(57)【要約】Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナリングを治療的に調節する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを含む薬剤組成物。
【請求項２】
薬剤として許容される希釈剤又は担体をさらに含む請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも３個のモジュレーターを含む請求項１又は２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも約５個のモジュレーターを含む請求項３に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも約１０個のモジュレーターを含む請求項４に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも約１００個のモジュレーターを含む請求項５に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
コンストラクトが、基体に結合した、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数のモジュレーターを含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
基体が、粒状基体である請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
粒状基体が、ビーズである請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
ビーズが、マイクロビーズ又はマイクロスフェアである請求項９に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
ビーズが、約０．００１から約１０００マイクロメートルの直径を有する請求項９又は１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
ビーズが、ポリマービーズである請求項１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
ビーズが、任意選択で変性、架橋、又は誘導体化形態であるポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、セルロース、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリラクチド、又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を含む請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
ビーズが、生分解性材料を含む請求項９〜１３のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターの少なくとも１個が、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化剤である請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターの少なくとも１個が、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体を含む請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｄｅｌｔａ若しくはＪａｇｇｅｄ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体を含む請求項１６に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメント及び免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質又はポリペプチドを含む請求項１〜１７のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを含む請求項１〜１８のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２から２０のＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
Ｎｏｔｃｈシグナリングを治療的に調節するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
免疫細胞活性を調節するための請求項１〜２１のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
Ｔ細胞活性を調節するための請求項１〜２２のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
炎症、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、又は自己免疫疾患の治療に用いるための請求項１〜２３のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２５】
滅菌形態である請求項１〜２４のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項２６】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することを含むＮｏｔｃｈシグナリングを治療的に調節する方法。
【請求項２７】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、免疫細胞においてＮｏｔｃｈシグナリングを治療的に調節する方法。
【請求項２８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、免疫細胞活性を治療的に調節する方法。
【請求項２９】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、Ｔ細胞活性を治療的に調節する方法。
【請求項３０】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、炎症、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、又は自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項３１】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも３個のモジュレーターを含む請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも約５個のモジュレーターを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも約１０のモジュレーターを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
コンストラクトが、同一でも異なっていてもよい、Ｎｏｔｃｈシグナリングの少なくとも約１００のモジュレーターを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
コンストラクトが、基体に結合した、Ｎｏｔｃｈシグナリングの同一でも異なっていてもよい多数のモジュレーターを含む請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
基体が、粒状基体である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
粒状基体が、ビーズである請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ビーズが、マイクロビーズ、ナノビーズ、又はマイクロスフェア、又はナノスフェアである請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ビーズが、約０．００１から約１０００マイクロメートルの直径を有する請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ビーズが、ポリマービーズである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ビーズが、任意選択で変性、架橋、又は誘導体化形態であるポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、セルロース、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリラクチド、又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化剤である請求項２６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、Ｄｅｌｔａ若しくはＪａｇｇｅｄ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメント及び免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質又はポリペプチドを含む請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、ＤＳＬ又はＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを含む請求項２６〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの少なくとも１個が、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２から２０のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチド、或いはそのようなタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクト。
【請求項４９】
免疫疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを有する粒子。
【請求項５０】
免疫細胞活性を調節する薬剤の製造における、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトの使用。
【請求項５１】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、免疫障害を治療する方法。
【請求項５２】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクトを含む薬剤組成物。
【請求項５３】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合、連結、又は固定化モジュレーターを含むコンストラクト、及び薬剤として許容される担体を含む薬剤組成物。
【請求項５４】
疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合モジュレーターを有する基体。
【請求項５５】
疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合モジュレーターを有する粒子。
【請求項５６】
粒状支持マトリクスに結合した、ＤｅｌｔａＤＳＬドメインを含む複数のタンパク質又はポリペプチドを含む粒子。
【請求項５７】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適した、薬剤として許容される支持マトリクス。
【請求項５８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの複数のモジュレーターを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適した、薬剤として許容される支持マトリクス。
【請求項５９】
移植可能支持マトリクスの形態である請求項５８に記載の支持マトリクス。
【請求項６０】
粒子の形態である請求項５８又は５９に記載の支持マトリクス。
【請求項６１】
Ｎｏｔｃｈリガンドを有する請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の支持マトリクス。
【請求項６２】
多数のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを有する請求項６１に記載の支持マトリクス。
【請求項６３】
対象由来の免疫細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合モジュレーターを有する基体と接触させることによって、免疫又は炎症性障害を治療するために免疫細胞活性を調節する方法。
【請求項６４】
対象由来の免疫細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合活性化剤を有する基体と接触させることによって、免疫応答をダウンレギュレートするために免疫細胞活性を調節する方法。
【請求項６５】
対象由来の免疫細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合阻害剤を有する基体と接触させることによって、免疫応答をアップレギュレートするために免疫細胞活性を調節する方法。
【請求項６６】
免疫細胞を対象から除去する段階、及びｅｘ  ｖｉｖｏで免疫細胞を基体と接触させる段階を含む請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
免疫細胞を基体と接触させた後に、前記細胞を同一又は異なる対象に戻すさらなる段階を含む請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
免疫細胞を、抗原又は抗原決定基と接触させるさらなる段階を含む請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
免疫細胞を、細胞表面に提示された抗原又は抗原決定基と接触させる段階を含む請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
免疫細胞が、末梢免疫細胞である請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
免疫細胞が、Ｔ細胞、ＡＰＣ、又はＢ細胞である請求項６３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
基体が、粒状基体である請求項６３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
粒状基体が、ビーズである請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ビーズが、約０．００１から約１０００マイクロメートルの直径を有する請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ビーズが、ポリマービーズである請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項７６】
ビーズが、任意選択で変性、架橋、又は誘導体化形態であるポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、セルロース、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリラクチド、又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を含む請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化剤である請求項６３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体を含む請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｄｅｌｔａ若しくはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体を含む請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターが、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのすべて又は一部、及び免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質又はポリペプチドを含む請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターが、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及びＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを含む請求項６３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターが、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び２から２０のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦ様ドメインを含むタンパク質又はポリペプチドを含む請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
基体が、プレート又はウェルを含む請求項６３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの１個又は複数のモジュレーターが、異種アミノ酸配列を含む請求項６３〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
異種アミノ酸配列が、ＩｇＦｃドメインを含む請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
免疫又は炎症性障害が、アレルギー、自己免疫疾患、癌、移植片拒絶、ＧｖＨＤ、又は感染症である請求項６３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
粒状支持マトリクスに結合したＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを含む粒子。
【請求項８８】
粒状支持マトリクスが、ビーズである請求項８７に記載の粒子。
【請求項８９】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｎｏｔｃｈリガンドである請求項８７又は８８に記載の粒子。
【請求項９０】
複数のＮｏｔｃｈリガンドが、粒状支持マトリクスに結合している請求項８９に記載の粒子。
【請求項９１】
粒状支持マトリクスに結合したＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを含む粒子。
【請求項９２】
粒状支持マトリクスが、ビーズである請求項８７に記載の粒子。
【請求項９３】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターが、Ｎｏｔｃｈリガンドである請求項８７又は８８に記載の粒子。
【請求項９４】
複数のＮｏｔｃｈリガンドが、粒状支持マトリクスに結合している請求項９３に記載の粒子。
【請求項９５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを有する、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適した薬剤として許容される支持マトリクス。
【請求項９６】
移植可能支持マトリクスの形態である請求項９５に記載の支持マトリクス。
【請求項９７】
粒子の形態である請求項９６に記載の支持マトリクス。
【請求項９８】
Ｎｏｔｃｈリガンドを有する請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の支持マトリクス。
【請求項９９】
多数のＮｏｔｃｈリガンドを有する請求項９８に記載の支持マトリクス。
【請求項１００】
本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１〜５個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０１】
本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜４個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０２】
本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０３】
本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０４】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１〜５個であり、５個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０５】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜４個であり、４個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０６】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜３個であり、３個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０７】
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）３個であり、３個以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０８】
結合因子が、化学結合に適している請求項１００〜１０７のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１０９】
結合因子が、吸着結合に適している請求項１００〜１０７のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１０】
結合因子が、タンパク質又はポリペプチドのＣ末端にある請求項１００〜１０９のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１１】
結合因子が、Ｃ末端システイン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸残基である請求項１００〜１０７のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１２】
ＤＳＬ及びＥＧＦドメインが、Ｄｅｌｔａドメインである請求項１００〜１１１のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１３】
ＤＳＬ及びＥＧＦドメインが、ヒトＤｅｌｔａドメインである請求項１１２に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１４】
以下の配列の全長に沿って、以下の配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列類似性を有する請求項１００〜１１３のいずれか一項に記載のタンパク質又はポリペプチド。
（物性データ１）
【請求項１１５】
請求項１１４に記載の配列の全長に沿って、請求項１１４に記載の配列に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有する請求項１１４に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１６】
請求項１１４に記載の配列の全長に沿って、請求項１１４に記載の配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列類似性を有する請求項１１４に記載のタンパク質又はポリペプチド。
【請求項１１７】
請求項１００〜１１６のいずれかに記載のタンパク質又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
請求項１００〜１１６のいずれかに記載の多数のタンパク質又はポリペプチドを有する、薬剤として許容される支持マトリクスであって、前記タンパク質が、前記マトリクスに化学結合、親和結合、又は吸着している支持マトリクス。
【請求項１１９】
粒状支持マトリクスである請求項１１８に記載の薬剤として許容される支持マトリクス。
【請求項１２０】
マイクロビーズ又はナノビーズである請求項１１９に記載の薬剤として許容される支持マトリクス。
【請求項１２１】
請求項１００〜１１６のいずれかに記載のタンパク質又はポリペプチドに結合した薬剤として許容される支持マトリクス。
【請求項１２２】
粒状形態である請求項１２１に記載の支持マトリクス。
【請求項１２３】
請求項１００〜１１６のいずれかに記載のタンパク質又はポリペプチドに結合したビーズ。
【請求項１２４】
約０．００１から約１０００マイクロメートルの直径を有する請求項１２３に記載のビーズ。
【請求項１２５】
ビーズが、ポリマービーズである請求項１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１２６】
ビーズが、生分解性材料を含む請求項１２３〜１２５のいずれかに記載のビーズ。
【請求項１２７】
ビーズが、任意選択で変性、架橋、又は誘導体化形態であるポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、セルロース、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリラクチド、又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を含む請求項１２５に記載のビーズ。
【請求項１２８】
請求項１２３〜１２７のいずれか一項に記載のビーズを含む薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の治療的調節に関し、これに限定されるものではないが、特に免疫細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリング経路の治療的調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈシグナル変換は、脊椎動物及び無脊椎動物組織の細胞運命決定において重要な役割を果たす。Ｎｏｔｃｈは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの胚及び幼虫発生の多くの段階、並びに多くの異なる細胞で発現し、これは神経発生、並びに中胚葉及び内胚葉細胞の分化における重要な役割を含む広範な機能を示唆している。少なくとも４種の哺乳動物Ｎｏｔｃｈ遺伝子が存在する（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、及びＮｏｔｃｈ−４）。無脊椎動物及び下等脊椎動物のタンパク質にもっとも類似しているＮｏｔｃｈ−１は広く発現し、初期発生に不可欠である。最近の証拠は、Ｎｏｔｃｈシグナリングが胸腺における未熟Ｔ細胞の系統決定に寄与することを示唆している。
【０００３】
胸腺での成熟中、Ｔ細胞は「自己寛容」と称される過程である、自己抗原を非自己抗原から識別する能力を獲得する。しかしながら、非自己抗原に対する寛容は、その抗原を含むペプチド断片による特定の条件下での免疫化によって誘導される可能性がある。多発性硬化症、関節リウマチ、又は糖尿病などの自己免疫疾患においては、寛容の適切な調節の不全がある。寛容を再確立する改善された治療法は、自己免疫疾患に望ましい。同様にアレルギー状態、及びドナー個体からの器官又は組織の移植においても、特定の異種抗原又は異種抗原プロファイルに対する寛容の誘導が望ましい。
【０００４】
Ｎｏｔｃｈ、並びにそのリガンド、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅの末梢免疫系の正常な成体細胞の細胞表面での発現は、Ｔ細胞獲得免疫能におけるこれらのタンパク質の役割を示唆している。Ｔ細胞は、Ｎｏｔｃｈ−１  ｍＲＮＡを構成的に発現する。Ｄｅｌｔａの発現は、末梢リンパ組織のＴ細胞のあるサブセットのみに限定されている。Ｓｅｒｒａｔｅの発現は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のサブセットに制限されている。Ｎｏｔｃｈシグナリングは末梢の不応答（寛容又はアネルギー）、連鎖抑制、及び感染寛容の誘導において中心的な役割を果たし、Ｎｏｔｃｈ受容体リガンドファミリーは胚発生後も免疫系で細胞運命決定の調節を続けるという考えを、これらの観察は強固なものにする（Ｈｏｙｎｅ等）。
【０００５】
例えば、ＷＯ９８／２０１４２で記載している通り、免疫療法、並びにＴ細胞媒介性疾患の予防及び／又は治療において、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の操作を用いることができる。特に、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、Ｔ細胞系の腫瘍誘発異常、並びにたとえばマラリア原虫種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュウドモナス、トキソプラスマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキシカラに起因する感染症を標的にすることができる。
【０００６】
感染寛容と称される過程である、抗原特異的寛容を他のＴ細胞に伝えることのできるある種の調節性Ｔ細胞の産生が可能であることも最近示されている（ＷＯ９８／２０１４２）。これらの細胞の機能活性は、それらの細胞表面、又は抗原提示細胞の表面におけるＮｏｔｃｈリガンドタンパク質の過剰発現によって模倣され得る。特に、調節性Ｔ細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質のＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅファミリーのメンバーの過剰発現によって生じ得る。１個の抗原エピトープに特異的なＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ誘導Ｔ細胞は、同一抗原又は関連抗原の他のエピトープを認識するＴ細胞に寛容を伝えることもでき、これは「エピトープ拡散」と称される現象である。
【０００７】
Ｎｏｔｃｈリガンド発現は、癌においても役割を果たす。実際、アップレギュレートされたＮｏｔｃｈリガンド発現が、いくつかの腫瘍細胞で観察されている。これらの腫瘍細胞は、特定の抗原による再刺激に対するＴ細胞不応答性を付与することができ、したがって腫瘍細胞がどのように正常なＴ細胞応答を妨げるかという説明を提供する。Ｔ細胞のin vivoでのＮｏｔｃｈシグナリングのダウンレギュレーションは、腫瘍特異抗原を認識するそれらのＴ細胞で、腫瘍細胞が免疫寛容を誘導するのを妨げるために用いることができる。次いで、これによりＴ細胞が腫瘍細胞に対する免疫応答を開始することが可能になる（ＷＯ００／１３５９９０）。
【０００８】
Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ等（Ｂｌｏｏｄ  １９９８、Ｖｏｌ９１、Ｎｏ１１、４０８４〜４０９１頁）は、ヒトＪａｇｇｅｄ−１を発現した３Ｔ３細胞層を用いて選別前駆細胞を共培養することにより、又はヒトＪａｇｇｅｄ−１の精製細胞外ドメインで被覆したビーズを用いて選択前駆体をインキュベートすることによって、マウス骨髄前駆細胞に対するＪａｇｇｅｄ−１の影響をどのように評価したかを記載している。
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ９８／２０１４２
【特許文献２】ＷＯ００／１３５９９０
【非特許文献１】Ｖａｒｎｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ等（Ｂｌｏｏｄ  １９９８、Ｖｏｌ９１、Ｎｏ１１、４０８４〜４０９１頁）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、治療においてＮｏｔｃｈシグナリング経路を調節するため、特に免疫治療において免疫細胞活性を調節するための方法、使用、及び組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
本発明によるＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターの投与は、改善された活性、特に改善されたＮｏｔｃｈシグナリングアゴニスト活性を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを含む薬剤組成物が提供される。適切には、薬剤組成物は、薬剤として許容される希釈剤又は担体をさらに含む。適切には、特にin vivoで用いられるとき、組成物は滅菌形態である。
【００１３】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化に適した配向でコンストラクトによって提示され、好ましくは、コンストラクトの表面に配向される。
【００１４】
本発明はさらに、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、Ｎｏｔｃｈシグナリングを治療的に調節する方法を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトをＴ細胞と接触させることによって、調節性Ｔ細胞を産生する、又は調節性Ｔ細胞の活性を増大する方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、免疫細胞においてＮｏｔｃｈシグナリングを治療的に調節する方法が提供される。
【００１７】
本発明の他の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、免疫細胞活性を治療的に調節する方法が提供される。
【００１８】
本発明の他の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、Ｔ細胞活性を治療的に調節する方法が提供される。
【００１９】
本発明の他の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、炎症、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、又は自己免疫疾患を治療する方法が提供される。
【００２０】
本発明の他の態様によれば、疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトが提供される。
【００２１】
本発明の他の態様によれば、免疫障害の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトが提供される。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合モジュレーターを有する粒子が提供される。適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化に適した配向で粒子に提示され、好ましくは、粒子の表面に配向される。
【００２３】
本発明の他の態様によれば、免疫障害の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合モジュレーターを有する粒子が提供される。
【００２４】
本発明の他の態様によれば、免疫細胞活性を調節する薬剤の製造における、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトの使用が提供される。好ましくは、免疫細胞は、幹細胞でない。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトを投与することによって、免疫障害を治療する方法が提供される。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、疾患の治療に用いる、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合モジュレーターを有する基体が提供される。
【００２７】
本発明の他の態様によれば、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を調節する薬剤を製造するための、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトの使用が提供される。
【００２８】
したがって、一態様において、ＩＬ−１０発現を増大する薬剤を製造するための、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトの使用が提供される。
【００２９】
或いは、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、又はＩＬ−１３から選択されたサイトカインの発現を低減する薬剤を製造するための、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトの使用が提供される。
【００３０】
本発明の他の態様によれば、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−５発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトの使用が提供される。
【００３１】
本発明の他の態様によれば、増大したＩＬ−１０発現、及び減少したＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−アルファ発現を有する免疫調節性サイトカインプロファイルを生じる薬剤を製造するための、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数の結合又は連結モジュレーターを含むコンストラクトの使用が提供される。
【００３２】
一実施形態において、コンストラクトは、実質的又は部分的に水溶性のコンストラクトであることができる。或いは、水不溶性又は分散性コンストラクトであることができる。
【００３３】
本発明の他の態様によれば、粒状支持マトリクスに結合した、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを含む粒子が提供される。適切には、粒状支持マトリクスはビーズである。適切には、複数のＮｏｔｃｈリガンドが、粒状支持マトリクスに結合している。
【００３４】
本発明の他の態様によれば、粒状支持マトリクスに結合した、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを含む粒子が提供される。適切には、粒状支持マトリクスはビーズである。適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド又はその断片である。適切には、複数のＮｏｔｃｈリガンドが、粒状支持マトリクスに結合している。
【００３５】
本発明の他の態様によれば、ＤＳＬドメイン及び少なくとも２個のＥＧＦドメインを含むＮｏｔｃｈリガンドタンパク質などのＮｏｔｃｈシグナリングアゴニストが結合した（化学的、或いは親和力又は吸着によって）表面（たとえばビーズ、ウェル、プレート）と免疫細胞を接触させることによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫細胞（たとえばＴ細胞）活性を改変し、その細胞を患者に投与する方法が提供される。
【００３６】
本発明はさらに、複数のＮｏｔｃｈシグナリングアゴニストで被覆されたプレート又はウェルを提供し、好ましくは、アゴニストは、化学的にプレートに結合していることができる。
【００３７】
本発明の他の態様によれば、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを有する、in vivoでの投与に適した、薬剤として許容される支持マトリクスが提供される。適切には、支持マトリクスは、移植可能支持マトリクスの形態、たとえば粒子の形態であることができる。適切には、支持マトリクスはＮｏｔｃｈリガンドを有し、適切には、多数のＮｏｔｃｈリガンドを有する。
【００３８】
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１〜５のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜４のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４０】
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜３のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４１】
本発明の他の態様によれば、本質的に以下の成分からなり、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）３個のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４２】
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）１〜５であり、５以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜４であり、４以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４４】
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）２〜３であり、３以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４５】
本発明の他の態様によれば、
ｉ）ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、
ｉｉ）３であり、３以下のＮｏｔｃｈリガンドＥＧＦドメイン、
ｉｉｉ）任意選択でＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメインのすべて又は一部、及び
ｉｖ）任意選択で１個又は複数の異種アミノ酸配列を含み、
支持又は担体因子との結合に適した結合エレメントを含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。
【００４６】
一実施形態において、結合因子は化学結合に適しており、たとえば化学反応性エレメントなどである。
【００４７】
或いは、結合因子は、たとえば静電若しくは疎水相互作用を用いる吸着結合、又はたとえば抗体を用いる親和結合に適していてもよい。
【００４８】
適切には、結合因子は、タンパク質又はポリペプチドのＣ末端にある。一実施形態において、結合因子は、Ｃ末端システイン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸残基である。
【００４９】
適切には、タンパク質又はポリペプチドは、以下の配列の全長に沿って、以下の配列に対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性（又は好ましくは配列同一性）を有する。
2006506322.tif 000002
2006506322.tif 000003
【００５０】
本発明の他の態様によれば、上述の多数のタンパク質又はポリペプチドを有する、薬剤として許容される支持マトリクスが提供され、前記タンパク質は、支持マトリクスに結合している。適切には、この結合は、化学結合、親和結合、又は吸着結合であることができる。適切には、支持マトリクスは、粒状支持マトリクス、好ましくはビーズ、好ましくはマイクロビーズ又はナノビーズであることができる。
【００５１】
本発明の他の態様によれば、上述のタンパク質又はポリペプチドに結合したビーズが提供される。適切には、ビーズは、約０．００１から約１０００マイクロメートルの直径を有する。
【００５２】
適切には、ビーズは、ポリマービーズである。一実施形態において、ビーズは、生分解性材料を含む。
【００５３】
適切には、たとえば、ビーズは、任意選択で変性、架橋、又は誘導体化形態であるポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、セルロース、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリラクチド、又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を含む。
【００５４】
本発明の他の態様によれば、記載の粒子又はビーズを含む、たとえばin vivoで用いる薬剤組成物が提供される。
【００５５】
本明細書では、「複数」という用語は、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、適切には少なくとも１０、２０以上の数を意味する。
【００５６】
本明細書では、「多数」という用語は、少なくとも３、好ましくは少なくとも５、適切には少なくとも１０、たとえば少なくとも２０、又は１００以上の数を意味する。
【００５７】
適切には、本発明の様々な実施形態で用いられるコンストラクトは、少なくとも３、好ましくは少なくとも５、適切には少なくとも１０、適切には少なくとも２０、たとえば１００以上のＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを含み、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００５８】
適切には、コンストラクトは、基体に結合したＮｏｔｃｈシグナリングの多数のモジュレーターを含む。好ましくは、基体は、ビーズなどの粒状基体である。適切には、基体は、特にin vivoで用いられる場合、生分解性であることができる。
【００５９】
適切には、そのような粒子又はビーズは、約０．００１から約１０００マイクロメートル、適切には０．０１から１００マイクロメートルの直径（或いは粒子又はビーズの集団の場合、平均直径）を有する。粒子又はビーズは、適切には、マイクロビーズ又はナノビーズ、或いはマイクロスフェア又はナノスフェアであることができる。
【００６０】
適切には、粒子又はビーズは、ポリマー粒子又はビーズである。たとえば、粒子又はビーズは、任意選択で変性、架橋、又は誘導体化形態であるポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックス、セルロース、シリカ、デキストラン、アガロース、セルロース、ポリラクチド、又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）を含むことができる。
【００６１】
適切には、粒子又はビーズは、生分解性材料を含む。適切には、粒子又はビーズは、滅菌形態である。
【００６２】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、薬剤として許容される支持材料上に治療的に投与することができる。
【００６３】
したがって、一実施形態において、本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを有する、in vivoでの投与に適した、薬剤として許容される支持マトリクスを提供する。
【００６４】
適切には、たとえば、支持マトリクスは、移植可能支持マトリクスの形態であることができる。或いは、たとえば、支持マトリクスは、粒子又はビーズの形態であることができる。
【００６５】
適切には、支持マトリクスは、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチド、好ましくは、多数のＮｏｔｃｈリガンドタンパク質又はポリペプチドを有することができる。
【００６６】
そのような支持材料、粒子、ビーズなどは、当分野でよく知られているとおり（たとえば本明細書の「薬剤組成物」の項目に記載のとおり）in vivo又はｅｘ  ｖｉｖｏで投与することができ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を調節するために（たとえば本明細書の「治療」の項目に記載の状態を治療するために）用いることができる。
【００６７】
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化することのできる因子である。好ましくは、この因子は、リンパ球、好ましくはＴ細胞においてＮｏｔｃｈシグナリングを活性化することができる。たとえば、因子は、Ｔｈ又はＴｃＴ細胞などのエフェクターＴ細胞の活性を低減及び／又は調節性Ｔ細胞の活性を増大するように作用することができる。
【００６８】
多数のモジュレーターが本発明によって提供される場合、個々の各モジュレーターは、他の各モジュレーターと同一でも異なっていてもよい。
【００６９】
一実施形態において、本発明に用いられる細胞は、幹細胞でない。
【００７０】
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ受容体、たとえばＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４受容体などを活性化することのできる因子である。適切には、たとえば、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド、或いはＮｏｔｃｈリガンドの生物活性断片又は誘導体、或いはそのようなＮｏｔｃｈリガンドのペプチド擬似体であることができる。好ましくは、因子は、Ｔ細胞などのリンパ球においてＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができる。
【００７１】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、融合タンパク質を含む、又はコードすることができる。たとえば、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメント及び免疫グロブリンＦｃセグメントを含む融合タンパク質を含む、又はコードすることができる。
【００７２】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド細胞外ドメインのセグメント及び免疫グロブリンＦｃセグメント（たとえばＩｇＧ１Ｆｃ又はＩｇＧ４Ｆｃ）を含む融合タンパク質、或いはそのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。そのような融合タンパク質は、たとえばＷＯ９８／２０１４２の実施例２に記載されている。ＩｇＧ融合タンパク質は、たとえばＵＳ５４２８１３０（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）に記載されているように、当分野でよく知られているとおり調製することができる。
【００７３】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、或いはその断片、誘導体、相同体、類似体、又は対立遺伝子変異体を含むタンパク質又はポリペプチドを含む、又はコードする。
【００７４】
好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、ＮｏｔｃｈリガンドＤＳＬドメイン、及び少なくとも１個のＥＧＦ様ドメイン、適切には少なくとも１から２０、適切には少なくとも２から１６、たとえば少なくとも２から１０、たとえば２から５のＥＧＦ様ドメインを含む、又はコードする。適切には、ＤＳＬ及びＥＧＦ配列は、哺乳動物配列であるか、哺乳動物配列に対応している。好ましい配列には、ヒト配列が含まれる。適切には、Ｎｏｔｃｈリガンドドメインは、ＩｇＦｃ配列などの異種アミノ酸配列に融合している。
【００７５】
或いは、又はそれに加えて、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体、或いはＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。
【００７６】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｄｅｌｔａ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体、或いはＤｅｌｔａ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７７】
或いは、又はそれに加えて、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体、或いはＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００７８】
或いは、又はそれに加えて、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体、或いはＮｏｔｃｈ、又はその断片、誘導体、相同体、類似体、若しくは対立遺伝子変異体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００７９】
或いは、又はそれに加えて、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリングリプレッサーの優性陰性型（dominant negative version）、又はＮｏｔｃｈシグナリングリプレッサーの優性陰性型をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００８０】
或いは、又はそれに加えて、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の下流成分の発現又は活性をアップレギュレートすることのできるポリペプチド、或いはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【００８１】
適切には、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターは、抗体、抗体断片、又は抗体誘導体、或いは抗体、抗体断片、又は抗体誘導体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。したがって、本発明はさらに支持体（たとえばビーズ、プレート、ウェルなど）を提供する。
【００８２】
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、多量体化形態で投与することができる。たとえば、一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、膜又は支持体に結合している。適切には、複数又は多数のモジュレーター（たとえば少なくとも５、１０、２０、又は１００）が、その膜又は支持体に結合する。そのような膜又は支持体は、当分野で知られているものから選択できる。一実施形態において、支持体は、粒状支持マトリクスであることができる。たとえば、支持体はビーズであることができる。ビーズは、たとえば磁気ビーズ（たとえば「Ｄｙｎａｌ」の商品名で入手可能）であることができる。
【００８３】
一実施形態において、免疫系の調節は、Ｔ細胞活性の低減を含む。たとえば、免疫系の調節は、エフェクターＴ細胞の低減、たとえばヘルパー（ＴＨ）及び／又は細胞傷害性（ＴＣ）Ｔ細胞活性の低減を含むことができる。適切には、免疫系の調節は、Ｔｈ１又はＴｈ２免疫応答の低減を含むことができる。
【００８４】
或いは、又はそれに加えて、免疫系の調節は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性の増大、たとえばＴｒ１又はＴｈ３調節性Ｔ細胞活性の増大などを提供する。
【００８５】
適切には、免疫系の調節は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の産生及び／又はＴｒｅｇ活性の増強を含む。
【００８６】
適切には、免疫系の調節は、喘息、アレルギー、移植片拒絶、移植片対宿主病、又は自己免疫疾患の治療を含む。
【００８７】
本発明の他の態様によれば、寛容を誘導する能力を有するリンパ球又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を産生する方法が提供され、その方法は、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、上述のＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと共にインキュベートすることを含む。
【００８８】
適切には、この方法は、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、上述のＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターの存在下、ＡＰＣと共にインキュベートすることを含む。
【００８９】
本発明の他の態様によれば、Ｔ細胞において寛容を誘導する能力を有するＡＰＣを産生する方法が提供され、その方法は、ＡＰＣを上述のＮｏｔｃｈシグナリング経路のモジュレーターと接触させることを含む。
【００９０】
本発明の他の態様によれば、寛容を誘導する能力を有するリンパ球又はＡＰＣを産生する方法が提供され、その方法は、ヒト又は動物の患者から得たリンパ球又はＡＰＣを、上述のとおり産生されたリンパ球又はＡＰＣと共にインキュベートすることを含む。
【００９１】
適切には、そのような方法において、リンパ球又はＡＰＣは、in vivo又はｅｘ  ｖｉｖｏでインキュベートすることができる。
【００９２】
本発明の他の態様によれば、粒状支持マトリクスに結合した複数、好ましくは多数のＤｅｌｔａタンパク質又はポリペプチドを含む粒子（マイクロビーズ及びナノビーズを含むビーズなど）が提供される。本明細書では「Ｄｅｌｔａタンパク質又はポリペプチド」という用語は、適切には少なくとも１個のＤｅｌｔａ１、Ｄｅｌｔａ３又はＤｅｌｔａ４などのＤｅｌｔａＮｏｔｃｈリガンド由来のＤＳＬドメイン、及び適切には少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、たとえば２から１０個のＤｅｌｔａＮｏｔｃｈリガンド由来のＥＧＦ様ドメインを有するタンパク質又はポリペプチドを含む。好ましくは、ＤｅｌｔａＮｏｔｃｈリガンドは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンド配列、たとえばＸｅｎｏｐｕｓ、マウス、又はヒト配列であるか、それに由来する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９３】
本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を、非限定的な例として、添付の図面を参照して記載する。
【００９４】
本発明の実施は、別段の指示のないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の通常の技法を用い、それらは当分野の技術者の能力の範囲内である。そのような技法は文献に説明されている。たとえば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．等（１９９５及び定期補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、及び１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、及びＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ及びＪａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ、並びにＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ及びＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。それぞれの全般的な原文を参照により本明細書の一部とする。
【００９５】
Ｎｏｔｃｈシグナリング
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈシグナリング」という表現は、「Ｎｏｔｃｈシグナリング経路」という表現と同義であり、Ｎｏｔｃｈ受容体の活性化を生じる、又は活性化から生じる（かつ活性化を含む）任意の１個又は複数の上流又は下流の事象を指す。
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、胚において二分細胞運命決定を方向づける。Ｎｏｔｃｈは、２種の異なるリガンド、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅの受容体として機能する膜貫通タンパク質としてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａで最初に記載された。脊椎動物は、複数のＮｏｔｃｈ受容体及びリガンドを発現する。今日までヒト細胞で、少なくとも４種のＮｏｔｃｈ受容体（Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、及びＮｏｔｃｈ−４）が同定されている。
【００９６】
Ｎｏｔｃｈタンパク質は単一ポリペプチド前駆体として合成され、これはフリン様コンバターゼによって開裂を受け、２個のポリペプチド鎖を生じ、さらに処理されて成熟受容体を形成する。原形質膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体は、２個のＮｏｔｃｈタンパク質分解性開裂産物のヘテロ２量体を含み、一方は細胞外ドメインの一部分、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなるＮ末端断片を含み、他方は細胞外ドメインの大部分を含む。受容体を活性化するＮｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂段階が起こり、フリン様コンバターゼによって媒介される。
【００９７】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、３６までの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様リピートを含有する細胞外ドメイン、及び細胞質ドメインを含有する膜貫通サブユニットからなるジスルフィド結合ヘテロ２量体分子として膜に挿入される。Ｎｏｔｃｈの細胞質ドメインは、６個のアンキリン様リピート、ポリグルタミンストレッチ（ＯＰＡ）、及びＰＥＳＴ配列を含有する。ＲＡＭ２３と称される他のドメインは、アンキリンリピートに近接して位置し、アンキリン様リピートと同様に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのへアレスのサプレッサー［Ｓｕ（Ｈ）］、及び脊椎動物のＣＢＦ１として知られる転写因子への結合に関与する（Ｔａｍｕｒａ）。
【００９８】
Ｎｏｔｃｈリガンドはさらに、すべてのＮｏｔｃｈリガンドの特徴である、システインに富むＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ  Ｌａｇ２）ドメインと共に、細胞外ドメインに複数のＥＧＦ様リピートを示す（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ）。
【００９９】
Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｄｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＳｃａｂｒｏｕｓなどの細胞外リガンドの、Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインのＥＧＦ様リピートとの結合によって活性化される。Ｄｅｌｔａは、活性化のための開裂を必要とする。これは細胞表面においてＡＤＡＭディスインテグリンメタロプロテアーゼＫｕｚｂａｎｉａｎによって開裂され、この開裂事象は可溶性で活性なＤｅｌｔａ形態を放出する。ＴＡＮ−１としても知られる、短縮細胞外ドメインを有するヒトＮｏｔｃｈ−１タンパク質の発癌性変異体は、構成的に活性であり、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病に関与することが見出されている。
【０１００】
ｃｄｃ１０／アンキリン細胞内ドメインリピートは、細胞内シグナル変換タンパク質との物理的相互作用を媒介する。もっとも顕著には、ｃｄｃ１０／アンキリンリピートは、へアレスのサプレッサー［Ｓｕ（Ｈ）］と相互作用する。Ｓｕ（Ｈ）は、Ｃプロモーター結合因子１［ＣＢＦ−１］、エプスタイン−バーウイルス誘発性のＢ細胞不朽化に関与する哺乳動物ＤＮＡ結合タンパク質のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ相同体である。少なくとも培養細胞において、Ｓｕ（Ｈ）は細胞質のｃｄｃ１０／アンキリンリピートと結合し、隣接細胞のリガンドＤｅｌｔａとのＮｏｔｃｈ受容体の相互作用により核に転移することが実証されている。Ｓｕ（Ｈ）はいくつかの遺伝子のプロモーターに見出される応答因子を含み、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の重要な下流タンパク質であることが見出されている。転写におけるＳｕ（Ｈ）の関与は、Ｈａｉｒｌｅｓｓによって調節されると考えられている。
【０１０１】
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）はさらに、直接核機能を有する（Ｌｉｅｂｅｒ）。最近の研究は実際に、Ｎｏｔｃｈ活性化は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの６個のｃｄｃ１０／アンキリンリピートが核に達し、転写活性化に関与する必要のあることを示している。Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部におけるタンパク質分解性開裂の部位は、ｇｌｙ１７４３とｖａｌ１７４４の間（部位３、又はＳ３と称される）であることが同定されている（Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ）。核内移行のためにＮｏｔｃｈＩＣを放出するタンパク質分解性開裂段階は、プレセニリン活性に依存する。
【０１０２】
細胞内ドメインは、核内に蓄積し、そこでＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）と転写活性因子複合体を形成することが示されている（Ｓｃｈｒｏｅｓｔｅｒ、Ｓｔｒｕｈｌ）。このＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ）。このＮｏｔｃｈの核機能は、哺乳動物Ｎｏｔｃｈ相同体に関しても示されている（Ｌｕ）。
【０１０３】
ＮｏｔｃｈＩＣプロセシングは、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ又はＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄの結合に応答してのみ起こる。Ｇｏｌｇｉの初期Ｎｏｔｃｈ受容体の翻訳後修飾（Ｍｕｎｒｏ、Ｊｕ）は、少なくともある程度、細胞表面での２種のリガンドとの相互作用を制御すると考えられる。Ｎｏｔｃｈ受容体は、Ｎｏｔｃｈ／Ｌｉｎモチーフに結合するグリコシルトランスフェラーゼ酵素Ｆｒｉｎｇｅによって細胞外ドメインで修飾される。Ｆｒｉｎｇｅは、ＥＧＦ様リピートにＯ結合フコース基を添加することによってＮｏｔｃｈを修飾する（Ｍｏｌｏｎｅｙ、Ｂｒｕｃｋｎｅｒ）。このＦｒｉｎｇｅによる修飾は、リガンド結合を妨げないが、Ｎｏｔｃｈのリガンド誘導性のコンフォメーション変化に影響を及ぼす可能性がある。さらに、最近の研究は、Ｆｒｉｎｇｅの作用はＮｏｔｃｈを修飾して、Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄリガンドとの機能的な相互作用を妨げるが、Ｄｅｌｔａとの選択的な相互作用を許容することを示唆している（Ｐａｎｉｎ、Ｈｉｃｋｓ）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは単一のＦｒｉｎｇｅ遺伝子を有するが、脊椎動物は複数の遺伝子を発現することが知られている（Ｒａｄｉｃａｌ、Ｍａｎｉｃ、及びＬｕｎａｔｉｃ  Ｆｒｉｎｇｅ）（Ｉｒｖｉｎｅ）。
【０１０４】
したがって、Ｎｏｔｃｈ受容体からのシグナル変換は、異なる経路によって起こり得る（図１〜３）。より明確な経路は、核に転移し、ＣＳＬファミリータンパク質ＣＢＦ１（へアレスのサプレッサー、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＳｕ（Ｈ）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＬａｇ−２）と転写活性因子複合体を形成する、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）のタンパク質分解性開裂を含む。ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＢＦ１複合体は、次いでｂＨＬＨタンパク質ＨＥＳ（スプリット様のヘアリーエンハンサー）１及び５などの標的遺伝子を活性化する。Ｎｏｔｃｈはさらに、細胞質ジンクフィンガー含有タンパク質Ｄｅｌｔｅｘを含むＣＢＦ−１非依存性の様式でシグナルを伝達することもできる（図３）。ＣＢＦ１とは異なり、Ｄｅｌｔｅｘは、Ｎｏｔｃｈ活性化後に核に移動しないが、その代わりに、Ｇｒｂ２と相互作用し、Ｒａｓ−Ｊｎｋシグナリング経路を調節することができる。
【０１０５】
上述のとおり、いくつかの内因性Ｎｏｔｃｈモジュレーターがすでに知られている。これらには、たとえばＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅが含まれる。本発明の目的は、新規なＮｏｔｃｈシグナリングモジュレーターの検出である。
【０１０６】
本明細書では、「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して、生物学的作用をもたらすことのできる因子を意味する。したがって本明細書では、この用語には、Ｄｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ／Ｊａｇｇｅｄなどの天然タンパク質リガンド、並びに天然リガンドに相当する生物学的作用を有するＮｏｔｃｈ受容体の抗体、ペプチド擬似体、及び低分子が含まれる。好ましくは、Ｎｏｔｃｈリガンドは、結合によってＮｏｔｃｈ受容体と相互作用する。
【０１０７】
本明細書では、「抗体」という用語は、エピトープ決定基に結合することのできる、完全分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖなどのそれらの断片を含む。これらの抗体断片は、その抗原又は受容体と選択的に結合する一部の能力を保持し、たとえば以下を含む。
（ｉ）Ｆａｂ、抗体分子の１価抗原結合断片を含有するこの断片は、全抗体を酵素パパインで消化して、１個の完全な軽鎖、及び１個の重鎖の一部を生じることによって産生できる。
（ｉｉ）Ｆａｂ’、抗体分子のこの断片は、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元して、１個の完全な軽鎖、及び重鎖の一部を生じることによって得ることができ、抗体分子当たり２個のＦａｂ’断片が得られる。
（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２、全抗体を後に還元することなくペプシンで処理することによって得られる抗体の断片であり、Ｆ（ａｂ’）２は、２個のジスルフィド結合によって結合した２個のＦａｂ’断片の２量体である。
（ｉｖ）ｓｃＦＶ、融合単一鎖分子として重鎖及び軽鎖の可変領域を含有する遺伝子操作断片を含む。
【０１０８】
「相同体」は、たとえば上に記載した既知のＮｏｔｃｈリガンドの任意の１個に対して、配列相同性、アミノ酸又は核酸配列相同性を示す遺伝子産物を意味する。典型的に、既知のＮｏｔｃｈリガンドの相同体は、対応する既知のＮｏｔｃｈリガンドに対して、そのＮｏｔｃｈリガンドの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、適切には少なくとも１００のアミノ酸の配列に渡って、又は全長に渡って、アミノ酸レベルで少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％同一である。２個以上のアミノ酸又は核酸配列間の配列相同性を算出する技法及びソフトウエアは、当分野でよく知られている（たとえば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、及びＡｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。
【０１０９】
Ｎｏｔｃｈリガンドの相同体は、いくつかの方法で同定することができ、たとえば、中から高ストリンジェンシー条件下（たとえば、約５０℃から約６０℃で０．０３Ｍの塩化ナトリウム及び０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム）Ｎｏｔｃｈリガンドをコードしている核酸のすべて又は一部を含むプローブでゲノム又はｃＤＮＡライブラリをプローブすることによる。或いは、相同体は、一般に保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。このプライマーは、１個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを有する配列のクローニングに用いられるより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
【０１１０】
Ｎｏｔｃｈ受容体などのＮｏｔｃｈシグナリング経路の成分に結合することのできる、抗体、ペプチド擬似体、及び有機低分子などの因子をスクリーニング及び開発するための技法は、当分野でよく知られている。これらの技法には、シグナリングタンパク質を発現するためのファージディスプレイ系の使用、及び潜在的な結合化合物の結合研究用のタンパク質を産生するためにトランスフェクトされたＥ．ｃｏｌｉ又は他の微生物の培養を用いることが含まれる（たとえば、Ｇ．Ｃｅｓａｒｉｎｉ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０７（１）：６６〜７０（１９９２年７月）、Ｈ．Ｇｒａｍ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６１：１６９〜１７６（１９９３）、及びＣ．Ｓｕｍｍｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３７５６〜３７６０（１９９２年５月）を参照のこと）。さらなるライブラリ及びスクリーニング技法は、たとえばＵＳ６２８１３４４（Ｐｈｙｌｏｓ）に記載されている。
【０１１１】
好ましくは、本発明に用いるＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ受容体、好ましくはＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４などのヒトＮｏｔｃｈ受容体に結合し、活性化することのできるＮｏｔｃｈリガンドなどのＮｏｔｃｈ受容体アゴニストである。そのような結合及び活性化は、たとえば本明細書に記載のin vitro結合アッセイ及び活性アッセイを含む、当分野で知られている多様な技法によって評価することができる。
【０１１２】
本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは特異的なシグナリングであり、シグナリングが、たとえばサイトカインシグナリングなどの他の著しい干渉又は競合要因ではなく、実質的に又は少なくとも主としてＮｏｔｃｈシグナリング経路、好ましくはＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用に起因することを意味する。したがって、好ましい実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、サイトカインシグナリングを除外する。
【０１１３】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター
本明細書では、「調節する」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、又はその標的シグナリング経路の生物活性の変化及び変更を指す。「モジュレーター」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリングのアンタゴニスト又は阻害剤、すなわち少なくともある程度、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の正常な生物活性を遮断する化合物を指すこともある。好都合には、そのような化合物は、本明細書において阻害剤又はアンタゴニストと呼ぶことができる。或いは、「モジュレーター」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリングのアゴニスト、すなわち少なくともある程度、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の正常な生物活性を刺激又はアップレギュレートする化合物を指すことができる。好都合には、そのような化合物を、アップレギュレーター又はアゴニストと呼ぶことができる。
【０１１４】
「候補モジュレーター」という用語は、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターとして機能できる、又は機能できると考えることのできる任意の１種又は複数の分子を説明するために用いられる。前記分子は、たとえば有機「低分子」又はポリペプチドであることができる。適切には、候補分子は、複数のそのような分子又はポリペプチド、或いはそれらのライブラリを含む。これらの分子は、既知のモジュレーターから誘導することができる。「誘導」は、候補モジュレーター分子が、好ましくは、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターの既知モジュレーターである開始配列から完全又は部分的に任意抽出されたポリペプチドを含むことを意味する。もっとも好ましくは、候補分子は、本明細書に定義したパラメータによるＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、１個又は複数の既知のＮｏｔｃｈモジュレーター分子に対して、少なくとも４０％相同、より好ましくは少なくとも６０％相同、さらに好ましくは少なくとも７５％相同、さらに好ましくはたとえば８５％又は９０％、さらに好ましくは９５％超相同であるポリペプチドを含む。
【０１１５】
本発明の候補モジュレーターは、有機化合物又は他の化学物質であることができる。この実施形態において、候補モジュレーターは、２個以上のヒドロカルビル基を含む有機化合物である。本明細書では、「ヒドロカルビル基」という用語は、少なくともＣ及びＨを含み、任意選択で１個又は複数の他の適切な置換基を含む基を意味する。そのような置換基の例には、ハロ、アルコキシ、ニトロ、アルキル基、環式基などが含まれる。置換基が環式基である可能性に加えて、置換基の組み合わせが環式基を形成することもできる。ヒドロカルビル基が２個以上のＣを含む場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合している必要はない。たとえば、それらの炭素の少なくとも２個は、適切な元素又は基を介して結合していることができる。したがって、ヒドロカルビル基は、ヘテロ原子を含有することができる。適切なヘテロ原子は、当分野の技術者に明らかであり、たとえば硫黄、窒素、及び酸素が含まれる。候補モジュレーターは、少なくとも１個の環式基を含むことができる。環式基は、非縮合多環式基などの多環式基であることができる。いくつかの適用例の場合、この因子は、他のヒドロカルビル基に結合した少なくとも１個の前記環式基を含む。
【０１１６】
好ましい一実施形態において、候補化合物は、アミノ酸配列、又はその化学的誘導体、或いはそれらの組み合わせである。他の好ましい実施形態において、候補化合物は、ヌクレオチド配列であり、これはセンス配列又はアンチセンス配列であることができる。候補モジュレーターは、抗体であることもできる。
【０１１７】
候補モジュレーターは、合成化合物、又は天然単離化合物であることができる。そのような合成又は天然モジュレーターの種々の例を以下に挙げる。
【０１１８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのアゴニストには、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、或いはＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の１個又は複数の成分をアップレギュレートすることのできる任意の分子が含まれる。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路をアップレギュレートするための候補モジュレーターには、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を変換又は活性化することのできる化合物が含まれる。
【０１１９】
Ｎｏｔｃｈシグナリング変換のモジュレーターには、Ｎｏｔｃｈの活性化、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の下流事象、下流標的遺伝子の転写調節、及び他の非転写下流事象（たとえば既存タンパク質の翻訳後修飾）を含むＮｏｔｃｈ受容体によるシグナリングに加わる分子を含む。より詳細には、そのようなモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の標的遺伝子の活性化を可能にする。
【０１２０】
本発明の一態様によれば、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈのシグナリング変換能を保持するＮｏｔｃｈポリペプチド又はポリヌクレオチド、又はその断片、変異体、誘導体、擬似体、若しくは相同体、或いはＮｏｔｃｈのシグナリング変換能を有するＮｏｔｃｈの類似体であることができる。Ｎｏｔｃｈによって、本出願人等は、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、Ｎｏｔｃｈ−４、及び他の任意のＮｏｔｃｈ相同体又は類似体を意味する。Ｎｏｔｃｈの類似体には、ＥＢＮＡ２、ＢＡＲＦ０、又はＬＭＰ２Ａなどのエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のタンパク質が含まれる。特定の好ましい実施形態において、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮｏｔｃｈＩＣ）、或いはそのサブ断片、変異体、誘導体、擬似体、類似体、又は相同体であることができる。
【０１２１】
Ｎｏｔｃｈシグナリング活性化のモジュレーターには、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、或いはＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の１個又は複数の成分を活性化することのできる分子が含まれる。
【０１２２】
そのようなモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリングリプレッサーの優性陰性型であることができる。他の実施形態において、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリングリプレッサーを阻害することができる。他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリング活性化のモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの陽性活性化剤である。
【０１２３】
特定の実施形態において、このモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導又は増大することができる。そのような分子は、Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドの発現を誘導又は増大することのできる核酸配列であることができる。
【０１２４】
一実施形態において、モジュレーターは、標的細胞においてＮｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドをコードする内因性遺伝子の発現をアップレギュレートすることができる。特に、モジュレーターは、標的細胞において内因性Ｎｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンドの発現をアップレギュレートすることができる免疫抑制性サイトカイン、或いはそのようなサイトカインをコードするポリヌクレオチドであることができる。免疫抑制性サイトカインには、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−ベータ、及びＦＬＴ３リガンドが含まれる。したがって、候補モジュレーターにはさらに、上述の任意のものの断片、誘導体、変異体、擬似体、類似体、及び相同体が含まれる。
【０１２５】
内因性アゴニストには、ノギン、コーディン、ホリスタチン、Ｘｎｒ３、線維芽細胞増殖因子が含まれる。したがって、候補モジュレーターには、その誘導体、断片、変異体、擬似体、類似体、及び相同体、或いは上述の任意の１個又は複数をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【０１２６】
他の実施形態において、モジュレーターは、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈリガンドをコードするポリヌクレオチドであることができる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的に種々の哺乳動物細胞、たとえば造血幹細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することができる。内因性Ｎｏｔｃｈリガンドには、Ｄｅｌｔａファミリーのポリペプチド、たとえばＤｅｌｔａ−１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｄｅｌｔａ−３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８４５７６、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、Ｄｅｌｔａ様３（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、Ｄｅｌｔａ−４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ０４３８９４）、並びにＳｅｒｒａｔｅファミリーのポリペプチド、たとえばＳｅｒｒａｔｅ−１及びＳｅｒｒａｔｅ−２（ＷＯ９７／０１５７１、ＷＯ９６／２７６１０、及びＷＯ９２／１９７３４）、Ｊａｇｇｅｄ−１及びＪａｇｇｅｄ−２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２９７７８、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、並びにＬＡＧ−２が含まれる。本発明の候補化合物には、上述の任意のものの断片、誘導体、変異体、擬似体、類似体、及び相同体が含まれる。
【０１２７】
好ましい実施形態において、モジュレーターは、構成的に活性なＮｏｔｃｈ受容体又はＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン、或いはそのような受容体又は細胞内ドメインをコードするポリヌクレオチドである。
【０１２８】
他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈ受容体の下流で作用する。したがって、たとえばＮｏｔｃｈシグナリングの活性化剤は、構成的に活性なＤｅｌｔｅｘポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることができる。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の他の内因性下流成分には、Ｄｅｌｔｅｘ−１、Ｄｅｌｔｅｘ−２、Ｄｅｌｔｅｘ−３、Ｄｅｌｔｅｘのサプレッサー（ＳｕＤｘ）、Ｎｕｍｂ及びそのイソ型、Ｎｕｍｂ関連キナーゼ（ＮＡＫ）、Ｎｏｔｃｈｌｅｓｓ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｓｈ）、ｅｍｂ５、Ｆｒｉｎｇｅ遺伝子（Ｒａｄｉｃａｌ、Ｌｕｎａｔｉｃ、及びＭａｎｉｃなど）、ＰＯＮ、ＬＮＸ、Ｄｉｓａｂｌｅｄ、Ｎｕｍｂｌｉｋｅ、Ｎｕｒ７７、ＮＦｋＢ２、Ｍｉｒｒｏｒ、Ｗａｒｔｈｏｇ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１及びＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２、Ｌｉｐ−１及びその相同体、Ｄｅｌｔｅｘによって調節されるＲａｓ／ＭＡＰＫカスケードに関与するポリペプチド、プレセニリンなどのＮｏｔｃｈのタンパク質分解性開裂に関与するポリペプチド、及びＮｏｔｃｈ標的遺伝子の転写調節に関与するポリペプチドが含まれる。したがって、本発明に用いられる候補モジュレーターには、上述の任意のものの構成的に活性な形態、その類似体、相同体、誘導体、変異体、擬似体、及び断片が含まれる。
【０１２９】
Ｎｏｔｃｈシグナリング活性化のモジュレーターにはさらに、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果として発現した任意のポリペプチド、及びそのようなポリペプチドの発現に関与する任意のポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。
【０１３０】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の阻害剤を抑制することによっても達成できる。したがって、候補モジュレーターには、任意のＮｏｔｃｈシグナリング阻害剤を抑制することのできる分子が含まれる。好ましくは、この分子は、Ｎｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の任意の下流成分の発現又は活性において低減を生じることのできる化合物の生成又は活性を低減する又は妨げるポリペプチド、又はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。好ましい実施形態において、モジュレーターは、Ｔｏｌｌ様受容体タンパク質ファミリー、サイトカイン、たとえばＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び増殖因子、たとえば骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＢＭＰ受容体、及びアクチビンのポリペプチドを抑制することができる。
【０１３１】
好ましくは、本発明のモジュレーターは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。任意の所与の因子がＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターとして作用するかどうか（作用する場合、そのようなシグナリングの活性化剤であるか、阻害剤であるか）は、たとえば本明細書の実施例に記載されているものなど、適切なアッセイ又はスクリーニングを用いて容易に判定することができる。
【０１３２】
Ｎｏｔｃｈリガンドドメイン
上述のとおり、Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的にいくつかの異なるドメインを含む。種々の天然ヒトＮｏｔｃｈリガンドのいくつかの予測される／潜在的ドメイン位置（前駆タンパク質のアミノ酸番号に基づく）を以下に示す。
【０１３３】
【表１】
2006506322.tif 000004
【０１３４】
【表２】
2006506322.tif 000005
【０１３５】
【表３】
2006506322.tif 000006
【０１３６】
【表４】
2006506322.tif 000007
【０１３７】
【表５】
2006506322.tif 000008
【０１３８】
ＤＳＬドメイン
典型的なＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができる。
2006506322.tif 000009
【０１３９】
好ましくは、ＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができ、
2006506322.tif 000010
配列中、
ＡＲＯは、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はヒスチジンなどの芳香族アミノ酸残基であり、
ＮＯＰは、グリシン、アラニン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、又はバリンなどの非極性アミノ酸残基であり、
ＢＡＳは、アルギニン、又はリシンなどの塩基性アミノ酸残基であり、
ＡＣＭは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、又はグルタミンなどの酸又はアミドアミノ酸残基である。
【０１４０】
好ましくは、ＤＳＬドメインは、以下の共通アミノ酸配列の大部分又はすべてを含むことができ、
2006506322.tif 000011
（配列中、Ｘａａは任意のアミノ酸であることができ、Ａｓｘはアスパラギン酸又はアスパラギンである）。
【０１４１】
種々の供給源由来のＮｏｔｃｈリガンドのＤＳＬドメインのアラインメントを図３に示す。
【０１４２】
用いられるＤＳＬドメインは、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ラット、マウス、又はヒトを含む、適切な任意の種に由来することができる。好ましくは、ＤＳＬドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０１４３】
適切には、たとえば、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１４４】
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえば、ヒトＪａｇｇｅｄ２のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１４５】
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ１のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１４６】
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ３のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１４７】
或いは、本発明に用いられるＤＳＬドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ４のＤＳＬドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１４８】
「ＮｏｔｃｈリガンドＮ末端ドメイン」という用語は、Ｎ末端からＤＳＬドメインの開始までのＮｏｔｃｈリガンド配列の部分を意味する。この用語は、天然ドメインに相当する活性を有する配列変異体、断片、誘導体、及び擬似体を含むことが理解される。
【０１４９】
本明細書では、「異種アミノ酸配列」又は「異種ヌクレオチド配列」という用語は、天然配列に見出されない（たとえば、あるＮｏｔｃｈリガンド配列が、天然Ｎｏｔｃｈリガンド配列に見出されない場合）又はそのコード配列に見出されない配列を意味する。好ましくは、任意のそのような異種アミノ酸配列は、ＴＳＳＴ配列でなく、好ましくはスーパー抗原配列でない。
【０１５０】
ＥＧＦ様ドメイン
ＥＧＦ様モチーフは、ＥＧＦ、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンドだけでなく、血液凝固カスケードに関与するものを含む種々のタンパク質に見出されている（Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８）。たとえば、このモチーフは、血液凝固因子ＩＸ及びＸなどの細胞外タンパク質（Ｒｅｅｓ等、１９８８、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：２０５３〜２０６１、Ｆｕｒｉｅ及びＦｕｒｉｅ、１９８８、Ｃｅｌｌ５３：５０５〜５１８）、他のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子（Ｋｎｕｓｔ等、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．７６１〜７６６、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ等、１９８８、Ｃｅｌｌ５５：１０４７〜１０５９）、並びにいくつかの細胞表面受容体タンパク質、たとえばトロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８９１〜１８９７）及びＬＤＬ受容体（Ｓｕｄｈｏｆ等、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：８１５〜８２２）などに見出されている。タンパク質結合部位は、トロンボモジュリン及びウロキナーゼのＥＧＦリピートドメインにマッピングされている（Ｋｕｒｏｓａｗａ等、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ２６３：５９９３〜５９９６、Ａｐｐｅｌｌａ等、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４３７〜４４４０）。
【０１５１】
ＰＲＯＳＩＴＥによって報告されているとおり、典型的なＥＧＦ様ドメインは、（ＥＧＦにおいて）ジスルフィド結合に関与することが示されている６個のシステイン残基を含むことができる。その主要な構造は、必ずしも必須ではないが、２本鎖βシートであり、Ｃ末端短２本鎖シートへのループが続くことが報告されている。保存システイン間のサブドメインは、以下の典型的なＥＧＦ様ドメインの概略図に示すように、長さが非常に多様である。
【０１５２】
【化１】
2006506322.tif 000012
図中、
Ｃ：ジスルフィド結合に関与する保存システイン
Ｇ：多くの場合、保存グリシン
ａ：多くの場合、保存芳香族アミノ酸
＊：両パターンの位置
ｘ：任意の残基
【０１５３】
第５システインと第６システインの間の領域は、２個の保存グリシンを含有し、少なくともその１個は一般にたいていのＥＧＦ様ドメインに存在する。
【０１５４】
用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、ラット、マウス、又はヒトを含む、適切な任意の種に由来することができる。好ましくは、ＥＧＦ様ドメインは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトＮｏｔｃｈリガンド配列に由来する。
【０１５５】
適切には、たとえば、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、ヒトＪａｇｇｅｄ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１５６】
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＪａｇｇｅｄ２のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１５７】
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ１のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１５８】
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ３のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１５９】
或いは、本発明に用いられるＥＧＦ様ドメインは、たとえばヒトＤｅｌｔａ４のＥＧＦ様ドメインに対して、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することができる。
【０１６０】
抗体
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、Ｎｏｔｃｈに結合し、活性化する抗体、誘導体、又は断片であることができる。したがって、本発明はさらに、Ｎｏｔｃｈに結合し、活性化することのできる抗体と結合する（たとえば化学的、親和力又は吸着によって）支持体（たとえばビーズ、プレート、又はウェル、好ましくはビーズ）を提供する。
【０１６１】
抗体を作製する一般的な方法は、当分野で知られている（たとえば、その原本を参照により本明細書の一部とする、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと）。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであることができるが、好ましくはモノクローナルである。
【０１６２】
適切には、結合親和性（平衡結合定数（Ｋａ））は、少なくとも約１０６Ｍ−１、少なくとも約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、又は少なくとも約１０９Ｍ−１であることができる。
【０１６３】
適切には、抗体、誘導体、又は断片は、Ｎｏｔｃｈの１個又は複数のＥＧＦ又はＬｉｎ／Ｎｏｔｃｈ（Ｌ／Ｎ）ドメイン（たとえばＮｏｔｃｈのＥＧＦリピート１１及び１２）に結合する。
【０１６４】
ブロッキング因子として用いる適切な抗体は、Ｎｏｔｃｈのすべて又は一部を含むペプチドで宿主動物を免疫化することによって得られる。
【０１６５】
用いられるペプチドは、完全タンパク質、或いはその断片又は誘導体を含むことができる。好ましい免疫原は、ヒトＮｏｔｃｈ（たとえばＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４、好ましくはＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ２）の細胞外ドメインのすべて又は一部を含み、これらの残基は、グリコシル化などの天然タンパク質に見出される任意の翻訳後修飾を含有する。細胞外ドメインを含む免疫原は、通常の組換え法を用いるクローン遺伝子の発現、及び／又は高レベルのＮｏｔｃｈを発現するＴ細胞又は細胞集団からの単離など、当分野でよく知られているいくつかの技法によって産生することができる。
【０１６６】
モノクローナル抗体は、当分野でよく知られている手段によって産生することができる。一般に、免疫化宿主動物の脾臓及び／又はリンパ節は、形質細胞の供給源を提供する。形質細胞は、骨髄腫細胞との融合によって不朽化し、ハイブリドーマ細胞を産生する。個々のハイブリドーマの培養上清を、標準的な技法を用いてスクリーニングして、所望の特異性を有する抗体を生じるものを同定する。この抗体は、不溶性支持体プロテインＡセファロースなどに結合したＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はその断片を用いるアフィニティクロマトグラフィなどの通常の技法によって、ハイブリドーマ細胞上清又は腹水から精製することができる。
【０１６７】
たとえば、Ｎｏｔｃｈに対する抗体は、ＵＳ５６４８４６４、ＵＳ５８４９８６９、及びＵＳ６００４９２４（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に記載されており、それらの原本を参照により本明細書の一部とする。
【０１６８】
Ｎｏｔｃｈ受容体に対して産生された抗体は、ＷＯ００２０５７６（この原本も参照により本明細書の一部とする）にも記載されている。たとえば、この文献は、ヒトＮｏｔｃｈ−１ＥＧＦ様リピート１１及び１２に対する抗体の産生を開示している。たとえば、特定の実施形態において、ＷＯ００２０５７６は、Ａ６と称される、ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ１２６５４を有するハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体、Ｃｌ１と称される、ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ１２６５６を有するハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体、及びＦ３と称される、ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ１２６５５を有するハイブリドーマによって分泌されたモノクローナル抗体を開示している。
【０１６９】
適切には、in vivoでヒト患者の治療に用いられる抗体は、キメラ又はヒト化抗体である。抗体「ヒト化」技法は、当分野でよく知られている。それらの技法は、典型的に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する組換えＤＮＡ技術の使用を含む。
【０１７０】
ＵＳ５８５９２０５に記載されているように、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）をヒト化する初期の方法はキメラ抗体の産生を含み、１個の抗体の完全な可変領域を含む抗原結合部位は、他の抗体由来の定常領域に結合している。そのようなキメラ化手順は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ＥＰ−Ａ−０１２５０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．及びＣｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ）、ＥＰ−Ａ−０１７１４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、及びＷＯ８６／０１５３３（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。たとえば、ＷＯ８６／０１５３３は、マウスＭＡｂの可変領域、及びヒト免疫グロブリンの定常領域を有する抗体分子を調製する方法を開示している。
【０１７１】
ＥＰ−Ａ−０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されている他のアプローチにおいて、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、長いオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的変異誘発によって、ヒト免疫グロブリンの可変領域のフレームワーク領域にグラフトされる。そのようなＣＤＲグラフトヒト化抗体は、それらが含有する非ヒトアミノ酸配列の割合がはるかに低いために、ヒト化キメラ抗体に比べて、抗抗体反応を生じる可能性が低い。リゾチームを認識するマウスＭＡｂ及びヒトＴ細胞の抗原を認識するラットＭＡｂがＣＤＲグラフト化によってヒト化された例は、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６、１９８８）及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ等（Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４、１９８８）にそれぞれ記載されている。ヒトＴ細胞の抗原に対するＣＤＲグラフト化抗体の調製は、ＷＯ８９／０７４５２（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）にも記載されている。
【０１７２】
ＷＯ９０／０７８６１において、Ｑｕｅｅｎ等は、ヒト化免疫グロブリンを設計するための４つの基準を提示している。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、ヒト化される非ヒトドナー免疫グロブリンに著しく相同である特定のヒト免疫グロブリンのフレームワークを用いる、又は多くのヒト抗体の共通フレームワークを用いることである。第２の基準は、フレームワークの特定の残基においてヒト配列として、そのヒトアクセプター残基が例外的であり、ドナー残基が典型的である場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を用いることである。第３の基準は、ＣＤＲに直接隣接する位置でアクセプターではなくドナーフレームワークアミノ酸残基を用いることである。第４の基準は、アミノ酸が３次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３Ａ以内に側鎖原子を有し、抗原又はヒト化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用することができると予測されるフレームワーク位置でドナーアミノ酸残基を用いることである。基準２、３、又は４は、基準１に加えて、又は基準１の代わりに適用でき、単独又は組み合わせて適用できることが提示される。
【０１７３】
アイソタイプの選択は、補体結合、又は抗体依存性細胞傷害の活性などの所望のエフェクター機能によって左右される。適切なアイソタイプには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれる。適切には、ヒト軽鎖定常領域、カッパ又はラムダを用いることができる。
【０１７４】
架橋
一実施形態において、本発明は、架橋形態でＮｏｔｃｈシグナリングの多数のモジュレーターを含むコンストラクトを用いることができる。
【０１７５】
そのような実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、たとえば、互いに直接又は間接的に結合していることができる。結合は、共有又は非共有（たとえば、静電及び／又は疎水相互作用による）であることができる。
【０１７６】
一実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター間の直接結合は、化学的架橋によって達成される。適切な化学的架橋の手順は、当分野でよく知られており、たとえばＣａｒｌｓｓｏｎ  Ｊ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３〜７３７、１９７８、Ｃｕｍｂｅｒ  Ｊ．Ａ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１２：２０７〜２２４、１９８５、Ｗａｌｄｅｎ  Ｐ．等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１９１〜１９７、１９８６、Ｇｏｒｄｏｎ  Ｒ．Ｄ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４：３０８〜３１２、１９８７、Ａｖｒａｍｅａｓ  Ｓ．等、Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：５３、１９６９、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｋ．Ｃ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：２８１５〜２８１９、１９７８、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｌ．等、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３１１〜３５０頁、１９８１を参照されたい。
【０１７７】
他の実施形態において、直接結合は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの多数のモジュレーターをコードする組換えキメラ遺伝子の設計及び発現によって達成することができる。その後、キメラ遺伝子を適切な発現系に発現させる。
【０１７８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーター間の間接結合は、スペーサー分子を用いて達成することができる。たとえば、一実施形態において、スペーサーは、たとえば１機能又は２機能抗体又は抗体誘導体であることのできる抗体を含むことができる。
【０１７９】
基体結合
或いは、又は加えて、本発明は、基体に結合したＮｏｔｃｈシグナリングの多数のモジュレーターを含むコンストラクトを用いることができる。
【０１８０】
基体は、ポリマー、プラスチック、多孔質材料、たとえば樹脂又は修飾セルロースなど、ビーズ（マイクロスフェア及びマイクロビーズ、ナノスフェア及びナノビーズなど）、実験用プレート及びウェル、並びにリポソームなどの多くの異なる形態を取り得ることが理解される。
【０１８１】
たとえば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの使用の場合、支持体は、マイクロタイタプレートなどのプレート、或いはたとえばウェル又は他の適切な容器であることができる。表面の少なくとも一部を、共有又は非共有手段によって結合したＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターで被覆することができる。
【０１８２】
一実施形態において、基体は、たとえば約０．００１から約１０００マイクロメートル、たとえば約０．０１から約１００マイクロメートル、適切には約０．１から１０マイクロメートルの直径（又は、たとえばビーズの集団では平均直径）を有するビーズ、球体、粒子、又は担体などの粒状基体であることができる。ビーズなどの粒状材料は、ある種の状況において取扱いが容易であり、細胞との相互作用により大きな表面積を提供する可能性があるという利点を有する。粒状材料はさらに、特に基体が生分解性材料を含むとき、in vivoの適用例により適している可能性がある。
【０１８３】
「直径」という用語は通常、実質的に球状又は他の丸い形態を有する粒子に適用されることが理解される。しかしながら、本発明に用いられる粒子は、そのような規則的な形態を有する必要はなく、より不規則な形態を有してもよいことが理解され、その場合、当該寸法は適切には最長直線寸法である。
【０１８４】
さらに、個々の粒子又はビーズに関して寸法が与えられる場合、それらは粒子又はビーズの集合又は集団にも適用されることが理解され、その場合、所与の寸法は、集合又は集団の平均寸法、適切には算術平均寸法に関する。たとえば、あるビーズが所与の範囲の直径を有すると提示される場合、同じ範囲の平均直径を有するビーズの集合又は集団に関しても考慮され得ることが理解される。
【０１８５】
好ましい粒子又はビーズの大きさは、２０〜１０００ｎｍ、たとえば約１００ｎｍ（０．１ミクロン）である。
【０１８６】
基体は、たとえば、天然又は合成ポリマー、たとえばポリスチレン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクチド、ポリアクリルアミド、ラテックス、シリカ、デキストラン、アガロース、デンプン、セルロース、キチン／キトサン、ポリラクチド、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）など、タンパク質／ポリペプチド、たとえばアルブミン、たとえばヒト血清アルブミンなど、並びにそれらの修飾、架橋、及び誘導化形態を含むことができる。適切な材料には、たとえば、ポリスチレン、セルロース、エピクロロヒドリンで架橋されたデキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ビスアクリルアミドで架橋したポリアクリルアミド（Ｂｉｏｇｅｌ（商標）、ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）、寒天、ガラスビーズ、ポリラクチドビーズ、及びラテックスビーズが含まれる。誘導体化微粒子には、たとえばマレイミド、アルデヒド基、アリル基、カルボキシアルキル基、たとえばカルボキシメチルなど、ホスホリル及び置換ホスホリル基、スルフェート、スルフヒドリル、及びスルホニル基、並びにアミノ及び置換アミノ基で誘導化された微粒子が含まれる。ビーズは、親水性又は疎水性の性質を有することができる。
【０１８７】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、任意の適切な手段で基体（たとえばビーズ）に結合することができる。たとえば、結合は、表面吸着などの非共有結合（たとえば疎水及び／又は静電相互作用による）、又は化学結合などの共有結合によることができる。たとえば、反応基（アミノ、アルデヒド、カルボキシ、エポキシ、又はトルエンスルホニル（トシル）、チオール、又はマレイミド基など）が基体（ビーズなど）表面に存在することができ、又は基体表面に導入することができ、それらはＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターに結合することができる。
【０１８８】
たとえば、タンパク質又はポリペプチド形態のＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、表面活性化基体（ビーズなど）をタンパク質又はポリペプチドと共にインキュベートすることによって、適切には、少なくとも１２から２４時間、適切には中性、又は中性から高いｐＨで、適切には基体／ビーズ上の反応基（たとえば、トシル、エポキシ、アミノ、カルボキシ、アルデヒド、チオール、又はマレイミド基）がタンパク質又はポリペプチド上の反応基（たとえば、タンパク質又はポリペプチド上の遊離アミノ又はスルフヒドリル基、或いはアルデヒド基）と反応して共有結合を形成するような充分な温度でインキュベートすることによって、基体（ビーズなど）に結合することができる。
【０１８９】
必要であれば、基体／粒子／ビーズをＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターに結合するために、種々のリンカー基を用いることができる。リンカーは当分野でよく知られており、適切には、酸性、塩基性、アルデヒド、エーテル、又はエステル反応基、或いはその残基を含む。適切なリンカー部分には、たとえば、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒド、マレイミド又は分岐マレイミド、ビオチン、ビニル誘導体、及びリン脂質が含まれる。
【０１９０】
たとえば、Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質及びポリペプチドなどのＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、スルホ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）などの結合因子を用いて、ビーズに化学的に結合させることができる。反応スキームを図７に示す。
【０１９１】
Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターを基体（ビーズなど）に結合するために、抗体を用いることもできる。たとえば、多くの実施形態の１つにおいて、ストレプトアビジンなどの抗体結合材料で被覆したビーズを用いて、ビオチン化抗ＩｇＧ抗体に結合し、次にそれをＩｇＧ融合タンパク質の形態でＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターに結合することができる。或いは、たとえば、ビオチン化剤／リガンドなどの適切に官能化した因子を、ストレプトアビジンビーズなどのビーズに直接結合することもできる。
【０１９２】
一実施形態において、粒子又はビーズは、磁気ビーズなど、たとえばＤｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、ＮｏｒｗａｙからＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）の商品名で入手可能なものなどの磁性粒子であることができる。これらは流体から磁気的に容易に分離されるという利点を有し、ｅｘ  ｖｉｖｏ使用例に用いるのに特に有利である可能性がある。そのような粒子又はビーズは、たとえば酸化鉄などの磁性又は常磁性材料をポリスチレンなどのポリマーマトリクスに組み込むことによって調製することができる。
【０１９３】
Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈウェブサイト（ｗｗｗ．ｄｙｎａｌ．ｎｏ）に記載のとおり、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、磁場に置かれたときにのみ磁性であり、磁場が除去されているときには残留磁気を持たない超常磁性ポリマー球体である。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）は、各ビーズに均等に分布した孔に沈降した磁性材料によって高度に架橋されたポリスチレンからなる。それらの孔には、好ましくはさらなるポリマー層が充填されており、それがビーズ内部の鉄材を封じている。後に、適切であれば、化学基（アミノ、カルボキシ、エポキシ、又はトルエンスルホニル（トシル）基など）をビーズ表面に導入することができる。
【０１９４】
粒子又はビーズは、親水性又は疎水性であることができる。親水性粒子又はビーズ（たとえば、シリアル番号Ｍ２７０としてＤｙｎａｌから入手可能なＤｙｎａｂｅａｄｓなど）は、不安定なタンパク質の機能活性を維持する、リガンドと表面との穏やかな結合を可能にする。このようなビーズの親水性によって水溶液における最適な分散度が確保される。これらの粒子又はビーズは、たとえばアミン及びカルボン酸官能基で表面活性化されることができる。アミン及びカルボン酸ビーズの官能基は、市販の架橋剤との結合により、多種多様な代替反応基のさらなる導入を可能にする。
【０１９５】
疎水性粒子又はビーズ（たとえば、シリアル番号Ｍ−４５０及びＭ−２８０としてＤｙｎａｌから入手可能なＤｙｎａｂｅａｄｓなど）は、抗体の結合に適している。抗体の疎水性Ｆｃ領域は、疎水性粒子又はビーズ表面に吸着され、その後、急速に共有結合が形成される可能性がある。したがって、この抗体の配向は、Ｆａｂ領域が外側を向いており一般に最適である。
【０１９６】
マトリクス、粒子又はビーズに結合されるリガンド又は化合物の活性部位の配向も考慮される必要のあることが理解される。粒子又はビーズとタンパク質の親水性部分との間の親水−親水相互作用が所望されるときには親水性ビーズが適しているが、疎水性粒子又はビーズは、粒子又はビーズとタンパク質の疎水性部分との間の疎水−疎水相互作用を促進する。
【０１９７】
一実施形態において、粒子又はビーズは、たとえばＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＵＳ）から入手可能なものなどのラテックスマイクロスフェアであることができる。Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓウェブサイト（ｗｗｗ．ｉｄｃｌａｔｅｘ．ｃｏｍ）に開示されているように、ラテックスマイクロスフェア／ビーズは、アニオン（負）又はカチオン性（陽）表面電荷として入手可能である。アニオン性ラテックス、たとえばスルフェート、カルボキシル、又はカルボキシレート修飾表面基などは、負荷電細胞表面に結合する可能性が低く、したがってしばしば生物適用例で用いられる。
【０１９８】
粒子又はビーズは、適切には、たとえば低温殺菌、適切には７８〜８０℃で約２４時間の低温殺菌によって、又はガンマ線照射、たとえば０．０３メガラドで、適切には約２４時間のガンマ線照射によって、使用前に滅菌することができる。
【０１９９】
適切には、粒子又はビーズは、非特異的に生体分子を吸収するそれらの能力を大幅に低減する種々のタンパク質又は多糖で被覆することができる。アビジン、ストレプトアビジン、及び抗体などのタンパク質分子の特異的不可逆的吸着は、指定の時間、単純にラテックスとタンパク質を混合し、次いで、遠心分離及び上澄みの除去により非結合タンパク質から結合形態を分離することによって達成することができる。
【０２００】
非特異的結合を低減するために、粒子又はビーズは、たとえばＢＳＡ又はデキストランで被覆することができる。非特異的結合をさらに低減するために、所望であれば、タンパク質、核酸、及び他の生体分子を、粒子又はビーズと共有結合させることができる。共有結合は受動的吸着に比べて手間を要する可能性があるが、長く活性のままである高い特異性を有するコンジュゲートを生じることができる。ＣＭＬラテックスとのカルボジイミドを介する結合は、低分子量ペプチド及びオリゴヌクレオチドをコンジュゲートするのに適した方法である。
【０２０１】
広範な適切なビーズ、マイクロ／ナノビーズ、及びマイクロ／ナノスフェアは、たとえばＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．４００  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｏａｄ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳからも入手可能である。
【０２０２】
他の実施形態において、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターは、通常の技法を用いて、リポソームの線状又は架橋主鎖にコンジュゲートすることができる（たとえばＯｓｔｒｏ  Ｍ．Ｊ．（編）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。リポソームを調製し、免疫グロブリンをそれらの表面にコンジュゲートする好ましい一方法は、Ｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ．７５、３５１〜３６０（１９８４）に記載されている。たとえば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、コレステロール、及びホスホチジルエタノールアミンからなる多層膜リポソームを調製する。次いで、架橋剤Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートによって、Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターをホスファチジルエタノールアミンに結合することができる。断片とリポソームの結合は、コンジュゲートされた断片と補体に対する二次抗体の処理によりリポソームから予め捕捉したマーカー、たとえばカルボキシ蛍光を放出することによって実証できる。
【０２０３】
ＮｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターがＩｇＦｃドメインを含む場合、Ｆｃドメインの炭水化物部分を介して、リポソーム又は本発明の他の担体に結合することができる。
【０２０４】
断片（抗体）との結合のために、糖環部分を誘導化してヒドラジド基を得る方法は、たとえばＲｏｄｗｅｌｌ  Ｊ．Ｄ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：２６３２〜３６（１９８６）に記載されている。
【０２０５】
以下の論文は、特に粒子を形成／被覆するために、本発明に用いるのに適した種々のポリマーを記載している。
デキストラン：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２（２００１）１１９７〜１２０３、Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ等。
【０２０６】
メタクリレート誘導化デキストランは生体適合性であり、薬剤送達の有望なシステムである。
Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ａｌ  ｆｉｖｅ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ  ９４（２００２）１２９３〜１２９７、Ｗｕｌｂｒａｎｄ等。過ヨウ素酸塩活性化デキストランに結合したソマトスタチンは、耐ホルモン性前立腺癌に関する臨床試験において長い半減期を有する。
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎａｔｅｄ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｏｄｅｘｔｒａｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５（１９９３）１０１８〜１０２３、Ｄａｕｂｒｅｓｓｅ等。薬剤コンジュゲートのための官能アミン基誘導化デキストラン。
ＰＥＧ：スチレンとのコポリマー；Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）（ＰＳ−ＰＥＧ２０００）  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ。２．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＰＥＧ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  in vitro  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  in vivo  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１（１９９４）１０１６〜１０２２。
ＰＥＧ被覆ビーズ；ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ５３２（２００２）３３８〜３４４、Ｇｈａｄａｍｏｓｉ等。１ミクロンポリスチレンビーズをＢＳＡで被覆し、次いでＰＥＧ化、食作用に対する集団耐性、及び補体活性化の低減。
Ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）／ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １（２０００）３９〜４８、Ｏｔｓｕｋａ等。ポリラクチドに表面反応性アルデヒドＰＥＧを被覆。
Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７８（２００２）１５〜２４、Ｖｉｌａ等。ＰＥＧ被覆ポリ（ラクチド）、キトサン被覆ポリ（乳酸−グリコール酸）、キトサン。
アルブミンナノ粒子；Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２１１（２０００）６７〜７８、Ｗｅｂｅｒ等。チオール基をヒト血清アルブミンナノ粒子の表面に導入。
「ステルスナノスフェア」；Ｐｒｏｌｏｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｄｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｐｒｉｏｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ−９０８．Ａ  ‘ｈｅｐａｔｉｃ−ｂｌｏｃｋａｄｅ’  ｅｖｅｎｔ  ｏｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  in vivo？  ＢＢＡ  １３３６（１９９７）１〜６、Ｍｏｇｈｉｍｉ  Ｓ．Ｍ．。６０又は２５０ナノメートルのポリスチレンは、ポロキサミン９０８又はポロキサミン−タンパク質コンジュゲートで被覆した場合、長い半減期を有する。
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃａｍｏｕｆｌａｇｅ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｏｏｒｌｙ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｓｕｒｆａｃｅ：ｔｏｗａｒｄｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ、ＢＢＡ  １５９０（２００２）１３１〜１３９、Ｍｏｇｈｉｍｉ  Ｓ．Ｍ．。ＰＥＧ化ＢＳＡ又はＩｇＧによるポリスチレンナノスフェアの被覆。
Ｃａｐｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｂｏｄｙ’ｓ  Ｄｅｆｅｎｓｅｓ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒ．Ｓｙｓｔ．１８（２００１）５２７〜５５０、Ｍｏｇｈｉｍｉ  Ｓ．Ｍ．及びＨｕｎｔｅｒＡ．Ｃ．。概説。
【０２０７】
ポリペプチド配列
本明細書では、「ポリペプチド」という用語は、用語「アミノ酸配列」及び／又は用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、「ポリペプチド」という用語は、用語「ペプチド」と同義である。
【０２０８】
一般に「ペプチド」は、１０から４０アミノ酸長、好ましくは１０から３５アミノ酸の短いアミノ酸配列を指す。
【０２０９】
ポリペプチド配列は、適切な供給源から調製及び単離することができ、或いは合成によって製造することができ、或いは組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。
【０２１０】
ポリヌクレオチド配列
本明細書では、「ポリヌクレオチド配列」という用語は、用語「ポリヌクレオチド」及び／又は用語「ヌクレオチド配列」と同義である。
【０２１１】
ポリヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成、或いは組換え由来のＤＮＡ又はＲＮＡである。これらは標準的な技法によってクローン化することもできる。ポリヌクレオチド配列は、センス又はアンチセンス鎖、或いはそれらの組み合わせであっても、２本鎖又は１本鎖であることができる。
【０２１２】
「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基から１０００塩基までの長さ、又はそれ以上のヌクレオチドのポリマー形態を指す。長いポリヌクレオチド配列は一般に、組換え手段、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて産生される。これには、クローン化を所望する標的化配列の領域に隣接するプライマー（たとえば約１５から３０ヌクレオチド）対を作る段階、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させる段階、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階、増幅断片を単離する段階（たとえばアガロースゲルで反応混合物を精製することによる）、及び増幅ＤＮＡを回収する段階を含む。このプライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化できるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
【０２１３】
核酸はＲＮＡ又はＤＮＡであることができ、好ましくはＤＮＡである。核酸がＲＮＡである場合、操作はｃＤＮＡ中間体を経て行うことができる。一般に、第１領域をコードしている核酸配列が調製され、５’及び／又は３’末端に適切な制限部位が提供される。好都合には、この配列は、標準的な実験ベクター、たとえばｐＢＲ３２２又はｐＵＣ１９に基づくプラスミドベクター（下記を参照のこと）などにおいて操作する。適切な技法の正確な詳細に関してはＳａｍｂｒｏｏｋ等によるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）、又は同様の標準的な参考文献を挙げることができる。
【０２１４】
核酸の供給源は、既刊の文献、又はＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクを参照することにより確認することができる。所望の第１又は第２配列をコードしている核酸は、そのような供給源がその材料を提供することをいとわない場合には学究的又は営利的供給源から得ることができ、或いは配列データのみが得られる場合には適切な配列の合成又はクローニングによって得ることができる。一般的に、これは当該遺伝子のクローニングを記載している文献を参照することにより行うことができる。
【０２１５】
或いは、限られた配列データが入手可能である場合、或いは知られている核酸に相同の又は関連した核酸を発現することが所望である場合、代表的な核酸は、当分野で知られている核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列とみなすことができる。
【０２１６】
ポリヌクレオチド配列は、たとえば、タンパク質コードドメイン、アンチセンス配列、又は機能モチーフ、たとえばタンパク質結合ドメインなどを含むことができ、それらの変異体、誘導体、類似体、及び断片が含まれる。この用語は、その核酸配列によってコードされるポリペプチドも指す。
【０２１７】
変異体、誘導体、類似体、相同体、及び断片
本明細書に記載の特定のポリペプチド及びポリヌクレオチド配列に加えて、本発明はさらにそれらの変異体、誘導体、類似体、相同体、擬似体及び断片の使用を包含する。
【０２１８】
本発明において、任意の所与の配列の変異体とは、当該ポリペプチド又はポリヌクレオチドが少なくとも１個の内因性機能を維持するような様式で、残基（アミノ酸又は核酸残基）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、天然タンパク質に存在する少なくとも１個の残基の付加、欠失、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、修飾、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、及び／又は変更によって改変され得る。
【０２１９】
本明細書では、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して「誘導体」という用語は、結果として生じるタンパク質又はポリペプチドが少なくとも１個の内因性機能を維持するという条件で、その配列から又はその配列への、１個（又は複数）のアミノ酸残基の置換、変更、修飾、置換、削除、及び／又は付加を含む。
【０２２０】
本明細書では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して「類似体」という用語は、内因性ポリペプチド又はポリヌクレオチドの機能の少なくとも１個を保持するが、一般にそれと異なる進化起源を有する任意のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む。
【０２２１】
本明細書では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して「擬似体」という用語は、それが擬態するポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも１個の内因性機能を有する化学化合物を指す。
【０２２２】
典型的に、アミノ酸置換は、修飾された配列が所要の標的活性又はＮｏｔｃｈシグナリングを調節する能力を維持するという条件で、たとえば１、２、又は３から１０又は２０の置換からなることができる。アミノ酸置換には、非天然類似体の使用を含むことができる。
【０２２３】
本発明に有用なタンパク質は、サイレント変化を生じ、機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を有することができる。意図的なアミノ酸置換は、標的又は調節機能が維持されるかぎり、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。たとえば、負の電荷を持つアミノ酸には、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が含まれ、正の電荷を持つアミノ酸には、リシン、又はアルギニンが含まれ、類似の親水性値を持つ非電荷極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０２２４】
参照を簡略化するために、主要な天然アミノ酸の１文字及び３文字の符号（並びに関連コドン）を以下に示す。
【０２２５】
【表６】
2006506322.tif 000013
【０２２６】
保存的置換は、たとえば以下の表に従って行うことができる。第２列の同じブロック、好ましくは第３列の同じ行のアミノ酸を互いに置換することができる。
【０２２７】
【表７】
2006506322.tif 000014
【０２２８】
本明細書では、「タンパク質」という用語は、１本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有又は非共有手段で結合している複数ポリペプチド複合体を含む。本明細書では、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、モノマーがアミノ酸であって、ペプチド又はジスルフィド結合によって結合しているポリマーを指す。サブユニット及びドメインという用語は、生物機能を有するポリペプチド及びペプチドを指すこともできる。
【０２２９】
「断片」も変異体であり、この用語は典型的に、機能的に又は例えばアッセイにおいて対象となるポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、完全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸配列を指す。
【０２３０】
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて調製することができる。挿入が行われる場合、挿入部位のいずれかの側の天然配列に対応する５’及び３’フランキング領域と共に挿入物をコードしている合成ＤＮＡが挿入される。配列が適切な酵素で切断され、合成ＤＮＡが切断部にライゲートできるように、フランキング領域は天然配列の部位に対応する都合のよい制限部位を含有する。次いで、本発明に従ってＤＮＡを発現させ、コードされたタンパク質を製造する。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作するための当分野で知られている多数の標準的技法の例示にすぎず、知られている他の技法も用いることができる。
【０２３１】
ポリヌクレオチド変異体は、好ましくはコドン最適化配列を含む。コドン最適化は、ＲＮＡ安定性、したがって遺伝子発現を増強する方法として当分野で知られている。遺伝子コードの重複は、いくつかの異なるコドンが同じアミノ酸をコードしている可能性のあることを意味する。たとえば、ロイシン、アルギニン、及びセリンは、それぞれ６個の異なるコドンによってコードされる。異なる有機体は、異なるコドンの使用を優先する。たとえば、ＨＩＶなどのウイルスは、多数の希少コドンを使用する。通常用いられる対応する哺乳動物コドンによって希少コドンが置き換えられるようにヌクレオチド配列を変えることによって、哺乳動物標的細胞において配列の発現を増大することができる。コドン使用表は哺乳動物細胞に関して当分野でよく知られており、種々の他の有機体に関しても同様である。好ましくは、配列の少なくとも一部は、コドン最適化されている。より好ましくは、配列の全体がコドン最適化されている。
【０２３２】
本明細書では、「相同性」という用語は「同一性」と同義であり得る。相同性配列は、少なくとも７５、８５、又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５又は９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むものと理解される。特に、相同性は典型的に、活性に必須であることが知られている配列の領域に関して（たとえば５１、５６、及び５７位のアミノ酸）考慮されるべきである。相同性は類似性（すなわち類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）という点から考慮されることもできるが、本発明においては、配列同一性という点から相同性を表すことが好ましい。
【０２３３】
相同性の比較は、目視で行うことができるが、より一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２個以上の配列間の相同性％を算出することができる。
【０２３４】
相同性のパーセントは、連続した配列について算出することができ、すなわち１個の配列を他の配列とアラインし、一方の配列の各アミノ酸を他方の配列の対応するアミノ酸と１度に１残基ずつ直接比較する。これは「ギャップのない（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的に、そのようなギャップのないアラインメントは、比較的に短い残基数についてのみ行われる。
【０２３５】
これは非常に簡単で一貫性のある方法であるが、たとえば、他の点では同一である配列対において、１個の挿入又は欠失によって、それに続くアミノ酸残基がアラインメントから押し出され、したがってグローバルアラインメントを行ったとき、潜在的に相同性％の大きな低減が生じることを考慮できない。その結果、たいていの配列比較法は、全体的な相同性スコアに不当にペナルティを課すことなく、挿入及び欠失の可能性を考慮に入れた最適なアラインメントを生じるように設計されている。これは、局所的な相同性を最大にするために、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０２３６】
しかしながら、より複雑な方法は、同一アミノ酸が同数である場合、可能なかぎり少ないギャップを有する（２個の比較配列間の高い関連性を反映する）配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列アラインメントに比べて高いスコアを得られるように、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。ギャップの存在に比較的高いコストを課し、そのギャップ内の連続した各残基に小さいペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が典型的に用いられる。これはもっとも一般的に用いられるギャップスコアシステムである。高いギャップペナルティは当然ながら、より少ないギャップを有する最適化アラインメントを生じる。たいていのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの変更が可能である。しかしながら、配列比較にそのようなソフトウエアを使用するとき、デフォルト値を用いることが好ましい。たとえば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記を参照のこと）を使用するとき、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップが−１２、各伸長は−４である。
【０２３７】
したがって、最大相同性％の算出には、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アラインメントをまず作製することが必要である。そのようなアラインメントを実行するのに適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）である。配列比較を行うことのできる他のソフトウエアの例には、これに限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ）、及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式が含まれる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡは共にオフライン及びオンライン検索で利用可能である。しかしながら、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムの使用が好ましい。
【０２３８】
最終的な相同性％は同一性の点から測定できるが、アラインメントのプロセス自体は典型的に、オールオアナッシングの対比較には基づいていない。その代わりに、一般的に、化学的類似性又は進化距離に基づく各対比較にスコアを割り当てる、調整類似性スコアマトリクスが用いられる。一般的に用いられるそのようなマトリクスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス、すなわち一連のＢＬＡＳＴプログラムのデフォルトマトリクスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般にパブリックデフォルト値、又は供給されている場合にはカスタムシンボル比較表を用いる（さらなる詳細はユーザーマニュアルを参照のこと）。ＧＣＧパッケージの場合にはパブリックデフォルト値の使用が好ましく、他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリクスの使用が好ましい。
【０２３９】
ソフトウエアによって最適アラインメントを作製した後、相同性％、好ましくは配列同一性％を算出することができる。ソフトウエアは典型的に、配列比較の一部としてこれを行い、数値で結果を示す。
【０２４０】
本発明で用いられる配列に相同性であるか、又は配列の変異体であるヌクレオチド配列は、いくつかの方法によって、たとえば様々な供給源から作製されたＤＮＡライブラリをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のウイルス／細菌、又は細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（たとえばラット、マウス、ウシ、及び霊長類細胞）に見出された細胞の相同体を得ることができ、一般にそのような相同体及びその断片は、本明細書の配列リストに示した配列に選択的にハイブリダイズすることができる。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリ、又は他の動物種のゲノムＤＮＡライブラリをプローブし、中から高ストリンジェンシー条件下、参照ヌクレオチド配列のすべて又は一部を含むプローブでそのようなライブラリをプローブすることによって得ることができる。本発明に有用なアミノ酸及び／又はヌクレオチド配列の種相同体及び対立遺伝子変異体の獲得にも同様の考えが適用される。
【０２４１】
変異体、及び株／種相同体も、本発明に有用な配列内の保存アミノ酸配列をコードしている変異体及び相同体の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、たとえばいくつかの変異体／相同体のアミノ酸配列をアラインすることによって予測することができる。配列アラインメントは、当分野で知られているコンピュータソフトウエアを用いて行うことができる。たとえば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられる。縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１個又は複数の縮重位置を含み、既知の配列に対する単一配列プライマーを用いる配列のクローニングより低いストリンジェンシー条件下で用いられる。
【０２４２】
或いは、そのようなヌクレオチド配列は、特徴決定した配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、たとえばそのヌクレオチド配列が発現する特定の宿主細胞のコドン選択を最適化するために、配列にサイレントコドン変化が必要である場合に有用である可能性がある。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するために、或いはポリヌクレオチド又はコードされたポリペプチドの活性を変えるために、望ましい可能性がある。
【０２４３】
一般にプライマーは合成手段によって産生され、１度に１ヌクレオチドずつ段階的に所望の核酸配列を製造することを含む。自動化技法を用いてこれを達成する技法は、当分野で容易に利用可能である。
【０２４４】
長いヌクレオチド配列は一般に、組換え手段、たとえばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技法を用いて産生される。これには、クローン化を所望する標的化配列の領域に隣接するプライマー（たとえば約１５から３０ヌクレオチド）対を作る段階、そのプライマーを動物又はヒト細胞から得たｍＲＮＡ又はｃＤＮＡに接触させる段階、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階、増幅断片を単離する段階（たとえばアガロースゲルで反応混合物を精製することによる）、及び増幅ＤＮＡを回収する段階を含む。このプライマーは、増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターにクローン化できるように、適切な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
【０２４５】
組換え産生の場合、宿主細胞を遺伝子操作して、発現系又は本発明のポリヌクレオチドを組み込むことができる。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓ等及びＳａｍｂｒｏｏｋ等など、多くの標準的な実験マニュアルに記載されている方法、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、バリスティック導入、及び感染などによって行うことができる。そのような方法は、薬剤送達系としてin vitro又はin vivoで用い得ることが理解される。
【０２４６】
適切な宿主の代表的な例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、Ｅ．ｃｏｌｉ、ストレプトミセス、及び枯草菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞及びアスペルギルス細胞などの真菌細胞、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、２９３、及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞、並びに植物細胞が含まれる。
【０２４７】
本発明に有用なポリペプチドを産生するために、多種多様な発現系を用いることができる。そのようなベクターには、特に、染色体、エピソーム、及びウイルス由来ベクター、たとえば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、並びにそれらの組み合わせ由来のベクター、たとえばコスミド及びファージミドなどの、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝子エレメントに由来するものなどが含まれる。発現系コンストラクトは、発現を生じるだけでなく、発現を調節する制御領域を含むことができる。一般に、この点に関して、宿主においてポリヌクレオチドを維持、増殖、又は発現し、かつ／又はポリペプチドを発現するのに適した任意の系又はベクターを、発現に用いることができる。適切なＤＮＡ配列は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載のものなど、よく知られている種々の慣例的な技法のいずれかによって発現系に挿入することができる。
【０２４８】
翻訳されたタンパク質を、小胞体の内腔、ペリプラズマ間隙、又は細胞外環境に分泌するために、適切な分泌シグナルを発現ポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは、ポリペプチドに内因性であることができ、或いは異種シグナルであることもできる。
【０２４９】
本発明に用いられる活性因子は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈降、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含む、よく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。もっとも好ましくは、精製に高速液体クロマトグラフィを用いる。単離及び／又は精製中にポリペプチドが変性するとき、活性な立体構造を再生するために、タンパク質をリフォールドするための知られている技法を用いることができる。
【０２５０】
本発明の一実施形態において、任意の１個又は複数の上述の候補モジュレーターを、免疫系の細胞と接触させる。本発明に用いる免疫系の細胞を以下に記載する。
【０２５１】
免疫系の細胞
本発明に用いる細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を変換することのできる免疫系の細胞である。
【０２５２】
もっとも好ましくは、本発明で用いる細胞はＴ細胞である。これらには、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋成熟Ｔ細胞、末梢又は胸腺起源の未成熟Ｔ細胞、並びにＮＫ−Ｔ細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０２５３】
或いは、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＡＰＣには、樹状細胞（ＤＣ）、たとえば相互連結ＤＣ又は濾胞ＤＣなど、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、或いはその表面にＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現する、又は活性化されて発現する上皮細胞、線維芽細胞、又は内皮細胞などの他の細胞型が含まれる。ＡＰＣの前駆体には、ＣＤ３４＋細胞、単球、線維芽細胞、及び内皮細胞が含まれる。ＡＰＣ又は前駆体は、培養条件によって修飾することができ、或いはたとえば１個又は複数の遺伝子のトランスフェクションによって遺伝子的に修飾することもできる。
【０２５４】
Ｔ細胞又はＡＰＣは、患者から、或いはドナー個体又は他の個体から単離することができる。細胞は、好ましくは、ヒト又はマウス細胞などの哺乳動物細胞である。好ましくは、細胞は、ヒト起源の細胞である。ＡＰＣ又は前駆体は、樹立細胞系又は初代細胞培養など、培養での細胞増殖によって提供することができる。例には、ハイブリドーマ細胞系、Ｌ細胞、及びＭＲＣ−５などのヒト線維芽細胞が含まれる。本発明で用いるための好ましい細胞系には、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈ９、ＣＥＭ、及びＥＬ４Ｔ細胞；ヒトＨＡ１．７又はマウスＤ１０細胞などの長期Ｔ細胞クローン；ＤＯ１１．１０細胞などのＴ細胞ハイブリドーマ；Ｕ９３７又はＴＨＰ１細胞などのマクロファージ様細胞；ＥＢＶ形質転換細胞などのＢ細胞系、たとえばＲａｊｉ、Ａ２０、及びＭ１細胞などが含まれる。
【０２５５】
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの手段によって単離／調製することができ、たとえば樹状細胞は、末梢血から直接精製する、或いはたとえばＧＭ−ＣＳＦによる処理によって末梢血に移行した後にＣＤ３４＋前駆体細胞から、又は骨髄から直接生じることができる。末梢血からの接着前駆体はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（Ｉｎａｂａ等）、或いは骨髄からの非接着ＣＤ３４＋細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αで処理することができる（Ｃａｕｘ等）。ＤＣは、精製末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、接着細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で２時間処理するＳａｌｌｕｓｔｏ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９９４）１７９（４）１１０９〜１８の方法と同様に、ヒト志願者の末梢血から慣例的に調製することもできる。必要に応じて、これらは磁気ビーズを用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞、及びＣＤ３＋、ＣＤ２＋Ｔ細胞を除去することができる（Ｃｏｆｆｉｎ等）。培養条件には、維持するためのＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−４などの他のサイトカイン、或いは樹状細胞又は他の抗原提示細胞の活性を含むことができる。
【０２５６】
本発明で用いるためのＴ細胞及びＢ細胞は、好ましくは、リンパ腫又は白血病細胞系などの細胞系、Ｔ細胞ハイブリドーマ又はＢ細胞ハイブリドーマから得られるが、免疫系の疾患を罹患している個体、又は移植手術のレシピエントから、或いは血縁又は非血縁ドナー個体から単離することもできる。Ｔ細胞及びＢ細胞は、血液又は他の供給源（リンパ節、脾臓、又は骨髄など）から得ることができ、標準的な手順で濃縮又は精製することができる。或いは、Ｔ細胞及び他の細胞型の供給源として、全血、或いは白血球濃縮血又は精製白血球を用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）の使用が特に好ましい。或いは、ＣＤ８＋細胞などの他のＴ細胞を用いることができる。
【０２５７】
本発明で用いる候補モジュレーターは、上述の免疫系の細胞と接触させる。さらなる段階において、候補モジュレーターによるＮｏｔｃｈシグナリングの調節を検出する。Ｎｏｔｃｈシグナリングの調節を検出するためのアッセイは以下に記載する。これらのアッセイの多くは、「標的細胞」の発現をモニターすることを含む。
【０２５８】
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の内因性標的細胞には、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｈｅｓファミリーの遺伝子（特にＨｅｓ−１）、エンハンサーオブスプリット［Ｅ（ｓｐｌ）］複合体遺伝子、Ｉｌ−１０、ＣＤ−２３、Ｄｌｘ−１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ−４、Ｄｌｌ−１、Ｎｕｍｂ、Ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、及びＤｓｈが含まれる。その発現がＮｏｔｃｈ活性化によって調節されるすべての遺伝子を、本発明の目的のために用いることができるが、好ましい内因性標的遺伝子を以下に記載する。
【０２５９】
細胞内ドッキングタンパク質であるＤｅｌｔｅｘはＳｕ（Ｈ）を置換し、図１に示した通り、Ｎｏｔｃｈの細胞内尾部との相互作用の部位を残す。Ｄｅｌｔｅｘは、ジンクフィンガーを含有する細胞質タンパク質である（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｍａｓ、Ｏｓｂｏｒｎｅ）。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインのアンキリンリピートと相互作用する。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｇｒｂ２と相互作用し、Ｒａｓ−ＪＮＫシグナリング経路を調節することによって、Ｎｏｔｃｈ経路の活性化を促進することが研究で示されている（Ｍａｔｓｕｎｏ）。Ｄｅｌｔｅｘは、Ｓｕ（Ｈ）がＮｏｔｃｈの細胞内尾部と結合するのを妨げるドッキングタンパク質としても作用する（Ｍａｔｓｕｎｏ）。したがって、Ｓｕ（Ｈ）は核に放出され、そこで転写モジュレーターとして作用する。最近の証拠はさらに、脊椎動物Ｂ細胞系において、Ｓｕ（Ｈ）相同体ＣＢＦ１ではなくＤｅｌｔｅｘが、Ｅ４７機能阻害の原因であることを示唆している（Ｏｒｄｅｎｔｌｉｃｈ）。Ｄｅｌｔｅｘの発現は、正のフィードバックループのＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｄｅｌｔｅｘ（ＤＴＸ１）ｍＲＮＡの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５３７００に見出すことができる。
【０２６０】
Ｈｅｓ−１（スプリット−１のヘアリーエンハンサー）（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ）は、塩基性へリックス−ループ−へリックス構造を有する転写因子である。Ｈｅｓ−１は、ＣＤ４サイレンサーの重要な機能部位に結合し、ＣＤ４遺伝子発現の抑制をもたらす。したがって、Ｈｅｓ−１は、Ｔ細胞の運命決定に強く関与する。Ｈｅｓファミリーの他の遺伝子には、その発現もＮｏｔｃｈ活性化によってアップレギュレートされるＨｅｓ−５（哺乳動物スプリットのエンハンサー相同体）、及びＨｅｓ−３が含まれる。Ｈｅｓ−１の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ヒトＨｅｓ−１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０００４１５及びＡＦ２６４７８５に見出すことができる。
【０２６１】
Ｅ（ｓｐｌ）遺伝子複合体［Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ］（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ）は７つの遺伝子を含み、Ｅ（ｓｐｌ）及びＧｒｏｕｃｈｏのみが、変異時に可視的表現型を示す。Ｅ（ｓｐｌ）は、Ｓｐｌｉｔ突然変異を増強する能力にちなんで命名されたものであり、ＳｐｌｉｔはＮｏｔｃｈの別名である。実際、Ｅ（ｓｐｌ）−Ｃ遺伝子は、ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ複合体遺伝子の発現を調節することによって、Ｄｅｌｔａを抑制する。Ｅ（ｓｐｌ）の発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。
【０２６２】
ＩＬ−１０（インターロイキン−１０）はＴｈ２ヘルパーＴ細胞によって産生された因子である。マスト細胞の増殖の補調節因子であり、エプスタイン−バーｂｃｒｆｉ遺伝子と広範な相同性を示す。ＩＬ−１０がＮｏｔｃｈシグナリング経路の直接下流標的であるかどうかは既知でないが、その発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化と同時に強くアップレギュレートされることが認められている。ＩＬ−１０のｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＧＩ１０４１８１２に見出すことができる。
【０２６３】
ＣＤ−２３は、Ｂ細胞活性化及び増殖の鍵分子である、ヒト白血球分化抗原ＣＤ２３（ＦＣＥ２）である。これはＩｇＥの低親和性受容体である。さらに、短縮型分子が分泌され、有効なマイトジェン増殖因子として機能し得る。ＣＤ−２３がＮｏｔｃｈシグナリング経路の直接顆粒標的であるとは思われないが、その発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化と同時に強くアップレギュレートされることが認められている。ＣＤ−２３の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＧＩ１７８３３４４に見出すことができる。
【０２６４】
Ｄｌｘ−１（ディスタルレス（ｄｉｓｔａｌｌｅｓｓ）−１）発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。Ｄｌｘの配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５１０００−３に見出すことができる。
【０２６５】
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球活性化タンパク質４）は、Ｔ細胞の表面に見出される補助分子であり、アレルゲン吸入後の気道炎症細胞漸増の調節及びＴヘルパー細胞分化に役割を果たすと考えられている。ＣＴＬＡ４をコードしている遺伝子のプロモーター領域は、ＣＢＦ１応答因子を有し、その発現はＮｏｔｃｈ活性化の結果としてアップレギュレートされる。ＣＴＬＡ４の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６に見出すことができる。
【０２６６】
ＣＤ−４発現は、Ｎｏｔｃｈ活性化の結果としてダウンレギュレートされる。ＣＤ−４抗原の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ００６９６６に見出すことができる。
【０２６７】
アッセイ
１個又は複数の標的細胞の発現をモニターするためのアッセイ、及びＮｏｔｃｈシグナリングの調節を検出する他の方法を以下に記載する。
【０２６８】
本発明のアッセイは、候補モジュレーターによる、免疫系の細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングの阻害又は増強を検出するために提供される。この方法は、必要に応じて合成レポーター遺伝子で形質転換又はトランスフェクトなどを行った免疫系の細胞を、適切な緩衝液中、充分な量の候補モジュレーターと混合し、Ｎｏｔｃｈシグナリングをモニターすることを含む。モジュレーターは、上述のとおり、低分子、タンパク質、抗体、又は他のリガンドであることができる。標的遺伝子の量又は活性は（上述）、標準的なアッセイ技法及び適切なコントロールを用いて、試験される各化合物に関して測定される。好ましくは、検出されたシグナルを参照シグナルと比較し、参照シグナルに対する任意の調節を測定する。
【０２６９】
アッセイは、Ｎｏｔｃｈシグナルを回復することのできる化合物を同定するために、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の既知のアンタゴニストの存在下で行うこともできる。
【０２７０】
任意の１個又は複数の適切な標的、たとえばアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列などは、様々な薬剤スクリーニング技法のいずれかの技法で、免疫系細胞のＮｏｔｃｈシグナリング経路を調節することのできる化合物を同定するために用いることができる。そのような試験に用いられる標的は、溶液に遊離しているか、固体支持体に付着しているか、細胞表面に支持されているか、又は細胞内に位置していることができる。本発明のアッセイは細胞をベースとするアッセイである。
【０２７１】
本発明のアッセイは、それによっていくつかの因子が試験されるスクリーニングであることができる。一態様において、本発明のアッセイ法は、ハイスループットスクリーニングである。
【０２７２】
薬剤スクリーニングの技法は、Ｇｅｙｓｅｎ、１９８４年９月１３日公開の欧州特許第０１３８８５５号に記載の方法に基づくことができる。要約すれば、多数の異なる低分子ペプチド候補モジュレーターを、プラスチックピン又はいくつかの他の表面などの固体基板に合成する。ペプチド試験化合物を、適切な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、たとえば当分野でよく知られている適切に適応させた方法などによって、結合した実体を検出する。精製された標的は、薬剤スクリーニング技法に用いるために、プレートに直接被覆することもできる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に用いるプレートは、好ましくは９６３８４、又は３８４を超えるウェル／プレートを有する、マルチウェルプレートである。細胞は「芝生」のように広げることもできる。或いは、ペプチドを捕獲し、それを固体支持体に固定するために、非中和抗体を用いることもできる。合成化合物に関して上に述べたハイスループットスクリーニングは、有機候補モジュレーターを同定するために用いることもできる。
【０２７３】
本発明はさらに、標的を特異的に結合することのできる中和抗体が、標的への結合に関して試験化合物と競合する、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用を企図する。
【０２７４】
本発明のアッセイ方法は、試験化合物の小規模及び大規模スクリーニング、並びに定量アッセイに適していることが予期される。
【０２７５】
種々の核酸アッセイもまた知られている。知られている、又は後に開示される任意の通常の技法を用いることができる。適切な核酸アッセイの例を以下に述べるが、増幅、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ブロット法、スペクトロメトリ、レポーター遺伝子アッセイ、遺伝子チップアレイ、及び他のハイブリダイゼーション法が含まれる。
【０２７６】
標的遺伝子の存在、増幅、及び／又は発現は、適切に標識されたプローブを用いて、たとえば通常のサザンブロット法、標的ｍＲＮＡの転写を定量するノザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって直接試料中で測定することができる。当分野の技術者は、所望であれば、これらの方法をどのように変更できるか容易に想定できるであろう。
【０２７７】
試料からの分析用核酸の生成は、一般に核酸の増幅を必要とする。多くの増幅方法は、酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、又は自律配列複製など）、或いはそれがクローン化されたベクターのすべて又は一部の複製に依存する。好ましくは、本発明による増幅は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応によって示されるような指数的増幅である。
【０２７８】
多くの標的及びシグナル増幅法は、文献に記載されており、たとえばこれらの方法の全般的な概説は、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  Ｕ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２２９〜２３７（１９８８）、及びＬｅｗｉｓ  Ｒ．、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １０：１、５４〜５５（１９９０）に記載されている。これらの増幅法は本発明の方法に用いることができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕ、リガーゼ増幅反応（ＬＡＲ）、リガーゼハイブリダイゼーション、Ｑベータバクテリオファージレプリカーゼ、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ）、転写産物配列によるゲノム増幅（ＧＡＷＴＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。種々の増幅技法での使用に適したプライマーは、当分野で知られている方法によって調製できる。
【０２７９】
ＰＣＲは、特に米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号に記載されている核酸増幅法である。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ産生プライマー伸長反応の繰り返しサイクルからなる。ＰＣＲは当初、不純試料からＤＮＡを増幅する手段として開発された。この技法は、反応溶液を繰り返し加熱及び冷却し、プライマーを標的配列にアニーリングさせ、重複娘鎖の形成のためにそれらのプライマーを伸長する温度サイクルに基づく。ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写酵素によって第１のｃＤＮＡ鎖を産生するためにＲＮＡ鋳型を用いる。次いで、このｃＤＮＡを標準的なＰＣＲプロトコルに従って増幅する。合成及び変性の反復サイクルによって、産生される標的ＤＮＡのコピー数が指数的に増加する。しかしながら、反応成分が限界となるにつれ、プラトーに達し、ＰＣＲ産物の純増加がほとんど又はまったくなくなるまで、増幅の速度は減少する。核酸標的の開始コピー数が大きいほど、この「エンドポイント」に早く到達する。ＰＣＲは、診断において、任意の知られている核酸を増幅するために用いることができる（Ｍｏｋ等（１９９４）Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、５２：２４７〜２５２）。
【０２８０】
自律配列複製（３ＳＲ）はＴＡＳの変形であり、酵素カクテル及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーによって媒介される逆転写酵素（ＲＴ）、ポリメラーゼ、及びヌクレアーゼ活性の順次巡回による核酸鋳型の等温増幅を含む（Ｇｕａｔｅｌｌｉ等（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４）。熱変性の代わりに、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖のＲＮＡの酵素的分解が用いられる。ＲＮａｓｅＨ及び他のすべての酵素が反応に添加され、すべての段階は、さらなる試薬を加えることなく同じ温度で起こる。このプロセスに続いて、４２℃１時間で、１０６から１０９の増幅が達成された。
【０２８１】
ライゲーション増幅反応又はライゲーション増幅システムは、ＤＮＡリガーゼ、及び４つ、標的鎖当たり２個のオリゴヌクレオチドを用いる。この技法は、Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．及びＷａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０に記載されている。オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ上の隣接配列にハイブリダイズし、リガーゼによって結合される。この反応は熱変性され、サイクルが繰り返される。
【０２８２】
別の増幅技術を本発明に利用することができる。たとえば、ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄｉ等（１９９８）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：２２５）は、市販され利用可能な増幅技術であり（ＲＣＡＴ（商標））、これはＤＮＡポリメラーゼによって駆動され、等温条件下で線形又は幾何学的動態で環状オリゴヌクレオチドプローブを複製できる。
【０２８３】
２個の適切に設計されたプライマーの存在下では、ＤＮＡ鎖置換及びハイパーブランチングによって幾何学的増幅が起こり、１時間で各サークルの１０１２以上のコピーが産生される。
【０２８４】
単一プライマーが用いられる場合、ＲＣＡＴは、その標的に共有結合した、数千の縦列に結合した標的のＤＮＡコピーの線状鎖を数分で産生する。
【０２８５】
さらなる技法、鎖置換増幅（ＳＤＡ；Ｗａｌｋｅｒ等（１９９２）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８０：３９２）は、特定の標的に固有の特に定義された配列から始まる。しかしながら、熱サイクルに依存する他の技法と異なり、ＳＤＡは、一連のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び制限酵素を利用して、固有の核酸配列を指数的に増幅する等温プロセスである。
【０２８６】
ＳＤＡは、標的産生相及び指数的増幅相の両方を含む。
【０２８７】
標的産生において、２本鎖ＤＮＡは熱変性され、２個の１本鎖コピーを生じる。一連の特別に製造されたプライマーはＤＮＡポリメラーゼと結合し（その塩基配列をコピーするための増幅プライマー、及び新しく作られた鎖を置換するためのバンパープライマー）、指数的増幅を行うことのできる改変標的を形成する。
【０２８８】
指数的増幅プロセスは、標的産生相の改変標的から始まる（制限酵素認識部位を有する１本鎖部分ＤＮＡ鎖）。
【０２８９】
増幅プライマーは、相補ＤＮＡ配列において各鎖に結合される。次いで、ＤＮＡポリメラーゼはこのプライマーを用いて、個々のヌクレオチドを添加するための鋳型として改変標的を用い、その３’末端からプライマーを伸長する位置を同定する。このように伸長プライマーは、各末端に完全制限酵素認識部位を含有する２本鎖ＤＮＡセグメントを形成する。
【０２９０】
次いで、制限酵素は、その認識部位において２本鎖ＤＮＡセグメントに結合される。制限酵素は、両面セグメントの１個の鎖のみを開裂した後に認識部位から解離し、ニックを形成する。ＤＮＡポリメラーゼはニックを認識し、この部位から鎖を伸長し、前に作られた鎖を置き換える。このように認識部位は、標的セグメントを含有するＤＮＡ鎖の連続置換により、制限酵素及びＤＮＡポリメラーゼによって繰り返しニッキングされ、復元される。
【０２９１】
その後、各置換鎖は、上述の増幅プライマーを用いてアニールするために利用可能である。このプロセスは、繰り返しニッキング、伸長、新しいＤＮＡ鎖の置換を続け、元のＤＮＡ標的の指数的増幅をもたらす。
【０２９２】
他の実施形態において、本発明は、ＲＮＡレベルでの遺伝子発現の検出を提供する。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる典型的なアッセイ形式には、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＲＮａｓｅプロテクションアッセイが含まれる（Ｍｅｌｔｏｎ等、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）。用いることのできる検出方法には、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、及び他の適切な標識が含まれる。
【０２９３】
リアルタイムＰＣＲは、蛍光タグ又は蛍光色素によって標識されたプローブを用い、さらに定数のサイクル後に産物の蓄積を測定するのではなく、蓄積時にＰＣＲ産物を検出するために用いられるという点で、定量アッセイのエンドポイントＰＣＲとは異なる。この反応は、サイクル中の時点で標的配列の増幅が蛍光の著しい増加によって最初に検出されることを特徴とする。
【０２９４】
リボヌクレアーゼ保護（ＲＮアーゼ保護）アッセイは、溶液中の特定のＲＮＡを定量するための極めて感度の高い技法である。リボヌクレアーゼ保護アッセイは、総細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ）選択ｍＲＮＡを標的として行うことができる。リボヌクレアーゼ保護アッセイの感度は、高比放射能に放射性標識された相補in vitro転写プローブの使用に由来する。このプローブ及び標的ＲＮＡを溶液中でハイブリダイズし、その後、混合物を希釈し、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）で処理して、残存するすべての１本鎖ＲＮＡを分解する。プローブのハイブリダイズされた部分は消化から保護され、変性ポリアクリルアミドゲル上での混合物の電気泳動、それに続くオートラジオグラフィによって視覚化することができる。保護断片は高分解能ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析されるので、リボヌクレアーゼ保護アッセイは、ｍＲＮＡの特徴を正確にマッピングするために用いることができる。プローブが標的ＲＮＡに対してモル過剰にハイブリダイズされる場合、生じるシグナルは試料中の相補ＲＮＡの量に正比例する。
【０２９５】
たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、１４節に記載されているように、ＰＣＲ技術は、標的核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドを選択するための方法を以下に記載する。
【０２９６】
本明細書では、プローブは、たとえば同数又はより多数の隣接塩基と同一（又は相補体）である１０から５０、好ましくは１５から３０、もっとも好ましくは少なくとも約２０の隣接塩基を含むヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。プローブとして選択された核酸配列は、偽陽性の結果が最小限となるように、充分な長さであり、充分に明確であるべきである。このヌクレオチド配列は一般に、保存された、又は高度に相同性のヌクレオチド配列又はポリペプチドの領域に基づいている。プローブとして用いられる核酸は、１個又は複数の位置で縮重していることができる。
【０２９７】
プローブが構築される好ましい領域には、５’及び／又は３’コード配列、リガンド結合部位をコードすることが予測される配列などが含まれる。たとえば、本明細書に開示の完全長ｃＤＮＡクローン又はその断片をプローブとして用いることができる。好ましくは、本発明の核酸プローブは、ハイブリダイゼーション時に容易に検出される適切な標識手段で標識される。たとえば、適切な標識手段は、放射性標識である。ＤＮＡ断片を標識する好ましい方法は、当分野でよく知られているように、ランダムプライミング反応において、３２ＰｄＡＴＰをＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と組み合わせることによるものである。オリゴヌクレオチドは一般に、３２Ｐ標識化ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼで末端標識される。しかしながら、断片又はオリゴヌクレオチドを標識するために、他の方法（たとえば非放射性）も用いることができ、たとえば酵素標識、適切な蛍光団による蛍光標識、及びビオチン標識を含む。
【０２９８】
好ましくは、そのような配列は高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズするプローブである。
【０２９９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。そのような条件は、当分野の技術者には明白である。当分野の技術者に知られているように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映され、配列相同性が１％低下するごとに約１から１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度と温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、高いストリンジェンシー条件下で行い、その後、種々のストリンジェンシーの洗浄を行う。
【０３００】
本明細書では、高ストリンジェンシーは、６５〜６８℃、１Ｍ  Ｎａ＋で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。高ストリンジェンシー条件は、たとえば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．１Ｎａ＋ピロリン酸、及び非特異的競合体として０．１ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含有する水溶液でのハイブリダイゼーションによって提供され得る。ハイブリダイゼーションに続いて、数段階の高ストリンジェンシー洗浄を行い、最終洗浄（約３０分）はハイブリダイゼーション温度、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで行うことができる。
【０３０１】
これらの条件は、種々の緩衝液、たとえばホルムアミドをベースとする緩衝液、及び温度を用いて、適合及び再現できることが理解される。デンハルト溶液及びＳＳＣは当分野の技術者によく知られており、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液も同様である（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ等編、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、又はＡｕｓｕｂｅｌ等編、（１９９０）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）。ハイブリダイズ対の長さ及びＧＣ含量も影響を与えるので、最適なハイブリダイゼーション条件は実験的に求められなければならない。
【０３０２】
遺伝子発現は、レポーター系を用いて検出することもできる。そのようなレポーター系は、たとえばモニターされている遺伝子など、発現系の制御下で容易に同定可能なマーカーを含むことができる。ＦＡＣＳによって検出し、選別することのできる蛍光マーカーが好ましい。特に好ましくは、ＧＦＰ及びルシフェラーゼである。他の種類の好ましいレポーターは、細胞表面マーカーであり、すなわち細胞表面に発現し、容易に同定可能なタンパク質である。したがって、細胞に基づくスクリーニングアッセイは、レポータータンパク質、すなわち容易にアッセイ可能なタンパク質、たとえばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、又はルシフェラーゼなどの発現がＮｏｔｃｈの活性化に依存する細胞系を構築することによって設計できる。たとえば、上述の１個のポリペプチドをコードするレポーター遺伝子は、Ｎｏｔｃｈシグナリングによって特異的に活性化される応答因子の制御下に置くことができる。別のアッセイ形式には、生体系における応答を直接評価するアッセイが含まれる。細胞に基づくアッセイ系が用いられる場合、同定された試験化合物は、その後、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路への影響を求めるためにin vivo試験に供することができる。
【０３０３】
一般に、レポーター遺伝子の発現によってＮｏｔｃｈシグナリングを検出するために有用なレポーターコンストラクトは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）の一般的な教示に従って構築することができる。典型的に、本発明によるコンストラクトは、対象となる遺伝子（すなわち、内因性標的遺伝子）によるプロモーター、及びたとえばＧＦＰ又はルシフェラーゼなどの、所望のレポーターコンストラクトをコードしているコード配列を含む。ＧＦＰ及びルシフェラーゼをコードしているベクターは、当分野で知られており、市販され入手可能である。
【０３０４】
遺伝子の発現の検出に基づく細胞の選別は、上に例示したように、当分野で知られている任意の技法によって行うことができる。たとえば、細胞はフローサイトメトリ又はＦＡＣＳによって選別することができる。全般的な参考文献として、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）Ａ．Ｒａｄｂｒｕｃｈ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。
【０３０５】
フローサイトメトリは、細胞を研究及び精製するための強力な方法である。フローサイトメトリは、特に免疫学及び細胞生物学において広範な適用が見出されているが、ＦＡＣＳの能力は生物学の他の多くの分野に適用することができる。頭字語ＦＡＣＳは、蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）を表し、「フローサイトメトリ」と互換的に用いられる。細い流体に保持された個々の細胞が１個又は複数のレーザービームを通過し、それによって光が散乱し、蛍光色素が様々な周波数で光を放射することがＦＡＣＳの原理である。光電子増倍管（ＰＭＴ）が光を電気信号に変換し、それをソフトウエアで解釈して細胞に関するデータを生じる。明確な特徴を有する細胞の亜集団を同定し、非常に高い純度で（〜１００％）懸濁液から自動的に選別することができる。
【０３０６】
ＦＡＣＳは、ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の標的遺伝子発現を測定するために用いることができる。これは、タンパク質産物の標識化によって直接、又はコンストラクトのレポーター遺伝子を用いて間接的に達成することができる。レポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。β−ガラクトシダーゼの活性は、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）などの蛍光性基質を用いて、ＦＡＣＳによって検出することができる。ＦＤＧは低張ショックによって細胞に導入され、酵素で開裂されて蛍光産物を生じ、蛍光産物は細胞内に捕獲される。したがって、１個の酵素が多量の蛍光産物を生じることができる。ＧＦＰコンストラクトを発現する細胞は、基質の添加なしに蛍光を発する。異なる励起周波数を有するが、同じチャンネルで蛍光を発するＧＦＰの変異体が利用可能である。２レーザーＦＡＣＳ装置において、異なるレーザーで励起される細胞を識別することができ、したがって２個のトランスフェクションを同時にアッセイできる。
【０３０７】
細胞を選別する別の手段も用いることができる。たとえば、本発明は、ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブの使用を含む。そのようなプローブは、後に手動又はＦＡＣＳ選別法を用いて選別できるように、個々にポリペプチドを発現する細胞を同定するために用いることができる。ｍＲＮＡに相補的な核酸プローブは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）によって記載されている一般的な手順を用い、上述の教示に従って調製することができる。
【０３０８】
好ましい実施形態において、本発明は、ＦＡＣＳ細胞選別で用いることのできる蛍光団にコンジュゲートした、標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子の使用を含む。
【０３０９】
いわゆる遺伝子チップアレイ又は高密度ＤＮＡアレイを用いて、遺伝子発現及び同一性に関する情報を得るための方法も記載されている（Ｃｈｅｅ）。これらの高密度アレイは、特に診断及び予後に有用である。in vivo発現技術（ＩＶＥＴ）を用いることもできる（Ｃａｍｉｌｌｉ）。ＩＶＥＴは、実験室培養と比較したときに、たとえば治療又は疾患中にアップレギュレートされた標的遺伝子を同定する。
【０３１０】
本発明はさらに、ポリペプチドを検出する方法を提供する。タンパク質アッセイを用いる利点は、Ｎｏｔｃｈ活性化を直接測定できることである。ポリペプチドのレベルを求めるために用いることのできるアッセイ技法は、当分野の技術者によく知られている。そのようなアッセイ方法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、タンパク質ゲルアッセイ、ウエスタンブロット分析、抗体サンドイッチアッセイ、抗体検出、ＦＡＣＳ、及びＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。たとえば、ポリペプチドは、タンパク質ゲル上の示差移動性、又は質量分析などの他のサイズ分析技法によって検出することができる。検出手段は、配列特異的であることができる。たとえば、in vivo又はin vitroでポリペプチドを特異的に認識するポリペプチド又はＲＮＡ分子を開発できる。
【０３１１】
たとえば、ＲＮＡアプタマーは、ＳＥＬＥＸによって作製することができる。ＳＥＬＥＸは、標的分子に高い特異性で結合する核酸分子のin vitro進化のための方法である。これは、たとえば、米国特許第５６５４１５１号、第５５０３９７８号、第５５６７５８８号、及び第５２７０１６３号、並びにＰＣＴ公開ＷＯ９６／３８５７９に記載されている。
【０３１２】
本発明は、いくつかの実施形態において、特異的にポリペプチドを認識及び結合する抗体を含む。
【０３１３】
抗体は、免疫された動物の血清から回収することができる。モノクローナル抗体は、免疫された動物由来の細胞から通常の方法で調製することができる。
【０３１４】
本発明の抗体は、モニターされている遺伝子を発現する細胞を同定するのに有用である。
【０３１５】
本発明による抗体は、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体などの自然種の全抗体であることができるが、好ましくはＩｇＧ抗体である。さらに本発明は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳｃＦｖなどの抗体断片を含む。Ｆｖ及びＳｃＦｖなどの小さい断片は、その小さいサイズ、及び結果として生じる優れた組織分布のために、診断及び治療適用例に有利な特性を有する。
【０３１６】
抗体は、標識を含むことができる。特に好ましくは、in vivo神経系細胞において抗体の画像化を可能にする標識である。そのような標識は、組織内で容易に視覚化できる金属粒子などの放射性標識又はＸ線不透明標識であることができる。さらに、そのような標識は、組織内で視覚化でき、細胞選別に用いることのできる、蛍光標識又は他の標識であることができる。
【０３１７】
より詳細には、本明細書では、抗体は、標識などのエフェクタータンパク質を含む改変抗体であることができる。特に好ましくは、in vivoでの抗体分布の画像化を可能にする標識である。そのような標識は、患者の体内で容易に視覚化できる金属粒子などの放射性標識又はＸ線不透明標識であることができる。さらに、そのような標識は、組織上で視覚化できる、蛍光標識又は他の標識であることができる。
【０３１８】
本明細書に記載の抗体は、細胞培養で産生することができる。細菌、又は好ましくは哺乳動物細胞培養において、確立された手順に従って、組換えＤＮＡ技術を用いて抗体を産生することができる。抗体産物は非分泌細胞から単離することができるが、選択された細胞培養系は、場合によって抗体産物を分泌する。
【０３１９】
in vitroでのハイブリドーマ細胞又は哺乳動物宿主細胞の増殖は、適切な培地で行われ、この培地は通常の標準培地、たとえば、任意選択で哺乳動物血清、たとえばウシ胎児血清、又は微量元素及び増殖維持補助剤、たとえば正常マウス腹腔滲出細胞などの支持細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インスリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸などで補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ１６４０培地である。細菌細胞又は酵母細胞である宿主細胞の増殖は、同様に当分野で知られている適切な培地で行われ、たとえば、細菌の場合、培地ＬＢ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２×ＹＴ、又はＭ９最小培地、酵母の場合、培地ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、最小培地、又は完全最小ドロップアウト培地で行われる。
【０３２０】
in vitro産生は比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の所望の抗体を得るためのスケールアップを可能にする。細菌細胞、酵母、又は哺乳動物細胞を培養するための技法は当分野で知られており、たとえばエアリフト反応器、又は連続攪拌反応器中での均一浮遊培養、或いは、たとえば中空糸、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ、又はセラミックカートリッジ上での固定化又は捕捉細胞培養が含まれる。
【０３２１】
大量の所望の抗体は、in vivoで哺乳動物細胞を増殖することによっても得ることができる。この目的のために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を組織適合性哺乳動物に注射して、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こす。任意選択で、注射の前に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）などの鉱油で動物をプライミングする。１から３週後、それらの哺乳動物の体液から抗体を単離する。たとえば、適切な骨髄腫細胞とＢａｌｂ／ｃマウス由来の抗体産生脾臓細胞との融合によって得られたハイブリドーマ細胞、又は所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系Ｓｐ２／０由来のトランスフェクト細胞を、任意選択でプリスタンによって前処理されたＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射し、１から２週後、動物から腹水液を採取する。
【０３２２】
前述及び他の技法は、たとえば、参照により本明細書の一部とするＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５〜４９７、米国特許第４３７６１１０号、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに記載されている。組換え抗体分子を調製する技法は、上記の参考文献、さらにたとえば、参照により本明細書の一部とするＥＰ０６２３６７９、ＥＰ０３６８６８４、及びＥＰ０４３６５９７に記載されている。
【０３２３】
細胞培養上清を、選択的に酵素イムノアッセイ、たとえばサンドイッチアッセイ又はドットアッセイ、或いはラジオイムノアッセイによって、所望の抗体に関してスクリーニングする。
【０３２４】
抗体を単離するために、培養上清又は腹水液中の免疫グロブリンを、たとえば硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性材料に対する透析、選択膜による濾過などによって濃縮することができる。必要且つ／又は所望であれば、通常のクロマトグラフィ法、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィ、及び／又は（免疫）アフィニティクロマトグラフィ、たとえば標的抗原又はプロテインＡによるアフィニティクロマトグラフィによって抗体を精製する。
【０３２５】
抗体は、好ましくは、抗体を検出するための手段と共に提供され、それらの手段は、酵素、蛍光、放射性同位体、又は他の手段であることができる。抗体及び検出手段は、キットにおいて、同時、同時個別、又は順次使用のために提供することができる。
【０３２６】
本発明の抗体は、当分野で知られている任意の方法によって、免疫特異的結合に関してアッセイされる。用いることのできるイムノアッセイには、これに限定されるのもではないが、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイを用いる競合及び非競合アッセイ系が含まれる。そのようなアッセイは当分野において慣例の手順である（たとえば、その全体を参照により本明細書の一部とするＡｕｓｕｂｅｌ等編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。代表的なイムノアッセイを以下に簡単に記載する。
【０３２７】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（たとえばＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０又はＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム  ｐＨ７．２、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）などの溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解する段階、対象となる抗体を細胞溶解産物に添加する段階、ある時間（たとえば１〜４時間）４℃でインキュベートする段階、プロテインＡ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解産物に添加する段階、約１時間以上４℃でインキュベートする段階、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する段階、及びＳＤＳ／試料緩衝液にビーズを再懸濁する段階を含む。対象となる抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、たとえばウエスタンブロット分析によって評価することができる。
【０３２８】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料を調製する段階、ポリアクリルアミドゲル（たとえば抗原の分子量に依存する８〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でのタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルのタンパク質試料を、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、又はナイロンなどの膜に移す段階、ブロッキング溶液（たとえば３％ＢＳＡ又は無脂肪乳を含むＰＢＳ）で膜をブロッキングする段階、膜を洗浄緩衝液（たとえばＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄する段階、膜をブロッキング緩衝液に希釈した１次抗体（対象となる抗体）に暴露する段階、膜を洗浄緩衝液で洗浄する段階、ブロッキング緩衝液に希釈した放射性分子（たとえば３２Ｐ又は１２５Ｉ）又は酵素基質（たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）とコンジュゲートした２次抗体（１次抗体、たとえば抗ヒト抗体を認識する）に膜を暴露する段階、洗浄緩衝液で膜を洗浄する段階、及び抗原の存在を検出する段階を含む。
【０３２９】
ＥＬＩＳＡは、一般に、抗原を調製する段階、９６ウェルマイクロタイタプレートのウェルを抗原で被覆する段階、酵素基質（たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）などの検出可能化合物とコンジュゲートした対象となる抗体をウェルに添加し、ある時間インキュベートする段階、及び抗原の存在を検出する段階を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、対象となる抗体は、必ずしも検出可能化合物とコンジュゲートしている必要はなく、代わりに、検出可能化合物とコンジュゲートした２次抗体（対象となる抗体を認識する）をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原で被覆する代わりに、抗体をウェルに被覆させることができる。この場合、対象となる抗原を被覆ウェルに添加した後、検出可能化合物にコンジュゲートした２次抗体を添加することができる。
【０３３０】
アッセイを行うとき、特に反応物が可溶であるとき、１個以上の反応物を固定するのが好都合である。本発明の場合、任意の１個以上の候補モジュレーター、Ｎｏｔｃｈリガンド、免疫細胞活性化剤、又は免疫細胞共刺激剤を固定するのが好都合である可能性がある。固定化のアプローチには、たとえばアミン結合、表面チオール結合、リガンドチオール結合、及びアルデヒド結合などを用いる共有固定化、固定化捕捉分子に対するリガンドの高親和性結合に依存する高親和性捕捉が含まれる。捕捉分子の例には、ストレプトアビジン、抗マウスＩｇ抗体、リガンド特異的抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、及びタグ特異的捕捉が含まれる。一実施形態において、固定化は、支持体、特に好ましくはビーズの形態である粒状支持体との結合によって達成される。
【０３３１】
臨床適用例に用いる寛容化Ｔ細胞のモニター又は検出を含むアッセイの場合、このアッセイは一般に、細胞内ドメインの開裂から生じるシグナルを検出する段階に先立って、患者から試料を摘出することを含む。
【０３３２】
本発明はさらに、Ｎｏｔｃｈシグナリングの候補モジュレーターをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、緩衝液中で適切な量のＮｏｔｃｈを混合する段階であって、Ｎｏｔｃｈの開裂をモニターするための検出手段によってＮｏｔｃｈが適切に標識されている段階、及び候補リガンドの試料、及びＮｏｔｃｈの任意の開裂をモニターする段階を含む。
【０３３３】
本明細書では、「試料」という用語は、天然（たとえば生物又は他の標本）又は人工的に構築された集団、たとえば実験室で見出される且つ／又は混合され得る因子などに見出される無機、有機、又は生化学的分子の採取物を指す。生物試料は、有機体全体を指すこともできるが、より一般的には、その組織、細胞、又は構成部分（たとえばこれに限定されるものではないが、血液、粘液、唾液、及び尿を含む体液）のサブセットを指す。
【０３３４】
本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの新規なモジュレーターを検出する方法を提供する。同定されたモジュレーターは、治療剤として、すなわち治療適用例において用いることができる。
【０３３５】
治療
「治療」という用語には、治癒効果、緩和効果、及び予防効果が含まれる。治療は、ヒト又は動物における治療であることができる。
【０３３６】
本発明のアッセイ法によって同定されたモジュレーターは、免疫系の障害及び／又は状態を治療するために用いることができる。特に、この化合物は、Ｔ細胞媒介性疾患又は障害の治療に用いることができる。Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の影響を受ける状態の詳細な記載は、本出願人等のＷＯ９８／２０１４２、ＷＯ００／３６０８９、及びＷＯ／００１３５９９０に見出すことができる。
【０３３７】
Ｔ細胞によって媒介されるとみなすことのできる疾患又は感染状態には、これに限定されるものではないが、喘息、アレルギー、Ｔ細胞系の腫瘍誘発異常、並びにマラリア原虫種、ミクロフィラリア、蠕虫、ミコバクテリア、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、シュウドモナス、トキソプラスマ、エキノコックス、Ｂ型インフルエンザ、麻疹、Ｃ型肝炎、又はトキシカラに起因するものなどの感染症のいずれか１種又は複数が含まれる。したがって、Ｔ細胞によって媒介される、治療又は予防することのできる特定の状態には、多発性硬化症、関節リウマチ、及び糖尿病が含まれる。本発明はさらに、臓器移植又は骨髄移植に用いることができる。本発明はさらに、自己免疫障害などの免疫障害、又は同種移植拒絶などの移植拒絶の治療にも有用である。
【０３３８】
自己免疫障害の例は、器官特異疾患（甲状腺炎、膵島炎、多発性硬化症、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、精巣炎、肝炎、アディソン病、重症筋無力症など）から関節リウマチ又はエリテマトーデスなどの全身性疾患に及ぶ。他の障害には、アレルギー反応などの免疫過敏症が含まれる。
【０３３９】
より詳細には、器官特異自己免疫疾患には、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、いくつかの形態の貧血（再生不良性貧血、溶血性貧血）、自己免疫性肝炎、甲状腺炎、膵島炎、虹彩毛様体炎、強膜炎、ブドウ膜炎、精巣炎、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）が含まれる。
【０３４０】
全身性自己免疫疾患には、関節リウマチ、若年性関節炎、強皮症及び全身性硬化症、シェーグレン症候群、未分化結合組織症候群、抗リン脂質症候群、種々の形態の脈管炎（結節性多発性動脈炎、アレルギー性肉芽腫症及びアレルギー性肉芽腫性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病、過敏性血管炎、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、ベーチェット症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎、閉塞性血栓血管炎）、エリテマトーデス、リウマチ性多発性筋痛、本態性（混合型）クリオグロブリン血症、尋常性乾癬及び乾癬性関節炎、好酸球増加症を伴う又は伴わない広汎性筋膜炎、多発性筋炎及び他の特発性炎症性筋障害、再発性皮下脂肪組織炎、再発性多発性軟骨症、リンパ腫様肉芽腫症、結節性紅斑、強直性脊椎炎、ライター症候群、種々の形態の炎症性皮膚炎が含まれる。
【０３４１】
より広範な障害の一覧には、望ましくない免疫応答及び炎症、たとえば関節リウマチを含む関節炎、過敏症に伴う炎症、アレルギー性反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病及び他の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症に伴う炎症、動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再潅流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群又は他の心肺疾患、消化性潰瘍に伴う炎症、潰瘍性大腸炎及び他の胃腸管疾患、肝線維症、肝硬変又は他の肝疾患、甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の腎臓及び泌尿器疾患、耳炎又は他の耳鼻咽頭疾患、皮膚炎又は他の皮膚疾患、歯周病又は他の歯性疾患、精巣炎又は精巣・精巣上体炎、不妊症、精巣外傷又は他の免疫関連精巣疾患、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症及び他の免疫及び／又は炎症関連婦人科疾患、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、眼内炎症、たとえば網膜炎又は類嚢胞黄斑水腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、変性眼底疾患の免疫及び炎症性成分、眼外傷の炎症性成分、感染による眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経障害、たとえば緑内障濾過手術後の過剰瘢痕、眼球移植に対する免疫及び／又は炎症反応及び他の免疫及び炎症関連眼疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）又は他の任意の器官の免疫及び／又は炎症抑制が有益である自己免疫疾患又は状態又は障害に伴う炎症、パーキンソン病、パーキンソン病治療の合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連痴呆複合型ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シドナム舞踏病、アルツハイマー病及び他のＣＮＳの変性疾患、状態、又は障害、卒中の炎症性成分、ポリオ後症候群、精神障害の免疫及び炎症性成分、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ギランバレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、ＣＮＳ圧迫症又はＣＮＳ外傷又はＣＮＳ感染の炎症性成分、筋萎縮又は筋ジストロフィーの炎症性成分、並びに中枢神経系及び末梢神経系の免疫及び炎症関連疾患、状態、又は障害、外傷後炎症、敗血症性ショック、感染症、外科手術又は器官の炎症性合併症又は副作用、たとえばウイルスキャリアによる感染、又はＡＩＤＳに伴う炎症に起因する、体液及び／又は細胞性免疫応答を抑制又は阻害するため、単球又はリンパ球の量を低減することによって、たとえば白血病などの単球又は白血球増殖性疾患を治療又は改善するため、天然又は人工細胞、組織、及び器官、たとえば角膜、骨髄、器官、水晶体、ペースメーカー、天然又は人工皮膚組織などの移植の場合には移植片拒絶の予防及び／又は治療のための、遺伝子療法の炎症及び／又は免疫合併症及び副作用が含まれる。
【０３４２】
本発明はさらに、細胞においてＮｏｔｃｈ経路機能を変えることにより、細胞、組織、又は器官型の運命を変える方法において有用である。したがって、本発明の適用例は、悪性疾患及び新生物発生前疾患の治療における適用を有する。本発明は、腺癌、たとえば小細胞肺癌、並びに腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、及び乳房の癌に関して特に有用である。たとえば、本発明によって治療可能である悪性疾患には、急性及び慢性白血病、リンパ腫、メラノーマ、肉腫、たとえば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、中皮腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、絨毛癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、精上皮腫、胎生期癌、頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、及び網膜芽腫瘍などが含まれる。
【０３４３】
本発明はさらに、神経系障害の治療における適用を有することができる。本発明によって治療することのできる神経系障害には、身体的損傷に起因する外傷性病変を含む神経病変、虚血性病変、悪性病変、ＨＩＶ、帯状疱疹又は単純ヘルペスウイルス、ライム病、結核、或いは梅毒に起因する感染性病変、変性病変及び疾患、並びに脱髄性病変が含まれる。
【０３４４】
本発明は、たとえば、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺を含む）、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連ミエロパシー、横断性ミエロパシー又は種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、橋中央ミエリン溶解、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症、脳梗塞又は虚血、脊髄梗塞又は虚血、進行性脊髄性筋萎縮、進行性球麻痺、原発性側索硬化症、乳児及び若年性筋萎縮、小児期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンド症候群）、ポリオ及びポリオ後症候群、並びに遺伝性運動感覚性ニューロパシー（シャルコー−マリー−ツース病）の治療に用いることができる。
【０３４５】
本発明はさらに、組織再生及び修復の促進に有用である可能性がある。したがって、本発明はさらに、欠損組織修復及び再生に関連する疾患、たとえば肝硬変、肥厚性瘢痕形成、及び乾癬などの治療に用いることができる。本発明はさらに、好中球減少及び貧血の治療、並びに器官再生及び組織工学の技術において有用である可能性がある。
【０３４６】
薬剤組成物
本発明は、治療上有効量の本発明の方法によって同定された少なくとも１種の化合物、及び薬剤として許容される担体、希釈剤、又は賦形剤（それらの組み合わせを含む）を投与することを含む、薬剤組成物を提供する。
【０３４７】
この薬剤組成物は、ヒト及び獣医学においてヒト及び動物に使用するものであることができ、典型的に任意の１種又は複数の薬剤として許容される希釈剤、担体、又は賦形剤を含む。治療上の使用に許容される担体又は希釈剤は、薬学分野でよく知られており、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬剤担体、賦形剤、又は希釈剤の選択は、意図される投与経路、及び標準的な薬剤の実施を考慮して選択することができる。この薬剤組成物は、担体、賦形剤、又は希釈剤として、或いはそれに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、被覆剤、可溶化剤を含むことができる。
【０３４８】
防腐剤、安定剤、染料、及び香味剤も、薬剤組成物に提供することができる。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。抗酸化剤及び懸濁化剤も用いることができる。
【０３４９】
種々の送達系に応じて、異なる組成物／製剤要件が存在する可能性がある。例として、本発明の薬剤組成物は、ミニポンプを用いて、或いはたとえば吸入用の鼻腔スプレー又はエアロゾル、又は摂取可能溶液として粘膜経路で、或いは組成物がたとえば静脈内、筋内、又は皮下経路によって送達される注入可能型で製剤化される非経口経路で送達されるように製剤化することができる。或いは、この製剤は、両方の経路で送達されるように設計することができる。
【０３５０】
化合物が、胃腸粘膜を通して粘膜から送達される場合、化合物は胃腸管を通過する間、安定性を持続できるべきであり、たとえばタンパク質分解に耐性であり、酸性ｐＨに安定であり、胆汁の洗浄作用に耐性であるべきである。
【０３５１】
適切な場合には、この薬剤組成物は、吸入、座剤又は膣座剤の形態で、或いはローション、溶液、クリーム、軟膏、又は粉剤の形態、皮膚用パッチ剤の使用により局所的に、デンプン又は乳糖などの賦形剤を含有する錠剤の形態、或いは単独又は賦形剤と組み合わせてカプセル剤又は小卵剤、或いは香味剤又は着色剤を含有するエリキシル剤、液剤、又は懸濁剤の形態で経口によって投与することができ、或いはこの薬剤組成物は、たとえば静脈内、筋内、又は皮下に非経口で注入することもできる。非経口投与の場合、この組成物は、他の物質、たとえば血液と等張の溶液を作るのに充分な塩又は単糖を含有することができる無菌水溶液の形態で用いるのが最善である可能性がある。頬又は舌下投与の場合、組成物は、通常の方法で製剤化できる錠剤又はロゼンジの形態で投与することができる。
【０３５２】
投与
典型的に、医師は、個々の対象にもっとも適している実際の投与量を決定し、その投与量は、特定の患者の年齢、体重、及び反応によって異なる。以下の用量は、平均的な場合の例である。当然ながら、より高い、又はより低い用量範囲が有利である個々の事例も存在し得る。
【０３５３】
本発明の組成物は、直接注入によって投与することができる。組成物は、非経口、粘膜、筋内、静脈内、皮下、眼内、又は経皮投与用に製剤化できる。
【０３５４】
「投与」という用語は、ウイルス又は非ウイルス技法による送達を含む。ウイルス送達機構には、これに限定されるものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが含まれる。非ウイルス送達機構には、脂質媒介トランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクチン、陽イオン面状両親媒性物質（ＣＦＡ）、及びその組み合わせが含まれる。そのような送達機構の経路には、これに限定されるものではないが、粘膜、鼻腔、経口、非経口、胃腸管、局所、又は舌下経路が含まれる。
【０３５５】
「投与」という用語には、これに限定されるものではないが、たとえば吸入用の鼻腔スプレー又はエアロゾルとして、又は摂取可能溶液として粘膜経路による送達、或いは送達がたとえば静脈内、筋内、真皮内、関節内、髄腔内、腹腔内、又は皮下経路、或いは消化管（たとえばパイアー斑）を経て行われる非経口経路による送達が含まれる。
【０３５６】
熟練した医師は、たとえば患者の年齢、体重、及び状態に応じて、任意の特定の患者に最適な投与経路及び投与量を容易に決定することができるので、記載した投与経路及び投与量は指針にすぎない。好ましくは、薬剤組成物は、単位投与形態である。本発明は、ヒト及び獣医学両方の適用例を含む。
【０３５７】
抗原提示細胞
必要であれば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、「プロフェッショナル」抗原提示細胞であることができ、又はＴ細胞に抗原を提示するように誘導され得る他の細胞であることができる。或いは、ＡＰＣを産生する培養条件下で分化する又は活性化されるＡＰＣ先駆体を用いることができる。
【０３５８】
ＡＰＣには、樹状細胞（ＤＣ）、たとえば相互連結ＤＣ又は濾胞ＤＣなど、ランゲルハンス細胞、ＰＢＭＣ、マクロファージ、Ｂリンパ球、或いは上皮細胞、線維芽細胞、又は内皮細胞などのトランスフェクションによって活性化又は操作されてその表面にＭＨＣ分子（クラスＩ又はＩＩ）を発現する他の細胞型が含まれる。ＡＰＣの前駆体には、ＣＤ３４＋細胞、単球、線維芽細胞、及び内皮細胞が含まれる。ＡＰＣ又は前駆体は、培養条件によって修飾することができ、或いはたとえば抗原提示及び／又は免疫相乗作用を促進する選択されたサイトカインの組み合わせ（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１８など）において役割を果たすタンパク質をコードしている１個又は複数の遺伝子のトランスフェクションによって遺伝子的に修飾することもできる。そのようなタンパク質には、ＭＨＣ分子（クラスＩ又はＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、又はＣＤ４０が含まれる。もっとも好ましくは、ＤＣ又はＤＣ前駆体がＡＰＣの供給源として含まれる。
【０３５９】
樹状細胞（ＤＣ）はいくつかの手段によって単離／調製することができ、たとえば樹状細胞は、末梢血から直接精製する、或いはたとえばＧＭ−ＣＳＦによる処理によって末梢血に移行した後にＣＤ３４＋前駆体細胞から、又は骨髄から直接生じることができる。末梢血からの接着前駆体はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４混合物で処理することができ（Ｉｎａｂａ  Ｋ等（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１１５７〜１１６７（Ｉｎａｂａ））、或いは骨髄からの非接着ＣＤ３４＋細胞はＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αで処理することができる（Ｃａｕｘ  Ｃ等、（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２５８〜２６１（Ｃａｕｘ））。ＤＣは、精製末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、接着細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４で２時間処理するＳａｌｌｕｓｔｏ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ及びＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９〜１１１８）の方法と同様に、ヒト志願者の末梢血から慣例的に調製することもできる。必要に応じて、これらは電磁ビーズを用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞、及びＣＤ３＋、ＣＤ２＋Ｔ細胞を除去することができる（Ｃｏｆｆｉｎ  ＲＳ等（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７１８〜７２２（Ｃｏｆｆｉｎ））。培養条件には、維持するためのＧＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−４などの他のサイトカイン、或いは樹状細胞又は他の抗原提示細胞の活性が含まれ得る。
【０３６０】
したがって本明細書では、「抗原提示細胞など」という用語は、ＡＰＣに限定されるものではないことが理解される。当分野の技術者は、Ｔ細胞集団に提示することのできる任意のビヒクルを使用できることを理解するであろうが、便宜上これらのすべてを指すためのＡＰＣという用語を用いる。上述のとおり、適切なＡＰＣの好ましい例には、樹状細胞、Ｌ細胞、ハイブリドーマ、線維芽細胞、リンパ腫、マクロファージ、Ｂ細胞、又は脂質膜などの合成ＡＰＣが含まれる。
【０３６１】
Ｔ細胞
必要に応じて、健康な患者などの任意の適切な供給源由来のＴ細胞を用いることができ、血液又は他の供給源（リンパ節、脾臓、又は骨髄など）から得ることができる。Ｔ細胞は場合によって標準的な手順で濃縮又は精製することができる。Ｔ細胞は、同一又は異なる個体から得られた他の免疫細胞と組み合わせて用いることができる。或いは、Ｔ細胞及び他の細胞型の供給源として、全血、或いは白血球濃縮血又は精製白血球を用いることができる。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）の使用が特に好ましい。或いは、ＣＤ８＋細胞などの他のＴ細胞を用いることができる。Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞系を用いるのも好都合である。
【０３６２】
ＡＰＣ及びＴ細胞への因子の暴露
Ｔ細胞／ＡＰＣは、上述のとおり培養することができる。たとえば、患者に投与するために調製することができ、又はin vitro（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴ細胞と共にインキュベートすることができる。
【０３６３】
ｅｘ  ｖｉｖｏで処理される場合、本発明の修飾細胞は、好ましくは患者のリンパ節への直接注射によって、宿主に投与される。典型的に、１０４から１０８の処理細胞、好ましくは１０５から１０７の細胞、より好ましくは約１０６の細胞が患者に投与される。好ましくは、細胞は濃縮細胞集団の形態を取る。
【０３６４】
本明細書では、本発明の細胞集団に適用される「濃縮」という用語は、それらが天然に伴っている他の細胞を少なく有する、より均質な細胞集団を指す。細胞の濃縮集団は、当分野で知られているいくつかの方法で得ることができる。たとえば、Ｔ細胞の濃縮集団は、Ｔ細胞でのみ見出される決定基に特異的なモノクローナル抗体を用い、イムノアフィニティクロマトグラフィを用いて得ることができる。
【０３６５】
濃縮集団は、正の選択（所望の細胞のみを回収）又は負の選択（所望でない細胞を除去）によって、混合細胞懸濁液から得ることもできる。親和性材料の特定細胞を獲得する技術は、当分野でよく知られている（Ｗｉｇｚｅｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２８：２３、１９６９、Ｍａｇｅ等、Ｊ．Ｉｍｎｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５：４７、１９７７、Ｗｙｓｏｃｋｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：２８４４、１９７８、Ｓｃｈｒｅｍｐｆ−Ｄｅｃｋｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．３２：２８５、１９８０、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇ等、Ｃｅｌｌ、４４：６５３、１９８６）。
【０３６６】
成熟分化細胞に特異的な抗原に対するモノクローナル抗体は、所望でない細胞を除去する、たとえばそれぞれ同種異系又は自己骨髄移植片からＴ細胞又は悪性細胞を枯渇させるために、種々の負の選択法で用いられてきた（Ｇｅｅ等、Ｊ．Ｎ．Ｃ．Ｉ．８０：１５４、１９８８）。モノクローナル抗体及び免疫磁気ミクロスフェアを用いる負の選択によるヒト造血細胞の精製は、複数のモノクローナル抗体を用いて達成することができる（Ｇｒｉｆｆｉｎ等、Ｂｌｏｏｄ、６３：９０４、１９８４）。
【０３６７】
細胞を分離する手順には、抗体被覆電磁ビーズを用いる磁気分離、アフィニティクロマトグラフィ、モノクローナル抗体と結合又はモノクローナル抗体と組み合わせた細胞傷害剤、たとえば補体及び細胞毒素、並びに固体マトリクス、たとえばプレートに結合させた抗体を用いる「パニング」、又は他の好都合な技法を含むことができる。正確な分離を提供する技法には、蛍光活性化細胞分離装置が含まれ、これは複数のカラーチャネル、小角及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、様々な程度の精度を有する。
【０３６８】
一実施形態において、本発明に用いられる治療剤は、in vivoで直接患者に投与できることが理解される。或いは、又はそれに加えて、この薬剤は、ｅｘ  ｖｉｖｏの様式で、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣなどの細胞に投与することができる。たとえば、Ｔ細胞又はＡＰＣなどの白血球を、知られている様式で患者又はドナーから得て、本発明の様式でｅｘ  ｖｉｖｏで処理／インキュベートし、その後、患者に投与することができる。さらに所望であれば、投与経路の組み合わせを用いてよいことが理解される。たとえば、適切な１個の成分（Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターなど）をｅｘ  ｖｉｖｏで投与し、他の成分をin vivoで投与することができ、又はその逆であってもよい。
【０３６９】
ＡＰＣ及びＴ細胞への核酸配列の導入
上述のＴ細胞及びＡＰＣは、任意選択でウシ胎児血清の存在下、ＤＭＥＭ又は他の規定培地などの適切な培地で培養される。
【０３７０】
ポリペプチド物質は、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣにおいてポリペプチドの発現を可能にする条件下、ポリペプチドをコードしている核酸コンストラクト／ウイルスベクターを細胞に導入することによって、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣに投与することができる。同様に、アンチセンスコンストラクトをコードしている核酸コンストラクトは、トランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によって、Ｔ細胞及び／又はＡＰＣに導入することができる。
【０３７１】
好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、コントロール配列に機能可能に結合され、これにはプロモーター／エンハンサー、及び他の発現調節シグナルが含まれる。「機能可能に結合」という用語は、記載の成分が、意図された様式でそれらが機能できる関係にあることを意味する。コード配列に「機能可能に結合」した調節配列は、好ましくは、コード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下で達成されるようにライゲートされる。
【０３７２】
プロモーターは、典型的に、哺乳動物細胞において機能するプロモーターから選択されるが、真核生物プロモーター、及び他の真核細胞で機能するプロモーターも用いることができる。プロモーターは、典型的に、ウイルス又は真核生物遺伝子のプロモーター配列に由来する。たとえば、発現が起こる細胞のゲノムから得ることができる。真核生物プロモーターに関しては、偏在的な様式（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターなど）、或いは組織特異的な様式（ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーターなど）で機能するプロモーターであることができる。リンパ球、樹状細胞、皮膚、脳細胞、及び眼内上皮細胞に特異的な組織特異プロモーターが特に好ましく、たとえばそれぞれＣＤ２、ＣＤ１１ｃ、ケラチン１４、Ｗｎｔ−１、及びロドプシンプロモーターである。好ましくは、上皮細胞プロモーターＳＰＣが用いられる。特定の刺激に応答するプロモーターであってもよく、たとえばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターである。ウイルスプロモーターも用いることができ、たとえばモロニーマウス白血病ウイルス長末端反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、又はヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターである。
【０３７３】
細胞の生存期間中、異種遺伝子の発現レベルが調節され得るように、プロモーターが誘導可能であることも有利である可能性がある。誘導可能とは、プロモーターを用いて得られる発現のレベルが調節できることを意味する。
【０３７４】
上述の任意のプロモーターは、さらなる調節配列、たとえばエンハンサー配列を加えることによって修飾できる。２個以上の異なるプロモーターの配列要素を含むキメラプロモーターも用いることができる。
【０３７５】
或いは（又はそれに加えて）、対象となる遺伝子が本発明で用いられる細胞でのみ発現するように、調節配列は細胞特異性であることができる。そのような細胞には、たとえばＡＰＣ及びＴ細胞が含まれる。
【０３７６】
必要であれば、細胞の少量のアリコートを、上に記載のとおりＮｏｔｃｈシグナリング活性のアップレギュレーションに関して試験することができる。細胞は患者に投与するために調製することができ、又はin vitro（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でＴ細胞と共にインキュベートすることができる。
【０３７７】
寛容化アッセイ
上述の任意のアッセイは（「アッセイ」を参照のこと）、臨床適用例に用いるために、免疫細胞における低減した応答性及び寛容化をモニター又は検出するように適合させることができる。そのようなアッセイには、たとえば、宿主細胞における増大したＮｏｔｃｈリガンド発現又は活性の検出、又はドナー細胞におけるＮｏｔｃｈ開裂のモニターが含まれる。免疫細胞活性をモニターするさらなる方法を以下に記載する。
【０３７８】
免疫細胞活性は、当分野の技術者に知られている任意の適切な方法によってモニターすることができる。たとえば、細胞傷害活性をモニターすることができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、活性化後の増強された細胞傷害活性を実証する。したがって、細胞傷害性の低下又は安定化は、応答性の低減を示唆する。
【０３７９】
活性化後、白血球は様々な新しい細胞表面抗原を発現する。ＮＫ細胞は、活性化後、たとえばトランスフェリン受容体、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ２５  ＩＬ−２受容体を発現する。したがって、応答性の低減は、これらの抗原の発現をモニターすることによって評価することができる。
【０３８０】
Ｈａｒａ等、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＩＩＩ，Ｒａｐｉｄ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ２８ｋＤ／３２ｋＤ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｅａｒｌｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＥＡ−１）ｂｙ  １２−０−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ  Ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−Ａｃｅｔａｔｅ，Ｍｉｔｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１９８８（１９８６）及びＣｏｓｕｌｉｃｈ等、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ（ＭＬＲ３）Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔｅｐ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ、８４：４２０５（１９８７）は、活性化直後に、Ｔ細胞に発現する細胞表面抗原を記載している。これらの抗原、ＥＡ−１及びＭＬＲ３はそれぞれ、２８ｋＤ及び３２ｋＤの主要成分を有する糖タンパク質である。ＥＡ−１及びＭＬＲ３は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではなく、さらにＭＬＲ３Ｍａｂは、ＩＬ−１結合を遮断する。これらの抗原は、１８時間以内に活性化Ｔ細胞に出現し、したがって免疫細胞応答性をモニターするために用いることができる。
【０３８１】
さらに、白血球応答性は、参照により本明細書の一部とするＥＰ０３２５４８９に記載のとおりモニターすることができる。簡潔には、これは、ＡＴＣＣ番号ＨＢ−９６２７と称されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって認識される細胞抗原と相互作用するモノクローナル抗体（「Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３」）を用いて行われる。
【０３８２】
Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、活性化され抗原刺激された白血球の細胞表面抗原を認識する。活性化ＮＫ細胞において、抗原Ｌｅｕ２３は、活性化後４時間以内に発現し、長ければ活性化後７２時間発現を続ける。Ｌｅｕ２３は、少なくとも２個のＮ結合炭水化物を有する２４ｋＤサブユニットからなるジスルフィド結合ホモ２量体である。
【０３８３】
ＮＫ細胞におけるＬｅｕ２３の出現は、細胞傷害性の発生と相関し、ある種のＴ細胞におけるＬｅｕ２３の出現は、Ｔ細胞抗原受容体複合体の刺激と相関するため、Ａｎｔｉ−Ｌｅｕ２３は、白血球の応答性をモニターするのに有用である。
【０３８４】
免疫細胞応答性をモニターするための技法のさらなる詳細は、参照により本明細書の一部とする「Ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ」Ｌｅｗｉｓ  Ｃ．Ｅ．及びＪ．Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９２、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ．「Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ」Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９、４７号、１８７〜３７６頁、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｇｅｎｅｓ」の第７章「Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」、Ｍａｋ  Ｔ．Ｗ．及びＪ．Ｊ．Ｌ．Ｓｉｍａｒｄ、１９９８に見出すことができる。
【０３８５】
プライムされたＡＰＣ及びリンパ球の調製
本発明の一態様によれば、免疫細胞は、抗原又はアレルゲンを提示するために用いることができ、かつ／又はＮｏｔｃｈ、Ｎｏｔｃｈリガンド、又はＮｏｔｃｈシグナリング経路の発現又は相互作用を調節するために処理することができる。したがって、たとえば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、任意選択でウシ胎児血清などの血清の存在下、ＤＭＥＭ又は他の規定培地などの適切な培地で培養することができる。最適サイトカイン濃度は、滴定によって求めることができる。次いで、典型的には、Ｎｏｔｃｈシグナリングの１種又は複数の調節因子を、対象となる抗原と共に培地に添加する。抗原は、物質の前、後、又は実質的に同時に添加することができる。細胞は、典型的に、物質及び抗原と共に少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３時間、適切には少なくとも９、１２、２４、４８又は３６時間以上３７℃でインキュベートする。必要であれば、上述のように、調節された標的遺伝子発現に関して、細胞の少量のアリコートを試験することができる。或いは、細胞の活性は、ＷＯ９８／２０１４２に記載されているように、表面マーカー、サイトカイン分泌又は増殖をモニターすることにより、Ｔ細胞活性化の阻害によって測定することもできる。
【０３８６】
上に論じたように、一実施形態では、ＡＰＣにおいてポリペプチドの発現を可能にする条件下、ポリペプチドをコードしている核酸コンストラクト／ウイルスベクターを細胞に導入することによって、ポリペプチド物質をＡＰＣに投与することができる。同様に、抗原をコードしている核酸コンストラクトは、トランスフェクション、ウイルス感染、又はウイルス形質導入によって、ＡＰＣに導入することができる。
【０３８７】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの調節性Ｔ細胞（及びＢ細胞）の調製
以下に記載する技法はＴ細胞に関して述べるが、Ｂ細胞にも同様に適用できる。用いられる技法は、Ｔ細胞が一般的にＡＰＣと共培養されることを除いて、ＡＰＣ単独に関して記載した技法と本質的に同じである。しかしながら、まずプライムＡＰＣを調製し、次いでそれらをＴ細胞と共にインキュベートするのが好ましい可能性がある。たとえば、プライムＡＰＣが調製された後、それらを沈殿させ、ＰＢＳで洗浄した後、新鮮培地に再懸濁することができる。これは、Ｔ細胞を異なる物質で処理することを望む場合、ＡＰＣに用いた異なる物質とＴ細胞を接触させないという利点を有する。プライムＡＰＣはそれ自体免疫寛容を誘発し、推定上はプライムＡＰＣとＴ細胞間のＮｏｔｃｈ／Ｎｏｔｃｈリガンド相互作用を介して、Ｔ細胞においてＮｏｔｃｈ又はＮｏｔｃｈリガンド発現を増大することができるので、プライムＡＰＣが調製された後、必ずしも任意の物質をＴ細胞に投与する必要があるとは限らない。
【０３８８】
インキュベーションは、典型的に、適切な培地において、３７℃で、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも３、６、１２、２４、４８、又は３６時間以上である。Ｎｏｔｃｈシグナリングの進行は、上述の方法を用いて、細胞の少量のアリコートに関して判定することができる。たとえばＤｅｌｔａの発現を方向づける核酸コンストラクトでトランスフェクトしたＴ細胞を、コントロールとして用いることができる。免疫寛容の誘導は、Ｔ細胞を続けて抗原で感作し、ＡＰＣに暴露していないコントロール細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって判定することができる。
【０３８９】
プライムＴ細胞又はＢ細胞は、同様の培養技法及びインキュベーション時間を用いて、ＡＰＣの不在下、他のＴ細胞又はＢ細胞に免疫寛容を誘導するために用いることもできる。
【０３９０】
或いは、Ｔ細胞を培養し、共刺激分子に対する抗体（たとえば抗ＣＤ２８）を含む又は含まない抗ＴＣＲ抗体（たとえば抗ＣＤ３）などのＡＰＣ代替物を用いて、ＡＰＣの不在下プライムすることができ、或いは、Ｔ細胞はＭＨＣ−ペプチド複合体（たとえば４量体）を用いて活性化することができる。
【０３９１】
免疫寛容の誘導は、Ｔ細胞を続けて抗原で感作し、ＡＰＣに暴露していないコントロール細胞と比較してＩＬ−２産生を測定することによって判定することができる。
【０３９２】
このようにプライムされたＴ細胞又はＢ細胞は、他のＴ細胞又はＢ細胞において免疫寛容を促進又は増大するために、本発明に従って用いることができる。
【０３９３】
本発明を、以下の非限定的な実施例に関してさらに説明する。
【実施例１】
【０３９４】
ＣＤ４＋細胞精製
マウス（種々、８〜１０週齢のＢａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週齢のＣ５７Ｂ／ｃ雌、８〜１０週齢のＣＡＲＤ１雌（Ｄ０１１．１０トランスジェニック、ＣＡＲトランスジェニック））から脾臓を摘出し、０．２μＭセルストレイナーから２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２２４０９）に２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの１０％ウシ胎児血清中β−メルカプトエタノールを添加）に通した。この細胞懸濁液を遠心分離し（１１５０ｒｐｍ、５分）、培地を除去した。
【０３９５】
（赤血球を溶解するために）脾臓当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（再蒸留水中０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０Ｍ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）と共に４分間、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を、Ｒ１０Ｆ培地で１回洗浄し、カウントした。ＣＤ４＋細胞を、製造者指示書に従って、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０４９−２０１）を用い、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＭＡＣＳ）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｉｓｌｅｙ、ＵＫ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）で正の選択により懸濁液から精製した。
【実施例２】
【０３９６】
抗体被覆
９６ウェル平底プレートを抗体で被覆するために、次のプロトコルを用いた。
【０３９７】
Ａ）プレートを、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ、カタログ番号５５３０５８、クローン番号１４５−２Ｃ１１）及び１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５５８７８）を含むダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆混合物を用いた。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、各ウェルに、ＤＰＢＳ１００μｌ、又は１０μｇ／ｍｌのＮｏｔｃｈリガンド（マウスＤｅｌｔａ１細胞外ドメイン／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ−ｄｅｌｔａ）を含むＤＰＢＳ１００μｌを加えた。
【０３９８】
プレートを、３７℃で２〜３時間インキュベートし、次いで、再びＤＰＢＳで洗浄し、その後、細胞（実施例１のとおり調製）を添加した。
【０３９９】
Ｂ）別法として、プレートを、１μｇ／ｍｌの抗ハムスターＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４００７）及び１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ４抗体を含むＤＰＢＳで被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆混合物を添加した。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、各ウェルに、抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）を含むＤＰＢＳ１００μｌ、又は抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）及びＦｃ−ｄｅｌｔａ（１０μｇ／ｍｌ）を含むＤＰＢＳ１００μｌを加えた。プレートを、３７℃で２〜３時間インキュベートし、次いで、再びＤＰＢＳで洗浄し、その後、細胞（実施例１のとおり調製）を添加した。
【実施例３】
【０４００】
１次ポリクローナル刺激
実施例２（Ａ）又は２（Ｂ）に従って予め被覆した９６ウェル平底プレートで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養した。細胞を、カウント後、４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）を含むＲ１０Ｆ培地中２×１０６／ｍｌで再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌを各ウェルに添加した。次いで、Ｒ１０Ｆ培地１００μｌを各ウェルに添加して、最終量２００μｌを得た（２×１０５細胞／ウェル、抗ＣＤ２８最終濃度２μｇ／ｍｌ）。次いで、プレートを、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０４０１】
次いで、上澄み１２５μｌを各ウェルから除去し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）の抗体対を用いて、ＩＬ−１０、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１３に関してＥＬＩＳＡで試験するまで−２０℃で保存した。細胞を、新しいウェル（被覆していない）に１個を３個に分けて入れ、組換えヒトＩＬ−２（２．５μｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、カタログ番号２００−０２）を含むＲ１０Ｆ培地を加えた。
【０４０２】
結果を図９に示す。
【実施例４】
【０４０３】
１次刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞のリアルタイムＰＣＲ分析
実施例３のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞を、４、１６、及び２４時間で採取した。全細胞ＲＮＡを、製造者指針に従って、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて単離した。
【０４０４】
それぞれ、１μｇの全ＲＮＡを、製造者指針に従って、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（１２−１８）又はランダムデカマーミックスを用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を用いて逆転写した。合成後、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ（１２−１８）及びランダムデカマープライムｃＤＮＡを等量で混合し、リアルタイム定量ＰＣＲ分析の実用ｃＤＮＡ試料を得た。
【０４０５】
リアルタイム定量ＰＣＲを、製造者指針に従って、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）システム（Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ）及びＳＹＢＲ緑色検出化学を用いて行った。次のＨＰＬＣ精製プライマー対を、ｃＤＮＡ特異増幅に用いた（５’から３’）。
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【０４０６】
リアルタイムＰＣＲ定量化に用いたエンドポイント、交点（Ｃｐ）は、アルゴリズムで定義されたシグナル閾値と交差するＰＣＲサイクル数として定義される。遺伝子特異的ｃＤＮＡの定量分析は、初めに、前もってプラスミドベクター（ｐＣＲ２．１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした１組の連続希釈遺伝子特異的増幅産物のＣｐｓを用いて、１組の標準を得ることによって達成した。これらの連続希釈は、ｃＤＮＡ試料のＣｐｓを比較した標準曲線に該当する。このシステムを用いて、１８Ｓ  ｒＲＮＡハウスキーピング遺伝子の発現レベルを各ｃＤＮＡ試料に関して得た。次いで、Ｈｅｓ−１を、連続希釈Ｈｅｓ−１特異的標準を用いて、同じ方法で分析し、Ｈｅｓ−１値を１８Ｓ  ｒＲＮＡ値で割って１個の値を得たが、これは各ｃＤＮＡ試料におけるＨｅｓ−１の相対発現を表す。すべてのＣｐ分析は、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステムソフトウェア内のＳｅｃｏｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍアルゴリズムを用いて行った。
【０４０７】
結果（Ｆｃ−ｄｅｌｔａを用いる、及びＦｃ−ｄｅｌｔａを用いない１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現に対するＨＥＳ−１発現）を図１０に示す。
【実施例５】
【０４０８】
極性条件下でのスクリーニング
実施例２（Ａ）のとおり、プレートを被覆し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を添加した。
【０４０９】
次いで、実施例３の手順を行ったが、ただし実施例３のウェル当たり１００μｌのＲ１０Ｆ培地の代わりに、以下のとおり、ウェル当たり１００μｌの極性カクテルを加えた。
非極性細胞：Ｒ１０Ｆ培地
Ｔｈ１極性細胞：抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４４３２）及びＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ２１０−１２）を含むＲ１０Ｆ培地
Ｔｈ２極性細胞：抗ＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４４７５）及び抗ＩＦＮｇ抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４４０８）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ２１４−１４）を含むＲ１０Ｆ培地
【０４１０】
次いで、細胞を刺激し、サイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、及びＩＬ−１３）を実施例３に記載のとおり、ＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図１１に示す。
【実施例６】
【０４１１】
可溶性リガンド
実施例２（Ａ）（ただしリガンドをプレートに添加しない）と実施例３（ただし可溶性Ｆｃ−ｄｅｌｔａをＲ１０Ｆ培地と共に添加）の手順を用いて、プレート結合Ｅｃ−ｄｅｌｔａを含む可溶性Ｆｃ−ｄｅｌｔａをコントロールと比較した。結果を図１２に示す。
【実施例７】
【０４１２】
２次刺激
１次刺激の７日後、すべての細胞を採取し、カウントし、以下の３つの方法の１つで刺激した。
【０４１３】
再刺激
細胞を、１次刺激（実施例３）のとおりに再刺激した。
【０４１４】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８の再チャレンジ
９６ウェル平底プレートを、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体を含むＰＢＳで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。
【０４１５】
細胞を、抗ＣＤ２８抗体（４μｇ／ｍｌ）を含むＲ１０Ｆ培地中２×１０６／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。次いで、Ｒ１０Ｆ培地１００μｌを各ウェルに添加し、最終量２００μｌを得た（２×１０５細胞／ウェル、抗ＣＤ２８最終濃度２μｇ／ｍｌ）。次いで、プレートを、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間後、実施例３（１次刺激）に記載のＥＬＩＳＡのために、上澄みを除去した。
【０４１６】
抗ＣＤ３を含むＡＰＣによる再刺激
実施例３の１次刺激細胞を７日後に採取し、抗ＣＤ３抗体を含む同じ系統（ウェル当たり２×１０４）のＡＰＣで再刺激した。
【０４１７】
カウント段階まで実施例１に記載のとおり、マウス脾臓細胞を単離した。次いで、Ｔｈｙ−１．２抗体結合細胞をＭＡＣＳカラムで除去し、流出物を回収し、マイトマイシンＣで４５分間処理し、その後、同数の実施例３の細胞と０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体と共に１００μｌのＲ１０Ｆ培地中９６ウェルプレートに添加した。
【０４１８】
製造者指示書に従って、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（化学発光）１６６９９１５のキットを用い、細胞増殖を測定した。プレートを７２時間でパルスし、ルミノメータで計測した。
【０４１９】
実施例３に記載のとおり、サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＦＮγ）を測定した。結果を図１３に示す。
【実施例８】
【０４２０】
ＣＨＯ−Ｎ２（Ｎ２７）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ａ）ルシフェラーゼレポータープラスミド１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ（ｐＬＯＲ９１）の構築
ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ付着末端を有するアデノウイルス主後期プロモーターＴＡＴＡボックスモチーフを以下のように生じた。
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【０４２１】
これを、ＢｇｉＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でプラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、プラスミドｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡを生じた。
【０４２２】
ＢａｍＨ１及びＢｇｌＩＩ付着末端を有するＴＰ１プロモーター配列（ＴＰ１は２ＣＢＦ１リピートに相当）を以下のように生じた。
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【０４２３】
この配列をＢｇｌＩＩ部位に繰り返し挿入することによって５量体化し、得られたＴＰ１の５量体（１０ＣＢＦ１リピートに相当）をＢｇｌＩＩ部位でｐＧＬ３−ＡｄＴＡＴＡに挿入して、プラスミドｐＬＯＲ９１を生じた。
【０４２４】
Ｂ）完全長Ｎｏｔｃｈ２及び１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃレポーターカセットを発現する安定なＣＨＯ細胞レポーター細胞系の産生
ヒトＮｏｔｃｈ２遺伝子の完全コード配列（たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３１５３５６を参照）に及ぶｃＤＮＡクローンを以下のように構築した。細胞内ドメイン全体及び細胞外ドメインの一部をコードしている３’ｃＤＮＡ断片を、ＰＣＲに基づくスクリーニング法を用いて、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリ（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）から単離した。残存する５’コード配列を、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅法）法を用いて単離し、両方の断片に共通のユニーク制限部位を用いて（Ｃｌａ  Ｉ）、既存３’断片にライゲートした。次いで、得られた完全長ｃＤＮＡを、終止コドンを用いずに哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、プラスミドｐＬＯＲ９２を生じた。哺乳動物細胞に発現するとき、ｐＬＯＲ９２は細胞内ドメインの３’末端にＶ５及びＨｉｓタグを有する完全長ヒトＮｏｔｃｈ２タンパク質を発現する。
【０４２５】
野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（たとえばＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１参照）を、Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＬＯＲ９２（ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＮｏｔｃｈ２−Ｖ５−Ｈｉｓ）でトランスフェクトし、完全長ヒトＮｏｔｃｈ２（Ｎ２）を発現する安定なＣＨＯ細胞クローンを生じた。トランスフェクタントクローンを、限定希釈法を用い、９６ウェルプレートにおいて、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（（ＨＩ）ＦＣＳ）、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で選択した。個々のコロニーを、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭで増殖させた。クローンを、抗Ｖ５モノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、細胞溶解産物のウエスタンブロットによって、Ｎ２の発現に関して試験した。次いで、陽性クローンを、レポーターベクターｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）による一過性トランスフェクション、及び完全長ヒトＤｅｌｔａ様リガンド１（ＤＬＬ１、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１９６５７１を参照）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ）との共培養によって試験した。（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ細胞は、Ｎｏｔｃｈ２の代わりにヒトＤＬＬ１を用い、ＣＨＯＮｏｔｃｈ２クローンと同じ方法で調製した。強陽性クローンを、抗Ｖ５ｍＡｂを用い、細胞溶解産物のウエスタンブロットによって選択した）。
【０４２６】
ｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）による一過性トランスフェクション、及び完全長ヒトＤＬＬ１（ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ１）を発現する安定ＣＨＯ細胞クローンとの共培養を行ったとき、１個のＣＨＯ−Ｎ２安定クローンＮ２７が、高レベルの誘導を与えることが見出された。ハイグロマイシン遺伝子カセット（ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を、ＢａｍＨ１及びＳａｌ１を用いてｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）に挿入し、このベクター（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ−ｈｙｇｒｏ）を、Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＨＯ−Ｎ２安定クローン（Ｎ２７）にトランスフェクトした。トランスフェクタントクローンを、限定希釈法を用い、９６ウェルプレートにおいて、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．４ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭで選択した。個々のコロニーを、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．２ｍｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭで増殖させた。
【０４２７】
クローンを、ＦＬヒトＤＬＬ１を発現する安定ＣＨＯ細胞系との共培養によって試験した。３個の安定レポーター細胞系、Ｎ２７＃１１、Ｎ２７＃１７、及びＮ２７＃３６が産生された。Ｎｏｔｃｈシグナリングの不在下でバックグラウンドシグナルが低く、したがってシグナリングが開始されたときに誘導倍率が高いことから、さらなる使用のためにＮ２７＃１１を選択した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１００μｌ／ウェル中、２×１０４Ｎ２７＃１１細胞／ウェルを用いて、９６ウェルプレートでアッセイを行った。
【０４２８】
Ｃ）１０ｘＣＢＦ１−ＬｕｃによるＣＨＯ−Ｎ２細胞の一過性トランスフェクション
別法として、一過性トランスフェクションの場合、ＣＨＯ−Ｎ２（クローンＮ２７）細胞を、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭで維持し、ＣＨＯ−Ｎ２細胞のＴ８０フラスコを次のとおりトランスフェクトした。細胞上の培地を、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む８ｍｌの新鮮なＤＭＥＭに置き換えた。滅菌ビジェ（ｂｉｊｏｕ）において、ｐＬＯＲ９１（１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃ）１０μｇをＯｐｔｉＭｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に加え、最終量１ｍｌを得て、混合した。第２の滅菌ビジェにおいて、ＯｐｔｉＭｅｍ９８０μｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬２０μｌを加え、混合した。
【０４２９】
各ビジェの内容物を混合し、室温で２０分間放置した。トランスフェクション混合物２ｍｌを、培地８ｍｌを含有する細胞のフラスコに加え、得られた混合物を、一晩ＣＯ２インキュベーターに置き、その後、トランスフェクト細胞を除去し、固定化Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質を含有する９６ウェルプレートに添加した。
【０４３０】
翌日、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて、トランスフェクトＣＨＯ−Ｎ２細胞を除去し、遠心分離し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。１０μｌの細胞をカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、２．０×１０５細胞／ｍｌに細胞密度を調整した。マルチチャネルピペットを用いて、ウェル当たり１００μｌ、すなわちウェル当たり２．０×１０４トランスフェクト細胞を９６ウェル組織培養プレート（平底）に加え、その後、プレートを一晩インキュベートした。
【０４３１】
Ｄ）Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質の９６ウェル組織培養プレートへの直接固定
精製Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質１０μｇを、滅菌エッペンドルフ管の滅菌ＰＢＳに添加し、最終容量１ｍｌを得た。滅菌ＰＢＳ５００μｌを含有する滅菌エッペンドルフ管に５００μｌを添加することによって連続１：２希釈溶液を作製し、１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．６２５μｇ／ｍｌ、及び０μｇ／ｍｌの希釈溶液を生じた。
【０４３２】
プレートの蓋をパラフィルムで密封し、プレートを４℃で一晩、又は３７℃で２時間放置した。その後、タンパク質を除去し、プレートをＰＢＳ２００μｌで２度洗浄した。
【０４３３】
Ｅ）Ａ２０−Ｄｅｌｔａ細胞
プラスミドｐＩＲＥＳｎｅｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）からＩＶＳ、ＩＲＥＳ、Ｎｅｏ、ｐＡエレメントを除去し、ニワトリベータアクチンプロモーターの下流で（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｅ０２１９９を参照）ｐＵＣクローニングベクターに挿入した。マウスＤｅｌｔａ−１（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７８６５）を、アクチンプロモーターとＩＶＳエレメントの間に挿入し、３個すべてのリーディングフレームに複数の終止コドンを有する配列をＤｅｌｔａとＩＶＳエレメントの間に挿入した。
【０４３４】
得られたコンストラクトを、エレクトロポレーション及びＧ４１８を用いてＡ２０細胞にトランスフェクトし、その表面にマウスＤｅｌｔａ１を発現するＡ２０細胞を得た（Ａ２０−Ｄｅｌｔａ）。
【０４３５】
Ｆ）ＣＨＯ及びＣＨＯ−ｈＤｅｌｔａ１−Ｖ５−Ｈｉｓアッセイコントロール
ＣＨＯ細胞を、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭで維持し、ＣＨＯ−ｈＤｅｌｔａ１−Ｖ５−Ｈｉｓ（クローン＃１０）細胞を、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓ、０．５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むＤＭＥＭで維持した。
【０４３６】
０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて細胞を除去し、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。細胞１０μｌをカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、細胞密度を５．０×１０５細胞／ｍｌに調整した。５．０×１０５細胞／ｍｌで各細胞系３００μｌを、９６ウェル組織細胞プレートの２重ウェルに加えた。１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１５０μｌを、各ウェル下の次の５ウェルに加えた。細胞１５０μｌを次の４ウェルに連続希釈し、５．０×１０５細胞／ｍｌ、２．５×１０５細胞／ｍｌ、１．２５×１０５細胞／ｍｌ、０．６２５×１０５細胞／ｍｌ、０．３１２５×１０５細胞／ｍｌ、及び０細胞／ｍｌの細胞密度希釈を得た。
【０４３７】
各ウェルの１００μｌを、１０ｘＣＢＦ１−ＬｕｃでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｎ２細胞１００μｌを含有する９６ウェルプレート（２．０×１０４トランスフェクトＣＨＯ−Ｎ２細胞／ウェル）に加え、プレートを一晩インキュベーターに放置した。
【０４３８】
Ｇ）細胞共培養
５×１０４ＣＨＯ−Ｎ２細胞を、９６ウェルプレートで平板培養した。必要に応じて、ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ又はＡ２０−Ｄｅｌｔａ細胞を滴定した（ＣＨＯ−Ｎ２：ＣＨＯ−Ｄｅｌｔａ最大比は１：１であり、ＣＨＯ−Ｎ２：Ａ２０−Ｄｅｌｔａ最大比は１：２であった）。この混合物を一晩インキュベートし、その後、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【０４３９】
Ｈ）ルシフェラーゼアッセイ
すべてのウェルから上澄みを除去した。ＰＢＳ１００μｌ及びＳｔｅａｄｙＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを添加し、細胞を室温で５分間放置した。混合物を２回ピペットで上下させて確実に細胞融解し、各ウェルの内容物を白色９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。ルミネセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。
【０４４０】
試料アッセイの結果（対応するコントロールに対して活性剤として（Ａ）プレート固定化ヒトＤｅｌｔａ−１／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質、（Ｂ）プレート固定化マウスＤｅｌｔａ−１／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質、（Ｃ）ＣＨＯ／ＣＨＯ−ヒトＤｅｌｔａ１共培養細胞、及び（Ｄ）Ａ２０／Ａ２０−マウスＤｅｌｔａ１共培養細胞と共に上述の安定ＣＨＯ−Ｎｏｔｃｈ２−１０ｘＣＢＦ１−Ｌｕｃレポーター細胞系を用いる）を図１４ＡからＤに示す。
【実施例９】
【０４４１】
Ｎｏｔｃｈリガンド活性を検出するためのダイナビーズルシフェラーゼアッセイ法
ＦｃタグＮｏｔｃｈリガンドを、以下のようにビオチン化α−ＩｇＧ−４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カタログ番号５５５８７９）のクローンＪＤＣ１４、０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に、ストレプトアビジン−ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ（ＵＫ）ＬｔｄのＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｉｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（カタログ番号１１５．２１）「ビーズ」、４．０×１０８ビーズ／ｍｌ）に固定化した。
【０４４２】
アッセイを行うそれぞれの試料に関して、２．５×１０７のビーズ（４．０×１０８ビーズ／ｍｌでビーズ６２．５μｌ）及び５μｇのビオチン化α−ＩｇＧ４を用いた。ＰＢＳをビーズに添加して１ｍｌとし、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿した。さらにＰＢＳ１ｍｌで洗浄した後、混合物を再び遠心沈殿した。その後、ビーズを、滅菌エッペンドルフ管のビオチン化α−ＩｇＧ４を含有するＰＢＳ最終容量１００μｌに再懸濁し、室温で３０分間シェーカーに置いた。ＰＢＳを添加して１ｍｌとし、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿し、その後、さらに２回、ＰＢＳ１ｍｌで洗浄した。
【０４４３】
次いで、混合物を１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿し、ビーズを試料当たり５０μｌのＰＢＳに再懸濁した。５０μｌのビオチン化α−ＩｇＧ４被覆ビーズを各試料に添加し、混合物を４℃で一晩、回転式シェーカーでインキュベートした。その後、管を、室温で５分間、１０００ｒｐｍで回転した。
【０４４４】
ビーズをＰＢＳ１０ｍｌで洗浄し、遠心沈殿し、ＰＢＳ１ｍｌに再懸濁し、滅菌エッペンドルフ管に移し、さらに２×１ｍｌのＰＢＳで洗浄、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ最終容量２５０μｌに、すなわち１．０×１０５ビーズ／μｌで再懸濁した。
【０４４５】
実施例８の安定Ｎ２７＃１１細胞（Ｔ８０フラスコ）を、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて除去し、遠心沈殿し、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１０ｍｌに再懸濁した。細胞１０μｌをカウントし、１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含む新鮮なＤＭＥＭを用いて、１．０×１０５細胞／ｍｌに細胞密度を調整した。１０％（ＨＩ）ＦＣＳ、グルタミン、Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ１ｍｌ中、２４ウェルプレートにウェル当たり１．０×１０５の細胞を平板培養し、細胞をインキュベーターに置き、少なくとも３０分間静置した。
【０４４６】
その後、１００μｌのビーズを第１のウェル対に２重で添加し、１．０×１０７ビーズ／ウェル（１００ビーズ／細胞）とし、２０μｌのビーズを第２のウェル対に２重で添加し、２．０×１０６ビーズ／ウェル（２０ビーズ／細胞）とし、４μｌのビーズを第３のウェル対に２重で添加し、４．０×１０５ビーズ／ウェル（４ビーズ／細胞）とし、０μｌのビーズを第４のウェル対に添加した。プレートを、ＣＯ２インキュベーターに一晩放置した。
【０４４７】
ルシフェラーゼアッセイ
すべてのウェルから上澄みを除去し、ＰＢＳ１５０μｌ及びＳｔｅａｄｙＧｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１５０μｌを添加し、生じた混合物を室温で５分間放置した。
【０４４８】
その後、混合物を２回ピペットで上下させて確実に細胞融解し、各ウェルの内容物をエッペンドルフ管に移し、１３０００ｒｐｍで１分間遠心沈殿し、ビーズペレットを残して、透明上澄みを白色９６ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ）に移した。次いで、ルミネセンスをＴｏｐＣｏｕｎｔ（商標）計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。
【実施例１０】
【０４４９】
Ｎｏｔｃｈリガンド活性を検出するためのダイナビーズＥＬＩＳＡアッセイ法
Ｍ４５０ストレプトアビジンダイナビーズを、抗ハムスターＩｇＧ１ビオチン化モノクローナル抗体、抗ヒトＩｇＧ４ビオチン化モノクローナル抗体、又は両抗体で被覆し、室温で２時間回転した。
【０４５０】
ビーズをＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄した。その後、抗ハムスターＩｇＧ１ビーズをさらに、抗ＣＤ３ε鎖モノクローナル抗体と共にインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ４ビーズをさらに、Ｆｃ−Ｄｅｌｔａと共にインキュベートし、２重被覆ビーズを、抗ＣＤ３ε鎖モノクローナル抗体及びＦｃ−Ｄｅｌｔａの両方と共にインキュベートした。ビーズを４℃で一晩回転し、ＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄し、再懸濁した。
【０４５１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びこのビーズを用いて、Ｔ細胞アッセイを行った。７２時間後に上澄みを除去し、実施例３に記載のとおりＥＬＩＳＡによってサイトカインを測定した。結果を図１５に示す。
【実施例１１】
【０４５２】
Ｄｙｎａｌマイクロビーズに固定されたＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４の存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生の調節
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて血液から精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地２１ｍｌに載せ、１８〜２０℃で４０分間、４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、３回洗浄して、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いた。
【０４５３】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造者指示書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈの抗ＣＤ４マイクロビーズを用い、正の選択により単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びβ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中、１０５ＣＤ４／ウェル／２００μｌで、９６ウェルプレート（平底）を用い３重でインキュベートした。
【０４５４】
サイトカイン産生は、１：１（ビーズ／細胞）の比率でＤｙｎａｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズ、又はプレート結合抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２μｇ／ｍｌ）で細胞を刺激することによって誘導した。マウスＤｅｌｔａ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質で被覆したビーズ（上述のとおり調製したが、ただしヒトＩｇＧ４とのインキュベーションは室温で３０〜４０分であり、Ｄｅｌｔａ−Ｆｃとのインキュベーションは室温で２時間であった）又はコントロールビーズを、１０：１（ビーズ／細胞）の比率でいくつかのウェルに添加した。３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気で３又は４日間インキュベートした後、上澄みを除去し、サイトカイン産生を、製造者指示書に従って、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、及びＩＦＮｇに関してそれぞれＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ  Ｓｅｔ  ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）、ＯｐｔＥＩＡ  ＳｅｔヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）、及びＯｐｔＥＩＡ  ＳｅｔヒトＩＦＮｇ（カタログ番号５５５１４２）を用い、ＴＮＦａに関してＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＴＮＦａＤｕｏＳｅｔ（カタログ番号ＤＹ２１０）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０４５５】
結果を図１６から１８に示す。
【実施例１２】
【０４５６】
ビーズ：細胞比の変化
実施例１１の手順を繰り返したが、ただしコントロールビーズと細胞の比率及びマウスＤｅｌｔａ−ｈＩｇＧ４融合タンパク質被覆ビーズと細胞の比率は、１６：１から０．２５：１の間で変化させ（１６：１、８：１、４：１、２：１、１：１、０．５：１、０．２５：１と多様）、ヒトＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４融合タンパク質被覆ビーズも比較のために同じ比率で用いた。
【０４５７】
結果を図１９に示す。
【実施例１３】
【０４５８】
ＣＤ４５ＲＯ＋（メモリー細胞）及びＣＤ４５ＲＯ−（ナイーブ細胞）の比較
実施例１１の手順を繰り返したが、ただし刺激前に、ヒトＣＤ４＋をＣＤ４５ＲＯ＋（メモリー細胞）及びＣＤ４５ＲＯ−（ナイーブ細胞、データはスライドに示していない）に分離した。磁気分離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈから供給される抗ＣＤ４  Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔマイクロビーズ（カタログ番号５５１−０１）、次いで抗ＣＤ４５ＲＯマイクロビーズ（カタログ番号４６０−０１）を用い、Ｍｉｌｔｅｎｙｉプロトコルに従って行った。
【０４５９】
結果を図２０に示す。
【実施例１４】
【０４６０】
極性条件下での刺激マウスＣＤ４＋細胞におけるサイトカイン産生の測定
（ｉ）ＣＤ４＋細胞精製
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週齢、Ｃ５７Ｂ／６雌、８〜１０週齢、ＣＡＲＤ１雌、８〜１０週齢（Ｄ０１１．１０トランスジェニック、ＣＡＲトランスジェニック）と多様）から脾臓を摘出し、０．２μＭセルストレイナーから２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２２４０９）に２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの１０％ウシ胎児血清中β−メルカプトエタノールを添加）に通した。細胞懸濁液を遠心分離し（１１５０ｒｐｍ、５分）、培地を除去した。
【０４６１】
（赤血球を溶解するために）脾臓当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（再蒸留水中０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０Ｍ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）と共に、細胞を４分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｒ１０Ｆ培地で１回洗浄し、カウントした。ＣＤ４＋細胞を、製造者指示書に従って、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０４９−２０１）を用い、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＭＡＣＳ）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｉｓｌｅｙ、ＵＫ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）で正の選択により懸濁液から精製した。
【０４６２】
（ｉｉ）抗体被覆
９６ウェル平底プレートを、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳ、カタログ番号５５３０５８、クローン番号１４５−２Ｃ１１）及び１μｇ／ｍｌの抗ＩｇＧ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５５８７８）を含むダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆混合物を用いた。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、各ウェルに、ＤＰＢＳ１００μｌ、又は１０μｇ／ｍｌのＮｏｔｃｈリガンド（マウスＤｅｌｔａ１細胞外ドメイン／Ｉｇ４Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ−ｄｅｌｔａ）を含むＤＰＢＳ１００μｌを加えた。プレートを、３７℃で２〜３時間インキュベートし、次いで、再びＤＰＢＳで洗浄し、その後、細胞（（ｉ）のとおり調製）を添加した。
【０４６３】
（ｉｉｉ）１次ポリクローナル刺激
上述の（ｉｉ）のとおり予め被覆した９６ウェル平底プレートで、ＣＤ４＋細胞を培養した。細胞を、カウント後、４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）を含むＲ１０Ｆ培地中２×１０６／ｍｌで再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌを各ウェルに添加した。次いで、以下のとおり、各ウェルに極性培地又はコントロール培地１００μｌを添加して、最終量２００μｌを得た（２×１０５細胞／ウェル、抗ＣＤ２８最終濃度２μｇ／ｍｌ）。
非極性細胞：Ｒ１０Ｆ培地
Ｔｈ１極性細胞：抗ＩＬ−４抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４４３２）及びＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ２１０−１２）を含むＲ１０Ｆ培地
Ｔｈ２極性細胞：抗ＩＬ−１２抗体（１０μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４４７５）及び抗ＩＦＮｇ抗体（１μｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５４４０８）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号２１４−１４）を含むＲ１０Ｆ培地
【０４６４】
その後、プレートを、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０４６５】
次いで、上澄み１２５μｌを各ウェルから除去し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）の抗体対を用いて、ＩＬ−１０及びＴＮＦａに関してＥＬＩＳＡで試験するまで−２０℃で保存した。細胞を、新しいウェル（被覆していない）に１個を３個に分けて入れ、組換えヒトＩＬ−２（２．５ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ、カタログ番号２００−０２）を含むＲ１０Ｆ培地を加えた。
【０４６６】
結果を図２１に示す。
【実施例１５】
【０４６７】
ｉ）ヒトＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質の調製
ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインに融合したヒトＤｅｌｔａ１（本明細書では「ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ」と称し、添付の図では「Ｄ１Ｅ８Ｇ４」及び「Ｄ１Ｅ８Ｆｃ４」とも称する）の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を、ヒトＤｅｌｔａ１の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（たとえばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２を参照のこと）を発現ベクターｐＣＯＮγ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）に挿入し、ＣＨＯ細胞に得られたコンストラクトを発現させることによって調製した。
【０４６８】
ｉ）クローニング
ヒトＤｅｌｔａ様リガンド１（ｈＥＣＤＬＬ−１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２を参照のこと）の１６２２ｂｐ細胞外（ＥＣ）断片を、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号２８７０６）を用いてゲル精製した（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳ）。次いで、その断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｉＷＩ切断ｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）にライゲートし、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｉＷＩ、及びＡｐａｌ部位を除去した。
【０４６９】
このライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）プレートに画線培養し、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーをプレートから３ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いて培養物から精製し、その後、診断的にＨｉｎｄＩＩＩで消化した。クローンを選択し、修飾ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ｈＥＣＤＬＬ−１のグリセロールストックを用いてＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）プレートに画線培養し、３７℃で一晩インキュベートした。このプレートからコロニーを６０ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で一晩インキュベートした。培養物を、製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いてマキシプレップし（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳ）、最終ＤＮＡペレットをｄＨ２Ｏ３００μｌに再懸濁して、−２０℃で保存した。
【０４７０】
５μｇの修飾ｐＣＲＢｌｕｎｔ−ｈＥＣＤＬＬ−１ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、ＡｐａＩで部分的に消化した。次いで、１６２２ｂｐのｈＥＣＤＬＬ−１断片を、製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋ３０５１−１）を用いてゲル精製した。ＤＮＡを別のＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）カラムに通し、ＰＣＲプロトコルにより単離後、試料の濃度をライゲーションに使用可能なアガロースゲル分析によって調べた。
【０４７１】
プラスミドｐｃｏｎγ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）をＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩで切断し、以下のオリゴを（配列番号１）にライゲートした。
2006506322.tif 000019
【０４７２】
このライゲーションをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートを形質転換物２００μｌで画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１２のクローンを２×ＹＴ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）に取り、３７℃で終日増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いて培養物から精製し、診断的にＮｏｔＩで消化した。クローン（「ｐＤｅｖ４１」とする）を選択し、ｐＤｅｖ４１のグリセロールストックを用いてＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートを画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、このプレートからクローンを６０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）に取り、振盪しながら、３７℃で一晩インキュベートした。このクローンを、製造者指示書に従ってＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いてマキシプレップし、−２０℃で保存した。その後、ｐＤｅｖ４１クローン５マキシプレップを、ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩで消化して、ＩｇＧ４Ｆｃ断片（１６２４ｂｐ）を生じた。この消化物を、１％アガロースゲルで精製し、主要なバンドを切り出し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋ３０５１−１）を用いて精製した。
【０４７３】
その後、ポリヌクレオチドを、強力なｈＣＭＶプロモーターエンハンサー領域（ｈＣＭＶ−ＭＩＥ）の下流、後期ＳＶ４０プロモーターの制御下にあり、所望の遺伝子の転写を方向づけるｈＣＭＶプロモーターを有する、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（グルタミンを含まない培地での選択に必要とされるＧＳ遺伝子をコードする；ＧＳミニ遺伝子−ＧＳｃＤＮＡを含有し、これは野生型ハムスターＧＳ遺伝子のポリリンカーアデニル化シグナル及び最後のイントロンを含む）の上流で、ｐＥＥ１４．４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）のポリリンカー領域にクローニングした。ｐＥＥ１４．４のマキシプレップ５μｇを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、産物をゲル抽出し、アルカリホスファターゼで処理した。
【０４７４】
ｉｉ）発現コンストラクトの生成
３断片ライゲーションを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ切断ｐＥＥ１４．４、修飾ｐＣＲ  ＢｌｕｎｔのＥＣＤＬＬ−１（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ）、及びｐＤｅｖ４１から切断されたＩｇＧ４Ｆｃ断片（ＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ）を用いて行った。これをＤＨ５α細胞に形質転換し、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートを形質転換２００μｌで画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１２のクローンを２×ＹＴ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）に取り、ミニプレップを３７℃で終日増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログ番号２７１０６）を用いてプレップから精製し、診断的に消化し（ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）、マキシプレップのためにクローン（クローン８、「ｐＤｅｖ４４」とする）を選択した。ｐＤｅｖ４４クローン８のグリセロールストックを、ＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレートに画線し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、コロニーを６０ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）培養液に取り、３７℃で一晩インキュベートした。このプラスミドＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ３００３−２）を用いて単離した。
【０４７５】
ｉｉｉ）最適ＫＯＺＡＫ配列の付加
Ｋｏｚａｋ配列を、以下のように発現コンストラクトに挿入した。オリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、アニールして、次の配列を生じた。
2006506322.tif 000020
【０４７６】
ｐＤｅｖ４４をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＢＩで消化し、ゲル精製し、アルカリホスファターゼで処理した。消化物をオリゴでライゲートし、熱ショックによってＤＨ５α細胞に形質転換した。各形質転換物２００μｌをＬＢ＋Ａｍｐプレート（１００μｇ／ｍｌ）に画線し、３７℃で一晩インキュベートした。ミニプレップを３ｍｌ、２×ＹＴ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（カタログ番号２７１０６）を用いてミニプレップから精製し、診断的にＮｃｏＩで消化した。クローン（ｐＤｅｖ４６）を選択し、配列を確認した。グリセロールストックを画線し、培養液を増殖させ、プラスミドをマキシプレップした。
【０４７７】
ｉｖ）トランスフェクション
約１００μｇのｐＤｅｖ４６クローン１ＤＮＡを、制限酵素ＰｖｕＩで線状化した。生じたＤＮＡ試料を、フェノール／クロロホルム／ＩＡＡ抽出を用いて洗浄し、その後エタノールで洗浄し、析出させた。そのペレットを滅菌水に再懸濁し、線状化及び定量化を、アガロースゲル電気泳動及びＵＶスペクトロメトリで検査した。
【０４７８】
４０μｇの線状化ＤＮＡ（ｐＤｅｖ４６クローン１）及び１×１０７ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、室温で４ｍｍのキュベット中、無血清ＤＭＥＭに混合した。次いで、細胞を２８０ｖ、９７５μＦでエレクトロポレートし、非選択ＤＭＥＭに洗い流し、９６ウェルプレートに希釈し、インキュベートした。２４時間後、培地を除去し、選択培地（２５μＭ、Ｌ−ＭＳＸ）と交換した。６週後、培地を除去し、ＩｇＧ４サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。選択培地を交換した。陽性クローンを同定し、選択培地Ｌ−ＭＳＸ２５μｍに継代接種した。
【０４７９】
ｖ）発現
細胞は、セミコンフルエントまで選択ＤＭＥＭ（２５μｍ、Ｌ−ＭＳＸ）で増殖させた。その後、３〜５日間、培地を無血清培地（ＵｌｔｒａＣＨＯ）と置き換えた。生じた培地からＦＰＬＣによって、タンパク質（ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質）を精製した。
【０４８０】
得られた発現融合タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりであった（配列番号４）。
2006506322.tif 000021
配列中、最初の下線を引いた配列はシグナルペプチド（成熟タンパク質から開裂）であり、２番目の下線を引いた配列はＩｇＧ４Ｆｃ配列である。このタンパク質は通常、システインジスルフィド結合によって結合した２量体として存在する（たとえば図６の概略図を参照のこと）。
【実施例１６】
【０４８１】
ｉ）粒子結合のための遊離システイン尾部を有するＮｏｔｃｈリガンド細胞外ドメイン断片の調製
ヒトＤｅｌｔａ１（ＤＬＬ−１、配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２を参照）のアミノ酸１から３３２を含み、遊離システイン残基で終わる（「Ｄ１Ｅ３ｃｙｓ」）タンパク質断片を、以下のとおり調製した。
【０４８２】
ヒトＤＬＬ−１（２個のサイレント変異を有する）細胞外（ＥＣ）ドメインの全コード配列を含む鋳型を、胎盤ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６５１８−１）から作製し、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）のＣ末端Ｖ５ＨＩＳと合わせた胎盤ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲクローニング法によって調製した。この鋳型はＨｉｎｄＩＩＩからＰｍｅＩで切断されて、ＥＣドメインをコードする断片を提供し、これを以下のとおりプライマーを用いるＰＣＲの鋳型として用いた。
2006506322.tif 000022
【０４８３】
ＰＣＲは、次のサイクル条件でＰｆｕ  ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳ）を用いて行った。９５Ｃ５分、９５Ｃ１分、４５〜６９Ｃ１分、７２Ｃ１分で２５サイクル、７２Ｃ１０分。
【０４８４】
５８Ｃ、６２Ｃ、及び６７Ｃの生成物を、製造者指示書に従ってＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、１×ＴＡＥ中１％アガロースゲルから精製し、ｐＣＲＩＩｂｌｕｎｔベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔキット）にライゲートし、その後、ＴＯＰ１０細胞（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。得られたクローン配列を確認し、元の２個のサイレント変異のみが親クローンに存在することが見出された。
【０４８５】
得られた「Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ」をコードする配列を、ＰｍｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切除し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、１％アガロースゲル、１×ＴＡＥで精製し、ＰｍｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５−ＨＩＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲートして、それによってＶ５ＨＩＳ配列を除去した。得られたＤＮＡを、ＴＯＰ１０に形質転換した。得られたクローン配列を、３’ライゲーション部位で確認した。
【０４８６】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓコード断片を、ＰｍｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＣＤＮＡ３．１から切除した。次いで、ｐＥＥ１４．４ベクタープラスミド（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＵＫ）を、ＥｃｏＲＩを用いて制限し、５’オーバーハングを、クレノウ断片ポリメラーゼを用いて充填した。ベクターＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製カラムで清浄し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて制限し、その後、Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）で処理した。ｐＥＥ１４．４ベクター及びＤ１Ｅ３ｃｙｓ断片を、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いて、１×ＴＡＥ中１％アガロースゲルで精製し、その後、ライゲートし（Ｔ４リガーゼ）、プラスミドｐＥＥ１４．４ＤＬＬΔ４−８ｃｙｓを得た。生じたクローン配列を確認した。
【０４８７】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓコード配列は、以下のとおりである（配列番号７）。
2006506322.tif 000023
【０４８８】
このＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎエンドフリーマキシプレップキットを用い、Ｌｏｎｚａ  ＧＳシステムにおいて、安定細胞系トランスフェクション／選択のために調製した。
【０４８９】
ｉｉ）Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓの発現
ＤＮＡの線状化
上記（ｉ）のｐＥＥ１４．４ＤＬＬΔ４−８ｃｙｓプラスミドＤＮＡを、ＰｖｕＩによる制限酵素消化によって線状化し、次いで、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール（ＩＡＡ）を用いて洗浄し、その後、エタノール沈殿を行った。プラスミドＤＮＡを線状化に関してアガロースゲルで調べ、プレップの量及び質に関して２６０／２８０ｎｍで推測した。
【０４９０】
トランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、トランスフェクションの２４時間前、培地３ｍｌ中（ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ）ウェル当たり７．５×１０５細胞で６ウェルに接種し、トランスフェクションの当日に９５％コンフルエントを得た。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用い、線状化ＤＮＡ５μｇを用いて細胞をトランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を、５．５時間細胞シートに放置し、その後、一晩のインキュベーションのために半選択培地（ＤＭＥＭ、１０％ｄＦＣＳ、ＧＳ）３ｍｌで置換した。
【０４９１】
トランスフェクション２４時間後、完全選択培地（ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、１０％ｄＦＣＳ（ウシ胎児血清）、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）、２５μＭ  Ｌ−ＭＳＸ（メチオニンスルホキシミン））に交換し、さらにインキュベートした。
【０４９２】
トランスフェクション４日後及び１５日後に、細胞をウェル当たり１０５細胞で９６ウェルに平板培養した。
【０４９３】
クローン平板培養２週後、増殖に関して、９６ウェルを顕微鏡でスクリーニングした。単一コロニーを同定し、コンフルエント％をスコアリングした。コロニーサイズが＞３０％であったとき、培地を除去し、抗ヒトＤｅｌｔａ１抗血清に対するドットブロットにより発現に関してスクリーニングした。培地のＰＡＧＥウエスタンブロットにおいて、抗ヒトＤｅｌｔａ１抗血清に反応性の３６ｋＤＡのバンドの存在によって、高陽性を確認した。
【０４９４】
細胞を、９６ウェルから、６ウェル、Ｔ２５フラスコに継代接種することにより増殖し、凍結した。最速増殖陽性クローン（ＬＣ０９  ０００１）を、タンパク質発現のために増殖した。
【０４９５】
Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓ発現及び精製
Ｔ５００フラスコに、選択培地８０ｍｌ中１×１０７細胞を接種した。インキュベーション４日後、培地を除去し、細胞シートをＤＰＢＳで洗浄し、ＧＳを補足した３２５培地１５０ｍｌを各フラスコに加えた。フラスコをさらに７日間インキュベートし、その後、採取した。採取培地を、０．６５〜０．４５μｍフィルタで濾過して浄化し、凍結した。凍結採取物を、次のとおりＦＰＬＣによって精製した。
【０４９６】
凍結採取物を解凍し、濾過した。１７ｍｌのＱセファロースカラムを、１０カラム容量に関して、０．１ＭのＴｒｉｓｐＨ８緩衝液に平衡した。採取物を、３ｍｌ／分に設定したＰ１ポンプを用いてカラムに負荷し、流出物を個別容器に回収した（これは逆精製である。多くのＢＳＡ混入物がＱセファロースＦＦに結合し、本発明の標的タンパク質は結合せず、そのため流出物に残存する）。流出物を、１０ｋＤａカットオフフィルタカートリッジを用いてＴＦＦ装置で濃縮し、濃縮中、３×０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７緩衝液で洗浄した。５００ｍｌを３５ｍｌ、最終濃度３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０４９７】
試料を、還元及び非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥに供した（ゲルを図２２に示す）。
【０４９８】
得られた発現Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりであった（配列番号８）。
2006506322.tif 000024
（配列中、イタリック体の配列はリーダーペプチドであり、下線を引いた配列はＤＳＬドメインであり、太字の配列は３個のＥＧＦリピートであり、末端Ｃｙｓ残基は太い下線で示している）。
【０４９９】
ｉｉｉ）Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質の還元
上記（ｉｉ）のＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質４０μｇに、１００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０及び５ｍＭのＥＤＴＡを加え、１００μｌとした。２容量の固定化ＴＣＥＰ（ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィン塩酸塩、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳ、カタログ番号７７７１２、１ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で予め３回洗浄）を添加し、混合物を回転しながら、室温で３０分間インキュベートした。
【０５００】
この樹脂を、微量遠心機（１３０００回転／分、５分）において室温で沈殿させ、上澄みを清浄なエッペンドルフ管に移し、氷上に保存した。タンパク質濃度を、Ｗａｒｂｕｒｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ法によって測定した。
【実施例１７】
【０５０１】
Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質による被覆Ｍ−４５０エポキシダイナビーズ
ダイナビーズＭ−４５０エポキシ（Ｄｙｎａｌ、カタログ番号１４０．０１、平均径４．５μｍ）は、４×１０８ビーズ／ｍｌの蒸留水中のエタノール洗浄ビーズとしてＤｙｎａｌ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）から供給される。これらのビーズは、さらなる活性化を必要としない表面エポキシ（グリシジルエーテル）反応基を有する磁気ポリスチレンビーズである。
【０５０２】
タンパク質は、２４時間後に生じる第一アミン基の共有結合による初期結合において疎水的に吸着される。結合反応は、４℃から３７℃の温度、２４時間のインキュベーション時間を通して、ｐＨ中性で起こる。
【０５０３】
適切な量のエポキシビーズを、磁石を用いてＰＢＳで洗浄した（３×１ｍｌ）。
【０５０４】
実施例１５の精製ｈＤｅｌｔａ１−ＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質、又は上記実施例１６のＤ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質を、最終濃度４〜８×１０８ビーズ／ｍｌでビーズに添加した（典型的な開始濃度１０７ビーズ当たり〜５μｇ）。
【０５０５】
一部の例では、次のように結合配向を助けるために、ブロッキングタンパク質を添加した。
【０５０６】
ビーズを、振盪しながら４〜３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。ブロッキングタンパク質として、０．１％ＢＳＡを添加した（Ｄｙｎａｌは典型的に、抗体結合用に、０．１〜０．５％ＢＳＡ又はＨＡＳを提案している）。次いで、タンパク質の安定性に応じて、ビーズを、振盪しながら４〜３７℃で１６〜２０時間放置し、確実に共有結合させた。被覆ビーズを、磁石を用いて、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。ここで、洗浄緩衝液への０．１％ＢＳＡの添加は、被覆後のビーズの完全なブロッキングを確実なものにする。被覆ビーズを、４℃で保存した。
【０５０７】
種々のビーズの活性は、上述のＣＨＯ−Ｎ２安定レポーターアッセイにおいて（コントロールとして同じ条件下でｈＩｇＧ４被覆ビーズを用いる平行実験と共に）試験した。ＣＨＯ／ＣＨＯ−ｈＤ１共培養アッセイ（ビーズの代わりに完全長Ｄｅｌｔａ１を発現するＣＨＯ細胞又は天然ＣＨＯ細胞を用いる）を、さらなるコントロールとして同時に行った。結果を図２３に示す。
【実施例１８】
【０５０８】
Ｎｏｔｃｈリガンドタンパク質による被覆Ｍ−２７０アミンダイナビーズ
活性化のために、１．５×１０８のＭ−２７０アミンダイナビーズ（平均径２．７μｍ）を、０．５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で３回洗浄し、その後、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７で２．５×１０８／ｍｌとした。
【０５０９】
スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２２３２２）を０．２ｍｇ／ｍｌに添加し、混合物を、回転しながら室温で３０分間インキュベートした。ビーズを、０．５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で３回洗浄し、その後、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７で１×１０９／ｍｌとした。
【０５１０】
１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７中の５×１０７の「活性化」アミンビーズを、上記実施例１６のＴＣＥＰ還元Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質２０μｇと合わせ、リン酸ナトリウムｐＨ７中で２５０μｌとした。得られた混合物を、回転しながら４Ｃで１８時間インキュベートした。
【０５１１】
得られたタンパク質結合ビーズを、ＤＰＢＳ０．５ｍｌで３回洗浄し、ＤＰＢＳで２×１０８／ｍｌとした。活性を、上述のＣＨＯ−Ｎｏｔｃｈ２レポーターアッセイを用いて（コントロールとして同じ条件下で非還元Ｄ１Ｅ３Ｃｙｓタンパク質被覆ビーズ及び非被覆ビーズを用いる平行実験と共に）測定した。結果を図２４に示す。
【実施例１９】
【０５１２】
Ｎｔｏｃｈリガンドタンパク質による被覆硫酸−ポリスチレン／ラテックスビーズ
界面活性剤を含まない硫酸白色ポリスチレンラテックスビーズ（製品番号１−５０００）は、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳ）から提供された。このポリスチレンマイクロスフェアは、平均径４．９μｍを有し、６．３×１０８ビーズ／ｍｌで蒸留脱イオン水に分散され、供給された。このビーズは負に荷電されており、表面にスルフェート基を有し、表面は本質的に疎水性である。
【０５１３】
ビーズを、Ｄ１Ｅ８Ｇ４（上記のとおり調製）又はヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４、Ｓｉｇｍａ、コントロールとして）で被覆するために、供給されたビーズの一部分を取り、１ｍｌの滅菌ＰＢＳに入れ、１３Ｋで１０分間回転し、さらに１ｍｌのＰＢＳで再洗浄した。このビーズを、１０７ビーズ当たり５０μｌでＰＢＳに再懸濁した。ビーズを被覆するために用いるタンパク質を、５００μｌエッペンドルフ管においてＰＢＳ中最終濃度２００μｇ／ｍｌ、１０７ビーズ当たり１０μｇの濃度で添加し、４℃で一晩、回転ホイールに置いた。翌日、１３Ｋで１０分間、微量遠心機で沈殿させ、３×１ｍｌＰＢＳで洗浄することによって、ビーズを洗浄した。最終洗浄の後、２×１０７ビーズ／ｍｌで完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＨＩＦＣＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ）に再懸濁し、完全培地で作製した連続１：２希釈のビーズを用いて、ウェル当たり２×１０６ビーズで開始して、ＣＨＯ−Ｎ２シグナリングアッセイで検定した。結果を図２５に示す。
【実施例２０】
【０５１４】
ＣＤ４＋細胞精製
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ雌、８〜１０週齢）から脾臓を摘出し、補助剤を含まないＲＰＭＩ培地中、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で４０分間処理した。組織を、０．２μセルストレイナー（Ｆａｌｃｏｎ）から２０ｍｌのＲ１０Ｆ培地（Ｒ１０Ｆ−ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２２４０９）に２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５×１０−５Ｍの１０％ウシ胎児血清中β−メルカプトエタノールを添加）に通した。細胞懸濁液を遠心し（１１５０ｒｐｍ、５分）、培地を除去した。
【０５１５】
（赤血球を溶解するために）脾臓当たり５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（再蒸留水中０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１．０Ｍ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）と共に、細胞を４分間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｒ１０Ｆ培地で１回洗浄し、カウントした。ＣＤ４＋細胞を、製造者指示書に従って、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０４９−２０１）を用い、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＭＡＣＳ）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｉｓｌｅｙ、ＵＫ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）で正の選択により懸濁液から精製した。
【実施例２１】
【０５１６】
抗体被覆
９６ウェル平底プレートを抗体で被覆するために、次のプロトコルを用いた。
【０５１７】
プレートを、１μｇ／ｍｌの抗ハムスターＩｇＧ抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳ、カタログ番号５５４００７）を含むダルベッコリン酸緩衝食塩水ＤＰＢＳで被覆した。ウェル当たり１００μｌの被覆混合物を用いた。プレートを、４℃で一晩インキュベートし、その後、ＤＰＢＳで洗浄した。次いで、各ウェルに、０．１〜１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５３０５８、クローン番号１４５−２Ｃ１１）を含むＤＰＢＳ１００μｌを加えた。
【０５１８】
プレートを、３７℃で２〜３時間インキュベートし、次いで、再びＤＰＢＳで洗浄し、その後、細胞（実施例２０のとおり調製）を添加した。
【実施例２２】
【０５１９】
１次ポリクローナル刺激
実施例２１に従って予め被覆した９６ウェル平底プレートで、ＣＤ４＋細胞を培養した。細胞を、カウント後、Ｒ１０Ｆ培地中４×１０６／ｍｌで再懸濁し、ウェル当たり５０μｌの懸濁液を添加した。８μｇ／ｍｌのＣＤ２８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号５５３２９４、クローン番号３７．５１）を含むＲ１０Ｆ培地を、ウェル当たり５０μｌ添加した。Ｎｏｔｃｈリガンドで被覆したビーズを適切な量で添加し、ビーズ：細胞の最終比０．１〜２０：１を得た。Ｒ１０Ｆ培地を添加して、最終量２００μｌを得た（２×１０５細胞／ウェル、抗ＣＤ２８最終濃度２μｇ／ｍｌ）。次いで、プレートを、３７℃で７２時間インキュベートした。
【０５２０】
次いで、上澄み１７０μｌを各ウェルから除去し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）の抗体対を用いて、ＩＬ−１０、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１３に関してＥＬＩＳＡで試験するまで−２０℃で保存した。
【０５２１】
上記のとおり調製した種々のビーズの結果を（コントロールとして対応する非被覆ビーズと共に）図２６から３３に示す。
【実施例２３】
【０５２２】
１μｍ、Ｄｙｎａｌビーズ
ＭｙＯｎｅストレプトアビジンビーズ（１μｍ、Ｄｙｎａｌ６５０．０１）及びＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎビオチンバインダー（４．５μｍ、Ｄｙｎａｌ１１５．２１）を、供給元によって推奨された結合能に基づいて、抗ｈＩｇＧ４−ビオチン抗体で被覆した。
【０５２３】
簡潔に述べると、抗ｈＩｇＧ４−ビオチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０μｇを、ＭｙＯｎｅビーズ（７〜１２×１０８ビーズに相当）１ｍｇ、又はＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎビーズ１０８と共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、ヒトＤｅｌｔａ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質１００μｇ、又はｈＩｇＧ４（Ｓｉｇｍａ）１００μｇと共に室温で２時間さらにインキュベートした。洗浄後、ＭｙＯｎｅビーズ又はＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎビーズを、５００μｌのＲＰＭＩ／ＢＳＡ０．１％に再懸濁し、４℃で保存した。
【０５２４】
ビーズを、上述のとおりＣＨＯ−Ｎ２レポーターアッセイで（コントロールとして非被覆ビーズと共に）試験した。結果を図３４に示す。
【実施例２４】
【０５２５】
ＭｙＯｎｅ又はＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ  Ｄｙｎａｌマイクロビーズに固定されたＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４の存在下でのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生の調節
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて血液から精製した。簡潔に述べると、血液２８ｍｌをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離培地２１ｍｌに載せ、１８〜２０℃で４０分間、４００ｇで遠心分離した。ＰＢＭＣを界面から回収し、３回洗浄して、ＣＤ４＋Ｔ細胞精製に用いた。
【０５２６】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造者指示書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈの抗ＣＤ４マイクロビーズを用い、正の選択により単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びβ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中、１０５ＣＤ４／ウェル／２００μｌで、９６ウェルプレート（平底）において３重でインキュベートした。
【０５２７】
サイトカイン産生は、１：１（ビーズ／細胞）の比率でＤｙｎａｌの抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞増殖ビーズで細胞を刺激することによって誘導した。１０、５、２．５、１．２５、０．６２μｌのヒトＤｅｌｔａ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質で被覆したビーズ（上述のとおり調製）又はコントロールビーズをいくつかのウェルに添加した。３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気で３日間インキュベーションした後、上澄みを除去し、サイトカイン産生を、製造者指示書に従って、ＩＬ−１０、ＩＬ−５に関してそれぞれＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ  Ｓｅｔ  ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）及びＯｐｔＥＩＡ  ＳｅｔヒトＩＬ−５（カタログ番号５５５２０２）を用い、ＩＬ−２に関してＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＩＬ−２ＤｕｏＳｅｔ（カタログ番号ＤＹ２０２）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０５２８】
結果を図３５に示す。
【実施例２５】
【０５２９】
混合リンパ球反応中のＭｙＯｎｅ又はＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎ  Ｄｙｎａｌマイクロビーズに固定されたＤｅｌｔａ１−ｈＩｇＧ４によるサイトカイン産生の調節
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、上述のとおり２人のドナー（ドナーＡ及びドナーＢ）の血液から精製した。
【０５３０】
ヒトＣＤ１４＋単球、及びＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造者指示書に従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈの抗ＣＤ１４及び抗ＣＤ４マイクロビーズを用い、正の選択によって、それぞれドナーＡ及びドナーＢのＰＢＭＣから単離した。
【０５３１】
ＣＤ１４＋Ｔ細胞（ドナーＡ）を、５０ｎｇ／ｍｌのｈＧＭ−ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのｈＩＬ−４（共にＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）の存在下、培地中［ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／グルタミン／Ｂ２−メルカプトエタノール／抗体］で６日間インキュベートすることによって、樹状細胞（ＤＣ）に分化した。最後の２４時間、ＬＰＳ１μｇ／ｍｌ（ＳｉｇｍａＬ−２６５４）の培養に添加することによって、樹状細胞成熟を誘導した。
【０５３２】
成熟ＤＣを、ＲＰＭＩ中５０μｇ／ｍｌのＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣ（Ｓｉｇｍａ）で１時間処理し、４回洗浄した。次いで、これらの細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びβ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地中、９６ウェルプレートにおいて３重で、４×１０４、１×１０４、２．５×１０３、６．２５×１０２細胞／ウェルで平板培養した。２×１０５同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞（ドナーＢ）を各ウェルに添加し、最終量２００μｌ／ウェルを得た。
【０５３３】
１０μｌのヒトＤｅｌｔａ１ＥＣドメイン−ｈＩｇＧ４融合タンパク質で被覆したビーズ（上述のとおり調製）又はコントロールビーズをいくつかのウェルに添加した。
【０５３４】
３７℃／５％ＣＯ２／加湿雰囲気でインキュベーション５日後に上澄みを除去し、サイトカイン産生を、製造者指示書に従って、ＩＬ−１０及びＩＦＮｇに関してそれぞれＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットＯｐｔＥＩＡ  Ｓｅｔ  ヒトＩＬ１０（カタログ番号５５５１５７）及びＯｐｔＥＩＡ  ＳｅｔヒトＩＦＮｇ（カタログ番号５５５１４２）を用い、ＴＮＦａに関してＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのヒトＴＮＦａＤｕｏＳｅｔ（カタログ番号ＤＹ２１０）を用い、ＥＬＩＳＡによって評価した。
【０５３５】
結果を図３６に示す。
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０５３６】
【図１】Ｎｏｔｃｈシグナリング経路の概略を示す図である。
【図２】Ｎｏｔｃｈリガンド、Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａの概略を示す図である。
【図３】種々のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び哺乳動物Ｎｏｔｃｈリガンド由来のＤＳＬドメインのアラインされたアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ヒトＤｅｌｔａ−１、Ｄｅｌｔａ−３、及びＤｅｌｔａ−４のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】ヒトＪａｇｇｅｄ−１及びＪａｇｇｅｄ−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図６】本発明に用いることのできる種々のＮｏｔｃｈリガンドドメイン／ＩｇＦｃドメイン融合タンパク質の概略を示す図である。
【図７】Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターをビーズと共有結合する反応スキームを示す図である。
【図８】Ｎｏｔｃｈシグナリングのモジュレーターとビーズとの非共有結合の概略を示す図である（ストレプトアビジン／ビオチン結合を使用）。
【図９】実施例３の結果を示す図である。
【図１０】実施例４の結果を示す図である。
【図１１】実施例５の結果を示す図である。
【図１２】実施例６の結果を示す図である。
【図１３】実施例７の結果を示す図である。
【図１４】実施例８の結果を示す図である。
【図１５】実施例１０の結果を示す図である。
【図１６】実施例１１の結果を示す図である。
【図１７】実施例１１の結果を示す図である。
【図１８】実施例１１の結果を示す図である。
【図１９】実施例１２の結果を示す図である。
【図２０】実施例１３の結果を示す図である。
【図２１】実施例１４の結果を示す図である。
【図２２】実施例１６の結果を示す図である。
【図２３】実施例１７の結果を示す図である。
【図２４】実施例１８の結果を示す図である。
【図２５】実施例１９の結果を示す図である。
【図２６】実施例２２の結果を示す図である。
【図２７】実施例２２の結果を示す図である。
【図２８】実施例２２の結果を示す図である。
【図２９】実施例２２の結果を示す図である。
【図３０】実施例２２の結果を示す図である。
【図３１】実施例２２の結果を示す図である。
【図３２】実施例２２の結果を示す図である。
【図３３】実施例２２の結果を示す図である。
【図３４】実施例２３の結果を示す図である。
【図３５】実施例２４の結果を示す図である。
【図３６】実施例２５の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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