(57)【要約】本発明は、ヒト臍帯血由来成熟内皮細胞群を提供する。該細胞は、血液凝固因子などのような治療的に有効なタンパク質をコードするＤＮＡにより形質導入される。該細胞は、血液凝固因子の産生方法に有用である。該細胞は、さらに血友病Ａまたは血友病Ｂの遺伝子治療に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程：
ａ）ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞および／または骨髄から得られる内皮前駆細胞を、内皮前駆細胞が成熟内皮細胞へ分化するのを促進する少なくとも１つの成長因子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること；および
ｂ）タンパク質をコードするＤＮＡにより成熟内皮細胞に形質導入する、または、工程ａ）に先立って、タンパク質をコードするＤＮＡにより内皮前駆細胞に形質導入すること、を含むことを特徴とする、該タンパク質を発現するヒト内皮細胞の産生方法。
【請求項２】
該ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞が、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、ＣＤ１４６、およびＦＧＦ１−Ｒから成る群より選択される細胞表面マーカーを少なくとも１つ発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）およびｂ）に先立って、臍帯血からＣＤ３４陽性細胞、ＡＣ１３３陽性細胞、ＣＤ１４６陽性細胞、および／またはＦＧＦ１−Ｒ陽性細胞を富化させることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
レトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターが該細胞に形質導入するために用いられることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該タンパク質が血液凝固因子であることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該血液凝固因子がヒト第ＶＩＩＩ因子であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得ることができるヒト内皮細胞群。
【請求項８】
少なくとも細胞の１０％が、タンパク質をコードする組換えＤＮＡを含むことを特徴とする、臍帯血由来のヒト内皮細胞群。
【請求項９】
該タンパク質が、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子であることを特徴とする、請求項７または８に記載のヒト内皮細胞群。
【請求項１０】
タンパク質をコードする組換えＤＮＡがヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の突然変異タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項７から９のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。
【請求項１１】
ヒト第ＶＩＩＩ因子の該突然変異タンパク質が、野生型第ＶＩＩＩ因子のＢ領域を少なくとも部分的に欠損していることを特徴とする、請求項１０に記載のヒト内皮細胞群。
【請求項１２】
タンパク質をコードする組換えＤＮＡが修飾第ＶＩＩＩ因子の相補的ＤＮＡであり、
（ｉ）野生型第ＶＩＩＩ因子の相補的ＤＮＡのうち、少なくともＢ領域部分が欠損されている、
（ｉｉ）少なくとも１つのイントロンが、第ＶＩＩＩ因子の相補的ＤＮＡの少なくとも１つの位置に挿入されている、および／または
（ｉｉｉ）ヒト第ＶＩＩＩ因子の野生型相補的ＤＮＡ配列の少なくとも１つのヌクレオチドが置換されている、
ことを特徴とする、請求項７から１１のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。
【請求項１３】
該細胞の少なくとも７５％が、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ１４６、およびＬＤＬ受容体から成る群より選択されるマーカーの少なくとも１つを発現することを特徴とする、請求項７から１２のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。
【請求項１４】
該細胞の少なくとも７５％がフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）を内因的に発現することを特徴とする、請求項７から１３のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。
【請求項１５】
請求項７から１４のいずれかに記載のヒト内皮細胞群から生成した不死化細胞株。
【請求項１６】
ａ）適当な条件下、請求項７から１４のいずれかに記載のヒト内皮細胞群、または請求項１５に記載の細胞株を培養する、およびｂ）該細胞培養培地から、タンパク質、好ましくは血液凝固因子を単離する、工程からなることを特徴とする該タンパク質、好ましくは該血液凝固因子を産生する方法。
【請求項１７】
該タンパク質が血液凝固第ＶＩＩＩ因子であり、かつ該単離工程がフォン・ビルブラント因子の存在下での血液凝固第ＶＩＩＩ因子の精製を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該タンパク質、好ましくは該血液凝固因子をウイルス不活化処理することを特徴とする、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血友病Ａまたは血友病Ｂの治療用医薬の製造のための、請求項７から１４のいずれかに記載のヒト内皮細胞群の使用。
【請求項２０】
ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分泌する細胞を、血友病Ａを患う個体に投与することを特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
循環器系疾患の治療用医薬の製造のための、請求項７から１４のいずれかに記載のヒト内皮細胞群の使用。
【請求項２２】
該疾患が心不全、および急性もしくは慢性心疾患から選ばれることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項７から１４のいずれかに記載のヒト内皮細胞群である医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、例えば、血液凝固因子、の産生方法に関する。該方法は、ヒト臍帯血由来内皮細胞を培養し、細胞培養培地から所望のタンパク質を単離することからなる。本発明は、さらにタンパク質、例えば、血液凝固因子、をコードするベクターにより形質導入されるヒト内皮細胞群に関する。該細胞は、タンパク質の産生方法あるいは遺伝子治療プロトコルで用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは、血液循環中において機能する凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）が不十分なレベルにあるか、まったく完全に欠乏していることによって引き起こされる。それは、５，０００人から１０，０００人の男性のうち１人が罹患するＸ染色体連鎖性出血性疾患である。ＦＶＩＩＩは、血液凝固カスケードの内因性経路に欠かせない成分である。ここで、ＦＶＩＩＩは、第Ｘ因子を活性化する膜結合複合体（Ｘａｓｅ複合体）内の活性化第ＩＸ因子の補因子の役目を果たしており、この活性型第Ｘ因子は今度は酵素原プロトロンビンのトロンビンへの変換に関与している。ＦＶＩＩＩは、３つの相同なＡ領域、２つの相同なＣ領域、および唯一のＢ領域から成る２３３２個のアミノ酸残基分子（〜３００ｋＤａ）として合成され、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の順序に配列される。ＦＶＩＩＩは、Ｂ領域内、およびＢ領域とＡ３領域の結合点における複数回の細胞内切断により、２価の金属陽イオン（Ｍｅ２＋）に架橋した軽鎖および重鎖から成るヘテロ二量体に形成される。重鎖は、Ａ１領域（１−３３６）、Ａ２領域（３７３−７４０）およびＢ領域（７４１−１６４８）を含み、軽鎖は、Ａ３領域（１６４９−２０１９）、Ｃ１領域（２０２０−２１７２）およびＣ２領域（２１７３−２３３２）を含む。循環血液中で、ＦＶＩＩＩは強固にフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）と結合している。ここでＶＷＦは、血漿中において正常なＦＶＩＩＩのレベルを維持するのに必要なタンパク質である。ＶＷＦは、Ｘａｓｅ複合体が早熟して形成されるのを阻害し、活性化タンパク質Ｃ、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）および活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）によってＦＶＩＩＩが不活化されることから防御する。ヒトおよび動物においては、ＶＷＦが欠乏するとＦＶＩＩＩの二次的欠乏を引き起こすことが示されており、このことはＶＷＦがＦＶＩＩＩの加速度的な消失をも防止することを示唆している。
【０００３】
血友病Ａの主な症状は、関節、筋肉および内臓への出血であり、それは突発的に起こり、生命を脅かす（Ｍａｎｎｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ，２００１；後述の参考文献データ参照）。血漿中のＦＶＩＩＩの残存活性を基に、血友病Ａは以下のように分類される：重症（正常活性の１％未満）、中症（１〜５％）、軽症（５〜３０％）。
【０００４】
血友病Ｂは、約２５，０００人の男性のうち１人に発生する。それは、セリンプロテアーゼ第ＩＸ因子（クリスマス（Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ）因子）の欠乏により特徴づけられる。この４１５個のアミノ酸ポリペプチドは、肝臓内で５６ｋＤａの糖タンパク質として合成される。その適当な機能を発揮するためには、ビタミンＫの存在下のみで起こる翻訳後のカルボキシル化の工程が必要である。
【０００５】
血友病ＡおよびＢの患者は、現在、血漿由来あるいは組換えＦＶＩＩＩおよびＦＩＸを静脈内点滴することにより、それぞれ治療されている（Ｍａｎｎｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｇｉａｎｇｒａｎｄｅ，２０００）。この補充療法は、最近１０年間で比較的安全で効果的になったものの、生涯にわたって輸液をする不便さやＦＶＩＩＩ濃縮製剤による感染症の感染の可能性などのいくつかの欠点がある（Ｈｏｏｔｓ，２００１；Ｔｅｉｔｅｌ，２０００；Ｗｈｉｔｅ  ＩＩ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。循環血液中のＦＶＩＩＩの半減期が比較的短い（１２〜１４時間）ため、血友病Ａの予防療法として、週に３回までＦＶＩＩＩ製剤の輸液を繰り返し行う必要がある。
【０００６】
組換え第ＶＩＩＩ因子の産生のために非ヒト細胞株を使用する際には、ある種の不都合に直面する。組換えｆｖｉｉｉの産生における主要な限界は、ＦＶＩＩＩ発現細胞からの収率が低いことであり、それは他のタンパク質の収率に比べて２桁低い。
【０００７】
ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを用いた血友病Ａの遺伝子治療のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの幾つかの研究が行われた（総説：Ｗｈｉｔｅ  ＩＩ，２００１；Ｃｈｕａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｙ，１９９９；ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋａｕｆｍａｎ，１９９９）。しかしながら、これらのアプローチに対しては安全性に対する懸念が依然として存在する。潜在的な副作用として、有害な免疫反応、ベクター媒介性細胞障害（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｏｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、および生殖細胞への感染が挙げられる。
【０００８】
ＦＶＩＩＩ合成は、生理的条件下、主に肝実質細胞あるいは肝類洞内皮細胞内で起こる（Ｗｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｚｅｌｅｃｈｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈｏｌｌｅｓｔｅｌｌｅ．，２００１）。これらの細胞あるいは、皮膚（Ｈｏｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、内皮細胞（Ｄｗａｒｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃｈｕａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、肝実質細胞（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、骨髄間質細胞（Ｃｈｕａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、および造血細胞（Ｈｏｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｅｖａｎｓ＆Ｍｏｒｇａｎ，１９９８；Ｔｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）などのような他の細胞のタイプが、遺伝子治療のアプローチに有用であろう。実際、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で修飾したＦＶＩＩＩを分泌する線維芽細胞の移植は、重症の血友病Ａ患者において十分に耐え得ることが証明されており、ＦＶＩＩＩの血漿濃度を検出可能にした（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０００９】
ＵＳ２００２／００４２１３０Ａ１およびＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）には、血友病Ａの遺伝子治療の為の、血液派生内皮細胞（ＢＯＥＣ）を用いた研究が記述されている。Ｇｅｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）は、ＡＣ１３３陽性前駆細胞から内皮細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を報告している。しかしながら、Ｇｅｈｌｉｎｇ等は、第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡによる細胞の形質導入については開示していない。ＥＰ１１３６５５３Ａ１およびＷＯ０１／７０９６８Ａ２は、ヒト不死化細胞株における組換え血液凝固因子の産生に関する。
【００１０】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）「Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（動脈硬化症、血栓症および血管生物学）」２０巻、２６８９−２６９５頁には、初代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＢ領域欠損第ＶＩＩＩ因子の遺伝子形質導入が記述されている。これらの細胞は、臍静脈の内壁を被覆するため、十分に分化した内皮細胞を代表し、非常に限られた増殖能を示す。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等は、臍帯血、すなわち胎盤に残留した血液由来の細胞の使用については開示していない。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等によって記述された細胞は、その表現型や増殖能において臍帯血由来内皮細胞とは異なっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、治療効果のあるタンパク質の十分な量を産生するのに適した細胞を提供することである。本発明のさらなる目的は、十分な量の機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生するのに適しており、遺伝子治療に使用することのできる細胞を提供することである。
【００１２】
驚くべきことに、ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞が、第ＶＩＩＩ因子をコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）によるウイルス形質導入により、高レベルの第ＶＩＩＩ因子を分泌する成熟内皮細胞へと分化できることが見出された。したがって、本発明は適当な条件下で臍帯血あるいは骨髄由来ヒト内皮細胞を培養して、タンパク質（例えば、血液凝固因子）を産生する方法；および細胞培養培地から所望のタンパク質を単離する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明による方法で用いられる細胞は、次の工程ａ）およびｂ）を含む方法によって得ることができる。工程ａ）ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞および／または骨髄から得られる内皮前駆細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも１つの成長因子と接触させ、それにより該成長因子が内皮前駆細胞を成熟内皮細胞へ分化することを促進する；工程ｂ）内皮前駆細胞または成熟内皮細胞を、該タンパク質をコードするＤＮＡで形質導入する。工程ａ）とｂ）の順序は変えることができる。
【００１４】
「成長因子」なる用語は、哺乳類細胞の増殖および／または分化を誘導することができる、例えばタンパク質のような物質を指す。
【００１５】
「細胞群」とは、少なくとも２個の細胞を含む構成を表す。一般的には、該群は少なくとも１００個の細胞を含み、好ましくは１０００個の細胞を含む。該細胞は、ある所定のマーカータンパク質の発現においては均一であり、別のマーカータンパク質の発現においては不均一である。
【００１６】
ここで使用されている「内皮細胞」あるいは「成熟内皮細胞」なる用語は、ＶＥ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）（ＣＤ１４４）、ＣＤ１４６、ＣＤ３１、およびＬＤＬ受容体等のマーカーを発現する細胞を示す。また、「内皮細胞」あるいは「成熟内皮細胞」は、十分に分化した内皮細胞の増殖能よりも大きい、かなりの大きい増殖能を有してもよい。
【００１７】
「分化した内皮細胞」あるいは「十分に分化した内皮細胞」は、最終分化した内皮細胞を指す。したがって、分化した内皮細胞は非常に限られた増殖能を有する。
【００１８】
「内皮前駆細胞」（ＥＰＣ）は、成熟内皮細胞へと分化され得る細胞である。ＥＰＣは通常ＣＤ３４、ＡＣ１３３および／または線維芽細胞成長因子１受容体（ＦＧＦ１−Ｒ）を発現し、その増殖能に特徴がある。
【００１９】
「内皮細胞群」においては、少なくとも細胞の１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％は、内皮細胞である。
【００２０】
ここで使用されている「ＣＤ３４陽性細胞」なる用語は、表面マーカータンパク質ＣＤ３４を発現する細胞を示す。ＣＤ３４の発現は、ＣＤ３４に対する抗体を用いた免疫蛍光分析またはＦＡＣＳ分析により測定できる。
【００２１】
「血液凝固因子」は、血液凝固カスケードの内因性経路の構成成分の凝固活性を有する、例えばタンパク質のような物質である。血液凝固カスケードの構成成分としては、以下に限定されないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＶＷＦなどが挙げられる。「第ＶＩＩＩ因子」は、血友病Ａ患者に投与した際、凝固欠損を修正する能力を有する、例えばタンパク質のような物質を示す。限定するものではないが、この定義には全長組換え第ＶＩＩＩ因子およびＢ領域欠損第ＶＩＩＩ因子が挙げられる。「第ＩＸ因子」は、血友病Ｂ患者に投与した際、凝固欠損を修正する能力を有する、例えばタンパク質のような物質を示す。 
【００２２】
「形質導入」なる用語は、ＤＮＡが細胞へと伝達される過程を指す。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、この過程で用いられてよい。該細胞は、好ましくはヒト細胞である。該ＤＮＡは、該細胞ゲノムに一体化されてもよいし、一体化されなくてもよい。形質導入のために、発現されるポリペプチドをコードする配列を含むベクターが用いられてよい。プロモーター遺伝子は、発現可能なようにコードする配列に通常結合しており、すなわち、プロモーター遺伝子はタンパク質（例えば、血液凝固因子）をコードするＤＮＡ配列の転写を促進できるように、ベクター内に位置している。
【００２３】
「組換えＤＮＡ」なる用語は、異種源からのＤＮＡ断片を結合することにより作成されたＤＮＡ分子を示す。そのような組換えＤＮＡ分子としては、ｃＤＮＡおよび遺伝子クローンが挙げられる。組換えＤＮＡ分子は、人為的介入により作られたものである。本発明による組換えＤＮＡ分子は、遺伝子工学によるタンパク質産生システム内での使用に適した形態を有している。該ＤＮＡは、プロモーターやターミネーターのような、天然に存在する５’−あるいは３’−非翻訳領域を含んでいてもよい。
【００２４】
好ましくは、ヒト内皮前駆細胞は臍帯血由来である。該内皮前駆細胞は、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、ＣＤ１４６およびＦＧＦ１−Ｒから成る群から選ばれる表面マーカーを少なくとも１つ発現してよい。特定の実施態様では、該内皮前駆細胞は４つの該表面マーカータンパク質のうち、少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいはすべてを発現する。通常は、内皮前駆細胞群の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％が、上記細胞表面マーカーの１つに対して陽性である。該内皮前駆細胞は、上記細胞表面マーカーの１つに対して陽性である細胞を富化させることにより得られる。最初の工程で、単核細胞がフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）による比重分離法により臍帯血から単離されてよい。単核細胞を洗浄した後、ＣＤ３４陽性細胞、ＡＣ１３３陽性細胞、ＣＤ１４６陽性細胞、またはＦＧＦ１−Ｒ陽性細胞を、磁気活性化細胞選別法により富化させることができる。最初の富化工程の後、目的とする別の細胞表面マーカータンパク質を用いて２回目の富化工程を行ってよい。
【００２５】
ヒト内皮前駆細胞は、骨髄からもまた得ることができる。骨髄細胞は吸引によって得ることができ、適当な内皮前駆細胞が本願明細書で述べられている適当な方法により選択され、増幅されてよい。また、臍帯血および骨髄から得られたヒト内皮前駆細胞は混合されてもよい。
【００２６】
ＣＤ３４陽性細胞を少なくとも１つの成長因子と接触させる場合、該細胞はヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞を富化することにより得られる。適当な富化技術は、当業者に既知である。最初の工程で、単核細胞はフィコールによる比重分離法により臍帯血から単離される。単核細胞を洗浄した後、ＣＤ３４陽性細胞を、磁気活性化細胞選別法を用いて富化することができる。この方法を用いて、ＣＤ３４陽性細胞分画は、単核細胞分画中２％未満から富化分画中８０％超まで富化できる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるＣＤ３４陽性細胞の単離もまた考慮されてよい。
【００２７】
少なくとも１つの成長因子と接触するＣＤ３４陽性細胞において、通常、その細胞の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％が、ＣＤ３４陽性である。好ましい実施態様では、ＣＤ３４陽性細胞の純度は８０％から９５％の範囲内である。この範囲のＣＤ３４陽性細胞純度をもつ細胞群は、上記に述べた細胞富化により得ることができる。
【００２８】
該細胞は、内皮細胞への分化のために、成長因子に接触させる前に、組織培養プレートまたはフラスコ中の適当な培地中で培養してよい。
【００２９】
本発明の方法に従えば、臍帯血由来内皮前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも１つの成長因子と接触させる。その際、少なくとも１つの成長因子は、内皮前駆細胞が成熟内皮細胞へと分化することを促進する。成長因子が内皮前駆細胞の成熟内皮細胞への分化を促進するかどうかの測定は、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞を成長因子と接触させ、内皮マーカーＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ３１、およびＬＤＬ受容体のうち１つまたはそれ以上が発現するかどうかを測定することにより行うことができる。
【００３０】
ある実施態様では、該細胞は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と接触させる。別の実施態様では、ＶＥＧＦは、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）あるいは幹細胞成長因子−β（ＳＣＧＦ−β）のような別の成長因子と配合させてもよい。該内皮前駆細胞は、次に示す成長因子の組み合わせのうちの１つと接触させてもよい：ＶＥＧＦ＋ｂＦＧＦ；ＶＥＧＦ＋ＳＣＦ；ＶＥＧＦ＋ＳＣＧＦ−β；ＶＥＧＦ＋ｂＦＧＦ＋ＳＣＦ；ＶＥＧＦ＋ｂＦＧＦ＋ＳＣＧＦ−β；ＶＥＧＦ＋ＳＣＦ＋ＳＣＧＦ−β。最も好ましくは、該内皮前駆細胞は４つの成長因子、すなわちＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦおよびＳＣＧＦ−βと接触させる。通常、該成長因子は該細胞の培養培地に添加される。好ましくは、該成長因子はヒト成長因子である。成長因子は組換え発現によって産生してよい。
【００３１】
ヒトＶＥＧＦ、ヒト塩基性ＦＧＦ、ヒトＳＣＦおよびヒトＳＣＧＦ−βのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は公知である（ＶＥＧＦ：Ｃｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  １９９０  Ａｐｒｉｌ  ８７（７）：２６２８−３２；Ｔｉｓｃｈｅｒ  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９１  Ｊｕｎｅ  ２５，２６６（１８）：１１９４７−５４；ｂＦＧＦ：Ｋｕｒｏｋａｗａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９８７  Ｍａｒｃｈ  ９，２１３（１）：１８９−９４；ＳＣＦ：Ｍａｒｔｉｎ  Ｆ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９９０  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ５，  ６３（１）：２０３−１１；ＳＣＧＦ−β：Ｈｉｒａｏｋａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  １９９７  Ｊｕｌｙ  ８，  ９４（１４）：７５７７−８２；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９８  Ｊａｎｕａｒｙ  ２３，２７３（４）：１９１１−６）。
【００３２】
ＶＥＧＦは、１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＥＰＣの細胞培養培地に添加することができる。塩基性ＦＧＦは、通常１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、該培地に添加される。ＳＣＦは、通常１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２５〜１００ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、該培地に添加してよい。ＳＣＧＦ−βは、通常１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、該培地に添加することができる。
【００３３】
該成長因子は、同時にあるいは逐次的に該細胞に添加されてよい。添加する順序は変えることができる。しかしながら、好ましいのは該成長因子が該細胞に同時に添加されることである。
【００３４】
本発明のある実施態様では、内皮表現型への分化を誘導する際、少なくとも１つの成長因子が該細胞に添加される。所望により、少なくとも２つ、あるいは少なくとも３つ、あるいは少なくとも４つの成長因子が、内皮表現型への分化を誘導するために細胞に追加的に添加される。追加の成長因子の例として、限定はされないが、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）などが挙げられる。
【００３５】
別の実施態様では、アトルバスタチンなどのような、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）阻害剤の少なくとも１つが、内皮表現型への分化を誘導する際、細胞に添加される。ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤（例えば、アトルバスタチン）は、１つまたはそれ以上の成長因子やサイトカインと組み合わせて添加してよい。
【００３６】
該細胞は、当該技術において公知の方法で培養することができる。該細胞は、例えば５×１０4〜１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で、ゼラチンまたはコラーゲンでコートしたプレートあるいはフラスコ中で増殖させてよい。ＥＰＣは、成長因子の存在により、（成熟）内皮細胞へと分化する。
【００３７】
該内皮細胞群において、通常少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の細胞が、マーカータンパク質ＣＤ１４４を発現する。該内皮細胞群において、通常少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の細胞が、マーカータンパク質ＣＤ１４６を発現する。該内皮細胞群において、通常少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の細胞が、マーカータンパク質ＣＤ３１を発現する。該内皮細胞群において、通常少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の細胞が、マーカータンパク質ＬＤＬ受容体を発現する。該細胞群中の内皮細胞は、実施例で述べるようにマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）アッセイで、好ましくは管腔を形成する能力をもつ。好ましい実施態様では、該内皮細胞群が、マーカー分子であるＣＤ１４４（ＶＥ−カドヘリン）、ＣＤ１４６、ＣＤ３１、および／またはＬＤＬ受容体を実質的に均一に発現することによって特徴づけられる。より好ましくは、ＣＤ１４４、ＣＤ１４６、ＣＤ３１そしてＬＤＬ受容体のうち、２つ、あるいは３つ、あるいは全てが実質的に均一に発現される。本発明の内皮細胞は、ＶＷＦを発現し、分泌することによってさらに特徴づけられる。該細胞が第ＶＩＩＩ因子を発現する際、上清中のＶＷＦとＦＶＩＩＩのモル比は、１：１から１００：１の間で変わり得る。また、該細胞はハリエニシダ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）の凝集素と結合することができる。該内皮細胞群において、通常少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の細胞が、ＶＷＦを発現する。該内皮細胞群において、通常少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の細胞が、ハリエニシダの凝集素と結合することができる。
【００３８】
本発明の内皮細胞は、好ましくはマーカー分子ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３、および／またはＨＬＡ−ＤＲを発現しない。最も好ましくは、本発明による細胞内では、その４つのマーカー分子のいずれも発現されない。該細胞分画において、例えば該細胞のうち１〜９０％、好ましくは５〜５０％が、マーカーＣＤ３４を発現することができる。
【００３９】
具体的な実施態様では、該細胞の９０％未満がＫＤＲ（＝ＶＥＧＦ受容体−２＝ｆｌｋ−１）を発現する。また、該細胞のうち５０％未満、あるいは２５％未満、あるいは１０％未満が、ＫＤＲを発現する。別の実施態様では、該細胞の９０％超がＫＤＲを発現する。
【００４０】
上記のようなマーカーの発現に関する様々な実施態様は、組み合わされてよい。
【００４１】
さらなる工程では、該内皮細胞は、治療効果のあるタンパク質（例えば、血液凝固因子）をコードするＤＮＡにより形質導入される。治療効果のあるタンパク質の例としては、限定はされないが、１．血液凝固因子、２．成長因子（例えば、ＮＥＧＦ、ＦＧＦ、ＳＣＦ）、３．ケモカイン類などが挙げられる。該ＤＮＡは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子などをコードすることができる。好ましくは、該ＤＮＡはヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする。該ＤＮＡは、成熟野生型第ＶＩＩＩ因子、またはそれの突然変異タンパク質をコードすることができる。第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質は、点変異を有する突然変異タンパク質、Ｃ末端側もしくはＮ末端側で短縮されている突然変異タンパク質、および／または部分的にもしくは完全にＢ領域を欠損した突然変異タンパク質であってよい。
【００４２】
ＵＳ  ６，３４６，５１３、ＷＯ  ８６／０６１０１、ＷＯ  ９２／１６５５７、およびＥＰ  ０  １２３  ９４５には、第ＶＩＩＩ因子のＢ領域をコードする配列の欠損が記述されている。ＥＰ  １  ２３３  ０６４、ＵＳ  ２００２／０１６５１７７、およびＵＳ  ６，２７１，０２５には、第ＶＩＩＩ因子をコードするｃＤＮＡへのイントロンの挿入が記述されている。ＵＳ  ５，４２２，２６０には、第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡ配列における点突然変異が記述されている。これらに記述されているコーディングＤＮＡ配列または非コーディングＤＮＡ配列の修飾は、本発明に従い用いることができる。開示されている該修飾の組み合わせも用いることができる。
【００４３】
ＵＳ  ６，２２８，６２０，  ＵＳ  ５，７８９，２０３、およびＵＳ  ５，６９３，４９９には、第ＶＩＩＩ因子の重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡの共発現が記述されている。これらの実施態様もまた、本発明に用いてよい。
【００４４】
特定の実施態様では、第ＶＩＩＩ因子突然変異タンパク質は、次の突然変異のうち少なくとも１つを有している（ＥＰ  １  １３６  ５５３  Ａ１）：
−  １６２位のバリンが、別の中性アミノ酸残基で置換されている；
−  ２０１１位のセリンが、別の親水性のアミノ酸残基で置換されている；
−  ２２２３位のバリンが、酸性アミノ酸残基で置換されている；
−  ７４０位のアルギニンから１６４０位のグルタミン酸までのＢ領域が、１０〜２５個の、好ましくは１４〜２０個のアミノ酸残基を含むアルギニンに富んだリンカーペプチドで置換されている。
【００４５】
該位置は、公表された成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を参照している（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８４，  ３１２（５９９２）：３４２−７；  Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８４，  ３１２（５９９２）：３３０−７；  Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８４，  ３１２（５９９２）：３２６−３０）。ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を、図７に示す（配列番号：３）。別の実施態様では、第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡは、修飾された第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡであり、少なくとも１つのイントロンが、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの少なくとも１つの位置に挿入されている。
【００４６】
第ＶＩＩＩ因子をコードするＤＮＡは、通常、細胞に形質導入するために用いられるベクターの一部である。該ベクターは、血液凝固因子をコードするＤＮＡ配列に発現可能なように結合しているプロモーターを含んでいてもよい。該ベクターはウイルスベクターであることが好ましく、好ましくはレトロウイルスベクター、より好ましくはレンチウイルスベクターである。より好ましくは、そのレンチウイルスベクターは、ＨＩＶ−１ウイルスベクターである。ＨＩＶ−１ウイルスの他に、ＨＩＶ−２ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびビスナウイルスに基づくベクターが使用されてもよい。別の実施態様では、ＦＶＭをコードするベクターは、プラスミドＤＮＡ（例えば、ｐｃＤＮＡ３）であってもよい。
【００４７】
本発明の内皮細胞は凍結保存でき、その後その増殖能を大きく失うことなく解凍され、培地に戻すことができる。該細胞を凍結保存するために、培養細胞を剥離し、適当な凍結培地に再懸濁できる。すなわち、そのような凍結培地は、糖類、ＢＳＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、グリセリンエステル等の凍結保存剤を含む。
【００４８】
本発明では、該細胞は、ＤＮＡによる形質導入に先立ち、あるいはＤＮＡによる形質導入の後に、凍結され、解凍されてもよい。本発明の別の実施態様では、ＥＰＣから成熟内皮細胞へ分化する前に、該細胞は形質導入される。
【００４９】
ある実施態様では、形質導入された内皮細胞は、４〜１０のオーダー（１０4〜１０10倍）で、好ましくは５〜９のオーダー（１０5〜１０9倍）で伸長されてよい。この伸長または増殖の工程は、工程ａ）およびｂ）が完了した後に行うことができる。伸長工程は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００５０】
上記の内皮細胞は、血液凝固因子の産生に有用である。該方法は、本発明による内皮細胞を適当な条件下で培養し、細胞培養培地から該血液凝固因子を単離することを含む。単離工程は、培地から該血液凝固因子を精製することを含む。適当な精製工程としては、限定はされないが、免疫親和性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーなど、あるいはその組み合わせが挙げられる。ヒト血漿から凝固因子を精製する詳細なプロトコルは、例えば、ＷＯ  ９３／１５１０５、  ＥＰ  ０  ８１３  ５９７、  ＷＯ  ９６／４０８８３、ＷＯ  ９６／１５１４０およびＷＯ  ９６／１５１５０に開示されている。それらは、組換え第ＶＩＩＩ因子および組換え第ＩＸ因子の単離に必要とされる要件に適合させることができる。硫酸アンモニウムによる沈殿工程に続いて、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーと同様にＤＥＡＥおよびＨＩＣ触腕（ｔｅｎｔａｃｌｅ）クロマトグラフィーを行うことを含む、第ＩＸ因子のために有効なプロトコルが紹介された（ＵＳ  ５，９１９，９０９）。精製工程の間およびその後の精製タンパク質の量および活性は、ＥＬＩＳＡアッセイおよび凝固アッセイによって追跡することができる。
【００５１】
好ましくは、該血液凝固因子はヒト第ＶＩＩＩ因子である。この場合、第ＶＩＩＩ因子はＶＷＦの存在下で精製してよい。ＶＷＦは、細胞培養培地中に存在してよく、第ＶＩＩＩ因子１モルあたり好ましくはＶＷＦ１〜１００モル、より好ましくは５０〜６０モルの量が用いられる。
【００５２】
第ＩＸ因子を産生する場合、培養はビタミンＫ存在下で行われ、ビタミンＫの量は、好ましくは０．１〜１００μｇ／ｍｌ−培養液、より好ましくは１〜２０μｇ／ｍｌ−培養液である。
【００５３】
タンパク質（例えば、血液凝固因子）の産生方法により得られる組成物は、ウイルスの不活化処理を施すことができる。ウイルスの不活化処理としては、（乾燥状態あるいは溶液状態で、プロテアーゼ阻害剤を含む化学物質を添加する、あるいは添加することなく）加熱する処理法が挙げられる。 ウイルスの不活化処理後、化学物質を除去するためにさらに精製する工程が必要かもしれない。特に、血漿から単離した第ＶＩＩＩ因子に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーにより高純度化したウイルス不活化タンパク質の回収について報告された（ＷＯ  ９３／１５１０５）。また、血漿あるいは他の生物源から高純度で非感染性の凝固因子を産生する方法がいくつか報告された。２相系を形成している疎水相で強い感染性のある物質を処理し、該疎水相から続いて水不溶性の部分を除去することにより、脂質外層を持つウイルスが効果的に不活化される。さらなる利点として、非イオン性生体適合性界面活性剤、およびジアルキルリン酸エステルまたはトリアルキルリン酸エステルを用いた処理を同時にまたは逐次的に行うことにより、疎水相による処理を補完することが判明した（ＷＯ  ９６／３６３６９，ＥＰ  ０  １３１  ７４０，ＵＳ  ６，００７，９７９）。非脂質外層を持つウイルスには、非イオン性界面活性剤による処理に続いて、数時間の加熱工程（６０〜６５℃）を含む不活化プロトコルが必要である（ＷＯ９４／１７８３４）。
【００５４】
有効量の単離タンパク質（例えば、血液凝固因子）を含む医薬組成物は、さらに医薬的に許容される添加剤を含んでもよく、そのような添加剤としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ−溶液）；ＣａＣｌ2などのような無機塩（好ましくは２〜５ｍＭ）；グリシン、リジン、またはヒスチジンのようなアミノ酸（好ましくは１つのアミノ酸あたり０．１〜１Ｍ）；ショ糖および／またはトレハロースのような二糖類（好ましくは０．４〜１Ｍ）；クエン酸ナトリウムのような有機塩（好ましくは５０ｍＭまで）などが挙げられる。該製剤は、水性でも非水性であってもよい。非水性製剤の場合、主要な成分はグリセリンおよび／またはポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−３００）である。該製剤は、乾燥形態（投与前に所望の溶媒に溶解する）であってもよい。
【００５５】
本発明の別の実施態様は、血友病Ａまたは血友病Ｂ、好ましくは血友病Ａを治療用医薬の製造のために、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を発現する本発明の細胞群を使用することである。第ＶＩＩＩ因子を発現する本発明の細胞は、血友病Ａのｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療プロトコルで用いることができる。第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を発現する本発明に従って形質導入された内皮細胞は、血友病Ａまたは血友病Ｂを患う個体に移植されてよい。移植方法としては、限定はされないが、形質導入された細胞で囲まれた人工管もしくは人工弁の移植、または形質導入された内皮細胞を収容するように設計された装置もしくはマトリックスの移植などが挙げられる。該細胞は、静脈内点滴などのような従来の手段で、一定時間、患者の血流に導入されてもよい。
【００５６】
さらに、本発明の別の実施態様は、循環器系疾患の治療用医薬の製造のために、本発明による細胞群を使用することである。この疾患としては、限定はされないが、心不全、急性あるいは慢性心臓病などが挙げられる。この実施態様によると、該細胞は好ましくは、血液循環を介して全身的な効果を有するあらゆるタンパク質の異所性合成および分泌のための自己細胞の貯蔵場所を供給する。特別の実施態様は、急性あるいは慢性心臓病における血管再生である。
【００５７】
通常、本発明による細胞は、改良された方法で罹患組織に組み込まれるので、よりよい治療効果を示す。また、これらの細胞のホーミング(移入)も大きく改善することができる。  
【００５８】
本発明による細胞は、レンチウイルスによる形質導入により、４〜１０のオーダーの規模、好ましくは５〜９のオーダーの規模で増殖することができ、タンパク質（例えば、第ＶＩＩ因子）を分泌する能力を有する。それゆえ、本発明により産生された内皮細胞は、血友病Ａの遺伝子治療に用いることができる。具体的な実施態様では、該細胞の増殖には限界がある。したがって、内皮細胞への分化のために少なくとも１つの成長因子を添加してから、１５週間で、好ましくは１２週間で、所望により８または９週間で、該内皮細胞は増殖を終了する。限られた増殖能を持つ細胞が、遺伝子治療プロトコルで使用するのには好ましい。
【００５９】
本発明に従って産生される内皮細胞は、高レベルの第ＶＩＩＩ因子を発現する。該細胞により分泌される第ＶＩＩＩ因子の量は、少なくとも２．５ＩＵ／１０6ｃｅｌｌ／４８ｈ、好ましくは少なくとも５ＩＵ／１０6ｃｅｌｌ／４８ｈ、最も好ましくは７ＩＵ／１０6ｃｅｌｌ／４８ｈである。
【００６０】
本発明の別の実施態様は、ここで述べられている内皮細胞群から、不死化細胞株を産生する方法に関する。該方法は、内皮細胞の形質転換を含む。該細胞は、ウイルス感染および／または非ウイルス感染（例えば、ヒトパピローマウイルス、エプシュタイン−バールウイルス、ＤＮＡプラスミド）により、あるいはヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のようなヒトテロメラーゼのサブユニットタンパク質をコードする遺伝子の導入、または１つもしくはそれ以上の癌遺伝子の導入により、不死化細胞株に転化することができる。この実施態様は、血液凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生および単離するのに好ましい。該不死化細胞株は本発明の範囲に包含される。
【００６１】
図１  内皮細胞の累積増殖曲線
ここで示す代表的実験において、２つのドナープールから得られた約１０6個の臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を、ゼラチン被覆プレート上のＥＤＭ中で培養した。その後、接着細胞が老化するまでＥＧＭ−２中で継代培養した。黒四角（ＷＴ；■）で定義されたグラフは、最初の継代後の時間に対してプロットした内皮細胞の数を表す。３７日後（Ａ）および２３日後（Ｂ）にそれぞれコンストラクトｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳ（Ｃ（Ｆ８）ＩＧＷＳと略記；白丸；○）およびコンストラクトｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷ（ＳＥＷと略記；白三角；△）を使用して、１０4個の細胞を４８時間、形質導入のために培養した。これらの細胞もまた、増殖が止まるまでＥＧＭ−２中に維持された。
【００６２】
図２  ＣＢＥＣ（臍帯血由来内皮細胞）の形態および表現型の特徴
４つの異なるバッチからのＣＢＥＣを、培養中の様々な時点においてフローサイトメトリーにより、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みおよび細胞表面マーカーの発現を分析した。Ｘ軸は、分析された細胞の蛍光強度である。Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬまたは抗体で標識された細胞は太線で表され、細線は適当な陰性対照を表す。ＣＢＥＣは一様にＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みおよび内皮マーカーＶＥ−カドヘリン、ＣＤ１４６、およびＣＤ３１に対して陽性であることをパネルは示している。細胞のサブセットはＣＤ３４を発現し、非常に弱くではあるが、ＫＤＲを発現した。すべてのＣＢＥＣが、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４５、およびＣＤ１４に対しては陰性であった。
【００６３】
図３  内皮細胞へのレンチウイルス形質導入
４つの独立した実験で、継体数３〜８のＣＢＥＣは、レンチウイルスコンストラクトｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷ（ＳＥＷと略する）およびｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳ（Ｃ（Ｆ８）ＩＧＷＳと略する）により形質導入される。（Ａ）それぞれのベクターに対して、感染多重度（ＭＯＩ）１０および１００で該コンストラクトにより形質導入を行い、陰性対照として形質導入していない細胞のＥＧＦＰ発現の分析を行うことによって、形質導入効率を測定した。（Ｂ）ヒストグラムは、ＦＡＣＳにより検出されたＥＧＦＰ発現のレベルを表す。線図は、４つの実験の代表例の結果を示す。ＦＡＣＳ分析は、Ｃ（Ｆ８）ＩＧＷＳによる形質導入（ＭＯＩ  １０；曲線下が黒い領域）、およびＳＥＷによる形質導入（ＭＯＩ  １０；曲線下が灰色の領域）して３０日後に行った。形質導入していない細胞は、陰性対照として用いた（曲線下が白い領域）。
【００６４】
図４  形質導入されたＣＢＥＣの表現型：Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ管腔形成
（ＡおよびＢ）ｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷによる形質導入（ＭＯＩ  １００）の５週間後、細胞をＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬと共に１時間インキュベートし、蛍光顕微鏡法により（Ａ）ＥＧＦＰ発現および（Ｂ）Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ取り込みを測定した。（ＣおよびＤ）管腔形成アッセイのために、ＣＢＥＣをトリプシン／ＥＤＴＡ処理により剥離し、マトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス上で培養した。該細胞を、８〜１０時間３７℃でインキュベートし、顕微鏡法で血管の形成を測定した（Ｃ：相の比較；  Ｄ：ＥＧＦＰ発現）。
【００６５】
図５  ＣＢＥＣ上清におけるＦＶＩＩＩ：Ｃの定量化 
３つのドナープール由来のＣＢＥＣを、ＭＯＩ  １０でＢＤＤ  ＦＶＩＩＩをコードするコンストラクトｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳにより形質導入した。形質導入後様々な時点でのＦＶＩＩＩ：Ｃの分泌を定量化するために、５×１０4個の細胞を１ｍｌのＥＧＭ−２中で培養し、３７℃でインキュベートした。４８時間後、上清を採り、短時間の遠心分離により細胞残屑を除き、分析するまで−８０℃で貯蔵した。どのアッセイにも、ｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷにより形質導入した細胞由来の上清、および形質導入していない細胞由来の上清が含んでいた。ＦＶＩＩＩ：Ｃは、これらの対照のいずれでも検出できなかった（検出限界：０．０１  ＩＵ／ｍｌ）。
【００６６】
図６  免疫ブロット法による濃縮ＣＢＥＣ上清中のＦＶＩＩＩタンパク質の検出 
形質導入していないＣＢＥＣ由来、およびｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳにより形質導入したＣＢＥＣ由来の無血清培養上清を、限外ろ過により２００〜４００倍に濃縮した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、免疫ブロットを行った。レーン１および２は、対照として市販のＦＶＩＩＩ濃縮物を示す。レーン３および４はＣＢＥＣ由来の濃縮上清を示す。様々な強度のシグナルを検出するために、オートラジオグラフィー・フィルムを異なる時間で曝露した（１ａ〜４ａ：１分間；１ｂ〜４ｂ：２０分間）。レーン１：Ｏｃｔ、Ｏｃｔａｎａｔｅ（登録商標）（血漿由来完全長ＦＶＩＩＩ）；レーン２：ＲｅＦ、ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）（組換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）；レーン３：ｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳにより形質導入したＣＢＥＣ由来上清（ＢＤＤＦＶＩＩＩ）；レーン４：形質導入していないＣＢＥＣ由来上清。
【００６７】
図７  ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列
図７はヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示す（２０位〜２３５１位のアミノ酸は成熟第ＶＩＩＩ因子に対応する）。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は本発明を説明するが、本発明を限定するものではない。
【００６９】
１．器具および方法
【００７０】
臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞の単離
単核細胞を、フィコールによる比重分離（ｄ＝１．０７７ｇ／ｍｌ）により健康なドナーの臍帯血から単離し、免疫蛍光染色法および蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）分析により測定すると、該単核細胞はＣＤ３４陽性細胞を２％未満含んでいた。２ｍＭ  ＥＤＴＡ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、タウフキルヒェン、ドイツ）および０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；ドイツ赤十字血液センター（ＤＲＫ−Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ）  ニーダーザクセン、シュプリンゲ、ドイツ）を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）ＰＢＳ（リン酸緩衝液；バイオウィッタカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ベルビエ、ベルギー）で、該細胞を２回洗浄し、直接ＣＤ３４陽性前駆細胞単離キット（Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ミルテニーバイオテク社（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ）を用いて製造者の指示書に従い、ＣＤ３４陽性細胞を磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）により富化した。ＣＤ３４陽性細胞の純度は、８０％から９５％の範囲内であった。
【００７１】
内皮細胞の分化
ＣＤ３４陽性細胞を、次から成る内皮細胞分化培地に再懸濁させた：８０％基礎Ｉｓｃｏｖｅ培地（バイオクロム社（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ）、ベルリン、ドイツ）、１０％ウマ血清（パンバイオテック社（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アイデンバッハ、ドイツ；選択されたロット）、１０％加熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；バイオクロム社；選択されたロット）、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（最終濃度  ２ｍＭ；バイオウィッタカー社）およびペニシリン−ストレプトマイシン（最終濃度  それぞれ１００Ｕ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ；バイオウィッタカー社）。培地を濾過し（孔径０．２２μｍ）、その後、組換えヒト（ｒｈ）ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子；５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈ塩基性ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子−２；２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＳＣＦ（幹細胞因子；５０ｎｇ／ｍｌ；以上全てアール・アンド・ディー・システムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ウィーズバーデン、ドイツ）、およびｒｈＳＣＧＦ−β（幹細胞成長因子−β；２０ｎｇ／ｍｌ；ペプロテック社（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）を添加した。成長因子を含むこの培地は、内皮細胞分化培地（ＥＤＭ）と称する。
【００７２】
ＣＤ３４陽性細胞の培養は、５％二酸化炭素の湿気雰囲気下３７℃で、１ウェル当たり３ｍｌ、５×１０4〜１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の濃度で、１％ゼラチン溶液（シグマ社）でコートした組織培養処理６ウェルプレートにおいて行った。１人のドナーから得られる該細胞が５×１０5個よりも少ない場合、該細胞は２４ウェルプレートで培養するか、または異なるドナーからの細胞をプールした。培地の半分を１週間に２回交換し、ウェルが接着細胞で８０〜９０％のコンフルエントとなるまで（通常最長３週間まで）、該細胞をインキュベートした。
【００７３】
トリプシン／ＥＤＴＡ処理により接着細胞を剥離し、ＥＧＭ−２培地（２％ＦＣＳ、ＶＥＧＦ、ｒｈＥＧＦ（表皮成長因子）、ｒｈ塩基性ＦＧＦ、Ｒ３−ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子）、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、ヘパリン、ゲンタマイシン、およびアムホテリシンＢを補完した内皮細胞基礎培地（ＥＢＭ）−２；クロネティクス社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）／バイオウィッタカー社、ベルビエ、ベルギー）において、ゼラチンコートした組織培養フラスコ上で、接着細胞を培養した。低密度（１×１０3／ｃｍ2）での増殖させた場合、細胞が最も効率的に増殖した。
【００７４】
免疫蛍光検査法
１％ＦＣＳ（バイオクロム社）および０．１％アジ化ナトリウム（シグマ社）を含むＰＢＳで洗浄することにより、およそ１０5個の細胞をフローサイトメトリー用に調製した。造血細胞表面マーカーおよび内皮細胞表面マーカーの発現を特徴づけるために、次のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた：抗ＣＤ１４−ＰＥ抗体、抗ＣＤ３４−ＰＥ抗体、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ抗体（これら全てビー・ディー・バイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ハイデルベルク、ドイツ）、抗ＣＤ１３３−ＰＥ抗体（ミルテニーバイオテク社）、抗ＣＤ１４６抗体、抗ＣＤ１４６−ＦＩＴＣ抗体、抗ＶＥ−カドヘリン抗体（これら全てケミコン社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、テメキュラ、カリフォルニア州）、抗ＣＤ３４−ＰＣ５抗体（イミューノテック社（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、マルセイユ、フランス）、抗ＣＤ３１−ＦＩＴＣ抗体および抗ＫＤＲ抗体（両者ともシグマ社）。細胞は、それぞれのｍＡｂに対して２０分間、２０℃でインキュベーション（抗ＣＤ３１−ＦＩＴＣ抗体、抗ＫＤＲ抗体の場合）、あるいは４℃で（他の全ての抗体の場合）インキュベーションした。第２ステップとして、ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ダコ社（Ｄａｋｏ）、グロストラップ、デンマーク）のＲＰＥでコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２断片をインキュベーションすることにより、コンジュゲートしていない１次モノクローナル抗体が検出された。細胞のサンプルは、アイソタイプが適合した対照抗体（ビー・ディー・バイオサイエンス社とイミューノテック社から購入）でも染色した。ＦＡＣＳ分析は、ＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメーター（ビー・ディー・バイオサイエンス社）およびセル・クエスト（Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ）ソフトウェア（ビー・ディー・バイオサイエンス社）を用いて行った。それぞれの分析は、少なくとも１０，０００回行った。死細胞は、その前方散乱特性および側方散乱特性に基づいて、除去した。
【００７５】
Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ標識
アセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬ）の取り込みによる内皮細胞の蛍光標識は、ＥＧＭ−２中６０分間３７℃で、２μｇ／ｍｌのＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（ハーバー・バイオ・プロダクツ社（Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ノーウッド、マサチューセッツ州）により該細胞をインキュベートすることで行った。その後、培地をＥＧＭ−２と交換し、該細胞のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ取り込みを、蛍光顕微鏡法（ニコン社、Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００）およびフローサイトメトリーにより分析した。
【００７６】
レンチウイルスコンストラクト
２つのＨＩＶ−１型由来自己不活化レンチウイルス遺伝子導入コンストラクトを、この実施例で用いた：ｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷベクター（Ｄｅｍａｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）は、脾限局巣形成ウイルス（Ｕ３−ＬＴＲ）のエンハンサー領域、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のｃＤＮＡ、およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）から成る遺伝子発現カセットを包含する。
【００７７】
ｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳベクターを生成するために、３つのクローニング工程を要した。最初は、ＨＩＶ−１型を基にしたモノシストロン性自己不活化ベクターｐＲＲＬ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ＳＩＮ（ＣＧＷＳ、Ｒ．Ｚｕｆｆｅｒｅｙ氏（ジュネーブ、スイス）より快く提供されたｐＲＲＬ−ＰＧＫ−ＧＦＰ−ＳＩＮ−１８ベクターおよびｐＨＲ’−ＣＭＶ−ｌａｃＺ−ＳＩＮ−１８ベクターの誘導体）、このベクターは５’位置で内部ＣＭＶプロモーターと３’位置でＷＰＲＥ配列と隣り合って（ｆｒａｎｋｅｄ）、マーカー遺伝子としてのＥＧＦＰ遺伝子をコードしており、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の挿入、および脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ；ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ由来のＭＣＳおよびＩＲＥＳ、クローンテック社、ハイデルベルク、ドイツ）の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の挿入により、そのベクターを改変した。２番目の工程で、ＨＩＶ−１型から、セントラルポリプリン配列およびセントラル終止配列（ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ；Ｃｈａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｚｅｎｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｓｉｒｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；  Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を、配列内ＣＭＶプロモーターのクラル（Ｃｌａｌ）５’部位へとクローンニングした。クラル制限酵素認識部位と隣り合うｃＰＰＴ／ＣＴＳ断片が、鋳型としてＨＩＶ−１  ＬＡＩ  ｇａｇ−ｐｏｌ  ｃＤＮＡ（Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）を含むプラスミドと、次に示すオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られた；ＰＰＴＣＴＳＣＬＡ−５：  ５’−ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＡ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  Ｃ−３’  （配列番号：１）およびＰＰＴＣＴＳＣＬＡ−３：  ５’−ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＣＣ−３’（配列番号：２）。最終的に、ヒトＢ領域欠損ＦＶＩＩＩ（ｈｕＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ；Ｔｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）に記述されている欠損）に対するｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターとＩＲＥＳ間のＭＣＳのＳａｌｌ部位にクローンニングし、２シストロン性ベクターｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳを得た。
レンチウイルス上清の産生
レンチウイルス粒子を生成するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、およびｔａｔ遺伝子をコードするパッケージングコンストラクトｐＣＭＶΔＲ８．９１（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）をコードするシュードタイピングコンストラクトｐＭＤ２．ＶＳＶＧ（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，２００２）のコトランスフェクションを３回行うことにより、遺伝子導入ベクターのＤＮＡが一時的に、２９３Ｔ細胞（Ｔｏｎｎｅｔ  ａｌ．，（２００２）に記述のように培養した）に導入された。
【００７８】
プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、リン酸カルシウムの共沈により行った。トランスフェクションから１６時間後、細胞に新鮮な培地（１０％加熱不活化ＦＣＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、およびペニシリン−ストレプトマイシンをそれぞれ１００Ｕ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌで補完したＤＭＥＭ（ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）、カールスルーエ、ドイツ））を与えた。さらに２４時間後、ウイルスの上清を集め、濾過し（孔径０．２２μｍ）、超遠心分離で濃縮後、再び濾過した。ウイルスの感染価は、ベクター濃縮物の希釈、および続いてのＦＡＣＳ分析による２９３Ｔ細胞の形質導入により、２９３Ｔ形質導入単位（２９３Ｔ−ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ）（ＴＵ／ｍｌ）として測定した。コンストラクトｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷおよびｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳの濃縮ベクターストックは、それぞれ１０8〜１０9ＴＵ／ｍｌ、１０7〜１０8ＴＵ／ｍｌの感染価を有した。
【００７９】
内皮細胞の形質導入
内皮細胞を、ＥＧＭ−２中で１ウェルあたり１×１０4個、ゼラチン被覆６ウェルプレート上で培養し、３７℃で４８時間インキュベートした。形質導入のために、４μｇ／ｍｌの硫酸プロタミン（シグマ社）および５０μＭのｄＮＴＰｓ（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）社、フランクフルト・アム・マイン、ドイツ）の存在下、ＥＧＭ−２中で濃縮されていないウイルス上清または濃縮されたウイルス上清と、培地を交換した。スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（１２５０ｇ、９０分、３２℃）後、該細胞を３７℃でさらに１６時間インキュベートした。それから、ウイルス上清を除去し、該細胞に新鮮なＥＧＭ−２を与えた。感染多重度（ＭＯＩ）は、標的細胞に対する２９３Ｔ−ＴＵ／ｍｌの割合として計算した。ＥＧＦＰ発現は、様々な時点でＦＡＣＳ分析および蛍光顕微鏡法により分析した。
【００８０】
ＦＶＩＩＩの定量化
分泌したＦＶＩＩＩの量を評価するために、形質導入した内皮細胞と形質導入していない対照細胞を、ゼラチンコートした１２ウェルプレートに、総体積１ｍｌのＦＧＭ−２中に５×１０4個の細胞で播種した。４８時間後、遠心分離（７００ｇ、３分、４℃）により上清から細胞残屑を除去し、分析まで−８０℃で複数のアリコート中に貯蔵した。ＦＶＩＩＩ抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）およびＦＶＩＩＩ活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）の測定は、それぞれ市販のＩｍｍｕｎｏｚｙｍ  ＦＶＩＩＩ：Ａｇ  ＥＬＩＳＡおよびＩｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ発色検出アッセイ（イミューノ社（Ｉｍｍｕｎｏ）、ハイデルベルク、ドイツ）により製造者の指示書に従い行った。ＦＶＩＩＩ濃度は国際単位（ＩＵ）／ｍｌで与えられ、１５０ｎｇ／ｍｌが１．０ＩＵ／ｍｌに対応する。両アッセイにおけるＦＶＩＩＩ標準品は、ＷＨＯ血漿標準に対して製造者が計算したものである。
【００８１】
ＦＶＩＩＩのウエスタンブロット
コンフルエントな内皮細胞層をＰＢＳで洗浄し、１５〜２４時間ＦＣＳ無しのＥＧＭ−２で培養した。培養上清を濾過し（０．２２μｍ）、細胞残屑を除去し、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）２０濃縮器（ザルトリウス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、ゲッチンゲン、ドイツ）での超遠心分離（排除分子量（ＭＷＣＯ）３０ｋＤａ）により、４００倍にまで濃縮した。濃縮物をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液（ＲｏｔｉＬｏａｄ  １；ロート社（Ｒｏｔｈ）、カールスルーエ、ドイツ）中で５分間煮沸し、１０％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜（ロート社）に移した。その膜を５％粉末スキムミルク中２０℃で３時間ブロックし、ポリクローナルヒツジ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子：Ｃ抗体（エンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、スワンシー、イギリス）とともに４℃で１５〜２０時間インキュベートした。十分に洗浄した後、ペルオキシダーゼでコンジュゲートしたロバ抗ヒツジＩｇＧ二次抗体（シグマ社）とともに、ブロットを室温で４０分間インキュベートした。さらに洗浄した後、ＥＣＬ法（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：高感度化学発光法）（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社、ボン、ドイツ）で、タンパク質を視覚化した。陽性対照として、組換えＢ領域欠損ＦＶＩＩＩであるＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）（ファルマシア＆アップジョン社、マルチンスリード、ドイツ）および血漿由来ヒトＦＶＩＩＩ（Ｏｃｔａｎａｔｅ（登録商標）；オクタファーマ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、フランクフルト・アム・マイン、ドイツのＬｏｔｈａｒ  Ｂｉｅｓｅｒｔ氏が快く提供）を用いた。
【００８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  マトリゲルを用いたアッセイ
予め冷蔵した２４ウェルプレートを、１ウェルあたり５００μｌのマトリゲル（登録商標）基底膜マトリックス（ビー・ディー・バイオサイエンス社）で被覆し、３７℃で１時間インキュベートした。内皮細胞はトリプシン／ＥＤＴＡ処理により採取し、ＥＧＭ−２中に再懸濁し、ゲル化したマトリックス上に４００μｌ中６×１０4〜１×１０5個、該細胞を播種した。培養物を３７℃でインキュベートした。８〜１０時間後、位相差顕微鏡法および蛍光顕微鏡法（ニコン社  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ３００）により管腔形成を確認した。
【００８３】
統計的分析
データは平均±標準偏差で示される。１対のスチューデントｔ検定を用いて、異なる感染多重度で形質導入した細胞の形質導入効率およびＦＶＩＩＩ分泌レベルを比較した。統計的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ３．０ソフトウェアを用いて行った。
【００８４】
２．結果
臍帯血由来内皮細胞（ＣＢＥＣ）の分化および培養
臍帯血単核細胞の単離後、ＭＡＣＳ免疫磁気ビーズを用いて、ＣＤ３４陽性細胞分画を純度８０％〜９５％で得た。ｒｈＶＥＧＦ、ｒｈ塩基性ＦＧＦ、ｒｈＳＣＦおよびｒｈＳＣＧＦ−β（「器具および方法」参照）を含むＥＤＭ中で、単一のドナーからの細胞あるいは数人のドナーからの細胞プールを約３週間培養した。内皮形態を有する増殖している接着細胞が検出できた場合、それらの細胞はコンフルエントに達する前に継体培養される。１０5〜１０7個のＣＤ３４陽性細胞の植え付けで、８週間の総培養時間で接着細胞が１０9倍増殖した。図１に、ドナープールからの細胞（「ＷＴ」と表す）を用いた２つの代表実験の累積増殖曲線を示す。この実施例では、約３０〜３５時間の倍化時間で細胞は増殖した。細胞が増殖を止め、培養物が老化する１０8倍を超えるまで増殖させた。
【００８５】
ＣＤ３４を単離する前の臍帯血（ＣＢ）由来単核細胞の培養物、およびＣＤ３４が劣化した分画の培養物は、別の同一条件下でも検出可能なＥＣの分化は得られず、かなり小数の細胞を得るのみであった。したがって、ＣＤ３４発現細胞の富化が好ましい。そのデータは、ＥＣがＣＤ３４陽性前駆細胞に由来したことを示唆している。
【００８６】
ＣＢＥＣの表現型の特徴
該接着細胞は、紡錘状扁平細胞の単層として増殖する（図２）。該細胞は、蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーで検出されるＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬを取り込むことができ、マトリゲルを用いたアッセイで管腔の形成を示した（以下参照）。該細胞は、様々な内皮細胞表面マーカーおよび造血細胞表面マーカーの発現に関して、フローサイトメトリーによりさらに特徴づけられ、内皮細胞について典型的な、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＣＤ１４６、およびＣＤ３１に対して一様に陽性であることが判明した。該細胞は、造血細胞表面マーカーであるＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１３３、およびＨＬＡ−ＤＲに対しては一様に陰性であった（図２）。ＥＣの５バッチをＦＡＣＳ分析することにより、このプロトコルで得られた細胞がＣＤ３４およびＫＤＲ／ＶＥＧＦ−Ｒ２の発現に関して不均一であることが示された（図２）。ＣＤ３４の発現は細胞の５〜４５％のサブセットで検出され、一方ＫＤＲはＣＢＥＣの５％未満で弱く発現した。上記細胞表面マーカーの発現は、細胞培養の間、不変であるように見えた。
【００８７】
ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ１４６、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、およびＫＤＲの発現に関するデータを、免疫組織化学分析（ＩＨＣ）により確認した。さらに、内皮マーカーフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）の発現およびハリエニシダ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）凝集素との結合をＩＨＣにより証明することができた。
【００８８】
形質導入効率
ＣＢＥＣがレンチウイルスベクターにより効率的に形質導入されることができるかを調べるために、３〜８の継体数でかつ１０および１００の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＥＧＦＰをコードするコンストラクトｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷ、およびヒトＢ領域欠損第ＶＩＩＩ因子とＥＧＦＰをコードするコンストラクトｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳを用いた最初の一連の実験において、４つの異なるドナープール由来のＣＢＥＣが形質導入された。形質導入効率は、形質導入後８日以降の少なくとも２つの異なる時点で、ＥＧＦＰ陽性細胞の検出により測定した。
【００８９】
ＥＣの形質導入に対して、ＭＯＩ  １０で、ｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷおよびｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳの形質導入効率として、それぞれ８８．２％±７．６％（８０．３％〜９５．６％の範囲）、７６．９％±５．０％（７３．１％〜８４．２％）を得た（図３Ａ）。ＭＯＩを１００に上げた場合、統計的に有意な形質導入効率の増加は無かった（両方のベクターに対して、ｐ＞０．０５で、９０．４％±９．５％および９０．６％±９．７％；図３Ａ）。
【００９０】
ＥＧＦＰの発現レベルと同様にＥＧＦＰ発現細胞のパーセンテージも、培養期間中、相対的に不変であった。代表的な実験において、ＭＯＩ  １０で形質導入３０日後の、形質導入された細胞と形質導入されていない細胞のＥＧＦＰ発現を、図３Ｂに示す。
【００９１】
レンチウイルスによる形質導入の細胞表現型および細胞増殖におよぼす影響
形質導入間／後の（特により高いＭＯＩにおける）細胞死、および図１に示した形質導入していない対照細胞の増殖速度に細胞が戻る前の誘導期から明らかなように、形質導入したＥＣへのいくつかのベクター媒介性毒性を観察した。したがって、このことが形質導入細胞と対照細胞間の表現型の変化に付随して起こるのかどうかを検討したいと考えた。形質導入して数週間後に、フローサイトメトリーによるＣＤ１４６、ＣＤ３４、ＫＤＲ、およびＣＤ１３３発現に対して、あるいはＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬを取り込む能力に対して、細胞を分析した。上記細胞表面マーカーの発現は、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みと同様、形質導入していない細胞と比較して変化が無かった（図４ＡおよびＢ）。また、ＣＢＥＣは、マトリゲルを用いたアッセイ（図４ＣおよびＤ）において、成熟した機能性ＥＣの特徴である管腔形成能力を保持した。
【００９２】
発色検出アッセイおよびＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩＩ分泌の定量化
ヒトＢ領域欠損ＦＶＩＩＩを発現するＣＢＥＣの能力を、７つの独立した実験で調べた。細胞は、ヒトＢ領域欠損ＦＶＩＩＩおよびＥＧＦＰをコードするレンチウイルスコンストラクトｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳにより形質導入され、老化するまで上記のように培養された。１２ウェルプレートに、１ｍｌのＥＧＭ−２中５×１０4個の細胞を播種し、４８時間後に細胞培養上清を回収することにより、様々な時点でＦＶＩＩＩの分泌を定量した。検出抗体としての軽鎖に対するモノクローナル抗体による発色検出アッセイおよびＥＬＩＳＡを用いた分析を行うまで、−８０℃でアリコートを貯蔵した。細胞は、増殖を止めるまで形質導入を維持した。
【００９３】
発色検出アッセイにより測定されるＦＶＩＩＩ：Ｃの濃度は、老化まで比較的一定であった。３つのドナープール由来の細胞の形質導入後最初の４週間、ＦＶＩＩＩ：Ｃの平均濃度は、７．０〜７．８ＩＵ／１０6ｃｅｌｌｓ／４８ｈに対応するＭＯＩ  １０で、０．３５〜０．３９ＩＵ／５×１０4ｃｅｌｌｓ／４８ｈであった(図５)。その後、増殖が減少し、最終的に老化することに伴って、全ての培地でＦＶＩＩＩ：Ｃ分泌は減少する。実験の２番目のセットでは、ＭＯＩのＦＶＩＩＩ分泌におよぼす影響を検討した。ＭＯＩを１０から１００に上げることによっては、ＦＶＩＩＩ：Ｃ分泌はわずかな増加しか引き起こさず、それは統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５、ｎ＝４）。対照コンストラクトｐＨＲ’ＳＩＮ．ｃＰＰＴ−ＳＥＷにより形質導入された細胞および形質導入していない細胞は、ＦＶＩＩＩ：Ｃを検出可能な量だけ分泌しなかった（両方とも＜０．０１ＩＵ／５×１０4ｃｅｌｌｓ／４８ｈ；ｎ＝７）。
【００９４】
同じＥＣ上清中のＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度の測定によって、ＭＯＩ  １０で０．４５〜０．６６ＩＵ／５×１０4ｃｅｌｌｓ／４８ｈとなり、ＦＶＩＩＩ：Ｃ（ｎ＝３）と比較してわずかに高いＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度を得た。この結果、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの平均比率０．５４〜０．８３（ｎ＝３；表１）となった。対照実験において、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ヒトＢ領域欠損ＦＶＩＩＩをコードするベクターにより形質導入した。６つの上清において、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの比率が０．９１±０．２３であることが判明した。この比率は、同じ導入遺伝子カセットを含むＦＶＩＩＩをコードするベクターにより形質導入された、いくつかの造血細胞株（Ｔｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の特徴である比率と違わない。
【００９５】
表１  異なるヒト細胞型における組換えＢ領域欠損ＦＶＩＩＩの比活性
造血細胞株、ＨＵＶＥＣ、およびＣＢＥＣ（臍帯血由来内皮細胞）を、同じＦＶＩＩＩ発現カセットを含むレンチウイルスベクターにより形質導入した。比活性は、これら細胞の上清におけるＦＶＩＩＩ：ＡｇとＦＶＩＩＩ：Ｃの比率として計算され、少なくとも３つの実験の平均値として与えられる。
【表１】
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【００９６】
ウエスタンブロット分析による、分泌ＦＶＩＩＩの特徴
ＥＣの分泌が正しく進み、それにより活性な凝血源ＦＶＩＩＩが産生しているという仮定を確認するために、排除分子量３０ｋＤａのビバスピン濃縮器を用いた限外濾過によって、細胞培養上清からＦＶＩＩＩを富化した。ＥＧＭ−２の血清含量が有効な濃度にならなかったので、ＥＣを血清なしで終夜培養した。試料は４００倍にまで濃縮され、ＥＬＩＳＡ、ＦＶＩＩＩウエスタンブロット、および発色検出アッセイにより分析した。
【００９７】
ｃＰＰＴ−Ｃ（ＦＶＩＩＩΔＢ）ＩＧＷＳにより形質導入されたＥＣの濃縮上清、および形質導入されていない細胞の濃縮上清について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法を行った。対照として、血漿由来ＦＶＩＩＩ（Ｏｃｔａｎａｔｅ（登録商標））および組換えＢ領域欠損ＦＶＩＩＩ（ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標））を用いた。Ｏｃｔａｎａｔｅ（登録商標）は約８０ｋＤａの軽鎖と様々な大きさの重鎖との二重鎖からなり、重鎖が様々な大きさを持つのはｉｎ  ｖｉｖｏでＢ領域を含む種々のタンパク質分解工程によるからである。ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）は、８０ｋＤａの二重鎖の軽鎖と９０ｋＤａの重鎖からなる。ＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）を発現するために用いられるＢ領域の欠損は、我々が用いる遺伝子導入ベクターにおける欠損とほぼ同一である。それゆえ、ポリクローナルな抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて、ＥＣ由来ＦＶＩＩＩと対照製剤において同じ高さで軽鎖のバンドが期待され、ＥＣ由来ＦＶＩＩＩとＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）においても同程度の大きさであることが期待された。図６はこのことが正に当てはまることを示している。より長く露出しておくと、ＦＶＩＩＩが細胞内で重鎖と軽鎖に切断されることが完全ではなかったかもしれないことを示す１７０ｋＤａでの弱いバンドが現れた。形質導入されていない細胞の濃縮上清では、ＦＶＩＩＩは全く検出できなかった。
【００９８】
免疫ブロット法の前に、ＥＣ由来試料のＦＶＩＩＩ：Ａｇ濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＣ由来ＦＶＩＩＩに対して見られた信号強度と、対照試料のものとはよく一致する。発色検出アッセイを用いて、濃縮上清が血液凝固活性を示すことも確認した。
【００９９】
本発明は、ＣＤ３４陽性細胞から内皮細胞への分化のためのサイトカイン類の新規な組み合わせを提供する。そして、臍帯血が細胞源に適していることが示された。臍帯血からＣＤ３４陽性細胞を富化させた後、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２、ＳＣＦ、およびＳＣＧＦ−βを含む培養物は、内皮表現型を持ち、非常に高いが限られている増殖能を有する接着細胞を産出した。以前の研究により、末梢血（Ｇｅｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）中および骨髄（Ｑｕｉｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）中の前駆細胞から、内皮細胞が由来し、非常に成長できることが示された。しかし、臍帯血は、この観点で検討されなかった。本研究では、ＶＥ−カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＣＤ３１、ＣＤ１４６およびＬＤＬ受容体の一様な発現、ＣＤ４５およびＣＤ１４の発現の不在、そしてマトリゲルを用いたアッセイでの管腔形成によって、明らかな内皮表現型が示された。多量の該細胞サブセットがＣＤ３４発現を保持する一方、ＫＤＲ陽性は驚くべきことに小さなパーセンテージで、非常に弱かった。ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１４４、およびＣＤ３１の発現については、細胞表面マーカーのこのパターンは今までに報告されておらず、Ｇｅｈｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）およびＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）の研究とは異なる。Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血由来ＣＤ１３３陽性細胞から、Ｇｅｈｌｉｎｇのプロトコルを用いて得られた細胞は、ただＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ１４４を発現するサブセットのみで、ほぼ一様にＫＤＲ陽性であった。Ｌｉｎのプロトコルに従い、分化した末梢血単核細胞由来の、血液由来内皮細胞（ＢＯＥＣ）はＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１４４、およびＣＤ３１に対して一様に陽性であった。他の研究ではマトリゲルを用いたアッセイは含まれておらず、そのため管腔形成という機能的特徴に関して、細胞は比較できない。その細胞は増殖能においても異なり、Ｌｉｎのプロトコルでは非常に大きく（６０日間以内で１８ｌｏｇ）、Ｇｅｈｌｉｎｇの研究では比較的低く見え、一方上記のプロトコルでは５〜９ｌｏｇと中間的な培養物の伸長を可能にしている。一定の細胞表現型を持った合計数ヶ月間のｅｘ  ｖｉｖｏ培養の後、培養物の老化がついに観察できた。免疫欠損マウスにおけるＢＯＥＣに関して、Ｌｉｎおよび共同研究者によって報告されたとおり、過剰で制御不可能なｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が極めて有害な影響を引き起こすかもしれないので、ここで示された内皮細胞が限られた増殖能を持つことが、現実には有利な点になりうる。
【０１００】
ＣＢＥＣは、血友病Ａの遺伝子治療のための有用な標的細胞でもあり得る。Ｂ領域を欠損した第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡおよびマーカー遺伝子としてのＥＦＧＰと安定的に組み込まれているＨＩＶ−１型由来自己不活化レンチウイルスベクターが、形質導入実験に用いられた。ＦＶＩＩＩ／ＥＧＦＰコントロールコンストラクトまたはＥＧＦＰコントロールコンストラクトに対して、概して７５％〜９５％の範囲にある高い形質導入割合を達成するのに、適度なＭＯＩ  １０で十分であることが判った。その形質導入の結果、発色検出アッセイおよびＥＬＩＳＡにより測定されるＦＶＩＩＩ分泌は、非常に高いレベルであった。ＦＶＩＩＩ：Ｃのレベルは、７．０〜７．８ＩＵ／１０6ｃｅｌｌｓ／４８ｈに相当し、他の組換え系でこれまでに報告された最も高いレベルのうちの１つであった。ＦＶＩＩＩ分泌で同程度のレベルは、同じベクターにより形質導入されたＨＵＶＥＣで達成されたが、同じ導入遺伝子カセットで形質導入された造血細胞株で、１０〜２０倍低いレベルであった（Ｔｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。また、ＨＵＶＥＣにおけるＦＶＩＩＩ分泌レベルは、レトロウイルスベクターを用いたＣｈｕａｈとその共同研究者によって報告されたものよりも１０倍を超えて高いことが判明した（Ｃｈｕａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１０１】
ＦＶＩＩＩ分泌に関するデータは、ＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡにより確認し、ＦＶＩＩＩ：Ｃ／ＦＶＩＩＩ：Ａｇの平均比率が０．５４〜０．８３の範囲内にあるように（造血細胞株およびＨＵＶＥＣについての約１に替わり）、ほんのわずかに高いＦＶＩＩＩ：Ａｇ値を得た。この比活性の減少は、細胞内の不完全なタンパク質分解によって引き起こされた。その理由は、濃縮された細胞上清のウエスタンブロットによって、予期された通りに９０および８０ｋＤａの重鎖および軽鎖へと形成される大半のＦＶＩＩＩとともに、ＦＶＩＩＩタンパク質の一部が１７０ｋＤａの前駆体として分泌されたことが示されたからである。しかし、血漿中のＦＶＩＩＩの活性化はさらなるタンパク質分解工程を包含するので、ＣＢＥＣ由来ＦＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏでの向凝血活性はおそらく通常の範囲にあるのであろう。
【０１０２】
実施例によって、内皮細胞がＦＶＩＩＩの組換え発現に特に適しており、レンチウイルスベクターが、以前用いられたウイルスまたは非ウイルス発現ベクターよりも非常に効率的な組換えＦＶＩＩＩ発現を可能にすることが示された。ＭＯＩ  １０での形質導入実験が、ベクターとのインキュベーション間／後でのある程度の細胞死、および形質導入をしていない細胞と比較して増殖における誘導期が短いという結果になったにもかかわらず、表現型の変化または形質導入されたＣＢＥＣの伸長の正味の減少もしくは増加は検出できなかった。ＦＶＩＩＩ：Ｃ特異的発色検出アッセイまたはＥＧＦＰに対するフローサイトメトリーによって測定されるように、導入遺伝子発現のレベルは、細胞が増殖を止めるまで比較的安定のままであった。したがって、実施例で選んだベクター系は、極めて効率的であるばかりでなく、予備的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析で安全でもあった。
【０１０３】
臍帯血由来内皮細胞は、血友病Ａの遺伝子治療にとって魅力的な自己細胞源である。凡そ３分の２の血友病Ａ患者では、潜在的な突然変異が遺伝し、それゆえＦＶＩＩＩ欠乏が家系に基づいて予見できる。こうしたケースでは、通常は処分されるであろう臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞を、内皮細胞の分化培養に用いることができた。未成年または成年の患者に対して、ＣＢＥＣに対する実施例で示されたプロトコルは、末梢血または骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞に適用できる。
【０１０４】
したがって、本発明は、タンパク質（例えば、血液凝固因子）を発現する内皮細胞の産生方法であって、ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト内皮前駆細胞を成長因子ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦおよびＳＣＧＦ−βに接触させること；およびｂ）該タンパク質をコードするＤＮＡで細胞に形質導入することからなる方法にも関する。内皮前駆細胞は、骨髄、末梢血、または臍帯血由来であってよい。この方法の好ましい実施態様は、上記の本発明の方法の好ましい実施態様と一致する。
【０１０５】
初期の時点でのレンチウイルスの形質導入後、効率的なＦＶＩＩＩ分泌および複製能をもつレンチウイルスが存在していないというような安全面から、培養物を成長させ、分析することができる。細胞の凍結バッチは貯蔵することができ、生存中、多数回にわたる注射に用いることができる。
【０１０６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるすべての培養物で今まで観察された老化は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適度な数の細胞群の倍増、およびそのために細胞輸液を繰り返す必要があることを示唆している。このシナリオは、摂生法の条件を伴うことなく尾静脈に注射した後、免疫欠損マウスの脾臓および骨髄に移植されることが示された、ＦＶＩＩＩをトランスフェクトされたＢＯＥＣのｉｎ  ｖｉｖｏ増殖にとって好ましいであろう（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。これまでに公表されたデータを基にすれば、血液異常または血栓症というリスクの増大を引き起こす、ＢＯＥＣでの骨髄の補充のような長期にわたる面倒な問題が、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖が制御できなければ、こうした細胞をあらゆる治療へ適用する前に、考慮しなければならないし、排除しなければならない。
【０１０７】
本発明は、血友病Ａおよび第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、またはα１抗トリプシンなどのような血漿タンパク質の欠乏によって特徴づけられる他の先天的疾患の遺伝子治療に対する内皮細胞の使用、特にＣＢＥＣの使用を提供する。
【０１０８】
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【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、内皮細胞の累積増殖曲線を示す。
【図２】図２は、ＣＢＥＣ（臍帯血由来内皮細胞）の形態および表現型の特徴を示す。
【図３】図３は、内皮細胞へのレンチウイルス形質導入を示す。
【図４】図４は、形質導入されたＣＢＥＣの表現型：Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ管腔形成を示す。
【図５】図５は、ＣＢＥＣ上清におけるＦＶＩＩＩ：Ｃの定量化を示す。
【図６】図６は、免疫ブロット法による濃縮ＣＢＥＣ上清中のＦＶＩＩＩタンパク質の検出を示す。
【図７】図７は、ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2006523446.tif 000013
【図４】
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【図５】
2006523446.tif 000015
【図６】
2006523446.tif 000016
【図７】
2006523446.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月15日(2005.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】特許請求の範囲【請求項１】工程：  ａ）ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞を、内皮前駆細胞が成熟内皮細胞へ分化するのを促進する少なくとも１つの成長因子とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させること；および  ｂ）血液凝固因子をコードするＤＮＡにより成熟内皮細胞に形質導入する、または、工程ａ）に先立って、血液凝固因子をコードするＤＮＡにより内皮前駆細胞に形質導入すること、を含むことを特徴とする該血液凝固因子を発現するヒト内皮細胞の産生方法。【請求項２】該ヒト臍帯血由来内皮前駆細胞が、ＣＤ３４、ＡＣ１３３、ＣＤ１４６、およびＦＧＦ１−Ｒから成る群より選択される細胞表面マーカーを少なくとも１つ発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。【請求項３】工程ａ）およびｂ）に先立って、臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞、ＡＣ１３３陽性細胞、ＣＤ１４６陽性細胞、および／またはＦＧＦ１−Ｒ陽性細胞を富化することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。【請求項４】レトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターが該細胞に形質導入するために用いられることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。【請求項５】該血液凝固因子がヒト第ＶＩＩＩ因子であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。【請求項６】請求項１から５のいずれかに記載の方法によって得ることができるヒト内皮細胞群。【請求項７】少なくとも細胞の１０％が、血液凝固因子をコードする組換えＤＮＡを含むことを特徴とする、臍帯血由来のヒト内皮細胞群。【請求項８】該血液凝固因子がヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子であることを特徴とする、請求項６または７に記載のヒト内皮細胞群。【請求項９】血液凝固因子をコードする組換えＤＮＡが、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の突然変異タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項６から８のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。【請求項１０】ヒト第ＶＩＩＩ因子の該突然変異タンパク質が、野生型第ＶＩＩＩ因子の少なくともＢ領域を部分的に欠損していることを特徴とする、請求項９に記載のヒト内皮細胞群。【請求項１１】血液凝固因子をコードする組換えＤＮＡが、修飾第ＶＩＩＩ因子の相補的ＤＮＡであり、  （ｉ）野生型第ＶＩＩＩ因子の相補的ＤＮＡの少なくともＢ領域部分を欠損し、  （ｉｉ）少なくとも１つのイントロンが第ＶＩＩＩ因子の相補的ＤＮＡの少なくとも１つの位置に挿入され、および／または  （ｉｉｉ）ヒト第ＶＩＩＩ因子の野生型相補的ＤＮＡ配列のうち、少なくとも１つのヌクレオチドが置換されている、ことを特徴とする、請求項６から１０のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。【請求項１２】該細胞の少なくとも７５％が、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ１４６、およびＬＤＬ受容体から成る群より選択されるマーカーの少なくとも１つを発現することを特徴とする、請求項６から１１のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。【請求項１３】該細胞の少なくとも７５％がフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）を内因的に発現することを特徴とする、請求項６から１２のいずれかに記載のヒト内皮細胞群。【請求項１４】請求項６から１３のいずれかに記載のヒト内皮細胞群から生成した不死化細胞株。【請求項１５】工程：  ａ）適当���条件下、請求項６から１３のいずれかに記載のヒト内皮細胞群、または請求項１４に記載の細胞株を培養し；および  ｂ）該細胞培養培地から、血液凝固因子を単離することを含む、該血液凝固因子を産生する方法。【請求項１６】該血液凝固因子が血液凝固第ＶＩＩＩ因子であり、かつ該単離工程がフォン・ビルブラント因子の存在下での血液凝固第ＶＩＩＩ因子の精製を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。【請求項１７】該血液凝固因子をウイルス不活化処理することを特徴とする、請求項１５または請求項１６に記載の方法。【請求項１８】血友病Ａまたは血友病Ｂの治療用医薬の製造のための、請求項６から１３のいずれかに記載のヒト内皮細胞群の使用。【請求項１９】ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子を分泌する細胞を、血友病Ａを患う個体に投与することを特徴とする、請求項１８に記載の使用。【請求項２０】循環器系疾患の治療用医薬の製造のための、請求項６から１３のいずれかに記載のヒト内皮細胞群の使用。【請求項２１】該疾患が心不全、および急性もしくは慢性心疾患から選ばれることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。【請求項２２】請求項６から１３のいずれかに記載のヒト内皮細胞群である医薬組成物。


【国際調査報告】
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