(57)【要約】本発明は、「開いた」位置または「閉じた」位置に存在し得る分子スイッチを含むオリゴヌクレオチドに関する。このプローブの分子スイッチ部分は、特に、この分子スイッチに相補的な配列の同定に感受性である。分子スイッチを含むオリゴヌクレオチドは、あらゆる種類のハイブリダイゼーションプロセスに適用可能である。このオリゴヌクレオチドのスイッチドメインの感受性に起因して、分子スイッチを含むプローブは、特に、１点ミスマッチの同定に有用である。より詳細には、オリゴヌクレオチドの１部分（全てではない）は、ミスマッチ標的から非結合となる。本発明はさらに、研究試薬および臨床診断薬用のこれらのオリゴヌクレオチドを使用するための方法に関する。例示的なオリゴヌクレオチドは、第一のハイブリダイゼーションドメイン、第二の架橋ブロックドメイン、および第三の結合ドメインを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドであって、以下：
（ａ）標的核酸の核酸残基の第一の配列に相補的な核酸領域および
（ｂ）少なくとも１つの架橋ドメインおよび少なくとも１つの結合ドメインを含むスイッチドメインであり、ここで、該領域（ａ）が、該標的核酸の核酸残基の該第一の配列と安定な二重鎖を形成する条件下で、該スイッチドメインが、（ｉ）該結合ドメインに相補的である該標的核酸の核酸残基の第二の配列と（ｉｉ）該結合ドメインに相補的ではない少なくとも１つの核酸残基を含む該標的核酸の核酸残基の第二の配列とを区別し得る、
を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記検出可能な標識から検出されるシグナル量が、前記スイッチドメインのハイブリダイゼーション状態の決定因子である、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記少なくとも１つの検出可能な標識が、蛍光標識である、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
クエンチャーをさらに含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該クエンチャーおよび前記蛍光標識が、該蛍光標識から検出されるシグナル量を調節するために相互作用する、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
クエンチャーおよび第二の蛍光標識をさらに含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該第二の蛍光標識から検出されるシグナル量が、前記領域（ａ）のハイブリダイゼーション状態の決定因子である、オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記スイッチドメインが前記標的核酸にハイブリダイズしない場合に前記少なくとも１つの検出可能な標識から検出されるシグナル量が、該スイッチドメインが該標的核酸にハイブリダイズする場合の前記少なくとも１つの検出可能な標識から検出されるシグナル量に比例して減少する、オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記少なくとも１つの検出可能な標識が、第一の蛍光標識および第二の蛍光標識であり、該第一の蛍光標識および該第二の蛍光標識が、前記スイッチドメインのハイブリダイゼーション状態に依存して、該第一の蛍光標識および／または該第二の蛍光標識から検出されるシグナル量を調節するために相互作用する、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記少なくとも１つの検出可能な標識が、化学発光標識である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項５に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記化学発光標識が、アクリジニウムエステルである、オリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記少なくとも１つの検出可能な標識が、単一の電子伝導体である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドであって、以下：
（ａ）二本鎖標的核酸の核酸残基の第一の配列に相補的な核酸領域、および
（ｂ）少なくとも１つの架橋ドメインおよび少なくとも１つの結合ドメインを含むスイッチドメインであり、ここで、該領域（ａ）が該二本鎖標的核酸の核酸残基の該第一の配列と安定な三重鎖核酸を形成する条件下で、該スイッチドメインが、（ｉ）該結合ドメインに相補的である該二本鎖標的核酸の核酸残基の第二の配列と（ｉｉ）該結合ドメインに相補的ではない少なくとも１つの核酸残基を含む該二本鎖標的核酸の核酸残基の第二の配列とを区別し得る、スイッチドメイン、
を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリー。
【請求項１４】
第一のオリゴヌクレオチドと会合する第一の検出可能な標識および第二のオリゴヌクレオチドと会合する第二の検出可能な標識さらに含む、請求項１３に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーであって、ここで、該タンデムオリゴヌクレオチドアセンプリーが標的核酸にハイブリダイズする場合に該第一の検出可能な標識および／または該第二の検出可能な標識から検出されるシグナル量は、いずれかの該オリゴヌクレオチドが該標的核酸に個々にハイブリダイズする場合の検出される該第一の検出可能な標識および／または該第二の検出可能な標識から検出されるシグナル量に比例して変化する、オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーであって、ここで、前記第一の検出可能な標識および前記第二の検出可能はともに、蛍光標識であり、さらに、前記第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドがともに前記標的核酸にハイブリダイズする場合に、前記第一の蛍光標識が、放射的にエネルギーを前記第二の蛍光標識に移す、タンデムオリゴヌクレオチドアセンブリー。
【請求項１６】
請求項１３に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーであって、ここで、前記第一のオリゴヌクレオチドおよび前記第二のオリゴヌクレオチドの結合ドメインが、少なくとも部分的に前記標的核酸のオーバーラップ領域とハイブリダイズする、タンデムオリゴヌクレオチドアセンブリー。
【請求項１７】
請求項１３に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーであって、ここで、前記第一のオリゴヌクレオチドが、固体支持体に付着される、タンデムオリゴヌクレオチドアセンブリー。
【請求項１８】
５’改変をさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該改変されたオリゴヌクレオチドが、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対して耐性である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、前記領域（ａ）が、１５〜１５０のヌクレオチド長である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、酵素反応におけるプライマーとしての使用に適切であり、前記スイッチドメインが、３’末端に位置付けられ、これによって、該オリゴヌクレオチドが、該スイッチドメインの結合ドメインが前記標的核酸に相補的でない場合には３’伸長を支持しないが、該スイッチドメインの結合ドメインが該標的核酸に相補的である場合には伸長を支持する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、ここで、該オリゴヌクレオチドが、電子伝導性の固体支持体に付着され、そして前記標的核酸へのハイブリダイゼーション量が、電流フロー量を制御する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
サンプル中の、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドの結合ドメインに相補的である標的配列の量を決定するための方法であって、該方法は、以下：ハイブリダイゼーションに適した条件下で請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと該標的核酸を含むサンプルとを接触させる工程；およびスイッチドメインの結合ドメインに相補的である該サンプル中の該標的核酸配列の量の指標として該スイッチドメインのハイブリダイゼーション状態を決定する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
サンプル中の、請求項１５に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーの第一のオリゴヌクレオチドの結合ドメインに相補的である標的配列の量および請求項１５に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーの第二のオリゴヌクレオチドの結合ドメインに相補的である標的配列の量を決定するための方法であって、該方法は、以下：ハイブリダイゼーションに適した条件下で請求項１５に記載のタンデムオリゴヌクレオチドアセンブリーと該標的核酸を含むサンプルとを接触させる工程；および第一の蛍光標識から第二の蛍光標識へのエネルギー移動を測定して各スイッチドメインのハイブリダイゼーション状態を決定する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、マッチした標的またはミスマッチした標的を同定するために使用されるオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、研究試薬および臨床診断薬のためにこれらのオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
本発明の背景の以下の考察は、本発明を理解する際の読者を助けるためにのみ提供され、本発明の先行技術を記載も、構成もしないことが認められる。
【０００３】
基本遺伝学における最近の知識の激増は、特定の広く行き渡っている遺伝変化の存在と、いくつかの非常に一般的なヒト疾患への感受性との間の明解な関連を確証している多数の臨床的追跡研究を生じている。さらに、ヒトゲノムプロジェクトの配列決定の試みは、（疑わしい疾患関連性を確証するための）研究ベースの遺伝関連研究および、明確である場合に、これらの疾患−遺伝子型関連の慣例的診断的臨床治療への転換の両方を必要とする、さらに多くの候補となる疾患遺伝子に寄与する。確証され、かつ評された疾患遺伝子（多くは一般的疾患について）のこの拡大するレパートリーを考えると、これらの臨床ベースおよび／または研究ベースの検出用の、迅速で、感受性で、特異的で、安価なアッセイに対する要求が、急速に高まりつつある。
【０００４】
ゆえに、かつては、珍しくかつ処置不能な古典的「遺伝」病を患う患者に対する、手動で、低容量で、かつ高労働の試験に慣れていた臨床的遺伝試験研究室も、すぐに、よりハイスループットで半自動的な方法の開発を必要とする。分子医学時代への速いアプローチにおいて、これらの新しい遺伝子型決定法は、症候性の患者を診断するためだけでなく、おそらくさらに重要なことには、効率的な予防介入が利用可能であり得る一般的で処置可能な疾患の危険性がある個体を、症候の出る前に（ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ）同定するために利用される。
【０００５】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、疾患の処置および診断、ならびに核酸の同定、定量、および単離についての分子生物学の分野において一般的に使用される方法である。従って、オリゴヌクレオチドの、それらの標的に対する特異性および親和性を増大するための方法を同定することが、重要である。このようにして、効率的で正確な回答を提供する診断薬が、作製され得る。オリゴヌクレオチドの特異性を増大させるための種々の方法は、当該分野で公知であり、この方法としては、長さを増加する工程、交差ハイブリダイズも、非特異的に結合する可能性の低いオリゴヌクレオチドを選択する工程、および高いアニーリング温度を有するオリゴヌクレオチドを設計する工程が挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１２０１−１２０９，１９９５；Ｎｉｃｏｌｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：４９２−４９３，１９９４；Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：４０３９−４０４３，１９９４；Ｂｒｏｗｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：５１４９−５１５２，１９９２参照）。
【０００６】
米国特許第５，７８０，２２３号は、「改善された核酸ハイブリダイゼーションプロセス（これは、改変されたオリゴヌクレオチドを使用する）」を開示し、ここで、「改変されたプローブは、少なくとも１つの人為的ミスマッチを含む」。「従って、適切な天然または非天然の人為的ミスマッチは、好ましくは、普遍的ミスマッチである」。米国特許第５，７８０，２２３号は、１つより多くの人為的ミスマッチを作製する場合、「人為的ミスマッチ間に１０ヌクレオチドのスペーシングが、所望される」ことを示す。さらに、米国特許第５，７８０，２２３号は、「人為的ミスマッチ位置は、プローブ中の総数の約２０％に過ぎない位置を担う」ことを示す。
【０００７】
別の例として、米国特許第６，３６１，９４０号は、「ハイブリダイズされた相補的塩基配列において自身の反対に位置する塩基との水素結合に参入し得ない」「特異性スペーサー」の組み込みが、「標的核酸のためのプローブ核酸の特異性を上昇」し得ることを記載する。米国特許第６，３６１，９４０号は、「２つの特異性スペーサーは、互いに隣接してはならず」、好ましくは「野生型の配列を有する４〜１４のヌクレオチドによって分離される」ことを示す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、核酸のハイブリダイゼーションまたは非ハイブリダイゼーションの検出を改善するための組成物および方法を提供する。特に、「分子スイッチ」領域を含むオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用するために提供される。この分子スイッチ領域は、「開いた」（非ハイブリダイズされた）位置または「閉じた」（ハイブリダイズされた）位置であり得るが、一方、概してオリゴヌクレオチドは、標的配列に対して部分的にハイブリダイズされたままである（図１概略図参照）。開いた位置において、分子スイッチは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間の「ミスマッチ」（すなわち、少なくとも１つの非ハイブリダイゼーション塩基対）の存在を検出するために使用され得る。閉じた位置において、分子スイッチは、オリゴヌクレオチドと標的配列との間の「マッチ」（または、相補的な核酸配列）を検出するために使用され得る。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の位置に相補的である「アンカー」核酸領域を介して標的配列と会合したままである。さらなるこのような領域はまた、所望の場合、オリゴヌクレオチド内に提供され得る。この様式で、オリゴヌクレオチドの他の部分は、オリゴヌクレオチドと標的配列との間に形成されるハイブリッド二重鎖の２つの鎖の完全な「融解」または解離を引き起こすことなく「融解」し得る。あるいは、分子スイッチの設計は、オリゴヌクレオチド全体の不安定化を引き起こし得、解離パラメーター（例えば、融点（Ｔｍ））全体に影響し得る。
【０００９】
分子スイッチ機能は、スイッチドメインによって提供される。このスイッチドメインは、少なくとも２つの特徴を有する：（ｉ）標的配列に相補的な核酸残基を含む結合ドメイン、および（ｉｉ）この結合ドメインから標的配列に結合する第一の核酸領域を物理的に分離する架橋ドメイン。結合ドメインは、好ましくは、標的配列とマッチする場合、少なくとも７５％相補的であるが；ミスマッチ（非ハイブリダイズ性塩基対）と相補的ではない少なくとも１つの核酸残基を含む。架橋ドメインは、非ハイブリダイズ性の普遍的塩基、一般的な（ｇｅｎｅｒｉｃ）塩基またはミスマッチした塩基を含み、スイッチドメインの結合領域と標的配列との間のミスマッチの存在に対して増強した感受性を提供する。１つより多くの分子スイッチはまた、単一のオリゴヌクレオチドまたは組み合わせで使用され得る。
【００１０】
従って、本明細書中で記載される分子スイッチを含むオリゴヌクレオチドは、慣用的なオリゴヌクレオチドを使用する分野で公知であるハイブリダイゼーション法を改善するために使用され得る。このような方法としては、例えば、核酸多型性（例えば、ＳＮＰ（一塩基多型））の検出、種々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、定量的ＰＣＲ、エンドポイントＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ）、ヌクレアーゼ保護アッセイ、発現アッセイ、およびＴ７またはＳＰ６増幅反応の検出が挙げられる。
【００１１】
本発明の第一の局面に従うと、２つの一般的領域を含むオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドの第一の領域は、標的核酸のいくつかの部分と相補的である核酸領域である。この領域は、安定な二重鎖を形成することによって、標的核酸にオリゴヌクレオチドを「アンカー（ａｎｃｈｏｒ）」するために役立つ。本明細書中で使用される場合、用語「相補的」とは、塩基対が、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対の形態の水素結合相互作用または他の水素結合相互作用（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合および逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合が挙げられる）によって標的核酸に保持される（ここで、この塩基対の少なくとも９０％が、標的配列におけるヌクレオチドまたはこれらのアナログと水素結合相互作用を形成する）ことを意味する。このアンカー領域は、約１５〜１０，０００ヌクレオチド長、好ましくは、約３０〜２００ヌクレオチド長、より好ましくは、１５〜１５０ヌクレオチド長であり得る。
【００１２】
第二の領域は、架橋ドメインおよび結合ドメインを含むスイッチドメインである。この結合ドメインは、同一の標的核酸の第二の部分にこのドメインを結合させる核酸配列を含む。この結合ドメインは、架橋ドメインよりもより高親和性で標的核酸と最適にハイブリダイズする。好ましくは、この結合ドメインの核酸配列は、標的核酸に対して７５％よりも相同性が高く、より好ましくは、８０％よりも相同性が高い。結合ドメインと標的核酸のこの第二の部分との間の正確なマッチの場合に、この配列は、完全に相補的である。本明細書中で使用される場合、用語「完全に相補的」とは、２つの核酸配列の間での、１００％の塩基対のマッチをいい、ここで、全ての塩基対は、適切な条件下でハイブリダイズする。好ましくは、上記結合ドメインは、２〜２０の核酸塩基またはこれらのアナログからなり、各々が、マッチする標的とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合を形成する。
【００１３】
上記架橋ドメインは、好ましくは、オリゴヌクレオチドが、例えば、第一の相補的領域を介して標的核酸と安定な二本鎖の二重鎖を形成する条件下で標的配列とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合を形成しない（非ハイブリダイズ性）、普遍的塩基、天然の塩基またはこれらのアナログを含む。本明細書中で使用される場合、普遍的塩基は、疎水的スタッキングが可能であるが、標的核酸配列を含むヌクレオチドまたはこれらのアナログとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合もしくは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合、もしくは関連の水素結合を形成しないリボ塩基アナログおよびデオキシリボアナログである。例としては、５−ニトロインドールデオキシリボシド、３−ニトロピロールデオキシリボシド、ネドラリン（ｎｅｄｕｌａｒｉｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、架橋ドメインは、２〜２０ヌクレオチド長である（本明細書中で使用される場合、「〜」は、その範囲が、整数２、３、４、５、．．．．１８、１９、および２０までの各々を包含することを示すが、本明細書中では便宜上短縮される。この「〜」は、事実上、本明細書中のこれらの整数の各々を表現し、数の可能な組合わせの各々を提供するものとして扱われるべきである）。代替的な実施形態において、架橋ドメインは、架橋ドメイン全体が弱いハイブリダイゼーション特性を有する限り、ハイブリダイズする塩基の最小数を含み得る（好ましくは、全部で５未満のハイブリダイズする塩基）。
【００１４】
スイッチドメインは、オリゴヌクレオチドの第一の領域が、標的核酸と安定な二重鎖を形成する条件下で、（ｉ）上記結合ドメインに相補的である（「マッチ」）標的核酸の核酸残基と、（ｉｉ）上記結合ドメインと相補的でない（「ミスマッチ」）少なくとも１つの核酸残基を含む標的核酸の核酸残基との間を区別し得る。
【００１５】
必要に応じて、上記スイッチドメインはまた、短いループ構造を形成するオリゴヌクレオチドの内部位置と結合し得る約１〜１５のヌクレオチドの内部結合配列を含み得る。この内部結合配列とともに、この結合は、通常、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合の形態をとる。好ましい実施形態において、このスイッチが開いた位置である場合、この内部結合配列は、効果を増幅するために互いに隣接して検出可能な標識を位置付ける。さらに、この内部結合配列は、このスイッチが開いた位置である場合、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの相補的位置の安定性を低下させるために役立ち得る。好ましくは、このスイッチが開いた位置である場合、内部結合配列は、蛍光をより完全にクエンチするために蛍光分子をクエンチング分子と隣接して位置付けるのに役立つ。このスイッチの開いた位置は、オリゴヌクレオチドとマッチしない標的との相互作用に起因し得るか、またはハイブリダイズされない形態でのオリゴヌクレオチドの存在に起因し得る。
【００１６】
オリゴヌクレオチドが酵素反応におけるプライマーとして使用され得る特定の実施形態において、上記スイッチドメインは、３’末端に位置付けられる。この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ標的の存在下で３’伸長を支持せず、マッチした標的との伸長を支持する。本明細書中で使用される場合、「プライマー」とは、一本鎖ＤＮＡテンプレートまたは一本鎖ＲＮＡテンプレートとハイブリダイズされる場合、３’方向にヌクレオチドを付加することによって伸長され得るオリゴヌクレオチドをいう。
【００１７】
従って、本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、普遍的塩基を含む、天然に存在する核酸塩基のポリマーならびに核酸のアナログおよびこれらの誘導体を有するポリマーを包含する。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０〜２００の塩基長であるが、標的核酸の性質およびこのオリゴヌクレオチドを合成するために使用される方法に依存してより長くてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、使用者によって所望される場合、他の成分（例えば、ポリＡテイルまたはポリＴテイル）などを含み得る。
【００１８】
標的核酸は、一本鎖形態または二本鎖形態（または二重鎖形態）の任意のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの混合された配列またはこれらのアナログであり得、これらに、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成または他の水素結合相互作用（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成および逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成が挙げられる）を通じて結合する。このような結合は、一般的に、特異的であり、適切な環境条件下でオリゴヌクレオチドによる標的の検出を可能にする。このような特異性は、存在し得る他の核酸と標的核酸との予期される混合物に適するように標準的手順によって調整される。例えば、特定の状況においては、オリゴヌクレオチドが１つの型の核酸のみを認識し結合する絶対的特異性を有することが好ましく；他の状況においては、競合する核酸の数が、限定され、特異性が減少され得ることが好ましい。当業者は、種々の状況におけるこのような選択を完全に認識する。本明細書中で使用される場合、「二本鎖」形成または「二重鎖」形成とは、水素結合相互作用によって一緒に保持された２つの一本鎖核酸またはこれらのアナログの直線状配列を意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、スイッチドメインに関する「区別する」とは、このスイッチドメインが、マッチしない標的と比較してマッチした標的の存在を検出および／または定量し得るか、またはマッチした標的またはマッチしない標的の存在下でその構造を変化し得ることを意味する。
【００２０】
代表的なハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、緩衝溶液中の塩、温度、ｐＨ、および他の試薬の変更が開発されて、オリゴヌクレオチドと相補的な標的核酸領域との間、特に標的核酸にアンカーするオリゴヌクレオチドの第一の相補的領域の間で二重鎖を形成させる。
【００２１】
好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの検出可能な標識（好ましくは、蛍光標識）を含む。本明細書中で使用される場合、「検出可能な標識」は、光学的、化学的、生化学的、磁気的、電気的、または電磁気的手段を使用して検出され得る化学的部分である。検出可能な標識としては、リガンド結合種（例えば、ビオチン）；化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル）、電子輸送物質（例えば、ダウノマイシンおよびメチレンブルー）；蛍光性化合物、他の化合物の蛍光性を変化させる化合物（例えば、クエンチャー）；光エネルギーを吸収し、そのエネルギーを他の物質に移す化合物（例えば、吸収体）；などが挙げられる。
【００２２】
代表的に、検出可能な標識から検出されるシグナルの量は、容易に定量化される（例えば、発せられる蛍光の量）ことが可能である。さらに好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドの検出可能な標識から検出されるシグナルの量は、スイッチドメインのハイブリダイゼーション状態の決定因子である。本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション状態」は、そのスイッチドメインが開いている（ミスマッチ、一本鎖オリゴヌクレオチド領域）か、または閉じている（マッチ、オリゴヌクレオチド領域は、標的核酸とともに二本鎖である）か否かをいう。その領域が標的と二重鎖となる適切な環境条件下で、この標識が、スイッチドメインが、マッチした標的かまたはミスマッチな標的のどちらかに近接しているかを決定するための機構を提供する場合、シグナルの量は、ハイブリダイゼーション状態の決定因子である。好ましくは、検出可能な標識から検出されるシグナルの量は、スイッチドメインが標的核酸にハイブリダイズしない（ミスマッチ）ことで減少される。この減少は、スイッチドメインが標的核酸にハイブリダイズされる（マッチ）場合に、検出可能な標識から検出されるシグナルの量に比例する。
【００２３】
あるいは、蛍光標識は、スイッチドメインによって形成される二重鎖の量に応答して、その蛍光特性を変化させ得る。本明細書で使用される場合、「蛍光特性における変化」としては、例えば、蛍光の量または蛍光の波長のどちらかにおける変化が挙げられる。二重鎖と会合する場合、蛍光の増加の例は、エチジウムブロマイドおよびそのアナログ、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＢＥＲ  Ｇｏｌｄなどである。この蛍光標識はまた、オリゴヌクレオチドのスイッチ位置の変化に応答して、リガンド交換反応を起こし得る。本明細書中で使用される場合、「リガンド交換」は、キレート化錯体において一つのリガンドを別のリガンドで置換することを意味する。特に興味深いものは、ランタニド蛍光性錯体である。ランタニド蛍光性錯体の蛍光の程度は、そのキレート化錯体中のリガンドに高く依存する。特に興味深いものはまた、スイッチの開放の際に、ランタニドが蛍光を「害する」リガンドと接触し、従ってそのスイッチが閉じる場合にのみ蛍光性シグナルを生じる構造である。
【００２４】
代替的な好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、蛍光標識とクエンチャー部分との両方を含む。本明細書で使用される場合、「クエンチャー」は、蛍光標識から検出されるシグナルの量を調節するために、蛍光標識と相互作用する部分である。代表的には、このクエンチャー部分は、それが物理的に蛍光標識に隣接する場合、蛍光標識によって発せられるシグナルの量を減少させる。従って、開いた位置において、ミスマッチ領域のオリゴヌクレオチドは、蛍光性標識の物理的に近接して、蛍光性標識をクエンチすることが可能である；一方、閉じられた位置においては、この領域は標的核酸とともに二重鎖となり、蛍光標識から物理的に分離され、クエンチャー効果は起こり得ない。
【００２５】
別の代替的な実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、２つの蛍光標識およびクエンチャー部分を含む。この場合において、第一の蛍光標識は、クエンチャーと一緒に上記ようなスイッチドメインのハイブリダイゼーション状態の決定因子である。加えて、第二の蛍光標識は、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドのアンカー領域のハイブリダイゼーション状態の決定因子である。この第二の標識は、標的オリゴヌクレオチド配列とともに形成する二重鎖の量についての内部コントロールとして、オリゴヌクレオチド全体のハイブリダイゼーションのモニタリングを提供する。次いで、第二の標識は、第一の標識から検出されるシグナルの量と比較され、同様にミスマッチの程度の定量化を提供し得るか、またはマッチ標的配列とミスマッチ標的配列との相対的部分の定量化を提供し得る。
【００２６】
さらに別の代替的な実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、２つの蛍光標識を含む。次いでこれら２つの蛍光標識は、相互作用し、このスイッチドメインのハイブリダイゼーション状態に依存するどちらかの標識かまたは両方の標識から検出されるシグナルの量を調節し得る。例えば、第一の蛍光標識は吸収体として役目を果たし得るが、他方第二の蛍光標識はエミッターとして役目を果たし得、この相互作用は、この分子スイッチがその開いた位置にある場合にのみ生じ得る。
【００２７】
別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による消化に対して、このオリゴヌクレオチドを耐性にする５’端の配列の改変を含み得る。本明細書中で使用される場合、この改変はオリゴヌクレオチドの合成によって達成され、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によるオリゴヌクレオチドの５’部分のホスホジエステル結合の切断に対して、オリゴヌクレオチドを耐性にする。このような耐性を与えるための改変としては、リボヌクレオチド、２’ＯＭｅリボヌクレオシド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｓｉｄｅ）、ホスホチオエートインターヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）結合、ホスホジチオエートインターヌクレオチド結合、メチルホスホネートインターヌクレオチド結合、ＰＮＡ誘導体、モルホリノ誘導体、ＬＮＡ（ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））誘導体、ならびに５’−５’結合、末端５’チオホスフェート基、および末端５’アルキルチオホスフェート基によるインターヌクレオチド結合が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、語句「消化に耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）」は、ネイティブのＲＮＡまたはＤＮＡの等価物と比較して、オリゴヌクレオチドが、特にそのオリゴヌクレオチドが標的核酸配列にハイブリダイスされる場合、それらの５’端におけるオリゴヌクレオチドを消化する能力を有する酵素による消化に対して、より耐性であることを意味する。例えば、一本鎖ＤＮＡテンプレートに沿って二重鎖に遭遇する場合に、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する、ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑポリメラーゼによる消化に対する耐性を与え得る。この例において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼが遭遇するオリゴヌクレオチドを、５’端から開始して切断することを試みる（図２の図式を参照のこと）。このオリゴヌクレオチドが未改変のままである場所では、このような酵素による消化に対する感受性は保存される。
【００２９】
別の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは電子伝導性固体表面に付着され得、マッチした標的の量は、電流フローの量を制御する。このような実施形態において、この検出可能な標識は、一個の電子伝導性（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）である。本明細書中で使用される場合、語句「一個の電子伝導性」は、一個の電子を受入れ、他の化学種に一個の電子を移し得る部分をいう。例としては、ヒドロキノン（例えば、ダウノマイシン）が挙げられる。一個の電子を受け入れる能力を有する種は、二重鎖から電子を受入れ、そしてこれらの電子を溶液中の他の種へ移す。この種がオリゴヌクレオチドに対して共有結合することは必要とされない。例えば、これは二重鎖との疎水性相互作用または他の相互作用により会合され得る。非限定的な例は、メチレンブルーであり、これは二重鎖の端の近くに結合する（そして共有結合しない）能力を有し、一個の電子を溶液中（例えば、フェリシアン化合物）に移して、フェリシアン化物の還元の際に色の変化を生じる。
【００３０】
本発明の第二の局面に従って、これらの領域が二本鎖の標的核酸へ結合する能力を有する点を除き、上に記載のものと同じフレームワーク領域を含むオリゴヌクレオチドが提供される。従って、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、このオリゴヌクレオチドの第一の相補的なアンカー領域は、標的核酸と共に安定な三本鎖核酸を形成する。このスイッチドメインは、その結合ドメインに相補的な二本鎖標的核酸と、その結合ドメインに相補的でない少なくとも１つの核酸残基を含む二本鎖標的核酸とを区別することが可能である。
【００３１】
この一本鎖オリゴヌクレオチドの第一の領域は、二本鎖標的核酸の核酸残基の配列に対して相補的であり、従って、安定な三本鎖複合体を形成する。第三の鎖（この場合において、このオリゴヌクレオチド）が、標的二重鎖のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ二重鎖の１つと同じ配位であり、同じ配列を有する場合、認識は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ、逆向きＨｏｏｇｓｔｅｅｎ、または並列認識（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）を通じてされ得る。この三本鎖構造は代表的に、２つの鎖が、従来の塩基対によって互いにハイブリダイズし、そして第三の鎖が、多くの水素結合相互作用の１つによって１本の鎖または両方の鎖を通じて二重鎖と会合する場合に、形成される。これらは、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆向きＨｏｏｇｓｔｅｅｎの水素結合相互作用を使用して、一つの鎖の内在するプリン配列を認識することを含む。別の様式において、第三の鎖は、内在するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合した二重鎖の間に形成された主溝（ｍａｊｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）において、内在するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ二重鎖によって形成された主溝内に結合することによって、結合する。
【００３２】
本発明の第三の局面に従って、上に記載の分子スイッチを含む少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む、タンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリが提供され、ここでこれらのオリゴヌクレオチドは、タンデムに並んで配置される。本明細書中で使用される場合、用語「タンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリ」は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズする場合、それらが並んで配置されるようなハイブリダイゼーションのために使用されることを意味する。一実施形態において、これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの間の標的核酸配列中にハイブリダイズされない標的核酸が存在しないように、並んで配置され得る。あるいは、このオリゴヌクレオチドを分離した標的核酸配列において、１個〜１０個のハイブリダイズされないヌクレオチドの空間が存在し得る。特定の実施形態において、このタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリの１つのオリゴヌクレオチドは、固体支持体（例えば、ガラス表面、プラスチック表面または金属表面）に付着され得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明のタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリは、各オリゴヌクレオチドに会合する検出可能な標識を含む。このタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリが標的核酸にハイブリダイズする場合、どちらかの検出可能な標識かまたは両方の検出可能な標識から検出されるシグナルの量は、どちらかのオリゴヌクレオチドが、独立して標的核酸にハイブリダイズする場合に、どちらかの標識から検出されるシグナルの量に対して変化する。好ましくは、この分離した検出可能な標識は、両方とも蛍光標識であり、ここで第一の蛍光標識は、両方のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズする場合、第二の蛍光標識にエネルギーを非放射的に移す。
【００３４】
別の実施形態において、このタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリは、標的核酸の重複領域と少なくとも部分的にハイブリダイズする能力を有する２つの結合ドメイン（２つのそれぞれのオリゴヌクレオチド構成要素のスイッチドメイン中に）を含む。この実施形態において、このスイッチドメインは、上記のスイッチドメインの各々の近くにおいて同じ標的核酸配列の一部分にハイブリダイズする潜在能力をそれぞれ有する。重複するスイッチドメインは、マッチ標的配列とミスマッチ標的配列とを区別する特異性をさらに増加させるために設計される。これらは、好ましくは、この標的配列が、第一の隣接オリゴヌクレオチドのスイッチドメインとマッチ標的を形成し、この標的配列が、第二の隣接オリゴヌクレオチドのスイッチドメインとミスマッチ標的を形成するように、設計される。この方法において、上記第一および第二の隣接オリゴヌクレオチドのスイッチドメインは、標的核酸と安定な二重鎖を形成するために互いに競合する。さらに、ミスマッチな標的核酸配列を結合する第一の隣接オリゴヌクレオチドのスイッチドメインは、より完全に「開いた」位置で維持される。なぜならば、この標的核酸配列は、より好ましくは、標的核酸配列とマッチを形成する第二の隣接オリゴヌクレオチドのスイッチドメインと安定な二重鎖を形成するからである。
【００３５】
一実施形態において、各々の隣接するオリゴヌクレオチドは、蛍光標識およびクエンチ標識（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）を含み、スイッチドメインがミスマッチ配列と会合する場合、このクエンチャーは、蛍光標識の蛍光強度を減少させる。別の実施形態において、この第一の隣接するオリゴヌクレオチドは、第一の蛍光標識を含み、この第二の隣接するオリゴヌクレオチドは、第二の蛍光標識を含み、第一の隣接するオリゴヌクレオチドのスイッチドメインがマッチする標的と会合する場合、上記第一の標識と上記第二の標識との間を移動する蛍光エネルギーは増強され、そして第二の隣接するオリゴヌクレオチドのスイッチドメインがマッチする標的と会合する場合、上記第一の標識と第二の標識との間を移動する蛍光エネルギーは、減少する。
【００３６】
別の実施形態において、各々の隣接するオリゴヌクレオチドは、化学発光標識（好ましくは、２つの別々に検出可能なアクリジニウムエステル）を含む。これら２つのアクリジニウムエステルは、異なる物理的特性のために検出され得る。一つの例は、異なる比率の光電子放出を有する化学発光アクリジニウムエステルの使用である。これらは、「フラッシャー（ｆｌａｓｈｅｒ）」および「グロウワー（ｇｌｏｗｅｒ）」として言及される。この異なる比率の光電子放出は、インタクトな「フラッシャー」および「グロウワー」の比率が容易に決定されることを可能にする。あるいは、２つの異なる化学発光アクリジニウムエステルによって発せられる光の波長は、反応培地中に存在するインタクトな標識の比率を決定するために使用され得る。
【００３７】
本発明の第四の局面において、サンプル中の、このオリゴヌクレオチドの結合ドメインに相補的な標的配列の量を決定するための方法が提供される。発明の方法は、ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、上に記載の分子スイッチを含むオリゴヌクレオチドを、標的核酸を推定上含むサンプルと接触させる工程を包含する。次いで、このスイッチドメインのハイブリダイゼーション状態が、スイッチドメインの結合ドメインに相補的な上記サンプル中の標的核酸配列の量の目安として決定される。
【００３８】
このような発明の方法は、定量的ＰＣＲアッセイまたはエンドポイントＰＣＲアッセイにおける本発明のオリゴヌクレオチドの使用を含む。定量的ＰＣＲアッセイでは、マッチした標的配列の量は、ＰＣＲ増幅反応の間に決定され、エンドポイントＰＣＲアッセイでは、マッチした標的配列の量は、ＰＣＲ増幅反応の完了の後に決定される。発明の方法はまた、リアルタイムのＴ７またはＳＰ６の増幅反応における本発明のオリゴヌクレオチドの使用を包含する。Ｔ７およびＳＰ６は、二重鎖中に挿入されたプロモーターとともにＤＮＡ二重鎖を最初に形成することによって、標的核酸配列を増幅するために使用される細菌プロモーターをいう。この増幅の生成物は一本鎖ＲＮＡであり、したがって代表的に、この発明のオリゴヌクレオチドは、増幅プロセスによって生成される場合の一本鎖ＲＮＡを検出するために使用される。この型の反応はまた、上に記載のＰＣＲ反応について、リアルタイムかまたはエンドポイントでモニタリングされ得る。
【００３９】
本発明の第五の局面において、サンプル中の、本発明のタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリの第一のオリゴヌクレオチドの結合ドメインに相補的な標的配列（ここで２つのタンデムなオリゴヌクレオチドは両方とも蛍光標識を含む）の量と、このタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリの第二のオリゴヌクレオチドの結合ドメインに相補的な標的配列の量とを決定するための方法が、提供される。これらの発明の方法は、ハイブリダイゼーションに適切な条件下で、このタンデムなオリゴヌクレオチドアセンブリを、標的核酸配列を推定上含むサンプルと接触させる工程を包含する。次いで、第一の蛍光標識から第二の蛍光標識へのエネルギーの移動が、各スイッチドメインのハイブリダイゼーション状態を決定するために測定される。
【００４０】
（発明の詳細な説明）
「分子スイッチ」を生成するための普遍的な塩基、天然の塩基またはそれらの類似体の使用を本明細書中に開示する。ここでこの「分子スイッチ」は、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーのサブドメインを生成し、これは、ミスマッチの存在に対する感度を増強している。このようにして、このプローブまたはプライマーの「分子スイッチ」部分は、ハイブリダイズされる核酸標的から、プローブまたはプライマーの全体が解離することを必要とすることなく、「開放」または「閉鎖」し得る。本明細書中に示されるように、この「分子スイッチ」が、「開放」位置または「閉鎖」位置にあるスイッチに対して感応性の検出方法と組み合わせられる場合、標的配列の配列中の小さな変化を検出する能力が増幅される。本明細書中に示されるように、オリゴヌクレオチドに普遍的な塩基を含む分子スイッチの取り込みによって、単一ヌクレオチドほど小さい差異である核酸の相違を増幅する。実際に、本明細書中に提供される実施例に示されるように、４〜６個の普遍的な塩基および天然の塩基に結合する５〜８個の水素を含む例示的な「分子スイッチ」構築体の存在は、３５℃の範囲を超えて単一のミスマッチを識別することが可能であった。それと比較して、全ての天然の塩基を含むオリゴヌクレオチドは、３℃〜５℃のみの効果を生じる。本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドは、非常に特異的であることが見い出された。「標的」によって、検出、定量、または増幅などされるべき核酸配列が意味され、この核酸配列は、増幅されるか、または増幅されず、そして一本鎖または二重鎖である、ＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはその類似体のいずれかからなる。
【００４１】
分子スイッチの存在が、たとえ単一のミスマッチ（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））であっても検出する能力を非常に顕著に増加させることを本明細書中にさらに開示する。一つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その長さに沿って連続的に、第１のハイブリダイズする「相補的領域」、第２のハイブリダイズしないドメインまたは部分的にハイブリダイズしないドメイン（本明細書中において「架橋ドメイン」と称される）、および第３のハイブリダイズするドメイン（本明細書中「結合ドメイン」と称される）を含む別々のドメインを含むように設計され、ここでこの相補的ドメインおよび結合ドメインは、同定されるべき配列に対して特異的である。さらに「結合ドメイン」は、対応する「相補的領域」よりも標的配列に対して低親和性を有する。オリゴヌクレオチド、プローブ、またはプライマーのスイッチドメインは、「架橋ドメイン」および「結合ドメイン」を含み、その結果、オリゴヌクレオチド、プローブ、およびプライマーのようなその最も単純な形態は、相補的領域およびスイッチドメインからなる。さらなる実施形態において、検出されるべきＳＮＰまたは多型は、スイッチドメインの「結合ドメイン」内に配置され、その標的配列に対する相補的領域よりもその対応する標的配列に対して低い親和性を有する。この様式において、プローブおよびプライマーを含むオリゴヌクレオチドの一部は、オリゴヌクレオチドとその対応する標的核酸配列との間に形成された全長ハイブリッド二重鎖の完全な「融解」または解離を生じることなく「融解」することが可能である。あるいは、このスイッチドメインの存在は、全長オリゴヌクレオチドの安定性を変化し得、例えば、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）に影響を及ぼし得る。このような状況下において、このスイッチが、開放位置にある場合、全長オリゴヌクレオチドは、不安定化する。対照的に、開放位置における「弱い」スイッチドメインは、全長オリゴヌクレオチドの安定性に最小限に影響を及ぼす（すなわち、Ｔｍは、定常を保つ）。
【００４２】
ある様式において、オリゴヌクレオチドが、「３部からなる」構築体を有する場合、これはまた、上記の３個のドメインが、含まれる限り、４個、５個またはそれ以上のサブドメインを含み得る。さらに、このオリゴヌクレオチドのスイッチドメインは、このオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に限定される必要はない。オリゴヌクレオチドはまた、このスイッチドメインが、オリゴヌクレオチドの内部に設計されるように構築され得る。一般に、このオリゴヌクレオチドのスイッチドメインは、２〜１１個の普遍的な天然の塩基、一般的な天然の塩基、またはミスマッチの天然の塩基および標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ二重鎖相互作用を形成する「結合ドメイン」を含む「架橋ドメイン」を含む。用いられ得る検出系は、プローブの一部が、「開放」または「閉鎖」であるのかを同定することが可能である。これを可能とする検出系としては、蛍光系、化学発光系、電子伝導系、比色分析系などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、このスイッチの「開放」位置または「閉鎖」位置は、異なる様式において、このスイッチの「開放」形態または「閉鎖」形態のいずれかに作用する酵素系と結合され得る。
【００４３】
さらに、分子スイッチが、このスイッチ付近の標的核酸領域内の非常に微妙な変化に対する応答において、「閉鎖」位置に対する「開放」位置にあることによってセンサーとして用いられ得るという事実により、多数の異なるフォーマットが、分子スイッチオリゴヌクレオチドを使用することが可能となる。分子スイッチオリゴヌクレオチドの特徴付けの過程において、このスイッチが、核酸標的配列に対するオリゴヌクレオチドに対して全体的な不安定化効果を有しても、有しなくても良いように設計され得るということが、また本明細書中に開示される。この分子スイッチの正確な構造は、２つの主要な効果を有した。第１に、スイッチが不一致の標的配列に応答して「開放」位置または「閉鎖」位置を占めることが可能である容易性は、「結合ドメイン」内のヌクレオチドの数および型によって容易に制御され得る。第２に、一致した核酸標的とのスイッチドメインの結合ドメインの安定性に依存して、このオリゴヌクレオチドのスイッチドメインは、ミスマッチ標的配列と比較して一致した標的配列に対するオリゴヌクレオチドの付加的な安定性に関与し得る。結果として、一致した標的およびミスマッチ標的のそれぞれに応答するスイッチドメインの「閉鎖」および「開放」だけではなく、また、「閉鎖」の場合の、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性の増加と比較した、「開放」の場合の、標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性の減少に関与し得る。標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性の増加および減少は、オリゴヌクレオチドと標的との間に形成される二重鎖の融解のＴｍの変化によって容易に観察される。あるいは、このスイッチドメインは、オリゴヌクレオチドの安定性に顕著に関与しないように構築され得るが、ミスマッチ標的と比較して一致した標的の存在に対してさらに高く応答する。この条件下において、このスイッチドメインは、標的に対するオリゴヌクレオチドのあるかないかの安定性に関与し、一致した標的とミスマッチ標的との区別は、「分子スイッチ」の「閉鎖」位置に対する「開放」位置によって単独で決定される。
【００４４】
オリゴヌクレオチドのスイッチドメインが、これら自体のハイブリダイゼーション特性を有するように構築され得るという事実により、多数のアッセイフォーマットが、あらかじめ可能ではない方法で用いられ得る。例えば、タンデムのオリゴヌクレオチドが用いられ得、ここでスイッチドメインが、タンデムのオリゴヌクレオチドの一つの５’末端におよび他方のタンデムのオリゴヌクレオチドの末端の３’位置に構築され、その結果この二つのスイッチ領域は、これら二つのタンデムのオリゴヌクレオチドが、共通の標的配列にハイブリダイズする場合、互いに対して配向される。さらに、検出可能な標識が、これら二つのスイッチドメインの末端へまたは末端付近に取り込まれ得、これら二つのスイッチドメインが、標的配列と結合する場合にのみ、固有のシグナルを提供する。蛍光共鳴エネルギー移動のプロセスを介した活性が検出可能である例は、標識である。これによって、ミスマッチの標的に対する一致した標的の非常に正確な識別方法を提供し得る。さらに、個々のオリゴヌクレオチドは、個々のタンデムのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズしない場合に、蛍光のバックグラウンドを減ずるクエンチ部分を含み得る。これによって、ハイブリダイズしていないプローブに関連するバックグラウンドが、診断ならびにインビボアッセイフォーマットおよびインサイチュアッセイフォーマットの両方のために、非常に低くあることが必要である場合に、理想的な実用性を提供する。
【００４５】
さらに、標的配列に対するハイブリダイゼーションのための近接するオリゴヌクレオチドが、構築され得、ここで各オリゴヌクレオチドのスイッチドメインが、標的配列に対する可能なハイブリダイゼーションと重複する。このスイッチドメインがさらに、構築され得、その結果、一標的配列の存在下において、一スイッチは、「閉鎖」し、そして異なる標的配列に応答して他のスイッチが、「閉鎖する」。このようにして、一スイッチが、「閉鎖」する場合、他方は、より完全に「開放」が維持されるので、これらのスイッチは、互いに競合し、さらにより決定的に標的配列を識別する。またさらにこのタンデムプローブのスイッチドメイは、スイッチドメインが、「開放」位置にあるという決定を提供する異なる検出可能な標識を用いて標識され得る。さらに、このスイッチドメインは、標的配列に対するハイブリダイゼーションについて競合し、ここで、この標的のミスマッチの状態に対する一致した状態に依存して、一スイッチは、「開放」であり、そして他のスイッチは、「閉鎖」である。
【００４６】
本発明のさらに別の用途において、３０〜２００の水素結合するヌクレオチドを含む長いオリゴヌクレオチドが、分子スイッチと結合され得る。この種の構造のオリゴヌクレオチドは、標的配列を有する非常に安定した二重鎖を形成し得、このオリゴヌクレオチドが侵入することを可能にし得、標的核酸の折りたたまれた二次構造に関連する問題を克服し得、同時に、さらにこのオリゴヌクレオチドが、このオリゴヌクレオチドのスイッチドメインの標的識別特性により、一致した標的配列とミスマッチの標的配列との間の非常に小さな差異を検出することを可能にする。
【００４７】
またさらなる実施形態において、２個〜８個のヌクレオチドの短い断片が、結合ドメインに結合され「クランプドメイン」を生成し得る。この「クランプドメイン」の目的は、結合ドメインが、「開放」である場合、別の標識に近接する一つの標識を配向する。好ましい実施形態は、さらに蛍光標識をクエンチャーの隣に配向し、その結果この蛍光標識による蛍光が、スイッチ「開放」位置内でより完全にクエンチされる。本発明のこの様式は、クランプドメインによる内部塩基の結合における、オリゴヌクレオチドの相補的領域が、クランプドメインに関連するようになる相補的領域の一部の塩基対により、標的配列に対する親和性を緩めるというさらなる利点を有する。
【００４８】
（オリゴヌクレオチド）
従って、上記オリゴヌクレオチドの種々の実施形態は、スイッチドメインの一部として「架橋ドメイン」を形成する普遍的なの非天然の塩基および／もしくは天然の塩基ならびに／または他の非天然の塩基および／もしくは天然の塩基を含み、そして種々の疾患を診断および処置するために試薬、プライマーおよびプローブとしてこのようなオリゴヌクレオチドを用いる方法を含む。この目的に用いられるように構築され得るオリゴヌクレオチドの実施形態は、米国特許出願０９／９３１，７３２（２００１年８月１６日出願）、同０９／９３２，１２９（２００１年８月１６日出願）、同０９／１３６，０８０（１９９８年８月１８日出願）、および同１０／１４２，７２９（２００２年５月８日出願）に見出され得る（これら全ては、その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【００４９】
ある文脈の中で、用語「普遍的な塩基」は、任意の核酸塩基に置換され得る部分を記載するために用いられる。この普遍的な塩基は、ハイブリダイゼーションに寄与する必要は無いが、ハイブリダイゼーションから顕著に取り除かれるべきではない。普遍的な塩基としては、２−デオキシイノシン、２−デオキシネブラリン、天然のヌクレオチド（例えば、イソシチジン、イソチミジンおよびイソグアニン）の誘導体、ならびに５−ニトロインドールおよび３−ニトロピロールのリボ誘導体およびデオキシリボ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、これら普遍的な塩基、天然の塩基の類似体、または天然の塩基は、並列され単一の「架橋ドメイン」を形成する。望ましくは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、または１１個の普遍的な塩基、天然の塩基もしくは天然の塩基の類似体は、「架橋ドメイン」内に並列され、そしてオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドの長さおよび所望される効果に応じて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個の架橋ドメインを含み得る。さらに、ある実施形態は、スペーサー９、スペーサー１８、スペーサーＣ３のような非核酸リンカーまたは、ｄＳｐａｃｅｒのような矢歩のスペーサーを含み、その結果この分子により大きな可撓性を与える。
【００５０】
さらに、このオリゴヌクレオチドは、特異的な位置で所望される標識の結合を可能とするために内部リンカーアーム部位または末端リンカーアーム部位を含み得る。これらのリンカーアームは、核酸塩基もしくはチミジンでの５−アリル置換のようなバックボーンに結合され得るか、またはＣ７  Ｕｎｉｌｉｎｋｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような非ヌクレオチドリンカーアームとしてこの配列へ挿入され得る。あるいは、標識は、用いられるＤＮＡ合成条件に適切なシントンとしてこの標識に取り込まれることによって、オリゴヌクレオチド内の所望される位置で配置され得る。ＤＮＡ合成の間のこの標識の直接的な取り込みのために、この標識は、核酸塩基に結合され得るか、またはヌクレオチド構成要素を欠く標識自体のシントンとして提供され、このオリゴヌクレオチド配列の内部に挿入されるかまたはこのオリゴヌクレオチドの３’末端位置もしくは５’末端位置に結合され得る。標識を取り込むための別の方法は、ＤＮＡ合成の開始際に、この標識が、合成オリゴヌクレオチドへ取り込みが生じるように、ＤＮＡ合成に用いられる固体支持体へ結合された標識を有するものである。このような標識方法は、当該分野において周知である。
【００５１】
非天然の塩基が、オリゴヌクレオチド内の天然の塩基と置換され、オリゴヌクレオチド（特に、「結合ドメイン」の領域）の親和性を改変し得ることが、さらに企図される。代表的に、特異的に水素結合するヌクレオチドに対するより高い親和性が、所望されるが、より低い親和性もまた、用いられ得る。このような種類の改変は、単一のヌクレオチド多型または多型部位を正常な部位から識別する能力を増加させる。ミスマッチの識別をさらに助長するためにスイッチドメインの「結合ドメイン」にこのような非天然の塩基を取り込むことが特に望ましい。
【００５２】
実施形態としては、少なくとも１０％の普遍的な塩基、非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体または普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体との混合体を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。他の実施形態としては、少なくとも１１％、１２％、１５％、２０％もしくは３０％の普遍的な塩基、一般的な塩基または普遍的な塩基と一般的な塩基との混合体を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなる実施形態は、少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、もしくはそれ以上の普遍的な塩基、非水素結合の天然の塩基またはその類似体あるいは普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基またはその類似体との混合体ならびに識別を増強するためにＳＮＰ位置に配置された非天然の塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
一実施形態において、普遍的な塩基としては、２−デオキシイノシン、２−デオキシネブラリン、イソ−シトジン（ｉｓｏ−ｃｙｔｏｄｉｎｅ）、イソ−チミジンおよびイソ−グアニンのような天然のヌクレオチドの誘導体、ならびに５−ニトロインドールおよび３−ニトロピロールのリボ誘導体およびデオキシリボ誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ある局面において、これらの普遍的な塩基、非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体または普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体との混合体は、並列される。望ましくは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、または８個の普遍的な塩基、非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体または普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体との混合体が、並列される。
【００５４】
ある局面において、普遍的な塩基、非水素結合の天然の塩基、水素結合の塩基、およびその類似体は、混合され、オリゴヌクレオチドの「架橋ドメイン」を形成することがまた望ましくあり得る。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸中の天然の塩基に水素結合する天然の塩基または非天然の塩基類似体を含み得る。さらに、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、天然の塩基もしくは非天然の塩基類似体または他の改変体を含み得、この他の改変体は、任意の天然の塩基と比較して、天然の塩基に対する低い親和性もしくは高い親和性を有するか、または天然の塩基に対して水素結合する能力を有する。「非天然に生じる塩基」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ以外の塩基を意味し、縮重塩基および普遍的な塩基ならびに天然の塩基または非天然に生じる塩基に対して特異的に結合することが可能である部分を含む。非天然に生じる塩基としては、プロピニルシトシン、プロピニルウリジン、ジアミノプリン、５−メチルシトシン、７−デアザアデノシンイソ−グアニン、イソ−シトシン、イソ−チミジン、および７−デアザグアニンが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態としては、普遍的な塩基、非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体を有するオリゴヌクレオチドまたは並列される普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体との混合体が挙げられる。一実施形態において、並列塩基の数は、２個以上である。一実施形態において、並列塩基の数は、４個以上であり、５個以上、６個以上、７個以上、および８個以上が挙げられるが、これらに限定されない。この並列塩基は、任意の天然の塩基に置換され得、および種々の異なる天然の塩基に置換され得る。この並列塩基は、ミスマッチに由来する１ヌクレオチドに近似し得る。別の実施形態は、少なくとも４個の並列核酸を普遍的な塩基または非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体あるいは普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体との混合体で置換することによってオリゴヌクレオチドの特異性を増加させる方法に関する。別の実施形態は、少なくとも５個、６個、７個またはそれ以上の並列核酸を普遍的な塩基または非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体あるいは普遍的な塩基と非水素結合の天然の塩基もしくはその類似体の混合体で置換することによってオリゴヌクレオチドの特異性を増加させる方法に関する。
【００５５】
ある実施形態は、二重標識化プローブ系との組み合わせにおいて分子スイッチ含有プローブを用いるものである。さらなる実施形態において、「架橋ドメイン」は、第１と第２の標識の間で置換され、その結果オリゴヌクレオチドの「分子スイッチ」部分は、第１または第２の標識のいずれかを含む。本実施形態のなおさらなる局面は、この第１および第２の標識の配向または近傍における相互の変化であって、その結果この変化の際、第１もしくは第２の標識のいずれかまたは両方の特性における検出可能な変化が存在し、その結果、相関関係が、「閉鎖」される「分子スイッチ」と対照的に「開放」される「分子スイッチ」を用いて作成され得る。次いでこの実施形態は、スイッチドメインに対して相補的である標的配列部分の配列の前後関係を直接的に決定することを可能とする。一実施形態において、このスイッチドメインは、ミスマッチの有無を検知するように設計される。またさらなる実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、ミスマッチが存在する場合、「スイッチドメイン」に結合するクエンチャーが、第２の蛍光標識とより密接に関連するように設計される。この関連は、ミスマッチが存在する場合、蛍光標識の蛍光発光を選択的にクエンチする。したがって、クエンチされた蛍光発光は、ミスマッチの存在を示す。
【００５６】
分子エネルギー移動（ＭＥＴ）は、エネルギーが、供与分子と受容分子との間を非放射的に通過することによるプロセスである。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、ＭＥＴの蛍光形態である。ＦＲＥＴは、特定の化学化合物の特性から生じ、光の特定の波長に曝露されることによって励起された場合、異なる波長で光を発する（すなわち、蛍光を発する）。このような化合物は、フロオロフォアと命名される。ＦＲＥＴにおいて、エネルギーは、フロオロフォアである供与分子と受容分子との間を長距離にわたって（１０〜１００Å）非放射的に通過する。この供与分子は、光子を吸収し、受容分子へこのエネルギーを非放射的に移動させる。Ｆｏｒｓｔｅｒ，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．Ａ４：３２１−３２７（１９４９）；Ｃｌｅｇｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｙａｚｙｍｏｌ．２１１：３５３−３８８（１９９２）を参照のこと。
【００５７】
適切な蛍光部分としては、当該分野において公知である以下のフルオロフォアが挙げられる：
４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸
アクリジンおよび誘導体：
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタリミド−３，５ジスルホン酸塩（ルシファーイエロー  ＶＳ）
Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  ＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ（ＢＨＱＴＭ）色素（ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ
ブリリアントイエロー
クマリンおよび誘導体：
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １５１）
Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）
シアノシン
４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）
７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミンペンタアセテート
４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸
４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−塩化スルホニル（ＤＮＳ、塩化ダンシル）
４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
ＥｃｌｉｐｓｅＴＭ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）
エオジンおよび誘導体：
エオジン
エオジンイソチオシアネート
エリトロシンおよび誘導体：
エリトロシン  Ｂ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセインおよび誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオロセイン（ＤＴＡＦ）
２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオロセイン（ＪＯＥ）
フルオロセイン
フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオロセイン（ＨＥＸ）
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）
フルオレスカミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
マラカイトグリーンイソチオシアネート
４−メチルウンベリフェロン
オルトクレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラロザニリン
フェノールレッド
Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）
ヨウ化プロピジウム
ピレンおよび誘導体：
ピレン
ピレンブチレート
スクシニミジル  １−ピレンブチレート
ＱＳＹ（登録商標）７、ＱＳＹ（登録商標）９、ＱＳＹ（登録商標）２１、ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）
Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド  ３Ｂ−Ａ）
ローダミンおよび誘導体：
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リサミンローダミンＢ塩化スルホニル
ローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１２３
ローダミングリーン
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾリン酸（ｒｏｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）
テルビウムキレート誘導体。
【００５８】
オリゴヌクレオチドの実施形態は、５’ヌクレアーゼ耐性領域を含み得るか、または５’ヌクレアーゼ活性に対して耐性であるように改変され得る。
【００５９】
実施形態はまた、上記のオリゴヌクレオチドを作製する方法を含む。例えば、一実施形態は、「分子スイッチ」を含むオリゴヌクレオチドを設計する方法に関連する。一実施形態において、この方法は、標的配列に対応するか、または相補的な配列を同定する工程、および上記配列において２〜１１塩基を、ユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいは、ユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物で置換する工程、を包含する。この２〜１１塩基の置換は、標的配列と標的領域中の下流配列または上流配列との間に「架橋ドメイン」を生成すると想定される。さらなる実施形態において、この「架橋ドメイン」は、その標的に対して架橋ドメインの相対する側の配列よりも、低い親和性を有する。
【００６０】
例えば、特定のＳＮＰが同定される場合、プローブは少なくとも以下の３つのドメインを含むよう構築され得る：ＳＮＰ上流の第１のハイブリダイズする相補ドメイン、上記の２〜１１個の置換を有する架橋ドメイン、およびＳＮＰを認識する結合ドメイン。この結合ドメインは、相補領域ドメインと比較して、標的に対してより低い親和性を有するよう構築され得る。この方法において、標的がＳＮＰを含まない場合、相補領域はなおハイブリダイズし得、そして結合ドメインはハイブリダイズしない。妥当な検出系と共に、これはサンプルにおけるＳＮＰの存在を同定するために使用され得る。
【００６１】
一実施形態において、この「架橋ドメイン」は、約２〜５０個のユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物を含む。さらなる実施形態において、この「架橋ドメイン」は、約２〜２０個（３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個および１９個が含まれるが、これらに限定されない）のユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物を含み、好ましくは２〜１２個、好ましくは４〜１２個、５〜１０個、４〜６個、６〜８個および４〜７個を含む。あるいは、５〜１２個の置換（６〜１２個、７〜１２個、８〜１２個および９〜１２個を含む）を含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、これらの塩基のいくつかは、プローブのハイブリダイズ可能な部分において含まれ得る。さらなる実施形態において、このプローブのハイブリダイズ可能な部分は、約５〜２００塩基長（５〜５０塩基長、５〜２０塩基長、５〜８塩基長、５〜９塩基長、５〜１０塩基長、５〜１１塩基長、５〜１２塩基長、５〜１３塩基長、５〜１４塩基長、５〜１５塩基長、５〜１６塩基長、５〜１７塩基長、５〜１８塩基長、５〜１９塩基長、６〜９塩基長、７〜１０塩基長および８〜１２塩基長が含まれるが、これらに限定されない）であり得、そして以下の代替的な塩基を含み得るが、これらに限定されない：天然塩基、天然塩基アナログ、標的核酸内の天然塩基に水素結合する非天然塩基アナログ、または他の改変体。「天然に存在しない塩基」とは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵ以外の塩基を意味し、変性塩基およびユニバーサル塩基、ならびに天然塩基または天然に存在しない塩基に特異的に結合可能な部分が挙げられる。さらなる実施形態において、相補領域は、結合ドメインより多い塩基からなる。さらなる実施形態において、相補領域は、その標的に対し、結合ドメインよりも高い親和性を有する。従って、目的の特定配列（例えば、ＳＮＰまたは多型）を認識する結合ドメインは、相補領域よりも低い親和性を有する。
【００６２】
さらなる実施形態は、オリゴヌクレオチドの相補領域と結合ドメインとの間で、塩基の総数の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％または３０％を、ユニバーサル塩基またはジェネリック塩基で置換する方法に関する。さらなる実施形態は、相補領域と結合ドメインとの間で、塩基の総数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％または４０％を、ユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物で置換する方法に関する。
【００６３】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドはまた、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の同定のために明らかに有用であるとしても、オリゴヌクレオチドを利用する他の従来の方法（例えば、診断、ハイブリダイゼーション、配列決定など）についても有用である。本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチドが使用される当該分野における当業者に公知の、ほとんどの方法において使用され得る。多くの方法が、ＳＮＰを検出する上記オリゴヌクレオチドの使用に関連するにもかかわらず、さらなる実施形態はまた、上記オリゴヌクレオチドのプライマーとしての使用（例えば、ＴＡＱＭＡＮＴＭアッセイ、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲと組み合わせて）、プローブとしての使用（例えば、ＨＰＳＡＴＭ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＥＡＣＯＮＴＭ、ＨＹＢＰＲＯＢＥＴＭ、ＣＰＴＴＭおよびＩＮＶＡＤＥＲＴＭアッセイ、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションまたはライブラリーハイブリダイゼーションと組み合わせて）、アレイにおける使用（例えば、チップベースのアレイ、ペプチド／核酸仮想アレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、アンチセンススキャンニングアレイまたはプレート型アレイ）およびオリゴヌクレオチドに関する他の技術における使用（例えば、５’または３’ＲＡＣＥまたは関連する技術）を包含する。本明細書中に使用される用語「プローブ」は、標的核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドまたは標的配列を固定化するためのオリゴヌクレオチドを意味し、一方、用語「プライマー」は、標的核酸を増幅または伸長するために使用され得るオリゴヌクレオチドをいうために使用される。従って、複数の実施形態は、従来の診断技術と組み合わせる具体化されたオリゴヌクレオチドを利用する診断方法に関連する。
【００６４】
上記オリゴヌクレオチドは、実質的に任意の配列および任意の長さの配列であり得、上記オリゴヌクレオチドは、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％以上、または５０％以下のユニバーサル塩基もしくは非水素結合する天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合する天然塩基またはそれらのアナログの混合物を含み、ここで塩基の少なくとも５％が、相補領域と結合ドメインとを分離する。さらに、上記結合ドメインは、ＳＮＰまたは多型のような特定の配列を認識する。用語「オリゴヌクレオチド」は、非核酸アナログおよびポリマーを含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドあるいは非核酸アナログおよびポリマーを含まないＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドからなる分子を指すために使用される。いくつかの実施形態において、上記ユニバーサル塩基もしくは非水素結合する天然塩基またはそのアナログ、あるいは上記ユニバーサル塩基および非水素結合する天然塩基またはそのアナログの混合物は、並列され、そして他に、少なくとも二つのユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物のクラスターが、オリゴヌクレオチド中に存在する。一実施形態において、配列は、疾患との関連を有するＳＮＰまたは他のジェネリックマーカーの存在または非存在を同定するために使用され得る、既存のプローブに対応する。例示的な配列は、嚢胞性線維症（例えば、米国特許第６，２０１，１０７号（本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）を参照のこと）、鎌状赤血球貧血（例えば、米国特許第４，６８３，１９４号（本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）を参照のこと）、ヘモクロマトーシス（例えば、米国特許第６，０２５，１３０号（本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）を参照のこと）および癌（例えば、米国特許第６，１９４，１５８号（本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）を参照のこと）に罹患する偏好を示すものである。疾患に対する偏好を示す当業者に公知の他の配列が、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドを生成するために使用され得るということが理解されるべきである。
【００６５】
オリゴヌクレオチド合成は、改変された塩基およびバックボーン連結を含むオリゴヌクレオチドの合成のように当該分野において公知である。実際に、そのようなオリゴヌクレオチドは、供給者に特定の配列および組成情報およびカスタム製造の要求とともに提供すると、市販の供給源からしばしば得られ得る。しかしながら大半の事例において、オリゴヌクレオチドの長さが１００塩基未満であるにもかかわらず、実施形態は、約５〜約１０，０００ヌクレオチド長、より具体的には１０〜約３００ヌクレオチド長、好ましくは１２〜約２００ヌクレオチド長、好ましくは１５〜約１００ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜約５０ヌクレオチド長、そして最も好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチド長であり得る。
【００６６】
上記オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡおよび／またはＲＮＡにハイブリダイズする分子を生じ得る任意のバックボーンおよび任意の配列を利用し得る。適切なバックボーンの例としては、ホスホジエステルおよびデオキシホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびデオキシホスホロチオエート、２’−Ｏ−置換ホスホジエステルおよびデオキシアナログ、２’−Ｏ−置換ホスホロチオエートおよびデオキシアナログ、モルホリノ、ＰＮＡ（米国特許第５，５３９，０８２号、本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）、２’−Ｏ−アルカリメチルホスホネート、３’−アミデート、ＭＭＩ、アルキルエーテル（米国特許第５，２２３，６１８号、本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）および、その他米国特許第５，３７８，８２５号、米国特許第５，４８９，６７７号および米国特許第５，５４１，３０７号（全て、本明細書においてその全体が参照として明確に援用される）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮａｓｅ活性が所望される場合、ＲＮａｓｅ基質として機能し得るバックボーンが、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して利用される。
【００６７】
本明細書に記載される実施形態とともに使用されるのに適する、ユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物としては、５−ニトロインドール、デオキシリボシド、３−ニトロピロールデオキシリボシド、４−ニトロベンゾイミダゾールデオキシリボシド、デオキシネブラリン、デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−ＯＭｅ  ５−ニトロインドールリボシド、２’−ＯＭｅ  ３−ニトロピロールリボシド、２’−Ｆ  イノシンリボシド、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ  ５−ニトロインドールリボシド、２’−Ｆ  ４−ニトロベンゾイミダゾールリボシド、２’−Ｆ  ３−ニトロピロールリボシド、ＰＮＡ−５−ニトロインドール（ｉｎｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンゾイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルホリノ−５−ニトロインドール、モルホリノ−ネブラリン、モルホリノ−イノシン、モルホリノ−４−ニトロベンゾイミダゾール、モルホリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミダイト−５−ニトロインドール、ホスホラミダイト−ネブラリン、ホスホラミダイト−イノシン、ホスホラミダイト−４−ニトロベンゾイミダゾール、ホスホラミダイト−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル  ５−ニトロインドールリボシド、２’−Ｏ−メトキシエチル  ４−ニトロ−ベンゾイミダゾールリボシド、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロールリボシド、デオキシＲＰＭＰ−５−ニトロインドールダイマー  ２’−Ｏｍｅ  ＲＰＭＰ−５−ニトロインドールダイマー、ならびに天然塩基Ａ，Ｔ、Ｃ、ＧおよびＵおよびそれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下の式を共有することで特徴付けられる：「ＸＲＹ」、ここで「Ｘ」は約５〜１０個、１１〜２０個または５〜２０個の天然または改変された核酸塩基からなり；「Ｒ」は約２〜５個、６〜１０個または２〜１０個の（架橋ドメインに対応する）並列されたユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物からなり；そして「Ｙ」は約２〜５個、６〜１０個、１１〜１５個または３〜２０個の核酸塩基からなり；ここで、Ｘ、ＲおよびＹは共有結合され、そして塩基の総数の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％あるいは５０％以下は、ユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物であり、そしてＸおよび／またはＹは、ＳＮＰ部位（または多型）に天然塩基または非天然塩基を含み得、そしてＸおよび／またはＹは、より高い親和性か、またはより低い親和性の塩基またはアナログを含み得る。さらなる実施形態において、Ｙは多型を含み、そしてＸは、その標的に対してＹよりも高い親和性を有する。さらなる実施形態において、この多型はまた、ウイルスまたは他の感染因子における改変領域、微生物、植物もしくは動物における改変領域または変異体であり得る。
【００６９】
本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドは、別個に市販され得、あるいは遺伝子の解析を容易にするキットと組み合され得る。例えば、多くの診断用のキットが、固有の核酸配列、特定遺伝子の発現レベルおよびＳＮＰを検出するために、現在入手可能である。これらのキットは、代表的には、疾患または状態と関連する特定の標的配列を検出するため、あるいは感染性の生物の存在を検出するために使用される、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを提供する。実施形態は、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチド構造に従って製造されるプローブおよびプライマーを備える診断用のキットを含む。すなわち、実施形態は、本明細書に記載の「分子スイッチ」を含む少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを備えるキットを含む。このキットは、必要に応じて支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、プラスチックまたは他の高分子）、ハイブリダイゼーション試薬または増幅試薬および指示書を提供し得る。以下の節は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに関する方法の多くを、より詳細に記載する。
【００７０】
（方法）
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドはＳＮＰの検出を含む多くの有用性を有し、このような有用性としては、他の診断用プロセス、発現解析、アレイ技術、配列決定、ハイブリダイゼーションおよび従来のオリゴヌクレオチドを使用する他の技術における応用が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチドが使用される、当業者に公知のほとんどの方法において使用され得る。
【００７１】
一つのアプローチによって、核酸を含むサンプル中の変異または多型の存在または非存在を検出する方法は、上記核酸を少なくとも一つの上記オリゴヌクレオチドと接触させ、そして標的分子の配列コンテクストに応じて、プローブのスイッチドメインが「開」位置にあるか、あるいは「閉」位置にあるかを同定することによって実施される。さらなる実施形態において、上記オリゴヌクレオチドのユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログ、あるいはユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基またはそれらのアナログの混合物は、変異または多型の部位に局在しないが、非天然塩基は、より高いＳＮＰ識別であり得る。さらに本方法は、増幅する工程（例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、あるいはＴ７またはＳＰ６またはローリングサイクル媒介性増幅）と組み合わせられ得、変異または多型の存在または非存在の同定に役立ち得る。以下の節は、「分子スイッチ」を有するオリゴヌクレオチドをより詳細に記載する。実施形態はまた、上記のオリゴヌクレオチドを作製および使用する方法を含む。一実施形態は、オリゴヌクレオチドを設計する方法に関連し、この方法は、標的配列に対応するか、あるいは標的配列を補完する配列を同定する工程、および標的配列に特異的な分子スイッチを含むオリゴヌクレオチドを設計する工程を包含する。一つのアプローチによって、疾患の存在または非存在を示す標的と相互作用する配列は、米国特許第６，２０１，１０７号；米国特許第４，６８３，１９４号；米国特許第６，０２５，１３０号；または米国特許第６，１９４，１５８号（これらの全てが、本明細書によってその全体が参照として明確に援用される）から選択される。診断用の部位（例えば、ＳＮＰまたは変異の部位）はユニバーサル塩基で覆われておらず、ＳＮＰ識別を強化する非天然塩基によって覆われ得るということを注意するべきである。
【００７２】
従って、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドは、任意の変異、対立遺伝子変異、多型および遺伝子の正常配列または野生型配列の同定に有用である。さらに、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、配列の存在を検出するために使用され得、または代替的に、このオリゴヌクレオチドは細胞によって生成される特定のｍＲＮＡの量を同定するために使用され得る。この定量化は、特定の標的配列の存在を同定することに加えて、またはこれとは別であり得る。
【００７３】
しかしながら、ヒトの遺伝的バリエーションの最も一般的な型は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であるので、二つの代替的な塩基が母集団において適切な頻度（＞１％）で現われる塩基位置、臨床的な診断のためのＳＮＰの利用、全ゲノム関連の不均衡スクリーニング、種の最近の進化的な歴史および種分化プロセスの決定は、ヒト遺伝学の主要な焦点となった。従って、本明細書中に記載のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子型の特定あるいは変異または多型（例えば、ＳＮＰ）の存在または非存在を決定する方法は、非常に有用な実施形態である。
【００７４】
分子診断（特にＳＮＰの分子診断）の、来るべき一次公衆衛生における役割のプロトタイプの例は、鉄過剰障害遺伝性ヘモクロマトーシスを罹患しているか、罹患する危険性がある個体の同定である。全ての単一遺伝子障害のうち、この最も一般的な（白人の０．５％において存在する）症例の９０％以上が、トランスフェリンレセプター結合タンパク質ＨＦＥにおける、ホモ接合性の保存された単一ヌクレオチド置換（ヌクレオチドＧ８４５Ａ；アミノ酸Ｃ２８２Ｙ）の存在によって引き起こされる。この機能喪失の変異は、ＨＦＥの通常の細胞表面における発現を破壊し、次いでトランスフェリン結合鉄に対するトランスフェリンレセプターの親和性をダウンレギュレートする機能を妨げ、そして恒常的な鉄吸着を生じる。
【００７５】
従って、ヘモクロマトーシスの危険性がある個体は、十分に保存された単一ヌクレオチド置換であるヌクレオチドＧ８４５Ａの検出を可能にするプローブまたはプライマーを選択することによって同定され得る（例えば、米国特許第６，０２５，１３０号（本明細書によってその全体が参照として明確に援用される）を参照のこと、ここで特定のプライマーおよびプローブが得られ得る）。いったん、適切なプローブが選択されると、それらは本明細書に教示される「分子スイッチ」を含むよう設計され得、そして上記個体が疾患を示す変異を有するかどうかを同定するために使用され得る。
【００７６】
同様の様式によって、嚢胞性線維症（ＣＦ）の危険性を有する個体が同定され得（適切なプライマーまたはプローブは、米国特許第６，２０１，１０７号において同定される）、癌に罹患する危険性を有する個体が同定され得（適切なプライマーおよびプローブは、米国特許第６，１９４，１５８号（本明細書によってその全体が参照として明確に援用される）において同定される）、かつ鎌状赤血球貧血の危険性を有する個体が同定され得る（適切なプライマーおよびプローブは、米国特許第４，６８３，１９４号（本明細書によってその全体が参照として明確に援用される）において同定される）。
【００７７】
特定の実施形態において、分子スイッチは、アレイまたは固体表面を用いてＳＮＰおよび／または発現情報を得るために使用され得る。分子スイッチを含むプローブは、まず固体表面上に（例えば、当該分野において公知のアレイ形式で）並べられ得る潜在的な標的核酸にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションに続いて、このプローブは（ＳＮＰアッセイのために）消化されるか、または（発現アッセイのために）検出可能な標識と組み合わせるために伸長される。スイッチが「開」である場合、プローブは（ＳＮＰアッセイのために）消化されるか、または（発現アッセイのために）伸長されず；スイッチが「閉」である場合、プローブは消化から保護され、そしてプローブ標識は（ＳＮＰアッセイのために）保存されるか、または（発現アッセイのために）検出可能な標識と組み合わせるために伸長される。次いでこのスイッチプローブは、各プローブ上の固有の配列要素または各プローブ上の特定の結合パートナーに従って分類され得る。ＳＮＰアッセイにおいて、スイッチ部分において標識がなお存在する場合、このスイッチはハイブリダイゼーションの間閉じられ；スイッチ部分において標識が失われた場合、このスイッチはハイブリダイゼーションの間開かれた。発現アッセイにおいて、（ハイブリダイゼーションの間の伸長に起因して）組み込まれた標識が存在する場合、スイッチは閉じられ；標識が検出されない場合、スイッチは閉じられ、そして標的は存在しなかった。
【００７８】
別の特定の実施形態において、分子スイッチを含む生物学的なプローブが、設計され得る。分子スイッチを含むプライマーが、設計され得、次いで生物学的に伸長され、末端にスイッチを組み込みながら長いプローブを生成する。このことは、組み込まれた分子スイッチに起因するミスマッチを解決する能力を保持する、複雑かつ長いプローブを構築する方法を提供する。
【００７９】
以下の実施例は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを作製するために使用され得るより詳細な技術を記述し、そして「分子スイッチ」を含むオリゴヌクレオチドの利点および改善を示す。この「分子スイッチ」は、非常に広い温度範囲におよぶ改善された特異性を生成し、そしてＰＣＲアッセイ、Ｔ７増幅およびＳＰ６増幅を用いるアッセイ、ローリングサイクル増幅アッセイ、ヌクレアーゼ保護アッセイおよび発現アッセイを含む増幅アッセイに、直接に作用され得る。
【００８０】
本発明は、ここで、以下の非限定的実施例を参照して、より詳細に記載される。
【実施例】
【００８１】
ヘモクロマトーシス遺伝子を、以下の実施例において、基本型多型として使用した。ヘモクロマトーシス遺伝子の標的Ｈ６３Ｄを標的とした二重標識プローブの性能を、融解温度について、そして標準的なＰＣＲアッセイにおいて評価した。ヘモクロマトーシス遺伝子のＨ６３Ｄ部位は、４１８位にＧ残基を有しており、この４１８位は、ヘモクロマトーシスを担う遺伝的変化の１つにおいて、Ｃに変異する。例示的なプローブおよび標的を、以下の表１に示す。
【００８２】
（実施例１）
上記プローブのスイッチドメインが、単一のミスマッチの影響によって制御されて「開き」得るか、または「閉じ」得るかどうかを決定するために、紫外線融解曲線測定を実施した。
【００８３】
標準的なＰＣＲ緩衝液条件下で、ユニバーサル塩基を含むプローブについて融解温度を決定し、そしてその結果を、ユニバーサル塩基を含まないコントロール配列（Ｍｕ／ＭｕおよびＷｔ／Ｗｔ）を用いて得られた結果と比較した。プローブおよびオリゴヌクレオチド標的配列については、表１を参照のこと。これらの研究のための配列は、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供され、そして、従来のホスホラミダイトＤＮＡ合成化学を用いて調製した。野生型（Ｗｔ）一本鎖標的および変異（Ｍｕ）一本鎖標的を用いたＵＶ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｅｌｔｓを用いて、ｄＮＴＰを除いたＰＣＲ反応緩衝液中で上記融解曲線測定を行った。上記プローブとしては、Ｘ１  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１）、Ｘ２  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号２）、Ｘ３  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号３）、Ｘ４  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号４）、Ｘ５  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号５）、Ｘ７  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号７）、Ｘ８  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号８）、Ｘ９  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号９）、Ｘ１０  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１０）、Ｘ１１  ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１１）、Ｘ１４  ＨＦＥ６３ＤＷｔ（配列番号１４）、およびＸ１５  ＨＦＥ６３ＤＭｕ（配列番号１５）が挙げられる。上記標的は、上記プローブに対して短い重複を有するマッチ一本鎖標的およびミスマッチ一本鎖標的（ＷｔおよびＭｕ）であり、これらの標的としては、ＡｎｔＨ６３ＤＷｔ（配列番号１３）、ＡｎｔＨ６３ＤＭｕ（配列番号１８）、ＡｎｔＨ６３ＤＷｔＬｏｎｇ（配列番号１９）およびＡｎｔＨ６３ＤＭｕＬｏｎｇ（配列番号２０）が挙げられる。標的コントロールがまた、アンチセンス配向の代わりにセンス配向で含まれ、これらの標的コントロールとしては、ＳｅｎＨ６３ＤＷｔ（配列番号１２）およびＳｅｎＨ６３ＤＭｕ（配列番号１７）が挙げられる。オリゴヌクレオチドプローブおよび標的の濃度は、ＰＣＲ反応のために設計された緩衝液系中で、１ミリリットル当たり各々０．３５  Ｏ．Ｄ．〜０．４０  Ｏ．Ｄ．であった：
【００８４】
【表１】
2006525027.tif 000002
【００８５】
【表２】
2006525027.tif 000003
ＰＳ＝ホスホチオエート；ＡＰＳ＝プロピルチオホスフェート；太字かつ下線の「Ｕ−Ｇ−Ａ」は、２’リボヌクレオチド（ＲＮＡ）に相当する；太字かつ下線の「ｔ−ｇ−ａ」または「ｃ−ｃ−ａ」は、デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）に相当する；ＦＡＭは、ＤＮＡ合成の間に上記配列中に挿入されたＣ７  Ｕｎｉｌｉｎｋｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に結合された、６−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキシスクシニド−フルオレセイン標識である。ＢＨＱ１は、ブラックホールクエンチャー（ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）である；Ｓ１８は、スペーサーである。配列番号１２、１３および１６〜２２は、センス（ｓｅｎ）またはアンチセンス（ａｎｔ）のいずれかの標的配列である。配列番号１〜１１、１４および１５は、全て、種々の改変を有するプローブである。
【００８６】
（表２：反応緩衝液）
５０ｍＭ  ＫＣＬ
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５
２．５％  スクロース
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２。
【００８７】
各々のプローブ／標的の組み合わせについて、融解温度決定を実施した。全ての混合物を、１０分〜１５分間、８５℃〜９５℃まで加熱し、そして使用前に室温まで冷却させた。Ｃａｒｙ  ０１．０１（４）Ｔｈｅｒｍａｌソフトウェアにより制御される、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ温度制御器を有するＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ３Ｅ  ＵＶ−可視分光光度計を用いて、密封クオーツキュベット中でＵＶ吸収によって融解温度を決定した。温度勾配は、１分当たり１℃で、９０℃〜２０℃まで低下した。
【００８８】
図３に示すように、分子スイッチを含むプローブは、多相（ｍｕｌｔｉ−ｐｈａｓｉｃ）融解を示し、このことは、この分子スイッチが、残りのプローブよりもずっと低い温度で融解するが、それはミスマッチが存在する場合のみであることを実証する。
【００８９】
全ての天然塩基を含む二重鎖の代表的な融解についてのコントロールとして、上記ＳｅｎＨ６３ＤＷｔと上記ＡｎｔＨ６３ＤＷｔとを、ハイブリダイズし、そして融解し、そして同様に、ＳｅｎＨ６３ＤＭｕとＡｎｔＨ６３ＤＭｕとの間の融解を実施した。その結果、両方の場合において、約７５℃を中心とするＴｍを有する、典型的なシグモイド融解プロファイルを示した。上記ＳｅｎＨ６３ＤＷｔ配列と上記ＡｎｔＨ６３ＤＭｕとの交差ハイブリダイゼーションおよび上記ＳｅｎＨ６３ＤＭｕと上記ＡｎｔＨ６３ＤＷｔとの交差ハイブリダイゼーションは、上記Ｔｍが７１℃〜７２℃まで低下したことを除いて、同一のシグモイド融解プロファイルを示した。約３〜４℃のＴｍの小さな低下は、ミスマッチ二重鎖におけるミスマッチの存在の結果であった。
【００９０】
同様の様式で、プローブＸ１〜Ｘ１０を、全て、上記ＡｎｔＨ６３ＤＷｔ配列およびＡｎｔＨ６３ＤＭｕ配列とハイブリダイズした。ＡｎｔＨ６３ＤＷｔとハイブリダイズした場合、全ての上記プローブは、約５０℃〜６２℃の範囲のＴｍを有する、コントロール配列について見られたものと同様の典型的なシグモイド融解プロファイルを示した。配列Ｘ１〜Ｘ１０と上記ＡｎｔＨ６３ＤＭｕ標的とをハイブリダイズした場合、その融解プロファイルは、２相になり、２つの転移が明らかになった。５０℃〜６０℃の範囲のより高い温度では、シグモイドプロファイルはそのままであるが、さらに、肩部（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）として現われ、そして２０℃に低下するまでずっと続く、第２の転移が存在した。この傾向に対する１つの注目すべき例外は、Ｘ７プローブであり、このＸ７プローブは、他のプローブと比較して弱い肩部を示した。
【００９１】
これらの結果は、ミスマッチの存在下では、上記プローブの「分子スイッチ」部分が、そのプローブの残りは大部分がハイブリダイズしたままである条件下で、ミスマッチに応答して開くという、直接的な証拠である。ＵＶ融解における肩部の実証に加えて、これらのプローブの多くはまた、ミスマッチに応答して上記スイッチ部分が開くことに起因して、プローブ全体に対するＴｍの低下を示した。上記スイッチが開くことによるＴｍ全体の低下を示したプローブの例としては、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ９およびＸ１０が挙げられる。ミスマッチに応答して上記スイッチが開く場合に、Ｔｍの小さな低下を示したプローブは、Ｘ５およびＸ６であった。従って、上記スイッチの構造および特性に依存して、上記スイッチが開くことは、ミスマッチに応答するプローブのＴｍ全体に対する効果を、有しても有さなくてもよい。図３は、代表的なＵＶ融解プロファイルを示し、そしてＸ１  ＷｔＨ６３ＤプローブおよびＸ２  ＷｔＨ６３Ｄプローブと、それらの対応するマッチ標的（ＡｎｔＨ６３ＤＷｔ）およびミスマッチ標的（ＡｎｔＨ６３ＤＭｕ）の標的配列とについての結果を例示する。
【００９２】
（実施例２）
実施例１に記載されるプローブのアニーリングおよび融解を再試験したが、ＵＶではなく、蛍光により測定した。完全なマッチの存在を、ミスマッチ一本鎖標的と比較した。
【００９３】
アッセイを以下のように実施した：オリゴヌクレオチドプローブおよび標的を別個に、水中に希釈して、４００μＭの濃度にした：１６μＬを３８４μＬの水に添加して、１６μＭのワーキングストックを作製した。次いで、１２．０μＬの各核酸希釈液および／または水を、２５μＬの２×ＬＩＦＥＴＥＣＨ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＰＣＲ反応緩衝液に全体で２５μＬまで添加して、５０μＬの総最終容量にした。アッセイは、ＦＡＭ／ＢＨＱ１相互作用を直接測定した。最終プローブ濃度は、４μＭであった。
【００９４】
反応を、ＭＪ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において実施した。９５℃での２〜５分のインキュベーション、および２０℃までの２〜１５分間の冷却後、上記混合物を、１分当たり２℃の速度で、２０℃〜９５℃までランプした（ｒａｍｐ）。０．５℃ごとに、蛍光を測定した。
【００９５】
上記プローブは、表１におけるものと同一であった。表１に列挙されたプローブＸ１〜Ｘ１０について、蛍光ハイブリダイゼーションデータを、そのプローブ単独について、ＡｎｔＨＦＥ６３ＤＷｔとハイブリダイズされたプローブについて、そしてＡｎｔＨＦＥ６３ＤＭｕに対してハイブリダイズされたプローブについて得た。全ての場合において、上記プローブは、野生型配列との所望されるハイブリダイゼーションを示し、そしてこのハイブリダイゼーションは、２０℃での強い蛍光により特徴付けられ、温度が５０℃〜６０℃に達するまで、わずかに蛍光が減少し、この５０℃〜６０℃の点で、蛍光の大きな減少が存在した。上記プローブの各々について、蛍光のシャープな減少は、実施例１において測定されたＴｍに対応していた。このことは、上記プローブが、全て、５０℃〜６０℃より下の温度で上記野生型標的にハイブリダイズしていること、そして上記蛍光が、ハイブリダイゼーションの際に上記フルオレサーと上記クエンチャーとの特定の分離に起因して上昇することを実証した。より高い温度での融解の際、上記フルオレサーおよびクエンチャーは、もはや特異的に分離せず、そして遊離して互いにより近く接触するようになった。上記プローブと標的との融解は、上記蛍光が、溶液中でのそのプローブだけの蛍光にまで減少することによって、さらに特徴付けられた。
【００９６】
上記プローブと野生型標的ＡｎｔＨＦＥ６３ＤＷｔとの融解プロファイルを比較すると、全てのプローブは、蛍光の減少を示し、Ｘ７を除いて、２０℃までずっと低下した。このことは、実施例１におけるＵＶ融解研究により既に実証されているように、上記プローブの分子スイッチ部分が、ミスマッチに応答して開いていること、そして少なくとも部分的に開いているそのスイッチの効果が、２０℃に低下するまでずっと観察されることを実証した。変異（ミスマッチ）標的に対する野生型標的についての蛍光融解プロファイルを比較すると、いくつかの重要な観察結果が存在した。第１に、ミスマッチに応答して上記プローブのスイッチ部分が開くと、いくつかのプローブは、プローブ全体のＴｍ全体の低下を示し、他方、その低下を示さないものもあった。プローブＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ９およびＸ１０は、Ｔｍの低下を示し、他方、プローブＸ５およびＸ６は、Ｔｍの低下を示さなかった。この観察結果は、同じ結果がなされた実施例１のＵＶ測定と関連した。これらの差異は、上記分子スイッチの結合ドメインの大きさに関連する。その結合ドメインに、より少ない水素結合塩基を有するもの（プローブＸ５およびＸ６）は、上記スイッチが開く場合に、そのプローブのＴｍに効果を生じず、他方、より多くの水素結合塩基を有するもの（プローブＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ８、Ｘ９およびＸ１０）は、そのＴｍに効果を生じる。この結果は、上記プローブのスイッチ部分が、野生型標的にハイブリダイズした場合にそのプローブの安定性全体に寄与する能力にさらに関連する。上記スイッチの結合ドメインが、より長く、そして結果としてより安定である場合、そのスイッチ部分は、上記プローブと野生型標的との親和性に寄与する。上記結合ドメインが、より短く、そしてより不安定である場合、そのスイッチ部分は、野生型標的に対する親和性にほとんどまたは全く寄与しない。結果として、低い親和性の結合ドメインを有する場合、上記スイッチが開いても、上記標的に対する上記プローブの親和性の変化は存在しない。なぜなら、そのスイッチの結合ドメインが、それがハイブリダイズされた場合に、その標的に対するそのプローブの有意な安定性に寄与していなかったからである。このことが実証していることは、上記プローブのスイッチ部分を、開くとそのプローブのＴｍ全体に効果を有するように設計するか、あるいはそのスイッチを、開いても効果をほとんどもしくはまったく有さないように設計することが、容易に可能であるということである。従って、上記スイッチ部分は、開発したいハイブリダイゼーション系に依存して、異なる全体的なハイブリダイゼーション特性を提供するように、容易に設計され得る。
【００９７】
第２の観察は、遊離プローブと関連する蛍光が、Ｘ３、Ｘ６、Ｘ９およびＸ１０についてよりも、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ７およびＸ８について、約５倍以上高いことであった。このことは、上記フルオレサーとクエンチャーとの間の間隔に関連していた。Ｘ７を除いて、より高い遊離プローブ蛍光を有する遊離プローブは、２２ヌクレオチド〜２６ヌクレオチドの上記フルオレサーとクエンチャーとの間の間隔を示し、他方、より低い蛍光を有するプローブは、１４ヌクレオチド〜１５ヌクレオチドの間隔を有していた。多くのハイブリダイゼーション様式において、遊離プローブからのより低いシグナルが所望され、そしてこの観察は、遊離プローブシグナルが、使用される標識（この場合は、クエンチャーとフルオレサー）の間の間隔を調節することによって制御され得ることを示す。
【００９８】
第３の観察は、上記分子スイッチのブッリジドメイン部分に体系化されていない可撓性なＳ１８スペーサーを含むＸ７プローブが、ブリッジドメインにユニバーサル塩基を含むプローブと比較して、不十分に機能することであった。Ｘ７プローブは、上記マッチ標的とミスマッチ標的との間のＴｍの識別を示さず、Ｘ７プローブは、遊離プローブに関連する非常に強い蛍光を有し、そしてＸ７プローブは、ミスマッチ標的の存在に応答する蛍光の不十分な減少を与えた。
【００９９】
この実施例全体が、マッチ標的およびミスマッチ標的を識別するための分子スイッチ構築物の有用性を実証する。さらに、この実施例全体は、遊離プローブに関連するシグナルを制御する能力、およびオリゴヌクレオチドを含む分子スイッチが使用される方法に依存した、所望される効果の範囲の、オリゴヌクレオチドのスイッチ部分を設計する能力を実証する。（末端ＦＡＭ構築物を有するプローブを用いた）図４および（内部ＦＡＭ構築物を有するプローブを用いた）図５は、これらの点を明確に例示する。
【０１００】
（実施例３）
この実施例を、上記プローブ配列が、Ｘ１１プローブ配列およびＸ１４プローブ配列であり、そして上記標的配列が、ＡｎｔＨ６３ＤＷｔＬｏｎｇ（マッチ）およびＡｎｔＨ６３ＤＭｕＬｏｎｇ（ミスマッチ）であったことを除いて、実施例２と同じ条件下で実施した。この実施例の目的は、さらにより長いスイッチ配列の効果を試験することであった。この実施例は、上記プローブのスイッチ部分をさらに長くすることが、マッチ標的とミスマッチ標的との間のＴｍのより良好な分離を与えるが、同時に、ずっとより低い温度（２０℃）での識別は、Ｘ１４プローブの場合、減少するかまたは全て失うことを実証した。従って、スイッチを含むプローブの融解温度特性は、そのスイッチ部分をさらに長くすることにより、さらに減少されて、所望される使用条件に適合され得る。図６は、これらのプローブのスイッチ部分が長くされた場合の、融解温度特性に対する効果を明確に示す。
【０１０１】
（実施例４）
ヘモクロマトーシス遺伝子標的Ｈ６３Ｄを標的とした二重標識プローブの性能を、以下の標準的なＰＣＲアッセイにおいて評価した。この実験において、分子スイッチを含む二重標識プローブを評価した。上記二重標識は、ブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）および蛍光標識ＦＡＭであった。上記二重標識に加えて、末端５’チオホスフェート、末端５’−アルキルチオホスフェートまたは末端５’チオホスフェートと一緒に、５’末端の３つのホスホチオエート結合を組み込むこと、および３つの２’−ＯＭｅ含有ヌクレオチドを組み込むことにより、上記オリゴヌクレオチドの５’部分に、５’エンドヌクレアーゼ活性に対する耐性を与えた。
【０１０２】
ＧＥＮＥＡＭＰ  ＰＣＲ  ＣＯＲＥ  ＲＥＡＧＥＮＴ  ＫＩＴ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、５０μｌ容量中で１０ｎｇのヒト胎盤ゲノムＤＮＡを増幅することにより、ＰＣＲを実施した。以下の条件を使用した：１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロール、１×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００〜５００μＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１５０ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２００ｎＭの表１に列挙される種々のプローブ、および５Ｕ  ＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。上記プライマーは、Ｕｇｏｚｚｏｌｉら（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０７：４７−５３，２００２）により使用されたものと同じであり、そして以下の表３に列挙される。
【０１０３】
【表３】
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ＡＭＰＬＩＴＡＱを活性化するための４分間、９５℃でのインキュベーションの後、以下のサイクルプロトコールを実施した：５０サイクルの９５℃、１５秒間の変性、次いで、５０℃〜５４℃、４５秒〜９０秒間のアニーリングおよび７２℃、６０秒間の伸長。反応を、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｌｔｈｍａｎ，ＭＡ）において実施した。上記プローブのハイブリダイゼーションにより生成された蛍光データを、ＰＣＲアニーリングプロセスの間、伸長の間および変性時に収集した。Ｏｐｔｉｃｏｎソフトウェアを用いてリアルタイム増幅プロットを分析することにより、データ分析を実施した。上記ＰＣＲサイクルの完了後、融解温度を決定した。２分〜５分間、９５℃でのインキュベーションおよび２分〜１５分間、２０℃までの冷却の後、その混合物を、１分当たり２℃の速度で、２０℃〜９５℃までランプした。０．５℃ごとに、蛍光を測定した。
【０１０４】
具体例として、インプットとして１０ｎｇの胎盤誘導性ヒトゲノムＤＮＡを用いて、Ｘ２ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号２）プローブを評価した。アッセイは、三連で行った。結果は、全ての３つの反復について、２６のＣｔ（サイクル時間（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ））を有する典型的な指数応答を示した。この結果は、定量的ＰＣＲアッセイ様式におけるこれらのプローブの有用性および結果の再現性を示した。図７は、このアッセイの結果を示す。
【０１０５】
（実施例５）
プローブのヌクレアーゼ安定性の試験として、ＰＣＲアッセイ後融解を実施して、プローブが、ＰＣＲ増幅の間に分解されたかどうかを決定した。実施例３におけるものと同一のＰＣＲ反応を実施し、そして生じたプローブ標的相互作用を、融解温度に関して分析した。上記プローブＸ３ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号３）を、野生型ヒトゲノムＤＮＡに対して使用した。
【０１０６】
その結果は、上記プローブが、約５８℃の融解温度を有し、この温度は、実施例１におけるＵＶ融解研究および実施例２における蛍光融解測定により、このプローブに関して観察されたのと同じ融解温度であることを示した。さらに、融解して遊離プローブを生成すると、蛍光は、遊離プローブのレベルにまで減少した。これらの観察の両方は、上記プローブが、ＰＣＲ増幅プロセス全体を通して、大部分が、完全にインタクトなままではないことを示している。上記プローブが、分解されたかまたは部分的に分解された場合、そのプローブは、異なるＴｍを示すことが予測される。さらに、上記プローブが、分解された場合、上記蛍光標識は、上記クエンチャーから分離されるようになり、そして融解すると、そのクエンチャーは、もはや上記フルオレサーに対する効力を有さない。この方法はまた、他のアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ。なぜなら、ＴＡＱＭＡＮプローブは、ＰＣＲ反応の間に分解されるからである。）を用いては不可能な、ＰＣＲ反応からの直接的なＴｍ測定を得る能力を示す。
【０１０７】
（実施例６）
スイッチ部分を含むプローブの有用性をさらに試験するために、共通の標的配列に対してそれらのスイッチ部分でオーバーラップしたプローブを、それらが、非常に広い温度範囲にわたって、ミスマッチ識別をさらに増強する能力について試験した。緩衝液およびアッセイ条件は、最終プローブ濃度および最終標的濃度が、２μＭ  Ｘ９（配列番号９）、３μＭ  ＨＦＥｒ９１Ｗｔ（配列番号２１）またはＨＦＥｒ９１Ｍｕ（配列番号２２）であり、そしてＸ１６（配列番号１６）が存在しないかまたは６μＭ  Ｘ１６であるかのいずれかであったことを除いて、実施例２に記載されているものと同じであった。この実施例において、Ｘ１６プローブは、そのスイッチ部分とＸ９プローブのスイッチ部分とにおいて重複するように設計されており、このとき、それらは、共通の配列に両方がハイブリダイズしていた。コンセプトは、上記Ｘ１６プローブ（非標識）および上記Ｘ９プローブ（標識）の競合するスイッチ部分を設計し、それにより、それらが、標的中の共通配列のハイブリダイゼーションに対して競合することである。このコンセプトの例示のためには、図８を参照のこと。さらに、上記Ｘ９は、そのスイッチ部分においてＨＦＥｒ９１Ｗｔ（野生型）標的に対して完全に相補的であるように設計され、他方、上記Ｘ１６プローブのスイッチ部分は、ＨＦＥｒ９１Ｍｕ（ミスマッチ）標的に対して相補的である。この「闘争する」スイッチアプローチにおいて、上記Ｘ１６プローブは、上記Ｘ９プローブのスイッチ部分をさらに置換してそのミスマッチ標的から離し、他方、それは、野生型標的による効力をほとんど有さない（なぜなら、それは、ミスマッチを有するからである）。図９は、このアプローチの利点を明確に示す。なぜなら、上記Ｘ１６プローブの存在下、ミスマッチ標的と比較したマッチ標的に対する上記Ｘ９プローブの識別は、約４倍上昇し、そして、約３０℃の温度範囲にわたって、非常に良好なミスマッチ識別を示すからである。
【０１０８】
代替的なスイッチ競合アッセイ様式において、上記分子スイッチは、競合する隣接の標識プローブを置換するために使用され得る。上記スイッチが、閉じている場合、上記標識プローブは、置換される；上記スイッチが開いている場合、上記標識は、置換されない。このことは、任意の検出可能標識による識別の増強を提供する。
【０１０９】
好ましい実施形態および方法が示され、そして記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく数多くの変更がなされ得ることが、当業者に明らかである。従って、以下の特許請求の範囲に従う場合を除いて、本発明は限定されない。
【０１１０】
そうではないと規定されなければ、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で記載されるものと同様または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体において、参考として援用される。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、上記材料、方法および例は、単に例示にすぎず、限定するものとして意図されない。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、本発明のＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ「分子スイッチ」の概略図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態の概略図であり、ここで二重標識された「三部からなる（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）」ＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭプローブは、分子スイッチとして作用する。
【図３】図３は、種々の分子スイッチを含むＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ  Ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓプローブを使用した融解曲線（吸光度によって測定した）の結果を示し、ｄＮＴＰを含まないＰＣＲ反応緩衝液において、野生型（Ｗｔ）および変異型（Ｍｕ）の標的配列の両方を検出した。図に示すように、ミスマッチは、他のプローブよりもはるかに低いＴｍで融解する、分子スイッチを示す二相性のプロフィールを生じる。
【図４】図４は、合わせて、末端ＦＡＭ構築物を有する分子スイッチを含む、種々のＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ  Ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓプローブを使用した融解曲線（蛍光によって測定する）の結果を示す。図４Ａ〜図４Ｄは、それぞれプローブのＸ２ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号２）、Ｘ５ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号５）、Ｘ４ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号４）およびＸ８ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号８）；ならびに標的のＡｎｔＨ６３ＤＷｔ（配列番号１３）およびＡｎｔＨ６３ＤＭｕ（配列番号１８）を表す。
【図５】図５は、合わせて、内部ＦＡＭ構築物を有する分子スイッチを含む、種々のＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ  Ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓプローブを使用した融解曲線（蛍光によって測定する）の結果を示す。図５Ａ〜図５Ｄは、それぞれプローブのＸ３ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号３）、Ｘ１０ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１０）、Ｘ９ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号９）およびＸ６ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号６）；ならびに標的のＡｎｔＨ６３ＤＷｔ（配列番号１３）およびＡｎｔＨ６３ＤＭｕ（配列番号１８）を表す。
【図６】図６は、合わせて、分子スイッチを含む種々のより長いＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ  Ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓプローブを使用した融解曲線（蛍光によって測定する）の結果を示す。図６Ａ〜図６Ｂは、それぞれプローブのＸ１４ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１４）およびＸ１１ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１１）；ならびに標的のＡｎｔＨ６３ＤＷｔＬｏｎｇ（配列番号１９）およびＡｎｔＨ６３ＤＭｕＬｏｎｇ（配列番号２０）を表す。
【図７】図７は、分子スイッチを含むＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ  ＨｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓプローブのＸ２ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号２）を使用する定量的ＰＣＲの結果を示す。
【図８】図８は、タンデムスイッチ競合プラットフォーム（ｓｗｉｔｃｈ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）におけるＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ「分子スイッチ」を図式的に説明する。
【図９】図９は、スイッチ効果をさらに増強する競合性タンデムスイッチフォーマル（ｆｏｒｍａｌ）において、ＳｐｅｃｉｍｅｒＴＭ  ＨｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓプローブのＸ９ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号９）およびＸ１６ＷｔＨ６３Ｄ（配列番号１６）ならびに標的のＨＦＥｒ９１Ｍｕ（配列番号２２）およびＨＦＥｒ９１Ｗｔ（配列番号２１）を使用した融解曲線（蛍光によって測定する）の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年11月9日(2005.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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