(57)【要約】主題の発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と、ＨＣＶ抗原に反応して生成した抗体の同時検出方法に関する。このような方法は、還元剤を含有するか又は還元剤を含有していない希釈剤の存在下で実施し得る。また、このような方法の性能は、固相上に被覆された抗原の性質、適用温度及び時間などの可変要因を変化させることによって最大にし得る。
2006516741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを同時に検出する方法であって、前記試験試料を、
ａ）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片（前記抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）と；及び
ｂ）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（前記抗原／抗体複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が存在することを示す。）と
の混合物と接触させることを含み、
前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項２】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記固相が微粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗原の存在と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在とを同時に検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片及び２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（但し、前記第一の抗体は抗ＨＣＶ抗体である。）と接触させる工程；
ｂ）コンジュゲートを、得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）（１）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加え（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）、同時に第二のコンジュゲートを、得られた抗原／抗体複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）（２）中の結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗原、少なくとも１種のＨＣＶ抗体、又はこの両方が存在することを示す。）
を含み、
前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項９】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、工程ａ）の後に熱を加えることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試験試料中の少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを同時に検出する方法であって、前記試験試料を、
ａ）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）と；
ｂ）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（前記の抗原／抗体複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が存在することを示す。）と
の混合物と接触させることを含み、
前記方法をジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びシステインからなる群から選択される還元剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項１５】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗原の存在と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在とを同時に検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片及び２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種の第一の抗体又はこの断片（但し、前記第一の抗体は抗ＨＣＶ抗体である。）と接触させる工程；
ｂ）第一のコンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記第一のコンジュゲートが（ａ）（１）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加え（但し、前記第一のコンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）、同時に第二のコンジュゲートを得られた抗原／抗体複合体に、前記第二のコンジュゲートが（ａ）（２）中の結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加える（但し、前記第二のコンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）工程；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗原、少なくとも１種のＨＣＶ抗体、又はこの両方が存在することを示す。）
を含み、
前記方法をＤＴＴ及びシステインからなる群から選択される還元剤を含有する希釈剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項２１】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択されるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記の固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ａ）の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）ことを含み、前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項２７】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原がコア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原がＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原がＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記固相が微粒子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる工程；
ｂ）コンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）
を含み、前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項３４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が工程（ａ）の後に熱を加えることをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）ことを含み、前記方法をＤＴＴ及びシステインからなる群の中から選択される還元剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項４０】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる工程；
ｂ）コンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）
を含み、前記方法をＤＴＴ及びシステインからなる群の中から選択される還元剤を含有する希釈剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項４６】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ａ）の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ａ）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原を含有する容器（但し、前記容器は還元剤を含有していない希釈剤を含有する。）と、及びｂ）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体を含有する容器を含むキット。
【請求項５２】
１）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原と２）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを含有する容器（但し、前記容器は還元剤を含有していない希釈剤を含有する。）を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
主題の発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体の改良された検出方法であって、前記抗体をコンビネーションアッセイ（ＨＣＶ抗原と抗体の両方を検出する）で又はＨＣＶ抗体だけを検出するアッセイで検出するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗体の改良された検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の疫学研究により、ＨＣＶが世界で１億７千万人を越える人々に感染していること及びこの５０％を超える症例において感染が慢性的であることが示されている。米国では、約４百万人の感染した人々がおり、毎年３０，０００の新たな感染が生じると推定されている（ＮＩＨ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌ  １：２Ｓ（１９９７））。また、ＨＣＶは、米国では毎年８，０００から１０，０００人の死亡を招き、肝臓移植に関する主要な指標である。
【０００３】
ＨＣＶゲノムは、ヌクレオチド約９４００から９５００個の長さの正の極性をもつ一本鎖ＲＮＡ分子である。このコード領域の構成は、他のフラビウイルス類〔Ｍａｊｏｒら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２５：１５２７（１９９７）〕及び最近になって発見されたＧＢウイルス〔Ｍｕｅｒｈｏｆｆ  ＡＳら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：５６２１（１９９５）〕の構成に類似している。ＨＣＶゲノムは、特定の分離株に応じてアミノ酸３０１０から３０３３個のポリタンパク質前駆物質をコードする大きな読み取り枠（ＯＲＦ）をもつ〔Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２４５１（１９９１）；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：１３８５（１９９３）〕。ＨＣＶ構造遺伝子（コア及びエンベロープ）は、ゲノムの５’末端付近にコードされ、続いてプロテアーゼ及びヘリカーゼ、ヘリカーゼ補因子及びレプリカーゼがコードされている。非コード領域（ＮＣＲ）は、複製に重要であると考えられ、ゲノムのそれぞれの末端に認められる。
【０００４】
ＨＣＶの感染は、主として非経口暴露によって、すなわち、注射針の共用によって、入れ墨によって、又は汚染された血液もしくは血液製品の輸血によって生じる。暴露後、ウイルスは感染しやすい肝細胞に入り、ウイルスの複製が生じる。約１０日間の暗黒期があり、この間はウイルスが存在する形跡がなく（すなわち、ウイルスＲＮＡは検出できない）、血清トランスアミナーゼ濃度は正常範囲内にあり、しかもＨＣＶに対する免疫応答の形跡がない〔Ｂｕｓｃｈら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０：１４３（２０００）〕。典型的には、暴露後約１０日目に、ＨＣＶ  ＲＮＡが検出でき、血清１ｍｌ当たり１００，０００から１２０，０００，０００個のＨＣＶ  ＲＮＡコピーのウイルス負荷を有する場合が多い。数週間後に、典型的には、肝臓の炎症を示すＡＬＴ値の上昇があり、暴露後平均約７０日目で抗体が検出される。
【０００５】
ＨＣＶの感染の蔓延を抑えるために用いられる予防措置の一つは、血液をＨＣＶへの暴露に関し、ＨＣＶに対する抗体を検出することによるか又は血清／血漿中のウイルス特異分子（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡ又はＨＣＶコアタンパク質）を検出することによって、選別することである。これらの試験によってＨＣＶに暴露されていると確認された個体由来の血液又は血液製品は、血液供給から除外され、血液製品の受容者に対する配布に利用されない（米国特許第６，１７２，１８９号公報参照）。これらの試験はまた、ＨＣＶ感染症に起因する肝疾患を診断する臨床応用において利用し得る。
【０００６】
天然の無傷ＨＣＶビリオンを利用できないために、血清学的抗体検査は、ウイルスポリタンパク質の選択された断片に相当する組換え抗原又は合成ペプチドに依存している。第一世代の抗ＨＣＶスクリーニング試験は、非構造ＮＳ−４タンパク質（Ｃ１００−３）中に配置された配列由来の組換えタンパク質（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）に対する抗体の検出に基づいていた〔Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９（１９８９）；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３６２（１９８９）〕。第一世代のアッセイは、慢性ＨＣＶ感染症を有する個人の約１０％において及び急性ＨＣＶ感染症を示す個人の最大１０から３０％において抗体を検出することができなかった。第二世代の抗ＨＣＶアッセイは、ＨＣＶゲノム（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）の３種類の領域に由来する組換えタンパク質、例えばコアタンパク質、ＮＳ３タンパク質及びＮＳ４タンパク質由来のアミノ酸配列を組み込んでおり〔Ｍｉｍｍｓら、Ｌａｎｃｅｔ  ３３６：１５９０（１９９０）；Ｂｒｅｓｔｅｒｓら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６２：２１３（１９９２）〕、ＨＣＶ感染献血者の特定において第一世代の試験よりも著しい向上を可能にした〔Ａａｃｈら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２５：１３２５（１９９１）；Ｋｌｅｉｎｍａｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３２：８０５（１９９２）〕。第二世代のアッセイは、慢性ＨＣＶの症例の１００％近くにおいて抗体を検出し〔Ｈｉｎｏ  Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７：７７（１９９４）〕、また感染後１２週までの急性の症例のほぼ１００％において抗体を検出する〔Ａｌｔｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２７：１８９９（１９９２）；Ｂｒｅｓｔｅｒｓら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６２：２１３（１９９２）〕。第三世代の試験は、ＮＳ５領域由来のアミノ酸配列を発現する組換えタンパク質、並びにコア、ＮＳ３及びＮＳ４由来の抗原を含む。幾つかの研究は、第三世代の試験を第二世代の試験と比較することにおいて若干の感度の向上を示した〔Ｌｅｅら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３５：８４５（１９９５）；Ｃｏｕｒｏｕｃｅら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ３４：７９０−７９５（１９９４）〕、しかしこの向上はＮＳ５を含有することよりもむしろＮＳ３タンパク質の変化に大きく起因している〔Ｃｏｕｒｏｕｃｅら、Ｌａｎｃｅｔ  ３４３：８５３（１９９４）〕。
【０００７】
一般的に、第二世代及び第三世代のＨＣＶ抗体検査は、暴露後約７０日目にＨＣＶに対する暴露を検出する。ＨＣＶが持続的感染及び多くの場合には生涯にわたる感染を確立して以来、ＨＣＶに対する抗体の検出は、ＨＣＶに対する暴露を調べる極めて効率的な方法に相当する。しかし、抗体検査単独では、暴露後の最初の７０日間はＨＣＶ感染者を発見することができない場合が多い。
【０００８】
現行のＨＣＶ抗原検査は、血清又は血漿中のＨＣＶコア抗原の存在を検出することによるものである。コア（又はヌクレオキャプシド）タンパク質は、ポリタンパク質の最初の１９１個のアミノ酸を含有してなる。血清中のＨＣＶコア抗原の検出を可能にする２つの異なるタイプの血清学的アッセイが開発されている。一方のアッセイフォーマットは、セロコンバージョンの前の患者においてＨＣＶコア抗原を検出するものであり、献血者のスクリーニングにおいて利用され、これに対して他方のアッセイフォーマットは、Ｃ型肝炎患者においてこのＨＣＶ抗体状態に関係なくコア抗原のみを検出するものであり、ＨＣＶに対する暴露を診断するか又は抗ウイルス療法を監視するために臨床検査室で利用される。
【０００９】
セロコンバージョン前の期間に得られる試料に関する最近のデータは、ＨＣＶ抗原検査が、抗体検査よりも著しく早くＨＣＶに対する暴露を検出することを示し〔Ａｏｙａｇｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３７：１８０２（１９９９）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７８：８０（２０００）；Ｄａｗｓｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，ＳＤ１６１，４０（２０００）；Ｍｕｅｒｈｏｆｆら、７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３−７，２０００〕、及びセロコンバージョン前の期間中のＨＣＶに対する暴露を検出するための核酸検査の代替法に相当する。ＨＣＶ抗原検出の利点は、試験が迅速であること、簡単であること、試料抽出又は他の前処理を必要としないものであり得ること、及びＨＣＶ  ＲＮＡ検査で生じ得るような取り扱いエラー（例えば、汚染）を生じる傾向がないことである。
【００１０】
臨床検査室では、ＨＣＶ抗原検査は、種々のＨＣＶ遺伝子型に感染した患者におけるＨＣＶに対する暴露の検出において〔Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１５１２（１９９９）〕及び抗ウイルス療法の監視において〔Ｔａｎａｋａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３２：３８８（２０００）；Ｔａｎａｋａら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２３：７４２（１９９５）〕ＨＣＶ  ＤＮＡ検査に相当する感度を有する。従って、ＨＣＶコア抗原検査は、献血者のスクリーニング又は抗ウイルス療法の監視のためのＨＣＶ  ＲＮＡの実用的な代替法を提示する。
【００１１】
本発明の特異性は、還元剤が存在しない環境において、ＨＣＶ抗体とＨＣＶ抗原を同時に検出できることにある（国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ９９／０４１２９号も参照）。従って、この併用試験すなわち「コンボ」アッセイは、セロコンバージョン前の「空白期」の間にＨＣＶに対する暴露を特定するための抗原検出と、セロコンバージョン後のＨＣＶに対する暴露を特定するための抗体検出とを利用する。
【００１２】
特に、本発明の方法に従って、抗コア抗体検出又は感度は、還元剤の存在下とは対照的に還元剤の不存在下においてはるかに優れている（特にｐ９ＭＢ−１８及び検出法中の熱ストレス適用時に関連して）。しかし、本発明はまた、抗体検出を向上させる目的で還元剤を使用する方法も含む。例えば、抗ＮＳ３抗体検出は、還元剤の存在下ではるかに優れている。他の可変要因もまた、抗体検出感度を向上させることを目的として、還元剤を用いて又は用いずに変化させ得る。
【００１３】
全ての米国特許公報、特許出願明細書（例えば、米国特許出願第０９／８９１，９８３号及び米国特許出願第１０／１７３，４８０号明細書）及び本明細書で挙げた刊行物は、この全部を本明細書に参照により組み込まれる。
【発明の開示】
【００１４】
（発明の要否）
主題の発明は、試験試料中の少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体（すなわち、ＨＣＶ抗原に対する抗体）を同時に検出する方法を包含する。特に、この方法は、試験試料を、
ａ）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片の混合物（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す）と；
ｂ）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（前記の抗原／抗体複合体の存在は、前記試験試料に少なくとも１種のＨＣＶ抗原が存在することを示す）とに接触させることを含む。この方法は、還元剤の不存在下で実施される。固相（例えば、微粒子）上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片の中から選択し得る。特に、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、固相上に被覆された抗原により検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得る。また、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１、３４−４６及び４９−１００を含有してなり得る。この抗原を利用する場合には、検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得る。（本明細書で挙げる全てのアミノ酸配列は、本明細書に参照によりその全部が組み込まれる米国特許出願第１０／１７３，４８０号明細書に記載されている）。
【００１５】
前記の方法はまた、接触工程の後に熱（すなわち、熱ストレス）を加える工程を含んでなり得る。この場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７及びコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、及び固相上に被覆された抗原によって検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗コア抗体であり得る。
【００１６】
本発明はまた、試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在を同時に検出する別の方法を包含する。この方法は、ａ）試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片及び２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片と接触させる工程；ｂ）第一のコンジュゲートを、得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）（１）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加え〔但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体（例えば、マウス、抗ヒトＩｇＧ）からなる〕、同時に第二のコンジュゲートを、得られた抗原／抗体複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）（２）中の結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる）；及びｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗原、少なくとも１種のＨＣＶ抗体、又はこの両方が存在することを示す）からなる。この方法は、還元剤の不存在下で実施される。固相上に被覆された抗原は、前記の抗原であり得、また前記抗体は抗原により検出され得る。さらに、加熱も前記のように利用し得る。前記の抗原の使用はまた、前記の少なくとも１種の抗体を検出するために熱ストレスを組み合わせ得る。
【００１７】
また、本発明は、試験試料の少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体を同時に検出する別の方法を含む。この方法は、試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片（前記の抗体／抗原複合体の存在は、試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す）と；２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（前記の抗原／抗体複合体の存在は、試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が存在することを示す）との混合物と接触させることからなり、この場合に、少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の検出は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びシステインからなる群から選択される還元剤の存在下で行われる。固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、又はこれらの断片であり得る。さらに詳しくは、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、この抗原によって検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体又は抗コア抗体であり得、及び還元剤は、例えば、ＤＴＴであり得る。また、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり得る。この抗原は、還元剤としてＤＴＴを使用する際には、少なくとも１種の抗体、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体を検出するのに使用し得る。
【００１８】
上記に記載の方法には、接触工程の後にさらに熱を適用し得る。熱を加える場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される少なくとも１種の抗体は抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、及び利用する還元剤はＤＴＴである。
【００１９】
さらにまた、本発明は、試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在を同時に検出する方法であって、ａ）前記試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片及び２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片と接触させる工程；ｂ）第一のコンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記第一のコンジュゲートが（ａ）（１）中の結合抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下で加え（但し、前記第一のコンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる）、同時に第二のコンジュゲートを得られた抗原／抗体複合体に、前記第二のコンジュゲートが（ａ）（２）中の結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加える（但し、前記第二のコンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる）工程；及びｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗原、少なくとも１種のＨＣＶ抗体、又はこの両方が存在することを示す）を含み、少なくとも１種のＨＣＶ抗体の検出をＤＴＴ及びシステインからなる群から選択される還元剤を含有する希釈剤の存在下で行うことを特徴とする方法も包含する。また、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、又はこれらの断片であり得る。特に、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、この抗原によって検出される少なくとも１種の抗体は抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、及び使用される還元剤はＤＴＴであり得る。また、この方法において、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり得、この抗原によって検出される少なくとも１種の抗体は抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、及び使用される還元剤はＤＴＴであり得る。
【００２０】
この方法には、工程（ａ）の後に加熱工程を加えてもよい。この加熱工程を利用する場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、この抗原によって検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、及び使用される還元剤は例えばＤＴＴであり得る。
【００２１】
さらにまた、本発明は、試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す）ことを含む方法であって、少なくとも１種のＨＣＶ抗体の検出を還元剤の不存在下で行うことを特徴とする方法を包含する。固相を被覆するのに使用される少なくとも１種の抗原は、前記の抗原であり、検出される抗体、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得る。
【００２２】
加熱を接触工程の後に適用してもよい。加熱を利用する場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗コア抗体である。
【００２３】
また、本発明は、試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、ａ）前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる工程；ｂ）コンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる）；及びｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す）を含む方法を含む。また、この方法は還元剤の不存在下で行われる。さらにまた、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は前記の抗原であり得る。特に、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得る。また、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり得、少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得る。
【００２４】
また、この方法は、さらに工程（ａ）の後に熱を加える工程を含んでなり得る。熱を加える場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、好ましくはＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される少なくとも１種の抗体は、抗コア抗体である。
【００２５】
本発明はまた、試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す）ことを含む方法を包含する。この検出方法は、ＤＴＴ及びシステインからなる群の中から選択される還元剤の存在下で行われる。この方法において、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５、及びこれらの断片であり得る。特に、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなる。前記の検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、還元剤は、例えば、ＤＴＴであり得る。また、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなる。検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、還元剤は、例えば、ＤＴＴであり得る。
【００２６】
この方法では、接触工程の後に熱ストレスを加えてもよい。この場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり、還元剤は例えばＤＴＴである。
【００２７】
また、本発明は、試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する別の方法を包含する。この方法は、ａ）試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる工程；ｂ）コンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートを（ａ）中の結合抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる）；及びｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す）からなる。この方法は、ＤＴＴ及びシステインからなる群の中から選択される還元剤を含有する希釈剤の存在下で行われる。また、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原は、例えば、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４又はＮＳ５、またはこれらの断片であり得る。特に、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなる。前記の検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、還元剤は、例えば、ＤＴＴであり得る。また、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなる。検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、還元剤は、例えば、ＤＴＴであり得る。
【００２８】
この方法はまた、さらに工程（ａ）の後に熱（すなわち、熱ストレス）を加える工程を含んでなる。熱を加える場合には、固相上に被覆された少なくとも１種の抗原は、例えば、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり得、検出される少なくとも１種の抗体は、例えば、抗ＮＳ３抗体及び／又は抗コア抗体であり得、還元剤は例えばＤＴＴであり得る。
【００２９】
本発明はまた、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原を含有する容器（但し、前記容器は還元剤を含有していない希釈を含有する）と；固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体を含有する容器を含むキットを包含する。
【００３０】
さらにまた、本発明は、１）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原と２）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを含有する容器（但し、前記容器は還元剤を含有していない希釈剤を含有する）含むキットを包含する。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
主題の発明は、生物学的試料中のＨＣＶの抗原及びＨＣＶに対する抗体を検出するために利用し得る種々の方法に関する。これらの方法は、還元剤を含有していない希釈剤の存在下で又は還元剤を含有する希釈剤の存在下で実施し得る。従って、個体がＨＣＶに対する特異抗体を発現しているか及び／又は供試生物学的試料中にＨＣＶ特異抗原を有する場合には、本発明の方法は陽性結果を生じるであろう。このような結果は、例えば、感染の存在及び状態（すなわち、急性又は慢性）について患者を診断するために及び輸血用の献血又は血液製品試料の適合性を調べるために使用し得る。
【００３２】
また、本発明は、個体がＨＣＶに感染しているかもしれないが未だ抗体を発現していないかもしれない「空白期間」（すなわち、感染後５０から６０日）に関連した問題を克服する。このような個体は、この期間中にＨＣＶを他人に感染させるかもしれない。従って、この「空白期間」中にＨＣＶを検出することによって、本発明は、抗体の発生を待つのに反して、ＨＣＶの迅速な診断を可能にし、血液供給の汚染を防止する。
【００３３】
本発明の１つの実施形態においては、ＨＣＶウイルス抗原（例えば、コア、Ｎ３、Ｎ４及びＮ５）、これらの部分、または全長タンパク質又はこの部分の混合物が、還元剤を含有していない希釈剤の存在下で又は還元剤を含有する希釈剤の存在下で、固相上に被覆される（又は液相中に被覆される）。次いで、試験試料又は生物学的試料（例えば、血清、血漿、尿など）を前記固相と接触させる。抗体が前記試料中に存在する場合には、このような抗体が前記固相上の抗原に結合し、次いで直接法又は間接法で検出される。直接法は、複合体自体の存在、従って抗体の存在を単純に検出することを含む。間接法では、コンジュゲートを結合抗体に加える。このコンジュゲートは、信号発生化合物又は標識に結合された第一の結合抗体に結合する第二の抗体を含有する。第二の抗体が結合第一の抗体に結合すると、信号発生化合物は、測定可能な信号を発生する。この場合、このような信号は試験試料中に第一の抗体が存在することを示す。
【００３４】
診断イムノアッセイにおいて使用される固相の例は、多孔質及び非多孔性物質、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（米国特許第５，７０５，３３０号公報参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウエル及びプラスチックチューブである。固相物質の選択及びコンジュゲート中に存在する抗原又は抗体を標識する方法の選択は、所望ならば、所望のアッセイフォーマットの性能特性に応じて決定される。
【００３５】
前記のように、コンジュゲート（又は指示試薬）は、信号発生化合物又は標識に結合された抗体（又は、おそらくはアッセイに応じて、抗抗体）を含有する。この信号発生化合物又は「標識」は、それ自体検出可能であるか、または１種又はそれ以上の追加化合物と反応して検出可能生成物を生成し得る。信号発生化合物の例としては、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ及び１４Ｃ）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視性又は蛍光性）、核酸、錯化剤又は触媒、例えば酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ）が挙げられる。酵素（例えば、アルカリホスファターゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ）を使用する場合には、色素原、蛍光原又は発光原基質の添加により、検出可能な信号が発生する。他の検出系、例えば、時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光分析も有用である。
【００３６】
前記イムノアッセイにより試験し得る生物学的流体の例としては、血漿、尿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液、唾液、涙、鼻洗浄液又は組織及び細胞の水性抽出物が挙げられる。
【００３７】
抗体が検出されるのと同時に、ＨＣＶ抗原も検出される。従って、本発明は、２種類の試験を実施する必要性を不要にする。（勿論抗体アッセイは、患者試料中の抗体の存在だけを探索する場合には、還元剤を含有していない希釈剤の存在下で、単独で実施し得る）。これは、ＨＣＶに対する特異抗体（例えば、コアに対するヒト又は動物モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体など）で被覆された固相（又は液相）に試験試料を暴露することによって達成される。抗原は、試料中に存在する場合には、固相に結合し、次いで前記の直接法又は間接法で検出し得る。さらに詳しくは、間接法は、標識又は信号発生化合物に結合された第二の抗体（これは結合抗原に結合する）を含有するコンジュゲートの添加を必要とする。第二の抗体が結合抗原に結合すると、この場合には検出可能な信号が生じ、試験サンプル中にＨＣＶ抗原が存在することを示す。
【００３８】
固相上に被覆される抗体及び「第二の抗体」は、前記のように、モノクローナル抗体（例えば、マウス抗ヒトＩｇＧ）又はポリクローナル抗体であり得る。例えば、モノクローナル抗体を使用することを選択する場合には、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）モノクローナル抗体１３−９５９−２７０、１４−１２６９−２８１、１４−１２８７−２５２、１４−１５３−２３４、１４−１５３−４６２、１４−１７０５−２２５、１４−１７０８−２６９、１４−１７０８−４０３、１４−１７８−１２５、１４−１８８−１０４、１４−２８３−１１２、１４−６３５−２２５、１４−７２６−２１７、１４−８８６−２１６、１４−９４７−１０４及び１４−９４５−２１８の中から選択し得る。以下の抗コアモノクローナル抗体も、本発明の目的に利用し得る：１０７−３５−５４、１１０−８１−１７、１３−９７５−１５７、１４−１３５０−２１０（米国特許第５，７５３，４３０号公報参照）並びにＴｏｎｅｎ  ＨＣＶコアモノクローナル抗体Ｃ１１−３、７、１０、１４及び１５（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ０９９／０６８３６号公報）。これらは全てｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９から入手可能である。〔モノクローナル抗体を作製し得る方法の論議については、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９４を参照；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｒｒｅｌｌ編（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８２）に総説されている。またＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８３）も参照；また米国特許第５，７５３，４３０号公報も参照〕。
【００３９】
ＨＣＶコアタンパク質は、アッセイのＨＣＶ抗原部分の一つの可能な標的であり得ることに注目すべきである。さらに詳しくは、コアタンパク質の検出は、コアタンパク質内のエピトープを指向するモノクローナル抗体を使用することによって達成される。これらの抗コアモノクローナル抗体は固相上に配置され、試験試料からのコア抗原タンパク質の捕捉を可能にする。試験試料中のＨＣＶ抗体の検出のために、組換えＨＣＶコアタンパク質も該固相上に配置される。しかし、抗原検査用の標的として及び抗体検出用の捕捉試薬として単一のタンパク質の使用に関連した重要な問題があること、すなわちコア抗原と固相上に被覆された抗コアモノクローナル抗体の間に有意な「交差反応性」があることに注目すべきである。これは、試験試料の不存在下であっても、モノクローナル抗体が組換えタンパク質上に存在するエピトープに結合することから、偽陽性信号をもたらす。
【００４０】
このような交差反応性を避けるために、アッセイの抗体検出部分に使用するコアタンパク質を、抗コア抗体のＨＣＶコア結合能力を排除するように修飾し得る。このような修飾は、エピトープ領域（すなわち、モノクローナル抗体の結合に必要なアミノ酸の短い配列）を除去又は修飾する組換えＤＮＡ技術を使用することによって達成し得る。従って、修飾された組換えコアタンパク質を使用すると、その結果として、感染個体の血清中に存在する抗体が結合する幾つかのヒトエピトープが維持される。しかし、抗原の捕捉に使用される抗コアモノクローナル抗体は修飾されたタンパク質に結合しないであろう。また、大部分の感染個体の血清中に存在する抗体に結合することが知られている配列を含むが、ＨＣＶコア抗原を検出するのに使用される抗コアモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを含有する配列を含まないポリペプチドで、ＨＣＶコア組換えタンパク質を置換することが可能であろう。
【００４１】
さらに詳しくは、前記のように、交差反応性を避けるために、アッセイにおいて抗体の検出のためにコア抗原を使用してもよい。特に、本発明においては、固相は、非構造タンパク質（ＮＳ）３、４及び／又は５（すなわち、ＮＳ３、ＮＳ４及び／又はＮＳ５）及び／又はコアタンパク質を用いて被覆し得る。（本明細書で論議されるタンパク質のアミノ酸配列については米国特許第５，７０５，３３０号公報参照）。また、本発明においては、固相は、（抗体の検出のために）前記の全長ＨＣＶタンパク質、又はこのセグメントもしくは部分のいずれかを単独で又は組み合わせて用いて被覆し得る。固相を被覆するのに使用される抗原は、単一体として又は離散体として組換えタンパク質として発現される連続組換えタンパク質として、または単一体又は離散体として設計される合成ペプチドとして作成し得る。
【００４２】
また、コンボアッセイにおいてＨＣＶ  Ｅ２に対する抗体（又はＨＣＶ抗原に対する他の抗体）を検出し得ることに注目すべきである。従って、本明細書に記載のこのアッセイを使用すると、抗コア抗体を検出するアッセイを代替し得る。また、このような抗コア抗体アッセイを、本明細書に記載のコンボアッセイの抗原アッセイ部分を用いて補足し得る（例えば、ＨＧＢＶ  Ｅ２抗体又は抗原の検出に関する米国特許第６，１５６，４９５号公報参照）。
【００４３】
本発明における抗原の検出に関して、前記のように、固相上に被覆されたモノクローナル又はポリクローナル抗体は、（抗体の検出のために）固相上で使用されるコア抗原を認識してはいけない。従って、例えば、本発明においては、完全抗体又はこの断片を使用し得る（本発明のために、抗体の「断片」又は「部分」は、結合特性に関して完全抗体と機能的に同じように反応する抗体のサブユニットとして定義される）。
【００４４】
また、イムノアッセイで使用される（ＨＣＶ抗原を検出するための）最初の捕捉抗体は、固相に共有結合させ得るか又は非共有結合（例えば、イオン結合、疎水結合など）させ得ることに注目すべきである。共有結合のための連結剤は、当該技術分野で公知であり、固相の一部であってもよいし又は被覆の前に固相を誘導体化してもよい。
【００４５】
ＨＣＶ抗体を検出するために固相を使用する第２の方法は、コア抗原を完全に除外することを含む。例えば、固相は、ＮＳ３、ＮＳ４及び／又はＮＳ５、並びにコアタンパク質又はこの領域の代替物（例えば、Ｅ２）で被覆される。これに対して、抗原の検出のために固相上で被覆される抗体は、ＨＣＶのコアタンパク質に対して指向する。
【００４６】
抗原及び抗体を同時に検出するために本発明の目的に使用し得る他のアッセイフォーマットとしては、例えば、二重アッセイストリップブロット、迅速試験、ウェスタンブロット、及び例えばＡｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）アッセイ（Ｆｒａｎｋ  Ｑｕｉｎｎ，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編，ｐ．３６３−３６７，２００１）における常磁性粒子の使用が挙げられる。このようなフォーマットは当業者には公知である。
【００４７】
本発明のアッセイはまた、所望ならば、ＨＣＶ抗原又はＨＣＶ抗体をこの両方よりもむしろ単独で検出するのに使用し得、単独ＨＣＶ抗体アッセイは還元剤を含有していない希釈剤の存在下で行われることが好ましいことに注目すべきである。確かに、感染が初期に存在することを確認することが望まれる場合には、「空白期間」中のように試験試料中の抗原の存在を調べることが単に望まれよう。一方、感染の段階（例えば、急性か又は慢性か）を確認したい場合には、抗体の存在及びこの力価を調べることが望まれよう。
【００４８】
また、前記のアッセイの要素はキットの形態で使用するのに特に適していることに注目すべきである。該キットは、バイアル、ボトル又はストリップなどの１つの容器からなり得、各容器は予め準備された固相を有し、他の容器はそれぞれのコンジュゲートを含有する。これらのキットはまた、アッセイを実施するために必要な他の試薬（例えば、洗浄剤、加処理剤及び指示試薬）のバイアル又は容器を含有し得る。
【実施例】
【００４９】
本発明を、以下の非限定的実施例を使用することによって例証し得る。
【００５０】
（実施例Ｉ）
微粒子上の切頭ＨＣ４３の被覆
ポリスチレン微粒子を、ｐＨ６．３の微粒子被覆用緩衝液〔すなわち、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を有する２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液〕中で、１％固形分（ｓｏｌｉｄ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）で１５分間平衡化し、次いで切頭ＨＣ４３（ｐ９ＭＢ１８又はｐ９ＭＢ３１）（米国特許第５，７０５，３５０号公報参照）を受動被覆のために最終濃度において５０μｇ／ｍｌで加えた（ｐ９ＭＢ１８及びｐ９ＭＢ３１の調製の考察ついては本発明の所有権者と同じ所有権を有する米国特許出願第１０／１７３，４８０号明細書参照）。混合物を回転させながら室温で一晩インキュベートした。
【００５１】
ｐ９ＭＢ１８被覆粒子又はｐ９ＭＢ３１被覆微粒子を、微粒子洗浄緩衝液で洗浄した。緩衝液は、リン酸塩、ＳＤＳ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナトリウム、を含有していた（ｐＨ６．５）。洗浄後に、微粒子を上記と同じ緩衝液に再懸濁し、５６℃で一晩熱を加えた。
【００５２】
（実施例ＩＩ）
ＨＣＶ抗体／抗原プロトタイプアッセイの性能
アッセイを、Ｄ．Ｓｈａｈ及びＪ．Ｓｔｅｗａｒｔによる刊行物「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐａｎｅｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ」（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｄ．Ｗｉｌｄ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ，ＮＹ）に記載のようにして、単一チャンネルＰＲＩＳＭ（登録商標）装置（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用することによって行った。
【００５３】
手短に言えば、試料１００μｌ；試料希釈剤緩衝液（ＳＤＢ）５０μｌ〔これは洗浄剤、ウシアルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するホウ酸塩であった〕；及びｐ９ＭＢ１８又はｐ９ＭＢ３１と結合させた微粒子５０μｌを、ステーション１のインキュベーションウエルに加えた。反応トレーを、１８分経過した後にステーション４に移した。ステーション４では、反応混合物を、洗浄剤及び０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を含有するトリス塩である移送洗浄緩衝液により反応ウエルに移した。反応混合物中の微粒子を、反応ウエル中で繊維質マトリック（液体を濾過する）により捕捉した。ステーション５で、アクリジニウム標識マウス抗ヒト抗体を含有するコンジュゲート５０μｌを、反応ウエルに分配した。反応トレーを２２．３分経過した後にステーション８に移し、反応ウエル中の反応混合物を最終洗浄緩衝液（これは洗浄剤及び０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を含有するホウ酸塩緩衝液であった）で洗浄した。次いで、トレーをステーション９に移し、ここでトリガー溶液、すなわちアルカリ性過酸化水素を反応ウエルに注入し、この信号を光電子倍増管で測定した。各ウエルからの化学発光カウント数をまとめ、この試料ＩＤと並べてバッチファイルに保存した。
【００５４】
アッセイコントロール：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（ＮＣ）は、再石灰化標準ヒト血漿であり、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢコア、及びＨＣＶについて陽性試験した。
【００５５】
（実施例ＩＩＩ）
種々の環境下での切頭ＨＣ４３被覆微粒子の試験
ｐ９ＭＢ１８及びｐ９ＭＢ３１被覆微粒子を、次の様な種々の微粒子希釈剤：すなわち、１）還元剤を含有していない希釈剤、２）２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有する希釈剤、３）スクロース、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中に２ｍＭシステインを含有する希釈剤、を用いて固体濃度０．０２５％まで希釈した。種々の緩衝液中の希釈微粒子を、種々の温度及び種々の時間でインキュベートした。次いで、微粒子を単一チャンネルＰＲＩＳＭ（登録商標）装置を用いて試験した。４つの陰性対照（ＮＣ）平均値のカウント数をバックグランドとして使用した。試験に使用した全ての試料を下記に示す表に示した。全ての試料は二重反復試験で試験した。陽性信号と陰性信号の比（Ｐ／Ｎ）を使用して感度を評価した。
【００５６】
【表１】
2006516741.tif 000003
【００５７】
（実施例ＩＶ）
抗コア抗体検出を改善するために４５℃で３日間インキュベートした後の切頭ＨＣ４３（ｐ９ＭＢ１８）の試験
ｐ９ＭＢ１８又はｐ９ＭＢ３１を、種々の微粒子希釈剤で希釈し、４５℃で３日間インキュベートし、次いで２℃から８℃で保存した同じ微粒子と、抗コア抗体検出の感度について比較した。結果を以下の表に示す。
【００５８】
ｐ９ＭＢ１８被覆微粒子：
【００５９】
【表２】
2006516741.tif 000004
＊：相対光単位
【００６０】
得られた結果は、ｐ９ＭＢ１８微粒子を、前記のように還元剤微粒子希釈剤の不存在下で４５℃で３日間インキュベートした場合に抗コア（パネルＡ及び試料１）抗体検出の感度が著しく高まったことを示した。
【００６１】
ｐ９ＭＢ３１被覆微粒子：
【００６２】
【表３】
2006516741.tif 000005
【００６３】
ｐ９ＭＢ３１微粒子は、ｐ９ＭＢ１８被覆微粒子によって示されるような抗コア抗体に対する加熱ストレスの影響を示さなかった。
【００６４】
（実施例Ｖ）
切頭ＨＣ４３（ｐ９ＭＢ１８）：抗コア抗体検出に対する温度及び時間の影響
ｐ９ＭＢ１８被覆微粒子を、実施例ＩＩＩに示したような種々の微粒子希釈剤に懸濁し、３７℃、４５℃及び５６℃で最大３日間インキュベートした。次いで、これらの微粒子を、２つの抗コア陽性試料（パネルＡ及び試料１）について試験した。
【００６５】
還元剤を含有していない微粒子希釈剤：
【００６６】
【表４】
2006516741.tif 000006
２ｍＭ  ＤＴＴ含有微粒子希釈剤：
【００６７】
【表５】
2006516741.tif 000007
３ｍＭシステイン含有微粒子希釈剤：
【００６８】
【表６】
2006516741.tif 000008
【００６９】
得られた結果は、前記に示す種々の微粒子希釈剤（還元剤含有又は無含有）中のｐ９ＭＢ１８被覆微粒子、及び３７℃から５６℃の熱ストレスが抗コア抗体検出を著しく向上させることを示す。
【００７０】
（実施例ＶＩ）
切頭ＨＣ４３（ｐ９ＭＢ１８及びｐ９ＭＢ３１）：抗ＮＳ３抗体検出に対する種々の微粒子希釈剤及び温度の影響
ｐ９ＭＢ１８被覆微粒子及びｐ９ＭＢ３１被覆微粒子の両方を、実施例ＩＩＩに示した種々の微粒子希釈剤で希釈し、４５℃で３日間インキュベートした。次いで、これらの微粒子を、抗ＮＳ３抗体検出の感度について、２℃から８℃で保存した上記と同じ微粒子と比較した。３種類のＮＳ３陽性試料（パネルＦ、パネルＢ）を試験に使用した。
【００７１】
ｐ９ＭＢ１８被覆微粒子：
【００７２】
【表７】
2006516741.tif 000009
【００７３】
ｐ９ＭＢ３１被覆微粒子：
【００７４】
【表８】
2006516741.tif 000010
【００７５】
得られた結果は、次のことを証明している。すなわち、１）ＤＴＴ還元剤は、抗ＮＳ３抗体試料の検出に関して、ｐ９ＭＢ１８被覆微粒子及びｐ９ＭＢ３１被覆微粒子の両方の安定性に必要であること及び２）ＤＴＴは還元剤としてシステインよりも優れていること。
【００７６】
３組のデータ（表に示したようなデータ）全部を一緒にして考慮すると、結果は次のように要約し得る。
【００７７】
１）熱ストレスについて、ｐ９ＭＢ−１８は、全体として、非熱ストレス条件と比較してパネルＡ及び試料１についてより高い感度を示した。
【００７８】
２）４５℃で３日間熱ストレスを加えた場合にｐ９ＭＢ−１８とｐ９ＭＢ−３１について（すなわち、異なる抗原組立て体）に関してパネルＡに関連して異なる反応性が認められた。
【００７９】
３）熱ストレスについて、パネルＢ及びＦの抗原は、還元剤を含有していない条件下で幾分感度を低下させた。しかし、両方のパネルは、ＤＴＴの存在下では感度を保持した。また、温和な還元剤システインを使用すると、両方のパネルは、４５℃で３日間の熱ストレスにより幾分感度を低下させた。
【００８０】
４）Ｐ９ＭＢ−３１−被覆微粒子は、ＤＴＴの不存在下で及びシステインの存在下で、熱ストレスにより、パネルＢ及びＦについて著しく感度を低下させた。従って、上記の点から見て、次の結論に到達し得る：１）ｐ９ＭＢ−１８は、熱ストレスに関して、ｐ９ＭＢ−３１と比べてパネルＡ（抗コア抗体試料）についてよりよい感度を示した。２）Ｐ９ＭＢ−３１−被覆微粒子は、ｐ９ＭＢ−１８被覆微粒子と比べて、パネルＢ及びＦについてよりよい感度を示した。３）４５℃で３日間の熱ストレスは、パネルＡ及び試料１を用いて評価すると、ｐ９ＭＢ−１８被覆微粒子についてよりよい性能をもたらした。ＤＴＴの存在は、ｐ９ＭＢ−１８被覆微粒子を用いて４５℃で３日間の熱ストレスを加えると、パネルＢ及びＦについてよりよい感度をもたらし、ｐ９ＭＢ−３１被覆粒子を用いたこれら２つのパネルについて感度を維持した。（システインの存在は、パネルＢについて安定性を向上させなかった）４）パネルＡ及び試料１は、ＤＴＴの存在下の微粒子に代えた場合と比べて、２から８℃で３日間、ＤＴＴの不存在下の及びシステインの存在下のｐ９ＭＢ−１８被覆微粒子についてよりよい感度を示した。パネルＡは、ＤＴＴの存在下の微粒子と代えた場合にと比べて、２から８℃で３日間、ＤＴＴの不存在下の及びシステインの存在下のｐ９ＭＢ−３１被覆粒子についてよりよい感度を示した。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＨＣＶ  Ａｂアッセイフォーマットを例示する。該アッセイは、ＨＣＶゲノムのコア、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５領域由来の組換えＨＣＶ抗原で被覆された微粒子からなる２段階フォーマットを使用する（ＨＣ４３、Ｃ１００又はＮＳ５で被覆された微粒子の考察については米国特許第５，７０５，３３０号公報参照）。これらの微粒子は、ドナー試料、還元剤を含有していない希釈剤、及びヤギポリクローナル抗ヒトＦ（ａｂ’）２断片／マウスモノクローナル抗ビオチン：アクリジニウムコンジュゲートの複合体と一緒にされた場合に、ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ａｃｔｉｖａｔｏｒ溶液を用いて誘発されると、該試料中の抗ＨＣＶ抗体の定性的測定に相当するある量の光子を生成する。
【図２】図２は、ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂアッセイコンボフォーマットを例示する。このアッセイは、２段階フォーマットを使用する。ＨＣＶ組換え抗原と、モノクローナル抗体混合微粒子（例えば、コア由来のＨＣＶペプチド、並びにｃ１１−１４で被覆された微粒子と混合されたＨＣＶゲノムのＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５領域由来の組換え抗原）とを、ドナー試料、還元剤を含有していない希釈剤及び混合アクリジニウム標識Ｍａｂ（例えば、アクリジニウム標識ｃ１１−１０及びアクリジニル化マウス抗ヒトＩｇＧ）と一緒にすると、ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ａｃｔｉｖａｔｏｒ溶液を用いて誘発させた場合に、該試料中の抗ＨＣＶ抗原又は抗ＨＣＶ抗体あるいはこれら両方の定性的測定に相当するある量の光子を生成する。
【図１】
2006516741.tif 000011
【図２】
2006516741.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月5日(2005.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを同時に検出する方法であって、前記試験試料を、
ａ）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片（前記抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）と；及び
ｂ）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（前記抗原／抗体複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が存在することを示す。）と
の混合物と接触させることを含み、
前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項２】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗原の存在と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在とを同時に検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片及び２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（但し、前記第一の抗体は抗ＨＣＶ抗体である。）と接触させる工程；
ｂ）コンジュゲートを、得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）（１）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加え（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）、同時に第二のコンジュゲートを、得られた抗原／抗体複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）（２）中の結合抗原に結合させるのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗原、少なくとも１種のＨＣＶ抗体、又はこの両方が存在することを示す。）
を含み、
前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記の固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、工程ａ）の後に熱を加えることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
試験試料中の少なくとも１種のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原と少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを同時に検出する方法であって、前記試験試料を、
ａ）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）と；
ｂ）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体又はこの断片（前記の抗原／抗体複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が存在することを示す。）と
の混合物と接触させることを含み、
前記方法をジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びシステインからなる群から選択される還元剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項１４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗原の存在と少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在とを同時に検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、１）抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片及び２）抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、前記固相上に被覆された少なくとも１種の第一の抗体又はこの断片（但し、前記第一の抗体は抗ＨＣＶ抗体である。）と接触させる工程；
ｂ）第一のコンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記第一のコンジュゲートが（ａ）（１）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加え（但し、前記第一のコンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）、同時に第二のコンジュゲートを得られた抗原／抗体複合体に、前記第二のコンジュゲートが（ａ）（２）中の結合抗原に結合するのに十分な時間及び条件下で加える（但し、前記第二のコンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）工程；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗原、少なくとも１種のＨＣＶ抗体、又はこの両方が存在することを示す。）
を含み、
前記方法をＤＴＴ及びシステインからなる群から選択される還元剤を含有する希釈剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項２０】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択されるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）ことを含み、前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項２６】
前記固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原がコア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原がＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原がＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１、３４−４６及び４９−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる工程；
ｂ）コンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）
を含み、前記方法を還元剤の不存在下で行う、前記方法。
【請求項３２】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が工程（ａ）の後に熱を加えることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗コア抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体を検出する方法であって、前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる（前記の抗体／抗原複合体の存在は、前記試験試料中に前記少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）ことを含み、前記方法をＤＴＴ及びシステインからなる群の中から選択される還元剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項３８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記接触工程の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記固相上に被覆された前記少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
試験試料中の少なくとも１種のＨＣＶ抗体の存在を検出する方法であって、
ａ）前記試験試料を、抗体／抗原複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原又はこの断片と接触させる工程；
ｂ）コンジュゲートを得られた抗体／抗原複合体に、前記コンジュゲートが（ａ）中の結合抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で加える工程（但し、前記コンジュゲートは、検出可能な信号を発生することができる化学発光化合物に結合された抗体からなる。）；及び
ｃ）前記の生じた信号を検出する工程（前記信号の存在は、前記試験試料中に少なくとも１種のＨＣＶ抗体が存在することを示す。）
を含み、前記方法をＤＴＴ及びシステインからなる群の中から選択される還元剤を含有する希釈剤の存在下で行う、前記方法。
【請求項４４】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５、及びこれらの断片からなる群の中から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３０、３４−４６及び４９−１００を含有してなり及び検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ａ）の後に熱を加える工程をさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記固相上に被覆された少なくとも１種の抗原が、ＮＳ３のアミノ酸１１９２−１４５７並びにコアタンパク質のアミノ酸１−３１及び５１−１００を含有してなり、検出される前記少なくとも１種の抗体が抗ＮＳ３抗体及び抗コア抗体からなる群の中から選択され、及び前記還元剤がＤＴＴである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ａ）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原を含有する容器（但し、前記容器は還元剤を含有していない希釈剤を含有する。）と、及びｂ）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体を含有する容器とを含むキット。
【請求項５０】
１）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗原と２）固相上に被覆された少なくとも１種のＨＣＶ抗体とを含有する容器（但し、前記容器は還元剤を含有していない希釈剤を含有する。）を含むキット。
【国際調査報告】
2006516741.tif 000013
2006516741.tif 000014
2006516741.tif 000015