(57)【要約】本発明は、TAP-46による発現をしない30個の新規なアミノ酸をコードする90個の新規なヌクレオチドの後に、76個のヌクレオチド塩基の欠失を有し、その結果25個のアミノ酸欠失を有する新規なトコフェロール結合蛋白質（TAP-38）DNA／蛋白質を提供する。本発明は、TAP-38によって、トコフェロールからつくられる化合物のアポトーシス誘導特性が増強され、そして、TAPの阻害によって、トコフェロールからつくられる化合物の有効性が減少するというデータを提供する。従って、本発明は、腫瘍細胞によるTAP-38の発現によって、トコフェロールからつくられる化合物のアポトーシス誘導特性が増強されることを特許請求するものである。本発明は、細胞増殖性疾患及び障害を治療及び予防するための方法として、TAP-38及びTAP-46 cDNAプラスミドを個別に、及びトコフェロールからつくられるアポトーシス誘導剤と組み合わせて、そしてその他の化学療法剤と共に送達するためのエアロゾル・リポソーム／トランスフェクション／感染の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離、精製されたDNAにおいて：
（ａ）前記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；
（ｂ）前記（ａ）の単離されたDNA とハイブリダイズし、前記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；及び
（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が前記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、前記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA
で構成される群から選択されるトコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離、精製されたDNA。
【請求項２】
前記DNAが、配列識別番号No：１に示される配列を有することを特徴とする請求項１記載のDNA。
【請求項３】
前記トコフェロール結合蛋白質-p38が、配列識別番号No：２に示される予想されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１記載のDNA。
【請求項４】
請求項１記載のDNA、及び前記DNAが細胞内で発現するために必要な調節要素で構成されるベクター。
【請求項５】
前記DNAが、配列識別番号No：２に示されるアミノ酸配列を有するトコフェロール結合蛋白質-p38をコードすることを特徴とする請求項４記載のベクター。
【請求項６】
前記ベクターが、プラスミドであることを特徴とする請求項４記載のベクター。
【請求項７】
前記プラスミドが、HA標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項６記載のベクター。
【請求項８】
前記プラスミドが、緑色蛍光蛋白質を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項６記載のベクター。
【請求項９】
前記プラスミドが、GST標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項６記載のベクター。
【請求項１０】
前記プラスミドが、HIS標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項６記載のベクター。
【請求項１１】
前記プラスミドが、テトラサイクリン調節TAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項６記載のＴＲＥベクター。
【請求項１２】
請求項４記載のベクターでトランスフェクトされる宿主細胞において、前記ベクターが前記トコフェロール結合蛋白質-p38を発現させることを特徴とする宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、バクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞で構成される群から選択されることを特徴とする請求項１２記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記バクテリア細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項１３記載の宿主細胞。
【請求項１５】
単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38において、
（ａ）前記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；
（ｂ）前記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、前記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；及び
（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が前記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、前記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA
で構成される群から選択されるDNAによってコードされる単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38。
【請求項１６】
配列識別番号No：２に示されるアミノ酸配列を有する請求項１５記載の単離、精製された前記トコフェロール結合蛋白質-p38。
【請求項１７】
請求項１５記載のトコフェロール結合蛋白質-p38に対する抗体。
【請求項１８】
前記抗体が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
突然変異したトコフェロール結合蛋白質-p38において、前記蛋白質が、生物学的機能を増強する突然変異を有し、前記突然変異が、リガンド結合ドメインに対する突然変異、転写促進ドメインに対する突然変異、核移行ドメインに対する突然変異、配列特異的DNA結合ドメインに対する突然変異、非配列特異的DNA結合ドメインに対する突然変異、二量化または三量化ドメインに対する突然変異、及びリン酸化及び脱ホスホリル化に対する突然変異で構成される群から選択されることを特徴とする突然変異したトコフェロール結合蛋白質-p38。
【請求項２０】
細胞増殖性疾患を治療するための方法において、前記方法が：
（ａ）前記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；（ｂ）前記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、前記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が前記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、前記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA
で構成される群から選択されるトコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードするDNA、及び前記DNAが細胞内で発現するために必要な調節要素で構成されるベクターを薬理的に有効な量で動物に投与するステップで構成される細胞増殖性疾患を治療するための方法。
【請求項２１】
前記DNAが、配列識別番号No：２に示されるアミノ酸配列を有するトコフェロール結合蛋白質-p38をコードすることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記DNAが、配列識別番号No：３に示されるアミノ酸配列を有するトコフェロール結合蛋白質-p46をコードすることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターが、プラスミドであることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記プラスミドが、HA標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記プラスミドが、緑色蛍光蛋白質を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記プラスミドが、GST標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記プラスミドが、HIS標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
前記動物が、ヒトまたはヒト以外であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞増殖性疾患が、腫瘍性疾患及び非腫瘍性障害で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３０】
前記腫瘍性疾患が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌、神経膠種、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟組織肉腫、骨肉腫、白血病、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、基底細胞癌及び扁平上皮癌で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記非腫瘍増殖性疾患が、乾癬、良性増殖性皮膚病、魚鱗癬、乳頭腫、再狭窄、強皮症、血管腫、白斑症、ウイルス性疾患、自己免疫障害及び自己免疫疾患で構成される群から選択されることを特徴とする請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記自己免疫疾患が、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、セリアック病及び慢性関節リウマチで構成される群から選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルス性疾患が、ヒト免疫不全ウイルス性疾患であることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記自己免疫障害が、心血管プラーク形成に関連する炎症プロセス、紫外線誘発性皮膚損傷及び免疫成分に関連する障害で構成される群から選択されることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、エアロゾル化されたリポソームの形状で投与されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項３６】
前記リポソームが、ジラウロイルホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記エアロゾルが、約５％から7.5％の二酸化炭素で構成されることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
ポリエチレンイミン窒素対DNAリン酸塩（窒素：リン酸塩）の割合が、約５：１から約20：１であることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が、アポトーシス、DNA合成停止、細胞周期停止または細胞分化によって腫瘍細胞の成長を抑制することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、腫瘍細胞の転移を抑制することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項４１】
前記ベクターを投与する前または後に抗癌剤を投与するステップでさらに構成される請求項２０記載の方法。
【請求項４２】
前記抗癌剤が、9-ニトロカンプトセシン、パクリタキセル、ドキソルビシン、9-ニトロカンプトセシン、5-フルオロウラシル、ミトザントロン、ビンクリスチン、シスプラチン、エトポシド、トコテカン、タモキシフェン及びカルボプラチンで構成される群から選択されることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記抗癌剤が、エアロゾル化されたリポソームの形状で投与されることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記ベクター及び前記抗癌剤が、エアロゾル化されたリポソームの形状で同時に投与されることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記リポソームが、ジラウロイルホスファチジルコリンであることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
前記エアロゾルが、約５％から7.5％の二酸化炭素で構成されることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
ポリエチレンイミン窒素対DNAリン酸塩（窒素：リン酸塩）の割合が、約５：１から約20：１であることを特徴とする請求項４３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、分子遺伝学、癌生物学、癌予防及び癌化学療法の分野に関するものである。より具体的には、本発明は、ヒト正常細胞及び乳癌細胞からの、TAP-38と称される新規なトコフェロール結合蛋白質のcDNAクローニング及びヌクレオチド配列、及び、この蛋白質が、DNA合成の抑制、細胞分化の誘導及びアポトーシス誘導を介して新規なトコフェロール化合物が癌細胞に成長停止をもたらすように誘導する能力に関連していることを示す分子／免疫技術の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生命促進性（細胞増殖）及び細胞死促進性（アポトーシス）の調節制御はきわめて複雑であり、多数の細胞内シグナル経路及び多数の相互作用的遺伝子産物を関与させる。癌細胞は、遺伝子の発現増強のように、細胞増殖の正常な調節制御に多くの異常を示す場合があり、それによって癌細胞の数が増大することが可能になる。生命促進性遺伝子の発現増強に加えて、癌細胞は、細胞死促進性シグナルを制御する遺伝子及び遺伝子産物を下方制御し、その結果、生命を脅かす癌細胞の集積及び転移の可能性をもたらす。従って、制御されない細胞増殖と、細胞死誘導シグナル経路の抑制との組み合わせによって、癌細胞には成長と生存という利点の両方が与えられる。
【０００３】
細胞の数が増えるかどうかは、マイナスに作用する、及びプラスに作用する成長調節遺伝子産物の発現のバランス、そして、機能細胞死シグナル経路の有無に依存する。マイナスに作用する成長調節遺伝子産物は、細胞周期における細胞の阻害の一因となる。アポトーシスに関与する遺伝子は、アポトーシス促進性または抗アポトーシス性のいずれでもよく、そして、それらの間の動的なバランスによって、細胞の生死が決まる。癌細胞は、生存し、その数を増やすために、時間の経過とともに調節制御を解除する一連の突然変異イベントをうけ、その結果、たとえアポトーシス促進性シグナルの存在下であっても抑制をされずに成長、生存する能力が癌細胞に付与され、癌細胞が免疫応答防御システムによる検出及び除去を逃れることが可能になる特質が進化する。癌は外科処置によって除去されるか、または薬剤で効果的に治療されなければ、個人の死を招く場合がある。
【０００４】
新規な治療上の戦略及び薬剤が治療上の利点を提供するために必要とされる多種多様な病理細胞の増殖状態が存在する。これらの病理状態は、異常な細胞増殖、または細胞死シグナルに対する異常な応答性の能力がある殆どすべての細胞タイプに発生し得る。病理的または異常な成長及び死の特徴を示す細胞タイプには、（１）繊維芽細胞、（２）血管内皮細胞、及び（３）上皮細胞などがある。従って、個体のすべてまたは殆どすべての器官及び組織系において局部的または播種性の病理状態を治療するために、新規な方法が必要とされる。
【０００５】
大部分の癌は、それらが前立腺癌または睾丸癌のような男性に特有のものであれ、それらが乳癌、卵巣癌または子宮頸癌のような女性に特有のものであれ、あるいは、それらが肝臓癌、皮膚癌または肺癌のように男女を問わず罹患するものであれ、時間の経過につれて遺伝子の損傷及び後生的イベントが増加し、ついには高度に転移性となって治療が困難になる。限局性癌の外科的除去については、癌が原発病変以外に広がっていない場合にのみ有効なことがわかっている。いったん癌がその他の組織や器官に広がると、外科的処置は、異常または悪性細胞を根絶するために他のより特定的な処置によって補完されなければならない。化学療法あるいは放射線のような異常または悪性細胞を治療するために通例用いられる補完的処置の大部分は、悪性細胞に対して比較的より大きな破壊効果を及ぼすものの、腫瘍細胞に限局されず、多くの場合は正常細胞にある程度の悪影響をもたらす。
【０００６】
一部の天然ビタミンＥ化合物及び一部のビタミンＥ誘導体は、アポトーシス促進性及びDNA合成抑制剤として用いられてきた。構造的には、ビタミンＥはクロマノール頭部とアルキル側鎖から成る。ビタミンＥには８つの主要な天然型：アルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）、及びデルタ（δ）トコフェロール及びα、β、γ、及びδトコトリエノールがある。トコフェロールは、それらが不飽和イソプレニル側鎖でなく飽和フィチル側鎖を有する点で、トコトリエノールと異なる。トコフェロール及びトコトリエノールの４つの型は、クロマノール頭部上のメチル基の数が異なっている（αは３個、β及びγは２個、そしてδは１個）。
【０００７】
RRR-α-トコフェロール・コハク酸塩は、クロマン頭部の位置６でヒドロキシル画分ではなくスクシニル画分を含むようにエステル結合を介して構造的に修飾されているRRR-α-トコフェロールの誘導体である。RRR-α-トコフェロールのこのエステル結合コハク酸塩画分は、ビタミンＥの最も強力な型であり、アポト−シスを引き起こし、DNA合成を抑制する生物学的作用に影響を及ぼす。ビタミンＥのこの型は腫瘍細胞にアポト−シスが起きるよう誘導するが、正常細胞へのアポト−シス誘導効果は持たない。ビタミンＥのコハク酸塩化された型は、インタクトな薬剤としての抗癌剤として有効である。しかしながら、コハク酸塩画分を切断可能であって、その結果RRR-α-トコフェロールのコハク酸塩型を遊離型RRR-α-トコフェロールに変える細胞性及び組織性エステラーゼは、この化合物の抗癌剤としての効果をなくしてしまう。RRR-α-トコフェロールは、上皮または免疫由来の細胞内で、抗増殖性あるいはアポトーシス促進性の生物活性のいずれも示さない。エーテル結合を介してRRR-α-トコフェロールのクロマン環上のC-6炭素にコハク酸塩画分を結合させることによって、細胞がコハク酸塩画分を切り取るエーテラーゼを持たないので、効果がなくなることのない安定なトコフェロールからつくられるアポトーシス誘導化合物が提供される。
【０００８】
抗癌剤としてのトコフェロール及びトコトリエノールの作用機序を、部分的に、理解するためには、これらの化合物と特異的に相互作用する蛋白質を介した、それらの結合及びそれらの細胞間及び細胞内輸送を理解することが必要である。超低密度リポ蛋白質（VLDL）は、肝臓内でRRR-α-トコフェロールをとり込み（２）、RRR-α-トコフェロールが循環系に入ることを可能にすることが、十分に立証されている。肝臓蛋白質アルファ-トコフェロール輸送蛋白質（-α-TTP）が、このプロセスに関与することが示されている（３、４）。α-TTPの配列が報告され、上記蛋白質は、その他の異性体及びビタミンE型と比較して、RRR-α-トコフェロール型に対する特異性を示す（５−７）。別の低分子量蛋白質が種々の組織に存在する（８−10）ことが報告されてきたが、この蛋白質の配列あるいは役割はまだ確認されていない。
【０００９】
近年、トコフェロールのRRR型に対する特異性を有するものとして１つの蛋白質がヒト及びウシから同定された（11、12）。上記蛋白質は質量が46 kDaで、疎水性リガンドとの結合に関与するドメインである、特徴的なCRAL−TRIOドメインを有する。この蛋白質はトコフェロール結合蛋白質（TAP-46）と呼ばれた。しかし、より最近の論文では、同じ蛋白質が、スクアレンのラノステロールへの変換を促進することによってコレステロール生合成の増強に役割を持つものとして同定され、蛋白質上清蛋白質因子（SPF）と呼ばれた（14）。
【００１０】
先行技術は、正常細胞に全く、または殆ど影響を及ぼさずに、多種多様な病理生理学的状態での望ましくない、または制御できない細胞増殖を抑制する１つの効果的な手段である。本発明は、本技術分野におけるこの長年のニーズと願望を満たすものである。
【発明の開示】
【００１１】
（発明の要約）
本発明は、ヒト正常細胞及び乳癌細胞からの、トコフェロール結合蛋白質（TAP-38）のcDNAクローニング及びヌクレオチド配列、そして、TAP-38及びTAP-46が、DNA合成の抑制、細胞分化の誘導及びアポトーシス誘導を介して新規なトコフェロール化合物が癌細胞に成長停止をもたらすように誘導する能力において役割を有することを示すデータに関するものである。
【００１２】
TAP／SPFが、腫瘍細胞にアポトーシスによる細胞死が起きるように誘導するビタミンＥ化合物の能力における役割を有するかどうかを調べた。ヒト正常細胞及び乳癌細胞からのcDNAをクローニングし、少なくとも２つのトコフェロール結合蛋白質、先に報告されたトコフェロール結合蛋白質（TAP-46）と、本明細書においてトコフェロール結合蛋白質-38（TAP-38）と称される新規なトコフェロール結合蛋白質の存在が示された。
【００１３】
TAP-38 cDNAは、90個のヌクレオチド・ミスマッチ配列の後に76個のヌクレオチド欠失があり、その後にただ１つのヌクレオチドが挿入される点でTAP-46と異なっている。従って、TAP-38蛋白質は、TAP-46蛋白質と55個のアミノ酸（25個のアミノ酸欠失と30個の新規アミノ酸）が異なっている。TAP-38とTAP-46の両方が、ビタミンＥ化合物の腫瘍細胞成長抑制の能力において役割を有する証拠が提供される。
【００１４】
本発明による１つの実施の形態で、（ａ）上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたゲノムDNA とハイブリダイズし、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたcDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA：で構成される群から選択されるトコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離、精製されたDNAが提供される。
【００１５】
本発明による別の実施の形態で、（ａ）上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA：で構成される群から選択されるDNAによってコードされる単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38が提供される。
【００１６】
本発明によるさらに別の実施の形態で、（ａ）上記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、上記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、上記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA、で構成される群から選択されるトコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA、及び上記DNAが細胞内で発現するために必要な調節要素で構成されるベクターを薬理的に有効な量で動物に投与するステップで構成される細胞増殖性疾患を治療するための方法が提供される。
【００１７】
本発明のその他及びさらなる態様、特徴、便益及び利点は、開示の目的で提供される本発明の現在のところ好ましい実施の形態の以下の説明によって明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１つの態様で、本発明は、（ａ）上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA：で構成される群から選択されるトコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離、精製されたDNAに関するものである。そうしたDNAの１つの代表例は、配列識別番号No：１に示される配列を有し、配列識別番号No：２に示される予想されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。
【００１９】
別の態様で、本発明は、本発明によるDNA、及び上記DNAが細胞内で発現するために必要な調節要素で構成されるベクターに関するものである。そうしたベクターの１例は、配列識別番号No：２に示されるアミノ酸配列を有するトコフェロール結合蛋白質-p38をコードするDNAを含んでいるベクターである。好ましくは、上記ベクターはプラスミドである。１つの代表的なプラスミドは、HA標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドである。突然変異したHA標識化TAP-38蛋白質を発現させると、腫瘍細胞を、アポトーシス誘導剤によるアポトーシスの誘導に対して増感させることができる。別の代表的なプラスミドは、緑色蛍光蛋白質を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドである。このプラスミドの利用によって、TAP-38が種々の型のビタミンＥによって調節（細胞質ゾルから核へ転座）されているかを判定することができる。別の代表的なプラスミドは、GST標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドである。このプラスミドによって、TAP-38蛋白質のリン酸化状態の分析及びTAP-38結合蛋白質複合体のリン酸化状態の分析が可能になる。別の代表的なプラスミドは、HIS標識を含んでいるTAP-38 cDNAプラスミドである。このプラスミドによって、アミノ酸配列の分析のため、及びビタミンＥ結合活性アッセイのために用いられる高レベルなTAP-38蛋白質の産生及び精製が可能になる。
【００２０】
別の態様で、本発明は、ドキソサイクリン誘導性TAP-38で構成されるTREベクターに関するものである。このベクターは、TAP-38を安定して発現させる細胞株をトランスフェクトし、選択するために用いられる。そうした細胞は、種々のレベルのTAP-38蛋白質のビタミンＥ化合物の抗腫瘍特性に対する寄与を調べるために用いられる。
【００２１】
別の態様で、本発明は、本発明によるベクターでトランスフェクトされる宿主細胞に関するものであり、前記ベクターはトコフェロール結合蛋白質-p38を発現させる。上記宿主細胞は、大腸菌のようなバクテリア細胞、哺乳動物細胞、植物細胞または昆虫細胞でもよい。
【００２２】
別の態様で、本発明は、（ａ）上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、上記トコフェロール結合蛋白質-p38をコードする単離されたDNA：で構成される群から選択されるDNAによってコードされる単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38に関するものである。好ましくは、上記単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38は、配列識別番号No：２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
さらに別の態様で、本発明は、本発明によるトコフェロール結合蛋白質-p38に対する抗体に関するものである。好ましくは、上記抗体はモノクローナル抗体である。
【００２４】
さらに別の態様で、本発明は、突然変異したトコフェロール結合蛋白質-p38に関するものであり、上記蛋白質は、生物学的機能を増強する突然変異を有し、上記突然変異は、リガンド結合ドメインに対する突然変異、転写促進ドメインに対する突然変異、核移行ドメインに対する突然変異、配列特異的DNA結合ドメインに対する突然変異、非配列特異的DNA結合ドメインに対する突然変異、二量化または三量化ドメインに対する突然変異、及びリン酸化及び脱ホスホリル化に対する突然変異で構成される群から選択される。
【００２５】
さらにまた別の態様で、本発明は、（ａ）上記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、上記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、上記トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNAで構成される群から選択されるトコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードするDNA、及び上記DNAが細胞内で発現するために必要な調節要素で構成されるベクターを薬理的に有効な量で動物に投与するステップで構成される細胞増殖性疾患を治療するための方法に関するものである。一般に、上記単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46は、（ａ）トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；（ｂ）上記（ａ）の単離されたDNAとハイブリダイズし、トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA；及び、（ｃ）遺伝子コードの縮重のためにコドン配列が上記（ａ）及び（ｂ）の単離されたDNAと異なっており、トコフェロール結合蛋白質-p38またはトコフェロール結合蛋白質-p46をコードする単離されたDNA：で構成される群から選択されるDNAによってコードされる。好ましくは、上記単離、精製されたトコフェロール結合蛋白質-p38は、配列識別番号No：２に示されるアミノ酸配列を有し、上記トコフェロール結合蛋白質-p46は、配列識別番号No：３及びNo：４に示されるアミノ酸及びヌクレオチド配列を有する。この方法は、上に述べられたようなプラスミドを利用することが可能であり、この方法は、ヒトまたはヒト以外の動物を治療するために用いることができる。一般に、この方法は、腫瘍性疾患または非腫瘍性障害のような細胞増殖性疾患を治療するために用いることができる。代表的な腫瘍性疾患には、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌、神経膠種、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟組織肉腫、骨肉腫、白血病、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、基底細胞癌及び扁平上皮癌などがある。代表的な非腫瘍増殖性疾患には、乾癬、良性増殖性皮膚病、魚鱗癬、乳頭腫、再狭窄、強皮症、血管腫、白斑症、ウイルス性疾患、自己免疫障害及び自己免疫疾患などがある。代表的な自己免疫疾患には、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、セリアック病及び慢性関節リウマチなどがある。代表的なウイルス性疾患はヒト免疫不全ウイルス感染である。代表的な自己免疫障害には、心血管プラーク形成に関連する炎症プロセス、紫外線誘発性皮膚損傷及び免疫成分に関連する障害などがある。
【００２６】
本発明によるこの方法の好ましい実施の形態で、上記ベクターは、エアロゾル化されたリポソームの形状で投与される。代表的なリポソームは、１つのリポソーム誘導剤に限られるものではないが、ジラウロイルホスファチジルコリンで調剤され、上記エアロゾルは、約５％から7.5％の二酸化炭素で構成されることができる。より詳しくは、上記エアロゾルは、ポリエチレンイミン窒素対DNAリン酸塩（窒素：リン酸塩）の割合を約５：１から約20：１で有することができる。一般に、この方法は、アポトーシス、DNA合成停止、細胞周期停止、細胞分化または腫瘍細胞転移による腫瘍細胞の成長を抑制するために用いることができる。
【００２７】
本発明によるこの方法の好ましい実施の形態で、上記方法は、上記ベクターを投与する前または後に抗癌化合物を投与するステップでさらに構成されることができる。代表的な抗癌剤には、9-ニトロカンプトセシン、パクリタキセル、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、ミトザントロン、ビンクリスチン、シスプラチン、エトポシド、トコテカン、タモキシフェン及びカルボプラチンなどがある。１つの態様で、抗癌剤はエアロゾル化されたリポソームの形状で投与される。オプションとして、上記ベクター及び上記抗癌剤は、エアロゾル化されたリポソームの形状で同時に投与される。
【００２８】
治療は、薬理的に有効な量である約１mg/kgから約100 mg/kgの該化合物を投与することによって実施することができる。そうした量の投与は、経口、局所、リポソーム／エアロゾル、眼内、鼻腔内、腸管外、静脈内、筋内または皮下送達によってもよい。
【００２９】
本発明による上記化合物及び方法は、選択された細胞が正常なプログラム細胞死またはアポトーシスを起こさないために罹患する非腫瘍性疾患を治療するために用いることができる。細胞死が起きないために生じる疾患及び障害の代表例は、自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、自己細胞、組織及び器官の免疫細胞の破壊によって特徴づけられる。自己免疫疾患の代表群には、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、セリアック病及び慢性関節リウマチなどがある。本発明は自己免疫に限らず、心血管プラーク形成に関連する炎症プロセス、または紫外線誘発性皮膚損傷のような免疫成分を有するすべての障害を含んでいる。
【００３０】
本発明による上記化合物及び方法は、ウイルス感染によって罹患する障害及び疾患を治療するために用いることができる。ウイルス感染によって生じる疾患及び障害の代表例は、ヒト免疫不全ウイルス性疾患（HIV）である。これらの化合物は細胞内シグナル・ネットワーク上で機能するので、上記化合物は、サイトカイン、ウイルス、バクテリア、毒素、重金属などのようなあらゆるタイプの外部細胞シグナルのシグナル伝達に影響を与える能力を有する。
【００３１】
以下の定義は、本明細書に開示される発明の理解を容易にする目的のために提供される。具体的に定義されないいずれの用語も、本技術分野における用語の一般的な意味に従って解釈されなければならない。
【００３２】
本明細書で用いられるように、『トコフェロール結合蛋白質-p38（TAP-38）cDNA及び蛋白質』及び『トコフェロール結合蛋白質-p46（TAP-46）cDNA及び蛋白質』及び『TAP-38及びTAP-46抗腫瘍機能』という用語は、in vitro及びin vivoでのTAP-38及びTAP-46及びコンストラクトの発現及び分析を含むものである。
【００３３】
本明細書で用いられるように、『個体』という用語は、動物及びヒトについて言及するものである。
【００３４】
本明細書で用いられるように、増殖性細胞の成長の『生物学的な抑制』または『抑制』という用語は、部分的または全体的な成長抑制を含むものであり、腫瘍細胞の増殖または成長速度の減少という意味も含んでいる。本発明による組成物の生物学的抑制性投与量は、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞の成長、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に対する試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００３５】
本明細書で用いられるように、『プログラム細胞死またはアポトーシスの誘導』という用語は、細胞が、確立された形態的及び生化学的アポトーシス特性を示している、部分的または全体的な細胞死を含むものである。アポトーシスを誘導する本発明による組成物の投与量は、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に対する試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００３６】
本明細書で用いられるように、『細胞周期停止の誘導』という用語は、処理された細胞がG0/G1またはG2/Mの細胞周期相で阻害されることによる成長停止を含むものである。細胞周期停止を誘導する本発明による組成物の投与量は、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に対する試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００３７】
本明細書で用いられるように、『細胞分化の誘導』という用語は、処理された細胞が、細胞増殖が起きない段階である、確立された形態的及び生化学的分化特性として定義されるような細胞分化を受けるよう誘導されることによる成長停止を含むものである。細胞分化を誘導する本発明による組成物の投与量は、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に対する試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００３８】
本明細書で用いられるように、『成長抑制濃度（IC50）』または『有効濃度（EC50）』という用語は、癌成長を制御するため、すなわち、DNA合成抑制、細胞分化、細胞周期阻害及び／又は細胞死を介して50％の癌成長を阻害することによる、有効な薬用量の化合物または組成物を含むものとする。
【００３９】
本発明による薬効学的に設計された化合物は、治療指数を改善し、癌細胞成長の強力な抑制剤である。すなわち、それらは最小限の副作用で高い抗腫瘍活性を示す。これらの化合物は、哺乳動物には周知のエーテラーゼが存在しないために、容易に分解することができないのであるが、過剰な細胞増殖に関連する癌及び障害の治療に、そして、抑制された細胞死機序のために数が増大する細胞に対して用いることができ、副作用は最小限である。本発明による化合物は、細胞分化の誘導、アポトーシスの誘導及びDNA合成停止によって癌細胞成長を抑制する。これらの化合物によるアポトーシスの誘導、引いては、腫瘍成長の抑制は、形質転換成長因子ベータ（TGF-β）、Fas/Fasリガンド、及び特定のマイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（MAPK）シグナル経路の調節を介するものであり、あるいは、一部のトコトリエノールの場合、これらの経路を関与させることが期待される。セラミド産生のようなその他の経路を介するアポトーシスの誘導が排除されるわけではない。これらの成長抑制特性によって、これらの化合物は、種々の細胞タイプ及び系統の癌、非腫瘍過増殖性疾患、及びアポトーシス・シグナル経路に異常を有する障害などの増殖性疾患の治療に用いることが可能になる。本発明によるいくつかの化合物は、アポトーシスの強力な誘導剤であると共に、種々の細胞系統を代表する腫瘍細胞のDNA合成停止の強力な抑制剤でもある。
【００４０】
本明細書で用いられるように、『転移の抑制』という用語は、原発病変からその他の器官への腫瘍細胞移動の部分的または全体的な抑制を含むものである。トコフェロールからつくられる化合物による転移の抑制を増強する本発明による組成物の生物学的レベルは、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞成長、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００４１】
本明細書で用いられるように、『血管形成の抑制』という用語は、腫瘍血管形成の部分的または全体的な抑制または腫瘍に血液を供給する血管の血液運搬能力の減少を含むものである。
【００４２】
本明細書で用いられるように、『プログラム細胞死またはアポトーシスの誘導』という用語は、細胞が、確立された形態的及び生化学的アポトーシス特性を示している、部分的または全体的な細胞死を含むものである。トコフェロールからつくられる化合物によるアポトーシスの誘導を増強する本発明による組成物の生物学的レベルは、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞成長、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００４３】
本明細書で用いられるように、『DNA合成停止の誘導』という用語は、処理された細胞がG0/G1、SまたはG2/Mの細胞周期相で阻害されることによる成長停止を含むものである。トコフェロールからつくられる化合物によるDNA合成停止の誘導を増強する本発明による組成物の生物学的レベルは、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００４４】
本明細書で用いられるように、『細胞分化の誘導』という用語は、処理された細胞が、細胞増殖が生じない段階である、確立された形態的及び生化学的分化特徴付けとして定義されるような細胞分化を受けるよう誘導されることによる成長停止を含むものである。トコフェロールからつくられる化合物による細胞分化の誘導を増強する本発明による組成物の投与量は、組織培養における標的となる悪性または異常増殖細胞成長、動物及び細胞培養における腫瘍成長、または本技術分野の当業者に周知のその他あらゆる方法に及ぼす試験要素の効果を評価することによって判定することができる。
【００４５】
本発明による、個別または他の抗癌剤と組み合わせた、TAP-38及びTAP-46の送達のための安定で一過性のトランスフェクション、感染及びエアロゾル・リポソームの方法を用いて、腫瘍性疾患及び非腫瘍性疾患を治療することができる。腫瘍性疾患の代表例は、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、精巣癌、前立腺癌、神経膠種、線維肉腫、網膜芽腫、黒色腫、軟組織肉腫、骨肉腫、白血病、大腸癌、腎臓癌、膵臓癌、基底細胞癌及び扁平上皮癌である。非腫瘍性疾患の代表例は、乾癬、良性増殖性皮膚病、魚鱗癬、乳頭腫、再狭窄、強皮症及び血管腫、及び白斑症で構成される群から選択される。
【００４６】
本発明による方法は、選択された細胞が正常なプログラム細胞死またはアポトーシスを起こさないために罹患する非腫瘍性疾患を治療するために用いることができる。細胞死が起きないために生じる疾患及び障害の代表例は、自己免疫疾患である。自己免疫疾患は、自己細胞、組織及び器官の免疫細胞の破壊によって特徴づけられる。自己免疫疾患の代表群には、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、疱疹状皮膚炎、セリアック病及び慢性関節リウマチなどがある。本発明は自己免疫に限らず、心血管プラーク形成に関連する炎症プロセス、または紫外線誘発性皮膚損傷のような免疫成分を有するすべての障害を含んでいる。
【００４７】
本発明による方法は、ウイルス感染によって罹患する障害及び疾患を治療するために用いることができる。ウイルス感染によって生じる疾患及び障害の代表例は、ヒト免疫不全ウイルス性疾患（HIV）である。腫瘍細胞によるTAP-38またはTAP-46の発現は、トコフェロールからつくられるアポトーシス誘発剤に対する上記腫瘍細胞の応答性をより強くするので、本発明は、サイトカイン、ウイルス、バクテリア、毒素、重金属などのようなあらゆるタイプの外部細胞シグナルのシグナル伝達に影響を与える能力を有する。
【００４８】
本発明による方法は、あらゆる動物を治療するために用いることができる。最も好ましくは、本発明による方法はヒトにおいて有用である。
【００４９】
一般に、薬理学的に有効な細胞死及び抗増殖性効果を達成するために、これら化合物及びその類縁物質は、いずれかの治療上有効な投与量で投与することができる。好ましくは、構造的に改変されたトコフェロール及びトコトリエノール及び類縁物質が、約0.1 mg/kgから約100 mg/kgの投与量で投与される。より好ましくは、構造的に改変されたトコフェロール及びトコトリエノール及び類縁物質が、約１mg/kgから約10 mg/kgの投与量で投与される。
【００５０】
本発明による化合物及び組成物の投与は、リポソーム／エアロゾル、局所、眼内、腸管外、経口、鼻腔内、静脈内、筋内、皮下またはその他適切な手段によることができる。投与される量は、年齢、臨床病期、その個体の疾病または遺伝子的素因の程度、疾患の位置、体重、もしあれば併用治療の種類、及び病理学的または悪性条件の種類による。本発明による方法において有用である、効果的な送達システムは、経口投与のための、リポソーム・エアロゾル、カプセル、タブレット、溶液、懸濁液またはエリキシル剤のような形状、あるいは溶液、懸濁液または乳濁液のような殺菌した液体の形状で用いることができる。局所用のために、上記送達システムは、軟膏、クリームまたはスプレーのような形状で用いることができる。あらゆる不活性な担体が、好ましくは、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水のような適切な可溶化剤と、あるいは、エタノール、アセトンまたはDMSOのような本発明による上記方法で用いられる化合物が、適切な溶解特性を有するいずれかのそうした担体と組み合わせて用いられる。
【００５１】
正常な細胞死の欠如のために多種多様な病理学的癌性及び非癌性細胞増殖性状態及び細胞集積が存在し、そのために本発明による組成物及び方法が治療上の利点を提供することになる。これらの病理学的状態は、異常な細胞増殖の能力を持つ、またはプログラム細胞死機序に欠陥がある殆どすべての細胞タイプに生じることが可能である。病理的または異常な成長または異常な死を示す細胞タイプには、（１）繊維芽細胞、（２）血管内皮細胞、そして（３）上皮細胞などがある。上記から、本発明による方法は、個体のすべてまたは殆どすべての器官及び組織系で局所性または播種性の病理状態を治療する上で有用なことが理解される。
【００５２】
従って、本発明は、特異的に癌細胞を標的とすることが可能であり、そして、成長促進性シグナルの下方制御、成長抑制性シグナルの上方制御、生存シグナルの下方修正及び／又は細胞死シグナルの上方制御のいずれかを行なうことが可能である新規な薬剤の設計と効果的な利用に関するものである。より具体的には、本発明は、成長抑制因子を活性化し、細胞死シグナル経路を誘導し、そして、DNA合成を抑制する新規な薬剤を開発し、特徴づけるものである。
【００５３】
以下の実施例は、本発明の種々の実施の形態を説明する目的のために提供されるものであり、いかなる意味でも本発明を限定する意図はない。
【実施例１】
【００５４】
クローニングの手順
ヒトTAPに対するcDNAのコード領域を、RT-PCRによってMDA-MB-435及びMCF-7ヒト乳癌細胞からの全RNAを使って増幅した。上記全RNAを、RNeasy Mini Kit（Cat# 74107, Qiagen）を使って製造業者の取扱説明書に従って抽出した。TAPオリゴヌクレオチド・プライマーを公開されたTAP配列（Accession # NM_012429）に基づいて、センス・オリゴマー・プライマー（5'-ATG AGC GGC AGA GTC GGC GAT-3'）（配列識別番号No：５）及びアンチセンス・オリゴマー・プライマー（5'-TTA TTT CGG GGT GCC TGC CCC CA-3'）（Integrated DNA Technologie, Inc IDT）（配列識別番号No：６）で合成した。RT-PCR条件；５μgの全RNAをランダム・プライマー（Cat# 48190-011 lot# 1088038 GIBCOBRL）と共に用いた。65℃で５分間の変性、42℃で50分間の逆転写及び70℃で15分間の不活性化。PCR条件；５μlのRT-PCR産物をPCR用に40サイクル用いた；94℃で30分間、70℃で１分間及び72℃で１分間。
【００５５】
約1.2 kDのPCR産物（図６）をQIAquick Gel Extraction Kit（Cat# 28704, Qiagen）で精製し、製造業者の取扱説明書に従ったＡテーリングの手順（promega）の後にpGEM−Tベクター（Cat# A3610, Promega）へサブクローニングした。そのコンストラクトをJM109 形質転換受容性細胞（Cat# A3610, Promega）へ熱ショックを用いて形質転換した。クローンをM13フォワード及びリバース・オリゴマー・プライマー（Integrated DNA Technologie, Inc IDT）を用いて配列決定した。 
【実施例２】
【００５６】
TAP-38とTAP-46のcDNA配列の比較（図１及び図３）
図１は、TAP-38とTAP-46のcDNA配列の比較を示す。TAP-38のcDNAは、塩基ヌクレオチド 55から始まって塩基ヌクレオチド131まで続く欠失、すなわち76塩基ヌクレオチドの欠失を有する。従って、始めの18個のアミノ酸（ヌクレオチド１−54）は、18個のＮ末端トコフェロール結合蛋白質アミノ酸をコードする。コドン131の後にヌクレオチド位置222に伸長する25個のアミノ酸欠失とトコフェロール結合蛋白質トリプレットの破壊がある。位置223にただ１つの塩基ヌクレオチド挿入がある。従って、ヌクレオチド132から222（90 塩基ヌクレオチド）は、新規なTAP-38アミノ酸（アミノ酸30個）をコードする。
【００５７】
TAP-38のヌクレオチド224から1,137は、TAP-46ヌクレオチドと100％の相同性を示す。このため、TAP-38蛋白質は、TAP-46よりもアミノ酸25個分短く（403−25＝378個のアミノ酸）、さらに、30個の別のアミノ酸がTAP-46と異なる。25個のアミノ酸欠失は、トコフェロール結合蛋白質のＮ末端ドメインで生じるが、その領域の機能は未だ確定されていない。TAP-38の新規な30個のアミノ酸は、トコフェロール結合蛋白質のCRAL-TRIOドメインへアミノ酸10個が伸長する（このドメインは、その他の領域と同様に、TTP、網膜結合蛋白質、SEC 14、PTN 9及びラット分泌蛋白質45と相同性を持つ（図２及び図４））（１）。
【００５８】
図５は、TAP-46に対する25個のアミノ酸欠失（19−43）及び30個の新規なアミノ酸（44−73）の位置を示すTAP-38蛋白質の概略図である。25個のアミノ酸欠失及び30個の新規なアミノ酸を除いて、TAP-38は、TAP-46のその他の領域と100％の相同性を示す。
【実施例３】
【００５９】
HA標識化TAP-38及びHA標識化TAP-46のクローニング
46 kDa及び38 kDaのトコフェロール結合蛋白質の蛋白質発現のために、Ｎ末端サイトにHA標識を含んでいるコンストラクトを設計した。PCRのためのセンス・プライマーは、EcoRI制限酵素切断部位、開始コドン及びHA残基、及び４−21塩基からのトコフェロール結合蛋白質配列（5'-CGC GAA TTC ATG TAT GAT GTT CCT GAT TAT GCT AGC CTC AGC GGC AGA GTC GGC GAT）（配列識別番号No：７）をコードし、そして、そのアンチセンス・プライマーは、トコフェロール結合蛋白質の終止コドン及びBamHI制限酵素切断部位を含んでいた。RT-PCR及びPCR条件は上に述べられたものと同じであった。MCF-7及びMDA-MB-435細胞からのPCR産物をpGEMベクターにクローニングした。各細胞株からの３つのクローンを上に述べられたM13フォワード及びリバース・オリゴマー・プライマー（Integrated DNA Technologie, Inc IDT）を用いて配列決定した。 
【００６０】
種々のプラスミドを生成するために、1.2 kb PCR-TAP産物をpGEM-Tベクターにサブクローニングした。次に、EcoRI及びBamH-1エンドヌクレアーゼを用いてpGFP、pTRE及びpGSTを含んでいるプラスミドを生成した。pTREコンストラクトを使って、pHISを含んでいるプラスミド（エンドヌクレアーゼEcoRI/Stul（ベクター）及びHpal（pTRE-TAP））、及びpcDNA3を含んでいるプラスミドを（EcoRI/xbalエンドヌクレアーゼを用いて）生成した（図７）。
【実施例４】
【００６１】
MCF-7及びMDA-MB-435ヒト乳癌細胞におけるHA標識化TAP-38及びHA標識化TAP-46の発現
MCF-7及びMDA-MB-435細胞を、pTRE-HA-TAP-38及びTAP-46ベクターで安定的にトランスフェクトした。TAP-38及びTAP-46を発現させるポジティブ・クローン（それぞれ３つ）を、スクリーニングによってHA標識抗体でのウェスタン・プロットを用いて選択した。MCF-7及びMDA-MB-435細胞を、pcDNA-3 HA-TAP-38及びHA-TAP-46ベクターで一過的にトランスフェクトした。
【実施例５】
【００６２】
MCF-7及びMDA-MB-435細胞におけるHA標識化TAP-38及びHA標識化TAP-46の機能的発現
細胞抽出物からのTAP-38及びTAP-46蛋白質を、HA標識に対する抗体及びTAPＣ末端ペプチドに対する抗体を用いてウェスタン・プロット分析にかけた（図８）。
【実施例６】
【００６３】
TAP-38またはTAP-46のいずれかによるMDA-MB-435ヒト乳癌細胞の一過的トランスフェクション
TAP-38またはTAP-46のいずれかでのMDA-MB-435ヒト乳癌細胞の一過的トランスフェクションによって、トコフェロール化合物＃１[2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ) 酢酸]がアポトーシスを誘導する能力が増強された（図９）。
【実施例７】
【００６４】
TAPのＮ末端領域に対するアンチセンス・オリゴマーを用いたMDA-MB-435細胞の一過性トランスフェクション
TAPのＮ末端領域に対するアンチセンス・オリゴマーを用いたMDA-MB-435細胞の一過性トランスフェクション（TAP-38及びTAP-46転写で干渉する）によって、トコフェロール化合物、ビタミンEコハク酸塩及び化合物＃１、がアポトーシスを誘導する能力が阻害され、TAP-38及びTAP-46が、腫瘍細胞成長を抑制するビタミンE化合物の能力に関与することを示した（図10）。
【実施例８】
【００６５】
緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）と融合されたTAP-38及びTAP-46のクローニング
GFP-TAPが、トコフェロールから作られる化合物での処理後、特定の細胞領域または細胞小器官に局在するかどうかを調べる（図11）。
【実施例９】
【００６６】
TAPに対するアンチセンス・オリゴマー
TAP（TAP-38とTAP-46の両方）に対するアンチセンス・オリゴマーによって、ビタミンEコハク酸塩または化合物＃１[2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ) 酢酸]によるアポトーシスの誘導が、トコフェロール結合蛋白質を関与させることが示される。トコフェロール結合蛋白質に対するアンチセンス・オリゴマーは、トコフェロール結合蛋白質に対するセンス・オリゴマーと比較して、細胞をビタミンEコハク酸塩及び化合物＃１[2,5,7,8-テトラメチル-(2R-(4R,8R,12-トリメチルトリデシル)クロマン-6-イルオキシ) 酢酸]で処理した場合に、ポリADBリボース・ポリメラーゼ（PARP）の切断を阻害した。さらに、トコフェロール結合蛋白質に対するアンチセンス・オリゴマーは、c-Junのリン酸化反応を阻害することをデータは示している（図12）。
【実施例１０】
【００６７】
他のアポトーシス誘導剤と組み合わされたTAP-38またはTAP-46製剤のエアロゾル・リポソ−ム・プラスミドDNA
TAP-38またはTAP-46に別個にトコフェロールからつくられたアポトーシス誘導剤をプラスし、そして9-ニトロカンプトセシン、ドキソルビシン及びタクソールのようなその他のアポトーシス誘導剤と組み合わせたリポソーム調剤には、参考文献（６）に概略されたリポソ−ム／プラスミドDNA手順の後にポリエチレンイミンが利用される。
【実施例１１】
【００６８】
エアロゾル・リポソ−ム／TAP-38またはTAP-46の投与
TAP-38またはTAP-46 cDNAプラスミドの投与は、感染、トランスフェクションによって、またはエアロゾル／リポソ−ム製剤によって行なうことができる。TAP-38またはTAP-46 cDNAプラスミドの送達のエアロゾル法を、送達方法の１例としてここに挙げる。エアロゾル・リポソ−ム／TAP-38またはTAP-46プラスミドDNA製剤は、トコフェロールからつくられるアポトーシス誘導剤と組み合わせて（またはその他の化学療法剤と組み合わせて）、ヒトを含むあらゆる動物に投与することが可能である。
【００６９】
エアロゾル送達の方法を、実験動物としてマウスを使って説明する。リポソ−ム／TAP-38またはTAP-46プラスミドDNA製剤及びトコフェロールからつくられるアポトーシス誘導化合物（その他の化学療法剤の有無に関わらず）を、密閉したプラスチック製ケージに入れた腫瘍を持つBalb/cマウス及び腫瘍を持たないBalb/cマウスに投与する。10 L／分の気流を生成するエア・コンプレッサ（EZ-Air PM 15F, Precision Medical）をAero Mist噴霧器（CIS-US, Inc. Bedford, MA）と共に用いて、エアロゾル粒子を生成する。上記リポソームを室温まで冷まして、その後十分な蒸留水を加えることによって上記製剤をもどし、最終容積を５mlにする。その溶液を室温で30分間一定時間ごとに反転しながら膨潤させ、その後噴霧器に加える。噴霧器を、伸縮式管（内径１cm）を介してケージの一端の入口に接続する。エアロゾルをケージの他端の開口部を通じて排出する。安全のため、噴霧は覆いの中で行なう。すべての処置が完了するまで（総容積５mlの送達は約30分間）、エアロゾルを密閉容器ケージ内のマウスに投与する。
【実施例１２】
【００７０】
ヒト癌細胞に対するin vivoの可能性
本発明による組成物を治療剤として用いることができる。ヌードマウスのような免疫無防備状態の動物に異所的または同所的のいずれかで移植された、ヒト腫瘍細胞の腫瘍成長及び転移に関するin vivoでの研究、あるいは、広く認められた動物モデルを用いたin vivoでの研究が行なわれる。免疫無防備状態のマウスに移植されたヒト腫瘍細胞の成長の抑制によって、臨床試験のための臨床前データが提供される。in vivoでの研究が、非エストロゲン応答性MDA-MB-435ヒト乳癌モデル、及びマウス同系66cl.4-GFP乳癌モデルの転移可能性に関して行なわれる。
【実施例１３】
【００７１】
MDA-MB-435乳癌モデル
標識蛋白質（緑色蛍光蛋白質、GFP）で安定的にトランスフェクトした無菌MDA-MB-435ヒト乳癌細胞を固形腫瘍として免疫無防備状態のヌードマウスで成長させる。１Ｘ106個の腫瘍細胞を同所的にメスのヌードマウスの乳腺脂肪体に注入、または異所的に第４及び第５乳頭近傍に注入する。腫瘍が１mmの大きさに達した時に、TAP-38または TAP-46と、アポトーシス誘導特性を示すトコフェロールからつくられた化合物とによる毎日の処置を開始する。処置動物及びコントロール動物の腫瘍成長、転移及び死亡を判定する。腫瘍成長は、腫瘍の大きさをノギス評価によって測定する。致死時に、腫瘍を除去し、容積を測定し、組織化学的検査のために用いる。膵臓、リンパ節、肺及び骨髄などの器官を、標識緑色蛍光蛋白質の発現のための組織切片の組織化学的染色によって、転移性細胞について検査する。
【実施例１４】
【００７２】
マウス同系66cl.4-GFP乳癌モデル
Balb/c系の無菌66cl.4-GFP乳癌細胞（100,000から200,000個）をメスのBalb/cマウスの第４及び第５乳頭近傍に注入する。処置は上に述べられたとおりである。腫瘍の肺への転移は100％のマウスで生じる。上記動物の腫瘍成長、転移及び死亡を判定する。腫瘍成長は、腫瘍の大きさをノギス評価によって測定する。致死時に、腫瘍を除去し、容積を測定し、組織化学的検査のために用いる。膵臓、リンパ節、肺及び骨髄などの器官を、標識緑色蛍光蛋白質の発現のための組織切片の組織化学的染色によって、転移性細胞について検査する。
【実施例１５】
【００７３】
siRNAを用いたTAP-46阻害実験
13.5 X 106/55cm2の細胞培養皿（100 mm X 20 mm; catalog # 430293, Corning Inc., Corning, NY）でMDA-MB-435細胞を、in vitroで転写したTAP siRNA（Silencer siRNA Construction Kit, Ambion）でsiPORT Lipidを使って製造業者の取扱説明書に従って（catalog # 4505, Ambion, Austin, TX）一過的にトランスフェクトした。細胞を１晩培地で培養し、その後無添加標準MEM培地で２回洗浄した。次にその細胞を１晩、５mlの無血清培地（OPTI-MEMI, catalog # 31985-070, Gibco）のsiRNA/siPORT脂質[10 mM/16μlまたは16μlのsiPORT脂質のみ（コントロールとして）]の存在下で培養した。siRNA/siPORT脂質複合体を２つのステップによって生成した：１）16μlのsiPORT脂質を、60μlのOPTI-MEMI培地で30分間室温で培養した；そして、２）その後、OPTI-MEMI中の60μlのsiPORT脂質を、500μlの希釈TAP siRNA［またはコントロールとしての500μlの培地（500μlのOPTI-MEMI培地での５μl の10μM TAP siRNA）］で20分間培養した。その後、トランスフェクトされた細胞を、アポトーシス用に1.5 X 105細胞／ウェルで12個のウェルに、そして、ウェスタン免疫ブロット分析用に3.5 X 106細胞／培養皿で55cm2の培養皿に分けた。
【００７４】
55cm2の培養皿の細胞を、２％血清処理培地の20μg/mlのα-TEAで15時間処理した後に、８時間培地で培養した。細胞を回収、分別し、その溶解物をウェスタン免疫ブロット分析によってTAPの蛋白質レベルについて分析した（図１３Ａ）。12ウェル・プレートで培養した細胞を、20μg/mlのα-TEA、20μg/mlのVES及び５μg/mlのRRR-δ-トコトリエノール（dt3）で処理して２日間培養した後に、１晩培地で培養した（図１３Ｂ）。
【００７５】
図１３Ａ及び図１３Ｂに示される結果によって、トコフェロール結合蛋白質46（TAP-46）は、トコフェロールからつくられる化合物（α-TEA、VEA、及びδT3など）がMDA-MB-435細胞ヒト乳癌細胞をアポトーシスによって細胞死を起こすよう誘導する上で重要なことが示される。
【００７６】
図１３Ａは、TAP siRNAでトランスフェクトされたMDA-MB-435細胞が、減少したレベルの細胞性TAP-46を示すことを示す。TAPを標的とする低分子干渉RNA（siRNA）で一過性にトランスフェクトされたヒトMDA-MB-435乳癌細胞の細胞溶解物におけるTAP蛋白質のレベルは、時間に依存してTAP蛋白質の発現を阻害した。TAP siRNAをMDA-MB-435細胞に２、４及び６日間一過性にトランスフェクトすると、TAP蛋白質の発現がそれぞれ０％、45％及び63％抑制された。これらのデータは、siRNAがTAP-46発現に対する効果的な阻害剤であることを示す。
【００７７】
図１３Ｂは、MDA-MB-435乳癌細胞をTAP siRNAで２、４及び６日間一過性にトランスフェクトし、その後２日間VES、α-TEAまたはδT3の存在下で培養すると、アポトーシスの生起が抑制されることを示す。例えば、TAP siRNAで６日間一過性にトランスフェクトされ、その後α-TEA、VESまたはδT3で処理された細胞は、上記３つの化合物で２日間培養されたコントロールの細胞と比較して、アポトーシスの誘導が約60％抑制された。
【００７８】
本明細書では以下の参考文献が引用されている。
1. Zimmer S, Stocker A, Sarbolouki MN, Spycer SE, Sassoon J, Azzi A. A 1. novel human tocopherol-associated protein: cloning, in vitro expression, and characterization. Journal of Biological Chemistry 275; 25672-80, 2000.
2. Traber, M.G. and Arai, H. Molecular mechanisms of vitamin E transport. Annual Rev. Nutr., 19:343-355, 1999.
3. Traber, M.G. and Sies, H. Vitamin E in humans: Demand and delivery. Annual Rev. Nutr. 16:321-347, 1996
4. Arita, M., Nomura, K., Arai, H., and Inoue, K.  Alpha-tocopherol transfer protein stimulates the secretion of alpha-tocopherol from a cultured liver cell line through a brefeldin A-insensitive pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12437-12441, 1997.
5. Ouahchi, et al., Ataxia with isolated vitamin E deficiency is caused by mutations in the alpha-tocopherol transfer protein. Nat. Genetics 9: 141-145, 1995.
6. Arita, et al., Human alph-tocopherol transfer protein; cDNA cloning, expression and chromosomal localization. Biochem J. 306:437-443, 1995.
7. Hosomi, et al., Affinity for alpha-tocopherol transfer protein as a determinant of the biological activities of vitamin E analogs. FEBS Lett, 409: 105-108, 1997.
8. Dutta-Roy, et al., Purification and partial characterization of an alpha-tocopherol-binding protein from rabbit heart cytosol. Mol. Cell. Biochem., 123:139-144, 1993.
9. Gordon, et al., Characterization of a novel alpha-tocopherol-binding protein from bovine heart cytosol. Arch Biochem. Biophys., 318: 140-146, 1995.
10. Dutta-Roy, A. K. Alpha-tocopherol-binding proteins; purification and characterization. Methods Enzymology 282: 278-297, 1997.
11. Stocker, A., Zimmer, S., Spycher, S. E., and Azzi, A. Identification of a novel cytosolic tocopherol-binding protein; structure, specificity, and tissue distribution. IUBMB Life, 48:49-55, 1999.
12. Zimmer, et al., A novel human tocopherol-associated protein: cloning, in vitro expression, and characterization. J. Boll. Chem., 275: 25672-25680, 2000.
13. Sha, et al., Crystal structure of the Saccharomyces cerevisiae phosphatidylinositol-transfer protein. Nature, 391:506-510, 1998.
14. Shibata, et al., Supernatant protein factor, which stimulates the conversion of squalene to lanosterol, is a cytosolic squalene transfer protein and enhances cholesterol biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98:2244-2249, 2001.
【００７９】
本明細書に記載されるすべての特許または刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示すものである。さらに、これらの特許及び刊行物は、あたかも個々の刊行物が引用によって組み込まれることが具体的、個別的に示されているような程度と同程度に、引用によって本明細書に組み込まれる。
【００８０】
当業者であれば、本発明が、述べられ、そして本明細書に内在する目的を実施し、目的及び利点を得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に述べられた方法、手順、処置、分子及び特定の化合物に加えて、本実施例は、現在のところ好ましい実施例を代表するものであり、例示するものであり、本発明の範囲の限定として意図されるものではない。請求項の範囲によって定義されるような本発明の精神に含まれる本明細書での変更及びその他の利用が、本技術分野の当業者に想起されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
本発明による上に述べられた特徴、利点及び目的、そして今後明らかになるその他の事項が達成され、詳細に理解することができるように、本発明のより具体的な説明が簡潔に要約される。上記事項は、添付図面で説明される本発明のいくつかの実施の形態を参照することによってよりよく理解することができる。これらの図面は本明細書の一部を形成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を説明するものであり、従って、それらの範囲を限定するものとはみなされないことに注意されたい。
【図１】TAP-38のcDNA配列（配列識別番号No.１）を示す図である。
【図２】TAP-38の予想されるアミノ酸配列を示す図である。
【図３】TAP-38とTAP-46のcDNA配列の比較を示す図である。
【図４】TAP-38及びTAP-46の予想されるアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図５】TAP-38蛋白質のアミノ酸欠失及び新規なアミノ酸を示す概略図である。
【図６】種々の乳癌細胞株から単離されたTAPのPCR産物を示す図である。（HEMC=ヒト上皮乳腺細胞；M10A＝不死化されたが、非発癌性であるヒト乳腺細胞；MDA-MB-435＝エストロゲン非応答性ヒト乳癌細胞；MDA-MB-231＝エストロゲン非応答性ヒト乳癌細胞；及びMCF-7＝エストロゲン応答性ヒト乳癌細胞。）
【図７】pGFP、pTRE、pGST、pHIS及びpcDNA3プラスミドを生成するためのプロセスを説明する概略図である。
【図８】MCF-7及びMDA-MB-435ヒト乳癌細胞におけるHA標識化TAP-38蛋白質及びHA標識化TAP-46蛋白質の発現を示す図である。
【図９】20マイクログラム／mlの化合物＃１（Co＃-１）での処理後、TAP-38及びTAP-46 cDNAで一過性にトランスフェクトされたヒトMDA-MB-435乳癌細胞の増強されたアポトーシス［ベクターのみ（ベクター・コントロール）で一過性にトランスフェクトされた細胞で得られたレベルよりも上）］を示す図である。
【図１０】ヒトMDA-MB-435細胞へ一過性にトランスフェクトされたTAP（TAP-38とTAP-46の両方）に対するアンチセンス・オリゴマーは、（センス・オリゴマー・トランスフェクト細胞と比較して、）ヒトMDA-MB-435細胞にアポトーシスが起きるよう誘導するビタミンＥコハク酸塩（VES）及び化合物＃１（Co＃-１）の能力を阻害することを示す図である。アポトーシスは、核濃縮及び断片化の実験によって判定された。
【図１１】pGFPベクター（コントロール）、GFP-TAP-38 cDNA及びGFP-TAP-46 cDNAでそれぞれ一過性にトランスフェクトされたヒトMDA-MB-435細胞の細胞質ゾルにおける緑色蛍光蛋白質（GFP）の発現を示す図である。
【図１２】TAP（TAP-38とTAP-46の両方）に対するアンチセンス（Ａ）・オリゴマーで一過性にトランスフェクトされたMDA-MB-435細胞は、［センス・オリゴマー（Ｓ）と比較して、］アポトーシス誘導剤であるビタミンＥコハク酸塩（VES）及び化合物＃１（Co＃-１）で処理された場合に、減少したレベルのアポトーシスを示す（PARP切断--PARP 116 kDA＝インタクト蛋白質、及びPARP-84 kDA＝切断生成物によって測定された場合）図である。さらに、TAPに対するアンチセンス・オリゴマーは、（アンチセンスまたはセンス・オリゴマーでトランスフェクトされた）MDA-MB-435細胞をビタミンＥコハク酸塩（VES）及び化合物＃１（Co＃-１）で処理した場合、転写因子蛋白質c-Jun（pc-Jun）のリン酸化を抑制した。
【図１３】トコフェロール結合蛋白質46（TAP-46）は、トコフェロールからつくられる化合物（アルファ-TEA、VES及びδT3など）がヒトMDA-MB-435ヒト乳癌細胞にアポトーシスによって細胞死が起きるように誘導する上で重要であること、そして、TAP siRNAがTAP-46発現の効果的な阻害剤であることを示す図である。図１３Ａは、TAPを標的とする低分子干渉RNA（siRNA）で一過性にトランスフェクトされたヒトMDA−MB−435乳癌細胞の細胞溶解物におけるTAP蛋白質のレベルが、時間に依存してTAP蛋白質の発現を阻害することを示す。Si＝TAP siRNAでトランスフェクトされた細胞；Co＝SiPORT脂質コントロール・レベル；TAP＝TAP-46；GAPDHレベルはレーン・コントロールとして、相対的な濃度測定分析を判定するために用いられた。図１３Ｂは、低分子干渉TAP RNA（siRNA）で２、４及び６日間一過性にトランスフェクトされ、その後VES、α-TEAまたはδT3の存在下で２日間培養されたヒトMDA-MB-435乳癌細胞が、アポトーシスの生起を抑制されたことを示す。
【配列表】
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2006506951.tif 000003
2006506951.tif 000004
2006506951.tif 000005
2006506951.tif 000006
【図１】
2006506951.tif 000007
【図２】
2006506951.tif 000008
【図３】
2006506951.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2006506951.tif 000013
【図８】
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【図９】
2006506951.tif 000015
【図１０】
2006506951.tif 000016
【図１１】
2006506951.tif 000017
【図１２】
2006506951.tif 000018
【図１３】
2006506951.tif 000019
【国際調査報告】
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2006506951.tif 000021
2006506951.tif 000022
2006506951.tif 000023