(57)【要約】Ｓｔａｔ３依存性およびサイトカイン−感受性細胞増殖の調節法、ならびにＳｔａｔ３依存性およびサイトカイン−感受性細胞増殖に影響する薬剤のスクリーニング法を提供する。方法は、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６の調節により例示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤を同定する方法であり：
ｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６と化合物をインキュベートし；
ii)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性を検出し；そして
iii)該化合物の非存在下のそれに対するＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の化合物−誘導調節を測定する(ここで、化合物存在下におけるＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の変化が、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤の指標である)
段階を含む、方法。
【請求項２】
該調節がＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の阻害であり、かつ該薬剤が細胞増殖のサイトカイン−誘導阻害の増強に有効である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該調節がＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の活性化であり、かつ該薬剤がＳｔａｔ３を発現する細胞の増殖阻害に有効である(ここで、該Ｓｔａｔ３はリン酸化されている)、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該細胞増殖がｒａｓ活性と無関係である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該細胞増殖が黒色腫または癌腫の増殖である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤を同定する方法であり：
(ｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６、その変異形およびフラグメントからなる群から選択される少なくとも一つのＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナーを、試験化合物の存在下でインキュベートし；そして
(ii)試験化合物の存在が該ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと該結合パートナーの間の相互作用を、該試験化合物の非存在下のそれと比較して調節するか否かを測定する
段階を含む、方法。
【請求項７】
ＴＥＬ／Ｅｔｖ６の変異形またはフラグメントがＳｔａｔ３と結合する能力を有する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＴＥＬ／Ｅｔｖ６のフラグメントが５０から３５０の間のアミノ酸長である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
該結合パートナーがＳｔａｔ３、その変異形またはフラグメントである、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
さらに試験化合物がＳｔａｔ３依存性細胞増殖の調節剤であることを確認することを含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドまたは結合パートナーを検出可能な標識で標識し、他方を固体支持体上に固定する、請求項６から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
調節が該相互作用の阻害である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
物質がサイトカイン−感受性癌の細胞増殖を阻害することを確認する段階を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該試験化合物がＴＥＬ／Ｅｔｖ６とＳｔａｔ３の物理的会合を阻害するか否かを測定する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
該方法が：
(ｉ)該結合パートナーと相互作用する能力を有するＴＥＬ／Ｅｔｖ６、その変異形またはフラグメントを発現する細胞と、試験化合物を接触させ、そして
(ii)該細胞における該相互作用を阻害する物質を同定する
段階を含む、請求項６から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
該方法が：
(ｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドおよびその結合パートナーおよびレポーター遺伝子構築物を発現できる細胞を提供し、
(ii)細胞と試験化合物を接触させ、
それにより、試験化合物によるＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナー間の結合の阻害が、レポーター遺伝子発現の減少として観察できる、
段階を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチド、その結合パートナーおよびレポーター遺伝子構築物を発現でき、それにより、該ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと該結合パートナー間の結合がレポーター遺伝子発現により観察できる、哺乳類細胞。
【請求項１８】
Ｓｔａｔ３発現癌細胞増殖を阻害する方法であり、Ｓｔａｔ３を発現する癌細胞を、Ｓｔａｔ３活性を阻害するのに十分な量の有効量のＴＥＬアクティベーターと接触させることを含む、方法。
【請求項１９】
該Ｓｔａｔ３がリン酸化されている、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
サイトカイン感受性癌を阻害する方法であり、サイトカイン−感受性癌細胞と、Ｓｔａｔ３活性を増強するのに十分な量の有効量のＴＥＬ活性インヒビターを接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
活性の阻害が、細胞におけるＴＥＬ／Ｅｔｖ６またはその同族体の下方制御によりもたらされる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該下方制御がＲＮＡｉによりもたらされる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該下方制御が、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６またはその同族体の部分をコードするＲＮＡ配列を含む、少なくとも部分的に二本鎖の２０から２５bp長の間のＲＮＡによりもたらされる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該ＴＥＬインヒビターが抗体または抗体フラグメントである、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
活性の阻害が、細胞中のＴＥＬ／Ｅｔｖ６またはその同族体と、結合パートナーの相互作用の阻害によりもたらされる、請求項２０または２４に記載の方法。
【請求項２６】
結合パートナーがＳｔａｔ３である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
サイトカイン−感受性癌細胞の細胞増殖阻害のための、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６、その同族体またはフラグメントをコードするＲＮＡ配列を含む、少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡの使用。
【請求項２８】
該ｄｓＲＮＡが２０から２５bpの間のｓｉＲＮＡ二本鎖である、請求項２７記載の二本鎖ＲＮＡの使用。
【請求項２９】
ＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性インヒビターの、サイトカイン−感受性癌に罹患している患者の処置用薬剤の製造における使用。
【請求項３０】
ＳＴＡＴ３発現癌に罹患している患者の処置に使用する薬剤を製造するためのＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性アクティベーターの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、癌の診断および治療において適用される、細胞増殖の分野に関する。本発明はまた予防的であれ治療的であれ、抗癌活性を有する可能性のある化合物のスクリーニングにも関する。
【０００２】
背景技術
世界中の豊かな国のほとんどで、癌は大まかに５人に１人の死亡原因である。１９９３年に、米国癌協会(American Cancer Society)は、５つの最も多い癌は肺、胃、乳房、結腸／直腸および子宮頚であると報告した。癌は全ての症例が致死的ではなく、癌を発症した人の約半数のみがそれで死亡する。癌患者とその医師が向き合う問題は、癌を治療しようとすることが、雑草を取り除こうとするようなものであることである。癌細胞は、外科的に摘出し、毒性化合物または放射線により破壊できるが、癌性細胞を全て除くことは非常に困難である。一般的な目標は、体内の正常細胞を影響を受けずに残しながら、癌細胞を選択的に殺すよりよい方法を見出すことである。この努力の一部に、新しい抗癌剤の同定が包含される。
【０００３】
癌細胞は細胞サイクルの正常な制御を失っており、正常細胞と比較して無制御に分裂する。細胞サイクルを制御する亜細胞性機構は、細胞の内容物の複製および分裂の必須過程を誘導し、調整する、一群の相互作用タンパク質からなる複雑な生化学的デバイスである。正常な細胞サイクルにおいては、制御系は該サイクルの特定の点で停止できるように調節されている。該停止点が、複製または分裂の過程からのシステムのフィードバック制御を可能にする。それらはまた環境シグナルによる調節のための点も提供する。
【０００４】
癌細胞の研究が、細胞内シグナル伝達カスケードの複雑なネットワークを通じて増殖因子が正常細胞の細胞増殖をどのように制御しているかを示すことを助けてきた。これらのカスケードは、最終的に遺伝子の転写および細胞サイクル制御システムの構築および活性化を調節する。該細胞サイクル制御機構の構成部分およびどのようにそれが作動するかに関する知識が増大するにつれ、癌細胞における制御の喪失を是正する可能性が増している。制御必須点と必須タンパク質が、当該制御機構の中で同定され、それぞれの必要性に応じて、アクティベーターまたはインヒビターとして作用する薬剤で標的化され得る可能性がある。
【０００５】
シグナル変換および転写活性化因子３(Ｓｔａｔ３)は多くの増殖因子およびサイトカインの効果を仲介する。いくつかの研究が発癌におけるＳｔａｔ３の可能性のある役割を記載しているが(例えば、J. Bromberg, 2002, The Journal of Clinical Investigation, 109, 1139-1142；Levy and Lee, 2002, The Journal of Clinical Investigation, 109, 1143-1148参照)、Ｓｔａｔ３が、ある場合は腫瘍細胞増殖のサイトカイン−誘導阻害のメディエーターであることを示す研究もある(例えば、J. Behrmann, 1999, Oncogene, 18, 3742-53；S Akira, 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 3963-3966参照)。このように、正常細胞および悪性細胞の両方におけるＳｔａｔ３の機能はまだ未解明である。原発性腫瘍および腫瘍細胞系における不適切に活性化されたＳｔａｔ(Ｓｔａｔ３を含む)の存在および異常なＳＴＡＴシグナル伝達におけるその役割は、Bowman et al. (Oncogene, 2000, 19: 2474-2488)によりレビューされている。
【０００６】
ＴＥＬ(“translocation-ETS-leukemia”、ＥＴＶ６としても既知)遺伝子は、白血病における転座の主要な標的であり、その遺伝子産物は白血病およびいくつかの固形腫瘍の腫瘍サプレッサーと推定されると記載されている。Ｒａｓ−形質転換ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるＴＥＬの発現は、軟寒天および通常培養において細胞増殖を阻害した(Fenrick et al., 2000, Molecular and Cellular Biology, 20, 5828-5839)。ＴＥＬはまたヌードマウスで癌形成を遅らせることが示されている(Van Rompaey et al., 2000, 19, 5244-5250)。
【０００７】
発明の開示
本発明の第１の態様によって、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤を同定する方法が提供され、該方法はｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６(またはその変異形(ｖａｒｉａｎｔ)またはフラグメント)と化合物をインキュベートし；ii)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性を検出し；そしてiii)該化合物非存在下のそれに対するＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の化合物−誘導調節を測定する(ここで、化合物存在下におけるＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の変化が、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤の指標である)段階を包含する。
【０００８】
当該調節はＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の阻害であり得るので、この場合、該薬剤は細胞増殖のサイトカイン−誘導阻害に有効である。また、当該調節はＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の活性化であることもあり、この場合、該薬剤はＳｔａｔ３、特にリン酸化Ｓｔａｔ３を過剰発現する細胞の増殖の阻害に有効である。後者の場合、細胞増殖はｒａｓと無関係であり得る。
【０００９】
また、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤を同定する方法が提供され、該方法は：(ｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６、その変異形またはフラグメントからなる群から選択されるＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナーを、試験化合物の存在下でインキュベートし；そして(ii)試験化合物の存在がＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナーの間の相互作用を、試験化合物の非存在下のそれと比較して調節するか否かを測定する段階を含む。ＴＥＬ／Ｅｔｖ６の変異形またはフラグメントは、好ましくはＳｔａｔ３と結合する能力を有する。ＴＥＬ／Ｅｔｖ６フラグメントは好ましくは５０から３５０の間のアミノ酸長である。好ましい結合パートナーはＳｔａｔ３、その変異形またはフラグメントである。所望により、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドまたは結合パートナーを検出可能標識で標識し、他方を固体支持体上に固定する。
【００１０】
本発明のさらなる態様において、当該スクリーニング方法は、試験化合物がＳｔａｔ３依存性細胞増殖の調節剤であることの確認を包含する。
【００１１】
該調節はＴＥＬ活性またはＴＥＬ結合パートナー相互作用の阻害であり、この場合、当該方法は物質がサイトカイン−感受性癌細胞の細胞増殖を阻害することを確認する段階を含んでよい。
【００１２】
該方法はインビトロまたは細胞使用のアッセイであり得る。このように、本発明によりまた提供されるのは、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチド、その結合パートナー、およびレポーター遺伝子構築物を発現でき、それにより、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナー(特にＳｔａｔ３)との結合がレポーター遺伝子発現により観察できる、哺乳類細胞である。
【００１３】
本方法は、黒色腫または癌腫(carcinoma)の細胞増殖を阻害するのに有効な薬剤の同定に特に有用である。
【００１４】
また提供されるのは、特に黒色腫または癌腫におけるＳｔａｔ３発現癌細胞の増殖を阻害する方法である。一つの態様において、当該方法はＳｔａｔ３、好ましくはリン酸化Ｓｔａｔ３を発現する癌細胞と、Ｓｔａｔ３活性を阻害するのに十分な量の有効量のＴＥＬを接触させることを含む。好ましくは、細胞増殖はｒａｓと無関係である。
【００１５】
さらなる態様において、本発明はサイトカイン感受性癌細胞増殖を阻害する方法であり、サイトカイン−感受性癌細胞と、Ｓｔａｔ３活性を増強するのに十分な量の有効量のＴＥＬインヒビターを接触させる方法を提供する。ＴＥＬインヒビターは、例えばＲＮＡｉまたは抗体であり得る。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞増殖におけるＳｔａｔ３の役割の研究の成果である。本発明は、サイトカイン−感受性黒色腫細胞系における誘導性Ｓｔａｔ３構築物の効果を評価し、適度なレベルまでのＳｔａｔ３の活性化が、細胞サイクルにおける細胞変化を減速させることにより、細胞増殖を抑制するのに十分であることを発見した(実施例１および３参照)。さらに、増強し、延長したＳｔａｔ３活性が細胞サイクルの停止およびアポトーシスをもたらした。
【００１７】
オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析を使用して、本発明者らは、さらに、Ｓｔａｔ３活性化で発現が増加または減少する遺伝子を同定した(実施例４参照)。かかるＳｔａｔ３標的遺伝子のひとつは、転写因子Ｃ／ＥＢＰデルタであることが判明し、これは、Ｃ／ＥＢＰデルタ発現の低分子量干渉(ｓｉ)ＲＮＡを使用した標的崩壊により支持されるので、細胞増殖におけるＳｔａｔ３阻害活性のメディエーターの一つである(実施例５参照)。対照的に、他のＳｔａｔ３標的であるＴＥＬ／Ｅｔｖ６転写因子の発現の阻害はＳｔａｔ３活性を増加し、Ｓｔａｔ３が細胞増殖を阻害するという発見をさらに支持する。このように、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６はＳｔａｔ３活性のインヒビターであり、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６の調節は、Ｓｔａｔ３シグナル伝達経路の制御を可能にする(実施例６参照)。
【００１８】
したがって、本発明は、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６レベルまたはＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の調節に基づいた、ＳＴＡＴ３依存性細胞増殖の抑制に有効な薬剤の同定法を提供する。典型的に、このような方法はｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６と化合物をインキュベートし；ii)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６のレベルまたはその活性を測定し；そしてiii)化合物非存在下のそれに対するＴＥＬ／Ｅｔｖ６レベルまたはその活性の化合物−誘導調節を測定する(ここで、化合物存在下のＴＥＬ／Ｅｔｖ６レベルまたはその活性の変更が、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤の指標である)段階を含む。
【００１９】
“ＴＥＬ”および“Ｅｔｖ６”は本明細書で互換的に使用され、ｅｔｓ変異体遺伝子６(ＴＥＬ癌遺伝子；ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１９８７；Golub, et al., Cell 77 (2), 307-316, 1994)を意味する。
【００２０】
当業者が認識するように、文脈から他の意味にならない限り、ポリペプチドまたは核酸が本明細書に記載の本発明の様相および態様において言及されている場合(例えばＴＥＬ、Ｓｔａｔ３)、必須の活性を依然としてコードしていることを条件として、当該ポリペプチドまたは核酸の変異体(例えば誘導体または同族体)も本発明で使用され得る。一般的に、このような変異体は‘野生型'または本明細書に特記の他の配列と実質的に同族的であり、すなわち、それらと配列類似性または同一性を共有する。類似性または同一性は、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列レベルのことであり、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、または７０％、または８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり得る。配列比較は、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰを使用して行い得る(Pearson &amp; Lipman, 1988. Methods in Enzymology 183:63-98参照)。パラメーターは、好ましくは以下のようにデフォルトマトリックスを使用して設定する：Gapopen(gapにおける最初の残基のペナルティ)：タンパク質に−１２／ＤＮＡに−１６ＤＮＡ；Ｇａｐｅｘｔ(ｇａｐにおけるさらなる残基のためのペナルティ)：タンパク質に−２／ＤＮＡに−４；ＫＴＵＰ単語長：タンパク質に２／ＤＮＡに６。類似性の分析は、ハイブリダイゼーションを使用してまた行い得る。特異的配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための一つの一般的な式は：Ｔｍ＝８１.５Ｃ＋１６.６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(％ホルムアミド)−６００／二本鎖におけるbp数である(Molecular Cloning:a Laboratory Manual:2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
【００２１】
ＴＥＬの例示的機能相同物または誘導体(変異体)は、ＴＥＬが、天然に存在するアミノ酸と異なる部分を含み得る置換、化学的、酵素的または他の適当な手段により共有結合的に修飾された分子を含む。共通構造特性を保持する誘導体は、ＴＥＬのフラグメントであり、特にフラグメントは転写調節活性(実施例８に記載のようなもの)、Ｓｔａｔ３結合活性、Ｓｔａｔ３調節活性またはイソ型特異的特徴を維持する。好ましくは、フラグメントは５０から３５０の間のアミノ酸長である。ＴＥＬの誘導体は、また、ＴＥＬの少なくとも一つの特徴、好ましくはＳｔａｔ３調節活性を維持しなければならないことを条件として、アミノ酸欠損、付加または置換を含むことができ、変異体も含む。このように、保存的アミノ酸置換は、実質的にＴＥＬの性質を変えることなくなされるもので、切断もあり得る。付加および置換は、本発明のスクリーニング法、特に、ＴＥＬ活性を増強し(例えば、転写調節活性、Ｓｔａｔ３結合活性、Ｓｔａｔ３調節活性、ＨＤＡＣ結合活性)またはある他の望ましい特性を提供する方法に使用したＴＥＬのフラグメントに対して行われる。
【００２２】
本発明のスクリーニングアッセイは、ＴＥＬの存在または活性の任意の特定の測定法に限定されない。ＴＥＬのレベルは、ＴＥＬ特異的抗体を使用して、例えば、免疫ブロットにおいて測定できる。ＴＥＬアッセイはまた当分野で既知であり(例えばVan Rompaey et al., 2000, Oncogene, 19, 5244-5250参照)、これは、Ｒａｓ発現の測定またはＤＮＡ結合アッセイを使用したＴＥＬ転写活性のアッセイの方法を記載する。要約すれば、ＴＥＬを適当な核酸基質(ＴＥＬ結合部位を含む)と、ＴＥＬのＤＮＡへの結合を可能にする緩衝液中でインキュベートする。直接結合は、移動性シフトアッセイを使用して、または、ｒａｓのような標的遺伝子もしくはＧＦＰのような生物工学処理標的遺伝子、または、下記に詳述するような他の検出可能なマーカーの転写に対する効果を検出することにより測定できる。あるいは、ＴＥＬ転写調節活性の生成物に特異的な抗体を活性の検出に使用できる。当業者には明らかなように、アッセイは、ロボット法および自動化法を使用したハイスループット技術を容易に利用できる。ＴＥＬ活性はまたタンパク質の下流標的の検出によりアッセイできる。例えば、ＴＥＬは多くの特異的標的の転写および翻訳に影響することが知られている。
【００２３】
ＴＥＬ活性またはレベルの化合物−誘導調節は、化合物非存在下のそれと比較して、化合物存在下でＴＥＬ活性(または発現)に変化があることを意味する。特に、ＴＥＬ(またはその活性)の化合物誘導阻害は、化合物非存在下のそれと比較して、減少したＴＥＬ活性により反映される。逆に、ＴＥＬ(またはその活性)の化合物誘導活性化は、化合物非存在下のそれと比較して、増加したＴＥＬ活性により反映される。
【００２４】
当該調節はしたがってＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の阻害であり得るので、この場合、薬剤は細胞増殖のサイトカイン−誘導阻害の増強に有効である。あるいは、当該調節はＴＥＬ／Ｅｔｖ６活性の活性化であり得るので、この場合、薬剤はＳｔａｔ３、特にリン酸化(活性化)Ｓｔａｔ３を発現する細胞の増殖の阻害に有効である。後者の場合、細胞増殖はｒａｓ活性と無関係であり得る。“Ｓｔａｔ３を発現する”癌細胞は、構造的に活性なＳｔａｔ３を過剰発現するか、構造的に活性なＳｔａｔ３を有し、不適当なＳｔａｔ３シグナル伝達に至る癌を包含することを意味する。
【００２５】
本方法は、特に黒色腫または癌腫の細胞増殖阻害に有効な薬剤の同定に有用である。
【００２６】
アクティベーターおよびインヒビターは好ましくは本明細書で集合的にモジュレーターと呼び、好ましくはＴＥＬ活性に直接影響する。再構成された成分を使用して行うアッセイは、直接ＴＥＬ調節(例えば、ＴＥＬ活性の特異的阻害)を達成するために容易に設計できる。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、ＴＥＬの結合パートナー、特にＳｔａｔ３への結合を調節する化合物を同定することによる、細胞増殖のようなＳＴＡＴ３依存性疾患に有効な薬剤のスクリーニング法が提供される。本発明のこの態様において、方法は(ｉ)ＴＥＬ／Ｅｔｖ６、その変異形またはフラグメントからなる群から選択されたＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナーを、試験化合物の存在下でインキュベートし；そして(ii)試験化合物の存在が、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６ポリペプチドと結合パートナーの間の相互作用を、試験化合物の非存在下の場合と比較して調節するか否かを測定する段階を含む。下記実施例９に例示するように、結合パートナーはＳｔａｔ３、その変異形またはフラグメントであってよい。
【００２８】
ポリペプチドと結合パートナーの間の相互作用を評価する方法は、本明細書に記載のような、当業者に既知の任意の方法であり得る。任意のこのような方法が、試験化合物がポリペプチド(この場合ＴＥＬ)と結合パートナーの間の相互作用を調節(例えば、阻害)するか否かの評価に使用できる。
【００２９】
一つの態様において、アッセイはＴＥＬと、Ｓｔａｔ３、特にリン酸化(活性化)Ｓｔａｔ３との相互作用に基づくものである。本発明者らは、非リン酸化Ｓｔａｔ３(特に、細胞の細胞質において)のみならずリン酸化Ｓｔａｔ３と相互作用するＴＥＬを検出している。ＴＥＬは一般に核タンパク質として知られており、リン酸化Ｓｔａｔ３は核に出入りし、核でＴＥＬと相互作用して転写を調節する。
【００３０】
試験化合物がＴＥＬとＳｔａｔ３ポリペプチドの間の相互作用を阻害するか否かの決定は、ＴＥＬポリペプチドとＳｔａｔ３ポリペプチドの間の物理的会合が阻害されるか否かの決定を含み得る。例えば、ＴＥＬとその結合パートナーの間の物理的会合は、一方を検出可能な標識で標識し、それを固体支持体上に固定されている他方と接触させることにより検討され得る。適当な検出可能な標識は、組み換え的に製造したＴＥＬおよび／またはその結合パートナーに組み込まれ得る３５Ｓ−メチオニンを含む。組み換え的に製造したＴＥＬおよび／または結合パートナーはエピトープを含む縮合タンパク質として発現され、該エピトープは抗体で標識できる。あるいは、当分野で既知のように、例えば、放射活性標識とシンチラントを使用した、二重標識を使用し得る。
【００３１】
一般に、固体支持体上に固定されたタンパク質は、固体支持体に結合したタンパク質に対する抗体を使用して、または、それ自体既知の他の技術を介して固定し得る。好ましいインビトロ相互作用は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)またはＨｉｓ６のようなタグを含む縮合タンパク質を利用し得る。タグは、例えば、各々グルタチオンアガロースビーズまたはＮｉ−マトリックス上に、親和性相互作用により固定し得る。
【００３２】
上記のタイプのインビトロアッセイ方式において、インヒビターと推定される化合物は、固定結合パートナー、それぞれの場合に応じて、例えば、ＧＳＴ結合パートナーまたはＧＳＴ−ＴＥＬに結合する、標識ＴＥＬまたは結合パートナーの量を調節するその能力をアッセイできる。これは、グルタチオン−アガロースビーズのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分画化により測定し得る。あるいは、ビーズを濯いで非結合タンパク質を除去し、結合しているタンパク質の量を、例えば、シンチレーションカウンター中で、存在する標識の量を計測することにより決定できる。
【００３３】
また、ＴＥＬまたは結合パートナー抗体の一つに対する、固体支持体に結合した抗体が、固体支持体に当該分子を結合するためにＧＳＴの代わりに使用され得る。ＴＥＬおよびその結合パートナーに対する抗体は、当分野でそれ自体既知の種々の方法で得られ得る。
【００３４】
別の形態において、ＴＥＬおよびその結合パートナーの一つを蛍光ドナー部分で標識し、他方をドナーからの発光を減少させ得るアクセプターで標識し得る。これは、本発明のアッセイを蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)により行うことを可能にする。この形態において、ドナーの蛍光シグナルは、ＴＥＬとその結合パートナーが相互作用したときに変化する。相互作用を調節する候補モジュレーター化合物の存在は、ドナーの未変化の蛍光シグナルの量を増加させるであろう。
【００３５】
ＦＲＥＴは当分野でそれ自体既知であり、したがって、厳密なドナーとアクセプター分子、およびそれらをＴＥＬおよびその結合パートナーに結合させる手段は、文献を参照して達成し得る。
【００３６】
適当な蛍光ドナー部分は、蛍光発生エネルギーを他の蛍光発生分子または化合物の部分に移すことができるものであり、クマリンおよびフルオレッセイン、ロードール(rhodols)およびローダミンのような関連色素、レゾルフィン、シアニン色素、ビマン(bimanes)、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、ルミノールおよびイソルミノール誘導体のようなアミノフタル酸ヒドラジン、アミノフラルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノンおよびユーロピウムならびにテルビウム錯体、および関連化合物を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
適当なアクセプターはクマリンおよび関連フルオロフォア、フルオレッセイン、ロードールおよびローダミンのようなキサンテン、レゾルフィン、シアニン、ジフルオロボラジアザインダセンおよびフタロシアニンを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
好ましいドナーはフルオレッセインであり、好ましいアクセプターはローダミンおよびカルボシアニンを含む。Aldrich Chemical Company Ltd, Gillingham, Dorset, UKから入手可能なこれらのフルオレッセインのイソチオシアネート誘導体およびローダミン部分は、ＴＥＬおよびその結合パートナーの標識に使用し得る。カルボシアニンの結合に関しては、例えばGuo et al, J. Biol. Chem., 270; 27562-8, 1995参照。
【００３９】
本発明のさらなる態様によって、ＴＥＬ遺伝子またはＴＥＬ調節配列の存在下に発現する遺伝子の発現を調節する化合物を同定することによる、細胞増殖のようなＳＴＡＴ３依存性疾患に有効な薬剤のスクリーニング法が提供される。
【００４０】
当該方法は、転写的に活性な細胞性成分を、好ましくは細胞中で、プロモーター配列に動作可能に結合したＴＥＬ遺伝子またはレポーター遺伝子に動作可能に結合したＴＥＬプロモーター配列(またはレポーター遺伝子の発現を可能にする他のＴＥＬ調節領域)をコードする核酸と、少なくとも一つの化合物の存在下接触させ；それがＴＥＬ発現であれ、レポーター遺伝子発現の発現であれ、コード領域の発現に対する当該化合物の効果を検出することを含む。ＴＥＬ発現またはプロモーター活性の減少または増加は、上記細胞増殖の阻害に有効な薬剤の指標である。このようなアッセイは、転写的に活性な細胞性成分と核酸が細胞中に存在するので、細胞ベースのアッセイであるが、インビトロの転写アッセイも当分野で既知である。
【００４１】
レポーター遺伝子は検出可能な変化を提供できる任意の分子をコードする。このようなレポーター分子は、蛍光部分を含む(例えば、シアン蛍光タンパク質、ＣＦＰ；黄色蛍光タンパク質、ＹＦＰ；青色蛍光タンパク質、ＢＦＰ；または緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰのような蛍光タンパク質；全てClontech Living Colors User Manualから市販されている)、抗原、レポーター酵素などである。レポーター酵素は下記のものを含むが、これらに限定されない：ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、レダクターゼ、デアミナーゼ、カタラーゼおよびウレアーゼ。本発明で請求している範囲内で使用するレポーター分子の選択において、レポーター分子それ自体、アッセイ混合物中に存在する任意のプロテアーゼ活性による不活性化を含む、スクリーニングアッセイにおいて存在する推定薬剤または他の成分により不活性化されてはならない。適当なレポーター分子の選択は、当業者には容易であろう。
【００４２】
核酸は典型的には、種々の細菌、酵母および哺乳類細胞について既知であるように、１個またはそれ以上の選択された宿主細胞中で複製できるベクター中に提供される。例えば、種々のウイルス起源(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ)は哺乳類細胞中のクローニングベクターとして有用である。ベクターは、例えば、細胞に取り込まれ、目的の配列またはレポーター遺伝子の発現に使用できる、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、ファージまたは任意の他の適当なベクターまたは構築物の形であり得る。構築物は一過性に、または、安定なエピソームとして発現されるし、または、宿主細胞のゲノム内に取り込まれ得る。
【００４３】
発現ベクターは、ｍＲＮＡ合成を指揮するように、目的のタンパク質コード核酸配列に動作可能に連結したプロモーターを、通常含む。ＴＥＬ調節配列およびプロモーター配列のように、種々の可能性のある宿主細胞により認識されるプロモーターが既知である。“動作可能に連結”は、同じ核酸分子の一部として、プロモーターから開始すべき転写のために適当な位置および配向で、結合していることを意味する。プロモーターに動作可能に連結したＤＮＡはプロモーターの“転写制御下”にある。哺乳類宿主細胞中のベクターからの転写は、例えば、プロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥サルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアン・ウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御されるが、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする。本発明の発現ベクターはまた、抗生物質または他の毒素への耐性を付与する遺伝子のような１個またはそれ以上の選択遺伝子も含み得る。
【００４４】
本発明の方法は、したがって、核酸を宿主細胞に挿入することを含んでもよい。挿入は、一般的に(特にインビトロ挿入について)“形質転換”と呼ぶが、これに限定されることはなく、任意の利用可能な技術を用い得る。真核細胞に関して、適当な方法は、当分野で既知のように、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、および、レトロウイルスまたは他のウイルス、例えばワクチニア(vaccini)ウイルスを使用したトランスダクションを含み得る。例えば、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527 537 (1990)およびMansour et al., Nature 336:348-352(1988)参照。
【００４５】
本明細書で記載の発現またはクローニングベクターでトランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞は、慣用の栄養培地で培養し得る。培地、温度、ｐＨなどの培養条件は、当業者が過度の実験をすることなく選択できる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原則、プロトコールおよび実施技術は“Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach”, M. Butler, ed. JRL Press, (1991) and Sambrook et al、前掲に見ることができる。
【００４６】
このように、本発明のアッセイはインビボでも行い得る。このようなアッセイは、適当な宿主細胞、例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳類宿主細胞で行い得る。酵母および哺乳類宿主細胞が特に適している。
【００４７】
一つの態様において、ＴＥＬポリペプチドおよびその結合パートナー(例えば、Ｓｔａｔ３)およびレポーター遺伝子構築物を発現できる構築物を細胞に挿入し、試験化合物の存在に応答したレポーター遺伝子の調節を評価し得る。
【００４８】
インビボアッセイはまた２ハイブリッドアッセイの形を取り得る。２ハイブリッドアッセイは、Fields and Song, 1989, Nature 340; 245-246により記載されたものと同一でよい。このようなアッセイにおいては、酵母ＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)および転写活性化ドメイン(ＴＡＤ)が、評価しようとする各々の反応分子と融合させる。機能的ＧＡＬ４転写因子は、二つの目的の分子が相互作用する場合のみ復元される。こうして、当該分子の相互作用を、該レポーター遺伝子の転写を活性化し得るＧＡＬ４  ＤＮＡ結合部位に動作可能に連結したレポーター遺伝子の使用により測定し得る。他の転写活性化ドメイン、例えばウイルスＶＰ１６活性化ドメインを、ＧＡＬ４  ＴＡＤの代わりに使用し得る。
【００４９】
一般に、ＴＥＬおよびその結合パートナーは融合タンパク質として発現でき、一方は酵母ＧＡＬ４結合ドメインのようなＤＮＡ結合ドメイン(ＤＢＤ)を含む融合タンパク質であり、他方はＧＡＬ４またはＶＰ１６由来のような活性化ドメインを含む融合タンパク質である。このような場合、宿主細胞(これはまた細菌、酵母、昆虫または哺乳類、特に酵母または哺乳類であり得る)は、ＤＢＤに適合し得るＤＮＡ結合エレメントを含むプロモーターと共にレポーター遺伝子構築物を担持する。
【００５０】
ＴＥＬおよびその結合パートナーおよびレポーター遺伝子を細胞に挿入し、一過性または安定に発現し得る。
【００５１】
ＴＥＬおよび／またはその結合パートナーを次いで試験化合物と接触させ、ＴＥＬとその結合パートナーとの結合阻害がレポーター遺伝子発現の減少として観察できる。
【００５２】
このスクリーニングで同定されるインヒビターは、例えば、上記のようにＳｔａｔ３依存性細胞増殖の調節のために使用し得る。それらは後記のような医薬として製剤され得る。
【００５３】
いくつかの態様においては、ＴＥＬおよび／またはその結合パートナー(特にＳｔａｔ３)がその活性化形であることが好ましい。例えば、インビトロ法のためには、活性化ＴＥＬまたはその結合パートナーを活性化細胞サンプルからの免疫沈降または親和性精製により提供し得る。細胞は、サイトカインで刺激されている細胞であってもよい。インビボ法用のためには、それは、例えば、サイトカインのようなリガンドを加えることにより活性化されているＳｔａｔ３を発現している細胞中で方法を実施することにより達成され得る。あるいは、それは構造的に活性であるか、またはリン酸化されていてもよい(Bowman et al., 2000, Oncogene, 19, 2474-2488; Bromberg et al. 1999参照)。
【００５４】
結合アッセイは競合的であっても、非競合的であってもよい。全てのアッセイ(結合アッセイまたは活性アッセイであれ)は、典型的に当業者には慣用的な安定な対照と共に行うか、あるいは、対照で予め決定した標準値と比較するアッセイを使用することにより数値を決定する。
【００５５】
本方法は、所望により、さらに、上記のように同定したＴＥＬ活性／結合のモジュレーターがＳｔａｔ３依存性細胞増殖のモジュレーターであるか否かを確認するための機能的アッセイを含んでもよい。
【００５６】
一つの態様において、当該方法は細胞とＴＥＬ活性／結合のモジュレーターを接触させ、該モジュレーターがＳｔａｔ３依存性細胞増殖を調節できることを確認する段階を含む。例えば、該調節はサイトカイン−感受性細胞増殖の阻害(例えば、下に例示のような、サイトカインの存在下培養したＡ３７５細胞を使用して)またはＳｔａｔ３を過剰発現する癌の阻害(例えば、Bowman et al., 2000の表ＩおよびII参照)であってもよい。
【００５７】
本発明はさらにＳｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に有効な薬剤を同定する方法を提供するものであり、当該方法は、化合物をＴＥＬ活性に依存する非ヒト動物モデルに投与し、細胞増殖が該化合物の非存在下の場合と比較して影響を受けているか否かを決定することを含む。該非ヒト動物は典型的にマウスまたはラットのような実験動物であり、種々の投与量を経口的に餌と混ぜてまたは他の適当な手段で投与でき、投与法は安定性および標的送達のような化合物の特性に依存して選択し得る。ＴＥＬ活性は、実験動物により発現される遺伝子由来であって異なる種由来のものであり、例えば、方法は、マウスＴＥＬ遺伝子を置換したヒトＴＥＬ遺伝子を含んでおり、これはヒト対象を使用せずにヒトＴＥＬに対する薬剤の効果を決定するのに特に有用であろう。
【００５８】
本スクリーニングシステムは好ましくは小分子ライブラリー、ペプチドライブラリー、ファージ提示ライブラリーまたは天然物ライブラリーに含まれる化合物のスクリーニングに使用する。化合物は無機または有機、例えば、抗生物質または抗体であり得る。投与を容易にするために、化合物は好ましくは小分子であり、それらはＤＮＡ結合部位または他の転写制御部位、Ｓｔａｔ３結合部位または実際Ｓｔａｔ３に結合できる。
【００５９】
ＴＥＬモジュレーターを可能ならば改善するために、単離ＴＥＬを、全タンパク質または少なくともＴＥＬ活性を担う領域の二次および三次構造を確立するために使用する。三次元構造の同定のための慣用法は、例えば、Ｘ線試験またはＮＭＲ試験である。これらまたは同等な方法により得たデータを、特異性を提供するためのような、ＴＥＬのモジュレーターを同定または改善するために直接または間接的に使用し得る。この点に関して通常使用されている方法は、例えば、コンピューターを利用したドラッグデザインまたは分子モデリングである。
【００６０】
このような化合物のスクリーニングに有用なキットがまた本発明によって提供され、本質的に、スクリーニングに有用なＴＥＬまたはそのフラグメントと指示書を含む。典型的には、ＴＥＬポリペプチドはＴＥＬ活性を測定する手段と少なくとも一つの化合物(推定上の薬剤)または既知の調節活性を有する薬剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、抗体または抗体フラグメントと一緒に提供される。本発明のキットに使用するためのＴＥＬは、例えば溶液、懸濁液または凍結乾燥したタンパク質の形で、またはＴＥＬもしくはそのフラグメントを産生し得る核酸配列の形で発現システム中、所望により即時使用形態で提供されてもよい。
【００６１】
本発明はまた、特にＳｔａｔ３−過剰発現型癌またはサイトカイン−感受性癌におけるＴＥＬ活性を調節する方法および材料に関する。
【００６２】
このように、一つの態様において、この目的のために、細胞におけるＴＥＬ活性を、例えば遺伝子サイレンシングにより減少させる方法を提供する。ＴＥＬに対するポリヌクレオチド、特にアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムがＴＥＬ活性を阻害するために使用されてもよく、また、組み換え的に製造するために上記のようなベクター中に挿入されてもよく、また別法として合成的に製造されてもよい。
【００６３】
アンチセンスに替わる方法は、センス配列に挿入された標的遺伝子の全てまたは一部のコピー(標的遺伝子と同一配向である)を、標的遺伝子の発現の低減を達成するために使用することである。ｄｓＲＮＡ介在サイレンシングは遺伝子特異的であり、しばしばＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)と呼ばれる(Fire(1999) Trends Genet. 15:358-363, Sharp(2001) Genes Dev. 15:485-490, Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2:1110-1119 and Tuschl(2001) Chem. Biochem. 2:239-245)参照。ＲＮＡ干渉は二段階過程である。第一に、ｄｓＲＮＡを細胞内で開裂して、約２１−２３nt長で、５'末端リン酸と３'短突出部(〜２nt)を有する低分子量干渉性ＲＮＡｓ(ｓｉＲＮＡｓ)を産生する。該ｓｉＲＮＡは、特異的に対応するｍＲＮＡ配列を、破壊のために標的とする(Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)。
【００６４】
したがって、ＴＥＬコード配列、例えば、“長い”二本鎖ＲＮＡ(例えば、Dicerインビトロを使用してｓｉＲＮＡに加工される)を含む二本鎖ＲＮＡは、Ｔｅｌ活性を阻害し、それによってＳｔａｔ３活性を阻害するために使用され得る。これらのＲＮＡ産物は、別法として、インビトロで、例えば、慣用の化学合成法により合成し得る。
【００６５】
ＲＮＡｉはまた３'−突出部末端と同じ構造の化学合成したｓｉＲＮＡ二本鎖を使用して効率的に誘導し得る(Zamore PD et al Cell, 101, 25-33, (2000))。合成ｓｉＲＮＡ二本鎖は、広範囲の哺乳類細胞系における内因性および異種遺伝子の発現を特異的に抑制することが示されている(Elbashir SM. et al. Nature, 411, 494-498, (2001))。
【００６６】
したがって、例えば、合成により製造され、所望により分解防止のための保護形である、ＴＥＬ配列の２０から２５bp、より好ましくは２１から２３bpを含む、ｓｉＲＮＡは本発明のひとつの態様を形成する。
【００６７】
あるいはｓｉＲＮＡはベクターから、インビトロで(回収および使用のため)またはインビボで製造されてもよい。したがって、該ベクターは、例えば、本明細書に引用した任意の引用文献に記載のような、当分野で既知の任意の方法で、ｓｉＲＮＡを細胞に挿入するのに適した、ＴＥＬ(またはその変異形またはフラグメント)をコードする核酸配列を含んでもよく、該引用文献は出典明示により本明細書に包含される。
【００６８】
一つの態様において、ベクターは、ＲＮＡとして発現された場合、センスおよびアンチセンス部分が結合して二本鎖ＲＮＡを形成するように、センスおよびアンチセンス配向の両方で本発明の核酸配列を含んでもよい。これは、例えば長い二本鎖ＲＮＡ(例えば、２３ntを超える)であってもよく、これは、Dicerにより処理され、ｓｉＲＮＡを産生する(例えばMyers(2003)Nature Biotechnology 21:324-328参照)。
【００６９】
あるいは、二本鎖ＲＮＡは、上記のような、ｓｉＲＮＡ二本鎖を形成する配列を直接コードし得る。別法として、センスおよびアンチセンス配列は、異なるベクター上に提供されてもよい。
【００７０】
これらのベクターおよびＲＮＡ産物は、例えば細胞中のＴＥＬポリペプチドの新規産生の阻害に有用であり得る。したがって、本発明のさらに別の態様は、核酸(例えば上記の任意のベクター)を宿主細胞に挿入することを含む、方法を提供する。
【００７１】
本明細書の記載に照らせば、ＴＥＬ活性のモジュレーターは、それと特異的に結合し、そのＳｔａｔ３との相互作用を阻害し、それによりＳｔａｔ３依存性細胞増殖の阻害に有用性を有する、抗体を含むことが理解され得る。ＴＥＬ抗体は、それが結合できるポリペプチドと、同種由来のそれが結合親和性を有しないか実質的に有しない(例えば少なくとも約１０００倍不良の結合親和性)ポリペプチドを区別できるという意味で特異的である。特異的抗体は分子上のエピトープ(他の分子には存在しないか接近できない)と結合する。
【００７２】
本発明の好ましい抗体は、他のポリペプチドと結合できる抗体のような汚染物を含まず、および／または血清成分を含まないという意味で単離されている。モノクローナル抗体がいくつかの目的のために好ましい。抗体は当分野で標準の技術を使用して得ることができる。抗体を産生する方法は、哺乳類(例えばマウス、ラット、ウサギ)を本発明のポリペプチドで免疫することを含む。抗体は当分野で既知の種々の任意の方法を使用して免疫した動物から得ることができ、好ましくは抗体と目的の抗原の結合を使用してスクリーニングする。例えば、ウェスタン・ブロッティング法また免疫沈降を使用し得る(Armitage et al, Nature, 357:80-82, 1992)。
【００７３】
ペプチドで哺乳類を免疫するのに替えてまたはそれに加えて、タンパク質に特異的な抗体を、例えばその表面に機能的免疫グロブリン結合ドメインを提示するラムダバクテリオファージまたは糸状バクテリオファージを使用して、発現した免疫グロブリン可変ドメインの組み換えにより産生したライブラリーから得ることができる；例えばＷＯ９２／０１０４７参照。
【００７４】
抗体は多くの方法で修飾することができ、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物および同族体を含み、合成分子および、形態が、抗原またはエピトープに結合することを可能にする抗体の形態を模倣している分子を含む。抗原または他の結合パートナーの結合を可能にする抗体フラグメントの例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣｌおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント；ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；抗体の一つのアームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；ＶＨドメインから成るｄＡｂフラグメント；単離されたＣＤＲ領域およびＦ(ａｂ')２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合により架橋した二つのＦａｂフラグメントを含む、２価フラグメントを含む。一本鎖Ｆｖフラグメントもまた含まれる。
【００７５】
元の非ヒト抗体よりも免疫原性を少なくした抗体を提供するために、非ヒト起源からのＣＤＲがヒトフレームワーク領域に、典型的にフレームワークアミノ酸残基のいくつかの変更を伴って継ぎ足されている、ヒト化抗体も含まれる。
【００７６】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝子変異または他の変異に付され得る。モノクローナル抗体が、親抗体の特性を保持した他の抗体またはキメラ分子を製造するための組み換えＤＮＡ法に付され得ることも、当業者によって理解されるであろう。このような方法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域(ＣＤＲ)をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に挿入することを含み得る。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ−Ａ−２１８８６３８またはＥＰ−Ａ−０２３９４００参照。キメラ抗体のクローニングと発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００７７】
他方、好ましくは確立された方法にしたがい化学合成されている低分子量化合物が主として治療的薬剤とされる。これらの化合物は、ＳＵＭＯ化(sumolation)またはリン酸化のようなＴＥＬの翻訳後修飾またはＴＥＬの発現を調節し得る。ＳＵＭＯ化はＴＥＬの核輸出、したがって不活性化をもたらす。ＴＥＬのリン酸化はＴＥＬ活性化に重要かもしれない。低分子量化合物および有機化合物(抗体を含む)は、一般に、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の調節に使用するための、そして好ましくはＴＥＬに選択的に作用する薬剤として有用である。
【００７８】
本発明の化合物は前記の方法を使用したスクリーニングにより同定することができ、好ましくは、確立された方法にしたがって天然または遺伝子修飾された起源からの抽出により、または、特に低分子量化学化合物の場合、合成により製造される。タンパク化合物は、組み換え発現系、例えばバキュロウイルス系、または細菌系における発現により製造し得る。タンパク化合物は、主にシグナル伝達経路の機能の研究に有用であるが、それらは、ＴＥＬに対するヒト化阻害抗体のような、治療的適用を有し得る。あるいは、ｓｉＲＮＡのような核酸をＴＥＬ活性を阻害するために投与できる。ｓｉＲＮＡ技術は、下記実施例に示すような、ＴＥＬに特異的な配列に基づいて慣用的に適用できる。ｓｉＲＮＡの標的発現は、組織特異的プロモーターの使用により達成できる。
【００７９】
本発明によりまた提供されるのはＳｔａｔ３発現癌細胞増殖、特に黒色腫または癌腫を阻害する方法であり、Ｓｔａｔ３、特にリン酸化Ｓｔａｔ３を発現する癌細胞と、Ｓｔａｔ３活性を阻害するのに十分な量の有効量のＴＥＬを接触させることを含む方法である。好ましくは、細胞増殖はｒａｓと無関係である。
【００８０】
さらなる態様において、本発明はサイトカイン感受性癌細胞増殖を阻害する方法であり、サイトカイン−感受性癌細胞と、Ｓｔａｔ３活性を増強するのに十分な量の有効量のＴＥＬインヒビターを接触させることを含む方法を提供する。ＴＥＬインヒビターは、例えばＲＮＡｉまたは阻害性抗体(またはそのフラグメント)であり得る。
【００８１】
このように、本発明によりまた提供されるのは、ＳＴＡＴ３依存性細胞増殖の阻害に使用するためのＴＥＬを直接調節する化合物である。ＴＥＬモジュレーター(例えば、インヒビター)は、モジュレーターの正確な性質に依存して慣用法により製剤することができ、典型的にモジュレーターまたはその前駆体を、生物学的に許容される担体と共に含む。種々の治療を考慮して、このような治療はＴＥＬおよび／またはＳｔａｔ３、特にリン酸化Ｓｔａｔ３の発現が証明されている組織を標的にし得ることが理解される。
【００８２】
影響を受けている細胞および組織へのモジュレーターの送達は、適当なパッケージングまたは投与系により達成できる。例えば、モジュレーターは、薬学的投与に利用できる薬剤と共に治療的使用のために製剤し、対象に所望の生理学的効果を産生するための許容される経路で送達し得る。有効量は、細胞増殖の低減のような所望の生理学的効果を発現する量である。
【００８３】
本発明のさらなる態様において、本発明はまたＳｔａｔ３依存性細胞増殖の治療的または予防的処置用医薬の製造のためのＴＥＬモジュレーターを提供する。
【００８４】
したがって、関係する方法は、さらに選択したモジュレーター(例えば、Ｓｔａｔ３依存性細胞増殖の制御が望まれる疾患、例えば頭頸部癌、ＨＴＬＶ−１依存性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、大型顆粒リンパ球白血病、リンパ腫、腎細胞癌腫、前立腺癌腫、黒色腫、膵臓腺癌腫および卵巣癌腫の処置のための医薬としてのインヒビター)を製剤する段階を含み得る。これらの疾患の処置に使用するためのこのようなインヒビターおよび医薬、ならびに、その使用を含む処置法は本発明のさらなる態様を形成する。
【００８５】
本明細書で使用する処置なる用語は防御および予防ならびにその状態または症状の軽減を含むことを意図する。
【００８６】
組成物は、上記成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、防腐剤、可溶化剤、増粘性物質、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、香味剤、浸透圧調整用塩、緩衝剤、またはコーティング剤を含み得る。このような物質は非毒性であり、活性成分の効果を妨害してはならない。担体または他の材料の厳密な性質は投与経路に依存し得る。方法およびプロトコールの例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”、１６版、Osol, A. (編), 1980に見ることができる. 
【００８７】
組成物を医薬組成物に製剤する場合、その投与は経口、経鼻(例えばプレー式点鼻薬の形で)または直腸(例えば坐薬の形で)のような経腸(parentally)で行い得る。しかしながら、投与はまた筋肉内、静脈内、皮膚、皮下または腹腔内(例えば注射液の形で)のような非経腸的にも行い得る。
【００８８】
このように、例えば、医薬組成物が錠剤の形である場合、それはゼラチンのような固体担体またはアジュバントを含み得る。錠剤、被覆錠、糖衣錠および硬ゼラチンカプセルの製造に関しては、活性化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩を、薬学的に不活性な、無機または有機賦形剤と共に加工できる。ラクトース、メイズ澱粉またはその誘導体、タルク、ステアリン酸またはその塩などを、例えば、錠剤、糖衣錠および硬ゼラチンカプセルのためのこのような賦形剤として使用し得る。軟ゼラチンカプセルのための適当な賦形剤は、例えば、植物油、蝋、脂肪、半固体および液体ポリオールなどである。組成物が液体の形である場合、それは一般に水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコールをまた包含し得る。溶液およびシロップの製造のために適当な他の賦形剤は、例えば、水、ポリオール、サッカロース、転化糖、グルコース、トレハロース(trihalose)などである。注射液のための適当な賦形剤は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などである。静脈内、皮膚または皮下注射、または脳へのカテーテル内輸液のために、活性成分は無発熱源であり、適当なｐＨ、等張性および安定性を有する非経腸可能水性溶液の形である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射を使用して、適当な溶液を製造できる。防腐剤、安定化剤、緩衝液および／または他の添加剤を必要に応じて包含し得る。
【００８９】
本発明はまたＳｔａｔ３依存性癌の診断法であり、サンプル中のＴＥＬのレベルを検出し、サンプルにおけるＴＥＬの量またはその活性の変化を、正常コントロール値または値の範囲と比較したとき、Ｓｔａｔ３依存性癌の傾向と相関させることを含む方法を提供する。ＴＥＬの存在は、上記のような抗体を使用してまたは活性アッセイを使用して容易に測定できる。例えば、正常コントロール値または値の範囲を比較して、ＴＥＬの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％の上昇は、Ｓｔａｔ３依存性癌の傾向の指標である(構造的に活性なＳｔａｔ３を有する)。サンプルは任意の生検材料または体液であり得る。
【００９０】
上記は主にＴＥＬ／Ｅｔｖ６と関連しているが、当業者には、本発明の記載に照らして、下記の表４に記載の遺伝子／遺伝子産物の任意の一つがＳｔａｔ３依存性細胞増殖の阻害のために調節できることが明白であろう。したがって、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６に関連した上記の教示に基づいた、しかし、ＴＥＬ／Ｅｔｖ６の代わりに表４に記載の細胞標的(例えば、ＳＴＡＴインヒビター３)を使用した、細胞増殖のアッセイおよび阻害法の設計は、当分野の技術の範囲内である。
【００９１】
これらの遺伝子は、Ｓｔａｔ３−依存性応答を介在する転写レギュレーター；レセプター(例えば、サイトカインレセプター、ＯＳＭレセプターおよび、ＩＬ−６タイプレセプターファミリーに属するサイトカインレセプター様因子−１)；細胞内シグナル伝達分子；接着タンパク質(オステオポンチンのような)および細胞性代謝の種々の側面に関連する遺伝子のような種々の機能グループに指定できる。例えば、ＳＯＣＳ３、Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達のインヒビター、Ｃ／ＥＢＰデルタ、ＪｕｎＢおよびアルファ−アンチキモトリプシン(セルピンＡ３)の発現は４ＨＴ処理により有意に増加した。同様に、死関連タンパク質キナーゼ１(ＤＡＰＫ１)およびセリンプロテアーゼインヒビター・セルピンＢ３も４ＨＴ処理により増加する。このように、例えば、ＤＡＰＫ１活性を細胞増殖の阻害のために調節できる。Ｓｔａｔ３活性の阻害が望まれる場合(リン酸化Ｓｔａｔ３発現癌または他の構造的に活性なＳｔａｔ３を発現する癌におけるような)、これはＤＡＰＫ活性(または、分泌されたホスホタンパク質１のような表４に列記の他の遺伝子産物の一つ)の阻害により達成し得る。同様に、Ｓｔａｔ３活性の増強が望まれる場合(サイトカイン感受性癌におけるような)、プロテアーゼインヒビター・セルピンＢ３を投与し得る。
【００９２】
本発明を、以下の実施例において、説明のみを目的としてさらに記載する。
【００９３】
実施例
本明細書で言及しているが、明確に記載していない分子遺伝学、タンパク質およびペプチド生化学および免疫学は、科学文献に報告され、かつ当分野で既知である。例えば、遺伝子操作における標準法は、本質的にSambrook et al., Molecular Cloning:A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989に記載のように行う。
【００９４】
実施例１：４−ヒドロキシタモキシフェン誘導Ｓｔａｔ３ＥＲＤＮＡ結合および転写活性
乳房癌腫および黒色腫細胞増殖のＩＬ−６−タイプサイトカインによる阻害は、Ｓｔａｔ３に依存する。誘導性Ｓｔａｔ３構築物を、細胞増殖の阻害におけるＳｔａｔ３の役割を、他のＩＬ−６−誘導シグナル伝達経路と無関係に調べることを可能にするために設計した。誘導性Ｓｔａｔ３構築物は、変異したエストロゲンレセプターリガンド結合ドメイン(ＥＲ−ＬＢＤ)と縮合したＳｔａｔ３の全コード配列(Accession No. NM_139276)を含み、本明細書ではＳｔａｔ３−ＥＲと呼ぶ。ＥＲ−ＬＢＤリガンドである４−ヒドロキシタモキシフェン(４ＨＴ)の添加は、Ｓｔａｔ３−ＥＲ二量体化、核への移動およびＳｔａｔ３依存性転写活性の活性化を開始させる。
【００９５】
概説すれば、マウスエストロゲンレセプターの変異したリガンド結合ドメイン(T Littlewood, Nucleic Acids Res, 1995, 23,1686-90)ＥＲＴＭを含むプラスミドを、ＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１フラグメントとしてｐｃＤＮＡ３.１(Invitrogenから市販されている)にクローン化した。さらなるＢａｍＨ１部位を有するＳｔａｔ３配列をｐＲｃ／ＣＭＶＳｔａｔ３のＰＣＲ増幅により得(J. Bromberg, Proc Natl Acad Sci U S A., 2001, 98, 1543-8)、ｐｃＤＮＡ３.１−ＥＲＴＭにクローン化した。
【００９６】
ＩＬ−６およびオンコスタチンＭ(ＯＳＭ)はＡ３７５黒色腫細胞増殖を阻害する。Ｓｔａｔ３−ＥＲ構築物をＡ３７５黒色腫細胞系にトランスフェクトし、高レベルのＳｔａｔ３−ＥＲを発現する数個のクローンを選択した。Ａ３７５黒色腫細胞を５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ中に維持した(Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)。プラスミドをEffecteneトランスフェクション試薬(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して、製造者のプロトコールにしたがって細胞内に挿入した。細胞を１mg／ml  Ｇ４１８中で選択し、いくつかのクローンを選択し、Ｇ４１８存在下に拡張させてＳＴＡＴ３−ＥＲ発現について分析した。二つの独立したＳＴＡＴ３−ＥＲクローン(ＡＥＲ１８およびＡＥＲ２)で類似の結果が得られた。
【００９７】
ＤＮＡ結合アッセイを４ＨＴ(１μＭ)で０、０.３、１、２、４および２４時間刺激した細胞を使用して行った。核抽出物を記載のように製造した(Andrew and Faller, 1991)。Stat3 Trans Cruzオリゴヌクレオチドアガロース接合体(２０マイクロタイター；Santa Cruz Biotechnology、5'-GAT CCT TCT GGG AAT TCC TAG ATC-3'；配列番号１)を結合緩衝液(２０mM  ＨＥＰＥＳ、０.５mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＤＴＴ、２μg／ml  ポリｄＩ−ｄＣ)中、８０μgの核抽出物に２時間、４℃で回転させながら添加する。サンプルを遠心し、ペレットをさらに２回結合緩衝液で洗浄する。タンパク質がビーズから２５μlの２×ローディング緩衝液(１％ＤＴＴ、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０.０２％ブロモフェノールブルー、０.２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ  １Ｍ  ｐＨ６.８)中の沸騰により抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００９８】
Ｓｔａｔ３ＥＲ−ＤＮＡ結合が刺激後２０分に早くも検出されたが、結合は刺激後２時間強く増大し、４ＨＴ刺激２４時間後に最大測定レベルに達した。このように、４ＨＴのＳｔａｔ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞への添加は、誘導核移動およびＳｔａｔ３−特異的オリゴヌクレオチドプローブのＤＮＡ結合を誘導した。ＤＮＡ結合の増加はＳｔａｔ３−ＥＲ発現の増加と不随し、これはおそらくＳｔａｔ３−ＥＲ縮合タンパク質のリガンド依存性安定化のためである。
【００９９】
ルシフェラーゼアッセイを使用し、Ｓｔａｔ３−ＥＲ構築物が転写活性であることを証明する。この目的のために、Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ３の標的である、アルファ２−マクログロブリン遺伝子の急性相応答エレメント(ＡＰＲＥ)により駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用した。
【０１００】
細胞(２×１０５細胞／６ウェル皿)を、ルシフェラーゼ遺伝子に結合した最小ｊｕｎＢプロモーターの上流の急性相応答エレメント(ＡＰＲＥ)の４つのコピーを含むレポータープラスミド(T Hirano, EMBO Journal, 1996, 15, 3651-3658)で、Promega(Madison, WI)の内部コントロールプラスミドｐＲＬ−ＳＶ４０と共にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、細胞を非刺激のままにするか、ＯＳＭ(PeproTechEC, London, United Kingdom)、４−ヒドロキシタモキシフェン(4HT; Sigma, St. Louis, MO)または４ＨＴ／ＯＳＭの組み合わせで２４時間刺激した。細胞抽出物の製造およびルシフェラーゼ活性の測定は、Autolumat LB 953(Berthold Technologies, Wildbad, Germany)中のPromega(Madison, WI)のデュアル−ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を使用して行った。ホタルルシフェラーゼ活性の変化は、サンプル中のウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性に比例して発現された。
【０１０１】
Ａ３７５細胞において、オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)は、インターロイキン６(ＩＬ−６)と白血病阻害因子(ＬＩＦ)を含む試験したＩＬ−６ファミリーメンバーの中で最も強力なＳｔａｔ３転写活性の活性化剤であった。Ｓｔａｔ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞中、４ＨＴ(１μＭ)はＡＰＲＥからの転写を、１００ng／ml  ＯＳＭよりも効率的に刺激した。結果は下記表１に示す：
【表１】
2006505286.tif 000002
【０１０２】
我々は、これらの条件下のこのアッセイにおいて、１μＭが４ＨＴの最適濃度であると決定した。ＡＰＲＥ−駆動レポーターアッセイにおいて、４ＨＴとＯＳＭの組み合わせは、４ＨＴまたはＯＳＭ単独により誘導された活性と比較して、ルシフェラーゼ活性を劇的に増加した。ＯＳＭの最高量で(１００ng／ml)、４ＨＴとの組み合わせにより誘導された転写は、個々に使用された４ＨＴまたはＯＳＭの転写活性よりも１００倍強かった。ＩＬ−６は４ＨＴと同様の協同活性を示す。このように、ＳＴＡＴ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞において、４ＨＴおよびｇｐ１３０シグナル伝達はＳｔａｔ３転写活性の増加に相乗的である。この実施例はまたＳｔａｔ３−ＥＲが細胞増殖におけるＳｔａｔ３の効果を確立するのに効率的に使用できることも証明する。
【０１０３】
実施例２：ＳＴＡＴ３ＤＮＡ結合はＴｙｒ７０５リン酸化に依存する
ＳＴＡＴ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞を、本質的に実施例１に記載のように４ＨＴで２４時間処理し、次いでＯＳＭを１５分、３０分、１時間、２時間、４時間または２４時間添加した。Ｓｔａｔ３−ＥＲと内因性Ｓｔａｔ３のＤＮＡ結合を、オリゴヌクレオチド結合タンパク質のウェスタン分析を行うことによりモニターした。Ｓｔａｔ３ＤＮＡ結合はＯＳＭ添加１５分後に検出され、処理１時間後に減少した。４ＨＴでの前処理のため、Ｓｔａｔ３−ＥＲは、ＯＳＭ添加前にＤＮＡ結合した。ＯＳＭの存在下、Ｓｔａｔ３−ＥＲＤＮＡ結合は増強され、内因性Ｓｔａｔ３が実験の全ての経過中結合したままであるのと対照的であった。Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ３−ＥＲのＤＮＡ結合動態は、本質的にＴｙｒ７０５リン酸化レベルと相関した。これらの結果は、ＯＳＭ−誘導ｇｐ１３０活性化が、Ｓｔａｔ３およびＳｔａｔ３−ＥＲの両方のリン酸化を誘導する；Ｓｔａｔ３が急速に脱リン酸化されている間、Ｓｔａｔ３−ＥＲはリン酸化されたままであり、したがって長期間ＤＮＡ結合する。この結果は、Ｓｔａｔ３依存性転写活性の刺激と、細胞増殖のＳｔａｔ３−誘導阻害における、４ＨＴとＯＳＭの間の相乗性を非常によく説明するようである。
【０１０４】
実施例３：Ｓｔａｔ３活性はＡ３７５細胞増殖を阻害する
Ａ３７５細胞増殖におけるＳｔａｔ３の役割を評価するために、Ａ３７５−Ｓｔａｔ３−ＥＲ細胞をＯＳＭまたは４ＨＴの存在下で増殖させ、細胞数を３日間にわたり測定した。１μＭの濃度で、４ＨＴは親Ａ３７５細胞の増殖に影響しなかった。細胞を３５mm皿で増殖させ、総細胞数をＯＳＭおよび／または４ＨＴ処理０、２４、４８および７２時間後に血球計で測定した。その値を下記表２に示す。
【０１０５】
【表２】
2006505286.tif 000003
４ＨＴ処置(１μＭ)により、Ａ３７５−Ｓｔａｔ３−ＥＲ細胞数は約４０％まで減少し、これは１００ng／ml  ＯＳＭの効果と同等であった。このように、Ｓｔａｔ３活性は必要なだけでなく、Ａ３７５黒色腫細胞増殖の阻害に十分である。組み合わせた場合、４ＨＴおよびＯＳＭは、Ａ３７５−Ｓｔａｔ３−ＥＲ細胞数の著しい減少を誘導した。
【０１０６】
細胞数減少におけるＳｔａｔ３活性化の役割をさらに詳細に述べるために、Ａ３７５−Ｓｔａｔ３−ＥＲ細胞の細胞サイクル分析を、４ＨＴ、ＯＳＭまたは組み合わせ４ＨＴ／ＯＳＭ処理して行った。簡単に、細胞を示した時間(２４、４８および７２時間)に回収し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、ヨウ化プロピジウム緩衝液(１mM  クエン酸ナトリウム(ｐＨ４.０)、１.５mM  ＮａＣｌ、５mM  ＥＤＴＡ、５mM  ＥＧＴＡ、０.１％ＮＰ４０、４mg／ml  ヨウ化プロピジウムおよび８０mg／mlのＲＮａｓｅ  Ａ)に再懸濁した。３０分暗所で氷上インキュベーション後、細胞サイクルの分布をBecton Dickinson FACScanフロー・サイトメーターで測定した。その結果を下記表３に示す：
【表３】
2006505286.tif 000004
【０１０７】
４ＨＴは細胞サイクルプロフィールにごくわずかしか作用せず、処理４８時間後に、細胞サイクルのＧ１相の細胞の一過性の５％増加を誘導した。細胞サイクルは処理３日後に再び正常になり、そのとき細胞数は約４０％減少する。同様に、ＯＳＭ単独はＡ３７５細胞サイクルプロフィールにわずかしか効果がなかった。対照的に、４ＨＴとＯＳＭの組み合わせ添加により、細胞は、細胞サイクルのＧ１相の急速な(２４時間)遮断を受けた。４８時間で、細胞はＧ１で蓄積され、サブ−Ｇ１ピークおよびＰＡＲＰ開裂の見かけにより示されるようにアポトーシスにより死滅し始めた。アポトーシス細胞の割合は、刺激３日後に２０％に到達した。このように４ＨＴとＯＳＭの組み合わせ作用により誘導される細胞数の減少は、ＳＴＡＴ３介在細胞死が主な原因である。
【０１０８】
細胞サイクルの異なる相における細胞分布は影響を受けないが、細胞サイクルにおけるＳｔａｔ３活性化の効果は、Ｇ１に同調しているＡ３７５  Ｓｔａｔ３−ＥＲ細胞の放出により観察できる。４ＨＴ−処置細胞がＳ相に入るのは、コントロール細胞と比較して遅かった。これらの結果は、細胞サイクル分布には影響しないが、Ｓｔａｔ３活性は細胞サイクルを通した進行を遅延させることを示す。
【０１０９】
実施例４：Ｓｔａｔ３遺伝子の転写的解析
Ｓｔａｔ３が細胞増殖および細胞死に影響する能力を理解するために、我々は、オリゴヌクレオチドマイクロアレーを使用して、Ａ３７５細胞におけるＳｔａｔ３活性化により発現される遺伝子のプロフィールを試験した。実験を、同量のＳｔａｔ３−ＥＲを発現するおよびＤＮＡ結合に同等の応答をする二つの独立したクローンで、Ｓｔａｔ３−駆動レポーターアッセイおよび細胞増殖の阻害で行った。ＤＮＡ結合実験およびレポーターアッセイは、Ｓｔａｔ３結合および転写活性が４ＨＴ添加２および４時間後に強く増加することを示した(実施例１参照)。これはマイクロアレー実験で確認された。
【０１１０】
簡単に、マイクロアレイ分析を、HG U95A GeneChipsTM(Affymetrix, Santa Clara, USA)を使用して、本質的に製造者の指示にしたがって行った。Ｓｔａｔ３−ＥＲ発現細胞を４ＨＴで４、２４および７２時間刺激し、その後ＲＮＡを回収した。３つの独立した実験由来のＲＮＡを貯蔵し、ビオチン標識ｃＲＮＡプローブを各サンプルから、１０μgの総細胞性ＲＮＡから開始して製造した。得られたビオチニル化ｃＲＮＡを、１２,０００以上の配列を含むAffymetrix U95Aオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズし、シグナルを検出した。チップ分析を、Affymetrix Microarray Suite v5(チップスケーリングのために標的強度５００を使用)およびGeneSpring 4.2.1(Silicon Genetics)を使用して行った。遺伝子発現の変化を符号付きウィルコキソン検定(Affymetrixにより推奨されるように)を使用して複製の間の一致した変化を探すことにより評価した。“変化”ｐ値閾値は発現の増加に関しては＜０.００３であり、発現の減少に関しては＞０.９９７であった。一致分析の後、これらの値は各々＜９×１０−６および＞０.９９９９９１となった。全ての実験条件で検出されたｐ値が＞０.０５である遺伝子を信頼できないデータとして分析から除いた。
【０１１１】
非処理細胞と比較して両方のクローンを有意に増加または減少した遺伝子(ｐ＜０.００３)をこの結果同定したが、さらなる実験のためにその発現が２倍以上変化した遺伝子のみを選択した。４ＨＴにより非トランスフェクトＡ３７５細胞で有意に増加または減少した遺伝子を、Ｓｔａｔ３−ＥＲ発現細胞における変化がＡ３７５細胞における変化と比較して両方のクローンで２倍以上である限り、除いた。
いくつかの既知のＳｔａｔ３標的遺伝子が我々の系で誘導され、我々の実験的試みの正当性を確認する(表４)。
【０１１２】
【表４】
2006505286.tif 000005
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１１３】
例えば、Ｊａｋ活性を妨害することによりＳｔａｔシグナル伝達の負のフィードバックに関与するＪａｋ／Ｓｔａｔシグナル伝達のインヒビターであるＳＯＣＳ３は、４ＨＴ処理により急速に上昇した(処理後１時間ほど早く)。同様に、Ｃ／ＥＢＰデルタ、ＪｕｎＢおよびアルファ−アンチキモトリプシン(セルピンＡ３)は、４ＨＴ処理により有意に増加した。しかしながら、他のＳｔａｔ３標的遺伝子も急速に活性化し、したがって新規Ｓｔａｔ３標的遺伝子として同定された。これらはＴＥＬ／Ｅｔｖ６転写因子、死関連タンパク質キナーゼ１(ＤＡＰＫ１)およびセリンプロテアーゼインヒビターセルピンＢ３を含む。
【０１１４】
全体的に４ＨＴ−誘導Ｓｔａｔ３活性化は、限定された数の遺伝子の発現の変化をもたらした。実際、処理２４時間後、１５４遺伝子が有意に増加し、かつ２３が減少したが、３９遺伝子のみが２倍以上上方制御された(表４)。遺伝子の配列は当分野で既知であり、Genbankのような種々のデータベースで提供される。遺伝子は、Ｓｔａｔ３依存性応答を介在する転写レギュレーター；レセプター(例えば、サイトカインレセプター、ＯＳＭレセプターおよび、ＩＬ−６タイプレセプターファミリーに属するサイトカインレセプター−様因子−１)；細胞内シグナル伝達分子；接着タンパク質(オステオポンチンのような)および細胞代謝の種々の側面に関連するような種々の機能グループに指定できる。
【０１１５】
Ｓｔａｔ３ＥＲ発現Ａ３７５細胞中の４ＨＴ−誘導遺伝子のマイクロアレースクリーニングの結果は、より生理学的なＳｔａｔ３アクティベーター、すなわちＯＳＭを使用して確証した。ＯＳＭがＭＡＰＫ、リボソームＳ６キナーゼまたはタンパク質キナーゼＣのようなｇｐ１３０を介したＳｔａｔ３以外の複数の経路を活性化するため、我々は、ＯＳＭ−誘導転写プロフィールが広いが、４ＨＴ標的を含むことを予期した。Ｓｔａｔ３−ＥＲ発現細胞において、ほとんどの４ＨＴ標的はまたＯＳＭ標的であった(表４)。しかしながら、ＯＳＭはより緩和な転写応答を誘発し、したがってほとんどの遺伝子が２倍閾値を超えて増加しなかった。フィブロネクチン、インターロイキン−８およびｃ−Ｊｕｎを含むいくつかの遺伝子は、ＯＳＭ標的ではないように見えた。逆に、いくつかの遺伝子がＯＳＭにより、４ＨＴよりもより効率的に誘導されるように見えた。クラスII主要組織適合複合体、推定癌抑制遺伝子Ａｉｍ２および癌原遺伝子ｃ−Ｍａｆを含むこれらの遺伝子の転写活性は、Ｓｔａｔ３の活性化だけでなく、ＭＡＰＫまたはＰＩ３Ｋ経路のような別の経路にも依存している。
【０１１６】
実施例５：細胞増殖のＳｔａｔ３介在阻害におけるＣ／ＥＢＰデルタの役割
低分子量干渉(ｓｉ)ＲＮＡを使用して、実施例３で細胞増殖のＳｔａｔ３−誘導阻害において役割を演じることが同定された遺伝子の発現を妨害する。この実施例は、４ＨＴまたは４ＨＴとＯＳＭの組み合わせで処理したＳｔａｔ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞の細胞増殖、続くＣ／ＥＢＰｄに対するｓｉＲＮＡの非存在下または存在下での細胞増殖にしたがう。
【０１１７】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションに関して、細胞をトランスフェクション前日に５×１０４細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに蒔いた。ｓｉＲＮＡ二本鎖をOligofectatAMINE試薬(Life Technologies)を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、１０μlの２０μＭ  ｓｉＲＮＡおよび３μlのトランスフェクション試薬／ウェルと共に挿入した。以下の２１量体オリゴヌクレオチドペアを使用した：
Ｃ／ＥＢＰデルタ  ｓｉＲＮＡ  nt  ８４４−８６４、5'-GCAGCUGCCCAGCCCGCCCdTdT-3'(配列番号２)および5'-GGGCGGGCUGGGCAGCUGdTdT-3'(配列番号３)。
【０１１８】
ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡをコントロールとして使用した。設計したＲＮＡオリゴヌクレオチドをＧＥＮＢＡＮＫ／ＥＭＢＬデータバンクに対して“BLAST検索(blasted)”し、遺伝子特異性を確認した。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは市販品から得た。発現ベクターをｓｉＲＮＡトランスフェクション１日後、Effecteneを使用して行った。定量的ＰＣＲで試験した場合、Ｃ／ＥＢＰデルタｍＲＮＡは４ＨＴ処理により有意に増加し、ＯＳＭ／４ＨＴ組み合わせ処理により強く増加し、マイクロアレー分析の結果を確認した。Ｃ／ＥＢＰデルタｓｉＲＮＡはＣ／ＥＢＰデルタの発現を有意に減少させた。コントロールｓｉＲＮＡの存在下、細胞増殖の約４０−４５％阻害が観察された。Ｃ／ＥＢＰデルタｓｉＲＮＡ存在下、Ａ３７５細胞増殖は有意に減少し(〜４０％、３つの独立した試験の平均、すなわち、細胞増殖の約２５％までの阻害)、Ｃ／ＥＢＰデルタがＳｔａｔ３機能のメディエーターであることを示唆した。
【０１１９】
実施例６：ＴＥＬはＳｔａｔ３活性の負のレギュレーターである
マイクロアレーデータは、ＴＥＬ  ｍＲＮＡがＳｔａｔ３活性化の４時間以内に増加することを示す。ＴＥＬは通常、ＡＴＧコドン１および４３でのＴＥＬ  ｍＲＮＡ翻訳開始に対応する(ＴＥＬおよびＴＥＬ−４３)、二つのタンパク質イソ型として発現する。ＴＥＬの両方のイソ型は、ＡＳＥＲ細胞への４ＨＴ添加８時間以内に有意に増加し、処理２４時間後に著しく増加した。ＴＥＬがＳｔａｔ３の天然標的であるかどうかを確認するために、我々は、ＯＳＭまたはＩＬ−６に応答した、ヒト癌細胞系細胞系でのその発現を試験した。実際ＴＥＬ発現は、Ｔ４７ＤおよびＳＫＢｒ−３乳癌細胞、ＤＵ１４５前立腺癌腫細胞およびＨｅｐＧ２肝腫由来細胞のＩＬ−６／ＯＳＭ処理に続いて増加した。しかしながら、ＴＥＬ発現は前立腺癌細胞ＰＣ３およびＬＮＣａＰおよびＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞を含む他の細胞系では、これらの細胞系各々でもＳｔａｔ３がＩＬ−６／ＯＳＭ処理により活性化されることが期待されたにもかかわらず、変わらなかった。
【０１２０】
本質的に実施例４に記載のように、しかし、ＴＥＬ  ｓｉＲＮＡ  nt  ５４０−５６０、5'-CCCUCCCACCAUUGAACUGdTdT-3'(配列番号４)および5'-CAGUUCAAUGGUGGGAGGGdTdT-3'(配列番号５)を使用して、細胞増殖のＳｔａｔ３介在阻害におけるＴＥＬの機能を試験するために実験を行った。この実施例は、４ＨＴまたは４ＨＴとＯＳＭの組み合わせで処理したＳｔａｔ３−ＥＲ発現Ａ３７５細胞の、ＴＥＬに対するｓｉＲＮＡの非存在下または存在下での増殖にしたがう。
【０１２１】
タンパク質分析をウェスタンブロッティングにより行った。簡単に、細胞をＮＰ４０抽出緩衝液(５０mM  Ｔｒｉｓ(ｐＨ７.５)、１mM  ＥＧＴＡ、５mM  ＥＤＴＡ、１２０mM  ＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、２mM  オルトバナジウム酸ナトリウム、５０mM  フッ化ナトリウム、
【化１】
2006505286.tif 000009
１０μg／ml  ロイペプチン、１０μg／ml  アプロチニン、および０.５mM  フェニルメチルスルホニルフルオリド)で５分氷上で回収した。融解物を遠心により浄化し、タンパク質濃縮をBio-Radタンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad Laboratories Gmbh, Munich, Germany)を使用して測定した。免疫沈殿のために、等量のタンパク質をSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)のＳｔａｔ３(Ｃ−２０)と１時間インキュベートした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)に続き、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜(Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)にブロットした。５０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の１０％ウマ血清(Life Technologies, Inc.)でブロックした後、フィルターを特異的抗体；Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)からのｃ−ＴＥＬ、Ｓｔａｔ３(Ｃ−２０)、Cell Signaling Technology(Beverly, MA)からのホスホ−Ｓｔａｔ３(Ｔｙｒ７０５)でプローブした。タンパク質を増強された化学ルミネッセンス検出系(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, United Kingdom)を使用して、ペルオキシダーゼ結合二次抗体で可視化した。
【０１２２】
タンパク質レベルでの分析は、４ＨＴまたは４ＨＴ／ＯＳＭ処理によりＴＥＬが強く増加することが確認された。この増加はＴＥＬ  ｓｉＲＮＡの存在下で非常に防止された。驚くべきことに、ＴＥＬ  ｓｉＲＮＡの存在下、Ａ３７５細胞増殖のＳｔａｔ３介在阻害は有意に増加した(約２８％から約４０％に)。これらの結果は、ＴＥＬがＳｔａｔ３活性のＳｔａｔ３が誘導する負のレギュレーターとして作用することを示唆した。
【０１２３】
ＴＥＬ発現の阻害がＳｔａｔ３活性に直接影響するか否かを試験するために、Ｓｔａｔ３依存性転写活性を、Ｓｔａｔ３−ＥＲ発現Ａ３７５で、ＴＥＬ  ｓｉＲＮＡの非存在下または存在下、上記のルシフェラーゼ活性を使用してアッセイした。４ＨＴまたはＯＳＭにより誘導されたルシフェラーゼのＳｔａｔ３依存性転写は、ＴＥＬ発現がｓｉＲＮＡにより減少した場合、有意に増加した(各々コントロールよりも約６から１６倍増加、および約９倍から１８倍増加)。
【０１２４】
したがって、ＴＥＬの発現は、ＴＥＬ  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより、コントロールＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞で観察されたレベルと比較して、強く減少した。加えて、４ＨＴおよびＯＳＭ処理Ｓｔａｔ３ＥＲＡ３７５細胞におけるＳｔａｔ３の抗増殖性効果は、コントロールＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡ処理培養と比較してＴＥＬ  ｓｉＲＮＡ処理培養において強く、Ｓｔａｔ３シグナル伝達のＳｔａｔ３が誘導する負のレギュレーターとしてのＴＥＬの機能をさらに支持した。
【０１２５】
Ｓｔａｔ３ＥＲＡ３７５細胞およびＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＬの過剰発現は、４ＨＴ(５０から７５％)およびＯＳＭ(＞７０％)に応答したＳｔａｔ３活性の強い減少をもたらした。これらの結果は、ＴＥＬがＳｔａｔ３転写活性の負のレギュレーターであることを証明する。
【０１２６】
要約すると、ＩＬ−６−タイプサイトカインによる乳癌腫および黒色腫の細胞増殖の阻害は、本明細書ではＡ３７５細胞で例示しているが、ＴＥＬ活性の減少により誘導できるＳｔａｔ３活性に依存している。
【０１２７】
実施例７：トリコスタチンＡによるＴＥＬ活性の阻害
ＴＥＬリプレッサー活性は、ｍＳｉｎ３Ａ、ＮｃｏＲおよびＳＭＲＴ(Chakrabarti and Nucifora 1999; Wang and Hiebert 2001)を含む、コ−リプレッサー複合体の補充に依存しており、これらはヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)と相互作用することが知られている。この実施例は、ＨＤＡＣ補充がＳｔａｔ３転写活性のＴＥＬ依存性抑制で役割を演じるか否かを見るために行う。
【０１２８】
簡単に、４ＨＴで処理した、ＴＥＬ−またはコントロール、ｐｃＤＮＡ３.１−トランスフェクトＳｔａｔ３ＥＲＡ３７５細胞を、本質的に上記のような一般的なＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ(ＴＳＡ；２５０ｎＭ)の存在下または非存在下で培養した。ＴＳＡの４ＨＴ刺激細胞への添加は、ＴＥＬによるＳｔａｔ３活性の抑制を予防するが、ｐｃＤＮＡ３.１トランスフェクト細胞におけるＳｔａｔ３介在転写活性には影響しなかった。このように、Ｓｔａｔ３介在転写におけるＴＥＬの阻害効果は、ＨＤＡＣの補充に依存する。
【０１２９】
実施例８：ＴＥＬはＳｔａｔ３活性をＤＮＡ結合ドメインと無関係に抑制する
この実施例は、ＴＥＬのどの領域がＳｔａｔ３転写活性の抑制に必要であるか、Ｓｔａｔ３ＥＲ−Ａ３７５細胞またはＨＥＫ−２９３細胞に種々のＴＥＬ変異体を発現させ、４ＨＴ−またはＯＳＭ−誘導Ｓｔａｔ３転写活性におけるその効果を評価することにより試験した。コ−リプレッサーであるＨＤＡＣ含有複合体がＴＥＬの少なくとも二つの異なるドメイン、ポインテッド・ドメインおよび中央抑制ドメインと相互作用することが既知であるため(Chakrabarti and Nucifora 1999; Wang and Hiebert 2001)、これらの両方の構築物をアッセイに包含させた。使用した構築物は：ＴＥＬΔ４１−１２７(すなわちΔＰ)、ＴＥＬΔ１２２−１７６、ＴＥＬΔ１２２−２１７、ＴＥＬΔ２６８−３３３、ＴＥＬΔ３０３−３３３、ＴＥＬΔ３３３−３５２、ＴＥＬΔ４４２−４５２、ＴＥＬＤＢＤＭ(Ｒ３９６Ｋ；Ｒ３９９Ｋ)であった。
【０１３０】
概説すると、Ｓｔａｔ３−ＥＲ−Ａ３７５細胞およびＨＥＫ２９３細胞を異なるＴＥＬ変異体、Ｓｔａｔ３レポータープラスミドおよびウミシイタケ(Renilla)プラスミドでトランスフェクトした。細胞を４ＨＴまたはＯＳＭで２４時間処理し、ルシフェラーゼ活性を実施例１に記載のルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。ポインテッド・ドメインを欠くＴＥＬΔＰのみがＳｔａｔ３活性の抑制をしなかった。ＴＥＬデルタ３３３−４５２はＳｔａｔ３活性を抑制したが、ＴＥＬデルタ４４２−４５２はＳｔａｔ３活性を抑制できなかった。ＴＥＬ、ＴＥＬデルタＰ、ＴＥＬデルタ３３３−４５２およびそれより程度は低いがＴＥＬデルタ４４２−４５２はまだＳｔａｔ３と相互作用した。ＴＥＬのＤＮＡ結合変異体は、両方の細胞タイプで４ＨＴ−またはＯＳＭ−誘導Ｓｔａｔ３活性を抑制する能力を維持しており、ＴＥＬがＳｔａｔ３活性をＤＮＡ結合ドメインと無関係に抑制するが、ポインテッド・ドメインの少なくとも一部を必要とすることを示唆する。
【０１３１】
実施例９：ＴＥＬはＳｔａｔ３と直接相互作用する
ＴＥＬ  ＤＮＡ結合ドメインはＳｔａｔ３活性の抑制に必要ではないため、この実施例は、ＴＥＬが直接Ｓｔａｔ３と相互作用する可能性を試験する。核に富むフラクションからの抽出物を、コントロールまたはＯＳＭ−刺激Ａ３７５細胞から調製した。抗体でプロービングした核融解物は、ＯＳＭ処理後の予期されたＳｔａｔ３レベルの上昇を確認するが、一方、ＴＥＬの核含量はＯＳＭにより影響されない。内因性ＴＥＬがＳｔａｔ３免疫沈降物に存在し、ＴＥＬのレベルはコントロール処理核抽出物と比較してＯＳＭ処理核抽出物で上昇したＳｔａｔ３と関連した。逆に、Ｓｔａｔ３はＴＥＬ含有複合体に存在し、固定化ＧＧＡＡ−含有オリゴヌクレオチドを介して低下し、該ヌクレオチドはＴＥＬの結合部位である。総合すると、これらの結果は、ＴＥＬは、Ｓｔａｔ３転写活性を、Ｓｔａｔ３と直接相互作用し、かつＨＤＡＣをＳｔａｔ３転写複合体に補充することにより抑制することを示唆する。
【０１３２】
本明細書ならびに２００３年８月１４日出願のＵＳ特許出願第６０／４９５,３０９号に引用した全ての刊行物は、出典明示により各々が個々に記載されているかのごとく本明細書に包含させる。
【配列表】
2006505286.tif 000010
2006505286.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月23日(2005.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006505286000001.app
【国際調査報告】
2006505286.tif 000012
2006505286.tif 000013
2006505286.tif 000014
2006505286.tif 000015
2006505286.tif 000016
2006505286.tif 000017