(57)【要約】オリゴヌクレオチドを脱保護する方法であって、（ａ）保護されたオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、（ｉ）５’末端が疎水性脱離基（例えばジメトキシトリチル）に連結されているか、又は（ｉｉ）両端が１対の疎水性脱離基に連結されており、その対において１つのメンバーが他の１つのメンバーに比べて疎水性が低い（例えば、アルキル、アリールアルキル若しくはアリールシロキシルである）、前記ステップと；（ｂ）有機溶媒を用いて、疎水性支持体（例えば、疎水性ポリスチレンベースの支持体）上にオリゴヌクレオチドを（例えば、乾燥によって）沈殿させ、それによってオリゴヌクレオチドを非共有結合で固定化し、かつ不溶性にするステップと；（ｃ）有機溶媒（例えば、２％トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液）に溶解した試薬を用いて、オリゴヌクレオチドを脱保護する（すなわち、疎水性脱離基を除去する）ステップとを含む、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを脱保護する方法であって、
ａ）複数のオリゴヌクレオチドを提供するステップ（前記複数のオリゴヌクレオチドは、保護されたオリゴヌクレオチドを含み、（ｉ）前記保護された各オリゴヌクレオチドの５’末端は疎水性脱離基に連結されているか、又は（ｉｉ）前記保護された各オリゴヌクレオチドは１対の疎水性脱離基に連結されており、前記１対の疎水性脱離基の１つのメンバーは前記１対の疎水性脱離基の他のメンバーよりも疎水性が低い）と；
ｂ）非共有結合で固定化されたオリゴヌクレオチドを得るために、有機溶媒を用いて、疎水性固体支持体上に前記複数のオリゴヌクレオチドを沈殿させるステップと；
ｃ）有機溶媒に溶解した試薬を用いて、（ｉ）前記５’脱離基を前記固定化されたオリゴヌクレオチドから選択的に除去するか、又は（ｉｉ）前記対の疎水性脱離基を前記固定化オリゴヌクレオチドから連続して除去することによって、前記固定化されたオリゴヌクレオチドを脱保護するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｂ）の前に、疎水性支持体上に前記複数のオリゴヌクレオチドを吸着させ、そして、（ｉ）前記５’疎水性脱離基を欠いているオリゴヌクレオチド、又は（ｉｉ）任意の保護基を欠いているオリゴヌクレオチド及び前記対の疎水性脱離基の疎水性が低い脱離基のみを含有するオリゴヌクレオチドを溶出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脱保護されたオリゴヌクレオチドを溶出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記有機溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン又はイソプロパノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記沈殿ステップが、前記疎水性固体支持体上の前記複数のオリゴヌクレオチドを予備乾燥させ、次いで前記有機溶媒で前記疎水性固体支持体を洗浄することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記５’疎水性脱離基がトリチル部分、疎水性アセタール又はチオアセタール基である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
トリチル部分が酸の非水溶液を用いて選択的に除去される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸の非水溶液が２％トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記疎水性固体支持体がカートリッジ又はマニフォールドの形態で提供され、前記マニフォールドが複数のカートリッジを含有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記疎水性固体支持体がポリスチレン、活性炭、黒鉛又はシリカベースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記トリチル部分が、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、ピキシル又はモノメトキシトリチル部分である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記トリチル部分が、４−ヘキシルオキシメトキシトリチル、４−デシルオキシメトキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシメトキシトリチル、４−オクタデシルオキシフェニルキサンチル、４−４’−ビス−ヘキシルオキシメトキシトリチル、４−４’−ビス−デシルオキシメトキシトリチル、４−４’−ビス−ヘキサデシルオキシメトキシトリチル、４−オクタデシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、及び４−ヘキシルオキシトリチル部分からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記対の疎水性脱離基の１つのメンバーが、前記対の疎水性脱離基の他のメンバーを除去しない条件下で除去可能であるリンカーによって前記オリゴヌクレオチドに連結されている直鎖状アルキル、分枝状アルキル、アリールアルキル、又はアリール基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカーがシロキシル基又はジシロキシル基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数のオリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドが非標準主鎖を含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非標準主鎖が、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸又はホスホルアミドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドがロックされた核酸（ＬＮＡ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、官能基に連結されている１種又は複数のヌクレオチドを含有している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記官能基が、アミノ、チオール、リン酸、アルデヒド、挿入剤、クエンチャー、又はフルオロフォアである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記官能基が、前記オリゴヌクレオチドのいずれか一端に配置されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記官能基が、前記オリゴヌクレオチドの両端に配置されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記官能基が各末端で異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
５’脱離基又は前記対の疎水性脱離基の１つのメンバーが前記官能基に結合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記対の疎水性脱離基の１つのメンバーがリンカーに結合されており、前記リンカーが前記官能基に結合されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、非水溶性条件を用いて、前記固定化されたオリゴヌクレオチドを誘導体化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記誘導体化ステップが、精製された前記オリゴヌクレオチドにフルオロフォアを組み入れることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記誘導体化オリゴヌクレオチドを溶出するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの分離及び脱保護に関する。さらに詳しくは、使い捨ての分離カートリッジを用いて、脱保護されたオリゴヌクレオチドを取得するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡに基づいた分析技術、特に、アレイに基づいた分析手法は、オリゴヌクレオチド生産産業の発展に大きな影響を及ぼしてきており、バイオテクノロジー市場の要求に応じてパラレル合成技術が開発された。パラレル合成は、１つの装置で１日に多数のオリゴヌクレオチドを合成することができる。この方法は、大部分の試料（特にＰＣＲプライマーとして設計されている短いオリゴヌクレオチド）が精製不要で使用可能なレベルまで最適化されてきている。実際、精製された試料を用いることによって得られるかもしれない利点があるにもかかわらず、多数のオリゴヌクレオチドが未精製の状態で直接利用されている。
【０００３】
多くの分析技術においては、より長いオリゴヌクレオチド（例えば、７０から１００ヌクレオチド長のパッドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ））を用いることが望ましい。その理由は、長いオリゴヌクレオチドの異なる標的を区別する特異性が、短いオリゴヌクレオチドに比べて良好であるからである。しかし、この長さの粗製合成オリゴヌクレオチドは短い断片による汚染がひどく、非特異的結合に関する問題を避けるために精製の必要がある（Ｊｏｂｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４（１）：１９９〜２０２（２００２））。また、カップリングの失敗及び／又は副反応が合成の間に起こり、完全長でないオリゴヌクレオチド又は不完全オリゴヌクレオチドが産生される可能性がある。さらに、酸触媒による脱プリン化が生じ、オリゴヌクレオチド脱保護中にオリゴヌクレオチド主鎖が切断されてしまう可能性がある。結果として、化学合成によりオリゴヌクレオチドの一群は得られるが、所望のオリゴヌクレオチドを得るためにはそれらを精製しなければならない。したがって、典型的な合成オリゴヌクレオチド反応混合物には、次の３つの主成分、すなわち：完全長の産物、切断された断片、及び事前に脱プリン化されたオリゴヌクレオチド断片の塩基性切断によって生じるオリゴヌクレオチドが含有されている。完全長の産物には、欠失された断片（例えば、１ヌクレオチド欠失（ｎ−１）又は２ヌクレオチド欠失（ｎ−２）のある断片）が含まれる可能性がある。さらにオリゴヌクレオチド反応混合物は、望ましくない二重に組み入れられたヌクレオチドを含有する産物（ｎ＋産物）により、また、不完全に、若しくは不正確に脱保護されている断片により、汚染される可能性がある。不純オリゴヌクレオチドは、長さにかかわらず、質量分析に基づいた分析において、又はいくつかの事例において（Ｖｉｌｌａｄａｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３００（１）：１０１〜１０３（２００２））明らかなように、不純オリゴヌクレオチドでは、いかなる重要な結果も得ることはできないというような、不正確な結果をもたらし得る。
【０００４】
したがって、合成され得る数多くのオリゴヌクレオチドを処理するためには、優れた精製方法が必要とされている。合成中、一般にトリチル部分は、完全長のオリゴヌクレオチドの精製を容易にするために、最終ヌクレオチドのカップリングの後、オリゴヌクレオチドの５’末端に残される。トリチル部分（通常、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）又はモノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ））は、最終的には除去されなければならない酸不安定性保護基である。この脱保護又は脱トリチル化は、通常、８０％酢酸水溶液を用いた溶液中で、又は２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水溶液を用いたカートリッジ上で行われる。カートリッジを用いるオリゴヌクレオチドの脱トリチル化中、遊離５’ＯＨを保持する遊離されたオリゴヌクレオチドと新しく形成されたトリチルカチオンはともに、この工程を通じて、カートリッジ上にしっかりと結合されていなければならない。続いて、酸を洗い流し、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドをアセトニトリル及び水で溶出する。この方法は非常に単純に見えるが、脱トリチル化反応
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は可逆的であり、平衡定数は、酸濃度と脱保護の両産物に依存する。カートリッジ上のオリゴヌクレオチドとトリチルカチオンの可動性を限定することにより、非常に効果的な濃度の両分子が生じる。結果として、カートリッジ上のオリゴヌクレオチドの脱トリチル化によって、脱トリチル化されたオリゴヌクレオチドの収率が低くなり（５０％以下）、かつトリチル部分の再結合が同時に起こり得る。長時間にわたる酸による脱保護はまたオリゴヌクレオチドにさらに脱プリン部位を生じる可能性があるが、脱トリチル化されていない試料は再度脱トリチル化され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、カートリッジ上のオリゴヌクレオチドを脱トリチル化する有効な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、オリゴヌクレオチドを不溶化する方法において、オリゴヌクレオチドが固体支持体上に非共有結合で固定化され得るという知見に基づいている。したがって、オリゴヌクレオチドは支持体にしっかりと結合されて維持することができ、他方で、オリゴヌクレオチドの一端又は両端に結合されている疎水性脱離基（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を選択的に除去することができる。本発明の方法は、脱保護されたオリゴヌクレオチドの収率を最大限に増やしながら、穏やかな条件下でオリゴヌクレオチドを速やかに脱保護する（例えば、脱トリチル化する）ことができる。さらに、非共有結合で固定化されているオリゴヌクレオチドは、非水溶性条件下のカートリッジ上で（例えばフルオロフォアを組み入れることによって）誘導体化することができる。本発明の方法は、複数のオリゴヌクレオチドを同時に精製し、誘導体化するために用いることができる。
【０００７】
一態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドを脱保護する方法を特徴とする。本方法は、保護されたオリゴヌクレオチドを含む複数のオリゴヌクレオチドを提供するステップ（（ｉ）保護された各オリゴヌクレオチドの５’末端が疎水性脱離基に連結されているか、又は（ｉｉ）保護された各オリゴヌクレオチドは１対の疎水性脱離基に連結されており、ここで、１対の疎水性脱離基の１つのメンバーは、その対の他のメンバーよりも疎水性が低い）と；非共有結合で固定化されたオリゴヌクレオチドを得るために、有機溶媒を用いて、疎水性固体支持体上に前記複数のオリゴヌクレオチドを沈殿させるステップと；例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン若しくはイソプロパノールなどの有機溶媒中に溶解した試薬を用いて、（ｉ）５’脱離基を前記固定化されたオリゴヌクレオチドから選択的に除去するか、又は（ｉｉ）１対の疎水性脱離基を固定化されたオリゴヌクレオチドから連続して除去することによって、固定化されたオリゴヌクレオチドを脱保護するステップとを含んでいる。沈殿には、疎水性固体支持体上の複数のオリゴヌクレオチドの予備乾燥と、その後の有機溶媒による疎水性固体支持体の洗浄が含まれ得る。疎水性の固体支持体は、カートリッジ又は複数のカートリッジを含有するマニフォールドの形態で提供することができる。疎水性固体支持体は、ポリスチレン、活性炭、黒鉛又はシリカベースのものであり得る。
【０００８】
さらに本方法は、沈殿前に、疎水性支持体上の複数のオリゴヌクレオチドを吸着するステップと、（ｉ）５’疎水性脱離基を欠いているオリゴヌクレオチド、又は（ｉｉ）すべての保護基を欠いているオリゴヌクレオチド及び１対の疎水性脱離基の疎水性の低い脱離基のみを含有しているオリゴヌクレオチドを溶出するステップを含んでいる。さらに、本方法には、脱保護されたオリゴヌクレオチドを溶出することを含み得る。
【０００９】
５’疎水性脱離基は、トリチル部分、疎水性アセタール又はチオアセタール基であってよい。トリチル部分は、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、ピキシル又はモノメトキシトリチル部分であってよい。例えば、トリチル部分は、４−ヘキシルオキシメトキシトリチル、４−デシルオキシメトキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシメトキシトリチル、４−オクタデシルオキシフェニルキサンチル、４−４’−ビス−ヘキシルオキシメトキシトリチル、４−４’−ビス−デシルオキシメトキシトリチル、４−４’−ビス−ヘキサデシルオキシメトキシトリチル、４−オクタデシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、及び４−ヘキシルオキシトリチル部分からなる群から選択することができる。トリチル部分は、酸（例えば、ジクロロメタン中の２％トリクロロ酢酸）の非水溶液を用いて選択的に除去することができる。
【００１０】
１対の疎水性脱離基の１つのメンバーは、前記対の疎水性脱離基の他の１つのメンバーを除去しない条件下で除去可能であるリンカーによってオリゴヌクレオチドに連結されている直鎖状アルキル、分枝状アルキル、アリールアルキル、又はアリール基であってよい。リンカーはシロキシル基又はジシロキシル基であり得る。
【００１１】
複数のオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含み、かつ、非標準主鎖（例えば、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸又はホスホルアミド）を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）であり得る。オリゴヌクレオチドは、官能基（例えば、アミノ、チオール、リン酸、アルデヒド、挿入剤、クエンチャー、又はフルオロフォア）に連結されている１種又は複数のヌクレオチドを含有することができる。官能基は、オリゴヌクレオチドのいずれか一端に配置されるか、又はオリゴヌクレオチドの両端に配置することができる。官能基は各末端で異なっていてもよい。５’脱離基又は１対の疎水性脱離基の１つのメンバーは、官能基に結合させることができる。１対の疎水性脱離基の１つのメンバーは、リンカーに結合させることが可能であり、かつそのリンカーは官能基に結合させることができる。
【００１２】
さらに本方法には、非水溶性条件を用いて、固定化オリゴヌクレオチドを誘導体化することが含まれ得る。例えば、誘導体化には、精製オリゴヌクレオチドへフルオロフォアを組み込み、誘導体化オリゴヌクレオチドを溶出することが含まれ得る。
【００１３】
特に記載のない限り、本明細書で用いられているすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関係する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の又は同等の方法及び原料を本発明の実施に用いることができるが、以下に好適な方法及び原料を記載する。本明細書中に記載されている全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の文献は、引用によりその全体を本明細書に援用するものとする。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が規制するものとする。さらに、原料、方法及び実施例は単に例示をするものであり、限定することを目的とするものではない。
【００１４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記載及び特許請求の範囲から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
一般に、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドの一端又は両端に結合されている疎水性脱離基により、複数の化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、固体支持体上で合成されたオリゴヌクレオチド）を分離することができる。本発明の方法は、オリゴヌクレオチド試料の脱プリン化とその後の切断により生じた短い断片を完全長のオリゴヌクレオチドから分離することができる。これは、クロマトグラフィーによって効率的に、かつ実際に分離することができる試料の長さを、今日のＤＮＡ合成の限界まで延長するものである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドを不溶化し、５’疎水性脱離基（例えば、５’保護基）を除去し、かつオリゴヌクレオチドが誘導体化され得るように、オリゴヌクレオチドを固体支持体上に非共有結合で固定化することができる。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１対の疎水性脱離基に結合されており、この場合、その１対の疎水性脱離基の１つのメンバーは、その１対の他のメンバーよりも疎水性は低い。本発明の方法は、使い捨てのカートリッジ（逆相カートリッジ）において、オリゴヌクレオチドの高スループットの複数分離に用いることができる。
【００１６】
オリゴヌクレオチド
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」という用語には、３’〜５’リン酸ジエステルの主鎖を有するリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのオリゴマー、並びに標準の３’〜５’ホスホジエステル結合（例えば、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はホスホルアミド結合）とは異なる主鎖構造のあるリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドのオリゴマーが含まれる。また、「オリゴヌクレオチド」という用語には、イノシン又はヌブラリンなどの標準以外の塩基成分、修飾塩基成分、修飾糖成分、及びかかる成分の組み合わせを含有するオリゴマーも含まれる。例えば、窒素含有塩基又は糖成分を修飾して、反応機能性（例えば、Ｃ５プロピン、ハロゲン化物又はビオチン）、及び標識（例えば、放射性、発光性、電子発光性、可視、近接ＩＲ、及び蛍光性の各標識）を含むことができる。糖成分のさらなる修飾としては、フラノース環の４’−Ｃ位置に２’−Ｏ位置を接続するメチレンリンカーの添加が含まれる。この修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）と称され、１種又は複数のＬＮＡ修飾を含有している核酸をＬＮＡと呼ぶ。
【００１７】
オリゴヌクレオチド（標準以外の塩基を含有しているオリゴヌクレオチドを含む）を合成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルホスホロアミダイト法によって構築することができる。例えば、「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、編集Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８４、ＷＯ９２／０９６１５；及びオリゴヌクレオチド合成方法の記載に関するＷＯ９８／０８８５７を参照されたい。自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを産生することができる。かかる合成装置は周知であり、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈをはじめとする多数の会社から購入可能である。
【００１８】
一般には、オリゴヌクレオチド合成は、ヌクレオチド３’−酸素にリンカーを介して結合されている１種又は複数の保護されたヌクレオチドに対する固体支持体を利用する。リンカーは、原子（例えば、炭素、窒素、酸素など）の鎖を含有する任意の分子を意味し、それは加水分解的に安定していて、支持体上で合成される分子を支持体と連結する役目を果たすものである。通常、支持体における合成が始まる前に、共有結合によってリンカーが支持体に結合され、合成される分子の前駆体の結合に関する１種又は複数の部位を供給する。時には、リンカーは、完成した完全長のオリゴヌクレオチドの一部ではない、１種又は複数のヌクレオチド（例えば、ｐｏｌｙＴ）を含んでいることは理解されよう。リンカーの一部であるが、しかし完成した完全長のオリゴヌクレオチドの一部ではないヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３’末端ではないと考えられる。特に、ジシロキシル含有リンカー（例えば、オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシルに直接的に連結されているテトライソプロピルジシロキシル基）は有用であり、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４：４６３２〜４６３８（１９９６）；Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７（２４）：４７１０〜１４（１９９９）；又はＷＯ９８／０８８５７号で提供されている方法を用いて調製することができる。官能基（例えば、アミノ、チオール、リン酸、アルデヒド、挿入剤、クエンチャー、又はフルオロフォア）をリンカーに結合させることができることに留意されたい。
【００１９】
引き続いて追加のヌクレオチドモノマーを添加すると、得られたオリゴヌクレオチドは３’末端から５’末端方向に伸長される。オリゴヌクレオチドが所望の長さに達した場合、上記の刊行物に記載されている技術を用いて、部分的にオリゴヌクレオチドを脱保護し、脱プリン部位を切断し、切断により生じたすべての短い断片を除去することができる。次いで、合成支持体へ結合して残存しているオリゴヌクレオチドを支持体から除去することができる。ジシロキシルリンカーの場合には、シリカ−酸素結合を不活性化する試薬を用いて、支持体からのオリゴヌクレオチドを切断することができる。
【００２０】
脱離基
一般には、本発明の方法においては、保護されたオリゴヌクレオチドを含有する複数のオリゴヌクレオチドを用いる。本明細書では、保護されたヌクレオチドとは、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されている１対のメンバー、及び３’末端に結合されている他のメンバーとともに、その５’末端に結合されている疎水性脱離を有するオリゴヌクレオチド基、又はオリゴヌクレオチドに結合されている１対の疎水性脱離基を有するオリゴヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドに１対の疎水性脱離基を結合させる場合、疎水性脱離基の１対の１つのメンバーは、他のメンバーよりも疎水性は低い。一実施形態では、３’脱離基は、５’脱離基に比べて、実質的に高い疎水性を有し得る。他の実施形態では、５’脱離基は、実質的に高い疎水性を有し得る。
【００２１】
オリゴヌクレオチドの３’末端に結合されている脱離基は、固体支持体とオリゴヌクレオチドの第１のヌクレオチド（すなわち３’末端）の間のリンカーの成分であり得る。一般に、オリゴヌクレオチドの３’末端上の脱離基は、アンモニア水での処理下では安定している。そのため、固体支持体からオリゴヌクレオチドを遊離する場合、脱離基はオリゴヌクレオチドから切断されない。好適な３’脱離基としては、例えば、直鎖状アルキル、分枝状アルキル、アリールアルキル又はアリール基が挙げられる。１，１０−デカンジオール又は他の疎水性ジオールなどの直鎖状又は分枝状ジオールは、特に有用な疎水性脱離基である。
【００２２】
５’脱離基は、末端の適切に誘導体化されたホスホルアミダイトが合成時にオリゴマーに添加された場合、５’末端ヌクレオチド構成成分と一緒に導入することができる。「構成成分」という用語は、リン酸、アミン、チオール、ヒドラゾ、アルデヒド又はアミノオキシル基などの末端官能基を導入する末端ヌクレオチド及び化学的成分の両方が含まれる。オリゴヌクレオチドの５’末端に好適な脱離基は、標準ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、ピキシル（Ｐｘ、ピロキシカム）又はモノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）基があるが（ただし、これに限定されるものではない）、すべてのタイプの酸不安定性保護基が含まれる。特定に重要であるのは、トリチル（Ｔｒ）、トリメトキシトリチル（ＴＭＴｒ）、メトキシピキシル（ＭＰｘ）、及びオリゴヌクレオチドにさらなる疎水性を導入する他の基である。後者は、４−ヘキシルオキシメトキシトリチル（Ｃ６ＭＴｒ）、４−デシルオキシメトキシトリチル（Ｃ１０ＭＴｒ）、４−ヘキサデシルオキシメトキシトリチル（Ｃ１６ＭＴｒ）、４−オクタデシルオキシフェニルキサンチル（Ｃ１８Ｐｘ）、４−４’−ビス−ヘキシルオキシメトキシトリチル（ビスＣ６Ｔｒ）、４−４’−ビス−デシルオキシメトキシトリチル（ビスＣ１０ＭＴｒ）、及び４−４’−ビス−ヘキサデシルオキシメトキシトリチル（ビスＣ１６ＭＴ）、４−オクタデシルオキシトリチル（Ｃ１８Ｔｒ）、４−ヘキサデシルオキシトリチル（Ｃ１６Ｔｒ）、４−デシルオキシトリチル（Ｃ１０Ｔｒ）、及び４−ヘキシルオキシトリチル（Ｃ６Ｔｒ）の中から選択され得る。また、他の疎水性の高いトリチル基の例については、米国特許第５８９２００７号を参照されたい。これらの高疎水性官能基は、比較的長いオリゴヌクレオチドを分離するのに有用である。通常のジメトキシトリチル基の寄与は、支持体上のトリチル化分子の定量的でロスのない固着に十分ではない。また、異なるタイプの置換トリチル基は、米国特許第５３１９０７９号に記載されているようにして、トリチル交換の工程で、合成オリゴヌクレオチド中の５’位置に導入することができる。疎水性アセタール基又はチオアセタール基もまた有用な５’官能基である。
【００２３】
疎水性が高い脱離基は、オリゴヌクレオチドの各末端が異なる染料で標識化されている、二重標識化オリゴヌクレオチド（例えば、ｔａｑｍａｎ−プローブ及び分子標識）の合成及び精製に有用である。かかるプローブは、染料蛍光のクエンチングを有効にするために、非常に純粋でなければならない。満足する純度を達成するには、多くの場合、この種類のプローブは数種類のステップ工程で調製され、続いて各ステップで広汎性クロマトグラフィーの精製が行われる。かかる長時間にわたる方法が必要とされることにより、市販の二重標識化プローブは高値になっている。二重標識化プローブを調製するために必要な典型的な染料は、実質的な疎水性を有している。したがって、５’脱離基として標準ＤＭＴｒ基を使用すると、ＨＰＬＣでの分離が非常に難しく、かつカートリッジで溶解するのが不可能な混合物が生じる。しかし、本発明の方法に従って、ＤＭＴｒ基を、ＤＭＴｒより疎水性が高いＣ１８Ｐｘ基又はＣ１８Ｔｒ基と交換すると、両染料による疎水性の寄与はなくなり、二重標識化プローブを分離することができる。
【００２４】
疎水性支持体への吸着
オリゴヌクレオチドを、それが合成された支持体から分離した後、オリゴヌクレオチドを疎水性支持体上に吸着させることができる。典型的には、疎水性支持体は、例えば、シリカ、活性炭、黒鉛又はポリスチレンベースの粒子などの、支持材に化学的に結合されている、４〜２４個の炭素（例えば、８〜１８個の炭素）に及ぶ炭化水素鎖から構成されている。炭化水素鎖は分枝状であってもよく、１種又は複数の芳香族置換を有していてもよい。例えば、シリカベースの粒子にＣ１８鎖を結合させ、有用な疎水性支持体を形成することができる。スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、比較的安価で、かつ多数の試薬及び溶媒に不活性な一般的支持材である。アルカリ性アンモニア溶液に対する耐性及びＴＢＡＦに対する耐性により、この原料は特に有用である。シリカベースの材料は、スチレンベースの支持体ほど試薬及び溶媒に耐性はないが、すべての有害な試薬とシリカベースの支持体の短時間の接触、並びに水でそれらを稀釈することによる一部試薬の非活性化の可能性により、この支持体は有用となり得る。実際、ＲＰ１８シリカが充填され、１０％のアンモニア水溶液又は０．１ＭのＴＢＡＦ水溶液で前処理した小型のＨＰＬＣカラムは、未処理のカラムと比較した場合、モデルのオリゴヌクレオチド反応混合物の分離において実質的な差異は示さなかった。
【００２５】
さらなる有用な支持体には、アルカリ分解に対する反応性が低い酸化ジルコニウムベースの材料、又はアルカリ分解に対して完全に耐性のある活性炭をベースとした支持体が含まれている。
【００２６】
一般には、疎水性支持体は、複数のカートリッジを含有しているカートリッジ又はマニフォールドの形態（例えばカートリッジプレート）で提供する。使い捨てのカートリッジは信頼性があり、あまり高価でなく、同時分離の数、又は分離試料の量を高めることができる。種々のエレメント（例えば、弁、ポンプ、射出ユニット及びフラクションコレクター）並びにカートリッジを含有している系を構成し、オリゴヌクレオチドの分離を自動化することができる。カートリッジは、特定のオリゴヌクレオチドについて好ましい分離オーダーに基づいて、逐次に、又は並列した方法で実施することができる。オリゴヌクレオチドの分離方法は、（例えば、すべてのサンプル及び溶媒を扱うための自動システムを用いて）自動化することができる。カートリッジ実施における差異に関する問題を回避し、処理時間を短縮するためには、マニフォールド又は他のプラットフォームは、各試薬又は溶離液の添加後に、すべてのカートリッジを乾燥させることができる真空システムに連結し、それにより作動させることができる。
【００２７】
疎水性支持体へオリゴヌクレオチドを吸着させる場合に産物の実質的な減少を回避するには、オリゴヌクレオチドを前処理して、固相との相互作用に最適の形態に達するようにすることができる。これは、オリゴヌクレオチドの疎水性をより高める、疎水性対イオンを含有しているバッファーを用いることにより達成することができる。オリゴヌクレオチドに導入する疎水性の程度は、トリメチル又はテトラメチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルアンモニウム塩からなる群から物質を選択することにより調節することができる。第３級アンモニウム塩及び第４級アンモニウム塩が特に有用である。実際には、容易に揮発する塩、例えば炭酸塩又は酢酸塩などを用いるのが有利である。別の考慮すべき問題は、強疎水性脱離基を保持するオリゴヌクレオチドが構造内に凝集し、支持体の細孔に入り込まず、むしろ、カートリッジを通ってストレートに流れやすい傾向にあることである。これらの凝集塊を破壊するには、塩濃度を比較的高い濃度まで上昇させ、エタノール、アセトニトリル又はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒を用いて、疎水性構造を溶媒和化することができる。
【００２８】
疎水性支持体にオリゴヌクレオチドが吸着されると、５’疎水性脱離基を欠いているオリゴヌクレオチドを溶出することができる。１対の疎水性脱離基に連結されているオリゴヌクレオチドの場合には、すべての保護基を欠いているオリゴヌクレオチド、及び疎水性の低い脱離基のみを含有しているオリゴヌクレオチドが溶出される。例えば、３’脱離基が高い疎水性を有している場合、５’脱離基のみを有しているオリゴヌクレオチドだけでなく、すべての脱離基を欠いているオリゴヌクレオチドを溶出することができる。５’脱離基が高い疎水性を有している場合には、すべての脱離基を欠いているオリゴヌクレオチドが、３’脱離基のみを有するオリゴヌクレオチドと同様に溶出され得る。
【００２９】
５’疎水性脱離基（例えば、トリチル基）を欠いているオリゴヌクレオチドを取り除くには、トリエチルアンモニウムアセテート及び１０〜２０％アセトニトリルからなる溶離液を用いて、疎水性の低いオリゴヌクレオチドを効果的に流し出すことができる。脱プリン化と、その後の脱プリン化鎖の切断の結果として出現するオリゴヌクレオチド断片は、完全長の試料より疎水性であり、分画することが困難であるが、本発明によれば、実際のカートリッジ分離の前に、これらの断片を効果的に流し出すか、或いは、２個の脱離基を用いて操作するシステムを用いて、カートリッジ上で選択的に除去することができる。
【００３０】
疎水性固体支持体におけるオリゴヌクレオチドの沈殿
すべての短い断片が除去された後、残存している産物はカートリッジから簡単に溶出され、次いで、揮発性物質のエバポレーション後に脱トリチル化することができる。しかし、この方法は、さらなる酸のエバポレーションと通常脱塩段階が必要である。本発明では、オリゴヌクレオチドの５’末端の脱離基、又はオリゴヌクレオチド上の１対の疎水性脱離基は、オリゴヌクレオチドがカートリッジに結合されている間に除去することができる。
【００３１】
本明細書に記載されているように、オリゴヌクレオチドは有機溶媒中、カートリッジ上に沈殿することができ、続いて、脱離基を除去することができる。５’脱離基（例えば、トリチル部分）が選択的に除去されるか、又は５’及び３’脱離基が続けて除去され得る間、オリゴヌクレオチドは、支持体へしっかりと結合されたままにすることができる。したがって、脱保護されたオリゴヌクレオチドの収率を最大限にしながら、オリゴヌクレオチドを穏やかな条件下で速やかに脱保護（例えば、脱トリチル化）することができる。本明細書では、「沈殿した」という用語は、支持体表面上に不溶性の無水試料を形成することを意味する。例えば、オリゴヌクレオチドは、エアーによって乾燥させ、次いで、アセトニトリルで洗浄することによりカートリッジ上に沈殿させることができる。かかる方法で処理されたオリゴヌクレオチドは、カートリッジにしっかりと結合されたままであり、アセトニトリルフロント画分においてでさえ、オリゴヌクレオチドの喪失は認められなかった。実施例１を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、アセトニトリルなどの有機溶媒、又はジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン又はイソプロパノールなどの他の有機溶媒により沈殿させることができる。有機溶媒は、割合の低い水を含有していてもよく、本発明での使用にいっそう好適であることに留意されたい。
【００３２】
オリゴヌクレオチドが非共有結合で固体支持体上に固定化されると、５’分離タグは酸の非水溶液（例えば、２％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）のジクロロメタン溶液）を用いて除去することができる。例えば、ＤＭＴｒ成分で保護されているオリゴヌクレオチドを含有するカートリッジに、２％ＴＣＡのジクロロメタン溶液を適用した場合、ＤＭＴｒカチオンのオレンジの可視性バンドが速やかに形成され、それは容易にカートリッジから洗浄された。本明細書に記載されているように、９６オリゴヌクレオチドは、３０分未満でＣ１８シリカカートリッジプレート上で分離することができる。これは、オリゴヌクレオチドを分離するために４時間かかり得る他の市販の系よりも速い。したがって、本方法では、トリチル部分がカートリッジから除去され、脱トリチル化反応が完了まで推し進められる。過剰の酸は有機溶媒（例えばアセトニトリル）で洗浄することにより除去され、アセトニトリル又は他の有機溶媒を含有する溶離液によりカートリッジから最終産物を溶出させることができる。４０％アセトニトリルを含有する組成物は、オリゴヌクレオチドを含有しているすべての試料を溶出することができた。所望ならば、残存するすべての脱保護されていないオリゴヌクレオチドを別のＨＰＬＣ分析の実施により検出することができる。本明細書に記載のとおり、トリチル化された出発試料（通常、５％未満）のトレースのみが確認されるが、これは、本脱トリチル化法が本質的に定量的であることを示している。
【００３３】
上述のように、ＭＭＴｒ基によって保護されている５’−アミノアルキルオリゴヌクレオチドが吸着、沈殿及び脱トリチル化された場合、ＭＭＴｒカチオンの黄色のバンドが直ちに形成され、カートリッジから容易に洗浄された。脱トリチル化全工程は、定量的収率を伴って、１９５秒足らずで行われた。この同一の時間枠において、２％ＴＦＡでは、脱トリチル化試料への変換はわずかに８．４％であった。第１オーダーの速度論を適用することによって、９９％の脱トリチル化には２％ＴＦＡでは１４０分かかると推測された。２％ｖ／ｖのＴＦＡの実際の酸濃度は０．２６Ｍに相当し、２％ｗ／ｖのＴＣＡはわずか０．１２Ｍである。したがって、ＴＦＡ溶液がＴＣＡに比べて約２０倍酸性であったという事実にもかかわらず、２％ＴＣＡが反応性において１２０倍の差異を有していたのは驚くべきことである。
【００３４】
１対の脱離基に連結されているオリゴヌクレオチドの場合（この場合、３’脱離基は５’脱離基よりも高い疎水性を有している）、リンカーは切断され、すべての疎水性官能基を欠いているオリゴヌクレオチドを溶出することができる。残存している試料は、上述のように、有機溶媒を用いてカートリッジ上に再度沈殿させ、５’脱離基を除去し、脱保護された純粋な産物を溶出することができる。５’脱離基が３’脱離基より高い疎水性を有している場合、上述のように、５’脱離基を除去し、疎水性官能基を欠いている断片を溶出させることができる。残存している試料は有機溶媒によりカートリッジ上に再沈殿させ、リンカーを切断し、脱保護された純粋な産物を溶出させることができる。
【００３５】
オリゴヌクレオチドの誘導体化
反応性の機能性を保持するオリゴヌクレオチドが固体支持体上に非共有結合で固定化された場合、オリゴヌクレオチドは、選択された有機溶媒中で、及びさもなければ水との反応性がある試薬を用いて誘導体化することができる。使用可能な非水溶性溶媒の例（これに限定されるものではない）としては、ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トリエチルアミン、アセトン、アセトニトリル及びジクロロメタンが挙げられる。水と反応する試薬の例（これに限定されるものではない）としては、酸塩化物、酸無水物、混合無水物、及び種々の活性化剤と共に用いられる酸が挙げられる。さらに、活性エステルとして多数の官能基が加えられるが、それらの多くは高価であり、また最大効率で用いる必要がある。したがって、本方法では、活性エステルを用いて、加水分解を受けることなく、オリゴヌクレオチドを誘導体化することができる。オリゴヌクレオチドの１種又は複数のヌクレオチドは、アミノ、チオール、リン酸、アルデヒド、挿入剤、クエンチャー、フルオロフォア、又はオリゴヌクレオチドが細胞膜に浸透できるようにする成分などの官能基を組み入れることにより誘導体化することができる。一実施形態では、官能基はオリゴヌクレオチドのいずれか一端に配置する。他の実施形態では、官能基はオリゴヌクレオチドの両端に配置する。官能基はオリゴヌクレオチドの各端部で異なり得る。
【００３６】
本発明は、以下の実施例でさらに詳細に記載するが、これは特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３７】
本実施例で使用する試薬と分析方法及び調製法
特に記載のない限り、以下の試薬及び方法を本方法のセクションの後の実施例で用いた。
【００３８】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシ）トリチルチミジリル３’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピル−ジシロキシル−３）−（１−Ｏ−３，６，９−トリオキサ）ウンデカン−１１−オール及びそのホスホルアミダイト誘導体は、国際公開第９８／０８８５７号に従って調製した。市販のＣＰＧ（１０００Å；ＣＰＧ  Ｉｎｃ．、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ；又はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は、Ｐｏｎ，ＲＴ、「第１９章、オリゴヌクレオチド合成の固体支持体（Ｃｈａｐｔｅｒ  １９  Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ、４６５〜４９７、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｗａｔａ、ＮＪ（１９９３）に記載されている方法と同様の方法でアミノ化した。ヒドロキシルＣＰＧは、アミノ誘導体化ＣＰＧをピリジン中のγ−ブチロラクトンと反応させることにより得た。市販の化学薬品はすべて合成品質であり、さらなる精製は行わずに用いた。
【００３９】
オリゴヌクレオチド合成は、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成装置で、又はＭｕｌｔｉＳｙｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎで開発された１５３６チャンネルオリゴヌクレオチド合成装置（Ｃｈｅｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００２））で行った。すべてのカップリングは、０．２μｍｏｌスケール合成又はより小規模なもので推奨されている条件下で、ベンゾイルによって保護されているアミダイト（ｄＡ、ｄＣ）、及び／又は環外のアミン官能基のイソブチリル（ｄＧ）基を用いて行った。必要により、最後のヌクレオシドホスホルアミダイトは別の５’保護基で誘導体化されたヌクレオシドホスホルアミダイトと置換するか、或いは最終のジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基はトリチル交換法（米国特許第５３１９０７９号を参照）に従って他のトリチル誘導体により交換した。
【００４０】
アンモニアにより脱保護されたオリゴヌクレオチドの分析液体クロマトグラフィーは、溶媒Ａ：０．１Ｍトリエチル酢酸アンモニウム（「ＴＥＡＡ」）に溶解したアセトニトリル（「ＭｅＣＮ」）５％ｖ／ｖ、ｐＨ７．０と溶媒Ｂ：０．１ＭのＴＥＡＡに溶解したアセトニトリル８０％ｖ／ｖ、ｐＨ７．０の、４０分の直線濃度勾配を用いて、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ１８（５μｍ）カラム、ダイオードアレイ検出器を装備したＨｉｔａｃｈｉ−Ｍｅｒｃｋ  Ｌａ  Ｃｈｒｏｍ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍで行った。キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）分析は、ｓｓＤＮＡ１００−Ｒキャピラリーユニット（キャピラリーの長さ３０ｃｍ）を用いて、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｓｙｓｔｅｍで実施した。
【００４１】
（実施例１）
ポリスチレン支持体上に調製されたジシロキシル結合オリゴヌクレオチドのカートリッジによる分離
オリゴヌクレオチド（２６ｍｅｒ）は、下記の方法に従ってアミノメチルポリスチレン支持体（ＡＢＩ）上で合成した（図１も参照されたい）：アミノメチルポリスチレン（１９ｍｍｏｌ／ｇ）の０．２ｍｍｏｌを含有するカセットをＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成装置上に置き、Ｔアミダイトの３連続カップリングを行った。これらのカップリングの後に、リンカー及びオリゴヌクレオチド合成の出発点を達成するジシロキシルｄＧアミダイトを１回添加した。残りの配列は、標準の方法に従って合成した。固体支持体上で合成された産物は、トリチルオン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ）法を用いて、濃縮アンモニア水で処理されたが、この場合、固相は、さらにアンモニア洗浄の代わりの方法が施された。
【００４２】
支持体をＳｏｅｒｓｔｅｄチューブに移し、１２時間５５℃にて濃縮アンモニア水で処理した。遠心分離の後、アンモニア上清を前述のアンモニア洗浄液と組み合わせ、脱プリン部位の塩基による切断により得られた、すべての短いトリチル含有断片の存在を明らかにするため、逆相ＨＰＬＣで分析した。残りの支持体をアセトニトリルで洗浄して乾燥し、室温で２時間、フッ化テトラブチルアンモニウム（０．２ｍｌ、１ＭのＴＨＦ溶液）で処理した。揮発性物質を真空中で蒸発させ、残りの懸濁液に結合バッファー（１ＭのＮａＣｌ＋５％ＤＭＦの水溶液）（１．０ｍｌ）を添加した。透明な上清を１３０ｍｇの疎水性ポリスチレンベースの支持体から調製したカートリッジに供給し、トリチル官能基を欠いている残りの断片を２０％アセトニトリル及び０．１Ｍトリエチル酢酸アンモニウム（ＴＥＡＡ）からなるバッファーで溶出し、ＨＰＬＣ分析により示されたように、カートリッジ上に残存する１つの完全長の産物を得た。微量の水を除去するためにカートリッジに空気を通過させ、続いて純粋アセトニトリル（２×１，０ｍｌ）に供し、カートリッジ上に存在する試料を沈殿させた。過剰のアセトニトリルを空気の流れによって除去し、ジクロロメタンに溶解した２％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）からなる脱トリチル化混合物を添加したところ、カートリッジ上にオレンジ色のバンドが瞬時に形成された。切断されたＤＭＴｒカチオンのこのバンドをカートリッジから速やかに溶出させ、それにより、全切断及び除去の工程は２分以内に完了した。残っている酸を含むカートリッジは純粋アセトニトリルで洗浄し、乾燥させ、最終の純粋産物は０．１ＭのＴＥＡＡを含有する４０％アセトニトリルを用いて溶出された。代わりに、乾燥させたカートリッジを純水で洗浄し、次いで、５０％アセトニトリルの水溶液で溶出させることができる。後者の方法では、過剰の塩類を含まないオリゴヌクレオチドが得られる。
【００４３】
（実施例２）
５’−アミノ誘導体化オリゴヌクレオチドからのＭＭＴｒ基の除去
ＭＭＴｒ−ＮＨ−Ｃ５基を含有しているオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドの標準的手法に従って調製した。脱保護した試料は、トリチル除去にわずかに時間を長くかける以外は本質的に実施例１に記載したようにして、カートリッジ精製、及びカートリッジにおけるトリチル除去に供した（図２も参照されたい）。黄色のＭＭＴｒカチオンが４分でカートリッジから取り除かれたが、別のＨＰＬＣ分析から確認した場合、それは産物の定量的脱トリチル化に十分な時間であった。
【００４４】
２％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液を用いる以外、類似の実験においては、同じ時間で産物の１０％未満しか脱トリチル化することができないことが確認された。
【００４５】
（実施例３）
２個の脱離基を含む分子を精製するための二重オンカートリッジオリゴヌクレオチド脱保護
オリゴヌクレオチドは、１つのエステル結合によって支持体に連結されているチミジン残基を含有する標準ＣＰＧ支持体上に構築した。この出発残基に対して、疎水性構成成分の連続する３カップリングとジシロキシルｄＧアミダイトの１カップリングを行った。本実験で用いる疎水性構成基は、１，１２−ドデカンジオールのホスホルアミダイト誘導体（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈからの市販品）であった。オリゴヌクレオチドの残部は、３０−ｍｅｒ（ＡＧ）１５、７１−ｍｅｒ（ＡＧ）３５Ｔ、９１−ｍｅｒ（ＡＧ）４５Ｔ、又は１１１−ｍｅｒ（ＡＧ）５５Ｔを得るために、標準ヌクレオチドを含有していた。トリチルオン合成物質をアンモニアで処理し、支持体からそれを切断した後、アンモニア中で部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチドを回収した。１２時間、５５℃で加熱し、これにより塩基反応活性保護基をすべて除去し、以下の４種類の大きな化合物群を含有している混合物が得られた；１）５’ＤＭＴｒ及び３’−疎水性官能基の両方を含有している完全長のオリゴヌクレオチド、２）切断型断片と、３’−疎水性成分を有する、脱プリン化されたオリゴヌクレオチドの３’部分、３）脱プリン化され、かつ切断されたオリゴヌクレオチドのトリチル化断片、４）合成物質のダブルの脱プリン／切断の結果形成された、すべての疎水性官能基を欠いている断片。上記の混合物をポリスチレンカートリッジ上に供し、グループ３及びグループ４に属する試料を３５％アセトニトリル＋０．１ＭのＴＥＡＡで洗浄し、次いで、カートリッジを水で洗浄し、空気で乾燥させ、吸着されたオリゴヌクレオチドをアセトニトリルで沈殿させた後、純粋テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で１回洗浄した。次いで、疎水性３’脱離基は、室温で２時間、１Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（０．４ｍｌ）を用いて、ジシロキシル官能基のオンカートリッジ切断により分離した。続いて、以下のステップを用いてカートリッジを処理した：ａ）ＴＨＦ、ｂ）アセトニトリル、ｃ）空気乾燥、ｄ）水、ｅ）２０％アセトニトリル＋０．１ＭのＴＥＡＡ、ｆ）水、ｇ）空気乾燥、ｈ）純粋アセトニトリル。この段階で、カートリッジは、沈殿した、トリチル化された完全長の成分のみを含有しており、それは、実施例１に記載のようにして、２％ＴＡＣで脱トリチル化され、最終的に、溶出した。分離し、蒸発させた試料は、逆相ＨＰＬＣ及びＣＥにより分析した。図３は、カートリッジ精製したオリゴヌクレオチドの代表的なＣＥ分析を提供している。
【００４６】
（実施例４）
二重標識化分子プローブの合成及び分離
１）ＤＡＢＣＹＬ（クエンチャー）成分、ＤＭＴｒＯ可変長部分、及びホスホロアミダート基を含有している三官能性構成成分（図４）は、ＤＡＢＣＹＬ−ＮＨＳエステル（スクシンイミジルエステル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）及び２−アミノ−１，３−プロパンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ）から出発して調製した。分離されたアミド１，３−ジオールは、標準の文献方法に従って、トリチル化し、ホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅｄ）した。機能的に同一である構成成分は、例えば、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入することができる。
【００４７】
２ａ）オクタデシルオキシフェニルブロミドは、公表されている方法に従って、オクタデシルブロミド及び４−ブロモフェノールから得られた。この化合物は、高真空での蒸留により精製した。
【００４８】
２ｂ）オクタデシルオキシトリフェニルメタン（Ｃ１８Ｔｒ−ＯＨ）は、脱水ＴＨＦ中のマグネシウムとオクタデシルオキシフェニルブロミドから出発したＧｒｉｇｎａｒｄ方法で調製した。その有機金属化合物にベンゾフェノンを添加し、２ＭのＨＣｌで生成物を加水分解した。後処理した反応混合物を乾燥させ、蒸発させ、純粋な生成物をトルエンから結晶化した。トリチルアルコールは、過剰の塩化アセチルによる処理によって、トリチルクロライドに変換された。
【００４９】
２ｃ）１−アミノ−ペンタノール−５は、ピリジン中のトリメチルクロロシランでシラン化し、得られたＣ１８Ｔｒ塩化物でトリチル化してＣ１８Ｔｒ−ＮＨ−Ｃ５−ＯＨを形成させた。続いて、疎水性を高めた脱離基を導入するために、分離した試料をホスフィチル化させ、構成単位を形成させた（図４）。上記の方法は、市販のＭＭＴｒ−ＮＨ誘導体の合成と同じようにして行った。
【００５０】
３）アミノメチルポリスチレン支持体は、３個の標準チミジン残基と、続いて１個のジシロキシル修飾チミジン単位と反応させた。分子標識の合成は、クエンチャーのアミダイトの１回のカップリング、続いて互いに相補的な各末端に６個の塩基を有している３８−ｍｅｒのＤＮＡプローブの合成により開始された。合成は、フルオロフォアユニット（ＣＹ３、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び脱離基としてのＣ１８Ｔｒ誘導体を添加することにより実施した。この合成物質をアンモニア水により脱保護し、アセトニトリル／水＝１：１で固体支持体を数回洗浄し、脱プリン化され、切断されたすべての分子を除去した。上述のようにして、支持体から残存している物質を切断し、分離カートリッジに供した。４０％アセトニトリル＋０．１ＭのＴＥＡＡを用いた広範囲の洗浄を用いて、微量の切断型配列及び脱プリン化された配列の３’末端部分のすべてを除去した。残存する物質は、実施例１に記載されているようにして沈殿させ、カートリッジ上で脱トリチル化した。最終的に溶出された物質の純度は、ＨＰＬＣ及びＣＥで試験したが、それによれば、二重標識した完全長の分子標識の存在のみが示された。
【００５１】
（実施例５）
オンカートリッジオリゴヌクレオチド誘導体化
ＭＭＴｒ−ＮＨ−Ｃ５基により５’末端で標識化されている、２６−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、実施例２に記載されているようにして、合成し、精製し、カートリッジ上で脱トリチル化した。しかし、生成物を溶出させる代わりに、沈殿させた５’アミノオリゴヌクレオチドを有する、アセトニトリルで洗浄したカートリッジを、室温で６時間、アセトニトリル：ＤＭＦ：ピリジン＝７：２：１からなる混合物に溶解した過剰のフルオレセインイソチオシアネートで処理した。未反応の試薬は同一組成の溶媒を用いて洗浄し、その後アセトニトリルで洗浄し、空気乾燥した。ＨＰＬＣにより最終的に溶出された生成物を分析したところ、出発原料が５’フルオレセイン標識化生成物に変換されていることが明らかであった。
【００５２】
他の実施形態
本発明はその詳細な記載と共に記載されているが、先の記載は例示することを目的とし、添付されている特許請求の範囲により定義されている、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。また、他の態様、利点及び変更は、添付の特許請求の範囲内である。
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【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ポリスチレン支持体上に調製されたジシロキシル結合オリゴヌクレオチドのカートリッジによる分離の図である。
【図２】ＭＭＴｒ−ＮＨ標識化オリゴヌクレオチドのカートリッジよる分離及び脱保護の図である。
【図３】カートリッジ精製オリゴヌクレオチドの選択されたキャピラリー電気泳動法の流出を示す。
【図４】二重に標識化されたオリゴヌクレオチド（分子標識）の合成スキームである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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