(57)【要約】この発明は、本出願で分泌タンパク質、特にメタロプロテアーゼファミリーのメンバーとして同定したINSP0055a及びINSP005bと称する新規タンパク質、並びにこれらタンパク質及びそのコード化遺伝子由来の核酸配列の、病気の診断、予防及び治療における使用に関する。
2006516888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
（ｉ）配列番号:34又は配列番号:36に示されるアミノ酸配列を含み；
（ii）メタロプロテアーゼ分類の分泌タンパク質として機能し、或いは前記（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するポリペプチドの断片であり；又は
（iii）前記（ｉ）若しくは（ii）の機能等価物である；
ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号:34又は配列番号:36に示される配列から成り、或いはその機能等価物である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドであって、該ポリペプチドが分泌ポリペプチドであり、かつ
（ｉ）配列番号:14に示されるアミノ酸配列を含み；
（ii）メタロプロテアーゼ分類の分泌タンパク質として機能し、或いは前記（ｉ）のポリペプチドと共通の抗原決定基を有するポリペプチドの断片であり；又は
（iii）前記（ｉ）若しくは（ii）の機能等価物である；
ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号:14に示される配列から成り、或いはその機能等価物である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号:14、配列番号:34又は配列番号:36に示されるアミノ酸配列と相同性であり、かつメタロプロテアーゼ活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の機能等価物であるポリペプチド。
【請求項６】
配列番号:14、配列番号:34若しくは配列番号:36に示されるアミノ酸配列又はその活性断片と80％より高い配列同一性、好ましくは85％、90％、95％、98％若しくは99％より高い配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の断片又は機能等価物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする精製核酸分子。
【請求項８】
配列番号:13、配列番号:33又は配列番号:35に示される核酸配列を有し、或いはその重複等価物又は断片である、請求項７に記載の精製核酸分子。
【請求項９】
高厳密条件下、請求項７又は請求項８に記載の核酸分子とハイブリダイズする精製核酸分子。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項で示される核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１１】
前記ベクターがPCR-TOPO-IPAAA78836-2ベクター（配列番号:39）である、請求項１０のベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがPCR-TOPO-IPAAA78836-1ベクター（配列番号:38）である、請求項１０のベクター。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合し、かつ好ましくは該ポリペプチドのメタロプロテアーゼ活性を阻害するリガンド。
【請求項１５】
抗体である、請求項１４に記載のリガンド。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現又は活性のレベルを高め、又は低減する化合物。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドに、該ポリペプチドのいずれの生物学的効果をも誘発することなく結合する、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
天然又は修飾基質、リガンド、酵素、受容体又は構造的若しくは機能的ミメティックである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
病気の治療又は診断で使うための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４若しくは１５に記載のリガンド、又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
患者の病気の診断方法であって、前記患者由来の組織内における請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現のレベルを評価する工程、又は請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの活性のレベルを評価する工程と、対照レベルに対する前記発現若しくは活性のレベルを比較する工程を含み、前記対照レベルと異なるレベルが病気の指標である、方法。
【請求項２１】
インビトロで行う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
以下の工程：（ａ）請求項１４又は１５に記載のリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生体試料と接触させる工程；及び（ｂ）前記複合体を検出する工程を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程：
ａ）患者由来の組織試料と核酸プローブとを、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プローブとの間のハイブリッド複合体の形成を許容する厳密条件下で接触させる工程；
ｂ）工程ａ）で用いる条件と同一条件下で対照試料と前記プローブとを接触させる工程；及び
ｃ）前記試料中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
を含み、前記対照試料内のハイブリッド複合体のレベルと異なる前記患者試料内のハイブリッド複合体のレベルの検出が病気の指標である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程：
ａ）患者の組織由来の核酸試料と核酸プライマーとを、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子と前記プローブとの間のハイブリッド複合体の形成を許容する厳密条件下で接触させる工程；
ｂ）工程ａ）で用いる条件と同一条件下で対照試料と前記プライマーとを接触させる工程；
ｃ）前記試料化核酸を増幅する工程；及び
ｄ）患者及び対照の両試料由来の増幅核酸のレベルを検出する工程；
を含み、前記対照試料内の増幅核酸のレベルと有意に異なる前記患者試料内の増幅核酸のレベルの検出が病気の指標である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程：
ａ）病気について検査する患者から組織試料を得る工程；
ｂ）請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を前記組織試料から単離する工程；及び
ｃ）前記核酸分子内における病気と関連する突然変異の存在を該病気の指標として検出することによって、前記患者を病気について診断する工程；
を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記核酸分子を増幅して増幅産物を形成する工程と、前記増幅産物内の突然変異の存否を検出する工程とを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
厳密条件下で前記核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブと前記核酸分子を接触させて、病気に関連する突然変異に対応するいずれかの部分に前記核酸プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二重鎖分子を形成する工程；及び病気関連突然変異の存否の指標として前記プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の存否を検出する工程によって、前記患者内の突然変異の存否を検出する、請求項２５又は２６の方法。
【請求項２８】
前記病気が、気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害、生殖障害又はメタロプロテアーゼが関係する他の病理状態である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記病気が自己免疫疾患、アルコール性肝不全を含むウィルス性若しくは急性肝疾患、又は炎症性疾患である、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの、分泌タンパク質、好ましくはメタロプロテアーゼとしての使用。
【請求項３１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４若しくは１５に記載のリガンド、又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の化合物を含んでなる医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を含んでなるワクチン組成物。
【請求項３３】
気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害、生殖障害又はメタロプロテアーゼが関係する他の病理状態の治療用薬物の製造で使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４若しくは１５に記載のリガンド、又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
自己免疫疾患、アルコール性肝不全を含むウィルス性若しくは急性肝疾患、又は炎症性疾患の治療用薬物の製造で使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４若しくは１５に記載のリガンド、又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
患者の治療方法であって、前記患者に、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクター、請求項１３に記載の宿主細胞、請求項１４若しくは１５に記載のリガンド、又は請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項３０に記載の医薬組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項３６】
罹患患者における前記天然遺伝子の発現又は前記ポリペプチドの活性が、健康な患者の発現又は活性のレベルに比べて低い病気では、前記患者に投与する前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアゴニストである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
罹患患者における前記天然遺伝子の発現又は前記ポリペプチドの活性が、健康な患者の発現又は活性のレベルに比べて高い病気では、前記患者に投与する前記ポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアンタゴニストである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
患者の病気の治療措置のモニタリング方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの発現若しくは活性のレベル、又は前記患者由来組織内における請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子の発現のレベルを時間期間にわたってモニターする工程を含み、前記時間期間にわたり前記発現又は活性のレベルが対照レベルに向けての変化することが、前記病気の退行の指標である方法。
【請求項３９】
病気の治療及び／又は診断に有効な化合物の同定方法であって、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド、又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を、前記ポリペプチド又は核酸分子に対する結合アフィニティーを有すると推測される１種以上の化合物と接触させる工程、及び前記核酸分子又はポリペプチドに特異的に結合する化合物を選択する工程を含む方法。
【請求項４０】
病気の診断に有用なキットであって、厳密条件下で請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含有する第１容器；前記核酸分子を増幅するために有用なプライマーを含有する第２容器；及び病気の診断を容易にするための前記プローブ及びプライマーの使用説明書を含んでなるキット。
【請求項４１】
さらに、非ハイブリダイズRNAを消化するための薬剤を保持する第３容器を含む、請求項４０のキット。
【請求項４２】
少なくとも１つの核酸分子が請求項７〜９のいずれか１項に記載の核酸分子である核酸分子のアレイを含んでなるキット。
【請求項４３】
請求項１〜６のいずれか１項で示されるポリペプチドに結合する１個以上の抗体と、前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬とを含んでなるキット。
【請求項４４】
形質転換して、高レベル、低レベル又は不在レベルて請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する、トランスジェニック又はノックアウト非ヒト動物。
【請求項４５】
請求項４４に記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させ、かつ前記動物の病気に及ぼす前記化合物の効果を決定することよって、病気の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４６】
前記病気が、請求項３３又は３４で述べた病気の１つである、請求項３５〜４１のいずれか１項又は請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、本出願で分泌タンパク質、特にメタロプロテアーゼファミリーのメンバーとして同定したINSP0055a及びINSP005bと称する新規タンパク質、並びにこれらタンパク質及びそのコード化遺伝子由来の核酸配列の、病気の診断、予防及び治療における使用に関する。
本明細書で引用するすべての出版物、特許及び特許出願は、参照によって全部取り込まれる。
【０００２】
（背景）
機能ゲノミクスの時代が成熟するにつれ、現在、創薬のプロセスが基本的変革を経験している。用語“機能ゲノミクス”は、バイオインファマティクス手段を利用して、機能を問題のタンパク質配列の結果とみなすアプローチに適用する。配列データの生成速度が、機能をこれらタンパク質配列に割り当てる研究所の能力を急速に追い越しているので、このような手段がますます必要になって来ている。
バイオインファマティクス手段の効力及び精度が増すにつれ、これら手段は、生化学的特徴づけの従来法を急速に置き換えている。実際、本発明を確認する際に使用する先端バイオインファマティクス手段は、今や高度の信頼を置ける結果を出力することができる。
配列データが入手可能になり、かつ進行中の基礎に基づいて重要な発見が為されているように、種々の施設や商業組織が配列データを調べている。しかし、さらに研究及び創薬用標的として遺伝子及び遺伝子がコードするポリペプチドを同定かつ特徴づけする継続的な必要が残っている。
【０００３】
（分泌タンパク質の背景）
細胞が細胞外タンパク質を合成かつ分泌する能力は、多くの生物学的プロセスにとって中心的である。酵素、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質及び信号発信分子はすべて細胞によって分泌される。これは、分泌小胞と原形質膜の融合による。すべてではないが、ほとんどの場合、タンパク質はシグナルペプチドによって小胞体及び分泌小胞中に方向づけられる。シグナルペプチドは、細胞質から分泌小胞のような膜結合区画へのポリペプチド鎖の運搬に影響するシス作用配列である。分泌小胞を標的にするポリペプチドは、細胞外マトリックス中に分泌され、又は原形質膜内に保持される。原形質膜内に保持されるポリペプチドは、１つ以上の膜貫通ドメインを有する。細胞が機能するときに中心的役割を果たす分泌タンパク質の例は、サイトカイン、ホルモン、細胞外マトリックスタンパク質（接着分子）、プロテアーゼ、並びに成長及び分化因子である。これらタンパク質のいくつかの説明を以下に述べる。
【０００４】
プロテアーゼは、ペプチド及びタンパク質中のアミド結合を不可逆的に加水分解する酵素である。プロテアーゼは広範に分布しており、タンパク質及びペプチドの活性化からタンパク質の分解まで多くの異なった生物学的プロセスに関与している。アンジオテンシン変換酵素(ACE)のインヒビターは数年間で最も成功した抗高血圧薬の１つであるが、プロテアーゼが多くの異なった病気に関与することが分かっているにもかかわらず、プロテアーゼを目標とする薬物は薬学ではまだ珍しい。最近、HIVプロテアーゼインヒビターの承認後、プロテアーゼが有益な治療目標として実質的パブリシティーを得た。
プロテアーゼは大ファミリーに分割できる。用語“ファミリー”を用いて、各メンバーが、全配列又は少なくとも触媒活性の原因である配列の一部にわたって少なくとも１つの他のメンバーに対して進化した関係を示すプロテアーゼの群を示す。各ファミリーの名称は、ファミリー内のプロテアーゼの触媒活性タイプを反映する。従って、セリンプロテアーゼはＳファミリーに属し、スレオニンプロテアーゼはＴファミリーに属し、アスパルチルプロテアーゼはＡファミリーに属し、システインプロテアーゼはＣファミリーに属し、メタロプロテアーゼはＭファミリーに属する。メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼは、細胞外マトリックス内で普通に見られる。
【０００５】
メタロプロテアーゼ（Ｍファミリー）
メタロプロテアーゼは、亜鉛結合モチーフ（HEXXH）の存否によって２つの主要群に分割できる。
1.1  HEXXHモチーフの存在(22ファミリー)：Prosite番号：PDOC00129
興味深いメンバーを有するファミリー：
M2：ぺプチジル-ジペプチダーゼA（アンギオテンシンI変換酵素：ACE）
M13：ネプリリシン(Neprilysin)（エンケファリナーゼA＝中性エンドペプチダーゼ）、内皮変換酵素（ECE）
M10B:マトリキシン(Matrixin)（マトリックスメタロプロテアーゼ＝MMPs）
M12B:レプロリシン(Reprolysin) (ADAM-10；ADAM-17＝NF-α変換酵素＝TACE)/デシンテグリン(Desintegrin )（他のADAMプロテアーゼ）。ADAMsは、細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用で複数の潜在的機能を有するタンパク質の大きく、広範に発現され、かつ発生的に制御されたファミリーである。これらのうち、TACEは、関節炎用の新興目標を代表する。
M41：このファミリーは、ATP-依存性メタロプロテアーゼ：FtsH、プロテアソームタンパク質を含む。
【０００６】
最高に治療的に興味深いメタロプロテイナーゼ群の１つは、マトリックスメタロプロテイナーゼファミリー(MMPs)である。マトリックスメタロプロテイナーゼは、体全体の細胞外マトリックスの再構築の責任がある亜鉛含有酵素である。これらは癌（侵襲性を高め、新しい血管に影響を及ぼす）、関節炎（軟骨退化(Dahlberg, L.ら,  Arthritis Rheum. 2000 43(3):673-82)及びTNF-α変換(Hanemaaijer,R.ら, J Biol Chem. 1997 272(50):31504-9, Shlopov, B.V.ら, Arthritis Rheum. 1997 40(11):2065-74)にも関与)に関係があることが分かっている。実際、種々のMMPsが関節炎（Seitz, M.ら, Rheumatology (Oxford)2000 39(6):637-645, Yoshihara, Y.ら, Ann Rheum Dis. 2000 59(6):455-61, Yamanaka, H.ら, Lab Invest. 2000 80(5):677-87, Jovanovic, D.V.ら, Arthritis Rheum. 2000 May;43(5):1134-44, Ribbens, C.ら, J Rheumatol. 2000 27(4):888-93）及び癌（Sakamoto, Y.ら, Int J Oncol. 2000 17(2):237-43, Kerkela, E.ら, J Invest Dermatol. 2000 114(6):1113-9, Fang, J.ら, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97(8):3884-9, Sun, Y.ら, J Biol Chem. 2000 275(15):11327-32, McCawley, L.J.ら, Mol Med Today. 2000 6(4):149-56, Ara,T.ら, J Pediatr Surg. 2000 35(3):432-7, Shigemasa, K.ら, Med Oncol. 2000 17(1):52-8, Nakanishi, K.ら, Hum Pathol. 2000 31(2):193-200, Dalberg, K.ら, World J Surg. 2000 24(3):334-40）のような病気で過剰発現されることが分かっている。これら酵素のインヒビターは、癌と関節炎の両治療で使う可能性のある治療薬として示唆されている。さらに最近では、MMPsが可溶性サイトカイン受容体、成長因子及び他の細胞メディエイターの放出で役割がありうることが示され、選択的MMPsインヒビターが以前に提言されたより広範な治療用途を有しうることを示唆している。
【０００７】
MMPsは、触媒領域以外のそのドメイン構造のアミノ酸配列相同性に基づいて４ファミリーに分割されている。
最小ドメインファミリー：マトリリジン(matrilysin)(PUMP-1、MMP-7)はプロテオグリカン、ラミニン及びフィブロネクチンを切断する。
ヘモペキシンドメインファミリー：
コラゲナーゼ：原繊維コラーゲンを切断するユニークな能力。軟骨退化におけるコラゲナーゼの役割のため、これらはリュウマチ性関節炎及び骨関節治療用のための魅力的な目標になっている。
・コラゲナーゼ線維芽細胞コラゲナーゼ（間質性コラゲナーゼ、MMP-1）
・好中球コラゲナーゼ(MMP-8)
・コラゲナーゼ-3(MMP-13)
メタロエラスターゼ：MME(MMP-12)
ストロメリシン-1(Stromelysin-1)(MMP-3)、2(MMP-10)及び3(MMP-11)。MMP-11は活性型として排出され、その機能は他のMMPsを活性化することができる。
フィブロネクチンドメインファミリー：多数のマトリックス基質(ゼラチン、エラスチン、IV型コラーゲン)を分解する。
ゼラチナーゼA(MMP-2)；その癌における関与に加え（腫瘍浸潤）、血小板活性化で重要な役割を果しうるので、抗血小板薬発見の可能性のある目標として提案されている。
ゼラチナーゼB(MMP-9) 
膜貫通ドメインファミリー：
MT-1-MMP、MT-4-MMP、MMP-14、MMP-17
MMPsの種々の特異性及びそのいくつかの病気での相対的関与に関する多くの研究が進行中である。
【０００８】
1.2 HEXXHモチーフの非存在(18ファミリー)： 
興味深いメンバーを有するファミリー：
M24A：メチオニルアミノペプチダーゼ、１型(原核及び真核MAP-1を含む)/Prosite番号：PDOC00575
M24C：メチオニルアミノペプチダーゼ、２型(真核MAP-2を含む)/Prosite番号：PDOC00575
【０００９】
表１．メタロプロテアーゼ及びその機能の概要
2006516888.tif 000003
【００１０】
メタロプロテアーゼは、種々多様な治療薬にわたって関与している。これには呼吸器疾患（Segura-Valdez, L.ら, Chest. 2000 117(3):684-94, Tanaka, H.ら, J Allergy Clin Immunol. 2000 105(5):900-5, Hoshino, M.ら, J Allergy Clin Immunol. 1999 104(2 Pt 1):356-63, Mautino, G.ら, Am J Respir Crit Care Med. 1999 160(1):324-30, Dalal, S.ら, Chest. 2000 117(5 Suppl 1):227S-8S, Ohnishi, K.ら, Lab Invest. 1998 78(9):1077-87)、心臓血管疾患（Taniyama, Y.ら,, Circulation. 2000 102(2):246-52, Hong, B.K.ら, Yonsei Med J. 2000 41(1):82-8, Galis, Z.S.ら, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 92(2):402-6）、細菌感染症（Scozzafava, A.ら, J Med Chem. 2000 43(9):1858-65, Vencill, C.F.ら, Biochemistry. 1985 24(13):3149-57, Steinbrink, D.Rら, J Biol Chem. 1985 260(5):2771-6, Lopez-Boado, Y.S.ら, J Cell Biol. 2000 148(6):1305-15, Chang, J.C.ら, Thorax. 1996 51(3):306-11, Dammann, T.ら, Mol. Microbiol. 6:2267-2278(1992), Wassif, C.ら, J. Bacteriol. 177 (20), 5790-5798 (1995)）、腫瘍学（Sakamoto, Y.ら, Int J Oncol. 2000 17(2):237-43, Kerkela, E.ら, J Invest Dermatol. 2000 114(6):1113-9, Fang, J.ら, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97(8):3884-9, Sun, Y.ら, J Biol Chem. 2000 275(15):11327-32, McCawley, L.Jら, Mol Med Today. 2000 6(4):149-56, Ara,T.ら, J Pediatr Surg. 2000 35(3):432-7, Shigemasa, K.ら, Med Oncol. 2000 17(1):52-8, Nakanishi, K.ら, Hum Pathol. 2000 31(2):193-200, Dalberg, K.ら, World J Surg. 2000 24(3):334-40）、及び炎症（リューマチ性及び骨関節炎（Ribbens, C.ら, J Rheumatol. 2000 27(4):888-93, Kageyama, Y.ら, Clin Rheumatol. 2000 19(1):14-20, Shlopov, B.V.ら, Arthritis Rheum. 2000 Jan;43(1):195-205)）が挙げられる。
【００１１】
メタロプロテアーゼは、有性生殖の生理学及び病理学にも関係しており、かつ絨毛膜状態、透明帯反応、受精膜の形成、避妊及び不妊症を調節することに関する治療に関与している（Shibataら(2000) J.Biol.Chem vol.275, No.12 p8349）。
従って、新規メタロプロテアーゼの同定は、これらタンパク質が関与する特定の病気状態につながる潜在的経路の理解を高め、かつこれら障害を治療するために有効な遺伝子又は薬物療法を開発する際にも非常に重要である。
【００１２】
（本発明）
本発明は、INSP005a及びINSP005bタンパク質が分泌プロテアーゼ分子、さらにメタロプロテアーゼファミリーの分泌プロテアーゼ分子として機能するという発見に基づく。好ましくは、INSP005a及びINSP005bタンパク質は、メタロプロテアーゼのコリオリシン(choriolysin)/アスタシン様ファミリーのメンバーである。
本発明の第１局面の一実施形態では、
（ｉ）配列番号:14に示されるアミノ酸配列を含み；
（ii）メタロプロテアーゼ分類の分泌タンパク質としての機能を有するか、又は（ｉ）のポリペプチドと共有する抗原決定基を有するその断片であり；或いは
（iii）（ｉ）又は（ii）の機能等価物である；
ポリペプチドが提供される。
好ましくは、この実施形態のポリペプチドは、配列番号:14に示される配列から成る。配列番号:14に示される配列を有するポリペプチドは、以後“INSP005aポリペプチド”と称する。
【００１３】
本発明の第１局面の第２実施形態では、
（ｉ）配列番号:34又は配列番号:36に示されるアミノ酸配列を含み；
（ii）メタロプロテアーゼ分類の分泌タンパク質としての機能を有するか、又は（ｉ）のポリペプチドと共有する抗原決定基を有するその断片であり；或いは
（iii）（ｉ）又は（ii）の機能等価物である、
ポリペプチドが提供される。
好ましくは、この実施形態のポリペプチドは、配列番号:34又は配列番号:36に示される配列から成る。配列番号:34に示される配列を有するポリペプチドは、以後“INSP005bポリペプチド”と称する。
【００１４】
本出願人は、この理論によって拘泥されたくないが、INSP005bポリペプチドの最初の23個のアミノ酸がシグナルペプチドを形成すると推定する。この推定したINSP005b成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び該INSP005b成熟ポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:35及び配列番号:36に示される。以後、配列番号:36に示される配列を有するポリペプチドを“INSP005b成熟ポリペプチド”と称する。
好ましくは、本発明の上述した局面のポリペプチドはメタロプロテアーゼとして機能する。用語“メタロプロテアーゼ”は、技術的によく理解されており、当業者は、技術的に周知の種々の検定法の１つを用いてメタロプロテアーゼ活性を容易に確認できるだろう。例えば、２つの一般的に適用される検定法は、定量的[3H]ゼラチンアッセイ(Martinら, Kidney Int. 36, 790-801)及びゼラチンザイモグラフィアッセイ(Herron G.S.ら, J. Biol. Chem. 1986, 261, 2814-2818)である。
さらに好ましくは、本発明の上記局面のポリペプチドは、メタロプロテアーゼのコリオリシン/アスタシン様ファミリーのメンバーである。
証拠は後述する実施例セクションで提示するが、劇症肝炎のインビボモデルにおけるINSP005b cDNA（以後IPAAA78836-2とも称する）の送達が血清中のTNF-α及びm-IL-6レベルを減じることが分かり、血清中で測定されるトランスアミナーゼの低減に重大な影響を及ぼした。
言及したアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ASAT)及びアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALAT)レベルの低減は、低減したTNF-α及びIL-6レベルが原因かもしれない。TNF-αはConA注射後の肝臓損傷に関与する重要なサイトカインである。この肝炎のマウスモデルでは、TNF-αは、主に肝性マクロファージ、いわゆるKupfer細胞によって産生される。抗TNF-α抗体は、病気に対する防御を与えることが分かっている（Seinoら 2001, Annals of surgery 234, 681)。従って、INSP005bポリペプチド及び機能的に関連する等価タンパク質は、自己免疫、ウィルス性又は急性肝疾患及びアルコール性肝不全の治療で有用であると考えられる。これらは、他の炎症性疾患の治療でも効果があると思われる。
本明細書では、INSP005aポリペプチド、INSP005bポリペプチド及びINSP005b成熟ポリペプチドを“INSP005ポリペプチド”と称する。
【００１５】
第２局面では、本発明は、本発明の第１局面のポリペプチドをコードする精製核酸分子を提供する。好ましくは、精製核酸分子は、配列番号:13（INSP005aポリペプチドをコードする）、配列番号:33（INSP005bポリペプチドをコードする）又は配列番号:35（INSP005b成熟ポリペプチドをコードする）に示される核酸配列を有し、或いはこれら配列のいずれかの重複等価物又は断片である。
第３局面では、本発明は、本発明の第２局面の核酸分子と高い厳密条件下でヒドリド化する精製核酸分子を提供する。
第４局面では、本発明は、本発明の第２又は第３局面の核酸分子を含有する、発現ベクターのようなベクターを提供する。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、ベクターはPCR-TOPO-IPAAA78836-1ベクターである（図９及び配列番号:38参照）。本発明のこの局面のさらに好ましい実施形態では、ベクターはPCR-TOPO-IPAAA78836-2ベクターである（図12及び配列番号:39参照）。
第５局面では、本発明の第４局面のベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。
第６局面では、本発明は、本発明の第１局面のポリペプチドに特異的に結合し、かつ好ましくは該ポリペプチドのメタロプロテアーゼ活性を阻害するリガンドを提供する。本発明のポリペプチドに対するリガンドは、天然又は修飾基質、酵素、受容体、2000Daまで、好ましくは800Da以下の小さい天然又は合成有機分子のような有機小分子、ペプチドミメティック、無機分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、上記の構造的又は機能的ミメティックを含む種々の形態で出現しうる。
【００１６】
第７局面では、本発明は、本発明の第１局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現を変え、又は本発明の第１局面のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
本発明の第７局面の化合物は、該遺伝子の発現レベル又はポリペプチドの活性を高め（アゴナイズ）又は低減（アンタゴナイズ）しうる。重要なことに、INSP005ポリペプチドの機能の同定は、病気の治療及び/又は診断で有効な化合物を同定しうるスクリーニング方法の設計を可能にする。このような方法を用いて本発明の第６及び第７局面のリガンド及び化合物を同定することができる。これら方法は、本発明の局面として包含される。
証拠は後述する実施例セクションで提示するが、INSP005bポリペプチドを用いて炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全を予防又は治療することができる。従って、INSP005bポリペプチドを立体配置的に模倣し、又はINSP005bポリペプチドのアゴニストである本発明の第７局面の化合物の規定は、このような化合物は上述したような炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全の予防又は治療での有用性を見出しうるので、特に好ましい。
【００１７】
第８局面では、本発明は、メタロプロテアーゼが関係する病気の治療又は診断で使用するための、本発明の第１局面のポリペプチド、又は本発明の第２若しくは第３局面の核酸分子、又は本発明の第４局面のベクター、又は本発明の第５局面の宿主細胞、又は本発明の第６局面のリガンド、又は本発明の第７局面の化合物を提供する。これら分子は、このような病気、特に気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害及び生殖障害の治療用薬物の製造でも使用することができる。本発明の第１、第２、第３、第４、第５、第６又は第７局面のこれら成分は、このような病気の治療用薬物の製造でも使用することができる。
本発明の第１、第２、第３、第４、第５及び第６局面の成分は、炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患（ウィルス性又は急性肝疾患を含む）及び肝不全（アルコール性肝不全を含む）の治療用薬物の製造で用いることが特に好ましい。
【００１８】
第９局面では、本発明は、患者の病気の診断方法であって、前記患者由来の組織内の本発明の第１局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現又は本発明の第１局面のポリペプチドの活性のレベルを評価する工程、及び前記発現又は活性のレベルを対照レベルと比較する工程（ここで、前記対照レベルと異なるレベルが病気の指標である）を含む方法を提供する。このような方法は、好ましくはインビトロで行う。患者の病気の治療措置のモニタリングのために同様の方法を用いることができ、この場合、時間期間にわたり（over the period of time）、ポリペプチド又は核酸分子の発現又は活性のレベルが対照レベルに向けて変化することが病気の退行の指標である。
本発明の第９局面の方法で診断する好ましい病気は炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患（ウィルス性又は急性肝疾患を含む）又は肝不全（アルコール性肝不全を含む）である。
【００１９】
本発明の第１局面のポリペプチドを検出する好ましい方法は、以下の工程：（ａ）抗体のような本発明の第６局面のリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生体試料と接触させる工程;及び（ｂ）前記複合体を検出する工程；を含む。
熟練読者は気づくように、ショートプローブによる核酸ハイブリダイゼーション、点突然変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅の方法及び抗体を用いて異常なタンパク質レベルを検出する方法のような多くの種々の本発明の第９局面の方法がある。同様の方法を短期又は長期ベースで用いて患者の病気の治療措置をモニターすることができる。本発明は、病気のこれら診断方法で有用なキットをも提供する。
【００２０】
第10局面では、本発明は、本発明の第１局面のポリペプチドの分泌タンパク質、好ましくはメタロプロテアーゼとしての使用を提供する。
第11局面では、本発明は、本発明の第１局面のポリペプチド、又は本発明の第２若しくは第３局面の核酸分子、又は本発明の第４局面のベクター、又は本発明の第５局面の宿主細胞、又は本発明の第６局面のリガンド、又は本発明の第７局面の化合物を、薬学的に許容しうる担体と共に含んでなる医薬組成物を提供する。
第12局面では、本発明は、気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害及び生殖障害又はメタロプロテアーゼが関係している他の病気のような病気の診断又は治療用薬物の製造で使用するための、本発明の第１局面のポリペプチド、又は本発明の第２若しくは第３局面の核酸分子、又は本発明の第４局面のベクター、又は本発明の第５局面の宿主細胞、又は本発明の第６局面のリガンド、又は本発明の第７局面の化合物を提供する。
本発明の第１、第２、第３、第４、第５及び第６局面の成分は、炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患及び肝不全の治療用薬物の製造で用いることが特に好ましい。
【００２１】
第13局面では、本発明は、患者の病気の治療方法であって、患者に、本発明の第１局面のポリペプチド、又は本発明の第２若しくは第３局面の核酸分子、又は本発明の第４局面のベクター、又は本発明の第５局面の宿主細胞、又は本発明の第６局面のリガンド、又は本発明の第７局面の化合物を投与する工程を含む方法を提供する。
本発明の第１局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現、又は本発明の第１局面のポリペプチドの活性が、健康な患者の発現又は活性のレベルと比較して低い病気では、患者に投与するポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、リガンド又は化合物は、アゴニストでなければならない。反対に、本発明の第１局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現、又は本発明の第１局面のポリペプチドの活性が、健康な患者の発現又は活性のレベルと比較して高い病気では、患者に投与するポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、リガンド又は化合物は、アンタゴニストでなければならない。このようなアンタゴニストの例として、アンチセンス核酸分子、リボザイム及び抗体のようなリガンドが挙げられる。
病気が炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全であることが特に好ましい。
【００２２】
第14局面では、本発明は、高レベル、低レベル又は不在レベル（absent level）の本発明の第１局面のポリペプチドを発現するように形質転換させたトランスジェニック又はノックアウト非ヒト動物を提供する。このようなトランスジェニック動物は病気の研究のための非常に有用なモデルであり、かつ該病気の治療又は診断で有効な化合物同定のスクリーニングレジメでも使用しうる。
病気が炎症性疾患、自己免疫疾患、肝疾患又は肝不全であることが特に好ましい。
本発明を役立たせるために使用しうる標準的技法及び手順の概要は後述する。この発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター及び試薬に限定されないことは理解されるだろう。本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態のみを記述する目的のためであることも理解され、この専門用語は本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【００２３】
この明細書ではヌクレオチド及びアミノ酸の標準的略号を用いる。
本発明の実施は、別に指定しない限り、分子生物学、微生物学、組換えDNA技術及び免疫学の通常の技法を利用し、これらは当該技術の当業者のスキルの範囲内である。
このような技法は、文献で完全に説明されている。参考のために特に好適なテキストの例として以下の文献が挙げられる：Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and 酵素s (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) タンパク質 Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986)。
【００２４】
本明細書では、用語“ポリペプチド”は、ペプチド結合又は修飾されたペプチド結合（すなわちペプチドアイソスター）で相互に結合している２個以上のアミノ酸を含むいずれのペプチド又はタンパク質も含む。この用語は、短鎖（ペプチド及びオリゴペプチド）と長鎖（タンパク質）の両者を指す。
上述したように、本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質の形態でよく、或いはプレ-、プロ-又はプロプレ-タンパク質の切断によって活性化して活性な成熟ポリペプチドを生成しうるプレ-、プロ-又はプロプレ-タンパク質でよい。このようなポリペプチドではプレ-、プロ-又はプロプレ-配列はリーダー又は分泌配列であり、或いは成熟ポリペプチド配列の精製で利用される配列でよい。
本発明の第１局面のポリペプチドは、融合タンパク質の一部を形成しうる。例えば、分泌又はリーダー配列、プロ-配列、精製で補助する配列、又は例えば組換え体生産の間により高いタンパク質安定性を与える配列を含みうる１個以上の追加のアミノ酸配列を含むことが有利なことが多い。これとは別に、或いはこれに加え、成熟ポリペプチドは、ポリペプチドの半減期を増やすための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合しうる。
【００２５】
ポリペプチドは、翻訳後プロセシングによってのような天然プロセスによって、或いは技術的に周知な化学修飾法によって修飾された、20個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含みうる。本発明のポリペプチド中に普通に存在しうる既知の修飾には、グリコシル化、脂質付着、硫酸塩化、例えばグルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、ヒドロキシル化及びADP-リボース化がある。他の可能性のある修飾として、アセチル化、アシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋結合の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、GPIアンカー形成、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質への転移RNA媒介付加、及びユビキチン化が挙げられる。
【００２６】
修飾は、ペプチド骨格鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのどこでも起こりうる。実際、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドではポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端、或いは両方の共有修飾による遮断が一般的であり、このような修飾は本発明のポリペプチド中に存在しうる。
ポリペプチドで起こる修飾は、該ポリペプチドがどうやって作られるかという相関であることが多い。組換え的に作られるポリペプチドでは、修飾の性質と範囲は大部分特定の宿主細胞の翻訳後修飾能力及び問題のポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって決まる。例えば、グリコシル化パターンは、宿主細胞の異なるタイプ間で変化する。
本発明のポリペプチドは、いずれかの適切な方法で調製することができる。このようなポリペプチドは、該ポリペプチドが天然に存在するポリペプチドである場合、単離された天然に存在するポリペプチド（例えば、細胞培養から精製された）及び組換え的に生成されるポリペプチド（融合タンパク質を含む）、合成的に生成されるポリペプチド又はこれら方法の組合せで生成されるポリペプチドが挙げられる。用語“単離された”は、該ポリペプチドが得られる方法又はその標本の純度レベルを示さない。従って、このような単離種は、組換え的に生成され、問題の細胞又は組織から直接単離され、或いは決定配列に基づいて合成的に生成されうる。
【００２７】
本発明の第１局面の機能的に等価なポリペプチドは、INSP005ポリペプチドに相同的なポリペプチドでよい。本明細書でこの用語を使用する場合、２個のポリペプチドの１個の配列が他方のポリペプチドの配列に十分高度な同一性又は類似性を有する場合、その２個のポリペプチドは“相同的”であると言う。“同一性”は、整列した配列中のいずれの特定位置でも該アミノ酸残基が配列間で同一であることを指す。“類似性”は、整列した配列中のいずれの特定位置でも、アミノ酸残基が配列間で同様のタイプであることを指す。同一性及び類似性の程度は容易に計算できる（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991)。
【００２８】
従って、相同性ポリペプチドは、INSP005ポリペプチドの天然の生物学的変異体（例えば、アレレ変異体又はポリペプチドが由来する種内の幾何的変化）及び突然変異体（アミノ酸置換、挿入又は欠失のような）を包含する。このような突然変異体は、１個以上のアミノ酸残基が保存若しくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）と置換しているポリペプチドを含み、かつこのような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードでコードされた残基でもされていない残基でもよい。該置換の典型は、Ala、Val、Leu及びIle間；Ser及びThr間；酸性残基Asp及びGlu間；Asn及びGln間；又は芳香族残基Phe及びTyr間にある。数個、すなわち５〜10、１〜５、１〜３、１〜２又はちょうど１個のアミノ酸がいずれかの組合せで置換、欠失又は付加されている変異体が特に好ましい。タンパク質の特性及び活性を変えないサイレント置換、付加及び欠失が特に好ましい。この点では保存的置換も特に好ましい。
このような突然変異体は、１個以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチドも包含する；
典型的に、２個のポリペプチド間で30％を超える同一性は、機能的等価の指標と考えられる。好ましくは、本発明の第１局面の機能的に等価のポリペプチドはINSP005ポリペプチド、又はその活性断片と80％を超える配列同一性の度合を有する。さらに好ましいポリペプチドは、それぞれ85％、90％、95％、98％、99％以上の同一性の度合を有する。
本発明の第１局面の機能的に等価のポリペプチドは、１種以上の構造アラインメント法を用いて同定されたポリペプチドでもよい。例えば、Biopendium検索データベース（PCT 特許出願WO 01/69507参照）を生成するために使用する検索ツールの１局面を形成するInpharmatica Genome Threaderテクノロジーを用いて、INSP005ポリペプチドに比べて低い配列同一性を有するが、INSP005ポリペプチド配列と有意な構造相同性を共有することによって、分泌分子活性を有すると予測される、現在未知の機能を同定することができる。“有意な構造相同性”は、Inpharmatica Genome Threaderが、２個のタンパク質が10％以上の確実性で構造相同性を共有すると予測することを意味する。
【００２９】
本発明の第１局面のポリペプチドは、INSP005ポリペプチドの断片及びINSP005ポリペプチドの機能等価物の断片も包含する。但し、当該断片がメタロプロテアーゼ活性を保持し、或いはINSP005ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
本明細書では、用語“断片”は、INSP005ポリペプチド又はその機能等価物の１つのアミノ酸配列と全部ではないが部分的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。断片は、該配列由来の少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含なければならず、特定配列によって、ｎは好ましくは７以上である（例えば、８、10、12、14、16、18、20又はそれ以上）。小断片は抗原決定基を形成しうる。
このような断片は“独立”、すなわち他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部でなく、他のアミノ酸若しくはポリペプチドに融合しておらず、或いは該断片は、それらが部分又は領域を形成する大きいポリペプチド内に包含されうる。大きいポリペプチド内に包含されている場合、本発明の断片は、最も好ましくは単一の連続領域を形成する。例えば、特定の好ましい実施形態は、断片のアミノ末端に融合しているプレ-、及び／又はプロ-ポリペプチド領域及び／又は断片のカルボキシル末端に融合しているさらなる領域を有する断片に関する。しかし、数個の断片が単一の大きいポリペプチド内に包含されうる。
本発明のポリペプチド又はその免疫原性断片（少なくとも１個の抗原決定基を含む）を用いて、該ポリペプチドに免疫特異的なポリクロナール又はモノクロナール抗体のようなリガンドを生じさせることができる。このような抗体を利用して本発明のポリペプチドを発現するクローンを同定し、或いはアフィニティークロマトグラフィーでポリペプチドを精製することができる。熟練読者には明かなように、他の応用の中でもとりわけ、本抗体を診断又は治療助剤として利用することもできる。
用語“免疫特異的”は、本抗体が、先行技術の他の関連ポリペプチドに対するそのアフィニティーより本発明のポリペプチドに対するアフィニティーが実質的に高いことを意味する。本明細書では、用語“抗体”は、Fab、F(ab')2及びFvのような、問題の抗原決定基に結合できる完全分子及びその断片を指す。従って、このような抗体は本発明の第１局面のポリペプチドに結合する。
【００３０】
“実質的に高いアフィニティー”によって、本発明のポリペプチドに対するアフィニティーの既知の分泌タンパク質に対するアフィニティーと比較して測定可能な増加があることを意味する。
好ましくは、アフィニティーは、既知の分泌タンパク質に対するアフィニティーより本発明のポリペプチドに対して少なくとも1.5倍、２倍、５倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍又は106倍高い。
ポリクロナール抗体が望ましい場合、マウス、ウサギ、ヤギ又はウマのような選択した哺乳類を本発明の第１局面のポリペプチドで免疫化することができる。動物を免疫化するために使用するポリペプチドは、組換えDNA技術で誘導することができ、或いは化学的に合成することができる。所望により、ポリペプチドを担体タンパク質と結合することができる。ポリペプチドを化学的に結合しうる通常用いられる担体として、ウシ血清アルブミン、チログロブリン及びキーホールリムペットヘモシアニンが挙げられる。結合ポリペプチドを用いて動物を免疫化する。免疫化した動物由来の血清を収集し、既知手順、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィーによって処理する。
本発明の第１局面のポリペプチドに対するモノクロナール抗体は、当業者によって容易に製造することができる。ハイブリドーマ技術によるモノクロナール抗体を製造する一般的方法論は周知である（例えば、Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozborら, Immunology Today 4: 72 (1983); Coleら, 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)参照）。
【００３１】
本発明の第１局面のポリペプチドに対して産生されるモノクロナール抗体のパネルを種々の特性、すなわちイソ型、エピトープ、アフィニティー等でスクリーニングすることができる。
モノクロナール抗体は、それらが向けられる個々のポリペプチドの精製で特に有用である。代わりに、例えば技術的に周知のPCR法で、問題のモノクロナール抗体をコードする遺伝子を単離し、クローン化し、適切なベクター中で発現させることができる。
非ヒト可変部がヒト定常部に結合又は融合しているキメラ抗体（例えば、Liuら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)参照）も使用しうる。
例えばヒト化によって、抗体を修飾して個体内で免疫原性を弱くすることができる（Jonesら, Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyenら, Science, 239, 1534 (1988); Kabatら, J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queenら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gormanら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991);及びHodgsonら, Bio/Technology, 9, 421 (1991)参照)。本明細書では、用語“ヒト化抗体”は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変部内のCDRアミノ酸及び選択された他のアミノ酸が、ヒト抗体中の等価アミノ酸の代わりに置換されている抗体分子を指す。従って、ヒト化抗体はヒト抗体に密接に似ているが、ドナー抗体の結合能を有する。
さらなる代替では、抗体は、２つの異なる抗原結合ドメインを有し、各ドメインが異なるエピトープに方向づけされている“二重特異性”抗体でよい。
【００３２】
ファージ表示技術を利用して、関連抗体をプロセシングするためにスクリーニングするヒト由来リンパ球のPCR増幅したＶ遺伝子のレパートリー、又は未処置ライブラリーから本発明のポリペプチドに対して結合活性のある抗体をコードする遺伝子を選択することができる（McCafferty, J.ら, (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J.ら, (1992) Biotechnology 10, 779-783）。これら抗体のアフィニティーは、鎖シャッフリングによって改良することもできる（Clackson, T.ら, (1991) Nature 352, 624-628）。
上記技術で生成される抗体は、ポリクロナール又はモノクロナールであれ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（RIA）又はエンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）で試薬として利用しうるという点でさらなる用途がある。これら用途では、ラジオアイソトープ、蛍光分子又は酵素のような分析的に検出可能な試薬で標識することができる。
【００３３】
本発明の第２及び第３局面の好ましい核酸分子は、配列番号:14、配列番号:34、又は配列番号:36に示されるポリペプチド配列及び機能的に等価なポリペプチドをコードする当該核酸分子である。これら核酸分子は、本明細書で述べる方法及び用途で使用することができる。本発明の核酸分子は、好ましくは本明細書で開示する配列由来の少なくともｎ個の連続したヌクレオチドを含み、特定配列によって、ｎは10以上（例えば、12、14、15、18、20、25、30、35、40又はそれ以上）である。
本発明の核酸分子は、上述した核酸分子に相補的な核酸をも包含する（例えば、アンチセンス又は探索目的のため）。
本発明の核酸分子は、mRNAのようなRNAの形態、又は例えばcDNA、合成DNA若しくはゲノムDNAを含むDNAの形態でよい。このような核酸分子は、クローニング、化学合成法又はその組合せによって得ることができる。核酸分子は、ゲノム又はcDNAライブラリーから例えば、固相ホスホラミダイト化学合成のような技法を用いる化学合成によって、或いは生物から分離によって調製することができる。RNA分子は、一般的にDNA配列のインビボ又はインビトロ転写によって生成しうる。
【００３４】
核酸分子は二本鎖又一本鎖でよい。一本鎖DNAは、センス鎖としても知られるコーディング鎖でよく、或いはそれはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コーディング鎖でよい。
用語“核酸分子”は、修飾骨格鎖を含有するもののようなDNA及びRNAの類似体、及びペプチド核酸（PNA）をも包含する。本明細書では、用語“PNA”は、好ましくはリジンで終わるアミノ酸残基のペプチド骨格鎖に結合した少なくとも５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗-遺伝子物質を指す。末端リジンは、この組成物に溶解性を与える。PNAsは、それらが相補一本鎖DNA及びRNAに優先的に結合し、かつ転写伸長を停止する場合、ペギレイト(pegylated)してその細胞内での寿命を延ばすことができる（Nielsen, P.E.ら (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63）。
【００３５】
配列番号:14のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:13に示される核酸分子のコーディング配列と同一でありうる。配列番号:34のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:33に示される核酸分子のコーディング配列と同一でありうる。配列番号:36のポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号:35に示される核酸分子のコーディング配列と同一でありうる。
これら分子は、遺伝コードの縮重の結果として、配列番号:14、配列番号:34又は配列番号:36のポリペプチドをコードする異なる配列を有することもある。このような核酸配列として、限定するものではないが、それ自体で成熟ポリペプチドのコーディング配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列とリーダー又は分泌配列をコードするもののような追加のコーディング配列、例えばプロ-、プレ-又はプロプレ-ポリペプチド配列；転写、リボソーム結合及びmRNA安定性で役割を果たす転写された非翻訳配列（末端シグナルを含む）のような転写非コーディング5'及び3'配列を含む非コーディング配列と共に、上述した追加のコーディング配列があるか又はない成熟ポリペプチドのコーディング配列が挙げられる。核酸分子は、追加の機能性を与えるアミノ酸のような追加のアミノ酸をコードする追加配列をも包含しうる。
【００３６】
本発明の第２及び第３局面の核酸分子は、本発明の第１局面のポリペプチド及び断片の断片又は機能等価物をもコードしうる。このような核酸分子は、天然に存在するアレレ変異体のような天然の変異体でよく、或いは該分子は天然に存在することが知られていない変異体でよい。該核酸分子のこのような天然に存在しない変異体は、核酸分子、細胞又は生物に適用されるものも含む突然変異誘発法によって生じさせうる。
この点の変異体には、ヌクレオチド置換、欠失又は挿入によって、上述した核酸分子と異なる変異体がある。置換、欠失又は挿入は、１個以上のヌクレオチドを巻き込みうる。変異体は、コーディング若しくは非コーディング又は両者が変わりうる。コーディング領域の変化が保存又は非保存アミノ酸置換、欠失又は挿入を生じさせうる。
遺伝子産物（ポリペプチド）のクローニング、プロセシング、及び／又は発現の修飾を含む種々の理由のため、当該技術で一般的に知られている方法を用いて、本発明の核酸分子を操作することができる。核酸分子を操作するために使用しうる技術として、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダム断片化及びPCR再構築によるDNAシャッフリングが挙げられる。部位特異的突然変異誘発を用いて新しい制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドン選択を変え、スプライス変異体を生成し、突然変異を導入するなどができる。
【００３７】
本発明の第１局面のポリペプチドをコードする核酸分子を異種配列に結合して、その結合核酸分子が融合タンパク質をコードするようにすることができる。このような結合核酸分子は、本発明の第２又は第３局面に包含される。例えば、本ポリペプチドの活性のインヒビターのペプチドライブラリーをスクリーニングするため、このような結合核酸分子を用いて、市販の抗体で認識できる融合タンパク質を発現させることは有用である。融合タンパク質を操作して本発明のポリペプチドの配列と異種タンパク質の配列との間に位置する切断部位を含めて、本ポリペプチドを切断し、異種タンパク質から精製できるようにすることができる。
本発明の核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に部分的に相補的であり、それゆえそのコードしている核酸分子にハイブリダイズする（ハイブリダイゼーション）アンチセンス分子をも含む。オリゴヌクレオチドのような該アンチセンス分子は、当該技術の当業者には分かるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、特異的に結合してその転写を妨げるように設計することができる（例えば、Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Leeら, Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooneyら, Science 241, 456 (1988); Dervanら, Science 251, 1360 (1991)）。
【００３８】
本明細書では、用語“ハイブリダイゼーション”は、水素結合による２個の核酸分子の結合を意味する。典型的に、一方の分子を他方の分子と水素結合を好む条件下で接触して置くことができる。この結合に影響しうる因子として、溶媒のタイプと体積；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；抗原；液相分子の非特異的結合を遮断するための薬剤（デンハート(Denhardt's試薬又はBLOTTO）；分子の濃度；分子の結合速度を高めるための化合物の使用（硫酸デキストラン又はポリエチレングリコール）；及びハイブリダイゼーション後の洗浄条件の厳密さが挙げられる（Sambrookら[前出]参照）。
完全相補分子の標的分子へのハイブリダイゼーションの阻害は、技術的に周知なようにハイブリダイゼーションアッセイで試験しうる（例えば、Sambrookら[前出]参照）。実質的に相同性の分子は、Wahl, G.M. and S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) and Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511)に教示されているように、厳密さの種々の条件下で、標的分子に対する完全相同分子と競合し、かつその結合を阻害する。
“厳密さ”は、異なる分子の結合の間中、非常に類似の分子の結合を好む、ハイブリダイゼーション反応における条件を指す。高い厳密さのハイブリダイゼーション条件は、50%ホルムアミド、5XSSC(150mM NaCl,15mM クエン酸三ナトリウム)、50mM リン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート溶液、10%硫酸デキストラン、及び20μg/mlの変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中42℃で終夜インキュベーション後、0.1X SSC中でフィルターを約65℃で洗浄するとして定義される。低い厳密さの条件は、35℃で行うハイブリダイゼーション反応を含む（Sambrookら[前出]参照）。好ましくは、ハイブリダイゼーションで使用する条件は高い厳密さの条件である。
【００３９】
本発明のこの局面の好ましい実施形態は、INSP005ポリペプチド（配列番号:13、配列番号:33及び配列番号:35）をコードする核酸分子に全長にわたって少なくとも70％の同一性である核酸分子、及び該核酸分子に実質的に相補的な核酸分子である。好ましくは、本発明のこの局面の核酸分子は、配列番号:13、配列番号:33及び配列番号:35で与えられる配列を有する核酸分子、或いはそれらに相補的な核酸分子にその全長にわたって少なくとも80％の同一性の領域を含む。この点で、上記と同じ核酸分子にその全長にわたって少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも98％又は99％の同一性の核酸分子が特に好ましい。この点に関する好ましい実施形態は、実質的にINSP005ポリペプチドと同一の生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする核酸分子である。
【００４０】
本発明は、本発明の核酸分子の検出方法であって、以下の工程：（ａ）本発明の核プローブをハイブリダイズ条件下で生体試料と接触させて二重体(duplex)を形成する工程；及びこのようにして形成された二重体を検出する工程を含む方法をも提供する。
本発明によって利用しうるアッセイと関連してさらに後述するように、上述したような核酸分子はRNA、cDNA又はゲノムDNA用ハイブリダイゼーションプローブとして用いてINSP005ポリペプチドをコードする全長cDNAs及びゲノムクローンを単離し、かつこれらポリペプチドをコードする遺伝子に対して高い配列類似性を有する相同又は定向進化遺伝子のcDNA及びゲノムクローンを単離することができる。
この点に関しては、技術的に周知の他の方法の中でとりわけ次の方法を利用することができ、例示目的のため以下に述べる。DNAのシークエンシング及び分析の方法は周知かつ当該技術で一般的に利用可能であり、実際に、本明細書で述べる本発明の多くの実施形態を実施するために使用しうる。このような方法は、DNAポリメラーゼI、Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland, OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham, Chicago, IL)、又はGibco/BRL(Gaithersburg, MD)販売のELONGASE増幅システムで見つけられるもののようなポリメラーゼとプルーフ-リーディングエキソヌクレアーゼの組合せのクレノウ断片として該酵素を利用しうる。好ましくは、シークエンシング法はHamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV)、Peltier Thermal Cycler(PTC200; MJ Research, Watertown, MA)及びABI Catalystと373及び377 DNAシークエンサー(Perkin Elmer)のような機械を用いて自動化することができる。
【００４１】
INSP005ポリペプチドの機能と等価の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子を単離する一方法は、技術的に承認されている標準的手順を用いて天然プローブ又は人工的に設計したプローブでゲノム又はcDNAライブラリーを探索することである（例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubelら (eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989,1992参照）。適切なコード化遺伝子（配列番号:13、配列番号:33又は配列番号:35）由来の核酸配列に対応し、或いは相補的な少なくとも15個、好ましくは少なくとも30個、さらに好ましくは少なくとも50個の連続した塩基を含むプローブが特に有用なプローブである。このようなプローブを分析的に検出可能な試薬で標識してその同定を容易にすることができる。有用な試薬として、限定するものではないが、ラジオアイソトープ、蛍光染料及び検出可能産物の形成を触媒できる酵素が挙げられる。これらプローブを用いて、当業者は、ヒト、哺乳類又は他の動物起源から問題のタンパク質をコードするゲノムDNA、cDNA又はRNAポリヌクレオチドの相補コピーを単離し、かつ該起源を関連配列、例えば該ファミリー、タイプ及び／又はサブタイプのさらなるメンバーについてスクリーニングすることができる。
【００４２】
多くの場合、単離されるcDNA配列は、該ポリペプチドをコードする領域が、通常は5'末端で切り詰められるという点で不完全である。全長cDNAsを得るため、或いは短いcDNAsを伸長するためにいくつかの方法を利用しうる。このような配列は、部分的なヌクレオチド配列を利用し、かつプロモーター及び調節要素のような上流配列を検出するための技術的に周知の種々の方法を使用して伸長しうる。例えば、使用しうる１つの方法はcDNA末端の急速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends)（RACE；例えば、Frohmanら, PNAS USA 85, 8998-9002, 1988参照）の方法に基づく。MarathonTM技術(Clontech Laboratories Inc.)で例示されるこの技術の最近の改良は、例えば、より長いcDNAの検索をかなり単純化した。“制限部位”PCRと称するわずかに異なる方法は、汎用プライマーを用いて既知の座に近接する未知の核酸配列を検索する（Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322)。逆PCRを用いて、既知領域に基づく発散プライマーで配列を増幅又は伸長することもできる（Triglia, T.ら (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186）。使用しうる別の方法は捕獲PCRであり、ヒト及び酵母の人工染色体DNA内の既知配列に隣接するDNA断片のPCR増幅を含む（Lagerstrom, M.ら (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119）。未知配列を検索するために使用しうる別の方法は、Parker, J.D.ら(1991);Nucleic Acids Res 19:3055-3060の方法である。さらに、PCR、入れ子状プライマー、及びPromoterFinderTMライブラリーを用いてゲノムDNAを散策することができる（Clontech, Palo Alto, CA）。この方法は、ライブラリーをスクリーニングする必要を回避し、かつイントロン／エキソン接合部を見つけるのに有用である。
【００４３】
全長cDNAをスクリーニングする場合、大きさを選択してより大きいcDNAsを包含するライブラリーを用いることが好ましい。また、ランダム-プライム(primed)ドライブラリーは遺伝子の5'領域を含む多くの配列を含むという点で好ましい。ランダムプライムドライブラリーの使用はオリゴd(T)ライブラリーが全長cDNAを産生しない状況で特に好ましい。ゲノムライブラリーは、配列の5'非-転写調節領域中への伸長で役立ちうる。
本発明の一実施形態では、本発明の核酸分子を染色体局所化に使用することができる。この技術では、核酸分子が個体のヒト染色体上の特定位置に特異的に標的にされ、かつそれとハイブリダイズすることができる。本発明の染色体に対する関連配列のマッピングは、遺伝子関連疾患との当該配列の関係確認で重要な工程である。一度配列を正確な染色体の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置を遺伝子マップデータと相関させることができる。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで入手可能）で見られる。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と病気との関係は、連鎖分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）を通じて同定する。これは、位置クローニング又は他の遺伝子発見法を用いて病気遺伝子を検索する調査員に有益な情報を与える。一旦、病気又は症候群を遺伝的連鎖によって特定のゲノム領域に天然のまま局所化すると、当該領域へのいずれの配列マッピングもさらなる調査用の関連遺伝子又は調節遺伝子を表現しうる。核酸分子を用いて、正常個体、保因者、又は患者間の転位、逆位などによる染色体位置の差異を検出することもできる。
【００４４】
本発明の核酸分子は、組織局所化にも有益である。このような方法は、それらをコードするmRNAsの検出によって、組織内のポリペプチドの発現パターンを決定しうる。この方法として、インサイツハイブリダイゼーション法及びPCRのようなヌクレオチド増幅法が挙げられる。これら研究の結果は、生体内のポリペプチドの正常機能の指標を与える。さらに、mRNAの正常発現パターンと突然変異遺伝子でコードされたmRNAsの発現パターンの比較研究は、病気における突然変異ポリペプチドの役割の有益な洞察を与える。このような不適切な発現は、一時的、空間的又は定量的性質の発現でありうる。
遺伝子スプライシングアプローチを行っても本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内因性発現を下方制御することができる。RNA干渉(RNAi)（Elbashir, SMら, Nature 2001, 411, 494-498）は、利用しうる配列特異的な転写後遺伝子スプライシングの１つの方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドをインビトロ合成して細胞中に導入する。これらdsRNAオリゴヌクレオチドの配列特異的結合が標的mRNAの分解を誘発し、標的タンパク質発現を減少又は除去する。
上で評価した遺伝子スプライシングアプローチの効率は、ポリペプチド発現の測定（例えば、ウエスタンブロット法によって）を通じ、かつTaqManベース方法論を用いてRNAレベルで評価することができる。
【００４５】
本発明のベクターは本発明の核酸分子を含み、かつクローニングベクター又は発現ベクターでよい。本発明のベクターで形質転換、形質移入又は形質導入される本発明の宿主細胞は、原核生物又は真核生物でよい。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中のそのコード化核酸分子の発現によって組換え型で調製することができる。このような発現方法は、当該技術の当業者に周知であり、Sambrookら(前出)及びFernandez & Hoeffler(1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto)によって多くのことが詳述されている。
【００４６】
一般に、核酸分子を維持し、増殖させ、又は発現させて必要な宿主内でポリペプチドを産生するのに適したいずれの系又はベクターも使用しうる。適切なヌクレオチド配列は、例えば、Sambrookら(前出)に記載されている方法のような種々の周知かつ日常的方法のいずれかによって発現系中に挿入することができる。通常、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌の発現用）及び、場合によってはオペレーターのような制御要素の制御下にコード化遺伝子を置いて、所望のポリペプチドをコードするDNA配列が、形質変換した宿主細胞内でRNAに転写されるようにすることができる。
適切な発現系の例として、例えば、染色体系、エピソーム系及び例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母菌エピソーム、挿入要素、酵母菌染色体要素、バキュロウィルスのようなウィルス、SV40のようなパポバウィルス、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス及びレトロウィルスから誘導されるベクター、又は例えばプラスミドと、コスミド及びファージミドを含むバクテリオファージ遺伝要素とから誘導されるもののようなそれらの組合せを含むウィルス誘導系が挙げられる。人工のヒト染色体(human artificial chromosomes)(HACs)を利用して含みうるより大きいDNA断片を送達してプラスミド内で発現させることもできる。
特に好適な発現系として、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物；酵母菌発現系で形質転換した酵母菌；ウィルス発現系（例えば、バキュロウィルス）で形質転換した昆虫細胞系；ウィルス発現系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）又は細菌発現系（例えば、Ti若しくはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられる。細胞フリー翻訳系を利用して本発明のポリペプチドを生じさせることもできる。
【００４７】
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞中への導入は、Davisら, Basic Methods in Molecular Biology (1986)及びSambrookら(前出)のような多くの標準的実験室マニュアルに記載されている方法で行うことができる。特に好適な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレイプローディング(scrape loading)、衝撃導入又は感染（Sambrookら, 1989 [前出]；Ausubelら, 1991 [前出]； Spector, Goldman & Leinwald, 1998参照）が挙げられる。真核生物細胞内では、発現系は系の必要性に応じて一時的（例えば、エピソーム）又は永久的（染色体完全体）でよい。
コード化核酸分子は、所望により、例えば翻訳されたポリペプチドの細胞小胞体の内腔中、又は細胞周辺腔中、又は細胞外環境中への分泌のための、シグナルペプチド又はリーダー配列のような制御配列をコードする配列を含んでも含まなくてもよい。これらシグナルペプチドはポリペプチドに内因性であり、或いはそれらは外因性シグナルでありうる。リーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて細菌宿主によって除去されうる。
【００４８】
制御配列に加え、宿主細胞の成長に関してポリペプチドの発現の調節を斟酌する調節配列を加えることが望ましい。調節配列の例は、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激、又は種々の温度若しくは代謝条件に応じて増減する遺伝子発現を引き起こすものである。調節配列はベクターの当該非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター、5'及び3'非翻訳領域である。これらが宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を行う。このような調節配列は、その長さと特異性が変化しうる。使用するベクター系と宿主によって、構成性及び誘導性プロモーターを含むいずれの数の好適な転写及び翻訳要素をも使用しうる。例えば、細菌系内でクローニングする場合、Bluescriptファージミド(Stratagene, LaJolla, CA)又はpSportlTMプラスミド(Gibco BRL)等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導性プロモーターを使用しうる。昆虫細胞内ではバキュロウィルスポリヘドリンプロモーターを使用しうる。植物細胞のゲノムから（例えば、熱ショック、RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、又は植物ウィルスから（例えば、ウィルスプロモーター又はリーダー配列）誘導されるプロモーター又はエンハンサーをベクター中にクローン化しうる。哺乳類細胞系内では、哺乳類遺伝子又は哺乳類ウィルス由来のプロモーターが好ましい。配列の複数コピーを含む細胞系を生成する必要がある場合、SV40又はEBVを基礎としたベクターを適切な選択可能マーカーと共に使用しうる。
【００４９】
発現ベクターは、特定の核酸コーディング配列が適切な調節配列と共に該ベクター内に位置するように構築し、該コーディング配列の調節配列についての位置決めと配向性は、調節配列の“制御”下でコーディング配列が転写されるように、すなわちDNA分子に結合するRNAポリメラーゼが調節配列のところでコーディング配列を転写するようにする。場合によっては、配列を修飾して、該配列が調節配列に適切な配向性で結合しうるように；すなわち、読み枠を維持する必要がある。
ベクター中への挿入前に制御配列及び他の調節配列を核酸コーディング配列に結合することができる。代わりに、既に制御配列及び他の適切な制限部位を含む発現ベクター中に直接コーディング配列をクローン化することができる。
組換えポリペプチドの長期的な高収率生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、問題のポリペプチドを安定して発現する細胞系は、同一又は別個ベクター上にウィルス複製起点及び／又は内因性発現要素及び選択可能マーカーを含みうる発現ベクターを用いて形質転換させうる。ベクターの導入後、培地を選択培地に交換する前に細胞を１〜２日間富化培地内で成長させてよい。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、その存在が、導入された配列をうまく発現する細胞の成長と回収を可能にする。安定に形質転換した細胞の耐性クローンは、細胞型に適した組織培養法を用いて増殖させることができる。
【００５０】
発現用宿主として利用しうる哺乳類細胞系は技術的に周知であり、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞系が挙げられ、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLa、ベビーハムスター腎臓(BHK)、サル腎臓(COS)、C127、3T3、BHK、HEK 293、Bowesメラノーマ及びヒト肝細胞癌(例えばHep G2)細胞及び多数の他の細胞系を含む。
バキュロウィルス系内では、バキュロウィルス／昆虫細胞発現系用の材料は、とりわけInvitrogen, San Diego CAのキット形態(“MaxBac”キット)で商業的に入手可能である。これらの方法は当該技術の当業者に一般的に知られており、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)に完全に記載されている。この系で使用するための特に好適な宿主細胞として、Drosophila S2及びSpodoptera Sf9細胞のような昆虫細胞が挙げられる。
【００５１】
技術的に周知の多くの植物細胞培養及び全植物遺伝子発現系がある。好適な植物細胞の遺伝子発現系の例として、US 5,693,506；US 5,659,122；及びUS 5,608,143に記載されているものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現のさらなる例は、Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991)に記載されている。
特に、原形質体を単離かつ培養して完全再生植物を与えうるすべての植物を利用できるので、その伝達された遺伝子を含有する完全植物が回収される。実用的に、すべての植物を培養細胞又は組織から再生することができ、限定するものではないが、サトウキビ、テンサイ、綿、果実及び他の木、豆果及び野菜が挙げられる。
特に好ましい細菌宿主細胞の例として、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセス及び枯草菌細胞が挙げられる。
真菌発現用の特に好適な宿主細胞の例として、酵母菌細胞（例えば、S. cerevisiae）及びアスペルギルス細胞が挙げられる。
形質転換した細胞系を回収するために使用しうるいくつかの選択系が知られている。例として、それぞれtk-又はaprt-細胞内で利用しうる単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（Wigler, M.ら (1977) Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, I.ら (1980) Cell 22:817-23）遺伝子が挙げられる。
また、代謝拮抗物質、抗生物質又は除草剤耐性を選択の基礎として使用することができ；例えば、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)(Wigler, M.ら (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)；アミノグリコシドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与えるnpt(Colbere-Garapin, F.ら (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14)及びそれぞれクロルスルホラン及びフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与えるals又はpat。さらなる選択遺伝子が記載されており、当業者にはその例が明かだろう。
【００５２】
マーカー遺伝子発現の存在又は非存在は、問題の遺伝子が存在することを示唆するが、その存在及び発現を確認する必要があるかもしれない。例えば、関連配列がマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、適切な配列を含有する形質転換細胞はマーカー遺伝子機能の非存在によって確認することができる。代わりに、単一のプロモーターの制御下、本発明のポリペプチドをコードする配列を有するタンデム内にマーカー遺伝子を置くことができる。同様に、誘導又は選択に応答するマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム遺伝子の発現を示す。
これとは別に、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつ前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の手順で確認することができる。この手順として、限定するものではないが、DNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば、蛍光活性化細胞分取（FACS）又はイムノアッセイ法（エンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ[ELISA]及びラジオイムノアッセイ[RIA]のような）が挙げられ、核酸又はタンパク質の検出及び／又は定量のための膜、溶液、又はチップベース技術を含む（Hampton, R.ら (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN及びMaddox, D.E.ら (1983) J. Exp. Med, 158, 1211-1216参照）。
当業者には種々多様な標識及び結合法が知られており、種々の核酸及びアミノ酸アッセイで使用しうる。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション又はPCRプローブを製造する手段として、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化又は標識化ポリヌクレオチドを用いるPCR増幅が挙げられる。代わりに、本発明のポリペプチドをコードする配列をmRNAプローブの製造用ベクター中にクローン化することができる。このようなベクターは技術的に周知で、商業的に入手可能であり、これを用いてT7、T3又はSP6のような適切なRNAポリメラーゼと標識化ヌクレオチドの付加によってRNAプローブをインビトロ合成することができる。これら手順は、種々の商業的に入手可能なキット（Pharmacia & Upjohn, (Kalamazoo, MI)；Promega (Madison WI)；及びU.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH）を用いて行うことができる。
検出を容易にするために使用しうる適切なリポーター分子又は標識として、放射性核種、酵素及び蛍光、化学発光又は発色剤並びに基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【００５３】
本発明の核酸分子を用いてトランスジェニック動物、特にげっ歯類動物を創造することもできる。このようなトランスジェニック動物は本発明のさらなる局面を形成する。これはを体細胞の修飾又は生殖細胞系療法によって局所的に行い、遺伝的修飾を組み込むことができる。このようなトランスジェニック動物は、本発明のポリペプチドのモジュレーターとして有効な薬物分子用動物モデルの製造に特に役立ちうる。
硫酸アンモニウム又はエタノール沈降法、酸抽出、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法で組換え細胞培養から本ポリペプチドを回収かつ精製することができる。精製には、高速液体クロマトグラフィーが特に好ましい。ポリペプチドが単離及び／又は精製の際に変性される場合、タンパク質の周知のリフォールディング法を利用して活性コンホメーションを再生することができる。
【００５４】
所望により、本発明のポリペプチドをコードする配列を可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することによって、特定化ベクター構成を用いてタンパク質の精製を促進することもできる。このような精製-促進ドメインの例として、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びFLAGS伸長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle, WA）内で利用するドメインが挙げられる。精製ドメインと本発明のポリペプチドとの間に、Factor XA又はエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego, CA)に特異的な配列のような切断可能なリンカー配列を含めて精製を促進することができる。このような１つの発現ベクターは、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位の前の数個のヒスチジン残基に融合している本発明のポリペプチドを含有する融合タンパク質の発現を与える。ヒスチジン残基はIMAC（Porath, J.ら (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281に記載されているような固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）で精製を促進しながら、チオレドキシン又はエンテロキナーゼ切断部位が、融合タンパク質からポリペプチドを精製する手段を与える。融合タンパク質を含有するベクターの考察は、Kroll, D.J.ら(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)に提供されている。
【００５５】
本ポリペプチドをスクリーニングアッセイで使うために発現させる場合、一般的に本ポリペプチドが発現する宿主細胞の表面で本ポリペプチドを生じさせることが好ましい。この場合、スクリーニングアッセイで使う前に、例えば蛍光活性化細胞分取（FACS）又はイムノアフィニティー法のような技術を用いて宿主細胞を収集することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、培地を回収して、発現したポリペプチドを回収かつ精製することができる。ポリペプチドが細胞内で産生される場合、ポリペプチドを回収する前に細胞をまず可溶化しなければならない。
本発明のポリペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング法で化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。このような化合物は、本発明の遺伝子の発現又はポリペプチドの活性のレベルを活性化（アゴナイズ）又は阻害（アンタゴナイズ）することができ、本発明のさらなる局面を形成する。好ましい化合物は、本発明の第１局面のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現を変え、或いは本発明の第１局面のポリペプチドの活性を調節するために有効である。
【００５６】
アゴニスト又はアンタゴニスト化合物は、例えば、細胞、細胞フリー標本、化学ライブラリー又は天然産物混合物から単離されうる。これらアゴニスト又はアンタゴニストは、天然若しくは修飾基質、リガンド、酵素、受容体又は構造的若しくは機能的ミメティックでよい。このようなスクリーニング法の適切なレビューのためColiganら, Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991)を参照せよ。
最も良いアンタゴニストと思われる化合物は、本発明のポリペプチドに結合する分子であって、該ポリペプチドに結合しても該ポリペプチドの生物学的効力を誘発しない分子である。可能性のあるアンタゴニストとして、本発明のポリペプチドに結合し、それによってその活性を阻害し、或いは失わせる小有機分子、ペプチド、ポリペプチド及び抗体が挙げられる。この様式では、ポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止するように、ポリペプチドの正常細胞結合分子に対する結合を阻害することができる。
このようなスクリーニング法で利用する本発明のポリペプチドは溶液内で遊離し、固体支持体に添付され、細胞表面上で支えられ、或いは細胞内に位置しうる。一般的に、このようなスクリーニング手順は、結合を観察するための試験化合物と接触しているポリペプチドを発現する適宜の細胞又は細胞膜の使用、或いは機能的応答の刺激又は阻害を含みうる。試験化合物に接触している細胞の機能的応答を試験化合物に接触していなかった対照細胞と比較する。このようなアッセイは、適切な検出システムを用いて、試験化合物がポリペプチドの活性化によってシグナルを生成するかを評価することができる。一般に、既知アゴニストの存在下で活性化のインヒビターをアッセイし、試験化合物の存在下、活性化に及ぼす該アゴニストによる効果を観察する。
本発明のINSP005ポリペプチドは、卵成熟又は受精のような生殖プロセスを含む種々の生理学的及び病理学的プロセスを調節することができる。従って、種々の適切なアッセイを用いてこのような調節活性の研究を可能にするシステム内でINSP005ポリペプチドの生物学的活性を試験することができる。例えば、可能なアッセイとして、排卵誘発後の卵母細胞受精及び／又は妊娠率の測定、胚移植率の測定、又は男性不妊の場合、精子運動率の測定が挙げられる（Luo C.W.ら, J. Biol. Chem. 276 (10), 6913-6921 (2001)）。
【００５７】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト化合物を同定するための好ましい方法は、以下の工程：
（ａ）本発明の第１局面のポリペプチドであって、該ポリペプチドへの化合物の結合に応答して検出可能シグナルを与えうる第２成分と会合しているポリペプチドをその表面上で発現する細胞を、前記ポリペプチドへの結合を許容する条件下、スクリーニングすべき化合物と接触させる工程；及び
（ｂ）前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを測定することによって、前記化合物が前記ポリペプチドに結合し、かつ前記ポリペプチドを活性化又は阻害するかを決定する工程；を含む。
【００５８】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するためのさらに好ましい方法は、以下の工程：
（ａ）本発明の第１局面のポリペプチドであって、該ポリペプチドへの化合物の結合に応答して検出可能シグナルを与えうる第２成分と会合しているポリペプチドをその表面上で発現する細胞を、前記ポリペプチドへの結合を許容する条件下、スクリーニングすべき化合物と接触させる工程；及び
（ｂ）前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用から生じるシグナルのレベルを、前記化合物の非存在下のシグナルのレベルと比較することによって、前記化合物が前記ポリペプチドに結合し、かつ前記ポリペプチドを活性化又は阻害するかを決定する工程；を含む。
さらに好ましい実施形態では、上記一般的方法は、さらに、ポリペプチド用の標識化又は非標識化リガンドの存在下でアゴニスト又はアンタゴニストの同定を行う工程を含むことができる。
【００５９】
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法の別の実施形態は、以下の工程：
本発明のポリペプチドへの結合を許容する条件下で候補化合物の存在下、該ポリペプチドを有する細胞、又は該ポリペプチドを含有する細胞膜へのリガンドの結合の阻害を決定する工程、及び前記ポリペプチドに結合したリガンドの量を決定する工程；を含む。
リガンドの結合を減少させうる化合物は、アゴニスト又はアンタゴニストであると考えられる。好ましくは、リガンドを標識化する。
【００６０】
さらに具体的には、ポリペプチドアンタゴニスト又はアゴニスト化合物のスクリーニング方法は、以下の工程：
（ａ）本発明のポリペプチドを細胞表面上で発現する完全細胞、又は本発明のポリペプチドを含有する細胞膜と共に標識化リガンドをインキュベートする工程、
（ｂ）前記完全細胞又は前記細胞膜に結合している標識化リガンドの量を測定する工程；
（ｃ）工程（ａ）の標識化リガンドと完全細胞又は細胞膜との混合物に候補化合物を添加し、かつ前記混合物を平衡に至らしめる工程；
（ｄ）工程（ｃ）後、前記完全細胞又は前記細胞膜に結合している標識化リガンドの量を測定する工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）で結合を減少させる化合物はアゴニスト又はアンタゴニストであるとみなすように、工程（ｂ）と（ｄ）で結合している標識化リガンドの差異を比較する工程；を含む。
【００６１】
上記アッセイで、本ポリペプチドは用量依存様式で種々の生理学的及び病理学的プロセスを調節することが分かる。従って、本発明のポリペプチドの“機能的等価物”は、上記アッセイで用量依存様式で何らかの同じ調節活性を示すポリペプチドを包含する。用量依存性活性の程度は、本発明のポリペプチドの程度と同一でないが、好ましくは“機能的等価物”は、本発明のポリペプチドと比較して所定の活性アッセイで実質的に同様の用量依存性を示す。
特定の上記実施形態では、簡単な結合アッセイを使用することができ、本ポリペプチドを有する表面への試験化合物の付着を、試験化合物と直接又は間接的に会合している標識という手段によって、或いは標識化コンペティターとの競合を伴うアッセイで検出する。別の実施形態では、競合薬スクリーニングアッセイを使用することができ、本ポリペプチドと結合可能な中和抗体が、結合について試験化合物と特異的に競合する。この方法では、抗体を用いて、本ポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有するいずれの試験化合物の存在をも検出することができる。
【００６２】
本ポリペプチドをコードするmRNAの細胞内での産生時に添加した試験化合物の効果を検出するようにアッセイを設計することもできる。例えば、技術的に周知の標準的方法でモノクロナール又はポリクロナール抗体を用いてポリペプチドの分泌又は細胞-会合レベルを測定するELISAを構築することができ、これを用いて、適切に操作した細胞又は組織からの本ポリペプチドの産生を阻害又は増強しうる化合物を検索することができる。そして、本ポリペプチドと試験する化合物との間の結合複合体の形成を測定することができる。
本発明の用語内にも包含されるアッセイ方法は、過剰発現又はアブレーションアッセイでの本発明の遺伝子及びポリペプチドの使用を含む。このようなアッセイは、細胞内のこれら遺伝子／ポリペプチドのレベルの操作と、操作した細胞の生理機能に及ぼすこの操作事象の影響の評価を含む。例えば、このような実験は、特定の遺伝子／ポリペプチドが関係する信号発信及び代謝経路の詳細を明らかにし、研究したポリペプチドが相互作用するポリペプチドのアイデンティティーに関する情報を生成し、かつ関連遺伝子及びタンパク質を調節する方法について手がかりを与える。
【００６３】
使用しうる薬物スクリーニングの別の方法は、問題のポリペプチドに対して適切な結合アフィニティーを有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する（国際特許出願WO84/03564参照）。この方法では、多数の種々の小さい試験化合物を固形基材上で合成し、本発明のポリペプチドと反応させ、かつ洗浄する。ポリペプチドを固定化する一手段は、非中和抗体を用いることである。そして、結合したポリペプチドを技術的に周知の方法で検出することができる。精製ポリペプチドを直接プレート上に塗布して上記薬物スクリーニング法で使うこともできる。
本発明のポリペプチドを用いて、リガンド結合及び架橋結合アッセイのような技術的に周知の標準的受容体結合法で膜結合型又は可溶性受容体を同定することができ、このアッセイでは、本ポリペプチドを放射性同位体で標識し、又は化学修飾し、又はその検出若しくは精製を容易にするペプチド配列に融合し、かつ推定受容体の起源（例えば、細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、又は体液の成分）と共にインキュベートする。結合の効力は、表面プラズモン共鳴（Biacore AB, Uppsala, Sweden供給）及び分光法のような生物物理学的方法で測定しうる。受容体の精製及びクローニングには結合アッセイを使用しうるが、その受容体への本ポリペプチドの結合と競合する、該ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定することもできる。スクリーニングアッセイを行う標準的方法は技術的によく理解されている。
【００６４】
本発明は、上述したアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素を同定する方法で有用なスクリーニングキットをも包含する。
本発明は、上記方法で発見された本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素、及び他の化合物を包む。
本発明は、適切な医薬担体と組み合わせて本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を含んでなる医薬組成物をも提供する。これら組成物は、詳細に後述するように、治療若しくは診断試薬、ワクチン、又は他の免疫原性組成物として好適である。
本明細書で使用する用語法では、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物[Ｘ]を含有する組成物は、不純物[本明細書ではＹ]が“実質的にない”（該組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも85質量％がＸの場合）。好ましくは、該組成物中のＸ＋Ｙの合計の少なくとも約90質量％、さらに好ましくは少なくとも約95質量％、98質量％又は99質量％をＸが占める。
【００６５】
本医薬組成物は、好ましくは治療的に有効量の本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド、又は化合物を含むべきである。本明細書では、用語“治療的に有効量”は、目的の病気若しくは状態を治療し、寛解させ、又は予防し、或いは検出しうる治療効果又は予防効果を示すために必要な治療薬の量を指す。いずれの化合物でも、治療的に有効な用量は、初めに、例えば新生細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、又はブタで評価することができる。動物モデルを用いて適切な濃度範囲と投与経路を決定することもできる。このような情報を用いてヒトに投与するために有用な用量と経路を決定することができる。
ヒト被験者に対する正確な有効量は、病気状態の重症度、被験者の通常の健康状態、被験者の年齢、体重、及び性別、食事制限、投与の時間と頻度、薬物の併用、反応感受性、及び療法に対する耐性／応答によって決まる。この量は、日常的な実験で決定することができ、臨床医の判断力の範囲内である。一般的に、有効な用量は、0.01mg/kg〜50mg/kg、好ましくは0.05mg/kg〜10mg/kgである。組成物は、患者に別個に投与してよく、或いは他の物質、薬物又はホルモンと組み合わせて投与することができる。
【００６６】
医薬組成物は、治療薬投与用の薬学的に許容しうる担体を含んでもよい。このような担体として、該担体がそれ自体該組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生を誘発せず、かつ過度の毒性なしで投与しうるという条件で、抗体及び他のポリペプチド、遺伝子及びリポソームのような他の治療薬が挙げられる。好適な担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウィルス粒子のような大きくて、ゆっくり代謝される巨大分子でよい。
本明細書では、薬学的に許容しうる塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩を使用することができる。薬学的に許容しうる担体の通し議論はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)で入手可能である。
治療薬中の薬学的に許容しうる担体は、さらに水、食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を含むことができる。さらに、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質が該組成物中に存在しうる。このような担体は、患者が摂取するための錠剤、丸剤、ドラギー(dragee)剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして医薬組成物を製剤化できるようにする。
製剤化すると、本発明の組成物は被験者に直接投与することができる。治療すべき被験者は動物でよく；特に、ヒト被験者を治療することができる。
【００６７】
この発明で利用する医薬組成物は、いくつかの経路で投与することができ、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮(transdermal)又は経皮(transcutaneous)投与（例えば、WO98/20734参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、腟内又は直腸手段が挙げられる。遺伝子ガン又はハイポスプレー(hypospray)を用いて本発明の医薬組成物を投与しうる。典型的に、治療組成物は、注射液、液状溶液又は懸濁液として調製することができ；注射前に液状媒体中溶液、又は液状媒体中懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。
本組成物の直接送達は一般的に注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内で達成され、或いは組織の間質腔に送達される。本組成物を病変中に投与することもできる。投薬治療は単用量スケジュール又は多用量スケジュールでよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の病気状態で過度な場合、いくつかのアプローチを利用しうる。１つのアプローチは、上述したようなインヒビター化合物（アンタゴニスト）を薬学的に許容しうる担体と共に、ポリペプチドの機能を阻害するために有効な量で、リガンド、基質、酵素、受容体の結合を遮断することによって、或いは第２シグナルを阻害することによってのように被験者に投与する工程と、それによって異常な状態を軽減する工程を含む。好ましくは、このようなアンタゴニストは抗体である。最も好ましくは、該抗体はキメラであり、及び／又は前述したようにその免疫原性を最小限にするためヒト化される。
【００６８】
別のアプローチでは、問題のリガンド、基質、酵素、受容体に対する結合アフィニティーを保持する、ポリペプチドの可溶性形態を投与しうる。典型的に、関連タンパク質を保持する断片の形態でポリペプチドを投与することができる。
代替アプローチでは、本ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、内部に産生され、又は別個に投与されるアンチセンス核酸分子（上述したような）の使用のような発現遮断法で阻害することができる。本ポリペプチドをコードする遺伝子の制御、5'又は調節領域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン）に対する相補配列又はアンチセンス分子（DNA、RNA、又はPNA）を設計することによって遺伝子発現の変化を得ることができる。同様に、“三重らせん”塩基対合方法論を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子、又は調節分子の結合のため十分に開く二重らせんの能力の阻害を引き起こすので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療進歩は文献に記載されている（Gee, J.E.ら (1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY）。転写物がリボソームに結合するのを妨げることによって、相補配列又はアンチセンス分子を設計してmRNAの翻訳を遮断することもできる。このようなオリゴヌクレオチドは投与することができ、或いはインビボ発現からインサイツ生成しうる。
【００６９】
さらに、本発明のポリペプチドの発現は、そのコード化mRNA配列に特異的なリボザイムを用いて阻止しうる。リボザイムは触媒的に活性なRNAsであり、天然又は合成でよい（例えば、Usman, N,ら., Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33参照）。選択した位置で特異的にmRNAsを切断し、それによってmRNAの機能性ポリペプチドへの翻訳を阻止するように合成リボザイムを設計することができる。リボザイムは、RNA分子内で普通に見られるように、天然リボースリン酸骨格鎖と天然塩基で合成されうる。代わりに、リボザイムは非天然骨格鎖、例えば2'-O-メチルRNAで合成され、リボヌクレアーゼ分解からの保護を与えることができ、かつ修飾塩基を含有しうる。
RNA分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を増やしうる。可能な修飾として、限定するものではないが、該分子の5'及び／又は3'末端でのフランキング配列の付加或いは該分子の骨格鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖よりはむしろホスホロチオエート又は2' O-メチルの使用が挙げられる。この概念はPNAsの産生に固有であり、これら分子のすべてでイノシン、キューオシン(queosine)及びブトシン(butosine)のような非伝統的塩基、並びにアセチル-、メチル-、チオ-及び内因性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同じように修飾した形態を包含することによって拡張することができる。
【００７０】
本発明のポリペプチドの発現不全及びその活性に関連する異常状態を治療するためにもいくつかのアプローチを利用しうる。１つのアプローチは、治療的に有効量の、本ポリペプチドを活性化する化合物、すなわち上述したようなアゴニストを被験者に投与して異常状態を軽減する工程を含む。代わりに、治療量の本ポリペプチドを適切な医薬担体と組み合わせて投与してポリペプチドの適切な生理学的バランスを回復させることができる。
遺伝子療法を利用して被験者内の関連細胞によって本ポリペプチドの内因性生産を果たすことができる。遺伝子療法を用い、欠陥遺伝子を修正治療用遺伝子で置換することによって、ポリペプチドの不適切な生産を永久的に治療する。
本発明の遺伝子療法はインビボ又はエキソビボで存在しうる。エキソビボ遺伝子療法は患者の細胞の単離と精製、治療用遺伝子の導入及び遺伝的に変化した細胞を患者に戻すことが必要である。対照的に、インビボ遺伝子療法は患者の細胞の単離と精製を必要としない。
治療用遺伝子は、典型的に、患者に投与するために“パッケージ”される。遺伝子送達媒体は、リポソームのような非ウィルス、又はBerkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992)に記載されているような複製欠失ウィルス又はMuzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992)及び米国特許第5,252,479号に記載されているようなアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターでよい。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子は、複製欠失レトロウィルスベクター内での発現用に操作することができる。この発現構築物を単離し、該ポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入したパッケージング細胞中に導入して、該パッケージング細胞が問題の遺伝子を含有する感染性ウィルス粒子を産生するようにする。これらプロデューサー細胞を被験者に投与して細胞をインビボ操作し、かつ本ポリペプチドのインビボ発現を操作することができる（Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (及びこの中で引用している参考文献) in Human Molecular Genetics (1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd参照）。
別のアプローチは、“裸のDNA”の投与であり、治療用遺伝子を直接血流又は筋肉組織中に注入する。
【００７１】
本発明のポリペプチド又は核酸分子が病気を引き起こす因子である状況では、本発明は、この病気を引き起こす因子に対して抗体を産生させるためのワクチンでそれらを使用できることを規定する。上記ポリペプチド又は核酸分子が上方制御されるものである場合、ワクチン開発は、このような因子に対する抗体又はＴ細胞の産生を含めることができる（WO00/29428に記載されているように）。
本発明のワクチンは予防用（すなわち感染を阻止するため）又は治療用（すなわち感染後の病気を治療するため）のどちらかでよい。このようなワクチンは、通常、上述したような薬学的に許容しうる担体と組み合わせて免疫化抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を含む。担体として、それ自体該組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生を誘発しないいずれの担体も挙げられる。さらに、これら担体は免疫刺激薬（“アジュバント”）として機能しうる。さらに、ジフテリア、破傷風、コレラ、H. ピロリ、及び他の病原由来のトキソイドのような細菌性トキソイドに抗原又は免疫原を接合させうる。
【００７２】
ポリペプチドは胃内で分解しうるので、ポリペプチドを含むワクチンは好ましくは非経口的に投与される（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、又は経皮注射）。非経口投与に好適な製剤として、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及びレシピエントの血液と等張性の製剤を与える溶質を含みうる水性及び非水性無菌注射溶液、並びに懸濁剤又は増粘剤を含みうる水性及び非水性無菌懸濁液が挙げられる。
本発明のワクチン製剤は、単服用量又は多服用量容器で提供することができる。例えば、使用直前に無菌液状担体の添加のみが必要な封止アンプル及びバイアルを凍結乾燥条件で貯蔵することができる。薬用量は、ワクチン特有の活性によって決まり、日常的実験で容易に決定することができる。
本発明のポリペプチドに結合する抗体の遺伝子送達は、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように達成することもできる。
ジェット式注射と呼ばれる技術（例えば、www.powderjet.com参照）もワクチン組成物の製剤化で有用である。
ワクチン接種及びワクチン送達システムに好適ないくつかの方法が国際特許出願WO00/29428に記載されている。
【００７３】
この発明は、本発明の核酸分子の診断試薬としての使用にも関する。機能不全に関連する本発明の核酸分子の特徴がある遺伝子の突然変異型の検出は、遺伝子の発現不全、過剰発現又は空間的若しくは時間的発現の変化に起因する病気、又は病気に対する感受性の診断に加え、或いはそれを定義しうる診断ツールを提供する。種々の技術によってDNAレベルで遺伝子に突然変異がある個体を検出することができる。
診断用核酸分子は、血液、尿、唾液、組織バイオプシー又は剖検材料のような被験者の細胞から得ることができる。ゲノムDNAを直接検出に使用し、或いは分析前にPCR、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換増幅（SDA）、又は他の増幅法（Saikiら, Nature, 324, 163-166 (1986); Bejら, Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyerら, J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)参照）を用いて酵素的に増幅することができる。
【００７４】
一実施形態では、本発明のこの局面は、患者の病気を診断する方法であって、本発明のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現レベルを評価する工程と、前記発現レベルを対照レベルと比較する工程とを含む方法を提供する。ここで、前記対照レベルと異なるレベルが病気の指標である。本方法は、以下の工程：
ａ）患者由来の組織試料を厳密条件下で核酸プローブと接触させる工程であって、前記厳密条件は、本発明の核酸分子と前記プローブとのハイブリッド複合体の形成を許容する工程；
ｂ）工程ａ）と同一条件下で前記プローブを対照試料と接触させる工程；及び
ｃ）前記試料中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程；
を含み、
前記対照試料中のハイブリッド複合体のレベルと異なる前記患者の試料中のハイブリッド複合体のレベルの検出が病気の指標である。
【００７５】
本発明のさらなる局面は、以下の工程：
ａ）病気について調べる患者由来の組織試料を得る工程；
ｂ）前記組織試料から本発明の核酸分子を単離する工程；及び
ｃ）病気と関連する前記核酸分子中の突然変異の存在を検出することによって、病気について患者を診断する工程；
を含む診断方法を含む。
上記方法で核酸分子の検出を補助するため、例えばPCRを用いる増幅工程を含めることができる。
正常な遺伝子型と比べた増幅産物の大きさの変化によって欠失及び挿入を検出することができる。本発明の標識化RNA又は代わりに、本発明の標識化アンチセンスDNA配列に増幅DNAをハイブリダイズすることによって、点突然変異を確認することができる。RNアーゼ消化又は融解温度の差を評価することによって、完全に一致する配列をミスマッチ二重鎖と区別することができる。患者内の突然変異の存在又は非存在は、厳密条件下でDNAにハイブリダイズする核酸プローブとDNAを接触させて、ハイブリッド二重鎖分子であって、病気に関連する突然変異に対応するいずれかの部分に核酸プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二重鎖分子を形成し；かつDNA鎖の対応部分内における病気関連突然変異の存在又は非存在の指標としてプローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の存在又は非存在を検出することによって、患者内の突然変異の存在又は非存在を検出しうる。
このような診断法は特に出生前検査で有用であり、かつ新生児期検査でさえ役立つ。
【００７６】
点突然変異及び参考遺伝子と“突然変異”遺伝子との他の配列差異は、直接DNAシークエンシング又は単鎖配座多形性のような他の周知技術によって同定しうる（Oritaら, Genomics, 5, 874-879 (1989)参照）。例えば、変形PCRで生成した二重鎖PCR産物又は単鎖鋳型分子と共にシークエンシングプライマーを使用しうる。放射標識化ヌクレオチドによる通常の手段又は蛍光標識による自動シークエンシング手段によって配列決定を行う。クローン化DNAセグメントをプローブとして用いて特有のDNAセグメントを検出することもできる。この方法の感度はPCRと併用すると非常に高まる。さらに、例えば、単ヌクレオチドが異なる配列のPCR増幅用のアレレ特異的オリゴヌクレオチドの使用を通じて、上述したように点突然変異及び他の配列変異を検出することができる。
DNA配列の差異は、変性剤があるか又は無いゲル中のDNA断片の電気泳動モビリティの変化によって、或いは直接DNAシークエンシングによっても検出しうる（例えば、Myersら, Science (1985) 230:1242）。特異的位置の配列変化は、RNアーゼ及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ又は化学的切断法によっても明らかにすることができる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4397-4401）。
【００７７】
通常のゲル電気泳動法及びDNAシークエンシングに加え、微小欠失、異数性、転位、逆位のような突然変異をインサイツ分析によって検出することもでき（例えば、Kellerら, DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA (1993)参照）、すなわち細胞の単離及び／又は膜上への固定化を必要とせずに突然変異について細胞中のDNA又はRNA配列を分析することができる。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（FISH）は、現在最も一般的に適用される方法であり、FISHの多くのレビューが出現している（例えば、Trachuckら, Science, 250, 559-562 (1990), 及びTraskら, Trends, Genet., 7, 149-154 (1991)参照）。
本発明の別の実施形態では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して遺伝的変異体、突然変異及び多形性の効率的スクリーニングを行うことができる。アレイ技法は周知であり、一般的適用可能性を有し、かつ遺伝子発現、遺伝的連鎖、及び遺伝的変異性を含む分子遺伝学の種々の問題を処理するために使用することができる（例えば、M.Cheeら, Science (1996), Vol 274, pp 610-613参照）。
【００７８】
一実施形態では、PCT出願WO95/1195(Cheeら)；Lockhart, D. J.ら(1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680；及びSchena, M.ら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619に記載されている方法に従ってアレイを調製かつ使用する。オリゴヌクレオチド対は２から100万を超える範囲でよい。光特異的化学法を用いて基材上の指定領域でオリゴマーを合成する。基材は紙、ナイロン若しくは他のタイプの膜、フィルター、チップ、スライドガラス又は他のいずれの適切な固形支持体でもよい。別の局面では、PCT出願WO95/25116(Baldeschweilerら)に記載されているように、化学的カップリング手順及びインクジェット適用装置を用いて基材の表面上でオリゴヌクレオチドを合成することができる。別の局面では、ドット（又はスロット）ブロットに似た“格子型”アレイを用いて、真空システム、熱、UV、機械的若しくは化学的結合手順でcDNA断片又はオリゴヌクレオチドを基材表面に配列かつ連結することができる。上述したようなアレイは、手で、或いは利用できる装置（スロットブロット又はドットブロット装置）、材料（いずれかの適宜の固形支持体）、及び機械（ロボット機器を含む）を用いて製造でき、かつ８、24、96、384、1536若しくは6144個、又は商業的に入手可能な計測器の効率的使用にそれを適合させる２〜100万を超える他のいずれかの数のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【００７９】
上記方法に加え、被験者由来の試料から、ポリペプチド又はmRNAの異常に減少又は増加したレベルを決定する工程を含む方法で病気を診断することができる。例えば、核酸増幅、例えばPCR、RT-PCR、RNアーゼ保護、ノーザンブロット法及び他のハイブリダイゼーション法のようなポリヌクレオチドの定量のための技術的に周知ないずれかの方法を用いて、減少又は増加した発現をRNAレベルで測定することができる。
宿主由来の試料内の本発明のポリペプチドのレベルを決定するために使用可能なアッセイ法は当該技術の当業者に周知であり、ある程度詳細に上述した（ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析及びELISAアッセイ）。本発明のこの局面は、以下の工程：（ａ）上述したようなリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で生体試料と接触させる工程；及び（ｂ）前記複合体を検出する工程；を含む診断方法を提供する。
【００８０】
ELISA、RIA、及びFACSのようなポリペプチドレベルを測定するための手順は、さらにポリペプチド発現の変化した又は異常なレベルを診断する基礎を与える。ポリペプチド発現の正常又は標準値は、正常な哺乳類被験者、好ましくはヒトから取った体液又は細胞抽出物を、複合体形成に適した条件下で、ポリペプチドに対する抗体と結合することによって立証される。測光手段のような種々の方法によって、標準的な複合体形成の量を定めることができる。
本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体は、該ポリペプチドの発現の特徴がある状態若しくは病気の診断、又は本発明のポリペプチド、核酸分子、リガンド及び他の化合物で治療する患者をモニターするためのアッセイで使用することができる。診断プロセスで有用な抗体は、治療薬について上述したのと同じ様式で調製することができる。本ポリペプチドの診断アッセイとして、該抗体と、ヒトの体液又は細胞若しくは組織の抽出物内で該ポリペプチドを検出するための標識を利用する方法が挙げられる。抗体は修飾し、又は修飾せずに使用でき、かつそれらを共有結合的又は非共有結合的にリポーター分子と結合することによって標識化しうる。技術的に周知の種々多様なリポーター分子を用いることができ、そのいくつかについて上述した。
被験者、対照及びバイオプシー組織由来の病気試料内で発現されるポリペプチドの量を標準値と比較する。標準値と被験者の値の偏差が病気を診断するためのパラメーターを確立する。診断アッセイを用いてポリペプチドの非存在、存在、及び過剰発現と区別し、かつ治療措置中のポリペプチドレベルの規則をモニターすることができる。このようなアッセイを用い、動物研究、臨床治験又は個々の患者の治療のモニタリングにおける治療措置レジメの効率を評価することもできる。
【００８１】
本発明の診断キットは、以下の要素：
（ａ）本発明の核酸分子；
（ｂ）本発明のポリペプチド；又は
（ｃ）本発明のリガンド；
を含みうる。
【００８２】
本発明の一局面では、診断キットは、厳密条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含有する第１容器；前記核酸分子を増幅するために有用なプライマーを含有する第２容器；及び病気の診断を容易にするための前記プローブとプライマーの使用説明書を含みうる。本キットは、さらに非ハイブリダイズRNAを消化するための薬剤を保持する第３容器を含みうる。
診断キットは、本発明の代替局面では、本発明の核酸分子の少なくとも１つの核酸分子のアレイを含むことができる。
本発明のポリペプチドを検出するため、診断キットは、本発明のポリペプチドに結合する１個以上の抗体；及び該抗体とポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬を含むことができる。
このようなキットは、メタロプロテアーゼが関係する病気、特に気腫や嚢胞性線維症を含む呼吸器障害、代謝障害、心臓血管障害、細菌感染症、高血圧症、癌を含む増殖性障害、リュウマチ性関節炎を含む自己免疫/炎症性障害、神経障害、発達障害及び生殖障害、又はこれら病気に対する感受性の診断で役に立つ。
以下、本発明の種々の局面及び実施形態を、特にINSP005ポリペプチドを参照しながら例としてさらに詳述する。
本発明の範囲から逸脱することなく細部の変更を為しうることを理解すべきである。
【００８３】
（実施例）
実施例１：INSP005予測ポリペプチド
私有のバイオインファマティクス法で予測したINSP005ポリペプチド配列(配列番号:37)を以下のデータベースの検索用の質問(query)配列として使用した。
NCBI-nr              NCBI-nt              NCBI-pat-aa
NCBI-pat-nt          NCBI-month-aa        NCBI-month-nt
NCBI-est
これら検索の結果を図１に要約し、２つの関連配列アラインメントを示す。図１の表題は、使用した検索／アラインメントアルゴリズムと検索したデータベースを示す。これら結果は、INSP005予測ポリペプチド配列に最も近い関連マッチは日本ウナギ(日本ウナギ)由来の孵化酵素EHE4であることを示す。これら検索は、問題の３つの他の先行技術の配列も同定した。
【００８４】
メタロプロテアーゼのコリオリジン(choriolysin)／アスタシン(asracin)様ファミリーのメンバーは、受精後の卵生魚卵の卵膜硬化に関与している（例えば、Shibataら(2000) J.Biol.Chem vol.275, No.12 p8349参照）。この受精後の変化が多精受精を防止し、かつウニ、両生類の受精膜の形成及び哺乳類の透明帯反応に相当する。それらは、孵化時における硬化卵膜の加水分解及び未受精卵膜の加水分解にも関与している。
上述したように、新規メタロプロテアーゼの同定は、これらタンパク質が関係する特定の病気状態につながる潜在的経路の理解の向上、及びこれら障害を治療するための有効な遺伝子又は薬物療法の開発で非常に重要である。同様に、メタロプロテアーゼのアスタシン／コリオリジン様ファミリーのさらなるメンバーの同定は、これらタンパク質が関係する特定の病気状態につながる潜在的経路の理解の向上、及びこれら障害を治療するための有効な遺伝子又は薬物療法の開発で非常に重要である。
【００８５】
実施例２：INSP005クローニングの概要
1.1 cDNAライブラリー
ヒトcDNAライブラリー(バクテリオファージラムダ(λ)ベクター)はStratagene又はClontechから購入し、或いはSerono Pharmaceutical Research Instituteで、製造業者のプロトコロル(Stratagene)に従ってλ ZAP又はλ GT10ベクター中で調製した。バクテリオファージλ DNAは、大腸菌感染した宿主株の小スケール培養からWizard Lambda Preps DNA精製システムを用い、製造業者の説明書に従って調製した(Promega, Corporation, Madison WI.)。使用したライブラリー及び宿主株のリストを図２に示す。５つの異なるライブラリー(100ng/μlファージDNA)の８種のツール(A-H)を以後のPCR反応で使用した。
【００８６】
1.2 逆転写cDNA鋳型の生成
全RNAは、TrizolTM試薬(Invitrogen)を用い、製造業者の説明書に従って主要なヒト細胞、ヒト細胞系及びヒト組織から単離し、或いはClontech、Invitrogen又はAmbionから購入した。RNAの質と濃度は、Agilent 2100 Bioanalyzerで分析した。
cDNA合成のため、反応混合物は以下の成分を含む：12μ1の体積中、オリゴ(dT)15プライマー(500μg/ml,Promega cat. no. C 1101)、2μgの全RNA、1μlの10mM dNTPs。この混合物を65℃に５分間加熱してから氷上で冷却した。以下の試薬を添加し：4μlの5X第１鎖緩衝液、2μlのDTT(0.1M)、1μlのRNAseOut組換えリボヌクレアーゼインヒビター(40単位/μl, Promega, cat. no. N 2511)、42℃で２分間インキュベート後、1μl(200単位)のSuperscript II(Invitrogen cat. no. 18064-014)を添加した。混合物を42℃で50分間インキュベートしてから70℃で15分間加熱した。RNA鋳型を除去するため、1μl(2単位)の大腸菌RNase H(Invitrogen cat. no.18021-014)を添加し、反応混合物を37℃でさらに20分間インキュベートした。最終反応混合物を無菌水で200μlに希釈し、-80℃で貯蔵した。同体積の５種のcDNA鋳型を混合してcDNAプールを生成した。
【００８７】
1.3 ファージライブラリーDNA由来の実際のcDNAsのPCR
INSP005をコードする部分的cDNAは、遺伝子特異的クローニングプライマー(CP1及びCP2、図３及び図４)を用いて248bpのPCR増幅産物として得た。PCRは、1X AmpliTaqTM緩衝液、200μMのdNTPs、それぞれ50pmolesのクローニングプライマー、2.5単位のAmpliTaqTM(Perkin Elmer)及び100ngの各ファージライブラリープールDNAを含有する最終体積50μl中、MJ Research DNA Engineを用い、以下のように計画して行った：94℃、1分；94℃、1分、ｘ℃、及びｙ分及び72℃の40サイクル(ｘは最低Ｔm-5℃、ｙ＝産物１kb当たり１分)；次いで72℃で７分を１サイクルかつ４℃で保持サイクル。
1 X TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で増幅産物を可視化し、予測分子量で移動するPCR産物をWizard PCR Preps DNA Purification System (Promega)でゲルから精製した。50μlの無菌水中に溶出したPCR産物を直接サブクローン化し、或いは-20℃で貯蔵した。
【００８８】
1.4 PCR用遺伝子特異的クローニングプライマー
Primer Designer Software (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)を用い、仮想cDNAの全長及び部分的配列を増幅するため18〜25塩基の長さを有するPCRプライマーの対を設計した。55±10℃に近いＴm及び40〜60％のGC含量を有するようにPCRプライマーを最適化した。標的配列INSP005に高い選択性を有するプライマーを選択した(非特異的プライミングがほとんど又は全くない)。 
【００８９】
1.5 PCR産物のサブクローニング
Invitrogen Corporationから購入したTAクローニングキットを用い、製造業者が指定した条件でPCR産物をトポイソメラーゼI修飾クローニングベクター(pCRII TOPO)中にサブクローン化した。要するに、ヒトライブラリープールN増幅からの4μlのゲル精製PCR産物を1μlのTOPOベクターと1μlの塩溶液と共に室温で15分間インキュベートした。以下のように反応混合物を大腸菌株TOP10(Invitrogen)中で形質転換させた：50μlずつのOne Shot TOP10細胞を氷上で解凍し、2μlのTOPO反応を加えた。混合物を15分間氷上でインキュベートしてから42℃で正確に30秒間インキュベートして熱ショックを与えた。試料を氷に戻し、250μlの温SOC培養液(室温)を加えた。試料を振とうさせながら(220rpm)37℃で１時間インキュベートした。この形質転換混合物を、アンピシリン(100μg/ml)を含有するL-ブロス(LB)プレート上に塗布し、37℃で一晩中インキュベートした。cDNA挿入断片を含有するアンピシリン耐性コロニーをコロニーPCRによって同定した。
【００９０】
1.6 コロニーPCR
無菌つまようじを用いて50μlの無菌水溶液中にコロニーを接種した。SP6及びT7プライマーを使用することを除き、上述したように全反応量20μl中10μlずつの接種材料をPCRに供した。サイクル条件は以下のとおりだった：94℃、２分；94℃、30秒、47℃、30秒及び１分間72℃の30サイクル；1サイクル、72℃、7分。さらなる分析前に試料を４℃(保持サイクル)で維持した。
PCR反応産物を1 X TAE緩衝液中１％アガロースゲル上で分析した。予想したPCR産物サイズ（248bp cDNA＋複数のクローニング部位又はMCSのため185bp）を与えたコロニーを、37℃220rpmで振とうさせながら、アンピシリン(100μg/ml)を含有する5mlのL-Broth(LB)中37℃で一晩中成長させた。
【００９１】
1.7 プラスミドDNA調製及びシークエンシング
Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SV Miniprepsキット(Promega cat. no. 1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養からMiniprepプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAを100μlの無菌水溶液中に溶出した。Eppendorf BO光度計でDNA濃度を測定した。BigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystems cat. no. 4390246)を用い、製造業者の説明書に従ってT7プライマー及びSP6プライマーによるDNAシークエンシングにプラスミドDNA(200〜500ng)を供した。Dye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアッププレート(Millipore cat. no. LSKS09624)でシークエンシング反応を精製してからApplied Biosystems 3700シークエンサーで分析した。
【００９２】
1.8 RACE PCRによるINSP005の全長配列の同定
INSP005 ORFの予測配列を図３に示す。オープンリーディングフレーム内のM96における第２予測開始部位を使用する全長予測又はより短いバージョンを増幅するためのプライマー対を用い、PCRで全長コーディング配列を単離する試みは、試験したライブラリーについて失敗した。INSP005に最も近い関連配列は、日本ウナギのアスタシン様メタロペプチダーゼとメダカ(Oryzias latipes)のコリオリジンHである。INSP005は、コリオリジンHのヒトオルトログ(orthologue)である。コリオリジンは卵生魚卵の受精後の卵膜硬化に関係があり、子宮がINSP005 mRNAの適切な起源でありうることを示唆している。この組織の選択は、さらにヒト子宮腫瘍由来の単EST、BI061462の発見によって支持された。
完全コーディング配列を同定するためGeneRacerキット(Invitrogen cat no. L1502-01)を用い、製造業者の説明書に従って、子宮RNA(Clontechから購入)から調製したcDNAについてRACE PCRを行った。3'末端の増幅のため、1μlのRACE Ready cDNA、5μlの10Xハイフィデリティー(High Fidelity)緩衝液、1μlのdNTPs(10mM)、2μlの50mM MgSO4、3μlのGeneRacer 3'プライマー(10μM)、1μlの遺伝子特異的プライマー(78836-GR1-3')(10μM)及び2.5単位(0.5μl)の白金Taq DNAポリメラーゼHi Fi(Invitrogen)を含有する50μlの溶液量で第１PCRを行った。サイクル条件は以下のとおりだった：94℃、2分；94℃、30秒及び72℃で２分の５サイクル；94℃、30秒及び70℃、5分の５サイクル；94℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、5分の25サイクル；68℃で10分間で最後の伸長。１μlの増幅反応を入れ子状PCRの鋳型として使用し、プライマー以外上記と同一の試薬で最終反応量50μlで行った。入れ子状PCRのプライマーは1μlのGeneRacer 3'入れ子状プライマー(10μM)と1μlの入れ子状遺伝子特異的プライマー(78836-GR1nest-3')(10μM)だった。サイクル条件は、94℃、2分；94℃、30秒、65℃、30秒及び68℃、5分の25サイクル；68℃で10分間最終伸長及び４℃で保持サイクル。PCR産物をゲル精製し、pCR4-TOPOベクター中にサブクローン化し、上述したように配列決定した。使用したすべてのプライマーを図４に示す。3' RACE産物のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を図５に示す。3' RACE産物によってコードされたアミノ酸配列は伸長したC-末端を有しており、ヌクレオチド位置85後の予測と異なり、二者択一的スプライス型を示唆している。
【００９３】
1.9 PCRによるINSP005の全長コーディング配列のクローニング
INSP005の推定全長コーディング配列をヒト子宮cDNA(セクション1.2で述べたように調製した)から2μlの子宮cDNA、5μlの10Xハイフィデリティー緩衝液、1μlのdNTPs(10mM)、2μlの50mM MgSO4、1μlの遺伝子特異的プライマー78836-FL-F(10μM)、1μlの逆遺伝子特異的プライマー78836-FL-R(10μM)及び2.5単位(0.5μl)の白金Taq DNAポリメラーゼHi Fi(Invitrogen)を含有する50μlのPCR反応混合物中PCRでクローン化した。サイクル条件は、94℃、2分；94℃、30秒、55℃、30秒及び68℃、1分30秒の40サイクル；68℃で10分間最終伸長及び４℃で保持サイクル。増幅産物を1 X TAE緩衝液(Invitrogen)中0.8％アガロースゲル上で可視化し、予測分子量(1048bp)で移動するPCR産物をゲルからWizard PCR Preps DNA精製システム(Promega)で精製した。セクション1.4で述べたように、PCR産物を50μlの無菌水に溶出し、pCR4 TOPOベクター中にサブクローン化した。増幅反応の伸長時間が２分であることを除き、セクション1.5で述べたとおりにいくつかのアンピシリン耐性コロニーをコロニーPCRに供した。正確な大きさの挿入断片(1048bp＋MCSのための99bp)を含有するコロニーを、アンピシリン(100μg/ml)を含有する5mlのL-Broth(LB)中、37℃220rpmで振とうさせながら37℃で一晩中成長させた。Qiaprep Turbo 9600ロボットシステム(Qiagen)又はWizard Plus SV ミニプレップキット(Promega cat. no. 1460)を用い、製造業者の説明書に従って5mlの培養からミニプレッププラスミドDNAを調製し、かつ200〜500ngのミニ-プレップDNAをセクション1.7で述べたようにT3及びT7プライマーで配列決定した(図６)。クローン化配列を図７に示す。予測配列と共にクローン化配列(INSP005a)のアミノ酸アラインメントを図13に示す。結果のプラスミドpCR4-TOPO-IPAAA78836-1(配列番号:38；プラスミド識別番号13164)の地図を図９に示す。
【００９４】
2.0 INSP005を含むcDNAライブラリー/鋳型の同定
CP1及びCP2で得られ、かつ正しい大きさ(248bp)で移動するPCR産物をライブラリープールN(ライブラリー18、19、20及び21)内で同定した。78836-FL-F及び78836-FL-Rプライマーを用い、推定全長INSP005(INSP005a)をコードするcDNAを子宮cDNAから単離した。プライマー78836-FL-Fは、予測配列のエキソン3内に位置する。予測のエキソン1内にプライマーがある逆プライマー(78836-FL-R)ではPCR産物は得られなかった。
プライマー78836-FL2-F及び78836-FL-Rを用い、代替5'末端を含有するINSP005(INSP005b)の第２推定全長バージョンをヒトの主要な肺線維芽細胞、ケラチノサイト及び骨関節炎滑液由来のcDNAsのプールからクローン化したが、子宮内では検出されなかった。結果PCR産物(1313bp−図10)をTOPO-TAクローニングキット及びセクション1.5〜1.7で述べたとおりの配列を用いてpCR4 TOPOベクター中にサブクローン化した。結果のプラスミド、pCR4-TOPO-IPAAA78836-2(配列番号:39；プラスミド識別番号13296)の地図を図12に示す。
【００９５】
2.1 クローニング結果の要約
全長INSP005予測ポリペプチドをクローン化する試みは、本明細書でINSP005a及びINSP005bと称するINSP005予測ポリペプチドの２種の変異体を同定した(図13；それぞれ配列番号:14及び配列番号:34)。上述したように、INSP005a及びINSP005bポリペプチド(及びINSP005b成熟ポリペプチド)は、本明細書ではINSP005予測ポリペプチドと区別するようにINSP005ポリペプチドと称する。
INSP005a及びINSP005bポリペプチド内の予測エキソンのヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜12及び配列番号15〜32に示す。上述したように、INSP005a及びINSP005bポリペプチドの推定全長ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号13及び33に示す。INSP005a及びINSP005bポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号14及び34に示す。
INSP005a及びINSP005bポリペプチド及びINSP005予測ポリペプチドと、問題の３つの先行技術の配列との間の関係を図13に示し、この図は配列の配列-レベルアラインメントを与える。以下、これらの結果を詳述する。
INSP005aは、子宮cDNAライブラリー由来のINSP005予測ポリペプチドの推定全長バージョンである。この配列は、元のINSP005予測ポリペプチドのメチオニン3で開始する、先端を切った5'末端を有する点で元のINSP005予測ポリペプチドと異なる(図13参照)。INSP005aは、INSP005予測ポリペプチドに対して余分のエキソンを組み入れる伸長した3'末端も有する。INSP005aは全部で６個の予測エキソンを有する。これらの差異は、他のメタロプロテアーゼに対する当該配列要素の低い相同性のため予測されなかった。さらに、INSP005予測ポリペプチドと比べてINSP005aの位置22で用いた択一的アミノ酸がある。INSP005aはシグナルペプチドを含むと予測されない。INSP005aは、上流STOPコドンの前にインフレーム択一的上流開始メチオニンを持たない。
【００９６】
配列番号:14に示されるポリペプチド配列(INSP005a)をNCBI非重複配列データベースに対するBLAST質問として使用した。ヒットした上位10件はすべて日本ウナギ由来卵孵化-関連酵素又はコリオリティック(choriolytic)プロテアーゼであり、非常に有意なE-値(e-115〜2e-41)で質問配列に整列する(図８)。図８は、トップの生化学的注釈付きヒット、日本ウナギ由来の孵化酵素HE13に対するINSP005aポリペプチド質問配列のアラインメントも示す。これら結果は、INSP005aポリペプチドがメタロプロテアーゼであり、さらに詳しくはそれはコリオリジン/アスタシン様メタロプロテアーゼであるという強い証拠を与える。
INSP005bは、ヒトの主要肺線維芽細胞、ケラチノサイト及び骨関節炎滑液由来のcDNAのプールからクローン化したINSP005予測ポリペプチドの推定全長バージョンである。INSP005bは、２つの択一的アミノ酸が位置117と222で使用されるが、元のINSP005予測ポリペプチド配列を包含する。それは３つの新しい上流エキソンと１つの下流エキソンをも含み、INSP005bを９エキソンポリペプチドにしている。最後のエキソンはINSP005aと共有されている。INSP005bは子宮内で検出されなかった。当該配列要素の他のメタロプロテイナーゼに対する低い相同性のため、これら差異は予測されなかった。上述したように、INSP005bは、アミノ酸23と24との間に切断部位を有するシグナルペプチドを含むと予測される(配列番号35及び36；図14)。
【００９７】
配列番号:34に示されるポリペプチド配列(INSP005b)をNCBI非重複配列データベースに対するBLAST質問として使用した。ヒットした上位10件はすべて日本ウナギ由来卵孵化-関連酵素又はコリオリティック(choriolytic)プロテアーゼであり、高度に有意なE-値(e-152〜4e-46)で質問配列に整列する(図11)。図11はトップの生化学的注釈付きヒット、日本ウナギ由来の孵化酵素HE13に対するクローン化ポリペプチド質問配列のアラインメントも示す。これら結果は、INSP005bポリペプチドがメタロプロテアーゼであり、さらに詳しくはそれはコリオリジン/アスタシン様メタロプロテアーゼであるという強い証拠を与える。
INSP005bの最初の７個のエキソンは、取得番号AX443328が付与され、WO200216566-A2で開示されるヌクレオチド配列と一致するが(図１及び図13参照)、最後の3'エキソンはWO200216566-A2で開示されていない(Applera Corp)。本発明のヌクレオチド及びポリペプチドモジュールは、WO200216566-A2に開示されているものを明確に除外する。
さらなる先行技術の問題の配列は、INSP005aのエキソン1とINSP005bのエキソン2、3及び4をカバーする子宮腫瘍由来のスプライスドESTである(BI061462.1；図１参照)。ESTの方向は報告に与えられず、かつ翻訳から開始メチオニンの存在について結論を出すことは難しい。しかし、本発明のヌクレオチド及びポリペプチドモジュールは、EST BI061462.1に開示されている配列を明確に除外する。
取得番号AX526191(Lexicon)を有する別の先行技術の問題の配列は(図１及び13)、関連データベースエントリー(WO02/066624に開示されている)でcDNAとして記載され、生殖役割の可能性に言及されていない。それは、INSP005aと、INSP005bのエキソン2〜8を包含する。しかし、INSP005b及びAX526191(Lexicon)配列中の対応するアミノ酸と比較してINSP005aの位置127で択一的アミノ酸が使用されている。AX526191は開始メチオニン、上記子宮腫瘍ESTによってカバーされる。AX526191では0.875の確率でシグナル配列が予測される。本発明のヌクレオチド及びポリペプチドモジュールは、取得番号AX526191の配列を含むWO02/066624で開示されている配列を含まない。
また、図13は、示される各ポリペプチドで同一である活性部位残基を強調表示する。これは、INSP005a及びINSP005bポリペプチドがメタロプロテアーゼであるという抗し難いさらなる証拠を与える。
従って、INSP005a及びINSP005bポリペプチドは新しいメタロプロテアーゼを表し、それらがメタロプロテアーゼのコリオリジン/アスタシン様ファミリーのメンバーであるという強い証拠がある。それゆえにINSP005a及びINSP005bポリペプチドは、ヒトの生理学的及び病理学的プロセス、特に生殖プロセスで重要な役割を果たしうる。
【００９８】
実施例３：クローン化His-標識INSP005bの発現及び精製
3.1 発現
Epstein-Barrウィルス核抗原を発現するヒト胎児腎臓293細胞(HEK293-EBNA, Invitrogen)をEx-細胞VPRO血清フリー培地(種ストック、維持培地、JRH)中懸濁液内で維持した。トランスフェクションの16〜20時間前(日-1)、細胞を2xT225フレーク(1フレーク当たり50ml、2×105細胞/mlの密度で2% FBS接種培地(JRH)を含有するDMEM/F12(1:1)中)に接種した。次の日(トランスフェクション：日-0)、JetPEITM試薬(2μl/μgのプラスミドDNA, PolyPlus-transfection)を用いてトランスフェクションを行った。各フレークで113μgのcDNA(プラスミド番号13403)を2.3μgのGFP(蛍光リポーター遺伝子)と共に形質移入した。トランスフェクションミックスを2xT225フレークに加え、37℃(5%CO2)で6日間インキュベートした。材料の量を増やすため、この手順を２個の追加フレークで繰り返して全部で200ml生成した。ポジティブトランスフェクションの確認は、日-6に定性蛍光検査で行った(Axiovert 10 Zeiss)。
日-6(収穫日)に、４つのフレークから上清(200ml)をプールし、遠心分離し(4℃,400g)、ユニークなアイデンティファイヤーを有するポット内に置いた。
6His-標識タンパク質のQC(内部バイオプロセシングQC)のため１アリコート(500ul)を保った。対応する送達シートはT. Battleのノートブック11140 p28内で見つけられる。
追加生産目的のため、以下のような500mlのスピナートランスフェクションでバッチ２を生成した：
Epstein-Barrウィルス核核抗原を発現するヒト胎児腎臓293細胞(HEK293-EBNA, Invitrogen)をEx-細胞VPRO血清フリー培地(種ストック、維持培地、JRH)中懸濁液内で維持した。トランスフェクションの日に、細胞を数え、遠心分離し(低速)、ペレットを1% FCSで補充した所望量のFEME培地中で再懸濁させ(以下参照)、1XE6生細胞/mlの細胞濃度を得た。#13403 cDNAをFEME (200ml/リットル体積)中2mg/リットル体積(2% eGFPと共-形質移入)で希釈した。ポリエチレンイミントランスフェクション薬(4mg/リットル体積)をcDNA溶液に加え、ボルテックスし、室温で10分間インキュベートした(トランスフェクションミックス生成)。
このトランスフェクションミックスをスピナーに添加し、CO2インキュベーター(5%CO2かつ37℃)内で90分間インキュベートした。90分後、新鮮なFEME培地(1% FCS)を加え、最初のスピナー体積の２倍にした。スピナーを６日間インキュベートした。日-6(収穫日)に、スピナー上清(500ml)を遠心分離し(４℃,400g)、プラスミド番号と発酵番号を有するユニークなアイデンティファイヤーを有するポット内に置いた。
6His-標識タンパク質のQC(内部バイオプロセシングQC)のため１アリコート(500μl)を保った。
【００９９】
3.2 精製プロセス
Ｃ末端6His標識を有する組換えタンパク質を含有する200mlの培養基試料を冷緩衝液Ａ(50mM NaH2PO4;600mM NaCl;8.7%(w/v)グリセロール,pH7.5)で最終体積400mlに希釈した。試料を0.22um無菌フィルター(Millipore,500mlフィルター単位)でろ過し、500mlの無菌方形培地ボトル(Nalgene)内４℃で保持した。
この500mlの培養基試料を冷緩衝液Ａで最終体積1000mlに希釈した。試料を0.22um無菌フィルター(Millipore,500mlフィルター単位)でろ過し、1000mlの無菌方形培地ボトル(Nalgene)内４℃で保持した。
精製は、自動試料装填機(Labomatic)に接続したVISIONワークステーション(Applied Biosystems)上４℃で行った。精製手順は、２つの連続工程、Niイオンで充填したPoros 20 MC(Applied Biosystems)カラム上(4.6×50mm,0.83ml)金属アフィニティークロマトグラフィー後、Sephadex G-25培地(Amersham Pharmacia)ゲルろ過カラム上(1,0×15cm)緩衝液交換で編成した。
第１クロマトグラフィー工程では、金属アフィニティーカラムを30カラム量のEDTA溶液(100mM EDTA;1M NaCl;pH8.0)で再懸濁させ、15カラム量の100mM NiSO4溶液による洗浄によってNiイオンで再充填し、10カラム量の緩衝液Ａ、次に７カラム量の緩衝液Ｂ(50mM NaH2PO4;600mM NaCl;8.7%(w/v)グリセロール,400mM;イミダゾール,pH7.5)で洗浄し、最後に15mMのイミダゾールを含有する15カラム量の緩衝液Ａで平衡化した。実験室試料装填機で試料を200mlの試料ループ中に写し、引き続き10ml/分の流速でNi金属アフィニティーカラム上に充填した。全試料体積(400又は1000ml)をNiカラム上に移すため、充填手順をそれぞれ２及び５回繰り返した。引き続きカラムを12カラム量の緩衝液Ａ、次に20mMのイミダゾールを含有する28カラム量の緩衝液Ａで洗浄した。20mMのイミダゾール洗浄の間、ゆるく結合した混入タンパク質がカラムの溶出液だった。最後に２ml/分の流速で10カラム量の緩衝液Ｂによって組換えHis-標識タンパク質を溶出し、溶出したタンパク質を1.6mlフラクションに収集した。
【０１００】
第２クロマトグラフィー工程では、Sephadex G-25ゲルろ過カラムを2mlの緩衝液Ｄ(1.137M NaCl;2.7mM KCl;1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4;pH7.2)で再懸濁させ、引き続き４カラム量の緩衝液Ｃ(137mM NaCl;2.7mM KCl;1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4;20%(w/v)グリセロール;pH7.4)で平衡化した。Ni-カラムから溶出したピークフラクションをVISION上の組込み試料装填機でSephadex G-25カラム上に自動装填し、２ml/分の流速で緩衝液Ｃでタンパク質を溶出した。Sephadex G-25カラムからタンパク質試料を2.2mlフラクションに回収した。このフラクションを0.22um無菌遠心分離フィルター(Millipore)でろ過し、凍結乾燥かつ-80℃で貯蔵した。１アリコートの試料をSDS-PAGE(4-12% NuPAGEゲル;Novex)上クーマシー染料及び抗-His抗体によるウエスタンブロットで分析した。
クーマシー染色：NuPAGEゲルを0.1%クーマシーブルーR250染色溶液中(30%メタノール,10%酢酸)室温で１時間染色し、引き続き背景が澄み、タンパク質バンドが明らかに見えるまで20%メタノール、7.5%酢酸中で脱染した。
ウエスタンブロット：電気泳動後、ゲルからニトロセルロース膜に290mAで１時間４℃でエレクトロトランスファーさせた。膜を緩衝液Ｅ中(137mM NaCl;2.7mM KCl;1.5mM KH2PO4;8mM Na2HPO4;0.1% Tween 20,pH7.4)5%ミルク粉末で１時間室温で遮断し、引き続き緩衝液Ｅ中2.5%ミルク粉末中２種のウサギポリクロナール抗-His抗体(G-18及びH-15,それぞれ0.2ug/ml;Santa Cruz)と共に４℃で一晩中インキュベートした。さらに室温で１時間のインキュベーション後、膜を緩衝液Ｅで洗浄(3×10分)してから、2.5%ミルク粉末を含有する緩衝液Ｅ中1/3000希釈した第２HRP-接合抗-ウサギ抗体(DAKO, HRP 0399)と共に室温で２時間インキュベートした。緩衝液Ｅ(3×10分)で膜を洗浄してからECLキット(Amersham Pharmacia)で膜を１分間現像した。引き続き膜をHyperfilm(Amersham Pharmacia)にさらし、このフィルムを現像し、ウエスタンブロット像を視覚分析した。
タンパク質アッセイ：標準物質としてウシ血清アルブミンを有するBCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いてタンパク質濃度を決定した。200ml及び500mlの培養基試料からそれぞれ78及び90μgの精製タンパク質を回収した。
【０１０１】
実施例４：劇症肝炎のマウスモデル中のINSP005b
4.1 序文
INSP005bをインビボ特徴づけするため、筋肉エレクトロトランスファー法を用いてWT及びConA処理動物の循環内でINSP005bタンパク質を発現させた。WT動物内におけるINSP005bのエレクトロトランスファー後、血清トランスアミナーゼレベル又はTNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4若しくはMCP-1サイトカインレベルの有意な変化は観察されなかった。そこで、エレクトロポレートした動物をConAで誘発して血清サイトカインレベルとトランスアミナーゼレベル及びINSP005b効果を決定した。
4.2 背景−コンカナバリンA(ConA)-誘発肝炎
毒性肝臓病はヒトの世界中の健康問題を代表し、現在までに薬理学的治療が発見されている。例えば、肝硬変につながる活性慢性肝炎は、活性化Ｔ細胞によって肝実質細胞が進行的に破壊される病気状態である。ConA-誘発肝毒性は、マウスで述べられているＴ細胞依存性アポトーシス及び壊死性肝損傷の３種の実験モデルの１つである。活性化抗-CD3モノクロナールAB又は超抗原SEBで誘発したGal N(D-ガラクトースアミン)感作マウスは重大なアポトーシスと二次壊死性肝損傷を発生する(Kusters S, Gastroenterology. 1996 Aug;111(2):462-71)。Ｔ細胞ミトゲン植物レクチンConAの非感作マウスへの注射も、壊死に進行する肝アポトーシスをもたらす。ConAは全身的なTNF-αやIFN-γ及び種々の他のサイトカインの放出を誘発する。TNF-αとIFN-γは両方とも肝損傷の重大なメディエイターである。傷害８時間後のトランスアミナーゼ放出は重大な肝臓破壊を示す。
いくつかの細胞型、CD4 T細胞、マクロファージ及び天然キラーが肝障害に関与することが分かっている(Kaneko J Exp Med 2000, 191, 105-114)。抗-CD4抗体はＴ細胞の活性化、ひいては肝障害を遮断する(Tiegsら 1992, J Clin Invest 90, 196-203)。CD8に対するモノクロナール抗体で前処理したマウスは防御に失敗したが、マクロファージの欠失は肝炎の誘発を阻止した。
【０１０２】
本研究を行い、ConA-誘発肝炎におけるINSP005b、コリオリジン様タンパク質の役割を調査した。いくつかのサイトカインは、ConA-誘発肝障害の誘発又はConA-誘発肝障害からの防御付与のどちらかで重要であることが分かった。例えば、TNF-α抗体は、病気からの防御を与える(Seinoら 2001, Annals of surgery 234, 681)。ConA-処理動物の血中トランスアミナーゼレベル減少で評価されるように、抗-IFN-γ抗血清は有意にマウスを防御するので、IFN-γも肝損傷の重大なメディエイターであると思われる(上記Kustersら参照)。肝損傷では、自己免疫性又はウィルス性肝炎の患者内でIFN-γの産生増加が観察された。さらに、肝臓内でINF-γを発現するトランスジェニックマウスは、慢性活性肝炎に似た肝損傷を発症する(Toyonagaら 1994, PNAS 91, 614-618)。インビトロIFN-γは、TNFで加速されたマウス肝細胞内で細胞死を誘発するので、IFN-γは肝細胞に対して細胞毒性であるかもしれない(Moritaら. 1995, Hepatology 21, 1585-1593)。
他の分子はConAモデル内で防御的であると記述されている。単投与のrhIL-6はトランスアミナーゼの放出を完全に阻害した(Mizuharaら 1994, J. Exp. Med. 179, 1529-1537)。
【０１０３】
4.3 問題のタンパク質の全身発現を達成するための筋線維中へのcDNAエレクトロトランスファー
インビボ遺伝子転移の非ウィルス法のうち、筋線維中へのプラスミドDNAの直接注射及びその後のエレクトロポレーションが簡単で安価かつ安全である。筋線維の分裂終了特性と長寿はトランスフェクトされた遺伝子の安定した発現を許容するが、トランスフェクトされたDNAは、一般的に染色体の組込みを受けない(Somiariら 2000, Molecular Therapy 2,178)。いくつかの報告は、筋肉-産生タンパク質の血流中への分泌が、対応するcDNAのエレクトロポレーション後に達成しうることを実証している(Rizzutoら PNAS, 1996, 6417; Aihara Hら, 1998, Nature Biotech 16, 867)。さらに、病気モデル内における筋肉発現Epo及びIL-18BPのインビボ効率が示されている(Rizzuto, 2000, Human Gene Therapy 41, 1891; Mallat, 2001, Circulation research 89, 41)。
【０１０４】
4.4 材料及び方法
4.4.1 動物
すべての研究で、オスのC57/BL6(週齢８)を用いた。一般に、１実験群で10匹の動物を用いる。マウスを標準条件で12-時間の明暗サイクル下、照射食品と適宜の水を与えて維持した。
4.4.2 筋肉エレクトロトランスファー
4.4.2.1 ベクターの選択
His又はStrepII標識IL6及びINSP005b(IPAAA78836-2)遺伝子を、CMVプロモーターを含有するゲートウェイ適合pDEST12.2ベクター内でクローン化した。
4.4.2.2 エレクトロポレーションプロトコロル
マウスをガスで麻酔した(イソフランBaxter,Ref：ZDG9623)。後脚をそり、エコーグラフィックゲルを適用した。ヒアルロニダーゼを後脛骨筋内に(20U 50μlの無菌NaCl 0.9%中, Sigma Ref. H3631)と共に注入した。10分後、100μgのプラスミド(脚毎50μg,25μlの無菌NaCl 0.9%中)を同筋肉内に注入した。筋肉注射前Buffer PBS-L-Glutamate(6mg/ml;L-Glutamate Sigma P4761)中でDNAを調製した。エレクトロトランスファーのため、各足について、ElectroSquarePorator BTX ref ECM830により各パルスで20ms間75ボルトで、１秒間隔で10パルス、２ラウンド電極(直径0.5mmの大きさ)で単極法で電場を掛けた。
4.4.3 ConAモデル
4.4.3.1 ConA静脈内注射及び血液サンプリング
週齢８のメスのマウスC57/Bl6をIFFA CREDOから購入した。ConA(Sigma ref.C7275)を18mg/kgで静脈内注射し、注射の1.30及び８時間後に血液試料を取った。犠牲時、血液を心臓から取った。
4.4.3.2 血液試料中のサイトカイン及びトランスアミナーゼの検出
TH1/TH2 CBAアッセイでIL2、IL5、IL4、TNF-α及びIFN-γサイトカインレベルを測定した。炎症CBAアッセイでTNF-α、IL-6、MCP1、IFN-α、IL-10及びIL-12を検出した。COBAS機器(Hitachi)を用いてトランスアミナーゼ血液パラメーターを決定した。
4.4.3.3 INSP005b及びIL-6エレクトロトランスファー
日-0にpDEST12.2.INSP005b、pDEST12.2-hIL-6及び空ベクター対照(上記エレクトロトランスファープロトコロル参照)のエレクトロトランスファーを行った。エレクトロトランスファー後の日-5にConA(18mg/kg)を静脈内注射し、血液を２時点(1.30、８時間)でサンプリングした。上記と同様にサイトカイン及びASAT ALAT測定を行った。
4.5 結果
劇症肝炎を模したマウスモデルにおいて、INSP005bのエレクトロトランスファーによる全身送達後、このタンパク質が肝損傷から防御することを見いだした。図15A及び15Bは、INSP005b-エレクトロトランスファー動物がConA誘発後８時間の空ベクター対照動物に比べて減少したトランスアミナーゼレベルを示すことを示している。さらに、これら動物内では、TNF-αとIL-6の両サイトカインレベルが有意に減少している(図16A及び図16B)。効果はポジティブ対照ベクターpDEST12.2hIL-6-SIIで得られた結果と同様である。
4.6 結論
これら結果は、劇症肝炎のインビボモデル内でのINSP005b cDNAの送達が血清中のTNF-α及びm-IL-6レベルを下げ、かつ血清中で測定されるASAT及びALATレベルの低減に有意な効果を有することを示す。
ASAT及びALATレベルの減少は、TNF-α及びIL6レベルの減少のためだろう。TNF-αは、ConA注入後の肝障害に関与する重要なサイトカインである。肝炎のこのマウスモデルでは、TNF-αは主に肝マクロファージ、いわゆるKupfer細胞によって産生される。抗TNF-α抗体は、病気に対する防御を与える(Seinoら 2001, Annals of surgery 234, 681)。
【０１０５】
配列情報：
配列番号:1(INSP005A ヌクレオチド配列エキソン1)
1 ATGGGTGGTA GTGGTGTCGT GGAGGTCCCC TTCCTGCTCT CCAGCAAGTA
51 CG
【０１０６】
配列番号:2(INSP005Aタンパク質配列エキソン1)
1 MGGSGVVEVP FLLSSKYD
【０１０７】
配列番号:3(INSP005Aヌクレオチド配列エキソン2)
1 ATGAGCCCAG CCGCCAGGTC ATCCTGGAGG CTCTTGCGGA GTTTGAACGT
51 TCCACGTGCA TCAGGTTTGT CACCTATCAG GACCAGAGAG ACTTCATTTC
101 CATCATCCCC ATGTATGG
【０１０８】
配列番号:4 (INSP005Aタンパク質配列エキソン2)
1 EPSRQVILEA LAEFERSTCI RFVTYQDQRD FISIIPMYG
【０１０９】
配列番号: 5 (INSP005A ヌクレオチド配列エキソン3)
1 GTGCTTCTCG AGTGTGGGGC GCAGTGGAGG GATGCAGGTG GTCTCCCTGG
51 CGCCCACGTG TCTCCAGAAG GGCCGGGGCA TTGTCCTTCA TGAGCTCATG
101 CATGTGCTGG GCTTCTGGCA CGAGCACACG CGGGCCGACC GGGACCGCTA
151 TATCCGTGTC AACTGGAACG AGATCCTGCC AG
【０１１０】
配列番号: 6 (INSP005A タンパク質配列エキソン3)
1 CFSSVGRSGG MQVVSLAPTC LQKGRGIVLH ELMHVLGFWH EHTRADRDRY
51 IRVNWNEILP G
【０１１１】
配列番号: 7 (INSP005A ヌクレオチド配列エキソン4)
1 GCTTTGAAAT CAACTTCATC AAGTCTCAGA GCAGCAACAT GCTGACGCCC
51 TATGACTACT CCTCTGTGAT GCACTATGGG AG
【０１１２】
配列番号: 8 (INSP005A タンパク質配列エキソン4)
1 FEINFIKSQS SNMLTPYDYS SVMHYGR
【０１１３】
配列番号: 9 (INSP005A ヌクレオチド配列エキソン5)
1 GCTCGCCTTC AGCCGGCGTG GGCTGCCCAC CATCACACCA CTTTGGGCCC
51 CCAGTGTCCA CATCGGCCAG CGATGGAACC TGAGTGCCTC GGACATCACC
101 CGGGTCCTCA AACTCTACGG CTGCAGCCCA AGTGGCCCCA GGCCCCGTGG
151 GAGAG
【０１１４】
配列番号: 10 (INSP005A タンパク質配列エキソン5)
1 LAFSRRGLPT ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG
51 RG
【０１１５】
配列番号: 11 (INSP005A ヌクレオチド配列エキソン6)
1 GGTCCCATGC CCACAGCACT GGTAGGAGCC CCGCCCCGGC CTCCCTATCT
51 CTGCAGCGGC TTTTGGAGGC ACTGTCGGCG GAATCCAGGA GCCCCGACCC
101 CAGTGGTTCC AGTGCGGGAG GCCAGCCCGT TCCTGCAGGG CCTGGGGAGA
151 GCCCACATGG GTGGGAGTCC CCTGCCCTGA AAAAGCTCAG TGCAGAGGCC
201 TCGGCAAGGC AGCCTCAGAC CCTAGCTTCC TCCCCAAGAT CAAGGCCTGG
251 AGCAGGTGCC CCCGGTGTTG CTCAGGAGCA GTCCTGGCTG GCCGGAGTGT
301 CCACCAAGCC CACAGTCCCA TCTTCAGAAG CAGGAATCCA GCCAGTCCCT
351 GTCCAGGGAA GCCCAGCTCT GCCAGGGGGC TGTGTACCTA GAAATCATTT
401 CAAGGGGATG TCCGAAGAT
【０１１６】
配列番号: 12 (INSP005A タンパク質配列エキソン6)
1 SHAHSTGRSP APASLSLQRL LEALSAESRS PDPSGSSAGG QPVPAGPGES
51 PHGWESPALK KLSAEASARQ PQTLASSPRS RPGAGAPGVA QEQSWLAGVS
101 TKPTVPSSEA GIQPVPVQGS PALPGGCVPR NHFKGMSED
【０１１７】
配列番号: 13 (INSP005A 完全ヌクレオチド配列)
1 ATGGGTGGTA GTGGTGTCGT GGAGGTCCCC TTCCTGCTCT CCAGCAAGTA
51 CGATGAGCCC AGCCGCCAGG TCATCCTGGA GGCTCTTGCG GAGTTTGAAC
101 GTTCCACGTG CATCAGGTTT GTCACCTATC AGGACCAGAG AGACTTCATT
151 TCCATCATCC CCATGTATGG GTGCTTCTCG AGTGTGGGGC GCAGTGGAGG
201 GATGCAGGTG GTCTCCCTGG CGCCCACGTG TCTCCAGAAG GGCCGGGGCA
251 TTGTCCTTCA TGAGCTCATG CATGTGCTGG GCTTCTGGCA CGAGCACACG
301 CGGGCCGACC GGGACCGCTA TATCCGTGTC AACTGGAACG AGATCCTGCC
351 AGGCTTTGAA ATCAACTTCA TCAAGTCTCA GAGCAGCAAC ATGCTGACGC
401 CCTATGACTA CTCCTCTGTG ATGCACTATG GGAGGCTCGC CTTCAGCCGG
451 CGTGGGCTGC CCACCATCAC ACCACTTTGG GCCCCCAGTG TCCACATCGG
501 CCAGCGATGG AACCTGAGTG CCTCGGACAT CACCCGGGTC CTCAAACTCT
551 ACGGCTGCAG CCCAAGTGGC CCCAGGCCCC GTGGGAGAGG GTCCCATGCC
601 CACAGCACTG GTAGGAGCCC CGCCCCGGCC TCCCTATCTC TGCAGCGGCT
651 TTTGGAGGCA CTGTCGGCGG AATCCAGGAG CCCCGACCCC AGTGGTTCCA
701 GTGCGGGAGG CCAGCCCGTT CCTGCAGGGC CTGGGGAGAG CCCACATGGG
751 TGGGAGTCCC CTGCCCTGAA AAAGCTCAGT GCAGAGGCCT CGGCAAGGCA
801 GCCTCAGACC CTAGCTTCCT CCCCAAGATC AAGGCCTGGA GCAGGTGCCC
851 CCGGTGTTGC TCAGGAGCAG TCCTGGCTGG CCGGAGTGTC CACCAAGCCC
901 ACAGTCCCAT CTTCAGAAGC AGGAATCCAG CCAGTCCCTG TCCAGGGAAG
951 CCCAGCTCTG CCAGGGGGCT GTGTACCTAG AAATCATTTC AAGGGGATGT
1001 CCGAAGAT
【０１１８】
配列番号: 14 (INSP005A 完全タンパク質配列)
1 MGGSGVVEVP FLLSSKYDEP SRQVILEALA EFERSTCIRF VTYQDQRDFI
51 SIIPMYGCFS SVGRSGGMQV VSLAPTCLQK GRGIVLHELM HVLGFWHEHT
101 RADRDRYIRV NWNEILPGFE INFIKSQSSN MLTPYDYSSV MHYGRLAFSR
151 RGLPTITPLW APSVHIGQRW NLSASDITRV LKLYGCSPSG PRPRGRGSHA
201 HSTGRSPAPA SLSLQRLLEA LSAESRSPDP SGSSAGGQPV PAGPGESPHG
251 WESPALKKLS AEASARQPQT LASSPRSRPG AGAPGVAQEQ SWLAGVSTKP
301 TVPSSEAGIQ PVPVQGSPAL PGGCVPRNHF KGMSED
【０１１９】
配列番号: 15 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン1)
1 ATGGAGGGTG TAGGGGGTCT CTGGCCTTGG GTGCTGGGTC TGCTCTCCTT
51 GCCAG
【０１２０】
配列番号: 16 (INSP005B タンパク質配列エキソン1)
1 MEGVGGLWPW VLGLLSLPG
【０１２１】
配列番号: 17 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン2)
1 GTGTGATCCT AGGAGCGCCC CTGGCCTCCA GCTGCGCAGG AGCCTGTGGT
51 ACCAGCTTCC CAGATGGCCT CACCCCTGAG GGAACCCAGG CCTCCGGGGA
101 CAAGGACATT CCTGCAATTA ACCAAG
【０１２２】
配列番号: 18 (INSP005B タンパク質配列エキソン2)
1 VILGAPLASS CAGACGTSFP DGLTPEGTQA SGDKDIPAIN QG
【０１２３】
配列番号: 19 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン3)
1 GGCTCATCCT GGAAGAAACC CCAGAGAGCA GCTTCCTCAT CGAGGGGGAC
51 ATCATCCGGC CG
【０１２４】
配列番号: 20 (INSP005B タンパク質配列エキソン3)
1 LILEETPESS FLIEGDIIRP
【０１２５】
配列番号: 21 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン4)
1 AGTCCCTTCC GACTGCTGTC AGCAACCAGC AACAAATGGC CCATGGGTGG
51 TAGTGGTGTC GTGGAGGTCC CCTTCCTGCT CTCCAGCAAG TACG
【０１２６】
配列番号: 22 (INSP005B タンパク質配列エキソン4)
1 SPFRLLSATS NKWPMGGSGV VEVPFLLSSK YD
【０１２７】
配列番号: 23 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン5)
1 ATGAGCCCAG CCGCCAGGTC ATCCTGGAGG CTCTTGCGGA GTTTGAACGT
51 TCCACGTGCA TCAGGTTTGT CACCTATCAG GACCAGAGAG ACTTCATTTC
101 CATCATCCCC ATGTATGG
【０１２８】
配列番号: 24 (INSP005B タンパク質配列エキソン5)
1 EPSRQVILEA LAEFERSTCI RFVTYQDQRD FISIIPMYG
【０１２９】
配列番号: 25 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン6)
1 GTGCTTCTCG AGTGTGGGGC GCAGTGGAGG GATGCAGGTG GTCTCCCTGG
51 CGCCCACGTG TCTCCAGAAG GGCCGGGGCA TTGTCCTTCA TGAGCTCATG
101 CATGTGCTGG GCTTCTGGCA CGAGCACACG CGGGCCGACC GGGACCGCTA
151 TATCCGTGTC AACTGGAACG AGATCCTGCC AG
【０１３０】
配列番号: 26 (INSP005B タンパク質配列エキソン6)
1 CFSSVGRSGG MQVVSLAPTC LQKGRGIVLH ELMHVLGFWH EHTRADRDRY
51 IRVNWNEILP G
【０１３１】
配列番号: 27 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン7)
1 GCTTTGAAAT CAACTTCATC AAGTCTCGGA GCAGCAACAT GCTGACGCCC
51 TATGACTACT CCTCTGTGAT GCACTATGGG AG
【０１３２】
配列番号: 28 (INSP005B タンパク質配列エキソン7)
1 FEINFIKSRS SNMLTPYDYS SVMHYGR
【０１３３】
配列番号: 29 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン8)
1 GCTCGCCTTC AGCCGGCGTG GGCTGCCCAC CATCACACCA CTTTGGGCCC
51 CCAGTGTCCA CATCGGCCAG CGATGGAACC TGAGTGCCTC GGACATCACC
101 CGGGTCCTCA AACTCTACGG CTGCAGCCCA AGTGGCCCCA GGCCCCGTGG
151 GAGAG
【０１３４】
配列番号: 30 (INSP005B タンパク質配列エキソン8)
1 LAFSRRGLPT ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG
51 RG
【０１３５】
配列番号: 31 (INSP005B ヌクレオチド配列エキソン9)
1 GGTCCCATGC CCACAGCACT GGTAGGAGCC CCGCTCCGGC CTCCCTATCT
51 CTGCAGCGGC TTTTGGAGGC ACTGTCGGCG GAATCCAGGA GCCCCGACCC
101 CAGTGGTTCC AGTGCGGGAG GCCAGCCCGT TCCTGCAGGG CCTGGGGAGA
151 GCCCACATGG GTGGGAGTCC CCTGCCCTGA AAAAGCTCAG TGCAGAGGCC
201 TCGGCAAGGC AGCCTCAGAC CCTAGCTTCC TCCCCAAGAT CAAGGCCTGG
251 AGCAGGTGCC CCCGGTGTTG CTCAGGAGCA GTCCTGGCTG GCCGGAGTGT
301 CCACCAAGCC CACAGTCCCA TCTTCAGAAG CAGGAATCCA GCCAGTCCCT
351 GTCCAGGGAA GCCCAGCTCT GCCAGGGGGC TGTGTACCTA GAAATCATTT
401 CAAGGGGATG TCCGAAGAT
【０１３６】
配列番号: 32 (INSP005B タンパク質配列エキソン9)
1 SHAHSTGRSP APASLSLQRL LEALSAESRS PDPSGSSAGG QPVPAGPGES
51 PHGWESPALK KLSAEASARQ PQTLASSPRS RPGAGAPGVA QEQSWLAGVS
101 TKPTVPSSEA GIQPVPVQGS PALPGGCVPR NHFKGMSED
【０１３７】
配列番号: 33 (INSP005B 完全ヌクレオチド配列)
1 ATGGAGGGTG TAGGGGGTCT CTGGCCTTGG GTGCTGGGTC TGCTCTCCTT
51 GCCAGGTGTG ATCCTAGGAG CGCCCCTGGC CTCCAGCTGC GCAGGAGCCT
101 GTGGTACCAG CTTCCCAGAT GGCCTCACCC CTGAGGGAAC CCAGGCCTCC
151 GGGGACAAGG ACATTCCTGC AATTAACCAA GGGCTCATCC TGGAAGAAAC
201 CCCAGAGAGC AGCTTCCTCA TCGAGGGGGA CATCATCCGG CCGAGTCCCT
251 TCCGACTGCT GTCAGCAACC AGCAACAAAT GGCCCATGGG TGGTAGTGGT
301 GTCGTGGAGG TCCCCTTCCT GCTCTCCAGC AAGTACGATG AGCCCAGCCG
351 CCAGGTCATC CTGGAGGCTC TTGCGGAGTT TGAACGTTCC ACGTGCATCA
401 GGTTTGTCAC CTATCAGGAC CAGAGAGACT TCATTTCCAT CATCCCCATG
451 TATGGGTGCT TCTCGAGTGT GGGGCGCAGT GGAGGGATGC AGGTGGTCTC
501 CCTGGCGCCC ACGTGTCTCC AGAAGGGCCG GGGCATTGTC CTTCATGAGC
551 TCATGCATGT GCTGGGCTTC TGGCACGAGC ACACGCGGGC CGACCGGGAC
601 CGCTATATCC GTGTCAACTG GAACGAGATC CTGCCAGGCT TTGAAATCAA
651 CTTCATCAAG TCTCGGAGCA GCAACATGCT GACGCCCTAT GACTACTCCT
701 CTGTGATGCA CTATGGGAGG CTCGCCTTCA GCCGGCGTGG GCTGCCCACC
751 ATCACACCAC TTTGGGCCCC CAGTGTCCAC ATCGGCCAGC GATGGAACCT
801 GAGTGCCTCG GACATCACCC GGGTCCTCAA ACTCTACGGC TGCAGCCCAA
851 GTGGCCCCAG GCCCCGTGGG AGAGGGTCCC ATGCCCACAG CACTGGTAGG
901 AGCCCCGCTC CGGCCTCCCT ATCTCTGCAG CGGCTTTTGG AGGCACTGTC
951 GGCGGAATCC AGGAGCCCCG ACCCCAGTGG TTCCAGTGCG GGAGGCCAGC
1001 CCGTTCCTGC AGGGCCTGGG GAGAGCCCAC ATGGGTGGGA GTCCCCTGCC
1051 CTGAAAAAGC TCAGTGCAGA GGCCTCGGCA AGGCAGCCTC AGACCCTAGC
1101 TTCCTCCCCA AGATCAAGGC CTGGAGCAGG TGCCCCCGGT GTTGCTCAGG
1151 AGCAGTCCTG GCTGGCCGGA GTGTCCACCA AGCCCACAGT CCCATCTTCA
1201 GAAGCAGGAA TCCAGCCAGT CCCTGTCCAG GGAAGCCCAG CTCTGCCAGG
1251 GGGCTGTGTA CCTAGAAATC ATTTCAAGGG GATGTCCGAA GAT
【０１３８】
配列番号: 34 (INSP005B 完全タンパク質配列)
1 MEGVGGLWPW VLGLLSLPGV ILGAPLASSC AGACGTSFPD GLTPEGTQAS
51 GDKDIPAINQ GLILEETPES SFLIEGDIIR PSPFRLLSAT SNKWPMGGSG
101 VVEVPFLLSS KYDEPSRQVI LEALAEFERS TCIRFVTYQD QRDFISIIPM
151 YGCFSSVGRS GGMQVVSLAP TCLQKGRGIV LHELMHVLGF WHEHTRADRD
201 RYIRVNWNEI LPGFEINFIK SRSSNMLTPY DYSSVMHYGR LAFSRRGLPT
251 ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG RGSHAHSTGR
301 SPAPASLSLQ RLLEALSAES RSPDPSGSSA GGQPVPAGPG ESPHGWESPA
351 LKKLSAEASA RQPQTLASSP RSRPGAGAPG VAQEQSWLAG VSTKPTVPSS
401 EAGIQPVPVQ GSPALPGGCV PRNHFKGMSE D
【０１３９】
配列番号: 35 (INSP005b成熟ヌクレオチド配列)
1 GCGCCCCTGG CCTCCAGCTG CGCAGGAGCC TGTGGTACCA GCTTCCCAGA
51 TGGCCTCACC CCTGAGGGAA CCCAGGCCTC CGGGGACAAG GACATTCCTG
101 CAATTAACCA AGGGCTCATC CTGGAAGAAA CCCCAGAGAG CAGCTTCCTC
151 ATCGAGGGGG ACATCATCCG GCCGAGTCCC TTCCGACTGC TGTCAGCAAC
201 CAGCAACAAA TGGCCCATGG GTGGTAGTGG TGTCGTGGAG GTCCCCTTCC
251 TGCTCTCCAG CAAGTACGAT GAGCCCAGCC GCCAGGTCAT CCTGGAGGCT
301 CTTGCGGAGT TTGAACGTTC CACGTGCATC AGGTTTGTCA CCTATCAGGA
351 CCAGAGAGAC TTCATTTCCA TCATCCCCAT GTATGGGTGC TTCTCGAGTG
401 TGGGGCGCAG TGGAGGGATG CAGGTGGTCT CCCTGGCGCC CACGTGTCTC
451 CAGAAGGGCC GGGGCATTGT CCTTCATGAG CTCATGCATG TGCTGGGCTT
501 CTGGCACGAG CACACGCGGG CCGACCGGGA CCGCTATATC CGTGTCAACT
551 GGAACGAGAT CCTGCCAGGC TTTGAAATCA ACTTCATCAA GTCTCGGAGC
601 AGCAACATGC TGACGCCCTA TGACTACTCC TCTGTGATGC ACTATGGGAG
651 GCTCGCCTTC AGCCGGCGTG GGCTGCCCAC CATCACACCA CTTTGGGCCC
701 CCAGTGTCCA CATCGGCCAG CGATGGAACC TGAGTGCCTC GGACATCACC
751 CGGGTCCTCA AACTCTACGG CTGCAGCCCA AGTGGCCCCA GGCCCCGTGG
801 GAGAGGGTCC CATGCCCACA GCACTGGTAG GAGCCCCGCT CCGGCCTCCC
851 TATCTCTGCA GCGGCTTTTG GAGGCACTGT CGGCGGAATC CAGGAGCCCC
901 GACCCCAGTG GTTCCAGTGC GGGAGGCCAG CCCGTTCCTG CAGGGCCTGG
951 GGAGAGCCCA CATGGGTGGG AGTCCCCTGC CCTGAAAAAG CTCAGTGCAG
1001 AGGCCTCGGC AAGGCAGCCT CAGACCCTAG CTTCCTCCCC AAGATCAAGG
1051 CCTGGAGCAG GTGCCCCCGG TGTTGCTCAG GAGCAGTCCT GGCTGGCCGG
1101 AGTGTCCACC AAGCCCACAG TCCCATCTTC AGAAGCAGGA ATCCAGCCAG
1151 TCCCTGTCCA GGGAAGCCCA GCTCTGCCAG GGGGCTGTGT ACCTAGAAAT
1201 CATTTCAAGG GGATGTCCGA AGAT
【０１４０】
配列番号: 36 (INSP005b 成熟ポリペプチド配列)
1 APLASSCAGA CGTSFPDGLT PEGTQASGDK DIPAINQGLI LEETPESSFL
51 IEGDIIRPSP FRLLSATSNK WPMGGSGVVE VPFLLSSKYD EPSRQVILEA
101 LAEFERSTCI RFVTYQDQRD FISIIPMYGC FSSVGRSGGM QVVSLAPTCL
151 QKGRGIVLHE LMHVLGFWHE HTRADRDRYI RVNWNEILPG FEINFIKSRS
201 SNMLTPYDYS SVMHYGRLAF SRRGLPTITP LWAPSVHIGQ RWNLSASDIT
251 RVLKLYGCSP SGPRPRGRGS HAHSTGRSPA PASLSLQRLL EALSAESRSP
301 DPSGSSAGGQ PVPAGPGESP HGWESPALKK LSAEASARQP QTLASSPRSR
351 PGAGAPGVAQ EQSWLAGVST KPTVPSSEAG IQPVPVQGSP ALPGGCVPRN
401 HFKGMSED
【０１４１】
配列番号: 37 (INSP005 予測ポリペプチド配列)
1  MLRLWDFNPG GALSDLALGL RGMEEGGYSC AGACGTSFPD GLTPEGTQAS GDKDIPAINQ  
61  GLILEETPES SFLIEGDIIR PSPFRLLSAT SNKWPMGGSG VVEVPFLLSS KYDEPSHQVI  
121  LEALAEFERS TCIRFVTYQD QRDFISIIPM YGCFSSVGRS GGMQVVSLAP TCLQKGRGIV  
181  LHELMHVLGF WHEHTRADRD RYIRVNWNEI LPGFEINFIK SQSSNMLTPY DYSSVMHYGR  
241  LAFSRRGLPT ITPLWAPSVH IGQRWNLSAS DITRVLKLYG CSPSGPRPRG RGEWHGRKVT  
【０１４２】
配列番号: 38 (pCR4 TOPO IPAAA78836-1 プラスミドヌクレオチド配列)
1  AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC  
61  ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC  
121  TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA  
181  TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCA  
241  GAATTAACCC TCACTAAAGG GACTAGTCCT GCAGGTTTAA ACGAATTCGC CCTTAGCCAC  
301  AGGCTTAATC TTCGGACATC CCCTTGAAAT GATTTCTAGG TACACAGCCC CCTGGCAGAG  
361  CTGGGCTTCC CTGGACAGGG ACTGGCTGGA TTCCTGCTTC TGAAGATGGG ACTGTGGGCT  
421  TGGTGGACAC TCCGGCCAGC CAGGACTGCT CCTGAGCAAC ACCGGGGGCA CCTGCTCCAG  
481  GCCTTGATCT TGGGGAGGAA GCTAGGGTCT GAGGCTGCCT TGCCGAGGCC TCTGCACTGA  
541  GCTTTTTCAG GGCAGGGGAC TCCCACCCAT GTGGGCTCTC CCCAGGCCCT GCAGGAACGG  
601  GCTGGCCTCC CGCACTGGAA CCACTGGGGT CGGGGCTCCT GGATTCCGCC GACAGTGCCT  
661  CCAAAAGCCG CTGCAGAGAT AGGGAGGCCG GGGCGGGGCT CCTACCAGTG CTGTGGGCAT  
721  GGGACCCTCT CCCACGGGGC CTGGGGCCAC TTGGGCTGCA GCCGTAGAGT TTGAGGACCC  
781  GGGTGATGTC CGAGGCACTC AGGTTCCATC GCTGGCCGAT GTGGACACTG GGGGCCCAAA  
841  GTGGTGTGAT GGTGGGCAGC CCACGCCGGC TGAAGGCGAG CCTCCCATAG TGCATCACAG  
901  AGGAGTAGTC ATAGGGCGTC AGCATGTTGC TGCTCTGAGA CTTGATGAAG TTGATTTCAA  
961  AGCCTGGCAG GATCTCGTTC CAGTTGACAC GGATATAGCG GTCCCGGTCG GCCCGCGTGT  
1021  GCTCGTGCCA GAAGCCCAGC ACATGCATGA GCTCATGAAG GACAATGCCC CGGCCCTTCT  
1081  GGAGACACGT GGGCGCCAGG GAGACCACCT GCATCCCTCC ACTGCGCCCC ACACTCGAGA  
1141  AGCACCCATA CATGGGGATG ATGGAAATGA AGTCTCTCTG GTCCTGATAG GTGACAAACC  
1201  TGATGCACGT GGAACGTTCA AACTCCGCAA GAGCCTCCAG GATGACCTGG CGGCTGGGCT  
1261  CATCGTACTT GCTGGAGAGC AGGAAGGGGA CCTCCACGAC ACCACTACCA CCCATGGGCC  
1321  ATTTGTTGCT GGTTGCTGAC AGAAGGGCGA ATTCGCGGCC GCTAAATTCA ATTCGCCCTA  
1381  TAGTGAGTCG TATTACAATT CACTGGCCGT CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC  
1441  TGGCGTTACC CAACTTAATC GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG  
1501  CGAAGAGGCC CGCACCGATC GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTATACG TACGGCAGTT  
1561  TAAGGTTTAC ACCTATAAAA GAGAGAGCCG TTATCGTCTG TTTGTGGATG TACAGAGTGA  
1621  TATTATTGAC ACGCCGGGGC GACGGATGGT GATCCCCCTG GCCAGTGCAC GTCTGCTGTC  
1681  AGATAAAGTC TCCCGTGAAC TTTACCCGGT GGTGCATATC GGGGATGAAA GCTGGCGCAT  
1741  GATGACCACC GATATGGCCA GTGTGCCGGT CTCCGTTATC GGGGAAGAAG TGGCTGATCT  
1801  CAGCCACCGC GAAAATGACA TCAAAAACGC CATTAACCTG ATGTTCTGGG GAATATAAAT  
1861  GTCAGGCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT CACCTAGATC CTTTTCACGT AGAAAGCCAG  
1921  TCCGCAGAAA CGGTGCTGAC CCCGGATGAA TGTCAGCTAC TGGGCTATCT GGACAAGGGA  
1981  AAACGCAAGC GCAAAGAGAA AGCAGGTAGC TTGCAGTGGG CTTACATGGC GATAGCTAGA  
2041  CTGGGCGGTT TTATGGACAG CAAGCGAACC GGAATTGCCA GCTGGGGCGC CCTCTGGTAA  
2101  GGTTGGGAAG CCCTGCAAAG TAAACTGGAT GGCTTTCTCG CCGCCAAGGA TCTGATGGCG  
2161  CAGGGGATCA AGCTCTGATC AAGAGACAGG ATGAGGATCG TTTCGCATGA TTGAACAAGA  
2221  TGGATTGCAC GCAGGTTCTC CGGCCGCTTG GGTGGAGAGG CTATTCGGCT ATGACTGGGC  
2281  ACAACAGACA ATCGGCTGCT CTGATGCCGC CGTGTTCCGG CTGTCAGCGC AGGGGCGCCC  
2341  GGTTCTTTTT GTCAAGACCG ACCTGTCCGG TGCCCTGAAT GAACTGCAAG ACGAGGCAGC  
2401  GCGGCTATCG TGGCTGGCCA CGACGGGCGT TCCTTGCGCA GCTGTGCTCG ACGTTGTCAC  
2461  TGAAGCGGGA AGGGACTGGC TGCTATTGGG CGAAGTGCCG GGGCAGGATC TCCTGTCATC  
2521  TCACCTTGCT CCTGCCGAGA AAGTATCCAT CATGGCTGAT GCAATGCGGC GGCTGCATAC  
2581  GCTTGATCCG GCTACCTGCC CATTCGACCA CCAAGCGAAA CATCGCATCG AGCGAGCACG  
2641  TACTCGGATG GAAGCCGGTC TTGTCGATCA GGATGATCTG GACGAAGAGC ATCAGGGGCT  
2701  CGCGCCAGCC GAACTGTTCG CCAGGCTCAA GGCGAGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT  
2761  CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG GAAAATGGCC GCTTTTCTGG  
2821  ATTCATCGAC TGTGGCCGGC TGGGTGTGGC GGACCGCTAT CAGGACATAG CGTTGGCTAC  
2881  CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC CGCTTCCTCG TGCTTTACGG  
2941  TATCGCCGCT CCCGATTCGC AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG  
3001  AATTATTAAC GCTTACAATT TCCTGATGCG GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT  
3061  TTCACACCGC ATACAGGTGG CACTTTTCGG GGAAATGTGC GCGGAACCCC TATTTGTTTA  
3121  TTTTTCTAAA TACATTCAAA TATGTATCCG CTCATGAGAC AATAACCCTG ATAAATGCTT  
3181  CAATAATATT GAAAAAGGAA GAGTATGAGT ATTCAACATT TCCGTGTCGC CCTTATTCCC  
3241  TTTTTTGCGG CATTTTGCCT TCCTGTTTTT GCTCACCCAG AAACGCTGGT GAAAGTAAAA  
3301  GATGCTGAAG ATCAGTTGGG TGCACGAGTG GGTTACATCG AACTGGATCT CAACAGCGGT  
3361  AAGATCCTTG AGAGTTTTCG CCCCGAAGAA CGTTTTCCAA TGATGAGCAC TTTTAAAGTT  
3421  CTGCTATGTG GCGCGGTATT ATCCCGTATT GACGCCGGGC AAGAGCAACT CGGTCGCCGC  
3481  ATACACTATT CTCAGAATGA CTTGGTTGAG TACTCACCAG TCACAGAAAA GCATCTTACG  
3541  GATGGCATGA CAGTAAGAGA ATTATGCAGT GCTGCCATAA CCATGAGTGA TAACACTGCG  
3601  GCCAACTTAC TTCTGACAAC GATCGGAGGA CCGAAGGAGC TAACCGCTTT TTTGCACAAC  
3661  ATGGGGGATC ATGTAACTCG CCTTGATCGT TGGGAACCGG AGCTGAATGA AGCCATACCA  
3721  AACGACGAGC GTGACACCAC GATGCCTGTA GCAATGGCAA CAACGTTGCG CAAACTATTA  
3781  ACTGGCGAAC TACTTACTCT AGCTTCCCGG CAACAATTAA TAGACTGGAT GGAGGCGGAT  
3841  AAAGTTGCAG GACCACTTCT GCGCTCGGCC CTTCCGGCTG GCTGGTTTAT TGCTGATAAA  
3901  TCTGGAGCCG GTGAGCGTGG GTCTCGCGGT ATCATTGCAG CACTGGGGCC AGATGGTAAG  
3961  CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT CTACACGACG GGGAGTCAGG CAACTATGGA TGAACGAAAT  
4021  AGACAGATCG CTGAGATAGG TGCCTCACTG ATTAAGCATT GGTAACTGTC AGACCAAGTT  
4081  TACTCATATA TACTTTAGAT TGATTTAAAA CTTCATTTTT AATTTAAAAG GATCTAGGTG  
4141  AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA ATCCCTTAAC GTGAGTTTTC GTTCCACTGA  
4201  GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA TCTTCTTGAG ATCCTTTTTT TCTGCGCGTA  
4261  ATCTGCTGCT TGCAAACAAA AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA  
4321  GAGCTACCAA CTCTTTTTCC GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT  
4381  GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC ACCGCCTACA  
4441  TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG GCTGCTGCCA GTGGCGATAA GTCGTGTCTT  
4501  ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG  
4561  GGTTCGTGCA CACAGCCCAG CTTGGAGCGA ACGACCTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG  
4621  CGTGAGCTAT GAGAAAGCGC CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA  
4681  AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA CGCCTGGTAT  
4741  CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC TGACTTGAGC GTCGATTTTT GTGATGCTCG  
4801  TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGGC  
4861  TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA CATGTTCTTT CCTGCGTTAT CCCCTGATTC TGTGGATAAC  
4921  CGTATTACCG CCTTTGAGTG AGCTGATACC GCTCGCCGCA GCCGAACGAC CGAGCGCAGC  
4981  GAGTCAGTGA GCGAGGAAGC GGAAG
【０１４３】
配列番号: 39 (XpCR4TOPO IPAAA78836-2 プラスミドヌクレオチド配列)
1  AGCGCCCAAT ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC  
61  ACGACAGGTT TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC  
121  TCACTCATTA GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA  
181  TTGTGAGCGG ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCA  
241  GAATTAACCC TCACTAAAGG GACTAGTCCT GCAGGTTTAA ACGAATTCGC CCTTAGCCAC  
301  AGGCTTAATC TTCGGACATC CCCTTGAAAT GATTTCTAGG TACACAGCCC CCTGGCAGAG  
361  CTGGGCTTCC CTGGACAGGG ACTGGCTGGA TTCCTGCTTC TGAAGATGGG ACTGTGGGCT  
421  TGGTGGACAC TCCGGCCAGC CAGGACTGCT CCTGAGCAAC ACCGGGGGCA CCTGCTCCAG  
481  GCCTTGATCT TGGGGAGGAA GCTAGGGTCT GAGGCTGCCT TGCCGAGGCC TCTGCACTGA  
541  GCTTTTTCAG GGCAGGGGAC TCCCACCCAT GTGGGCTCTC CCCAGGCCCT GCAGGAACGG  
601  GCTGGCCTCC CGCACTGGAA CCACTGGGGT CGGGGCTCCT GGATTCCGCC GACAGTGCCT  
661  CCAAAAGCCG CTGCAGAGAT AGGGAGGCCG GAGCGGGGCT CCTACCAGTG CTGTGGGCAT  
721  GGGACCCTCT CCCACGGGGC CTGGGGCCAC TTGGGCTGCA GCCGTAGAGT TTGAGGACCC  
781  GGGTGATGTC CGAGGCACTC AGGTTCCATC GCTGGCCGAT GTGGACACTG GGGGCCCAAA  
841  GTGGTGTGAT GGTGGGCAGC CCACGCCGGC TGAAGGCGAG CCTCCCATAG TGCATCACAG  
901  AGGAGTAGTC ATAGGGCGTC AGCATGTTGC TGCTCCGAGA CTTGATGAAG TTGATTTCAA  
961  AGCCTGGCAG GATCTCGTTC CAGTTGACAC GGATATAGCG GTCCCGGTCG GCCCGCGTGT  
1021  GCTCGTGCCA GAAGCCCAGC ACATGCATGA GCTCATGAAG GACAATGCCC CGGCCCTTCT  
1081  GGAGACACGT GGGCGCCAGG GAGACCACCT GCATCCCTCC ACTGCGCCCC ACACTCGAGA  
1141  AGCACCCATA CATGGGGATG ATGGAAATGA AGTCTCTCTG GTCCTGATAG GTGACAAACC  
1201  TGATGCACGT GGAACGTTCA AACTCCGCAA GAGCCTCCAG GATGACCTGG CGGCTGGGCT  
1261  CATCGTACTT GCTGGAGAGC AGGAAGGGGA CCTCCACGAC ACCACTACCA CCCATGGGCC  
1321  ATTTGTTGCT GGTTGCTGAC AGCAGTCGGA AGGGACTCGG CCGGATGATG TCCCCCTCGA  
1381  TGAGGAAGCT GCTCTCTGGG GTTTCTTCCA GGATGAGCCC TTGGTTAATT GCAGGAATGT  
1441  CCTTGTCCCC GGAGGCCTGG GTTCCCTCAG GGGTGAGGCC ATCTGGGAAG CTGGTACCAC  
1501  AGGCTCCTGC GCAGCTGGAG GCCAGGGGCG CTCCTAGGAT CACACCTGGC AAGGAGAGCA  
1561  GACCCAGCAC CCAAGGCCAG AGACCCCCTA CACCCTCCAT GGTAGAAAGG GCGAATTCGC  
1621  GGCCGCTAAA TTCAATTCGC CCTATAGTGA GTCGTATTAC AATTCACTGG CCGTCGTTTT  
1681  ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG CAGCACATCC  
1741  CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC GATCGCCCTT CCCAACAGTT  
1801  GCGCAGCCTA TACGTACGGC AGTTTAAGGT TTACACCTAT AAAAGAGAGA GCCGTTATCG  
1861  TCTGTTTGTG GATGTACAGA GTGATATTAT TGACACGCCG GGGCGACGGA TGGTGATCCC  
1921  CCTGGCCAGT GCACGTCTGC TGTCAGATAA AGTCTCCCGT GAACTTTACC CGGTGGTGCA  
1981  TATCGGGGAT GAAAGCTGGC GCATGATGAC CACCGATATG GCCAGTGTGC CGGTCTCCGT  
2041  TATCGGGGAA GAAGTGGCTG ATCTCAGCCA CCGCGAAAAT GACATCAAAA ACGCCATTAA  
2101  CCTGATGTTC TGGGGAATAT AAATGTCAGG CATGAGATTA TCAAAAAGGA TCTTCACCTA  
2161  GATCCTTTTC ACGTAGAAAG CCAGTCCGCA GAAACGGTGC TGACCCCGGA TGAATGTCAG  
2221  CTACTGGGCT ATCTGGACAA GGGAAAACGC AAGCGCAAAG AGAAAGCAGG TAGCTTGCAG  
2281  TGGGCTTACA TGGCGATAGC TAGACTGGGC GGTTTTATGG ACAGCAAGCG AACCGGAATT  
2341  GCCAGCTGGG GCGCCCTCTG GTAAGGTTGG GAAGCCCTGC AAAGTAAACT GGATGGCTTT  
2401  CTCGCCGCCA AGGATCTGAT GGCGCAGGGG ATCAAGCTCT GATCAAGAGA CAGGATGAGG  
2461  ATCGTTTCGC ATGATTGAAC AAGATGGATT GCACGCAGGT TCTCCGGCCG CTTGGGTGGA  
2521  GAGGCTATTC GGCTATGACT GGGCACAACA GACAATCGGC TGCTCTGATG CCGCCGTGTT  
2581  CCGGCTGTCA GCGCAGGGGC GCCCGGTTCT TTTTGTCAAG ACCGACCTGT CCGGTGCCCT  
2641  GAATGAACTG CAAGACGAGG CAGCGCGGCT ATCGTGGCTG GCCACGACGG GCGTTCCTTG  
2701  CGCAGCTGTG CTCGACGTTG TCACTGAAGC GGGAAGGGAC TGGCTGCTAT TGGGCGAAGT  
2761  GCCGGGGCAG GATCTCCTGT CATCTCACCT TGCTCCTGCC GAGAAAGTAT CCATCATGGC  
2821  TGATGCAATG CGGCGGCTGC ATACGCTTGA TCCGGCTACC TGCCCATTCG ACCACCAAGC  
2881  GAAACATCGC ATCGAGCGAG CACGTACTCG GATGGAAGCC GGTCTTGTCG ATCAGGATGA  
2941  TCTGGACGAA GAGCATCAGG GGCTCGCGCC AGCCGAACTG TTCGCCAGGC TCAAGGCGAG  
3001  CATGCCCGAC GGCGAGGATC TCGTCGTGAC CCATGGCGAT GCCTGCTTGC CGAATATCAT  
3061  GGTGGAAAAT GGCCGCTTTT CTGGATTCAT CGACTGTGGC CGGCTGGGTG TGGCGGACCG  
3121  CTATCAGGAC ATAGCGTTGG CTACCCGTGA TATTGCTGAA GAGCTTGGCG GCGAATGGGC  
3181  TGACCGCTTC CTCGTGCTTT ACGGTATCGC CGCTCCCGAT TCGCAGCGCA TCGCCTTCTA  
3241  TCGCCTTCTT GACGAGTTCT TCTGAATTAT TAACGCTTAC AATTTCCTGA TGCGGTATTT  
3301  TCTCCTTACG CATCTGTGCG GTATTTCACA CCGCATACAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT  
3361  GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG  
3421  AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA  
3481  CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC  
3541  CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC  
3601  ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT  
3661  CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC  
3721  GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA  
3781  CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG CAGTGCTGCC  
3841  ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG  
3901  GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA  
3961  CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG  
4021  GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA  
4081  TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG  
4141  GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT  
4201  GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT  
4261  CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG  
4321  CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT  
4381  TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT  
4441  TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT  
4501  TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA  
4561  GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC  
4621  AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC  
4681  AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT  
4741  GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG  
4801  GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC  
4861  TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG  
4921  AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG  
4981  CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT  
5041  GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC  
5101  GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGGCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG  
5161  TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC  
5221  CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAG
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】質問配列としてINSP005予測ポリペプチド配列を用いたデータベース検索結果の概要（配列アラインメントを示す）。
【図２】INSP005クローニング調査で用いたヒトcDNAライブラリーの表。
【図３】INSP005予測ポリペプチド及び予測アミノ酸配列のヌクレオチド配列。
【図４】INSP005クローニングプライマーの表。
【図５】RACE PCRで同定したINSP005の3'ヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【図６】INSP005シークエンシングの際に用いたプライマーの表。
【図７】ヒト子宮cDNAからクローン化した推定全長INSP005a。
【図８】INSP005a blastp対NCBI-nrデータベース（ヒットした上位10件とトップ関連アラインメントを示す）。
【図９】PCR4-TOPO-IPAAAIPAAA7883-1 INSP005aクローニングプラスミドの地図。
【図１０】ヒトの主要肺線維芽細胞、ケラチノサイト及び骨関節炎滑液由来のcDNAのプールからクローン化した推定全長INSP005b。
【図１１】INSP005b blastp対NCBI-nrデータベース（ヒットした上位10件及びトップ関連アラインメントを示す）。
【図１２】PCR-TOPO-IPAAA78836-2 INSP005bクローニングプラスミドの地図。
【図１３】INSP005予測ポリペプチド配列、INSP005aクローン化ポリペプチド配列、INSP005bクローン化ポリペプチド配列及び問題の特定の先行技術の配列複数アラインメント。
【図１４】INSP005bポリペプチドのSignalPシグナルペプチド予測データ。
【図１５Ａ】血清ASATレベルに及ぼすhIL-6又はINSP005bプラスミド送達の効果。
【図１５Ｂ】血清ALATレベルに及ぼすhIL-6又はINSP005bプラスミド送達の効果。
【図１６Ａ】血清mIL-6レベルに及ぼすhIL-6又はINSP005bプラスミド送達の効果。
【図１６Ｂ】血清TNF-αレベルに及ぼすhIL-6又はINSP005bプラスミド送達の効果。
【図１】
2006516888.tif 000004
【図２】
2006516888.tif 000005
【図３】
2006516888.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006516888.tif 000010
【図８】
2006516888.tif 000011
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
2006516888.tif 000017
【図１３−２】
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【図１４】
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2006516888.tif 000020
2006516888.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
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2006516888.tif 000023
2006516888.tif 000024
2006516888.tif 000025
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