(57)【要約】ＨＩＶ−１の中和耐性および高感染性表現型に寄与する、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のアミノ末端側半分およびカルボキシ末端側半分ならびにｇｐ４１のカルボキシ末端における変異が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じるヒト免疫不全ウィルスタイプ−１（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）ｇｐ１２０のｇｐ４１結合領域において、またはその近傍で１個以上のアミノ酸を置換するステップと、
（ｂ）哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じる、結合領域における１個以上のアミノ酸置換を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
ｇｐ４１結合領域におけるアミノ酸置換がｇｐ１２０のＣ１またはＣ２領域にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸置換が、アミノ酸９１、２４３、２４５および２４９からなる群より選択されるｇｐ１２０のアミノ酸位置に対応する位置にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アミノ酸置換が、Ｄ９１Ｎ、Ｎ２４３Ｋ、Ｔ２４５ＳおよびＰ２４９Ｓからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じるヒト免疫不全ウィルスタイプ−１（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）ｇｐ１２０のＣＤ４結合領域において、またはその近傍で１個以上のアミノ酸を置換するステップと、
（ｂ）哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じる、結合領域における１個以上のアミノ酸置換を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項６】
ＣＤ４結合領域におけるアミノ酸置換がｇｐ１２０のＣ２、Ｃ３、Ｃ４またはＶ５領域にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸置換が、アミノ酸２８７、２９０、３７１、３７２、４３５、４６６および４７２からなる群より選択されるｇｐ１２０のアミノ酸位置に対応する位置にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アミノ酸置換が、Ｄ２８７Ｎ、Ｄ２９０Ｎ、Ｎ３７１Ｋ、Ｐ３７２Ｑ、Ｋ４３５Ｎ、Ｅ４６６ＮおよびＤ４７２Ｎからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じるヒト免疫不全ウィルスタイプ−１（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）ｇｐ１２０のコレセプター結合領域において、またはその近傍で１個以上のアミノ酸を置換するステップと、
（ｂ）哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じる、結合領域における１個以上のアミノ酸置換を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項１０】
コレセプター結合領域における、またはその近傍でのアミノ酸置換がｇｐ１２０のＣ２またはＣ４領域にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸置換が、アミノ酸２１９および４２６からなる群より選択されるｇｐ１２０のアミノ酸位置に対応する位置にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸置換がＶ２１９ＩおよびＶ４２６Ｉからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じるヒト免疫不全ウィルスタイプ−１（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質を同定する方法であって、
（ａ）ｇｐ１２０の外部領域において、またはその近傍で１個以上のアミノ酸を置換するステップと、
（ｂ）哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じる、結合領域における１個以上のアミノ酸置換を同定するステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
アミノ酸置換が、アミノ酸３００、３４５、３９８および４１８からなる群より選択されるｇｐ１２０のアミノ酸位置に対応する位置にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸置換が、ｇｐ１２０のＶ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５領域にある、請求項１、５、９または１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸中の少なくとも１個のヌクレオチドが置換される、請求項１、５、９または１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１、５、９または１３のいずれかに記載の方法によって同定されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項１８】
アミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、３１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４１８、４２６、４３５、４６６および４７２からなる群より選択されるｇｐ１２０のアミノ酸に対応する位置に１個以上のアミノ酸置換を含む、分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項１９】
抗体中和耐性エンベロープタンパク質の少なくとも１個の第一の断片、および抗体中和感受性エンベロープタンパク質からの少なくとも１個の第二の断片を含む、分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２０】
第一または第二の断片が約５０〜約８００個のアミノ酸である、請求項１９に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２１】
抗体中和耐性エンベロープタンパク質の第一の断片が配列番号２（ＭＮ−Ｐ）からの断片を含む、請求項１９に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２２】
第一の断片が、配列番号２のアミノ酸１〜１２３、配列番号２の１２３〜２１２、配列番号２の２１２〜２７４、配列番号２の２７４〜３６７、配列番号２の３６７〜４６８、配列番号２の４６８〜５１７、配列番号２の５１７〜６１１、配列番号２の６１１〜７５９、および配列番号２の７５９〜８５８のアミノ酸からなる群より選択される、請求項２１に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２３】
抗体中和感受性エンベロープタンパク質の第二の断片が配列番号４（ＭＮ−ＴＣＬＡ）からの断片を含む、請求項１９に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２４】
第二の断片が配列番号４のアミノ酸１〜１２３、配列番号４の１２３〜２１２、配列番号４の２１２〜２７４、配列番号４の２７４〜３６７、配列番号４の３６７〜４６８、配列番号４の４６８〜５１７、配列番号４の５１７〜６１１、配列番号４の６１１〜７５９、および配列番号４の７５９〜８５８からなる群より選択される、請求項２３に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２５】
１個以上のアミノ酸置換を更に含む、請求項１９に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２６】
１個以上のアミノ酸置換が、アミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、３１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４１８、４２６、４３５、４６６および４７２からなる群より選択されるアミノ酸位置にある、請求項２５に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２７】
１個以上のアミノ酸置換が、Ｖ６４Ａ、Ｑ８４Ｅ、Ｎ２４３Ｋ、Ｔ２４５Ｓ、Ｐ２４９Ｓ、Ｄ２８７Ｎ、Ｄ２９０Ｎ、Ｎ３１１Ｙ、Ｙ３１２Ｎ、Ｋ３１４Ｒ、Ｋ３１６Ｔ、Ｎ３７１Ｋ、Ｐ３７２Ｑ、Ｖ４２６Ｉ、Ｋ４３５Ｎ、Ｅ４６６ＮおよびＤ４７２Ｎからなる群より選択される、請求項２６に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質。
【請求項２８】
請求項１８または１９に記載の分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項１８から２７のいずれか一項に記載のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３０】
１個以上の発現調節領域に作動的に結合される、請求項２９に記載の核酸分子。
【請求項３１】
請求項２９に記載の分離された核酸分子を含むベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項２９に記載の核酸分子を含有するように形質転換された宿主細胞。
【請求項３４】
前記宿主が原核宿主細胞および真核宿主細胞からなる群より選択される、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項２９に記載の核酸分子によって形質転換された宿主細胞を、前記核酸分子によってコードされたポリペプチドが発現される条件下で培養するステップを含む、ポリペプチドを生成する方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載の方法によって生成された分離されたポリペプチド。
【請求項３７】
請求項１８から２７のいずれか一項に記載のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３８】
請求項２９に記載の核酸分子を含む弱毒化ＨＩＶ−１。
【請求項３９】
請求項２９に記載の核酸分子を含むウィルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【関連出願データ】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている米国仮出願第６０／３７９，０５２号（２００２年５月１０日出願）の利益を主張する。
【連邦支援の謝辞】
【０００２】
本発明は、一部が国立衛生研究所の連邦助成金から資金援助を受けた研究によりなされた（ＡＩ３７４３８）。
【発明の分野】
【０００３】
本発明は、ウィルス学の分野に関するものであり、特にヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関する。本発明は特に、オリゴマータンパク質複合体の異なる領域間の相互作用を調節し、エンベロープの免疫学的表現型を決定する、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質アミノ酸配列に関する。
【背景】
【０００４】
幅広い防御性中和抗体反応の誘導は、ワクチンの潜在的有効性に関する主要な問題である。ＨＩＶ−１に対するワクチンを開発する努力は、ウィルスの中和に対する耐性、および保存された中和エピトープを発現する安定した高次構造のエンベロープタンパク質を調製する困難の結果として遅滞してきた。この耐性は、一次ウィルスアイソレートの実験適合ウィルスおよび系統間の抗原変異との比較において明らかである（Ｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９，４３１−４３８；Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６，３８４−３９７；Ｋａｔｚｅｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．３，８１０−８１６；Ｌａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，１８２３−１８３１）。
【０００５】
一部のレンチウィルス感染では、疾病発症が間欠的に起こり、逃避変異（エスケープミューテーション）の発生に続くウィルス複製増加の期間に関連付けられる（Ｋｏｎｎｏ  ＆  Ｙａｍａｍｏｔｏ（１９９０）Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．６０，３９３−４４９）。ＨＩＶ感染では、ウィルス複製の部分免疫制御の証拠がある。ウィルスは急性感染の間の早期に血漿中でただちに検出されるが、慢性感染の前ＡＩＤＳ期間には低レベルである（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７３，６０−６７）。複製の部分制御にもかかわらず、実質的なウィルス複製は慢性感染の前ＡＩＤＳ期間中には継続中のままであり、変異系統が出現する可能性がある（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１，１６２１−１６２５；Ｐｅｒｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１，１５８２−１５８６）。中和逃避変異は、慢性感染の期間中に、または後期の免疫低下に寄与するものとしてすら重要である。
【０００６】
生体内で、あるいは感染したヒトまたは動物由来の血清の存在下の生体外での中和逃避変異の、制限された研究が行われてきた（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＆  Ｃｌａｐｈａｍ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３，３５６−３６１；Ｐａｒｋ  ＆  Ｑｕｉｎｎａｎ  （１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５７０７−５７１３）。２つのグループが、感染進行中の早期に発生するＶ３領域逃避変異の証拠を報告した（Ｓａｗｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６，３４１−３５６；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，６４４−６５５）。複数のエピトープに対する抗体による中和に影響を及ぼす包括的耐性表現型を仲介する、ｇｐ４１における中和エピトープから離れた部位での変異についての報告もある（Ｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９，４３１−４３８；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２１０７−２１１４；ＭｃＫｅａｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１，７３２−７４２；  Ｒｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５４，５７−６３；Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，４５５７−４５６５）。おそらく、これらの変異は、エンベロープ複合体の高次構造への影響を通じて、中和耐性に寄与すると考えられている。
【０００７】
ｇｐ１２０の原子構造の決定およびケモカインレセプターがＨＩＶのコレセプターであるという発見は、エンベロープ複合体中の中和エピトープの性質、ならびに細胞接着および侵入におけるこれらのエピトープの潜在的役割の理解を実質的に前進させた（Ａｌｋｈａｔｉｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，１９５５−１９５８；  Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２，８７２−８７７；Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７０）  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｖｅｔ．６０，３９３−４４９；Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，７０５−７１１）。一次エンベロープ上で機能的である中和エピトープは、高次構造依存性の傾向がある（Ｆｏｕｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１，２７７９−２７８５）。一部のエピトープの接触性は、ＣＤ４の結合後に発生する高次構造変化に依存する。これらのＣＤ４誘導型エピトープは一般に、コレセプター結合部位内のエピトープと考えられる。実験用ワクチンに対する弱い中和抗体反応の結果として、レセプター結合に続く高次構造変化中に露出されるエピトープに対する抗体を誘導する方法を規定することに関心が生じた。中和耐性の機構および一次アイソレートの中和において機能的である標的エピトープの性質決定は、ＨＩＶに対して効果的に免疫化する努力を実質的に助長する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ｇｐｌ２０のｇｐ４１、ＣＤ４またはコレセプター結合領域、あるいはｇｐｌ２０の外部領域において１個以上のアミノ酸を置換することと、哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じる結合ドメインにおける１個以上のアミノ酸置換を同定することとを含む、哺乳動物への投与後に交差反応性免疫反応を生じるヒト免疫不全ウィルスタイプ１（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質を同定する方法を含む。これらの置換は、ｇｐ１２０のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４および／またはＶ５領域内に存在しうるものであり、アミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、２１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４２６、４１８、４３５、４６６および４７２より成る群から選択されるｇｐ１２０内のアミノ酸位置に対応する位置に配置され得る。ある実施形態では、置換はＤ９１Ｎ、Ｖ２１９Ｉ、Ｎ２４３Ｋ、Ｔ２４５ＳおよびＰ２４９Ｓ、Ｄ２８７Ｎ、Ｄ２９０Ｎ、Ｎ３７１Ｋ、Ｐ３７２Ｑ、Ｖ４２６Ｉ、Ｋ４３５Ｎ、Ｅ４６６ＮおよびＤ４７２Ｎからなる群より選択される。更に、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸において少なくとも１個のヌクレオチドが置換される。
【０００９】
本発明は、アミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、３１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４１８、４２６、４３５、４６６および４７２からなる群より選択される、ｇｐ１２０中のアミノ酸に対応する位置での１個以上のアミノ酸置換を含む分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含めて、本発明の方法によって同定されるどのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質も含む。
【００１０】
本発明は更に、抗体中和耐性エンベロープタンパク質の少なくとも１個の第一の断片および抗体中和感受性エンベロープタンパク質の少なくとも１個の第二の断片を含む、分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含む。ある実施形態において、第一または第二の断片は約５０〜約８００個のアミノ酸である。一実施形態において、中和耐性エンベロープタンパク質からの第一の断片は、配列番号２（ＭＮ−Ｐ）からの断片を含む。例示的な断片は、配列番号２のアミノ酸１〜１２３、配列番号２の１２３〜２１２、配列番号２の２１２〜２７４、配列番号２の２７４〜３６７、配列番号２の３６７〜４６８、配列番号２の４６８〜５１７、配列番号２の５１７〜６１１、配列番号２の６１１〜７５９、および配列番号２の７５９〜８５８を含むが、これらに限定されるわけではない。別の実施形態において、第二の断片は抗体中和感受性エンベロープタンパク質由来であり、配列番号４（ＭＮ−ＴＣＬＡ）からの断片を含む。例示的な断片は、配列番号４のアミノ酸１〜１２３、配列番号４の１２３〜２１２、配列番号４の２１２〜２７４、配列番号４の２７４〜３６７、配列番号４の３６７〜４６８、配列番号４の４６８〜５１７、配列番号４の５１７〜６１１、配列番号４の６１１〜７５９、および配列番号４の７５９〜８５８を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００１１】
ある実施形態において、本発明の上述のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は更に、１個以上のアミノ酸置換を含む。これらの置換は、アミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、３１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４１８、４２６、４３５、４６６および４７２からなる群より選択されるアミノ酸位置にありうる。これらの置換の例は、Ｖ６４Ａ、Ｑ８４Ｅ、Ｎ２４３Ｋ、Ｔ２４５Ｓ、Ｐ２４９Ｓ、Ｄ２８７Ｎ、Ｄ２９０Ｎ、Ｎ３１１Ｙ、Ｙ３１２Ｎ、Ｋ３１４Ｒ、Ｋ３１６Ｔ、Ｎ３７１Ｋ、Ｐ３７２Ｑ、Ｖ４２６Ｉ、Ｋ４３５Ｎ、Ｅ４６６ＮおよびＤ４７２Ｎからなる群より選択される１個以上のアミノ酸置換を含むが、これらに限定されるわけではない。本発明は、本発明のどのＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をも含む、融合タンパク質も含む。
【００１２】
本発明は、本発明の上記ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のいずれかをコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、核酸分子は１個以上の発現調節領域に作動的に結合される。分離された核酸分子を含むベクターおよびこれらのベクター（ウィルスベクターを含む）を含有する宿主細胞も、本発明の範囲内である。本発明は、上記核酸分子によってコードされたポリペプチドが発現される条件下でこのタンパク質をコードする核酸分子によって形質転換された宿主細胞を培養することを含む、本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を生成する方法も含む。
【００１３】
本発明は更に、本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。そのような組成物は、免疫原性およびワクチン組成物を含む。ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする本発明の核酸分子のいずれかを含む弱毒化ＨＩＶ−１も、本発明の範囲内である。
【詳細な説明】
【００１４】
既に、ＨＩＶ−１のＭＮ系統の中和耐性ミュータントの選択およびキャラクタリゼーションは述べられている（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，７０９９−７１０７；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５７０７−５７１３；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−４１９１）。表現型は、ｇｐ１２０における２個の変異、およびｇｐ４１のロイシンジッパー（ＬＺ）構造における４個の変異に起因した。中和耐性表現型は、６個の変異のうちの５個に起因する高感染性表現型と関連していることが見出された。高感染性は次に、感染中のウィルスの細胞表面結合に続き、ウィルス−細胞膜融合につながるステップの高い効率の結果である（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−４１９１）。本発明は、きわめて中和感受性である、Ｔ細胞系適合（ＴＣＬＡ）のＨＩＶ−１のＭＮ系統（ＭＮ−ＴＣＬＡ）および中和耐性であるＨＩＶ−１の一次ＭＮ系統（ＭＮ−Ｐ）から発現されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に関する。これらの表現型は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１全体に分布する複数の変異、ならびにｇｐ１２０の領域とｇｐ４１のＬＺ配列との機能的相互作用に依存していた。変異の一部は、ＣＤ４またはコレセプターのｇｐ１２０結合部位の中または近傍に局在化している。一次ＨＩＶ−１系統の中和耐性は、高感染効率表現型を付与するエンベロープタンパク質複合体全体に影響を伝達する複数の変異の結果である。
【００１５】
それゆえ本発明は、ＨＩＶエンベロープタンパク質に基づくワクチンおよび免疫原性組成物の合理的設計および調製の方法を提供する。本発明は、ｇｐ１２０内のあるアミノ酸残基がｇｐ４１、ＣＤ４およびコファクターレセプター（例えばＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４）との機能的相互作用を仲介するという発見を含む。ｇｐ１２０内のＣＤ４、コレセプターおよびｇｐ４１結合領域のアミノ酸配列は可変性であるが、あるアミノ酸残基の置換がエンベロープタンパク質の交差反応性免疫反応を幅広く誘発する能力に影響しうることが今や決定されている。このことは、各種の表現型およびクレードにわたってＨＩＶ系統を中和する抗体を誘発することができるＨＩＶサブユニットワクチンまたは免疫原性組成物の設計を促進する。
【００１６】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を同定する方法
本発明は、哺乳動物（例えばヒト）への投与後に交差反応性免疫反応を生成するヒト免疫不全ウィルスタイプ−１（ＨＩＶ−１）エンベロープタンパク質を同定する方法を含む。本発明の方法は、ｇｐ１２０内のＣＤ４、ｇｐ４１およびコファクターレセプター結合領域の中またはその近傍に、抗体中和に対する感受性に関して重要な、アミノ酸残基があるという発見に一部は基づいている。これらの残基は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＶ５を含むｇｐ１２０内の複数の領域にわたって位置する。これらの残基は、ｇｐ１２０のＣ１、Ｃ５、Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３またはＶ４領域あるいはｇｐ４１の任意の領域（例えばロイシンジッパー領域）に位置することもできる。
【００１７】
これらの領域のいずれかにおけるＨＩＶ−１エンベロープタンパク質において適切なアミノ酸を同定または置換するステップは、異なるクレードにわたってすらＨＩＶ−１の各種系統に対して幅広い交差反応性免疫反応が生じるように設計されたワクチンまたは免疫原性組成物を提供する。これらのアミノ酸を含有するこれらの領域のアミノ酸配列は可変性であるが、ｇｐ４１、ＣＤ４およびコレセプター結合領域におけるこれらの残基の位置は保存され、異なるクレードにわたって複数の最も一般的なＨＩＶ系統を中和できるワクチンまたは免疫原性組成物の設計を促進する（例えばＡ、Ａｌ、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｆｌ、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｎ、Ｏ、Ｖ）。
幅広い交差反応性免疫反応を生成することができるエンベロープタンパク質を同定する第一のステップは、ｇｐ４１、ＣＤ４およびコレセプターまたはｇｐ１２０タンパク質の表面に露出されたアミノ酸を含む外部領域と相互作用する、ｇｐ１２０領域内のアミノ酸の位置およびタイプを決定することである。これらの位置は、これらのアミノ酸を含有するｇｐ１２０の領域を配列決定することにより決定できる。あるいは、これらの結合領域のいずれかに特異的である抗体、好ましくはモノクローナル抗体が利用できる場合、異なる位置でのこれらのアミノ酸の置換の効果は、以下に述べる血清学的方法によって決定できる。
【００１８】
一実施形態において、これらのアミノ酸は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＶ５領域の１個以上にあるが、他の実施形態ではこれらのアミノ酸はＣ１、Ｃ５、Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３またはＶ４領域の１個以上に位置する。ｇｐ１２０タンパク質におけるこれらのアミノ酸残基の位置は、配列番号２または４の位置６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、２１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４２６、４１８、４３５、４６６および４７２に対応するアミノ酸を含むが、これに限定されるわけではない。これらの置換の例は、Ｖ６４Ａ、Ｑ８４Ｅ、Ｎ２４３Ｋ、Ｔ２４５Ｓ、Ｐ２４９Ｓ、Ｄ２８７Ｎ、Ｄ２９０Ｎ、Ｎ３１１Ｙ、Ｙ３１２Ｎ、Ｋ３１４Ｒ、Ｋ３１６Ｔ、Ｎ３７１Ｋ、Ｐ３７２Ｑ、Ｖ４２６Ｉ、Ｋ４３５Ｎ、Ｅ４６６ＮおよびＤ４７２Ｎを含むが、これらに限定されるわけではない。これらの位置のアミノ酸それぞれの役割は、適切な置換とともに、実施例で詳細に述べる。
【００１９】
ＨＩＶの各種アイソレートおよび系統のアミノ酸配列について述べる際には、最も一般的な番号方式は、イニシエータメチオニン残基を位置１として用いて、ｇｐ１２０タンパク質内のアミノ酸の位置を指す。アミノ酸の番号付けは、例えば図１の配列比較で示すように、成熟したＨＩＶ−１  ｇｐ１２０アミノ酸配列を反映している。他のＨＩＶアイソレート由来のｇｐ１２０配列の場合、その本来のＮ末端シグナル配列を含み、番号付けは異なることがある。ヌクレオチドおよびアミノ酸残基の番号は、上流の欠失または挿入がウィルスゲノムおよびｇｐ１２０の長さを変更する他の系統では一致しないかもしれないが、領域対応領域または個々のアミノ酸残基は本明細書の教示の参照によりただちに同定される。ｇｐ１２０の可変（Ｖ）領域および保存（Ｃ）領域は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられているＭｏｄｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，５７０−５７８の命名法に従って規定される。
【００２０】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質中の任意のアミノ酸置換がその中和表現型に与える影響を同定するために、修飾ｇｐ１２０によって動物を免疫して抗ｇｐ１２０抗体を誘導する。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。タンパク質の免疫原性組成物を調製するための方法は、宿主動物およびタンパク質によって変わることがあり、また周知である。例えばｇｐ１２０またはその抗原部分は、ＫＬＨまたはＢＳＡなどの免疫原性物質にコンジュゲートさせるか、またはアジュバントなどの中へ供給することができる。誘導された抗体は、それらがｇｐ１２０に対して特異的であるか否かを判定するために試験することができる。ポリクローナル抗体組成物が所望の特異性を提供しない場合、抗体は、無傷ｇｐ１２０またはｇｐ１２０の各種断片を使用してイオン交換クロマトグラフィーおよびイムノアフィニティー法によって分画して、多様な従来の方法によって特異性を向上させることができる。例えば抗体組成物を分画し、組成物を固体基質に固定されたｇｐ１２０と接触させることによって、他の物質への結合を低下させることができる。基質に結合するこれらの抗体は保持される。各種の固体基質に固定された抗原を使用する分画技法、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどを含むアフィニティークロマトグラフィーは周知である。
【００２１】
モノクローナル抗ｇｐ１２０抗体は、多くの従来の方法によって生成することができる。マウスにｇｐ１２０を含有する免疫原性組成物を注射し、脾臓細胞を得ることができる。これらの脾臓細胞は、融合パートナーと融合させてハイブリドーマを調製することができる。ハイブリドーマによって分泌された抗体をスクリーニングして、本明細書で述べるように抗体がＨＩＶ感染を中和するハイブリドーマを選択できる。所望の特異性の抗体を生成するハイブリドーマは標準技法によって培養する。
【００２２】
感染ヒトリンパ球を使用して、多数の技法、例えばマウス融合パートナーとの融合またはＥＢＶとの形質転換によってヒトハイブリドーマを調製することができる。加えて、ヒトまたはマウス脾臓のコンビナトリアルライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ中に発現させて、抗体を生成することができる。コンビナトリアルライブラリーを調製するためのキットは市販されている。ハイブリドーマ調製技法および培養方法は周知であり、本発明のどの部分も構成しない。
【００２３】
抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体の調製後、抗体をスクリーニングして、中和抗体であるこれらの抗体を決定する。モノクローナル抗体がＨＩＶ感染を中和するか否かを判定するアッセイは周知であり、文献で述べられている。簡潔には、抗体およびＨＩＶストックの希釈物を合わせて、抗体がウィルスに結合するのに十分な時間にわたってインキュベートする。その後、ＨＩＶ感染に対して感受性である細胞をウィルス／抗体混合物と合わせて培養する。ＭＴ−２細胞またはＨ９細胞は、実験室での増殖に適した大半のＨＩＶ系統による感染に感受性である。活性化末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはマクロファージは、一次アイソレート（Ｔ細胞系または形質転換細胞系において培養されていない患者試料からのアイソレート）によって感染させることができる。Ｄａａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，６５７４−６５７８は、一次アイソレートによって細胞を感染させる方法について述べている。
【００２４】
細胞を約５日間培養した後、ホルマザンＭＴＴ色素の代謝転換を測定することによって生細胞の数を決定する。感染性の抑制のパーセンテージは、ＨＩＶを中和するそれらの抗体を決定するために計算される。ＨＩＶ中和を決定するための好ましい手順の例は、実施例に述べられている。
【００２５】
ＨＩＶを中和するこれらのモノクローナル抗体は、抗体が結合するアミノ酸置換を含有するエピトープをマッピングするのに使用される。ｇｐ１２０中和エピトープの位置を決定するために、中和抗体をｇｐ１２０の断片と組み合せて、抗体が結合する断片を決定することができる。中和エピトープを局在化するために使用されるｇｐ１２０断片は、本明細書で述べられ、実施例で例示されている、組換えＤＮＡ法によって好ましくは作成される。ｇｐ１２０の異なる重複部分をそれぞれ含む複数の断片を使用することによって、中和抗体が結合する中和エピトープを含むアミノ酸配列が決定できる。
【００２６】
重複断片のこのような使用は、エピトープの位置を約２０〜４０個のアミノ酸残基の領域に狭めることができる。エピトープの位置を確認して、位置を領域約５〜１０個の残基の領域に狭めるために、部位特異的変異誘発性研究を実施する。そのような研究は、中和抗体の結合のために重要な残基を決定することもできる。
【００２７】
抗体に加えて、可溶性ＣＤ４レセプターは、中和に対する感受性を評価するために使用できる。本明細書で使用される可溶性ＣＤ４レセプターはヒトＣＤ４レセプタータンパク質全体およびその断片を含む。一部の実施形態において、当業界で周知であり、本明細書の実施例で与えられているように、可溶性ＣＤ４レセプター断片は膜貫通領域を欠いている。
【００２８】
部位特異的変異誘発性研究を実施するために、組換えＰＣＲ技法を利用して、中和エピトープを含有するｇｐ１２０断片内の選択部位に単一のアミノ酸置換を導入することができる。簡潔には、エピトープを含有する領域の重複部分は、所望のヌクレオチド変化を包含するプライマーを用いて増幅される。生じたＰＣＲ生成物はアニーリングおよび増幅されて、最終生成物が生成される。次に最終生成物が発現され、変異ｇｐ１２０断片を生成する。ｇｐ１２０またはその一部分をコードするＤＮＡの発現は本明細書で述べ、実施例に例示する。
【００２９】
修飾および／またはキメラｇｐ１２０タンパク質は次に、ｇｐ１２０を対照として用いたイムノアッセイで使用され、変異が中和抗体の結合を損傷または除去するときを決定する。これらの重要なアミノ酸残基は、エピトープを除去することなく制限された方法においてのみ変更できる中和エピトープの一部を形成する。エピトープを保存する各変更を決定できる。そのような変異原性研究は、中和抗体による同等の、低下したまたは向上した結合を提供するか、あるいは抗体結合を除去する中和エピトープのアミノ酸配列の変化を示す。ワクチンまたは免疫原性組成物で使用するために適した中和エピトープのアミノ酸配列の変化は、そのような分析によって決定することができる。
【００３０】
あるいは、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０関連部分をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は決定可能であり、ｇｐ１２０のアミノ酸配列を推定することができる。配列決定に十分なＤＮＡを提供するためにＨＩＶアイソレートからｇｐ１２０コード化ＤＮＡを増幅するための方法は、周知である。特にＯｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，１１６５−１１７１；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＡＩＤＳ  ５，６７５−６８１およびＷｏｌｉｎｓｋｙ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５，１１３４−１１３７は、ｇｐ１２０のＤＮＡを増幅するための方法について述べている。増幅ＤＮＡの配列決定は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに述べられている。
【００３１】
特定のエンベロープタンパク質にて置換されるアミノ酸の位置を同定するためのエンベロープアミノ酸およびヌクレオチド配列の配列比較は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって利用されるアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）解析によって実施できる（Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，２２６４−２２６８およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０−３００、参照により十分に組み入れられている）。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用される手法は、クエリー配列とデータベース配列との間で最初に同様の断片を検討し、次に同定されるすべての一致の統計的有意性を評価し、最後に有意性の予備選択閾値を満足する一致のみを要約することである。配列データベースの類似性検索における基本的問題の議論については、参照により十分組み入れられている、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．６，１１９−１２９を参照。  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ、ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ、ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ、ｅｘｐｅｃｔ（すなわちデータベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性閾値）、ｃｕｔｏｆｆ、ｍａｔｒｉｘおよびｆｉｌｔｅｒの検索パラメータはデフォルト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコアリングマトリクスは、  ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０９１５−１０９１９、参照により十分組み入れられている）。４個のｂｌａｓｔｎパラメータは、次のように調整した：Ｑ＝１０（ギャップ作成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ拡張ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってｗｉｎｋ番目の位置でワードヒットを生成）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップ付き配列比較が生成されるウィンドウ幅を設定）。同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用できる配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ作成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ拡張ペナルティ）を使用し、タンパク質比較での同等の設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００３２】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質およびペプチド
本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質およびペプチドは、図３に示したアミノ酸置換のいずれか１個以上を有するエンベロープタンパク質を含む。これらの置換は、Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５を含むエンベロープタンパク質の１個または複数の領域にありうる。これらはアミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、２１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４２６、４１８、４３５、４６６および４７２からなる群から選択されるｇｐ１２０中のアミノ酸に対応する位置に１個以上のアミノ酸置換を含む。これらの位置での置換は、ｇｐ１２０とｇｐ４１、ＣＤ４およびコレセプターとの相互作用および続く抗体による中和に対する感受性に影響することが決定されている。
【００３３】
本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、キメラエンベロープタンパク質でもよい。本明細書で使用される「キメラエンベロープタンパク質」は、第二のエンベロープタンパク質中の対応する配列または断片に置換されたアミノ酸配列の少なくとも１個の第一領域または断片を含有するエンベロープタンパク質を指す。一般に、これらのキメラエンベロープタンパク質は、当業界で周知の組換え法によって生成され、したがって自然には発生しない。第一の領域からの領域またはアミノ酸断片のサイズは、約５〜約８００個のアミノ酸の範囲が可能である。一実施形態において、本発明は、抗体中和耐性エンベロープタンパク質の少なくとも１個の第一の断片、および抗体中和感受性エンベロープタンパク質由来の少なくとも１個の第二の断片を含む分離されたＨＩＶ−１エンベロープタンパク質を含む。一部の実施形態において、第一の断片はＭＮ−Ｐ（配列番号２）などの抗体中和耐性エンベロープタンパク質に由来するが、抗体中和感受性エンベロープタンパク質の第二の断片は、ＭＮ−ＴＣＬＡ（配列番号４）に由来する。第二のエンベロープタンパク質中に置換できるエンベロープタンパク質からの領域またはアミノ酸断片の例は、アミノ酸約１〜約１２３、約１２３〜約２１２、約２１２〜約２７４、約２７４〜約３６７、約３６７〜約４６８、約４６８〜約５１７、約５１７〜約６１１、約６１１〜約７５９、および約７５９〜約８５８を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３４】
一部の実施形態において、キメラＨＩＶ−１エンベロープは１個以上のアミノ酸置換を更に含む。これらの置換は、Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４およびＣ５を含む、エンベロープタンパク質の１個または複数の領域にありうる。これらは、アミノ酸６４、８４、９１、２１９、２４３、２４５、２４９、２８７、２９０、３００、２１１、３１２、３１４、３１６、３４５、３７１、３７２、３９８、４２６、４１８、４３５、４６６および４７２から選択されるｇｐ１２０におけるアミノ酸に対応する位置における１個以上のアミノ酸置換を含む。これらの置換の例は、Ｖ６４Ａ、Ｑ８４Ｅ、Ｎ２４３Ｋ、Ｔ２４５Ｓ、Ｐ２４９Ｓ、Ｄ２８７Ｎ、Ｄ２９０Ｎ、Ｎ３１１Ｙ、Ｙ３１２Ｎ、Ｋ３１４Ｒ、Ｋ３１６Ｔ、Ｎ３７１Ｋ、Ｐ３７２Ｑ、Ｖ４２６Ｉ、Ｋ４３５Ｎ、Ｅ４６６ＮおよびＤ４７２Ｎを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３５】
本発明のエンベロープタンパク質は、本明細書で述べる組換え法を含む既知の技法によって調製できる。加えてペプチドは、当業界で周知の固相合成技法を用いて調製できる。ペプチド合成技法の例は、例えばＢｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙに見出せる。
【００３６】
本明細書で使用されるエンベロープタンパク質は、異なるＨＩＶからのエンベロープタンパク質を含む他の夾雑物からタンパク質が実質的に分離されたときに、「分離された」と言われる。
【００３７】
核酸および組換えタンパク質発現
本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質は、真核または原核宿主細胞中の所望のタンパク質またはペプチドの組換え発現を含む、任意の利用可能な手段によって調製できる（米国特許第５，６９６，２３８号を参照）。精製用の本発明のタンパク質を生成する方法は、当業界の通常技量レベル内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技法を利用できる。そのような技法は、文献で十分に説明されている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｌｏｖｅｒ（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照）。
【００３８】
本発明は更に、本発明のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質をコードする核酸分子を提供する。そのような核酸分子は、分離形であるか、または発現調節領域またはベクター配列に作動的に結合できる。本発明は更に、形質転換、形質移入、電気穿孔法または核酸を細胞内に導入する当業界で認識された他の任意の手段を介してベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００３９】
本明細書で使用される「レプリコン」は、生体内でのＤＮＡ複製の自律単位として機能する（すなわちそれ自体の制御下の複製が可能である）任意の遺伝要素（例えばプラスミド、染色体、ウィルス）である。
【００４０】
本明細書で使用される「ベクター」は、結合断片の複製を引き起こすために別の核酸（例えばＤＮＡ）断片が結合する、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンである。本発明のベクターはウィルスベクターを含む。
【００４１】
本明細書で使用される「核酸」は、その一本鎖形または二重らせんのいずれかの、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンおよび／またはシトシン）のポリマー形を指す。この用語は、分子の一次または二次構造のみを指し、特定の三次形に限定されない。それゆえ、この語は、線形ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、ウィルス、プラスミド、および染色体に見られる一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ、二重鎖ＤＮＡを含む。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を述べる場合、配列は本明細書では、ＤＮＡの非転写鎖（例えばｍＲＮＡと相同的である配列を有する鎖）に沿って５’〜３’方向の配列のみを与える通常の慣習に従って述べる。
【００４２】
核酸「コード配列」は、適当な制御配列の制御下に置かれた場合、生体内で転写されポリペプチドに翻訳される二重鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通例、コード配列に対して３’に位置するであろう。
【００４３】
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞のコード配列の発現を供給するＤＮＡ制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどである。
【００４４】
本明細書で使用される「プロモーター配列」は、細胞中のＲＮＡポリメラーゼと結合して、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモータ配列は転写開始部位によってその３’末端に（包括的に）結合され、上流（５’方向）に延伸して、バックグラウンドより上の検知可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基または要素の最低数を含む。プロモーター配列内に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合領域と同様に、転写開始部位が見出されるであろう。真核プロモーターは常にではないが、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有するであろう。
【００４５】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、それがコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるときに、転写および翻訳制御配列の「制御下に」ある。
【００４６】
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれることができるか、またはエンベロープタンパク質由来の本来の２９アミノ酸シグナルペプチド配列を使用できる。この配列は、宿主細胞に対して、ポリペプチドを細胞表面に導くように、またはポリペプチドを培地に分泌させるように伝えるシグナルペプチド、ポリペプチドのＮ末端、をコードする。このシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核細胞および真核細胞に固有の各種のタンパク質に結合されていることが見出される。例えば、未変性酵母タンパク質であるα因子は酵母から分泌され、そのシグナル配列は、培地に分泌される非相同性タンパク質に結合されることができる（米国特許第４，５４６，０８２号を参照）。更にα因子およびその類似物質は、サッカロマイセスおよびクリベロマイセスなどの各種の酵母から非相同性タンパク質を分泌することが見出されている（欧州特許第８８３１２３０６．９号；欧州特許第０３２４２７４号  公報、および欧州特許第０３０１６６９号）。哺乳動物細胞での使用例は、第ＶＩＩＩｃ因子軽鎖を発現させるために使用されるｔＰＡシグナルである。
【００４７】
細胞は、外因性または非相同性核酸が細胞内に導入されるときに、そのような核酸によって「形質転換」されている。形質転換核酸は、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれる（共有結合される）ことも、組み込まれないこともある。原核生物において、例えば、形質転換核酸は、プラスミドまたはウィルスベクターなどのエピソーム要素上に維持される。真核細胞に関して、安定して形質転換された細胞は、染色体複製を通じて娘細胞によって受け継がれるために、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれるようになった細胞である。この安定性は、真核細胞が形質転換核酸を含有する娘細胞の個体群より成る細胞系またはクローンを確立する能力によって証明される。
【００４８】
本明細書で使用される「細胞系」は、多くの世代にわたって生体外での安定成長が可能である一次細胞のクローンである。本明細書において、核酸配列は、ヌクレオチドの少なくとも８５％（好ましくは少なくとも約９０％および最も好ましくは少なくとも約９５％）がＤＮＡ配列の定義長にわたって一致する場合に、「実質的に相同的」である。実質的に相同的である配列は、例えばその特定の系に対して定義された厳密な条件下でサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当業界の技量の範囲内である。
【００４９】
核酸構築物の「非相同性」領域は、自然界でより大きい分子と関連して見出されない、より大きな核酸分子内の核酸の同定可能な断片である。それゆえ非相同性領域が哺乳動物遺伝子をコードするとき、遺伝子は通例、ソース生物のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡによって隣接されるであろう。非相同性コード配列の別の例は、コード配列自体が自然界に見出されない構築物である（例えばゲノムコード配列が、イントロン、または未変性遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮＡ）。
【００５０】
ベクターは、更なる処理のための大量の核酸の調製のために（クローニングベクター）、あるいはペプチドのＨＩＶエンベロープタンパク質の発現のために（発現ベクター）、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドをコードする核酸の操作を簡単にするために使用される。ベクターは、プラスミド、ウィルス（ファージを含む）、および組込みＤＮＡ断片（すなわち組換えによって宿主ゲノムに組み込まれる断片）を含む。クローニングベクターは、発現制御配列を含有する必要はない。しかしながら、発現ベクター内の制御配列は、転写プロモーター、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列などの、転写および翻訳制御配列を含む。発現ベクターは好ましくは、ＨＩＶエンベロープ遺伝子の安定発現を促進し、および／または形質転換細胞を同定するための選択遺伝子を含むべきである。しかしながら、発現を維持するための選択遺伝子は、真核宿主細胞を用いた同時形質転換系における独立ベクターによって供給することができる。
【００５１】
適切なベクターは一般に、レプリコン（非組込みベクターでの使用のための複製開始点）および意図する発現宿主に適合性のある種に由来する制御配列を含有するであろう。本明細書において、「複製可能な」ベクターという語によって、宿主ゲノムへの組込みによって複製されるベクターと同様に、そのようなレプリコンを含有するベクターを含むことが意図される。形質転換宿主細胞は、ＨＩＶエンベロープペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含有するベクターによって形質転換または形質移入された細胞である。発現されたＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドは、発現ペプチド（例えば、相同性または非相同性シグナル配列）における適切な処理シグナルの制御下で、培養上澄中に分泌される。
【００５２】
宿主細胞の発現ベクターは通常、複製開始点、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドコード配列から上流に位置するプロモーターを、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列と共に含む。当業者は、これらの配列の一定のものは一定の宿主での発現にとって必要ないことを認識するであろう。微生物との使用のための発現ベクターは、宿主によって認識される複製開始点、宿主内で機能するプロモーター、および選択遺伝子のみを含有する必要がある。
【００５３】
通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、ウシパピローマウィルス、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス、ネズミまたはヒト）、ラウス肉腫ウィルス、アデノウィルス、およびシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）に由来する。他の制御配列（例えばターミネーター、ポリＡ、エンハンサー、または増幅配列）も使用できる。
【００５４】
発現ベクターは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質またはペプチドコード配列が適当な制御配列を有するベクター内に位置するように作成され、制御配列に対するコード配列の位置決めおよび向きは、コード配列が制御配列の「制御」下で転写および翻訳されるようになっている（すなわち制御配列においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。制御配列は、上述したクローニングベクターのようなベクターへの挿入前にコード配列に連結できる。あるいはコード配列は、制御配列および適当な制限部位をすでに含有する発現ベクター内に直接クローニングできる。選択した宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、制御配列はＨＩＶ−１エンベロープタンパク質コード配列に対して非相同性または相同性でもよく、コード配列はイントロンを含有するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのどちらでもよい。
【００５５】
高等真核細胞の培養物を用いて、昆虫を含む、脊椎動物または無脊椎動物の細胞のどちらからも本発明のタンパク質を発現させることができ、その増殖方法は既知である。
【００５６】
哺乳動物組織で発現される場合、組換えＨＩＶ遺伝子生成物は、グリコシル化によって予想されるよりも高い分子量を持つことが認識されるであろう。したがって、１６０、１２０または４１キロダルトンとは多少異なる分子量を有するＨＩＶエンベローププレタンパク質またはペプチドの部分的または完全グリコシル化形が本発明の範囲内であることが意図される。
【００５７】
他の発現ベクターは、真核系での使用のための発現ベクターである。例示的な真核発現系は、当業界で周知のワクシニアウィルスを使用する系である（例えば国際公開公報第８６／０７５９３号を参照）。酵母発現ベクターは当業界で既知である（例えば米国特許第４，４４６，２３５号および第４，４３０，４２８号を参照）。別の発現系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を形質転換するベクターｐＨＳＩである（国際公開公報第８７／０２０６２号を参照）。哺乳動物組織は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼなどの選択マーカーをコードするＤＮＡ、およびＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡを用いて同時形質転換できる。野生型ＤＨＦＲ遺伝子が利用される場合、ＤＨＦＲが欠乏している宿主細胞を選択することが好ましく、それゆえヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンが欠乏したｈｇｔ培地でのＤＨＦＲコード配列の使用が成功する形質移入のマーカーとして許容される。
【００５８】
選択した発現系および宿主に応じて、ＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドは、上述の発現ベクターなどの外因性または非相同性ＤＮＡ構築物によって形質転換された宿主細胞を、ＨＩＶエンベロープタンパク質が発現される条件下で増殖させることによって生成される。ＨＩＶタンパク質またはペプチドは次に、宿主細胞から分離され、精製される。発現系がタンパク質またはペプチドを増殖培地に分泌したら、タンパク質は無細胞培地から直接精製することができる。適当な増殖条件および初期粗製物回収方法の選択は当業界の技能の範囲内である。
【００５９】
本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドのコード配列がいったん調製または分離されると、適切なベクター内にクローニングして、それによってどのＨＩＶエンベロープタンパク質コード配列も含有しない細胞を実質的に含まない、細胞の組成物中に保持することができる。上述したように、各種のクローニングベクターが当業者に既知である。
【００６０】
ワクチン組成物
ワクチンまたは免疫原性組成物中で使用する場合、本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質は、「サブユニット」または他のワクチンまたは免疫原として使用できる。そのようなワクチンまたは免疫原は、安全性および製造コストの点で従来のワクチンに勝る著しい利点を提供する；しかしながらサブユニットワクチンは、ホールウィルスワクチンよりもしばしば免疫原性が低く、その全潜在能力を及ぼすために、著しい免疫活性化能力を備えたアジュバントを添加することが期待される。
【００６１】
「サブユニットワクチン」という用語は本明細書で、当業界においてと同様に、ウィルスを含有するのではなく、むしろ１個以上のウィルスタンパク質またはウィルスタンパク質断片を含有するウィルスワクチンを指す。本明細書で使用される「多価」という用語は、ワクチンが少なくとも２個の異なるＨＩＶ−１アイソレート由来の修飾ｇｐ１２０を含有することを意味する。
【００６２】
現在、米国でヒトへの使用が承認されたアジュバントは、アルミニウム塩（ａｌｕｍ）を含む。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、およびインフルエンザを含む一部のワクチンに有用である。他の有用なアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ＭＤＰの合成類似物質、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシ−ホスホリルオキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）、ならびに代謝可能な油および乳化剤であって、実質的にすべてが直径１ミクロン未満の油滴を有する水中油型エマルジョンの形で存在する油および乳化剤を含有する、組成物を含む（例えば欧州特許第０３９９８４３号を参照）。
【００６３】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物の製剤は、タンパク質またはペプチド抗原の有効量を利用する。すなわち、任意の種類のＨＩＶへの続いての暴露からの保護を対象者に与えるために、アジュバントと併用して、対象者に特異的かつ十分な免疫反応を生じさせる抗原の量が含まれるであろう。免疫原性組成物として使用される場合、製剤はアジュバントと併用して、対象者に診断または治療目的で使用される特異性抗体を生じさせる抗原の量を含有するであろう。
【００６４】
本発明のワクチン組成物は、ＨＩＶ−１感染の予防または治療に有用である。ＨＩＶ−１に罹患しうるすべての動物をこの方法で治療できるが、本発明はもちろん、本発明のワクチンのヒトでの予防および治療使用に特に向けられている。所望の予防または治療効果を引き起こすためには、しばしば１回を超える投与が必要とされる；正確なプロトコル（投薬量および頻度）は、標準臨床手順によって確立することができる。
【００６５】
ワクチン組成物は、ワクチンを動物に導入する従来の任意の方法で投与され、通例は注射によって投与される。経口投与では、ワクチン組成物はインスリンなどの他のタンパク性物質の経口投与に使用される形と同様の形で投与できる。上述したように、予防または治療の使用のための正確な量および製剤は、抗原の固有の純度および活性の状況、追加の成分または担体、投与方法などによって変わる可能性がある。
【００６６】
非限定的な例示のために、投与されるワクチン投薬量は通例、ｇｐ１２０抗原に関しては最低約０．１ｍｇ／用量、更に通例は最低約１ｍｇ／用量、およびしばしば最低約１０ｍｇ／用量となるであろう。最大投薬量は通例、それほど重要ではない。しかしながら通例、投薬量は約１ｍｇ／用量以下、通例５００ｍｇ／用量以下、しばしば２５０ｍｇ／用量以下であろう。これらの投薬量は、投薬量を保持するのに十分な体積の適当な薬学的ビークルまたは担体中に懸濁できる。一般に担体、アジュバントなどを含む最終体積は通例、少なくとも０．１ｍｌ、更に通例、少なくとも約０．２ｍｌとなる。上限は、投与される量の実用性に支配され、一般に約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌ以下である。
【００６７】
ｇｐ１２０のＣＤ４、ｇｐ４１またはコファクター結合領域のいずれかなどの、エンベロープタンパク質の領域に対応する本発明のペプチドは、同じ領域の多量体または異なる領域の多量体を含む化合物または組成物に構築または製剤化することができる。例えばＶ５領域に対応するペプチドは、システイン残基の酸化によって環状化して、１、２、３、４個またはそれ以上の個別のペプチドエピトープを含有する多量体を形成することができる。環状形は、空気酸化などの標準酸化手順によってジスルフィド結合を形成するためにシステイン残基を酸化することによって得られる。
【００６８】
本発明の合成ペプチドは、エンベロープタンパク質にてそれらが発生するときの部分の形態を模倣するために環状化できる。環状化は、既存のシステイン残基間のジスルフィドブリッジによって促進される。システイン残基は、エンベロープタンパク質に由来するペプチドの部分に隣接するペプチド上の位置にも含まれる。あるいは、エンベロープタンパク質に由来するペプチドの部分内のシステイン残基は、そのような残基を包含するジスルフィドブリッジの形成を除去するために、削除および／または保存的に置換できる。ペプチドを環状化する他の手段も周知である。ペプチドは、アミノおよびカルボキシ末端における、またはその近傍などの、ペプチドのアミノ酸残基間の、アミド結合などの共有結合によって環状化できる（例えば米国特許第４，６８３，１３６号を参照）。
【００６９】
別の形式では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、宿主動物において本発明のＨＩＶエンベロープタンパク質またはペプチドを発現するワクチンベクターとして調製できる。ワクシニアウィルス、ベネズエラウマ脳炎ウィルスレプリコンを含む、入手可能ないずれのワクチンベクターも使用できる（例えば米国特許第５，６４３，５７６号を参照）。あるいは、抗原の発現を行うために、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする裸の核酸を直接投与できる（例えば米国特許第５，７３９，１１８号を参照）。
【００７０】
ワクチンでの使用のためのｇｐ１２０の調製は周知であり、以下に述べる。修飾エンベロープタンパク質の使用を除いて、本方法で調製したワクチンは、従来技術のｇｐ１２０サブユニットワクチンと異なる必要はない。
【００７１】
従来技術のｇｐ１２０サブユニットワクチンと同様に、所望の純度で抗体形成を誘発するために十分な濃度のｇｐ１２０を生理的に許容される担体と混合する。生理的に許容される担体は、ワクチンに利用される投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性である。一般にワクチンは注射用に、通例、筋肉内注射用または皮下注射用に製剤化される。注射に適切な担体は滅菌水を含むが、好ましくは普通の生理食塩水などの生理的塩溶液、あるいはリン酸緩衝生理食塩水または乳酸リンゲルなどの緩衝塩溶液である。ワクチンは一般に、アジュバントを含有する。有用なアジュバントは、細胞傷害性Ｔ細胞およびａｌｕｍ（水酸化アルミニウムアジュバント）を刺激するＱＳ２１を含む。細胞または局所免疫を向上させる各種のアジュバントを用いた製剤も使用できる。
【００７２】
ワクチンに存在しうる追加の賦形剤は、低分子量ポリペプチド（約１０個未満の残基）、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストランを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、および他の賦形剤を含む。
【００７３】
ワクチンは、他のＨＩＶタンパク質も含有することができる。特にｇｐ４１またはｇｐ４１の細胞外部分は、ワクチン中に存在することができる。ｇｐ４１は保存されたアミノ酸配列を有するため、ワクチン中に存在するｇｐ４１は、どのＨＩＶアイソレート由来でもよい。ワクチンで使用されるアイソレート由来のｇｐ１６０は、ワクチン中のｇｐ１２０を置換できるか、またはアイソレート由来のｇｐ１２０とともに使用できる。あるいは、ワクチンアイソレートとは異なる中和エピトープを有するアイソレート由来のｇｐ１６０は更にワクチン中に存在できる。
【００７４】
ワクチン製剤は一般に、好都合に、担体約１．０ｍｌ中に総量約３００〜６００μｇのｇｐ１２０を含む。ワクチン中に存在する任意のアイソレートのｇｐ１２０の量は、ｇｐ１２０の免疫原性によって変化するであろう。多価ワクチン中の免疫原性タンパク質の相対量を決定する方法は周知であり、例えば多価ポリオワクチン中の各種のアイソレートの相対比率を決定するために使用されている。
【００７５】
本発明のワクチンは、従来技術のＨＩＶ  ｇｐ１２０サブユニットワクチンと同様の方法で投与できる。特に、ワクチンはプロトコルに応じて、一般に０、１、６、８または１２ヶ月に投与される。免疫化手順の後、年１回または年２回の追加免疫を投与することができる。しかしながら免疫化プロセスの間およびその後、中和抗体レベルをアッセイして、それに従ってプロトコルを調整することができる。
【００７６】
ワクチンは未感染の個人に投与できる。加えてワクチンは、従来技術のＨＩＶワクチンと同様に、ウィルスへの免疫反応を向上させるために血清反応陽性の個人に投与することができる。宿主での発現のために、ワクチン用のｇｐ１２０の系統をコードするＤＮＡを適切なビークルに投与できることも検討される。この方法では、ｇｐ１２０が感染宿主にて生成可能であり、反復免疫化の必要性を除去する。
【００７７】
当業者は、更なる説明なしに、以上の説明および以下の実例となる実施例を使用して、本発明の化合物を作成および利用して、特許請求された方法を実施できると考えられる。以下の実施例は、本発明の実施形態を説明し、開示の残りを決して限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
シュードタイプウィルス構築、感染価測定および中和アッセイ
各種のｅｎｖプラスミドに由来するエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイプ化されたウィルスを、前に述べられているように、ｐＳＶ７ｄ−ｅｎｖおよびｐＮＬ−Ｌｕｃ−Ｅ−Ｒ−を用いて構築した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，７０９９−７１０７；Ｃｏｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５３０６−５３１１）。ｅｎｖプラスミドＤＮＡおよびｐＮＬ−Ｌｕｃ−Ｅ−Ｒ−を、リン酸カルシウム形質移入によって５０％コンフルエント２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に導入した。培養培地は、形質移入の１８時間後に１μＭ酪酸ナトリウムを含有する新しい培地と交換した。形質移入の４８時間後、シュードタイプウィルスを含有する上澄を回収し、４５μｍ孔径フィルターによって濾過し、ただちに感染性および中和アッセイに使用した。あるいは、濾過したシュードタイプウィルスは、更にウシ胎仔血清を最終濃度２０％まで添加し、−８０℃にて保管した。シュードタイプウィルスの感染性を測定するために、ＨＯＳ−ＣＤ４＋−ＣＸＣＲ４＋細胞を用いた発光アッセイを使用した。細胞（１．５×１０４／ｍｌ）を、Ｕ底ウェルの９６ウェルプレート中で連続希釈したシュードタイプウィルスを用いて接種した。培養物は３７℃にて３日間インキュベートして、その後、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１５μｌを用いて溶解させた。ルシフェラーゼ活性は、Ｌｕｍｉｎｏｓｃａｎ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社）で読み取った。
【００７９】
感染から生じた発光は、ＭＮ−ＴＣＬＡに比較した比として表現した。相対感染性は、所与のｙについてＸＭ／ＸＭＮ−ＴＣＬＡとして決定し、接種希釈物の関数として対数変換ルシフェラーゼ活性決定（光単位）の回帰分析によって決定した最良適合ラインを用いて計算した。各シュードタイプウィルスの中和表現型は、連続希釈血清の２５μｌ分割量を適切なシュードタイプウィルスの等量と混合し、４℃にて１時間インキュベートして、その後、ＨＯＳ−ＣＤ４＋−ＣＸＣＲ４＋細胞を添加したことを除いて、感染性アッセイと同様の方法で試験した。シュードタイプウィルス希釈物を選択して、バックグラウンドの約１００倍の非免疫性血清の存在下で発光を生成した。中和終点は、非中和対照と比較して９０％の発光低下を引き起こすと計算された最高の血清希釈度と見なした。ヒト中和血清２（ＨＮＳ２）および陰性参照血清を基準中和および非中和血清としてそれぞれ使用した（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＡＲＲＲＰ  １９８３  ａｎｄ  ２４１１），Ｖｕｊｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １１，７８３−７８７）。
【００８０】
（実施例２）
キメラエンベロープ糖タンパク質遺伝子の構築
複数のキメラｅｎｖクローンは、以前に述べられたように、中和感受性のＭＮ−ＴＣＬＡ、および中和耐性のＭＮ−Ｐ親ｅｎｖクローンの断片を交換することによって構築した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，７０９９−７１０７）。ｐＳＶ７ｄベクターにすべてのキメラｅｎｖ遺伝子をクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭビッグダイ−ターミネーター法によって配列決定した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）。解析は、ＥｄｉｔＳｅｑおよびＭｅｇＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳｔａｒ社）を用いて実施した。特異的制限酵素およびその認識配列の位置を図２に示す。ヌクレオチド位置は、ＭＮＣＧ配列（Ｇｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６４，５３１−５３６）に基づいて番号付けされる。キメラＡおよびＢは、プラスミドをＥｃｏＲＩ（ｐＳＶ７ｄ中のｅｎｖ開始コドンの上流）およびＳａｃＩ（ヌクレオチド１５５０）で消化することによって構築した。ＳａｃＩ部位がｇｐ１２０とｇｐ４１との間の開裂部位からアミノ酸４個下流に位置するため、キメラＡは、ＭＮ−ＴＣＬＡからのｇｐ１２０の配列全体を、ＭＮ−Ｐからの領域（ｇｐ４１）の残りと共に含有する。
【００８１】
キメラＣ、Ｄ、ＥおよびＦは、ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｐの両方のヌクレオチド１５５０および２２７５におけるＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をｐＵＣ１９に最初にサブクローニングして構築した。生成物をそれぞれｐＵＣ１９／ＭＮ−ＴＣＬＡｅｎｖまたはｐＵＣ１９／Ｐ３７ｅｎｖと呼んだ。キメラＣを構築するには、ｐＵＣ１９／Ｐ３７ｅｎｖのＳａｃＩ−ＢｓｍＩ断片（２６７ヌクレオチド）をｐＵＣ１９／ＭＮ−ＴＣＬＡｅｎｖのＢｓｍＩ−ＳａｃＩ断片と連結した。生成物をｐＵＣ１９／ｅｎｖＣと呼んだ。次にｐＵＣ１９／ｅｎｖＣのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をＭＮ−ＴＣＬＡの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４４９３ヌクレオチド）と連結した。キメラＤを作成するために、ｐＵＣ１９／ＭＮ−ＴＣＬＡｅｎｖのＳａｃＩ−ＢｓｍＩ断片（２６７ヌクレオチド）をｐＵＣ１９／Ｐ３７ｅｎｖのＢｓｍＩ−ＳａｃＩ断片と連結した。生成物をｐＵＣ１９／ｅｎｖＤと呼んだ。次にｐＵＣ１９／ｅｎｖＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をＭＮ−ＴＣＬＡの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４４９３ヌクレオチド）に連結した。キメラＥを作成するために、ｐＵＣ１９／ｅｎｖＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をＭＮ−Ｐの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４５１４ヌクレオチド）に連結した。キメラＦを作成するために、ｐＵＣ１９／ｅｎｖＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をＭＮ−Ｐの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４５１４ヌクレオチド）に連結した。キメラＧおよびＨは、大型および小型のＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片５７１および４６６８ヌクレオチドをそれぞれ、ＭＮ−ＰとＭＮ−ＴＣＬＡとの間で交換することによって構築した。キメラＧＣを構築するために、キメラＣのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ｂｐ）をキメラＧ（４４９３ヌクレオチド）の大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片と連結した。
【００８２】
キメラＧＤを作成するために、キメラＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＨの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４４９３ヌクレオチド）に連結した。キメラＨＣを作成するために、キメラＣのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＨの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４５１４ヌクレオチド）に連結した。キメラＨＤは、キメラＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＨの大型ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（４５１４ヌクレオチド）に連結して作成した。キメラＩは、キメラＧＤのＢａｍＨＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ断片（１３２４ヌクレオチド）をＭＮ−ＴＣＬＡの大型Ｂｓｕ３６Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（３８９４ヌクレオチド）と連結することによって構築した。キメラＪを作成するために、キメラＢのＢｓｕ３６Ｉ−ＳａｌＩ断片（１１７５ヌクレオチド）をＭＮ−ＴＣＬＡの大型ＳａｌＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ断片（４０４３ヌクレオチド）と連結した。キメラＫを作成するために、キメラＣのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＩの大型ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片（４４９３ヌクレオチド）と連結した。キメラＬを作成するために、キメラＣのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＪの大型ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片（４４９３ヌクレオチド）と連結した。キメラＭは、キメラＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＩの大型ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片（４４９３ヌクレオチド）と連結することによって構築した。キメラＮを作成するために、キメラＤのＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片（７２５ヌクレオチド）をキメラＪの大型ＳａｌＩ−ＳａｃＩ断片（４４９３ヌクレオチド）と連結した。
【００８３】
以下の８個のキメラは、考えられるｇｐ１２０−ｇｐ４１相互作用を考察するために構築した。キメラＯを構築するために、ＭＮ−ＰのＢａｍＨＩ−ＤｒａＩＩＩ断片（５９２ヌクレオチド）をキメラＣの大型ＤｒａＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（４６２６ヌクレオチド）と連結した。キメラＰを作成するために、キメラＨを最初に変異させてＥｃｏＲＶ部位をヌクレオチド６３６に導入し、キメラＨ（＋ＥｃｏＲＶ）を形成した。キメラＨ（＋ＥｃｏＲＶ）のＤｒａＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片（２６８ヌクレオチド）を次に、キメラＣの大型ＥｃｏＲＶ−ＤｒａＩＩＩ断片（４９５０）と連結した。キメラＱを作成するために、キメラＨ（＋ＥｃｏＲＶ）のＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片（９１４ヌクレオチド）をキメラＣの大型ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ断片（４３０４ヌクレオチド）に連結した。このクローンをＱａと呼んだ。ＱａのＥｃｏＲＶ部位を次に除去してキメラＱの構築を完了させた。キメラＲを作成するために、キメラＱを最初に変異させてＥｃｏＲＶ部位をヌクレオチド６３６に導入した。キメラＯ（＋ＥｃｏＲＶ）のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片（６３６ヌクレオチド）をキメラＱの大型ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片（４５７７ヌクレオチド）と連結した。
【００８４】
最後にＥｃｏＲＶ部位をキメラＱ配列のヌクレオチド６３６に戻し変異させて、キメラＲの構築を完了した。キメラＳは、キメラＣを最初に変異させて４個の変異、３００Ｋ／Ｎ、３４５Ｒ／Ｓ、３９８Ｐ／Ｓおよび４１８Ｎ／Ｓを導入することによって構築した。次に４個の変異を含有するキメラＣのＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（５７１ヌクレオチド）をキメラＲの大型ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（４６４２ヌクレオチド）と連結した。４個の変異を含有するキメラＣの同じＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（５７１ヌクレオチド）は、キメラＴを作成するためにＭＮ−ＴＣＬＡの大型ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片（４６４２ヌクレオチド）にも連結した。キメラＵを作成するために、ＭＮ−ＰのＢａｍＨＩ−ＤｒａＩＩＩ断片（３６８ヌクレオチド）をＭＮ−ＴＣＬＡの大型ＢａｍＨＩ−ＤｒａＩＩＩ断片（４８４５ヌクレオチド）と連結した。キメラＶを作成するために、キメラＲのＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片（１５５０ヌクレオチド）をＭＮ−ＴＣＬＡの大型ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片（３６６３ヌクレオチド）と連結した。
【００８５】
部位特異的変異誘発手順は、ｐｆｕポリメラーゼ（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を製造者の指示に従って使用して実施した。反応は自動サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ２４００）で実施した。ヌクレオチド配列は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭビッグダイ−ターミネーター法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列決定により確認した。
【００８６】
追加のミュータントエンベロープ遺伝子は、親遺伝子のそれぞれの特異的断片または配列を含有するように構築した。キメラＣの構築は、既に述べられている。キメラＰは、キメラＣのＶｌ／Ｖ２領域配列をＭＮ−Ｐからの対応する配列に置換することによって構築した。キメラＰの構築を準備するために、変異によってＥｃｏＲＶ部位をＭＮ−Ｐ配列にヌクレオチド６３６にて導入した。修飾ＭＮ−Ｐ配列からのＤｒａＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ配列を、キメラＣの対応する部位に移した。キメラＰ／７ＣＤ４ｂ（以下で定義）は、キメラＣ／７ＣＤ４ｂ（以下で定義）からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片をキメラＰの対応する部位に移すことにより構築した。
【００８７】
変異誘発手順は、前に述べたように製造者の指示に従って、単一または二重ヌクレオチド変化およびＰｆｕポリメラーゼによって設計されたプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）を用いて実施した（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，３１１９−３１３０）。反応は、自動サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ２４００）で実施した。導入された各変異のヌクレオチド配列は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭダイ−ターミネーター法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用した配列決定によって確認した。
【００８８】
（実施例３）
シュードウィルス構築および感染性および中和についてのアッセイ
各種のｅｎｖプラスミドに由来する、エンベロープ糖タンパク質を発現するシュードウィルスは、以前述べられているように、ｐＳＶ７ｄ−ｅｎｖおよびｐＮＬ４−３．Ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−プラスミドを用いて構築した（Ｌｅａｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７，５６０−５７０；Ｐａｒｋ  ＆  Ｑｕｉｎｎａｎ（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５７０７−５７１３；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，７０９９−７１０７；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−４１９１）。簡潔に説明すると、ｅｎｖプラスミドおよびｐＮＬ４−３．Ｌｕｃ．Ｅ−Ｒ−ＤＮＡは、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって、３０％コフルエント２９３Ｔ細胞培養物中に同時形質移入した。培地は、形質移入の１８〜２４時間後に１μＭ酪酸ナトリウムを含有する新鮮な培地と交換した。形質移入の４４〜４８時間後に、シュードウィルスを含有する上澄を回収し、４５ｐｍ孔径滅菌フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で濾過し、最終濃度２０％までウシ胎仔血清を添加して、ただちに使用しない場合には−８０℃にて保管した。シュードウィルスの感染性を測定するために、ＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４細胞を用いた発光アッセイを以前述べられているように使用した。ＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４細胞（１×１０４細胞／ｍｌ）を、平底ウェルの９６ウェルプレート内にて連続希釈シュードウィルスで接種した。培養物を、５％二酸化炭素、３７℃にて３日間インキュベートし、その後、細胞を１５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄し、１５μｌの細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって３０分間溶解させた。各ウェルにおけるルシフェラーゼ活性の量は、基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５０μｌを用いて、ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ照度計（Ｗａｌｌａｃ社）で決定した。
【００８９】
各シュードウィルスの中和表現型は、連続希釈血清または抗体の分割量を適当に希釈したシュードウィルスと混合して、４℃にて１時間インキュベートし、その後、ＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４細胞懸濁物を添加して、５％二酸化炭素、３７℃にて３日間インキュベートすることを除いて、感染性アッセイと同様の方法で試験した。
【００９０】
（実施例４）
ｇｐ１２０解離アッセイおよびＥＬＩＳＡ
自発的およびリガンド誘導ｇｐ１２０解離は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。簡潔に説明すると、形質移入細胞培養物の上澄中のシュードタイプウィルスを濾過し、２１，１３０×ｇ、４℃で２時間の遠心分離によって沈降させ（米国Ｔｏｍｙ  Ｔｅｃｈ社）、予め冷却したＰＢＳを用いて遠心分離により１回洗浄し、最初の体積の４０分の１の１０％ＦＢＳによってＰＢＳ中で再懸濁させた。シュードタイプウィルスをペレットとして、またはスクロースクッション上に、次にペレットに沈降させたときに、同様の結果を得る（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−４１９１；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５７０７−５７１３）。
【００９１】
濃縮シュードタイプウィルスの各分割量を５μｇ／ｍｌのｓＣＤ４またはＰＢＳによって３７℃にて１時間インキュベートした。次にシュードタイプ粒子を解離ｇｐ１２０から２１，１３０×ｇでの２時間の遠心分離によって分離した。ｇｐ１２０解離のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定した上澄およびペレットの試料中のｇｐ１２０抗原を比較して決定した。上澄およびペレットの両方のｐ２４抗原の量も測定した。ＥＬＩＳＡアッセイは、前に述べられているように抗原捕捉によって実施した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−  ４１９１；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５７０７−５７１３）。簡潔に説明すると、Ｉｍｍｕｌｏｎ−２マイクロタイタープレートの各ウェル（Ｄｉｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）をヒト抗ＨＩＶ−１  ＩｇＧでコーティングした。溶解緩衝液中で調製し、ブロッキング試薬中で希釈した抗原を利用して、結合した抗原をヒツジ抗ｇｐ１２０またはウサギ抗ｐ２４抗体のどちらかを使用して検出した。結合検出抗体は、ビオチン化抗ヒツジ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）または抗ウサギ抗体を、続いてアビジン抱合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）および次にオルトフェニレンジアミン（Ａｂｂｏｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）またはＴＭＢ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）基質現像をそれぞれ用いてアッセイした。アッセイで使用した標準抗原対照は、それぞれＮＩＨ−ＡＲＲＲＰより得たｐ２４およびＭＮ系統ｇｐ１２０（それぞれＡＲＲＲＰ３８２および３９２７）の連続希釈物より構成された。
【００９２】
（実施例５）
ｇｐ１２０原子構造におけるｇｐ１２０コア変異の位置
使用したＰＤＦファイルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  １ＧＣ１（Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６３０−  ６３１、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている）からのものである。変異の位置を表す図は、ＰＣＭｏｌｅｃｕｌｅ２（バージョン２．０．０  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＣｏｒｅｌＤｒａｗ（バージョン８．３６９）を用いて描画した。
【００９３】
（実施例６）
一次ＭＮクローンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列
一次ＭＮウィルスプールに由来する２個のクローンを、ウィルス粒子に対してシュードタイプ化したときに感染性アッセイにおいて機能性であることにもとづいて選択した。これらのクローンは、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｐ１４と命名した。これらのｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、予測したアミノ酸配列を前に述べられているように、図１に示すように、ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｅ６クローンのアミノ酸配列と比較した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−４１９１；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５７０７−５７１３）。ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｅ６クローンは、相互に９８％類似であったが、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｐ１４クローンに対してはわずか９１．５〜９２．５％類似であった。ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｐ１４クローンは相互に９５．６％類似であった。ＭＮ−ＰまたはＭＮ−Ｐ１４クローンがＭＮ−ＴＣＬＡクローンと異なった８８個のアミノ酸残基のうち、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｐ１４クローンはどちらも６４残基において変化した。加えて、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｐ１４クローンの両方が、余分なジスルフィド結合が考えられる余分なシステイン残基を生じた可変領域１（Ｖ１）における異常な挿入性変異を有していた。どちらの場合においても、この挿入変異が重複変異から生じたと思われた。それゆえＭＮ−Ｐクローンは、ＭＮ−Ｐ１４クローンと同様であり、それらが由来したウィルス擬似種混合物中に存在する他のクローンと同じ意味で合理的に典型であると思われる。
【００９４】
ｇｐ１２０における高度中和耐性ＭＮ−Ｐおよび中和感受性ＭＮ−ＴＣＬＡクローンを比較して見出された多型性は、ｇｐ１２０のＣ１領域の３個、Ｖｌ／２領域の７個、Ｃ２領域の７個、Ｖ３領域の４個、Ｃ３領域の３個、Ｖ４領域の２個、Ｃ４領域の２個、およびＶ５領域の２個を含む。ｇｐ４１の多型性は、ジスルフィド結合ループに対して近位のｇｐ４１のアミノ末端断片における７個を含み、この領域の大半は、融合活性状態において構造がαヘリックスであり、該領域は本明細書において以後、ロイシンジッパー領域（ＬＺ）と呼ばれ、膜近傍αヘリックス領域（ＡＨ）に７個、膜貫通（ＴＭ）に１個、および細胞質尾部（ＣＴ）に９個である。
【００９５】
ＭＮ−Ｐクローンは、変異がＭＮ−Ｅ６およびＭＮ−ＴＣＬＡの中和耐性表現型の相違を引き起こすとして報告された６個の残基のうち５個でＭＮ−ＴＣＬＡと異なった（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，４１８３−４１９１）。これらの残基のうち３個において、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｅ６をＭＮ−ＴＣＬＡから区別する変異は同じであり、Ｖ４２０Ｉ、Ｎ５６４Ｈ、およびＱ５８２Ｌであった。２個の残基において、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｅ６をＭＮ−ＴＣＬＡから区別する変異は異なり、Ｉ４６０Ｅ／ＮおよびＬ５４４Ｐ／Ｑであった。それゆえＭＮ−Ｅ６は、ＭＮ−Ｐクローンの共通の祖先であり、ＭＮ−ＴＣＬＡウィルスプールに残留していた、擬似種混合物中のクローンに由来したかもしれない。
【００９６】
（実施例７）
ＭＮ−Ｐの中和耐性および高感染性表現型
ＭＮ−ＰおよびＭＮ−ＴＣＬＡクローンならびにそれらに由来する各種のキメラ遺伝子の中和感受性および感染性を図２に示す。示された感染性および中和の結果は、ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｐクローンの８回の比較試験の平均結果である。示された他のクローンそれぞれについて示した結果は、クローン当たり３〜５回の試験の平均結果である；これらの試験のそれぞれ１回は、ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｐクローンを比較して示した実験の１つに含まれていた。加えて、本節で直接比較を行うクローンはそれぞれ、クローンが直接比較される反復実験に含まれていた。ＭＮ−Ｐクローンは、ＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞中でＭＮ−ＴＣＬＡクローンよりも１２５０倍感染性が高く、標準血清ＨＮＳ２による中和に対して２５６倍の耐性であった。ＭＮ−Ｐの中和耐性および感染性は、試験を行った他の一次ＨＩＶ−１エンベロープのそれらの特性と同様である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６，６４４−６５５；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，５２２５−５２３０）。
【００９７】
キメラクローンは、ＭＮ−Ｐの高い感染性および中和耐性表現型の原因であるＭＮ−Ｐ遺伝子の領域の評価を可能にするために構築された。キメラＡは、ＭＮ−ＴＣＬＡからｇｐ１２０−ｇｐ４１開裂部位のコード配列の４コドン下流に位置するＳａｃＩ部位までその５’配列を、そしてＭＮ−Ｐからその３’配列を抽出した。ＭＮ−ＰおよびＭＮ−ＴＣＬＡと比較して、それは感染性および中和耐性が一貫して中間であった。キメラＢは、ＭＮ−ＰからＳａｃＩ部位までその５’配列を、ＭＮ−ＴＣＬＡからその３’配列を抽出した。それはキメラＡよりも感染性および中和耐性が低かったが、ＭＮ−ＴＣＬＡよりもわずかに感染性および中和耐性が高かった。これらの結果は、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の両方における配列が、ＭＮ−Ｐの高感染性、中和耐性表現型に寄与することを示す。
【００９８】
以前の研究は、ＭＮ−Ｅ６クローンの高感染性、中和耐性表現型がｇｐ１２０のカルボキシ末端領域およびｇｐ４１のＬＺ領域の機能的相互作用に帰することを証明した。キメラＣおよびＦは、ＭＮ−ＰのＬＺ領域の重要性の試験を許容するために構築した。ＭＮ−ＴＣＬＡへのＭＮ−ＰのＬＺ領域の導入によって作成されたキメラＣは、ＭＮ−ＴＣＬＡと比べて中和耐性および感染性をわずかに上昇させた。反対に、ＭＮ−ＴＣＬＡに由来するＬＺ領域を備えたＭＮ−Ｐ配列でほぼ構成されるキメラＦも、ＭＮ−ＴＣＬＡよりもわずかだけ感染性および中和耐性であった。これらの結果は、ＭＮ−Ｐの高感染性、中和耐性表現型がＬＺ配列に依存するが、この配列が表現型を与えるのに十分でないことを証明した。
【００９９】
ＬＺ配列とのｇｐ１２０のアミノ末端の機能的相互作用は、キメラＣ、Ｆ、ＨＣおよびＨＤの比較により評価した。キメラＨＣは、ＭＮ−Ｐ  ｇｐ１２０のアミノ末端ならびにＭＮ−Ｐ  ｇｐ４１のアミノ末端および細胞質尾部からの配列をＭＮ−ＴＣＬＡバックグラウンドに組み込んだ。キメラＨＣはキメラＣまたはＦよりも、実質的に高感染性および中和耐性であった。キメラＨＣのこれらの表現型特性がｇｐ１２０のアミノ末端およびｇｐ４１のＬＺ領域の機能的相互作用を反映すると考えられる。ｇｐ４１の細胞質領域が表現型効果の一部に寄与しうる可能性は、まだ判定されていない。
【０１００】
ｇｐ１２０のカルボキシ末端およびＬＺ領域の機能的相互作用の可能性は、キメラＣ、Ｇ、Ｈ、およびＧＣの比較によって示す。キメラＧおよびＭＮ−ＴＣＬＡの間に比較的小さな相違があったが、キメラＧＣは実質的に、より感染性および中和耐性であった。これらの比較は、キメラＧＣの比較的高い感染性、中和耐性表現型が、ｇｐ１２０のカルボキシ末端およびＬＺの間の機能的相互作用によることを示す。キメラＩ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、およびＮの試験結果は、中和耐性、高感染性表現型に寄与する機能的相互作用がＭＮ−Ｐ  ｇｐ１２０のカルボキシ末端およびＬＺの異なる領域間で発生するという解釈を更に裏付けている。
【０１０１】
キメラＡ、Ｃ、Ｄ、ＧＤ、Ｅ、およびＨＤの比較は、ｇｐ４１のＡＨ領域とＬＺ領域との機能的相互作用を示した。キメラＡは、ＭＮ−Ｐ  ｇｐ４１全体の配列を含有し、キメラＣまたはＤのどちらよりも実質的により感染性および中和耐性であった。キメラＤは、ｇｐ４１外部領域のＡＨをコードするＭＮ−Ｐ配列を含有した。反対にキメラＥは、ＡＨ領域を除いて全体にＭＮ−Ｐ配列を有し、ＭＮ−Ｐよりも著しく低い感染性であった。キメラＧＤおよびＨＤはＭＮ−Ｐ  ＡＨ配列をＬＺ領域を除くＭＮ−Ｐの他の領域からの配列と組み合せ、相補性は観察されなかった。これらの結果は、ＭＮ−Ｐの中和耐性、高感染性表現型に寄与する、ＬＺおよびｇｐ４１のカルボキシ末端領域の間の特異的な機能的相互作用を示す。
【０１０２】
ここで示す解析に基づいて、ここで示す結果は、ＭＮ−Ｐ  ＬＺ領域の、ｇｐ１２０のアミノおよびカルボキシ末端ならびにｇｐ４１のカルボキシ末端領域との機能的相互作用を証明する。これらの結果は、ＬＺ領域がＨＩＶ−１エンベロープタンパク質複合体の機能の統合に重要な役割を果たすことを示す。その上、評価される表現型の２個の特性に対する特異的変異の効果の間に全般的な一致があった。エンベロープタンパク質のＬＺと他の領域との間のこれらの複数の機能的相互作用が共通の機構によって両方の特性を同時に調節する可能性を試験するために、本発明者らは図６に示すように、特性間に統計的相関があるか否かを試験した。強度の統計的に有意な相関が得られた。
【０１０３】
（実施例８）
ｇｐ１２０の原子構造のコアへのＭＮ−Ｐ変異の局在
ＭＮ−Ｐ  ｇｐ１２０のコア構造における変異の局在を、図９に示すように検討した。変異残基は、Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６３０−６３１の番号付けシステムに従って同定される。ｇｐ１２０コア構造で描出された残基に影響する変異のみが示されている。極部アミノ末端の最初の９０個のアミノ酸、ならびにｇｐ１２０のＶ１／Ｖ２およびＶ３領域の変異は図に示していない。変異のうち７個は、ＣＤ４結合ポケットの縁に、または縁の周囲に局在するものとして同定される。これらの７個の変異は、Ａｓｐ２８７、Ａｓｐ２９０、Ａｓｎ３７１、Ｐｒｏ３７２、Ｌｙｓ４３５、Ｇｌｕ４６６およびＡｓｐ４７２として示す。変異のうち２個は、コレセプター結合領域と考えられるｇｐ１２０の領域に局在し、Ｉｌｅ２１９およびＶａｌ４２６として同定される。変異のうち４個は、内部領域として示されるｇｐ１２０の極に局在し、Ａｓｎ９１、Ｌｙｓ２４３、Ｓｅｒ２４５およびＳｅｒ２４９を含む。４個の変異は、ｇｐ１２０の外部領域に局在したが、ＣＤ４またはコレセプター結合部位から離れていた。これらの４個の変異は、Ｌｙｓ３００、Ａｒｇ３４５、Ｐｒｏ３９８、およびＡｓｎ４１８であった。これらの変異の分布は、それらの一部または全部が、ＣＤ４、コレセプターおよびｇｐ４１を含む、ｇｐ１２０とそのリガンドとの相互作用を調節することによって、ＭＮ−Ｐの感染性および中和耐性を向上させるために総体で機能したことを示す。
【０１０４】
（実施例９）
ＭＮ−Ｐの高感染性表現型に寄与する結合部位から離れた特異性変異
キメラエンベロープは、Ｖ１／Ｖ２配列を含む、ｇｐ１２０アミノ末端配列の中和耐性、高感染性表現型に対する特異性寄与を評価するために構築した。Ｖ１／Ｖ２配列は、図１０に示すＤｒａＩＩＩ３６８−ＥｃｏＲＶ６３６断片に含まれている。Ｖ１／Ｖ２領域変異の表現型への潜在的寄与は、キメラＣ、ＨＣ、Ｏ、Ｐ、およびＱの比較によって評価した（図２および６）。クローンＯ、Ｐ、およびＱの感染性はキメラＣと同様であり、キメラＨＣの表現型を決定するにはＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ（８３２ヌクレオチド）断片の１個以上のサブ断片における配列が必要であることを示している。
【０１０５】
キメラＲは、感染性表現型の決定におけるアミノ末端のｇｐ１２０コア構造変異の役割を更に検討するために構築した。キメラＲは、Ｖ１／Ｖ２領域における変異を除いて、ＭＮ−ＰのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片の変異すべてを含む。キメラＲはキメラＨＣよりも多少低い感染性であったが（図２）、キメラＣ、Ｏ、またはＱよりも著しく感染性であり、ＭＮ−ＰＬＺ配列の状況では、ｇｐ１２０のアミノ末端領域の２個の断片が向上した感染性を決定するために共に機能することを示した。キメラＳは、ＣＤ４またはコレセプター結合部位と空間的に関連していない外部領域コア構造変異をキメラＲに導入することによって構築した。キメラＳはキメラＲよりも低い感染性であり、ＭＮ−Ｐ  ｇｐ１２０のアミノ末端の非Ｖ１／Ｖ２断片における変異の、感染性に対する効果がこれらの外部領域変異によって更に向上しないことを示した。キメラＴ、Ｕ、およびＶの試験から示された結果は、本明細書に示す解釈を更に裏付ける。
【０１０６】
（実施例１０）
ｇｐ１２０−ｇｐ４１解離
ｇｐ１２０およびｇｐ４１の残基間の非共有結合は、機能性エンベロープタンパク質複合体での２個の分子間の会合を維持する。ｇｐ１２０での変異がｇｐ１２０およびｇｐ４１の間の相互作用を高感染性表現型に寄与する方法で調節したという可能性のために、ｇｐ１２０−ｇｐ４１会合の安定性に対するＭＮ−Ｐ変異の効果を試験した。更に、ｇｐ１２０のＣＤ４への結合はある場合においてｇｐ４１とのその会合に影響し、ｇｐ１２０およびそのリガンドの間の協調した相互作用がその感染性表現型を決定するため、ｇｐ１２０−ｇｐ４１解離に対するｓＣＤ４結合の効果を試験した。ｇｐ４１からのｇｐ１２０の解離を測定するために、ＥＬＩＳＡを用いてシュードタイプウィルス粒子の遠心分離から生じた、粒子無しおよび粒子会合ｇｐ１２０の分離を判定した。粒子のペレットへの遠心分離によりウィルス粒子を培地上澄から分離するこの技法が、粒子をスクロースクッション上に回収したときに得られる結果と匹敵する結果を生じることが以前に見出されている。
【０１０７】
ＭＮ−ＴＣＬＡ、ＭＮ−Ｐ、ならびにキメラＲおよびＶについて、ｇｐ４１からのｇｐ１２０の自発的解離およびｓＣＤ４誘導解離を比較する実験を実施した。キメラＲは、ＭＮ−Ｐのアミノ末端の２個の変異、Ａ６４ＶおよびＥ８４Ｑはもちろん、分子の原子構造上のｇｐ１２０の内部領域に局在するＭＮ−Ｐ変異すべてを含有する。それはＭＮ−Ｐ  ＬＺ配列も含有する。キメラＶは、同じｇｐ１２０  ＭＮ−Ｐ配列を含有するが、ＭＮ−ＴＣＬＡ  ＬＺ配列を含有する。これらのシュードタイプウィルスからのｇｐ１２０の解離を試験する実験の結果を表１および図１１にまとめる。培地成分からの粒子の分離の有効性は、ペレットおよび上澄中のｐ２４の相対量を測定することによって評価した。上澄中のｐ２４のパーセンテージは、平均して１４．９％（ＭＮ−ＰプラスｓＣＤ４）および２８．８％（キメラＶプラスｓＣＤ４）であった。それぞれの場合で、これらの割合はｓＣＤ４の存在および非存在下で同様であった。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
ウィルス粒子と関連して測定したｇｐ１２０の量は一貫して、ＭＮ−ＴＣＬＡよりもＭＮ−Ｐで大きかった（表１および図６）。この相違は平均して約４倍であった。ペレット中のｇｐ１２０の量がｐ２４の量に比例して表現されたときに、相違はより大きく、６．７倍であった。キメラＲペレットと会合したｇｐ１２０の量も、ＭＮ−ＴＣＬＡペレットと会合したｇｐ１２０の量よりも３．９倍多く、この相違は、ｐ２４と比例して表現されたときに３倍にとどまった。ＭＮ−ＴＣＬＡ粒子よりも、キメラＶと会合したｇｐ１２０はやや多く、１．７５倍であったが、この相違はｐ２４と比例して表現されたときにわずか１．３倍であった。したがって、キメラＲは、ｇｐ１２０とウィルス粒子とのより大量の会合において、ＭＮ−Ｐに類似していたが、キメラＳは、ＭＮ−ＴＣＬＡに酷似していた。
【０１１０】
ＭＮ−ＴＣＬＡからのｇｐ１２０の自発的解離は、ｓＣＤ４の非存在時に３１．２％であり、１０．３％であるＭＮ−Ｐからの解離よりも有意に高かった。キメラＲからのｇｐ１２０の自発的ｇｐ１２０解離は、ＭＮ−ＴＣＬＡからの解離より低く１９．８％であったが、キメラＶからの解離はＭＮ−ＴＣＬＡとほぼ同じで３１．８％であった。ｓＣＤ４によって結合された場合、ＭＮ−ＴＣＬＡからのｇｐ１２０の放出に変化はなかったが、ＭＮ−Ｐからのｇｐ１２０放出は３倍を超えて上昇し、３５．３％となった。ｓＣＤ４による結合は、キメラＲからのｇｐ１２０放出を４２．７％まで著しく上昇させたが、キメラＶからの放出に対して著しい効果を持たなかった。したがって、キメラＲも、ビリオンからのｇｐ１２０の自発的およびｓＣＤ４誘導放出に関してＭＮ−Ｐに類似していたが、キメラＶは、これらの点でＭＮ−ＴＣＬＡに酷似していた。
【０１１１】
（実施例１１）
ｓＣＤ４による中和への耐性に寄与するＭＮ−Ｐ遺伝子の領域
ＭＮ−Ｐクローンの中和耐性、高感染性表現型は、ｇｐ４１  ＨＲ１をコードするＭＮ−Ｐ遺伝子の領域からの配列と、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の他の領域における配列との機能的相互作用に依存する。図３は、ＨＩＶ−１免疫ヒト血清およびそれぞれのエンベロープによってシュードタイプ化されたウィルスを使用してそこで報告された中和力価と同様に、キメラ遺伝子Ｃ、Ｆ、Ａ、ＧＣ、およびＨＣの構造を示す。図３は、ｓＣＤ４による中和への耐性を決定する分子内相互作用を解析するために、本試験で使用した追加のキメラ遺伝子の構造も示す。キメラＣは、ＭＮ−ＴＣＬＡ主鎖にＭＮ−Ｐ  ＨＲ１領域配列を有する。キメラＦは、ＭＮ−Ｐ主鎖にＭＮ−ＴＣＬＡＨＲ１領域を備えた相反構築物である。ＭＮ−Ｐからのｇｐ１２０のアミノ末端、ｇｐ１２０のカルボキシ末端、またはｇｐ４１のカルボキシ末端をそれぞれキメラＣに導入して、キメラＨＣ、ＧＣ、およびＡをそれぞれ形成した。これらの３個のキメラは、ｇｐ１２０またはｇｐ４１の異なる領域およびＨＲ１領域の間の機能的相互作用がｓＣＤ４による中和に対する耐性に寄与するか否かを評価するために使用した。キメラＰおよびＲの構築の理由を図１０の下部に示し、以下で考察する。図４に示すように、キメラＧＣは、ｓＣＤ４による中和に対してキメラＣよりも著しく耐性であったが、ＭＮ−Ｐよりも耐性が低かった。キメラＡおよびＨＣは、キメラＣと同様であった。これらの結果は、ｇｐ１２０のカルボキシ末端半分とＨＲ１との機能的相互作用がｓＣＤ４による中和に対する耐性に寄与したが、これらの比較に含まれるキメラ遺伝子において反映されなかった相互作用も耐性に寄与したことを示す。
【０１１２】
ｇｐ１２０の断片におけるアミノ酸置換は、ＭＮ−ＰによってキメラＧＣに寄与した。遺伝子の線形配列全体およびｇｐ１２０のコア構造上の、ＭＮ−ＰをＭＮ−ＴＣＬＡから区別する変異の分布を図９および１２に示す。Ｖ３には４個の特徴的なアミノ酸置換および、キメラＧＣ中に含まれるＭＮ−Ｐ  ｇｐ１２０の断片（ＭＮ−Ｐのアミノ酸２８４〜４７４）には１２個の追加の置換があった。１２個の非Ｖ３置換のうち７個は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合ポケットの中または近傍にある原子構造のモデルに見られた（図９）。これらのうち２個、Ｎ／Ｄ２９０およびＥ／Ｋ４３５は、Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６４８−６５９によって証明された、残基と一列に並んだアミノ酸を含み、ＣＤ４との直接接触を形成した。他の２個の変異、ＫＱ／ＮＰ３７１−２およびＮ／Ｅ４６６は、ＣＤ４と直接接触を形成する残基にすぐ隣接する残基に影響を及ぼした。加えて、７個の置換のうち６個は、電荷の変化を含み（Ｄ／Ｎ２８７、Ｎ／Ｄ２９０、Ｋ／Ｎ３７１、Ｅ／Ｋ４３５、Ｎ／Ｅ４６６、およびＮ／Ｄ４７２）、３個は潜在的なＮ結合グリコシル化部位の獲得または損失を含んでいた（Ｄ／Ｎ２８８、Ｋ／Ｎ３７１、およびＮ／Ｅ４６６）。アミノ酸２８４−４７４からの断片中の、しかしＣＤ４結合領域の中やその近接位にない、残りの５個のｇｐ１２０コア置換のうち、１個はコレセプター結合部位の中央に位置すると考えられる（Ｉ／Ｖ４２６）。この変異は、以前、ＭＮ−Ｅ６クローンにおいて見られ、その状況ではｓＣＤ４による中和に対する耐性を独力で付与しなかった。この断片における残りの４個の変異は、ＣＤ４およびコレセプター結合部位から離れたｇｐ１２０外部領域の表面に位置する。これらの考慮事項に基づいてＣＤ４結合ポケットの中または近傍の変異は、電荷の変化などにより、ＣＤ４に直接結合する残基における、またはＣＤ４との相互作用を修飾する隣接残基における置換を通じて、あるいはＣＤ４結合に立体効果を有するグリコシル化部位の変更によって、ＣＤ４による中和に対する感受性を変化させた。
【０１１３】
（実施例１２）
ｓＣＤ４による中和に対する耐性への、ＣＤ４結合部位の中または近傍の変異の効果
ＣＤ４結合領域の中または近傍の変異の重要性を試験するために、ｓＣＤ４による中和に対する耐性への他の変異の効果を試験するためのプラットフォームとしてキメラＣを使用した戦略を実施した。ＭＮ−ＴＣＬＡ、ＭＮ−Ｐ、およびキメラＣのｓＣＤ４による中和に対する比較感受性を、図５の上部近傍に示す。ＭＮ−Ｐクローンは、ＭＮ−ＴＣＬＡクローンよりもｓＣＤ４中和に対して５０倍を上回る耐性である。図５に示すアッセイの大半において、使用したｓＣＤ４の最大濃度は１．０μｇ／ｍｌであったため、ＭＮ−Ｐの中和は達成されなかった。ここで報告したアッセイに基づいて、本発明者らは、ＭＮ−ＰクローンがＭＮ−ＴＣＬＡよりも少なくとも２０倍の耐性であることを計算した。キメラＣは、ｓＣＤ４による中和に対して、ＭＮ−ＴＣＬＡよりも著しく耐性ではなかった。ＭＮ−ＴＣＬＡからＭＮ−Ｐを区別したＣＤ４結合部位の中または近傍に位置する７個の変異を、図５に示すように、キメラＣの中に単独で、および各種の組合せで導入した。キメラＣおよび、７個の変異すべてを含有するキメラＣのクローン（このクローンは次に、キメラＣ／７ＣＤ４ｂｓと呼ぶ）を含めた、これらのミュータントのいずれかの間にはごくわずかな相違のみが見られた。これらの結果は、ｓＣＤ４による中和に対するＭＮ−Ｐの耐性が、主にＣＤ４結合部位における変化によるものでないことを示した。
【０１１４】
ｓＣＤ４による中和に対する耐性に関して、キメラＲにて示される変異の考えられる重要性を次に検討した。キメラＲは、ｇｐ１２０のアミノ末端における変異が、ｓＣＤ４反応表現型を付与するＨＲ１配列との機能的相互作用を決定することを証明した以前の試験のために、興味深かった。ＭＮ−ＴＣＬＡは、高自発性ｇｐ１２０−ｇｐ４１解離表現型を有しているが、ｓＣＤ４結合の結果として、向上した解離を示さない。対照的に、ＭＮ−Ｐは低率の自発性ｇｐ１２０−ｇｐ４１解離を有し、これは実質的にｓＣＤ結合によって向上される。キメラＲは、ＭＮ−Ｐのようなｇｐ１２０−ｇｐ４１解離表現型を有する。キメラＲをキメラＣから区別する変異は、図３の内部領域において密集するのが見られる４個の変異（Ｄ／Ｎ９１、Ｎ／Ｋ２４３、Ｔ／Ｓ２４５、およびＰ／Ｓ２４９）はもちろんのこと、ｇｐ１２０の極部アミノ末端にあり、結晶学的に決定されたｇｐ１２０コア構造では描出されない２個（Ｖ／Ａ６４およびＱ／Ｅ８４）も含む。本発明者らは以前に、ｇｐ４１からのｇｐ１２０のＣＤ４誘導解離に対するその効果に基づいて、これらの６個の残基がｇｐ１２０での潜在的なｇｐ４１結合部位に寄与することを示唆した。顕著には、これらの変異がｓＣＤ４反応表現型を決定しても、それらはｓＣＤ４による中和に対する感受性に著しく影響を及ぼさなかった（図３および５）。
【０１１５】
Ｖ１／Ｖ２またはＶ３領域内の配列のｓＣＤ４耐性への寄与を次に検討した。以前の報告は、可変領域１および２がＣＤ４結合部位への接近を一部マスキングすることを証明した（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１９４９−１９５３，４４）。ＭＮ−ＰクローンはＶ１における異常重複はもちろんのこと、ＭＮ−ＴＣＬＡのＶ１／Ｖ２領域からそれを区別する多数の他の変異を有する。ｓＣＤ４耐性におけるＶ１／Ｖ２領域の役割の試験を可能にするために、本発明者らは、図３に示すように、ＭＮ−Ｐに由来するＶ１／Ｖ２およびＨＲ１領域を除いて、遺伝子の大部分に渡ってＭＮ−ＴＣＬＡ配列より成るキメラＰを構築した。追加の遺伝子は、ＣＤ４結合部位の中または近傍の７個の変異（キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ）、ＭＮ−Ｐ  Ｖ３領域の近位縁をＭＮ−ＴＣＬＡの近位縁と区別する４個の変異（ＹＮ／ＮＹ３１１−１２、Ｒ／Ｋ３１３、およびＴ／Ｋ３１５）（キメラＰ／Ｖ３）、または変異のこれらのセットの両方（キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３）を含有する断片の導入によって、キメラＰ主鎖を用いて構築した。キメラＰはｓＣＤ４による中和に対して、キメラＣよりもわずか１．９倍の耐性であったが（図５）、これに対してキメラＰ／７ＣＤ４ｂｓは１１．３倍の耐性であった。キメラＣ、キメラＰ、およびキメラＰ／７ＣＤ４ｂｓに対するｓＣＤ４の平均５０％中和濃度は、それぞれ１６、３１、および１７６ｎｇ／ｍｌであった。予想外に、キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３を形成する、キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓへのＶ３領域変異の添加は、中和耐性を排除した。これらの結果はＭＮ−ＰのｓＣＤ４耐性に寄与するＣＤ４結合領域およびＶ１／Ｖ２領域近傍の残基間の機能的関係はもちろんのこと、これらの領域およびＶ３の間の更なる機能的関係も示している。
【０１１６】
本発明者らは次に、ｓＣＤ４による中和に対して比較的耐性である、キメラＧＣの構造を検討した。キメラＧＣは、ＭＮ−Ｐ  ｇｐ１２０由来のカルボキシ末端配列をキメラＣ内に包含する。キメラＧＣ中のＭＮ−Ｐ由来のｇｐ１２０配列は、上述の７個のＣＤ４結合領域変異、Ｖ３領域変異、コレセプター−結合部位の中心に位置すると考えられる１個の変異（Ｉ／Ｖ４２６）、およびｇｐ１２０の外部領域の弱いクラスターに局在する４個の変異（Ｎ／Ｋ３００、Ｓ／Ｒ３４５、Ｓ／Ｐ３９８、およびＳ／Ｎ４１８）を含む。図５の下部に示すように、キメラＣ、Ｃ／Ｖ３、Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３、Ｐ、Ｐ／Ｖ３、およびＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３の間でｓＣＤ４耐性に認められたごくわずかな相違があった。したがって、Ｖ３の残基およびキメラＧＣにおいて変異される他の残基の間の相互作用は、中和耐性に寄与した。Ｓ／Ｐ３９８、Ｓ／Ｒ３４５、Ｓ／Ｎ４１８、およびＮ／Ｋ３００外部領域変異は、図７に示すように連続して導入し、効果について考察した。これらのうちで、Ｓ／Ｐ３９８およびＮ／Ｋ３００変異の両方が、小さいが統計的に有意な効果に寄与すると思われた。コレセプター結合部位変異Ｉ／Ｖ４２６はキメラＣに導入したときにｓＣＤ４中和に対する効果を持たなかったが、キメラＣ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３に導入したときに著しい効果を有した。このミュータント、キメラＣ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／４２６は、キメラＧＣよりも著しく低い耐性であり、４個の外部領域変異のうち１個以上がキメラＧＣの完全表現型の発現に必要とされることを示していた。最後に、キメラＧＣ  Ｖ３配列は、ＭＮ−ＴＣＬＡ  Ｖ３配列に戻し変異させて、キメラＧＣ−Ｖ３を形成した。このクローンも、キメラＧＣよりも中和に対する耐性が低く、Ｖ３配列が完全中和耐性表現型に必要であることを示した。したがって、これらの結果は、コレセプター結合部位の残基４２６の場合と同様に、Ｖ３領域および外部領域における変異残基の間の機能的相互作用の発生を証明している。
【０１１７】
（実施例１３）
中和に対するクローンの感受性
各種のＣＤ４結合領域リガンドによる中和に対するクローンの相対感受性が一貫しているかどうかを判定することに関心があった。ＣＤ４ＩｇＧ２は、一次エンベロープの中和においてｓＣＤ４よりも交差反応性の傾向があるが、ＣＤ４結合領域へのその接近を制限する、より大きな容積も有する。各種の抗ＣＤ４結合領域モノクローナル抗体の中で、ｂ１２は、一次エンベロープ内でより交差反応性の傾向がある。各種リガンドによる、ＭＮ−Ｐ、キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ、およびキメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３クローンによってシュードタイプ化されたウィルスの中和を図８に示す。ｓＣＤ４によるクローンの比較中和は一般に、ｂ１２を含む、ＣＤ４結合領域エピトープに対するモノクローナル抗体に見られた中和と同様であった。ＭＮ−Ｐはリガンドそれぞれによる中和に対して、他の２個のクローンのどちらよりも耐性であった。他のリガンドのそれぞれに観察されたキメラＰ／７ＣＤ４ｂよりも大きい、キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３の中和に対する感受性は、ＣＤ４ＩｇＧ２には観察されなかった。これらの結果は、ｓＣＤ４による中和に対する耐性を判定する現象が通例、各種のＣＤ４結合領域リガンドによる中和に対する耐性を判定するのと同様に作用することを示すとともに、中和に対する耐性の機構がリガンド結合の立体阻害でなかった可能性を示した。
【０１１８】
コレセプター結合部位（１７ｂおよび４．８ｄ）およびＶ３（１９ｂ）に対するモノクローナル抗体による中和を図８に示す。ＭＮ−Ｐシュードタイプウィルスの５０パーセントの中和は、これらの抗体の試験での最高濃度（２．５μｇ／ｍｌ）にて達成されなかった。キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３はキメラＰ／７ＣＤ４ｂｓよりも、１７ｂ（２１０対４８０ｎｇ／ｍｌ）、４．８ｄ（２０対６０ｎｇ／ｍｌ）、および１９ｂ（１６対６０ｎｇ／ｍｌ）によって、中和に対してより感受性であった。これらの結果は、非ＣＤ４結合領域エピトープに対するｓＣＤ４およびモノクローナル抗体による中和に対するこれらのクローンの相対感受性が同様であることを示した。その上、キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓおよびキメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３の比較感受性を説明する、Ｖ３とｇｐ１２０の他の領域との間の機能的相互作用も、包括的中和感受性を調節した。
【０１１９】
ここに示す試験の結果は、ｓＣＤ４中和に対するＭＮ−Ｐ耐性の機構が、おそらく包括的中和耐性についてと同様に、ｇｐ１２０コア構造の表面にわたるＶ１／Ｖ２およびＶ３領域の複数の機能的相互作用を包含することを証明した。これらの相互作用の程度を図１２に例示する。２個のループ構造のそれぞれの適切な遺伝子フットプリントを示す楕円が、ｇｐ１２０コアに重ねて示されている。Ｖ１／Ｖ２領域のフットプリントは、二重ループの軸からＣＤ４結合領域近傍の区域にまで延伸し、Ｖ３との相互作用を含む。Ｖ３のフットプリントはループの軸から延伸し、Ｖ１／Ｖ２と、結合部位から離れた外部領域変異と、コレセプター−結合部位中の残基４２６との相互作用を含む。これらの知見は、Ｖ１／Ｖ２およびＶ３ループ構造がＣＤ４、コレセプターおよびｇｐ４１結合部位の間で離れて機能的相互作用を仲介することを示す。ＣＤ４のＣＤ４結合領域への結合は、コレセプター相互作用に必要なＶ３の連続変化を引き起こすＶ１／Ｖ２およびｇｐ４１の立体配座変化を誘起する。この方法でのシグナルの伝達は、ＣＤ４相互作用に関連する結合エネルギー変化から生じるｇｐ１２０コア構造の立体配座の変化をうまく補完することができよう。そのような効果は、複合体の反対端にて、例えばｇｐ４１  ＨＲ１において、およびコレセプター結合部位の残基４２６などにおいて明らかである変異が、非常に強い機能的相互作用をどのように示すかをうまく説明しよう。ｇｐ１２０のそのリガンドそれぞれへの結合は、ｇｐ１２０コア全体に伝達される立体配座変化を生じる。リガンドとの相互作用も、機能性シグナルが複合体の表面を渡って伝達されるように、立体配座変化を生じる。要約すれば、本試験で評価した一次ウィルス中和耐性表現型は、ＨＩＶ−１エンベロープ複合体が、高い効率の感染性を生じる各種の立体配座変化を受ける能力である。このモデルは、一次ウィルス中和のために、またエンベロープ複合体の特定の立体配座を安定させる方法を設計するために重要であるエピトープの性質を理解するための基盤を与える。
【０１２０】
本発明はその特定の実施形態を参照して述べてきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、各種の変更が実施可能であり、同等物は置換できることは、当業者によって理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセスステップまたはステップを、本発明の目的、精神および範囲に適合させるために多くの改変を行うことができる。そのような改変はすべて、添付した特許請求の範囲の範囲内であるものとする。本出願で言及したすべての参考文献、特許および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ＨＩＶ−１ＭＮ系統の中和感受性（ＭＮ−ＴＣＬＡ）、高中和耐性（ＭＮ−ＰおよびＭＮ−Ｐ１４）および部分中和耐性（ＭＮ−Ｅ６）クローンのエンベロープのアミノ酸の配列比較。アミノ酸配列の上のバーは、糖タンパク質の領域のおおよその位置を次のように示す、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４＝ｇｐ１２０の定常領域；Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５＝ｇｐ１２０の可変領域；ｇｐ４１領域＝ＦＰ（融合ペプチド）、ＬＺ（ロイシンジッパー）、ＡＨ（膜近傍αヘリックス）、ＴＭ（膜貫通部位）、およびＣＴ（細胞質尾部）。アミノ酸の位置は、ＭＮ−Ｐにおいてと同様に番号付けされ、コンセンサスと異なるアミノ酸は、ボックスで囲み陰影付である。残基番号は、図２に示す制限酵素開裂部位に対応する位置のボックスに示されている。
【図２】ｇｐ４１ロイシンジッパーは、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の複数の領域と機能的に相互作用して、中和耐性、高感染性表現型を決定する。（Ａ）特異的酵素の開裂部位のヌクレオチド位置を示す、ＭＮ−ＴＣＬＡクローンの制限エンドヌクレアーゼ開裂マップ。マップの下に以下のように、糖タンパク質の領域のおおよその位置の表示があり、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４＝ｇｐ１２０の定常領域；Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５＝ｇｐ１２０の可変領域；ｇｐ４１領域＝ＦＰ（融合ペプチド）、ＬＺ（ロイシンジッパー）、ＡＨ（膜近傍αヘリックス）、ＴＭ（膜貫通部位）、およびＣＴ（細胞質尾部）。（Ｂ）材料および方法で述べたように、ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｐクローンの断片を交換することによって構築された一連のキメラ遺伝子（Ｃｈｉｍ）の模式図。（Ｃ）クローンについて得られた相対感染性および中和価。相対感染性は、ＸＭ／ＸＭＮ−ＴＣＬＡとして決定され、ここでＸは所与の活性を生じるウィルス希釈度である。ＸＭは考察した特定の変異について得た値であり、ＸＭＮ−ＴＣＬＡは、ＭＮ−ＴＣＬＡについて得た値である。最良適合ラインは、接種希釈度の関数としての対数変換ルシフェラーゼ活性定量（光単位）の回帰分析によって決定した。ＭＮ−ＴＣＬＡおよび他のクローンの比較に使用したｙ値は、比較される曲線のほぼ直線の部分を交差するように選択した。キメラの中和表現型は、ＨＩＶ中和血清２（ＨＮＳ２）を用いて決定した。力価は９０％以上の感染阻害を生じる逆数血清希釈度である。各キメラクローンは、ＭＮ−ＰおよびＭＮ−ＴＣＬＡとの比較で３〜５回試験して、幾何平均結果を示す。
【図３】ｓＣＤ４中和への耐性に対する遺伝的基盤の解析に使用される組換えｅｎｖ遺伝子の概略図。（Ａ）遺伝子組成。（Ｂ）追加のキメラ遺伝子の構造。ＭＮ−ＴＣＬＡ由来の各クローンの断片を陰影付バーで示し、ＭＮ−Ｐ由来の断片を白色バーで示す。部位特異的変異誘発によって導入された変異の性質を、垂直線で示した位置と共に示す。
【図４】ＭＮ−Ｐ（白四角）、あるいはキメラＡ（白丸）、ＧＣ（黒四角）、ＨＣ（黒菱形）またはＣ（黒丸）の各エンベロープによってシュードタイプ化されたウィルスのｓＣＤ４による中和。ＭＮ−ＴＣＬＡ（図示せず）およびキメラＣの中和感受性は同様であった。アッセイは３回行い、示した結果は各ｓＣＤ４濃度で得られた平均である。対照ルミネセンスは、ｓＣＤ４の非存在下で実施した感染に基づいて決定した。２つの同様の実験において、実質的に同一の結果が得られた。
【図５】ＣＤ４結合部位における変異、およびＣＤ４結合部位周囲の変異は、ＭＮ−Ｐ  Ｖ１／Ｖ２配列の状況においてｓＣＤ４耐性に寄与する。相対中和［ｓＣＤ４］は、各クローンについて以下のように決定した。ｓＣＤ４の５０パーセント抑制濃度（ＩＣ５０）は、直線回帰分析によって決定した。相対中和［ｓＣＤ４］は次に、試験クローンＩＣ５０／キメラＣ  ＩＣ５０として計算した。ＭＮ−ＰおよびキメラＣのＩＣ５０は、各実験で決定した。各クローンのアッセイの回数は、クローン名称後にカッコ内に示す。キメラＣ、Ｐ、ＧＣ、およびＨＣの構造を図２および３に示す。７個のＣＤ４結合領域変異の１個または組合せを含有する個々のクローンを構築した。キメラＣ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３、Ｐ／７ＣＤ４ｂｓ、およびＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３はそれぞれ、それぞれのキメラにおけるＭＮ−Ｐ由来の７個のＣＤ４結合領域変異を含有する。キメラＣ／Ｖ３、Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／Ｐ／Ｖ３、およびＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３はそれぞれ、図３に示す４個のＭＮ−Ｐ  Ｖ３領域変異を含有する。
【図６】ミュータントおよびキメラＭＮ系統エンベロープクローンによってシュードタイプ化されたウィルスの中和耐性と感染性との相関。相関無しの帰無仮説は、ｐ＜０．０００１で棄却された。
【図７】ｓＣＤ４によるキメラＧＣの中和に対する耐性は、Ｖ３の配列、コレセプター結合部位の残基４２６における変異、ならびにＣＤ４およびコレセプター結合部位から離れた外部領域における変異に依存する。ＣＤ４およびコレセプター結合部位から離れた外部領域における、残基２９８、３４５、４１８、および３００での変異は、キメラＣ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３内に連続して導入された。残基４２６におけるＶ／Ｉ変異は、キメラＣおよびキメラＣ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３の両方に導入された。ＭＮ−ＴＣＬＡ  Ｖ３領域配列に対応する４個の変異は、キメラＧＣに導入されて、キメラＧＣ−Ｖ３を形成した。示した結果は、各３回行った３つのアッセイの平均である。統計的比較は、ＡＮＯＶＡ（Ｃ対Ｃ／Ｖ３対Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３対Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／３９８対Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／３４５／３９８）、またはスチューデントのｔ検定（Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／３４５／３９８／４１８対Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／３００／３４５／３９８／４１８；Ｃ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３／４２６対ＧＣ；およびＢＣ−Ｖ３対ＧＣ）を用いて実施した。結果は、各３回行った３つの実験の平均および標準偏差である。
【図８】Ｖ１／Ｖ２およびＣＤ４結合領域の残基およびＶ３の機能的相互作用が、包括的中和耐性に影響を与える。クローンＭＮ−Ｐ（黒色バー）、キメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ（斜線付きバー）、およびキメラＰ／７ＣＤ４ｂｓ／Ｖ３（白色バー）を中和について試験した。結果は、各３回実施した２つのアッセイの平均である。（Ａ）抗ＣＤ４結合領域リガンドｓＣＤ４、ＣＤ４−ＩｇＧ２、Ｆ１０５、Ｆ９１、およびｂ１２による中和。（Ｂ）コレセプター結合部位１７ｂおよび４．８ｄ、ならびにＶ３領域１９ｂに向けられた抗体による中和。このパネルにおいて、使用した各抗体の最大濃度は、２．５μｇ／ｍｌであった。どの濃度においてもＭＮ−Ｐの中和はなかったため、抑制濃度は５μｇ／ｍｌ以上と考えられた。
【図９】ＣＤ４および中和抗体１７ｂによって複合体化されたＨＩＶ−１  ｇｐ１２０コアの原子構造におけるＭＮ−Ｐ／ＭＮ−ＴＣＬＡ変異の局在性。ＰＤＦファイルは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，１ＧＣ１（Ｋｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，６４８−６５９）による。ＰＣＭｏｌｅｃｕｌｅ２（バージョン２．０．０）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ社）により描画。分子複合体の前面（Ａ）および背面（Ｂ）を示す。ｇｐ１２０は青色、ＣＤ４は緑色、１７ｂ抗体は黄色（軽鎖）および薄青色（重鎖）で示す。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、ＰＤＦファイルから抽出して、ＣｌｕｓｔａｌＷ（バージョン１．７）によってＭＮ−ＴＣＬＡの配列と比較した。変異部位は、赤色で着色し、ＭＮ−Ｐ  ａ．ａ．および変異の位置番号としてマーキングする。位置番号は、ＭＮ−ＴＣＬＡ配列内のａ．ａ．位置に関して示す。Ｖ１／Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、およびＶ５ループの位置も示す。
【図１０】内部領域および選択した外部領域変異の感染性に対する効果。上側に示すＭＮ−ＴＣＬＡの制限酵素開裂マップは、図２で説明されている。ＭＮ−ＴＣＬＡおよびＭＮ−Ｐ遺伝子の断片を用いて構築したキメラｅｎｖ遺伝子の概略図は、左側に示す。キメラ（Ｃｈｉｍ）の図の上側の星は、生体外で導入された変異のおおよその位置を示す（説明は本文を参照）。キメラ遺伝子によってコードされたエンベロープを用いてシュードタイプ化されたウィルスの相対感染性を右側に示す。
【図１１】ｇｐ１２０の粒子会合。（Ａ）表１に示す結果。ｇｐ１２０の粒子会合率（ＰＡＦ  ｇｐ１２０）は各クローンについてＰ／（Ｐ＋Ｓ）として概算され、ここでＰはペレット中のｇｐ１２０の量であり、Ｓは上澄中の量である。結果は、ＰＡＦ（ｇｐ１２０）Ｍ／ＰＦＡ（ｇｐ１２０）ＴＣＬＡと表し、Ｍは試験されるミュータントクローンを指す。（Ｂ）ＰＡＦ（ｇｐ１２０）の結果をｐ２４分布について正規化する。ＰＡＦ（ｐ２４）は、各クローンについて計算した。ＰＡＦ（ｇｐ１２０／ｐ２４）は、ＰＡＦ（ｇｐ１２０）／ＰＡＦ（ｐ２４）の比として計算した。これらの結果は、ＰＡＦ（ｇｐ１２０／ｐ２４）Ｍ／ＰＡＦ（ｇｐ１２０／ｐ２４）ＴＣＬＡの比として示す。
【図１２】Ｖ１／Ｖ２およびＶ３領域ならびにｇｐ１２０の表面上のｇｐ４１の機能的相互作用の概略図。Ｖ１／Ｖ２およびＶ３ループの軸におけるシステイン残基はマゼンタで示し、赤色矢印はその位置を強調する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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