(57)【要約】本発明は、肝星状細胞（HSC）のアポトーシスのインビボにおける人工的な誘導が、肝線維化の寛解を促進可能であるという知見に基づく。したがって本発明は、肝星状細胞のアポトーシスを被験対象の肝臓で選択的に誘導可能なアポトーシスの誘導因子、またはこのような誘導因子を被験対象で生成可能な薬剤の投与を含む、被験対象の肝疾患の治療法を提供する。また本発明は、被験対象の肝星状細胞に特異的なアポトーシスの誘導因子、または肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子を生成可能な薬剤の選択的な輸送を含む、被験対象の肝線維化の治療法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導因子もしくは薬剤が、
（a）被験対象の肝臓内で、肝星状細胞に選択的に輸送される誘導因子もしくは薬剤；
（b）被験対象の肝臓内で、肝星状細胞のアポトーシスを選択的に誘導する誘導因子か、もしくは肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子を生じる薬剤；および/または、
（c）肝星状細胞でアポトーシスの誘導因子を特異的に生成する誘導因子もしくは薬剤である、肝星状細胞のアポトーシス誘導因子の有効量、または肝星状細胞のアポトーシス誘導因子を生成可能な薬剤の有効量を、被験対象に投与する段階を含む、被験対象の肝疾患の治療法。
【請求項２】
被験対象の肝臓においてアポトーシスを起こすように誘導される肝星状細胞の数が、アポトーシスを起こすように誘導される肝細胞の数と比較して少なくとも10倍大きい、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験対象に投与されるアポトーシスの誘導因子か、またはアポトーシスの誘導因子を生成する薬剤が、肝星状細胞のアポトーシスを被験対象の肝臓で誘導するが、他の細胞型のアポトーシスを被験対象の肝臓で誘導しない、請求項1記載の方法。
【請求項４】
投与されるか、または生成するアポトーシスの誘導因子が、肝星状細胞のアポトーシスのみを被験対象の肝臓で誘導可能であり、また他の任意の細胞型のアポトーシスを被験対象の身体で誘導不可能な、請求項1記載の方法。
【請求項５】
被験対象の肝星状細胞の表面には見出されるが他の肝臓細胞型の表面には見出されない分子に、被験対象に投与される誘導因子または薬剤が特異的に結合する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
被験対象の肝星状細胞の表面には存在するが、被験対象の身体内の他の細胞型の表面には存在しない分子に、被験対象に投与される誘導因子または薬剤が結合する、請求項5記載の方法。
【請求項７】
誘導因子と結合する分子が細胞表面受容体であり、受容体との結合がアポトーシスを引き起こす、請求項5記載の方法。
【請求項８】
分子と受容体の結合が、肝星状細胞内への誘導因子または薬剤の内在化を招く、請求項5記載の方法。
【請求項９】
投与されるか、または生成する誘導因子が5HT2受容体の拮抗物質である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
誘導因子が5HT2B受容体サブタイプの拮抗物質である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
誘導因子または薬剤が、リポソームまたはウイルスを用いて被験対象の肝星状細胞に輸送される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
被験対象に投与される薬剤が、以下の核酸コンストラクトを含む、請求項1記載の方法：
肝星状細胞のアポトーシスのポリペプチド誘導因子をコードするコンストラクト；
転写されて、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能なRNA分子を生成可能なコンストラクト；および/または、
発現されると、アポトーシスの誘導因子の生成につながるポリペプチドをコードするコンストラクト。
【請求項１３】
ポリペプチドをコードするか、または転写されてRNA誘導因子を生成可能な、被験対象に投与される薬剤中の核酸が、肝星状細胞に特異的なプロモーターに使用可能に連結されていることで、被験対象の肝星状細胞でのみ発現される、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
被験対象に投与される薬剤中の核酸が、肝星状細胞のアポトーシスを誘導するアンチセンス核酸またはsiRNA分子を発現可能な核酸領域を含む、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
被験対象に投与される誘導因子または薬剤が、被験対象の肝臓の肝星状細胞の表面には存在するが、肝臓の他の細胞型には存在しない受容体を用いて、肝星状細胞に選択的に輸送される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
被験対象に投与される誘導因子または薬剤が、被験対象の肝星状細胞の表面に存在する受容体に結合可能な分子を有するリポソームもしくはウイルスを用いて輸送されるか、または同リポソームもしくはウイルスを含み、またこのような誘導因子もしくは薬剤が細胞内に内在化される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
被験対象に投与される肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子が、グリオトキシン、または肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能なグリオトキシン誘導体からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
グリオトキシンまたは誘導体が、被験対象の体重1 kgあたり0.1〜25 mgの量で被験対象に投与される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
被験対象に投与されるか、または生成する、肝星状細胞のアポトーシス誘導因子が、神経成長因子、神経成長因子の誘導体、またはp75受容体の拮抗物質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
p75受容体の拮抗物質がスピペロンまたはこの誘導体である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
被験対象に投与されるか、または生成する誘導因子が、マトリックスメタロプロテアーゼ（TIMP）の組織阻害物質とマトリックスメタロプロテアーゼとの相互作用を阻害する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
被験対象に投与されるか、または生成する誘導因子が、TIMP-1とMMPの相互作用を阻害する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
投与されるか、または生成する誘導因子が、スルファサラジン、または肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能なこの誘導体である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
誘導因子または薬剤が、誘導因子または薬剤を含むインプラントの状態で被験対象に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
インプラントが被験対象の肝臓に挿入される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
治療対象となる被験対象が肝硬変に罹患している、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
被験対象が、病原体に起因する線維化、自己免疫状態に起因する線維化、薬剤曝露による線維化、化学物質曝露に起因する線維化、アルコール摂取に起因する線維化、遺伝条件に起因する線維化、および原発性胆汁性肝硬変からなる群より選択される状態である、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子、または肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子をインビボで生成可能な薬剤；および肝疾患に罹患した被験対象への誘導因子または薬剤の投与法が記載された指示書を含むキット。
【請求項２９】
肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子、または肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子をインビボで生成可能な薬剤；および肝疾患に罹患した被験対象の肝星状細胞に誘導因子または薬剤を選択的に輸送する方法が記載された指示書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、肝疾患の治療法に関し、また特に肝線維化の寛解を促進する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝線維化は、細胞外マトリックスタンパク質の蓄積を特徴とする。肝臓は、線維化で蓄積したマトリックスを分解することで、線維化を寛解に導く能力をある程度有するが、場合によっては、線維化は良好に寛解せず徐々に進行する。この結果、肝臓の組織全体が不安定化し、血流が変化し、また肝細胞を破壊に導く線維性物質を伴う肝機能損傷が拡大する。
【０００３】
肝線維化は、肝臓が、線維性物質および壊死物質の領域に囲まれた健康な（すなわち再生性の）肝臓組織の島を伴う結節状構造となる肝硬変に進行する場合がある。肝線維化が進行すると、罹患個体には重度の疾患が生じ、入院を繰り返すことが多くなり、また究極的には肝不全および死に至る場合がある。肝疾患は30〜60代における最も主要な死因の1つであり、また多くの場合、現時点で唯一の有効な治療法は肝移植である。
【０００４】
肝線維化には、いくつかの原因があり、また肝線維化は慢性肝損傷に対する一般的な応答である。肝線維化には、生体異物による損傷（xenobiotic damage）（例えば、過剰量の長期にわたるアルコール摂取に起因する場合があるほか、特定の薬剤による場合がある）；ウイルス感染（例えばB型肝炎やC型肝炎ウイルスの感染）；ならびに一部の遺伝病（例えば肝ヘモクロマトーシス）などのさまざまな機構が介在している可能性がある（Friedman et al., N. Engl. J. Med., (1993) 328: 1828-1835）。
【０００５】
線維化が一過性か進行性であるかを決定する可能性のある因子の1つは線維化の基礎疾患であり、また作用因子に一過的に曝露しただけか、または曝露が長期に及んだかということである。例えば、継続曝露が作用因子となるような場合では、これは肝臓が線維化から寛解する機会が事実上ないことを意味する場合がある。ある程度の寛解の期間がある可能性があるが、線維性物質の進行性の蓄積が全体的な傾向である。
【０００６】
肝星状細胞（HSC）は、肝線維化で重要な役割を果たすことが知られている（Friedman et al., J. Biol. Chem., (2000) 275: 2247-2250, Alcolado et al., Clin. Sci., (1997) 92: 103-112、およびIredale et al., J. Clin. Invest., (1998) 102: 538-549）。肝星状細胞は、肝臓内でディッセ腔に局在し、レチノイドを保存するように機能する。興味深いことに肝星状細胞には、線維化を促進可能な因子だけでなく、線維化の寛解を促すと考えられている因子の両因子を合成する能力がある。
【０００７】
肝損傷に応じて肝星状細胞は、筋線維芽細胞様（α平滑筋アクチンを発現する）の表現型に「活性化する」。現在得られている証拠は、活性化した肝星状細胞が、肝線維化で蓄積される細胞外マトリックスタンパク質の大半を合成することを示している（Milani et al., Hepatology (1989) 10: 84-92）。しかしながら星状細胞は、一連のマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）も放出可能である。このようなMMPの一部は、線維化に存在するマトリックスタンパク質を分解可能であるため寛解を促す。また肝星状細胞は、マトリックスの分解に関与する特定のMMPを阻害可能で、線維性物質の分解を妨げることが可能で、したがって線維化の全体的な進行を促進可能なTIMP（マトリックスメタロプロテアーゼの組織阻害物質）も放出可能である。肝星状細胞から放出される因子の量および種類は、これらの因子間の相互作用とともに、肝線維化の正味の進行または退縮を判定するのに役立つと考えられている。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、肝臓における肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導が、被験対象の肝疾患（特に肝線維化）の寛解を促進可能であるという知見に基づく。肝星状細胞のアポトーシスの誘導が、線維性物質の蓄積を防ぐことが可能な場合もある。したがって、肝星状細胞のアポトーシスを特異的に誘導することによって、肝疾患を治療することができる。
【０００９】
したがって本発明は、有効量の肝星状細胞のアポトーシス誘導因子、または肝星状細胞のアポトーシス誘導因子を生成可能な薬剤を被験対象に投与する段階を含む、被験対象の肝疾患の治療法を提供する。このような誘導因子または薬剤は以下の通りである：
（a）被験対象の肝臓の肝星状細胞に選択的に輸送される誘導因子もしくは薬剤；
（b）被験対象の肝臓で、肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子を選択的に誘導するか、または生成する誘導因子もしくは薬剤；および/または、
（c）アポトーシス誘導因子を肝星状細胞で特異的に生成する誘導因子もしくは薬剤。
【００１０】
本発明は、以下を含む含むキットも提供する：
肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子、または肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子をインビボで生成可能な薬剤；ならびに、
肝疾患の被験対象への誘導因子または薬剤の投与法が記載された指示書。
【００１１】
本発明はさらに、以下を含むキットを提供する：
肝星状細胞のアポトーシス誘導因子、または肝星状細胞のアポトーシス誘導因子をインビボで生成可能な薬剤；および、
肝疾患の被験対象の肝星状細胞に誘導因子または薬剤を選択的に輸送する方法が記載された指示書。
【００１２】
本発明の特に好ましい態様では、使用される肝星状細胞のアポトーシス誘導因子は5HT2受容体の拮抗物質である。本発明の別の特に好ましい態様では、誘導因子はスルファサラジン、または肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能なスルファサラジン誘導体である。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、インビボにおける肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導が、肝線維化の動物モデルにおける線維性コラーゲンの規模の縮小を招くという知見に基づく。本発明は、星状細胞のアポトーシスをインビボで誘導することが、肝線維化の治療法として使用可能なことを初めて示すものである。
【００１４】
肝星状細胞は、線維化の自然寛解に潜在的に役割を果たすと考えられている。したがって、肝臓内における創傷治癒反応に関与するあるクラスの細胞の同時除去が、線維化の寛解ではなく、肝臓の構造および機能を大きく乱すことがないことは驚きである。
【００１５】
また、肝臓はアポトーシス細胞を除去するクリアランス機構を備えているが、任意の時間に良好に処分可能なアポトーシス細胞の数は限られているに違いない。仮に、このようなクリアランス系が過負荷状態となった場合、残ったアポトーシス細胞は、壊死を起し、肝機能の損傷に至る周辺組織の損傷を引き起こす可能性がある。本明細書に記載された実験は、アポトーシス細胞の除去に関する肝臓の肝臓クリアランス機構が、肝星状細胞のアポトーシスが人工的に刺激される際に生成する、追加的なアポトーシス星状細胞に対処可能なことも示す。
【００１６】
本発明の方法は、肝星状細胞の選択的なアポトーシスにつながる。肝臓内（事実上、身体内）の他の細胞型のアポトーシスが本発明の方法で誘導されないこと、または他の細胞型のアポトーシスのレベルが、肝星状細胞のアポトーシスのレベルと比較して極めて小さいことが好ましい。例えば本発明の方法は、肝機能を乱すような、肝細胞または他の肝臓細胞型の細胞のアポトーシスを誘導しないことが好ましい。
【００１７】
治療対象となる被験対象
治療対象となる被験対象は典型的には、肝疾患に罹患している被験対象、肝疾患を発症しつつある被験対象、または肝疾患を発症するリスクのある被験対象である。特に被験対象は、肝線維化の対象、または肝線維化を発生するリスクのある対象である。線維化は、初期段階の場合もあれば、より進行した段階に進行している場合もある。場合によっては、線維化は、個体が肝硬変であるような段階に進行している可能性がある。被験対象は、その肝臓に領域に炎症を示す場合もあり、またネクローシスを起こした細胞か、または分解途上の細胞が肝臓に存在する場合がある。
【００１８】
被験対象の肝臓には、典型的には、線維性の細胞外マトリックスタンパク質が蓄積している。例えばこのような線維性細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン（特にI型、II型、および/またはIII型のコラーゲン）を含む場合がある。線維性蓄積物（fibrotic buildup）中に存在する可能性のある他のタンパク質の例には、ラミニン、フィブロネクチン、およびプロテオグリカンなどがある。
【００１９】
被験対象にみられる肝疾患（特に肝線維化）には、いくつかの原因がある。線維化は、病原体の感染に起因する可能性がある。例えば線維化は、ウイルス感染に起因する場合がある。特に被験対象は、肝炎を引き起こすウイルスに感染している場合があるほか、または過去に感染している。被験対象は、慢性ウイルス性肝炎の場合がある。このようなウイルスは例えば、B型肝炎、C型肝炎、またはD型肝炎のウイルスの場合がある。場合によっては、また特に被験対象がウイルス性肝炎に罹患している場合、被験対象はHIVに感染している場合もある。被験対象は、肝線維化を引き起こす他の生物（特にライフサイクルのいくつかの段階で肝臓中に存在する生物）に、感染している可能性があるほか、感染する場合がある。例えば被験対象は、肝吸虫を体内に含む場合があるほか、既に含んでいる。
【００２０】
被験対象は、肝疾患（特に肝線維化）を引き起こすか、または同疾患のリスクを大きくする遺伝病に罹患している場合がある。例えば被験対象は、1つもしくは複数の肝ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、またはα1-アンチトリプシン欠損症に罹患している場合がある。被験対象は、肝線維化の可能性を高める、肝臓における構造または機能の何らかの異常を引き起こす遺伝性疾患に罹患している場合がある。被験対象は、肝臓を損なうことで肝線維化に寄与する恐れのある自己免疫疾患を発症する遺伝的傾向をもつ場合がある。
【００２１】
本発明のいくつかの態様では、治療対象となる被験対象は、生体異物に起因する肝疾患に罹患している場合がある。例えば被験対象は、肝障害を引き起こすことで線維化を生じる化学物質、薬剤、または他の薬剤に曝露される可能性がある。被験対象は、肝障害、引いては潜在的に肝線維化を引き起こすと考えられているRezulin（商標）、Serzone（商標）、または他の薬剤に曝露されている可能性がある。被験対象は、特定の薬剤を過剰に使用している可能性があるほか、肝障害を引き起こしうる薬剤の推奨用量を超えて使用している場合がある。例えば被験対象は、過剰量のパラセタモールを服用している場合がある。被験対象は、例えば職場などで肝障害を引き起こしうる化学物質に曝露されている場合がある。例えば被験対象は、このような化学物質に、工業または農業の現場において曝露されている可能性がある。被験対象は、肝障害を引き起こしうる化合物を含む植物を摂取している可能性があり、特にこれは、被験対象が動物である場合にあてはまる。例えば被験対象は、サワギクなどのピロリジジンアルカロイドを含む植物を摂取している可能性がある。被験対象は、肝線維化を引き起こすと考えられる環境中の毒性物質に曝露された場合がある。
【００２２】
線維化は、アルコールによって誘導される場合がある。被験対象はアルコール依存性であるか、または過去にアルコール依存性であった可能性がある。被験対象は平均して1週間に50単位を上回るアルコール、好ましくは1週間に60単位を上回るアルコール、より好ましくは1週間に75単位を上回るアルコール、またさらにより好ましくは1週間に100単位を上回るアルコールを摂取したか、または摂取している場合がある。被験対象は、このようなレベルのアルコールを、典型的には5年を上回る期間、好ましくは10年を上回る期間、より好ましくは15年を上回る期間、またさらにより好ましくは20年を上回る期間にわたって摂取している場合がある。アルコールによって誘導される線維化の場合、被験対象の年齢は例えば、25歳以上であり、好ましくは35歳以上であり、より好ましくは45歳以上であり、またさらにより好ましくは60歳以上である場合がある。
【００２３】
本発明の他の態様では、被験対象は、例えば原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性の慢性活動性肝炎、および/または住血吸虫症などの、肝線維化を生じる可能性のある1つもしくは他の複数の状態の場合がある。被験対象は、胆管が閉鎖する可能性があるか、または既に胆管が閉鎖している。場合によっては、線維化の根本原因は不明な場合がある。例えば被験対象は、特発性肝硬変であると診断されている場合がある。
【００２４】
肝線維化および肝硬変の診断法は当技術分野において、また特に当技術分野の医師および獣医師に周知である。好ましくは被験対象は、医師または獣医師によって肝疾患に罹患していると診断される。被験対象には、黄疸、皮膚の変化、体液貯留、爪の変化、挫傷のしやすさ、鼻血、また男性被験対象の場合は乳房の膨らみのような、1つもしくは複数の肝疾患関連症状が見られる場合がある。被験対象には、疲労感（exhaustion/fatigue）、食欲減退、悪心、虚弱、および/または体重減少が見られる場合がある。
【００２５】
肝疾患は、超音波などの手法を含む理学的検査で確認されている可能性があるか、または確認される可能性がある。肝生検は、線維化の進行、壊死細胞、細胞変性、および/または炎症および肝疾患（特に肝線維化）の他の特徴を見つけるために実施される場合がある。肝機能は、これが被験対象で損なわれているか否かを判定するために、被験対象を対象に評価が行われる場合がある。肝線維化の性質および根本原因の特性を決定することができる。肝線維化の作用因子に対する任意の曝露歴を決定することができる。
【００２６】
治療対象となる被験対象は、ヒトや非ヒト動物を含むがこれらに限定されない脊索動物亜門の任意の生物である場合がある。被験対象は非ヒト霊長類の場合がある。被験対象は、チンパンジーの場合があるほか、別の類人猿やサル種の場合がある。本発明の好ましい態様では、治療対象となる被験対象はヒトである。被験対象は、例えば雌ウシもしくは雄ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、またはウマを含む飼育動物である場合があるほか、イヌやネコなどのペット動物である場合がある。被験対象は実験動物である場合があり、特に、例えばマウス、モルモット、ラット、またはハムスターを含む齧歯類の場合がある。被験対象は鳥類の場合がある。被験対象の年齢は問われないが、成熟した成体の被験対象であることが多い。
【００２７】
アポトーシスの誘導因子
本発明は、肝星状細胞のアポトーシスを特異的に誘導する方法を提供する。本明細書に記載された実験的な証拠は、この方法が、肝線維化の寛解を促進することを示している。（他の細胞型ではなく）肝星状細胞のアポトーシスを誘導することが望ましい。典型的には、この方法は以下の段階によって達成することができる：
（i）アポトーシスの選択的誘導因子（すなわち、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能だが、誘導因子が接触する他の細胞型のアポトーシスを誘導しない因子）を投与する段階；または、
（ii）肝星状細胞に特異的であるが、被験対象の他の細胞型には特異的ではないアポトーシスの誘導因子を輸送する段階。
【００２８】
あるいは、肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導は、以下のような状況で、治療対象となる被験対象で、肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子を生成可能な薬剤を投与することで達成できる：
（i）薬剤を肝星状細胞に特異的に輸送する状況；
（ii）薬剤が肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子を生じる状況；および/または、
（iii）薬剤が肝星状細胞でアポトーシスの誘導因子のみを生成する状況。
【００２９】
本発明の多くの態様では、このような薬剤は、転写されて、肝星状細胞のアポトーシスのポリペプチドまたはRNAの誘導因子を生成可能な核酸分子を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの態様では、上記の任意の方法、特に選択性を確保する方法を組み合わせることで、より高いレベルの、また好ましくは最大限の選択性を確実にすることができる。したがって誘導因子は、星状細胞に特異的に輸送可能となり、また星状細胞だけのアポトーシスを誘導することが可能となる。同様に、このような薬剤は、肝星状細胞のみに輸送することが可能なほか、および/または肝星状細胞で誘導因子を生成させることが可能である。
【００３１】
選択性を高めるために使用可能な別の因子は、誘導因子または薬剤が投与されて、身体の局所的な領域に有意な濃度でのみに至る因子である場合がある。好ましくは、誘導因子または薬剤は、肝臓に選択的に投与することができる。例えば、誘導因子または薬剤は肝門脈経由で輸送することができる。あるいは誘導因子または薬剤を、腹腔内に輸送することが可能であり、したがって、身体のより大きな比率が誘導因子または薬剤に曝露されることになるが、全身は曝露されない。
【００３２】
本発明のいくつかの態様では、誘導因子または薬剤をインプラント経由で投与することができる。インプラントを肝臓または周辺領域に挿入することで、誘導因子または薬剤が確実に肝臓に局所的に放出されるようにすることができる。特にインプラントは、線維性の肝臓の領域か、またはこのような領域の周辺に配置することができる。インプラントは、線維化の進行が最も高い領域に、またはこの周辺に配置することができる。典型的にはインプラントは、外科的手段で挿入される。複数のインプラントを、肝臓の複数の領域に導入することができる。典型的には、被験対象の条件（特に肝疾患の重症度）を評価して、インプラントを被験対象に挿入する時期の決定に役立てる。場合によっては、さらに別のインプラントを、既に使用していたインプラントの有効寿命が尽きた後に挿入することができる。このような場合、別のインプラントは例えば、既に使用していたインプラントの有効寿命が尽きた後に直ちに、または短い期間後に挿入することができるほか、治療対象となる被験対象で肝線維化が亢進を始めるか、またはさらに退縮を示さない場合に挿入することができる。
【００３３】
このようなインプラントは任意の適切な形状をとりうる。インプラントは例えば、3次元マトリックス、膜、または他の類似の構造をとることができる。インプラントは固体構造の形状をとりうる。インプラントは、誘導因子または薬剤の放出を促すように多孔性の場合がある。誘導因子もしくは薬剤そのもの、またはこれを含む組成物で、インプラント表面をコーティングすることができる。インプラントそのものが誘導因子または薬剤を含む場合がある。インプラントは、任意の適切な生体適合性材料を含む。インプラント、インプラントの一部、またはインプラントのコーティングは、徐々に分解されて、誘導因子または薬剤を周辺組織中に緩やかに放出するように設計することができる。インプラントはアルギン酸塩を含む場合があるほか、アルギン酸塩でコーティングされる場合がある。適切なインプラント、およびインプラントの作製法は当技術分野で周知であり、また本発明で使用することができる。インプラントを使用して、本発明の任意の誘導因子または薬剤、または実際には本発明の他の任意の分子を輸送することができる。
【００３４】
インプラントは典型的には、選択された速度で誘導因子または薬剤を放出するように設計される。例えば場合によっては、誘導因子または薬剤をインプラントから周辺組織中へ、1か月を上回る期間、好ましくは2か月を上回る期間、またさらにより好ましくは6か月を上回る期間などの長期にわたって放出させることが望ましい場合がある。インプラントからの誘導因子または薬剤の長期放出は例えば、被験対象が典型的には長期にわたって慢性肝疾患に罹患している場合に、また特に被験対象が、肝線維化に関与する刺激に対する曝露が継続する可能性が高い場合に望ましい場合がある。場合によっては、インプラントは誘導因子または薬剤を、例えば1か月未満、好ましくは2週間未満、またさらにより好ましくは1週間未満などの、短期間放出するように設計される場合がある。場合によっては、第1のインプラントが有効量の誘導因子または薬剤の放出を終えた後に、別のインプラントを挿入することができる。こうした補充は周期的な場合がある。あるいは別のインプラントは、線維化が再び進行を始める時期、または少なくとももはや退縮しない時点で挿入することができる。
【００３５】
インプラントは典型的には、選択された濃度の誘導因子または薬剤を周辺組織中に放出するように設計される。インプラントは好ましくは、有効量の誘導因子または薬剤を、肝臓（特に線維性組織）に輸送するように設計される。好ましくは、インプラントは、誘導因子または薬剤の濃度が、アポトーシスが任意の半径内でのみ誘導されるように放出されるように設計される。例えば、放出される誘導因子または薬剤の濃度は、細胞のアポトーシスが、肝臓内または肝臓の線維性部分でのみで誘導される濃度の場合がある。これは肝臓外の領域、または肝臓の健康な領域の、誘導因子または薬剤（特に誘導因子）による曝露を最小限に抑えることを可能とする。
【００３６】
誘導因子または薬剤を肝臓のみに、または肝臓を含む局所領域のみに投与することは、誘導因子または薬剤に曝露される細胞型の一部が減少することを意味する。これは、投与された誘導因子または生成した誘導因子のみが、細胞型の少数のアポトーシスの誘導が必然的に不可能となることで、望ましくない副作用を生じないことを意味する。例えばこれは、投与された誘導因子または生成した誘導因子が、肝星状細胞と、肝臓に存在する他の細胞型とを確実に区別することだけか、または輸送手段がこれらの細胞型を確実に区別することを意味する場合がある。
【００３７】
好ましい態様では、本発明の方法は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導するが、被験対象の身体における他の任意の細胞型のアポトーシスを誘導しない。好ましくは、投与された誘導因子または生成した誘導因子は、活性化した肝星状細胞（すなわちα平滑筋アクチン陽性肝星状細胞）のアポトーシスを誘導する。
【００３８】
典型的には、誘導因子は、（肝臓の他の細胞型ではなく）肝星状細胞でアポトーシスを誘導可能であり、および/または（他の肝臓細胞型ではなく）肝星状細胞に輸送されるか、またはこのような細胞で生成する。好ましくは誘導因子は、例えば浸潤性免疫細胞などの肝臓に存在する他の細胞型のアポトーシスを誘導しない。したがって好ましくは誘導因子は、肝細胞、クッパー細胞、上皮細胞、類洞内皮細胞、ピット細胞、胆道内皮細胞、マスト細胞、およびTリンパ球の1つもしくは複数、またはより好ましくはすべてのアポトーシスを誘導可能ではないか、またはこれらの細胞に輸送されないか、またはこれらの細胞で生成されない。
【００３９】
好ましくは誘導因子は、マクロファージ、リンパ球、および/または好中球などの、肝臓に存在する免疫細胞のアポトーシスを促進しない。特に好ましい態様では、誘導因子は、（被験対象の身体の他の任意の細胞型のアポトーシスではなく）肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能な選択的誘導因子であり、および/または（被験対象の身体の他の細胞型ではなく）肝星状細胞のみが標的とされるように輸送される。誘導因子は、使用薬剤のために肝星状細胞で生成するだけの場合がある。
【００４０】
いくつかの態様では、誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスに加えて、1つまたは複数の他の細胞型のアポトーシスを引き起こす可能性があるが、他の細胞型のアポトーシスは、肝星状細胞のアポトーシスと比較して低レベルである。例えば、肝星状細胞のアポトーシスのレベルは、星状細胞および第2の細胞型が等濃度の誘導因子に曝露される場合に、別の細胞型と比較して少なくとも2倍、好ましくは少なくとも5倍、より好ましくは少なくとも10倍、さらにより好ましくは少なくとも50倍、またさらにより好ましくは少なくとも100倍大きい場合がある。選択性のレベルは、500倍を上回る場合、好ましくは1000倍を上回る場合、さらにより好ましくは10,000倍を上回る場合があり、また最も好ましくは、誘導因子が肝星状細胞に対して絶対的に選択的である。このような選択性のレベルは、インビトロおよび/またはインビボで決定された値を参照することができる。これらは、被験対象の身体の肝星状細胞、および他の任意の特定の細胞型またはすべての細胞型に関する特異性を指す場合がある。また肝星状細胞、および他の任意の肝臓細胞型またはすべての肝臓細胞型を指す場合がある。好ましくは、このような選択性のレベルは肝細胞に関して示される。
【００４１】
投与される特定の誘導因子、または生成する特定の誘導因子が、特定の濃度で選択性を示すか、または最も選択性を示す場合もあり得る。したがって、滴定を行って、特定の濃度の誘導因子でアポトーシスが誘導される肝星状細胞の割合を決定することができる。これは、他の細胞型を対象に決定を行い、肝星状細胞と他の細胞型の値を比較することもできる。誘導因子が、肝星状細胞に対して最も選択性を示す濃度、および高レベルの肝星状細胞のアポトーシスをもたらす濃度を選択することができる。投与される誘導因子または薬剤の濃度は適宜選択することができる。したがって、第2の細胞型におけるアポトーシスのレベルが肝星状細胞のアポトーシスのレベルと比較して50%もしくはこれ未満、好ましくは25%もしくはこれ未満、より好ましくは10%もしくはこれ未満、さらにより好ましくは5%もしくはこれ未満、さらにより好ましくは1%もしくはこれ未満、またさらにより好ましくは0.1%もしくはこれ未満の濃度を使用することができる。このような試験はインビトロおよび/またはインビボで実施することができる。
【００４２】
アポトーシスの誘導因子は、いくつかの経路で作用する場合がある。肝星状細胞は、アポトーシスを起こす可能性を低めるように作用する刺激または分子に、天然の状況で曝露される可能性がある。実際には、星状細胞は、アポトーシスを起こさないように、または細胞がアポトーシスを起こす確率を低下させるようにシグナルを受ける。本発明の誘導因子は、このようなシグナルをブロックすることで、肝星状細胞のアポトーシスを促進する可能性がある。
【００４３】
本明細書に記載された実験結果は、マトリックスメタロプロテアーゼ（TIMP）の組織阻害物質が、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）に及ぼす作用によって肝星状細胞がアポトーシスを起こす確率を低くする可能性があることを示す。したがって、TIMPとMMPの相互作用を妨げることによって、星状細胞のアポトーシスの上昇がもたらされることになる。これは、いくつかの方法で達成することができる。例えばTIMPの発現レベルを抑制することが可能であり、したがってMMP活性の阻害が小さくなり、また逆に肝星状細胞のアポトーシスが増える。あるいはTIMPとMMPの相互作用を妨げたり、または減じたりすることが可能な分子を使用することができる。別の可能性は、MMP発現の実際のレベルが上昇する可能性があることである。本発明の好ましい態様では、標的となるTIMPはTIMP-1である。
【００４４】
TIMPの発現レベルは、アンチセンスRNA、siRNA（短い阻害型RNA）、および/またはTIMP転写物に特異的な触媒RNAなどの手法で抑制される場合がある。これらは、肝臓に導入した、また好ましくは肝星状細胞を特異的に標的としたコンストラクトから発現させることができる。またこれらは、TIMPの発現が、このような細胞型だけで特異的に抑制されることを確実なものとするために、肝星状細胞に特異的なプロモーターから発現される場合がある。あるいは、TIMP発現を抑制可能な他の分子を投与することができる。これらは、TIMP発現を抑制可能な天然の分子である場合があるほか、TIMP発現を抑制可能な合成的に作製された分子の場合がある。例えばライブラリーをスクリーニングして、TIMP発現を抑制可能な分子を同定し、これらを次に本発明に使用することができる。
【００４５】
TIMPとMMPの相互作用の拮抗物質に関しては、抗体または抗体誘導体などの物質である場合があるほか、小型化合物分子などの他の物質である場合がある。本明細書に記載されたアッセイ法で多数の物質をスクリーニングして、MMPとTIMPの相互作用を調節可能か否か、特に肝星状細胞のアポトーシスを促進可能か否かを判定することができる。このような調節因子を次に肝臓に導入するか、またはあるいはこれらを発現可能もしくは生成可能な核酸コンストラクトを導入して、TIMPとMMPの相互作用を阻害することができる。好ましくは、このような分子そのものを、TIMPとMMPの相互作用が阻害され、また過剰なMMP活性が妨げられる長期間のコントロールを可能とするように導入できる。
【００４６】
本発明の別の態様では、誘導因子は、その作用が、アポトーシスを妨げる分子と拮抗することではなくアポトーシスそのものを誘導することである因子である。したがって誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスに至る経路を活性化する可能性がある。例えば誘導因子は肝星状細胞上の受容体に結合して、結合状態の細胞のアポトーシスを招く場合がある。
【００４７】
本発明の一つの態様では、誘導因子は、肝星状細胞上に存在するp75受容体と結合可能である。p75との結合は、星状細胞のアポトーシスの引き金となる。P75は神経成長因子（NGF）の受容体であり、またp75との結合に使用される分子は、受容体と結合してアポトーシスを促進可能な神経成長因子またはこの誘導体である場合がある。受容体との結合に使用される分子は、受容体と結合可能で、アポトーシスを引き起こす受容体の拮抗物質である場合がある。拮抗物質は、受容体と結合してアポトーシスを誘導可能な抗体もしくは抗体誘導体、または他の物質である場合がある。また本発明のアッセイ法は、多数の候補物質をスクリーニングするために修飾することができる。p75は肝臓では肝星状細胞上だけで発現されるが、身体の他の部位で発現されるので、好ましくはp75のいずれかの拮抗物質を、肝臓に局所的に投与するか、および/または本発明の方法で星状細胞に特異的に輸送する。
【００４８】
本発明のいくつかの態様では、誘導因子は受容体に作用しないが、受容体の下流に位置する分子には作用する。したがって、最終的な結果は、受容体を拮抗する場合と同じとなる可能性があるが、受容体のシグナル伝達経路の分子などの下流の標的が標的として選択される。
【００４９】
本発明の一つの態様では、使用する誘導因子は、肝星状細胞の表面に存在する5HT2受容体と拮抗することで細胞のアポトーシスを誘導する。あるいは誘導因子は、5HT2受容体の下流で作用して、5HT2受容体と直接拮抗する同等の作用を誘導する可能性がある。受容体の下流で作用するということは、拮抗物質の細胞特異的な輸送または発現が、肝星状細胞のみがアポトーシスを起こすように誘導されることを確実なものとすることを意味する。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、拮抗物質は、5HT2B受容体または同受容体の下流に作用する（この受容体が、肝細胞ではなく、活性化した肝星状細胞上で発現されるため）。このような態様では、誘導因子または薬剤は、誘導因子に対する受容体を発現する身体における他の細胞型の曝露を最小限に抑えるために、肝臓に局所的に輸送することができる。好ましくは誘導因子は、他の5HT2受容体サブタイプとは結合しないか、および/または拮抗せず、5HT2B受容体サブタイプと結合および拮抗するか、または5HT2B受容体サブタイプに対する高度の選択性を有する。例えば拮抗物質は、5HT2B受容体サブタイプと結合し、および/または同受容体を、他の5HT2受容体サブタイプ（特に5HT2A受容体サブタイプ）と比較して2倍、4倍、10倍、100倍、1000倍、またはこれ以上容易に活性化することができる。拮抗物質、および/または拮抗物質の使用法は、本明細書に記載された任意の程度の選択性を有する。
【００５１】
いくつかの態様では、誘導因子は5HT2B受容体サブタイプに付加的または二者択一的に他の5HT2受容体サブタイプに作用するか、またはこの下流に作用する場合がある。一つの態様では、誘導因子は5HT2A受容体サブタイプ、またはこの下流に作用する場合があるが、このように輸送されるか、または選択的に発現されることで、肝星状細胞だけが誘導されてアポトーシスを起こすことが確実となる。
【００５２】
使用される5HT2拮抗物質は、セロトニンなどの受容体に対する天然のリガンドである場合がある。場合によっては、拮抗物質は、特に5HT2B受容体サブタイプに特異的に結合可能なセロトニンが誘導体化された物質である場合がある。場合によっては、拮抗物質は、5HT2受容体（特に5HT2B受容体サブタイプ）の人工拮抗物質である場合がある。このような人工拮抗物質は、ライブラリーをスクリーニングする方法（後述）などの、当技術分野で周知の方法で同定することができる。
【００５３】
本発明の他の態様では、誘導因子は、ミトコンドリアの透過性亢進（MPT）および/またはカルシウムフラックスを引き起こす場合がある。誘導因子は、星状細胞がアポトーシスを起こすか否かの制御に役割を果たすと考えられている因子NF-κBまたは他の因子の活性を阻害する場合がある。誘導因子は、NF-κBの機能の阻害物質であるIκBに作用する場合がある。特に誘導因子は、肝星状細胞中に存在するIκBのレベルを高めることで、NF-κBの機能を抑制する場合がある。いくつかの好ましい態様では、誘導因子はIκBの分解を阻害する場合がある。誘導因子は、Bcl-2の発現または活性を阻害する場合があるほか、あるいはカスパーゼ（特にカスパーゼ3）の活性を促進可能である。
【００５４】
本発明の一つの態様では、使用される誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能なスルファサラジン[2-ヒドロキシ-5-[-4-[C2-ピリジニルアミノ)スルホニル]アゾ]安息香酸]、またはこの誘導体である場合がある。いくつかの態様では、誘導因子は、5-アミノサリチル酸（5-ASA）、4-アミノサリチル酸（4-ASA）などのスルファサラジン誘導体である場合がある。他の態様では、誘導体はスルファピリジンである場合がある。肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能な5-アミノサリチル酸（5-ASA）、4アミノサリチル酸（4-ASA）、および/またはスルファピリジンの誘導体を本発明で使用することもできる。また選択性は、スルファサラジンまたはこの誘導体を、肝星状細胞に選択的に輸送することで確実なものとすることができる。多くの態様では、スルファサラジンまたは誘導体は、全身ではなく肝臓に投与される。
【００５５】
本発明のいくつかの態様では、肝星状細胞のアポトーシスの特異的な誘導は、肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子を用いることによって、またはこのような誘導因子を生成可能な薬剤を輸送することによって達成される。肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導するが、第2の細胞型のアポトーシスを誘導しない誘導因子である。好ましくは、誘導因子は、肝星状細胞以外の他の任意の細胞型のアポトーシスを誘導しないか、または少なくともアポトーシスを、本発明の方法において誘導因子に曝露される他の細胞型で誘導しない。肝星状細胞の特異性のレベルは例えば、上述の任意のレベルである場合がある。
【００５６】
誘導因子は、星状細胞のアポトーシスに選択的な場合がある。なぜなら誘導因子が、肝星状細胞上に存在する分子にのみ結合するからである。この結合は実際にアポトーシスそのものを誘導する場合があるほか、誘導因子が後にアポトーシスを誘導可能な細胞内への内在化を確実なものとする。あるいは誘導因子は、あらゆる細胞型へ侵入可能であるが、肝星状細胞のみのアポトーシスを引き起こす因子である場合がある。これは、標的が肝星状細胞中にのみ存在するからである。
【００５７】
肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子は、本発明のアッセイ法で同定することができる。場合によっては、肝細胞のアポトーシスを誘導可能な物質を第1のスクリーンを用いて同定し、これに続いて、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能な物質の第2のスクリーンを用いて、他の細胞型のアポトーシスを誘導しない物質を同定する。候補物質のライブラリー全体を場合によってはスクリーニング可能であるが、誘導因子の合理的設計により、選択的誘導因子の開発に、またはプロセスの合理化に役立てることができる。このような合理的設計では、肝星状細胞のアポトーシスの既知の誘導因子を出発物質として用いることができる。
【００５８】
本発明の一つの態様では、アポトーシスの選択的誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能で、好ましくは他の細胞型のアポトーシス（特に他の肝細胞型のアポトーシス）を誘導しないグリオトキシンまたはこの誘導体である場合がある。好ましくは、使用するグリオトキシン誘導体は、グリオトキシンのジスルフィド架橋を保持している。グリオトキシン誘導体が、星状細胞のアポトーシスを選択的に誘導する能力を、本明細書に記載された方法で評価することが可能であり、また特に肝星状細胞および肝細胞のアポトーシスを誘導する能力を決定して比較することができる。
【００５９】
本発明の多くの態様では、アポトーシス誘導因子、またはアポトーシス誘導因子を生成可能な薬剤を、肝星状細胞に特異的に輸送することで、このような細胞のみがアポトーシスを起こすように誘導することを確実なものとすることができる。星状細胞への誘導因子または薬剤の選択的輸送は、いくつかの方法で達成することができる。
【００６０】
誘導因子または薬剤は、さまざまな方法で包装したりカプセルで包んだりすることができる。例えば、誘導因子または薬剤は、リポソームまたはウイルス粒子中に存在する場合があるほか、リポソームまたはウイルス粒子を含む場合がある。誘導因子を生成可能な薬剤は、転写されて、誘導因子または誘導因子を生成可能なポリペプチド分子を生じることが可能な核酸分子である場合がある。例えば薬剤は、ウイルス粒子またはリポソーム中に包装される核酸を含む場合がある。ウイルスまたはリポソームは、接触することで誘導因子のみがこのような細胞型中で生成する、肝星状細胞に（他のどの細胞型でもなく）特異的に薬剤を輸送することができる。
【００６１】
誘導因子または薬剤が内部に存在する粒子、誘導因子または薬剤が複合化されている粒子、または誘導因子または薬剤を含む粒子は、肝星状細胞の表面上の分子に結合し、好ましくは肝星状細胞上にのみ存在するリガンドを有する場合がある。このため、粒子が特異的に結合し、肝星状細胞内への誘導因子または薬剤の侵入を可能とすることが確実なものとなりうる。
【００６２】
本発明のいくつかの態様では、誘導因子は誘導因子そのものではなく、核酸および被験対象に投与された核酸にコードされているか、または同核酸から転写される場合がある。このような態様における誘導因子は、ポリペプチドまたはRNA分子である場合がある。このような核酸は、肝星状細胞に特異的に輸送することができるほか、あるいは、さまざまな細胞型に輸送することができるが、肝星状細胞でのみ発現される。これは、誘導因子をコードする核酸分子に使用可能に連結されているか、または誘導因子が転写される、肝星状細胞特異的プロモーター、または他の肝星状細胞特異的な調節エレメントの存在に起因する場合がある。
【００６３】
場合によっては、核酸から発現されるか、または転写される誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子である場合があるので、このような核酸を、さまざまな細胞に輸送することができるが、肝星状細胞のみのアポトーシスを生じさせる。
【００６４】
本発明のいくつかの態様では、誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能なアンチセンスRNA分子の場合がある。このようなアンチセンスRNA分子は、被験対象に直接投与することができるか、あるいは転写されて、このようなアンチセンス分子を生成可能な、適切なプロモーターに使用可能に連結された核酸分子を含む薬剤を被験対象に投与することができる。本発明のいくつかの態様では、誘導因子は、結果としてアポトーシスを誘導する、肝星状細胞において遺伝子の発現を阻害可能なsiRNA（短鎖干渉RNA）分子である場合がある。好ましくは、このようなsiRNAは、肝星状細胞のアポトーシスを選択的に誘導する。他の態様では、誘導因子は、遺伝子の発現を肝星状細胞で妨げたり阻害したりすることが可能な触媒RNAである場合がある（このような阻害は肝星状細胞のアポトーシスを招く）。また触媒RNAは、被験対象に直接輸送することができるほか、または被験対象に投与された核酸から転写される場合がある。触媒RNAはリボザイムの場合がある。
【００６５】
誘導因子を生成するために転写される必要がある核酸の投与が関与する本発明の態様では、細胞特異的プロモーター、調節エレメント、および/またはエンハンサーを用いることで、核酸が肝星状細胞でのみ発現されることを確実にする。プロモーター、調節エレメント、および/またはエンハンサーは、完全に肝星状細胞に特異的な場合があるほか、または核酸が被験対象に輸送される細胞型以外では、肝星状細胞でのみ発現される。
【００６６】
場合によっては、肝星状細胞に特異的なプロモーター、調節エレメント、またはエンハンサーは、他の細胞型において、肝星状細胞と比較してかなり低いレベルおよび/または頻度で発現を生じる場合がある。例えば、本明細書に記載された任意の1つもしくは複数の細胞型を含む、他の細胞型における発現のレベルは、肝星状細胞でみられる場合と比較して10%未満、好ましくは5%未満、さらにより好ましくは1%未満、さらにより好ましくは0.1%未満、またさらにより好ましくは0.01%未満である場合がある。発現レベルは例えば、ブロッティングおよび/または定量RT-PCR法などの手法で決定することができる。あるいは、タンパク質発現のレベルを用いて、肝星状細胞における発現の特異性を決定することができる。
【００６７】
ディファレンシャルディスプレイやサブトラクティブハイブリダイゼーションなどの、細胞特異的なプロモーターを同定する手法は当技術分野で周知であり、本明細書に記載された任意のレベルの特異性を有するプロモーター、調節エレメント、またはエンハンサー（特に本発明で使用する場合は肝星状細胞に特異的なもの）を同定するために用いることができる。プロモーターまたは調節エレメントが発現の特定の特異性を生じる能力（特に肝星状細胞に特異的な発現を生じる能力）は、レポーター遺伝子に使用可能に連結されたプロモーター/調節エレメントを含むコンストラクトを、さまざまな細胞にインビトロでトランスフェクトした後に、レポーター遺伝子が発現された細胞型を検出することで確認することができる。典型的には、トランスフェクト対象細胞の範囲は、肝星状細胞、および本明細書に記載された任意の細胞型を含む他の肝細胞型を含む。
【００６８】
あるいは、レポーター遺伝子を用いることで、プロモーターおよび/または調節エレメントの特異性をインビボで評価することができる。このようなコンストラクトは導入遺伝子として導入することができるほか、あるいは成体動物に導入することができる。コンストラクトを用いて達成可能な発現の特異性を評価するために、核酸を細胞にインビボで輸送する任意の適切な手法を用いることができる。
【００６９】
いくつかの態様では、誘導因子をコードする領域に使用可能に連結されたこのようなプロモーターは誘導型である。これは、細胞特異的なプロモーターに対して付加的な場合があるほか代替的な場合がある。誘導性のプロモーターは、追加的な制御のレベルを肝星状細胞のアポトーシスに加えることができる。次に、このようなプロモーターを誘導するために必要な化合物または刺激を、局所的に、および/または特定の選択された時間に投与することができる。
【００７０】
肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子をコードする核酸を、任意の適切な方法で輸送することができる。特定の標的細胞への核酸の輸送法は当技術分野で周知であり、また本発明で使用することができる。核酸は例えば、リポソームまたはウイルス粒子の形状で輸送することができる。核酸は裸の核酸分子として投与することができる。いくつかの態様では、核酸を、適切な粒子表面をコーティングした核酸として投与することができる。核酸でコーティングされた粒子の輸送法は当技術分野で周知であり、また使用することができる。例えば、高速ジェットガスを用いて、核酸でコーティングされた粒子を輸送する、針不要のさまざまなシリンジが知られており、また本発明のコンストラクトを輸送するために使用することができる。
【００７１】
誘導因子は、肝臓（特に肝星状細胞）に対する向性を示すウイルスを用いて肝臓に輸送することができる。このような態様では、典型的にはウイルスは誘導因子をコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書に記載された任意の核酸分子を、ウイルスを用いて輸送することができる。標的細胞にウイルスを感染させることは、標的細胞における誘導因子の発現、引いては標的細胞のアポトーシスにつながる。任意の適切なウイルスを使用することができる。このようなウイルスは、当技術分野で周知の方法で調製することができる。一つの態様では、肝星状細胞に感染可能な組換えアデノウイルスを使用することができる。いくつかの態様では、使用するウイルスを、星状細胞以外のさまざまな細胞に感染させることができるが、誘導因子をコードする遺伝子を、誘導因子の発現を駆動するように選択されたプロモーターおよび/または調節エレメントのために、肝星状細胞でのみ発現させることができる。誘導因子の輸送用に選択されたウイルスは、本明細書に記載された任意のレベルの特異性を生じる可能性があり、また本明細書に記載された任意の核酸分子をウイルス経由で輸送することができる。
【００７２】
核酸は、任意の適切な経路で輸送することができる。いくつかの態様では、核酸分子を、手術中に標的領域に輸送することができる。例えば核酸を、手術中（典型的には、標的領域が露出されているか、または容易に接触可能な場合）に肝臓および/または肝臓周辺組織に輸送することができる。核酸は、血管（特に肝門脈）を介して輸送することができる。このような核酸分子の輸送機構は、核酸が肝星状細胞に特異的に輸送されることを確実なものとする場合がある。例えば、何らかの形状で核酸が折りたたまれるか、および/または包まれるリポソーム、ウイルス、および他の態様の場合、分子は、肝星状細胞へ輸送する対標的輸送用粒子の表面に存在する場合がある。典型的には、このような標的分子は、肝星状細胞上に特異的に存在する分子（受容体など）のみに結合する。
【００７３】
核酸を用いる本発明の態様では、適切な核酸誘導体を使用することもできる。例えば、容易に分解されないか、または他の好ましい性質を有する、さまざまなDNAおよびRNA類似分子が当技術分野で周知であり、また使用することができる。
【００７４】
本発明のいくつかの態様では、用いられる方法が、肝星状細胞のアポトーシスを特異的に誘導する能力のために、誘導因子または薬剤は、肝臓に局所的に投与される必要はないが、さまざまな細胞が誘導因子または薬剤に曝露されるような経路で投与することができる。例えば、薬剤または誘導因子を静脈経由で投与することができる。
【００７５】
本発明のいくつかの態様では、誘導因子は、プロセシングを受けて誘導因子を生成可能なプロドラッグ（すなわち不活性型）の状態の場合がある。プロドラッグは、肝星状細胞のアポトーシス誘導能力を完全に欠いている場合があるか、または実際の誘導因子の活性の10%未満、好ましくは1%未満、より好ましくは0.1%未満、またさらにより好ましくは0.01%未満などの、かなり低い活性を有する場合がある。典型的には、不活性型を誘導因子に酵素の作用で変換することができる。例えば不活性型は、特定の部位でタンパク分解性の切断を受けて誘導因子を生成可能なポリペプチドである場合がある。不活性型は、何らかの方法で切断されて、または修飾されて活性型となる必要のある化合物または他の物質である場合がある。
【００７６】
活性化には、誘導因子の不活性型と、第2の（すなわち別の）分子との反応が関与する可能性がある。あるいは活性誘導因子が、2つもしくはこれ以上の、相互に反応する分子から形成される場合がある。誘導因子の活性型の形成には、例えばリン酸基などの官能基の付加または除去、またはメチル化による分子の修飾が関与する場合がある。
【００７７】
本発明は、誘導因子そのものではなく、肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子を産生または生成する能力をもつ薬剤が投与される態様も含む。したがって、薬剤の非存在下では、肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子は産生されないか、または薬剤存在時に生じるレベルの50%未満、好ましくは25%未満、より好ましくは5%未満、さらにより好ましくは1%未満、またさらにより好ましくは0.1%未満などの、かなり低いレベルで生成される。
【００７８】
薬剤は、不活性型の誘導因子を活性型に変換する酵素である場合がある。薬剤は、このような酵素をコードする核酸である場合がある。あるいは薬剤は誘導因子を、1つまたは複数の基質から酵素学的に産生する場合がある。薬剤が作用する物質も投与することができるほか、または内因性の分子である場合がある。したがって、本発明のいくつかの態様では、薬剤は、被験対象に投与される薬剤のみである場合があり、また作用してアポトーシスの誘導因子を生成する分子は、被験対象に天然に状態で既に存在する。本発明の他の態様では、薬剤は、被験対象に存在する天然の酵素が作用して、誘導因子を生成可能な物質である場合がある。
【００７９】
肝星状細胞が特異的に誘導されてアポトーシスを起こすことを確実なものとする、いくつかの方法があることは明らかである。本発明は、肝細胞のアポトーシスの特異的な誘導を招く任意の組み合わせを含む。したがって、投与される薬剤は、1つもしくは複数の活性化薬剤、誘導促進因子、および/または誘導因子を生成するかまたは誘導因子生成に必要な化合物である場合がある。1つまたは複数の活性化薬剤、誘導促進因子、および/または誘導因子を生成するかまたは誘導因子生成に必要な化合物は内因的に存在する場合がある。本発明では、肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導を招く限りにおいて、任意の適切な組み合わせを使用することができる。肝星状細胞のアポトーシスを特異的に誘導する、本明細書に記載された任意の2つもしくはこれ以上の方法を組み合わせて、選択性のレベルを高めることができる。
【００８０】
本発明のいくつかの態様では、肝星状細胞の特異的な誘導を達成することができるほか、または寄与することができる。なぜなら、投与薬剤が肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子のみを生成するために必要な物質が、肝臓に局所的に（特に肝星状細胞のみに）存在するからである。
【００８１】
本発明の特定の方法が、肝星状細胞のアポトーシスを選択的に誘導する能力を評価する試験を、任意の適切なアッセイ法で、またはモデルを用いて実施することができる。このような評価は、インビトロまたはインビボで実施される。いくつかの態様では、正常な動物および/または細胞を対象に試験を実施することができる。例えば、齧歯類（特にラット）を対象に試験を実施することができる。他の態様では、特定の方法の有効性を、動物モデル（好ましくは齧歯類モデル、またさらにより好ましくはラットモデル）のような、肝線維化のモデル（特にインビボモデル）で評価することができる。特に、慢性肝線維化のモデルを使用することができる。
【００８２】
使用される肝線維化のモデルでは、典型的には、肝線維化を誘導可能な化合物を動物に投与する。あるいは、線維化を誘導する動物を対象に外科的処置を実施することができる。モデルには、四塩化炭素の動物への投与が関与する。例えば四塩化炭素を、1週間に1回、2回、またはこれ以上の回数を5〜15週間、好ましくは6〜12週間、またさらにより好ましくは8〜10週間にわたって投与することで肝線維化を誘導することができる。
【００８３】
本発明の誘導因子または薬剤は、線維化を誘導する薬剤と同時に、または線維化を誘導する薬剤を動物に投与する期間に投与することができる。この2つの薬剤は同じ組成物か、または別の組成物として投与することができる。あるいは誘導因子または薬剤を、線維化の誘導因子の投与終了後に投与することができる。典型的には、誘導因子、アポトーシス誘導因子を生成可能な薬剤、および/または肝線維化を引き起こすことが可能な薬剤を投与しない対照についても実施する。対照動物には、誘導因子および/または薬剤の投与には使用されるが実際の誘導因子もしくは薬剤を含まない溶媒を投与することができる。例えば、対照動物には、オリーブオイルのみを投与することができる。
【００８４】
本発明のいくつかの態様では、被験対象に投与されるか、または被験対象で生成される誘導因子は、肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子であることが既知ではない場合がある。肝星状細胞のアポトーシスの新規誘導因子を、当技術分野で周知の方法で、特にライブラリーをスクリーニングすることで同定することができる。このような方法では、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能な物質を最初に同定し、次に同定された物質のスクリーニングを行って、他の細胞型のアポトーシスを誘導しない物質を同定することができる。あるいは、後に肝星状細胞に選択的に輸送可能な、肝星状細胞を含むさまざまな細胞型のアポトーシスを誘導可能な誘導因子が、ライブラリーをスクリーニングすることで同定される。
【００８５】
本明細書に記載された任意のアッセイ法を用いることが可能であり、また特にアポトーシス細胞を同定する、本明細書に記載された任意の方法をアッセイ法で使用することができる。典型的には、最初のスクリーニング段階はインビトロで実施する。誘導因子が同定されたら、インビボにおけるその有効性を決定することができる。例えば、健康な個体および/または肝線維化の動物モデルにおける有効性を決定することができる。特に、本明細書に記載された肝線維化の四塩化炭素モデルを使用することができる。
【００８６】
肝星状細胞のアポトーシスの誘導因子を検討して同定可能な適切な試験物質には、コンビナトリアルライブラリー、既知化合物および化合物、ペプチドおよびペプチド模倣物質（peptide mimetics）、ディスプレイ（例えばファージディスプレイライブラリー）などのオリゴヌクレオチドおよび天然物のライブラリー、および抗体産物などがある。物質は、肝星状細胞のアポトーシスの既知誘導因子、および例えば変異導入および/または合理的設計によって作られるバリアントの構造を基礎とすることができる。
【００８７】
場合によっては、スクリーニング対象物質は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導する選択性の大きいバリアントを同定するために、肝星状細胞のアポトーシスを誘導可能であるが、他の細胞型のアポトーシスも誘導する物質のバリアントである。場合によっては、既に肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子である物質のバリアントを検討して、大きな特異性、および/または低毒性などの他の好ましい性質をもつバリアントを同定することができる。
【００８８】
典型的には、有機分子、好ましくは分子量が50〜2500ダルトンの小型有機分子をスクリーニングする。候補産物は、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはこれらの組み合わせを含む生体分子である場合がある。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、さまざまな供給源から得られる。構造類似体を作成するために、既知の薬物を直接的な化学的修飾、またはアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのランダムな化学的修飾の対象とすることができる。
【００８９】
試験物質は、例えば1回の反応あたり10種類の物質を対象とする最初のスクリーンに使用することが可能であり、また肝星状細胞のアポトーシス誘導能力を示すこのようなバッチの物質を個別に検討することができる。試験物質は、1 μM〜1000 μM、好ましくは1 μM〜100 μM、より好ましくは1 μM〜10 μMの濃度で使用することができる。好ましくは、試験物質の活性を、既知の誘導因子の活性と比較する。
【００９０】
場合によっては、アッセイ法は、試験物質と特定の標的分子との結合を評価する。このような結合は、肝星状細胞のアポトーシスを誘導することが知られている。このような結合を同定する適切なアッセイ法は当技術分野で周知であり、また使用することができる。結合する物質を次に、肝星状細胞のアポトーシスを活性化する能力について評価することができる。物質が、肝星状細胞以外の細胞型と結合する能力、および/または、このような細胞型で肝星状細胞のアポトーシスを誘導する能力を評価することができる。他の態様では、肝星状細胞がアポトーシスを起こすか否かを制御する既知標的分子の活性を試験物質が調節する能力を評価することができる。このようなアッセイ法は、細胞ベースの場合もあれば、無細胞系の場合もある。
【００９１】
本明細書に記載された方法で同定された任意の誘導因子を次に、被験対象に直接輸送するか、またはこのような誘導因子を生成可能な薬剤を投与することができる。
【００９２】
被験対象の評価
肝星状細胞のアポトーシス、および肝線維化の寛解を、被験対象を対象に、いくつかの手法で評価することができる。被験対象が罹患している肝疾患の全体的な改善を確認することもできる。被験対象の状態、および被験対象の肝機能を評価することができる。したがって被験対象を対象に、肝疾患（特に肝線維化）と関連する1つもしくは複数の症状の重症度の任意の低下、または完全な消失を追跡するために評価を行うことができる。例えば、黄疸、体液鬱滞、挫傷のしやすさ、鼻血の頻度、皮膚または爪の状態に何らかの変化が存在するか否かを評価することができる。被験対象の一般的な健康状態は改善する可能性があり、また改善を回復の指標として評価することができる。したがって被験対象には、食欲増進、悪心の発生率もしくは重症度の低下、体重の増加、および/または筋力や活力の全身的感覚の上昇がみられる場合がある。被験対象は、入院率や、他の医療処置が必要となる頻度が小さくなる場合もある。
【００９３】
被験対象の肝機能は、改善する（すなわち高められる）場合がある。肝機能は安定化する場合がある。肝機能は、さまざまな方法で評価することができる。肝生検試料または血液試料を採取して、肝機能のマーカーを決定することができる。検討可能な肝機能のマーカーには、ヒアルロン酸、プロコラーゲンIIINペプチド、プロコラーゲンICペプチド、Undulin-コラーゲン16、7S型IVコラーゲン、MMP-2、およびTIMP-1のレベルなどがある。
【００９４】
被験対象の肝臓には、結節形成の低下、壊死、および/または炎症がみられる場合がある。特に、被験対象の肝臓は、肝臓中の線維化の量の低下または安定化を示す場合がある。肝臓中の線維性物質の量は減少する場合があり、またこれは肝生検切片をシリウスレッドなどの染色液で染色することで決定できる。例えば、コラーゲン（特にコラーゲンIおよびIII）などの特定の線維性細胞外マトリックス成分の有無および量を決定することができる。被験対象におけるTIMPおよび/またはMMPのレベル、およびTIMP発現の低下を生化学的解析で決定することもできる。
【００９５】
肝臓中における肝星状細胞のアポトーシスも肝生検で決定することができる。肝星状細胞のアポトーシスの頻度の何らかの変化（特に任意の上昇）を測定することができる。アポトーシス細胞は、いくつかの既知の方法で同定することができる。TUNEL染色（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるデオキシウリジン三リン酸のニック末端標識）などの手法で、アポトーシス細胞を同定することができる。TUNEL染色は、アポトーシス細胞をインサイチューで同定するのに使用可能なので特に有用である。同時染色によって、α平滑筋アクチン発現細胞の染色などにより、アポトーシスを起こしている細胞が、肝星状細胞であるか否かを確認することができる。
【００９６】
例えば、アネキシンV染色、対1本鎖DNA抗体、カスパーゼ基質アッセイ法、ライゲーションPCR法、および細胞膜透過性染色（permeability staining）などの、アポトーシスを同定および/または定量する他の既知の方法を用いることができる。DNAの断片化は、ゲル電気泳動で解析することができる。染色により、膜泡形成（membrane blebbing）や核の分解といった、アポトーシスと関連した形態上の特徴を決定することもできる。アクリジンオレンジによる染色でアポトーシス細胞を同定することができる。細胞をヨウ化プロピジウムで染色してDNA含量を解析することができる。トリパンブルー染色などの試験で、膜の細胞が完全であること、またネクローシスではなくアポトーシスであることを確認することができる。
【００９７】
核酸の投与が関連する本発明の薬物および方法に関しては、当技術分野で周知のさまざまな手法で、投与された核酸からの発現を評価することができる。例えば、ノーザンブロッティングおよび/またはRT-PCR法でRNAレベルの発現を調べることができる。このような解析は、被験対象から回収した組織、また典型的には被験対象の肝臓に由来する組織を対象に実施することができる。肝生検試料を採取する手法は、当技術分野で周知であり、また使用することができる。場合によっては、組織切片を対象にインサイチューPCR法を実施することで、肝星状細胞と核酸コンストラクト発現細胞の両方を同定することができる。典型的には両者は1つであり、また同じであるはずである。あるいは、特定の細胞型を回収組織から分離して、どの細胞型が対象核酸を発現しているかということを解析することができる。
【００９８】
誘導因子の存在は、被験対象から回収した組織を対象に、特に被験対象から回収した肝組織を対象に同定することができる。ウェスタンブロッティングなどの手法で、対象タンパク質の有無および位置を決定することができる。誘導因子が肝星状細胞に局在することを示すために、肝星状細胞に特異的なマーカーで組織を染色することもできる。
【００９９】
製薬用組成物および投与
本発明の方法で使用される誘導因子および薬剤を、薬学分野で常用の手順で、標準的な薬学的に許容される担体および/または賦形剤で製剤化することができる。例えば、適切な物質を生理食塩水または注射用水に溶解することができる。製剤の詳細な性質は、投与対象の特定の物質および所望の投与経路などの複数の因子に依存する。場合によっては、製剤は、肝門脈を介する、および/または腹腔内注射を介する、または誘導因子もしくは薬剤の肝臓への局在を促す他の経路を介する投与に適切な製剤である。適切な種類の製剤については、全体が参照として本明細書に組み入れられる「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Company、Eastern Pennsylvania、第17版、1985）に詳細に記載されている。
【０１００】
誘導因子または薬剤を、腸管経路のほか、または経口、舌下、肛門内、肺内、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、もしくは他の適切な投与経路などの腸管外経路で投与することができる。本発明の好ましい態様では、誘導因子または薬剤を静脈内に投与する。場合によっては、誘導因子または薬剤を、全身ではなく被験対象の身体の局所領域のみに到達する方法で投与する。一つの態様では、誘導因子または薬剤を肝臓に選択的に投与する。特に、誘導因子または薬剤を肝門脈経由で投与する。他の態様では、また特に、投与されるか、または生成する誘導因子が、肝星状細胞だけでアポトーシスを誘導可能で、身体の他の任意の細胞型では誘導可能ではない場合は、誘導因子または薬剤を、さまざまな細胞型に対する曝露を引き起こす静脈内投与などの経路で投与する。
【０１０１】
治療的有効量の誘導因子または薬剤を被験対象に投与する。誘導因子または薬剤の用量は、さまざまなパラメータに従って、特に使用物質；治療対象となる患者の年齢、体重、および状態；投与経路；および必要とされる処方に従って決定することができる。医師であれば、任意の特定の患者に必要な投与経路および用量を決定することができる。ヒトへの投与に先立ち、インビトロ試験および動物対象試験で適切な有効量を決定することができる。典型的な1日量は、特定の誘導因子または薬剤の活性、治療対象となる被験対象の年齢、体重、および状態、退縮の種類および重症度、ならびに投与頻度および投与経路に従って、約0.01〜50 mg/kg体重である。好ましくは1日投与量は5 mg〜2 gである。
【０１０２】
グリオトキシンまたはこの誘導体の場合、被験対象には例えば、0.1〜20 mgのグリオトキシン/kg体重、好ましくは1〜10 mgのグリオトキシン/kg体重、さらにより好ましくは1〜5 mgのグリオトキシン/kg体重を投与することができる。本発明の他の誘導因子については、同等の用量範囲を用いることができる。
【０１０３】
本発明のいくつかの態様では、核酸分子を含む薬剤、または本質的に含む薬剤を被験対象に投与する。これは、ウイルス、リポソーム、コーティングされた粒子、および/または裸の核酸などの任意の適切な形状の場合がある。核酸コンストラクトは、任意の利用可能な手法、および/または上記の任意の経路を含む経路で投与することができる。特に核酸を、肝臓に、また好ましくは肝星状細胞に選択的に投与する。核酸コンストラクトの取り込みは、いくつかの既知のトランスフェクション法、例えばトランスフェクション用薬剤の使用を含む方法で高めることができる。このような薬剤の例には、陽イオン性薬剤、例えばリン酸カルシウム、およびDEAE-デキストラン、およびlipofectant（例えばlipofectamやtransfectam）などがある。投与する核酸の用量は変更することができる。典型的には核酸を、粒子による遺伝子輸送の場合は核酸量にして1 pg〜1 mg、好ましくは1 pg〜10 μgの範囲で、また他の経路の場合は10 μg〜1 mgの範囲で投与する。
【０１０４】
誘導因子または薬剤は、予防的に、または既に肝線維化に罹患している被験対象を治療するために投与することができる。したがって場合によっては、被験対象が、肝線維化を促進すると考えられる薬剤に曝露されていることがわかっている場合に、誘導因子または薬剤を投与する。したがって被験対象は例えば、単に薬剤の過剰投与状態であったり、または肝障害を引き起こすことが知られている他のいくつかの化合物の過剰投与の状態であったりする場合がある。場合によっては、被験対象は実際に肝線維化に罹患している場合があり、またこれが肝硬変に進みつつある場合がある。
【０１０５】
誘導因子または薬剤を単回量で、または1回、2回、3回、5回、10回、またはこれ以上の回数の用量などの複数回の用量で投与することができる。誘導因子または薬剤が複数回投与される場合には、これは例えば、毎日、隔日、隔週、または隔月で投与される場合がある。投与は、被験対象に、肝機能の有意な改善、および/または肝線維化の退縮がみられるまで継続することができる。投与は、個体が線維化のレベルの顕著な上昇を示しているか、および/または肝線維化の作用因子に対する曝露が上昇する回数で行われる場合がある。
【０１０６】
薬物および薬剤
本発明は、被験対象の肝疾患を治療するための薬物の製造における、肝星状細胞のアポトーシス誘導因子の用途、または肝星状細胞のアポトーシス誘導因子をインビボで生成可能な薬剤の用途も提供する。このような誘導因子または薬剤には、以下のようなものがある：
（a）被験対象の肝臓の肝星状細胞に選択的に輸送可能な誘導因子または薬剤；
（b）肝星状細胞のアポトーシスの選択的な誘導因子を、被験対象の肝臓で選択的に誘導可能か、または生成可能な誘導因子または薬剤；および/または、
（c）肝星状細胞で誘導因子を特異的に生成可能な誘導因子または薬剤。
【０１０７】
本発明は、被験対象の肝疾患を治療するための薬剤、肝星状細胞のアポトーシス誘導因子を含む薬剤、または肝星状細胞のアポトーシス誘導因子を生成可能な薬剤も提供する。このような誘導因子または薬剤には以下のようなものがある：
（a）被験対象の肝臓の肝星状細胞に選択的に輸送される誘導因子または薬剤；
（b）被験対象の肝臓の肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導因子を選択的に誘導するか、または生成する誘導因子または薬剤；および/または、
（c）肝星状細胞で誘導因子を特異的に生成可能な誘導因子または薬剤。
【０１０８】
本発明のこれらの態様の両方において、誘導因子、薬剤、肝疾患、治療対象となる被験対象、および他の局面は、本発明の他の態様と同じ場合がある。
【０１０９】
以下の実施例によって本発明を説明する。
実施例
実施例1：グリオトキシン投与によるインビボモデルにおけるグリオトキシンによる肝星状細胞のアポトーシスの選択的誘導および肝線維化の退縮の証明
【０１１０】
材料および方法
試薬
雄のSprague-Dawleyラット（200〜225 g）はCharles River（Margate, Kent, England）から購入した。グリオトキシン、ビス-デチオ-ビス（メチルチオ）-グリオトキシン（mt-グリオ）、四塩化炭素（CCl4）、[m]-ヨードベンジルグアニジン（m-IBG）、およびピロリジンジチオカルバメート（PDTC）はSigma Chemical Co.（Dorset, England）から購入した。Calcein-2AM、fluo-3AM、カスパーゼ阻害剤1（Z-VAD-FMK）、およびquin-2amはCalbiochem（Nottingham, England）から入手した。テトラメチルローダミンメチルエステル（TMRM）は、Molecular Probes（Eugene, Oregon）から入手した。他のすべての化合物は、最高純度のものを地域の業者から入手した。
【０１１１】
肝細胞の単離、培養、および処理
ラットの肝星状細胞（HSC）をプロナーゼ/コラゲナーゼ潅流法で単離し、Opti-prep（商標）（Nycomed, Amersham, England）、およびエルトリエーション法により、基本的に文献に記載の方法で等密度遠心法で精製した（Bahr et al., Hepatology (1999) 29: 839-848）。ヒト肝星状細胞を、切除されて廃棄された肝臓から同様のプロトコルで単離した（Trim et al., J. Biol. Chem., (2000) 275: 6657-6663）。科学的実験に対するヒト肝臓組織の使用に関しては、倫理委員会（UK South and West Local Research Ethics Committee）による承認を受け、患者の同意を得た。
【０１１２】
肝星状細胞を、単離時には検出不能なレベルから平滑筋アクチンの発現までの時間を徐々に長くし、少なくとも14日かけて文献に記載された手順で培養した（Bahr et al.、前出、およびTrim et al.、前出）（データは示していない）。肝臓の筋線維芽細胞が肝臓の線維形成に寄与する可能性があること、また肝臓の筋線維芽細胞が、継体中の肝星状細胞培養物に混入している恐れがあることが最近報告されている（Knittel et al., Gastronenterology, (1999) 117: 1205-1221）。本研究では、デスミンおよびグリア線維性酸性タンパク質陽性（肝星状細胞では発現されるが肝臓筋線維芽細胞では発現されないことがわかっているマーカー、Knittel et al.、前出）の肝星状細胞の初代培養のみを使用した。
【０１１３】
ラットの肝細胞をコラゲナーゼ灌流法により、基本的に文献の方法に従って単離した（Harvey et al., Biochemical J., (1998) 331: 273-281）。肝細胞を、肝星状細胞に関して文献に記載された手順で培養した（ただし最初に、コラーゲンでコーティングしたプレート内の、10%ウシ胎仔血清および1 μg/mLのインスリンを添加したウィリアムス培地Eで最初の2時間培養する点を除く）。
【０１１４】
細胞を、DMSO溶媒に溶解したグリオトキシンで処理した（2000倍モル濃度のストック液から培地に添加）。対照細胞をDMSO溶媒（0.05% vol/vol）のみで処理した。他のすべての培地添加物は、DMSOに溶解した濃縮ストック液から調製するか、または培地に直接添加した。ウェルのタンパク質含量をローリー法で決定した（Lowry et al., J.  Biol. Chem., (1951) 193: 265-275）。
【０１１５】
カスパーゼ3活性の決定
直径100 mmのディッシュ（Greiner, Frickenhausen, Germany）で培養した肝星状細胞を回収し、遠心してペレットを得た。培養上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの氷冷リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した。カスパーゼ3（DEVDase）活性を、比色CaspACEキット（Promega, Southampton, England）を用いて製造業者の指示書に従って決定した。
【０１１６】
低分子量DNAの断片化の試験
直径35 mmのディッシュ（Greiner）で培養した肝星状細胞を回収し、遠心してペレットを得て、DNAの断片化を、文献に記載された手順で決定した（Elsharkawy et al., Hepatology (1999) 30: 761-769）。
【０１１７】
ヨウ化プロピジウムフロー活性化細胞ソーティング解析
剥がれた細胞のペレットを遠心して得て、PBSで洗浄し、HYPO緩衝液（0.1% wt/vol）クエン酸ナトリウム、および50 mg/mLのヨウ化プロピジウムを含む0.1%（wt/vol） Triton（商標） X-100に再懸濁し、1時間インキュベートした。次に細胞をBecton Dickinson（San Jose, CA） FACScan装置を接続した蛍光標示式細胞分取器（FACS）で解析した（488 nmの励起波長と、530 nmの帯域通過フィルタを使用）。結合状態の細胞を、PBSで細胞を洗浄後にHYPO緩衝液中に掻き取った。
【０１１８】
培養した肝星状細胞および組織切片を対象とした、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるデオキシウリジン三リン酸のニック末端標識による染色
ラットおよびヒトの肝星状細胞、ならびにラットの肝組織を4%パラホルムアルデヒド（溶媒PBS）、または10%ホルマリン（溶媒PBS）中にそれぞれ固定してからギムザ染色を行った。DNAの断片化を、DNAの3'-OH末端に、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、Boehringer社のキットを用いて、基本的に製造業者記載の手順に従って、ジゴキシゲニン標識デオキシウリジン三リン酸（dUTP）を酵素の作用で付加して標識して調べた。非特異的な反応を減らすために、ラットの肝組織の切片を文献に記載された手順でジエチルピロカルボネートで調製した（Stahelin et al., J. Clin. Pathol. Mol. Pathol. (1998) 51: 204-208）。
【０１１９】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるデオキシウリジン三リン酸のニック末端標識（TUNEL）陽性細胞が活性化した肝星状細胞であるか否かを判定するために、TUNEL陽性の核を3-アミノ-9-エチルカルバゾール染色（赤）で同定し、続いて、Fast Blueで検出されるアルカリホスファターゼ結合型二次抗体でα平滑筋アクチンの免疫染色を基本的に文献の方法に従って行った（Iredale et al., J. Clin. Invest., (1998）; 102: 538-549）。
【０１２０】
NF-κBのDNA結合活性に関する電気泳動移動度シフトアッセイ法
NF-κBのDNA結合活性の解析を目的として、高塩濃度で抽出可能な粗核タンパク質を、活性化した肝星状細胞から、基本的に文献に記載された手順（Elsharkawy et al.、前出）で調製し、分注し、-80℃で必要時まで保存した。抽出タンパク質の濃度をローリー比色アッセイ法（Lowry et al.、前出）で、ウシ血清アルブミンを標準として決定した。コンセンサスNF-κB-DNA結合部位（下線部）を含む2本鎖の5'末端放射標識オリゴヌクレオチド
2006510586.tif 000002
（Baldwin et al., Annu. Rev. Immunol., (1996) 14: 649-681）を用いて、粗核抽出物のNF-κBのDNA結合活性を決定した（Elsharkawy et al.、前出）。
【０１２１】
共焦点顕微鏡
細胞内カルシウム濃度を、直径35 mmのディッシュに分注した、活性化した肝星状細胞をFluo-3AM（2.5 μmol/L）とともに2時間、事前にロードすることで調べた。ミトコンドリアの完全性を、TMRM（500 nmol/L）およびCalcein-AM（1 μmol/M）と細胞を同時に3時間ロードして決定した。ローディング後に、培地を除去し、細胞を共焦点顕微鏡観察用緩衝液（145 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgSO4、1 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L HEPES、25 mmol/L グルコース、1 mmol/L CaCl2、および2 mg/mL ウシ血清アルブミン、pH 7.4）で十分洗浄し、グリオトキシン（1.5 μmol/L）を含む2 mL の共焦点顕微鏡観察用緩衝液中で、またはDMSO溶媒対照中で37℃でインキュベートした。
【０１２２】
蛍光像を、Biorad microradiance共焦点スキャンシステムを接続したOlympus BX50WI顕微鏡で1 μm間隔で得た。Fluo-3およびCalceinによる蛍光を488 nmで励起させ、帯域幅フィルターを用いて515〜530 nmで回収した。TMRMは543 nmで励起させ、570 nmを超える波長で回収した。
【０１２３】
肝線維化の四塩化炭素（インビボ）モデル
ラットを各群にランダムに割り付け、2 mLのCCl4 ：オリーブオイル（1:1 [vol/vol]）/kg体重を、週2回の腹腔内注射して肝線維化を誘導した。対照個体には、オリーブオイル（1 mL/kg体重）を腹腔内に注射した。グリオトキシンを最大3 mg/kg体重となるまで腹腔内に注射した。グリオトキシンは、ジメチルスルホキシド（DMSO）を溶媒として溶解し、対照動物にはDMSOのみを注射した。
【０１２４】
必要な時間の経過後に、二酸化炭素で窒息させてラットを殺し、組織を摘出して解析を行った。血清を調製し、アルカリホスファターゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの活性を、基本的に文献の方法に従って解析した（Wright et al., Biochem. Pharmacol., (1992) 43: 237-243）。H&Eによる染色、シリウスレッドによる染色、およびα平滑筋アクチンの免疫化学染色により、ホルマリンで固定した肝切片の組織化学的染色を、基本的に文献の方法に従って行った（Iredale et al.、1998、前出）。
【０１２５】
結果
グリオトキシンは肝星状細胞のアポトーシスをインビトロで促進する
それぞれ14日間と24日間かけて培養活性化したラットとヒトの肝星状細胞をDMSO溶媒対照、またはグリオトキシン（1.5 μMol/L）で処理した。少なくとも6つの別個の細胞調製物を対象とした光学顕微鏡による観察の結果、グリオトキシンの添加が、顕著な形態変化を1時間以内に生じることがわかった。肝星状細胞は、細胞間境界が明瞭な平面状線維芽細胞の表現型から、基層から剥がれ、球状化し、また小疱状（blebbed morphology）へと変化した。4時間に満たないインキュベーションで、グリオトキシン処理に関連した形態変化が、すべての肝星状細胞で観察され、肝星状細胞の大半が培養ディッシュの基層から剥がれていた。
【０１２６】
次にカスパーゼ3（Ac-DEVD-pNA切断）活性を、グリオトキシンで処理した肝星状細胞と対照細胞を対象に調べた。直径100 mmのプレートで14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞を、DMSO（0.05%, vol/vol）、グリオトキシン（1.5 μmol/L）、Z-VAD-FMK（20 μmol/L）、またはクロルプロマジン（200 μmol/L）で3時間処理した。次に細胞を回収して、カスパーゼ3活性を「材料および方法」のセクションに記載された手順で調べた。得られた結果を図2Aに示す（結果は、3回の別個の実験で決定されたカスパーゼ活性の平均および標準偏差で表す）。
【０１２７】
得られた結果は、3時間のグリオトキシン処理で肝星状細胞におけるカスパーゼ3活性の有意な（7.6倍の）上昇が、カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKによる細胞の同時処理によって阻害されたことを示している。グリオトキシン処理時に認められたカスパーゼ3活性の上昇は、肝星状細胞をクロルプロマジンで処理した場合には認められなかった。クロルプロマジンは、基層からの剥離、形態変化、およびトリパンブルー（0.1%, wt/vol）を除外できない細胞の出現によって判断されるように、肝星状細胞に毒性を示した。肝星状細胞のグリオトキシン処理は、トリパンブルー（0.1%, wt/vol）を除外した剥離細胞を生じたことから、細胞膜が損なわれていないことが示唆された。
【０１２８】
DNAのヌクレオソームラダーへの切断にグリオトキシンが及ぼす作用を調べた。なぜなら、この切断現象はアポトーシスの特徴であるためである。6ウェルプレートで14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞を、DMSO（0.05%, vol/vol）で4時間、またはグリオトキシン（1.5 μmol/L）で0時間、30分間、1時間、2時間、または4時間のいずれかの時間、処理した。各時点において、剥離細胞と結合細胞を一括して回収し、低分子量DNA（20,000 gの上清）の断片化を、「材料および方法」のセクションに記載された手順で決定した。少なくとも3回の別個の実験を実施した。1キロ塩基対のDNAのラダー（Promega）を分子量マーカーとして用いた。得られた結果から、ラットの肝星状細胞のグリオトキシン処理が、DNA切断によるヌクレオソームラダー形成の時間依存性の増加を招くこと、そしてラダー形成が2時間の時点で見られ始め、実質的なラダー形成が4時間の時点で見られることがわかる。
【０１２９】
次に、さまざまな化合物がDNAラダー形成に及ぼす作用を決定した。6ウェルプレートで14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞を以下の試薬で処理した：
（a）DMSO（0.05%, vol/vol）；
（b）mt-グリオ（1.5 μmol/L）；
（c）グリオトキシン（1.5 μmol/L）；
（d）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋ピロリンジチオ炭酸塩（300 μmol/L）；
（e）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋Z-VAD-fMK（100 μM）；
（f）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋Z-VAD-fMK（10 μM）；または
（g）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋Z-VAD-fMK（1 μM）。
4時間の処理後に、DNAの断片化を決定した。
【０１３０】
グリオトキシン処理に応じたヌクレオソームラダーの出現は、100 μm/Lおよび10 μm/LのZ-VAD-fMKで完全に阻害され、また実質的な阻害が、低い1 μmol/LのZ-VAD-fMKで持続していた。しかし、100 μmol/Lの高濃度のZ-VAD-FMKは、グリオトキシンに起因する形態変化を妨げなかった。以上の結果は、カスパーゼ3の誘導およびDNA切断によるヌクレオソームラダーの出現が、グリオトキシンで促進されたアポトーシスの後期現象であることを示唆している。
【０１３１】
興味深いことに、mt-グリオ（mt-グリオの構造については図1を参照）は、ラットおよびヒトの肝星状細胞の形態に影響せず、またDNAのヌクレオソームラダーへの切断を生じなかった。これは、グリオトキシン内のジチオール架橋がアポトーシス誘導能力に不可欠なことを示唆しており、またこれは、チオール還元剤であるピロリジンジチオカルバミン酸が、ラットおよびヒトの肝星状細胞におけるグリオトキシンの、形態に対する作用を阻害し、またDNAのヌクレオソームラダーへの切断を阻害するという観察から支持される。したがって、グリオトキシンによる重要なチオール（群）の酸化は、形態変化およびDNA切断段階の前に生じる現象である。
【０１３２】
グリオトキシンに応じたアポトーシスの規模および重要性の特徴を明らかにするために、ラットの肝星状細胞におけるDNA鎖の切断を、ヨウ化プロピジウム染色細胞を対象としたFACS解析で評価した。14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞をDMSO溶媒対照（0.05%, vol/vol）、またはグリオトキシン（1.5 μmol/L）で2時間処理し、回収し、「材料および方法」のセクションに記載された手順で、ヨウ化プロピジウムで染色した。染色前に、対照およびグリオトキシンで処理した肝星状細胞の両方が、トリパンブルーを排除することがわかっていた。この事実は、細胞膜が損なわれていなかったことを意味する。次に細胞をFACSで解析した。得られた結果を図2Bに示す。
【０１３３】
図2Bは、グリオトキシン処理した肝星状細胞（1x104；斜線）で見られた現象と比較時の対照細胞（1x104；透明）で見られた現象を示す。この結果は、6回の別個の実験で典型的である。対照の肝星状細胞のヨウ化プロピジウムによる染色の結果、非切断のDNAを含む生きている星状細胞に由来する核の蛍光に明瞭なピークが生じた。また対照において、より大きな蛍光強度にみられる小さなピークは、有糸分裂が起きた星状細胞に由来する核である可能性が高い。グリオトキシン処理では、トリパンブルーを排除した肝星状細胞が得られたが、この処理細胞は、核をヨウ化プロピジウムで染色時に、広範囲に低レベルの蛍光を生じている。これはDNAの切断を意味する。
【０１３４】
DNA鎖の切断はTUNEL染色でも明らかにされた。14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞を、DMSO（0.05%, vol/vol）、またはグリオトキシン（1.5 μmol/L）で2時間処理し、DNA鎖の切断をTUNEL染色で、「材料および方法」に概略が記載された手順で調べた。TUNEL染色の忠実度は、dUTPをプロトコルに取り込むことなく、対照細胞およびグリオトキシン処理細胞を染色して決定し、DMSO対照で処理した肝星状細胞の場合と同様の染色結果を得た。ラットの肝星状細胞のグリオトキシン処理では、対照細胞とは対照的に、広範囲に及ぶTUNEL陽性染色がみられた。
【０１３５】
活性化したヒト肝星状細胞への、インビトロにおけるグリオトキシンの添加の結果、ラットの肝星状細胞で観察された場合と類似の形態変化がみられた。一般にヒトの肝星状細胞は、形態変化を、ラットの肝星状細胞と比較してより速やかに生じたが、ヒトの肝星状細胞は、そのDNAをオリゴヌクレオソーム長の断片へと切断しなかった（6回の独立した実験を実施して確認）。しかし、グリオトキシン処理に応じたDNAの切断が、ヒトの肝星状細胞の核をヨウ化プロピジウムによる染色か、またはTUNEL染色により検出されたことから、グリオトキシンが、ヒトならびにラットの肝星状細胞のアポトーシスを開始することが示唆された。
【０１３６】
グリオトキシンは高濃度でのみ細胞死の壊死機構を介してラット肝細胞を死滅させる
ラットの肝星状細胞および肝細胞を死滅させるのに必要なグリオトキシンの用量を比較した。14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞またはラットの肝細胞を、DMSO（0.05%, vol/vol）、またはグリオトキシン（1.5 μmol/L）のいずれかで処理し、細胞接着状態を、4時間後に各ウェルを対象としたタンパク質の直接アッセイ法で、「材料および方法」に概略が記載された手順で決定した。得られた結果を図3Aに示す。3回の別個の実験における、DMSO対照に対する、接着の平均および標準偏差のパーセンテージで表す。得られた結果から、インビトロにおいて、ラットの肝星状細胞と比較して、有意に（10〜100倍）高い濃度のグリオトキシンがラットの肝細胞を死滅させるのに必要であったことがわかる。グリオトキシンと肝細胞を長時間インキュベートしても、有意差のあるレベルの細胞死は認められなかった。
【０１３７】
さまざまな化合物が細胞の生存および接着に及ぼす作用を決定した。以下の試薬との4時間の処理後における接着状態と0.1 %（wt/vol）のトリパンブルーの排除によって判断されるラットの肝細胞の生存率を決定した：
（a）DMSO（0.05%, vol/vol）；
（b）グリオトキシン（50 μmol/L）；
（c）クロルプロマジン（200 μmol/L）；
（d）TNF-α（10 ng/mL）＋シクロヘキシミド（10 μmol/L）；または、
（e）メタピリレン（200 μmol/L）。
【０１３８】
得られた結果を図3Bに示す。この結果は、50 μmol/Lのグリオトキシンによる処理が、基層に対する細胞接着に有意な減少を引き起こすこと、また約90%の肝細胞が、肝細胞毒素であるクロルプロマジンおよびメタピリレンによってに引き起こされる場合と同等のレベルである、0.1%（wt/vol）のトリパンブルーを排除しないことを示している（Ratra et al., Toxicology (1998) 130: 79-93）。これとは対照的に、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、および肝細胞のアポトーシスを促進することが知られているシクロヘキシミド（Bradham、Mol. Cell. Biol., (1998) 18: 6353-6364）による肝細胞の処理は、0.1%（wt/vol）のトリパンブルーの排除で判断される膜の完全性を損なうことなく細胞の剥離を招いた。
【０１３９】
DNAラダー形成にも注目して、グリオトキシン、クロルプロマジン、メタピリレン、およびTNF-αとシクロヘキシミドとの組み合わせが、肝細胞および肝星状細胞に及ぼす作用を比較した。ラットの肝細胞を、以下の試薬で4時間処理した：
（a）DMSO（0.05%, vol/vol）；
（b）グリオトキシン（50 μmol/L）；
（c）クロルプロマジン（200 μmol/L）
（d）TNF-α（10 ng/mL）＋シクロヘキシミド（10 μmol/L）；または
（e）メタピリレン（200 μmol/L）。
処理後にDNAのラダーの形成を評価した。得られた結果は、グリオトキシン、クロルプロマジン、またはメタピリレンのいずれかで処理した肝細胞とは対照的に、TNF-α＋シクロヘキシミドで処理した肝細胞だけが、DNAをヌクレオソームラダーに切断することを示していた。
【０１４０】
興味深いことに、DNAの切断は肝星状細胞で濃度依存的に誘導され、またこの基準で判断されるアポトーシスは、低いグリオトキシン濃度（300 nmol/L）で処理した肝星状細胞で検出された。しかしながら、比較的高濃度のグリオトキシン（37.5 μmol/L）では、低濃度のグリオトキシンで処理した肝星状細胞と比較時に検出されるDNA切断のレベルの減少が認められた。この結果は、グリオトキシンが高濃度では、肝星状細胞と肝細胞の両方に対して壊死的に作用するが、低濃度では、肝星状細胞でのみアポトーシスを促進することを示唆している。
【０１４１】
グリオトキシンの作用機序：グリオトキシン依存性の肝星状細胞のアポトーシスにおいて、NF-κB、ミトコンドリアの透過性亢進、およびカルシウムが果たす役割
肝星状細胞のNF-κB活性にグリオトキシンが及ぼす作用を調べた。14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞を、以下の試薬を添加してから15分後にTNF-α（10 ng/mL）の存在下または非存在下でインキュベートした：
（a）DMSO溶媒（0.05%, vol/vol）；
（b）グリオトキシン（1.5 μmol/L）；
（c）N-アセチルシステイン（5 mM）；
（d）カルパイン阻害物質1（50 μM）；
（e）デキサメタゾン（0.5 μm）；または
（f）ペントキシフィリン（3.6 mM）。
【０１４２】
さらに30分後に、また任意の有意な形態的変化が現れる前に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、核抽出物を調製し、またNF-κBのDNA結合活性をゲルシフト解析で評価した。モル濃度で50倍を上回る冷NF-κBオリゴヌクレオチドを含む別の対照核抽出物をゲルに流したところ、特異的な飽和性結合（saturable binding）の存在が明らかとなった。各レーンは、6 mgのタンパク質を含み、得られた結果は、少なくとも3回の別個の実験で同じであった。
【０１４３】
得られた結果は、グリオトキシンが、構成的なNF-κBのDNA結合活性に対して顕著な阻害作用を示さないが、活性化したラット肝星状細胞でTNF-α誘導型のNF-κBのDNA結合活性を阻害することを示している。NF-κBのDNA結合活性に対する他の既知の阻害剤：N-アセチルシステイン（Staal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 9943-9947）；ペントキシフィリン（Lee et al., Am. J. Physiol., (1997) 273: G1094-G1100）；およびデキサメタゾン（Caldenhoven et al., Mol. Endocrinol., (1995) 9: 401-412）は、構成的またはTNF-α誘導的な、活性化したラット星状細胞のNF-κBのDNA結合活性のいずれに対してもほとんど作用を示さなかった。
【０１４４】
カルパイン阻害物質1は、グリオトキシンと類似の機構によってNF-κBを、IκB分解の阻害を介して阻害することが報告されている（Palombella et al., Cell (1994) 78: 773-785）。この結果から、カルパイン阻害物質1による処理が、ゲルシフトで検出される構成的およびTNF-α誘導的なNF-κBのDNA結合複合体の形成を阻害し、いずれの移動度をも変化させることがわかった。またCI-1処理により、対照（CI-1を含まない）星状細胞核抽出物には存在しなかった低移動度の複合体が出現した。しかしながら、NF-κBのDNA結合活性に対するこのような作用にもかかわらず、CI-1処理は、カスパーゼ3活性の誘導やDNAのヌクレオソームラダーへの切断などの、形態的基準および生化学的基準で判断されるラット肝星状細胞のアポトーシスを引き起こさなかった。
【０１４５】
CalceinおよびTMRMは、細胞質とミトコンドリア中にそれぞれ蓄積する蛍光色素である。これらを用いて、ミトコンドリアの透過性亢進の開始を可視化することができる（Bradham et al.、前出）。ミトコンドリアの透過性亢進（MPT）は、ミトコンドリア内膜の透過性の急激な上昇を招き、またシトクロムCの放出、カスパーゼの活性化、およびアポトーシスと関連する（Yang et al., Science (1997) 275: 1129-1132）。
【０１４６】
14日間かけて培養活性化したラットの肝細胞に、Calcein（緑色の蛍光）、およびTMRM（赤色の蛍光）をロードし、次にDMSO溶媒（0.05%, vol/vol）またはグリオトキシン（1.5 μmol/L）のいずれかで処理した。緑色の蛍光と赤色の蛍光を、「材料および方法」に概略が記載された手順で、定期的に可視化した。得られた結果は、少なくとも3回の別個の実験について典型的であった。
【０１４７】
ラットの肝星状細胞にCalceinおよびTMRMをロードしたところ、別の細胞分布が生じ、ミトコンドリアが極性を示し、また非処理細胞で低分子量の溶質を透過させないことがわかった。活性化したラットの肝星状細胞にグリオトキシンを添加してもインキュベーションの2時間後までに明瞭な作用は認められず、2時間後の時点でTMRM蛍光の細胞の周囲への移動が初めて認められ、また4時間後の時点ではTMRM蛍光は消失した。TMRM蛍光強度の消失は、ミトコンドリア透過性の消失と関連する可能性が高い（Bradham et al.、前出）。しかし、全ての実験において、ミトコンドリアの移動および膜透過性の変化が、有意な形態変化後にみられたことから、MPTがグリオトキシン依存性のアポトーシスにおける後期段階の現象であることを示唆している。
【０１４８】
次にDNAラダー形成を調べ、蛍光画像の結果が支持されるか否かを調べた。6ウェルプレートで14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞を、以下の試薬で処理した：
（a）DMSO（0.05%, vol/vol）；
（b）グリオトキシン（1.5 μmol/L）；
（c）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋タモキシフェン（100 μmol/L）；
（d）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋アクチノマイシンd（1 mg/ml）；
（e）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋シクロヘキシミド（10 μmol/L）；
（f）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋シクロスポリン（10 μmol/L）；
（g）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋m-ヨードベンジルグアニジン（250 μmol/L）；
（h）グリオトキシン（1.5 μmol/L）＋quin-2-am（50 μmol/L）； 
（i）quin-2-amのみ（50 μmol/L）；
（j）m-ヨードベンジルグアニジン（250 μmol/L）；
（k）シクロスポリン（10 μmol/L）；
（l）シクロヘキシミド（10 μmol/L）；
（m）アクチノマイシンd（1 μg/ml）；または
（n）タモキシフェン（100 μmol/L）。
【０１４９】
4時間の処理の後に、「材料および方法」に概略が記載された手順でDNAの断片化を判定した。得られた結果は、少なくとも3回の別個の実験に関して典型的であった。肝星状細胞をグリオトキシンで処理したすべての場合において、培地への他の添加物にかかわらず、細胞の剥離、および他の形態変化が依然として認められたことに注目されたい。
【０１５０】
MPTの阻害剤であるm-ヨードベンジルグアニジン（Juedes et al., FEBS. Lett., (1992) 313: 39-42）、およびタモキシフェン（Custodio et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., (1998) 152: 10-17）は、DNAのヌクレオソームラダーへの切断を妨げたが、シクロスポリンAは妨げなかった。しかし、基層からの肝星状細胞の剥離、およびグリオトキシンに起因する他の形態変化は妨げなかった。したがってMPTは、DNAのヌクレオソームラダーへの切断の上流に位置し、NF-κBの阻害などの初期段階の下流に位置する可能性が高い。
【０１５１】
MPTは、細胞死の可能性を高める、ミトコンドリアによるわずかなCa2+再利用を招く（Crompton et al., Biochem. J. (1999) 341: 233-249）。したがって、グリオトキシンによるアポトーシスの後期段階にMPTが果たす役割についても、細胞内カルシウムレベルを測定することで評価した。14日間かけて培養活性化したラットの肝星状細胞をfluo-3とともに6ウェルプレート中にロードし、DMSO対照またはグリオトキシン（1.5 μmol/L）による処理後に、「材料および方法」のセクションに記載された手順で蛍光像を得た。得られた結果は、細胞内Ca2+レベルが、グリオトキシンとのインキュベーションの2時間後まで、また細胞の剥離後まで上昇しないことを示していた。細胞透過性のCa2+キレート剤quin-2AMも、細胞の剥離を妨げることなくDNA切断を阻害した。
【０１５２】
肝線維化のラットモデルにおけるグリオトキシン投与による作用
ラットに四塩化炭素を7週間かけて投与した結果、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ活性は有意に上昇したが、血清アルカリホスファターゼ活性は上昇しなかった。この結果は、四塩化炭素が主に肝実質細胞を損なっていたことを示唆している（表1参照）。
【０１５３】
グリオトキシンの毒性に関するパイロット試験では、3 mg/kg体重の用量のグリオトキシンが、何ら明瞭な有害な作用をラットに引き起こさなかったことが示唆されており、また肝臓の組織切片の試験で、肝臓が損傷を受ける証拠は得られなかった。対照投与ラットまたは四塩化炭素投与ラットへのグリオトキシンの単回注射では、血清肝酵素レベルに何ら有意な変化は見られなかったことから、グリオトキシンが、この用量だけでは単独で肝毒性を示さないこと、また四塩化炭素の肝毒性を調節しないという証拠が支持される（表1参照）。
【０１５４】
（表１）肝線維化のインビボモデルにおけるグリオトキシン投与の作用
2006510586.tif 000003
＊ CCl4を週に2回、7週間にわたって（グリオトキシンの単回注射の場合）、または4週間（グリオトキシンの毎週注射の場合）にわたって、オリーブオイルと1：1（vol/vol）の混合物腹腔内注射で投与した（対照にはオリーブオイルのみ）。各投与群の個体数は3〜5匹とした。
＃  グリオトキシンはDMSOに溶解した。対照についてはDMSOのみを投与した。最後のCCl4注射の48時間後に個体を殺した（グリオトキシンの単回注射/連続注射の最終回の24時間後）。
a、b CCl4投与のみの個体に対して、有意に異なる（P>95%）血清肝臓酵素レベル。
¶ 免疫組織化学的染色で判断されたα-sma陽性細胞数の平均およびSD。各個体のスライドを染色し、20の無作為に選択した高倍率の視野（110倍）における平均数を用いて、各群の平均およびSDを算出した。
† 無作為に選択した20視野のα平滑筋アクチン陽性細胞の平均数が、CCl4投与のみのラットと比較して有意に異なる（スチューデントのt検定、両側、P>95%）。
§ シリウスレッドで染色したバンドのmid-intraobularの幅（1匹あたり10回の個別の測定の平均）。
£ CCl4投与のみのラットと比較時のシリウスレッドで染色したバンドの有意に低い平均幅（スチューデントのt検定、片側）。
n/d＝決定せず。
【０１５５】
次に、7週間の四塩化炭素投与後に、グリオトキシンの単回注射がα平滑筋アクチン肝臓免疫染色に及ぼす作用を決定した。四塩化炭素の最終注射の1日後に、ラットにグリオトキシンを投与し、その翌日に殺した。
【０１５６】
以下の試薬を投与したラットの肝切片を染色した：
（a）溶媒（オリーブオイル）で7週間と、これに続くDMSO；
（b）溶媒（オリーブオイル）で7週間と、これに続くグリオトキシン（3 mg/kg体重）；
（c）四塩化炭素で7週間と、これに続くDMSO；および、
（d）四塩化炭素で7週間と、これに続くグリオトキシン（3 mg/kg体重）。
得られた結果は、1回の投与あたり5匹の個体に関して典型的であった。
【０１５７】
染色した肝切片から、四塩化炭素の投与が、肝細胞脂肪の有意な変化、および肝臓の組織切片におけるα平滑筋アクチン陽性の肝星状細胞の増加を招くことが認められた。この結果はまた、四塩化炭素投与ラットへのグリオトキシンの単回注射に、α平滑筋アクチンの免疫染色の特徴および強度に対する明白な作用があることも示していた。各投与群の個体から調製した切片を対象とした定量試験から、四塩化炭素投与ラット肝におけるα平滑筋アクチン陽性細胞の数が、グリオトキシンの単回用量（3 mg/kg体重）の投与によって57%減じたことがわかった（表1参照）。
【０１５８】
グリオトキシンの単回注射が、7週間の四塩化炭素投与後に肝臓のTUNEL染色に及ぼす作用を測定した。四塩化炭素の最終注射の1日後に、ラットにグリオトキシンを投与し、その翌日に殺した。対照個体には、グリオトキシンの代わりにDMSOのみを投与した。ラットの肝切片を、dUTPを適宜取り込ませた染色プロトコルでTUNEL染色した。次に切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１５９】
組織切片のTUNEL染色から、グリオトキシン投与ラット肝のα平滑筋アクチン染色領域におけるTUNEL陽性細胞の数が増えることがわかった。TUNELとα平滑筋アクチンの二重染色から共存することが判明し、グリオトキシンに応じた、線維性の肝臓において、活性化した肝星状細胞の数に関して認められた減少にアポトーシスが関与することが確認された。
【０１６０】
7週間の四塩化炭素投与後のグリオトキシンの単回注射が、肝臓のシリウスレッド染色に及ぼす作用を次に決定した。前回と同様に、四塩化炭素の最終注射の1日後にラットにグリオトキシンを投与し、その翌日に殺した。
【０１６１】
以下の試薬を投与したラットの肝切片を対象に染色を実施した：
（a）溶媒（オリーブオイル）で7週間と、これに続くDMSO；
（b）溶媒（オリーブオイル）で7週間と、これに続くグリオトキシン（3 mg/kg体重）；
（c）四塩化炭素で7週間と、これに続くDMSO；および、
（d）四塩化炭素で7週間と、これに続くグリオトキシン（3 mg/kg体重）。
各投与を受けた5匹の個体で同等の結果が得られた。
【０１６２】
コラーゲンを同定するための、シリウスレッドで染色した肝切片を対象とした盲試験から、グリオトキシン（3 mg/kg）の単回注射が線維化を有意に減少することがわかった。染色の結果（a）〜（d）を図10に示す。線維性バンドのintraobularの平均厚を、接眼焦点板（eye-piece graticule）を用いて高倍率で測定した。表1は、線維性バンドのintraobularの平均厚が、グリオトキシンでも投与した四塩化炭素投与ラットの肝切片では、四塩化炭素のみを投与したラットと比較して有意に減じていたことを示す。
【０１６３】
得られた結果は、グリオトキシンで肝星状細胞のアポトーシスを促進することで、肝線維化の寛解を促すことが可能なことを示している。表1は、肝臓刺激中におけるグリオトキシンの投与によっても線維形成を調節することが可能な場合があることを示している。というのは、グリオトキシンの投与も、四塩化炭素を投与したラットにおける、活性化した肝星状細胞の数と、線維性バンドの厚みを有意に減じているからである。今回実施したインビトロ研究と一致して、グリオトキシンの長期投与そのものが肝毒性を示すという証拠はない。実際には、グリオトキシンの投与が、四塩化炭素投与（表1参照）によって誘導される肝臓の血清酵素のレベルを有意に減少させることから、線維形成の阻害が肝臓の壊死を防ぐ可能性があることが示唆される。
【０１６４】
考察
本明細書に記載されたデータは、ラットおよびヒトの肝臓の両方から単離された、培養活性化した肝星状細胞の即時かつ完全なアポトーシスをグリオトキシンが促進することを明白に示している。さらに、このデータは、グリオトキシンが、線維化の発生後におけるインビボにおける肝星状細胞のアポトーシスの関与にも有効であることを示している。
【０１６５】
肝星状細胞は、例えば線維性マトリックス（fibrotic matrix）の分解に関与する特定のマトリックスメタロプロテアーゼなどの、肝線維化の寛解に関与するいくつかの因子を分泌することが知られている。肝星状細胞のアポトーシスは肝線維化の自然寛解で生じるが、肝臓における創傷治癒反応に関与する細胞の同時除去が、段階的な低下に反して、肝線維化の寛解を促すのではなく、肝臓の構造および機能を大きく乱すと推測することができる。また肝臓がもつ、アポトーシスを起こした肝星状細胞のクリアランスの能力は有限であるはずなので、星状細胞のアポトーシスの誘導が、この能力を超えるアポトーシス星状細胞の数を誘導可能であると考えられる。仮に、これが起こるとすると、良好に除去されないアポトーシス細胞は、二次的な壊死を引き起こすだろう。したがって、今回得られた実験結果は、星状細胞のアポトーシスの誘導が、肝臓の表現型に有害な結果を生じることなく、肝線維化の寛解をインビボで良好に促進可能であることを初めて示すものである。
【０１６６】
本明細書に提示された証拠から、グリオトキシンがこの作用に、NF-κB経路に対する代替的あるいは付加的な機構を介して関与する可能性があることがわかる。活性化した肝星状細胞では、グリオトキシンは、NF-κBのDNA結合活性を強く阻害せず、これは、休止状態の肝星状細胞、またはTNF-αの投与により活性化したラット肝星状細胞で阻害が認められた結果とは対照的であった。実際には、カルパイン阻害物質1は、ラットの肝星状細胞のアポトーシスを促進することができなかったが、NF-κBのDNA結合活性を調節し、またチオール還元剤PDTC（NF-κBを阻害することも報告されている；Schreck et al., J. Exp. Med. (1992) 175: 1181-1194）は肝星状細胞の、グリオトキシンの形態的作用およびアポトーシス作用の両方を妨げた。これにもかかわらず、インビボにおけるグリオトキシンの作用は、機能的に意味のある経路でNF-κBに直接作用する可能性がある。なぜなら、肝炎の存在下では、類洞のTNF-αの濃度が上昇する場合があるからである。
【０１６７】
NF-κB以外の細胞内標的が、グリオトキシン依存性のアポトーシス機構に重要な役割を果たしている可能性は高い。グリオトキシンの重要な細胞内標的の1つに、ミトコンドリアの透過性亢進（MPT）が挙げられる。チオールは、MPTの調節に機能的役割を果たすことが報告されており（Crompton et al., Biochem. J., (1999) 341: 233-249）、またグリオトキシンは、そのジスルフィド結合（図1）を介して、タンパク質のチオールと共有結合的に反応することが知られている（Waring et al., Biochem. Pharmacol., (1995) 49: 1195-1201）。
【０１６８】
MPTは、電位依存性の陰イオンチャネル、アデニンヌクレオチドトランスロカーゼ、およびサイクロフィリンDを含むタンパク質の複合体によって構成されている。これらは、ある条件（例えば、酸化的ストレス、高ミトコンドリアCa2+、および有機リン酸レベル）では、ミトコンドリアの内膜と外膜の接触部位において、マトリックスからの1.5キロダルトン未満の分子の流出を可能とする孔を形成する（Crompton et al.、前出）。MPTの開口には、ネクローシスとアポトーシスによる細胞死の両方が関連づけられている（Crompton et al.、前出）。グリオトキシンは、ラットの骨格筋および肝臓のミトコンドリアからのCa2+の放出を促すことが報告されており（Schweizer et al., Biochemistry (1994) 33: 13401-13405、およびSilva et al., Redox. Rep., (1997) 3: 331-341）、このためCa2+キレート剤quin-2-amおよびMPTの阻害剤（m-IBGおよびタモキシフェン）が、DNAのヌクレオソームラダーへの切断を阻害する能力は、MPTおよびミトコンドリア内のCa2+が、グリオトキシンに応じたアポトーシスの段階の少なくとも後期段階に重要な役割を果たすことを示唆している。CsAが、DNAのヌクレオソームラダーへの切断を阻害できないことは、グリオトキシンが、サイクロフィリンDなどのMPT孔を構成するタンパク質（群）と直接混合型のジスルフィド結合を形成することでCsA結合を妨げる可能性があることを意味している。MPTは、シトクロムcの放出との関連から、カスパーゼの活性化を調節することがわかっており（Yang et al.、前出）、またカスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKのもつ、グリオトキシン投与ラットの肝星状細胞におけるカスパーゼ3誘導、およびDNAのヌクレオソームラダーへの切断を阻害する能力は、カスパーゼがDNAの切断を調節していることを意味する。しかしながら、高濃度のZ-VAD-FMKは、グリオトキシンに起因する形態変化を阻害できなかったため、肝星状細胞にカスパーゼ非依存性の（おそらくMPT非依存性の）グリオトキシンの作用があることが示唆される。
【０１６９】
肝星状細胞の促進されたアポトーシスが、線維性の肝臓のリモデリングを促す否かを判断することは極めて重要である。今回実施された研究は、肝星状細胞のアポトーシス率を高めることで、グリオトキシンを投与した個体にみられる線維性バンドが減じたことを示している。アポトーシスが迅速（24時間以内）に起きることは、迅速なコラーゲンの代謝回転が線維性の肝臓で起きている可能性を示唆している。またグリオトキシンは、コラーゲンの蓄積を阻害することで、実質的なコラーゲン合成を阻害する可能性がある。投与の24時間後におけるグリオトキシンの単回注射の作用を（グリオトキシンによるあらゆる全身作用を低下させるため）に決定し、肝線維化からの回復が有意に促進されることがわかったを示した。グリオトキシンの長期投与（例えば肝臓刺激中）により、肝線維化に対するさらにより有意な作用が認められた。
【０１７０】
本明細書に記載された以上のデータから、グリオトキシンが、肝星状細胞のアポトーシスを事実上誘導することがわかる。また肝星状細胞におけるアポトーシスの誘導が、実験的線維化の寛解を促進することがわかった。以上の結果を総合すると、肝星状細胞のアポトーシスの誘導に基づく方法が、効率の良い抗線維化の方法となる可能性が高いことがわかる。
【０１７１】
実施例2：肝星状細胞のアポトーシスがTIMPの作用によって阻害されることの証明
材料および方法
ヒトおよびラットの肝星状細胞の単離
ヒト肝星状細胞を、結腸転移癌の切除時に、正常なヒト肝臓の境界部位から、文献に記載された手順で抽出した（Iredale et al., Clin. Sci., (1995) 89: 75-81）。ラットの肝星状細胞を、正常なラット肝からプロナーゼおよびコラゲナーゼで切断して抽出し、遠心エルトリエーション法で文献に記載された手順で精製した（Arthur et al., J. Clin. Invest., (1989) 84: 1076-1085）。抽出後の肝星状細胞をプラスチック上で、7〜10日後に筋線維芽細胞の表現型に活性化されるまで培養した。初代培養または4回までの継体で、ヒトおよびラットの肝星状細胞を活性化後に実験に用いた。細胞をダルベッコ改変イーグル培地で、16%ウシ胎仔血清および抗生物質の存在下で培養した。
【０１７２】
肝星状細胞の増殖にTIMP-1が及ぼす作用
肝星状細胞を24ウェルの組織培養プレートで培養した。これを無血清培地で24時間洗浄した後に、細胞を、1〜100 ng/mlの濃度範囲のTIMP-1に24時間曝露させ、続いて、トリチウム化チミジン（0.5 μCi/ウェル）で18時間パルス処理した後に、シンチレーションの計数を文献に記載された手順で実施した（Boulton et al., Clin. Sci., (1995) 88: 119-130）。
【０１７３】
HSCのアポトーシスの促進、およびアクリジンオレンジによる核の形態の調査
肝星状細胞のアポトーシスを、完全血清除去（absolute serum deprivation）、シクロヘキシミド処理（Issa et al., Gut (2001) 48: S48-S57）、または神経成長因子の曝露によって、文献に記載された手順で誘導した（Trim et al., Am. R Pathol., (2000) 156, 1235-1243）。肝星状細胞を24ウェルの組織培養プレートで培養した。ラットおよびヒトの肝星状細胞を、組換え型TIMP-1（Biogenesis、Poole、UK）を適宜用いて、また後述する他の操作によってアポトーシスを促進する刺激に曝露させた。37℃で4時間のインキュベーション後に、アクリジンオレンジを各ウェルに添加し（最終濃度1 μg/ml）、細胞を青色蛍光下で観察して核の形態を評価した。アポトーシス小体の総数を数え、上清中に浮かぶアポトーシス小体を、対物レンズを保存しておくことで含めた。フィールドあたりの細胞の総数を数え、アポトーシス指標を算出した。各条件を2回実施し、各ウェルに対して3つの高倍率視野についてカウントした。無血清条件における18時間のインキュベーションに続いて、実験を平行して繰り返し実施した。自己分泌作用を調べるために、肝星状細胞を、アジ化物を含まない（azide free）対TIMP-1ポリクローナル中和抗体、および非免疫性IgG対照（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）と18時間インキュベートし、反応を、アクリジンオレンジ染色で評価してカウントした。アポトーシスをシクロヘキシミドによって誘導させる、非機能性のT2G変異型N-TIMP-1タンパク質および野生型TIMP-1タンパク質を用いた平行実験を実施し、アクリジンオレンジ法で評価した。
【０１７４】
TUNEL染色
肝星状細胞をガラスチャンバースライド上で培養後に、TIMP-1（100 ng/ml）を適宜含めて、50 μMのシクロヘキシミドに18時間曝露させた。次に、アポトーシスの特徴であるDNAの断片化をみるためにスライドをTUNEL反応で、文献に記載された手順を疑陽性出現率を下げるように最近報告された（Stahelin et al., Mol. Pathol., (1998) 51, 204-208）ように一部改変して実施して染色した（Iredale et al., J Clin. Invest., (1998) 102, 538-549）。次に各スライドを、内容を知らされていない者が観察して解析し、各条件について高倍率の10視野に関してTUNEL陽性のアポトーシス数およびTUNEL陰性細胞の数をカウントした。
【０１７５】
カスパーゼ-3活性の決定
アクリジンオレンジによる計数およびTUNEL染色で得られたデータを裏づけるために、組換え型TIMP-1、不活性なT2G変異型N-TIMP-1、野生型TIMP-1タンパク質、および広スペクトルのカスパーゼ阻害剤ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトンを用いた実験を繰り返し実施した。アポトーシスの定量を、カスパーゼ-3活性に対する比色アッセイ法（Promega）で、製造業者の指示書に従って行った。TIMP-1がカスパーゼ-3のアポトーシスを直接阻害するか否かを判定するために、個々の組換え型タンパク質を、組換え型カスパーゼ-3と1時間インキュベートした後に、カスパーゼ-3基質を添加し、カスパーゼ-3活性を上述の手順で測定した。
【０１７６】
PicoGreen蛍光によるDNA濃度の測定
培養した肝星状細胞を、滅菌済みのセルスクレイパー（cell scraper）で回収し、遠心してペレットを得た後に、500 μlのTE 緩衝液（10 mmol/Tris-HCl、1 mmol/liter EDTA、pH 8.0）に再懸濁して、超音波処理を15分間行った。100 μlのPicoGreen（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）（希釈率1：200）を、100 μlの試料に添加し、室温で遮光下で5分間インキュベートした。標準物質は、ニシンの精子DNAから調製した。Cytofluor II Microwell蛍光リーダー（Perceptive Biosystems, Framingham, MA）を用いて、標準波長（励起波長＝485 nm、発光波長＝530 nm）で蛍光を測定した。試料中の2本鎖DNAの濃度を標準曲線から計算した。
【０１７７】
平滑筋アクチンおよびBcl-2に対するウェスタンブロッティング
タンパク質の発現を検出するために、抗α平滑筋アクチンモノクローナル抗体（Sigma）、および対Bcl-2モノクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いて、ラットの肝組織および肝星状細胞を対象としたウェスタンブロット解析を実施した。抽出したタンパク質を対象に、タンパク質含量に関して規格化を行った後に12%のSDS-PAGEゲルで電気泳動を行った。ゲルによる分離後に、タンパク質試料を、二フッ化ポリビニリデン上に電気的に転写した。この膜を、5%脱脂粉乳（溶媒TBS）で1時間かけてブロックした。膜を一次抗体（1：500）または非免疫性IgG（陰性対照）（溶媒TBS）とともに室温で一晩インキュベートした。膜を0.1% Tween TBS（TTBS）で3回（各15分）洗浄した後に、0.5%脱脂粉乳を含む二次抗体（ウサギ抗マウスIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ、希釈率1：2000；溶媒TBS）を1時間かけて添加した。次に膜をTTBSで2回（各10分）洗浄した後に、滅菌水で洗浄した（10分）。反応性バンドを、ECL（Amersham Biosciences）およびオートラジオグラフィーで、製造業者の指示書に従って同定した。
【０１７８】
進行性線維化および線維化回復の実験モデル
12匹のSprague-Dawleyラットのコホートに四塩化炭素をそれぞれ6週間および12週間にわたって注射（週2回、腹腔内）することによって、可逆的な線維化および肝硬変の実験モデルを確立した。各モデルについて、線維化のピーク（四塩化炭素の最終注射の直後）と、自然回復期間の5日目と15日目に肝臓を回収した（各モデルの各時点の個体数＝4）。回収した肝臓を切り分け、ヘマトキシリンおよびエオシン染色用と、シリウスレッド染色用に固定し、また一部を瞬間凍結して生化学的解析および分子解析用とした。各肝臓を対象に組織学的解析を実施し、線維化のピーク時、および回復期間の15日目における凍結肝臓の試料を、ヒドロキシプロリンおよび全コラゲナーゼ活性に関して、文献に記載された手順で解析した（Iredale et al., J Clin. Invest., (1998) 102: 538-549）。このアッセイ法で活性を示すと予想されるMMPは、間質性コラゲナーゼ（MMP-1およびMMP-13）、ゼラチナーゼA（MMP-2）、ならびに膜型1 MMP（MMP-14）である。別の切片を個々の肝臓から切り出し、脱パラフィン処理を行い、マイクロウェーブ抗原回復を行った後に、平滑筋アクチンに関して、文献に記載された手順通りに免疫染色を実施した（Iredale et al., (1998)、前出）。3つの正常な非投与ラット肝も、各実験における対照用として回収した。平滑筋アクチン陽性細胞の数を、内容を知らされていない者が、文献に記載の手順通りにカウントした（Iredale et al., (1998)、前出）。
【０１７９】
Taqmanリアルタイム定量PCR法によるTIMP-1およびGAPDHのメッセンジャーRNAの定量
全RNAを、0日目（線維化のピーク）、および自然回復期間の15日目に、四塩化炭素投与ラット（6週間および12週間）の瞬間凍結した肝臓から抽出した（Qiagen）。first-strand cDNAの合成を、ランダムプライマーおよびモロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素系（Promega）を用いて実施した。すべてのプライマーおよびプローブは、Taqman Primer Expressプログラム、およびPerkinElmer Applied Biosystems 7700配列検出システムを用いるリアルタイムTaqman PCR mRNA定量法で設計した。使用ラットのGAPDH用のプライマーおよびプローブの配列は、センス鎖が
2006510586.tif 000004
で、アンチセンス鎖が
2006510586.tif 000005
であり、またプローブの配列は
2006510586.tif 000006
である。使用したラットのTIMP-1のプライマーおよびプローブの配列は、センス鎖が
2006510586.tif 000007
で、アンチセンス鎖が
2006510586.tif 000008
であり、またプローブの配列は
2006510586.tif 000009
である。1 μlのfirst-strand cDNA（RNA量は10 ng）、0.3 μMのプライマー、および0.3 μMのプローブを25 μlのリアルタイムTaqman PCR法に用いた。Taqman 2x Universal PCR Master Mix、および0.2 mlのOptical Reactionチューブ（PerkinElmer Applied Biosystems）を使用した。反応条件は、初期段階を50℃で2分間、95℃で10分間行い、続いて変性段階を95℃で15秒間、そしてアニーリング伸長段階を60℃で1分間とした。ハウスキーピング遺伝子であるGAPDHの発現の定量を行い、すべての反応を3回行った。各試料中の各mRNAの閾値サイクル（threshold cycle）の検出後に、相対濃度を計算し、平行して解析したGAPDHに関して規格化した。
【０１８０】
FasおよびFasリガンドを対象とした酵素結合免疫吸着アッセイ法
ヒトの肝星状細胞をコンフルエントになるまで成長させ、TIMP-1を適宜添加してBSAに曝露させた。細胞および上清を回収し、FasおよびFasリガンドに関するタンパク質抽出物のアッセイ法を、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ法で、製造業者（Calbiochem）の指示書に従って行った。FasおよびFasリガンドの量を、PicoGreen法によるDNA定量による細胞数に対して規格化した。
【０１８１】
結果
TIMP-1は、シクロヘキシミド、血清除去（serum deprivation）、および神経成長因子によって誘導されるアポトーシスを阻害する
実施例1に示した実験データから、肝星状細胞のアポトーシスを誘導することで肝線維化の寛解を促進可能なことがわかった。ここでは、肝星状細胞のアポトーシスを阻害する因子の1つであるTIMP-1の潜在的な抗アポトーシス作用を調べる。したがって、これは、肝星状細胞のアポトーシスを促進するための介入の標的となる可能性がある。
【０１８２】
アポトーシスをアクリジンオレンジ染色法で評価した。図4Aは、4時間のシクロヘキシミド曝露で誘導したアポトーシスを起こした肝星状細胞（矢印）の例を示す。正常細胞が、アポトーシス小体の周辺に位置している。この手法により、TIMP-1の存在下または非存在下でシクロヘキシミド曝露によってアポトーシスを起こした肝星状細胞のパーセンテージを決定した。肝星状細胞を、50 μMのシクロヘキシミド、および0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、または200 ng/mlのTIMP-1に曝露させた。血清のみで処理した細胞を対照として用いた。得られた結果を図4Bに示す。図4Bの結果から、任意の値を100%とする、対照に対するパーセンテージで表した平均±S.E.が明瞭にわかる。「*」は、シクロヘキシミド vs シクロヘキシミド＋TIMP-1（200 ng/ml）のスチューデントのt検定（n=5）による比較（p<0.001）。この結果から、TIMP-1が、シクロヘキシミド曝露によって誘導された、活性化した肝星状細胞のアポトーシスを1〜200 ng/mlの濃度範囲で用量依存的に有意に減少させることがわかる。TIMP-1と同じ作用が、無血清条件における24時間のインキュベーション後に認められた（データは示していない）。TIMP-1に関して、担体として使用したウシ血清アルブミンには抗アポトーシス作用は認められなかった。シクロヘキシミドで4時間処理したか、または18時間血清除去下においたヒト肝星状細胞を対象とした平行実験の結果、TIMP-1に関する同じ抗アポトーシス作用が認められた（データは示していない；n=4）。
【０１８３】
TIMP-1で処理した肝星状細胞では、シクロヘキシミドによるアポトーシスの誘導によるカスパーゼ-3活性が低下していた
カスパーゼ-3は、アポトーシス促進性カスケードにおける中心的なカスパーゼであり（Hengartner, Nature (2000) 407, 770-776）、アポトーシスを評価する別のアッセイ法として使用することができる。肝星状細胞をシクロヘキシミド（50 μM）＋TIMP-1（0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、または100 ng/ml）とともに培養した。カスパーゼ3阻害物質ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトンか、または血清のみのいずれかで細胞をインキュベートした対照についても実施した。得られた結果を図4Cに示す。データを平均±S.E.で、また任意の値を100%とする、対照に対するパーセンテージとして表す。「*」はp<0.001（n=3）。この結果は、TIMP-1処理が、検討した1〜100 ng/mlの濃度範囲で、カスパーゼ-3活性の用量依存性の低下をもたらすことを示している。10 ng/mlのTIMP-1で処理した細胞のカスパーゼ-3活性の平均は、100 ng/mlのTIMP-1で処理した場合と比較してわずかに低かったが、統計学的に有意ではなかった（スチューデントのt検定、p=0.67）。したがって、この結果は、アクリジンオレンジによる染色および計数によって観察された用量傾向の逆転を意味しなかった。
【０１８４】
カスパーゼ-3に関するデータ、およびアクリジンオレンジで得られた形態学的データは、相互に正確に対応しなかった。例えば10 ng/mlのTIMP-1は、カスパーゼ-3活性を50%低下させたが、アクリジンオレンジ染色および計数によるアポトーシスの形態の変化は30%の低下に留まった。高用量の100 ng/mlでは、TIMP-1は、両手法による測定時にアポトーシスを50%減少させるようであった。観察された用量反応の差は、2つの因子に基づく可能性がある。1つは、各アッセイ法の精度が同じである可能性が低いことである。もう1つは、カスパーゼ-3活性のアッセイ法はアポトーシスの尺度として受け入れられているが、明らかに複雑な酵素カスケードであり、アポトーシスの特徴である形態変化を招く16種類の既知のカスパーゼ酵素の1つの尺度に過ぎないことが挙げられる。
【０１８５】
カスパーゼ-3活性に対するTIMP-1の直接的な作用を除外するために、組換え型ヒトカスパーゼ-3（Calbiochem）を、さまざまな濃度（285〜2850 ng/ml）のTIMP-1とともに1時間インキュベートした後に、カスパーゼ-3基質を反応物に添加した。TIMP-1は、カスパーゼ-3活性を直接的に減じなかった（データは示していない）。
【０１８６】
TIMP-1で処理した肝星状細胞は、シクロヘキシミドによるアポトーシス誘導後にTUNEL法で評価したDNA断片化を減少させた
アポトーシスの別の診断関連性（pathognomonic）の特徴は、DNAがオリゴヌクレオソームの長さに断片化することである（Evan et al., Cell (1992) 69: 119-128）。断片化したDNAはTUNEL法で同定可能なので、シクロヘキシミドの存在下および非存在下における肝星状細胞のアポトーシス応答をさらに定量するために用いることができる。したがって、DNAの断片化を評価するために、活性化した肝星状細胞のアポトーシスを、シクロヘキシミド処理によって、TIMP-1の存在下および非存在下で誘導し、TUNEL陽性細胞の数を評価した。活性化した肝星状細胞をガラスチャンバースライド上で培養し、シクロヘキシミドに18時間曝露させた後に、「TIMP-1あり」または「TIMP-1なし」の条件で処理した。対照として、血清のみで処理した細胞を解析した。得られた結果を図4Cに示す。データを平均±S.E.で、また任意の値を100とする、対照に対するパーセンテージとして表す。「*」はp<0.001（n=2）。この結果は、TIMP-1で処理した、活性化した肝星状細胞が、TUNEL法で評価された断片化DNAを含む細胞の数を、「TIMP-1なし」の条件で処理した対照と比較時に有意に減じたことを示す。
【０１８７】
TIMP-1はBcl-2タンパク質の発現を促進する
タンパク質Bcl-2は、ミトコンドリア膜中への内挿によってアポトーシスを起こすように細胞の性質を調節する（Hengartner、前出）。Bcl-2は、細胞のアポトーシス耐性を高める。Bcl-2のタンパク質レベルの変化を明らかにするために、200 ng/mlのTIMP-1の存在下、および非存在下のいずれかにおいて、シクロヘキシミドで18時間処理した肝星状細胞の抽出物をウェスタンブロッティングで解析した。「血清のみ」、「シクロヘキシミドのみ」、または「シクロヘキシミド＋TIMP-1タンパク質（100 ng/ml）」に曝露させた、肝星状細胞に由来する等量のタンパク質抽出物（タンパク質濃度で決定）をブロッティングで評価した。得られた結果を図4Eに示す。シクロヘキシミドのみで処理した細胞に対して、TIMP-1＋シクロヘキシミドで処理した細胞では、血清のみで維持された肝星状細胞におけるレベルに近いBcl-2タンパク質の発現のレベルの上昇が認められた。
【０１８８】
TIMP-1は、神経成長因子によって誘導されるアポトーシスを阻害する
肝星状細胞は、低親和性の神経成長因子受容体（p75）を発現し、神経成長因子（NGF）の刺激を受けてアポトーシスを起こす。TIMP-1がNGF誘導型のアポトーシスを低下させるか否かを判定するために、NGFで活性化された肝星状細胞を、完全血清除去条件でTIMP-1の存在下（142.5 ng/ml）または非存在下で、NGF（100 ng/ml）に曝露させた。得られた結果を図5に示す。データを平均±S.E.で、また任意の値を100%とする、対照に対する相対値として表す。「*」は、「NGF単独処理」vs「NGF＋TIMP-1処理」に関してp<0.02（スチューデントのt検定、n=3）。予想された通り、NGFは、BSA担体のみで処理した細胞と比較して、肝星状細胞で有意に大きなアポトーシスを誘導した（データは示していない）。無血清条件でNGF曝露によって誘導されたアポトーシスは、TIMP-1によって有意に阻害された。
【０１８９】
TIMP-1はHSCの自己分泌生存因子（autocrine survival factor）である
TIMP-1は、活性化した肝星状細胞の主要合成産物である。したがって、TIMP-1は潜在的に、肝星状細胞の自己分泌生存因子である。肝星状細胞に由来するTIMP-1を中和する作用を決定するために、肝星状細胞を、アジ化物を含まない対TIMP-1ポリクローナル中和抗体と、5%ウシ血清アルブミン中で18時間インキュベートし、非免疫性IgG対照抗体の場合と、「材料および方法」に記載された手順で比較した。いずれの抗体も、アジ化物を含まない緩衝液中に溶解した。アポトーシスをアクリジンオレンジ法で定量した。得られた結果を図6に示す。データを平均±S.E.で、また任意の値を100%とする、対照に対する相対値として表す。「*」は、非免疫性IgG対照に対する、対TIMP-1中和抗体処理肝星状細胞のp<0.0001（スチューデントのt検定、n=3）。この結果は、対TIMP-1中和抗体が、活性化した肝星状細胞のアポトーシスを、非免疫性IgG対照曝露時と比較して有意に高めることを示しており、TIMP-1が、活性化した肝星状細胞における生存因子として自己分泌的に作用することが示唆される。
【０１９０】
肝星状細胞に対するTIMP-1の抗アポトーシス作用にはMMPの阻害が関与する
TIMP-1の抗アポトーシス活性がMMPの阻害に関与するか否かを判定するために、他のすべてのドメインが保存された変異型の非機能性のTIMP-1（T2G）を用いて実験を行った（Meng et al., J. Biol. Chem. (1999) 274: 10184-10189）。
【０１９１】
肝星状細胞を、野生型TIMP-1またはT2G変異型TIMP-1の存在下または非存在下でシクロヘキシミドに曝露させた。アポトーシス細胞のパーセンテージをアクリジンオレンジ染色で評価した。得られた結果を図7Aに示す。データを平均±S.E.で、また任意の値を100%とする、対照に対するパーセンテージとして表す。「*」はp<0.01（スチューデントのt検定）。「NS」は有意でないことを示す（スチューデントのt検定、n=3）。T2G変異型N-TIMP-1には、シクロヘキシミドによって誘導されるラットまたはヒトの肝星状細胞のアポトーシスに対する阻害作用は無かったが、野生型N-TIMP-1タンパク質は同じ濃度（142.5 ng/ml）で有意にアポトーシスを阻害した。したがって、MMPの阻害活性がTIMP-1の抗アポトーシス作用に必要であると考えられる。
【０１９２】
カスパーゼ3活性のレベルは、シクロヘキシミドと、野生型TIMP-1またはT2G変異型N-TIMP-1のいずれかで処理した肝星状細胞でも評価した。得られた結果を図7Bに示す。データを平均±S.E.で表す（p<0.01、n=3）。野生型TIMP-1は、T2G変異型に対してカスパーゼ-3活性を有意に低下させた。この結果は、野生型TIMP-1が、シクロヘキシミドで処理した肝星状細胞でカスパーゼ-3活性を低下させた一方で、T2G非機能性変異型ではこの作用は認められなかったことを示している。またこの結果は、TIMP-1によるアポトーシスの阻害がMMPに依存することを示唆している。
【０１９３】
次に、合成マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害物質（MMPI-1; Calbiochem）を用いて一連の実験を実施した。細胞をシクロヘキシミドと、TIMP-1（5 nM/Lに相当する142.5 ng/ml）、またはMMPI-1（1μMまたは30 μM）のいずれかで処理した。対照については、シクロヘキシミドのみで処理した細胞、または血清のみで処理した細胞を対象に実施した。次にアポトーシス細胞のパーセンテージをアクリジンオレンジ染色および細胞数計測によって評価した。得られた結果を図7Cに示す。データを平均±S.E.で、また任意の値を100%とする、対照に対する値として表す。「*」はp<0.001、「**」はp<0.0001（スチューデントのt検定、n=3）。上述したように、TIMP-1は、シクロヘキシミド曝露によって誘導されたアポトーシスを阻害した。合成マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害物質MMPI-1も、1〜30 μMの濃度で用量依存性の防御作用を示すことがわかった。使用した阻害物質の濃度を計算したところ、阻害物質および組換え型TIMP-1に関して公表されているKiを元に、142.5 ng/mlの組換え型TIMP-1に匹敵するMMP阻害のレベルを得た。この結果は、肝星状細胞における抗アポトーシス作用が、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害のみによってもたらされる可能性があることを示唆している。
【０１９４】
FAS/APO-1/CD95およびFasリガンドに対するTIMP-1の作用
次に実験を行って、TIMP-1がヒトの肝星状細胞でFasリガンドの切断を調節するか否かを判定した。肝星状細胞を、完全血清除去の条件で、BSAまたはBSA＋TIMP-1（142.5 ng/ml）と18時間インキュベートした。細胞を抽出して上清を回収した。細胞数を規格化した後（PicoGreen法によるDNA濃度による）に、抽出物を対象に、FasおよびFasリガンドに対する酵素結合免疫吸着アッセイ法により、「材料および方法」に記載された手順で解析した。ヒト肝星状細胞をTIMP-1で処理しても、BSAのみで処理した対照細胞と比較して、細胞内のFasもしくはFasリガンドタンパク質のレベルに作用は認められなかった。上清中のFasおよびFasリガンドタンパク質のレベルは全実験条件で検出できなかった（データは示していない、n=3）。したがってTIMP-1は、Fas切断の調節を介した抗アポトーシス作用に関与しないと考えられる。
【０１９５】
TIMP-1は肝星状細胞の増殖に作用を示さない
過去の研究で、TIMP-1が潜在的な増殖作用をもつことが明らかにされていることから、活性化した肝星状細胞を対象にこれを解析した。1〜100 ng/mlの濃度のTIMP-1は、ラットの肝星状細胞（n=4）の増殖に対して、24時間のインキュベーション時間では、陰性対照として使用したウシ血清アルブミン担体使用時と比較して作用を示さなかった（データは示していない）。
【０１９６】
活性化した肝星状細胞の維持、および肝線維化の寛解の低下にはTIMP-1の発現の持続が伴う
TIMP-1のレベルは、4週間の四塩化炭素投与後に、実験的線維化の自然回復中に低下する（Iredale et al., 1998、前出）。TIMP-1のmRNAが肝硬変で高値で留まるか否かを判定するために、実験的線維化の別のモデルを行った。「材料および方法」に記載された手順で四塩化炭素を投与したラットを、各モデルについて投与の12週間後および6週間後に、また自然回復のさらに5日後および15日後に回収した。TIMP-1のmRNAの発現は、全肝臓RNAを対象としたTaqman定量PCR法で決定した。得られた結果を図8Aに示す（「PF0」＝四塩化炭素の最終注射の直後の線維化のピーク；「PF15」＝自然回復期間の15日目）。データを、各データセットに関して任意の値を100とする、線維化のピークに対する平均変化として表す。すべての値は、平行して決定したGAPDHの発現に対して規格化してある。この結果から、6週間の四塩化炭素投与後に、TIMP-1発現の13倍の低下が、自然回復の最初の2週間以内に生じることがわかる（「PF0」と「PF15」を比較されたい；6週間のCCl4実験＝図8Aの上のパネル）。これとは対照的に、12週間の損傷ラット肝における回復期間の最初の15日間にTIMP-1のmRNAの場合は2倍の低下しか認められない（「PF0」と「PF15」を比較されたい；12週間のCCl4実験＝図8Aの下のパネル）。
【０１９７】
12週間の四塩化炭素投与後における、TIMP-1発現の持続が、活性化した肝星状細胞の維持、およびマトリックスが分解されないことと相関しているか否かを判定するために、平滑筋アクチンを対象とした免疫組織化学的解析、および組織学的解析を同じ肝臓を対象に実施した。
【０１９８】
6週間および12週間の四塩化炭素投与後、ならびに自然回復期間の15日目における切片を対象に、平滑筋アクチン（SMA）陽性HSCの数を、「材料および方法」に記載された手順で定量した。得られた結果を図8Bに示す（データは平均±S.E.で表し、各実験群の各時点における個体数は4、「**」はp<0.0001、「*」はp<0.03）。ラットの肝線維化からの自然回復の最初の2週間以内に、12週間の損傷肝臓（「PF0」と「PF15」を比較されたい；12週間）において平滑筋アクチン陽性肝星状細胞の数に非常に小さな変化が認められた。一方、6週間の損傷肝臓では、平滑筋アクチン陽性染色細胞数の劇的な減少が認められた（「PF0」と「PF15」を比較されたい；6週間）。6週間モデルでは、15日間の回復で、肝臓のヒドロキシプロリン含量が、非投与の対照肝臓で認められた値と同じレベルに50%低下した。これとは対照的に、12週間モデルでは、線維化のピークにおける正常肝臓に対して、ヒドロキシプロリンの150%のレベルの上昇が認められた。これは、15日間の自然回復中で有意に変化しなかった。
【０１９９】
ウェスタンブロッティング実験の結果を図8Cに示す（「正常」＝非投与肝臓の対照；「0日目」＝四塩化炭素の最終注射の直後；「5日目」および「15日目」＝自然回復期間のそれぞれ5日目と15日目；各時点におけるn=3）。平滑筋アクチンに関する全肝臓ホモジネートを対象としたウェスタンブロッティングの結果、6週間の四塩化炭素投与後の回復期間の最初の15日間に肝臓平滑筋アクチンタンパク質のレベルが低下することがわかった（「0日目」と「15日目」を比較されたい；6週間のCCl4）。これとは対照的に、平滑筋アクチンタンパク質のレベルは、12週間にわたる四塩化炭素で損傷を受けた個体から調製した全肝臓抽出物において、自然回復開始後の15日後においても高値で留まっている（「0日目」と「15日目」を比較されたい；12週間のCCl4）。両モデルにおいて、肝臓の平滑筋アクチンタンパク質のレベルは、正常肝臓に対して線維化のピーク「0日目」）で上昇していた。したがって、平滑筋アクチンに対する切片の免疫染色（細胞数の計測を含む）と、平滑筋アクチンに関する肝臓ホモジネートを対象としたウェスタン解析の両方から、平滑筋アクチン陽性の活性化肝星状細胞が、回復中にわずかに減少することが判明し、有意な数の平滑筋アクチン陽性の活性化肝星状細胞が、12週間の四塩化炭素投与後の15日間の回復期間の肝臓に存在していた。
【０２００】
週2回の6週間および12週間に及ぶ四塩化炭素投与後に回収したラット肝のシリウスレッド染色による組織学的解析を、「材料および方法」に記載された手順で実施した。肝臓を、12週間および6週間の投与後の線維化のピーク時（PF0）と、さらに15日間の自然回復後に回収した。12週間のモデルでは、6週間損傷時と比較して、より実質的な線維化（実際には肝硬変が存在する）が認められた。また12週間モデルでは、15日間の自然回復中に軽度のマトリックスリモデリングのみの証拠が認められた。6週間モデルでは、確立した中隔の線維化が存在しており、15日間におけるリモデリングの証拠を示している。
【０２０１】
TIMP-1のmRNAの発現について観察された変化が、MMPの阻害と関連するか否かを判断するために、全肝臓ホモジネートを対象にコラゲナーゼ活性の解析を実施した。この結果、12週間の四塩化炭素投与後に、いずれの時点（回復期間の0日目、5日目、15日目）でも、正常非投与肝臓を超える活性はないことが明らかとなった（正常肝臓に対するパーセンテージ±S.E.で表したコラゲナーゼ活性は、0日目＝70±1.9%、5日目＝60±3.3%、15日目＝55±3.7%）。これとは対照的に、6週間の四塩化炭素投与後には、肝臓ホモジネートのコラゲナーゼ活性は上昇していることが判明した。回復のピークは5日目であった（各時点における、正常肝臓に対するパーセンテージ±S.E.で表したコラゲナーゼ活性は、0日目＝70±1.9%、5日目＝147±3.3%、15日目＝107±1.6%）。以上を総合すると、得られた結果は、活性化した肝星状細胞の線維性損傷後の持続とTIMP-1発現が強く相関すること、およびコラゲナーゼ活性の持続的な阻害によりマトリックスが分解されないことを示している。
【０２０２】
考察
今回得られた結果は、活性化した肝星状細胞の生存をTIMP-1が促進することを示しており、また、この作用に、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）活性の阻害が特異的に関与することを示す適切な証拠となる。また、この機能関連のデータは、TIMP-1の発現と、毒性障害除去後における活性化肝星状細胞のインビボにおける生存が相関することを示す証拠と齟齬がない。
【０２０３】
ラットの四塩化炭素モデルおよび線維化の胆管結紮モデルにおける肝線維化からの回復中に、アポトーシスが関与する肝星状細胞数の減少が認められる。また同時に、TIMP-1の発現の低下がみられる。このような研究および本明細書に記載されたデータは、「線維性肝損傷（fibrotic liver injury）が回復に向かうか、それとも回復に失敗するかを決定する因子は何か」という、肝線維化の理解に対する重要な疑問に答えている。
【０２０４】
回復中に、活性化した肝星状細胞および線維性マトリックスの正味の減少が認められるが、進行性の線維化では、活性化した肝星状細胞、およびネオマトリックスは残っている。したがって、活性化した肝星状細胞の生存率を高める因子を同定することは、線維化の病的変化を理解するために、また線維化の寛解を速める方法を開発する上でも不可欠である。TIMP-1は、肝星状細胞の生存に関与する重要な潜在的な候補である。
【０２０５】
組織培養で活性化した星状細胞の確立された、かつ確実なモデルを用いて、網羅的な一連の実験を今回行い、さまざまな刺激によって誘導される肝星状細胞のアポトーシスにTIMP-1が及ぼす影響を解析した。組織培養で得られた結果は、TIMP-1が、直接的で一貫性があり、有意で、また濃度依存的な抗アポトーシス作用を、ヒトおよびラットの肝星状細胞の両方に及ぼすことを意味している。一連の相補的定量法で、血清除去、シクロヘキシミド曝露、および神経成長因子による刺激によって誘導されるアポトーシスをTIMP-1が減少させること、またこの作用が、ラットおよびヒトの肝星状細胞の両方で共通することがわかっており、これが生物学的に重要な現象であることが示唆されている。また、さまざまなアポトーシスの誘導手段があるにもかかわらず、TIMP-1の抗アポトーシス作用は驚くほど一貫している。TIMP-1には、活性化した肝星状細胞に対する増殖促進作用はなかった。生物学的視点からは、タンパク質が、同時に同じ細胞型でアポトーシスを阻害し、増殖を促進することは望ましくないように思われる。というのは、このようなタンパク質の発現は潜在的に発癌につながる恐れがあるからである。
【０２０６】
TIMP-1がアポトーシスを阻害する機構を明らかにするために、さらに実験を実施した。この実験は、組換え型TIMP-1に対する合成阻害物質の同等の阻害濃度を用いるために、使用試薬の公表されているKi値を用いる方向と、T2G変異型のN-TIMP-1を用いる方向の2つの角度から取組んだ。合成MMP阻害剤であるMMPI-1を用いた試験は、MMPの阻害は、肝星状細胞の生存に関与する機構である可能性が高いことを示唆している。T2G変異型N-TIMP-1を用いた場合、TIMP-1による肝星状細胞のアポトーシスの阻害には実際に、そのMMP活性に対する作用が関与することが直接示された。T2G変異型N-TIMP-1タンパク質は、野生型タンパク質とは、わずか1個のアミノ酸の置換（2位のアミノ酸がスレオニン→グリシン）が異なるだけである。この変異は、MMP-1およびMMP-3に対するTIMP-1の阻害定数を1000倍以上低下させる。また、この変異型タンパク質の二次構造は野生型と大きく異ならない。この事実は、アポトーシスの防御におけるMMP依存性の問題を説明する際に、TIMP-1が最も利用価値のある試薬となることを意味する。以上の実験で用いられたTIMP-1の用量（142.5 ng/ml）では、変異型TIMP-1は、MMP阻害活性を事実上示さないようであったが、野生型TIMP-1は、MMP活性を有意に低下させると予想されている。
【０２０７】
TIMP-1によりアポトーシスが制御されている可能性のある潜在的な機構は多数あり、また複数のMMPが関与する可能性がある。TIMPが生存に関与する主要候補機構は、マトリックスの分解を妨げることである。肝星状細胞は、マトリックスから直接的なシグナルを受け取る場合がある。またマトリックスは、マトリックスの分解によって解放される可能性のある、局所細胞集団に対する抗増殖性の作用、および/またはアポトーシス促進作用をもつ可能性のある、数多くのマトリックス結合型のサイトカイン（例えばトランスフォーミング成長因子）を含む。肝線維化の回復モデル（Iredale et al., 1998、前出）に関しては、線維性組織の分解中は、マトリックス結合型のサイトカインの放出も、活性化した肝星状細胞の回復およびアポトーシスのパターン決定に重要な役割を果たす場合がある。仮にTIMP-1が、マトリックスの分解を妨げることでアポトーシスを減少させるならば、これは、いくつかの重要な標的のMMPによる分解を妨げることで可能となる可能性がある。第1に、マトリックス結合型のアポトーシス促進因子の放出は妨げられる可能性がある。第2に、完全なマトリックスは直接的な細胞生存シグナルをもたらし、マトリックス結合型の生存シグナルを空間的に有効に提供する可能性がある。TIMPは、このようなシグナルを保存している可能性がある。この仮説の正しさを裏づけるように、コラゲナーゼによる切断に耐性を示す変異型コラーゲンが、肝星状細胞の生存率を線維化モデルで高めることが報告されている。また、本明細書に記載されたインビボ試験は、MMPの阻害および線維性マトリックスの保護を介して肝星状細胞の生存を促進するTIMP-1と矛盾しない。
【０２０８】
発明者らが過去に行った、ラットの肝線維化の4週間モデル、および本明細書に記載された四塩化炭素の6週間モデルから得られた結果から、自然回復が平滑筋アクチン陽性細胞数の減少と関連することがわかる。またこれはTIMP-1のmRNA発現の大きな低下、および平滑筋アクチンの変化と平行するコラゲナーゼ活性の上昇と関連する。これとは対照的に、12週間の四塩化炭素投与後に肝硬変が生じ、またマトリックスリモデリングの存在、コラゲナーゼ活性が亢進しないこと、および活性化した肝星状細胞が持続することを示す極めて小さな証拠がある。TIMP-1の発現は12週間モデルにおいて、15日間の自然回復期間で実際に穏やかに低下した。この結果は予想通りである。というのはTIMP-1が炎症細胞で、また損傷に対する急性反応で発現されるからである（Iredale et al., Hepatology (1996) 24: 176-184）。それにもかかわらず、四塩化炭素投与の12週間モデルにおける15日間の回復後に、TIMP-1の有意な発現は残っている。このインビボにおける証拠は、TIMP-1が関与するMMPの阻害が、活性化した肝星状細胞の生存率を高め、かつ線維性マトリックスの分解を妨げる統一的な機構であることを強く示唆している。
【０２０９】
MMPの阻害がインビボにおける生存に関与する別の機構がある。一部の細胞表面タンパク質が、その適切な「切断酵素（sheddase）」が存在し、かつ活性である場合に切断されることはよく知られている。MMPが、受容体（例えば腫瘍壊死因子受容体）の切断に関与する場合は、TIMPは細胞の挙動を間接的に調節している可能性がある。最近、TIMP-3が、細胞表面上の腫瘍壊死因子受容体を安定化させることによって、ヒトの結腸癌細胞のアポトーシスを誘導することが報告されている（Smith et al., Cytokine (1997) 9: 770-780）。内皮細胞は、アポトーシスを誘導することで腫瘍壊死因子の受容体を切断することが報告されている。これは、アポトーシス細胞死に応じた炎症を制限する機構の1つである可能性がある（Madge et al., J. Biol. Chem., (1999) 274, 13643-13649）。アポトーシスを調節する別のMMP依存性の細胞表面タンパク質系がFas/Fasリガンド系である。肝星状細胞は、FasおよびFasリガンドを細胞表面に発現することが知られている（Saile et al., Am. J. Pathol., (1997) 151, 1265-1272、およびGong et al., Hepatology (1998) 28: 492-502）。TIMP-1は、活性化したヒト肝星状細胞において、細胞内のFasまたはFasリガンドのタンパク質レベルに何ら作用を示さなかった。TIMP-1が、活性化した肝星状細胞および関連細胞においてアポトーシスを妨げることが知られている生存促進受容体（例えばインスリン様成長因子-1受容体）の切断を妨げることでアポトーシスを阻害する可能性もある（Issa et al., Gut (2001) 48, S48-S57、およびBaker et al., J. Clin. Invest. (1994) 94: 2105-2116）。細胞の生存を調節する、MMPによって切断される別の細胞表面受容体がカドヘリンである。カドヘリンおよびカテニン経路は、細胞のBcl-2レベルに、引いては任意の細胞がアポトーシスを起こす固有の傾向に影響することが知られている（Herren et al., Mol. Biol. Cell (1998) 9: 1589-1601）。
【０２１０】
本研究で明らかにされたデータは、TIMP-1が、これもMMP依存性の過程によって、活性化肝星状細胞のアポトーシスを阻害することによって線維化の促進に機械的に重要な役割を果たすことを示す強力な証拠となる。この観察結果は、TIMP-1が肝硬変治療における重要な治療標的であることを強く示している。
【０２１１】
実施例3：5HT2受容体の拮抗物質を用いて肝星状細胞のアポトーシスを促進可能である
単離直後のラット肝星状細胞、肝細胞、および10日間かけて培養活性化した肝星状細胞から全RNAを抽出した。いずれの場合も、ランダムヘキサマーをプライマーとして用いた逆転写によりcDNAを得た。次にcDNAを対象に、ラットの5HT2A受容体、5HT2B受容体、および5HT2C受容体に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて合成を開始させ、PCR法で最大40サイクルの増幅を行った後に、アガロースで分離した。
【０２１２】
PCR法の結果、5HT2A受容体のmRNAが、単離直後の細胞と、10日間かけて培養活性化した肝星状細胞、ならびに単離直後の肝細胞のいずれにおいても存在することが判明した。5HT2B受容体のmRNAは、10日間かけて培養活性化した肝星状細胞でのみで認められたが、5HT2C受容体のmRNAは、検討した全細胞で認められなかった。ウサギ抗5-HT2Aポリクローナル抗体を用いて行ったウェスタンブロットでも、5HT2A受容体タンパク質が、10日間かけて培養活性化した肝星状細胞に存在すること、また規模は小さいものの単離直後の肝星状細胞に存在することがわかった。10日間かけて培養活性化した肝星状細胞を、さまざまな5HT2拮抗物質（塩酸スピペロン、マレイン酸メチオセピン（Methiothepin Malate）、およびLY 53,857を含む）で、さまざまな濃度および時点で処理し、核の形態の評価を、アクリジンオレンジ（1 μg/ml）による染色で、実施例1および実施例2に記載された手順で行った。LY 53,857は、細胞を100 μMで24時間処理した際に最大の核凝縮（ほぼ100%）を引き起こすことがわかった。マレイン酸メチオセピンは、細胞を10〜100 μMで3時間処理した際に最大の核凝縮（100%）を引き起こすことがわかった。スピペロンは、細胞を100 μMで24時間処理した際に最大の核凝縮（80%）を引き起こすことがわかった。次にカスパーゼ3活性（pNAの解放により決定）を、所定の最適な時間および用量で、実施例1および実施例2に記載された手順で決定した。10日間かけて培養活性化した肝星状細胞を、5HT2阻害物質であるセロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン、100 μM）とともに拮抗物質でも処理して、カスパーゼ3特異的活性の何らかの修飾が、受容体結合部位をめぐる直接的な競合によって達成されるか否かを確認した。細胞をLY 53,857で処理（100 μM、24時間）したところ、1 pmol（pNA解放）/時/μgタンパク質の特異的なカスパーゼ3活性が認められた。これはセロトニンの存在下で有意に低下しなかった。細胞をマレイン酸メチオセピン（10 μM、3時間）で処理したところ、0.9 pmol（pNA解放）/時/μgタンパク質の特異的なカスパーゼ3活性が認められた。これはセロトニンの存在下で有意に低下しなかった。細胞をスピペロン（100 μM、24時間）で処理したところ、6.5 pmol（pNA解放）/時/μgタンパク質の特異的なカスパーゼ3活性が認められた。これはセロトニンの存在下では4 pmol（pNA解放）/時/pgタンパク質に有意に低下した（P<0.05）。
【０２１３】
結論として、ラットの肝星状細胞は5HT2受容体を発現し、このサブタイプ5-HT2Bは肝細胞上に存在しない。また肝星状細胞を、このような受容体に対する拮抗物質で処理すると、肝星状細胞のアポトーシス率の増加が促されることで、肝疾患（特に肝線維化）の治療に使用可能となる。
【０２１４】
実施例4：スルファサラジンによるNF-κB活性の阻害および肝星状細胞のアポトーシスの誘導
既知のIKK阻害物質である、抗炎症作用のある免疫抑制剤スルファサラジン（Weber et al., Gasteroenterology, (2000) 119, 1209-18）を用いて、星状細胞のアポトーシスの調節におけるNF-κBの役割を決定した。
【０２１５】
電気泳動移動度シフトアッセイ法による解析の結果、7日目の肝星状細胞を0.5 mM、1 mM、および2 mMのスルファサラジンで24時間で処理すると、NF-κBのDNA結合活性が、対照細胞と比較して用量依存的に阻害されたが、転写因子CBF1および上流のTIMP1結合エレメント（UTE1）の結合活性は阻害されないことがわかった。
【０２１６】
24時間のスルファサラジン処理によって、3種類のNF-κB応答性遺伝子プロモーター（PGJ21 (4xNF-κB)、IL6、およびIκBα）の活性が、非処理細胞と比較して抑制されたが、NF-κBに反応しない対照の7xAP1プロモーターの活性は抑制されなかった。
【０２１７】
活性化した肝星状細胞をスルファサラジン（0.5 mM、1 mM、または2 mM）で24時間処理したところ、アポトーシスが用量依存的に増加することが、いずれのアクリジンオレンジ染色（それぞれ30%、45%、および55%）でも明らかとなった。スルファサラジン（0.5 mM、1 mM、または2 mM）も、カスパーゼ3活性を用量依存的に高めた。
【０２１８】
実施例5：実験的に誘導された線維化にスルファサラジンが及ぼす作用
スルファサラジンが肝星状細胞のアポトーシスを促進するのではないかという、発明者らの得た知見を受けて、発明者らは、ラットで実験的に誘導された線維化からの回復を化合物が加速する能力を検討することにした。
【０２１９】
成体の雄のSprague Dawleyラットに、肝臓毒である四塩化炭素を週2回、6週間にわたって腹腔内注射により投与し、24時間かけて回復させてから、溶媒対照またはスルファサラジンのいずれかを投与した。次に個体を、さらに16時間または72時間のいずれかの期間で回復させた。16時間の回復では、発明者らは、対照肝臓と比較して、スルファサラジンを投与した肝臓における、活性化した肝星状細胞の数の大きな減少を認めたが、コラーゲンの沈着（線維化）に有意差は認められなかった。72時間の回復では、スルファサラジンを投与した肝臓で有意に少ないコラーゲンが認められた。これは熟練した病理医により、対象肝臓については1.5の線維化スコアと、対照肝臓については3の同スコアをつけたことで独立に確認された（1〜4のスコアシステムが臨床的に使用されており、1は「線維化なし」を意味し、4は「肝硬変」を意味する）。
【０２２０】
これらのデータから、スルファサラジンの投与が、コラーゲンを産生する活性化肝星状細胞の、疾患状態の肝臓からの迅速な除去を促すこと、またこのためにコラーゲンの後の分解、引いては正常組織の修復を促すことが可能なことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】グリオトキシンおよびmt-グリオ(ビス-デチオ-ビス(メチルチオ)-グリオトキシンの構造。
【図２】ラットの肝星状細胞におけるカスパーゼ3活性およびDNA完全性に対するグリオトキシンの作用。パネルAは、DMSO（対照）、グリオトキシン、Z-VAD-FMK、クロルプロマジン、またはグリオトキシン＋Z-VAD-FMKを投与したラットの肝星状細胞におけるカスパーゼ3活性のレベルを示す。星印（*）を付けたバーは、対照細胞に対して有意に異なる（P>95%）活性を意味する（スチューデントのt検定、両側）。パネルBは、DMSO（透明）、またはグリオトキシン（斜線）のいずれかを投与し、ヨウ化プロピジウムで染色したラットの肝星状細胞を対象としたFACS解析の結果を示す。
【図３】さまざまな刺激に応じた、ラットの肝細胞および肝星状細胞の細胞死の比較。パネルAは、任意のグリオトキシン濃度で培養容器に結合状態を維持したラットの肝細胞（白丸）および肝星状細胞（斜線の四角）のパーセンテージの比較を示す。パネルBは、DMSO、グリオトキシン、クロルプロマジン、TNF-α＋シクロヘキシミド、またはメタピリレンの投与後における、結合状態（白いバー）、および膜の完全性（斜線のボックス）を評価するためのトリパンブルーによる染色によって判断した、生存ラット肝細胞のパーセンテージを示す。
【図４】パネルAは、シクロヘキシミド曝露によって、アポトーシスを起こすように誘導され、アクリジンオレンジによる染色によってインサイチューで同定された、アポトーシスを起こした肝星状細胞（矢印）の例を示す。正常細胞は、アポトーシス小体の周辺に存在する。パネルBは、0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、または200 ng/mlのTIMP-1の存在下におけるシクロヘキシミド処理後に、アクリジンオレンジによる染色によって決定したアポトーシス細胞の割合（対照に対するパーセンテージで表示）、ならびに血清のみで処理した細胞に関して得られた結果を示す。「*」はp<0.001（n=5）。パネルCは、0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、または100 ng/mlのTIMP-1の存在下、またはベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp-フルオロメチルケトンのいずれかの存在下で、シクロヘキシミドで処理した肝星状細胞に由来する抽出物のカスパーゼ3活性のレベル（対照に対するパーセンテージで表示）を示す。血清のみの対照で得られた結果も示す。「*」はp<0.001（n=3）。パネルDは、TIMP-1の存在下または非存在下でシクロヘキシミドで処理した肝星状細胞を対象に、DNAの断片化を評価したTUNEL解析の結果を示す。血清のみの対照で得られた結果も示す。結果から、対照に対するTUNEL陽性細胞のパーセンテージがわかる。「*」はp<0.001（n=2）。パネルDは、TIMP-1の存在下または非存在下で、シクロヘキシミド処理によってアポトーシスが誘導された活性化肝星状細胞の細胞抽出物を対象とした、Bcl-2タンパク質に対するウェスタンブロットを示す。血清のみの対照で得られた結果も示す。
【図５】無血清条件で、TIMP-1の存在下または非存在下において、神経成長因子（NGF）による処理後にアポトーシスを起こした肝星状細胞の割合（対照に対するパーセンテージで表示）を示す。「*」は、NGF処理のみ vs NGF＋TIMP-1処理時に関してp<0.02（n=3）。
【図６】対TIMP-1中和抗体の存在下または非存在下における、5% BSAを含む無血清条件における18時間のインキュベーション後にアポトーシスを起こした肝星状細胞、および非免疫性IgG対照抗体で処理した細胞の割合（対照に対するパーセンテージで表示）を示す。血清のみの対照についても実験を行った。「*」は、非免疫性IgG対照に対する対TIMP-1中和抗体で処理した肝星状細胞に関してp<0.0001（n=3）。
【図７】パネルAは、野生型またはT2G変異型のTIMP-1を含むか、または含まない場合の、シクロヘキシミド曝露後の、アクリジンオレンジによる染色、およびアポトーシスを起こした肝星状細胞の計数の結果を示す。血清対照で得られた結果も示す。「*」はp<0.01。「NS」は有意でないことを示す（n=3）。パネルBは、野生型（活性型）TIMP-1、およびT2G変異型（MMP阻害活性なし）の存在下でシクロヘキシミド処理した細胞に由来する肝星状細胞抽出物のカスパーゼ3活性を示す。「*」はp<0.01（n=3）。パネルCは、TIMP-1（142.5 ng/ml；5 nM）、または合成MMP阻害物質MMPI-1のいずれかの存在下または非存在下における、シクロヘキシミド曝露後における、アポトーシスを起こした肝星状細胞の割合を示す。「*」はp<0.001、「**」はp<0.0001（n=3）。
【図８】パネルAは、全肝臓RNAを対象にTaqman定量PCR法で決定したTIMP-1のmRNAの発現レベルを示す。発現レベルは、CCl4を6週間または12週間投与したラットを対象に決定し、直ちに調べたか、または15日間の回復期間をおいた。「PF0」=線維化のピーク（四塩化炭素の最終注射の直後）。「PF15」＝自然回復期間の15日後。各実験群の個体数は各時点について3とした。全ての値は、平行して決定したGAPDHの発現に対して規格化した。パネルBは、ラットの肝臓における平滑筋アクチン（SMA）陽性の肝星状細胞の数を示す。各実験群の個体数は各時点について4とした。「**」はp<0.0001。「*」はp<0.03。パネルCは、ラットの全肝臓ホモジネートを対象とした、平滑筋アクチンに対するウェスタンブロッティングを示す。非投与ラットから調製した試料についても示す。
【図９】週2回の四塩化炭素投与の6週間後および12週間後に回収したラット肝の組織学的解析（シリウスレッド染色）。切片は、12週間（パネルA）および6週間（パネルC）の投与後における、ならびに、さらに15日間の自然回復後（それぞれパネルBとパネルD）における、線維化のピーク（PF0）で回収した肝臓に由来するもの。
【図１０】グリオトキシンの単回注射が、7週間の四塩化炭素投与後における肝臓のシリウスレッド染色に及ぼす作用。ラットに四塩化炭素を7週間投与した。四塩化炭素の最終注射の1日後に、ラットにグリオトキシンを投与し、その翌日に殺した。パネルA＝対照：溶媒（オリーブオイル）を7週間、またDMSOを投与したラットの肝切片。パネルB＝グリオトキシンのみ：溶媒（オリーブオイル）を7週間、およびグリオトキシン（3 mg/kg体重）を投与したラットの肝切片。パネルC＝四塩化炭素のみ：四塩化炭素を7週間、またDMSO溶媒を投与したラットの肝切片。パネルD＝四塩化炭素＋グリオトキシン：四塩化炭素を7週間、およびグリオトキシン（3 mg/kg体重）を投与したラットの肝切片。結果は、5匹の個体について典型的である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月12日(2005.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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