(57)【要約】本発明はヘアピンループを形成することができる無マークのポリヌクレオチドプローブの使用、前記プローブを含むバイオチップ、およびその使用方法に関する。本発明はさらに前記プローブおよびバイオチップを生産するための方法に関し、より詳しくは、本発明は、ポリヌクレオチド配列および場合によっては関連分子の操作と解析のための、前記無マークのプローブおよびバイオチップの使用に関する。さらに、本発明は、突然変異の解析、配列決定、選択的スプライシング変異体の検出、遺伝子発現の解析、対立遺伝子異常とヘテロ接合性喪失の解析、および前記有機体または前記有機体の残存物中に存在する全ての核酸の検出、のための前記プローブおよびバイオチップの調製および使用のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）長さが６〜３０ヌクレオチドの標的特異的配列；
（ｂ）長さが１０ヌクレオチドより短く、標的特異的配列の５’側にある第１腕；および
（ｃ）長さが１０ヌクレオチドより短く、標的特異的配列の３’側にある第２腕、
を含む無ラベルのプローブ（ここで、標的特異的配列は無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的でなく；また第１腕と第２腕とは互いに完全に相補的である）。
【請求項２】
標的特異的配列が１０〜２５ヌクレオチドの長さである、請求項１のプローブ。
【請求項３】
標的特異的配列が１５〜２０ヌクレオチドの長さである、請求項２のプローブ。
【請求項４】
標的分子が標的特異的配列とハイブリダイズするときは、前記プローブが「開」コンホメーションをとり、また「レポーター」分子が第１腕または第２腕とハイブリダイズすることができる請求項１〜３のいずれか１項のプローブ。
【請求項５】
「レポーター」分子が、第１腕または第２腕の核酸配列と完全に相補的である１０より少ないヌクレオチドを含む、請求項４のプローブ。
【請求項６】
「レポーター」分子が検出可能なマーカーを含む、請求項４の無ラベルのプローブ。
【請求項７】
検出可能なマーカーが、ヌクレオチド類似物質、蛍光ラベル、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、ポリペプチド、電子豊富分子、酵素、または放射性同位元素である、請求項６のプローブ。
【請求項８】
Ｄｔｍ（標的特異的配列と標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）と、第１腕と第２腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）との差）が１０より大きい、請求項１〜７のいずれか１項のプローブ。
【請求項９】
Ｄｔｍが１５に等しい、請求項８のプローブ。
【請求項１０】
Ｄｔｍ（標的特異的配列と標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）と、第１腕と第２腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）との差）が１０より低い、請求項１〜７のいずれか１項のプローブ。
【請求項１１】
基板、および少なくとも２つの請求項１〜７のいずれか１項のプローブを含むプローブバイオチップ。
【請求項１２】
プローブが基板に付着している、請求項１１のプローブ。
【請求項１３】
前記プローブがさらにリンカーを含み、前記リンカーにより基板に付着している、請求項１２のバイオチップ。
【請求項１４】
基板が、機能性ガラス表面、機能性プラスチック表面、機能性金属、伝導性金属表面、伝導性プラスチック表面、多孔性基材、多孔性金属、光ファイバー、ガラス繊維由来の基材、二酸化ケイ素、機能的脂質膜、リポソーム、または濾過膜から成る、請求項１３のバイオチップ。
【請求項１５】
機能性プラスチック表面がポリスチレンである、請求項１４のプローブバイオチップ。
【請求項１６】
機能性金属が白金、金、またはニッケルである、請求項１４のプローブバイオチップ。
【請求項１７】
伝導性プラスチック表面が炭素ベースの基材である、請求項１４のプローブバイオチップ。
【請求項１８】
炭素ベースの基材がポリマーである、請求項１４のプローブバイオチップ。
【請求項１９】
多孔性基材がガラスである、請求項１４のプローブバイオチップ。
【請求項２０】
全ての第１腕が同一の配列を有する、請求項１１のプローブバイオチップ。
【請求項２１】
１つのレポーター分子が各プローブとハイブリダイズすることができる、請求項２０のプローブバイオチップ。
【請求項２２】
標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドが、４℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ、請求項１１〜２１のいずれか１項のプローブバイオチップ。
【請求項２３】
標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドが、１℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ、請求項２２のプローブバイオチップ。
【請求項２４】
標的特異的配列と標的分子の会合により形成されるハイブリッドの融解温度と、標的特異的配列と標的特異的配列設計の対象でない分子との会合により形成されるハイブリッドの融解温度との差が、５℃以上である、請求項１１〜２３のいずれか１項のプローブバイオチップ。
【請求項２５】
前記融解温度間の差が８℃以上である、請求項２４のプローブバイオチップ。
【請求項２６】
少なくとも２つのプローブのＤｔｍ（標的特異的配列と標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）と、第１腕と第２腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）との差）が１℃の範囲以内で等しい、請求項１１〜２５のいずれか１項のプローブバイオチップ。
【請求項２７】
無ラベルの汎用アドレス指定システムであって：
（ａ）（ｉ）長さが６〜３０ヌクレオチドの標的特異的配列；および（ii）前記標的特異的配列の５’端または３’端に結合されたタグ配列；を含む少なくとも２つの無ラベルの固定されていない第１プローブ；および
（ｂ）基板および少なくとも２つの固定された請求項１１〜２６のいずれか１項の第２プローブを含むバイオチップ、
を含むシステム（ここで、各第１プローブのタグ配列は、各プローブ毎に異なり、また第２プローブの１つの標的特異的配列と相補的である）。
【請求項２８】
請求項２７の無ラベルの汎用アドレス指定システムであって、前記無ラベルの第１プローブが：
（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの標的特異的配列；
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の５’側にある第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の３’側にある第２腕；
（iv）１０〜５０ヌクレオチドの長さで、第１腕または第２腕に結合されたタグ配列、
を含むシステム（ここで、標的特異的配列が前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的ではなく；また第１腕および第２腕は互いに完全に相補的である）。
【請求項２９】
第１プローブ全ての第１腕が同一の配列を有する、請求項２８の汎用アドレス指定システム。
【請求項３０】
第２プローブの全ての第１腕が同一の配列を有する、請求項２７〜２９のいずれか１項の汎用アドレス指定システム。
【請求項３１】
同じレポーター分子が第１プローブまたは第２プローブとハイブリダイズすることができる、請求項２９〜３０のいずれか１項の汎用アドレス指定システム。
【請求項３２】
請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップおよび１以上の試薬を含むキット。
【請求項３３】
１組の、請求項１〜１０のいずれか１項の固定されていないプローブをさらに含む請求項３２のキット。
【請求項３４】
レポーター分子をさらに含む、請求項３２または３３のキット。
【請求項３５】
核酸を検出する方法であって：
（ａ）核酸試料を、生体外で請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップまたは請求項２７〜３１のいずれか１項の汎用アドレス指定システムに接触させること；および、
（ｂ）バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの、工程（ａ）における接触の後に開コンホメーションを取った少なくとも１つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法。
【請求項３６】
核酸試料中の遺伝的変異体を生体外で検出する方法であって：
（ａ）試料を請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップまたは請求項２７〜３１のいずれか１項の汎用アドレス指定システムに接触させること（ここで、バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの少なくとも１つのプローブが遺伝的変異体に特異的なプローブである）；および、
（ｂ）遺伝的変異体に特異的なプローブからの信号を検出すること（ここで、工程（ｂ）において検出される信号は核酸試料中に遺伝的変異体が存在することを示す）、
を含む方法。
【請求項３７】
検出される遺伝的変異体が単一ヌクレオチド多型である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
生体外で、任意の核酸を含む有機体またはその残存物を検出する方法であって：
（ａ）核酸試料を、請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップまたは請求項２７〜３１のいずれか１項の汎用アドレス指定システムに接触させること（ここで、少なくとも１つの前記プローブが、有機体またはその残存物の核酸に特異的である）；および
（ｂ）有機体の核酸に特異的なプローブからの信号を検出すること、
を含む方法（ここで、工程（ｂ）において検出される信号が核酸を含む有機体またはその残存物が存在することを示す）。
【請求項３９】
核酸を含む有機体がウイルスまたは細菌である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
生体外で核酸試料中の遺伝子の選択的スプライシング産物を検出する方法であって：
（ａ）試料を、請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップまたは請求項２７〜３１のいずれか１項の汎用アドレス指定システムに接触させること（ここで、バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの少なくとも１つのプローブは、遺伝子のエクソンに特異的または２つのエクソンの接続部に特異的なヘアピンプローブである）；および
（ｂ）遺伝子のエクソンに特異的または２つのエクソンの接続部に特異的なヘアピンプローブからの信号を検出すること（ここで、工程（ｂ）で検出される信号は、核酸試料中に遺伝子の選択的スプライシング産物が存在することを示す）、
を含む方法に関する。
【請求項４１】
核酸試料がｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
生体外でオリゴヌクレオチドの配列決定をする方法であって：
（ａ）オリゴヌクレオチドを含む試料を、請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップまたは請求項２７〜３１のいずれか１項の汎用アドレス指定システムに接触させること；および
（ｂ）バイオチップの少なくとも１つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法（ここで、工程（ｂ）で検出される信号は、オリゴヌクレオチドの配列の決定に使用される）。
【請求項４３】
工程（ｂ）における検出が、検出可能なマーカーでラベルされたレポーター分子を用いて得られる、請求項３５〜４２のいずれか１項の方法。
【請求項４４】
工程（ａ）の試料が、既に検出可能なマーカーでラベルされている、請求項３５〜４２のいずれか１項の方法。
【請求項４５】
核酸試料中の対立遺伝子不均衡とヘテロ接合性喪失を生体外で検出する方法であって：
（ａ）生体液または組織からの少なくとも２つの核酸試料からの１対のプライマーを用いて、少なくとも１つのマイクロサテライト型の染色体ＤＮＡ領域を増幅すること（ここで、生体液または組織からの試料の少なくとも１つが対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失を有さず、また、各組織または生体液が増幅中に異なってラベルされる）；
（ｂ）前記プライマーを増幅後に除去すること；
（ｃ）前記増幅産物を、請求項１１〜２６のいずれか１項のバイオチップまたは請求項２７〜３１のいずれか１項の汎用アドレス指定システムと接触させること（ここで、バイオチップまたは汎用アドレス指定システムの少なくとも１つのプローブが、前記染色体ＤＮＡ領域の増幅に用いたプライマーと相補的である）；および、
（ｄ）前記バイオチップの少なくとも１つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法（ここで、工程（ｄ）で検出される信号を、核酸試料の１つの中に対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失が存在することを決定するために用いる）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘアピンループを形成できる無ラベルのポリヌクレオチドプローブの使用、前記プローブを含むバイオチップおよびその使用方法に関する。本発明はさらに、前記プローブおよびバイオチップの設計方法に関する。より詳細には、本発明はポリヌクレオチド配列および場合によっては関連した分子の操作および解析のための、前記無ラベルのプローブおよびバイオチップの使用に関する。さらに本発明は、突然変異の解析、配列決定、選択的スプライシング変異体の検出、遺伝子発現の解析、対立遺伝子不均衡およびヘテロ接合性喪失の解析、ならびに有機体または前記有機体から得られる残存物中に存在する核酸の検出のための前記プローブおよびバイオチップの調製方法および使用方法に関する。
【０００２】
多くの異なる分子を含む試料中に存在する特定の分子の素性と存在度の迅速かつ正確な決定には、生物学および医学の分野で非常に関心が持たれている。特定の分子を検出するために多くのタイプのプローブおよび解析システム、例えば様々な核酸配列の検出を目指したプローブとバイオチップが創り出された。
【０００３】
特定の核酸を検出するためのそのようなプローブの１つが、米国特許第５，１１８，８０１号に開示された「分子スイッチ」である。それはプローブの中心部分が標的配列とハイブリダイズする場合には、プローブの端と端が互いに相互作用することができないという原理に従って動作する。各分子スイッチプローブは２つの相補的末端を有しており、それは少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、中心部分は１５〜１１５ヌクレオチドの長さである。測定条件によって、開示されたプローブは「閉」と「開」の立体構造をとることができる。プローブが閉構造にあるときは、プローブの両端が互いにハイブリダイズして「ステム」を形成し、中心部分が「ループ」を形成する。開構造にあるときは、プローブの中心部分は、それに対してプローブが設計されている所定の相補的な標的配列とハイブリダイズする。この開構造が結果として、プローブの両端を解離させそれによって両端は互いに相互作用できなくなる。開示されたプローブの一端または両端が、プローブが所定の標的配列へハイブリダイズしたことを示す検出可能な信号を選択的に生成することに役立つ生物学的に機能的な核酸部分を含む。例えば、好ましい部分はＲＮＡであって、それがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより指数関数的に複製され、放射性ヌクレオチドが複製物に取り込まれる。
【０００４】
通常「分子ビーコン」と呼ばれる別の型のプローブは、上述のものと類似しており、米国特許第５，９２５，５１７号に開示されている（次も参照のこと：Tyagi et al.,1996,Nat Biotechnol. 14:303-308; Tyagi et al.,1998, Nat.Biotechnol.16:49-53; Matsuo T.1998, Biochimica Biophysica Acta. 1379:178-184; Sokol et al.1998, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11538-11543; Leone et al.1998, Nucleic Acids Res.26:2150- 2155; Piatek et al.1998, Nat Biotechnol. 16:359-363; Kostrikis et at. 1998, Science 279:1228-1229; Giesendorf et al.1998, Clin.Chem.44:482-486; Marras et al.1999 Genet.Anal.14:151-156; Vet et at.1999, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:6394-6399）。分子ビーコンは、内部的に消光された蛍光団を有する分子であって、標的核酸に結合するとその蛍光が回復する。それらは、分子スイッチと同様に設計され，分子のループ部分が標的核酸分子に相補的なプローブ配列であり、ステムがプローブ配列の端にある相補的な「腕」配列のアニーリングによって形成される。１つの腕の端に蛍光部分が付着している。もう１つの腕の端に消光部分が付着している。標的分子が存在しない時には、この２つの部分が互いに非常に近接して、蛍光団の蛍光消光を引き起こす。プローブが完全に相補的な標的分子とハイブリダイズすると、分子ビーコンは立体構造変化をして、ステム部分が引き離されそのために蛍光団と消光団が互いに遠ざかる結果となる。これにより、分子ビーコンのその標的分子とのハイブリダイゼーションを、蛍光の出現を通じて検出できる。
【０００５】
現在、バイオチップシステムが、複雑な試料中の特定の物質の検出および測定に、広く用いられている。そのようなシステムにおいては、試料中の標的物質の素性と存在度を、標的配列とその標的配列用に特別に設計したプローブとの結合レベルを測定することにより決定する。核酸バイオチップ技術においては、各プローブが所定の配列を有する一組の核酸プローブを、各プローブが所定の領域に固定されるようにして、固体支持体上に固定する。固定されたプローブの組、即ちバイオチップを試料と接触させ、固定されたプローブの配列と相補的な配列がプローブと会合できるように、例えばハイブリダイズ、アニールまたは結合するようにする。会合しなかった材料を除いたのち、会合した配列を検出し測定する。
【０００６】
ＤＮＡバイオチップ技術が、多数の遺伝子転写物の発現レベルを同時にモニターすることを可能にした（例えば、Schena et al.,1995, Science 270:467-470; Lockhart et al., 1996, Nature Biotechnology 14:1675-1680; Blanchard et al.,1996, Nature Biotechnology 14:1649; Ashby et al., US Patent No.5,569,588 issued October 29,1996を参照のこと）。バイオチップ技術はまた、生物学的巨大分子の配列決定、フィンガープリント、およびマッピングに用いられてきた（US Patent No.6,270,961 issued August 7, 2001; US Patent No.6,025,136 issued February 15,2000; US Patent No.6,018,041 issued January 25, 2000; US Patent No.5,871,928 issued February 16, 1999; US Patent No.5,695,940 issued December 9, 1997）。ＤＮＡバイオチップには２つの主様式がある。これらの様式の１つにおいては、ＤＮＡバイオチップを、約数１０塩基から数千塩基にわたるサイズのＤＮＡ断片を適当な表面に沈着させることによって調製する（例えば、DeRisi et al.,1996, Nature Genetics 14:457-460; Shalon et at, 5 1996, Genome Res. 6: 689-645; Schena et al., 1995, Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93:10539-11286; and Duggan et al.,Nature Genetics Supplement 21:10-14参照）。例えば、ドットまたはメンブレンＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション（サザンブロッティング）などのブロット分析においては、核酸分子を例えば、初めにサイズによりゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなどのメンブレンフィルターに転写し固定して、単一のラベルされた配列とハイブリダイズさせる（例えば、Nicoloso, M. et al., 1989, Biochemical and Biophysical Research Communications 159:1233-1241; Vernier, P. et al. 1996, Analytical Biochemistry 235:1119、参照）。ｃＤＮＡバイオチップは、全長のｃＤＮＡ、ＥＳＴ（発現配列タグ）その他から得られたサイズが約０．６〜２．４ｋｂの範囲のｃＤＮＡ断片のポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）産物を適当な表面に沈着させることにより調製する（例えば、DeRisi et al., 1996, Nature Genetics 15 14:457-460; Shalon et al., 1996, Genome Res. 6:689-645; Schena et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10539-11286; and Duggan et al., Nature Genetics Supplement 21:1014参照）。高密度オリゴヌクレオチドバイオチップと呼ばれる他のバイオチップ様式は、表面の所定の位置に所定の配列に相補的な数千のオリゴヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、表面のその場所で、例えばフォトリソグラフを用いて合成される（例えば、20 Fodor et al.1991, Science 251:767-773; Pease et al.,1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5022-5026; Lockhart et al.,1996, Nature Biotechnology 14:1675; US Patent Nos.5,578,832; 5,556,752; 5,510,270; 5,445,934; 5,744,305; and 6,040,138 参照）。インサイツでのオリゴヌクレオチド合成のための、インクジェット技術を用いたバイオチップ生成方法もまた周知である（例えば、Blanchard,International Patent Publication WO98/4153,125,published September 24, 1998; Blanchard et al, 1996, Biosensors and Bioelectronics 11:687-690; Blanchard,1998,in Synthetic DNA Biochips in Genetic Engineering, Vol. 20, J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, New York at pages 111-123 参照）。
【０００７】
これらの技術的進歩にもかかわらず、この分野で高処理能力の遺伝子および遺伝子産物の特性決定（例えば、単一ヌクレオチド多型性（“ＳＮＰ”）の検出、多数の連続的な単一または複数ヌクレオチドの挿入および／または欠失、遺伝子配列決定、遺伝子発現解析、選択的スプライシングの検出、ヘテロ接合性喪失の解析、および任意のヌクレオチド含有有機体またはその残存物の検出）に有用な改良されたバイオチップと方法の必要性が依然として存在する。現存するバイオチップに存在する幾つかの問題には、プローブのサイズおよび位置調整、全てのプローブに対する単一の測定条件が欠けていること、バイオチップにデッドスペースをもたらすＧ／Ｃ含量のために複数のプローブが必要なこと、各配列を検出するために複数のＰＣＲオリゴヌクレオチドが必要なこと、および各標的をラベルする必要があることが含まれる。本発明は、これらの必要性に応えるものである。
【０００８】
本発明は、無ラベルのヘアピンを形成することのできる核酸プローブ、本発明の複数のプローブを含むバイオチップおよびそれらの使用方法を目的とする。ヘアピンを形成できる各ポリヌクレオチドプローブは、各側端の互いに相補的な２つの配列に挟まれた標的特異的な配列を含む無ラベル一本鎖の核酸である。各プローブが２つの立体構造を取ることができる。１つの立体構造は、「閉」または「ヘアピン」構造であって、相補的なプローブ端が互いにハイブリダイズして「ステム」を形成し、一方標的特異的配列が「ループ」を形成する（標的特異的配列はプローブの他のどの部分ともハイブリダイズしない）。この閉構造は、他の相補的な配列が腕（ステムを形成するプローブの端）に結合するのを排除する。第２の立体構造は「開」構造であり、ループを作る標的特異的な部分が標的分子とハイブリダイズして、２つの相補的な端を互いに解離させる。この開構造は、２つの相補的な端が再アニーリングすることを排除して、この端に相補的な他の配列が前記の端とハイブリダイズするのを許す。好ましい実施態様において、標的とのハイブリダイゼーションを、「レポーター」分子を用いて検出する。これは、本発明のフリーのプローブ端の少なくとも１つにハイブリダイズするよう特別に設計されている。
【０００９】
本発明の各ヘアピンプローブを、単一のヌクレオチド変異（例えば、単一ヌクレオチドの置換、欠失、または挿入）、または大きな挿入および欠失はもちろん、短い配列によって隔てられた数個のヌクレオチドの変異を有する特異的な標的分子を区別するように設計することができる。各ヘアピンプローブは、そのために特別に設計された標的とハイブリダイズするときは開となるよう設計されているので、標的を区別し検出することができる。この区別できる能力によって、１つの溶液中の複数の配列をスクリーニングすることができる。好ましい実施態様において、バイオチップが本発明の２以上のプローブを含み；標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドは、４℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ。もう１つの好ましい実施態様において、標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドは、３℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ。より好ましくは、標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドは、１℃の範囲以内で等しい融解温度を持つ。
【００１０】
別の好ましい実施態様において、本発明による各プローブの標的特異的配列は、６〜３０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは１０〜２５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１５〜２０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施態様において、本発明による各ヘアピンプローブのステムを含む末端のおのおのは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さから成り、好ましくは５〜９ヌクレオチドの長さである。
【００１１】
したがって本発明は、無ラベルのヘアピンを形成することのできる核酸プローブであって、
（ａ）６〜３０ヌクレオチドの長さの標的特異的配列；
（ｂ）１０ヌクレオチドより長さが短く、標的特異的配列の５’側にある第１腕；および
（ｃ）１０ヌクレオチドより長さが短く、標的特異的配列の３’側にある第２腕、
を含むヘアピンを形成することのできる核酸プローブに関する。ここで、標的特異的配列は前記プローブの他のどの部分とも相補的でなく；さらに第１腕と第２腕は互いに完全に相補的である。
【００１２】
好ましい実施態様において、標的特異的配列は１０〜２５ヌクレオチドの長さで、より好ましくは１５〜２０ヌクレオチドである。好ましくは、標的特異的配列が標的分子とハイブリダイズするとき、プローブが開構造を取り、「レポーター」分子が第１または第２腕とハイブリダイズする。「レポーター」分子は１０より少ないヌクレオチドを含み、第１腕または第２腕の核酸配列と完全に相補的である。「レポーター」分子は検出可能なマーカーを含む。検出可能なマーカーは、ヌクレオチド類似体、蛍光ラベル、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、ポリペプチド、電子豊富分子、酵素、または放射性同位元素である。好ましくは、Ｄｔｍ  （標的特異的配列と標的配列の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）と、第１と第２腕の会合により形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）との差）が１０より大きく、より詳しくは１５より大きい。あるいは、Ｄｔｍは１０より低い。
【００１３】
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のプローブと、少なくとも１つの「レポーター」分子を含む組成物に関する。
【００１４】
本発明はまた、無ラベルのヘアピンを形成することのできるプローブのバイオチップであって：
（ａ）基板；および
（ｂ）少なくとも２つの本発明のプローブ、
を含むバイオチップに関する。
【００１５】
好ましい実施態様においては、プローブが基板に付着している。あるいは、前記プローブがさらにリンカーを含み、前記リンカーによって基板に付着している。基板は、機能性ガラス表面、機能性プラスチック表面、機能性金属表面、伝導性金属表面、伝導性プラスチック表面、多孔性基材、多孔性金属、光ファイバー、ガラス繊維由来の基材、二酸化ケイ素、機能性脂質膜、リポソーム、または濾過メンブレンから成る。より詳しく言えば、機能性プラスチック表面がポリスチレンから成っていてもよく；機能性金属が白金、金、またはニッケルであってもよく；伝導性プラスチック表面が炭素ベースの基材でもよく、この基材が場合によってはポリマーでもよく；また多孔性基材がガラスであってもよい。ある実施態様において、各プローブの全ての第１腕は同一の配列を有する。したがって、同一の「レポーター」分子が各プローブとハイブリダイズする。好ましい実施態様において、標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドが、４℃の範囲以内で等しい融解温度を持ち、より好ましくは１℃以内である。好ましくは、標的特異的配列と標的配列の会合により形成されるハイブリッドの融解温度と、標的特異的配列と標的特異的配列設計の対象でない分子との会合により形成されるハイブリッドの融解温度との差は、５℃以上であり、より好ましくは、８℃である。好ましい実施態様において、少なくとも２つのプローブのＤｔｍが１℃以内の範囲で等しい。
【００１６】
本発明のある特定の実施態様は、汎用アドレス指定システムに関する。そのシステムでは、本発明の固定されたヘアピンプローブの標準化バイオチップを、標的分子を検出するための固定されていない標的特異的なヘアピン状または直鎖状プローブと共に用いる。
好ましくは、固定されていないプローブはヘアピン型である。
【００１７】
本発明はまた、無ラベルの汎用アドレス指定システムであって、
（ａ）
（ｉ）長さが６〜３０ヌクレオチドの標的特異的配列；および
（ii）１０〜５０ヌクレオチドの長さで、前記標的特異的配列の５’端に結合されたタグ配列と呼ぶ配列、
を含む少なくとも２つの無ラベルの第１プローブを含み（ここで前記標的特異的配列は前記無ラベルプローブの他のどの部分とも相補的でない）；
（ｂ）本発明のバイオチップ、
を含むシステムに関する。
好ましくは、前記無ラベルの第１プローブは：
（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの標的特異的配列；
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の５’側にある第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の３’側にある第２腕；および
（iv）１０〜５０ヌクレオチドの長さで、第１腕または第２腕に結合されたいわゆるタグ配列、
を含み、ここで、標的特異的配列が前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的ではなく；さらに第１腕および第２腕は互いに完全に相補的である。
【００１８】
好ましくは、第１プローブの全ての第１腕は同一の配列を与える。
そうすると、同一の「レポーター」分子が第１および第２プローブの一方または他方とハイブリダイズできる。
【００１９】
好ましくは、バイオチップは、無ラベルのヘアピンを形成することのできる少なくとも２つの第２プローブを含み、その第２プローブは：
（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの、第２標的に特異的な配列；
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の５’側にある前記第２プローブの第２第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の３’側にある前記第２プローブの第２第２腕；および
（iv）第１腕または第２腕を基板に結合するリンカー、
を含む。第２プローブの前記標的に特異的な前記配列は、前記第２プローブのどの他の部分とも相補的ではなく；前記第２プローブの前記第１腕および前記第２腕は互いに完全に相補的であり；そしてさらに、前記タグに結合した腕配列により完成された第１プローブのうちの１つの前記タグ配列は、第２プローブのうちの１つの前記第２の標的配列と相補的である。
【００２０】
本発明はまた、本発明のプローブとバイオチップの作製方法に関する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のプローブとバイオチップの使用方法に関する。本発明の具体的な実施態様は、突然変異解析、配列決定、遺伝子発現解析、ヘテロ接合性喪失と対立遺伝子不均衡の解析、および任意の核酸を含む有機体またはそれの残存物の検出、を目的とする。
【００２２】
本発明は核酸の検出方法であって、
（ａ）生体外で核酸試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること；および、
（ｂ）工程（ａ）の接触の結果開構造を取っている、バイオチップの少なくとも１つの前記プローブからの信号を検出すること；
を含む方法に関する。
【００２３】
本発明はさらに、生体外で核酸試料中の遺伝的変異体を検出する方法であって、
（ａ）核酸試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること（ここでバイオチップの少なくとも１つのプローブは、遺伝的変異体に特異的なプローブであり、前記遺伝的変異体と完全に相補的なループ領域を有する）；および
（ｂ）前記遺伝的変異体に特異的なプローブからの信号を検出すること（ここで工程（ｂ）において検出される信号が核酸試料中に前記遺伝的変異体が存在することを示す）、
を含む方法に関する。
【００２４】
好ましくは、検出される遺伝的変異体は単一ヌクレオチド多型である。
【００２５】
本発明は、生体外で、任意の核酸を含む有機体またはその残存物を検出する方法であって、
（ａ）核酸試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること（ここで、少なくとも１つのプローブは、有機体またはその残存物の核酸に特異的である）；および
（ｂ）前記プローブからの、核酸を含む有機体に特異的な信号を検出すること、
を含む方法に関する。なお工程（ｂ）で検出される信号は、核酸を含む有機体またはその残存物の存在を示す。
【００２６】
好ましくは、核酸を含む有機体はウイルスまたは細菌である。
【００２７】
本発明はさらに、生体外で核酸試料中の遺伝子の選択的スプライシング産物を検出する方法であって、
（ａ）核酸試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること（ここで、バイオチップの少なくとも１つのプローブは、遺伝子のエクソンに特異的であるかまたは２つのエクソンの接続部に特異的なプローブである）；および
（ｂ）遺伝子のエクソンに特異的な、または２つのエクソンの接続部に特異的なプローブからの信号を検出すること、
を含む方法に関する。なお工程（ｂ）で検出される信号が、核酸試料中に遺伝子の選択的スプライシング産物が存在することを示す。
【００２８】
好ましくは、核酸試料は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。
【００２９】
本発明はまた、生体外でオリゴヌクレオチドの配列決定をする方法であって、
（ａ）オリゴヌクレオチドを含む試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップに接触させること；および
（ｂ）バイオチップの少なくとも１つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法に関する。なお工程（ｂ）で検出される信号を、オリゴヌクレオチドの配列の決定に使用する。
【００３０】
好ましくは、前に記載された方法の工程（ｂ）で検出される信号を、検出可能なマーカーでラベルされた１つの「レポーター」分子を用いて取得する。工程（ａ）の試料が、既に検出可能なマーカーでラベルされていてもよい。
【００３１】
本発明はまた、対立遺伝子不均衡とヘテロ接合性喪失を生体外の核酸試料中で検出する方法であって、
（ａ）生体液または組織からの少なくとも２つの核酸試料からの１対のプライマーを用いて、少なくとも１つのマイクロサテライト型の染色体ＤＮＡ領域を増幅すること（ここで、細胞または組織から得た少なくとも１つの試料は対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失を有しておらず、さらにここで、各組織または流体が増幅中に区別してラベルされる。）；
（ｂ）前記プライマーを増幅後に除去すること；
（ｃ）前記増幅産物を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること（ここで、バイオチップの少なくとも１つのプローブが前記染色体ＤＮＡ領域の増幅に用いたプライマーと相補的である。）；および、
（ｄ）前記バイオチップの少なくとも１つのプローブからの信号を検出すること、
を含む方法に関する。なおなお工程（ｄ）で検出する信号を、核酸試料の１つの中の対立遺伝子不均衡またはヘテロ接合性喪失の存在を決定するために用いる。
【００３２】
本発明は生物学的および医学的試料中の様々な分子の存在または不在を決定するための本発明のプローブのバイオチップを含むキットを目的としている。各キットは、本発明のプローブを含む少なくとも１つのバイオチップ、および特異的な標的分子を検出するために必要な１または数個の追加の試薬を含む。加えて、キットが１組の固定されていない本発明のプローブを含んでもよい。場合によっては、キットがさらに「レポーター」分子を含むこともできる。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、無ラベルのヘアピンを形成することができるプローブ、複数個の本発明のプローブを含むバイオチップ、および本発明のプローブとバイオチップを調製し使用する方法に関する。それを以下に詳しく記載し、また実施例を挙げる。
【００３４】
ヘアピンを形成することができるプローブ
本発明は、ヘアピンを形成することができるプローブのバイオチップであって、
（ａ）基板；および
（ｂ）（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの標的特異的配列；
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで、標的特異的配列の５’側にある第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで、標的特異的配列の３’側にある第２腕；および、
（iv）第１腕または第２腕を前記基板と連結するリンカー；
を含む、少なくとも２つのヘアピンを形成することができる無ラベルのプローブ、
を含むバイオチップに関する。ここで、標的特異的配列は前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的でない。さらに、各プローブの第１腕と第２腕とは互いに完全に相補的である。
【００３５】
「無ラベル」とは、プローブが検出可能なマーカーを含まないことであると理解される。例えば、プローブが、プローブの直接検出を可能にするヌクレオチド類似物質、蛍光ラベル、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、ポリペプチド、電子豊富分子、酵素、または放射性同位元素を含まない。
【００３６】
本発明の無ラベルヘアピンプローブの２つの例を図１Ａと１Ｂに示す。本発明の目的のために、ヘアピンプローブは、標的特異的配列を有する６〜３０ヌクレオチドの長さの、好ましくは１０〜２５ヌクレオチドの長さの、極めて好ましくは１５〜２０ヌクレオチドの長さの「ループ」１０１、および標的特異的配列の両側にある２つの端、即ち「腕」、を含む一本鎖核酸である。１つの腕１０２は標的特異的配列の３’端に結合していて、もう１つの腕１０３は標的特異的配列の５’端に結合している。好ましくは、各腕は他の腕のヌクレオチドと完全に相補的な１０より少ないヌクレオチドを含む。より好ましくは、各腕は他の腕のヌクレオチドと完全に相補的な４〜９のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、各腕は他の腕のヌクレオチドと完全に相補的な６〜８のヌクレオチドを含む。もし２以上のヘアピンプローブが同時に用いられるならば（例えばバイオチップ中で）全てのヘアピンプローブが同一の腕配列構成を有するように設計してもよい。
【００３７】
本発明のヘアピンプローブは、また「リンカー」１０４を含んでもよい。ここで用いるように、リンカーとはヘアピンプローブの１腕に結合されている分子を指し、ヘアピンプローブのバイオチップを形成するために、ガラススライド（それに限られないが）などの基板１０５にヘアピンプローブを永久に固定する手段である。図１ｂに示すように、本発明のヘアピンプローブはまた「タグ」配列１０６を有してもよい。これは好ましくは、追加の５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは５〜２０ヌクレオチドであり、また汎用アドレス指定システム中で使用することができる。そのような配列タグは、ヘアピンプローブを、タグまたはタグの一部と完全に相補的な固定されたバイオチップ配列とハイブリダイズさせることによって、バイオチップの特定の場所に「アドレス指定」するために使用することができる。
【００３８】
ヘアピンプローブ設計
ヘアピンプローブを、一定濃度の塩、一定の温度、および一定濃度の１以上の付加的な化学物質、例えばホルムアミド、ジメチルスルフォキシド、テトラメチルアンモニウムクロリドおよび界面活性剤など、と共に使用するように設計できる。ヘアピンプローブを用いるための一定の温度を、始めに標的特異的配列と標的分子の融解温度「Ｔｍ」を「最近傍」Ｔｍ計算方法によりMeltcalcソフトウエアを用いて計算して取得できる（Schutz, E. et al. 1999. Biotechniques 27:1218-1224.; Allawi H.T. et al. 1998. Biochemistry 37(8): 2170-9; Allawi H.T. et al. 1997. Biochemistry 36:10581-94; Peyret N. et al. 1999. Biochemistry 38:3468-77、参照）または（Oligo 6, Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO.; Meltcalc, www.meltcalc.de、参照）。Meltcalcはミスマッチのあるまたはミスマッチのないオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの熱力学的融点を計算する表計算ソフトウエアである。Melcalcは様々な塩およびオリゴヌクレオチド濃度に基づいてオリゴヌクレオチドの融解温度を与える。標的と標的特異的配列の間に形成されるハイブリッドの好ましいＴｍ（「標的特異的配列と標的分子の間に形成されるハイブリッドのＴｍ」）が１００nM標的特異的配列と１００mM塩濃度において６０±１０℃であり、ナトリウム（ＮａＣｌ）とマグネシウム（ＭｇＣｌ2）が好ましい塩である。
【００３９】
２以上のヘアピンプローブを同時に使用するように設計するときは、標的特異的配列とヘアピンプローブの標的分子の会合により形成されるハイブリッドの各Ｔｍが、全ての他のヘアピンプローブの標的特異的配列とその標的分子の会合により形成される完全なハイブリッドのＴｍとほぼ等しいことが好ましい。好ましくは、標的特異的配列と標的分子の会合により形成されるハイブリッドのＴｍの差が４℃以内である。より好ましくは、標的特異的配列と標的分子の会合により形成されるハイブリッドのＴｍの差が３℃以内である。さらにより好ましくは、標的特異的配列と標的分子の会合により形成されるハイブリッドのＴｍの差が２℃以内である。最も好ましくは、標的特異的配列と標的分子の会合により形成されるハイブリッドのＴｍの差が１℃以内である。標的特異的配列が標的分子と会合して形成するハイブリッドの各Ｔｍの変化は、標的特異的配列の幾つかの操作によって得られる。例えば、標的特異的配列と標的分子間に形成されるハイブリッドのＴｍは、標的特異的配列中の塩基の数を変化させることにより増加させたり減少させたりすることができるが、これには限られない。標的分子に会合するヌクレオチド数が増加することによる標的特異的配列のヌクレオチド数の増加が、標的特異的配列が標的分子と会合して形成するハイブリッドのＴｍを増大させる。逆に、標的分子に会合するヌクレオチド数の減少による標的特異的配列のヌクレオチド数の減少が、標的特異的配列が標的分子と会合して形成するハイブリッドのＴｍを低下させる。標的特異的配列が標的分子と会合して形成するハイブリッドのＴｍを変更する他の手段を以下に述べる。
【００４０】
一旦、標的と標的特異的配列間のハイブリッドのＴｍが許容範囲内にあるループ配列を設計すると、腕を互いに相補的になるように設計してループ配列に付加することができる。好ましくはステムのＧ／Ｃ含量は８０％であり、好ましいＴｍ値が４０〜８０℃である。いったん各プローブを設計した場合は、mfold (Zuker, M. mfold-2.3. fttp://snark.wustl.edu）を、ヘアピンプローブ内に余計な内部ループが存在せず、またステムのヌクレオチドの会合のみによりプローブがヘアピン構造をとっていることを証明するために使用する。各ループと測定に用いる他のヌクレオチド配列（例えば、解析されるものと異なるＰＣＲ産物、解析されるものと異なるｃＤＮＡ）間に相同性が存在しないことを、次に検査する。全てのヘアピンプローブを各ＰＣＲ産物とアラインメントすることは、ＬＡＬＩＧＮ（http://fasta.bioch. virginia.edu/fasta/lalign.html）またはＬＦＡＳＴＡ（http://www.2.igh.cnrs.fr/fasta/lfasta-query.html）などのアラインメント手段を用いて実行する。
【００４１】
解析する配列と相補的な各プローブに対して、ループのＴｍとステムのＴｍの間の差を次の式を用いて計算する：
Ｄｔｍ＝Ｔｍｓ−Ｔｍｌ，ここで、Ｔｍ＝ステムＴｍ、およびＴｍｌ＝ループＴｍ、であり、Ｔｍは先に記載した通りに決定する。より詳細には、ステムのＴｍはプローブの第１および第２腕が会合して形成するハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）である。ループのＴｍは標的分子と標的特異的配列の間に形成される完全なハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）である。
【００４２】
好ましい実施態様において、Ｄｔｍは各プローブに対して１０より大きく、好ましい値は１５に近く（例えば、１２〜１７の間、好ましくは１３〜１６または１４〜１６の間）；例えば１５に等しい。しかし、信号感度をプローブの識別能力よりも優先させなければならないような目的のためには、Ｄｔｍは１０より低くてもよい。
【００４３】
実験において同時に用いる１組のプローブ（より具体的にはプローブバイオチップとして）に対して、１組のプローブに対するＤｔｍ値の分布は１０より大きい値の所に中心があり、好ましくは平均値が１５で、標準偏差が５である。しかし、信号感度をプローブの識別能力よりも優先させなければならないような目的のためには、この平均Ｄｔｍ値は１０より小さく、標準偏差が５でもよい。
【００４４】
１つの配列の２つの対立遺伝子（多型性または突然変異）を解析するために同時に使用する２つのプローブに対しては、これらのプローブのＤｔｍ値はできるだけ近くなければならない。１つの配列の２つの異なる対立遺伝子の解析に用いる２つのプローブのＤｔｍは２の範囲内で等しく、好ましくは１の範囲内で等しい。これらのＤｔｍ値は好ましい値であり、ある場合、塩基組成が等しいＤｔｍ値を得るには適当でないような場合には、１対のプローブに対して＜１または＞２の範囲で許容できる。
【００４５】
ヘアピンプローブの固定とバイオチップ
ヘアピンプローブを基板上に固定または包含させて、１以上の標的分子に対して配列特異性を有するヘアピンプローブのバイオチップなど（これに制限される訳ではないが）の製品を形成することができる。またヘアピンプローブをビーズまたはサブミクロンの粒子（これらに制限される訳ではないが）などの様々な基板に固定してもよい。各標的特異的ヘアピンプローブを、それを固定した後に、各ヘアピンプローブを他から区別している物理的、化学的、または光学的性質により特定することができる。プローブをまた、２次元システムまたは個別のアドレス指定システムを用いて、固体表面において直接合成できる。ヘアピンプローブの固定化が起こるために、ヘアピンプローブは、既に述べたように少なくとも１つの結合した部分、「リンカー」を含む。リンカーを有するヘアピンプローブはまた、リンカーに親和性を持ち基板に付着した部分によって固定されてもよい
【００４６】
標的分子の検出を、好ましくは本発明のプローブのバイオチップを用いて行う。バイオチップは、支持体上の、例えば固体基板上の、位置をアドレス指定できる結合部位の組織体であって、そこで各ヘアピンプローブが支持体の表面上に固定される。好ましくは、本発明で用いる基板は、ヘアピンプローブの共有結合的固定に適した化学基を作るためにシラン処理により修飾されたガラスのスライドであるが、それに限られない。これらの基には第１級アミン、チオール、カルボキシル、またはアルデヒドがあるが、それらに限られない。固定化に有用な他の表面には、二酸化シリコン、ポリスチレンのようなプラスチックポリマーまたは金属表面またはガラス状カーボンのような伝導性支持体が有るが、それらに限られない。支持体は多孔質または非多孔質でよい。例えば、ヘアピンプローブをニトロセルロースまたはナイロンメンブレンもしくはフィルターに付着させてもよい。本発明の具体的な実施形態は、次のような無ラベルのヘアピンプローブを目標とする。即ち、基板が、アミノ化またはチオール化されたプローブと反応して共有結合リンクをつくることができる部分を保持する、シランによりシラン化して得られる機能性ガラス表面、アミノ化またはチオール化されたプローブと反応して共有結合リンクを作るのに適した官能基を化学的または電気化学的酸化などで作ることにより得られる機能性プラスチック表面、伝導性金属表面、伝導性プラスチック表面、多孔性基材（ガラスが好ましい）、多孔性金属、光ファイバー、ガラスファイバー由来の基材、二酸化ケイ素、機能性脂質膜、リポソーム、または濾過メンブレンから成る。より詳しくは、好ましい機能性プラスチック表面はポリスチレンであり；好ましい機能性金属表面は白金、金、またはニッケルであり；好ましい伝導性プラスチック表面は炭素ベースの基材で、この好ましい炭素基材はポリマーである。
【００４７】
プローブの付着のためのそのような方法は周知である（例えば、Cass et al., eds., 1998, Immobilized Biomolecules in Analaysis, A practical approach, Ed., Oxford University Press, Great Clarendon Street, Oxford、参照）。
【００４８】
ヘアピンプローブバイオチップを周知の方法のどれを用いても作製できる。しかし、生産されたバイオチップは一般に一定の性質を共有する。本発明のヘアピンプローブバイオチップは再現可能であり、所定のバイオチップの複数のコピーを生産し、容易に互いに比較できる。ヘアピンプローブのバイオチップへの固定は、通常の配列器による流体移動、または動電学的移動若しくは電気活性ポリヌクレオチドの電気的重合を通じて、またプローブを直接表面に化学的に結合させ、プローブを固形支持体に包含させる全ての方法により、または予め製造しておいたマスクのセットを用いるフォトリソグラフィ（この方法のために調製した修飾塩基を用いて）によるその場での合成、により得られる。本発明のバイオチップは、核酸ハイブリダイゼーションのために用いられる条件下で安定な材料から作製される。バイオチップは好ましくは小さく、例えば、１cm2〜２５cm2の間であり、好ましくは１〜３cm2である。しかし、本発明ではより大きいバイオチップとより小さいバイオチップの両方を予想している。大きいバイオチップは、極めて多数の異なる標的を同時に評価するために好ましい。本発明のバイオチップ上のヘアピンプローブの密度は多様でよい。密度が、１cm2当たり数個（例えば、３，１０、３０）から１００個の異なる（即ち同一でない）プローブの範囲であってもよいし、より高くてもよい。
【００４９】
本発明において、ヘアピンプローブを、異なる標的配列特異性を持つ複数プローブのバイオチップとして固体表面に固定することができる。プローブの固定化を、各プローブの腕がそれ自身とまたは標的分子若しくは測定に用いられる他の物質と会合する能力をプローブが阻害しないようにして行う。上に指摘したように、本発明のプローブを、測定条件と相補的な核酸配列の存在・不存在に依存して２つの型の立体構造を取るように設計する。１つの構造が「閉」構造（ヘアピン）であり、この構造では両腕の配列は互いにハイブリダイズする。この構造は、これに都合の良い測定条件下、およびハイブリダイゼーション用プローブの標的特異的配列と会合する標的分子の不在のもとで得られる。第２の構造は「開」構造であり、腕の配列がハイブリダイズしていない。この立体構造は、標的特異的配列がそれの特異的標的と会合する時に検出できる。ヘアピンバイオチップを形成する好ましい方法は、一般にSchena et al., 1995, Science 270:467-470によって報告されているように、本発明のプローブをガラスプレートに直接接触させてまたは「印刷」して、表面に付着させることである。この方法はｃＤＮＡのバイオチップを調製するために特に有用である（DeRisi et al., 1996, Nature Genetics 14:457-460; Shalon et al., 1996, Genome Res. 6: 639-645; and Schena et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:10539-11286、参照）。バイオチップを作製する他の方法、例えばマスキングによるもの（Maskos and Southern, 1992, Nucl. Acids. Res. 20: 1679-1684）もまた用いることができる。原則として、上に指摘したように、いかなる型のバイオチップでも、例えば、ナイロンハイブリダイゼーションメンブレン上への「ドットブロット」（Sambrook, J. et al.,eds.,1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New York、参照）であっても使用することができる。
【００５０】
本発明のバイオチップは、オリゴヌクレオチド合成のためのインクジェット印刷装置によって、例えば、Blanchard, 国際公開WO98/41531, published September 24, 1998; Blanchard et al.,1996, Biosensors and Bioelectronics 11:687-690; Blanchard, 1998, in Synthetic DNA Biochips in Genetic Engineering, Vol. 20, J.K. Setlow, ed., Plenum Press, New York at pages 111-123; and US patent No. 6,028,189により記載された方法とシステムを用いて、製造できる。具体的には、そのようなバイオチップのヘアピンプローブを、好ましくは例えば、ガラススライド上に順次炭酸プロピレンなどの高表面張力溶媒の「微小液滴」中の個々のポリヌクレオチド塩基を順次沈着させることにより合成する。微小液滴は小さな体積（例えば１００plまたはそれ以下、より好ましくは５０plまたはそれ以下）を有し、バイオチップ上で互いに離れて（例えば、疎水的領域によって）、バイオチップの要素（即ち異なるプローブ）の位置を定義する円形の表面張力のウェルを形成する。ポリヌクレオチドのヘアピンプローブを、表面に共有結合的にヘアピンポリヌクレオチドの３’端または５’端で付着することができる。
【００５１】
標的分子
本発明の方法と組成物により解析される標的分子には、核酸分子、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子、ｃＲＮＡ分子（即ち試験管内で転写してｃＤＮＡ分子から調製するＲＮＡ分子）およびその断片などの（それらに限られないが）ＲＮＡ分子が含まれる。本発明の方法と組成物によってさらに解析される標的分子には、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、およびオリゴヌクレオチド、ＥＳＴ、ＳＴＳ、マイクロサテライト配列などを含むそれらの断片などのＤＮＡ分子も含まれる。しかしそれらに限られない。本発明の方法と組成物によって解析される他の標的分子には、タンパク質、タンパク質を含む複合体、他の分子、およびＤＮＡに親和性を有するそのような他の分子の複合体、例えば転写因子、ＤＮＡ修復系のタンパク質、および抗−ＤＮＡ抗体（それらに限られないが）、もまた含まれる（Fang, W. et al. 2000. Anal. Chem. 72:3280-5; Bar-Ziv, R. et al 2001.P.N.A.S. U.S.A. 98:9068-73; Hamaguchi, N. et al. 2001. Anal. Biochem. 294:126-31）。転写因子に対しては、ヘアピンプローブを、転写因子に対するどの推定上の親和性配列をヘアピンプローブのループ中に設計できるか、またどの配列が転写因子に対してより高い親和性を有するか、を決定するために使用することができた。
【００５２】
標的分子はどのような供給源から得てもよい。例えば、標的分子は、有機体から単離されるゲノムまたはゲノム外のＤＮＡ分子、または有機体から単離されるｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子、などの自然に存在する核酸分子でよい。あるいは、標的分子を合成してもよい。これらの標的分子は、例えばｃＤＮＡ分子、またはＰＣＲで合成されるポリヌクレオチド分子、試験管内転写で合成されるＲＮＡ分子などの生体内または試験管内で酵素的に合成される核酸分子でありうる。ＰＣＲ法は周知であって、例えばInnis et al., eds.,1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc., San Diego,CAに記載されている。標的分子の試料は例えばＤＮＡ、ＲＮＡ分子、またはＤＮＡとＲＮＡのコポリマーを含んでもよい。本発明の標的分子は、特定の遺伝子、特定の遺伝子転写物、または特定の遺伝子転写物の断片（例えば、細胞中に発現される特定のｍＲＮＡ配列またはそのようなｍＲＮＡ配列由来の特定のｃＤＮＡ配列）に対応している可能性がある。
【００５３】
解析する標的分子を細胞から抽出した核酸から試験管内で調製することもできる。例えば、ＲＮＡを細胞から抽出できるし（例えば、全細胞ＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋メッセンジャーＲＮＡ、またはその断片）、またメッセンジャーＲＮＡを全抽出ＲＮＡから精製できる。全ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの調製方法は周知であり、また一般に例えば上記のSambrook et al.によって記載されている。ＲＮＡは、本発明で興味ある様々なタイプの細胞から、チオシアン酸グアニジニウム細胞溶解とそれに続くＣｓＣｌ遠心およびオリゴｄＴ精製（Chirgwin et al.,1979, Biochemistry 18: 5294-5299）を用いて抽出できる。ＲＮＡはまた、細胞から、チオシアン酸グアニジニウム細胞溶解とそれに続くＲＮｅａｓｙカラム（Qiagen）による精製を用いて抽出できる。ｃＤＮＡを、次に精製したｍＲＮＡから、例えばオリゴｄＴまたはランダムプライマーを用いて合成できる。標的分子は、精製したメッセンジャーＲＮＡから、または細胞から抽出した全ＲＮＡから調製したｃＲＮＡでもよい。ここで用いるように、ｃＲＮＡとは元のＲＮＡと相補的なＲＮＡであると定義する。抽出したＲＮＡを次に増幅することができるが、それにはアンチセンスＲＮＡの転写が開始できる方向にＲＮＡポリメラーゼプロモーターとリンクされたプライマーを用いて二重鎖ｃＤＮＡがＲＮＡから合成される方法を用いる。アンチセンスＲＮＡ即ちＲＮＡｓｃを次に、二重鎖ＤＮＡｓｃの第２鎖からＲＮＡポリメラーゼを用いて転写できる（例えばU.S. Patent Nos. 5,891,636; 5,716,785; 5,545,522 and 6,132,997参照）。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでいるオリゴｄＴプライマーを用いることができる。全ＲＮＡをｃＲＮＡ合成の入力として用いることができる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含んでいるオリゴｄＴプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡの合成を開始することができ、またランダムヘキサマープライマーを用いてＭＭＬＶ逆転写酵素による第２鎖ｃＤＮＡ合成を開始することができる。この反応がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを３’端に含む二重鎖ｃＤＮＡを生成する。二重鎖ｃＤＮＡを次に、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってｃＲＮＡに転写することができる。合成された標的の濃度は、１μＭ〜５０nMの濃度範囲で変化する可能性がある。ＰＣＲで合成された標的の濃度は、５ng/μl〜５０ng/μlの間で変化する可能性がある。
【００５４】
標的分子はＰＣＲプライマーであるか、またはＰＣＲプライマー中に含まれることができる。このように、本発明のプローブはＰＣＲ産物増幅の検出に使用できる。より具体的には、この検出がＰＣＲの優れたネガティブブランクを構成する。これらのネガティブブランクを、ゲノムＤＮＡ無しで、しかしＰＣＲに必要な試薬とプライマー対、少なくともヘアピンプローブの標的特異的配列と完全に相補的な配列を含むプライマー対の１つ、の存在下で配列を増幅することによって、実行する。
【００５５】
本発明の方法と組成物で解析する標的分子は、検出できるようにラベルすることができるが、それが必要だとは限らない。例えば、ｃＤＮＡを即ちヌクレオチド類似物質により直接ラベルできるし、または例えば第１配列を鋳型にして第２のラベルされたｃＤＮＡ配列を作製することにより間接的にラベルできる。あるいは、二重鎖ｃＤＮＡをｃＲＮＡに転写して、その転写中にラベルできる。検出可能なラベルは、例えばヌクレオチド類似物質を取り込ませることによる蛍光ラベルでもよい。本発明での使用に適した他のラベルには、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、検出可能なポリペプチド、電子豊富分子、検出可能な信号を基質に対する作用によって生成できる酵素、および放射性同位元素が含まれるが、これに限られない。好ましい放射性同位元素には32Ｐ，35Ｓ，14Ｃ，15Ｎおよび125Ｉが含まれるが、それらに限られない。本発明での使用に適した蛍光分子には、フルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、テキサス赤、５’カルボキシフルオレセイン（“ＦＭＡ”）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン（“ＪＯＥ”）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン（“ＴＡＭＲＡ”）、６’カルボキシ−Ｘ−ローダミン（“ＲＯＸ”）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＩＲＤ４０、およびＩＲＤ４１が含まれるが、それらに限られない。本発明での使用に適した追加の蛍光分子にはさらに、シアニン色素（Ｃｙ３，Ｃｙ３．５およびＣｙ５を含むが、それらに限られない）、ＢＯＤＩＰＹ色素（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭ，ＢＯＤＩＰＹ−６３０／６５０，およびＢＯＤＩＰＹ−６５０／６７０を含むが、それらに限られない）、およびＡＬＥＸＡ蛍光色素（ＡＬＥＸＡ−４８８，ＡＬＥＸＡ−５３２，ＡＬＥＸＡ−５４６，ＡＬＥＸＡ−５６８，およびＡＬＥＸＡ−５９４を含むが、それらに限られない）が含まれるがそれらに限られず、さらに当業者に周知の任意の他の蛍光色素も含まれる。本発明での使用に適した電子豊富インディケーター分子には、フェリチン、ヘモシアニン、および／またはコロイド状金が含まれるが、それらに限られない。あるいは、第１グループを標的分子と特異的に錯体形成させて、標的分子をラベルできる。共有結合的にインディケーター分子とリンクしまた第１グループに対して親和性がある第２グループを、標的分子を間接的に検出するために使用できる。そのような実施態様において、第１グループとして使用するのに適した化合物には、ビオチンおよびイミノビオチンが含まれるが、それに限られない。第２グループとして使用するのに適した化合物には、アビジンおよびストレプトアビジンが含まれるが、それに限られない。臭化エチジウムまたはｓｙｂｒグリーンＩ色素のような蛍光性ＤＮＡ挿入化学種もまた、標的ポリヌクレオチドとヘアピンプローブがハイブリダイズしたときの、またはヘアピンプローブと「レポーター」分子とのハイブリダイゼーション時の、信号の蛍光増加をモニターするために使用できる（下参照）。この実施形態は、特にハイブリダイゼーションのリアルタイムでの解析に適している可���性がある。
【００５６】
好ましい実施態様において、しかし標的分子は無ラベルで、上述の検出できるラベルは「レポーター」分子に付着している（下参照）。
【００５７】
ヘアピンプローブとの使用に利用可能なハイブリダゼーションの方法
本発明のヘアピンプローブは、標的分子をスクリーニングするために使用するときに、２つの二者択一の立体構造を取るように設計されている。これらの２つの立体構造、「閉」構造と「開」構造を図２に示す。図２Ａおよび図２Ｂの両方が基板に連結されたヘアピンプローブを示す。
図２Ａが閉構造のヘアピンプローブを示す。ヘアピンプローブの特定の標的が存在しないとき、プローブの腕が互いにハイブリダイズして「ステム」２０１を形成し、また標的特異的配列が「ループ」２０２を形成する。ヘアピンプローブの他の立体構造は可能でない。何故ならヘアピンプローブの腕は互いにのみハイブリダイズするように設計されているからである。ヘアピンプローブによってスクリーニングするための好ましい一定温度は、ループの標的特異的配列とその標的分子の会合により形成されるハイブリッドのＴｍより５〜１０℃低い。この温度はプローブの長さ、およびループ構造中に付加的な突然変異が存在するかしないかに依存して変化する。より長いまたはより短い標的特異的配列またはステム配列を用いて、最適のハイブリダイゼーション温度を修正する。標的分子と会合したときヘアピンプローブが構造変化を受ける。ループ配列の一部が標的分子と会合（即ち、核酸の標的特異的配列とその標的核酸とのアニーリング）するとヘアピン構造を強制的に開に変える。
【００５８】
相補的な腕同士のハイブリダイゼーションおよび、標的特異的配列の標的分子とのハイブリダイゼーションの間の競合が、標的特異的配列のその標的分子との完全な会合と、他の標的分子との不完全な会合とを区別するための鍵である。ヘアピンプローブが、そのために設計された（即ち完全適合の）標的分子に晒されたとき、標的特異的配列と標的分子の間の相互作用がステムの解離を引き起こし、それによってヘアピンプローブの立体構造を「開」の配置に変化させる。図２Ｂは、標的分子２０３と会合した結果「開」構造をとるヘアピンプローブを示す。標的特異的配列２０４は標的分子２０３の一部２０５とハイブリダイズする。本発明はヘアピンプローブと標的分子間の相互作用を含む場合には、ループの全体部分が全標的分子とまたは標的分子のより小部分とハイブリダイズすることが想定されている。この標的特異的配列２０４と標的分子２０３の間のハイブリダイゼーションは、標的分子全体を包含する必要はない。標的特異的配列２０４が標的分子２０３の部分２０５とハイブリダイズすると、プローブの腕、標的特異的配列の５’端側の腕２０６および標的特異的配列の３’端側の腕２０７、は解離してアクセス可能となり、「レポーター」分子と相互作用できる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションにおける標的核酸のプローブ配列に対する結合親和性は、試料中の様々な標的配列の配列類似性と、ハイブリダイゼーションの厳密性条件、即ちハイブリダイゼーション温度、塩濃度、および親和性を減少させる化学物質の存在、との両方に依存する。結合速度論もまた試料中の種々の核酸の相対濃度に依存する。存在度の低い種を標的とする（即ちそれに相補的な）、または極めて類似した（即ち相同の）配列を有する核酸を標的とするポリヌクレオチドプローブに対しては、そのような「クロスハイブリダイゼーション」が混入する可能性が有意にあり、ハイブリダイゼーション測定の結果を汚染させ混乱させ得る。例えば、クロスハイブリダイゼーションはＳＮＰの検出において特に重要な関心事である。何故なら、検出されるべき配列（即ち特定のＳＮＰ）を唯１個のヌクレオチドが異なる他の配列から区別しなければならないからである。
【００６０】
クロスハイブリダイゼーションを減少させる幾つかの手法が従来技術において工夫されてきており、本発明の方法に使用できる。クロスハイブリダイゼーションを、ハイブリダイゼーション中および／またはハイブリダイゼーション後の洗浄のいずれかのハイブリダイゼーション厳密性を調節することにより最小にすることができる。例えば、「高度厳密性」洗浄条件を採用して、検出された信号が特異的配列とヘアピンプローブの標的特異的配列との完全な適合を表すように、最も安定な二重鎖を除く全ての二重鎖を不安定化することができる。高度厳密性条件の例には、例えば５×ＳＳＣ緩衝液、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），１mM  ＥＤＴＡ、６５℃でのＤＮＡのハイブリダイゼーション、および  ０．１×ＳＳＣ緩衝液／０．１％ＳＤＳ中の洗浄（Ausubel et al.,eds.,1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, Green Publishing Associates, Inc.,and John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, at p.2.10.3）が挙げられる。これらの洗浄は、標的特異的配列と標的分子間のハイブリッドのＴｍより５〜１０℃低い温度で実行する。高度厳密性条件は、例えば１０〜３０ヌクレオチド当たり１のミスマッチがあるヌクレオチド配列の対立遺伝的変異体を検出することを可能にする。あるいは、「中度厳密性」または「低厳密性」洗浄条件も用いることができる。中度厳密性または低厳密性条件もまた周知である（例えば、Sambrook,J. et al.,eds., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, at pp. 9.47-9.51 and 11.55-11.61; Ausube let al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol I, Green Publishing Associates, Inc., John Wiley & Sons, Inc., New York, at pp. 2.10.1-2.10.16,参照）。中度厳密性洗浄条件の例には、例えば０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．２×ＳＳＣ緩衝液中、４２℃での洗浄（上記，Ausubel et al., 1989）が挙げられる。低厳密性洗浄条件の例には、例えば５×ＳＳＣ緩衝液または０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温での洗浄（上記，Ausubel et al., 1989）が挙げられる。
【００６１】
ヘアピン信号に対するクロスハイブリダイゼーションの寄与を、適当な対照プローブからの信号を差し引くことにより、モニターし除去することができる。例えば、クロスハイブリダイゼーションの寄与を測定するために、どの標的ともハイブリダイズしないヘアピンプローブを測定に用いることができる。この非特異的ハイブリダイゼーションを次に特異的ハイブリダイゼーション信号から差し引くことができる。
【００６２】
クロスハイブリダイゼーションをまた、標的特異的配列と標的配列の会合により形成されるハイブリッドのＴｍの間の弱い差異、即ち１℃以下の差異を有する複数の本発明のプローブを用いて減少させることもできる。反対に、標的特異的配列と標的配列の会合により形成されるハイブリッドのＴｍの差が増すとき、即ち１℃より大きいときは、クロスハイブリダイゼーションがより重要な因子になる。そのような場合、既に述べたものと似た手法を採用することができて、各標的分子のスクリーニングに用いるヘアピンプローブの数を増すことができるし、またはこれらの手法の組み合わせを用いることもできる。
【００６３】
１以上の独特な対照配列を用いて、どのヘアピンプローブが対照配列とハイブリダイズするかを分析することにより温度を決定できる。この対照配列は、５〜１０個の異なるヘアピンプローブと相補的であり、それらは互いにループ配列の長さが異なり、それによってＴｍが異なる。例えば、１つのヘアピンプローブは、対照配列の中心に局在する８のヌクレオチドと相補的であり、標的と標的特異的配列間に形成されるハイブリッドのＴｍのハイブリダイゼーション温度が４０℃である。もう１つのヘアピンプローブは、対照配列の１２のヌクレオチドと相補的であり、標的と標的特異的配列間に形成されるハイブリッドが４５℃のＴｍを有する。別のヘアピンプローブは、対照配列の異なる領域と相補的であり、また標的と標的特異的配列間に形成されるハイブリッドが異なるＴｍを有する。したがって、利用者が、配列対照とハイブリダイズするヘアピンプローブを同定し、それに基づいて測定温度を決定することができる。
【００６４】
本発明は、標的特異的配列と標的分子の会合により形成される全ての完全なハイブリッドが、ほぼ４℃の範囲で等しい融解温度を有する、本発明のプローブのバイオチップに関するものである。
【００６５】
本発明はまた、各プローブの標的特異的配列が標的分子と会合して形成する各ハイブリッドが、他の全てのプローブの標的特異的配列が標的分子と会合して形成する他の全てのハイブリッドと１℃以内で等しい融解温度を有する、本発明のプローブのバイオチップを目的とするものである。
【００６６】
本発明はさらに、次の本発明のプローブのバイオチップを目的とする。そこでは標的特異的配列と標的配列の会合により形成されるハイブリッドの各融解温度と、標的特異的配列と設計の対象ではない分子との会合の第２の融解温度との差が５℃以上である。標的特異的配列と標的配列の会合により形成されるハイブリッドの各融解温度と、第２の融解温度との差は、何の制限も無ければ８℃以上でよい。
【００６７】
レポーター分子
本発明はまた、プローブの腕の長さに等しい長さを含む核酸配列などの、１以上の付着しておらず、ラベルされたまたは無ラベルの「レポーター」分子を含む。本発明はこのように、「レポーター」分子がヘアピンプローブのいずれかとハイブリダイズできる本発明のプローブのバイオチップを目的とする。本発明のヘアピンプローブを「レポーター」分子と共に用いることができる。レポーター分子はプローブの開構造とのみハイブリダイズでき、それにより開構造と閉構造を区別して、標的分子がヘアピンプローブの標的特異的配列と会合するときにのみ信号を生成する。
【００６８】
「レポーター」分子を、４〜１０ヌクレオチド、好ましくは６ヌクレオチドまたはそれ以下のステム、および１２〜２０ヌクレオチドを含むループを持つループステム構造を有し、前記ループの標的特異的配列がヘアピンプローブの１つの腕と完全に相補的になるように設計することができる。
【００６９】
「レポーター」分子を、ヘアピンプローブの１つの腕と完全に相補的な配列を含む直鎖構造を持つように設計することができる。
【００７０】
本発明は、そこで、標的分子が標的特異的配列にハイブリダイズし、またさらに「レポーター」分子が第１または第２腕にハイブリダイズする、無ラベルのヘアピンプローブのバイオチップを目標にする。「レポーター」分子は、第１または第２腕のヌクレオチド配列と完全に相補的な好ましくは１０より少ないヌクレオチドを含む。
【００７１】
「レポーター」分子を分子の１端に結合した副溝結合部を持つように設計できる。レポーター分子のラベルは、３’および／または５’端を蛍光ラベルすることによって、標的配列のラベルについての記載と同様の方法で達成できる（上を参照）。
【００７２】
試料が１つまたは一組のヘアピンプローブに曝露されると、ループがその標的配列と会合する結果、プローブの腕が相補的な「レポーター」分子にアクセスできるようになり、信号を生成できる。「レポーター」分子は、核酸配列、ペプチド核酸配列、ロックされた核酸、オリゴペプチド配列、タンパク質、または核酸配列に連結された酵素であってもよいが、それらに限られない。レポーター分子は好ましくは、「開」構造にあるときのみ本発明のプローブの腕に結合できる能力により特徴付けられる。レポーター分子は好ましくは、本発明のヘアピンプローブの１つの腕配列と、「開」構造にあるときのみ完全に相補的である少なくとも１つの配列を含む。「レポーター」分子は好ましくは、ヘアピンプローブの腕配列の１つと完全に相補的な少なくとも１つの配列を含む。レポーター分子を加えたときに、「レポーター」分子とヘアピンプローブの会合は、開構造にあるプローブの腕とのみ起こる。この開構造は、ヘアピンプローブのループとその特異的標的分子の会合の結果である。同一の基板上に固定されたヘアピンプローブのために、ヘアピンプローブが同一の腕配列を有するよう設計して、全てのヘアピンプローブとそれらの特異的標的分子との会合の解析のために唯１つの「レポーター」分子しか必要としないようにすることができる。
【００７３】
図３は、「レポーター」分子が、どのように本発明のヘアピンプローブと会合して、ヘアピンプローブとその標的分子とのハイブリダイゼーションの際に信号を生成するかを示す。図３Ａは「レポーター」分子がヘアピンプローブと会合する進行過程を示す。先ず、ヘアピンプローブ３０１が閉構造を取り、標的特異的配列の５’側にある腕３０２と標的特異的配列の３’側にある腕３０３とがハイブリダイズしてステム３０４を形成する。それに対してヘアピンプローブが設計された標的分子３０５（即ち核酸）へ曝露する過程３０６によって、標的特異的配列３０７が標的分子３０５とハイブリダイズする。これによってヘアピンプローブが開構造を取るようになり、ヘアピンプローブの腕３０２と３０３が互いに解離して「レポーター」分子にアクセスできるようになる。核酸を含む「レポーター」分子３０９の、開構造にある本発明のプローブへの付加３０８により、「レポーター」分子３０９が標的特異的配列の５’側の腕３０２とハイブリダイズする。それは「レポーター」分子３０９の一部が、標的特異的配列の５’側の腕３０２と相補的であるように設計されているからである。
【００７４】
各ヘアピンプローブは２つの腕を有するので、２つの異なる「レポーター」分子を設計し、ヘアピンプローブが標的分子とハイブリダイズするときに信号を生成するために用いることができる。図３Ｂは、ヘアピンプローブの両腕３１０および３１１が２つのレポーター分子３１２および３１３とハイブリダイズしている本発明の開構造プローブを示す。２つの「レポーター」分子を使用し、１つの「レポーター」分子をヘアピンプローブの１つの腕と相補な核酸配列を有するように設計し、もう１つの「レポーター」分子をヘアピンプローブのもう１つの腕と相補な核酸配列を有するように設計するときは、「レポーター」分子を順次ヘアピンプローブに加えること、および「レポーター」分子を加える工程の間に洗浄工程を置くことが必要である可能性がある。これは、各「レポーター」分子が他の「レポーター」分子の配列と完全に相補的な核酸配列を含有しているからである。もし両方の「レポーター」分子をヘアピンプローブに同時に加えると、「レポーター」分子はヘアピンプローブとはもちろん、互いにハイブリダイズする可能性がある。
【００７５】
「レポーター」分子は検出可能なマーカーを含むことができる。好ましくは「レポーター」分子は、ヌクレオチド類似物質、蛍光ラベル、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、ポリペプチド、電子豊富分子、酵素、または放射性同位元素であってよい。「レポーター」分子は、例えば、蛍光色素（図３Ａ、３Ｂ、５Ｂ、および５ＣでＦとして示す）でラベルされたヌクレオチド配列、またはそれが会合する腕に対する親和性が増すことになるような追加の修飾を有する無ラベルの配列でもよい。例えば、この修飾は、「レポーター」の３’または５’側に連結されたＤＮＡ副溝結合分子であるか、または特定の処理によってハイブリダイズしたＤＮＡ鎖との間で共有結合ができる「レポーター」の化学的修飾であってもよい。これらの修飾は全てホスホルチオ酸部分の「レポーター」分子のリン酸骨格への挿入を含めばよい（Cogoi, S. et al. 2001. Biochemistry 40:1135-43; Xodo, L. et al. 1994 Nucleic Acids Res. 22: 3322-30）。
【００７６】
「レポーター」分子はまた質量分析器および飛行時間解析を用いて、その質量によって検出できる。例えば、基板上に固定され標的配列および「レポーター」分子とハイブリダイズした本発明のプローブを、１つの特定のプローブに対応する固体表面の個別の領域に質量分析器のレーザー源を向け、各「レポーター」分子の質量と相対存在度を収集することにより、直接質量分析器によって分析することができる。「レポーター」分子は、長さと質量を変えることができるし、また質量分析法で検出可能な幾つかの重さの知られた分子種に結合できる（Laken, S.J. et al. 1998. Nat Biotechnol. 16:1352-6; Little, D.P.et al.1997. Nat Med. 3: 1413-6; Little,D.P.1997. Eur.J.Clin.Chem.Clin Biochem.35:545-8; Braun,A.et al.1997.Clin. Chem.43:1151-8）。
【００７７】
「レポーター」分子を、電位を与えたときに酸化還元電流を発生するフェロセンおよびコバルトセン誘導体のような電気化学的に活性のある分子と結合させることができる（Umek, R.M. et al. 2001, J.Mol.Diagn.3:74-84; Padeste, C. et al.2000, Biosens Bioelectron 15:431-8;Tsai,W.C. et al.1995, Analyst 120:2249-54）。「レポーター」分子はまた、電気触媒活性により、または電気化学的に不活性な基質を切断して電気化学的に活性のある生産物にすることにより、電気活性分子種を生成することのできる酵素であってもよい（Valat, C. et al. 2000. Analytica Chimica Acta 404:187-94; Oliver, B. et al. 1997 Anal. Chem. 69:4688-94; Limoges, B. 1996. Anal.Chem. 68:4141-48; Bourdillon, C. et al. 1996. J.Am.Chem.Soc.115:12264-69）。そのような「レポーター」分子のために、本発明のプローブを、二酸化ケイ素、黒鉛、ガラス状カーボン、酸化インジュウムセレン、金属表面またはプラスチックベースの伝導性ポリマーのような伝導性表面、あるいは、予め沈着した若しくは予め重合した伝導性材料の離散的領域を提供している非伝導性表面、に固定してもよい。この検出方法は、固体表面の検出器またはその一部の電気的重合を、信号電流または信号電位を検出する手段として使用することができる。
【００７８】
ヘアピンプローブと標的分子との会合を検出できるもう１つの「レポーター」システムは、ポリメラーゼラベルシステムを用いるものである。図４はそのようなシステムがどのように機能するかを示す。図４Ａは、追加の１０〜２０のヌクレオチド配列、即ちプローブの５’端の「プライマー」４０１、を有する閉構造のヘアピンプローブを示す。好ましくは、特定の検査条件下で用いられる全てのヘアピンプローブ上のプライマーが同一のヌクレオチド配列を持つように設計する。本発明はまた、ヘアピンプローブがその特異的標的配列とハイブリダイズするときに発生する信号間にもう一つのレベルの差異を加えるために、特定の検査条件下で様々なプライマーを使用することを含む。用いるどのプライマーに対しても、プライマーのヌクレオチド配列４０１を、全ての他のヘアピンプローブおよびポリメラーゼ反応物と配列相同性を有しないように制御する。好ましくは、プライマーは１８〜２０ヌクレオチドの長さを有し、融解温度が５９℃±２℃である。プライマー４０１を、ポリメラーゼによる少なくとも１つのラベルされたヌクレオチドの取り込み開始のために用いる。標的特異的配列と標的分子が会合すると、標的特異的配列の５’腕とプライマーがポリメラーゼ反応の反応物にアクセスできる。重合反応を、ＤＮＡを変性させることなく、また使用するポリメラーゼに依存して３７〜６０℃で実行する。適当なポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ  ｋｌｅｎｏｗ断片、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、および全ての入手できる自然のまたは遺伝子操作されたホットスタートを除くポリメラーゼ、である（Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 5.44-5.47; Ausubel, F.M. et al. 1997. Current Protocols in Molecular Biology, vol.1. John Wiley & Sons,Inc.,New York,3.5.11-3.5.12）。
【００７９】
図４Ｂは標的特異的配列の５’側にある腕４０２とプライマー４０１がアクセス可能でポリメラーゼ反応に参加できる、開構造にあるそのようなヘアピンプローブを示す。腕４０２の一部およびプライマー４０１と相補的な「レポーター」分子４０３が次にそれらの配列とハイブリダイズすることができる。図４Ｃはそのような腕４０２、プライマー４０１およびレポーター４０３のハイブリダイゼーションを示す。「レポーター」分子４０３は腕４０２の一部または全体と相補的であればよい。しかし、「レポーター」分子４０３はプライマー４０１全体と相補的であってはならない。腕４０２の一部およびプライマー４０１と相補性を有する「レポーター」分子４０３の部分は、プライマー４０１の３’端部分と会合してはならない、即ちその部分と相補的なヌクレオチドを有してはならない。好ましくは「レポーター」分子４０３のヌクレオチド配列は、それがハイブリダイズするプライマー４０１より１〜５ヌクレオチドだけ短い。この属性が、プライマー４０１のハイブリダイズしない配列４０４によって示され、ポリメラーゼがプライマー４０１に相補的なヌクレオチドを付加して「レポーター」分子４０３を伸長できるようにする。ポリメラーゼ４０５が「レポーター」分子４０３を伸長するときには（図４Ｄ参照）、ラベルされたヌクレオチド４０６が取り込まれて、標的特異的配列４０７の標的分子４０８とのハイブリダイゼーションを検出するための信号を生成する。
【００８０】
汎用アドレス指定システム
本発明は、固定されていないヘアピンプローブを固定されたヘアピンプローブと組み合わせて用いるシステムもまた目的としている。汎用アドレス指定システム（universal addressing system "UAS"）と呼ばれるこの生体外スクリーニングシステムは、使用者作製の固定されていないヘアピンプローブと共に使用するのに適した、予め作製された固定されたヘアピンプローブまたは直鎖状プローブのアレイの利点を提供し、したがって最終使用者がバイオチップを作製する手間を省く。例えば、ＵＡＳは、固定されたヘアピンプローブの標的特異的配列が、特異的配列タグを有する固定されていないヘアピン状または直鎖状プローブと会合するように設計された、ヘアピンプローブの予め特定された一組を含む汎用のバイオチップを提供することができる。これが任意の検査条件で使用できる単一のバイオチップの構築を可能にする。検出対象の標的ヌクレオチドは、最初に固定されていないヘアピンまたは直鎖プローブの標的特異的配列により捕獲され、そのプローブは次に特異的配列のタグを介して固定されたヘアピンプローブと会合するように設計されている。
【００８１】
好ましい実施態様において、ＵＡＳは２組のヘアピンプローブを含む。「第１ヘアピン」と呼ぶ１つのヘアピンプローブは基板上に固定されておらず、またその３’または５’腕から伸びるタグを有する。タグは、基板上に固定されタグと部分的または全体として相補的な、６〜３０ヌクレオチドの１本鎖核酸または「第２ヘアピン」と呼ぶヘアピンプローブとハイブリダイズできる。固定された部分が第２ヘアピンであるときには、第２ヘアピンの配列特異的配列は、タグ配列、タグ配列の一部、および／またはタグ配列の一部およびタグに隣接した腕の一部と相補的であればよい。タグの一部およびタグに隣接した腕の一部に対する標的特異的配列を有する第２ヘアピンプローブの使用により、標的特異的配列が標的分子に会合した第１ヘアピンプローブのみが第２ヘアピンプローブとハイブリダイズできることが保証されることになる。もし種々のタグ配列をＵＡＳと共に用いることになり、これを識別する必要があるならば、固定されたヘアピンプローブ上の相補的な標的特異的配列と特異的にハイブリダイズする他のタグとの間に完全な配列差異が存在するためには、第２ヘアピンのループ中央に位置する少なくとも２ヌクレオチドの差異が必要である。
【００８２】
本発明はしたがって、無ラベルの汎用アドレス指定システムであって、
（ａ）（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの標的特異的配列；および
（ii）標的特異的配列の５’端に結合した１０〜５０ヌクレオチドの長さの「タグ」配列、
を含む少なくとも２つの無ラベルで直鎖状の第１プローブと、
（ここで標的特異的配列は前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的でない）
（ｂ）ヘアピンを形成できる少なくとも２つの第２プローブであって、
（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの第２標的に特異的な配列；
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで前記標的特異的配列の５’側にある前記第２プローブの第２第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで前記標的特異的配列の３’側にある前記第２プローブの第２第２腕；および、
（iv）第１または第２腕を基板に結合するリンカー、
を含む第２プローブ、
（ここで、第２プローブの前記標的に特異的な前記配列は前記第２プローブの他のどの部分とも相補的ではなく；前記第２プローブの前記第１腕および前記第２腕は互いに完全に相補的であり；またさらにここで、第１プローブの１つの前記タグ配列は第２プローブの１つの前記第２標的配列と相補的である。）
とを含むシステムを目的としている。
【００８３】
好ましくは、本発明は無ラベル汎用アドレス指定システムであって、
（ａ）（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さの標的特異的配列；および
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の５’側にある第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の３’側にある第２腕；
および
（iv）１０〜５０ヌクレオチドの長さで、第１腕または第２腕に結合した「タグ」配列、
を含む少なくとも２つの無ラベルのヘアピンを形成できる第１プローブと、
（ここで標的特異的配列は前記無ラベルのプローブの他のどの部分とも相補的ではなく；さらにここで、第１腕と第２腕は互いに完全に相補的であり）；
（ｂ）（ｉ）６〜３０ヌクレオチドの長さで、第２標的に特異的な配列；
（ii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の５’側にある前記第２プローブの第２第１腕；
（iii）１０ヌクレオチドより短い長さで、前記標的特異的配列の３’側にある前記第２プローブの第２第２腕；および、
（iv）第１または第２腕を基板に結合するリンカー、
を含む少なくとも２つのヘアピンを形成できる第２プローブ、
（ここで、第２プローブの前記標的に特異的な前記配列は前記第２プローブの他のどの部分とも相補的ではなく；前記第２プローブの前記第１腕および前記第２腕は互いに完全に相補的であり；またさらにここで、このタグに結合した腕配列で終わる第１プローブの１つの前記タグ配列は、第２プローブの１つの前記第２標的配列と相補的である）を含むシステムを目的としている。
【００８４】
好ましい実施態様において、第１ヘアピンプローブの標的特異的配列は１０〜２５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１５〜２０ヌクレオチドである。
【００８５】
好ましくは、第２ヘアピンプローブの標的特異的配列は１０〜２５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１５〜２０ヌクレオチドである。
【００８６】
本発明はまた全ての第１腕が同一の配列を有する無ラベルの汎用アドレス指定システムも目的としている。
【００８７】
それはさらに第２ヘアピンプローブの全ての第１腕が同一の配列を有する、無ラベルの汎用アドレス指定システムを目指している。
【００８８】
本発明はまた同一のレポーター分子が本発明の第１プローブまたは第２プローブとハイブリダイズできる、無ラベルの汎用アドレス指定システムも目的としている。
【００８９】
本発明の第２プローブの第１腕および本発明の第２プローブの第２腕は、「タグ」の一部およびこのタグに結合された第１または第２腕の一部が第２プローブの標的特異的配列と会合するときは解離することができる。
【００９０】
本発明のある実施態様は、「タグ」が第２プローブの標的特異的配列と会合する無ラベルの汎用アドレス指定システムを目的としている。
【００９１】
図５はどのようにＵＡＳの１実施態様が動作するかを示す。この実施態様において、第２ヘアピンプローブの標的特異的配列を、第１ヘアピンプローブのタグおよびタグに隣接した腕の一部とハイブリダイズするように設計する。図５Ａは標的分子が存在しないときのＵＡＳ  ５０１を示す。タグ５０３を有する第１ヘアピンプローブ５０２、およびリンカー５０６によって基板５０５に付着されている第２ヘアピンプローブ５０４が閉構造にある。図５Ｂは第１ヘアピンプローブがその標的５０７とラベルされた「レポーター」分子５０８と会合するときにどのようにして開構造取るかを示す。図５Ｃは、第２ヘアピンプローブ５０４の標的特異的配列５１０と、タグ５０３およびタグに隣接した腕５０９の一部でハイブリダイズした第１ヘアピンプローブ５０２を示す。次に標的分子の位置を基板上の「レポーター」分子の位置を検出することにより決定することができる。
【００９２】
核酸の検出
本発明はまた、
（ａ）体外で核酸試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること；および、
（ｂ）工程（ａ）での接触に続いて開構造を取った、バイオチップの少なくとも１つのプローブからの信号を検出すること、
を含む核酸検出方法を目的としている。
【００９３】
工程（ｂ）における信号の検出が、好ましくは検出可能なマーカーでラベルされた「レポーター」分子を用いてできる。好ましくは、検出可能なマーカーはヌクレオチド類似物質、蛍光ラベル、ビオチン、イミノビオチン、抗原、補助因子、ジニトロフェノール、リポ酸、オレフィン酸化合物、ポリペプチド、電子豊富分子、酵素、または放射性同位元素である。
【００９４】
好ましい実施態様において、工程（ａ）の核酸試料は予め検出可能なマーカーによりラベルされている。
【００９５】
好ましくは、標的特異的配列が標的分子と会合して形成する全ての完全なハイブリッドが、４℃以内の範囲で、より好ましくは１℃以内の範囲で等しい融解温度を有する。標的特異的配列と標的配列の会合により形成されるハイブリッドの融解温度と、標的特異的配列と標的特異的配列設計の対象でない分子の会合により形成されるハイブリッドの第２融解温度との差は５℃以上であり、より好ましくは８℃である。
【００９６】
突然変異解析
本発明は、対立遺伝子変異を生じる可能性のある複数のＤＮＡ配列を解析するためのヘアピンプローブのバイオチップを設計し使用する方法を提供する。特に、本発明はＤＮＡの１つの配列上に複数の単一ヌクレオチド変異を生じている短いＤＮＡ断片上のハプロタイプ決定のための手法を提供する。この方法で解析可能な突然変異には、大きな挿入および欠失はもちろん、単一ヌクレオチド転換（または置換）、単一ヌクレオチドの欠失または挿入、または短い配列によって隔てられた複数の変異が含まれる。そのような突然変異の解析には１より多くの対立遺伝子特異的プローブが必要である可能性がある。各遺伝子変異において観察される対立性および解析に必要な信頼度に応じて、４つ迄の対立遺伝子特異的プローブを、単一転換解析のために設計し固定することができる。例えば、表１が肝核因子１タンパク質（“ＨＮＦ１ａ”）（Linder, T. et al. 1999. Hum. Molec. Genet. 8:2001-8）をコードするＴＣＦ１遺伝子のコドン１４２において見出される転換の解析に用いることのできるヘアピンプローブの配列を与える。１４２ＣＣ  ＣＹ５はＳｔｒＮＣｂヘアピンプローブに対するＣｙ５−ラベルされた標的分子であり、１４２ＣＴ  ＣＹ５はＳｔｒＮＴｂヘアピンプローブに対するＣｙ５−ラベルされた標的分子である。太字はループ配列を表し、下線を引いた文字は突然変異部位の位置を示す。自然に起こる突然変異はＣ／Ｔ転換または相補的な鎖のＧ／Ａ転換である。この可能性がある突然変異の解析に使用するために必要なヘアピンプローブは、Ｃを有するプローブのＳｔｒＮＣｂおよびＴを有するプローブＳｔｒＮＣＴである。他の２つのヘアピンプローブ、ＳｔｒＮＧｂおよびＳｔｒＮＡｂ、を使用することができるが必要ではない。
【００９７】
【表１】
2006520206.tif 000002
【００９８】
正確にマップされたゲノム配列を用いて、調査した領域の全ての多型変異が参照される。対立遺伝子決定のための解析が必要である変異に対して、一組のＰＣＲプライマーを、当業者に周知の一般的指針を用いて設計することができる。対立遺伝的変異体を取り込む可能性のあるプライマー配列を回避し、またＰＣＲ反応の特異性と収率を最大するために、既知の多型性を含有するゲノム領域にあるプライマー対を設計しないように注意を払う。対立遺伝子決定を必要とする各突然変異に対して、少なくとも２つのヘアピンプローブを設計し、使用する。対立遺伝子変異の位置を、特異的ループ配列の中心にできるだけ近い場所に取る（図１の１０１参照）、しかし配列の特徴に応じて変化しうる。対立遺伝的変異体の位置がループの中心から遠い所にあるときは、標的特異的配列と、標的特異的配列と完全に相補的ではない標的分子が会合したときに形成されるハイブリッドのＴｍが低下する。
【００９９】
同一の解析に用いるヘアピンプローブを設計するときには、標的特異的配列と標的分子の間のハイブリッドの全てのＴｍがほぼ１〜４℃以内で同一になるようにするために、標的特異的配列の長さの修正（上を参照）を行う。例えば、検出する対立遺伝子変異はループの中心から１〜１０塩基であればよく、好ましくは２〜５塩基である。一旦全てのヘアピンプローブの標的特異的配列を、許容できる範囲の（上を参照）Ｔｍを有するように設計すれば、次に他の対立遺伝子（ヘテロ二重鎖）とハイブリダイズする各ループのＴｍをMeltcalc（上を参照）を用いて計算する。完全なＤＮＡ二重鎖と不完全な二重鎖の間のＴｍの差異は可能な限り大きく保たれるが、標的特異的配列と完全には会合できない標的分子が会合して形成するハイブリッド、即ち少なくとも１つのミスマッチ塩基を持つハイブリッドのＴｍが、標的特異的配列と標的分子間のハイブリッドのＴｍよりも少なくとも５℃低い場合には、それは適切な区別をするのに十分であると考えられる。より好ましくは、標的特異的配列と完全には会合できない標的分子が会合したときに形成されるハイブリッドのＴｍは、標的特異的配列と標的分子間のハイブリッドのＴｍよりも少なくとも８℃低い。
【０１００】
標的配列はゲノムＤＮＡ、またはラベルされた若しくは無ラベルのＰＣＲ増幅ＤＮＡ配列でよい。ヌクレオチド数で表した検査される配列のサイズは、ハイブリダイゼーションプローブのループ部分と同じでよい。しかし検査される配列の最大サイズに関しては何の制限もなく、より大きなヌクレオチド数が好ましい。これらの二重鎖標的配列の各鎖を熱によって分離し、完全に適合する配列のみがそれに特異的な固定されたヘアピンプローブとハイブリダイズするように、個別の化学種としてまたは混合物としてヘアピンプローブのバイオチップとハイブリダイズさせることができる。
【０１０１】
１つの試料中で検出される各対立遺伝子の相対存在度を、各対立遺伝子に特異的な各プローブの相対信号を測定して決定することができる。例えば、１つの転換に対応する単一の２対立性に対しては、４つのヘアピンプローブのうちの２つ（それぞれ１つの対立遺伝子に対して１つの異なる塩基を持つ）がヘテロ接合体の試料に対して信号を出す。その対立遺伝子は固体表面上のヘアピンの位置によって決定することができる。ホモ接合体の試料に対しては、４つのヘアピンプローブのうちの唯１つが信号を出すに違いない。
【０１０２】
本発明はこのように生体外で核酸試料中の遺伝的変異体を検出する方法であって
（ａ）試料を、少なくとも２つのプローブを含む本発明のプローブのバイオチップに接触させること（ここでバイオチップの少なくとも１つのプローブは遺伝的変異体と完全に相補的なループを有する遺伝的変異体特異的な本発明のプローブである）；および
（ｂ）遺伝的変異体のヘアピンプローブからの信号を検出すること、
を含む方法を目的としている。なお工程（ｂ）で検出される信号は核酸試料中に遺伝的変異体が存在することを示している。
【０１０３】
好ましくは、検出された遺伝的変異体は、単一ヌクレオチド多型性、１以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入、または１以上のヌクレオチドの重複である。
【０１０４】
好ましい実施態様において、「レポーター」分子がバイオチップの各ヘアピンプローブとハイブリダイズできる。工程（ｂ）における信号の検出は、好ましくは検出可能なマーカーでラベルされた「レポーター」分子を用いて得られる。工程（ａ）の核酸試料は予め検出可能なマーカーでラベルしておいてもよい。
【０１０５】
配列決定
本発明は、化学的分解とジデオキシヌクレオチドによる鎖終止を用いる配列決定方法の手動の調製工程を回避して、生体外でオリゴヌクレオチド試料のＤＮＡ配列を決定する方法を提供する。本発明は、各プローブの標的特異的配列が、同じバイオチップ上に固定されたもう１つのプローブの別の標的特異的配列の少なくとも一部と同一な配列を含むような、ヘアピンプローブおよびヘアピンプローブのバイオチップの設計と使用を含む。解析する配列のサイズに応じて、固定されたヘアピンプローブの標的特異的配列をさらに、長さが少なくともヘアピンプローブの標的特異的配列の長さに等しいオリゴヌクレオチド配列のいずれともハイブリダイズするように設計する。この方法により、予め決められた長さの全てのオリゴヌクレオチドを配列決定するためのバイオチップを設計することができる。試料の一部とヘアピンプローブとの間で起こるハイブリダイゼーションの検出をモニターすることができ、また本発明の記載とUnited States Patent Nos. 6,270,961; 6,025,136; 5,871,928; and 5,695,940の記載に従って配列が決定される。
【０１０６】
本発明はこのように、生体外でオリゴヌクレオチドを配列決定する方法であって、
（ａ）オリゴヌクレオチドを含有する試料を少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること；および
（ｂ）バイオチップの前記プローブの少なくとも１つからの信号を検出すること、
を含む方法を目的とする。なお工程（ｂ）で検出する信号をオリゴヌクレオチドの配列決定に用いる。
【０１０７】
好ましい実施態様において、「レポーター」分子がバイオチップの各ヘアピンプローブとハイブリダイズできる。工程（ｂ）の検出を、好ましくは検出可能なマーカーでラベルされた１つのレポーター分子を用いて行う。工程（ａ）の試料は予め検出可能なマーカーでラベルしておけばよい。
【０１０８】
遺伝子発現解析
本発明は、遺伝子発現解析のための本発明のヘアピンプローブおよび本発明のヘアピンプローブバイオチップの設計と使用の方法を提供する。
【０１０９】
この実施態様は、多数の異なる配列を相対存在度に関して解析する必要があるときに、無ラベルの核酸の差分発現解析に役立つ。解析するそれぞれの遺伝子に対して、少なくとも１つのヘアピンプローブを遺伝子の各エクソン部分に対して設計すればよい。
【０１１０】
本発明はまた、基板上に固定された少なくとも２つの本発明のプローブを含む本発明のプローブのバイオチップを目的とする。好ましい実施態様において、ステムの構造が少なくとも２つの各ヘアピンプローブで同一である。より好ましくは、「レポーター」分子がバイオチップの本発明の各プローブとハイブリダイズできる。
【０１１１】
細胞抽出物または組織試料から発現レベルをモニターするために、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはラベルされた若しくは無ラベルのｃＤＮＡおよびｃＲＮＡを、ヘアピンプローブまたはヘアピンバイオチップの標的配列として用いることができる。もしｃＤＮＡおよびｃＲＮＡが発現解析に使用されるならば、それらの標的配列を、逆転写中または追加のＰＣＲ工程中に取り入れることによって蛍光色素でラベルすることができる。
【０１１２】
差分発現解析において、様々な条件を比較することができる。これらの条件は、生理的ストレスもしくは分化段階、代謝経路の活性化、または薬物の転写に対する活性であり得る。例えば、細胞もしくは組織から抽出した無ラベルのｍＲＮＡもしくは全ＲＮＡ、またはｃＤＮＡなどの核酸の２つのプールのおのおのを別々に、各条件に対して特異的に設計したヘアピンバイオチップと、またはＵＡＳによって解析するために特に設計した第１ヘアピンプローブの一組とハイブリダイズさせる処理をすることができる。
【０１１３】
選択的スプライシング産物の検出、および相対量の測定条件
本発明は、選択的スプライシング産物を解析する方法、あるいは各選択的スプライシング産物の同一の組織の異なる生理状態における相対量または各選択的スプライシング産物の同一遺伝子に対する異なる組織中での相対量を決定する方法を提供する。これの応用は、遺伝子産物が所定の経路中で相互作用すると考えられる多くの遺伝子の複数の変異体を解析するために有用である可能性がある。
【０１１４】
本発明はこのようにして、生体外で核酸試料中の遺伝子の選択的スプライシング産物を検出する方法であって、
（ａ）試料を、少なくとも２つの本発明のプローブを含み、少なくとも前記バイオチッププローブの１つが、遺伝子の１つのエクソンまたは２つのエクソンの接合部に特異的なプローブである本発明のバイオチップと接触させること；および
（ｂ）エクソン特異的なプローブまたは２つのエクソンの接合部特異的なプローブからの信号を検出すること（ここで、工程（ｂ）で検出される信号が、核酸試料中の遺伝子の選択的スプライシング産物の存在を示している）、
を含む方法を目的とする。
【０１１５】
好ましくは、核酸試料はｍＲＮＡを含む。
【０１１６】
ヘアピンプローブの標的特異的配列は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに相補的であるように設計する。より好ましくは、それらを各標的配列について既知の様々なスプライシング産物に相補的であるように設計する。様々なスプライシング変異体をもたらす大きな欠失はもちろん単一のヌクレオチド欠失を、これらの変異に特異的な同一のヘアピンプローブのバイオチップにより検出できる。
【０１１７】
研究する遺伝子のそれぞれの推定上のまたは既知のエクソン配列が、遺伝子産物中におけるエクソン、エクソンの一部もしくは２つのエクソンの接合部の存在または不存在を検出するために設計された特異的なヘアピンプローブを持つことができる。ヘアピンプローブの設計を遺伝子発現解析の設計と同様に実施でき、また配列を基板上にアドレス指定するためにＵＡＳを使用できる。さらに、解析するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの長さもしくは組成の変異を、その標的特異的配列が解析領域の中心とハイブリダイズするように設計した幾つかのヘアピンプローブによって解析できる。２つのｍＲＮＡ間のヌクレオチドの欠失または置換の解析は、例えば、標的特異的配列の中心の位置で１ヌクレオチドの差を有する２つのヘアピンプローブを設計することによって解析できる。
【０１１８】
これらのプローブの設計は、突然変異解析のために設計したプローブと同様である。ｍＲＮＡ中の大きな欠失の遺伝子検出のために、２つのヘアピンプローブ６０１および６０２の標的特異的配列をｍＲＮＡ配列とハイブリダイズするように設計すればよい（図６）。第１ヘアピンプローブ６０１の標的特異的配列を、欠失して選択的スプライシング型となったｍＲＮＡ６０３の領域６０４とハイブリダイズするように設計する。第２ヘアピンプローブ６０２の標的特異的配列を、欠失領域６０４の丁度５’および３’とハイブリダイズすることによって選択的スプライシング型６０５を検出するように設計することができる。これらのプローブの設計は、発現解析のために設計したプローブの設計と同様であり、バイオチップを次に、転写された同じ遺伝子のエクソンが存在するかしないかをスクリーニングするために使用できる。
【０１１９】
スプライシング変異体を差分解析するための手続きは、差分発現解析と同じである。ある生理状態にある２つの組織、または１つの組織もしくは２つの異なる組織の２つの生理状態に由来するｍＲＮＡ、が別々にｃＤＮＡに逆転写されてラベルされる（各組織または状態に対して異なるラベルで）。２つの供給源から得たラベルされたｃＤＮＡは、混合してヘアピンプローブバイオチップとハイブリダイズさせるか、またはＵＡＳシステムのヘアピンプローブとハイブリダイズさせ、さらに第２ヘアピンのバイオチップとハイブリダイズさせる。
【０１２０】
本発明の好ましい実施態様において、「レポーター」分子がバイオチップの各ヘアピンプローブとハイブリダイズできる。工程（ｂ）における検出は、好ましくは検出可能なマーカーでラベルした１つの「レポーター」分子を用いて行われる。工程（ａ）の試料は検出可能なマーカーで予めラベルしておくことができる。
【０１２１】
外来起源の分子を検出するためのヘアピンプローブ
本発明を、病原体、微生物、ウイルス、寄生生物、または遺伝的に修飾された有機体（“ＧＭＯ”）中に見出される遺伝子修飾などの任意のヌクレオチドを含有する有機体またはそれの残存物から得られる分子の検出に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ヘアピンプローブと会合する他の任意の分子の検出を通じて、用いることができる。しかしそのような分子に限られない。本発明によれば、「任意のヌクレオチドを含有する有機体の任意の残存物」とは、例えば感染細胞中のウイルスＤＮＡまたはそのウイルスＤＮＡから産生されたｍＲＮＡなど（これに限られないが）の、別の細胞に侵入したヌクレオチドを含有する有機体から得られる任意の分子、またはその分子に由来する任意の分子を意味する。この応用が、外来起源の種々の分子を同一の試料中で検出する必要のあるとき、または生物学的試料中で遺伝的変異体を解析するために特に有用である。
【０１２２】
本発明はまた、生体外で任意の核酸を含有する有機体またはその残存物を検出する方法であって、
（ａ）核酸試料を少なくとも２つの本発明のプローブを含むバイオチップと接触させること（ここで、少なくとも１つの前記プローブが核酸を含む有機体またはその残存物にたいして特異的である）；および、
（ｂ）有機体の核酸に特異的なプローブからの信号を検出すること（ここで、工程（ｂ）で検出される信号が核酸を含む有機体またはその残存物の存在を示す）、
を含む方法をも目的とする。
【０１２３】
核酸を含有する有機体は好ましくはウイルスまたはバクテリアである。
【０１２４】
本発明の好ましい実施態様において、「レポーター」分子がバイオチップの各ヘアピンプローブとハイブリダイズできる。工程（ｂ）における検出を、好ましくは検出可能なマーカーでラベルされた１つのレポーター分子を用いて行う。工程（ａ）の試料は予め検出可能なマーカーでラベルしておくことができる。
【０１２５】
好ましい実施態様において、ＰＣＲ反応によって増幅したｃＤＮＡはもちろん、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはラベルもしくは無ラベルｃＤＮＡを、検討する病原体、微生物、ウイルス、またはＧＭＯが存在するかしないかを検出するために、ヘアピンプローブのバイオチップ上で用いることができる。解析すべき外来起源の各分子に対して、少なくとも１つのヘアピンプローブを、スクリーニングする有機体中で一貫したレベルで発現していることが知られている遺伝子の少なくとも１つのエクソン部分に対して設計する。
【０１２６】
ヘテロ接合性喪失および対立遺伝子不均衡の解析
本発明はさらに、染色体断片の欠失もしくは挿入によって引き起こされる対立遺伝子不均衡およびヘテロ接合性喪失を解析するための本発明のプローブと本発明のプローブのバイオチップの設計と使用のための方法を目的とする。
【０１２７】
これの応用が、染色体の切断点（breakpoint）が知られているまたは知られていない染色体欠失の解析に有用である。欠失が局在するそれらのＤＮＡ断片の破壊点は知られていないことが多く、また時には個体に特異的である（Mateo M.et al.(1999), AM.J.Path.,154(5), 1583-1589）。このタイプの遺伝子変化が、前立腺、胸部、ある型の大腸癌、および、あるリンパ腫などの癌で発見されている（Larsson C.M. et al.(2001), Molecular Diagnosis.,6(3),181-188）。
【０１２８】
本発明は、健康な細胞（例えば血液リンパ球）と腫瘍と推定される細胞（例えば、生検で得られる細胞、または尿、脳脊髄液、もしくは分泌液などの液体）の間のゲノム配列の比較を、本発明のプローブのバイオチップを解析手段として用い、差分解析の方法で行うことを目的とする。
【０１２９】
この解析方法は、周知の方法を用いてＰＣＲによりマイクロサテライト配列を増幅すること、およびＰＣＲ産物を本発明のバイオチップ上でハイブリダイズさせることより成る。マイクロサテライト配列は高度に多型的な反復配列であり、規則的な間隔でゲノム中に存在しＰＣＲプライマーを配置するために適当な配列を両側に持つ（Goldstein,D.and C.Schlotterer,eds.1999. Microsatellites: evolution and Applications. Oxford University Press）。欠失が存在しない場合にはこれらの領域を増幅し、欠失が存在するときはＰＣＲ産物の増幅が無いようにするために、増幅するマイクロサテライト配列を欠失の可能性のある領域中に選ぶ（マイクロサテライト配列および適当なＰＣＲプライマーの選択には：Genome Database, http://www.gdb.org 参照）。本発明において、健康なおよび腫瘍と推定される細胞のマイクロサテライト配列を別々に増幅し、健康なおよび腫瘍の２つの型のそれぞれに対して異なるラベルがされたＰＣＲプライマーを用いて、別々にラベルする。好ましくは、マイクロサテライトマーカーの複数回のＰＣＲ増幅（多重ＰＣＲ）を利用する。病状と実行する解析に応じて、１個から数個のマイクロサテライト配列を増幅する。好ましいラベルのしかたは、健康な細胞から得たマイクロサテライトの増幅をＣｙ３でラベルされた１つのプライマーと無ラベルの相補的プライマーとを用いて行い、腫瘍細胞から得たマイクロサテライトの増幅をＣｙ５でラベルされた１つのプライマーと無ラベルの相補的プライマーとを用いて行うことである。次に、各マイクロサテライトマーカーから得られたＰＣＲ産物、健康な細胞に対するＣｙ３ラベルＰＣＲ産物および腫瘍細胞に対するＣｙ５ラベルＰＣＲ産物を、増幅後に残存している（ＰＣＲ中に取り込まれずに）フリーのＰＣＲプライマーを棄てるために処理する。ＰＣＲプライマーを棄てるいくつかの方法が考えられ、好ましいのは、exo/sap "ExoSAP-IT" キットのプロトコル（USB Corporation, 26111 Miles Road, Cleveland Ohio 44128, USA）による、エキソヌクレアーゼＩおよびエビのアルカリホスファターゼ（exo/sap）を用いる方法である。
【０１３０】
この処理に続いて、マイクロサテライト配列の増幅産物を１つの溶液中に貯めて、本発明のプローブのバイオチップとハイブリダイズさせる。あるいは、この貯める工程をＰＣＲプライマー除去工程の前に実行してもよい。本発明のバイオチップは少なくとも１つのプローブを含む。そのようなプローブは、少なくとも部分的にマイクロサテライト配列の増幅に用いるＰＣＲプライマーの１つと相補的であり、また好ましい実施態様においては、プライマーの配列の１領域または全配列と完全に相補的である。本発明のバイオチップ上で幾つかの型のプローブを用いることができ、あるいは好ましくはリンカーを付加して修飾した本発明のヘアピンプローブ、またはＵＡＳシステムのプローブを用いることができる。好ましい方法においては、プローブ配列を本発明の特徴を用いて設計する。特に解析のために数個のプローブを数個のマイクロサテライト配列と共に用いるときには、プローブの標的特異的配列とそれに相補的な標的マイクロサテライト配列との全てのハイブリッドのＴｍが４℃の範囲で等しく、好ましくは１℃の範囲で等しい。同様に、数個のプローブを１つのバイオチップ上で用いる場合は、好ましい方法における全てのプローブの１つの腕は同一の配列を有することができる。数個のマイクロサテライト配列を解析するときに、もし１つのバイオチップ上に２以上のプローブが必要な場合は、それらのプローブは幾つかの型、即ち直鎖状および／またはヘアピン、および／またはＵＡＳシステムのプローブでもよい。
【０１３１】
好ましい方法において、ＵＡＳシステムのプローブを、マイクロサテライト配列のＰＣＲにおける増幅のネガティブ基準を与えるために用いる。これらのネガティブ基準は、健康なまたは腫瘍細胞のゲノムＤＮＡが存在せず、しかしＰＣＲに必要な試薬と１対のプライマー（少なくともその１つは、第２の固定されたプローブの標的特異的配列と完全に相補的な「タグ」配列を保有するＵＡＳシステムの第１直鎖状プローブである）が存在する条件でマイクロサテライト配列を増幅して取得する。
【０１３２】
健康なまたは腫瘍性と推定されるマイクロサテライト配列を増幅して得られるＰＣＲ産物がバイオチップのプローブとハイブリダイズするときは、バイオチップのプローブはＰＣＲ産物の端に局在するＰＣＲプライマーとハイブリダイズする。細胞から得られるアンプリコンをＣＹ３およびＣＹ５で別々にラベルすることが、バイオチップの各プローブに対して、健康な細胞のＰＣＲ産物とプローブのハイブリダイゼーションによるＣｙ３の発光から成る信号、および腫瘍性と推定される細胞のＰＣＲ産物とプローブのハイブリダイゼーションによるＣｙ５の発光から成る信号を生成する。各ラベルに対する相対発光成分を測定して、健康な細胞および腫瘍細胞からのマイクロサテライト配列特異的なＰＣＲ産物の相対存在量を推定できる。マイクロサテライト配列は、マイクロサテライトを含有する領域中に欠失が起きたときは増幅されないので、欠失が起きたときには、（推定腫瘍細胞からの）Ｃｙ３発光が、（健康な細胞からの）Ｃｙ５発光と比較して減少するのが観測される。
【０１３３】
本発明において、マイクロサテライト配列増幅ＰＣＲ産物の相対存在量の解析が、ハイブリダイゼーション後に、Ｃｙ３とＣｙ５の相対発光値を内部較正曲線と比較することにより得られる。この較正曲線は、Ｙ染色体（ヘテロ接合性マーカー）上に局在する欠失のないマイクロサテライトマーカーおよび他の染色体（ホモ接合性マーカー）上に局在する他の欠失のないマーカーから得られたＤＮＡの、増幅と本発明のバイオチップのプローブとの競合ハイブリダイゼーションによって得られる。好ましい実施態様において、これらのマーカーの増幅は、両方の型の試料（健康なおよび推定腫瘍性細胞）を用いて、他のマイクロサテライトマーカーの増幅と同時に、上述のようにＣｙ５とＣｙ３による別々のラベルを利用して行う。ヘテロ接合性およびホモ接合性マーカーを増幅するために用いるＤＮＡを、マイクロサテライトマーカー遺伝子型がわかっている（これらのマーカーに欠失を有しない）個体から得る健康な細胞および腫瘍細胞のＤＮＡ抽出物から、または雄の個体から得られるこのＤＮＡの即興標本から、得ることができる。
【０１３４】
あるいは、較正曲線を、考慮する病状のために欠失していることのない２以上のマイクロサテライトマーカーのＰＣＲ増幅から構成することができる。これらのマーカーを、比較する各細胞型（健康細胞または推定腫瘍細胞）から抽出されたＤＮＡを順次希釈して、他のマイクロサテライトマーカーの増幅と同時に、増幅する。解析の実行後に、グラフ上にプロットして較正曲線が得られる。グラフのＸ軸がＣｙ３蛍光強度で、Ｙ軸がＣｙ５蛍光強度であり、各バイオチッププローブに対する両蛍光発光のそれぞれの値がマーカーの較正値に対応している。
【０１３５】
本発明の目的はまた、本発明のバイオチップからプローブおよびＲＴ−ＰＣＲ試薬を含む試薬までのキットであって、
−前立腺癌、腎臓癌、および膀胱癌
−乳癌
−大腸癌
−肺癌
−デュシェンヌ筋障害のような遺伝病および後天性疾患における大きな欠失の存在の解析、
における対立遺伝子不均衡を解析するためのキットをを目的とする。
【０１３６】
ヘアピンバイオチップキット
本発明はさらに、試料中の標的分子の存在を検出するために用いるキットを提供する。そのようなキットは一般にそのような測定を行うための２以上の構成要素を含む。そのような構成要素には、ヘアピンプローブのバイオチップおよび選ばれた標的分子を検出するために必要な試薬の供給品が含まれる。あるいは、キットはＵＡＳで用いるような固定されたおよび／または固定されていないプローブおよび試薬を含んでもよい。好ましいキットは、ヘアピンプローブのバイオチップ、一組の固定されていないヘアピンプローブ、および／または「レポーター」分子、および１以上の追加の試薬を含む。別の好ましいキットは、直鎖プローブのバイオチップ、１組の固定されていないヘアピンプローブおよび／または「レポーター」分子、および１以上の追加の試薬を含む。
【実施例】
【０１３７】
標的ＤＮＡと固定されたヘアピンプローブのハイブリダイゼーション
以下の実施例は本発明の説明のために示すのであって、いかなる形であれ本発明の制限を意図したものではない。特に、ここで以下に示す実施例は、ヘアピンバイオチップの標的配列検出のための使用を記述する。
【０１３８】
核酸分子
ＴＣＦ２遺伝子のエクソン２中のコドン１３７の突然変異は、重症の腎不全を伴うII型糖尿病表現型をもたらす７５塩基対の欠失である（Linder, T.et al.1999. Hum. Moles. Genet. 8:2001-8）。この実施例で用いる標的配列は、ＴＣＦ２遺伝子のエクソン２中のコドン１３７の欠失した配列の２６６〜２９０位置に対応する。図７Ａは、エクソン２中のコドン１３７の突然変異の位置を示す。太字括弧の部分、塩基２７６〜３５０が突然変異個体の欠失部位を表す。図７Ｂが、突然変異が起こるときのエクソン２の配列を示す。
【０１３９】
この実施例で用いた標的配列、Ｔｇ２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１、図７Ｃ、は、図７Ｂの太字配列の相補的配列、即ちネガティブ鎖である。図７Ｄに示すヘアピンプローブの標的特異的配列２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１は、突然変異した標的配列の中央の、標的配列と完全に相補的な１８ヌクレオチドを選んで設計した。次の研究のために設計した「レポーター」分子を図７Ｅに示す。これは１Ｍナトリウム塩および１μＭオリゴヌクレオチド溶液を用いると融解温度が２３℃である。２Ｘ２１３７Ｍ１ヘアピンプローブのステム構造は７２℃のＴｍを持つ。ヘアピンプローブの標的特異的配列を、標的特異的配列と標的分子間に形成されるハイブリッドが６０℃±２℃のＴｍを持つように、１００mMナトリウムおよび１００mMオリゴヌクレオチド濃度でパラメーター設定してMeltcalcソフトウエアを用いて設計した（Ｔｇ２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１／２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１二重鎖のＴｍ＝６０．８℃）。
【０１４０】
Meltcalcソフトウエアをオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションの熱力学的融点予測に用いた。このソフトウエアは、塩濃度、ＤＭＳＯ、およびオリゴヌクレオチド濃度が変化する場合を通して、Ｔｍを設定することができる。これらの実施例のヘアピンプローブを、０．１mMナトリウム塩濃度および０．１mMオリゴヌクレオチド濃度を用いて設計した。ヘアピンプローブの各腕の自分自身との会合を、ｍｆｏｌｄを用いパラメーターを、折り畳み温度３７℃、１Ｍナトリウム、マグネシウムなし、オリゴマー補正型、５％部分最適化および折り畳み計算の上限５０、として評価する。ｍｆｏｌｄで計算した全てのヘアピンプローブは、上のパラメーターを用いると、６ヌクレオチドの最大連続ステム長および６５〜７２℃のＴｍを有する。標的分子と、野生型および突然変異体の標的特異的配列の間の完全に相補的なハイブリッドのＴｍは６０℃であって、少なくとも５℃の、完全なハイブリダイゼーションと不完全なハイブリダイゼーションの間のＤＴｍを持ち、また各ステムが６５〜７２℃のＴｍを持つ。
【０１４１】
ヘアピンプローブの固定
５’端にアミノリンカーを持つように合成された全てのヘアピンプローブを、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（“ＮＨＳ”）で活性化されたガラススライド（NoAb Diagnostics, Mississauga, Ontario, Canada）上に、スライドと共に供給されるスポット用緩衝液を用い、４５分間３０℃下湿度室中でスポットした。残ったＮＨＳ基を、やはりスライドと共に供給されるブロック溶液を用い室温で３０分間不活性化した。スライドを次に、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液ｐＨ７で洗浄し、またミリＱ水ですすいだ。
【０１４２】
標的配列のハイブリダイゼーション
固定したヘアピンプローブの各バイオチップを、５０％ホルムアミドを含む６ＸＳＳＣ中のＣｙ５−ラベル標的配列Ｔｇ２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１  ４００nM溶液２０μlで処理した。各スライドの上にカバーグラスを置き、標的配列溶液を室温で１時間置いてハイブリダイズさせた。各バイオチップを次に４×ＳＳＣで５分間すすぎ、その次に０．１×ＳＳＣで２分間すすいだ。最後に、各スライドを、バイオチップスキャナー（Axon Instrument, Inc.,Union City, California, USA）により、Ｃｙ５およびＣｙ３の両方の励起および発光波長を用いて、撮像した。
【０１４３】
図８は、Ｃｙ５ラベル標的配列のハイブリダイゼーション後のＣｙ５およびＣｙ３の蛍光強度を示す。各値は各ヘアピンプローブの５回重複スポットの平均である。このスクリーニングに用いた１０のヘアピンプローブは、ＴＣＦ２遺伝子の異なるエクソンに位置する５つの異なる突然変異の解析のために設計されている。２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１（図８の“１３７Ｍ１”）のみが標的Ｔｇ２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１と完全に相補的である。対照は、５’端をＣｙ３でラベルされ、３’端をアミノリンカーで修飾された直鎖状の一本鎖配列である。対照は、スポットの位置決めであり、またスポットの質の対照である。Ｃｙ５ラベル標的配列に結び付いたＣｙ５信号は、事実上標的の完全に相補的な配列、２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１ヘアピンプローブのループに対応するスポット上のみに観測された。
【０１４４】
レポーター分子のハイブリダイゼーション
標的分子とのハイブリダイゼーションに続いて、固定されたヘアピンプローブの各バイオチップを、５０％ホルムアミドを含む６×ＳＳＣ緩衝液中のＣｙ３ラベル「レポーター」分子の１μＭ溶液２０μlで処理した。各スライドの上にカバーグラスを置き、「レポーター」分子溶液を室温で１時間置いてハイブリダイズさせた。各バイオチップを次に４×ＳＳＣで５分間、２回すすぎ、その次に０．１×ＳＳＣで２分間すすいだ。各スライドを、バイオチップスキャナーによって、Ｃｙ５およびＣｙ３の両方の励起および発光波長を用いて、撮像した。
【０１４５】
図９は、Ｃｙ３ラベル「レポーター」分子のハイブリダイゼーションの、５重複測定に基づくＣｙ５とＣｙ３の平均蛍光強度を示す。Ｃｙ３ラベル「レポーター」分子のハイブリダイゼーションに結び付いたＣｙ３信号は、事実上Ｃｙ５ラベルＴｇ２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１配列がそれの完全な相補物、即ち２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１ヘアピンプローブとハイブリダイズするスポット上のみに観測された。結果は、「レポーター」分子が好んで開プローブとハイブリダイズし、また開プローブは、標的分子が、標的特異的配列を含むヘアピンプローブとハイブリダイズするときにのみ見出されることを示す。
【０１４６】
ヘアピンプローブの特異性
ヘアピンプローブと標的分子の間の非特異的結合は、ハイブリダイゼーションの条件を変えることにより減少する可能性がある。図８において、Ｃｙ５ラベル標的と１５１Ｍ１プローブとの間の非特異的相互作用が明確に観察される。図９では、Ｃｙ３ラベル「レポーター」分子と全てのヘアピンプローブの間の明らかな相互作用が、２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１ヘアピンプローブを別にして観察される。非特異的相互作用を除く１つの方法は追加の洗浄によるものである。図９は、追加の洗浄によってＣｙ５ラベル標的配列と１５１Ｍ１ヘアピンプローブ間の非特異的結合が減少することを示す。非特異的結合を減少させるもう１つの方法はより厳しい条件を用いることである。図１０は、１５〜３０分間４×ＳＳＣ緩衝液を用い、「レポーター」分子のＴｍ  ＋５℃である２８℃下でのより厳しい洗浄が、どのようにレポーター分子と２Ｘ２Ｃ１３７Ｍ１ヘアピンプローブを除く全てのヘアピンプローブの間の大部分の非特異的結合を除去するかを示す。
【０１４７】
ヘアピンプローブによる単一ヌクレオチドの識別
表IIは、肝臓リパーゼ（“ＬＩＰＣ”）、コレステリルエステル転移酵素タンパク質（“ＣＥＰＴ”）、リポタンパク質リパーゼ（“ＬＰＬ”）、およびＴＣＦ１に対する遺伝子中の突然変異を解析するために設計した１６のヘアピンプローブの配列を示す。表IIにまとめたのは、各ヘアピンプローブの名前、遺伝子名と各ヘアピンプローブのコドン配列との対応、および標的配列とハイブリダイズしたときに各ヘアピンプローブが有するミスマッチの数と型である。ヘアピンプローブの標的特異的配列は、特定の標的分子に完全に適合する即ち相補的であるか、または完全には相補的ではなく１つまたは２つのミスマッチを有するか、または「−」で示したように標的分子に全く相補的でないか、のいずれかである。ヘアピンプローブを、単一ヌクレオチド多型を有する標的配列と相補的な１８〜２４ヌクレオチドのループ配列を選択することにより設計した。全てのＳＮＰ変異体はループの中心に、多型部位の両側に９〜１１のヌクレオチドを有するように置かれた。その特異的標的配列とハイブリダイズした各野生型および突然変異型ＳＮＰ変異体のループのＴｍを、Meltcalcソフトウエアにより、１００mMナトリウムおよび１００mMオリゴヌクレオチド濃度でパラメーターを設定して、６２±２℃となるように設計した。ヘアピンの配列を１以上のヌクレオチドをループの各の端に加えるおよび／または取り除くことにより調整して、６０℃のＴｍに達し、ヘテロ二重鎖とホモ二重鎖の間の融解温度の変化が少なくとも５℃であるようにした。
【０１４８】
ヘアピンプローブの固定化を上記のように行った。固定されたプローブの各バイオチップを、１Ｍナトリウム緩衝液２０μl、４００nM  Ｃｙ３ラベルＭ１９標的および４００nM  Ｃｙ５ラベル１４２ＣＣの溶液２０μlで、１時間６×ＳＣＣ緩衝液中２０℃で、カバーグラスで覆って処理した。バイオチップを次に４×ＳＳＣで５分間すすぎ、その次に０．１×ＳＳＣで２分間洗浄した。バイオチップを、Ｃｙ５およびＣｙ３の両方の励起および発光波長を用い、光電子倍増管（“ＰＭＴ”）を６００×６００倍にして、上記のように撮像した。
【０１４９】
図１１はＣｙ５ラベルおよびＣｙ３ラベル標的配列のハイブリダイゼーション後の５回重複測定に対する平均のＣｙ５およびＣｙ３蛍光強度を示す。Ｃｙ３信号がＭ１９標的のハイブリダイゼーションに対応し、またＣｙ５信号が１４２ＣＣ標的のハイブリダイゼーションに対応する。部分的または完全に標的配列と相補的なヘアピンプローブのみが、低厳密度条件で標的配列とハイブリダイズしたときに信号を発生することができた。ホモ二重鎖をヘテロ二重鎖から識別するために、各バイオチップを２０分間６×ＳＳＣ緩衝液中５０℃で洗浄し、続いて６×ＳＳＣですすぎ、次にＣｙ５とＣｙ３の蛍光を、６００×６００倍のＰＭＴで再スキャンした。
【０１５０】
図１２は、各バイオチップに対してより厳密な洗浄を行った後の、５回重複測定に対する平均のＣｙ５およびＣｙ３蛍光強度を示す。ラベルされた標的と完全に相補的であるヘアピンプローブ、ＳｔｒＭ１９ＧおよびＳｔｒＮＣｂ、が最高のハイブリダイゼーションを有する。単一のミスマッチを有するヘアピンプローブが次に高いハイブリダイゼーションのレベルを持ち、２つのミスマッチを有するプローブが最低のハイブリダイゼーションレベルを持つ。ハイブリダイゼーションのこの識別は、ヘアピンプローブと標的配列の間の完全な相補性のより高い安定性によって得られる。
【０１５１】
【表２】
2006520206.tif 000003
【０１５２】
ヘアピンプローブ設計の例
表IIIに示したプローブをシャルコー−マリー−ツース病に冒された個体中で起こっている突然変異を解析するために設計した。
【０１５３】
シャルコー−マリー−ツース病は最も出現頻度が高い末梢神経系の遺伝病である。それは本質的に複遺伝子性であり、一群の知覚性および運動性神経障害によって特徴付けられる（http://molgen-www.uia.ac.be/CMTMutations/CMT.cfm）。
【０１５４】
分子レベルでは、現在１４の遺伝子が、その突然変異によってシャルコー−マリー−ツース病の出現の原因となることが知られている。それらの中で、突然変異が優性である末梢ミエリンタンパク質遺伝子（ＰＭＰ２２）、ミエリンタンパク質ゼロ遺伝子（ＭＰＺ）、およびコネクソン３２遺伝子（ＧＪＢ１）を、この実施例で以下に表示する５つの突然変異解析用のプローブを設計するために用いる。
【０１５５】
【表３】
2006520206.tif 000004
【０１５６】
プローブ設計を、「発明の詳細な説明」中のプローブ設計の項の記載に従って実施した。
【０１５７】
これらの工程は：
１−  突然変異型および野生型プローブのループとステム配列を設計し、また完全なお
よび不完全なハイブリッドのＴｍをMeltcalcで計算すること
２−  プローブに腕（ステム）を加え、構造をチェックし、またヘアピンプローブのＴｍをＭｆｏｌｄで計算すること
３−  プローブとそのそれぞれの標的のアラインメントを行い、またヘアピンプローブと非相補的な標的との間の相同性の欠如を確かめること、
である。
【０１５８】
これらの突然変異を解析するために設計した全てのプローブを表IIIに一覧として挙げる。これらのプローブを次の手順によってバイオチップを設計するために使用する：
【０１５９】
各プローブを５’にアミノリンカーを付して合成する（Sigma Genosys, UK）。これらのプローブをMicrogrid II Bioroboticsスポッターを用いて活性化されたガラススライド（Genescore, France）上にスポットした。スポットすると、ガラス基板とアミノ化したプローブ端の間に共有結合連結が形成される。各スポットを５重に生成した。
【０１６０】
そのようなバイオチップを、表IIIのプローブと完全に相補的で、５’を蛍光色素（Cyanin 3, Sigma Genosys）でラベルされた一組のオリゴヌクレオチド標的（表IV）とハイブリダイズさせた。
【０１６１】
【表４】
2006520206.tif 000005
【０１６２】
２つの異なるバイオチップについて２組の実験を行った。第１チップを野生型対立遺伝子（ＷＴ、表IV（ａ））に対応する全ての標的とハイブリダイズさせた。第２チップを突然変異対立遺伝子（ＭＴ、表IV（ａ））に対応する全ての標的とハイブリダイズさせた。
【０１６３】
【表５】
2006520206.tif 000006
【０１６４】
【表６】
2006520206.tif 000007
【０１６５】
これらの各ハイブリダイゼーションに対して条件を：６×ＳＳＣ緩衝液中の１００nM標的、１Ｍ  ＮａＣｌ、１時間室温でハイブリダイズ、バイオチップ当たり２０μlの標的、５重試行の平均値、GSI lumonicsスキャナーによるスキャン、レーザーと５００×５００のＰＭＴ、に設定した。
【０１６６】
各野生型および突然変異のプローブの蛍光強度の中央値を走査後に解析し、各プローブの識別比（Ｒｄ）を計算するために使用した。
【０１６７】
プローブの識別比（Ｒｄ）は：
Ｒｄ＝完全なハイブリッドの蛍光強度／不完全なハイブリッドの蛍光強度
と定義する。
【０１６８】
ここで、完全なハイブリッドの蛍光強度＝注目しているヘアピンプローブと完全に相補的な標的のハイブリダイゼーションで測定される強度（例えば、標的ＣｉＳ２６ＬＷのヘアピンプローブＮｅｕ１Ｓ２６ＬＷ６とのハイブリダイゼーション、または標的ＣｉＳ２６ＬＭのヘアピンプローブＮｅｕ１Ｓ２６ＬＭ６とのハイブリダイゼーション）および、不完全なハイブリッドの蛍光強度＝ミスマッチが１つある標的のハイブリダイゼーションで測定される蛍光強度（例えば、標的ＣｉＳ２６ＬＷのヘアピンプローブＮｅｕ１Ｓ２６ＬＭ６とのハイブリダイゼーション、または標的ＣｉＳ２６ＬＭのヘアピンプローブＮｅｕ１Ｓ２６ＬＷ６とのハイブリダイゼーション）である。
【０１６９】
プローブの識別比（Ｒｄ）は次の意味を持つ：
【０１７０】
例えば、あるヘアピンプローブに対する１０のＲｄは、このヘアピンと完全に相補的な標的とのハイブリダイゼーションが、最初の標的と１塩基の差異を持つ標的とのハイブリダイゼーションに比較して１０倍大きい信号を発生することを意味する。
【０１７１】
これらのＲｄ値を、各ヘアピンプローブのループとステムのＴｍの計算値と共に表Ｖに示す。
【０１７２】
Ｄｔｍパラメーターもまた、これらのプローブのそれぞれについてＤｔｍ＝ステムのＴｍ−ループのＴｍ、として計算している。このパラメーターがプローブの識別の「相対能力」を表す。Ｄｔｍが高い（ステムのＴｍが高く、ループのＴｍが低い）ほど、高い相同性がある２つの配列を識別する能力が高い。
【０１７３】
全てのこれらの値をグラフ（図１４）に表すが、これはＤｔｍの進展と識別比Ｒｄの関係を示している。
【０１７４】
【表７】
2006520206.tif 000008
【０１７５】
ＲｄとＤｔｍの間のこの関係を、所望の解析に対して適当な構成と長さを有するプローブの設計において、ループとステムを選定するために用いることができる。例えば、全てのプローブの設計に１０のＲｄが必要であるならば、Ｄｔｍ値を９に選ぶことになる。
【０１７６】
ヒトゲノムＤＮＡ試料の突然変異解析結果の例
この実施例は、具体的には、シャルコー−マリー−ツース病の原因となる突然変異の１つである遺伝子ＰＭＰ２２のエクソン３のＷ１４０突然変異の野生型対立遺伝子の解析を目的とする。
【０１７７】
配列が表IIIに与えられている全てのヘアピンプローブがバイオチップ上に固定されている。
【０１７８】
ＰＭＰ２２遺伝子のエクソン３のゲノムＤＮＡをプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。プライマー対の１つは５’端が、蛍光性シアニン３分子でラベルされている。
【０１７９】
ＰＣＲを次のように実行した：健康な個体から得た１００ngのＤＮＡをＰＣＲキット（High fidelity expand PCR, Roche）と共に用い、メーカーのプロトコルおよび特定のＰＣＲプライマーを用いて４０サイクルを行った。ネガティブ基準（ゲノムＤＮＡを欠くＰＣＲウエル）も、ＰＣＲの実行中に含めた。
【０１８０】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル上の電気泳動によって検査し、ＰＣＲ産物の長さおよびネガティブ基準に対する汚染の欠如を確認した。増幅したＤＮＡをマイクロカラム（Quiaquick, Qiagen）で精製した後に、２６０nmのＵＶ吸収によって定量した。
【０１８１】
遺伝子ＰＭＰ２２のエクソン３のＰＣＲから得たＣｙ３ラベルＤＮＡ１．４μｇを１時間室温でヘアピンプローブのバイオチップ上でハイブリダイズさせた。
【０１８２】
ハイブリダイゼーションに続いてバイオチップをスキャンして、結果を図１５に表した。
【０１８３】
これらの結果は、ＰＣＲ産物が主に相補的なプローブ、または１塩基の差を有するプローブ（プローブＮｅｕ６Ｗ１４０ＲＭ４およびＮｅｕ６Ｗ１４０ＲＭ４）にハイブリダイズされることを示している。Ｒｄは６．６１（ＷＴ／ＭＴプローブ信号）である。
【０１８４】
この解析に与えられた遺伝子型はＷ１４０Ｒ突然変異に対する野生型ホモ接合体であって、検査した個体の「健康」表現型に対応する。
【０１８５】
引用文献
ここでの文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術であることの承認であると解してはならない。
【０１８６】
当業者にとって明らかなように、本発明の精神と展望から離れることなく、本発明の多くの修正または変形をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１Ａ】図１Ａはヘアピンプローブの実施態様を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂはヘアピンプローブの実施態様を示す。
【図２Ａ】図２Ａは固定されたヘアピンプローブの異なる立体構造を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは固定されたヘアピンプローブの異なる立体構造を示す。
【図３Ａ】図３Ａはヘアピンプローブが標的配列にハイブリダイズするときに、どのようにして信号が生成されるかを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂはヘアピンプローブが標的配列にハイブリダイズするときに、どのようにして信号が生成されるかを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ヘアピンプローブとポリメラーゼによるラベルシステムを用いた標的の検出を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヘアピンプローブとポリメラーゼによるラベルシステムを用いた標的の検出を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヘアピンプローブとポリメラーゼによるラベルシステムを用いた標的の検出を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ヘアピンプローブとポリメラーゼによるラベルシステムを用いた標的の検出を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、汎用アドレス指定システムを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、汎用アドレス指定システムを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、汎用アドレス指定システムを示す。
【図６】図６は、あるｍＲＮＡ、このｍＲＮＡの変異体、およびヘアピンプローブの標的であるこのｍＲＮＡの領域の配列を示す。
【図７】図７は、ヘアピンプローブがどのように標的および「レポーター」分子と相互作用するかを示すために用いられる核酸配列を示す。
【図８】図８は、ラベルされた標的配列とヘアピンプローブのハイブリダイゼーション後の蛍光強度の棒グラフである。
【図９】図９は、ラベルされた標的配列のヘアピンプローブとの、次に「レポーター」分子との、連続したハイブリダイゼーション後の蛍光強度の棒グラフである。
【図１０】図１０は、ラベルされた標的配列のヘアピンプローブとの、次に「レポーター」分子との連続したハイブリダイゼーション、それに続く非特異的結合の除去の後の、蛍光強度の棒グラフである。
【図１１】図１１は、いくつかのラベルされた標的とヘアピンプローブのハイブリダイゼーション後の蛍光強度の棒グラフである。
【図１２】図１２は、図１１よりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのいくつかのラベルされた標的とヘアピンプローブのハイブリダイゼーション後の蛍光強度の棒グラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ヘテロ接合性喪失および対立遺伝子不均衡の解析方法について、試料をＰＣＲ増幅する工程からバイオチップ上でのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションまでを示す。  ５’端を蛍光ラベル（Ｃｙ５）でラベルされ、マイクロサテライト配列１３０１のセンス鎖の３’端に存在するＰＣＲプライマー１３０２を、マイクロサテライト配列１３０１のアンチセンス鎖の３’端にある無ラベルのプライマー１３０３と共に用いて、健康な細胞１３０４から抽出したゲノムＤＮＡ試料中のこのマイクロサテライト配列を増幅し、ＰＣＲ産物１３０５を産生する。  ５’端を蛍光ラベル（Ｃｙ３）でラベルされ、マイクロサテライト配列１３０１のセンス鎖の３’端に存在するＰＣＲプライマー１３０７を、マイクロサテライト配列１３０１のアンチセンス鎖の３’端にある無ラベルプライマー１３０８と共に用いて、腫瘍性と推定される細胞１３０９から抽出したゲノムＤＮＡ試料中のこのマイクロサテライト配列を増幅し、ＰＣＲ産物１３１０を産生する。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ヘテロ接合性喪失および対立遺伝子不均衡の解析方法について、試料をＰＣＲ増幅する工程からバイオチップ上でのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションまでを示す。  プローブバイオチップを、図１３Ａの増幅工程１３０４と１３０９から得たＰＣＲ産物を含む混合物と接触１３１５させる。プローブバイオチップを、同一形態で共にリンカー１３１３を介して基板１３１２に固定されている２個のヘアピンプローブ１３１１および１３１４と共に示す。これら２つのプローブの標的特異的配列１３１９は、ＰＣＲ産物１３１６および１３１７に含まれるセンスＰＣＲプライマー配列１３１８と完全に相補的である。ＰＣＲ産物１３１６はＣｙ５でラベルされ、ＰＣＲ産物１３１７はＣｙ３でラベルされている。ＰＣＲ産物１３１６はＰＣＲ産物１３０５（図１３Ａ）を変性して得られ、ＰＣＲ産物１３１７はＰＣＲ産物１３１０（図１３Ａ）を変性して得られる。
【図１４】図１４は、ステムとループのＴｍ差（Ｄｔｍ）の関数としての、ヘアピンプローブの識別比（Ｒｄ）を示す。
【図１５】図１５は、ＰＭＰ２２遺伝子のエクソン３の増幅によるＰＣＲ産物のヘアピンプローブバイオチップ上でのハイブリダイゼーション後の、蛍光強度の棒グラフである。
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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