(57)【要約】本発明は、微生物と微生物がコロニーを形成する宿主との相互作用を解明するための、さらにそのような株が示す共生性の基礎を解明するための、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）株のＤＮＡ配列の使用、特にそのゲノム配列の使用に関する。さらに本発明は、乳酸菌と関連種の核酸またはポリペプチドを検出する方法に関する。Ｌａ１のヌクレオチド配列および／またはポリペプチド配列を含むデータキャリアーが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主と細菌との相互作用を解明するための、配列番号１で特定されるＤＮＡ配列、またはその一部、またはこれに相同な配列の使用。
【請求項２】
相互作用は、細菌株のプロバイオティクス性、好ましくは免疫系の刺激、抗病原性、および／または抗ウイルス性に基づく、請求項１記載の使用。
【請求項３】
配列は、配列番号１の番号付けに基づき、ヌクレオチド１〜５４５９６、５６０７０〜７７４３０、８１３０２〜３０８５３７、３０９５８８〜３４２７５７、３７８４５８〜３８９２１７、３８９７７９〜４０４５１０、４０５５６１〜５０１１１６、５０３８７３〜５５８１９４、５６３２６２〜６９６５１８、６９７５６９〜７２１７３６、７２２７８７〜７５６８４５、７６１６８２〜８６０４４６、８６０７２３〜８６５５５０、８６７２６０〜８６７４９０、８６８５４１〜１４４８２８８、１４６３８５１〜１５２６０７７、１５２７２７８〜１５５２０２４、１５６３１４７〜１８０９１１５、１８１０１６６〜１８５８１９０、１８６３２５８〜１８７２８７１、１８７７９３９〜１９３０４３０、１９３２０６３〜１９８３０４３よりなる群から選択される、配列番号１の断片である、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）株、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、配列番号１により特定されるポリヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列を、ポリメラーゼ酵素とヌクレオチドとの存在下で、ヌクレオチドの伸長を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中の伸長産物の存在を検出する（ここで、プライマー伸長産物の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）株が存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項５】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）株、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、配列番号１により特定されるポリヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列を、相補的塩基対のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する（ここで、ハイブリダイゼーション複合体の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）株が存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項６】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）株、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、配列番号１由来のポリペプチドに対して作成した抗体を、免疫複合体の形成に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中の免疫複合体の存在を検出する（ここで、免疫複合体の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）株が存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項７】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）ポリペプチドに対する抗体の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、請求項４または５で産生されるポリペプチドを、免疫複合体の形成に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中の免疫複合体の存在を検出する（ここで、免疫複合体の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）ポリペプチドが存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項８】
少なくとも配列番号１由来のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのアレイを含有するＤＮＡアレイ／チップ。
【請求項９】
配列番号１由来の読みとり枠により特定されるポリペプチドを発現することにより得られ得るポリペプチドの少なくとも１つを含むポリペプチドのアレイを含有するタンパク質アレイ／チップ。
【請求項１０】
配列番号１の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドに対する少なくとも１つの抗体を含む抗体のアレイを含有する抗体チップ。
【請求項１１】
（ａ）試験化合物に、配列番号１により特定されるポリヌクレオチドを、またはその一部を接触させ；そして
（ｂ）結合が起きることを検出する、
ことを含むスクリーニング測定法。
【請求項１２】
（ａ）試験化合物に、配列番号１由来の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドを接触させ；そして
（ｂ）結合が起きることを検出する、
ことを含むスクリーニング測定法。
【請求項１３】
（ａ）試験化合物に、配列番号１由来の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドに対して作成された抗体を接触させ；そして
（ｂ）結合が起きることを検出する、
ことを含むスクリーニング測定法。
【請求項１４】
配列番号１により特定されるポリヌクレオチドまたはその一部を含むキット。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドはプライマーまたはプローブであり、キットは任意にポリメラーゼとデオキシヌクレオチド三リン酸とを含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１６】
配列番号１の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドに対して作成した抗体を含むキット。
【請求項１７】
配列番号１により特定される核酸配列、またはその一部、または配列番号１により特定されるヌクレオチド配列由来のポリペプチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１８】
該媒体は以下よりなる群から選択される、請求項１７記載のコンピューター読み取り可能な媒体：
（ａ）フロッピー（登録商標）ディスク；
（ｂ）ハードディスク；
（ｃ）ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）；
（ｄ）リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）；および
（ｅ）ＣＤ−ＲＯＭ。
【請求項１９】
以下の要素を含む、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ゲノムの断片を同定するためのコンピューターベースのシステム：
（ａ）配列番号１により特定される核酸配列を含むデータ保存手段；
（ｂ）標的配列を相同配列を同定するための工程（ａ）のデータ保存手段のヌクレオチド配列と比較するための探索手段；および
（ｃ）段階（ｂ）の該相同配列を得るための検索手段。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物と微生物がコロニーを形成する宿主との相互作用を解明するための、さらにそのような株が示す共生性の基礎を解明するための、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）株のＤＮＡ配列の使用、特にそのゲノム配列の使用に関する。さらに本発明は、乳酸菌と関連種の核酸またはポリペプチドを検出する方法に関する。Ｌａ１のヌクレオチド配列および／またはポリペプチド配列を含むデータ担体が提供される。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌（すなわちその（発酵）活動中に乳酸を産生する微生物）は昔から知られており、例えばラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバシルス（Lactobacillus）属、連鎖球菌（Streptococcus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属およびペディオコッカス（Pediococcus）属を含む。これらの細菌は、通常乳汁および乳汁加工工場、死んだ植物または朽ちていく植物で顕著であり、ヒトや動物の腸内細菌叢の成分である。
【０００３】
乳酸菌は、その発酵活動中にｐＨを低下させる利点と、生成する生成物の作用とを利用して、食物の保存用物質として使用されており、例えば腐敗細菌の増殖を阻害する。さらに乳酸菌はまた、種々の異なる食物、例えば乳汁からチーズ、ヨーグルトおよび他の発酵乳製品を製造するのに使用されている。
【０００４】
最近いくつかの乳酸菌株は、摂取するとヒトや動物に有用な性質を示すことがわかってきたため大いに注目されている。特にラクトバシルス（Lactobacillus）属とビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の特定の株は、消化管の上部で破壊されずに、特に胃の低ｐＨの影響を受けることなく、生存活性のある生きた状態で消化管を通過できることがわかった。さらにこれらは、小腸粘膜にコロニー形成することがわかり、その消化管での一時的または持続的存在が、生物の健康に無数の良い影響を与えると考えられている。これらの株は、まとめてプロバイオティクス（probiotics）と呼ばれる。
【０００５】
ＥＰ０７６８３７５号は、小腸の細菌叢に移植可能なビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属のそのような特異的な株を開示する。このビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）株は免疫調節を助け、小腸細胞への病原性細菌の付着を競合的に排除でき、従って個体の健康の維持を支持すると報告されている。
【０００６】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）以外にも、ラクトバシルス（Lactobacillus）のいくつかの株が、ヒトに好ましい性質（例えば、病原性細菌による消化管のコロニー形成を防止するかまたはロタウイルス感染を妨害する）を示すことがわかっている。特にＰＣＴ／ＥＰ０２／００９５８号は、この両方の性質を有する株を開示する。
【０００７】
最近数年間食物業界は、そのような株を乳飲料または発酵酸性乳製品のような製品に応用している。これらの製品および／または細菌株を用いた臨床試験は、この種の細菌がインビボでの健康促進性の原因であり、潰瘍のような疾患と戦うのに使用されていることを確認した。特にラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）属の株は、ヒトの潰瘍の原因であることが認められているヘリコバクター（Helicobacter）と戦うことができることが証明された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
乳酸菌の特定の株が提供するこれらの有用な性質から、これらの健康促進性の分子的基礎を解明することに対して、当該分野に強い要求が存在する。特にこれらの作用に関与する物質を調べることは大いに興味があるであろう。このためには、これらの微生物をより詳細に研究して、プロバイオティクス性（宿主との相互作用、しかし中の異なる環境を通過（生存）できる現象、ならびに小腸粘膜に付着できること、そして最終的に免疫系や病原体に対する防御性を増強すること）（この情報は、これらの機構をさらに理解することを可能にするであろう）の基礎をなす分子的原理を解明するための、手段が必要である。
【０００９】
従って本発明の問題は、ヒトおよび／または動物に有益な性質を示す細菌株について実質的なデータを提供することである。
上記問題はプロバイオティック株ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１を構成するＤＮＡ配列を提供することにより解決された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ある態様において本発明は、細菌と宿主、好ましくは乳酸菌と宿主、さらに好ましくはラクトバシルス（Lactobacillus）と宿主との相互作用を解明するための、特にそのような株のプロバイオティクス性の原因である因子を測定するための、配列番号１の配列を有する乳酸菌ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１ゲノムのヌクレオチド配列、その一部、またはその相同的配列の使用に関する。
【００１１】
本出願においてゲノムまたはゲノム配列という用語は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の染色体の配列を意味すると理解される。ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチドまたは核酸という用語は、種々の長さの２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡまたは該ＤＮＡの転写生成物（約５〜２００、好ましくは１０〜１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む）を意味する。
【００１２】
本発明において相同的ヌクレオチド配列は、配列番号１の配列（またはその選択された部分）と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは９６％、およびさらに好ましくは少なくとも９８％のパーセント同一性を有するヌクレオチド配列を意味すると理解される。該相同物は、例えばラクトバシルス（Lactobacillus）、さらに好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種に属するゲノム配列またはその断片の配列に対応する配列、ならびに関連する種に属する細菌のゲノム配列またはその代表的な断片の配列に対応する配列を含む。
【００１３】
従ってこれらの相同配列は、同じ種内のまたは種間の変異に連結した変化に対応し、特に少なくとも１つのヌクレオチドの末端切断、置換、欠失および／または付加に対応する。相同配列はまた、その科、種、または変種に特異的であり、ラクトバシルス（Lactobacillus）中に存在する可能性のある、遺伝コードの縮重または遺伝コードの偏りに連結した変化に対応する。
【００１４】
タンパク質および／または核酸配列相同物は、当該分野で公知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムの任意のものを使用して評価してもよい。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、特に限定されないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷがある（例えば、ピアソン（Pearson）とリップマン（Lipman）、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448;アルトシュル（Altschul）ら、1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410;トンプソン（Thompson）ら、1994, Nucleic Acids Res. 22(2):4673-4680;ヒギンス（Higgins）ら、1996, Methods Enzymol. 266:383-02;アルトシュル（Altschul）ら、1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-410;アルトシュル（Altschul）ら、1993, Nature Genetics 3:266-272を参照）。
【００１５】
特に好適な実施態様においてタンパク質および核酸配列相同物は、当該分野で公知の「基礎的局所的整列探索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）」「ＢＬＡＳＴ」を使用して評価される。特に４つの具体的なＢＬＡＳＴプログラムを使用して以下のタスクが行なわれている：
【００１６】
（１）ＢＬＡＳＴＰ：問題のアミノ酸配列をタンパク質配列データベースに対して比較する
（２）ＢＡＬＳＴＮ：問題のヌクレオチド配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する
（３）ＢＡＬＳＴＸ：すべての読みとり枠で翻訳される問題のヌクレオチド配列をタンパク質配列データベースに対して比較する
（４）ＴＢＡＳＬＴＮ：問題のタンパク質配列をすべての読みとり枠で動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して比較する
【００１７】
代表的断片の中で、本明細書に開示のヌクレオチド配列と厳密性条件下でハイブリダイズできるものが好ましい。厳密性条件下でのハイブリダイゼーションは、２つの相補的ＤＮＡ断片の間でハイブリダイゼーションが維持されるように、温度とイオン強度が選択されることを意味する。そのような高厳密性条件は、例えば好適な６５℃の温度でＳＳＣ緩衝液（例えば、１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌと０．０５Ｍ  クエン酸ナトリウムに対応する）の存在下で実施することにより行われる。洗浄工程は、例えば以下の条件である：２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで室温で、次に１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ；０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ；０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで６８℃で１５分、３回洗浄。
【００１８】
ヌクレオチド配列配列番号１は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）Ｌａ１のゲノムを、クローンの挿入体の蛍光自動配列決定後の指向性配列決定、そしてソフトウェアによりヌクレオチド配列断片を集合する方法によりスクリーニングして得られている。このために、ゲノムの断片が作成され、増幅と増殖のための適当なベクターに連結され、対応する断片が配列決定された。その断片、そのヌクレオチド配列の重複と最終的整列は、適切なソフトウェアを使用して評価された。
【００１９】
配列決定用のクローンは、ＢＡＣクローンとして１０，０００ｂｐ余りの断片を含み、これは、より大きいフレームワークをアセンブリーに与えるのに使用された。いくつかの繰り返し領域の存在のために、正しい組み立ては極めて困難であった。これらは特に、ＩＳ成分、リボゾームオペロン、および特に２つの大きな細胞表面タンパク質（これは、１００〜２００のほとんど完全な１０アミノ酸繰り返しを含有する）の遺伝子のような繰り返し領域を含有した。この場合これらの領域の正確な配列は、現在のＤＮＡ配列決定技術では、一回のランで領域をカバーできないため、決定することができなかった。内部配列決定プライマーは、遺伝子内の複数の部位でプライムするため排除される。またこれらの２つの配列の相対的配向（長くて非常に高い配列類似性）は、これらを宿主組換えの標的候補としている。ここに示す構造は、適切なプライマーを用いてＰＣＲにより確認されているが、複製開始点と終止点の相対的配置により示されるように、ゲノムはそのような組換え事象の生成物である可能性が非常に高い。リボゾームオペロン繰り返しで遭遇する第２の問題は、４つの遺伝子座で６つのオペロンの存在が同定されていて、正確な遺伝子座の位置を正確に見つけることは困難であった。最後にＩＳ成分の２つは複数のコピーで存在し、その相対的配向に依存して、宿主組換えの標的となり得る。そのような事象は、ＩＳ成分にフランクする配列、および特に転位により複製される染色体標的配列を研究することにより同定され、従って各ＩＳ成分は、同一の直接繰り返しによりフランクされる。我々は、直接繰り返し配列がＩＳ成分中の宿主組換えによりスイッチしている２つのＩＳ成分を同定した。これは約６００，０００ｂｐの反転配列を産生し、これは特異的プライマーを用いるＰＣＲにより確認されている。このＩＳ成分特異的組換えは、増殖する培養物中で起きている動的イベントであり、これは大きな分子種＋組換えゲノムの小さな存在（例えば弱いＰＣＲバンド）を引き起こしているかも知れない。最後に我々は、部位特異的リコンビナーゼにより絶えず切断されているプロファージＬ７７１（約４０，０００ｂｐ）の例を持っている。我々は各変種の存在を検出し相対量を測定する定量的ＰＣＲ法を開発した。今日まで純粋な培養物は調製されていない。
【００２０】
配列番号１により同定される核酸配列の特に好適な断片は、それぞれ配列番号１の番号付けに基づき、１〜５４５９６、５６０７０〜７７４３０、８１３０２〜３０８５３７、３０９５８８〜３４２７５７、３７８４５８〜３８９２１７、３８９７７９〜４０４５１０、４０５５６１〜５０１１１６、５０３８７３〜５５８１９４、５６３２６２〜６９６５１８、６９７５６９〜７２１７３６、７２２７８７〜７５６８４５、７６１６８２〜８６０４４６、８６０７２３〜８６５５５０、８６７２６０〜８６７４９０、８６８５４１〜１４４８２８８、１４６３８５１〜１５２６０７７、１５２７２７８〜１５５２０２４、１５６３１４７〜１８０９１１５、１８１０１６６〜１８５８１９０、１８６３２５８〜１８７２８７１、１８７７９３９〜１９３０４３０、１９３２０６３〜１９８３０４３である。
【００２１】
本発明はまた、配列番号１から得られる読みとり枠（ＯＲＦ）の情報を利用して、かつ公知の技術に従って所望のポリペプチドを発現することにより、ポリペプチドを産生するのに利用される。この点で読みとり枠に対応する核酸が選択され、発現ベクター中に挿入される。次にベクターは宿主中に導入され、これは、適当な条件下でポリペプチドへの読みとり枠の転写と翻訳を可能にする。
【００２２】
配列番号１により特定されるゲノム配列から得られる核酸分子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を使用して対応する配列の特異的増幅により容易に得られる。本明細書に記載の配列情報から当業者は、任意の適当なプライマーヌクレオチドを設計かつ合成し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して目的の断片を増幅することができる。従って本発明はまた、核酸配列の増幅のためのプライマーとして使用できる配列番号１の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む。標的核酸分子を増幅するための他の方法を使用してもよく、例えばＴＡＳ（転写ベースの増幅システム（Transcription-based Amplification System））法、３ＳＲ（自己配列複製（Self-Sustained Sequence Replication））法、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅（Nucleic Acid Sequence Based Amplification））法、ＳＤＡ（鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification））法、またはＴＭＡ（転写介在増幅（Transcription Mediated Amplification））法などがある。
【００２３】
（ポリ）ヌクレオチドはプローブとして使用され、プローブとして機能する核酸を増幅または修飾するための技術、例えばＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応（Ligase Chain Reaction））法、ＲＣＲ（修復鎖反応（Repair Chain Reaction))法、ＣＰＲ（サイクリングプローブ反応（Cycling Probe Reaction））法、またはＱ−ベータ−レプリカーゼ増幅法は、充分応用される。
【００２４】
従って本発明は、ハイブリダイゼーション（検出）プローブと、本発明のヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド）を検出するためのプライマーとを企図する。標的がＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）である場合、該ｍＲＮＡは、直接検出されるかまたはｃＤＮＡに形質転換された後検出される。
【００２５】
あるいは、配列番号１により示される核酸の断片を得るために、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ゲノムＤＮＡを、選択された制限酵素を用いる消化に付し、断片を例えば電気泳動または他の適当な分離法により分離する。そのような方法は当該分野で公知であり、特にサムブルーク（Sambrook）ら、実験室マニュアル（A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９９２に開示されている。そのような断片は、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii)Ｌａ１のゲノムＤＮＡを単離し、必要な工程を行うことにより容易に得られる。
【００２６】
別の型では核酸はまた、そのサイズが大きすぎない時、当業者に公知の方法に従って、化学合成により得ることもできる。
【００２７】
修飾ヌクレオチド配列は、当業者に公知の技術に従って突然変異誘発により得られ、正常な配列と比較すると修飾（例えばポリペプチドの発現のための制御配列および／またはプロモーター配列、該ポリペプチドの発現レベルの修飾または特に複製サイクルの修飾を引き起こす）を示す任意のヌクレオチド配列を意味する。修飾ヌクレオチド配列はまた、後述の修飾ポリペプチドをコードする任意のヌクレオチド配列を意味すると理解される。
【００２８】
ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ゲノムの研究中に、以下の読みとり枠が決定され、生じるポリペプチドの機能は、既知のタンパク質に対する相同性に基づき可能であった。
【００２９】
【表１−１】
2006506042.tif 000002
【表１−２】
2006506042.tif 000003
【表１−３】
2006506042.tif 000004
【表１−４】
2006506042.tif 000005
＊  相補体＝逆鎖の上
＊  ａａ＝アミノ酸
【００３０】
種々のポリペプチドに対応するＯＲＦを上記表１に示し、配列番号１により特定されるゲノム配列中の位置により示す。
【００３１】
読みとり枠は、相同性分析ならびに可能性のあるＯＲＦ開始部位の分析により同定されている。各同定されたＯＲＦは、ＯＲＦヌクレオチド配列に対してフレーム内にある配列番号１の先行する停止コドンのすぐ３’から次の停止コドンの５’コドンまでの連続ヌクレオチド配列にまたがるヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
表１はまた、各ＯＲＦによりコードされるポリペプチドの配列をデータベース中の配列と比較した相同性検索の結果を示す。
【００３３】
本出願に開示された配列情報は、目的のポリヌクレオチド、すなわち、既知のまたは未知の、推定ポリペプチドをコードする読みとり枠を含有する核酸を選択し、選択されたポリヌクレオチドを用いて微生物を形質転換するのに使用される。形質転換ビヒクルとして、公知のプラスミド、ファージベクター（トランスフェクション）またはＦベクター（接合）が使用される。選択された微生物に導入された核酸が発現され、その生物学的機能が既知ならそのまま使用されるか、または未知のポリペプチドが発現されるなら、解明される。選択された微生物は、ラクトバシルス（Lactobacillus）自体でも、または他の公知の微生物、例えば細菌（大腸菌（E.coli）、連鎖球菌）、または酵母、昆虫細胞、または動物や植物細胞でもよい。
【００３４】
ポリペプチドが、そのまままたは融合ポリペプチドとして発現されることは理解されるであろう。そのような連結を実施し、対応する融合ポリペプチドを適切な細胞中で発現させる技術を、当業者は周知している。
【００３５】
本発明よりまた、本発明のヌクレオチド配列のクローニングおよび／または発現のための新しい組換えベクターが考案される。ベクターは、ある宿主細胞中でヌクレオチド配列の発現および／または選択を可能にするのに必要な成分（例えば、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび停止シグナル、ならびに転写制御のための適切な領域）を含む。例えば、タンパク質またはペプチドの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサー成分により制御される。プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端繰り返し配列中に含有されるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の制御配列、または原核生物発現系のために、β−ラクタマーゼプロモーター、ｔａｃプロモーターまたはＴ７プロモーターがある。
【００３６】
ベクターは、宿主細胞中で安定に維持できなければならず、翻訳されたタンパク質の分泌を特定する特定のシグナルを随時有する。これらの異なる成分は、使用される宿主細胞に従って選択される。このために、本発明のヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自律複製ベクター、または選択された宿主中の統合的（integrative）ベクター（例えば、酵母人工染色体、プラスミドまたはウイルスベクター）中に挿入される。
【００３７】
ベクター中にＤＮＡ断片を挿入するための当業者に公知の任意の標準的方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列とからなるキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロのレトロウイルスＤＮＡ法および合成法、およびインビボの組換え（遺伝子組換え）法がある。
【００３８】
ベクターは、配列番号１に含まれる核酸の転写および／または翻訳のために使用され、それぞれＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを産生する。そのようなベクターは、所望の転写体を産生できるなら、エピソームのままでもまたは染色体内に組み込まれてもよい。
【００３９】
本発明のアンチセンス核酸は、配列番号１のポリヌクレオチド配列のＲＮＡ転写体の少なくとも一部に相補的な配列を含み、ＲＮＡにハイブリダイズできるのに充分な相補性を有し、２本鎖を形成することができる配列を設計する。２本鎖アンチセンス核酸配列の場合、２本鎖ＤＮＡの１本鎖を試験し、３本鎖形成を測定してもよい。
【００４０】
本発明の情報からまた、本明細書に記載の核酸またはベクターで形質転換された宿主細胞が得られる。これらの細胞は、上記の適切な細胞またはヌクレオチド配列またはベクター中に導入し、次に形質転換／トランスフェクションされたヌクレオチド配列の複製および／または発現を可能にする条件下で該細胞を培養することにより、達成される。
【００４１】
宿主細胞は、真核生物系または原核生物系、例えば細菌細胞、酵母細胞、動物細胞ならびに植物細胞から選択される。本発明において細胞は、より高度の生物系を含んでよい。例えば動物、植物全体またはその一部。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の方法で遺伝子産物を修飾および処理する宿主細胞株を選択してもよい。
【００４２】
本発明のタンパク質の発現のための好適な宿主細胞は、原核細胞、例えばグラム陰性菌またはグラム陽性細菌からなる。本発明のさらに好適な宿主細胞は、ラクトバシルス（Lactobacillus）科に属する細菌、さらに好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種に属する細菌であり、またはラクトバシルス（Lactobacillus）種に関連する微生物から選択される。
【００４３】
本発明の形質転換／トランスフェクトされた細胞は、本ラクトバシルス（Lactobacillus）株がもたらす任意の有益な作用に関与することができる化合物を研究、同定および／または選択するためのモデルとして有利に機能し、かつその方法で使用される。
【００４４】
本発明はさらに、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ＯＲＦにコードされるポリペプチド（特に表１に列挙したもの）の合成を可能にする。本発明において、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質という用語は、同義で使用される。さらに本発明は、（ａ）ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを産生するのに適した条件下で本発明の宿主細胞を含有する工程；および（ｂ）培養物からポリペプチドを回収する工程、とを含む組換え手段によりそのようなポリペプチドを調製する方法を実施することを可能にする。
【００４５】
上記ポリペプチドは、最も活性が高いかまたは所望の性質を示す化合物を選択するように、ポリペプチドをある場所で修飾した後にモデル系で試験する、コンビナトリアル化学を使用して得ることもできる。
【００４６】
この点で化学合成は、非天然のアミノ酸または非ペプチド結合を使用できるという利点を有する。従って本発明のポリペプチドの寿命を延長するために、そのような非天然のアミノ酸（例えば、Ｄ型、またはアミノ酸類似体、好ましくはイオウ含有型）を使用するかことが有利かも知れない。
【００４７】
最後に、本発明のポリペプチドの構造、その相同物または修飾型、ならびに対応する断片は、ポリペプチド型の化学構造などに組み込まれる。従ってポリペプチドをインビボ環境で保存するために、プロテアーゼに対する変性に対して抵抗性を伝える化合物を、Ｎ末端およびＣ末端に提供することが好ましいであろう。
【００４８】
また、本発明の異なるポリペプチドおよび上記方法により産生されるポリペプチドは、宿主動物の免疫系に対して抗原であり、該ポリペプチドに対して抗体が産生されることは理解されるであろう。これらの抗体は、混合物中の目的のポリペプチドまたは一般的に試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）の株を検出するために使用される。さらにこれらは、例えば細胞表面エピトープに対する抗体を産生させ、細菌細胞壁に対するいくつかのポリペプチドのブロッキング効果を測定することにより、研究手段として使用される。
【００４９】
別の態様において本発明はまた、生体試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出および／または同定方法を提供する。この方法は、当該分野で公知のいくつかの技術、例えばＰＣＲ、または単に適当なプローブとのハイブリダイゼーションを含む。あるいは、ラクトバシルス（Lactobacillus）好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の細胞壁エピトープに対して作成された抗体を、該目的に使用してもよい。上記方法はまた逆に、免疫複合体の形成を可能にする条件下で、試料をラクトバシルス（Lactobacillus）のポリペプチドと接触させることにより、ラクトバシルス（Lactobacillus）に対する抗体の存在を測定してもよい。
【００５０】
本発明の情報で得られるポリペプチドと抗体および本明細書に記載のヌクレオチド配列は、ラクトバシルス（Lactobacillus）種に属する細菌を含有する可能性のある生体試料（生体組織または体液）中の該細菌を検出および／または同定するための、インビトロおよび／またはインビボの方法で使用される。使用されるポリペプチド、抗体およびヌクレオチド配列の特異性に依存するこれらの方法は、ラクトバシルス（Lactobacillus）種に属する細菌変種、ならびに選択される本発明のポリペプチド、抗体およびヌクレオチド配列により検出可能な、関連する微生物を検出および／または同定する。例えば、ラクトバシルス（Lactobacillus）科に特異的な本発明のポリペプチド、抗体および／またはヌクレオチド配列を選択することにより、ラクトバシルス（Lactobacillus）科の細菌を検出できる本発明のポリペプチド、抗体またはヌクレオチド配列を選択することが有利であろう。
【００５１】
本明細書の配列番号１に記載の配列は、添付の配列リストに列記されるが、これは本明細書の一部であると考えられる。
【００５２】
本発明はまた、固体支持体に共有結合または非共有結合したヌクレオチド配列またはポリペプチドを含む。第１の場合に、そのような支持体は特異的ハイブリダイゼーションにより、試験される生体試料から得られる標的核酸を捕捉するように機能する。必要であれば固体支持体は試料から分離され、捕捉プローブと標的核酸とで形成されたハイブリダイゼーション複合体は、次に容易に検出可能な成分で標識された第２のプローブ（検出プローブと呼ばれる）を用いて検出される。
【００５３】
そのような固体支持体は、いわゆるＤＮＡアレイまたはＤＮＡチップ（固体支持体上に正確に組織されたかまたは整列された複数の分子プローブ）の形を取ってよく、これは、遺伝子のスクリーニング、そこに含有される変異と遺伝子の発現の研究を可能にし、そのサイズが小さいこととアナライトの数の点で高い能力を有するため、現在注目されている。
【００５４】
これらのアレイおよび／またはチップの機能は、分子プローブ（主に、一般に必要に応じて数平方センチメートル以上のサイズを有する担体に結合したオリゴヌクレオチド）に基づく。分析のための担体（ＤＮＡアレイ／チップ）は、担体のあらかじめ決められた位置に整列したプローブで被覆される。次に、あらかじめ標識されている分析すべき標的核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の断片を含有する試料に、ＤＮＡアレイ／チップを接触させて、ハイブリダイゼーションにより２本鎖を形成させる。洗浄工程後、チップの表面の分析により、標的に結合している標識物が発するシグナルにより、有効なハイブリダイゼーションを見つけることが可能になる。適切なコンピューター解析により、この分析からハイブリダイゼーション指紋結果が得られ、これは、遺伝子の発現、試料中の特異的断片の存在、配列の測定および変異の存在などの情報を検索することを可能にする。
【００５５】
ＤＮＡチップ上でインサイチューで沈着または合成された本発明のプローブと分析すべき試料の間のハイブリダイゼーションは、例えば蛍光、放射活性または電子的検出により測定される。
【００５６】
本発明のヌクレオチド配列は、ラクトバシルス（Lactobacillus）遺伝子の発現の分析を実施するためにＤＮＡアレイ／チップで使用してもよい。この分析は、ある遺伝子を性状解析する特異性について選択されたどのプローブ上にＤＮＡアレイ／チップが存在するかに基づく。分析される標的配列は標識された後、チップにハイブリダイズされる。洗浄後、少なくとも二重測定でハイブリダイゼーションを行って標識化合物を検出し定量する。異なる試料について同じプローブおよび／または異なるプローブについて得られるシグナル強度の同じ試料との比較分析により、試料から得られるＲＮＡの異なる転写を測定する。
【００５７】
本発明のＤＮＡアレイ／チップはまた、他の微生物に特異的なヌクレオチドプローブを含有してもよく、これは、試料中の微生物の存在の迅速な同定を可能にする連続試験を可能にする。
【００５８】
詳細に上述したＤＮＡチップの原理はまた、その上で、支持体がＤＮＡの代わりに本発明のポリペプチドもしくは抗体またはそのアレイで被覆されたタンパク質チップを作成するのに使用することもできる。これらのタンパク質チップは、表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）により例えばタンパク質で被覆された支持体上に、標的アナライトを親和性捕捉することにより誘導される生体分子相互作用（ＢＩＡ）を分析することを可能にする。従って、分析される試料から得られる抗体またはポリペプチドに特異的に結合する本発明のポリペプチドまたは抗体は、試料中のタンパク質の検出および／または同定用の、タンパク質チップで使用される。
【００５９】
本発明はまた、その上に本発明の１つ以上のヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを記録した、コンピューターで読める媒体に関する。この媒体はまた、比較分析と得られる結果の利用を促進するように、本発明から得られる追加の情報（例えば、既知配列との類似性）および／または他の微生物のヌクレオチドおよび／またはポリペプチド配列に関する情報を含んでよい。好適な媒体は、例えば磁性、光学的、電気的およびハイブリッド媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、または記録カセットである。
【００６０】
本発明はまた、本発明のポリペプチド、適宜免疫学的または特異的反応に適した媒体を構成する試薬、本発明のポリペプチドと生体試料中に存在し得る抗体との免疫学的反応により生成される抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬（これらの試薬はまた標識を有することができ、標識試薬により認識されることができる）、さらに詳しくは本発明のポリペプチドが標識されていない場合、本発明のポリペプチドにより認識される抗体を含まない参照生体試料（陰性対照）、本発明のポリペプチドにより認識される抗体のあらかじめ決められた量を含有する参照生体試料、を含む、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種に属する細菌または関連する微生物の検出および／または同定のためのキットまたはセットに関する。
【００６１】
本発明はまた、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）種に属する微生物または関連微生物の検出および／または同定、または微生物の検出および／または同定のためのキットまたはセットであって、キットは本発明のタンパク質チップを含む、キットまたはセットに関する。
【配列表】
2006506042000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月29日(2004.4.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主と細菌との相互作用を解明するための、配列番号１で特定されるＤＮＡ配列、または配列番号１で特定されるＤＮＡ配列の断片、または配列番号１の配列と少なくとも９０％のパーセント同一性を有する配列の使用。
【請求項２】
相互作用は、細菌株のプロバイオティクス性、好ましくは免疫系の刺激、抗病原性、および／または抗ウイルス性に基づく、請求項１記載の使用。
【請求項３】
配列は、配列番号１の番号付けに基づき、ヌクレオチド１〜５４５９６、５６０７０〜７７４３０、８１３０２〜３０８５３７、３０９５８８〜３４２７５７、３７８４５８〜３８９２１７、３８９７７９〜４０４５１０、４０５５６１〜５０１１１６、５０３８７３〜５５８１９４、５６３２６２〜６９６５１８、６９７５６９〜７２１７３６、７２２７８７〜７５６８４５、７６１６８２〜８６０４４６、８６０７２３〜８６５５５０、８６７２６０〜８６７４９０、８６８５４１〜１４４８２８８、１４６３８５１〜１５２６０７７、１５２７２７８〜１５５２０２４、１５６３１４７〜１８０９１１５、１８１０１６６〜１８５８１９０、１８６３２５８〜１８７２８７１、１８７７９３９〜１９３０４３０、１９３２０６３〜１９８３０４３よりなる群から選択される、配列番号１の断片である、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）株、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、配列番号１により特定されるポリヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列を、ポリメラーゼ酵素とヌクレオチドとの存在下で、ヌクレオチドの伸長を可能にする条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中の伸長産物の存在を検出する（ここで、プライマー伸長産物の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）株が存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項５】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）株、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、配列番号１により特定されるポリヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列を、相補的塩基対のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中のハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する（ここで、ハイブリダイゼーション複合体の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）株が存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項６】
生物学的試料中のラクトバシルス（Lactobacillus）株、好ましくはラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、配列番号１由来のポリペプチドに対して作成した抗体を、免疫複合体の形成に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中の免疫複合体の存在を検出する（ここで、免疫複合体の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）株が存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項７】
生物学的試料中のラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ポリペプチドに対する抗体の検出、同定および／または選択方法であって：
（ａ）試料に、請求項４または５で産生されるポリペプチドを、免疫複合体の形成に適した条件下で接触させ；そして
（ｂ）試料中の免疫複合体の存在を検出する（ここで、免疫複合体の検出は、試料中にラクトバシルス（Lactobacillus）ポリペプチドが存在することを示す）
ことを含む上記方法。
【請求項８】
少なくとも配列番号１由来のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのアレイを含有するＤＮＡアレイ／チップ。
【請求項９】
配列番号１由来の読みとり枠により特定されるポリペプチドを発現することにより得られ得るポリペプチドの少なくとも１つを含むポリペプチドのアレイを含有するタンパク質アレイ／チップ。
【請求項１０】
配列番号１の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドに対する少なくとも１つの抗体を含む抗体のアレイを含有する抗体チップ。
【請求項１１】
（ａ）試験化合物に、配列番号１により特定されるポリヌクレオチドを、または配列番号１により特定されるＤＮＡ配列の断片を接触させ；そして
（ｂ）結合が起きることを検出する、
ことを含むスクリーニング測定法。
【請求項１２】
（ａ）試験化合物に、配列番号１由来の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドを接触させ；そして
（ｂ）結合が起きることを検出する、
ことを含むスクリーニング測定法。
【請求項１３】
（ａ）試験化合物に、配列番号１由来の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドに対して作成された抗体を接触させ；そして
（ｂ）結合が起きることを検出する、
ことを含むスクリーニング測定法。
【請求項１４】
配列番号１により特定されるポリヌクレオチド、または配列番号１により特定されるＤＮＡ配列の断片を含むキット。
【請求項１５】
ポリヌクレオチドはプライマーまたはプローブであり、キットは任意にポリメラーゼとデオキシヌクレオチド三リン酸とを含む、請求項１３記載のキット。
【請求項１６】
配列番号１の読みとり枠を発現することにより得られ得るポリペプチドに対して作成した抗体を含むキット。
【請求項１７】
配列番号１により特定される核酸配列、または配列番号１により特定されるＤＮＡ配列の断片、または配列番号１により特定される核酸配列由来のポリペプチド配列を記録しているコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項１８】
該媒体は以下よりなる群から選択される、請求項１７記載のコンピューター読み取り可能な媒体：
（ａ）フロッピー（登録商標）ディスク；
（ｂ）ハードディスク；
（ｃ）ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）；
（ｄ）リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）；および
（ｅ）ＣＤ−ＲＯＭ。
【請求項１９】
以下の要素を含む、ラクトバシルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）ゲノムの断片を同定するためのコンピューターベースのシステム：
（ａ）配列番号１により特定される核酸配列を含むデータ保存手段；
（ｂ）標的配列を相同配列を同定するための工程（ａ）のデータ保存手段のヌクレオチド配列と比較するための探索手段；および
（ｃ）段階（ｂ）の該相同配列を得るための検索手段。
【国際調査報告】
2006506042.tif 000006
2006506042.tif 000007
2006506042.tif 000008
2006506042.tif 000009
2006506042.tif 000010