriら、1995；Orlowら、1994；Arapら、1995）。プラスミド発現ベクターのトランスフェクションによって野生型p16INK4機能が回復すると、いくつかのヒト癌細胞株によるコロニー形成が減少した（Okamoto、1994；Arap、1995）。
【０２６８】
本発明に従って用いてもよい他の遺伝子には、Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合体、p21/p27融合体、抗血栓遺伝子（例えば、COX-1、TFP1）、PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300、血管新生に関与する遺伝子（例えば、VEGF、FGF、トロンボスポンジン、BAI-1、GDAIF、またはその受容体）およびMCCが含まれる。
【０２６９】
iii）プログラムされた細胞死の調節物質
アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、正常な胚発達、成体組織における恒常性の維持、および発癌の抑制にとって本質的なプロセスである（Kerrら、1972）。Bcl-2ファミリータンパク質およびICE-様プロテアーゼは、他の系におけるアポトーシスの重要な調節物質およびエフェクターであることが証明されている。濾胞性リンパ腫に関連して発見されたBcl-2タンパク質は、多様なアポトーシス刺激に反応してアポトーシスを制御する、および細胞生存を増強するために顕著な役割を有する（Bakhshiら、1985；Cleary and Sklar、1985；Clearyら、1986；Tsujimotoら、1985；Tsujimoto and Croce、1986）。進化的に保存されたBcl-2タンパク質は、現在では関連タンパク質ファミリーメンバーであると認識されており、これはデスアゴニストまたはデスアンタゴニストとして分類することができる。
【０２７０】
その発見後、Bcl-2は様々な刺激によって誘発される細胞死を抑制するように作用することが示された。同様に、共通の構造および配列相同性を有するBcl-2細胞死調節タンパク質ファミリーが存在することも現在では明らかである。これらの異なるファミリーメンバーは、Bcl-2と類似の機能を有する（例えば、BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1）、またはBcl-2機能を中和して、細胞死を促進する（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri）ことが示されている。
【０２７１】
5．手術
癌患者の約60％が何らかのタイプの手術を受け、これには、予防的、診断的、または進行期分類、治癒的、および待期的手術が含まれる。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および／または代替治療のような他の治療と併用して用いてもよい癌治療である。
【０２７２】
治癒的手術には、癌様組織の全てまたは一部を物理的に除去、切除、および／または破壊する切除が含まれる。腫瘍の切除は、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除の他に、手術による治療には、レーザー手術、冷凍外科、電気外科、および顕微鏡下で行う手術（モース外科）が含まれる。本発明は、表層部の癌、前癌、または正常組織の偶発的量の切除と共に用いてもよいとさらに企図される。
【０２７３】
癌様細胞、組織、または腫瘍の全ての部分を切除後、体に腔が形成されることがある。さらなる抗癌療法のその領域の潅流、直接注射、または局所適用によって治療を行ってもよい。そのような治療は例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日毎、または1、2、3、4および5週間毎、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月毎に繰り返してもよい。これらの治療はまた、用量を変化させてもよい。
【０２７４】
6．他の物質
治療の治療的有効性を改善するために、他の物質を本発明と併用して用いてもよいと企図される。これらのさらなる物質には、免疫調節剤、細胞表面受容体およびGAP接合部のアップレギュレーションに影響を及ぼす物質、細胞抑制および分化物質、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過増殖細胞の感受性を増加させる物質、または他の生体物質が含まれる。免疫調節物質には、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；IL-2および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカイン類似体；またはMIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、および他のケモカインが含まれる。Fas/Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAIL（Apo-2リガンド）のような細胞表面受容体またはそのリガンドのアップレギュレーションは、過増殖細胞に対するオートクラインまたはパラクライン効果を確立することによって、本発明のアポトーシス誘導能を増強するであろうとさらに企図される。GAP接合部の数を増加させることによって細胞内シグナル伝達を増加させると、隣接する過増殖細胞集団に対する抗過増殖作用を増加するであろう。他の態様において、細胞抑制または分化物質は、治療の抗過増殖有効性を改善するために、本発明と併用して用いることができる。細胞接着阻害剤は、本発明の有効性を改善すると企図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（FAKs）阻害剤およびロバスタチンである。抗体c225のようなアポトーシスに対する過増殖細胞の感受性を増加させる他の物質を、治療効率を改善するために本発明と併用して用いることができるであろうとさらに企図される。
【０２７５】
Apo2リガンド（Apo2L、TRAILとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（TNF）サイトカインファミリーメンバーである。TRAILは、多くのタイプの癌細胞において迅速なアポトーシスを活性化するが、正常細胞に対しては毒性ではない。TRAIL mRNAは多様な組織において起こる。最も正常な細胞は、TRAILのサイトカイン作用に対して抵抗性であるように思われ、TRAILによるアポトーシスの誘導に対して保護することができるメカニズムが存在することを示唆している。TRAILに関して記述された最初の受容体は、デス受容体4（DR4）と呼ばれ、細胞質「デスドメイン」を含む；DR4は、TRAILによって輸送されるアポトーシスシグナルを伝達する。TRAILに結合するさらなる受容体が同定されている。DR5と呼ばれる一つの受容体は、細胞質デスドメインを有し、DR4に非常に類似のアポトーシスシグナルを伝達する。DR4およびDR5 mRNAは、多くの正常組織および腫瘍細胞株において発現されている。最近、DR4およびDR5を通してTRAILによるアポトーシスの誘導を防止するDcR1およびDcR2のようなおとり受容体が同定されている。これらのおとり受容体は、細胞表面で直接アポトーシス促進性サイトカインに対する感受性を調節する新規メカニズムを表す。正常組織においてこれらの阻害性受容体が選択的に発現されることは、TRAILが正常細胞に影響を及ぼさずに癌細胞においてアポトーシスを誘導する抗癌剤として有用である可能性があることを示唆している（Marstersら、1999）。
【０２７６】
細胞障害性化学療法剤の導入後癌の治療に多くの進歩が見られた。しかし、化学療法の結末の一つは、薬剤耐性表現型の発生／獲得および多剤耐性の発生である。薬剤耐性の発生は、なおもそのような腫瘍の治療における主要な障害であり、したがって、遺伝子治療のような代替アプローチが明らかに必要である。
【０２７７】
化学療法、放射線療法、または生物療法と共に用いられるもう一つの型の治療には、患者の組織を高温（106°Fまで）に曝露する技法である温熱療法が含まれる。局所、限局、または全身温熱療法の適用には、外部または内部加熱装置が含まれてもよい。局所温熱療法は、腫瘍のような小さい領域に熱を適用することを含む。熱は、体外の装置から腫瘍を標的とする高周波によって外部から発生させてもよい。内部の熱は、薄い、加熱ワイヤまたは温水を満たした中空管、埋め込み型マイクロ波アンテナ、または高周波電極を含む滅菌プローブを含んでもよい。
【０２７８】
限局治療の場合には、患者の臓器または四肢を加熱するが、これは磁石のような高エネルギーを発生する装置を用いて行われる。または、患者の血液の一部を採取して、加熱してから内部加熱を行う領域に環流する。癌が全身に広がっている症例では、全身の加熱も同様に行ってもよい。この目的のために、温水ブランケット、ホットワックス、誘起コイル、および熱チャンバーを用いてもよい。
【０２７９】
ホルモン療法も同様に、本発明または既に記述された他の任意の癌治療と併用して用いてもよい。ホルモンは、テストステロンまたはエストロゲンのような特定のホルモンのレベルを低下させる、または作用を遮断するために、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頚癌のような特定の癌の治療において用いてもよい。この治療はしばしば、治療の選択肢として、または転移のリスクを低下させるために、少なくとも一つの他の癌治療と併用して用いられる。
【０２８０】
（表３）
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【０２８１】
e．免疫原性ポリペプチド／ペプチドおよび核酸
さらにもう一つの態様において、免疫原性分子は治療レジメの一部として提供される。免疫原性分子は、直接提供されてもよく、または免疫原性分子をコードする発現ベクターとして提供されてもよい。mda-7をコードするベクターを以下の遺伝子産物の一つをコードする第二のベクターと共に輸送すると、標的組織に対して複合誘導作用を有するであろう。または、双方の遺伝子をコードする単一のベクターを用いてもよい。
【０２８２】
（i）抗原
特定の態様において、本発明は、免疫治療を改善することに向けられる。腫瘍抗原に対する免疫応答も同様にMDA-7によって実行することができる。腫瘍抗原には、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、結核菌可溶性因子（Mtb）、フェノール可溶性モジュリン（PSM）、CMV-G、CMV-M、EBVカプシド-EB核抗原（EBNA）、gp120、gp41、tat、rev、gag、toxa抗原、風疹抗原、ムンプス抗原、α-フェトプロテイン（AFP）、腺癌抗原（ART-4）、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A*0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR.FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pml/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、またはWT1が含まれる。腫瘍抗原に対する反応を誘導するための用途は特に企図され、参照として本明細書に特に組み入れられる米国特許第5,552,293号および第6,132,980号において認められうる。
【０２８３】
3．ワクチン
本発明には、癌または前癌の発症を予防する方法および組成物が含まれる。そのため、本発明は、能動および受動免疫態様の双方において用いられるワクチンを企図する。ワクチンとして用いるために適していることが提唱されている免疫原組成物は、本明細書に開示の方法において調製された精製MDA-7から最も容易に直接調製される可能性がある。好ましくは、抗原性材料は、望ましくない低分子量分子を除去するために十分に透析して、および／または所望の溶媒により容易に調製するために凍結乾燥される。
【０２８４】
活性成分としてMDA-7配列を含むワクチンの調製は一般的に、その全てが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第5,958,895号、第6,004,799号、および第5,620,896号によって例示されるように、類推によって当業者に一般的に十分に理解される。典型的に、そのようなワクチンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射用剤として調製される：注射前の液体において溶液または懸濁液にとって適した固体剤形も同様に調製してもよい。調製物はまた、乳化してもよい。活性免疫原性成分はしばしば、薬学的に許容され、活性成分と適合性である賦形剤と混合される。適した賦形剤は、例えば水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノール等またはその組み合わせである。さらに、望ましければワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントのような微量の補助物質を含んでもよい。
【０２８５】
ワクチンは通常、非経口投与、注射例えば皮下または筋肉内注射によって投与される可能性がある。他の投与様式に適したさらなる製剤には、坐剤および場合によっては経口製剤が含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤および担体には、例えばポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれてもよい；そのような坐剤は、活性成分を約0.5％〜約10％、好ましくは約1％〜約2％の範囲で含む混合物から形成してもよい。経口製剤には、例えば薬学等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉剤の形であってもよく、活性成分を約10〜約95％、好ましくは約25％〜約70％含む。
【０２８６】
MDA-7タンパク質（またはその断片）またはMDA-7の全てまたは一部をコードする核酸は、中性または塩の形でワクチンに調製してもよい。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離のアミノ基によって形成される）が含まれ、これらは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離のカルボキシル基によって形成される塩も同様に、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基に由来してもよい。
【０２８７】
ワクチンは、投与製剤に適合する方法で、治療的に有効で免疫原性であるような量で投与される。投与量は、例えば個体の免疫系の抗体合成能および望ましい保護の程度を含む、治療される被験者に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に任せられる。しかし、適切な用量範囲は、活性成分数百マイクログラム／ワクチンの次数である。初回投与および追加免疫に適したレジメも同様に多様であるが、初回投与後にその後の接種または他の投与を行うことが典型的である。
【０２８８】
適用方法は広く異なってもよい。通常の投与法の如何なるものも適用可能である。これらは、固体の生理的に許容される基剤での経口適用、または生理学的に許容される分散液、非経口、注射等が含まれると考えられる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、宿主の体格に従って変化するであろう。
【０２８９】
ワクチンのアジュバント効果を得るための様々な方法には、一般的に約0.05〜約0.1％リン酸緩衝生理食塩液溶液として用いられる水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）のような物質を用いること、約0.25％溶液として用いられる合成糖ポリマー（Carbopol（登録商標））との混合、約70℃〜約101℃の範囲の温度で30秒〜2分間の熱処理によってワクチンにおけるタンパク質を凝集させることが含まれる。アルブミンに対するペプシン処理抗体（Fab）による再活性化による凝集、C. パルブムのような細菌細胞またはグラム陰性菌のエンドトキシンもしくはリポ多糖類成分との混合物、マンニドモノ-オレエート（Aracel A）のような生理的に許容される油媒体における乳剤、またはブロック代用物として用いられる20％ペルフルオロカーボン（Fluosol-DA（登録商標））溶液との乳剤も同様に用いてもよい。
【０２９０】
多くの場合、ワクチンを多数回投与すること、通常6回を超えないワクチン接種、より通常4回を超えないワクチン接種、および好ましくは1回またはそれ以上、通常少なくとも約3回のワクチン接種が望ましいであろう。ワクチン接種は通常2〜12週間の間隔で行われ、より通常3〜5週間の間隔で行われる。抗体の保護レベルを維持するためには、1〜5年の間隔、通常3年間隔での定期的な追加免疫が望ましいであろう。免疫過程の後に、上清の抗原に対する抗体に関するアッセイを行ってもよい。アッセイは、放射性核種、酵素、蛍光等のような通常の標識によって標識することによって行ってもよい。これらの技術は周知であり、これらのタイプのアッセイの実例として、米国特許第3,791,932号、第4,174,384号、および第3,949,064号のような広く多様な特許において認められるであろう。
【０２９１】
F．免疫原性分子の同定
本発明は、MDA-7がインターフェロン誘導ds-RNA依存的セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（PKR）をアップレギュレートするという知見を利用している。PKRは、多数の形質導入経路の活性化を通して抗腫瘍形成活性を媒介して、その結果増殖阻害およびアポトーシス誘導が起こるように思われる。これらの経路の活性化は、潜在的な不活性なホモ二量体型が活性化シグナルによってコンフォメーションの変化を受けるように誘導され、それによって自己リン酸化および活性化が起こった後に起こる（Vattemら、2001）。活性化されると、PKRは、様々な基質標的をリン酸化することができ、これは増殖の制御およびアポトーシスの誘導において重要である（Saelensら、2001；Sudharkarら、2000）。
【０２９２】
PKRの活性化は、Ad-mda7アポトーシスにおいて重要な事象である。特異的トレオニン／キナーゼ阻害剤である2-アミノ-プリン（2-AP）によってPKRを阻害すると、Ad-mda7アポトーシスのほぼ完全な逆転が起こり、eIF-2αリン酸化およびタンパク質合成阻害が阻害される。タンパク質合成の阻害は、おそらくアポトーシス阻害に関係する一つまたはそれ以上の短命のタンパク質の調節のために、アポトーシスの誘導にとって重要となる可能性がある。または、PKRによって制御される他の経路は、NF-κB、p53、MEK、IRF-1、またはFADDの調節に関与する経路のように重要となる可能性がある（Jagusら、1999；Gilら、1999；Cuddihyら、1999；Balachandranら、1998）。
【０２９３】
PKRを欠損するMEFsは、野生型PKRを有するMEFsとは対照的にアポトーシスを受けることができないことから、多数の経路が関与している可能性があっても、PKR活性化はAd-mda7アポトーシスにとって重要である。このアポトーシスの阻害は、アポトーシス促進性Ad-BakベクターによるPKR欠損MEFsの形質導入によって損なわれていないアポトーシスが起こることから、mda-7に対して特異的であるように思われた。MDA-7およびPKRがアポトーシスカスケードにおいてアポトーシス促進性Bak遺伝子の上流に存在するというこれらの知見に関するモデルを作製した。このモデルにおいて、MDA-7は様々な細胞経路に至るPKR活性化を誘導し、次に、カスパーゼ活性化およびアポトーシス誘導を誘導する。PKRの下流に存在するBakは、アポトーシスを誘導するためにPKR活性化には依存しない。データはまた、BID切断およびカスパーゼ8活性化を示し、これは、PKRアポトーシスがしばしば、Fas、FADD、カスパーゼ8およびBIDの活性化を通して媒介されることを証明した当技術分野における他の研究と一致する（Balachandranら、1998）。
【０２９４】
このように、MAD-7のアデノウイルス媒介過剰発現によって、PKRの迅速な誘導および活性化が起こり、他のPKR標的基質であるeIF-2αのリン酸化が起こり、アポトーシスが誘導される。肺癌細胞における2-APによるPKRの特異的阻害は、Ad-mda-7誘導PKR活性化、PKR基質標的リン酸化、およびアポトーシス誘導を消失させる。PKRヌル線維芽細胞によって示されるように、Ad-mda7アポトーシスは、機能的PKR経路に依存する。これらの結果は、Ad-mda7アポトーシスの重要なメディエータとしての多機能PKR遺伝子の新規役割を示している。さらに、PKRはMDA-7誘導アポトーシスにとって重要であることが本明細書において記述されていることから、そして免疫応答を誘導するために示唆されていることから、本発明は特定の態様において、免疫応答を増強するためにPKR発現を誘導することを企図し、データは、MDA-7ポリペプチドが、免疫応答を増強することができることを示している。
【０２９５】
他の態様において、本発明の方法は、免疫原性分子を同定することに向けられる。特に、本発明は、これまで同定されていない免疫原性分子、または例えば通常の免疫検出法の検出限界未満であるレベルで免疫原性を有する分子に対する免疫応答を増強するために有用である。
【０２９６】
本発明はさらに、免疫療法の候補患者の予後を決定する方法にも向けられる。本発明に従う診断試験は、抗原のような免疫原性分子に対する免疫応答に関してアッセイすることによって、患者が長期間進行しない候補患者であるか否かを評価することができる。本発明に含まれるもう一つの診断試験は、被験者が免疫応答を含む疾患および病態を予防する治療法の候補であるか否かを評価することができる。
【０２９７】
一つの態様において、本発明には、被験者が免疫原性分子に対する免疫応答を示すことができるか否かを決定する診断試験が含まれる。もう一つの態様において、診断試験は、被験者がT-細胞、NK細胞、またはマクロファージの活性の増加を示すか否かを決定するために用いられる。もう一つの態様において、診断法は、被験者がサイトカイン濃度の増加を示すか否かを決定するために用いられる。いずれの場合においても、被験者がそうであれば、本発明には、本明細書に記述の組成物を用いて免疫応答を誘発することが含まれる。さらなる態様において、誘導された免疫応答を示すまたは示すことができる被験者に、免疫応答を増強するための治療方法を投与する。
【０２９８】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の態様を証明するために含められる。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実践において十分に機能すると本発明者らによって発見された技術を表すことは、当業者によって認識されるはずである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様に多くの変更を行うことができ、それでも本発明の趣旨および範囲に含まれる同等または類似の結果が得られることを認識するはずである。
【０２９９】
実施例1：MDA-7は、IL-22受容体を通して血管新生を調節する新規リガンドである
材料および方法
1．細胞培養
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC；ロックビル、メリーランド州）から得たヒトの肺の非小細胞癌（NSCLC）細胞株A549（腺癌）およびヒト胎児腎細胞（293）を、10％ウシ胎児血清（ギブコ-BRL（GIBCO-BRL）、グランドアイランド、メリーランド州）を添加したハム/F12培地（A549）およびダルベッコ改変イーグル培地（293）において増殖させた。HUVECおよびHMVECは、クロネティクス（Clonetics、ウォーカービル、メリーランド州）から購入して、5％ウシ胎児血清および製造元の「弾丸状のキット」として供給されたさらなる試薬を含む内皮細胞基本培地において増殖させた。内皮細胞は、継代3〜9回で使用した。
【０３００】
2．分泌されたMDA-7タンパク質の産生および精製
MDA-7タンパク質は、293細胞に、完全長のmda-7 cDNAを有する真核細胞発現ベクターをトランスフェクトすることによって産生した。トランスフェクションが完了した後、細胞をヒグロマイシン（0.4 μg/ml）において14日間選択した。安定な細胞株（293-mda-7）を、ウェスタンブロット分析またはELISAによって可溶性のMDA-7（sMDA-7）タンパク質を産生するか否かに関して試験した。ELISAによって決定したところ、少量の細胞（293-mda-7）106個が、24時間のあいだに約30〜50 ng/mlのsMDA-7を産生した。sMDA-7タンパク質を大規模に精製するために、293-mda-7細胞を150 mm組織培養プレートにおいて90％コンフルエンシーまで増殖させた。組織培養上清を採取して、既に記述されているように（Caudelら、2002）アフィニティクロマトグラフィーによるタンパク質精製のためにプールした。sMDA-7タンパク質の大きさおよび純度は銀染色ゲルおよびウェスタンブロット分析によって決定した。
【０３０１】
3．内皮細胞増殖アッセイ
細胞増殖に及ぼすsMDA-7タンパク質の影響を調べるために、内皮細胞（HUVEC、HMVEC）を一晩血清枯渇した。翌日、細胞を2ウェルチャンバースライドガラス（1×104個/ウェル）に播種した。細胞を4〜6時間接着および伸展させ、前血管新生刺激剤として1 ng/ml bFGF、および様々な濃度のsMDA-7/IL-24（1、5、10、および50 ng/ml）を含む新鮮な培地を加えた。PBSを処置した細胞を対照とした。細胞を処置の3日後に回収して、既に記述されているように（Saekiら、2000）トリパンブルー排除アッセイ法によって細胞増殖を決定した。肺腫瘍細胞（H1299およびA549）増殖に及ぼすsMDA-7の影響も同様に評価した。実験条件は、腫瘍細胞をbFGFによって刺激しなかったことを除き、内皮細胞に関して先に記述した条件と同じであった。Ad-mda7（3000vp/細胞）によって処置した腫瘍細胞を陽性対照とした。
【０３０２】
4．内皮細胞分化アッセイ
内皮細胞の分化（管形成）アッセイは、インビトロ血管新生アッセイキット（ケミコン（Chemicon）、テメキュラ、カリフォルニア州）を用いて行った。簡単に説明すると、HUVECおよびHMVECを80％コンフルエンシーまで増殖させて、回収し、増殖培地に浮遊させて、マトリゲル（ケミコン、テメキュラ、カリフォルニア州）をコーティングした96ウェルプレートにおいて2×104個/ウェルの密度で播種した。細胞をsMDA-7タンパク質（1、5、10、および50 ng/ml）またはsMDAタンパク質を免疫的に除去した調製物によって37℃で24時間処置した。PBSを処置した細胞をこれらの実験における陰性対照とした。sMDA-7の管形成の阻害能は、明視野顕微鏡下で管の数を計数することによって決定および定量した。
【０３０３】
同等の試験を含む実験に関して、細胞を等モル濃度のsMDA-7（5、10、および300 ng/ml）、組換え型ヒトエンドスタチン（5.2、10.4、および315 ng/ml；カルビオケム（Calbiochem）、ラホヤ、カリフォルニア州）、組換え型IFN-γ（4.5、9、および268 ng/ml；R＆Dシステムズ（R&D Systems）、ミネアポリス、ミネソタ州）、または組換え型IP-10（2.4、4.5、および134 ng/ml；R＆Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）によって処置して、先に記述した管形成アッセイによって分析した。試料は全て1試料あたり2個ずつ試験した。実験は少なくとも5〜6回繰り返した。
【０３０４】
受容体遮断試験の場合、6ウェルプレートにおいて増殖させたHUVECをIL-22R1ブロッキング抗体（1 ng/mlおよび5 ng/ml）によって前処置した。一晩インキュベートした後、細胞を回収して洗浄し、マトリゲルコーティング96ウェルプレートに播種した。新鮮なIL-22R1ブロッキング抗体およびsMDA-7をウェルに1：1（1 ng/ml IL-22R1抗体：1 ng/ml sMDA-7）、または1：5（1 ng/ml IL-22R1抗体：5 ng/ml sMDA-7）の比率で加えて、37℃でインキュベートした。一晩インキュベートした後、プレートを管形成に関して調べた。他の実験技法は全て先に記述した方法と同じであった。エンドスタチンまたはIP-10を含む実験の場合、これらのタンパク質を、管形成アッセイにおいて阻害活性を示すより高濃度で用いた（エンドスタチン、315 ng/ml；IP-10、134 ng/ml）。エンドスタチンを含む実験に用いられるIL-22R1の相対量は315 ng/ml（比率1：1）であり、IP-10を含む実験では134 ng/ml（比率1：1）であった。他の実験技法は全て既に記述された技法と同じであった。抗IP-10または抗IFN-γ中和抗体（R＆Dシステムズ）を用いる遮断試験の場合、実験は、HUVECを適当な中和抗体（1 μgおよび5 μg/ml）によって処置してからsMDA-7（300 ng/ml）によって処置したことを除き、受容体試験に関して先に記述した通りに実施した。
【０３０５】
5．内皮細胞遊走アッセイ
細胞遊走アッセイは、HUVECを用いて行った。細胞を0.5％ウシ胎児血清を含む基本培地において一晩枯渇させて、回収し、同じ培地に再浮遊させ、孔径8 μm（ミリポア（Millipore）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の24ウェルトランスウェルインサートの上部表面上に細胞105個/ウェルの密度で播種した。インサートを、培地プラスPBS、培地プラスVEGF（100 ng/ml）、またはVEGFプラスsMDA-7（10または50 ng/ml）を含む6ウェルプレートに入れた。トランスウェルインサートを含むプレートを37℃で一晩インキュベートして遊走させた。翌日、ウェルを解体してメンブレンをクリスタルバイオレットにおいて固定し、下のウェルに遊走した細胞数を高倍率（×40）で計数した。
【０３０６】
6．IP-10およびIFN-γ産生の決定
最近の研究から、sMDA-7によってPBMCを処置すると、IFN-γの分泌が起こることが証明された（Caudellら、2002）。さらに、IFN-γは、IP-10の強力な誘導物質である（Majumderら、1998）。IFn-γおよびIP-10はいずれも、抗血管新生活性を有することが報告されている（Fathallah-Shaykhら、2000；Angiolilloら、1996）。sMDA-7の抗血管新生活性がIFN-γまたはIP-10によって媒介されるか否かを決定するための試験を行った。HUVECを6ウェルプレートに播種して（1×105個/ウェル）、sMDA-7（10 ng/ml）によって処置した。細胞培養上清を処置後6時間、24時間、および48時間に採取して、1200 rpmで遠心して、市販のELISAキットを用いてIP-10およびIFN-γタンパク質産生に関して分析した。アッセイは、製造元（R＆Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）によって推奨されるとおりに行った。組換え型IFN-γ（4.5 ng/ml）によって処置した細胞をIP-10アッセイの陽性対照とし、Ad-mda7（3000 vp/細胞）によって処置した細胞をIFN-γアッセイの陽性対照とした。これらの実験においてPBSによって処置した細胞を陰性対照とした。試料は1試料あたり4個ずつ分析し、データは、調べたsMDA-7の各濃度に関する平均値として表した。
【０３０７】
7．ウェスタンブロット分析
最近の研究から、sMDA-7の受容体への結合の測定として、HACAT細胞におけるSTAT-3発現の活性化が示されている（Dumoutierら、2001；Wangら、2002）。したがって、sMDA-7による処置後の内皮細胞におけるSTAT-3発現の活性化を決定する試験を行った。HUVECを6ウェルプレート（細胞5×105個/ウェル）に播種して、sMDA-7（10 ng/ml）によって処置した。無処置細胞を陰性対照とした。細胞を処置後4および24時間に採取して、既に記述されているように（Mhashilkarら、2001；Pataerら、2002）ウェスタンブロット分析によってSTAT-3発現に関して分析した。リン酸化STAT-2（pSTAT-3）タンパク質を、ウサギ抗ヒトpSTAT-3抗体（1000倍希釈、セルシグナリングテクノロジー（Cell Signaling Technology）、ビバリー、マサチューセッツ州）および西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（アマシャムバイオサイエンシズ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて検出した。最後に、タンパク質を、アマシャムの増強化学発光ウェスタンブロッティング検出系を適用することによって、増強化学発光フィルム（ハイパーフィルム、アマシャムバイオサイエンシズ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）上で可視化した。STAT-3タンパク質発現レベルは、イメージクアントソフトウェア（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics）、アマシャムファルマシアバイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて総STAT-3タンパク質発現によって標準化した後定量した。
【０３０８】
8．免疫蛍光アッセイ
STAT-3の活性化はまた、免疫蛍光アッセイによっても決定した。2ウェルチャンバースライドガラスに播種したHUVEC（1×104個/ウェル）をPBS（対照）またはsMDA-7（10 ng/ml）によって4時間処置後、PBSによって洗浄し、冷酢酸中で固定して、ウサギ抗ヒトpSTAT-3抗体（1000倍希釈、セルシグナリングテクノロジー、ビバリー、マサチューセッツ州）およびローダミン標識抗ウサギ二次抗体（5000倍希釈、モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージーン、オレゴン州）を用いてpSTAT-3（pSTAT-3）に関して染色した。スライドガラスに抗退色封入試薬（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories）、バーリンガム、カリフォルニア州）を加えた。写真は染色後1〜2時間で蛍光顕微鏡によって撮影した。
【０３０９】
9．マトリゲルプラグアッセイを用いた抗血管新生活性のインビトロ評価
sMDA-7の抗血管新生活性を決定するために、インビボ血管新生アッセイを行った。簡単に説明すると、sMDA-7（12.5 ng）およびbFGF（60 ng）をマトリゲル（ベクトンディッキンソン（Beckton Dickinson）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）500 μlと氷中で混合して無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。bFGF（60 ng）のみを含むマトリゲルを投与した動物を陽性対照とし、増殖因子を含まないマトリゲルを投与した動物を陰性対照とした。各群は動物5匹からなり、実験は2回行った。動物を注射の10日後に屠殺した。マトリゲルプラグを回収して、写真を撮影し、既に記述されているようにヘモグロビン分析を行った（Pessanitiら、1992）。
【０３１０】
10．ヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす効果
親293細胞および293 mda-7細胞を、その腫瘍形成能に関してまず試験した。細胞の少量106個を無胸腺BALB/c雌性ヌードマウスの下位右わき腹に皮下注射して、埋め込み部位を1ヶ月間モニターした。この細胞濃度では腫瘍は形成されなかったが、この細胞数を用いてその後の実験を行った。インビボ混合実験に関して、90％コンフルエンシーまで増殖させたヒト肺腫瘍細胞（A549）をトリプシン処理して、洗浄し、滅菌リン酸緩衝生理食塩液に5×106個/mlの密度で再浮遊させた。腫瘍-細胞浮遊液を等量（5×106個/ml）の親293細胞または293-mda-7細胞と混合して強く攪拌し、上記のようにヌードマウス（106個/動物）に皮下注射した。各群は動物8匹からなり、実験は2回行った。腫瘍の増殖をモニターして、既に記述されたように測定した（Saekiら、2002）。実験終了時、動物をCO2吸入によって安楽死させ、腫瘍を組織病理分析、ウェスタンブロット分析、ならびにCD31およびTUNEL染色のために回収した。
【０３１１】
腫瘍の増殖に及ぼすsMDA-7の全身作用を評価するために、A549腫瘍細胞（5×106個）をヌードマウスの下位右わき腹に注射することによって皮下腫瘍を確立した。腫瘍の大きさが50〜60 mm3に達した場合、動物を各群10匹の2群の一つに割付した。1群の動物に親293細胞（1×106個）を含むマトリゲルを注射して、他の群に293-mda-7細胞（1×106個）を注射した。細胞を含むマトリゲルを担癌マウスの上位右わき腹に皮下注射した。腫瘍の増殖に及ぼすsMDA-7の効果を上記のようにモニターした。実験終了時、動物を安楽死させ、腫瘍を上記のようにさらなる分析のために採取した。記述の動物実験は全て、少なくとも2回行い、腫瘍の増殖の差を統計学的有意性に関して試験した。
【０３１２】
11．免疫組織化学分析
腫瘍組織を、既に記述されているように（Saekiら、2002）CD31およびTUNELに関して染色した。一次抗体なしで染色、またはアイソタイプ抗体によって染色した組織切片を陰性対照とした。組織切片を分析して定量し、結果を盲検的に解釈した。
【０３１３】
12．統計分析
スチューデントt検定を用いて実験結果の統計学的有意性を計算した。0.05未満のP値は、統計学的に有意であると見なされた。
【０３１４】
実施例2：sMDA-7は内皮細胞の分化を阻害するが、細胞増殖は阻害しない
予備試験において、HUVECおよびHMVECを用いる内皮細胞の増殖に及ぼすsMDA-7の阻害作用を調べた。様々な濃度（1、5、10、および50 ng/ml）のsMDA-7によって細胞を処置しても、PBS処置対照細胞と比較して有意な抗増殖活性を示さなかった（図1A、B）。しかし、上記の濃度のsMDA-7によってHUVECおよびHMVECを処置すると、双方のタイプの内皮細胞による毛細管様構造の形成は有意に阻害された（P＝0.001）（図1C、図1D）。阻害作用は、全ての濃度で認められ、用量依存的であり、10 ng/mlを超える濃度では管形成の実質的に完全な消失を認めた（図1D）。
【０３１５】
sMDA-7タンパク質による内皮細胞管形成の阻害が、調製物における無関係なタンパク質のせいである可能性を除外するために、枯渇実験を行った。HUVECに加える前に試験調製物からsMDA-7タンパク質を免疫的に枯渇すると、内皮細胞の管形成の完全な回復が起こった（図1C、図1D）。これらのデータは、内皮細胞アッセイにおいて認められた阻害活性はsMDA-7によるものであったことを示し、sMDA-7が強力な抗血管新生活性を有することを示唆している。
【０３１６】
実施例3：sMDA-7は内皮細胞分化の阻害においてエンドスタチンより強力である
sMDA-7によって示された阻害活性を、管形成アッセイにおいてエンドスタチンと比較した。HUVECを等モル濃度のsMDA-7またはエンドスタチンによって処置した。sMDA-7は対照細胞と比較して低濃度で管形成を有意に阻害した（P＝0.001）が、エンドスタチンは阻害しなかった（図2）。しかし、エンドスタチンは、高濃度（315 ng/ml）では対照細胞と比較して管形成を有意に阻害し（対照と比較して40〜50％；P＝0.001）、用いたエンドスタチンタンパク質は機能的であることが証明された（図2）。これらの結果は、sMDA-7がエンドスタチンよりかなり強力な抗血管新生物質であることを示している。
【０３１７】
実施例4：sMDA-7は内皮細胞遊走を阻害する
sMDA-7が内皮細胞の遊走を阻害するか否かを決定するために、細胞の遊走に及ぼすVEGFの作用を調べる実験を行った。sMDA-7はVEGFに反応した内皮細胞遊走を有意に阻害した（P＝0.001）（図3）。sMDA-7/IL-24を含まない対照細胞の遊走に対する阻害作用を認めなかった。阻害は用量依存的に起こり、完全な阻害は50 ng/mlで起こった（図3）。sMDA-7/IL-24は、bFGFを誘導物質として用いた場合に類似の阻害活性を示した。
【０３１８】
実施例5：sMDA-7による内皮細胞分化の阻害はIFN-γまたはIP-10によって媒介されない
sMDA-7によって処置すると、ヒトPBMCによってIFN-γが産生されることが最近報告されている（Caudellら、2002）。この報告に基づき、sMDA-7による管形成の阻害がIFN-γまたはIP-10産生によって媒介されるか否かを評価する試験を行った。PBS処置およびsMDA-7処置HUVEC細胞からの組織培養上清を様々な時点で回収して、ELISAによってIFN-γおよびIP-10に関して分析した。sMDA-7は、対照細胞と比較して48時間のあいだにIFN-γ（＜30 pg/ml）およびIP-10（＜32 pg/ml）の分泌を誘導した（図4A、図4B）。sMDA-7によって誘導されるIFN-γまたはIP-10の量が少ないことが、HUVEC管形成に関して認められた阻害作用が原因であるか否かをさらに調べるために、比較試験を行った。sMDA-7の阻害活性を等モル濃度のIFN-γまたはIP-10と直接比較したところ、HUVECの管形成を有意に阻害するためには（P＝0.01；図4C）、sMDA-7（10 ng/ml）と比較してより高い濃度のIFN-γ（268 ng/ml）またはIP-10（134 ng/ml）が必要であった。さらに、HUVEC管形成に及ぼすsMDA-7の阻害活性は、抗IP-10または抗IFN-γ中和抗体の存在下で失われなかった（P＝0.001；図4D）。これらの結果は、sMDA-7がインビトロでIFN-γおよびIP-10より強力であること、そしてHUVEC管形成に及ぼすsMDA-7媒介阻害活性がIFN-γまたはIP-10によるものではないことを示している。
【０３１９】
実施例6：sMDA-7はSTAT-3発現を活性化して、その受容体を通してその阻害活性を媒介する
1．sMDA-7/IL-24はSTAT-3発現を活性化する
最近の研究から、sMDA-7が受容体に会合するとHACAT細胞およびPBMCsにおいてSTAT-3が活性化されることが示された（Dumoutierら、2001；Wangら、2002）。これらの報告に基づき、内皮細胞に及ぼすsMDA-7の活性は、受容体媒介であり、受容体に結合するとSTAT-3を活性化するであろうという仮説が立てられる。ウェスタンブロット分析および免疫蛍光アッセイから、HUVECにsMDA-7を加えると、STAT-3のリン酸化型（pSTAT-3）タンパク質の発現レベルが4時間ものわずかなあいだに増加し、処置後24時間でも持続することを示した。pSTAT-3発現の増加は、PBS処置対照細胞より2〜3倍高かった。同様に、sMDA-7/IL-24による処置後にHUVECにおけるpSTAT-3タンパク質の核局在の増加を認めた。対照的に、無処置対照細胞ではSTAT-3発現に変化を認めなかった。さらに、STAT-3活性化は、抗MDA-7抗体の存在下で阻害され、受容体媒介活性化を示している。
【０３２０】
2．sMDA-7はその受容体を通してその阻害活性を媒介する
sMDA-7の二つの関連する受容体が最近同定されている（Dumoutierら、2001；Wangら、2002）。sMDA-7は、二つの受容体複合体、すなわちIL-20R1/IL-20R2（IL-20受容体）ならびにIL-22R1およびIL-20R2（IL-22受容体）のいずれかに結合することができる。これらの報告に基づき、内皮細胞に及ぼすsMDA-7媒介阻害活性が受容体媒介であるか否かを決定する試験を行った。sMDA-7の存在下または非存在下においてIL-22R1に対するブロッキング抗体を用いて内皮の分化を評価した（図5A、図5B）。sMDA-7（5 ng/ml）は単独でHUVECにおける管形成を完全に阻害したが、無処置対照細胞では阻害を認めなかった（図5A）。しかし、HUVECをIL-22R1ブロッキング抗体によって前処置すると、管形成に及ぼすsMDA-7の阻害作用は有意に（P＝0.001）しかも用量依存的に消失した（図5A）。HUVECに1 ng/ml遮断抗体を加えると（1：5の比）、管形成はごく部分的に回復したが（＜60％）、5 ng/ml遮断抗体を加えると（1：1の比）、HUVECの管形成能は完全に回復した（＞90％）。遮断抗体単独ではHUVECの管形成能に有意な影響を及ぼさなかった。さらに、pSTAT-3タンパク質発現は、sMDA-7タンパク質をHUVECに添加した後有意に増加したが、sMDA-7媒介pSTAT-3発現は、IL-22R1抗体の存在下で増加しなかった。これらの結果は、内皮細胞管形成に及ぼすsMDA-7媒介阻害活性がIL-22R1を通して起こることを示している。
【０３２１】
この阻害の特異性を調べるために、HUVECを、IL-22R1抗体の存在下で高濃度のIP-10またはエンドスタチンによって処置した。IP-10またはエンドスタチンによって処置すると、IL-22R1抗体の存在下であっても、PBS処置対照細胞と比較してHUVEC管形成は有意に阻害された（P＝0.001；図5B）。これらの結果は、IL-22R1抗体がsMDA-7/IL-24媒介活性を特異的に阻害するがエンドスタチン、IFN-γ、またはIP-10の活性は阻害しなかったことを示している。
【０３２２】
実施例7：血管新生および腫瘍の増殖を調べるインビボモデル
1．sMDA-7はマトリゲルプラグモデルにおいて血管新生を阻害する
bFGFを含むマトリゲルに封入したsMDA-7をヌードマウスの皮下に移植した。bFGFのみを含むマトリゲルおよびPBSを含むマトリゲルをそれぞれ、陽性および陰性対照とした。bFGF誘導血管新生はsMDA-7/IL-24の存在下では、bFGFのみを含むマトリゲルおよびPBSを含むマトリゲルと比較して有意に阻害された（P＝0.0001；図6A）。
【０３２３】
2．sMDA-7はインビボでの皮下異種移植片腫瘍増殖を阻害する
ヒト肺腫瘍（A549）細胞を親293細胞（対照動物）またはsMDA-7タンパク質を産生する293細胞（293-mda-7）のいずれかと混合し（1：1）、マウスの下位右わき腹に皮下注射した。A549および293-mda-7細胞の混合物を投与された動物では、A549および親293細胞の混合物を投与された動物と比較して、腫瘍の増殖は有意に低かった（P＝0.001）（図6B）。293または293-mda-7細胞単独の注射はヌードマウスに腫瘍を形成しなかった。動物を移植後22日目に安楽死させて、腫瘍を摘出してさらに評価した。ウェスタンブロット分析から、MDA-7タンパク質が293-mda-7細胞を含む腫瘍において発現されたことが示された。親293細胞を含む対照腫瘍では、MDA-7タンパク質発現は検出されなかった。腫瘍組織の組織病理学試験では、対照および実験動物のあいだに腫瘍細胞の増殖指数または腫瘍細胞の浸潤に如何なる有意差も示されなかった。しかし、293-mda-7細胞を含む腫瘍は、CD31染色により、親293細胞を含む対照腫瘍より少ない血管形成を示した。実験群の動物からの腫瘍組織のTUNEL染色から、内皮細胞および腫瘍細胞がアポトーシス細胞死を受けていることが示された。対照的に、対照腫瘍組織ではTUNEL-陽性染色を認めなかった。さらに、ヘモグロビンレベルは親293細胞を含む腫瘍より293-mda-7細胞を含む腫瘍では有意に低かった（P＝0.02）（図6C）。CD31染色の減少およびヘモグロビンレベルの減少は、sMDA-7が血管新生を阻害することを示した。
【０３２４】
3．sMDA-7はインビボでの皮下異種移植腫瘍の増殖を全身性に阻害する
293-mda-7細胞によって産生されたsMDA-7が腫瘍の増殖を全身性に阻害するか否かを調べる試験を行った。マウスの下位右わき腹にA549腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が50〜100 mm3に達した際に、sMDA-7タンパク質を産生する293細胞（293-mda-7細胞）または親293細胞（対照）をマトリゲルに封入して、上位右わき腹に皮下移植した。腫瘍の測定は293細胞の移植後に開始した。A549肺腫瘍異種移植片は、293-mda-7細胞を処置したマウスでは対照群と比較して有意に小さかった（P＝0.001）（図6D）。対照マウスにおける腫瘍の増殖と比較して、封入された293-mda-7細胞を移植したマウスにおける腫瘍の増殖は、40〜50％抑制された。阻害効果がsMDA-7によることを確認するために、動物からの血清試料をウェスタンブロット分析およびELISAによってMDA-7タンパク質に関して試験した。ウェスタンブロット分析によって、293-mda-7細胞を移植した動物の血清において、予想される40 kDaの大きさにsMDA-7の強いバンドを認めた。しかし、対照動物の血清においてもかすかなバンドを認め、このことはマウス血清タンパク質との何らかの交叉反応性を示している。移植後3日目にELISAによって検出した循環中のsMDA-7の血清レベルは、約50 ng/mlであった。
【０３２５】
実験終了時、腫瘍および293-mda-7細胞を含む注射されたマトリゲルを摘出して評価した。腫瘍の肉眼的検査により、293-mda-7細胞を投与した動物では腫瘍の増殖が阻害されたことが示された。腫瘍組織の組織病理学的分析では、293細胞を投与した動物の標本と293-mda-7細胞を投与した動物の標本に差を認めなかった。さらに、293-mda-7細胞を処置したマウスの腫瘍は、CD31陽性の染色によって示されるように（図6E）、親293細胞を処置したマウスの腫瘍より有意に血管が少なかった（P＝0.001）。293-mda-7細胞を投与した動物からのマトリゲルの免疫組織化学分析では、MDA-7タンパク質が発現されていることが示された。対照的に、MDA-7は親293細胞を投与した動物から回収したマトリゲルでは検出されなかった。これらの結果は、sMDA-7が血管新生を阻害することによって腫瘍の増殖を全身性に阻害したことを示している。
【０３２６】
実施例8：Ad-mda-7は、進行癌患者においてアポトーシスを誘導し、免疫系を活性化する
試験デザインおよび患者の基準
進行中のフェーズI用量増加臨床試験において、非複製アデノウイルス構築物（Ad-mda7）を用いて、進行癌患者にmda-7を腫瘍内注射によって投与した。患者は、外科的に切除可能で針による注射に近づくことができる少なくとも一つの病変を有し、カルノフスキー動作状態が≧70％であり、許容される血液検査、腎機能および肝機能を有する組織学的に確認された癌腫を有した。活動的CNS転移を有する患者、慢性的に免疫抑制剤を使用している患者、またはアデノウイルスの投与を必要とする治療にこれまで参加したことがある患者は参加を除外した。
【０３２７】
外科的に切除可能な進行癌を有する患者に2×1010〜2×1012ウイルス粒子（vp）の1回腫瘍内注射を行った（図7）。今日まで、コホート8個（患者18人）が登録を完了した。腫瘍内mda-7治療の有効性の特徴を調べるために、注射した病変を注射後24〜96時間目に外科的に切除して、連続切片を作製し、ベクターDNAおよびRNAの分泌、形態、MDA-7タンパク質の発現、アポトーシス活性、微小血管密度、Ki-67陽性細胞数と共にiNOSおよびβカテニン発現に関して分析した。
【０３２８】
実施例9：腫瘍内Ad-mda7の効果
Ad-mda7は安全かつ良好に認容されるように思われ、主な毒性は注射部位での疼痛、一過性の微熱、および軽度の風邪様症状であった。これらの作用は、Ad-mda7のより高用量ではより一貫して認められた。作用は全て注射後48時間までに寛解した。DNA PCR分析によって、Ad-mda7のコピー数は低用量を処置した患者における7×106個/μg DNAから高用量を投与した患者における4×108個/μg DNAの範囲であった（図8）。最高のベクターコピー数は注射した病変の中心部に存在したが、ベクターDNAは注射点から1 cmまでの部分において普通に検出することができた。mRNA分布はDNA分布を反映した。IHC分析によって、強いMDA-7タンパク質発現が注射した病変の全てに認められた。高用量を注射した腫瘍の中心部にMDA-7陽性細胞の80％までが認められたのに対し、低用量の注射後では陽性染色細胞は20％までであった。非注射対照は等しく陰性であった。さらに、MDA-7発現領域は、TUNEL染色によって定義されるようにアポトーシス活性の増加を示した。アポトーシスは病変の中心部で最も強く、細胞の70％までが陽性であり、辺縁部も同様に非注射病変と比較して高いTUNEL反応を示した（図9）。核から細胞質膜へのβ-カテニン発現の顕著な減少および／または再分布は、調べたAd-mda7処置腫瘍病変8例中8例において認められ、前臨床での知見と一致した。iNOS発現の顕著な減少も同様に、治験に参加した限られた数の黒色腫症例において認められた。微小血管密度は、注射部位近傍で減少したが定量することは難しかった。このように、Ad-mda7の腫瘍内注射は十分に認容される。注射の24時間以内に、MDA-7タンパク質発現の用量依存的な増加およびアポトーシス細胞の顕著な増加を認め、これらは注射部位からの距離と相関する。72〜96時間までに、MDA-7発現およびアポトーシスは減少している（図8）。注射後30日までにMDA-7発現およびアポトーシス活性は消失した。
【０３２９】
Ad-mda7に対する全身性の免疫応答を血清サイトカインおよびリンフォカインサブセットによって分析した。大多数の患者が一過性の全身性サイトカイン（IL-6、調べた患者18人中14人；IL-10、18人中15人；γIFN、18人中8人；TNFα、18人中10人）（図10、図11）の増加を示した。数人の高用量患者も同様に、IL-6、γIFN、およびIL-10サイトカインmRNAの腫瘍内発現の増加を示した。さらに、CD3+ CD8+ T細胞は、mda-7処置後15日目において30±13％増加した（図12、図13）。これらの知見は、MDA-7が全身性のTH1サイトカイン産生を増加させて、CD8+ T細胞を動員することを示唆している。Ad-mda7の注射後、循環中のIL-6、IFN-γ、IL-10およびTNFαは、実質的に増加して、その後30日までに基準値レベルに低下した。サイトカインの増加は、CD8+細胞の増加と相関して、CD4/CD8比と反比例した。このように、結果は、Ad-mda7による免疫の活性化を示唆しており、培養におけるrhMDA-7のプロTH1活性と一致する。
【０３３０】
実施例10：抗体の産生
組換え型hisタグMDA-7タンパク質を大腸菌において産生して、ニッケルNTAアガロースカラムにおいて精製した。材料をニッケル樹脂にバッチモードで45分間結合させて、カラムに注ぎ、溶出液をカラム床の中に流した。0.5％chapsを含む10 mMトリスpH 8.0によって、材料を洗浄して、最終的に10 mMトリスpH 8.0プラス400 mMイミダゾールによってカラムから溶出した。溶出されたMDA-7を10 mMトリスpH 8.0に対して透析した。最終産物は、分子量約23 kDaの単一のバンドを有することが示された。アミノ末端タンパク質配列は、正確であることが示され、純度は90％より大きいと推定された。
【０３３１】
この材料を以下のプロトコールを用いてウサギに注射した。IFAと共にMDA-7タンパク質400 mgおよびMDP 100 mgを皮下注射して、3週間後、MDA-7タンパク質200 μgをIFAと共に注射して、3週間後にさらにMDA-7タンパク質100 mgを静脈内注射した。抗血清の力価は、ELISAアッセイに基づいて1/100,000より大きいことが示された。動物は必要に応じて追加免疫した。
【０３３２】
MDA-7タンパク質をスルフヒドリル結合によって固相支持体樹脂に共役させた。樹脂および結合したタンパク質を十分に洗浄した。この洗浄材料を用いて抗体精製のためにMDA-7カラムを作製した。ウサギポリクローナル抗血清を20 mMトリス緩衝液pH 8.0によって1：1希釈して、0.2ミクロンフィルターを通して濾過した後、MDA-7カラムに移した。次に、吸光度が基準値に回復するまで、カラムを同じ20 mMトリス緩衝液pH 8.0によって洗浄した。抗体を0.1 M酢酸によってカラムから溶出させた。抗体を含む溶出液を直ちにpH 8.0に調節した。このアフィニティ精製抗体を10 mMトリスpH 8.0に対して透析して濃縮した。
【０３３３】
実施例11：ポリクローナル抗体を用いた分泌型MDA-7の精製および特徴付け
1．アフィニティカラム作製
ウサギ血清からのヒトMDA-7に対する異なるポリクローナル抗体をまず精製した。凍結した血清試料を融解して、滅菌1×PBS緩衝液によって1：1希釈した。希釈した試料をプロテインAアガロース（シグマ（SIGMA））2 mlに軽く揺り動かしながら個々に4℃で曝露した。異なるカラム4個を作製した。樹脂をカラム容積の10倍量の20 mMリン酸水素ナトリウム（61 ml）によって洗浄して、pHを7.0にした。カラム容積の3倍量の0.15 M NaCl（pH 3.0）を少量ずつ3回に分けてカラムを溶出して、0.5 M HEPESによって中和した。ブラッドフォードタンパク質アッセイ（バイオラッド（BioRad））を用いて、溶出した抗体を定量した。次に、10,000 MWCO透析カセットにおいて一晩透析することにより、抗体を、0.5 M NaClを含む0.1 M NaHCO3（pH 8.3）に交換した。
【０３３４】
乾燥したCNBr-セファロースを活性化するために、1 gをカラム容積の10〜15倍量の1 mM冷HClによって洗浄した。5 mlの連続容量を用いて蔗糖を確実に除去した。次に、活性化CNBr-セファロースを、1カラム容積の連続洗浄によってカラム容積の10倍量で洗浄してpH 8.3の0.1 M NaHCO3に交換した。それぞれの場合において、精製および緩衝液の交換後、抗体約80〜90 mgを回収した。膨張した活性化CNBr-セファロース5 mlを、0.1 M NaHCO3溶液pH 8.3において精製抗体80〜90 mgと共に室温で軽く回転させながら4時間インキュベートした。
【０３３５】
抗体結合効率はブラッドフォードタンパク質アッセイによって決定し、それぞれの場合において、活性化CNBr-セファロースに結合した抗体は95％より多かった。共役後、カラム容積の25〜30倍量の0.1 Mトリス、pH 8.0によって洗浄することによって非反応基をブロックした。次に、カラムを0.1 Mトリス、pH 8.0、0.5 M NaClをカラム容積の5倍量で5回、0.1 M酢酸緩衝液pH 4.0、0.5 M NaClと交互に連続的に洗浄することによって洗浄した。タンパク質の推定は洗浄によって行い、タンパク質は検出されなかった。
【０３３６】
2．アフィニティクロマトグラフィー精製
可溶性のグリコシル化MDA-7を分泌する安定にトランスフェクトした293 T細胞を得て、1：100 L-グルタミン、1：100ペニシリン／ストレプトマイシンおよび1：100 HEPESと共に5％仔ウシ胎児血清を含むRPMIにおいて高コンフルエンシーで維持した。細胞を2〜3日ごとに分割して、1：1000希釈ヒグロマイシン（20 mg/ml保存液）において7日ごとに交互に維持した。上清400 mlを2〜3日ごとに回収して、分子量カットオフ10,000のメンブレンにおいてAMICON攪拌セルによって濃縮した。濃縮した上清50 mlをバッチ法で抗体-CNBrセファロース（アフィニティ樹脂）の5 ml床容積に軽く揺り動かしながら4℃で2日間曝露した。次に、アフィニティ樹脂をファルマシアXK 26カラムに充填して、抗体に対する抗原の結合が最大限となるように、上清を3回通過させた。アフィニティ樹脂を0.1 MトリスpH 8.0 20 mlによって重力の流れによって5回洗浄した。MDA-7は1 M NaCl、0.1 Mグリシン、pH 3.0の5 mlによって3回溶出して、HEPES緩衝液0.5 mlによって直ちに中和した。溶出および中和の直後、タンパク質の損失を保護するためにヒトアルブミン2 mgを加えた。溶出したタンパク質を分子量カットオフ10,000のスピンカラム（AMICON）によって濃縮して、滅菌1×PBSに交換した。次に、1×PBS交換アフィニティ精製タンパク質1〜1.5 mlを、3回洗浄したプロテインAセファロース（シグマ）200 μlに室温で2時間、または4℃で一晩回転させながら曝露した。プロテインA曝露は、溶出液分画に浸出した抗体を吸収する。
【０３３７】
その産生が本明細書において記述される四つの異なるポリクローナル抗体を、アフィニティ精製において試験した。サイズ分離精製（サイズ排除を参照されたい）を用いて、アフィニティ精製の前に上清から有意な混入タンパク質を除去したが、その最も多量に存在したのはウシ血清アルブミン（BSA）であった。しかし、このようにして単離されたMDA-7を曝露しても、カラム上の抗体はMDA-7を保持することができなかった。これはおそらく、BSAの非存在下でMDA-7を保持することができるBSAブロッキング非特異的結合部位のためであった。MDA-7は、高度にグリコシル化されたタンパク質であり、プラスチックおよび他の表面に粘着することができる。
【０３３８】
MDA-7含有上清からBSA-を除去すると、アフィニティクロマトグラフィーによるMDA-7の精製が阻害される。ほとんどのタンパク質は、フロースルーに存在した。MDA-7タンパク質は溶出までアフィニティカラムに保持されない。BSAの有意な量（銀染色による2〜3 mg/ml）を含むアフィニティ精製は、BSAの混入が有意に少ない精製より長い間生物機能を保持した。BSAの存在下でのアフィニティ精製によって、高モル濃度NaClおよび低いpHでの溶出までアフィニティカラム上にMDA-7を保持することができる。ポリクローナルアフィニティ樹脂によるアフィニティ精製によって、比較的類似の量のMDA-7の多数のロットが得られた。クーマシー分析から、比較的少量の混入タンパク質が示された。約20％均一性より大きいMDA-7の精製を認めた。
【０３３９】
アフィニティ精製は繰り返し可能であり、12％ポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色分析によって相対的純度までMDA-7を濃縮した。ウェスタンブロットにおいて検出されたバンドの強度から、アフィニティ樹脂に対する抗原の曝露がより長ければより多くのMDA-7が保持された。透析カセットおよびスピンカラムを比較すると、1×PBSへの交換法にほとんど差はなかった。
【０３４０】
3．陰イオン交換精製
アフィニティ精製MDA-7の2〜3ロットをプールして、10,000 MWCO透析カセットにおいて室温で2〜12時間50 mM MES、pH 5.0に交換した。次に、タンパク質を5 ml床容積の陰イオン交換カラムに流速1 ml/分でローディングした。フロースルー10 mlを採取して、結合したタンパク質を50 mM MES、pH 5.0における1 M NaClの段階的勾配によって溶出した。溶出プログラムは、流速2 ml/分で50 mM MES、pH 5.0の10 mlの洗浄によって開始した。第一段階の溶出は、0 M〜0.25 M NaClで5分間行い、50 mM MES、0.25 M NaCl、pH 5.0で5分間洗浄した。第二の勾配段階は、0.25 M NaCl〜0.5 M NaClにおいて5分の後5分間の洗浄であった。最終溶出は、0.5 M NaCl〜1 M NaClであった。MDA-7は、0.9〜1.0 M NaClによる溶出までカラムに保持された；MDA-7は約90％〜95％均一まで精製された。
【０３４１】
18 kDaの非グリコシル化タンパク質は、pH 5.0で陰イオン交換カラムに結合しなかった。MDA-7のアフィニティ後陰イオン交換からの分画の銀染色分画により、MDA-7の非グリコシル化型がグリコシル化タンパク質の同時精製に関連しないことが判明した。未変性のMDA-7複合体は、分子量31、28、27/26の少なくとも三つのタンパク質を含むように思われる。これまで、MDA-7を含む上清を50 mM MES、pH 6.0に交換する一段階陰イオン交換精製を利用して、MDA-7を精製する試みがなされた。一段階陰イオン交換精製から、陰イオン交換カラムからのそれぞれのピークが、ウェスタンブロットにおいてポリクローナル抗MDA-7によって検出されるMDA-7を含むことが示された（図14）。この方法による精製は、用いたNaClの全てのモル濃度でMDA-7がカラムから浸出したことから、如何なる範囲のイオン強度でもMDA-7を有意に濃縮することができなかった。
【０３４２】
4．サイズ排除クロマトグラフィー
XK 26 1メートルカラム（ファルマシア）に充填したS200セファデックス（ファルマシア）を用いて床容積200 mlのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを作製した。カラムを重力によって沈降させ、バイオラッドバイオロジックワークステーションによって3.5 ml/分で充填した。
【０３４３】
293 t細胞によって分泌されたMDA-7の見かけの分子量を決定するために、タンパク質分子量標準物質（マウスIgG 5 mg、アルカリホスファターゼ3 mg、BSA 10 mg、およびヒトβ2ミクログロブリン3 mg）を組み合わせて相対的保持時間を決定した。分子量に対する精製タンパク質の溶出時間をプロットして、R2値0.97を誘導した。MDA-7を含む293 t上清200 mlを、AMICON攪拌セルにおいて10,000 MWCOフィルター上で10 mlまで濃縮して、1×PBSにおいて2 ml/分でサイズ分離カラムにローディングした。分画を5 ml毎に採取した。相対的保持時間を、連続試料のウェスタンブロット分析によって決定して、既知の標準物質に由来する線と比較した。見かけの分子量80〜100 kDaを会合MDA-7に割付した。存在する総MDA-7の0.1％未満が単量体31 kDa型で存在することが判明した。図15は、分子量に対する保持時間の比較を示す。MDA-7複合体は分子量約85〜95 kDaのあいだに溶出された。
【０３４４】
6．サイズ、陰イオンおよびレクチン精製
MDA-7を精製する試みにおいて、コンカナバリンA-セファロースカラム上でのレクチン精製を用いた。しかし、総体純度に真の増加は得られなかった。サイズ排除、陰イオンおよびレクチン精製方法を含む複合精製法を全て組み合わせて、MDA-7を濃縮するために用いた。しかし、これらの方法を組み合わせても、アフィニティクロマトグラフィーの後に陰イオンクロマトグラフィーを行う場合より大きいMDA-7の精製は得られなかった。これらの結果は、MDA-7がアフィニティおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによって少なくとも90〜95％均一まで精製できることを示している。
【０３４５】
実施例12：モノクローナル抗体を用いた分泌型MDA-7の精製および特徴付け
1．抗体産生
7G11F.2（モノクローナル抗体）と命名されるハイブリドーマクローンは、ブレフェルディンAによって処置した安定にトランスフェクトされた293t細胞の細胞内FACS分析によって、IL-24/mda-7陽性細胞を検出するために最も有効である抗体を産生すると決定された。これらの予備的なデータを用いて、このクローンを利用して上清5 Lを産生した。簡単に説明すると、細胞（7G11F.2）を、1：100 L-グルタミン、1：100ペニシリン／ストレプトマイシン、および1：100 HEPESと共に10％仔ウシ胎児血清を添加したDMEM 50 mlにおいて1×106個/mlで播種した。細胞を播種して10日間増殖させた後、上清を採取した。
【０３４６】
2．抗体精製
2000 rpmで10分間遠心して、デカントすることによって上清から細胞を除去した。透明にした上清を0.22ミクロンセルロースアセテートフィルター上で滅菌濾過して、YMCO 30 kDaメンブレン上で窒素下でアミコン攪拌セルによって50 mlに濃縮した。濃縮された上清をrプロテインGクロスリンクセファロース（シグマ）に4℃で露出した。抗体を1 M NaCl pH 3.0によって、カラム容積の3倍量を3回に分けて溶出し、0.5 M HEPESによって中和した。混入しているウシIgGを除去するために、得られた溶出液を、透析カセット（ピアス／エンドゲン（Pierce/Endogen）、YMCO 30 kDa）によって0.4 M NaCl（全体）を含む1×PBSに交換した。タンパク質をセファロースにクロスリンクさせたrプロテインAに4℃で曝露した。プロテインAは、マウスIgG1aより高い親和性でウシIgGに結合することから、カラムからのフロースルーを採取した。総体純度をSDS PAGEでの分析によって決定したところ、90％純粋であると決定され（7G11F.2）、混入タンパク質はほぼウシIgGを含んだ。ブラッドフォードタンパク質アッセイ（バイオラッド）を用いて溶出した抗体を定量した。抗体を、10,000 MWCO透析カセットにおいて一晩透析することによって、0.5 M NaClを含む0.1 M NaHCO3、pH 8.3に交換した。
【０３４７】
3．アフィニティカラムの作製
乾燥CNBr-セファロースを活性化するために、1 gを1 mM冷HClのカラム容積の10〜15倍量で洗浄した。連続容積5 mlを用いて確実に蔗糖を除去した。活性化CNBr-セファロースを1カラム容積の連続洗浄による10カラム容積によって洗浄して、0.1 NaHCO3、pH 8.3に交換した。精製および緩衝液交換後、抗体（7G11F.2）25 mgを回収した。膨張した活性化CNBr-セファロース2 mlを、0.1 M NaHCO3、pH 8.3において精製抗体と共に室温で軽く回転させながら4時間インキュベートした。
【０３４８】
抗体結合効率は、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって決定し、95％を超える抗体が活性化CNBr-セファロースに結合した。
【０３４９】
共役後、非反応基を0.1 Mトリス、pH 8.0においてカラム容積の25〜30倍量で洗浄することによってブロックした。最後に、カラムを0.1 MトリスpH 8.0、0.5 M NaCl、5×カラム容積5回と0.1 M酢酸緩衝液、pH 4.0、0.5 M NaClと交互の連続洗浄によって洗浄した。洗浄液のタンパク質推定を行ったところ、タンパク質は検出されなかった。
【０３５０】
4．アフィニティ精製
可溶性のグリコシル化IL-24を分泌する安定にトランスフェクトした293t細胞をインビトロジェンインクから得て、1：100 L-グルタミン、1：100ペニシリン／ストレプトマイシン、および1：100 HEPESと共に5％仔ウシ胎児血清を添加したRPMIにおいて高コンフルエンシーで維持した。細胞を2〜3日毎に維持して1：1000希釈のヒグロマイシン（20 mg/ml保存液）における維持を7日ごとに交代して分割した。上清400 mlを2〜3日毎に採取して、分子量カットオフ10,000のメンブレン上でアミコン攪拌セルにおいて濃縮した。濃縮した上清50 mlをバッチ法で床容積5 mlの抗体-CNBrセファロース（アフィニティ樹脂）に軽く揺り動かしながら4℃で2日間曝露した。アフィニティ樹脂をファルマシアXK 26カラムに入れて抗体に対する抗原の結合を確実に最大限にするために上清を3回通過させた。アフィニティ樹脂を重力の流れによって0.1 MトリスpH 8.0 20 mlによって5回洗浄した。IL-24を1 M NaCl、0.1 Mグリシン、pH 3.0 5 mlによって3回溶出して、直ちにHEPES緩衝液0.5 mlによって中和した。溶出および中和の直後、ヒトアルブミン2 mgを加えて、タンパク質が損失しないように保護した。溶出したタンパク質を分子量カットオフ10,000のスピンカラム（アミコン（Amicon））によって濃縮して、滅菌1×PBSに交換した。1×PBSに交換したアフィニティ精製タンパク質1〜1.5 mlを3回洗浄した洗浄rプロテイン-Aセファロース（シグマ）200μlに、室温で回転させながら2時間曝露するか、または4℃で回転させながら一晩曝露した。プロテインAの曝露によって溶出液に浸出した抗体が吸収され、その除去はIL-24の機能を維持するために肝要である。
【０３５１】
7G11F.2モノクローナル抗体カラムは、実施例11におけるポリクローナルカラムと同様に、類似の量のIL-24/mda-7を保持した。
【０３５２】
実施例13：MDA-7および膵臓癌細胞
1．Ad-mda7は膵臓癌細胞を直接殺し、放射線増感する
異なる膵臓癌細胞株4個の評価から、これらの株のほとんどがAd-mda7に対して非常に感染性であることが示された。さらに、Ad-mda7は、これらの細胞株4個中3個において細胞を直接殺し、アポトーシスを誘導することが示された（図43）。最大の反応を示した細胞株2個、すなわちMiaPaCa2およびAsPc1をさらなる分析のために選択して、Ad-mda7がこれらの細胞を放射線増感するか否かを評価する異なる実験を実施した。MiaPaCa2細胞をAd-mda7によって前処置した後、48時間後にそれらに放射線を照射した。クローン原性生存をエンドとポイントとした場合、劇的な放射線増感を認めた（図44）。最後に、FACS分析によってサブG1/G0 DNA含有量に基づいてアポトーシスを評価した（図45）。この実験から、Ad-mda7および放射線を併用した場合に相加的より大きいアポトーシス誘導が示された。
【０３５３】
2．MDA-7タンパク質はSTAT3を活性化して膵臓癌細胞を直接殺す
MiaPaCa2膵臓癌細胞を、実施例11に記述したように、精製組換え型ヒトMDA-7タンパク質によって処置した。免疫蛍光によって、STAT3の実質的な活性化（リン酸化）および同時にpSTAT3の核への移動を認めた。STAT3活性化は、抗MDA-7抗体の存在下で遮断された。STAT3活性化は、MDA-7処置の30分以内に明白であり、MiaPaCa2細胞がMDA-7の受容体を有すること、そしてリガンド-受容体の結合が起こったことを示唆している。
【０３５４】
もう一つの研究において、MDA-7タンパク質の処置により、MiaPaCa2細胞の用量依存的な殺細胞が誘導された。膵臓腫瘍細胞は、MDA-7の受容体を有し、MDA-7が結合すると、STAT3シグナル伝達が誘導され、それによって腫瘍細胞の死が起こる。
【０３５５】
実施例14：前立腺癌細胞における細胞周期停止およびアポトーシスの選択的誘導
材料および方法
1．細胞株および細胞培養
ヒト前立腺細胞株DU145、LNCaP、およびPC-3をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックビル、メリーランド州、アメリカ）から得て、10％ウシ胎児血清、抗生物質およびL-グルタミン（ギブコ-BRL；グランドアイランド、ニューヨーク州、アメリカ）を含むRPMI 1640培地において増殖させた。正常な前立腺上皮細胞株（PrEC）をクロネティクス（サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）から得て、供給元の説明書に従って補助物質を添加したPrEBM培地において増殖させた。
【０３５６】
2．ウイルスの構築と形質導入効率
mda-7またはルシフェラーゼ（luc）を有する複製欠損アデノウイルス（Ad5）ベクターの構築および作製は、既に記述されている（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）。緑色蛍光タンパク質（Ad-GFP）をコードするアデノウイルスベクター（Ad-GFP）を用いた予備実験から、感染多重度（MOI）3000で投与したアデノウイルスの用量が、DU 145およびPC-3細胞の93.4％より多く、LNCaP細胞の76.2％、およびPrEC細胞の82％に感染できることが示された。したがって、本発明者らはその後の全ての実験においてAd-mda7またはAd-lucをMOI 3000で用いた。
【０３５７】
3．細胞増殖アッセイ
細胞株は全て6ウェル組織培養プレートにおいて細胞密度1×105個/ウェルで播種した。次に、腫瘍細胞をAd-mda7もしくはAd-lucによって処置するか、または偽対照として0.1 Mリン酸緩衝生理食塩液（PBS）を処置した。各群の細胞を1試料あたり3個ずつ播種して4日間培養した。次に、指定された時点で細胞をトリプシン処理によって回収して0.4％トリパンブルー（ギブコ^BRL；グランドアイランド、ニューヨーク州、アメリカ）によって染色して死細胞を明らかにした。次に、生存細胞を血球計算盤を用いて計算した。アポトーシス染色に関して、細胞をヘキスト33258によって感染後72時間目に染色して、既に記述されているように分析した（Saekiら、2000、2002）。
【０３５８】
4．細胞周期分析
細胞周期に及ぼすAd-mda7の作用を決定するために、細胞を10 cm培養皿に播種して（細胞5〜10×105個/皿）、Ad-mda7、Ad-luc、または0.1 M PBSを処置した。処置後の特定の時間に、細胞をトリプシン処理によって回収して氷冷0.1 M PBSによって1回洗浄し、70％エタノールによって固定し、-20℃で保存した。細胞を氷冷0.1 M PBSによって2回洗浄して、RNアーゼ（37℃で30分、500単位/ml；シグマケミカルズ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）によって処置して、DNAをヨウ化プロピジウム（PI）（50 μg/ml；ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、インジアナポリス、アメリカ）によって染色した。細胞周期の期およびアポトーシス率（サブG0/G1期の細胞）を蛍光活性化セルソーター（EPICS XL-MCL、ベックマンコールターインク（Beckman Coulter Inc.）、フュラートン、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて分析した。
【０３５９】
5．分裂指数
分裂指数を決定するために、細胞をAd-mda7による処置後72時間で回収した。細胞周期分析に関して記述した通りに細胞を固定してPIによって染色し、蛍光顕微鏡によって分析した。それぞれの試料に関して、蛍光顕微鏡において細胞少なくとも500個を高倍率（40倍）で無作為に計数し、核膜の喪失および染色体縮合の証拠から分裂細胞を肉眼的に同定した。
【０３６０】
6．イムノブロット分析
Ad-mda7、Ad-luc、またはPBSによって処置した腫瘍細胞（DU 145およびLNCaP）を処置後72時間目に回収して、細胞抽出物を、既に記述されているように（Saekiら、2000）、ウェスタンブロット分析のために調製した。以下の抗体を一次抗体として用いた：抗MDA-7抗体（イントロゲンテラピューティクスインク（Introgen Therapeutics Inc）、ハウストン、テキサス州、アメリカ）、カスパーゼ3；PARP；およびサイクリンE（ファーミンゲン（Pharmingen）、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）；サイクリンA、β-アクチン（シグマケミカルズ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）；NFkB、Chk1、Cdc2、リン特異的Jak-1 p27Kip1、リン特異的JNK、リン特異的STAT3（サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）、サンタクルズ、カリフォルニア州）、リン特異的Tyk2、リン特異的STAT1、およびCdc25C（セルシグナリングテクノロジーインク、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ）；サイクリンB1（ラブビジョンコーポレーション（Lab Vision Corp）、フリーモント、カリフォルニア州、アメリカ）；Chk2（ノバスバイオロジカルズ（Novus Biologicals）、リトルトン、コロラド州、アメリカ）；p21WAF1（オンコジーンリサーチプロダクツ（Oncogene Research Products）、ボストン、マサチューセッツ州、アメリカ）。
【０３６１】
7．統計分析
スチューデントt-検定を用いて実験結果の統計学的有意性を計算した。有意水準はP＜0.05に設定した。
【０３６２】
結果
1．ヒト前立腺癌および上皮細胞におけるAd-mda7処置後のMDA-7発現
細胞における外因性のMDA-7発現を検出するために、DU 145、LNCaP、PC-3、およびPrEC細胞を6ウェル組織培養プレート（1×105個/ウェル）において増殖させて、Ad-mda7およびAd-lucによって処置した。PBSによって処置した細胞を陰性対照とした。感染後24時間、48時間、および72時間目に、細胞溶解物を調製して、ウェスタンブロット分析によってタンパク質発現に関して評価した。MDA-7発現は、PBSおよびAd-lucを処置した細胞と比較して、Ad-mda7を処置した全ての細胞株において検出された。MDA-7タンパク質発現は、時間依存的であることが認められ、最大発現は48〜72時間のあいだに認められた。内因性のMDA-7発現は調べた細胞株において検出されなかった。
【０３６３】
2．MDA-7の過剰発現による前立腺癌細胞における細胞増殖の阻害
細胞増殖に及ぼすAd-mda7処置の影響を調べるために、腫瘍細胞（DU 145、LNCaP、およびPC-3）および正常細胞（PrEC）をPBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって処置した。細胞を処置後の様々な時点で回収して、細胞生存率に関して分析した。Ad-lucまたはPBSによって処置した対照細胞と比較して、Ad-mda7によって処置した全ての細胞株において、3日目から細胞増殖の有意な阻害（P≦0.01）を認めた。PC-3およびPrEC細胞では、細胞増殖の抑制は、DU 145およびLNCaP細胞において認められた場合より小さく、これらの細胞がAd-mda7に対する感受性が低い可能性があることを示唆している（図16）。しかし、後の時点での細胞増殖の分析（5および6日）では、PC-3細胞はPrEC細胞よりAd-mda7に対して感受性があることが示された。
【０３６４】
3．MDA-7の過剰発現による前立腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導
Ad-mda7処置がアポトーシスを誘導するか否かを調べるために、Ad-mda7、Ad-luc、またはPBSによって処置した細胞にフローサイトメトリー分析を行った。Ad-mda7を処置した腫瘍細胞（DU 145、LNCaP、PC-3）は、Ad-lucまたはPBSを処置した細胞と比較して、アポトーシスの指標であるサブG0/G1期の細胞数の増加を示した（図17）。しかし、アポトーシス細胞数（5〜18％）は腫瘍細胞株によって異なった。対照的に、Ad-mda7またはAd-lucによって処置した正常細胞（PrEC）は、PBS処置細胞と比較した場合に、サブG0/G1期細胞数に有意な変化を示さなかった。これらの結果をさらに確認するために、感染後72時間目に細胞をヘキスト33258によって染色した。Ad-mda7によって処置した腫瘍細胞は、アポトーシスの指標である凝縮して断片化した核を示したが、正常細胞は示さなかった。Ad-lucを処置した如何なる対照細胞にも変化を認めなかった。これらの結果は、MDA-7がアポトーシスを誘導することによって腫瘍細胞を選択的に阻害する可能性があるが、正常細胞は阻害しないことを示唆している。
【０３６５】
4．MDA-7の過剰発現によるG2細胞周期停止の誘導
ヒト肺癌、乳癌、および黒色腫細胞に関するこれまでの研究において報告されているように（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001；Lebedevaら、2002）、MDA-7が前立腺癌細胞においてG2/M細胞周期停止を誘導することができるか否かを調べるために、フローサイトメトリーによって細胞周期を分析した。細胞周期分析から、Ad-lucまたはPBSによって処置した腫瘍細胞と比較して、Ad-mda7による処置の72時間後にG2/M集団における腫瘍細胞数の増加が示された（図18）。腫瘍細胞とは異なり、Ad-mda7を処置した正常細胞は、対照細胞と比較してG2/M期の細胞数に有意な増加を示さなかった。これらの結果は、MDA-7が腫瘍細胞に選択的に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。さらに、分裂指数の分析により、MDA-7が腫瘍細胞においてG2期の停止を誘導するが、M期での停止を誘導しないことが示された（図18）。
【０３６６】
5．MDA-7は前立腺細胞における細胞内シグナル伝達経路を調節して、その結果アポトーシス細胞死を引き起こす
次に、前立腺腫瘍細胞（DU 145およびLNCaP）においてMDA-7誘導アポトーシスに関与する可能性がある細胞内シグナル伝達経路を評価した。リン酸化型のStat1（pSTAT-1）およびJNK（pJNK）の増加は、PBSおよびAd-lucによって処置した細胞と比較して、Ad-mda7によって処置したDU 145およびLNCaP細胞の双方において認められた。対照的に、Ad-mda7によって処置した双方の腫瘍細胞株においてリン酸化型STAT-3（pSTAT-3）およびNFkBの減少を認めた。二つの腫瘍細胞株において認められた唯一の差は、JAK1およびTyk2の発現であった。DU 145細胞ではAd-mda7による処置によって、対照細胞と比較してpJAK1発現の減少およびpTyk2発現の増加を認めた。対照的に、Ad-mda7処置によってLNCaP細胞においてpJAK発現が増加して、pTyk2発現が減少し、このことは、シグナル伝達の開始が二つの細胞株において異なる可能性があることを示している。
【０３６７】
下流の標的、すなわちカスパーゼに関するさらなる分析から、DU 145およびLNCaP細胞の双方においてAd-mda7処置後72時間目に、カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、およびPARPが活性化することが判明した。これらの結果は、Ad-mda7が前立腺細胞株において細胞内シグナル伝達経路を調節して、それによってカスパーゼカスケードによるアポトーシスの誘導が起こることを示している。
【０３６８】
6．MDA-7によるG2細胞周期停止はCdc25Cのダウンレギュレーションに関連する
MDA-7が前立腺癌細胞においてG2期停止を有意に誘導するメカニズムを調べるために、G1/SおよびG2/M細胞周期チェックポイントに関係するタンパク質をウェスタンブロット分析によって評価した。Ad-mda7処置DU 145およびLNCaP細胞は、リン酸化および非リン酸化Cdc25Cの双方の発現の減少を示し、Chk1およびChk2、ならびにG2/M期に関連するサイクリンB1タンパク質の発現の減少を示した。これらのタンパク質においてPBSまたはAd-lucによって処置した細胞に有意な変化を認めなかった。Cdc2を調べたところ、Ad-mda7を処置したLNCaP細胞ではCdc2発現のわずかな減少が認められたが、DU 145細胞では発現の減少は示されなかった。さらに、サイクリンAはAd-mda7によって処置した双方の細胞株において減少することが認められたが、サイクリンEは減少しなかった。MDA-7によって調節されるG1/Sおよび／またはG2/M細胞周期チェックポイントに関係するさらなるタンパク質を調べると、LNCaP細胞においてp27およびp21の発現の増加が示されたがDU 145細胞では発現は増加しなかった。p53遺伝子に関して野生型であるLNCaP細胞においてp27およびp21発現がこのように増加したことは、p53変異体DU 145細胞ではこれらのタンパク質の発現の変化が認められなかったことから、おそらくp53発現の増強によるものである。これらの結果は、MDA-7がG2/M関連タンパク質をダウンレギュレートすることによってG2細胞周期停止を誘導することを示しており、このことは、上記の細胞周期分析と一致する。
【０３６９】
実施例15：Ad-mda7は癌細胞を放射線増感させる
材料および方法
1．細胞培養、ベクター、および化学物質
ヒトNSCLC細胞株であるA549（wt-p53/wt-Rb）およびH1299（del-p53/wt-Rb）および正常ヒト肺線維芽細胞株（NHLF）、CCD-16、およびMRC-9は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から得た。細胞株は全て、ATCCによって明記されたとおりに維持した。
【０３７０】
組換え型アデノウイルスベクター（Ad-mda7）は、改変Ad5のE1欠失領域に挿入されたミニ遺伝子カセットにおいてCMVプロモーター、野生型mda-7 cDNA、およびSV40ポリアデニル化シグナルを含む。アデノウイルス媒介ルシフェラーゼ（Ad-Luc）を対照ベクターとして用いた。これらのベクターは既に記述されている（Mhashilkarら、2001）。調製物を複製コンピテントアデノウイルスおよびマイコプラズマに関して試験して、調製物はこれらを含まないと決定した。
【０３７１】
クルクミンおよびノコダゾールはシグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich、プール、イギリス）から購入した。クルクミンの保存溶液（10 mM）を、実験当日に化合物をエタノールに溶解することによって新しく調製した。偽処置細胞には同濃度のエタノールを投与した。次に、これを培地によって10 μMの濃度に希釈した。ノコダゾールをDMSOに溶解することによって、ノコダゾールの保存溶液（5 mg/ml）を調製した。次に、これを培地によって希釈した（200 ng/ml）。
【０３７２】
2．遺伝子輸送
全ての細胞株に関して、T25フラスコに細胞2×105個を播種することによって、インビトロトランスフェクション試験を行った。播種48時間後に、細胞を、血清を含まない培地1 ml中で精製ベクターと共に1時間インキュベートした。1時間後、10％FBSを添加した新鮮な培地をフラスコに加えた。無血清培地を偽感染に用いた。細胞をさらに48時間インキュベートした後、生存曲線を作製した。
【０３７３】
3．放射線およびクローン原性アッセイ
細胞に、T25フラスコにおいて高い線量率の137Csユニット（3.7 Gy/分）を室温で照射した。放射線照射はベクター処置の48時間後に行った。処置の有効性はクローン原性アッセイによって評価した。簡単に説明すると、A549、H1299、CCD-116、およびMRC-9細胞を上記のようにT25フラスコにおいて処置して、放射線の多様な線量を照射後、細胞をトリプシン処理して計数した。既知数の細胞を100 mm培養皿に播種してインキュベータに戻し、肉眼的な大きさのコロニーを形成させた。コロニーを10〜14日後に計数して、所定の処置後の細胞定着率および生存分画を、偽感染、Ad-luc、またはAd-mda7のいずれかを処置した非放射線照射細胞の生存に基づいて計算した。Ad-mda7による細胞定着率の同一の減少、すなわち80％が得られるように、用いたベクター処置をそれぞれの細胞株に関して調整した。したがって、用いたベクター濃度は、A549に関して1000 vp/細胞、H1299に関して250 vp/細胞、およびCCD-16およびMRC-9細胞に関して1500 vp/細胞であった。これらの処置によってほぼ100％のトランスフェクション効率が得られた。A549細胞に関する実験のいくつかは異なるロットのAd-mda7ベクターを用いたが、この場合、同じトランスフェクション効率を得るために2000 vp/細胞を必要とした。
【０３７４】
4．アポトーシス指数と細胞周期分析
アポトーシスは、APO-BRDU（商標）キット（ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州）を用いてフローサイトメトリーによって定量した。簡単に説明すると、細胞2×106個を1％パラホルムアルデヒドのPBS溶液によって室温で15分間固定して、PBSによって2回洗浄し、70％エタノールにおいて-20℃で保存した。分析に関して、細胞をDNA標識溶液において室温で一晩インキュベートした。蛍光標識抗BrdU抗体溶液を加えて、細胞を室温の暗所で30分間インキュベートした。染色細胞をEPICSフローサイトメーター（コールター（Coulter）、ハイアレア、フロリダ州）を用いてフローサイトメトリーによって分析した。段階は全て製造元の推奨に従って行った。分析領域は、陰性対照に基づいて設定し、標識細胞の割合をこの領域から計算した。
【０３７５】
アポトーシス指数は、5 Gyの放射線照射後2日目、または感染後4日目に分析した。この時間は最大のアポトーシス反応が得られる時間に関する予備的な知見に基づいた。上記の通り、Ad-mda7またはAd-Lucのいずれかによる感染は放射線照射の48時間前に行った。
【０３７６】
5．ウェスタン分析
簡単に説明すると、細胞をプレートから剥離させて、PBSによって洗浄し、細胞溶解緩衝液において溶解した。タンパク質30 μgを8％（pRbに関して）、12％（サイクリンB1、p-c-Jun、Fas、Bax、およびp53に関して）、および15％（MDA-7に関して）SDS-ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動によって分離して、ポリビニリドジフルオリドメンブレン（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ州）に転写した。pRb、サイクリンB1（ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州）、p53（DAKO、カーピンテリア、カリフォルニア州）、Fas（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、カリフォルニア州）に関するマウスモノクローナル抗体、およびBaxに関するウサギポリクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、カリフォルニア州）、MDA-7（イントロゲンテラピューティクスインク、ハウストン、テキサス州）、JNK-1（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）を一次抗体として用いた。セリン63上でリン酸化されたc-Jun p39に対して特異的な、p-c-Junに関する一次抗体は、サンタクルズバイオテクノロジーから得た。JNK-1に関する一次抗体は、c-Jun N-末端キナーゼJNKとしても知られるリン酸化された活性型のストレス活性化タンパク質キナーゼ（SAPK）を検出する。メンブレンをECL（商標）ウェスタンブロット検出試薬（アマシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州）を用いて、製造元の説明書に従って化学発光によって増強した。各レーンに適用した総細胞タンパク質をBCAタンパク質アッセイ試薬（バイオラッドラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州）によって等しい濃度に調節して、クーマシーブリリアントブルー染色法によって確認した。
【０３７７】
結果
1．Ad-mda7はNSCLCの放射線感受性を増強するがNHLF細胞株は増強しない
Ad-mda7感染がインビトロでの放射線照射に対してNSCLC細胞を増感するか否かを調べた。クローン原性アッセイを二つのNSCLC細胞、A549およびH1299ならびに二つの正常ヒト肺線維芽細胞（NHLF）細胞株、CCD-16およびMRC-9について行った。これらの細胞株にAd-mda7またはAd-Luc（対照ベクター）のいずれかを感染させて、48時間後に放射線を照射した。48時間は、この時間枠において最大のG2停止が起こることを証明した細胞周期分析に基づいた（下記を参照されたい）。図19に示すように、Ad-mda7は、2 Gyの臨床関連線量においても双方のNSCLC細胞株を放射線増感した。例えば、2 GyでのA549細胞の生存率は69.8％±3.1から38.5±3.2（図19A）に減少し、A549細胞におけるAd-mda7プラス放射線に関して50％生存レベルで計算した線量減少因子（DRF）は、1.93であった。2 GyでのH1299細胞に関する生存率は、78.2％±3.7から45.7％±4.5に減少し（図19B）、H1299細胞に関するDRFは2.06であった。対照ベクター、Ad-Lucは、同一のベクター濃度で用いた場合にA549またはH1299細胞のいずれに対しても増感作用を示さなかった。一方、Ad-mda7は、2 Gyの臨床関連線量でNHLF細胞株を放射線増感しなかった。2 Gyでの放射線単独および放射線プラスAd-mda7を処置したCCD-16細胞の生存率はそれぞれ、43.6％±7.0および45.4％±3.4であり（図19C）、MRC-9細胞に関してそれぞれ、24.2％±3.4および27.2％±1.6であった（図19D）。
【０３７８】
2．Ad-mda7はNSCLC細胞においてアポトーシスを誘導するが正常細胞においては誘導しない
TUNELアッセイを用いてアポトーシスレベルを測定した（図20）。偽感染、5 Gy単独、Ad-Luc単独、Ad-Lucプラス5 Gy、Ad-mda7単独、またはAd-mda7プラス5 Gyのいずれかを処置したA549細胞（図20A）、H1299細胞（図20B）、CCD-16細胞（図20C）、およびMRC-9細胞（図20D）におけるTUNEL陽性細胞の割合を図20に示す。放射線単独によって、A549細胞における対照と比較してTUNEL陽性細胞の比率は11％に増加した。この効果は、H1299細胞ではあまり明白ではなかった。予想されたように、Ad-mda7感染単独はA549細胞におけるTUNEL標識細胞の比率を10％まで、およびH1299細胞において18％まで中等度に増加させた。しかし、Ad-mda7と放射線照射の併用によって、双方のNSCLC細胞株において、A549細胞およびH1299細胞のそれぞれにおいて38％および35％のレベルに達したTUNEL陽性細胞数の相加的より大きい増加が得られた。放射線誘導アポトーシスのこのような増強は、Ad-mda7をAd-Lucに置換した場合には明白ではなかった。一方、Ad-mda7単独を処置したCCD-16（図20C）およびMRC-9（図20D）に関するTUNEL陽性細胞は、対照および併用治療と比較して実質的に増加しなかった。Ad-mda7プラス5 Gyは、NHLF細胞株におけるTUNEL陽性細胞の比率をごくわずかに増加したに過ぎなかった。
【０３７９】
3．Ad-mda7は細胞周期のG2/M期において細胞を停止する
これまでの報告は、Ad-mda7がNSCLC細胞株の増殖を抑制しG2/M細胞周期停止を誘導することを示した（Saekiら、2000）。これらの効果を確認して、細胞周期の調節に関与することが知られている二つのタンパク質、すなわちpRbおよびサイクリンB1の発現を調べた。ウェスタンブロット分析は、MDA-7タンパク質が感染後24時間までにA549およびH1299細胞株の双方において発現され始めることを示した。タンパク質のグリコシル化型の検出による多数のバンドが存在した（Wangら、2002；Lebedevaら、2002）。MDA-7タンパク質はAd-mda7投与後発現され始めたが、pRbの発現はA549およびH1299細胞において2〜4日以内に減少した。対照的に、サイクリンB1発現は2日目までにわずかにアップレギュレートされたが、これらのレベルは、A549細胞において3日までに、そしてH1299細胞において4日までに対照より低いレベルまで減少した。これらの結果は、細胞がAd-mda7トランスフェクション後約2日でG2/M期に蓄積する可能性があることを示唆した。このことは、Ad-mda7処置後2日目でのA549およびH1299細胞のフローサイトメトリー分析によって確認した（図21）。G2/M停止そのものがこれらの細胞の放射線感受性を増強するために役割を果たすか否かを調べた。微小管の重合化を可逆的に遮断する薬剤であるノコダゾールを用いて、A549およびH1299細胞をG2/Mに蓄積させた。Ad-mda7と比較して同程度のG2/M停止を誘導するためのノコダゾール（200 ng/ml）の処置スケジュールは、A549細胞に関して4時間、およびH1299細胞に関して3.5時間であった。次に、クローン原性アッセイを用いて、対照と比較してノコダゾールによって処置したA549およびH1299細胞の放射線感受性を決定した。図22に示す結果から、少なくともAd-mda7によって媒介される程度までのG2/M停止そのものでは、NSCLC細胞の放射線感受性を増強しないことが示される。
【０３８０】
4．Ad-mda7はp53、Bax、およびFasとは無関係に放射線感受性を増強する
A549およびH1299細胞におけるp53、Bax、およびFasタンパク質の発現を放射線照射単独、Ad-mda7単独、Ad-mda7プラス放射線照射、Ad-Luc、またはAd-Lucプラス放射線照射のいずれかによる処置後に分析した。p53タンパク質レベルは、放射線照射またはAd-mda7を処置したA549細胞において劇的に増加したが、Ad-Lucを処置した細胞では増加しなかった。放射線照射またはAd-mda7のいずれかを処置したA549細胞におけるFasタンパク質発現も同様に増加して、この効果は、H1299細胞（p53を発現しない）におけるFasタンパク質発現がこれらの処置によって増強されなかったことから、野生型p53に対する依存性と一致した。一方、Baxタンパク質発現はこれらの処置によっていずれの細胞株においても有意に変化しなかった。このように、A549およびH1299細胞は、Ad-mda7によって等しく放射線増感されるが、p53、Fas、またはBaxはAd-mda7による放射線増感に相関しなかった。
【０３８１】
5．Ad-mda7はp-c-Junタンパク質の発現を増強する
放射線誘導アポトーシスはc-Jun N-末端キナーゼ（JNK）の活性化を必要とすることが報告されている（Chenら、1996a；Chenら、1996b）。Ad-mda7がJNKを活性化できるか否か、そしてこれが放射線増感と相関するか否かに取り組んだ。Rb、p-c-JunおよびJNK-1タンパク質レベルを、放射線照射単独、Ad-mda7単独、Ad-mda7プラス放射線照射、Ad-Luc、またはAd-Lucプラス放射線照射のいずれかによって処置したA549、H1299、およびCCD-16細胞株において決定した。Rbタンパク質発現は、Ad-mda7を処置したA549およびH1299細胞において劇的に減少したが、これらの細胞株において対照ベクターによって変化しなかった。p-c-JunおよびJNK-1の発現はいずれも、Ad-mda7を処置したA549およびH1299細胞において増強された。しかし、CCD-16細胞において、Rbタンパク質発現はわずかに減少したが、p-c-JunおよびJNK-1の発現はAd-mda7処置によって増強されなかった。これらの結果は、Ad-mda7がJNK-1の活性化およびその後のp-c-Junの活性化を通して放射線感受性を媒介し、アポトーシスを増強する可能性と一致している。
【０３８２】
6．クルクミンはAd-mda7媒介放射線増感を消失させる
カレーの黄色に関与する食用色素であるクルクミンは、JNK活性化を阻害すると報告されている（Chen and Tan、1998）。したがって、p-c-Junタンパク質の発現を、放射線単独、クルクミン単独、Ad-mda7単独、放射線プラスクルクミン、放射線プラスAd-mda7、または放射線プラスクルクミンプラスAd-mda7のいずれかを処置したA549およびH1299細胞において決定した。単独で用いたクルクミンは、単独で用いたAd-mda7と同様にp-c-Jun発現を増強した。しかし、クルクミンは、放射線照射および非照射細胞においてAd-mda7媒介p-c-Jun活性化を減少させた。クルクミンがAd-mda7媒介放射線増感を阻害するか否かを調べるために、本発明者らはA549およびH1299細胞株を用いてクローン原性アッセイを行った。細胞にAd-mda7を感染させて、48時間後に放射線を照射した。図23に示すように、クルクミンは双方の細胞株においてAd-mda7による放射線増感を消失させた。
【０３８３】
実施例16；黒色腫細胞に対するMDA-7タンパク質の傍観者効果
rhMDA-7（IL-24）タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィーを用いて293-mda7細胞から精製した。様々なロットのタンパク質の純度は銀染色に基づくと30％〜＞80％であった。rhMDA-7タンパク質を黒色腫細胞株に適用して、トリパンブルーアッセイを用いて細胞生存率に関して評価した。図24に示すように、rhMDA-7タンパク質は、黒色腫細胞において用量依存的な死を引き起こした。rhMDA-7による黒色腫細胞の処置によって、STAT3の迅速な活性化（リン酸化によって）が起こる。黒色腫細胞において認められた細胞障害性は抗MDA-7抗体によって阻害される。図24は、ポリクローナルウサギ抗MDA-7およびモノクローナル抗MDA-7抗体がいずれもrhMDA-7媒介殺細胞を阻害するが、対照ヒトIgGは作用を示さないことを示している。平行な試験において、抗MDA-7抗体はまた、MDA-7媒介STAT3活性化を阻害した。
【０３８４】
rhMDA-7の抗腫瘍活性のメカニズムも同様に評価した。黒色腫細胞をrhMDA-7タンパク質によって処置して、TUNELアッセイを用いてアポトーシスに関して評価した。表4に示すように、40 ng/ml rhMDA-7を3日間処置した黒色腫細胞株6個中5個がrhMDA-7処置後に細胞障害性を示した。これらの細胞株はまた、アポトーシス誘導の上昇も示した。これらの新規データは、黒色腫細胞がMDA-7タンパク質による直接殺細胞に対して感受性があることを示している。このように、腫瘍細胞のAd-mda7形質導入は、隣接する細胞を殺すことができるMDA-7タンパク質の活性な分泌型を引き起こすであろうと予想される。これらの試験は、精製rhMDA-7タンパク質について行った。黒色腫細胞をまた、293-mda7細胞または対照293細胞からの上清によっても処置した。293-mda7上清のみが殺細胞を引き起こす。
【０３８５】
（表４）
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【０３８６】
実施例17：ヒト黒色腫における黒色腫分化関連遺伝子（mda-7）と誘導型酸化窒素シンターゼ（iNOS）の負の関連：MDA-7は黒色腫細胞においてiNOS発現を調節する
材料および方法
mda-7のタンパク質発現は、転移性黒色腫においてほぼ検出不能レベルまで減少する。対照的に、誘導型酸化窒素シンターゼ（iNOS）の発現は、黒色腫の進行期では増加し、iNOS発現はこの疾患において可能性がある予後マーカーであると提唱されている。このように、同じ腫瘍におけるこれらの分子の発現は相反する特徴を示すように思われる。これらの黒色腫進行分子の相対比は、ヒト黒色腫において腫瘍の進行または腫瘍の抑制のいずれかを定義する可能性があると仮説されている。この研究の最初の目的はMDA-7がiNOS発現と負の相関があるか否かを決定することであった。第二の目標は、iNOS発現が黒色腫細胞においてMDA-7によって調節されうるか否かを決定することであった。
【０３８７】
1．患者の試料
本試験において用いた腫瘍の試料は原発性皮膚黒色腫、および様々な部位からの黒色腫転移からなった。ホルマリン固定してパラフィン抱埋した黒色腫腫瘍切片を、M.D.アンダーソン癌センターの黒色腫皮膚癌中央研究所から得た。
【０３８８】
2．細胞培養
転移性黒色腫細胞株、A375およびA375.S2をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から得た。急速な増殖期および指数的増殖期の黒色腫細胞株WM35、WM793およびそのより浸潤性の高いサブクローンはRobert Kerbel博士（サニーブルック健康科学センター、トロント、オンタリオ州、カナダ）から提供された。高転移性悪性黒色腫細胞株MeWoは、David Menter博士（M.D.アンダーソン癌センター）から提供された。本試験において用いた黒色腫細胞株は、10％ウシ胎児血清（ライフテクノロジーズインク）、100単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、およびHEPES緩衝液（ライフテクノロジーズインク）を添加したRPMI 1640（ライフテクノロジーズインク、グランドアイランド、ニューヨーク州）において維持した。細胞を1〜20 ng/mlの精製MDA-7によって処置するか、またはインビトロ試験のためにAd-mda7もしくは対照Ad-lucに感染させた。
【０３８９】
3．ヒトMDA-7の精製
MDA-7の完全長のcDNAを、CMVプロモーターを含むpCEP4 FLAGベクター（インビトロジェン、サンジエゴ、カリフォルニア州）にクローニングした。プラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトして、安定なサブクローンをヒグロマイシン（0.4 μg/ml）を用いて単離した。分泌されたMDA-7を含む上清にプロテアーゼ阻害剤（1 μg/mlロイペプチン、1 μg/mlペプスタチン、および0.5 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド）、および0.05％アジ化ナトリウムを添加して、アミコン攪拌セル（アミコン、ビバリー、マサチューセッツ州）によってYM1Oメンブレン上で10倍濃縮した。濃縮した上清10 mlをS200スーパーデックス調製等級カラム（アマシャムファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）上で1×PBS（pH 7.4）において分離して、ウェスタンブロットおよびELISAによってMDA-7を含むと同定された分画をプールした。アミコン攪拌セルにおいて緩衝液を50 mM 4-モルフォリノプロパンスルホン酸（pH 6）に交換した後、バイオラッドSカラムを用いて第二段階の精製を行った。カラムの条件は0〜90 mM NaCl勾配、90 mM NaClにおいて5分間保持、90〜250 mM勾配で1 ml/分で30分、および250 mM NaClで5分間保持からなった。完全な精製は4℃で行い、MDA-7をELISAおよびウェスタンブロッティング技法を用いて同定した。最終試料は、ELISAによって決定して少なくとも300 ng/ml MDA-7を含んだ。部分精製したMDA-7の個々のロットを、QCL 1000定量的色素産生LALキット（バイオウィッタッカー、ウォーカースビル、メリーランド州）を用いてエンドトキシンに関して試験した。
【０３９０】
4．遺伝子移入
mda-7遺伝子を有する複製欠損ヒト5型アデノウイルス（Ad5）をイントロゲンテラピューティクス（ハウストン、テキサス州）から得た。mda-7遺伝子は内部CMV-IEプロモーターに結合し、その後にSV40ポリアデニル化部位が続く。Ad-LucおよびAd-CMVポリアデニル化（それぞれ、ルシフェラーゼおよび空のベクター）を対照ウイルスとして用いた。細胞を感染の1日前に播種した。1000〜5000ウイルス粒子/細胞を用いて、黒色腫細胞にアデノウイルスベクター（Ad-mda7またはAd-luc）を感染させた。実験条件は、免疫組織化学染色の結果に基づいて、細胞の＞70％のMDA-7タンパク質発現を得るように最適化した。
【０３９１】
5．試薬
抗iNOSマウスモノクローナル抗体（トランスダクションラボラトリーズ（Transduction Laboratories）、レキシントン、ケンタッキー州）をiNOS免疫組織化学のために用いて、種間で交叉反応性であることを確認した。アフィニティ精製ポリクローナルウサギ抗MDA-7抗体は、イントロゲンテラピューティクスから提供された。IRF-1およびIRF-2ポリクローナル抗体は、サンタクルズバイオテクノロジーインク（サンタクルズ、カリフォルニア州）から購入した。ホスホ-Stat1（Tyr701）およびホスホ-Stat3（Tyr705）抗体はセルシグナリングテクノロジー（ビバリー、マサチューセッツ州）から得た。免疫前の正常マウスIgG（ベクターラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア州）を陰性対照として用いた。抗ビメンチン抗体（バイオジェネックスラボラトリーズ（BioGenex Laboratories）、サンレーモン、カリフォルニア州）を全ての黒色腫染色に関する陽性対照として用いた。
【０３９２】
6．免疫組織化学
免疫組織化学標識は、厚さ4〜6 μmに切断した10％ホルマリン固定パラフィン抱埋黒色腫組織において行った。切片をシラン処理したスライドガラス（ヒストロジーコントロールシステムズ（Histology Control Systems）、グレンヘッド、ニューヨーク州）に載せて、キシレン中でパラフィンを除去し、エタノールの濃度を減少させて（100％〜85％）再水和させた。サイトカインの免疫染色を増強して最大の抗原性を回復するために、切片を抗原曝露溶液（ベクターラボラトリーズ）に入れて、沸騰温度を維持するためにマイクロ波を10分まで間欠的に照射した。スライドガラスを室温で30分間冷却した後、蒸留水およびPBSによって洗浄した。この最初の調製後、スライドガラスをPBSから除去して3％H2O2（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）のメタノール溶液で覆って内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断した。インキュベーションは全て湿潤のスライドチャンバーにおいて室温で行った。スライドガラスをPBSにおいて洗浄した後、0.05％トライトンX-100（シグマケミカル）を含むPBSにおいて15分間インキュベートして、細胞を透過性にした。アビジン-ビオチンペルオキシダーゼ複合体キット（ベクタスタイン；ベクターラボラトリーズ）を用いて染色を検出した。スライドガラスをブロッキング血清と共に30分間インキュベートした後、様々な希釈（1：100〜1：200）の一次抗体を加えて、スライドガラスを室温で60分間インキュベートした。スライドガラスを洗浄して、二次ビオチン化抗体と共に30分インキュベートした後、再度洗浄して、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体試薬と共に30分間インキュベートした。スライドガラスをPBSにおいて洗浄後、色素原として3-アミノ-9-エチルカルバゾールを用いて免疫染色を15分間展開させた。スライドガラスをヘマトキシリン（ベクターラボラトリーズ）によって対比染色して、アクアマウント（レーナーラボラトリーズ（Lerner Laboratories）、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）に封入した。それぞれの試料に関して、ビメンチンおよびアイソタイプをマッチさせた対照IgGをそれぞれ、陽性および陰性一次抗体対照とした。これらの抗体の特異性および感度は既に公表されている（Ekmekciogluら、2000；Lebedevaら、2002）。所定の患者からの組織試料は全て、同じ実験において免疫標識した。
【０３９３】
7．免疫組織化学採点
免疫標識を、二つの変数に関して個々に採点した：一つは陽性細胞数に関して、もう一つは陽性細胞の全体的な免疫反応性の強度に関して。陽性細胞数の採点は以下のように定義された：（0）は＜5％陽性細胞；（1）は5〜50％陽性細胞；（2）は50〜90％陽性細胞；および最後に（3）は＞90％陽性細胞であった。強度の採点は以下のように定義した：（0）は染色なし；（1）は軽度の染色；（2）は中等度の染色；および（3）は強度の染色。スライドガラスは異なる2人によって解釈した。
【０３９４】
8．イムノブロットアッセイ
培養黒色腫細胞株2×106個を氷冷PBSにおいて2回すすぎ、5 mM EDTA、0.2 mMオルトバナデート、10 mM NaF、ロイペプチン、アプロチニン、およびフェニルメチルスルホニルフルオリドを含む溶解緩衝液[25 mMトリス、140 mM NaCl、および1％NP40（pH 7.5）]60 μlにおいて氷中で10分間溶解した。等量の総タンパク質（DCタンパク質アッセイ試薬によって測定；バイオラッドラボラトリーズ、ハーキュルス、カリフォルニア州）を標準的な10％のSDSポリアクリルアミドゲルにローディングして、分画したタンパク質をニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロットした。ニトロセルロースメンブレンを、5％粉乳の1×PBS溶液を用いて室温で1時間ブロックして、0.05％ツイーン20を含むPBSにおいて室温で毎回5分間3回洗浄した。メンブレンを5％粉乳／0.1％ツイーン20のPBS溶液10 mlにおいてIRF-1およびIRF-2ポリクローナル抗体の2000倍希釈液と共に密封バッグにおいて4℃で一晩インキュベートした。メンブレンを0.05％ツイーン20を含むPBSにおいて各5分間3回洗浄した後、5％粉乳および0.1％ツイーン20を含むPBS溶液において、2000倍希釈のペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG二次抗体（トランスダクションラボラトリーズ）と共に室温で45分間インキュベートした。高感度化学発光検出キット（アマシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州）を用いて、ブロットを可視化した。
【０３９５】
9．統計分析
iNOSおよびMAD-7の変数に関する平均値およびSDを計算した。iNOSおよびMDA-7の数および強度の測定の関連を調べるために、相関の有無に関する試験をケンダルτ-b検定（Woolson、1987）を用いて行った。
【０３９６】
結果
1．黒色腫腫瘍MDA-7発現は腫瘍のiNOS発現と負の相関をする
MDA-7発現が同じ腫瘍においてiNOS発現と反比例するか否かを決定するために、本発明者らは、連続パラフィン抱埋悪性黒色腫切片に関する免疫組織化学分析を行った。原発性黒色腫38例および転移43例（腫瘍試料全体で81例）をこれらの実験において分析した。抗MDA-7ポリクローナル抗体および抗iNOSモノクローナル抗体による免疫染色後、陽性細胞数および染色強度に基づく試料の免疫反応性を分析した。MDA-7染色細胞とiNOS染色細胞数の直接比較により、負の関連が判明した。図25Aは、iNOSおよびMDA-7に関して正の染色を示す細胞数のあいだに有意な反比例関係が存在することを示している（相関係数＝-0.209、P＜0.05、ケンダルτ-b検定）。同様に、染色強度を比較することによってiNOSおよびMDA-7の関連に関するデータを分析した。図25Bは、iNOS強度とMDA-7強度とが反比例することを示し（相関係数＝-0.201、P＜0.05、ケンダルτ-b検定）、MDA-7強度が増加するにつれてiNOS強度の平均値は有意に減少することを反映している。腫瘍のMDA-7およびiNOS発現の評価により、原発性黒色腫の連続切片およびそれに由来する転移の連続切片におけるiNOSおよびMDA-7発現のあいだに負の関連が示された。対応のある試料における原発性黒色腫瘍のMDA-7免疫反応性は、強い細胞質の免疫標識を示すが、リンパ節転移および脳転移はいずれも陰性である。対照的に、原発性黒色腫瘍のiNOSが存在しない場合、リンパ節転移および脳転移は強く免疫標識される。
【０３９７】
2．Ad-mda7およびrhMDA-7はヒト黒色腫細胞株におけるiNOS発現をダウンレギュレートする
免疫組織化学によって示されたMDA-7とiNOSの逆の発現は、可能性がある原因／作用関係を示唆した。したがって、本発明者らは一連のインビトロ実験を行って、MDA-7によるiNOS発現の可能性がある調節を調べた。第一に、本発明者らは、黒色腫細胞株A375、MeWo、WM35、およびWM793にAd-mda7（500、1000、および2000 ウイルス粒子/細胞）またはAd-luc（1000ウイルス粒子/細胞）を感染させた。基準値において、これらの黒色腫細胞株は、高レベルのiNOSを発現し、MDA-7に関しては陰性である。ベクター処置の48時間後、細胞を回収して、サイトスピンを調製してiNOS発現を分析した。1000および2000ウイルス粒子/細胞のAd-mda7は、48時間までにiNOSの発現を完全にダウンレギュレートしたが、Ad-luc感染は作用を示さなかった。iNOSの発現を阻害したAd-mda7ベクターの用量は、この短期間のインキュベーションのあいだに有意な細胞死を引き起こさないように思われた。これらの実験結果は、遺伝子移入発現が黒色腫細胞におけるiNOS発現を特異的に遮断したことを示した。MDA-7はAd-mda7感染黒色腫によって分泌されることがこれまでに示されている（Lebedovaら、2002；Mhashilkarら、2001）。分泌されたMDA-7も同様にiNOS調節に関与しているか否かを調べるために、本発明者らは、黒色腫細胞株をrhMDA-7の0、5、または20 ng/mlと共にインキュベートして、iNOS発現に関して染色した。rhMDA-7は20 mg/mlの濃度によって、A375黒色腫細胞において48時間までにiNOS発現の明らかなダウンレギュレーションが起こった。
【０３９８】
3．MDA-7は黒色腫細胞におけるIRF-1およびIRF-2発現を調節する
黒色腫細胞のrh-MDA-7タンパク質処置によって、iNOS発現の強力なダウンレギュレーションが起こり、MDA-7が受容体媒介経路を通して機能する可能性があることを示唆している。最近、MDA-7はIL-20および受容体を通して結合およびシグナルを伝達することができることが示された。このように、本発明者らは、その双方がSTAT活性化を伴うクラスIIサイトカイン受容体であるIL-20および／またはIL-22受容体シグナル伝達経路が、MDA-7に曝露された黒色腫細胞において活性であろうと予測した。最初に、STAT1およびSTAT3リン酸化の双方をrhMDA-7と共にインキュベートした黒色腫試料において免疫組織化学標識によって調べた。STAT1リン酸化には変化を認めなかったが、無処置細胞と比較して、MDA-7処置MeWo細胞においてSTAT3のアップレギュレーションが一貫して検出された。類似の知見は、黒色腫細胞株A375、WM35、およびA375.S2、ならびに健康なドナーからの末梢血単核球において認められた。STAT3発現の増加は、20 ng/ml rhMDA-7を処置したMeWo細胞の細胞質において最初に認められた。その上、免疫組織化学標識試験において、ホスホSTAT3の染色が、これらのrhMDA-7処置黒色腫細胞の核において認められた。
【０３９９】
4．MDA-7は黒色腫細胞においてIRF-1およびIRF-2発現を調節する
MDA-7に対する暴露後のSTAT3リン酸化の誘導に関する知見に基づいて、次に、STATタンパク質の下流の標的を評価した。これらの標的の二つ、すなわちIRF-1とIRF-2は、腫瘍細胞においてその活性が互いに反対である。注目すべきは、IRF-1はiNOS遺伝子発現を誘導する（Sauraら、1999；Dell'Albaniら、2001）。MDA-7シグナル伝達をiNOS発現に結びつける可能性がある分子経路を調べるために、rhMDA-7処置後のIRF-1およびIRF-2発現を評価した。rhMDA-7処置細胞溶解物におけるIRF-1およびIRF-2分子のイムノブロッティングは、4時間以内にIRF-2発現のアップレギュレーションを示した。一方、IRF-1発現はMeWo細胞のrhMDA-7処置によって4時間以内に劇的に減少した（図26）。母集団の大きさが小さいために差は有意水準に達しなかったが、IRF-1発現はほぼ4倍減少したのに対し、IRF-2発現は4.7倍増加した。
【０４００】
実施例18：Ad-mda7はタモキシフェンの抗腫瘍効果を増強する
T47D細胞を、Ad-ベクターのMOI（0〜1000 vp/細胞）を増加させておよびタモキシフェン（0〜2 μg/ml）の濃度を増加させて同時に処置した。処置後4日目に、細胞の増殖をトリチウムチミジン取り込みアッセイを用いて分析した。図27はAd-mda7がタモキシフェンの抗腫瘍効果を増強することを示している。
【０４０１】
実施例19：MDA-7は内皮細胞においてSTAT3を活性化する
HUVEC細胞をチャンバースライド（細胞1000個/チャンバー）において精製MDA-7タンパク質10〜20 ngによって処置した。MDA-7はアフィニティ精製MDA-7であった。4時間後、細胞を洗浄して、ウサギ抗p-Stat3抗体（セルシグナリング、1：1000倍希釈）と共に4℃で1〜2時間インキュベートした。細胞をPBSによって3回洗浄して、二次テキサスレッド結合抗ウサギIgG（1：1000倍希釈）によって処置した。細胞を洗浄して、蛍光顕微鏡によってpStat3核染色に関して分析した。結果は、MDA-7が内皮細胞においてStat3を活性化することを示している。粗293-MDA7を用いても類似の結果が得られた。細胞を同時にヘキスト色素によって染色して核を可視化した。
【０４０２】
実施例20：Ad-mda7およびMDA-7タンパク質は、黒色腫細胞からのサイトカイン分泌を調節する
黒色腫細胞のAd-mda7またはMDA-7タンパク質処置によるサイトカイン誘導の比較の結果を図28に示す。
【０４０３】
実施例21：A549肺転移に及ぼすAd-mda7の影響
A549肺癌細胞をヌードマウスに静脈内注射して肺転移を確立した。Adベクター（Ad-空（Ad-EV）；Ad-luc、Ad-p53、およびAd-mda7）をプロタミンと複合体を形成させて、ヌードマウスに静脈内注射して肺における腫瘍の負荷を測定した。結果を図29に示す。
【０４０４】
実施例22：MDA-7は血管平滑筋細胞の増殖および遊走を選択的に阻害する
材料および方法
1．細胞培養および細胞数
PAC-1 SMCを37℃、5％CO2で、10％FBSを添加したDMEM（ギブコ/BRL、ライフテクノロジーズ）において維持した。PAC1細胞は、継代レベル70〜85代で使用した。PAC1細胞を0.1％FBSによって少なくとも24時間増殖を停止させた。正常ラット大動脈平滑筋細胞（RASMC）を継代10〜20代で用いた。初代培養ヒト冠動脈SMC（HCASMC）を販売元から得て、SmGM-2培地（クロネティクス、サンジエゴ、カリフォルニア州）において増殖させ、継代5〜10回で使用した。ウイルスの形質導入後の細胞生存率を、生存細胞（1試料あたり3回ずつ）を血球計算盤（フィッシャー）を用いて表記の時点で手動で計数することによって測定した。
【０４０５】
2．トリパンブルー排除アッセイを用いて細胞生存率を決定した。簡単に説明すると、総細胞（浮遊液＋トリプシン処理）をトリパンブルー溶液（ギブコ-BRL）と共に1：1混合して、光学顕微鏡下で血球計算盤によって観察した。青色細胞（死細胞）の割合を計数した（視野3〜5カ所の平均数を得た）。
【０４０６】
3．アデノウイルス形質導入
ヒトmda-7（Ad-mda7）またはルシフェラーゼ（Ad-Luc）のいずれかの発現を指示する組換え型複製欠損アデノウイルス（Mhashilkarら、2001）、Ad-RSVβ-galおよびAd-SM22-β-galが記述されている（Kimら、1997）。PAC-1 SMCを6ウェルプレートまたは100 mm培養皿において完全な培地において増殖させた。細胞が50〜90％コンフルエントに達した後、培地を2％FBSを含むDMEMに交換して、ウイルス保存調製物を必要であれば上記の培地によって希釈して、表記の感染多重度（MOI；pfu/cell）で細胞単層に接種した。手で10分ごとに回転させながら37℃で1時間ウイルスを吸着させた後、形質導入培養物に完全な培地を加えて、表記の時間37℃でインキュベートした。いくつかの実験において対照として、同一の群の細胞を形質導入せずに、2％FBSを含むDMEMにおいて10分毎に回転させながら1時間インキュベートした。X-gal組織化学を記述の通り実施した（Kimら、1997）。
【０４０７】
4．ノザンブロッティング
総RNAを、酸フェノール抽出法を用いてPAC1細胞から単離した（Chomczynski and Sacchi、1987）。総RNA 10 μgを、ホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルにおいて電気泳動して、ナイロンメンブレン（ゼータプローブ（Zeta Probe）、バイオラッドラボラトリー）に転写して、32P標識ヒトmda-7 cDNA断片とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、ナイロンメンブレンを洗浄して、オートラジオグラフィーのために曝露した。GAPDHプローブも同様に用いて、等量のローディングの対照としてGAPDH mRNAを検出するために、剥がしたメンブレンとハイブリダイズさせた。
【０４０８】
5．ウェスタンブロッティング
実験的処置後、PAC1細胞を溶解緩衝液において回収した。細胞溶解物を超音波処理して、14,000×gで4℃で15分間遠心した。上清を移して試料のタンパク質濃度をバイオラッドタンパク質アッセイキットを用いて評価した。いくつかの実験において、細胞を溶解する前にタンパク質分泌を分析するために条件培地も同様に回収した。細胞タンパク質30〜50 μgまたは条件培地10〜20 μlを10〜12％SDS-PAGEにおいて分画し、イモビロン-Pメンブレン（ミリポア）に転写した。メンブレンをその後タンパク質特異的抗血清MDA-7抗体（1：1000、イントロゲンテラピューティクス、ハウストン、テキサス州）および他のアポトーシス抗体（BAK、BAX、BCL-2、Bcl-xL、1：1000、サンタクルズ、カリフォルニア州）によってプロービングした。pSTAT-3タンパク質をウサギ抗ヒトpSTAT-3抗体（1：1000、セルシグナリングテクノロジー、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いて検出した。タンパク質ローディングの同等性は、抗β-チューブリン抗体を用いて評価した。免疫学的に同定されたタンパク質をアルカリホスファターゼ結合種特異的IgGおよび高感度化学発光（ピアス）を用いて認識した。
【０４０９】
6．アポトーシスの分析
アポアラートアネキシンV-FITCキット（クロンテック）を用いてPAC1細胞をアポトーシスに関して分析した。簡単に説明すると、ウイルス形質導入細胞をトリプシン処理によって回収して、PBSおよび結合緩衝液によって十分に洗浄した。次に細胞を、結合緩衝液において希釈したアネキシンV-FITC試薬と共に室温の暗所で10分毎に振り混ぜながら30分間インキュベートした。細胞をPBSによって2回洗浄して、FACS分析のために処理した。PAC1細胞はまた、DAPI染色アッセイを用いてアポトーシスに関して分析した。簡単に説明すると、ウイルス形質導入細胞を、各時点でPBSによって洗浄して4％パラホルムアルデヒドにおいて固定して、PBSにおいて希釈した300 nM DAPIと共に室温で1〜4分間インキュベートした。次に、細胞をPBSにおいてすすぎ、蛍光顕微鏡によって可視化して、アポトーシス細胞を核の分析によって決定して、既に記述されているように（Dimmelerら、1997）核400個の細胞総数におけるアポトーシス核×100％として表記した。PAC1細胞を、アポ-ONETM均一カスパーゼ3/7アッセイキット（プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて製造元のプロトコールに従ってカスパーゼ-3活性に関して分析した。簡単に説明すると、ウイルス形質導入細胞を低張緩衝液（25 mM HEPES、pH 7.5、5 mM MgCl2、5 mM EDTA、5 mM DTT、2 mM PMSF、10 μg/mlペプスタチン、10 μg/mlロイペプチン）において凍結融解2回によって溶解した後、13,500 rpmで4℃で15分間の遠心を行った。活性のアッセイのために上清を新しい試験管に移した。各反応に関して、細胞溶解物25 μlを用いて均一なカスパーゼ3/7試薬（緩衝液において希釈した基質）25 μlと共に室温で4時間、絶えず振とうさせながら150 nMカスパーゼ-3阻害剤（Ac-DEVD-CHO）の存在下または非存在下でインキュベートした。蛍光を蛍光プレートリーダーにおいて励起波長485 nmおよび放出波長535 nmで測定した。カスパーゼ3活性の分析は、測定した蛍光を総タンパク質によって標準化することによって行い、単位/10 μg総タンパク質として表記した。
【０４１０】
7．フローサイトメトリー
ウイルス形質導入後の細胞のアポトーシスおよび細胞表面上のインテグリンの発現をフローサイトメトリーによって評価した。ウイルスを形質導入したPAC1細胞をトリプシン処理によって回収して、PBSによって洗浄し、冷70％エタノールにおいて12時間固定した。細胞を遠心して、PBSによって2回洗浄して、PBSに再浮遊させた後、最終濃度50 μg/mlのヨウ化プロピジウム（PI）および20 μg/ml RNアーゼと共に室温でインキュベートした。対照として同一の群の細胞を形質導入せずに、上記と同じ処置を行った。細胞105個/mlのPBSの単細胞浮遊液として調製した処置細胞を、FACSキャリバーフローサイトメトリー（ベクトンディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いてFACS分析によって評価した。細胞のアポトーシスの百分率をModfitアポトーシス分析（ベクトンディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）プログラムを用いて決定した。異なる細胞集団について異なる実験3回を行った。フローサイトメトリー分析はまた、記述のように細胞表面上でのインテグリンタンパク質発現を評価するために実施した（Liら、2001）。
【０４１１】
8．細胞遊走分析
PAC1細胞の遊走率を、記述のように（Huang and Kontos、2002）ひっかき傷アッセイを用いて決定した。簡単に説明すると、PAC1細胞を60 mmプレートにおいて90％コンフルエントまで増殖させた後形質導入しない、またはウイルスを24時間形質導入した。24時間飢えさせた後、細胞単層を滅菌ピペットのチップによって破壊して無細胞域を作製した。次に、細胞を10％FBSの存在下または非存在下で処置した。処置24時間後、細胞を、カメラに接続したオリンパスIX-70顕微鏡下で可視化した。PAC1細胞遊走は、手動で設定した定規によって異なる3カ所の位置で無細胞域の幅（損傷した単層の端部間の距離）を測定することによって定量した。
【０４１２】
9．STAT-3活性化
細胞をチャンバースライドガラスに播種して、MDA-7タンパク質を60分間処置した後、PBSによって十分に（3回）洗浄した。次に、細胞をメタノール：酢酸（95：5容積：容積）によって固定して、抗pStat3モノクローナル抗体（1：1000倍希釈；セルシグナリング）によって4℃で1時間染色した。次に、細胞をPBSによって3回洗浄して、二次抗体（1：1000倍希釈；テキサスレッド結合ウサギ抗マウスIgG；シグマ）によって4℃で1時間処置した。次に細胞を洗浄して、蛍光顕微鏡下で調べた。
【０４１３】
10．統計分析
値は全て平均値±SEMとして表記した。グラフのデータは、2回繰り返した図30を除き、全て少なくとも3回の独立した実験の代表である。差に関する有意性の試験は、適当であればANOVAまたはスチューデントt検定によって行った。有意性はp＜0.05として決定した。
【０４１４】
結果
1．PAC1 SMCの特徴付け
PAC1細胞をラット肺動脈平滑筋細胞（SMC）から単離して、多数回の小培養を通して分化特性の安定な維持に基づいて誘導した（Rothmanら、1986；Firulliら、1998）。本研究において用いられた細胞は、クローン単離体から複数回継代されている（そして継代70〜85回で使用した）。これまでの研究から、PAC1が広範なSMC特異的マーカーを発現し、様々な生理的刺激に対して機能的反応を示すことから（表5を参照されたい）、PAC1がSMC分化の良好なモデルとして役立つことが示されている（Firulliら、1998；Rothmanら、1994）。PAC1細胞は、正常ラット大動脈平滑筋細胞（RASMC）に対するSMCマーカーの類似の相補体を発現するが、これらのマーカーは一般的にL6骨格筋芽細胞または正常ヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）において発現されない（表5を参照されたい）。
【０４１５】
PAC1 SMCにおけるアデノウイルスの形質導入効率を最初に評価した。図30に示すように、Ad-RSV-β-galをMOI 50 pfu/細胞で形質導入したPAC1 SMCによって、約60％β-gal陽性細胞が得られた（図30）。PAC1細胞のSMC表現型をさらに確認するために、それらに、β-ガラクトシダーゼの発現を促進する平滑筋特異的プロモーター（SM22α）を含むベクターであるAd-SM22-β-galを形質導入した（Kimら、1997）。PAC1細胞を非常に形質導入されやすい肺癌細胞株と比較した。Ad-RSV-β-galを対照ベクターとして用いて、H1299 NSCLC細胞をPAC1細胞と類似の効率で形質導入した。しかし、PAC1細胞はAd-SM22-β-galによる処置後にH1299細胞より10倍効率よく形質導入された（図30）。比較的低いβ-gal発現も同様に他の腫瘍細胞について認められ、PAC1細胞がSMC系列であることを示している。Ad-mda7による形質導入は、高レベルのトランスジェニックタンパク質発現をもたらす。PAC1細胞の効率的な形質導入は、アデノウイルス形質導入に関与している細胞表面分子の分析によってさらに評価した。PAC1細胞は、FACSによって細胞表面上に高レベルのCARおよびαvインテグリンを発現した。
【０４１６】
（表５）
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【０４１７】
2．Ad-mda7を形質導入したPAC1 SMCにおけるヒトMDA-7発現
内因性のmda-7 mRNAは、完全な培地において増殖しつつあるPAC1において検出されなかった。しかし、mda-7 mRNAおよびMDA-7タンパク質はいずれもAd-mda7を形質導入したPAC1において認められたが、対照ウイルス処置細胞ではmda-7 mRNAまたはタンパク質は検出されなかった。MDA-7タンパク質は、条件培地において検出され、このことはAd-mda7形質導入PAC1が可溶性のMDA-7タンパク質を分泌することを示唆している。この知見は、Ad-mda7を形質導入したヒト腫瘍細胞株におけるこれまでの研究と一貫している（Mhashilkarら、2001）。ヒト腫瘍細胞を用いたこれまでの研究（Mhashilkarら、2001）と一致して、MDA-7は細胞内型より大きいタンパク質としてPAC1細胞から分泌されたが、これは何らかの翻訳後改変（例えば、グリコシル化）を示している。分泌されたMDA-7タンパク質レベルの分析を行ったところ、100 pfu/細胞（MOI）で3日間のAd-mda7の形質導入後、PAC1細胞からのタンパク質分泌が一時的に増加したことが示されている。MDA-7タンパク質の用量依存的な増加はまた、増加させたMOIのAd-mda7を形質導入したPAC1細胞からの細胞溶解物および条件培地の双方において認められた。これらの研究は、PAC1 SMCにおけるMDA-7発現の非常に大きい増加を得ることが実現可能であることを確立する。
【０４１８】
3．異所MDA-7はPAC1 SMC増殖を阻害する
次に、mda-7の強制的な発現がPAC1細胞の増殖に対して阻害作用を示すか否かを調べた。PAC1 SMCに、Ad-mda7またはAd-LucをMOI 0、40、100、および200で形質導入して、生存細胞を形質導入の3日後に計数した。代表的な一つの試験を図31に示す。Ad-mda7を形質導入したPAC1 SMCは、Ad-Luc形質導入細胞と比較して生存細胞数の有意な減少を示した。PAC1細胞増殖に及ぼすmda-7発現の最大阻害作用は、MOI 100で認められ（Ad-Lucと比較してp＝0.02）、より高いMOIでは、Ad-Lucは毒性を示した。このように、その後の試験は全てAd-mda7をMOI 100で用いた。
【０４１９】
4．MDA-7発現はPAC1 SMCアポトーシスを増強する
これまでの研究は、Ad-mda7が、乳癌、結腸癌、および肺癌に由来する多様なヒト腫瘍細胞株においてアポトーシスを誘導することを示した（Mhashilkarら、2001；Saekiら、2002）。MDA-7によるPAC1細胞の阻害は、部分的にアポトーシスの増加によって媒介された可能性がある。最初の試験は、哺乳類細胞におけるアポトーシスにおいて重要なエフェクターの役割を果たすシステインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ（カスパーゼ）ファミリーメンバーであるカスパーゼ-3活性を決定するために行った（Nicholsonら、1995）。Ad-mda7処置PAC1細胞では、無処置またはAd-Luc処置細胞と比較してカスパーゼ-3活性の有意な増加を認めた（Ad-Lucと比較してp＜0.05）（図32A）。カスパーゼ-3活性は、カスパーゼ-3阻害剤（Ac-DEVD-CHO）によって特異的に阻害された。これらの知見は、mda-7の過剰発現がPAC1細胞においてカスパーゼ-3を活性化してアポトーシスを促進することを示唆している。
【０４２０】
PAC1 SMCにおけるMDA-7発現のアポトーシス作用を定量するために、本発明者らは次に、初期アポトーシスの測定手段としてFACS分析と共にアネキシンV染色を用いて、細胞表面上に存在するリン脂質であるホスファチジルセリン（PS）を調べた。対照Ad-Luc形質導入細胞と比較して、Ad-mda7処置によって形質導入後24時間もの早い時期にアポトーシスPAC1 SMCの数が有意に増加した（p＜0.05）（図32B）。DAPI染色アッセイを行って、核凝縮および破壊を分析することにより、後期アポトーシスに及ぼすAd-mda7の効果を定量した。Ad-mda7の形質導入によって、対照ウイルスと比較してそれぞれの時点でアポトーシス細胞数は有意に増加した（p＜0.05）（図32C）。もう一つの独立したアポトーシス測定手段において、本発明者らは、Ad-mda7処置細胞が細胞周期のサブG0/G1期の細胞数の強い増加を示すことに気付いた。これらの知見は共に、アポトーシスの増強が、Ad-mda7によるPAC1 SMC増殖の阻害に関与する可能性があることを示唆している。
【０４２１】
これまでの研究は、BAX、BAKレベルの変化およびBAX対BCL-2タンパク質比がmda-7による癌細胞におけるアポトーシスの誘導において重要なメディエータである可能性を示した（Lebedevaら、2002；Suら、1998；Madireddiら、2000）。これらのアポトーシス関連分子が、PAC1細胞において異所mda-7によって媒介されるプログラムされた細胞死に関与するか否かを決定するために、Ad-mda7による形質導入後6〜72時間での様々なタンパク質のレベルをウェスタンブロッティングによって決定した。アポトーシス促進タンパク質（BAK、BAX）のアップレギュレーションは、MOI 100のAd-mda7の形質導入後72時間でPAC1 SMCにおいて起こったが、BAKタンパク質は、24時間もの早期に増加するように思われる。Ad-Lucの72時間処置は、タンパク質レベルに差を示さなかった。対照的に、抗アポトーシスタンパク質（BCL-2）発現はMOI 100でのAd-mda7による形質導入後72時間でPAC1細胞において減少し、BCL-xLタンパク質はごくわずかに変化したに過ぎなかった。これらの結果は、Ad-mda7による形質導入に起因する、抗アポトーシス（BCL-2、BCL-xL）タンパク質に対するアポトーシス促進（BAK、BAX）タンパク質のレベルの増加が、PAC1細胞における後期アポトーシスを誘発する可能性があることを示唆している。アポトーシスは、Ad-mda7処置の24時間以内に検出可能であり（図32Bおよび32C）、これはBAKレベルの増加と一致するがBAXレベルとは一致しないことに注意されたい。このように、BAKアポトーシス促進タンパク質はPAC1細胞におけるアポトーシスのイニシエータである可能性がある。
【０４２２】
5．MDA-7はPAC1 SMC遊走を阻害する
細胞の遊走は、血管の病理における新生内膜の発達におけるもう一つの重要なプロセスである。mda-7発現がPAC1 SMC遊走を変化させるか否かを調べるために、アデノウイルス形質導入または非形質導入PAC1 SMCの遊走を、単層のひっかき傷を作製した後に測定した。血清によって刺激すると、PAC1の創傷への遊走が有意に増加した。対照的にmda-7の過剰発現は、基礎（p＜0.05）およびFBS刺激（p＜0.01）PAC1細胞遊走をMOI 100で有意に阻害した（図33）。このように、mda-7は血清刺激の非存在下においても遊走を遮断することができる。
【０４２３】
6．Ad-mda7は正常なSMC細胞の増殖を阻害しない
初代培養ヒト冠動脈SMC（HCASMC；継代5〜10回）および正常ラット大動脈SMC（RASMC；継代10〜20回）にAd-mda7またはAd-lucを様々なMOIで形質導入した。ウェスタンブロット分析から、MDA-7タンパク質が細胞内に産生され、SMCの双方の正常なタイプから、PAC1 SMCについて認められたレベルと同等のレベルで分泌されることが示された。正常なSMCにおいてまたはAd-Luc処置後にMDA-7は内因性に発現されなかった。MOI 100でAd-mda7形質導入後のPAC1細胞と類似のレベルのMDA-7タンパク質が、HCASMCまたはRASMCにおいて発現された。しかし、細胞生存率試験では、HCASMCまたはRASMCのAd-mda7処置後の細胞生存率の減少は示されなかった。類似の結果は、アポトーシス誘導に関する独立したアッセイとして細胞周期分析を用いた場合にも得られた（表6を参照されたい）。PAC1 SMCのみが、MOI 100で24時間のAd-mda7処置後にサブG0/G1細胞の増加を示した。このように、ラットPAC1 SMCにおいて認められた細胞増殖の阻害およびアポトーシスの誘導は、正常なラットSMCまたは初代培養ヒトSMCでは認められない。
【０４２４】
PAC1細胞対正常ラットおよびヒトSMCにおけるmda-7過剰発現の異なる活性を理解するために、本研究において用いたPAC1細胞の染色体の広がりを評価した。継代70〜85回のPAC1細胞の核型分析により、PAC1またはRASMC核型に関する初期の報告と比較して染色体分染パターンに根本的な差が判明した（Firulliら、1998）。特に、PAC1細胞はトリソミー20、それによってより大きいp腕が得られる第11染色体の転座、および未知起源のさらなるマーカー染色体を示した。このように、MDA-7媒介細胞死に対して感受性があるPAC1細胞株には実質的な染色体異常が存在する。
【０４２５】
（表６）
2006523227.tif 000018
【０４２６】
7．MDA-7は細胞内経路を通して細胞死に影響を及ぼす
PAC1 SMCにおいてAd-mda7によって誘導された選択的死が細胞表面媒介プロセスによるものか、または何らかの細胞内経路によるものであるかを調べるために、細胞死とSTAT-3活性化（MDA-7/IL-24受容体活性化の測定手段）を、組換え型MDA-7（rMDA-7）によるPAC1 SMCおよびRASMCの刺激後に測定した。rMDA-7によって刺激したPAC1 SMCでは、細胞死の統計学的に有意な増加を認めなかった。この知見と一致して、本発明者らはこれらの細胞におけるSTAT3活性化の如何なる証拠も示すことができなかった。これらの結果は、Ad-mda7が細胞内メカニズムを通してPAC1 SMCにおける選択的細胞死を媒介することを示唆している。
【０４２７】
実施例23：Ad-mda7の投与および発現に関する臨床試験結果および情報
材料および方法
1．患者の基準
針による注射を行うために近づくことができ、外科的に切除可能な少なくとも一つの病変を有する組織学的に確認した癌腫（フェーズ1患者）。カルノフスキー動作試験が70％より大きい。許容可能な血液、腎、および肝機能。活性なCNS転移を有する患者、慢性的に免疫抑制剤を使用している患者、またはこれまでにアデノウイルスの投与を必要とする治療に参加したことがある患者は除外した。
【０４２８】
2．定量的PCR、RT-PCR
試料をTaqMan（商標）に基づくアッセイを用いて試験した。アッセイは、CMVプロモーターの3'領域とmda-7遺伝子の5'領域とのあいだに存在する109ヌクレオチドのアンプリコンを検出する。アッセイは、DNAおよびRNAの双方においてINGN 241（その全てが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許出願第09/615,154号、第10/017,472号、および第10/378,590号に記述されるAd-MDA-7）を検出するために特異的である。
【０４２９】
3．免疫組織化学
INGN 241を注射した腫瘍の連続切片を、TUNEL反応（デッドエンド比色アポトーシス検出システム、プロメガ）によって定義されるアポトーシス活性に関して分析した。
【０４３０】
4．MDA-7タンパク質
INGN241注射腫瘍の連続切片を、イントロゲンテラピューティクスによって供給されるmda-7反応性ウサギ抗体（Ab 506-71）を用いて自動IHCによって分析した。
【０４３１】
結果
進行癌患者に腫瘍内注射によって投与するINGN 241のオープンラベルフェーズI単用量、用量増加試験を行った。評価はINGN 241ベクターの拡散半径、およびその得られたタンパク質および腫瘍塊内の生物学的作用に重点を置いて行った。
【０４３２】
参考注射点を、投与産物に色素を含めることによって印をつけた。
【０４３３】
同様に、局所腫瘍退縮および起こりうる遠位作用の双方を決定するために最適な用量でフェーズ2予備試験を行った。
【０４３４】
図34に示すように、コホートに異なる濃度および時間経過のINGN 241を投与した。ウイルスの濃度は2×1010、2×1011、または2×1012ウイルス粒子（vp）/投与であった。最後の注射の24時間後、腫瘍を採取して切片を作製した。片面に免疫組織化学を行って、もう片方の面にRT-PCRを行ってRNAおよびDAN濃度を評価した。5 cm×5 cm病変に2×1012 vpを投与した患者1人において、中心部分（注射部位から約6 mm以内）は、MDA-7 DNA 4.7×108コピー/μgを含み、MDA-7 RNA 5.6×107コピー/μgが検出された。注射部位から約6 mm離れた切片は、MDA-7 DNA 1.2×106コピー/μgおよびMDA-7 RNA 4.6×107コピー/μgを含んだ。注射部位から約12 mm離れた切片は、MDA-7 DNA 1.1×106コピー/μgおよびMDA-7 RNA 5.0×103コピー/μgを含んだが、注射部位から18 mm離れた切片は、MDA-7 DNA約1.9×105コピー/μgおよびMDA-7 RNA 9.8×103コピー/μgを含んだ。注射部位から約12 mm離れた部位の切片の免疫染色およびTUNEL分析により、MDA-7発現がアポトーシス領域と同時に局在することが示された。図35も参照されたい。
【０４３５】
異なる黒色腫患者を、注射部位からの距離に関連してMDA-7 DNA、RNA、およびタンパク質の発現レベルに関して評価した。図36を参照されたい。多数の患者を、発現レベル（図37）および発現レベルとアポトーシスとの相関（図38）に関して分析した。
【０４３６】
MDA-7の広がりおよびそのアポトーシスに及ぼす影響も同様に調べて評価した（図39）。
【０４３７】
DNA濃度の経時的変化を注射後1日、2日、4日、および30日目に調べた（図40）。同様に、タンパク質発現の経時的変化およびそのアポトーシスとの相関を調べた（図41）。MDA-7タンパク質発現の時間依存的な増加およびアポトーシス細胞の顕著な増加が認められ、これらは注射部位からの距離に有意に相関する。MDA-7タンパク質およびアポトーシスは、ベクターDNAの検出点を超えて測定可能であり、拡散性の活性産物を示唆している。96時間までに腫瘍内INGN 241 DNAレベルは減少する；30日では4対数の減少（中央値）を認めた。注射後30日までに、MDA-7タンパク質発現およびアポトーシス活性は検出できなかった。
【０４３８】
フェーズ2臨床試験において、多様なタイプの腫瘍において、INGN 241の1回投与を多数回投与（2×1012 vpを2週間毎に3回）と比較した（図42）。
【０４３９】
INGN 241 2×1012 vpを腫瘍内に6回投与するINGN 241の反復腫瘍内投与によって、黒色腫（2 cm×2 cm鎖骨上塊）患者において客観的な腫瘍の退縮が得られた。
【０４４０】
有害事象を図41に示す。全体的に、INGN 241の腫瘍内投与は良好に認容されることが試験から示された。
【０４４１】
実施例24：MDA-7はNF-κBを誘導する；スリンダクはヒト肺癌においてAd-mda7媒介アポトーシスを増強する
材料および方法
1．細胞株および細胞培養
ヒトNSCLC細胞株A549（腺癌、p53に関して野生型）およびH1299（大細胞癌、p53に関してヌルタイプ）をこれらの実験のいくつかにおいて用いた。正常な肺線維芽細胞株CCD-16をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックビル、メリーランド州）から得た。A549およびH1299細胞は既に記述されているように（5）適当な培地において維持した。CCD-16細胞は10％ウシ胎児血清（ギブコBRL、グランドアイランド、ニューヨーク州）を添加したアルファ培地において培養し、5％CO2プラス95％空気の大気中で37℃で維持した。
【０４４２】
2．物質
スリンダク、スリンダクスルホン、MG132（プロテオソーム阻害剤）およびシクロヘキシミド（タンパク質合成阻害剤）をシグマケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）から得た。スリンダクを1 Mトリス塩酸、pH 8.0 に溶解して100 mM保存液を作製した。MG132をDMSOに溶解して10 mM保存液を作製した。これらの保存液は-20℃で凍結保存した。
【０４４３】
3．組換え型アデノウイルスベクター
Ad-mda7およびAd-lucベクターは、既に報告されているように構築および精製した（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）。細胞株の形質導入効率をGFP（Ad-GFP）を有するアデノウイルスベクターによって決定した。形質導入効率は3000 vp/細胞で感染させた場合、80％より大きかった。これらの結果に基づいて、その後の全ての実験では細胞を3000 vp/細胞で処置した。
【０４４４】
アデノウイルス形質導入に及ぼすスリンダクの影響を調べるために、腫瘍および正常細胞にAd-GFPを100 vp/細胞で感染させ、24時間でのGFP発現をFACSによって分析した。
【０４４５】
4．細胞増殖アッセイ
三つの細胞株（A549、H1299、およびCCD-16）を全て直径60 mmの組織培養皿に密度1×105個/皿で1試料あたり3個ずつ播種した。翌日、細胞をPBS（対照）、Ad-luc（3000 vp/細胞；対照）、Ad-mda7（3000 vp/細胞；対照）、スリンダク、またはPBSプラススリンダク、Ad-lucプラススリンダク、またはAd-mda7プラススリンダクによって処置した。試験したスリンダクの濃度は0.125、0.25、および0.5 mMであった。処置開始後72時間目に細胞をトリプシン処理によって回収して洗浄し、既に記述されているように（Saekiら、2000）トリパンブルー排除アッセイを行った。細胞の増殖は、各処置群に関して細胞数の平均値を計算することによって決定し、PBS、Ad-luc、またはAd-mda7単独によって処置した総細胞数（100％に設定）の百分率として表記した。
【０４４６】
5．細胞周期の分布とアポトーシス
細胞（5×105個）を直径10 cmの組織培養皿に播種して、PBS、Ad-luc（3000 vp/細胞）、Ad-mda7（3000 vp/細胞）、スリンダク、またはPBSプラススリンダク、Ad-lucプラススリンダク、またはAd-mda7プラススリンダクによって処置した。各処置群は1試料あたり3個ずつ試験した。用いたスリンダクの濃度は細胞増殖アッセイに用いた濃度と同じであった。治療開始後72時間目に、細胞を回収して洗浄し、既に記述されているように（Saekiら、2000）細胞周期およびアポトーシス分画に関して分析した。細胞周期およびDNA含有量はFACscan（EPICS XL-MCL；ベックマンコールター、フュラートン、カリフォルニア州）を用いて分析した。
【０４４７】
6．免疫蛍光アッセイ
細胞（1×104個）を2ウェルチャンバースライド（フィッシャーサイエンティフィック）に播種して、PBS、Ad-mda7（3000 vp/細胞）、PBSプラススリンダク（0.5 mM）またはAd-mda7プラススリンダク（0.5 mM）によって処置した。処置開始後48時間目に、細胞をPBSによって洗浄してPBS緩衝4％パラホルムアルデヒドにおいて室温で30分間固定した。次に、細胞を0.1％トライトンX-100および0.1％クエン酸ナトリウムにおいて室温で10分間可溶化した後、正常ヤギ血清と共にインキュベートした。インキュベーション開始の30分後、細胞をPBSによって洗浄して、ウサギポリクローナル抗ヒトMDA-7抗体（イントロゲンテラピューティクスインク、ハウストン、テキサス州）と共に37℃で1時間インキュベートした。次に、細胞をPBSによって3回洗浄して、ヤギ抗ウサギFITC標識二次抗体（ベクターラボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア州）と共に1時間インキュベートして、PBSにおいて3回洗浄し、カバーガラスを載せて、ニコン蛍光顕微鏡（メルビル、ニューヨーク州）を用いてMDA-7タンパク質発現に関して観察した。顕微鏡写真は高倍率で得た。
【０４４８】
7．プロテアソーム活性アッセイ
プロテアソーム活性アッセイは、既に記述されているとおりに行った（Choiら、2003）。簡単に説明すると、H1299細胞を6ウェルプレート（2×105個/ウェル）に播種してAd-mda7、Ad-mda7プラススリンダク、またはAd-mda7プラスMG132（5 μM）によって処置した。調べたスリンダク濃度は、他のアッセイの濃度と同じであった。処置開始後24時間目に、細胞をプロテアソーム緩衝液（10 mMトリス-塩酸、pH 7.5、1 mM EDTA、20％グリセロール、5 mM ATP、および4 mM DTT）において溶解して、超音波処理した後1300×gで4℃で10分間遠心した。上清を回収して細胞溶解物のタンパク質濃度を既に記述されているように決定した（Saekiら、2000）。
【０４４９】
プロテアソームのキモトリプシン様活性を調べるために、蛍光原基質Suc-LLVY-AMC（ケミコンインターナショナルインク、テメキュラ、カリフォルニア州）を用いた。上記の各処置群からの総タンパク質20 μgを反応緩衝液（25 mM HEPES、pH 7.5、0.5 mM EDTA、0.05％NP-40、および0.001％SDS）において100 μlに希釈した。蛍光原基質を各試料に加えて、37℃で1時間インキュベートした。各試料溶液中の蛍光強度を蛍光プレートリーダー（ダイナテックラボラトリーズ（Dynatech Laboratories）、シャンティリー、バージニア州）を用いて励起波長360 nmおよび放出波長460 nmで測定した。読みは全て、等量の遊離の7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC）溶液（50 μM）の蛍光強度を用いて標準化した。値は、供給元によって提供された内部陽性対照の百分率より大きい対照の百分率として表記した。
【０４５０】
8．リアルタイム定量的RT-PCR
6ウェルプレート（5×105個/ウェル）に播種したH1299細胞をAd-mda7（3000 vp/細胞）またはAd-mda7プラススリンダク（0.125、0.25、または0.5 mM）によって処置した。無処置細胞をこれらの実験において対照とした。処置開始の36時間後、細胞をPBSによって洗浄し、トリプシン処理してPBS 1.0 mlに浮遊させた。細胞浮遊液を1.5 mlエッペンドルフチューブに移して、10,000 rpm、4℃で5分間遠心した。上清を捨てて、細胞沈降物からの総RNAを、RNA単離キット（アンビオンコーポレーション（Ambion Corp.）、オースチン、テキサス州）を用いて製造元によって記述されたとおりに抽出した。次に、単離されたRNAをDNアーゼIによって処置して、残留DNAを除去して、その後波長260 nmおよび280 nmで分光光度計を用いて定量した。各試料からの総RNA（0.1 μg）をスーパースクリプトRTキット（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて逆転写した。mda-7 mRNAの定量は、リアルタイム定量的RT-PCRを用いて行った。簡単に説明すると、定量的PCRを総RNA 1 μl、PCRスーパーミクス（PEアプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）10 μl、0.2 μM mda-7特異的プライマー、および0.1 μM蛍光プローブからなる容積20 μl中で行った。得られたレポーターおよびクエンチャー蛍光色素放出の相対的な増加を、PCR増幅の際に7700配列検出器（PEアプライドバイオシステムズ）を用いてリアルタイムでモニターした。二段階PCRサイクリングを以下のように行った：50℃で2分、95℃で10分、95℃で15分および60℃で1分を40サイクル。ヒトGAPDHハウスキーピング遺伝子を増幅反応における内部対照として用い、供給元（PEアプライドバイオシステムズ）によって提供されるプライマーを用いた。
【０４５１】
上記のアッセイにおいて用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである：
2006523227.tif 000019
【０４５２】
反応は全て、1試料あたり3個ずつ行った。サイクル反応の終了後、各試料の標準曲線、閾値サイクリング（Ct）値、および標準曲線に基づくその対応する開始量を、7700配列検出器システムソフトウェア（PEアプライドバイオシステムズ）を用いて決定した。様々な治療群におけるmda-7 mRNA発現の差をGAPDHに対する値の変化として表記した。
【０４５３】
9．半減期分析
H1299細胞を直径60 mmの組織培養皿において2×105個の密度で播種した。翌日、細胞をAd-mda7（3000 vp/細胞）に感染させた。感染の48時間後、スリンダク（1 mM）を加えて、または加えずにインキュベーションを継続した。2時間後、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（10 μg/ml）を細胞に加えて、インキュベーションを継続した。シクロヘキシミド処置後0、3、6、9、11、および13時間目に細胞を回収した；細胞溶解物を調製して、既に記述されているように（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）ウェスタンブロット分析によってMDA-7タンパク質発現に関して分析した。
【０４５４】
10．ウェスタンブロット分析
PBS、Ad-mda7、Ad-luc、スリンダク、スリンダクスルホン、またはAd-lucもしくはAd-mda7とスリンダクもしくはスリンダクスルホンの併用によって処置した細胞に、既に記述されているように（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）ウェスタンブロット分析を行った。以下の一次抗体を検出のために用いた：カスパーゼ-3およびPARP（BDファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州）；カスパーゼ-9、pJNK、およびpp38 MAPK（セルシグナリングテクノロジーインク、ビバリー、カリフォルニア州）、PKR、BAX、BAK、BCL-2、BCL-XL、COX-2、およびUb（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、カリフォルニア州）；β-アクチン（シグマ）；およびMDA-7（イントロゲンテラピューティクス）。タンパク質は、適当な西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて検出し、アマシャムの高感度化学発光ウェスタンブロッティング検出システムを応用することによって、高感度化学発光フィルム（ハイパーフィルム、アマシャム）において可視化した。
【０４５５】
11．インビトロ分析
スリンダクがインビボで異種移植片腫瘍のAd-mda7媒介腫瘍増殖阻害を増強するか否かを調べるために、H1299肺腫瘍細胞（5×106個）を、無胸腺BALB/c雌性ヌードマウス（n＝40）の下位右わきばらに皮下注射した。腫瘍が50〜100 mm3に達した場合、動物を群分けして以下のように処置した：PBS（n＝8）、スリンダク（n＝8）、Ad-mda7（n＝8）、Ad-lucプラススリンダク（n＝8）、またはAd-mda7プラススリンダク（n＝8）。マウスをAd-lucまたはAd-mda7の週3回腫瘍内投与（3×109 vp/細胞）によって処置した。スリンダクを投与したマウスでは、40 mg/kgを毎日腹腔内注射した。動物の体重を1週間に1回測定して、体重を決定した。腫瘍の増殖は既に記述されているように（Saekiら、2002；Rameshら、2003）週3回モニターして測定した。処置開始の22〜25日後、動物を全てCO2吸入によって屠殺し、組織病理学検査およびウェスタンブロット分析のために腫瘍を摘出した。実験は再現性および統計学的有意性のために異なる時期に2回行った。
【０４５６】
12．統計分析
スチューデントt検定およびANOVAを用いて実験結果の統計学的有意性を計算した。P＜0.05の値は統計学的に有意であると見なされた。
【０４５７】
結果
1．MDA-7はNF-κBを誘導する
本研究において、二つのNSCLC細胞株（H1299およびA549）におけるアデノウイルス媒介mda-7（Ad-mda7）遺伝子移入によって、電気移動度シフトアッセイ（EMSA）によって示されるように、NF-κB活性化が起こることが証明された。NF-κBの顕著な活性化は、Ad-mda7処置細胞において20〜48時間のあいだに認められたが、PBSを処置した対照細胞、またはAd-ルシフェラーゼを処置した細胞では認められなかった。さらに、NF-κBの活性化は用量依存的に起こり、Ad-mda7の濃度を増加させるとNF-κBの増加が起こった。
【０４５８】
NF-κBの活性化と一致して、NF-κBの阻害剤すなわちI-κBαの分解が起こった。Ad-mda7誘導NF-κBは、p50およびp65サブユニットからなることが判明した。Ad-mda7はまた、A549細胞の感染後36および48時間、ならびにH1299細胞の感染後42および48時間に行ったEMSAによれば、NF-κB（p65）の核転移を誘導し、NF-κBのDNA結合活性を用量依存的に増加させることが判明した。
【０４５９】
Ad-mda7はまた、NF-κBレポーター遺伝子発現を活性化することが判明した（図46）。同様にドミナントネガティブI-κBα細胞において細胞障害作用を有することも判明した（図47）。Ad-mda7は、ドミナントネガティブI-κBα細胞において細胞増殖を有意に抑制した（図48）。さらに、H1299細胞に、ドミナントネガティブI-κBを過剰発現するアデノウイルスベクター（Ad-mIκB）をトランスフェクトすると、Ad-lucによって処置した対照細胞と比較して、NF-κBのAd-mda7誘導転写およびDNA結合活性は有意に阻害され、それによって腫瘍細胞のアポトーシスが増加した。
【０４６０】
スリンダクは、EMSAによって決定するとNF-κB活性化を用量依存的に阻害することが判明した。さらに、非ステロイド性抗炎症剤であるスリンダクによるMDA-7媒介NF-κB活性化の阻害によって、相乗的な治療効果が得られた（図49A）。これらの結果は、肺癌細胞におけるMDA-7発現がNF-κBを誘導し、Ad-mIκBまたはスリンダクによるその阻害が治療効果を増強することを示している。
【０４６１】
2．スリンダクは肺癌細胞におけるAd-mda7媒介増殖阻害を増強する
これまでの研究から、スリンダクは癌細胞に対して細胞障害作用を発揮することが示されていることから（Sanchez-Alcazarら、2003）、NSCLC（A549およびH1299）細胞および正常（CCD-16）細胞に対してスリンダクの最小の細胞障害用量を決定するために、予備実験を行った。これらの細胞を様々な濃度（0.062、0.12、0.25、0.5、1、および2 mM）のスリンダクによって処置すると、増殖阻害が示され、IC50はA549、H1299、およびCCD-16細胞においてそれぞれ、0.58、0.61、および0.94 mMであった。より高用量（1および2 mM）では、細胞増殖は腫瘍および正常細胞の双方において阻害されてアポトーシスが起こった（データは示していない）。しかし、腫瘍細胞の増殖に対する阻害効果（＞90％）は正常細胞（60％）より大きかった。これらの結果に基づき、スリンダクはその後の実験において0.5 mMより低い濃度で調べた。
【０４６２】
Ad-mda7と併用したスリンダクが細胞増殖を阻害してアポトーシスを誘導できるか否かを調べるために、A549、H1299、およびCCD-16をPBS、Ad-luc、およびAd-mda7単独、またはスリンダク（0.125、0.25、または0.5mM）との併用によって処置した。処置後72時間での細胞の分析から、スリンダクとAd-mda7との併用は、Ad-mda7またはスリンダク単独によって処置した細胞と比較して腫瘍細胞の増殖を有意に阻害することが示された（P＝0.001；図49B）。この併用療法によって得られた増殖阻害作用はまた、他の治療群と比較しても有意であり、スリンダクの用量依存的であった。対照的に、Ad-mda7プラススリンダクを処置した正常線維芽細胞では、他の処置群と比較して調べた如何なる濃度においても有意な増殖阻害作用は認められなかった。これらの結果は、スリンダクが腫瘍におけるAd-mda7媒介阻害活性を選択的に増強するが正常細胞においては増強しないことを示している。
【０４６３】
Ad-mda7プラススリンダクによる処置がアポトーシスを誘導するか否かをさらに評価するために、腫瘍および正常細胞を処置後72時間目にFACS分析によってアポトーシス変化に関して分析した。アポトーシス変化の指標であるサブG0/G1期の細胞数は、Ad-mda7単独またはスリンダクとの併用によって処置した腫瘍（H1299およびA549）細胞では、これらの処置を行った正常細胞より有意に高かった（P＝0.001）（図49C）。しかし、Ad-mda7プラススリンダクを処置した腫瘍細胞におけるアポトーシス細胞数は、Ad-mda7単独によって処置した腫瘍細胞数より有意に多く（P＜0.01）、スリンダクの用量依存的であった。Ad-luc単独またはスリンダクとの併用を処置した細胞におけるアポトーシス細胞数は、PBS処置細胞におけるアポトーシス細胞数より有意に多くなかった。しかし、A549腫瘍細胞において、アポトーシス細胞数は、Ad-luc処置と併用した場合のスリンダクの最高濃度（0.5 mM）では、PBS処置細胞と比較して有意に増加した（P＝0.01）。CCD-16細胞をAd-mda7またはAd-mda7およびスリンダクによって処置すると、スリンダクの最高濃度（0.5 mM）においても、対照細胞と比較してアポトーシス細胞数に有意差を生じなかった（図49C）。類似の増殖阻害効果の増強はまた、肺癌細胞をスリンダクスルホンと併用してAd-mda7によって処置した場合にも認められた。これらの結果は、Ad-mda7およびスリンダクまたはスリンダクスルホンによって処置した場合に、肺腫瘍が選択的にアポトーシスを受けるが、正常細胞はアポトーシスを受けないことを示している。さらに、Ad-mda7およびスリンダクによって媒介される増殖阻害効果は、それらがp53ヌルおよびp53野生型タイプの腫瘍細胞株において起こることから、p53の状況とは無関係に起こる。
【０４６４】
3．スリンダクはAd-mda7形質導入を増加させない
治療物質がアデノウイルスの形質導入効率を増強することができることは、既に報告されている（Linら、2003）。この報告に基づき、スリンダクがアデノウイルス形質導入を増強するか否かを決定した。この目的に関して、腫瘍および正常細胞をAd-GFPに100 vp/細胞で感染させて、様々な濃度のスリンダクによって処置した（下記の表7）。より高いvpでは80％を超える細胞が形質導入され、形質導入に及ぼすスリンダクの効果を決定することが難しくなることから、細胞に低い粒子数でAd-GFPを形質導入した。処置後24時間目に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。Ad-GFPプラススリンダクを処置した細胞と、Ad-GFP単独を処置した細胞との形質導入効率に有意差を認めなかった（下記の表7）。しかし、形質導入は、より低い濃度のスリンダクを処置した他の群と比較して0.5 mMスリンダクを処置したA549細胞において増加した（P＝0.001）。
【０４６５】
（表７）Ad-GFPおよびスリンダクによって処置した肺癌（A549およびH1299）および正常（CCD-16）細胞における形質導入効率
細胞をAd-GFP（100 vp/細胞）によって3時間処置した後、表記の濃度のスリンダクによって24時間処置した。形質導入効率の百分率をフローサイトメトリーによって決定した。
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a  Ad-GFP処置単独と比較してP＜0.05。示された群のあいだの他の差は有意ではなかった。
【０４６６】
4．スリンダクは外因性のMDA-7発現を増加させる
スリンダクが肺癌細胞においてAd-mda7媒介増殖阻害およびアポトーシスを増強するメカニズムを同定するために、トランスジェニックMDA-7タンパク質発現をウェスタンブロッティングによって調べた。三つの細胞株（H1299、A549、およびCCD-16）を全てAd-mda7/スリンダクによって36時間処置して、MDA-7発現に関して分析した。Ad-mda7処置A549およびH1299細胞において、スリンダクはトランスジェニックMDA-7の定常状態レベルを用量依存的に顕著に増加し、内因性のMDA-7発現はPBSまたはスリンダク単独を処置した細胞では検出されなかった。さらに、スリンダクがトランスジェニックタンパク質発現を増加させることができることは、MDA-7に限定されなかった；スリンダクは、Ad-GFPおよびAd-p53によって処置した腫瘍細胞においてそれぞれ、トランスジェニックGFPおよびp53タンパク質の定常状態レベルを増加させた。対照的に、Ad-mda7を処置した正常なCCD-16細胞では、スリンダクは外因性のMDA-7タンパク質発現をごくわずかに増加させたに過ぎなかった。外因性のGFPまたはp53タンパク質に及ぼすスリンダクの影響は正常細胞では調べなかった。
【０４６７】
MDA-7タンパク質の細胞下局在を評価するために、免疫蛍光試験を行った。ウェスタンブロットのデータと一致して、MDA-7発現は、Ad-mda7単独を処置した細胞と比較して、Ad-mda7/スリンダクを処置した細胞において有意に上昇した。さらに、MDA-7の細胞下局在はスリンダク処置によって変化しなかった。MDA-7発現はPBSまたはスリンダク単独を処置した細胞において検出できなかった。これらの結果は、スリンダクがトランスジェニックMDA-7発現を用量依存的に増加させることを示し、この増加はアポトーシス活性の増加に関与することを示唆している。
【０４６８】
外因性のタンパク質発現を増加させることができることがスリンダクに独自であるか否かを調べるために、スリンダクスルホンを用いて同様に実験を行った。H1299細胞をAd-mda7およびスリンダクスルホンによって処置すると、Ad-mda7単独を処置した細胞と比較して外因性のMDA-7発現の増加を示した。MDA-7発現はPBSまたはスリンダクスルホンによって処置した細胞において検出されなかった。これらの結果は、スリンダクおよびその代謝物が外因性のタンパク質発現を増加させることができることを示している。
【０４６９】
5．スリンダクはAd-mda7媒介アポトーシスシグナル伝達を増強する
肺癌細胞におけるAd-mda7媒介アポトーシスの誘導がカスパーゼ-9、カスパーゼ-3、およびPARPの切断を含むカスパーゼカスケードの活性化に関連することが既に報告された（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）。Ad-mda7およびスリンダクによる処置がカスパーゼカスケードに影響を及ぼすか否かを調べるために、腫瘍および正常細胞をこれらの分子マーカーに関して分析した。Ad-mda7単独またはスリンダクとの併用を処置した腫瘍（A549およびH1299）細胞は、カスパーゼカスケードの活性化の指標であるカスパーゼ-9、カスパーゼ-3、およびPARPの切断を示した。切断されたカスパーゼ-9、カスパーゼ-3、およびPARPの発現は、スリンダクの濃度およびMDA-7発現レベルの双方に対応する。カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、およびPARPの活性化も同様に、Ad-lucプラス最高濃度のスリンダク（0.5 mM）を処置したA549細胞において認められ（H1299細胞では認められなかった）、FACS分析によってこれらの細胞において明らかになったアポトーシス分画の増加と一致した（図49C）。しかし、活性化のレベルは、Ad-mda7またはAd-mda7/スリンダクを処置したA549細胞の場合より有意に低かった。カスパーゼカスケードは、無処置またはスリンダク単独によって処置したA549またはH1299細胞において活性化されなかった。CCD-16細胞において、カスパーゼカスケードは、無処置またはスリンダク単独、Ad-luc単独、またはAd-lucプラススリンダクの併用によって処置した細胞と比較して、Ad-mda7単独またはスリンダクとの併用によって処置した細胞において活性化されなかった。これらの結果は、スリンダクが腫瘍細胞においてカスパーゼカスケードの活性化を選択的に増強するが、正常細胞では増強しないことを示している。
【０４７０】
次に、Ad-mda7およびスリンダク処置によって調節されるカスパーゼカスケードの上流のさらなるエフェクター分子の発現を調べた。これまでの研究から、PKR、p38MAPK、およびpJNKが、肺癌細胞におけるAd-mda7誘導アポトーシスにおいて重要であることが証明された（Pataerら、2002；Kawabeら、2002；Sarkarら、2002）。同様に、Bcl-2ファミリー（Bax、Bak、Bcl-2およびBcl-XL）タンパク質の調節は、スリンダク誘導アポトーシスにとって肝要であり、p53の状態とは無関係であることが示されている（Yangら、2003；McEnteeら、1999）。これらの報告に基づき、PKR、pJNK、pp38MAPKおよびいくつかのBcl-2ファミリーメンバーの発現を、Ad-mda7およびスリンダクによる処置後のH1299細胞において評価した。PKR、pJNK、およびpp38MAPKの発現は、無処置、スリンダク処置、およびAd-luc処置細胞と比較して、Ad-mda7単独またはスリンダクとの併用によって処置した細胞において増加した。PKRはまた、無処置、Ad-luc処置、およびスリンダク処置細胞と比較してAd-lucプラススリンダクによって処置した細胞においてわずかに増加した。しかし、Ad-lucプラススリンダクによって処置した細胞におけるPKRレベルは、Ad-mda7プラススリンダクによって処置した細胞において認められたものより低かった。PKR、pJNK、およびpp38MAPKの増加は、スリンダクによって誘導されるMDA-7の発現レベルに関連した。BaxまたはBakはアポトーシスの誘導物質であるが、その両者の発現レベルには変化はなく、アポトーシスの阻害剤であるBcl-XLの発現レベルの変化は、如何なる治療群においても検出されなかった。Bcl-2の発現レベルは、Ad-mda7および0.5 mMスリンダクによって処置した細胞に限ってわずかに減少した。これらの結果は、Ad-mda7プラススリンダクによるアポトーシスの誘導が、スリンダクが異所MDA-7発現を増強できることに主に依存するという考え方を支持する。
【０４７１】
次に、Ad-mda7プラススリンダク処置による腫瘍殺細胞の増強がCOX-2阻害による可能性を調べた。Ad-mda7およびAd-mda7プラススリンダクによって処置した細胞において、COX-2発現の増加を認めた。しかし、二つの治療群のCOX-2発現レベルには有意差を認めなかった。COX-2発現は、PBS、スリンダク、Ad-luc、およびAd-lucプラススリンダクによって処置した細胞において認められなかった。
【０４７２】
6．細胞周期に及ぼすスリンダクおよびAd-mda7処置の影響
これまでの研究から、スリンダクがG1で細胞周期停止を誘導すること（Piazzaら、1997）およびAd-mda7がG2/Mで細胞周期停止を誘導する（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001；Ekmekciogluら、2001）ことが示された。これらの報告に基づき、細胞周期の調節に及ぼすスリンダク/Ad-mda7処置の併用作用を、FACS分析によって調べた。腫瘍細胞を無処置またはスリンダク、Ad-luc、Ad-mda7、もしくはAd-mda7プラススリンダクによって72時間処置した。既に報告されているように、Ad-mda7処置によって、A549（27.2％）およびH1299（42.5％）細胞の双方において細胞周期のG2/M期の細胞数が増加した（下記の表8を参照されたい）。スリンダク単独の処置は、G1期の細胞を増加させた。双方の腫瘍細胞株において、G1期の細胞数は0.125 mMスリンダクと比較して0.5 mMでは顕著に増加した（A549において75.6％対64.8％およびH1299細胞において74.6％対66.4％）。スリンダクおよびAd-mda7による処置によって、Ad-mda7誘導G2/M停止が消失した。この作用は0.5 mMスリンダクをAd-mda7と併用して処置した細胞ではより強く、G2/M期の細胞数はA549細胞では27.2％から12.3％に、そしてH1299細胞では42.5％から32.4％に減少した。スリンダクによるAd-mda7誘導G2/M期停止の消失はまた、処置の48時間後においても認められた。これらの結果は、スリンダクおよびAd-mda7が細胞周期の異なる期に影響を及ぼすこと、およびスリンダクによって増強されたAd-mda7腫瘍の殺細胞がG2/M停止の増加によって起こるのではないことを示している。
【０４７３】
（表８）スリンダク、Ad-mda7またはその双方によって処置した肺癌細胞における細胞周期分布
細胞をPBS、Ad-luc、またはAd-mda7単独、または0.5 mMスリンダクと併用して72時間処置した後、FACS分析を行った。各細胞周期に存在する細胞の割合を、DNA含有量のヒストグラムの分析によって決定した。値は1試料あたり2個ずつの平均値である。少なくとも2回の独立した実験において、類似の結果を認めた。
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【０４７４】
7．スリンダクは外因性のMDA-7タンパク質分解を遅延させる
スリンダクが外因性のMDA-7タンパク質を増加させるメカニズムを評価するために、転写活性およびMDA-7タンパク質分解に及ぼすスリンダクの効果をH1299細胞において調べた。Ad-mda7の転写活性に及ぼすスリンダクの作用を決定するために、無処置またはAd-mda7単独もしくは様々な濃度のスリンダクによって処置した細胞から抽出したRNA試料を用いて、定量的リアルタイムPCR分析を行った。無処置およびAd-mda7処置細胞と比較してAd-mda7/スリンダクによって処置した細胞におけるmRNAレベルに有意差を認めなかった。
【０４７５】
スリンダク処置がMDA-7タンパク質分解を調節するか否かを評価するために、H1299細胞をAd-mda7単独またはスリンダクと併用して様々な期間処置して、MDA-7の半減期を決定した。Ad-mda7対照細胞におけるMDA-7タンパク質レベルは、経時的に減少した；タンパク質分解は11時間で完了した。対照的に、Ad-mda7プラススリンダクによって処置した細胞におけるMDA-7タンパク質の分解は、13時間で検出可能な実質的なタンパク質レベルが存在することによって示されるように、遅延した。タンパク質レベルの半定量的分析から、0〜13時間では、MDA-7タンパク質レベルは、Ad-mda7プラススリンダクによって処置した細胞ではAd-mda7処置細胞より8〜15倍高いことが示された。これらの結果は、Ad-mda7/スリンダクによって処置した細胞におけるMDA-7タンパク質発現の増加が、MDA-7タンパク質分解がスリンダクによって遅延した結果であることを示している。
【０４７６】
8．スリンダク増強MDA-7発現はプロテアソーム活性の阻害によるものではない
最近の研究から、いくつかのNSAIDsがプロテアソーム活性を阻害することが示されているが（Choiら、2003；Huangら、2002）、スリンダクによって媒介されるMDA-7タンパク質発現の増強がプロテアソーム活性の阻害能によるか否かを調べた。この目的に関して、スリンダクの効果を、ウェスタンブロッティング、Ub分解アッセイ、およびプロテアソーム酵素活性アッセイによって、既知のプロテアソーム阻害剤である（Heら、2003）MG132の効果と比較した。ウェスタンブロッティングから、Ad-mda7と12時間併用したスリンダクまたはMG132処置が、Ad-mda7単独によって処置した細胞と比較してMDA-7タンパク質発現を増強したことが示された。しかし、スリンダクは総MDA-7タンパク質レベルを増強し、これには、新生の非グリコシル化タンパク質と、多数のバンドによって示されるように、異なるレベルでグリコシル化されたMDA-7タンパク質の双方が含まれた。対照的に、MG132は、スリンダクより弱いものの新生MDA-7タンパク質レベルを増強し、MDA-7タンパク質の一つのグリコシル化型を増強した。類似の結果は処置後6および24時間において得られた。このように、スリンダクおよびMG132がMDA-7タンパク質を増強するメカニズムは異なるように思われる。
【０４７７】
次に、スリンダクのプロテアソーム活性阻害能を調べた。プロテアソーム経路の阻害の指標である総ユビキチン化タンパク質のウェスタンブロット分析では、MG132処置細胞においてユビキチン化タンパク質を示したがスリンダク処置細胞では示さなかった。これらの結果は、MG132とは異なり、スリンダクはプロテアソーム活性またはプロテアソーム経路を阻害しないことを示している。Ad-mda7単独またはスリンダクとの併用が無処置対照細胞と比較してプロテアソーム活性を阻害しなかったというプロテアソーム活性アッセイの結果は、これらの知見と一致する。対照的に、Ad-mda7プラスMG132による処置によって、プロテアソーム活性の有意な阻害が起こった（P＝0.01）。これらの結果は、スリンダク増強MDA-7タンパク質発現がプロテアソーム活性の阻害によるのではないことを示唆している。
【０４７８】
9．スリンダクはAd-mda7媒介肺腫瘍増殖の抑制を増強する
Ad-mda7プラススリンダク処置が腫瘍の増殖抑制を増強するか否かを決定するために、肺腫瘍異種移植片モデルを用いてインビボ予備試験を行った。PBS、スリンダク、Ad-mda7、またはAd-luc/スリンダクを処置したマウスと比較して、Ad-mda7/スリンダクによって処置したマウスは有意な増殖抑制を示した（P＝＜0.001）（図49D）。有意な腫瘍阻害はまた、PBS処置マウスと比較してAd-mda7単独またはAd-lucプラスサリンダクによって処置したマウスにおいて認められた（P＝0.03）。スリンダク処置マウスでは、PBS処置マウスと比較して有意な増殖阻害を認めなかった。さらに、罹患率、体重の減少および死によって示された処置関連毒性は、Ad-mda7プラススリンダクによって処置したマウスでは認められず、処置は良好に認容されたことを示唆している。
【０４７９】
スリンダクによる最後の処置後24時間での皮下腫瘍の分析から、Ad-mda7プラススリンダクによって処置したマウスからの腫瘍ではMDA-7タンパク質レベルがAd-mda7によって処置したマウスからの腫瘍より3〜12倍高いことが判明した。これらの結果は、MDA-7タンパク質発現の増強と平行してAd-mda7プラススリンダクによる肺腫瘍の処置が増殖抑制を増強することを示している。
【０４８０】
実施例25：アデノウイルス媒介mda-7遺伝子移入は、ヒト卵巣癌細胞において細胞周期停止およびアポトーシスを誘導する
材料および方法
1．細胞株および試薬
卵巣癌細胞OVCA 420およびMDAH 2774は、Dr. J.K. Wolf、MDアンダーソン癌センター、ハウストン、テキサス州から得た。卵巣癌細胞SKOV3-ip、HEYおよびDOV 13も同様にこれらの実験において用いた。SKOV-3 ipは10％FBSを含むDMEM高グルコース培地において増殖させた。DOV13およびHEYは10％FBSを含むRPMI 1640において維持した。MDAH 2774およびOVCA 420は10％FBSを含む最小非必須アミノ酸培地において増殖させた。
【０４８１】
2．形質導入効率の決定
GFP遺伝子を発現するアデノウイルス（Ad-GFP）を細胞に感染させることによって、アデノウイルスの形質導入効率を各卵巣癌細胞株について調べた。卵巣癌細胞（SKOV3-ip、Hey、DOV 13、MDAH 2774およびOVCA 420）を5×105個/ウェルで6ウェル組織培養皿に播種した。翌日、細胞を感染させない（偽）；またはAd-GFPもしくはAd-lucに感染させた。感染後24時間目に、細胞をPBSによって洗浄して遠心によって沈降させた。次に細胞をPBSに再浮遊させて、攪拌した後フローサイトメトリー分析を行った。
【０４８２】
3．組換え型アデノウイルスベクターの構築
複製欠損Ad-mda7を発現するmda-7の構築および精製が記述されている（Saekiら、2000）。簡単に説明すると、内部CMV-IEプロモーターに結合させたmda-7遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子を有し、その後にSV40ポリアデニル化（pA）シグナルが続く複製欠損ヒト5型アデノウイルス（Ad5）ベクターを構築した。ウイルスを293細胞において増殖させて、クロマトグラフィーによって精製した。
【０４８３】
4．細胞増殖速度の決定
腫瘍細胞（SKOV3-ip、Hey、DOV 13、MDAH 2774およびOVCA 420）を6ウェル組織培養皿に1×105個.ウェルで播種した。翌日、細胞を感染させない（偽）またはAd-mda7もしくはAd-lucに感染させた。感染の1、2、3、4、および5日目に細胞を回収して血球計算盤において計数した。
【０４８４】
5．細胞周期分析
MDAH 2774およびOVCA 420細胞（5×105個）を、6ウェルプレートにおいてAd-lucまたはAd-mda7（3000 vp/細胞）によって処置した。細胞を回収して、遠心によって沈降させ、PBSによって洗浄して、70％エタノールにおいて-20℃で一晩固定した。細胞をRNアーゼA（1 mg/ml）、50 μg/mlヨウ化プロピジウムを含むPBSに再浮遊させて、ボルテックスによって攪拌してからFACS分析を行った。非感染細胞を陰性対照とした。
【０４８５】
6．アポトーシス細胞の染色（ヘキスト染色）
細胞を6ウェルプレートに5×105個/ウェルの密度で播種して、Ad-mda7またはAd-luc（3000 vp/細胞）によって処置した。感染の72時間後、細胞をヘキスト33342号色素（シグマ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）と共に15分間インキュベートして、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）によって2回洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０４８６】
7．ウェスタンブロット分析
細胞を冷PBSによって1回洗浄し、溶解緩衝液（62.5 mMトリス-塩酸、2％SDS、10％グリセロール、4 M尿素）に再浮遊させた。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに回収して30秒間超音波処理を行い、95℃の水浴中で5分間加熱した後、14,400 rpmで4℃で10分間遠心した。上清を5％2-メルカプトエタノールと共に混合して-80℃で保存した。タンパク質濃度は、バイオラッドタンパク質アッセイシステムを用いて決定した。総タンパク質50 μgを含む細胞抽出物の少量を10％SDS-PAGEによって分離して、ゲルからニトロセルロースメンブレン（ハイボンド-ECL；アマシャムファルマシアバイオテック、イギリス）に転写した後、室温で1時間ブロッキングした（5％脱脂粉乳および0.1％ツイーン20のTBSまたはPBS溶液）。
【０４８７】
メンブレンを一次抗体、PKR（1：500）、p53（1：1000）、ホスホ特異的p38（1：1000）、ホスホ特異的pJNK（1：1000）、ホスホ特異的p44/42（1：1000）、ホスホ特異的pAKT（1：1000）、ホスホ特異的eIF2抗体（1：1000）、カスパーゼ-3（1：1000）、PARP（1：500）、カスパーゼ-9（1：500）と共にインキュベートした。p53およびPKRはサンタクルズバイオテクノロジー（サンタクルズ、カリフォルニア州、アメリカ）から得た。ホスホ特異的p38、ホスホ特異的pJNK、ホスホ特異的p44/42、ホスホ特異的pAKT、およびホスホ特異的eIF2抗体はセルシグナリングから得た。カスパーゼ-3、カスパーゼ9およびPARP抗体はファーミンゲンから得た。
【０４８８】
次に、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（アマシャム）と共にインキュベートした。最後に、アマシャムの高感度化学発光ウェスタンブロッティング検出システムを適用することによって、タンパク質を高感度化学発光フィルム（ハイパーフィルム、アマシャム）において可視化した。
【０４８９】
8．RNアーゼ保護アッセイ（RPA）
腫瘍細胞（MDAH 2774）を6ウェルプレートに5×105個の密度で播種して、PBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって処置した。これらの細胞からの総RNAを、既に記述されているようにトリゾル試薬を用いて処置後24、48、および72時間目に単離した。表記のアポトーシス関連遺伝子：カスパーゼ-8、Fas、FasL、FADD、FAF-1、TRAIL、TNFr、TRADD、およびRIPに関するmRNA転写物と共に内部対照L32およびグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼをhApo-3マルチプローブプローブ鋳型セット（ファーミンゲン）を用いて分析した。プローブの合成、ハイブリダイゼーション、およびRNアーゼの処置は、製造元のガイドラインに従ってRiboQuantマルチプローブRNアーゼ保護アッセイシステム（ファーミンゲン）を用いて行った。保護された転写物を変性アクリルアミドゲル（5％）上での電気泳動によって分離して、ハイパーフィルムに-80℃で一晩露出した。
【０４９０】
9．電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
MDAH 27743（5×105個）を6ウェルプレートにおいてAd-lucまたはAd-mda7によって処置した。細胞を様々な時点（24、48、および72時間）で回収して細胞質および核抽出物を調製し、既に記述されているようにEMSAを行った。簡単に説明すると、AP-1コンセンサス二本鎖オリゴヌクレオチド（プロメガ）をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ-32P]-ATPによって末端標識した。標識オリゴヌクレオチド、ポリ（dI-dC）0.5μg、および核タンパク質抽出物（10 μg）を含む典型的な結合反応混合物を、5×ゲルシフト結合緩衝液[20％グリセロール、5 mM MgCl2、2.5 mM EDTA、2.5 mM DTT、250 mM NaCl、50 mMトリス-塩酸（pH 7.5）]において25℃で30分間インキュベートした。複合体を非変性5％ポリアクリルアミドゲル上で0.5×トリスホウ酸EDTA緩衝液において300 Vで1時間30分分離した。バンドをオートラジオグラフィーによって可視化して、イメージクアントソフトウェア（モレキュラーダイナミクス、アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニューヨーク州）を用いて定量した。
【０４９１】
10．Fasプロモーター分析
6ウェルプレートに播種したMDAH 2774細胞（5×105個）に、ヒトFas（CD95）プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子からなるプラスミド（FHR+）をトランスフェクトさせた。Fasプロモーターに変異を含むプラスミド（△6）をトランスフェクトした細胞をこれらの実験における対照とした。トランスフェクションは、既に記述されているように、DOTAP：コレステロール（DOTAP：Chol）リポソームを用いて行った。トランスフェクションの6時間後、細胞をPBS、Ad-β-galまたはAd-mda7によって処置した。細胞を処置後12、24、48時間目に回収して、PBSによって洗浄し、レポーター溶解緩衝液（プロメガ）200μlにおいて溶解した。ルシフェラーゼ発現は、既に記述されているように測定して、相対光単位（RLU）/mgタンパク質として表記した。実験は少なくとも2回繰り返して2回の実験の平均値として結果を表記した。
【０４９２】
11．ドミナントネガティブFADD発現ベクターを用いた実験
腫瘍細胞を2ウェルチャンバースライドまたは6ウェルプレートに播種して、黄色蛍光タンパク質（YFP）およびドミナントネガティブFADDを有するプラスミド発現ベクター（YFP-dnFADD）をトランスフェクトするか、またはYFPのみを有するプラスミドベクターをトランスフェクトした。YFP-dnFADDプラスミドは、FADDタンパク質の可視化および機能の双方を可能にする融合タンパク質としてYFPおよびFADDを発現する。細胞に、既に記述されているようにDOTAP：Cholリポソームに封入したプラスミドをトランスフェクトさせた。トランスフェクションの24時間後、細胞をPBSによって処置するかまたはAd-mda7によって処置した。処置後24時間および48時間目に、細胞を形質転換効率に関して蛍光顕微鏡下で観察するか、または細胞溶解物を調製してウェスタンブロット分析によってFADD、カスパーゼ-9およびカスパーゼ-8に関してプロービングした。
【０４９３】
Ad-mda7媒介アポトーシスに及ぼすdnFADDの影響を調べるために、細胞を上記のように処置して、アポトーシス細胞の指標であるサブG0期における細胞数をフローサイトメトリーによって分析した。
【０４９４】
12．siRNA分析
siRNA分析に関して、siRNAキット（アンビオン、オースチン、テキサス州）を用いてFas特異的siRNAを合成して精製した。以下の配列を用いてsiRNAを合成した：
a）標的（Fas）siRNA：
2006523227.tif 000022
【０４９５】
6ウェルプレートに播種した細胞に、オリゴフェクタミンを用いてsiRNA（Fasまたは対照）をトランスフェクトした。空のオリゴフェクタミン単独によって処置した細胞をこれらの実験における対照とした。Fasに及ぼすsiRNAの阻害作用を分析するために、細胞をトランスフェクションの48時間後に回収して、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロット分析によってFas発現に関して分析した。Ad-mda7媒介アポトーシスに及ぼすsiRNAの効果を決定するために、細胞を上記のようにFas特異的またはスクランブルドsiRNAにトランスフェクトさせた。トランスフェクションの48時間後、細胞をPBSまたはAd-mda7によって処置した。細胞を処置後24時間目に回収して固定し、フローサイトメトリーによってアポトーシス細胞に関して分析した。
【０４９６】
結果
1．卵巣癌細胞株における形質導入効率
ウイルスベクターによる遺伝子移入の効率の関係を調べるために、調べた卵巣癌細胞株5個のアデノウイルス形質導入を、Ad-GFPに細胞を感染させることによって決定した。細胞株5個は形質導入効率が異なり、MDAH 2774、OVCA 420、DOV13およびHey細胞は形質導入が最も容易で、MOI 3000で90％を超える形質導入効率であり、SKOV-3-ip細胞はMOI 10,000でも最も難しかった（図50）。
【０４９７】
2．卵巣腫瘍および正常線維芽細胞におけるアデノウイルス投与mda-7の影響
SKOV3-ip、Hey、およびDOV 13腫瘍細胞株はmda-7の感染後増殖が阻害されなかった。対照的に、Ad-lucを感染させた、またはPBSによって処置した対照細胞と比較して、Ad-mda7を感染させたMDAH 2774およびOVCA 420では、細胞増殖の阻害が認められた。ヒト正常線維芽細胞ではAd-LucまたはAd-mda7による感染後、有意な増殖阻害を認めなかった（図51）。
【０４９８】
3．MDA-7は卵巣細胞においてG2/M細胞周期停止およびアポトーシスを選択的に誘導する
増殖抑制の分子メカニズムをさらに調べるために、フローサイトメトリー分析を行った。五つの細胞株のうち有意な増殖抑制を示した二つ、すなわちMDAH 2774およびOVCA 420においてG2/M集団の割合が顕著に増加することが判明した（図52）。対照Ad-lucによる感染は細胞周期のG2/M期の細胞の百分率を変化させなかった。Ad-mda7の感染後、MDAH 2774およびOVCA 420腫瘍細胞はアポトーシス細胞死を受けた。しかし、Ad-Lucまたは偽感染させた細胞では変化を認めなかった。
【０４９９】
4．Ad-mda7による卵巣細胞の感染は細胞内タンパク質および分泌型タンパク質の発現を誘導する
卵巣癌細胞にAd-mda7およびAd-lucを感染させた。細胞を感染後24、48、および72時間目に回収して、ウェスタンブロット分析のために抽出物を調製した。偽感染細胞からの抽出物をさらなる対照として用いた。MDA-7タンパク質発現はAd-mda7感染細胞株の全てにおいて検出されたが偽感染対照またはAd-luc感染細胞では検出されなかった。
【０５００】
5．mda-7の発現によって、PKR、pPKR、peIF2、p38、およびJNKのアップレギュレーションが起こる
MDAH 2774およびOVCA 420細胞において、mda-7はPKR、pPKR、peIF2、p38、およびJNKを活性化した。細胞をMOI 3000でAd-mda7に感染させると、PKRおよびその基質の最大活性化が48時間で認められた。
【０５０１】
6．mda-7発現後のカスパーゼカスケード活性化およびPARP切断
Ad-mda7による処置によって、カスパーゼ-9およびカスパーゼ-3の活性化、ならびにカスパーゼの基質であるPARPの切断が起こった。
【０５０２】
これらの結果は、卵巣癌細胞に対するmda-7の選択的効果を示し、卵巣癌の治療にAd-mda7を用いる根拠を提供する。
【０５０３】
7．MDA-7による様々なアポトーシス関連タンパク質の調節
研究によって、これまでにヒト肺癌細胞および黒色腫においてMDA-7によるいくつかのアポトーシス関連タンパク質（PKR、pJNK、p38、およびMAPK）の活性化が示されている。これらの知見に基づき、Ad-mda7処置後24および48時間での卵巣癌細胞におけるこれらのタンパク質の活性化を調べた。肺癌細胞のMDA-7媒介殺細胞において重要であることが既に示されているPKRは、48時間に限って有意に活性化されたが24時間では活性化されなかった。その下流の基質であるpeIF2の活性化はPKRに関連した。p38MAPKおよびpJNKも同様に、48時間に限って有意に活性化されたが24時間では活性化されなかった。しかし、MDA-7はpc-JunおよびpATF-2を24時間で活性化して48時間まで継続した。これらの結果は、MDA-7が様々なシグナル伝達分子を異なる時点で異なるように活性化することを示している。
【０５０４】
8．MDA-7は卵巣癌細胞においてFasおよびFas関連タンパク質を活性化する
さらなるシグナル伝達事象または分子が、これまでに報告されているより早期に活性化／誘発されて、それによってアポトーシスカスケードの開始が起こるか否かを調べるために、卵巣癌細胞をPBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって処置して、RPAによってアポトーシス関連分子に関して分析した。PBSおよびAd-luc処置細胞と比較して、Fas、Fas-L、FADD、カスパーゼ-8およびFAF1 mRNA発現の有意な増加をAd-mda7処置細胞において認めた。FAP発現の中等度の増加を認めた。様々な処置群においてTRADD、DR3、TNF、およびRIP発現の変化を認めず、このことはTNF関連ファミリーではなくてFasの活性化が初期事象である可能性があることを示唆している。mRNAレベルの変化は必ずしもタンパク質発現とは相関しないことから、ウェスタンブロット分析を行った。PBSおよびAd-luc処置細胞と比較して、Ad-mda7処置細胞においてFas、Fas-L、FAF1およびFADDタンパク質発現の有意な増加を認めた。タンパク質発現の増加は、mRNAの結果と一致した。しかし、FAPタンパク質発現は、PBSおよびAd-luc処置細胞と比較してAd-mda7処置細胞において減少した。様々な処置群においてTRADD発現に変化を認めなかった。これらの結果は、MDA-7によるFas-FasLの活性化が卵巣癌細胞における初期事象であることを示唆している。
【０５０５】
9．MDA-7はAP-1およびNFκBを活性化する
AP-1およびNFκBは、FosファミリーメンバーまたはATF2、CREBおよびNFATのような他の転写因子と会合してホモ二量体またはヘテロ二量体としてのJunファミリー転写タンパク質（c-Jun、JunD、およびJunB）の結合によって活性化される主要な転写因子である。この情報およびMDA-7がc-junおよびATF-2を活性化できることに基づき、本発明者らはMDA-7媒介シグナル伝達がAP-1および／またはNFκBを含むと推測した。この目的のために、核細胞溶解物をPBS、Ad-luc、またはAd-mda7処置後24および48時間目に調製して、EMSAによってAP-1およびNFκB活性化に関して分析した。Ad-mda7処置細胞からの核溶解物は、Ad-lucおよびPBS処置細胞より高いAP-1およびNFκB結合活性を示した。24および48時間の双方で活性の増加を認め、最大活性化は48時間で起こった。
【０５０６】
10．MDA-7は細胞表面でFas発現を増加させる
MDA-7は細胞表面でのFas発現を増加させるか否かを決定するために、PBS、Ad-lucまたはAd-mda7によって処置した腫瘍細胞を蛍光標識抗Fas抗体によって染色して、蛍光顕微鏡下で観察した。PBSおよびAd-luc処置細胞と比較してAd-mda7処置細胞では、細胞表面でのFas発現の増加を認めた。
【０５０７】
11．MDA-7はFasプロモーターを活性化する
次に、Ad-mda7処置がFasプロモーターを活性化できるか否かを調べた。野生型Fasプロモーターの制御下でluc遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクトした細胞は、PBSまたはAd-β-galによって処置した細胞と比較してAd-mda7処置後に有意に活性化された（P＝0.001）。PBS処置細胞と比較してAd-βgal処置細胞においても、ルシフェラーゼ発現のわずかな増加を認めた（P＝0.04）。対照的に、細胞に変異体Fasプロモーターを含むプラスミドをトランスフェクトした場合には様々な処置群において、ルシフェラーゼ発現の有意な増加は認められず、このことは、Ad-mda7処置によって野生型Fasプロモーターの特異的活性化が起こることを示している。
【０５０８】
12．ドミナントネガティブFADDの過剰発現はMDA-7媒介アポトーシスを阻害する
FADDは、FAS誘導シグナル伝達後に形成される細胞死誘導シグナル伝達複合体（DISC）の一部であることから、MDA-7媒介アポトーシスに及ぼすドミナントネガティブFADDの過剰発現の影響を調べた。実験開始前、細胞にEYFPまたはEYFP-dnFADDプラスミドをトランスフェクトさせて、形質導入効率およびdnFADD発現を決定した。EYFP融合タンパク質として発現されるdnFADDはバンド形成パターンのシフトによって内因性のFADDとは区別されることに注意されたい。その後の実験において、細胞をトランスフェクトせずに、またはEYFPもしくはEYFP-dnFADDによってトランスフェクトして、後にPBSまたはAd-mda7によって処置した。細胞をフローサイトメトリーによってアポトーシス細胞に関して分析して、ウェスタンブロット分析によってカスパーゼ-9およびカスパーゼ-8に関して分析した。Ad-mda7単独によって処置した細胞では、PBS、EYFPプラスミド単独またはEYFP-dnFADDプラスミド単独によって処置した細胞と比較して有意な数のアポトーシス細胞を認めた（15％；P＝0.001）。しかし、Ad-mda-7媒介アポトーシスは、dnFADDを過剰発現するEYFP-dnFADDトランスフェクト細胞では有意に阻害された。対照的に、EYFPトランスフェクト細胞においてAd-mda7処置を行うと、アポトーシスの増加が起こった。さらに、親細胞またはEYFPプラスミドをトランスフェクトした細胞のAd-mda7処置により、カスパーゼ-8および-9の活性化が起こった。対照的に、カスパーゼ-8および-9のMDA-7媒介活性化は、dnFADDを過剰発現する細胞では阻害された。PBS、EYFP単独、およびEYFP-dnFADD単独によって処置した細胞では、カスパーゼの活性化を認めなかった。
【０５０９】
13．siRNAによるFasの阻害はMDA-7媒介アポトーシスを抑制する
FasがMDA-7媒介アポトーシスにおいて役割を有するか否かをさらに調べるために、siRNA実験を行った。細胞にまず、ベクター単独、スクランブルドsiRNA、またはFasを標的とするsiRNAをトランスフェクトして、ウェスタンブロット分析によって分析した。Fasを標的とするsiRNAをトランスフェクトした細胞においてFasタンパク質発現の顕著な阻害を認めたが、スクランブルドsiRNAをトランスフェクトした細胞では認められなかった。Fasの阻害は、200 nm siRNAをトランスフェクトした細胞において認められた。これらの結果に基づき、その後の実験はFasまたはスクランブルドsiRNA 200 nmを用いて行った。Fas siRNAまたはスクランブルドsiRNAをトランスフェクトした細胞をAd-mda7によって処置して、アポトーシス細胞に関して分析した。スクランブルドsiRNAをトランスフェクトした細胞（19.2％）と比較してFas siRNAトランスフェクト細胞（9％）では、MDA-7誘導アポトーシス細胞数の有意な減少を認めた。PBS処置細胞ではアポトーシス細胞の有意な増加を認めなかった。これらの結果は、Fasが卵巣癌細胞におけるMDA-7媒介アポトーシスにおいて役割を有することを示している。
【０５１０】
実施例26：腫瘍増殖抑制因子遺伝子mda-7は、ヒト乳癌においてアポトーシスを誘導し、APC/β-カテニンの経路に影響を及ぼす
材料および方法
MDA-MD468乳癌細胞をインビトロおよびインビボ乳癌わき腹異種移植片モデルにおいて調べた。CMVプロモーターの制御下でmda-7を発現するmda-7トランスジーンを有する組換え型アデノウイルス（Ad-mda7）を用いた。対照細胞をAd-lucまたはPBSによって処置した。48時間目に、直接の細胞数によって細胞増殖を評価し、カスパーゼ-3およびPARPの切断によってアポトーシスを測定した。インビボでは、腫瘍の大きさが100 mm3に達した場合に、Ad-mda7、Ad-Luc、またはPBSの腫瘍内注射によって腫瘍を処置した。処置後48時間において、腫瘍を採取して、カスパーゼ-3およびPARPの切断の他に、TUNEL染色によってアポトーシスを評価した。腺腫様多発結腸ポリープタンパク質（APC）/β-カテニン経路は、Ad-mda7処置後にインビトロでのMDA-MB-468細胞において、およびインビボでAPCおよびβ-カテニンの発現を決定することによって評価した。
【０５１１】
結果
MDA-MB-468細胞をAd-mda7によって処置すると、対照処置細胞と比較して、インビトロおよびインビボの双方において有意なアポトーシスおよび増殖阻害が起こった（図53；P＜0.01、ANOVA）。Ad-mda7による処置後、有意に上昇したAPC発現レベルをインビトロおよびインビボの双方において認めた。これに対応して、Ad-mda7処置細胞におけるβ-カテニンレベルは対照と比較して有意に減少した。これらの研究により、MDA-MB-468乳癌細胞に及ぼすAd-mda7の有意な増殖阻害およびアポトーシス作用が確認される。さらに、これらのデータはこの細胞死がAPCのアップレギュレーションによる可能性があり、それによってAd-mda7トランスフェクション後に核β-カテニンのダウンレギュレーションが起こることを示唆している。これらの知見を確認するさらなる試験が現在進行中である。
【０５１２】
実施例27：アデノウイルス媒介MDA-7遺伝子治療は血管新生を抑制し、異種移植片腫瘍を放射線に対して増感する
材料および方法
1．細胞培養および化学物質
NSCLC細胞株A549をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から得た。A549細胞を10％ウシ胎児血清（ハイクローン、ローガン、ユタ州）および1％ペニシリン-ストレプトマイシン（インビトロジェン、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含むF-12培地において37℃、5％CO2において増殖させた。正常ヒト肺線維芽細胞株CCD16はアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むMEM-α培地において維持した。mda7または対照ベクターを安定にトランスフェクトしたヒト胎児腎293細胞は、イントロゲンテラピューティクスインク（ハウストン、テキサス州）から提供された。293細胞を10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むMEM高グルコース培地において維持した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をクロネティクス（サンジエゴ、カリフォルニア州）から得て、完全EGM-2培地（クロネティクス、サンジエゴ、カリフォルニア州）において製造元の説明書通りに維持した。24時間培養した293細胞（1×106個）は、ELISAアッセイに基づいて決定したところ、その培養培地にMDA-7タンパク質30 ng/mlを産生した。
【０５１３】
ヒトアンジオスタチン（クリングル1〜3）およびヒト組換え型エンドスタチンをカルビオケム（サンジエゴ、カリフォルニア州）から購入して細胞処置のために100 ng/mlの濃度に培地によって希釈した。
【０５１４】
2．動物実験
A549異種移植片腫瘍は、無血清培地に浮遊させた5×106個の生存細胞を4〜5週齢の雄性無胸腺ヌードマウス（nu/nu；ハーラン）の後肢に皮下注射することによって確立した。10〜14日以内に、腫瘍の大きさが200 mm3に達した（0日目）。処置後の腫瘍の増殖の遅れを評価した。腫瘍は直交三次元で測定した。容積は、楕円体を仮定して推定した。腫瘍の直径が15 mmを超えた場合、または腫瘍が潰瘍化した場合、動物を屠殺した。これらの実験において用いた動物は全て、米国農業省および米国国立衛生研究所の規則および標準に従って施設内動物施設に収容して維持した。動物は、施設内動物取り扱い委員会によって審査された承認されたプロトコールに従って用いた。
【０５１５】
3．アデノウイルス産生
米国特許出願第09/615,154号に記述されるようにAd-mda7を得た。この組換え型アデノウイルスベクターは、改変Ad5のE1欠失領域に挿入されたミニ遺伝子カセットにおいて、CMVプロモーター、野生型mda-7 cDNA、およびSV40ポリアデニル化シグナルを含む。ベクターを複製コンピテントアデノウイルスおよびマイコプラズマに関して試験してこれらをを含まないことを決定した。
【０５１６】
4．遺伝子輸送
ヌードマウスの後肢において増殖する皮下異種移植腫瘍についてインビボ実験を行った。腫瘍が200 mm3に達した際に、全投与量3×106 vpを等しく3回に分けて1、3、および5日目に投与することによって動物を処置した。精製ベクターの各注射は、全量100 μlのPBSに希釈して27.5ゲージのインスリン針を1回通過させて投与した。
【０５１７】
5．放射線照射
インビボ処置に関して、A549異種移植片腫瘍を有する動物に、60Co遠隔放射線療法ユニットを用いて麻酔しながら放射線を照射した。マウスを、腫瘍を有する後肢のみが照射場に存在して、体の残りの部分は鉛のブロックによって遮蔽されるように配置した。インビトロ処置の場合、細胞に高線量率の137Csユニット（3.4 Gy/分）を室温で照射した。
【０５１８】
6．免疫組織化学
MDA-7免疫染色の場合8日目に、または血管内皮増殖因子（VEGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、インターロイキン-8（IL-8）、もしくはCD31の免疫染色の場合14日目に、腫瘍を採取した。VEGF、bFGF、IL-8またはMDA-7免疫染色の場合、ホルマリン固定パラフィン抱埋組織の厚さ5ミクロンの切片を用いた。CD31免疫染色の場合、厚さ8ミクロンの切片を凍結切片から得た。ホルマリン固定パラフィン抱埋組織の切片をキシレン中でパラフィンを除去して、濃度を減少させたエタノール（100％から75％）において再水和した。免疫染色を増強するために、次に切片を抗原曝露溶液（ベクターラボラトリーズインク、バーリンガム、カリフォルニア州）に入れて、沸騰温度を維持するために10分間まで間欠的にマイクロ波を照射した。スライドガラスは全て室温で30分間冷却して、それらを蒸留水およびPBSにおいて洗浄した。この初回調製の後、ホルマリン固定パラフィン抱埋または凍結組織のいずれかから得たスライドガラスを3％H2O2のメタノール溶液で覆って、内因性のペルオキシダーゼ活性を遮断した。アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体キット（ベクターラボラトリーズインク）を用いて染色を検出した。ブロッキング血清および内因性のアビジン／ビオチンブロッキング溶液（ベクターラボラトリーズインク）による処置後、スライドガラスをVEGFに対するウサギポリクローナル抗体（サンタクルズバイオテック、サンタクルズ、カリフォルニア州）の1：500希釈液、bFGFに対するウサギポリクローナル抗体（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）の1：500希釈液、IL-8に対するウサギポリクローナル抗体（バイオソースインターナショナル（Biosource International）、カマリロ、カリフォルニア州）の1：50希釈液、マウスCD31に対するラットモノクローナル抗体の1：100希釈液、MDA-7に対するウサギポリクローナル抗体（イントロゲンテラピューティクス、ハウストン、テキサス州）の1：250希釈液と共に4℃で一晩インキュベートした。スライドガラスを洗浄して、二次ビオチン結合抗体と共に30分間インキュベートした後、再度洗浄して、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体試薬と共に30分間インキュベートした。スライドガラスをPBSにおいて洗浄後、3,3'-ジアミノベンジジンを用いて免疫染色を展開させた。スライドガラスをメチルグリーン（ベクターラボラトリーズインク）によって対比染色して、パーマウント（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）に封入した。
【０５１９】
免疫染色陽性細胞の割合を決定するために、細胞少なくとも1000個/スライドガラスを計数して、倍率400倍で採点した（Biancoら、2002；Weiderら、1991）。Weidnerら（1991）によって記述される方法に従って、CD31に関して免疫染色した切片を用いて微小血管を定量した。微小血管密度は倍率400倍の視野において同定された三つの最高領域の平均値として表記した。
【０５２０】
7．TUNELアッセイ
アポトーシス細胞を検出するために、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）-媒介dUTP標識（TUNEL）法を用いた。この目的に関して本発明者らは、ApopTag（登録商標）プラスペルオキシダーゼインサイチューアポトーシス検出キット（セロロジカルコーポレーション（Serological Corporation）、ノークロス、ジョージア州）を用いた。染色は製造元の技法に従って行った。キットに含まれる切片を染色して陽性対照とした。アポトーシス細胞を光学顕微鏡において（倍率400倍）無作為に選択した場において計数し、採点した細胞少なくとも1000個の百分率としてアポトーシス指数を計算した。
【０５２１】
8．細胞生存分析
4ウェルプレート（ヌンク（Nunc）、ロスキルデ、デンマーク）においてHUVECを播種した12時間後、培地を血清／増殖因子を含まない培地に交換した。血清／増殖因子を12時間枯渇した後、細胞を、MDA-7タンパク質（10 ng/ml）（293細胞の培養物から回収）、アンジオスタチン（100 ng/ml）、またはエンドスタチン（100 ng/ml）のいずれかを含む完全な培地によって処置した。12時間後、細胞に137Csユニット（3.4 Gy/分）を室温で照射して、トリプシン処理を行って計数した。既知数の細胞を60 mm培養皿に再度播種して、インキュベートして肉眼的なコロニーを発達させた。14日後にコロニーを計数して、非放射線照射細胞の生存に基づいて、所定の処置後の細胞定着率および生存分画を計算した。
【０５２２】
9．統計分析
統計学的有意性は、片側ANOVAまたは適当であればスチューデントのt検定を用いて決定した。p＜0.05であれば、その差は有意であると見なされた。
【０５２３】
結果
1．A549異種移植片腫瘍に及ぼすAd-mda7と放射線照射の併用治療の効果
A549細胞を無胸腺ヌードマウス（n＝20）の後肢に皮下注射した。腫瘍が200 mm3に達すると（0日目）、動物を以下の四つの群の一つに無作為に割付した：対照（生理食塩液の注射）、放射線照射単独（6日目に5 Gyを1回）；Ad-mda7単独（3×1010 vpを3回に分けて1、3、および5日目に）、または併用（Ad-mda7プラス放射線照射）。この処置プロトコールは、SW620異種移植片に関してAd-p53を用いた最初の実験に基づいて選択し、A549異種移植片においてAd-p53と放射線照射の併用を調べたその後の試験において用いたプロトコールと同じである（Kawabeら、2002；Spitzら、1996）。これによって、Ad-p53とAd-mda7を、A549異種移植片腫瘍の相対的放射線増感能に関して比較することができる。図54に示すように、放射線単独またはAd-mda7単独による処置は、ごく中等度の腫瘍増殖の遅れを示したに過ぎなかった。一方、Ad-mda7と放射線照射の併用療法によって、実質的で長期間持続する腫瘍増殖の遅れが認められた（図54A）。動物のプロトコールに従って、マウスは腫瘍の直径が15 mmに達すると屠殺しなければならなかった。それぞれのマウスを屠殺した時期を記録して、これを図54Bにプロットする。認められるように、併用療法による処置は、この期間を大きく延長させて、この群の動物5匹中1匹が治癒した。動物は全体で240日後に屠殺した。この動物には剖検時腫瘍の証拠を認めなかった。
【０５２４】
2．併用療法の効果は治療スケジュールに依存した
Ad-mda7 3×1010 vpの1回投与および5 Gyの放射線照射による併用治療の最適なレジメを決定するために、以下の治療を調べた：対照、Ad-mda7（1日目）プラス放射線照射（6日目）、Ad-mda7（5日目）プラス放射線照射（6日目）、または放射線照射（6日目）プラスAd-mda7（7日目）。腫瘍増殖の遅延に関する結果から、併用治療の最善の時期は、Ad-mda7を投与した5日後に5 Gyの放射線照射を行うことであることが示された（図55）。
【０５２５】
3．Ad-mda7の投与後の腫瘍におけるMDA-7タンパク質発現
MDA-7タンパク質発現を8日目の標本において免疫組織化学によって調べた。細胞質におけるMDA-7タンパク質の強い発現が、Ad-mda7処置後の腫瘍に検出されたが、Ad-mda7を投与しなかった腫瘍では特異的染色は検出されなかった。このパターンは、放射線照射も行った腫瘍からの標本では変化しなかった。
【０５２６】
4．Ad-mda7と放射線照射の併用療法はインビボでのアポトーシス誘導を増強した
先に、NSCLC細胞において放射線療法と併用したAd-mda7によるアポトーシス誘導の増強は、インビトロで処置した場合に認められた（Kawabeら、2002）。アポトーシスの類似の増強がインビボでも認められるか否かを調べるために、様々な治療後に採取した標本のTUNEL染色を行った。TUNEL陽性細胞は、特に治療群からの標本において組織切片を通して散在していることが認められた。TUNEL陽性細胞を計数して、得られた値を図63に示す。Ad-mda7と放射線照射の併用療法によって、バックグラウンドレベル1.2％を差し引いた後、放射線照射単独（2.2％）またはAd-mda7単独（1.3％）と比較して、相加的よりわずかに大きいアポトーシス指数（4.6％）が得られた。
【０５２７】
5．Ad-mda7は血管新生因子の放射線による発現の増強を遮断する
VEGF、bFGF、およびIL-8タンパク質発現を、14日目に採取した標本において免疫組織化学によって分析した。各標本に関して陽性細胞の割合を採点して、得られた値を図64A〜64Cにプロットした。これらの血管新生マーカーのそれぞれに関して無処置対照において何らかの構成的発現を認めた。しかし、放射線照射単独は、これらのタンパク質のそれぞれの発現を実質的に増加した。Ad-mda7処置は、VEGFおよびbFGFの構成的レベルを抑制して、三つ全ての血管新生マーカーの放射線による発現の増強を本質的に遮断した。
【０５２８】
6．Ad-mda7と放射線照射との併用療法は微小血管密度を抑制する
これまでの報告から、Ad-nda7が血管新生を阻害することによって腫瘍の増殖を抑制することが示唆された（Saekiら、2002）。したがって、単剤としておよび放射線照射と併用した場合のAd-mda7の抗血管新生作用を評価した。腫瘍を14日目に採取して、凍結切片をCD31（血小板内皮細胞接着分子-1）に関して染色して、微小血管密度を評価した。CD31-染色切片における微小血管密度の評価から、無処置対照腫瘍において倍率400倍の視野あたりの微小血管数の平均値が45±12個であったことが示された。Ad-mda7および放射線照射はいずれも、単剤として用いた場合、微小血管数をそれぞれ、26±3および30±6個に部分的に抑制することができた。しかし、Ad-mda7および放射線照射の併用によって治療した腫瘍では、微小血管数の平均値はさらに12±2個まで抑制された（図58）。併用による微小血管密度のこの3.8倍の減少は、他の群と比較して統計学的に有意であった。
【０５２９】
7．組換え型ヒトMDA-7タンパク質は放射線に対して内皮細胞を増感する
これまでの研究から、MDA-7タンパク質がAd-mda7感染腫瘍細胞から分泌されて、サイトカインIL-24として低濃度で機能しうることを報告されている（Dumoutierら、2001；Wangら、2002）。このように、Ad-mda7がA549異種移植片腫瘍を放射線に対して増感できることは、感染腫瘍細胞の直接放射線増感、血管新生因子の抑制、プラス感染腫瘍細胞によって分泌されたMDA-7タンパク質の抗血管新生および放射線増感特性を含む作用の組み合わせによる可能性があった。内皮細胞に及ぼす分泌型MDA-7タンパク質の放射線増感作用を調べるために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いてクローン原性生存アッセイを行った。HUVECは放射線照射の前に組換え型ヒトMDA-7タンパク質を含む培地によって12時間前処置した。この培地は、MDA-7タンパク質を分泌する293細胞の培養物に由来した。図59Aに示すように、MDA-7タンパク質は、推定濃度10 ng/mlで電離放射線に対してHUVECを増感した。陽性対照として、本発明者らはまた、HUVECを100 ng/mlのアンジオスタチン（図59B）またはエンドスタチン（図59C）によっても前処置した。それぞれプラスミノーゲンおよびコラーゲンXVIIIのタンパク質分解断片であるアンジオスタチンおよびエンドスタチンはいずれも、十分に定義された抗血管新生物質である（O'Reillyら、1994；O'Reillyら、1997）。これまでの報告から、アンジオスタチンおよびエンドスタチンはいずれも内皮細胞を放射線に対して増感することが示されている（Mauceriら、1998、Hannaら、2000）。アンジオスタチンおよびエンドスタチンはいずれも100 ng/mlでHUVECに対して放射線増感作用を生じたが（図59B、C）、MDA-7タンパク質はこの点においてより強力であるように思われた。
【０５３０】
8．組換え型ヒトMDA-7タンパク質はA549細胞または正常ヒト線維芽細胞を放射線に対して増感しない
Ad-mda7はA549細胞を放射線増感するが、正常なヒト肺線維芽細胞、CCD16細胞をインビトロで増感しないことがこれまでに報告された（Kawabeら、2002）。組換え型のヒトMDA-7タンパク質がこれらの細胞を放射線に対して増感するか否かを評価するために、安定にトランスフェクトした293細胞からの条件培地を用いて、クローン原性アッセイを上記のように行った。結果は、MDA-7タンパク質がA549細胞またはCCD16細胞のいずれにおいても放射線増感作用を有しないことを示した（図60A、B）。
【０５３１】
実施例28：MDA-7腫瘍抑制因子タンパク質の抗癌活性は小胞体（ER）からのシグナル伝達によって媒介される
本研究は、細胞内MDA-7タンパク質が特定の細胞下位置にターゲティングされると、殺細胞活性の増強を有するか否かという疑問に取り組む。発現されたタンパク質を、細胞質、核、およびERを含む様々な細胞下区画にターゲティングするベクターを用いて、いくつかのmda-7のプラスミド構築物を作製した（図61）。さらに、分泌シグナルを含む完全長のmda-7 cDNAを、細胞質骨格にサブクローニングした。再度ターゲティングされたベクターを、肺腫瘍細胞へのトランスフェクションによってMDA-7タンパク質発現に関して評価したところ、ウェスタンブロット分析によって、全て高レベルの細胞内MDA-7発現を引き起こした。MDA-7タンパク質発現の細胞下再ターゲティングは、免疫組織化学によって確認した。フローサイトメトリーおよびコロニー形成アッセイを用いて、再ターゲティングされたMDA-7が癌細胞を殺すことができるか否かを調べた（図62）。細胞質および核MDA-7構築物は、細胞死を誘発しなかったが、完全長（分泌型）MDA-7は細胞障害性であった。ER-ターゲティングmda-7構築物はまた、腫瘍細胞において細胞死を誘発した（図63）。このように、アポトーシスの誘導において有効であるためにはMDA-7が分泌経路に入る必要があるように思われる。
【０５３２】
実施例29：ヒト末梢血単核球におけるMDA-7のサイトカイン誘導
1．ヒト末梢血単核球（PBMC）におけるMDA-7の発現
最初に、イムノブロッティングを用いて、全PBMC集団の分裂促進性レクチン刺激後のMDA-7/IL-24タンパク質の有無を調べた。正常な健康ドナーの末梢血からヒストパック（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）上での遠心によってPBMCを単離した。細胞を、L-グルタミン、ヘペス、ペニシリン、ストレプトマイシン、および10％ヒトAB血清（ペルフリーズ（Pelfreez）、ブラウンディア、ウィスコンシン州）を添加したRPMI-1640に基づく培地において、5 μg/ml PHA-Pまたは10 μg/ml LPS（いずれもシグマ、セントルイス、ミズーリ州）の存在下で1×106個/mlの密度で培養した。回収する4時間前にブレフェルディンA（BFA、シグマ-アルドリッチ）を最終濃度10 μg/mlで加えて、サイトカイン分泌を阻害した。標準的なプロトコールに従って活性化PBMCから細胞溶解物を調製した。沸騰させて還元した試料を12％ゲル上でのSDS-PAGEによって分離して、ニトロセルロースに転写した。ブロッキングの後、メンブレンをウサギポリクローナル抗MDA-7抗体と共にインキュベートして、洗浄し、HRP結合ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした。ブロットをECL試薬（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって展開した。メンブレンを剥がして抗アクチン抗体によって再度プロービングした。
【０５３３】
PHAおよびLPSによって72時間刺激したPBMCにおけるMDA-7の発現を調べた。得られた活性化集団を、直接結合抗体およびミニマックス（ミルテニバイオテック（Miltenyi Bioitec）、サニーベール、カリフォルニア州）による磁気細胞ソーティングによってCD3+、CD19+、CD56+サブ集団に分離した。これらの集団におけるMDA-7の発現は、7G9抗MDA-7モノクローナル抗体による免疫組織化学染色によって決定した。この時点で抗CD3+細胞はMDA-7に関して陰性であったが、CD19+、B細胞と共にCD56+、NK細胞はMDA-7に関して陽性であった。これらの結果を考慮して、活性化PBMCにおけるMDA-7発現の動態を決定する実験を設定した。
【０５３４】
2．PBMC、タンパク質、およびmRNAにおけるIL-24のPHA誘導
活性化細胞におけるIL-24誘導の動態を決定するために、PBMCをPHAによって刺激して、早期の時点でタンパク質の発現に関して細胞を調べた。MDA-7タンパク質発現は細胞内フローサイトメトリーによって測定し、PBMCおよびmRNA発現はリアルタイムRT-PCRによって測定した。
【０５３５】
PBMCを、10％正常ヒト血清を含む培地において5 μg/ml PHAによって0、2、6、12、24、および48時間刺激した。細胞を指定の時間に単離して、タンパク質レベルを測定し、RNAを単離した。TaqMan一段階技法を製造元（アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州）のプロトコールに従って用いてリアルタイムRT-PCRを行った。MDA-7およびHPRTに関する遺伝子特異的プライマー／プローブをアプライドバイオシステムズから購入した。反応は、ABIプリズム7900 HT配列検出システムを用いて製造元のプロトコールに従って実施し、分析は配列検出ソフトウェアバージョン2.9を用いて行った。MDA-7タンパク質は細胞内FACs分析によって検出した。細胞を、回収の4時間前に10 μg/mlのブレフェルディンAによって処置してサイトカインの分泌を阻害した。適用可能な場合、細胞を最初に、直接結合抗体を用いて表面を染色してから、細胞内タンパク質を検出するために、細胞を4％パラホルムアルデヒドによる処置によって固定した後、洗浄剤である7 mg/ml n-オクチルグルコピラノシドによって可溶化した。可溶化の対照として、細胞を細胞内タンパク質であるビメンチンに対するモノクローナル抗体によっても染色した。免疫蛍光染色に関して、標準的なプロトコールに従った。免疫蛍光はセルクエストソフトウェアを備えたFACSキャリバー（BDイムノサイエンシズ（BD Immunosciences））において分析した。
【０５３６】
これらの実験の対照として、IL-2の発現も同様に分析した。MDA-7メッセージはIL-2メッセージの後に続き、刺激後6〜8時間でピークレベルに達し、非刺激PBMCと比較すると11,000倍に達する増加倍率であることが判明した。細胞内フローサイトメトリーによって測定したタンパク質発現は、メッセージの後に続き、8時間で最大発現に達した。
【０５３７】
3．MDA-7のサイトカイン誘導
上記の実験は、MDA-7 mRNAがPHAの刺激後比較的早期にピークに達することを示唆している。どのサイトカインがこの発現を促進しているかを調べるため、PBMCを、PHA活性化の際に産生される主なサイトカインであるIL-2によって刺激した。正常なPBMCを10％ヒト血清を含む培地において刺激した。細胞を特定の時間に回収して、細胞内FACSによってMDA-7タンパク質発現に関して調べ、リアルタイムRT-PCRによってMDA-7 mRNA発現を調べた。
【０５３８】
タンパク質発現は4時間目に増加し始めることが判明した。発現レベルはPHA刺激の場合に認められたレベルより低かったが、これは精製サイトカインと比較してマイトゲン刺激が強いことを反映しうる。同様に、IL-2受容体を発現していない細胞も同様にMDA-7を発現していることが反映されうる。mRNA発現は、1時間でピークに達してその後減少し、12時間で再度増加する二相性の動態を示唆している。もう一つの実験において、IL-2に対する中和抗体をPHA刺激の最初にPBMCに加えた。細胞を8時間で回収し、MDA-7タンパク質を細胞内FACSによって測定し、mRNAをRT-PCRによって測定した。MDA-7タンパク質およびmRNA発現はIgG対照と比較して約50％遮断された。
【０５３９】
他のサイトカインも同様に、休止時PBMCにおけるMDA-7発現の誘導能に関して調べた。PBMCを、100 U/ml IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、またはIFNγによる刺激後6時間目にMDA-7発現に関して分析した。この時点でIL-7およびIL-15はMDA-7 mRNAとタンパク質の双方の発現を刺激した。
【０５４０】
これらのデータは、IL-2、IL-7、およびIL-15がPBMCにおけるMDA-7発現のアップレギュレーションに関与していることを示唆している。これらの三つのサイトカインは共通のサイトカイン受容体γ鎖（γc）を共有する。IL-7Rは独自のα鎖とγcからなる。IL-2RおよびIL-15Rは三つのサブユニットからなる：IL-2R/IL-15Rβ、γc、およびそれぞれ独自のα鎖。γcを含む受容体に結合するサイトカインはT細胞の維持および恒常性に関与しているというかなりの証拠がある。これらのサイトカインがPBMCにおいてMDA-7の発現を刺激するという事実は、MDA-7も同様にT細胞恒常性に関与する可能性があることを示唆している。
【０５４１】
4．抗IL-2R抗体によるIL-24発現の遮断
γcに結合するサイトカインがMDA-7発現に関与するか否かをさらに確立するために、IL-2受容体の三つのサブユニット、すなわちIL-2Rα、IL-2/IL-15Rβ、およびγc（IL-2Rγ）に対する遮断抗体（R＆Dシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて、PHA活性化PBMCにおけるMDA-7発現の誘導を遮断する試験を行った。PHAと共に培養開始時に添加した抗体は5 μg/mlで用い、マウスIgGを非特異的遮断の対照として用いた。3回の異なる実験において、MDA-7 mRNA発現の遮断を認め、抗IL-2Rαに関して0％〜24％、抗IL-2/IL-15Rβに関して19％〜36％、および抗IL-2Rγに関して15％〜26％であった。
【０５４２】
MDA-7タンパク質発現は、抗IL-2モノクローナル抗体をPHA刺激開始時に添加することによって遮断された。このように、PBMCにおけるMDA-7の発現はIL-2、IL-7、およびIL-15によって誘導される。これらのサイトカインは全て、機能的IL-2受容体の成分を利用する。これらの結果は、MDA-7がTh1型免疫応答に関与する前炎症性サイトカインであるという考え方を支持する。
【０５４３】
実施例30：ヒト卵巣癌細胞のMDA-7/IL-24媒介殺細胞は、Fas/FasLシグナル伝達経路を含む
材料および方法
1．細胞株および試薬
ヒト卵巣癌細胞株OVCA 420およびMDAH 2774は、Dr. J.K.Wolf（M.D.アンダーソン癌センター、ハウストン、テキサス州）からの寄贈であった。細胞を10％FBSを添加した最小非必須アミノ酸培地において増殖させた。ヒト線維芽細胞株CCD-16はATCC（ロックビル、メリーランド州）から購入した。AP-1コンセンサスオリゴヌクレオチド
2006523227.tif 000023
はプロメガ（マディソン、ウィスコンシン州）から購入した。mda-7（Ad-mda7）またはルシフェラーゼ（Ad-luc）遺伝子を有するアデノウイルスはイントロゲンテラピューティクスインク（ハウストン、テキサス州）から得た。
【０５４４】
2．形質導入効率の決定
ヒト卵巣癌細胞株および正常線維芽細胞株（MRC-9）の形質導入効率を、GFP遺伝子を発現するアデノウイルス（Ad-GFP）を用いて決定した。細胞（MDAH 2774、OVCA420、およびMRC-9）を6ウェル組織培養皿において5×105個/ウェルで播種した。翌日、細胞を感染させない（偽）またはAd-GFP 2500、3000、5000、10000 ウイルス粒子/細胞（vp/細胞）で感染させた。感染の24時間後に、細胞を洗浄して、PBSに浮遊させ、フローサイトメトリー分析によって分析した。3000 vp/細胞では、全ての細胞株に関して90％を超える細胞が形質導入された。したがって、下記のその後の実験に関して、本発明者らはMOI 3000 vp/細胞を用いた。
【０５４５】
3．細胞増殖アッセイ
腫瘍細胞（MDAH 2774およびOVCA 420）および正常（MRC-9）細胞を6ウェル組織培養皿において1×105個/ウェルで播種した。翌日、細胞をPBS、Ad-luc、またはAd-mda7（3000vp/細胞）によって処置した。細胞を感染の1、2、3、4、および5日後に回収してトリパンブルーアッセイによって計数した。実験は異なる時期に少なくとも3回行い、結果は実験3回の平均値として表記した。
【０５４６】
4．細胞周期分析
腫瘍（MDAH 2774およびOVCA 420：5×105個）細胞を6ウェルプレートにおいてPBS、Ad-lucまたはAd-mda7（3000 vp/細胞）によって処置して37℃でインキュベートした。細胞を処置後24、48、および72時間目に回収して、PBSにおいて洗浄し、70％エタノールにおいて-20℃で一晩固定した。次に、細胞をRNアーゼA（1 mg/ml）および50 μg/mlヨウ化プロピジウム（シグマケミカルズ、セントルイス、ミズーリ州）を含むPBSに再浮遊させて、FACS分析を行った。これらの実験において非感染細胞を陰性対照とした。
【０５４７】
5．アポトーシス細胞染色
細胞（MDAH 2774およびOVCA 420）を6ウェルプレートにおいて5×105個/ウェルで播種して、PBS、Ad-lucまたはAd-mda7（3000 v.p./細胞）によって処置した。感染の72時間後、細胞をヘキスト33342号色素（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）と共に15分間インキュベートして、PBSによって2回洗浄し、断片化された核によって決定されるように、アポトーシス細胞に関して蛍光顕微鏡下で観察した。
【０５４８】
6．ウェスタンブロット分析
PBS、Ad-mda7またはAd-lucによって処置した腫瘍細胞に、当業者に既知である技術を用いてウェスタンブロット分析を行った。以下の一次抗体を用いた：PKR、ホスホ特異的p38、pJNK、p44/42、peIF2、カスパーゼ-9（セルシグナリング、ボストン、マサチューセッツ州）；カスパーゼ-3、PARP、FAF1、FADD、FasおよびFasL（ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州）。MDA-7に対するポリクローナル抗体はイントロゲンテラピューティクスインク（ハウストン、テキサス州）から得た。タンパク質は、アマシャムの高感度化学発光ウェスタンブロッティング検出システムを適用することによって、高感度化学発光フィルム（ハイパーフィルム；アマシャム）において可視化した。
【０５４９】
7．電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）
MDAH 27743（5×105個）を6ウェルプレートにおいてAd-lucまたはAd-mda7（3000 v.p./細胞）によって処置した。細胞を様々な時点（24、48、および72時間）で回収して細胞質および核抽出物を調製し、当業者に周知の技法を用いてEMSAを行った。簡単に説明すると、二本鎖オリゴヌクレオチドコンセンサスAP-1（プロメガ）をT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて[γ-32P]-ATPによって末端標識した。標識オリゴヌクレオチド、ポリ（dI-dC）0.5μg、および核タンパク質抽出物（10 μg）を含む典型的な結合反応混合物を、5×ゲルシフト結合緩衝液[20％グリセロール、5 mM MgCl2、2.5 mM EDTA、2.5 mM DTT、250 mM NaCl、50 mMトリス-塩酸（pH 7.5）]において25℃で30分間インキュベートした。複合体を非変性5％ポリアクリルアミドゲル上で0.5×トリスホウ酸EDTA緩衝液において300 Vで1時間30分分離した。バンドをオートラジオグラフィーによって可視化して、イメージクアントソフトウェア（モレキュラーダイナミクス、アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニューヨーク州）を用いて定量した。
【０５５０】
8．RNアーゼ保護アッセイ（RPA）
細胞（MDAH 2774）を6ウェルプレートにおいて5×105個/ウェルで播種して、PBS、Ad-lucまたはAd-mda7によって処置した。これらの細胞からの総RNAをトリゾル試薬を用いて処置後24、48、および72時間目に単離した。表記のアポトーシス関連遺伝子、カスパーゼ-8、Fas、FasL、FADD、FAF-1、TRAIL、TNFr、TRADDおよびRIPと共に内部対照L32およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼのmRNA転写物を、hApo-3マルチプローブ鋳型セット（ファーミンゲン）を用いて分析した。プローブ合成、ハイブリダイゼーション、およびRNアーゼ処置は、リボクアントマルチプローブ保護アッセイシステム（ファーミンゲン）を用いて製造元のガイドラインに従って行った。保護された転写物を変性ポリアクリルアミドゲル（5％）上での電気泳動によって分離して、ハイパーフィルムに-80℃で一晩露出した。
【０５５１】
9．Fasプロモーター分析
6ウェルプレートに播種したMDAH 2774細胞（5×105個）に、ヒトFas（CD95）プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子からなるプラスミド（FHR+）をトランスフェクトした。Fasプロモーターに変異を含むプラスミド（△6）をトランスフェクトした細胞をこれらの実験において陰性対照とした。トランスフェクションは、DOTAPリポソームを用いて行った。トランスフェクションの6時間後、細胞をPBS、Ad-βgalまたはAd-mda7（3000 vp/細胞）によって処置した。細胞を処置後異なる時点（12、24、48時間）で回収して、PBSにおいて洗浄し、レポーター溶解緩衝液（プロメガ）200 μlにおいて溶解した。ルシフェラーゼ発現は既に記述されているとおりに決定して、タンパク質1 mgあたりの相対光単位（RLU）として表記した。実験は少なくとも2回繰り返して結果を平均値として表記した。
【０５５２】
10．siRNA分析
siRNA分析は当業者に周知の方法を用いて行った。
【０５５３】
結果
1．Ad-mda7は卵巣癌細胞の増殖を選択的に阻害する
卵巣癌細胞（MDAH 2774、OVCA 420）にAd-mda7またはAd-luc（3000 vp/細胞）を感染させた。細胞を感染後様々な時点で回収し、MDA-7タンパク質発現および増殖阻害作用に関して分析した。PBSによって処置した細胞を対照とした。外因性のMDA-7タンパク質発現を、Ad-mda7によって処置した全ての細胞株において認めた。PBSまたはAd-lucを処置した細胞も同様に何らかの発現を示した。しかし、これは抗MDA7ポリクローナル抗体と非特異的タンパク質との交叉反応によるものである。MDA-7発現は全ての細胞株において認められたが、Ad-mda7による有意な（P＝0.001）増殖阻害は、PBSおよびAd-luc処置細胞と比較してMDAH 2774およびOVCA 420細胞に限って認められた（図64）。Ad-mda7処置HeyおよびDOV 13腫瘍細胞株には有意な増殖阻害効果を認めなかった。
【０５５４】
2．MDA-7は卵巣細胞においてG2/M細胞周期停止およびアポトーシスを誘導する
次に、Ad-mda7によって示される増殖阻害のメカニズムを調べた。Ad-mda7処置MDAH 2774（図65A）およびOVCA 420（図65B）は、PBSおよびAd-luc処置細胞と比較してG2/M期の細胞数の有意な増加を示した。しかし、Ad-mda7を処置したHey、DOV 13、およびSKOV3-ip細胞では、G2/M期の細胞数に有意な変化を認めなかった。MDAH 2774およびOVCA 420細胞におけるアポトーシスの誘導は、ヘキスト染色によって示されるように細胞周期の停止と関連した（図66）。PBSまたはAd-lucを感染させた細胞では、アポトーシス変化は認められなかった。
【０５５５】
3．PKRは卵巣細胞においてアポトーシスを誘導する
MDA-7がアポトーシスを誘導する分子メカニズムを調べるために、これまでにMDA-7に関与することが示されている様々なシグナル伝達分子の発現を分析した。PKRはdsRNA、ウイルスおよびストレス媒介アポトーシスにおいて役割を果たすことが示唆されている（Leeら、1994；Yeungら、1996；Kiblerら、1997）。Ad-mda7は肺癌細胞株A549およびH1299においてPKRによって媒介されるアポトーシスを誘導すると報告されている。したがって、PKR活性がAd-lucまたはAd-mda7による処置後に、感受性（MDAH 2774およびOVCA 420）および抵抗性（HeyおよびDOV 13）細胞株において増加するか否かを決定する試験を行った。PKRレベルは24〜48時間でMDAH 2774およびOVCA 420細胞において劇的に造渇して、その基質であるpeIF2はAd-mda7感染後48時間で増加することが判明した。しかし、HeyおよびDOV 13をAd-mda7に感染させてもPKRおよびその基質であるpeIF2を誘導せず、これはAd-mda7のアポトーシス誘導作用に対して抵抗性である。
【０５５６】
4．MDAH 2774細胞のMDA-7処置はMAPK、JNKおよびp38の活性化を誘導する
MDA-7がp38および／またはJNK経路を通してFasにシグナルを伝達するか否かを決定する実験を行った。JNKおよび／またはp38 MAPKの活性化（リン酸化）は、様々な癌細胞においてストレス誘発性のアポトーシスに至る経路に関係している。MDAH 2774およびOVCA 420におけるホスホ-JNKおよびホスホ-38 MAPKの発現を、Ad-mda7処置後にウェスタンブロッティングによって分析した。リン酸化JNKおよびp38はMDA-7感染MDAH 2774およびOVCA 420において48時間で有意に増加した。この知見は、アポトーシスにおけるリン酸化JNKおよびp38 MAPKの関与を示唆している。c-Junおよびp-ATF2の関与を確認するために、主要なAP-1成分（c-JunおよびATF-2）のレベルを、Ad-mda7およびAd-lucの感染後24および48時間でウェスタンブロット分析によって決定した。Ad-mda7は、24および48時間でpcJunおよびATF-2のレベルを有意に誘導した。Ad-lucおよび偽感染（PBS）細胞はpc-JunおよびpATF-2を活性化しなかった。これらの結果は、AP-1活性化におけるc-JunおよびpATF2の関与の可能性を示唆し、FasL刺激におけるAP-1活性の役割をさらに支持する。しかし、Ad-mda7は、抵抗性細胞株HeyおよびDOV 13においてホスホ-38、JNK、pc-Jun、ATF-2およびその標的AP-1を活性化しなかった。
【０５５７】
5．CD95Lプロモーター活性は、MDAh 2774細胞においてMDA-7による刺激の際にAP-1要素の活性化によってアップレギュレートされる
AP-1は、Junファミリー（c-Jun、JunD、およびJunB）、またはJunファミリーメンバーと任意のFosファミリーメンバー（c-Fos、FosB、Fra-1、およびFra-2）、またはATF2、CREB、およびNFATのような他の転写因子とのヘテロ二量体からなる主要な転写因子である。三つのMAPK経路（ERK、JNK、およびp38）が全てAP-1を活性化することができることから、次に、AP-1がp38およびJNKに伝達する統合分子として機能するか否かを調べる実験を行った。合成AP-1コンセンサス配列に対するAP-1結合活性をEMSAによって決定した。Ad-mda7感染細胞からの核溶解物は、24および48時間でAd-lucおよびPBS処置細胞より高いAP-1結合活性を有する。
【０５５８】
6．CD95LはAd-mda7感染時にアップレギュレートされる
これらのデータは、CD95-CD95L相互作用がAd-mda7感染後のアポトーシスの誘導にとって重要であることを示している。MDAH 2774細胞におけるFas転写物の発現状態に関する洞察を得るために、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて細胞死のシグナル伝達に関与するいくつかの遺伝子のmRNAレベルを測定した。Fas、FasL、FADD、およびカスパーゼ-8 mRNAレベルはMDA-7発現後24時間で増加するが、33時間では発現レベルに変化を認めないことが判明した。さらに、Ad-lucおよび偽処置細胞はFas、FasL、FADD、およびカスパーゼ-8のmRNA発現レベルに変化を示さなかった。併せて考慮すると、これらのデータは、MDA-7がp38およびJNK依存的c-Jun-pATF2/AP-1経路を通してFasLを活性化するという仮説を支持する。
【０５５９】
7．MDA-7発現後のカスパーゼカスケードの活性化
次に、アポトーシスに関与する下流の標的を調べた。カスパーゼ-9およびカスパーゼ-3の活性化は、PBSまたはAd-lucを処置した細胞と比較して、Ad-mda7処置MDAH 2774およびOVCA 420細胞において認められた。カスパーゼの基質であるPARPの切断は、カスパーゼの活性化に関連した。
【０５６０】
実施例31：mda-7遺伝子移入は癌と闘うために多数の分子経路を利用する
複製欠損アデノウイルス（Ad-mda7）を用いて黒色腫分化関連遺伝子7（mda-7）を細胞に導入すると、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、および黒色腫起源の癌を含む広いスペクトルの癌細胞において増殖阻害およびアポトーシスが起こる。正常細胞はMDA-7誘導死に対して抵抗性であることから、Ad-mda7の細胞障害活性は腫瘍選択的である。Ad-mda7の抗腫瘍活性はヌードマウスにおいて多数の異種移植片モデルを用いて確認されている。蓄積されたデータは、MDA-7が、アポトーシスの発生にとって重要な遺伝子およびシグナル伝達経路（例えば、p53、BAX、TRAIL、fas、PKR、MAPK、jnk）を活性化し、生存経路（例えばPI3K）を阻害することを示している。
【０５６１】
バイオインフォーマティクスおよび構造分析により、現在ではMDA-7タンパク質が、IL-10、-19、-20、-22、および-26を含むインターロイキン-10（IL-10）スーパーファミリーの新規メンバーであることが判明した。mda-7遺伝子は1q31/32でサイトカインクラスターと共に含まれる。MDA-7タンパク質は、IL-10の6-ヘリックス構造を共有するが、MDA-7はIL-10の免疫抑制特性を共有せず、Th1サトカインとして機能する。MDA-7は活性化リンパ球において発現される。ヒトPBMCをMDA-7によって処置すると、IL-6、γ-IFN、IL-12、TNF-α、およびGM-CSFの分泌が誘導される。これらのTh1サイトカインの分泌はIL-10によって阻害される。MDA-7はまた、内皮細胞に結合して、強力な抗血管新生タンパク質として機能する。この活性はIL-22受容体を通して媒介される。黒色腫細胞をAd-mda7またはMDA-7によって処置すると、IL-6およびγIFNの分泌を誘導する。したがって、最近IL-24と分類されているmda-7は、多様な抗癌特性を有する新規IL-10相同体である。アポトーシス誘導、抗血管新生、および免疫刺激のこの独自の組み合わせは、癌を攻撃するための強力なアプローチを提供するはずである。
【０５６２】
実施例32：MDA-7/IL-24の異所産生は、ヒト肺癌細胞の浸潤および遊走を阻害する
材料および方法
1．細胞培養
ヒトNSCLC細胞株A549（腺癌）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から購入した。ヒト肺大細胞癌細胞株H1299は、A. GazdarおよびJ.D. Minna（テキサス大学南西部メディカルセンター、ダラス、テキサス州）両博士の寄贈であった。腫瘍細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS、ギブコ-BRL、グランドアイランド、ニューヨーク州）、抗生物質（ギブコ）、およびL-グルタミンを含むRPMI 1640培地において維持した。実験を開始する前に、マイコプラズマが細胞に存在しないことを確認した。細胞は対数増殖期で使用した。
【０５６３】
2．組換え型アデノウイルスベクター
MDA-7遺伝子を有する複製欠損ヒト5型アデノウイルスベクター（Ad-mda7）の構築は既に記述されている（Saekiら、2000、およびMhashilkarら、2001）。ウイルスはヒト胎児腎293細胞において増殖させ、クロマトグラフィーによって精製した。
【０５６４】
3．細胞遊走アッセイ
腫瘍細胞（H1299およびA549）を6ウェル組織培養プレートにおいて5×105個/ウェルの密度で播種した。翌日、細胞をAd-mda7またはAd-lucに感染多重度2500ウイルス粒子/細胞で感染させた。感染の6時間後、細胞をトリプシン処理して、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）によって洗浄し、無血清RPMI-1640培地に再浮遊させた。細胞遊走アッセイは、既に記述されているように（Rameshら、2003）24-ウェルトランスウェルユニット（ミリポア、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）において行った。簡単に説明すると、孔径8 μmのポリカーボネートフィルターを用いた。トランスウェルユニットの下室に無血清培地を満たし、上室に各処置群からの細胞1×104個を1試料あたりウェル3個ずつ播種した。24および48時間インキュベートした後、フィルターを通過して下室に移動した細胞を計数して、細胞数を上のウェルおよび下のウェルの細胞の総数の百分率として表記した。実験は4回繰り返し、結果をこれらの実験の平均値としてMDA-7によって記録した。
【０５６５】
実験の平行な組において、上記のように様々な処置を行った腫瘍細胞に、既に記述されているように（Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）24および48時間で細胞生存率アッセイを行った。これらの実験は、MDA-7による細胞遊走の阻害が細胞障害性の結果である可能性を除外するために行った。
【０５６６】
4．細胞浸潤アッセイ
腫瘍細胞（H1299およびA549）を6ウェル組織培養プレートにおいて5×105個/ウェルの密度で播種した。翌日、細胞にAd-mda7またはAd-lucをMOI 2500 vp/細胞で感染させるか、または10 μM LY 294002（セルシグナリング、ビバリー、マサチューセッツ州）もしくは1 μg/ml MMP-II阻害剤（サンタクルズバイオテクノロジー、サンタクルズ、カリフォルニア州）によって処置した。トランスフェクション後、培養物に完全な培地を加えた。処置後6時間目に細胞をトリプシン処理してPBSにおいて洗浄し、無血清RPMI 1640培地に再浮遊させた。細胞浸潤アッセイは、既に記述されているように（Stewartら、2002）マトリゲルをコーティングした24ウェルトランスウェルユニット（ベクトンディッキンソン＆カンパニー（Becton Dickinson and Company）、フランクリンレークス、ニュージャージー州）において行った。簡単に説明すると、マトリゲルコーティングトランスウェルユニットの下室に無血清培地を満たし、上室に各処置からの細胞1×104個を1試料あたり3ウェルずつ播種した。24時間および48時間インキュベートした後、マトリゲルコーティングフィルターメンブレンを通過して下のウェルに移動した細胞を浸潤の測定手段として計数した。浸潤細胞を各処置について計数し、上のウェルと下のウェルの細胞の総数の百分率として表記した。実験を少なくとも3回繰り返し、結果をこれらの実験の平均値として記録した。
【０５６７】
5．ゼラチンザイモグラフィー分析
MMP産生に及ぼすAd-mda7処置の影響を決定するために、既に記述されているように（Zhangら、2002）ゼラチンザイモグラフィーアッセイを行った。簡単に説明すると、低血清（1％FBS）培地において増殖させた腫瘍細胞（H1299およびA549）を6ウェル組織培養プレートにおいて5×105個/ウェルで播種して、Ad-mda7またはAd-lucをMOI 2500 vp/細胞で感染させた。PBSを処置した細胞をこれらの実験における陰性対照とした。感染の6時間後、培養培地を除去して1％FBSを含む新しい培地に交換した。感染の24および48時間後、細胞培養の上清を回収して、遠心によって透明にし、ゼラチンと共重合したドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル（シグマケミカル、セントルイス、ミズーリ州）において電気泳動を行った。次に、ゲルを洗浄して、反応緩衝液（50 mMトリス塩酸[pH 7.4]、0.02％NaN3、および10 mM CaCl2）と共に絶えず振とうさせながら37℃で16時間インキュベートして、染色し、汚れを除去した。培養上清におけるタンパク質濃度を測定して、アッセイのために等量が用いられていることを確認した。MMP-2および-9の相対活性は、イメージクアントソフトウェア（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて定量した。
【０５６８】
6．イムノブロッティング
様々な抗体を用いたイムノブロッティングを既に記述されているとおりに行った（Saekiら、2000）。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理によって回収して、溶解緩衝液（62.5 mMトリス塩酸、2％SDS、10％グリセロール、および4 M尿素）に浮遊させた。タンパク質試料（各50 μg）を溶解緩衝液および5％2-メルカプトエタノールの溶液20 μlに希釈して（バイオラッドラボラトリーズ、ハーキュルズ、カリフォルニア州）、95℃の水浴中で5分間加熱した。次に、タンパク質抽出物を、垂直なスラブゲル電気泳動セル（バイオラッド）において10％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離した。次に、分離したタンパク質をゲルからニトロセルロースメンブレン（ハイボンド-ECL；アマシャムファルマシアバイオテック、バッキンガムシャー、イギリス）に転写して、ブロッキング溶液（5％粉乳および0.3％ツイーン20のPBS溶液）において1時間ブロックした。次に、メンブレンを、MMP-2、MMP-9、およびp85 PI3K（サンタクルズバイオテクノロジー）、リン酸化FAK（ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州）、MDA-7（イントロゲンテラピューティクスインク、ハウストン、テキサス州）、およびβ-アクチン（シグマケミカルズ）に関する一次抗体と共にインキュベートした。次に、メンブレンを西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（アマシャム、イギリス）と共にインキュベートした。最後に、タンパク質を、アマシャム高感度化学発光ウェスタンブロッティング検出システムを用いて、高感度化学発光フィルム（ハイパーフィルム、アマシャム、イギリス）において可視化した。様々な処置後のタンパク質発現レベルにおける相対的な変化をイメージクアントソフトウェア（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて定量し、PBS処置細胞に関する値を1として比率で表記した。
【０５６９】
7．実験的肺転移モデル
MDA-7/IL-24産生が転移を阻害できるか否かを決定するために、実験的肺転移モデル（Rameshら、2001）を用いる動物実験を行った。簡単に説明すると、150 mm組織培養プレートに播種したA549腫瘍細胞（5×106個）をPBS、Ad-lucまたはAd-mda7（2500 vp/細胞）によって処置した。感染後6時間目に細胞を回収して、洗浄し、滅菌PBSにおいて最終容量1 mlに浮遊させた（1×106個/100 μl）。細胞を雌性ヌードマウスの尾静脈から静脈内投与した。各治療群の動物は5匹であった。細胞の注射後3週間目に動物をCO2吸入によって安楽死させた。既に記述されているとおりに（Rameshら、2001）、三つの群のそれぞれのマウスの肺にインディアインクを気管内に注射して、フェケト溶液において固定した。腫瘍の転移に及ぼすMDA-7/IL-24の影響を、解剖顕微鏡下で各肺における転移腫瘍の数を計数することによって決定した。実験は2回行い、結果を実験2回の平均値として記録した。
【０５７０】
8．統計分析
実験結果の統計学的有意性はANOVAおよびマンホイトニー順位和検定を用いて計算した。群のあいだの差は、P値が0.05未満であれば統計学的に有意であると解釈した。
【０５７１】
結果
1．MDA-7/IL-24は腫瘍細胞の遊走を阻害する
Ad-mda7を処置した腫瘍細胞はAd-lucまたはPBSを処置した細胞より有意に遊走することができなかった（P＝0.002）（図67）。遊走した細胞数（A549およびH1299）は、Ad-mda7による処置後では（＜250個）PBS（＞500個）またはAd-luc（＞350個）による処置後より有意に少なかった。阻害作用は24時間より48時間でより有効であることが認められた。細胞遊走の阻害がMDA-7/IL-24媒介細胞死によるものではなかったことを示すために、異なるが平行の組の実験において、PBS、Ad-lucおよびAd-mda7によって処置した細胞に感染後24および48時間での細胞生存率アッセイを行った。細胞生存率における有意な差はこの時点では認められず、このことはMDA-7/IL-24による遊走の阻害が細胞死によるものではなかったことを示している（図67B）。形質導入後24時間では、三つの実験群は全て、重ね合わせることができ、有意な細胞死がなかったことを示している。48時間までに何らかの細胞死が起こったが、このベクターの用量ではAd-mda7による有意な細胞死は形質導入後72および96時間に限って認められた。これらの結果は、MDA-7/IL-24が細胞の遊走を阻害したことを示している。
【０５７２】
2．MDA-7は腫瘍細胞浸潤を阻害する
Ad-mda7によって処置した腫瘍細胞は、マトリゲル浸潤アッセイフィルターの外膜上の細胞数が少なかったことから示されるように、PBSまたはAd-lucによって処置した細胞より浸潤性がかなり低かった（図68）。A549細胞およびH1299細胞の双方において、浸潤細胞数はAd-mda7による処置後では（＜50個；P＝0.001）、PBS（＞140個）またはAd-luc（＞150個）より有意に少なかった。MDA-7によって示されるこの阻害効果は、PI3K阻害剤であるLY 94002によってまたはMMP-II阻害剤によって処置した細胞において認められた阻害作用と類似であった。細胞生存率アッセイは阻害がMDA-7/IL-24による細胞死の結果ではなかったことを示した。これらの結果は、MDA-7/IL-24が細胞浸潤を阻害したことを示している。
【０５７３】
3．MDA-7は細胞遊走および浸潤に関連するタンパク質の産生をダウンレギュレートする
細胞の遊走および浸潤のシグナル伝達経路に関連するタンパク質の調節を、ウェスタンブロット分析によって調べた。野生型p53（A549）を含むおよびp53に関して無効である（H1299）細胞株を用いた。MDA-7/IL-24産生はPBSまたはAd-luc処置腫瘍細胞では認められなかったが、Ad-mda7処置細胞ではMDA-7/IL-24の高レベル産生を認めた。H1299およびA549腫瘍細胞株におけるMDA-7/IL-24タンパク質の過剰産生によって、p85PI3KおよびpFAKの産生が減少し、pJNK、p38、MAPK、およびp44/42 MAPKの産生が増加した。対照的に、PBSまたはAd-luc処置細胞では、これらのタンパク質の産生に有意な変化を認めなかった。p85 PI3KおよびpFAKの阻害はまた、PI3K阻害剤であるLY 294002によって処置した細胞においても認められたが、二つの細胞株において阻害は異なった。MDA-7を過剰発現する細胞株におけるpFAK発現の減少は、LY 294004について認められた減少より大きかった。さらに、LY 294002処置によって、H1299細胞においてp38 MAPKおよびp44/42 MAPK産生の増加が起こった。A549細胞において、LY 294004は、pJNKおよびp44/42 MAPKの産生を増加させた。これらの結果は、MDA-7がLY 294002と同様にPI3Kを選択的に阻害するが、本試験において研究した他のシグナル伝達分子に対して有意な作用を及ぼさなかったことを示している。
【０５７４】
4．MDA-7/IL-24による腫瘍細胞におけるマトリクスメタロプロテナーゼ産生の阻害
次に、MDA-7を過剰発現する腫瘍細胞をザイモグラフィーおよびウェスタンブロット分析によってMMP調節に関して調べた。ザイモグラフィーおよびウェスタンブロット分析により、MMP-2および-9タンパク質の産生が、PBSまたはAd-luc処置した細胞と比較して、Ad-mda7を処置したA549腫瘍細胞において減少したことが示された。Ad-mda7を処置したH1299細胞では、PBSまたはAd-lucによって処置した細胞と比較した場合、MMP-2の減少が認められたがMMP-9の減少は認められなかった。ザイモグラフィー分析の結果は、ウェスタンブロット分析の結果と相関した。このように、Ad-mda7は、p53野生型およびp53ヌルNSCLC細胞株の双方においてMMP発現および活性を調節することができる。
【０５７５】
5．MDA-7/IL-24は実験的肺転移を阻害する
ヌードマウスにおいてA549ヒト肺癌細胞を用いる実験的肺転移において、Ad-mda7によって処置した腫瘍細胞を注射したマウスでは、PBSまたはAd-luc処置腫瘍細胞を注射したマウスより形成された肺腫瘍結節が有意に少なかった（P＝0.01）（図69）。実験的転移の阻害は、より少ない数の腫瘍を示した組織学染色と相関した。
【０５７６】
実験的転移の阻害は細胞死のみによるものではないことをさらに確認するために、さらなるインビボ実験を行った。肺腫瘍を有する動物をDOTAP：Chol-mda7によって処置すると、無処置またはDOTAP：Chol：CAT複合体によって処置したマウスと比較して実験的転移の有意な阻害（P＝0.001）が起こった（図70）。実験的転移の阻害能は、腫瘍細胞の遊走および浸潤の阻害に間接的に相関すると考えられる。これらの結果は、MDA-7がインビボでの腫瘍細胞の遊走および浸潤を阻害し、認められたインビトロの結果と一致することを示している。
【０５７７】
実施例33：リポソーム媒介MDA-7/IL-24遺伝子輸送後の肺腫瘍増殖の局所および全身的阻害
材料および方法
1．材料
脂質（DOTAP、コレステロール）は全て、アバンティポーラーリピッズ（Avanti Polar Lipids、アルバスター、アラバマ州）から購入した。ハム/F12培地およびウシ胎児血清（FBS）はギブコ-BRL-ライフテクノロジーズ（ニューヨーク、ニューヨーク州）から購入した。ポリクローナルウサギ抗ヒトMDA-7抗体はイントロゲンテラピューティクスインク（ハウストン、テキサス州）から得て、抗マウスCD31はサンタクルズバイオテクノロジーインク（パロアルト、カリフォルニア州）から得た。
【０５７８】
2．細胞株および動物
ヒトの肺の非小細胞癌細胞株A549は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、10％FBS、1％グルタメート、および抗生物質を添加したハムF12培地において維持した。マウスUV2237M細胞はDr. Isaiah J.Fidler（M.D.アンダーソン癌センター）博士から得て、他所で記述されているとおりに維持した（Rameshら、2001）。細胞を定期的に継代して、マイコプラズマの有無に関して試験した。試験に用いた4〜6週齢の雌性BALB/cヌード（nu/nu）マウス（ハーラン-スプレージドーリーインク（Harlan-Sprague Dawley Inc.）、インジアナポリス、インジアナ州）およびC3H/Ncrマウス（米国国立癌研究所、フレデリクスバーグ、メリーランド州）は、病原体を含まない環境において維持し、動物の飼育および使用に関して確立された施設内ガイドラインに従って取り扱った。
【０５７９】
3．プラスミドの精製
試験において用いたプラスミドは、pVaxプラスミドベクター（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）においてクローニングし、他所で記述されているとおりに精製した（Templetonら、1997；Gaenslerら、1999）。簡単に説明すると、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下で細菌のβ-ガラクトシダーゼ（Lac-Z）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、またはヒトmda-7 cDNAを有するプラスミドを、大腸菌宿主株DH5αにおいてカナマイシン選択下で増殖させた。精製プラスミドのエンドトキシンレベルは、色素原性リムラスアメーバ溶解物キネティックアッセイキット（キネティック-QCL；バイオウィッタッカー、ウォーカースビル、メリーランド州）を用いて決定した。精製プラスミドDNAの濃度および純度はOD260/280比によって決定した。
【０５８０】
4．DOTAP：Cholリポソームの合成およびDOTAP：Chol-DNA混合物の調製
DOTAP：Cholリポソームを合成して、他所で記述されているように（Chadaら、2003；Templetonら、1997）孔径を減少させた（1.0、0.45、0.2、および0.1μm）ホワットマン濾紙（ケント、イギリス）の中を通して押し出した。DOTAP：Chol-DNA複合体は、マウスに注射する2〜3時間前に新しく調製した。
【０５８１】
5．粒子径の分析
新しく調製したDOTAP：Chol-DNA複合体の平均粒子径をN4粒子径アナライザ（コールター、マイアミ、フロリダ州）を用いて分析した。リポソーム-DNA複合体の平均粒子径は300 nm〜325 nmの範囲であった。
【０５８２】
6．皮下腫瘍異種移植片に及ぼすDOTAP：Chol-mda7複合体の影響
全ての実験において、滅菌リン酸緩衝生理食塩液（PBS）に浮遊させた腫瘍細胞（A549）5×106個を右背側わき腹に注射した。腫瘍の大きさが4〜5 mm2に達した場合、動物を無作為に群分けして処置を開始した。担癌動物を1群6匹の4群に分けた。1群には処置を行わず、2群にPBSを投与し、3群にはDOTAP：Chol-LacZ複合体（50 μg/用量）、および4群にはDOTAP：Chol-mda-7複合体（50 μg/用量）を投与した；処置は全て腫瘍内に投与して、毎日計6回の投与を行った。腫瘍内注射のために、動物を施設内ガイドラインに沿ってメトキシフルラン（シェリング-プラウ（Schering-Plough）、ケニルワース、ニュージャージー州）によって麻酔した。腫瘍の測定は処置群を知らない観察者が2日毎に記録し、腫瘍容積は以下の式を用いて計算した：V（mm3）＝a×b2／2、式中「a」は長径および「b」は垂直方向の直径である（Saekiら、2002；Rameshら、2001）。抗腫瘍有効性データは、腫瘍の大きさと数の双方を含めて計算するために、各群における全ての動物に関して累積腫瘍容積として表記した。全ての実験において、腫瘍の大きさの変化に関する統計学的有意性はANOVAによって決定した。
【０５８３】
マウス腫瘍細胞に及ぼすmda-7の影響を調べるため、同系腫瘍モデルを利用した。この目的に関して、C3HマウスにマウスUV2237m線維肉腫細胞（1×106個）を皮下注射して、3群に分けた（n＝8/群）。腫瘍の大きさが4〜5 mm2に達した場合、動物に以下の腫瘍内処置を行った：無処置（対照）、DOTAP：Chol-CAT複合体、またはDOTAP：Chol-mda7複合体。処置スケジュールおよび治療効果の分析はA549腫瘍モデルに関して既に記述されたものと同じであった。実験は統計分析および有意性のために2回繰り返した。
【０５８４】
7．MDA-7、アポトーシス、およびCD31の測定
nu/nuまたはC3Hマウスにおいて確立した皮下A549またはUV2237m腫瘍をそれぞれ摘出して、4％緩衝ホルマリンにおいて固定し、パラフィンに抱埋して厚さ4 μmの切片に切断した。組織切片を、他所で記述されているように（Saekiら、2002；Rameshら、2003）MDA-7トランスジーン発現に関して免疫染色した。MDA-7に関して染色陽性の腫瘍細胞を明視野顕微鏡下で分析して、処置群を知らない観察者が定量した。標本あたり少なくとも5視野を分析した。処置後の腫瘍細胞の運命を決定するために、腫瘍の切片を、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Tdt）キット（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim）、インジアナポリス、インジアナ州）を用いて、アポトーシス細胞死に関して染色し、既に記述されているように（Saekiら、2002；Rameshら、2001）メチレンブルーまたはメチルグリーンによって対比染色した。全ての染色技法において、適当な陰性対照を含めた。CD-31染色の場合、記述されているように（Saekiら、2002；Rameshら、2003）組織を抗CD31-抗体によって染色した。
【０５８５】
8．処置後の腫瘍の特徴
mda-7遺伝子の治療効果を決定するために、最後の処置後に腫瘍をマウスから摘出して、組織病理学評価を行った。分析は、処置群を知らない病理学者が行った。
【０５８６】
9．実験的肺転移に及ぼすDOTAP：Chol-mda7複合体の影響
肺転移に及ぼすDOTAP：Chol-mda7複合体の影響を調べるため、雌性ヌードマウスの尾静脈に、滅菌PBS 100 μlに浮遊させたA549腫瘍細胞106個を注射した。6日後、マウスを3群に分けて、以下のように処置した：無処置（1群）、DOTAP：Chol-CAT複合体（2群）、およびDOTAP：Chol-mda7複合体（3群）。各群のマウスは8匹であった。処置は全て、リポソーム-DNA複合体50 μgを含み、27ゲージ針を用いて尾静脈から毎日合計6回投与した。最後の投与から3週間後、動物をCO2吸入によって安楽死させた。各マウスの肺にインディアインクを気管内に注射してフェケテス溶液（Rameshら、2003）において固定した。全身mda-7遺伝子処置の治療効果は、治療群を知らない観察者が解剖顕微鏡下で各肺における転移腫瘍の数を計数することによって決定した。データを分析して、マンホイトニー順位和検定によりP値が＜0.05であれば群の差は統計学的に有意であると解釈された。
【０５８７】
同系肺腫瘍モデルとして、C3HにマウスUV2237m線維肉腫細胞（1×106個）を注射して3群に分けた（n＝7/群）。注射の6日後、動物を以下のように処置した：無処置、DOTAP：Chol-CAT複合体、またはDOTAP：Chol-mda7複合体。処置スケジュールおよび治療効果の分析はA549腫瘍モデルに関して既に記述されたものと同じであった。実験は統計分析および有意性のために2回繰り返した。
【０５８８】
結果
1．DOTAP：Chol-mda-7複合体による腫瘍細胞のインビトロトランスフェクション
ヒトMDA-7/IL-24タンパク質をコードする発現プラスミドを用いて、DOTAP：Cholリポソームが、ヒト（A549）およびマウス（UV2237m）にプラスミドDNAを輸送することができるか否かを調べた。mda-7プラスミドDNAと複合体を形成したDOTAP：Cholリポソームのトランスフェクションによって、24および48時間でA549およびUV2237m腫瘍細胞の双方において外因性のMDA-7タンパク質の発現が得られた。MDA-7発現はPBS処置対照細胞では認められなかった。DOTAP：Chol-mda-7をトランスフェクトしたA549およびUV2237m細胞からの組織培養上清の分析により、48時間で分泌型MDA-7タンパク質が示されたが24時間では示されなかった。48時間での分泌型MDA-7タンパク質の検出は、分泌型MDA-7タンパク質が24時間で検出可能であるAd-mda7処置細胞において認められたものとは異なる（Mhashilkarら、2001）。このことは、DOTAP：Cholリポソームを用いて得られたトランスジェニックMDA-7発現が、Ad-mda7によって得られた発現より少ないことを示唆している。分泌型MDA-7タンパク質はPBS処置細胞では認められなかった。このように、DOTAP：Cholリポソームは、腫瘍細胞にmda-7 DNAを効率的に輸送することができ、それによってAd-mda7より少ないものの細胞内および分泌型トランスジェニックMDA-7産生が得られた。
【０５８９】
2．MDA-7は皮下腫瘍の増殖を阻害する
DOTAP：Chol-mda7複合体がA549ヒト肺皮下腫瘍を抑制できるか否かをnu/nuマウスにおいて評価した。担癌マウスをDOTAP：Chol-mda7複合体の腫瘍内投与によって処置すると、無処置、PBS処置、またはDOTAP：Chol-LacZ複合体を処置した動物における腫瘍の増殖と比較して、腫瘍の増殖が有意に阻害された（P＝0.001）（図71A）。腫瘍の組織病理学的分析では、様々な治療群において腫瘍浸潤細胞に有意差を認めなかった。
【０５９０】
次に、C3Hマウスにおける皮下マウス腫瘍に及ぼすmda-7遺伝子の治療効果を評価した。UV223M腫瘍を有するマウスを3群に分けた：1群は無処置、2群にはDOTAP：Chol-CAT複合体による処置、および3群にはDOTAP：Chol-mda7複合体による処置を行った。UV2237m腫瘍の増殖は、二つの対照群における腫瘍の増殖と比較した場合、DOTAP：Chol-mda7複合体の腫瘍内投与によって処置したマウスでは有意に阻害された（P＝0.01；図71B）。
【０５９１】
認められた腫瘍抑制効果はmda-7遺伝子発現によるものであったことを証明するために、注射後48時間に得られたA549およびUV2237m皮下腫瘍に、MDA-7タンパク質発現に関する免疫組織化学分析を行った。MDA-7タンパク質発現は、DOTAP：Chol-mda7複合体によって処置したA549およびUV223m細胞のそれぞれ、18％および13％において認められ（P＝0.001；図71C）、無処置、PBS処置、DOTAP：Chol-LacZ処置、またはDOTAP：Chol-CAT複合体によって処置した動物より有意に多かった。何らかのレベルの非特異的染色を、DOTAP：Chol-CAT複合体によって処置したA549腫瘍において認めた。MDA-7発現パターンの分析から、細胞外であるように思われるより散在性の染色パターンの他に強い細胞内染色が存在することが判明した。この染色パターンはヒト腫瘍異種移植片およびマウス同系腫瘍の双方において認められた。
【０５９２】
3．DOTAP：Chol-mda-7複合体によって処置した肺腫瘍におけるアポトーシス細胞死
DOTAP：Chol-mda-7複合体による処置後の腫瘍細胞の運命を決定するために、nu/nuマウスおよびC3Hマウスからの皮下腫瘍（A549、UV2237m）を、既に記述されているように（Saekiら、2002）アポトーシス細胞死に関して分析した。アポトーシス細胞死を示す有意なレベル（P＝0.001）のTUNEL陽性細胞（A549 13％およびUV2237m 9％）が、無処置、PBS処置、DOTAP：Chol-CAT複合体処置、またはDOTAP：Chol-LacZによって処置した対照動物からの腫瘍と比較して、DOTAP：Chol-mda7複合体によって処置した腫瘍において認められた（図72）。
【０５９３】
4．DOTAP：Chol-mda-7複合体によって処置した肺腫瘍におけるCD31-陽性染色の減少
腫瘍の脈管形成に及ぼすmda-7処置の影響を決定するために、腫瘍組織に、既に記述されているように（Saekiら、2002；Rameshら、2003）、CD31染色を行った。CD31陽性染色レベルは、無処置、PBS処置、DOTAP：Chol-LacZ複合体処置、およびDOTAP：Chol-CATに処置マウスから得た腫瘍組織と比較して、DOTAP：Chol-mda7処置A549（10％）およびUV2237m（5.8％）腫瘍組織において有意に（P＝0.01）減少した（図73）。CD31染色の減少は脈管形成の減少を示している。
【０５９４】
5．MDA-7は実験的肺転移を阻害する
次に、DOTAP：Chol-mda-7複合体の活性をヒトA549肺癌細胞またはマウスUV227m細胞を用いて実験的肺転移モデルにおいて調べた。腫瘍細胞を静脈内投与すると、肺に急速な腫瘍の播種が起こり、動物は30日後に抗しがたい肺腫瘍負荷に倒れる。A549およびUV2237m肺腫瘍を有するヌードまたはC3HマウスにDOTAP：Chol-mda7複合体を全身性に処置すると、PBSまたはDOTAP：Chol-CAT複合体による処置より肺転移数は有意に少なくなった（P＜0.05）（図74）。UV2237mマウスにおいて、DOTAP：Chol-CAT複合体処置では、PBSによって処置した腫瘍結節数と比較して腫瘍結節数の有意な減少が認められ、このことは何らかの非特異的抗腫瘍活性を示唆している（図74）。さらに、罹患率および死亡率の欠如によって証明されるように処置に関連した毒性は認められなかったことから、処置は良好に認容された。
【０５９５】
実施例34：Ad-mda7とトラスツズマブとの併用療法は、HER-2/NEU-過剰発現乳癌細胞における細胞死を増加させる
材料および方法
1．細胞株
SKBr3およびMCF-7乳癌細胞株をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。MCF-7-Her-18細胞は、Dr. Mien-Chie Hung博士から寄贈された。細胞は、10％ウシ胎児血清、10 mmol/Lグルタミン、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシン（ギブコインビトロジェンコーポレーション、グランドアイランド、ニューヨーク州）を添加した高グルコースDMEM培地において37℃、5％CO2において維持した。
【０５９６】
2．アデノウイルス形質導入
mda-7遺伝子（Ad-mda7）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ad-Luc）を有する組換え型アデノウイルスベクターを、イントロゲンテラピューティクス（ハウストン、テキサス州）から得た。細胞6×105個に、Ad-mda7およびAd-LucをMOI 2500ウイルス粒子（vp）/細胞を形質導入した。ベクターの用量は形質導入効率が確実に≧70％となるように選択した。ハーセプチンは用量5 μg/mlで培養物に添加した。
【０５９７】
3．ウェスタンブロット
細胞を溶解して、タンパク質濃度をバイオラッドアッセイ（バイオラッドラボラトリーズ、ハーキュルズ、カリフォルニア州）を用いて決定した。溶解物を10％SDSゲルを用いてウェスタンブロット分析によって分析した。レーンにタンパク質30〜50 μgをローディングして、90 Vで2時間電気泳動した。ゲルをニトロセルロースメンブレンに転写して1％粉乳によってブロックし、一次抗体（β-カテニン、Akt、およびp-Akt；サンタクルズバイオテクノロジーインク、サンタクルズ、カリフォルニア州）と共に4℃で一晩インキュベートした。メンブレンを洗浄して、二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。メンブレンを展開して、タンパク質シグナルを高感度化学発光（ECL）-ウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイエンシズ、バッキンガムシャー、イギリス）を用いて検出した。メンブレンをβ-アクチンに対する抗体（サンタクルズ）と共にインキュベートして、タンパク質が等量ローディングされていることを評価した。結果に密度測定を行った。
【０５９８】
4．動物実験
ヌードマウスはチャールスリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories、ウィルミントン、マサチューセッツ州）から得た。エストロゲンペレットを0.5 mgの用量で頚部後方領域に注射した。2日後、MCF-7-Her-18細胞を胸部乳房脂肪床に密度5×106個/マウスで注射した。腫瘍の大きさが100 mm3に達した際に、マウスを六つの治療群に分けた：リン酸緩衝生理食塩液（PBS）、Ad-Luc単独、Ad-mda7単独、ハーセプチン単独、Ad-Luc＋ハーセプチン、およびAd-mda7＋ハーセプチン。ウイルスベクターを2×1010ウイルス粒子の用量で週に1回、3週間腫瘍に直接注射した。ハーセプチンを110 μg/動物の用量で腹腔内注射によって輸送した。腫瘍の大きさを測定し、屠殺するまで週に2回記録した。
【０５９９】
5．統計分析
図に示したデータは、3回の独立した実験の平均値と共に標準偏差を表す。腫瘍の大きさの差を、スチューデントt検定によって有意性に関して分析した。ウェスタンブロットの密度測定も同様に、スチューデントt検定によって有意性に関して分析した。
【０６００】
結果
1．Ad-mda7処置は乳癌細胞の増殖を阻害する
乳癌細胞株SKBr3（Her2+）およびMCF-7（Her2-）をAd-mda7またはAd-Lucによって処置して、細胞生存率を評価した。図1に示すように、Ad-mda7はHer2+およびHer2-乳癌細胞株の双方の増殖を阻害し、MDA-7による殺細胞がHer2の状態とは無関係であることを示している。この結果を、さらなるHer2+およびHer2-乳腺腫瘍株において確認した。ハーセプチンとAd-mda7の併用効果を評価するために、同じ細胞株をハーセプチン単独、またはAd-mda7もしくはAd-Lucとの併用によって処置した。ハーセプチンは、Her2+ SKBr3乳腺腫瘍細胞の殺細胞を誘導したが、Her2-MCF-7細胞の殺細胞を誘導しなかった。低用量のハーセプチンと併用すると、Ad-mda7の細胞溶解活性はHer2+細胞の場合に限って強く増強され、相加的より大きい殺細胞が得られる。対照的に、Her2-細胞では、ハーセプチンによって提供された細胞障害性に有意差を認めなかった。Ad-lucをハーセプチンと併用すると、作用はハーセプチン単独と同等であった。これらおよびさらなる乳癌細胞株に関するさらなる試験から、図1において認められた細胞溶解活性の増強がAd-mda7＋ハーセプチンの併用によって処置したHer2+細胞におけるアポトーシス誘導の増加によるものであることが示された。
【０６０１】
ハーセプチンとAd-mda7との相乗効果のメカニズムを評価して、異種移植片モデルにおける組み合わせ相乗効果も評価した。残念なことに、先の段落で考察したHer2+細胞株は、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成せず、このように、本発明者らはMCF-7-Her-18細胞株を利用するモデル系を改変した。この細胞株は、Her-2/neu発現ベクターが安定にトランスフェクトされているHer2- MCF-7細胞に由来した。
【０６０２】
2．Ad-mda7はβ-カテニン、Akt、およびp-Aktレベルを減少させる
乳癌および肺癌細胞株のAd-mda7処置によって、Aktおよびp-Akt2の発現が減少する。同様に、β-カテニンはAd-mda7によって負の調節を受けることが示されている。Ad-mda7の他にハーセプチンがβ-カテニン、Akt、およびp-Aktのレベルにより大きい減少を引き起こすか否かを調べるために、MCF-7-Her-18細胞にAd-mda7またはAd-lucを個々にまたはハーセプチンと併用して形質導入した。Ad-mda7 2500 vp/細胞をトランスフェクトした後に、Akt、p-Akt、およびβ-カテニンのレベルの減少を認めた。細胞をAd-mda7＋ハーセプチンの併用によって処置した場合、三つ全てのタンパク質の定常状態レベルはより大きく減少する。ウェスタンブロット分析により、Ad-mda7およびハーセプチンをトランスフェクトした後MCF-7-Her18細胞においてAkt発現の減少が示された。タンパク質発現の減少は、PBSと比較して、Ad-mda7およびハーセプチンに関して認められた。しかし、ハーセプチン＋Ad-mda7の併用により、Ad-mda7またはハーセプチン単独のいずれかと比較してより有意な減少が示された（ｐ＜0.05）。対照アデノウイルスルシフェラーゼベクターは、Aktのタンパク質レベルにほとんどまたは全く減少を示さなかった。同様に、p-Aktのウェスタンブロット分析は、類似の結果を示した。Ad-mda7およびハーセプチンによる処置後のp-Aktタンパク質レベルは、PBSおよびAd-lucの双方より有意に低かった。AktのAd-mda7＋ハーセプチンによる阻害と比較すると、ハーセプチン＋Ad-mda7の併用によって、p-Aktはより大きく減少した。β-カテニンに関するもう一つのウェスタンブロット分析から、ハーセプチン＋Ad-mda7の併用療法により、Ad-mda7またはハーセプチン単独と比較してβ-カテニン発現がより大きく減少することが判明した。
【０６０３】
3．Ad-mda7＋ハーセプチンはヌードマウスにおいて腫瘍の増殖を阻害する
MCF-7-Her-18細胞から産生された皮下腫瘍を有するヌードマウスに、腫瘍が100 mm3に達した場合にAd-mda7またはAd-Lucを腫瘍内投与して、ハーセプチンを腹腔内注射によって全身投与した。PBSまたはAd-Lucによって処置した腫瘍は大きさが増加し続けたが、Ad-mda7単独またはハーセプチン＋Ad-mda7を注射した腫瘍は対照と比較して有意な増殖阻害を示した。全ての群の動物の処置は腫瘍が約100 mm3に達した場合に開始したことに注意されたい。PBSおよびAd-luc処置腫瘍の増殖速度は同等であった。しかし、Ad-mda7またはハーセプチンによって処置した腫瘍の増殖速度がかなり遅かったことは、図5に示す動態分析から明らかである。ハーセプチンおよびAd-Luc＋ハーセプチンによって処置した腫瘍は非常に類似の増殖パターンを示し、Ad-Lucに抗腫瘍効果がないことを確認した。Ad-mda7単剤治療によって処置した腫瘍は、ハーセプチン単剤療法によって得られた阻害よりいくぶん大きい増殖阻害を示した。しかし、Ad-mda7＋ハーセプチンの併用は活性の増強を示し、少なくとも15日間ほぼ完全な増殖抑制を示した後、腫瘍は徐々に増殖するように思われる。増殖速度の代わりに一般的に用いられる代用測定手段は腫瘍倍加時間である。PBSおよびAd-Luc対照に関して、これはそれぞれ、5日および11日で起こるであろう。ハーセプチンおよびAd-Luc＋ハーセプチン処置腫瘍はそれぞれ、16日および14日で倍加した。Ad-mda7によって処置した腫瘍は約21日で大きさが倍加したのに対し、Ad-mda7＋ハーセプチンの併用では、腫瘍倍加時間は28日より長かった。
【０６０４】
4．Ad-mda7とハーセプチンとの併用治療によるHER2/NEU過剰発現乳癌細胞のアポトーシスの増加
HER-2/neuを過剰発現するMCF-7乳癌細胞株（MCF/HER2-18）に、Ad-mda7、ハーセプチン、対照アデノウイルスルシフェラーゼベクター（Ad-Luc）、ならびにハーセプチンとAd-mda7およびAd-Lucの併用をそれぞれ形質導入した。細胞生存率を比色（MTT）アッセイによって評価して、アポトーシスを蛍光活性化細胞ソーティング分析（FACS）によって評価した。Bcl-2およびPARP発現はウェスタンブロットによって評価した。
【０６０５】
MCF/HER2-18においてAd-mda7およびハーセプチンの併用によって、MTTアッセイによって示されるように、ハーセプチンまたはAd-mda7単独と比較して増殖の急激な減少が得られた（P＜0.01、ANOVA）。さらに、FACS分析から、この併用療法によって有意なアポトーシス細胞死が示された。アポトーシスは、ウェスタンブロット分析においてPARP切断およびBcl-2発現の減少によって確認した。
【０６０６】
実施例35：MDA-7は二本鎖RNA活性化タンパク質キナーゼPKRと物理的に会合する
材料および方法
1．細胞株および試薬
A549（wt p53）およびH1299（p53ヌル）ヒト肺癌細胞株は、既に記述されているように（Pataerら、2002）アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。PKR+/+およびPKR-/-細胞は、Glen N Barber博士（マイアミ大学医学部）から得た。PKR+/+およびPKR-/-細胞は、10％ウシ胎児血清、10 mMグルタミン、100 単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン（ライフテクノロジーズインク、グランドアイランド、ニューヨーク州）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）において5％CO2大気中で37℃で維持した。シクロヘキシミド（CHX）はシグマケミカル（セントルイス、ミズーリ州）から得た。組換え型MDA-7タンパク質はイントロゲンテラピューティクス（ハウストン、テキサス州）から得た。
【０６０７】
2．アデノウイルス産生
Ad-mda7、Ad-bak、Ad-lacZ、およびAd-Lucベクターの構築は既に報告されている（Pataerら、2002）。様々な癌細胞株におけるアデノウイルスベクターの形質導入効率を、細胞にAd-LacZを感染させることによって決定し、細胞の少なくとも70％を形質導入するために必要な力価を決定した。
【０６０８】
3．フローサイトメトリー分析
アポトーシス細胞数はヨウ化プロピジウム染色およびFACS分析によって測定した。細胞を回収して遠心沈降させ、50 μg/mlヨウ化プロピジウム、0.1％トライトンX-100、および0.1％クエン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩液に浮遊させた。試料を4℃で1〜3時間保存して、ボルテックスミキサーによって攪拌してからFACS分析（ベクトンディッキンソンFACスキャン、マウンテンビュー、カリフォルニア州；FL-3チャンネル）を行った。
【０６０９】
4．リアルタイムPCR
RT-PCRは、製造元（ライフテクノロジーズ、ガイサースバーグ、メリーランド州、アメリカ）の説明書に従ってサーモスクリプトRT-PCRシステムキットを用いて行った。総RNAをトリゾル抽出のプロトコール（ライフテクノロジーズ）に従って単離し、各試料1 μgを、2 mMデオキシヌクレオチドミクス、100 mM DTT、RNアーゼ阻害剤40単位、ランダムプライマー50 ng、およびサーモスクリプト逆転写酵素15単位を含む反応によって相補的DNA（cDNA）に逆転写した。リアルタイムPCRは既に報告されているプロトコールを用いて行った（Vorburgerら、2002）。
【０６１０】
5．ウェスタンブロット分析
トランスフェクションの48時間後、細胞抽出物を調製して、表記の抗体を用いて記述されているとおりに（Pataerら、2002）イムノブロットアッセイを行った。以下の抗体を用いた：p53に対するモノクローナル抗体はファーミンゲン（サンジエゴ、カリフォルニア州）から購入した。抗-PKR（K-17）、抗β-アクチン、抗stat3（F-2）、およびホスホ特異的抗stat3（B-7）抗体はサンタクルズバイオテクノロジー（サンタクルズ、カリフォルニア州）から得た。MDA-7に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、イントロゲンテラピューティクスインク（ハウストン、テキサス州）から得た。
【０６１１】
6．同時免疫沈降分析
細胞をAd-mda7またはAd-Lucによって48時間処置した後、RIPA緩衝液（1×PBS、1％ノニデットP-40、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS）において溶解した。細胞溶解物500 μlをタンパク質A/Gアガロース20 μlと共に4℃で30分間インキュベートした。洗浄した細胞抽出物に一次抗体を加えて、軽く揺り動かしながら4℃で一晩インキュベートした。プロテインA/Gアガロースを混合物に加えて4時間インキュベートした。ビーズを2500 rpm、4℃での5分間の遠心によって沈降させた。沈降物をRIPA緩衝液1 mlによって4回洗浄した。最後の洗浄後、1×SDS-PAGE試料緩衝液50 μlをビーズに加えた。混合物をボルテックスミキサーによって攪拌した後、5分間沸騰させた。混合物を2500 rpmで1分間遠心して、上清をゲルにローディングした。
【０６１２】
7．細胞局在試験
A549およびH1299細胞（5×104個/ウェル）をチャンバースライドにおいて70％コンフルエンスまで増殖させた後、Ad-luc、Ad-mda7、またはPBSをトランスフェクトした。48時間後、細胞をPBSによって洗浄して、新しく調製した4％パラホルムアルデヒド/PBSによって15分間固定した。次に、細胞を0.2％トライトンX-100によって4℃で20分間透過性にして、1％正常ヤギ血清によって1時間ブロックした。ウサギポリクローナル抗PKR（K-17）およびマウスモノクローナル抗MDA-7を4℃で一晩インキュベートして、ローダミンまたはフルオレセイン-5-イソチオシアネート二次抗体によって37℃で30分間展開した。次に細胞を蛍光顕微鏡下で可視化して、共焦点顕微鏡によってさらに評価した。
【０６１３】
8．統計分析
報告されたデータは3回の独立した実験の平均値を表し、バーは標準偏差（SD）を示す。
【０６１４】
結果
1．Ad-mda7はヒト肺癌細胞においてアポトーシスおよびPKR誘導を誘導する
アポトーシスのフローサイトメトリー分析をA549（wt p53）およびH1299（ヌルp53）ヒト肺癌細胞においてAd-mda7、Ad-lucおよびPBSを感染後48時間に行った。Ad-lucおよびPBSと比較すると、Ad-mda7によって、A549およびH1299ヒト肺癌細胞の双方において高レベルのアポトーシスが起こった。Ad-mda7がインビトロでPKR誘導を誘導できるか否かを調べるために、Ad-mda7処置A549細胞をウェスタンブロット分析によって評価した。Ad-mda7処置によって、A549細胞においてPKRの用量依存的な誘導が起こった。低レベルのAd-mda7（500 vp/細胞；25 vp/細胞）もPKR誘導を引き起こしたが、PKRレベルはAd-mda7の用量と共に増加し続けた。類似のPKR誘導はH1299細胞においても認められた。
【０６１５】
2．細胞内MDA-7タンパク質はAd-mda7誘導細胞死において重要な役割を有する
最近の研究から、Ad-mda7形質導入細胞が、隣接する非形質導入癌細胞に対して傍観者的な殺細胞作用を誘発する可能性がある可溶型MDA-7タンパク質を分泌することが示されている（Mhashilkarら、2001）。Ad-mda7形質導入細胞の溶解物は、約30および23 kDaでMDA-7のバンドの免疫反応性二重項を示すが、上清の試料は約40 kDaで新規タンパク質バンドを示した（Mhashilkarら、2001）。したがって、分泌型MDA-7のA549細胞（wt p53）およびH1299（ヌルp53）ヒト肺癌細胞に及ぼす抗腫瘍効果を評価した。MDA-7分泌型タンパク質は、A549またはH1299肺癌細胞株に対して細胞増殖阻害または細胞死を誘導しなかった。対照的に、Ad-mda7処置によって、双方の肺癌細胞株に対して細胞増殖の阻害および同時にアポトーシスが起こった。MDA-7分泌型タンパク質がインビトロでPKR誘導を誘導することができるか否かを決定するために、MDA-7タンパク質処置細胞をウェスタンブロット分析によって評価した。MDA-7分泌型タンパク質は、A549細胞においてPKRを誘導しなかった。対照的に、Ad-mda7処置A549細胞は、PKRの強い発現およびStat3のリン酸化を誘導した。
【０６１６】
3．MDA-7はdsRNA依存的タンパク質キナーゼPKRと物理的に相互作用する
免疫蛍光染色および共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、A549およびH1299細胞におけるMDA-7およびPKRタンパク質悪双方の細胞下局在を調べた。これまでの研究から、PKRはサイトゾルおよび核に存在することが示されている（Taylorら、1999）。免疫蛍光試験から、MDA-7タンパク質は主に細胞質に分布することが示された。MDA-7は内因性のPKRタンパク質を誘導し、同様に双方のNSCLC細胞株においてPKRと同時に局在した。
【０６１７】
NF90（核因子90）およびPACT（PKRのタンパク質活性化因子）およびウイルスタンパク質TRBP（TAR RNA結合タンパク質）のような細胞タンパク質、ならびにワクシニアウイルスE3Lタンパク質を含む、いくつかのdsRNA結合タンパク質がPKRと相互作用する（Yinら、2003）。MDA-7タンパク質がPKRと物理的に相互作用できるか否かをA549およびH1299細胞において調べた。PKRタンパク質を、抗-PKR抗体を用いてPBS、Ad-luc、およびAd-mda7処置溶解物から免疫沈降させて、試料をMDA-7に対する抗体によるイムノブロッティングによって分析した。抗PKR抗体はPBS、またはAd-luc処置細胞においてMDA-7タンパク質を免疫沈降しなかった。対照的に、Ad-mda7形質導入細胞では、MDA-7はPKRに対する抗体によって免疫沈降することができる。一つの主要なMDA-7免疫反応性バンドがMDA-7抗体によって認識された。タンパク質-タンパク質相互作用を確認するために、相反する実験を行った。PBS、Ad-lucおよびAd-mda7処置細胞溶解物をMDA-7に対する抗体によって免疫沈殿させた場合、PKRはAd-mda7処置細胞溶解物に限って検出することができた。同時免疫沈降試験から、TRBP、PACT、NF90およびE3Lのように、MDA-7がdsRNA依存的タンパク質キナーゼPKRと物理的に相互作用できることが示された。
【０６１８】
4．Ad-mda7誘導細胞死におけるPKRタンパク質の役割
Ad-mda7誘導細胞死に対するPKR誘導の関与を評価するために、同質遺伝子PKR欠損細胞株（PKR+/+およびPKR-/-）を利用した。PKRヌル（-/-）および野生型PKR細胞株の双方における適切な形質導入およびMDA-7タンパク質の発現にもかかわらず、野生型PKR（+/+）細胞株のみがAd-mda7処置後に細胞死を受け、Ad-mda7による殺細胞がPKRに依存的であったことを示唆している。予想されたように、Ad-mda7は、PKR+/+細胞株においてPKR誘導を誘導した。Ad-mda7とは異なり、Ad-Bakによる殺細胞は、細胞死がPKRヌルおよび野生型PKR細胞株の双方において起こったことからPKRのゲノム状態に依存しなかった。次に、免疫沈降アッセイを行って、PKR+/+およびPKR-/-細胞株を用いてMDA-7およびPKRのリン酸化型を検出した。MDA-7およびPKRのリン酸化型は、PKR+/+細胞に限って検出され、PKR-/-細胞では検出されなかった。PKRおよびMDA-7タンパク質はいずれもAd-mda7形質導入細胞においてトレオニンおよびセリンの部位でリン酸化された。MDA-7またはPKRタンパク質のチロシンリン酸化は、Ad-mda7形質導入細胞において検出することができなかった。
【０６１９】
実施例36：組換え型ヒトMDA-7/IL-24タンパク質は内皮細胞におけるDNA修復およびアポトーシスの阻害に関係するタンパク質の発現を抑制する
組換え型MDA-7/IL-24タンパク質はインビトロでヒト内皮細胞の増殖を抑制して、内皮細胞を放射線増感する。
【０６２０】
アポトーシスの回復および放射線増感を媒介する可能性があるMDA-7/IL-24タンパク質の分子作用を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を10 ng/ml MDA-7/IL-24タンパク質によって12時間処置して、細胞をウェスタンブロットによって分析した。pSTAT3およびpATFの活性化が認められたが、pAKTおよびp-p38の減少が認められた。アポトーシスに関与するタンパク質であるBcl-xLおよびサバイビンのタンパク質レベルも同様に抑制された。同様に、MDA-7/IL-24による処置後に、放射線によるDNA損傷の修復に関与するタンパク質であるKu70およびXRCC4のダウンレギュレーションも認められ、血管新生に関与するタンパク質であるIL-8の抑制も認められた。他の多くのタンパク質、すなわちBax、p21、p27、およびp53のレベルはこれらの処置によって一定のままであった。
【０６２１】
HUVECにおけるMDA-7/IL-24処置後のタンパク質発現の変化がこれらのタンパク質をコードする遺伝子の転写の抑制によるものであるか否かを調べるために、MDA-7/IL-24を処置したHUVECをRPA分析によって分析した。結果から、HUVECのMDA-7/IL-24処置が、そのタンパク質産物が放射線によるDNA損傷の修復に重要に関与しているいくつかの遺伝子の転写に影響を及ぼすことが示唆された。したがって、MDA-7/IL-24タンパク質は、遺伝子転写の変化に至るシグナル伝達カスケードを開始させる可能性がある。これらによって、次にDNA修復に関与するタンパク質の発現が抑制された。これらのタンパク質における個々の変化は比較的小さいが、いくつかの重要な修復タンパク質が抑制され、それと共にそれらは放射線増感に至るDNA修復能に負の影響を及ぼす可能性がある。
【０６２２】
実施例37：マウス腫瘍細胞増殖のヒトMDA-7/IL-24媒介阻害におけるPERKの関与
MDA-7による腫瘍抑制活性のメカニズムは腫瘍細胞のタイプによって変化し、PKR、p38MAPK、およびpJNKはアポトーシスを誘導するための主要な経路であると同定された。
【０６２３】
本研究において、MDA-7/IL-24がマウス腫瘍細胞に対して類似の阻害活性を発揮できるか否かを調べた。マウス線維肉腫（UV2237mおよびMCA-16）をmda-7/IL-24遺伝子を有するアデノウイルスベクター（Ad-mda7；10,000 vp/細胞）によって処置すると、MDA-7/IL-24タンパク質の外因性の発現が起こり、PBS処置またはAd-luc（ベクター対照）処置細胞と比較してG2/M期で有意な（P＝0.001）増殖阻害が起こった。対照的に、正常マウス線維芽細胞（10T1/2）では、Ad-mda7によって処置しても増殖阻害作用を認めなかった。増殖阻害およびアポトーシスのメカニズムを調べる研究から、マウス腫瘍細胞ではヒト細胞とは異なり、PKR、p38MAPK、およびpJNKの活性化が認められないことが判明した。対照的に、PERKおよびその下流の標的であるeIF2-αおよびカスパーゼ-12の活性化が認められ、それによってその後カスパーゼ-9、カスパーゼ-3の活性化およびPARP切断が起こった。
【０６２４】
さらに、同系C3H/Ncrマウスにおいて自然発生的に確立されたUV2237m腫瘍を、DOTAP：コレステロール（DOTAP：Chol）リポソームベクターに封入したmda-7/IL-24遺伝子によって処置すると、PBSによって処置した腫瘍またはDOTAP：Cholリポソームに封入された対照プラスミドによって処置した腫瘍と比較して、有意な増殖阻害が起こった。動物を週3回の腫瘍内注射（50 μg DNA/用量）によって3週間処置した。さらに、mda-7/IL-24を処置した動物の40％において完全な退縮を認めた。これらの結果は、ヒトMDA-7/IL-24がインビトロおよびインビボの双方においてPERK経路を通してマウス腫瘍の増殖を阻害できることを示している。
【０６２５】
実施例38：アデノウイルス媒介MDA-7発現はDNA修復能を抑制し、肺の非小細胞癌細胞を放射線増感する
材料および方法
1．細胞培養
ヒトの肺の非小細胞癌（NSCLC）細胞株A549、正常ヒト肺線維芽細胞株（NHLF）、CCD-16、およびヒト神経膠腫細胞株MO59JおよびMO59Kは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）から得た。細胞株は全てATCCによって明記されたとおりに維持した。
【０６２６】
2．アデノウイルスベクターおよび遺伝子輸送
Ad-mda7、Ad-Luc、およびAd-β-galは全てイントロゲンテラピューティクスインク（ハウストン、テキサス州、アメリカ）から得た。Ad-Lucを対照ベクターとして用い、Ad-β-galはレポーターベクターとして用いた。ベクターは複製コンピテントアデノウイルスおよびマイコプラズマの有無に関して試験してそれらを含まないと決定された。播種の48時間後、細胞を、血清を含まない培地1 mlにおいて精製ベクターと共に1時間インキュベートした。インキュベーション後、10％ウシ胎児血清を添加した新鮮な培地を各フラスコに加えた。偽トランスフェクションのベクターを含めることを除いて同一であるプロトコールにおいて、無血清培地を用いた。感染多重度を計算するための細胞数は、無処置フラスコにおいて細胞を計数することによって決定した。
【０６２７】
3．核タンパク質抽出物
細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩液によって2回すすぎ、セルスクレイパーによって回収して500×gで4℃で10分間遠心した。細胞沈降物を冷溶解緩衝液（10.0 mM HEPES、pH 7.9、10.0 mM KCl、0.1 mMエチレンジアミン四酢酸、0.1 mMグリコールエーテルジアミン四酢酸、1.0 mMジチオスレイトール、2.0 μg/mlロイペプチン、2.0 μg/mlアプロチニン、0.5 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド）400 μlに浮遊させて、氷中で10分間インキュベートした。その後10％ NP-40 12.5 μlを加えて、混合物を5秒間ボルテックスミキサーによって攪拌した。次に、溶解物を500×gで、4℃で5分間遠心して、上清を除去し、細胞質抽出物として保存した。沈降物を抽出緩衝液（20.0 mM HEPES、pH 7.9、400.0 mM NaCl、1.0 mMエチレンジアミン四酢酸、1.0 mMグリコールエーテルジアミン四酢酸、1.0 mMジチオスレイトール、2.0 μg/mlロイペプチン、2.0 μg/mlアプロチニン、0.5 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド）30 μlに浮遊させて、十分に混合して氷中で30分間インキュベートした。沈降物を10分毎に攪拌した。30分後、抽出物を微量遠心機において最大速度で10分間遠心した。上清を核抽出物と命名して少量に分けて-70℃で保存した。得られた核タンパク質の量は、バイオラッドタンパク質アッセイ（バイオラッドラボラトリーズ、リッチモンド、カリフォルニア州、アメリカ）を用いて製造元の説明書に従って、タンパク質標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて決定した。
【０６２８】
4．抗体
DNA-PKcsおよびXRCC4に対するウサギポリクローナル抗体は、ジーンテクス（GeneTex、サンアントニオ、テキサス州、アメリカ）から購入した。Ku70およびβ-アクチンに対するヤギポリクローナル抗体は、サンタクルズバイオテクノロジー（サンタクルズ、カリフォルニア州、アメリカ）から購入した。Ku86に対するマウスモノクローナル抗体、クローンKu15はシグマ-アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）から購入した。DNAリガーゼIVに対するウサギポリクローナル抗体は、セロテック（Serotec、ローリー、ノースカロライナ州、アメリカ）から購入した。
【０６２９】
5．ウェスタンブロット分析
等量の核タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（4％スタッキングゲルを含む8〜12％ポリアクリルアミド）によって分離した後、イモビロン-Pメンブレン（ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ州、アメリカ）に転写した。5％脱脂粉乳のTBS-T（0.05％ツイーン-20を含むTBS）をブロッキング溶液として用い、TBS-T単独を洗浄緩衝液として用いた。メンブレンをブロッキング溶液において一次抗体と共に4℃で一晩処置して、ブロッキング溶液において二次抗体と共に室温で1時間処置した。結果を高感度化学発光（アマシャム、アーリントンハイツ、イリノイ州、アメリカ）によって製造元のプロトコールに従って可視化した。
【０６３０】
6．RNアーゼ保護アッセイ
細胞にAd-mda7またはAd-Lucのいずれかをトランスフェクトした。48時間インキュベートした後、トリゾル試薬（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、アメリカ）を用いてRNAを抽出した。プローブを32P-UTPによって標識して単離されたRNAとハイブリダイズさせた。用いたプローブセットは、hDSBR-2（ファーミンゲン、サンジエゴ、カリフォルニア州、アメリカ）であった。ハウスキーピング遺伝子L32およびGAPDHを試料の標準化のために用いた。RNアーゼの消化後、保護された断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。段階は全て製造元の推奨に従って実施した。
【０６３１】
7．DNA DSB修復アッセイ
電離放射線に曝露後のDNA DSB修復活性に関するアッセイは、既に記述されているとおりに（Kurimasaら、1999；Storyら、1994）行った。簡単に説明すると、ベクター処置の48時間後、細胞に氷中で137Csユニット（3.5 Gy/分）を用いて放射線照射して、累積線量40 Gyを照射した。放射線照射の直後、冷培地を37℃に加温しておいた培地に交換して、細胞を37℃の組織培養インキュベータに適当な時間（0分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、または24時間）入れて、DSBを修復させた。次に、細胞を氷中でトリプシン処理して洗浄し、アガロースプラグに抱埋して溶解し、プロテナーゼKによって消化した。DNAはコンタークランプド均一電場PFGE（CHEF-DR IIIシステム、バイオラッドラボラトリーズ）を用いて0.5×TBE緩衝液において1.5 V/cmで25℃で20時間分離した。ゲルをナイロンメンブレンに室温で3日間転写した。メンブレンを32P-標識ヒトAlu+プローブに45℃で18時間ハイブリダイズさせた。プラグからレーンに放出された活性の分画を、イメージクアントソフトウェアプログラム（モレキュラーダイナミクス、サニーベール、カリフォルニア州）によってストレージホスホイメージングシステムを用いて決定した。
【０６３２】
8．HCR
HCRアッセイの改変型を用いてDNA修復能を評価した（Eadyら、1992；McDonaldら、1996；Rainbow、1974；Rainbow and Mak、1972）。簡単に説明すると、6ウェルプレートに細胞を播種して、上記のようにAd-mda7、Ad-Luc、または偽処置を行った。細胞に、前処置後48時間目に、放射線を照射していないまたは照射したAd-β-galをトランスフェクトした。Ad-β-galに、1％ウシ胎児血清を添加した培地において1/100希釈で高線量率の137Csユニット（34.3 Gy/分）を用いて室温で放射線を照射した。Ad-β-galによるトランスフェクションの24時間後、細胞を2.00％ホルムアルデヒドおよび0.05％グルタルアルデヒドのリン酸緩衝生理食塩液溶液によって固定して、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）によって染色した。細胞修復系の能力は、顕微鏡下で陽性染色細胞を計数することによってアッセイした。放射線照射Ad-β-galを用いた結果を、放射線を照射していないAd-β-galによって処置した細胞の結果と比較した。実験は1試料あたり3個ずつ行った。
【０６３３】
結果
1．Ad-mda7は、NSCLC細胞においてDNA修復に関与するタンパク質の発現を抑制するが正常線維芽細胞では抑制しない
Ad-mda7はNSCLC細胞を放射線増感するが、正常線維芽細胞は増感せず、これは、このベクターがNSCLC細胞ではc-Jun転写因子の活性化を誘導できるが線維芽細胞では誘導できないことと相関する。このように、DNA修復の経路における変化のように放射線増感を支配する上で重要である遺伝子の発現の変化に関して調べることは興味深かった。
【０６３４】
哺乳類細胞において、非相同末端結合（NHEJ）は、電離放射線に対する曝露によって誘導されるDSBを修復するための主要な経路である。Ad-mda7がNHEJ経路に関与するタンパク質の発現レベルに影響を及ぼすか否かを決定するために、核タンパク質抽出物にウェスタンブロット分析を行った。A549細胞においてKu70、XRCC4およびDNAリガーゼIVタンパク質の発現レベルは、Ad-mda7処置によって減少した。一方、これらのタンパク質の発現の減少は同一に処置した場合CCD16細胞において認められなかった。NSCLC細胞における作用は、対照ベクター、Ad-Lucがいずれの細胞株においてもそれらのタンパク質の発現に影響を及ぼさなかったことから、Ad-mda7に対して特異的であるように思われた。
【０６３５】
2．Ad-mda7はA549細胞におけるDNA修復遺伝子mRNAの発現を減少させる
抑制されたタンパク質レベルがこれらのタンパク質をコードする遺伝子の転写の減少を反映するか否かを調べるために、対象遺伝子に関してRNアーゼ保護アッセイを行った。結果から、いくつかのDNA修復遺伝子に関するmRNAレベルがAd-mda7を処置したA549細胞では無処置対照と比較して低かったことが示された。いくつかの遺伝子において、対照ベクターAd-Lucはまた転写にも影響を及ぼした。しかし、対象遺伝子、すなわちKU70、Lig4、XRCC4、およびDNA-PKのいくつかの転写は、Ad-Lucによる場合よりAd-mda7によってより大きい程度に影響を受けた。
【０６３６】
3．放射線照射後のDNA DSB修復は、Ad-mda7トランスフェクションによって抑制される
上記のように、そのタンパク質産物が放射線誘導DSBの修復において重要である遺伝子の発現の抑制はAd-mda7の放射線増感作用と一致するが、これらの病変の修復が実際にこの処置後に損なわれていることを確認する必要があった。このように、Ad-mda7トランスフェクションがA549細胞においてDSB再結合動態に影響を及ぼすか否かを決定するために、放射線照射後の総DSB誘導および再結合をパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を用いて調べた。この分析の結果から、0時点で調べた場合に40 Gyの線量を照射後に断片化DNAの実質的な量がプラグからレーンへと移動したことが示された。この作用はAd-mda7処置細胞および対照に関して類似であり、Ad-mda7処置が放射線によるDSBの誘導を増強しないことを示している。しかし、時間の関数として、レーンにおけるDNAの比率は、DSBが再結合すると減少した；これは対照よりAd-mda7処置細胞ではより遅いプロセスであるように思われた。多くのゲルを定量して、平均値をプロットして、異なる処置後のDSB修復の動態を評価した。全体的な修復の動態は群が異なっても非常に類似であったが、Ad-mda7による前処置によって、無処置対照またはAd-Lucを前処置した細胞と比較して、24時間での残留非結合病変はより高レベルであったように思われた。
【０６３７】
4．宿主細胞の再活性化（HCR）はA549細胞ではAd-mda7によって抑制されるがCCD16細胞では抑制されない
厳密に言えば、上記で用いたDSB修復に関するPFGEアッセイは、総DSB再結合を実際に測定しており、これには染色体の転座に至るような切断されたDNA断片の不適切な再結合が含まれる。さらに、これはそれによって欠失が起こる誤修復病変を検出しないことから、細胞の生存に関与する修復量を過剰評価している。このように、DNA修復の信頼度および全体的な能力を調べるために、放射線増感を支配するDNA修復経路のAd-mda7による抑制能に関するさらなる試験としてHCRアッセイを用いた。γ放射線照射アデノウイルス媒介β-ガラクトシダーゼ（Ad-βgal）をレポーターベクターとして用い、β-ガラクトシダーゼを読み取り値として用いた。Ad-mda7もしくはAd-Lucによって、または偽トランスフェクトによって前処置したA549細胞およびCCD16細胞におけるレポーター遺伝子発現を測定することによって、修復の程度を評価した。結果は、Ad-Lucを前処置または偽トランスフェクトした対照細胞と比較して、Ad-mda7を前処置したA549ではHCRが抑制されたことを示した。対照的に、HCRの有意な抑制は、Ad-mda7を前処置後のCCD16細胞では認められなかった。HCRアッセイがDNA修復における既知の欠損を検出するために十分な感度であることを確認するために、DNA依存的タンパク質キナーゼ（DNA-PK）がそれぞれ、十分であるおよび欠損しているヒト神経膠腫細胞株MO59KおよびMO59Jにおいて、アッセイを試験した。HCRは、MO59K細胞と比較して、MO59J細胞では約50％有意に減少した。Ku70/Ku80ヘテロ二量体および触媒サブユニットDNA-PKcsを含むDNA-PKは、DSB修復のNHEJ経路にとって必要である。MO59J細胞のようなDNA-PK活性を欠損する細胞は、DNA-PK成分の欠損のために、電離放射線に対して過敏反応を示し、DSB再結合動態が損なわれていることが示されている（Allalunis-Turnerら、1993；Lees-Millerら、1995）。
【０６３８】
本明細書において開示および請求した成分および／または方法は全て、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作製および実行することができる。本発明の組成物および方法は、いくつかの態様に関して記述してきたが、組成物および方法、本明細書に記載の方法の段階または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、趣旨、および範囲に含まれることは当業者に明らかであろう。より詳しく述べると、化学的および生理学的に関連する特定の物質を、本明細書に記述の物質の代わりに用いてもよく、それでも同じまたは類似の結果が得られるであろうことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換および改変は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および考え方に含まれると思われる。
【０６３９】
参考文献
以下の参考文献は、特に参照として本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０６４０】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の特定の局面をさらに証明するために含められる。本発明は、本明細書に示した特定の態様に関する詳細な説明と共に、これらの図面の一つまたはそれ以上を参照することによってよりよく理解される。
【図１】sMDA-7は、内皮細胞の分化を阻害するが、インビトロの増殖は阻害しない。HUVECおよびHMVECを24時間無血清として、1 ng/ml bFGFおよび表記の濃度のsMDA-7を含む2-ウェルチャンバースライドガラスに播種した（A）。PBSおよびアンジオスタチンによって処置した細胞をそれぞれ、陰性および陽性対照とした。増殖は、実施例1に示すように72時間後に測定した。（B）、2ウェルチャンバースライドガラスに播種した肺腫瘍細胞（H1299およびA549）を、表記の濃度のsMDA-7によって処置した。PBSおよびAd-mda7によって処置した細胞をそれぞれ、陰性および陽性対照とした。増殖は、実施例1に示すように72時間後に測定した。マトリゲルコーティング96ウェルプレートに播種したHUVECをPBS、sMDA-7（50 ng/ml）またはsMDA-7を免疫的に枯渇した調製物によって処置して、管形成を観察した（C）。処置は全て1試料あたり2個ずつアッセイした。sMDA-7は、内皮の管形成を完全に阻害したが、sMDA-7タンパク質の免疫的枯渇によって、PBS処置対照細胞において認められた場合と類似の管形成の回復が得られた。倍率10倍。sMDA-7/IL-24処置HUVECおよびHMVECにおける内皮管形成数の半定量的分析から、双方の細胞タイプにおいてsMDA-7によって管形成の有意な（p＝0.001）阻害が示された（C）。バー、SE。
【図２】sMDA-7は、インビトロで内皮細胞分化の阻害においてエンドスタチンより強力である。HUVECを、1 ng/ml bFGFならびに表記の等モル濃度のsMDA-7およびエンドスタチンを含むマトリゲルコーティング96ウェルプレートに播種した。処置の24時間後、プレートを顕微鏡下で管形成に関して観察して、管の数を計数した。PBSを処置した細胞を陰性対照とした。処置は全て1試料あたり2個ずつアッセイし、実験は5〜6回繰り返した。sMDA-7は内皮の管形成を用量依存的に有意に（p＝0.001）阻害して、10 ng/mlより高い濃度では完全な阻害を認めたが、エンドスタチンは阻害しなかった。エンドスタチンによる管形成の阻害は、最高濃度（300 ng/ml）で認められたに過ぎなかった。値は、3回の実験の平均値として示す。バー、SE。
【図３】sMDA-7は内皮細胞の遊走を阻害する。HUVECを、0.5％FBSにおいて一晩枯渇させ、24ウェルトランスウェルインサートの上室に播種して、100 ng/ml VEGFおよび10 ng/ml sMDA-7を含む24ウェルプレートに入れた。下室に遊走した細胞数を高倍率下で計数した。sMDA-7は、VEGF単独によって処置した細胞と比較して、24時間におけるVEGF誘導HUVEC誘導を有意に（p＝0.001）阻害した。PBS処置細胞を陰性対照とした。
【図４】MDA-7の阻害活性は、HUVECによるIFN-γおよびIP-10産生によるものではない。6ウェルプレートに播種したHUVECをsMDA-7/IL-24（10 ng/ml）によって処置した。細胞培養上清を表記の時点で回収して、ELISAによってIFN-γ（A）およびIP-10（B）に関して分析した。IFN-γまたはAd-mda7を処置したHUVECからの上清をそれぞれ、IP-10およびIFN-γELISAの陽性対照とした。PBS処置細胞からの上清を陰性対照とした。処置は全て1試料あたり4個ずつアッセイした。（C）、マトリゲルコーティング96ウェルプレートに播種したHUVECをsMDA-7、IFN-γ、またはIP-10の等モル濃度によって処置して、管形成に関して分析した。管の数を計数することによって、阻害活性を決定した。sMDA-7は、IFN-γまたはIP-10と比較して低濃度で管形成を有意に（p＝0.01）阻害した。IFN-γまたはIP-10の阻害活性は高濃度に限って認められた。（C）管の数を計数することによって、阻害活性を決定した。sMDA-7は、IFN-γまたはIP-10と比較して低濃度で管形成を有意に（p＝0.01）阻害した。IFN-γまたはIP-10の阻害活性は高濃度に限って認められた。（D）、抗IL-10または抗IFN-γ中和抗体を処置したHUVECを、マトリゲルコーティング96ウェルプレートに播種して、sMDA-7によって処置して、管形成に関して分析した。sMDA-7は、管形成を有意に（p＝0.001）阻害した。バー、SE。
【図５】sMDA-7は、IL-22R1による内細胞分化を阻害する。HUVECを無処置、または異なる二つの濃度のIL-22R1ブロッキング抗体によって24時間処置した後、PBS、または表記の濃度のsMDA-7、エンドスタチン、もしくはIP-10を含むマトリゲルコーティング96ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を明視野顕微鏡において管形成に関して調べて定量した。管形成は、sMDA-7/IL-24処置HUVECにおいて阻害されたが、PBS処置対照細胞では阻害されなかった（A）。しかし、IL-22R1ブロッキング抗体の存在下では、HUVEC管形成に及ぼすsMDA-7の阻害作用は、用量依存的に消失した。エンドスタチンまたはIP-10は、IL-22R1抗体を前処置したHUVECの管形成を阻害した（B）。バー、SE。
【図６】インビボ血管新生および腫瘍増殖試験。bFGF 60 ngを含むマトリゲルに封入されたsMDA-7（12.5 ng）を無胸腺ヌードマウスの皮下に移植した。bFGFのみを含むマトリゲルを陽性対照とし、PBSを含むマトリゲルを陰性対照とした。10日後、マトリゲルを回収して、実施例1に記述するようにヘモグロビンレベルに関して分析した。対照と比較してsMDA-7/IL-24を含むマトリゲルにおいて、ヘモグロビンレベルの有意な（p＝0.0001）減少を認めた（A）。A549腫瘍細胞と親293細胞または293-mda-7細胞の等量混合物（1：1）をヌードマウスに移植することによって増殖させた皮下腫瘍の測定（B）。親293細胞を含む腫瘍と比較して293-mda-7細胞を含む腫瘍では、有意な（p＝0.001）増殖阻害を認めた（B）。各時点は、各群に関する平均腫瘍容積を表す。バーは標準誤差を表す。親293細胞を含む腫瘍と比較して293-mda-7細胞を含む腫瘍組織におけるMDA-7タンパク質発現を、ウェスタンブロット分析によって検出した。実験終了時、腫瘍を採取して分析した。293-mda-7細胞を含む動物からの腫瘍試料におけるヘモグロビンレベルは、親293細胞を含む動物からの腫瘍試料の場合より低かった（C）。A549腫瘍細胞を下位右わき腹に注入することによって、皮下腫瘍を確立した（D）。腫瘍が触診可能となれば、各マウスの上位右わき腹にマトリゲル封入親293細胞またはマトリゲル封入293-mda-7細胞を移植した。腫瘍の増殖はカリパーを用いて測定した。腫瘍の増殖は、293細胞を処置した腫瘍の場合より293-mda-7細胞を処置した腫瘍において有意により多く阻害された（p＝0.001）。各時点は各群の平均腫瘍容積を表す。バーは標準誤差を表す。CD31染色に関する腫瘍組織の半定量的分析から、親293細胞を処置した腫瘍と比較して293-mda-7細胞を処置した腫瘍では微小管密度の有意な減少が示された（E）。バー、SE。
【図７】mda-7を、非複製アデノウイルス構築物（Ad-mda7）を用いて進行癌腫を有する患者に腫瘍内注射によって投与した、フェーズI用量増加臨床試験の試験計画。試験計画は、コホートあたりの患者数、ウイルス用量、および生検時期を示す。
【図８】DNAコピー数／μg DNA対腫瘍内注射後の時間を表す棒グラフ。注射の24時間以内に、MDA-7タンパク質発現の用量依存的な増加を認めるが、これは96時間までに減少する。
【図９】TUNEL染色によるアポトーシスが病変中心部では最も強いことを示す患者の結果のチャート。病変辺縁部での部分は、非注射病変と比較して強いTUNEL反応を示した。
【図１０】Ad-mda7に対する血清サイトカイン反応の動態のグラフによる表示、血清サイトカインの％増加対処置後日数を示す。結果は、Ad-mda7の腫瘍内注射後、血清サイトカインが一過性に増加したことを示している。
【図１１】コホートあたりの腫瘍内Ad-mda7処置に対する血清サイトカインの反応。多数の患者が、全身性サイトカイン（IL-6、IL-10、IFNγ、TNFα、GM-CSF）の一過性の増加を示した。
【図１２】腫瘍内Ad-mda7を投与した患者における増加したCD8+ T細胞発生率のレベル。CD3+ CD8+ T細胞は、mda7処置後15日目で30±13％増加した。
【図１３】被験者におけるAd-mda7腫瘍内注射後の末梢血CD8+細胞の増加。
【図１４】MDA-7の一段階陰イオン交換精製。陰イオン交換カラムからのそれぞれのピーク（1、2、3、4）は、ウェスタンブロット上でポリクローナル抗MDA-7によって検出されたMDA-7を含む。
【図１５】分子量に対する保持時間の比較。MDA-7複合体は85〜95 kDaのあいだに溶出する。
【図１６】MDA-7過剰発現は細胞増殖を阻害する。腫瘍細胞（DU145、LNCaP、およびPC-3）および正常細胞（PrEC）をPBSによって処置、Ad-lucによって処置、またはAd-mda7によって処置して、様々な時点でMDA-7発現または細胞生存率に関して分析した。PBS、Ad-luc、およびAd-mda7による処置後の腫瘍および正常細胞の細胞増殖の測定。値は、1試料あたり3個ずつの平均値として表す。統計学的有意差はP＝＜0.05として設定した。誤差のバーは、標準誤差（SE）を示す。
【図１７】MDA-7発現は、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが正常細胞では誘導しない。PBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって処置した腫瘍細胞（DU 145、LNCaP、およびPC-3）および正常上皮細胞（PrEC）を処置の72時間後に回収して、フローサイトメトリーによってサブ-G0/G1期の細胞に関して分析した。各処置に関して20000事象を獲得し、データをヒストグラムとして表す。データは、1試料あたり3個ずつの平均値である。バーは標準誤差（SE）を示す。
【図１８】MDA-7によるG2細胞周期停止の誘導。腫瘍細胞（DU 145、LNCaP、およびPC-3）および正常細胞（PrEC）を、PBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって処置した。細胞を処置の72時間後に回収して、フローサイトメトリーを用いて細胞周期分析を行った。各処置に関して20000事象を獲得し、データをヒストグラムとして表す。Y-軸は細胞数を表し、X-軸は細胞周期の期を表す。データは、1試料あたり2個ずつの平均値である。バーは標準誤差（SE）を示す。
【図１９】クローン原性生存アッセイに基づいて決定したAd-mda7による放射線増感。Ad-mda7およびAd-lucに関して用いたベクター濃度は、A549細胞株（A）に関して1000 vp/細胞；H1299細胞株（B）に関して250；およびCCD-16（C）およびMRC-9（D）細胞株に関して1500であった。放射線はトランスフェクションの48時間後に照射した。各データポイントは、独立した3回の実験の平均値を表す。記号は偽感染（黒菱形）；Ad-mda7（黒四角）；およびAd-luc（黒三角）を表す。バー、SE。
【図２０】A549（A）、H1299（B）、CCD-16（C）、およびMRC-9（D）細胞に関するTUNELアッセイによって評価したアポトーシス。トランスフェクションの48時間後に細胞に放射線を照射して、放射線照射の2日後、またはトランスフェクションの4日後に回収した。用いたベクター濃度は、図19に用いた濃度と同一であった。各データポイントは、独立した実験2回の平均値を表す。バー、SE。
【図２１】Ad-mda7またはノコダゾール（200 ng/ml）のいずれかを処置したA549およびH1299の細胞周期分析。Ad-mda7のトランスフェクションの48時間後に存在する割合と同じ割合の細胞をG2/M期に蓄積させるノコダゾールの用量および曝露時間を、予備実験において決定した。示したデータは、独立した2回の実験の代表的な値である。
【図２２】ノコダゾール（200 ng/ml）によって誘導されるG2/M停止による放射線増感を決定するためのクローン原性生存アッセイ。A549細胞株に関してはノコダゾール曝露の4時間後、H1299細胞株に関してはノコダゾール曝露の3.5時間後に、放射線を照射した。記号は、放射線単独（黒菱形）；ノコダゾール（白四角）を表す。バー、SE。
【図２３】クルクミンまたはクルクミンプラスAd-mda7のいずれかを処置したA549およびH1299細胞における放射線増感を決定するためのクローン原性生存アッセイ。トランスフェクションの2日後に放射線を照射した。クルクミンはトランスフェクションの1日後に加えた。用いたベクター濃度は、図19に関して用いた濃度と同一であった。各データポイントは、独立した3回の実験の平均値を表す。バー、SE。
【図２４】rhMDA-7タンパク質は黒色腫細胞を殺す。MeWo細胞を0〜20 ng/ml rhMDA-7によって処置して、4日後、トリパンブルーを用いて生存率を評価した。細胞はまた、抗MDA-7抗体（ウサギポリクローナル：Pabまたはマウスモノクローナル抗体：Mab）または対照ヒトIgGの存在下で20 ng/ml rhMDA-7によって処置した。
【図２５】黒色腫腫瘍のMDA-7発現は、腫瘍のiNOS発現と負の相関を示す。iNOS数の平均値とMDA-7数の平均値のあいだの負の関連（A）。ケンドールのτ-b相関係数は‐0.209であり。0とはp＜0.05で有意に異なった。iNOSの強度の平均値とMDA-7の強度の平均値のあいだの負の関連（B）。ケンドールのτ-b相関係数は‐0.201であり、0とはp＜0.05で有意に異なった；バー、±SD。
【図２６】ヒト黒色腫細胞株MeWoをrhMDA-7によって処置後4時間でのIRF-1およびIRF-2のイムノブロッティング分析。処置には、培地のみ（レーン1、陰性対照）；非トランスフェクトHEK 293細胞からの上清（レーン2、陰性対照）；5 ng/ml rhMDA-7（レーン3）；および20 ng/ml rhMDA-7（レーン4）が含まれた。メンブレンを、2000倍希釈の抗IRF-1およびIRF-2抗体によってイムノブロットした。代表的な一つの実験を示す。グラフは、細胞溶解物におけるアクチンタンパク質に対して標準化後のIRF-1およびIRF-2発現を示し、実験2回の平均値を表す。バー、SD。
【図２７】Ad-mda7はタモキシフェンの抗腫瘍効果を増強する。
【図２８】Ad-mda7およびMDA-7タンパク質は、黒色腫細胞からのサイトカイン分泌を調節する。
【図２９】A549肺転移に及ぼすAd-mda7の影響。
【図３０】PAC1細胞は、アデノウイルスベクターによって強く形質導入される。ヒトH1299肺癌またはPAC1細胞に、50または100 pfu/細胞のAd-SM22-β-gal（Ad-SM22）、またはAd-RSV-β-gal（Ad-RSV）を表記のMOIで形質導入した。24時間後、細胞をβ-gal活性に関して染色してX-gal陽性細胞を計数した。データは1試料あたり3回の計数の平均値として示す。
【図３１】MDA-7は、PAC1細胞増殖を抑制する。PAC1 SMCにAd-mda7またはAd-lucを表記のMOIで形質導入した。形質導入の3日後、生存細胞を手動で1試料あたり3回ずつ計数した。データは平均値±SDとして示す。（*）対照ウイルス（Ad-luc）と比較してp＜0.05。
【図３２】Ad-mda7によるPAC1におけるアポトーシスの誘導。A．Ad-mda7はカスパーゼ-3活性を増加させる。PAC1細胞にAd-mda7またはAd-lucをMOI 100で形質導入した。形質導入の48時間後、細胞溶解物一組をカスパーゼ-3活性アッセイのために用い、もう一組を総タンパク質定量のために用いた。カスパーゼ-3活性を総タンパク質に対して標準化して、単位／総タンパク質10 μgとして表記した。対照ウイルス（Ad-luc）および無処置対照（A）と比較してp＜0.05（*）。アネキシンV結合アッセイ。PAC1細胞にAd-mda7またはAd-lucをMOI 100で形質導入して、形質導入の24時間後、FITC-標識アネキシンVによって染色した。処置細胞をフローサイトメトリーによって分析した（B）。初期アポトーシス細胞の百分率をModfitソフトウェアを用いて計算した。対照ウイルス（Ad-luc）と比較してp＜0.05（*）。DAPI染色アッセイ（C）。PAC1細胞にAd-mda7またはAd-lucをMOI 100で形質導入して、形質導入の24、48、72時間後にDAPIによって染色して、アポトーシス核が染色質の脱濃縮の証拠を示した場合に、アポトーシス核を陽性と採点した。対照ウイルス（Ad-luc）と比較してp＜0.05（*）。
【図３３】Ad-mda7によるPAC1細胞遊走の阻害。コンフルエントPAC1細胞にAd-mda7またはAd-lucをMOI 100で形質導入して、実施例22に記述されるように処置した。顕微鏡によって定量化した創傷への細胞の遊走を示す棒グラフ。+FBS対-FBSに関してp＜0.01（#）；Ad-mda7対無処置またはAd-luc+FBSに関してp＜0.01（*）；Ad-mda7対無処置またはAd-luc-FBSに関してp＜0.05（△）。
【図３４】INGN 241の生物作用に関する経時的変化と用量反応。INGN 241の臨床試験における異なる六つのコホートに関して示された経時的変化および用量。
【図３５】MDA-7タンパク質発現はアポトーシス誘導に相関する。MDA-7のタンパク質レベルを調べて異なる患者10人からの切片についてtunelアッセイを行った。
【図３６】異なる腫瘍切片におけるMDA-7のRNA、DNA、およびタンパク質発現レベルを、黒色腫を有する患者4において評価した。
【図３７】注射部位からのMDA-7 DNAおよびRNAの広がりを患者10人において評価した。
【図３８】MDA-7タンパク質レベルおよびアポトーシスの程度を多数の患者からの異なる切片において評価した。
【図３９】MDA-7発現の広がりも同様に評価して、TUNELアッセイを用いてアポトーシスレベルと相関させた。
【図４０】注射時点からのMDA-7 DNAの経時的変化を評価した。
【図４１】注射時点からのMDA-7タンパク質およびアポトーシスレベルの経時的変化を評価した。
【図４２】フェーズII臨床試験の初回結果。
【図４３】AsPc1、Capan2およびMiaPaCa2膵臓癌細胞を2000 vp/細胞のAd-mda7およびAd-lucによって72時間処置して、トリパンブルーを用いて生存率を分析し、アネキシンV染色を用いてアポトーシスを分析した。データは平均値＋SDとして示す。
【図４４】MiaPaCa2細胞をAd-mda7または対照によって処置して、40時間後に放射線を照射して、クローン原性アッセイのために播種した。
【図４５】AsPc1およびMiaPaCa膵臓癌細胞株を2000 vp/細胞のAd-lucまたはAd-mda7によって処置して、24時間後XRT（5 Gy）を処置した。細胞を、ヨウ化プロピジウムによる処置によって3日目に細胞周期の変化に関して評価して、FACSによって分析した。Ad-mda7/XRT試料におけるG2/Mブロックおよびサブ-G0シグナルに注目されたい。
【図４６】Ad-mda7は、NF-κB依存的レポーター遺伝子発現を活性化する。
【図４７】ドミナントネガティブI-κBα安定細胞におけるAd-mda7の細胞障害作用。
【図４８】Ad-mda7は、ドミナントネガティブI-κBα細胞における細胞増殖を有意に抑制する。
【図４９】Ad-mda7は、アポトーシスの誘導に関してスリンダクと相乗効果を示す。A．Ad-mda7単独およびスリンダクとの併用によって処置した細胞におけるアポトーシス率。B．腫瘍（A549およびH1299）および正常（CCD-16）細胞をPBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって3時間処置した。処置後、細胞を表記の濃度のスリンダクと共にインキュベートした。72時間後、トリパンブルー排除アッセイ法を用いて細胞生存率を決定した。細胞増殖の百分率は、各群の細胞数の平均値として計算して、PBS、Ad-luc、またはAd-mda7単独によって処置した各試料（100％に設定）と比較して表記した。Ad-mda7／スリンダクによって処置した腫瘍は、PBSおよびAd-luc処置と比較して有意に阻害されたが（p＝0.001）正常細胞は阻害されなかった。スリンダクによって媒介される阻害作用は用量依存的であった。バー、SE。C．FACSによるアポトーシス細胞の分析。腫瘍細胞（A549およびH1299）および正常（CCD-16）細胞を、様々な用量のスリンダクの存在下で、PBS、Ad-luc、またはAd-mda7によって処置した。処置の72時間後、細胞をヨウ化プロピジウムによって染色してFACS分析を行った。アポトーシス細胞の百分率は、サブ-G1期の細胞を定量することによって決定した。1試料あたり2個ずつの平均値を示す；少なくとも2回の独立した実験において類似の結果を認めた。バー、SE。D．皮下H1299担癌ヌードマウスを群に分けた（n＝8/群）。Ad-mda7／スリンダクによって処置した動物は、PBS、スリンダク、Ad-mda7、またはAd-luc／スリンダクによって処置した動物と比較して有意な腫瘍増殖阻害を示した。Ad-mda7（3×109 vp）を週に3回腫瘍内注射によって投与して、スリンダク（40 mg/kg）を腹腔内注射によって毎日注射した。表記の腫瘍容積は、各群／時点での平均値を表す。バー、SE。
【図５０】卵巣癌細胞株5個（MDAH2774、OVCAR 420、DOV 13、HEY、およびSKOV3-ip）のアデノウイルス形質導入を、細胞にAd-GFPを感染させることによって決定した。
【図５１】Ad-mda7による感染後の卵巣癌細胞株MDAH 2774およびOVCA 420における細胞増殖の阻害。
【図５２】フローサイトメトリー分析は、有意な増殖抑制を示した卵巣癌細胞株5個中2個、すなわちMDAH 2774およびOVCA 420におけるG2/M集団の百分率の顕著な増加を示す。
【図５３】MDA-MB-486乳癌細胞における細胞生存。
【図５４】A549腫瘍増殖（A）およびマウスの生存（B）における放射線処置前のAd-mda7投与の影響。A549細胞（5×106個）を、ヌードマウスにおいて異種移植片腫瘍として増殖させた。担癌マウスに放射線（5 Gy）、Ad-mda7（3×1010 vpを3つの分画で）、または両者の併用を処置した後、腫瘍容積を実施例27に記載するように測定した。腫瘍が直径15 mmに達した場合、または潰瘍化した場合に動物を屠殺した。データは平均値±SE（A）として表記する。
【図５５】A549腫瘍の増殖における併用療法の様々なレジメの効果。担癌マウスを以下のように処置した：対照、Ad-mda7（1日目）プラス放射線照射（6日目）、Ad-mda7（5日目）プラス放射線照射（6日目）、または放射線照射（6日目）プラスAd-mda7（7日目）。
【図５６】TUNELの免疫組織化学分析。腫瘍におけるアポトーシスを処置後（8日目）TUNEL染色によって検出して、アポトーシス細胞を光学顕微鏡（倍率400倍）下で計数して、癌細胞少なくとも1000個の百分率としてアポトーシス指数を計算した。
【図５７】VEGF、bFGF、およびIL-8のタンパク質発現を、免疫組織化学によって染色陽性であるか否かによって分析した。皮下腫瘍を14日目に採取した。陽性染色細胞を光学顕微鏡（倍率400倍）下で計数して、癌細胞少なくとも1000個の百分率として陽性率を計算した（A、B、C）。
【図５８】微小血管密度は、CD31陽性血管構造を計数することによって決定した。
【図５９】HUVECSのクローン原性生存。増殖因子を12時間枯渇させた後、HUVECSをMDA7タンパク質（10 ng/ml）（A）、アンジオスタチン（100 ng/ml；B）またはエンドスタチン（100 ng/ml；C）に12時間曝露した。次に、細胞に放射線（0〜6 Gy）を照射して、回収し、通常の培地に播種した。14日後にコロニーを染色して、生存分画を決定した。データは、異なる3回の実験の平均値±SEとして示す。
【図６０】A549細胞（A）およびCCD16細胞（B）のクローン原性生存。細胞を12時間血清を枯渇して、mda7タンパク質（10 ng/ml）を含む条件培地によって処置した。12時間後、細胞に放射線を照射して回収し、通常の培地に播種した。14日間インキュベートした後、コロニーを計数して、生存。
【図６１】完全長、細胞質、核、および小胞体（ER）を含むターゲティングプラスミド構築物。
【図６２】MDA-7のERターゲティングはコロニー形成を遮断する。
【図６３】ER-ターゲティングMDA-7はアポトーシス促進性である。
【図６４】卵巣癌細胞株においてAd-mda7によって引き起こされた増殖阻害。
【図６５】Ad-mda7処置卵巣癌細胞の細胞周期分析。A：MDAH 2774；B：OVCA 420。
【図６６】卵巣癌細胞におけるAd-mda7によるアポトーシスの誘導。
【図６７】MDA-7/IL-24は腫瘍細胞の遊走を阻害する。肺腫瘍細胞（A549およびH1299）をAd-lucまたはAd-mda7によって処置した。細胞をトランスフェクションの6時間後に回収して、トランスウェルユニットの上室に播種した。A：48時間後、メンブレンを固定してクリスタルバイオレットによって染色し、ウェルの下側に遊走した細胞数を明視野顕微鏡（上のパネル；倍率200倍）下で計数した。Ad-mda7によって処置した細胞はPBSまたはAd-luc（下のパネル）によって処置した細胞より、有意に遊走能が低かった（p＝0.002）。B：処置後24時間および48時間での細胞生存率の分析は、腫瘍細胞の増殖に有意な阻害を示さなかった。バーは標準誤差を示す。
【図６８】MDA-7/IL-24は腫瘍細胞の浸潤を阻害する。肺腫瘍細胞（H1299およびA549）をPBS、Ad-luc（2500 vp/細胞）もしくはAd-mda7（2500 vp/細胞）によって処置した、または10 μM LY 294002もしくは1μg/ml MMP-II阻害剤によって処置した。6時間後、細胞を回収して、計数し、マトリゲルコーティングウェルの上のウェルに加えた。37℃でのインキュベーションによって細胞を浸潤させた。48時間後、細胞を固定して、クリスタルバイオレットによって染色した。ウェルの下側に遊走した細胞を観察して、倍率200倍の光学顕微鏡下で計数した。処置あたりの浸潤細胞数を盲検的に計数して、異なる3回の実験の平均値として記録した。Ad-mda7を処置した細胞は、PBSまたはAd-lucを処置した細胞より少ない浸潤を示した（p＝0.001）。MDA-7によって媒介される阻害効果は、LY 294002およびMMP II阻害剤について認められた阻害効果と類似であった。バーは、標準誤差を示す。
【図６９】MDA-7/IL-24は肺転移を阻害する。A549肺腫瘍細胞をPBS、Ad-luc、およびAd-mda7によってエクスビボで処置した。6時間後、細胞を回収して、洗浄し、PBSに再浮遊させて、雌性ヌードマウスに尾静脈から注入した。動物は各群5匹であった、腫瘍細胞注入の3週間後、動物をCO2吸入によって安楽死させて、肺腫瘍結節を解剖顕微鏡下で計数した。Ad-mda7を処置した腫瘍細胞を注射した動物では、PBSまたはAd-lucを処置した腫瘍細胞を注射した動物より有意に少ない（p＝0.01）肺腫瘍を認めた。結果は、異なる2回の実験の平均値である。バーは標準誤差を示す。
【図７０】MDA-7/IL-24は肺転移を阻害する。実験的A549肺転移を有するマウスを無処置（対照）、またはDOTAP：Chol.CAT、またはDOTAP：Chol-mda7複合体によって処置した。動物を6用量の尾静脈注射によって毎日処置した。最後の処置の3週間後、動物を安楽死させて、肺腫瘍の数を計数した。DOTAP：Chol.mda-7複合体を処置した動物は、無処置またはDOTAP：Chol.CAT複合体を処置した動物と比較して、肺転移の有意な阻害を示した（p＝0.001）。バーは標準誤差を示す。
【図７１】DOTAP：Chol.mda-7複合体は、皮下腫瘍の増殖を抑制する。皮下腫瘍（A549またはUV223m）を有するヌードマウスおよびC3Hマウスを群に分けて、以下のように合計6用量（50 μg/用量）を毎日処置した：無処置、PBS、DOTAP：Chol.Lac-Z複合体、またはDOTAP：Chol.CAT複合体、およびDOTAP：Chol.mda-7複合体。A、A549。B、UV2237m。各時点は、各群の平均腫瘍容積を表す。バーは標準誤差を表す。C．皮下腫瘍を処置後48時間で採取して、MDA-7タンパク質発現に関して分析した。DOTAP：Chol.mda-7複合体によって処置した腫瘍では、A549腫瘍細胞の18％、およびUV2237m腫瘍細胞の13％がMDA-7タンパク質を産生したのに対し、対照腫瘍はMDA-7タンパク質を産生しなかった。
【図７２】MDA-7は、DOTAP：Chol-mda-7複合体による処置後にアポトーシス細胞死を誘導する。無処置、PBS、DOTAP：Chol-LacZまたはDOTAP：Chol.CAT複合体、またはDOTAP：Chol-mda7複合体を投与した動物からの皮下腫瘍（A549およびUV2237m）を採取して、TUNEL染色によってアポトーシス細胞死に関して分析した。DOTAP：Chol.mda-7複合体によって処置した腫瘍においてアポトーシス細胞死を受けた細胞の百分率（A549細胞に関して13％およびUV2237mに関して9％）は、他の治療群より有意に高かった（P＝0.001）。バーは標準偏差を示す。
【図７３】DOTAP：Chol-mda-7複合体は腫瘍の血管形成を阻害する。無処置、またはPBS、DOTAP：Chol-Lac-ZもしくはDOTAP：Chol-CAT複合体、またはDOTAP：Chol.mda7複合体によって処置した皮下腫瘍（A549およびUV2237m）を、CD31に関して染色し、半定量的分析を行った。CD31-陽性内皮染色は、DOTAP：Chol-mda-7処置腫瘍では他の治療群の腫瘍より有意に低かった（P＝0.01）。バーは標準偏差を示す。
【図７４】DOTAP：Chol-mda-7複合体は、実験的肺転移を阻害する。肺腫瘍（A549、UV2237m）を有するnu/nuまたはC3Hマウスに合計6用量（50 μg/用量）のPBS、DOTAP：Chol-CAT複合体またはDOTAP：Chol-mda-7複合体を毎日処置した。転移性の腫瘍増殖は、二つの対照群と比較してDOTAP：Chol-mda-7複合体を処置したヌードマウスおよびC3Hマウスではいずれも有意に阻害された（P＝＜0.05）。バーは標準偏差を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｂ】
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【図５９Ｃ】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７１Ｃ】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月26日(2006.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性である精製MDA-7タンパク質。
【請求項２】
少なくとも約25％均一まで精製される、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項３】
少なくとも約40％均一まで精製される、請求項２記載のMDA-7タンパク質。
【請求項４】
少なくとも約50％均一まで精製される、請求項３記載のMDA-7タンパク質。
【請求項５】
少なくとも約60％均一まで精製される、請求項４記載のMDA-7タンパク質。
【請求項６】
少なくとも約70％均一まで精製される、請求項５記載のMDA-7タンパク質。
【請求項７】
少なくとも約80％均一まで精製される、請求項６記載のMDA-7タンパク質。
【請求項８】
少なくとも約90％均一まで精製される、請求項７記載のMDA-7タンパク質。
【請求項９】
少なくとも約95％均一まで精製される、請求項８記載のMDA-7タンパク質。
【請求項１０】
活性タンパク質がアポトーシスを誘導する能力を有する、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１１】
活性タンパク質が血管新生を阻害する能力を有する、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１２】
活性タンパク質がIL-22受容体に結合する能力を有する、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１３】
活性タンパク質がSTAT3を活性化する能力を有する、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１４】
多量体である、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１５】
グリコシル化されている、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１６】
薬学的に許容される組成物に製剤化されている、請求項１記載の精製MDA-7タンパク質。
【請求項１７】
配列番号：2のアミノ酸100〜206位および小胞体ターゲティング配列を含むタンパク質。
【請求項１８】
請求項１記載の精製された分泌型MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、癌患者を治療する方法。
【請求項１９】
MDA-7タンパク質が活性であって、組成物中のタンパク質に関して少なくとも約80％均一である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
患者に放射線療法または化学療法を行うことをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
癌患者が上皮細胞癌を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
癌患者が黒色腫または膵臓癌を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
核酸が細胞において機能的なプロモーターの制御下に存在する、MDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターの有効量を細胞に投与することを含む、癌細胞を放射線増感する方法。
【請求項２４】
癌細胞が上皮細胞である、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
アデノウイルスベクターの投与後72時間以内に癌細胞に放射線照射を行うことをさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
NF-κB阻害剤と、MDA-7タンパク質またはプロモーターの制御下でMDA-7をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターのいずれかを含む組成物とを患者に投与することを含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項２７】
NF-κB阻害剤がスリンダクである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
MDA-7が、癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する、MDA-7タンパク質を含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する方法。
【請求項２９】
癌が黒色腫、肺の非小細胞、肺の小細胞、肺、肝癌、網膜芽種、星状細胞腫、神経膠芽腫、歯肉、舌、白血病、神経芽腫、頭部、頚部、乳腺、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮種、頚部、消化管、リンパ腫、脳、結腸、または膀胱である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
癌が肺癌である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
MDA-7タンパク質が癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する、MDA-7タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的に許容される組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における癌の局所浸潤および／または転移を阻害または防止する方法。
【請求項３２】
MDA-7タンパク質をコードするポリヌクレオチドが発現構築物を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
発現構築物が、プロモーターの制御下でMDA-7タンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む、請求項３２記載の方法。
【国際調査報告】
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