(57)【要約】アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）をコードする遺伝子を欠損するように細胞と非ヒトトランスジェニック動物を工作した。ＡｇＲＰ欠損トランスジェニック動物は日中呼吸商（ＲＱ）が低下したことから、ＡｇＲＰはエネルギー代謝の調節に関与しており、その結果、エネルギー源としての脂肪の使用が低下することを示す。これらのＡｇＲＰ欠損トランスジェニック動物はＡｇＲＰの潜在的モジュレーターを選択及び試験するために使用することができる。このデータからエネルギー代謝とカロリー利用を調節するＡｇＲＰモジュレーターのスクリーニング方法が得られる。本開示はＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹの潜在的モジュレーター（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）を選択及び試験するために使用することができるＮＰＹ／ＡｇＲＰ二重ノックアウトマウスにも関する。
2006506968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞と生殖細胞が、非機能的ＡｇＲＰ蛋白質をコードする改変アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）遺伝子に関してホモ接合であるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
動物が、非機能的ＡｇＲＰ蛋白質をコードする改変アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）遺伝子に関してホモ接合である体細胞と生殖細胞をもつマウスであり、更に前記マウスが日中呼吸商の低下を示す請求項１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
請求項２に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。
【請求項４】
体細胞が、アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）をコードする機能的マウス遺伝子と改変ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合であるトランスジェニックマウス。
【請求項５】
請求項４に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。
【請求項６】
体細胞が改変ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘミ接合であるトランスジェニックマウス。
【請求項７】
請求項６に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。
【請求項８】
体細胞と生殖細胞が、マウスアグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）をコードする機能的遺伝子を欠損するトランスジェニックマウスであって、非天然ＡｇＲＰ蛋白質に関する遺伝子を含むトランスジーンを含み且つ発現し、生存可能である前記トランスジェニックマウス。
【請求項９】
前記トランスジーンが野生型又は突然変異体形態のヒトＡｇＲＰをコードする請求項８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０】
（ａ）マウス胚性幹細胞のＡｇＲＰ対立遺伝子をターゲティングするように設計された改変形ＡｇＲＰをコードする遺伝子を提供する段階と；
（ｂ）改変遺伝子をマウス胚性幹細胞に導入する段階と；
（ｃ）改変遺伝子を含む胚性幹細胞を選択する段階と；
（ｄ）改変遺伝子を含む胚性幹細胞をマウス胚盤胞に導入する段階と；
（ｅ）注入した胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する段階と；および
（ｆ）胚を満期まで発生させ、キメラファウンダートランスジェニックマウスを生産する段階を含む、ＡｇＲＰをコードするマウス遺伝子を欠損する体細胞と生殖細胞をもつマウスの生産方法。
【請求項１１】
体細胞と生殖細胞が、非機能的ＡｇＲＰ蛋白質をコードする改変アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）遺伝子に関してホモ接合であると共に、非機能的ＮＰＹ蛋白質をコードする改変神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）遺伝子に関してホモ接合であるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。
【請求項１３】
体細胞と生殖細胞が、非機能的ＡｇＲＰ蛋白質をコードする改変アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）遺伝子に関してホモ接合であると共に、非機能的ＮＰＹ蛋白質をコードする改変神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）遺伝子に関してホモ接合であるトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
請求項１３に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞系。
【請求項１５】
体細胞が、改変ＡｇＲＰ遺伝子と改変ＮＰＹ遺伝子に関してヘテロ接合又はホモ接合であり、前記改変遺伝子が非機能的ＮＰＹ蛋白質をコードするトランスジェニックマウス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のトランスジェニック動物に由来する細胞系。
【請求項１７】
体細胞と生殖細胞が、マウスＡｇＲＰ蛋白質とＮＰＹ蛋白質をコードする機能的遺伝子を欠損するトランスジェニックマウスであって、非天然ＡｇＲＰ蛋白質をコードする第１のトランスジーンと非天然ＮＰＹ蛋白質をコードする第２のトランスジーンを含み且つ発現する前記トランスジェニックマウス。
【請求項１８】
前記第１のトランスジーンが野生型ヒトＡｇＲＰをコードし、前記第２のトランスジーンが野生型ヒトＮＰＹをコードする請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
（ａ）請求項２に記載のトランスジェニックマウスに候補化合物を投与する段階と；
（ｂ）エネルギーの消費及び／又は利用に及ぼす候補化合物の効果を測定する段階とを含む、エネルギーの消費及び／又は利用に及ぼす候補化合物の効果の評価方法。
【請求項２０】
（ａ）請求項１３に記載のトランスジェニックマウスに候補化合物を投与する段階と；
（ｂ）エネルギーの消費及び／又は利用に及ぼす候補化合物の効果を測定する段階とを含む、エネルギーの消費及び／又は利用に及ぼす候補化合物の効果の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本願は、本明細書中に参考として援用されている、２００２年７月３日に出願した、米国仮出願第６０／３９３,３９１号の利益を主張する。
連邦政府支援によるＲ＆Ｄに関する言及
該当せず
マイクロフィッシュ・アペンディックスに関する参照
該当せず
【０００２】
本発明はアグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）をコードする遺伝子を欠損するように工作された細胞と非ヒトトランスジェニック動物に関する。本明細書にはＡｇＲＰ欠損トランスジェニック動物が日中呼吸商（ＲＱ）の低下を示すことも示す。呼吸商は一般に炭水化物又は脂肪がエネルギー源として使用されているか否かを示すために使用することができる尺度である。ＡＧＲＰ−／−マウスで確認された日中ＲＱの低下はこれらのマウスが日中に優先的に脂肪を酸化することを示している。Ｆｌａｔｔら，（１９９１）Ｊ．Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２：１９３−２０２により提案された定常状態蛋白質酸化の前提の下にＥｌｉａ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｓｅｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ（１９９２）７０：６８−１３１により提案された炭水化物と脂肪酸化の簡易モデルを使用してＲＱ測定値から脂肪と炭水化物の相対利用率を算出することができる。このモデルを使用した処、（本明細書に開示する）ＡＧＲＰ−／−マウスは脂肪に由来するその日中エネルギーが野生型対照マウスよりも約２０％多いことが判明し、ＡｇＲＰはカロリー利用の調節、特にエネルギー源としての脂肪の利用の低下に関与していると思われた。これはＡｇＲＰが脂肪蓄積を増加するという多くのデータに一致する（例えばＣｈｅｎら，（２０００）Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  ９２（１−３）：１１３−９参照）。
【０００３】
ＡｇＲＰ欠損トランスジェニック動物はＡｇＲＰの潜在的モジュレーター（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）を選択及び試験するために使用することができる。ＡｇＲＰ欠損トランスジェニック動物は二重モジュレーター、例えばＡｇＲＰトランスジェニック動物が神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）も欠損している場合にはＡｇＲＰとＮＰＹの両者のモジュレーターを選択するためにも使用することができる。本明細書に開示する神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）／ＡｇＲＰ二重ノックアウトマウスはこの点で有用である。内在アンタゴニスト（ＡｇＲＰ）の欠損から低アゴニスト濃度でも同様の効力があると予想されるので、欠損トランスジェニック動物はメラノコルチン（ＭＣ）受容体ＭＣ−４Ｒ及びＭＣ−３Ｒの潜在的モジュレーター（例えばアゴニスト）を選択及び試験するためにも使用することができる。ＮＰＹとＡｇＲＰは末梢グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）の食欲促進作用のメディエーターであるので、本明細書に開示するＮＰＹ／ＡｇＲＰ二重ノックアウトマウスはグレリン−Ｒの潜在的モジュレーター（例えばアゴニスト）を選択及び試験するためにも使用することができる。この点で、本発明はエネルギー代謝に作用するＡｇＲＰ、ＮＰＹ、ＭＣ−４Ｒ及び／又はＭＣ−３Ｒ、グレリン−Ｒモジュレーターのスクリーニング方法と、神経ペプチド又はメラノコルチン受容体の１種以上の作用に応答性の種々の疾患又は疾病の関連治療方法にも関し、このような疾患又は疾病としては限定されないが、（食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により）肥満症、（グルコース耐性亢進、インスリン抵抗性低下により）糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌、胆嚢疾患、男性及び女性性機能不全（インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む）、サイトカイン放出調節、皮膚黒化、にきび及び他の皮膚疾患が挙げられる。
【背景技術】
【０００４】
アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ；Ｓｈｕｔｔｅｒら，（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１１：５９３−６０２）は視床下部の弓状核で多量に発現される１３２アミノ酸神経ペプチドであり、齧歯類で摂食と体重増加を強力に刺激する。実際に、ＡｇＲＰを過剰発現させると、肥満黄色（Ａｙ／ａ）及びＭＣ−４Ｒ欠損マウスに存在する特徴の多くが発生反復され、肥満症、体長増加、高インスリン血症、遅発性高脂血症、膵島増殖及びコルチコステロン上昇の欠損等を生じる（Ｇｒａｈａｍら，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：２７３−２７４；Ｏｌｌｍａｎｎら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１３５−１３８参照）。ＡｇＲＰは中枢神経系（ＣＮＳ）メラノコルチン−３及び−４受容体（ＭＣ−３Ｒ，ＭＣ−４Ｒ）におけるαメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）シグナル伝達に拮抗することにより機能すると考えられている。この相互作用に拮抗すると、α−ＭＳＨシグナリングに一般に起因する効果、即ち摂食量低下とエネルギー消費増加に対抗する。
【０００５】
ＡｇＲＰは視床下部弓状核ニューロンサブセットで独占的に発現される。ＡｇＲＰを発現することが知られている唯一の末梢組織は副腎である。ＡｇＲＰはラットとヒトの血漿中に低レベルで検出される。これらの２種類の種における血漿ＡｇＲＰ値は摂食量により変化し、血漿ＡｇＲＰ値は胞満を反映すると予想されている。
【０００６】
ＡｇＲＰは特にシステインリッチＣ末端ドメインにおいて蛋白質アグーチ（ａｇｏｕｔｉ）と２５％相同である。アグーチは皮膚で一般に発現される１３１アミノ酸パラクリンホルモンである。アグーチは皮膚で毛嚢のＧ蛋白質結合受容体であるＭＣ−１Ｒにおける阻害により毛色を制御する（Ｂｕｌｔｍａｎら，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７１：１１９５−１２０４）。特に天然肥満黄色（Ａｙ／ａ）突然変異マウスの脳でアグーチの異所性発現が観察されている。このマウスはその結果としてコルチコステロン非依存性の遅発性肥満症を示す。異所性発現アグーチ蛋白質は視床下部におけるＡｇＲＰの正常作用と同様に脳でＭＣ−３Ｒ及びＭＣ−４Ｒ受容体と拮抗する。これは、ＭＣ−４Ｒノックアウトマウスを作製するとアグーチ突然変異マウスの肥満表現型を発生反復することから確証された（Ｈｕｓｚａｒら，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８  ：１３１−１４１；及び１９９９年８月３日発行米国特許第５，９３２，７７９号参照）。
【０００７】
興味深いことに、ＡｇＲＰが発現される視床下部弓状核ニューロンのサブセットは食欲促進神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）も発現する。ＮＰＹはブタ脳から最初に単離された３６残基ペプチドであり、同様に摂食と体重増加に強力な効果をもつことが示されている（Ｔａｔｅｍｏｔｏら，（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：２５１４−２５１８；及びＴａｔｅｍｏｔｏら，（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２８５：４１７−４１８参照）。ＮＰＹ効果は特定ＮＰＹ受容体サブタイプにより媒介され、このようなサブタイプは多数同定されている。（例えばＡｍｂｉｋａｉｐａｋａｎ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，（１９９７）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １８（３）：４４５−４５７参照）。興味深いことに、ＮＰＹ欠損マウスは正常に摂食し、成長することが報告されている（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：４１５−４１８）。ＮＰＹの欠損は補償メカニズムにより無効にされると思われる。Ａｍｂｉｋａｉｐａｋａｎ  Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ，前出参照。
【０００８】
レプチンは脂肪細胞により分泌される末梢ホルモンであり、食欲促進ペプチドであるＮＰＹとＡｇＲＰの発現を低下させると同時にＰＯＭＣニューロンのニューロン活性を増加する（Ｃｏｗｌｅｙら，（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：１５５−１６３）。ＰＯＭＣニューロンのニューロン活性の増加はα−ＭＳＨの放出を増し、ＭＣ−３Ｒ及びＭＣ−４Ｒを作働化し、従って、食欲、エネルギー消費及び摂食効率を調節すると考えられる。これらの結論はＭＣ−３Ｒ及びＭＣ−４Ｒノックアウトマウスがその結果として肥満していることが試験により判明したことから確証された（Ｃｈｅｎら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２６：９７−１０２；及びＨｕｓｚａｒら，（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：１３１−１４１参照）。
【０００９】
胃由来グレリンは弓状核のＡｇＲＰ／ＮＰＹニューロンに作用して摂食を開始する。本明細書に記載する遺伝子データによると、ＡｇＲＰとＮＰＹは循環グレリンの食欲促進効果の必須メディエーターであることが実証され、薬理試験からの同様の結論が裏付けられた。
【００１０】
エネルギー代謝とカロリー利用を調節することが可能な新規薬剤を発見することが望ましい。その過程で特に重要になるのは種々の候補化合物をスクリーニング及び評価する手段である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明はＡｇＲＰ欠損動物細胞（ＡｇＲＰ／ＮＰＹ欠損動物細胞を含む）、関連非ヒトトランスジェニック胚、同様にＡｇＲＰ欠損又はＮＰＹ／ＡｇＲＰ欠損である非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔を開示することによりこれらの必要に対処し、満足するものである。本明細書に開示するＡｇＲＰ欠損又はＮＰＹ／ＡｇＲＰ欠損動物でエネルギー代謝とカロリー利用に作用する化合物の評価方法もこれらの必要を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はＡｇＲＰをコードする遺伝子の破壊によりＡｇＲＰ欠損に関してホモ接合である動物細胞に関する。この点で、本発明はＡｇＲＰをコードする遺伝子の破壊によりＡｇＲＰ欠損である（ＡｇＲＰヌル）非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔にも関する。
【００１３】
本発明は更に当該動物に天然である機能的ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合である動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔にも関する。
【００１４】
本発明は更に天然（野生型）ＡｇＲＰの存在下又は不在下に発現されるＡｇＲＰ蛋白質をコードする非天然遺伝子をもつ動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚及び非ヒトトランスジェニック同腹仔にも関する。非天然ＡｇＲＰ遺伝子はヒトＡｇＲＰ遺伝子が好ましい。
【００１５】
本発明は更にＡｇＲＰ遺伝子の少なくとも一部の欠失に関してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合であると共に、ＮＰＹ遺伝子又はメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）等の体重調節に関与することが示されている別の遺伝子の少なくとも一部の欠失にホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合である動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔にも関する。従って、本発明の或る側面はＡｇＲＰ−／＋／ＮＰＹ−／−；ＡｇＲＰ−／＋／ＮＰＹ−／＋；ＡｇＲＰ−／−／ＮＰＹ−／＋である動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔と、２種の別個の対立遺伝子に関するヘミ接合代替物に関する。本発明の特に好適な側面はＡｇＲＰ−／−／ＮＰＹ−／−二重ノックアウトマウスと関連動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。
【００１６】
本発明のトランスジェニック細胞及び動物はエネルギー代謝の調節に関してＡｇＲＰ遺伝子及び／又は蛋白質の活性又はＡｇＲＰ遺伝子及び／又は蛋白質の発現に及ぼす候補モジュレーターの効果を評価するのに有用である。メラノコルチン（ＭＣ）受容体（ＭＣ−３Ｒ及びＭＣ−４Ｒ）の内在アンタゴニスト（ＡｇＲＰ）を除去すると、本発明のトランスジェニック細胞及び動物はＭＣ−３Ｒ及びＭＣ−４Ｒの潜在的モジュレーターの選択と評価に使用することもできる。このアッセイはＭＣ受容体の内在アンタゴニストであるＡｇＲＰが不在であるという事実に基づく。従って、候補モジュレーターは低濃度で同様の効力を示すはずである。二重ノックアウト突然変異体（ＡｇＲＰ／ＮＰＹヌル）を使用すると、ＡｇＲＰとＮＰＹの両者の活性に依存する経路に及ぼすモジュレーター（例えばグレリン経路のモジュレーター）の効果を試験することができる。
【００１７】
本発明は更にエネルギー代謝及び／又は体重の調節に作用する蛋白質及び／又はＭＣ受容体のモジュレーターを選択するためのＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ／ＡｇＲＰに基づくアッセイにも関する。アッセイは細胞アッセイでもよいし、膜調製物を利用するものでもよい。このようなアッセイの使用により同定されるモジュレーターは神経ペプチド及び／又はメラノコルチン受容体の機能不全に関連する種々の疾患又は疾病の任意のものの治療で使用することができる。例えば、ＡｇＲＰ、ＮＰＹ／ＡｇＲＰアンタゴニスト及び／又はＭＣ受容体アゴニストは肥満症の治療で使用することができる。あるいは、ＡｇＲＰ又はＮＰＹ／ＡｇＲＰアゴニスト及び／又はＭＣ受容体アンタゴニストは食欲不振と関連疾患を治療するために使用することができる。
【００１８】
本発明は更にエネルギー代謝及び／又は体重の調節に作用するグレリン及び／又はグレリン受容体のモジュレーターを選択するためのＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ／ＡｇＲＰに基づくアッセイに関する。アッセイは細胞アッセイでもよいし、膜調製物を利用するものでもよい。このようなアッセイの使用により同定されるモジュレーターはグレリン及び／又はグレリン受容体の機能不全に関連する種々の疾患又は疾病の任意のものの治療で使用することができる。例えば、ＡｇＲＰ、ＮＰＹ／ＡｇＲＰアンタゴニスト及び／又はグレリン受容体アンタゴニストは肥満症の治療で使用することができる。あるいは、ＡｇＲＰ又はＮＰＹ／ＡｇＲＰアゴニスト及び／又はグレリン受容体アゴニストは拒食症と関連疾患を治療するために使用することができる。
【００１９】
ＡｇＲＰ、ＭＣ−３Ｒ、ＭＣ−４Ｒ、及びグレリン受容体の調節は以下の状態を治療するために使用することもできる。ＧＨ、ＩＧＦ１機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるようなヤセ型低体重、ＧＨ欠損に起因することを特徴とする他の状態、癌、悪液質、鬱病と不安に関連する疾患、（食欲低下、代謝率増加、又は炭水化物欲求低下により）肥満症、（グルコース耐性亢進、インスリン抵抗性低下により）糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、癌、男性及び女性性機能不全（インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む）、サイトカイン放出調節、並びに皮膚黒化。
【００２０】
本明細書で使用する「機能的」なる用語は細胞中又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ系に存在している場合に天然ないし非改変条件又は環境にあるかのように正常に機能する遺伝子又は蛋白質を表すために使用する。従って、機能的でない遺伝子（即ち「非機能的」、「破壊」、「改変」等）は野生型、天然ないし非改変蛋白質として機能しない蛋白質をコードするか、又は蛋白質を全くコードしない。このような非機能的遺伝子（例えば非機能的ＡｇＲＰ遺伝子）は本明細書に記載するような相同組換えイベントの産物とすることができ、非機能的遺伝子の機能的形態を含むターゲット染色体の領域に非機能的遺伝子を特異的にターゲティングし、野生型ないし天然遺伝子の「ノックアウト」を形成する。
【００２１】
本明細書でＡｇＲＰに関して使用する「モジュレーター」とはＡｇＲＰの通常属性である発現もしくは活性に変化を生じるか、又はＡｇＲＰとその受容体もしくは他の蛋白質（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の相互作用の効果に変化を生じる化合物である。
【００２２】
本明細書でＡｇＲＰとＮＰＹの二重モジュレーターに関して使用する「モジュレーター」とはＡｇＲＰとＮＰＹの通常属性である発現もしくは活性に変化を生じるか、又はＡｇＲＰとＮＰＹとその受容体もしくは他の蛋白質（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の相互作用の効果に変化を生じる化合物である。
【００２３】
本明細書でメラノコルチン受容体に関して使用する「モジュレーター」とはＭＣ−３ＲもしくはＭＣ−４Ｒの通常属性である発現もしくは活性に変化を生じるか、又はＭＣ−３ＲもしくはＭＣ−４Ｒとそのリガンドもしくは他の蛋白質（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の相互作用を変化させる化合物である。
【００２４】
本明細書でグレリン及び／又はグレリン受容体に関して使用する「モジュレーター」とはグレリン及び／又はグレリン受容体の通常属性である発現もしくは活性に変化を生じるか、又はグレリンとその受容体（例えばアゴニスト又はアンタゴニスト）の相互作用を変化させる化合物である。
【００２５】
本明細書で本発明のトランスジェニック動物に関して使用する「トランスジーン」とは遺伝子を含む遺伝子構築物である。トランスジーンは当分野で公知の方法により動物の細胞の１個以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、トランスジーンはトランスジェニック動物の染色体の少なくとも１カ所に担持される。遺伝子は蛋白質をコードするヌクレオチド配列又は構造的ＲＮＡである。遺伝子及び／又はトランスジーンは当分野で公知の遺伝子調節エレメント及び／又は構造エレメントも含むことができる。
【００２６】
本明細書で使用する「動物」なる用語はトランスジェニック動物と言う場合を除いて全哺乳動物を含む。後者の場合には、この用語の使用はヒトを除外する。「動物」なる用語は胚及び胎児段階を含む全発生段階の個体動物も含む。「トランスジェニック動物」とは細胞下レベルで慎重な遺伝子操作（例えば組換えウイルスのマイクロインジェクション又は感染）により直接又は間接的に受容した遺伝情報をもつ１個以上の細胞を含む動物である。この導入ＤＮＡ分子は染色体内に組込んでもよいし、染色体外で複製するＤＮＡでもよい。特に明記するか又は動物の記載の文脈からそうでないと解釈される場合を除き、本明細書で使用する「トランスジェニック動物」なる用語は遺伝情報が生殖細胞系に導入され、その情報を子孫に伝達する能力を付与されたトランスジェニック動物を意味する。子孫が実際に遺伝情報の一部又は全部をもつならば、これらの子孫もトランスジェニック動物である。遺伝情報は一般にトランスジーンの形態で提供される。
【００２７】
本明細書で使用する「標的遺伝子」又は「ノックアウト」（ＫＯ）とは非限定的な例として本明細書に記載する方法等の人的介入により非ヒト動物の生殖細胞系に導入したＤＮＡ配列である。本発明の標的遺伝子としてはコグネート内在対立遺伝子、特にＡｇＲＰ、又はＮＰＹとＡｇＲＰの両者をコードする内在対立遺伝子を特異的に改変するように設計した核酸配列が挙げられる。「ノックアウト」はＡｇＲＰ遺伝子の改変又は好ましくは完全欠失により得られるが、その他、限定されないが、ＡｇＲＰ（及びＮＰＹ）遺伝子欠失、遺伝子変異及び／又は遺伝子挿入により天然遺伝子を非機能的又は少なくとも実質的に非機能的にしてもよいし、発現又は活性を改変したＡｇＲＰ蛋白質（又はＮＰＹ及びＡｇＲＰ蛋白質）とすることもできる。上述のように、ＡｇＲＰ遺伝子をもたない非ヒトトランスジェニック動物はエネルギー代謝とその関連疾患におけるＡｇＲＰの役割を評価するために使用することができ、ＮＰＹ／ＡｇＲＰ二重ノックアウトは肥満症及び本明細書に記載する他の疾患におけるＮＰＹ／ＡｇＲＰ二重モジュレーターの役割を評価するために使用することができる。
【００２８】
本明細書で使用する「ＡｇＲＰ」又は「Ａｇｒｐ」とはアグーチ関連蛋白質を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する「ＮＰＹ」とは神経ペプチドＹを意味する。
【００３０】
本明細書で使用する「ＭＣ−１Ｒ」とはメラノコルチン−１受容体を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する「ＭＣ−３Ｒ」とはメラノコルチン−３受容体を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「ＭＣ−４Ｒ」とはメラノコルチン−４受容体を意味する。
【００３３】
本明細書で使用する「グレリン−Ｒ」とはグレリン受容体を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する「ＭＣＨ」とはメラニン凝集ホルモンを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は天然アグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）を欠失するトランスジェニック非ヒト動物（ＡｇＲＰヌル；ＡｇＲＰ−／−）、ヘテロ接合トランスジェニック非ヒト動物、天然ＡｇＲＰの存在下又は不在下に発現される非天然ＡｇＲＰ蛋白質をもつトランスジェニック動物、及びＡｇＲＰ欠損トランスジェニック動物に関する。この点で、本発明はＡｇＲＰをコードする遺伝子の破壊によりＡｇＲＰ欠損に関してホモ接合である動物細胞と、ＡｇＲＰをコードする遺伝子の破壊によりＡｇＲＰを欠損する（ＡｇＲＰヌル）非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。本発明は更に当該動物に天然である機能的ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合である動物、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔にも関する。更に、本発明は天然（野生型）ＡｇＲＰの存在下又は不在下に発現されるＡｇＲＰ蛋白質をコードする非天然遺伝子をもつ動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。非天然ＡｇＲＰ遺伝子はヒトＡｇＲＰ遺伝子が好ましい。
【００３６】
本発明は更にＡｇＲＰ遺伝子の少なくとも一部の欠失に関してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合であると共に、ＮＰＹ遺伝子又はメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）等の体重調節に関与することが示されている別の遺伝子の少なくとも一部の欠失にホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合である非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔にも関する。従って、本発明の側面はＡＧＲＰ−／＋／ＮＰＹ−／−；ＡｇＲＰ−／＋／ＮＰＹ−／＋；ＡｇＲＰ−／−／ＮＰＹ−／＋である非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。本発明の特に好適な側面はＡｇＲＰ−／−／ＮＰＹ−／−二重ノックアウトマウスと関連非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。
【００３７】
ＡｇＲＰノックアウトマウスの作製は報告されておらず、ＡｇＲＰノックアウトマウスが如何なる表現型を示すかも不明であった。本発明の本質はＡｇＲＰノックアウトマウスが実際に注目すべき表現型である日中呼吸商（ＲＱ）の低下を示すことから、これらのマウスが日中に優先的に脂肪を燃焼することを立証する点にある。即ち、この知見はＡｇＲＰがエネルギー代謝の調節、特にエネルギー源としての脂肪の使用の低下に関与していることを意味し、従って、エネルギー代謝とカロリー利用に作用するＡｇＲＰの候補モジュレーターを評価及び同定するための本明細書に記載する種々のアッセイが得られる。
【００３８】
本発明のトランスジェニック動物は候補モジュレーターがＡｇＲＰ遺伝子及び／又は蛋白質（二重ノックアウトの場合にはＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ遺伝子／蛋白質）の発現と活性に及ぼす効果を評価するのに使用することができる。内在アンタゴニストの欠損から低アゴニスト濃度で同様の効力があると予想されるので、本発明のトランスジェニック細胞及び動物はＭＣ−３Ｒ又はＭＣ−４Ｒモジュレーター（例えばアゴニスト）を選択及び試験するように設計したアッセイでも使用することができる。ＡｇＲＰとＮＰＹは摂食刺激に対するグレリンの作用を媒介するので、本発明のトランスジェニック細胞及び動物はグレリン−Ｒモジュレーター（例えばアンタゴニスト）を選択及び試験するように設計したアッセイでも使用することができる。従って、本発明のトランスジェニック動物はエネルギー代謝とカロリー利用の調節におけるＡｇＲＰ、ＮＰＹ／ＡｇＲＰ、及び／又はＭＣ受容体モジュレーターの役割の評価に使用することができる。神経ペプチド及び／又はメラノコルチン受容体、及びグレリン受容体の調節はヤセ型体重により定義される体重および筋肉重量の処置に使用することができ、限定されないが例えば肥満症、糖尿病、拒食症、悪液質、男性及び女性性機能不全、ＧＨ、ＩＧＦ１機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者のヤセ型低体重、ＧＨ欠損に起因することを特徴とする他の状態、癌、悪液質、並びに鬱病と不安に関連する疾患が挙げられる。
【００３９】
本明細書の教示に鑑みて、アンチセンスＲＮＡトランスジーン、リボザイム又は他のＲＮＡ発現モジュレーター又は他のＡｇＲＰ  ＲＮＡ生産調節手段（例えばプロモーター突然変異、転写に関する突然変異）を利用してマウスＡｇＲＰ蛋白質の発現を部分的又は完全にノックアウトすることは当業者が予想可能である。本発明で使用するアンチセンストランスジーンは宿主ＡｇＲＰ遺伝子の全部又は一部に少なくとも部分的に相補的であり且つ宿主ＡｇＲＰ遺伝子によりコードされるターゲット配列、最も具体的には宿主ＡｇＲＰ遺伝子から発現されるｍＲＮＡ転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードする。このような任意オリゴヌクレオチド配列は少なくとも約１５〜３０ヌクレオチド長とすべきであり、約３０ヌクレオチド長を上回ることが好ましく、この配列はターゲット宿主遺伝子と実質的に相補的である。アンチセンストランスジーンは完全な相補配列である必要はないが、発現されるアンチセンスＲＮＡトランスジーンが同時蛋白質発現を有効に阻害するように宿主ターゲット遺伝子から発現されるｍＲＮＡと有効にハイブリダイズするように十分な配列一致を含むべきである。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは当該配列を適当な遺伝子発現ベクターにサブクローニングし、本明細書に記載するように使用可能な多潜能力の胚性幹細胞にこのベクターを導入し、ＡｇＲＰ欠損非ヒトトランスジェニック動物の別の形態を作製することにより生産することができる。
【００４０】
マウスを含むＡｇＲＰ欠損トランスジェニック非ヒト動物の作製は特にエネルギー代謝とカロリー利用の調節、及び本明細書に列挙する他の適応症に関してＡｇＲＰのｉｎ  ｖｉｖｏ機能を定義するのに有用であり、このような適応症としては限定されないが、（ＭＣ受容体が適正に機能する場合に観察される効果である食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下を阻害することにより）肥満症、（ＭＣ受容体が適正に機能する場合に観察される効果であるグルコース耐性亢進、インスリン抵抗性低下に拮抗することにより）糖尿病、高血圧、高脂血症、不安、男性及び女性性機能不全（インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む）、サイトカイン放出調節、並びに皮膚黒化が挙げられる。更に、ＡｇＲＰヌル動物はヒトＡｇＲＰ遺伝子の挿入用系統として使用することができ、ＡｇＲＰ活性及び発現の調節の各種アプローチのデザインと評価に有用な動物モデルが得られる。このような変異トランスジェニック非ヒト動物は細胞培養用細胞源としても使用することができる。これらの細胞はＡｇＲＰ発現、活性及びその調節の対応するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に使用することができる。
【００４１】
本発明の１側面は細胞が動物に天然に生じる機能的ＡｇＲＰ遺伝子を欠失する動物を獲得するための方法である。「天然の遺伝子」とは本発明では動物に天然に存在するＡｇＲＰ遺伝子を意味する。遺伝子が突然変異体でない場合でも野生型と呼ぶ場合もある。改変ＡｇＲＰ遺伝子は宿主動物に天然のものと同一のＡｇＲＰを完全にコードすべきではなく、その発現産物を多少改変するか、完全に欠失させることができる。天然ＡｇＲＰ遺伝子の不在下にトランスジェニック動物で非天然ＡｇＲＰ遺伝子を発現させることが有用な場合には、改変ＡｇＲＰ遺伝子は動物でヌルノックアウト表現型を誘発することが好ましい。しかし、より低度の改変ＡｇＲＰ遺伝子が有用な場合もあり、同様に本発明の範囲に含まれる。ＡｇＲＰ突然変異は標的欠失突然変異、標的置換突然変異及び／又は標的挿入突然変異とすることができる。しかし、好適突然変異は欠失突然変異であり、特にＡｇＲＰ遺伝子の全部ではないとしても大半の欠失をもたらす欠失突然変異が特に好ましい。
【００４２】
アグーチ関連蛋白質をコードする遺伝子は３個のコーディングエキソン（エキソン２，３，及び４）と１個の可変的スプライス化非コーディングエキソン（エキソン１）をもつ。コードされる蛋白質は１３１アミノ酸蛋白質（ヒト蛋白質の場合には１３２）であり、α−ＭＳＨのアンタゴニストとしての適正な機能に重要であると考えられるシステインリッチカルボキシル末端をもつ。マウス配列はヒトＡｇＲＰポリペプチド配列と約８１％一致する。
【００４３】
好適欠失突然変異は任意場所の１ヌクレオチド欠失から、野生型ＡｇＲＰに関連するオープンリーディングフレームと関連シス作用調節配列を含む遺伝子全体の欠失までとすることができる。オープンリーディングフレーム内の小さい欠失は非機能的確率が最も高い蛋白質となるフレームシフト突然変異を生じるように３分割できないことが好ましい。任意のこのような３分割できない小さい欠失は非機能的切型の蛋白質産物の作製可能性を増すようにオープンリーディングフレームの５’領域にターゲティングすることが好ましい。しかし、上述のように、欠失突然変異は機能的ＡｇＲＰ蛋白質の発現阻害を確実にするようにＡｇＲＰ遺伝子の全部ではないとしても大半に及ぶことが好ましい。
【００４４】
ＡｇＲＰノックアウトターゲティングベクターは当分野で公知の方法により作製することができる。本発明の実施例ではマウスゲノムＤＮＡライブラリーをマウスＡｇＲＰプローブでスクリーニングした。２３ｋｂに亘るマウスゲノムクローンを単離し、５．２ｋｂ  ５’配列（長いアーム）と２．２ｋｂ  ３’配列（短いアーム）と陽性選択用ｐｇｋ−ｎｅｏ遺伝子及び陰性選択用ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子から構成される遺伝子ターゲティングベクターを構築した。この構築物を直鎖化し、ＡＢ２．２  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、陽性及び陰性選択のためにＧ４１８／ＦＩＡＵと共に培養した。１０個の陽性クローンを増殖と胚盤胞へのマイクロインジェクションに選択し、キメラマウスを作製した。
【００４５】
細胞が動物に天然の機能的ＡｇＲＰ遺伝子を欠失する動物を獲得するための方法は全般に天然ＡｇＲＰ遺伝子又は別の染色体位置に改変ＡｇＲＰを挿入することを含む。トランスジーンは胚性幹細胞に導入することができる。ＥＳ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した移植前の胚から得られ、胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓら，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら，（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５−９０６９；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４４５−４４８）。トランスジーンはエレクトロポレーション、リポフェクション、ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション又はレトロウイルス媒介形質導入等の種々の標準技術によりＥＳ細胞に効率的に導入することができる。その後、得られた形質転換ＥＳ細胞を胚盤胞に注入後、偽妊娠動物に移植することができる。その後、導入したＥＳ細胞は集落形成し、得られるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１４６８−１４７４）。代替態様では、トランスジーン標的胚性幹細胞を受精卵又は桑実胚と同時培養した後に雌に移植することができる。
【００４６】
妊娠後に得られる動物はキメラファウンダートランスジェニック動物である。ファウンダー動物を別態様で使用し、野生型動物と交配すると、改変ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合性のＦ１動物を生産することができる。別態様では、これらのヘテロ接合動物を交配すると、体細胞と生殖細胞が改変ＡｇＲＰ遺伝子に関してホモ接合性であり、従って機能的ＡｇＲＰ遺伝子を欠失する生存可能なトランスジェニック胚が得られる。他の態様では、ヘテロ接合動物を使用して細胞系を生産することができる。好適態様では、動物はマウスである。
【００４７】
遺伝子標的トランスジェニックマウスの作製における遺伝子標的ＥＳ細胞の使用は１９８７年に記載され（Ｔｈｏｍａｓら，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２）、他の文献にも記載されている（Ｆｒｏｈｍａｎら，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：１４５−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ，（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．５：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら，（１９８９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６：４８１−４９２；Ｗａｇｎｅｒ，（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３０２５−３０３２；Ｂｒａｄｌｅｙら，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４−５３９）。更にいずれも参考として本明細書中に援用されているＣａｐｐｅｃｃｈｉとＴｈｏｍａｓの１９９５年１１月７日発行の米国特許第５，４６４，７６４号、Ｂｅｒｎｓらの１９９８年８月４日発行の米国特許第５，７８９，２１５号も参照。従って、本発明のＡｇＲＰ欠損動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔を作製するための技術は当分野で入手可能である。標的組換えイベントと得られるノックアウトマウスの評価方法も当分野で容易に入手可能であり、公知である。このような方法としては限定されないが、ＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーションによる標的対立遺伝子の検出、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション並びにウェスタンブロットによるＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白質の検出が挙げられる。
【００４８】
本発明の別の側面は天然ＡｇＲＰヌルバックグラウンドで非天然ＡｇＲＰを発現するトランスジェニック非ヒト動物である。特定態様では、ヌルバックグラウンドは非機能的な改変天然ＡｇＲＰ遺伝子をもつ動物（即ちノックアウト）を生産することにより作製される。動物は改変ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合性（即ち２倍体ゲノムの１対の染色体の各々に遺伝子の異なる対立遺伝子形をもつ）でもよいし、ホモ接合性（即ち２倍体ゲノムの１対の染色体の各々に同一形の遺伝子をもつ）でもよいし、ヘミ接合性（即ち２倍体ゲノムの１対の染色体の一方のみに遺伝子をもつ）でもよいし、非天然ＡｇＲＰ遺伝子に関してホモ接合性でもよい。好適態様では、動物はマウスである。特定態様では、非天然ＡｇＲＰ遺伝子は野生型又は突然変異対立遺伝子、好ましくは野生型又は突然変異ヒト対立遺伝子とすることができる。別態様では、非天然ＡｇＲＰ遺伝子はプロモーターに機能的に連結している。本明細書で使用する機能的に連結とは相互の相対方向が変化してもよい２つのエレメント間の機能的結合を表すために使用する。この特定例では、当分野で自明の通り、遺伝子構築物においてコーディング配列から種々の距離に配置しながらコーディング配列の発現を指令するようにプロモーターを遺伝子のコーディング配列に機能的に連結できる。別態様は本発明のこの側面の動物に由来する細胞系と細胞である。
【００４９】
本発明の別の側面は天然ＡｇＲＰヌルバックグラウンドに非天然ＡｇＲＰ遺伝子を含むトランスジーンをもつことを特徴とするトランスジェニック動物とその作製方法である。本明細書に開示する１方法は細胞が機能的ＡｇＲＰ蛋白質をコードする天然遺伝子と改変された天然ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合性であるトランスジェニック動物を提供する段階を含む。非天然ＡｇＲＰ遺伝子を含むトランスジーンに関してヘミ接合性である本発明のトランスジェニック動物とこれらの動物を交配すると、改変された天然ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合性であると同時に非天然ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘミ接合性である動物が得られる。このような動物を交配すると、非天然ＡｇＲＰに関してホモ接合性又はヘミ接合性であり、改変天然ＡｇＲＰ遺伝子に関してホモ接合性又はヘテロ接合性である動物が得られる。特定態様では、上記開示方法の段階で生産した動物の任意のものから細胞を単離し、本発明の１側面を形成する細胞系を生産する。
【００５０】
本発明のトランスジェニック動物及び細胞は代謝及び最終的に体重の調節における非天然ＡｇＲＰのｉｎ  ｖｉｖｏ機能の判定に有用である。これらの動物は非天然ＡｇＲＰの野生型及び突然変異体対立遺伝子の種々の形態について天然ＡｇＲＰヌル欠損を救済する能力を判定するのにも有用である。これらの動物は種々の化合物が非天然ＡｇＲＰの発現又は活性のｉｎ  ｖｉｖｏモジュレーターとして作用する能力を確認及び試験するため、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に用いる培養用細胞を提供するためにも有用である。
【００５１】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物としては非ヒト哺乳動物種が挙げられ、限定されないが、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラット、トランスジェニックモルモット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックヤギ、トランスジェニック非ヒト霊長類（例えばチンパンジー、アカゲザル及びアフリカミドリザル）及びトランスジェニックウシが挙げられる。トランスジェニックマウスが好ましく、本明細書で例示する。
【００５２】
本発明の特定側面はノックアウトトランスジェニックマウスを作製し、これらの人為操作された動物の体内で種々の潜在的モジュレーターがどのように相互作用するかを試験することにより本発明により可能になったエネルギー代謝とその関連疾患に関連するＡｇＲＰの複雑な機能の分析に関する。本明細書により詳細に記載するように、天然野生型遺伝子は全能性ＥＳ細胞で選択的に不活化され、本発明のトランスジェニックマウスを作製するために使用される。任意遺伝子領域を不活化する技術や、標的相同組換えを使用して特定変異を染色体対立遺伝子に挿入することにより任意遺伝子領域を任意の所望の突然変異に改変する技術が利用可能である。マウスＡｇＲＰノックアウトを生産できるか否かは現在まで分かっていなかった。従って、本発明はＡｇＲＰ蛋白質の欠損生産を生じるように破壊ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合性又はホモ接合性である２倍体動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹仔に関する。細胞、胚及び非ヒトトランスジェニック動物は野生型レベル未満のＡｇＲＰ活性を生じるようにＡｇＲＰ対立遺伝子の少なくとも１個を突然変異させたＡｇＲＰの２個の染色体対立遺伝子を含む。破壊ＡｇＲＰ遺伝子に関してホモ接合性である２倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは野生型２倍体細胞に比較して少なくとも約５０％〜約１００％のＡｇＲＰ活性低下を示すことができる。破壊ＡｇＲＰ遺伝子に関してヘテロ接合性である２倍体マウス細胞、胚又は非ヒトトランスジェニックマウスは野生型２倍体細胞に比較して少なくとも約１０％〜約１００％のＡｇＲＰ活性低下を示すことができる。突然変異ＡｇＲＰ遺伝子に関してホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性であるマウス細胞における転写、発現及び／又は機能的ＡｇＲＰ活性のレベルを測定するために公知分子生物学技術を使用することは当業者が予想可能である。従って、本発明は特にホモ接合性、ヘテロ接合性又はヘミ接合性トランスジェニックマウスを作製し、これらの人為操作された動物の体内で種々の潜在的モジュレーターがどのように相互作用するかを試験することによるエネルギー代謝とカロリー利用に関連するＡｇＲＰの複雑な機能の分析に関する。
【００５３】
好適態様では、本明細書の記載によるトランスジェニック動物を提供し、動物を候補化合物に暴露し、総エネルギー代謝に及ぼす前記候補化合物の効果と他の関連生化学的及び生理的応答を測定することによりアッセイを実施する。（例えばエネルギー消費及び／又は利用の）これらの応答の種々の尺度が当分野で周知であり、理解されている。本明細書では例示の目的で呼吸商を尺度とする。しかし、エネルギー代謝及び／又は他の関連生化学的及び生理的応答に及ぼす効果を検出することが可能な当分野で利用可能な他の任意尺度が本明細書に記載するアッセイで使用するのに適切であるとみなされる。代謝率はこのような１例である。代謝率（ｋｃａｌ／ｈ）は式：（３．８１５＋１．２３２×ＲＥＲ）×ｖＯ２から計算することができ、式中、ＲＥＲは呼吸交換比［ＣＯ２発生容量（ｍｌ／ｋｇ体重／ｈ）／Ｏ２消費容量（ｍｌ／ｋｇ体重／ｈ）］であり、ｖＯ２は毎時消費容量である。得られる結果に及ぼす各種飼料の効果を測定するためには、試験マウスの飼料を変えることができる。好適態様は試験動物の少なくとも１種に高脂肪飼料（例えばＢｉｏｓｅｒｖｅ社，Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ，ＮＪの製品Ｂｉｏｓｅｒｖ  Ｆ３２８２，脂肪由来５４％ｋｃａｌ）又は中〜高脂肪（例えばＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ社，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪの製品Ｄ１２２６６Ｂ，３２％ｋｃａｌ脂肪由来）を摂取させる。
【００５４】
得られた測定値を化合物に暴露していない遺伝的に類似又は同一の動物における測定値と比較することができる。このような測定を容易にする１方法としてはＡｇＲＰノックアウト及び野生型マウスの両者に高脂肪飼料を与えて肥満を促進する（飼料誘発肥満症［ＤＩＯ］）。肥満になった後に、潜在的ＡｇＲＰアンタゴニストが（恐らく食欲抑制剤と併用した場合にも）エネルギー代謝又はカロリー利用に与える効果を野生型マウスで測定することができる。野生型マウスで得られた結果を（日中に優先的に脂肪を酸化している）ＡｇＲＰノックアウトマウス及び未処置野生型マウスで得られた結果と比較することにより、エネルギー代謝／カロリー利用に及ぼすアンタゴニストの効果に関する任意指標を識別することができる。肥満症や糖尿病等の他の関連疾患におけるＡｇＲＰモジュレーターの効果を試験するにも同様のプロトコールが有用であると思われる。従って、ＡｇＲＰの調節に関連する任意数の複雑なイベントを試験するために本発明の非ヒトトランスジェニック動物を使用することは当業者が予想可能である。ＡｇＲＰは副腎で発現され、副腎はストレス、代謝及びステロイド合成に関与（又は関連）するという事実に照らして、付加例として、限定するものではないが、副腎に関連する事態（例えば副腎摘出、下垂体摘出、慢性ストレス、及びヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼインヒビター治療）におけるＡｇＲＰの潜在的役割を試験することもできる。
【００５５】
本明細書に記載する（ＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ蛋白質を使用する）任意ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞及び／又は膜アッセイは本明細書に開示するトランスジェニック動物の任意のものと併用することができ、限定されないが、ＡｇＲＰ−／−ノックアウトマウス及び／又は当該二重モジュレーターを選択するためにはＡｇＲＰ−／−ＮＰｙ−／−二重ノックアウトマウスと併用することができ、あるいはＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ又はメラノコルチン受容体やグレリン受容体等の受容体を調節することができる他の任意化合物と併用し、本明細書に開示する種々の疾患及び疾病の治療に有用な改良化合物を提供することができる。これらの二重ノックアウトマウスは本明細書に記載する疾患に関連する他のプロセスの調節に関与するモジュレーター（この場合もＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹのアゴニスト又はアンタゴニスト）の選択にも有用であり、このような疾患としては限定されないが、肥満症、糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、男性及び女性性機能不全（インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む）、皮膚黒化、食欲不振、悪液質、ＧＨ、ＩＧＦ１機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるようなヤセ型低体重、ＧＨ欠損に起因することを特徴とする他の状態、悪液質、並びに鬱病と不安に関連する疾患が挙げられる。
【００５６】
好ましくは本明細書に記載するようなトランスジェニック又は野生型動物に当該化合物を投与してＡｇＲＰに及ぼす化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を測定し、更に非ヒト動物に及ぼす化合物投与の生物学的及び生理的効果を測定することにより、ＡｇＲＰにｉｎ  ｖｉｔｒｏ調節効果を示すスクリーニング後の化合物をｉｎ  ｖｉｖｏ分析することは本発明の範囲に含まれる。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ試験は単独で実施してもよいし、非限定的な例として例えばα−ＭＳＨ、又はアグーチ蛋白質等の公知ＭＣ−３Ｒ及び／又はＭＣ−４Ｒリガンドと併用して実施してもよい。
【００５７】
他の神経ペプチドに媒介されるか又は上下調節されていると思われる他の経路に対する感受性を測定し、これらの経路を調節する化合物の感受性の変化を測定することも本発明の必須部分である。この点では、ＭＣ−３Ｒ、ＭＣ−４Ｒ又は他のメラノコルチン受容体、ＮＰＹ受容体、ガラニン、グレリン受容体、ＭＣＨ受容体、インスリン受容体、オレキシン受容体、ボムベシンファミリー受容体に属する受容体（ＢＲＳ−３、ニューロメディン受容体、ガストリン放出ペプチド受容体）、モチリン受容体、ニューロメディンＵ受容体、アドレナリン受容体、レプチン受容体、ＳＴＡＴ及びＳＯＣ転写因子のモジュレーター、ホスホジエステラーゼ酵素等に作用する化合物の試験が本発明の非ヒトトランスジェニック動物の使用範囲に含まれ、このような動物としては限定されないが、本明細書に記載し、実施例に例示するように、改変された天然ＡｇＲＰ遺伝子に関してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合性のトランスジェニックマウスと、ＡｇＲＰ及びＮＰＹ天然遺伝子の二重ノックアウトに関してホモ接合、ヘテロ接合又はヘミ接合性のトランスジェニックマウスが挙げられる。この点で、本発明の１好適側面はｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞及び／又は膜アッセイにより初期同定することができるＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ蛋白質を調節することが示される化合物の選択に関する。ＡｇＲＰ及び／又はＮＰＹ遺伝子を改変したトランスジェニックマウスに投与し、本明細書に開示するような生物学的特徴を測定することによりこのような任意化合物を更に試験することができる。
【００５８】
化合物は適当な用量で単独使用することができる。あるいは、他の薬剤を同時又は逐次投与することが望ましい場合もある。
【００５９】
本発明は本発明の新規治療方法で使用するのに適した局所、経口、全身及び非経口医薬製剤を提供することも目的とする。化合物を含む組成物は慣用投与ビヒクル中の広範な治療剤形で投与することができる。例えば、タブレット、カプセル（各々定時放出製剤及び持続放出製剤を含む）、ピル、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、溶液、懸濁液、シロップ及び乳剤等の経口剤形又は注射により投与することができる。同様に、静脈内（ボーラス剤と輸液の両者）、腹腔内、皮下、閉鎖の有無を問わずに局所、又は筋肉内形態で投与することもでき、いずれも薬剤分野の当業者に周知の形態を使用する。
【００６０】
２種以上の活性剤を別個の製剤で使用して併用治療する場合には、活性剤を同時に投与してもよいし、各々時間をずらせて投与してもよい。
【００６１】
従って、本発明はＡｇＲＰの調節に関連するエネルギー代謝とカロリー利用に関する病因論の側面の研究に有用なトランスジェニック動物、特にＡｇＲＰ−／−マウス、細胞及びアッセイから構成されるモデルシステムを提供することが明らかである。種々のアッセイはエネルギー代謝とカロリー利用全般に効果のある化合物のスクリーニングと選択に有用であり、これらの化合物を更に試験すると共に、疾患を制御するために選択化合物をヒトに投与する可能性を試験するためにも有用であり、このような疾患としては限定されないが、（食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取量低下又は炭水化物欲求低下により）肥満症、（グルコース耐性亢進、インスリン抵抗性低下により）糖尿病、高血圧、高脂血症、骨関節炎、男性及び女性性機能不全（インポテンス、性欲低下及び勃起障害を含む）、皮膚黒化、食欲不振、悪液質、ＧＨ、ＩＧＦ１機能低下に関連する成長障害、虚弱高齢者に生じるようなヤセ型低体重、ＧＨ欠損に起因することを特徴とする他の状態、サイトカイン放出調節、並びに皮膚黒化が挙げられる。好適対象はヒトであるが、他の哺乳動物も本発明の要素により同定される化合物の有効な宿主であり、限定されないが、他の哺乳動物、特にイヌ及びネコ種、農耕用動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ）等の家畜哺乳動物や、齧歯類及び他の非家畜哺乳動物が挙げられる。ＡｇＲＰがエネルギー代謝とカロリー利用に関与するという知見によると、選択したＡｇＲＰアンタゴニストがエネルギー代謝を調節し、その関連疾患を治療する効率を直接測定することが可能になる。ＡＧＲＰ／ＮＰＹ二重ノックアウトマウスはＡｇＲＰ、ＮＰＹ又は両者の活性及び／又は発現に作用する化合物を試験するために使用することができる。
【００６２】
以下の実施例は例証の目的で記載し、種々の他の態様が当業者に自明であるので、以下の実施例は発明の範囲を制限するものではない。実施例に記載する全動物プロトコールはＲａｈｗａｙ，ＮＪに所在のＭｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認証された。マウスは空気シャワー口付き防壁施設又は特定病原体を含まない（ＳＰＦ）施設でマイクロアイソレーターケージ（Ｌａｂｐｒｏｄｕｃｔｓ（登録商標））に収容した。
【実施例１】
【００６３】
ＡｇＲＰターゲティングベクターの構築とＡｇｒｐ−／−マウスの作製
ヒトＡｇｒｐ（Ｓｈｕｔｔｅｒら，（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．１１：５９３−６０２）に由来するプライマーを使用してＰＣＲにより作製した４０２ｂｐマウスＡｇｒｐ  ｃＤＮＡプローブ（配列番号９）：
【００６４】
【化１】
2006506968.tif 000003
を用いてマウス１２９ＳｖＥｖゲノムライブラリー（Ｌａｍｂｄａ  ＦＩＸ  ＩＩベクター，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングした。オーバーラップする２３ｋｂのマウスＡｇｒｐゲノム配列を含む２個の陽性クローンを単離した。Ａｇｒｐをコードする領域と周囲領域を別々にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングした。ネオマイシン耐性カセットを挟むように、ｐＫＯ  Ｓｃｒａｍｂｌｅｒ  １９０１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ部位間に５．２ｋｂの５’ＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ制限フラグメントを挿入し、ＥｃｏＲＩ部位に２．２ｋｂの３’ＳｐｅＩ制限フラグメントを挿入することによりＡｇｒｐターゲティングベクターを作製した。ターゲティングベクターでは、完全ペプチドコーディング配列に亘るマウスＡｇｒｐの１．０３ｋｂ領域をネオマイシン耐性カセットで置換した（図９）。ターゲティングベクターをＳａｌＩ消化により直鎖化し、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを使用してエレクトロポレーションによりＡＢ２．２  ＥＳ細胞（Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に形質転換した。トランスフェクトした細胞を夫々陽性及び陰性選択のためにＧ４１８及びＦＩＡＵと共に培養した。約８００個のクローンを選択し、１０個の正しくターゲティングされたＥＳ細胞クローンをサザンブロット分析により同定した。ターゲティングしたＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６胚盤胞に注入し、偽妊娠雌マウスに移植した（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９９３），Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ（ｅｄ．），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕら，ｐｐ．１０７−１３６）。数匹のキメラ子孫が突然変異体Ａｇｒｐ対立遺伝子の生殖細胞系伝達を生じ、２種の独立Ａｇｒｐ＋／−系を樹立した。
【実施例２】
【００６５】
Ａｇｒｐマウスのゲノタイピング
作製した多数のマウスの遺伝子型同定を容易にするために、ノックアウト対立遺伝子を野生型対立遺伝子からＰＣＲにより区別するように３種のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。プライマーは以下の通りである。
ＡＧ５’  ：５’−ＡＡＡ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＡＣ  ＡＣＣ  ＣＣＧ  ＧＴ−３’（配列番号１２）；
ＡＧＫＯ３’  ：５’−ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  Ｔ−３’（配列番号１３）；
ＮＥＯ５’  ：５’−ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  Ｔ−３’（配列番号１４）；
プライマー対ＡＧ５’及びＡＧＫＯ３’は野生型ＡｇＲＰ対立遺伝子から３１１ｂｐフラグメントを作製し、プライマー対ＮＥＯ５’及びＡＧＫＯ３’は突然変異体ＡｇＲＰ対立遺伝子から３８３ｂｐフラグメントを作製する。
【００６６】
３’プローブとコーディング領域プローブを使用してサザンブロット分析によりＰＣＲゲノタイピングの結果を確認した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ｐｐ．９．３１−９．５８）。３’フランキングプローブはターゲティングベクターの短いアームの３’に位置する０．７５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ制限フラグメントである。ＢａｍＨＩ消化後、プローブは野生型Ａｇｒｐ対立遺伝子に由来する１１．０ｋｂバンドと、突然変異体対立遺伝子に由来する４．０ｋｂバンドを検出する。コーディング領域プローブは開始コドンの５’の５３ｂｐから終止コドンの５’の９７ｂｐまでの領域に亘るＡｇｒｐの０．７８ｋｂ  ＫｐｎＩ制限フラグメントである。コーディング領域プローブはＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡに由来する１１．０ｋｂ野生型バンドを検出するが、突然変異体対立遺伝子に由来するシグナルは検出しない（図１０）。
【実施例３】
【００６７】
子孫マウスの生産と特性決定
Ａｇｒｐ＋／−マウスを交配し、予想メンデル比で全３種の遺伝子型の子孫を生産した（Ａｇｒｐ＋／＋マウス，３１０；Ａｇｒｐ＋／−マウス，６６２；Ａｇｒｐ−／−マウス，３４５）。サザンブロット分析（図１０）とｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（図１１）により、夫々Ａｇｒｐ遺伝子とｍＲＮＡがＡｇｒｐ−／−マウスに存在しないことを確認した。生殖細胞系伝達キメラの子孫であるヘテロ接合Ｆ１  Ａｇｒｐ＋／−マウスを交配し、摂食及び行動分析用としてＦ２  Ａｇｒｐ＋／＋（野生型）、Ａｇｒｐ＋／−及びＡｇｒｐ−／−同腹仔群を作製した。全試験群は５０％Ｃ５７ＢＬ／６；５０％１２９ＳｖＥｖの類似遺伝子バックグラウンドをもつ。
【００６８】
Ａｇｒｐ−／−マウスは雌雄いずれも生殖能力があり、顕性組織学的又は病理学的異常を示さなかった。群毎に収容した野生型、Ａｇｒｐ＋／−及びＡｇｒｐ−／−同腹仔マウスは雌雄いずれも同様の成長率を示した（図１２Ａ及びＢ）。血清パラメーターを調べた処、雌Ａｇｒｐ−／−マウスの血漿グルコース、レプチン、インスリン、トリグリセリド及び遊離脂肪酸値は正常であることが判明した（表１）。マウスは採血前４時間絶食させた。数値は平均±ＳＥＭである。
【００６９】
【表１】
2006506968.tif 000004
【００７０】
自由摂食させた雄（図１３）及び雌（データは示さず）Ａｇｒｐ−／−マウスはいずれも野生型同腹仔マウスと同等レベルの摂食量であった。同様に、雌雄Ａｇｒｐ−／−マウスは４８時間の飼料剥奪後に反射性摂食亢進の欠損を示さなかった（データは示さず）。
【００７１】
自発運動を試験し、総エネルギー消費へのその寄与を評価した。１２時間明／１２時間暗の環境で維持したＡｇｒｐ−／−マウスは正常レベルの日常歩行運動（移動距離，Ａｇｒｐ−／−雄：１７８．１±２８．８ｍ；野生型雄：１２６．３±１５．６ｍ，ｎ＝８／遺伝子型，Ｐ＞０．０５；Ａｇｒｐ−／−雌：１１３．７±２６．２ｍ；野生型雌：９８．９±１３．０ｍ，ｎ＝７〜８／遺伝子型，Ｐ＞０．０５）と日常微細運動（データは示さず）を示した。
【００７２】
代謝率の大まかな尺度として深部体温を評価した。雌雄いずれのＡｇｒｐ−／−も野生型同腹仔マウスと同等の深部体温であった（データは示さず）。
【００７３】
ロータロッド結果と握力を測定し、運動協調を評価した。雌雄いずれのＡｇｒｐ−／−及び野生型同腹仔マウスもロータロッド結果は同等であり、同等の前脚及び後脚握力を示した（データは示さず）。
【００７４】
結論：Ａｇｒｐ−／−マウスは生存可能であり、正常な自発運動、成長率及び摂食量を示す。同様に、Ａｇｒｐ−／−；ＮＰＹ−／−マウスは生存可能であり、摂食行動又は体重が正常であると思われる。
【実施例４】
【００７５】
Ｉｎ  Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
Ａｇｒｐ−／−及び年齢と性別を一致させた野生型対照マウスをＣＯ２麻酔下に断頭した。すぐに脳を取出して−４０℃イソペンタンで凍結させ、使用時まで−８０℃で保存した。冠状脳切片（１４μＭ）を−１７℃にて低温ミクロトームで切り、熱したマイクロスライドに載せて解凍した。氷冷４％リン酸緩衝パラホルムアルデヒドで固定後、組織切片を使用時まで４℃で９５％エタノールに保存した。マウスＡｇＲＰハイブリダイゼーションプローブは、ＡｇＲＰのコーディング領域に対する下記配列を有する、２種のオーバーラップしないアンチセンスオリゴヌクレオチドの等モル混合物から構成される。
オリゴ２９６（マウスＡｇＲＰ．４５量体，５１％ＧＣ）：５’−ＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号１０）
オリゴ２９７（マウスＡｇＲＰ．４５量体，５３％ＧＣ）：５’−ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１１）。
【００７６】
プローブは［α−３３Ｐ］ｄＡＴＰと末端トランスフェラーゼを用いて末端標識し、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は従来記載されている通りとした（Ｇｕａｎら，（１９９８）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５９：２７３−２７９）。
【００７７】
従来記載されているようにｍＲＮＡレベルの定量分析を行った（Ｇｕａｎら，（１９９８）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．５９：２７３−２７９）。要約すると、オートラジオグラフを作製し、ＭＣＩＤ／Ｍ２画像分析器（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）で分析した。コード化画像にブラインドで密度測定を実施した。複数の隣接脳切片の各領域の光学密度を定量し、組織ｍＲＮＡレベル（ｎＣｉ／ｇ脳組織）を表すように変動量の３３Ｐ−ｄＡＴＰを含む一連の脳ペーストに校正した１４Ｃ標識オートラジオグラフ標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）と比較した。次に各脳領域の各神経ペプチド／受容体の平均値をマウス毎に獲得し、両側対ｔ検定を使用して結果を統計分析した。
【実施例５】
【００７８】
食欲行動の評価
Ａｇｒｐ＋／＋、Ａｇｒｐ＋／−、及びＡｇｒｐ−／−マウスを実験開始の少なくとも７日前に約１月齢で各マイクロアイソレーターケージに個別収容した。ワイヤーケージ頂部に飼料ホッパーを取付けて普通マウス飼料（Ｔｅｋｌａｄ  ７０１２：５．６７％ｋｃａｌ脂肪由来；３．４１ｋｃａｌ／ｇ，Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）をペレット飼料として９．５〜１０週齢雄マウスに摂取させ、３日間毎日体重測定した。連続３日間に亘り１匹１日当たりの平均飼料摂取量として摂食量を報告する（Ａｇｒｐ＋／＋，ｎ＝１２；Ａｇｒｐ＋／−，ｎ＝１０；Ａｇｒｐ−／−，ｎ＝１２）。
【実施例６】
【００７９】
野生型及びＡｇｒｐ−／−マウスにおけるＮＰＹ及びＭＣＨの発現レベル
Ｎｐｙ−／−マウスにおける摂食表現型の欠損を説明するためにＡｇＲＰによる補償が提言されている（Ｃｏｗｌｅｙら，（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：１５５−１６３；及びＭａｒｓｈら，（１９９９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８４８：６６−７７）。この仮説を裏付ける証拠として、ｉ）ＮＰＹとＡｇＲＰはある種の弓状核ニューロンでほぼ排他的に同時発現され（Ｂｒｏｂｅｒｇｅｒら，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３１２８−３１３３；Ｈａｈｎら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １：２７１−２７２；Ｏｌｌｍａｎｎら，（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８  ：１３５−１３８；Ｓｈｕｔｔｅｒら，（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１１：５９３−６０２）；ｉｉ）飢餓に応答して両者ペプチド及び対応するｍＲＮＡのレベルが増加し；ｉｉｉ）Ｎｐｙ−／−マウスの中枢に投与したＡｇＲＰ８３−１３２に対する感受性が増加し（Ｍａｒｓｈら，（１９９９）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．８４８：６６−７７）；およびｉｖ）ＮＰＹはＭｃ３ｒとＭｃ４ｒのアゴニストであるＭＴＩＩによるシグナル伝達を機能的に拮抗できることが知見されている（Ｃｏｗｌｅｙら，（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：１５５−１６３）。ＡｇＲＰがＮＰＹ−／−マウスにおけるＮＰＹ欠損を補償できるか否かを試験するために、Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−マウス系列を作製した。Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−マウスは生存可能であり、明白な摂食及び体重欠損がなく、明らかに正常である。
【００８０】
ＡｇＲＰ−／−マウスにおけるＮＰＹ及び他の摂食調節剤の役割を洞察するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施し、５か月齢雄動物における脳ｍＲＮＡレベルをＮＰＹ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）、ＰＯＭＣ、ＭＣ３ｒ及びＭＣ４ｒについて測定した。定量分析によると、ＮＰＹ  ｍＲＮＡレベルはＡｇＲｐ−／−マウスで有意変化がないことが判明した（図１４）。
【００８１】
他方、データによると、ＭＣＨ  ｍＲＮＡはＡｇＲＰ−／−マウスの視床下部外側野で低度（９％）であるが、一貫して増加している（Ｐ＜０．０５；ｎ＝５）（図１４）。ＡｇＲＰとＮＰＹほど強力に摂食を刺激するわけではないが、ＭＣＨは食欲調節においてＡｇＲＰとＮＰＹの下流で作用すると一般に考えられている食欲促進ペプチドである。低度ではあるが、ＭＣＨ  ｍＲＮＡに観察された増加はＡｇＲＰ欠損の１種の補償を示すかもしれない。
【００８２】
ＰＯＭＣ、ＭＣ３ｒ及びＭＣ４ｒに関するｍＲＮＡレベルの変化は検出されなかった。
【実施例７】
【００８３】
野生型及びＡｇｒｐ−／−マウスの間接的熱量測定
１６チャンバー開回路Ｏｘｙｍａｘシステム（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して間接的熱量測定により呼吸商（ＲＱ）を測定した。雄１６週齢ｇｒｐ−／−（ｎ＝１０）及びＡｇｒｐ＋／＋（ｎ＝１０）同腹仔に飼料（Ｔｅｋｌａｄ  ７０１２）と水を自由に摂取させながら１２時間明暗サイクル（明：８ＡＭ〜８ＰＭ）にて２１〜２４℃で維持した。動物は特別に組立てたプレキシガラスケージ（２０×１０．５×１２ｃｍ）に個別収容し、０．５３リットル／分の流速で通風した。各チャンバーからの排気を１５分間隔で７５秒間サンプリングした。サンプル空気を逐次Ｏ２及びＣＯ２分析器（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に通してＯ２及びＣＯ２濃度を測定した。ＲＱはＯ２消費容量（ｍｌ／ｋｇ体重／時）当たりのＣＯ２発生容量（ｍｌ／ｋｇ体重／時）から計算される呼吸商である。動物は試験前にチャンバーに馴化させた。各動物の応答を別時点で３回記録し、１０：３０ＡＭ〜５：３０ＰＭの全読取値の平均として平均１日ＲＱ応答を動物毎に測定した。
【００８４】
図１８は１日の各種時間における野生型及びＡｇｒｐ−／−マウスのＲＱを示す。ＡＧＲＰ−／−マウスの平均日中ＲＱ応答は０．８５±０．０３であり、野生型マウスの０．９１±０．０４と有意差があった（Ｐ＜０．０１）。Ｆｌａｔｔら，（１９９１）Ｊ．Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２：１９３−２０２により提案された定常状態蛋白質酸化の前提の下に、Ｅｌｉａ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｓｅｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ（１９９２）７０：６８−１３１により提案された炭水化物と脂肪酸化の簡易モデルを使用して、ＲＱ測定値から脂肪と炭水化物の相対利用率を算出することができる。この簡易モデルを使用した処、ＡＧＲＰ−／−マウスは脂肪に由来するその日中エネルギーが野生型対照マウスよりも約２０％多いことが判明した。呼吸ガス交換から計算したＲＱは実験知見を裏付け、Ａｇｒｐ−／−マウスは野生型マウスに比較して日中ＲＱの低下を示す。ＡＧＲＰは実際にＲＱを変化させない。これらの知見からＡＧＲＰはカロリー利用の調節に関与していると考えられる。
【００８５】
ＲＱに認められるような微妙な変化はＡＧＲＰの不在がエネルギー恒常性に実際の役割を果たしていることを示唆している。従って、ＡＧＲＰの急性調節は体重及び肥満の調節を生じ得る代謝変化のメカニズムを提供すると考えられる。
【実施例８】
【００８６】
Ａｇｒｐ／Ｎｐｙ二重ノックアウトマウスの作製と特性決定
Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−マウスを作製するために、Ａｇｒｐ＋／−；ＮＰＹ＋／＋マウスをＡｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ−／−マウスと交配した。得られたＡｇｒｐ＋／−；Ｎｐｙ＋／−マウスをＡｇｒｐ＋／＋Ｎｐｙ−／−マウスと戻し交配し、Ａｇｒｐ＋／−；−Ｎｐｙ−／−マウスを作製した後に同系交配してＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−及びＡｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ−／−マウスを作製した。同時に、Ａｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ＋／−マウスをＡｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ＋／＋マウスと交配し、類似遺伝子バックグラウンドをもつＡｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ＋／＋野生型対照マウスを作製した。全試験群は１２．５％Ｃ５７ＢＬ／６；８７．５％１２９ｓｖの類似遺伝子バックグラウンドとした。
【００８７】
一般に、Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−マウスは生存可能であり、明白な摂食及び体重欠損がなく、明らかに正常である。この結論は７週間普通飼料で維持した３か月齢Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−の成長率と摂食量（消費量）に基づく。図１５は雌雄マウスＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−（ｋｏｋｏ）マウスの成長率が野生型及びＡｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ−／−（ｗｔｋｏ）マウスと同等であることを立証している。図１６はマウスの摂食量がその遺伝子型に関係なく同等であったことを立証している。
【００８８】
４８時間の飼料剥奪後に野生型、Ａｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ−／−及びＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−マウスの摂食応答を評価した。Ａｇｒｐ−／−マウスと同様に、Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−マウスは正常な摂食亢進応答を示した（図１７）。従って、ＡｇＲＰとＮＰＹは食欲行動に有害な影響を与えることなく同時に除去できると結論することができる。
【実施例９】
【００８９】
野生型及びＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ノックアウトマウスの摂食量に及ぼすグレリンの効果
胃由来グレリンは最初に同定された末梢食欲促進ホルモンである（Ｋｏｊｉｍａら，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：６５６−６６０；Ｔｓｃｈｏｐら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：９０８−９１３；Ｎａｋａｚａｔｏら，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１９４−１９８）。グレリンは成長ホルモン分泌亢進能に加え、カロリー摂取を亢進すると共に体重と脂肪蓄積を増加することができる。グレリンがＣＮＳで神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）とアグーチ関連蛋白質（ＡｇＲＰ）により媒介される摂食に効果をもつことは多数の実験アプローチにより立証されており、例えば、グレリンにより誘発した摂食がグレリンとＮＰＹ及びＡｇＲＰに対する抗体の脳室内（ｉｃｖ）注射や、ＮＰＹ  Ｙ１受容体アンタゴニストによる薬物治療により阻止され（Ｎａｋａｚａｔｏら，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１９４−１９８；Ｗｒｅｎら，（２０００）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４１：４３２５−４３２８；Ｋａｍｅｇａｉら，（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０：２４３８−２４４３；Ｓｈｉｔａｎｉら，（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，２２７−２３２）、更に電気生理学的アプローチによると、グレリンはＮＰＹ／Ａｇｒｐニューロンを活性化すると同時にＰＯＭＣニューロンの活性を低下できることが立証されている（Ｃｏｗｌｅｙら（２００３）Ｎｅｕｒｏｎ，３７：６４９−６６１）。グレリンの食欲促進効果のメディエーターとしてのＡｇＲＰとＮＰＹの役割を更に実証するために、Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ノックアウト及び野生型対照マウスにグレリンを末梢投与した。
【００９０】
天然ヒト及びラットのグレリン（１−２８，Ｓｅｒ−３オクタノイル基）をＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡにより注文合成した。グレリン（１００μｌ食塩水中，ｉ．ｐ）、化合物Ａ（５％  Ｔｗｅｅｎ−８０と０．５％メチルセルロースを添加した水溶液２００μｌ中，ＰＯ）、又はビヒクルを１０：００時に投与し、摂食量を４時間後に測定した。
【００９１】
約１月齢のマウスを個別収容した。ワイヤーケージ頂部に飼料ホッパーを取付けて普通マウス飼料（Ｔｅｋｌａｄ  ７０１２：５．６７％ｋｃａｌ脂肪由来；３．４１ｋｃａｌ／ｇ，Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）をペレット飼料として摂取させた。
【００９２】
摂食量を平均±平均の標準偏差として報告し、対応のない両側非対スチューデントｔ検定により分析した。＜０．０５のＰ値を有意として報告した。
【００９３】
用量漸増実験の結果、明相中にヒトグレリン（３μｍｏｌｅ／ｋｇ）を１回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射すると、満腹野生型マウスの４時間摂食量は確実に増加した。飼料を自由摂取させたＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ノックアウトマウス及び野生型対照マウスにヒトグレリンを投与すると、野生型対照では４時間摂食量が１２０％増加したが、Ａｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ノックアウトマウスの摂食量には何ら効果がなかった（図１９）。この結果はＡｇＲＰとＮＰＹが循環グレリンの食欲促進効果の必須メディエーターであることを立証している。
【実施例１０】
【００９４】
グレリンアゴニスト化合物ＡのＩｎ  Ｖｉｔｒｏアッセイ
結合アッセイ：プラスミドベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に由来するヒトグレリン−Ｒ（ＧＨＳＲ１ａ）を発現する一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を用いて、従来記載されているように膜結合アッセイを実施した（Ｂｅｄｎａｒｅｋ，Ｍ．Ａ．ら（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４３７０−４３７６；Ｈｏｗａｒｄら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３，９７４−９７７；Ｐｏｎｇ，Ｓ．−Ｓ．ら，（１９９６）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１０，５７−６１）。従来記載されているように低張溶解により膜を調製し、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した２６。結合用緩衝液は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に、プロテアーゼインヒビターとして４ｇ／ｍＬロイペプチン（Ｓｉｇｍａ），４０ｇ／ｍＬバシトラシン（Ｓｉｇｍａ），５ｇ／ｍＬアプロチニン（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ），０．０５Ｍ  ＡＥＢＳＦ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），及び５ｍＭホスホラミドン（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加えた。［３５Ｓ］ＭＫ−０６７７（０．０５ｎＭ，比活性〜１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ  ｒｅｆ．２７）又は［Ｈｉｓ［１２５Ｉ］］−ヒトグレリン（０．１ｎＭ，比活性〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を競合試験リガンドの存在下又は不在下に膜蛋白質４μｇ／ウェルと結合させた。結合した膜を０．５％ポリエチレンイミンプレウェットフィルター（ＵｎｉＦｉｌｔｅｒ  ９６  ＧＦ／Ｃ，Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）で濾過した。フィルターを３回洗浄し（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％  ＢＳＡ）、乾燥し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  ２０（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）でカウントした。
【００９５】
比活性は５００ｎＭ未標識ヒトグレリンの存在下で実施した全結合と非特異的結合の差として定義される。Ｐｒｉｓｍ  ３．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用してＩＣ５０計算を実施した。ＩＣ５０値は３重に測定した。エクオリンバイオルミネッセンスアッセイ：ヒトグレリン受容体（ＧＨＳＲ１ａ）を発現する１種の安定な細胞系とエクオリン受容体蛋白質を使用してアゴニストにより誘発される細胞内カルシウム動員を従来記載されているように測定した（Ｈｏｗａｒｄら，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：９７４−９７７；Ｂｕｔｔｏｎ，Ｄ．；Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ  １４：６６３−６７１）。機能的ＥＣ５０値を３重に測定した。
【００９６】
ラット下垂体成長ホルモン（ＧＨ）放出：ラット下垂体前葉細胞の初代培養物からの成長ホルモン分泌を測定することにより化合物機能活性を評価した（Ｓｍａｌｌら，（１９９８）Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ７５−７６  ａｎｄ  ３０１−３０７）。ハンクス平衡塩溶液中２５０μｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅ  Ｉと０．５％トリプシンで酵素消化によりラット下垂体から細胞を単離した。細胞を培地に懸濁し、１．５×１０５個／ｍｌの濃度に調整し、この懸濁液１．０ｍｌを２４ウェルトレーの各ウェルに加えた。細胞を加湿５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気に３７℃で３〜４日間維持した。培地は０．３７％ＮａＨＣＯ３、１０％ウマ血清、２．５％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸、１％グルタミン、１％ナイスタチン、及び０．１％ゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭから構成した。化合物のＧＨ放出阻害能を試験する前に、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を加えた上記培地で細胞をまず２回１．５時間洗浄し、実験の開始直前に更に１回洗浄した。新鮮な培地１ｍｌを各ウェルに加えて３７℃で１５分間インキュベートした後に２０００×ｇで１５分間遠心して、いかなる細胞材料も除去することにより化合物を４重に試験した。上清液のＧＨを二重抗体ラジオイムノアッセイによりアッセイした。表２は化合物Ａのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合及び機能特性とグレリンの結合及び機能特性の比較を示す。
【００９７】
【表２】
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【実施例１１】
【００９８】
Ａｇｒｐ−／−単独ノックアウト、Ｎｐｙ−／−単独ノックアウト、及びＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ノックアウトマウスの摂食量に及ぼすグレリンアゴニスト化合物Ａの効果
強力な経口グレリンペプチド模倣化合物Ａの野生型及びＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ノックアウトマウスにおける摂食量に及ぼす効果も評価した。化合物Ａ（図２０）はヒトと動物で成長ホルモンの放出を促進することが知られている（その教示は参考として本明細書に援用されている米国特許第５，５７８，５９３に包括的に記載されている）グレリンアゴニストである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイから得られたデータによると、化合物Ａとグレリンはヒトグレリン受容体に対して比肩し得る結合親和性をもつことが立証された（表２）。化合物Ａの平均有効濃度（ＥＣ５０）は細胞内カルシウム動員アッセイとｉｎ  ｖｉｔｒｏ下垂体ＧＨ放出アッセイで夫々３．１及び０．７ｎＭであった。
【００９９】
グレリンアゴニスト化合物Ａに対する野生型Ｃ５７Ｂマウスの用量応答を測定するために、マウスに１、３、１０及び２０ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の用量の化合物Ａを経口（ＰＯ）投与し、明サイクル摂食量を測定した。摂食量に対する効果をアッセイした処、自由摂食させた満腹マウスに化合物Ａを投与すると、通常は非常に僅かしか摂食しない期間である日中の４時間摂食量が有意に増加した。摂食の最大刺激は用量３ｍｇ／ｋｇで得られた（図２１）。
【０１００】
図２２Ａに示すように、グレリン代用品として試験した場合に、５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０と０．５％メチルセルロースを加えた水溶液２００ｍｌ中３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを１回経口投与すると、野生型対照マウスの４時間日中摂食量は食塩水に比較して４倍増加した（化合物Ａ，０．５９±０．０６ｇに対して担体，０．１５±０．０４ｇ，Ｐ＜０．００１）。刺激の大きさはＮｐｙ−／−単独ノックアウトマウス（化合物Ａ，０．１７±０．０７ｇ対ビヒクル，０．０８±０．０２ｇ，Ｐ＜０．０５）では著しく低く、化合物ＡはＡｇｒ−／−；Ｎｐｙ−／−二重ヌルマウスには効果がなかった。別の群のＡｇｒｐ単独ノックアウトマウスとその野生型同腹仔も３ｍｇ／ｋｇ化合物Ａの経口投与により試験した。該化合物は野生型対照と同様にＡｇｒｐ−／−単独ノックアウトマウスでも有効であった（図２２Ｂ）。
【０１０１】
グレリンと化合物Ａに関するデータをまとめると、ＮＰＹを除去するとグレリンの摂食促進は著しく低下したが、ＡｇＲＰを失ってもそれだけでは循環グレリンのシグナル伝達は低下しないことが分かる。ＮＰＹ−／−単独ノックアウトマウスにおける摂食刺激から明らかなように、ＮＰＹ活性の損失はＡｇＲＰにより部分的に補償することができる。他方、ＮＰＹとＡｇＲＰの両方を除去すると、グレリン又はグレリンアゴニスト化合物Ａによるシグナル伝達は完全に失われた。要約すると、末梢グレリンによる摂食刺激はＮＰＹとＡｇＲＰを介して作用し、ＮＰＹが主要エフェクターである。従って、このデータから明らかなように、ＮＰＹとＡｇＲＰのｉｎ  ｖｉｖｏ機能の１つは末梢グレリンシグナル伝達を中継することである。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】マウスＡｇＲＰをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。図１、配列番号１に開示するマウスＡｇＲＰ遺伝子は従来にも開示されている（例えばＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ８９４８６参照）。このＤＮＡは好適ターゲット宿主であるＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ハツカネズミ）のＤＮＡである。
【図２】マウスＡｇＲＰのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】ヒトＡｇＲＰをコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４】ヒトＡｇＲＰのアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】マウスＮＰＹをコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図６】マウスＮＰＹのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図７】ヒトＮＰＹをコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図８】ヒトＮＰＹのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図９】マウス野生型Ａｇｒｐ対立遺伝子、ターゲティングベクター、及び突然変異体対立遺伝子を示す模式図である。突然変異体対立遺伝子は野生型対立遺伝子とターゲティングベクターの二重相互相同組換えに由来する。Ｒ，ＥｃｏＲＩ；Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｋ，ＫｐｎＩ；ＴＫ，チミジンキナーゼ遺伝子；ＰＧＫｎｅｏ，ＰＧＫ由来のネオマイシン耐性遺伝子。
【図１０】ＢａｍＨＩで消化した尾ＤＮＡのサザンブロット分析を示す。コーディングプローブ（図９に示す）はＡｇｒｐ＋／＋（野生型）及びＡｇｒｐ＋／−マウスに由来する１１ｋｂ制限フラグメントを検出するが、Ａｇｒｐ−／−マウスに由来するフラグメントは検出しない。
【図１１】図１１Ａ及びＢは２種のオリゴヌクレオチドプローブの混合物とＡｇｒｐのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＡｇＲＰ  ｍＲＮＡは野生型（＋／＋）マウスの弓状核で検出されるが、Ａｇｒｐ−／−（−／−）マウスの同一脳領域では検出されない。
【図１２】図１２Ａ及びＢは雌雄Ａｇｒｐ（野生型；＋／＋；白四角）、Ａｇｒｐ＋／−（＋／−，黒三角）及びＡｇｐ−／−（−／−，白円）同腹仔マウスの成長曲線を示す（雄：＋／＋，ｎ＝１７；＋／−，ｎ＝１７；−／−，ｎ＝２０；雌：＋／＋，ｎ＝１７；＋／−，ｎ＝２１；−／−，ｎ＝２３）。
【図１３】１０週齢雄Ａｇｒｐ＋／＋（野生型）、Ａｇｒｐ＋／−及びＡｇｒｐ−／−同腹仔マウスの平均１日摂食量を示す（＋／＋，ｎ＝１２；＋／−，ｎ＝１４；−／−，ｎ＝１０）。
【図１４】Ａｇｒｐ＋／＋（野生型；＋／＋）及びＡｇｒｐ−／−（−／−）同腹仔マウス（ｎ＝５／遺伝子型）の視床下部におけるＮＰＹ及びＭＣＨ  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。＊Ｐ＜０．０５，対応のあるスチューデントｔ検定。ＡＲＣ，弓状核；ＬＨＡ，視床下部外側野。
【図１５】図１５Ａ及びＢは雌雄野生型Ａｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ＋／＋（ｗｔｗｔ，白四角）；Ａｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ−／−（ｗｔｋｏ，黒三角）；及びＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−（ｋｏｋｏ，白円）マウスの成長曲線を示す（雌，ｎ＝９−１１／遺伝子型；雄，ｎ＝１０／遺伝子型）。全マウスは試験開始時に３カ月齢であった。
【図１６】図１６Ａ及びＢは７週間の試験期間にわたって図１５Ａ及びＢに要約するように成長する雌雄野生型Ａｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ＋／＋（ｗｔｗｔ，白四角）；Ａｇｒｐ＋／＋；Ｎｐｙ−／−（ｗｔｋｏ，黒三角）；及びＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−（ｋｏｋｏ，白円）マウスの累積摂食量を示す。
【図１７】図１７Ａ及びＢはＡｇｒｐ−／−；Ｎｐｙ−／−が絶食に対する正常摂食亢進応答を生じることを示す。６〜７か月齢野生型雌（ｗｔｗｔ）、Ａｇｐｒ＋／＋；Ｎｐｙ−／−（ｗｔｋｏ）、及びＡｇｒ−／−；Ｎｐｙ−／−（ｋｏｋｏ）マウス（ｎ＝１４／遺伝子型）を４８時間絶食させた後に、普通飼料を再給餌した。再給餌後の累積摂食量を７Ａに示し、絶食期間と再給餌期間中の体重変化を７Ｂに示す。
【図１８】１日の各種時間における、年齢を一致させた雄野生型及びＡｇｒｐ−／−マウスの呼吸商（ＲＱ）を示す。体重１ｋｇ当たりのＣＯ２発生容量と体重１ｋｇ当たりのＯ２消費容量の比を使用してＲＱを計算する。ＲＱの日中差（１０：３０ＡＭ〜５：３０ＰＭの平均応答）は統計的に有意であった。数値は平均±ＳＥＭ，ｎ＝１０／群である。Ａｇｒｐ−／−マウスは野生型マウスに比較して日中呼吸商の低下を示すことが判明した。
【図１９】ＡｇＲＰ／ＮＰＹ二重ノックアウト（ｋｏｋｏ，ｎ＝１２）マウスと野生型対照（ｗｔｗｔ，ｎ＝１２）における摂食量に及ぼすグレリンの効果を示す。食塩水に比較して、３μｍｏｌｅ／ｋｇヒトグレリンを腹腔内（ｉ．ｐ）注射すると野生型マウスでは４時間摂食量を刺激した（Ｐ＜０．００１）が、二重ノックアウトマウスでは効果がなかった。
【図２０】グレリンペプチド模倣化合物Ａの構造を示す。
【図２１】Ｃ５７Ｂ６マウスの摂食量に及ぼす化合物Ａの効果を示す。マウスにグレリンアゴニスト化合物Ａを経口（ＰＯ）投与し、明サイクル摂食量を測定した。全４種の用量の化合物は４時間摂食量を有意に刺激した（ビヒクルに対してＰ＜０．０１）。最大効果は３ｍｇ／ｋｇに達した。
【図２２】図２２Ａ及びＢは摂食量に及ぼす化合物Ａ（３ｍｇ／ｋｇ，ＰＯ）の効果を示す。図２２Ａは野生型（ｗｔｗｔ，ｎ＝１２）、ＮＰＹ単独ノックアウトマウス（ｗｔｋｏ，ｎ＝ｌｌ）及びＡｇＲＰ／ＮＰＹ二重ヌルマウス（ｋｏｋｏ，ｎ＝１２）の４時間摂食量に及ぼす化合物Ａの効果を示す。化合物Ａは野生型マウス（食塩水に対してＰ＜０．００１）及びＮＰＹ単独ノックアウトマウス（食塩水に対してＰ＜０．０５）で摂食量を有意に刺激したが、この効果はｗｔｋｏマウスでは著しく低下した。化合物ＡはＡｇＲＰ／ＮＰＹ二重ヌルマウス（ｋｏｋｏ，ｎ＝１２）において摂食量を刺激しなかった。図２２Ｂは化合物Ａが野生型（ｗｔｗｔ，ｎ＝１２，食塩水に対してＰ＜０．０１）及びＡｇＲＰ単独ノックアウトマウス（ｋｏｗｔ，ｎ＝１０，食塩水に対してＰ＜０．００１）の両者で４時間摂食量を有意に刺激することを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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