(57)【要約】本発明は、ブタウロプラキンII遺伝子のプロモーター、これを含む発現ベクター及びそのベクターを利用した有用タンパク質の生産方法に関する。本発明のプロモーターは高効率で目的タンパク質の膀胱特異的発現を促進する。本発明のプロモーターを利用して目的タンパク質を発現するように形質転換された動物は、尿中に目的タンパク質を高濃度で分泌し、このようにして生産されたタンパク質は既存の同種タンパク質より優れた生理活性を示す。従って、本発明のプロモーター、これを利用した発現ベクター及び形質転換動物は医薬学的に価値のある有用タンパク質の生産分野に有利に使用することができる。
2006505267.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の塩基配列を有するブタウロプラキンII遺伝子のプロモーター：
［配列番号：１］
gggctaggagtggaatcagagctggcctatgccacagcaacgcagaatccaaaccacatctccgacctacaccagaccgtcaccataacacaggatccttaacccactgagcaaggtcagggatcaaacccaaatcctcatggatactagtcgggttcttaacccgctgagccacagtgggcactcctgtttttgtttgtgtcttcgttttttggctgcatctgcagcatacagaagttcctgggttaaggattgaacccatgccacagcagcaacccgagccacagcagtgacaacagcctgatccttaactgctagaccaccagggaacgccccctcaacttttcatgccttggaaaccctgagtcagtacaacctgacaatngnttttttttttttttttttttgccttttctagggccacttcccgcggcatgtggagattcgcaggctanaggtctaatcggagctgtagccaccggcctacaccagagccatagcaacgagggatccgagccgagtctgcaacctacactacagctcatggcaacaccggatcgttaacccactgagcaaggccaggggatcgaacccgcaacctcatggttcctagtcagattcgttaaccactgcaccatgacaggaactcccaacctgacaattttatcatttctgcaccctagttgttgagtaatttgaaaaattcccaagatgtcaaggtcagtgtgatggttaattttatgtgtcaacctgactaggccatgttgcccggatgtggagtcattgttattctggatgttactgtgaagatatgttttggatgaaattaacatttaaatcagtggggggaaaaaaagaagttctcgttctggtgcatcagaaacaaatccgactaggaaacaagcggttgcaggttcgatccctggcctcacttagtggagtcaggatctggcgttgccgtgagctgtggtacaggtggcagatgcagctcggatctagcattgctgtggctgtggtgtaggccagcagctgtagctctgattaaaccccaagtctgggaacctccatatgccgtgggtgtggcccgaaaaagcaaaaaataaataaataaataaatttaaaccaggggattttgagcaaagcagattaccccataatatgggtgggtctcatcaagttcattgtaggccctagtggaacaaagaccgacctccaccttctccccatgagaaggaaagaattctgccaaaagaccgccttnggacntaaactgcaactctttcctgagtttccagcatgttggcctcccccatcagactttggacttgccaagcctccgcaattgcatgagccaattccttaaaataaatccgtctatatatacacatcctgttggttctgtttctccagagaaccctgactaacgcagtctgcacccctgaagaccagtggtccccacactcagctgggtgtcacctccaaacactcagccttcctcaaggctctttctagctgtgtcctcctctccccacaacagctgtttcaaactctcacccctcttcagggcgcaatcccttctcctccctgagtttcctacttcccagagaaagcagagaccttcaggagtgtgctgccttaacttacttccttcatccctcagccttgcaaaagtataagctttctctgcaccactgccccattcttctctctgcagacagggtcattcctaaagccaaacgctaatgcctccacctctgatctgagtcccatcttttccctcctccagaagcttcctcataaattctacccccttttcttccttatctttatctttgaaaacaaaatggaagacagccttcccgttgtggtgcagcggaaacagtggtgccttggaagcgctgggacgcaggttcgacccctggcccagcatagtaggttaaggatccagtgttgccacagttttggcttagattgaaactgcagctcagatctggtccctggcctgggaacttcatacgccacaggacggcccaaaaagaaaagaaagaaaaaataaaaaacaaaacagaaaagcctttcctgtacccccaattccctccagttatctctctctttcccttcccagccaagctctgcaaagagcggtctgcacagttctaactctacctcctcccagttggccctggactttctcagtctggcttctacccccctcacccgtaggaatctgctctgaaggacacgcacccctcacgatccttggcccagggacattttttgtaccagcctttcaatcctgaccttcatatcatccgacacctcctttgtgaaaccctccatccactttctcctggttcccctcctaagacccattccgccttcttcagccccctccctccatctgtcctttagatgccgcatttcctagtatcctgtcctgcgcggnctcgtccttcccttccacaactctcttcaaggactcttttctccatgtgcgattttgcccatggcccaccttccctctctttacccagactttcccccggtgctccagactcatagactcaattatgaaaacatagttttcatctgatttgcccaagatatttgcattagttattactgtataacagcttatcccccaatttagtggcttataaaataaacacttattctgagaatcagaaacctaggcaggacatagttggggtctcatgaagttgcactgaaaatgtccccctgggctaatcatacggaggactgaccagggctggaggatctgttccaagctcattcattcacatggccgtaggttggagacagctcttctctggatcttggcaggagcctcaattccttgtcacgtggacctccccttggagggggtcccatgtcctccatggtgagtaatccatgagagcaaggtggaaggtgccatgccatttaggacctagcctcaggagggacctacgtcacttctgttgtagtctgttggccacacagactaaccctgacacaatgcacccatccatgacctgctgccagtccattctccacactgtttccagaatgatatttacataagtaaaactcctcaaaggcttttgagattttttttcccattatagttgatttataacctcagaggcttttgttttcttcagcataaaaaccaagttccttaacatagcatgtaacccactggccaccctgccagtggctagaactctcaccatgtccatccttgaatactgctttctagccaagagctattgtttgcagttcccagaatgtgtcgggataactcacatctctgagccttttcatgtgctgttccctcactttggaatatccccttccatttaggaaggctaatgtccattcattntccaaaactcagaagcaaattttttttttttttttttttttttttttttgctttttagggccgaactctcagcatatggaggttcccaggttagccatcaaattggaattgtagctgctggcctacaccacagccatagcaacaccagacccaagtcacatctgcaacctacatcacagatcatggcaatactggatccttaacccactgagtgagcccagggatcaaacacaaattctcatggatactcgccaggttcattaccactgagccacaacaggaactcctctcctttttatggtcacacctgcagcatatggaagttcctgggccagggattgaatctgagtggcagctgtgacaatgccgtatcctttaattcactgtgctgggctgaggggntaaantgcccctcctaaaaaacctgagctgctgcagttggattcttaatccactgcaccacaagggggaaggtcaagaactgtcttgccatctctgtatcttatcacctagcatagtacccaccatagagaagttgctcaacaaatgtttactgaatgaataaatgcatgagctggagttcccattgcggctcagcagtaacaaacctgactagcattcataagaacttgggttcgatccctagcctcagtgggttaaggatgcagcattgctgtgagctgtggtgtaggtcgcagacgacactcagatcccacattgctgtcactgtggcgcaggccggcctctgtagctctgattcgactcctagcctgggaacgtccatatgccacaggtgaggccctaaaaagaaataaataagcaagcaagtaagcaagcaggcagtttcttggtgccttgtacccctgtggcctgtgtggtatacaagtaacagctgatccatgtctcagtcatgtttccccctcagactacctttcctgccccatctctccctttgacataattggaaaaacaaattcagaattttgtcccactacctttcttgctagctctgtggccttgggaaagctatttattgcctctgagcctctaattttcatctgcaccaaggattaataaaaaggagaggataagatgaattacttatattaatatttattgaaccagatactgtgctaggcactcttaaataaattagcttgagtgatagtcatagtatcctggtgagacagattttttttttccttttatggttgcacgtgcaacatatggaagttcctgggctggggtcgaattggagctgcaggtgcttgcctatgccacagccatggcaacatcatatacaaaccgcacctgtgacctacaccacagattgcagcaacgctggatccttcacccaaggagcaaggccaggaatcaaatgtgcatcctcacaaacactatgtccggtttttaacccgctgagccacaccaggaactccatggcgagacagattttatactctgtctacagaagaggaaagtgaagctcagaatggttaggtaggtaacttggccaagatcaaaaaattcaaagaagatttggggcaagtggtgatatcatggcagcattagaaaaaataaagaagcatccacttgttttccaacactgaac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【請求項２】
配列番号：１の塩基配列に1つまたはそれ以上の破壊、欠失、挿入、点、置換、ナンセンス、ミスセンス、多形性または再配列突然変異を有する機能的等価物から選択される、請求項１に記載のウロプラキンIIプロモーター。
【請求項３】
請求項１または２のプロモーター塩基配列及びそのプロモーターの3’末端に目的タンパク質をコードする塩基配列を含む発現ベクター。
【請求項４】
目的タンパク質がヒトエリスロポエチン(EPO)である、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
寄託番号KCTC10352BPとして寄託された発現ベクターpUP2/hEPOである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
選択マーカーとして配列番号：５のネオマイシン耐性遺伝子を含み、UPIIプロモーターの5’末端に配列番号：６のインシュレーターを含むI/pUP2/hEPOベクターである、請求項４に記載の発現ベクター：
［配列番号：５］
gcggccgcgcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtccgatcg
［配列番号：６］
tcgactctagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctaggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaaagctttaggctgaaagagagatttagaatgacagaatcatagaacggcctgggttgcaaaggagcacagtgctcatccagatccaaccccctgctatgtgcagggtcatcaaccagcagcccaggctgcccagagccacatccagcctggccttgaatgcctgcagggatggggcatccacagcctccttgggcaacctgttcagtgcgtcaccaccctctgggggaaaaactgcctcctcatatccaacccaaacctcccctgtctcagtgtaaagccattcccccttgtcctatcaagggggagtttgctgtgacattgttggtctggggtgacacatgtttgccaattcagtgcatcacggagaggcagatcttggggataaggaagtgcaggacagcatggacgtgggacatgcaggtgttgagggctctgggacactctccaagtcacagcgttcagaacagccttaaggataagaagataggatagaaggacaaagagcaagttaaaacccagcatggagaggagcacaaaaaggccacagacactgctggtccctgtgtctgagcctgcatgtttgatggtgtctggatgcaagcagaaggggtggaagagcttgcctggagagatacagctgggtcagtaggactgggacaggcagctggagaattgccatgtagatgttcatacaatcgtcaaatcatgaaggctggaaagcctccaagatccccaagaccaaccccaacccacccaccgtgcccactggccatgtccctcagtgccacatccccacagttcttcatcacctccagggacggtgacccccccacctccgtgggcagctgtgccactgcagcaccgctctttggagaaggtaaatcttgctaaatccagcccgaccctcccctggcacaacgtaaggccattatctctcatccaactccaggacggagtcagtgaggatggggctctagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctaggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaaagctttaggctgaaagagagatttagaatgacagaatcatagaacggcctgggttgcaaaggagcacagtgctcatccagatccaaccccctgctatgtgcagggtcatcaaccagcagcccaggctgcccagagccacatccagcctggccttgaatgcctgcagggatggggcatccacagcctccttgggcaacctgttcagtgcgtcaccaccctctgggggaaaaactgcctcctcatatccaacccaaacctcccctgtctcagtgtaaagccattcccccttgtcctatcaagggggagtttgctgtgacattgttggtctggggtgacacatgtttgccaattcagtgcatcacggagaggcagatcttggggataaggaagtgcaggacagcatggacgtgggacatgcaggtgttgagggctctgggacactctccaagtcacagcgttcagaacagccttaaggataagaagataggatagaaggacaaagagcaagttaaaacccagcatggagaggagcacaaaaaggccacagacactgctggtccctgtgtctgagcctgcatgtttgatggtgtctggatgcaagcagaaggggtccatgtccctcagtgccacatccccacagttcttcatcacctccagggacggtgacccccccacctccgtgggcagctgtgccactgcagcaccgctctttggagaaggtaaatcttgctaaatccagcccgaccctcccctggcacaacgtaaggccattatctctcatccaactccaggaacggagtcagtgag。
【請求項７】
選択マーカーとして配列番号：５のネオマイシン耐性遺伝子を含み、EPO遺伝子の3’末端に配列番号：７のマーモット肝炎ウイルス転写後調節要素(WPRE)を含むpUP2/hEPO(WPRE)ベクターである、請求項４に記載の発現ベクター：
［配列番号：７］
accaggttctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgtttcgcctcgggctcctcgag。
【請求項８】
選択マーカーとして配列番号：５のネオマイシン耐性遺伝子を含み、UPIIプロモーターの5’末端に配列番号：６のインシュレーターを含み、EPO遺伝子の3’末端に配列番号：７のWPREを含むI/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターである、請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項４ないし８のいずれかに記載の発現ベクターを導入した動物受精卵。
【請求項１０】
請求項９の受精卵を移植して得られる形質転換動物。
【請求項１１】
ブタ、マウス、ウシ、家禽、ヒツジまたはヤギから選択される、請求項１０に記載の形質転換動物。
【請求項１２】
請求項４ないし８のいずれかに記載の発現ベクターを導入した動物受精卵を代理母動物に移植し、代理母動物から形質転換動物を得、形質転換動物の尿から有用タンパク質を単離・精製する工程を含む、有用タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブタウロプラキンII(uroplakin II)遺伝子のプロモーター及びこれを利用した有用タンパク質の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬分野において、EPOなどの経済的付加価値の高いタンパク質の生産を最大化する方法として、細胞培養法による大量生産方式が主に用いられてきた。しかし、この方法は動物の血液を培養培地として利用するため生産費用が増し、培養技術に関する専門的な知識も求められる。また、培地に含まれる動物のEPOから新たに生産したEPOを完全に単離するのが不可能なので、最終的に得られるEPOの純度や活性が低いという問題点がある。
【０００３】
一方、形質転換動物を利用した有用タンパク質生産方法では、動物が分泌する体液中に目的タンパク質が含まれるため既存の細胞培養法に比べて目的タンパク質の単離・精製が容易であり、活性もまた良好に維持される。このためこの方法に対する関心が急激に高まっている。
【０００４】
これまで発展してきた形質転換動物生産技術では、目的タンパク質を生産する器官として、高タンパク質発現率を示すことが知られる乳腺を主に用いていた。しかし、動物実験の結果、EPOのような幾つかの重要な目的タンパク質を乳汁での発現で生産することは、乳腺組織だけでなく他組織でも発現するので、究極的には不可能であることが分かった。また乳汁にはアルブミンなど様々な種類のタンパク質がもともと多量に含まれているため、生じた目的タンパク質を精製するのは困難である。
【０００５】
このような問題点を克服するために、膀胱を利用した有用タンパク質生産方法が最近試されている。
【０００６】
膀胱は動物の年齢や性に関係なく生涯に渡って尿を生産し、且つ尿中に含まれるタンパク質及び脂肪成分は5〜25mg/lという極少量だけである。従って、膀胱を利用すると目的タンパク質の単離及び精製が遥かに容易になる。
【０００７】
しかし、今まで開発された膀胱特異的プロモーターを利用して形質転換された動物の該タンパク質生産効率は未だ非常に低い水準にとどまっている。
【０００８】
従って、目的タンパク質の発現を高い効率で促進する膀胱特異的プロモーターを緊急に開発する必要がある。
【発明の開示】
【０００９】
そこで、目的タンパク質の膀胱特異的発現を促進するブタウロプラキンII遺伝子のプロモーターを単離すること、またこのプロモーターを利用して有用タンパク質を大量生産できる方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
一態様において、本発明はブタウロプラキンII遺伝子のプロモーターを提供する。
【００１１】
本発明のブタウロプラキンIIプロモーターは好ましくは配列番号：１の塩基配列を有する。
【００１２】
［配列番号：１］：
gggctaggagtggaatcagagctggcctatgccacagcaacgcagaatccaaaccacatctccgacctacaccagaccgtcaccataacacaggatccttaacccactgagcaaggtcagggatcaaacccaaatcctcatggatactagtcgggttcttaacccgctgagccacagtgggcactcctgtttttgtttgtgtcttcgttttttggctgcatctgcagcatacagaagttcctgggttaaggattgaacccatgccacagcagcaacccgagccacagcagtgacaacagcctgatccttaactgctagaccaccagggaacgccccctcaacttttcatgccttggaaaccctgagtcagtacaacctgacaatngnttttttttttttttttttttgccttttctagggccacttcccgcggcatgtggagattcgcaggctanaggtctaatcggagctgtagccaccggcctacaccagagccatagcaacgagggatccgagccgagtctgcaacctacactacagctcatggcaacaccggatcgttaacccactgagcaaggccaggggatcgaacccgcaacctcatggttcctagtcagattcgttaaccactgcaccatgacaggaactcccaacctgacaattttatcatttctgcaccctagttgttgagtaatttgaaaaattcccaagatgtcaaggtcagtgtgatggttaattttatgtgtcaacctgactaggccatgttgcccggatgtggagtcattgttattctggatgttactgtgaagatatgttttggatgaaattaacatttaaatcagtggggggaaaaaaagaagttctcgttctggtgcatcagaaacaaatccgactaggaaacaagcggttgcaggttcgatccctggcctcacttagtggagtcaggatctggcgttgccgtgagctgtggtacaggtggcagatgcagctcggatctagcattgctgtggctgtggtgtaggccagcagctgtagctctgattaaaccccaagtctgggaacctccatatgccgtgggtgtggcccgaaaaagcaaaaaataaataaataaataaatttaaaccaggggattttgagcaaagcagattaccccataatatgggtgggtctcatcaagttcattgtaggccctagtggaacaaagaccgacctccaccttctccccatgagaaggaaagaattctgccaaaagaccgccttnggacntaaactgcaactctttcctgagtttccagcatgttggcctcccccatcagactttggacttgccaagcctccgcaattgcatgagccaattccttaaaataaatccgtctatatatacacatcctgttggttctgtttctccagagaaccctgactaacgcagtctgcacccctgaagaccagtggtccccacactcagctgggtgtcacctccaaacactcagccttcctcaaggctctttctagctgtgtcctcctctccccacaacagctgtttcaaactctcacccctcttcagggcgcaatcccttctcctccctgagtttcctacttcccagagaaagcagagaccttcaggagtgtgctgccttaacttacttccttcatccctcagccttgcaaaagtataagctttctctgcaccactgccccattcttctctctgcagacagggtcattcctaaagccaaacgctaatgcctccacctctgatctgagtcccatcttttccctcctccagaagcttcctcataaattctacccccttttcttccttatctttatctttgaaaacaaaatggaagacagccttcccgttgtggtgcagcggaaacagtggtgccttggaagcgctgggacgcaggttcgacccctggcccagcatagtaggttaaggatccagtgttgccacagttttggcttagattgaaactgcagctcagatctggtccctggcctgggaacttcatacgccacaggacggcccaaaaagaaaagaaagaaaaaataaaaaacaaaacagaaaagcctttcctgtacccccaattccctccagttatctctctctttcccttcccagccaagctctgcaaagagcggtctgcacagttctaactctacctcctcccagttggccctggactttctcagtctggcttctacccccctcacccgtaggaatctgctctgaaggacacgcacccctcacgatccttggcccagggacattttttgtaccagcctttcaatcctgaccttcatatcatccgacacctcctttgtgaaaccctccatccactttctcctggttcccctcctaagacccattccgccttcttcagccccctccctccatctgtcctttagatgccgcatttcctagtatcctgtcctgcgcggnctcgtccttcccttccacaactctcttcaaggactcttttctccatgtgcgattttgcccatggcccaccttccctctctttacccagactttcccccggtgctccagactcatagactcaattatgaaaacatagttttcatctgatttgcccaagatatttgcattagttattactgtataacagcttatcccccaatttagtggcttataaaataaacacttattctgagaatcagaaacctaggcaggacatagttggggtctcatgaagttgcactgaaaatgtccccctgggctaatcatacggaggactgaccagggctggaggatctgttccaagctcattcattcacatggccgtaggttggagacagctcttctctggatcttggcaggagcctcaattccttgtcacgtggacctccccttggagggggtcccatgtcctccatggtgagtaatccatgagagcaaggtggaaggtgccatgccatttaggacctagcctcaggagggacctacgtcacttctgttgtagtctgttggccacacagactaaccctgacacaatgcacccatccatgacctgctgccagtccattctccacactgtttccagaatgatatttacataagtaaaactcctcaaaggcttttgagattttttttcccattatagttgatttataacctcagaggcttttgttttcttcagcataaaaaccaagttccttaacatagcatgtaacccactggccaccctgccagtggctagaactctcaccatgtccatccttgaatactgctttctagccaagagctattgtttgcagttcccagaatgtgtcgggataactcacatctctgagccttttcatgtgctgttccctcactttggaatatccccttccatttaggaaggctaatgtccattcattntccaaaactcagaagcaaattttttttttttttttttttttttttttttgctttttagggccgaactctcagcatatggaggttcccaggttagccatcaaattggaattgtagctgctggcctacaccacagccatagcaacaccagacccaagtcacatctgcaacctacatcacagatcatggcaatactggatccttaacccactgagtgagcccagggatcaaacacaaattctcatggatactcgccaggttcattaccactgagccacaacaggaactcctctcctttttatggtcacacctgcagcatatggaagttcctgggccagggattgaatctgagtggcagctgtgacaatgccgtatcctttaattcactgtgctgggctgaggggntaaantgcccctcctaaaaaacctgagctgctgcagttggattcttaatccactgcaccacaagggggaaggtcaagaactgtcttgccatctctgtatcttatcacctagcatagtacccaccatagagaagttgctcaacaaatgtttactgaatgaataaatgcatgagctggagttcccattgcggctcagcagtaacaaacctgactagcattcataagaacttgggttcgatccctagcctcagtgggttaaggatgcagcattgctgtgagctgtggtgtaggtcgcagacgacactcagatcccacattgctgtcactgtggcgcaggccggcctctgtagctctgattcgactcctagcctgggaacgtccatatgccacaggtgaggccctaaaaagaaataaataagcaagcaagtaagcaagcaggcagtttcttggtgccttgtacccctgtggcctgtgtggtatacaagtaacagctgatccatgtctcagtcatgtttccccctcagactacctttcctgccccatctctccctttgacataattggaaaaacaaattcagaattttgtcccactacctttcttgctagctctgtggccttgggaaagctatttattgcctctgagcctctaattttcatctgcaccaaggattaataaaaaggagaggataagatgaattacttatattaatatttattgaaccagatactgtgctaggcactcttaaataaattagcttgagtgatagtcatagtatcctggtgagacagattttttttttccttttatggttgcacgtgcaacatatggaagttcctgggctggggtcgaattggagctgcaggtgcttgcctatgccacagccatggcaacatcatatacaaaccgcacctgtgacctacaccacagattgcagcaacgctggatccttcacccaaggagcaaggccaggaatcaaatgtgcatcctcacaaacactatgtccggtttttaacccgctgagccacaccaggaactccatggcgagacagattttatactctgtctacagaagaggaaagtgaagctcagaatggttaggtaggtaacttggccaagatcaaaaaattcaaagaagatttggggcaagtggtgatatcatggcagcattagaaaaaataaagaagcatccacttgttttccaacactgaac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【００１３】
また本発明のブタウロプラキンIIプロモーターは、配列番号：１の塩基配列に1つまたはそれ以上の破壊、欠失、挿入、点、置換、ナンセンス、ミスセンス、多形性または再配列突然変異を有する機能的等価物から選択され得る。
【００１４】
別の態様において、本発明は前記プロモーターの全体または一部を含む発現ベクターを提供する。
【００１５】
本発明の発現ベクターは、好ましくは前記プロモーターに加え、そのプロモーターの3’末端に目的タンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は前記発現ベクターを受精卵に導入して形質転換した動物を提供する。
【００１７】
さらなる別の態様において、本発明は有用タンパク質を大量生産する方法であって、形質転換動物から尿を採取し、尿中に発現された目的タンパク質を単離・精製する方法を提供する。
【００１８】
本発明のプロモーターは、ブタウロプラキンII遺伝子の5’末端に位置し、ブタウロプラキンII遺伝子の発現を調節する。
【００１９】
本発明のプロモーターは、以下の方法でブタゲノムライブラリーからスクリーニングして単離することができる。
【００２０】
まずスクリーニングのプローブとして使用されるブタウロプラキンII遺伝子の塩基配列の一部を得るために、塩基配列が既知の他の複数の動物のウロプラキンII塩基配列を互いに比較し、種間でよく保存された部分を基にプライマーセットを作成する(正方向プライマー：配列番号：２、逆方向プライマー：配列番号：３)。その後、ブタの膀胱の全RNAをテンプレートとしてRT-PCRを行う。
【００２１】
RT-PCRによってウロプラキンII断片の一部を得た後、得た部分をプローブにしてブタゲノムライブラリーをスクリーニングする。本発明において使用したプローブは図２に示された通り、ウロプラキンII遺伝子のエキソン２から５の部分を含むプローブA、およびエキソン１から２の部分を含むプローブBの2種類である。
【００２２】
図２に示されるように、ライブラリースクリーニングによりウロプラキンII遺伝子またはプロモーターを含むクローンが得られる。クローン間の塩基配列を比較してプロモーターの塩基配列を最終的に決定し、ブタウロプラキンIIプロモーターの完全な塩基配列を得る。
【００２３】
このようにして得られたプロモーターはトータルサイズが8847bpであり、その塩基配列においてハウスキーピング遺伝子の特徴である高いG/C含量率を示し、AP2及びGATAボックスなどの多様なSp1エレメントを含む。
【００２４】
本発明のプロモーターは、様々なブタ組織のうち膀胱組織でのみ特異的に目的タンパク質を発現させる。ブタウロプラキンII遺伝子の場合、全膀胱細胞の8〜14％で発現され、特に尿路上皮基底層直上細胞(urotherial suprabasal cell)で活発に増幅し、細胞分裂中のアンブレラ細胞(umbrella cell)において高い発現率を示す。
【００２５】
このように本発明のプロモーターは高効率でタンパク質の膀胱特異的発現を誘導するため、本発明のプロモーターを利用すれば外部由来の目的タンパク質を膀胱特異的に発現する発現ベクターを製造することができる。
【００２６】
本発明の発現ベクターを作成する際は、基本骨格となるタンパク質発現用の既存のベクターに本発明のプロモーターを挿入し、そのプロモーターの3’末端に目的タンパク質をコードする塩基配列を挿入することによって、本発明のベクターを作成する。
【００２７】
本発明の発現ベクターの作成において基本骨格として使用できるベクターは、一般的な発現ベクターから選択される適切なベクターでよく、その例として多様なクローニング部位を持つpBluescript SK系列のベクターや、pLNCXなどのレトロウイルスベクターなどがある。
【００２８】
本発明の発現ベクターは、医薬品の活性成分として使用される全てのタンパク質、例としてエリスロポエチン(EPO)、アルドステロン、副腎皮質刺激ホルモン、血液凝固因子、性腺刺激ホルモン、インスリン、プロラクチンまたは抗利尿ホルモンなどを発現させることができる。
【００２９】
本発明の発現ベクターは必要に応じて、別のプロモーター、エンハンサー、選択マーカー、非翻訳領域(5’−UTR、3’−UTR)、ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合配列、ゲノムの特定部位に挿入可能な塩基配列およびイントロンなどの調節因子を適切な位置に付加的に含むことができる。
【００３０】
本発明はブタウロプラキンIIプロモーターの調節下にヒトEPOを発現することのできる発現ベクターpUP2/hEPOを提供する(図３)。発現ベクターpUP2/hEPOは、ウロプラキンIIプロモーターを含む発現ベクターの好ましい例である。
【００３１】
本発明の発現ベクターpUP2/hEPOはpBluescript SK(-)ベクターを基本骨格として使用し、本発明のウロプラキンIIプロモーターの3’末端にヒトEPOをコードする遺伝子(Lin F.K.et.al,Proc.Natl.Acad.Sci,USA,Cloning and expression of the human erythropoietin gene,82:7580-7584,1985,配列番号：４)が融合されている。本発明の発現ベクターpUP2/hEPOは2002年10月17日韓国生命工学研究院遺伝子銀行(KCTC)に寄託番号KCTC 10352BPとして寄託した。
【００３２】
本発明の発現ベクターpUP2/hEPOは必要に応じて、ネオマイシン耐性遺伝子、インシュレーターまたはマーモット肝炎ウイルス転写後調節要素(a woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)(WPRE)を付加的に含むことにより、形質転換細胞株の確立を容易にし、目的タンパク質発現量の最大化及び発現の安定性を確保することができる。
【００３３】
ネオマイシン耐性遺伝子は細胞株の確立の際に用いるG418試薬に対して抵抗性を示す遺伝子で、UPIIプロモーターの調節下にタンパク質を発現する動物細胞株の確立において効果的な選択マーカーとして働くことが可能である。ネオマイシン耐性遺伝子は配列番号：５の塩基配列を有する。
【００３４】
［配列番号：５］
gcggccgcgcgcgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtcctgaggcggaaagaaccagctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaagatcgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaagacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccctagggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagcctcaggttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtccgatcg
【００３５】
インシュレーターはプロモーターに隣接する調節因子の作用を促進し、位置非依存的な発現を助ける因子で、UPIIプロモーターの調節下で目的タンパク質が安定的に発現できるようにする。インシュレーターは配列番号：６の塩基配列を有する。
【００３６】
［配列番号：６］：
tcgactctagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctaggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaaagctttaggctgaaagagagatttagaatgacagaatcatagaacggcctgggttgcaaaggagcacagtgctcatccagatccaaccccctgctatgtgcagggtcatcaaccagcagcccaggctgcccagagccacatccagcctggccttgaatgcctgcagggatggggcatccacagcctccttgggcaacctgttcagtgcgtcaccaccctctgggggaaaaactgcctcctcatatccaacccaaacctcccctgtctcagtgtaaagccattcccccttgtcctatcaagggggagtttgctgtgacattgttggtctggggtgacacatgtttgccaattcagtgcatcacggagaggcagatcttggggataaggaagtgcaggacagcatggacgtgggacatgcaggtgttgagggctctgggacactctccaagtcacagcgttcagaacagccttaaggataagaagataggatagaaggacaaagagcaagttaaaacccagcatggagaggagcacaaaaaggccacagacactgctggtccctgtgtctgagcctgcatgtttgatggtgtctggatgcaagcagaaggggtggaagagcttgcctggagagatacagctgggtcagtaggactgggacaggcagctggagaattgccatgtagatgttcatacaatcgtcaaatcatgaaggctggaaagcctccaagatccccaagaccaaccccaacccacccaccgtgcccactggccatgtccctcagtgccacatccccacagttcttcatcacctccagggacggtgacccccccacctccgtgggcagctgtgccactgcagcaccgctctttggagaaggtaaatcttgctaaatccagcccgaccctcccctggcacaacgtaaggccattatctctcatccaactccaggacggagtcagtgaggatggggctctagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctaggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaaagctttaggctgaaagagagatttagaatgacagaatcatagaacggcctgggttgcaaaggagcacagtgctcatccagatccaaccccctgctatgtgcagggtcatcaaccagcagcccaggctgcccagagccacatccagcctggccttgaatgcctgcagggatggggcatccacagcctccttgggcaacctgttcagtgcgtcaccaccctctgggggaaaaactgcctcctcatatccaacccaaacctcccctgtctcagtgtaaagccattcccccttgtcctatcaagggggagtttgctgtgacattgttggtctggggtgacacatgtttgccaattcagtgcatcacggagaggcagatcttggggataaggaagtgcaggacagcatggacgtgggacatgcaggtgttgagggctctgggacactctccaagtcacagcgttcagaacagccttaaggataagaagataggatagaaggacaaagagcaagttaaaacccagcatggagaggagcacaaaaaggccacagacactgctggtccctgtgtctgagcctgcatgtttgatggtgtctggatgcaagcagaaggggtccatgtccctcagtgccacatccccacagttcttcatcacctccagggacggtgacccccccacctccgtgggcagctgtgccactgcagcaccgctctttggagaaggtaaatcttgctaaatccagcccgaccctcccctggcacaacgtaaggccattatctctcatccaactccaggaacggagtcagtgag
【００３７】
WPREはmRNAの安定化に寄与し目的タンパク質の合成量を増大させることのできる調節因子で、UPIIプロモーターの調節下に目的タンパク質を大量に発現できるようにする。WPREは配列番号：７の塩基配列を有する。
【００３８】
［配列番号：７］
accaggttctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctgtttcgcctcgggctcctcgag
【００３９】
本発明は前記調節因子を付加的に含む発現ベクターの好ましい例として、I/pUP2/hEPOベクター、pUP2/hEPO(WPRE)ベクター、I/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターを提供する。
【００４０】
前記ベクターは本発明のpUP2/hEPOベクターにネオマイシン耐性遺伝子を挿入した後、EPO遺伝子の3’末端にWPREを挿入するか、またはUPIIプロモーターの5’末端にインシュレーターを挿入することによって作成する。
【００４１】
本発明の発現ベクターで形質転換可能な動物は、ブタ、マウス、ウシ、家禽、ヒツジまたはヤギなど、排尿する全ての動物である。
【００４２】
本発明の発現ベクターを利用した形質転換動物の生産方法は従来法に従って行う。即ち、形質転換しようとする動物のうち健康な個体から受精卵を採取し、受精卵に本発明の発現ベクターを導入する。精管結紮マウスを利用して偽妊娠マウスを得、これを代理母として卵管内に受精卵を移植した後、代理母から得た子孫の中から形質転換された個体を選別する。
【００４３】
その後形質転換されていることが確認された選別個体から尿を採取した後、目的タンパク質を単離・精製することによって有用タンパク質を生産する。
【００４４】
本発明の有用タンパク質生産方法の中の、尿の単離・精製工程は濾過またはクロマトグラフィーなどの従来技術で行うことができる。
【００４５】
このようにして産生される本発明の形質転換動物は、膀胱特異的に目的タンパク質を発現し、既存の方法に比べて非常に高い濃度で尿中に目的タンパク質を発現する。
【００４６】
その例として、本発明の発現ベクターpUP2/hEPOで形質転換されたマウスの場合、0.5〜1mg/mlという高いEPO発現量を示す。本来EPOは胎児の早期死亡を誘発するため発現が難しいタンパク質であるにもかかわらず、既存のウロプラキンプロモーターを用いて得られた尿中のタンパク質発現量に比べ、本発明の動物は少なくとも1,000倍以上高い発現量を示す。
【００４７】
また本発明の形質転換動物から生産されたタンパク質は市販の同種タンパク質よりも優れた生理活性を示す。
【００４８】
その例として、本発明の発現ベクターpUP2/hEPOで形質転換したマウスから得られたEPOは、EPO依存性肝細胞株の生存率を市販のEPOより高い水準に維持する。
【００４９】
従って本発明のプロモーター、これを利用した発現ベクター及び形質転換動物はこれまで大量生産が難しかった有用タンパク質の生産現場でより有利に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
以下本発明を下記実施例においてより詳しく説明するが、実施例によって本発明の範囲が限定されないことに留意されたい。
【実施例１】
【００５１】
本発明のブタウロプラキンIIプロモーターの単離
本発明のブタウロプラキンIIプロモーターを単離するために、次の通り実験を行った。
【００５２】
1）RT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によるプローブの調製
ブタウロプラキンII遺伝子の塩基配列が未知であるため、塩基配列が周知のマウスとウシのウロプラキンII cDNAを互いに比較し、2種間で高度に保存された部分に基づいて、ブタウロプラキンII cDNAの増幅に使用するディジェネレートプライマーセットを作成した。正方向プライマーの塩基配列は配列番号：２、逆方向プライマーの塩基配列は配列番号：３にそれぞれ示されている。
【００５３】
前記プライマーセットを利用して、ブタの膀胱の全RNAに対してMuMLV逆転写酵素を用いてRT反応を行い、生じたcDNAをTaqポリメラーゼを使用したPCRにかけた。増幅されたDNAは、塩基配列の判読結果、ウロプラキンII遺伝子の一部であることが確認された。増幅DNAをpGEMT-easyベクターを用いてクローニングした。
【００５４】
ウロプラキンIIプロモーターの単離に用いられるプローブを作成するために、クローニングしたDNA50ngを3分間煮沸し、氷中で冷却して変性させた。変性したDNAをプライマー、dNTP[α-32P]dCTP(3000Ci/nmol,NEN)を含有する反応緩衝液に加えた後、クレノー酵素(Klenow Fragment)を加えて37℃で1時間反応させた。こうして得られたプローブは、ウロプラキンII遺伝子のエキソン２から５の部分を含むプローブA、およびエキソン１から２の部分を含むプローブBの2種類である(図１)。
【００５５】
その後反応液をセファデックスG-50カラムを用いて精製し、32Pで標識されたブタウロプラキンIIプロモーター探知用DNAプローブA及びプローブBを調製した。
【００５６】
2）ライブラリースクリーニング
ブタウロプラキンIIプロモーターを単離するために、ブタゲノムライブラリーをスクリーニングした。本実施例においてブタゲノムライブラリーはラムダフィックスIIファージベクター(lambda FixII phage vector)(Stratagene)に挿入されたものを使用した。
【００５７】
ライブラリーを導入する宿主バクテリアは次のように調製した。
【００５８】
0.2％のマルトースを含有するLB培地5mlにバクテリアコロニー1つを播種して37℃で一晩培養した。前記培地の1％を再び新しい0.2％のマルトース含有LB培地50mlに移し、2.5時間培養した。600nmでの吸光度が約0.5になったとき、培養液を2500rpmで10分間遠心分離した。その結果得られた細胞沈殿物を滅菌した10ml硫酸マグネシウム溶液に懸濁させ、最終濃度が1×1010細胞/mlになるようにし、試験するまで4℃に保管した。
【００５９】
ライブラリーを適定(titration)するために、ライブラリーをSM溶液に様々な濃度で連続的に希釈した。固体LB培地を入れたプレートを37℃のインキュベーターで温め、トップアガーを溶解させ48℃に維持した水浴中に置いた。様々な濃度に希釈したそれぞれのファージ溶液10μlと前記で調製した宿主バクテリア100μlを混合し、37℃で宿主バクテリアをファージに感染させた。
【００６０】
ファージに感染した宿主バクテリアをトップアガーに加えよく振盪した後、前記で準備しておいたLB培地上に注いだ。15分後プレートを裏返しにして37℃のインキュベーターで一晩培養した。一晩培養したプレートの培地上では、ファージが宿主バクテリア内でライブラリーDNAを複製した後、宿主バクテリアを溶解させた跡であるプラークが形成されていた。以降の実験段階のために、プレートを4℃で少なくとも1時間冷ました。
【００６１】
通し番号をつけたNCフィルターを用意し、フィルターの真ん中の部分から接触するようにして前記で準備したライブラリーDNAプレートをフィルターで覆った。フィルターに針を垂直に刺して1点に印を付け、1分後そっとフィルターを培地から剥がした。
【００６２】
各フィルターを変性化溶液、中性化溶液および2×SSC溶液に順に1分ずつ浸した後、80℃のオーブンに2時間置き、転移されたライブラリーDNAがフィルター上に完全に固定されるようにした。
【００６３】
固定されたフィルターを2×SSC溶液上に浸した後、プレハイブリダイゼーション溶液が入っているペトリ皿に浸し、68℃で1時間ゆっくり振盪しながらプレハイブリダイゼーション反応を行った。プレハイブリダイゼーション後、それぞれのフィルターに実施例１の1)で調製したプローブを加え、68℃で18時間ゆっくり振盪してハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、0.1％SDSを含有する2×SSC溶液にフィルターを浸す過程および65℃で10分間振盪しながら洗浄する過程を2回繰り返した。洗浄後、フィルターを空気中で乾燥させ、オートラジオグラフィーにかけた。
【００６４】
オートラジオグラフィーの結果とプレートとを比較し、陽性反応を示すプラークを選択し、プラークをSM緩衝液500μlに入れクロロホルム一滴を添加した後よく混合し4℃で保管した。このようなスクリーニング過程を3回繰り返し、陽性反応を示すクローンを最終的に得た。各クローンに含まれるDNAをQiagenラムダミニキットを用いて精製した。
【００６５】
DNA塩基配列の判読はABI 377 DNAシーケンサー(Applied Biosystem)を用いて行い、配列判読結果はCAP2シーケンスアセンブリシステムを使用して処理し、配列比較はBLAST、SMART、PROSITEなどで、モチーフ解析はClustal Wプログラムを使用して行った。
【００６６】
結果、プローブAでスクリーニングした場合、図１のクローンA及びクローンBが得られ、プローブBでスクリーニングした場合、図１のクローンC及びクローンDが得られた。これらのそれぞれのクローンはブタウロプラキンIIのプロモーターまたはその3’末端に構造遺伝子を含んでいるため、これらを比較してブタウロプラキンIIプロモーターの完全な塩基配列を得た。
【００６７】
本発明のブタウロプラキンIIプロモーターはトータルサイズが8847bpであり、その塩基配列は配列番号：１に示されている。
【００６８】
3)本発明のプロモーターの調節下に発現されるタンパク質の発現パターンの確認
本発明のプロモーターの調節下に発現されるタンパク質の発現パターンを調べるために、ブタウロプラキンIIの発現を次の通り確認した。
【００６９】
3-1)本発明のプロモーターの調節下に発現されるタンパク質の膀胱特異的発現の確認
本発明のプロモーターの調節下に発現されるタンパク質が膀胱特異的に発現されるかどうかをノーザン分析で調べた。
【００７０】
実施例１の2)で得られたブタウロプラキンII cDNAをプローブとして用い、このとき全ての組織で一定水準で発現されるアクチンに対するプローブも対照群として用いた。前記プローブを用いて様々なブタ身体組織におけるブタウロプラキンII mRNAの発現を確認するために、膀胱、心臓、肝臓、肺、子宮及び脾臓などの組織の全RNAを次のように電気泳動にかけた。
【００７１】
アガロース0.7gを250ml容量の三角フラスコに入れ蒸留水58mlを加え、電子レンジで完全に溶解した後60℃に保った水浴で冷ました。アガロースゲルの温度が60℃になった時、10×泳動緩衝液7mlを振りながらそっと加え、11.9mlのホルムアルデヒドをさらに加えて1×ホルムアルデヒド泳動ゲル溶液を調製した。予め設置した電気泳動器具にこの溶液を注ぎ入れ、約20分間放置してゲルを作成した。
【００７２】
マイクロチューブにRNA6μl、10×泳動緩衝液2.5μl、ホルムアルデヒド4μl、ホルムアミド12.5μlをよく混合して、65℃で5分間加熱した後、氷中で冷却した。そのサンプルにゲルローディング緩衝液2.5μlを加えてよく混合した後、5Vで約5分間予め電気泳動しておいたゲルにローディングし、1×泳動緩衝液で120V/cmで電気泳動を行った。電気泳動後、0.05N水酸化ナトリウム溶液にゲルを約10分間浸しておき、以後の転移過程において効率が高まるようRNAを部分的に切断した。
【００７３】
ゲルをpH7.5の0.1Mトリス溶液に30分間、そして20×SSC溶液(3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム,pH7.3)に約30分間浸した後、正に荷電したメンブレンを利用してDNAを転移させた。転移が完了したメンブレンをRNA固定のために80℃で2時間おいた。
【００７４】
メンブレンが完全に漬かるだけの最少量のハイブリダイゼーション溶液が入ったビニール袋にメンブレンを入れた後、68℃の恒温振盪器内に少なくとも1時間置いた。その後、溶液を除去し、プローブを含有したハイブリダイゼーション溶液15mlに置き換えて68℃の恒温振盪器内に一晩置いた。
【００７５】
ハイブリダイゼーション後、室温で洗浄溶液1(2×SSC,0.1％SDS)を入れ換えながら30分間メンブレンを洗浄し、その後55℃で洗浄溶液2(0.2×SSC,0.1％SDS)を入れ換えながら30分間洗浄した。メンブレンを室温で完全に乾燥させた後、オートラジオグラフィーにかけてブタウロプラキンII mRNAの発現有無を調べ、その結果を図３に示した。
【００７６】
図３ａに示された通り、内部標準のアクチンmRNAは全ての組織で一様に発現された。一方、図３ｂに示された通り、本発明のプロモーターの調節下に発現されるウロプラキンII mRNAはブタの膀胱でのみ特異的に発現された(図３ｂ)。
【００７７】
従って、本発明のプロモーターは膀胱特異的に該タンパク質を発現させることが分かる。
【００７８】
3-2)本発明のプロモーターの調節下に発現されるタンパク質の尿路上皮特異的発現の確認
一方、本発明のプロモーターの調節下に発現されるタンパク質が膀胱組織のどの細胞でも発現されるのかを調べるために、次のように免疫組織化学的染色を行った。
【００７９】
ブタ膀胱組織のパラフィン切片を作製し、ヒストクリア(Histoclear)溶液に約10分間浸してパラフィンを除去した。切片をアルコール水溶液に浸し段階的に濃度を減少させながら脱水した後、3％過酸化水素を含有するメタノール及び0.1％ペプシンを含有する0.05N塩酸に浸し、非特異的に染色されるのを防止した。
【００８０】
前記切片をTBS緩衝液(0.05Mトリス、pH7.4、0.85％塩化ナトリウム)で5分間2回洗浄した後、1：5の比率に正常ウマ血清を希釈したTBS中でブロッキング反応を行った。
【００８１】
ブロッキングされた切片は1：500の比率に１次抗体を希釈したTBSに一晩浸しておいた。このとき１次抗体として、ブタウロプラキンIIタンパク質に特異的に結合するポリクローナル抗体を使用し、ネガティブコントロールとしてABCキットのウマ血清1滴を使用した。
【００８２】
１次抗体反応を行った切片をTBSで5分ずつ2回洗浄して過剰な抗体を除去した後、ビオチンが結合した２次抗体と30分間反応させた。その後、切片をTBSで5分間3回洗浄した後、ABC試薬と30分間反応させた。再び切片をTBSで洗浄し、1％Triton-X100を含有するPBSで30秒濯いだ後、0.5％ジアミノベンジジン(DAB)及び0.01％過酸化水素を含有する0.05Mトリス緩衝液(pH7.6)と反応させ発色反応を行った。
【００８３】
発色反応後、切片を水で洗浄し、マウンティングした後、光学顕微鏡下で発色した部分を観察した。その結果を図４に示す。
【００８４】
図４ａに示される通り、対照にはいかなる陽性反応も現われなかったが、図４ｂに示されるように、膀胱組織にウロプラキンIIタンパク質に対する抗体を反応させると、本発明のプロモーターはウロプラキンIIタンパク質をブタ尿路上皮でのみ、特に基底層直上細胞の細胞質で特異的に発現するように調節することが分かった。
【００８５】
3-3）本発明のプロモーター調節下に発現されるタンパク質の発現率の確認
尿路上皮細胞は、タンパク質合成が活発に行われる乳腺組織に比べ、相対的にタンパク質合成能力が低いものと知られているため、本発明のプロモーター調節下に発現されるタンパク質の実際発現水準をレーザースキャニングサイトメトリー(以下「LSC」という)で次のように調べた。
【００８６】
ブタ膀胱組織を細かく分割し、1mg/mlコラゲナーゼタイプＩ(Sigma)、0.51mg/mlヒアルロニダーゼ(Sigma)および50μg/mlゲンタマイシンを含有するDMEM/F12培地(Gibco)に加え、37℃で1時間分解反応を行った。
【００８７】
得られたものをPBSで洗浄した後、60μmナイロンメンブレン(Milipore)でろ過して大きな塊を取り除き、ばらばらの細胞の懸濁液を0.1％ゼラチンでコーティングしたLab-Tekチャンバースライド(Nunc)に付着させた。スライドに付着した細胞を冷PBSで洗浄し、冷メタノール中で15分間固定し、0.1％Triton-X100溶液で10分間処理した。
【００８８】
固定された細胞を1％BSAを含有するPBS溶液で1時間ブロッキングし、実施例１の3-2)で調製したウロプラキンIIポリクローナル抗体を1：100に希釈した溶液で2時間室温反応させた。細胞をPBSで洗浄した後、FITC結合抗マウスIgG２次抗体(Cappel Laboratories)と反応させた。このとき、ネガティブコントロールとして２次抗体のみと反応させた群も一緒に準備した。
【００８９】
細胞を0.1％Tween-20を含有するPBSで3回洗浄した後、全体の細胞数が測定できるように50μg/mlヨウ化プロピジウム(PI)で染色した。LSC解析において488nmのアルゴンレーザーで蛍光を放出させ、FITC用に530nmフィルターを、PI用に570nmフィルターを用いて蛍光発光を観察した。その結果を図５に示す。ネガティブコントロールの分析結果を図５ａ、膀胱細胞のうちウロプラキンIIを発現する細胞の分析結果を図５ｂ、ウロプラキンIIを発現する膀胱細胞の免疫表現型分析結果を図５cにそれぞれ示した。
【００９０】
図５bに示された通り、全膀胱細胞の約8〜14％がウロプラキンIIを発現した。図５cに示すように、その細胞の大部分は、活発に増殖し分裂中であるアンブレラ細胞であることが分かった。尿中のタンパク質は一般に5〜25mg/lという非常に低い水準であるということを考慮すると、前記のウロプラキンIIの発現率はかなり高いものである。膀胱組織を用いると乳腺組織を利用した時より高い効率でタンパク質を単離・精製できることが推察される。
【００９１】
従って、本発明のプロモーターによって、膀胱内で優れた効率で目的タンパク質を発現できることが分かる。
【実施例２】
【００９２】
本発明の発現ベクターpUP2/hEPOの作成
実施例１で単離した本発明のプロモーターを用い、このプロモーターの調節下にEPOを発現するベクターを次のように作成した。
【００９３】
基本骨格ベクターとしてpBluescript SK(-)ベクターを選択し、実施例１の2)で単離した本発明のプロモーターを挿入した。その後、プロモーターの3’末端にヒトEPOをコードする遺伝子(配列番号：４)を挿入した。
【００９４】
得られた発現ベクターの構造は図２に示す通りであり、本発明のウロプラキンIIプロモーターの調節下にEPOを発現する。このベクターをpUP2/hEPOと命名し、2002年10月17日韓国生命工学研究院遺伝子銀行(KCTC)に寄託番号KCTC10352BPとして寄託した。
【実施例３】
【００９５】
本発明の発現ベクターpUP2/hEPOを導入した受精卵の作製
実施例２で作成した本発明の発現ベクターpUP2/hEPOを導入した受精卵を次のように作製した。
【００９６】
1）受精卵の採取
受精卵を採取する3日前に、雌マウスの腹腔内にPMSGを投与し、2日後午後5時にhCGを投与した後、雄マウスと交配させた。交配翌日の午前中に雌マウスにプラグが生成されたかを観察して妊娠有無を確認した。
【００９７】
妊娠を確認したマウスを頚椎脱臼させた後、外科用ハサミで開腹して子宮の結合組織部分を分離した。卵管と子宮間をピンセットで裂いた後、卵巣と卵管間をハサミで切断した。ピンセットで裂いた部分の子宮側を切断し卵管を分離した。
【００９８】
分離した卵管をM２培地に入れ、断熱板に載せて温度低下を防いだ。1ml針を用いて顕微鏡下で卵管膨大部を破って胚を回収した。回収した胚を予め室温に取り出しておいたヒアルロニダーゼ溶液に入れ、卵丘細胞が離れるまで放置した。
【００９９】
得られた溶液をM2培地で2〜3回洗浄した後、13000rpmで5分間遠心分離し、再びM2培地で2〜3回洗浄し、正常受精卵を選別した。パラフィンオイルを塗布したM16培地で選別した受精卵を2〜3回洗浄した後、37℃のインキュベーターに移し保存した。
【０１００】
2）受精卵へのDNA微量注入
マイクロマニピュレーターを用いて、前記の通り採取した受精卵に本発明の発現ベクターpUP2/hEPOを注入した。
【実施例４】
【０１０１】
本発明のプロモーターの調節下にヒトEPOを生産する形質転換マウスの作製
実施例３で作製した受精卵を用いて、本発明のプロモーターの調節下にヒトEPOを生産する形質転換マウスを次のように作製した。
【０１０２】
1）精管結紮マウスの作製
代理母を偽妊娠させるのに用いる精管結紮マウスを次のように作製した。
【０１０３】
6週齢の雄ICRマウスを選択して麻酔した後、ピンセットとハサミで恥骨から約1.5cm上部の外皮を恥骨に沿って約1cm切開した。切開口が重ならないように右側または左側にずらして筋層を切開し、陰嚢に横たわっている精巣を腹腔内に移動させた。ピンセットで精巣、精巣上体及び精管を分離した後、精管の周囲の膜をピンセットで分離して熱したピンセットで精管を切断した。精管が分離されたのを確認した後、筋層を縫合しマウスを麻酔が覚めるまで加温器においた。
【０１０４】
2）偽妊娠代理母マウスの作製
実験日前に発情が確認されたICR雌マウスを実施例３の1)で作製した精管結紮マウスと交配させた。実験日の朝に雌マウスにプラグが生成されたかを観察し偽妊娠有無を確認した。
【０１０５】
3）卵管内への胚移植
実施例２の2)で作製した受精卵をマイクロピペットに一列に配列した。麻酔した代理母マウスの外皮と筋層を少し切開し、卵巣、卵管及び子宮角の上部をピンセットで体外に引き出した。卵巣嚢胞を通して見える部分が上になるように卵巣を配置し、止血クレンメで脂肪組織を挟んで卵巣を固定した。実体顕微鏡下で卵巣嚢胞の膜を取り除き、卵管と卵巣を引っ張って卵管采を探し、移植用ピペットの前方先端部分を卵管に2〜3mm挿入して受精卵を培養液と一緒に卵管内に慎重に注入した。ピペット内の2つの気泡のうちマーカーとする1つ目の気泡が卵管内に挿入されたかどうか観察して受精卵が確実に卵管に注入されたのを確認した。
【０１０６】
代理母のマウスから子孫を得、そのうち形質転換されたマウスをスクリーニングするために、EPOのエキソン1とエキソン2をプローブに用いてノーザン分析を行った結果、76匹のマウスのうち12匹が形質転換されていることが分かった。
【０１０７】
形質転換マウスのEPOタンパク質の発現パターンを調べた結果、EPOタンパク質は膀胱特異的に発現されることが分かった。
【実施例５】
【０１０８】
本発明の形質転換マウスのヒトEPO生産
1）本発明の形質転換マウスの尿中のEPO発現率の確認
本発明の形質転換マウスの尿中のEPO発現率を確認するために、形質転換マウスから尿を得て濾過した後、HPLC分析を行った。各分画のタンパク質成分を調べるために、電気泳動及びウェスターン分析を行いその結果を図７に示した。
【０１０９】
図７ａの電気泳動結果及び図７ｂのウェスターン分析結果に明白なように、本発明の形質転換マウスから得た尿中にはEPOが高い濃度で存在した。
【０１１０】
尿中のEPO濃度は発現量0.5〜1mg/mlと算出されたが、この値は既存の形質転換動物に見られる乳汁中の該タンパク質発現量に比べて著しく高い。
【０１１１】
従って、本発明のプロモーターを用いて作製した形質転換動物は優れた効率で尿中に目的タンパク質をできる。
【０１１２】
2）本発明の形質転換マウスから得たEPOの生理活性検査
本発明の形質転換マウスから得たEPOの生理活性を調べるために、実施例３の1)で得たEPOをEPO依存性の肝細胞に加えて培養した。このとき、対照には市販のEPOを加えた。培養してから24、48および72時間時に細胞の生存率を測定し、その結果を下の表１に示した。
【表１】
2006505267.tif 000003
【０１１３】
表１に示されたように、本発明の形質転換マウスの尿から単離したEPOは、全ての時間帯において、市販のEPOより高い生理活性を示すことが観察された。
【０１１４】
従って、本発明のプロモーターを用いて作製した形質転換動物を利用すると、既存の方法で得られるタンパク質よりはるかに優れた生理活性を示すタンパク質を生産することができる。
【実施例６】
【０１１５】
調節因子を含む本発明の発現ベクターの作成及びその効率の確認
1）調節因子を含む本発明の発現ベクターの構築
本発明のUPIIプロモーターの調節下にEPO生産を最大化することのできるベクターシステムを確立するために、次のようにpUP2/hEPOベクターに選択マーカー及び調節因子を導入し、一連の改良ベクターを作成した。
【０１１６】
1-1）pUPII/hEPO-Neoベクターの構築
UPIIプロモーターの調節下にタンパク質を発現できる細胞株の確立に効果的な選択マーカーをベクター内に挿入するために、ネオマイシン耐性遺伝子を次のように導入しpUP2/hEPO-Neoベクターを作成した。
【０１１７】
ネオマイシン耐性遺伝子を得るためにpEGFP-N1ベクター(Clontech)をテンプレートとし、正方向プライマー(配列番号：８)と逆方法プライマー(配列番号：９)を用いてPCR反応を行った。
5’-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC−3’(配列番号：８)
5’-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3’(配列番号：９)
【０１１８】
その結果得られた1.9kbのPCR産物をpGEM T-easyベクターに挿入した後NotＩ制限酵素で切断して、クローニングに使用するネオマイシン耐性遺伝子部分を調製した。
【０１１９】
本発明のpUP2/hEPOベクターのアンピシリン耐性遺伝子部位をNotＩとSalＩ制限酵素で切断して除去することによって、クローニングに使用するベクターを作成した。
【０１２０】
前記のように作成したネオマイシン耐性遺伝子を該ベクター内に複製し、ネオマイシン耐性遺伝子が既存のpUP2/hEPOベクターに挿入されたpUP2/hEPO-Neoベクターを作成した。
【０１２１】
1-2）I/pUP2/hEPOベクターの構築
UPIIプロモーターの調節下にタンパク質を安定して発現することのできる発現ベクターを得るために、インシュレーター遺伝子を次のようにpUP2/hEPO-Neoベクターに導入してI/pUP2/hEPOベクターを作成した。
【０１２２】
インシュレーター遺伝子を得るために、ニワトリのB-グロビンインシュレーター遺伝子が含まれているpBC1ベクター(Invitrogen)をテンプレートとし、正方向プライマー(配列番号：１０)と逆方向プライマー(配列番号：１１)を用いてPCR反応を行った。PCR効率を高めるために2コピーを増幅させた。
5’-TCGACTCTAGAGGGACAG-3’(配列番号：１０)
5’-CTCACTGACTCCGTTCCT-3’(配列番号：１１)
【０１２３】
その結果得られた2.4kbのPCR産物をpGEM T-easyベクターに挿入した後NotＩ制限酵素で切断し、クローニングに使用するインシュレーター遺伝子部分を調製した。
【０１２４】
前記のように作成したインシュレーター遺伝子と1-1)のベクターをNotＩ部位で互いに連結し、I/pUP2/hEPOベクター(図８)を作成した。
【０１２５】
1-3）pUP2/hEPO(WPRE)ベクターの構築
UPIIプロモーターの調節下にタンパク質を大量に発現できる発現ベクターを得るために、WPRE遺伝子を次のようにpUP2/hEPO-Neoベクターに導入しpUP2/hEPO(WPRE)ベクターを作成した。
【０１２６】
WPRE遺伝子をクローニングするために、正方向プライマー(配列番号：１２)と逆方向プライマー(配列番号：１３)を使用してPCR反応を行った。
5’-ACCAGGTTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC-3’(配列番号：１２)
5’-CTCGAGGAGCCCGAGGCGAAACAGGCG-3’(配列番号：１３)
【０１２７】
その結果得られた0.6kbのPCR産物をpGEM T-easyベクターに挿入した後、実施例６の1-1)で作成したpUP2/hEPO-NeoのNcoＩ制限部位に挿入した。得られたベクターをBspHＩ制限酵素で切断しクローニングに使用するWPRE遺伝子部分を調製した。
【０１２８】
一方、本発明のpUP2/hEPOベクターのEPO遺伝子後方をNcoＩ制限酵素で切断しクローニングに使用するベクターを作成した。
【０１２９】
前記のように調製したWPRE遺伝子をベクター内に複製し、pUP2/hEPO(WPRE)ベクター(図９)を作成した。
【０１３０】
1-4)Ｉ/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターの構築
UPIIプロモーターの調節下に発現量の最大化、発現の安定化及び効果的な細胞株の確立を全て満足できる発現ベクターを得るために、次のようにI/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターを作成した。
【０１３１】
実施例６の1-2)で作成したインシュレーター遺伝子と実施例６の1-3)のベクターをNotＩ部位で連結してI/pUP2/hEPOベクター(図１０)を作成した。
【０１３２】
2)本発明の発現ベクターの効率性の確認
実施例６で作成した発現ベクターの効率性を次のように調べた。
【０１３３】
2-1)本発明の発現ベクターのPCR分析
本発明の発現ベクターから生じたEPO遺伝子の発現量を調べるために、次のようにリアルタイムPCRを行った。
【０１３４】
実施例６において作成した本発明の発現ベクター4種類を形質移入キット(Effectene,Qiagen)を用いて膀胱細胞株RT4に導入した後、継代培養を経て安定した細胞株を確立した。それぞれの細胞株からゲノムDNAを抽出してPCRを行うことによって形質移入が適切になされているかを確認した。
【０１３５】
EPO遺伝子の発現量を確認するために、4種類の細胞株から全RNAをとった後RT-PCRにかけ、cDNAを増幅させた。そのcDNAをテンプレートとしEPOのエキソン領域を増幅させることのできる正方向プライマーと逆方向プライマーを用いてPCRを行った。
【０１３６】
それぞれの細胞株における発現量を調べるために、細胞内で一定量発現されるハウスキーピング遺伝子であるGAPDHを対照として使用して反復実験を3回行った。試験結果をSASプログラムを利用して統計処理し図１１に示した(pUP2：pUP2/hEPOベクター、IUP2：I/pUP2/hEPOベクター、PW：pUP2/hEPO(WPRE)ベクター、IW：I/pUP2/hEPO(WPRE)ベクター)。
【０１３７】
図１１に示されたように、本発明の発現ベクターは、pUP2/hEPOベクター、I/pUP2/hEPOベクター、pUP2/hEPO(WPRE)ベクター、I/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターの順により高いEPO遺伝子発現量を示した。
【０１３８】
特にWPREとインシュレーターの両方を含むI/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターは、別に調節因子を含まないpUP2/hEPOベクターよりも約50倍高い発現量を示した(図１１ｂ)。
【０１３９】
従って、I/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターをはじめとした本発明の発現ベクターを使用すると、EPOの生産を有利に行うことができる。
【０１４０】
2-2）本発明の発現ベクターのウェスターン分析
本発明の発現ベクターから生じたEPOタンパク質の発現量を調べるために、次のようにウェスターン分析を行った。
【０１４１】
実施例６の2-1)で本発明の発現ベクターをそれぞれ導入して確立した細胞株を、NP-40を含む溶解緩衝液(lysis buffer)に入れ超音波処理しタンパク質を抽出した。
【０１４２】
各40μlのタンパク質をSDS-PAGEゲルに電気泳動し、PVDF膜に転移させた後、EPO抗体で処理してEPOタンパク質発現量を調べた。EPOタンパク質の発現量を定量化するために、アクチンに対する抗体を対照として使用して反復実験を2回行った。結果はSASプログラムで統計処理し図１２に示した(pUP2：pUP2/hEPOベクター、IUP2：I/pUP2/hEPOベクター、PW：pUP2/hEPO(WPRE)ベクター、IW：I/pUP2/hEPO(WPRE)ベクター)。
【０１４３】
図１２に示されたように、本発明の発現ベクターはpUP2/hEPOベクター、I/pUP2/hEPOベクター、pUP2/hEPO(WPRE)ベクター、I/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターの順により高いEPOタンパク質発現量を示した。
【０１４４】
この結果は実施例７の1)で示された結果と一致する。
従ってI/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターをはじめとした本発明の発現ベクターを使用するとEPOの生産を有利に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明のプロモーターは膀胱特異的な目的タンパク質発現を誘導し、既存の方法に比べて非常に高い濃度で尿中に目的タンパク質を発現する。
【０１４６】
本発明のプロモーター及びその調節を受ける目的タンパク質からなる発現ベクターで形質転換された動物は、既存の形質転換動物に比べて遥かに高い効率で尿中に目的タンパク質を分泌する。さらに本発明の形質転換動物から得られたタンパク質は既存の同種タンパク質より優れた生理活性を示す。
【０１４７】
従って、本発明のプロモーター、これを用いた発現ベクター及び形質転換動物は医薬学的に価値のある有用タンパク質の生産分野に有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は本発明のブタウロプラキンIIプロモーターを単離するのに用いたプローブと、そのプローブで単離されたクローンの構造を示した図である。
【図２】図２は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOの構造を示した図である。
【図３】図３はブタウロプラキンII mRNAの膀胱特異的発現を示した図である。
【図４】図４はブタウロプラキンIIタンパク質の尿路上皮特異的発現を示した図である。
【図５】図５はブタウロプラキンIIタンパク質の膀胱細胞中の発現率及び該タンパク質のアンブレラ細胞特異的発現を示した図である。
【図６】図６は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOで形質転換されたマウスにおけるEPO mRNAの膀胱特異的発現を示した図である。
【図７】図７は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOで形質転換されたマウスにおけるEPOタンパク質の発現を示した図である。
【図８】図８は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOの構造を示した図である。
【図９】図９は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOの構造を示した図である。
【図１０】図１０は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOの構造を示した図である。
【図１１】図１１は本発明の発現ベクターのEPO遺伝子発現量を比較した図である。
【図１２】図１２は本発明の発現ベクターのEPOタンパク質発現量を比較した図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006505267.tif 000031
【図９】
2006505267.tif 000032
【図１０】
2006505267.tif 000033
【図１１】
2006505267.tif 000034
【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年6月29日(2005.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
結果、プローブAでスクリーニングした場合、図１のクローン１及びクローン２が得られ、プローブBでスクリーニングした場合、図１のクローン３及びクローン４が得られた。これらのそれぞれのクローンはブタウロプラキンIIのプロモーターまたはその3’末端に構造遺伝子を含んでいるため、これらを比較してブタウロプラキンIIプロモーターの完全な塩基配列を得た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
ゲルをpH7.5の0.1Mトリス溶液に30分間、そして20×SSC溶液(3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸ナトリウム,pH7.3)に約30分間浸した後、正に荷電したメンブレンを利用してRNAを転移させた。転移が完了したメンブレンをRNA固定のために80℃で2時間おいた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
この結果は実施例６の2-1)で示された結果と一致する。
従ってI/pUP2/hEPO(WPRE)ベクターをはじめとした本発明の発現ベクターを使用するとEPOの生産を有利に行うことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
【図１】図１は本発明のブタウロプラキンIIプロモーターを単離するのに用いたプローブと、そのプローブで単離されたクローンの構造を示した図である。
【図２】図２は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOの構造を示した図である。
【図３】図３はブタウロプラキンII mRNAの膀胱特異的発現を示した図である。
【図４】図４はブタウロプラキンIIタンパク質の尿路上皮特異的発現を示した図である。
【図５】図５はブタウロプラキンIIタンパク質の膀胱細胞中の発現率及び該タンパク質のアンブレラ細胞特異的発現を示した図である。
【図６】図６は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOで形質転換されたマウスにおけるEPO mRNAの膀胱特異的発現を示した図である。
【図７】図７は本発明の発現ベクターpUP2/hEPOで形質転換されたマウスにおけるEPOタンパク質の発現を示した図である。
【図８】図８は本発明の発現ベクターI/pUP2/hEPOの構造を示した図である。
【図９】図９は本発明の発現ベクターpUP2/hEPO(WPRE)の構造を示した図である。
【図１０】図１０は本発明の発現ベクターI/pUP2/hEPO(WPRE)の構造を示した図である。
【図１１】図１１は本発明の発現ベクターのEPO遺伝子発現量を比較した図である。
【図１２】図１２は本発明の発現ベクターのEPOタンパク質発現量を比較した図である。
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月27日(2005.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2006505267000001.app
【国際調査報告】
2006505267.tif 000036
2006505267.tif 000037
2006505267.tif 000038