(57)【要約】本発明は、低ｐＨによって誘導可能であるマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ構築物に関する。本発明は、さらに、病原性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ疾患または感染の治療または予防のための診断方法およびワクチンに関する。本発明はまた、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼの活性、産生、または分泌を調整することができる化合物のスクリーニング方法に関する。
2006501830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列であって、前記プロモーターまたはプロモーターフラグメントは目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能である、単離ＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３】
目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能であるプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列であって、前記プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓａｐＭプロモーター（配列番号１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ｓａｐＭプロモーター（配列番号２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ｓａｐＭプロモーター（配列番号３）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ｓａｐＭプロモーター（配列番号４）からなる群から選択されるｓａＭプロモーターとハイブリダイズする、単離ＤＮＡ配列。
【請求項４】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であるマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼのプロモーターまたはプロモーターフラグメントと、
（ｂ）前記プロモーターまたはプロモーターフラグメントに作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列と、
（ｃ）転写終結領域とを含む、転写カセット。
【請求項７】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼプロモーターまたはプロモーターフラグメントは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓａｐＭプロモーター（配列番号１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ｓａｐＭプロモーター（配列番号２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ｓａｐＭプロモーター（配列番号３）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ｓａｐＭプロモーター（配列番号４）からなる群から選択される、請求項６に記載の転写カセット。
【請求項８】
マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼＮ末端シグナル配列をさらに含む、請求項６または請求項７に記載の転写カセット。
【請求項９】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼＮ末端シグナル配列は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓａｐＭ  Ｎ末端シグナル配列（配列番号５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ｓａｐＭ  Ｎ末端シグナル配列（配列番号６）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ｓａｐＭ  Ｎ末端シグナル配列（配列番号７）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ｓａｐＭ  Ｎ末端シグナル配列（配列番号８）からなる群から選択される、請求項８に記載の転写カセット。
【請求項１０】
（ａ）被験体から生体サンプルを得ることと、
（ｂ）前記サンプルをマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼに特異的な抗体の存在について分析することとを含み、
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼに特異的な抗体の検出は、病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法。
【請求項１１】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ（配列番号１０）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ（配列番号１２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ（配列番号１４）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭ（配列番号１６）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）被験体から核酸サンプルを得ることと、
（ｂ）前記サンプルをマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼをコードする核酸の存在について分析することとを含み、
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼをコードする前記核酸の検出は、病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法。
【請求項１３】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼをコードする前記核酸は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ｓａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ｓａｐＭ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ｓａｐＭからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）被験体から生体サンプルを得ることと、
（ｂ）前記サンプルをマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ活性の存在について分析することとを含み、
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ活性の検出が、病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法。
【請求項１５】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ活性が、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ活性、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ活性、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ活性、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭ活性からなるマイコバクテリア群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む核酸構築物であって、前記プロモーターまたはプロモーターフラグメントが測定可能なシグナルを産生することができるレポーター遺伝子に作動可能に連結されている核酸構築物を用意することと、
（ｂ）試験化合物を用意することと、
（ｃ）前記試験化合物に前記核酸構築物を曝露することと、
（ｄ）前記レポーター遺伝子によって産生される前記シグナルを測定することとを含み、前記試験化合物の非存在下と比較した前記試験化合物の存在下で産生された前記シグナルの変化は前記試験化合物が前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼの産生を調整することができることを示す、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ産生を調整することができる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼプロモーターまたはプロモーターフラグメントは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメントからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ、前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼの基質、および試験化合物を含む混合物をインキュベートすることと、
（ｂ）前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ活性を測定することとを含み、
前記試験化合物の非存在下と比較した前記試験化合物の存在下での活性の変化は前記試験化合物が前記分泌酸性ホスファターゼ活性を調整することができることを示す、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ活性を調整することができる化合物のスクリーニング方法。
【請求項１９】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼを分泌するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を試験化合物に曝露することと、
（ｂ）前記Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞によって分泌された前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼの量を測定することとを含み、
前記試験化合物の非存在下と比較した前記試験化合物の存在下でのマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ分泌の変化が前記試験化合物が前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ分泌を調整することができることを示す、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼの分泌を調整することができる化合物のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼと、
（ｂ）前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼに特異的な少なくとも１つの抗体と、
（ｃ）前記抗体の検出に必要な１つまたは複数の試薬を含む、病原性マイコバクテリア疾患または感染の検出用キット。
【請求項２３】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭからなる群から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
（ａ）配列番号１〜配列番号４、または配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５の配列と相補的であり、相補的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズできる核酸配列由来の連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドの相補核酸配列へのハイブリダイゼーションのための試薬を含む、病原性マイコバクテリア疾患または感染の検出用キット。
【請求項２５】
マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼまたはそのポリペプチドフラグメントと特異的に結合することができる抗体。
【請求項２６】
前記マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼは、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ（配列番号１０）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ（配列番号１２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ（配列番号１４）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭ（配列番号１６）からなる群から選択される、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の抗体を含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２８】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の単離ＤＮＡ配列を含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項２９】
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ  ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ  ＳａｐＭ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ  ＳａｐＭ、またはそのポリペプチドフラグメントからなる群から選択されるマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項３０】
ＳａｐＭポリペプチドを含み且つ病原性マイコバクテリアの培養物中で自然に混合される他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない、被験体の病原性マイコバクテリア疾患または感染の検出に有用な抗原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病原性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたは病原性菌類疾患または感染のための診断方法およびワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
病原性マイコバクテリア（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が含まれる）は、宿主マクロファージのファゴソーム内（ほとんどの微生物に有害な過酷な環境）に生息している。結核菌は、それ自体の細胞内生存を強化するためにこのファゴソーム区画を改変することが明らかである（Ｃｌｅｍｅｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９５）。これには、Ｒａｂ  ＧＴＰアーゼ組成物の変化（Ｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｌｅｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）および液胞プロトンＡＴＰアーゼの排除（Ｓｔｕｒｇｉｌｌｅｔ  ａｌ．，１９９４）が含まれる。したがって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍファゴソームは成熟の初期段階で停止し、ｐＨ６．１〜６．５へと穏やかな酸性化しかしなくなる（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；  Ｓｔｕｒｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；  Ｃｌｅｍｅｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９５）。病原性マイコバクテリアがマクロファージ中で生き残る能力は、疾患の確立および進行において重要な役割を果たす。しかし、宿主プロセスを脆弱にする特定の細菌因子のほとんどは依然未知である。細菌病原性に寄与する遺伝子が感染時に選択的に発現するという仮定に基づいて、その発現がｉｎ  ｖｉｖｏで（すなわち、マクロファージ内で）（（Ｔｒｉｃｃａｓ  ａｎｄ  Ｇｉｃｑｕｅｌ，２０００）に概説）またはバチルスが遭遇する宿主環境を模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下（例えば、低酸素分圧、酸性ｐＨ、および栄養の枯渇）で優先的に上方調節される結核菌遺伝子を同定するために種々のアプローチが使用されている（Ｂｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。多数の候補病原性遺伝子が記載されているにもかかわらず、その多くは有する生物的機能が何一つ知られておらず、バチルスの細胞内生存におけるその直接的な役割は不明瞭である。細菌の複製および生存に寄与するマイコバクテリアタンパク質の同定は、疾患の病因および防御機構の理解に重要である。
【０００３】
細胞内細菌病原体（結核菌およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｒａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が含まれる）は、片利共生種に接近不可能な宿主内の広範な種々の環境条件に遭遇する。環境因子に反応し過酷な細胞内条件に適応する能力により、これらの病原体の生存が可能になる。環境因子（温度、浸透圧、ｐＨ、酸素分圧、および栄養利用可能性が含まれる）は細菌遺伝子の特定のサブセットの誘導シグナルとして作用することが見出されており、その誘導は生存または増殖の強化に寄与する。これらの遺伝子の多くは、サルモネラで同定されており、いくつかが感染および／または病原性において重要な役割を果たすことが示されている（Ｌｕｃａｓ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，２０００に概説）。種々の手法を用いて、結核菌の多数の候補ビルレンス遺伝子も同定されている（Ｔｒｉｃｃａｓ  ａｎｄ  Ｇｉｃｑｕｅｌ，２０００）。ビルレンスにおける必要とされる役割を支持する直接的な証拠は、未だいくつかの遺伝子（例えば、イソクエン酸リアーゼ（ａｃｅＡ）（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、α−クリスタリン（ａｃｒ）（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、およびＥｘｐｏｒｔｅｄ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｅｒｐ）（Ｂｅｒｔｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）においてしか得られていない。
【０００４】
病原性マイコバクテリアは能動的にファゴソームｐＨを改変することが周知である。生存可能な病原体結核菌またはＭ．ａｖｉｕｍ（Ｍ．ａｖｉｕｍ）を含むファゴソームは穏やかにしか酸性化されない（ｐＨ６〜６．５）が、それは少なくとも部分的にはプロトンＡＴＰアーゼの不足によるものである（Ｓｔｕｒｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。対照的に、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｏｒｄｏｎａｅなどの非病原性マイコバクテリアまたは死滅した病原性マイコバクテリアは、ファゴソーム酸性化を遮断せず、これらの細菌を含むファゴソームのｐＨを、エンドソーム後期およびリソソームのｐＨ（約ｐＨ５）に近い値に酸性化する（Ｋｕｅｈｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。これらのデータにより、病原性株のみで見出される因子の産生はファゴソーム酸性化の阻害および細胞内生存に重要であることが示唆される。酸性化は、ファゴソーム成熟を変化させるために必要な遺伝子の発現を誘導するためのシグナルであり得る。ＳａｐＭ（結核菌Ｈ３７Ｒｖの分泌酸性ホスファターゼ）が最近同定された（Ｓａｌｅｈ  ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，２０００）。
【非特許文献１】クレメンス  ディー  エル  アンド  ホルビッツ  エム  エー（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｄ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍ．Ａ．）（１９９５）「結核菌ファゴソームの特徴づけおよびファゴソーム成熟が阻害される証拠」（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｐｈａｇｏｓｏｍａｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ）  ジャーナルオブエクスペリメンタルメディスン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）  １８１：２５７−２７０．
【非特許文献２】サレ  エム  ティー  アンド  ベリスル  ジェイ  ティー（Ｓａｌｅｈ，Ｍ．Ｔ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，Ｊ．Ｔ．）（２０００）「真核生物酸性ホスファターゼに類似するマイクロバクテリウム・ツベルクロシスによる酸性ホスファターゼ（ＳａｐＭ）の分泌」（Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＳａｐＭ）  ｂｙ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ）ジャーナルオブバクテリオロジー（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ）  １８２：６８５０−６８５３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ遺伝子（（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５））のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含み、プロモーターまたはプロモーターフラグメントが目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能である単離ＤＮＡ配列を提供する。
【０００６】
本発明はまた、結核菌（配列番号９）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ（配列番号１１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ（配列番号１３）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ（配列番号１５）からなる群から選択される分泌酸性ホスファターゼ遺伝子のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列を提供する。
【０００７】
本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）とハイブリダイズし、目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能であるプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列に関する。
【０００８】
本発明はまた、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ遺伝子（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含み、プロモーターまたはプロモーターフラグメントが目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能である単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。
【０００９】
本発明はまた、結核菌（配列番号９）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ（配列番号１１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ（配列番号１３）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ（配列番号１５）からなる群から選択される分泌酸性ホスファターゼ遺伝子のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。
【００１０】
本発明はまた、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）とハイブリダイズし、目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能であるプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。
【００１１】
本発明は、さらに、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ遺伝子（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含み、プロモーターまたはプロモーターフラグメントが目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能である単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１２】
本発明は、さらに、結核菌（配列番号９）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ（配列番号１１）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ（配列番号１３）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ（配列番号１５）からなる群から選択される分泌酸性ホスファターゼ遺伝子のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）とハイブリダイズし、目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能であるプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）と、ｓａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメント（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）に作動可能に連結された目的のヌクレオチド配列と、転写終結領域とを含む転写カセットである。１つの実施形態では、転写カセットは、さらに、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼＮ末端シグナル配列（配列番号５）、（配列番号６）、（配列番号７）、（配列番号８）またはその機能的部分を含む。別の実施形態では、転写カセットは、さらに、結核菌（配列番号５）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓ（配列番号６）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ（配列番号７）、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ（配列番号８）からなる群から選択される分泌酸性ホスファターゼＮ末端シグナル配列を含む。
【００１５】
本発明のなおさらなる態様では、被験体から生体サンプルを得ることと、サンプルをＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）に特異的な抗体の存在について分析することとを含み、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）に特異的な抗体の検出が病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法が存在する。
【００１６】
本発明の１つの態様では、被験体から核酸サンプルを得ることと、サンプルをｓａｐＭをコードする核酸（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）の存在について分析することとを含み、ｓａｐＭ（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）の検出が病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法が存在する。１つの実施形態では、病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法は、検出されたｓａｐＭ（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）の量を定量する工程をさらに含む。
【００１７】
本発明の別の態様は、被験体から生体サンプルを得ることと、サンプルをＳａｐＭホスファターゼ活性の存在について分析することとを含み、ＳａｐＭホスファターゼ活性の検出が病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法である。
【００１８】
本発明はまた、ｓａｐＭプロモーター（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）またはその機能的部分を含む核酸構築物であってプロモーターまたはその機能的部分が、検出可能または測定可能なシグナルを産生することができるレポーター遺伝子に作動可能に連結されている核酸構築物を用意あるいは使用することと、候補または試験化合物に核酸構築物を曝露することと、レポーター遺伝子によって産生されたシグナルを検出または測定することとを含み、試験化合物の非存在下と比較した候補または試験化合物の存在下で産生されたシグナルの変化が試験化合物がマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼの産生を調整できることを示す、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）の産生を調整または制御することができる化合物のスクリーニング方法に関する。１つの実施形態では、複数の化合物を試験する。
【００１９】
本発明はまた、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）、ＳａｐＭ基質、および試験化合物を含む混合物をインキュベートすることと、ホスファターゼ活性を測定することとを含み、試験化合物の非存在下と比較した試験化合物の存在下での活性の変化が試験化合物が前記分泌酸性ホスファターゼ活性を調整できることを示す、ＳａｐＭホスファターゼ活性を調整または制御することができる化合物のスクリーニング方法に関する。１つの実施形態では、複数の化合物を試験する。
【００２０】
本発明はさらに、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）を分泌するマイコバクテリア細胞を試験化合物に曝露することと、マイコバクテリア細胞によって分泌されたＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）の存在または活性を検出することと、マイコバクテリア細胞によって分泌されたマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ量を測定することとを含み、試験化合物の非存在下と比較した試験化合物の存在下でのマイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ分泌の変化が試験化合物がマイコバクテリア分泌ホスファターゼ分泌を調整できることを示す、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）の分泌を制御または調整することができる化合物のスクリーニング方法に関する。１つの実施形態では、複数の化合物を試験する。
【００２１】
本発明はまた、ＳａｐＭタンパク質（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）またはそのポリペプチドと、少なくとも１つのＳａｐＭ抗体と、ＳａｐＭ特異的抗体の検出に必要な１つまたは複数の試薬とを含む、病原性マイコバクテリア疾患または感染の検出用キットに関する。
【００２２】
本発明はまた、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）、（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）の配列と相補的であり、相補的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイゼーションすることができる核酸配列由来の連続ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドの相補核酸配列へのハイブリダイゼーションのための試薬を含む、病原性マイコバクテリア疾患または感染の検出用キットに関する。
【００２３】
本発明の別の態様では、ＳａｐＭタンパク質（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）またはそのポリペプチドフラグメント（配列番号２２）と特異的に結合することができる抗体が存在する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様では、ＳａｐＭタンパク質（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）またはそのポリペプチドフラグメント（配列番号２２）と特異的に結合することができる抗体を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物が存在する。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、マイコバクテリア分泌酸性ホスファターゼ遺伝子のコード領域の開始部位の５’上流隣接領域由来のプロモーターまたはプロモーターフラグメント（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）を含み、プロモーターまたはプロモーターフラグメントが目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり且つ低ｐＨ条件下で誘導可能である、単離ＤＮＡ配列を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物が存在する。
【００２６】
本発明の別の態様は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）とハイブリダイズし、目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能であるプロモーターまたはプロモーターフラグメント、を含む単離ＤＮＡ配列を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【００２７】
本発明は、ＳａｐＭタンパク質（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）またはそのポリペプチドフラグメント（配列番号２２）を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）とハイブリダイズし、ＳａｐＭタンパク質（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）またはそのポリペプチドフラグメント（配列番号２２）を発現させる単離ＤＮＡ配列または配列フラグメントを含む、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる攻撃に対して哺乳動物を治療または予防するためのワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【００２９】
本発明はさらに、ＳａｐＭポリペプチドを含み、且つ病原性マイコバクテリアの培養物中でＳａｐＭポリペプチドと自然に混合される他のタンパク質または糖タンパク質を実質的に含まない、被験体の病原性マイコバクテリア疾患または感染の検出に有用な抗原性組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明を、本発明の好ましい実施形態を示す添付の図面を参照してより完全に説明する。しかし、本発明は異なる形態で実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は開示を十分なものとするために示され、これによって本発明の範囲は当業者に完全に伝達されることとなろう。
【００３１】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、天然の抗体、および抗体の生物学的に活性な誘導体（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、またはＦｖなど、ならびに単一ドメインおよび単鎖抗体）、の両方を含むことを意味する。抗体の生物学的に活性な誘導体は、抗原に結合する能力を保持する。
【００３２】
本明細書中で記載される、用語「単離ＤＮＡ配列」には、一本鎖であるか二本鎖であるかを問わず、ＤＮＡが含まれる。配列は（すなわち、その天然の環境から）実質的に純粋な形態または均一な形態に単離および／または精製されるが、このとき目的の種の核酸または遺伝子、またはプロモーターまたはプロモーターフラグメント配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないか実質的に含まない。本発明のＤＮＡ配列は、全部または一部が合成であり得る。用語「単離した」は、これら全ての可能性を含む。
【００３３】
本明細書中で使用される、用語「低ｐＨ条件」は、ｐＨ範囲が５．０〜７．０、より好ましくは５．８〜６．６、最も好ましくは６．２の弱酸性条件をいう。
【００３４】
本明細書中で記載される、用語「オリゴヌクレオチド」は、任意の配列番号１〜配列番号４、または（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）に記載の任意の１４またはそれ以上の連続した塩基と同一の（または相補的な）少なくとも１４個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも５０個の連続した塩基を含むヌクレオチド配列を有する一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのアナログであるプローブまたはプライマーをいう。
【００３５】
プローブの構築に好ましい領域には、配列番号９、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）の５’および／または３’コード領域が含まれる。
【００３６】
さらに、配列番号１８の全ｃＤＮＡコード領域または配列番号２０に対応する全配列をプローブとして使用することができる。下記のような当該分野で周知の方法によってプローブを標識し、種々の診断キットで使用することができる。
【００３７】
本明細書中で記載される、用語「作動可能に連結された」は、同一のプロモーターから開始される転写に対する適切な位置と配向を有して同一の核酸分子の一部として連結していることを意味する。
【００３８】
本明細書中に記載される、用語「プロモーター」は、下流に（すなわち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上の３’方向に）作動可能に連結されたＤＮＡの転写を開始することができる、ヌクレオチド配列をいう。
【００３９】
本明細書中で記載される、用語「プロモーター活性」は、転写を開始する能力をいう。
【００４０】
本明細書中で記載される、用語「転写カセット」は、転写される核酸をコードする核酸配列をいう。転写を容易にするために、典型的にはプロモーターおよびエンハンサーならびに転写終結配列などの核酸エレメントが転写カセットに含まれる。
【００４１】
本発明者らは、ＳａｐＭはマイコバクテリア病原性の重要な決定要因であることを見出した。
【００４２】
多数の細菌酸性ホスファターゼと対照的に、ＳａｐＭの発現は、環境無機リン酸濃度によって制御されない。そのかわり、ｐＨによって制御される。病原性マイコバクテリアは、弱酸性ｐＨで高レベルのＳａｐＭを産生し、発現はｐＨ６．２で最大である。ｓａｐＭ遺伝子は、病原性マイコバクテリアのみで存在する。ｓａｐＭ遺伝子は、宿主マクロファージで選択的に発現し、結核菌を含むマイコバクテリアのビルレンスおよび病原性に重要である。結核菌ｓａｐＭの発現は、細胞内ｐＨによって誘導され、この遺伝子は病原性マイコバクテリアに特異的である。ＳａｐＭは、固有の酵素活性を有し、マイコバクテリア病原性の重要な決定要因である。他の細菌酸性ホスファターゼと異なり、ＳａｐＭは、ＧＴＰに対して非常な高活性を示し、細胞ＧＴＰ含有量およびその後のＲａｂタンパク質の活性形態と不活性形態とのバランスに影響を与え得る。ＳａｐＭが細胞外で分泌される小タンパク質（２８ｋＤ）であり、且つマクロファージの細胞質ゾルに接近できる可能性が高いので、これは特に関連する点である。マイコバクテリア病原性におけるＳａｐＭ機能の重要性は、ＳａｐＭが病原性マイコバクテリア中に存在するが非病原性マイコバクテリア中に存在しないという注目に値する発見によってさらに示される。ＳａｐＭホモログは、結核菌、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍ（全て病原性を示す）で見出される。対照的に、ＳａｐＭタンパク質およびｓａｐＭ遺伝子はいずれもＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）およびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）などの非病原性の環境マイコバクテリアでは検出されない。
【００４３】
（プロモーターフラグメント）
本発明は、プロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む単離ＤＮＡ配列を提供し、プロモーターまたはプロモーターフラグメントは（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）に記載のヌクレオチド配列を含む。プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、目的のヌクレオチド配列の発現の調節に十分であり、且つ低ｐＨ条件下で誘導可能である（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）に記載のヌクレオチド配列の１つまたは複数のフラグメントを含み得る。プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、結核菌の（配列番号１）に示す５’側４９８位までのヌクレオチド配列または他の病原性マイクロバクテリウムもしくは病原性菌類の同等の配列を含み得る。
【００４４】
制限酵素またはヌクレアーゼを使用し核酸を消化し、その後適切なアッセイによってプロモーター活性に必要な最小ヌクレオチド配列を決定することができる。
【００４５】
プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、発生および／または組織特異的な発現の調節、または外因性基質または環境条件による調節の制御を付与する１つまたは複数の配列モチーフまたはエレメントを含み得る。例えば、プロモーターまたはプロモーターフラグメントは、肺特異的調節制御エレメントまたは外因的に付加した糖（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなど）によって制御されるエレメントを含み得る。
【００４６】
本発明は、ヌクレオチドの付加、挿入、置換、または欠失による対立遺伝子、変異体、変異型、または誘導体であるヌクレオチド配列を有するプロモーターまたはプロモーターフラグメントにまで及ぶ。当業者に公知の技術によってヌクレオチド配列を変化させることができる。本発明のプロモーターまたはプロモーターフラグメント配列またはフラグメントの１つまたは複数の変化はプロモーター活性を増減させ得るし、又はプロモーターまたはプロモーターフラグメントの活性を調整することができる化合物またはタンパク質の効果の程度を減少させ得る。
【００４７】
（発現ベクター）
本発明はまた、本明細書中に開示のプロモーターまたはプロモーターフラグメントを含む発現ベクターを提供する。プロモーターまたはプロモーターフラグメントを、当該分野で周知の手段によって種々のベクターにクローン化することができる。このようなベクターは、本発明のプロモーターまたはプロモーターフラグメントに作動可能に連結されたベクターへの目的の核酸配列の挿入のための、適切に位置付けられた制限部位または他の手段を含み得る。このようなベクターは、適切に位置付けられた制限部位またはプロモーターまたはプロモーターフラグメントに作動可能に連結されたベクターへの目的のヌクレオチド配列の挿入のための他の手段を含み得る。
【００４８】
適切な調節配列（プロモーター配列またはそのフラグメント、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適切となるように含む）を含む適切なベクターを選択または構築することができる。
【００４９】
アッセイまたは実験で使用するために、ｐＥＴシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＰＲＯシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＴｅｔシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＢａｃＰＡＫシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販のベクターを使用することができる。遺伝子治療で使用するために、ｐＴ−Ｒｅｘ、ｐＩＮＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＶＡＸ１、およびｐＥＦなどのベクターを使用することができる。発現ベクターは、高レベルのポリペプチド発現を得るために有用である。本発明のＤＮＡ配列で形質転換した細胞培養物は、特にファゴソームの輸送および成熟に対するＳａｐＭの効果の研究のための研究ツールとして有用である。当該分野で公知の多数の技術による過剰発現および研究で細胞培養を使用することができる。例えば、細胞株（不死化細胞培養、初代細胞培養のどちらでもよい）を、産生された目的の核酸、ポリペプチド、得られた細胞の機能性および表現型のレベルを評価することができる本発明の転写カセットを含むベクターでトランスフェクトすることができる。
【００５０】
さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。細胞へのＤＮＡの移入手順は使用する宿主に依存するが、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム形質転換法など周知である。
【００５１】
（宿主細胞）
本発明のさらなる態様は、本発明の転写カセットを含む宿主細胞を提供する。特に望ましい宿主細胞には、結核菌、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ複合体のメンバー、Ｅ．ｃｏｌｉ（およびＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）などの誘導体）、タンパク質過剰発現用昆虫細胞株（Ｓｆ２１など）、哺乳動物細胞株（ＲＡＷおよびＪ７７４など）が含まれる。ｓａｐＭプロモーターの調節下で発現すべき適切な遺伝子の例は、以下である：抗原８５遺伝子（ｆｂｐＡ、ｆｂｐＢ、ｆｂｐＣ）、１９−Ｋｄリポタンパク質遺伝子（ｌｐｐｏ）、およびα−クリスタリン遺伝子（ａｃｒ）。
【００５２】
形質転換について当該分野で公知の方法には、エレクトロポレーション、塩化ルビジウム、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、またはクロロキントランスフェクション、ウイルス感染、ファージ形質導入、およびマイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されず、カチオン性脂質および脂質／アミノ酸複合体の使用、またはリポソームの使用、広範な種々の他の市販のトランスフェクションアジュバントおよび容易に合成されるトランスフェクションアジュバントは、宿主細胞にＳａｐＭ核酸分子を導入するのに有用である。
【００５３】
宿主細胞は従来の栄養培地中で培養される。プロモーターの誘導、目的の核酸配列の増幅、または形質転換体の選択に適切なように培地を改変することができる。温度、組成、およびｐＨなどの培養条件は明らかとなろう。形質転換後、選択可能な表現型に基づいて形質転換体を同定することができる。
【００５４】
（診断方法）
ｓａｐＭ核酸、ＳａｐＭタンパク質、またはＳａｐＭホスファターゼ活性の検出は、病原性マイコバクテリアもしくは病原性菌類感染の存在のスクリーニングツールとしてまたは病原性マイコバクテリアもしくは病原性菌類感染の進行のモニタリングに有用である。
【００５５】
本発明は、
ａ）被験体から生体サンプルを得ることと、
ｂ）サンプルをＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）に特異的な抗体の存在について分析すること、
を含む被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法であって、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）に特異的な抗体の検出は、病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法に関する。
【００５６】
免疫アッセイでＳａｐＭを用いることによってＳａｐＭに特異的な抗体の存在を分析することができ、ここでＳａｐＭは液相で使用しても固相キャリアに結合させて使用してもよい。さらに、抗ＳａｐＭ抗体を使用した免疫アッセイでの使用のために、種々の方法においてＳａｐＭを検出可能に標識することができる。本発明の方法を使用した抗ＳａｐＭ抗体検出のための好ましい免疫アッセイには、放射性免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、または当該分野で公知の他のアッセイ（免疫蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、または生物発光アッセイなど）が含まれる。
【００５７】
本発明は、
（ａ）被験体から核酸サンプルを得ることと、
（ｂ）サンプルをＳａｐＭをコードする核酸の存在について分析することとを含む被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法であって、ｓａｐＭの検出が病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法に関する。
【００５８】
例えば、ＰＣＲ分析、ＤＮＡ配列決定、ＳＳＣＰ分析、またはＲＦＬＰ分析によってサンプルをＳａｐＭをコードする核酸の存在について分析することができる。
【００５９】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）被験体から生体流動体サンプルを得ることと、
（ｂ）サンプルをＳａｐＭホスファターゼ活性の存在について分析することとを含む被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法であって、ＳａｐＭホスファターゼ活性の検出が病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の存在を示す、被験体の病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断方法に関する。
【００６０】
補因子としてＧＴＰおよび／またはＮＡＤＰＨおよび基質としてｐ−ニトロフェニルホスフェートを使用した酸性ホスファターゼアッセイの実施によって、サンプルをＳａｐＭホスファターゼ活性の存在について分析することができる。
【００６１】
病原性マイコバクテリア感染または病原性菌類感染の診断だけでなく、治療応答のモニタリング、予後評価、患者の疾患リスクの評価、およびリスクのある患者の疾患予防治療の成功のモニタリングのためにもｓａｐＭ核酸、ＳａｐＭタンパク質、またはＳａｐＭホスファターゼ活性の測定を使用することができる。
【００６２】
他のアッセイ（ならびに上記アッセイの変形）は、本発明の説明および技術から明らかである。
【００６３】
（スクリーニング方法）
本発明はまた、本発明のプロモーターまたはプロモーターフラグメントＤＮＡのプロモーター活性を制御または調整する合成化合物またはタンパク質のスクリーニング方法に関する。ＳａｐＭプロモーターまたはプロモーターフラグメントのプロモーター活性を制御または調整する合成化合物またはタンパク質の同定方法は、
ａ）ＳａｐＭプロモーター（配列番号１）、（配列番号２）、（配列番号３）、（配列番号４）の機能的部分を含む核酸構築物であって、プロモーターの機能的部分が検出可能なシグナルを産生することができるレポーター遺伝子に作動可能に連結されている核酸構築物を用意するか使用することと、
ｂ）核酸構築物を候補化合物またはタンパク質に曝露することと、
ｃ）試験される化合物またはタンパク質の非存在下で産生されたシグナルと比較することとを含む。
【００６４】
レポーター遺伝子は、好ましくは、検出可能なシグナルを産生する反応を触媒する酵素をコードする。多数の例（例えば、緑色蛍光タンパク質をコードするｇｆｐ（および増強される緑色、青色／シアン、および黄色蛍光タンパク質をコードするｇｆｐ変異型）、赤色蛍光タンパク質をコードするＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ、β−グルコロニダーゼをコードするｇｕｓ、細菌ルシフェラーゼをコードするｌｕｘＡＢ（またはｌｕｃＣＤＡＢＥ）、ホタルルシフェラーゼをコードするｌｕｃ、およびアルカリホスファターゼをコードするｐｈｏＡ）が公知である。当業者は、遺伝子活性を決定するために使用することができる複数の可能なレポーター遺伝子およびアッセイ技術を熟知している。任意の適切なレポーター／アッセイを使用することができ、本発明には特定の選択は不可欠ではなく、また当該選択は本発明の限定でもないと認識されるべきである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ発現系においてレポーター遺伝子を使用することができる。プロモーターまたはプロモーターフラグメントに加えて、発現には一般に、転写開始領域ならびに転写および翻訳終結領域の存在が必要である。
【００６５】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）、ＳａｐＭの基質、および試験化合物を含む混合物をインキュベートすることと、
（ｂ）ホスファターゼ活性を測定することと、
（ｃ）試験される化合物またはタンパク質の非存在下でのホスファターゼ活性と比較することとを含む、ＳａｐＭホスファターゼ活性を制御または調整する合成化合物またはタンパク質のスクリーニング方法に関する。
【００６６】
基質は、ｐＮＰＰ、ＧＴＰ、またはＮＡＤＰＨを含み得る。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、
（ａ）試験される化合物またはタンパク質にＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）を分泌するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を曝露することと、
（ｂ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞によって分泌されたＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）の活性の存在を検出することと、
（ｃ）試験される化合物またはタンパク質の非存在下でのＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）の分泌を比較することとを含む、ＳａｐＭ分泌を制御または調整する合成化合物またはタンパク質のスクリーニング方法に関する。
【００６８】
「調整」、「調整する」は、発現もしくは活性の増加、発現もしくは活性の減少、存在する発現もしくは活性の型もしくは種類の変化、発現もしくは活性の完全な停止（すなわち、発現もしくは活性の非存在）、または発現もしくは活性の刺激を指しうる。使用することができる適切な化合物には、タンパク質、核酸、低分子、ホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、薬物（化学療法薬、発癌性物質、または他の細胞（すなわち、細胞−細胞接触））が含まれるが、これらに限定されない。照射、活動ポテンシャルなどの環境因子または生理学的因子の通常の遺伝子発現に対する効果について細胞をスクリーニングすることもできる。
【００６９】
他のアッセイ（および上記アッセイの変形形態）は、本発明の説明および米国特許第５，８５１，７８８号、同第５，７３６，３３７号、および同第５，７６７，０７５号（その全体が本明細書中で参照により取り込まれる）に開示のものなどの技術から明らかとなろう。例えば、試験化合物レベルを固定するか増加させることができ、一度に複数の化合物またはタンパク質を試験することができる。
【００７０】
（キット）
本発明は、少なくとも１つの本発明のプローブを含むＳａｐＭ核酸分子の存在を検出するためのキットを含む。キットは、公知の技術にしたがって調製することができる（例えば、米国特許第５，８５１，７８８号および同第５，７５０，６５３号を参照のこと）。キットは、好ましくは、相補核酸配列へのプローブのハイブリダイゼーションに適切な試薬を含む。本発明はまた、少なくとも１つの本発明の抗ＳａｐＭ抗体を含むＳａｐＭタンパク質の存在を検出するためのキットを含む。キットを、公知の技術にしたがって調製することができる（例えば、米国特許第５，８５１，７８８号および同第５，７５０，６５３号を参照のこと）。
【００７１】
キットは、好ましくは、抗体、抗体と抗体によって認識されるポリペプチドとの間の免疫学的複合体の形成に適切な溶媒、および生体サンプル中のＳａｐＭまたは類似のポリペプチドの存在を確認するための免疫学的複合体を検出することができる試薬を含む。抗体の使用におけるさらなる背景は、例えば、米国特許第５，６９５，９３１号および同第５，８３７，４７２号（その全体が本明細書中に参照により取り込まれる）に記載されている。
【００７２】
（抗体の調製）
本発明は、本発明のポリペプチドに免疫反応性を示す単離抗体を含む。抗体は、好ましくは、天然のＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）または（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）のＳａｐＭの合成ペプチドのエピトープに対して作製される。抗体を、検出可能なマーカーで標識してもよく、標識しなくてもよい。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。ＳａｐＭ抗体を使用して、ＳａｐＭポリペプチドを含む生物をスクリーニングすることができる。抗体はまた、粗抽出物由来のポリペプチドの免疫精製に有益である。例えば、抗体と抗体によって認識されるポリペプチドとの間で免疫学的複合体を形成し、免疫学的複合体の有無を検出し、それによりサンプル中でＳａｐＭまたは類似のポリペプチドの存在が検出される条件下で、生物学的サンプルと抗体とを接触させることができる。本発明はまた、組成物（好ましくは、抗体が含まれる）、抗体と抗体によって認識されるポリペプチドとの間での免疫学的複合体の形成に適切な溶媒、およびＳａｐＭまたは類似のポリペプチドの存在を確認するための、免疫学的複合体を検出することができる試薬を含む。
【００７３】
ＳａｐＭを認識するために、例えば、（配列番号２２）（ＮＤＭＨＤＧＳＩ）などの、分子全体に分布するそれぞれ異なった一連のエピトープに対して抗体を作製することができる。ＳａｐＭの分泌を遮断するためにＮ−末端シグナル配列をターゲティングする抗体を作製することができるであろう。さらに、これらの抗体または他のＳａｐＭエピトープに対する他の抗体は、亢進したＳａｐＭクリアランス／分解と、それに付随したＳａｐＭホスファターゼ活性の減少によってＳａｐＭ活性を遮断することができる。
【００７４】
本願の説明および当該分野で公知の技術によってモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を調製する。モノクローナル抗体の調製および使用の例については、米国特許第５，６８８，６８１号、同第５，６８８，６５７号、同第５，６８３，６９３号、同第５，６６７，７８１号、同第５，６６５，３５６号、同第５，５９１，６２８号、同第５，５１０，２４１号、同第５，５０３，９８７号、同第５，５０１，９８８号、同第５，５００，３４５号、および同第５，４９６，７０５（その全体が本明細書中に参照により取り込まれる）を参照のこと。ポリクローナル抗体の調製および使用の例は、米国特許第５，５１２，２８２号、同第４，８２８，９８５号、同第５，２２５，３３１号、および同第５，１２４，１４７（その全体が本明細書中に参照により取り込まれる）に開示されている。
【００７５】
本発明はまた、抗体の使用方法を含む。例えば、本発明は、ａ）抗体との特異的反応性を示すポリペプチドへの抗体の結合に適切な条件下での１つまたは複数のポリペプチドを含むサンプルの本発明の抗体との接触、ｂ）抗体からの非結合ポリペプチドの分離、およびｃ）サンプル中で１つまたは複数のポリペプチドに結合したままの抗体の検出による、（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）、または（配列番号２２）などのＳａｐＭポリペプチドの存在の検出方法を含む。
【００７６】
（免疫原性組成物）
当業者は、本発明の免疫原性組成物の適切な投与方法が利用可能であると認識する。好ましくは、非経口（例えば、静脈内、動脈内、鞘内、皮下、皮内、または筋肉内）で組成物を投与する。非経口組成物のための有効な薬学的キャリアの要件は当業者に周知である（例えば、Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ（ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，（１９８２）およびＴｏｉｓｓｅｌ，ＡＳＨＩＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ  （４th  ｅｄ．）を参照のこと）。このような溶液は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および意図するレシピエントの血液と処方物とを等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含み得る。化合物は生理学的に許容可能な希釈剤を含む薬学的キャリア中で投与されてもよい。例えば（薬学的に許容可能な界面活性剤（セッケンまたは界面活性剤）、懸濁化剤（ペクチンなど）、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース、または乳化剤ならびに他の薬学的アジュバントを添加するか添加していない）滅菌液体もしくは液体の混合物（水、生理食塩水、水性デキストロース、および関連糖溶液、アルコール（エタノール、イソプロパノール、またはヘキサデシルアルコールなど）、グリコール（プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド、グリセロールケタール（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなど）、エーテル（ポリ（エチレングリコール）４００など）、オイル、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリドまたはアセチル化脂肪酸グリセリドが含まれる）。
【００７７】
非経口処方物で有用なオイルには、石油、動物油、植物油、または合成油が含まれる。このような処方物で有用なオイルの特定の例には、ピーナツ油、ダイズ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、および鉱物油が含まれる。非経口処方物で使用するための適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【００７８】
非経口処方物で使用するための適切なセッケンには、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩が含まれ、適切な界面活性剤には、陽イオン洗剤、陰イオン洗剤、非イオン洗剤、両性洗剤、およびその混合物が含まれる。
【００７９】
非経口処方物は、典型的には、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の活性成分を含む。防腐剤および緩衝液を使用することができる。非経口処方物は、単位用量（ユニットドーズ）または複数回用量（マルチドーズ）の密封コンテナ中に存在することができ、且つ凍結乾燥することができる。即時注射溶液および懸濁液を、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。局所処方物（経皮薬物放出に有用なものが含まれる）は当業者に周知であり、且つ本発明の文脈で皮膚への適用に適切したものである。
【００８０】
経口投与に適切な処方物は、溶液、カプセル、粉末、懸濁液、および適切な乳濁液からなり得る。液体処方物には、希釈液（水およびアルコールなど）が含まれ得る。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤、および不活性充填剤（ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびコーンスターチなど）を含む通常の硬殻または軟殻ゼラチン型であり得る。錠剤形態には、賦形剤、着色料、希釈剤、緩衝化剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、着香薬、および薬学的に適合する賦形剤が含まれ得る。
【００８１】
本発明の免疫原性組成物を、吸入によって投与されるエアゾール処方物に作製することができる。エアゾール投与に適切な処方物には、界面活性剤および高圧ガスが含まれ得る。鼻腔内送達用のキャリアも含まれ得る。
【００８２】
本発明の組成物を、種々の基剤（乳化基剤または水溶性基剤など）との混合によって座剤として投与することもできる。膣内投与に適切な処方物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレイ剤型で存在し得る。
【００８３】
免疫原性組成物についてのＳａｐＭタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントの濃度は、広範に変化することができ（すなわち、約１％未満から、通常１０重量％または少なくとも１０重量％から２０重量％〜５０重量％またはそれ以上）、選択された特定の投与様式にしたがって、主に流動物の体積、粘度などが選択される。非経口投与用組成物の実際の調製方法は、当業者に公知または自明であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１７th  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，（１９８５）により詳細に記載されている。
【００８４】
本発明の化合物を、包接複合体またはリポソームとして処方することができる。リポソームは、ＳａｐＭタンパク質またはそのポリペプチドフラグメントペプチドの特定の組織へのターゲティングに役立つ。リポソームはまた、組成物の半減期を増加させることができる。
【００８５】
（ワクチンの調製および使用）
ワクチンとしての使用に適切な免疫原性組成物を、ＳａｐＭタンパク質およびそのポリペプチドフラグメントならびにＳａｐＭタンパク質をコードする核酸分子およびそのポリペプチドフラグメントから調製することができる。ワクチンの調製方法および使用の例については、米国特許第４，６０１，９０３号、同第４，５９９，２３１号、同第４，５９９，２３０号、および同第４，５９６，７９２号（その全体が本明細書中に参照により取りこまれる）を参照のこと。
【００８６】
免疫原性組成物（ワクチンが含まれる）を、注射物質（溶液または懸濁液又は注射前の液体中の溶液あるいは懸濁液に適切な個体形態のいずれか）として調製することができる。調製物を乳化するか、タンパク質をリポソームにカプセル化することもできる。生の免疫原性成分は、薬学的に許容可能であり且つ活性成分に適合する賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなどおよびその組み合わせである。さらに、所望ならば、ワクチンは、少量の助剤（湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、および／またはワクチンの有効性を強化するアジュバントなど）を含み得る。有効であり得るアジュバントの例には、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩ（細菌から抽出した３つの成分を含む）、モノホスホリル脂質Ａ、ジミコール酸トレハロース（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０TM乳濁液が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
やはり種々のアジュバントから構成されるＳａｐＭワクチンの投与に起因するＳａｐＭ抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドに指向する抗体量の測定によって、アジュバントの有効性を決定することができる。
【００８８】
ワクチンは、従来のように、注射（例えば、皮下または筋肉内のいずれか）によって非経口投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方物には、座剤、ある場合には、経口処方物が含まれる。座剤について、従来の結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得る；このような座剤を、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２の範囲の活性成分を含む混合物から形成することができる。経口処方物には、試薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性処方物、または粉末の形態をとり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の活性成分を含む。剤形に適合する様式および予防および／または治療効果のある量でワクチンを投与する。
【００８９】
ワクチンを単回処方計画、好ましくは複数回処方計画で投与することができる。複数回処方計画は、最初に一連のワクチン接種を１〜１０回個別投与で行い、その後免疫応答を維持および／または増進に必要な時間間隔（例えば、第２の投与については１〜４ヶ月、必要に応じて、数ヵ月後に投与）で残りの投与を行うものである。投薬計画はまた、少なくとも部分的には個体のニーズによって決定され、これは開業医の判断に依存する。
【００９０】
さらに、ワクチンを、他の免疫調節薬（例えば、免疫グロブリン）と組み合わせて投与することができる。
【００９１】
（核酸分子）
（機能的に等価な核酸またはポリペプチド配列）
用語「単離ＤＮＡ配列」は、その構造がいかなる天然に存在するＤＮＡ配列の構造または天然に存在するＤＮＡ配列の３つを超える別々の遺伝子にわたる任意のフラグメントの構造と同一ではないＤＮＡ配列をいう。したがって、この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するＤＮＡ、（ｂ）得られる分子がいかなる天然に存在するベクターまたはゲノムＤＮＡと同一とはならないように、それぞれ原核生物または真核生物のベクターまたはゲノムＤＮＡに組み込まれた一つのＤＮＡ配列、（ｃ）個別の分子（ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ＰＣＲによって増幅することができるポリＡ  ＲＮＡの逆転写によって産生されたフラグメント、または制限フラグメントなど）、および（ｃ）一つのハイブリッド遺伝子（すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子）の一部である一つの組換えＤＮＡ配列を対象とする。詳細には、この定義から排除されるのは（ｉ）ＤＮＡ分子混合物中、（ｉｉ）トランスフェクトした細胞混合物中、および（ｉｉｉ）細胞クローンの混合物中に存在する核酸である（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーなどのＤＮＡライブラリー中のものなど）。
【００９２】
化学的に等価なまたは化学的に類似のアミノ酸配列が産生されるＤＮＡ配列の修飾は、本発明の範囲内に含まれる。修飾には、ヌクレオチドの置換、挿入、もしくは欠失、またはヌクレオチドの相対的な位置もしくは順序の変化が含まれる。
【００９３】
本発明のポリペプチドの変異型は例えば変異によって天然に生じ得るものであり、またはアミノ酸置換について当該分野で周知の指定部位突然変異誘発などのポリペプチド操作技術を使用して作製することができる。例えば、アラニンなどの疎水性残基を、ロイシン、バリン、またはイソロイシンなどのさらに疎水性の高い残基と置換することができる。グルタミン酸をアスパラギン酸などの負電荷のアミノ酸に置換することができる。リジンなどの正電荷のアミノ酸によって、アルギニンなどの別の正電荷のアミノ酸を置換することができる。
【００９４】
したがって、本発明は、アミノ酸配列の保存的交換または置換を有するポリペプチドを含む。保存的置換は、置換したアミノ酸配列と類似の化学的性質を有する１つまたは複数のアミノ酸を挿入する。本発明は、ＳａｐＭ活性を破壊しないで保存的置換を行った配列を含む。
【００９５】
本発明はまた、フラグメントが活性を保持している場合、ＳａｐＭ活性を付与するために使用することができる本発明のポリペプチドのポリペプチドフラグメントを含む。本発明はまた、ポリペプチドまたはその活性を特徴付けるための研究ツールとして使用することができる本発明のポリペプチドのポリペプチドフラグメントを含む。このようなポリペプチドは、好ましくは、少なくとも５個のアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、これらは、６〜１０個、１１〜１５個、１６〜２５個、２６〜５０個、５１〜７５個、７６〜１００個、または１０１〜２５０個の、本発明のポリペプチドのアミノ酸（またはより長いアミノ酸配列）からなりうる。フラグメントは、好ましくは、ＳａｐＭ活性を有する。フラグメントは、１つまたは複数のアミノ酸（例えば、ＳａｐＭ配列中のＣ末端アミノ酸）が除去された配列を含み得る。
【００９６】
本発明はまた、ＳａｐＭ活性を増減する保存的置換を行った配列を含む。
【００９７】
１つまたは複数のｄ型アミノ酸を含むポリペプチドは本発明内に意図される。Ｎ末端の１つまたは複数のアミノ酸がアセチル化されたポリペプチドも意図される。当業者は、本発明の対応するポリペプチド化合物と同一または同様の所望のＳａｐＭ活性を有するが、溶解性、安定性、ならびに／または加水分解およびタンパク質分解に対する感受性に関してポリペプチドよりも好ましい活性を有するポリペプチド模倣物の構築に種々の技術が利用可能であることを認識する。例えば、Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｇａｉｎｏｒ，（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４：２４３−２５２を参照のこと。ポリペプチド模倣物の例は、米国特許第５，６４３，８７３号に記載されている。模倣物をどのようにして作製および使用するのかについて記載されている他の特許には、米国特許第５，７８６，３２２号、同第５，７６７，０７５号、同第５，７６３，５７１号、同第５，７５３，２２６号、同第５，６８３，９８３号、同第５，６７７，２８０号、同第５，６７２，５８４号、同第５，６６８，１１０号、同第５，６５４，２７６号、同第５，６４３，８７３号が含まれる。当該分野で公知の他の技術にしたがって（例えば、水素基の水酸基またはアミノ基などの別の基への変換によって側基を化学的に変化させる薬剤での本発明のポリペプチドの処理により）、本発明のポリペプチドの模倣物を作製することもできる。
【００９８】
模倣物は、好ましくは、完全にアミノ酸から作製された配列またはアミノ酸および修飾アミノ酸または他の有機分子を含むハイブリッドである配列を含む。
【００９９】
本発明はまた、例えば、融合ポリペプチドをコードするために、１つの種由来のｓａｐＭ  ＤＮＡ配列を植物、哺乳動物、細菌、または酵母の配列由来のヌクレオチド配列と組み合わせたハイブリッド核酸分子およびポリペプチドを含む。本発明は、融合タンパク質の第１の成分が本発明のポリペプチド、好ましくは全長ＳａｐＭポリペプチド（またはその一部、以下を参照のこと）を含む、少なくとも２つの成分を有する融合タンパク質を含む。融合タンパク質の第２の成分は、好ましくはタグ（例えば、ＧＳＴ、エピトープタグまたは酵素）を含む。融合タンパク質はまた、ｌａｃＺ、アルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼなどの組織化学的もしくは細胞化学的マーカーまたはＧＦＰもしくはその誘導体の１つなどの蛍光マーカーを含み得る。
【０１００】
本発明はまた、好ましくは細胞形質転換のために組成物中にキャリアを含むか含まない、本発明の単離ＤＮＡ分子（好ましくは、ｓａｐＭ（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５））の全てまたは一部を含む組成物を含む。本発明はまた、好ましくはポリペプチド活性の研究または調整のためのキャリアを含むか含まない単離ＳａｐＭポリペプチド（好ましくは、ＳａｐＭ（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）、または（配列番号２２））を含む組成物を含む。
【０１０１】
（配列同一性）
本発明は、（配列番号１）〜（配列番号４）、または（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）（またはその部分的配列またはその相補配列）に記載のＤＮＡ配列と少なくとも約１７％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超、より好ましくは少なくとも約９５％超、９９．５％超の配列同一性を有する改変核酸分子を含む。好ましくは、約１、２、３、４、５、６〜１０、１０〜２５、２６〜５０、５１〜１００、または１０１から２５０個のヌクレオチドが改変されている。配列同一性は、ＢＬＡＳＴバージョン２．１プログラム高度検索（上記のパラメータ）のアルゴリズムによって評価することが最も好ましい。ＢＬＡＳＴは、オンライン（ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で利用可能な一連のプログラムである。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴ検索の参考文献は、以下である：
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０．
Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆  Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．（１９９３）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｂｙ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．
Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｔａｔｕｓｏｖ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｚｈａｎｇ，Ｊ．（１９９６）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ｓｅｒｖｅｒ”Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１．
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｃｈｌaｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．
Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆  Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）“ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ  ：  Ａ  ｎｅｗ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢＬＡＳＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６．
他の種における相同ｓａｐＭ核酸分子によってコードされるポリペプチドは、（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）（またはその部分配列）に記載のアミノ酸配列の少なくとも約２０％超、２５％超、２８％超、３０％超、４０％超、または５０％超アミノ酸配列が同一であろう。いくつかの種は、（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）（またはその部分配列）に記載のアミノ酸配列の全部または一部と少なくとも約６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超、より好ましくは少なくとも約９５％超、９９％超、または９９．５％超の配列が同一なポリペプチドを有し得る。当該分野で公知の方法に従って、同一性を計算する。配列同一性は、ＢＬＡＳＴバージョン２．１プログラム高度検索（上記のパラメータ）によって評価することが最も好ましい。好ましくは、約１、２、３、４、５、６〜１０、１０〜２５、２６〜５０、５１〜１００、または１０１から２５０個のヌクレオチドまたはアミノ酸が改変されている。
【０１０３】
本発明は、ＳａｐＭ活性に関与しないポリペプチドの一部のアミノ酸変化または変異によりポリペプチド活性が増減するようにＳａｐＭ活性に関与するポリペプチドの一部のアミノ酸変化を生じる変異を有する核酸分子を含む。
【０１０４】
多数の技術にしたがって、本発明の配列を調製することができる。本発明は、いかなる特定の調製手段にも制限されない。例えば、本発明の核酸分子を、ｃＤＮＡクローニング、ゲノムクローニング、ｃＤＮＡ合成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはこれらのアプローチの組み合わせによって産生することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。周知の方法および装置（自動化合成機など）を使用して、配列を合成することができる。
【０１０５】
（ハイブリダイゼーション）
ＳａｐＭ  ＤＮＡ分子の他の機能的に等価な形態を、従来のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を使用して単離することができる。これらの核酸分子およびＳａｐＭ配列を、その活性に有意に影響を与えることなく改変することができる。
【０１０６】
本発明はまた、（配列番号１）〜（配列番号４）、および（配列番号９）、（配列番号１１）、（配列番号１３）、（配列番号１５）（またはその部分的配列もしくはその相補配列）に記載の１つまたは複数のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、（配列番号１０）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１６）のＤＮＡによって産生されるＳａｐＭポリペプチドと実質的に等価な活性を示すペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸分子を含む。このような核酸分子は、好ましくは、本明細書中に定義の低、中（中程度）、または高ストリンジェンシー条件下でｓａｐＭまたはその相補物の全部または一部とハイブリダイゼーションする（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｍｏｓｔ  ｒｅｃｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ）を参照のこと）。ハイブリダイズする核酸の一部は、典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、または５０）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、ＳａｐＭポリペプチドまたはその相補物をコードする核酸の一部または全部の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも９５％または少なくとも９８％）同一である。本明細書中に記載のハイブリダイズする核酸型を、例えば、クローニングプローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、または診断プローブとして使用することができる。核酸サンプルへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを、典型的にはストリンジェントな条件下で行う。核酸二重鎖またはハイブリッド安定性を、融点（すなわちＴｍ）（プローブが標的ＤＮＡから解離する温度）で示す。この融点を使用して、必要なストリンジェンシー条件を定義する。プローブに関連し、同一よりもむしろ実質的にプローブと同一である配列が同定される場合、まず塩（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）の特定の濃度で相同性ハイブリダイゼーションのみが起こる最も低い温度を最初に確立することは有用である。次いで、１％のミスマッチによりＴｍが１℃低下すると仮定すると、それに応じてハイブリダイゼーション反応における最終洗浄温度は減少する（例えば、プローブと９５％より高い同一性を有する配列を探索する場合、最終洗浄温度は５℃低下する）。実際には、Ｔｍの変化は、１％のミスマッチあたり０．５℃と１．５℃との間であり得る。低ストリンジェンシー条件は、５０℃における約１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。高ストリンジェンシー条件は、６５℃における約０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。中ストリンジェンシーは、６０℃における約１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。プローブと標的核酸との間に至適な同一性レベルを達成するために塩濃度および温度のパラメーターを変化させることができる。
【０１０７】
本発明はまた、本願に記載のものと等価な塩および温度条件下でＳａｐＭポリペプチドまたは遺伝子縮重形態のアミノ酸配列をコードし、且つＳａｐＭ活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ分子とハイブリダイゼーションする、改変されているか改変されていない任意の供給源由来の核酸分子を含む。好ましくは、ポリペプチドは、ＳａｐＭポリペプチドと同一または類似の活性を有する。核酸分子によってコードされたポリペプチドがＳａｐＭ特異的抗体（本願で列挙した抗体が含まれるが、これらに限定されない）によって特異的様式で認識される場合、上記核酸分子は、本発明のｓａｐＭ核酸分子と機能的に等価であるとみなされる。
【０１０８】
（塩化アンモニウムに対して成長させたＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧでｓａｐＭの発現が誘導される）
細菌の酸性およびアルカリホスファターゼは、典型的には、環境無機リン酸濃度によって制御される（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８で概説）。リン酸化成分の外因性供給源の無機リン酸への加水分解を触媒するこれらの酵素の発現を、リン酸枯渇下で誘導した。次いで、この必須制限栄養素が、膜透過酵素によって細胞に輸送される。最近の研究では、結核菌のＳａｐＭが培養培地に分泌された酸性ホスファターゼであることが示された（Ｓａｌｅｈ  ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，２０００）。ＳａｐＭがリン酸同化に関与するかどうかを決定するために、ＳａｐＭ発現および活性に対する環境リン酸濃度の効果を試験した。４つのＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株（結核菌に密接に関連する生物）を、３つの異なる濃度の無機リン酸（０．０５、０．５、および５．０ｇ／Ｌ）を含むＳａｕｔｏｎ培地で成長させ、培養物ろ過タンパク質（ＣＦＰ）画分中の酸性ホスファターゼ活性をアッセイした。これらの条件下で、酸性ホスファターゼ活性は、低く、４０〜１３０ｎｍｏｌ・ｈｒ-1・ｍｇ-1（総タンパク質）の範囲であった。ほとんどの細菌酸性ホスファターゼと対照的に、ＢＣＧ培養物のＣＦＰ画分の酸性ホスファターゼ活性は、リン酸濃度によって制御されず、ホスファターゼ枯渇によってその活性は増加しなかった（図１Ａ）。培養培地中の炭素源の枯渇によっても酵素活性に影響を与えなかった（図１Ａ）。
【０１０９】
興味深いことに、窒素源として塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）を含む培地中で成長させたＢＣＧで高レベルの酸性ホスファターゼ活性が検出された（図１Ａ）。元のＳａｕｔｏｎ培地は、主な窒素供給源として２７ｍＭのアスパラギンを含む。アスパラギンを、等モル濃度のＮＨ4Ｃｌに置換し、新鮮な培地をｐＨ７．４に調整した。全てのテストしたＢＣＧ株（ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ）はアンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地中で正常に成長した。これらの条件下で調製したＣＦＰ画分は、元のＳａｕｔｏｎで成長させたものよりもはるかに高い酸性ホスファターゼ活性レベルを示した（図１Ａ）。ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇは、１３６から３，４５９ｎｍｏｌ・ｈｒ-1・ｍｇ-1に約２５倍の劇的な増加を示した。他のＢＣＧ株は、５〜１０倍の酸性ホスファターゼ活性の増加を示した。アンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地中のリン酸またはグリセロール濃度の調整では酵素活性レベルは変化しなかった（データ示さず）。
【０１１０】
ＳａｐＭが結核菌培養物の細胞外画分中で検出される唯一の酸性ホスファターゼであることが以前に示された（Ｓａｌｅｈ  ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，２０００）。ＳａｐＭが認められた酸性ホスファターゼ活性の増加に寄与するかどうかを決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＣＦＰ画分を分析した。図１Ｂに示すように、銀染色によって可視化したタンパク質バンドが、アンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ中で成長したＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇによって作られ、通常のＳａｕｔｏｎ培地中で成長した培養物では検出されなかった。このタンパク質の移動度は、成熟ＳａｐＭタンパク質（約２８ｋＤ）の分子量および部分精製ＳａｐＭの分子量に対応する。このタンパク質の同一性を確認するために、ＳａｐＭタンパク質のアミノ酸残基２０１〜２０８に対応する合成ペプチドに対する抗体を作製し、ウェスタンブロッティングを行った。実際、２８ｋＤタンパク質は抗ＳａｐＭ抗血清と反応し、このタンパク質がＳａｐＭであることを示す（図１Ｂ）。他のＢＣＧ株について、ＳａｐＭタンパク質はあまり明瞭でなく、これらの株で検出されたより低い酵素活性レベルに対応する（図１４）。
【０１１１】
（Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧのＳａｐＭは、弱酸性ｐＨで選択的に発現する。）
なぜＳａｐＭ発現がＮＨ4Ｃｌを含む培地で誘導されるのかすぐには明らかにならなかった。本発明者らの最初の仮説はＳａｐＭが窒素源の利用可能性によって制御されるというものであったにもかかわらず、窒素枯渇によってＳａｐＭ発現または活性は変化しなかった（データ示さず）。しかし、アンモニア（ＮＨ４+）は膜トランスポーターによって取り込まれ、これによってアンモニア取り込みとＨ+輸出とが対となり得る（Ｗｅｓｔｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これにより、培養培地が段階的に酸性化する。実際、消費されたＢＣＧ培養培地のｐＨの測定により、細胞が成長するにつれてＮＨ4Ｃｌを含むＳａｕｔｏｎ培地が酸性化するのに対し（すなわち、７．４から５．８〜６．２へのｐＨ変化）、アスパラギン含有Ｓａｕｔｏｎ培地のｐＨは７．４〜７．８のままであることが明らかとなった。
【０１１２】
したがって、本発明者らは、培養培地の酸性化はＳａｐＭ発現の誘導を担うと仮定した。これを試験するために、アスパラギン含有Ｓａｕｔｏｎ培地（ｐＨ７．４）中でＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇを成長させ、その後、細胞部分を洗浄し、適切な緩衝液でｐＨを７．０、６．６、６．２、および５．８に調整すること以外は同一の培地で培養した。これらの培養物のＣＦＰ画分由来の酸性ホスファターゼ活性を決定し、酸性ホスファターゼ活性レベルと培養培地のｐＨとの間の相関関係が明らかとなった（図２Ａ）。ｐＨ７．０〜７．４では、酸性ホスファターゼ活性レベルは非常に低い。弱酸性条件下では（すなわち、ｐＨ５．８〜６．６）、高レベルの酸性ホスファターゼ活性が検出され、ｐＨ６．２で最大であった（図２Ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析により、ｐＨ５．８〜６．６でＳａｐＭ発現が誘導され（図２Ｂ）、これは同一ｐＨでの高レベルの酵素活性とよく相関することが確認された。これらの結果は、弱酸性ｐＨでｓａｐＭが選択的に発現されたことを示す。ｐＨ５．８〜６．２でＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇで検出されたＳａｐＭ活性レベルは、アンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地で成長したそれと類似しており（図１Ａと２Ａとの比較）、上記アンモニウムによるＳａｐＭ発現の誘導はｐＨ効果を実際に反映することが示唆される。
【０１１３】
ｐＨ７．０〜７．４では、銀染色またはウェスタンブロッティングのいずれによってもＳａｐＭは検出されず（図２Ｂ）、ＳａｐＭレベルは非常に低いか検出限界未満であり、これらのｐＨ値で検出された残存酸性ホスファターゼ活性と一致することが示唆される（図２Ａ）。あるいは、残存酸性ホスファターゼ活性は、細胞成長時に培地外に漏れる細胞表面会合酸性ホスファターゼの小画分に由来し得る。ＳａｐＭ以外では、結核菌のたった１つの遺伝子産物（Ｒｖ２５７７）のみが、酸性ホスファターゼであると予想される（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。しかし、Ｒｖ２５７７は、搬出シグナル配列を保有せず、細胞表面に会合しているようである（Ｂｒａｉｂａｎｔ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｅｎｔ，２００１）。ＢＣＧの細胞表面会合酸性ホスファターゼおよびアルカリホスファターゼの活性は、培養培地中のｐＨの変化に影響を受けず（図２Ｃ）、ｐＨ依存性発現はＳａｐＭの特異的性質であることが示唆される。
【０１１４】
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおける結核菌ｓａｐＭのクローニングおよび発現）
ＳａｐＭは、最初、グリセロール−アラニン−塩（ＧＡＳ）培地中で成長させた結核菌Ｈ３７Ｒｖの細胞外培地から生化学的アプローチによって同定された（Ｓａｌｅｈ  ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，２０００）。本発明者らのアンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地と同様に、ＧＡＳは窒素源としてＮＨ4Ｃｌを含み、消耗したＧＡＳ培地は弱酸性である（データ示さず）。結核菌のＳａｐＭがＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧと同一の性質を共有することを確認するために、ｓａｐＭ遺伝子を含むＤＮＡフラグメント（Ｒｖ３３１０）をシャトルベクターｐＭＤ３１にクローン化して、ｐＳＡＰを作製し（図３Ａ）、次いで、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ2−１５５に形質転換した。ｓａｐＭ遺伝子は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ染色体に存在せず、ＳａｐＭ活性は細胞外ＣＦＰ画分で検出されなかった（以下を参照のこと）。しかし、ｓａｐＭを含む組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓをＮＨ4Ｃｌを含むＳａｕｔｏｎ培地で成長させた場合、ＣＦＰ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析でＳａｐＭタンパク質が検出された（図３Ｂ）。ＳａｐＭは、アスパラギン含有Ｓａｕｔｏｎで成長させたｐＳＡＰ株およびクローニングベクターｐＭＤ３１を含むコントロール株に存在しなかった。これらの結果は、結核菌ｓａｐＭ遺伝子を発現することができ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓから分泌することができることを示した。
【０１１５】
結核菌ｓａｐＭがｐＨによって制御されるかどうかを試験するために、上記の様な種々のｐＨレベルに調整したＳａｕｔｏｎ培地（アスパラギンを含む）でｍｃ2−１５５／ｐＳＡＰを成長させた。ＳａｐＭの酵素活性およびタンパク質濃度は互いに相関し、共に培養培地のｐＨに依存した（図４Ａ〜Ｃ）。ｐＨ５．８〜６．６で高レベルのＳａｐＭ発現および活性が検出され、これはＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧで得た結果と一致する。クローニングベクターのみを含むコントロール株は、残存酸性ホスファターゼ活性を示し、これは細胞表面会合酸性ホスファターゼの漏れに起因する可能性が高く、ｐＨで誘導されない。
【０１１６】
（結核菌ｓａｐＭ遺伝子は、マクロファージ中で選択的に発現される）
本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ｓａｐＭがｐＨ５．８〜６．６で選択的に発現することを示し、これは弱酸性マイコバクテリア含有ファゴソームと一致するｐＨレベル（ｐＨ６．１〜６．５）であり（Ｓｔｕｒｕｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ｓａｐＭ発現はマクロファージ内で誘導されていることを示唆する。ｓａｐＭがｉｎ  ｖｉｖｏで発現することを証明するために、２つの転写融合物を構築した。ｐＳＡＰＭ−ＧＦＰは、ｓａｐＭコード領域の上流５６０ｂｐおよびｓａｐＭ遺伝子の３’末端から６７ｂｐが切り取られたｓａｐＭ遺伝子を含む。ｐＳＡＰＣ−ＧＦＰは同一の５６０ｂｐｓａｐＭプロモーターフラグメント、全ｓａｐＭ遺伝子、およびその３’末端から１８３ｂｐが切り取られたｓａｐＣ遺伝子（Ｒｖ３３１１）を含む（図５Ａ）。ｓａｐＭおよびｓａｐＣ遺伝子は、同時転写されるようである。両ベクターでは、短縮遺伝子は、転写によって無プロモーター変異緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰ）と融合する（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。これらの構築物を、クローニングベクターｐＦＰＶ２７と共にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍ（染色体遺伝子座からＳａｐＭも産生する魚類病原体）に形質転換した（以下を参照のこと）。ｓａｐＭ発現が誘導されないか非常に低レベルで誘導されるアスパラギン含有Ｓａｕｔｏｎ培地（ｐＨ７．４）中で成長した組換えＭ．ｍａｒｉｎｕｍ株を使用して、マウスマクロファージ様細胞株Ｊ７７４Ａ．１に感染させた。予想するように、マクロファージ内で、ｐＳＡＰＭ−ＧＦＰまたはｐＳＡＰＣ−ＧＦＰを含むＭ．ｍａｒｉｎｕｍ細胞は明るく蛍光を発するのに対し、細胞外細菌の蛍光は最小であった（図５Ｂ）。クローニングベクターｐＦＰＶ２７（図５Ｂ）またはｓａｐＭプロモーターが反対方向に挿入された構築物（データ示さず）を含むＭ．ｍａｒｉｎｕｍ株は非蛍光であった。この結果は、上記の本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータと合わせると、ｓａｐＭは培養マクロファージのマイクロバクテリアファゴソームの弱酸性環境によって誘導されることを示す。
【０１１７】
（ｓａｐＭ遺伝子は、病原性マイコバクテリアのみで存在する）
上記のように、ｓａｐＭタンパク質および酵素活性は、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（非病原性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種）で検出されなかった。ＳａｐＭが病原性マイコバクテリアに特異的であるかどうかを試験するために、本発明者らは、２つの他のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（非病原性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｃｈｅｌｏｎａｅおよび魚病原体Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）を分析し、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧと同様に、アンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地で成長させたＭ．ｍａｒｉｎｕｍ培養物のＣＦＰは、高レベルの酸性ホスファターゼ活性（データ示さず）を示し、この活性は培養培地のｐＨに依存していた（データ示さず）。対照的に、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅはＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓに類似し、培地ｐＨによって制御されない残存レベルの酸性ホスファターゼ活性を示した（データ示さず）。これらの結果から、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍはＳａｐＭホモログを含む一方で、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓは含まないことが示唆される。ＴＩＧＲおよびＳａｎｇｅｒセンターで利用可能な非公開ゲノム配列の検索では、ＳａｐＭホモログはＭ．ｍａｒｉｎｕｍおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ（鳥類病原体）に存在するが、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓには存在しない（図６Ａ）。
【０１１８】
上記結果を確認するために、結核菌ｓａｐＭに特異的な放射性標識プローブを使用して、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅの染色体ＤＮＡのＤＮＡハイブリダイゼーションを行った。Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧの染色体ＤＮＡおよびｓａｐＭ含有プラスミドｐＳＡＰを正のコントロールとして含んでいた。結果は、ｓａｐＭ対立遺伝子がＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅ染色体中で検出されないことを示した（図６Ｂ）。
【０１１９】
（ＳａｐＭの免疫原性）
ヒト感染におけるＳａｐＭの抗原性を、部分精製結核菌ＳａｐＭおよび７人の個体から採取した血清を使用したウェスタンブロットによって評価した。これらの個体は、血清採取の４ヶ月前に化学療法を開始したリンパ節ＴＢと診断された１人の患者、Ｍ．ａｖｉｕｍに対して唾液塗抹標本陽性の１人の患者、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧをワクチン接種した２人の個体、患者の世話に関与する１人およびＰＰＤ陽性をテストした１人を含む３人の見かけ上健常な個体を含んでいた。興味深いことに、２人の患者（ＴＢ患者およびＭ．ａｖｉｕｍ感染患者）由来の血清がＳａｐＭと反応するのに対し（レーン４および５、図７）、ＰＰＤ陽性について試験した１人を含む２人の健常な個体由来の血清はＳａｐＭと反応しない（レーン２および６）。しかし、ＢＣＧをワクチン接種された２人の個体（レーン７および８）およびＴＢ患者管理に関与する個体（レーン３）もまたＳａｐＭと反応した。これらの結果により、ＳａｐＭはＴＢ患者またはＢＣＧをワクチン接種した個体由来の抗体によって認識されるが、結核菌に曝露されていない健常な個体由来の抗体では認識されないことが示唆される。
【０１２０】
結核菌は、ＧＴＰおよびＮＡＤＰＨに対して顕著に高い活性を示す分泌性酸性ホスファターゼ（ＳａｐＭ）を産生する。ＳａｐＭの生物学的機能は未知である。本研究では、本発明者らは、ｓａｐＭはｐＨによって制御されることを見出した。ＳａｐＭの発現レベルおよび酵素活性は、培養培地のｐＨを７．０〜７．４から５．８〜６．６に低下させた場合に劇的に増加する（約３０倍まで）。短縮ｓａｐＭの無プロモーターｇｆｐとの転写融合物により、感染マクロファージ中でｓａｐＭ発現が誘導されることが証明された。ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび配列分析は、ｓａｐＭ遺伝子が病原性マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｍａｒｉｎｕｍが含まれる）中に存在し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｃｈｅｌｏｎａｅなどの非病原性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に存在しないことを示した。さらに、ＴＢ患者またはＢＣＧワクチン接種個体由来の抗体はＳａｐＭを認識するが、健常な個体由来の抗体はＳａｐＭを認識しない。まとめると、これらの結果は、ＳａｐＭはマイコバクテリアによる病原性に重要であり、ファゴソーム成熟に関与するエフェクター分子に干渉することによる細胞内生存に寄与し得る。
【０１２１】
（材料と方法）
（株および培養条件）
Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ株（ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、およびＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ）は、Ｍａｒｃｅｌ  Ｂｅｈｒ（ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供された。Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ１２１８Ｒ株はＬｕｃｉａ  Ｂａｒｋｅｒ（Ｒｏｃｋｙ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＩＡＩＤ）から提供された。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ2−１５５およびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅＰＳ４７７０は前に記載されている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｉｕｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１２２】
マイコバクテリア細胞を、（１Ｌあたり）：０．５ｇＫＨ2ＰＯ4、０．１４ｇ  ＭｇＳＯ4、２．０ｇクエン酸、０．０５ｇクエン酸第２鉄アンモニウム、５．０ｇアスパラギン、および６０ｍｌグルセロールを含む通常のＳａｕｔｏｎ培地で成長させた。ｐＨを７．４に調整した。酸性ホスファターゼ活性に対するリン酸濃度の影響を研究するために、細菌をＳａｕｔｏｎ培地で指数期まで成長させ、ＫＨ2ＰＯ4を含まない同一の培地で洗浄し、リン酸濃度を以下のように変化させた１００ｍｌのＳａｕｔｏｎ培地中に接種した：（１Ｌあたり）ＫＨ2ＰＯ4を１０倍に増加させて５．０ｇとするか（高Ｐｉ培地）、１０倍希釈した０．０５ｇとする（低Ｐｉ培地）。酸性ホスファターゼに対する窒素源の影響を研究するために、元のＳａｕｔｏｎ中のアスパラギン（５ｇ／ｌ）をＮＨ4Ｃｌ（１．４２ｇ／ｌ）で置換した。炭素源枯渇のために、Ｓａｕｔａｎ培地のグリセロールを省略した。酸性ホスファターゼ活性に対するｐＨの影響を研究するために、元のＳａｕｔｏｎ培地のｐＨを以下の緩衝液で調整した：２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０および６．６）または２０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．２および５．８）。Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍおよびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅを３０℃で成長させること以外は、全ての培養物を３７℃で連続的に振動しながら成長させた。
【０１２３】
（分子クローニング）
結核菌Ｈ３７Ｒｖゲノムの順序付けＢＡＣライブラリーを、クローニングのためのＤＮＡテンプレートとして使用した。標準的なＤＮＡ操作プロトコールを使用した。Ｒｖ３３０９（ｕｐｐ）、Ｒｖ３３１０（ｓａｐＭ）、およびＲｖ３３１１（ｓａｐＣ）を含むＢＡＣ４０３の３ｋｂ  ＮｈｅＩフラグメントのプラスミドｐＭＤ３１の固有のＸｂａＩ部位へのライゲーションによってｓａｐＭをクローニングし、ｐＳＡＰを作製した。無プロモーター変異体ｇｆｐへの転写融合を、ｐＦＰＶ２７へのｐＳＡＰフラグメントのクローニングによって構築した。ｐＳＡＰＣ−ＧＦＰを構築するために、ｓａｐＭの上流５６０ｂｐ、完全なｓａｐＭ遺伝子、およびその３’末端から１８３ｂｐを短縮したｓａｐＣ（Ｒｖ３３１１）を含むｐＳＡＰＭの２．５６ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメントを、ｐＦＰＶ２７の固有のＥｃｏＲＶ部位に挿入した（Ｂａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ｐＳＡＰＭ−ＧＦＰを作製するために、ベクターｐＳＡＰＣ−ＧＦＰをＢｇｌＩＩで切断し、（ｐＦＰＶ２７、ｓａｐＭ開始コドンの上流５６０ｂｐ、および６７ｂｐを除くｓａｐＭコード領域の全て）を含む３．８ｋｂおよび２．５ｋｂのフラグメントを再ライゲーションした。エレクトロポレーションによってプラスミドをＭ．ｍａｒｉｎｕｍおよびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ2−１５５に移入し、組換え体を１０％ＯＡＤＣ濃縮物（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および２５μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９寒天（Ｄｉｆｃｏ）にて選択した。
【０１２４】
（サザンブロッティング）
標準的な方法にしたがってサザンブロッティングを行った。簡単に述べれば、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ2−１５５、およびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅから染色体ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に移した。次いで、メンブレンを、α32Ｐ−ＣＴＰ放射性標識ｓａｐＭプローブ（ｐＳＡＰの６６０ｂｐのＨｐｈＩ−ＮｄｅＩフラグメント）とハイブリダイズし、ホスホイメージャーカセットで曝露した。
【０１２５】
（酵素アッセイ）
分泌された酸性ホスファターゼ活性アッセイのために、培養濾過物タンパク質（ＣＦＰ）画分を、対数期（Ａ600約０．８）まで成長させた培養物から回収し、遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮し、４℃で一晩蒸留水に対して透析した（１５０〜２００×体積）。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。前に記載のように（Ｓａｌｅｈ  ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，２０００）マイクロタイター形式にてｐＨ６．８でｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を使用して酸性ホスファターゼアッセイを行った。１８，３８０ｍＭ  ｈｒ-1ｃｍ-1のニトロフェノールの減衰係数を使用して比活性を計算し、ホスファターゼ活性はｎｍｏｌ  ｈｒ-1  ｍｇ-1（総ＣＦＰタンパク質）で表した。
【０１２６】
細胞表面会合酸性ホスファターゼおよびアルカリホスファターゼのアッセイのために、細菌細胞を回収し、短時間超音波処理して細胞クランプを破壊した。次いで、細胞をＴｒｉｓ緩衝生理食塩水で３回洗浄し、その後蒸留水で最終洗浄を行い、細胞密度をＯＤ595＝０．４２に調整した。ｐＮＰＰに対するホールセルのホスファターゼ活性を、上記の様に放出させたｐ−ニトロフェノールの測定によってアッセイした。典型的には、５０μｌの細菌細胞を、１５０μｌの２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）（酸性ホスファターゼアッセイ用）または２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０．０）（アルカリホスファターゼ用）と混合した。反応緩衝液はまた、ＭｇＣｌ2およびＺｎＣｌ2を各々１ｍＭ含んでいた。最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにｐＮＰＰを添加して反応を開始させた。３７℃で３０分間のインキュベーション後、遠心分離によって細胞をペレット化し、１５０μｌの反応物を、５０μｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨを含むＥＬＩＳＡプレートウェルに移して反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダーにおいてＯＤ405nmを測定した。
【０１２７】
（抗ＳａｐＭ抗血清の作製）
ＳａｐＭアミノ酸配列中の残基２０１〜２０８に対応するペプチドを、固相ペプチド合成を使用して合成した。カルボキシル末端のアセチル化およびアミノ末端のシステインの付加によってペプチドを修飾した。配列ＣＮＤＧＨＤＧＳＩ−Ａｃを有する約１０ｍｇの精製ペプチドを、２０ｍＭ  ＤＴＴを含む４．０ｍｌの１０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．０）（緩衝液Ａ）への溶解によって還元し、室温で２時間インキュベートした。還元ペプチドを、緩衝液Ａで予め平衡化した１．５ｃｍ×４．０ｃｍ陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ５０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードし、その後ＤＴＴを含まない２５ｍｌの同一の緩衝液で洗浄した。結合したペプチドを、１０ｍｌの１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶離した。その直後に総体積２．０ｍｌのペプチドを、２ｍｇのｍｃＫＬＨ（Ｐｉｅｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含むチューブに瞬時に添加し、その後２００μｌの１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を添加し、室温で２時間継続して混合した。抱合したＫＬＨを、その後、ＰＢＳ中Ｇ−１０カラム（１．５ｃｍ×２５ｃｍ）で脱塩した。２匹のニュージーランドウサギに、２５０μｇのＫＬＨ抱合体で初回免疫を行い、２８日後に第１の追加免疫を行い、５６日後に第２の追加免疫を行った（各１００μｇ）。第２の追加免疫から９日後に血清をスクリーニングし、翌日に抗血清を回収した。
【０１２８】
（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング）
ＳａｐＭタンパク質の検出のために、ＣＦＰサンプル（典型的には、８〜１０μｇタンパク質）を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１４％ポリアクリルアミドゲルで分離し、銀染色によって可視化するか、ウェスタンブロッティングの場合、ニトロセルロースメンブレンに移した。次いで、メンブレンを、４００倍希釈した抗ＳａｐＭ抗血清でプローブし、抗ウサギＩｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体およびＢＣＩＰ／ＮＢＴで発色させた。ＳａｐＭ抗原性アッセイのために、以前に記載の方法を使用して（Ｓａｌｅｈ  ａｎｄ  Ｂｅｌｉｓｌｅ，２０００）、ＳａｐＭタンパク質を、プラスミドｐＳＡＰを保有する組換えＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ株から部分精製した。タンパク質を、１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移した。各レーンを切り出し、１５０倍希釈の各ヒト血清でプローブし、上記のように発色させた。ヒト血清サンプルは、Ｔｏｎｙ  Ｍａｚｚｕｌｌｉ（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）から提供された。
【０１２９】
（蛍光顕微鏡）
マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４を、ウシ胎児血清（５％）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１００ユニット／ｍｌペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍでの感染のために、細胞を、インキュベーター中でガラスカバースリップ（２２×２２ｍｍ）に３７℃、５％ＣＯ2で一晩接着させた。次いで、消耗した培地を新鮮な培地（抗生物質なし）と交換し、１０：１のＭＯＩのＭ．ｍａｒｉｎｕｍを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。過剰なバチルスを、滅菌ＰＢＳでの数回の洗浄によって除去し、最後に感染細胞を新鮮な培地で被覆し、インキュベーターに戻した。感染から所与の時間後、カバースリップをＰＢＳで数回洗浄し、３．７％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過化処理し、テキサスレッドファロイジンで１時間染色した。全ての処理を室温でおこなった。Ｈａｍａｍａｔｓｕデジタルカメラを具備したＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＢＥ顕微鏡で画像を収集した。ＧＦＰを可視化するためのＦＩＴＣフィルターまたはテキサスレッドに結合した細胞骨格特異的色素ファロイジンで処理したマクロファージを可視化するためのテキサスレッドフィルターを具備した微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を使用して画像を収集した。
【０１３０】
本発明を詳細に且つ特に好ましい実施形態を参考として説明しているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく変更を加えることができることは通常の技術を有する当業者に理解されるであろう。例えば、タンパク質について言及している箇所では、しばしばペプチドおよびポリペプチドを使用することができることが明らかである。同様に、本願中で遺伝子が記載されている箇所では、しばしば核酸または遺伝子フラグメントを使用することができることが明らかである。
【０１３１】
全ての刊行物（Ｇｅｎｂａｎｋエントリを含む）、特許、および特許出願は、各刊行物、特許、および特許出願が具体的且つ個別にその全体が参照により取り込まれるのと同様の範囲でその全体が参照により取り込まれる。
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Ｘｕ，Ｓ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ａ．，Ｓｔｕｒｇｉｌｌ，Ｋ．，ｖａｎ，Ｈ．，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｄ．，Ｏｒｍｅ，Ｉ．，Ａｌｌｅｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．（１９９４）「マイクロバクテリウム・ツベルクロシスおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ａｖｉｕｍ感染マクロファージの細胞内輸送」（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５３：２５６８−２５７８．
Ｙｕａｎ，Ｙ．，Ｃｒａｎｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｙ．Ｑ．，Ｈｉｃｋｅｙ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｒｙ，Ｃ．Ｅ．（１９９８）「結核菌の１６ｋＤａのα−クリスタリン（Ａｃｒ）タンパク質はマクロファージ中での成長に必要である」（Ｔｈｅ  １６−ｋＤａ  ａｌｐｈａ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ  （Ａｃｒ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：９５７８−９５８３．
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
本発明の好ましい実施形態を、図面に関して記載する。
【図１】（Ａ）栄養ストレスに応答したＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧの培養上清の酸性ホスファターゼ活性。ＢＣＧ株（３連）を、標準的なアスパラギン含有Ｓａｕｔｏｎ培地、低リン酸Ｓａｕｔｏｎ、低グリセロールＳａｕｔｏｎ、またはアンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ中で初期静止期まで成長させ、培養上清中の酸性ホスファターゼ活性を「実験手順」に記載のように決定した。（Ｂ）Ｓａｕｔｏｎ培地で成長させたＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧにおけるＳａｐＭ発現。等量のタンパク質（６μｇ）を、各レーンにロードし、銀染色（上のパネル）またはＳａｐＭ抗血清を使用したウェスタンブロッティング（下のパネル）によって可視化した。レーン２、４、６、および８は、通常のＳａｕｔｏｎ培地中のＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ、およびＢＣＧ−Ｊａｐａｎの培養上清に由来する。レーン３、５、７、および９は、アンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地中で成長した対応する株である。レーン１０は、ｍｃ2−１５５／ｐＳＡＰ由来の部分精製ＳａｐＭであり、レーン１は分子量マーカーである。
【図２】Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ−ＢａｉｒｋｈａｕｇにおけるＳａｐＭのｐＨ依存性発現。（Ａ）適切な緩衝液によってｐＨを表示のレベルに調整したＳａｕｔｏｎ培地中で成長したＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ培養物のＣＦＰ画分で決定された酸性ホスファターゼ活性。結果は、３連の培地に由来する。（Ｂ）パネル（Ａ）と同一のＣＦＰ画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。等量のタンパク質（７μｇ）を、各レーンにロードし、銀染色（上のパネル）またはＳａｐＭ抗血清でのウェスタンブロッティング（下のパネル）によって可視化した。コントロールとして矢印で示した部分的に精製したＳａｐＭを含んでいた。（Ｃ）ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ由来の細胞表面会合酸性ホスファターゼ（白抜きのバー）活性およびアルカリホスファターゼ（黒塗りのバー）活性。「実験手順」に記載の数と同数の細胞から活性を検出する。
【図３】Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおける結核菌ｓａｐＭのクローニングおよび発現。（Ａ）ｐＳＡＰの構築。結核菌ゲノム（ＢＡＣ４０３）の３ｋｂのＮｈｅＩフラグメントを、ＸｂａＩ線状化ｐＭＤ３１にライゲーションした。得られたプラスミドｐＳＡＰは、ｕｐｐ、ｓａｐＭ（Ｒｖ３３１０）、およびｓａｐＣ（Ｒｖ３３１１）を含む。制限酵素部位：Ｂ（ＢｇｌＩＩ）、Ｈ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、Ｋ（ＫｐｎＩ）、Ｖ（ＥｃｏＲＶ）、およびＸ（ＸｂａＩ）。（Ｂ）Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓにおけるｓａｐＭの発現。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの細胞を、通常のアスパラギン含有Ｓａｕｔｏｎ培地（レーン１および３）またはアンモニウム含有Ｓａｕｔｏｎ培地（レーン２および４）で成長させ、ＣＦＰ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色（上のパネル）またはＳａｐＭ抗血清を使用したウェスタンブロッティング（下のパネル）によって可視化した。レーン１、２：ｍｃ2−１５５／ｐＳＡＰ、レーン３、４：ｍｃ2−１５５／ｐＭＤ３１。矢印は、ＳａｐＭを示す。
【図４】結核菌ｓａｐＭのｐＨ誘導性発現。（Ａ）Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ組換えｍｃ2−１５５／ｐＳＡＰ株（黒塗りのバー）およびコントロールｍｃ2−１５５／ｐＭＤ３１株（白抜きのバー）を、表示のｐＨに調整したＳａｕｔｏｎ培地で成長させ、ＣＦＰ画分中の酸性ホスファターゼ活性を決定した。（Ｂ＆Ｃ）パネルＡ由来の同一のＣＦＰ画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、（Ｂ）銀染色または（Ｃ）ウェスタンブロッティングによって可視化した。上のパネルは、ｍｃ2−１５５／ｐＭＤ３１に由来し、下のパネルはｍｃ2−１５５／ｐＳＡＰに由来する。コントロールとして矢印で示した部分精製ＳａｐＭを含んでいた。
【図５Ａ】ＧＦＰ融合ベクターの構築。ｐＳＡＰの２．５ｋｂのＥｃｏＲＶフラグメントを、ＥｃｏＲＶ線状化ＧＦＰ融合ベクターｐＦＰＶ２７にライゲーションした。得られたｐＳＡＰＣ−ＧＦＰは、全ｓａｐＭ遺伝子およびｇｆｐと転写融合した短縮ｓａｐＣ遺伝子を含む。ついで、ベクターｐＳＡＰＣ−ＧＦＰを、ＢｇｌＩＩで切断した。ｓａｐＭ、ｇｆｐ、およびベクター骨格を含む３．８ｋｂおよび２．５ｋｂのフラグメントを再ライゲーションした。得られたｐＳＡＰＭ−ＧＦＰは、ｇｆｐと転写融合した短縮ｓａｐＭ遺伝子を含む。
【図５Ｂ】Ｊ７７４細胞に、ｐＳＡＰＭ−ＧＦＰ（パネルＡ〜Ｃ）、ｐＳＡＰＣ−ＧＦＰ（パネルＤ〜Ｆ）、またはクローニングベクターｐＦＰＶ２７（パネルＧ〜Ｈ）を保有するＭ．ｍａｒｉｎｕｍを感染させ、顕微鏡で試験した。Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ細胞を、Ｓａｕｔｏｎ培地（ｐＨ７．４）中で培養し、分析前にＪ７７４細胞に細菌を２４時間感染させた。画像を、ＤＩＣモード（パネルＡ、Ｄ、およびＧ）、テキサスレッドファロイジンについての赤色蛍光チャネル（パネルＢ、Ｅ、およびＨ）、および緑色蛍光チャネル（パネルＣ、Ｆ、およびＩ）にて各視野について取得した。細胞内細菌を矢印で示し、細胞外細菌を矢じりで示す。
【図６】（Ａ）結核菌、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、およびＭ．ｍａｒｉｎｕｍのゲノムデータベースで見出されたＳａｐＭホモログのアラインメント。矢印は、推定シグナル配列切断部位を示す。（Ｂ）サザンブロット分析。プラスミドｐＳＡＰならびにＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、およびＭ．ｃｈｅｌｏｎａｅから単離した染色体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩまたはＥｃｏＲＶで消化し、アガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレンに移し、放射性標識ｓａｐＭプローブでハイブリダイゼーションした。
【図７】ヒト血清のｍｃ2−１５５／ｐＳＡＰから部分的に精製したＳａｐＭとの反応性。部分精製ＳａｐＭをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移した。各レーンを切り出し、ヒト血清での１５０倍希釈物で探索した。レーン１：「実験手順」に記載の合成ペプチドに対して作製されたウサギＳａｐＭ抗血清。２：ＰＰＤ陽性試験を受けた健常な個体由来の血清。３および６：未知のＰＰＤ反応性を有する健常な個体。４：４ヶ月間化学療法を受けたリンパ節結核症を有する患者、５：唾液中に明らかにＭ．ａｖｉｕｍを有する患者、７：１９７７年にＢＣＧのワクチン接種を受けた健常な個体、８：１９５３年にＢＣＧワクチン接種を受けた健常な個体由来の血清。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図６】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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