(57)【要約】少なくとも１種類のペプチドYY化合物、およびペプチドYYの鼻粘膜送達を促進する１種類以上の鼻腔内送達促進剤を含む、哺乳動物対象において、肥満症を含めた多様な疾患および状態を処置するための医薬組成物および方法を記載する。１態様において、鼻腔内送達配合物および方法は、同一濃度または同一量のペプチドYYを皮下注射により対象に投与した後の対象の血流または中枢神経系（CNS）組織または体液中のペプチドYYのピーク濃度（Cmax）より20%高い対象の血流またはCNS組織または体液中のペプチドYYのピーク濃度をもたらすことにより、血流またはCNS組織または体液へのペプチドYYの送達を促進する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも50μgのY2受容体結合アゴニストを含有する量を哺乳動物に経粘膜投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも5 pmoleまたはそれ以上高めることができる、経粘膜Y2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項２】
Y2受容体結合ペプチドが、ペプチドYY（PYY）、神経ペプチドＹ（NPY）および膵臓ペプチド（PP）よりなる群から選択される、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
さらに、下記よりなる群から選択される少なくとも１種類の粘膜送達促進剤を含む、請求項１および２に記載の配合物：
(a)可溶化剤；
(b)電荷調節剤；
(c)pH調整剤；
(d)分解酵素阻害剤；
(e)粘液溶解剤または粘液清澄剤；
(f)毛様体制止剤；
(g)下記のものから選択される膜透過促進剤：(i)界面活性剤、(ii)胆汁酸塩、(ii)リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソームもしくはキャリヤー、(iii)アルコール類、(iv)エナミン類、(v)NO供与化合物、(vi)長鎖両親媒性分子、(vii)低分子疎水性透過促進剤、(viii)ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、(ix)アセト酢酸のグリセロールエステル、(x)シクロデキストリンもしくはβ-シクロデキストリン誘導体、(xi)中鎖脂肪酸、(xii)キレート化剤、(xiii)アミノ酸もしくはその塩、(xiv)N-アセチルアミノ酸もしくはその塩、(xv)特定の膜成分に対して分解性の酵素、(ix)脂肪酸合成の阻害剤、(x)コレステロール合成の阻害剤；または(xi)(i)-(x)に挙げた膜透過促進剤のいずれかの組合わせ；
(h)上皮結合生理の調節剤；
(i)血管拡張剤；
(j)選択的輸送促進剤；および
(k)安定送達用のビヒクル、キャリヤー、支持体または複合体形成種。
【請求項４】
配合物が鼻腔内配合物である、請求項１に記載の配合物。
【請求項５】
配合物が、水およびY2受容体結合ペプチドを含む水性配合物である、請求項４に記載の配合物。
【請求項６】
Y2受容体結合ペプチドが、PYYペプチド、NPYペプチド、およびPPペプチドよりなる群から選択される、請求項５に記載の配合物。
【請求項７】
Y2受容体結合ペプチドがPYYペプチドであり、PYYペプチドがSEQ ID NO:1-21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の配合物。
【請求項８】
配合物がさらに少なくとも１種類の経粘膜送達剤を含む、請求項４、５、６および７に記載の配合物。
【請求項９】
経粘膜送達剤が下記よりなる群から選択される、請求項８に記載の配合物：
(a)可溶化剤；
(b)電荷調節剤；
(c)pH調整剤；
(d)分解酵素阻害剤；
(e)粘液溶解剤または粘液清澄剤；
(f)毛様体制止剤；
(g)下記のものから選択される膜透過促進剤：(i)界面活性剤、(ii)胆汁酸塩、(ii)リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソームもしくはキャリヤー、(iii)アルコール類、(iv)エナミン類、(v)NO供与化合物、(vi)長鎖両親媒性分子、(vii)低分子疎水性透過促進剤、(viii)ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、(ix)アセト酢酸のグリセロールエステル、(x)シクロデキストリンもしくはβ-シクロデキストリン誘導体、(xi)中鎖脂肪酸、(xii)キレート化剤、(xiii)アミノ酸もしくはその塩、(xiv)N-アセチルアミノ酸もしくはその塩、(xv)特定の膜成分に対して分解性の酵素、(ix)脂肪酸合成の阻害剤、(x)コレステロール合成の阻害剤；または(xi)(i)-(x)に挙げた膜透過促進剤のいずれかの組合わせ；
(h)上皮結合生理の調節剤；
(i)血管拡張剤；
(j)選択的輸送促進剤；および
(k)安定送達用のビヒクル、キャリヤー、支持体または複合体形成種。
【請求項１０】
配合物がさらに少なくとも２種類のポリオールを含む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１１】
ポリオールが乳糖およびソルビトールである、請求項１０に記載の配合物。
【請求項１２】
さらにキレート化剤を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１３】
キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、請求項１２に記載の配合物。
【請求項１４】
さらに可溶化剤を含む、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１５】
可溶化剤がシクロデキストリンである、請求項１４に記載の配合物。
【請求項１６】
さらに界面活性剤を含む、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１７】
界面活性剤がL-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）である、請求項１６に記載の配合物。
【請求項１８】
Y2受容体アゴニストがPYYペプチドである、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項１９】
PYYペプチドがSEQ ID NO:1-21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の配合物。
【請求項２０】
PYYペプチドがPYY3-36である、請求項１８に記載の配合物。
【請求項２１】
さらに可溶化剤を含む、請求項２０に記載の配合物。
【請求項２２】
可溶化剤がシクロデキストリンである、請求項２１に記載の配合物。
【請求項２３】
シクロデキストランがメチル-β-シクロデキストランである、請求項２２に記載の配合物。
【請求項２４】
配合物がさらに水を含む、請求項２０ないし２３のいずれか１項に記載の配合物。
【請求項２５】
配合物が約3-6のpHを有する、請求項２４に記載の配合物。
【請求項２６】
pHが5.0±0.3である、請求項２５に記載の配合物。
【請求項２７】
少なくとも50μgのPYYを含有する量を個体に鼻腔内投与した場合に、個体の血漿中のPYYの濃度を血漿1L当たり少なくとも5pmoleまたはそれ以上高めることができる、PYYペプチドを含む鼻腔内配合物。
【請求項２８】
さらに粘膜促進剤を含む、請求項２７に記載の鼻腔内配合物。
【請求項２９】
粘膜促進剤が下記よりなる群から選択される、請求項２８に記載の鼻腔内配合物：
(a)可溶化剤；
(b)電荷調節剤；
(c)pH調整剤；
(d)分解酵素阻害剤；
(e)粘液溶解剤または粘液清澄剤；
(f)毛様体制止剤；
(g)下記のものから選択される膜透過促進剤：(i)界面活性剤、(ii)胆汁酸塩、(ii)リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソームもしくはキャリヤー、(iii)アルコール類、(iv)エナミン類、(v)NO供与化合物、(vi)長鎖両親媒性分子、(vii)低分子疎水性透過促進剤、(viii)ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、(ix)アセト酢酸のグリセロールエステル、(x)シクロデキストリンもしくはβ-シクロデキストリン誘導体、(xi)中鎖脂肪酸、(xii)キレート化剤、(xiii)アミノ酸もしくはその塩、(xiv)N-アセチルアミノ酸もしくはその塩、(xv)特定の膜成分に対して分解性の酵素、(ix)脂肪酸合成の阻害剤、(x)コレステロール合成の阻害剤；または(xi)(i)-(x)に挙げた膜透過促進剤のいずれかの組合わせ；
(h)上皮結合生理の調節剤；
(i)血管拡張剤；
(j)選択的輸送促進剤；および
(k)安定送達用のビヒクル、キャリヤー、支持体または複合体形成種。
【請求項３０】
さらに少なくとも２種類のポリオールを含む、請求項２７ないし２９のいずれか１項に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３１】
２種類のポリオールが乳糖およびソルビトールである、請求項３０に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３２】
さらに可溶化剤を含む、請求項２７ないし３１のいずれか１項に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３３】
可溶化剤がシクロデキストリンである、請求項３２に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３４】
可溶化剤がメチル-β-シクロデキストリンである、請求項３３に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３５】
さらにキレート化剤を含む、請求項２７ないし３４のいずれか１項に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３６】
キレート化剤がEDTAである、請求項３５に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３７】
さらに界面活性剤を含む、請求項２７ないし３６のいずれか１項に記載の鼻腔内配合物。
【請求項３８】
界面活性剤がDDPCである、請求項３７に記載の鼻腔内PYY配合物。
【請求項３９】
配合物が水性配合物である、請求項２７ないし３８のいずれか１項に記載の鼻腔内配合物。
【請求項４０】
水性配合物が3-6のpHを有する、請求項３９に記載の鼻腔内PYY配合物。
【請求項４１】
pHが5.0±0.3である、請求項４０に記載の鼻腔内配合物。
【請求項４２】
PYYがPYY3-36（SEQ ID NO:2）である、請求項２７ないし４１のいずれか１項に記載の鼻腔内PYY配合物。
【請求項４３】
配合物が安定剤であるポリペプチドまたはタンパク質を実質的に含有しない、請求項２７ないし４２のいずれか１項に記載の鼻腔内PYY配合物。
【請求項４４】
少なくとも50μgのY2受容体結合アゴニストを含有する量を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、医薬が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも5 pmoleまたはそれ以上高めることができる、哺乳動物において肥満症の処置または減量誘発に用いる鼻腔内医薬の調製のためのY2受容体結合ペプチドの使用。
【請求項４５】
Y2受容体結合ペプチドが、ペプチドYY（PYY）、神経ペプチドY（NPY）および膵臓ペプチド（PP）よりなる群から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
Y2受容体結合ペプチドが、PYYペプチド、NPYペプチド、およびPPペプチドよりなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
Y2受容体結合ペプチドがPYYペプチドであり、PYYペプチドがSEQ ID NO:1-21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
医薬がさらに少なくとも１種類の経粘膜送達剤を含む、請求項４４、４５、４６および４７に記載の使用。
【請求項４９】
経粘膜送達剤が下記よりなる群から選択される、請求項４８に記載の使用：
(a)可溶化剤；
(b)電荷調節剤；
(c)pH調整剤；
(d)分解酵素阻害剤；
(e)粘液溶解剤または粘液清澄剤；
(f)毛様体制止剤；
(g)下記のものから選択される膜透過促進剤：(i)界面活性剤、(ii)胆汁酸塩、(ii)リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソームもしくはキャリヤー、(iii)アルコール類、(iv)エナミン類、(v)NO供与化合物、(vi)長鎖両親媒性分子、(vii)低分子疎水性透過促進剤、(viii)ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、(ix)アセト酢酸のグリセロールエステル、(x)シクロデキストリンもしくはβ-シクロデキストリン誘導体、(xi)中鎖脂肪酸、(xii)キレート化剤、(xiii)アミノ酸もしくはその塩、(xiv)N-アセチルアミノ酸もしくはその塩、(xv)特定の膜成分に対して分解性の酵素、(ix)脂肪酸合成の阻害剤、(x)コレステロール合成の阻害剤；または(xi)(i)-(x)に挙げた膜透過促進剤のいずれかの組合わせ；
(h)上皮結合生理の調節剤；
(i)血管拡張剤；
(j)選択的輸送促進剤；および
(k)安定送達用のビヒクル、キャリヤー、支持体または複合体形成種。
【請求項５０】
医薬がさらに少なくとも２種類のポリオールを含む、請求項４４ないし４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
ポリオールが乳糖およびソルビトールである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
医薬がさらにキレート化剤を含む、請求項４４ないし４９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（EDTA）である、請求項２２に記載の使用。
【請求項５４】
さらに可溶化剤を含む、請求項４４ないし５３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
可溶化剤がシクロデキストリンである、請求項５４に記載の使用。
【請求項５６】
医薬がさらに界面活性剤を含む、請求項４４ないし５５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５７】
界面活性剤がL-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）である、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
医薬中のY2受容体アゴニストがPYYペプチドである、請求項４４ないし５７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５９】
PYYペプチドがSEQ ID NO:1-21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
PYYペプチドがPYY3-36（SEQ ID NO:2）である、請求項５８に記載の使用。
【請求項６１】
医薬がさらに可溶化剤を含む、請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
可溶化剤がシクロデキストリンである、請求項６１に記載の使用。
【請求項６３】
シクロデキストランがメチル-β-シクロデキストランである、請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
医薬がさらに水を含む、請求項４４ないし６４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６５】
医薬が約3-6のpHを有する、請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
pHが5.0±0.3である、請求項６５に記載の使用。
【請求項６７】
哺乳動物における肥満症の処置または減量誘発または満腹感誘発のために50-800μgのY2受容体結合ペプチドを哺乳動物に投与する、請求項４４ないし６６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６８】
哺乳動物における肥満症の処置または減量誘発または満腹感誘発のために75-約400μgのY2受容体結合ペプチドを哺乳動物に投与する、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
哺乳動物における肥満症の処置または減量誘発または満腹感誘発のために100-約300μgのY2受容体結合ペプチドを哺乳動物に投与する、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
哺乳動物における肥満症の処置または減量誘発または満腹感誘発のために150-約200μgのY2受容体結合ペプチドを哺乳動物に投与する、請求項６９に記載の使用。
【請求項７１】
Y2受容体結合ペプチドが、PYYペプチド、NPYペプチドまたはPPペプチドである、請求項４４ないし７０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７２】
Y2受容体結合ペプチドがPYYペプチドである、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
PYYペプチドがSEQ ID NO:1-21よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
PYYペプチドがPYY3-36（SEQ ID NO:2）である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７５】
Y2受容体アゴニストがヒト配列であり、かつ哺乳動物がヒトである、請求項１ないし７５のいずれか１項に記載の配合物および使用。
【請求項７６】
Y2受容体結合ペプチド、水および可溶化剤を含み、配合物がポリペプチドまたはタンパク質である安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項７７】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項７６に記載の配合物。
【請求項８０】
さらに１種類以上のポリオールを含む、請求項７６に記載の水性配合物。
【請求項８１】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項８０に記載の水性配合物。
【請求項８２】
さらに界面活性剤およびキレート化剤を含む、請求項７６ないし８１のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項８３】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項８２に記載の水性配合物。
【請求項８４】
水、Y2受容体結合ペプチド、キレート化剤および１種類以上のポリオールを含み、配合物のpHが約3-約6.5であり、配合物がポリペプチドまたはタンパク質である安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項８５】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項８４に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項８６】
さらに可溶化剤を含む、請求項８４および８５に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項８７】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項８６に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項８８】
さらに界面活性剤を含む、請求項８４ないし８７のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項８９】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項８８に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９０】
Y2受容体結合ペプチド、水、キレート化剤および可溶化剤を含み、配合物が3.0-約6.5のpHを有し、配合物がポリペプチドまたはタンパク質である安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９１】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項９０に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９２】
さらに１種類以上のポリオールを含む、請求項９０および９１に記載の水性配合物。
【請求項９３】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項９２に記載の水性配合物。
【請求項９４】
Y2受容体結合ペプチド、水、キレート化剤および界面活性剤を含み、配合物が3.0-約6.5のpHを有し、配合物がポリペプチドまたはタンパク質である安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９５】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）、ラノリンアルコール、およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項９４に記載の水性配合物。
【請求項９６】
さらに可溶化剤を含む、請求項９４および９５に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９７】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項９６に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９８】
水、Y2受容体結合ペプチド、１種類以上のポリオールおよび界面活性剤を含み、配合物が約3.0-約6.5のpHを有し、配合物がポリペプチドまたはタンパク質である安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項９９】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項９８に記載の水性配合物。
【請求項１００】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ツウィーン80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）、ラノリンアルコール、およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項９８および９９に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０１】
さらに可溶化剤およびキレート化剤を含む、請求項９８ないし１０１のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０２】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項１０１に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０３】
水、Y2受容体結合ペプチド、１種類以上のポリオールおよび可溶化剤を含み、配合物が約3.0-約6.5のpHを有し、配合物がタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０４】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項１０３に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０５】
さらに界面活性剤およびキレート化剤を含む、請求項１０３および１０４に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０６】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項１０５に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０７】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項１０３ないし１０６のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０８】
水、Y2受容体結合ペプチド、可溶化剤および界面活性剤を含み、配合物が約3.0-約6.5のpHを有し、配合物がタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１０９】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項１０８に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１０】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項１０８および１０９に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１１】
さらに１種類以上のポリオールおよびキレート化剤を含む、請求項１０８ないし１１０のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１２】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項１１１に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１３】
水、Y2受容体結合ペプチド、可溶化剤、１種類以上のポリオールおよび界面活性剤を含み、配合物が約3.0-約6.5のpHを有する、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１４】
配合物が2種類のポリオール、およびキレート化剤を含む、請求項１１３に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１５】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項１１３および１１４に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１６】
ポリオールがソルビトールおよび乳糖である、請求項１１５に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１７】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項１１３ないし１１６のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１８】
可溶化剤がメチル-β-シクロデキストリンである、請求項１１７に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１１９】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項１１３ないし１１８のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２０】
界面活性剤がL-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）である、請求項１１９に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２１】
水、Y2受容体結合ペプチド、およびキレート化剤を含み、配合物が約3.0-約6.5のpHを有し、配合物がタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない、Y2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２２】
さらに可溶化剤を含む、請求項１２１に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２３】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項１２２に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２４】
さらに界面活性剤を含む、請求項１２１ないし１２３のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２５】
界面活性剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される、請求項１２４に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２６】
さらに１種類以上のポリオールを含む、請求項１２１ないし１２５のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２７】
ポリオールが、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される、請求項１２６に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２８】
キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはエチレングリコール四酢酸（EGTA）である、請求項１２１ないし１２７のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１２９】
Y2受容体結合ペプチドが、PYYペプチド、NPYペプチドまたはPPペプチドである、請求項７６ないし１２８のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１３０】
Y2受容体結合ペプチドがSEQ ID NO:1-21、SEQ ID NO:72、73および74、ならびにSEQ ID NO:90-104よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むPYYペプチドである、請求項１２９に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１３２】
PYYペプチドがPYY(3-36）ペプチドである、請求項１２９および１３０に記載の鼻腔内PYY配合物。
【請求項１３３】
PYY受容体結合ペプチドが、SEQ ID NO:2、3およびSEQ ID NO:90-105よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むPYY(3-36）ペプチドである、請求項１２９ないし１３２のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１３４】
エンドトキシンを含有しないY2受容体結合ペプチドを含む、非注入投与に適する医薬配合物。
【請求項１３５】
さらに、非注入投与用の粘膜送達促進用賦形剤を含む、請求項１３４に記載の配合物。
【請求項１３６】
Y2受容体結合ペプチドが、NPY、PPおよびPYYよりなる群から選択される、請求項７６に記載のY2受容体結合ペプチド水性配合物。
【請求項１３７】
ペプチドがPYY(3-36）ペプチドである、請求項７８に記載の配合物。
【請求項１３８】
非注入投与が鼻腔、口腔、腸、頬、気管支肺、膣、および／または直腸の粘膜表面による、請求項７７に記載の配合物。
【請求項１３９】
さらに、エンドトキシンを含有しないPYY約0.5mg/kg、および経口投与のための１種類以上の粘膜送達促進用賦形剤100-約200mg/kgを含む、請求項７６に記載の配合物。
【請求項１４０】
非注入投与が皮下注射、筋肉内注射および／または腹腔内注射による、請求項７６に記載の配合物。
【請求項１４１】
投与が経鼻である、請求項８０に記載の配合物。
【請求項１４２】
投与が経口である、請求項８０に記載の配合物。
【請求項１４３】
投与が肺内である、請求項８０に記載の配合物。
【請求項１４４】
１日１回、少なくとも10日間投与した後に最高2.5ポンドの減量を生じるのに十分な量の、エンドトキシンを含有しないY2受容体結合ペプチドを含む、医薬配合物。
【請求項１４５】
配合物が１回投与当たり約50-250μgの濃度のPYY3-36を含む、請求項８５に記載の配合物。
【請求項１４６】
投与が経鼻である、請求項８５に記載の配合物。
【請求項１４７】
Y2受容体結合ペプチドおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含み、該Y2受容体結合ペプチド配合物が、インビトロ組織透過アッセイにおいて水、塩化ナトリウム、緩衝剤およびY2受容体結合ペプチドからなる対照配合物より少なくとも1%高い透過率を有する、Y2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１４８】
配合物が、インビトロ組織透過アッセイにおいて水、塩化ナトリウム、緩衝剤およびY2受容体結合ペプチドからなる対照配合物より少なくとも2%高い透過率を有する、請求項１４７に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１４９】
配合物が、インビトロ組織透過アッセイにおいて水、塩化ナトリウム、緩衝剤およびY2受容体結合ペプチドからなる対照配合物より少なくとも3%高い透過率を有する、請求項１４７に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５０】
配合物が、インビトロ組織透過アッセイにおいて水、塩化ナトリウム、緩衝剤およびY2受容体結合ペプチドからなる対照配合物より少なくとも6%高い透過率を有する、請求項１４７に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５１】
Y2受容体結合配合物がさらに、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール、およびキレート化剤よりなる群から選択される少なくとも１種類の賦形剤を含む、請求項１４７ないし１５０のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５２】
界面活性剤が、ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）、ポリソルベート、ドデシルエーテル、ポリソルベート20、ポリソルベート80、PEG、セチルアルコール、PVP、PVA、ラノリンアルコール、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）およびモノオレイン酸ソルビタン、ならびにコール酸ナトリウムよりなる群から選択される、請求項１５１に記載の配合物。
【請求項１５３】
配合物が、Y2受容体結合ペプチド、水および少なくとも2種類のポリオールを含む、請求項１４７ないし１５２のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５４】
ポリオールが糖および糖アルコールを含む、請求項１５３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５５】
糖が乳糖であり、糖アルコールがソルビトールである、請求項１５４に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５６】
キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびエチレングリコール四酢酸（EGTA）よりなる群から選択される、請求項１５１ないし１５５のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５７】
可溶化剤が、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストランおよびメチル-β-シクロデキストリンよりなる群から選択される、請求項１５１ないし１５５のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５８】
配合物が3.0-約6.5のpHを有する、請求項１５１ないし１５５のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１５９】
Y2受容体結合ペプチドが、PYYペプチド、NPYペプチドまたはPPペプチドである、請求項１４７ないし１５８のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６０】
Y2受容体結合ペプチドが、SEQ ID NO:1-21、SEQ ID NO:72、73および74、ならびにSEQ ID NO:90-105よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むPYYペプチドである、請求項１４７ないし１５９のいずれか１項に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６１】
PYYペプチドがPYY(3-36）ペプチドである、請求項１５９および１６０に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６２】
PYY受容体結合ペプチドPYY(3-36）ペプチドが、SEQ ID NO:2、3およびSEQ ID NO:90-105よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６１に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６３】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも5pmoleまたはそれ以上高めることができる、Y2受容体結合ペプチドを含む経粘膜Y2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６４】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも10pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６５】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも20pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６６】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも40pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６７】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも60pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６８】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも80pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１６９】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも100pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１７０】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも120pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１７１】
100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、配合物が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも140pmoleまたはそれ以上高めることができる、請求項１６３に記載のY2受容体結合ペプチド配合物。
【請求項１７２】
哺乳動物がヒトである、請求項１６３ないし１７２いずれか１項に記載の配合物および使用。
【請求項１７３】
Y2受容体結合ペプチドをスプレー剤として投与し、該スプレー剤が10-100μmのサイズの液滴サイズを有し、100μLのスプレー剤をヒトに鼻腔内投与した場合に、該スプレー剤が哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも5pmole/L高めることができる、Y2受容体結合ペプチドを含む医薬の調製のための、Y2受容体結合ペプチドの使用。
【請求項１７４】
Y2受容体結合ペプチドをスプレー剤として投与し、該スプレー剤が10-100μmのサイズの液滴サイズを有し、100μLのスプレー剤をヒトに鼻腔内投与した場合に、該スプレー剤がが哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも10pmole/L高めることができる、Y2受容体結合ペプチドを含む医薬の調製のための、Y2受容体結合ペプチドの使用。
【請求項１７５】
Y2受容体結合ペプチドをスプレー剤として投与し、該スプレー剤が10-100μmのサイズの液滴サイズを有し、100μLのスプレー剤をヒトに鼻腔内投与した場合に、該スプレー剤がが哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも20pmole/L高めることができる、Y2受容体結合ペプチドを含む医薬の調製のための、Y2受容体結合ペプチドの使用。
【請求項１７６】
Y2受容体結合ペプチドをスプレー剤として投与し、該スプレー剤が10-100μmのサイズの液滴サイズを有し、100μLのスプレー剤をヒトに鼻腔内投与した場合に、該スプレー剤がが哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも30pmole/L高めることができる、Y2受容体結合ペプチドを含む医薬の調製のための、Y2受容体結合ペプチドの使用。
【請求項１７７】
Y2受容体結合ペプチドをスプレー剤として投与し、該スプレー剤が10-100μmのサイズの液滴サイズを有し、100μLのスプレー剤をヒトに鼻腔内投与した場合に、該スプレー剤がが哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも40pmole/L高めることができる、Y2受容体結合ペプチドを含む医薬の調製のための、Y2受容体結合ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
肥満症およびその関連障害は米国内および世界中で共通のきわめて重大な保健問題である。上半身肥満症は２型糖尿病について知られる最強リスク因子であり、かつ強い心血管疾患リスク因子である。肥満症は、高血圧症、アテローム硬化症、うっ血性心不全、卒中、胆嚢疾患、骨関節炎、睡眠無呼吸、生殖障害、たとえば多嚢胞卵巣症候群、胸部、前立腺および結腸の癌、ならびに全身麻酔の合併症の発生率増大について強いリスク因子であることが認められている。それは寿命を縮め、前記の疾患、ならびに感染症、静脈瘤、黒色表皮腫、湿疹、運動不耐症、インスリン抵抗性、高血圧性高コレステロール血症、胆石症、整形傷害、および血栓性疾患などの障害の併発の重大なリスクをもつ。肥満症は、インスリン抵抗性症候群、または”Ｘ症候群”と呼ばれる一群の症状のリスク因子でもある。
【０００２】
哺乳動物に末梢投与した場合にY2受容体に結合するあるペプチドが減量（体重減少）を誘発することが今回示された。これらのY2受容体結合ペプチドは、Y2受容体に結合する神経ペプチドである。神経ペプチドは、ペプチド作動性ニューロンおよび内分泌／傍分泌細胞により合成される大型前駆タンパク質に由来する低分子ペプチドである。しばしば、これらの前駆物質は多数の生物活性ペプチドを含む。一次遺伝子転写体のオータナティブスプライシングおよび前駆物質プロセシングの相異のため、脳には著しく多様な神経ペプチドがある。神経ペプチド受容体は、リガンドを識別し、適切なシグナルを活性化する作用をもつ。これらのY2受容体結合ペプチドは、ペプチドYY（PYY）、神経ペプチドＹ（NPY）および膵臓ペプチド（PP）を含むペプチドファミリーに属する。
【０００３】
NPYはアミノ酸36個のペプチドであり、哺乳動物の脳に最も多く存在することが確認された神経ペプチドである。NPYは、中枢神経系および末梢神経系の両方において重要な調節物質であり、精神運動活性、摂食、中枢内分泌、および心血管系における血管作用を含めた広範な生理的パラメーターに影響を及ぼす。高濃度のNPYが冠動脈、脳、および腎臓の血管に供給する交感神経中にみられ、血管収縮に関与するとされている。NPY結合部位は、脾臓、腸膜、脳、大動脈平滑筋、腎臓、精巣、および胎盤を含めた多様な組織中に同定されている。
【０００４】
神経ペプチドＹ（NPY）受容体の薬理作用は現在、膵臓ポリペプチドファミリー内での構造活性関係により定められる。このファミリーには、主にニューロンにおいて合成されるNPY；主に腸の内分泌細胞により合成されるPYY；および主に膵臓の内分泌細胞により合成されるPPが含まれる。これらのアミノ酸約36個のペプチドは、ペプチドの中央に”PP-フォールド”を伴う緻密ならせん構造をもつ。特別な特色には、残基1-8のポリプロリンヘリックス、残基9-14のβ−ターン、残基15-30のα-ヘリックス、残基30-36の外向き突出C-末端、およびカルボキシル末端アミド（生物活性に重要と思われる）が含まれる。これらのペプチドは、Y1、Y2、Y3、Y4およびY5として知られる少なくとも5種類の受容体サブタイプを決定するために用いられる。NPYによるY1受容体認識は、このペプチドのN-およびC-末端領域の両方が関与する；Pro34によるGln34の交換はかなり良好に耐容される。NPYによるY2受容体認識は主に、ペプチドの両親媒性α-ヘリックスの後にある4個のC-末端残基（Arg33-Gln34-Arg35-Tyr36-NH2）に依存する。Pro34によるGln34の交換は良好には耐容されない。Y1とY2を識別する重要な薬理学的特色のひとつは、Y2受容体（Y1受容体ではなく）がNPYペプチドのカルボキシル末端フラグメントNPY-(13-36)およびPYYフラグメントPYY22-36に対して高い親和性をもつという事実である。
【０００５】
ペプチドYY(1-36)[PYY(1-36)]と呼ばれるアミノ酸36個のペプチド
【０００６】
【化１】
2006516262.tif 000002
【０００７】
を注射により個体に末梢投与すると体重が減少し、したがって肥満症および関連疾患の治療に使用できることがが示された；Morley, J. Neuropsychobiology 21:22-30 (1989)。その後、この効果を発生させるためには、Y2受容体に結合したPYY、およびY2受容体へのY2アゴニストの結合が、炭水化物、タンパク質の摂取および食事量を低下させることが見いだされた；Leibowitz,S.F. et al. Peptides, 12:1251-1260 (1991)。PYYの別の分子形態は
【０００８】
【化２】
2006516262.tif 000003
【０００９】
である。このフラグメントは、ヒトおよびイヌの腸抽出物中の全PYY様免疫反応性の約40%、ならびに空腹状態の全血漿PYY免疫反応性の約36%を構成し、食後には50%をわずかに超える。これは、PYYのジペプチジルペプチダーゼ-IV（DPP4）開裂生成物であると思われる。PYY3-36は、報告によればY2およびY5受容体の選択的リガンドである。これらの受容体は、N-末端トランケートNPY類似体（すなわちそのC-末端フラグメント）を好むという点で薬理学的に特異であると思われる。残基22-36のみをもつPYYフラグメントがなおY2受容体に結合することも示された。しかし、このペプチドのカルボキシル末端のいずれが開裂しても、このペプチドはY2受容体への結合能を失う。したがってPYYアゴニストは、全長PYYの部分配列であって、視床下部の弓状核にあるY2受容体に結合できるペプチドである。以下において用語PYYは、全長PYYおよびY2受容体に結合するいずれかのPYYフラグメントを表わす。
【００１０】
PYYおよびPYY3-36を静脈内注入または注射により投与すると、ショックに際して起きる致命的な血圧低下、特にエンドトキシンにより起きるものを治療できること（USP 4,893, 343）、哺乳動物において潅流、非経口、静脈内もしくは皮下投与、および埋込みにより膵臓腫瘍の増殖を阻害できること（USP 5,574,010）、肥満症を治療できること（Morley, J. Neuropsychobiology 21:22-30 (1989)および米国特許出願20020141985）が知られている。有効量のPYYを非経口、経口、経鼻、直腸および局所経路で家畜またはヒトに投与して、ナトリウム依存性の共輸送栄養素の消化器吸収を増大させることにより対象の体重を増加させうるという主張もある（USP 5,912,227）。しかし、肥満症、および糖尿病を含めた関連疾患の処置のためには、投与様式は静脈内IV注入に限定され、PYY3-36を他の様式で投与するのに最適な有効配合物がない。これらの先行技術の教示からは、PYYまたはPYY(3-36)と賦形剤を組み合わせた粘膜送達（すなわち経鼻、頬、経口）を促進するように設計された配合物は提供されず、エンドトキシンを含有しない注入以外のY2受容体結合ペプチド配合物投与の有用性も教示されない。したがって、PYY3-36を投与するための配合物および方法の開発が要望されている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、個体において肥満症を処置し、満腹感を誘発し、個体において減量を促進し、糖尿病を予防または治療するために、Y2受容体結合ペプチド、たとえばPYY、膵臓ペプチド（PP）およびNPYを粘膜送達、特に鼻腔内送達するための新規かつ有効な方法および組成物の提供により、前記の要望を満たし、他の目的および利点を満たすものである。本発明のある態様においては、ある量のY2受容体アゴニストの配合物を鼻腔内投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも5pmol、好ましくは少なくとも10pmol高めることができるように、Y2受容体結合ペプチドを配合物中において哺乳動物粘膜に送達する。さらに好ましい配合物は、鼻腔内投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を10pmol、好ましくは20pmol高めることができる。150μgを哺乳動物に鼻腔内投与する場合、好ましい配合物は血漿1L当たり少なくとも40 pmol高めることができる。200μgのY2受容体結合ペプチドを鼻腔内投与すると、本発明の配合物は血漿1L当たり少なくとも80pmolのY2受容体結合ペプチド増加を誘発する。
【００１２】
好ましくは、Y2受容体結合ペプチドはPP、PYYまたはNPYペプチドであり、哺乳動物はヒトである。最も好ましい態様において、Y2受容体結合ペプチドはPYY、好ましくはPYY（3-36）であり、哺乳動物はヒトである。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも50μgのY2受容体結合アゴニストを含有する量を哺乳動物に投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも5pM高めることができる、Y2受容体結合ペプチド配合物に関する。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも100μgのY2受容体結合アゴニストを含有する量を哺乳動物に投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも20pM高めることができる、Y2受容体結合ペプチド配合物に関する。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも150μgのY2受容体結合アゴニストを含有する量を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも30pM高めることができる、Y2受容体結合ペプチド配合物に関する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも200μgのY2受容体結合アゴニストを含有する量を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも60pM高めることができる、Y2受容体結合ペプチド配合物に関する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００１７】
本発明はまた、配合物を安定化するポリペプチドまたはタンパク質を実質的に含有しない、鼻腔内Y2受容体アゴニスト配合物に関する。特に、好ましい配合物はアルブミンなどのタンパク質、およびコラーゲン由来のタンパク質、たとえばゼラチンを含有しない。
【００１８】
本発明の他の態様において、経粘膜Y2受容体結合ペプチド配合物は、Y2受容体結合ペプチド、水および可溶化剤を含み、3-6.5のpHをもつ。好ましい態様において、可溶化剤はシクロデキストリンである。
【００１９】
本発明の他の態様において、経粘膜Y2受容体結合ペプチド配合物は、Y2受容体結合ペプチド、水、可溶化剤、好ましくはシクロデキストリン、および少なくとも１種類のポリオール、好ましくは少なくとも2種類のポリオールを含む。他の態様において、配合物は下記のいずれかまたは全部を含有することができる：キレート化剤、界面活性剤および緩衝剤。
【００２０】
本発明の他の態様において、配合物は、Y2受容体結合ペプチド、水、キレート化剤および可溶化剤を含む。
本発明の他の態様において、配合物は、Y2受容体結合ペプチド、水およびキレート化剤を含み、3-6.5のpHをもつ。
【００２１】
本発明の他の態様において、配合物は、Y2受容体結合ペプチド、水、キレート化剤、および少なくとも１種類のポリオール、好ましくは少なくとも2種類のポリオールを含む。他の態様は、下記のうち１種類以上を含有することができる：界面活性剤、可溶化剤および緩衝剤。
【００２２】
本発明の他の態様において、配合物は、Y2受容体結合ペプチド、水、および少なくとも2種類のポリオール、たとえば乳糖およびソルビトールを含む。配合物に添加できる他の物質には、可溶化剤、キレート化剤、１種類以上の緩衝剤、および界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明の方法および組成物によるY2受容体結合ペプチドアゴニストの鼻腔内送達促進により、これらの薬剤を哺乳動物対象における多様な疾患および状態の処置に有効な医薬として利用できる。
【００２４】
本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質である安定剤を実質的に含有しない液体または脱水Y2受容体結合ペプチド配合物を提供することにより、この要望を満たす。液体PYY配合物は、水、PYY、および少なくとも１種類の下記よりなる群から選択される添加剤を含む：ポリオール、界面活性剤、可溶化剤およびキレート化剤。配合物のpHは、好ましくは3-約7.0、好ましくは4.5-約6.0、最も好ましくは約5.0±0.3である。
【００２５】
本発明の他の態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、ポリオールおよび界面活性剤を含む本発明のY2受容体結合水性配合物であり、この配合物は約3-約6.5のpHをもち、この配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００２６】
本発明の他の態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、ポリオールおよび可溶化剤を含むY2受容体結合ペプチド水性配合物であり、この配合物は約3.0-約6.5のpHをもち、この配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００２７】
本発明の他の態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、可溶化剤および界面活性剤を含むY2受容体結合ペプチド水性配合物であり、この配合物は約3.0-約6.5のpHをもち、この配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００２８】
本発明の他の態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、可溶化剤、ポリオールおよび界面活性剤を含むY2受容体結合ペプチド水性配合物であり、この配合物は約3.0-約6.5のpHをもち、この配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００２９】
本発明の他の態様においては、安定な水性配合物を脱水して、Y2受容体結合ペプチド、ならびにポリオール、界面活性剤、可溶化剤およびキレート化剤よりなる群から選択される少なくとも１種類の添加剤を含むY2受容体結合ペプチド脱水配合物を調製し、このY2受容体結合ペプチド脱水配合物は、タンパク質またはポリペプチドである安定剤、たとえばコラーゲン、またはコラーゲン由来のタンパク質、たとえばゼラチンを実質的に含有しない。脱水は、凍結乾燥、噴霧乾燥、塩誘導沈殿および乾燥、真空乾燥、回転蒸発、または超臨界CO2沈殿など多様な手段で実施できる。
【００３０】
１態様において、Y2受容体結合ペプチド脱水配合物はY2受容体結合ペプチド、ポリオールおよび可溶化剤を含み、この配合物はタンパク質である安定剤を実質的に含有しない。
他の態様において、Y2受容体結合ペプチド脱水配合物はY2受容体結合ペプチド、ポリオールおよび界面活性剤を含み、このY2受容体結合ペプチド配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００３１】
他の態様において、Y2受容体結合ペプチド脱水配合物はY2受容体結合ペプチド、界面活性剤および可溶化剤を含み、このY2受容体結合ペプチド配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００３２】
本発明の他の態様において、Y2受容体結合ペプチド脱水配合物はY2受容体結合ペプチド、ポリオール、界面活性剤および可溶化剤を含み、このY2受容体結合ペプチド配合物はタンパク質またはポリペプチドである安定剤を実質的に含有しない。
【００３３】
いかなる可溶化剤も使用できるが、好ましいものはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストラン、メチル-β-シクロデキストリンおよびキトサンよりなる群から選択される。
【００３４】
一般にポリオールは、乳糖、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、マンノースおよびマルトースならびにその誘導体および同族体よりなる群から選択される。
界面活性剤は、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）、ポリソルベート20（ツウィーン(Tween)20）、ポリソルベート80（Tween 80）、ポリエチレングリコール（PEG）、セチルアルコール、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリビニルアルコール（PVA）、ラノリンアルコール、およびモノオレイン酸ソルビタンよりなる群から選択される。
【００３５】
好ましい配合物において、Y2受容体結合ペプチド配合物はキレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）またはエチレングリコール四酢酸（EGTA）をも含む。微生物の増殖を阻害するために、保存剤、たとえばクロロブタノールまたは塩化ベンジルコニウムを配合物に添加することもできる。
【００３６】
pHは一般に緩衝剤、たとえばクエン酸ナトリウムとクエン酸、および酢酸ナトリウムと酢酸を用いて調整される。他の緩衝液は、酢酸と酢酸ナトリウム、またはコハク酸と水酸化ナトリウムである。
【００３７】
好ましいY2受容体結合ペプチドは、PYY、PPまたはNPYペプチド、好ましくはPYY（3-36）ペプチドである。
本発明は、Y2受容体結合ペプチドの濃度が0.1-15.0mg/mL、好ましくは1.0-2mg/mLであり、水溶液のpHが3.0-6.5、好ましくは約5.0±0.3である配合物をも含む。
【００３８】
本発明はさらに、ポリオールの濃度が約0.1-10%（w/v）であるY2受容体結合ペプチド配合物、さらにポリオールの濃度が約0.1-約3%（w/v）であるY2受容体結合ペプチド配合物を含む。
【００３９】
本発明は、界面活性剤の濃度が約0.00001-約5%（w/v）である配合物、さらに界面活性剤の濃度が約0.0002-約0.1%（w/v）である配合物をも含む。
本発明は、可溶化剤の濃度が1-10%（w/v）である配合物、さらに可溶化剤の濃度が2-5%（w/v）である配合物をも含む。
【００４０】
最終溶液を濾過し、当業者に周知の方法で凍結乾燥装置の製造業者の指示に従って凍結乾燥（freeze-dried, lyophilized）することができる。これにより、タンパク質である安定剤を実質的に含有しないY2受容体結合ペプチド脱水配合物が得られる。
【００４１】
本発明の他の態様において、Y2受容体結合ペプチド配合物はY2受容体結合ペプチドおよび医薬的に許容できるキャリヤーを含み、このY2受容体結合ペプチド配合物は、実施例2および7に示す経上皮電気抵抗アッセイにより測定して、水、塩化ナトリウム、緩衝剤およびY2受容体結合ペプチドからなる対照配合物より少なくとも1%、好ましくは少なくとも3%、最も好ましくは少なくとも6%高いインビトロ組織透過アッセイ透過率をもつ。好ましい態様において、Y2受容体結合ペプチド配合物はさらに、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール、およびキレート化剤よりなる群から選択される少なくとも１種類の賦形剤を含む。好ましくはY2受容体結合ペプチドはPYYペプチド、NPYペプチドまたはPPペプチドである。
【００４２】
本発明の他の好ましい態様においては、100μLの配合物を哺乳動物に鼻腔内投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度を血漿1L当たり少なくとも5、好ましくは10、20、40、60、80pmoleまたはそれ以上高めることができるY2受容体結合ペプチド配合物が提供される。
【００４３】
態様例において、本発明の促進された送達方法および組成物は、哺乳動物対象の肥満症および摂食障害を予防または治療するために、療法有効なY2受容体結合ペプチドアゴニスト粘膜送達を提供する。本発明の１態様においては、療法有効量のY2受容体結合ペプチドおよび本明細書に記載する１種類以上の鼻腔内送達促進剤を含む、鼻腔内投与に適する医薬配合物が提供される。この配合物は、哺乳動物対象において肥満症または摂食障害の発症または進行を阻止するための本発明の鼻粘膜送達方法に有効である。療法有効量のY2受容体結合ペプチドおよび１種類以上の鼻腔内送達促進剤を経鼻粘膜送達すると、対象においてY2受容体結合ペプチドアゴニストのレベルが上昇し、哺乳動物において摂食が阻害され、肥満症または摂食障害の症状が軽減する。
【００４４】
本発明の送達促進方法および組成物は、哺乳動物対象において多様な疾患および状態を予防または治療するための療法に有効なY2受容体結合ペプチド粘膜送達を提供する。Y2受容体結合ペプチドは多様な粘膜経路で、たとえばY2受容体結合ペプチドを鼻粘膜上皮、気管支もしくは肺の粘膜上皮、口腔頬表面、または口腔および小腸粘膜表面と接触させることにより投与できる。態様例において、本発明の方法および組成物は鼻腔内送達（たとえば鼻粘膜送達または鼻腔内粘膜送達）を目的とし、またはそのために配合される。
【００４５】
本発明の１態様においては、療法有効量のY2受容体結合ペプチドアゴニストおよび本明細書に記載する１種類以上の鼻腔内送達促進剤を含む、鼻腔内投与に適する医薬配合物が提供される。この配合物は、哺乳動物対象において肥満症、糖尿病、癌、または癌関連の栄養障害もしくは衰弱の発症または進行を阻止し、あるいは１種類以上の臨床的に周知の糖尿病症状を軽減し、またアルツハイマー病、結腸癌、結腸腺癌、膵臓癌、膵臓腺癌、胸部癌を処置するための本発明の鼻粘膜送達方法に有効である。
【００４６】
本発明の他の態様において、医薬配合物および方法は、Y2受容体結合ペプチドアゴニストをコハク酸ビタミンEと組み合わせて投与することを目的とする。コハク酸ビタミンEと組み合わせたY2受容体結合ペプチドアゴニストは、癌、たとえば結腸腺癌、膵臓腺癌または胸部癌の症状を軽減し、発症を阻止し、あるいはそれらの発症率および重症度を低下させるために投与できる。
【００４７】
本発明の他の態様において意外にも、エンドトキシンを含有しないY2受容体結合ペプチド、たとえばPYY（3-36）を使用すると、エンドトキシンを除去していないペプチドと比較して高い粘膜送達を生じることが見いだされた。したがって、エンドトキシンを含有しないY2受容体結合ペプチドを医薬配合物中に使用すると、粘膜送達、経鼻、経口、肺、膣、直腸などを含めた、注入以外の経路による投与が可能になる。
【００４８】
前記の本発明のY2受容体結合ペプチド粘膜配合物および製剤ならびに送達方法は、Y2受容体結合ペプチドを哺乳動物対象に送達するための改良された粘膜送達を提供する。これらの組成物および方法は、１種類以上のY2受容体結合ペプチドと１種類以上の粘膜送達促進剤との組合わせ配合物または併用投与を伴うことができる。これらの配合物および方法を達成するために選択される粘膜送達促進剤には下記のものが含まれる：(a)可溶化剤；(b)電荷調節剤；(c)pH調整剤；(d)分解酵素阻害剤；(e)粘液溶解剤または粘液清澄剤；(f)毛様体制止剤；(g)下記のものから選択される膜透過促進剤（たとえば(i)界面活性剤、(ii)胆汁酸塩、(ii)リン脂質もしくは脂肪酸添加剤、混合ミセル、リポソームもしくはキャリヤー、(iii)アルコール類、(iv)エナミン類、(v)NO供与化合物、(vi)長鎖両親媒性分子、(vii)低分子疎水性透過促進剤、(viii)ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、(ix)アセト酢酸のグリセロールエステル、(x)シクロデキストリンもしくはβ-シクロデキストリン誘導体、(xi)中鎖脂肪酸、(xii)キレート化剤、(xiii)アミノ酸もしくはその塩、(xiv)N-アセチルアミノ酸もしくはその塩、(xv)特定の膜成分に対して分解性の酵素、(ix)脂肪酸合成の阻害剤、(x)コレステロール合成の阻害剤；または(xi)(i)-(x)に挙げた膜透過促進剤のいずれかの組合わせ）；(h)上皮結合生理の調節剤、たとえば酸化窒素（NO）刺激剤、キトサンおよびキトサン誘導体；(i)血管拡張剤；(j)選択的輸送促進剤；および(k)安定送達用のビヒクル、キャリヤー、支持体または複合体形成種：それらとY2受容体結合ペプチドが効果的に結合、会合、内包、封入または接着して有効成分が安定化され、粘膜送達が促進される。
【００４９】
本発明の各種態様においては、ペプチドYYを前記の(a)-(k)に挙げた粘膜送達促進剤のうち1、2、3、4種類またはそれ以上と組合わせる。これらの粘膜送達促進剤を、医薬的に許容できる配合物または送達ビヒクル中において、単独で、または一緒にペプチドYYと混合し、あるいは他の方法で組み合わせることができる。本発明の教示によるペプチドYYと１種類以上の粘膜送達促進剤の配合物（所望により前記の(a)-(k)から選択される2種類以上の粘膜送達促進剤を含む）は、ペプチドYYを哺乳動物対象の粘膜表面へ送達した後のペプチドYYの生物学的利用能を増大させる。
【００５０】
したがって本発明は、哺乳動物において食欲を抑制し、減量を促進し、摂食を減少させ、あるいは肥満症および／または糖尿病を処置する方法であって、少なくとも50μgのY2受容体を哺乳動物に経粘膜投与した場合に、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度が血漿1L当たり少なくとも5pmol、好ましくは少なくとも10pmol高まるように、Y2受容体結合ペプチドを含む配合物を経粘膜投与することを含む方法である。そのような配合物の例を前記に述べた。
【００５１】
本発明はさらに、哺乳動物において食欲を抑制し、減量を促進し、摂食を減少させ、または肥満症を処置するのに用いるY2受容体結合ペプチド経粘膜投与用医薬の調製のための、Y2受容体結合ペプチドの使用を提供する。これにより、約50μgのY2受容体を哺乳動物に経粘膜投与した場合、哺乳動物の血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度が血漿1L当たり少なくとも5pmol上昇する。100μgのY2受容体結合ペプチドを哺乳動物に鼻腔内投与した場合、哺乳動物の血漿中のY2受容体アゴニストの濃度が血漿1L当たり少なくとも20pmol上昇する。150μgを投与した場合、濃度。
【００５２】
本発明の医薬配合物中のペプチドYYの粘膜有効量は、たとえば約0.001-約100pmol/kg体重、約0.01-約10pmol/kg体重、または約0.1-約5pmol/kg体重を含む。他の態様例において、ペプチドYYの投与量は約0.5-約1.0pmol/kg体重である。好ましい態様において、鼻腔内投与量は50-400μg、好ましくは100-200μg、最も好ましくは100-150μgであろう。本発明の医薬配合物は、１日１回以上（たとえば食前）、または週3回もしくは週１回を、１週間ないし少なくとも96週間、または個々の患者もしくは対象の生涯にわたってすら投与できる。ある態様において、本発明の医薬配合物は、１日１回以上、１日2回、１日4回、１日6回、１日8回、投与される。
【００５３】
鼻粘膜表面内への、またはそれを通したペプチドYYの送達を促進する鼻腔内送達促進剤を用いる。受動的に吸収される薬物について、薬物輸送に対する傍細胞および経細胞経路の相対的な関与は、薬物のpKa、分配係数、分子半径および電荷、薬物が送達される管腔環境、ならびに吸収表面の面積に依存する。本発明の鼻腔内送達促進剤は、pH調整剤であってもよい。本発明の医薬配合物のpHは、薬物輸送に対する傍細胞および経細胞経路によるペプチドYYの吸収に影響を及ぼす要因である。１態様においては、本発明の医薬配合物を約pH3.0-6.5にpH調整する。他の態様においては、本発明の医薬配合物を約pH3.0-5.0にpH調整する。さらに他の態様においては、本発明の医薬配合物を約pH4.0-5.0にpH調整する。一般にpHは5.0±0.3である。
【発明の詳細な記載】
【００５４】
前記のように本発明は、哺乳動物対象に多様な疾患および状態の治療または予防のためにY2受容体結合ペプチドを粘膜送達する、改良された方法および組成物を提供する。本発明方法による治療および予防に適した哺乳動物の例には、ヒトおよびヒト以外の霊長類、家畜種、たとえばウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギ、ならびに研究用の種および愛玩種、たとえばイヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモットおよびウサギが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明をより良く理解するために下記の定義を示す。
Y2受容体結合ペプチド
本発明の粘膜配合物に使用するY2受容体結合ペプチドには、膵臓ポリペプチドファミリーが含まれる。本明細書中で用いるものは、3種類の天然の生物活性ペプチドファミリー、PP、NPYおよびPYYを含む。Y2受容体結合ペプチドの例およびそれらの使用は下記に記載されている：
【００５６】
【化３】
2006516262.tif 000004
【００５７】
本発明によれば、Y2受容体結合ペプチドには、遊離塩基、酸付加塩、または金属塩、たとえばカリウム塩もしくはナトリウム塩、またはアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化および環化（USP 6,093,692およびUSP 6,225,445）ならびにペジル化（pegylation）により修飾されたペプチドY2受容体結合ペプチドが含まれる。
【００５８】
ペプチドYYアゴニスト
本明細書中で用いる用語”PYY”は、天然、合成または組換えなどあらゆる供給源に由来する、天然配列のPYY（1-36）またはその変異体、ならびにPYYの誘導体、フラグメント、および類似体を表わす。PYYは、PYY配列の少なくとも最後の15個のアミノ酸残基、PYY（22-36）（SEQ ID NO:3）またはその類似体を含まなければならない。使用できる他のPYYペプチドは下記のものである：
【００５９】
【化４】
2006516262.tif 000005
【００６０】
これらのペプチドは一般に脳その他の部位のＹ受容体、特にY2および／またはY5受容体に結合する。一般にこれらのペプチドはエンドトキシンを含有しない形または発熱物質を含有しない形で合成されるが、必ずしもその必要はない。
【００６１】
他のPYYペプチドには、保存的アミノ酸残基変化、たとえば下記を含めたPYYペプチドの部位特異的変異がなされたPYYが含まれる：
【００６２】
【化５】
2006516262.tif 000006
【００６３】
他のPYYペプチドには、下記を含めた少なくとも2個の保存的アミノ酸残基を変化させたペプチドが含まれる：
【００６４】
【化６】
2006516262.tif 000007
【００６５】
PYYの類似体、たとえば下記に開示されるものも含まれる：USP 5,604,203および5,574, 010；Balasubramaniam, et al., Peptide Research 1:32 (1988)；特願平2-2,225,497；Balasubramaniam, et al., Peptides 14:1011,1993；Grandt, et al.,Reg.Peptides 51:151,(1994)；PCT国際特許出願94/03380、USP 5,604,203および5,574,010。これらのペプチドは一般に脳その他の部位のＹ受容体、特にY2および／またはY5受容体に結合する。一般にこれらのペプチドはエンドトキシンを含有しない形または発熱物質を含有しない形で合成されるが、必ずしもその必要はない。
【００６６】
PYYアゴニストには下記のものが含まれる：ヒトに対応するラットPYY（SEQ ID NO:72）およびアミノ末端トランケート形、ヒトに対応するブタPYY（SEQ ID NO:73）およびアミノ末端トランケート形、ならびにヒトに対応するモルモットPYY（SEQ ID NO:74）およびアミノ末端トランケート形。
【００６７】
本発明によれば、PYYペプチドには、ペプチドの遊離塩基、酸付加塩、または金属塩、たとえばカリウム塩もしくはナトリウム塩、ならびにアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化および他の周知の共有結合修飾法により修飾されたPYYペプチドが含まれる。これらのペプチドは一般に脳その他の部位のＹ受容体、特にY2および／またはY5受容体に結合する。一般にこれらのペプチドはエンドトキシンを含有しない形または発熱物質を含有しない形で合成されるが、必ずしもその必要はない。
【００６８】
神経ペプチドＹアゴニスト
NPYは他のY2受容体結合ペプチドである。NPYには全長NPY（1-36）（SEQ ID NO:22）、およびNPY（1-36）のアミノ末端がトランケートしたフラグメントが含まれる。Y2受容体結合に有効であるためには、NPYアゴニストはカルボキシル末端の少なくとも11個のアミノ酸残基をもたなければならない：すなわちNPY（26-36）（SEQ ID NO:23）を含む。Y2受容体に結合するNPYアゴニストの他の例は下記のものである：
【００６９】
【化７】
2006516262.tif 000008
【００７０】
他のNPYアゴニストには下記のものが含まれる：ヒト形と同様なラットNPY（SEQ ID NO:75）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY（26-36）まで、ヒト形と同様なウサギNPY（SEQ ID NO:76）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY（26-36）まで、ヒト形と同様なイヌNPY（SEQ ID NO:77）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY（26-36）まで、ヒト形と同様なブタNPY（SEQ ID NO:78）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY（26-36）まで、ヒト形と同様なウシNPY（SEQ ID NO:79）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY26-36まで、ヒト形と同様なヒツジNPY（SEQ ID NO:80）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY（26-36）まで、ならびにヒト形と同様なモルモットNPY（SEQ 81）およびアミノ末端トランケート形NPY（3-36）からNPY（26-36）まで。
【００７１】
本発明によれば、NPYペプチドには、ペプチドの遊離塩基、酸付加塩、または金属塩、たとえばカリウム塩もしくはナトリウム塩、ならびにアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化および他の既知の共有結合修飾法により修飾されたNPYペプチドが含まれる。これらのペプチドは一般に脳その他の部位のＹ受容体、特にY2および／またはY5受容体に結合する。一般にこれらのペプチドはエンドトキシンを含有しない形または発熱物質を含有しない形で合成されるが、必ずしもその必要はない。
【００７２】
膵臓ペプチド
膵臓ペプチド（PP）およびPPアゴニストもY2受容体に結合する。PPアゴニストの例は、全長PP（1-36）（SEQ ID NO:47）、およびアミノ末端がトランケートした多数のPPフラグメントである。Y2受容体に結合するためには、PPアゴニストはカルボキシル末端の少なくとも11個のアミノ酸残基をもたなければならない：PP（26-36）（SEQ ID NO:48）。Y2受容体に結合するPPアゴニストの他の例は下記のものである：
【００７３】
【化８】
2006516262.tif 000009
【００７４】
他のPPアゴニストには下記のものが含まれる：ヒト形と同様なヒツジPP（SEQ ID NO:82）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ヒト形と同様なブタPP（SEQ ID NO:83）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ヒト形と同様なイヌPP（SEQ ID NO:84）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ヒト形と同様なネコPP（SEQ ID NO:85）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ヒト形と同様なウシPP（SEQ ID NO:86）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ヒト形と同様なラットPP（SEQ ID NO:87）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ヒト形と同様なマウスPP（SEQ ID NO:88）およびアミノ末端トランケート形PP（3-36）からPP（26-36）まで、ならびにモルモットPP（SEQ ID NO:89）。
【００７５】
本発明によれば、PPペプチドには、ペプチドの遊離塩基、酸付加塩、または金属塩、たとえばカリウム塩もしくはナトリウム塩、ならびにアミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化および他の既知の共有結合修飾法により修飾されたPPペプチドが含まれる。これらのペプチドは一般に脳その他の部位のＹ受容体、特にY2および／またはY5受容体に結合する。一般にこれらのペプチドはエンドトキシンを含有しない形または発熱物質を含有しない形で合成されるが、必ずしもその必要はない。
【００７６】
粘膜送達促進剤
”粘膜送達促進剤（mucosal delivery enhancing agent）”は、化学物質その他の賦形剤であって、水、塩類および／または一般的な緩衝剤、ならびにY2受容体結合ペプチドからなる配合物（対照配合物）に添加した場合に、血液、血清または脳脊髄液中の最大濃度（Cmax）により測定した、あるいは濃度対時間のプロットの曲線下面積（AUC）により測定した、粘膜を通るY2受容体結合ペプチドの輸送が有意に増大した配合物を生成するものと定義される。粘膜には、鼻腔、口腔、腸、頬、気管支肺、膣、および／または直腸の粘膜表面、ならびに体外と連絡する体腔または管路を内張りする粘液分泌膜が実際上すべて含まれる。粘膜送達促進剤は、時にはキャリヤーと呼ばれる。
【００７７】
エンドトキシンを含有しない配合物
”エンドトキシンを含有しない配合物”とは、Y2受容体結合ペプチドおよび１種類以上の粘膜送達促進剤を含有する配合物であって、エンドトキシンおよび／または関連の発熱物質を実質的に含有しないものを意味する。エンドトキシンには、微生物の内部に限定され、微生物が破壊されるか、または死んだ場合にのみ放出される毒素が含まれる。発熱物質には、細菌その他の微生物の外膜に由来する発熱誘発性の熱安定性物質（糖タンパク質）が含まれる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与された場合に発熱、血圧低下およびショックを引き起こす可能性がある。エンドトキシンを含有しない配合物を調製するには特殊な装置、熟練した専門家が必要であり、エンドトキシンを含有しない配合物ではない配合物を調製するより著しく経費がかかる可能性がある。げっ歯類にNPYまたはPYYをエンドトキシン注入と同時に静脈内投与すると、エンドトキシン単独の投与に伴う血圧低下、さらには死亡が阻止されるので（USP 4,839,343）、非経口以外の（注射以外の）投与についてはエンドトキシンを含有しないこれらの療法薬の配合物が必ずしも必要とは考えられない。
【００７８】
非注入投与
”非注入投与”とは、動脈内または静脈内への直接注入を伴わないいずれかの送達方法、すなわち注射針、注射器または他の侵襲的方法で（一般に液体を）いずれかの部位に押し込むかまたは誘導する、特に身体部分に導入する送達方法方法を意味する。非注入投与には、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、および粘膜への注射以外の送達方法が含まれる。
【００７９】
肥満症の治療および予防
前記のように、本発明は哺乳動物対象において肥満症を予防および治療するためにY2受容体結合ペプチドを鼻粘膜送達するのに有用な改良された方法および組成物を提供する。本明細書中で用いる肥満症の予防および治療とは、食事中の摂食量を減らし、および／または投与期間中に体重を減少させ、または減量後の減少した体重もしくは体重増加が起きる以前の体重を維持することにより、臨床的肥満症の発症を阻止し、または発症率もしくは重症度を低下させることを意味する。
【００８０】
本発明は、哺乳動物対象において肥満症を予防および治療するために、Y2受容体結合ペプチドを脳の領域、たとえば視床下部またはプロオピオメラノコルチン（POMC）およびNPY弓状ニューロンへ鼻粘膜送達するのに有用な改良された方法および組成物を提供する。Y2受容体結合ペプチドをY1受容体アンタゴニスト、たとえばジヒドロピリジンと一緒に投与してもよい。
【００８１】
送達の方法および組成物
哺乳動物対象にY2受容体結合ペプチドを粘膜投与するための改良された方法および組成物により、Y2受容体結合ペプチド投与計画が最適化される。本発明は、１種類以上の粘膜送達促進剤と配合したY2受容体結合ペプチドの粘膜送達を提供し、その際、投与したY2受容体結合ペプチドの放出は、粘膜投与後ほぼ0.1-2.0時間；0.4-1.5時間；0.7-1.5時間；または0.8-1.0時間にわたるY2受容体結合ペプチドの有効送達期間中、実質的に正規化および／または持続する。達成されるY2受容体結合ペプチドの持続放出は、本発明の方法および組成物による外因性Y2受容体結合ペプチドの反復投与により促進することができる。
【００８２】
持続放出のための組成物および方法
哺乳動物対象にY2受容体結合ペプチドを粘膜投与するための改良された組成物および方法により、Y2受容体結合ペプチド投与計画が最適化される。本発明は、Y2受容体結合ペプチドを１種類以上の粘膜送達促進剤および場合により持続放出促進剤（１種類以上）と組み合わせて含む配合物の改良された粘膜（たとえば鼻）送達を提供する。本発明の粘膜送達促進剤により送達が効果的に増大し、たとえば最大血漿中濃度（Cmax）が上昇して、粘膜投与したY2受容体結合ペプチドの療法活性が増大する。血漿中およびCNS中のY2受容体結合ペプチドの療法活性に影響を及ぼす第2の要因は、滞留時間（RT）である。持続放出促進剤を鼻腔内送達促進剤と組み合わせると、Y2受容体結合ペプチドのCmaxが上昇し、滞留時間（RT）が延長される。持続放出促進配合物を与えるポリマー系の送達ビヒクル、たとえばポリエチレングリコール（PEG）および他の物質ならびに本発明方法を、本明細書に開示する。本発明は、哺乳動物対象における肥満症、結腸癌、膵臓癌または胸部癌に関連する症状を処置するための改良されたY2受容体結合ペプチド送達方法および剤形を提供する。
【００８３】
本発明の粘膜送達配合物および方法において、Y2受容体結合ペプチドはしばしば粘膜送達に適したキャリヤーまたはビヒクルと組み合わせて、または協調して投与される。本明細書中で用いる用語”キャリヤー”は、医薬的に許容できる固体または液状の充填剤、希釈剤または封入剤を意味する。水を含有する液体キャリヤーは、医薬的に許容できる添加剤、たとえば酸性化剤、アルカリ化剤、抗微生物性保存剤、酸化防止剤、緩衝剤、キレート化剤、複合体形成剤、可溶化剤、保湿剤、溶剤、沈殿防止剤および／または増粘剤、張性剤、湿潤剤または他の生体適合性物質を含有できる。前記カテゴリーに挙げた成分の一覧は米国薬局方U.S. Pharmacopeia National Formulary, 1857-1859,(1990)にある。医薬的に許容できるキャリヤーとして使用できる物質の若干例は下記のものである：糖類、たとえば乳糖、グルコースおよびショ糖；デンプン、たとえばトウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン；セルロースおよびその誘導体、たとえばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、たとえばカカオ脂および坐剤ろう；油類、たとえばラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；グリコール類、たとえばプロピレングリコール；ポリオール、たとえばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、たとえばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、たとえば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質を含有しない水；等張塩類溶液；リンゲル液、エチルアルコールおよびリン酸緩衝液、ならびに医薬配合物に用いられる他の無毒性の適合性物質。湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、たとえばラウリン硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤および香料、保存剤ならびに酸化防止剤が、配合者の要望に従って組成物中に存在してもよい。医薬的に許容できる酸化防止剤の例には、水溶性酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；油溶性酸化防止剤、たとえばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど；ならびに金属キレート化剤、たとえばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。キャリヤー物質と組み合わせて単一剤形を製造しうる有効成分の量は、個々の投与様式に応じて異なるであろう。
【００８４】
本発明の粘膜送達用の組成物および方法には、粘膜表面内への、またはそれを通したY2受容体結合ペプチドの送達を促進する多様な送達促進剤が用いられる。これに関して、粘膜上皮を通したY2受容体結合ペプチドの送達は、”経細胞”または”傍細胞”で起きる可能性がある。これらの経路がY2受容体結合ペプチドの全体的な流入および生物学的利用能に寄与する程度は、粘膜の環境、活性物質の物理化学的特性、および粘膜上皮の特性に依存する。傍細胞輸送経路は、受動拡散のみを伴うのに対し、経細胞輸送は受動、促進または能動プロセスにより起きる可能性がある。一般に、親水性の受動輸送される極性溶質は傍細胞経路で拡散し、一方、より親油性の溶質は経細胞経路を使う。受動吸収および能動吸収される多様な溶質の吸収および生物学的利用能（たとえば透過係数または生理学的アッセイに反映される）は、本発明に含まれるいかなる特定のY2受容体結合ペプチドについても、傍細胞性および経細胞性両方の送達成分に関して容易に評価できる。受動吸収される薬物について、薬物輸送の傍細胞経路および経細胞経路の相対的寄与は、薬物のpKa、分配係数、分子半径および電荷、薬物が送達される管腔環境、ならびに吸収表面の面積に依存する。傍細胞経路は、鼻粘膜上皮の到達可能な表面積のうち比較的小さな部分である。一般に細胞膜は、傍細胞空間が占めるものより1000倍大きな粘膜表面積を占めると報告されている。したがって、到達可能な面積がより小さく、サイズおよび電荷に基づいて高分子透過と区別されることから、傍細胞経路は一般に経細胞送達より優位でないことが示唆される。意外にも本発明の方法および組成物は、傍細胞経路による粘膜上皮内への、およびそれを通した生物療法薬の輸送を有意に増大させる。したがって、本発明の方法および組成物は、傍細胞経路と経細胞経路の両方をいずれか単一の方法または組成物でターゲティングできる。
【００８５】
本明細書中で用いる”粘膜送達促進剤”には、Y2受容体結合ペプチドまたは他の生物活性化合物（１以上）の放出または溶解度（たとえば配合物送達ビヒクルからの）、拡散速度、透過容量およびタイミング、取込み、滞留時間、安定性、有効半減期、ピーク濃度または持続濃度レベル、クリアランスおよび目的とする他の粘膜送達特性（たとえば送達部位、または選択した送達ターゲット部位、たとえば血流もしくは中枢神経系において測定したもの）を増大させる物質が含まれる。したがって、粘膜送達の増大は、多様な機序のいずれかにより起きる：たとえばY2受容体結合ペプチドの拡散、輸送、持続性または安定性の増大、膜流動性の増大、細胞内透過または傍細胞透過を調節するカルシウムその他のイオンの利用能または作用の調節、粘液成分（たとえば脂質）の可溶化、粘膜組織の非タンパク質およびタンパク質スルフヒドリルレベルの変化、粘膜表面を通した水の流入の増大、上皮結合生理の調節、粘膜上皮を覆う粘液の粘度低下、粘膜毛様体クリアランス速度の低下、ならびに他の機序。
【００８６】
本明細書中で用いる”粘膜有効量のY2受容体結合ペプチド”には、多様な送達または輸送経路を伴った、対象の薬物活性ターゲット部位へのY2受容体結合ペプチドの有効な粘膜送達が考慮される。たとえばある活性物質は粘膜細胞間でのクリアランスにより前進して隣接する血管壁に到達し、一方、この物質は他の経路によって受動的または能動的に粘膜細胞内へ取り込まれてそれらの細胞内で作用し、あるいはそれらの細胞から排出または輸送されて二次ターゲット部位、たとえば全身循環に到達するであろう。本発明の方法および組成物は、そのような別個の経路のうち１以上による活性物質のトランスロケーションを促進し、あるいは粘膜組織または近接する血管組織に直接作用して活性物質（１以上）の吸収または透過を促進するることができる。これに関して吸収または透過の促進は、これらの機序に限定されない。
【００８７】
本明細書中で用いる”血漿中のY2受容体結合ペプチドのピーク濃度（Cmax）”、”血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度-対-時間曲線下面積（AUC）”、”血漿中のY2受容体結合ペプチドの最大血漿中濃度に到達するまでの時間（tmax）”は、当業者に既知の薬物動態パラメーターである。Laursen et al.,Eur. J.Endocrinology, 135:309-315, 1996。”濃度-対-時間曲線”は、対象の血清中におけるY2受容体結合ペプチドの濃度を、その対象にY2受容体結合ペプチドを鼻腔内、筋肉内、皮下、または他の非経口投与経路で投与した後の時間に対して測定する。”（Cmax）”は、１回量のY2受容体結合ペプチドを対象に投与した後の対象の血清中におけるY2受容体結合ペプチドの最大濃度である。”（tmax）”は、１回量のY2受容体結合ペプチドを対象に投与した後の対象の血清中におけるY2受容体結合ペプチドの最大濃度に到達するまでの時間である。
【００８８】
本明細書中で用いる”血漿中のY2受容体結合ペプチドの濃度-対-時間曲線下面積（AUC）”は、直線台形則に従い、残部面積を加算して計算される。2つの投与間の23%の減少または30%の増加が90%の確率で検出される（タイプII誤差＝10%）。”送達速度”または”吸収速度”は、最大濃度（Cmax）に到達するまでの時間（tmax）の比較により推定される。Cmaxおよびtmaxは両方とも、非パラメーター法により分析される。筋肉内、皮下、静脈内および鼻腔内へのY2受容体結合ペプチド投与の薬物動態比較を、分散分析（ANOVA）により実施した。対比較のために、ベンフェロニ-ホームズ逐次法（Benferroni-Holmes sequential procedure）を用いて有意性を比較した。3つの鼻腔投与量間の用量-応答関係を、回帰分析により推定した。P<0.05を有意とみなした。結果を平均+/- SEMとして示す。
【００８９】
吸収促進の機序は本発明の粘膜送達促進剤が異なるのに伴って変化する可能性はあるが、これに関して有用な物質は粘膜組織に有害な影響を及ぼさないものであり、個々のY2受容体結合ペプチドまたは他の活性物質もしくは送達促進剤の物理化学的特性に従って選択されるであろう。これに関して、粘膜組織の浸透性または透過性を増大させる送達促進剤は、しばしば粘膜の防御透過バリヤーをある程度変化させるであろう。本発明に有用なそのような送達促進剤について、一般に粘膜透過性の有意のいかなる変化も、目的とする薬物送達期間に適した時間枠内で可逆的であることが望ましい。さらに、長期使用に伴って実質的な累積毒性があってはならず、粘膜のバリヤー特性に永久的な劣化性変化も誘発されるべきではない。
【００９０】
本発明のある態様において、本発明のY2受容体結合ペプチドとの協調投与（coordinate administration）または組合わせ配合物（combinatorial formulation）のための吸収促進剤は、親水性の低分子から選択され、これにはジメチルスルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド、エタノール、プロピレングリコール、および2-ピロリジノンが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、長鎖両親媒性分子、たとえばデアシルメチルスルホキシド、アゾン、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸、および胆汁酸塩を用いてY2受容体結合ペプチドの粘膜透過を増大させることができる。他の態様においては、界面活性剤（たとえばポリソルベート）を補助化合物、加工剤または配合物添加剤として用いて、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内送達を増大させる。DMSO、ポリエチレングリコールおよびエタノールなどの物質が十分に高い濃度で送達環境に存在すると（たとえば前投与、または療法用配合物に含有させることにより）、これらは粘膜の水相に進入してその可溶化特性を変化させ、これによりビヒクルから粘膜へのY2受容体結合ペプチドの分配が増大する。
【００９１】
本発明の協調投与および加工方法ならびに組合わせ配合物に有用な他の粘膜送達促進剤には、下記のものが含まれるが、これらに限定されない：混合ミセル；エナミン類；酸化窒素供与剤（たとえばS-ニトロソ-N-アセチルペニシラミン、NOR1、NOR4--これらは好ましくはNOスカベンジャー、たとえばカルボキシ-PITOまたはドクロフェナク（doclofenac）ナトリウムと共投与される）；サリチル酸ナトリウム；アセト酢酸のグリセロールエステル（たとえばグリセリル-1,3-ジアセトアセテートまたは1,2-イソプロピリデングリセリン-3-アセトアセテート）；および粘膜送達に生理的に適合する他の放出-拡散または上皮内透過もしくは経上皮透過の促進剤。他の吸収促進剤は、Y2受容体結合ペプチドの粘膜送達、安定性、活性または経上皮透過を増大させる多様なキャリヤー、基剤および賦形剤から選択される。これらには、特にシクロデキストリンおよびβ-シクロデキストリン誘導体（たとえば2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンおよびヘプタキス(2,6-ジ-O-メチル-β-シクロデキストリン）が含まれる。所望により１種類以上の有効成分とコンジュゲートさせ、さらに所望により油脂性基剤中に配合したこれらの化合物は、本発明の粘膜配合物中における生物学的利用能を増大させる。粘膜送達に適したさらに他の吸収促進剤には中鎖脂肪酸が含まれ、これにはモノ-およびジグリセリド（たとえばカプリン酸ナトリウム--ヤシ油の抽出物、Capmul）、およびトリグリセリド（たとえばアミロデキストリン、Estaram 299、Miglyol 810）が含まれる。
【００９２】
治療および予防用の本発明の粘膜用組成物に、粘膜バリヤーを通したY2受容体結合ペプチドの吸収、拡散または透過を促進するいずれか適切な透過促進剤を補充できる。透過促進剤は、医薬的に許容できるいかなる促進剤であってもよい。したがって、より詳細な本発明組成物の態様においては、下記のものから選択される１種類以上の透過促進剤を含有する組成物が提供される：サリチル酸ナトリウムおよびサリチル酸誘導体（たとえばアセチルサリチル酸、コリンサリチル酸、サリチルアミドなど）；アミノ酸およびその塩類（たとえばモノアミノカルボン酸、たとえばグリシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリンなど；ヒドロキシアミノ酸、たとえばセリン；酸性アミノ酸、たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸など；および塩基性アミノ酸、たとえばリシンなど--それらのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩を含む）；ならびにN-アセチルアミノ酸（N-アセチルアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、N-アセチルセリン、N-アセチルグリシン、N-アセチルリシン、N-アセチルグルタミン酸、N-アセチルプロリン、N-アセチルヒドロキシプロリンなど）およびそれらの塩類（アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩）。本発明の方法および組成物における透過促進剤としては、一般に乳化剤として用いられるもの（たとえばオレイルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステルなど）、カプリン酸、乳酸、リンゴ酸およびクエン酸、ならびにそのアルカリ金属塩、ピロリドンカルボン酸、アルキルピロリドンカルボン酸エステル、N-アルキルピロリドン、プロリンアシルエステルなども付与される。
【００９３】
本発明の多様な態様において、本発明のY2受容体結合ペプチドおよび他の療法薬を投与部位と選択したターゲット部位の間の粘膜バリヤーを通して送達できる改良された鼻粘膜送達配合物および方法が提供される。ある配合物は、選択したターゲット細胞、組織もしくは臓器、さらには特定の病的状態に特に適合する。他の態様において配合物および方法は、一定の細胞内経路または細胞間経路に沿ったY2受容体結合ペプチドの効果的な選択的エンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを提供する。一般にY2受容体結合ペプチドは、有効な濃度レベルでキャリヤーその他の送達ビヒクルに効果的に装填され、たとえば鼻粘膜に、ならびに／あるいは細胞内コンパートメントおよび膜を貫通して薬物作用を得るための遠くのターゲット部位（たとえば血流、または特定の組織、臓器、もしくは細胞内コンパートメント）へ到達する間、安定な形で送達および保持される。Y2受容体結合ペプチドを送達ビヒクルに装入し、または他の方法で修飾する（たとえばプロドラッグの形で）ことができ、その際、Y2受容体結合ペプチドの放出または活性化は生理的刺激（たとえばpH変化、リソソーム酵素など）により開始される。しばしばY2受容体結合ペプチドはその作用ターゲット部位に到達するまで薬理学的に不活性である。大部分の場合、Y2受容体結合ペプチドおよび他の配合物成分は無毒性および非免疫原性である。これに関して、キャリヤーおよび他の配合物成分は、一般に生理的条件下で速やかに分解して排出されるように選択される。同時に、有効貯蔵期間中、配合物の剤形は化学的および物理的に安定である。
【００９４】
ペプチドおよびタンパク質の類似体および模倣体
本発明に使用するための生物活性ペプチドおよびタンパク質の定義には、治療または予防に有効な天然または合成のペプチド（2個以上の共有結合アミノ酸からなる）、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質のフラグメント、ペプチドまたはタンパク質の類似体、および有効なペプチドまたはタンパク質の化学修飾した誘導体または塩類が含まれる。Y2受容体結合ペプチドの有用である多様な類似体および模倣体が本発明に用いるものとして考慮され、既知の方法で製造および生物活性試験することができる。本発明に用いるY2受容体結合ペプチドのペプチドおよびタンパク質または他の生物活性ペプチドおよびタンパク質はしばしば、天然または自然の（たとえば野生型、天然の変異体、または対立遺伝子バリアント）ペプチドまたはタンパク質配列のアミノ酸の部分置換、付加または欠失によって容易に得ることができる変異体である。さらに天然のペプチドまたはタンパク質の生物活性フラグメントが含まれる。そのような変異誘導体およびフラグメントは、天然のペプチドまたはタンパク質の目的とする生物活性を実質的に保持する。炭水化物鎖をもつペプチドまたはタンパク質の場合、これらの炭水化物種の変化を特色とする生物活性バリアントも本発明に含まれる。
【００９５】
本明細書中で用いる用語”保存的なアミノ酸置換”は、類似の側鎖をもつ一般的なアミノ酸残基の互換性を表わす。たとえば脂肪族側鎖をもつ一般に互換性のアミノ酸群はアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸群はセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖をもつアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖をもつアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖をもつアミノ酸群はリシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖をもつアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。保存的置換の例には、非極性（疎水性）残基、たとえばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン相互の置換が含まれる。同様に、本発明は極性（親水性）残基の置換、たとえばアルギニンとリシン間、グルタミンとアスパラギン間、およびトレオニンとセリン間の置換が考慮される。さらに、塩基性残基、たとえばリシン、アルギニンまたはヒスチジン相互の置換、あるいは酸性残基、たとえばアスパラギン酸またはグルタミン酸相互の置換も考慮される。保存的なアミノ酸置換の例は下記のものである：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミン。ペプチドまたはタンパク質の類似体を対応する天然のペプチドまたはタンパク質と適切にアラインすることにより、また適切なアッセイ法、たとえば接着タンパク質または受容体結合アッセイ法を用いて特定の生物活性を測定することにより、本発明の方法および組成物に使用するための作動可能なペプチドおよびタンパク質類似体を容易に同定できる。作動可能なペプチドおよびタンパク質類似体は、一般に対応する天然ペプチドまたはタンパク質に対して産生された抗体と特異的に免疫反応する。
【００９６】
本発明の固体タンパク質配合物を安定化する方法は、精製（たとえば凍結乾燥）したタンパク質の物理的安定性を高めるものである。これにより、タンパク質のアンフォールディングに伴う疎水性相互作用および共有経路による凝集が阻止される。これに関して安定化配合物にはしばしば、ポリマーベースの配合物、たとえば生物分解性ヒドロゲル配合物／送達系が含まれる。前記のように、タンパク質の構造、機能および安定性における水の重要な役割は周知である。一般にタンパク質は、バルク水を除去した固体状態では比較的安定である。しかし固体の療法用タンパク質配合物は、高湿度での貯蔵中または持続放出組成物もしくは医療用具から送達される際に水和される可能性がある。タンパク質の安定性は一般に、水和の増大に伴って低下する。水は固体タンパク質凝集に際しても、たとえばタンパク質の弾性を増大させて反応性基への到達性を高めるこれにより、反応体に対する移動相を提供することにより、またβ-脱離および加水分解など幾つかの劣化プロセスにおいて反応体として作用することにより、重要な役割を果たす可能性がある。
【００９７】
約6-28%の水を含有するタンパク質製剤は、最も不安定である。このレベルより低いと、結合水の可動性およびタンパク質の内部運動性は低い。このレベルより高いと、水の可動性およびタンパク質の運動性が全水和のものに近づく。ある点までは、水和の増大に伴い固相凝集性が増大することが幾つかの系で観察されている。しかし、より高い含水率では、希釈効果のため凝集がみられることは少なくなる。
【００９８】
これらの原理によれば、粘膜送達のためのペプチドおよびタンパク質を固相凝集に対して安定化するのに有効な方法は、固体配合物の含水率を制御し、配合物中の水の活性を最適レベルに維持することである。このレベルは、タンパク質の性質に依存するが、一般にそれらの”単層”水被覆率より低く維持されたタンパク質は卓越した固相安定性を示すであろう。
【００９９】
タンパク質の安定性を高めるために含水率を効果的に制御する多様な添加剤、希釈剤、基剤および送達ビヒクルが本発明において付与される。この意味での抗凝集剤として有効なこれらの物質およびキャリヤー物質には、たとえば多様な機能性をもつポリマー、たとえばポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、およびカルボキシメチルセルロースが含まれる。これらはそれと混和または結合したペプチドおよびタンパク質の安定性を有意に高め、固相凝集を低下させる。場合により、ペプチドまたはタンパク質薬物の水溶液に添加した多様な添加剤によってタンパク質の活性および物理的安定性を高めることもできる。たとえばポリオール（糖類を含む）、アミノ酸、タンパク質、たとえばコラーゲンおよびゼラチンなどの添加剤、ならびに多様な塩類を使用できる。
【０１００】
特定の添加剤、特に糖類その他のポリオールは、乾燥した、たとえば凍結乾燥したタンパク質に、有意の物理的安定性も付与する。タンパク質を凝集に対して保護するために、これらの添加剤を本発明において、凍結乾燥中のみでなく、乾燥状態での貯蔵中にも使用できる。たとえばショ糖およびFicoll 70（ショ糖単位を含むポリマー）は、多様な条件下での固相インキュベーション中のペプチドまたはタンパク質の凝集に対して有意の保護を示す。これらの添加剤は、ポリマーマトリックスに埋め込まれた固体タンパク質の安定性も高める。
【０１０１】
さらに他の添加剤、たとえばショ糖は、本発明の特定の持続放出配合物に起きる可能性のある加湿雰囲気下で高められた温度での固相凝集に対してタンパク質を安定化する。ゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質も、これに関して不安定なタンパク質の変性および凝集を低下させる安定剤または充填剤として作用する。これらの添加剤を、本発明のポリマー溶融プロセスおよび組成物に取り込ませることができる。たとえば前記の多様な安定化用添加剤を含有する溶液を単に凍結乾燥または噴霧乾燥することにより、ポリペプチド微粒子を調製できる。これにより、凝集していないペプチドおよびタンパク質の持続放出を長期間にわたって達成できる。
【０１０２】
他の多様な調製用成分および調製方法ならびに特定の配合物添加剤が本発明において提供され、凝集しやすいペプチドおよびタンパク質を粘膜送達するための配合物がこれにより得られる。この場合、可溶化剤を用いてペプチドまたはタンパク質を実質的に純粋な凝集していない形態で安定化する。これらの方法および配合物に用いるために、広範な成分および添加剤が考慮される。これらの可溶化剤の例は、シクロデキストリンの結合二量体（CD）であり、これらはポリペプチドの疎水性側鎖に選択的に結合する。これらのCD二量体は、凝集を有意に阻害する様式でタンパク質の疎水性部分に結合することが認められた。この阻害は、CD二量体と関与するタンパク質の両方に関して選択的である。そのような選択的なタンパク質凝集阻害により、本発明の鼻腔内送達方法および組成物においてさらに利点が得られる。これに関して用いられる他の物質には、ペプチドおよびタンパク質凝集を特異的に遮断するリンカーにより制御された多様な幾何学的形状をもつCD三量体および四量体が含まれる。本発明に用いられるさらに他の可溶化剤および方法は、タンパク質-タンパク質相互作用を選択的に遮断するペプチドおよびペプチド模倣体を使用するものである。１態様において、CD多量体について報告された疎水性側鎖の特異的結合は、同様にタンパク質凝集を特異的に遮断するペプチドおよびペプチド模倣体の使用により、タンパク質にも及ぶ。本発明の組成物および方法に用いるために、広範な適切な方法および抗凝集剤を利用できる。
【０１０３】
電荷調節およびpH調整のための物質および方法
疎水性粘膜バリヤーを通した送達を促進して生物活性物質（Y2受容体結合ペプチド、他の有効ペプチドおよびタンパク質、ならびに高分子および低分子薬物を含む）の輸送特性を改善するために、本発明は本明細書に記載する選択した生物活性物質または送達促進剤の電荷を調節する方法および物質をも提供する。これに関して、高分子の相対透過性は一般にそれらの分配係数に関係する。粘膜表面における分子のpKaおよびpHに依存する分子のイオン化度も、分子の透過性に影響を及ぼす。粘膜送達について、本発明のY2受容体結合ペプチドおよび類似体を含めた生物活性物質の透過および分配は、活性物質または透過促進剤の電荷の変更または電荷の拡散により促進され、これはたとえば荷電官能基の変更、活性物質を送達する送達ビヒクルもしくは溶液のpHの調整、または電荷もしくはpHを変更する物質と活性物質の協調投与により達成される。
【０１０４】
これらの一般的な教示と一致して、本発明の方法および組成物におけるY2受容体結合ペプチドならびに他の生物活性ペプチドおよびタンパク質を含めた荷電高分子種の粘膜送達は、活性物質を実質的に非イオン化状態または中性電荷状態で粘膜表面へ送達した場合、実質的に改善される。
【０１０５】
本発明に用いる粘膜配合物の、あるY2受容体結合ペプチドならびに他の生物活性ペプチドおよびタンパク質成分を、ペプチドまたはタンパク質の正電荷密度が増大するように電荷修飾する。これらの修飾は、本明細書に開示するペプチドおよびタンパク質コンジュゲート、キャリヤーおよび他の送達形態のカチオン化にも及ぶ。カチオン化は、本発明のタンパク質および高分子の生体分布および輸送特性を変更する好都合な手段となる。カチオン化は、活性物質の生物活性を実質的に保存し、組織損傷および毒性を含めた潜在的に有害な副作用を制限するように行われる。
【０１０６】
分解酵素を阻害する物質および方法
経粘膜透過製剤に含有させることができる他の賦形剤は、分解酵素阻害剤である。本発明の粘膜送達配合物および方法に有用な粘膜接着性ポリマー-酵素阻害剤複合体には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：カルボキシメチルセルロース-ペプスタチン（抗ペプシン活性をもつ）；ポリ（アクリル酸）-ボーマン-バーク（Bowman-Birk）阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-エラスタチナール（elastatinal）（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース-エラスタチナール（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル（Polycarbophil）-エラスタチナール（抗エラスターゼ）；キトサン-アンチペイン（antipain）（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）-バシトラシン（抗アミノペプチダーゼN）；キトサン-EDTA（抗アミノペプチダーゼN、抗カルボキシペプチダーゼA）；キトサン-EDTA-アンチペイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）。後記にさらに詳述するように、本発明のある態様には所望により新規なキトサン誘導体またはキトサンの化学修飾形が含まれる。本発明に用いるそのような新規誘導体のひとつは、β-[1→4]-2-グアニジノ-2-デオキシ-D-グルコースポリマー（poly-GuD）と表示される。
【０１０７】
生物活性物質（１以上）を保護するために酵素活性を阻害するいかなる阻害剤も、本発明の組成物および方法に使用できる。生物活性タンパク質およびペプチドを保護するのに有用な酵素阻害剤には、たとえばダイズトリプシンインヒビター、膵臓トリプシンインヒビター、キモトリプシンインヒビター、ならびにバレイショ（solanum tuberosum L）塊茎から単離したトリプシンおよびキモトリプシンインヒビターが含まれる。阻害剤の組合わせまたは混合物も使用できる。本発明に用いる他のタンパク分解酵素阻害剤には、オボムコイド酵素、ガバキセートメシラート（gabaxate mesylate）、α1-アンチトリプシン、アプロチニン、アマスタチン（amastatin）、ベスタチン（bestatin）、ピューロマイシン、バシトラシン、ロイペプシン、α2-マクログロブリン、ペプスタチン、および卵白またはダイズのトリプシンインヒビターが含まれる。これらおよび他の阻害剤を単独で、または組み合わせて使用できる。阻害剤（１以上）を、生物活性物質と組み合わせて、または別個に投与される（たとえば前投与される）配合物中において、キャリヤー（たとえば親水性ポリマー）に取込みまたは結合させ、鼻粘膜と接触する剤形の表面にコーティングし、あるいは表面の表相に取り込ませることができる。
【０１０８】
本発明の組成物に所望により含有させる阻害剤、たとえばタンパク分解酵素阻害剤の量は、下記に応じて異なるであろう：(a)個々の阻害剤の特性、(b)その分子中に存在する官能基（これらを反応させて、ヒドロゲル形成モノマーとの共重合に必要なエチレン性不飽和を導入することができる）の数、および(c)阻害剤分子中に存在するレクチン基、たとえばグリコシドの数。それは、投与する予定の個々の療法薬にも依存する可能性がある。一般に、有用な酵素阻害剤量は、配合物（すなわち、別個のプロテアーゼ阻害剤配合物、または阻害剤および生物活性物質の組合わせ配合物）の約0.1-約50mg/ml、しばしば約0.2-約25mg/ml、より一般的には約0.5-約5mg/mlである。
【０１０９】
トリプシン阻害の場合、適切な阻害剤はたとえばアプロチニン、BBI、ダイズトリプシンインヒビター、ニワトリオボムコイド、ニワトリオボインヒビター、ヒト膵臓トリプシンインヒビター、カモスタットメシラート（camostat mesylate）、フラボノイド阻害剤、アンチペイン、ロイペプチン、p-アミノベンザミジン、AEBSF、TLCK（トシルリシンクロロメチルケトン）、APMSF、DFP、PMSF、およびポリ（アクリラート）誘導体から選択できる。トリプシン阻害の場合、適切な阻害剤はたとえばアプロチニン、BBI、ダイズトリプシンインヒビター、キモスタチン、ベンジルオキシカルボニル-Pro-Phe-CHO、FK-448、ニワトリオボインヒビター、糖ビフェニルボロン酸複合体、DFP、PMSF、β-フェニルプロピオネート、およびポリ（アクリラート）誘導体から選択できる。エラスターゼ阻害の場合、適切な阻害剤はたとえばエラスタチナール、メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-クロロメチルケトン（MPCMK）、BBI、ダイズトリプシンインヒビター、ニワトリオボインヒビター、DFP、およびPMSFから選択できる。
【０１１０】
本発明に用いる他の酵素阻害剤は、効力および毒性の程度が異なる広範な非タンパク質阻害剤から選択される。後記にさらに詳述するように、毒性が生じる場合、それを低下またはさらに排除するために、マトリックスまたは他の送達ビヒクルへのこれらの補助剤の固定化、あるいは化学修飾した類似体の開発を容易に実施できる。本発明に用いるこの広範なグループの候補酵素阻害剤には、有機リン系阻害剤、たとえばジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）が含まれる。これらはセリンプロテアーゼ（たとえばトリプシンおよびキモトリプシン）の有効な不可逆的阻害剤である。これらの化合物による追加のアセチルコリンエステラーゼ阻害のため、これらは無制御な送達設定では高毒性である。他の候補阻害剤4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド（AEBSF）は、DFPおよびPMSFに匹敵する阻害活性をもつが、毒性が顕著に低い。(4-アミノフェニル)-メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（APMSF）は他の有効なトリプシン阻害剤であるが、無制御な送達設定では毒性である。これらの阻害剤と対照的に、4-(4-イソプロピルピペラジノカルボニル)フェニル1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ナフトエートメタンスルホナート（FK-448）は低毒性物質であり、有効かつ特異的なキモトリプシン阻害剤である。この非タンパク質グループの阻害剤候補の他の代表例であって、低い毒性リスクをも示すものは、カモスタットメシラート（N,N'-ジメチルカルバモイルメチル-p-(p'-グアニジノ-ベンジルオキシ)フェニルアセテートメタン-スルホナート）である。
【０１１１】
本発明の方法および組成物に用いるさらに他のタイプの酵素阻害剤は、特定の療法化合物の酵素分解を阻害するアミノ酸および修飾アミノ酸である。これに関して用いられるアミノ酸および修飾アミノ酸は、実質的に無毒性であり、低価格で製造できるものである。それらは分子サイズが低く、溶解性が良好であるため、粘膜環境で直ちに希釈されて吸収される。それにもかかわらず、適正な条件下ではアミノ酸はプロテアーゼ酵素の可逆的な競合阻害剤として作用できる。ある修飾アミノ酸は、はるかに強い阻害活性を示すことができる。これに関して目的に従って修飾されたアミノ酸は、”遷移状態”阻害剤として知られる。これらの化合物がもつ強い阻害活性は遷移状態の形状の基質に対するそれらの構造類似性に基づくが、それらは一般に酵素の活性部位に対して基質そのものよりはるかに高い親和性をもつように選択される。遷移状態阻害剤は可逆的な競合阻害剤である。このタイプの阻害剤の例は、α-アミノボロン酸誘導体、たとえばボロ-ロイシン、ボロ-バリンおよびボロ-アラニンである。これらの誘導体中のホウ素原子は、ペプチドがアミノペプチダーゼにより加水分解される際の遷移状態のペプチドに類似すると考えられる四面体ボロネートイオンを形成することができる。これらのアミノ酸誘導体はアミノペプチダーゼの有効な可逆的阻害剤であり、ボロ-ロイシンは酵素阻害においてベスタチンより100倍以上有効であり、ピューロマイシンより1000倍以上有効であると報告されている。強いプロテアーゼ阻害活性が報告されている他の修飾アミノ酸は、N-アセチルシステインであり、これはアミノペプチダーゼNの酵素活性を阻害する。この補助剤は粘液溶解特性をも示し、本発明の方法および組成物において粘液拡散バリヤーの作用を低下させるために使用できる。
【０１１２】
本発明の協調投与方法および組合わせ配合物に用いるさらに他の有用な酵素阻害剤は、ペプチドおよび修飾ペプチド酵素阻害剤から選択できる。このクラスの阻害剤の重要な代表例は、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）から得られた環状ドデカペプチド、バシトラシンである。これらのタイプのペプチドのほか、あるジペプチドおよびトリペプチドはあるプロテアーゼに対して弱い非特異的阻害活性を示す。アミノ酸と同様に、それらの阻害活性は化学修飾により改善できる。たとえばホスフィン酸ジペプチド類似体も、アミノペプチダーゼに対して強い阻害活性をもつ”遷移状態”阻害剤である。報告によれば、それらは鼻腔投与されるロイシンエンケファリンを安定化するために用いられている。遷移状態類似体の他の例は修飾ペンタペプチド、ペプスタチンであり、これはきわめて有効なペプシン阻害剤である。数種類の合成類似体の阻害活性を試験することにより、ペプスタチンの構造分析から阻害活性に対するこの分子の主要な構造-機能特性が証明された。他の特殊なタイプの修飾ペプチドには、その構造中に末端位アルデヒド官能基をもつ阻害剤が含まれる。たとえば、キモトリプシンについて知られている一次および二次特異性要件を満たす配列ベンジルオキシカルボニル-Pro-Phe-CHOが、このターゲットプロテアーゼの有効な可逆的阻害剤であることが認められた。末端位アルデヒド官能基をもつ他の阻害剤、たとえばアンチペイン、ロイペプチン、キモスタチンおよびエラスタチンの化学構造も当技術分野で知られており、他の既知の可逆的な修飾ペプチド阻害剤、たとえばホスホランドン、ベスタチン、ピューロマイシンおよびアマスタチンの化学構造も同様である。
【０１１３】
ポリペプチド系プロテアーゼ阻害剤は比較的高い分子質量であるため、薬物キャリヤーマトリックス中において低分子化合物より濃厚送達しやすい。本発明の配合物および方法に含まれる他のプロテアーゼ阻害剤は、錯化剤の使用を伴う。これらの物質は、多くのプロテアーゼの補因子である二価カチオンを鼻腔内環境（または製剤または療法用組成物）から欠乏させることにより、酵素阻害を仲介する。たとえば適切な濃度で協調投与または組合わせ配合する補助剤としての錯化剤EDTAおよびDTPAは、特定のプロテアーゼを阻害し、これにより本発明による生物活性物質の鼻腔内送達を高めるのに十分であろう。このクラスの阻害剤の他の代表例は、EGTA、1,10-フェナントロリンおよびヒドロキシキノリンである。さらにこれらおよび他の錯化剤は、二価カチオンをキレート化する性質のため、本発明において直接的な吸収促進剤として有用である。
【０１１４】
本明細書の他の箇所でより詳細に述べるように、各種ポリマー、特に粘膜接着性ポリマーを、本発明の協調投与、多重処理および／または組合わせ配合方法および組成物における酵素阻害剤として用いることも考慮される。たとえばポリ（アクリラート）誘導体、たとえばポリ（アクリル酸）およびポリカルボフィルは、トリプシン、キモトリプシンを含めた多様なプロテアーゼの活性に影響を及ぼす。これらのポリマーの阻害効果も、二価カチオン、たとえばCa2+およびZn2+の錯化に基づくと思われる。さらにこれらのポリマーは、前記の他の酵素阻害剤に対するコンジュゲートパートナーまたはキャリヤーとして作用することができると考えられる。たとえば亜鉛依存性プロテアーゼの酵素活性に対して強い阻害作用を示すキトサン-EDTAコンジュゲートが開発されており、本発明に有用である。これに関して、他の酵素阻害剤が共有結合した後のポリマーの粘膜接着性が実質的に損なわれるとは考えられず、本発明に含まれる生物活性物質の送達ビヒクルとしてのこれらのポリマーの全般的な有用性が低下するとも考えられない。むしろ、粘膜接着機序により生じる送達ビヒクルと粘膜表面の距離の短縮は活性物質の前全身代謝（presystemic metabolism）を最小限に抑え、一方では、共有結合した酵素阻害剤が薬物送達部位に濃厚なまま残留し、不都合な阻害剤希釈作用ならびに毒性およびそれにより起きる他の副作用が最小限に抑えられる。こうして、希釈作用の排除により、協調投与する酵素阻害剤の有効量を減らすことができる。
【０１１５】
本発明の粘膜用配合物および方法に有用な粘膜接着性ポリマー-酵素阻害剤複合体の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：カルボキシメチルセルロース-ペプスタチン（抗ペプシン活性をもつ）；ポリ（アクリル酸）-ボーマン-バーク阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-エラスタチナール（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース-エラスタチナール（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル-エラスタチナール（抗エラスターゼ）；キトサン-アンチペイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）-バシトラシン（抗アミノペプチダーゼN）；キトサン-EDTA（抗アミノペプチダーゼN、抗カルボキシペプチダーゼA）；キトサン-EDTA-アンチペイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）。
【０１１６】
粘液溶解および粘液清澄のための物質および方法
生物療法薬を鼻腔内投与によって効果的に送達するには、粘膜層の糖タンパク質への結合による薬物損失のほか、鼻粘膜の粘膜防御内張りを通る際の薬物輸送速度の低下を考慮しなければならない。普通の粘液は、水、電解質、ムチン、高分子、および壊死した上皮細胞からなる粘弾性のゲル様物質である。それは主に、下部の粘膜組織に対する細胞保護性および潤滑性をもつ被蓋として作用する。粘液は、鼻腔上皮および他の粘膜上皮に存在するランダムに分布した分泌細胞により分泌される。粘液の構成単位はムチンである。主にこの糖タンパク質が粘液の粘弾性に関係するが、他の高分子もこの特性に関与している可能性がある。気道粘液の場合、そのような高分子には局所産生される分泌性IgA、IgM、IgE、リゾチーム、およびブロンコトランスフェリンが含まれ、これらは宿主防御機序においても重要な役割を果たす。
【０１１７】
本発明の協調投与方法は所望により、効果的な粘液溶解剤または粘液清澄剤を使用する。これらは鼻腔粘膜表面からの粘液を分解、希釈または清澄化して、鼻腔内投与された生物療法薬の吸収を促進する作用をもつ。これらの方法では、粘液溶解剤または粘液清澄剤を補助化合物として協調投与し、生物活性物質の鼻腔内送達を促進する。あるいは、有効量の粘液溶解剤または粘液清澄剤を本発明の多重処理法における処理剤として、または本発明の組合わせ配合物の添加剤として使用し、鼻腔内粘液のバリヤー作用を低下させることにより、生物療法化合物の鼻腔内送達を促進する改良された配合物を得る。
【０１１８】
本発明の方法および組成物に使用するために多様な粘液溶解剤または粘液清澄剤を利用できる。粘液溶解剤または粘液清澄剤は、それらの作用機序に基づいて、しばしば下記のグループに分類できる：ムチン糖タンパク質のタンパク質コアを開裂するプロテアーゼ（たとえばプロナーゼ、パパイン）；ムコタンパク質のジスルフィド結合を切断するスルフヒドリル化合物；および粘液内の非共有結合を破壊する界面活性剤（たとえばTriton X-10、Tween 20）。これに関連する他の化合物には胆汁酸塩および界面活性物質、たとえばデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、およびリゾホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
粘液の構造破壊における胆汁酸塩の有効性は、デオキシコール酸塩＞タウロコール酸塩＞グリココール酸塩の順序である。粘液の粘度または接着性を低下させて本発明方法による鼻腔内送達を増大させる他の有効な物質には、たとえば短鎖脂肪酸、およびキレート化により作用する粘液溶解剤、たとえばN-アシルコラーゲンペプチド、胆汁酸、およびサポニン（後者は一部は、粘液層構造を維持するのに重要な役割を果たすCa2+および／またはMg2+のキレート化により作用する）が含まれる。
【０１２０】
本発明の方法および組成物に用いる他の粘液溶解剤には、N-アセチル-L-システイン（ACS）が含まれる。これは気管支肺粘液の粘度および接着性を共に低下させる有効な粘液溶解剤であり、麻酔したラットにおいてヒト成長ホルモンの経鼻生物学的利用能を適度に増大させると報告されている（7.5%から12.2%に）。これらおよび他の粘液溶解剤または粘液清澄剤を、一般に約0.2-20mMの濃度で、生物活性物質の投与と協調して鼻粘膜と接触させると、鼻腔内粘液の極性粘度および／または弾性が低下する。
【０１２１】
さらに他の粘液溶解剤または粘液清澄剤は、粘液糖タンパク質のグリコシド結合を開裂する一連のグリコシダーゼ酵素から選択できる。α-アミラーゼおよびβ-アミラーゼはこのクラスの酵素の代表例であるが、それらの粘液溶解作用には限界がある。微生物がそれらの宿主の粘膜層を透過するのを可能にする細菌性グリコシダーゼは、これと対照的である。
【０１２２】
ペプチドおよびタンパク質療法薬を含めた本発明において生物活性がきわめて高い薬剤と併用するためには、一般に非イオン原性界面活性剤も粘液溶解剤または粘液清澄剤として有用である。これらの物質は一般に療法用ポリペプチドの活性を変化させず、または実質的に損なうことがない。
【０１２３】
毛様体制止のための物質および方法
ある粘膜組織（たとえば鼻粘膜組織）の粘膜毛様体クリアランスによる自己清浄能は防御機能として必要である（たとえば粉塵、アレルゲンおよび細菌を排除するために）ので、粘膜投薬によりこの機能を実質的に損なってはならないと一般に考えられていた。気道の粘膜毛様体輸送は、感染に対する特に重要な防御機序である。この機能を達成するために、鼻腔および気道の毛様体搏動が粘液層を粘膜に沿って移動させ、吸入された粒子および微生物を排除する。
【０１２４】
粘膜（たとえば鼻腔内）投与した本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の滞留時間を延長するために、毛様体制止剤が本発明の方法および組成物に有用である。特にある態様において、粘膜細胞の毛様体活動を可逆的に阻害して粘膜投与した活性物質（１以上）の滞留時間を一時的に可逆的に延長する機能をもつ１種類以上の模倣体制止剤を協調投与または組合わせ配合物することにより、本発明の方法および組成物のこれらの薬剤の送達は有意に増大する。本発明のこれらの態様に用いるために、前記の毛様体制止因子はその作用が特異的または間接的のいずれであってもすべて、適宜な量で（濃度、送達の期間および様式に依存する）毛様体制止剤として効果的に使用するための候補である。これにより、それらは投与粘膜部位における毛様体クリアランスを一時的（すなわち可逆的）に低下または停止して、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の送達を増大させ、許容できない有害な副作用はない。
【０１２５】
より詳細な態様においては、特異的な毛様体制止因子を、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質との組合わせ配合物または協調投与プロトコルに用いる。文献中で単離および特性解明された多様な細菌毛様体制止因子を、本発明のこれらの態様に使用できる。緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来の毛様体制止因子には、フェナジン誘導体、ピオ（膿、pyo）化合物（2-アルキル-4-ヒドロキシキノリン）、およびラムノリピド（ヘモリシンとしても知られる）が含まれる。ピオ化合物は50μg/mlの濃度で毛様体制止を生じ、明らかな超微細構造病変はみられなかった。フェナジン誘導体も毛様体運動を阻害したが、若干の膜破壊を引き起こした。ただし、これより実質的に高い濃度400μg/mlにおいてであった。気管外植片をラムノリピドに限定暴露すると毛様体制止が起き、これに伴って毛様体膜が変化した。より長期間のラムノリピド暴露に伴って、軸糸からダイニンアームが除去された。
【０１２６】
界面活性剤および方法
より詳細な本発明の態様において、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の粘膜送達を増大させるために、本発明の粘膜送達方法または配合物に１種類以上の膜透過促進剤を使用できる。これに関して膜透過促進剤は下記のものから選択できる：(i)界面活性剤、(ii)胆汁酸塩、(ii)リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソームもしくはキャリヤー、(iii)アルコール類、(iv)エナミン類、(v)NO供与化合物、(vi)長鎖両親媒性分子、(vii)低分子疎水性透過促進剤、(viii)ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、(ix)アセト酢酸のグリセロールエステル、(x)シクロデキストリンもしくはβ-シクロデキストリン誘導体、(xi)中鎖脂肪酸、(xii)キレート化剤、(xiii)アミノ酸もしくはその塩、(xiv)N-アセチルアミノ酸もしくはその塩、(xv)特定の膜成分に対して分解性の酵素、(ix)脂肪酸合成の阻害剤、または(x)コレステロール合成の阻害剤；あるいは(xi)(i)-(x)に挙げた膜透過促進剤のいずれかの組合わせ。
【０１２７】
ある界面活性剤は、本発明の粘膜送達配合物および方法に粘膜吸収促進剤として容易に使用できる。本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質と協調投与または組合わせ配合できるこれらの物質は、既知の広範な界面活性剤群から選択できる。界面活性剤は一般に3クラスに属する：(1)非イオン性ポリオキシエチレンエーテル；(2)胆汁酸塩、たとえばグリココール酸ナトリウム（SGC）およびデオキシコール酸ナトリウム（DOC）；ならびに(3)フシジン酸誘導体、たとえばタウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（STDHF）。これら各クラスの界面活性剤の作用機序には、一般に生物活性物質の可溶化が含まれる。しぱしぱ凝集体を形成するタンパク質およびペプチドについて、これらの吸収促進剤は界面活性作用によりタンパク質と相互作用することができ、これにより界面活性剤被覆されたモノマーなどの小単位が溶液状態に維持されやすくなる。他の界面活性剤の例は、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル（DDPC）、ポリソルベート80およびポリソルベート20である。これらのモノマーは凝集体より輸送されやすいと推定される。可能性のある第2の機序は、粘膜環境でのプロテアーゼによるタンパク質分解性破壊からペプチドまたはタンパク質を保護することである。胆汁酸塩およびあるフシジン酸誘導体は、報告によれば、タンパク質の吸収を増大させるのに必要な濃度またはそれと同等な濃度で、鼻ホモジェネートによるタンパク質のタンパク質分解性破壊を阻害する。このプロテアーゼ阻害は、生物学的半減期が短かいペプチドについて特に重要であろう。
【０１２８】
脂肪酸合成およびコレステロール合成に対する分解酵素および阻害剤
本発明の関連態様において、粘膜投与のためのY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質を、分解酵素もしくは代謝刺激剤、または脂肪酸、ステロールもしくは他の特定の上皮バリヤー成分（USP 6,190,894）から選択される透過促進剤と共に配合し、または協調投与する。たとえば、粘膜バリヤーに不可逆的な損傷を引き起こすことなく、Y2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の粘膜透過を促進するために、分解酵素、たとえばホスホリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼおよびコンドロイチナーゼを使用できる。１態様においては、本明細書に示す方法および組成物にコンドロイチナーゼを用いて粘膜透過バリヤーの糖タンパク質または糖脂質成分を変化させ、これにより本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の粘膜吸収を増大させる。
【０１２９】
粘膜バリヤー成分の合成阻害剤に関しては、脂肪酸が上皮脂質の20-25重量％を占めることに注目する。遊離脂肪酸の生合成における2種類の律速酵素は、アセチルCoAカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンセターゼである。一連の段階を経て、遊離脂肪酸はリン脂質に代謝される。たとえば、本発明の方法および組成物に用いる、遊離脂肪酸の合成および代謝の阻害剤には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アセチルCoAカルボキシラーゼ阻害剤、たとえば5-テトラデシルオキシ-2-フランカルボン酸（TOFA）；脂肪酸シンセターゼ阻害剤；ホスホリパーゼA阻害剤、たとえばゴミシンA（gomisin A）、2-(p-アミルシンナミル)アミノ-4-クロロ安息香酸、ブロモフェナシルブロミド、モノアライド（monoalide）、7,7-ジメチル-5,8-エイコサジエン酸、ニセルゴリン（nicergoline）、セファランチン（cepharanthine）、ニカルジピン（nicardipine）、ケルセチン（quercetin）、ジブチリル-サイクリックAMP、R-24571、N-オレオイルエタノールアミン、N-(7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール-4-イル)ホスファチジルセリン、サイクロスポリンA、局所麻酔薬（ジブカインを含む）、プレニラミン（prenylamine）、レチノイド類、たとえば全トランスおよび13-シス-レチノイン酸、W-7、トリフルオペラジン（trifluoperazine）、R-24571（カルミダゾリウム）、1-ヘキサドシル-3-トリフルオロエチルグリセロ-sn-2-ホスホメントール（MJ33）；カルシウムチャンネル遮断剤：ニカルジピン（nicardipine）、ベラパミル（verapamil）、ジルチアゼム（diltiazem）、ニフェジピン（nifedipine）およびニモジピン（nimodipine）を含む；抗マラリア薬：キナクリン、メパクリン、クロロキンおよびヒドロキシクロロキンを含む；β遮断剤：プロパナロール（propanalol）およびラベタロール（labetalol）を含む；カルモジュリンアンタゴニスト；EGTA；チメルソール（thimersol）；グルココルチコステロイド：デキサメタゾンおよびプレドニソロンを含む；ならびに非ステロイド系抗炎症薬：インドメタシンおよびナプロキセンを含む。
【０１３０】
遊離ステロール、主にコレステロールは、上皮脂質の20-25重量％を占める。コレステロール生合成の律速酵素は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル（HMG）CoAレダクターゼである。本発明の方法および組成物に用いられるコレステロール合成阻害剤には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：（HMG）CoAレダクターゼの競合阻害剤、たとえばシンバスタチン（simvastatin）、ロバスタチン（lovastatin）、フルインドスタチン（fluindostatin）（フルバスタチン（fluvastatin））、プラバスタチン（pravastatin）、メバスタチン（mevastatin）、ならびに他のHMG CoAレダクターゼ阻害剤、たとえばオレイン酸コレステロール、硫酸コレステロールおよびリン酸コレステロール、ならびに酸化ステロール、たとえば25-OH-および26-OH-コレステロール；スクアレンシンセターゼの阻害剤；スクアレンエポキシダーゼの阻害剤；DELTA7またはDELTA24レダクターゼの阻害剤、たとえば22,25-ジアザコレステロール、20,25-ジアザコレステロール、AY9944、およびトリパラノール（tripanalol）。
【０１３１】
脂肪酸合成阻害剤またはステロール合成阻害剤はそれぞれ、活性物質（１以上）の上皮透過を増大させるために、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質と協調投与または組合わせ配合できる。粘膜送達のための療法配合物または補助配合物中のステロール阻害剤の有効濃度範囲は、一般に全体の約0.0001-約20重量％、より一般的には約0.01-約5重量％である。
【０１３２】
酸化窒素供与のための物質および方法
本発明の他の関連態様において、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の粘膜送達を増大させるための膜透過阻害剤として、酸化窒素（NO）供与剤が選択される。多様なNO供与剤が当技術分野で知られており、本発明の方法および配合物に有効な濃度で用いられる。NO供与剤の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ニトログリセリン、ニトロプルシッド、NOC5［3-(2-ヒドロキシ-1-(メチル-エチル)-2-ニトロソヒドラジノ)-1-プロパンアミン］、NOC12［N-エチル-2-(1-エチル-ヒドロキシ-2-ニトロソヒドラジノ)-エタナミン］、SNAP［S-ニトロソ-N-アセチル-DL-ペニシラミン］、NORIおよびNOR4。本発明の方法および組成物においては、有効量の選択したNO供与剤を本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質と協調投与または組合わせ配合し、粘膜上皮内へ、またはそれを通して送達する。
【０１３３】
上皮結合の構造および／または生理を調節する物質
本発明は、１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質を本明細書に開示する粘膜送達促進剤と組み合わせて粘膜送達用医薬製剤中に配合した、医薬組成物を提供する。
【０１３４】
透過促進剤は、一般に対象の粘膜上皮表面の上皮結合の構造および／または生理を調節することにより、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増大させる。この作用は一般に、隣接上皮細胞の上皮膜接着タンパク質間のホモタイプおよびヘテロタイプ結合を透過阻害剤により阻害することを伴う。このホモタイプおよびヘテロタイプ結合遮断のターゲットタンパク質は、関連する多様な結合部接着分子（JAM）、オクルディン類またはクラウディン類から選択できる。
【０１３５】
さらに他の詳細な態様において、本発明は粘膜上皮の傍細胞輸送を増大させる透過促進ペプチドならびにペプチド類似体および模倣体を提供する。本発明のペプチドならびにペプチド類似体および模倣体は一般に、本発明の組成物および方法において、哺乳動物対象の粘膜上皮表面の上皮結合の構造および／または生理を調節することにより作用する。ある態様において、本発明のペプチドならびにペプチド類似体および模倣体は、結合接着分子（JAM）、オクルディン類またはクラウディン類から選択される上皮膜接着タンパク質のホモタイプおよびヘテロタイプ結合を効果的に阻害する。
【０１３６】
広範に研究されたそのような物質のひとつは、”閉鎖帯毒素”（ZOT）として知られるビブリオ・コレレ（Vibrio cholerae）由来の細菌毒素である。この毒素は腸粘膜透過の増大を仲介し、感染対象において下痢を含めた病的症状を引き起こす。Fasano et al., Proc.Nat.Acad.Sci., U.S.A., 8:5242-5246 (1991)。ウサギ回腸粘膜について試験した場合、ZOTは細胞内密着結合の構造を調節することにより腸透過性を増大させた。より最近になって、ZOTは腸粘膜の密着結合を可逆的に開放しうることが見いだされた。ZOTは鼻粘膜の密着結合を可逆的に開放しうることも報告された。USP 5.908,825。
【０１３７】
本発明の方法および組成物においては、ZOT、ならびにZOT活性のアゴニストおよびアンタゴニストとして機能するZOTの多様な類似体および模倣体が、生物活性物質の鼻腔内送達促進に有用である−鼻粘膜内およびそれを通した傍細胞吸収の増大による。これに関して、ZOTは一般に密着結合の構造再編成を引き起こすことにより作用する。この再編成は結合部タンパク質ZO1の局在化の変化を特色とする。本発明のこれらの態様において、ZOTは、実質的に有害な副作用なしに鼻粘膜透過性の可逆的増大により活性物質の吸収を有意に増大させるのに有効な量で、生物活性物質と協調投与または組合わせ配合される。
【０１３８】
血管拡張のための物質および方法
本発明の協調投与ならびに組合わせ配合方法および組成物において有益な有用性を示すさらに他のクラスの吸収促進剤は、血管作用性化合物、より詳細には血管拡張剤である。これらの化合物は本発明において粘膜下血管の構造および生理を調節し、粘膜上皮内もしくはそれを通した、および／または特定のターゲット組織もしくはコンパートメント（たとえば全身循環または中枢神経系）への、Y2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の輸送速度を高める機能をもつ。
【０１３９】
本発明に用いる血管拡張剤は一般に、細胞質カルシウムの減少、酸化窒素（NO）の増加、またはミオシンL鎖キナーゼの阻害により、粘膜下血管弛緩を引き起こす。それらは一般に9クラスに分類される：カルシウムアンタゴニスト、カリウムチャンネル開放剤、ACE阻害剤、アンギオテンシン-II受容体アンタゴニスト、α-アドレナリン作動性およびイミダゾール受容体アンタゴニスト、β1-アドレナリン作動性アゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エイコサノイドおよびNO供与剤。
【０１４０】
カルシウムアンタゴニストは、化学的な相異にもかかわらず、それらの薬物動態特性が類似する。全身循環への吸収は高いので、これらの物質は肝臓によりかなりの初回通過代謝を受け、薬物動態に個々の変動が生じる。ジヒドロピリジンタイプの新しい薬物（アモルジピン（amoldipine）、フェロジピン（felodipine）、イスラジピン（isradipine）、ニルバジピン（nilvadipine）、ニソルジピン（nisoldipine）およびニトレンジピン（nitrendipine））を除いて、カルシウムアンタゴニストの半減期は短かい。したがって、有効薬物濃度を維持するためには、本明細書の他の箇所に記載したように、これらの多くについて多数回投与または制御放出配合物による送達が必要であろう。カルシウムチャンネル開放剤ミノキシジル（minoxidil）による処置も、副作用の可能性があるため投与の様式および量が制限される。
【０１４１】
ACE阻害剤は、アンギオテンシン-Iからアンギオテンシン-IIへの変換を阻止するので、レニン産生が増大した場合に最も有効である。ACEは有効な内因性血管拡張因子ブラジキニンを不活性化するキナーゼ-IIと同一であるので、ACE阻害剤はブラジキニンの分解を低下させる。ACE阻害剤は、動物モデルにおいて心臓線維形成および心室肥大を阻止および好転させることにより、さらに心臓保護作用および心臓修復作用の利点を備えている。大部分のACE阻害剤の主要な排出経路は腎排出によるものである。したがって、腎障害がある場合は排出低下が生じるので、中等度ないし重度の腎障害を伴う患者には25-50%の投与量減少が推奨される。
【０１４２】
NO供与剤に関して、これらの化合物は本発明において粘膜透過性に対する追加作用のため特に有用である。前記のNO供与剤のほか、NOと求核性物質の複合体（NO／求核剤、またはNONOateと呼ばれる）は、水溶液中に溶解した状態で生理的pHにおいて酵素によらずに自然にNOを放出する。これに対しニトロ系血管拡張剤、たとえばニトログリセリンは、NO放出のために特異的な酵素活性を必要とする。NONOateは、特定の化学量論的量で、ジエチルアミン／NOの＜3分からジエチレントリアミン／NO（DELTANO）の約20時間までの予測可能な速度で、NOを放出する。
【０１４３】
本発明のある方法および組成物においては、選択した血管拡張剤を、活性物質（１以上）の粘膜吸収を増大させて対象のターゲット組織またはコンパートメント（たとえば肝臓、門脈、CNS組織もしくは体液、または血漿）に到達させるのに有効な量で、１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質と協調投与し（たとえば全身もしくは鼻腔内に、同時に、または組合わせ効果のある時間的関係で）または組合わせ配合する。
【０１４４】
選択的輸送促進のための物質および方法
本発明の組成物および送達方法は、所望により１種類以上の生物活性物質の輸送を促進する選択的輸送促進剤を使用する。これらの輸送促進剤は、１種類以上の他の生物活性物質の送達を協調促進し、活性物質（１以上）の粘膜送達を増大させて対象のターゲット組織またはコンパートメント（たとえば粘膜上皮、肝臓、CNS組織もしくは体液、または血漿）に到達させるために、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体との組合わせ配合物または協調投与プロトコルに使用できる。あるいは、輸送促進剤を組合わせ配合物または協調投与プロトコルに用いて、他の生物活性物質の送達を協調促進し、または促進せずに、１種類以上のY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体の粘膜送達を直接増大させることができる。
【０１４５】
本発明のこの態様に用いる選択的輸送促進剤の例には、上皮輸送バリヤー成分と特異的に相互作用することが知られているグリコシド、糖含有分子、および結合剤、たとえばレクチン系結合剤が含まれるが、これらに限定されない。本発明の生物活性物質の粘膜送達、たとえば鼻腔送達を増大させるためのキャリヤーまたは結合輸送仲介物質として、たとえば細胞表面の糖部分に受容体仲介相互作用により結合する植物性および細菌性レクチンを含めた特異的な”生体接着性”リガンドを使用できる。本発明に用いるある生体接着性リガンドは上皮ターゲット細胞への生体信号の伝達を仲介し、これによって特殊な細胞性輸送プロセスによる接着性リガンドの選択的取込み（エンドサイトーシスまたはトランスサイトーシス）が開始する。したがってこれらの輸送仲介物質は、粘膜上皮内および／またはそれを通した、１種類以上のY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の選択的取込みを刺激または指向するための”キャリヤー系”として使用できる。これらおよび他の選択的輸送促進剤は、本発明の高分子生物医薬（特にペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクター）の粘膜送達を有意に増大させる。レクチンは、真核細胞の糖タンパク質および糖脂質の表面にある特定の糖に結合する植物タンパク質である。レクチンの濃厚溶液は”粘膜吸引（mucotractive）”作用をもち、多数の研究で、レクチンおよびレクチンコンジュゲート（たとえばコロイド金粒子とコンジュゲートしたコンカナバリンA）が粘膜表面を通して速やかに受容体仲介エンドサイトーシス（RME）されることが証明された。他の研究では、インビボでの腸薬物ターゲティングにレクチンの取込み機序を利用できると報告された。これらのうちある研究で、ポリスチレンナノ粒子（500nm）をトマトレクチンに共有結合させ、ラットに経口投与した後、全身取込みが改善されたと報告された。
【０１４６】
植物レクチンのほか、微生物性接着因子および侵入因子が、本発明の粘膜送達方法および組成物において接着性／選択的輸送キャリヤーとして使用するための豊富な候補供給源を提供する。細菌の接着プロセスには2種類の成分、細菌’アドヘシン’（接着または定着因子）および宿主細胞表面の受容体が必要である。粘膜感染を引き起こす細菌は、それ自体が上皮表面に付着する前に粘液層を透過する必要がある。この接着は、通常は細菌の線毛（fimbriaeまたはpilus）構造体により仲介されるが、他の細胞表面構成要素もこのプロセスに関与する可能性がある。接着性細菌は、ターゲット細胞内での信号伝達機序を介した増殖および一連の生化学反応の開始により、粘膜上皮にコロニー形成する（毒素の補助を受けて、または受けずに）。これらの侵入機序に関連して、多様な細菌およびウイルスが産生する多様な生体接着性タンパク質（たとえばインベイシン（invasin）、インターナリン（internalin））が知られている。これらにより、それらの微生物は宿主種に、さらには特定のターゲット組織にすら、著しい選択性で細胞外接着することができる。そのような受容体-リガンド相互作用により伝達される信号が、エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスのプロセスにより、無傷の生存微生物を上皮細胞内へ、また場合によるそれを通して輸送する引き金となる。粘膜上皮内もしくはそれを通した、および／または指定した他の薬物作用ターゲット部位への生物活性化合物の送達を増大させるために、そのような自然現象を本発明の教示に従って利用することができる（たとえばY2受容体結合ペプチドなどの生物活性物質とアドヘシンの複合体形成による）。
【０１４７】
特異的なレクチン様の様式で上皮表面に結合する多様な細菌性および植物性毒素も、本発明の方法および組成物に有用である。たとえばジフテリア毒素（DT）はRMEにより宿主細胞に速やかに侵入する。同様に大腸菌（E. coli）易熱性毒素のBサブユニットは、腸上皮細胞の刷子縁にレクチン様の様式で高特異的に結合する。インビボおよびインビトロで腸細胞の側底側へのこの毒素の取込みおよびトランスサイトーシスが報告されている。他の研究で、ジフテリア毒素の膜貫通ドメインをマルトース結合融合タンパク質として大腸菌において発現させ、それを化学的に高分子量ポリ-L-リシンに結合させた。得られた複合体を用いてインビトロでレポーター遺伝子のインターナリゼーションを仲介させるのに成功した。これらの例のほか、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、スーパー抗原および毒素の両方として作用する一組のタンパク質（たとえばスタフィロコッカスエンテロトキシンA（SEA）、SEB、毒素ショック症候群トキシン１（TSST-1））を産生する。これらのタンパク質に関する研究で、Caco-2細胞におけるSEBおよびTSST-1の用量依存性の促進トランスサイトーシス促進が報告された。
【０１４８】
ウイルスヘマグルチニンは、本発明の方法および組成物において生物活性物質の粘膜送達を促進するための他のタイプの輸送剤を構成する。多くのウイルス感染の初期段階は、粘膜細胞への表面タンパク質（ヘマグルチニン）の結合である。これらの結合タンパク質は、レトロウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、アデノウイルス、ジャガイモ葉捲病ウイルス、およびレオウイルスを含めた大部分のウイルスについて同定されている。これらおよび他のウイルスヘマグルチニンの例を、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体との組合わせ配合物（たとえば混合物またはコンジュゲート配合物）または協調投与プロトコルにおいて、１種類以上の生物活性物質の粘膜送達を協調促進するために使用できる。あるいは、ウイルスヘマグルチニンを組合わせ配合物または協調投与プロトコルに用いて、他の生物活性物質の送達を促進し、または促進せずに、１種類以上のY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体の粘膜送達を直接増大させることができる。
【０１４９】
多様な内因性の選択的輸送仲介因子も本発明に利用できる。哺乳動物細胞は、特異的基質のインターナリゼーションを促進し、これらを特定のコンパートメントへ向けるための、一連の機序を発達させた。これらの膜変形プロセスはまとめて’エンドサイトーシス’と呼ばれ、食作用、飲作用、受容体仲介エンドサイトーシス（クラスリン仲介RME）、およびポトサイトーシス（非クラスリン仲介RME）からなる。RMEは高特異的な細胞生物プロセスであり、その名称が示すように、これによって多様なリガンドが細胞表面受容体に結合し、次いでインターナリゼーションされ、細胞内で転送される。多くの細胞においてエンドサイトーシスのプロセスは活発であるため、膜表面全体が半時間以内にインターナリゼーションされて交換される。それらの細胞膜内配向に基づいて、2クラスの受容体が提唱されている；Ｉ型受容体のアミノ末端は膜の細胞外側に位置し、これに対しII型受容体はこの同じタンパク質テイルを細胞内環境中にもつ。
【０１５０】
本発明のさらに他の態様は、粘膜送達される生物活性物質のキャリヤーまたはRME刺激剤としてトランスフェリンを使用する。80kDaの鉄輸送糖タンパク質であるトランスフェリンは、RMEにより細胞に効率的に取り込まれる。トランスフェリン受容体は大部分の増殖細胞表面にみられ、赤芽球および多種類の腫瘍にはより多数みられる。トランスフェリン（Tf）およびトランスフェリンコンジュゲートのトランスサイトーシスは、報告によれば真菌代謝産物ブラフェルディンA（BFA）の存在下で増大する。他の研究で、BFA処理はMDCK細胞においてリシン（ricin）およびHRPの頂端側エンドサイトーシスを速やかに増大させると報告された。したがって、薬剤を組合わせ配合（たとえばコンジュゲート）および／または協調投与する本発明方法において、Y2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体を含めた生物活性物質の受容体仲介輸送を増大させるために、受容体仲介輸送を刺激するBFAおよび他の物質を使用できる。
【０１５１】
ポリマー系の送達ビヒクルおよび方法
本発明のある態様において、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質、ならびに前記の送達促進剤を、個別に、または組み合わせて、キャリヤーまたは基剤として機能する生体適合性ポリマーを含有する粘膜（たとえば鼻腔）投与配合物に装入する。そのようなポリマー系キャリヤーには、他のポリマー形態のうち、ポリマー粉末、マトリックスまたは微粒子状の送達ビヒクルが含まれる。ポリマーは植物、動物または合成に由来するものであってよい。しばしばポリマーは架橋される。さらにこの送達系において、Y2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体を、ポリマーに共有結合できるように官能化し、単なる洗浄によりポリマーから分離しないようにすることができる。他の態様において、生物活性物質および／または送達促進剤を分解または不活性化する可能性のある酵素その他の物質の阻害剤で、ポリマーを化学修飾する。ある配合物において、ポリマーは部分的または完全に水不溶性であるが水膨潤性であるポリマー、たとえばヒドロゲルである。本発明のこの態様に有用なポリマーは、有意量の水を吸収するために水と相互作用性および／または親水性であることが望ましく、それらは水との平衡状態に達するのに十分な期間、水または水性環境と接触した場合、しばしばヒドロゲルを形成する。より詳細な態様において、ポリマーはヒドロゲルであり、室温で水に暴露されて過剰の水と接触した場合に、平衡状態で少なくともその重量の2倍の水を吸収する；USP 6,004,583。
【０１５２】
生分解性ポリマーをベースとする薬物送達系が多くの生物医薬用として好ましい。そのような系は加水分解または酵素反応により無毒性分子に分解するからである。分解速度は、生分解性ポリマーマトリックスの組成を操作することにより制御される。したがって、これらのタイプの系をある設定では生物活性物質の長期放出に利用できる。ポリ（グリコール酸）（PGA）、ポリ（乳酸）（PLA）およびポリ（D,L-乳酸-co-グリコール酸）（PLGA）などの生分解性ポリマーは有望な薬物送達キャリヤーとしてかなり注目されている。これらのポリマーの分解生成物は毒性が低いことが認められたからである。身体の正常な代謝機能において、これらのポリマーは二酸化炭素と水に分解する。これらのポリマーは卓越した生体適合性も示す。
【０１５３】
本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質、ならびに任意の送達促進剤の生物活性を持続させるために、これらの薬剤をポリマーマトリックス、たとえばポリオルトエステル、ポリアンヒドリドまたはポリエステルに装入することができる。これにより、たとえばポリマーマトリックスの分解により測定して、活性物質（１以上）の持続的な活性および放出が得られる。生物療法分子を合成ポリマーの内側に封入してそれらを貯蔵および送達に際して安定化することができるが、ポリマーベースの放出技術の最大の障害は、しばしば熱、超音波処理または有機溶剤を伴う配合プロセス中の療法分子の活性損失である。
【０１５４】
本発明に用いるものとして考慮される吸収促進ポリマーには、前記タイプのポリマーの誘導体および化学的または物理的に修飾した変異形、ならびに他の天然または合成ポリマー、ガム、樹脂および他の物質、ならびにこれらの物質相互または他のポリマーとのブレンドを含めることができる。ただし、これらの変更、修飾またはブレンディングは、有用な用途の目的特性、たとえば吸水性、ヒドロゲル形成性および／または化学的安定性に不都合な影響を及ぼさないものである。より詳細な本発明の態様において、ナイロン、アクリランその他の普通は疎水性である合成ポリマーなどのポリマーを、水膨潤性にする反応および／または水性媒質中で安定なゲルを形成する反応によって十分に修飾できる。
【０１５５】
本発明の吸収促進ポリマーには、下記のビニルモノマーの多様な組合わせに基づくホモポリマーおよびコポリマーのグループからのポリマーを含めることができる：アクリル酸類およびメタクリル酸類、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸またはメタクリル酸ヒドロキシエチル、ビニルピロリドン、ならびにポリビニルアルコールおよびそのコポリマーおよびターポリマー、ポリ酢酸ビニル、それと前記モノマーとのコポリマーおよびターポリマー、ならびに2-アクリルアミド-2-メチル-フロパンスルホン酸（AMPS、登録商標）。きわめて有用なものは、前記モノマーとたとえば下記の共重合可能な官能性モノマーとのコポリマーである：アクリルまたはメタクリルアミド、アクリル酸またはメタクリル酸エステル：エステル基は直鎖または分枝鎖アルキル、最高4個の芳香環をもつアリール（炭素原子1-6個のアルキル置換基を含むことができる）から誘導される；ステロイド系、スルフェート系、ホスフェート系またはカチオン性のモノマー、たとえばN,N-ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノアルキル、（メタ）アクリルオキシアルキルトリメチルアンモニウムクロリド、（メタ）アクリルオキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド。
【０１５６】
本発明に用いる他の吸収促進ポリマーは、デキストラン、デキストリンとして分類されるもの、ならびに天然ゴムおよび樹脂として分類されるクラスの物質からのもの、または天然ポリマーのクラスからのもの、たとえば加工されたコラーゲン、キチン、キトサン、プララン（pullalan）、ズーグラン（zooglan）、アルギナートおよび改質アルギナート、たとえば”Kelcoloid”（ポリプロピレングリコール改質アルギナート）、ゲランガム、たとえば”Kelocogel”、キサンタンガム、たとえば”Keltrol”、エラスタチン、α ヒドロキシブチラートおよびそのコポリマー、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリ乳酸およびポリグリコール酸。
【０１５７】
本発明に使用できるきわめて有用なクラスのポリマーは、少なくとも１つの活性化された炭素-炭素オレフィン性二重結合および少なくとも１個のカルボキシル基を含むオレフィン性不飽和カルボン酸；すなわちそれがモノマー分子中に存在することにより重合に際して容易に機能するオレフィン性二重結合を、カルボキシル基に対してα-β位に、または末端メチレン基の一部として含む酸に容易に変換する酸または官能性グループである。このクラスのオレフィン性不飽和酸には、アクリル酸そのものを代表例とするアクリル酸類、α-シアノアクリル酸、β-メタクリル酸（クロトン酸）、α-フェニルアクリル酸、β-アクリルオキシプロピオン酸、ケイ皮酸、p-クロロケイ皮酸、1-カルボキシ-4-フェニルブタジエン-1,3、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニチン酸、マレイン酸、フマル酸、およびトリカルボキシエチレンが含まれる。本明細書中で用いる用語”カルボン酸”には、ポリカルボン酸およびそれらの酸無水物、たとえば無水マレイン酸が含まれる。酸無水物基は、同一カルボン酸分子にある2個のカルボキシル基から１分子の水が離脱することにより形成される。
【０１５８】
本発明において吸収促進剤として有用な代表的アクリラートには、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸メチル、エタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸2-エチルヘキシル、アクリル酸ノニル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸n-ヘキシルなどが含まれる。アクリル酸高級アルキルエステルは、アクリル酸デシル、メタクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸ベヘニルおよびアクリル酸ミリスチル、ならびにそのメタクリル酸形である。2もしくは3またはそれ以上の種類の長鎖アクリルエステルの混合物をカルボン酸モノマーのいずれかと重合させることができる。他のコモノマーにはオレフィン類が含まれ、これにはα-オレフィン、ビニルエーテル、ビニルエステル、およびその混合物が含まれる。
【０１５９】
アクリルニトリルを含めた他のビニリデンモノマーも、１種類以上のY2受容体結合ペプチド、タンパク質、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の送達および吸収を増大させるために、本発明の方法および組成物中に吸収促進剤として使用できる。これには対象のターゲット組織またはコンパートメント（たとえば粘膜上皮、肝臓、門脈、CNS組織もしくは体液、または血漿）への活性物質の送達を増大させることも含まれる。有用なα,β-オレフィン性不飽和ニトリルは好ましくは、3-10個の炭素原子をもつモノオレフィン性不飽和ニトリル、たとえばアクリロニトリル、メタクリロニトリルなどである。最も好ましいものは、アクリロニトリルおよびメタクリロニトリルである。3-35個の炭素原子を含むアクリルアミド（モノオレフィン性不飽和アミドを含む）も使用できる。代表的アミドには下記のものが含まれる：アクリルアミド、メタクリルアミド、N-t-ブチルアクリルアミド、N-シクロヘキシルアクリルアミド、高級アルキルアミド（窒素上のアルキル基が8-32個の炭素原子を含む）、α,β-オレフィン性不飽和カルボン酸のN-アルキロールアミドを含めたアクリルアミド：4-10個の炭素原子をもつもの、たとえばN-メチロールアクリルアミド、N-プロパノールアクリルアミド、N-メチロールメタクリルアミド、N-メチロールマレイミド、N-メチロールマレアミド酸エステル、N-メチロール-p-ビニルベンズアミドなど。
【０１６０】
さらに他の有用な吸収促進物質は下記のものである：2-18個の炭素原子、より好ましくは2-8個の炭素原子を含むα-オレフィン；4-10個の炭素原子を含むジエン；ビニルエステルおよびアリルエステル、たとえば酢酸ビニル；ビニル芳香族化合物、たとえばスチレン、メチルスチレンおよびクロロ-スチレン；ビニルおよびアリルエーテルおよびケトン、たとえばビニルメチルエーテルおよびメチルビニルケトン；クロロアクリラート；アクリル酸シアノアルキル、たとえばアクリル酸α-シアノメチル、ならびにアクリル酸α-、β-およびγ-シアノプロピル；アクリル酸アルコキシ、たとえばアクリル酸メトキシエチル；ハロアクリラート、たとえばアクリル酸クロロエチル；ハロゲン化ビニルおよび塩化ビニル、塩化ビニリデンなど；ジビニル、ジアクリラートその他の多官能性モノマー、たとえばジビニルエーテル、ジアクリル酸ジエチレングリコール、ジメタクリル酸ジエチレングリコール、メチレン-ビス-アクリルアミド、アリルペンタエリトリトールなど；ならびにビス(β-ハロアルキル)アルケニルホスホナート、たとえばビス(β-クロロエチル)ビニリデンホスホナートなど；これらは当業者に既知である。カルボキシ含有モノマーが副成分であって、主成分として他のビニリデンモノマーが存在するコポリマーは、本明細書に開示する方法に従って容易に製造される。
【０１６１】
ヒドロゲルを本発明において吸収促進剤として用いる場合、これらは水と相互作用性および膨潤性であるアクリル酸およびメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸ヒドロキシエチル（HEA）またはメタクリル酸ヒドロキシエチル（HEMA）、ならびにビニルピロリドンの群からの合成コポリマーを含むことができる。特にペプチドまたはタンパク質の送達に有用なポリマーの具体例は下記のタイプのポリマーである：（メタ）アクリルアミドおよび0.1-99重量％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-75重量％の（メタ）アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-75重量％の（メタ）アクリルアミド；アクリル酸および0.1-75重量％の（メタ）アクリル酸アルキル；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-75重量％のAMPS.RTM（Lubrizol Corp.の商標）；（メタ）アクリルアミドおよび0-30重量％のアルキル（メタ）アクリルアミドおよび0.1-75重量％のAMPS.RTM；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-99重量％のHEMA；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-75重量％のHEMAおよび0.1-99重量％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸および0.1-99重量％のHEMA；50モル%のビニルエーテルおよび50モル%の無水マレイン酸；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-75重量％の（メタ）アクリルオキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；（メタ）アクリルアミドおよび0.1-99重量％のビニルピロリドン；（メタ）アクリルアミドおよび50重量％のビニルピロリドンおよび0.1-99重量％の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸および0.1-75重量％のAMPS.RTMおよび0.1-75重量％のアルキル（メタ）アクリルアミド。前記の例において、アルキルはC1-C30、好ましくはC1-C22の直鎖および分枝鎖、ならびにC4-C16の環状であり；（メタ）を用いた場合、それはメチル基を含むモノマーと含まないモノマーが含まれることを意味する。他のきわめて有用なヒドロゲルポリマーは、膨潤性であるが不溶性の形のポリ（ビニルピロリドン）デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびポリビニルアルコールである。
【０１６２】
本発明に有用な他のポリマー系ヒドロゲル材料には、下記のものが含まれる：（ポリ）ヒドロキシアルキル（メタ）アクリラート；アニオン性およびカチオン性ヒドロゲル；ポリ（電解質）複合体；残留アセテートの低いポリ（ビニルアルコール）；架橋寒天と架橋カルボキシメチルセルロースの膨潤性混合物；わずかに架橋した寒天と混合したメチルセルロースを含む膨潤性組成物；微細に分割された、無水マレイン酸とスチレン、エチレン、プロピレンまたはイソブチレンのコポリマーの分散液により調製した水膨潤性コポリマー；N-ビニルラクタムの水膨潤性ポリマー；カルボキシメチルセルロースの膨潤性ナトリウム塩など。
【０１６３】
本発明の生物活性物質を粘膜送達するための親水性ヒドロゲルを形成するのに有用な他のゲル化性の流体吸収および保持性ポリマーには、下記のものが含まれる：ペクチン；多糖類、たとえば寒天、アラビアゴム、カラヤゴム、トラガカントゴム、アルギン類およびグアーゴム、ならびにそれらの架橋形；アクリル酸のポリマー、コポリマーおよび塩誘導体、ポリアクリルアミド；水膨潤性インデン無水マレイン酸ポリマー；デンプン架橋コポリマー；原重量の約2-400倍の吸水能をもつアクリラートタイプのポリマーおよびコポリマー；ポリグルカンのジエステル；架橋ポリ（ビニルアルコール）とポリ（N-ビニル-2-ピロリドン）の混合物；ポリオキシブチレン-ポリエチレンブロックコポリマーゲル；イナゴマメガム（carob gum）；ポリエステルゲル；ポリウレアゲル；ポリエーテルゲル；ポリアミドゲル；ポリイミドゲル；ポリペプチドゲル；ポリアミノ酸ゲル；ポリセルロースゲル；架橋インデン-無水マレイン酸アクリラートポリマー；ならびに多糖類。
【０１６４】
本発明に用いる合成ヒドロゲルポリマーは、数種類のモノマーを数種類の比率で無限に組み合わせることにより製造できる。ヒドロゲルは架橋することができ、一般に流体を吸収（imbibe, absorb）して拡張した平衡状態にまで膨潤または膨張することができる。ヒドロゲルは一般に、鼻粘膜表面に送達した際に、その重量の約2-5倍、5-10倍、10-50倍、最高50-100倍、またはそれ以上の水を吸収して膨潤または膨張する。そのヒドロゲルに関する最適膨潤度は、種々の生物活性物質について、ポリマー内に保有または捕獲または封入される活性物質の分子量、サイズ、溶解度および拡散特性、ならびに各ポリマーに関連する個々のスペーシングおよび協調した鎖運動などの要因に応じて決まるであろう。
【０１６５】
本発明に有用な親水性ポリマーは、水不溶性であるが、水膨潤性である。そのような水膨潤ポリマーを一般にヒドロゲルまたはゲルと呼ぶ。そのようなゲルは、水溶性ポリマーから、それらのポリマーを適切な架橋剤で架橋するプロセスにより、簡便に調製できる。しかし、個々のポリマーから、特定のpH、温度および／またはイオン濃度条件下で、当技術分野で既知の方法に従って安定なヒドロゲルを形成することもできる。一般にポリマーを架橋させる。すなわちポリマーが良好な親水性を保持し、改善された物理的統合性をもち（架橋していない同一または類似のタイプのポリマーと比較して）、かつゲル網目構造内に目的の生物活性物質およびそれと共投与するための他の化合物（たとえばサイトカインまたは酵素阻害剤）の両方を保持する改善された能力を示し、一方では活性物質（１以上）を適切な部位および時間で放出する能力を保持する程度に架橋させる。
【０１６６】
一般に、本発明に用いるヒドロゲルポリマーを、コポリマー形成モノマーの重量に対して0.01-25重量％の量の二官能性架橋剤、より好ましくは0.1-20重量％、より多くの場合0.1-15重量％の架橋剤で架橋させる。他の有用な架橋剤量は0.1-10重量％である。三官能性、四官能性またはそれ以上の多官能性架橋剤も使用できる。そのような架橋剤を用いる場合、均等な架橋密度、すなわち生物活性物質（１以上）を効果的に内包するのに十分な架橋度または網目特性を達成するためには、低い量の方が必要であろう。
【０１６７】
架橋剤は、水を含有する流体の存在下で膨潤する能力をもつポリマーと共有結合、イオン結合または水素結合することができる。そのような架橋剤および架橋反応は当業者に既知であり、多くの場合そのポリマー系に依存する。たとえば架橋網目構造は、不飽和モノマーの遊離基共重合により形成できる。ポリマーヒドロゲルは、ポリマーにある官能基（たとえばアルコール、酸、アミン）とグリオキサール、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド、ビスアンヒドリドなどの基を反応させることにより予備形成したポリマーを架橋させることによっても形成できる。
【０１６８】
ポリマーをいずれかのポリエンと架橋させることもできる：たとえばデカジエンまたはトリビニルシクロヘキサン；アクリルアミド、たとえばN,N-メチレン-ビス(アクリルアミド)；多官能性アクリラート、たとえばトリアクリル酸トリメチロールプロパン；または少なくとも2個の末端CH2＜基を含む多官能性ビニリデンモノマー：たとえばジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アクリル酸アリルなどを含む。ある態様において、コポリマーの製造に用いる架橋用モノマーは、分子当たり１個より多いアルケニルエーテル基をもつポリアルケニルポリエーテルであり、これらは所望により末端メチレン基に結合したオレフィン性二重結合が存在するアルケニル基をもつことができる（たとえば少なくとも2個の炭素原子および少なくとも2個のヒドロキシル基を含む多価アルコールのエーテル化により製造）。このクラスの化合物は、ハロゲン化アルケニル、たとえば塩化アリルまたは臭化アリルを、１種類以上の多価アルコールの強アルカリ水溶液と反応させることにより製造できる。生成物は、異なる数のエーテル基をもつポリエーテルの複雑な混合物の可能性がある。ポリエーテル系架橋剤の有効性は、その分子にある重合有効基の数に伴って増大する。一般に分子当たり平均2個以上のアルケニル基を含むポリエーテルを用いる。他の架橋用モノマーには、たとえばジアリルエステル、ジメタリルエーテル、アクリル酸アリルまたはメタリル、およびアクリルアミド、テトラビニルシラン、ポリアルケニルメタン、ジアクリラートおよびジメタクリラート、ジビニル化合物、たとえばジビニルベンゼン、ポリアリルホスフェート、ジアリルオキシ化合物およびホスファイトエステルなどが含まれる。代表的な架橋剤はアリルペンタエリトリトール、アリルスクロース、トリメチロールプロパントリアクリラート、1,6-ヘキサンジオールジアクリラート、トリメチロールプロパンジアリルエーテル、ペンタエリトリトールトリアクリラート、テトラメチレンジメタクリラート、エチレンジアクリラート、エチレンジメタクリラート、トリエチレングリコールジメタクリラートなどである。アリルペンタエリトリトール、トリメチロールプロパンジアリルエーテルおよびアリルスクロースが適切なポリマーを提供する。架橋剤が存在する場合、ポリマー混合物は通常は、カルボン酸モノマーと他のモノマーの合計に対して約0.01-20重量％、たとえば1重量％、5重量％、10重量％またはそれ以上の架橋用モノマーを含有する。
【０１６９】
より詳細な本発明の態様において、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の粘膜送達は、徐放作用または酵素保護もしくは生理的保護作用をもつキャリヤーまたはビヒクル中、たとえば活性物質を分解酵素の作用から遮蔽するヒドロゲル中に活性物質（１以上）を保持することにより増大する。ある態様においては、活性物質を化学的手段でキャリヤーまたはビヒクルに結合させ、これに他の物質、たとえば酵素阻害剤、サイトカインなどを混合または結合させることもできる。あるいは、活性物質をキャリヤーまたはビヒクル内、たとえばポリマーマトリックス内に物理的に十分に捕獲することにより固定化してもよい。
【０１７０】
本発明に有用なヒドロゲルなどのポリマーは、官能性結合した物質、たとえばそれに配合した活性物質の鼻腔内生物学的利用能を増大させるためにポリマーに化学的に取り込ませたグリコシドを含むことができる。そのようなグリコシドの例は、グルコシド、フルクトシド、ガラクトシド、アラビノシド、マンノシド、およびそれらのアルキル置換誘導体、ならびに天然グリコシド、たとえばアルブチン、フロリジン、アミグダリン、ジギトニン、サポニンおよびインジカンである。代表的なグリコシドをポリマーに結合させる幾つかの方法がある。たとえばグリコシドまたは他の類似炭水化物のヒドロキシル基の水素を、ヒドロゲルポリマーからのアルキル基で交換して、エーテルを形成することができる。同様に、グリコシドのヒドロキシル基をポリマーヒドロゲルのカルボキシル基とその場で反応させてエステル化し、ポリマーエステルを形成することができる。他の方法は、アセトブロモグルコースと、マレイン酸コポリマー上のコレスト-5-エン-3β-オールの縮合を利用するものである。N-置換ポリアクリルアミドは、活性化ポリマーとω-アミノアルキルグリコシドの反応により合成できる：(1)(炭水化物-スペーサー)(n)-ポリアクリルアミド、'擬多糖類'；(2)(炭水化物-スペーサー)(n)-ホスファチジルエタノールアミン(m)-ポリアクリルアミド、ネオ糖脂質、ホスファチジルエタノールアミン誘導体；(3)(炭水化物-スペーサー)(n)-ビオチン(m)-ポリアクリルアミド。これらのビオチニル化誘導体を粘膜表面のレクチンに結合させて生物活性物質、たとえばポリマー封入したY2受容体結合ペプチドの吸収を促進することができる。
【０１７１】
より詳細な本発明の態様において、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質、ならびに所望により第2の活性物質、たとえばプロテアーゼ阻害剤（１以上）、サイトカイン（１以上）、さらに細胞内結合生理の調節剤（１以上）などを含むものを修飾して、ポリマー系のキャリヤーまたはマトリックスに結合させることができる。これはたとえば、ペプチドまたはタンパク質である活性物質および他の任意物質（１以上）を架橋ポリマー網目構造内に化学結合させることにより達成できる。ポリマーを別個に相互作用性物質、たとえばグリコシダール含有分子で化学修飾することもできる。ある態様においては、生物活性物質（１以上）および第2の活性物質（１以上）を官能化することができる。すなわちこの場合、適切な反応基を同定し、または活性物質（１以上）に化学的に付加する。最も多くの場合、エチレン性重合基を付加し、次いでこの官能化された活性物質とモノマーおよび架橋剤を、標準的重合法、たとえば溶液重合（通常は水）、乳化重合、懸濁重合または分散重合により共重合させる。官能化剤は活性物質（１以上）上の数箇所を官能化するのに十分な高濃度の官能基または重合基を備えている場合がしばしばある。たとえば16のアミン部位を含むポリペプチドの場合、一般に少なくとも2、4、5、7、および最高8個またはそれ以上の部位を官能化することが望ましい。
【０１７２】
官能化の後、官能化した活性物質（１以上）と、目的ポリマーを形成する試薬を含むモノマーおよび架橋剤とを混合する。次いでこの媒質中で重合を誘導して、結合した活性物質（１以上）を含有するポリマーを形成する。次いでポリマーを水または他の適切な溶剤で洗浄し、あるいは精製して微量の未反応不純物を除去し、必要であれば撹拌などの物理的手段、メッシュへの強制通過、超音波処理その他の適切な手段で粉砕または破砕して目的の粒径にする。次いで、活性物質（１以上）を変性そのほか劣化させない方法で溶剤（通常は水）を除去する。望ましい１方法は凍結乾燥であるが、他の方法もあり、利用できる（たとえば真空乾燥、風乾、噴霧乾燥など）。
【０１７３】
ペプチド、タンパク質その他の活性物質に重合基を導入するためには、利用できるアミノ、ヒドロキシ、チオールその他の反応基と、不飽和基を含む求電子試薬を反応させることができる。たとえば、N-ヒドロキシスクシンイミジル基を含む不飽和モノマー、活性カーボネート、たとえば炭酸p-ニトロフェニル、炭酸トリクロロフェニル、トレシラート（tresylate）、オキシカルボニルイミダゾール、エポキシド、イソシアナートおよびアルデヒド、ならびに不飽和カルボキシメチルアジドおよび不飽和オルトピリジル-ジスルフィドがこのカテゴリーの試薬に属する。不飽和試薬の具体例は、アリルグリシジルエーテル、塩化アリル、臭化アリル、ヨウ化アリル、塩化アクリロイル、イソシアン酸アリル、塩化アリルスルホニル、無水マレイン酸、無水マレイン酸とアリルエーテルのコポリマーなどである。
【０１７４】
アルデヒド以外のリシン活性誘導体はすべて、局所環境によりこれらの基の求核性が高まれば、一般に他のアミノ酸、たとえばヒスチジンのイミダゾール基およびチロシンのヒドロキシル基およびシスチンのチオール基と反応することができる。アルデヒドを含有する官能化試薬はリシンに特異的である。リシン、システイン、チロシンから得られる基についてのこれらのタイプの反応は文献に広く記載されており、当業者に既知である。
【０１７５】
アミン基を含む生物活性物質の場合、それらの基とアシロイルクロリド類、たとえばアクリロイルクロリドを反応させ、この反応した物質に重合性アクリル基を導入することが好都合である。次いでポリマーの製造中、たとえばアクリルアミドとアクリル酸のコポリマーの架橋中に、前記の官能化した活性物質をアクリル基によりポリマーに結合させると、ポリマーに結合した状態になる。
【０１７６】
本発明の他の態様においては、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、およびインビボで活性である他の分子を、ポリマーの一体部分として親水性部分（たとえば線状ポリアルキレングリコール）と親油性部分の両方を含むポリマーに１種類以上の活性物質を共有結合させることによりコンジュゲーション安定化する（たとえばUSP 5,681,811参照）。１態様においては、生物活性物質と下記を含むポリマーを共有結合させる：(i)線状ポリアルキレングリコール部分および(ii)親油性部分；その際、活性物質、線状ポリアルキレングリコール部分および親油性部分は、有効療法物質が酵素分解に対する増大したインビボ抵抗性（すなわち、それに結合したポリマーを含まない非コンジュゲート形における同様な条件下での安定性と比較して）をもつように互いに立体的に配置される。他の態様においてコンジュゲーション安定化した配合物は、下記を含むポリソルベート複合体と共有結合した生物活性物質からなる三次元コンホメーションをもつ：(i)線状ポリアルキレングリコール部分および(ii)親油性部分；その際、活性物質、線状ポリアルキレングリコール部分および親油性部分は、(a)親油性部分が三次元コンホメーションの外側にあり、(b)組成物の内にある活性物質が酵素分解に対して増大したインビボ抵抗性をもつように、互いに立体的に配置される。
【０１７７】
他の関連態様においては多重リガンドコンジュゲート複合体が提供され、これは生物活性物質が、トリグリセリド主鎖部分の炭素原子と結合したポリアルキレングリコールスペーサー基を介してトリグリセリド主鎖部分と共有結合し、かつ少なくとも１つの脂肪酸部分が、トリグリセリド主鎖部分の炭素原子に直接に、またはポリアルキレングリコールスペーサー部分を介して、共有結合している（たとえばUSP 5,681,811参照）。そのような多重リガンドコンジュゲート療法薬複合体において、トリグリセリド生物活性部分のα'およびβ炭素原子は脂肪酸部分をもち、これはトリグリセリドに直接に共有結合し、またはポリアルキレングリコールスペーサー部分を介して間接的に共有結合している。あるいは、脂肪酸部分は直接にまたはポリアルキレングリコールスペーサー部分を介してトリグリセリド主鎖部分のαおよびα'炭素に結合し、生物活性療法薬はトリグリセリド主鎖部分のγ炭素と共有結合し、その際トリグリセリドに直接共有結合しているか、またはポリアルキレングリコールスペーサー部分を介して間接的に結合してもよい。本発明の範囲で、トリグリセリド主鎖部分を含む多重リガンドコンジュゲート療法薬複合体について、多様な構造、組成およびコンホメーション形態が可能であることは認識されるであろう。さらに本発明の範囲で、そのような多重リガンドコンジュゲート療法薬複合体において、生物活性物質（１以上）を、アルキルスペーサー基または他の許容できるスペーサー基を介してトリグリセリド修飾主鎖部分と有利に共有結合させうることも認識される。そのような関係において用いるスペーサー基の許容性とは、立体的、組成的、および最終用途特異的な許容性を表わす。
【０１７８】
本発明のさらに他の態様においては、コンジュゲーション安定化した複合体が提供され、これはトリグリセリド主鎖部分を含有する、ポリソルベート部分を含むポリソルベート複合体を含む；主鎖のα、α'およびβ炭素原子に、(i)脂肪酸基；および(ii)ポリエチレングリコール基を含む官能化基が共有結合し、生物活性物質または部分がそれに共有結合している：たとえばポリエチレングリコール基の適宜な官能基に結合している。そのような共有結合はたとえばポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端官能基に直接であってもよく、あるいは共有結合は間接的であって、たとえばポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端を末端カルボキシ官能性スペーサー基で反応性キャッピングし、したがって得られるキャッピングされたポリエチレングリコール基は末端カルボキシ官能基をもち、これに生物活性物質または部分が共有結合してもよい。
【０１７９】
本発明のさらに他の態様においては、安定な水溶性コンジュゲーション安定化した複合体が提供され、これは本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質が生理的適合性ポリエチレングリコール（PEG）修飾した糖脂質部分に共有結合したものを含む。そのような複合体において生物活性物質（１以上）は、生理的適合性PEG修飾した糖脂質部分に、活性物質の遊離アミノ酸基における不安定共有結合により共有結合させることができ、この不安定共有結合はインビボで生化学的加水分解および／またはタンパク質分解により切断可能なものである。生理的適合性PEG修飾した糖脂質部分には、有利にはポリソルベートポリマー、たとえばモノパルミテート、ジパルミテート、モノラウレート、ジラウレート、トリラウレート、モノオレエート、ジオレエート、トリオレエート、モノステアレート、ジステアレート、およびトリステアレートよりなる群から選択される脂肪酸エステル基を含む、ポリソルベートポリマーが含まれる。そのような複合体において、生理的適合性PEG修飾した糖脂質部分は、適切には脂肪酸のポリエチレングリコールエーテル、および脂肪酸のポリエチレングリコールエステルよりなる群から選択されるポリマーが含まれる。その際、脂肪酸はたとえばラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、およびステアリン酸よりなる群から選択される脂肪酸を含む。
【０１８０】
材料の保存
本発明のある態様において、本発明の組合わせ配合物および／または協調投与方法には有効量のペプチドおよびタンパク質を使用する。これらは、荷電したガラスに付着することにより容器内で有効濃度が低下する可能性がある。ガラス容器へのポリペプチドまたはタンパク質の吸着を減らすために、シラン化した容器、たとえばシラン化ガラス容器を用いて最終製剤を保存する。
【０１８１】
本発明のさらに他の態様において、哺乳動物対象を処置するためのキットは、哺乳動物対象へ粘膜送達するために配合した１種類以上のY2受容体結合ペプチド化合物の安定な医薬組成物を含み、この組成物は肥満症、癌、または癌関連の栄養障害もしくは衰弱のうち１種類以上の症状を、許容できない有害な副作用なしに軽減するのに有効である。キットはさらに、１種類以上のY2受容体結合ペプチド化合物を収容するための医薬用バイアルを含む。医薬用バイアルは医薬用ポリマー、ガラスまたは他の適切な材料からなる。医薬用バイアルは、たとえばシラン化ガラスバイアルである。キットはさらに、組成物を対象の鼻粘膜表面へ送達するための開口を含む。送達用開口は、医薬用ポリマー、ガラスまたは他の適切な材料からなる。送達用開口は、たとえばシラン化ガラスバイアルである。
【０１８２】
シラン化技術は、シラン化すべき表面の特殊な清浄技術と低圧シラン化法を組み合わせたものである。シランは気相であり、高められた表面温度で表面をシラン化する。この方法は、単層の特性をもつ安定で均一な機能性シラン層を備えた再現性のある表面を提供する。シラン化した表面は、本発明のポリペプチドまたは粘膜送達促進剤がガラスに結合するのを防ぐ。
【０１８３】
この方法は、本発明のY2受容体結合ペプチド組成物を収容するシラン化した医薬用バイアルを製造するのに有用である。ガラストレーを使用前に2回蒸留水（ddH2O）ですすぐことにより清浄にする。次いでシラントレーを95% EtOHですすぎ、アセトントレーをアセトンですすぐ。医薬用バイアルをアセトン中で10分間、超音波処理する。アセトン超音波処理の後、医薬用バイアルをddH2Oトレー内で少なくとも2回洗浄する。医薬用バイアルを0.1M NaOH中で10分間、超音波処理する。医薬用バイアルをNaOH中で超音波処理する間に、シラン溶液をフード下で調製する（シラン溶液：800mLの95% エタノール；96Lの氷酢酸；25mLのグリシドオキシプロピルトリメトキシシラン）。NaOH溶液超音波処理の後、医薬用バイアルをddH2Oトレー内で少なくとも2回洗浄する。医薬用バイアルをシラン溶液中で3-5分間、超音波処理する。医薬用バイアルを100% EtOHトレー内で洗浄する。医薬用バイアルを予備精製N2ガスで乾燥させ、使用前に100℃のオーブン内に少なくとも2時間保存する。
【０１８４】
生体接着性送達ビヒクルおよび方法
本発明のある態様において、本発明の組合わせ配合物および／または協調投与方法は、１種類以上の生物活性物質の粘膜送達を増大させるために、有効量の無毒性生体接着剤を補助化合物またはキャリヤーとして使用する。これに関して生体接着剤は、ターゲット粘膜の１以上の構成要素または表面に対して全般的または特異的接着性を示す。生体接着剤は、粘膜内またはそれを通した生物活性物質の望ましい濃度勾配を維持し、かなり大きな分子（たとえばペプチドおよびタンパク質）を確実に粘膜上皮内へ、またはそれを通して透過させる。一般に本発明の方法および組成物に生体接着剤を用いることにより、粘膜上皮内への、またはそれを通したペプチドおよびタンパク質の透過性が、2-5倍、しばしば5-10倍増大する。この上皮透過増大により、しばしば大型高分子が効率的に経粘膜送達され、たとえば鼻上皮の基底部分へ、または隣接する細胞外コンパートメントもしくは血流またはCNS組織もしくは体液に達する。
【０１８５】
この送達増大により、生物活性ペプチド、タンパク質および他の高分子療法種の送達有効性が大幅に改良される。これらの結果は一部はこの化合物の親水性によるものであり、これにより、水不溶性化合物と比較して親水種についてより大きな透過が達成されるのであろう。これらの効果のほか、粘膜表面における薬物存続性を増大させるために生体接着剤を用いることにより、薬物遅延送達のための溜め機序が誘発され、これにより化合物は粘膜組織を透過するだけでなく、表面にある物質が枯渇すると粘膜表面へ逆拡散する。
【０１８６】
経口投与のための多様な適切な生体接着剤が当技術分野で開示されている：USP 3,972,995；4,259,314；4,680,323；4,740,365；4,573,996；4,292,299；4,715,369；4,876,092；4,855,142；4,250,163；4,226,848；4,948,580；米国再交付特許33,093；これらを本発明の新規な方法および組成物に使用できる。本発明の新規な方法および組成物における多様な生体接着性ポリマーの粘膜（たとえば鼻）送達プラットフォームとしての効力は、それらがY2受容体結合ペプチドを保持および放出する能力の測定、ならびに活性物質を取り込んだ後にそれらが粘膜表面と相互作用する能力によって容易に評価できる。さらに、選択したポリマーと粘膜投与部位の組織との生体適合性を測定する周知の方法を適用する。ターゲット粘膜が粘液で覆われている場合（すなわち粘液溶解または粘液清澄処理をしていない状態）、それは下層の粘膜上皮への連絡結合として作用できる。したがって本発明に用いる用語”生体接着剤”には、本発明の生物活性物質の粘膜送達を増大させるのに有用な粘液接着性化合物も含まれる。しかし、特に速やかな粘液クリアランスが起きる鼻腔表面では、粘液ゲル層への接着により仲介される粘膜組織への接着性接触は、粘液層と下層組織の付着が不完全または一時的であることにより制限される。これに関して、ムチン糖タンパク質は連続的に分泌され、それらは細胞または分泌腺から放出された後に粘弾性ゲルを形成する。しかし、管腔の接着性ゲル層表面は、機械的作用、酵素作用および／または毛様体作用によって連続的に侵食される。そのような活動がより顕著な部位、または長い接着時間が望まれる部位では、本発明の協調投与方法および組合わせ配合物には、前記のようにさらに粘液溶解および／または毛様体制止のための方法および物質を使用する。
【０１８７】
一般に本発明に用いる粘膜接着性ポリマーは、湿潤した粘膜組織表面に、複雑であるが非特異的な機序により接着する、天然または合成高分子である。これらの粘膜接着性ポリマーのほか、本発明は、受容体仲介相互作用を含めた特異的相互作用により、粘膜にではなく細胞表面に直接接着する生体接着剤を使用した方法および組成物をも提供する。この特異的様式で機能する生体接着剤の一例は、レクチンとして知られる化合物群である。これらは糖タンパク質であり、鼻腔内上皮細胞膜を形成する”レクチン受容体”と呼ぶことができる糖分子、たとえば糖タンパク質または糖脂質を特異的に認識してそれらに結合する能力をもつ。
【０１８８】
本発明のある態様において、生物活性物質の鼻腔内送達を増大させるための生体接着剤は、湿潤した粘膜表面に接着できる親水性、たとえば水溶性または水膨潤性のポリマーまたはポリマー混合物のマトリックスを含む。これらの接着剤は、軟膏剤、ヒドロゲル（前記を参照）、薄膜、および他の適用形態として配合できる。活性物質を徐放または局所送達するために、しばしばこれらの接着剤と生物活性物質を混合する。あるものには、鼻粘膜を通してたとえば個体の循環系内への活性物質の透過を促進するために、追加成分を配合する。
【０１８９】
天然および合成ともに多様なポリマーが、生理的条件下で粘液および／または粘膜上皮に有意の結合を示す。この相互作用の強度は、機械的剥ぎ取り試験または剪断試験によって容易に測定できる。湿潤した粘膜表面に適用すると、多くの乾燥物質が少なくともわずかには自然に付着する。そのような初期接触の後、ある親水性物質は吸着力、膨潤力または毛管力により水を引き寄せ始め、この水が下の基層またはポリマー-組織界面から吸収される場合、その接着は粘膜による生物活性物質の吸収を増大するという目標を達成するのに十分であろう。そのような’水和による接着’はかなり強い可能性はあるが、この機序を利用するように適合させる配合物には、投与物が水和漿剤に変換するのに伴って持続する膨潤を考慮しなければならない。これは、本発明に有用な多くのヒドロコロイド、特にある種のセルロース誘導体について予想される。これらは水和前状態で投与した場合、一般に非接着性である。それにもかかわらず、そのような物質を乾燥ポリマー粉末、マイクロスフェアまたはフィルムタイプの送達形態で適用した場合、粘膜投与用の生体接着性薬物送達系は本発明に有用である。
【０１９０】
他のポリマーは乾燥状態で適用した場合のみでなく、完全水和した状態、および過剰量の水の存在下で適用した場合にも粘膜表面に接着する。したがって粘膜接着剤の選択には、組織への接触を形成および維持する生理的条件および物理化学的を十分に考慮する必要がある。特に、意図する接着部位に通常存在する水または水分の量、支配するpHが各種ポリマーの粘膜接着結合強度に大きく影響することが知られている。
【０１９１】
この20年間、数種類のポリマー系の生体接着性薬物送達系が作成され、研究されてきたが、必ずしも常に成功したわけではない。しかし、現在そのようなキャリヤーが歯科、眼科および外科用として臨床用途に用いられている。たとえばアクリル系ヒドロゲルは生体接着用具に広く用いられている。アクリル系ヒドロゲルは部分膨潤状態で弾性および非摩擦性であり、接触した組織に対する損傷の原因となる摩滅が少ないため、生体接着に好適である。さらに、それらの膨潤状態での透過性が高いため、未反応モノマー、非経架橋ポリマー鎖、および開始剤は重合後のマトリックスから洗い去られる。これは本発明に用いる生体接着性物質を選択するための重要な特色である。アクリル系ポリマー用具はきわめて高い接着結合強度を示す。ペプチドおよびタンパク質薬物を制御粘膜送達するために、本発明の方法および組成物は所望によりキャリヤー、たとえばポリマー系送達ビヒクルを使用する。これは一部は生物活性物質をタンパク質分解による破壊から遮蔽する機能をもち、同時に鼻粘膜内への、またはそれを通したペプチドまたはタンパク質の透過を増大させる。これに関して、生体接着性ポリマーは経口薬物送達についてはかなりの効力を示した。一例として、ラットに粘膜接着性ポリ（アクリル酸）誘導体ポリカルボフィルの1% (w/v)食塩水分散液と一緒に十二指腸内投与した9-デスグリシンアミド、8-アルギニンバソプレッシン（DGAVP）の生物学的利用能は、このポリマーを含まないペプチド薬物の水溶液と比較して3-5倍増大した。
【０１９２】
ポリ（アクリル酸）タイプの粘膜接着性ポリマーは、ある腸プロテアーゼの有効な阻害剤である。この酵素阻害の機序は、メタロ-プロテイナーゼ、たとえばトリプシンおよびキモトリプシンの必須補因子である二価カチオン、たとえばカルシウムまたは亜鉛に対するこのクラスのポリマーの強い親和性により説明される。ポリ（アクリル酸）によりそれらの補因子からプロテアーゼを枯渇させると、酵素タンパク質の不可逆的な構造変化を誘発し、それに伴って酵素活性が失われると報告された。同時に、他の粘膜接着性ポリマー（たとえばある種のセルロース誘導体およびキトサン）は、特定の条件下ではタンパク質分解酵素を阻害できない。本発明に用いることが考慮される比較的低分子である他の酵素阻害剤（たとえばアプロチニン、ベスタチン）と異なり、阻害性ポリマーの経鼻吸収はこれらの分子のサイズからみて少ないと思われ、これにより有害な副作用の可能性が排除される。したがって、安全性の問題を考慮した場合、粘膜接着性ポリマー、特にポリ（アクリル酸）タイプのものは、吸収促進接着剤および酵素に対する保護剤の両方として作用し、ペプチドおよびタンパク質薬物の制御送達を増大させることができる。
【０１９３】
本発明に用いる生体接着剤および他のポリマー系または非ポリマー系吸収促進剤は、酵素分解に対して保護するほか、生物学的物質に対する粘膜透過性を直接増大させると思われる。鼻腔上皮バリヤーを通した大型親水性分子、たとえばペプチドおよびタンパク質の輸送増大に対して、粘膜接着性ポリマーおよび他の物質は、送達系の前粘膜滞留時間が長いことにより考慮されるものより高い透過効果を与えると推定された。報告によれば、薬物血漿中濃度の時間経過から、生体接着性マイクロスフェアが鼻粘膜を通した速やかな、ただし一時的なインスリン透過性増大を引き起こした。本発明に用いる他の粘膜接着性ポリマー、たとえばキトサンは、報告によれば、水溶液またはゲルとして適用した場合ですら、ある粘膜上皮の透過性を増大させる。上皮透過性に直接影響を及ぼすと報告された他の粘膜接着性ポリマーは、ヒアルロン酸およびそのエステル誘導体である。本発明の協調投与および／または組合わせ配合物に特に有用な生体接着剤は、キトサンならびにその類似体および誘導体である。キトサンは無毒性、生体適合性および生分解性のポリマーであり、低毒性および良好な生体適合性というその好ましい特性のため、医薬用および医療用に広く用いられている。それはキチンからアルカリを用いるN-デアセチル化により製造されする天然ポリアミノ糖である。本発明の方法および組成物に使用すると、キトサンは適用粘膜部位における本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の保持を増大させる。この投与様式は、患者によるコンプライアンスおよび受入れも向上させる。さらに本明細書に提示する本発明の方法および組成物は、所望により新規なキトサン誘導体または化学修飾した形のキトサンを含む。本発明に用いるそのような新規誘導体のひとつは、β-[1→4]-2-グアニジノ-2-デオキシ-D-グルコースポリマー（poly-GuD）と表示される。キトサンは、経口および鼻腔内配合物のためのマイクロスフェアの製造に広く用いられている天然ポリマーであるキチンのN-デアセチル生成物である。キトサンポリマーは、非経口薬物送達のための可溶性キャリヤーとしても提唱されている。本発明の１態様においては、o-メチルイソ尿素を用いてキトサンアミンをそのグアニジニウム部分に変換する。グアニジニウム化合物は、たとえばキトサンとo-メチルイソ尿素の等規定溶液（8.0を超えるpH）間の反応により製造される。
【０１９４】
グアニジニウム生成物は-[14]-2-グアニジノ-2-デオキシ-D-グルコースポリマーである。これは、この関係でpoly-GuDと略称される（キトサン中のアミンのモノマーF.W.＝161;poly-GuD中のグアニジニウムのモノマーF.W.＝203）。
【０１９５】
本発明方法に用いるpoly-GuD製造方法の一例は、下記のプロトコルを用いる。
溶液：
0.5%酢酸溶液（0.088N）の調製：
2.5mLの氷酢酸を500mLのメスフラスコにピペットで移し、精製水で希釈して体積調整する。
【０１９６】
2N NaOH溶液の調製：
約20gのNaOHペレットをビーカーに約150mLの精製水と共に移す。溶解し、室温に冷却させる。この溶液を250mLのメスフラスコに移し、精製水で希釈して体積調整する。
【０１９７】
硫酸O-メチルイソ尿素（0.4N尿素基当量）の調製：
約493mgの硫酸O-メチルイソ尿素を10mLのメスフラスコに移し、溶解し、精製水で希釈して体積調整する；
この溶液のpHは4.2である。
【０１９８】
塩化バリウム溶液（0.2M）の調製：
約2.086gの塩化バリウムを50mLのメスフラスコに移し、溶解し、精製水で希釈して体積調整する。
【０１９９】
キトサン溶液（0.06Nアミン当量）の調製：
約100mgのキトサンを50mLのビーカーに移し、10mLの0.5%酢酸（0.088N）を添加する。撹拌して完全に溶解する；
この溶液のpHは約4.5である。
【０２００】
O-メチルイソ尿素クロリド溶液（0.2N尿素基当量）の調製：
5.0mLの硫酸O-メチルイソ尿素溶液（0.4N尿素基当量）および5mLの0.2M塩化バリウム溶液をビーカーにピペットで移す。沈殿が生じる。溶液をさらに5分間撹拌し続ける。溶液を0.45mフィルターで濾過し、沈殿を廃棄する。上清溶液中のO-メチルイソ尿素クロリドの濃度は0.2N尿素基当量である；
この溶液のpHは4.2である。
【０２０１】
操作：
セクション2.5の記載に従って調製した1.5mLの2N NaOHを10mLのキトサン溶液（0.06Nアミン当量）に添加する。溶液のpHを2N NaOHで約8.2-8.4に調整する。溶液をさらに10分間撹拌する。前記に従って調製した3.0mLのO-メチルイソ尿素クロリド溶液（0.2N尿素基当量）を添加する。溶液を一夜撹拌する。
【０２０２】
0.5%酢酸溶液（0.088N）で溶液のpHを5.5に調整する。
溶液を精製水で希釈して最終体積25mLにする。
溶液中のpoly-GuD濃度は5mg/mL、0.025N（グアニジニウム基）に相当する。
【０２０３】
本発明に用いる生体接着剤として分類される他の化合物は、一般に”受容体-リガンド相互作用”と分類される、生体接着化合物と粘膜上皮表面の化合物との相補的構造体間の特異的相互作用を介して作用する。レクチン-糖相互作用に例示されるように、天然の多くの例がこの形の特異的結合性の生体接着を示す。レクチンは非免疫由来の（糖）タンパク質であり、多糖類または糖コンジュゲートに結合する。
【０２０４】
幾つかの植物レクチンを医薬用吸収促進剤の候補として調べた。ある植物レクチン、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）ヘマグルチニン（PHA）は、ラットに給餌した後、10%を超える高い経口生物学的利用能を示す。トマト（Lycopersicon esculeutum）レクチン（TL）は、多様な投与様式について安全であると思われる。
【０２０５】
要約すると、以上の生体接着剤は、本明細書に開示する１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の存続性を延長し、または他の様式で粘膜吸収を増大させるために、所望により有効な量および形態の生体接着剤を使用する本発明の組合わせ配合物および協調投与方法に有用である。生体接着剤を本発明の組合わせ配合物中の補助化合物または添加剤として協調投与できる。ある態様において生体接着剤は'医薬用の膠（glue）'として作用し、一方、他の態様において生体接着剤の補助送達または組合わせ配合物は生物活性物質と鼻粘膜の接触を強化する；これは、ある場合には上皮細胞”受容体”との特異的受容体-リガンド相互作用を促進することによるもの、他の場合には上皮透過性を増大させてターゲット送達部位（たとえば肝臓、血漿、またはCNS組織もしくは体液）において測定した薬物濃度勾配を有意に高めることによるものである。本発明に用いるさらに他の生体接着剤は酵素（たとえばプロテアーゼ）阻害剤として作用し、生体接着剤との協調送達または組合わせ配合物中での送達により粘膜投与した生物療法薬の安定性を増大させる。
【０２０６】
リポソームおよびミセル系の送達ビヒクル
本発明の協調投与および組合わせ配合物は、Y2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質を粘膜送達する改良された配合物を提供するために、所望により、有効な脂質系または脂肪酸系のキャリヤー、加工助剤、または送達ビヒクルを使用する。たとえば１種類以上のこれらの活性物質、たとえばペプチドまたはタンパク質を含む、粘膜送達のための多様な配合物および方法であって、粘膜送達に際して生物活性物質の化学的および物理的安定性を高め、半減期を延長するために（たとえばタンパク質分解、化学修飾および／または変性されやすさを低下させることにより）、リポソームおよびミセル系のキャリヤーと混合し、もしくはそれに封入し、またはそれと協調投与されるものが提供される。
【０２０７】
本発明のある態様において、生物活性物質のための特殊な送達系はリポソームとして知られる低分子脂質ビヒクルを含む。これらは一般に天然の生分解性、無毒性かつ非免疫原性脂質分子から作成され、ペプチドおよびタンパク質を含めた薬物分子をそれらの膜内または膜上に効果的に捕獲または結合することができる。本発明のペプチドおよびタンパク質送達系としてのリポソームの魅力は、封入されたタンパク質をそれらの好ましい小胞内水性環境に保持し、一方ではリポソーム膜がそれらをタンパク質分解その他の脱安定化因子に対して保護するという事実によって高まる。ペプチドおよびタンパク質の特異な物理的および化学的特性のため、必ずしも既知のすべてのリポソーム調製方法がペプチドおよびタンパク質の封入に適するわけではないが、幾つかの方法はこれらの高分子を不活性化させずに封入することができる。
【０２０８】
本発明に用いるリポソームの調製には多様な方法を利用できる：USP 4,235,871、4,501,728、および4,837,028。リポソーム送達に用いるために、生物活性物質を一般にリポソーム、すなわち脂質小胞に捕獲し、またはその外側に結合させる。
【０２０９】
リポソームと同様に粘膜吸収を増大させる活性をもつ不飽和長鎖脂肪酸も、2層様構造をもつ閉鎖小胞（いわゆる”ウファソーム（ufasome）”）を形成できる。これらは、たとえばオレイン酸を用いて形成され、生物活性ペプチドおよびタンパク質を本発明の粘膜（たとえば鼻腔内）送達のために捕獲することができる。
【０２１０】
本発明に用いる他の送達系は、ポリマーとリポソームを併用し、天然ポリマーフィブリン内への封入のように両ビヒクルの有利な特性を結びつける。さらに、共有架橋およびフィブリンポリマーに対する抗フィブリン溶解剤の添加により、この送達系からの生物療法化合物の放出を制御できる。
【０２１１】
本発明に用いるさらに簡単な系には、カチオン脂質を送達ビヒクルまたはキャリヤーとして用いることが含まれる。これは、脂質系キャリヤーとタンパク質およびポリアニオン核酸のような荷電した生物活性物質との静電相互作用を得るために、効果的に利用できる。これにより薬物を効率的にパッケージングして、粘膜投与および／またはそれに続く全身コンパートメントへの送達に適した形にすることができる。
【０２１２】
本発明に用いる他の送達ビヒクルには、長鎖および中鎖脂肪酸、ならびに脂肪酸と界面活性剤の混合ミセルが含まれる。自然界で最も多くみられるエステル形の脂質は、粘膜表面を通したそれら自身の輸送に関して重要な示唆をもつ。遊離脂肪酸および極性基が結合したそれらのモノグリセリドは、混合ミセルの形で腸バリヤーに対し透過促進剤として作用することが証明された。遊離脂肪酸（鎖長12-20炭素原子のカルボン酸）がもつこのバリヤー改質機能およびそれらの極性誘導体の知見は、粘膜吸収促進剤としてのこれらの物質利用に関する研究を著しく刺激した。
【０２１３】
本発明方法に用いる長鎖脂肪酸、特に融合誘導性（fusogenic）脂質（不飽和脂肪酸およびモノグリセリド、たとえばオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレインなど）は、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質の粘膜送達を増大させるのに有用なキャリヤーとなる。中鎖脂肪酸（C6-C12）およびモノグリセリドも、腸の薬物吸収を増大させる活性をもち、本発明の粘膜送達配合物および方法に適用できることが示された。さらに、中鎖および長鎖脂肪酸のナトリウム塩も、本発明の生物活性物質を粘膜送達するのに有効な送達ビヒクルおよび吸収促進剤である。したがって脂肪酸は、可溶性ナトリウム塩の形で、または無毒性界面活性剤、たとえばポリオキシエチル化水素化ヒマシ油、タウロコール酸ナトリウムなどを添加して使用できる。本発明に有用な他の脂肪酸および混合ミセル調製物には、カプリル酸ナトリウム（C8）、カプリン酸ナトリウム（C10）、ラウリン酸ナトリウム（C12）、オレイン酸ナトリウム（C18）を、所望により胆汁酸塩、たとえばグリココール酸塩およびタウロコール酸塩と組み合わせたものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１４】
PEG化（pegylation）
本発明において提供される他の方法および組成物は、ポリマー材料、たとえばデキストラン、ポリビニルピロリドン、糖ペプチド、ポリエチレングリコールおよびポリアミノ酸の共有結合による生物活性ペプチドおよびタンパク質の化学修飾を伴う。得られるコンジュゲートペプチドおよびタンパク質は、粘膜投与のためのそれらの生物活性および溶解性を保持している。他の態様においては、Y2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性ペプチドおよびタンパク質を、ポリアルキレンオキシドポリマー、特にポリエチレングリコール（PEG）にコンジュゲートさせる；USP 4,179,337。
【０２１５】
本発明に使用するためのアミン反応性PEGポリマーには、分子量2000、5000、10000、12000、および20000のSC-PEG；U-PEG-1000；NHS-PEG-3400-ビオチン；T-PEG-5000；T-PEG-12000；およびTPC-PEG-5000が含まれる。生物活性ペプチドおよびタンパク質のPEG化（PEGylation）は、カルボキシル部位の修飾（たとえばカルボキシル末端へのアスパラギン酸基またはグルタミン酸基の付加）により達成できる。酸性条件下でのカルボジイミド活性化したタンパク質カルボキシル基の選択的修飾におけるPEG-ヒドラジンの有用性が記載されている。あるいは、生物活性ペプチドおよびタンパク質の二官能性PEG修飾を採用できる。ある方法においては、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含めた荷電アミノ酸残基がタンパク質表面に到達できる溶剤としての顕著な傾向をもつ。
【０２１６】
活性物質の他の安定化修飾
PEG化のほか、循環半減期を延長するために、活性物質を他の既知の保護化合物または安定化化合物へのコンジュゲーションによって活性部分を遮蔽することにより、たとえば１種類以上のキャリヤータンパク質、たとえば１種類以上の免疫グロブリン鎖に結合した活性ペプチド、タンパク質、類似体または模倣体を含む融合タンパク質を形成することにより、本発明に用いるペプチドおよびタンパク質などの生物活性物質を修飾することができる。
【０２１７】
配合物および投与
本発明の粘膜送達配合物は、一般に１種類以上の医薬的に許容できるキャリヤー、および所望により他の療法成分と組み合わせた、Y2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体を含む。キャリヤー（１以上）は、他の配合物成分と適合性でありかつ対象において許容できない有害作用を誘発しないという意味で、”医薬的に許容できる”ものでなければならない。そのようなキャリヤーは前記に述べたもの、あるいは薬理学の専門家に周知である。望ましくは、配合物は、投与される生物活性物質と不適合であることが分かっている酵素または酸化剤などの物質を含有すべきでない。本発明の配合物は医薬技術分野で周知の方法により調製できる。
【０２１８】
本発明の組成物および方法において、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質は、経口、直腸、膣、鼻腔内、肺内もしくは経皮送達、または眼、耳、皮膚もしくは他の粘膜表面への局所送達を含めた多様な粘膜投与様式で対象に投与できる。所望により、本明細書に開示するY2受容体結合ペプチドタンパク質、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質は、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、腹腔内または非経口経路を含めた非粘膜経路で協調投与または補助投与することができる。他の別態様において、たとえば生物活性物質を適切な液体または固体キャリヤー中に含有するex vivo組織または臓器処理用配合物の成分として、哺乳動物対象に由来する細胞、組織または臓器に直接暴露することにより、生物活性物質をex vivo投与することができる。
【０２１９】
本発明による組成物は、しばしば水溶液中において鼻腔スプレー剤として投与され、当業者に既知の多様な方法によりスプレー剤形で配分できる。液体を鼻腔スプレー剤として配分するための好ましい系は、USP 4,511,069に開示されている。本発明の配合物を多数回分の容器、たとえばUSP 4,511,069に開示される密閉した配分システムとして提供できる。他のエアゾル送達剤形、たとえば医薬用溶剤、たとえば水、エタノールまたはその混合物に溶解または懸濁した生物活性物質を送達する圧縮空気式、ジェット式、超音波式および圧電式ネブライザーも含めることができる。
【０２２０】
本発明の鼻内および肺スプレー液剤は一般に、所望により界面活性剤、たとえば非イオン界面活性剤（たとえばポリソルベート-80）、および１種類以上の緩衝剤と配合した投与薬物を含む。本発明のある態様において、鼻腔スプレー液剤はさらに噴射剤を含む。鼻腔スプレー液剤のpHは所望により約pH3.0-6.0、好ましくは5.0±0.3である。これらの組成物に用いるのに適切な緩衝剤はは前記に述べたもの、あるいは当技術分野で既知のものである。化学的安定性の増大または維持のために、保存剤、界面活性剤、分散剤またはガスを含めた他の成分を添加してもよい。適切な保存剤にはフェノール、メチルパラベン、パラベン、m-クレゾール、チオメルサール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなどが含まれるが、これらに限定されない。適切な界面活性剤にはオレイン酸、トリオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート、レシチン、ホスファチジルコリン、ならびに各種の長鎖ジグリセリドおよびリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。適切な分散剤にはエチレンジアミン四酢酸などが含まれるが、これらに限定されない。適切なガスには窒素、ヘリウム、クロロフルオロカーボン（CFC）、ヒドロフルオロカーボン（HFC）、二酸化炭素、空気などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２１】
他の態様においては、鼻腔内送達に適切な粒径または適切な粒径範囲の乾燥状態（通常は凍結乾燥）の生物活性物質を含む粘膜配合物を、乾燥粉末配合物として投与する。鼻腔または肺管内で沈着するのに適切な最小粒径は、しばしば約0.5μの質量中央等価空気力学的直径（mass median equivalent aerodynamic diameter、MMEAD）、一般に約1μのMMEAD、より一般的には約2μのMMEADである。鼻腔内で沈着するのに適切な最大粒径は、しばしば約10μのMMEAD、一般に約8μのMMEAD、より一般的には約4μのMMEADである。これらの粒径内の鼻内吸入可能な粉末は、多様な常法により、たとえばジェットミリング、噴霧乾燥、溶剤析出、超臨界流体濃縮などにより製造できる。適切なMMEADをもつこれらの粉末を、一般的な乾燥粉末インヘラー（dry powder inhaler、DPI）により患者に投与できる。これは、患者の呼吸に依存し、肺または鼻への吸入に際して粉末をエーロゾル量に分散させる。あるいは、粉末を分散させてエーロゾル化量にするために外力源を利用する空気補助式用具、たとえばピストンポンプにより乾燥粉末を投与することができる。
【０２２２】
乾燥粉末用具は、１回エーロゾル量（”パフ”）を発生させるために、一般に1-20mgの粉末質量を必要とする。生物活性物質の必要量または望ましい量がこの量より少ない場合、粉末状の活性物質を一般に医薬用の乾燥増量剤粉末と組み合わせて必要な全粉末質量を得る。好ましい乾燥増量剤粉末には、ショ糖、乳糖、デキストロース、マンニトール、グリシン、トレハロース、ヒト血清アルブミン（HSA）およびデンプンが含まれる。他の適切な乾燥増量剤粉末には、セロビオース、デキストラン、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどが含まれる。
【０２２３】
本発明の粘膜送達用組成物を配合するために、生物活性物質を、医薬的に許容できる多様な添加剤、ならびに活性物質（１以上）を分散させるための基剤またはキャリヤーと組み合わせることができる。望ましい添加剤にはpH調整剤、たとえばアルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、局所麻酔剤（たとえばベンジルアルコール）、等張化剤（たとえば塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（たとえばTween 80）、溶解促進剤（たとえばシクロデキストリンおよびその誘導体）、安定剤（たとえば血清アルブミン）、および還元剤（たとえばグルタチオン）を含有させることができる。粘膜送達用組成物が液体である場合、0.9% (w/v)生理食塩水の張度を１として測定した配合物の張度を、一般に投与部位の鼻粘膜に実質的な不可逆的組織損傷が誘発されない数値に調整する。一般に溶液の張度を約1/3-3、より一般的には1/2-2、最も多くの場合3/4-1.7に調整する。
【０２２４】
生物活性物質を基剤またはビヒクルに分散させることができ、これらは活性物質および添加剤を分散させる能力をもつ親水性化合物を含むことができる。これらの基剤は広範な適切なキャリヤーから選択でき、これにはポリカルボン酸またはその塩、無水カルボン酸（たとえば無水マレイン酸）と他のモノマー（たとえば（メタ）アクリル酸メチル、アクリル酸など）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、たとえばポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、たとえばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど、ならびに天然ポリマー、たとえばキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、およびその無毒性金属塩が含まれるが、これらに限定されない。しばしば、生分解性ポリマー、たとえばポリ乳酸、ポリ（乳酸-グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（ヒドロキシ酪酸-グリコール酸）コポリマー、およびその混合物が基剤またはキャリヤーとして選択される。あるいは、またはさらに、合成脂肪酸エステル、たとえばポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなどをキャリヤーとして使用できる。親水性ポリマーおよび他のキャリヤーを単独で、または組み合わせて使用でき、部分結晶化、イオン結合、架橋などによりキャリヤーに高い構造統合性を付与することができる。キャリヤーは、鼻粘膜に直接適用するための流体または粘稠溶液、ゲル、ペースト、粉末、マイクロスフェアおよびフィルムを含めた多様な形態で供給できる。これに関して選択したキャリヤーの使用により、生物活性物質の吸収が促進される。
【０２２５】
生物活性物質を多様な方法で基剤またはキャリヤーと組み合わせることができ、活性物質の放出は拡散、キャリヤーの崩壊、またはそれに伴う水チャンネルの形成により行われる。場合により、適切なポリマー、たとえば2-シアノアクリル酸イソブチルから調製したマイクロカプセル（マイクロスフェア）またはナノカプセル（ナノスフェア）内に活性物質を分散させ、生体適合性分散媒質に分散させて鼻粘膜に適用すると、長時間にわたる持続した送達および生物活性が得られる。
【０２２６】
本発明医薬の粘膜送達をさらに増大させるために、活性物質を含む配合物は、親水性低分子量化合物を基剤またはキャリヤーとして含有することもできる。そのような親水性低分子量化合物は通路媒体となり、それを通って水溶性活性物質、たとえば生理活性ペプチドまたはタンパク質が底部から体表へ拡散し、そこから吸収される。親水性低分子量化合物は所望により粘膜または投与環境から水分を吸収し、水溶性の活性ペプチドを溶解する。親水性低分子量化合物の分子量は、一般に10000を超えず、好ましくは3000を超えない。親水性低分子量化合物の例には、ポリオール化合物、たとえばオリゴ糖、二糖および単糖、たとえばショ糖、マンニトール、ソルビトール、乳糖、L-アラビノース、D-エリスロース、D-リボース、D-キシロース、D-マンノース、トレハロース、D-ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリンおよびポリエチレングリコールが含まれる。本発明においてキャリヤーとして有用な親水性低分子量化合物の他の例には、N-メチルピロリドンおよびアルコール類（たとえばオリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）が含まれる。これらの親水性低分子量化合物を、鼻腔内配合物中において単独で、あるいは相互または他の活性成分もしくは不活性成分と組み合わせて使用できる。
【０２２７】
あるいは本発明の組成物は医薬的に許容できるキャリヤーとして、生理的条件に近似させるのに必要な物質、たとえばpH調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤など、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有することができる。固体組成物については、一般的な無毒性の医薬的に許容できるキャリヤーを使用でき、これにはたとえば医薬用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン酸ナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０２２８】
生物活性物質を投与するための療法組成物は、溶液、マイクロエマルション、または高濃度の有効成分に適した他の秩序構造体として配合することもできる。キャリヤーは、たとえば水、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む溶剤または分散媒質であってよい。溶液の適正な流動性は、たとえばコーティング、たとえばレシチンの使用により、分散性配合物の場合は望ましい粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持できる。多くの場合、等張化剤、たとえば糖類、ポリアルコール、たとえばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが望ましいであろう。組成物中に吸収を遅延させる物質、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含有させることにより、生物活性物質の長時間吸収を達成できる。
【０２２９】
本発明のある態様では、生物活性物質を持効性配合物中、たとえば徐放性ポリマーを含有する組成物中において投与することができる。即時放出に対して保護するキャリヤー、たとえば制御放出ビヒクル、たとえばポリマー、マイクロカプセル封入した送達系または生体接着剤ゲルと共に活性物質を調製することができる。本発明の多様な組成物中における活性物質の持続送達は、吸収を遅延させる物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを組成物に含有させることにより達成できる。生物活性物質の制御放出配合物が望ましい場合、本発明に従って使用するのに適した制御放出性結合剤には、活性物質に対して不活性でありかつ生物活性物質を取り込むことができる生体適合性の制御放出物質が含まれる。多数のそのような物質が当技術分野で知られている。有用な制御放出結合剤は、それらを鼻腔内送達した後、生理的条件下で（たとえば鼻粘膜表面で、または経粘膜送達後に体液の存在下で）徐々に代謝される物質である。適切な結合剤には、当技術分野でこれまで持続放出配合物に用いられている生体適合性ポリマーおよびコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。そのような生体適合性化合物は、周囲組織に対して無毒性かつ不活性であり、著しく有害な副作用、たとえば鼻刺激、免疫反応、炎症などを誘発しないものである。それらは代謝されて、同様に生体適合性であって身体から容易に排出される代謝産物になる。
【０２３０】
これに関して用いるポリマー材料の例には、コポリマーおよびホモポリマー状のポリエステルから誘導される加水分解性エステル結合をもつポリマーマトリックスが含まれるが、これらに限定されない。これらのうち多数が生分解性であって無毒性または低毒性の分解産物になることが当技術分野で知られている。ポリマーの例には、ポリグリコール酸（PGA）およびポリ乳酸（PLA）、ポリ（DL-乳酸-co-グリコール酸）（DL PLGA）、ポリ（D-乳酸-co-グリコール酸）（D PLGA）およびポリ（L-乳酸-co-グリコール酸）（L PLGA）が含まれる。他の有用な生分解性または生侵食性ポリマーには、ポリ（ε-プロラクトン）、ポリ（ε-アプロラクトン-CO-乳酸）、ポリ（ε-アプロラクトン-CO-グリコール酸）、ポリ（β-ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル-2-シアノアクリラート）、ヒドロゲル、たとえばポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（たとえばL-ロイシン、グルタミン酸、L-アスパラギン酸など）、ポリ（エステルウレア）、ポリ（2-ヒドロキシエチル DL-アスパルタミド）、ポリアセタールポリマー、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、多糖類、およびそのコポリマーなどのポリマーが含まれるが、これらに限定されない。そのような配合物を調製するための多数の方法が当業者に一般に知られている。他の有用な配合物には、たとえば下記の制御放出組成物が含まれる：マイクロカプセル、USP 4,652,441および4,917,893；マイクロカプセルおよび他の配合物の調製に有用な乳酸-グリコール酸コポリマー、USP 4,677,191および4,728,721；ならびに水溶性ペプチドのための持続放出組成物、USP 4,675,189。
【０２３１】
無菌液剤は、必要量の活性化合物を、必要に応じて１種類以上の前記成分の組合わせと共に、適切な溶剤に装入し、続いて無菌的に濾過することにより調製できる。一般に分散液は、基本的な分散媒質および前記のうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を装入することにより調製される。無菌散剤の場合、調製方法には真空乾燥および凍結乾燥が含まれる。これにより、予め無菌的に濾過したその溶液から有効成分と希望する追加成分の粉末が得られる。微生物作用の防止は、多様な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。
【０２３２】
本発明による粘膜投与は、投与量および副作用を抑制およびモニターする十分な安全策が講じられれば、患者による効果的な自己投与による処置を可能にする。粘膜投与は、他の投与形態、たとえば注射がもつある欠点も克服する。注射は痛みを伴い、患者を感染に曝す可能性があり、薬物の生物学的利用能の問題を提起することがある。鼻腔および肺への送達のためには、療法用液剤をスプレーとして制御下にエアゾル配分するためのシステムが周知である。１態様において、特別に構築された機械的ポンプ弁により計量された量の活性物質が送達される；USP 4,511,069。
【０２３３】
投与量
予防および治療の目的で、本明細書に開示する生物活性物質（１以上）を、１回ボーラス送達、長時間にわたる連続送達（たとえば連続的な経皮、粘膜、または静脈内送達）、または反復投与プロトコル（たとえば１時間、１日または週に１回の反復投与プロトコル）により対象に投与できる。これに関して生物活性物質（１以上）の療法有効量は、前記の目標疾患または状態に関連する１以上の症状または検出可能な状態を軽減する有意の結果をもたらす長期間の予防方式または治療方式での反復投与量を含む。これに関して有効量の決定は、一般に動物モデル試験に続くヒトの臨床試験を基礎とし、対象において目標疾患の症状または状態の発症または重症度を有意に低下させるのに有効な投与量および投与プロトコルを決定することによりなされる。これに関して適切なモデルには、たとえば当技術分野で既知のネズミ、ラット、ブタ、ネコ、ヒト以外の霊長類、および他の許容される被験動物モデルが含まれる。あるいは、有効量はインビトロモデル（たとえば免疫学的および組織病理学的アッセイ法）を用いて決定できる。そのようなモデルを用いると、一般に療法有効量の生物活性物質（１以上）を投与するのに適切な濃度および投与量（たとえば、目的とする応答を誘発するのに鼻腔内有効、経皮有効、静脈内有効、または筋肉内有効である量）を決定するために、通常の計算および調整が必要であるにすぎない。
【０２３４】
生物活性物質の実際の投与量はもちろん、適応疾病および対象の具体的状態（たとえば対象の年齢、体格、適性、症状の程度、感受性要因など）、投与の時間および経路、同時に施される他の薬物または処置、ならびに対象において目的の活性または生物学的応答を誘発するについての生物活性物質（１以上）の個々の薬理などの要因に従って異なるであろう。投与方式は、最適な予防応答または治療応答を得るように調整できる。療法有効量は、臨床期間中の生物活性物質の有毒または有害な副作用より療法上有益な効果の方が高い量でもある。限定ではないが、本発明の方法および配合物におけるY2アゴニストの療法有効量の範囲は、0.7-約25 μg/kgである。減量を促進するためには、満腹感を高めるのに十分なほど高く、ただし吐き気などの不都合な副作用を誘発しないのに十分なほど低い量で、Y2受容体結合ペプチドを鼻腔内投与する。PYY3-36の好ましい鼻腔内投与量は、約1-10 μg/kg（患者の体重）、最も好ましくは約1.5-約3 μg/kg（患者の体重）である。標準投与においては、患者に50-1600 μg、より好ましくは約75-800 μg、最も好ましくは100μg、150μg、200-約400 μgを投与する。あるいは、限定ではないが、本発明の方法および配合物における生物活性物質の療法有効量の範囲は、約0.001-約100 pmol/kg（体重）、約0.01-約10 pmol/kg（体重）、約0.1-約5 pmol/kg（体重）、約0.5-約1.0 pmol/kg（体重）である。この範囲の投与量は、１回または多数回の投与、たとえば１日多数回、１日１回または週１回の投与により達成できる。平均的なヒト対象に、投与１回当たり少なくとも1μgの生物活性物質（たとえば１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質）、より一般的には約10μg-5.0mg、ある態様においては約100μgないし1.0または2.0mgを投与することが望ましい。ある経口投与については、適切な血漿中濃度を達成するために0.5 mg/kg（体重）という高い量が必要な場合がある。さらに、個々の要求、および透過性ペプチド（１以上）その他の生物活性物質（１以上）を投与または管理している者の専門的な判断に従って、個々の対象について具体的な投与方式を経時的に評価および調整しなければならないことを留意すべきである。PYYの鼻腔内投与量は、50-1600 μg、好ましくは約75-800 μg、より好ましくは100-400μg、最も好ましくは100-200μgのPYYであり、150μgがきわめて有効な投与量であると考えられる。投与間隔約0.1-24時間、好ましくは投与間隔約0.1-2.0時間の計画による本発明配合物の鼻腔内反復投与は、臨床上の有益性を最大にする一方で過剰暴露および副作用のリスクを最小限に抑える、正規化された持続療法レベルのY2受容体結合ペプチドを維持するであろう。この投与量を１日数回、好ましくは食事の半時間前に、または空腹感が起きたときに、満腹感を高めるために投与することができる。
【０２３５】
ターゲット部位において目的濃度を維持するためのY2アゴニスト、たとえばPYYの投与量は、担当医または患者（一般用剤形を自己投与する場合）によって異なる可能性がある。
【０２３６】
他の態様において本発明は、Y2受容体結合ペプチドを鼻腔内送達するための組成物および方法を提供し、その際、Y2受容体結合ペプチドを１日１回または週１回の計画で対象に多数回投与する鼻腔内有効投与方式によりY2受容体結合ペプチド化合物（１以上）を反復投与して、高いまたは低いY2受容体結合ペプチドパルスレベルを長い投与期間にわたって維持する。本発明の組成物および方法は、8-24時間の長期間にわたって高いまたは低い療法有効Y2受容体結合ペプチドパルスレベルを維持するために、鼻腔内配合物により１日2-6回患者が自己投与するY2受容体結合ペプチド化合物（１以上）を提供する。
【０２３７】
キット
本発明は、哺乳動物対象において疾患および他の状態を予防および治療する際に使用する前記の医薬組成物、有効成分、および／またはそれを投与するための投与用具を収容した、キット、パッケージおよびマルチコンテナユニットをも含む。すなわちこれらのキットは、１種類以上のY2受容体結合ペプチド、類似体および模倣体、ならびに他の生物活性物質を、本明細書に開示する粘膜送達促進剤と組み合わせて粘膜送達用医薬製剤中に配合したものを含む、容器または配合物を含む。
【０２３８】
本発明の鼻腔内配合物は、いずれかのスプレーボトルまたは注射器で投与できる。鼻腔スプレーボトルの例は”安全クリップ付き鼻腔スプレーポンプ、Pfeiffer SAP # 60548”であり、これは１回噴射当たり0.1mLの量を送達し、36.05mmの浸漬チューブ長さをもつ。これはPfeiffer of America（ニュージャージー州プリンストン）から購入できる。Y2受容体結合ペプチド、たとえばPYYの鼻腔内投与量は、0.1-約1500 μg/kgである。鼻腔内スプレーに入れて投与する場合、スプレー剤の粒径は10-100μm（ミクロン）の大きさ、好ましくは20-100μmの大きさであることが好ましい。
【０２３９】
減量を促進するためには、満腹感を高めるのに十分なほど高く、ただし吐き気などの不都合な副作用を誘発しないのに十分なほど低い量の鼻腔内用量Y2受容体結合ペプチドPYYを投与する。Y2受容体結合ペプチド、たとえばPYY(3-36)の好ましい鼻腔内投与量は、約3-10 μg/kg（患者の体重）、最も好ましくは約6μg/kg（患者の体重）である。標準投与量で、患者に50-800μg、より好ましくは約100-400μg、最も好ましくは150-約200μgを投与する。Y2受容体結合ペプチド、たとえばPYY(3-36)を、吐き気を防ぐために食事の少なくとも10分ないし１時間前に、ただし食事の前約12-24時間を超えない時点で投与することが好ましい。患者が目標量の体重を減量するまで、患者に少なくとも１日１回、好ましくは毎食前に投薬する。次いで、その減量を維持するために、少なくとも週１回、好ましくは１日１回、患者に維持量を投与する。
【０２４０】
下記実施例のデータにより示されるように、PYY(3-36)は本発明のY2受容体結合ペプチド配合物によりヒトに鼻腔内投与すると食欲を低下させることが見いだされた。実施例は、Y2受容体結合ペプチドがPYY(3-36)である本発明のY2受容体結合ペプチド配合物を用いる鼻腔内経路により、PYYペプチドの食後生理的レベルに初めて到達できたことも示す。
【０２４１】
以下の実施例は説明のために示したものであり、限定ではない。
【実施例】
【０２４２】
実施例１
本発明の教示によるペプチドYYの鼻粘膜送達を増大させるための下記の配合物を調製し、評価した。
【０２４３】
表１：ペプチドYY配合物の組成
【０２４４】
【表１】
2006516262.tif 000010
【０２４５】
実施例２
鼻粘膜送達−透過係数および細胞毒性
１．臓器型モデル
下記の方法は一般に、本発明の配合物および方法におけるペプチドYYについて鼻粘膜送達パラメーター、薬物動態および副作用を評価するために、またペプチドYYとの組合わせ配合物または協調投与のための本明細書に開示する多様な鼻腔内送達促進剤の有効性および特性を判定するために有用である。
【０２４６】
透過動態および細胞毒性も、粘膜送達促進剤との組合わせ配合物または協調投与のための本明細書に開示する多様な鼻腔内送達促進剤の有効性および特性を判定するために有用である。プロトコルの一例においては、生物活性療法薬、たとえばペプチドYYと組み合わせた前記に開示した鼻腔内送達促進剤について、透過動態、および許容できない細胞毒性がないことを証明する。
【０２４７】
呼吸器官を内張りする擬重層上皮（pseudostratified epiterium）のモデルとして、MatTek Corp（マサチュセッツ州アッシュランド）によりEpiAirway系が開発された。上皮細胞を多孔膜底付き細胞培養インサート上で気-液界面において増殖させると、細胞が分化して高度に分極した形態になる。頂端表面には小絨毛微細構造の毛様体があり、この上皮は粘液を産生する（ムチンの存在が免疫ブロット法で確認された）。インサートは0.875cmの直径をもち、0.6cm2の表面積を備えている。搬送の約3週間前に、工場で細胞をインサートに接種する。１つの”キット”は24ユニットからなる。
【０２４８】
Ａ．到着すると、ユニットを6-ウェルマイクロプレート内の無菌支持台に乗せる。各ウェルに5mLの市販培地を入れる。このDMEMベースの培地は無血清であるが、上皮増殖因子その他の因子を補充してある。サイトカインまたは増殖因子の内因レベルについて常に培地を検査する。これらは鼻腔内送達について考慮すべきものであるが、インスリンを除いて、現在までに調べたすべてのサイトカインおよび因子が含有されなかった。5mLの容量は、支持台上のユニットの底に接触するが、上皮の頂端表面は空気と直接接触した状態を維持するのにちょうど十分な量である。この工程、および以後のユニットを液体含有ウェルへ移すすべての工程に無菌ピンセットを用いて、ユニットの底と培地の間に空気がトラップされないことを確実にする。
【０２４９】
Ｂ．プレート内のユニットを空気中5% CO2の雰囲気内にあるインキュベーター内で24時間、37℃に保持する。この時間の終了時点で培地を新鮮な培地と交換し、ユニットをインキュベーターに戻してさらに24時間おく。
【０２５０】
２．実験プロトコル−透過速度
Ａ．5種類の異なる配合物を評価するために24個のEpiAirwayユニットの”キット”をルーティンに使用できる。各配合物を四重試験ウェルに付与する。各ウェルを透過速度（4時点）、経上皮抵抗、MTT還元により測定したミトコンドリアレダクターゼ活性、およびLDHの放出により測定した細胞溶解の測定に用いる。他の一組のウェルを対照として用い、透過速度の測定に際してこれらを偽処理するが、他の点では経上皮抵抗および生存率の測定のための被験試料含有ユニットと同等に取り扱う。対照の測定も四重試験ユニットについてルーティンに行うが、場合により本発明者らは対照について三重試験ユニットを用い、キット中の残り4ユニットを非処理ユニットにおける経上皮抵抗および生存率の測定に用い、あるいは100%細胞溶解の基準として用いる全LDHレベルの測定のためにこれらのユニットを凍結融解した。
【０２５１】
Ｂ．すべての実験において、鼻粘膜送達用の被験配合物を各ユニットの頂端表面に100μLの容量で付与する。これは頂端表面全体を覆うのに十分なものである。頂端表面に付与した濃度の被験配合物を、ELISAまたは表記した他のアッセイ法による活性物質濃度測定のために適量（一般に100μLより多くは必要ない）取り分けておく。
【０２５２】
Ｃ．ユニットを、下記の実験のために支持台なしで6ウェルプレートに入れる：各ウェルに0.9mLの培地を入れる。これは、ユニットの多孔膜底と接触するのに十分であるが、ユニットに著しい上向き静水圧を発生しないものである。
【０２５３】
Ｄ．誤差の原因となる可能性を最小限に抑え、濃度勾配が形成されるのを避けるために、試験の各時点でユニットを0.9mL収容ウェルから他のウェルへ移動させる。これらの移動は、100μL容量の被験物質を頂端表面に付与したゼロ時を基準として、下記の時点で行われる：15分、30分、60分、および120分。
【０２５４】
Ｅ．各時点間では、プレートに入れたユニットを37℃のインキュベーター内に保持する。プレートを取り出してユニットを１ウェルから他のウェルへピンセットで移動させる短期間に起きる温度変化が最小限となるように、ウェル当たり0.9mLの培地を入れたプレートもインキュベーター内に保持する。
【０２５５】
Ｆ．各時点の終了時に、各ユニットをそこから移動させたウェルより培地を取り出して2本の試験管へ分配し（一方の試験管に700μL、他方に200μL）、透過した被験物質の濃度の測定、また被験物質が細胞毒性である場合は上皮からの細胞質ゾル酵素である乳酸デヒドロゲナーゼの放出の測定に使用する。アッセイを24時間以内に実施する予定の場合はこれらの試料を冷蔵庫内に保存する。あるいは試料を小分配し、アッセイのため回融解するまで、-80℃に凍結保存する。凍結融解サイクルの反復は避けるべきである。
【０２５６】
Ｇ．誤りを最小限に抑えるために、実験開始前にすべての試験管、プレートおよびウェルに予めラベルを貼る。
Ｈ．120分の時点の終了時に、ユニットを最後の0.9mL入りウェルから、ウェル当たり0.3mLの培地を入れた24-ウェルマイクロプレートに移動させる。この容量も、ユニットの底と接触するのに十分であるが、ユニットに上向き静水圧を及ぼさないものである。このユニットをインキュベーターに戻した後、経上皮抵抗を測定する。
【０２５７】
３．実験プロトコル-経上皮抵抗
Ａ．組織を通した溶質の流れを制限する密着結合由来の気道上皮細胞；インビボおよびインビトロ。これらの結合部は、切除した気道組織において数百オーム×cm2の経上皮抵抗を与える；MatTek EpiAirwayユニットにおいて、製造業者は経上皮抵抗（transepithelial electrical resistance、TER）がルーティンに約1000オーム×cm2であると述べている。本発明者らは、透過試験の一連の工程中に偽暴露した対照EpiAirwayユニットのTERがこれより若干低い（700-800オーム×cm2）であることを認めたが、低分子の透過はTERの逆数に比例するので、この数値はなお透過に対する大きなバリヤーを提供するのに十分なほど高い。これに対し、細胞を含まない多孔膜底ユニットは最小の経膜抵抗（5-20オーム×cm2）を与えるにすぎない。
【０２５８】
Ｂ．正確なTER測定には、オーム計の電極を膜上下の有意表面積にわたって配置し、膜からの電極の距離を再現性をもって制御する必要がある。MatTekが推奨し、本発明のすべての実験に採用したTER測定方法には、”EVOM”（商標）上皮電圧オーム計および”ENDOHM”（商標）組織抵抗測定チャンバーを用いる；World Precition Instruments, Inc.、フロリダ州サラソタ。
【０２５９】
Ｃ．電極を平衡化するために、チャンバーにまずダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）をTER測定前に少なくとも20分間充填しておく。
Ｄ．1.5mLのPBSをチャンバーに入れ、測定する膜底ユニットに350μLのPBSを入れて、TERを測定する。細胞を含まない（ただし350μLのPBSを含む）ユニットの膜の真上に上電極を配置し、次いで配置を確実に再現できるように固定する。無細胞ユニットの抵抗は一般に5-20オーム×cm2である（”バックグラウンド抵抗”）。
【０２６０】
Ｅ．チャンバーを用意し、バックグラウンド抵抗を記録すると、透過測定に用いたばかりの24-ウェルプレート内のユニットをインキュベーターから取り出し、個別にTER測定用チャンバーに入れる。
【０２６１】
Ｆ．PBSを入れたペトリ皿に各ユニットをまず移し、確実に膜底が湿るようにする。350μLアリコートのPBSをユニットに添加し、次いで慎重にラベル付き試験管内へ吸引し、頂端表面をすすぐ。次いで2回目の350μL PBS洗浄液をユニットに添加し、同じ採集試験管内へ吸引する。
【０２６２】
Ｇ．ユニットを穏やかにブロットして外表にある過剰のPBSのみを除いた後、チャンバー（新鮮な1.5mLアリコートのPBSを収容）へ入れる。350μLアリコートのPBSをユニットに添加した後、上電極をチャンバーに配置し、TERをEVOM計で読み取る。
【０２６３】
Ｈ．ユニットのTERをENDOHMチャンバー内で読み取った後、ユニットを取り出し、PBSを吸引して保存し、ユニットの頂端表面が空気界面になる状態で、ウェル当たり0.3mLの培地を入れた24-ウェルプレートへ戻す。
【０２６４】
Ｉ．ユニットを下記の順に読み取る：すべての偽処理対照、続いてすべての配合物処理試料、続いて各偽処理対照の2回目のTER読取り。すべてのTER測定が完了した後、24-ウェルマイクロプレート内のユニットをMTT還元による生存率測定のためにインキュベーターに戻す。
【０２６５】
４．実験プロトコル−MTT還元による生存率
MTTは細胞透過性テトラゾリウム塩であり、無傷のミトコンドリア機能をもつ生存細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性により、またはレスピラトリーバーストを発生しうる細胞からの非ミトコンドリアNAD(P)Hデヒドロゲナーゼ活性により還元されて、不溶性の有色ホルマザンになる。上皮細胞は有意のレスピラトリーバーストを発生しないので、ホルマザンの形成は上皮細胞生存の好適な指標である。本発明者らはMatTek Corpが生存率評価のために自社ユニット用に調製したMTT試薬キットを用いた。
【０２６６】
Ａ．MTT試薬は濃厚液として供給され、生存率アッセイ当日に（一般に透過速度およびTERを午前中に測定した日の午後）市販のDMEM系希釈剤中に希釈される。使用前に短時間の遠心分離により不溶性試薬を除去する。最終MTT濃度は1 mg/mLである。
【０２６７】
Ｂ．最終MTT溶液を24-ウェルマイクロプレートのウェルにウェル当たり350μLの容量で添加する。前記のように、この容量はEpiAirwayユニットの膜と接触するのに十分であるが、細胞に上向き静水圧を及ぼさないものである。
【０２６８】
Ｃ．ユニットをTER測定後に入れた24-ウェルプレートから取り出し、ユニットの外面から過剰の液体を除去した後、MTT試薬を入れたプレートへ移す。次いでプレート内のユニットを、空気中5% CO2の雰囲気内にある37℃のインキュベーターに3時間入れておく。
【０２６９】
Ｄ．3時間のインキュベーション後、生存細胞を含むユニットは明瞭に紫色になっているであろう。MTT還元の程度を定量するためには、不溶性ホルマザンをユニット内の細胞から抽出しなければならない。ホルマザンの抽出は、前記のようにユニットの外面から過剰の液体を除去した後、ウェル当たり2mLの抽出液を入れた24-ウェルマイクロプレートにユニットを移すことにより行われる。この容量はユニットの膜および頂端表面を両方とも完全に覆うのに十分なものである。遮光チャンバー内において室温で一夜、抽出を進行させる。MTT抽出剤は本来高濃度の界面活性剤を含有し、細胞を破壊する。
【０２７０】
Ｅ．抽出が終了した時点で、各ユニットからの流体および周囲のウェル内の流体を合わせて試験管に移し、続いて96-ウェルマイクロプレートに配分し（200μLアリコートが最適）、VMaXマルチウェルマイクロプレート分光光度計で570nmにおける吸光度を測定する。抽出したユニットに由来する細胞屑による混濁が吸光度に関与しないことを確実にするために、各ウェルについてVMaXにより650nmにおける吸光度も測定し、570nmにおける吸光度から自動的に差し引く。ホルマザン吸光度の測定に関する”ブランク”は、ユニットを暴露していない200μLアリコートの抽出剤である。この吸光値を生存率ゼロであると仮定する。
【０２７１】
Ｆ．24 EpiAirwayユニットの各キットのうち2ユニットを、透過速度およびTERの測定に際して非処理のまま残す。これらのユニットを細胞100%生存率の陽性対照として用いる。実施したすべての試験において、これらの非処理ユニットの細胞は、透過速度について偽処理してTER測定を行った対照ユニットの細胞と対比して、生存率に統計的な有意差がなかった。被験配合物で処理したすべてのユニットの吸光度が、MTTと共にインキュベーションした時点のユニット内の細胞の生存率％に正比例すると仮定する。一般に被験物質を頂端表面へ導入した後、そしてTER測定に際してユニットの頂端表面をすすいだ後、4時間より以前にはこのアッセイを実施しないことを留意すべきである。
【０２７２】
５．LDH放出による生存率測定
MTT還元によるミトコンドリアレダクターゼ活性の測定は細胞生存率の高感度法であるが、このアッセイ法は必然的に細胞を破壊するので、各試験の最後にしか実施できない。細胞が壊死溶解した場合、それらの細胞質ゾル内容物は周囲の培地中へ排出し、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）をこの培地中に検出できる。培地中のLDHのアッセイは、24時間透過速度測定の各時点で取り出した培地試料について実施できる。したがって、有意時間が経過するまで発現しない配合物の細胞毒性、および気道上皮暴露の最初の数分間で細胞溶解を誘発する配合物の作用を検出できる。
【０２７３】
Ａ．EpiAirwayユニットの細胞溶解を評価するために推奨されるLDHアッセイは、NADからのNADH生成を伴う、乳酸からピルビン酸への変換に基づく。次いでこのNADHは粗製”ジアホラーゼ”調製物により触媒されて再酸化され、同時にテトラゾリウム塩INTが還元される。INTの還元により形成されたホルマザンは可溶性であるので、乳酸、NAD、ジアホラーゼおよびINTを含有する均一な水性媒質中でLDH活性のアッセイ全体を実施できる。
【０２７４】
Ｂ．LDH活性のアッセイは、各時点で採取したEpiAirwayユニット周囲の”上清”培地の試料のうち50μLアリコートについて実施される。これらの試料を冷蔵庫に24時間以内保存し、あるいは採取後、数時間以内に凍結したのち融解する。各EpiAirwayユニットから、被験物質投与後、15分、30分、1時間および2時間目に採取した上清培地試料が得られる。それらのアリコートをすべて96-ウェルマイクロプレートに移す。
【０２７５】
Ｃ．ユニットに暴露していない50μLアリコートの培地を”ブランク”、すなわち細胞毒性0%の陰性対照として用いる。本発明者らは、アッセイ試薬混合物と非暴露培地の反応後に存在する”内因性”LDHの見掛けレベルが、実験誤差内で、透過速度試験の実施に必要な2時間の時間経過全体にわたってすべての偽処理対照ユニットにより放出される見掛けのLDHレベルと同じであることを認めた。したがって、透過速度測定の時間経過全体にわたって、これらの偽処理ユニットは実験誤差内で上皮細胞の溶解を示さない。
【０２７６】
Ｄ．ユニット内の細胞を100%溶解した後に放出されるLDHレベルを反映する上清培地の試料を調製するために、透過速度測定のためのプロトコルと同様に、0.9mLの培地を入れた6-ウェルマイクロプレートに予め操作を施していないユニットを添加し、ユニットを含むプレートを-80℃で凍結し、次いでウェル内容物を融解させる。この凍結-融解サイクルにより、細胞が効率的に溶解し、LDHを含めたそれらの細胞質ゾル内容物を上清培地中へ放出する。凍結および融解した細胞からの培地50μLアリコートを、100%細胞毒性を反映する陽性対照として96-ウェルプレートに添加する。
【０２７７】
Ｅ．アリコートの上清培地を入れた各ウェルに、50μLアリコートのLDHアッセイ試薬を添加する。次いでプレートを暗所で30分間インキュベートする。
Ｆ．”停止”溶液1M酢酸の添加により反応を停止し、停止溶液の添加後１時間以内に490nmにおけるプレートの吸光度を測定する。
【０２７８】
Ｇ．細胞溶解度％の計算は、培地のみから得た吸光度を細胞溶解度0%の基準とし、凍結および融解したユニットの周囲の培地から得た吸光度を細胞溶解度100%の基準として用いた、吸光度と細胞溶解度の直線関係に基づく。
【０２７９】
６．ELISA測定
本発明の粘膜送達促進剤との協調投与または組合わせ配合物に関連する活性物質の透過増大を評価するために被験物質である生物活性物質の濃度を測定する方法は、一般に前記のもの、および既知方法、ならびに個々のアッセイに用いるELISAキットの個々の製造業者の指示に従ったものである。生物活性物質の透過速度は、一般に生物活性物質を頂端細胞表面と接触させた（頂端細胞表面を粘膜送達促進剤（１以上）に暴露するのと同時、またはその後であってもよい）後、多数の時点（たとえば15分、30分、60分、120分）での測定値を求めることにより判定される。
【０２８０】
哺乳動物対象の血流、中枢神経系（CNS）組織もしくは体液、脳脊髄液（CSF）、または他の組織もしくは体液中におけるペプチドYY、神経ペプチドY、および膵臓ペプチドの濃度を測定する方法は、ペプチドYY、神経ペプチドY、および膵臓ペプチドの免疫アッセイにより決定できる。本発明の粘膜送達促進剤との協調投与または組合わせ配合物に関連する活性物質の透過増大を評価するために被験物質であるペプチドYY、神経ペプチドY、および膵臓ペプチドの濃度を測定する方法は、一般にペプチドYY、神経ペプチドY、および膵臓ペプチドに関する前記のもの、ならびに既知方法に従ったもの、およびラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素免疫アッセイ（EIA）、および免疫組織化学または免疫蛍光測定のための抗体試薬に関する個々の製造業者の指示に従ったものである。Bachem AG（ペンシルベニア州キングオブプルシア）。
【０２８１】
EpiAirway（商標）組織膜をフェノールレッドおよび無ヒドロコルチゾン培地中で培養する（MatTek Corp.、マサチュセッツ州アッシュランド）。この組織膜を37℃で48時間培養して組織を平衡化させる。無血清培地0.9mLを入れた6-ウェルプレートの個別のウェル内に各組織膜を置く。100μLの配合物（被験試料または対照）を膜の頂端表面に付与する。各被験試料（生物活性物質ペプチドYYと組み合わせた粘膜送達促進剤）および対照試料（生物活性物質ペプチドYYのみ）の三重または四重試料を各アッセイにおいて評価する。各時点（15、30、60および120分）で、新鮮な培地を入れた新たなウェルへ組織膜を移動させる。下にある0.9mLの培地試料を各時点で収穫し、ELISAおよび乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）アッセイのために4℃に保存する。
【０２８２】
ELISAキットは一般に2工程サンドイッチELISAである：免疫反応形の被験物質を、96-ウェルマイクロプレートに固定化した抗体により”捕獲”し、結合していない物質をウェルから洗い去った後、結合した免疫反応性物質と”検出”抗体を反応させる。この検出抗体は一般に酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼの場合が最も多い）にコンジュゲートしており、次いでプレートの免疫複合体に結合した酵素の活性を色原体試薬でアッセイすることにより酵素量を測定する。透過速度試験の各時点で採取した上清培地試料のほか、速度試料の開始時にユニットの頂端表面に付与した適宜希釈された配合物試料（すなわち本発明の生物活性被験物質を含有するもの）も、製造業者提供の標準品セットと共にELISAプレートでアッセイする。各上清培地試料を一般に二重ウェルにおいてELISAによりアッセイする（透過速度測定の各配合物について四重ユニットを用い、4時点すべてにわたって合計16の上清培地試料を採取したことは思い起こされるであろう）。
【０２８３】
Ａ．上清培地試料またはユニットの頂端表面に付与した希釈物質試料中の活性被験物質の見掛け濃度が、ELISA終了後に標準品の濃度範囲外にあることは稀ではない。標準品の濃度より高い場合、外挿により実験試料中に存在する物質の濃度を判定しない；むしろ試料を再希釈して、反復ELISAにおいて標準品間の内挿によりさらに正確に測定できる被験物質濃度にする。
【０２８４】
Ｂ．生物活性被験物質、たとえばペプチドYYに関するELISAは、その設計および推奨されたプロトコルにおいて特異である。大部分のキットと異なり、このELISAは2種類のモノクローナル抗体を用いる：一方は捕獲用、他方は生物活性被験物質（たとえばペプチドYY）についてオーバーラップしない決定因子に対して形成された検出抗体（この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしている）。アッセイの上限未満の濃度のペプチドYYが実験試料中に存在する限り、製造業者の指示によるアッセイプロトコルを採用できる。これは、ELISAプレート上の試料を両方の抗体が同時に存在する状態でインキュベーションできる。試料中のペプチドYYのレベルがこの上限より著しく高い場合、免疫反応性ペプチドYYのレベルがインキュベーション混合物中の抗体の量を超え、検出抗体が結合していない若干のペプチドYYはプレートに捕獲され、一方、検出抗体が結合した若干のペプチドYYは捕獲されない可能性がある。このため試料中のペプチドYYのレベルが著しく過小推定される（そのような試料中のペプチドYYのレベルは、アッセイの上限より有意に低いように見えるであろう）。この可能性を排除するために、アッセイプロトコルを改変した：
Ｂ１．固定化した捕獲抗体を含むELISAプレート上で、検出抗体の不存在下に１時間、希釈試料をまずインキュベートする。この１時間のインキュベーション後、結合していない物質がなくなるまでウェルを洗浄する；
Ｂ２．検出抗体をプレートと共に１時間インキュベートして、すべての捕獲抗体と免疫複合体を形成させる。検出抗体の濃度は、捕獲抗体が結合したペプチドYYの最大レベルと反応するのに十分なものである。次いでプレートを再び洗浄して、結合していない検出抗体を除去する；
Ｂ３．ペルオキシダーゼ基質をプレートに添加し、15分間インキュベートして発色させる；
Ｂ４．”停止”溶液をプレートに添加し、VMaxマイクロプレート分光光度計により450nmおよび490nmで吸光度を読み取る。490nmにおける有色生成物の吸光度は450nmにおけるものよりはるかに低いが、各波長における吸光度はなお生成物の濃度と比例する。2つの読みにより、VMax計測器の作動範囲にわたって吸光度が結合ペプチドYYの量に関して直線的であることが確認される（範囲をルーティンに0-2.5 ODに限定するが、この計測器は0-3.0 ODの範囲にわたって正確であると報告されている）。試料中のペプチドYYの量を、ELISAに含めた異なる標準品について得たOD値間で内挿することにより判定する。標準品について得た範囲外にあるODの読みをもつ試料は再希釈して、反復ELISA実験を行う。
【０２８５】
結果
TERアッセイによる経上皮抵抗の測定：  最終アッセイ時点の後、膜を24ウェル培養プレートの個別のウェル内で0.3mLの清浄な培地に入れ、EVOM上皮電圧オーム計およびEndohmチャンバー（World Precition Instruments、フロリダ州サラソタ）により経上皮抵抗（TER）を測定した。上電極を膜の上面に近接して、ただし接触しないように調整した。組織を一度に1個ずつ、それらの各ウェルから取り出し、清浄なPBSに浸漬することにより底面をすすいだ。頂端表面をPBSで2回、穏やかにすすいだ。組織ユニットをEndohmチャンバーに入れ、250μLのPBSをインサートに添加し、上電極を交換して抵抗を測定し、記録した。測定後、PBSをデカントし、組織インサートを培養プレートに戻した。すべてのTER値を組織表面積の関数として報告する。
【０２８６】
最終数値を下記により計算した：
膜のTER＝（膜を含むインサートの抵抗(R)−ブランクインサートのR）×膜の面積(0.6cm2)
ペプチドYYおよび鼻腔内送達促進剤を含む医薬配合物がEpiAirway（商標）細胞膜（粘膜上皮細胞層）上でのTER測定値に及ぼす影響を図１に示す。対照値（対照＝約1000オーム-cm2；100に正規化）と比較したTER値の低下は、細胞膜抵抗の低下および粘膜上皮細胞透過性の増大を表わす。
【０２８７】
ペプチドYY配合物の例、配合物Pは、細胞膜抵抗の最大低下を示した（表２）。この結果は、例示配合物（たとえば配合物P）が試験濃度で膜抵抗を対照の1%未満にまで低下させることを表わす。示した数値は各配合物の三重測定の平均である。配合物AおよびBはペプチドYY（Bachem AG、ペンシルベニア州キングオブプルシア）を再構成することにより調製した対照であり、60μgのペプチドY3-36を100mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）pH7.4または5.0中に含有する。粘膜送達促進剤を含まないペプチドYYは抵抗を低下させなかった。
【０２８８】
この結果は、ペプチドYYの鼻腔内送達を促進するための例示配合物（たとえば配合物P）が細胞膜抵抗を低下させ、粘膜上皮細胞透過性を有意に増大させることを表わす。例示配合物は、鼻腔内から血清または中枢神経系の組織もしくは体液へのペプチドYYの送達を増大させるであろう。この結果は、これらの例示配合物を粘膜上皮と接触させるとペプチドYYに対する粘膜上皮透過性を有意に増大させることを表わす。
【０２８９】
表２：ペプチドYYおよび鼻腔内送達促進剤を含む医薬配合物がEpiAirway細胞膜の経上皮抵抗（TER）に及ぼす影響
【０２９０】
【表２】
2006516262.tif 000011
【０２９１】
ELISAアッセイにより測定した透過速度：  ペプチドYYおよび鼻腔内送達促進剤を含む本発明の医薬配合物がEpiAirway（商標）細胞膜（粘膜上皮細胞層）を通したペプチドYYの透過に及ぼす影響を、前記に従って測定する。結果を表３に示す。EpiAirway（商標）細胞膜を通したペプチドYYの透過をELISAアッセイにより測定する。
【０２９２】
本発明の例示配合物（たとえば配合物P）について、表３に示すように、配合物PにおいてペプチドYYの透過の最大増大が起きた。この方法では、ELISAアッセイを用いて、上皮細胞から周囲の培地中へ透過した生物活性ペプチドYYの濃度を多数の時点で測定した。この結果は、配合物Pが配合物AまたはB（ペプチドYY対照配合物；60μgのペプチドY3-36を100mlのリン酸緩衝食塩水（PBS）pH7.4または5.0中に含有する；Bachem AG、ペンシルベニア州キングオブプルシア）。平均して、例示鼻腔内配合物Pを用いた120分での透過の累積増大は、配合物AまたはB対照より約1195倍大きい。
【０２９３】
【表３】
2006516262.tif 000012
【０２９４】
MTTアッセイ：  MTT-100、MatTekキットを用いてMTTアッセイを実施した。300mLのMTT溶液を各ウェルに添加した。組織インサートを清浄なPBSで穏やかにすすぎ、MTT溶液に入れた。試料を37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション後、次いで細胞培養インサートをウェル当たり2.0mLの抽出剤溶液に浸漬して各インサートを完全に覆った。蒸発を減らすために、抽出プレートをカバーおよびシールした。室温、暗所で一夜、抽出を行った。抽出期間の終了後、抽出剤溶液を混合し、96-ウェルマイクロタイタープレートにピペットで移した。各試料および抽出剤ブランクを三重に装填した。次いで試料の光学濃度を550nmでプレートリーダー（Molecular Devices）により測定した。
【０２９５】
本明細書の教示に従ったペプチドYYの鼻粘膜送達増大のための例示配合物（たとえば配合物P）について、対照配合物（配合物AまたはB）と比較したMTTアッセイを表４に示す。ペプチドYYおよび１種類以上の鼻腔内送達促進剤を含む配合物、たとえば配合物Pの結果（三重測定により実験を実施）は、この例示態様が粘膜上皮組織の生存率に及ぼす毒性が最小であることを表わす。
【０２９６】
表４：ペプチドYYおよび鼻腔内送達促進剤を含む医薬配合物がEpiAirway細胞膜の生存率に及ぼす影響：MTT％により示す
【０２９７】
【表４】
2006516262.tif 000013
【０２９８】
LDHアッセイ：  本明細書の教示に従ったペプチドYYの鼻粘膜送達増大のための例示配合物（たとえば配合物P）について、LDHアッセイを表５に示す。配合物Pの三重測定についての結果は、この例示態様が粘膜上皮組織の生存率に及ぼす毒性が最小であることを表わす。
【０２９９】
表５：ペプチドYYおよび鼻腔内送達促進剤を含む医薬配合物がEpiAirway細胞膜の生存率に及ぼす影響：死細胞％により示す（LDHアッセイ）
【０３００】
【表５】
2006516262.tif 000014
【０３０１】
実施例３
トリアムシノロンアセトニドコルチコステロイドと組み合わせた本発明の配合物P（ペプチドYY）は細胞生存率を改善する
この実施例は、ステロイド組成物、たとえばトリアムシノロンアセトニドと組み合わせ、さらに１種類以上の鼻腔内送達促進剤と組み合わせて鼻腔内送達したペプチドYY、たとえばヒトペプチドYYの透過率および上皮粘膜炎症の軽減を測定するためのインビトロ試験法を提供する。この試験法は、ペプチドYYおよびトリアムシノロンアセトニドを含む態様を適用して、TERアッセイにより上皮細胞透過率を測定し、MTTアッセイにおける細胞生存率により測定した上皮粘膜炎症の軽減を測定することを伴う。
【０３０２】
配合物P（前記の表１を参照）を、0.5、2.0、5.0、または50μgのトリアムシノロンアセトニドと組み合わせ配合する。季節性アレルギー性鼻炎のための普通のトリアムシノロンアセトニド（ナサコルト（Nasacort、登録商標、Aventis Pharmaceuticals））投与量は、１噴射当たり55μgである。トリアムシノロンアセトニドコルチコステロイドと組み合わせた配合物Pは、MTTアッセイにより測定した細胞生存率を改善し、一方ではTERおよびELISAアッセイにより測定した上皮細胞透過性を維持する。
【０３０３】
本発明の方法および配合物に従って、トリアムシノロンアセトニドの存在下での配合物Pの透過率の測定を、EpiAirway（商標）細胞膜における経上皮電気抵抗（TER）アッセイにより実施する。トリアムシノロンアセトニドを0.5、2.0、5.0、または50μgの濃度で含む配合物PのTERアッセイは、ペプチドYYの透過率が低下せず、配合物P単独と同等であったことを表わす。トリアムシノロンアセトニドを１噴射当たり0-50μgの濃度で含む配合物Pは、一般に配合物AまたはB（ペプチドYY対照）の透過率より少なくとも10-100倍大きい。
【０３０４】
本発明の方法および配合物に従って、トリアムシノロンアセトニドの存在下での配合物Pの透過率の測定を、EpiAirway（商標）細胞膜におけるELISAアッセイにより実施する。前記のTERアッセイと同様に、トリアムシノロンアセトニドを１噴射当たり0.5、2.0、5.0、または50μgの濃度で含む配合物PのELISAアッセイは、ペプチドYYの透過率が低下せず、配合物P単独と同等であったことを表わす。トリアムシノロンアセトニドを１噴射当たり0-50μgの濃度で含む配合物Pは、一般に配合物AまたはB（ペプチドYY対照）の透過率より大きい。
【０３０５】
本発明の方法および配合物に従って、MTTアッセイにより配合物Pの細胞生存率をトリアムシノロンアセトニドの存在下または不存在下で測定した。一般にトリアムシノロンアセトニド（１噴射当たり0.5、2.0、5.0、または50μgの濃度）を配合物Pに添加すると、トリアムシノロンアセトニドの不存在下の配合物Pと比較して細胞生存率が改善される。
【０３０６】
トリアムシノロンアセトニドを配合物Pに添加すると、細胞生存率が増大し、TERアッセイにより測定してトリアムシノロンアセトニドの不存在下の配合物Pに匹敵する上皮透過率を維持する。
【０３０７】
鼻腔内投与したペプチドYYの上皮粘膜炎症の軽減が、１種類以上のステロイドまたはコルチコステロイド化合物（一般に高力価化合物または配合物、場合によっては中力価または低力価化合物または配合物）と組み合わせた鼻腔内ペプチドYY配合物により達成される。高、中および低力価ステロイドの全力価（同等な投与量）を示す。一般に高力価ステロイド配合物と組み合わせた鼻腔内ペプチドYY配合物は、ベータメタゾン（投与量0.6-0.75mg）またはデキサメタゾン（投与量0.75mg）を含むが、これらに限定されない。他の配合物において、中力価ステロイド配合物と組み合わせた鼻腔内ペプチドYY配合物は、メチルプレドニソロン（投与量4mg）、トリアムシノロン（投与量4mg）、またはプレドニソロン（投与量5mg）を含むが、これらに限定されない。他の配合物において、低力価ステロイド配合物と組み合わせた鼻腔内ペプチドYY配合物は、ヒドロコルチゾン（投与量20mg）またはコルチゾン（投与量25mg）を含むが、これらに限定されない。
【０３０８】
実施例４
タンパク質である安定剤を含まないPYY配合物の調製
タンパク質である安定剤を実質的に含まない、下記の組成をもつPYYの鼻腔内投与に適したPYY配合物を調製した：
１．約3/4の水をビーカーに添加し、撹拌プレート上で撹拌バーにより撹拌し、クエン酸ナトリウムを完全に溶解するまで添加した；
２．次いでEDTAをを完全に溶解するまで撹拌した；
３．次いでクエン酸を添加し、完全に溶解するまで撹拌した；
４．メチル-β-シクロデキストリンを添加し、完全に溶解するまで撹拌した；
５．次いでDDPCを添加し、完全に溶解するまで撹拌した；
６．次いで乳糖を添加し、完全に溶解するまで撹拌した；
７．次いでソルビトールを添加し、完全に溶解するまで撹拌した；
８．次いでクロロブタノールを添加し、完全に溶解するまで撹拌した；
９．PYY3-36を添加し、溶解するまで穏やかに撹拌した；
１０，１１．pHを検査して確実に5.0±0.25であるようにした。希HClまたは希NaOHを添加してpHを調整した；
１１．水を添加して最終容量にした。
【０３０９】
【表６】
2006516262.tif 000015
【０３１０】
配合物のpH 5±0.25
オスモル濃度  約250
実施例５
前記に従って第２の配合物を調製した。ただしPYY3-36の濃度は表７に示すように15 mg/mLであった。
【０３１１】
【表７】
2006516262.tif 000016
【０３１２】
配合物のpH 5±0.25
実施例６
PYYの最適pHの判定
40℃、5日間の、pHに対するPYY3-36の安定性の測定
Ａ．PYY（3-36）／pH安定性試験試料を調製するためのプロトコル
オスモル濃度：目標250mM
クエン酸／三塩基性クエン酸ナトリウム緩衝液、10mMを使用
容量オスモル濃度＝粒子数×モル濃度
＝（1+4）×10mM＝50mM
したがって、100mM NaCl（2個の粒子）によりオスモル濃度を250mMにする。
【０３１３】
Ｂ．下記に従って安定性試料を調製（3500μl）
最終濃度
クエン酸緩衝液  1400μL 25mM（必要な最終pH）10mM
PYY  700μl 1.5 mg/mL  300 ug/ml
クロロブタノール  350μl 2.5%, 0.25%
NaCl, 350μl 1.OM, 100mM
pHを検査し、必要ならば調整する；
適量の水で3500μLにする；
方法：
120ulの試料  200ulのシラン化インサート  オートサンプラーバイアル中；
各時点につき3回の採取；
試料を40℃で5日間インキュベート。
【０３１４】
Ｃ．安定混合物の目標pHと実際の最終pHの比較
【０３１５】
【表８】
2006516262.tif 000017
【０３１６】
Ｄ．HPLC法
カラム：  Waters C18 Bondapak 10um 4.6×300mm
HPLCシステム：  Waters Alliance 2690
検出器：  Waters 2487 二重波長  220nmで
流速：  1 ml/分
注入容量：  30μl
カラム温度：  30℃
移動相：
緩衝液A: 0.1% TFA, 1%アセトニトリル  水中
緩衝液B: 0.11% TFA  アセトニトリル中
勾配：
【０３１７】
【表９】
2006516262.tif 000018
【０３１８】
Ｅ．結果および結論：
結果は、この試験に用いた特定の条件下で、安定性に最適なpHは4.90であることを表わす。pHを2.99から4.90に高めると、安定性が76%から87%に増大する。
【０３１９】
より高いpH、すなわち7.38では、PYY3-36の安定性は大幅に低下し、ゼロ時点の15%が残留するにすぎない。
実施例７
鼻腔内配合物の開発
ペプチドおよびタンパク質は低分子量療法薬と比較してかなり脆弱な分子である。配合物開発期の目的は、鼻腔内送達に適した候補配合物を同定することであった。許容できる薬物安定性、鼻粘膜を通した送達、毒性および保存有効性を備えた配合物を同定してこの目標を達成するために、多数の候補を試験した。
【０３２０】
まずpHの作用を調べた。図１は、高温（40℃）で3.0-7.4の種々のpHにおけるPYY3-36のの安定性を示す。生理的pHで、高められた温度では実質的な薬物損失が生じた。ほぼpH5.0で最大の安定性が達成された。以後の配合物最適化にはこのpHを選択した。
【０３２１】
安定性をさらに最適化するために、各種安定剤が鼻粘膜の薬物通過を促進する能力を調べた。それらが限られた細胞毒性で密着結合を開放する能力に基づいて、促進試験を選択した。これを達成するために、初代ヒト上皮細胞モデル（EpiAirway、MatTek Corp.、マサチュセッツ州アッシュランド）を用いた。この細胞系は、鼻腔内にみられる呼吸上皮に類似した密着結合をもつ擬重層円柱上皮細胞層を形成する。薬物配合物をこの組織層の頂端側に配置し、基底側の媒質について薬物定量を行った。経上皮電気抵抗（TEER）の低下により密着結合開放の程度を測定した。細胞生存率および毒性を、それぞれMTTおよびLDHアッセイによりモニターした。代表的なスクリーニング実験からのデータを図２−５に示す。
【０３２２】
図２はTEERについてのデータを示す。若干例では対照と比較してほとんどまたは全くTEER低下がなかった。他の例では、密着結合開放を表わす実質的なTEER低下があった。この結果は、このインビトロモデルは種々の配合物が密着結合を開放する能力を識別できることを証明する。
【０３２３】
試験した候補配合物において細胞生存率（図３；MTT）は良好であり、細胞毒性（図４；LDH）は低かった。
このインビトロスクリーニングモデルのハイスループット性を考慮して合計200種類を超える配合物を試験した。利用できるすべてのデータを用い、多変量解析を行って各配合物成分が7種類の出力変数（薬物透過率、オスモル濃度、冷蔵および促進条件下での安定性、TEER、ならびにMTTおよびLDHアッセイ）に及ぼす影響を解明した。多変量解析は、出力パラメーターとのあるレベルの相関性（p<0.1）についての各配合物成分の初期分析からなっていた。同定されたサブセットについて、線形回帰または段階的算定選択モデルを用いた。それらの結果は、１種類の賦形剤はオスモル濃度と毒性（それぞれr2= 0.91および0.27）、2種類はPYY3-36透過率（r2 = 0.44）、3種類は安定性（r2= 0.24）、5種類は傍細胞抵抗（r2 = 0.55）に相関することを示唆する。この方法で測定した最良の配合物は、単純な緩衝液と比較してPYY3-36の輸送を少なくとも30-75倍増大させた。
【０３２４】
これらの分析に基づいて、以後の開発のために最適化されたPYY3-36配合物を選択した。この最適化配合物は2種類の安定剤、2種類の透過促進剤、１種類のキレート化剤、および１種類の保存剤を酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）中に含有していた。この配合物は米国保存剤有効性試験（USP Preservative Effectiveness Test）に合格した。薬物透過に対する各種成分の相乗効果を図５に示す。同一オスモル濃度の単純な緩衝剤配合物と比較して、最適化配合物は100倍を超える薬物透過率増大を示す。
【０３２５】
最後に、前臨床および臨床バッチの最適化配合物を調製し、最終製品包装状態で5℃および25℃において安定性試験した。表８に示す予備データは、5℃または25℃のいずれにおいても１カ月目の時点で本質的に薬物損失がないことを証明する。
【０３２６】
【表１０】
2006516262.tif 000019
【０３２７】
要約すると、本発明の配合物開発方法により、適切な薬物安定性、鼻粘膜を通した送達、毒性および保存有効性を備えたPYY3-36配合物が調製され、これにより4kDのペプチドの送達が可能になる。
【０３２８】
前臨床試験
現在までに、一連の6種類の前臨床試験をラット、ウサギおよびイヌにおいて完了した。すべての種において、確証済みの市販ラジオイムノアッセイ法により血漿PYY3-36レベルを測定した。
【０３２９】
ラットにおける生物学的利用能（血漿中に同定された薬物のモル分率を鼻腔内投与量で割ったもの）は約6%であり、ウサギにおいては約8%であった。サンプリング前の血漿中でのペプチド分解、またはプロテアーゼ阻害剤の存在にもかかわらず起きるサンプリング後の分解は、生物学的利用能の測定値を低下させるので、これらの数値は真の生物学的利用能より低く推定された可能性がある。
【０３３０】
ヒトの臨床投与量の50倍の量（mg/kg基準）で、ラットおよびウサギモデルにおいて連続14日間、鼻毒性を評価した。被験品に関連する顕微鏡または肉眼による病的所見はなかった。臨床所見はなかった。
【０３３１】
静脈内投与後の全身毒性をラットおよびウサギモデルにおいて評価した。予想ヒト投与量の最高約160倍（ラットにおいて400 ug/kg、ウサギにおいて205 ug/kg）の4回目の投与時点で、被験品に関連する顕微鏡または肉眼による病的所見はなかった。
【０３３２】
麻酔したイヌモデルにおいて、試験計画の範囲の投与量で心血管毒性を評価した。最高投与量、すなわち60分間にわたる最高24 ug/kgのPYY3-36注入は、体表面積基準で予想ヒト投与量の33倍に相当する。得られた血漿レベル30 ng/mLは、イヌ基礎血漿レベルの約380倍であった。この血漿レベルで、動脈血圧、大腿血流、またはQTcに影響はなく、わずかな変化が心拍数（123から148に増加）および呼吸数（54から36に減少）にみられた。
【０３３３】
これらの前臨床試験において薬物動態データを収集した。ラットの１試験から、種々の量で鼻腔内投与した後の血漿レベルを図６、７および８に示す。図６は、5分以内にPYY3-36が血漿中にみられ、10-15分でピーク血漿中濃度（Tmax）に達し、末端排出半減期は約15分であることを示す。ＣmaxおよびAUC0-tの両方とも鼻腔内投与量に対して直線的である。
【０３３４】
臨床試験
PYY3-36の鼻腔内配合物の安全性、PK、および生物学的利用能を目標として、広範な投与量の臨床試験を開始した。現在までに、患者は5種類の投与量コホートのうち最初の2種類に参加している。１人の患者が喉の裏側に味を感じたと報告した；現在のところ、他の不都合な事象はない。
【０３３５】
結論
PYY3-36の鼻腔内配合物に関して、配合、前臨床および初期臨床試験を開始した。配合方法により、この4kDペプチドの経膜透過率が100倍以上増大し、細胞毒性は増大しなかった。前臨床試験は、PYY3-36について鼻、心血管および全身毒性に対する広い安全縁を証明した。現在行っている投与量拡大臨床試験に基づいて、長期投与減量試験を計画している。
【０３３６】
実施例８ａ
臨床プロトコル
健康なヒト被験者における鼻腔内ペプチドYY3-36（PYY3-36）の経鼻吸収
この試験の目的：
この試験の目的は、鼻腔内投与したPYY3-36の鼻から血流中への吸収を評価することであった。これは、空腹状態の正常かつ健康な男性および女性ボランティアを伴うＩ相、院内、１回投与、用量漸増試験であった。漸増量の鼻腔内PYY3-36を20-200μgで評価し、PYY3-36の安全性、鼻耐容性および吸収を評価した。各人における食欲感覚の評価も行った。
【０３３７】
各群3人ずつ5群に分けた健康な15人にPYY3-36を投与した：
Ｉ群
第１群には鼻腔内スプレーにより20μgのPYY3-36を0.1mlの溶液中において投与した；
II群
第2群には50μgのPYY3-36を0.1mlの溶液中において鼻腔内投与した；
III群
第3群には100μgのPYY3-36を0.1mlの溶液中において鼻腔内投与した；
IV群
第4群には150μgのPYY3-36を0.1mlの溶液中において鼻腔内投与した；
V群
第5群には200μgのPYY3-36を0.1mlの溶液中において鼻腔内投与した。
【０３３８】
投与後、5、7.5、10、15、20、30、45、60分の時点で血液試料を採取し、PYYの血漿中濃度を測定した。次いで被験者に食事をとらせ、食後30分の時点で血液試料を採取し、PYYの血漿中濃度を測定した。PYY3-36の血漿中濃度は確証された分析法により測定された。
【０３３９】
各被験者について、可能な場合は常に、モデルとは無関係な方法でPYY3-36の血漿中濃度に基づいて下記のPKパラメーターを計算した：
Cmax    最大濃度測定値；
tmax    最大濃度に達するまでの時間；
AUC0-t  時間0から測定可能な最後の濃度の時間までの濃度-時間曲線下面積：直線菱形則により計算。
【０３４０】
データから下記のパラメーターを正確に推定できる場合は、これらのパラメーターを計算した：
AUC0-∞  無限まで外挿した濃度-時間曲線下面積：次式により計算。
【０３４１】
【化９】
2006516262.tif 000020
【０３４２】
式中のCtは測定可能な最後の濃度であり、Keは見掛け終末期速度定数である；
Ke    見掛け終末期速度定数、Keは終末期のlog濃度-対-時間プロフィールの線形回帰の傾きの大きさである；
t1/2    見掛け終末期半減期（可能な場合は常に）、ここでt1/2＝(ln2)/Ke
PKの計算は、市販のソフトウェア、たとえばWinNonlin（Pharsight Corporation、バージョン3.3以上）を用いて行われた。結果を下記のグラフに示す。
【０３４３】
考察および結論
背景：
各投与群には3人の被験者を含み、発熱物質を含まない合成ヒトPYY3-36を含有する特定量の本発明の配合物を１回、鼻腔内投与した。5投与群は、配合物中に漸増量のPYY3-36を含有するように組織化された。特定間隔で、リチウムヘパリン（凝固を防ぐために）およびアプロチニン（PYY3-36を保存するために）を入れた採血管内へ血液試料を採取した。各血液試料から遠心分離により血漿を採集し、アリコートとして凍結保存した。各血液試料の１凍結アリコートをNastech Analytical Servicesへ送り、凍結状態で到着した。ラジオイムノアッセイ（RIA）によりPYY濃度をアッセイするまで、各試料を凍結したまま保存した。
【０３４４】
所見：
１群：  この群の被験者には20μgのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小”20 pg/ml未満”（ラジオイムノアッセイの定量の下限）から最大159 pg/mlまで変動した。濃度測定値の傾向は、被験者の血液中への有意の薬物吸収と一致しない；
2群：  この群の被験者には50μgのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小50 pg/mlから最大255 pg/mlまで変動した。濃度測定値の傾向は、被験者の血液中への有意の薬物吸収に一致する；
3群：  この群の被験者には100μgのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小87 pg/mlから最大785 pg/mlまで変動した。濃度測定値の傾向は、被験者の血液中への有意の薬物吸収に一致する；
4群：  この群の被験者には150μgのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小45 pg/mlから最大2022 pg/mlまで変動した。濃度測定値の傾向は、被験者の血液中への有意の薬物吸収に一致する；
5群：  この群の被験者には200μgのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小48 pg/mlから最大1279 pg/mlまで変動した。濃度測定値の傾向は、被験者の血液中への有意の薬物吸収に一致する；
これらの結果は、PYY3-36の用量依存性吸収に一致する。
【０３４５】
追加の所見およびデータ：
所見のまとめ：
・鼻腔内投与量50-200ugでは、PYYは用量依存性で血漿に取り込まれる；
・上昇した血漿中濃度の持続時間は、予測したものよりかなり長く、排出半減期は55分と計算された；
・CmaxおよびAUC 0-tは用量との良好な直線性を示す；
・ある用量ではかなりの被験者間変動性がある；
・意外にも、この試験では食後PYY上昇が検出されなかった；だし実際に摂取した食物の量を測定しておらず、摂食量が少なすぎた場合はこの所見を説明できるであろう；
・ビジュアル-アナログ目盛の空腹感質問は、PYY投与量の増加に伴って空腹感が低下することを示唆する；
・吐き気およびめまいは、きわめて高い血漿PYY濃度に関連すると思われる；
・本明細書に記載するアッセイに基づく数値は、これまでに文献に報告されているものより2-3倍高いと思われる。
【０３４６】
注釈：
・ある例ではpMol/LをPYY測定単位として用いる；他の分析ではpg/mLを用いる。換算係数はpmol/L * 4.05＝pg/mLである；
・ある例では150分の時点をプロットに示す。厳密に言えばこれは食後データ点であるので、PK評価を混乱させる可能性がある。しかし予想外の所見は、後記にさらに詳述するように食後30分の時点でベースライン値と差がなかったことである。
【０３４７】
血漿PYY濃度：
本明細書に記載するPYYアッセイ法は、それ自体の血漿PYY濃度アッセイ法として評価されている。このアッセイ法を用いて、各時点からの試料を三重アッセイした。180のデータ点のうち生物学的に疑いのある”異常値（outlier）”と思われるのは3（1.6%）である点に注目されたい。この予備分析全体のデータはこれら3つのデータ点を除いたデータセットを使用する。
【０３４８】
表９
記述PKパラメーター：
計算したPKパラメーターには下記のものが含まれる：
【０３４９】
【表１１】
2006516262.tif 000021
【０３５０】
平均PKプロットの検査により、50-200 ugの用量で用量応答が示唆されるが、20ug用量はノイズである。したがって、以後の多くの分析は50-200 ug用量からのデータのみに基づく。PYYは内因性分子であるので、AUC 0-tの方がAUC 0-∞より関連があることも提唱する。
【０３５１】
TmaxおよびT1/2（排出半減期）：
【０３５２】
【表１２】
2006516262.tif 000022
【０３５３】
24分のTmaxが鼻腔内製剤に一般的である。55分という半減期は予測したものよりかなり長い。参考文献にはt1/2が一般に5-10分であると示されている。排出半減期は、Tmax後に起きる鼻粘膜からの若干の連続取込み、およびペプチド代謝に影響を及ぼす配合物成分によっても影響される可能性がある。あるいは、本明細書に記載したアッセイ法は抽出法を用いるので、アッセイに際して遊離PYYおよびタンパク質結合PYYの両方を捕獲するが、抽出法を用いないアッセイ法は主に遊離画分をアッセイするからであろう。
【０３５４】
ベースラインからの平均VAS変化（10、30および60分値の平均マイナスベースライン）-対-用量のこの分析から、下記の所見が得られる：
VAS Q1 ”どれくらい空腹に感じていますか？”に対して、高い量のPYYを投与された後ほど被験者は空腹感が低かった；
VAS Q3 ”どれ位の量を食べられると思いますか？”に対して、高い量のPYYを投与された後ほど被験者は食べられる量が少ないと思った；
しかし、VAS Q2 ”どれくらい満腹に感じていますか？”に対しては、高い量のPYYを投与された後ほど被験者は満腹感が低かった；
これは、PYY投与に伴う感覚には満腹感、鼓脹、または胃の高収縮が含まれないことを示唆する。
【０３５５】
実施例８ｂ
ヒトへのPYY投与および減量
下記のPYY鼻腔内配合物を調製した。
【０３５６】
【表１３】
2006516262.tif 000023
【０３５７】
配合物のpH 5±0.25
１日１または2噴射を10日間にわたって被験者に投与し、2.5ポンドの減量が記録された。投与後、10分ないし12時間の間、被験者は空腹感の低下を記録した。
【０３５８】
実施例９
PYY3-36の口腔内配合物
（Prophetic）
二重層錠剤を下記の方法で製造する。接着層を下記により調製する：70重量部のポリエチレンオキシド（Polyox 301N ; Union Carbide）、20重量部のポリアクリル酸（Carbopol 934P ; B.F.Goodrich）、および10重量部の圧縮適性キシリトール／カルボキシメチルセルロース充填剤（Xylitab 200；Xyrofilm）。これらの成分をジャー内で3分間混転することにより混合する。次いでこの混合物を蒸発皿に移し、無水エタノールと共に速やかに湿式造粒して半餅状の稠度にする。この素材を即時、速やかに14メッシュ（開口1.4mm）のステンレス鋼スクリーンに通すと、これに湿潤顆粒が付着する。スクリーンを有孔アルミニウム箔で覆い、湿潤顆粒を30℃で一夜乾燥させる。乾燥顆粒をスクリーンから取り出し、次いで20メッシュ（開口0.85mm）のスクリーンに通して顆粒サイズをさらに小さくする。20メッシュスクリーンを通過しない粒子は、微粒子の量を少なくするために短時間、乳鉢と乳棒で摩砕し、次いで20メッシュスクリーンを通す。得られた顆粒を次いで混合ジャーに入れ、0.25重量部のステアリン酸および0.06重量部のミントフレーバー（Universal Flavors）を顆粒に添加してブレンドする。したがって、成分の最終重量％は、ポリエチレンオキシド69.78%、圧縮適性キシリトール／カルボキシメチルセルロース充填剤9.97%、ポリアクリル酸19.94%、ステアリン酸0.25%、ミントフレーバー0.06%である。この混合物50mg量を直径0.375インチのダイに入れ、Carver Press Model Cにより圧力0.25メートルトン、滞留時間3秒で予備圧縮すると、接着層が形成される。
【０３５９】
有効層を下記により調製する：49.39重量部のマンニトール、34.33重量部のヒドロキシプロピルセルロース（Klucel L F；Aqualon、デラウェア州ウィルミントン）および15.00重量部のタウロコール酸ナトリウム（Aldrich、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を秤量し、ジャー内で3分間混転することにより混合する。次いでこの混合物を蒸発皿に移し、無水エタノールと共に速やかに湿式造粒して半餅状の稠度にする。この素材を即時、速やかに14メッシュのステンレス鋼スクリーンに通すと、これに湿潤顆粒が付着する。スクリーンを有孔アルミニウム箔で覆い、顆粒を30℃で乾燥させる。乾燥顆粒を順に20メッシュ、40メッシュ（開口0.425mm）および60メッシュ（開口0.25mm）のスクリーンに通して顆粒サイズをさらに小さくする。メッシュスクリーンを通過しない粒子は、微粒子の量を少なくするために短時間、乳鉢と乳棒で摩砕し、次いで20メッシュスクリーンを通す。ふるい分けた粒子を秤量し、次いで0.91重量部のPYY3-36および0.06重量部のFD&Cイエロー#6HTアルミニウムレーキ色素を順に幾何学的希釈により乾燥顆粒とブレンドする。次いで乾燥顆粒を混合ジャーに入れ、0.25重量部のステアリン酸マグネシウム（滑沢剤）および0.06重量部のミントフレーバーと3分間混転することにより混合する。この試料50mgを部分圧縮した接着層に乗せ、次いで両層を1.0トンの圧力で滞留時間3秒間圧縮すると、口腔送達に適した二重層錠剤が得られる。
【０３６０】
この操作により、有効層が0.91重量％のPYY3-36、15重量％のNaTC、および84.09%の充填剤、滑沢剤、着色剤、配合助剤または着香剤を含有する歯肉錠が得られる。
実施例１０
実施例１の方法に従って、無エンドトキシンPYY3-36と無エンドトキシンではないPYY3-36が気管支上皮を透過する能力を比較する試験を実施した。エンドトキシンを含有するPYY3-36の配合物と比較して約2倍量の無エンドトキシンPYY3-36が気管支上皮を透過すると判定された。
【０３６１】
両配合物とも2.5 mg/mlのクロロブタノール、2. mg/mlのDDPC、10 mg/mlのアルブミン、1 mg/mlのEDTA、および45 mg/mlのM-B-CDを含有していた。一方の配合物は無エンドトキシンPYY3-36を含有し、他方の配合物は70EUまたはそれ以上のエンドトキシンを含有していた。
【０３６２】
エンドトキシンを含有するPYY3-36配合物の平均MTTは91.72%であり、これに対し無エンドトキシンPYY3-36配合物は100.16%の平均MTTをもっていた。
エンドトキシンを含有するPYY3-36配合物の平均透過率は5.36%であり、これに対し無エンドトキシンPYY3-36配合物の平均透過率は10.75%であった。
【０３６３】
既知の粘膜送達用賦形剤を無エンドトキシンY2受容体結合ペプチド、特に無エンドトキシンPYY3-36と効果的に組み合わせることができ、非注入配合物、特に経口送達配合物の改良に使用できる。そのような賦形剤は下記の米国特許出願に含まれ、これらを援用する：
【０３６４】
【化１０】
2006516262.tif 000024
【０３６５】
Y2受容体結合ペプチドの経口配合物
Y2受容体結合ペプチドの経口配合物は、下記の方法に従って調製できる。経口送達に好ましい配合物は、約0.5 mg/kgの無エンドトキシンPYYおよび100-約200 mg/kgの粘膜送達促進用賦形剤１種類以上を含有する。
【０３６６】
（Prophetic）
実施例１１
N-シクロヘキサノイルフェニルアラニンアルデヒドの製造：
フェニルアラニンメチルエステル（1g, 0.0046mol）をピリジン5mLに溶解する。シクロヘキサノイルクロリド（0.62mL）を添加し、混合物を2時間撹拌する。反応混合物を塩酸（1N）および砕き氷に注ぐ。この水性混合物をトルエンで2回抽出する。トルエン抽出液を真空濃縮すると、1.1gの粗製N-シクロヘキサノイルフェニルアラニンメチルエステルが得られる。
【０３６７】
N-シクロヘキサノイルフェニルアラニンメチルエステル（0.5g）をエチレングリコールジメチルエーテル（20mL）に溶解する。溶液を-70℃に冷却し、水素化ジイソブチルアルミニウム（トルエン中の1.5M溶液2.04mL）を添加する。得られた反応混合物を-70℃で2時間撹拌する。2N塩酸の滴加により反応を停止する。混合物を冷酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル溶液をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させる。真空濃縮すると白色固体が得られ、これをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０３６８】
【化１１】
2006516262.tif 000025
【０３６９】
質量分析：M+1 m/e 261。
実施例１２
N-アセチルフェニルアラニンアルデヒドの製造：
N-アセチルフェニルアラニンメチルエステル（4.2g, 19mmol）をエチレングリコールジメチルエーテルに溶解する。溶液を-70℃に冷却し、水素化ジイソブチルアルミニウム（トルエン中の1.5M溶液25.3mL, 39mmol）を添加する。得られた反応混合物を-70℃で2時間撹拌する。2N塩酸の滴加により反応を停止する。混合物を冷酢酸エチルで4回、トルエンで4回抽出する。抽出液を合わせてブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。真空濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィーにより2.7gの白色固体が得られる。NMRは文献に報告されたものと同様である；Biochemistry, 18:921-926 (1979)。
【０３７０】
実施例１３
3-アセトアミド-4-(p-ヒドロキシ)フェニル-2-ブタノン（N-アセチルチロシノン）の製造：
チロシン（28.9g, 16mmol）、無水酢酸（97.9g, 96mmol）およびピリジン（35g, 16 mmol）の混合物を100℃に１時間加熱する。反応混合物を真空濃縮すると黄色の油が得られる。この油を減圧蒸留して、29.9gの油を得る。
【０３７１】
【化１２】
2006516262.tif 000026
【０３７２】
実施例１４
3-アセトアミド-7-アミノ-2-ブタノン（N-アセチルリシノン）の製造：
実施例３の方法に従って、リシンをN-アセチルリシノンに変換する。
【０３７３】
【化１３】
2006516262.tif 000027
【０３７４】
実施例１５
3-アセトアミド-5-メチル-2-ブタノン（N-アセチルロイシノン）の製造：
実施例３の方法に従って、ロイシンをN-アセチルロイシノンに変換する。
【０３７５】
【化１４】
2006516262.tif 000028
【０３７６】
実施例１６
ベンゼンスルホニルクロリドによる4-(4-アミノフェニル)酪酸の修飾
4-(4-アミノフェニル)酪酸（20g, 0.11mol）を110mLの2N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。室温で約5分間撹拌した後、ベンゼンスルホニルクロリド（14.2mL, 0.11mol）をアミノ酸溶液に15分間かけて滴加する。室温で約3時間撹拌した後、塩酸の添加により混合物をpH2の酸性にする。これにより淡褐色の沈殿が生成し、これを濾過により単離する。沈殿を温水で洗浄し、乾燥させる。融点は123-25℃である。
【０３７７】
必要ならばこれらの修飾アミノ酸を再結晶および／またはクロマトグラフィーにより精製することができる。
実施例１７
ベンゼンスルホニルクロリドによる4-アミノ安息香酸の修飾
実施例６の方法に従って、4-アミノ安息香酸を4-(フェニルスルホンアミド)安息香酸に変換する。
【０３７８】
実施例１８
ベンゼンスルホニルクロリドによる4-アミノフェニル酢酸、4-アミノ馬尿酸、および4-アミノメチル安息香酸の修飾
実施例６の方法に従って、4-アミノフェニル酢酸、4-アミノ馬尿酸、および4-アミノメチル安息香酸を、それぞれ4-（フェニルスルホンアミド）フェニル酢酸、4-（フェニルスルホンアミド）馬尿酸、および4-（フェニルスルホンアミドメチル）安息香酸に変換する。
【０３７９】
実施例１９
ベンゼンスルホニルクロリドによるアミノ酸の修飾
化学修飾の前に16種類のアミノ酸の混合物を調製する。この混合物の成分を次表にまとめる。65gのアミノ酸混合物（［--NH2］基の総濃度＝0.61mol）を760mLの1N水酸化ナトリウム溶液（0.7625当量）に室温で溶解する。20分間撹拌した後、ベンゼンスルホニルクロリド（78ml, 1当量）を20分間かけて添加する。次いで反応混合物を加熱せずに2.5時間撹拌する。若干の沈殿が生成する場合があるので、pH9.3に達するまで溶液にさらにNaOH溶液（2N）を添加してもよい。反応混合物を室温で一夜撹拌する。次いで混合物を希塩酸（38%, 1:4）で酸性にすると、クリーム色の物質が沈殿する。生成した沈殿をデカンテーションにより単離し、水酸化ナトリウム（2N）に溶解する。次いでこの溶液を真空濃縮すると黄色固体が得られ、これを凍結乾燥機で乾燥させる。
【０３８０】
表１０
アミノ酸の組成
【０３８１】
【表１４】
2006516262.tif 000029
【０３８２】
実施例２０
ベンゼンスルホニルクロリドによる5種類のアミノ酸の混合物の修飾
86.1g（0.85molのNH2）のアミノ酸混合物（次表を参照）を643mL（1.5当量）の2N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。室温で30分間撹拌した後、ベンゼンスルホニルクロリド（108mL, 0.86mol）を15分間かけて少量ずつアミノ酸溶液に添加する。室温で2.5時間撹拌した後、2N水酸化ナトリウム溶液の追加により反応混合物のpH（pH5）をpH9に調整する。反応混合物を室温で一夜撹拌する。次いで反応混合物のpHを希塩酸水溶液（4:1, H2O :HCl）の添加によりpH2.5に調整すると、修飾アミノ酸の沈殿が生成する。上層を廃棄し、生成した黄色沈殿をデカンテーションにより単離し、水で洗浄し、2N水酸化ナトリウム（2N）に溶解する。この溶液を真空濃縮すると黄色固体が得られ、これを一夜凍結乾させる。
【０３８３】
【表１５】
2006516262.tif 000030
【０３８４】
実施例２１
ベンゼンスルホニルクロリドによる5種類のアミノ酸の混合物の修飾
86g（0.85molのNH2）のアミノ酸混合物（実施例２０の表を参照）を637mL（1.5当量）の2N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。室温で10分間撹拌した後、ベンゾイルクロリド（99mL, 0.85mol）を10分間かけて少量ずつアミノ酸溶液に添加する。室温で2.5時間撹拌した後、反応混合物のpH（pH12）を希塩酸溶液（4:1, H2O:HCl）の添加によりpH2.5に調整すると、修飾アミノ酸の沈殿が生成する。１時間沈降させた後、生成した沈殿をデカンテーションにより単離し、水で洗浄し、水酸化ナトリウム（2N）に溶解する。次いでこの溶液を真空濃縮すると粗製修飾アミノ酸が白色固体として得られる（予想収量220.5g）。
【０３８５】
実施例２２
ベンゼンスルホニルクロリドによるL-バリンの修飾
L-バリン（50g, 0.43mol）を376mL（0.75当量）の2N水酸化ナトリウム水溶液に、室温で10分間撹拌することにより溶解する。ベンゼンスルホニルクロリド（68.7mL, 0.38mol, 1.25当量）を20分間かけて室温でアミノ酸溶液に添加する。室温で2時間撹拌した後、沈殿が生成する。この沈殿を2N水酸化ナトリウム溶液の追加により溶解する。さらに30分間撹拌した後、反応混合物のpHが2.6になるまで希塩酸水溶液（4:1, H2O:HCl）を添加する。修飾アミノ酸の沈殿が生成し、これをデカンテーションにより回収する。この物質を2N水酸化ナトリウムに溶解し、真空濃縮すると白色固体が得られる。粗製修飾アミノ酸の予想収量は84.6g（77%）である。
【０３８６】
実施例２３
ヒップリルクロリドによるフェニルアラニンメチルエステルの修飾
L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（15g, 0.084mol）をジメチルホルムアミド（DMF）（100mL）に溶解し、これにピリジン（30mL）を添加する。ヒップリルクロリド溶液（16.6g, 0.084mol, 100mLのDMF中）を直ちにアミノ酸エステル溶液に2回に分けて添加する。反応混合物を室温で一夜撹拌する。次いで反応混合物を真空濃縮し、1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。メチルエステルを加水分解して遊離カルボキシル基にするために、この溶液を70℃に3時間加熱する。次いで希塩酸溶液（1:3, HCl/H2O）により溶液をpH 2.25の酸性にする。ガム状の沈殿が生成し、これを回収し、1N水酸化ナトリウムに溶解する。この溶液を真空濃縮すると予想した18.6gの粗製修飾アミノ酸生成物が得られる。アセトニトリルから再結晶して、純粋な修飾フェニルアラニン（予想収量12g）を白色粉末として回収する。融点223-225℃。
【０３８７】
実施例２４
PYY（3-36）の投与溶液の調製
試験管内で、568mgのアセチルフェニルアラニンアルデヒド、132mgのカルボメトキシフェニルアラニルロイシンおよび100mgのアセチル-Phe-Leu-Leu-Argアルデヒドを、2.9mlの15%エタノールに添加する。この溶液を撹拌し、NaOH（1.0N）を添加してpHを7.2に高める。水を添加して全容量を4.0mLにする。この試料はキャリヤー濃度200 mg/mLをもっていた。PYY（3-36）（800μg）を溶液に添加する。全PYY3-36濃度は200 μg/mLである。
【０３８８】
同様な方法で、668mgのアセチルフェニルアラニンアルデヒドおよび132mgのカルボメトキシフェニルアラニルロイシンをキャリヤー組成物として含む第2の溶液、ならびにアセチルフェニルアラニンアルデヒドをキャリヤーとして含む第3の溶液を調製する。各溶液は無エンドトキシンPYY（3-36）濃度200 μg/mLをもっていた。
【０３８９】
実施例２５
修飾アミノ酸／PYY（3-36）組成物の調製
カプセル封入した無エンドトキシンPYY3-36を含有する修飾アミノ酸マイクロスフェアの調製
実施例９に従って調製した修飾アミノ酸混合物を40℃で蒸留水（pH7.2）に100mg/mlの濃度で溶解する。次いでこの溶液を0.2ミクロンのフィルターで濾過し、温度を40℃に維持する。PYY3-36（Bachem）を、クエン酸水溶液（1.7N）およびゼラチン（5%）に150 mg/mlの濃度で溶解する。次いでこの溶液を40℃に加熱する。次いで、加熱した2つの溶液を1:1（v/v）で混合する。次いで、得られたマイクロスフェア懸濁液をグラスウールで濾過し、1000gで50分間遠心分離する。ペレットを0.85Nクエン酸で元の容量より5-7倍少ない容量に再懸濁する。再懸濁ペレットのPYY3-36濃度をHPLCにより測定する。前記方法に従って、PYY3-36を含まないマイクロスフェアをさらに調製する。必要ならば、これらの”空のマイクロスフェア”を用いてカプセル封入サケPYY3-36マイクロスフェア調製物を希釈し、最終投与懸濁液にする。
【０３９０】
(b)可溶性修飾アミノ酸キャリヤー／PYY3-36系の調製
PYY3-36を含有する可溶性アミノ酸投与用製剤を下記により調製する：修飾アミノ酸材料を蒸留水（pH8）に適宜な濃度に溶解する。この溶液を40℃に加熱し、次いで0.2ミクロンフィルターで濾過する。次いで、同様に蒸留水に溶解したPYY3-36を、経口投与前に修飾アミノ酸溶液に添加する。
【０３９１】
PYY3-36の肺送達
（Prophetic）
下記に従って調製するキャリヤー化合物は、１種類以上の化合物または塩、ポリアミノ酸またはペプチドを無エンドトキシンY2受容体結合ペプチドと混合するだけで、肺送達用の送達キャリヤーとしてそのまま使用できる。
【０３９２】
キャリヤー水溶液と活性成分の水溶液を投与直前に混合することにより、投与混合物を調製する。あるいは、キャリヤーと生物活性または化学活性成分を製造中に混合することもできる。これらの溶液は、所望により添加剤、たとえばリン酸緩衝液、クエン酸、酢酸、ゼラチンおよびアラビアゴムを含有してもよい。多数の既知の送達方法を、無エンドトキシンY2受容体結合ペプチド、特にPYY3-36に使用して、肺へのPYYの送達を改善することができる。限定ではない下記の米国特許出願を肺送達の参考として本明細書に援用する：
【０３９３】
【化１５】
2006516262.tif 000031
【０３９４】
実施例２６
キャリヤーの調製
2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸（キャリヤーB）の製造
58.6g（0.355mol）の2-(4-アミノフェニル)プロピオン酸および500mLの塩化メチレンのスラリーを、90.11ml（77.13g, 0-710mol）のトリメチルシリルクロリドで処理し、120分間、加熱還流する。反応混合物を0℃に冷却し、184.44ml（107.77g, 1.065mol）のトリエチルアミンで処理する。5分間撹拌した後、70.45g（0.355mol）のO-アセチルサリチロイルクロリドおよび150mlの塩化メチレンの溶液で処理する。反応混合物を25℃に加温し、64時間撹拌する。揮発性成分を真空中で除去する。残留物を2N水酸化ナトリウム水溶液中で１時間撹拌し、2M硫酸水溶液で酸性にする。固体をエタノール／水から2回再結晶すると淡褐色固体が得られる。濾過により単離して、予想収量53.05g（収率52%）の2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸を得る。特性：溶解度；200 mg/m：200mg + 350μL 2N NaOH + 650μL H2O-pH-7.67。分析：C, 67.36；H, 5.3；N, 4.91。
【０３９５】
2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸ナトリウム（キャリヤーBのナトリウム塩）の製造
53.05g（0.186mol）の2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸および300mLのエタノールを、水22mlに溶解した7.59g（0.190mol）のNaOHで処理する。反応混合物を25℃で30分間、0℃で30分間、撹拌する。得られた淡黄色固体を濾過により単離して、52.61gの2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸ナトリウムを得る。特性：溶解度；200 mg/ml透明溶液；pH＝6.85。分析：C, 60.45；H, 5.45；N, 3.92；Na, 6.43。融点236-238℃。
【０３９６】
キャリヤーCのナトリウム塩の製造
磁気撹拌機および還流冷却器を備えた2Lの丸底フラスコに、3-(4-アミノフェニル)プロピオン酸（15.0g, 0.084mol, 1.0当量）のジクロロメタン（250ml）懸濁液を添加する。クロロトリメチルシラン（18.19g, 0.856mol, 2.0当量）を一度に添加し、混合物をアルゴン下で1.5時間、加熱還流する。反応物を室温に放冷し、氷浴（内部温度<10℃）に入れる。還流冷却器を、トリエチルアミン（25.41g, 0.251mol, 3.0当量）を入れた滴下ろうとと交換する。トリエチルアミンを15分間かけて滴加すると、添加中に黄色固体が生成する。このろうとを、2,3-ジメトキシベンゾイルクロリド（18.31g, 0.091 mol, 1.09当量）のジクロロメタン（100mL）溶液を入れた他の滴下ろうとと交換する。この溶液を30分間かけて滴加する。反応物を氷浴内でさらに30分間、周囲温度で3時間、撹拌する。ジクロロメタンを真空蒸発させると褐色の油が得られる。この褐色の油を氷浴内で冷却し、飽和炭酸水素ナトリウムの氷冷溶液（250ml）を添加する。氷浴を取り除き、反応物を１時間撹拌すると、透明な褐色の溶液が得られる。この溶液を濃HClで酸性にし、約SCで１時間保存する。混合物をジクロロメタン（100mLで3回）抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、塩を濾別し、ジクロロメタンを真空中で除去する。得られた固体を50%酢酸エチル／水（v/v）から再結晶して、キャリヤーCを灰白色針状晶として得る（25.92g, 90%）。分析：C19H21NO5：C, 66.46；H, 6.16；N, 4.08。融点99-102℃。
【０３９７】
12gのキャリヤーC酸をエタノール75mLに加温しながら溶解する。この溶液に8.5M水酸化ナトリウム（1.02モル当量, 水4.5mL中1.426g）溶液を添加する。混合物を15分間撹拌する。約3/4のエタノールを真空中で除去し、得られた油にn-ヘプタン100mLを添加して沈殿を生成させる。この固体を50℃で真空乾燥する。分析：C19H20NO5Na 0.067H2O：C, 62.25；H, 5.54；N, 3.82；Na, 6.27。
【０３９８】
N-(4-メチルサリチロイル)-8-アミノカプリル酸（キャリヤーD）の製造
(a)オリゴ(4-メチルサリチラート）の製造
無水酢酸（32mL, 34.5g, 0.338mol, 1.03当量）、4-メチルサリチル酸（50g, 0.329 mmol, 1.00当量）、およびキシレン（100mL）を、磁気撹拌バー、温度計および冷却器を備えた1Lの四口丸底フラスコに添加する。フラスコを砂浴に入れ、混濁白色混合物の加熱を開始する。反応混合物は約90℃で透明な黄色溶液になる。大部分の揮発性有機物質（キシレンおよび酢酸）を3時間かけてディーン-スターク（Dean-Stark）トラップ内へ蒸留する（135-146℃）。蒸留をさらに１時間続けると（合計110mLが留出）、その間にポット温度は徐々に204℃に上昇し、留出物が緩慢になって滴状になる。残留物を熱時、アルミニウムトレー内へ注ぎ出す。冷却すると、脆い黄色ガラス状となる。この固体を粉砕して微細な粉末にする。得られたオリゴ(4-メチルサリチラート）をさらに精製せずに使用する。
【０３９９】
(b)N-(4-メチルサリチロイル)-8-アミノカプリル酸の製造
7M炭酸カリウム溶液（45mL, 43.2g, 0.313mol, 0.95当量）、8-アミノカプリル酸（41.8g, 262mol, 798当量）、および水（20mL）を、磁気撹拌バー、冷却器および滴下ろうとを備えた1Lの丸底フラスコに添加する。白色混濁混合物をオリゴ(4-メチルサリチラート）（44.7g, 0.329mmol, 1.0当量）およびジオキサン（250mL）の溶液を30分間かけて添加処理する。反応混合物を90℃に3時間（この時点で反応が終了したとHPLCにより判定された）加熱する。透明なオレンジ色の反応混合物を30℃に冷却し、50%硫酸水溶液（64g）でpH=2の酸性にする。生成した固体を濾過により単離する。白色固体を1170mLの50%エタノール-水から再結晶する。固体を濾過により回収し、50℃の真空オーブン内で18時間かけて乾燥させる。N-(4-メチルサリチロイル)-8-アミノカプリル酸を白色粉末として単離する（30.88g, 52%）。融点113-114℃。分析：C6H23NO4：C, 65.51；H, 7.90；N, 4.77。
【０４００】
次いでPYY（3-36）の水溶液を調製し、１種類以上のキャリヤーと混合してPYY（3-36）組成物を調製し、次いでこれを肺に噴霧する。得られる組成物に適切なPYY3-36の濃度は、約400 μg/mLとすべきである。米国特許出願20030072740を参照。
【０４０１】
実施例２７
血漿中のPYY濃度を測定するための全抽出ラジオイムノアッセイ
1.0  前置き：
ヒト血漿中のヒトペプチドYY（3-36）（hPYY）濃度を測定するために、ラジオイムノアッセイ法を開発した。抗凝固剤（EDTA）およびプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン）を用いて試料を採集し、凍結する。このアッセイは4日アッセイ法である。１日目に、試料、対照および標準品をアルコール中に抽出し、乾燥させる。2日目に、すべての試料を再構成し、hPYYに対して形成されたポリクローナルウサギ抗血清と混合する。3日目に、ヨウ素化hPYYを添加する。4日目に、特異的沈殿剤（ヤギ抗ウサギIgGおよび正常ウサギ血清）を添加する。結合トレーサーを遊離トレーサーから遠心分離し、結合トレーサーをガンマ計数計で計数する。標準曲線の内挿により濃度を計算し、アッセイ性能を品質管理試料で管理する。
【０４０２】
2.0  材料：
2.1  Peninsula PYYキット（Peninsula Laboratories、カタログNo.S-2043-0001）
2.2  試薬アルコール（Fisher Inc.、カタログNo.A995-4）（または同等品）
2.3  ストリッピング処理ヒト血漿（リチウムヘパリン含有、空腹時、プールしたもの）Golden West Biologics Inc.（カタログNo. SD1020-H）（分析用SOP#A-003）
2.4  氷浴（Fisher、カタログNo.11-676-36）（または同等品）
2.5  使捨て10mLピペット（Fisher、カタログNo.13-678-11E）（または同等品）
2.6  標準合成ヒトPYY、Nastech QC（3-36）から（Bachem、カタログNo.H8585）
2.7  蒸留水（Milli-Q Millipore、カタログNo.ZMQ56VFT1）（または同等品）
2.8  Triton X-100（Sigma、カタログNo.T-9284）（または同等品）
2.9  アルミニウム箔（Fisher、カタログNo.01-213-3）（または同等品）
2.10  アプロチニン（ICN Biomedicals Inc.、カタログNo.190779）（または同等品）
2.11  12×75mm試験管（Evergreen Scientific、カタログNo.214-2023-010）（または同等品）
2.12  12×75mm試験管キャップ（Evergreen Scientific、カタログNo.300-2912-G20）（または同等品）
2.13  1.5mLマイクロフュージ試験管（Fisher、カタログNo.05-402-25）（または同等品）
2.14  
3.0  計測器：
3.1  Wallac WIZARD 1470自動ガンマ計数計（Perkin Elmer,モデルNo.1470-002）（または同等品）
3.2  恒温標準型フリーザー、-70℃（Kendro Laboratory Products,モデルNo.C90-3A31）（または同等品）
3.3  CentriVap濃縮機（Labconco、カタログNo.7810000）（または同等品）
3.4  VX-2500 Multi-tube Vortexer（VWR、カタログNo.58816-115）（または同等品）
3.5  Marathon 21000R遠心機（Fisher、カタログNo.04-977-21000R）（または同等品）
3.6  揺動バケットローター（Fisher、カタログNo.04-976-006）（または同等品）
3.7  モーター付きピペットエイド（Fisher、カタログNo.13-681-15E）（または同等品）
3.8  エッペンドルフマイクロピペット
3.8.1  2μL-20μL（Fisher、カタログNo.21-371-6）（または同等品）
3.8.2  20μL-200μL（Fisher、カタログNo.21-371-10）（または同等品）
3.8.3  100μL-100μL（Fisher、カタログNo.21-371-13）（または同等品）
3.9  エッペンドルフ反復ピペッター（Fisher、カタログNo.21-380-9）（または同等品）
3.10  エッペンドルフ反復ピペッターCombi-tip
3.10.1  2.5mL（Fisher、カタログNo.21-381-331）（または同等品）
3.10.2  25mL（Fisher、カタログNo.21-381-115）（または同等品）
3.11  容量型ピペット（Fisher、カタログNo.21-169-10A）（または同等品）
4.0  操作
１日目
4.1  アッセイに必要な試薬および試料を融解する。十分な量が得られない場合、RIA緩衝液を１×濃度（RIAB）に調製する；
4.2  プールしたストリッピング処理ヒト血漿中に標準曲線用試料を調製する。出発濃度12.8 μg/mLを用いる場合は下記に従って調製する；
4.2.1  990μLのRIABを試験管Oに添加する；
4.2.2  990μLのプール血漿を試験管Aに添加する；
4.2.3  500μLのプール血漿を試験管B-Hに添加する；
4.2.4  12.8 μg/mLの標準品10μLを試験管Oに添加する。渦撹拌する；
4.2.5  10μLの溶液を試験管Oから試験管Aに添加する。渦撹拌する；
4.2.6  500μLの溶液を試験管Aから試験管Bに添加する。渦撹拌する；
4.2.7  500μLの溶液を試験管Bから試験管Cに添加する。渦撹拌する；
4.2.8  4.2.7と同様な希釈を試験管Hまで繰り返す（ダイヤグラム#1を参照）；
4.3  必要ならば、未知の被験ヒト血漿試料を希釈する。プールしたストリッピング処理ヒト血漿中に試料を希釈しなければならない；
4.4  NSB、TB、すべての標準品、QC試料、および被験ヒト血漿試料について、1.2mLの冷アルコールを添加して試験管から空ける；
4.5  プールしたストリッピング処理ヒト血漿400μLをNSBおよびTBの試験管に添加する。渦撹拌する；
4.6  4.2.5から4.2.8までで調製した標準試料それぞれ400μLを標準曲線用試験管H-Aそれぞれに添加する（ダイヤグラム#1を参照）。キャップをして渦撹拌する；
4.7  400μLのQC試料をそれぞれの試験管に添加する。キャップをして渦撹拌する；
4.8  400μLの各被験試料をそれぞれの試験管に添加する。キャップをして渦撹拌する；
4.9  すべての試料を氷上で30-60分間インキュベートする；
4.10  濃縮器の冷却トラップのスイッチを入れる；
4.11  すべての試験管を3000rpm、4℃で15分間、遠心分離する；
4.12  各試料からの上清1.3mLを新たな一組の空の試験管へ移す。直ちにスピンしない場合は氷浴または2-8℃に保存する；
4.13  試料を濃縮機に入れる；
4.14  試料を40℃で2時間、次いで周囲温度で合計5時間、または乾燥するまでスピンする；
4.15  乾燥試料を取り出し、カバーし、2-8℃で一夜保存する；
2日目
4.16  乾燥した試験管を2-8℃の冷却器から取り出す；
4.17  100μLの4×RIA緩衝液濃縮物を各試験管に添加する；
4.18  100μLの0.6% TX100を各試験管に添加する（付表#1を参照）。最低30秒間渦撹拌して、すべての抽出物を確実に完全に再構成する；
4.19  すべての試料を氷上で30-60分間インキュベートする；
4.20  200μLの蒸留水を各試験管に添加する。渦撹拌する；
4.21  100μLの各試料抽出液を各試験管に添加する；
注釈：NSB、TB、TC、標準曲線用試料、およびQCを一般に三重試験するので、試料当たり3本の試験管が必要である。ヒト血漿試料は、試料の入手性に応じて任意の形で試験できる（最高で三重試験）；
4.22  Peninsula Laboratoriesキット説明書の記載に従ってウサギ抗-PYYを作製する；
4.23  100μLのRIABを各NSB試験管に添加する；
4.24  200μLのRIABを各TC試験管に添加する；
4.25  100μLのウサギ抗-PYYを残りすべての試験管に添加する。渦撹拌する；
4.26  箔でカバーして2-8℃に一夜保存する；
3日目
4.27  試験管を2-8℃のクーラーから取り出す；
4.28  125I-ペプチドYYトレーサーを調製する（付表#2を参照）；
4.29  調製したトレーサー100μLをすべての試験管に添加する；キャップをして渦撹拌する；
4.30  2-8℃に一夜保存する；
4日目
4.31  試験管を2-8℃のクーラーから取り出す；
4.32  Peninsula Laboratoriesキット説明書の記載に従ってヤギ抗ウサギIgG血清（GARGG）および正常ウサギ血清（NRS）を調製する；
4.33  100μLのGARGGを各試験管に添加する（TC試験管を除く）；
4.34  100μLのNRSを各試験管に添加する（TC試験管を除く）。渦撹拌する；
4.35  室温で90-120分間インキュベートする；
4.36  500μLのRIABを、直ちに遠心分離する予定の試験管に添加する（TC試験管を除く）。渦撹拌する；
注釈：500μLのRIABを遠心分離直前に試験管に添加すべきである。遠心分離する用意ができた本数の試験管にのみRIABを添加する。他の試験管には、遠心分離する用意ができた時点で500μLのRIABを添加すべきである；
4.37  試験管（500μLのRIABを含有する）を3000rpm、4℃で15分間、遠心分離する。TC試験管は遠心分離しない；
4.38  遠心分離した試験管から上清を吸引する；
4.39  試験管を、ガンマ計数計での計数のために指定した黒色ラックに置く。最初のラックには適切なプログラム番号を付ける必要がある。以後のすべてのラックには番号を付けるべきでない。試料を以下の順序で付与する：
4.39.1  NSB試験管
4.39.2  TB試験管
4.39.3  TC試験管
4.39.4  標準品試験管（漸増濃度）
4.39.5  QC試料（3種類の濃度）
4.39.6  未知のヒト試料
4.39.7  QC試料（3種類の濃度）
4.40  計数する予定のすべての試料の後に、停止ラベルを付けた空の黒色ラックを置く；
4.41  ガンマ計数計キーパッドの’Start’を押して計数を開始する；
4.42  CPM結果を表示させるために、ガンマ計数計キーパッドのエンター用’E’を押す；
5.0  結果の評価
5.1  アッセイの異常値を同定および排除するために下記の指針を適用する。ある結果を異常値と判定して結果の最終計算に含めないためには、下記のすべての条件を満たさなければならない：
5.1.1  QCおよび未知試料：
5.1.1.1  すべての重複測定の%CVが20%より大きくなければならない；
5.1.1.2  評価する結果が少なくとも3つなければならない；
5.1.1.3  異常値の疑いがある結果と次の最近接結果との差が20%より大きくなければならない；
5.1.1.4  残りの最高結果と最低結果の差が20%より小さくなければならない；
5.1.2  標準曲線用試料：
5.1.2.1  すべての重複測定の%CVが15%より大きくなければならない；
5.1.2.2  評価する結果が少なくとも3つなければならない；
5.1.2.3  異常値の疑いがある結果と次の最近接結果との差が15%より大きくなければならない；
5.1.2.4  残りの最高結果と最低結果の差が15%より小さくなければならない；
6.0  アッセイの詳細
6.1  QC試料を下記の濃度で調製する。1つのアッセイにおいて各濃度の少なくとも2つのQC試料を試験する。6つのQC被験試料のうち4つは、下記の範囲になければならない（公称濃度±30%）。データを許容できるためには、いずれの濃度においても2つのQC被験試料のうち少なくとも1つはそのアッセイの範囲になければならない：
6.1.1  QC1（100pg/mL）  70-130 pg/mL
6.1.2  QC2（200pg/mL）  140-260 pg/mL
6.1.3  QC3（500pg/mL）  350-650 pg/mL
6.2  標準曲線パラメーター要件TBD
【０４０３】
【表１６】
2006516262.tif 000032
【０４０４】
付表#1
0.6% TX-100
試薬：    0.6% TX-100
材料：    Milli-Q蒸留水
TX-100
調製法  ：1)50mLのMilli-Q蒸留水を秤量する；
2)容量型ピペットにより300μLのTX-100を添加する；
3)十分に混合する
付表#2
125I-ペプチドPYYトレーサー
試薬：    125I-ペプチドPYYトレーサー
材料：    1×RIA緩衝液
125I-ペプチドPYY
調製法  ：1)トレーサーを1mLの1×RIA緩衝液で再構成する；
2)トレーサーの量をガンマ計数計で測定する。10μLの再構成トレーサーを試験管に移す。それをプログラム#30と付けてガンマ計数計の黒色ラックに入れる；
3)停止ラックを後に入れてラックをガンマ計数計に乗せる；
4)’Start’を押して計数を開始し、次いで’E’を押してCPM結果を表示させる；
5)トレーサー調製量（X μL）およびRIAB必要量（Y mL）を下記に従って決定する：
X μL＝(5μL)(cpm値)(試験管数+10)
(原液のcpm)
Y mL＝(0.1)(試験管数+10)
6)X μLの125I-ペプチドPYYとY mLのRIABを合わせる。十分に混合する；
実施例２８
タンパク質である安定剤を含有しないNPY配合物の調製
NPYの鼻腔内投与に適した、タンパク質である安定剤を実質的に含有しない、下記の組成をもつPYY配合物を調製する：
12.  約3/4の水をビーカーに添加し、撹拌プレート上で撹拌バーにより撹拌し、クエン酸ナトリウムを完全に溶解するまで添加する；
13.  次いでEDTAを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
14.  次いでクエン酸を添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
15.  メチル-β-シクロデキストリンを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
16.  次いでDDPCを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
17.  次いで乳糖を添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
18.  次いでソルビトールを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
19.  次いでクロロブタノールを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
20.  NPY（3-36）を添加し、それが溶解するまで穏やかに撹拌する；
21.  11 pHを検査して5.0±0.25であることを確認する。希HClまたは希NaOHを添加してpHを調整する；
22.  水を添加して最終容量にする。
【０４０５】
【表１７】
2006516262.tif 000033
【０４０６】
配合物のpH 5.0±0.25
オスモル濃度  約250
実施例２９
前記と同様にして第２配合物を調製する。ただしNPY（3-36）の濃度は下記の表１３に示すように15 mg/mLである。
【０４０７】
【表１８】
2006516262.tif 000034
【０４０８】
配合物のpH 5.0±0.25
実施例３０
タンパク質である安定剤を含有しない膵臓ペプチド（PP）配合物の調製
PPの鼻腔内投与に適した、タンパク質である安定剤を実質的に含有しない、下記の組成をもつPYY配合物を調製する：
23.  約3/4の水をビーカーに添加し、撹拌プレート上で撹拌バーにより撹拌し、クエン酸ナトリウムを完全に溶解するまで添加する；
24.  次いでEDTAを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
25.  次いでクエン酸を添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
26.  メチル-β-シクロデキストリンを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
27.  次いでDDPCを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
28.  次いで乳糖を添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
29.  次いでソルビトールを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
30.  次いでクロロブタノールを添加し、それが完全に溶解するまで撹拌する；
31.  NPY（3-36）を添加し、それが溶解するまで穏やかに撹拌する；
32.  11 pHを検査して5.0±0.25であることを確認する。希HClまたは希NaOHを添加してpHを調整する；
33.  水を添加して最終容量にする。
【０４０９】
【表１９】
2006516262.tif 000035
【０４１０】
配合物のpH 5.0±0.25
オスモル濃度  約250
実施例３１
前記と同様にして第２配合物を調製する。ただしPP（3-36）の濃度は下記の表１５に示すように15 mg/mLである。
【０４１１】
【表２０】
2006516262.tif 000036
【０４１２】
配合物のpH 5.0±0.25
以上、本発明を明確に理解するために実施例によって詳述したが、これらは説明のために示したものであって限定ではなく、この開示によりある変更および修飾が考慮されること、ならびに過度の実験を行うことなく特許請求の範囲に記載の範囲内で実施できることは当業者に自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０４１３】
【図１】高温（40℃）で3.0-7.4の種々のpHにおけるPYY3-36の安定性を示す。
【図２】透過促進剤のTEERのデータを示す。
【図３】候補PYY配合物の細胞生存率を示す。
【図４】候補配合物の細胞毒性を示す。図２−４において：  EN1＝PBS pH5.0  EN2＝L-アルギニン（10% w/v）  EN3＝ポリ-L-アルギニン（0.5% w/v）  EN4＝γ-シクロデキストリン（1% w/v）  EN5＝α-シクロデキストリン（5% w/v）  EN6＝メチル-β-シクロデキストリン（3% w/v）  EN7＝n-カプリン酸ナトリウム（0.075% w/v）  EN8＝キトサン（0.5% w/v）  EN9＝L-α-ホスファチジルコリンジデカニル（3.5% w/v）  EN10＝S-ニトロソ-N-アセチルペニシラミン（0.02% w/v）  EN11＝パルモトイル(palmotoyl)-DL-カルニチン（0.5% w/v）  EN12＝プルロニック-127（0.3% w/v）  EN13＝ニトロプルシッドナトリウム（0.3% w/v）  EN14＝グリココール酸ナトリウム（1% w/v）
【図５】各種成分が薬物透過に及ぼす相乗作用を示す。図５においてEN1はDDPC、EN2はメチル-β-シクロデキストリン、EX1はEDTAである。
【図６】ラット血漿中のPYY3-36を示す。四角は4.1μg/kgの投与量、三角は41μg/kgの投与量、丸は205μg/kgの投与量を表わす。
【図７】PYY3-36をラットに鼻腔内投与した後の用量直線性を示す：Cmax-Cbas pg/mL  対  投与量μg/kg。
【図８】PYY3-36をラットに鼻腔内投与した後の用量直線性を示す：AUC  対  投与量μg/kg。
【図９】それぞれ20μgのPYY（3-36）を鼻腔内投与した3人のボランティアにおける、PYYの平均血漿中濃度  対  時間（分）を示す。
【図１０】それぞれ50μgのPYY（3-36）を鼻腔内投与した3人のボランティアにおける、PYYの平均血漿中濃度  対  時間（分）を示す。
【図１１】それぞれ100μgのPYY（3-36）を鼻腔内投与した3人のボランティアにおける、PYYの平均血漿中濃度  対  時間（分）を示す。
【図１２】それぞれ150μgのPYY（3-36）を鼻腔内投与した3人のボランティアにおける、PYYの平均血漿中濃度  対  時間（分）を示す。
【図１３】それぞれ200μgのPYY（3-36）を鼻腔内投与した3人のボランティアにおける、PYYの平均血漿中濃度  対  時間（分）を示す。
【図１４】PYY（3-36）を鼻腔内投与した5群の健康人ボランティアについて、PYYの平均血漿中濃度pmol/L  対  時間を示す。PYY3-36の投与量は200μg、150μg、100μg、50μg、20μgであった。
【図１５】用量直線性を示す：PYYのCmax（pg/mL）  対  ヒトボランティアに投与したPYY（3-36）の量。
【図１６】用量直線性を示す：PYYの平均AUC（pg/mL）  対  ヒトボランティアに投与したPYY（3-36）の量。
【図１７】ビジュアルアナログ目盛（VAS）  対  ヒトボランティアに投与したPYY（3-36）の量を示す。質問は”どれくらい空腹ですか？”であった。100点目盛で目盛が低いほどその人の空腹度は低かった。
【図１８】ビジュアルアナログ目盛（VAS）  対  ヒトボランティアに投与したPYY（3-36）の量を示す。質問は”どれ位の量を食べられると思いますか？”であった。100点目盛で目盛が低いほどその人の空腹度は低かった。
【図１９】ビジュアルアナログ目盛（VAS）  対  ヒトボランティアに投与したPYY（3-36）の量を示す。質問は”どれくらい満腹に感じていますか？”であった。100点目盛で目盛が低いほどその人の満腹度は低かった。
【図２０】エンドトキシンを含有しないPYY（3-36）に対比したエンドトキシンを含有するPYY（3-36）の透過率（%）を示す。
【配列表】
2006516262.tif 000037
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2006516262.tif 000039
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2006516262.tif 000064
【図６】
2006516262.tif 000065
【図７】
2006516262.tif 000066
【図８】
2006516262.tif 000067
【図９】
2006516262.tif 000068
【図１０】
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【図１１】
2006516262.tif 000070
【図１２】
2006516262.tif 000071
【図１３】
2006516262.tif 000072
【図１４】
2006516262.tif 000073
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2006516262.tif 000078
【図２０】
2006516262.tif 000079
【国際調査報告】
2006516262.tif 000080