(57)【要約】本発明は、架橋剤を用いた架橋酵素微粒子の生成方法に関する。本発明では、酵素微粒子の形成後に、少なくともｎ個（ｎ≧３）の反応基を有し分子量が＞２，０００Ｄａである架橋剤で架橋処理する。本発明の方法によって、従来技術によって架橋処理された酵素微粒子よりも高い酵素活性を有する酵素微粒子が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋剤を使用した架橋酵素微粒子の生成方法であって、酵素微粒子の懸濁液の形成ステップを含み、酵素微粒子を少なくともｎ個（ｎ≧３）の反応基を有して分子量が＞２，０００Ｄａである溶解性架橋剤を使用して架橋処理するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
架橋剤は少なくとも０．１／ｍｌの溶解度を有する水溶性であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
架橋剤の分子量は少なくとも５，０００であることが望ましく、少なくとも１０，０００であることがさらに望ましく、少なくとも２５，０００であることがよりさらに望ましいことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
架橋剤はポリアルデヒドであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
多糖類を化学的または酵素処理することでポリアルデヒドを生成し、その後に架橋対象の酵素と接触処理することを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
多糖類を澱粉、グリコーゲン及びデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
多糖類の化学的処理は過ヨウ素酸塩との処理を含むことを特徴とする請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
酵素処理は酸素分子の存在下でのガラクトースオキシダーゼとの処理が関与することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
架橋酵素微粒子を還元剤で処理することを特徴とする請求項４から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
還元剤を水酸化ホウ素ナトリウム及びシアン水酸化ホウ素ナトリウムから成る群から選択することを特徴とする請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は架橋剤を使用した架橋酵素微粒子の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
このような方法は一般的に従来技術において知られている。費用効果が高く利用し易い架橋剤としてグルタルジアルデヒドがよく使用される。酵素微粒子は酵素結晶あるいは酵素集合体でよい。酵素結晶及び集合体の生成方法は従来技術でよく知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
結果として得られる固定酵素の活性は、元の非架橋酵素微粒子よりもかなり減少する。
【０００４】
本発明の目的は、少なくともいくつかの酵素について、酵素活性の減少をより少なくする架橋酵素微粒子の生成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明による方法の特徴は、酵素微粒子の形成後に、少なくともｎ個（ｎ≧３）の反応基を有し、分子量が２，０００＞Ｄａである架橋剤を使用して架橋処理されることである。
【０００６】
出願人は、酵素によっては従来方法で架橋処理した酵素微粒子よりも大幅に高い活性を有する架橋酵素微粒子を生成することができることを発見した。
【０００７】
ｎは３よりも大きく、例えば、１，０００Ｄａあたり＞０．５であり、分子量は少なくとも１０，０００であることが有利である。
【０００８】
架橋剤は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する水溶性架橋剤であることが望ましい。
【０００９】
これによって、本方法を、ほとんどの酵素にとって都合の良い水溶性条件下で実行することが可能になる。
【００１０】
架橋剤の分子量は少なくとも５，０００であることが望ましく、さらに、少なくとも１０，０００であることが望ましく、さらに、少なくとも２５，０００であることがより望ましい。
【００１１】
特定の理論の裏付けはないものの、分子量が多いほど架橋剤は酵素微粒子内に入ることが困難となり、酵素微粒子内で酵素分子又はその活性部位と反応せずに不活性化すると考えられている。
【００１２】
好適実施例によれば、架橋剤はポリアルデヒドである。
【００１３】
ポリアルデヒドは費用面で効率が良く、効果的な架橋剤であると考えられる。
【００１４】
好適実施例によれば、多糖類は化学的または酵素処理によりポリアルデヒドを生成し、その後に架橋対象酵素と接触処理される。
【００１５】
多糖類は低費用で、選択的に高純度で入手でき、ポリアルデヒドへ容易に変換できる。
【００１６】
多糖類は澱粉、グリコーゲン及びデキストランから成る群から選択されることが望ましい。
【００１７】
多糖類の好適な生成方法は、ａ）多糖類の過ヨウ素酸塩との化学的処理、と、ｂ）酸素分子の存在下でのガラクトースオキシダーゼとの酵素処理、とを含んでいる。
【００１８】
望まれる場合には、酵素のアルデヒド基とアミノ基との反応によって生成される結合は、架橋酵素微粒子を還元剤で処理することで低減される。
【００１９】
還元剤は、水酸化ホウ素ナトリウム(sodium borohydride)、シアン水酸化ホウ素ナトリウム(sodium cyanoborohydride)からなる群から選択されることが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明を実施例と共に説明することにする。
【００２１】
酵素の活性分析評価：
シュードモナスフルオレセンス由来ニトリラーゼ：
ｐＨ７．４の２０ｍＭ燐酸塩バッファの１８００μｌに、マンデルニトリル溶液１００μｌ（メタノール１０ｍｌ中１３．６ｍｇ）と、シュードモナス蛍光溶液のニトリラーゼ含有無細胞抽出物１００μｌが加えられた。この反応は攪拌下で３０℃に放置された。別の時間に１００μｌのサンプルが採取され、２０％のアセトニトリルを含む水溶液４００μｌとｐＨ２．２の燐酸塩バッファ５０mMを追加することによって反応は停止された。反応停止後、生成物の分量は。ＨＰＬＣによって定量された。これらの分析評価には、クロモリスＲＰ−１８ｅ  ５０−４．６カラム(Chromolith RP-18e 50-4.6 column) (Merck)が用いられ、可動相は２０％アセトニトリル、８０％水及び０．１％トリフルオロアセテイック酸であった。
【００２２】
乳酸短桿菌由来アルコール脱水素酵素：
アルコール脱水素酵素の活性後（Julich Fine Chemicals, Julich, Germany）、は分光測光法によると、攪拌下で３０℃、３４０ｎｍにおいて吸収度が減少した。反応混合物は：１１ｍＭアセトフェノン１．９４０ｍｌ及びｐＨ７の５０ｍＭ ＴＥＡバッファ中の１ｍＭ ＭｇＣｌ2、９．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ（ｐＨ７のバッファ中）４０μｌ、及び希釈酵素溶液２０μｌで構成された。
【００２３】
デキストランの酸化：
デキストラン（ＭＷ１００−２００ｋＤａ）１．６５ｇが、水５０ｍｌ内で溶解され、重炭酸ナトリウム３．８５ｇが加えられた。最終溶液は攪拌下で室温にて９０分間放置された。この後、溶液は５００倍以上の水に対して透析された
【００２４】
CLEAの生成：
グルタルジアルデヒド（コントロール）使用：異なる酵素溶液１０ｍｌへ、ｐＨ７の０．５M燐酸バッファ２ｍｌ、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）１５ｍｌ及び水溶性２５％（ｗ／ｖ）グルタルジアルデヒド１．６ｍｌが加えられた。結果として得られた懸濁液は攪拌下において４℃で１６時間放置され、その間に架橋が生じた。この後、ＣＬＥＡは水で洗浄され、真空下で乾燥された。
【００２５】
本発明によるポリアルデヒドデキストラン使用：異なる酵素溶液１ｍｌへ：ｐＨ８の燐酸バッファ５００ｍＭの１ｍｌ、前述の方法に従って生成された酸化デキストラン２ｍｌ及びジメトキシエタン（ＤＭＥ）４ｍｌが加えられた。結果としての懸濁液は４℃で１６時間攪拌され、その間に架橋が生じた。この後、得られたCLEAは、１ｍｇ／ｍｌの水酸化ホウ素ナトリウムを含む水溶性水酸化ホウ素ナトリウム溶液（ｐＨ＝８．５）４０ｍｌ内で再度懸濁された。この溶液は４℃で１時間反応状態に放置された。最終的に還元されたCLEAは４℃の水で洗浄された。
【００２６】
結果：
ニトリラーゼによるCLEA
グルタルジアルデヒドが架橋剤として使用された時、得られた最終活性は無視できる程度のものであった。これは、酵素活性部位の反応性求核原子によるものであると推定される。一方、ポリアルデヒドデキストランが架橋剤として使用された時、CLEAのために得られた最終活性は溶解性酵素に対して略５０％であった。特定の理論の裏付けはないが、多糖類系の架橋剤によって生じる立体障害によって、ポリマーと活性部位の低減された反応可能性のために、酵素活性損失が低減すると考えられる。
【００２７】
アルコール脱水素酵素によるCLEA
酵素がグルタルジアルデヒドと架橋されると完全に活性を失うことが分かった。しかし、ポリアルデヒドデキストランを架橋剤として使用することで、溶解性酵素について略１０％の活性を保つことができる。
【００２８】
勧められるものではないが、沈殿剤の追加によって酵素集合体が形成される前に、架橋剤を可溶性となった酵素へ加えることもできる。しかし、本発明によれば、これは酵素の不活性化につながる可能性があるため一般的には勧められるものではない。本発明によれば、酵素集合体形成前に架橋によって、７５％以下、さらに好適には５０％以下、さらに好適には２０％以下の不活性が生じることが好ましい。
【００２９】
酵素微粒子の大きさは（集合体あるいは結晶）一般的に１から５０ミクロンである。本発明による微粒子は主に酵素物質（＞７５重量％、さらに好適には＞９０重量％）で成り、これは例えば一般的に１０％重量以下のさらに少ない酵素物質を含むキャリア結合酵素と対照的である。
【国際調査報告】
2006505269.tif 000002
2006505269.tif 000003
2006505269.tif 000004