(57)【要約】本発明は、変形性関節症（ＯＡ）を罹患した個体の同定における特定の有利性を証明する配列の同定および選択に関する。本発明はまた、個体の変形性関節症の進行度の診断およびＯＡの新規の治療標的の同定で特に有用な配列の選択を提供する。本発明は、さらに、疾患進行の診断および治療計画の有効性のモニタリングのためのツールとしてのこれらの配列の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項２】
図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項３】
本質的に図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる単離されたバイオマーカー。
【請求項４】
図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項５】
図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項６】
図６ｂで同定された核酸から本質的になる単離されたバイオマーカー。
【請求項７】
図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項８】
図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項９】
図６ｃで同定された核酸から本質的になる単離されたバイオマーカー。
【請求項１０】
図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項１１】
図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される２以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカー。
【請求項１２】
図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸から本質的になる単離されたバイオマーカー。
【請求項１３】
サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含む個体の軽度変形性関節症の診断方法であって、前記バイオマーカーが図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により軽度変形性関節症の指標となるか、軽度変形性関節症の予測となる、方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチド配列が、図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチド配列が、図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチド配列が、図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含む個体の重度変形性関節症の診断方法であって、前記バイオマーカーが図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により重度変形性関節症の指標となるか、重度変形性関節症の予測となる、方法。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチド配列が、図２、４、５、６ｄ、７ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチド配列が、図２、４、５、６ｄ、７ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチド配列が、図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含む個体の中程度変形性関節症の診断方法であって、前記バイオマーカーが図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により中程度変形性関節症の指標となるか、中程度変形性関節症の予測となる、方法。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチド配列が、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド配列が、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチド配列が、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含む個体の著しい変形性関節症の診断方法であって、前記バイオマーカーが図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により著しい変形性関節症の指標となるか予測される、方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチド配列が、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド配列が、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチド配列が、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の請求項２に記載の単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、
（ｃ）前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの前記発現レベルの相違を決定するステップと、ここで前記相違が前記患者の軽度変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、
を含む、患者の軽度変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法。
【請求項３０】
（ａ）治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の請求項５に記載の単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、
（ｃ）前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの前記発現レベルの相違を決定するステップと、ここで、前記相違が前記患者の中程度変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、
を含む、患者の中程度変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法。
【請求項３１】
（ａ）治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の請求項８に記載の単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、
（ｃ）前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの前記発現レベルの相違を決定するステップと、ここで、前記相違が前記患者の著しい変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、
を含む、患者の著しい変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法。
【請求項３２】
（ａ）治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと、
（ｂ）前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の請求項１１に記載の単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと、
（ｃ）前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの発現レベルの相違を決定するステップと、ここで、前記相違が前記患者の重度変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、
を含む、患者の重度変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法。
【請求項３３】
（ａ）変形性関節症と診断された患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）治療薬の有無における図１〜７に記載のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと、
（ｃ）前記治療薬の存在下で測定した発現レベルと前記治療薬の非存在下で測定した発現レベルを比較するステップと、前記バイオマーカーの発現の相違の減少が変形性関節症治療用の治療薬の指標となることと、
を含む、変形性関節症の治療薬の同定方法。
【請求項３４】
前記サンプルがヒト軟骨である、請求項１３、１７、２１、２５、２９、３０、３１、３２、または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記バイオマーカーがマイクロアレイに固定されている、請求項１３、１７、２１、２５、２９、３０、３１、３２、または３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記バイオマーカーの発現レベルをマイクロアレイへのハイブリッド形成または実時間ＲＴ−ＰＣＲによって決定する、請求項１３、１７、２１、２５、２９、３０、３１、３２、または３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２００２年９月１２日提出の米国特許仮出願番号６０／４１０，１８０号の利益を主張する。上記出願の教示全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、変形性関節症（ＯＡ）を罹患した個体の同定における特定の有利性を証明する配列の同定および選択に関する。本発明はまた、個体の変形性関節症の進行度の診断およびＯＡの新規の治療標的の同定で特に有用な配列の選択を提供する。本発明は、さらに、疾患進行の診断および治療計画の有効性のモニタリングのためのツールとしてのこれらの配列の使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）は、関節表面を形成する骨の末端に存在する関節軟骨が長期にわたり徐々に変性する慢性疾患である。患者を変形性関節症にかかりやすくすると考えられる多数の素因（遺伝的感受性、肥満症、偶発性または運動による外傷、手術、薬物、および重労働が含まれる）が存在する。変形性関節症は、関節軟骨の損傷によって発症する。関節の２つの最も一般的な損傷は、スポーツ関連損傷および長期の「反復使用による」関節の損傷である。最も一般的に変形性関節症に影響を受ける関節は、ヒザ、臀部、および手である。ほとんどの場合、ヒザおよび臀部の不可欠な体重負荷機能により、これらの関節の変形性関節症は、手の変形性関節症よりもさらに能力的な障害を受ける。軟骨変性が進行するにつれて、他の組織および骨、筋肉、靭帯、半月板、および滑膜を含む関節周囲で二次的変化が起こる。軟骨組織の一次故障および他の組織への二次的損傷の正味の影響は、患者が罹患関節の痛み、腫れ、機能的能力の脆弱性および喪失を経験することである。これらの症状は頻繁に患者の生産性およびまたは生活の質の結果の喪失に関して有意に影響を与える点まで進行する。
【０００４】
関節軟骨は、主に、軟骨細胞、ＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカン、および水から構成される。関節軟骨は血液または神経が供給されず、軟骨細胞がこの組織中の唯一の組織型である。軟骨細胞は、軟骨基質を形成するＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンの製造を担う。この基質は、基質を水で満たす物理化学的性質も有する。この構造−機能関係の正味の効果は、関節軟骨が優れた磨耗特性を有し、且つ関節軟骨表面間の無摩擦運動を可能にすることである。変形性関節症の非存在下で、関節軟骨はしばしば厳しい物理的条件下でさえも一生体重負荷に対して無痛であり、且つ関節の動きに制限がない。
【０００５】
胎児成長時、関節軟骨は最初に帯間間葉の濃縮に由来する。間葉細胞は互いに集団化し、基質タンパク質を合成する。基質の蓄積により細胞が分離して形状が球状になる場合に、組織は軟骨と認識し、ここで軟骨細胞と呼ばれる。軟骨の形成および成長時、軟骨細胞は急速に増殖し、大量の基質を合成する。骨格の成熟前に、軟骨細胞はその代謝活性レベルが最も高くなる。骨格が成熟した場合、軟骨細胞の代謝活性および細胞分裂の速度が減少する。骨格の完全な成長後、ほとんどの軟骨細胞は分裂しないが、コラーゲン、プロテオグリカン、および他の非コラーゲンタンパク質などの基質タンパク質を合成し続ける。（Ｚａｌｅｓｋｅ  ＤＪ．Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎｓｔｒ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｌｅｃｔ  １９９８；４７：４６１−）；（Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ＪＡ，Ｍａｎｋｉｎ  ＨＪ．Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ：Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ−Ｍａｔｒｉｘ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｉｎｓｔｒ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｌｅｃｔ  １９９８；４７：４７７−８６．）
【０００６】
全ての生組織と同様に、関節軟骨は「古い」細胞および基質成分が除去されて（異化作用）、「新規の」細胞および分子を産生する（同化作用）新生プロセスを継続的に受ける。ほとんどの組織と比較して、関節軟骨における同化／異化の代謝回転速度は遅い。成熟軟骨構造の完全性の長期維持は、基質の合成と分解との間の適切なバランスに依存する。軟骨細胞は、その環境からの化学的および機械的刺激への応答によって基質の均衡を維持する。これらの刺激に対する適切且つ有効な軟骨細胞の応答は、軟骨ホメオスタシスに不可欠である。不適切な同化作用または過剰な異化作用のいずれかによるホメオスタシスの破壊により、軟骨が分解するか変形性関節症を発症し得る。（Ｗｅｓｔａｃｏｔｔ  ＣＩ，Ｓｈａｒｉｆ  Ｍ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｒ  Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  Ｊｏｉｎｔ  Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ？  Ｓｅｍｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９９６；２５：２５４−７２）。損傷を受けて異化作用が増加したほとんどの組織は、同化応答が増加し始めて組織が治癒し得る。不運なことに、軟骨細胞の軟骨基質の損傷または喪失への応答において同化作用をアップレギュレートしてプロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの合成を増大させる能力は非常に限られている。軟骨細胞のこの基本的な制限は、変形性関節症を防止および治癒し得る治療の開発を妨げている中心的な問題である。さらに、初期変形関節症を検出するための決定的な診断試験および患者の治療に対する応答を有効にモニタリングする予後試験が必要である。
【０００７】
関節痛は、初期変形性関節症の最も一般的な徴候である。痛みは、一時的に数日間から数週間持続し、自然に軽減する傾向がある。関節の赤みおよび腫れは共通しておらず、変形性関節症の急激な再発時に関節は圧痛がある。
【０００８】
「軽度」または「初期段階の変形性関節症」は、診断が困難である。医師は、主に、軽度変形性関節症の診断には患者の病歴および身体検査に依存する。Ｘ線では、関節軟骨の潜在的な初期の変化が認められない。初期段階の変形性関節症の診断の確認に使用される生化学マーカーは認識されない。
【０００９】
Ｘ線の変化により、中程度変形性関節症の診断を確認する。正常な関節のＸ線により、十分に保存された対照的な関節の空間が明らかとなる。変形性関節症患者のＸ線で認められる変化には、新規の骨形成（骨増殖体）、関節空間の狭小、および硬化（骨の肥厚）が含まれる。この段階では、「中程度変形性関節症」の診断の確認に使用される生化学マーカーは認識されない。
【００１０】
重度変形性関節症の関節の臨床試験により、柔らかさ、関節の変形、および可動度の喪失が明らかとなる。試験時の受動的関節運動により、関節が動くにつれて骨と骨との関節摩擦音または研磨を誘発し得る。Ｘ線の変化はしばしば著しい：関節空間が消滅し、関節のずれが認められる。新規の骨形成（骨増殖体）が顕著である。さらに、「重度変形性関節症」の診断の確認のために使用した生化学マーカーは認識されない。
【００１１】
「変形性関節症」は、最も一般的な慢性関節疾患である。これは、進行性の軟骨の分解および最終的な喪失によって特徴付けられる。現在、変形性関節症の治療単位を変化させる有効な治療が必要である。変形性関節症の疾患過程の予防、修正、または治癒のさらなる発展は、臨床的に少なくとも一部が軟骨の同化および異化過程の基礎をなす分子機構の完全な理解に依存する。細胞機能が実質的に細胞を発現する遺伝子によって決定されるので、異なる発達および疾患段階での関節軟骨で発現される遺伝子の解明により、必然的に軟骨の形成、損傷、疾患、および修復に関与する分子および機構に対する新規の洞察が得られる。
【００１２】
推定的に正常および重度の変形性関節症のヒト軟骨組織由来のｃＤＮＡライブラリーが構築されている（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，４６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ，ｐ．１０３１）。しかし、この研究は、重症度の異なるヒト変形性関節症（軽度、中程度、著しい（ｍａｒｋｅｄ）、および重度）の軟骨由来の軟骨細胞遺伝子発現の相違に適切に取り組んでいない。さらに、死後２４時間以上の死亡ドナーから「正常な軟骨」サンプルを得ていた。したがって、このｃＤＮＡライブラリーは、下記のヒヒでの研究によって証明されたサンプリングした関節への灌流の停止後に起こる急速なＲＮＡの分解のために正常な軟骨細胞の遺伝子発現を真に反映しない。
【００１３】
異なる重症度の変形性関節症を証明する個体由来のｃＤＮＡライブラリーの構築時でさえ、変形性関節症の診断に特に有用な配列を同定することが困難であった。より重要には、以前の研究は、初期の検出および治療の両方を補助するための変形性関節症の進行度の診断または新規の治療標的の同定のいずれかに有効な配列を同定していなかった。
【００１４】
異なる重症度の変形性関節症を証明する個体由来のｃＤＮＡライブラリーの構築時でさえ、変形性関節症の診断に特に有用な配列を同定することが困難であった。より重要には、以前の研究は、初期の検出および治療の両方を補助するための変形性関節症の進行度の診断に有効な配列を同定していなかった。さらに、以前の研究は、変形性関節症の治療に有用な薬剤の同定に有効な配列を同定していなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、変形性関節症（ＯＡ）を罹患した個体の同定における特定の有利性を証明する配列の同定および選択に関する。本発明はまた、個体の変形性関節症の進行度の診断およびＯＡの新規の治療標的の同定で特に有用な配列の選択を提供する。本発明は、さらに、疾患進行の診断および治療計画の有効性のモニタリングのためのツールとしてのこれらの配列の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は、図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１７】
１つの実施形態では、本発明は、図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明は、本質的に図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる単離されたバイオマーカーを提供する。
【００１９】
１つの実施形態では、本発明は、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２０】
１つの実施形態では、本発明は、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２１】
１つの実施形態では、本発明は、本質的に図６ｂで同定された核酸からなる単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、本発明は、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明は、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明は、図６ｃで同定された核酸から本質的になる単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２５】
１つの実施形態では、本発明は、図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される５１％以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２６】
１つの実施形態では、本発明は、図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される２つまたはそれ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２７】
１つの実施形態では、本発明は、本質的に図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる単離されたバイオマーカーを提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記バイオマーカーが図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により軽度変形性関節症の指標となるか、軽度変形性関節症の予測となる、個体の軽度変形性関節症の診断方法を教示する。
【００２９】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する。
【００３０】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する。
【００３１】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図１、３、５、６ａ、７ａで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記バイオマーカーが図２、４、５、６ｄ、７ｂで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により重度変形性関節症の指標となるか、重度変形性関節症の予測となる、個体の重度変形性関節症の診断方法を教示する。
【００３３】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図２、４、５、６ｄ、７ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する。
【００３４】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図２、４、５、６ｄ、７ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する。
【００３５】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図２、４、５、６ｄ、７ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記バイオマーカーが図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により中程度変形性関節症の指標となるか、中程度変形性関節症の予測となる、個体の中程度変形性関節症の診断方法を教示する。
【００３７】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する。
【００３８】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する。
【００３９】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、サンプル中のバイオマーカーの発現レベルを決定するステップを含み、前記バイオマーカーが図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される１以上のポリヌクレオチド配列を含み、それによりバイオマーカーコントロールと比較した前記バイオマーカーの発現レベルの相違により著しい（ｍａｒｋｅｄ）の変形性関節症の指標となるか予測される、個体の著しい変形性関節症の診断方法を教示する。
【００４１】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の５’領域に由来する。
【００４２】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の３’領域に由来する。
【００４３】
さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチド配列が、図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される遺伝子の内部コード領域に由来する。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと；前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の図１、３、５、６ａ、および７ａで同定された核酸からなる群から選択される２つまたはそれ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと；前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの発現レベルの相違を決定するステップとを含み、前記発現レベルの相違が前記患者の軽度変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、患者の軽度変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法を教示する。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと；前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の図６ｂで同定された核酸からなる群から選択される２つまたはそれ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと；前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの発現レベルの相違を決定するステップとを含み、前記発現レベルの相違が前記患者の中程度変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、患者の中程度変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法を教示する。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと；前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の図６ｃで同定された核酸からなる群から選択される２つまたはそれ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと；前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの発現レベルの相違を決定するステップとを含み、前記発現レベルの相違が前記患者の著しい変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、患者の著しい変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法を教示する。
【００４７】
別の実施形態では、本発明は、治療前の患者からサンプルを得て、治療後に前記患者から第２のサンプルを得るステップと；前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中の図２、４、５、６ｄ、および７ｂで同定された核酸からなる群から選択される２つまたはそれ以上の遺伝子を含む単離されたバイオマーカーの発現レベルを検出するステップと；前記第２のサンプルと比較して前記第１のサンプル中の前記バイオマーカーの発現レベルの相違を決定するステップと、前記発現レベルの相違が前記患者の重度変形性関節症の治療薬の有効性の指標となる、患者の重度変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする方法を教示する。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、変形性関節症と診断された患者からサンプルを得るステップと；治療薬の有無における図１〜７に記載のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップと；前記治療薬の存在下で測定した発現レベルと前記治療薬の非存在下で測定した発現レベルを比較するステップと、前記バイオマーカーの発現の相違の減少が変形性関節症治療用の治療薬の指標となることとを含む、変形性関節症の治療薬の同定方法を教示する。
【００４９】
別の実施形態では、サンプルがヒト軟骨である。
【００５０】
別の実施形態では、バイオマーカーがマイクロアレイに固定されている。
【００５１】
別の実施形態では、バイオマーカーの発現レベルをマイクロアレイへのハイブリッド形成または実時間ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、上記の１以上の本発明の単離されたバイオマーカーの単離されたバイオマーカーおよびそのパッケージング手段を含むキットを提供する。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、固体支持体に結合した上記の１以上の本発明の単離されたバイオマーカーの単離されたバイオマーカーを含むマイクロアレイを提供する。
【００５４】
本発明の目的および特徴を、以下の詳細な説明および図面を参照してより深く理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
本発明は、異なる疾患進行段階での軟骨細胞における差分的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｌ）遺伝子発現を同定するためのヒト軟骨細胞で発現された遺伝子配列のプロファイリング方法に関する。差分的に発現された遺伝子およびその産物（例えば、ｍＲＮＡおよびタンパク質）を、変形性関節症の診断方法、予後方法、スクリーニング方法、または治療方法で使用することができる。
【００５６】
本発明の実施は、他で記載しない限り、当業者の範囲内の従来の分子生物学技術、微生物学技術、および組換えＤＮＡ技術を使用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；および叢書のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９５）を参照のこと。
【００５７】
［定義］
本発明の実施は、他で記載しない限り、当業者の範囲内の従来の分子生物学技術、微生物学技術、および組換えＤＮＡ技術を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；および叢書のＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９５）を参照のこと。本明細書中に記載の全ての特許、特許出願、および刊行物（前述および後述）は、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【００５８】
以下の定義は、以下の明細書で使用した特定の用語について記載する。
【００５９】
本明細書中で使用される、「変形性関節症」は、特定の形態の関節炎、特に、関節面を形成する骨の末端に存在する関節軟骨が長期にわたり徐々に変性する慢性疾患をいう。軟骨の変性は、不均衡な異化作用（「古い」細胞および基質成分の除去）および同化作用（「新規の」細胞および分子の産生）に起因し得る（Ｗｅｓｔａｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｓｅｍｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，２５：２５４−７２）。
【００６０】
本明細書中で使用される、「軟骨」または「関節軟骨」は、哺乳動物（ヒトおよび他の種が含まれる）の弾力性のある半透明の結合組織をいう。軟骨は、主に、軟骨細胞、ＩＩ型コラーゲン、少量の他のコラーゲン型、他の非コラーゲンタンパク質、プロテオグリカン、および水から構成され、通常、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンの基質ならびに他のプロテオグリカン中の線維芽細胞から構成される軟骨膜で囲まれている。ほとんどの軟骨は、成熟時に骨となるが、いくつかの軟骨は、鼻、耳、膝、および他の関節などの位置で元の形態のままである。軟骨は血液または神経が供給されず、軟骨細胞がこの組織中の唯一の組織型である。
【００６１】
本明細書中で使用される、「軟骨細胞」は、軟骨由来の細胞をいう。
【００６２】
本明細書中で使用される、「滑液」は、各関節を囲む「滑膜」から分泌される流動物をいう。滑液は、関節を保護し、関節を潤滑して関節軟骨に栄養分を与えるように作用する。本発明に有用な滑液は、本明細書中に記載の当分野で周知の方法によってＲＮＡを単離することができる細胞を含む。
【００６３】
本明細書中で使用される、用語「変形性関節症（ＯＡ）の病期分類」または「変形性関節症（ＯＡ）の悪性度分類」は、軟骨疾患の発症および／またはその進行または後退の程度の決定をいう。軟骨を異なる病期に分類するために、当分野で公知の方法による評価システムを使用する。好ましくは、Ｍａｒｓｈａｌｌ（Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｗ．，１９９６，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２３：５８２−５８４（参照することにより組み込まれる））に記載の評価システムを使用する。この方法によれば、６つの各関節面（膝蓋骨、大腿骨滑車、大腿骨内側顆、内側脛骨プラトー面、大腿骨外側顆、および外側脛骨プラトー面）を、特定の表面上に存在する最悪の病変に基づいて軟骨悪性度に割り当てる。次いで、各関節面が関節面の軟骨重症度を反映するＯＡ重症度数を与えられる評価システムを適用する。例えば、大腿骨内側顆がその最も重篤な軟骨損傷としてグレードＩ病変を有する場合、値１を割り当てる。次いで、患者の全スコアは、６つの関節面に対するスコアの合計に由来する。全スコアに基づいて、各患者を、以下の４つのＯＡ群に分類する。「軽度」（初期）はマーシャルスコアが１〜６と定義し、「中程度」はマーシャルスコアが７〜１２と定義し、「著しい」はマーシャルスコアが１３〜１８と定義し、「重度」はマーシャルスコアが１８を超えると定義する。
【００６４】
本明細書中で使用される、「診断」は、個体が疾患または病気であるかどうかを決定するプロセスをいう。本発明によれば、「ＯＡの診断」または「ＯＡ診断」は、個体がＯＡを罹患しているかどうかの決定、または一旦患者がＯＡと診断されると、当分野で公知の方法（すなわち、関節Ｘ線）を使用した患者の病歴および身体検査に基づいたＯＡの病期または悪性度の決定を意味する。好ましくは、ＯＡ病期を、マーシャル（前出）によって記載された評価システムを使用して測定する。「ＯＡの予後」は、ＯＡ患者の予想される発症および／または進行の予測ならびにＯＡからの回復見込みまたはＯＡの症状の改善の見込み、またはＯＡの逆転の見込みをいう。
【００６５】
本明細書中で使用される、「患者」は、関節炎と診断された哺乳動物をいい、さらに軽度、中程度、著しい、または重度のＯＡと診断された哺乳動物が含まれる。
【００６６】
本明細書中で使用される、「正常」は、いかなるＯＡの症状（関節痛が含まれる）も示さず、軟骨損傷またはＯＡと診断されなかった個体または個体群をいう。好ましくは、正常な個体は、ＯＡに影響を与える投薬を受けておらず、いかなる他の疾患とも診断されていなかった。より好ましくは、正常な個体は、試験サンプルと比較して類似の性、年齢、および体格指数（ＢＭＩ）である。本発明の「正常な」はまた、正常な個体から単離したサンプルをいい、正常な個体から単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡが含まれる。正常な個体から採取したサンプルには、ＯＡと診断されず、且つ組織採取時にいかなるＯＡの症状も示さない個体由来の軟骨組織から単離した全軟骨または一部からＲＮＡを単離した、軟骨組織サンプルから単離したＲＮＡが含まれ得る。本発明の１つの実施形態では、「正常な」軟骨サンプルを死後１４時間で単離し、抽出したｍＲＮＡサンプルの完全性を確認する。正常な個体から採取したサンプルには、サンプルが単離された時点でＯＡと診断されず、且ついかなるＯＡの症状も示さない個体に由来するサンプルから単離したＲＮＡも含まれ得る。
【００６７】
本明細書中で使用される、用語「バイオマーカー」は、疾患時に異なる調節を受ける遺伝子セットをいう。
【００６８】
本明細書中で使用される、「単離されたバイオマーカー」は、バイオマーカーが混合物から単離され、それにより混合物の一部ではなく、５０遺伝子を超えるＷＯ０２／０７０７３７号に教示のＯＡ遺伝子を含むＯＡ遺伝子セットを含むことを意味する。
【００６９】
用語「〜を含む」は、列挙された配列（すなわち、「バイオマーカー」配列）を含み、且つ記載されていない配列も含むことを意味する。
【００７０】
用語「〜からなる」は、バイオマーカー中に記載の配列のみが存在し、且つバイオマーカー中に他の配列が存在しないことを意味する。
【００７１】
用語「〜から本質的になる」は、バイオマーカー中に列挙された配列（すなわち、ＯＡ病期特異的配列）が存在することを意味する。用語「〜から本質的になる」は、ＯＡに特異的なさらなる列挙されていない配列がバイオマーカー中に存在しないことを意味する。したがって、「本質的にからなる」は、ＯＡに特異的でない配列を排除しない。本明細書中で定義されるＯＡ特異的または病期特異的ＯＡは、所与の配列が、正常（ＯＡを罹患していない）と比較して、軽度、中程度、著しい、および／または重度ＯＡ中で差分的に発現することを意味する。
【００７２】
１つの実施形態では、変形性関節症の診断のためのバイオマーカーは、本質的に図１〜７に記載の遺伝子からなる。
【００７３】
別の実施形態では、軽度変形性関節症の診断のためのバイオマーカーは、本質的に図１、３、５、６ａ、または７ａに開示の遺伝子からなる。
【００７４】
別の実施形態では、重度変形性関節症の診断のためのバイオマーカーは、本質的に図２、４、５、６ｄ、または７ｂに記載の遺伝子からなる。
【００７５】
別の実施形態では、中程度変形性関節症の診断のためのバイオマーカーは、本質的に図６ｂに開示の遺伝子からなる。
【００７６】
別の実施形態では、著しい変形性関節症の診断のためのバイオマーカーは、本質的に図６ｃに開示の遺伝子からなる。
【００７７】
本明細書中で使用される、「遺伝子」は、ｍＲＮＡをコードするＤＮＡをいい、コード領域の上流にプロモーターおよびエンハンサーを含まない。
【００７８】
本明細書中で使用される、「〜によってコードされるポリペプチド配列」は、本明細書中で定義される遺伝子のタンパク質コード領域の翻訳後に得られるアミノ酸配列をいう。各遺伝子のｍＲＮＡヌクレオチド配列を、そのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号（図１〜７を参照のこと）によって区別し、対応するポリペプチド配列をＰｒｏｔｅｉｎアクセッション番号またはＧｅｆＳｅｑまたはＲｅｆＳｅｑ（図１〜７を参照のこと）によって区別する。図１〜７で同定したＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号は、各遺伝子のｍＲＮＡヌクレオチド配列内の５’ＵＴＲ、タンパク質コード領域（ＣＤＳ）、および３’ＵＴＲの位置を示す。
【００７９】
タンパク質またはタンパク質のフラグメントを使用して宿主動物を免疫化する場合、多数のタンパク質領域は、タンパク質上の所与の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導することができる；これらの領域または構造をエピトープまたは抗原決定基という。本明細書中で使用される、「抗原フラグメント」は、１以上のエピトープを含むポリペプチド部分をいう。エピトープは、線状（本質的に抗原由来の線状配列を含む）または高次構造（他の配列によって遺伝的に離れているが、ポリペプチドリガンドの結合部位で構造的に一体となる配列を含む）であり得る。「抗原フラグメント」は、５０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、２０、１０、または５アミノ酸長であり得る。
【００８０】
本明細書中で使用される、「５’末端」は、最初の１０００ヌクレオチドまでのｍＲＮＡの末端またはｍＲＮＡの最初のヌクレオチドから始まるｍＲＮＡの１／３（ｍＲＮＡの全長は、ポリＡテールを含まない）をいう。遺伝子の「５’領域」は、遺伝子の５’末端内または５’末端に存在するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）をいい、５’非翻訳領域（これが存在する場合、遺伝子の５’タンパク質コード領域）が含まれるが、これらに限定されない。５’領域は、８ヌクレオチド長より短くなく、且つ１０００ヌクレオチド長を超えない。他の可能な５’領域の長さには、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００、および５００ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書中で使用される、「３’末端」は、最後の１０００ヌクレオチドまでのｍＲＮＡの末端またはｍＲＮＡの１／３（３’末端ヌクレオチドがポリＡテール（存在する場合）に随伴するコード領域または非翻訳領域の末端ヌクレオチドである）をいう。したがって、ｍＲＮＡの３’末端には、ポリＡテール（存在する場合）を含まない。遺伝子の「３’領域」は、遺伝子の３’末端内または３’末端に存在するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）をいい、３’非翻訳領域（これが存在する場合、遺伝子の３’タンパク質コード領域）が含まれるが、これらに限定されない。３’領域は、８ヌクレオチド長より短くなく、且つ１０００ヌクレオチド長を超えない。他の可能な３’領域の長さには、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００、および５００ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本明細書中で使用される、遺伝子の「内部コード領域」は、本明細書中に定義の遺伝子の５’領域と３’領域との間に存在するポリヌクレオチド（二本鎖または一本鎖）をいう。「内部コード領域」は、８ヌクレオチド長よりも短くなく、且つ１０００ヌクレオチド長を超えない。他の可能な「内部コード領域」の長さには、１０、２０、２５、５０、１００、２００、４００、および５００ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
５’、３’、および内部領域は重複せず、連続し得るがその必要はなく、且つ合計で対応する遺伝子の全長までであり得るがその必要はない。
【００８４】
本明細書中で使用される、ポリペプチドの「アミノ末端」領域は、遺伝子の５’末端内または５’末端に存在するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列をいい、遺伝子の５’タンパク質コード領域が含まれるが、これに限定されない。本明細書中で使用される、「アミノ末端」領域は、最初の３００アミノ酸までのポリペプチドまたはポリペプチドの最初のアミノ酸から始まるポリペプチドの１／３のアミノ末端をいう。ポリペプチドの「アミノ末端」領域は、３アミノ酸長よりも短くなく、且つ３５０アミノ酸長よりも長くない。他の可能なポリペプチドの「アミノ末端」領域の長さには、５、１０、２０、２５、５０、１００、および２００アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書中で使用される、ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、遺伝子の３’末端内または３’末端に存在するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列をいい、遺伝子の３’タンパク質コード領域が含まれるが、これに限定されない。本明細書中で使用される、「カルボキシ末端」領域は、３００アミノ酸までのポリペプチドのカルボキシ末端またはポリペプチドの最後のアミノ酸から１／３のポリペプチドをいう。「３’末端」は、存在する場合、ポリＡテールを含まない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、３アミノ酸長よりも短くなく、且つ３５０アミノ酸長よりも長くない。他の可能なポリペプチドの「カルボキシ末端」領域の長さには、５、１０、２０、２５、５０、１００、および２００アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書中で使用される、ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」は、本明細書中で定義のポリペプチドのアミノ末端領域とカルボキシ末端領域との間に存在するポリペプチド配列をいう。ポリペプチドの「内部ポリペプチド領域」は、３アミノ酸長よりも短くなく、且つ３５０アミノ酸長よりも長くない。他の可能なポリペプチドの「内部ポリペプチド」領域の長さには、５、１０、２０、２５、５０、１００、および２００アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
ポリペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端、および内部ポリペプチド領域は、重複せず、連続し得るがその必要はなく、且つ合計で対応するポリペプチドの全長までであり得るがその必要はない。
【００８８】
本明細書中で使用される、「ポリヌクレオチド」には、８ヌクレオチド長を超える二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡが含まれる。
【００８９】
本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、２つまたはそれ以上、好ましくは３つ以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから構成される分子と定義する。その正確なサイズは、多数の要因に依存し、言い換えると、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、約８〜約１，０００ヌクレオチド長であり得る。８〜１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが本発明で有用であるが、好ましいオリゴヌクレオチドの範囲は、約８塩基長から約１５塩基長まで、約８塩基長から約２０塩基長まで、約８塩基長から約２５塩基長まで、約８塩基長から約３０塩基長まで、約８塩基長から約４０塩基長まで、または約８塩基長から約５０塩基長までである。
【００９０】
本明細書中で使用される、用語「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下および適切な温度およびｐＨ）に置かれた場合に合成の開始点として作用することができる、精製制限消化物として天然に存在するか合成されたオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、一本鎖または二本鎖であってよく、誘導剤の存在下での所望の伸長産物の合成を開始するのに十分に長くなければならない。正確なプライマーのサイズは、多数の要因（温度、プライマーの供給源、および使用方法が含まれる）に依存する。例えば、診断のために、プローブ配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少数のヌクレオチドを含んでも良い。適切なプライマー長の決定に関与する要因は、当業者に容易に知られる。
【００９１】
本明細書中で使用される、用語「プローブ」は、オリゴヌクレオチドおよびそのアナログを意味し、標的配列のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用によってポリヌクレオチド標的配列を認識する一定範囲の化学物質をいう。プローブまたは標的配列は、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡまたは一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、またはＤＮＡ塩基とＲＮＡ塩基との組み合わせであり得る。プローブは、少なくとも８ヌクレオチド長であり、且つ遺伝子の全長未満である。標的遺伝子の全長未満である限り、プローブは、１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、および２０００ヌクレオチド長までであり得る。
【００９２】
オリゴヌクレオチドおよびそのアナログは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡもしくはＤＮＡのアナログであってよく、一般に、アンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドという。このようなＲＮＡまたはＤＮＡアナログには、２−’Ｏ−アルキル糖修飾、メチルホスホネート、ホスホロチエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３’−チオフォルムアセタール、スルホン、スルファメート、およびニトロキシド骨格修飾、および塩基部分が修飾されたアナログが含まれるが、これらに限定されない。さらに、オリゴマーのアナログは、糖部分が修飾されるか別の適切な部分に置換されてポリマーとなるポリマーであり得る（モルホリノアナログおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）アナログ（Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）−−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ａｃｈｉｒａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ，（１９９２））が含まれるが、これらに限定されない）。
【００９３】
プローブはまた、天然のＤＮＡまたはＲＮＡを含むかこれらと組み合わせた任意のオリゴヌクレオチドアナログ型の混合物であり得る。同時に、オリゴヌクレオチドおよびそのアナログを、単独または１以上のさらなるオリゴヌクレオチドもしくはそのアナログと組み合わせて使用することができる。
【００９４】
本明細書中で使用される、「核酸標的」、「核酸マーカー」、「アレイ上の核酸メンバー」、または「アレイ上の核酸標的」には、アレイ上に固定され、且つ一連の非共有結合相互作用（相補塩基対合相互作用が含まれる）によって相補配列の核酸メンバーと結合することができる核酸も含まれる。本明細書中で使用される、「核酸標的」には、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）が含まれ得る。さらに、ハイブリッド形成を妨害しない限り、核酸標的中の塩基を、リン酸ジエステル結合以外の結合によって連結することができる（すなわち、核酸標的は、標準的なストリンジェンシーまたは選択的ハイブリッド形成条件下で依然としてその相補配列と特異的に結合する）。したがって、核酸標的は、連続する塩基がリン酸ジエステル結合よりもむしろペプチド結合によって連結するペプチド核酸であり得る。
【００９５】
「ｍＲＮＡ」は、遺伝子に相補的なＲＮＡを意味し、ｍＲＮＡはタンパク質コード領域を含み、且つ５’末端および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）も含み得る。
【００９６】
「コード領域」は、ｍＲＮＡをコードするＤＮＡをいう。
【００９７】
「タンパク質コード領域」は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ部分をいう。
【００９８】
本明細書中で使用される、「ｍＲＮＡの完全性」は、軟骨サンプル由来のｍＲＮＡ抽出物量をいう。完全性の良好なｍＲＮＡ抽出物は、当分野で周知の方法（例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ））で試験した場合に分解しないようである。好ましくは、ｍＲＮＡサンプルは、抽出した軟骨サンプルの遺伝子発現レベルを真に示すのに良好な完全性（例えば、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満のｍＲＮＡが分解している）を有する。
【００９９】
本明細書中で使用される、「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と交換可能であり、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または任意のその組み合わせであり得る。「核酸」には、一本鎖および二本鎖核酸が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される、用語「核酸」には、１以上の修飾塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「核酸」である。本明細書中で使用される、用語「核酸」は、このような核酸の化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態ならびにウイルスおよび細胞（例えば、単細胞および多細胞が含まれる）のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を含む。「核酸」または「核酸配列」には、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡ領域またはその任意の組み合わせも含むことができ、本発明のいくつかの実施形態による発現配列タグ（ＥＳＴ）も含まれ得る。ＥＳＴは、ｃＤＮＡを作製するためにｍＲＮＡのある領域の逆転写によって作製される遺伝子発現配列の一部（すなわち、配列の「タグ」）である。
【０１００】
核酸に関して使用される場合、本明細書中で使用される、「単離」または「精製」は、天然に存在する配列がその通常の細胞（例えば、染色体）環境から取り出されているか、非天然環境下で合成される（例えば、人為的に合成される）ことを意味する。したがって、「単離」または「精製」配列は、無細胞溶液中に存在するか、異なる細胞環境下に置かれ得る。用語「精製された」は、ヌクレオチドのみが存在する配列であることを意図しないが、ヌクレオチドと天然に会合する非ヌクレオチド物質を本質的に含まず（純度約９０〜９５％）、それにより単離染色体と区別される。
【０１０１】
本明細書中で定義される、「核酸アレイ」は、各核酸メンバーが固有の前選択領域中の支持体に結合している、支持体に結合している複数の固有の核酸（または「核酸メンバー」）をいう。１つの実施形態では、支持体表面に結合した核酸標的はＤＮＡである。好ましい実施形態では、支持体表面に結合した核酸標的はｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドのいずれかである。別の好ましい実施形態では、支持体表面に結合した核酸標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されたｃＤＮＡである。本明細書中で使用される、用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と交換可能である。別の好ましい実施形態では、「核酸アレイ」は、サザンおよび／またはノーザンブロッティング技術で使用されるニトロセルロースメンブレンまたは他のメンブレンに結合した複数の固有の核酸をいう。
【０１０２】
本明細書中で使用される、用語「増幅された」は、核酸配列に適用される場合、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応法（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５）によって１以上の特定の核酸配列コピーがテンプレート核酸から作製されるプロセスをいう。「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、特定の核酸テンプレート配列の増幅のためのインビトロ法をいう。ＰＣＲ反応は、一連の反復温度サイクルを含み、典型的には、５０〜１００μｌの体積で行う。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つの各デオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ））、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸テンプレートを含む。ＰＣＲ反応は、第１のプライマーが核酸テンプレート配列の第１の鎖中の領域に相補的な配列を含み、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成をプライミングし、第２のプライマーがプローブ核酸配列の第２の鎖中の領域に相補的な配列を含み、且つ相補ＤＮＡ鎖の合成をプライミングするポリヌクレオチドプライマーセットを得ることと、（ｉ）テンプレート配列内に含まれるプローブ核酸配列の増幅に必要なプライマーをアニーリングし、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成するプライマーを伸長するＰＣＲサイクリングステップを許容する条件下でのテンプレート依存重合剤として核酸ポリメラーゼを使用して核酸テンプレート配列を増幅することとを含む。「ポリヌクレオチドプライマーセット」または「ＰＣＲプライマーセット」は、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のプライマーを含み得る。１つの実施形態では、ＰＣＲ反応においてエクソＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸テンプレートを増幅する。他の増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異性ベースの増幅（ＮＳＢＡ）、または当分野で公知の任意の他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本発明によれば、アレイは、固体支持体に固定された特定の遺伝子セットまたは対応する５’末端セットもしくは対応する３’末端セットもしくは対応する内部コード領域セットを意図する。勿論、同一のＯＡ診断結果を得るために、一方の遺伝子の５’末端の混合物を別の遺伝子の３’末端と組み合わせて標的またはプローブとして使用することができる。
【０１０４】
本明細書中で使用される、「複数の」または「〜セット」は、２つを超えることをいう（例えば、３つまたはそれ以上、１００またはそれ以上、１０００またはそれ以上、または１０，０００またはそれ以上）。
【０１０５】
本明細書中で使用される、用語「大部分」は、全組成物メンバーの５０％を超える数（例えば、５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％まで）をいう。用語「大部分」は、アレイに関する場合、アレイの固体基板と安定に会合する全核酸メンバーの５０％を超える（例えば、５１％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％まで）ことを意味する。
【０１０６】
本明細書中で使用される、「結合」または「スポッティング」は、共有結合、水素結合、またはイオン相互作用を介して核酸が固体基板に安定に結合するように、固体基板上に核酸が沈着して核酸アレイが形成されるプロセスをいう。
【０１０７】
本明細書中で使用される、「安定に会合した」は、典型的にはアレイが分析される条件下で（すなわち、１以上のハイブリッド形成ステップ、洗浄ステップ、および／またはスキャニングステップなどにて）、アレイと安定に会合した全ての他の核酸または固体基板上の全ての他の選択前領域と比較して核酸がその固有の選択前の位置を保持するように共有結合、水素結合、またはイオン相互作用を介してアレイを形成させるために固体基板に安定に結合した核酸をいう。
【０１０８】
本明細書中で使用される、「固体基板」または「固体支持体」は、硬質または半硬質表面を有する材料をいう。用語「基板」および「支持体」は、本明細書中で用語「固体基板」および「固体支持体」と交換可能に使用される。固体支持体は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらの任意の組み合わせであってよく、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チュービング、球体、ビーズ、コンテナー、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、チップなどとして存在し得る。しばしば、基板は、シリコンまたはガラス表面、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、荷電膜（ナイロン６６またはニトロセルロースなど）、またはその組み合わせである。好ましい実施形態では、固体支持体はガラスである。好ましくは、少なくとも１つの基板表面は実質的に平面である。好ましくは、固体支持体は、反応基（カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、およびチオールなどが含まれるが、これらに限定されない）を含む。１つの実施形態では、固体支持体は光学的に透明である。
【０１０９】
本明細書中で使用される、「選択前領域」、「定義前領域」、または「固有の位置」は、核酸沈着のために使用するか、使用したか、使用することを意図する基板上の局在化領域または、本明細書中では「選択領域」または単純に「領域」ともいう。選択前領域は、任意の都合の良い形状（例えば、環状、長方形、楕円形、Ｖ字型など）を有し得る。いくつかの実施形態では、選択前領域は、約１ｃｍ2未満、より好ましくは１ｍｍ2未満、さらにより好ましくは０．５ｍｍ2未満、いくつかの実施形態では、０．１ｍｍ2未満である。「選択前領域」、「定義前領域」、または「固有の位置」での核酸メンバーは、その同一性（例えば、配列）を領域でのその位置または固有の位置によって決定することができるものである。
【０１１０】
本明細書中で使用される、「核酸プローブ」または「核酸プローブマーカー」は、非共有結合相互作用セット（相補塩基対合相互作用が含まれる）によって相補配列のアレイに結合した核酸に結合することができる核酸と定義される。核酸プローブは、遺伝子もしくはその一部に対応する単離核酸配列であり得るか、核酸プローブはサンプルから単離した総ＲＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。より好ましくは、核酸プローブは、ヒト軟骨、総ＲＮＡ抽出物、好ましくはｍＲＮＡ抽出物由来の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドである。
【０１１１】
１つの実施形態では、アレイに結合した「標的」配列の従来の核酸アレイは、全ヒトゲノムの代表であり（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ）、図１〜７に記載の２つまたはそれ以上の遺伝子または遺伝標的からなるか含む単離されたバイオマーカーを、従来のアレイに適用する。
【０１１２】
別の実施形態では、アレイに結合した配列は本発明の単離されたバイオマーカーであり、総細胞ＲＮＡをアレイに適用する。
【０１１３】
本明細書中で使用される、「軟骨核酸サンプル」は、軟骨由来の核酸をいう。好ましくは、軟骨核酸サンプルは、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡであるか、ＲＮＡに対応する核酸（例えば、ｃＤＮＡ）である。軟骨核酸サンプルには、総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物も含まれ得る。
【０１１４】
本明細書中で使用される、用語「〜とのハイブリッド形成」または「ハイブリッド形成」は、相補核酸との配列特異的非共有結合相互作用（例えば、アレイ上でのプローブ核酸配列と標的核酸メンバーとの間の相互作用）をいう。
【０１１５】
本明細書中で使用される、「特異的にハイブリッド形成する」、「特異的ハイブリッド形成」、または「選択的ハイブリッド形成」は、２つの核酸配列が実質的に相補的である場合に（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドと少なくとも約６５％相補的、好ましくは少なくとも７５％相補的、より好ましくは少なくとも約９０％相補的）起こるハイブリッド形成をいう。Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：２０３（参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照のこと。結果として、一定の程度のミスマッチが許容されることが予想される。このようなミスマッチは、小規模であり得る（モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチドなど）。あるいは、ミスマッチ領域は、４つまたはそれ以上の連続したヌクレオチドセット中にミスマッチが存在する領域と定義されるループを含み得る。多数の要因が２つの核酸のハイブリッド形成の効率および選択性（例えば、核酸配列を探索するためのアレイ上の標的核酸メンバーのハイブリッド形成）に影響を与える。これらの要因には、核酸メンバーの長さ、ヌクレオチド配列および／または組成、ハイブリッド形成温度、緩衝液の組成、および核酸メンバーがハイブリッド形成する必要がある領域中の立体障害の可能性が含まれる。核酸の長さとプローブ核酸が標的配列にアニーリングされる効率と正確さの両方との間に正の相関が存在する。特に、配列が長いほどより短い配列よりも融点（ＴM）が高く、所与のプローブ配列内で繰り返される可能性が低いので、無差別なハイブリッド形成が最小になる。ハイブリッド形成温度は、核酸メンバーのアニーリング効率と反比例して変化する。同様に、ハイブリッド形成混合物中の有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度はアニーリング効率と反比例して変化し、ハイブリッド形成混合物中の塩濃度の増加によりアニーリングが促進される。ストリンジェントなアニーリング条件下では、核酸が長いほどより短い核酸よりも効率的にハイブリッド形成し、より寛大な条件下で十分である。
【０１１６】
本明細書中で使用される、用語「ディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成」は、第１の相補核酸プローブとの核酸標的のハイブリッド形成をコントロール核酸プローブとの同一の核酸標的のハイブリッド形成と比較した量的レベルの相違をいう。「ディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成」はまた、核酸プローブとの第１の核酸標的のハイブリッド形成を第２のコントロール核酸標的と比較した量的レベルの相違をいうことができる。「ディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成」は、コントロールと比較した第１のサンプルのハイブリッド形成レベルの比が１．０ではないことを意味する。例えば、第２のプローブと比較した第１のプローブへの標的のハイブリッド形成レベルの比は、１．０よりも大きくまたは１．０未満であり、１．５よりも大きくかつ０．７未満、２よりも大きくかつ０．５未満が含まれる。ハイブリッド形成が一方のサンプルで検出可能であるが、別のサンプルで検出不可能である場合、ディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成も存在する。
【０１１７】
本明細書中で使用される、用語「差分的な発現」は、第２のサンプル中の同一の遺伝子の発現レベルと比較した第１のサンプル中の遺伝子に相補的なＲＮＡ（ｍＲＮＡが含まれる）レベルの量によって測定される遺伝子発現レベルの差をいう。差分的な発現を、ディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成またはｍＲＮＡ発現のレベルまたは量を測定するために使用する当分野で公知の他の方法の結果として決定することができる。
【０１１８】
本明細書中で使用される、用語「差分的な発現」はまた、第２のサンプル中の同一の遺伝子のタンパク質発現の量またはレベルと比較した第１のサンプル中の遺伝子によってコードされたタンパク質の量またはレベルによって測定された遺伝子発現レベルの差をいう。差分的なタンパク質発現を、特定のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体への結合またはタンパク質発現のレベルまたは量の測定に使用する当分野で公知の他の方法の結果として決定することができる。
【０１１９】
「差分的な増加発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｓｉｏｎ）」は、１．１倍、１．２倍、１．４倍、１．６倍、１．８倍、またはそれ以上をいう。「差分的な減少発現」は、１．０倍未満、０．８倍、０．６倍、０．４倍、０．２倍、０．１倍、またはそれ以下をいう。
【０１２０】
本明細書中で使用される、本発明の文脈中の用語「コントロール」または「コントロールサンプル」は、正常と分類される個体または個体群から単離した１以上の軟骨核酸サンプルをいう。コントロールまたはコントロールサンプルはまた、疾患と診断された患者群（ＯＡと診断された患者または特定のＯＡ期と診断された患者が含まれる）から単離したサンプルをいうことができる。用語「コントロール」または「コントロールサンプル」はまた、正常と分類される１人または複数の個体、疾患またはある病期と診断された１人または複数の個体、または疾患の治療を受けた１人または複数の個体サンプル由来のデータの編集物（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）をいうことができる。
【０１２１】
本明細書中で使用される、本発明の文脈中の用語「アップレギュレート」または「発現レベルの増加」は、配列の量の測定により、変形性関節症または変形性関節症の病期分類によって決定された変形性関節症の同定病態を有する個体から単離した軟骨中の遺伝子の正常な個体または変形性関節症の病期分類によって決定された変形性関節症の異なる同定病態を有する個体から単離した軟骨中の同一の遺伝子と比較した、アレイ分析または他の類似の分析を使用して決定することができる発現レベルの増大が証明される発現遺伝子に対応する配列をいう。本発明の「発現レベルの増加」は、例えば、本発明の方法によるハイブリッド形成強度によって測定したところ、発現の増加は、少なくとも１０％またはそれ以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上）または１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である。例えば、アップレギュレート配列には、正常な個体から単離した軟骨と比較して軽度、中程度、著しい、または重度のＯＡを有すると特徴付けられた個体から単離した軟骨中で発現レベルが増大した配列が含まれる。
【０１２２】
本明細書中で使用される、本発明の文脈中の用語「ダウンレギュレート」または「発現レベルの減少」は、配列の量の測定により、変形性関節症または変形性関節症の病期分類によって決定された変形性関節症の同定病態を有する個体から単離した軟骨中の遺伝子の正常な個体または変形性関節症の病期分類によって決定された変形性関節症の異なる同定病態を有する個体から単離した軟骨中の同一の遺伝子と比較した、マイクロアレイ分析または他の類似の分析を使用して決定することができる発現レベルの減少が証明される発現遺伝子に対応する配列をいう。本発明の「発現レベルの減少」は、例えば、本発明の方法によるハイブリッド形成強度によって測定したところ、発現の減少は、少なくとも１０％またはそれ以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上）または１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上である。例えば、ダウンレギュレート配列には、正常な個体から単離した軟骨と比較して軽度、中程度、著しい、または重度のＯＡを有すると特徴付けられた個体から単離した軟骨中で発現レベルが減少した配列が含まれる。
【０１２３】
本明細書中で使用される、用語「標準的なストリンジェント条件」は、配列間で少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％同一であり、同一領域が少なくとも１０ヌクレオチドを含む場合のみでハイブリッド形成されることを意味する。１つの実施形態では、４２℃で一晩の配列のインキュベーションおよびその後のストリンジェントな洗浄（６５℃で０．２×ＳＳＣ）に従うストリンジェントな条件下で配列がハイブリッド形成する。
【０１２４】
洗浄ストリンジェンシーの程度を、温度、ｐＨ、イオン強度、２価陽イオン濃度、体積、および洗浄時間の変化によって変化させることができる。例えば、ハイブリッド形成のストリンジェンシーを、プローブの融点未満の種々の温度でのハイブリッド形成によって変化させることができる。プローブの融点を、以下の式を使用して計算することができる。
【０１２５】
１４ヌクレオチド長と１７ヌクレオチド長との間のオリゴヌクレオチドプローブのために、融点（Ｔｍ）（℃）を、以下の式を使用して計算することができる。Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドの長さである）。
【０１２６】
例えば、Ｎａ＋濃度が約１Ｍのハイブリッド形成緩衝液を６８℃から４２℃まで５℃刻みで低下させてハイブリッド形成温度を低下させることができる。ハイブリッド形成後、フィルターを、ハイブリッド形成温度の２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで洗浄することができる。これらの条件のうち、５０℃を超えるものを「中程度のストリンジェンシー」条件と見なし、５０℃未満を「低ストリンジェンシー」条件と見なす。「中程度のストリンジェンシー」でのハイブリッド形成条件の特定の例は、上記ハイブリッド形成を５５℃で行う場合である。「低ストリンジェンシー」でのハイブリッド形成条件の特定の例は、上記ハイブリッド形成を４５℃で行う場合である。
【０１２７】
ホルムアミドを含む溶液中でハイブリッド形成を行う場合、融点を、以下の式を使用して計算することができる。Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ+］）＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）。
【０１２８】
例えば、ホルムアミドを含む６×ＳＳＣなどの温度４２℃の緩衝液中でハイブリッド形成を行うことができる。この場合、プローブに対する相同性レベルが減少したクローンを同定するために、ハイブリッド形成緩衝液中のホルムアミド濃度を、５０％〜０％まで５％刻みで減少させることができる。ハイブリッド形成後、フィルターを、５０℃の６×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳで洗浄することができる。これらの条件のうち、２５％ホルムアミドを超えるものを「中程度のストリンジェンシー」条件と見なし、２５％ホルムアミド未満を「低ストリンジェンシー」条件と見なす。「中程度のストリンジェンシー」でのハイブリッド形成条件の特定の例は、上記ハイブリッド形成を３０％ホルムアミドで行う場合である。「低ストリンジェンシー」でのハイブリッド形成条件の特定の例は、上記ハイブリッド形成を１０％ホルムアミドで行う場合である。
【０１２９】
本明細書中で使用される、用語「発現レベル」は、（コントロールと比較した）ハイブリッド形成または実時間ＲＴ−ＰＣＲなどのより定量的な測定（ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）テクノロジーの使用が含まれ、且つ遺伝子発現範囲との正比例に相当する）によって決定された所与の核酸の測定可能な量をいう。当分野で周知の方法によって核酸の発現レベルを決定する。用語「差分的な発現」または「発現レベルの相違」は、コントロールと比較した所与の核酸の測定可能な発現レベルの増減をいう。本明細書中で使用される、「差分的な発現」または「発現レベルの変化」は、マイクロアレイ分析または実時間ＲＴ−ＰＣＲをいう場合、一方のサンプル中の所与のポリヌクレオチドの発現レベルと別のサンプル中の所与のポリヌクレオチドの発現レベルとの比が１．０ではないことを意味する。「差分的な発現」または「発現レベルの変化」はまた、本発明のマイクロアレイ分析または実時間ＲＴ−ＰＣＲをいう場合、一方のサンプル中の所与のポリヌクレオチドの発現レベルと別のサンプル中の所与のポリヌクレオチドの発現レベルとの比が１．０より大きくまたは１．０未満である（１．５より大きくかつ０．７未満ならびに２．０より大きくかつ０．５未満が含まれる）ことを意味する。核酸はまた、２つのサンプルのうちの１つの核酸の発現が検出不可能である場合、２つのサンプルは差分的に発現したという。既知濃度の１以上のコントロール核酸種を含めることと、コントロール核酸量に基づいて検量線を作成することと、検量線に関して未知の実時間ＲＴ−ＰＣＲハイブリッド形成強度からの「未知の」核酸種の発現レベルの推定によって、核酸発現レベルの絶対量を得ることができる。
【０１３０】
本明細書中で使用される、「バイオマーカーの発現レベル」は、内部標準と比較したハイブリッド形成によって決定したバイオマーカーの各遺伝子の測定可能な量をいう。
【０１３１】
本明細書中で使用される、「発現レベルの相違」は、バイオマーカーをいう場合、バイオマーカーとバイオマーカーコントロールと比較した各遺伝子の発現レベルの比の変化を示し、バイオマーカーコントロールが以下の２つの集団、ａ）当分野で公知の手段を使用してＯＡでないことが確認された集団（正常な集団）およびｂ）ＯＡを罹患しているか特定の病期のＯＡを罹患している個体のコントロール集団（罹患集団）から構成され、当分野で公知の手段を使用して罹患集団がＯＡまたは特定のＯＡ期であると確認され、適切に秤量して正常な集団と罹患集団と比較した場合のバイオマーカーの各遺伝子の発現レベルの比の変化を、ＲＯＣ分析（Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＲＯＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｚ．Ｅ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８，４（１９７８））または類似の統計学的方法（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標），Ｍｅｄｃａｌｃ（商標）バージョン７．２，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、当業者は、患者がＯＡまたはＯＡの特定の病期を有すると正確に分類することができる。
【０１３２】
マイクロアレイ分析のために、当分野で周知の方法による標識プローブ核酸を使用したハイブリッド形成分析によって発現レベルを測定する。プローブ核酸上の標識は、発光標識、酵素標識、放射性標識、化学標識、または物理標識であり得る。好ましくは、プローブ核酸を、蛍光分子で標識する。好ましい蛍光標識には、フルオレセイン、アミノクマリン酢酸、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＲＣ）、テキサスレッド、シアニン３（Ｃｙ３）、およびシアニン５（Ｃｙ５）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
本明細書中で使用される、用語「有意な適合」は、核酸配列をいう場合、当分野で周知の比較方法（すなわち、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １５：１０００−１０１１）を使用して、２つの核酸配列が、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％同一であることを示すことを意味する。本明細書中で使用される、「有意な適合」は、当分野で日常的なアラインメント法を使用して最大に整列させた場合に配列が少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％同一であることを示す限り、不連続または散在する同一のヌクレオチドを含む。
【０１３４】
本明細書中で使用される、「遺伝子発現パターン」、「遺伝子発現プロフィール」、または「核酸アレイ発現プロフィール」は、コントロールと比較した場合のアレイ上の複数の核酸標的とハイブリッド形成した複数のプローブ核酸配列のディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成パターンを含む。
【０１３５】
本明細書中で使用される、「疾患の指標」は、疾患または別の病期を示さない患者よりも疾患または病期を示す患者で発現パターンが有意により頻繁に見出されるような疾患または病期診断の発現パターンをいう（最小９５％の信頼水準を設定する日常的な統計法を使用して決定した場合）。好ましくは、疾患の指標となる発現パターンは、罹患患者の少なくとも６０％で見出され、罹患していない患者の１０％未満で見出される。より好ましくは、疾患の指標となる発現パターンは、罹患患者の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上で見出され、罹患していない患者の１０％未満、８％未満、５％未満、２．５％未満、または１％未満で見出される。
【０１３６】
本明細書中で使用される、「治療薬」または「薬剤」は、本明細書中で定義の任意の２つの以下の発達または変形性関節症病期、（ａ）軽度、（ｂ）中程度、（ｃ）著しい、（ｄ）重度由来の軟骨細胞、または（ｅ）正常な個体由来の軟骨細胞で差分的に発現される１以上のポリヌクレオチド配列の発現が増減する化合物をいう。本発明の治療薬はまた、軟骨細胞の同化作用を増減させる化合物をいう。本発明は、１）変形性関節症の発症を予防し；２）痛み、腫れ、罹患関節の機能的能力の脆弱性および喪失などの変形性関節症の症状のを軽減、遅延、または消失させ；３）軟骨変性を軽減、遅延、または消失させ、そして／または軟骨細胞代謝活性および細胞分裂速度を増大させ；および／または４）患者に投与した場合、患者の１以上の疾患の指標となる核酸の１以上の発現プロフィールを、より初期の病期の個体または正常な個体とより類似するプロフィールに修復する「治療薬」を提供する。
【０１３７】
本明細書中で使用される、用語「薬物有効性」は、薬物の効果をいう。「薬物有効性」を、通常、薬物で処置したまたは処置している患者の臨床反応によって測定する。所望の結果（例えば、本明細書中に記載の変形性関節症の症状の軽減または変形性関節症の進行の臨床予防）が達成された場合、薬物は有効性が高いと見なされる。薬物の吸収量を使用して、患者の反応を予想することができる。原則は、所望の最大の効果に到達するまで、薬物用量が増大するにつれて、患者でより高い効果が認められることである。最大点まで到達した後により大量の薬物を投与した場合、通常、副作用が増大する。
【０１３８】
本明細書中で使用される、「リガンド」は、本発明のバイオマーカー遺伝子の１つによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する分子である。リガンドは、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、ポリペプチド、ペプチド、または化合物であり得る。本発明のリガンドは、ペプチドリガンド（例えば、足場ペプチド、線状ペプチド、または環状ペプチド）であり得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドリガンドは抗体である。抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、インタクトな免疫グロブリン（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはそのサブタイプ）であり得る。抗体を、機能的部分（例えば、生物学的または化学的機能を有する化合物）（第２の異なるポリペプチド、治療薬、細胞傷害薬、検出可能な部分、または固体支持体であり得る）に抱合することができる。ポリペプチドリガンド（例えば、本発明の抗体）は、バイオマーカー遺伝子の１つによってコードされるポリペプチドと高親和性且つ高特異性で相互作用する。例えば、ポリペプチドリガンドは、バイオマーカー遺伝子の１つによってコードされるポリペプチドと、少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは少なくとも１０8Ｍ-1、１０9Ｍ-1、または１０10Ｍ-1の親和定数で結合する。
【０１３９】
本明細書中で使用される、用語「特異的に結合する」は、各分子上の特定の構造の存在に依存する、２つの分子の相互作用（例えば、リガンドとタンパク質またはペプチドとの相互作用）をいう。例えば、２つの分子がタンパク質分子である場合、第１の分子上の構造は、一般にタンパク質より第２の分子上の構造を認識して結合する。本明細書中で使用される、用語「特異的結合」は、分子が非特異的分子との結合よりもその特定の結合パートナーと少なくとも２倍の親和性、好ましくは、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。
【０１４０】
本明細書中で使用される、用語「免疫グロブリン」は、実質的に免疫グロブリン遺伝子によってコードされた１以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識されたヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記定常領域遺伝子の１つ（例えば、γ）（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされる。
【０１４１】
用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合フラグメントを含む。本明細書中で使用される、用語抗体の「抗原結合フラグメント」（または単純に「抗原フラグメント」または「フラグメント」）は、本発明のバイオマーカー遺伝子の１つによってコードされたポリペプチドに特異的に結合する能力を保持した全長抗体の１以上のフラグメントをいう。用語抗体の「抗原結合フラグメント」に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメント）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント）、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の１つのアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、および（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）が異なる遺伝子によってコードされるが、これらを、組換え法を使用したＶＬおよびＶＨ領域を対合させる１つのタンパク質鎖として作製させることができる合成リンカーによって連結して、１価の分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知）を形成することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）。このような単鎖抗体はまた、用語抗体の「抗原結合フラグメント」の範囲内に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントを、当業者に公知の従来技術を使用して獲得し、フラグメントを同一の様式でインタクトな抗体としての有用性についてスクリーニングする。抗体は、好ましくは、単一特異的（例えば、モノクローナル抗体）またはその抗原結合フラグメントである。用語「単一特異的抗体」は、特定の標的（例えば、エピトープ）に対して１つの結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語には、本明細書中で使用されるように、１分子組成の抗体またはそのフラグメントの調製物をいう「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」が含まれる。
【０１４２】
［軟骨細胞が豊富で且つ軟骨細胞に特異的なポリヌクレオチド配列の同定］
ヒト胎児、正常、軽度、中程度、著しい、および／または重度変形性関節症軟骨サンプルからｃＤＮＡライブラリーを構築した。これらのライブラリー由来の既知および新規のクローンを使用して、軽度（初期）変形性関節症検出のための診断ツールとして有用な差分的遺伝子発現プロフィールを得るために、ヒト軟骨細胞特異的マイクロアレイを構築した。本発明のアレイは、変形関節症の診断ならびに新規の薬物標的の治療有効性の同定およびモニタリングのための使用のための最良の標準として有用である。
【０１４３】
所与の組織における遺伝子発現パターンの１つの有効且つ迅速な特徴付け方法は、発現配列タグ（ＥＳＴ）を作製するためにこのような組織から産生したｃＤＮＡライブラリーの大規模部分配列決定による。このアプローチにより、種々の組織および細胞における遺伝子発現に関する定性的および定量的情報が得られている（Ａｄａｍｓ  ＭＤ，Ｋｅｒｌａｖａｇｅ  ＡＲ，Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ  ＲＤ，Ｆｕｌｄｎｅｒ  ＲＡ，Ｂｕｌｔ  ＣＪ，Ｌｅｅ  ＮＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｉｔｉａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ８３  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９５；３７７  Ｓｕｐｐｌ：３−１７４．）；（Ｈｗａｎｇ  ＤＭ，Ｄｅｍｐｓｅｙ  ＡＡ，Ｗａｎｇ  ＲＸ，Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｍ，Ｂａｒｒａｎｓ  ＪＤ，Ｄａｉ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｔｏｗａｒｄ  ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９７；９６：４１４６−２０３．）；（Ｍａｏ  Ｍ，Ｆｕ  Ｇ，Ｗｕ  ＪＳ，Ｚｈａｎｇ  ＱＨ，Ｚｈｏｕ  Ｊ，Ｋａｎ  ＬＸ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４+  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９８；９５：８１７５−８０）；（Ｈｉｌｌｉｅｒ  ＬＤ，Ｌｅｎｎｏｎ  Ｇ，Ｂｅｃｋｅｒ  Ｍ，Ｂｏｎａｌｄｏ  ＭＦ，Ｃｈｉａｐｅｌｌｉ  Ｂ，Ｃｈｉｓｓｏｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ２８０，０００  ｈｕｍａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１９９６；６：８０７−２８）。
【０１４４】
ｃＤＮＡライブラリーはライブラリーを構築するために使用した組織の細胞中に遺伝子の転写を示すので、無作為なサンプリングおよび配列決定によって作製した遺伝子発現プロフィールを、試験組織の発達と、正常と、病理学的状態との間の詳細な遺伝子レベルの比較のために使用する。
【０１４５】
異なる罹患状態の軟骨において異なるレベルで多数のヒト遺伝子が発現する。場合によっては、いくつかの病態において遺伝子は全く発現せず、他の病態において高レベルで発現する。本発明によれば、ＥＳＴベースのアプローチを使用した異なる軟骨の発達段階および異なる病態における軟骨細胞遺伝子発現のディファレンシャル（差分的）分析により、変形性関節症の病因および軟骨修復において重要な役割を果たす遺伝子が同定された。この方法の利点は、他の方法よりも大量に遺伝子発現情報が得られることである。このアプローチによって作製されたｃＤＮＡクローンはまた、一定の遺伝子の機能研究にも有用である。このゲノムベースのアプローチ型により、変形性関節症の疾患プロセスの理解への重要な新規の洞察ならびに新規の診断、予後、および治療アプローチが得られる。
【０１４６】
［ＯＡの診断に有用なバイオマーカーの同定］
本発明は、正常な個体中の１以上の遺伝子の発現レベルと比較した場合に、その発現レベルが軽度、中程度、著しい、または重度変形性関節症のいくつかの程度の存在の指標となる、サンプル中で同定可能な病期特異的遺伝子（図１〜７）を提供する。したがって、これらの遺伝子またはこれらの遺伝子の産物の組み合わせは、ＯＡを罹患した個体の同定のためのバイオマーカーとして有用である。
【０１４７】
２つまたはそれ以上のこれらの遺伝子またはこれらの遺伝子の産物の組み合わせがバイオマーカーとして有用であることが当業者に理解される。
【０１４８】
より詳細には、有用な組み合わせ数が記載されており（Ｆｅｌｌｅｒ，Ｗ．Ｆ．，Ｉｎｔｒｏ  ｔｏ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  Ｔｈｅｏｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｖｏｌｕｍｅ  １，１９６８，ｅｄ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ）、以下の一般式を使用して計算することができる。
Ｘ！／（ｎ）！（ｘ−ｎ）！（式中、ｎは組み合わせのために選択される遺伝子数であり、ｘは考慮される遺伝子数である）。
【０１４９】
例えば、重度ＯＡでダウンレギュレートされた２１遺伝子のうちの２遺伝子の可能な組み合わせは、
【数１】
2006506979.tif 000002
である（図２）。
【０１５０】
同様に、２１！／３！（２１−３）！は、重度ＯＡでダウンレギュレートされた２１遺伝子のうちの３遺伝子の可能な組み合わせである（図２）。
【０１５１】
［病期特異的ＯＡの同定に有用なバイオマーカーの同定］
本発明は、さらに、変形性関節症の別の病期と比較して変形性関節症の少なくとも１つの病期でその発現レベルが異なる図１〜７に記載の遺伝子を提供する。例えば、本発明は、正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、軽度変形性関節症患者から単離した軟骨中でダウンレギュレート（図１）またはアップレギュレート（図３）されるが、重度変形性関節症患者ではダウンレギュレートも（図１）アップレギュレート（図３）もされないと同定された遺伝子を提供する。同様に、本発明は、正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、重度変形性関節症患者から単離した軟骨中でダウンレギュレート（図２）またはアップレギュレート（図４）されるが、軽度変形性関節症患者ではダウンレギュレートも（図２）アップレギュレート（図４）もされないと同定された遺伝子を提供する。本発明はまた、特定のＯＡの病期（例えば、軽度ＯＡのみ（図６ａおよび７ａ）、中程度ＯＡのみ（図６ｂ）、著しいＯＡのみ（図６ｃ）、または重度ＯＡのみ（図６ｄおよび７ｂ））で差分的に発現する遺伝子を提供する。本発明は、さらに、重度ＯＡでアップレギュレートされ、且つ軽度ＯＡでダウンレギュレートされる遺伝子を提供する（図５）。
【０１５２】
したがって、これらの遺伝子、これらの遺伝子の一部、またはこれらの遺伝子の産物は、単独または組み合わせて、患者のＯＡ病期を同定するためのバイオマーカーとして有用である。これらの遺伝子、これらの遺伝子の一部、またはこれらの遺伝子の産物は、単独または組み合わせて、治療の有効性を同定するためのバイオマーカーとしても有用である（例えば、首尾の良い治療の結果として病期の進行を同定することができる）。
【０１５３】
［ＯＡを診断するための本発明のバイオマーカーの使用方法］
本発明は、正常な個体中の遺伝子発現レベルと比較した場合にその発現レベルが変形性関節症の存在の指標となるＯＡのバイオマーカーとしての図１〜７に記載の遺伝子の使用を意図する。本発明のバイオマーカーの発現レベルを、遺伝子のタンパク質産物レベルの測定によって決定することができるか、発現レベルの測定のために１以上の本発明の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその一部を使用したｍＲＮＡ発現の測定によって決定することができる。
【０１５４】
コントロールと比較した試験個体サンプルのディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成がＯＡの指標となる、コントロールと比較して試験個体のこれらの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルを測定するための、例えば、オリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその一部を、アレイ上に固定し、且つ１以上の本発明の遺伝子またはその一部に特異的な総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＴ−ＰＣＲにハイブリッド形成する核酸標的として使用することができる。
【０１５５】
本発明は、さらに、核酸を市販のアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｆｆｙ  Ｕ１３３など）または加工アレイとハイブリッド形成した核酸プローブとして使用することができ、アレイが１以上のヒトゲノム遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドｃＤＮＡ、ＥＳＴ、またはＤＮＡから構成される、１以上の本発明の遺伝子またはその一部に対応する総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＴ−ＰＣＲ産物の使用を意図する。コントロールと比較したＲＴ−ＰＣＲ産物のアレイへのハイブリッド形成レベルを測定し、コントロールと比較したＲＴ−ＰＣＲ産物のディファレンシャル（差分的）ハイブリッド形成はＯＡの指標となる。
【０１５６】
本発明は、さらに、ＯＡ診断手段としてコントロールと比較した本発明の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを決定するための定量実時間ＲＴ−ＰＣＲなどの技術（例えば、本発明の遺伝子と相補的なＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）標識プローブを使用する）の使用を意図する。
【０１５７】
本発明は、さらに、ＯＡ診断手段としてコントロールと比較した本発明の遺伝子の発現レベルを決定するために本発明の遺伝子に対応するタンパク質レベルを測定するための当業者に公知の技術（例えば、ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降タンパク質マイクロアレイ分析などの技術）の使用を意図する。
【０１５８】
したがって、１つの実施形態では、患者がＯＡを罹患しているかを決定する方法は、（ａ）試験個体由来のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＴ−ＰＣＲ産物に対応する核酸プローブをアレイ上にスポッティングした１以上の本発明の遺伝子に対応する１以上のオリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその一部を有するアレイとハイブリッド形成させるステップと、（ｂ）アレイ上の各固有の位置への各サンプルのハイブリッド形成量を測定するステップと、（ｃ）アレイへの試験個体の核酸プローブのハイブリッド形成量をコントロールと比較するステップと、コントロールと比較した試験サンプルのディファレンシャル（差分的な）ハイブリッド形成がＯＡを罹患した試験個体の指標となることとを含む。
【０１５９】
別の実施形態では、患者がＯＡを罹患しているかを決定する方法は、（ａ）試験個体から総細胞タンパク質を単離するステップと、（ｂ）抗体標的として使用するための本発明の１以上の遺伝子またはその一部によってコードされるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を作製するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の抗体標的をアレイにスポッティングするステップと、（ｄ）試験個体由来の総細胞タンパク質をアレイとインキュベーションするステップと、（ｅ）アレイ上の各固有の位置での結合量を測定するステップと、（ｆ）試験個体の総細胞タンパク質の結合量をコントロールと比較するステップと、前記コントロールが正常な個体由来の総細胞タンパク質を使用することとを含む。
【０１６０】
［ＯＡの進行を決定するための本発明のバイオマーカーの使用方法］
本発明は、その発現レベルが変形性関節症の一定の病期の存在の指標となる図１〜７に記載の遺伝子またはその組み合わせの使用を意図する。当分野で公知の任意の手段によって、サンプル中のマーカー遺伝子の発現レベルを決定することができる。例えば、本発明のバイオマーカーの発現レベルを、遺伝子のタンパク質産物レベルの測定によって決定するか、発現レベルを測定するために本発明の１以上の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはその一部を使用して決定することができる。
【０１６１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の１以上の遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその一部は、コントロールと比較した試験個体のこれらの遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現レベルの測定のためのアレイ上の核酸標的として使用され、コントロールと比較したｍＲＮＡの差分的な発現は試験個体のＯＡの進行または後退の決定手段として有用である。
【０１６２】
本発明は、さらに、核酸を市販のアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｆｆｙ  Ｕ１３３など）または加工アレイとハイブリッド形成した核酸標識として使用することができ、アレイが１以上のヒトゲノム遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、またはＥＳＴから構成され、コントロールと比較したＲＴ−ＰＣＲ産物のハイブリッド形成レベルが試験個体のＯＡの進行または後退の決定手段として有用である、本発明の１以上の遺伝子に対応する総ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＴ−ＰＣＲ産物、またはその一部の使用を意図する。
【０１６３】
本発明は、さらに、試験個体のＯＡの進行または後退の決定手段としてコントロールと比較した本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現レベルを決定するための定量実時間ＲＴ−ＰＣＲなどの技術（例えば、本発明の遺伝子と相補的なＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎまたはＴａｑＭａｎ（登録商標）標識プローブを使用する）の使用を意図する。
【０１６４】
本発明は、さらに、試験個体のＯＡの進行または後退の決定手段としてコントロールと比較した本発明の遺伝子の発現レベルを決定するために本発明の遺伝子に対応するタンパク質レベルを測定するための当業者に公知の技術（例えば、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびタンパク質アレイ分析などの技術）の使用を意図する。
【０１６５】
したがって、１つの実施形態では、患者がＯＡを罹患しているかを決定する方法は、（ａ）試験個体由来のＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＴ−ＰＣＲ産物に対応する核酸プローブをアレイ上にスポッティングした本発明の遺伝子に対応する１以上のオリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその一部を有するアレイとハイブリッド形成させるステップと、（ｂ）アレイ上の各固有の位置のハイブリッド形成量を測定するステップと、（ｃ）試験個体の核酸プローブのハイブリッド形成量をコントロールと比較するステップと、コントロールが、疾患の進行または後退の決定手段として正常な個体または異なるＯＡ病期の個体由来の核酸プローブを使用することとを含む。
【０１６６】
したがって、別の実施形態では、患者がＯＡを罹患しているかを決定する方法は、（ａ）試験個体サンプル由来の総タンパク質をアレイ上にスポッティングした本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドと特異的に結合する１以上のモノクローナル抗体を有するタンパク質アレイとインキュベーションするステップと、（ｂ）アレイ上の各固有の位置での結合量を測定するステップと、（ｃ）試験個体の総細胞タンパク質の結合量をコントロールと比較するステップと、前記コントロールが、疾患の進行または後退の決定手段として正常な個体または異なるＯＡ病期の個体由来の総細胞タンパク質を使用することとを含む。
【０１６７】
［サンプル］
軟骨
１つの態様では、当分野で公知の方法を使用して胎児から軟骨を得た。胎児軟骨の軟骨細胞の代謝活性レベルおよび細胞分裂速度は、正常な成人または任意の病期の変形性関節症（軽度、中程度、著しい、および重度）と診断された個体のいずれか由来の軟骨由来の軟骨細胞と比較して高い。
【０１６８】
別の態様では、軟骨を、当分野で公知であり、且つ以下に記載の方法に従って、生きている正常な個体から得るか、死後１４時間未満の軟骨組織から得る。任意の公知の方法を使用して、ヒト成人由来の正常な関節軟骨を得る。しかし、真に正常な軟骨は、一般に、倫理的配慮により生きたドナーからサンプリングすることができない。好ましくは、時間枠を越えて認められるＲＮＡの分解を最小にするために、正常な軟骨サンプルを、死後１４時間以内のサンプリングした関節への灌流の停止後に死亡したドナーから得る。他の実施形態では、死後１４時間未満（死後１３、１２、１１、１０、９、８、６、４、２、または１時間など）に「正常な」組織を得る。このアプローチを確認するためにヒヒ研究を行い、これを以下の実施例１１に記載する。好ましくは、正常な軟骨を、死後１４時間未満で得る。より好ましくは、正常な軟骨を、死後１２時間未満で得る。
【０１６９】
本発明の別の態様では、軟骨を、以下の変形性関節症の病期からも単離する。軽度、著しい、中程度、および重度。任意の公知の方法を使用して変形性関節症個体由来のヒト軟骨サンプルを得る。好ましくは、関節鏡検査または全関節置換術を受けた個体から軟骨を得て、サンプルを必要になるまで液体窒素中で保存する。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーの構築のための２μｇの総ＲＮＡ抽出物を得るために最少で０．０５ｇの軟骨サンプルを単離する。別の好ましい実施形態では、マイクロアレイ用のプローブサンプルとして使用するための１μｇの総ＲＮＡ抽出物を得るために、最少で０．０２５ｇの軟骨サンプルを単離する。本発明で有用な軟骨サンプルは、本発明の１以上の核酸配列の検出に十分な量である。
【０１７０】
［関節軟骨の発達および病期］
好ましくは、軟骨細胞を、任意の以下の発達および病期から得た。胎児、正常、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、または重度変形性関節症。
【０１７１】
ヒト胎児（例えば、胎児発達時）から単離した軟骨を上記のように特徴づけ、本発明の胎児軟骨細胞の分析に有用である。
【０１７２】
本明細書中で定義の「正常な」個体から単離した軟骨はまた、本発明の「正常な」軟骨細胞の単離および分析に有用である。
【０１７３】
軽度、中程度、著しい、および重度変形性関節症の任意の１つと診断された患者から単離した軟骨はまた、本発明で有用である。
【０１７４】
病期によって関節を分類するために、評価システムを使用するので、関節鏡専門医による主観的決断が最小になる。本明細書中に記載の病期を定義する評価システムは、Ｍａｒｓｈａｌｌ、前記（参照することにより本明細書中に組み込まれる）のものである。この方法によれば、６つの各関節面（膝蓋骨、大腿骨滑車、大腿骨内側顆、内側脛骨プラトー面、大腿骨外側顆、および外側脛骨プラトー面）を、特定の表面上に存在する最悪の病変に基づいて軟骨悪性度に割り当てる。次いで、表１に記載のように、各関節面が関節面の軟骨重症度を反映する変形性関節症の重症度数を与えられる評価システムを適用する。
【０１７５】
【表１】
2006506979.tif 000003
【０１７６】
例えば、大腿骨内側顆は、その最も重篤な軟骨損傷として悪性度Ｉ病変を有する場合、値１を割り当てる。次いで、患者の総スコアを、６つの関節面のスコアの合計から得る。総スコアに基づいて、各患者を以下の４つの変形性関節症群の１つに分類する。軽度（１〜６）、中程度（７〜１２）、著しい（１３〜１８）、および重度（＞１８）。
【０１７７】
［ＲＮＡ調製］
１つの態様では、本明細書中に記載の種々の疾患または発達段階に由来する軟骨サンプルからＲＮＡを単離する。サンプルは、一人の患者由来、または複数の患者由来でプールされ得る。
【０１７８】
当分野で周知の方法に従って、軟骨サンプルから総ＲＮＡを抽出する。１つの実施形態では、以下の方法に従って、軟骨組織からＲＮＡを精製する。個体または患者からの目的組織の取り出し後、ＲＮＡの分解を防止するために組織を液体窒素中で急速冷凍する。一定体積の組織グアニジニウム溶液の添加の際、組織サンプルをホモジナイザー（ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ）にて１０秒間の破壊を２〜３回行って粉砕する。組織グアニジニウム溶液（１Ｌ）を調製するために、５９０．８ｇのグアニジニウムイソチオシアネートを、約４００ｍｌのＤＥＰＣ処理Ｈ2Ｏに溶解する。２５ｍｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）（最終濃度０．０５Ｍ）および２０ｍｌ  Ｎａ2ＥＤＴＡ（最終濃度０．０１Ｍ）を添加し、溶液を一晩撹拌し、体積を９５０ｍｌに調整し、５０ｍｌ  ２−ＭＥを添加する。
【０１７９】
ホモジナイズした組織サンプルを、１２℃で１２，０００×ｇの遠心分離に１０分間供する。得られた上清を、０．１倍体積の２０％Ｓａｒｋｏｓｙｌの存在下にて６５℃で２分間インキュベートし、９ｍｌの５．７Ｍ  ＣｓＣｌ溶液（０．１ｇ  ＣｓＣｌ／ｍｌ）上に重層し、２２℃で一晩の１１３，０００×ｇの遠心分離で分離する。慎重な上清の除去後、チューブを反転させ、チューブを排水する。チューブの底（ＲＮＡペレットを含む）を、５０ｍｌのプラスチックチューブに入れ、３ｍｌ組織再懸濁緩衝液（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５５（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）の存在下で４℃で一晩（またはそれ以上）インキュベートして、ＲＮＡペレットを完全に再懸濁する。得られたＲＮＡ溶液を、２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、その後２４：１クロロホルム／イソアミルアルコールにて連続的に抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５倍体積の１００％エタノールの添加によって沈殿させ、ＤＥＰＣ水に再懸濁する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４）。
【０１８０】
あるいは、以下の１ステッププロトコールに従って、軟骨組織からＲＮＡを単離する。ガラステフロン（登録商標）ホモジナイザーでの１００ｍｇ組織あたり１ｍｌの変性溶液（４Ｍチオ硫酸グアニジニウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ  ２−ＭＥ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）中での均質化によって目的の組織を調製する。ホモジネートを５ｍｌポリプロピレンチューブに移した後、０．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１ｍｌ水飽和フェノール、および０．２ｍｌの４９：１クロロホルム／イソアミルアルコールを連続的に添加する。各成分の添加後にサンプルを混合し、全ての成分を添加した後に０〜４℃で１５分間インキュベートする。サンプルを、１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって分離し、１ｍｌの１００％イソプロパノールの添加によって沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートし、４℃、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化する。得られたＲＮＡペレットを、０．３ｍｌ変性溶液に溶解し、微量遠心管に移し、−２０℃で３０分間の０．３ｍｌの１００％イソプロパノールの添加によって沈殿させ、４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。ＲＮＡペレットを、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ、１００〜２００μｌのＤＥＰＣ処理水またはＤＥＰＣ処理０．５％ＳＤＳに再懸濁する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６）。
【０１８１】
好ましくは、軟骨サンプルを液体窒素中で微粉化し、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用して総ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの純度および完全性を、２６０／２８０ｎｍでの吸光度およびアガロースゲル電気泳動及びその後の紫外線下での洞察によって評価する。
【０１８２】
［ｃＤＮＡライブラリーの構築］
当分野で周知の方法に従って、ｃＤＮＡライブラリーを構築する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前記およびＳａｍｂｒｏｏｋ、前記（参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１８３】
１つの態様では、ｃＤＮＡサンプル（すなわち、ｍＲＮＡなどのＲＮＡに相補的なＤＮＡ）を調製する。ｃＤＮＡの調製は当分野で周知であり、且つ十分に報告されている。
【０１８４】
以下の方法に従ってｃＤＮＡを調製することができる。（記載のように）総細胞ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムを通過させてポリＡＲＮＡを単離する。結合したポリＡｍＲＮＡを、低イオン強度緩衝液を使用してカラムから溶離する。ｃＤＮＡ分子を産生するために、短いデオキシチミジンオリゴヌクレオチド（１２〜２０ヌクレオチド）を、逆転写酵素（ＤＮＡ合成用のテンプレートとしてＲＮＡを使用する酵素）のプライマーとして使用されるポリＡテールとハイブリッド形成させる。あるいはまたはさらに、ｃＤＮＡ合成用プライマーとして目的のｍＲＮＡに相補的な多数の配列を含む短いオリゴヌクレオチドフラグメントの使用によって、多数の位置からｍＲＮＡ種をプライミングする。当分野で周知の種々の酵素ステップによって得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを二本鎖ＤＮＡ分子に変換する（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１８５】
ｃＤＮＡライブラリーを構築するために、ポリ（Ａ）+ＲＮＡ画分を、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって単離することができ、３〜５μｇのポリ（Ａ）+ＲＮＡを使用して、λＺＡＰ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にｃＤＮＡライブラリーを構築する。あるいは、ＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ａｔ  ５’  ｅｎｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用したＰＣＲベースの方法によって、ｃＤＮＡライブラリーをλＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターに構築することができる。５’メチルｄＣＴＰの存在下でＸｈｏＩ−オリゴ（ｄＴ）アダプター−プライマーを使用して第１のｃＤＮＡ鎖を合成する。第２の鎖の合成およびＥｃｏＲＩアダプターのライゲーション後、ｃＤＮＡをＸｈｏＩで消化し、５’末端でＥｃｏＲＩ部位と隣接し、且つ３’末端でＸｈｏＩ部位と隣接するｃＤＮＡを得る。消化したｃＤＮＡを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００スピンカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でサイズ分画し、その後、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで予め消化したλＺＡＰ発現ベクターにライゲーションする。得られたＤＮＡ／ｃＤＮＡ鎖状体を、Ｇｉｇａｐａｃｋ  Ｇｏｌｄパッケージング抽出物を使用してパッケージングする。滴定後、一次パッケージング混合物のアリコートを、−８０℃で一次ライブラリーストックとして７％ＤＭＳＯ中で保存し、残りを安定なライブラリーストックを確立するために増幅させる。
【０１８６】
増幅ライブラリーから、適切な培地上にファージプラークをプレートする。好ましくは、ファージプラークを、色での選択のためにＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌで被覆した大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅＭＲＦ’上に２００〜５００ｐｆｕ／１５０ｍｍプレートの密度でプレートする。次いで、プラークを無作為に採取し、当分野で周知であり、且つ以下に記載の方法によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって陽性インサートを同定する。好ましくは、プラークを、７５μｌの懸濁培地緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０２％ゼラチン）に採取する。１２５ｕｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１０ｐｍｏｌの各改変Ｔ３（５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１９））プライマーおよびＴ７（５’−ＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２０））プライマー、ならびに２ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むＰＣＲ反応物（総体積５０μｌ）のためにファージ溶離物（５  ｕｌ）を使用することができる。反応物を、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のサイクルに供する（９５℃で５分間の変性、その後の３０サイクルの増幅（９４℃で４５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分間）、および最後の定温伸長（７２℃で３分間））。アガロースゲル電気泳動を使用して、インサートの存在および純度を評価する。
【０１８７】
次いで、ＰＣＲ産物を、公知の方法を使用したＤＮＡ配列決定に供する（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、前記およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、前記を参照のこと）。配列決定法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、または組換えポリメラーゼの組み合わせなどの酵素ならびにＥＬＯＮＧＡＳＥ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのプルーフリーディングエクソヌクレアーゼを使用する。好ましくは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｌａｂ  ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ  ＮＶ）、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、およびＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどの機械を使用してプロセスを自動化する。
【０１８８】
ＰＣＲ産物を、最初に、特定のプライマー、ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖ２．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｒｉｓ  ＭｇＣｌ緩衝液、および水を使用したサーマルサイクラー中のＤＮＡ配列決定反応に供する。配列決定反応物を、９４℃で２分間、その後９４℃で３０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間を２５サイクルならびに９４℃で３０秒間および７２℃で１分間を１５サイクル、および７２℃で５分間インキュベートした。次いで、反応物を、当分野で周知の方法（すなわち、アルコール沈殿またはエタノール沈殿）を使用して精製されるまで４℃で保持する。ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  
【０１８９】
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して自動化配列決定を行うことが好ましい。
【０１９０】
［ＰＣＲ］
１つの態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって本発明の核酸配列を増幅する。ＰＣＲ法は、当業者に周知である。
【０１９１】
ＰＣＲは、目的の標的配列を増幅するための熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される複数のＤＮＡ複製サイクルの使用による特定の核酸配列の迅速な増幅方法を提供する。ＰＣＲには、増幅すべき核酸、増幅すべき配列に隣接する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液、および塩の存在が必要である。
【０１９２】
ＰＣＲ法は、当分野で周知である。Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５（参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載のように、ＰＣＲを行う。
【０１９３】
テンプレートＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、より有用には１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲを行う。典型的な反応混合物には、以下が含まれる。２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．４μｌの１．２５μＭ  ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および脱イオン水（総体積を２５μｌにする）。鉱物油を重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行う。
【０１９４】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度ならびにサイクル数を、事実上のストリンジェンシー要件に従って調整する。プライマーがテンプレートにアニーリングすると予想される効率および許容されるミスマッチの程度の両方によってアニーリング温度およびタイミングを決定する。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適にする能力は、十分に当業者の範囲内である。３０℃と７２℃との間のアニーリング温度を使用する。テンプレート分子の最初の変性は、通常、９２℃と９９℃との間で４分間、その後の変性（９４〜９９℃で１５秒間から１分間）、アニーリング（上記で考察して決定した温度；１〜２分間）、および伸長（７２℃で１分間）を２０〜４０サイクルで起こる。最終伸長ステップを一般に７２℃で４分間行い、その後４℃で無期限（０〜２４時間）とし得る。
【０１９５】
電気泳動を使用しないで定量的にＰＣＲ産物を検出するためのいくつかの技術は、本発明に有用であり得る。転写物特異的アンチセンスプローブを使用してこれらの技術のうちの１つ（Ｔａｑｍａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの市販のキットが存在する）を行う。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、遺伝子由来の核酸フラグメント）に特異的であり、消光剤およびオリゴヌクレオチドの５’末端と複合体形成した蛍光レポータープローブを使用して調製する。異なる蛍光マーカーを、異なるレポーターに結合させて、１つの反応で２つの産物を測定することができる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを活性化する場合、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によってテンプレートに結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。消光剤の非存在下で、レポーターは蛍光を発する。レポーターの色の変化は、各特異的産物の量に比例し、蛍光光度計によって測定するので、各色の量を測定してＰＣＲ産物が定量される。多数の個体由来のサンプルを処理して同時に測定されるようにＰＣＲ反応を９６ウェルプレート中で行う。Ｔａｑｍａｎ（商標）システムは、ゲル電気泳動を必要とせず、検量線を使用した場合に定量可能であるというさらなる利点を有する。
【０１９６】
［本発明に有用な核酸配列］
本発明は、マイクロアレイ上に配置された、標的として使用することができ、そして／または変形性関節症の治療薬の開発に使用することができる単離核酸配列（ＥＳＴが含まれる）を提供する。
【０１９７】
１つの態様では、本発明は、異なる病期の変形性関節症と診断された変形性関節症患者の軟骨遺伝子発現プロフィールをモニタリングすることである。本発明の第２の態様は、罹患軟骨細胞の遺伝子発現プロフィールを変化させる潜在的な治療薬をスクリーニングすることである。したがって、本発明は、以下の各病期で存在する核酸配列を提供する。正常、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、および重度変形性関節症。本発明はまた、以下の発達および病期の任意の２つで差分的に発現する核酸配列を提供する。正常、胎児、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、および重度変形性関節症。
【０１９８】
発達または病態（正常、胎児、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、および重度変形性関節症）からの軟骨組織サンプルの単離、ｃＤＮＡライブラリーの調製（上記）、および発現配列タグ（ＥＳＴ）を作製するためのｃＤＮＡライブラリーの大規模部分的配列決定（本明細書中に記載）の実施によって、本発明で有用な核酸を調製する。本発明で有用なＥＳＴは、好ましくは５０〜１０００ヌクレオチド長の範囲、最も好ましくは５０〜５００ヌクレオチド長の範囲である。
【０１９９】
本発明は、「新規」または「公知」と分類される核酸配列またはＥＳＴ（「機能を有する公知の配列」および「公知の機能を有さない公知の配列」（全て本明細書中で定義される）が含まれる）を提供する。
【０２００】
［核酸メンバーおよび標的］
１つの態様では、本発明は、プローブ核酸配列（例えば、軟骨核酸サンプル中に存在する）に特異的に結合する核酸メンバーおよび標的を提供する。
【０２０１】
本発明のアレイを含めるために、核酸メンバーは固体支持体と安定に会合する。核酸メンバーの長さは、５０〜６０００ヌクレオチド、１００〜５００ヌクレオチド、他の実施形態では、５００〜１５００ヌクレオチドの範囲であり得る。核酸メンバーは、一本鎖または二本鎖であり、そして／またはｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲフラグメントであり得る。
【０２０２】
本発明はまた、プローブを含む核酸配列を提供する。一定の実施形態では、当分野で公知の方法によってプローブを標識する。本発明のプローブは、５０〜５０００ヌクレオチド長、より好ましくは１００〜５００ヌクレオチド長、最も好ましくは５０〜２５０ヌクレオチド長である。プローブは、一本鎖または二本鎖であり、且つｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲフラグメントであり得る。
【０２０３】
本発明の核酸メンバーおよび標的を使用して、軟骨細胞が豊富であるか軟骨細胞に特異的な配列、好ましくはサンプル中でのその存在が変形性関節症の病期の指標となるか、診断または予後となる配列などのプローブ配列を検出することができる。
【０２０４】
分析すべきプローブ核酸配列は、好ましくはヒト軟骨に由来し、好ましくはＲＮＡまたはＲＮＡに対応する核酸（すなわち、ｃＤＮＡまたはＲＮＡもしくはｃＤＮＡの増幅産物）を含む。
【０２０５】
［ポリペプチドおよび抗体］
１つの態様では、本発明は、アレイに結合し、且つ２つまたはそれ以上の単離されたバイオマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチド（例えば、図１〜７のヌクレオチド配列によってコードされる標識タンパク質）に選択的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、単離されたバイオマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドの産生および精製ならびに図１〜７に記載の遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体の単離、特徴づけ、および産生を提供する。
【０２０６】
［タンパク質産生］
標準的な組換え核酸法を使用して、本発明のポリペプチドまたは抗体を発現することができる。一般に、ポリペプチドをコードする核酸配列を、核酸発現ベクターにクローン化する。勿論、タンパク質が多数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖を同一または異なる細胞で発現する発現ベクター（例えば、同一または異なるベクター）にクローン化しなければならない。タンパク質が十分に小さい場合、（すなわち、タンパク質は、５０アミノ酸未満のペプチドである）、自動化有機合成法を使用してタンパク質を合成することができる。本明細書中で定義の単離されたバイオマーカー遺伝子の５’領域、３’領域、または内部コード領域を含むポリペプチドを、単離されたバイオマーカー遺伝子の５’領域、３’領域、または内部コード領域に対応するヌクレオチド配列のみを含む核酸発現ベクターから発現させる。図１〜７に記載の遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドまたは図１〜７に記載の遺伝子の５’領域、３’領域、または内部コード領域によってコードされるポリペプチドに指向する抗体の産生方法を以下に提供する。
【０２０７】
ポリペプチドを発現するための発現ベクターには、ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするセグメントに加えて、調節配列（例えば、目的の核酸に作動可能に連結されたプロモーターが含まれる）が含まれ得る。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知であり、本発明の組換え構築物の作製製品が市販されている。例として、以下のベクターを示す。細菌：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴＩ、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。好ましいライブラリーの１つの好ましいクラスは、下記のディスプレイライブラリーである。
【０２０８】
当業者に周知の方法を使用して、本発明のポリヌクレオチドおよび適切な転写／翻訳調節シグナルを含むベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照のこと。ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを含む他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。２つの適切なベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特に注目される細菌プロモーターには、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰ、およびｔｒｃが含まれる。真核生物プロモーターには、ＣＭＶ最初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルス由来のＬＴＲプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、および種々の当分野で公知の組織特異的プロモーターが含まれる。
【０２０９】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞を形質転換させる選択マーカー（例えば、Ｅ．コリおよびＳ．セレビシエ栄養要求性マーカーのアンピシリン耐性遺伝子（ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、およびＴＲＰｌ遺伝子など））ならびに下流構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、特に糖分解酵素（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）など）、ａ因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。本発明のポリヌクレオチドを、翻訳開始配列および翻訳終結配列、好ましくは翻訳タンパク質の細胞膜周辺腔または細胞外培地への分泌を指示することができるリーダー配列を使用して適切な局面で構築する。任意選択的に、本発明の核酸は、融合タンパク質（所望の特徴（例えば、発現した組換え産物の安定化または単純化した精製）を付与するＮ末端同定ペプチドが含まれる）をコードすることができる。任意選択的に機能的プロモーターを用いた作動可能な読み取り段階で適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって、細菌に有用な発現ベクターを構築する。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、所望の場合、宿主内で増幅する１以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換に適切な原核生物宿主には、Ｅ．コリ、バチルス・ズブチリス、サルモネラ・チフィムリウム、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス属内の種々の種が含まれるが、選択肢として他も使用することができる。
【０２１０】
代表的であるが非限定的な例として、細菌に有用な発現ベクターは、選択マーカーおよび周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝因子を含む市販のプラスミド由来の細菌複製起点を含み得る。このような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）が含まれる。
【０２１１】
本発明は、さらに、公知の形質転換、トランスフェクション、または感染法を使用して核酸が宿主細胞に記入された、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。例えば、宿主細胞には、種々の鎖から構築されたライブラリーのメンバーが含まれ得る。宿主細胞は、真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞など）、下等真核生物宿主細胞（酵母細胞など）、または原核細胞（細菌細胞など）であり得る。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））によって宿主細胞に組換え構築物を移入することができる。
【０２１２】
任意の宿主／ベクター系を使用して、本発明の１以上の標的エレメントを同定することができる。これらには、真核生物宿主細胞（ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞など）および原核生物宿主（Ｅ．コリ、およびＢ．ズブチリスなど）が含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、通常特定のレポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現しないか天然で低レベルでレポーターポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。
【０２１３】
本発明の宿主は、酵母または他の真菌であり得る。酵母では、構成性または誘導性プロモーターを含む多数のベクターを使用することができる。概説として、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｈ．１３（１９８８）；Ｇｒａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．ＩＩ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，Ｃｈ．３（１９８６）；Ｂｉｔｔｅｒ，Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６７３−６８４（１９８７）；およびＴｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｅｄｓ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８２）を参照のこと。
【０２１４】
本発明の宿主はまた、Ｅ．コリなどの原核細胞、セラチア・マレスカンスなどの他の腸内細菌科、細菌、種々のシュードモナス、または形質転換、トランスフェクション、および／または感染することができる他の原核生物であり得る。
【０２１５】
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。例えば、このような宿主細胞は、公知の形質転換、トランスフェクション、または感染法を使用して宿主細胞に移入された本発明の核酸を含み得る。本発明は、なおさらに、細胞内のポリヌクレオチドの発現を駆動する宿主細胞に対して異種の調節配列と作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。
【０２１６】
宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞、または細菌細胞などの原核細胞であり得る。
【０２１７】
リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）によって宿主細胞に組換え構築物を移入することができる。本発明の１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を従来の様式で使用して、単離フラグメントによってコードされた遺伝子産物を産生することができる（ＯＲＦの場合）。
【０２１８】
任意の宿主／ベクター系を使用して、本発明の１以上の種々の鎖を発現させることができる。これらには、真核生物宿主（ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞など）および原核生物宿主（Ｅ．コリ、およびＢ．ズブチリスなど）が含まれるが、これらに限定されない。最も好ましい細胞は、通常特定のポリペプチドまたはタンパク質を発現しないか天然で低レベルでポリペプチドまたはタンパク質を発現する細胞である。適切なプロモーターの調節下で、成熟タンパク質を、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生するために、無細胞翻訳系を使用することもできる。原核生物宿主および真核生物宿主での使用に適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）（その開示全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【０２１９】
種々の哺乳動物細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現させることもできる。
【０２２０】
哺乳動物発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５（１９８１）に記載のサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株および類似のベクターを発現することができる他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターを含み、任意の必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、転写終結配列、および５’隣接非転写配列も含む。
【０２２１】
ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０起点）、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、およびポリアデニル化部位を使用して、必要な非転写遺伝因子を得ることができる。細菌培養で産生される組換えポリペプチドおよびタンパク質を、通常、細胞ペレットからの最初の抽出、その後の１以上の塩析、水性イオン交換クロマトグラフィ、またはサイズ排除クロマトグラフィステップによって単離する。いくつかの実施形態では、テンプレート核酸はまた、ポリペプチドタグ（例えば、ペンタ−またはヘキサ−ヒスチジン）をコードする。次いで、種々の鎖のライブラリーによってコードされた組換えポリペプチドを、アフィニティクロマトグラフィを使用して精製することができる。
【０２２２】
任意の従来の方法（凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる）によって、タンパク質発現で使用された細菌細胞を破壊することができる。多数の細胞型は、タンパク質発現に適切な宿主細胞として作用することができる。Ｓｃｏｐｅｓ（（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）は、組換え（および非組換え）タンパク質の多数の一般的な精製方法を提供している。この方法には、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、選択的沈殿、透析、および疎水性相互作用クロマトグラフィが含まれる。
【０２２３】
哺乳動物宿主細胞には、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換初代細胞株、正常な二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養由来の細胞株、一次移植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。
【０２２４】
あるいは、酵母などの下等真核生物または細菌などの原核生物中でタンパク質を産生することが可能である。潜在的に適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、クヴェロミセス株、カンジダ、または異種タンパク質を発現することができる任意の酵母株が含まれる。潜在的に適切な細菌株には、大腸菌、バチルス・ズブチリス、サルモネラ・チフィムリウム、または異種タンパク質を発現することができる任意の細菌株が含まれる。タンパク質が酵母または細菌で作製される場合、例えば、機能的タンパク質を得るために、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって産生されたタンパク質を修飾する必要があり得る。公知の化学的または酵素的方法を使用して、このような共有結合を行うことができる。本発明の別の実施形態では、細胞および組織を、誘導性調節エレメントの調節下で本発明のポリヌクレオチドを含む内因性遺伝子を発現するように操作することができ、この場合、内因性遺伝子の調節配列を相同組換えによって置換することができる。本明細書中で記載される、「遺伝子ターゲティング」を使用して、遺伝子の既存の調節領域を、異なる遺伝子から単離した調節配列または遺伝子操作法によって合成した新規の調節配列と置換することができる。
【０２２５】
このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、足場結合領域、負の調節エレメント、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、または前記配列の組み合わせから構成され得る。あるいは、産生されたＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を与える配列を、ターゲティングによって置換、除去、付加、または修飾することができる（タンパク質の輸送または分泌特性を増強または修飾するためのポリアデニル化シグナル、ｍＲＮＡ安定性エレメント、スプライス部位、リーダー配列、またはタンパク質またはＲＮＡ分子の機能または安定性を変化させるか改良する他の配列が含まれる）。
【０２２６】
［モノクローナル抗体の産生］
バイオマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドに指向するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製方法は、米国特許再発行第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号、同第４，４１１，９９３号、および同第４，１９６，２６５号（参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載されている；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）（これらも参照することにより本明細書中に組み込まれる）も参照のこと。組換え技術によって抗体を産生することができる他の技術（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｄ．Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｌ．Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７２８−５７３２（１９８９）；およびＭｉｃｈｅｌｌｅ  Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：１−９（１９９０）（Ｓｔｒａｔａｃｙｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．から市販されている系を含む）に記載の技術）を使用してモノクローナル抗体を構築することもできる。
【０２２７】
１つの好ましい実施形態では、哺乳動物細胞中でモノクローナル抗体を産生する。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントの発現に好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＤＨＦＲ選択マーカー（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１）に記載）と共に使用されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０）に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞が含まれる）、リンパ球性細胞株（例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞）、ＣＯＳ細胞、およびトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニック哺乳動物）由来の細胞が含まれる。例えば、細胞は、哺乳動物上皮細胞である。
【０２２８】
種々の免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、さらなる配列（宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）など）および選択マーカー遺伝子を保有し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが移入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが移入された宿主細胞に薬物耐性（Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなど）を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を使用したｄｈｆｒ宿主細胞での使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０２２９】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現系の例では、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒＣＨＯ細胞に移入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、遺伝子を高転写レベルで駆動するように、それぞれエンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、およびアデノウイルスなど由来のもの（ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント、またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなど））に作動可能に連結される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキセート選択／増幅を使用してベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を選択するＤＨＦＲ遺伝子を保有する。選択された形質転換宿主細胞を、抗体重鎖および軽鎖を発現するように培養し、培養培地からインタクトな抗体を取り出す。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。例えば、いくつかの抗体を、ＰｒｏｔｅｉｎＡまたはＰｒｏｔｅｉｎＧを使用したアフィニティクロマトグラフィによって単離することができる。
【０２３０】
Ｆｃドメインを含む抗体のために、抗体産生系は、Ｆｃ領域がグリコシル化された抗体を合成することが好ましい。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインを、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７でグリコシル化する。このアスパラギンは、二触覚型（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ−ｔｙｐｅ）オリゴサッカリドでの修飾部位である。このグリコシル化には、Ｆｃγ受容体および補体Ｃ１ｑによって媒介されたエフェクター機能が必要であることが証明されている（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。好ましい実施形態では、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系でＦｃドメインを作製する。Ｆｃドメインには、他の真核生物翻訳後修飾も含まれ得る。
【０２３１】
トランスジェニック動物によって抗体を産生することもできる。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺中での抗体の発現方法を記載している。ミルク特異的プロモーター、目的の抗体をコードする核酸、および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子を構築する。このようなトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生されたミルクは、ミルク中に分泌された目的の抗体を含む。ミルクから抗体を精製し、いくつかの適用のために直接使用することができる。
【０２３２】
［ＥＳＴ配列のデータ収集および分析］
本発明は、ＥＳＴ配列（「新規の配列」、「新規の発現配列タグ（ＥＳＴ）」、および「公知の配列」（「機能を有する公知の配列」および「公知の機能を有さない公知の配列」が含まれる）が含まれる）を提供する。
【０２３３】
公知の遺伝子と適合するＥＳＴまたは他のＥＳＴについての推定同一性を決定するために、作製されたＥＳＴ配列を、利用可能なデータベース（ＮＣＢＩから利用可能な「ｎｔ」、「ｎｒ」、「ｅｓｔ」、「ｇｓｓ」、および「ｈｔｇ」データベースが含まれる）で検索する。次いで、公知の方法を使用して相対ＥＳＴ頻度レベルを計算することができる。任意の公知の方法に従って公知の遺伝子との適合を使用したＥＳＴ機能の特徴づけを行う。好ましくは、作製したＥＳＴ配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（８）を使用した重複の無いＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪおよびｄｂＥＳＴデータベースと比較する。配列同一性が不連続または散在している場合、最小値Ｐ＝１０-10および９５％超のヌクレオチド配列同一性には、公知の遺伝子または他のＥＳＴに対するＥＳＴ適合のために推定同一性の割り当てが必要である。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）サイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＵｎｉｇｅｎｅ、Ｅｎｔｒｅｚ、およびＰｕｂＭｅｄを用いてＥＳＴセット中に示される重複の無い遺伝子リストの構築を行う。各遺伝子のＥＳＴコピー数を分析したＥＳＴの総数で割ることにより、相対遺伝子発現頻度を計算する。
【０２３４】
公知の方法に従って、ＥＳＴ由来の遺伝子を同定する。ＥＳＴ配列由来の新規の遺伝子を同定するために、ＥＳＴは、好ましくは、アノテーションのために少なくとも１００ヌクレオチド長、より好ましくは１５０ヌクレオチド長であるべきである。好ましくは、ＥＳＴは、読み取り枠特性を示す（すなわち、推定ポリペプチドをコードすることができる）。
【０２３５】
ヒトゲノム計画の完了のために、ゲノム配列と適合する特異的ＥＳＴを、ゲノム配列の染色体位置に基づいて特定の染色体にマッピングすることができる。しかし、この配列によってコードされるタンパク質が機能的であることを知ることができないので、ＥＳＴは機能的な意味で「新規」であると見なされる。１つの態様では、本発明を使用して、機能が知られていないより大きな公知の配列の一部である新規のＥＳＴを同定し、これを使用してＥＳＴを含む遺伝子の機能（例えば、軟骨形成および／または罹患軟骨中の遺伝子によって産生される発現産物の役割など）を決定する。あるいはまたはさらに、ＥＳＴを使用して、軟骨形成および／または罹患軟骨の診断または予後マーカーとしてより大きな配列によってコードされるｍＲＮＡまたはポリペプチドを同定することができる。
【０２３６】
より大きな配列に対応するＥＳＴが同定され、ＥＳＴを含むより大きな配列の他の部分をアッセイで使用して遺伝子機能を解明することができる（例えば、遺伝子によってコードされるポリペプチドの単離、これらのポリペプチドと特異的に反応する抗体の作製、ポリペプチドの結合パートナー（受容体、リガンド、アゴニスト、およびアンタゴニストなど）の同定、および／または胎児、成体、正常、および／または罹患個体における軟骨細胞中の遺伝子の発現（またはその欠損）の検出）。
【０２３７】
別の態様では、本発明は、クエリー使用時に配列データベース中の任意の公知の配列との「有意な適合」が証明されない核酸配列を提供する。これらの新規のＥＳＴ配列型を含むより長いゲノムセグメントをゲノムライブラリーの探索によって同定することができ、より長い発現配列をｃＤＮＡライブラリーおよび／または当分野で公知のプライマー配列に由来するようにＥＳＴ配列を使用したポリメラーゼ伸長反応（例えば、ＲＡＣＥ）の実施によって同定することができる。より長いフラグメントをＦＩＳＨおよび他の技術によって特定の染色体にマッピングし、その配列をゲノムおよび／または発現配列データベース中の公知の配列と比較し、上記のようにさらなる機能分析を行うことができる。
【０２３８】
同定された遺伝子をその推定される機能に従って目録を作成することができる。Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｈｗａｎｇ  ＤＭ，Ｄｅｍｐｓｅｙ  ＡＡ，Ｗａｎｇ  ＲＸ，Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｍ，Ｂａｒｒａｎｓ  ＪＤ，Ｄａｉ  ＫＳ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｔｏｗａｒｄ  ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９７；９６：４１４６−２０３に記載のカテゴリーに従って、公知の遺伝子適合を使用してＥＳＴの機能的特徴づけを行う。各細胞内カテゴリー中の遺伝子の分布は、組織の動態の指標となり、変形性関節症の罹患プロセスへの重要な洞察が得られる。
【０２３９】
ＥＳＴの別の分析方法も利用可能である。例えば、各ライブラリー由来のＥＳＴを、配列アラインメント、編集、およびアセンブリプログラム（ＰＨＲＥＤおよびＰＨＲＡＰ（Ｅｗｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．３：１７５（本明細書中で組み込まれる）；ワールドワイドウェブｂｏｚｅｍａｎ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／）など）を使用してコンティグに組み立てることができる。単一のＥＳＴｃＤＮＡクローンのための非重複５’および３’配列読み取りに共通のＥＳＴクローン識別番号を使用した非重複配列コンティグの集団化によってコンティグの重複性を減少させる。１つの態様では、各クラスター由来のコンセンサス配列を、ＮＣＢＩサイトのｕｎｉｇｅｎｅ、Ｅｎｔｒｅｚ、およびＰｕｂＭｅｄを用いたＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、重複の無いＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪおよびｄｂＥＳＴデータベースと比較する。
【０２４０】
［公知の核酸配列またはＥＳＴおよび新規の核酸配列またはＥＳＴ］
既存の核酸配列データベース中の少なくとも１つの既存の配列に有意な適合（６５％超、好ましくは９０％またはそれ以上の同一性）を示すＥＳＴを、本発明の「公知の」配列として特徴付ける。このカテゴリー内で、いくつかの公知のＥＳＴは公知の機能を有するポリペプチドをコードする既存の配列と適合し、これを「機能を有する公知の配列」という。他の「公知の」ＥＳＴは未知の機能を有するポリペプチドをコードする既存の配列と有意に適合し、これは「公知の機能を有さない公知の配列」という。
【０２４１】
上記で引用した利用可能なデータベース中のいかなる既存の配列とも有意に適合しない（６５％未満の同一性）ＥＳＴ配列を、新規のＥＳＴと分類する。これらの新規のＥＳＴは、いかなる他の遺伝子または任意の他の組織由来のＥＳＴと適合しないので、軟骨細胞特異的と見なす。ＥＳＴ配列由来の新規の遺伝子を同定するために、ＥＳＴは、好ましくは１５０ヌクレオチド長である。より好ましくは、ＥＳＴは、少なくとも読み取り枠の一部（すなわち、潜在的にポリペプチド配列に翻訳される翻訳開始コドンと終止コドンとの間の核酸配列）をコードする。
【０２４２】
本発明は、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、および重度変形性関節症の軟骨で固有に発現する公知および新規の核酸配列を提供する。図６および７は、本発明の方法を使用して軟骨ｃＤＮＡライブラリーで同定された軽度ＯＡのみ（図６ａ、７ａ）、中程度ＯＡのみ（図６ｂ）、著しいＯＡ（図６ｃ）、および重度ＯＡ（図６ｄ、７ｄ）を診断するＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号および対応するＰｒｏｔｅｉｎアクセッション番号を有するＯＡ病期特異的マーカーを示す。
【０２４３】
本発明はまた、軽度変形性関節症および重度変形性関節症の軟骨でアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる公知および新規の核酸配列を提供する。
【０２４４】
［潜在的な薬物マーカーの核酸分子］
本発明の多数の新規の核酸分子は、種々の変形性関節症の病期間で差分的に発現し、それにより、変形性関節症の罹患過程の潜在的な薬物標的またはマーカーとして有用である。
【０２４５】
［マイクロアレイ］
マイクロアレイの構築
１つの態様では、ヒト軟骨ｃＤＮＡライブラリーから作製されたｃＤＮＡをマイクロアレイ上に整列させる。好ましくは、本発明のマイクロアレイは、軟骨細胞富化遺伝子または軟骨細胞特異的遺伝子を含み、変形性関節症の罹患過程で重要な全範囲の遺伝子が含まれる。
【０２４６】
本発明のマイクロアレイを使用して、新規のＥＳＴ配列について異なる発達段階と変形性関節症の病期との間で異なる発現プロフィールを示すことができる。これらの新規のＥＳＴ配列を、多数の固有の遺伝子がどのようにして新規のＥＳＴ配列によって示されるのかを決定するためのクラスターおよびアラインメント分析によってさらに特徴付けることができる。同定された新規の固有の遺伝子により、変形性関節症の疾患の進行および治療における重要なマーカーの同定の基本を得ることができる。
【０２４７】
本発明の方法では、実質的な固体支持体表面に安定に会合する核酸メンバーのアレイを、アレイ上の固有の位置の１以上の相補核酸メンバーがプローブ核酸と特異的にハイブリッド形成する相補的核酸メンバー／プローブ複合体のハイブリッド形成パターンを得るのに十分なハイブリッド形成条件下でプローブ核酸を含むサンプルと接触させる。ハイブリッド形成するプローブ核酸の同一性を、アレイ上の核酸メンバーの位置に関して決定することができる。
【０２４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写（ＲＴ）などの確立された技術を使用して核酸メンバーを産生することができる。これらの方法は、現在当分野で公知の方法と類似している（例えば、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉｎｎｉｓ（Ｅｄｉｔｏｒ），ｅｔ  ａｌ．（１９９５）およびＰＣＲ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｇｒａｈａｍ（１９９７）を参照のこと）。当分野で周知の方法（例えば、カラム精製またはアルコール沈殿）によって、増幅核酸を精製する。プライマーおよび所望の核酸の合成時に産生された不完全な産物を実質的に含まないように単離された場合、核酸を純粋と見なす。好ましくは、精製核酸はまた、分子の特異的結合活性を妨害するかマスキングし得る夾雑物を実質的に含まない。
【０２４９】
本発明のマイクロアレイは、固体支持体の一方の表面に密度が１ｃｍ2あたり２０種を超える核酸で結合した複数の固有の核酸を含み、各核酸は、同一でない選択前領域の固体支持体の表面に結合する。アレイ上の各結合サンプルは、以下に詳述の公知の同一性（通常、公知の配列）の核酸組成物を含む。本発明で任意の考えられる基板を使用することができる。
【０２５０】
１つの実施形態では、固体支持体表面に結合した核酸はＤＮＡである。好ましい実施形態では、固体支持体表面に結合した核酸はｃＤＮＡまたはＲＮＡである。別の好ましい実施形態では、固体支持体表面に結合した核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成されたｃＤＮＡである。好ましくは、本発明のアレイ中の核酸メンバーは、少なくとも５０ヌクレオチド長である。１つの実施形態では、核酸メンバーは、少なくとも１５０ヌクレオチド長である。好ましくは、核酸メンバーは、１０００ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、核酸メンバーは、５００ヌクレオチド長未満である。１つの実施形態では、アレイは、固体支持体の一方の面に結合した少なくとも１０個の異なる核酸を含む。別の実施形態では、アレイは、固体支持体の一方の面に結合した少なくとも１００個の異なる核酸を含む。さらに別の実施形態では、アレイは、固体支持体の一方の面に結合した少なくとも１０，０００個の異なる核酸を含む。なおさらに別の実施形態では、アレイは、固体支持体の一方の面に結合した少なくとも１５，０００個の異なる核酸を含む。
【０２５１】
本発明のアレイでは、支持体が軟質または硬質固体支持体であり得る場合、核酸組成物は固体支持体表面に安定に会合される。「安定に会合した」は、各核酸メンバーが、ハイブリッド形成および洗浄条件下で固体支持体に対して固有の位置を維持することを意味する。したがって、サンプルは、支持体表面と安定に非共有結合または共有結合する。非共有結合会合の例には、非特異的吸着、静電的相互作用に基づく結合（例えば、イオン対相互作用）、疎水性相互作用、水素結合相互作用、および支持体表面に共有結合した特定の結合対メンバーによる特異的結合などが含まれる。共有結合の例には、硬質支持体の表面上に存在する核酸と官能基（例えば、−ＯＨ）との間で形成される共有結合が含まれ、下記に詳述するように、官能基は導入された結合基のメンバーとして天然に存在するか存在し得る。
【０２５２】
各組成物中の核酸の存在量は、アレイが使用されるアッセイ時にプローブ核酸配列の適切なハイブリッド形成および検出に十分である。一般に、アレイの固体支持体に安定に会合した各核酸メンバーの量は、少なくとも約０．００１ｎｇ、好ましくは少なくとも約０．０２ｎｇ、より好ましくは少なくとも約０．０５ｎｇであり、量が１０００ｎｇまたはそれ以上もの量になり得る場合、通常、約２０ｎｇを超えない。核酸メンバーが固体支持体上の全円範囲を含むスポットに「スポッティング」される場合、「スポット」の直径は、一般に約１０から５０００μｍまで、通常約２０から２，０００μｍまで、より通常には約１００から２００μｍまでの範囲である。
【０２５３】
コントロール核酸メンバーは、オリゴヌクレオチドを含む核酸メンバーまたはゲノムＤＮＡに対応する核酸、ハウスキーピング遺伝子、ベクター配列、植物核酸配列、ならびに負およびポジティブコントロール遺伝子などを含むアレイ上に存在し得る。コントロール核酸メンバーは、その機能において目的の特定の「重要な」遺伝子が発現されるかどうかは問題とされないが、むしろ他の有用な情報（バックグラウンドまたは基本レベルの発現など）を提供する較正またはコントロール遺伝子である。
【０２５４】
他のコントロール核酸をアレイにスポッティングし、標的に指向するプローブ以外のサンプル中の核酸への非特異的結合または交差ハイブリッド形成をモニタリングするためのプローブ発現コントロール核酸およびミスマッチコントロールヌクレオチドとして使用する。したがって、ミスマッチ標的は、ハイブリッド形成が特異的であるかどうかを示す。例えば、プローブが存在する場合、好ましく適合した標的は一貫してミスマッチした標的よりも輝いているはずである。さらに、全てのコントロールミスマッチが存在する場合、ミスマッチ標的を使用して変異を検出する。
【０２５５】
［固体基板］
本発明のアレイは、軟質または硬質基板を含む。軟質基板は、湾曲させることができるか、折りたたむことができるか、同様に破損することなく操作することができる。本発明の軟質固体支持体である固体材料の例には、メンブレン（例えば、ナイロンおよび軟質プラスチックフィルムなど）が含まれる。「硬質」は、支持体が固体であり、且つ容易に湾曲しない（すなわち、支持体が軟質でない）ことを意味する。したがって、本発明のアレイの硬質支持体は、アレイが使用されるアッセイ条件下、特に高処理操作条件下で物理的支持体および構造をこれらの上に存在する会合核酸に供給するのに十分である。
【０２５６】
基板は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらの任意の組み合わせであってよく、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、チュービング、球体、ビーズ、コンテナー、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、チップなどとして存在し得る。基板は、任意の従来の形状（ディスク、四角形、球体、円形など）を有し得る。好ましくは、基板は、フラットまたは平面であるが、種々の別の表面構造をとることができる。基質は、重合ラングミュア−ブロジェット膜、官能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ2、ＳＩＮ4、変性シリコン、または広範な種々のゲルもしくはポリマーの任意の１つ（（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはその組み合わせなど）であり得る。他の基板材料は、この開示を再検討した場合に当業者に自明である。
【０２５７】
好ましい実施形態では、基質は平面ガラスまたは単結晶シリコンである。いくつかの実施形態によれば、基板表面を所望の表面特異性を得るために周知の技術を使用してエッチングする。例えば、トレンチ、ｖ溝、またはメサ構造などの形成により、合成領域を、入射光の焦点内により近づけて配置することができ、蛍光源などからの集光を最大にするための反射「ミラー」構造を得ることができる。
【０２５８】
固体基板上の表面は、通常、常にではないが、基板と同一の材料から構成される。あるいは、表面は、任意の広範な種々の材料（例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖、シリカ、またはシリカベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス、メンブレン、または任意の上記基板材料）から構成され得る。いくつかの実施形態では、表面は、基板表面と強固に結合したケージ化結合膜の使用を提供することができる。好ましくは、表面は、反応基（カルボキシル、アミノ、またはヒドロキシルなどである）を含む。最も好ましくは、表面は、光学的に透明であり、表面にＳｉ−−ＯＨ官能基（シリカ表面に見出されるものなど）を有する。
【０２５９】
基板表面は、好ましくは、リンカー分子層と共に提供され、リンカー分子は本発明のエレメントを必要としないことが理解される。リンカー分子は、好ましくは、本発明の核酸と結合し、基板上で他の核酸分子とハイブリッド形成し、そして基板に曝露された分子と自由に相互作用するのに十分に長い。
【０２６０】
しばしば、基板は、シリコンまたはガラス表面、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、荷電膜（ナイロン６６またはニトロセルロースなど）、またはその組み合わせである。好ましい実施形態では、固体支持体はガラスである。好ましくは、少なくとも１つの基板表面が実質的に平面である。好ましくは、固体支持体表面は、反応基（カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、またはチオールなどが含まれるが、これらに限定されない）を含む。１つの実施形態では、表面は、光学的に透明である。好ましい実施形態では、基板は、ポリリジンコーティングスライドまたはγアミノプロピルシランコーティングＣｏｒｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ＧＡＰＳまたはＣＭＴ−ＧＡＰ２コーティングスライドである。
【０２６１】
核酸メンバーが結合することができる任意の固体支持体を、本発明で使用することができる。適切な固体支持体材料の例には、ガラスおよびシリカゲルなどのケイ酸塩、セルロースおよびニトロセルロースペーパー、ナイロン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゴム、およびＴＥＦＬＯＮ（商標）などのフッ素樹脂が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６２】
広範な種々の形状（スライドおよびビーズが含まれるが、これらに限定されない）で固体支持体材料を使用することができる。スライドは、いくつかの機能的利点を提供するので、固体支持体の好ましい形態である。その平坦な表面のために、ガラススライドを使用してプローブおよびハイブリッド形成試薬を最少にすることができる。スライドはまた、試薬を集中して適用することができ、一定温度に保持するのが容易であり、洗浄および固体支持体上に固定したＲＮＡおよび／またはＤＮＡの直接的視覚化が容易である。スライドを使用して、固体支持体上に固定したＲＮＡおよび／またはＤＮＡの除去も容易である。
【０２６３】
所望の機能が得られる限り、固体支持体として選択した特定の材料は本発明で不可欠ではない。通常、本発明を作製または使用する者は、コストおよび利用可能性に関する経済性、最終生成物の予想される適用要件、および全製造過程の要求に基づいて最良の市販の材料を選択する。
【０２６４】
［スポッティング法］
１つの態様では、本発明は、アレイを含む各核酸メンバーを固体支持体にスポッティングしたアレイを提供する。
【０２６５】
好ましくは、以下のようにスポッティングを行う。増幅に使用した同一の９６ウェルチューブ中の変形性関節症由来のｃＤＮＡクローン、胎児または正常な軟骨ｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲ産物（約４０μｌ）を、４μｌ（１／１０倍体積）の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および１００μｌ（２．５倍体積）のエタノールで沈殿させ、−２０℃で一晩保存する。次いで、これらを、４℃、３，３００ｒｐｍで１時間遠心分離する。得られたペレットを、５０μｌの氷冷７０％エタノールで洗浄し、３０分間再度遠心分離する。次いで、ペレットを風乾し、２０μｌの３×ＳＳＣまたは５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に一晩十分に再懸濁する。次いで、ロボット利用のＧＭＳ４１７または４２７アレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃａ）を使用して、スライド上にサンプルをスポッティングする（単一または二重）。
【０２６６】
ダイヤモンドスクライバーを使用してマイクロアレイ上のスポットの境界をマーキングすることができる（処理後スポットが見えなくなるので）。加温無粒子ｄｄＨ2Ｏの皿上へのスライドの約１分間の懸濁によってアレイを再水和し（スポットは僅かに膨潤するが、混じりあうことはない）、倒立加熱ブロックで７０〜８０℃で３秒間急速乾燥させる。次いで、核酸をスライドにＵＶ架橋するか（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，６５ｍＪ−ディスプレイを６５０×１００μＪである「６５０」に設定する）、ハイブリッド形成前にアレイを８０℃で２〜４時間ベーキングする。アレイをスライドラックに置く。空のスライドチャンバーを調製し、以下の溶液を充填する。３．０ｇの無水コハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を１８９ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノンに溶解し（試薬を迅速に添加することが重大である）、その直後に最後の無水コハク酸の薄片を溶解し、２１．０ｍｌの０．２Ｍホウ酸ナトリウムを混合し、溶液をスライドチャンバーに注ぐ。スライドラックを迅速且つ均一にスライドチャンバーに押し込み、数秒間強く震盪して確実にスライドから溶液が除去されないようにし、オービタルシェイカーで１５〜２０分混合する。次いで、スライドラックを、９５℃のｄｄＨ2Ｏ中に２分間穏やかに押し込み、その後９５％エタノールに５回押し込む。次いで、過剰なエタノールをペーパータオルにドリップさせることによりスライドを風乾する。アレイを、使用するまで室温でスライドボックス中で保存する。
【０２６７】
本発明の核酸メンブレンの基板への貼り付け（「スポッティング」と呼ばれるプロセス）のための多数の方法を使用することができる。例えば、ポリマーの接着方法の教示のために、例えば、米国特許第５，８０７，５２２号（参照することにより本明細書中に組み込まれる）の教示を使用して核酸を貼り付ける。
【０２６８】
あるいは、当分野で公知の密着印刷テクノロジーを使用してスポッティングを行うことができる。
【０２６９】
［核酸マイクロアレイ］
任意の軟骨細胞ｃＤＮＡライブラリーから作製した核酸配列の任意の組み合わせを、マイクロアレイの構築に使用する。１つの実施形態では、マイクロアレイは、軟骨細胞特異的であり、変形性関節症の罹患過程に重要な全範囲の遺伝子を含むと予想される。本発明のマイクロアレイは、好ましくは、１０個と２０，０００個との間の核酸メンバーを含み、より好ましくは少なくとも５０００個の核酸メンバーを含む。核酸メンバーは、本明細書中に記載の公知または新規の核酸配列またはその任意の組み合わせである。本発明のマイクロアレイを使用して、異なる軟骨発達段階および変形性関節症の病期で特異的に発現される遺伝子の異なる遺伝子発現プロフィールを確認する。
【０２７０】
本発明はまた、変形性関節症発症の初期の危険因子を同定するための正常と軽度変形性関節症患者との間で差分的に発現される遺伝子を含むマイクロアレイを提供する。本発明はまた、正常な個体と軽度、中程度、顕著、または重度変形性関節症と診断された患者との間で差分的に発現される１以上の核酸配列を含む変形性関節症診断のためのマイクロアレイを提供する。このようなアレイを、患者の治療に対する応答をモニタリングするための予後方法に使用することもできる。好ましくは、変形性関節症の診断のためのアレイは、１０〜２０，０００個の核酸メンバー、より好ましくは５０〜１５，０００個の核酸メンバーを含む。１つの実施形態では、上記マイクロアレイを使用して、以下の任意の軟骨細胞疾患または発達段階（胎児、正常、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、および重度変形性関節症）由来の軟骨細胞の同化作用を調整するか軟骨細胞で差分発現される少なくとも１つの核酸配列の発現レベルを変化させる（例えば、増加または減少させる）治療薬を同定する。
【０２７１】
本発明のマイクロアレイとハイブリッド形成して分析されるプローブ核酸サンプルは、好ましくはヒト軟骨に由来する。この手順では、プローブ核酸サンプルとしての利用可能なＲＮＡ量が制限される。好ましくは、本発明での使用のために少なくとも１μｇの総ＲＮＡを得る。多数の軟骨剖検サンプル中のＲＮＡ量が非常に少量であるので、これは有利である。
【０２７２】
［ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）］
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）標的アレイは固有且つ頑丈なプロセス（フォトリソグラフィとコンビナトリアルケミストリーとの組み合わせ）によって製造され、アレイは多数の強力な能力を有する。計算したところ最少合成ステップ数で、ＧｅｎｅＣｈｉｐテクノロジーにより、非常に高密度にパッケージングされた数十万の異なる標的を有するアレイが製造される。この特徴により、研究者は少量のサンプルを使用して高品質のゲノム範囲のデータを得ることができる。標的の長さ（その数ではない）によって必要な合成ステップ数が決定されるので、製造の拡大縮小が可能である。この頑丈で自動化したプロセスにより、高再生可能性を有するアレイが得られ、各研究所でそのアレイを製造および試験する必要性の排除によりユーザーの設定時間が減少する。
【０２７３】
半導体産業から適用したテクノロジーを使用して、ＧｅｎｅＣｈｉｐ製造は５インチ四方の石英ウエハーから開始する。最初にその表面を確実に均一にヒドロキシル化するために石英を洗浄する。石英は自然にヒドロキシル化されるので、その後アレイ上の標的を位置付けるために使用するリンカー分子などの化合物の接着のための優れた基板が得られる。
【０２７４】
ウエハーを石英の水酸基と反応する両方のシランに位置付けて共有結合した分子の行列を形成させる。これらのシラン分子の間の距離により標的の記録密度が決定され、たった１．２８平方センチメートル内に５００，０００個の標的位置（または配置（ｆｅａｔｕｒｅ））にアレイを保持することが可能である。これらの各配置は、何百万もの同一のＤＮＡ分子を保有する。シランフィルムにより、標的アセンブリを開始するための均一な水酸基密度が得られる。シラン行列に結合したリンカー分子により、光によって空間的に活性化することができる表面が得られる。
【０２７５】
標的合成を並行して行い、複数の成長中の鎖にＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧヌクレオチドが同時に付加される。オリゴヌクレオチド鎖が各ステップでヌクレオチドを受け取ることを定義するために、各配置の範囲に対応する１８〜２０平方μｍのウィンドウを有するフォトリソグラフィマスクをコーティングしたウエハー上に置く。各標的の所望の配列に基づいてウィンドウはマウス上に分布する。第１の合成ステップでマスク上に紫外線を当てた場合、曝露したリンカーが脱保護されてヌクレオチドカップリングに利用可能となる。このステップで重要なのは、各合成ステップ前にウエハーでのマスクの正確なアラインメントである。この重要なステップを確実に正確に完了するために、ウエハーおよびマスク上のクロムマークを完璧に整列させる。
【０２７６】
一旦所望の配置が活性化されると、除去可能な保護基を有する単一のデオキシヌクレオチド型を含む溶液を、ウェハー表面上に急速に流す。ヌクレオチドは活性化リンカーに結合し、合成を開始する。
【０２７７】
プロセスが非常に効率的であるにもかかわらず、いくつかの活性化分子は新規のヌクレオチドに結合できない。これらの「分離物」が、ヌクレオチドが失われた標的となることを回避するために、キャッピングステップを行ってこれらを切断する。さらに、分岐オリゴヌクレオチドの形成を回避するためにヌクレオチドの側鎖を保護する。
【０２７８】
以下の合成ステップでは、次の脱保護およびカップリングラウンドのためにウエハー上に別のマスクを置く。標的がその完全長（通常、２５ヌクレオチド）に達するまで、このプロセスを繰り返す。
【０２７９】
オリゴヌクレオチド配列中の各位置に１〜４個のヌクレオチドを占めることができるにもかかわらず（ウエハーあたり２５×４または１００個の異なるマスクが必要である）、この必要数を有意に減少させるように合成プロセスをデザインすることができる。マスク利用の最小化を補助するアルゴリズムにより、各標的の合成速度の調整および同一のマスクを複数回使用することができる場合の状況の同定によってどのようにして標的成長を最良に調整するかが計算される。
【０２８０】
一旦合成が完了すると、ウエハーを脱保護し、ダイスカットし、得られた各アレイをフローセルカートリッジにパッケージングする。アレイあたりの標的配置数に依存して、１つのウエハーから４９個と４００個との間のアレイを得ることができる。
【０２８１】
製造プロセスは、包括的な一連の品質管理試験で終了する。さらに、各ウエハーからのアレイのサンプリングを使用して、コントロールハイブリッド形成の実施によってバッチを試験する。標準化コントロール標的を使用して、ハイブリッド形成の定量試験も行う。
【０２８２】
これらの厳格な試験の合格後、基本的な生物学的機構の発見から新規の疾患の治療薬の開発までの意欲的な目標の遂行を補助するために、ＧｅｎｅＣｈｉｐ標的アレイを十分に調製する。
【０２８３】
［ヒトゲノムＵ１３３セット］
２つのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）アレイからなるヒトゲノムＵ１３３（ＨＧ−Ｕ１３３）セットは、約３３，０００個の十分に立証されたヒト遺伝子由来の３９，０００個を超える転写物を示すほとんどの４５，０００個の標的セットを含む。このセットのデザインには、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ｄｂＥＳＴ、およびＲｅｆＳｅｑから選択された配列を使用する。
【０２８４】
ＵｎｉＧｅｎｅデータベース（Ｂｕｉｌｄ  １３３、２００１年４月２０日）から配列クラスターを作製した。次いで、これらを分析および多数の他の公的に利用可能なデータベース（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＥＳＴ  ｔｒａｃｅ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙおよびｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｐａｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（２００１年４月リリース）が含まれる）との比較によって絞り込んだ。
【０２８５】
ＨＧ−Ｕ１３３Ａアレイには、ＲｅｆＳｅｑデータベース配列の表示およびヒトゲノムＵ９５Ａｖ２アレイで以前に示された配列に関する標的セットが含まれる。ＨＧ−Ｕ１３３Ｂアレイは、主にＥＳＴクラスターを示す標的セットを含む。
【０２８６】
［１５Ｋ  ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）（バージョン２ｂ）］
ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）バージョン２ｂは、１５０００個の軟骨細胞特異的ｃＤＮＡライブラリー由来の軟骨細胞の新規および公知のＥＳＴ配列を含む軟骨細胞特異的マイクロアレイチップである。
【０２８７】
［ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）のコントロール］
マイクロアレイ上で使用したコントロールには２つの型が存在する。第１に、ポジティブコントロールは、その発現レベルが異なる調査段階で不変の遺伝子であり、以下をモニタリングするために使用する。
ａ）スライドへの標的ＤＮＡの結合、
ｂ）スライドへの標的ＤＮＡのスポッティングおよび結合処理量、
ｃ）ＲＮＡサンプルの量、および
ｄ）プローブの逆転写および蛍光標識の効率。
【０２８８】
第２に、ネガティブコントロールは、目的のサンプルと無関係であり、それにより交差ハイブリッド形成する可能性が低い生物由来の外部コントロールである。これらを、以下をモニターするために使用する。
ａ）スライド上のバックグラウンド蛍光の変化、および
ｂ）非特異的ハイブリッド形成。
【０２８９】
ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）上に現在以下からなる６３個のコントロールスポットが存在する。
型                                数
ポジティブコントロール            ２
外来ＤＮＡ                        １２
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ＤＮＡ      １０
スポッティング緩衝液              ４１
【０２９０】
［タンパク質アレイ］
本発明のポリペプチドをタンパク質アレイ上に固定することができる。タンパク質アレイを、本明細書中で定義の１以上のバイオマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドの存在についての診断ツール（例えば、医学的サンプル（生検など）のスクリーニング用）として使用することができる。タンパク質アレイには、例えば、バイオマーカー遺伝子によってコードされるポリペプチドに結合する抗体および他のリガンドも含まれ得る。
【０２９１】
ポリペプチドアレイの作製方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：ｅ３；ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／４０８０３、ＷＯ９９／５１７７３Ａ１、および米国特許第６，４０６，９２１号に記載されている。例えば、市販のロボットを利用した装置（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）、またはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ））を使用して、アレイにポリペプチドを高速でスポッティングすることができる。アレイ基板は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス（例えば、表面変性ガラス）であり得る。アレイには、多孔質基質（例えば、アクリルアミド、アガロース、または別のポリマー）も含まれ得る。
【０２９２】
例えば、アレイは、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ、前記に記載の抗体のアレイであり得る。ポリペプチドリガンドを産生する細胞をアレイ形式でフィルター上に増殖させることができる。ポリペプチド産生を誘導し、発現抗体を、細胞の一定位置でフィルターに固定する。アレイの各アドレスでの結合範囲に関する情報を、例えば、コンピュータデータベースにプロフィールとして保存することができる。
【０２９３】
別の例では、アレイは、本明細書中に記載の本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドのアレイである。
【０２９４】
［ＲＴ−ＰＣＲ］
１つの態様では、本発明の核酸標的または核酸標的プローブとして有用な核酸配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と組み合わせた逆転写（ＲＴ）を使用した軟骨由来のＲＮＡの増幅によって作製することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法は、当業者に周知である。
【０２９５】
テンプレートとして総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを使用し、本発明の遺伝子の転写部分に特異的なプライマーを使用して逆転写を開始させる。市販のソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  １．０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅなど）を使用して、プライマーをデザインすることができる。その後、逆転写産物をＰＣＲのテンプレートとして使用する。
【０２９６】
ＰＣＲは、目的のプローブ配列を増幅するための熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される複数のＤＮＡ複製サイクルの使用による特定の核酸配列の迅速な増幅方法を提供する。ＰＣＲには、増幅すべき核酸、増幅すべき配列に隣接する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、緩衝液、および塩の存在が必要である。
【０２９７】
ＰＣＲ法は、当分野で周知である。Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５（参照することにより本明細書中に組み込まれる）に記載のように、ＰＣＲを行う。
【０２９８】
テンプレートＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ、より有用には１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲを行う。典型的な反応混合物には、以下が含まれる。２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．４μｌの１．２５μＭ  ｄＮＴＰ、０．１５μｌ（または２．５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、および脱イオン水（総体積を２５μｌにする）。鉱物油を重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行う。
【０２９９】
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度ならびにサイクル数を、事実上のストリンジェンシー要件に従って調整する。プライマーがテンプレートにアニーリングすると予想される効率および許容されるミスマッチの程度の両方によってアニーリング温度およびタイミングを決定する。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを最適にする能力は、十分に当業者の範囲内である。３０℃と７２℃との間のアニーリング温度を使用する。テンプレート分子の最初の変性は、通常、９２℃と９９℃との間で４分間、その後の変性（９４〜９９℃で１５秒間から１分間）、アニーリング（上記で考察して決定した温度；１〜２分間）、および伸長（７２℃で１分間）を２０〜４０サイクルで起こる。最終伸長ステップを一般に７２℃で４分間行い、その後４℃で無期限（０〜２４時間）とし得る。
【０３００】
［定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲ］
電気泳動を使用しないで定量的にＰＣＲ産物を検出するためのいくつかの技術は、本発明に有用であり得る（例えば、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，（１９９０）を参照のこと）。
【０３０１】
転写物特異的アンチセンスプローブを使用してこれらの技術のうちの１つ（Ｔａｑｍａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの市販のキットが存在する）を行う。このプローブは、ＰＣＲ産物（例えば、遺伝子由来の核酸フラグメント）に特異的であり、消光剤およびオリゴヌクレオチドの５’末端と複合体形成した蛍光レポータープローブを使用して調製する。異なる蛍光マーカーを、異なるレポーターに結合させて、１つの反応で２つの産物を測定することができる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを活性化する場合、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によってテンプレートに結合したプローブの蛍光レポーターを切断する。消光剤の非存在下で、レポーターは蛍光を発する。レポーターの色の変化は、各特異的産物の量に比例し、蛍光光度計によって測定するので、各色の量を測定してＰＣＲ産物が定量される。多数の個体由来のサンプルを処理して同時に測定されるようにＰＣＲ反応を９６ウェルプレート中で行う。Ｔａｑｍａｎ（商標）システムは、ゲル電気泳動を必要とせず、検量線を使用した場合に定量可能であるというさらなる利点を有する。
【０３０２】
ＰＣＲ段階中にＰＣＲ産物に組み込まれてＰＣＲ産物量に比例して蛍光を発する蛍光標識としてＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを使用して、電気泳動を使用しないＰＣＲ産物の定量的検出に有用な第２の技術（ＱｕａｎｔｉＴｅｓｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの市販のキットが存在する）を行う。
【０３０３】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）およびＱｕａｎｔｉＴｅｓｔ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）システムをその後使用してＲＮＡを逆転写することができる。ＰＣＲステップとして同一の反応混合物中で逆転写を行うことができるか（１ステッププロトコール）、ＰＣＲ使用した増幅の前に最初に逆転写を行うことができる（２ステッププロトコール）。
【０３０４】
［キット］
本発明は、本発明のアレイを使用した発現アッセイ用キットを提供する。したがって、本発明のこのようなキットは、少なくとも核酸メンバーと会合した本発明のアレイおよびパッケージング手段を含む。キットは、さらに、種々の方法で使用する１以上の以下のさらなる試薬を含み得る。１）試験核酸を作製するためのプライマー、２）任意選択的に１以上の固有に標識されたｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（例えば、ビオチン化Ｃｙ３またはＣｙ５タグ化ｄＮＴＰ）を含むｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ（プレミックスまたは個別のいずれか）、３）合成後標識試薬（蛍光色素の化学活性誘導体など）、４）逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼなどの酵素、５）種々の緩衝液（例えば、ハイブリッド形成緩衝液および洗浄緩衝液）、６）スピンカラムなどのような標識プローブ精製試薬および成分、７）およびシグナル発生および検出試薬（例えば、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体、および化学蛍光基質または化学発光基質など）。
【０３０５】
［マイクロアレイの使用］
本発明の核酸アレイを、１以上の標的核酸配列を含むサンプル中で多数の核酸をアッセイすることができる高処理技術で使用することができる。本発明のアレイは、種々の適用（遺伝子発現分析、変形性関節症の診断、変形性関節症の診断、患者の治療に対する応答のモニタリング、および薬物スクリーニングなどが含まれる）で使用される。
【０３０６】
１つの態様では、本発明のアレイを、他の用途もあるが、ディファレンシャルな（差分的な）遺伝子発現アッセイで使用する。例えば、アレイは、（ａ）疾患および／または病期の診断、（ｂ）発達中の軟骨（例えば、胎児軟骨）、（ｃ）外部または内部刺激に対する軟骨細胞の応答、（ｄ）治療に対する軟骨／軟骨細胞の応答、（ｅ）軟骨組織の操作、（ｆ）薬理ゲノミクスなどの差分的な発現分析で有用である。
【０３０７】
例えば、本発明で有用なアレイには、正常な個体と比較して変形関節症患者で発現の増減が証明される配列が含まれ得る。より詳細には、本発明で有用なアレイには、特定の進行段階の疾患（例えば、軽度変形性関節症）を有すると同定された患者で発現の増減が証明されるが、別の進行段階の疾患（例えば、重度変形性関節症）で発現の増減が証明されない配列が含まれる。
【０３０８】
変形性関節症の診断手段としてまたは変形性関節症の治療薬の有効性をモニタリングする目的で、これらの配列の少なくとも１つ、より好ましくは大部分を使用してアレイを作製することができる。
【０３０９】
例えば、本発明のアレイを使用して、発現が増減すると同定された配列を含むアレイへの患者のＲＮＡに相補的なサンプルのハイブリッド形成およびこのサンプルと正常な個体から単離したＲＮＡに相補的なサンプルとの間の類似または同一の第２のアレイへのハイブリッド形成レベルの強度の比較によって変形性関節症を罹患した個体を診断することができる。
【０３１０】
同様に、本発明のアレイを使用して、患者のＲＮＡに相補的なサンプルにハイブリッド形成することと、変形性関節症の進行を減少させるように患者を処置することと、前記ハイブリッド形成強度と本発明の別のアレイにハイブリッド形成した標準サンプルのハイブリッド形成強度とを比較することによって変形性関節症患者の治療有効性をモニタリングすることができる。
【０３１１】
さらに、本発明のアレイを使用して、正常な個体由来の軟骨細胞を候補薬剤とインキュベートすることと、前記軟骨細胞を死後１４時間未満の正常な個体から得た軟骨サンプルから単離することと、本発明のアレイに患者のＲＮＡに相補的なサンプルをハイブリッド形成させることと、本発明の別のアレイに標準として有用なサンプルをハイブリッド形成させることと、アレイ上の対応する固有の位置の間の発現の強度を比較することとによって、本発明のポリヌクレオチド配列の発現を増減させる薬剤を同定することができる。
【０３１２】
標準サンプルの選択は、当業者によって十分に理解されており、変形性関節症を発症していない１人または複数人の正常な個体から単離したＲＮＡに相補的なサンプルが含まれる。標準サンプルには、軟骨細胞から単離したＲＮＡに相補的なサンプルが含まれる。
【０３１３】
［プローブの調製］
本発明のマイクロアレイ用のプローブは、ヒト軟骨に由来することが好ましい。
プローブ核酸は、１以上の化学結合型、通常相補塩基対合、通常水素結合形成によって核酸標的または相補配列の核酸メンバーに結合することができる。
【０３１４】
本明細書中で使用される、「ｍＲＮＡ転写物由来の核酸」または「ｍＲＮＡに対応する核酸」は、ｍＲＮＡ転写物またはそのサブシーケンスの合成を最終的にテンプレートとして使用する核酸をいう。したがって、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、このｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、このｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、この増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは全てｍＲＮＡ転写物に由来するかこれに対応し、このような由来するか対応する産物の検出はサンプル中の元の転写物の存在および／または存在度の指標となるか比例する。したがって、適切なプローブ核酸サンプルには、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、このｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、このｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されたＤＮＡ、およびこの増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡなどが含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される核酸プローブは、ヒト軟骨に由来することが好ましい。好ましくは、プローブは、ヒト軟骨抽出物由来の核酸である。核酸は、当分野で公知の方法（例えば、逆転写またはＰＣＲ）を使用してヒト軟骨ｍＲＮＡ抽出物から合成した一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。
【０３１５】
最も簡単な実施形態では、このような核酸プローブは、軟骨サンプルから単離した総ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対応する核酸サンプル（例えば、ｃＤＮＡ）を含む。別の実施形態では、総ｍＲＮＡを、例えば、酸性グアニジニウム−フェノール−クロロホルム抽出法を使用して所与のサンプルから単離し、ポリＡ＋ｍＲＮＡをオリゴｄＴカラムクロマトグラフィまたは（ｄＴ）ｎ磁性ビーズの使用によって単離する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）。好ましい実施形態では、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１５５９６）を使用して総ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの純度および完全性を、２６０／２８０ｎｍの吸光度およびアガロースゲル電気泳動ならびにその後の紫外線下での洞察によって評価する。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、ハイブリッド形成前にプローブ核酸サンプルを増幅することが望ましい。当業者は、定量的結果が望ましい場合、どのような増幅方法を使用しても、増幅した核酸の相対頻度を維持または制御する方法を使用することに注意しなければならないことを認識する。「定量的」増幅方法は当業者に周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同一のプライマーを使用した既知量のコントロール配列の同時増幅を含む。これにより、ＰＣＲ反応を較正するために使用することができる内部標準が得られる。次いで、高密度アレイは、増幅核酸の定量のための内部標準に特異的な標的を含み得る。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコールは、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，（１９９０）に記載されている。
【０３１７】
他の適切な増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９０））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ，８９：１１７，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｋｗｏｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３を参照のこと）、および自律配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１８】
特に好ましい実施形態では、プローブ核酸サンプルｍＲＮＡは、逆転写酵素ならびにオリゴｄＴおよびＴ７ファージプロモーターをコードする配列からなるプライマーで逆転写されて一本鎖ＤＮＡテンプレートが得られる。ＤＮＡポリメラーゼを使用して、第２のＤＮＡ鎖を重合させる。二本鎖ｃＤＮＡの合成後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し、ｃＤＮＡテンプレートからＲＮＡを転写する。それぞれの１つのｃＤＮＡテンプレートからの連続的転写ラウンドにより、増幅ＲＮＡが得られる。インビトロ転写法は、当業者に周知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前記を参照のこと）、この特定の方法は、この方法によるインビトロ増幅によって種々のＲＮＡ転写物の相対頻度が保存されることを証明したＶａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１６６３−１６６７に詳述されている。さらに、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３０１０−３０１４は、元の出発材料の１０6倍を超える増幅を達成し、それにより生体サンプルが限定されている場合でさえも発現をモニタリングすることが可能なインビトロ転写を介した２ラウンドの増幅を使用するプロトコールを記載している。
【０３１９】
［標的または核酸プローブの標識］
標的または核酸プローブのいずれかを標識することができる。
【０３２０】
分子に結合するか組み込まれる任意の分析で検出可能なマーカーを本発明で使用することができる。分析で検出可能なマーカーは、分析で検出および定量される任意の分子、部分、または原子をいう。
【０３２１】
本発明での使用に適切な検出可能な標識には、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気学的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。本発明で有用な標識には、標識ストレプトアビジン抱合体での染色用のビオチン、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、および緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般的に使用されている他の酵素）、およびコロイド状金ビーズ、着色ガラスビーズ、またはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色分析用標識などが含まれる。このような標識の使用を教示した特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号（その全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる）が含まれる。
【０３２２】
このような標識の検出手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して放射性標識を検出することができ、放射光を検出するための光検出器を使用して蛍光マーカーを検出することができる。酵素標識を、典型的には、酵素への基質の供給および基質上の酵素作用によって産生される反応生成物の検出によって検出し、比色分析用標識を着色標識の簡単な視覚化によって検出する。
【０３２３】
当業者に周知の任意の多数の手段によって標識を組み込むことができる。しかし、好ましい実施形態では、サンプル核酸の調製における増幅ステップ時に標識を同時に組み込む。したがって、例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、標識増幅産物が得られる。好ましい実施形態では、標識ヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用した上記の転写増幅により、転写核酸に標識が組み込まれる。
【０３２４】
あるいは、標識を、元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に直接付加することができるか、増幅後に増幅産物を完了する。核酸への標識の結合方法は、当業者に周知であり、例えば、核酸のキナーゼ処理およびその後のサンプル核酸に結合する核酸リンカーの標識（例えば、フルオロフォア）への結合（ライゲーション）によるニック翻訳または末端標識（例えば、標識ＲＮＡを使用）が含まれる。
【０３２５】
好ましい実施形態では、蛍光修飾は、シアニン色素（例えば、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＵＴＰ、Ｃｙ−３／Ｃｙ−５  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）またはａｌｅｘａ色素（Ｋｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５００９−５０１３））による。
【０３２６】
好ましい実施形態では、比較のために使用する２つのプローブサンプルを、区別可能な検出シグナルを発生する異なる蛍光色素で標識する（例えば、正常な軟骨から作製したプローブをＣｙ５で標識し、軽度変形性関節症の軟骨から作製したプローブをＣｙ３で標識する）。ディファレンシャルな（差分的な）標識プローブサンプルを、同一のマイクロアレイに同時にハイブリッド形成する。好ましい実施形態では、当分野公知の方法（例えば、エタノール精製またはカラム精製）を使用して標識プローブを精製する。
【０３２７】
好ましい実施形態では、プローブには、マイクロアレイから発生されるシグナルを標準化するためにマイクロアレイ上のコントロール標的にハイブリッド形成する１以上のコントロール分子が含まれる。好ましくは、標識された標準化プローブは、上記マイクロアレイ上にスポッティングしたコントロールオリゴヌクレオチドと完全に相補的な核酸配列である。ハイブリッド形成後の標準化コントロールから得たシグナルにより、ハイブリッド形成条件、標識強度、「読み取り」効率、およびアレイ間によって異なる完全なハイブリッド形成のシグナルを生じ得る他の要因のばらつきについてのコントロールが得られる。好ましい実施形態では、アレイ中の全ての他の標的から読み取ったシグナル（例えば、蛍光強度）を、コントロール標的由来のシグナル（例えば、蛍光強度）で割ることにより、測定値を標準化する。
【０３２８】
好ましい標準化プローブを、サンプル中に存在する他のプローブの平均の長さを反映するように選択するが、一定範囲の長さを対象とするように選択する。標準化コントロールを、アレイ中の他の標的の（平均）塩基組成を反映するように選択することもできるが、好ましい実施形態では、１つまたは少数の標準化標的のみを使用し、これらが十分にハイブリッド形成するが（すなわち、二次構造を有さず、且つ自己ハイブリッド形成しない）、いかなるプローブ分子とも適合しないようにこれらを選択する。
【０３２９】
ハイブリッド形成効率における空間的ばらつきを制御するためのアレイによって、標準化標的をアレイ中の任意の位置または複数の位置に局在させる。好ましい実施形態では、標準化コントロールを、アレイの隅または先端ならびに中央に位置付ける。
【０３３０】
［ハイブリッド形成条件］
核酸ハイブリッド形成は、プローブ核酸メンバーおよびその相補的標的が相補塩基対合を介して安定なハイブリッド二本鎖を形成することができる条件下で変性標的核酸メンバーおよびプローブ核酸を得ることを含む。ハイブリッド二本鎖を形成しない核酸を洗浄して除去し、典型的には結合した検出可能な標識の検出によって検出すべきハイブリッド形成核酸を遊離する。一般に、核酸を含む緩衝液の温度上昇または塩濃度の減少によって、核酸を変性させることが認識されている。低ストリンジェンシー条件下で（例えば、低温および／または高塩濃度）、アニーリング配列が完全に相補的でない場合でさえもハイブリッド二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。したがって、ハイブリッド形成の特異性は低ストリンジェンシーで減少する。対照的に、より高いストリンジェンシー（例えば、高温または低塩濃度）では、首尾の良いハイブリッド形成にはよりミスマッチを減少させることが必要である。
【０３３１】
本発明は、Ｄｉｇハイブリッド形成ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）またはホルムアミドベースのハイブリッド形成溶液（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、前記およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．前記に記載）を含むハイブリッド形成条件を提供する。
【０３３２】
ハイブリッド形成条件の至適化方法は当業者に周知である（例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９９３）を参照のこと）。
【０３３３】
ハイブリッド形成後、洗浄によって非ハイブリッド形成標識または非標識核酸を支持体表面から都合よく除去し、それにより基板表面上のプローブ核酸のハイブリッド形成パターンが得られる。種々の洗浄液が当業者に公知であり、これらを使用することができる。得られた標識されたハイブリッド形成オリゴヌクレオチドおよび／または核酸のハイブリッド形成パターンを、種々の方法で視覚化または検出することができ、試験核酸の特定の標識に基づいて特定の検出様式を選択し、各検出手段には、シンチレーションカウンティング、オーロラジオグラフィ、蛍光測定、比色測定、および発光測定などが含まれる。
【０３３４】
［画像収集およびデータ分析］
上記のハイブリッド形成および任意の洗浄ステップならびに／またはその後の処理後、得られたハイブリッド形成パターンを検出する。ハイブリッド形成パターンの検出または視覚化では、標識の強度またはシグナル値が検出も定量もされず、これにより、ハイブリッド形成の各スポット由来のシグナルを測定し、既知数の末端標識プローブ核酸によって発生したシグナルに対応する単位と比較して、ハイブリッド形成パターン中のアレイ上の特定のスポットにハイブリッド形成した各末端標識プローブのコピー数の計算値または絶対値が得られることを意味する。
【０３３５】
アレイへのハイブリッド形成から収集したデータの分析方法は当分野で周知である。例えば、ハイブリッド形成の検出に蛍光標識が含まれる場合、データ分析には、収集データから基板位置の関数としての蛍光強度を決定するステップと、異常値（すなわち、所定の統計的分布から逸脱したデータ）を除去するステップと、残りのデータから試験核酸の相対結合親和性を計算するステップとを含み得る。得られたデータを、会合したオリゴヌクレオチドおよび／または核酸と試験核酸との間の結合親和性によって変化する各領域の強度と共に画像として表示する。
【０３３６】
各サンプルを異なる蛍光色素で標識する、比較すべき２つの軟骨サンプルの同時分析に以下の検出プロトコールを使用する。
【０３３７】
マイクロアレイの各エレメントを、第１の蛍光色でスキャニングする。各アレイエレメントの蛍光強度は、サンプル中の遺伝子の発現レベルに比例する。
【０３３８】
第２の蛍光標識のために、スキャニング操作を繰り返す。２つの蛍光強度の比により、２つの組織サンプル中の相対遺伝子発現レベルが非常に正確且つ定量的に測定される。
【０３３９】
好ましい実施形態では、固定化プローブ核酸配列の蛍光強度を、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光物質（ｆｌｏｕｒ）に適切なレーザー励起源および干渉フィルターを具備した外注共焦点顕微鏡を使用して得た画像から決定した。２２５μｍ2／ピクセルの解像度および６５，５３６の階調で各蛍光物質から異なるスキャンを得た。ハイブリッド形成の強度領域に対する画像分割、２つの蛍光物質の画像間の強度の標準化、および各プローブでの標準化した平均蛍光値の計算は記載されている（Ｋｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５００９−５０１３．Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ  ２：３６４−３７４）。画像間の標準化を使用して、２つの異なる蛍光物質の異なる標識および検出効率を調整する。アレイ上にスポッティングされた内部コントロール遺伝子セットの１つのシグナル強度比の較正によってこれを行う。
【０３４０】
別の好ましい実施形態では、アレイをＣｙ３およびＣｙ５チャネルでスキャニングし、個別の１６ビットのＴＩＦＦ画像として保存する。画像を組み込み、アレイ上の各スポット由来のハイブリッド形成強度データをキャプチャするためのグリッディング処理を含むソフトウェアを使用して分析する。各スポットの蛍光強度およびバックグラウンド除去したハイブリッド形成強度を収集し、Ｃｙ５とＣｙ３との測定平均強度の比を計算する。標準化に線形回帰アプローチを使用し、測定したＣｙ３強度に対するＣｙ５強度の散布図はその範囲を示すと予想される。比の平均を計算し、これを使用してデータを再測定し、これに対して勾配を調整する。１．０倍を超えるアップレギュレートまたはダウンレギュレートの標準化後カットオフを使用して、差分的な発現遺伝子を同定する。
【０３４１】
検出または視覚化後、ハイブリッド形成パターンを使用して、ハイブリッド形成パターンを作製するためにアレイと接触させた標識プローブ核酸サンプルの遺伝子プロフィールに関する定量的情報および標識プローブ核酸サンプルが由来する生理学的供給源を決定する。「遺伝子プロフィール」は、サンプル中に存在する核酸型（例えば、相補的な遺伝子型など）および／またはサンプル中の特定の各核酸のコピー数に関する情報を意味する。このデータから、プローブ核酸サンプルが由来する生理学的供給源に関する情報（標的の生理学的供給源である組織または細胞で発現した遺伝子型および特に定量的な意味での各遺伝子の発現レベルなど）を誘導することもできる。
【０３４２】
［診断または予後試験］
本発明はまた、変形性関節症を検出するための診断試験を提供する。本発明はまた、患者の治療に対する応答をモニタリングするための予後試験を提供する。
【０３４３】
本発明の方法によれば、軽度、中程度、顕著、または重度変形関節症を、患者から軟骨サンプルを得ることによって検出する。ＲＮＡに対応する核酸（すなわち、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を含むサンプルを、患者の軟骨サンプルから調製する。ＲＮＡに対応する核酸を含むサンプルは、軽度、中程度、顕著、または重度変形関節症と診断された患者から単離した軟骨中の少なくとも１つのメンバーが本発明の「正常な個体」と比較して差分的に発現する場合、固体基板および複数の核酸メンバーを含むアレイにハイブリッド形成される。この診断試験によれば、正常なコントロールと比較したサンプルのＲＮＡのディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成は、疾患の指標となる。
【０３４４】
本発明の診断試験の使用によって、治療に応答した患者をモニターする。１つの態様では、本発明の診断試験は、治療前、治療中、および治療後の患者から軟骨サンプルを得るステップを含む。好ましくは、サンプル採取の少なくとも１２時間前に患者を処置する。ＲＮＡに対応する核酸（すなわち、ＲＮＡまたはｃＤＮＡ）を含むサンプルを、患者の軟骨サンプルから調製する。ＲＮＡに対応する核酸を含むサンプルは、軽度、中程度、顕著、または重度変形関節症と診断された患者から単離した軟骨中の少なくとも１つのメンバーが本発明の「正常な個体」と比較して差分的に発現する場合、固体基板および複数の核酸メンバーを含むアレイにハイブリッド形成される。治療がモニターされる患者の診断状態に関してアレイを選択する。この予後試験によれば、アレイ上の１以上の核酸メンバーへの治療前後に単離したＲＮＡに対応する核酸を含むサンプルのディファレンシャルな（差分的な）ハイブリッド形成は、有効な治療の指標となる。好ましくは、治療された患者の遺伝子発現プロフィールは、疾患の重症度の低い形態の患者の遺伝子発現プロフィールとより密接に類似するように、より好ましくは、正常な患者の遺伝子発現プロフィールと密接に類似するように変化する。遺伝子発現プロフィール変化の範囲を、さらに、重症度の減少および／または疾患に関連する１以上の症状の発生などの種々の治療終点と相関させることができる。
【０３４５】
［治療薬］
本発明の有用な治療薬により、軟骨細胞の同化作用および／または異化作用を増減させることができる。好ましくは、治療薬により、軟骨細胞の同化作用および／または異化作用を未処置軟骨細胞と比較して１．０倍超、より好ましくは１．５〜５倍、最も好ましくは５〜１００倍増減させることができる。
【０３４６】
１つの実施形態では、治療薬により、以下の任意の軟骨細胞疾患または発達段階（胎児、正常、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい（顕著）変形性関節症、および重度変形性関節症）由来の軟骨細胞で差分的に発現される少なくとも１つの核酸配列の発現レベルが変化する（例えば、増加または減少）。好ましくは、治療薬により、任意の以下の軟骨細胞疾患または発達段階（胎児、正常、軽度変形性関節症、中程度変形性関節症、著しい変形性関節症、および重度変形性関節症）に由来する軟骨細胞で差分的に発現する核酸配列の発現レベルが変化するか、核酸配列の発現が増減し、この変化は、候補治療薬の非存在での発現レベルよりも１．０倍超、より好ましくは１．５〜５倍、最も好ましくは５〜１００倍増減する。
【０３４７】
別の実施形態では、本発明の治療薬により、変形性関節症に関連する少なくとも１つの症状および／または変化（軟骨の変性または軟骨変性に関連する罹患関節の痛み、腫れ、機能的能力の脆弱性および喪失が含まれる）を緩和することができる。
【０３４８】
候補治療薬は、合成化合物または化合物の混合物であるか、天然物（例えば、植物抽出物または培養上清）であり得る。
【０３４９】
合成または天然化合物の巨大ライブラリー由来の候補治療薬または化合物をスクリーニングすることができる。糖、ペプチド、および核酸ベースの化合物の無作為および指示された合成のために多数の手段が現在使用されている。合成化合物ライブラリーは、多数の企業から市販されている（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ）が含まれる）。稀な化学ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から利用可能である。組み合わせライブリラリーが利用可能であり、調製されている。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物形態の天然化合物のライブラリーは、例えば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）またはＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＮＣ）から利用可能であるか、当分野で周知の方法によって容易に産生可能である。さらに、天然および合成生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修飾される。
【０３５０】
有用な化合物を、多数の化学クラス内で見出すことができる。有用な化合物は、有機化合物または小有機化合物であり得る。小有機化合物の分子量は、５０ダルトン超且つ２，５００ダルトン未満、好ましくは約７５０ダルトン未満、より好ましくは約３５０ダルトン未満である。クラスの例には、複素環、ペプチド、糖、およびステロイドなどが含まれる。効率、安定性、および薬学的適合性などを増大させるために、化合物を修飾することができる。薬剤の構造の同定を使用して、さらなる薬剤を同定、作製、またはスクリーニングすることができる。例えば、ペプチド剤を同定する場合、これらをその安定性を増大させる種々の方法（非天然アミノ酸（Ｄ型アミノ酸、特にＤ−アラニンなど）の使用など）（アミノ末端またはカルボキシ末端の官能化（例えば、アミノ基についてはアシル化またはアルキル化、カルボキシル基についてはエステル化またはアミド化など）による）で修飾することができる。
【０３５１】
［薬物有効性のモニタリング］
変形性関節症の異なる病期と比較した変形性関節症の１つの病期由来の任意の２つの軟骨サンプル間での１以上の差分的な発現遺伝子の発現プロフィールの比較によって薬物の有効性をモニタリングすることができる。上記の候補薬物の処置時または処置後の個体から軟骨サンプルを採取した。比較として、薬物処置前の同一の個体または薬物で処置していない別の個体のいずれかからも軟骨サンプルを採取した。上記のサンプルから核酸を抽出し、本発明のアレイとハイブリッド形成させる。アレイ上の１以上の核酸メンバーは、未処置個体から採取したサンプルと比較して処置個体から採取したサンプル中で異なるレベルで発現することが見出された場合、これは、変形性関節症の治療薬の有効性の指標となった。次いで、発現の相違を評価するために、追跡分析（例えば、ＰＣＲまたはウェスタンブロット分析による）を行った。
【０３５２】
［投薬量および投与］
好ましくは生体適合溶液または薬学的に許容可能な送達賦形剤中の本発明の治療薬を、注入、注射、吸入、または当分野の多数の他の日常的方法によって患者に投与する。投薬量は、患者によって異なる。「治療有効量」を、例えば、機能増強レベル（例えば、軟骨細胞の同化作用の増減、以下の任意の軟骨細胞の疾患または発達段階（胎児、正常、軽度、中程度、顕著、または重度変形性関節症）由来の軟骨細胞で差分的に発現される少なくとも１つの核酸配列の発現の増減）によって決定する。
【０３５３】
本発明の治療薬を単回用量で投与する。この投薬量を、毎日、毎週、毎月、毎年、または主治医によって適当と見なされる期間繰り返すことができる。
【０３５４】
［薬学的組成物］
本発明は、生理学的に適合可能なキャリアと混合した本発明の治療薬を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される、「生理学的に適合可能なキャリア」は、水、リン酸緩衝化生理食塩水、または生理食塩水などの生理学的に適合可能な希釈剤をいい、さらにアジュバントが含まれ得る。フロイント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンなどのアジュバントが当分野で周知の材料である。
【０３５５】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。有効成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用される適切な薬学的に許容可能なキャリア調製物を含み得る。
【０３５６】
経口投与のための薬学的組成物を、経口投与に適切な投薬量での当分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアを使用して処方する。このようなキャリアにより、薬学的組成物を、患者が摂取するための錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、および懸濁液などとして処方することができる。
【０３５７】
活性化合物と、固体賦形剤との組み合わせによって経口用薬学的調製物を得るが、任意選択的に、得られた混合物を粉砕し、所望ならば、適切な添加剤の添加後に顆粒混合物を処理して錠剤または糖衣錠のコアを得る。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質の充填剤（糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；セルロース（メチルセルロース、ヒドロキシプロピリメチルセルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースなど）、ゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムが含まれる）、およびタンパク質（ゼラチンおよびコラーゲンど）など）である。所望ならば、崩壊剤または可溶化剤（架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）など）を添加することができる。
【０３５８】
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物も含み得る濃縮糖溶液などの適切なコーティングを使用した糖衣錠コアを提供する。製品の区別または活性化合物量（すなわち、投薬量）の特徴づけのために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または色素を添加することができる。
【０３５９】
経口で使用される薬学的調製物には、ゼラチンから作製された押出し式（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセルならびにゼラチンから作製された密封軟カプセルおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングが含まれる。押出し式カプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択的に安定剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセルでは、活性化合物を、安定剤を含むか含まない脂肪油、流動パラフィン、または流動ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁することができる。
【０３６０】
非経口投与のための薬学的処方物には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の薬学的組成物を、水溶液、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水など）に処方することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質（カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど）を含み得る。さらに、活性溶媒または賦形剤の懸濁液には、ゴマ油などの脂肪油またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。任意選択的に、懸濁液は、高濃縮溶液を調製するために化合物の安定性を増大させる適切な安定剤または薬剤も含み得る。
【０３６１】
鼻腔投与のために、処方物に浸透させるべき特定のバリアに適切な浸透剤を使用する。このような浸透剤は、一般に、当分野で公知である。
【０３６２】
本発明の薬学的組成物を、当分野で公知の様式（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、レビテーション、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによる）で製造することができる。
【０３６３】
薬学的組成物を塩として得ることができ、多数の酸（塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが含まれるが、これらに限定されない）を使用して処方する。塩は、水溶液または対応する無塩基形態である他のプロトン酸溶液中での可溶性を高める傾向がある。他の場合、好ましい調製物は、使用前に緩衝液と組み合わせる、ｐＨが４．５〜５．５の範囲である１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトールを含む凍結乾燥粉末であり得る。
【０３６４】
許容可能なキャリア中で処方された本発明の治療薬を含む薬学的組成物の調製後、これらを適切な容器に入れ、投与量、投与頻度、および投与方法が含まれる情報を含む適応症の治療のためのラベルを貼る。
【０３６５】
［定義された治療薬を使用した変形性関節症の治療有効性］
本発明の任意の治療薬を使用した治療の有効性を、医療従事者が決定する。この決定は、罹患関節の痛み、腫れ、機能的能力の脆弱性および喪失などの変形性関節症の症状の緩和、および／またはＭａｒｓｈａｌｌ（１９９６、前記）に記載の変形性関節症の診断および病期分類の基準に関連し得る。
【０３６６】
上記開示は、一般に、本発明を説明する。例示のみを目的とし、且つ本発明の範囲を限定することを意図しない本明細書中に記載の以下の特定の実施例を参照してより完全な理解を得ることができる。
【０３６７】
以下の実施例は、本発明を制限せず、且つ本発明の種々の態様および特徴を単に代表する。
〔実施例１〕
【０３６８】
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの構築、およびＥＳＴ分析
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉのドナープログラムから正常な軟骨を得た。非常に初期の軟骨変性（軽度）領域、または関節鏡視下膝手術または膝関節全置換術のいずれかの間の中程度、顕著、または重度関節変性部位からＯＡ軟骨サンプルを得た。Ｍａｒｓｈａｌｌ（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＷ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，１９９６：２３（４）５８２−８５）によって記載のシステムに従って、ＯＡ重症度を悪性度分類した。簡単に述べれば、６つの各膝関節面を、特定の各表面で認められた最も重篤な病変に基づいてポイントを使用して軟骨悪性度に割り当てた。悪性度０は正常であり（０ポイント）、悪性度Ｉの軟骨は、軟化または肥厚しているが、関節面はインタクトである（ポイント１）。悪性度ＩＩの病変では、軟骨表面はインタクトではないが、損傷は軟骨下骨まで拡大していない（２ポイント）。悪性度ＩＩＩ損傷は、軟骨下骨まで拡大しているが、骨は侵食も象牙質化もしていない（３ポイント）。悪性度ＩＶ病変では、骨への侵食または象牙質化が認められる（４ポイント）。患者の総スコアを、６つの軟骨表面のスコアの合計から得る。任意の関連疾患（半月板裂傷（ｍｅｎｉｓｃｕｓ  ｔｅａｒ））が存在する場合、総スコアにポイントを追加する。総スコアに基づいて、各患者を以下の４つの変形性関節症群の１つに分類する。軽度（１〜６）、中程度（７〜１２）、顕著（１３〜１８）、および重度（＞１８）。
【０３６９】
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ）を使用して、軟骨由来の総ＲＮＡを抽出した。上記のようにＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ａｔ  ５’  ｅｎｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用したＰＣＲベースの方法によってｃＤＮＡライブラリーをλＴｒｉｐｌＥｘ２ベクターに構築した。ファージプラークを無作為に採取し、ＰＣＲによって正のインサートを同定した。アガロースゲル電気泳動を使用して、インサートの存在および純度を評価した。次いで、ＰＣＲ産物を、５’ベクター特異的正方向プライマーを使用した自動化ＤＮＡ配列決定に供し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  アナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって配列決定した。各ｃＤＮＡライブラリーからＥＳＴを獲得し、配列決定した。
【０３７０】
［ｃＤＮＡインサートの大規模配列決定］
増幅λＺＡＰ発現ライブラリーから、色選択のためにＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌで被覆した大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅＭＲＦ’上に２００〜５００ｐｆｕ／１５０ｍｍプレートの密度でプレートした。プラークを、７５μｌの懸濁培地緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０２％ゼラチン）に採取する。１２５ｕｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１０ｐｍｏｌの各改変Ｔ３（５’−ＧＣＣＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１９））プライマーおよびＴ７（５’−ＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３’（配列番号２０））プライマー、ならびに２ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むＰＣＲ反応物（総体積５０μｌ）のためにファージ溶離物（５  ｕｌ）を使用した。反応物を、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のサイクルした（９５℃で５分間の変性、その後の３０サイクルの増幅（９４℃で４５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分間）、および最後の定温伸長（７２℃で３分間））。アガロースゲル電気泳動を使用して、インサートの存在および純度を評価した。ＰＣＲ産物を、特定のプライマー、ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｖ２．０  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔｒｉｓ  ＭｇＣｌ緩衝液、および水を使用したサーマルサイクラー中のＤＮＡ配列決定反応に供する。配列決定反応物を、９４℃で２分間、その後９４℃で３０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間を２５サイクルならびに９４℃で３０秒間および７２℃で１分間を１５サイクル、および７２℃で５分間インキュベートした。次いで、反応物を、当分野で周知の方法（すなわち、カラム精製またはアルコール沈殿）を使用して精製されるまで４℃で保持する。ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して自動化配列決定を行う。
【０３７１】
配列を手動で編集するか、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）を使用して編集した。全ての編集ＥＳＴ配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（８）を使用した重複の無いＧｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪおよびｄｂＥＳＴデータベースと比較した。最小値Ｐ＝１０-10および９５％超のヌクレオチド配列同一性には、公知の遺伝子または他のＥＳＴに対するＥＳＴ適合のために推定同一性の割り当てが必要である。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）サイト（ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＵｎｉｇｅｎｅ、Ｅｎｔｒｅｚ、およびＰｕｂＭｅｄを用いてＥＳＴセット中に示される重複の無い遺伝子リストの構築を行った。
〔実施例２〕
【０３７２】
マイクロアレイの構築
上記の４つのｃＤＮＡライブラリーから単離したＥＳＴを使用したマイクロアレイを作製した。
【０３７３】
上記のＯＡ軟骨ｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンのＰＣＲ産物（約４０μｌ）を増幅のために同一の９６ウェルチューブ中で使用し、４μｌ（１／１０倍体積）の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および１００μｌ（２．５倍体積）のエタノールで沈殿させ、−２０℃で一晩保存した。次いで、これらを、４℃、３，３００ｒｐｍで１時間遠心分離する。得られたペレットを、５０μｌの氷冷７０％エタノールで洗浄し、３０分間再度遠心分離した。次いで、ペレットを風乾し、５０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または２０μｌの３×ＳＳＣに一晩十分に再懸濁する。次いで、ロボット利用のＧＭＳ４１７または４２７アレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｃａ）を使用して、Ｇａｍｍａ  Ａｍｉｎｏ  Ｐｒｏｐｙｌ  Ｓｉｌａｎｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣＭＴ−ＧＡＰＳまたはＣＭＴ−ＧＡＰ２、カタログ番号４０００３，４０００４）またはポリリジンコーティングスライド（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ０４２５）上に単一または二重にサンプルを沈着させる。ダイヤモンドスクライバーを使用してマイクロアレイ上のＤＮＡスポットの境界をマーキングする。本発明は、アレイを調製するために固体支持体上に１０〜２０，０００個のＰＣＲ産物をスポッティングしたアレイを提供する。
【０３７４】
加温無粒子ｄｄＨ2Ｏの皿上へのスライドの約１分間の懸濁によってアレイを再水和し（スポットは僅かに膨潤するが、混じりあうことはない）、倒立加熱ブロックで７０〜８０℃で３秒間急速乾燥させる。次いで、ＤＮＡをスライドにＵＶ架橋するか（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ，６５ｍＪ−ディスプレイを６５０×１００μＪである「６５０」に設定する）、８０℃で２〜４時間ベーキングする。アレイをスライドラックに置く。空のスライドチャンバーを調製し、以下の溶液を充填する。３．０ｇの無水コハク酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）を１８９ｍｌの１−メチル−２−ピロリジノンに溶解し（試薬を迅速に添加することが重大である）、その直後に最後の無水コハク酸の薄片を溶解し、２１．０ｍｌの０．２Ｍホウ酸ナトリウムを混合し、溶液をスライドチャンバーに注ぐ。スライドラックを迅速且つ均一にスライドチャンバーに押し込み、数秒間強く震盪して確実にスライドから溶液が除去されないようにし、オービタルシェイカーで１５〜２０分混合する。次いで、スライドラックを、９５℃のｄｄＨ2Ｏ中に２分間穏やかに押し込み、その後９５％エタノールに５回押し込む。次いで、過剰なエタノールをペーパータオルにドリップさせることによりスライドを風乾する。アレイを、使用するまで室温でスライドボックス中で保存する。
〔実施例３〕
【０３７５】
標的核酸の調製および構築アレイを使用したハイブリッド形成
［ｍＲＮＡ由来の蛍光ＤＮＡプローブの調製］
本発明のアレイを使用した分析のために、蛍光標識標的核酸サンプルを調製する。
【０３７６】
２μｇのオリゴｄＴプライマーを、７０℃で１０分間の加熱によって総体積１５μｌで上記のように変形性関節症と診断された患者由来の軟骨サンプルから単離した２μｇのｍＲＮＡにアニーリングし、氷上で冷却する。最終濃度が５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ非標識ｄＮＴＰ、４００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（２００Ｕ／μＬ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、および１５ｍＭのＣｙ３またはＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含む１００μｌの体積中での４２℃で１．５〜２時間のサンプルのインキュベーションによってｍＲＮＡを逆転写する。次いで、１５μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨの添加および７０℃で１０分間のインキュベーションによってＲＮＡを分解する。１５μｌの０．１Ｎ  ＨＣＬの添加によって反応混合物を中和し、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で５００μｌの体積にし、２０μｇのＣｏｔ１ヒトＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を添加する。
【０３７７】
Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０微量濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）での遠心分離によって、標識標的核酸サンプルを精製する。２つの異なる標的核酸サンプル（例えば、異なる患者由来の２サンプル）を分析して同一のアレイとのハイブリッド形成によって比較する場合、各標的核酸サンプルを異なる蛍光標識（例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５）で標識し、個別に濃縮する。個別に濃縮した標的核酸サンプル（Ｃｙ３およびＣｙ５での標識）を新たなセントリコンに合わせ、５００μｌＴＥで洗浄し、７μｌ未満の体積に再度濃縮する。１μＬの１０μｇ／μｌポリＡ  ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ番号Ｐ９４０３）および１μｌの１０μｇ／μｌ  ｔＲＮＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、番号１５４０１−０１１）を添加し、蒸留水で体積を９．５μｌに調整する。最終標的核酸調製物のために、２．１μｌの２０×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ８．０））および０．３５μｌの１０％ＳＤＳを添加する。
【０３７８】
［ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）構築アレイを使用したハイブリッド形成］
１００℃で２分間の加熱によって標識核酸を変性させ、３７℃で２０〜３０分間インキュベートし、その後２２ｍｍ×２２ｍｍカバーガラス下に核酸アレイを置く。小リザーバで３×ＳＳＣの湿度を維持した特注のスライドチャンバー中にて６５℃で１４〜１８時間ハイブリッド形成を行う。０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ、その後の１×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣ中への浸漬および２〜５分間の攪拌によってアレイを洗浄する。最後に、Ｍｉｃｒｏｐｌｕｓキャリア中のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ６卓上式遠心分離機でのスライドラックにおける６５０ＲＰＭで２分間の遠心分離によってアレイを乾燥させる。
〔実施例４〕
【０３７９】
標的核酸の調製およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｕ１３３Ａマイクロアレイを使用したハイブリッド形成
［ビオチン化ｃＤＮＡの調製］
ビオチン化ＤＮＡプローブを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）真核生物標的調製プロトコールを使用して総ｍＲＮＡから調製する。
【０３８０】
より詳細には、２μｇのＴ７オリゴ−ｄＴプライマー（５μＭ）を、７０℃で６分間の加熱によって総体積２μｌで上記のように変形性関節症と診断された患者由来の軟骨サンプルから単離した２μｇのｍＲＮＡにアニーリングし、氷上で冷却する。最終濃度の１×第１の鎖の緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））、２０ｍＭ  ＤＴＴ、１．２５ｍＭ非標識ｄＮＴＰ、１００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（２００Ｕ／μＬ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む２０μｌの体積中での４２℃で１時間のサンプルのインキュベーションによってｍＲＮＡを逆転写する。最終体積１５０μｌでの最終濃度の１×第２の鎖の反応緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１０Ｕ  Ｅ．コリＤＮＡリガーゼ；４０Ｕ  Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ１および２ＵのＥ．コリＲＮアーゼＨ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））における第１の鎖の反応物の１６℃で２時間のインキュベーションによって第２の鎖の合成を行う。２μｌ（１０Ｕ）のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、反応物をさらに５分間再度インキュベートする。１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加によって反応を停止させる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して、ｃＤＮＡを精製する。
【０３８１】
ｃＲＮＡを作製し、テンプレートｃＤＮＡと１×ＨＹ反応緩衝液、１×ビオチン標識リボヌクレオチド、１×ＤＴＴ、１×Ｒｎａｓｅインヒビターミックス、および１×Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））とのインキュベーションによって標識し、反応物を３７℃で４〜５時間インキュベートした。
【０３８２】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅを使用して、標識ｃＲＮＡ核酸サンプルを精製する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）プロトコールに従って、ハイブリッド形成前にｃＲＮＡを分画する。
【０３８３】
［Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｕ１３３Ａアレイを使用したハイブリッド形成］
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎプロトコールに従って、ハイブリッド形成を行う。１以上の標識標的核酸サンプルでのアレイのハイブリッド形成後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ４５０およびＧｅｎｅｃｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））を使用して、アレイを直接スキャニングする。
〔実施例５〕
【０３８４】
軽度ＯＡまたは重度ＯＡに特異的なＯＡバイオマーカー（核酸）の検出
本実施例は、図１〜４で証明したＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）を使用した軽度ＯＡ特異的または重度ＯＡ特異的バイオマーカーのいずれかを検出するための本発明の使用を証明する。
【０３８５】
正常な個体、軽度変形性関節症を罹患した個体、および重度変形性関節症を罹患した個体の軟骨サンプルから単離したＲＮＡについてデータ分析を行った。本明細書中に記載のように、Ｍａｒｓｈａｌｌ（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＷ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，１９９６：２３（４）５８２−８５）に記載のシステムに従ってＯＡ重症度を悪性度分類した。
【０３８６】
正常、軽度、または重度ＯＡ軟骨のいずれか由来のサンプルＲＮＡを蛍光色素Ｃｙ３またはＣｙ５で標識し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，製品番号７４００００）を残りの蛍光色素で標識し、異なる色素の使用結果との強度の相違を考慮して決定した各サンプルＲＮＡについて強度を標準化する。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ４．１．５を使用して分析を行い、正常な軟骨由来の強度または任意の他の病期特異的軟骨ＲＮＡのいずれかと比較した場合に発現強度において２倍を越える病期の特異的相違を証明された遺伝子が同定された。
【０３８７】
図１〜４は、軽度または重度ＯＡのいずれかに固有と同定された遺伝子を提供する。
〔実施例６〕
【０３８８】
軽度ＯＡ、著しいＯＡ、中程度ＯＡ、または重度ＯＡに特異的なＯＡバイオマーカーの検出
本実施例は、図６および図７でそれぞれ証明したＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｕ１３３Ａを使用した病期特異的ＯＡバイオマーカーを検出するための本発明の使用を証明する。
【０３８９】
正常な個体、軽度変形性関節症を罹患した個体、中程度変形性関節症を罹患した個体、著しい変形性関節症を罹患した個体、および重度変形性関節症を罹患した個体の軟骨サンプルから単離したＲＮＡについてデータ分析を行った。本明細書中に記載のように、Ｍａｒｓｈａｌｌ（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＷ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，１９９６：２３（４）５８２−８５）に記載のシステムに従ってＯＡ重症度を悪性度分類した。
【０３９０】
正常、軽度、中程度、顕著、または重度ＯＡ軟骨のいずれか由来のサンプルＲＮＡを蛍光色素Ｃｙ３またはＣｙ５で標識し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，製品番号７４００００）を残りの蛍光色素で標識し、異なる色素の使用結果との強度の相違を考慮して決定した各サンプルＲＮＡについて強度を標準化した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ６．０を使用して分析を行った。以下のように各疾患群を正常なサンプルと比較した。軽度／正常、中程度／正常、顕著／正常、および重度／正常。統計的有意性についてのカットオフｐ値は０．０５であった。統計的検定：ノンパラメトリック（ウィルコクソン−マン−ホイットニーの検定またはクルスカル−ウォリスの検定）またはパラメトリックで２つの母分散が等しくない（ウェルチＡＮＯＶＡ）（Ｇｌａｎｔｚ  ＳＡ．Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．５ｔｈ  ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，２００２）。正常なコントロールと比較した場合に統計的有意差が証明される１５Ｋ  ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）上の１４，９６７個の遺伝子由来の遺伝子を関連する疾患群として遺伝子を同定した。（「ＯＡリスト」）。発現レベルが、年齢、性別、ハイブリッド形成データ、およびスライドバッチなどの他のパラメーターと相関する（このようなパラメーターを再検討することができる場合）遺伝子を、ＯＡリストから除去した。各病期特異的サンプルから作製したＯＡリストを比較し、各特異的病期に固有の遺伝子を同定した。
〔実施例８〕
【０３９１】
軽度ＯＡまたは重度ＯＡに特異的なＯＡバイオマーカー（タンパク質）の検出
この実施例は、健常な患者から採取したサンプルと比較したＯＡ患者から採取したサンプル中の異なる遺伝子発現の検出による軽度または重度変形性関節症の診断のための本発明の使用を証明する。
【０３９２】
本明細書中で定義の軽度または重度変形性関節症と臨床的に診断された患者から軟骨サンプルを採取する。次いで、遺伝子発現プロフィールを分析し、ＯＡを罹患していない患者由来のプロフィールと比較する。いずれの場合も、変形性関節症の診断を、熟達した認定専門医との協力の下に行う。
【０３９３】
各患者から採取した軟骨サンプル由来の総細胞タンパク質を、ＢＤ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇキット（カタログ番号Ｋ１８４８−１または６３１７８６）を使用して、最初に単離および標識した。簡単に述べれば、抽出プロトコールは、以下の３つの主なステップからなる。細胞の機械的破壊、細胞の可溶化、および抽出物の遠心分離。細胞ペレットまたは凍結組織からプロセスを開始することができ、任意の機械的破壊方法（フレンチプレス、超音波処理、刻み、または粉砕）を使用することができる。一旦破壊されると、抽出／標識緩衝液（１：２０ｗ／ｖ）の添加によってサンプルを溶解する。Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）−エステル色素（例えば、Ｃｙ３およびＣｙＳ色素）での標識のために緩衝液を処方するので、色素の反応を完了させるいかなるプロテアーゼインヒビターまたは還元剤も含まない。抽出後、サンプルを遠心分離して、染色体ＤＮＡなどの不溶性物質をペレット化する。次いで、可溶性抽出物を、Ｃｙ３およびＣｙ５蛍光色素（単一機能性ＮＨＳ−エステル）で標識する。次いで、標識タンパク質を、図１、３、６ａ、７ａ（軽度ＯＡ）または図２、４、６ｄ、または７ｂ（重度ＯＡ）に記載の遺伝子によってコードされる全長ポリペプチドに指向するモノクローナル抗体のアレイとインキュベートする。ＧＭＳスキャナー４１８でのスキャニングおよびＳｃａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｅｉｓｅｎ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）での試験データの処理、その後のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＡ）分析によってアレイへの特異的結合の検出を測定する。健常な患者とそれぞれ比較した軽度および重度変形性関節症患者由来のサンプル中の軽度ＯＡ特異的遺伝子と重度ＯＡ特異的遺伝子との間の差分的な発現を、ウィルコクスン−マン−ホイットニーの順位和検定を使用した統計分析によって決定する（Ｇｌａｎｔｚ  ＳＡ．Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．５ｔｈ  ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，２００２）。図１、３、６ａ、７ａに記載の各遺伝子の差分的な発現は、軽度変形性関節症の診断に用いる。図２、４、６ｄ、または７ｂに記載の各遺伝子の差分的な発現は、重度変形性関節症の診断に用いる。
〔実施例９〕
【０３９４】
薬物有効性のモニタリング
正常および異なる病期の変形性関節症由来の任意の２つの軟骨サンプルの間の１以上の差分的な発現遺伝子の発現プロフィールの比較によって、薬物有効性をモニタリングすることができる。軟骨サンプルを、上記の候補薬物の処置中または処置後の個体から採取する。比較として、軟骨サンプルを薬物での処置前の同一の個体または薬物で処置していない別の個体のいずれかから採取することもできる。核酸を上記サンプルから抽出し、本発明のアレイとハイブリッド形成させる。アレイ上の１以上の核酸メンバーが未処置個体から採取したサンプルと比較して処置個体から採取したサンプルと異なるレベルで発現することが見出される場合、変形関節症の治療薬の有効性の指標となった。発現の相違を評価するために、追跡分析（例えば、ＰＣＲまたはウェスタンブロット分析による）を行うことができる。
【０３９５】
当業者により、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本明細書中に記載の事項の変形形態、修正形態、および他の実施が考慮される。以下に示された本明細書中で言及されている参考文献は、その全体が参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３９６】
【図１】正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、軽度変形性関節症患者から単離した軟骨でダウンレギュレートされるが、重度変形性関節症患者ではダウンレギュレートされないことが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。１００Ｋｂを超える領域と適合するか新規のＥＳＴ配列を、配列番号によって識別する。
【図２】正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、重度変形性関節症患者から単離した軟骨でダウンレギュレートされるが、軽度変形性関節症患者ではダウンレギュレートされないことが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。１００Ｋｂを超える領域と適合するか新規のＥＳＴ配列を、配列番号によって識別する。
【図３】正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、軽度変形性関節症患者の軟骨でアップレギュレートされるが、重度変形性関節症患者ではアップレギュレートされないことが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。１００Ｋｂを超える領域と適合するか新規のＥＳＴ配列を、配列番号によって識別する。
【図４】正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、重度変形性関節症患者から単離した軟骨でアップレギュレートされるが、軽度変形性関節症患者ではアップレギュレートされないことが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。１００Ｋｂを超える領域と適合するか新規のＥＳＴ配列を、配列番号によって識別する。
【図５】正常な個体から単離した軟骨と比較した場合、重度変形性関節症患者から単離した軟骨でアップレギュレートされるが、軽度変形性関節症患者ではダウンレギュレートされることが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。１００Ｋｂを超える領域と適合するか新規のＥＳＴ配列を、配列番号によって識別する。
【図６】本明細書中に開示の１５Ｋ  ＣｈｏｎｄｒｏＣｈｉｐ（商標）マイクロアレイ分析を使用して正常な個体から単離した軟骨と比較したＯＡ軟骨における（ａ）軽度ＯＡのみ、（ｂ）中程度ＯＡのみ、（ｃ）著しいＯＡのみ、および（ｄ）重度ＯＡのみのＯＡ期特異的マーカーであることが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。
【図７】本明細書中に開示のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ｕ１３３Ａアレイ分析を使用して正常な個体から単離した軟骨と比較したＯＡ軟骨における（ａ）軽度ＯＡのみおよび（ｂ）重度ＯＡのみのＯＡ期特異的マーカーであることが同定されたＥＳＴ配列名および対応する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号またはＵｎｉｇｅｎｅ番号）およびポリペプチド配列（Ｐｒｏｔｅｉｎアクセッション番号）（公知である場合）を列挙した図表である。
【配列表】
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【図１−１】
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【図２−１】
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【図３−１】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ−１】
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【図６ｂ−１】
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【図６ｃ−１】
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【図６ｄ−１】
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【図７ａ−１】
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【図７ｂ−１】
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