(57)【要約】本発明は、内皮細胞に特異的に結合するペプチドに関する。該ペプチドは遺伝子運搬ビークルに取り込まれ、成長因子及びサイトカインのような蛋白質及び小分子を含む、治療剤を導く（方向づける）ことが出来る。標的ベクター、ペプチド、又は小分子は、癌、並びに、虚血性心臓病、末梢四肢疾患、静脈移植狭窄、及び再狭窄のような心疾患の治療に使用することが出来る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群から選択されるペプチド：
（ａ）
2006510360.tif 000029
（ｂ）（ａ）のペプチドのアミノ酸１−８；
（ｃ）（ａ）のペプチドのアミノ酸２−９；及び
（ｄ）（ａ）のペプチドのアミノ酸２−８；
【請求項２】
ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＣＬＧＱＨＡＦＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＣＳＳＮＴＡＰＨＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＣＨＶＬＰＮＧＮＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＣＫＰＱＹＰＳＬＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＱＴＡＲＴＰＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、及びＣＸＸＰＴＰＰＸＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）から成る群から選択される、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１記載の内皮細胞ターゲティングペプチド及び生物学的剤の結合体。
【請求項４】
生物学的剤が、薬剤、ペプチド、蛋白質、放射性核種、核酸、遺伝子運搬ベクター、及びリポソームからなる群から選択される、請求項３記載の結合体。
【請求項５】
生物学的剤が、ＳＶ４０ウィルス、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及び単純疱疹ウィルスからなる群から選択される遺伝子運搬ベクターである、請求項３記載の結合体。
【請求項６】
遺伝子運搬ベクターがアデノウィルスである、請求項５記載の結合体。
【請求項７】
アデノウィルスが内皮細胞ターゲティングペプチドを含有するように修飾されたファイバー蛋白質をコードする核酸を含む、請求項６記載の結合体。
【請求項８】
生物学的剤がレトロウィルスである遺伝子運搬ベクターである、請求項４記載の結合体。
【請求項９】
レトロウィルスが内皮細胞ターゲティングペプチドを含有するように修飾された表面蛋白質をコードする核酸を含む、請求項８記載の結合体。
【請求項１０】
蛋白質が成長因子又は成長因子断片である、請求項４記載の結合体。
【請求項１１】
請求項１記載のペプチドを含有するように修飾された蛋白質をコードする核酸を含むウィルスベクター。
【請求項１２】
ベクターが、ＳＶ４０ウィルス、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及び単純疱疹ウィルスからなる群から選択されるウィルスに由来する、請求項１１記載のウィルスベクター。
【請求項１３】
該ウィルスがアデノウィルスである、請求項１２記載のウィルスベクター。
【請求項１４】
修飾蛋白質がファイバー蛋白質である、請求項１３記載のウィルスベクター。
【請求項１５】
該ウィルスがレトロウィルスである、請求項１２記載のウィルスベクター。
【請求項１６】
修飾蛋白質が表面蛋白質である、請求項１５記載のウィルスベクター。
【請求項１７】
請求項１記載のペプチドを含有するように修飾された蛋白質を含むウィルスベクター粒子。
【請求項１８】
ベクター粒子が、ＳＶ４０ウィルス、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及び単純疱疹ウィルスからなる群から選択されるウィルスに由来する、請求項１７記載のウィルスベクター粒子。
【請求項１９】
該ウィルスがアデノウィルスである、請求項１８記載のウィルスベクター粒子。
【請求項２０】
修飾蛋白質がファイバー蛋白質である、請求項１９記載のウィルスベクター粒子。
【請求項２１】
修飾蛋白質がＣＡＲである、請求項１９記載のウィルスベクター粒子。
【請求項２２】
該ウィルスがレトロウィルスである、請求項１７記載のウィルスベクター粒子。
【請求項２３】
修飾蛋白質が表面蛋白質である、請求項２２記載のウィルスベクター粒子。
【請求項２４】
請求項１記載のペプチドを含む修飾ウィルス蛋白質をコードする核酸。
【請求項２５】
ウィルス蛋白質が、ＳＶ４０ウィルス、ウシパピローマウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、及び単純疱疹ウィルスからなる群から選択されるウィルスに由来する蛋白質である、請求項２４記載の核酸。
【請求項２６】
ウィルス蛋白質がファイバー蛋白質である、請求項２５記載の核酸。
【請求項２７】
ウィルス蛋白質がレトロウィルス由来の蛋白質である、請求項２４記載の核酸。
【請求項２８】
ウィルス蛋白質が表面蛋白質である、請求項２７記載の核酸。
【請求項２９】
請求項１記載のペプチド及び生物学的活性ペプチド又は蛋白質を含む融合蛋白質をコードする核酸。
【請求項３０】
生物学的活性ペプチド又は蛋白質が成長因子、毒素、血管由来ペプチド、抗血管由来ペプチド、及びプロアポトーシスペプチドからなる群から選択される、請求項２９記載の核酸。
【請求項３１】
請求項１記載のペプチド及び生物学的活性ペプチド又は蛋白質を含む融合蛋白質。
【請求項３２】
生物学的活性ペプチド又は蛋白質が成長因子、毒素、血管由来ペプチド、抗血管由来ペプチド、及びプロアポトーシスペプチドからなる群から選択される、請求項３１記載の融合蛋白質。
【請求項３３】
生物学的剤が細胞毒性薬剤である薬剤である、請求項４記載の結合体。
【請求項３４】
請求項３−３３のいずれか一項に記載の結合体及び薬学的許容可能なキャリヤを含む医薬組成物。
【請求項３５】
請求項３４記載の医薬組成物を投与することから成る、内皮細胞に治療物質をターゲットする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、特定の細胞に治療物質を狙わせる（ターゲットする）ことに関する。本発明は特に、内皮細胞に物質を運搬するのに使用するターゲティング分子、例えば、ペプチドに関する。このようなターゲティング分子は様々な治療操作に使用することが出来る。より具体的には、本発明は内皮細胞に特異的に結合するペプチドに関する。該ペプチドは遺伝子運搬ビークルに取り込まれ、（成長因子及びサイトカインのような）蛋白質及び（薬剤、及び他の治療剤のような）小分子を含む、治療剤を導く（方向づける）ことが出来る。標的ベクター、ペプチド、又は小分子は、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リューマチ、乾癬、血小板破壊、再狭窄、虚血性血管障害、創傷治癒、鬱血性心不全、心筋虚血、再灌流傷害、末梢動脈疾患、肥満、並びに、虚血性心臓病、末梢四肢疾患、静脈移植狭窄、及び再狭窄のような心疾患等の様々な疾患の治療に使用することが出来る。
【０００２】
本発明の背景を詳細に説明する為に本明細書中で使用される刊行物及び他の資料、特に、実施に関する更なる詳細を提供する物は、引用文献（参照文献）として本明細書中に取り込まれ、便宜的に、著者及び日付で文章中で引用され、添付の文献目録の中で著者のアルファベット順にリストにされている。
【０００３】
しばしば、特定の病状（病変）の影響は罹患者の体全体で明らかであるが、一般的には、内在する病変は単独の器官、組織又は細胞型のみに影響を与えることがある。多くの場合に、特定の疾患で苦しむ患者の治療には薬剤が治療として選択される。遺伝子治療は特定の疾患で苦しむ患者の治療のための第二の選択肢である。組織にターゲットする薬剤又は他の剤の運搬の改良に、長年の間、かなりの研究の焦点が当てられてきた。現在、患者に非経口的に投与される剤の多くは、標的化されてなく、その結果、その剤が体の不必要及び時には望ましくない細胞及び組織にまで、全身に運搬されることになる。これは、薬剤による副作用を引き起こし、しばしば、投与可能な薬剤（例えば、細胞毒性薬剤、及び他の抗がん剤又は抗ウィルス剤）の投与量が限定されてしまう。これと較べて、薬剤の経口投与は一般的に原理で経済的な投与方法であると認識されているが、経口投与によって、(a) 内皮バリアーを通過して取り込まれるための望まない全身への運搬、又は、(b) 薬剤の胃腸菅内での一時的に滞在、が引き起こされる。従って、主な目的は、治療による利益を受ける細胞又は組織に薬剤を特異的にターゲットする方法を開発し、このような薬剤が他の細胞又は組織に不適切に運搬されることによる一般的な生理学的効果を避けることであった。
【０００４】
様々な薬剤及び遺伝子運搬ビークルの標的特異性を増大させることに多大な努力が費やされてきた。幾つかの場合には、疾患組織又は器官に存在する特定の細胞型が特異的な細胞表面マーカーを発現することがある。このような場合には、この特異的な細胞表面マーカーに対する抗体が作られ、薬剤は抗体に結合させることが出来る（Ferkol他, 2000）。患者に薬剤／抗体複合体を投与した際に、該抗体の細胞表面マーカーに対する結合により、薬剤が比較的高濃度で組織又は器官に運搬される。同様な方法が、疾患器官で特定の細胞型が特異的な細胞表面受容体又は特定受容体に対するリガンド又を発現している場合にも使用することが出来る。このような場合には、薬剤は、ペプチドのような特異的リガンド又は受容体に結合され、疾患器官へ比較的高濃度の薬剤を運搬する手段を提供する（Ruoslahti
及び Rajotte, 2000；ＷＯ９８／４４９３８；ＷＯ００／０６１９５）。
【０００５】
疾患器官又は組織に存在する特定の細胞型に向かう分子に薬剤を結合することにより、顕著な治療効果が得られる一方で、一つ又は少数の組織又は器官のみにおいて発現する特異的標的細胞マーカーを同定し、このようなマーカーと相互作用する分子を同定する必要がある。様々な細胞型は特異的なマーカを発現し、従って、器官に向かう分子の標的となり得るものを提供する。例えば、結果の内表面を覆う内皮細胞は、異なる組織において、別の形態及び生化学的なマーカーを有する。リンパ系の血管は、例えば、リンパ球の帰還を導く、様々な付着性蛋白質を発現する。例えば、リンパ節に存在する内皮細胞は、Ｌ−セレクチンに対するリガンドである細胞表面マーカーを発現し、ペイヤーパッチ小静脈の内皮細胞は、a４b７インテグリンに対するリガンドを発現する。
【０００６】
哺乳動物内に、特定の外来性又は本来の遺伝子配列を導入し、該遺伝子を発現する能力は、医学及び生物学的研究分野における実質的な価値がある。このような能力は、遺伝子調節の研究、及び疾患治療の為の治療的基礎を設計するための手段を提供する。遺伝子を哺乳動物に導入することに加えて、所望の場所で特異的に遺伝子を発現させることは困難な試みである。巨大分子輸送の生来の細胞経路を利用してＤＮＡを標的細胞に運搬する方法が開発されてきた。この点に関して、分子共役ベクターを採用し、受容体媒介エンドサイトーシス経路を介して遺伝子移送は完成された。
【０００７】
殆どのアデノウィルス血清型はコクサッキー：アデノウィルス受容体（ＣＡＲ）を利用しており、それは、アデノウィルスとＢ型コクサッキーウィルスとの結合以外の未知の機能を有する内在性膜蛋白質である（Bergelson 他、1997）。ＣＡＲへのアデノウィルスへの結合は、ファイバーノブを介して起こる（Stevenson 他、1995;
Henry 他、1994）。ファイバー媒介細胞付着の後に、ペントンベースがＲＧＤモチーフを介して、avb3及びavb5インテグリン共受容体に結合し、内部化を可能にする（Bai他、1993;
Stewart 他、1999）。アデノウィルス粒子の再標的化により、標的細胞膜上のウィルスリガンド−受容体相互作用の数、及び標的細胞の細胞質に移動するウィルス粒子数を増加させることが仮定された。アデノウィルスファイバーのカルボキシ末端及びファイバーノブに存在ずるＨＩループは、標的細胞により発現される細胞表面受容体に特異的に認識されるペプチドモチーフの取り込みの為の場所の例である。環状ＲＧＤモチーフを含むように修飾されたＨＩループを有するアデノウィルスは、静脈に対する遺伝子運搬が増大したことが観察された（Hay
他、2001）。
【０００８】
レトロウィルスも遺伝子治療に使用することが出来る。レトロウィルスベクター粒子の指向性（トロピズム）エンベロープの複数の部位に小ペプチドリガンドを挿入することによって修飾することが出来る。例えば、ガストリン放出蛋白質及びヒト表皮増殖因子の受容体に対する小ペプチドリガンドを有する、モロニーマウス白血病ウィルスエンベロープ誘導体が調製されている（Gollan 及びGreen、2002）。これらキメラエンベロープ誘導体を含有する偽ウィルスは、同系（同起源）受容体を過剰発現するヒト癌細胞ラインに特異的に形質導入する。ガストリン放出蛋白質受容体にターゲットするレトロウィルスはチミジンキナーゼ遺伝子をヒトメラノーマ及び乳がん細胞に運搬することが出来、それら細胞はガンシクロビルをその後添加することによって殺すことが出来る。
【０００９】
欠陥移植狭窄は冠状動脈バイパス移植後の主な合併症である。外科的治療アプローチでは、自己伏在静脈又は内部哺乳動脈を利用することが出来る。動脈移植は静脈移植に比べて高い開放（パテンシー）率を有している（Cameron他、1996）。血栓機構は早期閉塞に関与する（Yang他、1991）一方、後期閉塞は移植血管における新生脈管内膜の形成及びアテローム班の発達の結果である（Angelini及び
Newby、1989; Kalan 及びRoberts、1990）。遺伝子治療、特に、導入遺伝子のアデノウィルス媒介運搬は、バイパス移植による新生脈管内膜の過形成（肥厚化）を防ぐために現在追求されている戦略である（Cable他、1999）。酸化窒素シンターゼ及びマトリックスメタロプロテインナーゼを含む様々な治療導入遺伝子が臨床前の挿入移植モデルで評価され、新生脈管内膜の形成を減少させることに効果的であることが示されてきた（Newby及びBaker、1999）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、内皮細胞に特異的に結合するペプチドを開発する必要性が存在する。本発明は、このような必要性を満たすものであり、これに関連する利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一般的に、特定の細胞に治療物質を狙わせる（ターゲットする）ことに関する。本発明は特に、内皮細胞に物質を運搬するのに使用するターゲティング分子、例えば、ペプチドに関する。このようなターゲティング分子は様々な治療操作に使用することが出来る。より具体的には、本発明は内皮細胞に特異的に結合するペプチドに関する。該ペプチドは遺伝子運搬ビークルに取り込まれ、（成長因子及びサイトカインのような）蛋白質、及び（薬剤、放射性核種及び他の治療剤のような）小分子を含む、治療剤を導く（方向づける）ことが出来る。標的ベクター、ペプチド、又は小分子は、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リューマチ、乾癬、血小板破壊、再狭窄、虚血性血管障害、創傷治癒、鬱血性心不全、心筋虚血、再灌流傷害、末梢動脈疾患、肥満、並びに、虚血性心臓病、末梢四肢疾患、静脈移植狭窄、及び再狭窄のような心疾患等の様々な疾患の治療に使用することが出来る。即ち、本発明は、その第一の態様として、内皮細胞に特異的に結合するペプチドを提供するものである。
【００１２】
第二の態様として、本発明は、少なくとも一つの生物学的剤に結合したターゲティング分子であって、該ターゲティング分子は、本明細書に記載のぺプチドを含む、内皮細胞に特異的に結合するペプチドを含むものを提供する。「生物学的剤」は、以下のものに限定されるものではないが、例えば、放射性核種、薬剤、ペプチド、蛋白質、核酸、遺伝子運搬ベクター、及びリポソーム等である。
【００１３】
第三の態様として、本発明は、上記のような、少なくとも一つの生物学的剤に結合したターゲティング分子及び薬学的に許容可能なキャリヤを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
第四の態様として、本発明は、内皮細胞に関連する疾患、病気又は状態に罹患した患者の治療方法であって、患者に上記の医薬組成物を投与する方法を提供する。このような疾患又は状態には、例えば、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リューマチ、乾癬、血小板破壊、再狭窄、虚血性血管障害、創傷治癒、鬱血性心不全、心筋虚血、再灌流傷害、末梢動脈疾患、肥満、並びに、虚血性心臓病、末梢四肢疾患、静脈移植狭窄、及び再狭窄のような心疾患等を挙げることが出来る。
【００１５】
第五の態様として、本発明は、内皮細胞に関連する疾患、病気又は状態に罹患した患者において、上記の医薬組成物を投与することからなる、その進行の阻止方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、一般的に、特定の細胞に治療物質を狙わせる（ターゲットする）ことに関する。本発明は特に、内皮細胞に物質を運搬するのに使用するターゲティング分子、例えば、ペプチドに関する。このようなターゲティング分子は様々な治療操作に使用することが出来る。より具体的には、本発明は内皮細胞に特異的に結合するペプチドに関する。該ペプチドは遺伝子運搬ビークルに取り込まれ、（成長因子及びサイトカインのような）蛋白質及び（薬剤、及び他の治療剤のような）小分子を含む、治療剤を導く（方向づける）ことが出来る。標的ベクター、ペプチド、又は小分子は、インビトロ又はインビボで細胞をターゲットするのに使用することが出来る。内皮細胞をターゲットすることは、遺伝子、ペプチド及び小分子を、細胞プロセス、細胞標識（マーキング）又は治療目的などの様々な目的で、遺伝子、ペプチド及び小分子を運搬するのに使用することが出来る。標的ベクター、ペプチド、又は小分子は、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リューマチ、乾癬、血小板破壊、再狭窄、虚血性血管障害、創傷治癒、鬱血性心不全、心筋虚血、再灌流傷害、末梢動脈疾患、肥満、並びに、虚血性心臓病、末梢四肢疾患、静脈移植狭窄、及び再狭窄のような心疾患等の様々な疾患の治療に使用することが出来る。
【００１７】
本発明の第一の態様では、、内皮細胞結合性ペプチド、即ち、内皮細胞に特異的に結合するペプチドが提供される。これらのペプチドは本明細書において、「ターゲティングペプチド」とも呼ばれる。本発明のペプチドは内皮細胞の表面分子に選択的に結合する。ペプチドが、該細胞表面分子の結合ドメインとより大きな親和性（アフィニティ）で相互作用したとき、又は、他の細胞表面分子の他の結合ドメインと比べてその結合ドメインにより特異的であるときに、該ペプチドは該細胞表面分子に「選択的に結合する」ものである。「特異的」という用語は、ペプチドが相互作用する相互作用分子の数及び型に関してペプチドにより示される選択性の程度、並びに、このような反応の速度及び程度、例えば、抗体が結合する抗原の数及び型に関して抗体により示される選択性の程度及びこのような反応の速度及び程度を意味するものである。本明細書において、「選択的に結合する」という語句は、本発明の方法において有用であるのに十分な結合であることを意味する。当該技術分野において公知であるように、例えば、受容体に対して有用な選択的結合は、結合親和性と該授与体近傍にある接近可能なリガンド濃度との双方に依存する。従って、治療対象の細胞又は組織が、例えば、細胞表面受容体への結合に関して競合するに十分な添加リガンド濃度を容認できる限りは、任意の天然の競合リガンドに関して見出される結合親和性より低い結合親和性も有用であり得る。
【００１８】
本発明における「細胞表面分子」という用語は、本発明のペプチドに選択的に結合する、内皮細胞の表面膜に提示される任意の分子を包含する。「細胞表面分子」によって、本発明のペプチドが相互作用して細胞に結合することが出来る、該細胞表面に存在する、任意の部位、即ち、単独の分子又は複数の分子を意味する。
【００１９】
殆どの場合に、本発明のターゲティングペプチドは約５から約５０個のアミノ酸、好ましくは約５から約３０個のアミノ酸、更に好ましくは約７から約２０個のアミノ酸、最も好ましくは約７から約１０個のアミノ酸を含む。このようなパラメーターを満たすペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（配列番号）１−３７及び４４（表２）に記載されている。標的に結合することが可能なペプチドの間にはコンセンサス配列が同定できることが認められる。このようなコンセンサス配列には結合に必須の重要な（キーとなる）アミノ酸又はアミノ酸のパターンが同定される。コンセンサス配列は内皮細胞に結合可能なペプチドパターンを分析することによって決定することが出来る。コンセンサス領域は一度認識されると、内皮細胞の標的化に使用するほかのペプチドを構築するのに使用することが出来る。このようなコンセンサス配列は、ペプチドを構築し、コンセンサス配列の結合に与える影響を決定することで試験することが出来る。この方法で、コンセンサス配列が存在する限り、ペプチドは標的に結合する。幾つかの場合に、比較的長いペプチドは標的細胞により容易に結合するので有用である。
【００２０】
コンセンサス配列は当該技術分野における標準的な操作で求めることが出来る。一例は、Pileup プログラム（Wisconsin Package 10.2, Genetic Computer Group (GCG),
Madison, Wisconsin）を使用するものである。Pileupを用いて標準設定で配列番号１−３７を分析した結果、ＣＸＸＰＴＰＰＸＣ（配列番号４４）がが得られた。ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である。即ち、本発明のもう一つの具体例として、配列番号４４が含まれる。
【００２１】
標的組織に対する親和性を示すペプチドが選択されると、それを当該技術分野において公知の方法で修飾することが出来る。このような方法には、ランダム突然変異、及び、選択したアミノ酸置換用のペプチド合成がある。様々な長さのペプチドが構築され、その結合親和性及び特異性に対する効果を試験される。この方法で、結合親和性を増大又は変更することが出来る。即ち、内皮細胞に対する特異的結合を示すペプチド、及び、所望の内皮細胞による特異的結合を示すペプチドが同定される。
【００２２】
「ターゲティング分子」という用語は、開示されたペプチドの模倣ペプチド（peputidomimetic）も含むものである。本明細書において、「模倣ペプチド」は、開示された内皮細胞特異的ペプチドの結合活性を有するペプチド様分子を意味するように、広範囲で使用される。本発明のターゲティングペプチドに関しては、化学修飾ペプチドを含む模倣ペプチド、非天然アミノ酸を含むペプチド様分子、及びペプトイド等は、模倣ペプチドが由来する開示されたターゲティングペプチドの内皮細胞結合活性を有する（例えば、Wolff,
1995を参照）。
【００２３】
本発明のターゲティングペプチドは、配列番号１−３７及び４４のペプチドが含まれる。当業者であれば、これらの全ての配列が１番目及び８番目にＣｙｓを有していることが理解するであろう。理論的に拘束されるものではないが、これらの位置におけるシステインはジスルフィド結合を形成し、制約的な（constrained）ループを生み出すものと考えられる。この制約的なループは２及び８番目のアミノ酸の接近度（accessibility）及び／又は露出度（exposure）を高めるものと考えられる。システイン自体は標的細胞受容体との結合に関与しているか又は関与していないかも知れない。従って、本発明のターゲティングペプチドには、配列番号１−３７及び４４からなる群から選択されるアミノ酸１−８番目を含むペプチド、配列番号１−３７及び４４からなる群から選択されるアミノ酸２−９番目を含むペプチド、及び、配列番号１−３７及び４４からなる群から選択されるアミノ酸２−８番目を含むペプチドも含まれる。
【００２４】
模倣ペプチドを同定する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、模倣ペプチド候補のライブラリーを含むデータベースのスクリーニングを挙げることが出来る。例えば、ケンブリッジ構造データベースは、公知の結晶構造を有する300,000以上の化合物のコレクションを含む（Allen 他、1979）。この構造寄託は、新たな結晶構造が決定されと標的継続的に更新され、、適当な形態、例えば、ターゲティングペプチドと同じ形態、及び、ターゲティングペプチドに結合される標的分子に対する幾何学的又は化学的な相補性を有する化合物をスクリーニング出来る。ターゲティングペプチド又はターゲティングペプチドに結合する標的分子の結晶構造が利用できないときは、例えば、ＣＯＮＣＯＲＤプログラム（Rusinko
他、1989）を用いて構造を作成することが可能である。もう一つのデータベースである、ケミカルヂレクトリー（Molecular Design Limited,
Information Systems; San Leandro Calif.）は、市販されている約100,000種の化合物を含み、ターゲティングペプチドの模倣ペプチド候補をサーチするのに使用することが出来る。
【００２５】
様々な型の、ペプチド、ペプトイド及び模倣ペプチドのような分子の多様な集団を含むライブラリーの調整方法は当該技術分野で周知であり、様々なライブラリーが市販されている（例えば、Ecker 及びCrooke、1995: Blondelle 他、1995: Goodman 及びRo,1994 を参照）。分子がペプチド、蛋白質又はその断片である場合には、該分子はインビトロで直接に製造するか、又は、核酸からインビトロで発現させることが出来る。合成ペプチド及び核酸化学の方法は当業者に周知である。
【００２６】
内皮細胞特異的ペプチドをコードするヌクレオチド配列も本願発明に包含される。遺伝子コードに基づき、適当なヌクレオチド配列を設計することが出来る。従って、本発明は、具体的なペプチドをコードする全てのヌクレオチド配列を含むものである。必要な場合には、本発明で使用するベクター又は融合蛋白質の構築する際に、該ヌクレオチド配列を使用することが出来る。このような方法は当該技術分野で公知である（例えば、WO00/06195を参照）。更に、、発現に必要なプロモーター、ターミネーター、及びエンハンサー等に加えて、発現カセットの構築も公知である。
【００２７】
ペプチドは、ターゲティング遺伝子、蛋白質、医薬、放射性核種、リポソーム、又は、内皮細胞に対する他の化合物又は物質において使用する。ペプチドは標的細胞に対する特異的なヌクレオチド又は組成物の運搬用の任意のベクター系において使用することが出来る。ヌクレオチドとは、遺伝子配列、ＤＮＡ，ＲＮＡ及びアンチセンス核酸を意味する。
【００２８】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー状の形態、と定義され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。このような用語は、一本鎖、二重鎖、又は三重鎖ＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又は、プリン及びピリミジン塩基、又は天然塩基、化学的、生化学的に修飾された非天然若しくは誘導核酸塩基を含む。ポリヌクレオリド骨格には糖及び燐酸基（ＲＮＡおよびＤＮＡに典型的に含まれるように）、又は、修飾若しくは置換糖又は燐酸基が含まれていても良い。
【００２９】
本明細書において、「ＤＮＡ」には、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇの塩基のみではなく、メチル化ヌクレオチドのようなこれら塩基の任意のアナログ又は修飾塩基、非電荷結合及びチオエートのようなヌクレオチド間修飾、糖アナログの使用、並びに、ポリアミドのような修飾及び／又は別の骨格構造も含まれる。
【００３０】
一具体例において、ターゲティングペプチドは、遺伝子治療に有用なベクター粒子内に遺伝的に取り込まれる。外来性又は本来の（native）遺伝子を哺乳動物細胞内に導入するための数多くのベクター系が知られている。これらには、ＳＶ４０（Okayama
他、1985）、ウシパピローマウィルス（DiMAio 他、1982）、アデノウィルス（Morin 他、1987: Dai 他、1995: Yang 他、1996:
Tripathy 他、1991: Quantin 他、1992: Rosenfeld 他、1991: Wagner, 1992: Curiel 他1992:
Curiel, 1991: LeGal LaSalle 他、1993: Kass-Eisler 他、1993）、アデノ随伴ウィルス（Muzyczka,
1994: Xiao 他、1996）、単純疱疹ウィルス（Geller 他、1988: Huard他、1995: 米国特許第5,501,979）、レンチウィルス（Douglas 他、2001: Miyoshi 他、1999: Garvey 他、1990: Berkowitz 他、2001: PCT公開第WO 01/44458: 米国特許第6,277,633 及び第5,380,830）が含まれる。ターゲティングペプチドは任意の哺乳動物発現ベクターと共に使用し、適当な標的内皮細胞に発現系をターゲットすることが出来る。例えば、Ｗｕ他（１９９１）、Ｗｕ及びＷｕ（１９８８）、Ｗｕ他（１９８９）、Ｚｅｎｋｅ他（１９９０）、Ｗａｇｎｅｒ他（１９９０）を参照することができる。Ｇｒｉｆｍａｎ他（２００１）は、腫瘍ターゲティングペプチドを組換えＡＡＶキャプシド内への取り込みについて記載している。記載の目的でのみ、本具体例は好適な例である、アデノウィルスベクターのみに関して記載する。しかしながら、該具体例は、従来記載された任意のベクター系及び当業者に公知の他のベクター系に適用できることを理解されたい。
【００３１】
第一の具体例の好適態様として、内皮細胞特異的ペプチド、又は、ターゲティングペプチド若しくはターゲティング分子とも称されるものは、ファイバー蛋白質を修飾することによって、アデノウィルスベクター粒子のキャプシド内に遺伝子学的に取り込ませて、該アデノウィルス粒子をターゲットする。本具体例において使用できるファイバーノブのループ領域に関して、ファイバーノブの結晶構造が記載されている（Ｘｉａ他、１９９４参照）。ノブモノマーは８つの鎖の逆平行βサンドイッチフォールドを有する。ノブモノマー三量体の全体構造は３枚翼のプロペラに類似しており、３つのモノマーの夫々のβ鎖が翼の面を有している。特に、Ａｄ５ファイバーの部における以下の残基がβサンドイッチモチーフにおける水素結合において重要であると思われる：４００−４０２、４１９−４２８，４３１−４４０，４５４−４６１，４７９−４８２，４８５−４８６，５１６−５２１，５２９−５３６，５５０−５５７、及び５７３−５７８。該蛋白質の他の残基（ファイバー蛋白質の二次構造の形成には重要ではないと思われる）は蛋白質ノブドメインの露出したループを規定する。特に、４０３−４１８を含む残基はＡＢループを含み、４４１−４５３を含む残基はＣＤループを含み、４８７−５１４を含む残基はＤＧループを含み、５２２−５２８を含む残基はＧＨループを含み、５３７−５４９を含む残基はＨＩループを含み、そして、５５８−５７２を含む残基はＩＪループを含む。
【００３２】
「ループ」という用語は、細胞ターゲティングを可能にするペプチドモチーフを含むように非天然アミノ酸配列により置換することが可能なアミノ酸残基の範囲（長さ）を規定する一般的な意味（即ち、一つより多い、好ましくは２００より少ない、より好ましくは３０より少ない）する。本明細書中では、このようなループは、Ａｄ５に関して規定するが、他のファイバー種の配列アライメントも記載されている（例えば、Ｘｉａ他、１９９４参照）。これら他の種（特に、Ｘｉａ他、１９９４に記載のＡｄ２，Ａｄ３，Ａｄ７，Ａｄ４０及びＡｄ４１）に関しては、ノブドメインの対応するループ領域が相当し得るものである。様々なクラスの蛋白質ループがＯｌｉｖａ他、１９９７に記載されている。
【００３３】
即ち、第一の具体例によって、好ましくは、ターゲティングペプチド配列を含むキメラアデノウィルスファイバー蛋白質が提供される。個的には、ターゲティングペプチド配列はキメラファイバー蛋白質のノブのループ内に存在するものに制限される。特に、ターゲティングペプチド配列はは、キメラアデノウィルスファイバー蛋白質のノブのループにおける蛋白質配列の変わりに又はその中に挿入されることが望ましい。適宜、ファイバー蛋白質ループは、ＡＢ，ＣＤ，ＤＧ，ＧＨ，及びＩＪから成る群から選択される。又、好適には、このループは、ファイバーノブにおいて、Ａｄ５残基４００−４０２、４１９−４２８，４３１−４４０，４５４−４６１，４７９−４８２，４８５−４８６，５１６−５２１，５２９−５３６，５５０−５５７、及び５７３−５７８以外のアミノ酸残基を含む。望ましくは、該ループは、残基４０３−４１８，４４１−４５３，４８７−５１４，５２２−５２８，５３７−５４９及び５５８−５７２から成る群から選択されるアミノ酸残基を含む。特に、ループに存在するターゲティングペプチド配列は、本明細書に記載のターゲティングペプチドのアミノ酸配列を含む。或いは、ループは米国特許第6,057,155号記載のファイバーノブにおいて作ることも可能である。
【００３４】
ターゲティングペプチド配列はＤＮＡレベルで導入される。従って、第一の具体例は、本発明のターゲティングペプチドの限定されたアミノ酸配列を含むキメラアデノイウィルスファイバー蛋白質をコードする単離・精製核酸も提供するものである。このようなキメラファイバー蛋白質を作製えする手段、特に、ＤＮＡレベルで配列を導入する手段は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｈａｙ他、２００１、米国特許第5,543,328号、第5,756,086号、及び、第6,329,190号参照）。簡潔に述べると、該手段には、配列をファイバーたんぱく質をコードする配列に導入し、新たなペプチドモチーフを該野生型ファイバー蛋白質のＣ末端、又はそのノブのループにおける蛋白質配列内、又はそれに代わり挿入することから成る。このような導入により、新たなペプチド結合モチーフが挿入され、又は、ペプチドモチーフが創出される（例えば、該モチーフを含む或る配列は既に天然のファイバー蛋白質内に存在する）。該方法は、ファイバー配列を本発明のターゲティングペプチドのアミノ酸配列と置換するために実施することも出来る。
【００３５】
一般的に、この具体例は、配列の操作の容易にする為に、キメラファイバー蛋白質をコードする核酸をプラスミド又は他のベクター内にクローニングすることによって達成される。次に、配列をファイバー蛋白質に追加するためのユニークな（特異的な）制限部位をファイバー配列内で同定又は挿入する。二重鎖合成オリゴヌクレオチドは一般的に、合成の単鎖センス及びアンチセンスを重複させて、二重鎖オリゴヌクレオチドが標的配列の隣りに制限部位を取り込み、例えば、置換ＤＮＡを取り込むべく使用することが出来る。プラスミド又は他のベクターが制限酵素によって切断され、相補的な粘着性末端を有するオリゴヌクレオチド配列が該プラスミド又は他のベクター内に結合され、野生型ＤＮＡと置換する。インビトロ部位特異的突然変異の他の手段は、当業者に公知で可能であり（特に、ＰＣＲを使用するもの）、例えば、市販のキットを用いて、ファイバー蛋白質コード配列に変異配列を導入するために使用することが出来る。
【００３６】
一度、ターゲティングペプチド配列がキメラ外皮蛋白質内に導入されると、該配列をコードする核酸断片は、例えば、５‘及び３’プライマー、好ましくは、更にユニークな制限部位で終結するものを用いるＰＣＲ増幅により単離することが出来る。プライマーをこの様式で使用する結果、ユニークな制限部位に隣接したキメラファイバー含有断片が増幅される。ユニークな制限部位は更に便利な断片のサブクローニングに使用される。キメラファイバー蛋白質を作製するほかの方法も採用可能である。これらの方法は当業者に非常に良く知られたものである。
【００３７】
本明細書で使用する「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」、及び「ベクター構築物」は同義に使用し、当業者が理解するように、遺伝子移入の為のあらゆる核酸構築物を意味する。
【００３８】
本明細書において、「ウィルスベクター」は、当該技術分野で理解されている意味で使用される。それは、核酸ベクター構築物であり、少なくとも、一つのウィルス起源エレメントを有し、ウィルスベクター粒子内にパッケージすることが出来るものである。ウィルスベクター粒子は、ＤＮＡ，ＲＮＡ又は他の核酸をインビトロ又はインビボで細胞内に移入（トランスファー）する目的で利用することが出来る。ウィルスベクターには、以下に限定されるものではないが、レトロウイルス（retoroviral）ベクター、ワクシニア(vaccinia)ベクター、レンチウイルス(lentiviral)ベクター、ヘルペスウイルス(herpes
virus)ベクター（例えばＨＳＶ）、バキュロウイルス(baculoviral)ベクター、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus:ＣＭＶ）ベクター、パピローマウイルス(papillomavirus)ベクター、シミアンウイルス（ＳＶ４０）ベクター、シンドビス（Sindbis）ベクター、セムリキ森林熱ウイルス(semliki
forest virus) ベクター、ファージベクター、アデノウイルス(adenoviral)ベクター、及びアデノ随伴ウイルス（adeno-associated
viral:ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。適切なウイルスベクターは、例えば米国特許第６，０５７，１５５号、５，５４３，３２８号及び５，７５６，０８６号に記載されている。
【００３９】
「アデノウイルスベクター」及び「アデノウイルス性ベクター」という用語は同義に使用し、当分野で周知であり、アデノウイルスゲノムの全部又は一部を含むポリヌクレオチドを意味する。アデノウイルスベクターは数種の形態の任意のものとすることができ、限定されないが、裸のＤＮＡ、アデノウイルスキャプシドに封入されたＤＮＡ、別のウイルスもしくはウイルス様形態（例えば単純ヘルペス及びＡＡＶ）にパッケージングされたＤＮＡ、リポソームに封入されたＤＮＡ、ポリリジンとの複合体、合成ポリカチオン分子との複合体、トランスフェリンとのコンジュゲート、分子を免疫学的に「マスク」するため及び／又は半減期を増すための化合物（例えばＰＥＧ）との複合体、あるいは非ウイルス蛋白質との共役体が挙げられる。
【００４０】
「ウィルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウィルスベクター粒子」、「ウィルス」及び「ビリオン」は同義で使用され、例えば、本発明のウィルスベクターが適当な細胞又はセルライン内に感染性粒子を生成の為に形質導入されたときに、形成される感染性ウィルス粒子を意味するものとして広義に理解されたい。本発明の目的の為に、これらの用語は好ましくは、本発明のアデノウィルスベクターがアデノウィルスキャプシド内に封入されたときに形成される組換えアデノウィルスを含むアデノウィルスを意味する。
【００４１】
「アデノウイルス」及び「アデノウイルス性粒子」という用語は同義で使用され、アデノウイルスとして分類することができるあらゆるウイルスが含まれ、ヒト又は動物に感染する任意のアデノウイルスを含み、全グループ、サブグループ、及び血清型を含む。従って、本発明で使用する「アデノウイルス」及び「アデノウイルス粒子」とはウイルス自体とその誘導体を意味し、特に指定しない限り、全血清型及びサブタイプと天然及び組換え形態を含む。ヒト細胞に感染するアデノウイルスも含む。アデノウイルスは野生型でもよいし、当該技術分野で公知又は本明細書に開示する種々の方法で変異させてもよい。このような変異としては限定されないが、感染性ウイルスを作製するように粒子にパッケージングされたアデノウイルスゲノムの変異が挙げられる。変異の例としてはＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、又はＥ４コーディング領域の１種以上の欠失等の当該技術分野で公知の欠失が挙げられる。他の変異の例としてはアデノウイルスゲノムの全コーディング領域の欠失が挙げられる。このようなアデノウイルスは「ガットレス」アデノウイルスとして知られる。これらの用語は所定型の細胞又は組織で優先的に複製するが、他の型では複製程度が低いか又は全く複製しないウイルスである複製条件付きアデノウイルスも意味する。本発明の特に好適な具体例として、例えば、本発明に開示するアデノウイルス粒子としては、固形癌や他の腫瘍等の異常増殖組織で複製するアデノウイルス粒子が挙げられる。これらの例としては米国特許第５，９９８，２０５号（１９９９年１２月７日発行：Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ他）及び米国特許第５，８０１，０２９号（１９９８年９月１日発行、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）に開示されているウイルスが挙げられる。これら文献の全ての開示内容は本明細書内に参照され、取り込まれる。このようなウイルスは「細胞溶解性」又は「細胞変性」ウイルス（又はベクター）とも言い、腫瘍細胞にこのような効果をもつ場合には、「腫瘍溶解性」ウイルス（又はベクター）と言う。
【００４２】
本発明の更なる具体例として、本発明のターゲティングペプチド配列を含むキメラアデノウィルスファイバー蛋白質が提供される。該アデノウィルスベクター粒子は更に、ファイバー蛋白質に対する他の変異を有していてもよい。これら変異の例としては、限定されるものではないが、米国仮出願第60/391,967号（２００２年６月２６日出願）、ＷＯ０１／９２２９９、米国特許第5,962,311号、ＷＯ９８／０７８７７及び米国特許第6,153,435号に記載の変異を挙げることが出来る。これらは、特定の細胞型又は一つ以上の細胞型に対するウィルスベクター粒子の結合を減少させ、特定の細胞型又は一つ以上の細胞型に対するウィルスベクター粒子の結合を増加させ、及び／又は、動物内におけるアデノウィルスベクター粒子に対する免疫応答を減少させるような変異が含まれる。更に、本発明のアデノウィルスベクター粒子には、他のウィルスキャプシド蛋白質に対する変異も含まれる。このような変異の例として、限定されるものではないが、米国特許第5,731,190号、第6,127,525号、第5,922,315号に記載の変異を挙げることが出来る。
【００４３】
本発明のアデノウィルスは当業者に公知の標準的な方法で作製することが出来る。ベクターを当業者に公知の技術でパッケージング細胞内に移入させる。パッケージング細胞はアデノウィルス粒子内にパッケージされるアデノウィルスゲノムにおける遺伝子により提供される機能を補う機能を提供する。このような粒子の生産には、ベクターが複製され、感染性ウィルスを集合させるのに必要な蛋白質がが生産されなければならない。パッケージング細胞は所望のウィルスベクター粒子の生産が可能な条件下で培養される。粒子は標準的な方法で回収される。好適なパッケージング細胞は、野生型アデノウィルス粒子になるような相同組換えが制限されるように設計されたパッケージング細胞である。このような細胞は、米国特許第5,994,128（１９９９年１１月３０日発行、Fallaux 他）、及び米国特許第6,033,908（２０００年３月７日発行、Bout 他）に開示されている。これらの特許に記載されている、ＰＥＲ．Ｃ６として公知のパッケージング細胞は特に好適である。
【００４４】
本具体例による特に好適なベクターは、アデノウィルスベクター（即ち、アデノウィルス科、特に、マストデノウィルス属）である。Ａｄ２，Ａｄ５及びＡｄ３５ベースのベクターが望ましく、他の血清型のアデノウィルスも使用することができる。本発明において使用可能なアデノウィルス保存には任意の血清型が含まれる。アデノウィルス血清型１〜４７が現在アメリカン・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，マナサス、ＶＡ）から入手可能であり、本発明は、以下の表１に挙げた血清型を含む任意のソースから入手可能な他のあらゆる血清型を含むものである。本発明で使用使用可能なアデノウィルスはヒト又は非ヒト起源である。例えば、アデノウィルスは、サブグループＡ（血清型１２、１８、及び３１）、サブグループＢ（血清型３，７，１１，１４，１６，２１，３４，３５）、サブグループＣ（血清型１、２、５、及び６）、サブグループＤ（血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６〜３９、及び４２〜４７）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０及び４１）、又は他の任意のアデノウイルスであり得る。
【００４５】
遺伝子移入に使用するアデノウィルスベクターは複製成分であり得る。或いは、アデノウィルスベクターは、ウィルス複製を欠失させることができる、少なくとも一つの修飾を有する遺伝学的材料を含むものであり得る。更に、アデノウィルスベクターは、ウィルス複製を条件的にさせることができる、即ち、腫瘍溶解性アデノウィルスベクターのように特定の細胞又は組織でのみ複製可能なように（ＷＯ９６／１７０５３及びＷＯ９９／２５８６０）、少なくとも一つの修飾を有する遺伝学的材料を含むものであり得る。アデノウィルスベクターは更に、例えば、ファイバー蛋白質自身の中に、追加配列又は変異を有するものであり得る。例えば、本発明のベクターは、パッセンジャー遺伝子、通常は異種遺伝子、好適には治療遺伝子又は受容体遺伝子を含むことが出来る。
【００４６】
本発明の組換えアデノウィルスベクター及び粒子を作製する方法は当業者に公知である。例えば、キメラファイバー蛋白質を含む組換えアデノウィルス及び更にパッセンジャー遺伝子又は特定細胞で発現することができる遺伝子を含む組換えアデノウィルスは、移入ベクター、好適には、ウィルス又はプラスミド移入ベクターを用いて本発明に従い作製することが出来る。このような移入ベクターは、好ましくは、既に記載したキメラアデノウィルスファイバー配列を含むものである。キメラファイバー蛋白質遺伝子配列には、天然配列の代わりに、欠失、又は天然配列への追加を含む非天然（即ち、非野生型）配列が含まれる。
【００４７】
各クラスの代表的なウィルスに関するアメリカン・カルチャー・コレクションカタログ＃を含むヒト及び動物アデノウィルスの例
【００４８】
【表１−１】
2006510360.tif 000002
【００４９】
【表１−２】
2006510360.tif 000003
【００５０】
【表１−３】
2006510360.tif 000004
【００５１】
本発明のベクターは、更に、ファイバー蛋白質の内部、それに代わり、又はその外部に、該ファイバー蛋白質が三量体化する能力に影響を与える追加配列、又は、プロテアーゼ認識配列を含むことが可能である。三量体化する能力に影響を与える追加配列は、ファイバー三量体化を可能にする一つ又はそれ以上の配列である。
【００５２】
本具体例によるベクター及び移入（transfer）ベクターの製造に関して、移入ベクターは当業者に公知の標準的な分子及び遺伝子技術を用いて構築することが出来る。ビリオン又はウィルス粒子は適当なセルライン内でウィルスベクターを用いて製造することが出来る。同様に、アデノウィルスファイバーキメラ含有粒子は標準的なセルライン、例えば、アデノウィルスベクター用に現在使用されているようなセルライン内で製造することが出来る。ＰＣＴ公開ＷＯ００・４２２０８に記載されたように、アデノウィルス欠失ファイバーを作製することが出来る。
【００５３】
本具体例は、内皮細胞に結合し、該細胞への高高率な形質導入を媒介することが出来るファイバー蛋白質、及び、ベクター及びそれを含む移入ベクターを提供する。
【００５４】
本発明のベクター及び移入ベクターはインビトロ又はインビボで細胞と接触させるために使用することが出来る。方法は、特定の導入手段に依存するものではなく、そのように解釈されるものではない。導入手段は当業者に周知である。即ち、本具体例の複合体はインビボで宿主に投与することが出来る。宿主は、、哺乳動物宿主、霊長類宿主及びヒト宿主を含む動物宿主であり得る。従って、該複合体はヒトを含む動物の病気の治療に用いる医薬品として、及び医薬品の製造に有用である。
【００５５】
本具体例は、更に、アデノウィルス粒子を細胞表面分子を発現する細胞にターゲットする方法であって、該細胞にターゲットするに適したターゲティングペプチドを含むように修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子を該細胞表面分子にターゲットするステップ、及び、該細胞を該粒子と接触させるステップを含む前記方法を提供する。
【００５６】
本具体例は、更に、細胞表面分子を発現する細胞にアデノウィルス粒子を選択的に運搬する方法であって、該細胞にターゲットするに適したターゲティングペプチドを含むように修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウィルスベクターを有するアデノウィルス粒子を該細胞表面分子にターゲットするステップ、及び、該細胞を該アデノウィルス粒子と接触させるステップを含む前記方法を提供する。
【００５７】
更に、本具体例は、細胞表面分子を発現する細胞に異種遺伝子を選択的に運搬する方法であって、該異種遺伝子及び該細胞にターゲットするに適したターゲティングペプチドを含むように修飾されたファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子を該細胞と接触させるステップを含む前記方法。
【００５８】
複合体は宿主に治療効果を提供するに十分な量で投与される。一つの態様において、ウィルス粒子は１ウィルス粒子〜約１０１４ウィルス粒子の範囲、好ましくは約１０６ウィルス粒子〜約１０１３ウィルス粒子の範囲で投与される。宿主は、ヒト又はヒト以外の動物である。好ましくは、複合体粒子は、例えば、静脈投与（例えば、門脈注射又は末梢静脈注射）、筋肉内投与、腹腔内投与、眼球内投与、又は経鼻投与により、全身に投与される。複合体粒子は、患者への投与に適した医薬上許容可能なキャリヤと組み合わせて投与することが出来る。キャリヤは液体キャリヤ（例えば、生理食塩水）、又は、例えば、μキャリヤビーズのような固体キャリヤであり得る。複合体粒子は、このような複合体粒子をインビボで投与することによって、所望の細胞又は組織に直接いく。そして、標的ウィルス粒子は所望の細胞又は組織に感染する。
【００５９】
本発明のベクターを構築するための標準的な技術は、当業者に周知であり、Sambrook 他（１９８９）及びSambrook 及びRussel（２００１）のような参照文献に記載されている。ＤＮＡ断片の結合に利用できるか数々の戦略があり、ＤＮＡ断片末端の性質に従い、当業者であれば容易に選択することが出来る。
【００６０】
本発明のペプチドが発現遺伝子をターゲティングする際には、発現される遺伝子は、標的細胞型における該遺伝子の発現に必要な適当なっ調節要素と共に発現カセットにで提供される。このような調節要素は当業者に周知であり、プロモーター、ターミネーター、及びエンハンサー等がある。
【００６１】
第二の具体例において、ペプチドは可溶性受容体、好ましくは、アデノウィルスベクター粒子、の内に遺伝子的に組み込まれ、粒子をデターゲット又は再ターゲットする（ＷＯ０２／２９０７２、本明細書内に参照文献として取り込まれる）。本具体例では、内皮細胞特異的ペプチドがターゲティングリガンドドメインとして使用され、ＣＡＲ細胞外ドメイン（ｓＣＡＲ）にような可溶性アデノウィルス受容体ドメインを使用するターゲティング戦略を提供する。ターゲティンググリガンドドメインは可溶性アデノウィルス受容体ドメインに付けられ、アデノウィルス粒子に追加される。結合体はアデノウィルス粒子のファイバーノブに結合し、複合体を形成し、それによって、粒子を異なる表面分子に再び向かわせる。アデノウィルス受容体ドメインを三量体化することによって、このようなターゲティング分子のアデノウィルス粒子への結合を増強させることが好ましい。三量体化ドメイン及びターゲティングリガンドドメインを有するターゲティング分子と複合したアデノウィルス粒子はインビトロ及びインビボで細胞に効率的に形質導入する。このアデノウィルス粒子の再ターゲティングアプローチは、修飾ファイバー又は他のキャプシド蛋白質を有するアデノウィルス粒子の生成を必要としない。アデノウィルス粒子は、標準的なプロトコール及びセルラインを使用して調製及び高力価まで増殖させることが出来る。ｓＣＡＲのような適当な可溶性アデノウィルス受容体ドメインをターゲティングドメインに融合させて追加することによって、アデノウィルスベクター粒子の正常な指向性を阻害し、同時にそれを選択した標的に向かわせる。
【００６２】
可溶性アデノウィルス受容体ドメインは、アデノウィルス受容体分子の断片、化学的修飾断片、又は全部分で有り得、それらは、アデノウィルスファイバー蛋白質に対する結合特異性を保持し、生理的条件下で水溶液に溶解する。好適には、可溶性アデノウィルス受容体ドメインはアデノウィルス受容体ドメインの単離された細胞外ドメインである。可溶性アデノウィルス受容体ドメインの好適例は、ｓＣＡＲである。ｓＣＡＲのｃＤＮＡ配列は当業者に公知であり、ＧｅｎＢａｎｋの寄託番号Ｙ０７５９３で公開されている。本発明の一具体例では、ｓＣＡＲは公開されているｓＣＡＲのｃＤＮＡ配列の、ＡＴＧコドンから第一のＩｇ様ドメイン（Ｄ１ドメイン）まで伸長する少なくとも６０〜４８７塩基を含む。本発明の好適ｓＣＡＲはＣＡＲ配列の５４〜７６７塩基を含む
【００６３】
ターゲティング分子の三量体化ドメインは可溶性アデノウィルス受容体ドメインに対して異種の三量体化であっても良い。即ち、それは可溶性アデノウィルス受容体ドメインに関して非天然アミノ酸配列を含むものであっても良い。「非天然アミノ酸配列」には、可溶性アデノウィルス受容体ドメインにおける同じ位置に見出されない任意のアミノ酸配列を含み、それは、例えば、遺伝子発現レベルにおいて、可溶性アデノウィルス受容体ドメインに組み込まれる。非天然アミノ酸配列の例として、酵母ロイシンジッパー分子のようなロイシンジッパー分子に由来するアミノ酸配列を挙げることができる。非天然アミノ酸配列の一例として、或るロイシン残基がイソロイシン残基に変異している、酵母ロイシンジッパー分子の変異体がある（Ｈａｒｂｕｒｙ他、１９９３）。三量体化ドメインは可溶性アデノウィルス受容体ドメインに三量体化、特にホモ三量体化形成能を、直接又は間接的に付与する。間接的ホモ三量体化は、例えば、可溶性受容体における三量体化ドメイン又は他のドメインと相互作用する、抗体又はその断片のような二重特異性又は多重特異性結合剤を介して、達成される。
【００６４】
三量体化ドメインは可溶性アデノウィルス受容体ドメインのＣ末端の下流に位置させることが出来る。三量体化ドメインは可溶性アデノウィルス受容体ドメインの配列内に導入することも可能である。三量体化ドメインが可溶性アデノウィルス受容体ドメインの配列内に導入されるときには、そのＣ末端に導入することが好ましい。三量体化ドメインには、本明細書に引用文献として取り込まれるＷＯ０２／２９０７２に開示された任意のものが含まれる。
【００６５】
当業者であれば、特定のセッティングにおける適切な三量体化ドメインを選択する重要な基準は、第一に、その「強さ」及び、第二に、その「大きさ」であることは容易に理解されよう。三量体化ドメインの強さは、例えば、その会合／解離動力学で測定可能な、ある規定された条件下で形成された三量体分子の安定性として定量化される。三量体化ドメインの大きさ（特に、三量体化ドメインの全アミノ酸数）は、特定のターゲティング分子を構築する際の選択基準であろう。何故ならば、三量体化ドメインはアデノウィルス受容体ドメインの結合機能を破壊することなく、その中に取り込まれることが出来るだけ小さい必要があるからである。
【００６６】
更に別の具体例では、ターゲティング分子はさらに、アデノウィルス受容体ドメインのＣ末端と三量体化ドメインの間に位置するリンカー要素を含むことが出来る。このリンカー要素は好ましくはペプチドリンカーである。本明細書において、「ペプチドリンカー」とは、例えば、アデノウィルス受容体ドメインのＣ末端と三量体化ドメインの間で、スペーサーとして機能する短いペプチド配列を意味する。このような配列は、三量体化ドメインが可溶性アデノウィルス受容体ドメインによって立体的傷害を受けないように、効果的に相互作用してホモ三量体を形成できるようにする為に、望ましくは蛋白質内に取り込まれている。リンカー配列は任意の適当な長さ、好ましくは、約３〜約３０アミノ酸であり、任意のアミノ酸、例えば、グリシン及びセリン残基を含むことが出来る。最適には、リンカー配列は、可溶性アデノウィルス受容体ドメインの機能に干渉しない。好適態様においては、リンカー要素は交互のグリシン及びセリン残基から構成される。
【００６７】
ターゲティング分子は、非共有結合によって欠くドメインを結合することによって、全体的又は部分的に集合又は結合される。
【００６８】
本具体例は、アデノウィルス粒子とターゲティング分子との複合体も更に提供する。この「複合体」は、例えば、アデノウィルス粒子とターゲティング分子との間の共有又は非共有結合のような任意の相互作用である。好適には、それは非共有結合による相互作用である。複合体形成はアデノウィルス粒子とターゲティング分子とが接触したときに生じる。このような「接触」は、本明細書に記載のように、当業者に公知の任意の手段により行うことが出来、アデノウィルス粒子とターゲティング分子の相互接触が奏効される。例えば、アデノウィルス粒子とターゲティング分子の接触は、これら要素を同じ溶液の少容量内で混合することにより実施することが出来る。例えば、アデノウィルス粒子とターゲティング分子は適当な溶液中で、３７℃３０分間で会合させることが出来る。適宜、アデノウィルス粒子とターゲティング分子は共有結合、例えば、当業者に公知の任意の手段、好ましくは、単結合相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ワンデルワールス力、及び／又は非極性相互作用）により結合させることも可能である。好適には、アデノウィルス粒子とターゲティング分子の複合体は細胞に接触させる前に形成させる。この時間は凡そ、例えば、凍結乾燥、又は凍結安定剤の存在下−80℃、のような使用可能な形態でアデノウィルス粒子とターゲティング分子の複合体が安定に維持される最大期間と同じ時間である。
【００６９】
本具体例は又、本発明のターゲティング分子のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。更に、このようなポリヌクレオチドの変異体であって、ターゲティング分子のアミノ酸配列の対応する機能変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に参照文献として取り込まれるＷＯ０２／２９０７２に記載のように、機能変異体は一つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、追加（粗乳）、欠失、削除、  又はそれらの任意の組み合わせによる相違があるが、参照ターゲティング分子と同じ生物学的機能を有する。
【００７０】
本明細書中において、「生物学的機能」は広義に理解される。それは、以下に限定されるものではないが、本明細書に記載のターゲティング分子の要素の特定の機能、ここで要素とは可溶性アデノウィルス受容体ドメイン、三量体化ドメイン、及びターゲティングリガンドドメインである。従って、生物学的機能は、ポリペプチドが生理的意味において示す機能、即ち、生体器官又は細胞の一部としての機能のみではなく、非生理的条件、例えば、インビトロにおいて示す機能も含むものである。例えば、本明細書における可溶性アデノウィルス受容体ドメインの生物学的機能とは、インビボ又はインビトロにおいて本発明のアデノウィルス粒子のファイバー蛋白質に結合する能力を意味する。本明細書における三量体化ドメインの生物学的機能とは、インビトロで本発明のターゲティング分子を三量体化してインビボでその三量体状態を維持する能力である。。本明細書におけるターゲティングリガンドドメインの生物学的機能とは、インビトロ又はインビボで本明細書で規定する対応する細胞表面分子に結合する能力である。例えば、蛋白質の特定のリガンドとの結合特性のような、必要な特性を評価するアッセイは当業者に周知である。
【００７１】
このようなターゲティング分子の作製手段、特に、三量体化ドメイン配列を、ＤＮＡレベルで可溶性アデノウィルス受容体ドメイン内部又はその３‘末端に導入する手段は、当業者に周知であり、更に、ＷＯ０２／２９０７２に記載されている。簡潔に記載すると、選んだ三量体化ドメイン配列選ばれたアデノウィルス受容体ドメインをコードする配列内に導入し、新たなペプチドモチーフが野生型の蛋白質質配列内、又はそれに代わり挿入される。このような導入によって新たなペプチド結合モチーフを導入したり、又は、例えば、モチーフを含む該配列のある者は既に野生型ア可溶性デノウィルス受容体ドメインに存在しており、ペプチドモチーフの創出をすることが出来る。この方法を用いて、可溶性アデノウィルス受容体ドメイン配列を本発明の非天然アミノ酸配列を交換することも出来る。一般的に、これは、可溶性アデノウィルス受容体ドメインをコードする核酸配列を該配列の操作を容易にする為のプラスミド又は他のベクター内にクローニングすることにより達成される。その際に、更に配列を追加するための単一制限部位を同定したり、可溶性アデノウィルス受容体ドメインの配列を含むプラスミド配列内に挿入することが出来る。二重鎖合成オリゴヌクレオチドは、一般的に、合成一本鎖センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを、二重鎖合成オリゴヌクレオチドが標的配列の隣りに制限部位を組み込み、例えば、置換ＤＮＡを取り込むために使用できるように、合成一本鎖センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることにより作製することが出来る。プラスミド又は他のベクターは制限酵素で切断され、適合可能な粘着末端を有するオリゴヌクレオチド配列はプラスミド又は他のベクター内に結合され、野生型ＤＮＡと交換される。当業者に公知である他の手段、特にＰＣＲを用いて、三量体化ドメインを可溶性アデノウィルス受容体ドメインのドード配列内に導入することが可能である。
【００７２】
本発明の第二の具体例は更に、ターゲティング分子の核酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は、リガンド分子及び可溶性アデノウィルス受容体ドメインをコードする少なくとも二つのポリヌクレオチド、更に適宜、三量体化ドメインの配列を含む発現ベクターが提供される。適当な発現ベクターは、適当な宿主細胞内で繁殖する際に挿入されたＤＮＡ配列の発現に必要な遺伝的要素を含む任意のベクターである。数多くの発現ベクターが当業者にはく公知であり、市販されている。
【００７３】
本具体例はアデノウィルス粒子及びターゲティング分子との複合体を提供するものである。
【００７４】
本具体例は、更に、アデノウィルス粒子を、可溶性アデノウィルス受容体ドメイン、三量体化ドメイン、及びターゲティングペプチドドメインを含むターゲティング分子と接触させ、細胞表面分子にターゲットするのに適当な複合体を得、該複合体と該細胞を接触させることから成る、アデノウィルス粒子を該細胞表面分子を発現する細胞にターゲットする方法を提供する。
【００７５】
この具体例は更に、アデノウィルスベクターを含むアデノウィルス粒子を、可溶性アデノウィルス受容体ドメイン、三量体化ドメイン、及びターゲティングペプチドドメインを含むターゲティング分子と接触させ、細胞表面分子にターゲットするのに適当な複合体を得、該複合体と該細胞を接触させることから成る、該細胞表面分子を発現する細胞に選択的に該アデノウィルスベクターを運搬する方法を提供する。
【００７６】
更に、本具体例は、異種遺伝子を含むアデノウィルス粒子を、可溶性アデノウィルス受容体ドメイン、三量体化ドメイン、及びターゲティングペプチドドメインを含むターゲティング分子と接触させ、細胞表面分子にターゲットするのに適当な複合体を得、該複合体と該細胞を接触させることから成る、該細胞表面分子を発現する細胞に選択的に該異種遺伝子を運搬する方法を提供する。
【００７７】
従って、本具体例の複合体はインビボで宿主に投与することが出来る。宿主は、哺乳動物、霊長類及びヒトを含む動物宿主である。従って、該複合体は、ヒトを含む哺動物の疾患を治療するための医薬、及び、医薬の製造用として有用である。
【００７８】
本具体例の複合体はインビトロで細胞に投与することも出来る。これはエキソビボ遺伝子治療の中で行われることがある。更に、これらの複合体は遺伝子移入の一般的な方法として使用可能である。
【００７９】
第三の具体例として、ターゲティングペプチドは遺伝的にレトロウィルス又はレンチウィルスベクター粒子内に取り込ませることが出来る（ＰＣＴ公開公報WO98/44938号，Gollan
及びGreen, 2002,米国特許第6,004,798号及び第5,985,655号、及びＰＣＴ公開公報WO98/51700号及び WO94/111524号）。レトロウィルス又はレンチウィルスベースのベクターは当該技術分野で周知である（Curan 他、1982; Gazzit 他、1986; Miller 1992; Kavanaugh 他、1994; Smith他、1990;
ＰＣＴ公開公報WO98/44938号、WO01/44458号、及び米国特許出願第60/353,177号）。ターゲティングペプチドは好適には、ウィルスエンベロープポリペプチドのようなウィルス表面蛋白質内に取り込まれ、内皮細胞にターゲットするレトロウィルス粒子を提供する。ターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチドによる特異的なターゲティングを可能にする任意のウィルス表面蛋白質の任意の領域に位置させることが出来る。一具体例では、ターゲティングペプチドはウィルス表面蛋白質の二つの連続するアミノ酸残基の間に置かれる。或いは、ウィルス表面蛋白質のアミノ酸残基が除去され、ターゲティングペプチドにとって代わられる。
【００８０】
一つの態様では、レトロウィルスエンベロープの受容体結合領域はターゲティングペプチドを含むように修飾される。例えば、ターゲティングペプチドは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９８／４４９３８に記載されているようなエコトロピック又は同種指向性（ecotropic）レトロウィルスエンベロープのアミノ酸残基６及び７、又はアミノ酸残基１８及び１９の間に挿入される。受容体結合領域の修飾の代わり、又は、修飾された受容体結合領域に加えて、レトロウィルス粒子は、例えば、分泌シグナル又は「リーダー」シグナル、ヒンジ領域、又はボディ部分のような、ターゲティングペプチドをエンベロープの他の領域が有するように、エンベロープ蛋白質の他の領域が修飾されていても良い。このような修飾には、受容体結合領域以外の領域からのアミノ酸残基が除去されてターゲティングペプチドと置換されるか、又は、ターゲティングペプチドがウィルスエンベロープの受容体結合領域以外の領域の連続する番号のアミノ酸残基の間に位置しているような、レトロウィルスエンベロープのアミノ酸残基の欠失又は置換が含まれる。
【００８１】
もう一つの別の態様では、レトロウィルスエンベロープが細胞外マトリックス成分に結合するターゲティングペプチドを含むように修飾される前に、異なる指向性を有する領域を有するエンベロープとすることが出来る。例えば、レトロウィルスエンベロープは、同種指向性部分及び両種指向性及び／又は異種指向性を有するｇｐ７０蛋白質を含むモロニーマウス白血病ウィルスエンベロープであり得る。
【００８２】
別の態様では、レトロウィルスベクター粒子は、第一のレトロウィルスエンベロープ及び第二のレトロウィルスエンベロープを含む。第一のレトロウィルスエンベロープ及び第二のレトロウィルスエンベロープの夫々は、表面蛋白質を含む。該表面蛋白質は(i) 受容体結合領域；(ii)超可変ポリプロリン、又は「ヒンジ領域」；及び(iii)ボディ部分を含む。受容体結合領域、超可変ポリプロリン、及び、ボディ部分は、一般的には非レトロウィルスペプチドを有していない、第一のレトロウィルスエンベロープでは保存される。第二のレトロウィルスエンベロープにおいて、細胞外マトリックス成分に結合する結合領域を含むターゲティングペプチドが、上記の様に、表面蛋白質の２つの連続するアミノ酸残基の間に挿入される。
【００８３】
第一のレトロウィルスエンベロープは、両種指向性（amphotropic）、同種指向性（ecotropic）、又は異種指向性（zenotropic）であり得る。又は、  第一のレトロウィルスエンベロープは異なる指向性領域を有するものであり得る。例えば、一具体例では、第一のレトロウィルスエンベロープは、(i)同種指向性受容体結合領域；(ii)
両種指向性腸可変ポリプロリン領域；及び同種指向性ボディ部分を表面蛋白質を含むものであり得る。第ニのレトロウィルスエンベロープは、上記のような、両種指向性エンベロープ、同種指向性エンベロープ、又は異種指向性エンベロープ、又は、異なる指向性を有するエンベロープであり得る。
【００８４】
結合領域に加えて、ターゲティングペプチドは更に、一つ又はそれ以上のアミノ酸残基から成るリンカーを結合領域のＮ末端及び／又はＣ末端に有していても良く、それによってこのようなリンカーが修飾エンベロープポリペプチドの回転自由度（rotational flexibility）及び／又は立体障害（steric hindrance）に影響を与える。好ましくは、リンカーは回転自由度を増加し、及び／又は立体障害を最小化する。
【００８５】
この第三の具体例の一態様において、ベクターを内皮細胞にターゲットする為の修飾ウィルス表面蛋白質をコードする修飾ポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドには、内皮細胞に結合するヶ手烏合領域を含むターゲティングペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。ベクター及び修飾ウィルス表面蛋白質は当該技術分野において周知のもの及び本明細書に記載の中から選択することができる。ポリヌクレオチドは、当業者に周知の従来技術、本明細書に記載の技術、及びＷＯ９８／４４９３８，ＷＯ０１／４４４５８及び米国特許出願６０／３５３１７７（組換えウシ免疫不全ウィルスに基づく遺伝子移入システム）に記載の技術により調製することが出来る。例えば、未修飾エンベロープをコードするポリヌクレオチドを含む第一の発現プラスミドを構築する。このプラスミドを次に、ターゲティングペプチドをコードするポリヌクレオチドが未修飾エンベロープの連続するアミノ酸残基をコードする二つのコドンの間に挿入されるように改変するか、又は、が未修飾エンベロープの一部をコードするポリヌクレオチドを除去するように改変し、それによって、このような部分がターゲティングペプチドをコードするポリヌクレオチドと置換されるように改変する。ターゲティングペプチドをコードするポリヌクレオチドは第二の発現プラスミドに含まれるか、又は裸のポリヌクレオチドとして存在しても良い。ターゲティングペプチドをコードするポリヌクレオチド又はこのようなポリヌクレオチドを含むプラスミドを適当な制限酵素で切断し、同様に制限酵素部位で切断された第一の発現プラスミド内にクローニングする。その結果得られた発現プラスミドは修飾エンベロープ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは該発現ベクターからクローンアウトされ、レトロウィルスベクター内にクローニングされる。その結果得られるレトロウィルスベクターには修飾エンベロープ蛋白質をコードするポリヌクレオチドが含まれ、更に、異種蛋白質又はペプチドをコ−ドするポリヌクレオチドが含まれていても良く、該レトロウィルスベクターは適当なパッケージングセルラインにトランスフェクトされ、修飾エンベロープ蛋白質を含むレトロウィルスベクター粒子を生成する産生細胞（プロデューサー細胞）を形成する。
【００８６】
或いは、修飾エンベロープ蛋白質をコードする裸のポリヌクレオチド配列を、gag及び pol 蛋白質をコードする核酸配列を含むプレパッケージングセルラインにトランスフェクトし、それによってパッケージングセルラインを形成し、又は、gag、
pol及び野生型（未修飾）env 蛋白質をコードする核酸配列を含むパッケージングセルラインにトランスフェクトし、それによって野生型env蛋白質及び修飾エンベロープ蛋白質をコードする核酸配列を含むパッケージングセルラインを形成する。このようなパッケージングセルラインに異種たんぱく質又はペプチドをコードする核酸配列含むレトロウィルスベクターをトランスフェクトして、修飾エンベロープ蛋白質を含むレトロウィルスベクター粒子を生成する産生細胞（プロデューサー細胞）を形成する。このようなポリヌクレオチドは上記レトロウィルスベクター粒子に含まれるか、又は、上記レトロウィルスベクター粒子を生成する産生細胞に含まれる。
【００８７】
本第三の具体例における更なる態様では、本発明による修飾エンベロープを有するベクター粒子は、所望の細胞において発現される異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。異種ポリペプチドは、一具体例において、治療剤である。「治療剤」という用語は一般的な意味で使用され、治療用剤、予防剤、及び交換剤（replacement agent）を含むものである。修飾エンベロープポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び治療剤は当業者に公知の遺伝子工学技術で適当なベクター内に置かれても良い。
【００８８】
本具体例は、細胞表面分子を発現する細胞にレトロウィルス粒子をターゲットする方法であって、該細胞表面分子を発現する細胞をターゲットする適したターゲティングペプチドを含むように修飾されたウィルス表面蛋白質を有するレトロウィルス粒子を接触させるステップ、及び、該粒子を該細胞と接触させるステップを含む前記方法を提供する。
【００８９】
本具体例は更に、細胞表面分子を発現する細胞にレトロウィルス粒子を選択的に運搬する方法であって、レトロウィルスベクターを有するレトロウィルス粒子を該細胞表面分子を発現する細胞をターゲットするに適したターゲティングペプチドを含むように修飾されたウィルス表面蛋白質と接触させるステップ、及び、該細胞をレトロウィルス粒子と接触させるステップを含む前記方法を提供する。
【００９０】
更に、本具体例は、細胞表面分子を発現する細胞に異種遺伝子を選択的に運搬する方法であって、異種遺伝子を有するレトロウィルス粒子を該細胞表面分子を発現する細胞をターゲットするに適したターゲティングペプチドを含むように修飾されたウィルス表面蛋白質と接触させるステップ、及び、該細胞をレトロウィルス粒子と接触させるステップを含む前記方法を提供する。
【００９１】
従って、本具体例における複合体はインビボで宿主に投与される。宿主は、哺乳動物、霊長類及びヒトを含む動物宿主である。従って、該複合体は、ヒトを含む哺動物の疾患を治療するための医薬、及び、医薬の製造用として有用である。
【００９２】
第四の具体例において、ターゲティングペプチドは、成長因子及びサイトカイン（ＷＯ００／０６１９５；Curnis
他、2002）のような治療用蛋白質又はペプチド内に取り込まれる。これらの融合蛋白質は内皮細胞に結合することが出来る。「融合蛋白質」は二つ又はそれ以上の異なる蛋白質、又は、同じ蛋白質由来で通常は連続していない二つ又はそれ以上の領域に由来するアミノ酸配列の部分を含むポリペプチドである。断片は、成長因子のような蛋白質の部分であって、成長因子活性を示すものを意味し、即ち、該成長因子断片は完全長の成長因子と実質的に同じ生物学的活性を保持している。更に、断片は、天然蛋白質と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を有することが出来る。「実質的に同一」とは、アミノ酸配列が、完全ではないが、ほぼ同じであり、関連する配列の機能活性を保持していることを意味する。一般的には、少なくとも８５％同一、又は、配列中に保存変異があれば、二つのアミノ酸配列は実質的に同一、又は実質的に「ホモロガス」である。ＢＬＡＳＴプログラム（Altshul他1990）のようなコンピュータープログラムを用いて、配列の同一性を比較し、ＡＬＯＭ（Klein他、1985）を用いて末端及び膜貫通領域の可能性のあるアミノ酸配列を分析することが出来る。
【００９３】
本明細書において、「成長因子（growth
factor）」は細胞間でシグナルを伝達する任意のぺプチドを意味する。従って、「成長因子」という用語は、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子及びケモカインを含む。成長因子の例には、以下のものに限定されないが、アンジオポエチン‐１、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、インターロイキン‐８、成長ホルモン、アンジオポエチン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、酸性及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦｓ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、ＣＹＲ６１及び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がある。更に、追加の成長因子に関しては、McKay
及びLeigh (1993) を参照されたい。
【００９４】
第四の具体例の更に別の態様において、本発明は、成長因子又はその機能的断片に結合されたターゲティングペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。「単離された核酸配列」は、それが由来する生体の天然のゲノムにおいて直接に連続（隣接）する（５‘末端及び３’末端）双方の配列とは直接に隣接していないポリヌクレオチドを意味する。従って、この用語は、例えば、(a)(i)ベクター、(ii)自律的複製プラスミド又はウィルス、(iii)真核又は原核細胞のゲノムＤＮＡ内に取り込まれているか、又は、(b)
他の配列とは独立して分離した分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する、組換えＤＮＡを意味する。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又はこれらヌクレオチドの修飾形態であり得る。
【００９５】
成長因子又はその機能的断片に結合されたターゲティングペプチドをコードする単離された核酸配列は発現調節配列に機能的に結合されている。「機能的に結合される」とは、これらの成分がそれらの意図する様式で機能することが可能な関係にあるようなジャクスタポジション（並列）を意味する。コード配列に機能的に結合した発現調節配列は、コード配列の発現が発現調節配列と適合する条件下で達成されるように結合される。本明細書において、「発現調節配列」とは、それが機能的に結合している核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。発現調節配列が核酸配列の転写、及び、適当な場合には、翻訳を調節及び制御するときに、該発現調節配列は機能的に核酸配列に結合している。従って、発現調節配列は、適当なプロモーター、エンハンサー、転写終結因子、蛋白質コーディング遺伝子の前の開始コドン（即ち、ＡＴＧ）、イントロンののスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適当な翻訳を可能にする該遺伝子の正しい読み取りフレームの維持、及び停止コドンを含むものである。「調節配列」という用語は、最低でも、その存在が発現に影響を与える成分を意味し、更に、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列のような、それが存在すると有益であるような追加成分を含むことが出来る。発現調節配列は当業者に周知であり、任意の適当な配列を使用することが出来る。
【００９６】
本具体例の更なる態様において、本発明は、本具体例の融合ポリペプチドをコードする核酸配列が挿入されているベクターが提供される。ベクターには、クローニングベクター、ヘルパーベクター、発現ベクター及び当業者に周知の他のベクターが含まれる。「発現ベクター」という用語は、本発明の融合ペプチドをコードする核酸配列が挿入又は取り込まれている、当該技術分野で公知のベクターを意味する。
このようなベクターは当業者に周知である。該ベクターを含む形質転換細胞も本具体例で提供される。適当な細胞には原核細胞又は真核細胞があり、これらは全て当該技術分野で周知である。最後に、本具体例は、当該技術分野で周知の技術に従い、形質転換細胞内で、融合蛋白質をコードする核酸を発現するおとにより、該融合蛋白質を生産することを提供する。該融合蛋白質は従来技術により単離・精製される。
【００９７】
融合蛋白質の医薬組成物は従来法で調製される。該融合蛋白質の医薬組成物は当該技術分野で周知の方法に従い投与される。或いは、該融合蛋白質をコードする核酸が当該技術分野で周知の方法に従い投与される。
【００９８】
本発明の第五の具体例において、ペプチドが二重機能的ペプチド、例えば、本発明ペプチドをターゲティングドメインとして（第一機能ペプチド）、及びプロアポチックドメイン（Ellerby他、1999; Arap 他、2002）、毒性ドメイン（リシンのような）等のような治療的機能ドメイン（第二機能ペプチド）のペプチドを含む二重機能性ペプチドを提供する。以下の記載において、抗血管由来（antiangiogenic）ペプチドが第二機能ペプチドとして使用される。しかしながら、本具体例は、第二機能ペプチドとして抗血管由来ペプチドに限定されるものではないことを理解されたい。
【００９９】
所望ならば、追加成分を二重機能ペプチドの一部として含有させることが出来る。例えば、幾つかの場合には、ターゲティングペプチド及び抗血管由来ペプチドの間にオリゴヌクレオチドスペーサーを使用し、例えば、二重機能性ペプチドに柔軟性を付与することが出来る。このようなスペーサーは当該技術分野で周知であり、例えば、Fitzpatrick及び
Garnett（1995）に記載され、例えば、グリシングリシンリンカー、アラニンアラニンリンカー又はグリシン、アラニン又は他のアミノ酸を含むほかのリンカーがある。
【０１００】
第五の具体例である二重機能性ペプチドは、固相ペプチド合成を用いて必要な量を容易に合成することが出来る。或るいは、二つのペプチド及び任意の追加成分から融合蛋白質は上記方法によって容易に調製することが出来る。更に、二つのペプチドは別個に合成され、及／び又は単離され、そして一緒に結合しても良い。第二の機能性ペプチドをターゲティングペプチドに結合させることが出来る幾つかの方法が当該技術分野で周知であり、該ペプチドの特定の化学的性質に応じて使用することが出来る。例えば、ハプテンをキャリヤ蛋白質に結合するために通常応用免疫学の分野で使用される方法（例えば、Harlow 及びLane, 1988; Hermanson,1996を参照）。
【０１０１】
予め作成された第二の機能性ペプチド（例えば、抗血管由来ペプチド）は、例えば、カルボジイミド結合体を用いて、ターゲティングペプチドに結合させることも可能である（Bauminger及び Wilchek, 1980）。カルボジイミドは一般式：RN=C=NR’(R及びR’は脂肪族又は芳香族)を有する化合物の一群であり、ペプチド結合の合成に使用される。代表的な操作は単純であり、比較的早く、温和な条件下で実施することが出来る。カルボジイミド化合物はカルボキシル基を攻撃し、それを遊離アミン基に対して反応性の部位に変化させる。カルボジイミド結合体は抗体保護用のキャリヤに様々な化合物を結合するのに使用されてきた。
【０１０２】
水溶性カルボジイミドである、１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）は抗血管由来ペプチドをターゲティングペプチドに結合させるのに使用することが出来る。このような結合にはアミノ基が存在することが必要であり、アミノ基は、例えば、抗血管由来ペプチドによって得提供され、更に、カルボシル基が存在することが必要であり、アミノ基は、例えば、ターゲティングペプチドによって提供される。
【０１０３】
ペプチド結合の直接の形成にカルボジイミドを使用するに加えて、EDCはN-ヒドロオキシサクシンイイミド（NHS）エステルのようなか活性エステルを調製するのにも使用することが出来る。NHSエステルはアミノ基のみに結合し、したがって、他の第二機能性ペプチドの単一のアミノ基とのアミド結合の形成を導入するのに使用することが出来る。EDC及びNHSは通常組み合わせて結合のために使用され、結合体の収率を増加させる（Bauminger及び
Wilchek, 1980）。
【０１０４】
抗血管由来ペプチドをターゲティングペプチドに結合させる為に他の方法を使用することも可能である。例えば、適当な反応体の過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化及び還元的アルキル化、並びにグルタルアルデヒド架橋を使用する音画でいる。しかしながら、本具体例の二重機能性ペプチドの製造にどの方法を用いるかに拘らず、ターゲティング分子がそのターゲティング能力を維持していること、及び第二機能性ペプチドがその機能を維持していることを確認しなければならないことは理解されなければならない。当該技術分野で公知の方法を用いて二重機能ペプチドの活性を確認することが出来る。
【０１０５】
二重機能性ペプチドの医薬組成物は従来方法で調製することが出来る。医薬組成物又は二重機能性ペプチドは当該技術分野で公知の操作で投与することが出来る。
【０１０６】
第六の具体例として、ターゲティングペプチドが、治療剤又は検出剤のような小分子に結合する。検出剤は放射腺核種又はイメージング剤（Wolfe他、2002）であり、それらによって検出又は視覚化が可能となる。検出剤の型は応用（適用）に応じて選択される。治療剤は、本発明のターゲティングペプチドに結合したときに内皮細胞においてその昨日を発揮するような、細胞毒性剤（例えば、ドキソルビシン、Arapほか、1998;
米国特許第6,316.024参照）、アンピシリンのような抗生物質、リバビリンのような抗ウィルス剤、アンチセンス核酸分子、又は、プロテアーゼインヒビターのような薬（ドラッグ）である、任意の生物学的に有効な剤である。例えば、ドキソルビシンのような薬をターゲティングペプチドにＥＤＣ及びＮＨＳを用いて結合させる（Bauminger
及びWilcheck, 1980; Arap他、1998）。結合体は従来技術を用いて単離・精製される。ターゲティングペプチド‐小分子結合体の医薬組成物は従来技術で調製される。医薬組成物又は結合体は当該技術分野で周知のプロセスに従い投与される。
【０１０７】
第七の具体例において、ペプチドはリポソーム表面に結合し、リポソーム（Jaafari 及びFoldvari, 2002; Lestini他、2002）、ポリリジン（Nah他、2002）、又は他のポリカチオン結合体及び合成分子にターゲットする。例えば、de
Haan 他、(1996); Gorlach (1996); Benameur 他（1995）; Bonanomi他(1987); 及びZekorn他（1995）参照。以下の記載において、リポソームは例示的にのみ使用される。この具体例はリポソームに限定されるものではないことを理解されたい。
【０１０８】
本発明組成物での使用に適したリポソームには、主にベシクル形成脂質から成るものがある。このようなベシクル形成脂質は、リン脂質のように水中で自発的に二重層ベシクルを形成し得るもの、又は、その疎水性部分が脂質二重層膜の内部の疎水性領域と接触し、そして、その頭部基は膜の外部の極性表面方向に配向して該二重層膜内に安定的に取り込まれるものが含まれる。適当なリポソームは米国特許第6,316,024号に記載されている。
【０１０９】
リポソームは、Szoka, F., Jr. (1980) に記載のような様々な技術で調製することが出来る。調製されたリポソームの具体例は以下に記載される。典型的には、リポソームは多層ベシクル（MLVs）であり、それは単純な脂質フィルム水和技術によって形成することが出来る。この操作において、適当な有機溶媒中に溶解した上記の典型的なリポソーム形成脂質の混合物が容器中で蒸発されて薄層フィルムが形成され、これは水性媒体で覆われる。脂質フィルムは水和してMLVsを形成し、その大きさは典型的には約０．１から１０ミクロンである。
【０１１０】
一態様では、予形成されたリポソームは、リポソーム表面上に親水性ポリマー鎖から成る表面被膜（コーティング）が形成されるように親水性ポリマーで誘導されたシクル形成脂質が含まれる。このような被膜は好ましくは、例えば、ベシクル形成脂質のような残りのリポソーム形成成分に１〜２０モル％の誘導脂質を含ませることによって調製される。誘導脂質及びポリマー被覆リポソームの調製法の例は米国特許第5,013,556; 5,631,018;
5,395,619号に記載あれており、これらは引用文献として本明細書に取り込まれる。親水性ポリマーは安定的に脂質に結合し、又は、ポリマー鎖の不安定なリンケージを介して結合し、それによって、血流中で循環しているとき又は刺激に応答する際に、被覆リポソームがポリマー鎖を捨てることが可能となることが理解されよう。
【０１１１】
選択した治療又は診断剤を標準的な方法によってリポソーム内に取り込むことが出来る。該方法には、(i) 脂質フィルムを該剤の水溶性液体で水和することによる水溶性化合物の受動的捕捉（passive entrapment）、(ii)該剤を含む脂質フィルムを水和することによる新油性化合物の受動的捕捉、及び、(iii)
イオン化薬剤を内部／外部リポソームｐH勾配にかけること、がある。逆蒸発相リポソーム調製のようなほかの方法も適当である。治療又は診断剤、核酸のような従来からリポソームに含有されていた任意剤であり得る。例えば、米国特許第6,316,024号を参照されたい。
【０１１２】
ターゲティング結合体は(i) 極性頭部基及び疎水性尾（テイル）を有する脂質、例えば、上記した任意のベシクル形成脂質が適当である；(ii)該ベシクル形成脂質の頭部に結合した親水性ポリマー；及び(iii)
該ポリマーに結合したターゲティングペプチドから構成される。例えば、米国特許第6,316,024号を参照されたし。ターゲティングペプチドはベシクル形成脂質に末端で付着している親水性ポリマー鎖の自由先端末端に共有結合で付着される。選択した親水性ポリマーを選択した脂質に結合させ、未結合の自由なポリマー末端を選択したリガンドとの反応の為に活性化する技術には様々なものがあり、特に親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は広範囲に使用されている（Allen 他、1995; Zalipsky 1993; 
Zalipsky 他、1994; Zalipsky 他、1995; Zalipsky 1995）。
【０１１３】
一般的には、ＰＥＧ鎖は、例えば、ターゲティングペプチドに存在するスルフヒドリル及びアミノ基のような基と反応させるために適した反応性基を含むように機能化されている。このようなＰＥＧ末端反応性基にはマレイミド（一級アミン反応性）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（スルフヒドリル基と優先的に反応性）、及びジチオピリジン（チオール反応性）がある。このような基によるＰＥＧ活性化のための合成反応スキームは米国特許第5,631,018; 5,527,528 及び5,395,619号に記載されている。
【０１１４】
標的化されたリポソームの医薬組成物は従来法で調製することが出来る。医薬組成物又は標的化されたリポソームは当該技術分野で周知の操作に従い投与される。
【０１１５】
本発明のペプチドは、癌、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リューマチ、乾癬、血小板破壊、再狭窄、虚血性血管障害、創傷治癒、鬱血性心不全、心筋虚血、再灌流傷害、末梢動脈疾患、肥満、並びに、虚血性心臓病、末梢四肢疾患、静脈移植狭窄、及び再狭窄のような心疾患等の、内皮細胞に関連する疾患、病気又は状態の治療を提供することが出来る。即ち、遺伝子、蛋白質、薬剤、放射性核種、及び他の治療又は検出剤を、上記の疾患、病気又は状態に罹患した患者の内皮細胞に指向させることが出来る。
【０１１６】
例えば、内皮細胞障害に対する慢性応答には、内膜過形成及び動脈硬化があり、これらは環状動脈バイパス移植が長期に亘って成功することを制限する（Asimakopoulos Taylor, 1998）。環状動脈バイパス移植に伴う外科的外傷により誘発されるインテグリンの発現は、好中球及び単球の補充により特徴付けられる炎症と関連がある（Takala
他、1996）。循環する好中球の移動がaｖb３インテグリンの内皮細胞発現により指示されること、及び、この指示される移動はaｖb３インテグリン相互作用をＲＧＤ含有ペプチドで中和することにより、排除できることが示された（Rainger 他、1999）。aｖインテグリンの発現の増加が単離されたヒト伏在静脈セグメント（Meng 他、1999）及びウサギ静脈で観察され、ＲＧＤ含有ペプチドでインテグリン相互作用を阻害することを目指す戦略により、新生内膜形成を減少させた（Racanelli
他、2000）。従って、炎症（Wickham 他、1997）及び血管外傷の間に上調節される血管受容体により特異的に認識される分子リガンドを遺伝子的に取り込むことにより、ウィルスベクター粒子を再ターゲティングすることは、治療用移入遺伝子のアデノウィルス媒介運搬の為の顕著な効果を示すことが出来る戦略であり得る。本明細書に記載のように、本発明のターゲティングペプチドをファイバーＨＩループ内に挿入することにより、遺伝子移入及びヒト臍静脈内皮細胞における発現が増大される。
【０１１７】
バイパス移植操作の前に、アデノウィルスをエキソビボで静脈に形質導入することによって、全血管の腔内及び外部該膜層の双方へ最大に露出することを達成する明確な効果が得られる。更に、ウィルス溶液は移植前に除去でき、これによって、全身循環に放出されるアデノウィルス粒子によって引き起こされる望ましくない免疫学的応答を阻止することが可能である。ブタ頚静脈の遺伝子移入（Kibbe 他、1999）及び、酸化窒素シンターゼ（Cable 他、1999）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−１の組織由来阻害剤（George他、1998）を有するアデノウィルスベクターで形質導入されたヒト伏在静脈により、エキソビボ形質導入の実行可能性及び治療用移入遺伝子のアデノウィルス媒介運搬の臨床的応用可能性が確立した。最近のランダム化単一センター臨床試験によって、遺伝子治療によりヒトバイパス静脈移植の失敗率を低下させる能力が示された（Mann
他、1999）。細胞結合及び内部化を担うウィルス成分（フィバー及び／又はペントンベース）の遺伝子工学操作のような、エキソビボのアデノウィルスベクター運搬を最大限にする実験戦略により、遺伝子移入及びこれらベクターの治療効果の効率が改善される。
【０１１８】
本発明の各具体例に対して、一つ又はそれ以上のペプチドを使用して内皮細胞へのターゲティングを増強させることが可能である。更に、本発明のペプチドは、内皮細胞に結合する又は結合しない他のターゲティングペプチドと組み合わせて使用することも出来る。
【０１１９】
上記のように、本発明のターゲティングペプチドはインビトロ診断イメージ研究の実施が出来るように対象の外側の検出可能な部位に結合するか、又は、腫瘍に放射活性を運搬することが出来る部位に結合することが出来る。腫瘍のイメージを提供することが目的である場合には、常磁性、放射活性又は蛍光発生剤のようなイメージングにおいて検出可能な診断用薬剤を使用することを望むであろう。多くの診断用薬剤が、それらのペプチドへの結合方法、及び、イメージング目的で有用であることが、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第5,021,236及び4,472,509号を参照されたい。これらはいずれも、本明細書中に参考として取り込まれる）。常磁性イオンの例として、クロム（ＩＩＩ），マンガン（ＩＩ），鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ），イットリウム（ＩＩＩ），ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム（ＩＩＩ）、が挙げられ、特に、ガドリニウムが好適である。Ｘ線イメージングのような他の点で有用なイオンの例には、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、及び特にビスマス（ＩＩＩ）がある。更に、治療及び／又は診断目的で適当にされる放射線同位体には、１３１ヨウ素、、１２３ヨウ素、、９９ｍテクネシウム、１１１インジウム、、１８８レニウム、１８６レニウム、６７ガリウム、６７銅、９０イットリウム、１２５ヨウ素、又は、２１１アスタチンがある。１８ホウ素のような、短時間ポジトロン発光トモグラフ（ＰＥＴ）放射性同位体も腫瘍診断で使用可能なペプチドの標識に使用することが可能である（Okarvi,
2001）。
【０１２０】
腫瘍の治療が目的である場合には、腫瘍を放射線照射する放射性核種を使用することを望むであろう。適当な放射性核種には、１３１ヨウ素、、１２３ヨウ素、、９９ｍテクネシウム、１１１インジウム、、１８８レニウム、１８６レニウム、６７ガリウム、６７銅、９０イットリウム、１０５ロジウム、８９ストロンチウム、１５３サマリウム、２１１アスタチン、２１２ビスマス、２１３ビスマス、１７７ルテチウム、６７銅、４７スカンジウム、１０９パラジウムがある。最適には、放射性核種は、（ａ）その崩壊モード及び放射エネルギーが運搬部位に適合するか；（ｂ）それらの半減期及び化学的特性が生物学的プロセスと相補的であること；及び（ｃ）製造方法が必要なレベルの特異的活性及び放射性核種純度を有する放射性核種を生み出すこと、等の物理的及び化学的特性に基づき具体的な目的の為に選択される。
【０１２１】
ペプチド内に放射金属を取り込む為には、一般的には、特定の金属に特異的なキレート、及び、該キレートをターゲティングペプチドに共有結合させるためのリンカー基を使用する、即ち、二重機能性キレート方法を用いる。有用なキレートの設計は具体的な放射性金属の配位要求（条件）に基づく。動力学的ＴＥＴＡ，ＮＯＴＡに関するＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、Ｐ２Ｓ２−ＣＯＯＨ  ＢＦＣＡ要求が共通する例である。ペプチドの或る部分との共有結合用の機能化アームを有する多座配位子キレートリガンドを使用することによって、金属複合体の動力学的安定性に対する要求はしばしば達成される。放射性核種を蛋白質にキレートする技術は当該技術分野で周知である（WO91/01144を参照）。
【０１２２】
本発明の化合物を活性成分として含有する医薬組成物は従来の医薬化合物製造技術に従い調製すること画でＫリウ。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack
Publishing Co., Easton, PA)を参照されたし。典型的には、活性成分のアンタゴニー量を薬学的に許容されるキャリヤと予混合する。キャリヤは、経静脈、経口、非経口又は髄腔内のような投与に望まれる調製の形態に応じて広範囲な形態をすることが出来る。運搬方法の例として、参照として本明細書中に取り込まれる米国特許第5,844,077号を参照されたし。
【０１２３】
「医薬組成物」とは、薬剤投与に適した物理的には別個の凝集した（集合した）部分を意味する。「投与単位形態の医薬組成物」は、薬剤投与に適した物理的には別個の凝集した（集合した）単位であって、夫々が、活性成分を一日分の投与量、又は、一日分の投与量の数倍（４倍まで）又は分割分（４０分の一まで）をキャリヤと共に含むか、及び／又はエンベロープ内に含むものを意味する。組成物が一日分、一日の半分、３分の一、又は４分の一の投与量を含むかは、例えば、医薬組成物が、夫々、一日に１回、２回、３回、及び４回投与されるかに依る。
【０１２４】
「塩」という用語は、本明細書において、無機又は有機の酸及び／又は塩基と形成される酸性及び／又は塩基性の塩、好ましくは塩基性の塩を意味する。特に、本発明の化合物を薬剤として使用するときには、薬学的に許容される（許容可能な）塩が好ましいが、、例えば、これら化合物を加工するとき、又は、非薬剤型の使用を意図するときには、他の塩も有用である。これら化合物の塩は当業者に公知の技術で調製される。
【０１２５】
このような薬学的に許容される塩の例として、これらに限定されないが、塩化水素、硫酸塩、硝酸塩、又はリン酸塩及び酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、イソチオン酸塩、テオフィリン酢酸塩、サリチル酸塩、等を上げることが出来る。低級アルキル四級アンモニウム塩等も同様に適当である。
【０１２６】
本明細書において、「薬学的に許容される（許容可能な）」キャリヤ、という用語は、非毒性、不活性固体、半固体液体である、充填剤、希釈剤、封入剤、任意の型の形成補助剤、又は、生理的食塩水のような単なる滅菌水性媒体を意味する。薬学的に許容される（許容可能な）」キャリヤとして使用できる物質の幾つかの例としては、ラクトース、グルコース及びシュクロースのような糖、コーンスターチ及びポテトスターチのような澱粉、セルロース及びカルボキシメチルセルロースのようなその誘導体、エチルセルロース及びセルローセアセテート、粉末化トラガカント、モルト、ゼラチン、タルク、ココアバター及び坐薬ワックスのような賦形剤、ピーナッツオイル、綿種油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、ダイズ油のような油、ｐロピレングリコールノヨウナグリコール、グリセリン、ソルビオトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールのようなポリオール、エチルオレート及びエチルラウレートのようなエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムのような緩衝剤、アルギン酸、パイロジェン非含有水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール及びリン酸緩衝液、並びに、薬剤調製で使用される他の非毒性適合物質を挙げることが出来る。
【０１２７】
湿潤剤、乳化剤、及び、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、並びに、着色剤、放出剤、被覆剤、甘味剤、香料剤、芳香剤、保存剤、抗酸化剤も、調剤する者の判断で組成物に配合することが出来る。薬学的に許容される抗酸化剤の例として、以下のものに限定されないが、アスコルビン酸、システイン塩酸、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の溶性抗酸化剤、アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ハイドロオキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ハイドロオキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、αトコフェノール等の油溶解性抗酸化剤、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が含まれる。
【０１２８】
経口投与用に、化合物は、カプセル、錠剤、タブレット、トロ−チ、溶解粉末、懸濁液、乳化液のような固形又は液体製剤に調剤される。経口投与用形態の組成物を調製するに際して、例えば、（例えば、懸濁液、エリキシル剤及び溶液のような）経口液体調剤の場合には、水、グリコール、油、アルコール、香料剤、保存剤、着色剤及び懸濁剤等のような通常の薬学的媒体；（例えば、粉末、カプセル、及びタブレットのような）経口固形調剤の場合には、澱粉、糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等の薬剤キャリヤを使用することが出来る。投与が簡便である為に、タブレット及びカプセルは最も便利な経口投与単位形態であり、その場合には明らかに固形薬剤キャリヤが使用される。所望に応じて、タブレットを糖で被覆し、又は、標準的技術により腸溶性被覆をすることが出来る。活性剤を封入して、胃腸菅を通過するのに安定であり、且つ、脳血管関門を通過できるようにすることが出来る。例えば、WO96/11698を参照されたし。
【０１２９】
非経口投与投与用には、化合物は薬学的キャリヤに溶液又は懸濁液として溶解されて投与される。適当なキャリヤの例としては、水、生理的食塩水、デキストロース溶液、フラクトース溶液エタノール、又は、動物油、植物又は合成油を挙げることが出来る。キャリヤは更に、例えば、保存剤、懸濁剤、可溶化剤、緩衝剤等の他の成分を含有することが出来る。化合物が髄腔内に投与されるときは、脳脊髄液に溶解させることも出来る。
【０１３０】
様々な投与経路を利用することが出来る。選択される特定のモードは、当然のことながら、選択されて特定の薬剤、治療対象患者の疾患の程度、及び治療効果に必要な薬剤の量に依る。一般的には、本発明の方法は、臨床的に共用できない副作用を生じることなく、活性成分の有効なレベルを生じるモードであれば、如何なる医薬的に許容される投与モードを用いて実施することができる。このような投与モードには、経口、経直腸、舌下、局所的、経鼻、経皮、又は非経口ルートが含まれる。「非経口」という用語には、皮下、静脈、硬膜外、洗浄、筋肉投与、放出ポンプ、または灌流が含まれる。
【０１３１】
活性剤は好適には治療上有効量で投与される。活性剤の「治療上有効量」、又は、単に、「有効量」とは、任意の医療処置に於いて適用される合理的な効果／危険率において、所望の状態に治療するに十分な量の化合物を意味する。投与される実際の量、速度、及び時間経過は、治療対象の性質及び程度に依る。適当な投与量は当業者により容易に決定することが出来る。治療処方箋、例えば、投与量の決定、時期、等は一般的な実務者又は専門家の責任下にあり、典型的には、処置する疾患、患者個人の状態、運搬部位、投与方法及び実務者に公知の他の因子が考慮される。技術及びプロトコールの例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences に記載されている。
【０１３２】
有利には、組成物は投与単位に調剤され、各単位は活性成分の固定された投与量を提供するように適合されている。タブレット、被覆タブレット、カプセル、アンプル、及び坐薬は本発明の投与形態の例である。
【０１３３】
活性成分は有効量を構成することのみが必要である。即ち、適当な有効量は一回又は複数回の単位投与に採用される投与形態に合致したものである。正確な個々の投与及び一日の投与量はヒト又は動物で使用する場合には、医者又は獣医の指示の下で標準的な医薬原理に従い決定される。
【０１３４】
医薬組成物は、全組成物に対して、約０．０００１〜９９重量％、好ましくは約０．００１〜５０重量％、より好ましくは約０．０１〜１０重量％の活性成分を含有する。活性成分に加えて、医薬組成物及び医薬は他の薬学的活性化合物を含有することが出来る。他の薬学的活性化合物の例として、以下に限定されるものではないが、鎮痛薬、サイトカイン及び臨床医学の主な分野の全ての治療薬剤が含まれる。他の薬学的活性化合物と一緒に使用されるときには、本発明の治療薬剤は、ドラッグカクテルの形態で運搬されても良い。カクテルは、本発明で有用ないずれかの化合物と他の薬又は剤との混合物である。本具体例では、共通の投与ビークル（たとえば、錠剤、タブレット、インプラント、ポンプ、注射用溶液、等）に即席の組成物が補助増強剤と組み合わされて含有される。カクテルの個々の薬剤は夫々、治療上有効な量で投与される。治療上有効量は上記パラメーターによって決められる。しかしながら、如何なる場合であっても、所望の効果を達成するに有効な期間薬剤が必要とされる体内の部位において、該薬剤のレベルが確立されるような量である。
【０１３５】
実施例
他に指示のない場合には、本発明は、当該技術分野に属する化学、分一生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及び遺伝子移入生物学の従来技術を用いて実施さあれる。以下の文献を参照のこと。Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Sambrook 及びRussell,
2001; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie Fink, 1991;
Harlow Lane, 1988; Jakoby 及びPastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B.D.
Hames eds. 1984); Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.,
1987); Immobilized Cell and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbel, A Practical
Guide To Molecular Cloning (1984); 専門書、Methods In Enzymology (Academic Press,
Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and
M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology,
Vols. 154 & 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods in Cell and
Moleculra Biology (Mayer Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook
Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. WeirC.C. Blackwell, eds., 1986);
Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific
Publications, Oxford, 1988; Hogan
et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring
Harbor, N.Y., 1986)
【実施例１】
【０１３６】
内皮細胞結合に特異的なペプチド
内皮細胞に特異的なペプチドの配列（配列（SEQUENCE）及び配列番号(SEQ ID NO:)）
【０１３７】
【表２】
2006510360.tif 000005
【実施例２】
【０１３８】
内皮細胞に特異的なアデノウィルスベクター粒子の構築
ＰＤ１ペプチド（配列番号１(SEQ ID NO:1)）を核局在化βガラクトシダーゼリポーター遺伝子を含むアデノウィルスのファイバーノブのＨＩループ内に遺伝学的に挿入することによって、アデノウィルスＡｖ３ｎＢｇＰＤ１を作製した。インビトロ形質導入実験を実施し、ＰＤ１標的化ウィルス粒子の初代ヒト内皮細胞及び３種類のヒト癌セルラインに対する結合特性を決定した。Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１アデノウィルス粒子は初代内皮細胞及び非小細胞癌セルラインであるＨ４６０細胞への形質導入を顕著に増強させた。これらのデータは、該ペプチドがアデノウィルスを血管内皮細胞及び幾つかの癌細胞にターゲッティングさせるのに有効であることを示唆するものである。
【０１３９】
アデノウィルス粒子の分子再ターゲティングによって、細胞膜上のウィルスリガンド−受容体相互作用の数、及び、標的細胞の細胞質内に移動するウィルス粒子の数が増大するものと仮定されている。アデノウィルスファイバーのカルボキシル末端及びファイバーノブに存在するＨＩループは、標的細胞によって発現される該細胞表面受容体に特異的に認識される短いペプチドモチーフを取り込むための部位を示すものである。ファイバーノブのＨＩループは、ファイバー機能を損なわずに、短い異種ターゲティングペプチドの挿入に有用であることが示されてきた（Krasnykh 他、1998）。
【０１４０】
本実施例では、アミノ酸（ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）を含む９つのアミノ酸ペプチドが遺伝学的にファイバーＨＩループに取り込まれる。このペプチド（配列番号１）は「ＰＤ１」と称される。「Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１」と呼ばれるアデノウィルスベクターが作製され、これはリポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有し、ＰＤ１ペプチドをファイバーノブ内に有し、Ｅ１及びＥ２領域が欠けた遺伝子を有する（Gorziglia 他1996）。標的化アデノウィルスベクター粒子は初代内皮細胞及び数種のヒト癌セルラインへの形質導入を増大（増強）させる能力について分析される。
【０１４１】
細胞培養
Ｓ８細胞は、別個のデキサメタゾン誘導性プロモーター下でアデノウィルスＥ１及びＥ２ａ遺伝子でトランスフェクトしたＡ５４９細胞である（Gorziglia 他,1996）。Ｓ８細胞は１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩＦＢＳ）添加のＩＭＥＭ培地（Biofluids,
Rockville, MD）で培養された。ウィルス保護の為に、細胞は０．３ｕＭデキサメタゾンと共に培養され、Ｅ１及びＥ２ａ遺伝子の発現が誘導された。Ｈ４６０細胞は、ヒト非小細胞肺癌（ＡＴＣＣ,
Manassas, VA）であり、１０％ＨＩＦＢＳ添加のＲＰＭＩ培地１６４０（Life Technologies, Gaitherburg, MD）中で培養された。ＰＣ３細胞は、ヒト前立腺癌セルライン（ＡＴＣＣ）であり、１０％ＨＩＦＢＳ添加のＲＰＭＩ培地１６４０中で培養された。ＨｅＬａ細胞は、ヒト子宮ガンセルライン（ＡＴＣＣ）であり、１０％ＨＩＦＢＳ添加のＤＭＥＭ培地中で培養された。初代内皮細胞、特に、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）はClonetics Corporation (Walkerville, MD: AC-7018)から入手した。これらの細胞は奨励される培地で培養した。
【０１４２】
組換えアデノウィルスを作製するツープラスミドシステム
核局在化βガラクトシダーゼ及びファイバーノブのＨＩループ内にＰＤ１ペプチドを含むアデノウィルスである、Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１をラピッドツープラスミドシステム（rapid two plasmid system）で作製した。簡潔に記載すると、ＨＩループ内に挿入されたＰＤ１ペプチドで修飾されたファイバー遺伝子を有するアデノウィルス血清型５ゲノムの２９Ｋｂ右腕部分を含むプラスミド、ｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１をＣｌａ１を用いて直線化した。第二のプラスミドである、ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇ、はＲＳＶでプロモートされる核局在化βガラクトシダーゼｃＤＮＡ及び相同組換えを可能にする重複配列を含むアデノウィルスゲノムの左末端をコードしている。ｐＡｄｍｉｒｅプラスミドをＰｃａＩ及びＳａｌＩで消化し、プラスミド中のＩＴＲ及びＥ．ｃｏｌｉ配列を放出させた。消化されたプラスミドをカチオン性脂質リポフェクタミンプラスシステム（Life Technologies, Gaitherburg, MD）を使用して誘導されたＳ８細胞内にコトランスフェクトした。トランスフェクトされたＳ８細胞はこの結果得られた組換えアデノウィルスの増殖を助けた。図１ＢはＡｖ３ｎＢｇＰＤ１アデノウィルスを作製するためのｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１プラスミドを示す。
【０１４３】
Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１の構築
ＰＤ１配列、ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）は、核局在化βガラクトシダーゼ遺伝子をコードするＥ１／Ｅ２ａ欠失アデノウィルスベクターにおいて、Ａｄ５ファイバーのＨＩループ内のＤ５４４及びＴ５４５の間に挿入された。挿入は、ＰＤ１ペプチドを含有するオリゴヌクレオチドと、リガンド挿入を可能にする為にＨＩループ内に作られたＢｃｌＩ及びＢｓｒＧ１部位用のオーバーハングをアニーリングすることにより行われた。該リゴヌクレオチドは以下のとおりである。
３４マー、５．０μｇ／μｌ
5’-
GATCAATGTCCTGACCTACACCACCACATGTGTT-3’ （配列番号３８）
３４マー、４．０μｇ／μｌ
5’-
GTACAACACATGTGGTGGTGTAGGTCAGGACATT-3’ （配列番号３９）
【０１４４】
各オリゴヌクレオチドは、５μｌオリゴ、１０μｌの５ｘフォワードバッファー（ＬＴＩ）、５μｌの１００ｍＭＡＴＰ，２μｌのキナーゼ（ＬＴＩ）及び３２．５μｌＨ２Ｏ（全量５０μｌ）を混合することによる個別の反応でリン酸化された。反応液は３７℃で一時間インキュベートした。リン酸化オリゴは５０μｌのキナーゼ反応物、９６μｌのＴＥｐＨ７．４、及び４μｌの５ＭＮａＣｌ（全量２００μｌ）を混合することにより、アニールした。アニール反応は３分間沸騰させ、次に室温まで徐々に冷却することによって実施した。ＤＮＡを沈殿させ、ｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＲＧＤのＢｃｌＩ及びＢｓｒＧ１部位に結合することによって、ｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＲＧＤ１（図１Ａ）を作製した。このプラスミドはファイバーのＨＩループのコード配列内に挿入されたＰＤ１コード配列を含み、ファイバー遺伝子のこの場所に他のペプチドリガンドをコードする配列を挿入できるようにＢｃｌＩ及びＢｓｒＧ１部位が隣接している。更に、Ａｄ５ファイバー遺伝子に加え、このプラスミドはＡｄ５ｄ１３２７ウィルスゲノムの右末端から約８０００ｂｐを含有している。ｐ５ＦｌｏｘＨＲＦＲＧＤ１から単離したＳｐｅＩ／ＰａｃＩ断片をｐＮＤＳＱ３．１に結合してプラスミドｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１を作製することによって、最終的にｐＮＤＳＱ３．１Ｐプラスミドを作製した。正しいｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１プラスミド（図１Ｂ）は制限酵素分析及び配列分析によって確認した。
【０１４５】
６穴組織培養プレートにウェル（穴）当り５ｘ１０５個のＳ８細胞を撒き（Gorziglia 他, 1996）、１０％のＨＩＦＢＳ及び０．３３μＭデキサメタゾン含有ＩＭＥＭ培地で約２４時間培養した後トランスフェクションした。ｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１プラスミドをＣｌａＩで消化し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出し、そして、ＤＮＡをエタノール及び３Ｍ酢酸ナトリウムで沈殿させた。ＤＮＡをペレット処理してｄＨ２Ｏ中で１μｇ／μｌの濃度で再懸濁した。ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇプラスミドも、ＰａｃＩ及びＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した以外は、同様に処理した。消化したｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇプラスミドをペレット処理してｄＨ２Ｏ中で０．５μｇ／μｌの濃度で再懸濁した。リポフェクタミンプラスカチオン性脂質システム（Life Technologies, Gaitherburg, MD）を使用して、これらのプラスミドを以下のように、デキサメタゾンで誘導されたＳ８細胞内にコトランスフェクトした。各二重の反応用に、１μｇのＣｌａＩ消化ｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１及び０．５μｇのＰａｃＩ／ＳａｌＩ消化ｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇを６μｌプラス反応液及び９２μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地に加えた。１００μｌプラス／ＤＮＡ溶液を室温で１５分間インキュベートした。別の試験管において、４μｌリポフェクタミン及び１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地を混合した。インキュベートの後に、ＤＮＡ混合物をリポフェクタミン溶液に添加して混合し、室温で更に約１５分間インキュベートした。Ｓ８細胞単層をｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地（Life Technologies, Gaitherburg, MD）で洗浄し吸引した。各ウェルに８００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地及び２００μｌのトランスフェクション複合体によりＤＮＡトランスフェクションを加えた。これらの反応物をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で３〜５時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を吸引し、各ウェルに０．３３μＭデキサメタゾン含有の増殖培地２ｍｌを添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２下で７日間、培養した。
【０１４６】
トランスフェクトされたＳ８細胞に、ウィルス産生の結果、細胞が丸くなりブドウ状クラスターになるような細胞変性効果（cytopathic effect：CPE）が出現するかどうかをモニターした。増幅は以下のとおり行った。セルリフターを用いて細胞をウェルから剥がし、細胞及び培地を１５ｍｌの三角フラスコに移した。細胞を攪拌し、凍結融解操作を３回繰り返し、各融解後には激しく渦巻くよう（vortexing）に攪拌した。細胞デブリスをペレット操作し、６ウェル組織培養プレートに撒かれた各ウェル当り５ｘ１０５個の誘導された単層Ｓ８細胞に６００μｌの粗ウィルス溶解物（Crude
Viral Lysate:ＣＶＬ）を適用した。ＣＶＬを３７℃インキュベーターで３時間ロックした。２ｍｌの増殖培地及びデキサメタゾンを各ウェルに添加し、プレートをを３７℃、ＣＯ２インキュベーター内に置いた。７日後に第２回目の増幅を行った。ＣＰＥが観察されたら、ウィルスを誘導されたＳ８細胞を含む１５枚の１５０ｃｍプレートにスケールアップした。Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１のウィルス調製物は標準的なＣｓＣｌ遠心により調製された。１ｍｌ当りのウィルス粒子数は顕微鏡により測定した（Mitterefer 他、１９９６)。
【０１４７】
インビトロ形質導入分析
Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１の形質導入効率は、初代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び、ＨｅＬａ，ＰＣ３及びＨ４６０細胞を含むヒト癌セルラインを用いて調査した。各細胞型は、キメラファイバー含有ウィルスであるＡｖ３ｎＢｇＰＤ１又は野生型ファイバーのコントロールウィルスであるＡｖ３ｎＢｇで形質導入した。ＨＵＶＥＣは細胞当り全粒子（ＰＰＣ）が０、１０、１００、及び１０００で形質導入し、３種のヒト癌セルラインは０，５０，１００及び１０００のＰＰＣで形質導入した。全ての細胞は２％ＨＩＦＢＳ含有培養培地（全容量２ｍｌ）中で３７℃で１時間形質導入し、１０％ＨＩＦＢＳ含有完全培地（１ｍｌ）を添加した。細胞を更に２４時間インキュベートしてアデノウィルス媒介でβ‐ガラクトシダーゼ発現をさせた。細胞単層をＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定し、約２４時間のＸ−ｇａｌ染色でインキュベートした。Ｘ−ｇａｌ染色は、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ-４−クロロ-３−インドリル-β-Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ、ＤＭＳＯ中の５０ｍｇ／ｍｌストック）、５ｍＭフェロシアナイドカリウム、５ｍＭフェリシアナイドカリウム、及び、２ｍＭＭｇＣｌ２から成る。形質導入の割合（％）は光学顕微鏡で、すでに記載したように区画当りの陽性形質導入青色細胞数を計数することにより測定した（Stevenson
他、1997）。
【０１４８】
結果及び検討
ＰＤ１ペプチド：ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）はファイバーノブのＨＩループにおける５４４及び５４５番目のアミノ酸の間に遺伝子学的に挿入されるように設計された。コトランスフェクションはｐＮＤＳＱ３．１ＰＤ１及びｐＡｄｍｉｒｅＲＳＶｎＢｇを用いて、各局在化したβ-ガラクトシダーゼｃＤＮＡ及びファイバーノブ中のＰＤ１ペプチドを含むＡｖ３ｎＢｇＰＤ１を作製して実施した。
【０１４９】
Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１の形質導入効率は、初代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及び、３種類の別のヒト癌セルラインを用いて調査した。ＰＤ１キメラファイバーを有するＡｖ３ｎＢｇＰＤ１とコントロールウィルスであるＡｖ３ｎＢｇを用いて細胞に形質導入した。上記操作に従い実施した実験例の結果は以下の表３に示す。
【０１５０】
【表３】
2006510360.tif 000006
【０１５１】
各細胞型は記載された投与量の各ベクター粒子で形質導入した。＃ＰＰＣ、細胞辺りの粒子数。データは、平均＋標準偏差（３回の代表的実験からの）を示す。＊非ペア、２テールのｔ−テストによるＡｖ３ｎＢｇコントロールからの有意な差（ｐ＜０．０００１）。アデノウィルス投与の関数としての形質導入％は初代ＨＵＶＥＣに対して示されている。どちらのベクターもヒトＥＣに投与量依存的に形質導入した。しかしながら、１０００ＰＰＣの投与量において、統計学的に有意な増加がＡｖ３ｎＢｇＰＤ１を使用した場合に観察された（Ａｖ３ｎＢｇで得られた２１．７％の陽性細胞に対して、４２．１％の陽性細胞が得られた）。ＰＤ１媒介形質導入はＨｅＬａ，ＰＣ３及びＨ４６０細胞を含むヒト癌セルラインを用いて評価された。ＨｅＬａ及びＰＣ３細胞は、両方のベクターによる形質導入に等しい感受性を示しＰＤ１は効果を与えないことが示された。それと比較して、Ａｖ３ｎＢｇＰＤ１は１０００ＰＰＣにおいてＨ４６０細胞に対してアデノウィルス遺伝子移入を有意に増強させた。
【０１５２】
本実施例で示されたように、ＰＤ１（配列番号１）は内皮細胞への形質導入を増強させた。本実施例はアデノウィルスベクター粒子へのＰＤ１ペプチド（配列番号１）の取り込み、及び、その結果、内皮細胞への形質導入％の増加を示す。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【実施例３】
【０１５３】
ターゲティングペプチドと結合したｓＣＡＲの調製
ｓＣＡＲのＣ末端にターゲティングペプチドをコードする発現プラスミドを構築するために、相補的なオリゴヌクレオチド対を合成し、アニールして、所望のターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ二重鎖を形成させた。該ＤＮＡ二重鎖はその両端にＮｏｔＩ適合性オーバーハングを含み、該断片をｐＣＩネオ-ｓＣＡＲｂ（ＷＯ０２／２９０７２）のＮｏｔＩ部位に挿入することが出来る。ペプチド：ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）をｓＣＡＲ末端に融合するか、又は、標的細胞に該ターゲティングペプチドを特異的に結合されることを可能にする位置に取り込ませる。ペプチド：ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）を生じるように合成されたオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。
5’-GGCCTGTCCTGATCTTCATCATCATATGTGTGC-3’
（配列番号４０）及び
5’-GGCCGCACACATATGATGATGAAGATCAGGACA-3’
（配列番号４１）
【０１５４】
三量体化ｓＣＡＲをコードするプラスミド及びＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）ターゲティングペプチドを含むｃＳＡＲの三量体化バージョンをコードするプラスミドをＷＯ０２／２９０７２に記載のように構築した。ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）に結合したｓＣＡＲはＷＯ０２／２９０７２に記載のように調製し精製した。アデノウィルスベクター粒子及びターゲティングペプチド結合ｓＣＡＲの複合体はＷＯ０２／２９０７２に記載のように調製した。複合体は内皮細胞に特異的に結合した。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【実施例４】
【０１５５】
ターゲティング修飾表面蛋白質を有するレトロウィルス粒子の調製
ターゲティングペプチド：ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）が取り込まれることにより修飾された修飾表面蛋白質を有するレトロウィルス粒子をＷＯ９８／４４９３８記載のように調製した。修飾表面蛋白質をコードする核酸を作成するのに、ターゲティングペプチドをコードするヌクレオチド配列：ＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴ（配列番号４２）を使用した。レトロウィルス粒子は内皮細胞に特異的に結合した。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【実施例５】
【０１５６】
成長因子−ターゲティングペプチド融合蛋白質の調製
血管内皮細胞成長因子及びＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）から成る融合蛋白質をコードする核酸及びこの核酸を含有する発現ベクターをＷＯ００／０６１９５に記載の方法で調製した。この融合蛋白質は該発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において発現し、従来技術を用いて単離された。該融合蛋白質は特異的に内皮細胞に結合した。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【実施例６】
【０１５７】
二重機能性ペプチドの調製
ターゲティングドメインとしてのＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）及びプロ−アポトーシスドメインとしてＤ（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ）（配列番号４３）を含む二重機能性ペプチドであって、プロ−アポトーシスドメインにおける全てのアミノ酸残基がＤエナンチオマーである、二重機能性ペプチドを調製した。二つドメインの間のグリシン−グリシン架橋を有する二重機能性ペプチドの合成は従来の固相技術を用いて実施された。この二重機能性ペプチドは内皮細胞に対する結合選択性を保持していた。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【実施例７】
【０１５８】
ターゲティングペプチド及び小分子の結合（Conjugation）
ドキソルビシン塩酸塩（１モル等量）をジイソプロピルアミン（２モル等量）含有ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に懸濁させた。Ｎ−ヒドロキシサクシニミジル−マレイミドプロピオネート（１モル等量）を添加し、２０分間インキュベートした。ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）を含有するチオール（ＤＭＦ中に可溶化したシステイン又はアミノ末端３−メルカプトプロピオン酸）を反応混合物に添加し、２０分間インキュベートした。ペプチド及び結合体に対する受容基準は、分子量及び質量分析器に対する断片パターンによれば、ＨＰＬＣ純度で＞９８％であった。
【０１５９】
別の方法では、ドキソルビシン塩酸塩をジイソプロピルアミン含有ＤＭＦに懸濁させた。ＤＭＦ中の溶解無水コハク酸（１モル等量）を加え、２０分間インキュベートした。得られたドキソルビシン  ヘミサクシネートをＤＭＦ中に溶解したベンゾトリアゾール−１−イル−オキソピロリジンホスホニウム（１．１モル等量）の添加で活性化した。活性化の５分後にターゲティングペプチドとしてのＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）を反応混合物に加え、更に２０分間放置してカップリングさせた。更なる操作及び結合体の純度の確認は上記のとおりに行った。ターゲティングペプチドに結合した小分子ドキソルビシンは選択的に内皮細胞に結合した。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【実施例８】
【０１６０】
標的化（ターゲット化）リポソームの調製
部分的水素化大豆ホスファチジルコリン（ＰＨＰＣ，ヨウ価：３５、Lipoid (Ludwigshafen, Germany)）、コレステロール（Croda(Fullerton, Calif.)）及びｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（Zalipsky,
1993に記載のように調製）を、丸底フレスコ内のクロロホルム及び／又はメタノール中で、モル比５５：４０：３で混合することによってリポソームを調製した。溶媒を回転エバポレーターで除去し、得られた乾燥脂質フィルムをリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ，１４０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７）又はＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７）で水和し、大きな多層ベシクルを製造した。得られたベシクルを、Counter
N4MD (Hialeah, Fla.) を用いる動的光散乱によりモニターして、平均直径分布が約１００ｎｍになるまで（米国特第6,316,024B1号）、圧力下に０．２、０．１及び０．０５ｍ孔径のポリカーオネート膜に繰り返し通した。
【０１６１】
ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）から成るターゲティング結合体を、Zalipsky他（1997）に記載に従い調製した。
【０１６２】
前調製したリポソームを２５℃又は３７℃で、１．２モル％のターゲティング結合体とインキュベートした。様々な経過時間において、ターゲティング結合体（ミセル）を挿入したターゲティング結合体（リポソーム）からサイズ排除クロマトグラフィにより分離した。シアリル−ルイスＸ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合体には、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、及び０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ６．５  で平衡化したバイオゲルＡ５０Ｍカラムを使用した。ＣＰＤＬＨＨＨＭＣ（配列番号１）−ＰＥＧ−ＤＳＰＥには、１０％シュクロース及び１０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０を溶出液として使用するセファロース４Ｂカラムを用いた。
【０１６３】
排除クロマトグラフィにより回収した分画（１ｍＬ）をメタノール中で希釈（１：１０）し、リガンド含量をＨＰＬＣ（Shimazu 及びRainin システム）で分析した。リポソーム内にターゲティングペプチドが取り込まれることによって、リポソームが選択的に内皮細胞に結合するようになる。本実施例は、配列番号１のペプチドを用いた本発明の一具体例を示すものであり、本発明の任意のターゲティングペプチド（配列番号２−３７及び４４；表２）も同様に使用することが出来ることを理解されたい。
【０１６４】
本発明の方法及び組成物には様々な具体例の形態がが含まれ、その中のほんの少しが本明細書に記載されていることを理解されたい。、他の具体例が存在し、本発明の思想から逸脱しないことは当業者には明白である。従って、ここに記載された具体例は例示であり、限定的なものと解釈してはならない。
【０１６５】
引用（参照）文献一覧表
【０１６６】
【表４】
2006510360.tif 000007
【０１６７】
【表５】
2006510360.tif 000008
【０１６８】
【表６】
2006510360.tif 000009
【０１６９】
【表７】
2006510360.tif 000010
【０１７０】
【表８】
2006510360.tif 000011
【０１７１】
【表９】
2006510360.tif 000012
【０１７２】
【表１０】
2006510360.tif 000013
【０１７３】
【表１１】
2006510360.tif 000014
【０１７４】
【表１２】
2006510360.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１Ａ】Av3nBgPD1を作製するのに使用するプラスミドを示す。p5FloxHRFPD1は、ファイバーＨＩループ内にＰＤ１ペプチドを含む修飾ファイバーのコード配列を有する。６ＫＢのSpeI/PacI断片を単離し、pNDSQ3.1内にクローニングし、pNDSQ3.1PD1を作製した。
【図１Ｂ】Av3nBgPD1を作製するのに使用するプラスミドを示す。pNDSQ3.1PD1は、アデノウィルス５ゲノムの右手部分を含む。コードされたファイバーはノブのＨＩループ内にＰＤ１ペプチドを含むように修飾されている。
【配列表】
2006510360.tif 000016
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2006510360.tif 000031
【国際調査報告】
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