(57)【要約】糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌細胞に、Glu+表現型を復元させることに関する方法を開示する。Glu+表現型を含む細菌細胞は、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼをエンコードしているポリヌクレオチドと作動可能に結合している修飾された内生染色体調節領域を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)グルコース同化タンパク質上流(5’)に対応するプロモータ及びDNAフランキング配列から成るDNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコース同化タンパク質と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾と、
b)Glu+表現型の復元のために該DNA構築物の組み込みをさせること、及び
c)適切な条件下における形質転換された宿主細胞の培養と、
から成り、宿主細胞内の該代謝経路への炭素流量が、実質的に同じ培養条件下で培養されたPTS細菌宿主細胞内の同じ代謝経路への炭素流量と比較して、増えていることを特徴とする、糖質輸送に対して本来ホスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用することができるPTS-/Glu-細菌宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法。
【請求項２】
プロモーターが宿主細胞のプロモーターではない、請求項1の方法。
【請求項３】
プロモーターが変性内生プロモーターである請求項1の方法。
【請求項４】
グルコース同化タンパク質がグルコーストランスポーターである請求項1の方法。
【請求項５】
グルコーストランスポータが、大腸菌から得られたガラクトースパーミアーゼ又は、少なくともこれと80％以上の配列相同性を有するグルコーストランスポーターである請求項4の方法。
【請求項６】
グルコース同化タンパク質がリン酸化タンパク質である請求項1の方法。
【請求項７】
リン酸化タンパク質がグルコキナーゼである請求項6の方法。
【請求項８】
請求項5の方法であって、さらに、グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列から成る第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と操作可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項1の方法。
【請求項１０】
PTS-/Glu-宿主細胞が、ptsl、ptsH及びcrrからなる群より選択される1以上の遺伝子の欠失をさせることにより、PTS細胞より得られる、請求項1の方法。
【請求項１１】
さらに、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びホスホエノールピルビン酸シンターゼからなる群より選択される、少なくとも1の酵素をエンコードしたポリヌクレオチドを用いたPTS-/Glu+宿主細胞の形質転換をさらに含む、請求項1の方法。
【請求項１２】
請求項1の方法であって、さらに、DHAPシンターゼ、DHQシンターゼ、DHQ脱水酵素、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、EPSPシンターゼ、及びコリスミ酸シンターゼからなる群より選択される、少なくとも1の酵素をエンコードしたポリヌクレオチドを用いてPTS-/Glu+宿主細胞の形質転換をさらに含む方法。
【請求項１３】
請求項1の方法により得られる、形質転換細菌細胞。
【請求項１４】
a)プロモーターを含むグルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸に作用可能に結合している内生プロモーターと置換されるPTS-/Glu-宿主細胞内で染色体上に組み込まれるDNA構築物を用いたPTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の形質転換と、
b)適切な条件下での該形質転換された宿主細胞の培養と、
c)PTS-/Glu+表現型を有する宿主細胞を得るために、グルコース同化タンパク質を発現させること、及び
d)実質的に同じ培養条件の下でのPTS細菌細胞培養に対応する目的生成物の量と比較して、形質転換細菌宿主細胞内で増加した量の目的生成物を得ることからなり、前記目的生成物が、ピルビン酸、PEP、乳酸塩、酢酸塩、グリセロール、エタノール、コハク酸塩及びコリスミ酸塩からなる群より選択されることを特徴とする、糖質輸送に対するPTSを利用する能力を本来有しているPTS-/Glu-宿主細胞内で、目的とする生成物の生産を増加させる方法。
【請求項１５】
細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項14の方法。
【請求項１６】
グルコース同化タンパク質が、大腸菌から得られたガラクトースパーミアーゼ又は、少なくともこれと80％以上の配列相同性を有するグルコーストランスポーターである請求項14の方法。
【請求項１７】
グルコース同化タンパク質が、大腸菌から得られたグルコキナーゼ又は、少なくともこれと70％以上の配列相同性を有するグルコキナーゼである請求項14の方法。
【請求項１８】
目的生成物が、コリスミ酸である請求項14の方法。
【請求項１９】
目的生成物が、コハク酸である請求項14の方法。
【請求項２０】
目的生成物が、エタノールである請求項14の方法。
【請求項２１】
目的生成物が、グリセロールである請求項14の方法。
【請求項２２】
a)ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
b)グルコキナーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
c)第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼがこの宿主細胞内で発現され、前記発現が、対応する置換の起きていないPTS-/Glu-宿主細胞内の同じ代謝経路内の炭素流量と比較して、形質転換された宿主細胞の代謝経路内への炭素流量を増やすように、第一及び第二DNA構築物の組み込みをさせることから成る、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞の代謝経路内へ、炭素流量を増やす方法。
【請求項２３】
細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項22の方法。
【請求項２４】
代謝経路が芳香環経路である請求項22の方法。
【請求項２５】
トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードするポチヌクレオチドを用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換をさらに含む、請求項22の方法。
【請求項２６】
a) グルコーストランスポータの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域からなる第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコーストランスポーターをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾と、
b)グルコーストランスポーターをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換する、第一DNA構築物の組み込みをさせること、及び
c) PTS-/Glu-宿主細胞にGlu+表現型を復元させるグルコーストランスポーターの発現をさせること、から成る糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PST)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞にGlu+表現型を復元する方法。
【請求項２７】
細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項26の方法。
【請求項２８】
グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応する外来プロモーター及びDNAフランキング領域からなる第二DNA構築物を用いて、PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞のグルコキナーゼをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
グルコキナーゼをエンコードしている核酸の外来プロモーターを置換する第二DNA構築物の組み込みをさせること、及び
グルコキナーゼの発現をさせることをさらに含む、請求項26の方法。
【請求項２９】
細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項28の方法。
【請求項３０】
Glu+を復元した細胞が、少なくとも0.4hr-1の特定の成長速度を有する、請求項26の方法。
【請求項３１】
グルコーストランスポータがガラクトースパーミアーゼである、請求項26の方法。
【請求項３２】
請求項26の方法に従い、得られた、復元されたGlu+表現型を有する細菌系統。
【請求項３３】
請求項28の方法に従い、得られた、復元されたGlu+表現型を有する細菌系統。
【請求項３４】
a)糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有している、PTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の選択と、
b)プロモーターを含むグルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置換する、選択された細菌宿主細胞内の染色体上に組み込まれるDNA構築物を用いた、前記選択された宿主細胞の形質転換からなる、選択された宿主細胞の、内生染色体調節領域の修飾と、
c)適切な条件下における形質転換された宿主細胞の培養と、及び
d)PEP利用度が、実質的に同じ培養条件下における対応する修飾されていないPTS細菌宿主細胞のPEP利用度と比較して増えている、PTS-/Glu+表現型を有する修飾された宿主細胞を得るためのグルコース同化タンパク質の発現をさせることからなる、細菌宿主細胞内のフォスフォエノールピルビン酸(PEP)の利用度を増やす方法。
【請求項３５】
グルコース同化タンパク質が、ガラクトースパーミアーゼ及びガラクトースパーミアーゼの内生プロモーターと置換される外生プロモーターを含むDNA構築物である、請求項34の方法。
【請求項３６】
グルコース同化タンパク質が、グルコキナーゼ及びグルコキナーゼの内生プロモーターと置換される外生プロモーターを含むDNA構築物である、請求項34の方法。
【請求項３７】
選択された細菌宿主細胞内の染色体上に組み込まれる、プロモーターを含むグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置換するDNA構築物を用いた細菌宿主細胞の形質転換から成る、選択された細菌宿主細胞の内生染色体調節領域の修飾をさらに含む、請求項35の方法。
【請求項３８】
細菌宿主細胞が大腸菌細胞、バシルス細胞、及びパンテア細胞からなる群より選択される、請求項34の方法。
【請求項３９】
請求項34の方法であって、さらに、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼをエンコードする核酸を用いた、選択された宿主細胞の形質転換をさらに含む方法。
【請求項４０】
請求項34の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
【請求項４１】
a) ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)に対応する外来プロモーター及びDNAフランキング領域からなる、第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
b) グルコキナーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
c) 第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターを置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換される、第一及び第二DNA構築物の組み込みをさせること、
d)適切な条件下における形質転換された細菌宿主細胞の培養と、及び
e)実質的に同じ培養条件下における対応する修飾されていないPTS細菌宿主細胞の特定の成長速度と比較して早い成長速度を有する修飾された宿主細胞を得るために、適切な調節領域からガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせることからなる、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を本来有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞の成長速度を速める方法。
【請求項４２】
請求項41の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
【請求項４３】
細菌細胞が、パンテア細胞である、請求項41の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
【請求項４４】
細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項41の方法に従い得られた、変性宿主細胞。
【請求項４５】
トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを用いた、選択された宿主細胞の形質転換をさらに含む、請求項41の方法。
【請求項４６】
a) ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)に対応する、外生プロモーター及びDNAフランキング領域からなる、第一DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸配列と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾と、
b) グルコキナーゼの上流(5’)に対応するプロモーター及びDNAフランキング配列を含む第二DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾と、
c)ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせるための、適切条件下における形質転された大腸菌PTS-/Glu-の培養と、及び
d)実質的に同じ条件下で培養された対応する大腸菌PTS-/Glu-細胞内の目的生成物の量と比較して増量された、形質転換された大腸菌細胞内の目的生成物を得ることにおいて、該目的生成物が、エタノール、コリスミ酸及びコハク酸である、糖質輸送に対するPTSを用いる能力を生来有しているPTS-/Glu-大腸菌細胞内における、目的生成物の生産を増やす方法。
【請求項４７】
外生プロモーターが、Gl、trc、tac、及びこれらの誘導体からなる群より選択される非天然プロモーターである請求項46の方法。
【請求項４８】
請求項46の方法に従い得られた、大腸菌細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願に関するクロスリファレンス
本出願は、2002年10月4日に提出されたU.S.仮出願No.60/414,166及び、2002年10月4日に提出されたU.S.仮出願No.60/374,931に対し優先権を主張する。これらの全ては、参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、細菌宿主細胞内の遺伝工学的代謝経路に関係し、遺伝工学的に改造された宿主細胞内の目的生成物の生産に関連する、方法およびシステムを提供する。具体的には、本発明は、芳香環アミノ酸経路等の目的とする代謝経路内へのPTSフォスフォエンエノールピルビン酸(PEP)の消費を抑え、PEP及びPEP前駆体へ転化することによって、フォスフォエノールピルビン酸(PEP)を利用する能力、すなわち、グルコース輸送に関するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を用いる能力を有する宿主細胞内において、グルコース輸送を高めることに関係する。
【背景技術】
【０００３】
多くの工業的に重要な微生物は、生物反応の生成物の生産のために、グルコースを炭素源として用いる。それゆえ、コスト効率がよく、高いパーセンテージで増量する、効率的なこれら生成物の生物合成生成物は、グルコース等の、前記生成物へ転化することができる炭素源を要求する。この要求を満たすため、芳香環経路、TCA回路及びアナプレオチックオキサロ酢酸合成経路等の各種代謝経路内への炭素源の流入を増やすことは、有利である。
【０００４】
宿主細胞の糖質代謝の初期段階において、各グルコース分子は、細胞質ゾル内で、2分子のフォスフォエノールピルビン酸(PEP)になる。PEPは、細胞が合成ルートで使用する主要な代謝構築ブロックである。例えば、PEPはさらに、ピルビン酸に転化される。グルコースからピルビン酸に転化される化学反応はエムデンマイヤホフ経路と言われる。出発物質のグルコース、糖質及び最終産物のピルビン酸の間のすべての代謝中間体は、リン酸化合物である。腸内細菌科及びビブリオ科のメンバー等のエムデンマイヤホフ経路を通じて、グルコースを発酵する細菌は、Bouvet et al., (1989) International Journal of Systematic Bacteriology, 39: 61-67に記載されている。ピルビン酸は、引き続き、代謝により、乳酸、エタノール、ギ酸、酢酸及びアセチルCoA等の生成物を産出する(図1A及び1Bを参照のこと)。
【０００５】
エムデンマイヤホフ経路に加えて、多くの細菌は、フォスフォエノールピルビン酸(PEP)依存性フォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)として知られている、活性輸送システムを有する。このシステムは、グルコース等の炭素源から、リン酸化への輸送を連絡する。ここでは、リン酸基が、PEPから酵素I及び、酵素Iからタンパク質HPrへと次々に転移される。実際の転移段階は、1以上の炭素源に特異的な膜結合酵素(酵素IIといわれる)のメンバーによって触媒される。参考文献は、Postma et al., (1993) Phosphoenolpyruvate : Carbohydrate Phosphotransferase Systems in Bacteria,Microbiol. Reviews. 57: 543-594 及び Postma P. W. (1996) Phosphotransferase System for Glucose and Other Sugars. In : Neidhardt etal., Eds. ESCHERICHIA COLI AND SALMONELLATYPHIMURIUM : CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY. Vol. 1. Washington, D. C. ASM Press pp 127-141である。しかしながら、PTSは炭素源をリン酸化してPEPを代謝する事から、PTSシステムの目的物質に対する、炭素基質変換効率は減少する。解糖において、2分子のPEPは、個々分子が、分解グルコース分子を形成する。しかし、PEPの1分子が、PTSを機能させるために必要とされると、残りの1のPEP分子のみが、生物合成反応に利用可能となる。
【０００６】
中心的な代謝産物としてのPEPの役割に関して、数多くのアプローチが細胞内のPEP供給を増加させるために用いられてきた。そのいくつかを以下に列挙する：
a) pkr変異体の生産によるピルビン酸キナーゼ活性の排除。ピルビン酸キナーゼはPEPからピルビン酸への転化を触媒する(Mori et al., (1987) Agric. Biol. Chem. 51: 129-138)
b) ppc変異体の生産によるPEPカルボキシラーゼ活性の排除。PEPカルボキシラーゼはPEPからオキサロ酢酸への転化を触媒する(Miller et al., (1987) J. Ind. Microbiol. 2: 143-149)
c) PEPシンターゼをエンコードするppsの発現の増幅。PEPシンターゼはピルビン酸塩からPEPの転化を触媒する(USSN 08/307,371)及び
d) 例えば、トランスケトラーゼ遺伝子(tktA及びtktB)の過剰発現又は、トランスアルドラーゼ遺伝子(talA)の過剰発現(lida et al., (1983) J.Bacteriol. 175:5375- 5383)によるD-エリトロース-4-リン酸 (E4P)の供給の増加。トランスケトラーゼはD-フルクトース6リン酸のE4Pへの転化を触媒し、トランスアルドラーゼは、D-セドヘプツロース7リン酸+グリセルアルデヒド3リン酸のE4P+フルクトース6リン酸への転化を触媒する。
【０００７】
上に列挙したアプローチに加えて、研究者はPTSを減少させる方法、すなわち、PTS機能の排除又は修飾によるPEP依存性消費について、調査した。PEPはATPよりも2倍エネルギーを有しているので、このアプローチもまた魅力的であった。これらの研究の多くは、PTSシステムを不活性化させることに焦点をあてていた。PTSシステムの操作に関する研究の例を以下に挙げる：
a) ザイモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)由来のグルコース促進拡散タンパク質及びグルコキナーゼをコードしたglf及びglk遺伝子の導入による、pstHlcrrオペロンの欠失によるPTS不活性大腸菌細胞内でのGlu+表現型の復元(USP 5,602, 030 及び Snoep et al., (1994) J. Bact. 176: 2133-2135)、及び
b) PTS-/Glu-大腸菌系統に対して、グルコース含有培地上での培養を継続することによる選択を行い、野生型PTS-/Glu-系統よりも成長速度が速いGlu+復帰突然変異体(PTS-/Glu+)の獲得(Flores etal., (2002) Metab. Eng 4 : 124-137; Flores et al., (1996) Nature Biotechnol. 14: 620-623 及びW096/34961)
しかしながら、これらのアプローチは各種の制限を有していた。通常、異種遺伝子の使用は、新宿主の中では効果的に機能しない。加えて、グルコース促進拡散タンパク質等の膜タンパク質は通常、細胞膜内の脂質と密に関係しており、これらは種間において多様である。導入されたグルコキナーゼ等の可溶性タンパク質は、プロアーゼの分解作用を受けるであろう。さらに、ある表現型を取り戻した自然発生変異体を使用することは、予測不可能な結果を招来する。工業的生産に用いるには、完全に特徴付けられている系統が好ましい。
【０００８】
前述の方法とは対照的に、本発明は、この過程におけるPEPを消費せずに、グルコース輸送能を有する細菌系統内の代謝経路中に炭素流量を増やす。転化PEP又はPEP前駆体は、目的産物を多く生産する特定の代謝経路内へ移行する。これらの系統は、PTS不活性化を維持しながらも、炭素源としてグルコースを使用する能力を細胞に復元又は再取得させる、グルコース同化タンパク質及び、より具体的には、グルコーストランスポーター及び/又はグルコースリン酸化タンパク質と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾による、不活性PEP依存性PTSを有する細胞内で生産される。これらの細胞は、PTS-/Glu+と称される。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、本来糖質輸送に関するPTS利用能力を有する細菌宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法を提供する。この方法は、PTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の選択及び、Glu+表現型の復元のためのグルコース同化に関するタンパク質をエンコードした核酸に作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾からなる。
【００１０】
第一の側面において、本発明は、実質的に同じ条件下で培養した場合に、PTS宿主細胞内の対応する同じ代謝経路と比較して、形質転換宿主細胞の代謝経路への炭素流量が増えることを特徴とし、a)グルコース同化タンパク質の上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域からなるDNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、宿主細胞内のグルコース同化タンパク質をエンコードする核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾；b)Glu+表現型を復元するためのDNA構築物の組込み、及びc)形質転換された宿主細胞の適切な条件下の培養からなる、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有するPTS-/Glu-宿主細胞の代謝経路への炭素流量を増やす方法に関係する。本方法のある態様においては、プロモーターは非宿主細胞プロモーター、又は、修飾された内生プロモーターである。第2の態様では、グルコース同化タンパク質はグルコーストランスポーター、好ましくは、大腸菌由来ガラクトパーミアーゼ、又はこれらと少なくとも80％配列が相同であるグルコーストランスポーターである。第3の態様では、グルコース同化タンパク質は、リン酸タンパク質、好ましくは、大腸菌由来グルコキナーゼ又はこれと少なくとも80％配列が相同であるグルコキナーゼである。第4の態様では、細菌宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞及びパンテア細胞の群より選択される。第5の態様では、PTS-/Glu-宿主細胞は、ptsl、ptsH及びcrrよりなる群から選択される1以上の遺伝子が欠失されたPTS細胞から得られる。第6の態様では、PTS-/Glu-宿主細胞は、トランスアルドラーゼ、フォスフォエノールピリビン酸シンターゼ、DAHPシンターゼ、DHQシンターゼ、DHQデデハイドラターゼ、シキメイトデハイドロゲナーゼ、シキメイトキナーゼEPSPシンターゼ及びコリスメイトシンターゼからなる群より選択されるタンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドにより形質転換される。
【００１１】
第二の側面では、本発明は、第一の側面で述べた方法及び、さらに、グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域からなる第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードする核酸配列と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾を含む方法に関係する。
【００１２】
第三の側面では、本発明は、目的とするタンパク質が、ピルビン酸、PEP、乳酸塩、酢酸、グリセロール、スクシニル、エタノール及びコリスミ酸からなる群より選択され、a) DNA構築物が、グルコース同化タンパク質をエンコードしている核酸と作動可能に連結している内生プロモータと置換され、 PTS-/Glu-宿主細胞の染色体上に組み込まれることを特徴とする、プロモーターを含むDNA構築物を有するPTS-/Glu-表現型細菌宿主細胞の形質転換、b)該形質転換された宿主細胞の適切な条件下での培養 c)PTS-/Glu+表現型を得るためのグルコース同化タンパク質の発現をさせること、及びd) 実質的に同じ培養条件で培養された対応するPTS宿主細胞内で生産される目的生成物の量と比較して、増量された目的生成物の量を形質転換された宿主細胞内で得ることからなる、糖質輸送に対する、本来PTSを利用する能力を有しているPTS-/Glu-細菌宿主細胞内で目的生成物の生産を増やす方法に関係する。ある態様では、宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞及びパンテア細胞からなる群より選択される。第2の態様では、グルコース同化タンパク質は、大腸菌由来のガラクトースパーミアーゼ又はそれらと少なくとも80％配列相同性を有するグルコーストランスポーターである。第3の態様では、グルコース同化タンパク質は大腸菌由来グルコキナーゼ又は少なくともそれらと70％の配列相同性を有するグルコキナーゼである。
【００１３】
第四の側面では、本発明は、a) プロモーター及び、ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応するDNAフランキング領域からなる第一DNA構築物を有するPTS-/Glu-宿主細胞形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾、b)グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域からなる第二DNA構築物を有するPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾、c)第一DNA構築物が、ガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換され、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの両者が、宿主細胞内で発現し、両発現が、形質転換された宿主細胞内への炭素流量が、組換えが起こっていないPTS-/Glu-細菌細胞に対応する同じ代謝経路内への炭素流量と比較して、増えることを特徴とする、第一DNA及び第二DNAの組換えからなる、本来糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を有するPTS-/Glu-細菌宿主細胞の代謝経路内への炭素流量を増やす方法に関係する。ある態様では、この代謝経路は、芳香環経路である。第二の態様では、この方法は、さらにトランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ及びフォスフォエノールピルビン酸シンターゼから選択されるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを有する形質転換PTS-/Glu-宿主細胞を含む。
【００１４】
第五の側面では、本発明は、a)グルコーストランスポーターの上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域を含む第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコーストランスポーターをエンコードしている核酸と、作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾、b)グルコーストランスポーターをエンコードしている核酸の内生のプロモーターを置換するDNA構築物の組換え及び、c)PTS-/Glu-宿主細胞へGlu+表現型を復元させる、グルコーストランスポーターの発現からなる、糖質輸送に対するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有するPTS-/Glu-細菌宿主細胞へGlu+表現型を復元させる方法に関係する。好ましい態様では、この方法は、第五の側面に応じた方法に、グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するプロモーター及びDNAフランキング領域からなる第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、このPTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸に作動可能に結合している内生染色体調節領域の修飾；第二DNAグルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置換される第二DNA構築物の組換えをさせること；及びグルコキナーゼを発現させることを、さらに含む。ある態様では、Glu+表現型を復元した細胞は少なくとも約0.4hr-1の特定の成長速度を有する。他の態様では、グルコーストランスポーターは、ガラクトースパーミアーゼである。
【００１５】
第六の側面においては、本発明は、a)糖質輸送に関するフォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を有する、PTS-/Glu-表現型を有する細菌宿主細胞の選択；b) DAN構築物が、グルコース同化タンパク質をエンコードする核酸と作動可能に結合している内生プロモーターと置き換わるように宿主細胞内へ組み込まれることを特徴とする、プロモーターを含む、DNA構築物を用いた、前記細菌宿主細胞の形質転換を含む、選択された細菌宿主細胞の内生染色体調節領域の修飾；c)適切な環境下における形質転換された細菌宿主細胞の培養；及びd) PEPの利用度が、実質的に同じ培養条件で培養された非形質転換PTS宿主細胞に対応するPEP利用度と比較して、増加していることを特徴とする、PTS-/Glu+表現型を有する形質転換された宿主細胞を得るための、グルコース同化タンパク質の発現をさせること、からなる、細菌宿主細胞内のフォスフォエノールピルビン酸(PEP)利用能を増加させる方法に関係する。一の態様では、グルコース同化タンパク質は、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコースパーミアーゼの内生プロモーターと置き換わる外来プロモーターを含むDNA構築物である。他の態様では、グルコース同化タンパク質は、グルコキナーゼ及びグルコキナーゼの内生プロモーターと置き換わる外来プロモーターを含むDNA構築物である。
【００１６】
第八の側面では、a)ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応する外来プロモーター及びDNAフランキング領域からなる第一DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾、b)グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応する外来プロモーター及びDNAフランキング領域からなる第二DNA構築物を用いたPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換による、PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードしている核酸と作動可能に結合する内生染色体調節領域の修飾、c)第一DNA構築物がガラクトパーミアーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置き換わり、第二DNA構築物が、グルコキナーゼをエンコードしている核酸の内生プロモーターと置き換わる、第一及び第二DNA構築物の組込み、d)適切な環境下における形質転換宿主細胞の培養及びe)実質的に同じ培養条件で培養された対応する非形質転換PTS細菌宿主細胞の成長速度と比較して、速い特定の成長速度を有する形質転換された細菌細胞を得るために、修飾された調節領域から、ガラクトースパーミアーゼ及びグルコキナーゼの発現をさせること、からなる、糖質輸送に対する、フォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)を利用する能力を本来有している、PTS-/Glu-宿主細胞の成長速度を増加させる方法に関係する。
【００１７】
第九の側面は、本発明は、a)ガラクトースパーミアーゼの上流(5’)領域に対応する内生プロモーター及びDNAフランキング領域からなる、第一DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換によって、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のガラクトースパーミアーゼをエンコードする核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾；グルコキナーゼの上流(5’)領域に対応するb)内生プロモーター及びDNAフランキング領域からなる、第一DNA構築物を用いた大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の形質転換により、大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内のグルコキナーゼをエンコードする核酸と作動可能に結合している、内生染色体調節領域の修飾；c)ガラクトースパーミアーゼの発現及びグルコキナーゼの発現をさせるための、形質転換された大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞の適切な環境下における培養；及びd) 目的生成物がエタノール、コリスミ酸又はコハク酸であり、実質的に同じ培養条件において培養された対応する大腸菌PTS-/Glu-宿主細胞内の目的物質の量と比較して、増量された、形質転換された大腸菌内の目的生成物を得ることからなる、糖質輸送に対する、PTSを利用する能力を本来有するPTS-/Glu-大腸菌宿主細胞内の目的生成物の生産を増やす方法に関係する。
【００１８】
第十の側面では、本発明は、第一から第九の側面の方法に従って得られた形質転換細菌宿主細胞に関係する。ある態様では、該形質転換細菌宿主細胞は、大腸菌細胞、バシルス細胞又はパンテア細胞である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の実施は、違った形で示されない限り、本技術分野の範囲内である、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来の技術を使用する。そのような技術は、MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 and annual updates); GENE EXPRESSION TECHNOLOGY, (Goeddel, D. ed., 1991, METHODS IN ENZYMOLOGY Vol. 185 Academic Press, San Diego, CA); GUIDE To PROTEIN PURIFICATION (Deutshcer M. P. ed., 1989, METHODS INENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego, CA); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA);OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait, ed., 1984); PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION,(Mullis et al., eds. , 1994); MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Second Edition (A. L. Demain, et al., eds. 1999); MANUAL OF METHODS FOR GENERALBACTERIOLOGY (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N.Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Philips, eds), pp. 210-213 American Society for Microbiology, Washington, DC.; 及び BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, (Thomas D. Brock) Second Edition (1989)Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massに詳細に説明されている。
【００２０】
定義
ここに違った形で定義されない限り、ここに使ったすべての技術の、そして科学用語は、一般的に、当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., JohnWiley and Sons, New York (1994) 及び Hale and Marham, THE HARPER DICTIONARY OF BIOLoGY, Harper Perennial, New York (1991)は、本発明で用いられる数多くの用語の一般的な辞書である。
【００２１】
数の範囲は、範囲を定義している数を含む。違った形で示されない限り、塩基配列は左から右に向かって5’末端から3’末端を表す；アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端を表す。
【００２２】
ここに提供された見出しは、明細書を全体として理解し得る本発明の実施態様の様々の態様を限定するものではない。従って、すぐ下で定義された用語はこの明細書によってより完全に定義される。
【００２３】
ここで引用する参考文献、交付済み特許及び係属特許出願は、本明細書中に参照により援用される。
【００２４】
フォスフォトランスフェラーゼ輸送システム(PTS)(E.C.2.7.1.69)は、フォスフォエノールピルビン酸-依存性糖取り込みシステムを言う。ある糖類の輸送及びフォスフォエノールピルビン酸に依存したリン酸化に関与する、輸送タンパク質のシステムである。このシステムは、すべてのPTS糖質に共通であり、PEPから糖質特有膜結合酵素IIへの、及びそれらから糖質へのリン酸基の転移に触媒作用を及ぼす、2のリン酸化タンパク質、酵素I及びHPrを含む。いくつかのケースでは、酵素IIIは、HPr及び酵素IIの間に位置する。各種酵素IIと酵素IIIを区別するため、3つの上付き文字が、どの糖質が最も好まれた基質であるかを示すために使用される。例えば、酵素IIgluは、グルコースが最も好ましい基質であることを示す。しかし、他の基質も使用されることもある。
【００２５】
「Ptsl」及び「酵素I」の語は、大腸菌ptslによりエンコードされるフォスフォトランスフェラーゼEC2.7.3.9 を言う。「HPr」及び「PtsH」の語は、大腸菌ptsHによりエンコードされるリン酸輸送タンパク質を言う。「グルコース特有IIA成分」、「酵素IIglu」及び「Crr」は、大腸菌crrによりエンコードされるEC2.7.1.69を言う。PTSはPtsl、PtsH及びCrr及びこれらと機能的に同等なタンパク質からなる。
【００２６】
「PTS-/Glu-表現型」及び「PTS-/Glu-」は、対応する野生型PTS細胞と比較してPEP依存PTSが不活性であるために、炭素源としてグルコースを利用する能力が大幅に減少している、宿主細胞を言う。事実上、野生型PTS細胞よりも、より少ないPEPがグルコースの輸送に用いられる。「Glu+表現型の復元」は、PTSが不活性であるにもかかわらず、グルコースを炭素源として使用することができる宿主細胞を言う。更に、「PTS-/Glu+表現型」は、ここでは、Glu+表現型を復元したPTS-/Glu-宿主細胞を言う。
【００２７】
「増加したフォスフォエノールピルビン酸(PEP)利用度」とは、代謝又は生産経路に入る炭素を増やす、細胞内PEPの量が増えることを言う。前記PEPは、これとは別に、PTS内でのグルコースのリン酸エステル化により代謝される。
【００２８】
「増加された炭素流量」は、代謝及び生産経路への、炭素基質の利用度が高くなることをいう。前記炭素基質は、これとは別に、PTSのPEPの代謝により供給される。特定の経路への炭素流量は、ガスクロマトグラフィー及びマススペクトロコピー等の、よく知られた方法で測定することができる。生産産物を用いて測定した炭素流量は、実質的に同じ生育条件で成長させた対応するPTS細胞の炭素流量よりも少なくとも、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、又は、これらよりも大きい。
【００２９】
「特定成長速度(μ)」は、時間当たりの質量又は細胞数の増量を言う。本発明のある態様では、Glu+表現型を復元した細胞は、グルコース上で生育した場合、およそ、少なくとも0.3hr-1、少なくとも0.4hr-1、少なくとも0.5hr-1、少なくとも0.6hr-1、少なくとも0.7hr-1、少なくとも0.8hr-1の特定成長速度(μ)を有する。
【００３０】
「調節領域」及び「調節配列」の語は、ここでは互換的に用いられ、コード領域の発現をさせるように遺伝子のコード領域と作動可能に結合した核酸配列を意味する。調節配列は、作動可能に結合しているコード配列の発現又はmRNAの翻訳を阻害、抑制、又は促進することができる。調節配列の例は、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合部位、オペレーター及びサイレンサーを含む。
【００３１】
「内生染色体調節領域」及び「相同な染色体調節領域」は、宿主細胞内で自然発生し、この宿主細胞内でグルコース同化タンパク質と作動可能に結合している染色体調節領域を言う。
【００３２】
ここで用いる「プロモーター」の語は、遺伝子の下流遺伝子の転写に直接機能する調節核酸配列を言う。本発明のプロモーターは、2のコンセンサス領域を含む。第一コンセンサス領域は、転写開始の開始部位から約10ベースペア(ｂｐ)上流に中心があり、-10コンセンサス領域という(-10ボックス又はプリブナウボックスとも言われる)。第二コンセンサス領域は、中心が開始部位の約35bp上流にあり、-35コンセンサスボックス又は配列と言われる。リンカー又はスペーサー配列は、コンセンサスボックスの間に位置しており、通常、14から20bpである。
【００３３】
ここで用いる「外来プロモーター」は、自然発生プロモーター以外の、宿主細胞内の内生グルコース同化タンパク質のコード領域と作動可能に結合してるプロモーターをいい、非天然プロモーター、合成プロモーター、及び修飾された自然発生プロモーターを含むがこれらに限定されない。修飾自然発生プロモーターは、グルコース同化タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと作動可能に結合し、修飾され、その後宿主細胞の染色体上に組み込まれる、天然内生プロモーター及び、グルコース同化タンパク質の内生コード領域に作動可能に結合していない天然内生プロモーターをも含む。
【００３４】
「輸送プロモーター」、「修飾プロモーター」及び「変異プロモーター」は、少なくとも１の核酸が変性されているプロモーターを意味する。ある好ましい態様では、輸送プロモーターは、プロモーターの-35ボックスの少なくとも1の核酸の置換等の修飾から成る。
【００３５】
「制御コントロール下」及び「転写が制御された」という語は、転写の開始又は促進に寄与するエレメントと作動可能に結合することにより開始する、ポリヌクレオチド配列、通常、DNA配列の転写を意味するということは、当該技術分野で知られている。
【００３６】
「作動可能に結合する」という語は、ある要素が、機能的に関連する配置の中にあるように、並列することを言う。例えば、プロモーターが、配列の転写に向かう場合には、プロモーターはコード領域に作動可能に結合している、という。
【００３７】
「翻訳制御下」という語は、mRNAが形成された後に起こる調節過程を示すことは、本分野においてよく理解されている。
【００３８】
ここで用いる「遺伝子」という語は、ポリペプチドを生産するDNA断片を意味し、コード領域に先行または後に続く領域、及び個々のコード断片(エクソン)間の介在配列(イントロン)を含む。
【００３９】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、ここでは、互換的に用いられ、リボヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドのどちらか一方の任意の長さの、ヌクレオチド(塩基)のポリマー形成をいう。これらは、1本鎖、2本鎖、3本鎖DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、又はプリン及びピリミジン基を含むポリマー又は、他の野生型、化学的及び生化学的に修飾された、非天然又は誘導されたヌクレオチド塩基を含む。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例は：遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、DAN構築物及びプライマー、である。ポリヌクレオチドは、メチル化ポリヌクレオチド及びヌクレオチドのアナログのような修飾ポリヌクレオチド、ウラシル、他の糖類及び、フルオロリボース及びチオアート等の結合基、及び分岐ヌクレオチドを含む。
【００４０】
「構造配列」は、生成物の形成をエンコードする、一般的なDNAポリヌクレオチド配列である。構造配列は、第一生成物であるメッセンジャーRNAを有するポリペプチド鎖のアミノ酸配列をエンコードする。構造配列は、構造的又は調節的機能を有するRNAの形成をもエンコードする。
【００４１】
ここで用いる「ベクター」という語は、1以上の細胞型へ、核酸を導入することを目的としたDNA構築物である。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、カセット及び同種のものを含む。DNAカセットのあるケースにおいては、DNAはPCR又は他の適切な技術によりインビトロで生産することができる。
【００４２】
「過剰発現」という語は、宿主内で同じ遺伝子産物の複製の数が増えることをいう。
【００４３】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」という語は、ここでは、互換的に用いられる。アミノ酸をコードする3の文字は、生化学命名法(JCBN)のIUPAC-IUB合同委員会において定義されているように、本明細書にて用いる。1のポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重により、1以上のヌクレオチド配列によりコードされることは、よく知られている。ここで、タンパク質及びそれらをエンコードする遺伝子の説明に用いるために、遺伝子に対する語は、大文字を持ちいず、イタリックで表す（ただし、本文中のイタリックは、下線文字で示す。）、例えば、glkAのように。タンパク質に対する語は、例えば、GlkAのように通常、イタリックを用いず、始めの文字を大文字で表す。
【００４４】
「グルコース同化タンパク質」又は「グルコース同化と関係する酵素」は、宿主細胞がグルコースを炭素源として利用することができるようにする、酵素又はタンパク質を意味する。グルコース同化に関係する酵素及びタンパク質は、細胞膜を通過するグルコース輸送に関係する酵素又はタンパク質及びグルコースをグルコース-6-リン酸にリン酸化する酵素及びタンパク質を含む。
【００４５】
「リン酸化酵素」は、グルコースをグルコース-6-リン酸への反応を触媒する酵素を意味する。
【式１】
【００４６】
2006501851.tif 000002
この反応を触媒すると知られている酵素は、ヘキソキナーゼ(E.C.No.：2.7.1.1)及びグルコキナーゼ(E.C.No.2.7.1.2)を含む。グルコキナーゼは、大腸菌内のglkによりエンコードされる。
【００４７】
「輸送タンパク質」又は「トランスポーター」という語は、細胞膜を通過する分子の動きを触媒するタンパク質をいう。好ましい態様では、トランスポーターは、パーミアーゼとも言われる、グルコーストランスポーターである。グルコーストランスポーターは、細胞膜を通過し、細胞質内へのグルコースの活性型輸送を触媒する。グルコーストランスポーターは、他の糖の輸送も触媒する。グルコース輸送の1の例は、ガラクトース-プロトン-シンンポーター(ガラクトースパーミアーゼとして知られている)、GalPである。GalPは、大腸菌内でgalPによりエンコードされる(Henderson et al., (1990) Phil. Trans. R. Soc., London 326:391-410)。
【００４８】
「活性型輸送」は、エネルギーの消費につながる細胞内への化合物の輸送を言う。本発明に含まれる1の実施例は、グルコーストランスポーターによる膜タンパク質の使用である。
【００４９】
ここで用いる、「選択マーカー」という語は、導入されたベクター又は核酸を含む宿主を容易に選択するために、宿主細胞内で発現させる遺伝子をいう。各選択マーカーの実施例は、抗菌薬(例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、アクチノミオシン、クロラムフェニコール、スペクチニマイシン及びテトラサイクリン)を含むがこれらに限定されない。例えば「CmR」及び「CAT」の表示は、同じ遺伝子をいい、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子として知られているものを指す。
【００５０】
「フランキング領域」は、議論されている配列の上流又は下流のいずれか一方の任意の配列を言う(例えば、遺伝子A、B及びCについて、；遺伝子BはA及びCの遺伝子配列の側面に配置されている)。いくつかの実施態様では、フランキング配列は、DNA断片のシングルサイト(3’又は5’のどちらか)のみに現れるが、好ましい実施態様では、議論されている配列の各側が側面に配置されている。
【００５１】
野生型という語は、天然又は自然に発生した宿主細胞又は宿主細胞配列をいう。
【００５２】
ここで用いる「内生」という語は、宿主細胞内に、自然発生する核酸によりエンコードされるタンパク質又は核酸をいう。「外来」という語は、異なる宿主細胞系統由来のタンパク質又は核酸をいう。外来配列は、宿主細胞の配列でないもの、及び天然の配列を合成修飾したものである。
【００５３】
「相同性」という語は、同じ由来をもつ、系統又は種のことを言う。「相同配列」とは、同じ遺伝的由来及び種内に見られる配列を言う。例えば、もし宿主系統がある特定の遺伝子を欠いている場合であって、しかし他の同じ遺伝子が、同じ種の他の系統に見られるとき、この遺伝子は相同配列であると考えられる。
【００５４】
「異種の」という語は、異なる有機体、系統、種及びさらに特に、宿主細胞内に非自然発生した核酸又はアミノ酸配列をいう。
【００５５】
「形質転換」、「形質導入」及び「トランスフェクション(形質移転)」は、細胞内への新しい表現型の結合または導入を言う。導入されたポリヌクレオチドは、染色体DNAに組み込まれ、又は染色体外の複製配列に導入される。
【００５６】
「単離」又は「精製」という語は、天然に結合している少なくとも１の成分を取り除いた、酵素、タンパク質、ペプチド又は共同因子をいう。
【００５７】
「目的生成物」の語は、生物転換された炭素基質の中の得ようとする生成物をいう。目的生成物の例は、コハク酸、リジン、グリセロール、メチオニン、トレオニン、イソロイシン、ピルビン酸、エタノール、ギ酸エステル、酢酸、DAHP、DHQ、DHS、SHK、S3P、EPSP、コリスマート、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびアスコルビン酸中間体である。
【００５８】
ここで用いる「炭素源」の語は、6炭糖等の本来微生物が用いる適切な炭素基質を含み、D又はL型のどちらかにおける、すべてのグルコース、グロース、ラクトース、ソルボース、フルクトース、イドース、ガラクトース及びマンノース又は、グルコースとフルクトース、および／または6炭糖酸などの6炭糖の組み合わせをいう。好ましい炭素基質は、グルコース及びフルクトースを含む。
【００５９】
「非機能的」、「不活性化の」及び「不活性化」の語は、遺伝子又はプロモーターを参照するときは、遺伝子又はタンパク質の既知の正常な機能又は活性が、排除、または著しく減退していることを言う。遺伝子又はタンパク質の機能を停止する、不活性化は、核酸配列の、欠失、変異、置換、切断、挿入等の方法を含む。
【００６０】
「宿主細胞」は、異種ポリヌクレオチドの導入が可能である細胞を言う。ある態様では、宿主細胞は、グラム陰性又はグラム陽性細菌である。
【００６１】
ここで用いる「細菌」の語は、原核生物、すなわち、結合膜と細胞内器官を欠く微生物の任意のグループを言う。全ての細菌は、細胞内外への物質の流れを調節する、脂質膜で覆われている。剛性細胞壁は完全にバクテリア属を取り囲み、膜の外に位置する。多くの異なる細菌の種類が存在し、これらは、バチルス、放線菌、シュードモナス及び腸内細菌科のファミリー系統を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
ここで用いる「腸内細菌科」のファミリーは、本来、グラム陰性であり、条件的嫌気性の特徴を有する細菌系統をいう。腸内細菌科のファミリーに含まれるものは、エルウィニア、エンテロバクター、グルコノバクター、クレブシエラ、エシェリキア、アセトバクター、コリネバクテリア(Coyrnebacteria)、およびパンテアである。
【００６３】
本発明に関係する「変性された細菌宿主」又は「修飾された細菌宿主」は、PTS-/Glu+表現型を有するように、遺伝的に改造された細胞である。
【００６４】
「非変性細菌宿主細胞」は、PTSをグルコースの輸送及びリン酸化に使う細菌宿主細胞又はPTS-/Glu-細胞を言う。
【００６５】
ここで用いる「染色体への組み込み」は、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞の染色体内へ組み込まれる過程をいう。この過程は、好ましくは、相同組換えにより起こる。相同組換えは、宿主細胞の染色体の相同領域と並ぶ、導入されたポリヌクレオチドの相同配列及び染色体の相同領域間の配列が、二十交叉中に導入されたポリヌクレオチド配列により置換される、DNA断片の交換である。
【００６６】
「標的部位」の語は、DNA断片の組み込みが起こる宿主細胞の染色体内の、あらかじめ定められた遺伝子の位置である。
【００６７】
ここで用いる、宿主細胞により生産される、「修飾された」タンパク質又は酵素活性レベルは、培養中に生産されるタンパク質及び酵素活性のレベルを、高めたり、低めたり、望むように、制御することをいう。
【００６８】
ここで用いる、核酸又はポリヌクレオチドを参照していう「修飾された」の語は、核酸の全部又は一部の、変異、置換、挿入、欠失等により又は、転写制御領域と作動可能に結合することにより、野生型の核酸と比較していくつかの方法で変性された核酸をいう。ここで用いる、核酸を参照する「変異体」の語は、核酸が部分的又は全体的に不活性になるような、核酸ないの任意の変異をいう。変異の例は、点(突然)変異、フレームシフト変異、遺伝子の一部あるいは全部の欠失を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
他の配列に対して、「配列相同性」の所定の百分率(例えば、80％、85％、90％、95％、96％、97％又は99％)を有するポリヌクレオチド及びポリペプチドは、並置したときに、2の配列の比較において、アミノ酸又は塩基の百分率が同じであることを意味する。この整列及び相同性の百分率又は配列の相同性は、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausub el et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7. 7. 18に開示されている、本技術分野で既知のソフトウェアーを用いて測定することができる。好ましい、プログラムは、GCG Pileup program、FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448) 及び BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol.Inf., Natl Library Med. (NCBI NLM), NIH, Bethesda MD and Altschul et al., (1997) NAR 25: 3389-3402)を含む。他の好ましい配列プログラムは、ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania)で、以下の規定値を用いるのが好ましい：ミスマッチー=2；オープンギャップ=0；エクステントギャップ=2。用いることができる他の配列ソフトウェアプログラムは、TFastA Data Searching Program available in the Sequence Analysis Software Package Version 6.0 (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison,WI)である。本発明により包含される配列は、ストリンジェンシー条件下で例示された配列とハイブリダイズする能力により定義されることも、本技術分野で認識されている。
【００７０】
核酸の1本鎖形成は、温度及び溶液中のイオン強度の適切な条件下で他の核酸に対してアニールすることができる場合、核酸は、他の核酸に「ハイブリダイズ」される。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、よく知られており、上記のSambrook (1989)、 (特に、chapters 9 及び 11参照のこと)に説明されている。低いストリンジェンシーハイブリダイズ条件は、55℃でのTmに相当する(例えば、5X SSC、0.1% SDS、0.25%ミルク及び ホルムアミド非添加、又は 5X SSC、0.5% SDS 及び 30%ホルムアミド)。適度なストリンジェンシー条件は、6X SSC、0.1% SDS、0.05%ミルク、(ホルムアミドは、添加してもよく、添加しなくてもよい)に相当する。ストリンジェンシー条件は、例えば、65℃のTm又は0. 1X SSC, 0.1% SDSに相当する。
【００７１】
糖の酸誘導体及び有機酸のような他の成分は、溶液ならば、溶液内に、または、固体ならば、調製された固体内外に、各種のイオン化状態で存在することは、本技術分野でよく知られている。例えば、グルコン酸、酢酸等の語の使用は、それらの分子を意味するほか、それらの有機酸のすべてのイオン化状態をも含めることを意図する。従って、例えば、「グルコン酸」及び「グルコネート」は同じ有機酸の部分をいい、具体的に特定のイオン状態又は化学構造を言うものではない。
【００７２】
ここで用いる「培養」の語は、反応管内での目的生成物に対する炭素基質の発酵生物転換を言う。生物転換は、炭素基質を目的生成物に転換するための炭素基質と微生物との接触を言う。
【００７３】
ここで用いる「から成る」及びその同義語は、包括的意味に用いられる、すなわち、「含む」及びその同義語と同じである。
【００７４】
「一の」、「この」の語は、違った形でとくに定義しない限り、複数形も含まれる。
【００７５】
「炭素源から、目的とする生成物が対応する非変性宿主細胞における目的生成物と比較して高められている目的生成物を生産させる」とは、目的物質を得るためにPTS-/Glu+宿主細胞と基質、例えば、炭素源を接触させることを意味する。
【００７６】
好ましい実施態様
本発明は、糖質輸送に対するPTSを利用する能力を本来有する宿主細胞の目的代謝経路に炭素流量を増やす方法に関係する。前記方法は、有効なPTS-表現型を有する宿主細胞の選択、グルコース同化に関するポリペプチドをエンコードする染色体核酸と作動可能に結合している、少なくとも1の染色体調節領域の変性、及び、結果的にGlu+表現型を復元すること、及びそれゆえ、目的代謝経路内への炭素流量が増えることを含んでいる。
【００７７】
A.PTS宿主細胞
PTSの一般的な概説は、(Postma et al.,1993, Microbiol. Rev. 57:543-594; Romano et al., 1979, J.Bacteriol. 139: 93-97 and Saier et al. 1990, In: BACTERIAL ENERGETICS pp. 273-299, T. A.Krulwich, Ed. Academic Press, NY)である。本発明に有用な、宿主細胞又は系統は、糖質輸送に対するPTSシステムを用いる能力を有する任意の有機体を含む。これは、エシェリキア、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、バチルス、シュードモナス、放線菌、パンテア、またはブドウ球菌の類に属している原核生物を含む。表1に適切な有機体の一覧を挙げる。これらの有機体中のPTSの不活性化は、代替的な代謝経路に対する細胞内の、炭素流及びPRP(及びPEP前駆体)の利用度を、潜在的に増やし、引き続き、それらの細胞から、目的化合物(例えば、芳香族化合物)の生成を増やす。
【表１】
2006501851.tif 000003
【００７８】
好ましい宿主系統は、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、パンテア属、およびバチルス属から選択される系統を含む。パンテア属は、それらの技術分野で知られている全てのメンバーを含み、P.シトレア(P.citrea)、P.アナナティス(P.ananatis)、P.ステワリティ(P.stewartii)、P.アグロメランス(P.agglomerans)、P.パンカタ(P.punctata)、およびP.テレア(P.terrea)も含まれるが、これらに限定されない。有用なバシルス属は、B. スブチルス(B. subtilis)、B. リケニフォルミス(B. licheniformis)、B. レンタス(B. lentus)、B. ブレビス(B. brevis)、B. ステアルセルモフィラス (B. stearothermophilus)、B. アルカロフィリス(B. alkalophilus)、B. アミロリキファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B. コアグルランス(B. coaglulans)、B. シキュランス(B. ciculans)、B. ラウタス(B. lautus)、およびB. スリンギエンシス(B. thuringiensis)を含む。
【００７９】
B.PTS-/Glu+宿主細胞の選択
PTS-細胞の選択は、本技術分野で知られている技術を用いて行うことができる。不活性化は、PEPリン酸化を測定不可能なレベルまで低める(Gachelin, G. (1969)による Biochem.Biophys. Acta. 34: 382-387; Romero, et al., (1979) J. Bact. 139: 93-97; 又は Bouvet and Grimont., (1987)Ann. Inst. PasteurlMicrobiol. 138: 3-13に記載の方法を用いた、2-デオキシ-D-グルコースのPEP-依存性リン酸化の測定による)。PEPリン酸化の測定もまた、PTS-発現のレベルを測定するのに有用である。
【００８０】
PTS-/Glu-宿主細胞は、PTSを含む酵素の一部又はすべてをエンコードした少なくとも1の遺伝子の不活性化により、PTS野生型宿主細胞から選択される。例として、ある態様では、PTSは、PTSのEl、HPr、及びllAGluを、それぞれエンコードしているptsl、ptsH、及びcrrからなるグループから選択される、少なくとも1の遺伝子の欠失により不活性化される(Postma, et al (1993) Microbiol. Rev. 57: 543-594)。他の態様では、これらの遺伝子の少なくとも2つが、不活性化される。ptsl、ptsH、及びcrrの塩基配列は、決定されている(Saffen et al., (1987) J.Biol. Chem. 262: 16241-16253; Fox et al., (1984) Biochem. Soc. Trans. 12: 155-157; Weigel et al., (1982) J.Biol. Chem. 257: 14461-14469 及びDeReuse et al., (1988) J.Bacteriol. 176: 3827-3837)。他の実施態様では、欠失によるptsl、ptsH、及びcrr、3の遺伝子の不活性化は、PEPのリン酸化を検出不可能なレベルまで低める。
【００８１】
一般的に、PTSの不活性化に関して本発明で用いている方法論は、以下のようである。大腸菌内のptsl、ptsH、及びcrrは、オペロン内で互いにリンクしていることは、知られている。大腸菌の系統 JM101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-119) 及び PB103 (Mascarenhas (1987) PCTWO/87/01130) 内のptsHlcrrオペロンは、EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS, pp 110-112, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. に記載のSilhavy, et al. (1984) により提唱された、遺伝子導入方法を用いた欠失により、不活性化することができる。P1virファージは形質転換を実施するために用いられ、TP2811系統(Levy et al., (1990) Gene 86: 27-33) は、ptsHlcrr欠失のドナーとして用いられた。この過程は2の段階で行われた。第一に、ファージの無細胞の懸濁液は、系統TP2811の上のバクテリオファージP1virを成長させることによって準備された。TP2811系統内では、大部分のptsHlcrrオペロンが欠失され、同じDNA領域にカナマイシン遺伝子が挿入された。得られたP1vir溶解産物は、ptsHlcrr欠失とカナマイシン抵抗性標識を同時に変換することができた。第二にこれらのファージは、レシピエント系統に感染させられた、JM101又はPB103及び形質導入株は、カナマイシン含有マックコンキーグルコースプレート上の感染細胞の平板培養により、選択された。37℃、16時間の培養の後、プレート上に白いコロニーが出現した。受容株(JM101とPB103)はカナマイシンに対して感受性があり、マックコンキーグルコースプレート上に赤のコロニーを結成する。マックコンキーグルコースプレートは、pHに依存して、白から深紅に変わることができる指示薬色素を含んでいる。もし、細胞がグルコースを早い速度で輸送できるなら、通常それらは有機酸を分泌し、赤いコロニーを形成する。もし、グルコース輸送系が減退し、又は存在しないならば、細胞は有機酸を生産することができず、コロニーは白になる。このことにより、宿主細胞がグルコース+またはグルコース表現型を表しているかどうかを確かめることができる。
【００８２】
カナマイシン耐性コロニーを生じる形質転換体のコロニーは白かった、これは、グルコースを同化する細胞の能力が影響を受けたことを示す、このことはptsHlcrrオペロン欠失の移入によると考えられる。これを確認するために、仮形質転換体は、選択され、グルコースを唯一の炭素源として含んでいる最少培地の中に接種された。37℃、12時間の育成の後、この形質転換体は、検出可能な細胞成長を示さないのに対し、PTS親系統のJM101及びPB103は、よく成長するであろうことが、予測される。参考文献は、WO96/34961である。観察されたこれらの結果に基づき、JM101のPTS-誘導体はPB11と称され、PB103のPTS-誘導体はNF6と称された。
【００８３】
PTSシステムの不存在に関する他の試験は、PTS-系統は、PTS系統は抗生物質のホスホマイシンに抵抗力があるという事実に基づいてなされている(Cordaro et al., (1976) J. Bacteriol128 : 785-793)。
【００８４】
上記の方法が、不活性化したPTS(PTS-/Glu-)を提供する好まれた方法である一方で、他の方法もまた、用いることができる。あるさらなる非限定方法は、特定分子の存する中で起こる、遺伝子の発現をさせるような、発現されたタンパク質をエンコードしている、遺伝子と、作動可能に結合しているリプレッサー結合領域の、挿入又は修飾を含む。例えば、lacオペレーターは、Lacリプレッサーによって認識されるDNA配列である。もし、このオペレーターがプロモーターと関係して、正しい位置にあるなら、そして、もし、リプレッサーがオペレーターと結合するならば、それはRNAポリメラーゼの結合を妨げて、遺伝子転写を妨げるであろう。この阻害はインデューサーIPTG(イソプロピルp-Dチオガラクトシド)の付加によって取り除くことができる。発現及び/又は誘発のレベルは、プロモーターの強度、オペレーターの位置及び配列だけでなく、リプレッサー及びインデューサーの量にも依存する (Muller J. et al., (1996) J.Mol. Biol. 257: 21-29)。Lacオペレーターは、雑種trcプロモーター及びlacプロモーターの各種変異体の中の、プロモーターの数を調節するために用いられる。
【００８５】
PTS-/Glu-表現型に影響を及ぼす、他の非限定的な方法は、所定の条件下における、構造遺伝子配列の発現に影響するプロモーターの結合を含む。例えば、TOLプラスミド由来Pmプロモーターは、遺伝子発現に用いることができる。このシステムにおいて、培地にベンゾエイト又はトルエンが付加されたときに、遺伝子発現が達成される((Mermod et al., (1986) J.Bact.1 67 : 447454)。PTS表現型に影響するさらなる非限定的方法は、Carrier and Keasling (1997) Biotechnol. Prog. 13: 699-708による記載のような、mRNA安定性の変更である。
【００８６】
しかしながら、PTS不活性宿主細胞内の目的とする経路への炭素流量を増やす又は、目的経路内へ炭素流量を差し向けるためには、グルコース輸送とリン酸エステル化は規制解除されるか、拡大されなければならない。
【００８７】
C.グルコース表現型の復元
理論により限定することは意図してはいないが、選択的グルコース同化経路の修飾は、PTSの活性型輸送の能力のなさを補うと考えられてきた、それゆえに、この修飾により、宿主細胞は、他の目的のためにグルコースの輸送中に違った形で代謝されるPEPを用いることができるようになる。
【００８８】
一旦、PTS-/Glu-宿主細胞が得られると、グルコース同化に関係するポリペプチドをエンコードしている染色体上の核酸と作動可能に結合している、相同染色体調節領域は、グルコース+表現型を復元するように修飾される、このことより、PTS-/Glu+宿主細胞を得ることができる。グルコース同化に関係するポリペプチドの発現と作動可能に結合している調節領域は、オペレーター、インヒビター又は、リプレッサーである。
【００８９】
ある好ましい態様においては、プロモーターを含む、調節領域を含むDNAカセットは、PTS-/Glu-宿主細胞内へ導入され、グルコース同化と関係するポリペプチドをエンコードしている染色体上の核酸と作動可能に結合している相同染色体調節領域は、グルコース+表現型を復元するように修飾される。
【００９０】
D.調節領域を含むDNA組込みカセットの構築
PTS-/Glu-宿主内の内生染色体調節領域修飾に有用な、本発明に応じた、典型的なDNAセット又は構築物は、プロモーターのような調節配列を含む。他の態様では、DNAカセットはさらに、自律増殖またはリコンビナーゼ認識部位などの染色体上への組込みを成す選択マーカー及びその配列を含む。別の態様においては、DNAカセットはさらにリコンビナーゼ認識部位の上流(5’)及び下流(3’)に位置する、フランキング配列を含む。
【００９１】
プロモーター
ある態様では、DNAカセットを含む調節領域はプロモーターを含む。さらなる態様では、このプロモーターは外来のプロモーターである。他の態様では、この外来プロモーターは、非天然プロモーター又はその誘導体である。さらなる態様では、このプロモーターは、本来グルコース同化タンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドと作動可能に結合していない天然プロモーターである。いくつかの態様において、天然プロモーターを変性して、宿主細胞内へ再導入される、外来プロモーターは、本来グルコース同化タンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドと操作可能に結合している、修飾された自然発生プロモーターである。例えば、天然プロモーターが-35領域、-10領域又は結合領域に修飾を受けている、又は天然プロモーターがリプレッサー結合領域の修飾を含んでいる場合である。他の態様では、天然プロモーターは、ガラクトースシンポーター等のグルコーストランスポーターをエンコードするポリヌクレオチドと、より具体的にはgalPと結合していないものである。さらに他の態様では、天然プロモーターは、グルコキナーゼ等のリン酸化タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、より具体的にはglkと、結合していないものである。調節領域及び、特に発明に応じた有益なDNAカセット内に含まれるプロモーターは、約20から200bp、約20から150bp及び約20から100bpの配列を含む。
【００９２】
好ましくは、このプロモーターは、自然発内生野生型プロモーターよりも強いことから、グルコース同化タンパク質の発現は増加される。プロモーターの相対的強度を検出する各種方法は当該技術分野で知られている。プロモーターの強度は、DNAの特定断片へのRNAポリメラーセの結合動態を測定する、インビトロでの方法を用いて測定することができ、これは、転写抑制の測定もすることができる(Hawley D. K et al., Chapter 3: in: PROMOTERS: STRUCTURE AND FUNCTION. R.L/Rodriguez and M. J.Chamberlin eds. Praeger Scientific. New York)。インビボの方法も、プロモーター強度の定量に用いられる。例えば、プロモーターをレポーター遺伝子と融合することにより、RNA合成の効率が測定される。Deuschle et al., (1986)(EM80 J. 5: 2987-2994.) は、3の異なるプロモーター遺伝子を用いて、14の大腸菌のプロモーターの強度を測定した。これらのプロモーターは、以下のものが含まれる、trc, tacl, D/E20, H207, N25, G25, J5,A1, A2, A3, L, Lac,LacUV5, Con,ss-lactamase(bla), T5初期PL, 及び H/McC。これらのプロモーターまたはその誘導体のそれぞれは本発明に従って外来プロモーターとして使用される。
【００９３】
加えて、本来グルコース同化タンパク質をエンコードしているポリヌクレオチドと作動可能に結合していない、修飾された自然発生プロモーター及び天然プロモーターも、本発明に従い使用される。制限することを意図しないけれども、ある態様においては、特定遺伝子の配列決定が行われ、想定されるプロモーター配列は、コンピューター化された検索アルゴリズムを用いて決定される。例えば、ある遺伝子領域が配列決定されると、プロモーター予測ソフトウェアーに関するニューラルネットワーク(Neural Network for Promoter Prediction softwa；NNPP)を用いて、想定されるプロモーターの配列が解析される。NNPPは、1がTATAボックスを認識し、1が、転写開始部位をまたいでいる「イニシエーター」といわれるものを認識する、主として2の特徴的な層からなる、遅延型ニューラルネットワーク時間である。両方の機能層は1つの出力ユニットに統合される。推定される配列は、その後、大腸菌の中の予備特性、及び/又は、大腸菌内の直接的な特徴付けに適当なカセットの中にクローン技術で生産される。相同プロモータ配列の同定は、相同分析によって、例えば、BLASTを使って識別することができる。想定されるプロモーター配列は、その後、大腸菌内の、適切な、あらかじめ特徴付けられたカセット内で、クローンされる。
【００９４】
数多くのプロモーター及びその誘導体が用いられるが、好ましいプロモーターは、trcプロモーター及びそれらの誘導体を含む(Amann et al., (1983) Gene 25: 167-178)。このtrcプロモーターは図2に示されている。この図において、-35ボックスはTTGACA及び、-10ボックスは、TATAATである。他の好ましい態様では、プロモーターは、tacプロモーターである。このtacプロモーター及びtrcプロモーターの核酸配列は、リンカー領域を除いて同じである。このtacプロモーターのリンカー領域は、1bp異なる (Russell and Bennett (1982) Gene 20: 231-243)。
【００９５】
他の好ましいプロモーターは、グルコースイソメラーゼ(GI)プロモーターである(キシロースイソメラーゼプロモーターとしても知られている)。参考文献は、Amore et al. (1989)Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 351-357である。GIプロモーターの短断片の配列(-10ボックスの+50から-7)は、SEQ ID NO.5に示される
5’ CGAGCCGTCACGCCCTTGACAATGCCACATCCTGAGCAAATAAT 3’ 
ここで、-35ボックスはTTGACAで表され、-10ボックスは、AATAATで表される。
【００９６】
誘導体プロモーターは、-35ボックス、リンカー領域又は-10ボックス内の塩基に対応する位置の少なくとも1の塩基の修飾からなる。好ましい態様では、これらの誘導体の促進因子は35ボックスの中の位置と一致している位置において変更される。特に好ましいプロモーター誘導体は、-35ボックス内のTTGACA及びTTTCAに対応する変更を含む。いくつかのTTGACA修飾は、TTGAAA、TTCAC及びCTGACAを含む。ある特定の修飾は、-35位置に対応する位置の修飾である。特に好ましいプロモーター誘導体も、TATAAT、TAAGAT及びTATGTTに対応する-10ボックスの修飾を含む。リンカー領域もまた修飾される(Burr et al., (2000)NAR 28: 1864-1870)修飾されているか、いないかにかかわらず、好ましいリンカー領域は、14から20bpの長さで、好ましくは、16bp、17bp、18bp及び19bpである。プロモーターの修飾に用いる方法は、本発明の技術分野においてよく知られているが、これらの方法に制限されるわけではない。ある典型的な方法は、Quikchange Kit (Stratagene)の使用を含む；引用文献はWO98/07846；Russell and Bennett (1982) Gene 231-243 and Sommer et al. (2000)Microbiol. 146: 2643-2653である。
【００９７】
さらに好ましいプロモーター誘導体は、trc誘導体プロモーターである。このtrc誘導体プロモーターは、-35コンセンサスボックス、-10コンセンサスボックス及びリンカー領域内の少なくとも1の修飾を含む。この修飾は、挿入、置換又は欠失である。好ましい態様においては、trc誘導体プロモーターは、少なくとも1の-35ボックス内の修飾を有する。例えば、大腸菌において、-30位のコドンは、アデニン(A)であるから、チミン(T)、グアニン(G)、シトシン(C)に置換される；-31位のコドンは、Cであるから、A、T及びGに置換される；-32位のコドンがAであるから、T、G及びCと置換される；-33位のコドンがGであるから、C、T及びAと置換される；-34位のコドンがTであるから、A、C及びGと置換される；-35位のコドンがTであるからA、G及びCと置換される。ある具体的な好ましいtrc誘導体プロモーターは、-35位のコドンの修飾を含み、最も好ましい修飾は、TがCに置換されている。
【００９８】
他の好ましいtrc誘導体プロモーターは、-10ボックス内の修飾を含む。例えば、-7の塩基が、Tであるから、それは、C、G、及びAから成る群より選択される塩基と置換される；-8の塩基が、Aであるから、それは、C、G、及びTから成る群より選択される塩基と置換される；-9の塩基が、Gであるから、それは、C、T、及びAから成る群より選択される塩基と置換される；-10の塩基が、Aであるから、それは、C、G、及びTから成る群より選択される塩基と置換される；-11の塩基が、Aであるから、それは、T、G、及びCから成る群より選択される塩基と置換される；-12の塩基が、Tであるから、それは、A、C、及びGから成る群より選択される塩基と置換される。
【００９９】
選択マーカー及びリコンビナーゼ認識部位
発明に含まれるDNAカセットは、選択マーカーを含むであろうし、大腸菌内の遺伝子の挿入を検出するために、数多くの遺伝子を使うことができる。これらの遺伝子のいくつかは、大腸菌に、選択的表現型を与える。このケースにおいて、活性化遺伝子の表現型を有するコロニーだけが成長するように、培地条件を調整する。他の遺伝子は、選択される表現型を大腸菌に与える。選択可能な表現型は、遺伝子の発現のレベルについての情報を提供することがある。任意の好ましいマーカーを使用することができるが、有用な抗生物質耐性(AnbR)マーカーは、その性質に基づいて、CmR、KmR 及びGmRを含むが、これらに限定されるわけではない。選択マーカーの好ましい非限定的な例は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子である。
【０１００】
好ましい態様において、宿主細胞の染色体内の標的部位へ組み込むためのプロモーターを含んでいるDNAカセットは、リコンビナーゼ認識部位の両側面に配置された選択マーカーを含む。リコンビナーゼ認識部位は、本発明の技術分野においてよく知られており、それらの触媒作用に基づき、2のファミリーに区別される。参考文献は、Huang et al., (1991) NAR. 19: 443; Datsenko and Warner (2000) Proc.Natl. Acad.Sci 97 : 6640-6645 and Nunes-Duby, D, et al, (1998)NAR 26: 391-406である。
【０１０１】
よく知られた組換え技術は、Flp酵素及び2の非対称の34bpFRT最小組換え部位を含む、サッカロマイセスFlp/FRT組換えシステムである(Zhu et al., (1995) J.Biol. Chem 270 : 11646-11653)。FRT部位は、8 bpのコア非対称の配列を取り囲む、交叉が起こるところで、逆方向に不完全な繰り返しを有している2の13bpの配列からなる(Huffman et al., (1999) J. Mol.Biol. 286: 1-13)。
【０１０２】
ある好ましい、組換えシステムは、Cre酵素及び2の非対称34bpのloxP組換え部位を含む、バクテリオファージP1のCre/loxP部位特異組換えシステムである (Sternberg and Hamilton (1981) J. Mol. Biol. 150: 467-486); Palmeros, B, et al (2000) Gene 247: 255-264; Hoess et al. (1986)NAR 14: 2287-2300; Sauer B. (1994) Curr.Opinions in Biotechnol. 5: 521-527)。LoxP部位は、8 bpコア非対称の配列を取り囲む、交叉が起こるところで、逆方向に不完全な繰り返しを有する2の13bpの配列からなる。2つの並列のloxPサイト結果の間に起こるCre依存性分子内の組み換えにより、それぞれが1のloxP部位を含む、2の組換え生成物を生産する、環状分子として介在している任意のDNA配列は、切除される (Kilby et al., (1993) Trends Genet. 9: 414-421)。
【０１０３】
相同フランキング領域
本発明によるDNAカセットの組み込みは、グルコース同化タンパク質をエンコードする遺伝子の上流(5’)領域に対して相同な核酸配列を含んでいる。これらの相同配列は、このましくは、第一リコンビナーゼ認識部位(5’に向かって)及びプロモーター(3’に向かって)の側面に配置している。グルコース同化タンパク質をエンコードしている遺伝子の上流(5’)領域に相同な、核酸配列は、a)修飾を目的とした内生調節領域の5’配列及びb)修飾を目的とした内生調節領域の3’配列由来の配列を含んでいる。3’配列は、グルコース同化タンパク質コード配列の一部を含んでいる。相同フランキング配列は、約2から300bp、約5から200bp、約5から150bp、約5から100bp、約5から50bpの塩基を含む。
【０１０４】
遺伝子及びグルコース同化タンパク質の単離
細菌細胞から目的遺伝子を得る方法は、一般的であり、該技術分野でよく知られている。例えば、ある遺伝子の配列が知られている場合、好適な遺伝子ライブラリーが作られ、スクリーニングされる。一旦ある配列が単離されると、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(USP 4,683,202)のような標準的な技術を用いて、所定のDNA量を得るために、DNAが増幅される。参考文献は、上記のSambrook et al.である。グルコース同化タンパク質をエンコードしている、任意の遺伝子の上記で定義されている上流配列は、本発明の方法の使用に有用である。
【０１０５】
ある態様では、グルコース同化タンパク質をエンコードしている遺伝子は、グルコーストランスポーターである。トランスポーターについては、Saier et al., (1998) ADVANCES. IN MICROBIAL PHYSIOLOGY, Poole, R. K. Ed. pp 81-136 Academic press, San Diego, CAに開示されている。通常、ここで定義するグルコーストランスポーターは、トランスポートクラス2(GALP)及び/又はトランスポートクラス4(PTS)の、輸送カウンセル(Transport Council(TC))区分と一致する。
【０１０６】
好ましいグルコーストランスポーターは、大腸菌内でgalPによりエンコードされているGalPである。大腸菌以外の由来から単離された、GalPをエンコードしている遺伝子もまた、本発明の使用に適していることは、本技術分野で認識されている。グルコーストランスポーターとして機能し、少なくとも、20％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％及び98％大腸菌由来のGalPとアミノ酸配列が一致している、タンパク質は、本発明に従い使用するのに適切である。
【０１０７】
加えて、既知の利用可能な、コンピュータープログラムはグルコース同化タンパク質、特にグルコーストランスポーターに一致する配列を検出するために用いることができる。好ましいプログラムは、GCG Pileup program, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448) 及び BLAST (BLAST Manual, Altschul etal., Natl. Cent. Biotechnol.Inf.,Natf Library Med. (NCBI NLM), NIH, Bethesda MD andAltschul et al., (1997) NAR 25: 3389-3402)を含む。
【０１０８】
BLASTの使用により、タンパク質配列がGalPに似ている、少なくとも3のパーミアーゼが発見された。例えば、araEは64％の相同性を有し；xylEは34％相同性を有し、及びyaaUは23％の相同性を有する。これらのパーミアーゼも、グルコーストランスポーターとして機能する。
【０１０９】
多くのケースにおいて、トランスポータータンパク質は、細胞内で高く制御されており、通常、トランスポーター遺伝子の発現は培地中の基質の存在によって引き起こされる。グルコーストランスポーター、大腸菌由来のガラクトースパーミアーゼは、ガラクトースにより誘発される、しかし、好ましい基質はグルコースである(Henderson & Maidenn (1990).Phil. Trans. R. Soc. Lond. 326: 391-410)。大腸菌内の、GalPを除いて、他のパーミアーゼはグルコースを認識し、輸送することができる、例えば；
a)       mglBCA遺伝子によりエンコードされている高親和性ガラクトース輸送システム(Hogg et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229: 453-459 and Ferenci T. (1996)FEMS Microbiol. Rev. 18: 301-317)；及び
b)       膜成分PtsMが広い基質特異性を持っていて、グルコースとフルクトースを輸送することが可能である、マンノースPTSシステム(Postma &Lengeler (1985) Microbial Rev. 49: 232-269 and Erni et al., (1987) J.Biol. Chem. 262: 5238-5247)
さらに、通常、グルコースPTSシステムの一部であるptsG遺伝子の生成物は、グルコース同化タンパク質として機能する、より具体的にはグルコース促進因子として機能するPTS依存性トランスポーターの突然変異誘発により、転化することができる(Ruijter et al (1992) J. Bact. 174: 2843-2850 and Erni et al(1986) J.Biol. Chem 261: 16398-16403)。
【０１１０】
上の特徴付けられている例のほかに、他のブドウ糖トランスポーターはTransportDBデータベース内に列挙されているものを含む。これは、完全な遺伝子配列が入手可能な生物に対する予測された細胞膜輸送タンパク質補体を記載するリレーショナルデータベースである(http://66.93.129.133/transporter/wb/index.html)。
【０１１１】
他の実施例においては、グルコース同化タンパク質は、リン酸化タンパク質である。リン酸化タンパク質は、ヘキソキナーゼ及び好ましくは、グルコキナーゼである。ある好ましいグルコキナーゼは、Glkであり、参考文献はNCBI(NC000913)である。グルコーストランスポーターに関して上記で示したように、他のグルコースリン酸化酵素は、FASTA、GCGPilrup及びBLAST等のコンピュータープログラムを用いて、同定されている。
【０１１２】
大腸菌は、Flores et al. (2002) Met. Eng. 4: 124-137 and Curtis et al. (1975) J. Bacteriol. 122: 1189- 1199)の結果により示唆されているように、他のグルコースリン酸化酵素を含んでいる。大腸菌内でglkが阻害されると、この細胞は、野生型系統と比較して、22％から32％の残余グルコースリン酸化活性を有している。Glk配列を用いた大腸菌遺伝子のBLAST検索は、34％以上の配列相同性レベルを有するタンパク質を示さなかった。このことは、測定されたグルコキナーゼ活性は、1以上の酵素に依存しているか、あるいは、Glkにあまり関係していないことを示す。グルコキナーゼ活性に関係する、いくつかのグルコース同化タンパク質を以下に挙げる；
2006501851.tif 000004
【０１１３】
このリストは網羅的ではなく、適切な変異誘発-選択プロトコルを使って、これらの、及び/又は他の助酵素が、グルコースをリン酸化する能力を高めるように修飾することは、本発明の範囲内である。
【０１１４】
PTS-/Glu-細胞内へのDNAカセットの導入
一旦好適なDNAカセットが構築されると、それらは、プラスミド内へ導入されるか、あるいは、直接適切なPTS-/Glu-宿主細胞の形質転換に用いられる。微生物の中でベクターとして用いることができるプラスミドは、よく知られており、引用文献は、Maniais, et al., MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, 2d Edition (1989) AND MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, second edition (Sambrook et al., 1989) and Bron, S, Chapter 3, Plasmids, in MOLECULAR BIOLOGY METHODS FOR BACILLUS, Ed. Harwood and Cutting, (1990) JohnWiley & Sons Ltdである。
【０１１５】
本発明に有用なベクターは、pSYC0101 (図8及び9), 及び pSYCO 101 誘導体プラスミドpSYC0103及びpSYC0106；pKD46；pR6K-ECHO(インビトロジェン)；pJW168 (Palmeros et al., 2000 Gene, 247: 255-264)；ptrcM2；ptrc99A；pTrc99 (ファルマシア)；pACYC177；pMCGG ;pSC101；pKD46 (Datsenko and Wanner (2000) PNAS 97: 6640-6645)；及びpKP32 (WO 01/012833)を含む。
【０１１６】
DNAカセット及び他のベクターの宿主細胞内への導入は、既知の遺伝子輸送技術により行うことができる。これらの遺伝子輸送技術は、形質転換、形質導入、接合及び原形質融合を含む。遺伝子導入は、外来的に付加されたDNAが微生物により取り込まれる、遺伝子又はポリヌクレオチドの細胞内への移転である。一般的な形質転換手順は、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(vol. 1, edited by Ausubel et al., JohnWiley & Sons, Inc. 1987, Chapter 9) に記載されており、カルシウムリン酸法、DETA-デキストランを用いた形質転換及び電気穿孔法が含まれる。与えられた宿主細胞に核酸を導入する、各種形質転換手順は、本技術分野において知られている(参考文献はUSP 5,032, 514; Potter H. (1988) Anal. Biochem 174: 361-373; Sambrook, J.et al., MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); and Ferrari et al., Genetics, pgs 57-72 in BACILLUS, Harwood et al., Eds. Plenum PublishingCorpである)。
【０１１７】
PTS-/Glu-宿主細胞への、プロモーター及びグルコース同化タンパク質をエンコードする遺伝子の上流配列を含むDNAカセットの導入は、内生染色体調節領域の修飾、好ましくは、内生調節領域の置換を結果として生じる。ある態様では、外来プロモーター及び、内生調節領域を含むDNAカセットは、置換される。プロモーターを含む導入された調節領域は、PTS-/Glu-宿主細胞内の染色体上に組み込まれ、導入された配列は、内生調節領域と置き換わるグルコース同化タンパク質のコード配列と作動可能に結合する。好ましい態様において、DNAカセットの組み込みにより導入された選択マーカーは、好ましくは、Palmeros et al. (2000) Gene 247: 255-264に開示の方法により取り除かれる。外来プロモーターと結合しているグルコース同化タンパク質が発現すると、グルコース+表現型を有する細胞となる。ここで開示する、グルコース+表現型(PTS-/Glu+)を有する細菌系統も本発明に包含される。
【０１１８】
さらなる態様において、修飾される内生調節領域は、グルコーストランスポーターの調節領域である。好ましい態様では、グルコーストランスポーター遺伝子は、大腸菌由来GalP及び大腸菌由来GalPに対して少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％及び98％のアミノ酸配列の相同性を有するグルコーストランスポーターをエンコードしている。他の態様では、修飾された内生調節領域は、リン酸化タンパク質の調節領域である。好ましい態様においては、このリン酸化タンパク質は、グルコキナーゼ及び、より好ましくは、大腸菌由来Glk及び大腸菌由来Glkに対して少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％及び98％のアミノ酸配列の相同性を有するリン酸化タンパク質である。
【０１１９】
ある態様においては、グルコース同化タンパク質と作動可能に結合している修飾された内生調節領域を有する、具体的には、ガラクトースパーミアーゼと作動可能に結合している修飾された内生調節領域及び、グルコキナーゼと作動可能に結合している修飾された内生調節領域を有する、PTS-/Glu+細胞は、野生型宿主細胞と比較して、目的化合物の生産を増やすことができる。目的化合物は、図1Bにて示した化合物である。具体的な目的化合物は、ジヒドロキシアセトン-P、グリセロール、1,3-プロパンジオール、ピルビン酸、チロシン、コハク酸、エタノール、及びアセチル-CoAである。好ましい、目的化合物は、ピルビン酸、コリスミ酸、及びスクシニル酸を含む。
【０１２０】
更なるPTS-/Glu+細胞の修飾
本発明の方法に従い得られたPTS-/Glu+細胞は、炭素流量を芳香環経路内へ及び、芳香環内を通るようにする1以上のタンパク質をエンコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。この異種ポリヌクレオチドは、Glu+表現型の復元の前、中、及び復元後のいずれかに、PTS-/Glu+細胞内に導入される。
【０１２１】
ある態様においては、本発明に従ったPTS-/Glu+細胞は、tktA及びtktBによりエンコードされている、トランスケトラーゼを過剰発現する。トランスケトラーゼは、生成物としてE4Pを生産する2の分離した反応を触媒する、ペントースリン酸化回路の酵素である(図1を参照のこと)。トランスケトラーゼをエンコードする核酸配列の導入による、このtktA遺伝子の増幅は、最終的に、芳香族のE4P前駆体の細胞内濃度を上げる(US Patent 5,168,056)。
【０１２２】
他の態様では、DHAPシンターゼをエンコードしている、1以上の遺伝子(aroG、aroF及びaroH)は、本発明に従い、PTS-/Glu+細胞内へ導入され、増幅される。E4P及びDAHPシンターゼの発現が増加されると、DAHPシンターゼの発現のみが増加されている系統と比較して、芳香環経路内への炭素流量が有意に増加する(US Patent 5,168,056)。
【０１２３】
従って、ある態様において、本発明は、PTS不活性化(PTS-)によりPEPを保存する宿主細胞に加え、トランスケトラーゼの増幅に依存して、炭素流の糖を生産する宿主細胞に関係する。
【０１２４】
宿主細胞が、芳香族経路の中への炭素流量を増加するような条件下で培養されているので、この経路内の速度制限段階を同定し、この制限段階を乗越えなければならないということは、認識されている。このことに関する方法論は当業者に利用可能である。例えば、US Pat. Nos. 5,168, 056 及び 5,776, 736. を参照のこと。
【０１２５】
以下の転化における例として
【式２】
【０１２６】
2006501851.tif 000005
経路内の炭素流の糖を生産する条件下においては、例えば、PTS-/Glu+及びTktの過剰発現系統において、DHQシンターゼの活性レベルは、DAHPの生成と同じ速さでDAHPを消費するには不十分である。aroBのこの自然な速度制限段階の結果として、DAHPは蓄積し、培養上清の中に排出される。このDAHの蓄積により、PTS-/Glu+系統ではPEPレベルがその細胞内に増えていること確認することができる。
【０１２７】
芳香族経路を通して炭素流量を増大させることに加えて、以下の遺伝子：大腸菌内でPEPシンターゼをエンコードしているpps (US Pat. No. 5,985, 617参照のこと)及びトランスアルドラーゼをエンコードしているtalA (lida et al. (1993) J. Bacterial. 175: 5375-5383)は、本発明に従ってPTS-/Glu+細胞の中で過剰発現させることができる。さらに、芳香環経路内の反応を触媒している酵素をエンコードしている任意の遺伝子(例えば、DAHP シンターゼ(aroF、aroG、aroH), DHQ シンターゼ (aroB), DHQ 脱水酵素 (aroD), シキミ酸 デヒドロゲナーゼ (aroE), シキミ酸キナーゼ(aroL,aroK), EPSP シンターゼ (aroA)及び コリスミ酸シンターゼ (aroC))は、本発明に包含されるPTS-/Glu+細胞内で増幅される。
【０１２８】
さまざまな違う遺伝子が、目的とする生成物に応じて、過剰発現することができることは当業者において明確である。
【０１２９】
好ましい態様においては、目的生成物がコリスミ酸であるなら、本発明のPTS-/Glu+細胞は、DAHPシンターゼ、DHQシンターゼ； DHQデヒドラターゼ；シキミ酸デヒドロゲナーゼ；シキミ酸キナーゼ； EPSPシンターゼとコリスミ酸シンターゼの酵素をコードしている遺伝子から成る、芳香環経路の任意の1の遺伝子を過剰発現させる。
【０１３０】
ある態様においては、目的生成物がトリプトファンである場合、トリプトファンシンターゼ(trpA及びtrpB)、ホスホリボシルアントラニル酸塩イソメラーゼインドールグリセロルリン酸シンターゼ(trpC)、アントラニル酸フォスフォリボシルトランスフェラーゼ(trpD)及びアントラニル酸シンターゼ(trpE)の酵素をエンコードしている遺伝子を含む、芳香環経路のトリプトファン特異断片内の任意の遺伝子が増幅される。他の態様においては、トリプトファナーゼをエンコードしている遺伝子(tanA)は、欠失している。
【０１３１】
他の態様では、目的とする生成物がピルビン酸であるならば、本発明に応じたPTS-/Glu+細胞は、pykを過剰発現するために遺伝的に設計されるかもしれない。この遺伝子はピルビンキナーゼをエンコードする。目的物質が、オキサロ酢酸の場合には、本発明のPTS-/Glu+細胞は、PEPカルボキシラーゼ(E.C.4.1.1.31)をエンコードするppcを過剰発現するように遺伝的に改変される。
【０１３２】
目的生成物が、カテコールである場合には、本発明のPTS-/Glu+細胞は、1以上の以下の酵素：DAHPシンターゼ(aroF、aroG、aroH)；3デヒドロエステル(DHQ)シンターゼ(aroB)；トランスケトラーゼ(tktAまたはtktB)；3デヒドロシキミ酸(DHS)デヒドラターゼ(aroZ)またはプロトカテク酸(PCA)脱炭酸酵素(aroY)(US Patent 5,272、073及び5,629,181参照のこと)を、エンコードしているDNAを用いて、さらに形質転換させられる。
【０１３３】
さらに例として、目的生成物がアジピン酸であるなら、以下の1以上の酵素：3-デヒドロシキミ酸(DHS)デヒドロターゼ(aroZ)；プロトカテク酸(PCA)デカルボキシラーゼ(aroY)又は1,2-ジオキシゲナーゼ(catA)；そして、オプションでトランスケトラーゼ(tktA 又はtktB)；DAHPシンターゼ(aroF、aroG、aroH)または本発明に応じたPTS-/Glu+細胞の中のDHQシンターゼ(aroB)(US Patent 5,374, 543参照のこと)が、対応する遺伝子の増幅により過剰発現させられる。
【０１３４】
目的生成物がインディゴであるなら、本発明のPTS-/Glu+細胞は、トリプトファンシンターゼベータサブユニットのアナログポリペプチドをエンコードしているDNA及び芳香族ジオキシゲナーゼ酵素をエンコードしているDNAを用いて、さらに形質転換される。
【０１３５】
従って、PEPとPEP前駆物質を所定の経路内に差し向けることにより、芳香族アミノ酸経路、解糖系、TCA回路、及びペントースリン酸回路等の代謝経路への炭素流量の増加を結果として生じているPEP有するPTS-/Glu+系統を提供する本発明は、対応するPTS宿主細胞内の同じ生成物の生産と比較して、目的生成物の生産を高めることに用いる宿主細胞システムを提供する。
【０１３６】
細胞培養及び発酵
細菌細胞の維持及び成長に適した方法は既知であり、参考文献は、MANUAL OF METHODS OF GENERAL BACTERIOLOGY, Eds. P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC (1981) and T. D. Brock in BIOTECHNOLOGY : A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2nd ed. (1989)Sinauer Associates, Sunderland, MAである。
【０１３７】
細胞予備培養
典型的な細胞培養は、25℃から32℃の間、好ましくは、約28℃又は29℃で、適切な培地内で培養される。本発明に有用な典型的な成長培地は、Luria Bertani (LB) ブロス, Sabouraud Dextrose (SD) ブロス 又は Yeast medium (YM) ブロス等の商業的に調製されている培地であるが、これらに限られない。これらは例えばGIBCO/BRL(ゲーサーズバーグ、MD)から入手できる。他に記載のある合成の増殖培地を用いてもよく、特定の細菌の成長に対して適切な培地は微生物学または発酵科学の当業者には知られている。発酵に適切なpHレンジはpH5からpH8の間である。種フラスコに対する好ましいレンジは、pH7.0からpH7.5であり、発酵管に対する好ましいpHレンジは、pH5からpH6である。発酵過程に影響する多くの因子は、アスコルビン酸中間体生産を最大化するために最適化され、制御される必要があるということは、当該技術分野においてよく知られている。pH、炭素源濃度、及び溶解酸素レベル等の因子の多くは、アスコルビン酸中間体生産に用いられる細胞のタイプに応じて、影響される。
【０１３８】
目的生成物の生産は、発酵環境、すなわちインビボ環境、又は非発酵環境、すなわちインビトロ環境；又はインビボ/インビトロの組み合わせ環境において、行うことができる。この発酵又は生物反応は、バッチプロセス及び連続プロセスにおいて行われる。
【０１３９】
発酵培地
本発明の発酵培地は、適切な炭素源、グルコース等の単糖類、ラクトース又はスクロースのような小糖類、スターチ又はセルロースのような多糖類、及び、再生可能資源由来のチーズ乳清浸透液、トウモロコシ浸透液、テンサイ糖ミツおよび大麦麦芽などのからの精製されていない混合を含まなければならないが、これらに限定されるわけではない。さらに、炭素基質は、炭素などの1炭素基質であるかもしれない。本発明で用いられる炭素源は、基質に含まれる各種幅広い炭素を包含し、それは、微生物の選択によってのみ制限される一方、好ましい炭素基質は、グルコース及び/又はフルクトース及びそれらの混合物をも含んでいる。本出願の他の所で説明される遺伝子修飾を組み合わせたグルコース及びフルクトースの混合物の使用により、代謝経路から酸化経路を切り離すことは、宿主細胞の代謝要求を満たすフルクトースが用いられる一方で、生成物の高められた生産性に対するグルコースの使用及び目的とするアスコルビン酸中間体への転化を促進する。
【０１４０】
上で述べた炭素基質の全ては本発明において適切であるが、好ましい糖質は、グルコース、フルクトース又はスクロースである。炭素基質の濃度は、重量対重量に基づいて、約55％から約75％である。好ましい濃度は、重量対重量に基づいて、約60％から約70％である。発明者は、最も好ましい60%または67%のグルコースを使用した。
【０１４１】
好ましい炭素源に加えて、発酵培地は、成長又は培養及びアスコルビン酸中間体生成に対して、必要な酵素経路の促進に適したミネラル、塩、ビタミン、共同因子及び緩衝剤を含まなければならない。
【０１４２】
バッチ(回分)発酵及び連続発酵
本発明のプロセスは、培養システムに関して、バッチ、フェドバッチ、連続培養のいずれかを用いる。これらの方法は、本発明の技術分野で既知であり、例は、上記のBrockである。旧来のバッチ発酵は、発酵の開始時に培地の成分がセットされ、発酵の間、成分の人工的な入れ替わりが起きない閉鎖系であった。従って、発酵の開始時に、培地は要求された1以上の微生物を接種され、発酵は、この間、何もシステムに追加しないで、行われる。しかし、一般に、「バッチ」発酵は炭素源の付加について回分であり、pHと酸素濃度などの要因を制御することは、発酵中においても、しばしば行われる。バッチシステムの中で、常に、発酵が停止する時間まで、システムの代謝産物と生物量組成は変わる。回分培養の中では、細胞は、静的誘導期から高成長誘導期及び最終的には、成長が減少するか停止する、定常期を通じて、適量になる。未処置ならば、定常期の中の細胞は結局死ぬであろう。遅滞期の中の細胞が一般に最終産物または中間体の生産の大きさに関係する。
【０１４３】
標準的なバッチシステムのバリエーションは、フェドバッチシステムである。フェドバッ発酵プロセスもまた、本発明に有用であり、基質が発酵過程中に増量分として追加される事を除いては、フェドバッチシステムは、典型的なバッチシステムと同じである。代謝抑制により、細胞の代謝を抑制する傾向がある時に及び培地の中で基質の量を制限したことが望ましい所にフェドバッチシステムは有益である。フェドバッチシステム内の実際の基質濃度を測定することは難しい、それゆえ、基質濃度は、pH、融解酸素及びCO2等の消費ガスの部分的な圧力等の、測定可能な要素の変化に基づいて見極められる。
【０１４４】
本発明では、バッチ又はフェドバッチ法が好ましいが、連続発酵方法もまた、用いられる。連続発酵は、発酵培地が生物反応に連続的に添加され、同じ量の培地が同時にプロセスから取り除かれる、開放系である。連続発酵は、培地を、細胞が第一に対数期成長にある所で、一定の高密度に保つことができる。連続発酵は、細胞成長又は最終生成物に影響を及ぼす、1のあるいは任意の要素の変更をすることができる。例えば、ある方法は、炭素源又は、窒素レベル等の制限栄養分を一定の割合で維持し、他のパラメーターを適度に調節することができる。他の系では、成長に影響する多くの要素は連続的に変更することができる一方、培地濁度により測定される細胞濃度を、一定にすることができる。連続培養システムは、安定した状態の成長条件を維持するために調整され、したがって、排出される培地に起因する細胞のロスは、この発酵系内における細胞成長に対してバランスがとれたものとなる。連続発酵プロセスに関する適した栄養分及び成長因子に関する方法だけでなく、生成物形成速度の最大化に関する技術も、工業的微生物学の分野でよく知られており、各種方法は、上記のBrockに、詳述されている。
【０１４５】
本発明を実施するための手順及び方法は、以下の実施例を参照することにより、当業者により十分に理解されるであろう。以下の実施例は、ここに記載されている発明又は請求項の範囲を制限することを意図していない。ここで引用されたすべての文献及び特許刊行物は、参照により引用される。
【実施例】
【０１４６】
実施例1- rtcプロモーターを用いたPTS-大腸菌系統の構築
A). loxP-CAT-loxPカセット、プラスミドpTrcM42の構築
線形DNAは、販売元(ニューイングランドバイオラド)の仕様に従い、HindIII及びNcol制限酵素を用いて消化されたプラスミドpTrc99a(ファルマシア)から得た。精製の後、消化DNAの端部は、TADNAポリメラーゼを用いて、Sambrookらの方法により、鈍化させられた。この鈍化端部を有する線形DNAは、一般的な方法により、環状にされ、大腸菌TOP-10コンポーネント細胞(インビトロジェン、カールズバッド、カナダ)内で形質転換された。細胞は、50μg/mlのカルベニリシンを含む、Luria-agar(LA)プレート(LB培地は、5g/L酵母抽出物；10g/Lトリプトン及び10g/L NaCl+2％アガーを含んでいる)上で平板培養された。37℃、16時間の培養の後、さらなる解析のために4のコロニーが選択された。精製プラスミドDNAは、これらのコロニーから得られた、そして、制限酵素を用いて解析された。4コロニーは同じプラスミドを含んでおり、HindIII及びNcolの間のDNA領域が欠失していることが確認された。このプラスミドはpTrc1と称された。
【０１４７】
プラスミドpTra1は、trcプロモーターの-35領域の約120bp上流に位置している、制限酵素BspM11に対する、1のみの認識領域を含んでいる。この位置は、摘出可能選択マーカーの導入のために、選択されたものである。pTrcは、販売元(ニューイングランドバイオラド)の仕様に従い、BspM1酵素を用いて消化された。この線状pTrc1は、QIAクイックゲル抽出キット(キアゲン)を用いてゲル精製され、Sambrookらの方法により、T4DNAポリメラーゼを用いて、鈍化させられ、loxP-CAT-loxP DNAカセットに結合された。このloxP-CAT-loxP DNAカセットは、Stu1及びBam H1を用いて消化されたプラスミドpLoxCAT2(Palmeros et al., (2000) Gene 247: 255-264)から得られた。この結合混合物は、大腸菌TOP-10コンポーネント細胞(インビトロジェン)内で形質転換させられ、50μg/mlカルベニリシン、及び20μg/mlクロラムフェニコールを含む、Luria-agarプレートで平板培養された。37℃、16時間の培養の後、いくつかのコロニーがプレート上に現れた。これらのコロニーのいくつかは、カルベニリシン及びクロラムフェニコールを含む、フレッシュLBプレートに移された。プラスミド精製及び制限酵素解析の後、trcプロモーターに対して、同じ側及び反対側に位置するloxP-CAT-loxPカセット内にloxP-CAT-loxP-trcを有する2のプラスミドが選択され、pTrcm41及びpTrcm42で消化された(図6)。
【０１４８】
B). ga/P(pR6KqaIP)のためのtrcプロモーター置換テンプレートの構築
loxP-CAT-loxPカセットの上流にtrcプロモーター及びlacオペレーターを含むDNAカセットは、GalA/GalP2のプライマーセットを用いたpTrcm42からのPCRにより増幅された。
【０１４９】
GalA：(SEQ ID NO.6)  
5’ TCGGTTTTCACAGTTGTTACATTTCTTTTCAGTAAAGTCTGGATGC  ATATGGC GGCCGCAT 3’ 
GaIP2：(SEQ ID NO.7)  
5’CATGATGCCCTCCAATATGGTTATTTTTTATTGTGAATTAGTCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTA 3’ 
このプライマーペアは、PCRプロダクトの各端部に対するgalP上流領域に対して相同な40bpを含んでいる。増幅は、Taqポリメラーゼ(ロシュ)を用いて、95℃1分；55℃1分；72℃2分を30サイクル行った。このDNAカセットは、Echo pUni/His5 R6Kベクター(インビトロジェン)内でクローン技術により増幅され、大腸菌Pir1細胞内で形質転換された。陽性コロニーは、断片を放出する制限酵素(解析)により、確認された。この構築物は、pR6KgalPとされた。
【０１５０】
C). glk(pR6Kglk)のためのtrcプロモーター置換テンプレートの構築
loxP-CAT-loxPカセットの上流にtrcプロモーター及びlacオペレーターを含むDNAカセットは、GlkA/Glk2のプライマーセットを用いたpTrcm42からのPCRにより増幅された。
【０１５１】
GlkA : (SEQ ID NO. 8) 5’-ACTTAGTTTGCCCAGCTTGCAAAAGGCATCGCTGCAATTGGATGCATATGGCG GCCGCAT 3’ 
Glk2 : (SEQ ID NO. 9) 5’-CATTCTTCAACTGCTCCGCTAAAGTCAAAATAATTCTTTCTCGTCTGTTTCCTGTGT GAAATTGTTA 3’
このプライマーペアは、PCRプロダクトの各端部に対するglk上流領域に対して相同な40bpを含んでいる。増幅は、Taqポリメラーゼ(ロシュ)を用いて、95℃1分；55℃1分；72℃2分を30サイクル行った。このDNAカセットは、Echo pUni/His5 R6Kベクター(インビトロジェン)内でクローン技術により増幅され、大腸菌Pir1細胞内で形質転換された。陽性コロニーは、制限酵素により、確認され、この構築物は、pR6Kglkとされた。
【０１５２】
D). 大腸菌ptsHlcrr欠失系統KLpts7の構築
大腸菌KLndh81(KLp23ndh)のPTS-(△ptsHlcrr)系統は、カナマイシン耐性マーカーを用いて、ptsH、ptsl及びcrrを含むオペロン全体の置換により得られた(Levy et al.,(1990) Gene 86: 27-33)。これは、Flores et al., (1996) Nature Biotechnol., 14: 620-623に記載の方法により、ファージ溶解物2611NK9pykF::Gmを用いた、P1vir形質導入によりなされた。オペロンの欠失は、欠失部の上流又は下流領域にハイブリダイズする(ptsHF/crrR)プライマーを用いたPCRによる、この領域の増幅及びマックコンキー(ラクトース-)アガー+1％グルコース上の平板培養のコロニーの出現の有無により、確認された。
【０１５３】
ptsHF (SEQ ID NO. 23)
5’ AGAATTGCAACAGTAATGCCAGCTTGTTAAAAATGCGTA 3’ 
crrR (SEQ ID NO. 24) 
5’ CCTGTTTTGTGCTCAGCTCATCAGTGGCTTGCTGAA 3’
グルコース::PTSシステム内の欠失を有するコロニーは、グルコース及び生成される酸を用いる能力がないことから、プレート上で、白いコロニーを形成する。これらの系統は、KLpst7とされた。
【０１５４】
E). 線形DNAのカセット形質転換によるgalPの天然プロモーターと合成外来trcプロモーターとの置換。
【０１５５】
大腸菌palP上流領域に対して相同な各端部上のDNAフランキング(領域)の40bpを有するloxP-CAT-loxP-ptrcを含むDNAカセットは、同じテンプレートとして、rTth  RNAポリメラーゼ(パーキンエルマー)、pR6K-galP(SEQ ID NO.1)及びGalA/GalP2(SEQ ID NO.6/ SEQ ID NO.7)を用いて生成された。PCR産物は、Datsenko and Wanner(2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645に記載の方法による、ラムダレッドシステム(lambda Red system)を用いて生産し、統合のためにpKD46を含むエレクトロコンペテントKLpts7細胞内で形質転換した。このカセットの組み込みは、galPATG開始コドンの上流36-183bpの調節領域の置換を生じた。KLpts: :galP-trc系統に提供されるloxP-CAT-loxP-ptrcカセットに関しては、GenBank Accession &num; U28377を参照のこと。
【０１５６】
コロニーは、10μg/mlクロラムフェニコールを含むLAプレート上で選択された。この組み込みは、GaIA/GaIP2 (SEQ IDNO.6/SEQ ID NO.7)プライマーペア(1.4kb産物を与えるための組込み部位の増幅)及びGalB1/GalC11(2.1kb産物を与えるための上流及び下流領域を含む組込み部位の増幅)を用いたPCR解析により確認された。
【０１５７】
GalB1 (SEQ ID NO.10) 5’ ACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAA 3’ 
GaIC11 (SEQ ID NO.11) 5’ AGAAAGATAAGCACCGAGGATCCCGATA 3’
PCRパラメーターは、メーカーの指示に従い、TaqDNAポリメラーゼ又はrTthポリメラーゼを用いて、95℃1分、55℃2分、72℃2分を30サイクル行った。この系統、KLpts::galP-trcは、マックコンキー(ラクトース-)アガー+1％グルコース上で平板培養された。このコロニーは、白を示すKLptsと比較して、わずかに赤いコロニーを生成した、前者は酸からグルコースを作ることができるのに対して、後者(親系統)は、それができないということを示している。このことにより、galPが発現していること及びGalPがグルコースの取り込みをしてるということが確認された。プロモーター領域は、促進因子の存在を確認するために配列決定された。クロラムフェニコールマーカーは、Palmeros et al. (2000) Gene 247: 255-264 に記載されているように、Creリコンビナーゼを用いて取り除かれた、この除去は、GalB1/GalC11(SEQ ID NO.1)のプライマーセットを用いたPCRにより確認された。
【０１５８】
F). 線状DNAカセット形質転換による合成外来trcプロモーター(KLGG)を用いた天然グルコキナーゼプロモーターの置換
glkの上流領域に相同な、DNAフランキング(領域)の40bpを有するloxP-CAT-loxP-ptrcを含むDNAカセットは、上記実施例1E)にて開示されたgalPDNAを用いて調整された。用いたプライマーセットは、glkATGの上流149-189から5’末端及びglkATGから3’末端に向かって ATGの上流37bpのDNAフランキングを付加するGlkA/Glk2(SEQ ID NO.8及びSEQ ID NO.9)である(glkの信託番号はEA000327)。PRC増幅に用いたテンプレートは、rTthポリメラーゼ(パーキンエルマー)及びpR6Kglkである。Glk-trcDNAカセットは、上記Datsenko 及び Wanner (2000)らの開示の方法に従い、pKD46プラスミドを含むエレクトロコンピテントKlgalP-trc細胞内で形質転換された。陽性コロニーは、10μg/mlクロラムフェニコールを含むLAアガープレート上で選択された。カセットの組換えは、GlkB1/GlkC11プライマーセットを用いたPCRにより確認された。このPCRプログラムは、KLgalP-trcの構築において開示されている。GlkB1は、glkATGの700bp上流に結合する前向きプライマーであり、GlkC11は、glkATG開示コドンの500bp下流に結合する。
【０１５９】
GlkB1 (SEQ ID NO. 12) 
5’ AACAGGAGTGCCAAACAGTGCGCCGA 3’ 
GlkC11 (SEQ ID NO. 13) 
5’ CTATTCGGCGCAAAATCAACGTGACCGCCT 3’
コロニーはマックコンキーアガー(ラクトース-)+1％グルコースで平板培養された。コロニーは深紅を示した、ペアレントKLgalP-trcと比較して、グルコースを酸に転化する能力が増えたことを意味する。このクロラムフェニコールマーカーは、Creリコンビナーゼを用いて、上記Palmerosらの開示の方法により、取り除かれ、1.3kbpの生成物を与えるGlkB1/GlkC11プライマーセットを用いたPCRにより、除去が確認された。生じた1.3kb生成物はKLGGと称された。
【０１６０】
G). pACYC177(pMCGG)中にクローン技術で生み出されたptrcを用いたPEP非依存グルコース輸送系の建築
trcプロモーター由来galP及びglkの発現をさせる適切なコピー数のプラスミドが構築された。trcプロモーターの制御下におかれたgalP及びgalkを含む3040bpのAccl断片はプラスミドpVHGalPglk11(図13)から単離された。プラスミドpVHGalPglk11は、スペクチノマイシン抗生物質耐性及びtrcプロモーターの制御下にある大腸菌由来galP及びglk遺伝子を運ぶ、pCL1920ベクター(Lerner et al. (1990) NAR 18: 4631)由来の低いコピー数のプラスミドである。Accl消化により得られる3040bpのDNA断片の核酸配列(SEQ ID NO.25)は、図14A-Eに示した。端部は通常の方法により鈍化された (Sambrook et al., 上記)。断片の鈍化された端部は、pACYC17(ニューイングランドバイオラド)のClal部位内でクローンされた 、このことにより、カナマイシン耐性遺伝子は不活性化された。コロニーはカルベニシリン(100μg/ml) 上で成長し、カナマイシン(10μg/ml) 上では成長しないことを確認するために、スクリーニングされた。プラスミドDNAは、標準的方法を用いて単離され、目的断片の存在は、クローン断片内で1度のみ切断するXbal及びプラスミド内の認識部位を2有するBamHlを用いた制限酵素消化により確認された。これは、発明者が挿入された破片の方向づけを決定することを可能にした。このプラスミドはpMCGGと称された。
【０１６１】
H). pSYCO構築物の構築
グルコースから生成物への炭素転化するPTS-/Glu+系統(実施例1E-G)の利用は、DHAPから1,3プロパンジオールの転化を行う酵素をエンコードしている遺伝子を運ぶプラスミドにおいて試験された。このpSYCO構築物は、DHAP(ジヒドロキシアセトンP)の遺伝子変換のための遺伝子を、サッカロマイセス・セレヴィシエ (グリセロール経路と称される)由来のグリセロール(dar1とgpp2)に運び、続いてグリセロールから1,3-プロパンジオール(クレブシエラ由来dhaB1-3, dhaX, onW, X, 及びY )(1,3-プロパンジオール経路と云われる)に関する遺伝子を運ぶプラスミドに基づく、pSC101(ストラテゲン)である。この実施例に用いられているpSYCO構築物は、pSYCO101、130及び106で、図8及び図9に、それぞれ、核酸配列とプラスミドマップが記載されている。このpSYCO構築物は、グリセロール経路遺伝子及びpSYC0101のグリセロール経路遺伝子の逆の定位における2つのEcoR1サイトを除いてはpSYCO101と同一である。pSYCO106構築物は、図9に示されるようにEcoR1部位から10589-11145 bpの間の非コードプラスミド領域の126bpの除去を除いては、pSYCO103と同じである。ここに説明された実験においては、プラスミドは機能的に等しい。
【０１６２】
実施例2-グルコース取り込みに対するPEP-PTSシステムを欠いている系統の染色体からガラクトースパーミアーゼをエンコードしているgalPの構成要素の発現。
【０１６３】
Glu+表現型を有するPTS-/Glu+大腸菌系統内でのグリセロール及び1.3プロパンジオールの生成が測定された。このPTS-/Glu+大腸菌系統は、KLpts7/pMCGGを作るための標準的方法(Sambrook et al. 上記)によりpMCGG(実施例1G)でのPTS-/Glu-系統(KLpts7)の形質転換又は、KlgalP-ptrc(実施例1E)をつくるKLpts7内の内生天然galPプロモーターの置換をするためのtrcプロモーターの染色体上への組み込みにより、得ることができる。KLpts7/pMCGG及びKlgalP-ptrcは、グリセロール及び1,3-プロパンジオールに関係する経路に運ぶプラスミドを用いて標準的方法(Sambrook et al.上記)により形質転換された。細胞質量、グリセロール、1,3-プロパンジオールは発酵により試験された。
【０１６４】
標準的な発酵は、以下の手順で行われた：500ml種フラスコは、35℃、2YT培地(Sambrook et al.上記)で、4-6時間、200rpmで育成された。この種培地は、グルコース存在下、 ：K2HP04 (13.6 g/L) ;KH2PO4 (13.6 g/L) :MgS04・7H2O (2 g/L); クエン酸1水和物(2 g/L), クエン酸鉄第2アンモニウム(0.3 g/L), (NH4) 2SO4 (3.2 g/L) 酵母抽出物 (5 g/L) 微量元素溶液 (1 ml) からなり、pHを6.8に調整したTN2培地中で、35℃、pH6.8、60時間で実施される14Lの発酵装置内の発酵に用いられた。微量元素の溶液は、クエン酸一水和物 (4.0 g/L)、MnS04・ H20 (3.0 g/L)、NaCI (1.0 g/L)、FeS04. 7H20 (0.10 g/L), CoCl2・6H20 (0.10 g/L),ZnSO4・7H20 (0.10 g/L), CuS04・5H20(0 : 01 g/L), H3BO3 (0.01 g/L) 及びNa3Mo04. 2H20(0. 01 g/L)を含んでいた。発酵物は、細胞密度については、分光光度計の中で600nMでの培養の光学濃度(OD)を決定することによって、グリセロール及び1,3-プロパンジオールについてはHPLCを用いて解析された。
【０１６５】
1,3-プロパンジオールの単離
グルコースからグリセロール及び1,3-プロパンジオールの転化は、HPLCでモニターされた。解析は、クロマトグラフィーの分野において利用可能な標準的方法及び材料を用いて行われた。ある好適な利用可能な方法は、RI検出を用いたウォーターズアライアンスHPLCシステムである。サンプルは、Cation H Refill Cartridgeプレカラム (4.6 mm x 30 mm, バイオラド, ヘラクレス, CA)をつけた、AminexHPX87Hカラム(7.8mm×3000mm、バイオラド、ヘラクレス、カナダ)に付加され、温度は50℃に調整され、移動層として5 mMH2SO4を用い、流量0.4ml/分で分析された。通常、グルコース、グリセロール、1,3-プロパンジオール及び酢酸の保持時間はそれぞれ、12.7分、19.0分、25.2分及び21.5分である。
【０１６６】
この実施例において、2のシステムが比較された。第一のシステムは、大腸菌系統に、glkの天然の調整下におけるグルコキナーゼ生成をさせるため、trcプロモーターを、galP標的部位内に組み込んだ系である(galPの位置は、実施例1Eを参照)、第二のシステムでは、trcプロモーターをgalP標的部位及びglk標的部位の両方内に組み込んだ系(glkの位置については、実施例1Fを参照)である。図10及び図11は、それぞれ、pSYC0101 及びpSYC0103を用いて形質転換されたKLpts7/pMCGG 及びKLgaIP-ptrcの発酵結果を示す。
【０１６７】
KLpts7/pMCG内のグルコース輸送システムをエンコードしているプラスミドは、この系統に高い細胞密度(図10A)とグリセロール及び1,3-プロパンジオールの生産(図10B)をさせた。しかしながら、細胞質量に対するグリセロール及び1,3-プロパンジオールの量は、OD600が194のときに、1,3-プロパンジオールが約7g/Lと、低かった。対照的に図11に示すように、KLgaIP-ptrcは、発酵における細胞質量は少なかったが、生成物は、OD600が70であるときに、約61g/Lの1,3-プロパンジオール及び36g/Lのグリセロールを生産した。
【０１６８】
trcプロモーターから染色体の上のgalPを構成的に発現させることよって、グルコースからの炭素のフラックスは、細胞集団を生産する経路よりも、目的製品、グリセロール及び1,3-プロパンジオール、に関する経路の中に増大した。
【０１６９】
実施例3-PTS-系の染色体上から、galP及びglkの構成要素の発現
PTS-/Glu-系統であるKLpts7は、KLGG系統を作るために、galP及びglk標的部位でのtrcプロモーターの組み込みにより、Glu+になった。上記実施例1を参照のこと。この系統は、pSYCO101を用いた一般的な手順で形質転換された。この細胞集団の生成物、グリセロール及び1,3-プロパンジオールは、一般的な発酵によりテストされた(実施例2を参照のこと)。
【０１７０】
図11及び図12に示すように、KLgaIP-ptrcとの比較において、KLGGはより早く成長した(T33.9においてKLGGは24.7のOD600を示し、KlgalPは19.6のOD600を示した)。KLGGは70g/Lの1,3-プロパンジオールを生成したのに対し、KlgalP系統による生産量は、61g/Lであった。加えて、KLGGの発酵においては、最大濃度が短時間で達成された(KgalPの62.7時間に対して、56.8時間)。Trcプロモーターの染色体上の組み込みによるgalP及びglkの構成要素の発現はそれゆえ、galPの構成要素の発現のみよりも、より短い発酵時間で多くの1,3−プロパンジオールを生産した。
【０１７１】
実施例4-大腸菌の早く成長するPTS-/Glu+系統の選択と解析
上記実施例3において、KLGG系統の発酵実験において示したグリセロール及び、1,3-プロパンジオールの生産中の長い停滞期は、以下の表2に示す、KLGGの24時間と48時間における振とうフラスコ内の実験においても繰り返された。
【表２】
2006501851.tif 000006
発酵時間を短くするため、早い成長をするKLGGの変異体は、PH6.8、35℃でTM2培地のグルコース存在下の発酵におけるKLGG成長により、選択された。細胞は、早期指数成長期に収穫され(例えば、図12AのT31を参照のこと)、コロニーを分離するために、Lアガー上で平板培養された。分離されたコロニーは、KLGGと等しい濃度において、pSYCOと形質転換させたときにグリセロール及び1,3-プロパンジオールを生産する変異体に対してスクリーニングされた。変異体は同定され、FMPと称された。FMPはKLGGと同じ性能を示したが、この性能は、16時間の培養で達成された(KLGGは48時間であった)。
【０１７２】
振とうフラスコ実験は、TM2培地中50μg/mlの2％グルコース+スペクチノマイシン及び2mg/LのB12を含む培地で実施された。pSYCOプラスミドとこの系統の一晩の培養は、50μg/mlのLB+スペクチノマイシン、37℃、200rpmで行われた。振とうフラスコは、オーバーナイト培養200μl(250mlバッフルドフラスコ内の10ml培養液)が接種され、200rpm、34℃で生育された。この培養液は、細胞密度(DO600)及びグルコース消費及び、HPLCにより、グリセロール及び1,3-プロパンジオールの生成が測定された(実施例2を参照のこと)。
【０１７３】
変異体の早い成長の解析::FMP変異体は、グルコキナーゼ活性、glkmRNAの相対レベル、及び遺伝子及びプロモーター発現について解析された。表3に示すように、FMPのグルコキナーゼ活性は、KLGGの0.08ユニットに対して、0.22ユニットと3倍に増えた。これは、コード領域内の突然変異が、より活性の高い酵素を生産するか、又は酵素量を増やしているかのどちらかを結果として生じていることを示している。
【表３】
2006501851.tif 000007
発現レベルをテストするため、glkmRNAが決定され、表4A及び4Bに示した。ライトサイクラーを用いて、交叉時間の形成に関するデータが作成された。低い交叉時間は、より多くのmRNAが存在していることを示す。galPの交叉時間は、KLGG及びFMP内では同じであった。このことは、両系統内のmRNAレベルが等しいことを示す。Glkの交叉時間は、KLGGの交叉時間よりも低く(それぞれ、15.7に対して18.47であった)、交叉時間比は、1.18(KLGG-glk：FMP-glk)であり、このことは、より多くのmRNAが、FMP系統に存在していることを示す。試料は、2回(1又は2)測定され、平均値(Ave.)が採られた。平均値は、比を決定するのに用いられた(glk-K/glk-Fは、KLGG-glk及びFMPglk、をそれぞれ現す)。
【表４Ａ】
2006501851.tif 000008
【表４Ｂ】
2006501851.tif 000009
配列解析は、KLGG及びFMPglk遺伝子及びtrcプロモーターについて行われた。FMPのglkコード配列には、変異は見られなかった。このtrcプロモーターの配列は、glkB1/glkBC11プライマーを用いて、KLGG及びFMPの染色体からのPCRを用いた増幅により、決定された。TrcF(SEQ ID NO.14)5’ GCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATT 3’を用いた、配列決定も行われた。
【０１７４】
GからAの一の変異が、以下に示す、FMP内のtrcプロモーターのlacオペレーター内で、確認された。
【０１７５】
TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT : 野生型lacオペレーター (KLGG) (SEQ ID NO. 15) TGGAATTGTGAACGGATAACAATT : lacオペレーター(FMP) (SEQ ID NO.16)
この変異は、明らかに、結合する遺伝子の発現を増し、lacレセプターのオペレーターの親和性を減らすOCオペレーターの構成要素となる変異のひとつであることが、THE OPERON, Miller, JH and Reznikoff, WS eds. , 1980, p190-192 and references thereinに記載されている。このことは、事実上、プロモーターからのglkの転写を増やし、これは酵素活性の増加によって示された。代謝経路に入るグルコースをリン酸化する多くのグルコキナーゼがあり、多くのG-6-Pは主要な代謝経路の中に送られることから、この変異系統はより早く成長する。
【０１７６】
グルコキナーゼのアッセイは以下の条件で行われた；
100mMリン酸緩衝液pH7.2、5mM  MgCl2、500ｍM  NADP、5mMATP、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ2ユニット。このアッセイは、以下のスキームにより、NADHP2の出現をモニターすることにより、グルコース及びATPからグルコース-6-リン酸の転化を検出する。
【式３】
【０１７７】
2006501851.tif 000010
振とうフラスコ実験における16S rRNA遺伝子(rrsH)を対照としたgalP、glkのmRNAの相対レベルのライトサイクラー検出―KLGG及びFMP系統は、10mlsのTM2+2％グルコース、20のOD600、内で生育された。この培養の10mlは、液体窒素の中で、直接50mlのコニカルチューブに移され、以下の方法でRNAが精製された。以下のプライマーが用いられた。
【０１７８】
For galP 
GalP-R1 5'GTGTCTTCTTCCTGCCAGAC 3' (SEQ ID NO. 17) 
GaIP-F1 5'CCTGCAACAGTACGCCAAG 3' (SEQ ID NO. 18) 
For glk 
Glk-R1 5'CATCTGGTCCATGTCGATAAGC 3' (SEQ ID NO. 19) 
Glk-F1 5'GCGGTTGTCAGCTTTCACAA 3' (SEQ ID NO. 20) 
For rrsH 
rrsH-F1 5'AGCTGGTCTGAGAGGATG 3' (SEQ ID NO. 21) 
rrsH-R1 5'AATTCCGATTAACGCTTGC 3' (SE ID NO. 22)
このライトサイクラー反応は、ライトサイクラーRNA増幅キットSYBR  GreenI(ロシュ)を用いて、10μlに対する反応を修正して、この使用説明書に従い、行った。一反応あたり、500ngのRNAが用いられた。このプログラムの条件は：標的温度55℃；インキュベーション時間10分及び温度の変動速度は、20℃/秒であった。
【０１７９】
このRNA単離手順は、上記実施例4で述べた、適切な条件下における振とうフラスコ内での系統の生育及び50mlコニカルチューブの液体窒素を直接、7から10mlsピペッティングすることによる採取を含んでいる。このサンプルは、使用するまで-70℃で保存された。RNA単離に用いられる標準操作法は、以下で述べる初期調製の後に行われた：凍結サンプルの50mlチューブは、ドライアイスバケット内に置かれた；15mlのフェノール：クロロホルム(1：1)及び1.5mlの３M  NaOAc  pH4.8は、それぞれ50mlチューブに添加された；少量の凍結サンプル(ブロスの約500から2000μl)は、ドライアイスによって予備凍結されているコーヒーミルに移された；2、3のドライアイスの小片をさらに、コーヒーミルに追加し、サンプルは少なくとも1分間粉砕された；ミルは、ミルキャップの中にすべての材料を入れるためにたたかれ、粉砕された細胞ブロス及び残りのドライアイスはの入ったミルカップは、取り外された；等量の2×RNA抽出緩衝液は、すばやくカップ内にピペットを用いて移された；凍結された材料は、使い捨ての無菌のループを使って、液状になるまでかき混ぜられ、15mlのフェノール：クロロホルム/NaOAcを含むコニカルチューブ内に加えられた；混合され、氷上に置かれた。この後の標準的な手順は、当該技術分野で知られている(Sambrook et al.,上記)。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１Ａ】図1Aは、アミノ酸の生物合成における化合物を含む、各種目的生成物に関する炭素の輸送を示した大腸菌内の主要炭素代謝の経路を示している。図1Aからは、(a)グルコースは、ガラクトースパーミアーゼ(GalP)輸送タンパク質によって細胞膜を横切り輸送され、(b)グルコースは、PTSシステム内のPEPによってリン酸化されるために、細胞膜を横切って移動することがわかる。このPTSによるリン酸化は、PTS細胞内のPEPの主たる消費者であり、図の中に示す百分率は、Holms (1986) The central metabolic pathways of Escherichia coli : relationship between flux and control at a branch point, efficiency of conversion to biomass, and excretion of acetate. In : CURRENT TOPICS IN CELLULAR REGULATION, Vol. 28, pp.69-105 Academic Press, New Yorkに述べられている競合する経路内への高められたPRP量を表している。例えば、生産されたPEPの66％は、PTSシステムに用いられる。続く代謝経路は、図の中に概略的に示した：エムデンマイヤホフ経路(解糖系)、ペントースリン酸経路、トリカルボンサン(TCA)回路、芳香環経路、及びエントナードゥドロフ経路である。図中に用いる以下の省略形の意味を示す；PEP=フォスフォエノールピルビン酸；DAHP=3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソネイト-7リン酸；DHQ=３−デヒドロキナ酸塩；DHS=3-デヒドロシキミ酸塩；SHK=シキミ酸；S3P=シキミ酸3-リン酸；EPSP=5-エノールピルビルシキミ酸3-リン酸；PHE=フェニルアラニン；TYR=チロシン；TRP=トリプトファン；Pyk=pyk遺伝子によりエンコードされているピルビン酸キナーゼ；及びPpc=ppc遺伝子によりエンコードされているPEPカルボキシラーゼ。さらに、芳香環経路で用いられている以下の遺伝子の意味を示す；aroBはDHQシンターゼをエンコードしている；aroDはDHQデヒドラーゼをエンコードしている；aroEはシキミ酸デハイドラーゼをエンコードしている；aroL及びaroKはシキミ酸キナーゼをエンコードしている；aroAはEPSPシンターゼ及びaroCはコリスミシンターゼをエンコードしている。特に図示してはいないが、aroG、aroF、及びaroHは、大腸菌内で、エリトロース-4P(E4P)及びPEPからDAHPへの転化を触媒するDAHPシンターゼの3つの酵素をエンコードすることは本技術分野で知られている。
【図１Ｂ】図1Bは、アミノ酸の生物合成における化合物を含む、各種目的生成物に関する炭素の輸送を示した大腸菌内の主要炭素代謝の経路を示しており、さらに、本発明に包含される方法による、各種化合物、炭素流量の増加による生成物の増量及び、PEP利用度を示す。
【図２】図2は、R6Kベクター(pR6K-galP)内でクローンされたSEQ ID No.1のGalP-ptrc DNAカセットのDNA配列を示す。イタリック体及び太字の核酸配列は、loxP配列を表す；太字及び下線の塩基配列は、galPに対する逆伸長における、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を現す；下線の配列は、trcプロモーターの-35領域(TTGACA)及び-10領域(TATAAT)を現す；イタリック体の塩基は、trcプロモーターのlacオペレーターを現す；及び太字はgalP ATG開始コドンを表す(これは実施例1Bに関すものである)。
【図３】図3は、CAT遺伝子の除去後の(SEQ ID NO.2)galP-trc DNA カセットのDNA配列示す(SEQ ID NO.2)。太字及びイタリックの核酸は、trcプロモーター領域を示し、-35ボックス及び-10ボックスはアンダーラインで示した(これは実施例1Eに関連す)。
【図４】図4は、R6Kベクター内のクローンに用いられる、SEQ ID NO.3のglk-trcDANカセットのDNA配列である。イタリック及び太字の塩基配列は、loxP配列を表す；太字及び下線の塩基配列は、glkに対する逆伸長における、CAT遺伝子を現す；下線の配列は、trc誘導プロモーターの-35領域(CTGACA)及び-10領域(TATAAT)を現す；イタリック体の塩基は、trcプロモーターのlacオペレーターを現す；太字の塩基は、glkATG開始コドンを表す(実施例1Fに関連する)。
【図５】図5は、pMCGGのプラスミドマップを表し、関連は実施例1Gである。galP及びglkオペロンリーディングフレーム(orfs)は、それぞれ、trcプロモーターの制御を受け、pACYC177内でクローンされる。Trc=trcプロモーター；galP=ガラクトースパーミアーゼコード配列；glk=グルコキナーゼコード領域；KmR’ =pACYC177のカナマイシン耐性マーカー(クローン遺伝子により切断される)；Amp=pACYC177のアンプリシン耐性マーカー及びori=複製のプラスミドの起点。
【図６】図6は、pTrcm42のプラスミドマップを表し、関連は実施例1Aである。LoxP=loxPサイト；trc=trcプロモーター、laclq=Laclq抑制タンパク質をエンコードしている遺伝子；CAT=CATをエンコードしている遺伝子；5S=5StRNA；rrnBT1及び2=リボゾームRNAターミネーター；Amp=pTrc99aのアンプリシン耐性遺伝子；及びori=複製のpMB1起点。
【図７Ａ】図7Aは、loxP-CAT-loxP-ptrcを含むカセットに組み込まれるスキミ酸プロモータDNAの図表である。カセット全体の側面に配置されるような、好ましい組み込み部位に対するDNA相同性はPCRによって確認される。実施例1E及び1Fを参照されたい。loxP=loxP部位；CAT=クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子；trc=trcプロモーター；及びATG=DNAカセットの組み込みをターゲットとしたグルコース同化遺伝子の開始コドン。
【図７Ｂ】図7Bは、galP(5’フランク)のATG開始コドンの211-183bp上流からgalPの調節領域及び40bp上流及びgalP(3’フランク)のATG開始コドンを含む、相同な40-bpによって側面に設置される、図7AのDANカセットの増幅によって作られる、pR6K-galP-trcのプラスミドマップを説明する。ploxP=loxをエンコードしているプラスミド；loxP=DNAカセットから導入されたloxP配列；trc=trcプロモーター；Km=カナマイシン耐性遺伝子；CATは上と同様；ori=R6Kのプラスミド複製起点。
【図８Ａ】図8Aは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図８Ｂ】図8Bは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図８Ｃ】図8Cは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図８Ｄ】図8Dは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図８Ｅ】図8Eは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図８Ｆ】図8Fは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図８Ｇ】図8Gは、pSYCO101プラスミドの核酸配列を示す(SEQ ID NO.4)。
【図９】図9は、pSYCO101のプラスミドマップを示す。DAR1(デハイドロキシアセトンリン酸リダクターゼ)及びGPP2(グリセロール-リン酸フォスファターゼ)はグリセロール回路遺伝子である；STR(R)は、スペクチノマイシン耐性遺伝子エンコード遺伝子である；pSC101oriはプラスミドの複製の起点である；AspA期間はアスパラギン-アンモニア-リジン-遺伝子ターミネーターである；dhaB1-3、dhaX及びorfW、X、Zは1,3-プロパンジオール経路遺伝子である；Thrアテニュエーター(Thr atten)は大腸菌セロニンオペロンアテニュエーターである；TonB  termは大腸菌tonB遺伝子ターミネーターである；trcはtrcプロモモーター及びEcoR1はpSYCO101内のEcoR1制限酵素部位(実施例1Hを参照)である。
【図１０Ａ】図10Aは、PEP非依存グルコース輸送システムをエンコードしているプラスミドによる大腸菌PTS-/Glu-内の発酵時間(ｈ)における細胞成長を示す。PTS-/Glu-系統、KLpts7(実施例1D)は、pMCGG(実施例1G)及びpSYCO101により形質転換させられ、その結果生じた系統は、細胞成長に関して試験、分析を受けた。光学密度(OD600)は、-◆-で表す。
【図１０Ｂ】図10Bは、PEP非依存グルコース輸送システムをエンコードしているプラスミドによる大腸菌PTS-/Glu-内の発酵時間(ｈ)におけるグリセロール及び1,3-プロパンジオールの生産を示す。PTS-/Glu-系統、KLpts7(実施例1D)は、pMCGG(実施例1G)及びpSYCO101により形質転換させられ、その結果生じた系統は、グリセロール及び1,3-プロパンジオール生成に関して試験、分析を受けた。グリセロール濃度は、-▲-、1,3-プロパンジオール濃度は-■-(黒四角)でそれぞれ表す。
【図１１Ａ】図11Aは、染色体に組み込まれたtrcプロモーターにより制御されるgalPの発現及び自然調節によるgalの発現による、大腸菌PTS-/Glu+内の発酵時間(ｈ)の間の細胞成長を示す。PTS-/Glu-系統、KLpts7(実施例1D)はKgalP-ptrc(実施例1E)系統を生産するため、galPターゲット部位でのtrcプロモーターの統合によりGlu+に形質転換された。この系統はpSYCO103により形質転換され、発酵によって分析された(実施例2)。分析されたパラメーターは、細胞密度(OD600)は(-◆-)で表す。
【図１１Ｂ】図11Bは、染色体に組み込まれたtrcプロモーターにより制御されるgalPの発現及び自然調節によるgalの発現による、大腸菌PTS-/Glu+内の発酵時間(ｈ)の間のグリセロール及び1,3-プロパンジオールの生産を示す。PTS-/Glu-系統、KLpts7(実施例1D)はKgalP-ptrc(実施例1E)系統を生産するため、galPターゲット部位でのtrcプロモーターの統合によりGlu+形質転換された。この系統はpSYCO103により形質転換され、発酵によって分析された(実施例2)。分析されたパラメーターは、グリセロール濃度は-▲-、1,3-プロパンジオール濃度は-■-(黒四角)で、それぞれ表す。
【図１２Ａ】図12Aは、trcプロモーター染色体上への組み込より制御されるgalP及びglkの発現による、大腸菌PTS-/Glu+内の発酵時間(ｈ)の間における、細胞成長を示す。PTS-/Glu-系統、KLpts7(実施例1D)はKLGG(実施例1F)系統を生産するため、galP及びglfターゲット部位でのtrcプロモーターの組み込みによりGlu+形質転換された。この系統はpSYCO101により形質転換され、発酵によって分析された(実施例3)。分析されたパラメーターは、細胞密度(OD600)は-◆-で表す。
【図１２Ｂ】図12Bは、trcプロモーター染色体上への組み込より制御されるgalP及びglkの発現による、大腸菌PTS-/Glu+内の発酵時間(ｈ)の間における、グリセロール及び1,3-プロパンジオールの生産を示す。PTS-/Glu-系統、KLpts7(実施例1D)はKLGG(実施例1F)系統を生産するため、galP及びglkターゲット部位でのtrcプロモーターの組み込みによりGlu+形質転換された。この系統はpSYCO101により形質転換され、発酵によって分析された(実施例3)。グリセロール濃度は-▲-、1,3-プロパンジオール濃度は-■-(黒四角)で表す。
【図１３】図13は、実施例1Gに記載するプラスミドpVHGalPglK11のマップである。
【図１４Ａ】図14Aは、核酸配列(SEQ ID NO.25)及びpVHGalPglK11のgalP及びGlk(SEQ ID NO.26)に対するコード配列である。
【図１４Ｂ】図14Bは、核酸配列(SEQ ID NO.25)及びpVHGalPglK11のgalP及びGlk(SEQ ID NO.26)に対するコード配列である。
【図１４Ｃ】図14Cは、核酸配列(SEQ ID NO.25)及びpVHGalPglK11のgalP及びGlk(SEQ ID NO.26)に対するコード配列である。
【図１４Ｄ】図14Dは、核酸配列(SEQ ID NO.25)及びpVHGalPglK11のgalP及びGlk(SEQ ID NO.26)に対するコード配列である。
【図１４Ｅ】図14Eは、核酸配列(SEQ ID NO.25)及びpVHGalPglK11のgalP及びGlk(SEQ ID NO.26)に対するコード配列である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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