(57)【要約】カロテノイド供給源、例えばPhaffia rhodozyma酵母をふくめ種々のバイオマスであってもよいバイオマスからカロテノイド類を抽出する全般的方法において、カロテノイド供給源を水、植物油などの疎水性のカロテノイド溶媒及びエタノールなどの水溶性共溶媒とを含んで成る混合溶媒により高温で処理して、該カロテノイド供給源からのカロテノイドを疎水性溶媒中に抽出させることから成る前記方法。利点としては、（ａ）食餌への配合・混合が容易であること、（ｂ）生体内利用可能性の増大が計れること及び（ｃ）抗酸化のための安定化が容易であることが挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド供給源からカロテノイドを抽出する方法において、カロテノイド供給源を水、疎水性溶媒及び水溶性共溶媒を含んで成る混合溶媒により高温で処理して、該カロテノイド供給源からのカロテノイドを疎水性溶媒中に抽出させることから成る前記方法。
【請求項２】
該方法が５０℃以上の温度で実施される、請求項１において記載された方法。
【請求項３】
該方法が５０乃至８０℃の温度で実施される、請求項２において記載された方法
【請求項４】
該方法が６０乃至７０℃の温度で実施される、請求項２において記載された方法。
【請求項５】
該カロテノイド供給源及び混合溶媒が該処理過程において撹拌される、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項６】
該抽出が少なくとも３０分間実施される、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項７】
該抽出が少なくとも３０分乃至３時間実施される、前記請求項６において記載された方法。
【請求項８】
該抽出がほぼ１時間実施される、前記請求項７において記載された方法。
【請求項９】
該疎水性溶媒が、食用油、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、Ｃ5又はそれ以上のアルカン又はクロロホルムである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１０】
該水溶性共溶媒が、アルコール、ケトン、エーテル又は環状エーテルである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１１】
該水溶性共溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール若しくはイソプロパノールであるか、又はエチレングリコールのモノアルキルエステル（セロソルブ）又は１，３−ジオキサン若しくは１，４−ジオキサンである、請求項１０において記載された方法。
【請求項１２】
該疎水性溶媒が食用油ではなく、且つ該抽出後に、該疎水性溶媒を食用油と混合し、その後混合溶媒から蒸発させる、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１３】
蒸発させた疎水性溶媒を前記抽出法に再使用する、請求項１２において記載された方法。
【請求項１４】
該カロテノイドがアスタキサンチン、リコペン又はベーターカロテンである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１５】
該カロテノイド供給源がバイオマスである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１６】
該バイオマスが、Phaffia属の酵母、貝、貝廃棄物、オキアミ、藻類、菌類、野菜又はトマトである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１７】
該カロテノイド供給源が、カロテノイド合成反応混合物である、請求項１乃至１４の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１８】
該カロテノイド供給源が、固体カロテノイドである、請求項１乃至１４の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１９】
カロテノイドを食用油中に溶かした溶液を製造する方法において、カロテノイドを揮発性の、水と混和しない溶媒中に溶かした溶液を前記食用油と混合し、次いで水と混和しない溶媒を前記混合物から蒸発させることから成る前記方法。
【請求項２０】
飼料材料を製造する方法において、請求項１乃至１８の内の何れか一項において記載されたカロテノイド抽出方法を実施して、かくしてカロテノイドを食用油に溶かした溶液を得て、次いで前記溶液を飼料成分に添加することから成る前記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、カロテノイド（又はカロチノイド）供給源、例えば天然の存在するか又は所定の目的のために培養されるバイオマスなどからカロテノイド類（又はカロチノイド類）を抽出するための抽出方法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】
自然状態で飼育されたサケ科の魚は、赤色ピグメントであるアスタキサンチンを含有するミクロ甲殻類を常食の天然成分として摂食した結果生じたピンク色の着色を獲得する。サケ科の魚を閉塞状態で飼育した場合、かかるアスタキサンチンを人工的に飼料に添加して、サケ科魚肉に所望とするピンク色の着色を付与するのである。このような着色を実現するために必要とするアスタキサンチンの量は典型的には、飼料１キログラム当りほぼ６０ｍｇである。このようなピグメントはまた、シーブリームなどの養殖魚の皮膚色を増大させるためや海老養殖においても使用されている。
【０００３】
アスタキサンチンの供給源としては、合成であれまた天然であれ、何れもサケ科魚のピグメント着色を行うために使用されてきた。現在使用されている主たる供給源は、天然供給源によった場合の製剤のコストが高いため合成供給源である。天然供給源による製剤は、アスタキサンチン含量の高いバイオマス、例えばPfaffia rhodozyma酵素、Haematococcus pluvalis海藻、や甲殻類製品をそのままサケ科の魚飼料に直接的に添加・混入することから成るものであった。しかしながら、個のような直接的添加・混入は、合成製品に比較した場合、魚の消化系は、バイオマス細胞からアスタキサンチンを効率的に抽出する能力がないため、即ちかかる供給源の生体内利用可能性が低いため、コスト的に効率的ではないことが判明している。
【０００４】
リコペンやβ―カロチンを含めたその他の商業的に重要なカロテノイド類もまた目下のところ、天然供給源から抽出した場合相当する合成品よりもコストが高い。
【０００５】
アスタキサンチンや多のカロテノイド類が有する経済的な重要性に鑑みて、カロテノイド顔料の高いバイオマスの生産を最適化し、かくしてカロテノイド類の抽出を改良する多くの方法が、試みられてきた。
【０００６】
アスタキサンチンの天然の供給源として公知のものは、例えば貝類、オキアミ、酵母P.rhodozyma、緑色海藻Haematococcus pluvialisやいくつかのバクテリア株が挙げられる。リコペンの天然供給源としては、トマトとトマト廃材が挙げられ、またニンジンは、β―カロチンの天然供給源である。
【０００７】
海老の加工廃材が大量に利用可能であるため、アスタキサンチンの有望な供給源であるものと見られてきた。しかしながら、含有濃度が低く、また試みられた抽出法はコスト高であることが判明している。
【０００８】
US Patent No.3906112は、海老廃材を微細に破砕し、得られた粉体を油と共に加熱混合し、アスタキサンチンの一部を該油に抽出することを記載している。
【０００９】
US Patent No.4,505,936には、類似の方法が記載されているが、この方法においては、キチン質殻を除去し、タンパク質組織を酸性化した後油と共に加熱するのである。
【００１０】
更に最近の研究では、超臨界ＣＯ2を使用して抽出を行うものであり、US Patent No.5,210,186では、沸騰状態の灰汁を使用してアルカリ性抽出液を得る方法が記載されている。
【００１１】
これらのすべての方法に共通する欠点は、含まれるアスタキサンチンの濃度が低くまた抽出コストが高いため、抽出されたアスタキサンチンは、合成の代替物と比較してコスト的に効率的ではないことである。
【００１２】
バクテリアの発酵による培養抽出製品は、工業的には公知であって、この目的に合致した菌株開発の方向で膨大な研究努力がこれまでに行われてきた。US Patent No.5,607,839には、アスタキサンチンを含めたカロテノイド類を産生する能力を有する新たに発見された属に属する細菌が記載されている。同様な菌株開発の研究努力が、ミクロ藻供給源を目指して行われている。しかしながら、何れの供給源も、収率が低いため商業化には未だ程遠い。
【００１３】
近年は、アスタキサンチン産生酵母である、P. rhodozymaの菌株開発に多くの商業的努力がなされてきた。この検討は、P. rhodozymaの上位菌株によって高収率のアスタキサンチンを産生させることに成功している。例えば、US Patent No.5,599,711には、数千ｐｐｍの範囲でアスタキサンチンを産生する能力を有するこの酵母の菌株が記載されている。しかしながら、このように高い収率が得られたにも拘わらず、この酵母は、下記の理由によってコスト的に効率的ではないのである；即ち、
【００１４】
１．P.rhodozymaを飼料に直接添加した場合、生体内利用可能性は、細胞壁が硬く、そのため消化時間サイクル内での魚の消化系によるアスタキサンチン分子の抽出が妨害されるので、低くなる。かかる生体内利用可能性を上げるため細胞壁を粉砕又は破砕する方策もかかる結果を僅かに改善するに過ぎなかった。
２．アスタキサンチンが細胞内に強固に結合していることが、P.rhodozymaから当該物質を化学的に抽出する方法が有する相対的にコスト高となる本質の背景にある理由である。例えば、US Patent No.5,356,810においては、乾燥して、未破砕のP.rhodozyma細胞から氷酢酸を用いてアスタキサンチンを抽出ことが開示されている。
【００１５】
カロテノイド類全般を抽出することに関する文献は広範に存在する。
【００１６】
US Patent No.5,830,738には、細胞壁を破壊して植物胞内に閉じ込められたカロテノイ  ド類を抽出するために酵素を使用することが記載されている。
【００１７】
US Patent No.5,789,647においては、有機の吸引剤と共に例えばブタンやプロパンな  どの圧縮ガスを使用して天然物からカロテノイド類を抽出することが記載されている。
【００１８】
US Patent No.5,773,075は、高温及び高圧を利用して植物材料からカロテノイド類を抽出することを記載している。しかしながら、これらの方法は全て、高コストであり、かくしてバイオマスからカロテノイド類を商業的規模で抽出するには適していない。
【００１９】
以下において記載する本発明に従えば、水、水に混和しない溶媒及び水溶性共溶媒と  から成る混合物を用いて、カロテノイドをカロテノイド供給源から抽出するのである。
【００２０】
US-A-4439629には、藻類を水酸化カルシウムで５０乃至１００℃にて処理して、含有されるクロロフィルを鹸化し、次いで塩化メチレン、へキサン又は高沸点石油エーテルなどの溶媒でβ―カロテンを抽出することによって藻類からβ―カロテンを抽出することが開示されている。
【００２１】
US-A-4871551は、例えば油類、芳香族化合物類（例えばベンゼンなど）、ハロゲン化炭化水素類（例えば塩化メチレンなど）又はアルカン類（例えばへキサンなど）などの溶媒類で抽出することによってアスタキサンチンをHaematococcus algaeから抽出することを記載している。
【００２２】
EP-A-612775は、Dunaliella属の好塩海藻、例えばD.salina、  D.parva、D.tertiolecta、  D.primolecta及びD.peirceiなどからβ―カロテンを抽出することを記述している。かかるバイオマスの水性懸濁液を食用油（大豆油、ピーナッツオイル、又はひまわり種油）を用いて高温で乳化し、得られた混合物を膜限外ろ過に供するのである。
【００２３】
WO98/03480には、藻類(Dunaliella)、野菜（ニンジン）、又は菌類(Blakeslea)から、酢酸エチル、酢酸ブチル、ヘキサン又は植物油などの水と混和しない溶媒で抽出し、次いで結晶化させ、得られた結晶を例えばエタノール又は酢酸エチルなどβ―カロテンの貧溶媒で洗浄することによってβ―カロテンを抽出することが記載されている。
【００２４】
WO98/50574には、湿潤バイオマスの細胞を可能ならばオクタノールなどの溶媒を使用して破砕し、選択的に油、ヘキサン又は酢酸エチルであってもよい水に混和しない溶媒を添加し、次いで残屑を除去して液面に固形カロテンを浮遊させることによってバイオマス中に結晶として存在するカロテンを抽出することが記載されている。固体の上層を水で洗浄し、次いで例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール又はアセトンなどのカロテノイドの貧溶媒で洗浄して、脂質を除去してもよい。
【００２５】
溶媒としてアセトン、メチルエチルケトン、メタノール、エタノール、プロパンー２−オール、ヘキサン、ジクロロメタンや超臨界二酸化炭素の内の一種を用いて天然供給源からβ―カロテンを抽出することは、US-A-5714658に記載されているが、酢酸エチルなど酢酸エステルと食用油との混合物の使用と同様である。しかしながら、このことは、二種類の水に混和しない溶媒の組み合わせである。
【００２６】
魚飼料中のアスタキサンチン含量の定量法において使用可能な抽出プロトコールは、“Analytical Methods for Vitamins and Carotenopids in Feed” Ed.:P.Hofmann, H.E. Keller,J. Scierle and W. Schueep,Dept. of Vitamin Research and Development - Roche Baselにおいて記載されている。この測定法は、ジクロロメタンとエタノールとの単一相の媒体による抽出から成るものである。
【００２７】
要約すれば、アスタキサンチンの高収率天然供給源（P.rhodozyma）が既に開発されているものの、先行従来技術における抽出では、かかるアスタキサンチンを案化に抽出し、配合することが不可能であったため、サケ類の飼料としては目下のところコスト的に効率的ではないのである。同様に、天然供給源からその他のカロテノイド類を抽出しようとするいくつかの試みは、それぞれの合成類似品のコストと比べて安価な態様では実行されたことはない。
【００２８】
そこで本発明は、カロテノイド供給源からカロテノイドを抽出する方法において、カロテノイド供給源を水、疎水性カロチノイド溶媒及び水溶性共溶媒を含んで成る多相混合溶媒を用いて高温で処理して、該カロテノイド供給源からのカロテノイドを疎水性溶媒中に抽出させることから成る前記抽出方法を提供するものである。
【００２９】
水は、添加してもよいし又はカロテノイド供給源に自然に含まれていてもよい。かかる多相混合物はもちろん、通常は二つの相、即ち一つは主として水溶性及びもう一つは主として非水溶性、つまり油性のもから成るのである。
【００３０】
この方法は好ましくは、温度としては５０℃以上、例えば５０乃至８０℃、より好ましくは６０乃至７０℃なる温度において実施される。
【００３１】
かかるバイオマスは好ましくは、該処理の過程においてかき混ぜ混合、例えば攪拌される。
【００３２】
該抽出処理は、適当な時間、但し好ましくは少なくとも３０分間、例えば３０分乃至３時間、好ましくはほぼ１時間実施する。
【００３３】
該疎水性溶媒は好ましくは、その疎水性を当該カロテノイドに対する良溶媒能と組み合わせる用に選択されるのであって、適当には食用油、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、Ｃ5又はそれ以上のアルカン又はクロロホルムである。
【００３４】
該水溶性共溶媒は好ましくは、水溶性であり且つ少なくともカロテンを溶解する、限定された能力を有するように選択されるが、但し該溶媒と共溶媒との間におけるカロテノイドの分配係数が、共溶媒に溶解したカロテノイドが溶媒に転移されるようなものとなるよう選択される。適当には、かかる共溶媒は、アルコール、ケトン、エーテル、又は環状エーテルである。好ましくはかかる水溶性共溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール又はイソプロパノールであるか、又はエチレングルコールのモノアルキルエステル（セロソルブ）であるか又は１，３−ジオキサン若しくは１，４−ジオキサンである。
【００３５】
カロテノイドを食用油に溶かした溶液は、直接食用油を溶媒として使用することによってえることが出来るが、場合によっては該疎水性溶媒が食用油であり且つ前記抽出を行った後、該疎水性溶媒を食用油と混合し、次いで混合物から蒸発させることが有利である。蒸発させた疎水性溶媒は好ましくは、前記抽出方法に再利用する。
【００３６】
該カロテノイドは、例えばアスタキサンチン、リコペン又はベータカロテンである。
【００３７】
本発明の適用可能な主たる分野は、カロテノイド供給源はバイオマスであり、例えばPhaffia属の酵母、貝類、貝類の廃棄物、オキアミ、藻類、菌類、野菜類又はトマトである。
【００３８】
しかしながら、本方法は通常は、カロテノイドを溶解させる、特に食用油中に溶解させるために使用することができ、従って前記カロテノイド供給源は、例えばカロテノイド合成反応混合物又は合成若しくは天然供給源からの前記抽出から得られた固体カロテノイドであればよい。従って本発明は、本明細書に記載した抽出法を含む後処理操作でカロテノイドを抽出するために使用される反応混合物を生成するカロテノイド合成方法をも含むものである。
【００３９】
本発明は更に、カロテノイドを揮発性の、水に混和しない溶媒中に溶かしたカロテノイド溶液を食用油と混合し、次いで前記混合物から水に混和しない溶媒を蒸発させることから成る、カロテノイドを食用油に溶かした溶液を製造する方法をも含むのである。
【００４０】
本発明は更には、前記した抽出方法を実施して、カロテノイドを食用油を溶かした溶液を調製し、次いで前記溶液を飼料配合成分に添加することから成る、飼料材を製造するための方法をも提供するのである。
【００４１】
本発明の好ましい特徴は、以下に記載するが、下記する議論及び例示は大半は、アスタキサンチンの抽出と配合に係わるものである。尤も、この方法をその他のカロテノイド類に一般的に適用することは、当該技術分野に通暁した専門家にいは容易に理解されるであろう。
【００４２】
適当には、バイオマスの水性懸濁液を水及びアスタキサンチン又は他のカロテノイド類を容易に溶解させる消耗品油などの食用油と接触するエタノール共溶媒と一緒に加熱するのである。理論に制約された洗浄を行うことなく、この水―エタノール混合物は、（ａ）カロテノイドを細胞内に保持するタンパク質−カロテノイド結合を解離させること及び（ｂ）バイオマスの細胞壁を経由して該カロテノイドを除去するのに役立つのである。アスタキサンチンは親油性であり、そのため親水性の共溶媒よりも油などの疎水性溶媒によく溶解するため、アスタキサンチンは、水溶性共溶媒から油に移行し、この油にアスタキサンチンが集積されることになる。この水溶性共溶媒と油との間の接触を最適化するために、かかる溶液は激しく攪拌し、かくして乳化液が生成することになる。この水性懸濁液から油層を分離することによって、アスタキサンチンが油層中に除去される。
【００４３】
アスタキサンチンに対する疎水性溶媒は、油か又は例えば酢酸エチルなどの揮発性化合物であってもよい。最終の油製剤物中のアスタキサンチンの濃度を挙げることが要望される場合は、以下のような二段階法を使用してもよい：即ち、（ａ）酢酸エチルは、上記アスタキサンチン抽出においては疎水性溶媒として機能する、（ｂ）層を分離した後、アスタキサンチンを含む酢酸エチルを別の容器中で油と混合し、次いで酢酸エチルを蒸発させ、かくしてアスタキサンチンを油に移行させる。かかる代替疎水性溶媒を数回油中に循環させることによって、該油中のアスタキサンチン濃度は、有意に増大せしめられ、かくして有利に輸送コストを低減させることになる。
【００４４】
本発明の方法によって生成させたアスタキサンチン含量の高い油は、直接サケ類の魚飼料への添加物として、好ましくは適当な抗酸化物を添加した後に使用してもよい。前記添加物に関する生体内利用可能性試験の結果、かかるアスタキサンチン含量の高い油は有利なことに、市販の合成品(Hoffman La-Roche社から販売されている“Carophyl Pink”)よりも生体内利用可能性が高く、また乾燥したP.rhodozymaよりも生体内利用可能性は遥かに高いことが判明した。
【００４５】
かかるカロテンは好ましくは、キサントフィルカロテン、即ち酸素含有基（−ＯＨ、−Ｏ−又は＝Ｏ）を含むカロテンである。
【００４６】
【実施例】
この方法及び操作原理は、下記する具体的な実施例を参照することによってより良く理解されるであろう。
【００４７】
実施例１：アスタキサンチンをP.rhodozymaからエタノール量を変量させた大豆油中に抽出すること
P.rhodozymaの湿潤バイオマス（５ｇ、乾燥量１ｇ）をエタノール（抗酸化剤である没食子酸プロピル、０．０２％を含む）及び大豆油と混合し、抽出を６５℃において３時間激しく攪拌しながら実施した。このバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有大豆油層を分離した。
【００４８】
【表１】
2006516293.tif 000002
【００４９】
実施例２：アスタキサンチンをP.rhodozymaから異なる大豆油量を含む大豆油中に抽出すること
P.rhodozymaの湿潤バイオマス（５ｇ、乾燥量１ｇ）をエタノール（抗酸化剤である没食子酸プロピル、０．０２％を含む１０．０ｍｌ）及び大豆油と混合し、抽出を６５℃において３時間激しく攪拌しながら実施した。このバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有大豆油層を分離した。
【００５０】
【表２】
2006516293.tif 000003
【００５１】
実施例３：P.rhodozymaから大豆油中へのアスタキサンチン抽出の経時的変化  P.rhodozymaの湿潤バイオマス（５ｇ、乾燥量１ｇ）をエタノール（抗酸化剤である没食子酸プロピル、０．０２％を含む１０．０ｍｌ）及び大豆油（１０ｍｌ）と混合し、抽出を６５℃において異なる時間激しく攪拌しながら実施して、最適抽出に必要な時間を測定し、決定した。このバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有大豆油層を分離した。
【００５２】
【表３】
2006516293.tif 000004
【００５３】
実施例４：アスタキサンチンをP.rhodozymaから異なる大豆油量で抽出すること
ほぼ１時間が当該抽出に対する最適時間であるという、上記実施例３からの結果に基いて、下記する実験を行って、最適抽出を実現するために必要な油の比率を決定した：即ち、P.rhodozymaの湿潤バイオマス（５ｇ、乾燥量１ｇ）をエタノール（抗酸化剤である没食子酸プロピル、０．０２％を含む１０ｍｌ）及び大豆油（１０ｍｌ）と混合し、抽出を６５℃において１時間激しく攪拌しながら実施した。最後にこのバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有大豆油層を分離した。
【００５４】
【表４】
2006516293.tif 000005
【００５５】
上記実験１乃至４の結果を要約すると、P.rhodozyma（ｇＤＷ）のエタノール（ｍｌ）及び大豆油に対する最適比率は、かかるスケールではほぼ１：１０：５であることが明らかである。
【００５６】
濃度とスケールアップ
大豆油中のアスタキサンチンの濃度を増大させるための種々のルートを実施した。アスタキサンチンを抽出する疎水性溶媒（例えば油）を別の代替疎水性溶媒として（ａ）アスタキサンチンに高い親和性を有するもの及び（ｂ）沸点の低いもので置換した場合、かかる溶媒を使用して、第二段階において下記する実験において記載したように当該アスタキサンチンを油中に転移させることができる。
【００５７】
実施例５：アスタキサンチンの酢酸エチルへの抽出
P.rhodozymaの湿潤バイオマス（１．５ｋｇ、乾燥量０．３ｋｇ）を抗酸化剤である没食子酸プロピル（０．０２％）を含むエタノール及び酢酸エチル（１．２リットル）と混合し、抽出を６５℃において１時間激しく攪拌しながら実施した。最後にこのバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有酢酸エチル層を分離した。この酢酸エチル層を大豆油（１００ｍｌ）と併せ、次いで酢酸エチルを蒸発させることによって除去した。この操作を行った結果、１ｍｌの大豆油当り１４．９ｍｇの濃度で１．４９ｇのアスタキサンチンが得られた。同一の油の飼料を用いてこの方法を繰り返すことによって、アスタキサンチンが、ますます高い濃度で油中に集積する。
【００５８】
当業者には明らかなように、種々のエンジニアリング形態を用いて
本発明の方法を工業レベルのプロセスにまでスケールアップすることができる。一つの好ましい実施態様においては、アスタキサンチン抽出は、下記する段階で実施される：
【００５９】
ｉ）P.rhodozymaの湿潤バイオマスを発酵容器から取り出し、発酵培養液から分離し、次いで第一の容器に移す、
ｉｉ）アスタキサンチン抽出を上記した第一の容器内の酢酸エチルに行う（実施例５）、
ｉｉｉ）激しい攪拌を停止し、その時点で水層（バイオマスを含む）が酢酸エチル層から分離する、
ｉｖ）酢酸エチルを油が入っている第二の容器内に排出する、
ｖ）水層をろ過し、エタノールを再使用するために回収し、使用したバイオマスを廃棄物ストリームに廃棄する、
ｖｉ）第一の容器には、再使用したエタノールと共に投入した湿潤バイオマスの別のバッチを入れる、
ｖｉｉ）第二容器内の酢酸エチルを第一容器内で終結したパイプを経由して蒸発させ、かくして第一の容器内で再循環させる、
ｖｉｉｉ）第二容器中に入ったアスタキサンチン含量の高い食用油をこの時点でプロセスから取り出すか又は工程ｂ）乃至ｇ）を油を取り出す前に何回も繰り返す。
【００６０】
得られた油中での濃度は、第二容器中における酢酸エチルの油に対する比率と工程ｂ）乃至ｇ）を反復した回数との函数であることは、既に明らかである。これらの溶媒は、一定のフラクションが常に失われ、再循環するに応じてその量を補充することになろう。このプロセスを通して抗酸化剤が存在することは、酸化が原因で処理工程で失われるアスタキサンチンの量を最小化するのに役立つ。
【００６１】
プロセスの一般性
本発明のプロセスが一定範囲のバイオマス、カロテノイド類及び油に対して有する一般性を、（ａ）実施例６乃至８における多数の異なるアスタキサンチン含有供給源から魚油及び大豆油へのアスタキサンチン抽出及び（ｂ）トマトからのリコペン抽出を実証することによって決定した。
【００６２】
実施例６：アスタキサンチンを種々の供給源から魚油に抽出すること
P.rhodozymaの湿潤バイオマス（５ｇ、乾燥量１ｇ）をエタノール（抗酸化剤である没食子酸プロピル、０．０２％を含む１０ｍｌ）及び魚油（５ｍｌ）と混合し、抽出を６５℃において１時間激しく攪拌しながら実施した。最後にこのバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有魚油層を分離した。
【００６３】
乾燥オキアミ加水分解物、冷凍オキアミ及びエビ粉末（それぞれ１ｇ）をエタノール（没食子酸プロピル、０．０２％を含む５ｍｌ）及び魚油（２．０ｍｌ）を用いて６５℃にて０．５時間抽出した。
【００６４】
【表５】
2006516293.tif 000006
【００６５】
実施例７：アスタキサンチンを種々の供給源から大豆油に抽出すること
乾燥オキアミ加水分解物（５ｇ）をエタノール（没食子酸プロピル、０．０２％を含む２０ｍｌ）及び大豆油（２．５ｍｌ）を用いて６５℃にて０．５時間抽出した。冷凍オキアミ及びエビ粉末（それぞれ１０ｇ）を４０ｍｌのエタノール及び２．５ｍｌの油を用いて抽出した。抽出は、６５℃にて１時間激しく攪拌しながら実施した。このバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有大豆油を分離した。
【００６６】
【表６】
2006516293.tif 000007
【００６７】
実施例８：アスタキサンチンを種々の供給源から水添加によって抽出すること  アスタキサンチン供給源を異なる量の水及び没食子酸プロピル（０．０２％）を含むエタノール並びに大豆油（２．５ｍｌ）と混合した。抽出は、６５℃にて１時間激しく攪拌しながら実施した。このバイオマスをろ過することによって除去し、アスタキサンチン含有大豆油を分離した。
【００６８】
【表７】
2006516293.tif 000008
【００６９】
即ち、実施例１乃至８によって、本発明の方法においてアスタキサンチンなるカロテノイドが本発明の方法を用いてバイオマスから油中に抽出されることが実証されている。
【００７０】
その他のカロテノイド類を大豆油中に抽出することを四件するために、リコペンが、エタノールを用いて同様な態様でトマトペーストから抽出されたのである。前記と同様に、抽出は、６５℃において１時間激しく攪拌しながら行った。バイオマスをろ過によって除去し、得られたリコペン含量の高い大豆油を分離した。この方法を最適化することは試みなかった。
【００７１】
製剤の生体内利用可能性試験
２ヶ月に渉って行った試験において、それぞれ１０匹の魚から成る１１個のタンクの魚に異なるピグメントの餌を与えた：
A群（タンク１−５）には、市販の合成アスタキサンチンを与えた。
B群（タンク６−８）には、P.rhodozymaを与えた。
Ｃ群（タンク９−１１）には、本発明の方法を用いて製造した添加物を与えた。
下記の表に生体内利用可能性試験の結果を示す：
【００７２】
【表８】
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【００７３】
これらの結果に従えば、本発明の方法に従って製造された添加物は、既存の合成製品及びP.rhodozymaの直接消費を基準とした生体内利用可能性増大させたことが判る。
【００７４】
この製剤のもう一つの利点は、油は何れの場合にも、サケ科魚の飼料の主要成分となることであり、そのため製剤は、既存の飼料製造プロセスに容易に組み入れることができる、ということである。またこの製剤の更なる利点は、液体であるため、酸化から保護し安定化させるために適当な液状の抗酸化剤を添加することが簡単であることである。
【００７５】
ここにおいて例示した方法は、バイオマスからカロテノイド類を効率的に抽出するための改善され且つ安価な方法を提供するものである。P.rhodozymaを魚飼料に直接添加する方法に対して本方法が有する更なる利点は、後者においては、P.rhodozymaは、輸送前に乾燥しなければならないということである。本発明の方法は、湿潤P.rhodozymaを使用するので、P.rhodozymaを乾燥するためのコストを節減することができる。尤も、本方法はもちろん、部分的に乾燥したか又は乾燥したP.rhodozymaに適用出来、その場合抽出工程のために再度湿潤させるのである。
【００７６】
更なる利点は、その他の成分を添加して動物飼料を製造するプロセスにおいてカロテノイド類のプロセス安定性が増大することである。
【００７７】
本発明の方法に関して、二つ以上のチャンバーから成るマルチチャンバー装置を用いることや溶媒及び／又は抽出物を循環使用することを含め、多くのエンジニアリング上の修正・改良を実行することが可能であることは、当該具術分野に通暁した者ならば容易に理解するであろう。同様に、バイオマス、水性共溶媒及び疎水性溶媒の比率を種々に変えて使用することによって、アスタキサンチンは、いくつかの細胞性バイオマスから抽出することが出来るのであり、またその他のカロテノイド類もそれぞれの天然の供給源から抽出することが出来る。
【手続補正書】
【提出日】平成13年7月1日(2001.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスのカロテノイド供給源からカロテノイドを抽出する方法において、該バイオマスを水、疎水性溶媒及び水溶性共溶媒を含んで成る混合溶媒により高温で処理して、該バイオマスからのカロテノイドを疎水性溶媒中に抽出させることから成る前記方法。
【請求項２】
該方法が５０℃以上の温度で実施される、請求項１において記載された方法。
【請求項３】
該方法が５０乃至８０℃の温度で実施される、請求項２において記載された方法
【請求項４】
該方法が６０乃至７０℃の温度で実施される、請求項２において記載された方法。
【請求項５】
バイオマスの供給源及び混合溶媒が該処理過程において撹拌される、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項６】
該抽出が少なくとも３０分間実施される、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項７】
該抽出が少なくとも３０分乃至３時間実施される、前記請求項６において記載された方法。
【請求項８】
該抽出がほぼ１時間実施される、前記請求項７において記載された方法。
【請求項９】
該疎水性溶媒が、食用油、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、Ｃ5又はそれ以上のアルカン又はクロロホルムである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１０】
該水溶性共溶媒が、アルコール、ケトン、エーテル又は環状エーテルである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１１】
該水溶性共溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール若しくはイソプロパノールであるか、又はエチレングリコールのモノアルキルエステル（セロソルブ）又は１，３−ジオキサン若しくは１，４−ジオキサンである、請求項１０において記載された方法。
【請求項１２】
該疎水性溶媒が食用油ではなく、且つ該抽出後に、該疎水性溶媒に食用油と混合し、その後混合溶媒から蒸発させる、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１３】
蒸発させた疎水性溶媒を前記抽出法に再使用する、請求項１２において記載された方法。
【請求項１４】
該カロテノイドがアスタキサンチン、リコペン又はベーターカロテンである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１５】
該バイオマスが、Ｐｈａｆｆｉａ属の酵母、貝、貝廃棄物、オキアミ、藻類、菌類、野菜又はトマトである、前記請求項の内の何れか一項において記載された方法。
【請求項１６】
カロテノイドを食用油中に溶かした溶液を製造する方法において、カロテノイドを揮発性の、水と混和しない溶媒中に溶かした溶液を前記食用油と混合し、且つ水と混和しない溶媒を前記混合物から蒸発させることから成る前記方法。
【請求項１７】
飼料材料を製造する方法において、請求項１乃至１８の内の何れか一項において記載されたカロテノイド抽出方法を実施して、かくしてカロテノイドを食用油に溶かした溶液を得て、次いで前記溶液を飼料成分に添加することから成る前記製造方法。
【国際調査報告】
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