(57)【要約】本発明はエリスロポエチン受容体と結合してこれを活性化する抗体及びその抗体フラグメントに関する。本発明は前記抗体を使用して哺乳動物におけるエリスロポエチン受容体の内因性活性を調節する方法と、前記抗体を含有する医薬組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化するが、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２】
エリスロポエチン受容体に対する内因性ヒトエリスロポエチンの結合親和性の１００倍以内の結合親和性を示す、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化することが可能な抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３】
配列番号３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項４】
配列番号５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項５】
配列番号３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域と、配列番号５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項６】
配列番号７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項７】
配列番号９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項８】
配列番号７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域と、配列番号９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項９】
配列番号１１、１５、１９、３１、３５、３９、４３、４７、５１及び５５又はその抗体フラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１３、１７、２１、２３、２５、２７、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３及び５７又はその抗体フラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１１】
配列番号１１／配列番号１３、配列番号１５／配列番号１７、配列番号１９／配列番号２１、配列番号１１／配列番号２３、配列番号１１／配列番号２５、配列番号１１／配列番号２７、配列番号１１／配列番号２９、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３５／配列番号３７、配列番号３９／配列番号４１、配列番号４３／配列番号４５、配列番号４７／配列番号４９、配列番号５１／配列番号５３及び配列番号５５／配列番号５７又はその抗体フラグメントから構成される群から選択される少なくとも１個の重鎖可変領域と少なくとも１個の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１２】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１３】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１４】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１５】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１６】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号１１又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１７】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号１３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１８】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号１５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項１９】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号１７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２０】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号１９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２１】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号２１又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２２】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号２３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２３】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号２５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２４】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号２７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２５】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号２９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２６】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号３１又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２７】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号３３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２８】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号３５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項２９】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号３７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３０】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号３９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３１】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号４１又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３２】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号４３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３３】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号４５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３４】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号４７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３５】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号４９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３６】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号５１又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３７】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号５３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３８】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号５５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項３９】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能であり、配列番号５７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項４０】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体と結合することが可能であり、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１とそのフラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列をもつＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む重鎖可変領域を含む単離抗体。
【請求項４１】
哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体と結合することが可能であり、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８及びそのフラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列をもつＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体。
【請求項４２】
ヒトエリスロポエチン受容体を活性化するために治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含み、抗体又は抗体フラグメントが配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の活性化方法。
【請求項４３】
受容体の活性を調節するために治療的に有効な量の請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の調節方法。
【請求項４４】
治療を必要とする哺乳動物に受容体を活性化するために治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントを投与する段階を含み、前記抗体又は抗体フラグメントが配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、形成不全症の哺乳動物の治療方法。
【請求項４５】
治療を必要とする哺乳動物に受容体の活性を調節するために治療的に有効な量の請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与する段階を含む、形成不全症の哺乳動物の治療方法。
【請求項４６】
抗体又はその抗体フラグメントが配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない、治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントと医薬的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物前記医薬組成物。
【請求項４７】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、そのフラグメント、相補配列、及び縮重コドン等価物から構成される群から選択される単離精製ポリヌクレオチド配列。
【請求項４８】
配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及びそのフラグメントから構成される群から選択される単離精製アミノ酸配列。
【請求項４９】
γ−２アイソタイプである、哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメント。
【請求項５０】
前記抗体又は抗体フラグメントがモノクローナル抗体である請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５１】
前記抗体又は抗体フラグメントがヒト化抗体である請求項５０に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５２】
前記抗体又は抗体フラグメントがヒト抗体である請求項５０に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５３】
前記抗体又は抗体フラグメントが配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない請求項５０に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５４】
前記抗体又は抗体フラグメントがＡｂ３、Ａｂ１２、Ａｂ２２、Ａｂ５４、Ａｂ６０、Ａｂ１０２、Ａｂ１３５、Ａｂ１４５、Ａｂ１９８、Ａｂ２５４、Ａｂ２６７、Ａｂ３９０、Ａｂ４１２、Ａｂ４３０／４３２、Ａｂ４６７及びＡｂ４８４から構成される群から選択される請求項５０に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５５】
ヒトエリスロポエチン受容体を活性化するために治療的に有効な量の請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の活性化方法。
【請求項５６】
受容体の活性を調節するために治療的に有効な量の請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の調節方法。
【請求項５７】
治療を必要とする哺乳動物に受容体を活性化するために治療的に有効な量の請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与する段階を含む、形成不全症の哺乳動物の治療方法。
【請求項５８】
治療を必要とする哺乳動物に受容体の活性を調節するために治療的に有効な量の請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与する段階を含む、形成不全症の哺乳動物の治療方法。
【請求項５９】
治療を必要とする哺乳動物に受容体の活性を調節するために治療的に有効な量の請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメントを投与する段階を含む、貧血症の哺乳動物の治療方法。
【請求項６０】
治療的に有効な量の請求項４９に記載の抗体又は抗体フラグメントと医薬的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む２００２年１０月１４日付け米国予備出願第６０／４１８，０３１号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明はエリスロポエチン受容体を認識し、これに結合し、好ましくはこれを活性化する抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）は赤血球産生の主要なレギュレーターである糖蛋白質である。特に、ＥＰＯは赤血球前駆細胞の増殖、分化及び生存を促進し、成熟赤血球を産生するのに関与している。血液及び組織中の酸素濃度の変化に応答して、エリスロポエチンは未成熟赤芽球の増殖と分化を刺激すると思われる。更に増殖因子として機能し、赤血球バースト形成及びコロニー形成単位等の赤血球前駆細胞の分裂活性を刺激する。更に分化因子として機能し、赤血球コロニー形成単位から前赤芽球への変換を誘導する（Ｅｒｓｌｅｖ，Ａ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｒ  Ｍｅｄ．，３１６：１０１−１０３（１９８７）参照）。
【０００４】
ＥＰＯは分子量約３４，０００ダルトンであり、α、β及びアシアロの３形態で存在することができる。妊娠中期〜後期にＥＰＯは胎児肝で合成される。その後、ＥＰＯは腎臓で合成され、血漿中を循環し、尿中に排泄される。
【０００５】
ヒト尿ＥＰＯは単離精製されている（Ｍｉｙａｋｅら，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：５５５８（１９７７）参照）。更に、ＥＰＯをコードする遺伝子の同定、クローニング及び発現方法（米国特許第４，７０３，００８号参照）とＥＰＯを細胞培地から精製する方法（米国特許第４，６６７，０１６号参照）も当分野で公知である。
【０００６】
ＥＰＯの活性はエリスロポエチン受容体と呼ばれる細胞表面受容体の結合と活性化により媒介される。ＥＰＯ受容体はサイトカイン受容体スーパーファミリーに属しており、少なくとも２種の異なるポリペプチド５５〜７２ｋＤａ種と８５〜１００ｋＤａ種を含むと考えられている（米国特許第６，３１９，４９９号，Ｍａｙｅｕｘら，Ｒ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６６：２３３８０（１９９１），ＭｃＣａｆｆｅｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１０５０７（１９９１）参照）。１１０、１３０及び１４５ｋＤａ等の分子量をもつＥＰＯ受容体の他のポリペプチド複合体も報告されている（米国特許第６，３１９，４９９号参照）。
【０００７】
マウス及びヒト両者のＥＰＯ受容体がクローニングされ、発現されている（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，Ｃｅｌｌ，５７：２７７（１９８９）；Ｊｏｎｅｓら，Ｂｌｏｏｄ，７６：３１（１９９０）；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎら，Ｂｌｏｏｄ，７６：２４（１９９０）；ＷＯ９０／０８８２２／米国特許第５，２７８，０６５号参照）。全長ヒトＥＰＯ受容体は４８３アミノ酸トランスメンブレン蛋白質であり、約２５アミノ酸シグナルペブチドを含む（米国特許第６，３１９，４９９号参照）。ヒト受容体はマウス受容体と約８２％のアミノ酸配列相同性を示す。前出参照。
【０００８】
リガンドの不在下でＥＰＯ受容体は予備形成二量体として存在する。ＥＰＯがその受容体と結合すると細胞質ドメインを密接に接近させるようなコンホメーション変化が生じる。完全には解明されていないが、この「二量化」が受容体の活性化に関与すると考えられている。ＥＰＯ受容体の活性化の結果として多数の生物学的効果が生じる。これらの活性としては増殖の刺激、分化の刺激及びアポトーシスの阻害が挙げられる（米国特許第６，３１９，４９９号，Ｌｉｂｏｉら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：１１３５１（１９９３），Ｋｏｕｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：３７８（１９９０）参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＥＰＯ受容体二量化と活性化の関係を利用し、（１）ＥＰＯ受容体を二量化し；（２）この受容体を活性化することが可能なＥＰＯ以外の化合物（即ち抗体など）を同定することができる。これらの化合物は貧血の哺乳動物を治療し、機能不全ＥＰＯ受容体をもつ哺乳動物を識別するのに有用であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１態様では、本発明はエリスロポエチン受容体に結合する抗体に関する。１態様では、抗体は配列番号３、７、１１、１５、１９、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５及びそのフラグメントから構成される群から選択される重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は配列番号５、９、１３、１７、２１、２３、２５、２７、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７及びそのフラグメントから構成される群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体に結合することが可能な単離抗体に関する。このような抗体はＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１及びそのフラグメントから構成される群から選択される。ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及びそのフラグメントから構成される群から選択される。
【００１２】
別の態様では、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化するが、ＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない抗体に関する。
【００１３】
別の態様では、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化することが可能な抗体に関し、前記抗体又はその抗体フラグメントはエリスロポエチン受容体に対する内因性ヒトエリスロポエチンの結合親和性の１００倍以内の結合親和性を示す。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメントに関する。抗体又はその抗体フラグメントは配列番号３又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域、及び／又は配列番号５又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、但し、抗体又はその抗体フラグメントはＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００１５】
更に別の態様では、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメントに関する。抗体又はその抗体フラグメントは配列番号７又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖可変領域、及び／又は配列番号９又はその抗体フラグメントのアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、但し、抗体又はその抗体フラグメントはＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００１６】
本態様は更に配列番号１１、１５、１９、３１、３５、３９、４３、４７、５１、及び５５又は上記配列番号のいずれかの抗体フラグメントから構成される群から選択される他の重鎖可変領域を含み、前記抗体又はその抗体フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。本態様に含まれる他の軽鎖可変領域は配列番号１３、１７、２１、２３、２５、２７、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３及び５７又は上記配列番号のいずれかの抗体フラグメントから構成される群から選択することができ、前記抗体又はその抗体フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化する抗体又はその抗体フラグメントを提供し、前記抗体は配列番号１１／配列番号１３、配列番号１５／配列番号１７、配列番号１９／配列番号２１、配列番号１１／配列番号２３、配列番号１１／配列番号２５、配列番号１１／配列番号２７、配列番号１１／配列番号２９、配列番号３１／配列番号３３、配列番号３５／配列番号３７、配列番号３９／配列番号４１、配列番号４３／配列番号４５、配列番号４７／配列番号４９、配列番号５１／配列番号５３及び配列番号５５／配列番号５７又はその抗体フラグメントから構成される群から選択される少なくとも１個の重鎖可変領域と少なくとも１個の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含み、前記抗体又はその抗体フラグメントは配列番号１のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００１８】
更に別の態様では、本発明は哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の活性化方法に関する。本方法はＥＰＯ受容体を活性化するために治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含む。抗体又はその抗体フラグメントはＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００１９】
更に別の態様では、本発明は哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の調節方法に関する。本方法は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の調節するために治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含み、前記抗体又はその抗体フラグメントはＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００２０】
更に別の態様では、本発明は抗エリスロポエチン中和抗体により誘導される純赤血球形成不全症の哺乳動物の治療方法に関する。本方法は治療を必要とする哺乳動物に前記受容体を活性化するために治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントを投与する段階を含み、前記抗体又は抗体フラグメントはＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００２１】
更に別の態様では、本発明は医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は治療的に有効な量の抗体又はその抗体フラグメントと医薬的に許容可能な賦形剤を含有する。医薬組成物に含まれる抗体又は抗体フラグメントは哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性を活性化するが、ＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用しない。
【００２２】
更に別の態様では、本発明はエリスロポエチン受容体と結合してこれを活性化するＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントに関する。本態様のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントはＥＰＯ受容体の活性化に関与する任意エピトープと結合し、相互作用する。このような抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいし、その任意抗体フラグメントでもよい。ＩｇＧ２抗体はキメラ、ヒト化又はヒト抗体でもよい。
【００２３】
更に別の態様では、本発明は受容体を活性化するために治療的に有効な量の本発明のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の活性化方法を提供する。
【００２４】
更に別の態様では、本発明は受容体を調節するために治療的に有効な量の本発明のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントを哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物におけるヒトエリスロポエチン受容体の内因性活性の調節方法を提供する。
【００２５】
更に別の態様では、本発明は形成不全症の哺乳動物の治療方法を提供し、本方法は治療を必要とする哺乳動物に受容体を活性化するために治療的に有効な量の本発明のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントを投与する段階を含む。
【００２６】
更に別の態様では、本発明は形成不全症の哺乳動物の治療方法を提供し、本方法は治療を必要とする哺乳動物に受容体を調節するために治療的に有効な量の本発明のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントを投与する段階を含む。
【００２７】
更に別の態様では、本発明は治療的に有効な量の本発明のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントと医薬的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。
【００２８】
最後に、本発明は単離精製ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列に関する。単離精製ポリヌクレオチド配列は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６とそのフラグメント、相補配列、及び縮重コドン等価物から構成される群から選択することができる。
【００２９】
本発明は更に配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８とそのフラグメント及び相補配列から構成される群から選択される単離精製アミノ酸配列に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
定義
本明細書で使用する「抗体」又は「免疫グロブリン」なる用語はポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヒト又はヒト化の類に属する１本鎖、２本鎖、及び３本鎖以上の蛋白質及び糖蛋白質を意味する。「抗体」なる用語はその合成及び遺伝子組換え変異体も含む。
【００３１】
本明細書で使用する「抗体フラグメント」なる用語はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントと、少なくとも１個の所望エピトープに対して特異性をもつ抗体の任意部分を意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「γ−２」、「γ−２アイソタイプ」又は「ＩｇＧ２」なる用語は免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のサブクラス２とその任意抗体フラグメントを意味する。ＩｇＧ分子の４種のサブクラスが十分に特性決定され、当業者に周知である（例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓら著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第２版，１９８９参照）。ヒト免疫グロブリンの全ヒトアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ）及びサブアイソタイプ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）を認識する種々のモノクローナル抗体が入手可能である。
【００３３】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」なる用語は親抗体の抗原結合特性を維持又は実質的に維持するが、ヒトにおいて免疫原性が低い非ヒト抗体（即ちマウス）に由来する抗体を意味する。
【００３４】
本明細書で使用する「ヒト抗体」なる用語はヒト免疫グロブリン遺伝子をもつトランスジェニックマウス（例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス）、ヒトファージディスプレイライブラリー、又はヒトＢ細胞に由来する抗体等のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する配列をもつ抗体を意味する。
【００３５】
本明細書で使用する「エピトープ」なる用語は抗体又はＴ細胞受容体と特異的に結合することが可能な任意蛋白質決定基を意味する。エピトープ決定基は一般にアミノ酸や糖側鎖等の化学的に活性な表面分子群から構成され、一般に特異的三次元構造特徴と特異的電荷特徴をもつ。
【００３６】
本明細書で使用する「内因性」なる用語は外部からの物質又は活性に対して生体又は細胞内で生じる物質又は活性を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する指定配列「から誘導される」又は「に特異的な」ポリヌクレオチドなる用語は指定ヌクレオチド配列の領域に対応即ち一致するか又は相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。配列は当分野で公知の技術により決定した場合に特定ポリヌクレオチド配列に固有の配列に相補的でもよいし、一致していてもよい。配列を誘導することができる領域としては限定されないが、特異的エピトープをコードする領域と、非翻訳及び／非転写領域が挙げられる。
【００３８】
誘導ポリヌクレオチドは必ずしも該当ヌクレオチド配列から物理的に誘導する必要はなく、限定されないが、ポリヌクレオチドが誘導される領域の塩基配列により提供される情報に基づく化学的合成、複製、逆転写又は転写等の任意方法で作製することができる。従って、元のポリヌクレオチドのセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。更に、指定配列の領域に対応する複数の領域の組み合わせを当分野で公知の方法で所期用途に合わせて修飾してもよい。
【００３９】
本明細書で使用する「〜によりコードされる」なる用語はポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列又はその一部はこの核酸配列によりコードされるポリペプチドに由来する少なくとも３〜５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも１５〜２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む。この配列によりコードされるポリペプチドで免疫的に識別可能なポリペプチド配列も含まれる。即ち、「ポリペプチド」、「蛋白質」又は「アミノ酸」配列は本発明の抗体に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の一致度をもつ。更に、本発明の抗体は本発明の抗体のポリペプチド又はアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の類似度をもつことができる。本発明の抗体のアミノ酸配列は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５及び５７から構成される群から選択することができる。本発明の抗体の好適アミノ酸配列は配列番号３、５、７、９、５１及び５３から構成される群から選択される。
【００４０】
本明細書で使用する「組換えポリペプチド」、「組換え蛋白質」、又は「組換え技術により生産されたポリペプチド」なる用語は本明細書では同義に使用することができ、その起源又は操作により天然で会合しているポリペプチドの全部又は一部と会合していないか、及び／又は天然で結合している以外のポリペプチドと結合しているポリペプチドを意味する。組換え又はコード化ポリペプチド又は蛋白質は必ずしも指定核酸配列から翻訳されない。化学的合成や組換え発現システムの発現等の任意方法で作製することもできる。
【００４１】
本明細書で使用する「合成ペブチド」なる用語は当分野で周知の方法により化学的に合成することができる任意長ポリマー形アミノ酸を意味する（米国特許第４，８１６，５１３号、５，８５４，３８９号、５，８９１，９９３号及び６，１８４，３４４号参照）。
【００４２】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」なる用語はリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである任意長ポリマー形ヌクレオチドを意味する。この用語は分子の一次構造のみを意味する。即ち、この用語は２本鎖及び１本鎖ＤＮＡと２本鎖及び１本鎖ＲＮＡを含む。メチル化又はキャッピング等の修飾形と未修飾形のポリヌクレオチドも含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、及び「オリゴ」なる用語は本明細書では同義に使用する。
【００４３】
本明細書で使用する「精製ポリヌクレオチド」なる用語は該当ポリヌクレオチドが天然に会合する蛋白質を実質的に含まず、例えば約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％未満である該当ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを意味する。該当ポリヌクレオチドの精製技術は当分野で周知であり、例えばポリヌクレオチドを含む細胞をカオトロピック剤で破壊し、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度差による沈降によりポリヌクレオチドと蛋白質を分離する方法が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用する「精製ポリペプチド」又は「精製蛋白質」なる用語は該当ポリペプチドが天然に会合する細胞成分を実質的に含まず、例えば約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％未満である該当ポリペプチド又はそのフラグメントを意味する。該当ポリペプチドの精製方法は当分野で公知である。
【００４５】
本明細書で使用する「単離」なる用語はその本来の環境（例えば天然に存在する場合には天然環境）から取出された材料を意味する。例えば、生きた動物に存在する天然ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、同一ポリヌクレオチド又はＤＮＡ又はポリペプチドが天然系の共存材料の一部又は全部から分離されている場合には単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部でもよいし、及び／又はこのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部でもよく、ベクター又は組成物はその天然環境を構成しないので単離されていると言える。
【００４６】
本明細書で使用する「ポリペプチド」及び「蛋白質」なる用語は同義に使用され、共有及び／又は非共有結合を介して結合した少なくとも１個のアミノ酸分子鎖を意味する。この用語は物質の特定長を意味ない。即ち、ポリペプチドの定義にはペブチド、オリゴペブチド及び蛋白質が含まれる。この用語はポリペプチドの翻訳後修飾物も含み、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等が挙げられる。更に、蛋白質フラグメント、類似体、突然変異又は変異体蛋白質、融合蛋白質等もポリペプチドの意味に含まれる。
【００４７】
本明細書で使用する「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、及び単細胞体として培養された微生物又は高等真核細胞株を表す他の同様の用語は組換えベクター又は他の導入ＤＮＡのレシピエントとして使用することができるか又は使用された細胞を意味し、トランスフェクトされた初代細胞の初代子孫を含む。
【００４８】
本明細書で使用する「レプリコン」なる用語は細胞内でポリヌクレオチド複製の自律単位として機能するプラスミド、染色体又はウイルス等の任意遺伝子エレメントを意味する。
【００４９】
本明細書で使用する「機能的に連結」なる用語は指定成分がその所期方法で機能できるように配置されている状態を意味する。従って、例えばコーディング配列に「機能的に連結」した制御配列は制御配列と適合可能な条件下でコーディング配列を発現できるようにライゲーションされている。
【００５０】
本明細書で使用する「ベクター」なる用語は例えば結合したセグメントの複製及び／又は発現を誘発するように別のポリヌクレオチドセグメントと結合したレプリコンを意味する。
【００５１】
本明細書で使用する「制御配列」なる用語はライゲーションされているコーディング配列の発現を行うために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の種類は宿主生物によって異なる。原核生物では、このような制御配列としては一般にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターと、場合によりエンハンサーが挙げられる。従って、「制御配列」なる用語はその存在が発現に必要である全成分を少なくとも含むものであり、更に存在すると有利な付加成分（例えばリーダー配列）も含むことができる。
【００５２】
「トランスフェクション」なる用語は導入に使用する方法に関係なく、原核又は真核宿主細胞への外来ポリヌクレオチドの導入を意味する。「トランスフェクション」なる用語はポリヌクレオチドの安定導入と一過的導入の両者を意味し、ポリヌクレオチドの直接取込み、形質転換、形質導入及びｆ交配を含む。一旦宿主細胞に導入したら、外来ポリヌクレオチドを非組込みレプリコン（例えばプラスミド）として維持することもできるし、あるいは宿主ゲノムに組込むこともできる。
【００５３】
本明細書で使用する「治療」なる用語は予防及び／又は治療を意味する。
【００５４】
本明細書で使用する「精製物質」なる用語は物質が通常会合している細胞成分及び該当試料中に存在する可能性のある他の型の細胞から単離された物質の調製物を意味する。
【００５５】
本明細書で使用する「エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体の活性化」なる用語はＥＰＯ受容体が受ける１種以上の分子プロセスであり、その結果として受容体をもつ細胞の内部にシグナル伝達を生じるものを意味する。最終的にこのシグナルは細胞生理機構に１種以上の変化をもたらす。ＥＰＯ受容体の活性化は一般にＥＰＯ受容体をもつ細胞（限定されないが、赤血球前駆細胞など）の増殖又は分化をもたらす。ＥＰＯ受容体の活性化には多数のイベントが関与しており、限定されないが、受容体の二量化が挙げられる。
【００５６】
抗体の構造単位は四量体である。各四量体はポリペプチド鎖の２個の同一対から構成され、各対は１個の「軽」（２５ｋＤａ）鎖と１個の「重」（約５０〜７０ｋＤａ）鎖をもつ。各鎖のアミノ末端部分は抗原認識に主に関与する可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は抗体のエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖はκ及びλ軽鎖として分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、又はεとして分類され、抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして規定する。ＩｇＧ免疫グロブリンは更に夫々γ−１、γ−２、γ−３及びγ−４重鎖をもつ４種のサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）に分類される。市販の治療用ヒト、キメラ又はヒト化抗体の殆どはＩｇＧ１抗体型であり、乳癌用ハーセプチン、非ホジキンリンパ腫用リツキサン並びにリウマチ様関節炎用ヒュミラ及びレミケードが挙げられる（Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，８：５０３（２００３）参照）。
【００５７】
軽鎖及び重鎖内で可変領域と定常領域は「Ｊ」領域により結合されており、重鎖は更に「Ｄ」領域も含む。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗原結合部位を形成する。従って、無傷の抗体は二機能性ないし二重特異性抗体の場合を除いて同一の２個の結合部位をもつ。二機能性ないし二重特異性抗体は２個の異なる重鎖／軽鎖対と２個の異なる結合部位をもつ人工ハイブリッド抗体である。二機能性ないし二重特異性抗体は当分野で公知の日常的技術を使用して作製することができる。
【００５８】
抗体の鎖の構造は３個の超可変領域（相補性決定領域又はＣＤＲとも言う）により結合された同一一般構造の比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域により連結され、特異的エピトープに結合することができる。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖と重鎖はいずれもＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。
【００５９】
米国特許第６，３１９，４９９号はエリスロポエチン受容体（ＥＰＯ−Ｒ）と結合してこれを活性化する抗体を記載している。この特許に具体的に記載されている抗体はＭａｂ７１及び７３である。Ｍａｂ７１はアミノ酸配列ＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）をもつペブチド「ＳＥ−３」に結合する（実施例３参照）。ＳＥ−３はヒトＥＰＯ−Ｒのアミノ酸残基４９−７８に位置する。米国特許第６，３１９，４９９号によると、ＥＰＯ−Ｒのこの領域（即ちアミノ酸残基４９−７９）をＭａｂ７１等の架橋剤と結合させると、ＥＰＯ受容体が活性化される。米国特許第６，３１９，４９９号の実施例６はＭａｂ７１が試験した他のペブチドに比較して「有意量のＳＥ−３」と結合すると記載している。同実施例は更に、このことは「Ｍａｂ７１が残基４９−７８を含むか又はこれとオーバーラップするヒトＥＰＯ−Ｒの領域に結合することを示す」と記載している。Ｍａｂ７１及び７３はマウス抗体である。齧歯類抗体とヒト抗体はいずれもターゲット特異性の精度が高いが、ヒト抗体のほうが遥かに有効に生体の天然防御因子と相互作用し、齧歯類抗体と同程度まで抗体に対する応答を誘発しない（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３（１９９１））。更に、ヒトＩｇＧサブクラスはフレキシビリティに差があり（Ｒｏｕｘ，Ｋ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３３７２（１９９７））、齧歯類ＩｇＧアイソタイプはその対応するヒトアイソタイプと異なるのでこの差は齧歯類ＩｇＧアイソタイプにも及ぶ。蛋白質フレキシビリティは抗体−抗原認識に影響を与える可能性があるので（Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｒ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：９２（２００３））、ヒトＩｇＧ２アイソタイプはマウス抗体とは異なる抗原認識メカニズムになる可能性がある。マウスＩｇＧアイソタイプは一般にヒトＩｇＧアイソタイプと異なる。
【００６０】
１態様では、本発明はエリスロポエチン受容体と結合する抗体又は抗体フラグメントに関する。エリスロポエチン受容体と結合する抗体又は抗体フラグメントは配列番号３、７、１１、１５、１９、３１、３５、３９、４３、４７、５１、５５及びそのフラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の重鎖を含む。第２の態様において、エリスロポエチン受容体と結合する抗体又は抗体フラグメントは配列番号５、９、１３、１７、２１、２３、２５、２７、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、５７及びそのフラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列をもつ少なくとも１個の軽鎖を含む。
【００６１】
第３の態様において、本発明は哺乳動物においてヒトエリスロポエチン受容体と結合することが可能な単離抗体に関する。より詳細には、抗体はＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０及び配列番号６１とそのフラグメントから構成される群から選択される。ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３の連続配列を含む軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、及び配列番号６８とそのフラグメントから構成される群から選択される。更に、本発明は少なくとも１個のＣＤＲを含む重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む単離抗体に関する。より詳細には、抗体は配列番号１１のアミノ酸残基９９−１１２、配列番号３の２６−３５、配列番号３の５０−６５、配列番号３の９８−１０５、配列番号１９の２６−３５、配列番号１９の５０−６６、配列番号１９の９９−１０５、配列番号３１の５０−６６、配列番号３１の９９−１０５、配列番号３９の２６−３５、配列番号３９の５０−６５、配列番号３９の９８−１０５、配列番号４３の２６−３７、配列番号４３の５２−６７、配列番号４３の１００−１０７、配列番号４７の２６−３５、配列番号４７の５０−６５、配列番号５１の２６−３５、配列番号５１の５０−６５、配列番号５１の９８−１０５、配列番号５５の２６−３７及び配列番号５５の５２−６７から構成される群から選択される少なくとも１個のＣＤＲを含む重鎖可変領域又は配列番号１３のアミノ酸残基２４−３４、配列番号１３の５０−５６、配列番号５の８９−９７、配列番号２７の２４−３４、配列番号９の５０−５６、配列番号３３の２４−３９、配列番号３３の５５−６１、配列番号４１の２４−３４、配列番号４１の８９−９７、配列番号４５の２４−３４、配列番号４５の５０−５６、配列番号４５の８９−９７、配列番号４９の８９−９７及び配列番号５７の２４−３４から構成される群から選択される少なくとも１個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む。
【００６２】
第４の態様では、本発明はエリスロポエチン受容体と結合してこれを活性化する抗体又は抗体フラグメントに関する。本発明の抗体はＥＰＯ受容体の活性化に関与する少なくとも１個のエピトープと結合する（実施例４）。米国特許第６，３１９，４９９号に記載されている抗体のようにエリスロポエチン受容体と結合してこれを活性化するとして当分野で知られている抗体又は抗体フラグメントとは異なり、本発明の抗体はペブチドＳＥ−３と相互作用しない。驚くべきことに、本発明の抗体は抗体がＳＥ−３ペブチドと結合しないにも拘わらず赤血球産生性である。従って、本発明の抗体は米国特許第６，３１９，４９９号に記載されている抗体とは異なる少なくとも１種のエピトープとヒトＥＰＯ受容体上で相互作用する。
【００６３】
第５の態様では、本発明はエリスロポエチン受容体と結合してこれを活性化するＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントに関する。本態様のＩｇＧ２抗体又は抗体フラグメントはＥＰＯ受容体の活性化に関与する任意エピトープと結合し、相互作用する。
【００６４】
更に、実施例１に示すＢＩＡｃｏｒｅ結果により実証されるように、本発明の抗体はエリスロポエチン受容体に対する内因性ヒトエリスロポエチンの結合親和性の１００倍以内の結合親和性を示す。ＥＰＯには２個の非等価受容体結合部位があるため、ＥＰＯに対するＥＰＯ受容体の親和性はして高値（〜１ｎＭ）と低値（〜１μＭ）が報告されている（Ｐｈｉｌｏ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：１６８１（１９９６）参照）。
【００６５】
本発明の抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体（米国特許第６，０２０，１５３号参照）又はヒトもしくはヒト化抗体又はそのフラグメントとすることができる。上記の任意のものの合成及び遺伝子組換え変異体（米国特許第６，３３１，４１５号参照）も本発明に含まれる。しかし、本発明の抗体はヒト又はヒト化抗体が好ましい。ヒト又はヒト化抗体の利点は宿主レシピエントで抗体の免疫原性を増減することにより、バイオアベイラビリティを増したり、不利な免疫反応の可能性を少なくすることができ、潜在的に多重抗体投与を可能にできる点である。
【００６６】
ヒト化抗体としてはキメラ又はＣＤＲグラフト抗体が挙げられる。また、動物の抗体遺伝子発現を抑圧し、ヒト抗体遺伝子発現で機能的に置き換えた遺伝子組換え動物株を使用してヒト抗体を生産することもできる。
【００６７】
ヒト化及びヒト抗体の作製方法は当分野で公知である。ヒト抗体の作製方法の１例ではトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物を利用する。これらのトランスジェニック動物はそれ自体のゲノムに挿入されたヒト抗体産生ゲノムの実質的部分を含み、抗体産生において動物自体の内因性抗体産生を欠損させる。このようなトランスジェニック動物の作製方法は当分野で公知である。このようなトランスジェニック動物はＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術又は「ミニローカス」アプローチを使用して作製することができる。Ｘｅｎｏｍｉｃｅ（登録商標）の作製方法は米国特許第６，１６２，９６３号、６，１５０，５８４号、６，１１４，５９８号及び６，０７５，１８１号に記載されている。「ミニローカス」アプローチを使用するトランスジェニック動物の作製は米国特許第５，５４５，８０７号、５，５４５，８０６号及び５，６２５，８２５号に記載されている。国際公開第ＷＯ９３／１２２２７号も参照。
【００６８】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を使用してＸｅｎｏＭｏｕｓｅｔ（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に該当抗原を免疫することによりヒト抗体を獲得することができる。抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えばＢ細胞）を回収する。これらの回収細胞を骨髄型細胞株と融合すると、不死ハイブリドーマ細胞株を作製することができる。これらのハイブリドーマ細胞株をスクリーニング及び選択すると、該当抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株で抗体を発現させてもよい。より詳細には、特定抗体をコードする配列を抗体産生細胞からクローニングし、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に使用することができる。
【００６９】
形質転換はポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する任意公知方法により実施することができ、例えばポリヌクレオチドをウイルス又はウイルスベクターにパッケージングし、宿主細胞にウイルス又はベクターを形質導入する方法や、米国特許第４，３９９，２１６号、４，９１２，０４０号、４，７４０，４６１号及び４，９５９，４５５号に記載されているようなトランスフェクション法が挙げられる。例えば、重鎖をコードする１個以上の遺伝子を細胞で発現させ、軽鎖をコードする１個以上の遺伝子を第２の細胞で発現させることができる。得られた重鎖と軽鎖を次に当分野で公知の技術により相互に融合に融合して本発明の抗体を形成することができる。あるいは、制限エンドヌクレアーゼを使用して重鎖と軽鎖の部分をコードする遺伝子をライゲーションし、各鎖をコードする遺伝子を再構築することもできる。その後、このような遺伝子を細胞で発現させ、本発明の抗体を生産することができる。
【００７０】
使用する形質転換法は形質転換する宿主により異なる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入する方法は当分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム封入及びＤＮＡ分子の直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【００７１】
発現用宿主として使用することができる哺乳動物細胞株は当分野で周知であり、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞、細菌細胞（例えば大腸菌）、酵母細胞（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられる。
【００７２】
ＣＤＲグラフトアプローチを使用してヒト化抗体を作製することもできる。このようなヒト化抗体は当分野で周知である。一般に、ヒト化抗体はＥＰＯ受容体と結合する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列をコードする核酸配列を獲得し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列中に相補性決定領域ないし「ＣＤＲ」を同定し、ＣＤＲ核酸配列をヒトフレームワーク核酸配列にグラフトすることにより作製される（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び５，２２５，５３９号参照）。
【００７３】
選択されるヒトフレームワークはｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適したもの、即ち免疫原性を示さないものとする。例えば、このような決定はこのような抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用とアミノ酸類似性試験による予備実験で実施することができる。
【００７４】
核酸のクローニング方法は当分野で公知である。これらの方法は適当なプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりクローニングする抗体配列を増幅する。抗体核酸配列と特にマウス重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列の増幅に適したプライマーは当分野で公知である。
【００７５】
ヒト化しようとするクローン化抗体配列のＣＤＲとＦＲが同定されたら、ＣＤＲをコードするアミノ酸配列を同定し、対応する核酸配列を選択したヒトＦＲにグラフトする。これは公知プライマー及びリンカーを使用して実施することができ、これらの選択は当分野で公知である。
【００７６】
選択したヒトＦＲにＣＤＲをグラフトした後、得られた「ヒト化」重鎖可変領域及び軽鎖可変領域配列を発現させ、ＥＰＯ受容体と結合するヒト化Ｆｖ又はヒト化抗体を生産する。一般に、ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域配列はヒト定常領域配列をもつ融合蛋白質として発現されるので、ＥＰＯ受容体と結合する無傷の抗体が得られる。他方、定常配列を含まないヒト化Ｆｖ抗体を生産することもできる。ヒト定常配列とヒト化可変領域の融合が好ましい。
【００７７】
本発明の抗体を使用して結合され、好ましくは活性化されるＥＰＯ受容体は哺乳動物ＥＰＯ受容体が好ましく、ヒトＥＰＯ受容体が最も好ましい。本発明は米国特許第５，２９２，６５４号に記載されているようなＥＰＯ受容体の類似体の使用も想定する。ヒトＥＰＯ受容体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から購入することができる。
【００７８】
（１）ＥＰＯ受容体に結合してこれを活性化し；（２）ＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＱＡＰＴＡＲＧＡＶ（配列番号１）のアミノ酸配列をもつペブチドと相互作用せず；（３）ＥＰＯ受容体に対する内因性ヒトＥＰＯの結合親和性の１００倍以内の結合親和性を示す２種の抗体の１例はヒト抗体Ａｂ１２及びＡｂ１９８である。Ａｂ１２及びＡｂ１９８は本明細書に記載するＸｅｎｏＭｏｕｓｅｇ（登録商標）ＸｅｎｏＭａｘ技術（実施例１参照）を使用して作製されたヒト抗体である。
【００７９】
別の態様では、本発明は本明細書に記載する抗体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド配列に関する。このようなポリヌクレオチドは重鎖と軽鎖の各々の可変領域と定常領域をコードすることが好ましいが、本発明は他の組み合わせも想定する。
【００８０】
本発明は開示するポリヌクレオチドから誘導されるオリゴヌクレオチドフラグメントとこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列も想定する。ポリヌクレオチドはＲＮＡ形でもＤＮＡ形でもよい。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体及び合成ＤＮＡ形態のポリヌクレオチドが本発明の範囲に含まれる。ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよく、１本鎖の場合にはコーディング（センス）鎖でも非コーディング（アンチセンス）鎖でもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は本明細書に記載するコーディング配列と同一でもよいし、遺伝コードの冗長又は縮重の結果として本明細書に記載するＤＮＡと同一ポリペプチドをコードする別のコーディング配列でもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチドは本発明の少なくとも１個の重鎖可変領域と少なくとも１個の軽鎖可変領域をコードすることが好ましい。このようなポリヌクレオチド例は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４及び５６とそのフラグメント、相補配列及び縮重コドン等価物で示される。例えば、配列番号２はＡｂ１２の重鎖（可変領域）をコードし、配列番号４はＡｂ１２の軽鎖（可変領域）をコードする。配列番号６はＡｂ１９８の重鎖（可変領域）をコードし、配列番号８はＡｂ１９８の軽鎖（可変領域）をコードする。
【００８２】
本発明はポリヌクレオチド欠失、置換又は付加等の修飾を含む変異体ポリヌクレオチドと、変異体ポリヌクレオチド配列に起因する任意ポリヌクレオチド修飾形も含む。本発明のポリヌクレオチドは本明細書に記載するコーディング配列の天然変異体であるコーディング配列をもつことできる。
【００８３】
ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドと本明細書に記載する配列との一致度が少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％である場合にこの配列とハイブリダイズするとみなされる。
【００８４】
本発明は更に本発明の抗体をコードするポリペプチドと、このようなポリペプチドのフラグメント、類似体及び誘導体にも関する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然精製ポリペプチド又は合成ポリペプチドとすることができる。本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体又は類似体はアミノ酸残基の１個以上が保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるものでもされないものでもよいし；アミノ酸残基の１個以上が置換基を含むものでもよいし；ポリペプチドの半減期を延ばすための化合物（例えば、ポリエチレングリコール）等の別の化合物とポリペプチドを融合したものでもよいし；リーダーもしくは分泌配列又はポリペプチドの精製に使用される配列又はプロ蛋白質配列等の付加アミノ酸をポリペプチドと融合したものでもよい。このようなフラグメント、誘導体及び類似体も本発明の範囲に含まれる。
【００８５】
本発明のポリペプチドは本明細書に記載する抗体と同一のアミノ酸配列でもよいし、１個以上のアミノ酸置換による小変異をもつアミノ酸配列でもよい。変異は一般に約１〜５アミノ酸の範囲の「保存置換」とすることができ、置換アミノ酸は類似の構造又は化学特性をもち、例えば、ロイシン→イソロイシン又はスレオニン→セリンの置換である。他方、変異は非保存置換でもよく、例えばグリシン→トリプトファンの置換である。同様の小変異としてはアミノ酸欠失又は挿入又はその両者が挙げられる。生物又は免疫活性を変化させずにどのアミノ酸残基を何個置換、挿入、又は欠失させればよいかを決定する指針は当分野で周知のコンピュータープログラムを使用して見いだすことができ、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を利用できる。
【００８６】
ポリペプチドは本発明の抗体の少なくとも１個の重鎖可変領域又は少なくとも１個の軽鎖可変領域をコードすることが好ましい。ポリペプチドは本発明の抗体の少なくとも１個の重鎖可変領域と１個の軽鎖可変領域をコードすることがより好ましい。このようなポリペプチドの例は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４６、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、及びそのフラグメントに示すアミノ酸配列をもつものである。特に、Ａｂ１２の重鎖は配列番号３に示すアミノ酸配列をもち、軽鎖は配列番号５に示すアミノ酸配列をもつ。Ａｂ１９８の重鎖のアミノ酸配列は配列番号７に示され、軽鎖は配列番号９に示すアミノ酸配列をもつ。
【００８７】
本発明は本発明のポリヌクレオチドを含むベクターと、本発明のベクターで遺伝子組換えされた宿主細胞と、組換え技術による本発明の抗体の生産も提供する。
【００８８】
宿主細胞はクローニングベクター又は発現ベクター等のベクターで遺伝子組換え（トランスフェクト、形質導入又は形質変換）される。ベクターはプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態とすることができる。組換え宿主細胞はプロモーターの活性化、トランスフェクト細胞の選択等に合わせて適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は発現に選択する宿主細胞で従来使用されている条件であり、当業者に自明である。
【００８９】
本発明のポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドとその結果として抗体を生産するために使用することができる。本発明のポリヌクレオチド配列は多様な発現媒体の任意１種、特にポリペプチド発現用ベクター又はプラスミドに挿入することができる。このようなベクターとしては染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬病ウイルス）が挙げられる。しかし、宿主で複製可能且つ生存可能である限り、他の任意プラスミド又はベクターも使用することができる。
【００９０】
適当なＤＮＡ配列を種々の方法によりベクターに挿入することができる。一般には、当分野で公知の方法により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位にＤＮＡ配列を挿入する。発現ベクター中のポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ合成を誘導するのに適した発現制御配列（即ちプロモーター）と機能的に連結する。このようなプロモーターの例としては限定されないが、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター及び原核又は真核細胞又はそのウイルスで遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターが挙げられる。発現ベクターは更に翻訳開始用リボソーム結合部位と転写ターミネーターも含む。ベクターは更に発現を増幅するのに適した配列も含むことができる。例えば、ベクターはＳＶ４０等のサルウイルス、ポリオーマウイルス、ウシパピローマウイルスもしくはモロニー肉腫ウイルス等に由来するウイルス起源、又はゲノム起源の転写刺激ＤＮＡ配列であるエンハンサーを含むことができる。ベクターは更に複製起点を含むことが好ましい。ベクターは外来複製起点を含むように構築することもできるし、又はこのような複製起点はＳＶ４０もしくは別のウイルス源に由来するものでもよいし、宿主細胞染色体複製メカニズムによるものでもよい。
【００９１】
更に、ベクターはトランスフェクトした宿主細胞の選択用マーカー遺伝子を含むことが好ましく、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ又はＧ−４１８（ネオマイシン誘導体であるゲネチシン）やハイグロマイシン等の抗生物質、又はチミジンキナーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ等の欠損等の宿主細胞の遺伝子損傷を相補する遺伝子が挙げられる。
【００９２】
本発明で使用するのに適したベクターは当分野で公知である。宿主で複製可能且つ生存可能である限り、本発明では任意プラスミド又はベクターを使用することができる。使用可能なベクターの例としては哺乳動物宿主に適しており、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、パポバウイルスＢＫ突然変異体（ＢＫＶ）、又はマウス及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＶＭ）等のウイルス複製システムをベースとするものが挙げられる。
【００９３】
別の態様では、本発明は上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳動物細胞等の高等真核細胞でもよいし、酵母細胞等の下等真核細胞でもよいし、宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞でもよい。機能的四量体抗体分子の生合成には正確な初期ポリペプチド鎖フォールディング、グリコシル化及びアセンブリが必要であるので、宿主細胞は活性抗体の生産に適した環境を提供するものが好ましい。適切な宿主細胞の例としてはＣＯＳ−７細胞、ボーズメラノーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胚性肺細胞Ｌ−１３２、及びリンパ由来哺乳動物細胞（例えばミエローマ又はリンパ腫細胞）等の哺乳動物細胞が挙げられる。（例えば従来記載されているような２種の異なるベクターを使用して）Ｈ鎖のみをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと軽鎖のみをコードする第２のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることができる。宿主細胞に２種の異なるベクターをトランスフェクトすることが好ましい。
【００９４】
ベクターの宿主細胞導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション又はエレクトロポレーションにより実施することができる（Ｌ．Ｄａｖｉｄら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇ，Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ  Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．（１９９４））。
【００９５】
本発明の抗体を得るためには、本発明の抗体の軽鎖及び重鎖可変領域と軽鎖及び重鎖定常領域をコードする１種以上のポリヌクレオチド配列をベクターに組込む必要がある。本発明の抗体の軽鎖と重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を１又は複数のベクターに組込んだ後に宿主細胞に組込むことができる。
【００９６】
Ａｂ１２及びＡｂ４６７抗体を発現する細胞株はブダペスト条約に基づき、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０に２００３年９月３０日付けで寄託され、アクセション番号ＰＴＡ−５５５４及びＰＴＡ−５５５５を付与された。これらの寄託株は当業者の便宜のために記載するものであり、本発明を実施するためにこれらの寄託株が必要であるという意味ではなく、また、本明細書の開示に鑑みて等価態様が当業者に容易に想到されないという意味でもない。これらの寄託株は公共に入手可能であるが、寄託材料を本特許又は他の任意特許の下に製造、使用又は販売するための実施権を許諾するものではない。寄託材料の核酸配列は参考資料として本明細書の開示に組込み、本明細書に記載する配列と矛盾する場合にはこれらの核酸配列を基準にする。
【００９７】
本発明の抗体には多数の用途がある。一般に、抗体はエリスロポエチン又はその生体活性変異体もしくは類似体により治療可能な任意病状を治療するために使用することができる。例えば、本発明の抗体は赤血球濃度の低下及び／又はヘモグロビン濃度の低下を特徴とする疾患（例えば貧血）の治療に有用である。更に、本発明の抗体は血液又は組織中の酸素濃度の低下又は正常値以下を特徴とする疾患（例えば、低酸素血症又は慢性組織低酸素症）及び／又は血液循環不全又は血流低下を特徴とする疾患の治療にも使用することができる。本発明の抗体は更に創傷治癒の促進又は脳／脊髄損傷、脳卒中等に起因する神経細胞及び／又は組織損傷に対する保護にも有用であると思われる。本発明の抗体により治療することができる病状の非限定的な例としては、化学療法に起因する貧血、癌関連貧血、慢性疾患の貧血、ＨＩＶ関連貧血、骨髄異色関連貧血等の貧血症、心不全、虚血性心疾患及び腎不全が挙げられる。従って、本発明は治療的に有効な量の前記抗体を哺乳動物に投与する段階を含む上記疾患又は病状の任意のものの治療方法を含む。哺乳動物はヒトが好ましい。
【００９８】
本発明の抗体は機能不全ＥＰＯ受容体をもつ哺乳動物を識別及び診断するために使用することもできる。機能不全ＥＰＯ受容体をもつ哺乳動物は貧血等の疾患により特徴付けられる。識別及び診断する哺乳動物はヒトが好ましい。更に、本発明の抗体は赤血球形成不全症の哺乳動物で貧血の治療に使用することができる。赤血球形成不全症は組換えエリスロポエチンによる治療中の患者に抗エリスロポエチン中和抗体が形成されることに起因すると考えられる（Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｎ．ら，ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４６９（２００２））。本方法は治療を必要とする前記形成不全症の哺乳動物に治療的に有効な量の本発明の抗体を投与する段階を含む。
【００９９】
本発明の別の態様では、本発明のＥＰＯ受容体抗体及び抗体フラグメントは酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学等の慣用イムノアッセイを使用して（例えば、組織検体、無傷細胞、又はその抽出物等の生体試料中で）ＥＰＯ受容体を検出するために使用することもできる。本発明は生体試料を本発明の抗体又は抗体フラグメントと接触させる段階と、抗体（又は抗体部分）を検出することにより生体試料中のＥＰＯ受容体を検出する段階を含む生体試料中のＥＰＯ受容体の検出方法を提供する。結合又は未結合抗体又は抗体フラグメントを検出し易くするために、抗体又は抗体フラグメントを検出可能物質で直接又は間接的に標識する。種々のイムノアッセイフォーマット（例えば競合アッセイ、直接又は間接サンドイッチイムノアッセイ等）を実施することができ、これらは当業者に周知である。
【０１００】
適切な検出可能物質としては種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としてはストレプトアビジン／ビオチンとアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としてはウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としてはルミノールが挙げられ；適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが挙げられる。
【０１０１】
更に別の態様では、本発明は治療的に有効な量の本発明の抗体と医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤を含有する医薬組成物に関する。本明細書で使用する「医薬的に許容可能なキャリヤー」又は「医薬的に許容可能な賦形剤」は生理的に適合可能な全溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含む。医薬的に許容可能なキャリヤー又は賦形剤の例としては水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等とその組み合わせが挙げられる。多くの場合には、例えば糖類、多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に加えることが好ましい。抗体又は抗体部分の保存期間又は効力を増す湿潤量又は微量の助剤（例えば湿潤剤、乳化剤、防腐剤又は緩衝液）等の医薬的に許容可能な物質も加えることができる。場合により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を加えてもよい。賦形剤に加え、血清アルブミン等のキャリヤー蛋白質、緩衝液、結合剤、甘味剤及び他の矯味剤、着色剤及びポリエチレングリコールの１種以上も医薬組成物に添加することができる。
【０１０２】
本発明の組成物は種々の形態にすることができる。例えば、液体、半固体及び固体剤形が挙げられ、例えば溶液剤（例えば注射用溶液及び輸液用溶液）、分散液又は懸濁液、タブレット、ピル、散剤、リポソーム及び座剤が挙げられる。好適剤形は所期投与方法及び治療用途に依存する。典型的な好適組成物は注射用溶液及び輸液用溶液であり、他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されているものに類似する組成物が挙げられる。好適投与方法は非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１好適態様では、静脈内輸液又は注射により抗体を投与する。別の好適態様では、筋肉内又は皮下注射により抗体又は抗体フラグメントを投与する。医薬組成物に適切な他の投与経路としては限定されないが、直腸、経皮、膣、経粘膜又は腸投与が挙げられる。
【０１０３】
治療用組成物は一般に製造及び保存条件下で無菌安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高薬剤濃度に適した他の規定構造として製剤化することができる。滅菌注射溶液は必要量の活性化合物（即ち抗体又は抗体フラグメント）を必要に応じて上記成分の１種又は組み合わせと共に適当な溶媒に添加した後に濾過滅菌することにより製造することができる。一般に、分散液は塩基性分散媒と必要な他の上記成分を含有する滅菌ビークルに活性化合物を添加することにより製造される。滅菌注射溶液の調製用滅菌粉末の場合には、好適製造方法は真空乾燥と凍結乾燥であり、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分と任意付加所望成分の粉末を形成する。溶液の適正な流動性は例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持及び界面活性剤の使用により維持することができる。吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸塩及びゼラチン）を組成物に添加することにより注射用組成物の持続吸収が可能になる。
【０１０４】
本発明の抗体及び抗体フラグメントは当分野で公知の種々の方法により投与することができるが、多くの治療用途に好ましい投与経路／方法は静脈内注射又は輸液である。当業者に自明の通り、投与経路及び／又は方法は所望結果により異なる。所定態様では、化合物の迅速放出を防ぐキャリヤーを活性化合物に加え、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセルデリバリーシステム等の制御放出製剤とすることができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の多数の製法が特許登録されており、又は当業者に一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０１０５】
所定態様では、本発明の抗体又は抗体部分は例えば不活性希釈剤又は同化性食用キャリヤーと配合して経口投与することができる。化合物（及び所望により他の成分）をハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、タブレット、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース等に製剤化してもよい。本発明の抗体又は抗体フラグメントを非経口投与以外の方法で投与するためには、その不活化を防ぐための材料で化合物をコーティングするか又はこのような材料と化合物を同時投与することが必要であると思われる。
【０１０６】
補助活性化合物も組成物に添加することができる。所定態様では、本発明の抗体又は抗体フラグメントを１種以上の付加治療剤と同時製剤化及び／又は同時投与する。例えば、他のターゲットと結合する１種以上の付加抗体（例えば他のサイトカインと結合するか又は細胞表面分子と結合する抗体）又は１種以上のサイトカインと本発明のＥＰＯ受容体抗体又は抗体フラグメントを同時製剤化及び／又は同時投与することができる。更に、１種以上の本発明の抗体を上記治療剤の２種以上と併用することもできる。このような併用療法は治療剤の投与量を減らし、各種単独療法に伴うと予想される毒性又は合併症を避けることができるという利点がある。
【０１０７】
本明細書で使用する「治療的に有効な量」なる用語は投与により効果を生じる抗体又は抗体フラグメントの量を意味する。厳密な用量は当業者が確認することができる。当分野で公知の通り、年齢、体重、性別、食事、投与時間、薬剤相互作用及び病状の重篤度に基づく調節が必要であると思われ、このような調節は当業者が日常的実験で確認することができる。治療的に有効な量は抗体又は抗体フラグメントの治療的に有益な効果が毒性又は有害効果を上回るような量でもある。「予防的に有効な量」とは所望予防結果を達成するために必要な用量と時間で有効な量を意味する。一般に、初期疾患段階以前の対象には予防用量を使用するので、予防的に有効な量は治療的に有効な量よりも少量である。
【０１０８】
投与レジメンは最適所望応答（例えば治療又は予防応答）が得られるように調節することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、用量を数回に分けて経時的に投与してもよいし、治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に増減してもよい。投与し易くすると共に用量を均質にするために非経口組成物を用量単位形態に製剤化すると特に有利である。本明細書で使用する用量単位形態とは被験哺乳動物対象に単位用量として適した物理的不連続単位を意味し、各単位は必要な医薬キャリヤーと共に所望治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位形態の規格は（ａ）活性化合物の固有特徴と達成すべき特定治療又は予防効果及び（ｂ）個体の過敏症治療に関するこのような活性化合物の配合分野で固有の制約により決定され、これらに直接依存する。
【０１０９】
本発明の抗体又は抗体部分の治療又は予防的に有効な量の典型的な非限定的範囲は０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。当然のことながら、用量値は緩和すべき病状の種類と重篤度により変動し得る。更に当然のことながら、任意特定対象の特定投与レジメンは個体の必要と組成物の投与者又は投与監督者の専門的判断により継時的に調節すべきであり、本明細書に記載する用量範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載する組成物の範囲又は実施を制限するものではない。
【０１１０】
以下、実施例により本発明を説明するが、これらの実施例により本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【０１１１】
ヒトエリスロポエチン受容体抗体の作製
抗原作製。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物の免疫に使用した抗原は２種の異なる方法を使用して万能Ｔ細胞エピトープ（ＴＣＥ）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１４９９（１９９２））とカップリングした。各等量を含有する混合物を免疫原として使用した。
【０１１２】
１）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）２．３ｍｇとシステイン結合ＴＣＥ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１４９９（１９９２））２００μｇを室温で３０分間混合した。ＤＴＴをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーカラムで遠心除去した。還元したシステイン結合ＴＣＥをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，１．６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１３６ｍＭ  ＮａＣｌ，２．６ｍＭ  ＫＣｌ，ｐＨ７．４）に再懸濁したヒトＥｐｏＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の可溶性細胞外ドメイン２００μｇと４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（スルホＳＭＣＣ）３３μｇに加え、４℃で一晩混合した。未反応ＥｐｏＲを１０ＫＤａカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で遠心除去した。
【０１１３】
２）ヒトＥｐｏＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の可溶性細胞外ドメイン（２００μｇ）をＰＢＳに再懸濁し、ＴＣＥ−ＢＰＡ（ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン）４μｇと混合し、ＵＶ光（３６２ｎＭ）下に室温で４５分間インキュベートした。未反応ＥｐｏＲを１０ＫＤａカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で遠心除去した。
【０１１４】
動物の免疫。上記のようにＴＣＥとカップリングした可溶性ＥｐｏＲをＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）ＸＧ２，Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ及びＶａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）に免疫することにより、Ａｂ１２及びＡｂ１９８（本明細書では夫々ＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２及びＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８とも言う）を含む本発明のモノクローナル抗体を産生させた。初期免疫はマウス１匹当たり抗原２０μｇを完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と１：１ｖ／ｖに混合して使用した。後続免疫は抗原２０μｇを不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）と１：１ｖ／ｖに混合して使用した。特に、０、１４、２８及び４２日に尾基部及び腹腔内注射により各動物を免疫した。
【０１１５】
ＥｐｏＲのビオチン化。ＥｐｏＲ（Ａｂｂｏｔｔ  ＣＨＯ細胞由来ｒｅｆ．＃ＲＢ６９０８４：４）３００μｇをＰＢＳ（ｐＨ８．６）９９０μＬに再懸濁し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶かしたビオチン−ＮＨＳ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）１００μｇに加え、４０分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。遊離ビオチンと緩衝液を５ｋＤａ  Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎカラムで遠心除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で数回洗浄し、終濃度６００μｇ／ｍＬとなるように適当な容量に再懸濁した。
【０１１６】
回収用動物の選択。抗ＥｐｏＲ抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。ビオチンＥｐｏＲ（上記）０．７μｇ／ｍｌをストレプトアビジンプレート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に室温で１時間コーティングした。未結合ビオチンＥｐｏＲを含む溶液を除去し、全プレートをｄＨ２Ｏで５回洗浄した。ＥｐｏＲ免疫動物又はナイーブＸｅｎＭｏｕｓｅ（登録商標）動物からのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）血清を１００倍初期希釈液から２個ずつ２％ミルク／ＰＢＳで２倍希釈により滴定した。最後のウェルはブランクとし、プレートをｄＨ２Ｏで５回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で標識した抗体を終濃度１μｇ／ｍＬとなるように１時間室温で加えた。プレートをｄＨ２Ｏで５回洗浄した。ＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を３０分間加えてプレートを展開させ、１Ｍリン酸を加えることによりＥＬＩＳＡを停止した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物から得られた特異的力価を４５０ｎｍの光学密度から決定し、表１に示す。力価は血清の希釈倍率の逆数であり、従って、値が大きいほどＥｐｏＲに対する体液免疫応答が大きい。
【０１１７】
【表１】
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表１の血清分析データに基づいてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物１４を回収用に選択した。
【０１１８】
Ｂ細胞の培養と選択。Ｂａｂｃｏｏｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：７８４３−７８４８（１９９６）に記載の手順にほぼ従い、回収動物からのＢ細胞を培養し、ＥｐｏＲ特異的抗体を分泌する細胞を単離した。血清力価について上述したように実施したＥＬＩＳＡを使用してＥｐｏＲ特異的ウェルを同定した。細胞５００個／ウェルの密度で培養したプレート５０枚をビオチンＥｐｏＲでスクリーニングし、抗原特異的ウェルを同定した。表２に示すデータから明らかなように、バックグラウンド（０．０５）を有意に上回るＯＤを示す７０１個のウェルの存在が判明した。
【０１１９】
【表２】
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これらのデータによると、ヒット頻度は非常に低く、ウェルが抗原特異性に関してモノクローナルであることを示した。これらの７０１個の陽性ウェルをビオチンＥｐｏＲで再スクリーニングした処、（下表３に太字で示す）１３７個のウェルがバックグラウンド（０．０５）を有意に上回るＯＤを示す真の抗原特異的ウェルであることが判明した。
【０１２０】
【表３】
2006523083.tif 000004
【０１２１】
アゴニスト活性アッセイ。Ｅｐｏ応答性細胞株の増殖をアゴニストスクリーンの基準として使用した。ヒト赤白血病細胞株ＵＴ−７／Ｅｐｏ（Ａｂｂｏｔｔ  ｒｅｆ＃．ＲＢ２９４５４−１７４）を使用してこれらの１３７個のウェルをアゴニスト活性についてスクリーニングした。ハーフエリア９６ウェルプレートで最終容量５０μＬとなるように上清１２．５μＬをＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ）中細胞１×１０５個／ウェルに加えた。ウェルサイズは典型的９６ウェルプレートの面積の２分の１である。増殖を目視確認し、基線対照として滴定量のヒトＥｐｏを含むか又はＥｐｏを含まない培地中の細胞と比較した。増殖活性を示す１１個のウェルが同定された。
【０１２２】
ＥｐｏＲ特異的溶血プラークアッセイ。このアッセイを実施するためには多数の特殊試薬が必要である。これらの試薬は以下のように調製した。
【０１２３】
ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）のビオチン化：ＳＲＢＣをＲＰＭＩ培地に２５％ストックとして保存した。ストック１．０ｍｌを１５ｍｌファルコンチューブに分注し、細胞をスピンダウンさせ、上清を除去することにより、２５０μｌＳＲＢＣパック細胞ペレットを得た。次に細胞ペレットを５０ｍｌ試験管でＰＢＳ（ｐＨ８．６）４．７５ｍｌに再懸濁した。別の５０ｍｌ試験管でスルホＮＨＳビオチン２．５ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ８．６）４５ｍｌに加えた。ビオチンが完全に溶解したら、ＳＲＢＣ５ｍｌを加え、試験管を室温で１時間回転させた。ＳＲＢＣを３０００ｇで５分間遠心し、上清を吸引除去し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５ｍｌで洗浄した。洗浄サイクルを３回繰返した後、免疫細胞培地（１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０）４．７５ｍｌを２５０μｌビオチン化ＳＲＢＣ（Ｂ−ＳＲＢＣ）ペレットに加え、Ｂ−ＳＲＢＣ（５％Ｂ−ＳＲＢＣストック）を温和に再懸濁した。ストックを必要時まで４℃で保存した。
【０１２４】
Ｂ−ＳＲＢＣのストレプトアビジン（ＳＡ）コーティング：５％Ｂ−ＳＲＢＣストック１ｍｌを別のエッペンドルフチューブに移した。Ｂ−ＳＲＢＣ細胞をマイクロ遠心機で８０００ｒｐｍ（６８００ｒｃｆ）のパルススピンでペレット化し、上清を吸引除去し、ペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．４）１．０ｍｌに再懸濁し、遠心を繰返した。洗浄サイクルを２回繰返した後、Ｂ−ＳＲＢＣペレットを終濃度５％（ｖ／ｖ）となるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）１．０ｍｌに再懸濁した。１０ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ストック溶液１０μｌを加え、試験管を混合し、室温で２０分間回転させた。洗浄段階を繰返し、ＳＡ−ＳＲＢＣをＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌに再懸濁した（５％（ｖ／ｖ））。
【０１２５】
ＳＡ−ＳＲＢＣのＥｐｏＲコーティング：ＳＡ−ＳＲＢＣに１０μｇ／ｍｌビオチン化ＥｐｏＲをコーティングし、混合し、室温で２０分間回転させた。ＳＲＢＣを上記と同様にＰＢＳ（ｐＨ７．４）１．０ｍｌで２回洗浄した。ＥｐｏＲをコーティングしたＳＲＢＣを終濃度５％（ｖ／ｖ）となるようにＲＰＭＩ（＋１０％ＦＣＳ）に再懸濁した。
【０１２６】
免疫蛍光（ＩＦ）によるＥｐｏＲ−ＳＲＢＣの品質測定：ＰＢＳ４０μｌを入れた夫々別の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに５％ＳＡ−ＳＲＢＣ１０μｌと５％ＰＴＨコートＳＲＢＣ１０μｌを各々加えた。マウス抗ＥｐｏＲ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ．＃  ＭＡＢ３０７）２０μｇ／ｍｌをＳＲＢＣの各試料に加えた。試験管を室温で２５分間回転させた後、細胞をＰＢＳ１００μｌで３回洗浄した。細胞をＰＢＳ５０μｌに再懸濁し、Ａｌｅｘａ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体４０μｇ／ｍＬと共にインキュベートした。試験管を室温で２５分間回転させた後、ＰＢＳ１００μｌで洗浄し、細胞をＰＢＳ１０μｌに再懸濁した。染色細胞１０μｌを透明ガラス顕微鏡スライドにスポットし、ガラスカバースリップをかぶせ、蛍光下に観察し、０〜４の任意スケールでスコアした。
【０１２７】
血漿細胞の作製：先のアッセイにより該当免疫グロブリンを分泌するＢ細胞クローンを含むと同定された単一微量培養ウェルの内容物を回収した。１００−１０００μｌピペットマンを使用し、３７Ｃ  ＲＰＭＩ（＋１０％ＦＣＳ）を加えることによりウェルの内容物を回収した。細胞をピペッティングにより再懸濁した後に別の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した（最終容量５００〜７００μｌ）。細胞をマイクロ遠心機で１５００ｒｐｍ（２４０ｒｃｆ）にて２分間室温で遠心した後、試験管を１８０°反転させ、再び２分間１５００ｒｐｍで遠心した。凍結培地を吸引除去し、免疫細胞をＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）１００μｌに再懸濁した後、遠心した。ＲＰＭＩ（１０％ＦＣＳ）によるこの洗浄を繰返し、細胞をＲＰＭＩ（ＦＣＳ）６０μｌに再懸濁し、使用時まで氷上保存した。
【０１２８】
プラークアッセイ：ガラススライド（２×３インチ）に予めシリコンエッジを付着し、一晩室温で硬化させた。使用前にスライドをＳｉｇｍａＣｏａｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）約５μｌで処理し、ガラス表面を均等に拭き取り、乾燥させた後、強く拭き取った。ＥｐｏＲコートＳＲＢＣ（５％ｖ／ｖストック）、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ中で調製した４×モルモット補体（Ｓｉｇｍａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）ストック、及び４×濃化用血清ストック（１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ中１：９００）各６０μｌを細胞試料６０μｌに加えた。予備処理したスライドに混合物（３〜５μｌ）をスポットし、スポットを未希釈パラフィン油で覆った。スライドを３７℃で最低４５分間インキュベートした。
【０１２９】
プラークアッセイ結果：二次検出試薬単独（０／４）に比較してコーティングを検出するためにＭＡＢ３０７を使用して免疫蛍光顕微鏡測定によりコーティングを定性測定した処、非常に高品質（４／４）であることが判明した。ストレプトアビジンのみをコーティングした赤血球でＭＡＢ３０７抗体を使用した場合にはシグナルは検出されなかった（０／４）。次にこれらの赤血球を使用して表４に示す１４個のウェルから抗原特異的血漿細胞を同定した。抗原特異的血漿細胞を回収する顕微操作後に、可変領域遺伝子をコードする遺伝子を単一血漿細胞でＲＴ−ＰＣＲにより回収した。
【０１３０】
【表４】
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【０１３１】
発現。単一血漿細胞の単離後に、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写ＰＣＲを実施してｃＤＮＡを作製した。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して重鎖及び軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅した。重鎖可変領域はＩｇＧ２発現ベクターにクローニングした。このベクターはヒトＩｇＧ２の定常領域をｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）のマルチクローニング部位にクローニングすることにより作製した。軽鎖可変領域はＩｇＫ発現ベクターにクローニングした。このベクターはヒトＩｇＫの定常領域をｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）のマルチクローニング部位にクローニングすることにより作製した。次に重鎖及び軽鎖発現ベクターの適当な対を７０％コンフルエントヒト胚性腎２９３細胞の６０ｍｍ皿にコリポフェクションし、トランスフェクト細胞に組換え抗体を２４時間分泌させた。上清（３ｍＬ）をＨＥＫ２９３細胞から回収し、ヒトＩｇＧを特異的に検出するサンドイッチＥＬＩＳＡで無傷抗体（ＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２及びＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８）の分泌を確認した（表５，第４列）。ＥＬＩＳＡを使用して組換え抗体とビオチン化とＥｐｏＲの結合によりＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２とＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８の特異性を確認した（表５，第５列）。
【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
抗原特異的抗体のＥＬＩＳＡは以下のように実施した。対照プレートには２ｍｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ  Ｏ／Ｎをコーティングした。結合プレートには、ビオチン−ＥｐｏＲ（０．７μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に１時間室温でコーティングした。プレートをｄＨ２Ｏで５回洗浄した。７個のウェルについて組換え抗体を未希釈ミニリポフェクション上清から２倍希釈により滴定した。プレートをｄＨ２Ｏで５回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的ＨＲＰ標識抗体を終濃度１μｇ／ｍＬとなるように１時間室温で加え、分泌及び結合試験用ＥＬＩＳＡを実施した。プレートをｄＨ２Ｏで５回洗浄した。ＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を３０分間加えてプレートを展開させ、１Ｍリン酸を加えることによりＥＬＩＳＡを停止した。各ＥＬＩＳＡプレートを分析し、各ウェルの４５０ｎｍの光学密度を測定した。
【０１３４】
ＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２及びＡＢ−ＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８の精製。大規模生産のために、ＨＥＫ２９３細胞を７０％コンフルエントまで培養した１００ｍｍ皿１０枚に重鎖及び軽鎖発現ベクター（各鎖２．５μｇ／皿）をリポフェクションした。トランスフェクト細胞を３７℃で４日間インキュベートし、上清（６ｍＬ）を回収し、新鮮な培地６ｍＬと交換した。７日目に上清を取出し、初期回収液（プレート１０枚から合計１２０ｍＬ）と共にプールした。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）アフィニティクロマトグラフィー（１ｍＬ）を使用してＡＢＴ２−ＸＧ２−０１２及びＡＢＴ２−ＸＧ２−１９８抗体を上清から精製した。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）５００μＬを使用して抗体をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａカラムから溶出させた。溶出液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、濾過滅菌した。抗体を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、純度と収率を測定した。
【０１３５】
組換え抗体のアゴニスト活性。上記アゴニスト活性アッセイの項に記載したようにＵＴ−７／Ｅｐｏ細胞を使用してこれらの組換え抗体がＥｐｏ応答性細胞の増殖を刺激する能力を試験し、ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により増殖を定量し、４９０ｎｍで測定した。ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２及びＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８は下記のように抗体を含まない培地中の細胞に比較して増殖を誘導した（夫々図１４及び１５）。
【０１３６】
抗ヒトＦｃの効果。ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２及びＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８のアゴニスト活性は自己凝集に起因する可能性がある。この問題を検討するために、抗ヒトＦｃ二次抗体の添加により凝集を誘導し、ＵＴ−７／Ｅｐｏ細胞を使用してＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２及びＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８のアゴニスト活性に及ぼす効果を調べた。下記のように、二次抗体の添加はＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８の活性には効果がなく（図１６）、ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２の活性を阻害した。（図４  １７）。
【０１３７】
二次Ａｂの添加はＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２の活性を阻害したので、この抗体の凝集がその活性を妨害し、従って、ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２は凝集に起因するアゴニスト活性をもつとは思われないと結論した。他方、ＡＢＴ２ＳＣＸ−１９８の結果は解釈しにくい。効果がないのはＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８が完全に凝集し、従って、二次Ａｂを添加してもその活性にそれ以上効果がないためであると考えられる。あるいは、効果がないのはＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８の活性が二次抗体によるコンホメーション制限により変化しないためであるとも考えられる。
【０１３８】
ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２及びＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８の配列分析。抗体ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２及びＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８の重鎖可変領域と軽鎖可変領域をシーケンシングし、そのＤＮＡ配列を決定した。抗ＥｐｏＲ抗体の完全配列情報とγ重鎖及びκ軽鎖の各可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を図１、２、及び１８〜３０に示す。図１及び２は定常領域を含む全長配列を示す。
【０１３９】
重鎖可変領域配列を分析し、ＶＨファミリー、Ｄ領域配列及びＪ領域配列を決定した。次に配列を翻訳し、一次アミノ酸配列を決定し（図２９）、生殖細胞系列ＶＨ、Ｄ及びＪ領域配列と比較し、体細胞超変異を調べた。抗ＥｐｏＲ抗体γ鎖全体の一次アミノ酸配列は図１６に示す。生殖細胞系列配列を上段に示し、突然変異を新規アミノ酸配列で示す。未変異アミノ酸はダッシュ（−）で示す。軽鎖を同様に分析し、Ｖ及びＪ領域を決定し、生殖細胞系列κ配列からの体細胞突然変異を同定した（図３０）。ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２の重鎖はＶＨ４−５９（ＤＰ−７１）、ＤＩＲ４ｒｃ及びＪＨ４ａ遺伝子セグメントを使用することが判明し、軽鎖はＶｋＩ（Ａ３０）及びＪｋｌ遺伝子セグメントを使用することが判明した。ＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８の重鎖はＶＨ３−３０（Ｖ３−３０）、Ｄ４−２３及びＪＨ６ｂ遺伝子セグメントを使用することが判明し、軽鎖はＶｋＩ（Ｌ５）及びＪｋ３遺伝子セグメントを使用することが判明した。
【実施例２】
【０１４０】
組換えＥＰＯ受容体を発現するＣＨＯ細胞との結合に関するＡｂ１２と１２５Ｉ標識ＥＰＯの競合
全長組換えヒトＥＰＯ受容体を発現するＣＨＯ細胞をアッセイ前の７２時間２４ウェルプレートに５×１０５個／ウェルでプレーティングした。アッセイ当日にＲＰＭＩ１６４０，０．５％ＢＳＡ，１ｍＭ  ＮａＮ３で希釈した指定濃度（図５に示す）のＡｂ１２、Ａｂ１９８、又はＥＰＯ９５μｌと、１２５Ｉ−ＥＰＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃａｔ．＃ＩＭ１７８，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ  ４８６ｃｉ／ｍＭ）５μｌ（６ｎｇ）をウェルに加えた。３７℃で１．５時間インキュベーション後にウェルを冷ＨＢＳＳで３回洗浄し、０．１Ｎ  ＮａＯＨ０．５ｍｌを使用して回収した。試料をＭｉｃｒｏｍｅｄｉｃ  ＭＥ  Ｐｌｕｓγカウンターで計数した。結果を図５に示す。特に、結果はＡｂ１２及び１９８がエリスロポエチン受容体との結合に関してＥＰＯと競合することを示す。
【実施例３】
【０１４１】
Ｂｉａｃｏｒｅ試験
Ｂｉａｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアバージョン３．１．（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してＢｉａｃｏｒｅ  ２０００で以下の試験を実施した。チップ表面に直接固相化した抗体で結合分析を実施した後に、種々の濃度の受容体を注入した。
【０１４２】
抗体の固相化
抗体の固相化はＢｉａｃｏｒｅソフトウェアパッケージでデフォルト固相化プログラムを使用して実施した。抗体を同梱酢酸緩衝液で１０μｇ／ｍＬまで希釈し、固相化を実施するのに適したｐＨをプレスクリーニングした。固相化のために抗体を適当な酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩，ｐＨ４．０）で希釈し、３種の異なる蛋白質濃度（５００、１０００、及び１５００ＲＵ）で標準ＥＤＣ化学を使用してチップ表面に直接カップリングした。４番目のフローセルはモックであり、ＥＤＣとカップリングしてカルボキシル基をキャッピングし、陰性対照としてのバックグラウンド表面とした。
【０１４３】
結合試験
結合試験は種々の濃度の可溶性ヒトＥＰＯ受容体をチップ表面に連続注入することにより実施した（５００ＲＵ固相化蛋白質）。結合分析はランニング緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ）で所望濃度（１０〜２００ｎＭ）まで希釈した受容体を使用して同梱ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液［ＨＢＳ緩衝液−１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ＝７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ），Ｂｉａｃｏｒｅ］中で実施した。実験は流速３０μＬ／分で実施した。受容体を３分間注入した後に１５分間解離させた。陰性対照として作製したフローセルにも同時注入を行った。全注入は３回ずつ実施した。
【０１４４】
モデルフィッティング
ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０．２ソフトウェアパッケージ（Ｂｉａｃｏｒｅ）で提供されるモデルにデータをフィットさせた。陰性対照表面への同時注入からのデータ点を差し引くことにより実験注入からのデータ点を補正した。補正データを使用してＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアパッケージで提供される１：１（ラングミュア）結合モデルと２価分析物モデルにフィットさせた。ラングミュア結合モデルとのフィッティングから解離定数を直接計算した。２価分析物モデルでは、解離速度定数と会合速度定数ｋｄ及びｋａの計算値を使用して間接的に解離定数を計算した。
【０１４５】
【表６】
2006523083.tif 000007
【実施例４】
【０１４６】
ＥＰＯ依存的ヒト細胞増殖アッセイ
１０％ウシ胎仔血清と組換えヒトエリスロポエチン１単位／ｍＬを加えたＲＰＭＩ１６４０培地にヒト赤白血病細胞株Ｆ３６Ｅ細胞のストック培養液を保存した。アッセイの前に、ＥＰＯを含まない増殖培地に密度４．０〜５．０×１０５個／ｍＬで細胞を一晩培養した。細胞を回収し、洗浄し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）に密度１．０×１０６個／ｍＬで再懸濁し、細胞５０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えた。アッセイ培地中Ａｂ１２、Ａｂ３９０、Ａｂ４１２、Ａｂ４６７、Ａｂ４８４、Ａｂ４３０／４３２及びＡｂ１９８又はＥＰＯ標準（組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ））各５０μＬをウェルに加え、プレートを５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃の加湿インキュベーターでインキュベートした。７２時間後に、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ（登録商標）試薬（製造業者の指示に従って調製，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｉｎ）２０μＬを全ウェルに加えた。プレートを５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で４時間インキュベートし、マイクロプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，Ｗａｌｌａｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して４９０ｎｍの光学密度を測定した。結果を図６に示す。全ＡｂはＦ３６Ｅ細胞株の増殖を刺激した。最大増殖活性はＥＰＯ対照で観察される活性と同等であり、濃度増加としてベル形曲線により示される。図７の結果から明らかなように、Ａｂ１２は４℃で２０日間まで保存後にＦ３６Ｅ細胞の増殖の誘導に活性である。増殖活性はＥＰＯ対照で観察される活性と同等であり、最大応答はモル当量基準で約１０倍の差がある。
【実施例５】
【０１４７】
ヒトＣＤ３６＋ＣＦＵｅアッセイ
Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ））から入手した凍結ヒトＣＤ３６＋赤血球前駆細胞を融解し、ＩＭＤＭ−２％ＦＢＳ中細胞１０４個／ｍｌとした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ，Ｃａｔ．＃０４２３０）２．４ｍｌ、幹細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｃａｔ．＃Ｓ７９０１，１００μｇ／ｍｌ）０．３ｍｌ、及びＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ａｂ１２、又はＩＭＤＭ−２％ＦＢＳ０．３ｍｌを入れた０．３ｍｌ試験管に細胞（０．３ｍｌ）を加えた。混合後、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ懸濁液１．１ｍｌを３５ｍｍ非組織培養液処理滅菌ペトリ皿に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２週間インキュベートした。コロニーを顕微鏡で確認した。結果を図８に示す。特に、Ａｂ１２はヒトＣＤ３６＋前駆細胞からＣＦＵ−Ｅコロニーの形成を誘導した。顕微鏡で確認されたコロニーを赤で示した。コロニーのサイズと個数は恐らく増殖シグナルの低下によりＥＰＯ対照で観察されるよりも減少している。
【実施例６】
【０１４８】
培養液中の赤血球産生活性の実証
Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４＋  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を使用してＣＤ３４＋細胞をヒト末梢血から集積させた。回収した細胞をα培地で２回洗浄し、懸濁培養培地（α培地に３０％ＦＣＳ，１％脱イオンＢＳＡ，１０−５Ｍβ−メルカプトエタノール，１０−６Ｍデキサメタゾン，０．３ｍｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン及び１０ｎｇ／ｍＬヒト組換え幹細胞因子を補充）に再懸濁した。濃度０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの試験抗体を加えた６ウェルマイクロプレート２枚に細胞を密度１×１０４個／ｍＬでプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２週間インキュベートした。細胞計数及びベンジジン染色用に各ウェルから２個ずつ試料を回収した（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｆｉｂａｃｈ，Ｅ．，１９９８  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，２２：５−６，４４５−４５８）。
【０１４９】
結果を図９に示す。特に、Ａｂ１９８は前駆細胞から誘導されるヒト赤血球産生細胞の増殖を用量依存的に誘導した。ベンジジン染色により測定した増殖細胞数とヘモグロビン発現百分率はこの場合も恐らく増殖シグナルの低下によりＥＰＯ処理対照に比較して減少した。
【実施例７】
【０１５０】
カニクイザル骨髄ＣＦＵｅアッセイ
カニクイザルから骨髄を抽出し、ＰＢＳで２倍に希釈した。希釈した骨髄３ｍｌをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  Ｃａｔ．＃１００１９６７）６ｍｌに重層し、２７００ｒｐｍで２０分間遠心し、バフィーコートを回収し、ＩＭＤＭ−２％ＦＢＳ１０ｍｌで希釈した。細胞を遠心し、ＩＭＤＭ−２％ＦＢＳに１０６個／ｍｌで再懸濁した。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ，Ｃａｔ．＃０４２３０）２．４ｍｌ，幹細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．＃Ｓ７９０１，１００μｇ／ｍｌ）０．３ｍｌ、及びＥＰＯ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、試験抗体（Ａｂ１９８）、又はＩＭＤＭ−２％ＦＢＳ０．３ｍｌを入れた試験管に細胞（０．３ｍｌ）を加えた。混合後、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ懸濁液１．１ｍｌを３５ｍｍ非組織培養液処理滅菌ペトリ皿に加え、３７℃、５％ＣＯ２で２週間インキュベートした。コロニーが顕微鏡で確認された。このアッセイの結果を図１０に示すように、（コロニー数はＥＰＯ対照で観察されるよりも少ないが）Ａｂ１９８はＣＦＵ−Ｅコロニーの形成を誘導することが立証された。
【実施例８】
【０１５１】
ＳＥ−３ペブチドの結合を測定するためのＥＬＩＳＡ
０．０１５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３，０．０３５Ｍ  ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．４で希釈した５μｇ／ｍｌ可溶性ＥＰＯ受容体（ｓＥＰＯＲ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）Ｃａｔ．＃３０７−ＥＲ／ＬＦ）、又はペブチドＳＥ−３（ＰＧＮＹＳＦＳＹＱＬＥＤＥＰＷＫＬＣＲＬＨＷＡＰＴＡＲＧＡＶ）（米国特許第６，３１９，４９９号に記載）８０μｌを９６ウェルポリスチレンプレート（Ｄｙｎａｔｅｃ（Ｅｌｋ  Ｇｒｏｖｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＩＬ）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  ４）に２時間室温及び一晩４℃でコーティングした。プレートを３０分間室温にてＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））Ｃａｔ．＃１００１０）中５％ＢＳＡ１００μｌでブロックした。ブロッキング溶液の除去後、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌＡｂ１２  ５０μｌをウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。Ｓｋａｔｒｏｎ  ４００  Ｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒを使用してプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄し、ＰＢＳ／０．２５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で希釈した二次抗体５０μｌをウェルに加えた。Ａｂ１２には１０００倍に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（Ｃａｌｔａｇ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）Ｃａｔ．＃Ｈ１０５０７）を使用し、Ａｂ７１Ａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＨＢ１１６８９から入手可能、米国特許第６，３１９，４９９号にも記載）には５０００倍に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）Ｃａｔ．＃１１５−０３５−１６４）を使用した。１時間室温でインキュベーション後、プレートを上記と同様に３回洗浄し、ＯＰＤ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｐ９１８７）５０μｌを各ウェルに加えた。１Ｎ  ＨＣｌ  ５０μｌを加えて発色を停止し、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０  Ｍｕｌｔｉ−Ｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒで４９０ｎｍの光学密度を測定した。
【０１５２】
図１１に示すように、Ａｂ１２はＳＥ−３ペブチドと相互作用（即ち結合）しない。Ａｂ７１ＡはＳＥ−３ペブチドと相互作用（即ち結合）する。Ａｂ１２及び７１Ａはいずれも固相化エリスロポエチン受容体と相互作用した。
【実施例９】
【０１５３】
ＥＰＯ依存的増殖アッセイ
初代ハイブリドーマ上清を実施例５に記載したようにアッセイ培地で希釈し、Ｆ３６Ｅヒト赤白血病細胞の増殖刺激能を試験した。５個の初代上清の結果を図１２に示す。これらの試料はＦ３６Ｅ細胞の増殖を刺激した。
【実施例１０】
【０１５４】
ハイブリドーマ上清とＳＥ−３ペブチドの結合を測定するためのＥＬＩＳＡ
４２個の初代ハイブリドーマ上清が固相化ＥＰＯ受容体又はペブチドＳＥ−３と結合する能力を実施例１０に記載したように試験した。図１３に示すように、試験した全ハイブリドーマ上清は固相化ＥＰＯ受容体と相互作用したが、バックグラウンドを上回るレベルでＳＥ−３ペブチドと結合したのは試料１６のみであった。
【実施例１１】
【０１５５】
γ−１  Ａｂ１２とγ−２  Ａｂ１２の赤血球産生活性の比較
Ｆ３６ｅヒト赤白血病細胞でγ−１  Ａｂ１２とγ−２  Ａｂ１２の赤血球産生活性を比較するために（実施例４に記載したような）増殖アッセイを実施した。結果を図３１に示す。図３１に示すように、γ−２  Ａｂ１２はγ−１  Ａｂ１２よりもＦ３６Ｅ細胞株の増殖の刺激に有効であった。
【実施例１２】
【０１５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ赤血球産生に及ぼすＡｂ１２の効果
（ａ）ｍＥｐｏＲ−／−，ｈＥｏｐＲ＋トランスジェニックマウスの作製：ヒトＥｐｏＲのみを産生し（ｈＥｐｏＲ＋，単一対立遺伝子）、内因性マウスＥｐｏＲを産生しない（ｍＥｐｏＲ−／−，二重対立遺伝子突然変異）トランスジェニックマウスをＬｉｕ，Ｃ．ら，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２：３２３９５（１９９７）とＹｕ，Ｘ．ら，Ｂｌｏｏｄ，９８（２）：４７５（２００１）に記載されているように作製した。繁殖コロニーを樹立し、ｉｎ  ｖｉｖｏ赤血球産生試験用マウスを作製した。
【０１５７】
（ｂ）多回投与レジメン：初期実験では、動物にＡｂ１２の多回投与レジメンを実施し、抗体が網状赤血球数及び／又はヘマトクリット％を増加させるか否かを試験した。５匹のトランスジェニックマウス（ｍＥｐｏＲ−／−，ｈＥｐｏＲ＋）にビークル（０．１％ウシ血清アルブミン（［ＢＳＡ］を添加したリン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］）０．２ｍＬ中５μｇ又は５０μｇのＡｂ１２を皮下注射した。対照動物にも同様に等容量のビークル単独又はＥｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ａｍｇｅｎｅ（登録商標），Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）５Ｕを添加したビークルを注射した。全動物に以下のスケジュールに従って３週間投与した。
【０１５８】
【表７】
2006523083.tif 000008
【０１５９】
４日目（第１週の木曜日）に網状赤血球数と１９日目（第３週の金曜日）ヘマトクリットを測定するために採血した。当分野で周知の方法を使用して網状赤血球数及びヘマトクリット測定を実施した。図３２に示すように、Ａｂ１２はＡｂ１２抗体５又は５０μｇを投与した動物に網状赤血球数とヘマトクリット％の（対照に対して）統計的に有意な増加を生じた。
【０１６０】
（ｃ）週１回投与レジメン：多回投与レジメンで検出された結果がＡｂ１２の投与回数を減らした動物でも観察されるか否かを調べるために、トランスジェニックマウスに（上記（ｂ）に記載したように）各種濃度（０．５、２．５、５．０、５０及び２５０μｇ）のＡｂ１２又は対照としてＥｐｏｇｅｎ（登録商標）の高活性変異体であるＡｒａｎｅｓｐ（Ａｒｎｇｅｎｏ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）を１、８及び１５日目に注射し、４日目と１９日目に採血し、夫々網状赤血球数とヘマトクリットを測定した。対照動物にはビークル単独又はヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照を単回投与した。図３３に示すように、Ａｂ１２は最低濃度を除く全試験濃度でヘマトクリット百分率を（ビークル及びアイソタイプ対照に対して）統計的に有意に増加した。
【０１６１】
（ｄ）単回と週１回投与レジメンの比較：Ａｂ１２の単回投与が３週間後の赤血球産生に効果があるか否かを調べるために、トランスジェニックマウスにＡｂ１２（５０μｇ）を１週間おきに３週間又はＡｂ１２（１５０μｇ）を単回投与し、１９日目に採血し、ヘマトクリット百分率を測定した。対照動物にはビークル単独、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）（９００ｎｇ）単回投与又はＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）を１週間おきに合計３回（３００ｎｇ×３）投与した。図３４に示すようにＡｂ１２はどちらの投与レジメンでもヘマトクリット百分率をビークル対照に対して統計的に有意に増加した。他方、Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標）の単回投与レジメンはこの効果がなかった。
【０１６２】
本明細書に引用する全抄録、文献、特許及び公開特許出願は参考資料として本明細書に組込む。
【０１６３】
以上、説明と実施例により本発明を例証した。以上の記載は非限定的な例証を目的とし、以上の記載に鑑みて多数の変形が当業者に自明である。
【０１６４】
本発明の概念と範囲から逸脱することなく本明細書に記載する本発明の方法の組成物、操作及び構成に変更を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１−１】ヒト抗体Ａｂ１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号６９及び配列番号７０）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７１〜７４を含む。定常領域のみの配列を配列番号７５として示す。可変鎖はヌクレオチド１２８３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１２８４−１２８９である。定常領域はヌクレオチド１２９０−２８２６である。
【図１−２】ヒト抗体Ａｂ１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号６９及び配列番号７０）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７１〜７４を含む。定常領域のみの配列を配列番号７５として示す。可変鎖はヌクレオチド１２８３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１２８４−１２８９である。定常領域はヌクレオチド１２９０−２８２６である。
【図１−３】ヒト抗体Ａｂ１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号６９及び配列番号７０）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７１〜７４を含む。定常領域のみの配列を配列番号７５として示す。可変鎖はヌクレオチド１２８３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１２８４−１２８９である。定常領域はヌクレオチド１２９０−２８２６である。
【図１−４】ヒト抗体Ａｂ１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号６９及び配列番号７０）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７１〜７４を含む。定常領域のみの配列を配列番号７５として示す。可変鎖はヌクレオチド１２８３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１２８４−１２８９である。定常領域はヌクレオチド１２９０−２８２６である。
【図２】ヒト抗体Ａｂ１２の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号７６及び配列番号７７）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７８を含む。定常領域のみの配列を配列番号７９として示す。可変鎖はヌクレオチド１３６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３６４−１３６９である。定常領域はヌクレオチド１３７０−１６１８である。
【図３−１】ヒト抗体Ａｂ１９８の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８０及び配列番号８１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド１３０４までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３０５−１３１０である。定常領域はヌクレオチド１３１１−２８４７である。
【図３−２】ヒト抗体Ａｂ１９８の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８０及び配列番号８１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド１３０４までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３０５−１３１０である。定常領域はヌクレオチド１３１１−２８４７である。
【図３−３】ヒト抗体Ａｂ１９８の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８０及び配列番号８１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド１３０４までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３０５−１３１０である。定常領域はヌクレオチド１３１１−２８４７である。
【図３−４】ヒト抗体Ａｂ１９８の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８０及び配列番号８１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド１３０４までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３０５−１３１０である。定常領域はヌクレオチド１３１１−２８４７である。
【図４−１】ヒト抗体Ａｂ１９８の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８３及び配列番号８４）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７８を含む。可変鎖はヌクレオチド１３５１までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３５２−１３５７である。定常領域はヌクレオチド１３５８−１６０６である。
【図４−２】ヒト抗体Ａｂ１９８の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８３及び配列番号８４）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号７８を含む。可変鎖はヌクレオチド１３５１までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド１３５２−１３５７である。定常領域はヌクレオチド１３５８−１６０６である。
【図５】組換えＥＰＯ受容体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞との結合に関するＡｂ１２と１２５Ｉ標識ＥＰＯの競合を示す。
【図６】Ａｂ１２とＡｂ１９８を使用したＥＰＯ依存的ヒト細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図７】Ａｂ１２が４℃で２０日間まで保存後にＦ３６Ｅ細胞増殖の誘導に活性であることを示す。
【図８】Ａｂ１２がヒト３６＋前駆細胞からＣＦＵ−Ｅ（赤血球コロニー形成単位）の形成を誘導することを示す。
【図９】Ａｂ１９８によるヒト赤血球産生細胞増殖の誘導を示す。
【図１０】Ａｂ１９８がカニクイザル骨髄由来赤血球前駆細胞からＣＦＵ−Ｅコロニーの形成を誘導することを示す。
【図１１】Ａｂ１２がペブチドＳＥ−３と相互作用しないことを示す。Ａｂ７１ＡはＳＥ−３ペブチドと相互作用する。
【図１２】初代ハイブリドーマにより分泌されるヒトＡｂがＦ３６Ｅ細胞の増殖を誘導することを示す。
【図１３】初代ハイブリドーマにより分泌されるヒトＡｂ上清は無傷ＥＰＯ受容体と相互作用するが、ペブチドＳＥ−３とは相互作用しないことを示す。
【図１４】ＵＴ７／ＥＰＯ細胞の増殖に対する各種濃度のＡｂ１２の活性を示す。
【図１５】ＵＴ７／ＥＰＯ細胞の増殖に対する各種濃度のＡｂ１９８の活性を示す。
【図１６】ＵＴ７／ＥＰＯ細胞の成長と増殖に対する各種濃度のＡｂ１９８の活性（二次ヤギ抗ヒトＦＣ抗体添加時と非添加時）を示す。
【図１７】ＵＴ７／ＥＰＯ細胞の成長と増殖に対する各種濃度のＡｂ１２の活性（二次ヤギ抗ヒトＦＣ抗体添加時と非添加時）を示す。
【図１８】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−００３により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図１８Ａ（配列番号１０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図１８Ｂ（配列番号１１）は図１８Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図１８Ｃ（配列番号１２）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図１８Ｄ（配列番号１３）は図１８Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図１９】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０１２（本明細書ではＡｂ１２とも言う）により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図１９Ａ（配列番号２）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図１９Ｂ（配列番号３）は図１９Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図１９Ｃ（配列番号４）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図１９Ｄ（配列番号５）は図１９Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２０】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０２２により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２０Ａ（配列番号１４）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２０Ｂ（配列番号１５）は図２０Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２０Ｃ（配列番号１６）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２０Ｄ（配列番号１７）は図２０Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２１】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０５４により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２１Ａ（配列番号１８）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２１Ｂ（配列番号１９）は図２１Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２１Ｃ（配列番号２０）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２１Ｄ（配列番号２１）は図２１Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２２】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−０６０により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２２Ａ（配列番号１０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２２Ｂ（配列番号１１）は図２２Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２２Ｃ（配列番号２２）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２２Ｄ（配列番号２３）は図２２Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２３】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−１０２により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２３Ａ（配列番号１０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２３Ｂ（配列番号１１）は図２３Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２３Ｃ（配列番号２４）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２３Ｄ（配列番号２５）は図２３Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２４】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−１３５により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２４Ａ（配列番号１０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２４Ｂ（配列番号１１）は図２４Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２４Ｃ（配列番号２６）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２４Ｄ（配列番号２７）は図２４Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２５】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−１４５により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２５Ａ（配列番号１０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２５Ｂ（配列番号１１）は図２５Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２５Ｃ（配列番号２８）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２５Ｄ（配列番号２９）は図２５Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２６】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−１９８（本明細書ではＡｂ１９８とも言う）により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２６Ａ（配列番号６）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２６Ｂ（配列番号７）は図２６Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２６Ｃ（配列番号８）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２６Ｄ（配列番号９）は図２６Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２７】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−２５４により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２７Ａ（配列番号３０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２７Ｂ（配列番号３１）は図２７Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２７Ｃ（配列番号３２）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２７Ｄ（配列番号３３）は図２７Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２８】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−２６７により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図２８Ａ（配列番号３４）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２８Ｂ（配列番号３５）は図２８Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図２８Ｃ（配列番号３６）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図２８Ｄ（配列番号３７）は図２８Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２９】本発明により作製された抗ＥＰＯｒｍＡｂの重鎖可変領域とその関連生殖細胞系列可変領域配列のアミノ酸配列アラインメントを示し、フレームワーク領域と相補性決定領域を同定する表である。
【図３０】本発明により作製された抗ＥＰＯｒｍＡｂの軽鎖可変領域とその関連生殖細胞系列可変領域配列のアミノ酸配列アラインメントを示し、フレームワーク領域と相補性決定領域を同定する表である。
【図３１】Ｆ３６ｅヒト赤白血病細胞株に対する各種濃度のγ−１  Ａｂ１２モノクローナル抗体（Ｍａｂ）とγ−２  Ａｂ１２  Ｍａｂの赤血球産生活性を比較したグラフである。
【図３２】ビークル、Ｅｐｏｇｅｎ（５Ｕ）又はＡｂ１２抗体（５又は５０μｇ）の多回投与レジメン下のトランスジェニックマウスにおける網状赤血球百分率とヘマトクリット百分率の増加を示すグラフである。
【図３３】各種濃度のＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）又はＡｂ１２の週１回投与レジメン（３週間）下のトランスジェニックマウスにおけるヘマトクリット百分率の増加を示すグラフである。
【図３４】各種濃度のＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）又はＡｂ１２の単回投与と週１回投与レジメン下のトランスジェニックマウスにおけるヘマトクリット百分率の増加を比較したグラフである。
【図３５】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−３９０により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図３５Ａ（配列番号３８）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３５Ｂ（配列番号３９）は図３５Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図３５Ｃ（配列番号４０）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３５Ｄ（配列番号４１）は図３５Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３６】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−４１２により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図３６Ａ（配列番号４２）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３６Ｂ（配列番号４３）は図３６Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図３６Ｃ（配列番号４４）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３６Ｄ（配列番号４５）は図３６Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３７】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−４３０／４３２により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図３７Ａ（配列番号４６）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３７Ｂ（配列番号４７）は図３７Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図３７Ｃ（配列番号４８）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３７Ｄ（配列番号４９）は図３７Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３８】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−４６７により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図３８Ａ（配列番号５０）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３８Ｂ（配列番号５１）は図３８Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図３８Ｃ（配列番号５２）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３８Ｄ（配列番号５３）は図３８Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３９】本発明の細胞株ＡＢＴ２−ＳＣＸ−４８４により発現されるヒト抗ＥＰＯ−Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域ヌクレオチド及びアミノ酸配列の一覧であり、図３９Ａ（配列番号５４）は重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３９Ｂ（配列番号５５）は図３９Ａに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示し、図３９Ｃ（配列番号５６）は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を示し、図３９Ｄ（配列番号５７）は図３９Ｃに示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４０】本発明により作製された抗ＥＰＯｒｍＡｂの重鎖可変領域とその関連生殖細胞系列可変領域配列のアミノ酸配列アラインメントを示し、フレームワーク領域と相補性決定領域を同定する表である。
【図４１】本発明により作製された抗ＥＰＯｒｍＡｂの軽鎖可変領域とその関連生殖細胞系列可変領域配列のアミノ酸配列アラインメントを示し、フレームワーク領域と相補性決定領域を同定する表である。
【図４２−１】ヒト抗体Ａｂ３９０の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８６及び配列番号８７）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８８と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４２−２】ヒト抗体Ａｂ３９０の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８６及び配列番号８７）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８８と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４２−３】ヒト抗体Ａｂ３９０の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８６及び配列番号８７）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８８と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４２−４】ヒト抗体Ａｂ３９０の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８６及び配列番号８７）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号８８と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４３−１】ヒト抗体Ａｂ３９０の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８９及び配列番号９０）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９１を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４３−２】ヒト抗体Ａｂ３９０の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号８９及び配列番号９０）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９１を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４４−１】ヒト抗体Ａｂ４１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９２及び配列番号９３）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９４と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７６−２０１２である。
【図４４−２】ヒト抗体Ａｂ４１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９２及び配列番号９３）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９４と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７６−２０１２である。
【図４４−３】ヒト抗体Ａｂ４１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９２及び配列番号９３）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９４と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７６−２０１２である。
【図４４−４】ヒト抗体Ａｂ４１２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９２及び配列番号９３）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９４と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７６−２０１２である。
【図４５−１】ヒト抗体Ａｂ４１２の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９５及び配列番号９６）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９７を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４５−２】ヒト抗体Ａｂ４１２の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９５及び配列番号９６）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号９７を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４６−１】ヒト抗体Ａｂ４３２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９８及び配列番号９９）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１００と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４６−２】ヒト抗体Ａｂ４３２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９８及び配列番号９９）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１００と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である
【図４６−３】ヒト抗体Ａｂ４３２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９８及び配列番号９９）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１００と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である
【図４６−４】ヒト抗体Ａｂ４３２の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号９８及び配列番号９９）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１００と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である
【図４７−１】ヒト抗体Ａｂ４３０の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０１及び配列番号１０２）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０３を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４７−２】ヒト抗体Ａｂ４３０の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０１及び配列番号１０２）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０３を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４８−１】ヒト抗体Ａｂ４６７の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０４及び配列番号１０５）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０６と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４８−２】ヒト抗体Ａｂ４６７の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０４及び配列番号１０５）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０６と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４８−３】ヒト抗体Ａｂ４６７の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０４及び配列番号１０５）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０６と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４８−４】ヒト抗体Ａｂ４６７の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０４及び配列番号１０５）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０６と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−２００６である。
【図４９−１】ヒト抗体Ａｂ４６７の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０７及び配列番号１０８）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０９を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図４９−２】ヒト抗体Ａｂ４６７の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１０７及び配列番号１０８）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１０９を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図５０−１】ヒト抗体Ａｂ４８４の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１１０及び配列番号１１１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１１２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７０−２０１２である。
【図５０−２】ヒト抗体Ａｂ４８４の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１１０及び配列番号１１１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１１２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７０−２０１２である。
【図５０−３】ヒト抗体Ａｂ４８４の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１１０及び配列番号１１１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１１２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７０−２０１２である。
【図５０−４】ヒト抗体Ａｂ４８４の重鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１１０及び配列番号１１１）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１１２と配列番号７２〜７４を含む。可変鎖はヌクレオチド４６９までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４７０−４７５である。定常領域はヌクレオチド４７０−２０１２である。
【図５１−１】ヒト抗体Ａｂ４８４の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１１３及び配列番号１１４）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１１５を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【図５１−２】ヒト抗体Ａｂ４８４の軽鎖の単離精製ポリヌクレオチド（上段及び下段夫々配列番号１１３及び配列番号１１４）とアミノ酸配列を示す。アミノ酸配列は配列番号１１５を含む。可変鎖はヌクレオチド４６３までである。可変／定常結合領域（下線部）はヌクレオチド４６４−４６９である。定常領域はヌクレオチド４７０−７１８である。
【配列表】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４４−３】
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【図４４−４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６−１】
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【図４６−２】
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【図４６−３】
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【図４６−４】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４８−３】
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【図４８−４】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５０−３】
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【図５０−４】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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