(57)【要約】実質的にテトラマーを含まないヘモグロビン溶液及び実質的にテトラマーを含まないヘモグロビン溶液を生成するための方法。この方法は、ヘモグロビンの溶液を重合するステップ、重合ヘモグロビン溶液を処理して、このポリマーをテトラマーへと部分的に分解するステップ、及びこのヘモグロビン溶液からテトラマーを除去するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的にテトラマーを含まないヘモグロビン溶液を生成するための方法であって、
ａ）溶液中のヘモグロビンを重合するステップ；
ｂ）溶液中の前記重合ヘモグロビンを熱処理するステップ；
ｃ）溶液中の前記重合ヘモグロビンからテトラマーを除去するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ヘモグロビンが哺乳動物の血液由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物の血液がヒト血液であり、前記ヘモグロビンがピリドキシル化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘモグロビンがウシ血液由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘモグロビンがグルタルアルデヒドを用いて重合される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記テトラマーが濾過によって除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記熱処理が、約４５℃よりも高い温度で少なくとも約２４時間前記溶液を加熱するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）の完了時の前記テトラマー濃度が、前記溶液中の総ヘモグロビンの約１．０％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）の完了時の前記テトラマー濃度が、前記溶液中の総ヘモグロビンの約０．３％未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）に加えて、前記熱処理するステップの前に前記溶液からテトラマーを除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液がテトラマーを本質的に含まなくなるまで、前記熱処理するステップの前に前記溶液からテトラマーを除去する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記熱処理するステップの前の前記テトラマー濃度が、前記溶液中の総ヘモグロビンの約１．０％未満である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記熱処理するステップの前の前記テトラマー濃度が、前記溶液中の総ヘモグロビンの約０．３％未満である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法によって生成されるヘモグロビン溶液。
【請求項１５】
本質的にテトラマーを含まない重合ヘモグロビン溶液を安定化するための方法であって、
前記重合ヘモグロビン溶液を処理して、前記重合ヘモグロビンをテトラマーへと部分的に分解するステップ、及び
前記溶液から前記テトラマーを除去するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記処理するステップが、前記溶液を熟成させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記処理するステップが、前記テトラマー濃度が溶液中の総ヘモグロビンの約１．０％より高くなるまで前記溶液を熟成させるステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記処理するステップが、前記溶液を加熱するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記処理するステップが、前記テトラマー濃度が溶液中の総ヘモグロビンの約１．０％より高くなるまで前記溶液を加熱するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヘモグロビンが哺乳動物の血液由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物の血液がヒト血液であり、前記ヘモグロビンがピリドキシル化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヘモグロビンがウシ血液由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヘモグロビンがグルタルアルデヒドを用いて重合される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記テトラマーが濾過によって除去される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記加熱するステップが、約４５℃よりも高い温度で少なくとも約２４時間前記溶液を加熱するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
安定化された重合ヘモグロビン溶液を生成するための方法であって、
ａ）重合ヘモグロビン溶液を生成するステップ；
ｂ）前記重合ヘモグロビン溶液からテトラマーを除去して、テトラマーを実質的に含まない重合ヘモグロビン溶液を生成するステップ；
ｃ）前記重合ヘモグロビン溶液を熟成させるステップ；及び
ｄ）作製したテトラマーを除去するステップ
を含む方法。
【請求項２７】
前記熟成させるステップが、前記テトラマー濃度が総ヘモグロビンの約１．０％より高くなるまで前記ヘモグロビン溶液を保存するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記熟成させるステップが、前記テトラマー濃度が総ヘモグロビンの約３．０％より高くなるまで前記ヘモグロビン溶液を保存するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記熟成させるステップが、前記ヘモグロビン溶液を１年を超えて保存するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
テトラマーを実質的に含まないヘモグロビン溶液を生成するための方法であって、
ａ）溶液中のヘモグロビンを、重合剤を含む重合反応に供するステップ；
ｂ）前記重合反応を、クエンチ剤でクエンチするステップ；
ｃ）前記クエンチするステップの間に前記溶液を加熱するステップ；
ｄ）前記溶液中の重合ヘモグロビンからテトラマーを除去するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
前記溶液が、少なくとも３時間にわたって、前記クエンチするステップの間に少なくとも約４０℃に加熱される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶液が約４０℃〜５０℃に加熱される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／４４３，４３６号（２００３年１月２９日出願）の特典を主張する。
【０００２】
本発明は、安定化された酸素運搬溶液に関する。より具体的には、本発明は、ポリマー結合安定性を増強するため及び作製されたテトラマーを除去するために処理されたヘモグロビン溶液に関する。
【背景技術】
【０００３】
増加し続ける手術及び外傷の負担のため、並びに血液銀行の不足を補充するための、すぐに使用できる血液製品に対する一貫した必要性が存在する。酸素運搬溶液（例えば、ヘモグロビン由来溶液）は、増強された酸素運搬能力を必要とする患者のために、白血球又は赤血球の代わりに使用することができる。これらの溶液はドナーの利用可能性に依存しないので、このような溶液は、緊急の状況又は血液銀行の不足の間に、より容易に入手可能とすることができる。また、輸血の結果としての血液由来の病原体の感染の危険性により、患者は、白血球又は赤血球の代わりに、輸血用にヘモグロビン由来溶液を好む可能性がある。特に、このような溶液には、米国特許第６，４９８，１４１号、同第６，１３３，４２５号、同第５，４６４，８１４号、同第５，４３８，０４１号、同第５，２１７，６４８号、同第５，１９４，５９０号、同第５，０６１，６８８号及び同第４，８２６，８１１号（これらの教示は、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる）に開示されるような、酸素担体、血液代用品及びヘモグロビン由来組成物が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０００４】
ストローマフリーヘモグロビンは、酸素輸送能及び可逆的酸素（又はリガンド）結合能を有することが当該分野で公知である。しかし、ヘモグロビン溶液は、生命を維持するのに充分な量の酸素を運搬し得るものの、いくつかの所望されない副作用（例えば、腎機能の低下）により問題があった。これらの作用は、溶液から除去されない望ましくない混入物（例えば、細菌内毒素又は赤血球膜の断片（ストローマ））の存在に起因すると考えられた。これらのような混入物は腎変化を実際に生じ得るが、このような混入物を本質的に含まないヘモグロビン溶液でもなお、実質的な腎機能不全を生じる。腎機能不全の原因は、とりわけ、生理学的に許容できない量の非重合ヘモグロビンテトラマーに帰することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本質的にテトラマーを含まないヘモグロビン溶液は、血管収縮、腎毒性、血色素尿症又は作製若しくは半作製の酸素担体及び血液代用品の静脈内投与に関連する他の問題点を引き起こすことなく、ヒト患者の血液体積の本質的にすべてを補充するために使用することができる。これらの溶液は優れた効果を提供するものの、ヘモグロビンポリマーは経時的にテトラマー単位へとゆっくりと分解することが知られているので、この製品の貯蔵寿命は限定されている。したがって、溶液の貯蔵寿命を増加させるために、長期間にわたって、実質的にテトラマーを含まない溶液としてこの溶液を維持するための方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、実質的にテトラマーを含まないヘモグロビン溶液を生成するための方法を提供し、この方法は、溶液中でヘモグロビンを重合するステップ、重合ヘモグロビンを処理してテトラマーを作製するステップ、及び重合ヘモグロビン溶液からテトラマーを除去するステップを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、ヘモグロビンの溶液を重合するステップ、重合ヘモグロビン溶液を熱処理してテトラマーを作製するステップ、及び重合ヘモグロビン溶液からテトラマーを除去するステップによって生成される、テトラマーを実質的に含まないヘモグロビン溶液に関する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、重合ヘモグロビン溶液を安定化するための方法に関し、この方法は、重合ヘモグロビン溶液を処理して、重合ヘモグロビンをテトラマーへと部分的に分解するステップ、及びこの溶液からテトラマーを除去するステップを含む。
【０００９】
なお別の態様において、本発明は、安定化された重合ヘモグロビン溶液を生成するための方法を提供する。この方法は、重合ヘモグロビン溶液を生成するステップ、重合ヘモグロビン溶液からテトラマーを除去して、テトラマーを実質的に含まない重合ヘモグロビン溶液を生成するステップ、重合ヘモグロビン溶液を熟成させてテトラマーを作製させるステップ、及び作製したテトラマーを除去するステップを含む。この熟成させるステップは、このテトラマー濃度が総ヘモグロビンの約１．０％より高くなるまで（例えば、１年を超えて）このヘモグロビン溶液を保存するステップを含み得る。
【００１０】
このヘモグロビンは、哺乳動物の血液（例えば、ヒト又はウシの血液）由来であり得る。このヘモグロビンは、グルタルアルデヒドを用いて重合することができる。このテトラマーは、濾過によって除去することができる。テトラマーを作製するための重合した溶液の処理は、約４５℃よりも高い温度で少なくとも約２４時間この溶液を加熱することによって達成することができる。テトラマーを除去するステップの後のテトラマー濃度は、この溶液中の総ヘモグロビンの約１．０％未満又はこの溶液中の総ヘモグロビンの約０．３％未満であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、ストローマ、ストローマ性混入物及び他の混入物を実質的に含まない、本質的にテトラマーを含まない、架橋され、重合したヘモグロビンを含む酸素運搬溶液を提供する。
【００１２】
本発明を詳細に記載する前に、いくつかの用語を定義する。本明細書中で使用される用語は、特定の実施例のみを記載する目的のためのものであり、限定することを意図しないことと理解されるべきである。本明細書中で使用する場合、単数形「１つの（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）」は、文脈が明確に他を示さない限り複数形の指示対象を含む。
【００１３】
「ヘモグロビン」とは、任意の供給源由来のヘモグロビンをいう。ヘモグロビンは、ヒト、ウシ、ブタ及びヒツジを含む哺乳動物由来でもよく、他の供給源由来でもよい（例えば、ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、１２：５５−５９（１９９４）に記載される遺伝子導入により生成されたヘモグロビン、及び組換えにより生成されたヘモグロビン（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：２５８−２６０（１９９２）に記載される組換えにより生成されたヘモグロビン））。本明細書中で使用する場合、％総ヘモグロビン（ＴＨｂ）は、１００ｍＬの溶液中のヘモグロビンのグラム数として定義される。
【００１４】
「ヘモグロビンの溶液」とは、テトラマーヘモグロビン分子又は重合ヘモグロビン分子の溶液をいい、この溶液において、これらの分子は赤血球内に含まれていない。このような溶液は、赤血球のストローマ若しくはストローマ性混入物を含まないもの又は実質的に含まないものである必要はない。しかし、本発明の一態様において、重合ヘモグロビンの溶液は、赤血球のストローマ又はストローマ性混入物を実質的に含まない。
【００１５】
「架橋（された）」とは、その分子の形状、サイズ、機能又は物理的特徴を変更する目的での、分子上若しくは分子中への、又は分子間での、分子「橋」の化学的配置を意味する。架橋された分子は、重合されていても重合されていなくてもよい。すなわち、架橋された分子はテトラマー性であり得る。
【００１６】
「テトラマー」又は「テトラマー（性）」とは、約６４Ｋｄの分子量を有するヘモグロビン分子をいう。すなわち、この用語は、未変性のヘモグロビン分子及び分子内架橋されたヘモグロビン分子の両方をいう。本明細書中で使用する場合、％テトラマーとは、溶液中の総ヘモグロビン（ＴＨｂ）の量の百分率としてのテトラマーの量をいう。例えば、１０％のＴＨｂ及び１％のテトラマーを有する１００ｍＬのヘモグロビン溶液は、溶液中に０．１ｇのテトラマーを有する。
【００１７】
「本質的にテトラマーを含まない」とは、哺乳動物中に投与されたテトラマーに対する特定の生物学的応答がもはや存在しない、テトラマー混入に関する純度のレベルを意味する。主な基準は、薬学的に有効な量が注入された場合に腎機能の変化が存在しないこと、すなわち、約９９％以上の純度のレベル（約１％未満のテトラマーが存在する）である。本発明の方法によって生成される好ましい製品は、総ヘモグロビン（ＴＨｂ）の重量に基づいて、約０．８％以下のテトラマーを含む。言い換えると、本発明に従う本質的にテトラマーを含まない製品は、生理学的に許容される量以下の非重合ヘモグロビンテトラマーを含む。本発明の特に好ましい製品は約０．５％未満のテトラマーを含み、本発明の最も特に好ましい製品は、約０．３％〜０．４％のテトラマーを含む。このような量のテトラマーは生理学的に許容されることが見出されている。
【００１８】
「作製」又は「テトラマー作製」とは、テトラマーへの重合ヘモグロビンの分解に起因する、溶液中のテトラマーの量の増加をいう。ポリマーの分解は、化学物質を用いた処理、温度、時間又はこれらの組合せの結果であり得る。一般に、テトラマーは、加熱の際又は重合した溶液が熟成する際に作製される。したがって、％テトラマーは、溶液の保存の間に増加する。テトラマー作製は、重合ヘモグロビン溶液を加熱することによって加速することができる。溶液中のテトラマーの量の任意の増加後に、作製が生じたといわれる。本明細書中で使用する場合、重合ヘモグロビンの部分的な分解とは、溶液中のポリマーのすべてではないがいくらかかがテトラマーへと分解されることをいう。
【００１９】
ヘモグロビン溶液を「熟成させる」とは、任意の温度で任意の時間量にわたってこの溶液を保存することをいう。より高い温度は、ヘモグロビン溶液に対する熟成の効果を加速する。「熟成された」ヘモグロビン溶液は、保存されてその結果テトラマーが作製した溶液である。
【００２０】
「予備処理」又は「テトラマーの予備処理」とは、テトラマーの作製を促進するために熱処理を利用する技術をいう。
【００２１】
「ホットクエンチ」とは、反応を完了させるために重合クエンチ反応の間に溶液を加熱するステップを含む処理技術をいう。
【００２２】
「重合する」又は「重合（した）」とは、分子間若しくはテトラマーサブユニット間の分子橋の配置の作用又はその結果を意味し、ここで、得られた重合分子のサイズ及び重量は、未変性又はテトラマーのヘモグロビンと比べて増加している。重合ヘモグロビンはテトラマーヘモグロビンではない。重合は、生化学的に適切な担体中で種々の重合剤（グルタルアルデヒド、イミドエステル又はその他を含む）を使用して達成することができ、また当業者に周知である。
【００２３】
「ピリドキシル化（された）」又は「ピリドキシル化」とは、ピリドキサール−５’−ホスフェート（「Ｐ５Ｐ」）又は２−Ｎｏｒ−ホルミルピリドキサール−５’−ホスフェートとヘモグロビン分子を反応させることによる、ヘモグロビン分子へのピリドキサール−５’−ホスフェート含有分子の結合の方法又はその結果をいう。ピリドキシル化は、可逆的酸素結合能を都合よく変更する、すなわち、特定の哺乳動物ヘモグロビン（例えば、ヒトヘモグロビン）のＰ５０を増加させることが示されている。
【００２４】
「安定（な）」又は「安定性」とは、分解に対して抵抗性であり、不安定な溶液の貯蔵寿命よりも長い保存寿命を有するヘモグロビン溶液の状態又は特徴をいう。例えば、本発明に従って安定化されたヘモグロビン溶液は、本発明に従って調製されていない溶液と比較して、溶液の保存の間により少ないか又はより遅いテトラマー作製を有する。ヘモグロビン溶液の安定性は、テトラマー作製と無関係ないくつかの他のパラメータ（例えば、デオキシヘモグロビンが如何に迅速にオキシヘモグロビン又はメタヘモグロビンに変換されるかを含む）に依存する。このパラメータは、とりわけ、保存の間にパックされた溶液に酸素が入るのを防ぐことによって制御することができる。安定化されたヘモグロビン溶液は、非安定化溶液よりも遅い速度でではあるが、なお分解し得る。
【００２５】
本発明は、テトラマー（未変性又は分子内架橋された）ヘモグロビン、ストローマ性混入物及び種々の他の混入物を本質的に含まない重合ヘモグロビン溶液を提供する。この溶液は、生理学的に許容され、なおかつ治療的及び臨床的に有用である。この製品は、酸素輸送特性に必要な可逆的酸素結合能を有する。この製品は、全血と類似した酸素−ヘモグロビン解離曲線（Ｐ５０）を有することと相関する、使用における良好な酸素充填特徴及び非充填特徴を実証する。この製品は、肺を通る毛細管中で高い親和性で酸素を結合し、次いで身体中の組織へと適切に酸素を放出する。この製品はまた、レシピエントとの適合性研究を必要としない。
【００２６】
一態様において、この製品はまた、ヒトに投与される場合、少なくとも約１５時間の半減期を有し得る。別の態様において、この半減期は約２４時間よりも長い。このヘモグロビン製品は、血管収縮、腎毒性、血色素尿症又は作製若しくは半作製の酸素担体及び血液代用品の静脈内投与に関連する他の問題点を引き起こすことなく、ヒト患者の血液体積の本質的にすべてを補充するために使用することができる。
【００２７】
本発明の得られた製品の半減期は、哺乳動物（例えばヒト）においてｉｎ  ｖｉｖｏで決定される。典型的に、この製品を哺乳動物に注入した後の一定の時間期間、血液サンプルを哺乳動物から採取する。次いで、この血液サンプルを遠心分離し、血漿部分を搾り出し、血漿ヘモグロビンレベルを分光光度法により決定し、次いで哺乳動物中に残存する製品の量をこの製品の半減期と相関させることによって、この製品の量を決定する。
【００２８】
本発明の方法により、増強された貯蔵寿命を有する安定化された重合ヘモグロビン溶液が得られる。一般に、テトラマーは、重合ヘモグロビン溶液が熟成する際に作製する。作製されたテトラマーは、本発明の方法によって、熟成ヘモグロビン溶液から除去することができる。テトラマーを除去するために処理された熟成ヘモグロビン溶液は、新たに処理された（熟成されていない）ヘモグロビン溶液と比較して、さらなる保存の際によりゆっくりしたテトラマー作製を示す。したがって、本発明に従って処理されたヘモグロビン溶液は、テトラマー作製に関して、新たに処理された溶液よりも高い安定性を示す。
【００２９】
一般に、生理学的及び臨床的に有用なヘモグロビン溶液は、１．０％未満のテトラマーを含むことが見出されている。したがって、テトラマーは、保存の間に経時的に作製され、ヘモグロビン溶液についての合理的な貯蔵寿命を可能にするので、溶液中でテトラマーが作製されるであろうことを予測して、新たに処理したヘモグロビン溶液は約０．３％未満のテトラマーを含むことが所望されるが、この溶液は、テトラマーが１．０％に達するまでは生理学的に有用なままである。図１は、２℃〜８℃で保存したヘモグロビン溶液のテトラマー作製の典型的な量を示す。約０．５％の開始テトラマーレベルを有する溶液において、テトラマーレベルは、約１８カ月後に１．０％より高くまで上昇する。図２は、２３℃〜２７℃で保存したヘモグロビン溶液についてのテトラマー作製の典型的な量を示す。約０．５％の開始テトラマーレベルを有する溶液において、テトラマーレベルは、約３週間〜４週間で１．０％より高くまで上昇する。したがって、上昇した温度でのヘモグロビン溶液の保存は、テトラマー作製の速度を増加させる。テトラマー溶液の熟成は、延長された時間期間にわたってこのヘモグロビン溶液を単に放置することによって達成することができる。より高い温度は、より低い温度よりも速くヘモグロビン溶液を熟成させる。
【００３０】
図３は、新たに処理したヘモグロビン溶液と本発明に従って処理した（「再処理した」）「熟成された」ヘモグロビン溶液との間のテトラマー作製の比較を示す。両方の溶液を２℃〜８℃で保存した。２４カ月後、テトラマーは新たなヘモグロビン溶液中で約０．８％増加したが、再処理した溶液中で、テトラマーは約０．３％だけ増加した。３６カ月で、再処理した溶液中のテトラマーは約０．４％増加した。同様に、図４は、２３℃〜２７℃で保存した場合、再処理した溶液と比較して、新たに処理した溶液中でテトラマーがより速く作製されることを示す。
【００３１】
一態様において、本発明の方法は、テトラマー作製を加速するために溶液を加熱することによって、溶液の安定性を増強するためにヘモグロビン溶液を予め作製するステップを含む。作製したテトラマーは、テトラマー作製に関して、テトラマー作製を加速するための熱処理がなされていない重合した溶液よりも安定である溶液を提供するために、この溶液から除去することができる。一旦作製したテトラマーがヘモグロビン溶液から除去されると、さらなるテトラマー作製は減速又は低下される。
【００３２】
熱処理は、溶液の精製の前又は後のいずれかで生じ得る。この溶液が処理の間に熱処理される場合、このような熱処理は、溶液の重合後であるべきである。次いでこの溶液は、実質的にすべてのテトラマーを除去するために精製することができる。熱処理が精製後である場合、この溶液は、作製したテトラマーを除去するために再精製されねばならない。
【００３３】
熱処理は、約４５℃〜５５℃の温度に約２０時間〜３０時間にわたって重合ヘモグロビン溶液を供することによって達成することができる。他の処理温度及び処理時間が、テトラマーを作製するために充分であることが予測される。なぜなら、テトラマー作製はとりわけ、時間及び温度の関数であることが示されているからである。
【００３４】
本発明の方法は、最終製品を微生物抗原及びウイルス抗原並びに微生物病原体及びウイルス病原体を実質的に含まないようにし得るという点で、さらなる利点を提供する。このような微生物抗原及びウイルス抗原並びに微生物病原体及びウイルス病原体は、検出不能なレベルまで低減される。すなわち、この製品は、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、ＸＸＩＩＩ  第７１章に示される分析によって決定する場合、滅菌である。このような抗原及び病原体の例には、例えば、細菌、リケッチア、真菌、原生動物、ウイルス及び他の生物が含まれる。最も重要なことに、この方法は、肝炎及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすウイルスを含まない生物学的製品を提供する。
【００３５】
ヘモグロビン溶液の熱処理は、ウイルスの実質的な不活化を生じる。ウイルス不活化熱処理は、別個のステップの熱処理であり得るか、又はテトラマーを除去するための熱処理と組み合わせることができる。一般に、製造作業者の安全性の目的のために、ウイルス低減熱処理は、赤血球からヘモグロビンが除去された後に実施されることが好ましい。しかし、重合後の溶液の熱処理もまた、所望のウイルス不活化を達成することが予測される。重合前のウイルス低減熱処理ステップが排除される場合、テトラマーを作製するための重合後の熱処理の温度は、ウイルスの不活化を確実にするために、約６０℃〜６２℃又は他の適切な温度まで上昇させることができる。したがって、特定の態様において、重合後の１回の熱処理ステップが、ウイルス低減及びテトラマー作製の両方を達成する。
【００３６】
本発明の生物学的製品は、少なくとも約１０．０Ｌまでの量で注入される場合、血管収縮、腎毒性、血色素尿症及び生理学的に所望されない量のテトラマーヘモグロビンを含む公知のヘモグロビン溶液の静脈内投与に関連する他の問題点を引き起こさない。本明細書中に記載される方法によって生成された製品の静脈内投与は、尿生成における感知できる低下も、糸球体濾過速度における感知できる低下も、腹膜腔中への感知できる管外遊出も、生成された尿の色における感知できる変化も生じない。
【００３７】
したがって、本発明の方法は、外傷、心筋梗塞、発作、急性貧血及び酸素欠乏障害（例えば、肺が血液を完全に酸素化する能力が損なわれていること又は完全に酸素化できないことに起因する、低酸素血症、低酸素症又は末期低酸素症）の処置において有用な無細胞性赤血球代用品を提供する。この製品はまた、蘇生流体を必要とする任意の疾患又は医学的状態（例えば、外傷特に出血性ショック）、血管内体積増量薬又は交換輸血を必要とする任意の疾患又は医学的状態の処置において有用である。医学的処置に加えて、この製品は、移植のための器官を保存することにおいて有用であり得る。
【００３８】
一態様において、本発明の方法における出発材料は、ヒト全血又は濃厚赤血球である。一般に、血液保存バッグ上に示された有効期限後２週間以下の間保存された供給源赤血球を使用することが所望されるが、不可欠ではない。２週間より長く期限が過ぎたヒト全血の使用は、ヘモグロビンを抽出すること並びに細胞性残遺物（例えば、ストローマ性のタンパク質及び混入物）を除去することにおいてさらなる困難を提供する。さらに、本明細書中に記載される方法は、当業者の範囲内の軽微な改変を伴って、すべてのヘモグロビンに適用可能である。
【００３９】
出発材料としてヒト血液を使用する場合、赤血球の吸引及び濾過の間に、赤血球（ＲＢＣ）を、血液中に空気を導入することなくドナーバッグから吸引により引き出し、一連のフィルタを通過させると、白血球及び血小板の量が低下したＲＢＣ懸濁物を生じる。次いで、得られた懸濁物を細胞の洗浄／溶解に供する。
【００４０】
この懸濁物を、残留血漿タンパク質を除去するために、一酸化炭素雰囲気下で約１％のＮａＣｌ溶液で洗浄する。次いで、洗浄したＲＢＣは、細胞を溶解するために注射用水（「ＷＦＩ」）で処理し、得られた混合物を、クロスフロー濾過ユニットを使用して清澄化させる。当業者に公知の赤血球を溶解する他の方法（例えば、機械的に又は超音波により細胞を溶解することを含む）を使用することができる。次いで、清澄化した産物は、ウイルス不活化のため及び濾過によって除去されるさらなるストローマ性材料を沈殿させるために、熱処理することができる。この手順の産物は、約３％（ｗ／ｖ）のＴＨｂを含む、ストローマフリーヘモグロビン（ＳＦＨ）溶液である。
【００４１】
清澄化の後、カルボキシヘモグロビンを含む溶液は、好ましくは濃縮及び脱気されて、デオキシヘモグロビンを含むストローマフリーヘモグロビン溶液を生じる。脱気は、カルボキシヘモグロビン溶液を酸素で１６時間最初に飽和させて、酸素化ヘモグロビン及びヘモグロビンの総重量に基づいて約７重量％のカルボキシヘモグロビンの溶液を生成することを含む。引き続いて、この酸素を、窒素、アルゴン又はヘリウムで駆逐し、遊離ヘモグロビン（すなわち、錯体化していないヘモグロビン）及びヘモグロビンの総重量に基づいて約７重量％のオキシヘモグロビンを含む溶液を形成する。得られた脱気溶液は濾過して、化学的改変のために容器中に移す。
【００４２】
脱気に引き続き、ヒトヘモグロビンを含むストローマフリーヘモグロビン溶液は、約１：１〜３：１のヘモグロビンに対するピリドキサール−５’−ホスフェートのモル比でピリドキサール−５’−ホスフェート（Ｐ５Ｐ）を使用してピリドキシル化すべきである。或いは、ストローマフリーヘモグロビンは、２−Ｎｏｒ−２ホルミルピリドキサール−５’−ホスフェートを使用してピリドキシル化することができる。還元剤（例えば、水素化シアノホウ素ナトリウム又は好ましくは水素化ホウ素ナトリウム）が、ピリドキシル化混合物に添加される。過剰な試薬及び塩を、発熱物質を含まない水に対する透析又は好ましくはＷＦＩでのダイアフィルトレーションによって除去する。ヒト血液以外の供給源由来のヘモグロビンは、ピリドキシル化を必要としない可能性がある。ヘモグロビン溶液の当業者は、ピリドキシル化が必要な場合を容易に理解する。
【００４３】
ストローマフリーヘモグロビン溶液は、ヘモグロビン溶液の当業者に公知の任意の方法を使用して重合する。好ましくは、水性グルタルアルデヒドを重合剤として使用する。重合の持続時間及び添加されるグルタルアルデヒドの量は、ヘモグロビン溶液の体積、ポリマーの所望の収率及び所望の分子量分布に依存する。一般に、より長い重合時間は、ポリマーの収率及び分子量分布を増加させる。ヘモグロビンの総重量に基づいて約７５重量％のポリマーの収率が、約１６時間〜１８時間で得られる。重合の好ましい終点は、サイズ排除ＨＰＬＣによってモニタリングした場合、総ヘモグロビン重量に基づいて約７５重量％のポリマーをこの溶液が含む点として規定される。或いは、この終点は、ヘモグロビンの総重量に基づいて約６５％のポリマーをこの溶液が含む時点（すなわち約２．５時間）として規定される。
【００４４】
重合後、この反応は適切な薬剤でクエンチすべきである。一態様において、この重合反応は、水性グリシンの添加によってクエンチされる。このグリシンは、可能な限り迅速に添加すべきである。次いで架橋が、水素化ホウ素ナトリウム水溶液を再度可能な限り迅速に添加することによって安定化される。この重合溶液を引き続いて濃縮し、次いでダイアフィルトレーションする。最後に、この溶液が約４重量％のヘモグロビンを含むまで、水をこの溶液に添加する。
【００４５】
別の態様において、この溶液は、クエンチ反応を完了させるために、グリシンの添加と同時に、少なくとも３時間にわたってこの溶液を４０℃〜５０℃に加熱することによって「ホットクエンチ」することができる。図５は、新たに処理したヘモグロビン溶液と３時間にわたるホットクエンチに供されたヘモグロビン溶液との間のテトラマー作製の比較を示す。両方の溶液を２℃〜８℃で保存した。１０カ月後、テトラマーは、新たなヘモグロビン溶液中で０．４％〜０．５％の間に増加したが、ホットクエンチした溶液中では、テトラマーは約０．４％だけ増加した。図６は、２３℃〜２７℃で保存した場合の、新たに処理した溶液とホットクエンチした溶液との間のテトラマー作製における差異を示す。この溶液の安定性は、より長い（例えば２４時間までの）ホットクエンチにこの溶液を供することによって増強されることが予測される。約６５℃までのより高い温度もまた使用することができる。
【００４６】
本発明に従う重合は、図９及び以下の実施例中に示されるように、高い収率の、狭い分子量範囲を有するポリマーを生じる。
【００４７】
別の態様において、クエンチ後の重合した溶液は、テトラマーを作製するための熱処理によって予め作製することができる。この熱処理は、精製後の任意の時点まで延期することができるが、この溶液は再精製を必要とする。熱処理は、約４５℃より高い温度に少なくとも約２４時間この溶液を加熱することによって達成することができる。ウイルス不活化がこの時点で所望される場合、この溶液は、約６０℃よりも高い温度に加熱することができる。アスコルビン酸のような抗酸化剤を、加熱処理方法の間のメタヘモグロビンの形成を防止するために添加することができる。
【００４８】
図７は、新たに処理したヘモグロビン溶液と本発明に従って処理した予め作製したヘモグロビン溶液との間のテトラマー作製の比較を示す。両方の溶液を２℃〜８℃で保存した。１５カ月後、テトラマーは新たなヘモグロビン溶液中で約０．５％増加したが、予め作製した溶液中で、テトラマーは約０．４％だけ増加した。同様に、図８は、２３℃〜２７℃で保存した場合、予め作製した溶液と比較して、新たに処理した溶液においてテトラマーがより速く作製することを示す。
【００４９】
次いで、重合したピリドキシル化ヘモグロビン溶液が精製される。一態様において、残留未重合（テトラマー）ヘモグロビンを溶液から除去するために、精製は、カラムクロマトグラフィー、濾過（例えば膜濾過）又はこれら両方を利用して、この溶液を酸素化する酸素雰囲気下で達成する。次いで、精製された重合ヘモグロビン溶液は、ガス交換のための調製物中で、限外濾過装置を使用して約６％まで濃縮する。
【００５０】
次いで、濃縮された溶液は、窒素で脱酸素化する。この脱酸素化は、この溶液中のオキシヘモグロビンの量が総ヘモグロビンの約１６重量％未満になるまで、約１０℃〜１２℃で生じる。
【００５１】
次いで、得られた脱酸素化されて精製された重合ヘモグロビン溶液は、冷却容器中で窒素雰囲気下で限外濾過によって濃縮する。そのｐＨは約８．８〜９．０を調整し、電解質の量は、正常な血漿の電解質の量を示すレベルまで、必要に応じて調整することができる。さらに、従来の抗酸化剤（例えば、グルタチオン、アスコルベート又はグルコース）を、任意選択で添加することができる。この溶液を所望のレベル（好ましくは約１０重量％総ヘモグロビン）まで濃縮した後、この溶液を濾過によって滅菌し、滅菌移転装置を介して、適切な薬学的に許容される容器中に移す。
【００５２】
このヘモグロビン溶液がテトラマー作製を促進するために予め熱処理されていない場合、この溶液を熱処理し、作製したテトラマーを除去するために再精製することができる。抗酸化剤及び製剤化化学物質が添加されている場合、これらは、熱処理及び精製の前にダイアフィルトレーションによって除去することができる。
【００５３】
さらに、熱処理の代替法として、完成したヘモグロビン溶液のテトラマー作製は、この溶液を適切な温度で熟成させることによって達成することができる。次いでこの溶液を、作製したテトラマーを除去するために再精製することができる。一般に、この溶液は、テトラマーレベルが約１％〜３％を上回るまで熟成すべきであり、より高いテトラマーレベルは、この溶液がテトラマーを除去するために精製された後に、増加した安定性の利益を与えることが予測される。しかし、本発明の利点は、作製したテトラマーが溶液の熟成後に除去される限り任意の時間期間にわたってこの溶液が熟成される場合に達成されることが予測される。
【００５４】
得られたヘモグロビン溶液の特徴は図９中に示され、以下の通りである：
総ヘモグロビン（ｇ／ｄｌ）              ９．５〜１０．５
メタヘモグロビン（総Ｈｂの％）          ＜８．０
カルボキシヘモグロビン（総Ｈｂの％）    ＜５．０
Ｐ５０（ｔｏｒｒ）                        ２６〜３２
重量オスモル濃度（ｍｍｏｌ／Ｋｇ）      ２８０〜３６０
ナトリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）              １３５〜１５５
カリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）                ３．５〜４．５
塩化物（ｍｍｏｌ／Ｌ）                  ８５〜１１０
遊離鉄（ｐｐｍ）                        ＜２．０
分子量分布−１２８Ｋｄのピーク（％）    ９〜２３
分子量分布−１９２Ｋｄのピーク（％）    １６〜１８
分子量分布−２５６Ｋｄのピーク（％）    ４９〜７４
テトラマー（６４Ｋ）（％）              １．０以下
内毒素（ＥＵ／ｍＬ）                    ＜０．０３
リン脂質ｎｇ／Ｈｂ                      ＜５０
糖脂質（ｎｇ／Ｈｂ）                    ＜２
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本発明の特定の態様を実証する。しかし、これらの実施例は例示目的だけのためであり、本発明の条件及び範囲に関して完全に規定することを目的としていないことが理解されるべきである。すべての温度は、他に特定されない限り摂氏で示される。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間）が与えられる場合、これらの特定の範囲を上回る条件及び下回る条件の両方もまた、一般にあまり簡便ではないものの使用することができることがまた、理解されるべきである。
【００５６】
反対に示されない限り、本発明の方法において使用されるすべての溶液及びタンクは、３１６−Ｌステンレス鋼、好ましくは高度に研磨され、したがって容易かつ迅速に清浄化される、薬学等級のこのようなステンレス鋼で製造されたものである。種々の接続パイプ及びチューブは、同じステンレス鋼又は薬学等級のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）若しくはシリコーンチュービングで製造されたものである。この方法において使用されるフィルタ及び膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎ又はＣｕｎｏ  Ｉｎｃ．から購入することができる。
【００５７】
本発明に従う分析用サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣを、以下の手順に従って実施する。サンプルを、約ｐＨ６．９の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で０．２ｇ／ｄｌに希釈し、０．２μフィルタを介して濾過し、以下の成分（システムフローの順）からなるＨＰＬＣシステム中に注射する：
１．Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １１００  Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ  Ｐｕｍｐ
−  移動相は、約ｐＨ６．９の０．１Ｍリン酸ナトリウムである
−  流速は、０．５ｍＬ／分である
２．４５ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチュービング、内経０．０１０インチ
３．Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ
４．１８ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチュービング、内経０．０１０インチ
５．０．５μプレカラムフィルタフリット
６．９ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチュービング、内経０．０１０インチ
７．Ｔｏｓｏ  ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ４０×６０ｍｍ  ガードカラム
８．２４ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチュービング、内経０．０１０インチ
９．Ｔｏｓｏ  ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ  ３００×７．８ｍｍ  分析カラム
１０．２３ｃｍのＰＥＥＫ又はチタンチュービング、内経０．０１０インチ
１１．Ａｇｉｌｅｎｔ  １００可変波長検出器
−  波長：２８０ｎｍ
−  フローセル：１４μＬの体積、１０ｍｍの光路長
−  範囲：２ＡＵＦＳ
−  時間定数：：１０秒
２８０ｎｍでのピーク吸光度を、個々のピーク面積を積分し、総ヘモグロビン面積を計算するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎによって、各ポリマー種について記録する。
【００５８】
（実施例１）
細胞の吸引及び濾過
ここで図１１を参照して、期限切れの血液（全血又は濃厚赤血球）のドナーバッグ２０を、適切な無菌吸引装置２２中に配置する。吸引装置中の針でドナーバッグを刺し、約１５０ｍｌの１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液を導入し、減圧下又は真空下で、ドナーバッグから期限切れの血液を吸引する。吸引した血液を、白血球吸着デプス型フィルタ２４、或いは連続２６中の２つの５μデプス型フィルタに通過させる。血液がこれらのフィルタを通過する際に、白血球が血液から除去される。典型的に、約２２５単位の期限切れ全血を吸引し、濾過し、引き続いて図１１に示されるようなタンク１に移す。次いで、これらのフィルタを、約７５リットルの１％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム水溶液でリンスする。
【００５９】
（実施例２）
細胞の洗浄及び溶解
タンク１への血液の導入前に、タンク１を、約４０Ｌ〜５０Ｌの１％塩化ナトリウム水溶液で満たす。２２５単位すべての期限切れ全血を吸引、濾過及び移動して、これらのフィルタをリンスした後、このタンクは４％の総ヘモグロビン溶液約３６５リットル〜３９５リットルを含む。吸引するステップ及び濾過するステップの間、タンク１を減圧（すなわち、２０インチＨｇ〜２８インチＨｇの真空）に維持する。一旦すべての期限切れ血液がタンク１に移されたところで、この真空のスイッチを切り、一酸化炭素をタンクに導入し、このタンクが一酸化炭素雰囲気を含むようにする。
【００６０】
タンク１を、図１１中に示されるように、０．６５μの分岐フローフィルタ２８に連結する。３６５リットル〜３９５リットルの４％の総ヘモグロビン溶液の最初の充填を、この分岐フローフィルタを介した精密濾過によって、約２１５Ｌ〜２２５Ｌの７％の総ヘモグロビン溶液へと濃縮する。この時点でのヘモグロビン溶液のｐＨは約６〜６．５である。７％の総ヘモグロビンへの濃縮に続いて、この溶液を、１％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム溶液の添加により洗浄し、ダイアフィルトレーションし、塩化ナトリウム溶液が添加されるのと同じ速度でこの濾液を除去する。２１５Ｌ〜２２５Ｌのヘモグロビン溶液は、約８体積の１％の塩化ナトリウム溶液（約１，８００Ｌ）で典型的に洗浄する。洗浄に続いて、この溶液は、約９０Ｌ〜９５Ｌ（すなわち約１６％の総ヘモグロビン）まで濃縮し、注射用水（「ＷＦＩ」）を添加して、この溶液の体積を約２２０Ｌまでにする。ＷＦＩの添加により、これらの細胞は膨潤し、破裂してヘモグロビンを溶液中に放出する。得られたヘモグロビン溶液の濃度は、約７％の総ヘモグロビン（ＴＨｂ）である。
【００６１】
得られた溶液を、タンク１中になお存在したままで清澄化させる。この溶液を約９０Ｌまで最初に濃縮し、その濾液をタンク２に移す。この溶液がフィルタを横切ってポンピングされる際に、赤血球、ストローマ混入物及び細胞壁材料が保持され、フィルタによって除去される。タンク１中の残留する９０Ｌの溶液を、約２８０ＬのＷＦＩで洗浄（ダイアフィルトレーション）し、その洗浄液をタンク２に添加する。次いで、タンク１中に残留する材料を約２０Ｌまで濃縮し、その濾液をタンク２に添加する。タンク２中に生じる体積は、約４０５Ｌ〜４１５Ｌの３．３％の総ヘモグロビン溶液である。
【００６２】
（実施例３）
ウイルス低減及びストローマ性沈殿のための任意選択の熱処理
次いで、得られたストローマフリーヘモグロビンの溶液を、約６０℃〜６２℃の温度で、約１０時間の期間にわたってタンク２中で熱処理する。この時間の間に、この溶液を適度に攪拌する。この溶液が加熱されて約５５℃の温度を通過する際に、沈殿物が形成される。
【００６３】
（実施例４）
清澄化及びウイルス低減
次いで、得られた３．３％  ＴＨｂのストローマフリーの熱処理したヘモグロビン溶液を、０．２μのプレフィルタ３０とその後の０．１μのプレフィルタ３２を介して濾過し、次いで１００ｋＤのウイルス低減ウルトラフィルタ（図示せず）を介してタンク３中へとポンピングする。
【００６４】
（実施例５）
限外濾過／濃縮
次いで、濾過したヘモグロビン溶液を８５Ｌ〜１０５Ｌ（約１４％のＴＨｂ）まで濃縮し、引き続いて洗浄して、約４体積のＷＦＩ（３５０Ｌ）でダイアフィルトレーションする。この濃縮及びダイアフィルトレーションを、１０ｋＤの分子量のウルトラフィルタ３４を使用して達成する。ウルトラフィルタ３４に付随する排水３５が濾液を収集する。この時点で、１４％の総ヘモグロビン溶液は、約６〜６．５のｐＨで、ヘモグロビン１グラム当たり約５０ｎｇ未満のリン脂質、ヘモグロビン１グラム当たり約２ｎｇ未満の糖脂質、約１％未満のメタヘモグロビン、１ミリリットル当たり約０．０３単位未満の内毒素を含む。この溶液中のヘモグロビンはカルボキシヘモグロビンである。
【００６５】
（実施例６）
脱気
次いで、得られたカルボキシヘモグロビン溶液を１７５Ｌの容器（タンク４）に移し、このタンク４でカルボキシヘモグロビンを最初に酸素化し、次いで脱酸素化する。タンク４は、酸素ガス及び窒素ガスのラインに連結されたガススパージリング、タンク４の上部に位置付けられたこのタンクの底から計量スプレー装置までの供給、及び泡沫缶３６に接続された泡沫オーバーフロー収集器と嵌合され、その結果、タンク４中で発生した泡沫が泡沫缶３６に供給され、この泡沫缶３６においてこの泡沫は液体へと液化し、タンク４へと戻し供給される。この泡沫缶３６の代替として、タンク４は、機械的泡沫破壊機に嵌合することができる。タンク４は、中心に取り付けられたガス散布攪拌器をさらに備える。泡沫缶３６は、ガスの除去のためのガス通気孔を備える。タンク４中の溶液は、１３％の総ヘモグロビン溶液である。
【００６６】
第１の酸素化ステップの間に、容器中のガスの均一な散布を有するのに充分な速度でこの溶液中に酸素をスパージする。この容器を、ガスで約６６Ｌ／分の速度でスパージする。カルボキシヘモグロビンの酸素化を、得られた溶液が総ヘモグロビンの重量に基づいて５％未満のカルボキシヘモグロビンを含むように、約１８時間の期間にわたって実施する。酸素化を約１０℃の温度で実施する。タンク４中で発生した泡沫を、泡沫缶３６において収集し、落ち着かせた後、得られた溶液をタンク４中に戻し移す。
【００６７】
酸素化後、この溶液を約３時間〜３．５時間にわたって、又は総ヘモグロビンの重量に基づいて１０％未満のオキシヘモグロビンが溶液中に残存するまで、同様の流れの窒素でスパージする。窒素スパージを、約１０℃の温度及び約６．９５〜７．１０のｐＨで実施する。或いは、カルボキシヘモグロビンは、膜交換機を使用してデオキシヘモグロビンに変換することができる。泡沫化ステップから通常予測されるように、ヘモグロビンの変性が実質的に存在しないことが留意される。
【００６８】
（実施例７）
化学的改変
ここで図１２を参照して、デオキシヘモグロビン溶液を、化学的改変のためにタンク５に移す。次いで、約４℃のデオキシヘモグロビン溶液を含むタンク５に、１：１〜１：３のヘモグロビンに対するＰ５Ｐのモル比で、ピリドキシル−５−ホスフェート（Ｐ５Ｐ）水溶液（９３．７５ｇ／Ｌ）を添加する。２：１のヘモグロビンに対するＰ５Ｐのモル比が好ましい。ピリドキシル化を約４℃の温度で実施する。このＰ５Ｐ溶液を、典型的には約１分間かけて添加し、約１５分間混合し、その後、水素化ホウ素ナトリウム／水酸化ナトリウム溶液を、約２０：１のヘモグロビンに対する水素化ホウ素ナトリウムのモル比で、ヘモグロビン溶液に添加する。適切な水素化ホウ素ナトリウム／水酸化ナトリウム水溶液は、２リットル当たり０．８ｇの水酸化ナトリウム及び２リットル当たり９０．８ｇの水素化ホウ素ナトリウムを含む。水素化ホウ素溶液を、約１分間の期間にわたって可能な限り迅速に添加し、次いで１時間にわたって攪拌する。
【００６９】
（実施例８）
反応物の除去
１５０Ｌの得られたピリドキシル化ヘモグロビンの溶液を、過剰な反応物を除去するために、４体積（６００Ｌ）のＷＦＩを用いて、１０Ｋダルトンのウルトラフィルタ３８を使用して引き続いてダイアフィルトレーションする。ウルトラフィルタ３８に付随する排水４０は、フィルタ３８から濾液を収集する。
【００７０】
（実施例９）
重合
ピリドキシル化ヘモグロビンを含むタンク５に、４．５％の総ヘモグロビン溶液（約２６５Ｌのヘモグロビン溶液）を調製するのに充分なＷＦＩを添加する。グルタルアルデヒド溶液を、約２４：１のヘモグロビンに対するグルタルアルデヒドのモル比で、ピリドキシル化ヘモグロビン溶液に添加する。典型的には、このグルタルアルデヒド溶液を、計量ポンプによって約２．５時間の期間にわたって、ヘモグロビン溶液に添加する。重合反応を約１８時間にわたって進行させる。標的分子量分布は、約７５％のポリマー及び２５％のテトラマーである。標的ポリマーは約６００，０００未満の分子量を有し、優勢な画分の分子量は１００，０００〜３５０，０００の範囲に存在する。
【００７１】
重合反応が標的分子量分布に達したところで（約１８時間後）、水性グリシン（約１６６ｇ／Ｌ）を、１４０：１のヘモグロビンに対するグリシンのモル比で（クエンチとして）ヘモグロビン溶液に添加する。この時点で、この溶液を、少なくとも３時間にわたって４０℃〜５０℃に加熱して、クエンチ反応を完了させ得る（「ホットクエンチ」）。
【００７２】
図１０は、得られた重合したグリシンでクエンチしたヘモグロビン産物のＨＰＬＣ追跡を示す。次いで得られた溶液を約１０分間混合し、その後水素化ホウ素ナトリウム／水酸化ナトリウム溶液（上で特定した濃度を有する）を、２８：１のヘモグロビンに対する水素化ホウ素ナトリウムのモル比で、ヘモグロビン溶液に添加する。この得られた混合物を約１時間攪拌する。次いで、この溶液を約１５０Ｌに濃縮し（ウルトラフィルタ３８）、４体積（６００Ｌ）のＷＦＩで洗浄する。上に示したのと同じモル比の水素化ホウ素ナトリウムのさらなるアリコートをこの濃縮された溶液に添加し、再度１時間混合する。得られた溶液を、４体積（６００Ｌ）のＷＦＩで洗浄する。
【００７３】
（実施例１０）
テトラマー作製のための任意選択の熱処理
この時点で、この溶液をテトラマーを作製するために熱処理し得る。この溶液は、４５℃〜５５℃での約２０時間〜３０時間にわたる加熱に供することができる。このステップの間にウイルス低減が所望される場合、この温度は６０℃より高い温度まで上昇することができる。溶液を加熱するために、加熱媒体（例えば、約８０℃のプロピレングリコール溶液）を、Ｈｂ溶液を激しく攪拌しながらタンクジャケットを通して循環させる。加熱後、ヘモグロビン溶液を約２℃〜８℃に冷却する。
【００７４】
（実施例１１）
精製
得られた溶液を、酸素雰囲気下に溶液を放置することによって酸素化し、引き続いて精製システム４２に移す。この精製は、カラムクロマトグラフィー、濾過（好ましくは膜濾過（ダイアフィルトレーション））又は濾過とカラムクロマトグラフィーとの組合せによって達成することができる。
【００７５】
一実施形態において、この溶液を、図１３中に示されるように、クロマトグラフィー供給容器であるタンク６に移す。この実施形態において、次いで、オキシヘモグロビンの得られた溶液を、タンク６中で約２００Ｌ（４％の総ヘモグロビン）まで希釈し、塩化物の濃度を、塩化ナトリウム溶液を用いて２２ｍＭに調整する。ナトリウム濃度の調節は必要ない。
【００７６】
次いで、得られたヘモグロビン溶液の４０Ｌアリコート５つを、カラム４４を使用してクロマトグラフィーにかける。カラム４４は、テトラマーよりもポリマーに対して高い親和性を有する黄色色素（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｌｔｄ．からＭｉｍｅｔｉｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｎｏ．１として市販される）で改変されたアガロースゲルであるアフィニティゲルを含む。
【００７７】
クロマトグラフィーを以下のように達成する。酸素化した重合したピリドキシル化ストローマフリーヘモグロビン溶液４０Ｌを、カラム４４上に充填する。このカラムを、１５カラム体積（約７５０Ｌ）の３０ｍＭの水性ＮａＣｌ緩衝液で洗浄して、テトラマーを除去する。次いで、このカラムを約２５０Ｌの３００ｍＭの塩化ナトリウム緩衝液で洗浄して、ポリマーを洗浄して外す。ポリマー画分をタンク７中に収集する。望まれない画分は排水４６に送る。各アリコートを除去した後、このカラムを１５ｍＭのＨＣＬ溶液（１５０Ｌ）で再生し、３０ｍＭの水性ＮａＣｌ（２５０Ｌ）で再平衡化し、供給溶液の別のアリコート（４０Ｌ）をこのカラムに充填する。このカラムを３０ｍＭのＮａＣｌで再度洗浄し、その後３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄する。４０Ｌのアリコートのヘモグロビン溶液をこのカラムに添加し、タンク６が空になるまでクロマトグラフィーにかける。
【００７８】
タンク７中で収集した画分を、排水５０に付随するフィルタ４８を使用して、約４０Ｌの体積（６％の総ヘモグロビン）まで限外濾過（濃縮）する。次いで、濃縮したヘモグロビン溶液を、脱酸素化のためにガス交換タンク８に移す。
【００７９】
或いは、この溶液を、図１４中に示されるように、濾過リサイクル容器１０に移す。次いでこのヘモグロビンを、タンク１０中で約４％のＴＨｂまで希釈する。次いで、この４％のＴＨｂ溶液を、１０ｍＭのＮａＣｌ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販される３００，０００の分子量のフィルタ５２を使用してダイアフィルトレーションする。この濾過を、約９７％のヘモグロビン材料がフィルタを通ってタンク１１中へと通過するまで継続する（約３％の材料（すなわち高分子量ポリマー）がタンク１０中に保持される）。ヘモグロビンの量を、ｃｏオキシメータを使用して、分光光度法により決定する。
【００８０】
タンク１１中の得られた材料は、約４％〜８％のＴＨｂであり、ＴＨｂに基づいて約７％〜１０％のテトラマーを含む。次いで、この４％〜８％のＴＨｂを、１０ｍＭのＮａＣｌ及び排水又はトラップ５６に付随する１００，０００の分子量のフィルタ５４（Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎから市販される）を使用してダイアフィルトレーションする。Ｔｏｓｏ  ＢｉｏＳｅｐ  ３００×７．８ｍｍ  カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって決定する場合にテトラマーレベルが１．０重量％未満のヘモグロビン質量になるまで、この濾過を継続する。得られた精製されたヘモグロビン溶液は、タンク１１中に最初に残留し、脱酸素化のためにガス交換タンク８に引き続いて移される。
【００８１】
（実施例１２）
脱酸素化
ガス交換タンク８は、タンク４と同じタンク又は好ましくは異なるタンクであり得る。ガス交換タンク８は、ガス交換タンク４と本質的に同じ様式で備えられ、泡沫缶５８に取り付けられるか又はタンク４と同一の様式で機械的泡沫破壊機を備える。脱酸素化を、約１０℃及び約８．８の溶液ｐＨで、窒素スパージを用いて約２．５時間で達成する。窒素スパージを、総ヘモグロビンの重量に基づいて約１６％未満のオキシヘモグロビンが溶液中に残留するまで継続する。得られたデオキシヘモグロビン溶液を、製剤化のためにタンク９に引き続いて移す。
【００８２】
実施例１０の熱処理ステップが延期されている場合、この熱処理ステップはこの段階で実施することができる。熱処理をここで実施する場合、実施例１１の精製手順及び本実施例の脱酸素手順を反復すべきである。実施例１０の熱処理ステップ及びこの時点での熱処理ステップは任意選択であり、完全に排除してもよい。
【００８３】
（実施例１３）
製剤化
製剤化タンク９において、この溶液を、約７％の総ヘモグロビンまで最初に濃縮し、そのｐＨを４℃で約８．８〜９．０に調整する。このｐＨは、０．２ＭのＮａＯＨを使用して調整する。グルコース及びグリシンを添加して、それぞれ約１ｇ／Ｌ及び３．５ｇ／Ｌの最終濃度を達成する。塩化カリウムをこの溶液に添加して、約３．５ｍＭ〜４．５ｍＭのカリウム濃度を得る。次いで、３Ｍの塩化ナトリウムを添加して、８５ｍＭ〜１１０ｍＭの塩化物濃度を得る。引き続いて乳酸ナトリウムを添加して、１３５ｍＭ〜１５５ｍＭのナトリウムイオン濃度を得る。最後に、０．４５モルのアスコルビン酸溶液を、このアスコルビン酸濃度が約１０００ｍｇ／Ｌに達するまで添加する。そのｐＨを、０．２２ＭのＮａＯＨを使用して１０℃〜１５℃で８．７〜９．１に調整する。得られたヘモグロビン溶液は、１ｋｇ当たり約２８０ｍｍｏｌｅ〜３６０ｍｍｏｌｅの最終オスモル濃度を有する。
【００８４】
次いで、製剤化したヘモグロビン溶液を、トラップ６２に付随するフィルタ６０を使用して約１０％の総ヘモグロビンまで濃縮する。次いで、この１０％のヘモグロビン溶液を、フィルタ６４を介した濾過によって滅菌し、予め滅菌したバッグ中に無菌的に充填する。
【００８５】
（実施例１４）
溶液の予備処理
この溶液が処理の間にテトラマーを作製するためにホットクエンチステップ又は任意選択の熱処理ステップに供されていようとなかろうと、この溶液を、約２０時間〜３０時間にわたって約４５℃〜５５℃にこの溶液を加熱することによって、又はテトラマーが約１％〜３％を超えて増加するまでこの溶液を加熱することによって、製剤化後の任意の時点で加熱してテトラマーを作製し得る。熱処理後、この溶液は実施例１１と同様に精製し、実施例１３と同様に脱気すべきである。この溶液はこの時点ですでに製剤化されているので、実施例１２において導入される添加剤は、精製の前にダイアフィルトレーションによって好ましくは除去され、次いで再製剤化の間に再導入される。
【００８６】
（実施例１５）
熟成ヘモグロビン溶液の再処理
期限切れ又は熟成ヘモグロビン溶液は、加熱処理なしに、実施例１４と同様に再処理することができる。典型的には、約２℃〜８℃の保存条件で約１２カ月〜１８カ月よりも古いヘモグロビン溶液は、約１．０％より高いレベルのテトラマーを有する。この材料は、タンク５に導入することができ、実施例１１〜１３に従って精製及び再製剤化することができる。この溶液はこの時点ですでに製剤化されているので、実施例１３において導入される添加剤は、精製の前にダイアフィルトレーションによって好ましくは除去し、次いで再製剤化の間に再導入される。
【００８７】
上記において、限定の目的ではなく例示の目的のために、本発明の好ましい実施形態の詳細な記載を提供してきた。本開示に基づいて当業者に明らかなすべての他の改変、派生方法及び等価物は、特許請求される本発明の範囲内であると意図されることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】２℃〜８℃で保存したヘモグロビン溶液におけるテトラマー作製の量を示す図である。
【図２】２３℃〜２７℃で保存したヘモグロビン溶液におけるテトラマー作製の量を示す図である。
【図３】２℃〜８℃で保存した、新たに処理したヘモグロビン溶液と再処理した熟成ヘモグロビン溶液との間のテトラマー作製の比較を示す図である。
【図４】２３℃〜２７℃で保存した、新たに処理したヘモグロビン溶液と再処理した熟成ヘモグロビン溶液との間のテトラマー作製の比較を示す図である。
【図５】２℃〜８℃で保存した、新たに処理したヘモグロビン溶液とホットクエンチした溶液との間のテトラマー作製の比較を示す図である。
【図６】２３℃〜２７℃で保存した、新たに処理したヘモグロビン溶液とホットクエンチした溶液との間のテトラマー作製の比較を示す図である。
【図７】２℃〜８℃で保存した、新たに処理したヘモグロビン溶液と予め作製した溶液との間のテトラマー作製の比較を示す図である。
【図８】２３℃〜２７℃で保存した、新たに処理したヘモグロビン溶液と予め作製した溶液との間のテトラマー作製の比較を示す図である。
【図９】精製された重合ヘモグロビン溶液のＨＰＬＣ追跡の図である。重合ヘモグロビンは、ＲＴ  １５．１９、ＲＴ  １６．０１、ＲＴ  １７．１６及びＲＴ  １８．７９におけるピークによって示される。テトラマーは、ＲＴ  ２１．２２及びＲＴ  ２１．８３におけるピークによって示される。
【図１０】グリシン処理後であるが精製前の重合ヘモグロビン溶液のＨＰＬＣ追跡の図である。重合ヘモグロビンは、保持時間（ＲＴ）１４．６２、ＲＴ  １５．４４、ＲＴ  １６．６０及びＲＴ  １８．２４におけるピークによって示される。テトラマーは、ＲＴ  ２０．７１におけるピークによって示される。ポリマーは、この材料の約７５％である。
【図１１】ピリドキシル化及び重合のために調製された脱酸素化ヘモグロビン溶液を生成するために使用される方法及び設備の部分を示す模式図である。
【図１２】ピリドキシル化及び重合で開始する、脱酸素化した精製されたピリドキシル化した重合ヘモグロビン製品を生成するための方法及び装置の部分、並びに生理学的レベルの電解質を含む最終ヘモグロビン製品を製剤化するための方法及び装置の部分を示す模式図である。
【図１３】本発明において使用されるカラムクロマトグラフィー精製方法を示す模式図である。
【図１４】本発明において使用される膜濾過精製方法を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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