(57)【要約】本発明は、表面を有する固体状の担体；および、前記表面に共有結合した化学式（Ｉ）を有する複数の化合物を含む化合物結合基板を特徴とする。    【化１】2006504077.tif 000011式中、Ｌは連結基であり、Ａは、前記連結基の末端の１つに共有結合する免疫グロブリンＧタンパク質結合分子である。
2006504077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を有する固体状の担体；並びに、
前記表面に共有結合した化学式（Ｉ）を有する複数の化合物：
【化１】
2006504077.tif 000009
を含み、この際、Ｌは連結基または結合であり；および、Ａはその末端の１つで共有結合している免疫グロブリンＧタンパク質結合分子である、化合物結合基板。
【請求項２】
免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を含有する第１のポリペプチドを含むキメラタンパク質をさらに含み、前記キメラタンパク質が前記表面に結合する、請求項１に記載の化合物結合基板。
【請求項３】
前記キメラタンパク質が、受容体タンパク質を有する第２のポリペプチドをさらに含む、請求項２に記載の化合物結合基板。
【請求項４】
前記第２のポリペプチドが、受容体タンパク質の細胞外ドメインである、請求項３に記載の化合物結合基板。
【請求項５】
前記受容体タンパク質がＩ型膜タンパク質である、請求項４に記載の化合物結合基板。
【請求項６】
前記受容体タンパク質が腫瘍壊死因子−αである、請求項５に記載の化合物結合基板。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、プロテインＡまたはプロテインＧである、請求項５に記載の化合物結合基板。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項５に記載の化合物結合基板。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、そのＣ末端で硫黄原子に共有結合しているペプチドである、請求項１に記載の化合物結合基板。
【請求項１０】
免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を含有する第１のポリペプチドを含むキメラタンパク質をさらに含み、前記キメラタンパク質が前記表面に結合する、請求項９に記載の化合物結合基板。
【請求項１１】
前記キメラタンパク質が、受容体タンパク質を有する第２のポリペプチドをさらに含む、請求項１０に記載の化合物結合基板。
【請求項１２】
前記第２のポリペプチドが、受容体タンパク質の細胞外ドメインである、請求項１１に記載の化合物結合基板。
【請求項１３】
前記受容体タンパク質がＩ型膜タンパク質である、請求項１２に記載の化合物結合基板。
【請求項１４】
前記受容体タンパク質が腫瘍壊死因子−αである、請求項１３に記載の化合物結合基板。
【請求項１５】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、プロテインＡまたはプロテインＧである、請求項１３に記載の化合物結合基板。
【請求項１６】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１３に記載の化合物結合基板。
【請求項１７】
以下の段階：
式−Ｌ−Ｘ（Ｌは連結基または結合であり、Ｘはマレイミド基である）の化学基を含む表面を有する固体状の担体を準備し；
それぞれが自身の末端の１つにメルカプト基を有する複数の免疫グロブリンＧタンパク質結合分子を準備し；そして、
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子を前記表面と接触させる、
を有する方法により製造される、化合物結合基板。
【請求項１８】
以下の段階：
免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を有する第１のポリペプチドおよび受容体タンパク質を有する第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質を準備し；そして、
前記キメラタンパク質を前記表面と接触させる。
をさらに有する、請求項１７に記載の化合物結合基板。
【請求項１９】
以下の段階：
（ａ）式−Ｌ−ＮＨ２（Ｌは連結基または結合である）の化学基を含む複数の分子を有する表面を準備し；
（ｂ）無水マレイン酸を前記表面と接触させ；そして、
（ｃ）マレイミド形成試薬を前記表面と接触させる、
を有する、基板の調製方法。
【請求項２０】
段階（ｃ）後に、それぞれがメルカプト基を含む複数のポリペプチドを前記表面と接触させることをさらに有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
それぞれのポリペプチドが、最大で１つのメルカプト基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
それぞれのポリペプチドが、その末端の１つにメルカプト基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
それぞれのポリペプチドが、そのＣ末端のみにメルカプト基を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載の化合物結合基板；並びに、
免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を有する第１のポリペプチドおよび受容体タンパク質を有する第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質、
を含み、前記キメラタンパク質が前記化合物結合基板に結合し、この際結合したキメラタンパク質が少なくとも５×１０１５分子／ｃｍ２の密度を有する、基板。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、そのＣ末端で硫黄原子に共有結合しているペプチドである、請求項２４に記載の基板。
【請求項２６】
前記第２のポリペプチドが受容体タンパク質の細胞外ドメインである、請求項２４に記載の基板。
【請求項２７】
前記受容体タンパク質がＩ型膜タンパク質である、請求項２６に記載の基板。
【請求項２８】
前記受容体タンパク質が腫瘍壊死因子−αである、請求項２７に記載の基板。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、プロテインＡまたはプロテインＧである、請求項２７に記載の基板。
【請求項３０】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項２７に記載の基板。
【請求項３１】
それぞれのアドレス可能な部位が、化学式（Ｉ）：
【化２】
2006504077.tif 000010
式中、Ｌは連結基または結合であり；および、Ａはその末端の１つで共有結合している免疫グロブリンＧタンパク質結合分子である、
の化合物を有する、アドレス可能な複数の部位を有する基板を含み、それぞれのアドレス可能な部位が、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を有する第１のポリペプチドおよび受容体タンパク質を有する第２のポリペプチドを含むキメラタンパク質を有し、前記キメラタンパク質が前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子に結合する、アレイ。
【請求項３２】
前記受容体タンパク質が、アドレス可能な部位間でそれぞれ固有である、請求項３１に記載のアレイ。
【請求項３３】
前記受容体タンパク質が、それぞれのアドレス可能な部位間で同一である、請求項３１に記載のアレイ。
【請求項３４】
前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子が、そのＣ末端で硫黄原子に共有結合しているペプチドである、請求項３１に記載のアレイ。
【請求項３５】
結合した前記キメラタンパク質が、少なくとも５×１０１５分子／ｃｍ２の密度を有する、請求項３４に記載のアレイ。
【請求項３６】
リガンドを、請求項３に記載の化合物結合基板と接触させ；そして、
前記リガンドが前記受容体タンパク質と結合するか否かを決定する、
ことを含む、受容体結合リガンドの同定方法。
【請求項３７】
前記リガンドが蛍光ラベルされたものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
試験化合物および受容体結合リガンドを、請求項３に記載の化合物結合基板と接触させ；そして、
前記リガンドの結合が、前記試験化合物が存在しない場合の結合と異なるか否かを決定する、
ことを含む、受容体タンパク質への受容体結合リガンドの結合を阻害する化合物の同定方法。
【請求項３９】
前記リガンドが蛍光ラベルされたものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験化合物が蛍光ラベルされたものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記試験化合物がポリペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記試験化合物が有機小分子である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１に記載の化合物結合基板を含む、化合物の受容体への結合能を試験するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
ヒトゲノムプロジェクトの完了により、３０，０００〜４０，０００個の遺伝子の配列が明らかとなった。遺伝子同定後の重要な課題は、全ての関連するコードされたタンパク質の機能、修飾および調節を理解することである。現在、ｍＲＮＡ発現プロファイル、遺伝子の分解の表現型、ツーハイブリッド相互作用、およびタンパク質の細胞内での局在化を分析することにより、遺伝子の、そしてそれ故にタンパク質の、機能および調節に焦点を当てた多くの努力がなされている。例えば、Ｒｏｓｓ−Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：  ４１３；  ＤｅＲｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：  ６８０；  Ｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：  ６２３；およびＩｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ．  ＮａｔＬ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：  １１４３を参照。これらの研究は有用ではあるが、タンパク質アレイによるタンパク質自身の生化学的活性の分析により、タンパク質の機能についてのより多くの情報がもたらされる。例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：  ２１０１；および、ＭａｃＢｅａｔｈ  ＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：  １７６０を参照。タンパク質の活性の分析だけでなく、タンパク質アレイは小分子のスクリーニング（薬物の発見）、薬物のバリデーション、治療法の開発、および診断に有用である。例えば、Ｆｌａｎａｇａｎ  （２００２）  Ｇｅｒｔｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  ２２（１０）：  １を参照。
【発明の開示】
【０００２】
要約
本発明は、部分的には、受容体タンパク質に結合し、そしてそれにより受容体の活性を調節するリガンドの同定に有用な受容体タンパク質アレイの設計および調製に基づいている。
【０００３】
一形態において、本発明は、表面を有する固体状の担体；並びに、前記表面に共有結合した化学式（Ｉ）を有する複数の化合物：
【０００４】
【化１】
2006504077.tif 000003
【０００５】
を含み、この際、Ｌは連結基または結合であり；および、Ａは例えばその末端の１つで共有結合している免疫グロブリンＧタンパク質結合分子である、化合物結合基板を特徴とする。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この化合物結合基板は、前記表面に結合するキメラタンパク質を含む。このキメラタンパク質としては、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を含有するポリペプチド、および、受容体タンパク質の細胞外ドメイン（例えば、腫瘍壊死因子αタンパク質のようなＩ型膜タンパク質の細胞外ドメイン）のような受容体タンパク質を有する他のポリペプチドが挙げられる。かような化合物結合基板は、受容体結合リガンドを同定するために用いられうる。この同定は、リガンドを上記の化合物結合基板と接触させ、さらに、例えば蛍光法（例えば、前記リガンドは蛍光ラベルされたものである）によって、前記リガンドが受容体タンパク質に結合するか否かを決定することを含む。上記の化合物結合基板はまた、受容体結合リガンドの受容体タンパク質への結合を阻害する化合物（例えば、ポリペプチドまたは有機分子）を同定するためにも用いられうる。この同定は、試験化合物および受容体結合リガンドを上記の化合物結合基板と接触させ、さらに、前記リガンドの結合が、前記試験化合物が存在しない場合の結合と異なるか否かを決定することを含む。前記リガンドまたは前記試験化合物のいずれかは、蛍光ラベルされたものであってもよい。
【０００７】
本発明はまた、化合物の受容体タンパク質への結合能を試験するためのキットを特徴とする。当該キットは、上記の化合物結合基板を含む。
【０００８】
他の形態において、本発明は、上記の化合物結合基板、および前記化合物結合基板に結合するキメラタンパク質を含み、この際、結合したキメラタンパク質が少なくとも５×１０１５〜５×１０１６分子／ｃｍ２の密度を有する、基板を特徴とする。
【０００９】
さらなる形態において、本発明は、以下の段階：式−Ｌ−Ｘ（Ｌは連結基または結合であり、Ｘはマレイミド基、すなわち−Ｎ［Ｃ（Ｏ）ＣＨ］２である）の化学基を含む表面を有する固体状の担体を準備し；それぞれが自身の末端の１つにメルカプト基、すなわち−ＳＨを有する複数の免疫グロブリンＧタンパク質結合分子を準備し；そして、前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子を前記表面と接触させる、を有する方法により製造される、化合物結合基板を特徴とする。この方法はまた、以下の段階：免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を有するポリペプチドおよび受容体タンパク質を有する他のポリペプチドを含むキメラタンパク質を準備し；そして、前記キメラタンパク質を前記表面と接触させる、を含んでもよい。
【００１０】
さらなる形態において、本発明は、基板の調製方法を特徴とする。この方法は、以下の段階：式−Ｌ−ＮＨ２（Ｌは連結基である）の化学基を含む複数の分子を有する表面を準備し；無水マレイン酸を前記表面と接触させ；そして、マレイミド形成試薬（すなわち、ＺｎＢｒ２／ＨＭＤＳのような、マレイミドの形成を誘導するのに適当な１以上の試薬）を前記表面と接触させる、を有し、必要であれば、それぞれのポリペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子がメルカプト基を含む（例えば、最大で１つのメルカプト基を含む）複数のポリペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子を前記表面と接触させる、を有する。前記メルカプト基は、各ポリペプチドの末端の１つ（例えば、Ｃ末端）または各オリゴヌクレオチドの末端の１つ（例えば、３’末端もしくは５’末端）に位置してもよい。
【００１１】
アレイもまた、本発明の範囲に含まれる。前記アレイは、それぞれのアドレス可能な部位が、上記化学式（Ｉ）の化合物を有し、それぞれのアドレス可能な部位が、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を有するポリペプチドおよび受容体タンパク質を有する他のポリペプチドを含むキメラタンパク質を有し、前記キメラタンパク質が前記免疫グロブリンＧタンパク質結合分子に結合する、アドレス可能な複数の部位を有する基板を含む。いくつかの実施形態において、前記受容体タンパク質は、アドレス可能な部位間でそれぞれ固有である。他の実施形態において、前記受容体タンパク質は、それぞれのアドレス可能な部位間で同一である。
【００１２】
本明細書で用いる場合、「基板」という語は、軟質および硬質の固体状基板の双方を含む。「軟質」とは、固体状基板が柔軟であることを意味する。例えば、軟質の基板は、少なくともある程度は壊れずに湾曲し、折りたたまれ、または同様に動かされうる。基板の表面は、平坦な表面（例えば、スライドまたはプレート）であってもよく、凸状の表面（例えば、ビーズ）であってもよく、凹状の表面（例えば、ウェル）であってもよい。有用な可能性のある基板としては、質量分析プレート（例えば、ＭＡＬＤＩ用）、ガラス（例えば、機能化ガラス、ガラススライド、多孔性ケイ酸ガラス、単結晶シリコン、石英、またはＵＶ透過性石英ガラス）、プラスチックおよびポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ二フッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ＰＤＭＳ、またはアクリル）、金属被覆基板（例えば、金）、シリコン基板、ラテックス、膜（例えば、ニトロセルロース、またはナイロン）、並びに、表面プラズモン共鳴に適当な屈折面が挙げられる。固体状の基板はまた、例えばゲルまたはマトリックスのように多孔性であってもよい。有用な可能性のある多孔性の基板としては、アガロースゲル、アクリルアミドゲル、焼結ガラス、デキストリン、および網目状のポリマー（例えば、マクロポーラス架橋デキストリン、セファクリル、およびセファロース）が挙げられる。
【００１３】
「連結基」の語は、炭化水素鎖または結合を意味する。前記炭化水素鎖は、ヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｓ、またはＯ）を有するまたは有しない、直鎖状または分枝状のアルキル鎖でありうる。前記炭化水素鎖はまた、アリール基であってもよい。アルキル鎖の例としては、以下に制限されないが、メチレン単位、すなわち−（ＣＨ２）ｎ−およびｎは１〜１２の鎖、並びに、エチレングリコール単位、すなわち−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−およびｎは１〜１２の鎖が挙げられる。アリール鎖の例は、フェニル部分、すなわち、
【００１４】
【化２】
2006504077.tif 000004
【００１５】
およびｎは１〜１２、の環状構造である。
【００１６】
「免疫グロブリンＧタンパク質」の語は、（１）Ｆａｂ領域（ＶＨ、ＶＬ、およびＣＨ１ドメインを含む）、（２）ヒンジ領域、および（３）Ｆｃ部位（ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む）を含有するポリペプチドを意味する。例えば、米国特許第６，２２５，４４８号を参照。前記Ｆｃ領域は、免疫グロブリンポリペプチド上の定常領域であり、免疫グロブリンの重鎖上に位置し、抗原への結合には関与しないが、Ｆｃ受容体への結合に関与する。
【００１７】
「免疫グロブリンＧタンパク質結合分子」の語は、免疫グロブリンＧタンパク質に対して高い親和性（例えば、１．０×１０−７〜４．４×１０−８ＭのＫａ）を有する分子（例えば、ペプチドまたは有機化合物）を意味する（Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ  ＆  Ｂｊｏｒｃｋ  （１９８６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：  １０２４０−１０２７４に記載の結合アッセイにより規定される）。より具体的には、免疫グロブリンＧタンパク質結合分子は、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位に対して高い親和性を有する。免疫グロブリンＧタンパク質結合分子の例としては、例えば配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列を含むペプチドのような、プロテインＡ、プロテインＧ、マウスおよびヒトの高親和性免疫グロブリンＧ受容体、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメイン、プロテインＧの免疫グロブリンＧ結合ドメイン（例えば、Ｃｏｌｂｅｒｔ  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ３：  ２５５；およびＯｌｓｓｏｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｅ．  Ｊ．  ：Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６８：  ３１９を参照）；配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリンＧ結合受容体（例えば、Ｓｅａｒｓ  Ｄ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｍｏｌ．  １４４（１）：  ３７１；およびＰｅｌｔｚ，  Ｇ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６  （３）：  １０１３を参照）が挙げられる。
【００１８】
【表１】
2006504077.tif 000005
【００１９】
免疫グロブリンＧタンパク質結合分子はまた、プロテインＡ、プロテインＧ、高親和性免疫グロブリンＧ受容体、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメイン、もしくはプロテインＧの免疫グロブリンＧ結合ドメインに対して、または、配列番号１、２、３、４、５、６、もしくは７に対して少なくとも６０％（例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９８％）相同なアミノ酸配列を含有するペプチドであってもよく、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位に対して高い親和性を有する。２つのアミノ酸配列の「百分率相同性」は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルツシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３−５８７７）におけるのと同様にして改変された、カーリンおよびアルツシュルのアルゴリズム（１９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−２２６８）を用いることにより、決定されうる。かようなアルゴリズムは、アルツシュルら（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。本明細書中に記載のペプチド分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて行われうる。２つの配列間にギャップが存在する場合には、アルツシュルら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：  ３３８９−３４０２に記載されるのと同様のギャップＢＬＡＳＴが用いられうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータが用いられうる。
【００２０】
「キメラタンパク質」は、異なる源由来の配列の混合物を有するタンパク質である。本明細書で用いる場合、キメラタンパク質は、免疫グロブリンＧタンパク質のＦｃ部位を含有する第１のポリペプチド、および、例えば受容体タンパク質（受容体タンパク質の細胞外ドメイン）を含有する第２のポリペプチドを含む。前記第１のポリペプチドは、前記第２のポリペプチドのＣ末端に結合する。
【００２１】
「受容体タンパク質」とは、細胞の表面上に見られ、ホルモン、抗体、薬物、ペプチド、またはウイルスのような特定の分子と相互作用するタンパク質を意味する。受容体タンパク質は、少なくとも１つの細胞外ドメイン、および、Ｉ型膜タンパク質のような少なくとも１つの細胞質ドメインを含む。「Ｉ型膜タンパク質」は、単一の膜貫通ドメイン、および細胞の細胞外側に面するＮ末端を有するタンパク質である。例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐ  ４０１を参照。Ｉ型膜タンパク質の例としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）受容体Ｉ、ＴＮＦ−α受容体ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＥＰＯ受容体、ＥＧＦ受容体、インターロイキン４受容体、およびトロンボポエチン受容体が挙げられる。
【００２２】
本発明は、以下の１以上の利点を提供する。上記の化合物結合基板の調製方法は、経済的かつ多用途であり、予期せぬ高い均質性、そしてそれ故に、順に添加されるキメラタンパク質との高い結合効率を示す化合物結合基板を提供する。さらに、受容体結合リガンドの同定、または受容体タンパク質への受容体結合リガンドの結合を阻害する化合物の同定が、高効率で、放射性ラベルを用いることなく達成されうる。本明細書で用いる場合、均質性とは、反応性基（例えば、メルカプト）を介して基板に共有結合する免疫グロブリンＧタンパク質結合分子（例えば、ペプチド）の末端の１つに位置する反応性基が同一であることを意味する。本明細書で用いる場合、効率とは、キメラタンパク質が、基板または受容体結合リガンドと相互作用する能力を意味する。
【００２３】
本発明の他の利点、特徴、および目的は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１は、キメラＩｇＧ融合受容体の概略図である。このキメラＩｇＧ融合受容体は、ＩｇＧタンパク質のＦｃ部位および受容体の細胞外ドメインを含有する。
【００２５】
図２は、プロテインチップの構造を示す。プロテインチップの構造は、（ｉ）マレイミド修飾表面、（ｉｉ）固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧ、（ｉｉｉ）キメラＩｇＧ融合受容体、および（ｉｖ）リガンドを含む。プロテインチップへのリガンドの結合は、蛍光または質量分析により検出されうる。
【００２６】
図３は、キメラＩｇＧ融合受容体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの概略図である。キメラＩｇＧ融合受容体は、１２．５％ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。レーン１：タンパク質の分子量マーカー。レーン２：キメラＩｇＧ融合受容体（非還元条件下）。レーン３：キメラＩｇＧ融合受容体（還元条件下）。銀染色法によりゲルを染色し、矢印は、キメラＩｇＧ融合受容体の単量体およびジスルフィド結合した二量体を指した。
【００２７】
図４は、プロテインＡで被覆したチップ上でのＴＮＦＲ１−ＩｇＧの滴定を示す。蛍光色素であるＣｙ３を用いてラベル化したキメラＩｇＧ融合受容体（ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ、ＴＮＦ受容体１の細胞外ドメインおよびＩｇＧの定常領域を含有）を、種々の濃度で、プロテインＡチップ上にプリントした。結合した受容体は、蛍光スキャナにより検出した。
【００２８】
図５は、ＴＮＦＲ１チップ上でのＴＮＦα−Ｃｙ５の滴定を示す。蛍光色素であるＣｙ５を用いてラベル化した種々の濃度のＴＮＦαを、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ）とともに、プロテインＡチップ上にプリントした。結合したＴＮＦα−Ｃｙ５は、蛍光スキャナにより検出した。
【００２９】
詳細な説明
本発明は、化合物結合基板、並びに、受容体タンパク質アレイの調製および受容体結合リガンドの同定へのその使用に関する。
【００３０】
化合物結合基板の調製
本発明の化合物結合基板は、表面を有する固体状の担体、および、前記表面に共有結合した上記の化学式（Ｉ）を有する複数の化合物を含む。化学式（Ｉ）に関して、固定化された免疫グロブリンＧタンパク質結合分子（以下、ＩｇＧ結合分子と称する）は、マレイミド基および連結基を介して前記表面に連結された、末端の硫黄原子を含む。この硫黄原子から表面までの距離は、連結基の長さにより本質的に決定される。連結基の適当な長さは、固定化されたＩｇＧ結合分子がコンビナトリアルアッセイに用いられうるように選択される。具体的には、ＩｇＧ結合分子へのＩｇＧタンパク質のＦｃ部位の結合の効率により、最適な長さが決定されうる。
【００３１】
連結基は、任意の個数または組み合わせの原子または分子から形成されて、基板と硫黄原子との間に最適な距離を提供する。例えば、連結基は、有機ポリマー、例えばポリエチレングリコールの繰り返し単位、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−Ｏ−から形成されて、許容しうる親水性条件および適切な長さを提供する。一般に、ポリエチレングリコール連結基は、約１〜約１２個の繰り返し単位を有する。
【００３２】
固体状の担体は、固体状または多孔性かつ固体状の担体でありうる。いくつかの実施形態において、前記担体は、ビーズ、マイクロ粒子、ナノ粒子、マトリックス、またはゲルである。ビーズ、マイクロ粒子、およびナノ粒子は、例えば、スクリーニング用途に用いられうる。ビーズ、マトリックス、およびゲルは、例えばマトリックスをカラムクロマトグラフィに用いるように、例えば精製方法に用いられうる。ビーズは、有効表面積を増大させる内表面を有してもよく、分離コンポーネントを有してもよい。本明細書で用いる固体状の担体は、任意の軟質または硬質のいずれの材料からも作製されうる。一般に、この材料は、合成およびアッセイの分析条件の多様性に対して抵抗性である。もちろん、１以上の材料の混合物であってもよい。例えば、ガラススライドのようなガラス担体は、ポリマー材料を用いて被覆されて、固体状の担体を生成する。さらに、固体状の担体は任意の形状、例えば、平面状、管状、円形、で作製されてもよく、また、エッチ、リッジ、またはグリッドを含んで、パターン化された基板を生成してもよい。固体状の担体は、不透明でも、半透明でも、または透明でもよい。さらに、固体状の担体は、ウェルまたは堀を含んでもよい。例えば、Ｂｒｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ  Ｐｒｏｇ  ８：  １５５；  Ｍｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：  １２２８７；  Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １４：１９２７，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ９：  １５９；および、Ｗｈａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：  ６６５を参照。
【００３３】
上記の化合物結合基板は、本明細書に開示した方法により、調製されうる。より具体的には、当該方法は、以下の段階：マレイミド基を有する固体状の担体を準備し；それぞれが自身の末端の１つ（例えば、Ｃ末端）にメルカプト基を有する複数のＩｇＧ結合分子を準備し；そして、前記ＩｇＧ結合分子を表面と接触させる、を含む。
【００３４】
プロテインＧのＩｇＧ結合ドメイン、プロテインＧ、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン、およびプロテインＡを含むＩｇＧ結合分子は、ＩｇＧタンパク質に対して高い親和性を有するペプチドであってもよい。このペプチドは、化学的（例えば、ペプチド合成機上で）に、または生物学的（例えば、宿主細胞からの発現）に調製されうる。ＩｇＧ結合ペプチドは、天然には存在しない類似体、例えば、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチドミメティクスを含みうる。末端の１つのメルカプト基は、例えば、メルカプト含有化学基またはシステインの組み込みにより、導入されうる。
【００３５】
マレイミド基を有する固体状の担体は、本明細書に記載の方法により、調製されうる。固体状の担体（例えば、コーニング  インコーポレイテッド  ライフ  サイエンス製のアミノスライド）の表面上で、無水マレイン酸をアミノと反応させてもよく；続いて、マレイミド形成試薬（例えば、ＺｎＢｒ２／ＨＭＤＳ）を添加してもよい。こうして調製した固体状の担体は、それぞれのポリペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子がメルカプト基を含む、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、または有機分子を固定化するために用いられうる。
【００３６】
上記の方法はまた、本発明の化合物結合基板を最終的に調製する目的で、本明細書に具体的に記載された段階の前または後に、適当な保護基を添加または除去する段階をさらに含んでもよい。さらに、種々の段階が、別の配列または順序で行われてもよい。上記の化合物結合基板の調製に有用な合成化学の変形および保護基の方法論（保護および脱保護）は本技術分野において周知であり、例えば、Ｒ．  Ｌａｒｏｃｋ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  （１９８９）；  Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９１）  Ｌ．  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｆｉｅｓｅｒ，  Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｒｉｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９４）；および、Ｌ．  Ｐａｑｕｅｔｔｅ，  ｅｄ．，  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９９５）、並びにこれらの続編の版に記載の方法論が挙げられる。
【００３７】
キメラタンパク質の調製
本発明の方法を実施するために、ＩｇＧタンパク質のＦｃ部位を含有するポリペプチドおよび、例えば受容体タンパク質（受容体タンパク質の細胞外ドメイン）を含有する他のポリペプチドを含むキメラタンパク質は、当業者に周知の方法により調製されうる。当該方法は、例えば、上記の成熟タンパク質をコードする組換え核酸を得るために、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限ＤＮＡ断片を交換することを含む。次いで、この組換え核酸をベクター、例えばｐＣＥＩ発現ベクター中にライゲーションする。例えば、米国特許第５，５８０，７５６号、第５，５２１，２８８号、および第５，４４７，８５１号を参照。
【００３８】
ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適当な形態の組換え核酸を含む。特に、かようなベクターは、発現させるべき核酸配列に動作可能なように連結された１以上の調節配列を含みうる。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節因子（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。調節配列としては、ヌクレオチド配列の構成的な発現、並びに組織特異的な調節配列および／または誘導可能な配列を導くものが挙げられる。ベクターの設計は、軽質転換させる宿主細胞の選択や、タンパク質の所望の発現レベルといった要因に依存しうる。ベクターは宿主細胞中に導入され、それにより上記のキメラタンパク質を産生する。
【００３９】
ベクターは、キメラタンパク質を原核または真核宿主細胞で発現させるように設計されうる。キメラタンパク質は、例えば、大腸菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）もしくはＣＯＳ細胞）で発現する。適当な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，  （１９９０）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡにさらに説明されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳されうる。
【００４０】
「宿主細胞」の語は、特定の被験細胞のみならず、かような細胞の子孫または子孫となる可能性のある細胞を意味する。変異または環境による影響により、後の世代においてある種の修飾が生じるため、かような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、それでも本明細書で用いる場合には、その語の範囲内に含まれる。
【００４１】
ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して、宿主細胞中に導入されうる。本明細書で用いる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」の語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクチン、およびエレクトロポレーションのような、宿主細胞中への外来核酸（例えば、ＤＮＡ）の導入用に本技術分野で認識されている種々の技術を意味するものとする。
【００４２】
宿主細胞は、キメラタンパク質が産生されるように、適当な培地中で当該宿主細胞を培養し；そして、当該キメラタンパク質を培地または宿主細胞から単離する段階を経て、キメラタンパク質を産生する（すなわち、発現させる）ために用いられうる。
【００４３】
こうして産生されたキメラタンパク質は、必要であれば、次いでカラムクロマトグラフィ（例えば、アフィニティカラムクロマトグラフィ）または他の技術により精製されうる。純度は、適当な任意の方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィ分析、によって容易に測定されうる。
【００４４】
スクリーンアッセイ
本発明は、受容体タンパク質に結合し、例えば受容体タンパク質とその結合リガンドとの結合に対して促進もしくは阻害作用を示し、または、例えば受容体タンパク質の活性に対して促進もしくは阻害作用を示す、リガンドまたは試験化合物（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティクス、ペプトイド、小分子または他の薬物）を同定する方法（本明細書中、「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。こうして同定されたリガンドまたは化合物は、治療プロトコルにおいて、または受容体タンパク質の生物学的機能を明らかにするために用いられる。
【００４５】
リガンドまたは試験化合物は、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素的分解に抵抗性であるにもかかわらず生物活性を維持している新規な非ペプチド骨格を有する分子のライブラリー；例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：２６７８−８５を参照）；空間アドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および、アフィニティクロマトグラフィ選択を用いた合成ライブラリー法のような、本技術分野において周知のコンビナトリアルライブラリー法における膨大なアプローチのいずれかを用いて得られる。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーによるアプローチはペプチドライブラリーに限定されるのに対し、他のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ  （１９９７）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．  １２：１４５）。分子ライブラリーの合成方法の例は本技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：  ６９０９；  Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：  １１４２２；  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：  ２６７８；  Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：  １３０３；  Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：  ２０５９；  Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３３：  ２０６１；および、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３７：  １２３３において見られる。
【００４６】
任意の反応体のラベル化を用いるまたは用いない受容体タンパク質に対するリガンド（または試験化合物）の結合能は評価されうる。例えば、リガンド（または試験化合物）はラベル化される。放射性ラベルよりもむしろ、蛍光、化学発光、または電気化学的発光のようなラベルが用いられうる。蛍光ラベルの例としては、フルオレセイン、ロダミン（米国特許第５，３６６，８６０号、および第５，９３６，０８７号、第６，０５１，７１９号）、シアニン（米国特許第６，０８０，８６８号、およびＷＯ９７／４５５３９号）、および金属ポルフィリン錯体（ＷＯ８８／０４７７７号）が挙げられる。他の例において、リガンドと受容体タンパク質との相互作用は、例えば、リガンドおよび受容体タンパク質の双方をラベル化し、蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）（米国特許第５，６３１，１６９号、および第４，８６８，１０３号）を用いて検出される。第１の「ドナー」分子上のフルオロフォアラベルは、その発する蛍光エネルギーが、吸収したエネルギーによりその後に蛍光を発しうる第２の「アクセプター」分子上のフルオロフォアラベルにより吸収されるように選択されうる。ラベルは、「アクセプター」分子のラベルが「ドナー」のラベルと区別されるように、異なる波長の光を発するものが選択される。ＦＥＴ結合の発生は、本技術分野において周知の標準的な蛍光検出手段により（例えば、フルオリメーター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて）、従来のように測定されうる。さらなる例において、受容体タンパク質へのリガンドの結合能の測定は、リガンドも受容体タンパク質もラベル化せずに、リアルタイム生体分子相互作用分析（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ＆  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ  （１９９１）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ６３：  ２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｔｉｃ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ５：  ６９９−７０５を参照）を用いて達成されうる。結合表面における質量の変化（結合発生の指標）により、表面付近の光の屈折率が変化し（表面プラズモン共鳴の光学的現象）、リガンドと受容体タンパク質との間のリアルタイム反応の指標として用いられる検出可能なシグナルが生じる。
【００４７】
アレイ
本発明の基板上に作製されたアレイもまた、本発明の範囲内に含まれる。キメラタンパク質は、アレイの形態で固体状の基板上に付着しうる。このアレイは、上記のスクリーニングアッセイにおいて用いられうる。アレイは、ｃｍ２あたり、少なくとも１０、５０、１００、２００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、もしくは１０９アドレスの密度、および／または、１０、５０、１００、２００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、もしくは１０９アドレス／ｃｍ２以下の密度を有するものであってもよい。好ましくは、複数のアドレスは、少なくとも１０、１００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００、もしくは５０，０００アドレス、または９、９９、４９９、４，９９９、９，９９９、もしくは４９，９９９未満のアドレスを含む。アドレス間の中心と中心との距離は、５ｃｍ、１ｃｍ、１００ｍｍ、１０ｍｍ、１ｍｍ、１０ｎｍ、１ｎｍ、０．１ｎｍ、もしくはそれ未満、および／またはこれらの間の範囲でありうる。各アドレスの最大直径は、５ｃｍ、１ｃｍ、１００ｍｍ、１０ｍｍ、１ｍｍ、１０ｎｍ、１ｎｍ、０．１ｎｍ、もしくはそれ未満、および／またはこれらの間の範囲でありうる。各アドレスは、１０ｍｇ、１ｍｇ、１００ｎｇ、１ｎｇ、１００ｐｇ、１０ｐｇ、０．１ｐｇ、もしくはそれ未満、および／またはこれらの間の範囲の標的化合物を含有する。あるいは、各アドレスは、１００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８もしくは１０９、もしくはそれ以上、および／またはこれらの間の範囲の、自身に結合したキメラタンパク質の分子を含有する。複数のアドレスに加えて、アドレスがアレイ上に付着しうる。アドレスは、１次元で、例えば直線状のアレイ；２次元で、例えば平面状のアレイ；または３次元で、例えば３次元のアレイとして、基板上に分布しうる。
【００４８】
上記の平坦な表面を有する基板は、受容体タンパク質の多様なセット、または受容体タンパク質の限定的なセットのアレイを作製するために用いられうる。用途の一例においては、配列の異なる受容体タンパク質が、アレイの表面上に位置する。かようなアレイは、１つのリガンドまたは試験化合物を調べるのに用いられうる。他の例においては、同じ配列の受容体タンパク質が、アレイの表面上に位置する。かようなアレイは、複数のリガンドまたは試験化合物を調べるために用いられうる。
【００４９】
これらに限定されないが、アブストラクト、記事、ジャーナル、出版物、テキスト、専門書、インターネットのウェブサイト、データベース、特許、および特許公報のような、本明細書において引用した参考文献は、印刷物の形態、電子の形態、コンピュータ読出し可能な媒体、または他の媒体にかかわらず、その全体が参照により明確に組み込まれる。
【００５０】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるであろう。以下の実施例は例示のみを目的とするものであって、いかようにも本発明を限定するものとして解釈されることはないと理解されるべきである。
【実施例】
【００５１】
実施例
本発明を説明するために、実施例を記載する。キメラＩｇＧ融合受容体の実施例は、ヒトＴＮＦ−受容体１細胞外ドメイン（ＴＮＦＲ１−ＥＤ）およびヒトＩｇＧ１定常領域（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３）融合受容体（ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ）である。被覆ガラススライドの実施例は、マレイミドガラススライドである。プロテインＡの実施例は、システイン含有プロテインＡである。これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、本発明の範囲および思想に含まれるべきものである。
【００５２】
キメラＩｇＧ融合受容体の調製
ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＨＬ６０細胞系より調製した全ＲＮＡから、ＴＮＦＲ１−ＥＤのｃＤＮＡをクローニングした。このＰＣＲ反応に用いたプライマーは：
【００５３】
【表２】
2006504077.tif 000006
【００５４】
であった。
【００５５】
５０℃にて３０分間、逆転写反応を行い、反応混合物を、５０℃、３０秒間；６８℃、１分間、および９４℃、３０秒間のプログラムを用い、サーマルサイクラー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））にて３０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応に供した。反応混合物をゲル電気泳動にて分析し、次いで制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを用いて切断し、そして発現ベクターｐＣＥＩ（エス．ワイ．ショー（Ｓ．Ｙ．Ｓｈａｗ）により構築された、未発表）中にライゲーションした。ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域をコードするｐＣＥＩプラスミドを、上述した手法（Ｓｅｅｄ  ＆  Ａｒｕｆｏ）と同様にして調製した。ＴＮＦＲ１−ＩｇＧをコードする組換えプラスミド（ｐＴＮＦＲ１−ＩｇＧ）をＮｈｅＩ切断により直線状とし、次いでエレクトロポレーション法を用いてＣＨＯ細胞中を形質転換させた。ＴＮＦＲ１−ＩｇＧを産生させるために、１００ｍＭメトトレキサートに抵抗性の形質転換細胞を選択した。
【００５６】
キメラＩｇＧ融合受容体の産生および精製
ｐＴＮＦＲ１−ＩｇＧ形質転換細胞を２週間かけて無血清培地（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中に順応させた。順応させた細胞を１Ｌのスピナーフラスコバイオリアクター中で増殖させて、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧタンパク質を産生させた。このリアクターからの馴化培地を、プロテインＡアフィニティカラム（アマシャム  ライフ  サイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））に通した。０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）を用いて、結合したタンパク質を溶出し、次いで１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に対して透析した。
【００５７】
システイン含有プロテインＡの発現
コワン（Ｃｏｗａｎ）Ｉ（ＡＴＣＣ１２５９８）の全ゲノムＤＮＡから、プロテインＡをコードするＤＮＡをＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ反応用のプライマー配列は：
【００５８】
【表３】
2006504077.tif 000007
【００５９】
であった。
【００６０】
この５’末端プライマーは、プロテインＡのＣ末端にシステイン残基を導入するための付加配列を有するプロテインＡの５’末端に対応していた。
【００６１】
ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを、ＢｓｐＨＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、次いでｐＥＴ２１（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））のＢｓｐＨＩ／ＢａｍＨＩサイトにライゲーションして、発現プラスミドｐＰＡＳＨを得た。システイン含有プロテインＡを発現させるために、このｐＰＡＳＨで大腸菌ＢＬ２１を形質転換させた。
【００６２】
システイン含有プロテインＡ（ＰＡ−ＳＨ）の産生および精製
プラスミドｐＰＡ−ＳＨで形質転換された大腸菌細胞を、アンピシリン（０．５ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地中で、光学密度が０．３になるまで増殖させ、ＩＰＴＧを添加してＰＡ−ＳＨの発現を誘導した。４時間誘導後、遠心分離により細胞を回収し、次いでホモジナイザー（マイクロフルイド  システム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ））を用いてホモジナイズした。上清中のＰＡ−ＳＨを、ＩｇＧアフィニティカラム（アマシャム  ライフ  サイエンス）に通して精製した。
【００６３】
マレイミド被覆ガラススライドの調製
スキーム１に示すように、アミンガラススライドを被覆して、マレイミド基で擬制された表面を得た。スキーム１においては、トルエン中、室温にて無水マレイン酸（１．６ミリモル）をアミンガラススライドと反応させることにより、マレイミド被覆ガラススライドを調製した。１時間後、ＺｎＢｒ２（１．６ミリモル）を添加し、ＨＤＭＳ（２．４ミリモル）を、３０分間かけてゆっくりと反応混合物中に添加した。１００℃にてさらに１時間、反応物を還流させた。反応後、水でスライドを洗浄し、Ｎ２下で乾燥させた。
【００６４】
【化３】
2006504077.tif 000008
【００６５】
マレイミド被覆ガラススライドへのシステイン含有プロテインＡ（ＰＡ−ＳＨ）の固定化
チオール含有タンパク質は、チオエーテル結合を介して容易にマレイミド被覆ガラスに結合しうる。最終タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように、ＰＡ−ＳＨを１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。このＰＡ−ＳＨ溶液にトリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（１８０μｇ）を添加して、ＰＡ−ＳＨタンパク質を還元した。室温にて３０分間反応を行い、次いで室温にて１時間以上のマレイミド被覆ガラススライドとの反応に用いた。蒸留水を用いてプロテインＡ被覆スライド（ＰＡスライド）を洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いてブロッキングした。
【００６６】
ＰＡスライド上へのＴＮＦＲ１−ＩｇＧ融合受容体のコーティング
ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ分子のＩｇＧ部位とＰＡスライド上のプロテインＡ分子との間の親和性による相互作用を介して、ＰＡスライド上にＴＮＦＲ１−ＩｇＧをコーティングした。コーティングは、室温にて３０分間、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍＬ）中でＰＡスライドをインキュベートすることにより行った。ＴＮＦＲ１でコーティングされたスライドを、ＰＢＳおよび蒸留水を用いて洗浄し、乾燥条件下で貯蔵した。
【００６７】
ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ融合受容体チップへの蛍光ラベルＴＮＦαのプリント
蛍光色素Ｃｙ−３（アマシャム  ライフ  サイエンス）を用い、ＴＮＦ−αをラベルした。ＴＮＦ−α（５０μｇ）を、１００μＬの炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＭ、ｐＨ６．８）に溶解させた。この溶液にＣｙ３（１ｍｇ）を添加し、室温にてインキュベートした。１時間後、１０μＬのトリス緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加し、室温にて３０分間、過剰なＣｙ３をブロッキングした。ブロッキング反応が完了したら、１ｍｇのＢＳＡを添加し、反応混合物をリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）に対して透析した。０．０１ｍｇ／ｍＬ〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の、Ｃｙ３ラベルＴＮＦ−αを用いて、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ受容体チップへのその結合活性を調べた。ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ受容体チップへのＣｙ３ラベルＴＮＦ−αのマイクロアレイは、５００μｍの針を備えるアフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）４１７（アフィメトリクス）で行った。０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を添加したＰＢＳを用いて、プリントしたスライドを洗浄し、次いで蛍光スキャナ（アクソン（Ａｘｏｎ））で検出した。その結果から、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ受容体チップへのＣｙ３ラベルＴＮＦ−αの結合は０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で結合の最大値に達することが示される。
【００６８】
ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ受容体チップへの蛍光ラベルＴＮＦ−αの競合的な結合
Ｃｙ３ラベルＴＮＦ−α（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を、等体積の種々の濃度の非ラベルＴＮＦ−α（０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬ）と混合することにより、蛍光ラベルＴＮＦ−αをＴＮＦＲ１−ＩｇＧ融合受容体に競合的に結合させた。５００μｍの針を備えるマイクロアレイヤー（アフィメトリクス）により、この混合物をＴＮＦＲ１−ＩｇＧ受容体チップ上にプリントした。０．１％トゥイーン２０を添加したＰＢＳを用いて、プリントしたスライドを洗浄し、空気中で乾燥させ、次いで蛍光スキャナ（アクソン）で検出した。その結果から、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ受容体へのＣｙ３ラベルＴＮＦ−αの結合は、非ラベルＴＮＦ−αにより用量依存的に阻害されうることが示される。
【００６９】
他の実施形態
本明細書に開示した全ての特徴は、任意に組み合わせて用いられうる。本明細書に開示したそれぞれの特徴は、同一の、均等な、または類似の目的を達成する他の特徴により置換されうる。よって、そうでないと明確に特記しない限り、開示したそれぞれの特徴は、均等な、または類似の一連の一般的な特徴の単なる例に過ぎない。
【００７０】
上記の記載から、当業者であれば容易に本発明の本質的な特徴を確定することができ、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、本発明を様々に変更および修飾して、種々の用途および条件に適応させうる。よって、他の実施形態もまた、特許請求の範囲に従い、本発明の技術的範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、キメラＩｇＧ融合受容体の概略図である。このキメラＩｇＧ融合受容体は、ＩｇＧタンパク質のＦｃ部位および受容体の細胞外ドメインを含有する。
【図２】図２は、プロテインチップの構造を示す。プロテインチップの構造は、（ｉ）マレイミド修飾表面、（ｉｉ）固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧ、（ｉｉｉ）キメラＩｇＧ融合受容体、および（ｉｖ）リガンドを含む。プロテインチップへのリガンドの結合は、蛍光または質量分析により検出されうる。
【図３】図３は、キメラＩｇＧ融合受容体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの概略図である。キメラＩｇＧ融合受容体は、１２．５％ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。レーン１：タンパク質の分子量マーカー。レーン２：キメラＩｇＧ融合受容体（非還元条件下）。レーン３：キメラＩｇＧ融合受容体（還元条件下）。銀染色法によりゲルを染色し、矢印は、キメラＩｇＧ融合受容体の単量体およびジスルフィド結合した二量体を指した。
【図４】図４は、プロテインＡで被覆したチップ上でのＴＮＦＲ１−ＩｇＧの滴定を示す。蛍光色素であるＣｙ３を用いてラベル化したキメラＩｇＧ融合受容体（ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ、ＴＮＦ受容体１の細胞外ドメインおよびＩｇＧの定常領域を含有）を、種々の濃度で、プロテインＡチップ上にプリントした。結合した受容体は、蛍光スキャナにより検出した。
【図５】図５は、ＴＮＦＲ１チップ上でのＴＮＦα−Ｃｙ５の滴定を示す。蛍光色素であるＣｙ５を用いてラベル化した種々の濃度のＴＮＦαを、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ（５０μｇ／ｍＬ）とともに、プロテインＡチップ上にプリントした。結合したＴＮＦα−Ｃｙ５は、蛍光スキャナにより検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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