(57)【要約】本発明はｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物の細胞増殖アッセイであって：１）ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を含む細胞であって、細胞増殖に適した条件下でリガンド刺激による細胞増殖に反応する、前記細胞；２）細胞による増殖を誘導できるｅｒｂＢ−３に対するリガンドである、第一リガンド；３）化合物の存在下および非存在下における１）と２）を混合すること；４）化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果を持つか否かを測定すること、を含む前記アッセイ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物の細胞増殖アッセイであって、
１）ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を含み、そして細胞増殖に適した条件下でリガンド刺激による細胞増殖に反応する、細胞；
２）細胞による増殖を誘導できるｅｒｂＢ−３に対するリガンドである、第一リガンド；
３）化合物の存在下および非存在下において１）と２）を混合すること；
４）化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果持つか否かを測定すること
を含む、前記アッセイ。
【請求項２】
非特異的細胞毒性を検出するために、リガンドの非存在下で、前記化合物を並行して試験する、対照の付加を含む、請求項１に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項３】
化合物がＥＧＦＲを介して活性を持つか否かを測定するアッセイである第二アッセイであって、以下の
１）細胞増殖に適した条件下での、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３、およびＥＧＦＲを含む細胞；
２）細胞による増殖を誘導できるＥＧＦＲに対するリガンドである、第二リガンド；
３）化合物の存在下および非存在下において１）と２）を混合すること；
４）化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果を持つか否かを測定すること
を含む前記第二アッセイ、の付加を含む、請求項１または２に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項４】
細胞が、内生的にＥＧＦＲおよび／またはｅｒｂＢ−２および／またはｅｒｂＢ−３を発現する、前述のいずれかの請求項に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項５】
細胞が、内生的にＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を発現する、請求項４に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項６】
第一リガンドがヘレグリンである、前述のいずれかの請求項に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項７】
第一リガンドがヘレグリンβ１である、請求項６に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項８】
第二リガンドがＥＧＦである、請求項３−７のいずれかに記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項９】
細胞が不死化した正常上皮Ｈ１６Ｎ−２細胞である、前述のいずれかの請求項に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項１０】
細胞がＭＣＦ−７細胞である、請求項１−８のうちいずれかに記載の細胞増殖アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物の細胞増殖アッセイであって、細胞がリガンド刺激による細胞増殖に反応性である、前記アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌に対する新しい治療手段が必要である。受容体チロシンキナーゼは、細胞複製を始める有糸分裂促進シグナルの伝達に、特に重要である。これらの大きな糖タンパク質は、細胞の細胞膜を貫通し、それらに対する特異的なリガンド（例えばＥＧＦ受容体に対する上皮成長因子（ＥＧＦ））に対する細胞外結合ドメインを持つ。リガンドの結合が、受容体の細胞内部位にコードされる受容体のキナーゼ酵素活性の活性化をもたらす。この活性が標的タンパク質の重要なチロシンアミノ酸をリン酸化し、細胞の細胞膜を横切る増殖シグナルの伝達をもたらす。
【０００３】
受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーは、ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３およびｅｒｂＢ−４を含み、高頻度に腫瘍細胞の増殖や生存の駆動に関連することが知られている（Ｏｌａｙｉｏｙａら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０００，  １９，  ３１５９  で概説される）。これを達成することができる一つの機構は、一般的に遺伝子増幅の結果としての、受容体のタンパク質レベルでの過剰発現による。これは多くの共通するヒトの癌で観察された（Ｋｌａｐｐｅｒら，  Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２０００，  ７７，  ２５で概説される）。
【０００４】
これらの受容体（特にｅｒｂＢ−２）の１つまたはそれより多くの誤った調節の結果として、多くの腫瘍は臨床的により悪性となり、患者へのより悪い予後に関係すると広く信じられている（Ｂｒａｂｅｎｄｅｒら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００１，  ７，  １８５０；  Ｒｏｓｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ２００１，  １９，  ５５４，  Ｙｕら．，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，  ２０００，  ２２．７，  ６７３）。これらの臨床的な発見に加えて、豊富な臨床前情報は、受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーは細胞の形質転換に関係することを示唆する。これは、多くの腫瘍細胞株が１つまたはそれより多くのｅｒｂＢ受容体を過剰発現し、そしてまたＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２は、非腫瘍細胞にトランスフェクションしたとき、これらの細胞を形質転換する活性を持つ観察を含む。この腫瘍形成性活性は、ｅｒｂＢ−２を過剰発現するトランスジェニックマウスが自然に乳腺に腫瘍を発生することにより、さらに立証された。これに加えて、多くの臨床前研究は、低分子抑制剤、優性ネガティブあるいは抑制的な抗体により１つまたはそれより多くのｅｒｂＢの活性を不活性化することにより、抗増殖的効果が誘導できることを実証した（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２０００，  １９，  ６５５０で概説される）。このように、これらの受容体チロシンキナーゼの抑制剤は、哺乳類癌細胞の増殖の選択的抑制剤として有用であると認識された（Ｙａｉｓｈら  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８８，  ２４２，  ９３３，  Ｋｏｌｉｂａｂａら  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １９９７，  １３３，  Ｆ２１７Ｆ２４８；  ＡｌＯｂｅｉｄｉら  ２０００，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９，  ５６９０５７０１；  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら  ２０００，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９，  ６５５０６５６５）。この臨床前のデータに加えて、ＥＧＦＲおよびｅｒｂＢ−２に対する抑制的な抗体（それぞれｃ−２２５およびｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）の使用の所見は、選択された充実性腫瘍の治療に臨床上有益であることが判明した（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎら  ２０００，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９，  ６５５０６５６５で概説される）。
【０００５】
新薬の探索はしばしば「スクリーニングカスケード」を含む。このカスケードは多くの場合インビトロのアッセイに始まり、最終的にインビボのアッセイまで広がる。より意義のあるデータは多くの場合インビボのアッセイから得られるが、処理能力を犠牲にするため、インビボのアッセイを通じて多種類の化合物の実験することは、通常実施できない。よりハイスループットなアッセイで化合物を探索し、より有望な誘導だけを、最適な効果のためのスクリーニングカスケードでの次のアッセイに進めるのが通常である。インビトロアッセイとインビボアッセイの間の、非常に好ましいアッセイは細胞増殖アッセイである。
【０００６】
Ｈ１６Ｎ−２のような非新生物性上皮細胞は、ＥＧＦまたはヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）のいずれかの刺激に細胞増殖的方法で反応することができることが知られている（Ｒａｍ，  Ｇ．Ｒ．と  Ｅｔｈｉｅｒ，  Ｓ．Ｐ．（１９９６）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ７，  ５５１−５６１）。しかしながら、細胞増殖抑制および細胞毒性の活性を測るリガンド刺激細胞増殖アッセイを使った、ｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物の細胞に基づいたアッセイは、現在のところ知られていない。ｅｒｂＢ−２を介して細胞増殖を特異的に抑制する化合物（陽性）と、その化合物による非特異的な毒性を介して細胞成長を抑制するそれらの化合物（擬陽性）とを区別する要望のため、そのようなアッセイが必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の側面は、ｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物の細胞増殖アッセイであって、
１）ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を含む細胞であって、細胞増殖に適した条件下でリガンド刺激による細胞増殖に反応する、前記細胞；
２）細胞による増殖を誘導できるｅｒｂＢ−３に対するリガンドである、第一リガンド；
３）化合物の存在下および非存在下での、１）と２）を混合すること；
４）化合物が細胞増殖を減じる効果を持つか否かを測定すること
を含む、前記アッセイを提供する。
【０００８】
細胞は組換え体または非組換え体でもよいが、もし組換え体ならば、リガンドへの反応性を得るために低い／正常の、レベルの受容体を発現する、確立された株でなければならない。「混合する」とは、構成物を均一混合物に一緒にすることを単に意味し、継続的な混合は必要とされない。細胞増殖の測定は任意の適した方法による；実施例１の下部はひとつの適した方法を例示する。
【０００９】
好ましくは、細胞増殖アッセイは、非特異的な細胞毒性を検出するために、リガンドの非存在下で前記化合物を並行して試験する対照の追加を含む。これは、ｅｒｂＢ−２を介して細胞増殖を特異的に抑制する化合物（陽性）と、その化合物による非特異的毒性を介して細胞成長を抑制するそれらの化合物（擬陽性）とを区別することができる利点を持つ。
【００１０】
好ましくは、細胞増殖アッセイは化合物がＥＧＦＲを介した活性を持つか否かの測定するアッセイである第二アッセイであって、以下の
１）細胞増殖に適した条件下での、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３およびＥＧＦＲを含む細胞；
２）細胞による増殖を誘導できるＥＧＦＲに対するリガンドである、第二リガンド；
３）化合物の存在下および非存在下での１）と２）を混合すること；
４）化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果を持つか否かを測定すること
を含む前記第二アッセイ、の付加を含む。
【００１１】
ｅｒｂＢ−２およびＥＧＦＲを介して潜在的に作用する化合物の活性のプロファイルをすることができるため、これは有利である。製薬の目的のためには、両方のターゲットを介して作用する（二重特異性）化合物を有することが望ましいことは留意すべきである。個々の化合物の組み合わせを試験することも可能であることも企図される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
好ましくは、本明細書中で提供される細胞増殖アッセイは、ＥＧＦＲおよび／またはｅｒｂＢ−２および／またはｅｒｂＢ−３、より好ましくはＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を内生的に発現する。「内生的」は、細胞が特定の受容体を発現するように組換えにより確立されていないことを意味する。
【００１３】
好ましくは、第一リガンドはニューレグリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）ファミリーのメンバーのリガンド、好ましくはヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）である。もっとも好ましい第一リガンドはヘレグリンβ１である。
【００１４】
好ましい第二リガンドはＥＧＦである。
ひとつの態様において、好ましい細胞は不死化した正常上皮Ｈ１６Ｎ−２細胞である。
もうひとつの別の態様として、好ましい細胞はＭＣＦ−７細胞である。ＭＣＦ−７細胞はＡＴＣＣから入手できる。ＭＣＦ−７細胞は新生物性ではあるが、「正常の」ｅｒｂＢ受容体発現のプロフィールを持つ。
【００１５】
「細胞増殖」とは、細胞分裂の過程を通じて、細胞数が増加することを意味する。細胞増殖に適した条件は、適切な培地、培養条件などの供給を通じて当該分野において知られている。実施例１の下部は、特定の細胞株のための一連の条件を提供する。
【００１６】
「リガンド刺激による細胞増殖」とは、外因性リガンド添加による内生的受容体の活性化を通じて、細胞増殖が駆動されることを意味する。
「細胞増殖を減じる」とは、対照と比較して細胞数が統計学的に有意に（９５％の信頼性、好ましくは９９％の信頼性）減少することを意味する。
【００１７】
「対照」とは、実験誤差を減少させるために、試験結果と比較する、参照測定を意味する。
「ｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物」とは、ｅｒｂＢ−２への結合活性の抑制の結果として、増殖が減少することを意味する。本発明は、キナーゼ抑制剤の化合物、例えばＡＴＰ擬態物、の発見に特に有用である。ｅｒｂＢ−３キナーゼドメインは、高度に相同性を持つ他のファミリーメンバーのキナーゼドメインとほとんど相同性を持たない点に注意すべきである。仮にこれがキナーゼドメインだとしても、いずれかの重要な活性の欠如が示されるので、非機能的である。そのためにこのアッセイで発見されるそのようなキナーゼ抑制化合物で、ｅｒｂＢ−３を介して機能する化合物は予測できない。本アッセイはヘレグリンのｅｒｂＢ−３に対する結合、またはｅｒｂＢ−３のｅｒｂＢ−２に対する結合を阻害する化合物の発見にも有用であると考えられる。
【００１８】
「ＥＧＦＲを介しての活性を持つ化合物」とは、ＥＧＦＲへの結合活性の抑制の結果として、増殖が減少することを意味する。本発明は、キナーゼ抑制剤の化合物、例えばＡＴＰ擬態物、の発見に特に有用である。本アッセイは、ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合、またはｅｒｂＢ−３のＥＧＦＲへの結合、またはＥＧＦＲの二量体化を阻害する化合物の発見にも有用であると考えられる。
【００１９】
「並行して試験された」とは、対照として充分に近い時間内にアッセイすることを意味する。誤解を避けるために、厳密な同時は必要とされない。
「非特異的細胞毒性」とは、化合物の有毒的効果が、化合物が妨害しようとしている以外の細胞の機構または過程の抑制を介して影響を及ぼすことを意味する。
【００２０】
「ｅｒｂＢ−２」とは、上皮成長因子受容体２として定義される。
「ｅｒｂＢ−３」とは、上皮成長因子受容体３として定義される。
「ＥＧＦＲ」とは、上皮成長因子受容体１で定義される。
【００２１】
「ヘレグリンβ１（Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎβ１）」とは、選択的にｅｒｂＢ−２／ｅｒｂＢ−３のヘテロ二量体の形成を促進するニューレグリンファミリーのメンバーのリガンドである。
【００２２】
ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３およびｅｒｂＢ−４を含む受容体チロシンキナーゼのｅｒｂＢファミリーは、Ｏｌａｙｉｏｙｅら  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０００，  １９，  ３１５９で概説される、ことに留意されたい。
【００２３】
「ｅｒｂＢ−３に結合し、次いでｅｒｂＢ−２駆動細胞増殖を活性化するリガンド」とは、理論的考察に束縛されることを望まないが、ｅｒｂＢ−２については同族のリガンドが知られていないために、リガンドがｅｒｂＢ−３に結合し、次いでｅｒｂＢ−２とヘテロ二量体を形成することにより、この受容体が非直接的に活性化され、そして、当該受容体の細胞内キナーゼドメインが細胞内で有糸分裂シグナル機構の開始を活性化することを意味する。キナーゼドメインに結合し、および抑制する化合物が、請求の範囲に記載の発明により検出されている。
【００２４】
「不死化した正常上皮Ｈ１６Ｎ−２細胞」は、Ｂａｎｄ，  Ｖ．とＳａｇｅｒ，  Ｒ．  Ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｉｎ：  Ｊ．  Ｓ．  Ｒｈｉｍ  ａｎｄ  Ａ．  Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌｏ  （ｅｄｓ．），  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  ｐｐ  １６９−１７８、Ｃｌｉｆｔｏｎ，  ＮＪ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１）  ．に記述され、  Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ４４  Ｂｉｎｎｅｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ０２１１５，  ＵＳＡから得られる。Ｈ１６Ｎ−２細胞の使用にかかわる参考文献は以下のものを含む：  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｖｏｌｖｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈ１６Ｎ−２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｔｈｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：    Ｒａｍ  （１９９６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：  ２２７−２３８；    Ｒａｍ  （１９９６）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ７：５５１−５６１；  Ｒａｍ  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６３：  ５８９−５９６；  Ｂｅｒｑｕｉｎ  （２００１）  ２０：  ４０８９−４０２８；  Ｒａｍ  （２０００）  Ｊ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １８３：  ３０１−３１３  ａｎｄ  Ｒａｍ  （２０００）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １１：１７３−１８３。
【００２５】
「ｅｒｂＢ−３に対するリガンド」とは、ｅｒｂＢ−２とｅｒｂＢ−３のヘテロ二量体の形成を優先的に促進するニューレグリンファミリーのメンバーのリガンドを意味する；ヘレグリンβ１が好ましい。
【００２６】
「ＥＧＦＲに対するリガンド」は、ＴＧＦαまたはＥＧＦを意味する；ＥＧＦが好ましい。
本発明は、以下の非限定的な実施例で説明される。
【実施例】
【００２７】
実施例１
Ｈ１６Ｎ−２細胞増殖アッセイ
本アッセイは、Ｈ１６Ｎ−２細胞のヘレグリンβ１またはＥＧＦで駆動された増殖を抑制する、試験化合物の活性を測る。これらの非新生物性上皮細胞は、ＥＧＦまたはヘレグリンβ１のいずれかの刺激に増殖的方法で反応し  （Ｒａｍ，  Ｇ．Ｒ．とＥｔｈｉｅｒ，  Ｓ．Ｐ．（１９９６）  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ７，  ５５１−５６１）、ヒト乳腺組織から分離され（Ｂａｎｄ，  Ｖ．とＳａｇｅｒ，  Ｒ．  Ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．    Ｉｎ：  Ｊ．  Ｓ．  ＲｈｉｍとＡ．  Ｄｒｉｔｓｃｈｉｌｏ  （ｅｄｓ．），  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  ｐｐ  １６９−１７８．    Ｃｌｉｆｔｏｎ，  ＮＪ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１）、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  ４４  Ｂｉｎｎｅｙ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  ０２１１５から入手された。
【００２８】
Ｈ１６Ｎ−２細胞は、培養培地（１％ウシ胎児血清、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１μｇ／ｍｌインスリン、１２．５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、２．８μＭヒドロコルチゾン、２ｎＭエストラジオール、５μＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．１ｍＭホスホエタノールアミン、１５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、１０ｎＭトリヨードチロニン、３５μｇ／ｍｌウシ下垂体抽出物、および０．１ｍＭエタノールアミンを含む、Ｇｉｂｃｏ  Ｆ１２とＨａｍ’ｓ  αＭＥＭ培地の１：１の混合）で、３７℃、７．５％のＣＯ2雰囲気のインキュベーターで日常的に培養された。細胞は、トリプシン／  エチルアミンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて、培養フラスコから回収された。細胞の密度は血球計算盤を用いて測定し、生存率はトリパンブルー溶液を用いて計算し、そして９６穴プレートの各穴に１．０×１０3細胞の濃度で細胞をまき、上記培地で３７℃、７．５％のＣＯ2雰囲気中で７２時間静置した。
【００２９】
この後に、細胞を２４時間の飢餓培地（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｎＭエストラジオール、５μＭアスコルビン酸、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、０．１ｍＭホスホエタノールアミン、１５ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭエタノールアミンを含む、Ｇｉｂｃｏ  Ｆ１２とＨａｍ’ｓ  αＭＥＭ培地の１：１の混合）の添加により血清に飢えさせ、３７℃、７．５％のＣＯ2でインキュベートした。細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中（最終濃度は１％）の化合物一連の濃度の存在下または非存在下で２時間処理し、次に外因性リガンド（１００ｎｇ／ｍｌヘレグリンβ１または５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦの最終濃度）を添加し、および両リガンドと化合物の４日間、３７℃、７．５％のＣＯ2でインキュベートした。インキュベーション時間に続き、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭素（ＭＭＴ）を５０μｌ添加し、３７℃、７．５％のＣＯ2雰囲気のインキュベーターで２時間インキュベートすることにより、細胞数を測定した。その後、空気乾燥し１００μｌのＤＭＳＯの添加で溶解させることができるように、ＭＭＴ溶液は吸引により細胞から除いた。
【００３０】
細胞量を定量化するために、可溶化した細胞の吸光度は５４０ｎｍで測定した。増殖の抑制はＩＣ50値として表した。これは、５０％の増殖抑制を与えるのに必要とされる化合物濃度の計測により決定した。増殖の程度は、正（プラスリガンド剤）および負（マイナスリガンド剤）の対照値から計算した。
【００３１】
実施例２
実施例１の細胞増殖アッセイを用いて得られた実験結果。
ｅｒｂＢ−２の選択的化合物、ＥＧＦＲ選択的化合物および両受容体に活性のある化合物からえられる標準的な実験データは、非特異的毒性の測定のための対照（リガンドなし）とともに、下表で示した。
【００３２】
【表１】
2006504422.tif 000002
【００３３】
「ＳＤ」は、標準偏差を意味する。
上表の要約データ作成に使用されたプロットは図１−３示される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ヘレグリンで駆動された細胞増殖への化合物２の効果を示す
【図２】図２は、ＥＧＦで駆動された細胞増殖への化合物２の効果を示す
【図３】図３は、非特異的毒性を見出すためにリガンドの非存在下での、化合物２の細胞への効果を示す。
【図１】
2006504422.tif 000003
【図２】
2006504422.tif 000004
【図３】
2006504422.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月12日(2005.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｒｂＢ−２を介して作用する化合物の細胞増殖アッセイであって、
１）ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を含み、そして細胞増殖に適した条件下でリガンド刺激による細胞増殖に反応する、細胞；
２）細胞による増殖を誘導できるｅｒｂＢ−３に対するリガンドである、第一リガンド；
３）化合物の存在下および非存在下において１）と２）を混合すること；
４）化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果持つか否かを測定すること
を含む、前記アッセイ。
【請求項２】
非特異的細胞毒性を検出するために、リガンドの非存在下で、前記化合物を並行して試験する、対照の付加を含む、請求項１に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項３】
化合物がＥＧＦＲを介して活性を持つか否かを測定するアッセイである第二アッセイであって、以下の
１）細胞増殖に適した条件下での、ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３、およびＥＧＦＲを含む細胞；
２）細胞による増殖を誘導できるＥＧＦＲに対するリガンドである、第二リガンド；
３）化合物の存在下および非存在下において１）と２）を混合すること；
４）化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果を持つか否かを測定すること
を含む前記第二アッセイ、の付加を含む、請求項１または２に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項４】
細胞が、内生的にＥＧＦＲおよび／またはｅｒｂＢ−２および／またはｅｒｂＢ−３を発現する、前述のいずれかの請求項に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項５】
細胞が、内生的にＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２およびｅｒｂＢ−３を発現する、請求項４に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項６】
第一リガンドがヘレグリンである、前述のいずれかの請求項に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項７】
第一リガンドがヘレグリンβ１である、請求項６に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項８】
第二リガンドがＥＧＦである、請求項３−７のいずれかに記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項９】
細胞が不死化した正常上皮Ｈ１６Ｎ−２細胞である、前述のいずれかの請求項に記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項１０】
細胞がＭＣＦ−７細胞である、請求項１−８のうちいずれかに記載の細胞増殖アッセイ。
【請求項１１】
請求項１記載のアッセイによって、化合物が細胞増殖を減じるいずれかの効果を持つと判断された化合物を投与することを含む癌の治療法。
【国際調査報告】
2006504422.tif 000006
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