(57)【要約】本発明は、ＰｏｌＩＩプロモーターおよび多リボザイム配列を含むベクターを用いて、例えばヘルペスウイルスの非存在下で、インフルエンザウイルスを調製するのに有用な組成物を提供する。
2006525815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のオルソミクソウイルスベクターを含む組成物であって、以下の：
ａ）転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから選択される少なくとも2つのベクターであって、少なくとも1つのベクターが、転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結されるウイルスｃＤＮＡに連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む少なくとも2つのベクター；ならびに
ｂ）インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから；そして任意に、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；またはインフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから選択される少なくとも2つのベクター
を含む組成物。
【請求項２】
複数のオルソミクソウイルスベクターを含む組成物であって、以下の：
ａ）転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるＮＢおよびＮＡに関するインフルエンザウイルスｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから選択される少なくとも2つのベクターであって、少なくとも1つのベクターが、転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結されるウイルスｃＤＮＡに連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む少なくとも2つのベクター；ならびに
ｂ）インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから；そして任意に、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；インフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから選択される少なくとも2つのベクター
を含む組成物。
【請求項３】
ＨＡがＡ型ＨＡである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
ＨＡがＢ型ＨＡである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
ａ）の複数のベクターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項６】
ａ）の全てのベクターがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項７】
ａ）の各々のベクターが別個のプラスミド上に存在する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項８】
ｂ）の各々のベクターが別個のプラスミド上に存在する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項９】
1つまたは複数のベクター（しかしａ）のベクターの全てではない）のプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＴ３プロモーターである、請求項１または２記載の組成物。
【請求項１０】
ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターがヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含まない１つまたは複数のベクターの転写終結配列がＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列またはリボザイムである、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
ｂ）のベクターの各々がＲＮＡ転写終結配列をさらに含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項１３】
転写終結配列に連結される３’オルソミクソウイルス非コード配列を含む３’オルソミクソウイルス配列に連結される当該ｃＤＮＡに連結される５’オルソミクソウイルス非コード配列を含む５’オルソミクソウイルス配列に連結されるプロモーターを含むベクターをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
当該ｃＤＮＡがセンス配向で存在する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
当該ｃＤＮＡがアンチセンス配向で存在する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結される３’オルソミクソウイルス非コード配列を含む３’オルソミクソウイルス配列に連結される当該ｃＤＮＡに連結される５’オルソミクソウイルス非コード配列を含む５’オルソミクソウイルス配列に連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むベクターをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
当該ｃＤＮＡが病原体の免疫原性ポリペプチドまたはペプチド、あるいは治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１３または１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
感染性インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物と細胞を接触させることを包含するインフルエンザウイルスの製造方法。
【請求項１９】
ウイルスを単離することをさらに包含する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の方法により得られるウイルス。
【請求項２１】
遺伝子送達ビヒクルの製造方法であって、インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の組成物と細胞を接触させ、そしてウイルスを単離することを包含する方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法により得られるウイルス。
【請求項２３】
請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物と接触される細胞。
【請求項２４】
請求項２０または２２記載のウイルスに感染される細胞。
【請求項２５】
二次リボザイム配列に連結されるインフルエンザウイルスｃＤＮＡに連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むベクターであって、インフルエンザウイルスｃＤＮＡがインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＭ１  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＭ２  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＮＳ２  ｃＤＮＡ、インフルエンザウイルスＢＭ２  ｃＤＮＡ、またはインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡであるベクター。
【請求項２６】
二次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列をさらに含む、請求項２５記載のベクター。
【請求項２７】
インフルエンザウイルスの製造方法であって、インフルエンザウイルスを産生するために、転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、および；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターであって、ウイルスｃＤＮＡを含む少なくとも1つのベクター中のプロモーターが転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結されるウイルスｃＤＮＡに連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むベクターと細胞を接触させることを包含する方法。
【請求項２８】
インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、および；インフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターをさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
インフルエンザウイルスの製造方法であって、転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるＮＢおよびＮＡに関するインフルエンザウイルスｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、および；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、および；インフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターであって、ウイルスｃＤＮＡを含む少なくとも1つのベクターが転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結されるウイルスｃＤＮＡに連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むベクターと細胞を接触させることを包含する方法。
【請求項３０】
インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭをコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＭ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；インフルエンザウイルスＢＭ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、および；インフルエンザウイルスＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターをさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
転写終結配列に連結される３’インフルエンザウイルス非コード配列を含む３’インフルエンザウイルス配列に連結される当該ｃＤＮＡまたはその断片に連結される５’インフルエンザウイルス非コード配列を含む５’インフルエンザウイルス配列に連結されるプロモーターを含むベクターをさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結される３’インフルエンザウイルス非コード配列を含む３’インフルエンザウイルス配列に連結される当該ｃＤＮＡまたはその断片に連結される５’インフルエンザウイルス非コード配列を含む５’インフルエンザウイルス配列に連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むベクターをさらに含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
当該ｃＤＮＡが病原体の免疫原性ポリペプチドまたはペプチド、あるいは治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
ＨＡがＡ型ＨＡである、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＨＡがＢ型ＨＡである、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ａ）の全てのベクターがＲＮＡ  ＰｏＩＩプロモーターを含む、請求項２７または２９記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスを単離することをさらに包含する、請求項２７〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２７〜３７のいずれか一項に記載の方法により得られるウイルス。
【請求項３９】
請求項３８記載のウイルスと接触される細胞。
【請求項４０】
請求項３８記載のウイルスに感染される細胞。
【請求項４１】
病原体に対して個体を免疫感作するための方法であって、個体を免疫感作するために有効な量の請求項３８記載のウイルスを個体に投与することを包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、米国特許出願第60/473,797（2003年5月28日提出）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）の出願日の35U.S.C.§ 119(e)下での利益を主張する。
政府権利の陳述
本発明は、アメリカ合衆国政府からの補助金を用いてなされた（国立アレルギーおよび感染性疾患研究所・公衆衛生総局からの補助金AI-47446）。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ネガティブ・センスＲＮＡウイルスは、一般的ヒト病原体、例えば呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルスおよびエボラウイルス、ならびに家禽および畜牛産業に及ぼす大きな経済的影響を有する動物ウイルス（例えばニューカッスル病ウイルスおよび牛疫ウイルス）を含む7つの科（ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブンヤウイルス科およびアレナウイルス科）に分類される。はじめの4つの科は非セグメント化ゲノムにより特性化され、一方、後者3つはそれぞれ6〜8、3または2つのネガティブ・センスＲＮＡセグメントから成るゲノムを有する。ネガティブ・センスＲＮＡウイルスの共通の特徴は、それらのＲＮＡゲノムの負極性である；即ちウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）はｍＲＮＡと相補的であり、したがってそれ自体感染性でない。ウイルス転写および複製を開始するために、ｖＲＮＡは、ウイルスポリメラーゼ複合体および核タンパク質により、それぞれプラスセンスｍＲＮＡまたはｃＲＮＡに転写されなければならない；Ａ型インフルエンザウイルスに関しては、ウイルスポリメラーゼ複合体は3つのポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡで構成される。ウイルス複製中、ｃＲＮＡは新しいｖＲＮＡ分子の合成のための鋳型として役立つ。全てのネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに関して、ｖＲＮＡおよびｃＲＮＡの５’および３’末端の両方の非コード領域は、ウイルスゲノムの転写および複製に重要である。細胞またはウイルスｍＲＮＡ転写体と違って、ｃＲＮＡおよびｖＲＮＡはともに、５’末端にキャップ形成されず、あるいはまさに３’末端でポリアデニル化されない。
【０００３】
多数のウイルスタンパク質の基本的機能は、生化学的におよび／またはウイルス感染の情況で解明されてきた。しかしながら逆遺伝学系は、それらのウイルス複製および病原性に関して、ならびに生弱毒化ウイルスワクチンに関して、ネガティブ鎖セグメント化および非セグメント化ＲＮＡウイルスについてのわれわれの知識を劇的に増大した。逆遺伝学は、当該用語が分子ウイルス学で用いられる場合、クローン化ｃＤＮＡ由来のゲノムを保有するウイルスの生成と定義される（再検討のためには、Neumann et al., 2002参照）。
【０００４】
ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスのウイルス複製を開始するためには、ｖＲＮＡ（単数または複数）またはｃＲＮＡ（単数または複数）は、ポリメラーゼ複合体および核タンパク質と同時発現されなければならない。狂犬病ウイルスは、クローン化ｃＤＮＡから完全に生成された最初の非セグメント化ネガティブ・センスＲＮＡであった：Schnell等（1994）は、全長ｃＲＮＡをコードするｃＤＮＡ構築物、ならびにＬ、ＰおよびＮタンパク質に関するタンパク質発現構築物（全てＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にある）の同時トランスフェクションにより、組換え狂犬病を生成した。Ｔ７ポリメラーゼを提供する組換えワクシニアウイルスによる感染は、感染性狂犬病ウイルスの生成を生じた。このＴ７ポリメラーゼ系では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの制御下の全長ｃＲＮＡの一次転写は、非キャップｃＲＮＡ転写体を生じた。しかしながら、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのための最適開始配列を構成する3つのグアニジンヌクレオチドは、５’末端に結合された。増殖感染サイクルに不可欠であるｃＲＮＡ転写体の確証的３’末端を作成するために、肝炎デルタリボザイム（ＨＤＶＲｚ）配列が、ｃＲＮＡ転写体の３’末端での的確な自己触媒的切断のために用いられた。
【０００５】
Schnell等（1994）による初期の報告以来、同様の技法を用いる逆遺伝学系は、多数の非セグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの生成をもたらした（Conzelmann, 1996; Conzelmann, 1998; Conzelmann et al., 1996; Marriott et al., 1999; Munoz et al., 2000; Nagai, 1999; Neumann et al., 2002; Roberts et al., 1998; Rose, 1996）。初めの救済手法は、安定的トランスフェクト化細胞株（Radecke et al., 1996）からの、またはタンパク質発現プラスミド（Lawson et al., 1995）からのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現を、あるいは救済効率を増大するための熱ショック手法（Parks et al., 1999）を包含した。Ｔ７ポリメラーゼ系を基礎にして、BridgenとElliott（1996）は、クローン化ｃＤＮＡからブンヤムウエラBunyamweraウイルス（ブンヤウイルス科）を作製し、Ｔ７ポリメラーゼ系によりセグメント化ネガティブ・センスＲＮＡウイルスを人工的に生成することの実現可能性を実証した。
【０００６】
1999年に、完全にクローン化ｃＤＮＡからのセグメント化Ａ型インフルエンザウイルスの生成のための細胞ＲＮＡポリメラーゼＩを基礎にして、プラスミドベースの逆遺伝学技法が創造された（Fodor et al., 1999; Neumann and Kawaoka, 1999）。核小体酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩは、インフルエンザウイルスＲＮＡと同様に５’キャップまたは３’ポリＡ構造を含有しないリボソームＲＮＡを合成する。ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーター配列が隣接するインフルエンザウイルスｃＤＮＡを含有する構築物のＲＮＡポリメラーゼＩ転写は、インフルエンザｖＲＮＡ合成を生じた（Fodor et al., 1999; Neumann and Kawaoka, 1999; Neumann and Kawaoka, 2001; Pekosz et al., 1999）。当該系は非常に効率的で、トランスフェクション後48時間に108個より多い感染性ウイルス粒子／プラスミドトランスフェクト化細胞の上清1 mlを産生した。しかしながらＲＮＡポリメラーゼＩの宿主細胞特異性は、ＲＮＡポリメラーゼＩ系の使用を制限する。例えばヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターのプロモーター配列は、異種ＲＮＡポリメラーゼＩ、例えばネズミＲＮＡポリメラーゼＩにより認識されない（Grummt et al., 1982; Learned et al., 1982）。
【０００７】
したがって必要とされるのは、完全にクローン化ｃＤＮＡからのセグメント化ネイティブ鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルソミクソウイルス、例えばＡ型インフルエンザウイルスを調製するための改良型方法である。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、以下の単離および／または精製ベクターのうちの少なくとも1つを提供する：転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；または転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＢＭ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターであって、この場合、ベクターは、転写終結配列に連結される二次（３’）リボザイム配列に連結されるウイルスｃＤＮＡに連結される一次（５’）リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。本発明の範囲内のリボザイムとしては、テトラヒメナリボザイム、ＲＮアーゼＰ、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎リボザイム、ならびに合成リボザイムが挙げられるが、これらに限定されない（例示的リボザイムに関しては、Kumar et al. (1995); Pley et al. (1994); Chowrira et al. (1994); Kijima et al. (1995)；ならびに米国特許第5,631,115号および第5,683,902号参照）。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むベクター中のリボザイム配列は、同一であるかまたは異なり得るし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む複数のベクターが用いられる場合、各ベクターは、任意のその他のベクターと比較して、同一のまたは異なるリボザイム配列を含み得る。同様に、一ベクター中のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、異なるベクター中のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと同一であるかまたは異なり得る。ｃＤＮＡは、プロモーターに対してセンスまたはアンチセンス配向であり得る。したがって本発明のベクターは、オルソミクソウイルスタンパク質（センス）またはｖＲＮＡ（アンチセンス）をコードし得る。任意の適切なプロモーターまたは転写終結配列を用いて、タンパク質、例えばウイルスタンパク質、非ウイルス性病原体のタンパク質または治療用タンパク質を発現し得る。
【０００９】
一実施形態では、ｖＲＮＡ産生のための1つまたは複数のベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。別の実施形態では、ｖＲＮＡ製造のための、1つまたは複数の（しかし全てというわけではない）ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター以外のプロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、例えばヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーターまたはＴ３プロモーター（これらに限定されない）を含む。存在する場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むｖＲＮＡに関するベクター中の転写終結配列は、好ましくは３’リボザイム配列に対して３’であるＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列である。ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターを含まないｖＲＮＡベクターに関する好ましい転写終結配列としては、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列またはリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはベクターは、インフルエンザｃＤＮＡ、例えばＡ型（例えば任意のＡ型インフルエンザ遺伝子、例えば１５ＨＡまたは９ＮＡ亜型のいずれか）、ＢまたはＣ型インフルエンザＤＮＡを含む（Chapters 45 and 46 of Fields Virology (Fields et al. (eds.)), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia, PA(1996)参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）が、しかし任意のウイルスの遺伝子（単数または複数）が本発明のベクターまたは方法に用いられ得る、と予見される。
【００１０】
本発明は、本発明の複数のオルソミクソウイルスベクターを含む組成物を提供する。本発明の一実施形態では、組成物は：ａ）転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター、または；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから選択される少なくとも2つのベクターであって、少なくとも1つのベクターが、転写終結配列に対して５’である二次リボザイム配列に対して５’であるウイルスコード配列に対応する配列に対して５’である一次リボザイム配列に対して５’であるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む少なくとも2つのベクター；ならびにｂ）インフルエンザウイルスＰＡをコードするベクター；インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするベクター；インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするベクター、および；インフルエンザウイルスＮＰをコードするベクターからから選択される少なくとも2つのベクターを含む。任意に、ｂ）のベクターは、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ、例えばＭ１およびＭ２、ＨＡまたはＮＡをコードする1つまたは複数のベクターを含む。
【００１１】
別の実施形態では、組成物は：ａ）転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ１  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＰＢ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＨＡ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＰ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＭ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＮＳ  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクター；および転写終結配列に連結されるインフルエンザウイルスＢＭ２  ｃＤＮＡに操作可能的に連結されるプロモーターを含むベクターから選択される少なくとも2つのベクターであって、少なくとも1つのベクターが、転写終結配列に対して５’である二次リボザイム配列に対して５’であるウイルスコード配列を含むウイルス配列に対応する配列に対して５’である一次リボザイム配列に対して５’であるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む少なくとも2つのベクター；ならびにｂ）インフルエンザウイルスＰＡをコードするベクター；インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするベクター；インフルエンザウイルスＰＢ２をコードするベクター、および；インフルエンザウイルスＮＰをコードするベクターからから選択される少なくとも2つのベクターを含む。任意に、ｂ）のベクターは、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ、ＨＡまたはＮＡをコードする1つまたは複数のベクターを含む。
【００１２】
好ましくはウイルスタンパク質をコードするベクターは、転写終結配列をさらに含む。インフルエンザウイルスｃＤＮＡを含むベクターに関するプロモーターとしては、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターが挙げられるが、しかしながらｖＲＮＡに関する少なくとも1つのベクターはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む、というのが好ましい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含むｖＲＮＡに関するベクターは、リボザイム配列、ならびに任意に３’リボザイム配列に対して３’であるＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列が隣接するウイルスコード配列を含む。一実施形態では、ｖＲＮＡ産生のための1つまたは複数の（しかし全てというわけではない）ベクターは、転写終結配列、例えばＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列またはリボザイムを含む。一実施形態では、ｖＲＮＡ産生のための少なくとも2つの、好ましくはそれ以上の、例えば3、4、5、6、7または8つのベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、一次リボザイム配列（これは、転写終結配列に対して５’である二次リボザイム配列に対して５’であるウイルスコード配列を含むウイルス配列に対応する配列に対して５’である）を含む。各ｖＲＮＡベクター中の各ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、任意のその他のｖＲＮＡベクター中のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと同一であるかまたは異なり得る。同様に、各ｖＲＮＡベクター中の各リボザイム配列は、任意のその他のｖＲＮＡベクター中のリボザイム配列と同一であるかまたは異なり得る。一実施形態では、単一ベクター中のリボザイム配列は同一ではない。好ましくはベクターは、インフルエンザＤＮＡ、例えばＡ、ＢまたはＣ型インフルエンザＤＮＡを含む。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、転写終結配列に連結される３’オルソミクソウイルスコード配列またはその一部分を任意に含む３’オルソミクソウイルス配列に連結される所望の核酸配列、例えば所望のｃＤＮＡに連結される５’オルソミクソウイルスコード配列またはその一部分を任意に含む５’オルソミクソウイルス配列に連結されるプロモーターを含むベクターをさらに含む上記のような本発明の組成物を含む。好ましくは所望の核酸配列、例えばｃＤＮＡは、アンチセンス配向で存在する。オルソミクソウイルス複製に対して許容的な宿主細胞中へのこのような組成物の導入は、３’オルソミクソウイルスコード配列またはその一部分を任意に含む３’オルソミクソウイルス配列に連結されるｃＤＮＡに連結される５’オルソミクソウイルスコード配列またはその一部分を任意に含む５’オルソミクソウイルス配列を含むベクターの配列に対応するｖＲＮＡを含む組換えウイルスを生じる。ｖＲＮＡ産生のためのこのようなベクター中のプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターであり得るし、任意にベクターは、転写終結配列、例えばＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列またはＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写終結配列またはリボザイムを含む。一実施形態では、所望のｃＤＮＡ（当該ｃＤＮＡ）を含むベクターは、転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結される当該ｃＤＮＡに連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。別の実施形態では、ベクターは、転写終結配列に連結される二次リボザイム配列に連結される３’オルソミクソウイルスコード配列またはその一部分を任意に含む３’オルソミクソウイルス配列に連結される当該ｃＤＮＡに連結される５’オルソミクソウイルスコード配列またはその一部分を任意に含む５’オルソミクソウイルス配列に連結される一次リボザイム配列に連結されるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを含む。別の実施形態では、当該ｃＤＮＡは、タンパク質発現のためのベクター中に存在し得る。当該ｃＤＮＡは、ｖＲＮＡのためのベクター中であれ、タンパク質産生のためのベクター中であれ、免疫原性エピトープ、例えば癌療法またはワクチン、あるいは遺伝子療法に有用なエピトープをコードし得る。
【００１４】
本発明の複数のベクターは物理的に連結され得るし、あるいは各ベクターは、個々のプラスミド上にまたはその他のもの、例えば線状核酸送達ビヒクル上に存在し得る。
【００１５】
本発明は、インフルエンザウイルスの製造方法も提供する。本方法は、本発明の複数のベクターと細胞を、例えば逐次的にまたは同時に、例えば感染性インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で本発明の組成物を用いて、接触させることを包含する。本発明は、組成物と接触させられた細胞からウイルスを単離することも包含する。したがって本発明はさらに、単離ウイルス、ならびに本発明の組成物またはウイルスと接触された宿主細胞を提供する。別の実施態様では、本発明は、他のベクター（ｖＲＮＡまたはタンパク質産生ベクター）の前に、１つまたは複数のベクター（ｖＲＮＡまたはタンパク質産生ベクター）と細胞を接触させることを包含する。
【００１６】
本明細書中で下記に説明するように、完全にクローン化ｃＤＮＡからＡ型インフルエンザウイルスを調製した。さらに同一アプローチは、完全にクローン化ｃＤＮＡから、非セグメント化ネイティブ鎖ＲＮＡウイルス（即ちパラミクソウイルス科、ラブドウイルス科およびフィロウイルス科）またはその他のネイティブ鎖ＲＮＡウイルス、例えばアレナウイルス科およびブンヤウイルス科を生成するために他のウイルスに対して用いられ得る。
【００１７】
本発明の方法は、例えばウイルスゲノム中への弱毒性突然変異の導入により、インフルエンザウイルスの容易な操作を可能にする。さらに、インフルエンザウイルスは強力な体液性および細胞性免疫を誘導するため、本発明は、特に逐次的に用いられて遺伝子療法のための反復使用を可能にするウイルスの天然変異体の利用可能性に鑑みて、ワクチンベクターとしてこれらのウイルスを大いに強化する。
【００１８】
したがって本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質を発現するかまたはコードする、あるいはネイティブおよび組換えｖＲＮＡの療法のインフルエンザｖＲＮＡを発現するかまたはコードする単離および精製ベクターまたはプラスミドを提供する。したがって本発明のベクターまたはプラスミドは、当該遺伝子またはオープンリーディングフレーム、例えばワクチンとして有用な免疫原性ペプチドまたはタンパク質をコードする異種遺伝子を含み得る。好ましくはインフルエンザｖＲＮＡを発現するベクターまたはプラスミドは、特定の宿主細胞、例えば鳥類または哺乳類宿主細胞、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジまたは霊長類細胞、例えばヒト細胞中での発現のために、あるいは好ましくは1つより多くの宿主中での発現のために適しているプロモーターを含む。さらにまた好ましくは、インフルエンザｖＲＮＡを調製するのに有用なＤＮＡを含む1つまたは複数のベクターまたはプラスミドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列を含む。当該遺伝子またはオープンリーディングフレームを含むベクターまたはプラスミドに関しては、遺伝子またはオープンリーディングフレームは５’および３’インフルエンザウイルス配列、例えばインフルエンザウイルスのそれぞれ５’および３’非コード配列に隣接されること、そして一実施形態では、５’および３’インフルエンザウイルス配列に隣接される遺伝子またはオープンリーディングフレームはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列と操作可能的に連結されることが好ましい。ウイルスを調製する場合、遺伝子またはオープンリーディングフレームを含むベクターまたはプラスミドは、インフルエンザウイルス遺伝子をあるベクターまたはプラスミドに置換し得るし、あるいは全てのインフルエンザウイルス遺伝子に関するベクターまたはプラスミドに加えて、存在し得る。
【００１９】
ヘルパーウイルス感染を必要としない本明細書中に記載したウイルスの製造方法は、ウイルス突然変異誘発研究において、そしてワクチン（例えばＡＩＤＳ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペスならびに手足口病のための）、ならびに遺伝子療法ベクター（例えば癌、ＡＩＤＳ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損および中枢神経系腫瘍のための）の製造において有用である。したがって医学療法（例えばワクチンまたは遺伝子療法）に用いるためのウイルスが提供される。
【００２０】
本発明は、病原体、例えば細菌、ウイルスまたは寄生生物、あるいは悪性腫瘍に対して個体を免疫感作するための方法も提供する。本方法は、個体を免疫監査するのに有効な量の少なくとも1つの本発明の単離ウイルスを、任意にアジュバントと組合せて、個体に投与することを包含する。ウイルスは、病原体によりコードされるポリペプチドまたは腫瘍特異的ポリペプチドを含むｖＲＮＡを含む。
【００２１】
内因性タンパク質の量の低減または欠如により特性化される適応症または疾患を有する哺乳類における内因性タンパク質の発現を増強または増大するための方法も提供される。本方法は、哺乳類における内因性タンパク質の量を増強または増大するのに有効な量の本発明の単離ウイルスを哺乳類に投与することを包含する。好ましくは哺乳類はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる場合、「単離されたおよび／または精製された」という用語は、それがin vivo物質に関連しない、あるいは実質的にin vitro物質から精製されるような本発明のベクター、プラスミドまたはウイルスのin vitro調製、単離および／または精製を指す。単離ウイルス調製物は一般にin vitro培養および増殖により得られ、そして他の感染性作因を実質的に含有しない。本明細書中で用いる場合、「実質的に含有しない」とは、その作因に関して、標準検出方法を用いた特定の感染性作因に関する検出レベルより低いことを意味する。「組換え体」ウイルスは、ウイルスゲノムに変更を導入するために、例えば組換えＤＮＡ技術を用いてin vitroで操作されたものである。本明細書中で用いる場合、「組換え核酸」または「組換えＤＮＡ配列またはセグメント」という用語は、その配列が天然に存在しないか、あるいは天然ゲノム中にそれらが位置するように位置されない天然配列に対応するよう、供給源から得られるかまたは単離され、その後、in vitroで化学的に変更され得る核酸、例えばＤＮＡを指す。供給源から「得られる」ＤＮＡの一例は、有用な断片として同定されるＤＮＡ配列であり、これはその後、本質的に純粋形態で化学的に合成される。供給源から「単離される」このようなＤＮＡの一例は、それが、遺伝子工学処理の方法により、本発明で用いるためにさらに操作され、例えば増幅され得るよう、化学的手段により、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用により、上記供給源から切断されるかまたは除去される有用なＤＮＡ配列である。
【００２３】
インフルエンザウイルス複製
Ａ型インフルエンザウイルスは、10個のタンパク質の全体をコードする8つの一本鎖ネガティブ・センスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のゲノムを保有する。インフルエンザウイルス生活環は、宿主細胞の表面のシアル酸含有受容体へのヘマグルチニン（ＨＡ）の結合と、その後の受容体媒介性エンドサイトーシスにより開始する。後期エンドソーム中の低ｐＨがＨＡの立体配座シフトを誘発し、それによりＨＡ２サブユニット（いわゆる融合ペプチド）のＮ末端を曝露する。融合ペプチドは、ウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、そしてマトリックスタンパク質（Ｍ１）およびＲＮＰ複合体が細胞質中に放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをキャプシド形成する核タンパク質（ＮＰ）ならびにＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２タンパク質により形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。ＲＮＰは核中に輸送され、ここで転写および複製が起こる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、3つの異なる反応を触媒する：５’キャップおよび３’ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、全長相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、ならびに鋳型としてｃＤＮＡを用いたゲノムｖＲＮＡの合成。新規に合成されたｖＲＮＡ、ＮＰおよびポリメラーゼタンパク質は次に、ＲＮＰに集合され、核から輸出され、そして形質膜に輸送され、ここで子孫ウイルス粒子の出芽が起こる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去し、したがって細胞表面から新規集合ビリオンを放出して、ウイルス粒子の自己凝集を防止することにより、感染において後期に重要な役割を演じる。ウイルス集合体はタンパク質−タンパク質およびタンパク質−ｖＲＮＡ相互作用を包含するが、しかしこれらの相互作用の性質はほとんど未知である。
【００２４】
ＢおよびＣ型インフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザウイルスと構造的および機能的に類似するが、しかしいくつかの差異が存在する。例えばＢ型インフルエンザウイルスは、イオンチャンネル活性を有するＭ２タンパク質を有さない。同様にＣ型インフルエンザウイルスは、イオンチャンネル活性を有するＭ２タンパク質を有さない。しかしながらＣＭ１タンパク質はこの活性を有すると思われる。イオンチャンネルタンパク質の活性は、当該技術分野で周知の方法により測定され得る（例えばHolsinger et al. (1994)およびWO 01/79273参照）。
【００２５】
トゴトウイルス
トゴトウイルス（ＴＨＯＶ）は、オルソミクソウイルスの科における新規の属を表す。それらはマダニにより伝播され、そして家畜、例えばラクダ、ヤギおよび畜牛中で見出されている。その結果として、ＴＨＯＶはマダニおよび脊椎動物細胞中で複製し得る。ＴＨＯＶゲノムは、一本鎖ネガティブ・センスＲＮＡの6つのセグメントを含む。3つの最大セグメントによりコードされるタンパク質は、インフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡとの有意の相同性を示す。セグメント５は、インフルエンザウイルスＮＰに関連したタンパク質をコードする。セグメント４によりコードされるＴＨＯＶ糖タンパク質はインフルエンザウイルスＨＡまたはＮＡと相同でないが、しかしそれはバキュロウイルス糖タンパク質との配列類似性を示す。最小セグメントはマトリックスタンパク質をコードすると考えられ、インフルエンザウイルスタンパク質のいずれとも類似しない。インフルエンザウイルスと同様に、ｖＲＮＡの３’および５’末端はともに、プロモーター活性のために必要とされ、そしてこの活性は、それぞれｖＲＮＡの３’および５’末端の末端部１４および１５ヌクレオチドで突き止められる。
【００２６】
ＴＨＯＶのｍＲＮＡ合成は、宿主細胞由来キャップ構造により起動される。しかしながらインフルエンザウイルスと対照して、キャップ構造のみが（付加的ヌクレオチドを伴わずに）、細胞ｍＲＮＡから切断される（Albo et al., 1996; Leahy et al., 1997; Weber et al., 1996）。ｖＲＮＡの５’および３’末端はともに、エンドヌクレアーゼ活性のために必要である（Leahy et al., 1998）が、しかしインフルエンザウイルスに関して示されているように（Cianci et al., 1995; Hagen et al., 1994）、モデルｃＲＮＡプロモーターの付加はエンドヌクレアーゼ活性を刺激しない（Leahy et al., 1998）、ということをin vitro切断検定は明示した。「フック」構造がＴＨＯＶに関して提唱されており（Leahy et al., 1997; Weber et al., 1997）、これはインフルエンザウイルスに関して提唱された栓抜き構造に類似する（Flick et al., 1996）。しかしながらこの「フック」構造は、ＴＨＯＶ  ｖＲＮＡプロモーター中に見出されるのみである。ｃＲプロモーター配列は、ｃＲＮＡの５’末端の位置２および９、ならびに３および８間の塩基対の形成を可能にしない。これらのヌクレオチド間の塩基対合を可能にするための位置３または８での変更は、エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、これは提唱された「フック」構造を強力に支持する証拠である（Leahy et al., 1998）。さらにこの構造は、ＴＨＯＶ生活環の調節のために重要である；「フック」構造を構成するｖＲＮＡプロモーターは、ＰＢ２エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、それにより転写を可能にする。これに対してｃＲＮＡプロモーターは「フック」構造を構成せず、したがってエンドヌクレアーゼ活性を刺激し得ず、このようにして複製を生じる。
【００２７】
ブンヤウイルス科
ブンヤウイルス科は、ヒトにおいて出血性または脳炎熱（例えばリフトバレー熱、ハンターン熱、ラ・クロス熱およびクリミア・コンゴ出血熱）を引き起こすいくつかのウイルスを包含する。球状、有エンベロープビリオンは、一本鎖ネガティブ・センスＲＮＡの3つのセグメントを含有する（Elliott, 1997で再検討）。最大セグメント（Ｌ）はウイルスＲＮＡポリメラーゼタンパク質（Ｌタンパク質）をコードし、一方、Ｍセグメントは2つのウイルス糖タンパク質Ｇ１およびＧ２、ならびに非構造タンパク質（ＮＳｍ）をコードする。最小セグメント（Ｓ）は、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）および二次非構造タンパク質（ＮＳｓ）をコードする。ウイルス複製および転写は細胞質中で起こり、そして新規集合ビリオンはゴルジ装置の膜を通して出芽する。
【００２８】
Bridgen & Elliott (1996)は、完全にクローン化ｃＤＮＡから感染性ブンヤムウエラウイルスを生成するための逆遺伝学系を確立した。彼等は、狂犬病ウイルスに関してSchnell等（1994）により最初に記載された戦略に従った：ウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質を発現する細胞中でのポジティブ・センス抗ゲノムＲＮＡをコードする（ししかしネガティブ・センスゲノムＲＮＡをコードしない）ｃＤＮＡの細胞内転写。Bridgen & Elliott (1996)は、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスをＨｅＬａＴ４＋細胞に感染させ、そしてこれらの細胞に、Ｓ、ＭおよびＬセグメントによりコードされるタンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトした。次に彼等は、これらの細胞に、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターおよびデルタ肝炎ウイルスリボザイムに隣接される全長抗ゲノムｃＤＮＡをコードする3つのプラスミドをトランスフェクトした。ワクシニアウイルス粒子の数に比してブンヤウイルス粒子の数を増大するために、著者等は、ブンヤムウエラは複製するが、しかしワクシニアウイルスは複製しない蚊細胞を用いた。このプロトコールは、ブンヤウイルスを遺伝子工学処理するためだけでなく、異なるブンヤウイルス株を細胞に同時感染させることによっては容易に得られない再集合株ウイルスを生成するためにも用いられ得る。
【００２９】
転写および複製のために必要とされるブンヤウイルスプロモーター素子およびウイルスタンパク質を試験するために、Dunn等（1995）は、ブンヤムウエラＳ  ＲＮＡセグメントの５’および３’非翻訳領域間にネガティブ・センス配向でＣＡＴ遺伝子をクローン化した。細胞は、ＬおよびＳセグメントによりコードされるタンパク質を発現する構築物でトランスフェクトされ、次にin vitro転写ＲＮＡでトランスフェクトされ、これがＣＡＴ活性を生じた。ブンヤウイルスＳセグメントは、重複リーディングフレーム中の2つのタンパク質ＮおよびＮＳｓをコードする。これらのタンパク質がともに転写および複製に必要とされるか否かを確定するために、ＮまたはＮＳｓのみを発現する構築物が、ＣＡＴ活性に関して試験された。Ｎタンパク質発現は、Ｌタンパク質と一緒にＣＡＴ活性を生じ、一方、ＮＳｓ発現構築物に関してはＣＡＴ活性は検出されなかった。したがってＬおよびＮタンパク質は、ブンヤウイルス様ＲＮＡの転写および複製に十分である。
【００３０】
インフルエンザウイルスを用いる場合と同様に、ブンヤウイルスＲＮＡの末端配列は、相補的であり、且つ高度に保存される。したがって、これらの配列素子はブンヤウイルスプロモーターを限定し、そしてプロモーター活性に重要である、と推定される。ウイルスＲＮＡの３’末端の5つのヌクレオチドの欠失は、ＣＡＴ発現を徹底的に低減する（Dunn et al., 1995）。したがってインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体と同様、ブンヤウイルスポリメラーゼタンパク質は明らかに、内部的に転写および／または複製を開始し得る。
【００３１】
本発明に用いられ得る細胞株およびインフルエンザウイルス
本発明によれば、インフルエンザウイルスの効率的複製を支持する任意の細胞、例えばインフルエンザウイルスの受容体である1つまたは複数のシアル酸のレベル低減または減少を発現する突然変異体細胞が本発明で用いられ得る。本方法により得られるウイルスは、再集合株ウイルスに作製され得る。
【００３２】
好ましくは細胞は、ＷＨＯ認証または認証可能連続細胞株である。このような細胞株を認証するための要件としては、系統、増殖特性、免疫学的マーカー、ウイルス感受性、腫瘍形成能および貯蔵条件のうちの少なくとも1つに関する、ならびに動物、卵および細胞培養を試験することによる特性化が挙げられる。このような特性化は、細胞が検出可能な外因性作用物質を含有しないことを確証するために用いられる。いくつかの国では、核学も必要とされ得る。さらに腫瘍形成能は、好ましくは、ワクチン製造のために用いられるものと同一継代レベルである細胞で試験される。ウイルスは好ましくは、ワクチン製造のために不活性化または弱毒化される前に、一貫した結果を生じることが示された方法により精製される（例えばWorld Health Organization, 1982参照）。
【００３３】
最終生成物の純度に関する適切な試験が含まれ得るよう、用いられるべき細胞株の完全特性化を確立することが好ましい。本発明に用いられるべき細胞の特性化のために用いられ得るデータとしては、（ａ）その起源、誘導および継代歴に関する情報；（ｂ）その増殖および形態学的特質に関する情報；（ｃ）外因性作用物質の試験の結果；（ｄ）細胞を他の細胞株の間で明らかに認識させる生化学的、免疫学的および細胞遺伝学的パターンといった特徴の識別；ならびに（ｅ）腫瘍形成能に関する試験の結果が挙げられる。用いられる宿主細胞の継代レベル、または集団倍加は、できるだけ低いのが好ましい。
【００３４】
細胞中で産生されるウイルスは、ワクチンまたは遺伝子療法処方前に高度に精製されるのが好ましい。一般に精製手法は、細胞ＤＮＡ、その他の細胞構成成分および外因性作用物質の広範な除去を生じる。ＤＮＡを広範に分解するかまたは変性する手法も用いられ得る（例えばMizrahi, 1990参照）。
【００３５】
ワクチン
本発明のワクチンは、免疫原性タンパク質、例えば任意の病原体の糖タンパク質、例えば1つまたは複数の細菌、ウイルス、酵母または真菌からの免疫原性タンパク質を含み得る。したがって一実施形態では、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスまたはその他のウイルス性病原体、例えばレンチウイルス、例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、例えばＣＭＶまたはＨＳＶ、あるいは手足口病ウイルス（これらに限定されない）のためのワクチンベクターであり得る。
【００３６】
完全ビリオンワクチンは限外濾過により濃縮され、次にゾーン遠心分離により、またはクロマトグラフィーにより精製される。それは、例えばホルマリンまたはβ−プロピオラクトンを用いて、精製の前または後に不活性化される。
【００３７】
サブユニットワクチンは、精製糖タンパク質を含む。このようなワクチンは、以下のように調製され得る：洗剤を用いた処理により断片化されたウイルス懸濁液を用いて、例えば超遠心分離により、表面抗原が精製される。したがってサブユニットワクチンは、主としてＨＡタンパク質を、そしてＮＡも含有する。用いられる洗剤は、例えば陽イオン性洗剤、例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（Bachmeyer, 1975）、陰イオン性洗剤、例えばデオキシコール酸アンモニウム（Laver & Webster, 1976; Webster et al., 1977）、または非イオン性洗剤、例えばトリトンＸ100の名称で市販されているものであり得る。ヘマグルチニンも、プロテアーゼ、例えばブロメリンでビリオンを処理後に単離され、次に、Grand and Skehel (1972)により記載されたような方法により精製され得る。
【００３８】
スプリット・ワクチンは、脂質を溶解する作用物質による処理に付されたビリオンを含む。スプリット・ワクチンは、以下のように調製され得る：（不活性化された場合またはされない場合の）上記のようにして得られた精製ウイルスの水性懸濁液は、洗剤と会合される脂質溶媒、例えばエチルエーテルまたはクロロホルムにより、撹拌下で、処理される。ウイルスエンベロープ脂質の溶解は、ウイルス粒子の断片化を生じる。主にヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼからなるスプリットワクチンを含有し、除去されたそれらの元の脂質環境ならびにコアまたはその分解産物を伴う水性相が回復される。次に、これがすでに実行されていない場合、残留感染性粒子が不活性化される。
【００３９】
不活性化ワクチン。  本発明の不活性化インフルエンザウイルスワクチンは、既知の方法、例えばホルマリンまたはβ−プロピオラクトン処理（これらに限定されない）を用いて、本発明の複製ウイルスを不活性化することにより提供される。本発明に用いられ得る不活性化ワクチン型は、全ウイルス（ＷＶ）ワクチンまたはサブビリオン（ＳＶ）（スプリット）ワクチンを包含し得る。ＷＶワクチンは、無傷の不活性化ウイルスを含有し、一方、ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化し、その後、残留ウイルスを化学的に不活性化する洗剤で崩壊された精製ウイルスを含有する。
【００４０】
さらに、用いられ得るワクチンとしては、表面抗原またはサブユニットワクチンと呼ばれる単離ＨＡおよびＮＡ表面タンパク質を含有するものが挙げられる。概して、ＳＶおよび表面抗原（即ち精製ＨＡまたはＮＡ）ワクチンに対する応答は類似する。流行病ウイルスに免疫学的に関連するＮＡ抗原および非関連ＨＡを含有する実験的不活性化ＷＶワクチンは、慣用的ワクチンより低有効性であると思われる（Ogra et al., 1977）。両関連表面抗原を含有する不活性化ワクチンが好ましい。
【００４１】
生弱毒化ウイルスワクチン。  生弱毒化インフルエンザウイルスワクチンも、既知の方法過程に従って、インフルエンザウイルス感染を予防または治療するために用いられ得る。弱毒化は好ましくは、既知の方法に従って、複製単離物または再集合ウイルスに弱毒化供与体から弱毒化遺伝子を移入することにより、単一段階で達成される（例えばMurphy, 1993参照）。Ａ型インフルエンザウイルスに対する耐性は、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質に対する免疫応答の発現により媒介されるため、これらの表面抗原をコードする遺伝子は再集合ウイルスまたは高増殖臨床単離株から得られなければならない。弱毒化遺伝子は、弱毒化親に由来する。このアプローチでは、弱毒化を付与する遺伝子は、好ましくはＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードしない。別の情況では、これらの遺伝子は、臨床ウイルス単離株の表面抗原を保有する再集合株に移入され得ない。
【００４２】
多数の供与体ウイルスは、インフルエンザウイルスを再現可能的に弱毒化するそれらの能力に関して評価された。非限定例として、Ａ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ（ＡＡ）／６／６０（Ｈ２Ｎ２）寒冷順応（ｃａ）供与体ウイルスは、弱毒化ワクチン製造のために用いられ得る（例えばEdwards, 1994; Murphy, 1993参照）。さらに生弱毒化再集合株ウイルスワクチンは、ｃａ供与体ウイルスを本発明の有毒複製ウイルスと交配することにより生成され得る。次に、弱毒化Ａ／ＡＡ／６／６０（Ｈ２Ｎ２）ｃａ供与体ウイルスの表面抗原を保有するウイルスの複製を抑制するＨ２Ｎ２抗血清の存在下で、再集合株子孫が25℃で（有毒ウイルスの複製に限定的）選択される。
【００４３】
大型シリーズのＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２再集合株がヒトにおいて評価され、申し分なく：（ａ）感染性、（ｂ）血清陰性小児および免疫学的に感作された成人に対して弱毒化され、（ｃ）免疫原性、ならびに（ｄ）遺伝子安定性であることが判明した。ｃａ再集合株の免疫原性は、それらの複製レベルと平行する。したがって新規の野生型ウイルスによるｃａ供与体ウイルスの6つの移入可能遺伝子の獲得は、感染しやすい成人および小児にワクチン接種するのに用いるために、これらのウイルスを再現可能的に弱毒化した。
【００４４】
その他の弱毒性突然変異は、これらの突然変異体遺伝子を保有する感染性ウイルスを救済するための部位特異的突然変異誘発によりインフルエンザウイルス遺伝子中に導入され得る。弱毒性突然変異は、ゲノムの非コード領域に、ならびにコード領域に導入され得る。このような弱毒性突然変異は、ＨＡまたはＮＡ以外の遺伝子、例えばＰＢ２ポリメラーゼ遺伝子中にも導入され得る（Subbarao et al., 1993）。したがって部位特異的突然変異誘発により導入された弱毒性突然変異を保有する新規の供与体ウイルスも生成され、そしてこのような新規の供与体ウイルスは、Ａ／ＡＡ／６／６０ｃａ供与体ウイルスに関して上記されたものと同様の方法で、生弱毒化再集合株Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ワクチン候補の低減に用いられ得る。同様に、その他の既知のならびに適切な弱毒化供与体株は、本発明のインフルエンザウイルスと再集合されて、哺乳類のワクチン接種に用いるのに適した弱毒化ワクチンを生成し得る（Ewami et al., 1990; Muster et al., 1991; Subbarao et al., 1993）。
【００４５】
このような弱毒化ウイルスは、元の臨床単離株のものと実質的に同様の抗原決定基をコードするウイルスからの遺伝子を保持するのが好ましい。これは、弱毒化ワクチンの目的が、ワクチン接種哺乳類における重篤な病原性状態を誘導する最小変化をワクチンが引き起こす程度に感染性を同時に欠きながら、ウイルスの元の臨床単離株と実質的に同一の抗原性を提供することであるためである。
【００４６】
したがってウイルスは、動物、例えば哺乳類における免疫応答を誘導するためのワクチンとして、既知の方法に従って、弱毒化されるかまたは不活性化され、処方され、そして投与され得る。このような弱毒化または不活性化ワクチンが臨床的単離株またはそれに由来する高増殖株のものと類似の抗原性を保持したか否かを確定するための方法が、当該技術分野で周知である。このような既知の方法としては、供与体ウイルスの抗原決定基を発現するウイルスを排除するための抗血清または抗体の使用；化学的選択（例えばアマンタジンまたはリマンチジン）；ＨＡおよびＮＡ抗体活性および抑制；ならびに抗原決定基をコードする供与体遺伝子（例えばＨＡまたはＮＡ遺伝子）が弱毒化ウイルス中に存在しないことを確証するためのＤＮＡスクリーニング（例えばプローブハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ）が挙げられる（例えばRobertson et al., 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry et al., 1985; Robertson et al., 1992参照）。
【００４７】
医薬組成物
接種に、あるいは非経口または経口投与に適した本発明の製剤組成物は、弱毒化または不活性化インフルエンザウイルスを含み、任意に滅菌水性または非水性溶液、懸濁液および乳濁液をさらに含む。組成物は、当該技術分野で既知のような助剤または賦形剤をさらに含み得る（例えばBerkow et al., 1987; Goodman et al., 1990; Avery’s Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992参照）。本発明の組成物は一般に、個々の用量（単位用量）の形態で存在する。
【００４８】
慣用的ワクチンは、一般にそれらの組成物中に入り込む株の各々からの約0.1〜200 μg、好ましくは10〜15 μgのヘマグルチニンを含有する。本発明のワクチン組成物の主要構成成分を構成するワクチンは、Ａ、ＢまたはＣ型のウイルス、あるいはそれらの任意の組合せ、例えば3つの型のうちの少なくとも2つ、異なる亜型のうちの少なくとも2つ、同一型のうちの少なくとも2つ、同一亜型のうちの少なくとも2つ、あるいは異なる単離株（単数または複数）または再集合株（単数または複数）を含み得る。ヒトＡ型インフルエンザウイルスとしては、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２亜型が挙げられる。
【００４９】
非経口投与のための調製物としては、当該技術分野で既知の助剤または賦形剤を含有し得る滅菌水性または非水性溶液、懸濁液および／または乳濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。担体または閉鎖包帯は、皮膚浸透性を増大し、抗原吸収を増強するために用いられ得る。経口投与のための液体剤形は一般に、液体剤形を含有するリポソーム溶液を含む。リポソームを懸濁するための適切な形態としては、当該技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳濁液、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシルが挙げられる。不活性希釈剤のほかに、このような組成物は、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、あるいは甘味剤、風味剤または香料も包含し得る（例えばBerkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery’s, 1987; Osol, 1980;およびKatzung, 1992参照）。
【００５０】
本発明の組成物が個体への投与のために用いられる場合、それはさらに、塩、緩衝剤、アジュバントまたは組成物の効力を改善するために望ましいその他の物質を含み得る。ワクチンのために、アジュバント、即ち特定の免疫応答を増大し得る物質が用いられ得る。普通は、アジュバントおよび組成物は、免疫系への提示前に混合され、あるいは別個に、しかし免疫感作されている生物体の同一部位に提示される。ワクチン組成物に用いるのに適した物質の例は、Osol (1980)に提示されている。
【００５１】
ワクチンの不均質性は、その中の2〜50株または任意の範囲または値のような少なくとも2つのインフルエンザウイルス株に関する複製インフルエンザウイルスを混合することにより提供され得る。現代の抗原性組成物を有するＡ型またはＢ型インフルエンザウイルス株が好ましい。本発明によれば、ワクチンは、当該技術分野で既知の技法を用いて、インフルエンザウイルスの単一株における変異のために提供され得る。
【００５２】
本発明の製剤組成物は、さらにまたは付加的に、例えば遺伝子療法、免疫抑制剤、抗炎症剤または免疫増強剤のための、ならびにワクチンのための少なくとも1つの化学療法化合物を含み、化学療法剤としては、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−アルファ、チオセミカルバルゾン、メチサゾン、リファムピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカルネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤またはガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されない（例えばKatzung (1992)ならびにその中のそれぞれ798-800および680-681ページに引用された参考文献参照）。
【００５３】
組成物は、可変量のしかし少量の内毒素無含有ホルムアルデヒド、そして安全で且つ組成物が投与される生物体中での望ましくない作用に関与しないことが判明した防腐剤も含有し得る。
【００５４】
医薬目的
組成物（またはそれが引き出す抗血清）の投与は、「予防的」または「治療的」目的のためであり得る。予防的に提供される場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染の任意の症候が症状発現するようになる前に提供される。組成物の予防的投与は、任意のその後の感染を防止するかまたは弱毒化するために役立つ。予防的に提供される場合、本発明の遺伝子療法組成物は、疾患の任意の症候が症状発現するようになる前に提供される。組成物の予防的投与は、疾患に関連した1つまたは複数の症候を防止するかまたは弱毒化するために役立つ。
【００５５】
治療的に提供される場合、弱毒化または不活性化ウイルスワクチンは、実際の感染の症候の検出時に提供される。化合物（単数または複数）の治療的投与は、任意の実際の感染を弱毒化するのに役立つ（例えばBerkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987;およびKatzung, 1992参照）。治療的に提供される場合、遺伝子療法組成物は、疾患の症候または適応症の検出時に提供される。化合物（単数または複数）の治療的投与は、その疾患の症候または適応症を弱毒化するのに役立つ。
【００５６】
したがって本発明の弱毒化または不活性化ワクチン組成物は、感染の開始前に（予測される感染を防止するかまたは弱毒化するために）、あるいは実際の感染の開始後に提供され得る。同様に、遺伝子療法に関しては、組成物は、障害または疾患の任意の症候が症状発現される前に、あるいは1つまたは複数の症候が検出された後に提供され得る。
【００５７】
組成物は、その投与がレシピエント患者により耐容され得る場合、「薬理学的に許容可能」であるといわれる。このような作用物質は、投与される量が生理学的に十分である場合、「治療的有効量」で投与されると言われる。本発明の組成物は、その存在がレシピエント患者の生理学における検出可能な変化を生じる、例えば乾癬製インフルエンザウイルスの少なくとも1つの株に対する少なくとも1つの一次または二次体液性または細胞性免疫応答を増強する場合、生理学的に十分である。
【００５８】
提供される「防御」が絶対というわけではない、即ちインフルエンザ感染は、患者の対照集団または組と比較して、統計学的に有意の改善が存在する場合、全体的に防止されるかまたは根絶される必要はない。防御は、インフルエンザウイルス感染の症候の開始の重症度または急速度を緩和するよう制限され得る。
【００５９】
製剤投与
本発明の組成物は、受動免疫法または能動免疫法により、1つまたは複数の病原体、例えば1つまたは複数のインフルエンザウイルス株に耐性を付与し得る。能動免疫法では、不活性化または弱毒化生ワクチン組成物が宿主（例えば哺乳類）に予防的に投与され、そして投与に対する宿主の免疫応答が感染および／または疾患に対して防御する。受動免疫法に関しては、引き指された抗血清が回収され、そして少なくとも1つのインフルエンザウイルス株により引き起こされる感染を有することが疑われるレシピエントに投与される。本発明の遺伝子療法組成物は、能動免疫法により、予防的または治療的レベルの所望の遺伝子産物を産生し得る。
【００６０】
一実施形態では、ワクチンは、雌および胎児または新生児をともに防御するのに役立つ免疫応答の生成を引き起こす（胎盤を通してまたは母親の乳汁中に抗体を受動混入することによる）のに十分な時間および量の条件下で、哺乳類雌に（妊娠または分娩時またはその前に）提供される。
【００６１】
したがって本発明は、障害または疾患、例えば病原体のうちの少なくとも1つの株による感染を防止するかまたは弱毒化するための方法を包含する。本明細書中で用いる場合、ワクチンは、その投与が疾患の症候または状態の全体的または部分的弱毒化（即ち抑制）を、あるいは疾患に対する個体の全体的または部分的免疫を生じる場合、疾患を防止または弱毒化すると言われる。本明細書中で用いる場合、遺伝子療法組成物は、その投与が疾患の症候または状態の全体的または部分的弱毒化（即ち抑制）を、あるいは疾患に対する個体の全体的または部分的免疫を生じる場合、疾患を防止または弱毒化すると言われる。
【００６２】
本発明の少なくとも1つの不活性化または弱毒化インフルエンザウイルス、あるいはその組成物は、上記のような製剤組成物を用いて、意図された目的を達成する任意の手段により投与され得る。
【００６３】
例えばこのような組成物の投与は、種々の非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮膚内、筋肉内、腹腔内、鼻内、蛍光または皮膚経路によるものであり得る。本発明の製剤組成物を用いる好ましい方式は、筋肉内または皮下適用によるものである（例えばBerkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery, 1987;およびKatzung, 1992参照）。
【００６４】
インフルエンザウイルス関連病態を予防し、抑制しまたは治療するための典型的レジメンは、単一治療として投与されるか、あるいは1週間〜約24ヶ月、あるいはその中の任意の範囲または数値までの期間に亘って、強化または追加投与量として反復される本明細書中に記載されるような有効量のワクチン組成物の投与を包含する。
【００６５】
本発明によれば、組成物の「有効量」は、所望の生物学的作用を達成するのに十分である量である。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば、共存的治療の種類、治療の頻度、ならびに望まれる作用の性質によっている、と理解される。以下に提示される有効用量の範囲は、本発明を限定するものではなく、好ましい用量範囲を表す。しかしながら最も好ましい投与量は、当業者に理解され、確定されるように、個々の被験者に適応される（例えばBerkow et al., 1992; Goodman et al., 1990; Avery’s, 1987; Ebadi, 1985およびKatzung, 1992参照）。
【００６６】
哺乳類（例えばヒト）または鳥類成体生物体のための弱毒化ウイルスワクチンの投与量は、約103〜107プラーク形成単位（PFU）／kg、またはその中の任意の範囲または値からであり得る。不活性化ワクチンの用量は、約0.1〜200 μgの範囲、例えば50 μgのヘマグルチニンタンパク質であり得る。しかしながら投与量は、出発点として先在ワクチンを用いて慣用的方法により確定した場合に、安全且つ有効な量であるべきである。
【００６７】
複製ウイルスワクチンの各用量での免疫反応性ＨＡの投与量は、適量の、例えば1〜50 μg、またはその中の任意の範囲または値、あるいは米国公衆衛生局（ＰＨＳ）により推奨される量（通常は3歳児以上の年長小児用：15 μg／構成成分；3歳未満の小児用：7.5 μg／構成成分）を含有するよう標準化され得る。しかしながらＮＡの量も標準化され、この糖タンパク質はプロセッサー精製および貯蔵中は不安定であり得る（Kendal et al., 1980; Kerr et al., 1975）。各々0.5 ml用量のワクチンは、好ましくは約1〜500億個のウイルス粒子、好ましくは100億個の粒子を含有する。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
実施例１
材料および方法
細胞およびウイルス。  ２９３Ｔヒト胚腎細胞およびマディン・ダービーイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）を、それぞれ10％ウシ胎仔血清を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、および5％ウシ新生仔血清を含有する変法イーグル培地（ＭＥＭ）中に保持した。全ての細胞を、37℃で5％ＣＯ2中に保持した。インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を、10日齢卵中で増殖させた。
【００６９】
プラスミドの構築。  ＲＮＡポリメラーゼＩ構築物を生成するために、Ａ／ＷＳＮ／３３またはＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスＲＮＡ由来のクローン化ｃＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーターおよびターミネーター配列間に導入した。要するに、ＢｓｍＢＩで消化されたＢｓｍＢＩを含有するプライマーを用いたＰＣＲにより、クローン化ｃＤＮＡを増幅し、そしてＢｓｍＢＩ部位により分離されるヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含有するｐＨＨ２１ベクターのＢｓｍＢＩ部位中にクローン化した（図２）。Ａ／ＷＳＮ／３３株のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、ＭおよびＮＳ遺伝子を、以下のプラスミドの使用によりＰＣＲ増幅した：それぞれｐＳＣＷＰＢ２、ｐＧＷ−ＰＢ１およびｐＳＣＷＰＡ（全てDr. Debi Nayak at the University of California Los Angelesから得られる）、ならびにｐＷＨ１７、ｐＷＮＰ１５２、ｐＴ３ＷＮＡ１５（Castrucci et al., 1998）、ｋＰＴ３ＷＭおよびｐＷＮＳ１。鋳型としてｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）（Perez et al., 1998）を用いて、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８派３４ウイルスのＰＢ１遺伝子を増幅した。プライマーの配列に関しては図６を参照されたい。遺伝子が望ましくない突然変異を含有しないことを保証するためには、ＰＣＲ由来断片は、メーカーに推奨されたプロトコールに従ってオートシークエンサー（Applied Biosystems Inc., CA, USA）を用いた配列であった。Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスのＨＡ、ＮＰ、ＮＡおよびＭ１遺伝子をコードするｃＤＮＡを記載された（Huddleston et al., 1982）とおりにクローン化して、真核生物発現ベクターｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ（ニワトリβアクチンプロモーターにより制御）（Niwa et al., 1991）中にサブクローニングして、それぞれｐＥＷＳＮ−ＨＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ0−１４、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５およびｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−Ｍ１−２／１を生じた。ＰＣＲによりＡ／ＰＲ／８／34ウイルスからのＭ2およびＮＳ2遺伝子を増幅し、ｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ中にクローン化して、ｐＥＰ24ｃおよびｐＣＡ−ＮＳ２を産生した。最後に、ｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）、ｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）およびｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）を用いて、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下でＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡタンパク質を発現した（Perez et al., 1998）。
【００７０】
感染性インフルエンザ粒子の生成。  メーカーの使用説明書に従って、トランスＩＴ  ＬＴ−１（Panvera, Madison, Wisconsin）の使用により、異なる量で最大17のプラスミドを用いて、２９３Ｔ細胞（1×106）をトランスフェクトした。要するに、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を混合し（2 μlトランスＩＴ−ＬＴ−１／ＤＮＡ1 μg）、室温で45分間インキュベートし、細胞に付加した。6時間後、ＤＮＡトランスフェクション試薬混合物を、0.3％ウシ血清アルブミンおよび0.01％ウシ胎仔血清を含有するオプチ−ＭＥＭ（Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland）に入れ換えた。トランスフェクション後異なる時間に、ウイルスを上清から収穫し、ＭＤＣＫ細胞に関して滴定した。ヘルパーウイルスはこの手法に必要とされなかったため、回収されたトランスフェクト体ウイルスを、プラーク精製を伴わずに分析した。
【００７１】
ウイルスを産生するプラスミドトランスフェクト化細胞のパーセンテージの測定。  トランスフェクション後24時間に、２９３Ｔ細胞を、単一細胞中に0.02％ＥＤＴＡとともに分散した。次に細胞懸濁液を10倍に希釈し、24ウエルプレート中のＭＤＣＫ細胞の集密的細胞単層に移した。血球凝集検定により、ウイルスを検出した。
【００７２】
免疫染色検定。  インフルエンザウイルス感染後9時間目に、細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で2回洗浄し、室温で20分間、3.7％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で固定した。次にそれらを0.1％トリトンＸ−100で処理し、Neumann等（1997）が記載したように加工処理した。
【００７３】
結果
ウイルスＲＮＡセグメント、3つのポリメラーゼサブユニットおよびＮＰタンパク質のプラスミド駆動発現による感染性ウイルスの生成。  精製ビリオンから抽出されたＲＮＰの混合物を用いた細胞のトランスフェクションは感染性インフルエンザ粒子を生じるが、しかしこの戦略は、8つの異なるin vitro生成ＲＮＰとともに用いられる場合、効率的であるとは思われない。完全にｃＤＮＡから感染性インフルエンザウイルスを産生するために、8つのウイルスＲＮＰをin vivoで生成した。したがって、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターに隣接されたＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスの全長ウイルスＲＮＡに関するｃＤＮＡを含有するプラスミドを調製した。原則として、真核生物細胞中へのこれら8つのプラスミドのトランスフェクションは、8つのインフルエンザｖＲＮＡ全ての合成を生じるべきである。タンパク質発現プラスミドの同時トランスフェクションにより生成されるＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡおよびＮＰタンパク質は次に、機能性ｖＲＮＰ中にｖＲＮＡを集合させ、これらは複製され、転写されて、最終的に感染性インフルエンザウイルスを生成する（図３）。1×106個の２９３Ｔ細胞をタンパク質発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）1 μg、ｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）1 μg、ｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）0.1 μg、およびｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ0／１４1 μg）、ならびに以下のＲＮＡポリメラーゼＩプラスミドの各々1 μg（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ、ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＭおよびｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＳ）でトランスフェクトした。低減量のｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）を用いることの決定は、過去の観察（Mena et al., 1996）、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）の生成に関する最適条件に関するデータ（示されていない）を基礎にした。２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後24時間目に、7×103 pfuのウイルス／mlが上清中に見出された（実験１、表１）が、これは、完全にプラスミドからＡ型インフルエンザウイルスを産生する逆遺伝子学の能力を初めて実証した。
【００７４】
【表１】
2006525815.tif 000003
【００７５】
全てのウイルス構造タンパク質の同時発現を伴うインフルエンザウイルス産生の効率。  ウイルスＮＰおよびポリメラーゼタンパク質の発現はインフルエンザウイルスのプラスミド駆動性生成のために十分であるが、しかし効率は改善され得る可能性もあった。過去の研究では、全てのインフルエンザウイルス構造タンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２）の発現は、レポータークロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする人工ｖＲＮＡを含有するＶＬＰを生じた（Mena et al., 1996）。したがってウイルスＲＮＡ複製および転写に必要とされるものだけの代わりの構造タンパク質の全相補体の利用可能性は、ウイルス産生の効率を改善し得る。この目的のために、２９３Ｔ細胞を最適量のウイルスタンパク質発現プラスミド：ｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）およびｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）1 μg；ｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）0.1 μg；ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ0／１４およびｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５  1 μg；ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−Ｍ１−２／１  2 μg；ｐＣＡ−ＮＳ２  0.3 μg；ならびにｐＥＰ２４ｃ（Ｍ２）0.03 μg（ＶＬＰ産生により判定；未発表データ）を、各ＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド1 μgと一緒に用いて、トランスフェクトした（実験２、表１）。同一組のＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（ＰＢ１遺伝子を除く：これは再集合株ウイルスを生成しようと努力してｐＰｏｌＩ−ＰＲ／８／３４−ＰＢ１に置換された）を、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰのみを発現するプラスミド（実験３、表１）あるいは全てのインフルエンザ構造タンパク質を発現するプラスミド（実験４、表１）と一緒に用いて、第二組の細胞をトランスフェクトした。ＷＳＮウイルスの産生は、トランスフェクション後24時間（実験１および２、表１）でまたは36時間（データは示されていない）で感知可能程度に異ならなかった。しかしながら、全てのインフルエンザウイルス構造タンパク質が提供された場合、ＰＲ／８／３４−ＰＢ１による10倍より大きいウイルス産生増大が見出された（実験３および４、表１）。ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２またはＮＰタンパク質の発現のためのプラスミドのうちの1つを欠くネガティブ対照は、いかなるウイルスも産生しなかった（実験５〜８、表１）。したがって、生成されるウイルスによって、Ａ型インフルエンザウイルス構造タンパク質の発現は、逆遺伝学方法の効率を容易に評価可能程度に改善した。
【００７６】
次に、Ａ／ＰＲ／８／３４−ＰＢ１遺伝子を有するウイルスを生成するために用いられるプラスミド組を用いて、細胞のトランスフェクション後のウイルス産生の動態を確定した。3つの実験のうち2つにおいて、トランスフェクション後24時間に、最初にウイルスを検出した。その時間に測定された力価＞103 pfu/mlは、トランスフェクション後48時間では＞106 pfu/mlに増大した（表２）。ウイルスを産生しているプラスミドトランスフェクト化細胞のパーセンテージを概算するために、トランスフェクションの24時間後にＥＤＴＡ（0.02％）で２９３Ｔ細胞を処理して、細胞を分散し、次に限定希釈試験を実施した。この実験では、この時点での培養上清中に遊離ウイルスは見出されなかった。結果は、103.3細胞中の1つが感染性ウイルス粒子を生成中である、ということを示した。
【００７７】
【表２】
2006525815.tif 000004
【００７８】
ＮＡタンパク質中のＦＬＡＧエピトープを含有するインフルエンザウイルスの回収。  新規の逆遺伝学系がＡ型インフルエンザウイルスのゲノム中への突然変異の導入を可能にすることを立証するために、ＮＡタンパク質中のＦＬＡＧエピトープを含有するウイルス（Castrucci et al., 1992）を生成した。ＮＡタンパク質およびタンパク質頭部の底のＦＬＡＧエピトープの両方をコードするｃＤＮＡを含有するＲＮＡポリメラーゼＩプラスミド（ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ／ＦＬ７９）を、必要なＲＮＡポリメラーゼＩおよびタンパク質発現プラスミドと一緒に用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。回収ウイルス（ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９）が実際にＮＡ−ＦＬＡＧタンパク質を発現しないことを確証するために、ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９またはＡ／ＷＳＮ／３３野生型ウイルスに感染させた細胞の免疫染色検定を実施した。ＦＬＡＧエピトープに対するモノクローナル抗体はＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９に感染した細胞を検出したが、しかし野生型ウイルスに感染したものを検出しなかった（図４）。ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９ウイルスの回収は、非タグ化野生型ウイルスに関する場合と同様に効率的であった（データは示されていない）。これらの結果は、新規の逆遺伝学系がＡ型インフルエンザウイルスゲノム中への突然変異の導入を可能にする、ということを示す。
【００７９】
ＰＡ遺伝子中に突然変異を含有する感染性インフルエンザウイルスの生成。  ＰＡ遺伝子中に突然変異を保有するウイルスを産生するために、2つのサイレント突然変異を導入して、制限エンドヌクレアーゼに関する新規の認識配列を作製した（ｍＲＮＡの位置４８６にＢｓｐ１２０１および位置１２８４にＰｖｕＩＩ）。従来は、信頼できる選択系の欠如のため、逆遺伝学によりこの遺伝子を修飾することはできなかった。トランスフェクト体ウイルスＰＡ−Ｔ８４６ＣおよびＰＡ−Ａ１２８４を回収した。2連続限定希釈により、回収トランスフェクト体ウイルスを生物学的にクローン化した。回収ウイルスが実際にＰＡ遺伝子中の突然変異を有するトランスフェクト体であることを立証するために、逆転写酵素−ＰＣＲにより、ＰＡ遺伝子に関するｃＤＮＡを得た。図５に示したように、ＰＡ−Ｔ８４６ＣおよびＰＡ−Ａ１２８４Ｃウイルスは、新規導入制限部位の存在により実証されるように、ＰＡ遺伝子内に予期された突然変異を有した。同一ウイルス試料のＰＣＲおよび逆転写段階を有さないプライマーは、いかなる生成物も産生できなかった（データは示されていない）が、このことは、ＰＡ  ｃＤＮＡが、ウイルスを生成するために用いられるプラスミドの代わりにｖＲＮＡに事実上由来することを示す。これらの結果は、ヘルパーウイルスの使用を伴わずに突然変異化遺伝子を有するウイルスが産生され、回収され得る方法を例証する。
【００８０】
考察
本明細書中に記載した逆遺伝学系は、完全にクローン化ｃＤＮＡからＡ型インフルエンザウイルスを効率的に産生するのを可能にする。BridgenとElliott（1996）も、逆遺伝学を用いて、ブンヤムウエラウイルス（ブンヤウイルス科）を生成しているが、しかしそれは、ネガティブ・センスＲＮＡの3つのセグメントのみを含有し、そしてその産生効率は低く、102 pfu/107細胞であった。ウイルス収率は実験間で異なったが、しかし8つのセグメントを含有するインフルエンザウイルスに関して、一貫して＞103 pfu/106細胞を得た。本明細書中に上記した逆遺伝学系の高効率に関しては、いくつかの解釈がある。in vitroでＲＮＰを産生する（Luytjes et al., 1989）代わりに、ＲＮＡポリメラーゼＩを用いたｖＲＮＡの細胞内合成により、そしてウイルスポリメラーゼタンパク質およびＮＰのプラスミド駆動性発現により、ＲＮＰをin vivoで生成した。さらにまた、プラスミドで容易にトランスフェクトされる２９３Ｔ細胞の使用（Goto et al., 1997）は、細胞の大集団がウイルス産生のために必要なプラスミドの全てを受容することを保証した。さらに、増殖中の細胞中で最も豊富に発現される酵素の1つであるＲＮＡポリメラーゼＩにより産生される多数の転写体は、当該系の全体的効率に寄与すると思われた。これらの特徴は、ｖＲＮＡのキャプシド形成、核中のＲＮＰの生成、ならびに新規のウイルスが集合され、放出される細胞膜へのこれらの複合体の輸出のための、それ相当に多数のｖＲＮＡ転写体および適量のウイルスタンパク質をもたらした。
【００８１】
従来確立された逆遺伝学系（Enami et al., 1990; Neumann et al., 1994; Lyutjes et al., 1989; Pleschka et al., 1996）は、ヘルパーウイルス感染を必要とし、したがって少数のトランスフェクト体を膨大な数のヘルパーウイルスから回収させる選択方法を必要とする。このような戦略は、以下のｃＤＮＡ由来遺伝子のうちの1つを保有するインフルエンザウイルスを生成するために用いられてきた：ＰＢ２（Subbarao et al., 1993）、ＨＡ（Enami et al., 1991; Horimoto et al., 1994）、ＮＰ（Li et al., 1995）、ＮＡ（Enami et al., 1990）、Ｍ（Castrucci et al., 1995; Yasuda et al., 1994）およびＮＳ（Enami et al., 1991）。選択方法のほとんどが、ＨＡおよびＮＡ遺伝子に適用可能なものを除いて、増殖温度、宿主範囲制限または薬剤感受性によっており、したがって遺伝子産物の機能性分析のための逆遺伝学の有用性を制限する。信頼できる抗体駆動性選択計が利用可能であるＨＡおよびＮＡ遺伝子に関する場合でも、顕著な増殖欠陥を有するウイルスを産生することは難しい。これに対して、本明細書中に記載した逆遺伝学系は、ヘルパーウイルスを必要とせず、任意の遺伝子セグメント中に突然変異を有する、あるいはいくつかの増殖欠陥を有するトランスフェクト体の生成を可能にする。この利点は、図５で実証されている（突然変異化ＰＡ遺伝子を用いたトランスフェクト体ウイルスの回収）。Ａ型インフルエンザウイルスゲノム中に任意の実行可能な突然変異を導入するための技法を有するならば、多数の積年の問題、例えばウイルスゲノムの非翻訳領域における調節配列の性質、ウイルスタンパク質の構造−機能関係、ならびに宿主範囲制限およびウイルス病原性の分子的基礎を処理することができる。
【００８２】
不活性化インフルエンザワクチンが利用可能であるが、しかしそれらの効力は、一部は、局所的ＩｇＡおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答を引き出すそれらの限定能力のため、最適以下である。目下進行中の寒冷順応生インフルエンザワクチンの臨床試験は、インフルエンザ症候を引き起こさないがしかし依然として防御免疫を誘導するよう、このようなワクチンが最適に弱毒化される、ということを示唆する（Keitel & Piedra, 1998で再検討）。しかしながら予備的結果は、これらの生ウイルスワクチンが最良の不活性化ワクチン（Keitel & Piedra, 1998で再検討）より有意に有効であるというわけではなく、さらなる改善の余地を残している、ということを示す。可能性の1つは、上記の逆遺伝学系を用いて寒冷順応ワクチンを修飾することである。あるいは内部タンパク質をコードする遺伝子中に多数の弱毒性突然変異を有する「マスター」Ａ型インフルエンザ株を産生するために逆遺伝学を用いることにより、ゼロから出発し得る。本明細書中に記載した逆遺伝学系の最も興味をそそる用途は、新規のＨＡまたはＮＡ亜型インフルエンザウイルスを含めた汎発性流行が疑われる場合の弱毒化生ウイルスワクチンの迅速生産に見出され得る。
【００８３】
この新規の逆遺伝学系は、ワクチンベクターとしてのインフルエンザウイルスの使用を増強すると思われる。ウイルスは、インフルエンザウイルスタンパク質のほかに、外因性タンパク質または免疫原性エピトープを発現するよう工学処理され得る。例えば第九番目のセグメントとして外因性タンパク質を有するウイルスを生成し（Enami et al., 1991）、そしてそれらを生ワクチンとして用い得る。インフルエンザウイルスは強力な細胞媒介性および体液性免疫応答を刺激するだけでなく、それらは広範な一連のビリオン表面ＨＡおよびＮＡタンパク質（例えば15のＨＡおよび9つのＮＡ亜型ならびにそれらの流行病性変異体）ももたらして、同一標的集団の反復免疫感作をも可能にする。
【００８４】
ウイルス構造タンパク質およびワクシニア−Ｔ７ポリメラーゼ系を有するｖＲＮＡを発現することにより、レポーター遺伝子をコードする人工ｖＲＮＡを保有するインフルエンザＶＬＰが産生されている（Mena et al., 1996）。逆遺伝学を用いて、目下、ｖＲＮＡ転写および複製に必要とされるタンパク質をコードするｖＲＮＡ（即ちＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰ）ならびに当該タンパク質をコードするｖＲＮＡを含有すＶＬＰを生成し得る。このようなＶＬＰは、有用な遺伝子送達ビヒクルであり得る。ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子のそれらの欠如は、感染性ウイルスがＶＬＰ−遺伝子療法後には産生されないことを保障する、ということは重要である。インフルエンザウイルスゲノムが宿主染色体中に組み込まれないため、ＶＬＰ系は、細胞の短期間形質導入（例えば癌治療のため）のみを要する情況において遺伝子療法に適している。アデノウイルスベクター（Kovesdi et al., 1997）と対比して、インフルエンザＶＬＰはＨＡおよびＮＡ変異体の両方を含有して、標的集団の反復治療を可能にする。
【００８５】
オルソミクソウイルス科は、Ａ、ＢおよびＣ型インフルエンザウイルス、ならびに近年分類されたトゴトウイルスを含む。本明細書中に記載したクローン化ｃＤＮＡから完全に感染性Ａ型インフルエンザウイルスを生成するための戦略は、任意のオルソミクソウイルスに、そしておそらくはその他のセグメント化ネイティブ・センスＲＮＡウイルス（例えばブンヤウイルス科、アレナウイルス科）にも同様に当てはまる。技術的制限なしにウイルスゲノムを操作する能力は、ウイルス生活環およびそれらの調節、ウイルスタンパク質の機能およびウイルス病原性の分子メカニズムの研究のための深い含蓄を有する。
【００８６】
実施例２
インフルエンザウイルスタンパク質ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡおよびＮＰの発現は人工ウイルスＲＮＡの複製および転写をもたらす。  インフルエンザＶＬＰを生成するために、in vivoでのインフルエンザウイルスＲＮＡの細胞内合成のためのＲＮＡポリメラーゼＩ系を用いた（図７）。この系では、アンチセンス配向でのレポーター遺伝子をコードするｃＤＮＡは、インフルエンザウイルスＲＮＡの５’および３’非コード領域に隣接される。このカセットは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびターミネーター間に挿入される。真核生物細胞中へのこのような構築物のトランスフェクションは、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩによるレポーター遺伝子の転写をもたらし、それによりインフルエンザウイルス様ＲＮＡを生成する（Neumann et al., 1994）。インフルエンザウイルス感染時に、人工ｖＲＮＡは複製され、そしてウイルスポリメラーゼ複合体により転写されて、レポーター遺伝子の発現を生じる。
【００８７】
ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡおよびＮＰタンパク質の発現がＲＮＡポリメラーゼＩ由来転写体によりコードされるレポーター遺伝子の発現をもたらすか否かを確定するために、ニワトリβアクチンプロモーター（ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ0/14）の制御下でＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＮＰタンパク質を、サイトメガロウイルスプロモーター［ｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）、ｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）およびｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）］の制御下でＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスのポリメラーゼタンパク質を、そしてＲＮＡポリメラーゼＩレポーター遺伝子構築物（ｐＰｏｌＩ−ＧＦＰ）を発現するプラスミド（各々1 μg）、ヒト胚腎（２９３Ｔ）細胞中にトランスフェクトした。48時間後、30％〜40％の細胞がＧＦＰを発現中であった（図８）。これに対比して、ＧＦＰ発現は、ポリメラーゼまたはＮＰタンパク質を欠くトランスフェクト化細胞中で検出されなかった。これらの結果は、ＮＰおよび3つのインフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質が、ＲＮＡポリメラーゼＩ由来ＧＦＰｖＲＮＡを複製し、転写した機能的複合体を生成していた、ということを示した。
【００８８】
最適ｖＲＮＡ転写および複製。  最適レポーターＧＦＰ発現に必要なプラスミドＤＮＡの量を確定するために、ポリメラーゼタンパク質およびＮＰの発現をわれわれは調節した。従来の研究は、多量のＰＡが転写／複製系におけるレポーター遺伝子の発現の程度を低減する、ということを示した（Mena et al., 1996）。したがって段階的方法において、プラスミドからのＰＡの発現を低減し、鋳型量として0.1 μgのｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）を同定して、ＧＦＰの最強発現を生じた。ＲＮＰ複合体の大構造構成成分であるＮＰに関しては、多量のタンパク質発現プラスミドを必要とし得る。しかしながらより多量のプラスミドはＧＦＰ陽性２９３Ｔ細胞の数に容易に感知できるほどには影響を及ぼさなかった。さらに種々の量のＰＢ２およびＰＢ１タンパク質発現プラスミド（1.0〜0.03 μgの範囲）は、２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現に影響を及ぼさなかった。それゆえその後の全ての実験において、0.1 μgのｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）；ならびに1.0 μgのｐｃＤＮＡ７７４（ＰＢ１）、ｐｃＤＮＡ７６２（ＰＢ２）およびｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−ＮＰ0/14を用いた。
【００８９】
クローン化ｃＤＮＡからのインフルエンザＶＬＰの生成。  ワクシニアウイルスＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ系を用いた従来の研究は、インフルエンザＶＬＰの生成が9つのインフルエンザウイルスタンパク質：ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２を要する、ということを示した（Mena et al., 1996）。ＮＳ１タンパク質は、それに反して、粒子生成には必須でない（Mena et al., 1996）。ＶＬＰ生成のための効率的プラスミド駆動系を確立するために、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２遺伝子をコードするｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡを真核生物発現ベクターｐＣＡＧＧＳ／ＭＣＳ（ニワトリβアクチンプロモーターにより制御）中にクローニングして、それぞれｐＥＷＳＮ−ＨＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＳＮ−Ｍ１−２／１およびｐＣＡ−ＮＳ２を生じた。ウエスタンブロット分析により、各タンパク質の発現を確証した。
【００９０】
ＶＬＰを生成するために、1.0 μgの各タンパク質発現プラスミド（0.1 μgが用いられたｐｃＤＮＡ７８７（ＰＡ）以外）、ならびに1 μgのレポーター遺伝子構築物ｐＰｏｌＩ−ＧＦＰを用いて、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に培養上清を収穫し、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスと混合して、ＧＦＰ  ｖＲＮＡの複製および転写に必要なインフルエンザウイルスタンパク質を提供した。インキュベーションの10時間後に、450粒子／上清1 mlに対応するＧＦＰ陽性ＭＤＣＫ細胞を検出した（表３）。したがって全てのインフルエンザウイルス構造タンパク質のプラスミド駆動性発現が、ＧＦＰ  ｖＲＮＡを含有する感染性インフルエンザＶＬＰの生成を生じた。さらにＧＦＰ  ｖＲＮＡをＭＤＣＫ細胞にデリバリーした。
【００９１】
インフルエンザウイルスの最適集合。  異なる量のＲＮＡポリメラーゼＩレポーター遺伝子構築物、ならびにＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２プラスミドＤＮＡを発現する細胞において、ＶＬＰ生成も試験した。ｐＰｏｌＩ−ＧＦＰを用いた実験では、1.0 μgのプラスミドＤＮＡはＶＬＰの生成に際して高効率的であったが、一方、2.0 μgまたは3.0 μgに関しては、効率は有意に低減された。ＮＳおよびＭ２タンパク質は感染において後期に低量で発現されるため、最適ＶＬＰ生成のためには相対的に少量の発現プラスミドが必要とされる。1.0 μgから0.3 μgへのＭ２発現構築物の低減は、ＧＦＰ陽性ＭＤＣＫ細胞の数の10倍より多い増大を生じた（表３）。0.03 μgへのプラスミドのさらなる低減は、ＶＬＰの数を増大しなかった。ＮＳ２に関しては、試験したより低量のプラスミド（0.1 μg）は、ＶＬＰの低効率的生成に関連した（表３）。
【００９２】
Ｍ１タンパク質は、ビリオンの主構造構成成分である。したがって高レベルのＭ１発現が、ＶＬＰの効率的生成のために必要であると思われる。この予測を、1.0 μgまたは2.0 μgのＭ１プラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた細胞におけるＶＬＰ生成を比較する実験において、試験した。表３に示したように、より高量のプラスミドは、ＧＦＰ陽性ＭＤＣＫ細胞の数の10倍より多い増大を生じた。ＨＡおよびＮＡタンパク質を発現するプラスミドの2つの異なる量（1 μg対2 μg）の比較は、ＶＬＰ生成におけるいかなる容易に感知可能な差も明示せず、その後の実験で用いるための1 μgの各プラスミド（ｐＥＷＳＮ−ＨＡ、ｐＣＡＧＧＳ−ＷＮＡ１５）の選択をもたらした。全体的に、これらの試験は、ＶＬＰ生成の効率における＞100倍増を生じ、最終的に104より多い感染性インフルエンザウイルス粒子／上清1 mlの産生をもたらした（図９）。
【００９３】
【表３】
2006525815.tif 000005
【００９４】
完全にプラスミドから産生されるＶＬＰの確実性。  ＶＬＰが確かなインフルエンザウイルスと同一方法で感染を開始することを立証するために、ＷＳＮ  ＨＡに対する抗体を用いてＶＬＰを中和した。プラスミドトランスフェクト化２９３Ｔ細胞由来のＶＰＬ含有上清を、抗ＷＳＮ  ＨＡモノクローナル抗体のプールとともに、または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質に対するモノクローナル抗体（陰性対照）とともに、室温で1時間インキュベートした。抗ＷＳＮ  ＨＡモノクローナル抗体のプールにより中和されないＡ／ＰＲ／８／３４ヘルパーウイルスを混合物に付加し、ＭＤＣＫ細胞中に接種した抗ＷＳＮ−ＨＡ特異的モノクローナル抗体のみがＶＬＰを中和したが、このことは、ＨＡが結合および細胞中へのＶＬＰの進入を媒介することを示す。
【００９５】
次にＶＬＰの生成に必要とされる最小組のタンパク質を同定した。他のものは、3つのインフルエンザウイルスポリメラーゼおよびＮＰがｖＲＮＡの複製および転写に不可欠である、ということを確立していた（Honda et al., 1988）。したがってこれら4つのタンパク質の各々が含まれたが、しかしＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２またはＮＳ２は引き続き省かれた。これらのプラスミドのいずれかの排除は、トランスフェクト化２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ  ｖＲＮＡの複製／転写に影響を及ぼさなかった。ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１またはＮＳ２タンパク質を欠くトランスフェクト化２９３Ｔ細胞由来の上清は感染ＭＤＣＫ細胞におけるＧＦＰ発現を促進しなかったが、これは、感染性ＶＬＰの非存在を示す。Ｍ２を省いて、感染性ＶＬＰを検出したが、その数は少なかった（完全組の構造タンパク質と比較して＞500倍低減）。したがってワクシニアウイルス系の試験からのデータと一致して、感染性ＶＬＰの効率的生成のためには全感染性ウイルス構造タンパク質が必要とされる（Mena et al., 1996）。
【００９６】
ＶＳＶ糖タンパク質はＶＬＰの産生においてＨＡおよびＮＡに取って換わり得る。  インフルエンザウイルスＨＡおよびＮＡタンパク質を、受容体結合および融合において機能するＶＳＶ  Ｇタンパク質に置き換えた。ｐＰｏｌＩ−ＧＦＰ；最適量のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２発現構築物；ならびに1μgのＶＳＶ−Ｇ構築物（ｐＣＡＧＧＳ−ＶＳＶ−Ｇ）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞では、インフルエンザウイルス糖タンパク質によるＶＳＶ−Ｇタンパク質の置換は、ＶＬＰ生成に悪影響を及ぼさなかった。それとは反対に、ＨＡおよびＮＡよりむしろ、ＶＳＶ−Ｇがウイルス糖タンパク質として役立つ場合、より多数のＧＦＰ陽性細胞が再現可能的に見出された。したがってＶＳＶ  Ｇタンパク質はインフルエンザビリオン中に効率的に組入れられ、そしてウイルス放出および進入においてＨＡおよびＮＡと同様に機能し得る。
【００９７】
感染性インフルエンザウイルス粒子を生成するための効率的系は、このウイルスを用いた研究における、そしておそらくは遺伝子両方のためのワクチンおよびベクターの産生における一利点である。現存するワクシニアウイルス系に対比して、ここに記載したＶＬＰ産生戦略は、細胞の初期トランスフェクションに、そしてＶＬＰの産生において（＞104感染性粒子／上清1 ml）ともに、高効率的である。さらにそれは、インフルエンザウイルスタンパク質を発現するプラスミドにより完全に駆動され（即ち任意のその他のウイルスタンパク質の非存在下で）、これは、結果の解釈を大いに簡単にする。別の主要利点は、ビリオン生成、ＲＮＰ複合体のパッケージング、ウイルス複製の出芽、ならびに結合および融合過程における致死突然変異の作用を試験する能力である。さらに、本明細書中で上記した系は、他のウイルス、例えばパラミクソウイルスおよびラブドウイルスと十分に同等に作動し得る、と思われる。
【００９８】
インフルエンザウイルスＨＡおよびＮＡタンパク質は、ＶＳＶ糖タンパク質Ｇにより機能的に置き換えられ得る。従来、組換えＳＶ４０ウイルスにより提供される場合、インフルエンザウイルスはＶＳＶ  Ｇタンパク質を組入れ得ない、ということが報告されてきた（Naim et al., 1993）。本明細書中に記載した結果は、ＨＡもＮＡもＶＬＰの生成に不可欠ではないが、しかしこれらの糖タンパク質が他のウイルスタンパク質との相互作用に一役を演じ、したがって無尾ＨＡ、ＮＡまたはその両方を発現するウイルスの形状延長により示唆されるように、ビリオンの構造に影響を及ぼすということは除外し得ない、ということを示唆する（Garcia-Sastre et al., 1995; Jin et al., 1994; Jin et al., 1997; Mitnaul et al., 1996）。
【００９９】
本明細書中に上記したプラスミドベースの系は、治療的遺伝子送達のために特に有用であり得る。転写および複製に必要とされるタンパク質（即ちＮＰおよびポリメラーゼ）をコードするｖＲＮＡ、ならびに当該タンパク質をコードするｖＲＮＡを含有するＶＬＰが調製され得る。これらの粒子は感染性であり、そしてそれが複製し、転写される標的細胞中に意図された遺伝子を送達し得る。これらの粒子はウイルス遺伝子の完全相補体を含有しないため、それらは感染性子孫ウイルスを産生し得ない。この特徴は、宿主染色体中へのウイルスゲノムの組込みの欠如とともに、ヒトおよび非ヒト被験者における遺伝子送達の生物学的安全性を保証する。最後に、15のＨＡおよび9つのＮＡならびにそれらの変異体の利用可能性は、ＶＬＰの反復投与を可能にし、それにより、その他のウイルスベクター、例えばアデノウイルスの反復しように直面する主要障害物であるベクター生成タンパク質に対する免疫抵抗性を克服する。プラスミド駆動系のさらなる利点は、癌治療におけるように、外因性タンパク質の短期間発現のみを要する情況において実感され得る。
【０１００】
実施例３
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いることにより、複製欠損ウイルスの産生のためのパッケージング細胞株を生成し得る。例えば、2つのｌｏｘＰ部位に隣接される転写停止カセット（例えばLife Technologies, Bethesda, MarylandのｐＢＳ３０２；ならびにSauer et al., 1993; Lasko et al., 1992; Pichel et al., 1993; Bolivar et al., 1977; Stuhl et al., 1981; Stuhl, 1985; Fiers et al., 1978）およびウイルス遺伝子のうちの1つを含有するタンパク質発現ベクターを調製する。プロモーター配列で開始される転写は、転写停止部位で遮断される。したがってウイルス遺伝子は転写および翻訳されない。このようなベクターで安定的にトランスフェクトされる細胞は、ｌｏｘＰ系中にクローン化される遺伝子をコードするｖＲＮＡを欠くインフルエンザウイルスに感染される。このウイルスは、Ｃｒｅタンパク質をコードする付加的ｖＲＮＡも含有する。このウイルスは、そのｖＲＮＡのうちの1つを欠くため、正常細胞中では生存可能でない。しかしながらパッケージング細胞株中では、ｖＲＮＡから発現されるＣｒｅタンパク質はｌｏｘＰ部位での組換えを生じて、転写停止部位の欠失を引き起こす。したがってそれぞれのウイルス遺伝子（単数または複数）がここで転写され、発現されて、これらの細胞中でウイルスを増幅させる（図１０）。
【０１０１】
さらに、ｌｏｘＰ系により制御される後期ウイルスタンパク質（即ちＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２）を発現するパッケージング細胞株を調製する。ＨＡおよびＮＡは、他のウイルス受容体結合および融合タンパク質（例えばエボラＧＰ、マルブルクＧＰ、ブンヤウイルス糖タンパク質ＧＰ１およびＧＰ２、ラブドウイルスおよびパラミクソウイルスのＧおよび／またはＦタンパク質、トゴトウイルス糖タンパク質、ならびにポジティブ鎖ＲＮＡウイルスの糖タンパク質）により取り換えられ得る。複製／転写に必要とされるタンパク質（即ちポリメラーゼおよびＮＰタンパク質）をコードするｖＲＮＡ、当該遺伝子をコードするｖＲＮＡおよびＣｒｅをコードするｖＲＮＡを含有するウイルス様粒子を生成する。これらのｖＲＮＡを、パッケージング細胞株中のウイルス様粒子中にパッケージする。
【０１０２】
これらのウイルス様粒子は、（ｉ）それらがウイルス遺伝子の完全相補体を含有せず、したがって感染性子孫粒子が生成され得ず、緊縮安全性問題に遭遇し；（ｉｉ）それらが高レベルで外因性タンパク質を発現すると思われ；（ｉｉｉ）それらが主要抗原であるウイルス糖タンパク質（ＨＡ、ＮＡ）を発現せず、したがってウイルスタンパク質に対する宿主免疫応答が制限されるはずであるため、ワクチンおよび遺伝子療法目的に用いられ得る。
【０１０３】
実施例４
任意の脊椎動物細胞株、例えばヒト２９３Ｔ細胞、ネズミＮＡ細胞またはハムスターＢＨＫ−２１細胞においてインフルエンザウイルス、例えばＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスまたはＣ型インフルエンザウイルスの生成をもたらし得るＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系を確立した。Ａ型インフルエンザｖＲＮＡを発現させて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによりＲＮＡ転写体から得られるセグメント（ＰＢ２）を含有するＡ型インフルエンザウイルスを生成した。
【０１０４】
材料および方法
細胞
シミアンウイルス４０抗原に関する遺伝子を継続的に発現する２９３細胞株の誘導体である２９３Ｔヒト胚腎細胞（DuBridge et al., 1989）を、10％ＦＣＳ、4 mMＬ−グルタミンおよび抗生物質を補足したＤＭＥＭ（グルコース濃度：4.5 g/l）中に保持した。マディン・ダービーイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）を、5％ウシ新生仔血清、4 mMＬ−グルタミンおよび抗生物質を含有するイーグル塩を有する最小必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。
【０１０５】
プラスミド構築
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ駆動性ｖＲＮＡ発現ベクターの構築は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ媒介性転写がβアクチンニワトリプロモーター／ＣＭＶエンハンサーカセットにより駆動されるｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳ（Hatta et al., 2001; Niwa et al., 1991）を基礎にした。プライマー5’-GCATGCGAAGACTTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCT-3’（配列番号１７）および5’-AGATCTAGGGAGCTCTCCCTTAGCCATCCGA-3’（配列番号１８）を用いてｐＸ８ｄＴ（Schnell et al., 1984）からＨＤＶＲｚカセットを増幅し、Ｂｇ／ＩＩおよびＳｐｈＩ制限部位を用いてｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳ中にクローン化した。ｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳ中でＥｃｏＲＩおよびＮｓｉＩ部位を用いて、5’-AATTCTTTCTACTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACCGGAGTCCCGGGTCGGAGACGATGCA-3’（配列番号１９）および5’-TCGTCTCCGACCCGGGACTCCGGGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGTAGAAAG-3’（配列番号２０）を用いたオリゴリンカー結繋により、ＨａｍＲｚカセットを作製した。その結果生じたＰｏｌＩＩ／二重リボザイムベクターｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−１（図１２）のＢｂｓＩおよびＢｓｍＢＩによる消化は、5’-CGTCTCCGGTCAGTAGAAACAAGG-3’（配列番号２１）および5’-CGTCTCCACCCAGCAAAAGCAGG-3’（配列番号２２）を用いたＰＣＲ増幅により得られるウイルスｃＤＮＡ構築物の挿入のための線状化ベクターを産生した。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ駆動性発現およびその後の、５’および３’末端での2つのリボザイムの自己触媒的切断は、確証的３’および５’末端を有するＡ型インフルエンザｖＲＮＡ分子を生じる（図１３）。ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅは、アミノ酸位置627に単一のＬｗｓからＧｌｕへの置換を含有するＨＫ４８３のＰＢ２ｖＲＮＡを発現した。
【０１０６】
組換えウイルスの作製
専らＲＮＡポリメラーゼＩ逆遺伝学系を基礎にした組換えＡ型インフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／３３およびＨＫ３／ＰＢ２−６２７Ｅの生成は、それぞれNeumann et al. (1999)およびHatta et al. (2001)により記載された。
【０１０７】
ＨＫ３／ＰＢ２−６２７Ｅ（図１４）またはＷＳＮ／ＨＫ４８３  ＰＢ２  ６２７Ｅ（図１４）を生成するために、ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅ（0.1 μg、ＰＢ２セグメントの産生のため）を、ＲＮＡポリメラーゼＩによりそれぞれのウイルスの残りのＲＮＡセグメントを産生するためのプラスミド（各々0.1 μg、ｐＰｏｌＩプラスミド）とともに用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。これらの細胞を、ＷＳＮ／３３のＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰのためのタンパク質発現構築物（各々1 μg）を用いても、トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、２９３Ｔ細胞上清のアリコートを収集し、ウイルスをＭＤＣＫ細胞中で増幅するか、またはプラーク検定によりＭＤＣＫ細胞に関して滴定した。組換えウイルスのさらなる分析のために、ウイルスＲＮＡをウイルス上清から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲおよびシーケンシング反応によりＰＢ２  ｖＲＮＡを分析した。陰性対照として、ＰＢ２に関するｖＲＮＡ発現構築物をトランスフェクション混合物から省いた。ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅの代わりに、ＰＢ２  ｖＲＮＡに関するＲＮＡポリメラーゼＩ発現構築物を用いて、陽性対照として役立てた。
【０１０８】
結果
確証的５’および３’末端を有する全長Ａ型インフルエンザｖＲＮＡの合成のために、ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−１を構築した（図１２）。次に全長ウイルスＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、それらがＨＲｚにより５’末端で、そしてＨＤＶＲｚ配列により３’末端で隣接されるよう、挿入した。この二重リボザイムカセットの発現は、ニワトリβアクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサーカセットにより上流で制御される。細胞中へのこのような構築物のトランスフェクション時に、二重リボザイムカセット、例えばウイルス配列を細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写し、そして転写体の両端での自己触媒的リボザイム切断により確証的ｖＲＮＡを生成する（図１３）。
【０１０９】
このアプローチの実現可能性を試験するために、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅを構築した。この構築物は、2つのリボザイム部位間のアミノ酸位置627にＧｌｕを含有するＨＫ３／ＰＢ２−６２７ＥのＰＢ２  ｖＲＮＡをコードする。２９３Ｔ細胞中での12のプラスミドの同時発現により、逆遺伝学アプローチでこの構築物を検定した：ＰＢ２  ｖＲＮＡをｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅにより発現させ、そしてＨＫ３／ＰＢ２−６２７Ｅ残りのｖＲＮＡ（ＰＡ、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＮＡ、ＨＡ）をＲＮＡポリメラーゼＩ系により発現させた；タンパク質発現プラスミドは、Ａ／ＷＳＮ／３３のＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰを提供した（図１４）。陰性対照として、ＰＢ２に関するｖＲＮＡ発現構築物をトランスフェクション混合物から省き、陽性対照として、ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅの代わりに、ＰＢ２  ｖＲＮＡに関するＲＮＡポリメラーゼＩ発現構築物（ｐＰｏｌＩ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅ）に置き換えた。トランスフェクションの48時間後に、２９３Ｔ細胞上清のアリコートを、ＭＤＣＫ細胞とともにインキュベートした。48時間以内に、ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７ＥまたはｐＰｏｌＩ−ＰＢ２／４８３−６２７Ｅでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞由来の上清に関して細胞変性作用（ＣＰＥ）を観察したが、これは、これらの細胞中でのインフルエンザウイルスの生成を示す。ＣＰＥは、ＰＢ２  ｖＲＮＡ発現プラスミドの非存在下では観察されなかった。インフルエンザｖＲＮＡを発現するＲＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム構築物の組合せによりインフルエンザビリオンが実際に生成されたことを立証するために、ｖＲＮＡをＭＤＣＫ細胞上清から単離し、ＰＢ２  ＲＴ−ＰＣＲ産物をアミノ酸位置６２７でシーケンシングした。組合せウイルスは実際、ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７ＥによりコードされるＰＢ２遺伝子を含有した。
【０１１０】
ＲＮＡポリメラーゼＩ／二重リボザイム系の機能性をさらに立証するために、ＨＫＰＢ２−６２７ＥのＰＢ２ｖＲＮＡの産生のためのｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−ＰＢ２／４８３−６２７ＥおよびＡ／ＷＳＮ／３３のＰＡ、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＮＡ、ＨＡ  ｖＲＮＡの産生のためのｐＰｏｌＩプラスミドを、Ａ／ＷＳＮ／３３のＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰのタンパク質発現のためのプラスミドとともに用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした（図１５）。ＰＢ２ｖＲＮＡを含めた全てのｖＲＮＡがｐＰｏｌＩプラスミドにより発現された場合に陽性対照中で観察されたのと同様に、トランスフェクション48時間後に２９３Ｔ細胞の上清中に、5×103 pfu/mlのウイルスが見出された。
【０１１１】
考察
この試験は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系が確証的５’および３’末端を有するＡ型インフルエンザｖＲＮＡを生成し得る、ということを実証する。この系では、強力なニワトリβアクチンプロモーター／ＣＭＳエンハンサーカセットが、ｖＲＮＡの５’末端（ＨＲｚ）および３’末端（ＨＤＶＲｚ）でリボザイム配列により隣接されるＡ型インフルエンザｖＲＮＡをコードするＲＮＡ転写体の発現を駆動する。リボザイム部位でのこの一次ＲＮＡ転写体の自己触媒的切断が、Ａ型インフルエンザｖＲＮＡを生成した。
【０１１２】
この系を用いて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系由来のＰＢ２ｖＲＮＡを保有する組換えＡ型インフルエンザウイルスを生成した。したがってこの実験は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系により生成されるＡ型インフルエンザｖＲＮＡ分子の機能性を明白に立証し、このことは、完全にクローン化ｃＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系がＡ型インフルエンザウイルスおよび／またはその他のセグメント化ＲＮＡウイルスの生成を可能にするはずであることを示す。
【０１１３】
新規のＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系は、今までに記載されたネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに関する2つの逆遺伝学系を上回るいくつかの主要利点を提供する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、宿主細胞特異性を有さない。したがってこのＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム逆遺伝学系は、任意の脊椎動物細胞株に用いられ得る。これに対比して、ＲＮＡポリメラーゼＩは宿主特異的である：ヒトＲＮＡポリメラーゼＩは、マウスプロモーターから転写を開始することができなかったし、その逆でもあった（Grummt et al., 1982; Learned et al., 1982）。さらに、Ｔ７ポリメラーゼ系と比較して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系は、トランスでのＲＮＡポリメラーゼの発現ならびにウイルスＲＮＡ末端の精確なトリミングを必要としないという利点を提供する。多数のウイルスに関して、ウイルスＲＮＡゲノムの的確な３’末端の合成は、効率的ウイルス生成のためには重要である。しかしながらＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ系では、1〜3つのＧヌクレオチドの付加が効率的転写のために必要であり、これは、多くの場合、ウイルス複製誘導の効率を低減し、したがって逆遺伝学による組換え体の生成を提言する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系は、確証的ウイルスＲＮＡと同一の末端を有するＲＮＡ分子を合成する。
【０１１４】
要するに、確証的Ａ型インフルエンザｖＲＮＡを人工的に合成するＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系の能力を示した。これは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩベースの逆遺伝学系由来のＲＮＡセグメントを保有するセグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの生成についての最初の記載である。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系は宿主細胞種に関する制限を受けないため、生物学的安全性対策のために極げんてい数の細胞株のみが用いられ得るワクチン製造に大きな影響を及ぼし得ると思われる。ニワトリ胚繊維芽細胞は生ワクチンの製造のために認可されるべきものであると思われ、したがってこの細胞における候補株が逆遺伝学により生成される。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターはニワトリ胚繊維芽細胞中で機能的でないため（データは示されていない）、ＲＮＡポリメラーゼＩを基礎にした逆遺伝学系は、この系においてはうまくいかない。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系はこれらの制限を克服し、インフルエンザおよびその他のネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに対するワクチン製造のための逆遺伝学系の広範な使用のための基礎を提供すると思われる。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
【表７】
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【０１１９】
出版物、特許および特許出願は全て、参照により本明細書中で援用される。上記の明細書中で、そのある種の好ましい実施形態に関連して本発明を説明し、多数の詳細を例示の目的のために記述してきたが、本発明がさらなる実施形態を受け入れ可能であり、そして本明細書中に記載した詳細のあるものは、本発明の基本原理を逸脱しない限りかなり変更され得る、ということは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１．  確立された逆遺伝学系の模式図である。ＲＮＰトランスフェクション法（Ａ）では、in vitro合成ｖＲＮＡを用いて精製ＮＰおよびポリメラーゼタンパク質をＲＮＰに集合させる。細胞をＲＮＰでトランスフェクトし、その後ヘルパーウイルス感染させる。ＲＮＡポリメラーゼＩ法（Ｂ）では、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、救済されるべきｖＲＮＡをコードするｃＤＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含有するプラスミドを細胞中にトランスフェクトする。ＲＮＡポリメラーゼＩによる細胞内転写は、合成ｖＲＮＡを産生し、これはヘルパーウイルスによる感染時に子孫ウイルス粒子中に包装される。両方法を用いて、ヘルパーウイルス集団から、トランスファクタント・ウイルス（即ちクローン化ｃＤＮＡ由来のＲＮＡを含有するもの）を選択する。
【図２】図２．  ＲＮＡポリメラーゼＩ構築物の生成の模式図。インフルエンザウイルス由来のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＢｓｍＢＩで消化し、そしてｐＨＨ２１ベクターのＢｓｍＢＩ部位中にクローン化した（E. Hoffmann, Ph.D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany）が、これは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター（Ｐ）およびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーター（Ｔ）を含有する。ターミネーター配列の上流のチミジンヌクレオチド（*Ｔ）は、インフルエンザウイルスＲＮＡの３’末端を表す。Ａ型インフルエンザウイルス配列は、太字で示されている（配列番号２６〜３７）。
【図３】図３．  セグメント化ネガティブ−センスＲＮＡウイルスを生成するための提唱された逆遺伝学法。ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、8つのウイルスＲＮＡセグメントの各々に関するｃＤＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含有するプラスミドを、タンパク質発現プラスミドと一緒に、細胞中にトランスフェクトする。感染性ウイルスはＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰを発現するプラスミドを用いて精製し得るが、しかし残りの構造タンパク質（大括弧内に示される）全ての発現は、生成されるウイルスによってウイルス産生の効率を増大する。
【図４】図４．  トランスフェクタント・ウイルスに感染した細胞中のＦＬＡＧエピトープの検出。抗体染色を用いて、ＰＲ８−ＷＳＮ−ＦＬ７９（Ａ，Ｄ）またはＡ／ＷＳＮ／３３野生型ウイルス（Ｂ、Ｅ）に感染したＭＤＣＫ細胞中の、または偽感染ＭＤＣＫ細胞（Ｃ、Ｆ）におけるＮＡを同定した。感染9時間後に、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、トリトンＸ−100で処理し、抗ＦＬＡＧ（Ａ〜Ｃ）または抗ＷＳＮ  ＮＡ（Ｄ〜Ｆ）モノクローナル抗体とともにインキュベートした。強ゴルジ染色（赤色）が、陽性試料（Ａ、ＤおよびＥ）において明白である。
【図５】図５．  ＰＡ突然変異体の回収。1226 bp断片（ｍＲＮＡの位置677〜1903、レーン１、３、５）を産生するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより各ウイルスのＰＡ遺伝子を増幅し、これを次に制限酵素Ｂｓｐ１  ２０Ｉ（ｍＲＮＡの位置846、レーン４、７）またはＰｖｕＩＩ（ｍＲＮＡの位置1284、レーン２、６）で消化した。ＰＣＲ産物中のＢｓｐ１  ２０ＩまたはＰｖｕＩＩ部位の存在は、それぞれ169 bpおよび1057 bpまたは607 bpおよび619 bp断片を産生した。ＭＷ＝分子量マーカー。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂ．  インフルエンザ配列を増幅するために用いられるプライマー（配列番号１〜１６）。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂ．  インフルエンザ配列を増幅するために用いられるプライマー（配列番号１〜１６）。
【図７】図７．  ＧＦＰタンパク質をコードするインフルエンザウイルス様（ＶＬＰ）ＲＮＡを生成するためのｐＰｏｌＩ−ＧＦＰプラスミド。このプラスミドは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターに隣接されるＡ型インフルエンザウイルスセグメント５の５’および３’非コード領域間にアンチセンス配向でＧＦＰ遺伝子（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１由来；Clontech, Palo Alto, CA）を含有する。個々のタンパク質発現プラスミド、ならびにＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、ＧＦＰレポーター遺伝子をコードするｃＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターを含有するプラスミドを、２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトする。ＲＮＡポリメラーゼＩによる細胞内転写は、逆文字により示されるようなネガティブ極性のＧＦＰ  ｖＲＮＡを産生する。ＶＬＰを含有する上清を収穫し、インフルエンザヘルパーウイルスと混合し、ＭＤＣＫ細胞中に接種する。
【図８】図８．  Ａ型インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩにより産生されたＧＦＰ  ｖＲＮＡをキャプシド形成して、ＧＦＰ発現をもたらす。レポーター遺伝子ｖＲＮＡの細胞内合成のために、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡおよびＮＰタンパク質を発現するプラスミド（Ａ）、またはＮＰタンパク質を発現するもの以外の全てのプラスミド（Ｂ）を、ＲＮＡポリメラーゼＩ−ＧＦＰ遺伝子プラスミドと一緒に用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの48時間後に固定し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現を確定した。
【図９】図９．  感染性インフルエンザＶＬＰの生成。各々異なるウイルス構造タンパク質を発現する9つのプラスミドを（Ａ）、あるいはＮＰに関する構築物を欠いた8つのプラスミドを（Ｂ）、ＲＮＡポリメラーゼＩ−ＧＦＰ遺伝子プラスミドと一緒に用いて、２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション48時間後、ＶＬＰ含有上清を収集し、Ａ／ＷＳＮ／３３ヘルパーウイルスと混合し、ＭＤＣＫ細胞中に接種した。細胞を感染10時間後に固定し、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現を確定した。
【図１０】図１０．  そのゲノムが組換えＤＮＡ分子で増強される細胞中でインフルエンザＮＳ２タンパク質を発現するためのＣｒｅリコンビナーゼの使用についてのスキーム。細胞のゲノムは、ＮＳ２遺伝子に連結された一次部位特異的組換え部位と同一配向での二次部位特異的組換え部位に連結された転写停止配列に連結された部位特異的組換え部位（例えばｌｏｘＰ）に連結されたプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子を含む。
【図１１】図１１．  複製欠損インフルエンザウイルスの調製。
【図１２】図１２．  ｐＣＡＧＧＳ−２Ｒｉｂｏ−１のベクター地図。脊椎動物細胞では、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、強力なニワトリβアクチンプロモーター／ＣＭＶエンハンサーカセットの制御下にある二重リボザイムカセットのＲＮＡ転写を駆動する。ウイルスｃＤＮＡを、ハンマーヘッドリボザイム部位（ＨａｍＲｚ）の下流およびＨＤＶリボザイム部位（ＨＤＶＲｚ）の上流にクローン化する。
【図１３】図１３．  逆遺伝学に関する全長ｖＲＮＡを生成するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系の模式図。ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより生成される一次ｍＲＮＡ転写体は、2つのリボザイム部位（ＨａｍＲｚおよびＨＤＶＲｚ）に隣接されるｖＲＮＡを含む。リボザイムによる自己触媒的切断は、５’および３’末端を有するｖＲＮＡを生じ、これはウイルス転写および複製における鋳型として役立つ。
【図１４】図１４．  クローン化ｃＤＮＡからのＨＫ３ＰＢ２−６２７Ｅウイルスの生成。ＲＮＡポリメラーゼＩ系によりＨＫ３／ＰＢ２−６２７ＥのＰＡ、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＮＡおよびＨＡ  ｖＲＮＡを合成し、一方、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系によりＰＢ２  ｖＲＮＡを提供する。タンパク質発現構築物により発現されるウイルスＮＰおよびポリメラーゼタンパク質は、ｖＲＮＡを複製し、転写して、全てのウイルスタンパク質の合成、ならびに複製インフルエンザウイルスの生成を生じる。
【図１５】図１５．  クローン化ｃＤＮＡからのＷＳＮ／ＨＫ３ＰＢ２−６２７Ｅウイルスの生成。ＲＮＡポリメラーゼＩ系によりＡ／ＷＳＮ／３３のＰＡ、ＰＢ１、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＮＡおよびＨＡ  ｖＲＮＡを合成し、一方、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ／二重リボザイム系によりＷＳＮ／ＨＫ３ＰＢ２−６２７ＥのＰＢ２  ｖＲＮＡを提供する。タンパク質発現構築物により発現されるウイルスＮＰおよびポリメラーゼタンパク質は、ｖＲＮＡを複製し、転写して、全てのウイルスタンパク質の合成、ならびに複製インフルエンザウイルスの生成を生じる。
【図１６】図１６は、例示的ハンマーヘッド（ＨＨ）、ヘアピン（ＨＰ）およびＨＤＶリボザイム配列（配列番号２３〜２５）。実線矢印は、自己プロセシング部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
2006525815.tif 000013
【図４Ｂ】
2006525815.tif 000014
【図４Ｃ】
2006525815.tif 000015
【図４Ｄ】
2006525815.tif 000016
【図４Ｅ】
2006525815.tif 000017
【図４Ｅ】
2006525815.tif 000018
【図５】
2006525815.tif 000019
【図６Ａ】
2006525815.tif 000020
【図６Ｂ】
2006525815.tif 000021
【図７】
2006525815.tif 000022
【図８Ａ】
2006525815.tif 000023
【図８Ｂ】
2006525815.tif 000024
【図９Ａ】
2006525815.tif 000025
【図９Ｂ】
2006525815.tif 000026
【図１０】
2006525815.tif 000027
【図１１】
2006525815.tif 000028
【図１２】
2006525815.tif 000029
【図１３】
2006525815.tif 000030
【図１４】
2006525815.tif 000031
【図１５】
2006525815.tif 000032
【図１６】
2006525815.tif 000033
【配列表】
2006525815000001.app
【国際調査報告】
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