(57)【要約】ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤を用いた再生可能な幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ拡大方法、再生可能な幹細胞の拡大された集団、およびその用途。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害する方法であって、
（ａ）細胞増殖のための条件を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え；
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され；それにより幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害すること
を含む方法。
【請求項２】
前記幹細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される前記調節剤は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、
（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイム
からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記与えることは前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記与えることは、
（ａ）前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして
（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによりＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えること
によって行われる請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞増殖のための条件を与えることは栄養素およびサイトカインを細胞に与えることによって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞は骨髄または末梢血から由来する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞は新生児臍帯血から由来する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
造血幹細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択はＣＤ３４を介して行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
初期造血幹／先祖細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択はＣＤ１３３を介して行われる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
拡大された未分化の幹細胞に外来遺伝子を形質導入する方法であって、前記方法は、
（ａ）幹細胞集団を得；
（ｂ）（ｉ）前記幹細胞に細胞増殖のための条件を与え、（ｉｉ）前記幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を与えることによって前記幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、ただし工程（ｉ）および（ｉｉ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われ；それにより前記幹細胞を拡大しかつその分化を阻害し；そして
（ｃ）前記拡大された未分化の幹細胞に外来遺伝子を形質導入すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記形質導入は外来遺伝子を含むベクターによって行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される前記調節剤は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、
（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイム
からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記与えることは前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記与えることは、
（ａ）前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして
（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによりＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えること
によって行われる請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞増殖のための条件を与えることは栄養素およびサイトカインを細胞に与えることによって行われる請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記幹細胞は骨髄または末梢血から由来する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記幹細胞は新生児臍帯血から由来する請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
造血幹細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記選択はＣＤ３４を介して行われる請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
初期造血幹／先祖細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記選択はＣＤ１３３を介して行われる請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１〜４５のいずれかに記載の方法に従って拡大された未分化の造血細胞を含む治療用のｅｘ  ｖｉｖｏ培養された幹細胞集団。
【請求項４７】
ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤を含む培養培地中に与えられ、前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される請求項４６に記載の細胞集団。
【請求項４８】
前記培地から単離される請求項４７に記載の細胞集団。
【請求項４９】
請求項４６に記載の細胞集団および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項５０】
請求項４８に記載の細胞集団および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。
【請求項５１】
レシピエントに造血幹細胞を移植する方法であって、前記方法は、
（ａ）造血幹細胞集団を得；
（ｂ）（ｉ）前記造血幹細胞に細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで与え、（ｉｉ）前記造血幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をｅｘ  ｖｉｖｏで与えることによって前記造血幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより前記造血幹細胞を拡大しかつその分化を阻害し；そして
（ｃ）レシピエントに前記造血幹細胞を移植すること
を含む方法。
【請求項５２】
前記造血幹細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される前記調節剤は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、
（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイム
からなる群から選択される請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記与えることは前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記与えることは、
（ａ）前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして
（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによりＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えること
によって行われる請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞増殖のための条件を与えることは栄養素およびサイトカインを細胞に与えることによって行われる請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
前記幹細胞は骨髄または末梢血から由来する請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記幹細胞は新生児臍帯血から由来する請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
造血幹細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項７０】
前記選択はＣＤ３４を介して行われる請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
初期造血幹／先祖細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項７２】
前記選択はＣＤ１３３を介して行われる請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
養子免疫療法であって、前記方法は、
（ａ）患者から先祖造血細胞を得、
（ｂ）（ｉ）細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで前記先祖造血細胞に与え、（ｉｉ）前記先祖造血細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を与えることによって前記造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより前記先祖造血細胞を拡大させかつその分化を阻害し、そして
（ｃ）前記先祖造血細胞をレシピエントに移植すること
を含む方法。
【請求項７４】
前記造血幹細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される前記調節剤は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、
（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイム
からなる群から選択される請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記与えることは前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記与えることは、
（ａ）前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして
（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによりＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えること
によって行われる請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞増殖のための条件を与えることは栄養素およびサイトカインを細胞に与えることによって行われる請求項７３に記載の方法。
【請求項８３】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する請求項７３に記載の方法。
【請求項８９】
前記幹細胞は骨髄または末梢血から由来する請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記幹細胞は新生児臍帯血から由来する請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
造血幹細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項７３に記載の方法。
【請求項９２】
前記選択はＣＤ３４を介して行われる請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
初期造血幹／先祖細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項７３に記載の方法。
【請求項９４】
前記選択はＣＤ１３３を介して行われる請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
骨髄幹細胞を採取するためにドナー末梢血へ骨髄幹細胞を動員する方法であって、前記方法は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をドナーに投与し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより骨髄幹細胞集団を拡大しかつその分化を阻害し、そして
（ｂ）ロイコフォレシスによって細胞を採取すること
を含む方法。
【請求項９６】
β−異常ヘモグロビン症の患者の治療のために赤血球前駆体細胞の成熟／分化を阻害する方法であって、前記方法はＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を前記患者に投与することを含み、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより前記患者の幹細胞集団を拡大させかつその分化を阻害し、前記患者からの前記ＰＩ３−キナーゼ調節剤の除去により前記幹細胞は加速的に成熟し、増大した胎児ヘモグロビン生産を生じ、それにより前記患者におけるβ−異常ヘモグロビン症の徴候を改善することを含む方法。
【請求項９７】
サイトカインを前記患者に投与する工程をさらに含む請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される前記調節剤は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、
（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイム
からなる群から選択される請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０８】
未分化の幹細胞を保存する方法であって、前記方法はＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を未分化の幹細胞に与え、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択されることを含み、前記与えることは未分化の造血細胞の採取、単離および貯蔵の工程の少なくとも１つで行われる方法。
【請求項１０９】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される前記調節剤は、
（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、
（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、
（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および
（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイム
からなる群から選択される請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記与えることは前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
前記与えることは、
（ａ）前記アンチセンスポリヌクレオチド、前記リボザイム、前記ｓｉＲＮＡ分子または前記ＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして
（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによりＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えること
によって行われる請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１６】
栄養素およびサイトカインを細胞に与えることをさらに含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１７】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記幹細胞は骨髄または末梢血から由来する請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記幹細胞は新生児臍帯血から由来する請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
造血幹細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２６】
前記選択はＣＤ３４を介して行われる請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
初期造血幹／先祖細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１２８】
前記選択はＣＤ１３３を介して行われる請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
ある量のＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が補充された幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液であって、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、前記量は未分化の造血細胞集団の分化を阻害するのに十分な量である、幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３０】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤である請求項１２９に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３１】
前記ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である請求項１３０に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３２】
ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である請求項１２９に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３３】
栄養素およびサイトカインをさらに補充されている請求項１２９に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３４】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される請求項１３３に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３５】
前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択される請求項１３４に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３６】
前記初期活動サイトカインはＦＬＴ３リガンドである請求項１３４に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３７】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される請求項１３４に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３８】
前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子である請求項１３４に記載の幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液。
【請求項１３９】
ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が細胞の分化を阻害することができるかどうかを決定するためのアッセイであって、前記アッセイは、
（ａ）前記ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の存在下または不在下で分化することができる細胞集団を培養し、そして
（ｂ）前記細胞の分化の変化を評価することを含み、
未処理の細胞と比較した分化の増大は、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が分化を阻害することができないということを示し、未処理の細胞と比較した分化の欠失または減少は、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が分化を阻害することができるということを示すアッセイ。
【請求項１４０】
前記分化することができる細胞は幹または先祖細胞、または細胞系の実質的に未分化の細胞である請求項１３９に記載のアッセイ。
【請求項１４１】
前記幹または先祖細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である請求項１４０に記載のアッセイ。
【請求項１４２】
栄養素およびサイトカインを細胞に与えることをさらに含む請求項１３９に記載のアッセイ。
【請求項１４３】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択されることができる請求項１４２に記載のアッセイ。
【請求項１４４】
前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する請求項１４０に記載のアッセイ。
【請求項１４５】
前記分化の変化を評価することは分化マーカーを介して行われる請求項１３９に記載のアッセイ。
【請求項１４６】
前記分化マーカーはＣＤ１３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ３３、ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ３，ＣＤ６１およびＣＤ１９からなる群から選択される請求項１４５に記載のアッセイ。
【請求項１４７】
幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害する方法であって、前記方法は、
（ａ）細胞増殖のための条件を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え、そして
（ｂ）ＰＩ３−キナーゼ活性が関与するシグナル伝達経路に対する前記幹細胞の応答能力をｅｘ  ｖｉｖｏで減少させ；それにより幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生可能な幹細胞の拡大方法、拡大させた再生可能な幹細胞の集団、およびその使用に関する。特に、例えばウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２の如きホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）阻害剤を介してタンパク質レベルでの、または遺伝子操作技術（干渉性低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、リボザイムおよびアンチセンス技術など）による発現レベルのいずれかでの、ＰＩ３−キナーゼのシグナル伝達のダウンレギュレーションによってｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞を拡大させることが本発明に従って達成される。
【０００２】
本発明は、さらに、これらの方法および／または上記方法によって得られた拡大幹細胞集団を使用する治療的適用に関する。
【背景技術】
【０００３】
特に幹細胞拡大およびレトロウイルス媒介遺伝子形質導入などの目的のための造血幹細胞および非造血幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物の必要性が高まっている。しかし、今までのところ、幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物の作製方法では幹細胞集団の活性が急激に低下し、さらに、自己再生能力が著しく損なわれ、培養された細胞集団の移植可能性が減少する。このような方法を改良する必要性は自明である。さらに、レトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療の適用には、増殖している造血幹細胞を使用する必要があり、さらに、これらの細胞は、形質導入された遺伝子の発現を長期間維持するために、培養物中で未分化の状態で維持する必要がある。したがって、長期自己再生能力を有する造血および非造血幹細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物を維持する能力は、広範な一連の治療用途に非常に重要である。
【０００４】
現在、再生可能な幹細胞は、線維芽細胞の支持層上で幹細胞を増殖させるか、初期活動性サイトカインであるトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で細胞を増殖させることによって、拡大されている（Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１０：４８１，Ｐｕｎｚｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３：９２，ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：９４３）。支持細胞層上での幹細胞の拡大により巨大で実質的に終わりなく細胞が拡大される一方で、初期活動性サイトカインの存在下での支持細胞層を使用しない幹細胞の拡大により分化度が上昇する（実施例およびＬｅｓｌｉｅ  ＮＲ  ｅｔ  ａｌ（Ｂｌｏｏｄ（１９９８）９２：４７９８）、Ｐｅｔｚｅｒ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｊｕｎ  １８３：２５５１、Ｋａｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．８：７３に記載のコントロールを参照のこと）。
【０００５】
いかなる場合でも、最初に実質的に富化するか均一に単離されない限り、現在までの技術を使用して幹細胞を拡大させることができない。
【０００６】
現在のところは、当業者は支持細胞層を使用することなく再生可能な幹細胞を拡大させるための有効な方法を教示できていない。
【０００７】
ＣＤ３８
ＣＤ３８は、その基質がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）（自然界の至る所に分布している補酵素）であるサイトゾル型膜結合酵素のエマージングファミリーのメンバーである。ヒトでは、ＣＤ３８は、４５ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。最近、ＣＤ３８はＮＡＤ＋糖加水分解酵素活性およびＡＤＰ−リボシルシクラーゼ活性の両方を発揮し、それによりその基質からニコチンアミド、ＡＤＰ−リボース（ＡＤＰＲ）、サイクリックＡＤＰＲ（ｃＡＤＰＲ）、およびニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）を産生することができる多機能酵素であることが証明された（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１０５６−１０５９；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０；７８５−７９３）。ヒトＣＤ３８の可溶性ドメインは、共通の共有結合中間体を介するＮＡＤ＋のサイクリックＡＤＰ−リボースおよびＡＤＰ−リボースへの転換を触媒する（Ｓａｕｖｅ，Ａ．Ａ．，Ｄｅｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ａｎｇｅｌｌｅｔｔｉ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｒａｍｍ，Ｖ．Ｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，７８５５−７８５９）。
【０００８】
しかし、ＣＤ３８は複数の酵素活性のみによって特徴付けられるのではなく、さらにカルシウムを動員してシグナルを伝達し、ヒアルロナンおよび他のリガンドへと結合することができることも見出されている。種々の白血球小集団に対するＣＤ３８との相互作用は、その寿命に対する種々の効果によって以前に示されている（Ｆｕｎａｒｏ  Ａ，Ｍａｌａｖａｓｉ  Ｆ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ  １９９９、Ｊａｎ−Ｍａｒ；１３（１）：５４−６１  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３８，ａ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ａｎ  ｅｎｚｙｍｅ，ａｎ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ｎｏｔ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）。
【０００９】
ＣＤ３８は、造血細胞および非造血系由来の細胞の両方で広く発現されている。ＣＤ３８のホモログもまた、哺乳動物間質細胞（Ｂｓｔ−１）および無脊椎動物Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａから単離された細胞で発現することが見出されている（Ｐｒａｓａｄ  ＧＳ，１９９６，ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌ．３：９５７−９６４）。
【００１０】
ＣＤ３８によって産生された２つの代謝産物（ｃＡＤＰＲおよびＮＡＡＤＰ）は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物の組織から単離された細胞中での細胞内カルシウムの放出を誘導することが示されており、これらの代謝産物がカルシウム反応の一般的な調節因子であり得ることが示唆されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０；７８５−７９３）。ｃＡＤＰＲおよびＮＡＡＤＰは共にＩｐ３受容体によって制御されるものとは異なるカルシウム貯蔵からカルシウム放出を誘導することが公知である（Ｃｌａｐｐｅｒ，ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．２６２：９５６１−９５６８）。
【００１１】
したがって、最も良好に特徴付けられている哺乳動物ＡＤＰ−リボシルシクラーゼであるＣＤ３８は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのサイクリックＡＤＰ−リボースの重要な供給源であると仮定される。
【００１２】
核質カルシウムイオン（Ｃａ２＋）は、遺伝子の転写、アポトーシス、ＤＮＡ修復、トポイソメラーゼ活性化、およびポリメラーゼアンフォールディングなどの非常に重要な核機能に影響を与える。Ｃａ２＋チャネルの典型であるイノシトール三リン酸受容体およびリアノジン受容体が共に核膜中に存在するにもかかわらず、核Ｃａ２＋のホメオスタシスにおけるその役割は依然として不明である。
【００１３】
ＣＤ３８／ＡＤＰ−リボシルシクラーゼが核質内にその触媒部位を有し、それによりＮＡＤ＋の核内環状化を触媒して核質ｃＡＤＰＲを産生することが見出された。後者は、核内膜のリアノジン受容体を活性化して核質Ｃａ２＋放出を誘発する（Ａｄｅｂａｎｊｏ  ＯＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ｎｏｖ；１（７）：４０９−１４  Ａ  ｎｅｗ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＣＤ３８／ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  Ｃａ２＋  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）。
【００１４】
リアノジン受容体のアゴニストがｃＡＤＰＲ媒介カルシウム放出を感作し、リアノジン受容体のアンタゴニストがｃＡＤＰＲ依存性カルシウム放出を遮断することがさらに見出された（Ｇａｌｉｏｎｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１４３−１４６）。これにより、ｃＡＤＰＲはリアノジン受容体が発現される筋肉および膵臓などの組織中でカルシウム応答を調節している可能性があるということが提案されている（Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  １２０：４１７−４２２；Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５６：９９７−１００３）。哺乳動物の平滑筋細胞では、アセチルコリンに応答するカルシウム放出を、リアノジン受容体アンタゴニストを用いるだけでなく、８−ＮＨ２−ｃＡＤＰＲまたは８−Ｂｒ−ｃＡＤＰＲなどのｃＡＤＰＲの特異的アンタゴニストを用いてもまた遮断することができることも示されている（Ｇｕｓｅ，ＡＨ，１９９９，Ｃｅｌｌ．Ｓｉｇｎａｌ．１１：３０９−３１６）。これらの所見は、他の所見と同様に、ｃＡＤＰＲなどのリアノジン受容体アゴニスト／アンタゴニストが多様な種から単離された細胞中のカルシウム応答を調節できることを示す。
【００１５】
上記で考察するように、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方での造血幹細胞および先祖細胞（ＨＰＣ）の自己再生は、細胞分化によって制限される。造血系の分化には、他の変化もあるが、表面抗原発現の変化が含まれる（Ｓｉｅｆｆ  Ｃ，Ｂｉｃｋｎｅｌｌ  Ｄ，Ｃａｉｎｅ  Ｇ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｊ，Ｌａｍ  Ｇ，Ｇｒｅａｖｅｓ  ＭＦ（１９８２）  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ６０：７０３）。正常なヒトでは、多能性造血幹細胞およびその系統が約束されている先祖細胞のほとんどがＣＤ３４＋である。細胞の大部分はＣＤ３４＋ＣＤ３８＋であり、少数の細胞（１０％未満）はＣＤ３４＋ＣＤ３８−である。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−表現型は、自己再生が可能であり多系統への分化を行うことができるほとんど未成熟の造血細胞とみなすことができるようである。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞画分は、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）前ＣＦＵを含み、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞と比較してその表現型をより長く維持し、サイトカインに対する増殖反応を遅延させる。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリンパ系細胞および骨髄性細胞を生じ、ＳＣＩＤマウスを再生させる（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）高い能力を有する（Ｂｈａｔｉａ  Ｍ，Ｗａｎｇ  ＪＣＹ，Ｋａｐｐ  Ｕ，Ｂｏｎｎｅｔ  Ｄ，Ｄｉｃｋ  ＪＥ（１９９７）Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５３２０）。さらに、自己血球移植を受けた患者では、注入されたＣＤ３４＋ＣＤ３８−の細胞数は造血回復速度に正に相関する。これらの機能的特徴と一致して、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞は、検出可能なレベルのテロメラーゼを有することが示されている。
【００１６】
最近、ヒトＨＬ−６０細胞（ある系統への分化増殖能力を獲得した細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｃｅｌｌ）株）の顆粒球分化を、レチノイン酸によって誘導することができ、これにはＣＤ３８の大規模な発現が伴うことが報告された。ＣＤ３８の発現にはｃＡＤＰＲの蓄積が伴い、両経時変化は分化の発生より前に起こり、ＣＤ３８の原因となる役割が示唆される。一貫して、ＣＤ３８の透過インヒビター（ニコチンアミド）でのＨＬ−６０細胞の処理により、ＣＤ３８の活性および分化の両方が阻害された。そのｍＲＮＡを標的化するモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によりＣＤ３８の発現はさらに特異的に遮断され、これによって対応する分化の阻害も同様に生じる（Ｍｕｎｓｈｉ  ＣＢ，Ｇｒａｅｆｆ  Ｒ，Ｌｅｅ  ＨＣ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２  Ｄｅｃ  ２０；２７７（５１）：４９４５３−８）。
【００１７】
ｃＡＤＰＲおよびリアノジンシグナル伝達経路に対するＣＤ３８の作用およびそれによる細胞の拡大および分化に対するその作用に関する上記の所見を考慮して、本発明者らは、ＣＤ３８の発現および／または活性の調節により、幹細胞の拡大および分化を制御できると仮定した。特に、ＣＤ３８の発現をダウンレギュレートするかその活性を阻害する薬剤を使用したＣＤ３８の発現および／または活性の低下により、分化していない再生可能な幹細胞を拡大させることができると仮定した。
【００１８】
ニコチンアミド（ＮＡ）は、水溶性のビタミンＢ誘導体であり、その生理学的活性形態はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨ）である。ＮＡの生理学的活性形態は、種々の重要な代謝反応において補酵素として作用する。ニコチンアミドは、さらに、ＣＤ３８の酵素活性を阻害し、それによりｃＡＤＰＲシグナル伝達経路に影響を与えることが公知である（その特徴は例えば、上記の研究で証明されている）（例えば、Ｍｕｎｓｈｉ  ＣＢ，Ｇｒａｅｆｆ  Ｒ，Ｌｅｅ  ＨＣ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２  Ｄｅｃ  ２０；２７７（５１）：４９４５３−８を参照のこと）。
【００１９】
したがって、本発明の着想時に、ニコチンアミドならびにＣＤ３８の酵素活性を阻害することが公知の他の薬剤を、幹細胞集団を拡大しながら幹細胞の分化を阻害するために使用することができると仮定した。ＣＤ３８の発現を直接または間接的に妨害することができる他の小分子を同様に使用することができるとさらに仮定した。
【００２０】
レチノイン酸（ＲＡ）（ビタミンＡ（レチノール）の天然の酸誘導体）は、胚発生の重要な調節因子であり、広範な種々の成体細胞型の増殖および分化にも影響を与える。ＲＡの生物学的作用は、一般に、特異的リガンド活性化核転写因子（その同族ＲＡ受容体（ＲＡＲ））との相互作用を通じて媒介される。レチノイン酸ファミリーの受容体には、ＲＡＲ、ＲＸＲ、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（ＴＨＲ）などが含まれる。特異的リガンドによって活性化された場合、これらの受容体は転写因子として作用し、胚発生および成体の成長時に遺伝子発現を調節する。受容体のＲＡＲおよびＲＸＲファミリーは、異なるＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを有するモジュラー構造を独自に示す。これらの受容体は、おそらく、それらの特異的標的遺伝子のプロモーター中に存在するＲＡＲ−ＲＸＲヘテロ二量体として調節エレメント（例えば、レチノイン酸応答エレメント、すなわちＲＡＲＥ）への結合によってその生物学的効果を媒介する（１，２，３）。
【００２１】
したがって、レチノイド受容体は、リガンド依存性転写調節因子として作用し、リガンドが存在しない場合には転写を抑制し、その存在下で転写を活性化する。転写に対するこれらの相違する効果は、コレギュレーターの使用によって媒介される：非リガンド化受容体はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）活性を示す複合体内で見出されるコリプレッサー（ＮＣｏＲおよびＳＭＲＴ）に結合し、一方、リガンド化受容体はヒストンアセチラーゼ活性（ＨＡＴ）を有するコアクチベーターを使用する。クロマチンリモデリングも必要であり、複数の同時調節複合体によって行われるＲＡ標的遺伝子のプロモーター構造改変物のヒエラルキーが示唆される。
【００２２】
同定された第１のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ−αと命名）は、ステロイド／甲状腺ホルモン細胞内受容体スーパーファミリーの多数のメンバーについて後に認められたように、リガンド依存的様式で特異的標的遺伝子の転写を調節する。ＲＡＲ−αの転写調節活性は内因性低分子量リガンドに依存し、この内因性低分子量リガンドはオールトランス型レチノイン酸である。レチノイン酸受容体によって媒介される遺伝子発現の変化により、複数の組織に影響を与える特徴的な細胞表現型変化が生じる。さらなるＲＡＲ−α関連遺伝子（ＲＡＲ−βおよびＲＡＲ−γと命名）が同定されており、ＲＡＲ−αに対して、および互いに高レベルの相同性を示す（４，５）。３つのＲＡＲサブタイプ受容体のリガンド結合領域の一次アミノ酸配列の相違は１５％未満である。
【００２３】
同様に、レチノイン酸に応答するステロイド／甲状腺受容体スーパーファミリーのさらなるメンバーが同定されており（６）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ファミリーと命名されている。ＲＡＲと同様に、ＲＸＲもまた、対応する固有の発現パターンを有する少なくとも３つのサブタイプまたはイソ型（すなわち、ＲＸＲ−α、ＲＸＲ−β、およびＲＸＲ−γ）を含むことが公知である（７）。
【００２４】
ＲＡＲおよびＲＸＲの両方がリガンドオールトランス型レチノイン酸とｉｎ  ｖｉｖｏで結合するにもかかわらず、受容体はいくつかの重要な局面が異なる。第１に、ＲＡＲおよびＲＸＲは、その一次構造（特に、そのリガンド結合ドメインに関して）が非常に異なる（例えば、αドメインのアミノ酸同一性はわずか２７％にすぎない）。これらの構造の相違は、種々のビタミンＡ代謝産物および合成レチノイドに対する応答性の相対的な度合いの相違を示す。さらに、ＲＡＲとＲＸＲとで組織分布パターンが明らかに異なる。ＲＡＲとＲＸＲは異なる標的遺伝子特異性を示す。１つの例は、細胞網膜結合タンパク質ＩＩ型（ＣＲＢＰＩＩ）およびアポリポタンパク質ＡＩタンパク質に関し、これらは、ＲＸＲに対する反応性を付与するがＲＡＲについては付与しない。さらに、ＲＡＲはまた、ＣＲＢＰＩＩ  ＲＸＲ応答エレメントを介したＲＸＲ媒介活性化を抑制することが示されている（８）。これらのデータは、２つの別のレチノイン酸応答経路が単に重複して存在しているのではなく、複雑に互いに影響しあっていることを示している。
【００２５】
ビタミンＤ（ＶｉｔＤ）は、レチノイド受容体スーパーファミリーに属する受容体の１つのさらに強力なアクチベーターである。核ホルモン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１α，２５（ＯＨ）（２）Ｄ（３））は、その同族受容体（ＶＤＲ）に結合し、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、コアクチベータータンパク質、および特異的ＤＮＡ結合部位（ＶＤＲＥ）と接触して結合すると転写因子として作用する。ＶＤＲのリガンドによって媒介される高次構造変化には、分子スイッチを制御する核１α，２５（ＯＨ）（２）Ｄ（３）シグナル伝達事象を含む。
【００２６】
細胞特異的ＶＤＲアンタゴニストは、カルシウムホメオスタシス、骨鉱化作用、および他の細胞機能が維持される、多面的１α，２５（ＯＨ）（２）Ｄ（３）内分泌系の巨力な制御および調節を示す。ＶｉｔＤに対するアンタゴニストは、同一の機構を介して作用することが示されている：これらはＶＤＲ−ＲＸＲ−ＶＤＲＥ複合体内のＶＤＲのリガンド結合ドメインの拮抗高次構造を選択的に安定化させ、ＶＤＲのコアクチベータータンパク質との相互作用およびトランス活性化の誘導を阻害する。興味深いことに、ＶｉｔＤアンタゴニストで処理された細胞は、ＶｉｔＤアゴニストで刺激された細胞と比較して異なる高次構造のＶＤＲ−ＲＸＲヘテロ二量体を含む。
【００２７】
レチノイン酸およびＶｉｔＤは、共通のＤＮＡ結合部位またはホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）を含む転写事象を共同で刺激することができる。対照的に、ＶＤＲ／ＲＸＲヘテロ二量体は、特定の極性を用いずにＲＡ応答エレメントを含むように転写による非生産的様式で結合し、これらの環境下でビタミンＤがＲＡに対する応答を阻害することが見出されている。ＤＮＡへの結合についての競合がこの阻害応答に関係している可能性があるにもかかわらず、ＶＤＲによる共通のコアクチベーターの滴定もまた、このトランス抑制に関与するようである。したがって、ＲＡおよびＶｉｔＤに対する転写応答の調節は、異なる受容体、コアクチベーター（１７）、および適切なＤＮＡ結合部位へのその結合の間の相互作用の複雑な組み合わせパターンに依存する。
【００２８】
転写調節因子としてのその機能と並行して、ＲＡＲおよびＲＸＲなどのレチノイド受容体は種々の細胞型の成長および分化の調節においても重要な役割を果たす（１８）。オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）などのＲＡＲアゴニストは、末期分化の強力な誘導が明らかである悪性癌細胞および胚性幹細胞を使用した実験（１９）で認められるように、細胞分化の誘導でのその効果について広く公知である。しかし、ＲＡはその成熟状態に依存して培養された造血細胞に対して異なる効果を示すことが認められているので、細胞分化は排他的結果ではない（２０）。一方、レチノイドは精製されたＣＤ３４＋細胞のサイトカイン刺激培養において顆粒球先祖細胞の成長および分化を加速させ、幹細胞の使用により反対の効果が得られた（４２）。レチノイド処理はまた、前脂肪細胞の分化を阻害することが示された（４３）。
【００２９】
ＲＡＲアンタゴニストであるＡＧＮ１９３１０９は造血幹細胞の分化に対してポジティブな作用を発揮するが（４１）、ＲＡＲアゴニストである４−［４−（４−エチルフェニル）ジメチル−クロメン−イル］エチニル｝−安息香酸は、反対の様式で機能する。対照的に、ＲＡＲアンタゴニストは、前骨芽球株ＨＬ−６０を使用した実験で顆粒球分化を妨害することが示されている（４１）。同様に、そのレチノイド受容体を介したシグナル伝達が欠損している骨髄性細胞株は、Ｇ−ＣＳＦの存在下で顆粒球分化を受けず（２２）、レチノイド欠損組織は前癌表現型となり、同時に分化できなくなる（２９，３０）。種々の癌腫由来の悪性細胞株は、レチノイン酸受容体ｍＲＮＡの発現が低下しており、このことは、発現の喪失が腫瘍形成において重要な事象であり得ることを意味している（３３，３４，３５，３６，３７）。さらに、ＲＡＲ遺伝子が破壊されているノックアウトマウスモデルで証明されるように、レチノイン酸受容体活性の破壊は顆粒球分化に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遮断を示す（３８，３９）。
【００３０】
しかし、同様のアプローチを使用した他の研究により、造血細胞株が得られた（２３）。造血幹細胞および初期先祖細胞は、ＣＤ３４＋として公知の表面抗原マーカーのその表面発現および表面系統抗原マーカーＬｉｎ−の発現の除外によって特徴付けられる。いくつかの白血病細胞株を使用した実験によって、レチノイン酸受容体媒介シグナル伝達により、分化マーカーＣＤ３８細胞表面抗原の発現が誘導される一方で、ＲＡＲに対するアンタゴニストによりＣＤ３８抗原のアップレギュレーションが消滅することが明らかにされた（２４，２５）。
【００３１】
したがって、今日までの、骨髄単球および前骨髄球の分化の誘導またはこれらのプロセスの妨害におけるＶｉｔＤおよびＲＡの決定的な役割についてのデータは混乱している。アンタゴニスト、アンチセンス技術、または短型受容体を使用した形質導入法を使用したＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＶＤＲの不活化を使用した以前のいくつかの研究で顆粒球および単球の分化が阻害されているにもかかわらず、これらの研究は、骨髄芽球または前骨髄球段階で分化が遮断された白血病細胞株を使用して行われていた（１９，２２，６４）。
【００３２】
ＰＩ３−キナーゼおよびＣＤ３８
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）は、Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有調節サブユニット（ｐ８５）および１１０ｋＤａの触媒作用サブユニット（ｐ１１０）から構成される脂質キナーゼである。ＰＩ３−キナーゼ活性は増大した細胞成長、増殖、接着、転移および血管新生を含む細胞変態プロセスの多くの側面に関連しており、結腸直腸ガン、胸ガン、卵巣がん、および頸ガンの病原性、並びに胸および他の組織のエストロゲンの増殖性および抗アポトーシス効果に関与している（Ｆｒｙ，Ｂｒｅｓｔ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ２００１，３：３０４−１２，Ｂｈａｔ−Ｎａｋｓｈａｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；９０：８５３−９）。ＰＩ３−キナーゼは、ＰＩＰＩ３−キナーゼのＤ３位でリン酸化されたイノシトールリン脂質の形成を触媒する。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のウォルトマンニン（ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）およびＬＹ２９４００２は、ＣＤ１５７（レチノイン酸にさらされたＨＬ−６０細胞および正常な骨髄ＣＤ３４＋細胞の表面におけるＣＤ３８関連抗原）の発現を妨げるだけでなく、増大したＣＤ３８ｍＲＮＡ発現および膜ＣＤ３８抗原の過剰発現を妨げることが示されていた［Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅｓ  ａｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ３８  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  Ｄ，Ｌｉｎａｓｓｉｅｒ  Ｃ，Ｉｏｃｈｍａｎｎ  Ｓ，Ｄｅｇｅｎｎｅ  Ｍ，Ｄｏｍｅｎｅｃｈ  Ｊ，Ｃｏｌｏｍｂａｔ  Ｐ，Ｂｉｎｅｔ  Ｃ，Ｈｅｒａｕｌｔ  Ｏ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００２  Ａｕｇ：１１８（２）：５３５−４４］。
【００３３】
種々のＲＡＲ、ＲＸＲ、ＶＤＲおよびＴＨＲなどの核受容体により負わされている下流のシグナル伝達もまた、適切な受容体シグナル伝達のための必須因子であるＰＩ３−キナーゼの阻害によって阻害され得る。ＶＤＲなどの核受容体の活性化におけるＰＩ３−キナーゼの非常に重要な機能がＴＨＰ−１細胞で明らかにされていた。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）を用いたＴＨＰ−１細胞の処理は、ＰＩ３−キナーゼ活性の迅速かつ一時的な増大、ならびに、骨髄細胞の成熟化、そしてＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ（細胞分化マーカー）の表面発現と関連していた。Ｄ３に応答したＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの発現の誘導は、（ａ）ＰＩ３−キナーゼ阻害剤のＬＹ２９４００２およびウォルトマンニンによって、（ｂ）ＰＩ３−キナーゼのｐ１１０触媒作用サブユニットについてのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、そして、（ｃ）ＰＩ３−キナーゼの優性ネガティブ変異体によって逆転した。同様に、ＬＹ２９４００２およびウォルトマンニンは末梢血単球におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの両方のＤ３誘導による発現を阻害した。ＶＤＲの免疫沈殿物に対して行われたウエスタンブロットおよびインビトロキナーゼアッセイは、Ｄ３処理が、ＰＩ３−キナーゼおよびＶＤＲの両方を含有する複合体を形成させることを示していた。これらの発見により、単球の分化を調節するホルモン作用の新しい非ゲノム機構が解明されている：この機構では、ビタミンＤ３により、ＶＤＲおよびＰＩ３−キナーゼに依存したシグナル伝達経路が活性化される［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９０，Ｎｕｍｂｅｒ  １１，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ６，１９９９  １５８３−１５９４；５−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｉｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−Ｋｉｎａｓｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｚａｋａｒｉａ  Ｈｍａｍａ，Ｄｅｖｋｉ  Ｎａｎｄａｎ，Ｌａｕｒａ  Ｓｌｙ，Ｋｅｉｔｈ  Ｌ．Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｖｅｌｉｔ，ａｎｄ  Ｎｅｉｌ  Ｅ．Ｒｅｉｎｅｒ］。
【００３４】
白血病細胞の分化の誘導に関与する細胞経路における下流の必須因子としてのＰＩ３−キナーゼの機能性もまた、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸により顆粒球分化に誘導されるＨＬ−６０細胞で明らかにされていた。共焦点顕微鏡による免疫化学分析および免疫組織化学分析により、核レベルでは特に明らかであるＰＩ３−キナーゼの量の増大が明らかにされた。ナノモル濃度のウォルトマンニンによるＰＩ３−キナーゼ活性の阻害、およびｐ８５αのアンチセンスフラグメントを用いたトランスフェクションによるその発現の阻害は分化プロセスを妨げた。さらに、オールトランスレチノイン酸を用いた分化に先立つＨＬ−６０細胞のウォルトマンニン処理によるＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害は致死的であり、分化後にアポトーシスを導いた。これらのデータは、ＰＩ３−キナーゼ活性が、顆粒球分化を促進する際に不可欠な役割を果たしていることを示している［Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９；５９：５４２−５４６；およびＭａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ２００４；３，６７−７０］。
【００３５】
細胞分化調節経路におけるＰＩ−３キナーゼの関与は非造血細胞でもまた明らかにされていた。平滑筋細胞（ＳＭＣ）の脱分化が、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ）によって誘導される一方、ＩＧＦ−Ｉによってトリガーされたシグナル伝達経路は培養物中の内臓ＳＭＣの分化した表現型を維持する。明らかに異なるシグナル伝達経路がＳＭＣの表現型を調節していることが明らかにされた。ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｂＦＧＦおよびＥＧＦにより開始されるＥＲＫ経路およびｐ３８ＭＡＰＫ経路の両方は、ＳＭＣの分化を誘導する際に不可欠な役割を果たしていることが見出され、これに対して、ＰＩ３−キナーゼ／プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）経路は、分化状態を維持する際に重要であった。表現型決定に関わる同じシグナル伝達経路が血管ＳＭＣにおいて認められた。従って、ＰＩ３−キナーゼ／プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）経路とＥＲＫ経路およびｐ３８ＭＡＰＫ経路との間におけるバランスの変化により、内臓ＳＭＣおよび血管ＳＭＣの表現型が決定されるであろう［Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １４５，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，Ｍａｙ  １７，１９９９  ７２７−７４０（Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂａｌａｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−Ｋｉｎａｓｅ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｂ（Ａｋｔ）  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍｉｔｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅｓ（ＥＲＫ／ｐ３８ＭＡＰＫ）Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ａ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｖｉｓｃｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｃｅｌｌｓ．Ｋｅｎ’ｉｃｈｉｒｏ  Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍａｓａｎｏｒｉ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋａｚｕｈｉｒｏ  Ｋｉｍｕｒａ，Ｗａｔａｒｕ  Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓａｇａ，ａｎｄ  Ｋｅｎｊｉ  Ｓｏｂｕｅ］。
【００３６】
従って、いくつかの分化誘導剤はＰＩ３−キナーゼを活性化することができ、ＰＩ−３Ｋ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路の阻害はこれらの細胞株における分化プロセスを阻止する［Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｈｉｇ  Ｍｅｄ  Ｄｏｓｗ  １９９９；５３（２）：３０５−１３．Ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ“ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”ｅｘｉｓｔ？  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬ−６０  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  １，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ３，Ｍａｒｃｉｎｋｏｗｓｋａ  Ｅ］。骨成長および発達についての最近の研究はＣＳＦ−１受容体、ＲＡＮＫおよびアルファ（Ｖ）Ｂ（３）インテグリンの如き破骨細胞および骨芽細胞の分化および生存の重要な因子の下流におけるＰＩ３−Ｋシグナル伝達の重要な役割を示す（Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｏｎｅ  ２００４；３４：３−１２）。同様に、ＰＩ３−キナーゼによって媒介されるｐ７０  Ｓ６キナーゼの活性化は培養物中のヒトの神経幹細胞の増殖にとって重要であることが示されている（Ｒｙｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．２００３；７２：３５２−６２）。
【００３７】
ＷＯ  ９９／４０７８３およびＷＯ  ００／１８８８５は両方とも特定の銅キレーターが様々な源からの再生可能な幹細胞の拡大を誘導することができることを教示している。これらの文献はかかる拡大された細胞がＣＤ３８−であることも教示している。
【００３８】
さらに、細胞のＰＩ３−キナーゼ活性はＣｕ＋＋への暴露後に強く増大されたことが報告されている［Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２００２  Ｊａｎ  １５；３９７（２）：２３２−９，ｃｏｐｐｅｒ  ｉｏｎｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ−３−ｋｉｎａｓｅ／Ａｋｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｏｓｔｒａｋｈｏｖｉｔｃｈ  ＥＡ，Ｌｏｒｄｎｅｊａｄ  ＭＲ，Ｓｃｈｌｉｅｓｓ  Ｆ，Ｓｉｅｓ  Ｈ，Ｋｌｏｔｚ  ＬＯ］。
【００３９】
しかし、細胞分化と関連する現象におけるＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の役割はまだほとんど理解されていない。例えばＰｔａｓｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ（米国特許第６４１３７７３号）はＰＩ３−キナーゼ阻害剤を用いた未分化のヒト胎児細胞における分化の誘導を教示する。他の研究はＰＩ３−キナーゼの阻害によるＰＭＡ刺激されたＨＬ−６０細胞における分化した単球表現型の誘導を示す（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘ  ２００２；２４：２１−２６）。
【００４０】
上述の発見に鑑み、本発明者はＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を調節することによって幹細胞の拡大および分化が制御されることができることを想像した。特に、ＰＩ３−キナーゼの発現をダウンレギュレートするかまたはその活性を阻害する薬剤を用いてＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を減少させることによって、分化していない再生可能な幹細胞の拡大が達成されるであろうという仮説が立てられた。
【００４１】
上述の記載に基づき、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境における多数の幹細胞を増殖させる方法が必要であることが広く認識されており、これは非常に有効である。したがって、多数のこれらの細胞集団を産生する幹細胞画分のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大を可能にする方法は、ヒト治療のための実行可能な幹細胞療法の先駆けとなり、無数の病状および疾患の治療に対して明白且つ直接的に影響を与える。いくつかの病理学的および医学的に誘導された病態は、ｉｎ  ｖｉｖｏの自己のまたは移植された再生可能な幹細胞が少ないことによって特徴付けられる。このような症状については、幹細胞拡大をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導することができる薬剤があれば有効である。
【発明の開示】
【００４２】
本発明は、幹細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大を誘導するための種々のＰＩ３−キナーゼの調節剤の使用を開示する。かかる調節剤を例えば、造血幹細胞に適用した場合には、多数の未分化のＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−（ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４など）ならびにＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（特にＣＤ３４＋ｄｉｍ／Ｌｉｎ−細胞）が得られる。
【００４３】
この新規且つ多用途の技術を、多数の幹細胞集団を必要とする任意のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの適用のための、その自己再生能力を維持している造血系および他の起源の幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大に使用することができる。
【００４４】
本発明の実施にいたるまでに、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤が幹細胞の分化プロセスを抑制し、活性な細胞増殖の期間およびｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞の拡大を刺激および延長させることが予想外に見出された。
【００４５】
これらの予想外の効果は、驚いたことに、細胞の供給源がＣＤ３４＋富化造血細胞（幹細胞および初期先祖細胞）である場合、最も驚いたことには、細胞の供給源が単核血球の全画分（幹細胞、先祖細胞、およびある系統への分化増殖能力を獲得した細胞を含む白血球の全画分）を含む場合に得られた。
【００４６】
ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達に関連するＣＤ３８の阻害剤と共にインキュベートした初代肝細胞培養物によりα−フェトプロテインを産生する細胞の比率が増大し、初期肝細胞の増殖がシグナル伝達されるという所見も同様に予想外であった。従って、ＰＩ３−キナーゼ活性および遺伝子発現の調節剤のこの新規に発見された効果を、以下にさらに詳述するように種々の細胞型のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大の最大化に使用することができると予測される。
【００４７】
本発明の１つの態様によれば、幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害する方法が与えられ、前記方法は：（ａ）細胞増殖のための条件を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え；（ｂ）ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され；それにより幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害することによって行われる。
【００４８】
本発明の別の態様によれば、拡大された未分化の幹細胞に外来遺伝子（ｅｘｏｇｅｎｅ）を形質導入する方法が与えられ、前記方法は（ａ）幹細胞集団を得；（ｂ）（ｉ）幹細胞に細胞増殖のための条件を与え、そして（ｉｉ）幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を与えることによって幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、ただし工程（ｉ）および（ｉｉ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われ；それによって幹細胞を拡大しかつその分化を阻害し；そして（ｃ）拡大された未分化の幹細胞に外来遺伝子を形質導入することによって行われる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、形質導入は外来遺伝子を含むベクターによって行われる。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、幹細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である。
【００５１】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の方法に従って拡大された未分化の造血細胞を含む治療用のｅｘ  ｖｉｖｏ培養された幹細胞集団が与えられる。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞集団はＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤を含む培養培地中に与えられ、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞集団は前記培地から単離される。
【００５４】
本発明の別の態様によれば、細胞集団および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物が与えられる。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、レシピエントに造血幹細胞を移植する方法が与えられ、前記方法は：（ａ）造血幹細胞集団を得；（ｂ）（ｉ）造血幹細胞に細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで与え、そして（ｉｉ）造血幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をｅｘ  ｖｉｖｏで与えることによって造血幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それによって造血幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大しかつその分化を阻害し；そして（ｃ）レシピエントに造血幹細胞を移植することによって行われる。
【００５６】
本発明のなお別の態様によれば、養子免疫療法が与えられ、前記方法は（ａ）患者から先祖造血細胞を得、（ｂ）（ｉ）細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで先祖造血細胞に与え、そして（ｉｉ）先祖造血細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を与えることによって造血細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それによって先祖造血細胞を拡大させかつその分化を阻害し、そして（ｃ）先祖造血細胞をレシピエントに移植することを含む。
【００５７】
本発明の別の態様によれば、骨髄幹細胞を採取するためにドナー末梢血へ骨髄幹細胞を動員する方法が与えられ、前記方法は：（ａ）ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をドナーに投与し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それによって骨髄幹細胞集団を拡大しかつその分化を阻害し、そして（ｂ）ロイコフォレシス（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって細胞を採取することによって行われることを含む。
【００５８】
本発明のなお別の態様によれば、β−異常ヘモグロビン症の患者の治療のために赤血球前駆体細胞の成熟／分化を阻害する方法が与えられ、前記方法はＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を患者に投与することを含み、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それによって患者の幹細胞集団を拡大させかつその分化を阻害し、前記患者からのＰＩ３−キナーゼ調節剤の除去により幹細胞は加速的に成熟し、増大した胎児ヘモグロビン生産を生じ、それによって患者におけるβ−異常ヘモグロビン症の徴候を改善することを含む。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記方法はサイトカインを患者に投与する工程をさらに含む。
【００６０】
本発明のさらに別の態様によれば、未分化の幹細胞を保存する方法が与えられ、前記方法はＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を未分化の幹細胞に与え、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される。前記与えることは未分化の造血細胞の採取、単離および貯蔵の工程の少なくとも１つで行われる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記方法は栄養素およびサイトカインを細胞に与えることをさらに含む。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、幹細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される調節剤は（ａ）ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、（ｂ）ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、（ｃ）ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、（ｄ）ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、および（ｅ）ＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイムからなる群から選択される。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる調節剤は抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、抗ＰＩ３−キナーゼ抗体はＳｃＦＶまたはＦａｂである。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記与えることはアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子またはＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記与えることは（ａ）アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子またはＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによってＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えることによって行われる。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤は抗ＰＩ３−キナーゼＳｃＦｖまたはＦａｂをコードする発現性ポリヌクレオチドである。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記細胞増殖のための条件を与えることは栄養素およびサイトカインを細胞を与えることによって行われ、前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択される。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択され；前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記幹細胞は骨髄または末梢血、または新生児臍帯血から由来する。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記方法は造血幹細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記選択はＣＤ３４またはＣＤ１３３を介して行われる。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記方法は初期造血幹／先祖細胞について豊富にされている幹細胞集団を選択する工程をさらに含む。
【００７７】
本発明の別の態様によれば、ある量のＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が補充された幹細胞回収バッグ、幹細胞分離および幹細胞洗浄緩衝液が与えられ、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、前記量は未分化の造血細胞集団の分化を阻害するのに十分な量である。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤または抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２である。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、幹細胞回収バッグおよび緩衝液は栄養素およびサイトカインをさらに補充されている。前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択されることができる。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択され；前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される。
【００８２】
本発明の別の態様によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が細胞の分化を阻害することができるかどうかを決定するためのアッセイが与えられ、前記アッセイは（ａ）ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の存在下または不在下で分化することができる細胞集団を培養し、そして（ｂ）細胞の分化の変化を評価することを含む。未処理の細胞と比較した分化の増大は、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が分化を阻害することができないということを示し、未処理の細胞と比較した分化の欠失または減少は、ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤が分化を阻害することができるということを示す。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、分化することができる細胞は幹または先祖細胞、または細胞系の実質的に未分化の細胞である。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、幹または先祖細胞は初期造血および／または造血先祖細胞である。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記アッセイは栄養素およびサイトカインを細胞に与えることをさらに含む。
【００８６】
前記サイトカインは初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインからなる群から選択されることができる。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記初期活動サイトカインは幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−６、トロンボポイエチンおよびインターロイキン−３からなる群から選択され；前記後期活動サイトカインは顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子およびエリスロポイエチンからなる群から選択される。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、前記幹細胞は造血細胞、神経細胞、希突起膠細胞、皮膚細胞、肝細胞、胚性幹細胞、筋肉細胞、骨細胞、間葉細胞、膵細胞、軟骨細胞、および間質細胞からなる群から選択される源から由来する。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化の変化を評価することは分化マーカーを介して行われる。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前記分化マーカーはＣＤ１３３，ＣＤ３４，ＣＤ３８，ＣＤ３３、ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ３，ＣＤ６１およびＣＤ１９からなる群から選択される。
【００９１】
本発明の別の態様によれば、幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害する方法が与えられ、前記方法は：（ａ）細胞増殖のための条件を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え、そして（ｂ）ＰＩ３−キナーゼ活性が関与するシグナル伝達経路に対する前記幹細胞の応答能力をｅｘ  ｖｉｖｏで減少させ；それによって幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害することを含む。
【００９２】
本発明は、細胞の増殖方法を提供し、さらにはＣＤ３８またはＰＩ３−キナーゼ発現、活性および／またはＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の妨害によりその分化を遅延させることによって、現在知られている形態の欠点にうまく対応する。
【００９３】
本発明は、さらに、ある系統への分化増殖能力を獲得した細胞の存在下での再生可能な幹細胞の拡大を初めて可能としたことによって現在知られている形態の欠点にうまく対応し、再生可能な幹細胞が僅かな比率でしか存在しない細胞の混合集団を供給源とするにもかかわらず、再生可能な幹細胞の拡大集団を得ることができた。
【００９４】
本発明の細胞調製方法および製品のさらなる特徴および利点は、以下の説明を読むことによって当業者に明らかとなる。
【００９５】
図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図１ＡはＦＡＣＳ分析プロットを示す図であり、ＣＤ３４、ＣＤ３８、および関連する系統の抗原の十分な発現を有するコントロールの細胞表面マーカーの発現を示す。
図１ＢはＦＡＣＳ分析プロットを示す図であり、ＣＤ３４抗原の類似の発現レベルを有するが、コントロールと比較してＣＤ３８および関連する系統の抗原の発現がほとんど完全に失われている、ＲＡＲアンタゴニスト（１０−５Ｍ）で処理した培養細胞の表面マーカー発現を示す。
図１ＣはＦＡＣＳ分析プロットを示す図であり、ＣＤ３４抗原の類似の発現レベルを有するが、コントロールと比較してＣＤ３８および関連する系統の抗原発現がほとんど完全に失われている、ＲＡＲアンタゴニスト（１０−６Ｍ）で処理した培養細胞表面マーカー発現を示す。
図２ＡはＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールおよびＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物中での同等のＣＤ３４＋細胞拡大レベルを示す。
図２ＢはＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールと比較して、１０−５Ｍまたは１０−７Ｍのいずれかの濃度でのＲＡＲアンタゴニストでの処理に応答して顕著に増加したＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の拡大レベルを示す。
図２ＣはＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールと比較して、１０−５Ｍまたは１０−７Ｍのいずれかの濃度でのＲＡＲアンタゴニストでの処理に応答して顕著に増加したＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の拡大レベルを示す。
図３ＡはＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールおよび処理した培養物の播種から２週間後までの同様のＣＤ３４＋表面発現を示す。培養物を、ＲＡＲアンタゴニスト（１０−５Ｍおよび１０−７Ｍ（すなわち、４１μｇ／リットルから０．４１μｇ／リットル））および４つのサイトカイン（ＩＬ−６、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、およびＳＣＦ）の組み合わせで処理し、ＦＡＣＳ分析前にさらなるポジティブ選択工程に供した。しかし、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物においては、播種から９および１１週間後にコントロールと比較して発現の顕著な増加が認められた。
図３ＢはＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、さらなるポジティブ選択工程に供したサンプルにおける、コントロールおよびＲＡＲアンタゴニストとサイトカインで処理した（図３Ａと同様に処理した）培養物の播種から２週間後までの同様のＣＤ３４＋ＣＤ３８−表面発現を示す。ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物においては、播種から９および１１週間後にコントロールと比較して発現の顕著な増加が認められた。
図３ＣはＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、さらなるポジティブ選択工程に供したサンプルにおける、コントロールと比較したＲＡＲアンタゴニストで処理した（図３Ａと同様に処理した）培養物の播種から２週間後のＣＤ３４＋Ｌｉｎ−表面発現の増加を示す。ＲＡＲアンタゴニストで処理した群においては、播種から９および１１週間後に発現の顕著な増加が認められた。
図４はＦＡＣＳ分析およびＬＴＣ−ＣＦＵ能力によって収集したデータのグラフであり、播種からほぼ１２週間までに１０−７ＭのＲＡＲアンタゴニストと上記の４つのサイトカインの組み合わせで処理したｅｘ  ｖｉｖｏ培養物における高レベルＣＤ３４＋細胞増殖および長期コロニー形成単位能力を示す。１０週および１１週（それぞれ、ＣＦＵ細胞およびＣＤ３４細胞）で、これらの集団は減少し始める。
図５ＡはネガティブコントロールのＦＡＣＳ分析プロットであり、バックグラウンド染色がないことを示す。
図５Ｂは再選択した細胞培養物のポジティブコントロールのＦＡＣＳ分析プロットであり、十分なＣＤ３４＋細胞表面染色を示す。
図５Ｃは再選択から２週間後のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物のＦＡＣＳ分析プロットであり、ほとんど分化していない状態と一致する、プロフィールにおける顕著な左方向へのシフトを示す。
図５Ｄは再選択から１１週間後のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物（１０−７）のＦＡＣＳ分析プロットであり、十分なＣＤ３４＋細胞表面染色と、より分化した状態と一致するプロフィールを示す。
図５Ｅは再選択から１１週間後のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物（１０−５）のＦＡＣＳ分析プロットであり、ほとんど分化していない状態と一致する、プロフィールにおける顕著な左方向へのシフトを示す。
図６Ａはコロニー形成単位データのグラフであり、アンタゴニストを使用して最初の３週間パルスした長期培養物またはＲＡＲアンタゴニストを連続投与した培養物の両方がコントロール値と比較してＣＦＵ含有量の５倍増加を示すことを示している。
図６Ｂは細胞計数データのグラフであり、アンタゴニストを使用して最初の３週間のパルスまたはＲＡＲアンタゴニストの連続投与のいずれかを行った長期培養物がコントロール値と比較してＣＦＵ含有量の５倍増加を示すことを示す。
図７は混合コロニー形成単位データのグラフであり、アンタゴニストを使用して最初の３週間パルスした長期培養物またはＲＡＲアンタゴニストを連続投与した培養物の両方がコントロール値と比較してＣＦＵ含有量の劇的増加を示し、パルス処理によって最も高いＣＦＵ値が得られることを示す。
図８Ａはマウスから単離した３週齢の初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。肝細胞を、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現についてプローブし、ヘマトキシリンで対比染色した。中程度のＡＦＰ染色が認められる（赤褐色沈殿）。
図８Ｂはマウスから単離した３週齢の初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。肝細胞を、１０−５Ｍのレチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＡＧＮ  １９４３１０）の存在下でインキュベートし、同様にＡＦＰ発現についてプローブし、ヘマトキシリンで対比染色した。ＡＧＮ  １９４３１０で処理した肝細胞は、コントロールと比較してＡＦＰ発現の顕著な増加が明らかとなった。
図９Ａはギムザ染色した３週齢の初代マウス肝細胞培養物の顕微鏡写真であり、細胞形態を示している。典型的な形態を有する多数の肝細胞（細い矢印）とは対照的に、本サンプル（太い矢印）では楕円形細胞はほとんど認められなかった。
図９Ｂは１０−５Ｍレチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＡＧＮ１９４３１０）の存在下でインキュベートしたギムザ染色した初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。アンタゴニストで処理した細胞は、楕円形の細胞集団の顕著な増加を示した（矢印）。
図９Ｃは１０−５Ｍレチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＡＧＮ１９４３１０）の存在下でインキュベートし、その後トリプシン処理し、１：２の比でのサイトカインを含まない培養培地中に再プレーティングを行った、ギムザ染色した初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。これらの培養物は、特徴的な肝細胞形態を同様に示した。
図１０Ａはマウスから単離し、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充した、３週齢の初代肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。肝細胞を、１０−Ｍから１０−７ＭのＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０で処理し、アルブミン発現についてプローブし、ヘマトキシリンで対比染色した。検出可能なバックグラウンド染色は認められない。アンタゴニストを補充した培養物中で拡大させた細胞が本質的に肝細胞であることを示す。
図１０Ｂはマウスから単離し、同様にＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、アルブミン発現についてプローブした、３週齢の初代肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。ここでも同様に、無視できる程度のバックグラウンド染色が認められる。
図１０Ｃはマウスから単離し、同様にＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、α−フェトプロテイン発現についてプローブした３週齢の初代肝細胞ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物の顕微鏡写真を示す。極めて強いＡＦＰ染色が認められ（赤褐色沈殿）、これは先祖細胞の拡大を示している。
図１０Ｄはマウスから単離し、同様にＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、α−フェトプロテイン発現についてプローブした、３週齢の初代肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。わずかな染色が認められ、これはより分化した細胞表現型を示している。全ての図は、１０ｘ／０．３倍で撮影した。
図１１Ａは上記のように、マウスから単離し、ＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、培養２週間後に１：２に分割し、さらに１週間培養し、アルブミン発現についてプローブした、第１継代肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。多数の典型的な肝細胞（小さな矢印）が認められる。
図１１Ｂは図１１Ａのように培養し、アルブミン発現についてプローブした、マウスから単離したＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−５〜１０−７Ｍ）で処理した第１継代の肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。同様にこのフレームで典型的な肝細胞の形態（小さな矢印）が認められる。
図１１Ｃは図１１Ｂのように培養およびプローブしたＲＡＲアンタゴニストで処理した第１継代の肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。視野内で多数の特徴的な楕円形の細胞が認められる（大きな矢印）。倍率−２０ｘ／０．５。
図１１Ｄは図１１Ｃの低倍率の顕微鏡写真である。ほとんど分化していない表現型と一致する、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物中の楕円細胞の多数の島を示している。
図１１Ｅは上記のように、マウスから単離し、ＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、培養２週間後に１：２に分割し、さらに１週間培養し、１：４に分割し、その後最後にさらに４日間培養し、アルブミン発現についてプローブした、第２継代の肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。肝細胞はほとんど認められない。
図１１ＦはＲＡＲアンタゴニスト（ＡＧＮ１９４３１０）（１０−５〜１０−７Ｍ）で処理した、同様に単離および培養した第２継代の肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。コントロールと比較して本培養物中ではかなり多くの肝細胞が認められる。倍率−２０ｘ／０．５。
図１２Ａは再選択から３週間後にサイトカインのみ（コントロール）、ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−７Ｍ）、およびＲＡＲアンタゴニスト（１０−７Ｍ）とＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析を示すプロットである。未処理のコントロールおよびＲＡＲアンタゴニストで処理したものと比較して、ＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストの組み合わせ処理のプロフィールにおいては顕著な左方向へのシフトが明らかであり、これは、ほとんど分化していない状態と一致する。
図１２Ｂは再選択から５週間後にサイトカインのみ（コントロール）、ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−７Ｍ）、およびＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４（１０−７Ｍ）、およびＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせ（１０−７Ｍ）で処理した培養物のＦＡＣＳ分析を示すプロットである。ＲＡＲアンタゴニストで処理したものと比較して、ＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストの組み合わせ処理のプロフィールにおいては顕著な左方向へのシフトが明らかであり、これは、ほとんど分化していない状態と一致する。
図１３ＡはＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびそれらの組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。播種から３週間および５週間後に決定された類似のＣＤ３４＋表面発現レベルが認められる。未処理の（サイトカインのみ）コントロール、ＲＡＲアンタゴニスト、およびＲＸＲアンタゴニストでの処理と比較してＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせで処理した培養物においては、発現の顕著な増加が認められる。
図１３ＢはＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびそれらの組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。播種から３週間および５週間後に決定された類似のＣＤ３４＋／３８−表面発現レベルが認められる。未処理の（サイトカインのみ）、ＲＡＲアンタゴニスト、およびＲＸＲアンタゴニストでの処理と比較してＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせで処理した培養物においては、発現の顕著な増加が認められる。
図１３ＣはＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびその組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。播種から３週間および５週間後に決定された類似のＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−表面発現レベルが認められる。未処理のコントロール（サイトカインのみ）、ＲＡＲアンタゴニスト、およびＲＸＲアンタゴニストでの処理と比較してＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせで処理した培養物においては、発現の顕著な増加が認められる。
図１３ＤはＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびその組み合わせで処理した培養物の総細胞密度を示す棒グラフである。播種から３週間および５週間後に決定された類似の数の細胞が認められる。未処理のコントロール（サイトカインのみ）、ＲＡＲアンタゴニスト、およびＲＸＲアンタゴニストでの処理と比較して、播種から５週間後にＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストで処理した培養物においては、細胞密度の顕著な増加が認められる。
図１３ＥはＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびその組み合わせで処理した培養物のコロニー形成単位（ＣＦＵ）データを示す棒グラフである。播種から３週間および５週間後に決定された類似のＣＦＵレベルが認められる。未処理のコントロール（サイトカインのみ）、ＲＡＲアンタゴニスト、およびＲＸＲアンタゴニストでの処理と比較してＲＡＲとＲＸＲとの組み合わせで処理した培養物においては、ＣＦＵの顕著な増加が認められる。
図１４は３週間培養物中で計数したＣＤ３４＋細胞密度を示す棒グラフである。細胞培養物に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３サイトカインを補充し、濃度１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充したかまたは補充しなかった。ニコチンアミドで処理した培養物においては、ＣＤ３４＋細胞密度の顕著な増加が認められる。
図１５は３週間培養物中のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。細胞培養物に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３サイトカインを補充し、濃度１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充したかまたは補充しなかった。ニコチンアミドで処理した培養物においては、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞密度の顕著な増加が認められる。
図１６は３週間培養物中のＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。細胞培養物に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３サイトカインを補充し、濃度１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充したかまたは補充しなかった。ニコチンアミドで処理した培養物中では、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞密度の顕著な増加が認められる。
図１７は３週間培養物中のＣＤ３４＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８）−細胞のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。細胞培養物に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３サイトカインを補充し、濃度１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充したかまたは補充しなかった。ニコチンアミドで処理した培養物においてＣＤ３４＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８）−細胞の密度に顕著な増加が認められる。
図１８Ａはサイトカインで処理し、５ｍＭニコチンアミドで処置したかまたは処理しなかった３週間培養物から再選択したＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すドットプロットである。ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞を、プロットの左上の部分に示し、ニコチンアミドで処理した培養物中でのＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の顕著な増加が認められる。
図１８Ｂは再選択の３週間後に、３週間の間、サイトカインで処理し、５ｍＭニコチンアミドで処理したかまたは処置しなかった培養物から再選択したＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すドットプロットである。ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞を、プロットの左上の部分に示し、ニコチンアミドで処理した培養物中でのＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞の顕著な増加が認められる。
図１８Ｃは再選択の３週間後に、３週間の間、サイトカインで処理し、５ｍＭニコチンアミドで処理したかまたは処置しなかった培養物から再選択したＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すドットプロットである。ＣＤ３４＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８）−細胞を、プロットの左上の部分に示し、ニコチンアミドで処理した培養物中でのＣＤ３４＋／＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８）−細胞の顕著な増加が認められる。
図１９はＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルに対するＴＥＰＡの短期間の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は低用量のサイトカインの存在下で３×１０４個細胞／ｍｌで液体培地で培養された：５ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、様々な濃度のＴＥＰＡありまたはなし。７日目に０．１ｍｌの少量が半固型培地中でクローニングされ、１４日後にコロニーを計数することによってコロニー形成細胞について評価された。２つの独立した実験の結果が示される。
図２０は全細胞およびＣＤ３４細胞に対するＴＥＰＡの短期間の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は５ｎｇ／ｍｌのＦＬ、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の存在下でＴＥＰＡ（２０μＭ）ありまたはなしで液体培地で培養された。７日目にウェルは培養物容積の半分を除去して新鮮な培地およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）で置換することによって細胞数を半分に減らされた。１４日目に希釈率を掛けられたＣＤ３４細胞の割合（右）および全細胞数（左）が測定された。
図２１ａ−ｂは細胞数およびＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルに対するＴＥＰＡの長期間の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は高用量のサイトカインの存在下で３×１０４個細胞／ｍｌで液体培地で培養された：５０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、１Ｕ／ｍｌのＥＰＯ、ＴＥＰＡ（２０μＭ）ありまたはなし。４日目に培養物はサイトカインおよびＴＥＰＡを補充された０．９ｍｌの新鮮な培地で１：１０に希釈された。７，１４および２１日目に培養物は培養物容積の半分を除去して新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡで置換することによって示されたように細胞数を半分に減らされた。回収された培地の細胞は計数され、１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地でクローニングされた。希釈率を掛けられた液体培地中の細胞数（２１ａ）および半固型倍地中のコロニー数（２１ｂ）が示される。＊は小さなコロニーおよび細胞クラスターを示す。
図２２ａ−ｂは初期サイトカインで培養されたＣＤ３４細胞に対するＴＥＰＡの長期間の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は５０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、および２０ｎｇ／ｍｌのトロンボポイエチン（ＴＰＯ）の存在下でＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで液体培地で培養された。週間隔をおいて培養物は培養物容積の半分を除去して新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡで置換することによって示されたように細胞数を半分に減らされた。回収された培地の細胞は計数され、１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地でクローニングされた。希釈率を掛けられた液体培地中の細胞数（２２ｂ）および半固型倍地中のコロニー数（２２ａ）が示される。＊はコロニーが発達しなかったことを示す。
図２３は赤血球前駆体の発達に対するＴＥＰＡの効果を示す。成人の正常なドナーから得られた末梢血単核細胞は赤血球二相液体培養システム（２３〜２５）で培養された。培養物の第二相は１０μＭのＴＥＰＡを補充されていたかまたは補充されていなかった。培養物は１４日後に全細胞およびヘモグロビン含有［ベンジジン陽性（Ｂ＋）］細胞について分析された。
図２４ａ−ｄは細胞成熟に対するＴＥＰＡの効果を示す。ＴＥＰＡの不在下（２４ａおよび２４ｃ）および存在下（２４ｂおよび２４ｄ）での長期間（７週間）培養物における細胞の形態が示される。サイトスピン調製されたスライドはＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａで染色された。拡大倍率：２４ａおよび２４ｂは×６００；２４ｃおよび２４ｄは×１４８５。
図２５はＣＤ３４細胞で開始された培養物の細胞数およびクローン原性に対する遷移金属キレート化剤の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は示されたように２０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ６、および１０μＭのＴＥＰＡ、１０μＭのカプトプリル（ＣＡＰ）または１０μＭのペニシラミン（ＰＥＮ）の存在下で液体培地中で培養された。７日目に細胞は計数され１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地で培養された。バーは７日目における全細胞数（×１０３／ｍｌ）およびクローニングの１４日目におけるプレートあたりのコロニー数を示す。
図２６ａ−ｂはＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルおよび全細胞数に対する銅の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞はサイトカインの存在下で液体培地中で培養された：１０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６。培地は示されたように５μＭの硫酸銅および２０μＭのＴＥＰＡを補充された。７日目に細胞は計数され（２６ｂ）、１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地中で培養された。コロニーは１４日後に計数された（２６ａ）。
図２７は培養されたＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルに対するイオンの効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は１０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の存在下で１０μＭのＴＥＰＡありまたはなしで液体培地中で培養された。培養物は示された通り５ｍＭの硫酸銅、５ｍＭの亜セレン酸ナトリウムまたは０．３ｍｇ／ｍｌの鉄飽和されたトランスフェリンを補充された。７日目に１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地で培養された。コロニーは１４日後に計数された。
図２８はＣＤ３４細胞の増殖ポテンシャルに対する亜鉛の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は１０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、１０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の存在下で１０μＭのＴＥＰＡまたは５ｍＭの硫酸亜鉛ありでまたは両者ありで液体培地中で培養された。７日目に１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地で培養された。コロニーは１４日後に計数された。
図２９ａ−ｃは長期間のＣＤ３４培養物に対するＴＥＰＡの効果を示す。培養は精製された１０４個の臍帯血由来のＣＤ３４細胞をＳＣＦ、ＦＬＴ３およびＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで液体培地中で培養することによって開始された。週間隔で培養物は細胞の半分を除去して新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡを添加することによって細胞数を半分に減らされた。示された週に細胞は計数され半固型培地でクローニングすることによってコロニー形成細胞（ＣＦＵｃ）についてアッセイされた。ＣＦＵｃ頻度（コロニー形成率）は細胞数あたりのＣＦＵｃの数として計算された。１日目の精製されたＣＤ３４細胞のクローニングは１０４個の初期細胞あたり２×１０３のＣＦＵｃを生じた。＊はコロニーが発達しなかったことを示す。
図３０−３２は初期サイトカインの様々な組合せの存在下での細胞増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞はＳＣＦ，ＦＬＴ３およびＩＬ−６（ＳＣＦ、ＦＬＴ、Ｉｌ−６）（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＴＥＰＡ（１０μＭ）ありまたはなしで液体培地中で図１１ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。加えて、培地は示されるようにＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍｌ）またはそれらの両方を補充された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡを補充された。示された週に細胞は計数され（図３０）、ＣＦＵｃについてアッセイされ（図３１）、そしてＣＦＵｃ頻度が計算された（図３２）。＊はコロニーが発達しなかったことを示す。
図３３はコントロールのＣＦＵｃ頻度およびＴＥＰＡを補充されたＣＤ３４培養物に対するＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図１１ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。一週間後、コントロールおよびＴＥＰＡ培養物の半分は後期活動サイトカインＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）を補充された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡを補充された。３，４および５週目に細胞は計数され、ＣＦＵｃについてアッセイされ、ＣＦＵｃ頻度が計算された。
図３４−３５は長期間細胞増殖およびＣＦＵｃ生成に対する部分的なまたは完全な培地＋ＴＥＰＡ変換の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図１１ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡを補充された。週間隔で培養物内容（細胞および上澄み）の半分は除去され、ＴＥＰＡありまたはなし（部分的な変換）の新鮮な培地、サイトカインで置換された。代わりに、培養物の全内容物は回収され、遠心分離され、上澄みおよび細胞の半分は捨てられ、残りの細胞はＴＥＰＡありまたはなし（完全な変換）の新鮮な培地、サイトカインで再培養された。示された週に細胞数（図３４）およびＣＦＵｃ（図３５）が測定された。
図３６はＣＤ３４細胞拡大に対するＴＥＰＡの効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図２９ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。１，２および３週目にＣＤ３４＋細胞はフローサイトメトリーによって計数された。＊はコロニーが発達しなかったことを示す。
図３７はＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの遅延された添加の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図２９ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。ＴＥＰＡ（１０μＭ）は培養開始時（１日目）にまたは６日後に添加された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡを補充された。３，４および５週目に細胞は計数され、ＣＦＵｃについてアッセイされ、ＣＦＵｃ頻度が計算された。
図３８は長期間のＣＦＵｃ生成に対する単一のサイトカインを用いた短期間の前培養の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図１１ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。培養物は１日目にＴＥＰＡ（１０μＭ）を補充され、またはＴＥＰＡを補充されず、およびＳＣＦ，ＦＬＴ３，ＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充された。代わりに、培養物は１日目にＴＥＰＡ（１０μＭ）およびＦＬＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ）を単一のサイトカインとして補充された。ＳＣＦ，ＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）は２日目にこれらの培養物に添加された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびＴＥＰＡを補充された。示された週に細胞はＣＦＵｃについてアッセイされた。
図３９ａ−ｃはＣＤ３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図２９ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。ポリアミンキレート化剤テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）またはトリエチレン−テトラアミン（ＴＥＴＡ）が様々な濃度で添加された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびキレート化剤を補充された。３，４，６および７週目に細胞は計数され、ＣＦＵｃについてアッセイされた。示される結果は最適活性を有する濃度についてのものである：ＴＥＰＡ−４０μＭ，ＰＥＨＡ−４０μＭ，ＥＤＡ−２０μＭおよびＴＥＴＡ−２０μＭ。
図４０ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する遷移金属キレート化剤の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図２９ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。キレート化剤カプトプリル（ＣＡＰ）、ペニシラミン（ＰＥＮ）およびＴＥＴＡが様々な濃度で添加された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびキレート化剤を補充された。４，５および７週目に細胞は計数され、ＣＦＵｃについてアッセイされた。示される結果は最適活性を有する濃度についてのものである：ＴＥＰＡ−１０μＭ，ＰＥＮ−５μＭおよびＣＡＰ−４０μＭ。
図４１ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する亜鉛の効果を示す。臍帯血由来のＣＤ３４細胞は図２９ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。亜鉛（Ｚｎ）が１日目に様々な濃度で添加された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよび亜鉛を補充された。４，５および７週目に細胞は計数され、ＣＦＵｃについてアッセイされた。
図４２は末梢血由来のＣＤ３４細胞培養物に対するＴＥＰＡの効果を示す。末梢血由来のＣＤ３４細胞は図２９ａ−ｃの説明で詳述したように培養された。培養物はＴＥＰＡを補充されるかまたは補充されなかった。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地およびＴＥＰＡを補充された。１および４週目に細胞はＣＦＵｃについてアッセイされた。＊はコロニーが発達しなかったことを示す。
図４３ａ−ｂはＣＤ３４＋細胞培養物に対する銅キレート化ペプチドの効果を示す。培養は精製された１０４個の臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞をＳＣＦ，ＦＬＴ３およびＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）および銅キレート化ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（ＧＧＨ）またはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（ＧＨＬ）（それぞれ１０μＭ）、または後期活動サイトカイン顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で液体培地中で培養することによって開始された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびペプチドを補充された。７週目に細胞は計数され（図４３ａ）、培養物中のコロニー形成細胞（ＣＦＵｃ、図４３ｂ）についてアッセイされた。
図４４は本発明に従うアッセイで使用された遷移金属キレート化剤の化学構造を示す。これらのキレート化剤は細胞分化を拘束または誘導するためのいかなるキレート化剤の潜在能力を測定するために使用されることができる。
図４５ａ−ｆは５週間ＴＥＰＡありで（図４５ａ−ｄ）またはＴＥＰＡなしで（図４５ｅ−ｆ）ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された肝細胞培養物の写真を示す。
図４６は造血幹細胞分化に対するＰＩ３−キナーゼの阻害の効果を示す。グラフはＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４先祖細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて２週目のコントロールおよびＬＹ２９４００２処理された培養物から再精製された初期ＣＤ３４＋細胞サブセットの代表的なＦＡＣＳ分析ドットプロットを示す。精製された細胞は記述されたようにＰＥおよびＦＩＴＣ標識された抗体を用いてマーカーＣＤ３４／ＣＤ３８およびＣＤ３４／Ｌｉｎ（ＣＤ３８，ＣＤ３３，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ３，ＣＤ６１，ＣＤ１９）について染色された。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の割合はプロットの左上に示されている。
図４７Ａおよび図４７Ｂは培養物中の造血幹細胞形態に対するＰＩ３−キナーゼの阻害の効果を示す。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤（５μＭ／Ｌ）の不在下（コントロール、サイトカイン、図４７Ｂ）および存在下（ＬＹ２９４００２、図４７Ａ）での３週目の培養物中の細胞の形態が示される。サイトスピン調製されたスライドはＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａで染色された。コントロール培養物におけるラメリポディアのマクロファージ状の外観および多数の封入（図４７Ｂ）と比較した、ＬＹ２９４００２処理された培養物における幹細胞に典型的な丸い外観および顆粒の欠失（図４７Ａ）に注意されたい。スケールバーは５００μｍに等しい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９６】
本発明は、幹細胞集団を拡大させると同時にｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞分化を実質的に阻害する方法である。１つの実施形態では、本発明は、分化が阻害される一方で細胞拡大が増大する、再生可能な幹細胞の拡大された巨大集団を含む治療用のｅｘ  ｖｉｖｏ培養細胞調製物としての有効利用を促す。詳細には、これに関して、本発明を使用して、造血細胞の移植および遺伝子操作に適切な幹細胞の作製での適用に使用することができる幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大集団を得ることができる。これは、細胞遺伝子治療に使用することができる。さらなる適用には、養子免疫治療、複数の疾患（例えば、β−異常血色素症など）の治療、ｉｎ  ｖｉｖｏでのシス分化およびトランス分化環境への幹細胞の移植、およびシス分化およびトランス分化環境へのｅｘ  ｖｉｖｏでの組織操作が含まれ得るが、これらに限定されない。本発明は、さらに、拡大させられた幹細胞調製物およびこれを調製するための製品に関する。
【００９７】
本発明は、ＰＩ３−キナーゼ発現および／または活性を妨害し、それにより幹細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大を誘導する種々の分子（本明細書中では薬剤および／または調節剤ともいう）の使用を開示する。これにより、例えば、造血幹細胞に適用した場合には、多数の未分化のＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−（ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４など）細胞、さらにはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞（特にＣＤ３４＋ｄｉｍ／Ｌｉｎ−細胞）が得られる。この新規の用途の広い技術は、幹細胞の大きな集団を必要とするｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでのあらゆる適用のための、その自己再生能力を維持している造血系に起源するおよび他の起源の幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大に使用することができる。
【００９８】
本発明の実施に至るまでに、ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を妨害することができる一連の分子が、ｅｘ  ｖｉｖｏで、幹細胞の分化プロセスを抑制し、活発な細胞の増殖および拡大期を刺激し、これを延長することを予想外に見出した。ＣＤ３８発現の阻害剤を用いた同様の研究では、拡大の約１６〜１８週間後、細胞は分化し始める；すなわち、これらの分子の効果は可逆的であることが見出されている。言い換えれば、本明細書に記載するようなｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞の処理によっては、細胞の細胞株への転換は生じない。
【００９９】
この予想外の効果は、驚いたことに、細胞の供給源がＣＤ３４＋富化造血細胞（幹細胞および初期先祖細胞）である場合に、最も驚いたことには、単核の血球の全画分（幹細胞、先祖細胞およびある系統への分化増殖能力を獲得した細胞を含む白血球の全画分）を含む細胞の供給源を使用した場合にも得られた。背景技術のセクションで記載したように、現在のところ、富化させていない幹細胞を拡大させるための技術は開示されていない。
【０１００】
さらに、ＣＤ３８発現を阻害する薬剤と共にインキュベートした初代肝細胞培養物で、α−フェトプロテインを産生し、それにより初期肝細胞集団の増殖が誘導される細胞集団の増加が明らかとなった。サイトカインを用いずに増殖させたアンタゴニストで処理（処置）した肝細胞培養物は培養物中で少なくとも３週間維持された。このことは、特にサイトカインが存在しない場合には長期間にわたって培養物中で初代肝細胞を増殖させることがほとんど不可能であることを示した以前のデータとは全く対照的であった（Ｗｉｃｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＡＬＴＥＸ．１９９７；（１４（２）：５１〜５６；Ｈｉｎｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９  Ｍａｒ  ５；２５６（１）：１８４〜９１；ａｎｄ  Ｔａｔｅｎｏ  Ｃ，ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ  Ｋ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９６；１４８（２）：３８３〜９２）。成長因子のみの補充では肝細胞の増殖を刺激するには不十分であり、肝細胞培養物のＣＤ３８阻害剤のみでの処理では初期肝細胞集団が増殖し、その培養を継続すると、その後の第１回目および第２回目の継代でさらに顕著になる。
【０１０１】
以下にさらに詳述し、以下の実施例の節で例示するように、本発明の状況で好適な分子のこの新規に発見された効果を、種々の型の細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大の最大化に使用した。
【０１０２】
本発明の原理および操作は、図面および以下の説明および実施例を参照してより深く理解することができる。
【０１０３】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に記載されているか実施例に例示されている構成の詳細および構成要素の並べ方へのその適用に制限されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態または種々の方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で使用した表現および専門用語は説明を目的とし、制限とみなすべきではないと理解すべきである。
【０１０４】
ＣＤ３８は、サイトゾルおよびその基質がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）である膜結合酵素のエマージングファミリーのメンバーである。ＣＤ３８によって産生される２つの代謝産物であるｃＡＤＰＲおよびＮＡＡＤＰは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物の組織から単離された細胞中で細胞内カルシウムの放出を誘導することが示されており、これらの代謝産物がカルシウム応答の広範な調節因子であることが示唆されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０；７８５〜７９３）。
【０１０５】
最近、ヒト腫瘍細胞株ＨＬ−６０細胞の顆粒球への分化をレチノイン酸によって誘導することができ、これには大量のＣＤ３８発現が伴うことが報告された。ＣＤ３８発現と同時にｃＡＤＰＲが蓄積し、いずれの経時変化も分化が生じるより前に起こり、ＣＤ３８の原因としての役割が示唆されている。これと一致して、ＣＤ３８の恒久的インヒビター（ニコチンアミド）でのＨＬ−６０細胞の処理により、ＣＤ３８の酵素活性と分化の両方が阻害された。そのｍＲＮＡをターゲティングするモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によりＣＤ３８発現はさらに特異的に遮断された。このモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用はさらに、これに対応する分化も阻害した（Ｍｕｎｓｈｉ  ＣＢ，Ｇｒａｅｆｆ  Ｒ，Ｌｅｅ  ＨＣ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２  Ｄｅｃ  ２０；２７７（５１）：４９４５３−８）。
【０１０６】
他の研究では、先祖細胞の分化に対するＣＤ３８シグナル伝達の反対の作用が示された。短期間のｃＡＤＰＲでのヒト先祖細胞の処理により、コロニーサイズおよびコロニー量の顕著な増加が媒介された。これは、ＣＤ３８シグナル伝達とｅｘ  ｖｉｖｏでの幹細胞の拡大との間の直接的な相関関係を意味している（Ｐｏｄｅｓｔａ（２０００）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１４：６８０−６９０）。同グループによって報告されたより最近の研究では、放射線を照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの造血幹細胞の移植に対するｃＡＤＰＲの作用が研究された（Ｐｏｄｅｓｔａ（２００２）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．Ｄｅｃ  ３  ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）。この研究では、ヒト造血先祖細胞に対するｃＡＤＰＲの２つの作用（本質的に、短期移植の改良のためのある系統への分化増殖能力を獲得した先祖細胞の増殖の強化と、二次レシピエント中に長期間ヒト組織を植えつけた状態でのヒト幹細胞の拡大）がｉｎ  ｖｉｖｏで証明された。したがって、これらの結果は、ヒト幹細胞の長期拡大を達成するためのｃＡＤＰＲの使用を示唆する。
【０１０７】
したがって、先行技術の研究はヒト幹細胞について行われており、今までのところ、ヒト幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大のためのｃＡＤＰＲ（ＣＤ３８触媒に起因する産物）の使用が教示されている。
【０１０８】
最近、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌはＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２が単球の分化を阻害すること、および用量依存的な様式でＰＭＡで誘導されたＨＬ−６０細胞にアポトーシスを誘導することを示した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．２００２  Ｍａｙ；２４：２１１−２６）。同様に、Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌは初期胚性ＡＭＬ細胞におけるＰＩ３−キナーゼ活性の阻害がＩＬ−１で誘導された細胞増殖の阻害を生ずることを示した（Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ，ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０００；２８：１２３９−４９）。しかし、Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌはＰＩ３−キナーゼ阻害剤で処理されたヒトＢ細胞先祖はＣＤ３８−ライゲーション誘導される増殖阻害の逆転を示すことを報告しており、（Ｋｉｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７；１５９：１８４−９２）、ＣＤ３８に関連する幹細胞および先祖細胞の増殖および発達におけるＰＩ３−キナーゼシグナル伝達の役割がまだ不明確であることを示している。実際、Ｐｔａｓｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ（米国特許第６４１３７７３号、ここに参考文献として組入れる）は幹細胞集団の分化を誘導するためのＰＩ３−キナーゼ阻害剤の使用を開示している。未分化のヒト胎児細胞を用いて、Ｐｔａｓｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌはＬＹ２９４００２でＰＩ３−キナーゼ活性を阻害することによって、インシュリン、グルカゴンおよびソマトスタチンのｍＲＮＡレベルの増大と関連する形態学的および機能的ホルモン分化、並びにインシュリンタンパク質含有量および分泌促進薬に対する分泌応答の増大を誘導した。ＰＩ３−キナーゼのダウンレギュレート調節も多数のホルモンを共発現する多能性前駆細胞の割合およびこれらの前駆細胞から由来する末端分化された細胞の全数を増大させた。
【０１０９】
先行技術とは明らかに対照的に、本発明の実施に至るまでに、本発明者らは、驚いたことに、ＰＩ３−キナーゼの活性または発現の阻害によりヒト幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大が生じると同時に細胞分化が制限されることを発見した。
【０１１０】
明らかに、上記の先行技術は、本発明と異なる教示をしている。
【０１１１】
ＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＶＤＲなどのレチノイド受容体ならびにそのアゴニスト（ビタミンＡおよびその活性な代謝産物ならびにビタミンＤおよびその活性な代謝産物など）は、細胞の増殖および分化に関連する遺伝子発現経路の調節に関与している。
【０１１２】
ビタミンＤは、骨髄単球の分化誘導因子であることが示されており、ＲＸＲ−ＶＤＲレチノイド受容体のヘテロ二量体形成の誘導によってそのシグナルを伝達し（２８）、一方ＲＡＲ−ＲＸＲまたはＲＸＲ−ＲＸＲヘテロ二量体はレチノイドが誘導する顆粒球の分化に不可欠である。
【０１１３】
レチノイドは多数の組織における正常な分化の維持に不可欠であることが示された。
【０１１４】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）活性の破壊は、ヒト急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の特徴であり、顆粒球分化の遮断に関連している。このことは、ＲＡＲが正常な骨髄分化の重要な調節因子であることを示している。
【０１１５】
上記証拠は骨髄造血の調節におけるＲＡＲの重要な役割を明確に示すが、いくつかの重要な問題が未解決なままである。ＲＡＲ活性がリガンド濃度に依存する場合に、ＲＡＲ活性が、おそらくは血液および骨髄中に存在する均一な「生理学的」濃度のレチノイドに曝露された細胞の骨髄分化を調節する機構は、何であろうか？臨床的観点から最も重要なことは、なぜ急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）のみがレチノイドに劇的な応答を示し、一方で、他の急性骨髄性白血病は正常なＲＡＲを発現するにもかかわらず、他の９０％の急性骨髄性白血病はレチノイドに対して応答を示さないのか？である（４０）。
【０１１６】
正常な非白血病性造血幹細胞に対するレチノイドおよびレチノイド受容体の生物学的効果はＰｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって報告されている（４１）。
【０１１７】
Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）は、薬理学的レベル（１μｍｏｌ）のオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）によりＬｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋マウス造血前駆体の液体懸濁培養物中でコロニー形成細胞（ＣＦＣ）およびコロニー形成単位−脾臓（ＣＦＵ−Ｓ）の生成が増加することを明らかにした。Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）は、さらに、移植可能な細胞（ｐｒｅ−ＣＦＵ−Ｓ、短期再生幹細胞（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＳＴＲＣ）、および長期再生幹細胞（ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ：ＬＴＲＣ）を含む）の生成に対する、ＡＴＲＡの、ならびにＲＡＲアンタゴニストであるＡＧＮ１９３１０９の作用を調査した。Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）は、ＡＴＲＡにより液体懸濁液中で１４日間培養したＬｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞由来の競合する再生ＳＴＲＣおよびＬＴＲＣのｅｘ  ｖｉｖｏでの維持および産生が増大することを明らかにした。さらに、ＡＴＲＡにより１４日の培養の間、これらの原始幹細胞のより成熟したｐｒｅ−ＣＦＵ−Ｓへの分化が妨げられた。非常に対照的に、ＡＧＮ１９３１０９（ＲＡＲアンタゴニスト）と共に７日間培養したＬｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋細胞は、事実上短くない、すなわち長期の再生能力を示したが、約６倍増のｐｒｅ−ＣＦＵ−Ｓ集団を示した。これらの研究からＰｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）は、ＲＡＲに対するアゴニスト、すなわち、レチノイン酸は、短期および長期再生幹細胞の維持および自己再生を増大させるということを結論付けた。対照的に、ＲＡＲアンタゴニストであるＡＧＮ１９３１０９は再構築能力を消滅させ、これは原始幹細胞の分化の促進による可能性が最も高い。Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）は、これらの結果が、造血幹細胞分化の調節におけるレチノイドの重要且つ予想外の役割を意味すると主張している（４１）。
【０１１８】
レチノイドは、精製されたＣＤ３４＋細胞のサイトカインで刺激した培養物においては顆粒球先祖細胞の増殖および分化を促進する一方で（４２）、幹細胞レベルでは、反対の効果を示す。
【０１１９】
非造血組織ではあるが、Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）に基づいて、Ｋａｍｅｉもまた、レチノイド（特に、オールトランス型レチノイン酸）が前脂肪細胞の分化を阻害することを明らかにした（４３）。
【０１２０】
したがって、造血系では、核レチノイド受容体は、ある系統への分化増殖能力を獲得した細胞の下流分化を制御および促進する経路に強く関与していた。分化の骨髄芽細胞または前骨髄細胞段階で遮断されるある系統への分化増殖能力を獲得した細胞であるいくつかの白血病細胞株モデル（ＨＬ−６０、ＮＨ４、および３２Ｄなど）について詳述したように、特異的アンタゴニスト、アンチセンスまたは短型受容体での形質導入によるこれらの受容体の不活化は、顆粒球および単球の分化の誘導の阻害に関与する。
【０１２１】
正常な細胞とは対照的に、白血病では、細胞の増殖および分化を制御する調節経路の間が破壊される。これらの経路は、正常な細胞においては厳密に連携している。これら２つのプロセス（増殖および分化への方向付け）が連携していない唯一の例外は、幹細胞の自己再生増殖経路である。したがって、上記の全研究は、幹細胞レベルでのレチノイド受容体の役割については何ら教示していない（１９，２２，６４）。
【０１２２】
本発明の実施により、限られた短期間の間にｅｘ  ｖｉｖｏ造血培養物または肝細胞培養物に添加された場合に、レチノイン酸アンタゴニストは、自己再生可能な幹細胞の拡大を長期化することができることが明らかになった。
【０１２３】
アンタゴニストは、短期間の培養においては、細胞全体およびＣＤ３４＋細胞拡大に対して有意なポジティブまたはネガティブな作用のいずれも示さなかった。さらに、ＣＤ３４＋抗原は、ある系統への分化増殖能力を獲得した細胞ならびに多能性幹細胞上で発現する。全ＣＤ３４＋細胞集団のごく一部の割合（ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞）のみが、幹細胞および初期先祖細胞の区分に属する。
【０１２４】
２週間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養物中でのこれら２つの稀な小集団の含有率の分析により、ＲＡＲアンタゴニストを補充した培養物は、初期活動性サイトカインであるトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）のみで処理した培養物と比較してＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞の比率が高いことが明らかとなった。アンタゴニストは、ＣＤ３８抗原の発現を完全に消滅させた。種々の他の系統特異的（Ｌｉｎ）抗原も阻害した。アンタゴニストの効果は特異的であり、自己再生および分化の決定への方向付けのチェックポイントに存在する重要な調節遺伝子を明らかにターゲティングしている。これらの結論は、本明細書中の実施例の節に記載する結果から導いた。実施例では、ＲＡＲアンタゴニストは分化関連抗原の発現のみをダウンレギュレートするが、ＣＤ３４抗原などの幹細胞表現型に関連する抗原ではダウンレギュレートが起こらないことを示している。ＣＤ３４＋細胞の比率および絶対数は、短期間の培養においてはアンタゴニストによっては影響を受けなかった。
【０１２５】
自己再生および分化への方向付けの調節事象に対するアンタゴニストの特異的作用は、初代肝細胞培養物と継代肝細胞培養物を用いて本明細書中で行った実験によってさらに支持される。アンタゴニストと共にインキュベートした初代培養物により、α−フェトプロテイン産生細胞の比率および組織学的に明らかな楕円形細胞数（初期肝細胞集団の増殖に関連する事象）の増加が明らかとなった。これらの初期肝細胞集団は、サイトカインを補充しなくとも、少なくとも３週間の培養で持続した（最も前例のない所見）。さらに、培養物への成長因子の補充では初期肝細胞集団の増殖に対する作用はなかったが、ＲＡＲアンタゴニストでの処理により第１回目の継代後にもなおこの集団を拡大させることができ、これは第２回目の継代後において有意に肝細胞集団を拡大させた。このことは、細胞の自己再生能力におけるアンタゴニストの役割をさらに示している。
【０１２６】
短期間の培養に対するその作用に加えて、本発明の実施により、アンタゴニスト分子での短期間の処理により、幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞およびＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞）の長期間のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大および自己再生も可能であることが明らかにされた。興味深いことに、幹細胞のＦＡＣＳ分析および機能的ＬＴＣ−ＣＦＵによって示すように、アンタゴニストへの限定的な曝露は長期および延長された長期の培養物の有意且つ顕著な延長を生じるに十分であった。長期および延長した長期培養の間、ＣＦＵおよびＣＦＵ−混合物の含有量は、サイトカインのみで処理した培養物におけるＣＦＵの含有量と比較して顕著に増加し、実際は、長期間の培養の間に減少する。実際、多数のコントロール培養物は長期および延長した長期培養においてＣＦＵ能力を全く維持できなかった。延長した長期培養期間でＣＦＵ−混合物の劇的且つ継続的な増加を示した、アンタゴニストで３週間処理した培養物とは対照的に、サイトカインのみで処理した培養物は、全培養期間で混合物コロニーを拡大できないだけでなく維持さえもできなかった。表現型特徴づけから明らかなように、幹細胞の拡大は、機能的ＬＴＣ−ＣＦＵアッセイによって測定した長期自己再生能に完全に一致する。いずれのアッセイも、アンタゴニスト分子でパルスした培養物中での自己再生幹細胞の優れた長期拡大を示している。
【０１２７】
ＲＡＲアンタゴニストによりある系統への分化増殖能力を獲得した前骨髄細胞（ＨＬ−６０細胞）のＲＡ誘導顆粒球分化が阻害されることが示された（２５）。短型ＲＡＲの遺伝子トランスフェクションによりマウス由来骨髄性白血病細胞株（３２Ｄ）のＧ−ＣＳＦに対する応答が阻害されることも示された（２２）。しかし、これらの研究は白血病系統への分化増殖能力を獲得した細胞株を用いて行われており、特に、ＲＡまたはＧ−ＣＳＦによって誘導された顆粒球分化の阻害のみを示している。したがって、上記研究から幹細胞レベルでの調節を結論付けることはできない。
【０１２８】
その技術について上記に記載したＰｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）とは対照的に、レチノイド受容体に対するアンタゴニスト分子およびヒト幹細胞培養物およびＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、レチノイド受容体が幹細胞自己再生の調節に関与していることが本明細書中で明らかにされる。限られた短期間の間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養培地へのこれらの分子の添加により、長期間その表現型を変化させずに幹細胞を継続的に増殖させることができることが本明細書中でさらに明らかにされた。さらに、レチノイン酸受容体アンタゴニストのこれらの作用は、いかなる細胞形質転換にも関与せず、いかなる細胞株も形成しない。
【０１２９】
短型のドミナントネガティブＲＡＲでの形質導入によって偶然に得られる細胞株とは対照的に（２２−２３）、最初の２〜３週間のみまたは培養期間全体にわたって継続的にアンタゴニストを補充するかしないかのいずれにしても、全ての培養細胞は正常な骨髄性細胞、赤血球、およびリンパ球への分化を受け、培養開始から１６〜１８週間後には細胞増殖能力を完全に喪失することを本明細書中に示す。
【０１３０】
遺伝子発現および細胞機能（形質導入遺伝子が遮断されない場合）の不定変化を誘導する形質導入手順によって得られた遺伝子改変とは対照的に、ＲＡＲアンタゴニストでの継続的処理によりＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−表現型が不定に拡大または維持されなかった。したがって、ドミナントネガティブ受容体活性の機構は、ＲＡＲアンタゴニスト分子の機構と非常に異なる。異なる作用様式のさらなる裏づけとなるデータは、ドミナントネガティブＲＡＲで形質導入した細胞は分化誘導因子の存在下でさえも未熟なままであることを示している実験から得られる（２２）。これは、ＲＡＲアンタゴニストで処理した正常な非白血病性細胞を用いた場合とは明確に異なっている。
【０１３１】
正常なマウス由来の骨髄（ＢＭ）細胞を用いて開始し、その後の短型ＲＡＲ受容体での形質導入により、Ｃｏｌｌｉｎｓ（２３）は、偶然にマウス幹細胞株を得た。しかし、同一のマウス由来細胞およびＲＡＲアンタゴニストを使用して、Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）は、ＲＡＲアンタゴニストが幹細胞分化を促進する一方で、レチノイン酸は幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大を補助することを明らかにした（４１）。Ｐｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（４１）およびＣｏｌｌｉｎｓ（２３）によって得られたこれらのデータは、本明細書中で考察するように、２つの異なる関連のない機構の存在を支持する。
【０１３２】
造血組織に対するレチノイド受容体の作用に加えて、レチノイド受容体ファミリーに属する受容体は正常な胚形成および成体組織発達を制御する分化経路に関与していることが明らかにされた。
【０１３３】
ビタミンＡが不足している動物およびレチノイン酸受容体遺伝子「ノックアウト」マウスで多数の胚奇形が生じる。このことは、レチノイン酸（ビタミンＡの活性代謝産物）が正常な発達におけるいくつかの不可欠な機能を果たすことを示している。レチノイドはまた、皮膚の形態に影響を与えることが以前より知られている。妊娠後期（受胎１４日後（ｄｐｃ））にＲＡＲに対するアンタゴニストが投与された場合、これらはマウスの胚の皮膚および毛包の分化および成熟を遅延させる（６５）。
【０１３４】
ＲＸＲ−αの除去により、皮膚の炎症反応を伴うケラチノサイト過剰増殖および異常な末端分化が起こる表皮性毛包内過形成を発症する。ＲＸＲ−α／ＶＤＲヘテロ二量体は、毛周期調節で主要な役割を果たすことがさらに示されており、他の核受容体とヘテロ二量体形成したＲＸＲ−αによって媒介されるさらなるシグナル伝達経路が、出生後の毛包の成長に関与していることが示唆されている（６６）。
【０１３５】
上記データをまとめると、幹細胞レベルで、レチノイド受容体ファミリーに属する受容体を介した正および負のシグナルが正常な造血幹細胞および非造血幹細胞の自己再生と分化への方向付けとの間の生理学的均衡を制御すると結論付けられる。
【０１３６】
細胞分化の新規のｅｘ  ｖｉｖｏダウンレギュレーション方法により、胚および成体の造血および非造血幹細胞を大きく拡大させることができ、これを造血細胞の移植、遺伝子治療、細胞置換療法、または幹細胞数の増加を必要とする任意の他の適用に使用することができる。
【０１３７】
幹細胞を大きく拡大させるための小分子の使用は、実行可能で経済的且つ安全な方法である。
【０１３８】
それ故、本研究の過程で、レチノイン酸、レチノイドＸおよび／またはビタミンＤ受容体に結合する一連の化学物質が適切な受容体シグナル伝達を妨害することが見出された。この妨害は、幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの分化プロセスを可逆的に阻害し（遅延させる）、それにより活発なｅｘ  ｖｉｖｏ幹細胞拡大を刺激および延長させることができる。
【０１３９】
上述の核受容体によって強要される下流シグナル伝達は、適切な受容体シグナル伝達のための必須要素であるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）の阻害によって阻止されることができる。
【０１４０】
上述の背景技術の欄で述べたように、ＰＩ３−キナーゼは細胞核に位置しており，ＨＬ−６０およびＴＨＰという骨髄白血病細胞で示されるように白血病細胞分化のＲＡおよびビタミンＤ誘導に必須である。オールトランスレチノイン酸によるＨＬ−６０細胞の顆粒球への分化誘導後、ＰＩ３−キナーゼの量の増大が特に核レベルで観察された。ＶＤＲの如き核受容体の活性化におけるＰＩ３−キナーゼの重要な機能は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）での処理により示された。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（Ｄ３）はＰＩ３−キナーゼ活性の迅速かつ一過的な増大並びに骨髄細胞の成熟および細胞分化のマーカーであるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの表面発現に関連していた。
【０１４１】
上述の背景技術の欄でさらに述べたように、Ｄ３に対する応答におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ発現の誘導並びにＨＬ−６０細胞分化のＲＡ誘導およびＣＤ３８＋タンパク質発現のアップレギュレーションは（ａ）ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２およびウォルトマンニンによって；（ｂ）ＰＩ３−キナーゼのｐ１１０触媒サブユニットのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって；（ｃ）ＰＩ３−キナーゼのドミナントネガティブ突然変異体によって；および（ｄ）ｐ８５αのアンチセンス断片のトランスフェクションによって阻止された。ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害は白血病細胞の分化過程を阻害し、このことはＰＩ３−キナーゼ活性が顆粒球分化の促進に必須の役割を果たしているということを示す。
【０１４２】
同様に、および上述の背景技術の欄でさらに述べたように、ＬＹ２９４００２およびウォルトマンニンというＰＩ３−キナーゼ阻害剤は末梢血単球におけるＣＤ１４およびＣＤ１１ｂの両方のＤ３で誘導される発現を阻害した。ＶＤＲの免疫沈殿物について実行されたウェスタンブロットおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、Ｄ３処理がＰＩ３−キナーゼおよびＶＤＲの両方を含む複合体の形成をもたらしたことを示した。
【０１４３】
同様に、および上述の背景技術の欄でさらに述べたように、いくつかの分化誘導剤はＰＩ３−キナーゼを活性化し、ＰＩ３Ｋ／ｐ７０Ｓ６Ｋ経路の阻害はこれらの細胞系における分化過程を阻害する（Ｍａｒｃｉｋｏｗｓｋａ，Ｅ  Ｐｏｓｔｅｐｙ  Ｈｉｇ  Ｍｅｄ  Ｄｏｓｗ  １９９９；５３（２）：３０５−１３）。
【０１４４】
これらの発見は単球分化を制御するホルモン作用の新規な非ゲノム性メカニズムを明らかにし、そこではビタミンＤ３がＶＤＲおよびＰＩ３−キナーゼ依存性シグナル伝達経路を活性化する。
【０１４５】
上述のデータからすると、ＲＡおよびビタミンＤはそれぞれ核受容体であるＲＡＲおよびＲＸＲ、並びにＲＸＲおよびＶＤＲの二量体化の誘導を介して細胞分化を増大させ、それは活性化の後、追加のタンパク質であるＰＩ３−キナーゼを補充するということが仮定されることができる。核ヘテロ二量体による下流のシグナル伝達はＰＩ３−キナーゼに依存しているように見える。活性型ＰＩ３−キナーゼの存在下でのみ、これらの受容体は遺伝子発現をさらに制御し、その結果、細胞分化を誘導して加速させる。部位特異的なＰＩ３−キナーゼ阻害剤によるＰＩ３−キナーゼ酵素活性の阻害はＣＤ３８発現をダウンレギュレートし、並びにＲＡまたはビタミンＤによって誘導される白血病細胞の分化を阻止した。
【０１４６】
白血球細胞の分化の遅い段階のＲＡおよびビタミンＤ誘導体を特異的に阻害し並びにＣＤ３８発現をダウンレギュレートする化合物、即ちＲＡＲ，ＲＸＲおよびＶＤＲアンタゴニストは正常な幹／初期先祖細胞分化のサイトカイン誘導を阻害することもここで示される。それ故、部位特異的阻害剤によるＰＩ３−キナーゼ活性および／または発現の阻害はＲＡＲアンダゴニストおよび／またはニコチンアミドと同様にまたはこれらの化合物より良好にＣＤ３４＋細胞の分化を阻害するということが予想される。
【０１４７】
上述の背景技術の欄でさらに述べたように、銅イオンはＰＩ３−キナーゼを強く活性化する。その結果、高い細胞銅濃度では、ＰＩ３−キナーゼは極めて活性となり、一方低い細胞銅濃度ではＰＩ３−キナーゼはその活性を少なくとも部分的に失うであろう。実際、銅キレート化剤による細胞内の銅の調節は細胞分化の速度を加速または減速させたということがここで示されている。
【０１４８】
従って、銅はＣＤ３８遺伝子発現および細胞分化のアップレギュレーションの必須要因であるＰＩ３−キナーゼの活性化（高い細胞内銅含有量で）または不活性化（低い細胞内銅含有量で）させることを介して細胞増殖および分化を調節する。
【０１４９】
（テトラエチレンペンタアミン−ＴＥＰＡの如き銅キレート化剤を培養培地に補充することによって負わされる）低い銅含有量では、ＰＩ３−キナーゼは活性が少なく、細胞分化の遅延を生ずる。一方、高い細胞銅含有量ではＰＩ３−キナーゼは強く活性化され、細胞分化の加速を生ずる。
【０１５０】
これらのことを総合すると、ＲＡＲアンタゴニスト（ＣＤ３８遺伝子発現を中止させる）、ニコチンアミド（その生物学的酵素活性を阻止する）の如き部位特異的試薬、並びにレチノイド受容体を介した効果の低いシグナルを生ずる細胞内銅含有量の減少によるＰＩ３−キナーゼの酵素活性の減少はすべて、ＣＤ３４＋細胞分化を強く阻害したことが示される。
【０１５１】
ＣＤ３８の阻害剤は様々な細胞濃度で活性であるが、幹細胞分化の極めて強い阻害剤である。ＰＩ３−キナーゼ特異的阻害剤であるＲＡＲアンタゴニストによる転写レベルでのＣＤ３８の阻害、銅キレート化剤によるＰＩ３−キナーゼの不活性化、並びにＣＤ３８酵素活性の阻害（ＡＤＰリボシルシクラーゼ）はＣＤ３４＋細胞分化の阻害および初期先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大の増大を生じた。
【０１５２】
ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路を介したＣＤ３８の制御は自己再生の方向または分化の方向における幹細胞決定の重要な事象であると仮定される。様々な細胞内標的に対して活性な様々な試薬を組合せた実験は、付加的な効果や相乗的な効果を示さなかった。これらの結果は幹細胞の自己再生の制御における偶然の事象としてのＣＤ３８タンパク質のＰＩ３−キナーゼで媒介される制御およびその生物学的機能を支持する。
【０１５３】
単一の仮説に制限されることは望まないが、ＰＩ３−キナーゼ活性は幹細胞における分化と増殖のシグナル伝達の重要な交点にあること、およびここで述べられた幹細胞分化に対するＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路のダウンレギュレーションの新規な効果はＰＩ３−キナーゼ活性の減少によるサイトカイン、受容体アゴニスト等の如き複数の幹細胞効果的要因の効果の調節の結果であることが理解されるであろう。
【０１５４】
この新たに発見されたＰＩ３−キナーゼシグナル伝達を介したＣＤ３８の生物学的活性並びにレチノイド受容体シグナル伝達の調節の効果は、造血細胞、肝細胞、および胚性幹細胞を含む種々の細胞型のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大の最大化に使用することができる。このようなｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた細胞を、いくつかの臨床状況で適用することができる。以下にいくつかを列挙する。
【０１５５】
造血細胞の移植：造血細胞の移植は、種々の遺伝病または悪性疾患に最適な治療となりつつある。初期の移植手順は骨髄（ＢＭ）集団全体を使用していたが、最近では、幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）を富化させたより顕著な特性を有する集団が使用されている（４４）。骨髄に加えて、このような細胞は、末梢血（ＰＢ）および新生児臍帯血（ＣＢ）などの他の供給源から得ることもできる（４５）。ＢＭと比較して、ＰＢ細胞の移植により、汎血球減少の期間が短くなり、感染および出血のリスクが低くなる（４６−４８）。
【０１５６】
移植にＰＢを使用するさらなる利点は、その利用しやすさである。ＰＢの移植を制限する要因は、循環している多能性幹細胞／先祖細胞数が少ないことである。
【０１５７】
移植に十分なＰＢ由来の幹細胞を得るためには、これらの細胞を、化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環へのその動員後に、ロイコフォレシスを繰り返すことによって「採取」する（４６−４７）。このような処置は、正常なドナーには明らかに適切ではない。
【０１５８】
移植へのｅｘ  ｖｉｖｏで拡大した幹細胞の使用は以下の利点を有している（４９−５０）。
【０１５９】
成体造血系の再構成に必要な血液量を減少させ、動員およびロイコフォレシスの必要性を回避することができる（４６）。
【０１６０】
将来使用する可能性のために少数のＰＢまたはＣＢ幹細胞を保存することができる。
【０１６１】
悪性疾患のレシピエントの自己移植の場合には、自己輸液への腫瘍細胞の混入が、多くの場合、疾患の再発の一因となる（４６）。ＣＤ３４＋幹細胞を選択し拡大させることにより、最終的な移植片中の腫瘍細胞の負荷量が減少する。
【０１６２】
培養によりＴリンパ球が有意に減少し、これは移植片対宿主病の軽減のための同種異系移植の状況に有用であり得る。
【０１６３】
臨床試験は、少数のＰＢ ＣＤ３４＋細胞に由来するｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた細胞の移植により、高用量の化学療法で処置したレシピエントの造血を回復させることができることが示されるにもかかわらず、結果は依然としてこれらの培養細胞の長期間にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ造血能力について結論を得ていない（４６−４７）。
【０１６４】
移植の成功のためには、血球減少期間の短縮ならびに長期間の植え付けが重大である。移植片に中期および後期先祖細胞を含めることにより、ドナー由来の成熟細胞の産生が促進され、それにより血球減少期間を短縮することができる。したがって、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた細胞には、幹細胞に加えて、短期間での回復および造血の長期間にわたる修復を最適にするためのより分化した先祖細胞が含まれることが重要である。幹細胞の拡大を同時に生じる、中期および後期先祖細胞（特に、好中球および巨核球系統に方向付けられたもの）の拡大はこの目的に役立つはずである（５１）。
【０１６５】
このような培養物は、骨髄が完全に取り除かれたレシピエントの造血の回復、さらには従来の放射線治療および化学療法後のレシピエントの骨髄回復を早めるための支援手段の獲得に有用であり得る。
【０１６６】
稀な細胞における遺伝的欠損の出生前診断：出生前診断は、妊婦由来の子宮内の胚細胞の採取および遺伝的欠損の分析を含む。好ましい非侵襲性の胚細胞採取手段としては、末梢母体循環系に浸潤した胚性有核赤血球前駆体の分離が挙げられる。しかし、これらの細胞の量は非常に少ないので、さらに本発明を適用して、分析の前に、本明細書中に記載の方法によりこのような細胞を拡大させる。したがって、本発明は、出生前診断に適用するための胚細胞の拡大手段を提供する。
【０１６７】
遺伝子治療：長期間にわたる遺伝子治療の成功のためには、そのゲノム内に安定に組み込まれた導入遺伝子で遺伝子が改変された幹細胞が高頻度で存在することが絶対に必要である。ＢＭ組織では、大部分の細胞は、循環している先祖細胞および前駆細胞であり、幹細胞は細胞集団の小さい割合を構成するにすぎず、そのほとんどが休止した循環していない状態にある。ウイルスベースの（例えば、レトロウイルス）ベクターは、宿主ゲノム中に導入遺伝子を組み込むために活発な細胞分裂を必要とする。したがって、新鮮なＢＭ幹細胞への遺伝子導入はあまり効果がない。精製された幹細胞集団を拡大させ、その細胞分裂をｅｘ  ｖｉｖｏで調節する能力により、その遺伝子を改変する可能性が増大する（５２）。
【０１６８】
養子免疫療法：ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させ、顕著な特性を有するリンパ系小集団が研究されており、種々の悪性疾患、免疫不全疾患、ウイルス性疾患、および遺伝性疾患の養子免疫療法に使用されてきた（５３−５５）。
【０１６９】
この処置により、必要な免疫応答が増強されるか、または欠損機能が置き換えられる。このアプローチは、非常に多数の自己のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させられた非特異的キラーＴ細胞を、続いて、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させられた特異的腫瘍浸潤性リンパ球を使用して、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（５６）によって最初に行われた。
【０１７０】
同様に、機能的に活性な抗原提示細胞を、サイトカインを維持させた培養物中のＣＤ３４＋ＰＢ細胞の出発集団から成長させることができた。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、自己Ｔ細胞に対する可溶性タンパク質抗原を提示することができるので、高用量の化学治療の投与後に残っている極小さい病変の免疫療法に新しい見通しを与える。同様に、抗原を提示する樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大も研究されており、これは現在提案されている技術のさらなる有望な適用である（５７−５９）。
【０１７１】
非造血幹細胞および先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大：本明細書中で提案されている技術のさらなる適用には、非造血幹細胞および先祖細胞（例えば、神経幹細胞、乏突起膠細胞前駆体などが含まれる）のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大の可能性が含まれる。
【０１７２】
ミエリン障害は、今までのところは不治である、ヒト神経疾患の重要な群を形成する。動物モデル、特に乏突起膠細胞系統の細胞移植の進歩により、有意な病巣再髄鞘形成が起こり、機能回復の生理学的証拠が得られている（６０）。将来的な治療は、移植および内因性修復の促進を含み、２つのアプローチをドナー組織のｅｘ  ｖｉｖｏでの操作と組み合わせることができる。
【０１７３】
米国特許第５，４８６，３５９号は、単離されたヒト間葉幹細胞を１つ以上の組織型（例えば、骨、軟骨、筋肉、または骨髄基質）へと分化させることができ、培養物中のヒト間葉幹細胞の単離、精製、および拡大方法を提供することを例示している。
【０１７４】
米国特許第５，７３６，３９６号は、最適な系統への幹細胞の分化の誘導に有効な生物活性因子での間葉幹細胞の接触を含む単離した培養拡大ヒト間葉幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの特定の系統方向への誘導方法を提供する。間葉組織の再生または修復のための、元の自己宿主への培養−拡大された特定の系統方向へと誘導した間葉幹細胞の導入を含む方法がさらに開示されている。
【０１７５】
米国特許第４，６４２，１２０号は、軟骨および骨の欠損を修復するための組成物を提供する。これらを、ゲル形態そのまま、または天然もしくは人工の骨に包埋された形態で提供される。ゲルは、一定の型の細胞を含む。細胞は、方向性胚軟骨細胞または典型的には、フィブリノゲン、抗タンパク質分解酵素、およびトロンビンと組み合わせて軟骨形成誘導因子を含むことによって、機能的な軟骨細胞に変換することができる能力を有している任意の間葉起源の細胞であり得る。
【０１７６】
米国特許第５，６５４，１８６号は、動物モデルによって証明されるように、血行性間葉細胞が培養およびｉｎ  ｖｉｖｏで増殖し、血液から創傷部位へ移動して皮膚を形成することができることを明らかにしている。
【０１７７】
米国特許第５，７１６，４１１号は、動物またはヒトにおける創傷または火傷の皮膚再生方法を示す。この方法は、最初にコラーゲングリコサミノグリカン（ＧＣ）マトリクスで創傷を被覆する工程と、移植したＧＣマトリクス内の健常な基底組織からの間葉細胞および血管浸潤を促進する工程とを含む。その後、動物またはヒトの無創傷部位から採取した上皮細胞から成長させた培養した上皮自家移植片を、体表に適用する。得られた移植片は優れた封入速度を有し、正常な皮膚の外観、成長、成熟、および分化を有する。
【０１７８】
米国特許第５，７１６，６１６号は、骨、軟骨、または肺の欠損によって特徴付けられる疾患、障害、または病態を罹患したレシピエントの治療方法を提供する。本方法は、正常な同系個体から単離した間質細胞の静脈内投与または単離細胞の遺伝子欠損の修復後にレシピエントから単離した間質細胞の静脈内投与を含む。レシピエント個体への遺伝子の導入方法も開示する。本方法は、レシピエント個体または適合する同系ドナーのいずれかから骨髄サンプルを得る工程と、前記サンプルから接着細胞を単離する工程とを含む。一旦単離すると、ドナー接着細胞を遺伝子でトランスフェクトし、レシピエント個体に静脈内投与する。調節配列に作動可能に連結された外因性遺伝子を含む単離した間質細胞を含む組成物を同様に開示している。
【０１７９】
上記例のそれぞれでは、非造血幹細胞および先祖細胞を、器官の喪失および損傷した細胞の補充のための外部細胞供給源として使用する。このような使用は、提案される治療の成功のためには、高レベルの幹細胞および先祖細胞の拡大が必要である。多数の拡大幹細胞および先祖細胞の集団がこのように差し迫って必要とされているので、本発明の方法および適用は、上記米国特許に開示の任意の方法の重要部分に取り組んだ。
【０１８０】
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの適用についてのさらなる例：幹細胞および先祖細胞の拡大のさらなる適用には、皮膚再生、肝臓再生、筋肉再生、および骨粗鬆症への適用のための骨成長の刺激が含まれる。
【０１８１】
骨髄幹細胞の末梢血への動員（末梢化）：ＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現の調節剤の作用を、さらにｉｎ  ｖｉｖｏで適用する。上記のように、移植のためのＰＢ由来幹細胞を、化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環へのその動員後に、ロイコフォレシスを繰り返すことによって「採取」する（４６−４７）。
【０１８２】
勿論、化学療法の使用は、正常なドナーには適切ではない。ドナーへのアンタゴニストの投与により、骨髄幹細胞のプールを増大させることができ、次いでこれを、内因性または注射したＧ−ＣＳＦによって末梢に動員する。
【０１８３】
胎児ヘモグロビン産生の刺激：胎児ヘモグロビンの増加によって鎌状赤血球貧血およびβ−サラセミアなどのβ−異常血色素症を罹患したレシピエントの臨床症状を改善することが示された（６１）。
【０１８４】
通常は総ヘモグロビンの１％である胎児ヘモグロビンにより、赤血球生成促進が高められる（例えば、急性溶血もしくは出血またはエリスロポイエチン投与後）（６２）。
【０１８５】
この現象は赤血球前駆体の成熟／分化プロセスの加速に関連することが示唆されている（６３）。β−異常血色素症のレシピエントへのＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現の調節剤の投与により、先祖細胞分化の遮断によってその初期赤血球前駆体プールを最初に増加および同期化させることができる。
【０１８６】
薬物の投与および体内からのその除去の停止後、この初期集団は次いで成熟が促進されて、胎児ヘモグロビンの産生が増大し得る。
【０１８７】
Ｓｅｒｒｅｒｏに対する米国特許公報第０３／０２１５４４５号はＰＩ３−キナーゼ経路によって媒介される悪性増殖過程における悪性細胞によって分泌される糖タンパク質ＧＰ８８の役割を記述する。著者は悪性造血細胞増殖の阻害のための、特にリンパ球白血病および多発性骨髄腫の如きＢ−細胞悪性腫瘍の阻害のための、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路を阻害する。抗Ｇ８８抗体、抗Ｇ８８アンチセンス構築物および他のＧ８８アンタゴニストの使用を開示する。しかし、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤を用いた幹細胞または幹細胞集団の拡大についての言及はなされていない。
【０１８８】
シグナル伝達経路の阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は当該技術分野では周知である。チロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブメシレート（ＳＴ１５７１）またはＧｌｅｅｖｅｃ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）は慢性骨髄性白血病の治療のためのＦＤＡ承認を受け取っており、２００３年から臨床設定で用いられている。ゲニスタインおよびジアゼンは特定のチロシンキナーゼ阻害活性を有するイソフラボンであるが、それらの抗光発がんおよび抗光老化特性に加えてヒトの幅広い多様な病気の治療のために用いられている：胸および前立腺のがん、閉経後症候群、骨粗鬆症および心臓血管病（ゲニスタインおよびジアゼンの論評についてはＣｏｓ，ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ  ２００３；６９：５８９−９９を参照されたい）。実際、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害およびその血管新生効果はＲｏｂｅｒｔ  Ｍｏｃｈａｒｎｕｋ  ｅｔ  ａｌによって最近論評されているように異常細胞増殖および腫瘍形成に関連する多数の病気のための治療標的として提案されている：
【０１８９】
「まず、悪性のＧＢＭ細胞は自発的なＥＧＦＲシグナル伝達を介して腫瘍形成を促進する。次に、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤はＥＧＦＲを過剰発現するタイプの特定のがんでは効果が小さいかもしれない。これは特にＰＩ３／ＡＫＴシグナル伝達経路がＰＴＥＮ突然変異によってなお活性化されている場合はそうであるかもしれない。従って、活性化ＰＴＥＮ突然変異がなお存在する場合は単にＥＧＦＲ活性を阻害することは下流にある仮想的なエフェクター分子（ＰＩ３／ＡＫＴ）を阻害するのには不十分であるかもしれない。このことは腫瘍の制御を達成するための手段として上流（ＥＧＦＲ）および下流（ＰＩ３／ＡＫＴ）リン酸化を阻害する２以上の医薬またはＰＩ３／ＡＫＴの阻害剤を開発する必要性を示唆するであろう。」（Ｍｏｃｈａｒｎｕｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，ｗｗｗ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ，Ｎｏｖ  ２００２）。
【０１９０】
本発明の特定の態様および実施形態に関して以下により詳細に説明する。
【０１９１】
本発明の１つの態様によれば、幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害する方法が与えられる。本発明のこの態様による方法はｅｘ  ｖｉｖｏ細胞増殖のためのｅｘ  ｖｉｖｏ培養条件を幹細胞に与え、同時にＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の有効濃度を細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで与え、それにより幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害することによって行われる。
【０１９２】
本明細書中で使用される場合は、句「幹細胞」は、正しい増殖条件を与えると、その細胞を得た生物中に存在するあらゆる細胞系統へと発達することができる多能性細胞をいう。本明細書中で使用される場合は、この句は、組織または身体中に細胞塊の生成を担う最初期の再生可能な細胞集団およびいくらかより分化しているが依然として方向付けられておらず、且つ最初期の再生可能な細胞集団の一部になるように容易に復帰することができる極めて初期の先祖細胞の両方をいう。異なる組織から得た幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの培養方法は、細胞培養の分野で周知である。これを行うためには、例えば、テキストブック「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（その教示が本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと。
【０１９３】
本明細書中で使用される場合は、用語「阻害」は、減速、減少、遅延、防止、逆転または廃止をいう。同様に、用語「ダウンレギュレーション」は、示された活性または発現を部分的にまたは完全に減少させることをいう。本発明においてはそれらの決定的な代謝的重要性のため、ＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路のダウンレギュレーションは部分的なダウンレギュレーションであることが好ましいということは理解されるであろう。
【０１９４】
本明細書中で使用される場合は、用語「分化」は、発達の間の比較的一般化または特殊化した変化をいう。種々の系統の細胞分化は、十分に報告されたプロセスであり、本明細書中でさらに説明する必要はない。本明細書中で使用される場合は、用語「分化」は、いくつかの場合に細胞分裂に関与しているが、機能するための特定の細胞型へと成熟し、次いで例えばプログラムされた細胞死によって死滅するプロセスである、成熟とは異なる。
【０１９５】
句「細胞の拡大」は、実質的に細胞分化を欠く細胞増殖プロセスを説明するために本明細書中で使用する。したがって、拡大される細胞は、その細胞再生特性を維持し、多くの場合は、本明細書中で再生可能な細胞（例えば、再生可能な幹細胞）をいう。
【０１９６】
本明細書中で使用される場合は、用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、生きた生物から細胞を取り出し、生物外（例えば、試験管内）で増殖させるプロセスをいう。しかし、本明細書中で使用される場合は、用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、種々の細胞株（例えば、ＨＬ−６０、ＭＥＬ、ＨｅＬａなど）などのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのみ増殖することが公知の細胞を培養するプロセスについてはいわない。本発明で教示されかつ特許請求されているようにかかる細胞は培養中で分化せずにサイトカインまたは特異的な分化阻害要因の不在下で自発的に増殖し、「ある系統への分化増殖能力を獲得しており（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」（分化されており）、未分化の幹または先祖細胞ではない。かかる細胞系は定義により自発的に分化するそれらの能力を「阻止」されており、造血幹細胞および／または先祖細胞に対するＰＩ３−キナーゼの効果を示すためのモデルを構成できない。言い換えれば、本発明によってｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された細胞は、これらが最終的に分化するという点で、細胞株に転換していない。
【０１９７】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた細胞に与えることは、栄養素、好ましくは１つ以上のサイトカイン（以下にさらに詳述する）を細胞にあてがうことを含む。
【０１９８】
上記のように、幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる条件での細胞の処理と同時に、ＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるために細胞を短期間または長期間処理する。
【０１９９】
本発明の一実施形態によれば、ＰＩ３−キナーゼの活性を減少させることはＰＩ３−キナーゼの触媒活性を阻害するＰＩ３−キナーゼの調節剤（即ち、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤）を細胞に与えることによって行われる。
【０２００】
本明細書中で使用される場合は、「ＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤」は、幹細胞中でＰＩ３−キナーゼ活性をダウンレギュレートまたは抑制することができる薬剤をいう。
【０２０１】
本発明のこの態様によるＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤はＰＩ３−キナーゼ固有の活性を阻害する「直接的阻害剤」であることができるか、またはＰＩ３−キナーゼシグナル伝達要素（例えばＡｋｔおよびＰＤＫ１シグナル伝達経路）またはＰＩ３−キナーゼ活性によって影響を受ける他のシグナル伝達経路の活性または発現を阻害する「間接的阻害剤」であることができる。
【０２０２】
本発明のこの態様の現在知られている実施形態によれば、ウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２は好ましいＰＩ３−キナーゼ阻害剤である。
【０２０３】
従って、一実施形態では本発明のこの態様による方法は例えば米国特許第５３７８７２５号、第５４８０９０６号、第５５０４１０３号、および国際特許公報ＷＯ  ０３０７２５５７およびＷＯ  ９６０１１０８（これらの文献は参考としてここに組入れられる）に記載されたようなウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２およびそれらの活性な誘導体の如き公知のＰＩ３−キナーゼ阻害剤を与えることによって、およびＭｅｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌに対する米国特許公報２００３０１４９０７４（この文献も参考としてここに組入れられる）に記載されたような特異的ＰＩ３−キナーゼ阻害剤によって行われる。
【０２０４】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤は当業者には周知である。かかる阻害剤はＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）およびウォルトマンニン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｏ．）（これらは両方とも強くかつ特異的なＰＩ３Ｋ阻害剤である）を含むがこれらに限定されない。ＬＹ２９４００２の化学的特性はＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：５２４１−５２４８に詳述されている。簡潔に述べるとＬＹ２９４００２はクェルセチン誘導体であり、ＡＴＰのホスファチジルイノシトール３−キナーゼ結合に競合することによってホスファチジルイノシトール３−キナーゼを阻害することが示されている。ＬＹ２９４００２がＰＩ３ＫのＡＴＰ結合部位を十分に阻害する濃度ではそれはＰＩ４−キナーゼ、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ、ｓｒｃ様キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣ、およびＡＴＰａｓｅを含む多数の他のＡＴＰ要求酵素に対して何の阻害効果も有さない。
【０２０５】
ＬＹ２９４００２は組織培養培地中で極めて安定であり、膜透過性であり、細胞毒性を有さず、ＰＩ３Ｋファミリーのメンバーを阻害する濃度では他のシグナル伝達分子に何の影響も与えない。
【０２０６】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼはホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のイノシトール環の３位をリン酸化してホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ−３Ｐ）を形成させることが見出されている（Ｗｈｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３２２：６６４−６４６）。ＰＩに加えて、この酵素はホスファチジルイノシトール４−ホスフェートおよびホスファチジルイノシトール４，５−ビスホスフェートをリン酸化してホスファチジルイノシトール３，４−ビスホスフェートおよびホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェート（ＰＩＰ３）をそれぞれ生成することもできる（Ａｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ，５７：１６７−１７５）。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤はＰＩ３−キナーゼのこれらの活性の一方または両方を減少または削除する材料である。かかる阻害剤の同定、単離および合成はＰｔａｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第６４１３７７３号に開示されている。
【０２０７】
句「活性な誘導体」はｉｎ  ｖｉｖｏでまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで例えば触媒活性、結合研究などによって測定されるようなＰＩ３−キナーゼダウンレギュレート活性を有するウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２のいかなる構造的誘導体もいう。
【０２０８】
代わりに、本発明のこの態様によるＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現をダウンレギュレートする調節剤は、例えばＰＩ３−キナーゼの触媒領域または基質結合部位に結合する活性中和抗ＰＩ３−キナーゼ抗体であることができ、それによってＰＩ３−キナーゼの触媒活性を阻害することができる。しかし、ＰＩ３−キナーゼは細胞内タンパク質であるので、原形質膜を通って送達されることができる調節剤を用いることができるということは理解されるであろう。この点においてＦａｂ断片（以下で説明する）の如き断片化された抗体または遺伝子工学的に改変されたＳｃＦＶを用いることが好ましい。
【０２０９】
本発明で使用される、用語「抗体」には、完全な分子ならびにマクロファージに結合することができるその機能的フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）が含まれる。これらの機能的抗体フラグメントを以下のように定義する：
【０２１０】
Ｆａｂ：抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含み、完全な軽鎖および１つの重鎖の一部を得るために酵素パパインでの完全な抗体の消化によって産生される、フラグメント；
【０２１１】
Ｆａｂ’：完全な軽鎖および重鎖の一部を得るためにペプシンでの完全な抗体の処理およびその後の還元によって得ることができる抗体分子のフラグメント；抗体分子あたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる；
【０２１２】
（Ｆａｂ’）２：その後に還元することなく酵素ペプシンでの完全な抗体の処理によって得ることができる抗体のフラグメント；（Ｆａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合により互いに結合した２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；
【０２１３】
Ｆｖ：２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；および
【０２１４】
単鎖抗体（「ＳＣＡ」）：適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む、遺伝子融合された１本鎖分子としての遺伝子操作された分子。
【０２１５】
これらのフラグメントの作製方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８（本明細書中で参考として援用されている）を参照のこと）。
【０２１６】
本発明の抗体フラグメントを、Ｅ．ｃｏｌｉまたは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）でフラグメントをコードするＤＮＡを発現させることによって調製することができる。
【０２１７】
従来の方法による完全な抗体のペプシンまたはパパイン消化によって、抗体フラグメントを得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる５Ｓフラグメントを得るためのペプシンでの抗体の酵素分解によって抗体フラグメントを産生することができる。チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基をブロックする基を使用してこのフラグメントをさらに切断して、１価の３．５ＳＦａｂ’フラグメント産生することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素切断により、２つの１価のＦａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接産生する。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４０３６９４５号、および同第４３３１６４７号ならびにこれらに記載の参考文献（これらの特許は、その全体が本明細書中で参考として援用されている）によって記載されている。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９−１２６，１９５９もまた参照のこと。フラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限りは、１価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素技術、化学的技術、または遺伝子技術などの抗体を切断するための他の方法を使用することもできる。抗ＰＩ３−キナーゼ抗体は商業的に入手可能であり、例えばモノクローナルヒト組換え抗ＰＩ３−キナーゼ（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（Ａ），抗ＰＩ３−キナーゼｐ８５サブユニットヒトモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ  ａｎｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｉｎｃ）、および抗ｐ８５  Ｎ−ＳＨ２ドメインモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）が挙げられる。
【０２１８】
Ｆｖフラグメントは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の結合を含む。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２，１９７２に記載のように、この結合は非共有結合であり得る。あるいは、可変鎖は、分子内ジスルフィド結合によって結合するか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチド結合によって連結したＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）を、オリゴヌクレオチドによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子の構築によって調製する。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、その後Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単鎖ポリペプチドを合成する。ｓＦｖの産生方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：９７−１０５，１９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９９８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７，１９９３；ａｎｄ  Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４９４６７７８号（その全体が本明細書中で参考として援用されている）によって記載されている。
【０２１９】
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）を、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子の構築によって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して調製する。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６−１０，１９９１を参照のこと。
【０２２０】
非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどのヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基に置換されたヒト免疫グロブリンレシピエント抗体が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に置換する。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体、取り込まれたＣＤＲ、またはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てのまたは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、実質的に全ての、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域）の少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；ａｎｄ  Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０２２１】
非ヒト抗体のヒト化方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源由来のアミノ酸残基に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。典型的には導入可変ドメインから採取されるこれらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば導入残基といわれる。本質的に、げっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の対応するヒト抗体配列との置換によるＷｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓの方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））にしたがってヒト化を行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインがヒト以外の種由来の対応配列に置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際には、ヒト化抗体は一般に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０２２２】
当該分野で公知の種々の技術（ファージディスプレイライブラリーを含む）を使用してヒト抗体を産生することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。ヒトモノクローナル抗体の調製のためのＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．ａｎｄ  Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術も利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、トランスジェニック動物（例えば、外因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているマウス）へのヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入によってヒト抗体を作製することができる。チャレンジにより、ヒト抗体産生が認められる。これは、遺伝子の再配置、構築、および抗体レパートリーを含むあらゆる点でヒトで認められる特徴に非常に類似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および以下の科学刊行物：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）に記載されている。
【０２２３】
代わりに、本発明のこの態様による方法はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる調節剤をｅｘ−ｖｉｖｏで培養された幹細胞に与えることによって行われ、前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、およびＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイムからなる群から選択される。
【０２２４】
ＰＩ３−キナーゼ発現をダウンレギュレートする薬剤とは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかでＰＩ３−キナーゼ合成（遅延）または分解（加速）に影響を与える任意の薬剤をいう。例えば、ＰＩ３−キナーゼ発現をダウンレギュレートすることはＰＩ３−キナーゼｍＲＮＡの転写またはリボゾームでのＰＩ３−キナーゼ転写物の翻訳を特異的に阻止するようにデザインしたオリゴヌクレオチド分子を用いて本発明のこの態様に従って達成されることができる。一実施形態では、かかるオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０２２５】
ＰＩ３−キナーゼ発現を効果的に阻害するために用いられることができるアンチセンス分子のデザインはアンチセンスアプローチに対する２つの重要な側面を考慮に入れて行われなければならない。第一の側面は適切な細胞の細胞質中へのオリゴヌクレオチドの送達であり、第二の側面は細胞内の指定されたｍＲＮＡの翻訳を阻害するような態様で細胞内の指定されたｍＲＮＡに特異的に結合するオリゴヌクレオチドのデザインである。ＰＩ３−キナーゼｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プロモーターおよび／またはＰＩ３−キナーゼの他の制御配列に特異的に結合するオリゴヌクレオチドの構築および合成に用いるのに好適な配列は公表されているＰＩ３−キナーゼのヌクレオチド配列で利用可能であり、これにはＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：ＡＦ３２７６５６（ヒトのガンマ触媒サブユニット）；ＮＭ００６２１９（ヒトのベータサブユニット）；ＮＭ００２６４７（ヒトのクラスＩＩＩ）；ＮＭ１８１５２４（ヒトのｐ８５アルファサブユニット）；Ｕ８６４５３（ヒトのｐ１１０デルタ同位型）；およびＳ６７３３４（ヒトのｐ１１０ベータ同位型）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２６】
従来技術は幅広い種類の細胞中にオリゴヌクレオチドを効果的に送達するために用いられることができる多数の送達戦略を教示する（例えばＬｕｆｔ（１９９８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７６（２）：７５−６；Ｋｒｏｎｅｎｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１（３）：８５２−６２；Ｒａｊｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ８（６）：９３５−４０；Ｌａｖｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３７（３）：５６６−７１  ａｎｄ  Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３１（３）：５４０−５を参照）。
【０２２７】
加えて、標的ｍＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドの両方における構造的変化のエネルギーを計算に入れる熱動力学サイクルに基づく標的ｍＲＮＡに対する最高の予想された結合親和性を有する配列を同定するためのアルゴリズムも利用可能である（例えばＷａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ６５（１）：１−９参照）。
【０２２８】
かかるアルゴリズムは細胞におけるアンチセンスアプローチを実行するために成功して用いられてきている。例えば、Ｗａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって開発されたアルゴリズムを用いて科学者はウサギのベータグロブリン（ＲＢＧ）およびマウスの腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインするのに成功している。同じ研究グループは動的ＰＣＲ技術によって評価されるように細胞培養物中で３つのモデル標的ｍＲＮＡ（ヒトの乳酸デヒドロゲナーゼＡおよびＢおよびラットのｇｐ１３０）に対する合理的に選択されたオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性はホスホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチド化学を用いた２つの細胞型における３つの異なる標的に対する試験を含むほぼ全ての場合において有効であることを証明する結果をより最近報告している。
【０２２９】
加えて、インビトロシステムを用いて特定のオリゴヌクレオチドをデザインしてその有効性を予測するためのいくつかのアプローチも発表されている（Ｍａｔｖｅｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，１３７４−１３７５）。ＰＩ３−キナーゼの発現をダウンレギュレートすることができることが示されているアンチセンス分子の例はＭｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  ２００４；１６：６３１−４２）によって記述されているＰＩ３−キナーゼ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、この文献はここに参照として組入れる。ＰＩ３−キナーゼ特異的アンチセンス分子の製造はＰｔａｓｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ（米国特許第６４１３７７３号）によって開示されており、この文献はここに参照として組入れる。
【０２３０】
いくつかの臨床試験がアンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性、実行可能性および活性を証明している。例えばがんの治療のために好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは成功して用いられており（Ｈｏｌｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １（３）：３７２−８５）、一方、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化ｃ−ｍｙｂ遺伝子、ｐ５３およびＢｃｌ−２を介した血液の悪性腫瘍の治療は臨床試験の段階に入っており、患者によって耐えられることが示されている（Ｇｅｒｗｉｔｚ（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １（３）：２９３−３０６）。
【０２３１】
より最近、ヒトのヘパラナーゼ遺伝子発現のアンチセンス媒介された抑制がマウスモデル中のヒトがん細胞の胸膜転移を阻害することが報告されている（Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１（２１）：７８５５−６０）。
【０２３２】
従って、現在のコンセンサスは、アンチセンス技術の分野における最近の開発は上述の通り極めて正確なアンチセンスデザインアルゴリズムおよび幅広いオリゴヌクレオチド送達システムの生成を導き、当業者が過度の試行および誤りの実験を行う必要なしに既知配列のダウンレギュレート発現に好適なアンチセンスアプローチをデザインして実行することを可能にする。ここで記述するアンチセンス配列はそれに融合されたリボザイム配列も含むことができる。本発明で用いるのに好適なリボザイムは以下で更に記述される。かかるリボザイム配列は固相オリゴヌクレオチド合成を用いて容易に合成されることができる。
【０２３３】
本発明の教示にしたがってデザインしたオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成方法（酵素合成または固相合成など）にしたがって作製することができる。固相合成を実施するための装置および試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。このような合成のための任意の他の手段も使用することができる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として作用することができる。このような酵素の例には、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ  Ｈが含まれる。したがって、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性化により、ＲＮＡ標的が切断され、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害効率が非常に増大する。したがって、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合、同一の標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して短いオリゴヌクレオチドを使用して類似の結果をしばしば得ることができる。必要に応じて、当該分野で公知の核酸ハイブリッド形成技術と組み合わせたゲル電気泳動によってＲＮＡ標的の切断を日常的に検出することができる。
【０２３５】
上記のように２つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドの複合構造（修飾オリゴヌクレオチド）として本発明のキメラアンチセンス分子を形成することができる。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５０１３８３０号、同第５１４９７９７号、同第５２２０００７号、同第５２５６７７５号、同第５３６６８７８号、同第５４０３７１１号、同第５４９１１３３号、同第５５６５３５０号、同第５６２３０６５号、同第５６５２３５５号、同第５６５２３５６号、および同第５７００９２２号（それぞれ全体が本明細書中で参考として援用されている）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３６】
本発明のこの実施形態で使用したオリゴヌクレオチドは、１０〜約２００塩基、好ましくは１５〜１５０塩基、より好ましくは２０〜１００塩基、最も好ましくは２０〜５０塩基の範囲から選択される長さを有するものである。
【０２３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、３’〜５’ホスホジエステル結合で結合したプリン塩基およびピリミジン塩基からなる複素環式ヌクレオシドを含み得る。
【０２３８】
好ましくは、使用するオリゴヌクレオチドは、以下で広く説明するように、骨格、ヌクレオシド間結合、または塩基のいずれかで修飾されたものである。このような修飾は、しばしばオリゴヌクレオチド取り込みおよび細胞内条件に対する抵抗性を促進させることができる。
【０２３９】
本発明のこの態様で有用な好ましいオリゴヌクレオチドの特定の例には、修飾された骨格または非天然のヌクレオシド内結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドとして、米国特許第６８７８０８号、同第４４６９８６３号、同第４４７６３０１号、同第５０２３２４３号、同第５１７７１９６号、同第５１８８８９７号、同第５２６４４２３号、同第５２７６０１９号、同第５２７８３０２号、同第５２８６７１７号、同第５３２１１３１号、同第５３９９６７６号、同第５４０５９３９号、同第５４５３４９６号、同第５４５５２３３号、同第５４６６６７７号、同第５４７６９２５号、同第５５１９１２６号、同第５５３６８２１号、同第５５４１３０６号、同第５５５０１１１号、同第５５６３２５３号、同第５５７１７９９号、同第５５８７３６１号、および同第５６２５０５０号に開示の骨格中にリン原子を保持するものが挙げられる。
【０２４０】
好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、通常の３’−５’結合を有するホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルのホスホネート（３’アルキルホスホネートおよびキラルなホスホネートを含む）、ホスフィナート、ホスホラミデート（３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネートを含む）、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、これらの２’−５’結合アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’で結合している逆の極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も使用することができる。
【０２４１】
あるいは、その中にリン原子を含まない修飾されたオリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、混合へテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、または１つ以上の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド内結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルフォキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分を有する他の骨格を有するものが含まれ、これらは、米国特許第５０３４５０６号、同第５１６６３１５号、同第５１８５４４４号、同第５２１４１３４号、同第５２１６１４１号、同第５２３５０３３号、同第５２６４５６２号、同第５２６４５６４号、同第５４０５９３８号、同第５４３４２５７号、同第５４６６６７７号、同第５４７０９６７号、同第５４８９６７７号、同第５５４１３０７号、同第５５６１２２５号、同第５５９６０８６号、同第５６０２２４０号、同第５６１０２８９号、同第５６０２２４０号、同第５６０８０４６語、同第５６１０２８９号、同第５６１８７０４号、同第５６２３０７０号、同第５６６３３１２号、同第５６３３３６０号、同第５６７７４３７号、同第５６７７４３９号に開示されている。
【０２４２】
本発明で使用することができる他のオリゴヌクレオチドは、糖およびヌクレオシド内結合の両方が修飾されたものである（すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が新規の基に置換されている）。適切なポリヌクレオチド標的との相補性のために塩基単位は維持される。このようなオリゴヌクレオチド模倣物の例には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、糖−骨格がアミド含有骨格（特に、アミノエチルグリシン骨格）に置換されたオリゴヌクレオチドをいう。塩基が保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する米国特許には、米国特許第５５３９０８２号、同第５７１４３３１号および同第５７１９２６２号（それぞれ本明細書中で参考として援用されている）が含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用することができる他の骨格修飾は、米国特許第６３０３３７４号に開示されている。本発明のオリゴヌクレオチドには、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書中で使用される場合は、「非修飾」または「天然の」塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、および２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然の塩基が含まれるが、これらに限定されない。さらなる塩基としては、米国特許第３６８７８０８号に開示の塩基、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｉｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示の塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示の塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されている塩基を挙げることができる。このような塩基は、特に、本発明��オリゴマー化合物の結合親和性の増大に有用である。これらには、５置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５−メチルシトシン置換により、核酸二重鎖の安定性が０．６〜１．２℃増大することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２７６−２７８）、これが現在好ましい塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせるとさらに好ましい。
【０２４３】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増大させる１つ以上の部分もしくは抱合体へのオリゴヌクレオチドの化学結合を含む。このような部分には、米国特許第６３０３３７４号に開示のコレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）、チオコレステロール、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール）またはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミン、またはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４４】
所与のオリゴヌクレオチド分子中の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、１つの化合物または１つのオリゴヌクレオチド内の１つのヌクレオシドに１つ以上の上記修飾を組み込むことができる。
【０２４５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）はＰＩ３−キナーゼを特異的に阻害するために本発明によって利用されることができるさらに別のアプローチである。ＲＮＡ干渉は２つの工程プロセスである。開始工程と称される第一工程では、加えられたｄｓＲＮＡがたぶんダイサー（ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮＡａｓｅ  ＩＩＩファミリーの一員であり、ｄｓＲＮＡをＡＴＰ依存性の様式で加工（開裂）する）の作用によって２１〜２３個のヌクレオチド（ｎｔ）の干渉性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと消化される。成功した開裂事象はＲＮＡを１９〜２１ｂｐの二本鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解し、このそれぞれは２−ヌクレオチド３’オーバーハングを有する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３−３６６）。
【０２４６】
エフェクター工程と称される第二工程では、ｓｉＲＮＡ二本鎖はヌクレアーゼ複合体に結合してＲＮＡによって誘導されるサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ｓｉＲＮＡ二本鎖のＡＴＰ依存性巻き戻しがＲＩＳＣの活性化のために要求される。次に、活性なＲＩＳＣは塩基対合相互作用によって相同な転写物を標的とし、ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドの断片へと開裂する（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２，Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９，Ｓｈａｒｐ（２００１）Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０）。開裂のメカニズムは未だ明らかにされていないが、研究は各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅを含むことを示している（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２）。ＲＮＡｉの顕著な有効性のため、ＲＮＡｉ経路は増幅工程を用いるのではないかということが示唆されている。増幅は、加えられたｄｓＲＮＡを複写すること（これはより多くのｓｉＲＮＡを生み出す）によって、または形成されたｓｉＲＮＡを複製することによって生じることがありうる。代わりにまたは追加的に、増幅はＲＩＳＣの多数の代謝事象によって行われることがありうる（Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９，Ｓｈａｒｐ（２００１）Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１５：４８５−９０，Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２：２２５−２３２）。ＲＮＡｉについてのさらなる情報についてはＴｕｓｃｈｌ（２００１）ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，Ｃｕｌｌｅｎ（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９  ａｎｄ  Ｂｒａｎｔｌ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ．１５７５：１５−２５の解説を参照されたい。
【０２４７】
本発明で用いるのに好適なＲＮＡｉ分子の合成は以下のようにして行われることができる。まず、ＰＩ３−キナーゼのｍＲＮＡ配列はＡＡジヌクレオチド配列についてＡＵＧ開始コドンの下流に走査される。各ＡＡおよび３’隣接１９ヌクレオチドの存在は潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録される。好ましくはｓｉＲＮＡ標的部位はオープンリーディングフレームから選択される。なぜなら、非翻訳領域（ＵＴＲ）は制御タンパク質結合部位に富んでいるからである。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉するかもしれない（Ｔｕｓｃｈｌ（２００１）ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５）。しかし、非翻訳領域に指向されたｓｉＲＮＡもＧＡＰＤＨについて示されているように効果的であることは理解されるであろう。そこでは５’ＵＴＲに指向されたｓｉＲＮＡは細胞内ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの約９０％の減少を媒介し、タンパク質レベルを完全に阻止した（ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｎ／９１／９１２．ｈｔｍｌ）。
【０２４８】
仮想的な標的部位の選択の後、標的部位配列は、ＮＣＢＩサーバ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から入手可能なＢＬＡＳＴソフトウェアなどのいかなる配列アラインメントソフトウェアを用いて適切なゲノムデータベース（例えばヒト、マウス、ラットなど）と比較される。他のコード配列に対して顕著な相同性を示す仮想的な標的部位は取り除かれる。
【０２４９】
定性的標的配列はｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択される。好ましい配列は低いＧ／Ｃ含有量を含む配列である。なぜなら、かかる配列は５５％より高いＧ／Ｃ含有量を有する配列と比較してより効果的に遺伝子サイレンシングを媒介することが証明されているからである。いくつかの標的部位は評価のために標的遺伝子の長さに沿って選択されることが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のためには、陰性コントロールを併用することが好ましい。陰性コントロールｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むがゲノムに対する顕著な相同性を欠くことが好ましい。従って、いかなる他の遺伝子に対しても顕著な相同性を示さないという条件の下で、ｓｉＲＮＡの混合されたヌクレオチド配列は用いられることが好ましい。
【０２５０】
上述の方法に従って、Ｃｚａｕｄｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２００３；３１：６７０−８２。この文献はここに参照として組入れられる。）はＰＩ３−キナーゼのｐ１１０ベータサブユニットの配列に基づく合成ｓｉＲＮＡを発現させることによってＰＩ３−キナーゼの発現および細胞内の活性を阻害することに成功した。
【０２５１】
ＰＩ３−キナーゼの発現阻害はリボザイムを用いても行われることができる。リボザイムは、関心のあるタンパク質をコードするｍＲＮＡの開裂によって遺伝子発現を配列特異的に阻害するためにますます用いられるようになってきている（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８  Ｏｃｔ；９（５）：４８６−９６）。いかなる特定の標的ＲＮＡを開裂させるようにリボザイムをデザインする可能性は、リボザイムを研究および治療、用途の両方における価値あるツールにした。治療領域では、リボザイムは感染性の病気におけるウイルスＲＮＡ、がんにおける主要な腫瘍遺伝子および遺伝病における特異的な体細胞突然変異を標的化するために用いられている（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｊｕｌ  １５；１０（２−３）：１６３−７１．）。最も注目に価することに、ＨＩＶ患者のためのいくつかのリボザイム遺伝子治療プロトコールはすでにＰｈａｓｅ  １試験にある。より最近、リボザイムはトランスジェニック動物研究、遺伝子標的確認および経路解明のために用いられている。いくつかのリボザイムは臨床試験の様々な段階にある。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥはヒトの臨床試験で研究するために化学的に合成された最初のリボザイムであった。ＡＮＧＩＯＺＹＭＥは血管新生経路における重要な要素であるＶＥＧＦ−ｒ（管内皮増殖因子受容体）の形成を特異的に阻害する。Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，並びに他の企業は動物モデルにおいて抗血管新生治療の重要性を証明している。Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）ＲＮＡを選択的に破壊するようにデザインされたリボザイムであるＨＥＰＴＡＺＹＭＥは細胞培養アッセイにおいてＨｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ウイルスＲＮＡを減少させるのに効果的であることが見出されている（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−ＷＥＢホームページ）。
【０２５２】
ＤＮＡｚｙｍｅも本発明によって利用されることができる。ＤＮＡｚｙｍｅは、一本鎖および二本鎖標的配列の両方を開裂することができる一本鎖のポリヌクレオチドである（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５；２：６５５；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  １９９７；９４３：４２６２）。ＤＮＡｚｙｍｅの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。「１０−２３」ＤＮＡｚｙｍｅは、それぞれ７から９個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインに隣接した１５個のデオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。このＤＮＡｚｙｍｅ型は、プリン：ピリミジン連結点でその基質ＲＮＡを有効に切断することができる（Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９；ＤＮＡｚｙｍｅの概説については、Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，ＬＭ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００２，４：１１９−２１を参照のこと）。
【０２５３】
一本鎖および二本鎖標的切断部位を認識する合成された操作ＤＮＡｚｙｍｅの構築および増幅の例は、Ｊｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第６３２６１７４号に開示されている。ヒトウロキナーゼ受容体に指向する類似のデザインのＤＮＡｚｙｍｅは、最近、ウロキナーゼ受容体発現を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏで結腸癌細胞転移を首尾よく阻害することが認められた（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００２，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４０９，Ａｎｎ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ  ｗｗｗ．ａｓｇｔ．ｏｒｇ）。別の適用では、ｂｃｒ−ａｂ１癌遺伝子に相補的なＤＮＡｚｙｍｅは、白血病細胞中での癌遺伝子の発現を首尾よく阻害し、ＣＭＬおよびＡＬＬの場合には、自己骨髄移植における再発率を低下させた。
【０２５４】
以下にさらに記載するように、本発明のタンパク質薬（例えば、抗体）およびオリゴヌクレオチド薬（例えばリボザイム、ＤＮＡｚｙｍｅ，ＲＮＡｉなど）を、これをコードするポリヌクレオチドから発現させ、適切な遺伝子送達媒介物／方法および核酸構築物を使用してｅｘ  ｖｉｖｏ培養した幹細胞に提供することができることが明らかである。
【０２５５】
かかる構築物は一過的または安定な発現であることができる。従って、本発明の１つの実施形態によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現の調節剤を与えることはアンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子またはＤＮＡザイムを幹細胞中で一過的に発現することによって行われる。他の好ましい実施形態によれば、発現は安定であり、前記与えることは（ａ）アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ分子またはＤＮＡザイムを発現することができる発現性ポリヌクレオチドを与え、そして（ｂ）前記発現性ポリヌクレオチドを細胞のゲノム中に安定に組入れ、それによってＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼ遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を与えることによって行われる。好適な構築物および細胞におけるそれらの安定なおよび一過性の発現のための方法は以下に記述される。
【０２５６】
適切な構築物の例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ＰｚｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ（それぞれ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）から市販されている）が含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターおよびパッケージング系の例は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から販売されているもの（多クローニング部位にクローニングすることができ、導入遺伝子がＣＭＶプロモーターから転写される、Ｒｅｔｒｏ−ＸベクターｐＬＮＣＸおよびｐＬＸＳＮが含まれる）である。導入遺伝子が５’ＬＴＲプロモーターから転写されるＭｏ−ＭｕＬＶ由来のベクター（ｐＢａｂｅなど）もまた含まれる。
【０２５７】
本発明のこの態様によれば、幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害する方法を、上で詳述するように、ウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２またはそれらの誘導体などのＰＩ３−キナーゼ阻害剤を使用してタンパク質レベルまたは遺伝子操作技術による発現レベルのいずれかでＰＩ３−キナーゼ発現および／または活性を調節することによって行うので、本発明によれば、いくつかの好ましい幹細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大かつ分化阻害方法がさらに与えられる。
【０２５８】
ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害はウォルトマンニン、ＬＹ２９４００２およびそれらの誘導体の如き公知のＰＩ３−キナーゼ阻害剤によって行われることができ、これは例えば米国特許第５３７８７２５号、第５４８０９０６号、第５５０４１０３号および国際特許公報ＷＯ  ０３０７２５５７およびＷＯ  ９６０１１０８に記述されており、これらの文献はここに参照として組入れられる。また、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害はＭｅｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許公報２００３０１４９０７４に記述されている特異的なＰＩ３−キナーゼ阻害剤によって行われることもでき、この文献はここに参照として組入れられる。
【０２５９】
調節剤の最終濃度は、特定の適用に応じてμＭまたはｍＭの範囲であり得る。例えば、約０．１μＭ〜約１００ｍＭの範囲内または約４μＭ〜約５０ｍＭの範囲内、より好ましくは約５μＭ〜約４０ｍＭの範囲内である。本発明を実行に移す際に、ＣＤ３４＋造血幹細胞分化およびＣＤ３４＋集団の再生の効果的な阻害は、０．１μＭ／Ｌ〜１００μＭ／Ｌの範囲でＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２を与えられた細胞で示された。従って、１つの好ましい実施形態では、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤の有効濃度は約０．１μＭ／Ｌ〜約１００μＭ／Ｌ、より好ましくは１〜５０μＭ／Ｌ、最も好ましくは１０〜２０μＭ／Ｌである。
【０２６０】
上記の特徴によれば、幹細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大は、再生可能な造血幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大するために使用することができる。
【０２６１】
したがって、本発明の別の態様によれば、再生可能な造血幹細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大する方法が与えられる。前記方法は、成体または新生児臍帯全白血球（当該分野で単核細胞画分としても公知）サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞増殖のための条件であって、同時に上記のようにＰＩ３−キナーゼの発現および／または活性を低下させるためのｅｘ  ｖｉｖｏ培養条件をサンプル中の細胞に与え、それによりサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によって行われる。
【０２６２】
本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、前記方法は、成体または新生児臍帯全白血球サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞増殖のための条件であって、同時に幹細胞のＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させるためのｅｘ  ｖｉｖｏ培養条件をサンプル中の細胞に与えることによりサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によって行われる。
【０２６３】
本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、前記方法は、成体または新生児臍帯全白血球サンプルまたは全骨髄細胞サンプルを得る工程と、幹細胞ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞増殖のための条件およびＰＩ３−キナーゼ阻害剤をサンプル中の細胞に与える工程と、それによりサンプル中の再生可能な幹細胞集団を拡大させる工程によって行われる。
【０２６４】
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境で幹細胞集団の拡大をさらに使用することができ、その結果、本発明のさらに別の態様によれば、幹細胞集団がｉｎ  ｖｉｖｏで拡大すると同時に幹細胞の分化をｉｎ  ｖｉｖｏで実質的に阻害する方法が与えられる。本発明のこの態様による方法は、上記の特徴にしたがって、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の治療有効量をそれを必要としている被検体に投与する工程によって行われる。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される。
【０２６５】
本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、上記で定義するように、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の治療有効量をそれを必要としている被検体に投与する工程によって行われる。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、ＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力を低下させるように作用する。
【０２６６】
本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤の治療有効量をそれを必要としている被検体に投与する工程によってこの方法を行う。
【０２６７】
本明細書全体で使用される、句「治療有効量」または「有効量」は、幹細胞拡大を誘導するが依然としてその分化を制限する薬剤の投与量をいう。
【０２６８】
幹細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大のための上記の方法により、特に、幹細胞集団を拡大させることができる。
【０２６９】
したがって、さらに本発明の態様により、３〜２０％の細胞が再選択可能なＣＤ３４＋細胞であり、そのうちの少なくとも４０％の細胞がＣＤ３４＋ｄｉｍであり（すなわち、ＦＡＣＳ分析における強度の中央値まで低下する）、再選択可能なＣＤ３４＋細胞のうち、Ｌｉｎ−である大部分の細胞はまたＣＤ３４＋ｄｉｍ細胞でもあることによって特徴付けられる複数の細胞を含む、造血幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた集団を提供する。１つの実施形態では、造血幹細胞は、骨髄、末梢血、および新生児臍帯血からなる群より選択される供給源に由来する。別の実施形態では、細胞集団は単一の遺伝的背景を有する。さらに別の実施形態では、造血幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた集団は、単一ドナー由来の少なくともＮ個の細胞（Ｎ＝新生児臍帯血、骨髄、または末梢血の単一サンプル由来のＣＤ３４＋細胞の平均数×１０００）を含む。ＣＤ３４および／またはＬｉｎマーカーの細胞表面発現は、例えば、ＦＡＣＳ分析または免疫組織学的染色技術によって決定することができる。幹細胞の自己再生能力は、以下の実施例でさらに例示される長期コロニー形成（ＬＴＣ−ＣＦＵｃ）またはＳＣＩＤ−Ｈｕマウスモデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ移植によって決定することができる。ＳＣＩＤ−Ｈｕマウスモデルは、ヒト胎児胸腺および肝臓組織または胎児ＢＭ組織を移植したＣ．Ｂ．−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウスを使用し、推定のヒト造血幹細胞の評価のための適切なモデルを提供する。ヒト胎児組織を用いてＳＣＩＤマウスを再構築できるので、このモデルは幹細胞を増殖させ（この場合は、ヒト造血幹細胞を増殖させ）、そしてこれはヒト起源の造血微小環境下で機能する。マウスは、典型的には、放射線照射され、その後、幹細胞が移植され、再生した器官のＦＡＣＳおよび免疫組織化学を含む任意の方法によって再構築が測定される（Ｈｕｍｅａｕ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０：３４９６）。
【０２７０】
さらに、上記の方法を使用して、移植可能な造血細胞調製物を産生することができ、その結果、本発明のさらに別の態様によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の有効量の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた、造血細胞の未分化集団を含む、治療用のｅｘ  ｖｉｖｏで培養された幹細胞集団が与えられる。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより分化を上述の通り阻害する。本発明では治療用の幹細胞集団は、培養培地から単離され薬学的に許容可能なキャリアと組合されたＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる調節剤を含む培養培地に沿って与えられることができるということは理解されるであろう。したがって、本発明の細胞集団を含む滅菌生理食塩水および緩衝液などの薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤を投与することができる。このようなキャリアおよび希釈剤の使用は、当該分野で周知である。
【０２７１】
本発明のこの態様の１つの特定の実施形態では、治療用のｅｘ  ｖｉｖｏで培養された幹細胞集団は、幹細胞のＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する応答能力を低下させ、幹細胞の分化を実質的に阻害する有効量の薬剤および薬学的に許容可能なキャリアの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた、造血幹細胞の拡大集団を含む。
【０２７２】
本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、移植可能な造血細胞調製物は、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤の有効量および薬学的に許容可能なキャリアの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた、造血幹細胞の拡大集団を含む。
【０２７３】
本発明の薬剤の幹細胞分化を阻害する能力は、種々の技術的適用でさらに使用することができる。
【０２７４】
本発明のさらなる態様によれば、幹細胞の保存方法が与えられる。１つの実施形態では、前記方法は以下の工程の少なくとも１つで幹細胞を操作する工程によって行われる：有効量のＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の有効量の存在下での採取、単離、および／または保存。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される。１つの実施形態では、前記方法は、以下の工程の少なくとも１つで幹細胞を操作する工程によって行われる：ウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２の如きＰＩ３−キナーゼ阻害剤、つまりＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の有効量の存在下での採取、単離、および／または保存。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものまたは抗ＰＩ３−キナーゼ抗体から選択される。
【０２７５】
本発明のなおさらなる態様によれば、細胞回収／培養用バッグが与えられる。本発明の細胞回収／培養用バッグには、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の有効量が補充される。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される。１つの実施形態では、調節剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２の如きＰＩ３−キナーゼ阻害剤、または抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である。
【０２７６】
本発明によれば、細胞分離および／または洗浄用緩衝液もまた与えられる。分離および／または洗浄用緩衝液には、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現の調節剤の有効量が補充される。ここで調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される。１つの実施形態では、調節剤はウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２の如きＰＩ３−キナーゼ阻害剤、または抗ＰＩ３−キナーゼ抗体である。
【０２７７】
以下でさらに詳述するように、幹細胞は、細胞遺伝子治療を実施するために使用することができる。
【０２７８】
本明細書中で使用される場合は、「遺伝子治療」は、遺伝病、後天性疾患、または病態もしくは表現型を治療または予防するための宿主への目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入をいう。目的の遺伝物質は、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの産生が望ましい産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）をコードする。例えば、目的の遺伝物質は、治療価値のあるホルモン、受容体、酵素、ポリペプチド、またはペプチドをコードすることができる。概説については、一般に、テキスト「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）を参照のこと。
【０２７９】
遺伝子治療の２つの基本的なアプローチを以下に記しておく：（ｉ）ｅｘ  ｖｉｖｏまたは細胞内遺伝子治療および（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療。ｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療では、患者から細胞を取り出し、培養してｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置する。一般に、機能置換遺伝子を、適切な遺伝子送達媒介物／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換えなど）および必要に応じて、発現系を介して細胞に導入し、改変した細胞を培地で拡大し、宿主／レシピエントに戻す。これらの遺伝的に再移植した細胞は、ｉｎ  ｓｉｔｕでトランスフェクトされた遺伝物質を発現することが示されている。
【０２８０】
従って、本発明の別の態様によれば、拡大された未分化の幹細胞に外来遺伝子を形質導入する方法が与えられる。前記方法は（ａ）形式導入されるべき幹細胞集団を得；（ｂ）（ｉ）幹細胞に細胞増殖のための条件を与え、そして（ｉｉ）幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を与えることによって幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され；それにより幹細胞を拡大しかつその分化を阻害し；そして（ｃ）拡大された未分化の幹細胞に外来遺伝子を形質導入することによって行われる。工程（ｉ）および（ｉｉ）はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われることができること、および工程（ｂ）と（ｃ）の順序は逆にすることができることは理解されるであろう。
【０２８１】
本発明のこの態様の別の特別な実施形態によれば、工程（ｉｉ）はＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力を減少させ、それにより幹細胞を拡大しかつその分化を阻害することによって行われる。
【０２８２】
好ましい実施形態では、外来遺伝子または導入遺伝子を含むベクター（例えば、ウイルスベクターまたは核酸ベクター）によって細胞の遺伝子の改変を行う。細胞遺伝子治療での使用に適切な多数のウイルスベクターが公知であり、例を以下に示す。同様に、以下にさらに記載するように、一定範囲の核酸ベクターを使用して、本発明の拡大させた細胞の遺伝子を形質転換することができる。
【０２８３】
したがって、本発明の拡大細胞を、遺伝子産物を発現するように改変することができる。本明細書中で使用される場合は、句「遺伝子産物」は、タンパク質、ペプチド、および機能的ＲＮＡ分子をいう。一般に、核酸分子によってコードされる遺伝子産物が被験体への供給に望ましい遺伝子産物である。このような遺伝子産物の例には、通常レシピエント被験体の器官によって産生されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、およびリポタンパク質が含まれる。例えば、遺伝子置換によって膵臓中の欠損器官に供給することができる遺伝子産物には、インスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、カルボキシペプチダーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、およびアミラーゼが含まれ、通常肝臓によって産生される遺伝子には、血液凝固因子（第ＶＩＩＩ血液凝固因子および第ＩＸ因子など）、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランスカルバノイラーゼ、およびシトクロムｐ４５０酵素、ならびに血清アデノシンのプロセシングまたは低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスのためのアデノシンデアミナーゼが含まれ、胸腺によって産生される遺伝子産物には、血清胸腺因子、胸腺液性因子、サイモポイエチン、およびサイモシンα１が含まれ、消化管によって産生される遺伝子産物には、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロチニン、および物質Ｐが含まれる。
【０２８４】
あるいは、コードされる遺伝子産物は、細胞によって所望の遺伝子産物の発現を誘導するものである（例えば、導入される遺伝物質は、被験体に供給すべき遺伝子産物の転写を誘導する転写因子をコードする）。
【０２８５】
さらに別の実施形態では、組換え遺伝子により、異種タンパク質（例えば、それが発現される細胞にとっては本来有しているものではないタンパク質）を得ることができる。例えば、ヒトレシピエントへの移植を補助するためにヒト以外の細胞に種々のヒトＭＨＣ成分を提供することができる。あるいは、導入遺伝子は、通常、微小器官移植片中で発現されるドナーＭＨＣ遺伝子産物の発現または作用を阻害するものである。
【０２８６】
細胞に導入された核酸分子は、核酸によってコードされる遺伝子産物の細胞中での発現に適切な形態である。したがって、核酸分子には、遺伝子（またはその一部）の転写に必要なコード配列および調節配列が含まれ、遺伝子産物がタンパク質またはペプチドである場合、遺伝子核酸分子の翻訳には、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルならびにコードされたタンパク質またはペプチドの輸送に必要な配列（例えば、タンパク質またはペプチドの細胞または分泌表面への輸送のためのＮ末端シグナル配列）が含まれる。
【０２８７】
遺伝子産物が発現される細胞型および遺伝子産物の所望の発現レベルに基づいて、遺伝子産物の発現を調節するヌクレオチド配列（例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列）を選択する。例えば、プロモーターに連結した遺伝子に細胞型特異的発現を付与することが公知のプロモーターを使用することができる。この遺伝子産物の筋肉特異的発現を付与するために、筋芽細胞遺伝子発現に特異的なプロモーターを、目的の遺伝子に連結させることができる。当該分野で公知の筋肉特異的調節エレメントには、ジストロフィン遺伝子（Ｋｌａｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２３９６）、クレアチンキナーゼ遺伝子（Ｂｕｓｋｉｎ  ａｎｄ  Ｈａｕｓｃｈｋａ，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２６２７）およびトロポニン遺伝子（Ｍａｒ  ａｎｄ  Ｏｒｄａｈｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：６４０４）由来の上流領域が含まれる。他の細胞型に特異的な調節エレメントは当該分野で公知である（例えば、肝臓特異的発現のためのアルブミンエンハンサー；膵島細胞特異的発現のためのインスリン調節エレメント；神経ジストロフィン、神経エノラーゼ、およびＡ４アミロイドプロモーターを含む種々の神経細胞特異的調節エレメント）。
【０２８８】
あるいは、種々の異なる細胞型で恒常的な遺伝子発現を指示することができる調節エレメント（ウイルス調節エレメントなど）を使用することができる。一般に遺伝子発現の駆動に使用されるウイルスプロモーターの例には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０、およびレトロウイルスＬＴＲ由来のものが含まれる。
【０２８９】
あるいは、連結する遺伝子の発現を誘導する調節エレメントを使用することができる。誘導性調節エレメント（例えば、誘導性プロモーター）の使用により、細胞中での遺伝子産物の産生を調節することができる。真核生物細胞での使用におそらく有用である誘導性の調節システムの例には、ホルモン調節エレメント（例えば、Ｍａｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｊ．Ｈ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５６０３−５６０７を参照のこと）、合成リガンド調節エレメント（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１０１９−１０２４を参照のこと）、および電離放射線調節エレメント（例えば、Ｍａｎｏｍｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１０６０７−１０６１３；Ｄａｔｔａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０１４−１０１５３を参照のこと）が含まれる。将来開発されるであろうさらなる組織特異的または誘導性の調節システムもまた、本発明にしたがって使用することもできる。
【０２９０】
細胞への遺伝物質の導入のための技術は当該分野において多数存在しており、これらを本発明の細胞の改変に適用することができる。
【０２９１】
１つの実施形態では、核酸は、裸の核酸分子の形態である。この状況では、改変すべき細胞に導入された核酸分子は、遺伝子産物をコードする核酸および必要な調節エレメントのみからなる。
【０２９２】
あるいは、遺伝子産物をコードする核酸（必要なエレメントを含む）は、プラスミドベクター内に含まれる。プラスミド発現ベクターの例には、ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が含まれる。
【０２９３】
別の実施形態では、細胞に導入される核酸分子は、ウイルスベクター内に含まれる。この状況では、遺伝子産物をコードする核酸は、ウイルスゲノム（またはウイルスゲノムの一部）に挿入される。遺伝子産物の発現を指示する調節エレメントは、ウイルスゲノムに挿入された核酸と共に含められるか（すなわち、ウイルスゲノムに挿入された遺伝子に連結した）、ウイルスゲノム自体によって得ることができる。
【０２９４】
リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注射、および受容体媒介取り込みを使用して、裸の核酸を細胞に導入することができる。
【０２９５】
核酸およびリン酸カルシウムを含む沈殿を形成させることによって、裸の核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入することができる。例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水を、塩化カルシウムおよび核酸を含む溶液と混合して沈殿を形成させることができ、次いで、沈殿を細胞とインキュベートする。グリセロールまたはジメチルスルホキシドショック工程を加えて、一定の細胞によって取り込まれる核酸量を増加させることができる。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションを使用して、細胞を安定に（または一過的に）トランスフェクトすることができる。これは細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの改変にのみ適用可能である。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｇｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  １６．３２−１６．４０または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。
【０２９６】
核酸とＤＥＡＥ−デキストランとの混合物を形成し、そして混合物を細胞とともにインキュベートすることによって裸の核酸を細胞に導入することができる。核酸取り込み量を増加させるためにジメチルスルホキシドまたはクロロキノンショック工程を加えることができる。ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションは、細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの改変のみに適用可能であり、これを使用して細胞にＤＮＡを一過的に導入することができるが、安定にトランスフェクトされた細胞の作製には好ましくない。したがって、本方法は、遺伝子産物の短期産生に使用することができるが、遺伝子産物の長期産生に最適な方法ではない。ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションのプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｇｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．２およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  １６．４１−１６．４６または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。
【０２９７】
適切な緩衝液中で細胞および核酸を共にインキュベートし、細胞を高圧電気パルスに供することによって、裸の核酸を細胞に導入することができる。エレクトロポレーションによって細胞に核酸が導入される効率は、印加電場の強度、電気パルスの強度、温度、ＤＮＡの高次構造および濃度、ならびに媒体のイオン組成に影響を受ける。エレクトロポレーションを使用して、広範な種々の細胞型を安定に（または一過性に）トランスフェクトすることができ、これは細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの改変にのみ適用可能である。エレクトロポレーション細胞のプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．３およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  １６．５４−１６．５５または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。
【０２９８】
裸の核酸を細胞に導入することができる別の方法には、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）が含まれる。核酸を、カチオン性脂質を含むリポソーム懸濁液と混合する。次いで、ＤＮＡ／リポソーム複合体を、細胞とインキュベートする。リポソーム媒介トランスフェクションを使用して、培養細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定に（または一過性に）トランスフェクトすることができる。プロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．４および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。さらに、リポソームを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子送達を行った。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８；およびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８４：４２９−４３８を参照のこと。
【０２９９】
細胞への核酸の直接注入によって、裸の核酸を細胞に導入することもできる。細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためには、微量注入によってＤＮＡを導入することができる。各細胞を個別に微量注入するので、多数の細胞を改変する場合は、このアプローチは非常に大きな労働力を必要とする。しかし、微量注入が最適な方法である状況は、トランスジェニック動物の産生である（以下にさらに詳細に考察する）。この状況では、ＤＮＡは受精した卵母細胞中に安定に導入されて、次いでこれは動物へと発達する。得られた動物は、卵母細胞に導入されたＤＮＡを保有する細胞を含む。裸のＤＮＡの細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏで導入のためには、直接注入も使用されている（例えば、Ａｃｓａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８１５−８１８；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８を参照のこと）。ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞へのＤＮＡ注入のための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を使用することができる。このような装置は市販されている（例えば、ＢｉｏＲａｄ）。
【０３００】
裸の核酸を、受容体媒介エンドサイトーシスによって取り込まれる細胞表面受容体のリガンドに結合するポリリジンなどのカチオンと複合体形成させることができる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．ａｎｄ  Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許第５１６６３２０号を参照のこと）。核酸−リガンド複合体の受容体への結合により、受容体媒介エンドサイトーシスによってＤＮＡの取り込みが促進される。ＤＮＡ−リガンド複合体をターゲティングした受容体には、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体が含まれる。エンドソームを天然に破壊し、それにより細胞質に物質を放出するアデノウイルスキャプシドに連結したＤＮＡ−リガンド複合体を使用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避することができる（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２１２２−２１２６を参照のこと）。受容体媒介ＤＮＡ取り込みを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞にＤＮＡを導入することができ、さらに、目的の標的細胞上で選択的に発現する受容体に結合するリガンドの使用によって、ＤＮＡを特定の細胞型に選択的にターゲティングすることができるという特徴が加えられる。
【０３０１】
一般に、裸のＤＮＡを培養細胞に導入する場合は（例えば、上記のトランスフェクション技術の１つによって）、一般的には、細胞の小画分（約１０５個のうちの１個）のみがトランスフェクトされたＤＮＡをそのゲノムに取り込む（すなわち、ＤＮＡは細胞のエピソーム中に維持される）。したがって、外因性ＤＮＡを取り込んだ細胞を同定するために、目的の核酸と共に細胞に選択マーカーをコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることが有利である。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬物に耐性を付与するものが含まれる。選択マーカーを、目的の遺伝子と同一のプラスミドに導入するか、または異なるプラスミドに導入することもできる。
【０３０２】
遺伝子産物をコードする核酸の細胞への好ましい導入アプローチは、遺伝子産物をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターの使用による。ウイルスベクターでの細胞の感染は、細胞が高い比率で核酸を受け入れるので核酸を受け入れた細胞を選択する必要性を回避することができるという利点を有する。さらに、ウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクター中に含まれるｃＤＮＡ）は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現され、従って、ウイルスベクター系はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用することができる。
【０３０３】
欠損レトロウイルスは、遺伝子治療のための遺伝子導入での使用について十分に特徴付けられている（概説として、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１を参照のこと）。レトロウイルスゲノムに挿入した目的の遺伝子産物をコードする核酸を持たせて、組換えレトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去してレトロウイルスに複製欠損を付与することができる。次いで、複製欠損レトロウイルスを、ビリオンにパッケージングし、これを使用して標準的な技術により、ヘルパーウイルスを使用して標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスの産生およびｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのこのようなウイルスでの細胞感染のプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９），Ｓｅｃｔｉｏｎ  ９．１０−９．１４および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例には、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭが含まれる。適切なパッケージングウイルス株の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｉｐ、Ψ２、およびΨＡｍが含まれる。レトロウイルスを使用して、種々の遺伝子がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで多数の異なる細胞型（上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞が含まれる）に導入されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４８６８１１６号；同第４９８０２８６号；特許出願ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；同第８９／０５３４５号、および同第９２／０７５７３号を参照のこと）。レトロウイルスベクターには、宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスゲノム（およびそれに挿入される外来核酸）��細胞内で核酸を安定に導入するためには、標的細胞の分裂が必要である。したがって、標的細胞の複製を刺激する必要があり得る。
【０３０４】
目的の遺伝子産物をコードしこれを発現するが、正常な細胞溶解性ウイルスの生活環でのその複製能力については不活性であるようにアデノウイルスのゲノムを操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照のこと。アデノウイルスＡｄ５型株ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者に周知である。細胞分裂を必要としない有効な遺伝子送達媒介物であり、これを使用して広範な種々の細胞型（気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）前出）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（Ｈｅｒｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）、および筋細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）が含まれる）に感染することができるという点で、組換えアデノウイルスは有利である。さらに、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびその中に含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノム中には組み込まれずエピソームにとどまり、それにより導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）に組み込まれるようになる状況で挿入変異誘発が起こり得るという潜在的問題が回避される。さらに、他の遺伝子送達ベクターと比較してアデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ保持能力は大きい（８ｋｂまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．前出；Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ５７：２６７）。現在使用されているほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、８０％ものアデノウイルス遺伝物質を保持している。
【０３０５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および産生生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照のこと）。そのＤＮＡを分裂していない細胞に組み込み、高頻度の安定な組み込みを示すことができる数少ないウイルスの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３を参照のこと）。わずか３００塩基対のＡＡＶを含むベクターをパッケージングして組み込むことができる。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限定されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０などに記載されているＡＡＶベクターを使用して、細胞にＤＮＡを導入することができる。ＡＡＶベクターを使用して、種々の核酸が異なる細胞型に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
【０３０６】
特定の発現ベクター系の効率および核酸の細胞への導入方法を、当該分野で日常的に使用されている標準的アプローチによって評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡは、フィルターハイブリッド形成技術（例えば、サザンブロッティング）によって検出することができ、導入されたＤＮＡの転写によって産生されたＲＮＡは、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護、または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。遺伝子産物は、適切なアッセイ（例えば、特異的抗体などを使用した産生タンパク質の免疫学的検出または酵素アッセイなどの遺伝子産物の機能活性を検出するための機能アッセイ）によって検出することができる。細胞によって発現されるべき目的の遺伝子産物を容易にアッセイできない場合には、使用する調節エレメントおよびベクターに連結されるレポーター遺伝子を使用して発現系を最初に最適化することができる。レポーター遺伝子は、容易に検出可能な遺伝子産物をコードするので、これを使用して系の効率を評価することができる。当該分野で使用される標準的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、およびヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が含まれる。
【０３０７】
細胞集団への核酸の導入に使用した方法により高比率で細胞が改変され、細胞によって遺伝子産物が十分に発現される場合（例えば、ウイルス発現ベクターを使用した場合に頻繁に生じるように）、集団内の各細胞をさらに単離またはサブクローニングすることなく改変された細胞集団を使用することができる。すなわち、細胞集団によって遺伝子産物を十分に産生することができ、さらに細胞を単離する必要はない。あるいは、遺伝子産物を十分に発現する細胞を単離するために単一の改変された細胞から同じように改変された細胞の均一な集団を増殖させることが望ましい場合もある。このような均一な細胞集団は、限界希釈クローニングによる単一の改変された細胞の単離、その後に標準的な技術によって培養物中で単一細胞をクローン細胞集団へと拡大させることによって調製することができる。
【０３０８】
上記で詳細に述べたように、幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大を、造血細胞の移植で有利に使用することができる。したがって、本発明の別の態様により、造血細胞の移植方法を提供する。本発明のこの態様の方法は：（ａ）移植されるべき造血幹細胞集団を得；（ｂ）（ｉ）造血幹細胞に細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで与え、そして（ｉｉ）造血幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をｅｘ  ｖｉｖｏで与えることによってｅｘ  ｖｉｖｏで造血幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより前記造血幹細胞を拡大しかつその分化を阻害し；そして（ｃ）レシピエントに造血幹細胞を移植することによって行われる。
【０３０９】
本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明のこの態様による方法は、ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、およびＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイムからなる群から選択されるＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができる調節剤をｅｘ  ｖｉｖｏで培養された幹細胞に与えることによって行われることができる。
【０３１０】
本発明のこの態様の別の特定の実施形態では、方法は：（ａ）移植されるべき造血幹細胞をドナーから得；（ｂ）（ｉ）造血幹細胞に細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで与え、そして（ｉｉ）造血幹細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をｅｘ  ｖｉｖｏで与えることによってｅｘ  ｖｉｖｏで造血幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより前記造血幹細胞を拡大しかつその分化を阻害し；そして（ｃ）レシピエントに造血幹細胞を移植することによって行われる。さらに別の実施形態では工程（ｂ）はＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力を減少させるためのｅｘ  ｖｉｖｏ培養条件を幹細胞に与えることによって行われる。
【０３１１】
ドナーおよびレシピエントは、単一の個体または異なる個体（例えば、同種異系個体）であり得る。同種異系移植を実施する場合、当該分野で周知の移植片拒絶および／または移植片対宿主病の軽減のための投薬計画に着手すべきである。このような投薬計画は、現在、ヒトの治療で実施されている。最も進んだ投薬計画は、Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００２）２２：６４およびＪ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ（２００２）１１：２６５）、ＧｕｒＨ．ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ（２００２）９９：４１７４）、およびＭａｒｔｅｌｌｉ  ＭＦ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２００２）３９：４８）（本明細書中で参考として援用されている）による刊行物に開示されている。
【０３１２】
本発明のなお別の態様によれば、養子免疫療法が与えられる。本発明のこの態様による方法は（ａ）患者から先祖造血幹細胞を得、（ｂ）（ｉ）細胞増殖のための条件をｅｘ  ｖｉｖｏで先祖造血幹細胞に与え、そして（ｉｉ）先祖造血細胞にＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度を与えることによって造血幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させかつその分化を阻害し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより前記先祖造血幹細胞を拡大させかつその分化を阻害し、そして（ｃ）先祖造血幹細胞をレシピエントに移植することを含む。
【０３１３】
本発明のこの態様の別の特定の実施形態によれば、前記方法の工程（ｂ）はＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力を減少させるための条件を細胞に与え、それにより幹細胞集団を拡大し、同時に幹細胞の分化を実質的に阻害することによって行われる。
【０３１４】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択される調節剤は、ＰＩ３−キナーゼ触媒活性の阻害剤、ＰＩ３−キナーゼをコードするｍＲＮＡ転写物と特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンスポリヌクレオチド、ＰＩ３−キナーゼ転写物、コード配列および／またはプロモーター要素を特異的に開裂するリボザイム、ＰＩ３−キナーゼ転写物の分解を誘導することができるｓｉＲＮＡ分子、およびＰＩ３−キナーゼ転写物またはＤＮＡを特異的に開裂するＤＮＡザイムからなる群から選択される。
【０３１５】
本発明の状況で使用されるＰＩ３−キナーゼの発現または活性を低下させる薬剤の作用は、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境に限定されない。したがって、本明細書中に記載の所見に基づいて、これらの薬剤の新規のｉｎ  ｖｉｖｏ適用が想定される。
【０３１６】
本発明の別の態様によれば、骨髄幹細胞を採取するためにドナー末梢血へ骨髄幹細胞を動員する方法が与えられる。本発明のこの態様による方法は：（ａ）ＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤の有効濃度をドナーに投与し、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、そして（ｂ）ロイコフォレシス（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって細胞を採取することによって行われることを含む。
【０３１７】
本発明のこの態様のさらに別の特定の実施形態では、前記方法の工程（ａ）はＰＩ３−キナーゼが関与するシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力を減少させるための薬剤の有効量をドナーに与え、それにより骨髄細胞集団を拡大しかつその分化を阻害することによって行われる。
【０３１８】
好ましくは、幹細胞の動員方法は、さらに、末梢血への細胞の動員を誘導するために現在使用されている少なくとも１つのサイトカイン、好ましくは少なくとも１つの初期サイトカインをドナーに投与する工程を含む。
【０３１９】
本発明のなお別の態様によれば、β−異常ヘモグロビン症の患者の治療のための赤血球前駆体細胞の成熟／分化を阻害する方法が与えられる。本発明のこの態様による方法はＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤を患者に投与することを含み、ここで前記調節剤はＰＩ３−キナーゼ活性またはＰＩ３−キナーゼをコードする遺伝子の発現をダウンレギュレートすることができるものから選択され、それにより患者の幹細胞集団を拡大させかつその分化を阻害し、前記患者からのＰＩ３−キナーゼ調節剤の除去により幹細胞は加速的に成熟し、増大した胎児ヘモグロビン生産を生じることによって行われる。
【０３２０】
本発明のこの方法により用いられることができる調節剤はＰＩ３−キナーゼシグナル伝達に対する細胞の応答能力を阻害するかまたは減少させるための薬剤、ウォルトマンニンまたはＬＹ２９４００２の如き阻害剤、または阻害性ＰＩ３−キナーゼ抗体であることができる。別の実施形態では、この方法はサイトカインを患者にさらに投与することによって行われる。
【０３２１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ環境では、ＰＩ３−キナーゼの発現または活性を低下させる薬剤（例えば、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるウォルトマンニンおよびＬＹ２９４００２、または抗ＰＩ３−キナーゼ抗体）を、これらの薬剤を含み、増粘剤、キャリア、緩衝液、希釈剤、界面活性剤、防腐剤など（全て当該分野で周知である）をさらに含み得る薬学的組成物によって投与することができる。
【０３２２】
薬学的組成物を、局所治療または全身治療の優先度および処置される範囲に依存して、種々の方法で投与することができる。局所（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口、吸入、または非経口（例えば、点滴または腹腔内、皮下、硬膜下、筋肉内または静脈内注射、または埋め込み型送達デバイス）によって投与することができる。
【０３２３】
局所投与用の処方物としては、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、座剤、ドロップ、液体、スプレー、および粉末を挙げることができるが、これらに限定されない。従来の薬学的キャリア、水溶液、粉末、または油性基剤、および増粘剤などが必要である場合があり、またそれらが望ましい場合もある。
【０３２４】
経口投与用の組成物としては、粉末、顆粒、懸濁液、または水溶液または非水性媒体の溶液、サシェ、カプセル、または錠剤が挙げられる。増粘剤、希釈剤、香料、分散助剤、乳化剤、または結合剤が望ましい場合もある。
【０３２５】
非経口投与用の処方物としては、滅菌溶液を挙げることができるが、これらに限定されない。これには、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含めることもできる。
【０３２６】
埋め込み型送達デバイス用の処方物としても同様に、滅菌溶液を挙げることができるが、これらに限定されない。これには、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物を含めることもできる。
【０３２７】
投薬は、治療条件の反応性に依存するが、通常、１日あたり１回または複数回であり、一連の治療を数日から数ヶ月間または必要な効果が得られるまで続ける。当業者は、最適な投薬量、投薬方法、および反復速度を容易に決定することができる。徐放投与計画は、いくつかの適用で有利であり得る。
【０３２８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞増殖のための条件を使用した幹細胞の獲得は、栄養素およびサイトカインを細胞に与える工程を含む。好ましくは、サイトカインは、初期作用性サイトカイン（幹細胞因子、ＦＬＴ３リガンド、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−６、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、腫瘍壊死因子α、およびトロンボポイエチンなどであるが、これらに限定されない）である。これに関しては、おそらく新規のサイトカインが発見されつづけ、そのうちのいくつかは本発明の細胞拡大方法で使用することができると認識される。
【０３２９】
後期活動サイトカインを使用することもできる。これらには、例えば、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、肝細胞成長因子、およびマクロファージコロニー刺激因子が含まれる。
【０３３０】
本発明の方法によって拡大される幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞であり得る。胚性幹細胞およびその回復方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  ＡＯ（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  （２００１）１３：５２３）、Ｒｏａｃｈ  ＭＬ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）１８５：１）、およびＳｍｉｔｈ  ＡＧ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ（２００１）１７：４３５）に記載されている。成体幹細胞は、成体組織由来の幹細胞であり、これらもまた当該分野で周知である。成体幹細胞を単離または富化させる方法は、例えば、Ｍｉｒａｇｌｉａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｌｏｏｄ  ９０：５０１３、Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１４７２０、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７８：５５、Ｐｒｏｃｋｏｐ  ＤＪ（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ（２００１）３：３９３）、Ｂｏｈｍｅｒ  ＲＭ（Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ（２００２）１７：８３）、およびＲｏｗｌｅｙ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（１９９８）２１：１２５３），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｌ．Ｇａｒｄｎｅｒ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ．Ｈｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｈａｍｐｌｉｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ（２０００）に記載されている。
【０３３１】
現在好ましい成体幹細胞の供給源は、造血系である。したがって、本発明の好ましい実施形態によれば、幹細胞は造血幹細胞である。このような幹細胞は、骨髄、末梢血、および新生児臍帯血から得ることができる。幹細胞について白血球（単核細胞）を富化させる方法は、当該分野で周知であり、これにはＣＤ１３３およびＣＤ３４＋発現細胞の選択が含まれる。ＣＤ１３３およびＣＤ３４＋細胞には、多能性幹細胞および適切な条件下で幹細胞に戻ることができる（これらはある系統への分化増殖能力を獲得した細胞ではないので）極めて初期の先祖細胞が含まれる。
【０３３２】
本発明の実施により得られた１つの最も驚くべき結果は、血液の単核細胞画分（すなわち、白血球）中に存在する幹細胞を、血液の幹細胞について富化させたＣＤ３４＋細胞画分と類似の様式で本発明の方法を使用して拡大させることができることであった。したがって、本発明の実施形態によれば、拡大させた幹細胞をある系統への分化増殖能力を獲得した細胞と混合する（例えば、分離も富化もしない）。細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ培養前の細胞分離のために必要な単調で退屈な作業が取り除かれるので、本発明のこの実施形態は特に有利である。
【０３３３】
別の実施形態では、造血ＣＤ１３３＋細胞またはＣＤ３４＋細胞について細胞を富化させ、これを、細胞表面抗原ＣＤ３８および系統特異的抗原（Ｌｉｎ：ＣＤ３、ＣＤ６１、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、および／またはＣＤ４が含まれる）を発現しないことまたは発現の有意な低下によって特徴づける。
【０３３４】
開示されたシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力の低下が可逆的（例えば、本質的の可逆的）であることを実験によって見出した。いくつかの実験では、培養において１６〜１８週間で細胞は拡大を停止し、分化を始める。言い換えれば、本発明のプロトコールを使用して拡大させた細胞は、細胞株とはならない。したがって、このような細胞を十分な拡大後に、分化が誘導される成長条件に供することによって、細胞に対して、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのシスおよびトランス分化を含む所望の方向へのｅｘ  ｖｉｖｏでの分化を指示することができる。
【０３３５】
本明細書中で使用される場合は、「シス分化」は、成体幹細胞が得られた組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、ＣＤ３４＋造血細胞の異なる方向性／成熟血球への分化はシス分化に含まれる。
【０３３６】
本明細書中で使用される場合は、「トランス分化」は、成体幹細胞が得られたものとは異なる組織への成体幹細胞の分化をいう。例えば、ＣＤ３４＋造血細胞の異なる組織起源の細胞（例えば、筋細胞）への分化はトランス分化に含まれる。
【０３３７】
本発明の状況において細胞拡大に使用する幹細胞は、動物および植物の両方を含む任意の多細胞成分の任意の組織から得ることができる。幹細胞は、多数の器官および組織に存在することが示されており、全ての動物組織（骨髄（Ｒｏｗｌｅｙ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２１：１２５３）、末梢血（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｋ，（２０００）Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２６：７８７）、肝臓（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＢＥ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：４３３）、および脳（Ｐａｇａｎｏ  ＳＦ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １８：２９５）が含まれるが、これらに限定されない）に存在すると考えられている。全てのこのような細胞は、本発明の方法を使用して拡大させることができると見越している。
【０３３８】
最近の研究（Ｐｅｌｅｄに対するＰＣＴ  ＩＬ  ０３／００２３５参照。本願はこの出願を優先権主張している）で、本発明者はｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された幹細胞が心臓、肺、骨髄および脈管細胞を含む様々な細胞型へとｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に分化することを予期せぬことに発見した。
【０３３９】
源となる幹細胞および標的器官に応じて、分化はシス分化またはトランス分化または両者の組合せであることがあり得る。
【０３４０】
上述の通り、「シス分化」は幹細胞が得られた組織と同一の組織への幹細胞の分化をいう。例えば、ＣＤ３４＋造血細胞の異なる方向性／成熟血球への分化はシス分化に含まれる。
【０３４１】
上述の通り、「トランス分化」は幹細胞が得られた組織とは異なる組織への幹細胞の分化をいう。例えば、ＣＤ３４＋造血細胞の異なる組織起源の細胞（例えば、心臓細胞）への分化はトランス分化に含まれる。
【０３４２】
本発明の拡大された幹細胞は様々な特定の細胞型にｉｎ  ｖｉｖｏで分化することができるので、および分化は源と標的組織の組合せによって予め決定されることができるので、本発明の方法は細胞置換療法で利用されることができる。
【０３４３】
ＭＩラットへの臍帯血幹細胞の移植は細胞分化およびＭＩの傷および損なわれた肺の柔組織の位置への分化した細胞の標的化を生ずることが示されているので、上述の方法を用いて拡大されて投与された幹細胞は損傷を受けた組織を再生するためにおよび細胞置換療法で用いられることができる。従って、本発明の方法は細胞または組織置換を必要とする病気の治療に用いられることができる。
【０３４４】
病気は神経の病気、筋肉の病気、心臓脈管の病気、血液の病気、皮膚の病気、肝臓の病気などであることができる。
【０３４５】
ミエリンの病気は未だ治療不可能なヒト神経病の重要な一群を形成している。動物モデルでの進行、特に希突起膠細胞系譜の細胞移植での進行は有意な焦点再ミエリン化および機能回復の生理学的証拠を生じている（Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ．１９９７．ｐｐ．５５４−５６１）。将来の治療は移植および内因性修復の促進の両方を含むことがありえ、これらの２つのアプローチはドナー組織のｅｘ  ｖｉｖｏ操作と組合されることがありえるであろう。軟骨および骨の欠陥も本発明の教示を用いて治療されることができる。かかる病気の治療のために幹細胞を利用する方法は米国特許第４６４２１２０号に与えられている。動物またはヒトにおける傷または火傷の皮膚再生も本発明の教示を用いて治療されることができる。かかる病気の治療のために幹細胞を利用する方法は米国特許第５６５４１８６号および５７１６４１１号に与えられている。
【０３４６】
上述の適用に加えて、本発明の教示はいくつかの他の治療適用で利用されることもできる。
【０３４７】
造血細胞の移植は様々な遺伝性のまたは悪性の病気のための治療の選択肢となった。初期の移植手順は全骨髄（ＢＭ）集団を利用していたが、最近では幹細胞について豊富にされているより規定された集団（ＣＤ３４＋細胞）が用いられている（Ｖａｎ  Ｅｐｐｓ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ，ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ，ａｎｄ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：４１１，１９９４）。骨髄に加えて、かかる細胞は末梢血（ＰＢ）および新生児臍帯血（ＣＢ）の如き他の源から由来することもできる（Ｅｍｅｒｓｏｎ  ＳＧ．Ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：３０８２，１９９６）。ＢＭと比べて、ＰＢを用いた移植は無形成性貧血の期間を短縮し、感染および出血の危険を減縮させる（Ｂｒｕｇｇｅｒ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔａｅｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３３：２８３，１９９５；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  ８７：１６８７，１９９６）。
【０３４８】
ＰＢを移植に用いる追加の利点はそのアクセス性である。ただし、今日までＰＢ移植における制限要因は採取のために利用可能な循環多能性幹／先祖細胞の数の少なさであった。移植のための十分なＰＢ由来の幹細胞を得るため、これらの細胞は化学療法およびサイトカインでの治療による骨髄から循環中へのそれらの動員に続く繰返しのロイコフォレシスによって「採取」される。かかる処理は正常なドナーにとっては明らかに適切でない。従って、移植のためのｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された幹細胞の使用はいくつかの利点を与える：（ｉ）それは成体の造血系の再構築のために必要な血液の量を減少させ、動員およびロイコフォレシスの必要性をうまく回避することができる；（ｉｉ）それは潜在的な将来の使用のために少数のＰＢまたはＣＢ幹細胞を貯蔵することを可能にする；そして（ｉｉｉ）それは悪性腫瘍を持つレシピエントの自家移植にしばしば付随する汚染の制限を回避する。かかる場合、自家浸出での腫瘍細胞の汚染は病気の再発をしばしばもたらし、ＣＤ３４＋幹細胞を選択して拡大させることは最終移植物における腫瘍細胞の負荷を減少させるであろう。
【０３４９】
加えて、拡大された幹細胞培養物はＴリンパ球を欠失しており、従ってＴ細胞が移植片対宿主病をもたらす異系移植で有利である（Ｋｏｌｌｅｒ  ＭＲ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  ＳＧ，Ｐａｌｓｓｏｎ  ＢＯ．Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８２：３７８，１９９３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  ｉｓｏｋａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ２０：４０４，１９９４）。
【０３５０】
臨床研究は、少数のＰＢ  ＣＤ３４＋細胞由来のｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された細胞の移植は高用量の化学療法で処理されたレシピエントにおける造血を回復をさせることが示されている。ただし、この結果はこれらの培養細胞の長期間のｉｎ  ｖｉｖｏでの造血能力を確実に結論付けることをまだ可能にするものではない。
【０３５１】
移植の成功のためには、血球減少相期間の短縮、並びに長期間の植え付けが重要である。中期および後期先祖細胞の移植物への包含はドナー由来の成熟細胞の生産を加速し、それにより血球減少相を短縮することができる。
【０３５２】
従って、かかる適用では、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された細胞が幹細胞に加えて一層分化した先祖細胞を含むことが造血の短期間の回復および長期間の復活を最適化するために重要である。中期および後期先祖細胞の拡大、特に好中球および多核球系譜に分化することを方向付けられている細胞の拡大は、幹細胞の拡大に付随してこの目的に役立つにちがいない（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８６：９５８，１９９５）。かかる培養物は骨髄を完全に除去されたレシピエントにおいて造血を回復させるために、並びに従来の放射線または化学療法の後でレシピエントの骨髄回復を短縮するための支持的な手段を与えるために有用であろう。上述の適用に加えて、本発明の教示は肝再生、筋肉再生および骨粗鬆症における適用のための骨成長の刺激に向けて適用されることもできる。本発明の教示は様々な悪性腫瘍、免疫不全、ウイルスおよび遺伝病の免疫療法を含む養子免疫療法の如き増大された免疫応答または不全機能の置換を必要とする症例にも適用されることができる（Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ＡＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．（１９９６）．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２：４６；Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：５５１；Ｐｒｏｔｔｉ  ＭＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｐｒｉｍｅ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．（１９９６）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：１２１０）。
【０３５３】
ＰＩ３−キナーゼのシグナル伝達経路に対する幹細胞の応答能力の低下は、ＰＩ３−キナーゼ活性および／または遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる調節剤の有効量の存在下で、好ましくは幹細胞の全ｅｘ  ｖｉｖｏ培養期間の０．１〜５０％、好ましくは０．１〜２５％、より好ましくは０．１〜１５％の期間、または全期間の間、幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏ培養することによる。本発明を実行する間に、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害剤への最初のパルス曝露が、培養環境から阻害剤を除去した後で細胞の拡大を生じるのに十分であることが明らかとなった。
【０３５４】
本発明のさらなる態様によれば、ＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現の特定の調節剤が細胞の分化を阻害することができるかどうかを決定するアッセイが与えられる。本発明のこの態様のアッセイは、前記調節剤の存在下または不在下で幹細胞の如き分化することができる細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋造血細胞）、先祖細胞または実質的に未分化の細胞株の細胞（ＵＳＰ−１およびＵＳＰ−３（Ｓｕｋｏｙａｎ  ＭＡ（２００２）Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ，３５（５）：５３５）、Ｃ６、ｃ２、Ｃｒ／Ａ−３、ＤＢ１、およびＢ６−２６（米国特許第６，１９０，９１０号）、ならびにＨ９．１およびＨ９．２（Ｏｄｏｒｉｃｏ  Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １９：１９３）などであるが、これらに限定されない）を培養する工程と、長期間（例えば、数週間から数ヶ月）細胞の分化の変化を監視する工程とを含む。未処理の細胞と比較した分化の増大は、ＰＩ３−キナーゼ活性または遺伝子発現の調節剤が分化を阻害することができないということを示し、未処理の細胞と比較した分化の欠失または減少は、調節剤が分化を阻害することができるということを示し、これは例えばここで開示される本発明の方法でＰＩ３−キナーゼ活性の調節剤として有効に用いられることができる。
【０３５５】
好ましくは、幹細胞集団または実質的に未分化の細胞株の細胞の培養を、有効量のサイトカイン（好ましくは、初期活動サイトカインまたはこのようなサイトカインの組み合わせ（例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）））の存在下で行う。当業者は、このアッセイを使用して、以下に列挙したどのアンタゴニストが以下にさらに記載の本発明の種々の方法、調製物、および製品の実施に最も有効であるかを決定することができる。最適な結果のために最も有効な濃度および曝露時間を、異なる起源の幹細胞を使用して得る。
【０３５６】
本発明のさらなる目的、利点、および新規の特徴は、制限を意図しない以下の実施例の実験によって当業者に自明である。さらに、上記の本発明および以下の特許請求の範囲に記載の各々の種々の実施形態および態様は、以下の実験により支持される。
【実施例】
【０３５７】
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。
【０３５８】
一般に、本明細書中で使用した用語および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編、１９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号、および同第５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編、１９９４；Ｓｔｉｔｅｓら編、“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ、１９９４；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは、特許および化学論文に広く記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号、および同第５２８１５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８５；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８４；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編、１９８６；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、第１〜１３７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６（その全てが本明細書中に完全に記載されているかのように参照として援用される）を参照のこと。他の一般的引例を、本明細書中に記載する。引例中の手順は当該分野で周知であると考えられ、読者の都合のために記載する。引例中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。
【０３５９】
実施例１
（ｅｘ  ｖｉｖｏでの造血細胞の拡大におけるＲＡＲアンタゴニストおよびその使用）
（材料と実験方法）
高親和性レチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＲＡＲ）の合成：
ＲＡＲアンタゴニスト４−｛［４−（４−エチルフェニル）２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロマン−６−イル］エチニル｝安息香酸（ＡＧＮ１９４３１０）の合成：
ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０を、Ｊｏｈｎｓｏｎによって記載された手順（２６）に一部修正を加えて合成した。
【０３６０】
３−（４−メトキシフェニルチオ）−３−メチル−酪酸の合成：
肉厚のねじ蓋付きチューブに、３−メチル−２−ブテン酸（１３．８６ｍｇ）、３，３−ジメチルアクリル酸（１３８．４ｍｍｏｌ）、４−メトキシチオフェノール（１４３．２ｍｍｏｌ）、およびピペリジン（４１．６ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れた。混合物を、１０５〜１１０℃で３２時間加熱し、室温に冷却した。反応混合物を、撹拌しながら酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（７００ｍｌ）に溶解させ、得られた溶液を１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍｌ×２）、水（５０ｍｌ）、および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍｌ）で洗浄した。その後、有機溶液をＮａＳＯ４上で乾燥させた。この有機溶液の減圧濃縮によってオイルが得られ、これを−２０℃で２日間インキュベートして結晶性固体を得た。４０ｍｌのペンタンを固体に添加し、粉砕し、そして濾過した。固体を、濾紙上でペンタン（２０ｍｌ、２回）を用いて洗浄し、淡黄色結晶として生成物３−（４−メトキシフェニルチオ）−３−メチル−酪酸を得た（３１．４ｇ、収率９４．４％、融点６２〜６４℃）。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８Ｈｚ），ｄ６．９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），ｄ３．９（ｓ、３Ｈ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ），ｄ２，６（ｓ，２Ｈ），ｄ１．３（ｓ，６Ｈ）］
【０３６１】
３−（４−メトキシフェニルチオ）−３−メチル−ブチリルクロライドの合成：
９３．６２ｍｍｏｌの塩化オキサリルを含む１０ｍｌのベンゼンを、３−（４−メトキシフェニルチオ）−３−メチル−酪酸の１００ｍｌベンゼン溶液に室温で３０分間かけて添加した。塩化オキサリルの添加時に、溶液は黄色に変色した。反応混合物を室温で４時間撹拌した後、反応溶液を５℃に冷却し、氷冷した５％ＮａＯＨ水溶液（５ｍｌ×６）で洗浄し（この手順で、大量のガスが発生する）、その後、氷冷した水（１５ｍｌ×２）、最後に飽和ＮａＣｌ水溶液（１５ｍｌ）で洗浄した。有機溶液をＮａＳＯ４上で乾燥させ、減圧濃縮して透明な黄色オイルとしてアシルクロライド生成物を得た。この物質を、さらに精製することなく次の工程で使用した。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ３．８（ｓ，３Ｈ），ｄ３．１（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４（ｓ，６Ｈ）。
【０３６２】
６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンの合成：
塩化スズ（ＩＶ）の３０ｍｌジクロロメタン溶液を、０℃で、３−（４−メトキシフェニルチオ）−３−メチル−ブチリルクロライドの１８０ｍｌジクロロメタン溶液に滴下し、暗赤色溶液を得た。０℃で２時間の反応混合物の撹拌後、水１１５ｍｌをゆっくり添加することによって反応を停止させた。暗赤色反応混合物は黄色になった。
【０３６３】
有機層を、１Ｍ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍｌ）、５％ＮａＯＨ水溶液（５０ｍｌ）、および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。得られた有機溶液を減圧濃縮し、真空蒸留して（１３５〜１４２℃、０．６ｍｍ／Ｈｇ）、残留淡黄色オイルとして６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンを得た（１１ｇ、８０．７％）。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．６（ｓ，１Ｈ），ｄ７．１（ｓ，１Ｈ），ｄ７．０（ｓ，１Ｈ），ｄ３．８（ｓ，３Ｈ），ｄ２．８６（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４６（ｓ，６Ｈ）］。
【０３６４】
６−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンの合成：
三臭化ホウ素（２０ｇ）を含む８０ｍｌジクロロメタンを、２０分かけて６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンの５０ｍｌジクロロメタン溶液に添加した。反応混合物を−２３℃に冷却し、５時間撹拌し、−７８℃に冷却し、その後５０ｍｌの水をゆっくり（０．５時間）添加することにより反応を停止させた。室温への加温後、無色沈殿を濾過した。有機層の分離後、水層を、１２０ｍｌジクロロメタンで抽出した。混合した有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）、水（５０ｍｌ）、および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。減圧下で有機溶媒を除去して、緑色固体（６ｇの粗生成物）を得た。この生成物を、１００ｍｌのジエチルエーテルに溶解させ、得られた溶液を３００ｍｌの石油エーテルで希釈した。−１５℃での一晩のインキュベーションにより、結晶性生成物を得た（２．３ｇ、収率４１％、融点１２２〜１２６℃）。濾過物を真空蒸発させ、残渣（３．４２ｇ）を３０ｍｌのジエチルエーテルに溶解させた。エーテル溶液を、１５０ｍｌの石油エーテルで希釈し、得られた混合物を−２０℃のフリーザーの中で一晩保持した。沈殿および溶液の濾過により、１．５ｇの生成物６−メトキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンを得た。この化合物を、３０ｍｌのジエチルエーテルに溶解させて再度沈殿させ、その後、２０ｍｌの石油エーテルで希釈した。４℃で一晩のインキュベーションにより、１ｇ（収率８０．７％、融点１３５〜１４２℃、０．６ｍｍ／Ｈｇ）の緑色結晶性生成物６−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンを得た。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．８（ｓ，１Ｈ），ｄ７．７（ｓ，１Ｈ），ｄ７．１（ｓ，１Ｈ），ｄ２．８（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４５（ｓ，６Ｈ）］。
【０３６５】
２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル−トリフルオロ−メタンスルホネートの合成：
６−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−チオクロマン−４−オンを含む無水ピリジンの撹拌溶液にトリフルオロメタンスルホン酸無水物を添加した。混合物を、０℃で４時間撹拌し、室温で一晩撹拌した。高真空下での濃縮により残渣を得、これをジエチルエーテル（７５ｍｌ）で処理した。ピリジンとトリフルオロメタンスルホン酸との塩の形成によって生じる沈殿物からエーテル溶液を分離した。エーテル溶液を水で洗浄し、その後ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。エーテルの除去後、残渣を結晶化させた。微量のピリジンを高減圧下で除去した。０．７ｇの粗生成物が得られ、１４ｇのシリカおよび２００ｍｌ石油エーテル：酢酸エチル（９５：５）溶液（１５ｍｌ展開液×１３）を使用してカラムクロマトグラフィによってさらに精製した。生成物画分の蒸発後、無色結晶として０．６２ｇの２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル−トリフルオロ−メタンスルホネートを得た（収率７６．５％、融点７０〜７４℃）。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．９（ｓ，１Ｈ），ｄ７．３（ｓ，２Ｈ），ｄ２．８（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４（ｓ，６Ｈ）］。
【０３６６】
２，２−ジメチル−６−トリメチルシラニル−エチニル−チオクロマン−４−オンの合成：
２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル−トリフルオロ−メタンスルホネートを含むトリエチルアミンおよびジメチルホルムアミドの溶液に、アルゴンを１０分間吹き込んだ。この溶液にトリメチルシリルアセチレンおよびビス［トリフェニルホスフィン］パラジウム（ＩＩ）クロライドを添加した。反応混合物を９５〜１００℃の浴中で加熱し、８８〜９０℃の反応温度を５時間保持した。反応溶液を室温に冷却し、２００ｍｌの水で希釈し、１００ｍｌの酢酸エチル（６０ｍｌ×３）で抽出した。得られた有機相を水（５０ｍｌ×２）および塩性溶液（５０ｍｌ）で洗浄した。最後に、有機溶液をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、得られた残渣を、４２ｇシリカおよび４００ｍｌ石油エーテル：酢酸エチル（９７：３）から構成される溶離系を使用してカラムクロマトグラフィによってさらに精製して、２，２−ジメチル−６−トリメチルシラニル−エチニル−チオクロマン−４−オンを得た（１．８２ｇ、収率７６．４％、融点６７〜７０℃）；［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．８（ｓ，１Ｈ），ｄ７．３（ｓ，２Ｈ），ｄ２．８（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４（ｓ，６Ｈ），ｄ０．２３（ｓ，９Ｈ）］。
【０３６７】
６−エチニル−２，２−ジメチルチオクロマン−４−オンの合成：
２，２−ジメチル−６−トリメチルシラニル−エチニル−チオクロマン−４−オンを含むメタノールおよび重炭酸カリウムの溶液を、室温で一晩撹拌した。炭酸カリウムを溶解させ、反応物を蒸発させて容量を３０〜４０ｍｌまで減少させ、水で（約７０〜１００ｍｌに）希釈し、氷水浴で冷却し、ジエチルエーテル（６０ｍｌ×３）で抽出した。混合した有機層を、３０ｍｌの水および飽和ＮａＣｌ水溶液（３０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。減圧下での溶媒の除去により、橙色固体として６−エチニル−２，２−ジメチルチオクロマン−４−オンを得た（１．３ｇ、収率９７．７％、融点６３〜６６℃）；［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．８（ｓ，１Ｈ），ｄ７．３（ｓ，２Ｈ），ｄ３．０（ｓ，１Ｈ），ｄ２．８（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４（ｓ，６Ｈ）］。
【０３６８】
エチル４−ヨードベンゾエートの合成：
４−ヨード安息香酸、２５ｍｌエチルアルコール、および２０ｍｌ乾燥ＨＣｌ溶液をエチルアルコール中に含む混合液を、２時間還流した。１時間のボイル後、固体を溶解させた。反応溶液を室温に冷却し、減圧下で蒸発させて１０ｍｌの容量にした。下部に、酸のエステルへの化学変換により有機層を形成させた。得られた混合物を、氷浴で冷却した。この混合物に８０ｍｌのジエチルエーテル、乾燥炭酸水素ナトリウム（１ｇ）、および５０ｇの氷を添加した。この溶液を撹拌し、飽和重炭酸ナトリウムの５０ｍｌ水溶液および水を溶解させることによって洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で蒸発させて、液体オイル生成物としてエチル４−ヨードベンゾエートを得た（５．４３ｇ、収率９６．１％）；［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ７．８（ｓ，１Ｈ），ｄ７．７９（ｓ，１Ｈ），７．６（ｓ，１Ｈ），ｄ４．４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），ｄ１．４（ｓ，３Ｈ）］。
【０３６９】
エチル４−［（２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル］−ベンゾエートの合成：
６−エチニル−２，２−ジメチルチオクロマン−４−オンおよびエチル４−ヨードベンゾエートを含む８０ｍｌのトリエチルアミン溶液を、アルゴンで１０分間パージした。この溶液に０．７ｇのＰｄ［ＰＰｈ３］２Ｃｌ２および０．１９ｇのＣｕＩを添加した。溶液にアルゴンをさらに５分間吹き込み、次いで室温で２日間撹拌した。反応混合物をセライトパッドで濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。濾過物を、減圧下で蒸発させた。固体残渣を、カラムクロマトグラフィ（４０ｇのシリカ、石油エーテル：酢酸エチル９５：５、７５０ｍｌ溶離溶媒系）によって精製して、エチル４−［（２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル］−ベンゾエートを得た（１．２６ｇ、収率５６．５％、融点１０２〜１０４℃）。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ８．２７５（ｓ，２Ｈ），ｄ７．６（ｓ，３Ｈ），ｄ７．５（ｓ，１Ｈ），ｄ７．２（ｓ，１Ｈ），ｄ４．３）（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７），ｄ２．８（ｓ，２Ｈ），ｄ１．４８（ｓ，３Ｈ）］。
【０３７０】
エチル４−［（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル］−ベンゾエートの合成：
ビス（トリメチルシリル）アミドナトリウム（０．６Ｍトルエン溶液）および１０ｍｌのテトラヒドロフランの溶液を−７８℃に冷却し、エチル４−［（２，２−ジメチル−４−オキソ−チオクロマン−６−イル）エチニル］−ベンゾエートを含む１０ｍｌテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液をゆっくり添加した。３０分後、反応混合物に２−［Ｎ，Ｎ−ビス（トリフルオロメタンスルホニル）アミノ］ピリジンを含む７ｍｌ  ＴＨＦ溶液を添加した。５分後、冷却浴を取り除き、反応溶液を室温に加温し、一晩撹拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍｌ）の添加によって反応を停止させた。２つの溶媒層が形成された。溶液混合物を、酢酸エチル（７５ｍｌ）で抽出した。混合した有機層を、５％ＮａＯＨ水溶液（１０ｍｌ）および水（１５ｍｌ×２）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、次いで減圧下で濃縮した。粗生成物（１．７４ｇ）を、３５ｇシリカおよび２％酢酸エチル／石油エーテル（５００ｍｌ、２０×２５ｍｌ）溶離系を用いてカラムクロマトグラフィによって精製した。混合した溶離生成物の画分の蒸発後、淡黄色固体としてエチル４−［（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメタンスルホニルオキシ）−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル）エチニル］−ベンゾエートを得た（１．１６ｇ、収率７１％、融点１００〜１０４℃）。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ８．２（ｓ，２Ｈ），ｄ７．６（ｓ，３Ｈ），ｄ７．５（ｓ，１Ｈ），ｄ７．２（ｓ，１Ｈ），ｄ６．０（ｓ，１Ｈ），ｄ４．４（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝２４Ｈｚ）］。
【０３７１】
エチル４−［［４−（４−エチルフェニル）−２，２−ジメチル−［２Ｈ］−チオクロメン−６−イル］−エチニル］−ベンゾエートの合成：
ｐ−ブロモ−エチル−ベンゼンを含む４ｍｌのＴＨＦ溶液（−７８℃に冷却）に、７．２５ｍｌの１．７Ｍ  ＬｉＣ（ＣＨ３）３を含むペンタンを添加した。６５８．７ｍｇの塩化亜鉛を含む８ｍｌ  ＴＨＦ溶液を添加し、反応混合物を室温に加温し、４０分間撹拌し、その後、エチル４−［（２，２−ジメチル−４−トリフルオロメチルスルホニル）−（２Ｈ）−チオクロメン−６−イル］エチニル］ベンゾエートおよびＰｄ（ＰＰｈ３）４を含む８ｍｌ  ＴＨＦを含む第２のフラスコに移した。得られた溶液を５０℃で２時間加熱し、室温で一晩撹拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍｌ）を１０分間かけて添加して反応を停止させた。２つの層が形成された。混合物を、７５ｍｌ酢酸エチルで抽出し、混合した有機層を、水（１０ｍｌ）および飽和ＮａＣｌで洗浄した。ＭｇＳＯ４上での有機溶液の乾燥後、溶液を減圧下で濃縮し、２４ｇシリカおよび石油エーテル：酢酸エチル（９５：５）溶離系（２００ｍｌ）を使用してカラムクロマトグラフィによって精製して、エチル４−［［４−（４−エチルフェニル）−２，２−ジメチル−［２Ｈ］−チオクロメン−６−イル］−エチニル］−ベンゾエートを得た。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：ｄ８．２（ｓ，２Ｈ），ｄ７．６（ｓ，２Ｈ），ｄ７．４（ｓ，２Ｈ），ｄ７．２（ｓ，１Ｈ），ｄ７．１（ｓ，２Ｈ），ｄ７．０（ｓ，２Ｈ），ｄ６．０（ｓ，１Ｈ），ｄ４．４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２４Ｈｚ），ｄ２．８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝１５Ｈｚ），ｄ１．６（ｓ，６Ｈ），ｄ１．４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝１４Ｈｚ）］。
【０３７２】
４−［［４−（４−エチルフェニル）−２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロマン−６−イル］−エチニル］−安息香酸の合成：
エチル４−［［４−（４−エチルフェニル）−２，２−ジメチル−［２Ｈ］−チオクロメン−６−イル］−エチニル］−ベンゾエートを含むＴＨＦおよびエタノール溶液に、２ｍｌの２Ｍ  ＮａＯＨ溶液を添加した。溶液を４０℃に加熱し、一晩撹拌し、その後室温に冷却した。反応混合物を、１Ｎ  ＨＣｌ（４ｍｌ）で酸性化した。プロセスの開始時に、反応混合物は不均一な系を形成した。混合物を酢酸エチル（２５ｍｌ×２）で抽出した。混合した有機層を、１０ｍｌ水、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。残存固体（０．３１ｇ）をアセトニトリル（２５ｍｌ）から再結晶させて、無色の固体として４−［［４−（４−エチルフェニル）−２，２−ジメチル−（２Ｈ）−チオクロマン−６−イル］−エチニル］−安息香酸（ＡＧＮ１９４３１０）を得た（０．２３６ｇ、７０％）（融点２１０〜２１２℃）。［１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：ｄ８．２（ｓ，２Ｈ），ｄ７．８（ｓ，２Ｈ），ｄ７．６（ｓ，２Ｈ），ｄ７．４（ｓ，２Ｈ），ｄ７．２（ｓ，２Ｈ），ｄ７．０（ｓ，１Ｈ），ｄ６．０（ｓ，１Ｈ），ｄ２．６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝３５Ｈｚ），ｄ１．６（ｓ，６Ｈ），ｄ１．４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝４６Ｈｚ）］。
【０３７３】
単核細胞画分の回収および精製：
ヒト血球を、月満ちて生まれた正常な出産後の女性患者の臍帯血から得た（インフォームドコンセントを得た）。サンプルを回収し、分娩１２時間以内に処理した。血液を、３％  Ｇｅｌａｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合し、３０分間沈殿させてほとんどの血球を除去した。白血球を多く含む画分を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（１．０７７ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）に重層し、４００ｇで３０分間遠心分離した。境界層中の単核細胞画分を回収し、３回洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｓｉｇｍａ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）に再懸濁した。
【０３７４】
単核細胞画分からのＣＤ３４＋細胞の精製：
ＣＤ３４＋単核細胞を精製するために、画分を、製造業者により推奨されるようにＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）またはＣｌｉｎｉｍａｘ（登録商標）ＣＤ３４先祖細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用して２サイクルの免疫磁性分離に供した。フローサイトメトリーによって決定したところ（以下を参照のこと）、得られたＣＤ３４＋集団の純度は、９５％〜９８％の範囲であった。
【０３７５】
ＣＤ３４＋集団をＣＤ３４＋３８−またはＣＤ３４＋Ｌｉｎ−小画分へとさらに精製するために、精製したＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３８（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）または系統抗原（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｒｅｒｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）についてさらに標識した。ネガティブに標識された画分を測定し、ＦＡＣＳソーターで分離した。
【０３７６】
ＣＤ３４−Ｌｉｎ−の精製のために、ネガティブ選択カラム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＣＤ３４−画分を系統抗原を発現する細胞から除去した。
【０３７７】
ＣＤ３４＋／−細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大：
上記のＣＤ３４＋を発現する精製した細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を補充したアルファ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中で、１０４細胞／ｍｌの濃度で２４ウェルＣｏｓｔａｒ細胞培養クラスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）または培養バッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏｒｐ）にて培養した。以下のヒト組換えサイトカインを添加した：トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）（最終濃度は全てそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌであるが、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−３をＳＣＦと共にまたはその代わりに添加した）。非造血系細胞の分裂には、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＬＩＦ、または肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を単独または種々の組み合わせで増殖培地に補充して使用した。使用した全てのサイトカインは、Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入した。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿空気中でインキュベートした。
【０３７８】
あるいは、単核細胞画分（ＭＮＣ）全体を、上記のように単離し、培養し、サイトカインを補充した。
【０３７９】
１週間間隔で、細胞培養物を減らし（ｔｏｐｅ）、細胞数を半分に減らし、新鮮な培地、血清、およびサイトカインを補充するか、または新鮮な成長培地のみを補充した。所定の時点で、細胞を、採取し、トリパンブルーで染色し、計数し、そしてサイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ，ＵＫ）（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａ溶液で染色した塗抹標本）を使用して細胞の形態を決定した。
【０３８０】
ｅｘ  ｖｉｖｏの造血幹細胞／先祖細胞培養物へのＲＡＲアンタゴニストの補充：
上記のように精製したＣＤ３４＋培養物および全ＭＮＣ培養物を調製し、維持した。１×１０−３〜１×１０−１１Ｍ（または４１０μｇ／ｌ〜４．１×１０−５μｇ／ｌ）の範囲の濃度でＡＧＮ１９４３１０ＲＡＲアンタゴニストを試験培養物に添加した。３週間までの所定の限られた期間、または全培養期間の間連続してアンタゴニストを添加した。
【０３８１】
形態学的評価：
サイトスピン（Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）によりスライドガラス上に堆積した細胞のアリコートについて、得られた培養集団の形態学的特徴づけを行った。細胞を固定し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａ染色液で染色し、顕微鏡で試験した。
【０３８２】
表面抗原分析：
細胞を採取し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ溶液で洗浄し、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリン結合抗体（全てＩｍｍｕｎｏｑｕａｌｉｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて４℃で６０分間染色した。次いで、細胞を同じ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳキャリバまたはＦａｃｓｔａｒｐｌｕｓフローサイトメーターによって分析した。シース液として生理食塩水を使用して、細胞を１０００細胞／秒の速度で通過させた。４８８ｎｍのアルゴンレーザビームを励起光源として使用した。対数増幅を使用して１０，０００個の細胞の発光を測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。マウスＩｇＧ−ＰＥ（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびマウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、細胞のネガティブコントロール染色を行った。
【０３８３】
ＣＤ３４および他の造血マーカーの発現の決定：
精製したＣＤ３４＋細胞または全ＭＮＣ画分のいずれかを用いて開始した短期および長期培養物について、ＣＤ３４表面発現を、以下のように決定した：ＣＤ３４＋細胞を再度ポジティブ選択し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉキット）、計数した。その後、ＦＡＣＳおよび細胞形態分析によって、純度を確認した。
【０３８４】
再選択したＣＤ３４＋細胞サブセットを、以下の抗原の組み合わせで染色した：ＣＤ３４ＰＥ／ＣＤ３８ＦＩＴＣおよびＣＤ３４ＰＥ／３８，３３，１４，１５，３，４，６１，１９（Ｌｉｎ）ＦＩＴＣ。ＣＤ３４について陽性であり、ＣＤ３８については陰性である画分を、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−と定義した。ＣＤ３４について陽性でＬＩＮについては陰性の画分を、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞画分と定義した。
【０３８５】
細胞集団の計算：
ＦＡＣＳ分析の結果を、細胞の比率で示す。サブセットの絶対数を、ＣＤ３４＋細胞の絶対数から計算する。
【０３８６】
ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞のベースラインレベルの決定を、以下のように行った：ＣＤ３４＋細胞を３つの解凍臍帯血単位から精製し、上記マーカーについて染色した。これらの実験の平均を、ベースライン値と見なした。
【０３８７】
総細胞数、ＣＤ３４＋細胞およびサブセットの数、ならびにＣＦＵ数を、培養物が継代されていないということを前提として、累積数（すなわち、ｍｌあたりの細胞数×実施した継代の数）として示す。
【０３８８】
コロニー形成単位（ＣＦＵ）能力のアッセイ：
２ＩＵ／ｍｌエリスロポイエチン（Ｅｐｒｅｘ，Ｃｉｌａｇ  ＡＧ  Ｉｎｔ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、幹細胞因子、およびＩＬ−３（共に２０ｎｇ／ｍｌ）、ならびにＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（共に１０ｎｇ／ｍｌ）（全てＰｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ）を補充した半固体メチルセルロース含有培地中で細胞をクローニングした。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿空気中で１４日間インキュベートした。
【０３８９】
ＬＴＣ−ＣＦＵ値の決定：
簡単に述べれば、培養物の自己再生を維持する能力を、上記引例に記載されているように、長期および延長した長期培養物におけるコロニー形成単位細胞（ＬＴＣ−ＣＦＵ）の含有量の決定によって測定した。
【０３９０】
（実験結果）
富化させたＣＤ３４＋集団のＲＡＲアンタゴニストでの処理により、表面分化マーカー発現が変化し、短期培養物でほとんど分化していない表現型を示す多数の細胞が得られる：
幹細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大に対するレチノイド受容体アンタゴニストの効果を決定するために、異なる濃度のレチノイン酸受容体アンタゴニストＡＧＮ１９４３１０を用いて、またはそれを含めずに、４つのサイトカイン組み合わせの存在下でのＣＤ３４＋細胞富化培養を開始した。最初の播種から２週間後、ＣＤ３４＋マーカー（最も系統が方向付けられた先祖細胞と考えられる）を有している細胞の割合ならびにマーカーＣＤ３４＋／ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−（幹細胞および初期先祖細胞画分を示すと考えられる）を有している細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。
【０３９１】
ＦＡＣＳ分析プロットを、図１Ａ〜Ｃに示す。レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストで処理した培養物は、サイトカインのみで処理した培養物と比較して類似の総細胞数およびＣＤ３４＋細胞数を含んでいた。ＲＡＲアンタゴニストでの処理によりＣＤ３８抗原の発現は完全に消滅し、同時に、さらなる分化に関する抗原ＣＤ３３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ６１の発現が有意に阻害された。これは全く予想外の現象であった。以下の表１に、ＦＡＣＳの分析データをまとめる。
【０３９２】
【表１】
2006521813.tif 000002
【０３９３】
さらなる実験では、幹細胞および初期先祖細胞のサブセットを、再選択したＣＤ３４＋細胞画分からの２週間の拡大後に測定した。培養２週間後、ＣＤ３４＋細胞を再選択し、上記のように、ＦＡＣＳによって表面マーカーＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−の存在について分析した（図２）。再選択したＣＤ３４＋細胞のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物については、表面発現がＣＤ３４＋ＣＤ３８−で１０００倍、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−で５００倍増加した。非常に対照的に、サイトカインのみで処理した再選択したコントロール培養物については、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ではわずかに３６倍の拡大、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−画分ではわずかに８倍の拡大であった。表面抗原発現の顕著な相違にもかかわらず、総細胞数および総ＣＤ３４＋細胞数は全ての培養物について類似していた。これらの結果は、ＲＡＲアンタゴニストにより幹細胞画分を好ましく顕著に増殖させるが、分化は依然として制限することを示す。したがって、ＲＡＲアンタゴニストは、短期間の培養の間にこれらの稀な細胞を高倍率に拡大させることに対して強い影響を与える。アンタゴニストは、より成熟したある系統への分化増殖能力を獲得したＣＤ３４＋細胞に対しては正負のいずれの影響も与えないとも結論付けることができる。
【０３９４】
富化させたＣＤ３４＋集団のＲＡＲアンタゴニストでの処理により、表面分化のマーカーの発現が変化し、長期培養でほとんど分化していない表現型を示す多数の細胞が得られる：
ＲＡＲアンタゴニストが幹細胞画分により高い自己再生能力を与えることができるかを見出すために、ＣＤ３４＋細胞およびサブセットの長期拡大に対する、限られた短期（２〜３週間）のＲＡＲアンタゴニストでの培養物の処理の効果を、試験した。培養物を、最初の３週間の間だけＲＡＲアンタゴニストで処理し、その後さらに８週間アンタゴニストが存在しない状況でインキュベートした。ＣＤ３４＋細胞の短期および長期拡大に対するアンタゴニストの効果を決定するために、示した間隔で（図３）培養物から代表サンプルを採取し、ＣＤ３４＋細胞を再選択した。ＣＤ３４＋の表面発現を、ＦＡＣＳ分析によって再度決定し、その後ポジティブ選択工程を行った（図５Ｂ）。最初の３週間のインキュベーションの間には、ＣＤ３４＋を有している細胞数に関してコントロールとＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物との間に有意差はなかった。さらなる８週間のインキュベーション後（培養１１週間）、ＲＡＲアンタゴニストで前処理した培養物については、表面ＣＤ３４＋抗原発現の持続的な長期間の増大が認められたが（図３Ａ）、コントロール培養物ではＣＤ３４＋細胞は検出されなかった。３〜１１週間の間にＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物で発現が９２倍に増加し、この画分は培養開始から１６２１倍に拡大した。
【０３９５】
高度に精製したＣＤ３４＋について再選択した画分において、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−表面マーカーの発現を検証した（図３Ｂ−Ｃ）。培養２週間後、コントロールサンプルでは、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−表面発現が小幅な１０倍増加であり、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物は５３０倍の顕著な拡大を示した。１１週目（アンタゴニストでの処理の終了から９週間後）には、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−発現は１６，７００倍に増加した。ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物とコントロール細胞との拡大倍率の比較により、前者のみが延長した長期培養において幹細胞の増殖を有意に持続させることができることが示される。ＲＡＲアンタゴニストが存在しない状況での幹細胞の拡大の持続は、比較的短いアンタゴニストのパルスでさえも幹細胞応答の改変に十分であることを示している。
【０３９６】
さらなる実験では、培養物をわずか１週間だけ、サイトカインのみ（コントロール）またはサイトカインとＲＡＲアンタゴニストで処理した。以下の表２に示す結果で証明されるように、１３週間のインキュベーションでＲＡＲアンタゴニストの顕著な長期効果が認められた。２０週間で、ＲＡＲアンタゴニストで前処理した培養物が劣化し、細胞は正常に分化するが、コントロールよりも速度は遅い。これらの結果は、ＲＡＲアンタゴニストは幹細胞を一時的に増殖させるが、その自己再生能は依然として保たれるので、ｅｘ  ｖｉｖｏ条件での幹細胞の増殖能力を劇的に調節するには１週間のＲＡＲアンタゴニストでの処理で十分であることを示している。
【０３９７】
【表２】
2006521813.tif 000003
【０３９８】
ＲＡＲアンタゴニストによって可能となった限られた大量且つ継続的な細胞増殖を別の実験でさらに証明する。ここでは、ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−７Ｍまたは０．４１μｇ／ｌ）を補充したｅｘ  ｖｉｖｏ培養物が、培養細胞の最初の播種からわずか１１週間後までではあるが細胞を増殖させることができることを示す（図４）。ＣＦＵ形成能力を同様にアッセイしたが、ピークコロニー形成単位能は、約１週間までにＣＤ３４＋細胞のピーク絶対数を超え、直後に増殖が急激に減少し、その時点で細胞分化が起こり、これは培養物のクローン形成能力（ＣＦＵ形成能）の喪失によって証明される。幹細胞の正常な挙動を示すこれらの結果（すなわち、大量増殖後の分化）は、ドミナントネガティブレチノイド受容体遺伝子の組み込みにより無限の増殖が持続する（言い換えれば、細胞株が作製される）（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００１  Ｊｕｌ  ２７：２８５（４）：８９１−６“ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）という以前の報告とは全く対照的ではあるが、本発明では、延長したｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖後に、細胞は完全に正常に分化することができる。
【０３９９】
再選択から２週間および１１週間後のＣＤ３４＋細胞の代表的なＦＡＣＳチャートプロットを、図５に示す。発現プロフィールの左側へのシフトによって明らかであるように、コントロール培養物はより分化した状態についてのマーカーを発現し、ＲＡＲアンタゴニストで処理したサンプルはほとんど分化していない表現型を発現した。これらの所見は、系統ネガティブではないが、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物から得られたほとんどのＣＤ３４＋細胞がごくわずかにしか系統に関連する表面マーカーを発現しないことを示している。
【０４００】
単核細胞集団のＲＡＲアンタゴニストでの処理によりほとんど分化していない表現型を示す細胞集団が拡大する：
ＲＡＲアンタゴニストおよびサイトカインの存在下で培養した単核細胞画分は、同様に、最初の播種から２週間後および５週間後（それぞれ）に再選択した高度に精製したＣＤ３４＋細胞画分からＦＡＣＳ分析で定量したところ、コントロールと比較して、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞数の有意な増加を示した（７８％、２４％）（表３）。しかし、これらの細胞は、ＣＤ３４＋集団の精製を先に行わない混合培地条件でもなお、ＲＡＲアンタゴニストに応答し、未分化の集団を拡大させることが最も顕著である。ＲＡＲアンタゴニストでの処理は、播種から５週間後で幹細胞／先祖細胞画分の特異的拡大を刺激するのに十分である一方で、コントロールのＭＮＣでは検出可能なＣＤ３４＋集団は得られず、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物では有意な数のＣＤ３４＋細胞が得られ、これらは系統マーカーを欠いていた。したがって、コントロールサンプル中でのＣＤ３４＋細胞の生存を抑制するＭＮＣ培養細胞によって詳しく調べられた全ての因子では、この画分を詳しく調べるためにＲＡＲアンタゴニストによって得られたシグナルを超えるには不十分である。
【０４０１】
【表３】
2006521813.tif 000004
【０４０２】
ＲＡＲアンタゴニストでの処理は長期培養コロニー形成単位（ＬＴＣ−ＣＦＵｃ）能力を増大させる：
培養物のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を形成する能力の証明は、高い自己再生能力を有する幹細胞および初期先祖細胞の存在を検証するための別の実用的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。ここでは、延長した長期培養期間の間の漸増数のＣＦＵ細胞の存在によって証明されるように、ＲＡＲアンタゴニストで前処理した培養物が自己再生能力を有する細胞をさらに拡大させることができることを証明する。
【０４０３】
長期ＣＤ３４＋細胞培養物に、種々の所定の濃度のＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０とともに、またはそれを含めずに、４つのサイトカイン（ＦｌＴ３、ＴＰＯ、ＩＬ−６、およびＩＬ−３）の組み合わせを補充した。培養物のＲＡＲアンタゴニストでの処理を、３週間に制限するか、または全培養期間継続させた。短いパルスまたは継続した２用量のＲＡＲアンタゴニストで処理した長期（６週間）培養物についてＣＦＵの形成能力を決定し、サイトカインのみで処理したコントロールサンプルと比較した。アンタゴニストで最初の３週間パルスした長期培養物は、コントロール培養物と比較してＣＦＵ含有量が５倍であった（図６Ａおよび６Ｂ）。混合コロニーの計数により、コントロール培養物はいかなる混合コロニー形成単位細胞も含まず、アンタゴニストで処理した培養物は非常に多数のＣＦＵ混合能力を有する細胞を含むことが示された（図７）。
【０４０４】
ＲＡＲアンタゴニストでの処理は延長した長期培養コロニー形成単位（ＬＴＣ−ＣＦＵｃ）能力を増大させる：
同様に、ＲＡＲアンタゴニストで処理した延長した長期（８〜１０週間）培養物についてのＣＦＵｃ形成能力を決定した。この培養期間の間に、ＣＦＵ含有量の差は顕著に明白になった。ＲＡＲアンタゴニストでの処理により、コントロール培養物と比較して６週〜１０週の間にＣＦＵｃ含有量は顕著に増加し、ＣＦＵ能力を有する細胞を再生する能力が失われた（図６Ａおよび６Ｂ）。ＲＡＲアンタゴニストでのパルス処理または連続処理により、ＣＦＵ含有量が１５×１０４まで増加した。同様に、アンタゴニストでのパルス処理により、最も高レベルのＣＦＵ混合含有量が得られた（図７）。
【０４０５】
実施例２
（ｅｘ  ｖｉｖｏでの肝細胞拡大におけるＲＡＲアンタゴニストおよびその使用）
（材料と実験方法）
初代肝細胞の単離および培養：
３つの完全な肝臓を、３週齢のＶＬＶＣ雌マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）から採取し、切断し、ＤＭＥＭ（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）で２回洗浄し、０．０５％コラゲナーゼを含むＤＭＥＭ中で３７℃で３０分間インキュベートし、粉砕して２００μｍメッシュの篩にかけ、それぞれの肝細胞を得た。細胞を２回洗浄し、トリパンブルーを使用して生存を確認した。細胞を、コラーゲンをコーティングした３５ｍｍの組織培養プレートに、４×１０４生細胞／ｍｌの密度でＦ１２培地（１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．１％グルコース、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、グルタミン、０．５単位／ｍｌインスリン、７．５ｍｃｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、および１０％ウシ胎児血清を含む）にプレートした。１２時間後に培地を交換し、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、新しい培地を加えた。培地を１週間に２回交換した。
【０４０６】
肝細胞もまた、Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＲＥ，Ｒｅｙｅｓ  Ｍ，Ｋｏｏｄｉｅ  Ｌ，Ｊｉａｎｇ  Ｙ，Ｂｌａｃｋｓｔａｄ  Ｍ，Ｌｕｎｄ  Ｔ，Ｌｅｎｖｉｋ  Ｔ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｓ，Ｈｕ  ＷＳ，Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ  ＣＭ．Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００２；１０９（１０）：１２９１−３０２）に記載されたように、全培養期間の間、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子β鎖（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−４）、および肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（それぞれ２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で成長させた。肝細胞を、Ｒｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｒｕｎｇｅ  Ｄ，Ｒｕｎｇｅ  ＤＭ，Ｊａｇｅｒ  Ｄ，Ｌｕｂｅｃｋｉ  ＫＡ，Ｂｅｅｒ  Ｓｔｏｌｚ  Ｄ，Ｋａｒａｔｈａｎａｓｉｓ  Ｓ，Ｋｉｅｔｚｍａｎｎ  Ｔ，Ｓｔｒｏｍ  ＳＣ，Ｊｕｎｇｅｒｍａｎｎ  Ｋ，Ｆｌｅｉｇ  ＷＥ，Ｍｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＫ．Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ，ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２６９（１）：４６−５３）にしたがって、無血清培地中でも成長させた。
【０４０７】
上記肝細胞培養条件の全てにおいて、細胞を、１０−５Ｍ〜１０−９Ｍの濃度範囲のレチノイン酸アンタゴニストＡＧＮ１９４３１０の存在下またはそれを含まない条件下で増殖させた。
【０４０８】
３週間後、１０−５Ｍのアンタゴニストで処理した培養物を、０．２５％トリプシンで分離し、分割し、１：２の比率で再度プレーティングした。細胞を、下記のように免疫染色するか、またはギムザ染色で視覚化した。
【０４０９】
ＥＧＦおよびＨＧＦを補充したマウス肝細胞培養物を、初代培養物または以下の第１継代物および第２継代物として評価した。下記のように、第１継代培養物を、２週間成長させ、１：２に分割し、８日後にアルブミンの存在について免疫染色した。第２継代培養物を同様に２週間成長させ、１：２に分割し、さらに１週間成長させ、１：４に分割し、４日後に同様に免疫染色した。
【０４１０】
組織学的特徴づけ：
肝細胞およびｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた細胞を、その細胞培養プレート中で直接メタノールで固定し、各手順を、以下に概説した標準的な手順によって行った。
【０４１１】
肝細胞の機能のマーカーとして一般的に使用されている培養肝細胞による有機アニオンの細胞取り込みを、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）色素取り込みによって調べた。ＩＣＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）を、ＤＭＥＭ中に溶解させて最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした（Ｙａｍａｄａ  Ｔ，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍ，Ｋａｎｄａ  Ｓ，Ｋａｔｏ  Ｙ，Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｙ，Ｉｓｈｉｚａｋａ  Ｓ，Ｔｓｕｎｏｄａ  Ｙ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００２；２０（２）：１４６−５４）。１０日間培養した肝細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４００μｌの色素と共に３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳで３回リンスし、光学顕微鏡で観察した。
【０４１２】
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させた細胞および肝細胞を、製造業者（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）の説明書に従ってギムザ染色にて室温で４分間染色し、緩衝液中で４分間洗浄し、リンス溶液で３〜４回洗浄した。
【０４１３】
免疫細胞化学：
マウス由来のＡＦＰと交差反応するヒト起源の組換えタンパク質に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体（Ｈ−１４０  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用してα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現について、およびマウスアルブミンに対するウサギ抗血清（Ｃａｐｐｅｌ−ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，Ｏｈｉｏ）を使用してアルブミンの発現について、肝細胞をプローブした。細胞を、メタノール中で−２０℃で１０分間固定し、ＰＢＳで５分間リンスし、０．１％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）を含むＰＢＳ中に５分間浸した。次いで、細胞を、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で５分間洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳとともに１０分間インキュベートした。ペルオキシダーゼブロック（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）との室温で５分間のインキュベーションによって内因性ペルオキシダーゼを不活化した。細胞を、マウスアルブミン（１００倍希釈）に対して、またはα−フェトプロテイン（２５倍希釈）に対してウサギ中で惹起させた抗体とともに３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、ペルオキシダーゼ活性（製造業者の説明書にしたがってＥｎｖｉｓｉｏｎ  ＨＲＰ−システム（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用した方法）について視覚化し、ヘマトキシリン（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で対比染色した。
【０４１４】
（実験結果）
サイトカインを含まない培地で増殖させた３週齢のマウス肝臓由来の初代培養物を、α−フェトプロテイン（ほとんど分化していない先祖細胞に特異的なマーカー）および成熟肝細胞のマーカーであるアルブミンなどの初期発生マーカーを含む肝細胞特異的マーカーの発現について培養３週間後にプローブした。培養細胞は、α−フェトプロテイン（赤褐色沈殿）（図８Ａ）およびアルブミン（データ示さず）についてポジティブに染色され、これは、機能的肝細胞の存在を示している。１０−５Ｍレチノイン酸アンタゴニストの存在下での培養物のインキュベーションにより、コントロール培地と比較してα−フェトプロテインについてポジティブに染色された細胞画分が増加した（図８Ｂ）。この増加は、初期肝細胞の増殖を示し得る。同様に、培養物のギムザ染色によりレチノイン酸アンタゴニストで処理した培養物において楕円形細胞（肝幹細胞先祖細胞は楕円形細胞として定義される）の大きな集団が認められ（図９Ｂ）、一方でこれは、未処理のコントロール培養物ではほとんど認められなかった（図９Ａ）。
【０４１５】
アンタゴニストの存在下およびサイトカインを含まない条件下で３週間増殖させた肝細胞培養物を、トリプシン処理し、分割し、再度プレーティングした。細胞は培養プレートに再接着し、典型的な肝細胞形態を示した（図９Ｃ）。これは、特にサイトカインを含まない条件下で長期間の培養において初代肝細胞を増殖させることが困難であることを示す以前のデータとは対照的である（Ｗｉｃｋ  Ｍ，Ｋｏｅｂｅ  ＨＧ，Ｓｃｈｉｌｄｂｅｒｇ  ＦＷ．Ｎｅｗ  ｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：Ｃｅｌｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ＡＬＴＥＸ．１９９７；１４（２）：５１−５６；Ｈｉｎｏ  Ｈ，Ｔａｔｅｎｏ  Ｃ，Ｓａｔｏ  Ｈ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｃ，Ｋａｔａｙａｍａ  Ｓ，Ｋｏｈａｓｈｉ  Ｔ，Ａｒａｔａｎｉ  Ａ，Ａｓａｈａｒａ  Ｔ，Ｄｏｈｉ  Ｋ，Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ  Ｋ．Ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｓｈｏｗ  ａ  ｈｉｇｈ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９  Ｍａｒ  ５；２５６（１）：１８４−９１；Ｔａｔｅｎｏ  Ｃ，Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ  Ｋ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｎｏｒｍａｌ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９６；１４８（２）：３８３−９２）。
【０４１６】
ＲＡＲアンタゴニストで処理した初代肝細胞の培養において成長因子を培養培地に補充することにより、成長因子を補充したがＲＡＲアンタゴニストを加えなかったコントロール培養物と比較して、補充した培養物がα−フェトプロテイン産生についてポジティブに染色され（図１０Ｃ）、免疫染色が明らかではなかった（図１０Ｄ）という点で補充していない培地と類似の結果が得られた。アルブミンの発現についてのプローブすることによって決定されたバックグラウンド染色は、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物（図１０Ａ）および未処理の補充した培養物（図１０Ｂ）においてごく僅かであった。したがって、成長因子のみを補充した培養物では、ほとんど分化していない細胞表現型の拡大に不十分である。
【０４１７】
同様に、成長因子を補充した肝細胞培養物の第１および第２継代物について、その培養継続能力を評価した。成長因子を補充した第１継代培養物では、ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物（図１１Ｂ）および未処理のコントロール培養物（図１１Ａ）は、典型的な肝細胞の存在を示したが、ＲＡＲで処理した培養物（図１１ＣおよびＤ）だけは、肝幹細胞集団を示す多数の楕円形細胞の島を示した。
【０４１８】
成長因子を補充した第２継代培養物は、ＲＡＲで処理した培養物（図１１Ｆ）と比較してコントロール培地（図１１Ｅ）で肝細胞数が顕著に減少し、これは、成長因子のみの補充では培養において肝細胞を拡大および維持できないことを示す。ＲＡＲアンタゴニスト処理のみによって、肝細胞集団の発現と長期培養が可能であった。
【０４１９】
実施例３
（ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞拡大におけるＲＸＲおよびＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストおよびその使用）
（材料と実験方法）
ＲＸＲアンタゴニスト（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−［３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸（ＬＧＮ１００７５４）の合成：
ＬＧＮ１００７５４の合成は、以下に基づいて行った：（ｉ）Ｃａｎａｎ−Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９，１７，３２２９−３２３４（反応スキーム、ｐ３２３１）および（ｉｉ）タイトル「二量体選択性ＲＸＲモジュレータおよびその使用方法」の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４８７６（ＷＯ９７／１２８５３）の合成プロトコール。全ての材料を、Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から購入した。
【０４２０】
６−エチニル−１，１，４，４−テトラメチル−７−プロポキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレンの合成：
室温の窒素雰囲気下でオキシ塩化リン（０．２３４ｇ、０．１４２ｍｌ、１．５２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４ｍｌ）に滴下した。溶液を３０分間撹拌した。橙色溶液に１−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）エタノンを急激に（１回で）添加し、反応溶液を、６０℃に加熱し、１２時間撹拌した。得られた暗褐色溶液を氷水に注ぎ、水層を固体炭酸水素ナトリウムでｐＨ７に調整した。酢酸エチル抽出によって、橙色／褐色オイルとして粗生成物クロロエナル（ｃｈｌｏｒｏｅｎａｌ）（６−［１−ヒドロキシ，２−クロロ−エテニル］−１，１，４，４−テトラメチル−７−プロポキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン）（０．１２８ｇ）が得られた。粗クロロエナルを含むジオキサン：水（３：２；５ｍｌ）溶液を、８０℃で、ＮａＯＨ（０．０６１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）を含むジオキサン：Ｈ２Ｏ（３：２；２０ｍｌ）溶液に添加し、反応混合物を２時間撹拌して橙色反応溶液を得た。反応溶液を室温に冷却し、塩性溶液中に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して橙色オイルとした。これをラジアル（ｒａｄｉａｌ）クロマトグラフィ（１０：１  ヘキサン：酢酸エチル）によって精製して、黄色オイルとして生成物６−エチニル−１，１，４，４−テトラメチル−７−プロポキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン（３９％）を得た。［１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ７．３８（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７６（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），３．９８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ３），３．１９（ｓ，１Ｈ，ＣＨ），１．８３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．６６（ｍ，２Ｈ，２ＣＨ２），１．２６（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．２３（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），０．９３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）］
【０４２１】
３−（３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）プロピンニトリルの合成：
臭化エチルマグネシウム（３．３３ｍｌの１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液、３．３２ｍｍｏｌ）を、室温のアセチレンエーテル（６−エチニル−１，１，４，４−テトラメチル−７−プロポキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン）（０．４５０ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に滴下した。溶液を６時間加熱還流し、その後、室温に冷却した。反応溶液にフェニルシアネート（０．４０ｇ、０．５０ｍｌ、３．３３ｍｍｏｌ）（原液）を添加し、さらに２時間還流し続けた。反応溶液を室温に冷却し、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を停止させた。水を添加し、その後ラジアルクロマトグラフィ（２０：１  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）によって、黄色固体として生成物３−（５，５，８，８−テトラメチル−３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロピンニトリル（８０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ７．４４（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７８（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），３．９７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），１．８３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．６７（ｍ，２Ｈ，２ＣＨ２），１．２７（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．２４（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【０４２２】
３−（３−プロポキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）ブト−２−エンニトリルの合成：
炎で乾燥させたフラスコに、ヨウ化銅（Ｉ）（０．０５７ｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（５ｍｌ）懸濁液を入れ、混合物を０℃で窒素雰囲気下で撹拌した。メチルリチウム（０．４３ｍｌの１．４Ｍエーテル溶液、０．５９６ｍｍｏｌ）を滴下して、無色の溶液を得た。溶液を−７８℃に冷却し、黄色／褐色物質を得た。アセチレンニトリル３−（５，５，８，８−テトラメチル−３−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン−２−イル）プロピオニトリル（０．０４０ｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（３．０ｍｌ）を滴下し、溶液を−７８℃で４５分間撹拌し、その後、メタノール（５ｍｌ）で反応を停止させた。水を添加して、黄色オイルとしてシス−アルケンニトリル３−（３−プロポキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−ブト−２−エンニトリル（９７％）を得た；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ７．１９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７８（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），５．３５（ｓ，１Ｈ，オレフィン），３．９２（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．２７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．７９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．６７（ｓ，２Ｈ，２ＣＨ２），１．２８（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．２７（ｓ、６Ｈ，２ＣＨ３），１．０２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【０４２３】
（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸の合成：
Ｎ２バブラー、セプタム、および撹拌バーを備えた丸底フラスコに、３−（３−プロポキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）ブト−２−エンニトリル付加化合物を含むヘキサン（５ｍｌ）およびトルエン（５ｍｌ）溶液を入れ、−７８℃に冷却した。ＤＩＢＡＬ（３．７１ｍｌの１．０Ｍトルエン溶液、５．６ｍｍｏｌ）を注射器から一滴ずつ溶液に添加し、その後、−７８℃で１．５時間撹拌し、酒石酸カリウムナトリウム水溶液（１０ｍｌ）で反応を停止させ、３０分間かけて室温まで加温した。水層を酸性化し（１．０Ｍ  ＨＣｌでｐＨ＝４にする）、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍｌ）で抽出した。混合した有機抽出物を水および塩性溶液で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、濾過し、濃縮して、黄色オイルとしてシス−アルケニル，シス−３−（３−プロポキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）ブト−２−エナールを得た；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ９．３６（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＯ），６．９９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．０９（ｓ，Ｊ−８．４Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン），３．９０（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．２９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），１．７６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．６８（ｓ，２Ｈ，２ＣＨ２），１．３（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．２４（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．００（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【０４２４】
次いで、Ｎ２バブラー、セプタム、および撹拌バーを備えた、炎で乾燥させた丸底フラスコに、ジエチル３−エトキシカルボニル−２−メチル−プロプ−２−エニルリン酸（０．４１７ｇ、１．５８ｍｍｏｌ、０．３９ｍｌ）のＴＨＦ（２．０ｍｌ）溶液および１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ、０．７ｍｌ）を入れた。溶液を、−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（０．９６ｍｌの１．５Ｍヘキサン溶液、１．４４ｍｍｏｌ）を注射器から一滴ずつ添加した。反応混合物を、０℃に加温し、１５分間撹拌した。得られた溶液を−７８℃に冷却し、シス−３−（３−プロポキシ−５，５，８，８−テトラメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）ブト−２−エナール（１．３１ｍｍｏｌ）をカニューレから一滴ずつ添加した。溶液を室温にまで加温した。１．５時間の撹拌後、水（１５ｍｌ）で反応を停止させ、水層をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍｌ）で抽出した。混合した有機層を、ＣｕＳＯ４水溶液、水、および塩性溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗エステルとして（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチル−オクタ−２，４，６−トリエン酸エチルエステルを得た。粗エステルを、還流温度で、ＫＯＨ（過剰量）を含むメタノール（７ｍｌ）で加水分解し、１Ｍ  ＨＣｌ（５ｍｌ）で反応を停止させた。溶液を濃縮し、水（１０ｍｌ）で希釈し、水層をＥｔＯＡｃ（３×１５ｍｌ）で抽出した。混合した有機層を水および塩性溶液で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮し、ラジアルクロマトグラフィおよびその後の分取シリカゲルＴＬＣで精製して、淡黄色固体として（２Ｅ，４Ｅ，６Ｚ）−７−３［−プロポキシ−５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレン−２−イル］−３−メチルオクタ−２，４，６−トリエン酸］を得た；融点１７７〜１７９℃；１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：ｄ６．９５（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．７９（ｓ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ），６．６２（ｄｄ，Ｊ＝１５．３，１１．０Ｈｚ，１Ｈ，オレフィン），６．２２（ａｐｐｐ  ｂｒ  ｄ，２Ｈ，２＊オレフィン），５．７６（ｓ，１Ｈ，オレフィン），３．８９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ２），２．１９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．１３（ｓ，３Ｈ，２ＣＨ３），１．７７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．６８（ｓ，４Ｈ，２ＣＨ２），１．３０（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．２３（ｓ，６Ｈ，２ＣＨ３），１．０１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【０４２５】
ＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニスト４−［５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸（ＨＸ５３１と呼ぶ）の合成：
Ｍａｓｙｕｋｉ  Ｅｂｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４７（１２）：１７７８−１７８６（１９９９）に記載の手順に基づいて、ＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストＨＸ５３１の合成を行った。
【０４２６】
２，５−ジメチル−２，５−ヘキサンジオールの合成：
ｔ−ブチルアルコール水溶液（２８５ｍｌまたは３ｍｏｌを含み２３ｍｌの硫酸を含む８００ｍｌ水溶液）に３０℃で過酸化水素（１．０５ｍｏｌ）および硫酸第１鉄（１ｍｏｌおよび１ｍｏｌの硫酸）溶液を同時に当量で添加した。これにより、収率３６％で樟脳臭を呈する半固体生成物を単離した。乾燥および再結晶（ＥｔＯＡｃ）によって、２，５−ジメチル−２，５−ヘキサンジオール生成物を精製した（融点（ｍｐ）：８５〜８７℃）。
【０４２７】
２，５−ジクロロ−２，５−ジメチルヘキサンの合成：
以前に記載のように合成を行った（Ｍａｙｒ，Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１２４：２０３，１９９９）。２，５−ジメチル−２，５−ヘキサンジオール（７３．１ｇ、０．５００ｍｏｌ）を、３７％ＨＣｌ水溶液（２５０ｍｌ）と共に１時間撹拌した。最初均一だった混合物から沈殿が生じて結晶生成物が得られた。生成物を、６００ｍｌの石油エーテルで抽出し、ＣａＣｌ２で乾燥させた。溶媒の蒸発によって、８１．９ｇ（８９％）のＮＭＲスペクトルで純粋な固体が得られ、これを石油エーテルから再結晶させて、２，５−ジクロロ−２，５−ジメチルヘキサンを得た（融点：６８〜６８．５℃）。
【０４２８】
６−ブロモ−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチルナフタレンの合成：
撹拌棒および還流冷却器を備えた２００ｍｌの丸底フラスコに、ブロモベンゼン（１０９ｍｍｏｌ、１７ｍｌ）および２，５−ジクロロ−２，５−ジメチルヘキサン（１０ｇ、５４．６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（３０ｍｌ）溶液を添加した。塩化アルミニウム（１．４５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）を、自発的還流が弱まるまでゆっくり溶液に添加した。室温で１０〜１５分間の撹拌後、反応物を氷水（３０ｍｌ）に注ぎ、層分離させた。水層をＥｔＯＡｃ（５×２０ｍｌ）で抽出した。混合した有機層を、水および塩性溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して６−ブロモ−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチルナフタレン生成物を得た。
【０４２９】
６−ブロモ−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチルナフタレン（３０ｇ、１１０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５６．１ｇ、４１ｍｍｏｌ）、およびヨウ化銅（４．５３ｇ）を含むｏ−キシレン（３００ｍｌ）の混合物を、１５０℃で１４時間加熱した。溶媒の除去後、残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン  １：１００）によって精製して、赤色プレート（ｎ−ヘキサン）として生成物２−ニトロ−１−アミノ−［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチルナフタレン］−ベンゼンを得た（３６．０９ｇ、収率８２％の表題化合物、融点１１８℃）。
【０４３０】
ＮａＯＨ（６０％、９２ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍｌ）懸濁液に２−ニトロ−１−アミノ−［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチルナフタレン］−ベンゼン（５００ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液を添加し、混合物を３０分間撹拌し、その後ヨウ化メチル（０．５ｍｌ）を添加し、さらに１時間撹拌した。溶媒の除去後、残渣を水にとり、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水および塩性溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。減圧下での溶媒の除去により、粗生成物２−ニトロ−１−メチルアミノ−［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチル−ナフタレン］ベンゼン（５４３ｍｇ）を得た。
【０４３１】
２−ニトロ−１−メチルアミノ−［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチル−ナフタレン］ベンゼン（５４０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）を、２０ｍｌのメタンに溶解させ、１０％のエチルアルコール（５５ｍｇ）で１時間水素付加した。濾過および溶媒の除去後、残渣を、シリカゲル（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン  １：８）でのクロマトグラフィにかけ、生成物として２−アミノ−１−メチルアミノ−［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチル−ナフタレン］ベンゼンを得た。
【０４３２】
２−アミノ−１−メチルアミノ−［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチル−ナフタレン］ベンゼン（４２０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を含むベンゼン（１０ｍｌ）およびピリジン（２ｍｌ）の溶液に、テレフタル酸モノメチルエステルクロライド（３８１ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４時間撹拌し、２Ｎ塩酸に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を乾燥させ、シリカゲル（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン  １：８）で精製して、２−［アミノ−４−安息香酸メチル−エステル］−１−メチル−アミノ［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチル−ナフタレン］−ベンゼン（６３１ｍｇ）を得た。
【０４３３】
ポリリン酸（６．０ｇ）に２−［アミノ−４−安息香酸メチル−エステル］−１−メチル−アミノ［１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチル−ナフタレン］−ベンゼン（６３０ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液を添加し、混合物を１１０℃で１８時間加熱した。冷却後、反応物に水を添加し、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機層を塩性溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン  １：６）で精製して、生成物２−［アミド−４−安息香酸メチルエステル］−１−メチルアミノ［１，２，３，４−テトラヒドロ１，１，４，４−テトラメチルナフタレン］４−ニトロベンゼン（１０４ｇ）を得た。
【０４３４】
０℃で２−［アミド−４−安息香酸メチルエステル］−１−メチルアミノ［１，２，３，４−テトラヒドロ１，１，４，４−テトラメチルナフタレン］４−ニトロベンゼン（２００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の硫酸（１２ｍｌ）溶液にＫＮＯ３（７３ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を添加した。２．５時間後、混合物を氷水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を、１Ｎ  ＮａＨＣＯ３、水、および塩性溶液で連続して洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。蒸発後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＥｔＯＡｃ：ｎ−ヘキサン  １：８）で精製して、メチル４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）ベンゾエート（１００ｍｇ、４５．５％）を得て、生成物を回収した（８４ｍｇ）。この化合物を、塩基性条件下（２Ｎ  ＮａＯＨ／ＥｔＯＨ）で以下のように加水分解した。
【０４３５】
４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸の合成：
（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸メチルエステル（８４ｍｇ）を含むエタノール（４ｍｌ）および２Ｎ  ＮａＯＨ（２ｍｌ）の溶液を室温で２時間撹拌した。混合液を、２Ｎ塩酸に注ぎ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を塩性溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。蒸発後、粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ジクロロメタン：メタノール  ２０：１、その後８：１）で精製して、生成物４−（５Ｈ−２，３−（２，５−ジメチル−２，５−ヘキサノ）−５−メチル−８−ニトロジベンゾ［ｂ，ｅ］［１，４］ジアゼピン−１１−イル）安息香酸（すなわち、ＨＸ５３１）を得た。
【０４３６】
ｅｘ  ｖｉｖｏの造血幹細胞／先祖細胞培養物へのＲＸＲ、ＲＡＲ、およびＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストの補充：
上記のように培養物を調製し、維持した。ＲＸＲ、ＲＡＲ、またはＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストを、希釈濃度１５５０μｇ／ｌ〜０．１５５μｇ／ｌに相当する１０−４Ｍから１０−９Ｍまで（１００μＭ〜１０−３Ｍ）の濃度範囲でいくつかの培養物に添加した。所定の時間、限定期間、３週間まで、または全培養期間継続して、アンタゴニストを添加した。
【０４３７】
単核細胞画分の回収および精製、単核細胞画分からのＣＤ３４＋細胞の精製、ＣＤ３４＋／−集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大、形態評価、表面抗原の分析、ＣＤ３４および他の造血マーカー発現の決定、ならびに細胞集団の計算を含む全ての他の手順を、上記の実施例１の実験方法の節に記載したように行った。
【０４３８】
（実験結果）
培養物中の幹細胞および先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大に対するＲＡＲ、ＲＸＲ、およびＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストならびにＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせの効果の比較：
種々の濃度の以下のアンタゴニストとともに、またはそれを含めないで、４つのサイトカイン（ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３）の組み合わせの存在下でＣＤ３４＋細胞富化培養を開始した：（ｉ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、（ｉｉ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アンタゴニストＬＧＤ１００７５４、および（ｉｉｉ）ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０とＲＸＲアンタゴニストＬＧＤ１００７５４との組み合わせ。最初の播種から３週間後および５週間後には、ＣＤ３４＋マーカーを有している細胞（ある系統への分化増殖能力を最も獲得した先祖細胞と考えられる）の割合ならびにマーカーＣＤ３４＋／ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−を有している細胞（幹細胞および初期先祖細胞画分を示すと考えられる）の割合を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。
【０４３９】
細胞集団数、ＣＦＵ数、およびＦＡＣＳ分析から得られたデータを、図１２ａ〜ｂおよび１３ａ〜ｅに示す。結果は、サイトカインＩＬ−３（細胞分化促進物質）と共に１０−７Ｍの濃度で培養培地に補充した場合、ＲＸＲアンタゴニストは活性を示さず、ＲＡＲアンタゴニストは中程度の活性を示し、ＲＡＲアンタゴニストとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせでの処理により、コントロール（サイトカインのみ）、ＲＡＲアンタゴニストでの処理、およびＲＸＲアンタゴニストでの処理と比較して実質的に高レベルのＣＦＵ、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋／３８−細胞、およびＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞が得られることを示す。明らかに、ＲＡＲアンタゴニストとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせにより、幹細胞／先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大に対する相乗効果が発揮されている。
【０４４０】
さらなる実験では、ＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストＨＸ−５３１（すなわち、レチノイン酸およびレチノイドＸ受容体両方のアンタゴニスト）（１０−６Ｍ；ＭＷ＝４８３）とともに、またはそれらを含まない、４つのサイトカイン（ＴＰＯ、ＦＬＴ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３）の組み合わせの存在下でＣＤ３４＋細胞富化培養を開始した。ＣＦＵおよびＣＤ３４＋細胞のレベルを、最初の播種から３、７、９、および１１週間後に決定した。この実験の結果を、以下の表４にまとめる。
【０４４１】
【表４】
2006521813.tif 000005
【０４４２】
これらの結果は、ＲＡＲ＋ＲＸＲアンタゴニストは、幹細胞画分を好ましく顕著に増殖させることができるが、依然として分化を制限し、それにより短期および長期培養期間の間に幹細胞／先祖細胞を直接高倍率に拡大させることを示している。
【０４４３】
実施例４
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アンタゴニストである１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３−２６，２３−ラクトンの合成：
Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ２４２：８２，１９８５によって記載された手順、または以下の手順にしたがって、１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３−２６，２３−ラクトンの４つのジアステレオマーを合成することができる。
【０４４４】
メチル−４−ヨード−２−メチル−ブチレートの合成：
窒素流下のリチウムの２ｍｌエーテル（乾燥）懸濁液に、フェニルブロマイドの３ｍｌエーテル溶液を滴下した。リチウムが完全に溶解するまで反応混合物を加熱した。アルゴン流下でヨウ化メチレンのエーテル溶液を調製し、−７８℃に冷却した。フェニルリチウム溶液をこの溶液に、注射器で一滴ずつ０．５時間かけて添加し、さらに、メチル（Ｒ）−（＋）−３−ブロモ−２−メチルプロピオネートのエーテル（５ｍｌ）溶液をこれに添加した。反応混合物を、２５℃で一晩撹拌した。次いで、ＤＭＳＯ（７ｍｌ）を添加し、エーテルを蒸発させた。反応混合物を１００℃で一晩撹拌した。
【０４４５】
（１α，３β，５Ｅ，７Ｅ，２０Ｒ，１’Ｅ）−１，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２０−メチル（２−メチル，１’−ヘプテニレート）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０，（１９）−トリエンの合成：
窒素雰囲気下で、リチウム金属の２ｍｌ乾燥エーテル懸濁液に、フェニルブロマイドの３ｍｌ乾燥エーテル溶液を滴下した。リチウム金属の溶解時に、発熱反応が認められた。リチウム金属が完全に溶解するまで、反応混合物を加熱した。
【０４４６】
トリフェニルホスフィン９９％（１．４４７ｇ、５．５２ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯを、上記のメチル４−ヨード−２−メチル−ブチレート反応溶液に添加し、得られた混合物を１００℃で１８時間加熱した。次いで、混合物を窒素雰囲気下で−３０℃に冷却し、フェニルリチウム溶液を含むエーテルをこれに添加した。
【０４４７】
この反応混合物を、０℃で１時間撹拌し、その後アルデヒドＣＬＰ−８−β，５Ｅ，７Ｅ，２０Ｒ，１’Ｅ）−１，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０，（１９）−トリエン−アルデヒドのヘキサン溶液を添加した。得られた混合物を、１００℃で一晩撹拌した。その後エーテルおよびヘキサンを蒸留させ、反応混合物を６０℃に冷却し、５０ｍｌ酢酸エチルの７５ｍｌ水溶液をこれに添加した。有機層を分離し、２５ｍｌの水および塩性溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させ、展開液としてヘキサン−ＥｔＯＡｃ（９８：２）の混合物を使用してシリカゲルカラム（６０ｇ）で精製して、６０ｍｇの生成物（１α，３β，５Ｅ，７Ｅ，２０Ｒ，１’Ｅ）−１，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２０−（２−メチル，１’ヘプテニレート）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０，（１９）−トリエンを得た。
【０４４８】
（１α，３β，５Ｅ，７Ｅ，２０Ｒ，１’Ｅ）−１，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２０−（２−メチル−２−ヒドロキシ−１’ヘプテン酸）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０，（１９）−トリエンの合成：
（１α，３β，５Ｅ，７Ｅ，２０Ｒ，１’Ｅ）−１，３−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−２０−（２−メチル−１’−ヘプテニレート）−９，１０−セコプレグナ−５，７，１０，（１９）−トリエン（６０ｍｇ）を３ｍｌのＴＨＦに溶解させ、アルゴン流下で溶液を−７８℃に冷却した。ＬｉＮ（ｉＰｒ）２を反応混合物に添加して、リチウム誘導体を得、−７８℃で１時間さらに酸素と反応させた。その後、トリフェニルホスフィンを添加し、反応混合物を３０分間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を、減圧下で水分を蒸発させた。ＫＯＨのメタノール溶液を残渣に添加し、反応混合物を、６０℃で２．５時間加熱し、その後０．５ｍｌ  １Ｎ  ＨＣｌで希釈し、減圧下で蒸発させた。残渣をクロロホルムに溶解させ、生成物を、展開液として９７：３  ヘキサン−酢酸エチルの混合物（２回）を使用してシリカゲルプレート（２０×２０）上で精製し、画分２（Ｒｆ＝０．８１）として６．３ｍｇの生成物を得た。
【０４４９】
次いで、得られた生成物を、ピリジン（１２ｍｇ）の存在下で１５．２ｍｇのヨウ素の２ｍｌ塩化メチレン溶液で処理し、反応混合物を減圧下で、その後高減圧下で蒸発させた。残渣をＴＨＦで溶解させ、ｎ−Ｂｕ３ＳｎＨ（２９．１ｍｇ）をこれに添加した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、その後、減圧下で蒸発させた。
【０４５０】
残渣を、触媒量のＨＣｌのメタノール溶液で５０℃で５時間処理した。反応混合物を減圧下で蒸発させ、残渣を、展開液として９５：５クロロホルム−メタノール混合物を使用してシリカゲルＴＬＣプレート（２０×２０）上で精製し、画分１（Ｒｆ＝０．４）として２．６４ｍｇの所望の生成物９，１０−セココレスタ−５，７，１０（１９）−トリエン−２６−酸、１，３，２３，２５−テトラヒドロキシ−γ−ラクトンまたは（２３Ｓ，２５Ｒ）−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−２６，２３−ラクトンを得た；ＦＡＢ−ＭＳ：Ｃａｌｃ．４２６．６０、Ｆｏｕｎｄ  ４２６．８８。
【０４５１】
実施例５
（造血幹細胞／先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大に対するニコチンアミドの効果）
ｅｘ  ｖｉｖｏ造血幹細胞／先祖細胞培養物へのニコチン補充：
上記のように培養物を調製し、維持した。３週間までの培養期間に１、５、または１０ｍＭの濃度のニコチンアミドを細胞培養物に添加した。単核細胞画分の回収および精製、単核細胞画分からのＣＤ３４＋細胞の精製、幹細胞／先祖細胞集団のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大、形態評価、表面抗原分析、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｌｉｎ、および他の造血マーカー発現の決定、ならびに細胞集団の計算を含む全ての他の手順は、上記の実施例１の実験方法の説に記載したように行った。
【０４５２】
（実験結果）
幹細胞および造血先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大に対するニコチンアミドの効果：
異なる濃度のニコチンアミドとともに、またはそれらを含めないで、５つのサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬｔ３、ＩＬ−６、およびＩＬ−３）の組み合わせの存在下で造血ＣＤ３４＋細胞培養を開始した。３週間のインキュベーション後、ＣＤ３４＋細胞を親和性再精製法によって培養物から再選択し、計数した。図１４に示す結果は、未処理の（サイトカインのみ）コントロールでは１ｍｌあたりわずかに３５×１０４個のＣＤ３４＋細胞であったことと比較して、１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充した培養物については、１ｍｌあたりそれぞれ９９×１０４および１８０×１０４個のＣＤ３４＋細胞が得られたことを示している。さらに、再選択したＣＤ３４＋細胞画分を、幹細胞／先祖細胞マーカーについてＦＡＣＳ分析した。図１５〜１７および１８ａ〜ｂに示す結果は、ニコチンアミドで処理した培養物における、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−、およびＣＤ３４＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８−）細胞の割合の実質的な増加を示している。図１５は、１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充した培養物について、未処理の（サイトカインのみ）コントロールと比較してＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞の密度がそれぞれ１．７倍および５１．７倍に増加したことを示している。図１６は、１ｍＭおよび５ｍＭのニコチンアミドを補充した培養物について、未処理の（サイトカインのみ）コントロールと比較してＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞密度がそれぞれ１０．５倍および２０５．５倍に増加したことを示している。図１７は、５ｍＭのニコチンアミドを補充した培養物について、未処理の（サイトカインのみ）コントロールと比較してＣＤ３４＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８−）細胞密度が１１．５倍に増加したことを示している。したがって、ニコチンアミドは、幹細胞および先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大促進のための非常に有効な薬剤であることが見出された。
【０４５３】
さらなる実験では、培養物を、５ｍＭおよび１０ｍＭのニコチンアミドで処理した。以下の表５は、幹細胞および初期先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大に対するニコチンアミドの強力な効果をさらに証明する結果を示している。
【０４５４】
【表５】
2006521813.tif 000006
【０４５５】
実施例６
遷移金属キレート化剤で幹および先祖細胞を処理することによる幹および先祖細胞の増殖の強制および分化の制限
実験手順
ＣＤ３４細胞の選択：全血単位から由来する末梢血「軟膜」細胞、ロイコフォレシス後に得られる末梢血細胞、または臍帯血細胞はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅに積層され（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）、そして１０００×ｇで２０分間室温で遠心分離された。単核細胞の間期層は採取され、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＣａ／Ｍｇ非含有リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄された。細胞はマウスのモノクローナル抗ＣＤ３４抗体（０．５μｇ／１０６単核細胞）で４℃で３０分間インキュベートされ、その後ｍｉｎｉＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者のプロトコールに従って用いて単離された。
【０４５６】
培養手順：先祖細胞の拡大のため、ＣＤ３４＋について富化された画分または未分離の単核細胞が１０％の予め選択されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むアルファ最小必須培地（両方ともＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹより）、または血清非含有培地（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−３４培地、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で約１〜３×１０４個細胞／ｍｌで播種された。培地は増殖因子と遷移金属キレート化剤の混合物を補充された。培養物は３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気で過湿状態でインキュベートされた。培地の半分はすべての補充物を含む新鮮な培地と毎週交換された。
【０４５７】
クローニングポテンシャルの評価：液体培地で発達した細胞のクローニングポテンシャルは異なる間隔で半固型培地でアッセイされた。細胞は洗浄され、組換え増殖因子（ＳＣＦ，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＰＯ）を補充されたアルファ培地を含むメチルセルロース中に３５ｍｍの皿に播種された。２週間の培養後、培養物は倒立顕微鏡を用いて計数された。コロニーはそれらの細胞組成に従って芽細胞、混合物、赤血球、骨髄細胞および巨核細胞として分類された。
【０４５８】
形態学的評価：生じる培養物集団を特性決定するために、少量の細胞がスライドガラス（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に付着され、固定され、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａで染色された。他の少量は細胞内ヘモグロビンについてベンジジンで染色された。
【０４５９】
免疫蛍光染色：異なる間隔で、液体培養物からの細胞はＣＤ３４抗原についてアッセイされた。少量が採取され、洗浄され、ＦＩＴＣでラベルされた抗ＣＤ４５モノクローナル抗体およびＰＥでラベルされた抗ＣＤ３４（ＨＰＣＡ−２）モノクローナル抗体またはＰＥでラベルされたコントロールのマウスＩｇと共に氷上でインキュベートされた。インキュベート後、赤血球は溶解液を用いて溶解され、残りの細胞は洗浄されてフローサイトメーターによって分析された。
【０４６０】
フローサイトメトリー：細胞はＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて分析され分類された。細胞は生理食塩水をシース液として用いて１０００個細胞／秒の速度で７０ｍｍのノズルを通して通過させられた。２５０ｍＷでの４８８ｎｍアルゴンレーザービームが励起のための光源として用いられた。緑（ＦＩＴＣ由来）蛍光は５３０±３０ｎｍ帯域通過フィルターを用いて測定され、赤（ＰＥ由来)の蛍光は５７５±２６ｎｍ帯域フィルターを用いて測定された。ＰＭＴｓは適切な電圧に設定された。対数増幅は蛍光の測定のために適用され、線形増幅は前方光散乱のために適用された。少なくとも１０４個の細胞が分析された。
【０４６１】
実験結果
造血先祖細胞の増殖を刺激しかつ分化を阻害する培養条件を開発する試みにおいて、ＣＤ３４＋細胞は以下の補充物で培養された：
テトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）、カプトプリル（ＣＡＰ）、ペニシラミン（ＰＥＮ）の如き遷移金属キレート化剤、または遷移金属代謝と干渉する亜鉛の如き他のキレート化剤またはイオン；
初期活動サイトカイン−幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）およびインターロイキン−３（ＩＬ−３）；
後期活動サイトカイン−顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびエリスロポイエチン（ＥＰＯ）。
【０４６２】
ＴＥＰＡは短期間ＣＤ３４＋培養物の増殖およびクローニング能力に対して影響を与える：低用量の初期活動サイトカインで培養されたＣＤ３４＋細胞に対するＴＥＰＡの添加は、サイトカインのみを補充された培養物と比較して全細胞数、ＣＤ３４＋細胞数（蛍光ラベルされた特異的抗体を用いてフローサイトメトリーによって測定された。図２０参照。）および細胞のクローニング能力（少量の培養物を半固型培地に培養して２週間後に生じたコロニーを計数することによって測定された。図１９参照。）の有意な増大を生じた。ＴＥＰＡの存在下で半固型培地で生じたコロニーは骨髄細胞、赤血球および混合された表現型のものであった。
【０４６３】
ＴＥＰＡの効果は高用量の初期活動サイトカインを補充された培養物で（表６）、または初期活動サイトカインと後期活動サイトカインの組合せを補充された培養物で（図２１ａ−ｂ）さらに評価された。結果は、ＴＥＰＡはこれらの培養物においてＣＤ３４＋細胞のクローニング能力および割合を有意に増加させたことを示す。全細胞数については、これは初期活動サイトカインを補充された培養物ではＴＥＰＡによって増加されたが（表６、図２０）、一方、初期活動サイトカインと後期活動サイトカインの両方を補充された培養物ではＴＥＰＡはぎりぎりの阻害を生じた（図２１ａ−ｂ）。
【０４６４】
臍帯血由来のＣＤ３４細胞は５０ｎｇ／ｍｌのＦＬ、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６の存在下で、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３ありまたはなしで、１０μＭのＴＥＰＡありまたはなしで液体培地中で培養された。７日目にＣＤ３４細胞の割合および全細胞数が決定された。１×１０３個の初期細胞に等しい少量が半固型培地でクローニングすることによってコロニー形成単位（ＣＦＵ）について０日目と７日目にアッセイされた。ＣＦＵ拡大は０日目に存在するＣＦＵに対する７日目に存在するＣＦＵの比を表す。
【０４６５】
【表６】
2006521813.tif 000007
【０４６６】
長期間ＣＤ３４＋培養物の増殖およびクローニング能力に対するＴＥＰＡの効果：長期間培養物は毎週細胞数を半分に減らすことによって３〜５週間維持された（培養容積の半分が除去され、新鮮な培地およびサイトカインで置換された）。ＴＥＰＡの添加は、サイトカインのみを補充された培養物と比較して初期活動サイトカインを補充された長期間培養物（図２２ａ−ｂ）または初期活動サイトカインおよび後期活動サイトカインの両方を補充された長期間培養物（図２１ａ−ｂ）において高いクローニング能力を生じた。
【０４６７】
３週間後の培養物において、サイトカインのみを補充された培養物ではクローニング能力の鋭い減少があったが、サイトカインと組合せたＴＥＰＡで処理した培養物は高いクローニング能力を維持し、これは短期間培養物のクローニング能力よりずっと高かった。
【０４６８】
造血細胞の成熟に対するＴＥＰＡの効果：造血細胞の成熟に対するＴＥＰＡの効果がいくつかのモデルでテストされた：
【０４６９】
マウスの赤白血病細胞（ＭＥＬ）：ＭＥＬ細胞は赤芽球様細胞である。いくつかの化学物質（分化誘導剤）での処理後、細胞は赤血球分化を行い、ヘモグロビンを蓄積する。ＭＥＬ細胞は分化誘導剤であるヘキサメチレンビスアセタミド（ＨＭＢＡ）およびキレート化剤であるＴＥＰＡまたはカプトプリルの存在下で培養された。培養の３日目に細胞の全数およびヘモグロビン含有細胞の割合が決定された（表７）。結果はＴＥＰＡおよびカプトプリルの両方がＭＥＬ細胞のＨＭＢＡによって誘導される分化を阻害したことを示した。
【０４７０】
ヒトの赤血球細胞培養物：正常なヒトの赤血球細胞は本質的に参考文献６７−７０に記載されているように二相液体培養手順に従って増殖された。第一相では末梢血単核細胞は初期増殖因子の存在下で５〜７日間培養された。第二相ではこれらの因子は赤血球特異的な増殖／分化因子であるエリスロポイエチンで置換された。
【０４７１】
培養物は第二相の開始時にＴＥＰＡを補充された。全細胞数およびヘモグロビン含有細胞の割合は１４日後に決定された。結果（図２３）はＴＥＰＡの存在下でヘモグロビン含有細胞の鋭い減少があり、一方細胞の全数はわずかしか減少しなかったことを示す。
【０４７２】
これらの結果はＴＥＰＡは赤血球の分化を阻害するが、先祖細胞の増殖能力には有意に影響を与えないことを示唆する。
【０４７３】
【表７】
2006521813.tif 000008
【０４７４】
ＣＤ３４＋から開始された培養物：ＣＤ３４＋細胞で開始された長期間の液体培養物はサイトカインの異なる混合物で維持された。培養物の半分はＴＥＰＡを連続的に補充された。細胞分化の状態をテストするため、サイトスピン調製物はＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａで染色された（図２４ａ−ｂ）。結果はＴＥＰＡなしで４〜５週間維持された培養物は十分に分化した細胞のみを含むが、ＴＥＰＡありで維持された培養物は十分に分化した細胞に加えて１０％〜４０％の未分化の芽細胞様細胞のサブセットを含んでいたことを示した。
【０４７５】
これらの結果はＴＥＰＡはＣＤ３４＋細胞分化において遅延を誘導し、これは長期間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養における延長された増殖および初期先祖細胞の蓄積を生ずるということを強く示唆する。
【０４７６】
ＴＥＰＡの活性メカニズム：ＴＥＰＡが銅の如き遷移金属の消耗を介してＣＤ３４＋細胞に影響を与えるかどうかを決定するために、２つのアプローチがとられた。
【０４７７】
第一のアプローチは異なる遷移金属キレート化剤：テトラ−エチルペンタミン（ＴＥＰＡ）、カプトプリル（ＣＡＰ）またはペニシラミン（ＰＥＮ）の効果を評価するものであった。結果はすべてのこれらの化合物がＴＥＰＡと同一の効果をＣＤ３４＋細胞に対して有するということを示した（図２５）。
【０４７８】
第二のアプローチはＴＥＰＡで処理された培養物に銅を補充することであった。結果はＴＥＰＡ活性は銅によって逆転されるということを示した（図２６ａ−ｂ）が、鉄やセレンの如き他のイオンを補充されると、少なくともここで用いられた短期間〜中期間の培養物ではかかる逆転は起こらなかった（図２７）。
【０４７９】
亜鉛は銅代謝の如き遷移金属代謝を妨げることが知られているが、それ自体で培養物のクローニング能力を拡大する。この結果は亜鉛およびＴＥＰＡの両方の存在下で一層明白であった（図２８）。
【０４８０】
上述の実施例では初期活動サイトカインおよび例えばテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）の如きポリアミン剤をＣＤ３４細胞培養物に補充することによって間質の支持なしに長期間培養物（ＬＴＣ）を維持することが可能であることが証明された。これらの培養物では次の３つの現象が明らかであった：（ｉ）連続的な細胞増殖；（ｉｉ）クローン原性細胞の拡大（ＣＦＵｃ）；および（ｉｉｉ）未分化状態での細胞の維持。
【０４８１】
対照的に、コントロールのＴＥＰＡで処理されなかった培養物は増殖を中止し、ＣＦＵｃを生成し、それらの細胞はより初期に分化した。
【０４８２】
従って、ＴＥＰＡおよび他の遷移金属キレート化剤は遷移金属、特に銅のキレート化を通して細胞分化を阻害する／遅延させることによって長期間培養物を維持する。
【０４８３】
以下の実施例は上述の結果をさらに実証し；長期間培養物のための最適培養条件を教示し、造血細胞の分化に影響を与える追加のキレート化剤を教示し、そして標的細胞に対するＴＥＰＡおよび他のキレート化剤の活性のメカニズムにより多くの光をあてる。
【０４８４】
ヒトの新生児臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞は免疫磁気法で精製され、次にサイトカインを補充された液体培地中で遷移金属キレート化剤ありまたはなしで培養された。週間隔で培養物は培養物の内容（上澄みおよび細胞）の半分を除去して新鮮な培地；サイトカインおよびキレート化剤で置換することによって細胞数を半分に減らされた。示された週に培養物の細胞含有量は（手動の顕微鏡／血球計算法によって）全細胞について、（免疫フローサイトメトリーによって）ＣＤ３４＋細胞について、および（サイトカインを補充された半固型培地で細胞をクローニングすることによって）クローン原性細胞について定量された。培養は１×１０４個の細胞から開始され、その５０〜８０％はＣＤ３４＋であり、２５〜５０％はＣＦＵｃであった。図２９〜４２に示される結果は１×１０４個の初期細胞について計算された（数は希釈率を掛けられた）。
【０４８５】
図２９は長期間のＣＤ３４培養物に対するＴＥＰＡの効果を示す。（間質細胞の不在下で）初期活動サイトカインを補充された液体培地中でＣＤ３４細胞で開始された培養はＴＥＰＡによって長時間（＞６週間）維持されることができた。かかる培養ではＴＥＰＡはサイトカインとの組合せでクローン原性細胞（ＣＦＵｃ）の維持および拡大を支持した：培養は２．５×１０３個のＣＦＵｃで開始された。６週間後の停止時に、ＴＥＰＡで処理された培養物は３００×１０３個のＣＦＵｃを含んでいた（即ち、１２０倍の拡大）が、コントロールの培養物はＣＦＵｃを含んでいなかった。
【０４８６】
図３０〜３２は初期サイトカインの様々な組合せの存在下での細胞増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの効果を示す。初期活動サイトカインＴＰＯ，ＳＣＦ，ＦＬＴ，ＩＬ−６とＴＥＰＡの組合せはクローン原性ポテンシャルを有する細胞の長期間の拡大および維持についての最適の組合せであることが見出された。
【０４８７】
図３３はコントロールのおよびＴＥＰＡを補充されたＣＤ３４培養物のＣＦＵｃ頻度に対するＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。後期活動サイトカインＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを培養物に補充することは細胞分化を刺激し、クローン原性細胞の迅速な損失を生じた。この分化刺激効果はＴＥＰＡによって阻害された。
【０４８８】
図３４−３５は長期間の細胞増殖に対する（図３４）およびＣＦＵｃ生成に対する（図３５）部分的なまたは完全な培地＋ＴＥＰＡ交換の効果を示す。得られた結果は、最大の拡大を維持するためにはＴＥＰＡは少なくとも週間隔で完全に置換されるべきであるということを示す。
【０４８９】
図３７はＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの遅延された添加の結果を示す。ＴＥＰＡに対するＣＤ３４細胞の初期の暴露がＣＦＵｃの長期間の維持および拡大に決定的であることが明らかであり、これはＴＥＰＡが分化の様々な段階で先祖細胞の分化に影響を与えるということを示唆する。
【０４９０】
図３８は長期間のＣＦＵｃ生成に対する単一のサイトカインを用いた短期間の前培養の効果を示す。結果はサイトカインの全量よりも単一のサイトカインを最初の２４時間に補充されたとき、ＬＴＣ−ＣＦＣはＴＥＰＡで処理された培養物中に一層多く保存されたことを示し、これは前者の条件下で細胞は一層効果的に阻害されることを示唆する。
【０４９１】
図３９ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の効果を示す。ポリアミンキレート化剤は長期間の培養中、細胞増殖を支持し、ＣＦＵｃを拡大した。テストされた化合物のうち、長鎖ポリアミンであるＴＥＰＡとＰＥＨＡが短鎖ポリアミンよりずっと効果的であることが見出された。
【０４９２】
図４０ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養に対する遷移金属キレート化剤の効果を示す。ペニシラミン（ＰＥＮ）およびカプトプリル（ＣＡＰ）は遷移金属キレート化剤として知られているが、長期間の培養中、クローン原性細胞の細胞増殖および拡大を支持した。
【０４９３】
図４１ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する亜鉛の効果を示す。亜鉛は遷移金属、特に銅の代謝を妨げることが知られており、長期間の培養物に対するキレート化剤の効果を模倣するが、その効果はキレート化剤それ自体の効果よりは少ない。
【０４９４】
従って、造血先祖細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大はこれらの細胞の非分裂の分化した細胞への発展によって制限される。この分化過程は先祖細胞を間質細胞層上で培養することによって遅延されることができる。間質細胞は連続的な細胞増殖およびＣＦＵｃの長期間の生成を支持するので、間質細胞は先祖細胞に対して抗分化効果を有すると考えられる。
【０４９５】
本発明の別の実施形態によれば、臍帯血由来の幹細胞、末梢血由来の幹細胞および骨髄由来の幹細胞の如き（ただしこれらに限定されない）幹細胞を保存する方法が与えられる。前記方法は例えばＴＥＰＡの如き遷移金属キレート化剤の存在下で採取され、単離されおよび／または貯蔵された幹細胞を取扱うことによって行われる。
【０４９６】
臍帯血由来の細胞は採取され、１０μＭのＴＥＰＡの存在下または不在下で２４時間４℃で貯蔵された（未分離状態で）。次にＣＤ３４＋細胞は１０μＭのＴＥＰＡ−ＰＢＳ緩衝液またはＴＥＰＡ非含有ＰＢＳ緩衝液を用いて分離された。次に、細胞は１０μＭのＴＥＰＡの存在下で長期間培養で増殖させられた。
【０４９７】
結果は、ＴＥＰＡの存在下で取り扱われた細胞で開始された培養物は８週間拡大したが、ＴＥＰＡなしで貯蔵された細胞から開始された培養物はほんの５週間後に拡大を停止したことを示す。
【０４９８】
細胞を採取してから凍結または移植するまでに通常少なくとも数時間かかることは周知である。
【０４９９】
これらの結果は、ＴＥＰＡの如き遷移金属キレート化剤を採取バッグおよび分離および洗浄緩衝液に添加することは幹細胞の収率を増大させ、長期間の増殖に対するそれらのポテンシャルを改良し、かくして「新鮮な」、凍結保存されたまたはｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された造血細胞の移植後の短期間の定着（ｔａｋｅ）および長期間の再集団形成を容易にすることを示す。
【０５００】
従って、本発明によれば有効量または濃度の分化を阻害する遷移金属キレート化剤を補充された幹細胞採取バッグおよび分離および洗浄緩衝液がさらに与えられる。
【０５０１】
上述の実施例で特別に示されているように、間質非含有培養物中の連続的な細胞増殖およびＣＦＵｃの長期間の生成を支持する（図２９）新規のシステムが開発された。このシステムは幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＬＴ３、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）の如き初期活動サイトカインの使用（インターロイキン−３ありまたはなし）を遷移金属キレート化剤と組合せる（図３０−３２）。初期活動サイトカインはＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの如き後期活動サイトカインと比較して分化についての減少された刺激で先祖細胞の生存および増殖を支持する（図３３）。キレート化剤は遷移金属、特に銅のキレート化を通して分化を阻害する。部分的な変化と比較した週間隔での完全な培地の交換はＬＴＣ−ＣＦＣ維持を改良し、このことはＴＥＰＡ−銅錯体の如きＴＥＰＡ−遷移金属錯体が安定でないことを示唆する（図３４−３５）。
【０５０２】
いくつかの証拠はＴＥＰＡが初期先祖細胞の分化を阻害するということを示唆する（図３６）。例えば、ＴＥＰＡの添加が培養の６日目まで遅れるとその効果は１日目からＴＥＰＡを補充された培養物と比較して減少された（図３７）。
【０５０３】
ＴＥＰＡが１日目に添加された場合は最適の結果が得られたが、サイトカインの全量を２日目に添加することが有利であった。従って、１日目に一種類のサイトカイン（例えばＦＬＴ３）のみが補充され、その後で他のサイトカイン（ＳＣＦ，ＴＰＯおよびＩＬ−３）が添加されたＴＥＰＡで処理された培養物はすべてのサイトカインが１日目に添加された培養物より長く維持された（図３８）。細胞分化はサイトカインによって誘導され、銅および他の遷移金属に依存するので、分化の阻害はサイトカインの全量への暴露に先立つその消耗を必要とすると我々は仮定した。単一のサイトカインは迅速な活性化（増殖および分化）を支持しないが、細胞の生存性を維持し、従って活性化前の静止した未分化のＣＤ３４細胞中でＴＥＰＡが遷移金属を効果的にキレート化することを可能とする。
【０５０４】
スクリーニングにより、様々なキレート化剤が連続的な細胞増殖およびＣＦＵｃの長期間の生成を支持することが見出され、細胞分化を遅延させることが見出された。それらの中には、ＴＥＰＡ，ＥＤＡ，ＰＥＨＡおよびＴＥＴＡの如きポリアミン（図３９ａ−ｂ）、またはペニシラミン（ＰＥＮ）およびカプトプリル（ＣＡＰ）の如きキレート化剤（図４０ａ−ｂ）があったがこれらに限定されない。遷移金属（特に銅）代謝を妨げる亜鉛もＬＴＣ−ＣＦＣを支持した（図４１ａ−ｂ）。
【０５０５】
実施例７
ＣＤ３４細胞培養物における増殖およびクローニング能力に対する銅キレート化ペプチドの効果
実験手順
ＣＤ３４細胞の選択：全血単位から由来する末梢血「軟膜」細胞、ロイコフォレシス後に得られる末梢血細胞、または臍帯血細胞はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅに積層され（密度１．０７７ｇ／ｍｌ）、そして１０００×ｇで２０分間室温で遠心分離された。単核細胞の間期層は採取され、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＣａ／Ｍｇ非含有リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄された。細胞はマウスのモノクローナル抗ＣＤ３４抗体（０．５μｇ／１０６単核細胞）で４℃で３０分間インキュベートされ、その後ｍｉｎｉＭＡＣＳ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ−Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者のプロトコールに従って用いて単離された。
【０５０６】
培養手順：先祖細胞の拡大のため、ＣＤ３４＋について富化された画分が１０％の予め選択されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むアルファ最小必須培地（両方ともＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹより１×１０４個細胞／ｍｌで播種された。培地は増殖因子と銅キレート化剤の混合物を補充された。培養物は３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気で過湿状態でインキュベートされた。培地の半分はすべての補充物を含む新鮮な培地と毎週交換された。
【０５０７】
培養された細胞のクローニングポテンシャルは半固型培地でアッセイされた。細胞は洗浄され、３０％ＦＣＳおよび組換え増殖因子（幹細胞因子（ＳＣＦ），Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦおよびエリスロポイエチン（ＥＰＯ））を補充されたアルファ培地を含むメチルセルロース中に３５ｍｍの皿に播種された。２週間の培養後、培養物は倒立顕微鏡を用いて計数された。コロニーはそれらの細胞組成に従って芽細胞、混合物、赤血球、骨髄細胞および巨核細胞として分類された。
【０５０８】
形態学的評価：生じる培養物集団を特性決定するために、少量の細胞がスライドガラス（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）に付着され、固定され、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ  Ｇｉｅｍｓａで染色された。
【０５０９】
ＣＤ３４抗原のための免疫蛍光染色：細胞は、ＦＩＴＣでラベルされた抗ＣＤ４５モノクローナル抗体およびフィコエリスリン（ＰＥ）でラベルされた抗ＣＤ３４（ＨＰＣＡ−２）モノクローナル抗体またはＰＥでラベルされたコントロールのマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）と共に氷上でインキュベートされた。インキュベート後、細胞は洗浄されてフローサイトメーターによって分析された。
【０５１０】
フローサイトメトリー：細胞はＦＡＣＳｔａｒｐｌｕｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて分析された。細胞は生理食塩水をシース液として用いて１０００個細胞／秒の速度で７０μｍのノズルを通して通過させられた。２５０ｍＷでの４８８ｎｍアルゴンレーザービームが励起のための光源として用いられた。緑（ＦＩＴＣ由来）蛍光は５３０±３０ｎｍ帯域通過フィルターを用いて測定され、赤（ＰＥ由来)の蛍光は５７５±２６ｎｍ帯域フィルターを用いて測定された。ＰＭＴｓは適切な電圧に設定された。対数増幅は蛍光の測定のために適用され、線形増幅は前方光散乱のために適用された。少なくとも１０４個の細胞が分析された。
【０５１１】
実験結果
ＣＤ３４細胞培養物における増殖およびクローニング能力に対する銅キレート化ペプチドの効果
培養は精製された１０４個の臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞をＳＣＦ，ＦＬＴ３およびＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）および銅結合ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（ＧＧＨ）またはＧｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ（ＧＨＬ）（それぞれ１０μＭ）、または後期活動サイトカイン顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で液体培地中で培養することによって開始された。週間隔で培養物は細胞数を半分に減らされ、新鮮な培地、サイトカインおよびペプチドを補充された。７週目に細胞は計数され、ＣＦＵｃについてアッセイされた。
【０５１２】
図４３ａ−ｂに示すように、結果はＧＧＨおよびＧＨＬが細胞数をそれぞれ１０％および２５％減らし、Ｇ−ＣＳＦ＋ＧＭ−ＣＳＦは細胞数を２０％減らしたということを示した。培養物のクローン原性ポテンシャルに対する効果はずっと明白であった。：８０％および７８％の減少がＧＧＨおよびＧＨＬによってそれぞれ生じ、８９％の減少がＧ−ＣＳＦ＋ＧＭ−ＣＳＦによって生じた。
【０５１３】
実施例８
細胞分化に対する特定の遷移金属キレート化剤の効果を決定するための遷移金属キレート化剤のアッセイ
実験手順
分化の阻害：ＭＥＬ（マウスの赤白血球病細胞系）が１ｍｌ当たり８×１０３個の細胞数で以下の表８に示される濃度の様々なキレート化剤と２４時間インキュベートされた。次に、培養物は分化誘導剤であるヘキサメチレンビスアセタミド２ｍＭを補充された。細胞数および分化した細胞（ベンジジン陽性）の割合は誘導剤添加の７２時間後に決定された。
【０５１４】
同様に、ＨＬ−６０（ヒト骨髄白血球病細胞系）が１ｍｌ当たり１×１０５個の細胞数で以下の表８に示される濃度の様々なキレート化剤と２４時間インキュベートされた。次に、培養物は分化誘導剤であるビタミンＤまたはレチノイン酸（両方とも１×１０−７Ｍ）を補充された。細胞数および分化した（食作用を行う）細胞の割合が決定された。
【０５１５】
分化の誘導：１ｍｌ当たり１×１０５個のＨＬ−６０細胞が様々なキレート化剤とインキュベートされた。細胞数および分化した（食作用を行う）細胞の割合が決定された。
【０５１６】
銅決定：細胞は１０００×ｇで５分間の遠心分離によって採取された。細胞ペレットは細胞をＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋非含有）に再懸濁させて１０００×ｇで遠心分離することによって３回洗浄された。次に、２×１０６個の細胞を含む少量が金属非含有Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移され、細胞は１０００×ｇでの遠心分離によって回収された。細胞ペレットは０．０３Ｍの超純粋硝酸に再懸濁されて１×１０７個細胞／ｍｌの濃度を与えた。細胞は高剪断力ミキサー（ｐｏｌｙｔｒｏｎ，Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で１分間ホモジナイズされて細胞を粉砕させて細胞内銅含有量を放出させられた。細胞サンプルはボルテックスされてからバイアル自動サンプル採取機に移され、３２４．７ｎｍでＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ黒鉛炉原子吸光光度計によって２回分析された。サンプルは０．０３Ｍの超純粋硝酸で希釈された商業的なストック溶液から調製された銅標準溶液に対して分析された。
【０５１７】
実験結果
以下の表８はＨＬ−６０細胞についての結果を示す。ＭＥＬ細胞の分化の阻害は匹敵しうる結果を生じた。図４４はこれらの実験で用いられた様々なキレート化剤の化学構造を与える。
【０５１８】
【表８】
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【０５１９】
上記表８から明らかなように、細胞内銅含有量を調節するキレート化剤の能力とそれら生物学的活性の間には良好な相関が見出された。細胞内銅含有量を減少させるキレート化剤は強い分化阻害剤である。一方、細胞内銅含有量を増大させるキレート化剤は強い分化誘導剤である。実際、ＴＥＰＡ，ＰＥＨＡの如き分化阻害キレート化剤はＣＤ３４＋細胞に対するそれらの活性についてテストされたとき、分化を阻害することが見出された。１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカンおよび銅結合ペプチドＧＧＨおよびＨＨＫの如き分化誘導活性を持つキレート化剤は分化を刺激することが見出された。従って、細胞内銅含有量を調節（増大または減少）するキレート化剤の能力についてスクリーニングすることは、造血幹（ＣＤ３４＋）細胞の如き様々な細胞型に対するキレート化剤の効果についての予測的なアッセイでありうる。
【０５２０】
実施例９
非造血細胞に対する銅キレート化剤による分化の調節
上述の背景部分で示されるように、および科学論文から知られるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの銅消耗は造血細胞を含むがこれに限定されない複数の細胞系譜に影響を与える。それ故、分化に対する遷移金属キレート化剤の効果は造血細胞系譜の細胞に限定されず、むしろこの効果はすべての真核細胞に共通する根元的な現象であると予測された。
【０５２１】
胚性幹細胞：胚性幹細胞は培地に白血病阻害因子（ＬＩＦ）が補充された場合、培地中に未分化状態で維持されることができる。ＴＥＰＡは細胞の未分化表現型を維持することにおいてＬＩＦを置換することができることが見出された。
【０５２２】
従って、胚性幹細胞は本質的に文献６６に記述されるようにしてＬＩＦ（２０〜１００ｎｇ／ｍｌ）またはＴＥＰＡ（１０〜２０μＭ）の存在下で３〜４日培養され、それらの分化は未処理のコントロール細胞と比較された。
【０５２３】
【表９】
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【０５２４】
表９に示される結果はＴＥＰＡは他の細胞型に対して発揮するのと同様の効果を胚性幹細胞に対して発揮するということを明らかに示す。
【０５２５】
肝細胞：肝臓は麻酔されたＢＡＬＢ／ｃマウスから滅菌された道具を用いて切除され、Ｆ１２培養培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）中に含浸された。肝臓は３％のＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液を用いて３回洗浄され、はさみを用いて小片に切り分けられた。３％のＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、肝臓の小片は５％ＣＯ２雰囲気下で連続的に撹拌しながら３７℃で０．０５％コラゲナーゼと共に３０分インキュベートされた。消化された肝臓組織は次に微細メッシュストレーナーを通して加圧することによって押しつぶされた。３％のＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後、肝細胞は１５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、０．１のグルコース、１０ｍＭの二炭酸ナトリウム、０．５ｕ／ｍｌのインシュリンおよび７．５ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンで富化されたＦ１２培地中に１５μｇ／ｍｌのＴＥＰＡありまたはなしで播種され、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートされた。一晩のインキュベート後、培地は除去され、細胞は上述したような１５μｇ／ｍｌのＴＥＰＡありまたはなしの新鮮な富化されたＦ１２培地を補充された。肝細胞は１５μｇ／ｍｌのＴＥＰＡありまたはなしの富化されたＦ１２培養培地で３７℃で５％ＣＯ２雰囲気下で数週間３５ｍｍ皿でインキュベートされた。細胞培養培地は毎週新鮮な培地で置換された。ＴＥＰＡで５週間ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大された肝細胞培養物は多くの分割および未分化細胞を含んでいたが（図４５ａ−ｄ）、ＴＥＰＡで処理されなかった培養物はごく少量の分化のみ行った細胞を含んでいた（図４５ｅ−ｆ）。
【０５２６】
植物細胞：植物細胞の細胞内銅含有量に対するＴＥＰＡの効果は以下のようにして決定された。ボストンタマシダのカルス組織培養物は商業的な植物組織培養生産施設（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｔ  Ｈａ’Ｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）から入手され、様々な濃度のＴＥＰＡで培養培地中で２日間室温でインキュベートされた。ＰＢＳで３回洗浄した後、組織は０．０３Ｍの超純粋硝酸に懸濁され、高剪断力ミキサー（ｐｏｌｙｔｒｏｎ，Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で３分間ホモジナイズされて細胞を粉砕させて細胞内銅を放出させられた。細胞サンプルはボルテックスされてからバイアル自動サンプル採取機に移され、３２４．７ｎｍでＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ黒鉛炉原子吸光光度計によって２回分析された。サンプルは０．０３Ｍの超純粋硝酸で希釈された商業的なストック溶液から調製された銅標準溶液に対して分析された。
【０５２７】
以下の表１０は植物細胞の細胞内銅濃度に対する増殖培地中の様々なＴＥＰＡ濃度の効果をまとめる。
【０５２８】
【表１０】
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【０５２９】
上記表１０から、植物細胞をＴＥＰＡと共にインキュベートすると細胞の細胞内銅含有量が減少することが明らかである。
【０５３０】
実施例１０
ｅｘ  ｖｉｖｏで培養された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの能力の評価
ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大されたヒト造血細胞によるＳＣＩＤマウスの植え付け：新鮮なまたは２または４週間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養（ＴＥＰＡありまたはなしで）後の臍帯血由来の精製されたＣＤ３４＋細胞は本質的に文献５６に記載されているようにしてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射された。４週間後、マウスは屠殺され、それらの大腿骨および脛骨が切除され、骨髄は２５ゲージ針を装着され、シリンジで洗い流された。単一細胞懸濁液が調製され、細胞は洗浄され、少量がＴｒｙｐａｎブルーを用いて計数された。
【０５３１】
ヒト起源の植え付けられた細胞を定量化するため、細胞はＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＣＤ４５抗体およびＰＥコンジュゲート化抗ＣＤ３４，ＣＤ１９またはＣＤ３３抗体で染色された。抗ＣＤ４５抗体はヒトの細胞を認識するが、マウスの細胞は認識しない。従って抗ＣＤ４５抗体はヒト起源の細胞を示す。
【０５３２】
植え付けられた細胞の増殖および分化能力は本質的に文献５６に記載されているようにしてヒト由来のコロニーを特異的に増殖させる条件下で半固型培地で骨髄細胞をクローニングすることによってアッセイされた。
【０５３３】
結果（表１１）は、拡大された細胞の植え付け能力（２０〜６０％のＣＤ４５＋細胞）は新鮮な細胞のそれ（３〜６％のＣＤ４５＋細胞）より高いことを示す。ＴＥＰＡの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された６つの臍帯血サンプルは全て動物への植え付けに成功したが、ＴＥＰＡなしで拡大されたサンプルは６つのサンプルのうち２つしか植え付けできなかった。
【０５３４】
【表１１】
2006521813.tif 000014
【０５３５】
致死量を照射されたマウスの造血再構築−新鮮な細胞対ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された細胞：３ヶ月齢のメスのＢａｌｂ／ｃ  Ｘ  Ｃ５７Ｂｌ／６  Ｆ１マウスは致死量（１０００ｒａｄ）を照射され、１日後に１×１０５個の新鮮な骨髄細胞またはＴＥＰＡありまたはなしで３〜５週間ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された１×１０５個の骨髄細胞の収量を移植された（詳細は表１２参照）。末梢血ＷＢＣ計数は週単位で行われた。
【０５３６】
結果は、ＷＢＣの回復は、新鮮な細胞またはＴＥＰＡなしで拡大された細胞と比較してＴＥＰＡの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された骨髄細胞を移植されたマウスの方が早かったことを示した。
【０５３７】
【表１２】
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【０５３８】
移植されなかった照射マウスの生存率は３つの実験全てで０／５であった。
【０５３９】
実施例１１
銅キレート化剤とＲＮＡアンタゴニストとの共処理は幹細胞拡大にいかなる相加的または相乗的効果も与えない
ＣＤ３４＋細胞培養物は次の４種類のサイトカイン：ＳＣＦ，ＴＰＯ，ＩＬ−６およびＦＬＴ３の組合せを、次の添加剤：５μＭのＴＥＰＡ、１０−５ＭのＲＡＲアンタゴニストおよび５μＭのＴＥＰＡプラス１０−５ＭのＲＡＲアンタゴニストありまたはなしで３週間補充された。３週目以降、すべての培養物はサイトカインのみを補充された。７週目に細胞の数およびＣＤ３４＋細胞の数が決定された。ＣＤ３４＋細胞の培養物の計数は、精製されて再選択された画分から、ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４先祖細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて決定された。再選択された細胞は計数されて、培養物中のＣＤ３４＋細胞の絶対数を与えた。初期ＣＤ３４＋細胞サブセット、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−の割合は再選択されたＣＤ３４＋細胞画分から決定された。細胞はＣＤ３４ＰＥでおよびＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＣＤ３８，ＣＤ３３，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ６１，ＣＤ１９抗体の混合物でＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の決定のために二重に染色された。
【０５４０】
得られた結果は銅キレート化剤とＲＡＲアンタゴニストとの共処理は幹細胞拡大にいかなる相加的または相乗的な効果も与えないことを示し、これは銅キレート化剤とＲＡＲアンタゴニストが単一のシグナル伝達経路に影響を与えることを示唆する。
【０５４１】
実施例１２
銅キレート化剤とＣＤ３８阻害剤との共処理は幹細胞拡大にいかなる相加的または相乗的効果も与えない
ＣＤ３４＋細胞培養物は次の４種類のサイトカイン：ＩＬ−３，ＴＰＯ，ＩＬ−６およびＦＬＴ３の組合せを、次の添加剤：１０μＭのＴＥＰＡ、１０ｍＭのニコチンアミドおよび１０μＭのＴＥＰＡプラス１０ｍＭのニコチンアミドありまたはなしで３週間補充された。３週目以降、すべての培養物はサイトカインのみを補充された。５週目に細胞の数およびＣＤ３４＋細胞の数が決定された。ＣＤ３４＋細胞の培養物の計数は、精製されて再選択された画分から、ＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４先祖細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて決定された。再選択された細胞は計数されて、培養物中のＣＤ３４＋細胞の絶対数を与えた。
【０５４２】
得られた結果は銅キレート化剤とＣＤ３８阻害剤との共処理は幹細胞拡大にいかなる相加的または相乗的効果も与えないことを示し、これは銅キレート化剤とＣＤ３８阻害剤が単一のシグナル伝達経路に影響を与えることを示唆する。
【０５４３】
従って、実施例１１および１２から明らかなように、様々な細胞内標的に対して活性のある様々な試薬を組合せることは相加的な効果も相乗的な効果も与えないことが証明された。これらの結果はＣＤ３８タンパク質およびその生物学的機能が幹細胞の自己再生の制御における偶然の事象であることを支持する。
【０５４４】
実施例１３
ＰＩ３−キナーゼの阻害は幹細胞拡大を生じる
実験手順：
ＣＤ１３３＋細胞：ＣＤ３４＋を富化された臍帯血または末梢血白血球細胞は移植のための未分化の造血細胞に富む参照集団を伝統的に構成するが、ＣＤ１３３（以前はＡＣ１３３として知られていた）の如き追加のマーカーを発現するヒト造血細胞の最近の同定および単離は、ヒトにおける造血先祖および幹細胞についての新規の見地を与え、ヒト造血系を含む亜集団の細胞表面表現型とそれらの増殖および分化能力との間の関係のより良い理解を与えた（例えばＢｈａｔｉａ，Ｍ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２００１；１５：１６８５〜８８参照）。ＡＣ１３３＋亜集団の培養物の研究はＣＤ１３３＋細胞は高い自己再生能力を持っており、初期造血幹／先祖細胞（ＨＳＰＣ）の特性を維持しており、ＣＤ３４＋細胞と比較して培養中の生存性に優れていることを示す（Ｆｏｒｒａｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００２；１１９：５１６〜２４参照）。広範囲の未分化の造血幹／先祖細胞への移植のための細胞の拡大および分化の阻害のための本発明の方法の適用性はＣＤ１３３＋細胞を用いてもアッセイされることができる。ＣＤ１３３＋細胞はＣＤ１３３  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いてＣＤ１３３のために最適化されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）または抗ＣＤ１３３モノクローナル抗体（カタログ番号１６−１３３１；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ，ＵＳＡ）の如き当該技術分野では周知の手順を用いて培養のためにまたはサイトメトリーのために同定されて単離されることができる。
【０５４５】
単核細胞画分の採取および精製：ヒトの血液細胞は全期間の正常な分娩後の女性患者からの臍帯血から得られた（インフォームドコンセントが得られた）。サンプルは分娩後１２時間以内に採取され、処理された。血液は３％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合され、３０分間沈殿させられて大部分の赤血球細胞が除去された。白血球に富む画分は回収されてＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（１．０７７グラム／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）に積層され、４００ｇで３０分間遠心分離された。界面層の単核細胞画分は回収され、３回洗浄されて０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、画分Ｖ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｍｉｓ，ＭＯ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）中に再懸濁された。
【０５４６】
単核細胞画分からのＣＤ３４＋細胞の精製：ＣＤ３４＋単核細胞を精製するために、単核細胞画分はＭｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）またはＣｌｉｎｉｍａｘ（登録商標）ＣＤ３４先祖細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を製造者の推奨通りに用いて２サイクルの免疫磁気分離に供された。得られたＣＤ３４＋集団の純度はフローサイトメトリー（以下参照）によって決定された通り、９５％〜９８％であった。
【０５４７】
ＣＤ３４＋集団をＣＤ３４＋３８−またはＣＤ３４＋Ｌｉｎ−亜画分へとさらに精製するために、精製されたＣＤ３４＋細胞はＣＤ３８に対して特異的なモノクローナル抗体（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）または系譜抗原に対して特異的なモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｒｅｒｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いてさらに標識化された。陰性に標識化された画分（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−またはＣＤ３４＋Ｌｉｎ−）は測定されてＦＡＣＳ分類器によって分類された。
【０５４８】
ＣＤ３４―Ｌｉｎの精製のために、ＣＤ３４−画分は陰性選択カラム（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いて系譜抗原を発現する細胞から減少させられた。
【０５４９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ拡大：精製されたＣＤ３４＋細胞は１×１０４個細胞／ｍｌの濃度でＭＥＭα／１０％ＦＣＳ中で培養バッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ  Ｃｏ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）中で培養された。前記ＦＣＳは次のヒト組換えサイトカイン：トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ−３をそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で含んでおり（Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるＬＹ２９４００２あり（０．１，０．５，１，５，１０，２０，５０，１００μＭ／ｌ）またはなしであった。細胞は３７℃で空気中の５％ＣＯ２の加湿雰囲気でインキュベートされた。培養物は同容量の新鮮な培地、ＬＹ２９４００２および増殖因子を３週間の間、毎週補充された。３週間目以降実験の終了までの間、培養物は毎週細胞数を半分に減少させられた。細胞はトリパンブルーでの染色後に計数された。様々な時点で、回収された細胞は培養物中のコロニー形成単位（ＣＦＵｃ）の内容のアッセイ、再選択後のＣＤ３４＋細胞の計数および免疫表現型分析のために用いられた。細胞形態はＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａ溶液で染色されたサイトスピン（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）調製されたなすりつけ標本で決定された。
【０５５０】
表面抗原分析：細胞は１％のＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で洗浄され、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲート化抗体で染色された（４℃で、３０分間）。細胞は次に上述の緩衝液で洗浄され、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて分析された。細胞は１０００個細胞／秒までの速度で、励起光源として４８８ｎｍのアルゴンレーザー光線を用いて通過させられた。１０４個の細胞の放出は対数増幅を用いて測定され、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析された。ＦＩＴＣおよびＰＥコンジュゲート化同位型コントロール抗体で染色された細胞は背景蛍光を決定するために用いられた。
【０５５１】
拡大後のＣＤ３４＋細胞含有量の決定：ＣＤ３４＋細胞の含有量はＭｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４先祖細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者の推奨に従って用いて拡大された造血先祖細胞の精製されて再選択された画分から決定された。簡単に述べると、培養物の一部分から由来する単核細胞は２サイクルの免疫磁気ビーズ分離に供された。かくして得られたＣＤ３４＋集団の純度はフローサイトメトリーによって評価されるように９５〜９８％であった。全培養物のＣＤ３４＋細胞含有量は以下のようにして計算された：拡大後、再精製により回収されたＣＤ３４＋細胞の数が、培養物の容積／再精製に供された培養物の部分の容積と掛けられた（ＣＤ３４＋ｔｏｔａｌ＝サンプル中のＣＤ３４＋×全培養容積／再精製されたサンプルの容積）。３週間目まで、培養物は新鮮な培地を毎週補充された。従って、培養物の容積は直接測定された。３週間目以降は、（細胞数を半分に減少される処理のため）培養容積は実際の容積に経代数を掛けることによって計算された。拡大倍率は培養物のＣＤ３４＋細胞含有量を接種されたＣＤ３４＋細胞の数で割ることによって計算された（拡大倍率＝全ＣＤ３４＋含有量／接種されたＣＤ３４＋）。８週間目の培養物からの細胞のＦＡＣＳ分析は再精製されたＣＤ３４＋細胞の前方光散乱（ＦＳＣ−Ｈ）および側方光散乱（ＳＳＣ−Ｈ）が培養前のＣＤ３４＋細胞のものと同様であることを示した。Ｇｉｅｍｓａ染色は細胞の形態が新鮮な精製されたＣＤ３４＋細胞のものと同一であることを示した（データは示さず）。
【０５５２】
初期ＣＤ３４＋細胞サブセットの決定：初期ＣＤ３４＋細胞サブセットの割合は再精製されたＣＤ３４＋細胞画分と同様にして決定された。細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の決定のためにＰＥ抗ＣＤ３４およびＦＩＴＣ抗ＣＤ３８抗体で、およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の決定のためにＰＥ抗ＣＤ３４抗体および分化抗原（ＣＤ３８，ＣＤ３３，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ３，ＣＤ６１，ＣＤ１９）に対するＦＩＴＣコンジュゲート化抗体の混合物で二重に染色された。ＣＤ３４，ＣＤ３８およびＣＤ６１に対する抗体はＤＡＫＯ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入され、ＣＤ３３，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ３およびＣＤ１９に対する抗体はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から購入された。上述のサブセットのＦＡＣＳ分析結果はＣＤ３４＋細胞の割合として表される。培養物中のＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の絶対数は、再精製工程後に回収されたＣＤ３４＋細胞の全数から計算された。
【０５５３】
形態学的評価：生じた培養物集団の形態学的特性決定はサイトスピン（Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ，Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）を介してスライドガラスに付着された少量の細胞を用いて行われた。細胞は固定され、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ／Ｇｉｅｍｓａ染色を用いて染色され、顕微鏡で観察された。
【０５５４】
コロニー形成単位（ＣＦＵｃ）についてのアッセイ：メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ）、３０％のＦＣＳ、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１×１０−５Ｍのβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍＭのグルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ＩＵ／ｍｌのエリスロポイエチン（Ｅｐｒｅｘ，Ｃｉｌａｇ  ＡＧ  Ｉｎｔ．，Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳＣＦおよびＩＬ−３（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｒｐｏ  Ｔｅｃｈ）および２μＭのヘミン（Ｓｉｇｍａ）を含む半固型培地に単核細胞が添加された（１５００個細胞／３ｍｌ）。撹拌後、混合物は２つの３５ｍｍ皿に分割された。皿は１４日間３７℃で空気中の５％ＣＯ２の加湿雰囲気でインキュベートされた。インキュベート期間の終わりに骨髄細胞および赤血球細胞コロニーが倒立顕微鏡下で４０倍で計数された。拡大された培養物のＣＦＵｃ含有量は以下のようにして計算された：２つの皿当たりの計数されたコロニーの全数×全単核細胞数／１５００。３週間目までは全単核細胞は１ｍｌ当たりの細胞数に培養物容積を掛けることによって決定された。３週目以降は継代培養の数も考慮に入れられた（細胞数を半分に減少させる処理のため）。
【０５５５】
結果：幹および初期先祖細胞の分化および拡大に対するＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害の効果を決定するために、造血幹細胞培養は上述のようにして確立された：ＣＤ３４＋細胞は３週間の間、サイトカイン混合物をＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるＬＹ２９４００２ありまたはなしで補充された。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤への短い暴露後の拡大についての長期間の能力を決定するために、３週間目以降培養物はサイトカインのみを補充された。初期（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋Ｌｉｎ−）および後期（ＣＤ３４＋  ＣＦＵｃ）先祖細胞は実験の開始後２および３週間目に分析された。後期先祖細胞は実験の残りの期間に分析された。
【０５５６】
２週間目の培養物のＦＡＣＳ分析（表１３）はコントロールの培養物中の初期先祖細胞サブセットであるＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の割合（それぞれ２．０％および１．０％）と比較してＬＹ２９４００２で処理された培養物中の割合（それぞれ９．１％および２．５％）が有意に高いことを示す。ＣＤ３４／ＣＤ３８およびＣＤ３４／ＣＤ３８／Ｌｉｎに関するＬＹ２９４００２処理細胞およびコントロール細胞のサンプルの代表的なＦＡＣＳ分析は図４６に示されている。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞の絶対含有量はコントロールの培養物（それぞれ２×１０４個および１×１０４個細胞）よりＰＩ３−キナーゼ阻害剤で処理された培養物（それぞれ９×１０４個および２．５×１０４個細胞）より有意に高かった。後期先祖細胞であるＣＤ３４＋細胞の含有量は処理培養物（６５×１０４個細胞）および未処理培養物（５５×１０４個細胞）の両方で同様であった。しかし、全培養細胞の中のＣＤ３４＋細胞の頻度はコントロールの培養物の頻度（０．２）よりＰＩ３−キナーゼ阻害剤処理の２週間後の頻度（０．３）の方が高かった。
【０５５７】
【表１３】
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【０５５８】
培養された造血幹細胞の形態学的評価は培養の３週間後でも、サイトカイン単独で処理されたコントロールのマクロファージ様の外観と比較してＬＹ２９４００２に暴露された細胞の特徴的なＣＤ３４＋細胞の形態の持続を明らかに示した（図４７）。
【０５５９】
これらの結果を総合すると、これらの結果は、低分子量の特異的阻害剤による幹細胞中のＰＩ３−キナーゼシグナル伝達経路の阻害がサイトカイン単独処理と比較して幹／初期先祖細胞の自己再生分裂を可能にするということを明らかに示す初めての証拠である。単一の仮説に限定されることは望まないが、これらの結果の１つの可能な解釈はＰＩ３−キナーゼが造血細胞分化を支配するシグナル伝達経路の下流に関与しているということである。それ故、ＰＩ３−キナーゼ活性の阻害はＣＤ３４およびＣＤ１３３抗体によって選択されるものの如き幹および初期先祖細胞の分化を阻害しつつ拡大を可能とし、幹細胞分裂のバランスを幹細胞拡大の方向に変化させることができる。
【０５６０】
明確にするために異なる実施形態の状況について記載してきた本発明の一定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて得ることもできることが認識される。逆に、簡潔にするために１つの実施形態の状況について記載した本発明の種々の特徴を、個別または任意の適切な組み合わせで得ることもできる。
【０５６１】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、本明細書中に記載した特許および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。
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【図面の簡単な説明】
【０５６２】
【図１Ａ】ＦＡＣＳ分析プロットを示す図であり、ＣＤ３４、ＣＤ３８、および関連する系統の抗原の十分な発現を有するコントロールの細胞表面マーカーの発現を示す。
【図１Ｂ】ＦＡＣＳ分析プロットを示す図であり、ＣＤ３４抗原の類似の発現レベルを有するが、コントロールと比較してＣＤ３８および関連する系統の抗原の発現がほとんど完全に失われている、ＲＡＲアンタゴニスト（１０−５Ｍ）で処理した培養細胞の表面マーカー発現を示す。
【図１Ｃ】ＦＡＣＳ分析プロットを示す図であり、ＣＤ３４抗原の類似の発現レベルを有するが、コントロールと比較してＣＤ３８および関連する系統の抗原発現がほとんど完全に失われている、ＲＡＲアンタゴニスト（１０−６Ｍ）で処理した培養細胞表面マーカー発現を示す。
【図２Ａ】ＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールおよびＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物中での同等のＣＤ３４＋細胞拡大レベルを示す。
【図２Ｂ】ＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールと比較して、１０−５Ｍまたは１０−７Ｍのいずれかの濃度でのＲＡＲアンタゴニストでの処理に応答して顕著に増加したＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の拡大レベルを示す。
【図２Ｃ】ＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールと比較して、１０−５Ｍまたは１０−７Ｍのいずれかの濃度でのＲＡＲアンタゴニストでの処理に応答して顕著に増加したＣＤ３４＋Ｌｉｎ−細胞の拡大レベルを示す。
【図３Ａ】ＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフであり、コントロールおよび処理した培養物の播種から２週間後までの同様のＣＤ３４＋表面発現を示す。
【図３Ｂ】ＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフである。
【図３Ｃ】ＦＡＣＳ分析によって収集したデータのグラフである。
【図４】ＦＡＣＳ分析およびＬＴＣ−ＣＦＵ能力によって収集したデータのグラフである。
【図５Ａ】ネガティブコントロールのＦＡＣＳ分析プロットである。
【図５Ｂ】再選択した細胞培養物のポジティブコントロールのＦＡＣＳ分析プロットである。
【図５Ｃ】再選択から２週間後のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物のＦＡＣＳ分析プロットである。
【図５Ｄ】再選択から１１週間後のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物（１０−７）のＦＡＣＳ分析プロットである。
【図５Ｅ】再選択から１１週間後のＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物（１０−５）のＦＡＣＳ分析プロットである。
【図６Ａ】コロニー形成単位データのグラフである。
【図６Ｂ】細胞計数データのグラフである。
【図７】混合コロニー形成単位データのグラフである。
【図８Ａ】マウスから単離した３週齢の初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。。
【図８Ｂ】マウスから単離した３週齢の初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。
【図９Ａ】ギムザ染色した３週齢の初代マウス肝細胞培養物の顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】１０−５Ｍレチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＡＧＮ１９４３１０）の存在下でインキュベートしたギムザ染色した初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。
【図９Ｃ】１０−５Ｍレチノイン酸受容体アンタゴニスト（ＡＧＮ１９４３１０）の存在下でインキュベートし、その後トリプシン処理し、１：２の比でのサイトカインを含まない培養培地中に再プレーティングを行った、ギムザ染色した初代肝細胞培養物の顕微鏡写真である。
【図１０Ａ】マウスから単離し、ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を補充した、３週齢の初代肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１０Ｂ】マウスから単離し、同様にＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、アルブミン発現についてプローブした、３週齢の初代肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１０Ｃ】マウスから単離し、同様にＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、α−フェトプロテイン発現についてプローブした３週齢の初代肝細胞ＲＡＲアンタゴニストで処理した培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１０Ｄ】マウスから単離し、同様にＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、α−フェトプロテイン発現についてプローブした、３週齢の初代肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１１Ａ】上記のように、マウスから単離し、ＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、培養２週間後に１：２に分割し、さらに１週間培養し、アルブミン発現についてプローブした、第１継代肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａのように培養し、アルブミン発現についてプローブした、マウスから単離したＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−５〜１０−７Ｍ）で処理した第１継代の肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｂのように培養およびプローブしたＲＡＲアンタゴニストで処理した第１継代の肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｃの低倍率の顕微鏡写真である。
【図１１Ｅ】上記のように、マウスから単離し、ＥＧＦおよびＨＧＦを補充し、培養２週間後に１：２に分割し、さらに１週間培養し、１：４に分割し、その後最後にさらに４日間培養し、アルブミン発現についてプローブした、第２継代の肝細胞コントロール培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１１Ｆ】ＲＡＲアンタゴニスト（ＡＧＮ１９４３１０）（１０−５〜１０−７Ｍ）で処理した、同様に単離および培養した第２継代の肝細胞培養物の顕微鏡写真を示す。
【図１２Ａ】再選択から３週間後にサイトカインのみ（コントロール）、ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−７Ｍ）、およびＲＡＲアンタゴニスト（１０−７Ｍ）とＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析を示すプロットである。
【図１２Ｂ】再選択から５週間後にサイトカインのみ（コントロール）、ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０（１０−７Ｍ）、およびＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４（１０−７Ｍ）、およびＲＡＲとＲＸＲアンタゴニストとの組み合わせ（１０−７Ｍ）で処理した培養物のＦＡＣＳ分析を示すプロットである。
【図１３Ａ】ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびそれらの組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。
【図１３Ｂ】ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびそれらの組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。
【図１３Ｃ】ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびその組み合わせで処理した培養物のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。
【図１３Ｄ】ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびその組み合わせで処理した培養物の総細胞密度を示す棒グラフである。
【図１３Ｅ】ＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９４３１０、ＲＸＲアンタゴニストＬＧＮ１００７５４、およびその組み合わせで処理した培養物のコロニー形成単位（ＣＦＵ）データを示す棒グラフである。
【図１４】３週間培養物中で計数したＣＤ３４＋細胞密度を示す棒グラフである。
【図１５】３週間培養物中のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−細胞のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。
【図１６】３週間培養物中のＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。
【図１７】３週間培養物中のＣＤ３４＋／（ＨＬＡ−ＤＲ３８）−細胞のＦＡＣＳ分析によって得られたデータを示す棒グラフである。
【図１８Ａ】サイトカインで処理し、５ｍＭニコチンアミドで処置したかまたは処理しなかった３週間培養物から再選択したＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すドットプロットである。
【図１８Ｂ】再選択の３週間後に、３週間の間、サイトカインで処理し、５ｍＭニコチンアミドで処理したかまたは処置しなかった培養物から再選択したＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すドットプロットである。
【図１８Ｃ】再選択の３週間後に、３週間の間、サイトカインで処理し、５ｍＭニコチンアミドで処理したかまたは処置しなかった培養物から再選択したＣＤ３４＋細胞のＦＡＣＳ分析を示すドットプロットである。
【図１９】ＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルに対するＴＥＰＡの短期間の効果を示す。
【図２０】全細胞およびＣＤ３４細胞に対するＴＥＰＡの短期間の効果を示す。
【図２１】図２１ａ−ｂは細胞数およびＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルに対するＴＥＰＡの長期間の効果を示す。
【図２２】図２２ａ−ｂは初期サイトカインで培養されたＣＤ３４細胞に対するＴＥＰＡの長期間の効果を示す。
【図２３】赤血球前駆体の発達に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図２４Ａ−Ｂ】図２４ａ−ｂは細胞成熟に対するＴＥＰＡの効果を示す。ＴＥＰＡの不在下（２４ａ）および存在下（２４ｂ）での長期間（７週間）培養物における細胞の形態が示される。
【図２４Ｃ−Ｄ】図２４ｃ−ｄは細胞成熟に対するＴＥＰＡの効果を示す。ＴＥＰＡの不在下（２４ｃ）および存在下（２４ｄ）での長期間（７週間）培養物における細胞の形態が示される。
【図２５】ＣＤ３４細胞で開始された培養物の細胞数およびクローン原性に対する遷移金属キレート化剤の効果を示す。
【図２６】図２６ａ−ｂはＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルおよび全細胞数に対する銅の効果を示す。
【図２７】培養されたＣＤ３４細胞のクローン原性ポテンシャルに対するイオンの効果を示す。
【図２８】ＣＤ３４細胞の増殖ポテンシャルに対する亜鉛の効果を示す。
【図２９】図２９ａ−ｃは長期間のＣＤ３４培養物に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図３０】初期サイトカインの様々な組合せの存在下での細胞増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図３１】初期サイトカインの様々な組合せの存在下での細胞増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図３２】初期サイトカインの様々な組合せの存在下での細胞増殖、ＣＦＵｃおよびＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図３３】コントロールのＣＦＵｃ頻度およびＴＥＰＡを補充されたＣＤ３４培養物に対するＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦの効果を示す。
【図３４】長期間細胞増殖およびＣＦＵｃ生成に対する部分的なまたは完全な培地＋ＴＥＰＡ交換の効果を示す。
【図３５】長期間細胞増殖およびＣＦＵｃ生成に対する部分的なまたは完全な培地＋ＴＥＰＡ交換の効果を示す。
【図３６】Ｄ３４細胞拡大に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図３７】ＣＦＵｃ頻度に対するＴＥＰＡの遅延された添加の効果を示す。
【図３８】長期間のＣＦＵｃ生成に対する単一のサイトカインを用いた短期間の前培養の効果を示す。
【図３９】図３９ａ−ｃはＣＤ３４細胞培養物に対するポリアミンキレート化剤の効果を示す。
【図４０】図４０ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する遷移金属キレート化剤の効果を示す。
【図４１】図４１ａ−ｂはＣＤ３４細胞培養物に対する亜鉛の効果を示す。
【図４２】末梢血由来のＣＤ３４細胞培養物に対するＴＥＰＡの効果を示す。
【図４３】図４３ａ−ｂはＣＤ３４＋細胞培養物に対する銅キレート化ペプチドの効果を示す。
【図４４】本発明に従うアッセイで使用された遷移金属キレート化剤の化学構造を示す。
【図４５Ａ−Ｂ】図４５ａ−ｂは５週間ＴＥＰＡありでｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された肝細胞培養物の写真を示す。
【図４５Ｃ−Ｄ】図４５ｃ−ｄは５週間ＴＥＰＡありでｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された肝細胞培養物の写真を示す。
【図４５Ｅ−Ｆ】図４５ｅ−ｆは５週間ＴＥＰＡなしでｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された肝細胞培養物の写真を示す。
【図４６】造血幹細胞分化に対するＰＩ３−キナーゼの阻害の効果を示す。
【図４７】図４７Ａおよび図４７Ｂは培養物中の造血幹細胞形態に対するＰＩ３−キナーゼの阻害の効果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ−Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ−Ｂ】
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【図４５Ｃ−Ｄ】
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【図４５Ｅ−Ｆ】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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