(57)【要約】トリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPを含む加水分解カゼイン製品の製造方法であって、この方法においては、カゼインまたはカゼイン断片を含む基質を、アスペルギルス(Aspergillus)に由来する酵素で処理し、酵素濃度はカゼインに基づいて2から10重量％であり、酵素は高いタンパク質分解活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPを含む加水分解カゼイン製品の製造方法であって、カゼインまたはカゼイン断片を含む基質をアスペルギルスに由来する酵素処理に供する製造方法であり、酵素濃度がカゼインに基づいて2から10重量％であり、酵素が高いタンパク質分解活性を有することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記酵素濃度が、カゼインに対して2から5重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、400U/kg以上のX-プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼおよびプロテイナーゼを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、アスペルギルス・オリゼーに由来する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ラクトバシラス・ヘルヴェティクスによる発酵を行う工程を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記発酵を前記酵素処理の前に行う、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記IPPの収率が60％以上である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記VPPの収率が50％以上である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
200μM以上のIPPeq、好ましくは400μM以上のIPPeqを含む加水分解カゼイン製品。
【請求項１１】
苦味を有さない、請求項１０に記載の加水分解カゼイン製品。
【請求項１２】
乾燥させた、請求項１０または１１に記載の加水分解カゼイン製品
【請求項１３】
スプレー乾燥または凍結乾燥させた、請求項１２に記載の加水分解カゼイン製品。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって得ることが出来る、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の加水分解カゼイン製品。
【請求項１５】
請求項９から１３のいずれか一項に記載の加水分解カゼイン製品を含む食品製品。
【請求項１６】
500μM以上のBPPeqを含む加水分解カゼイン製品。
【請求項１７】
前記LPPのモル収率が20％以上である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記LPPのモル収率が45％以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記モル収率が80％以上である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
25μM以上のLPPを含む、請求項９から１３のいずれか一項に記載の加水分解カゼイン製品を含む食品製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPを含む加水分解カゼイン製品に関する。本発明は、更に、このような加水分解カゼイン製品の製造方法と加水分解カゼイン製品を用いて製造される食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症または高血圧は、心臓血管疾患(CVD)の主要な危険因子の1つであると考えられている。血圧を制御する機序の1つは、レニン-アンジオテンシン系である。これは、アンジオテンシンIIの形成を誘導する反応のカスケードであって、強い血管収縮作用と、それによる血圧上昇作用を有する。このカスケードにおけるキーとなる1つの酵素：アンジオテンシンI転換酵素(ACE)の阻害により、アンジオテンシンIIの形成を低下させ、その結果、血圧低下作用をもたらすことができる。長期にわたるヒト関与の研究によると、少量のACE阻害剤を定期的に摂取した場合、CVDが25%まで低減することが明らかになった(Gersteinら、(2000)、The Lancet 355、253〜259)。プラセボコントロール試験において、高血圧のヒトに対する、サワーミルク中のVPPおよびIPPの血圧低下効果が示された(Hata Y.ら、(1996)、American Journal of Clinical Nutrition 64、767-771)。
【０００３】
「軽い高血圧症の人に適している」ことを謳っている市販の発酵乳製品はカルピスサワーミルクである。これは、カルピス食品工業(日本)によって製造されている、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lactobacillus helveticus)、およびサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cervisiae)による発酵製品である。
【０００４】
別の市販発酵乳製品はValio社(フィンランド)製造のEvolusである。これは、「血圧低下を促進するヨーロッパで初の機能性食品」であることを謳っている。
【０００５】
両方の発酵乳製品は、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lb. helveticus)株を用いて発酵させている。これらの製品は、カゼインのタンパク質分解によって得られる、in vitroでのACE阻害に関与する生理活性ペプチド（VPPおよびIPP）を含有している。他の乳酸菌と比較した場合、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lb. helveticus)は、最も優れたタンパク分解性ラクトバチルス種の1種である。
【０００６】
乳酸菌のタンパク質分解系によるカゼインの分解は、3段階に分けることができる。最初に、細胞外プロテイナーゼによりカゼインの分解が行なわれ、次の段階では、特定の取り込み機序により、ジペプチド/トリペプチドおよびオリゴペプチド(4から12個のアミノ酸残基)の取り込みが行なわれる。最終段階では、細胞内ペプチダーゼによりペプチドがさらに分解され、その結果、細菌が増殖するための小さなペプチドおよびアミノ酸が生じる。乳酸菌のこの複雑なタンパク質分解系については、Kunjiら、(1996)、Molecular Microbiology 27、1107〜1118に記載されている。細胞内ペプチダーゼ系についての概説は、Christensenら、(1999)、Molecular Microbiology 76、217〜246で確認することができる。
【０００７】
EP-A-1016709によれば、発酵乳中に生成される乳酸の含有量と比べて高含有量のラクトトリペプチドを含む発酵乳の製造が望まれている。ここでは、発酵中に、DL-乳酸0.01g当たり、30から50μgのトリペプチドVal-Pro-Pro (VPP)とIle-Pro-Pro (IPP)が得られるラクトバチルス・ヘルヴェティクス株CM4が提供されている。EP-A-1016709の表2には、この株が38.5μg/ml乳漿のVPPと23.5μg/ml乳漿のIPPを生産したことが開示されているが、これは140のIPPeq値(下記に定義されているとおりである)に相当する。
【０００８】
WO 01/034828には、酵素を用いたカゼインから、トリペプチドVPPおよび/またはIPPの製造方法が開示されている。この方法においては、カゼインをプロテアーゼで処理して、中間体ペプチドを調製し、その後、中間体ペプチドをペプチダーゼで分解している。WO 01/034828における最も好ましい結果は実施例２に示してあり、実施例２においては、パパインおよびラクトバシラス・ヘルヴェティクス(Lactobacillus helveticus)に由来するペプチダーゼで加水分解したカゼイン（ベータ-カゼインに基づく）により、25％のVPP収率および97.5％のIPP収率が得られた。脱脂粉乳には、平均して、30重量％のベータ-カゼインと15重量％のカッパ-カゼインが含まれていると想定すると、ベータ-カゼインに基づく97.5％のIPP収率は、本出願で使用されているようにベータ-カゼインとカッパ-カゼインの両方に基づくと54％の収率に対応する。他の実施例においては、より低い収率が報告されている。
【特許文献１】EP-A-1016709
【特許文献２】WO 01/034828
【非特許文献１】Gersteinら、(2000)、The Lancet 355、253〜259
【非特許文献２】Hata Y.ら、(1996)、American Journal of Clinical Nutrition 64、767-771
【非特許文献３】Kunjiら、(1996)、Molecular Microbiology 27、1107〜111
【非特許文献４】Christensenら、(1999)、Molecular Microbiology 76、217〜246
【非特許文献５】Kohmura, M.ら、(1990)、Agricultural and Biochemical Chemistry、54、835-836
【非特許文献６】Nakamura, Y.ら、(1995)、J. Dairy Sci. 78、1253-1257
【非特許文献７】Maruyama, S.ら、（1989）、Agricultural and Biochemical Chemistry、53、1077-108
【非特許文献８】K. Shisukeら、（1991）、Agric. Biol. 55(5)、1407-1408
【非特許文献９】Adler-Nissen、J. in Agric. Food Chem. 27、1256〜1262 (1979)
【非特許文献１０】Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of food proteins. New York: Elsevier Applied Science Publishers p. 110〜169 (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、高含量のトリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPを有する食品を供給することである。WO 01/034828を考慮すると、トリペプチドVPPおよび/またはIPPの収率を増すことが目的である。他の目的は、単純で低価格で、VPP、IPPおよび/またはLPPを含む食品の製造方法を供給することである。他の目的は、良好な味を有する食品を供給することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これらの目的の1つまたは複数は、VPP、IPPおよび/またはLPPを含む加水分解カゼイン製品の製造方法を提供するという本発明により達成され、この方法においては、カゼインまたはカゼイン断片を含む基質を、アスペルギルス(Aspergillus)に由来する酵素で処理し、酵素濃度はカゼインに基づいて2から10重量％であり、酵素は高いタンパク質分解活性を有する。
【００１１】
好ましい実施態様によれば、酵素は、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼおよびプロテイナーゼを含む。本発明は、更に、200μM以上のIPPeq（後に定義する）、好ましくは400μM以上のIPPeqを含む加水分解カゼイン食品に関する。有利なことには、加水分解カゼイン食品は、苦くない味覚を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
特段の記載のない限り、本出願における重量パーセントは、全重量に対して表されているものである。
【００１３】
本出願における酵素は、また、1つより多い酵素の混合物も含むと理解される。
【００１４】
共通の一文字コードは、アミノ酸を記載するのに一般に使用されているものである。
【００１５】
本出願におけるカゼインは、アルファ-カゼイン、ベータ-カゼイン、ガンマ-カゼインおよびカッパ-カゼインを含む全てのタイプのカゼインを含むと理解される。断片IPPは、ベータ-カゼインおよびカッパ-カゼインの両方から生じる。断片VPPおよびLPPの両方は、ベータ-カゼインから生じる。
【００１６】
本出願における基質は、酵素で処理される原料として使用される場合、カゼインおよび/またはカゼイン断片を含む任意の物資を意味する。
【００１７】
本出願においては、プロテアーゼは、タンパク質（ポリペプチド）のペプチド結合を切断し、より短いペプチドおよびアミノ酸を生じる任意の酵素群を指す。
【００１８】
本出願においては、エキソペプチダーゼは、ポリペプチド鎖の末端近くにおいてのみ作用する酵素と定義する。NまたはC末端での作用部位に基づいて、それぞれ、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼとして分類される。
【００１９】
本出願においては、エンドペプチダーゼは、NおよびC末端から離れたポリペプチド鎖の内部の領域のペプチド結合に選択的に作用する酵素として定義する。
【００２０】
本出願においては、酵素の高いタンパク質分解活性は、本明細書の実施例に従って、6時間の加水分解時間およびカゼインに基づいて5重量％の酵素濃度で測定した場合に、20％以上の加水分解の程度に対応するタンパク質分解活性として定義される。
【００２１】
好ましくは、酵素は、400 U/kg以上、より好ましくは700 U/kg以上、更により好ましくは1200 U/kg以上のX-プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性を有する。
【００２２】
ペプチドVal-Pro-ProはVPPと略記し、ペプチドIle-Pro-ProはIPPと略記し、ペプチドLeu-Pro-ProはLPPと略記する。本出願においては、ラクトバシラス(Lactobacillus)は、Lb.と略記する。
【００２３】
本出願に定義されるトリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPには、VPP、IPP、LPPおよびこれらのペプチドの混合物が含まれる。本出願では、混合物中のトリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPの全モル量は、混合物中へのトリペプチドの添加モル量によって算出される。
【００２４】
本発明による方法は、異なる活性を有する、活性トリペプチドVPP、IPPおよびLPPを生産する。IC50(ACE活性の50%阻害をもたらす濃度)は、IPPでは5μM、VPPでは9μMである(Kohmura, M.ら、(1990)、Agricultural and Biochemical Chemistry、54、835-836、およびNakamura, Y.ら、(1995)、J. Dairy Sci. 78、1253-1257)。LPPのIC50 ACE阻害値は、9.6μMである（Maruyama, S.ら、（1989）、Agricultural and Biochemical Chemistry、53、1077-1081）。LPPは、とうもろこし（ゼイン）加水分解物中に存在することが示されており、自然発生高血圧ラットにおいて、抗高血圧効果を有することが示されている（K. Shisukeら、（1991）、Agric. Biol. 55(5)、1407-1408）。
【００２５】
本出願においては、1つの図式でこれらの活性ペプチドIPPおよびVPPの全濃度を示すために、IPP当量濃度（IPPeq）を使用し、この濃度は、次式:
[IPPeq] = [IPP] + 5/9* [VPP]       (1)
のように定義され、好ましくはμMで表される。
【００２６】
本出願では、分枝鎖を有するアミノ酸-プロリン-プロリンを含む全てのトリペプチド（例えば、IPP、VPPおよびLPP）の全濃度を示すために、BPP当量濃度（BPPeq）も使用し、この濃度は、次式：
BPPeq = [IPP] + 5/9* [VPP] + 5/9.6* [LPP]       (2)
のように定義され、μMで表される。
【００２７】
本発明による方法は、基質をアスペルギルス(Aspergillus)に由来する酵素との処理に供する工程を含む。本出願においては、基質は、酵素処理に供される物質として定義される。
【００２８】
基質は、任意のカゼインおよび/またはカゼイン断片を含む人の食物として適した物質とすることができる。
【００２９】
好ましくは、基質は乳である。ウシの乳、ヤギの乳、ラクダの乳、ウマの乳等の動物の乳は、基質として使用することができる。基質中の固体成分は、特に制限されないが、通常は5から20重量％である。基質は、水と乳成分、例えば（脱脂）粉乳を混ぜて調製した還元乳とすることができる。基質は、酵素処理および/または発酵を妨げない限り、炭水化物等の添加剤を含有していてもよい。
【００３０】
好ましい実施態様においては、基質は、以後に記載する発酵方法によって得られる発酵乳である。この好ましい実施態様においては、カゼインを最初に発酵に供し、その後、酵素処理に供する。
【００３１】
他の実施態様には、発酵と酵素処理を同時に行うこと（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)に由来する酵素を、発酵を行う発酵槽に加えることによって行うこと）を含む。
【００３２】
酵素処理は、一般的な方法で行うことが出来る。酵素処理は、酵素（または酵素の混合物）を基質に加える工程、および、酵素による加水分解を行うのに適した制御条件下に得られた反応混合物を維持する工程を含む。制御すべき条件は、温度、pH、反応時間および酵素濃度を含む。反応混合物の好ましい温度は40から60℃、より好ましくは45から55℃、最も好ましくは約50℃である。反応混合物のpHは、好ましくは5から9、より好ましくは5.5から7、最も好ましくは6から6.5である。酵素濃度は、カゼインの総重量に基づいて、2から10重量％、より好ましくは3から10重量％、最も好ましくは4から6重量％である。反応時間（加水分解時間）は、好ましくは2から50時間、より好ましくは2から10時間、最も好ましくは4から8時間である。酵素は、アスペルギルス(Aspergillus)に由来すべきである。我々は、驚くべきことに、比較的に多い量のアスペルギルス(Aspergillus)に由来する酵素でカゼインを加水分解することによって、非常により多量のトリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPを産生することを見出した。好ましくは、酵素は、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)に由来する。
【００３３】
他の好ましい実施態様においては、カゼインの加水分解は、アスペルギルス(Aspergillus)を用いた発酵工程によって置き換えることが出来る。この好ましい実施態様においては、真菌類アスペルギルス(Aspergillus)は、発酵の間、in situでカゼインを加水分解する酵素を産生すると考えられている。この好ましい実施態様においては、発酵は、in situで多量の酵素（エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼおよびプロテイナーゼを含む）を産生する方法で行われるべきである。
【００３４】
本発明による食品は、ヒトの消費に適した製品であって、本発明によるカゼイン加水分解製品を顕著なACE阻害効果が得られるような有効な量で成分として使用している製品として定義される。
【００３５】
（発酵を含む好ましい実施態様の記載）
この好ましい実施態様によれば、酵素処理のための基質は、ラクトバシラス・ヘルヴェティクス(Lb. helveticus)による発酵により得られる発酵産生物である。加水分解カゼイン製品の製造方法は、それゆえ、任意に、発酵工程を含む。
【００３６】
ラクトバシラス・ヘルヴェティクス(Lb. helveticus)による発酵は、一般的な発酵槽でおこなうことができ、発酵槽内で、培地としてカゼイン含有出発原料にラクトバシラス・ヘルヴェティクス(Lb. helveticus)を接種する。カゼイン含有出発原料は、カゼインを含む任意の物質とすることができ、乳のような前記で定義した基質としても使用される物質が好ましい。
【００３７】
発酵工程の条件は、以下に具体的に示す。ラクトバシラス・ヘルヴェティクス(Lb.helveticus)は、如何なるラクトバシラス・ヘルヴェティクス(Lb.helveticus)株であってよい。好ましいLb.helveticus株は、多量のトリペプチドVPPおよび/またはIPPを生産するものである。最も好ましい株は、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス株CNRZ 244であるが、この株は、Jouy-en-Josas(フランス)のCentre National de Recherches Zootechniquesに寄託されている。
【００３８】
本発明の目的が達成される限り、場合によっては、他の微生物を発酵培地に添加してもよい。例えば、生産される加水分解カゼイン製品の風味および嗜好性を改善するために、さらに酵母を用いることができる。
【００３９】
酵母の株は特に限定されるものでなく、例えば、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)などのサッカロマイセス属の酵母を用いるのが好ましい。酵母の量は、所望する成果に応じて、適切に選択することができる。
【００４０】
培地に接種されるLb.ヘルヴェティクスの量については特に限定されない。接種量は、通常、約107から109の細胞のLb.ヘルヴェティクス細菌である。Lb.ヘルヴェティクスは、好ましくは、十分な活性を有する前培養スターターの形態で発酵に添加することができる。スターターの最初の細胞数は、約107から109細胞/mlであるのが好ましい。
【００４１】
Lb.ヘルヴェティクス接種原料およびカゼイン含有出発乳原料を含む発酵槽中の原料は、均質の発酵培地を得るために慣用の方法で混合することができる。
【００４２】
発酵は、有利には、3から80時間、好ましくは6から25時間、25から50℃、好ましくは35から45℃で実施することができる。発酵温度は38から42℃であるのが好ましい。その理由は、この温度範囲において、最も多量のトリペプチドVPPおよび/またはIPPが形成されるからである。
【００４３】
発酵中のpHは、形成されるトリペプチドVPPおよび/またはIPPの量に関して重要である。従って、発酵の本質的部分の期間のpHは、好ましくは4.3から4.9、より好ましくは4.4から4.8、最も好ましくは4.5から4.7である。本明細書において、発酵の本質的部分とは、発酵時間の少なくとも1時間以上を意味する。発酵中のpHを、発酵時間の好ましくは3時間以上の間、より好ましくは5時間以上の間、調節することが好ましい。
【００４４】
pHは、発酵培地へ塩基(またはバッファー)を添加することによって調節することができる。塩基は、食品の製造における使用に適した如何なる塩基であってもよい。本出願においては、このような調節された発酵は、pH調節発酵と称する。本出願においては、pH調節を行わない場合は、無調節酸性化発酵と称する。
【００４５】
発酵中、Lb.ヘルヴェティクスは特に乳酸を生産する。乳酸(HLaまたはLaH)は、プロトン、H+、および乳酸アニオン、La-(本出願においては、通常、塩基またはバッファー塩由来の他のカチオン源が存在する場合に、溶解乳酸塩として呼称する場合がある)に解離する。解離の量は、溶液のpHと乳酸のpKaに関係する。25℃における乳酸のpKaは3.86である(50℃では、pKaは約3.89である)。下記の方程式(3)は、pH、pKa、および乳酸の解離度がどのように関連しているかについて説明するものである。
pH = pKa + log ([La-] / [LaH])       (3)
【００４６】
方程式(3)は、pHが酸のpKaと等しい場合、酸の半分が解離していることを示している。pHが高いと、大部分の乳酸は乳酸アニオン形態である。発酵培養液が3.0から4.5の間のpHを有していれば、未解離形態の乳酸が顕著な量で存在する。実際には、25℃での乳酸イオンに対する遊離乳酸(未解離)のモル比は、pH3.0では約7.0であり;pH約4.5では、25℃での比は約0.23である。
【００４７】
pH調節発酵の好ましいプロトコルは、以下のように実施する。接種後、(1)所望のpH(4.3から4.9の範囲)に到達するまでの無調節酸性化発酵、続いて、(2)pH調節発酵、および場合により、(3)引き続き、終了までの第2の無調節酸性化発酵、例えば、pH3.5から4.0。このプロトコルの結果、加水分解カゼイン製品中の塩類を比較的低濃度に維持しながら、多量のIPP当量を生産することができる。
【００４８】
塩基は金属塩であり、その金属は食品において一般的であるが、血圧を上昇させないものであることが好ましい。好ましくは、塩基は水酸化物である。従って、水酸化ナトリウムなどのナトリウムを含有する塩基は除くのが好ましい。さらに好ましくは、塩基は、カルシウム塩、カリウム塩、および/またはマグネシウム塩からなる群から選択される塩である。そのような塩基のK+、Ca2+および/またはMg2+金属イオンは、pH調節発酵の結果、加水分解カゼイン製品の一部になるが、ヒトにおいて血圧を低下させ得る。
【００４９】
発酵中の溶存酸素(dO2)の濃度は、5%以下であるのが好ましい。溶存酸素濃度が低い場合、トリペプチドVPPおよび/またはIPPの生産は、酸素濃度が高い場合に比べて高まる。低溶存酸素濃度を達成するために、窒素などの不活性ガスを用いて、発酵槽に噴霧してもよい。
【００５０】
有利には、酵素処理および任意の発酵終了後、追加の生産工程をいくつか実施することができる。例えば、固体状の乳酸カルシウムおよび/または乳酸マグネシウムは、例えばこれらの乳酸塩が沈殿するように加水分解カゼイン製品を冷却することによって、加水分解カゼインから分離させることができる。加水分解カゼイン製品は、そのような製品として使用され得るか、あるいは希釈され得るか、濃縮され得るか、精製され得るか、または乾燥、好ましくは、スプレー乾燥もしくは凍結乾燥され得る。本発明によれば、比較的多くの数のVPP、IPPおよび/またはLPP分子が、基質に由来する。好ましくは、その基質に対するVPPのモル収率は30%以上、好ましくは40%以上、より好ましくは50%以上である。
【００５１】
VPPのモル収率は、本実験（発酵および/または酵素による加水分解）に生産されたVPPのモル量を、実験開始前のカゼイン含有出発乳原料中に存在するベータ-カゼインの全質量中のVPP断片のモル量で割ったものと定義する。同様の計算によりIPPおよびLPPのモル収率が得られる。VPPおよびLPP配列がベータ-カゼインに存在するのに対して、IPP配列がベータ-カゼインおよびカッパ-カゼインの両方に存在することに留意すべきである。
【００５２】
IPPのモル収率は、好ましくは60%以上、より好ましくは75%以上、最も好ましくは80%以上である。
【００５３】
本発明の方法により、200μM以上、より好ましくは400μM以上、更により好ましくは600μM以上、最も好ましくは700から3500μMのIPP当量濃度[IPPeq]として表されるトリペプチドVPP、IPPおよび/またはLPPの量を含む、加水分解カゼイン製品を得ることができる。
【００５４】
好ましくは、本発明による加水分解カゼイン製品の製造方法においては、LPPのモル収率は20％以上、より好ましくは45％以上、更により好ましくは80％以上である。好ましくは、本発明による食物製品には、25μM以上のLPPを含む。
【００５５】
好ましくは、加水分解カゼイン製品は、50から200mmol/kgのK+、および/または15から60mmol/kgのCa2+、および/または6から25mmol/kgのMg2+、より好ましくは、100から150mmol/kgのK+、および/または30から50mmol/kgのCa2+、および/または10から25mmol/kgのMg2+、最も好ましくは、110から135mmol/kgのK+、および/または35から45mmol/kgのCa2+、および/または13から20mmol/kgのMg2+を含む。本明細書では、これらのイオン濃度は、K、Ca、およびMgとして(すなわち、イオン電荷に関係なく)測定される。これらのイオンの添加により、抗高血圧効果がもたらされるであろう。
【００５６】
加水分解カゼイン製品またはそれから得られる製品は、それ自体がヒトによって消費され得る。またこれらは、食品原料成分として食品中で用いることもできる。そのような場合、食品のIPP当量濃度のレベル、ならびにK+、Ca2+およびMg2+のレベルは、加水分解カゼイン製品について本出願で定義した範囲内にあるのが好ましい。
【００５７】
本発明による加水分解カゼイン製品またはそれから得られる食品製品は、低温殺菌または滅菌することが出来る。
【００５８】
本発明による食品製品は、いかなる食品のタイプであってもよい。これらの食品は、適当な量で、加水分解カゼイン製品に加えて、一般的な食品成分、例えば、香味料、糖、フルーツ、ミネラル、ビタミン、安定剤、増粘剤等を含んでいてもよい。好ましくは、本食品製品は、フルーツジュース製品、乳製品または凍結菓子製品である。これらの好ましい食品製品の種類は、下記の一部の詳細、および実施例に記載されている。
【００５９】
（フルーツジュース製品）
本発明によるフルーツジュース製品の例としては、オレンジおよびグレープフルーツのような柑橘類、トロピカルフルーツ、バナナ、モモ、ピール、イチゴを原料とするジュースであり、この場合、固形物は部分的にまたは完全に加水分解カゼインの固形物からなっている。
【００６０】
（乳製品）
本発明による乳製品の例としては、乳、ディリースプレッド、クリームチーズ、乳タイプ飲料、およびヨーグルトであり、この場合、乳固形物は、部分的にまたは完全に加水分解カゼインの固形物からなっている。加水分解カゼイン製品は、乳タイプ飲料としても使用することができる。その代わりに、香味料または他の添加物を加えることが出来る。乳製品は、また、加水分解カゼインの固形物を水または乳製品に加えることによっても調製することができる。
【００６１】
ヨーグルトタイプの製品の組成物の例は、約50から80重量%の水、0.1から15重量%の加水分解カゼインの固形物、0から15重量%の粉末ホエー、0から15重量%の糖(例えば、ショ糖)、0.01から1重量%のヨーグルト培養物、0から20重量%のフルーツ、0.05から5重量%のビタミンおよびミネラル、0から2重量%の香味料、0から5重量%の安定剤(増粘剤またはゲル化剤)である。
【００６２】
ヨーグルトタイプの製品の典型的な一人分の分量は、50から250g、一般に80から200gであり得る。
【００６３】
（凍結菓子製品）
本発明の目的において、凍結菓子製品という用語には、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベ、アイスミルクおよびフローズンカスタード、ウォーターアイス、グラニタ、ならびに凍結フルーツピューレなどの乳含有の凍結糖菓が含まれる。  
【００６４】
好ましくは、凍結糖菓中の固形物(例えば、糖、脂肪、香味料など)の濃度は、3重量%以上、さらに好ましくは10から70重量%、例えば40から70重量%である。
【００６５】
一般には、アイスクリームは、脂肪0から20重量%、加水分解カゼインの固形物0.1から20重量%、甘味料、無脂肪乳成分0から10重量%、および任意の成分、例えば、乳化剤、安定剤、保存剤、香味成分、ビタミン、ミネラル等を含み、バランスは水である。典型的には、アイスクリームは、例えば、20から400%、より詳しくは40から200%の超過量まで炭酸ガスを満たし、-2から-200℃、さらに詳しくは-10から-30℃の温度に凍結させる。アイスクリームは、通常、約0.1重量％の濃度のカルシウムを含む。
【００６６】
本発明による他の食品は、通常の一般知識に基づいて、当業者により、好適な量の成分として、加水分解カゼインの固形物等の加水分解カゼイン製品または加水分解カゼインに由来する製品を使用して製造することができる。そのような食品の例としては、ベーカリー製品、乳製品、スナックなどが挙げられる。
【００６７】
有利には、食品製品は、油および水を含有するエマルジョン、例えばスプレッドである。本出願においては、油および水のエマルジョンは、油と水を含むエマルジョンとして定義され、水中油型(O/W)エマルジョン、および油中水型(W/O)エマルジョン、ならびに高次複合エマルジョン、例えば、水中油中水型(W/O/W/O/W)エマルジョンを含む。本出願においては、油には脂肪が含まれるものと定義する。
【００６８】
好ましくは、食品製品は、プレッド、凍結糖菓、またはソースである。
【００６９】
本発明によるスプレッドは、30から90重量%の植物油を含むのが好ましい。有利には、スプレッドは、4.2から6.0のpHを有する。
【実施例】
【００７０】
（IPP量、IPPL量、LPP量およびVPP量の測定）
IPP、IPPL、LPPおよびVPPの定量は、ESIポジティブモードでHPLC-MRM-MSを用いて実施した。試料は、Quattro-II三連四重極質量分析計(Micromass製(英国))と組み合わせたHP1100(Agilent製)HPLCシステムを用いて分析した。GL SciencesのプレパックVarian 150×2.1mm Inertsil ODS-3カラムに試料をインジェクトした。流速0.2ml/分、60℃のカラム温度で、溶離液のグラジエントは、リニアグラジエント（46分間で、0.1%のトリフルオロ酸(TFA)を含有する100%水から0.1%のTFAを含有する100%アセトニトリル）とした。MSのイオン源は、ポジティブ-エレクトロスプレーモードで作動させた。娘イオンm/z 213.1およびm/z 183.1をIPPおよびLPPの親イオンm/z 326.3で、m/z 213.1をVPPの親イオンm/z 169.1で、m/z 213.1を内部標準UC13IPPの親イオンm/z 189.1のMRMでモニターした。全ての化合物について、コーン電圧および衝突エネルギーは、20Vおよび20eVであった。使用した衝突ガスはアルゴンで、衝突ガス圧力は2.3×10-3mbarであった。定量は、両化合物についての個別の相対的な内部検量線を用いて実施した。
【００７１】
（プロテイナーゼ活性）
酵素混合物のプロテイナーゼ活性は、基質として、Universal Protease Casein resorufin-labeled（Boehringer Mannheim製）を用いて測定した。このアッセイは、プロテイナーゼを用いたresorufinでラベルしたカゼインの分解によって、resorufinでラベルしたペプチドが時間の経過とともに遊離するという原理に基づく。
【００７２】
50μlのラベルした基質溶液、50μlの100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)および100μlの酵素溶液を、適切な希釈液中で混合し、50℃で60分間インキュベートした。残ったresorufinでラベルしたカゼインを、トリクロロ酢酸を加えて遠心分離（10分間14000rpm）することによって沈殿させた。80μlの上清試料を、120μlのアッセイバッファー(pH 8.8)に加え、574nmの吸光度を測定した。
【００７３】
1つの酵素混合液を幾つかに希釈して、同じ方法で試験して、60分間インキュベーション後の574nm吸光度と酵素混合物の量（μg）の間で直線を作成した。プロテイナーゼ活性は任意単位(arbitrary units (AU))で表され、この単位は、前記直線の傾きに10000をかけることによって計算した。具体的なプロテイナーゼ活性は、酵素混合物μg当たりの任意単位(AU/μg)として表した。
【００７４】
（X-プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性）
酵素混合物のX-プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性は、100mMリン酸バッファー(pH 7.0)に溶かした1mMのグリシン-プロリン-パラ ニトロアニリン(GP-pNa)基質溶液を用い、適切に希釈した酵素試料を50℃でインキュベートして、20分間405nmの吸光度をモニターすることによって測定した。酵素活性は、9620M-1cm-1であるパラ-ニトリルアニリンのモル吸光係数を使用して、吸光度の増加から単位当たりで計算した。クルードな酵素混合物による、1分間当たりの1μMol GP-pNaの変換を1Uとする。
【００７５】
（タンパク質分解活性）
酵素による加水分解および/または乳酸菌を用いた発酵後の総タンパク質分解を評価するために、加水分解カゼイン試料中の(遊離アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質としての)アミノ基の全量の存在を用いた。Adler-Nissen、J. in Agric. Food Chem. 27、1256から1262 (1979)によって記載されている、食品タンパク質水解物の加水分解度を測定する方法を用いた。
【００７６】
5μLの試料、5μlのロイシンスタンダード(0.25から2.5mM)、または5μlの蒸留水を、40μLの0.21Mリン酸緩衝液(pH8.2)および40μLの0.1重量％のTNBS溶液に添加し、次いで、50℃にて60分間、暗所にてインキュベーションを行なった。80μLの0.1M HClを添加することによって反応を止めた。340nmで吸光度を測定した(Adler-Nissen J. Enzymatic hydrolysis of food proteins. New York: Elsevier Applied Science Publishers p. 110〜169 (1986))。
【００７７】
加水分解カゼイン製品中に存在するアミノ基の総量は、mMのロイシン当量として表した。酵素によって加水分解したカゼイン製品および/または発酵したカゼイン製品のタンパク質分解の程度は、加水分解度(DH)で表した。この数値は、以下のように定義される：
加水分解度＝切断されたペプチド結合の数/タンパク質に存在するペプチド結合の総量＊100％。
【００７８】
（実施例１および２：加水分解乳の調製）
9重量％の脱脂粉乳（Promex, Coberco製(オランダ)）を水道水中で混合して滅菌することによって、脱脂乳（9％ SMP）を還元した。滅菌した還元脱脂乳を、0.16重量％（カゼインに基づいて5重量％）のFungal Protease Concentrate(Genencor製)または0.16重量％（カゼインに基づいて5重量％）のUmamizyme(Amano製)のいずれかを用いて、pH 7.0、50℃で6時間インキュベートした。両方の酵素混合物は、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)に由来し、プロテイナーゼおよびペプチダーゼを含む。
【００７９】
（実施例３から６および比較例ＡからＩ：加水分解した発酵乳の調製）
カゼイン出発原料を、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lactobacillus helveticus) CNRZ 244で発酵し、得られた発酵乳（ここでは発酵乳基質とする）を、表１に記載の酵素で処理した。
【００８０】
発酵乳基質の調製：
滅菌脱脂乳(Yopper、Campina製(オランダ))を、前記脱脂乳において完全な増殖培地として-80℃で保存し、終濃度が6％グリセロールになるように滅菌10％グリセロールで希釈したラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lactobacillus helveticus) CNRZ 244の4％培養液で、37℃で24時間接種させた。得られた生成物を前培養物-1と称する。
【００８１】
滅菌脱脂乳(Yopper、Campina製(オランダ))を用い、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス(Lactobacillus helveticus) CNRZ 244の4重量％前培養物-1を接種して、前培養物(前培養物-2)を調製した。ヘッドスペース窒素ガスフラッシュを用いて、この前培養物-2を攪拌し、37℃で24時間、嫌気性条件下でインキュベートした。
【００８２】
9重量％の脱脂粉乳（Promex, Coberco製(オランダ)）を水道水中で混合して滅菌することによって、脱脂乳を還元した。滅菌した還元脱脂乳を、2重量％の前培養物-2を用いて、滅菌したタンクリアクター内で接種した。攪拌速度は150rpmに維持し、溶存酸素およびpHをモニターした。
【００８３】
嫌気条件は、窒素ガスによるヘッドスペースフラッシュを用いて保持した。発酵の最初の8時間の間に、乳のpHは、pH6.5からpH4.6へと減少した。pH4.6で、水酸化カルシウムおよび水酸化カリウムの塩基混合物を用いて、3.5時間、pHを調節した。このpH調節段階が終了後、pHを再度4.0へと減少させた。
【００８４】
発酵終了後、発酵乳を、75℃で15秒間、低温殺菌した。低温殺菌した発酵乳生成物を、比較例Ａの発酵乳基質とする。
【００８５】
実施例３から６および比較例ＢからＩについては、発酵乳基質を、0.16重量％（カゼインに基づいて5重量％）のプロテイナーゼおよびペプチダーゼを含む様々な酵素混合物と、pH7で、50℃で6時間インキュベートした。
【００８６】
【表１】
2006525003.tif 000002
【００８７】
【表２】
2006525003.tif 000003
【００８８】
実施例１から５の結果により、アスペルギルス(Aspergillus)、特にアスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)に由来する酵素混合物でインキュベートした乳および発酵乳の両方により、高いIPP、LPPおよびVPPレベルがもたらされたことが示された。
【００８９】
ベータ-カゼインに対するLPPのモル収率は、実施例１から５において20％よりも高くなることがわかった。
【００９０】
実施例１、２、４および５は、全て、高いレベルのIPP、VPPおよびLPPを示し、それ故、高い対応するIPPeqおよびBPPeqが求まった。これらの実施例においては、酵素は、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)に由来した。
【００９１】
実施例２によって、Umamizyme(Amano製)で還元乳をインキュベーションすることによって、高いレベルのIPP、LPPおよびVPPが得ることが出来ることが示された。更にその上、それぞれ80％および84％という高いVPPおよびLPPのモル収率が、実施例２において見出された。
【００９２】
実施例４においては、98％のモル収率が示すように、Fungal protease concentrate(Genencor製)で発酵乳をインキュベーションした後で、ベータ-カゼインに存在する全てのVPPのほぼ完全な遊離を示すことが出来た。
【００９３】
実施例１、２、４および５におけるタンパク質加水分解全体の高い値は、37から55％という乳タンパク質の高い加水分解度に対応する。
【００９４】
実施例１から５においては、IPPLが非常に少ししか見出されないか、全く見出されない。それ故、これらのインキュベーションの間、形成されたIPPLの大部分が、IPPへと変換された。
【００９５】
比較例ＢからＨでは、プロテイナーゼおよびペプチダーゼ混合物とのインキュベーション後に、発酵乳基質（実施例Ａ）に存在する濃度と比較して、生物活性を有するペプチドIPPおよびVPPの濃度の減少が示された。これら比較例ＢからＨにおいては、LPPの形成は見られなかった。
【００９６】
（実施例６および７：乳および発酵乳飲料の調製）
実施例１から４によって得られた加水分解カゼイン製品を、乳および発酵乳飲料を調製するのに用いた。
【００９７】
この乳飲料は、12.5重量％の低温殺菌した脱脂乳中の加水分解カゼイン製品と、以下の成分：4.5重量％のショ糖(CSM製、オランダ)、1重量％のフルクトースシロップ(Sensus製、オランダ)、2重量％のマルチフルーツフルーツパルプ(Wild製、オランダ)、0.1重量％のヨーグルトフレーバーZD-49492(Quest製、オランダ)、0.03重量％のフルーツフレーバー037-00330-11(Givaudan製、スイス)、0.1重量％のクリームフレーバーU33162(Danisco製、デンマーク)、および0.8重量%GenuペクチンYM-115-H(CPKelco製、デンマーク)を含有していた。
【００９８】
これらの成分が混合された後、150barで乳飲料を均質化し、75℃にて15秒間低温殺菌した。
【００９９】
この乳飲料の味は良好であった。如何なる苦味も感じなかった。
【０１００】
（実施例８：加水分解カゼインの固形物を含むヨーグルト飲料）
加水分解カゼインの固形物を以下のように調製した：
リアクターを10重量％のカゼイン塩カルシウム(DMV製、オランダ)で満たし、85℃にて20分間低温殺菌し、50℃冷却し、0.5重量％のUmamizyme(Amano製)で、50℃にて6時間、嫌気性条件下でインキュベートした。
【０１０１】
インキュベーション後、乳酸(Purac製、オランダ)を用いて、加水分解物のpHをpH6.2からpH4へと調整し、加水分解物を95℃で20分間加熱することによって、残っている酵素を失活させた。凍結乾燥前に、加水分解物を-20℃で保存した。
【０１０２】
凍結乾燥後、トリペプチドVPP、IPPおよびLPPの濃度を、前記したように、HPLC-MRM-MSによって分析した。加水分解カゼインの固形物は、1677.2μg/gのVPP、2664.6μg/gのIPPおよび2019.5μg/gのLPPを含んでいた（6回の測定の平均値）。
【０１０３】
ヨーグルト飲料は、60重量％の低脂肪ヨーグルト(Melkan製、オランダ)、9重量％%ショ糖(CSM製、オランダ)、0.35重量％のAMD 783 ペクチン(Danisco製、デンマーク)、1.23重量％の加水分解カゼインの固形物、0.025重量％のラズベリー502824 A(Firmenich製、スイス)および29.4重量％の脱イオン水を含有していた。
【０１０４】
全ての成分をヨーグルトへと混合した後、ヨーグルト飲料を150barで均一化し、75℃にて15秒間低温殺菌した。ヨーグルト飲料の最終的なVPP、IPPおよびLPP濃度は、それぞれ、66μM、100μMおよび76μMであった。1.23重量％の加水分解カゼインの固形物を含むヨーグルト飲料の味は良好であり、如何なる苦味も感じなかった。
【０１０５】
（実施例９から１２：異なるレベルのカゼインおよび脱脂粉乳を用いた加水分解カゼインおよび還元乳の調製）
水道水中で、適切なレベルのカゼイン塩カルシウム(DMV製、オランダ)を混合することによって、3.2重量％、6重量％および10重量％のカゼイン基質を調製した。18重量％の脱脂粉乳(Coberco製、オランダ)を水道水中で混合することによって、高含量の脱脂乳(18% SMP)基質を調製した。全ての基質、18% SMPおよびカゼイン基質を50℃で6時間インキュベートした。これらのインキュベーションの前に、pHをpH7.0に調整した。全ての基質うをUmamizyme(Amano製)でインキュベーションし、カゼインに対する酵素混合物の比率を5重量％とした。
【０１０６】
【表３】
2006525003.tif 000004
【０１０７】
実施例９、１０および１１の結果により、カゼイン基質の量が増加することによって生物活性を有するペプチドVPP、IPPおよびLPPがより高いレベルになり、対応するIPPeqおよびBPPeq値も非常に高くなったことが示された。カゼイン基質レベルが増すにつれて、VPP、カゼインに対するIPPおよびLPPのモル収率は低くなったが、最も高いレベルのカゼイン基質（10重量％）での得られたモル収率でも依然として50％を超えていた。
【０１０８】
（実施例１３から１５および比較例Ｊ：異なる酵素/基質比率を用いた加水分解カゼインの調製）
これらのインキュベーションに用いた基質は、10重量％のカゼインを含み、水道水中で適切なレベルのカゼイン塩カルシウム(DMV製、オランダ)を混合することによって調製した。インキュベーションは、50℃にて6時間行い、これらのインキュベーション前にはpHを調整しなかった。全てのインキュベーションは、Umamizyme(Amano製)酵素混合物を用いて行い、用いたカゼインに対する酵素混合物の比率は、1重量％、2.5重量％、4重量％および5重量％であった。
【０１０９】
【表４】
2006525003.tif 000005
【０１１０】
実施例１３から１５および比較例Ｊの結果により、カゼイン基質に対して高い収率のVPP、IPPおよびLPPを得るには、基質に対する酵素の比率が1％を超えることが必要であることが示された。
【０１１１】
再度、非常に高いレベルのVPP、IPPおよびLPPが得られた。実施例１５においては、最も高いレベルのVPP、IPPおよびLPPが得られ、対応するIPPeq値は1531μMであり、BPPeq値は1955μMであった。
【０１１２】
（比較例Ｋ：Flavourzymeを用いた加水分解カゼインの調製）
比較例Ｋは、異なる酵素混合物を用いる以外は、カゼインに基づいて基質に対する酵素の比率を5％にして、実施例１５に従って行った。10％のカゼイン溶液を、Umamizyme(Amano製)に代わってFlavourzyme(Novozymes製)を用いてインキュベートした。インキュベーション後、生物活性なペプチドVPPおよび加水分解度を求めた。Flavourzyme酵素混合物の幾つかの特徴は、表１に示す。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
結果から、高いレベルの活性トリペプチドVPPを得るには、高いタンパク質分解活性に加えて、相対的に高いX-プロリル ジペプチジル アミノペプチダーゼ活性が必要であることが示された。
【国際調査報告】
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