(57)【要約】フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートするための方法、システム及び装置が、望ましいソート特性を有する安定なソートから流れの一部の複数の画像を作成し；該複数の画像から該安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成し；ソーティングの際に該流れの該一部の複数の移動画像を連続的に収集し；該複数の移動画像から該複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成し；そして、各数値試料平均を該数値参照標準と比較し、試料平均がソートの調整を必要とする該参照標準からの偏差を示すかどうか決定することによって提供される。次に、このソートを調整し、偏差を排除又は低減して参照ヒストグラムの安定なソートを維持することができる。本方法を実行するフローサイトメータにおいて新規の画像化装置を用いることができる。
2006504970.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法であって、
（ａ）望ましいソート特性を有する安定なソートから流れの一部の複数の画像を作成する工程；
（ｂ）該複数の画像から該安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成する作成工程；
（ｃ）ソーティングの際に該流れの該一部の複数の移動画像を連続的に収集する工程；
（ｄ）該複数の移動画像（ｃ）から該複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成する作成工程；及び
（ｅ）各数値試料平均（ｄ）を該数値参照標準（ｂ）と比較し、該平均（ｄ）がソートの調整を必要とする該参照標準からの偏差を示すかどうか決定する工程
を含む、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法。
【請求項２】
（ｆ）前記サイトメータにおける前記ソートの処理条件を前記偏差に応じて調整する調整工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の画像（ａ）又は（ｃ）が複数の連続的な画像である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記画像（ａ）又は（ｃ）がバックグラウンドノイズを取り去った画像を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記作成工程（ｂ）が、
前記画像（ａ）のそれぞれを、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有するヒストグラムに変換する工程；
選択された数値を各ヒストグラムから決定する工程；並びに
複数の画像の該ヒストグラムからの該選択された数値を平均して前記数値参照標準を作成する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記作成工程（ｂ）が、
それぞれの複数の画像（ａ）を、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有する単一の平均ヒストグラムに変換する工程；並びに
選択された数値試料平均値を該単一の平均ヒストグラムから決定して前記数値参照標準を規定する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記作成工程（ｄ）が、
前記画像（ｄ）を、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有する試料ヒストグラムに変換する工程；
前記参照標準に対応する選択された数値を各ヒストグラムから決定する工程；並びに
複数の試料画像（ｄ）の複数の試料ヒストグラムからの該選択された数値を平均して、複数の移動画像の各集合の試料ソートの少なくとも１つの数値試料平均を作成する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記数値が、
ｉ．    各ヒストグラムのネック領域下流に現れる波動の上流辺の勾配；
ｉｉ．  各ヒストグラムのネック領域上流に現れる波動の下流辺の勾配；
ｉｉｉ．各ヒストグラムの勾配（ｉ）と（ｉｉ）の絶対値の合計の平均；
ｉｖ．  各ヒストグラムの下流の波動の勾配を規定する部分の中点；
ｖ．    勾配（ｉ）と（ｉｉ）の勾配値の低い方の間の該ヒストグラムの面積の積分；及び
ｖｉ．  それらの組み合わせ
から成る群より選択された、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記調整工程（ｆ）により、以降の試料平均における前記偏差を最小にし、前記参照標準で表される安定なソートを維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記偏差によって補正できない試料ソートが生じた場合に、前記調整工程（ｆ）によって前記ソートが停止される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の画像（ａ）又は前記複数の移動試料画像（ｃ）のそれぞれが少なくとも約５個の画像を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の画像が約５〜約４０個の画像を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の画像が約１０〜約２５個の画像を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の画像が約１０個の画像を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記流れの前記一部が、該流れが前記フローサイトメータのノズルを出た後に形成される液滴形成領域である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記流れの前記一部が近位点を含み、該流れが該近位点で前記ノズルを出て、連続流が個々の液滴に移行する遠位点へと進む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記流れの前記一部が、該流れから完全に分離する最初の液滴の前に該流れのネックを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
１つ又は複数のアルゴリズムを前記ヒストグラムに適用して、前記数値参照標準（ｂ）と前記数値試料平均（ｄ）を作成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記処理条件が、シース圧力、試料圧力、結晶ドライブ、結晶周波数、及びそれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記数値が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から成る群より選択され、調整される前記処理条件が結晶ドライブである、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記数値が（ｉｖ）であり、調整される前記処理条件がシース圧力及び試料圧力又は結晶周波数である、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記数値が（ｖ）であり、前記調整がソートを停止することである、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程の全て又は一部をコンピュータープログラムによって実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
画像キャプチャ装置と照射野の間に前記流れを配置することにより、該流れの各画像をキャプチャすることをさらに含み、該照射野が対照的な明領域と暗領域のパターンを有し、該画像キャプチャ装置が、該照射野により後方から照射される該流れの少なくとも一部の画像を得るよう配置され、該流れの該画像が、流体流自体の中に画像化された対照的な明領域と暗領域の該パターンの画像を含むようにする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記照射野が、光源と、該光源と前記流れの間に配置された所定のパターンを有する不透明マスクとを含み、該所定のパターンが、該流れに対して実質的に平行に延びた細長いスリットを含み、該細長いスリットが、画像化される該流れの幅の約３〜３０倍の幅を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記所定のパターンが、前記画像上に参照マークとして現れる１つ又は複数の識別マークをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記暗領域が、前記画像において見たときに前記流れの側縁を示し、前記画像キャプチャ装置が、該流れの全幅と、該流れの側縁に隣接してその外に投射する前記照射野からの光とをキャプチャする光許容角度を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記フローサイトメータが、
（ａ）前記試料中の粒子とシース流体をノズルに通して流れの中で順番に並べるための装置；
（ｂ）液滴形成領域を含む該流れから液滴を生成するための液滴生成器；
（ｃ）検出装置；
（ｄ）該液滴の偏向後軌道が電荷の関数となるよう該液滴を荷電するための偏向装置；
（ｅ）共通の偏向後軌道を有する該液滴を収集するための収集装置；及び
（ｆ）該流れの一部を画像化するための装置
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）前記試料中の粒子とシース流体を前記流れの中で順番に並べる工程；
（ｂ）ノズルを出たジェット流部分が液滴形成領域を含む該流れから液滴を生成する工程；
（ｃ）該流れの該液滴を荷電する工程；
（ｄ）該液滴の偏向後軌道が電荷の関数となるよう該液滴を偏向する工程；及び
（ｅ）共通の偏向後軌道を有する該液滴を収集する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
試料中に浮遊した粒子の安定なソートを維持するための方法であって、
（ａ）出口ノズルを有する導管において流速を有する流れの中で前記粒子とシース流体を順番に並べる工程；
（ｂ）該流れから共通の初期軌道を有する液滴を生成し、各液滴が対応するジェット流部分から形成され、該ノズルを出た該ジェット流部分が液滴形成領域を含む工程；
（ｃ）該液滴が対応する流れ部分の内容物の特性評価に応じて荷電されるように、経時変化する電界を該流れに印加する工程；
（ｄ）該液滴の偏向後軌道が電荷の関数となるよう該液滴を偏向する工程；
（ｅ）共通の偏向後軌道を有する該液滴を収集する工程； 
（ｆ）望ましいソート特性を有する安定なソートから該流れの一部の複数の画像を作成する工程；
（ｇ）該複数の画像から該安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成する工程；
（ｈ）ソーティングの際に該流れの該一部の複数の移動画像を連続的に収集する工程；
（ｉ）該複数の移動画像（ｈ）から該複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成する工程；
（ｊ）各数値試料平均（ｉ）を該数値参照標準（ｇ）と比較し、各平均（ｉ）が該ソートの調整を必要とする該参照標準（ｇ）からの偏差を示すかどうか決定する工程；及び
（ｋ）該偏差に応じて前記フローサイトメータにおける該ソートの処理条件を調整し、以降の試料平均値の該偏差を最小にして該参照標準の該安定なソートを維持する工程
を含む、試料中に浮遊した粒子の安定なソートを維持するための方法。
【請求項３１】
フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法であって、
（ａ）近位点であって、そこで流れがサイトメータのノズルを出て、連続流が個々の液滴に移行する遠位点へと進む近位点を含む流れの一部の複数の画像を、望ましいソート特性を有する安定なソートから作成する工程；
（ｂ）該複数の画像から該安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成する工程；
（ｃ）ソーティングの際に該流れの該一部の複数の移動画像を連続的に収集する工程；
（ｄ）該複数の移動画像（ｃ）から該複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成する工程；及び
（ｅ）各数値試料平均（ｄ）を該数値参照標準（ｂ）と比較し、該平均（ｄ）がソートの調整を必要とする該参照標準からの偏差を示すかどうか決定する工程
を含む、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法。
【請求項３２】
フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法であって、
（ａ）流れの一部の複数の画像を望ましいソート特性を有する安定なソートから作成する工程；
（ｂ）該複数の画像から該安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成する工程；
（ｃ）ソーティングの際に該流れの該一部の複数の移動画像を連続的に収集する工程；
（ｄ）該複数の移動画像（ｃ）から該複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成する工程；及び
（ｅ）各数値試料平均（ｄ）を該数値参照標準（ｂ）と比較し、該平均（ｄ）がソートの調整を必要とする該参照標準からの偏差を示すかどうか決定する工程
を含み、該数値参照標準と該数値試料平均が、
ｉ．    各複数の画像（ａ）又は（ｃ）から作成されたヒストグラムのネック領域下流に現れる波動の上流辺の平均勾配；
ｉｉ．  該ヒストグラムのネック領域上流に現れる波動の下流辺の平均勾配；
ｉｉｉ．該ヒストグラムの勾配（ｉ）と（ｉｉ）の絶対値の合計の平均；
ｉｖ．  該ヒストグラムの下流の波動の勾配を規定する部分の平均中点；
ｖ．    勾配（ｉ）と（ｉｉ）の勾配値の低い方の間の該ヒストグラムの面積の平均積分；及び
ｖｉ．  それらの組み合わせ
から成る群より選択される、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法。
【請求項３３】
フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートするシステムであって、
（ａ）流れの一部の複数の画像を作成するための画像化装置；及び
（ｂ）少なくとも１つの情報処理装置であって、
ｉ．    望ましい特性を有する安定なソートの複数の画像から該安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成し；
ｉｉ．  ソーティングの際に該流れの該一部の複数の移動画像を連続的に収集し、該複数の移動画像から該複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成し、そして
ｉｉｉ．各数値試料平均を該数値参照標準と比較し、該試料平均のいずれかがソートの調整を必要とする該参照標準からの偏差を示すかどうか決定するための、少なくとも１つの情報処理装置
を含む、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートするシステム。
【請求項３４】
（ｃ）前記偏差に応じて前記サイトメータにおける前記ソートの処理条件を調整し、以降の試料平均の該偏差を最小にして前記参照標準の安定なソートを維持するための調整手段をさらに含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記複数の画像が複数の連続的な画像である、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
前記画像がバックグラウンドノイズを取り去った画像を含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３７】
前記装置（ｂ）により、前記安定なソートの各画像を、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有するヒストグラムに変換し；選択された数値を各ヒストグラムから決定し；そして、複数の画像のヒストグラムからの該選択された数値を平均して前記数値参照標準を作成する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３８】
前記装置（ｂ）により、前記安定なソートの前記複数の画像を、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有する単一の平均ヒストグラムに変換し；そして、選択された数値平均値を該単一の平均ヒストグラムから決定して前記数値参照標準を規定する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３９】
前記装置（ｂ）により、前記複数の移動試料画像のそれぞれを、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有する試料ヒストグラムに変換し；前記参照標準に対応する選択された数値を各ヒストグラムから決定し；そして、複数の試料画像の複数の試料ヒストグラムからの該選択された数値を平均して、複数の移動画像の各集合の試料ソートの少なくとも１つの数値試料平均を作成する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項４０】
前記装置（ｂ）により、前記複数の移動試料画像を、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及び該ネック領域下流の少なくとも１つの波動であって、正の勾配と負の勾配を含む波動を有する単一の平均試料ヒストグラムに変換し；そして、複数の移動画像の各集合の試料ソートの選択された数値試料平均値を該単一の平均試料ヒストグラムから決定する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項４１】
前記数値が、
ｉ．    各ヒストグラムのネック領域下流に現れる波動の上流辺の勾配；
ｉｉ．  各ヒストグラムのネック領域上流に現れる波動の下流辺の勾配；
ｉｉｉ．各ヒストグラムの勾配（ｉ）と（ｉｉ）の絶対値の合計の平均；
ｉｖ．  各ヒストグラムの下流の波動の勾配を規定する部分の中点；
ｖ．    勾配（ｉ）と（ｉｉ）の勾配値の低い方の間の該ヒストグラムの面積の積分；及び
ｖｉ．  それらの組み合わせ
から成る群より選択される、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４２】
前記調整手段により、以降の試料平均における前記偏差を最小にし、前記参照標準で表される安定なソートを維持する、請求項３３に記載のシステム。
【請求項４３】
前記偏差によって補正できない試料ソートが生じた場合に、前記調整手段が前記ソートを停止するための手段を含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項４４】
前記複数の安定なソート画像又は前記複数の移動試料画像のそれぞれが少なくとも約５個の画像を含む、請求項３３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記複数の画像が約５〜約４０個の画像を含む、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記複数の画像が約１０個の画像を含む、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４７】
前記流れの前記一部が、該流れが前記フローサイトメータのノズルを出た後に形成される液滴形成領域である、請求項３３に記載のシステム。
【請求項４８】
前記流れの前記一部が近位点を含み、該流れが該近位点で前記ノズルを出て、連続流が個々の液滴に移行する遠位点へと進む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
前記流れの前記一部が、該流れから完全に分離する最初の液滴の前に該流れのネックを含む、請求項４８に記載のシステム。
【請求項５０】
前記装置（ｂ）により、少なくとも１つのアルゴリズムを前記安定なソート画像の前記ヒストグラムに適用して前記数値参照標準を作成する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項５１】
前記装置（ｂ）により、前記試料平均ヒストグラムに適用される少なくとも１つのアルゴリズムを用いて前記数値試料平均を作成する、請求項３９に記載のシステム。
【請求項５２】
前記調整手段により、シース圧力、試料圧力、結晶ドライブ、結晶周波数、及びそれらの組み合わせから成る群より選択された処理条件が調整される、請求項３４に記載のシステム。
【請求項５３】
前記数値が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）から成る群より選択され、調整される前記処理条件が結晶ドライブである、請求項４１に記載のシステム。
【請求項５４】
前記数値が（ｉｖ）であり、調整される前記処理条件がシース圧力であって、さらに前記調整手段によって該シース圧力とともに試料圧力が調整されるか又は結晶周波数が調整される、請求項４１に記載のシステム。
【請求項５５】
前記数値が（ｖ）であり、前記調整によってソートが停止される、請求項４１に記載のシステム。
【請求項５６】
前記手段の全て又は一部がコンピューター支援された、請求項３３に記載のシステム。
【請求項５７】
対照的な明領域と暗領域のパターンを有する照射野をさらに含み、前記画像化手段が、該照射野により後方から照射される流れの少なくとも一部の画像を得るよう配置され、該流れの該画像が、流体流自体の中に画像化された対照的な明領域と暗領域の該パターンの画像を含むようにする、請求項３３に記載のシステム。
【請求項５８】
前記照射野が、光源と、該光源と前記流れの間に配置された所定のパターンを有する不透明マスクとを含み、該所定のパターンが、該流れに対して実質的に平行に延びた細長いスリットを含み、該細長いスリットが、画像化される該流れの幅の約３〜３０倍の幅を有する、請求項５７に記載のシステム。
【請求項５９】
前記所定のパターンが、前記画像上に参照マークとして現れる１つ又は複数の識別マークをさらに含む、請求項５８に記載のシステム。
【請求項６０】
前記暗領域が、前記画像化手段によって見たときに前記流れの側縁を示し、該画像化手段が、該流れの全幅と、該流れの側縁に隣接してその外に投射する前記照射野からの光とをキャプチャする光許容角度を有する、請求項５７に記載のシステム。
【請求項６１】
（ａ）前記試料中の粒子とシース流体をノズルに通して流れの中で順番に並べるためのフロー装置；
（ｂ）液滴形成領域を含む該流れから液滴を生成するための液滴生成器；
（ｃ）検出装置；
（ｄ）該液滴を荷電するための荷電装置；
（ｅ）電荷の関数である該液滴の偏向後軌道を作り出すための偏向装置；及び
（ｆ）共通の偏向後軌道を有する該液滴を収集するための収集装置
を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項６２】
流体流の画像を得るためのアセンブリであって、
側面から流体流を照射するために該流体流に対して配置され、対照的な明領域と暗領域のパターンを与える照射野と；
該照射野により後方から照射される該流体流の少なくとも一部の画像を得るよう配置された画像キャプチャ装置であって、該画像キャプチャ装置によってキャプチャされる該流体流の画像が、該流体流中に画像化された対照的な明領域と暗領域の該パターンの画像を含むようする画像キャプチャ装置と
を含む、流体流の画像を得るためのアセンブリ。
【請求項６３】
前記照射野が、光源と、該光源と前記流体流の間に配置された所定のパターンを有する不透明マスクとを含む、請求項６２に記載のアセンブリ。
【請求項６４】
前記照射野が、前記光源と前記マスクの間に配置された光拡散プレートを含む、請求項６３に記載のアセンブリ。
【請求項６５】
前記光源が発光ダイオードを含む、請求項６６に記載のアセンブリ。
【請求項６６】
前記所定のパターンが幾何学的パターンである、請求項６５に記載のアセンブリ。
【請求項６７】
前記マスクが、前記幾何学的パターンを画定する細長いスリットを含む、請求項６６に記載のアセンブリ。
【請求項６８】
前記細長いスリットが、画像化される流体流に対して実質的に平行に延びている、請求項６７に記載のアセンブリ。
【請求項６９】
前記細長いスリットが、画像化される流体流の幅の約３〜３０倍の幅を有する、請求項６８に記載のアセンブリ。
【請求項７０】
前記幾何学的パターンが、前記流体流の画像中に参照マークとして現れる少なくとも１つの識別マークを含む、請求項６６に記載のアセンブリ。
【請求項７１】
前記マスクが前記流体流の中に画像化され、該マスクによって与えられる前記暗領域が、前記画像キャプチャ装置によって得られる前記画像で見たときに該流体流の側縁を示すようにする、請求項６８に記載のアセンブリ。
【請求項７２】
前記画像キャプチャ装置が、前記流体流の全幅と、該流体流の側縁に隣接してその外に投射する前記光源からの光とをキャプチャする光許容角度を有する、請求項７１に記載のアセンブリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、流れの液滴中に伴われた粒子を含む流れの特性を研究するための、特に液滴ソーティング、具体的には液滴生成の監視及び制御のためのフローサイトメータシステムの分野に関する。流れ及びその液滴中に伴われた生物細胞をソートすることで、生体臨床医学研究と臨床医学の両方に比較的純粋な試料が提供される。フローサイトメトリーを用いて細胞をソートする種々の技術が過去２０年間にわたり使用されている。中でも、例えば、Ｌｉｎｄｍｏらの「Ｆｌｏｗ Ｓｏｒｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌｓ」ｉｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，１４５−１６９頁；並びに米国特許第３，７１０，９３３号明細書；同第４，３６１，４００号明細書；同第４，９８１，５８０号明細書；同第５，４８３，４６９号明細書；及び同第５，６０２，０３９号明細書を参照されたい。
【背景技術】
【０００２】
細胞ソーティングに使用される技術には、フローソーター、例えば、フローサイトメータがある。通常のフローサイトメータ、例えば、米国特許第６，０７９，８３６号の図１に図示されるものは、シース流体中の少量の試料（これは色素処理されてもよい）から成る流体の流れを生成する装置を含む。一般に、シース流体とそれに伴われる試料は流体力学的に集束してノズルから流出し、それによりジェット流を形成する。サイトメータの液滴生成器は、例えば、ジェットを振動させて流れから液滴を生成し、それによりソーティングのための個々の液滴を形成する。さらに、通常のサイトメータは、ジェットを荷電して液滴を偏向させることができる装置を含む。例えば、米国特許第５，６０２，０３９号明細書及び同第５，４８３，４９６号明細書を参照されたい。サイトメータはまた、液滴を偏向させて電荷の関数である液滴の偏向後軌道を作り出す装置を含む。さらに、このような通常のサイトメータは、共通の偏向後軌道を有する液滴を収集するための収集装置を含む。
【０００３】
このようなサイトメータ及びこれらが作動するシステムの重要な構成部分は、流れ特には液滴の特性の検出と画像化を可能にする構成部分である。例えば、液滴を含むことができるシースと試料の流れに光線又はレーザーを向け、流れの中の色素を励起して蛍光を発生させることができる。種々のパラメータ、例えば、前方光散乱、側方光散乱、及び光の蛍光波長を検出して流れの試料粒子を同定し、特定の液滴をソートしてその中の粒子の試料を得る。さらに他のサイトメータは、流れと液滴の画像をキャプチャするための、標準的なビデオカメラ及び標準的なビデオキャプチャシステム、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、及び他のビデオ装置を含む。
【０００４】
このような通常のフローサイトメータは、粒子をソートするのに使用される静電ソーティングシステム又は流体ソーティングシステムから成る。静電システムでは、システムオペレーターが幾つかのソーティングパラメータを制御することが可能である。オペレーターが制御する静電ソーティングパラメータには、液滴の電荷、結晶の周波数、結晶のドライブ振幅、シース圧力及び試料圧力がある。
【０００５】
典型的には、試料粒子を含有する液滴のソーティングは長時間にわたって行われ、その間の環境の変化によって静電ソーターの性能が不利に影響を受ける場合がある。このような環境の変化には、温度、音響振動、及び大気圧がある。これら環境変化のうち１つ又は複数はソートに絶えず影響を及ぼすので、ソートの汚染を防ぐためシステムオペレーターはソーティングの際に装置を調整する必要がある。ソートの効率を高く維持するためには、装置の調整に熟練したオペレーターがジェット流の様子を監視し、変化があればマニュアルで補正しなければならない。これらのパラメータ及びソートの実行をオペレーターが絶えず監視することは費用がかかり面倒である。
【０００６】
ソートを改善するための先行技術の解決策は、特にダイレクトジェットモニター、例えば、光学モニターを使用し、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによってジェット及びジェット内の状態を明らかにすることであった。このシステムを使用するサイトメータでは、実際の液滴の分離点とジェット流の光画像が提供される。幾つかの光監視システムは、ジェット又は液滴の分離が起こる点の水平位置を自動的に変更するためのフィードバックシステムと結びついている。例えば、米国特許第５，６０２，０３９号明細書を参照されたい。さらに他のサイトメータシステムでは、流れ中の流体速度の測定に基づいて落下の遅延時間を調べるか、又はサイトメータが使用するノズルサイズに相関する流れの幅を決定している。例えば、米国特許第６，２４８，５９０号明細書を参照されたい。
【０００７】
当技術分野のさらに他の改善されたフローサイトメータでは、５〜２００ＫＨｚの音響振動により流体ジェットが励起され、この振動は典型的には圧電結晶素子によって作り出されるが、任意の振動装置が使用可能である。この励起によってジェット流を波立たせ、励起速度で液滴を生成することができる。波動及び生成する液滴の位相並びにジェット流ノズルに対する波動及び液滴の位置は、これらのソーターの適切な操作にとって重要である。波動と位相の制御を自動化するため、標準的なビデオカメラと標準的なビデオキャプチャシステムを用いてジェット流の画像がキャプチャされる。
【０００８】
しかしながら、ビデオ画像及びビデオ処理を利用する自動化システムでは、分析するのに十分なコントラストをジェット流が有する必要がある。現在の画像化手段では、ジェット流とジェット流後方の明視野との間にほとんどコントラストがない画像が作成される。ソーティングを改善するための当技術分野における他の解決策は、デジタル化の前にコントラストを改善するためイメージインテンシファイアやアナログビデオプロセッサのようなハードウェアを使用することを含む。しかしながら、コントラストの改善の程度は限定的であり、更なる画像操作によって細部を取り去り、真の画像を変えてしまう可能性があるので、適切な制御は理想的ではない。例えば、米国特許第５，７００，６９２号明細書を参照されたい。
【０００９】
それゆえ、安定なソーティングシステムを確立し、ソーティングシステムのソーティングパラメータを自動調整することによって安定なソーティングシステムを維持するための効率的な方法、システム及び装置に対するニーズが当技術分野にある。さらには、調整の効果を監視でき、さらにこれらパラメータの調整によって安定なソーティングシステムを維持できる組成物及び方法に対するニーズがある。フローサイトメータ装置の向上、及びコントラストの改善を可能にしかつ液滴中の粒子の正確な特性評価を可能にする方法もまた必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、１つの態様においては、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする新規の方法を提供することにより当技術分野のニーズを満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１つの態様においては、本発明の方法は、望ましいソート特性を有する安定なソートから流れの一部の複数の画像の群を作成することを伴う。任意選択でこれらの画像は連続的であり、さらにそこからバックグラウンドノイズを取り去ることができる。この複数の画像の群から安定なソートの代表的な平均数値参照標準が作成される。ソーティングの際に流れの同じ部分の複数の移動画像の１つ又は複数の群が連続的に収集される。任意選択でこれらの画像は連続的であり、さらにそこからバックグラウンドノイズを取り去ることができる。これらの複数の移動画像から複数の移動画像の各群の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均が作成される。次いで、各数値試料平均を数値参照標準と比較し、任意の数値試料平均がソートの調整を必要とする参照標準からの偏差を示すかどうか決定される。それゆえ、このような方法の追加の態様は、サイトメータにおけるソートの処理条件を偏差に応じて調整することを伴うことができる。それにより、この方法は、続いて作成される数値試料平均の偏差を最小にして参照標準の安定なソートを維持する。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、画像キャプチャ装置と新規照射野との間に流れを配置することにより流れの各画像がキャプチャされる上記の新規ソーティング方法を提供する。照射野は、ある幾何学的パターンの光投影領域と不透明なマスク領域とを与え、そのパターンが画像キャプチャ装置により撮影した流れの画像中に画像化されるようにする。１つの予想される実施態様においては、マスク領域は流れの外縁を示すように画像において現れ、画像キャプチャ装置は、流れの全幅の画像並びに流れの両方の側縁に沿って照射野から出る光をキャプチャするのに十分な光許容角度を有し、流れと画像のバックグラウンドとの間に所望のコントラストを与える。
【００１３】
さらに別の態様においては、本発明は、以下の工程を含む試料中に浮遊した粒子の安定なソートを維持するための方法を提供する。粒子とシース流体は、出口ノズルを有する導管において流速を有する流れの中で順番に並べられる。流れから液滴が生成され、これらは共通の初期軌道を有する。各液滴は対応するジェット流部分から形成され、ノズルを出たとき、このジェット流部分は液滴形成領域を含む。液滴が対応する流れ部分の内容物の特性評価に応じて荷電されるよう経時変化する電界が流れに印加される。その後、液滴の偏向後軌道が電荷の関数となるよう液滴が偏向される。共通の偏向後軌道を有する液滴が収集される。これらの工程を利用して、流れの一部の複数の画像が望ましいソート特性を有する安定なソートから作成される。一般に、望ましい特性は方法のオペレーターにより記載される。複数の画像から安定なソートの代表的な平均数値参照標準が作成される。
【００１４】
ソーティングの際に流れの一部の複数の移動画像が連続的に収集される。この複数の移動画像から少なくとも１つの数値試料平均が作成される。この平均は、複数の移動画像の各集合に関する試料ソートの代表的なものであり、数値参照標準と比較される。上記のように、この方法により、各数値試料平均がソートの調整を必要とする参照標準からの偏差を示すかどうか決定される。もしそうであれば、サイトメータにおけるソートの処理条件を偏差に応じて調整して以降の試料平均値における偏差を最小にし、参照標準の安定なソートを維持する。
【００１５】
本発明のさらに別の態様においては、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法は以下の工程を含む。近位点であって、そこで流れがサイトメータのノズルを出て、連続流が個々の液滴に移行する遠位点へと進む近位点を含む流れの一部の複数の画像の群が、望ましいソート特性を有する安定なソートから作成される。それから安定なソートの代表的な平均数値参照標準が確立される。ソーティングの際に流れの一部の複数の移動画像の少なくとも１つの群、好ましくはそれ以上の群が連続的に収集される。各群の複数の移動画像から、少なくとも１つの数値試料平均が作成され、これは各群の試料ソートの代表的なものである。各数値試料平均が数値参照標準と比較され、試料平均がソートの調整を必要とする参照標準からの偏差を示すかどうか決定される。
【００１６】
さらに別の態様においては、本発明は、上記方法の工程を含むフローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法であって、複数の画像の群の１つ又は複数のヒストグラムから作成された幾つかの具体的な数値の中から、数値参照標準と数値試料平均を選択する追加の工程を含む方法を提供する。１つの数値は、複数の参照画像又は試料画像の各群から作成されたヒストグラムのネック領域下流に現れる波動の上流辺の平均勾配である。別の数値は、これらのヒストグラムのネック領域上流に現れる波動の下流辺の平均勾配である。さらに別の数値は、上記勾配の絶対値の合計の平均である。別の有用な値は、ヒストグラムの下流の波動の勾配を規定する部分の平均中点である。さらに別の数値は、上記した上流勾配と下流勾配の勾配値の低い方の間のヒストグラムの面積の平均積分である。
【００１７】
さらに別の態様においては、本発明は、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートするシステムを提供する。このシステムの構成部分は、流れの一部の複数の画像を作成するための画像化装置；望ましい特性を有する安定なソートの複数の画像から安定なソートの代表的な平均数値参照標準を作成するための自動化装置；ソーティングの際に流れの一部の複数の移動画像を連続的に収集し、複数の移動画像から複数の移動画像の各集合の試料ソートの代表的な少なくとも１つの数値試料平均を作成するための自動化手段；及び各数値試料平均を数値参照標準と比較し、試料平均のいずれかがソートの調整を必要とする参照標準からの偏差を示すかどうか決定するための自動化設定を含む。
【００１８】
なお更なる態様においては、本発明は、流れの縁と画像内にキャプチャされるバックグラウンドとの間で劇的に向上したコントラストを作り出すように流体流の画像を得るためのアセンブリを提供する。このアセンブリは、その側面から流体流を照射するための照射野を含む。照射野は、対照的な明領域と暗領域のパターンを与える。画像キャプチャ装置は、照射野により後方から照射される流体流の少なくとも一部の画像を得るよう流体流に対して配置される。結果として得られる流体流の画像は、流体流中に画像化された対照的な明領域と暗領域の前記パターンの画像を含む。照射野は、光源と、光源と流体流の間に配置された所定のパターンを有する不透明マスクとを含むことが好ましい。例えば、所定のパターンは、細長いスリットを有するマスクにより与えられる幾何学的パターンであることができ、マスクによって与えられる暗領域は、画像キャプチャ装置によって撮影される画像中にキャプチャされると流体流の側縁を示すことができる。この目的で、画像キャプチャ装置は、所望のコントラストを得るために、流体流の全幅と、流体流の側縁に隣接してその外に投射する光源からの光とをキャプチャする光許容角度を有することができる。加えて、マスクの幾何学的パターンは、流体流の画像中に参照マークとして現れる少なくとも１つの識別マークを含むことができる。
【００１９】
本発明の他の態様及び利点は、以下に続くその好ましい実施態様の詳細な説明においてさらに説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、浮遊液又は流体試料中の粒子をソートするためのシステム、浮遊液又は流体試料中の粒子をソートする方法、及び浮遊液又は流体試料中の粒子をソートするためのソーティングフローサイトメータ又は装置を提供する。これらのシステム、方法及び装置は、当技術分野の幾つかの欠点を克服し、最も特には安定なソーティングシステムを達成することに向けられる。
【００２１】
通常のフローサイトメータによりシース中の粒子含有浮遊液の流れを最適化しようとすると、ジェットの粘度を含む粒子のソートに影響を与える幾つかのパラメータが変化する。具体的には、粘度の変化は温度変化（これは通常は装置によって制御されない）によることがわかっているため、本発明者らは、液滴形成に影響を与える幾つかのパラメータ、例えば、中でも液滴生成器の周波数、液滴生成器の周波数の振幅、及び試料圧力とシース圧力を含む圧力を変化させ、それにより粘度の変化を相殺することによって粘度と他の変動を補正した。
【００２２】
さらに、安定した液滴の分離点を与える周波数範囲は、安定した液滴の分離を達成する圧力範囲よりも狭いことが見出された。シース圧力を調整して粘度の変動を補正する１つの面倒な点は、試料浮遊液の圧力を同様の量だけ上下させなければならないことであった。試料の圧力が適切に調整されない場合には、試料の流れが加速又は減速して高いソーティング収率に必要とされる粒子（細胞）と液滴の比率が乱れた。
【００２３】
以下に詳細に記載されるように、本発明は、ソートが所望の効率と安定性で作動しているときに、ジェット流の選択部分、好ましくは液滴形成領域の複数の画像から作成された少なくとも１つの数値参照標準を提供することにより当技術分野のこれら及び他の問題に対処する。その後、ソートの際に、流れの同じ部分の複数の連続した移動画像を引き続き使用し、参照標準に対応する試料平均数値を作成する。試料平均値は絶えず参照標準と比較され、試料平均と参照標準の間に有意な偏差が見られた場合には、ソーティングパラメータの調整を始めてソートを補正し、以降の試料平均を参照標準と実質的に同一に戻す。このように、このシステムはソートを安定化させるためそれ自体を絶えず補正する。例として、１つのこのような調整は、電子圧力調整器を利用してシース圧力と試料圧力の電子的な調整を可能とし、それによりソーティングパラメータのコンピューター制御を可能にすることを伴う。
【００２４】
偏差の検出と結果として生じる調整は、本発明の方法を指令するコンピュータープログラムを使用することにより自動的に行われ、それにより安定なソート操作をマニュアルで維持するための時間の消費とコストを排除することができる。
【００２５】
Ｉ．定義
本明細書を通して用いられる「浮遊液」又は「試料」という用語は、本発明に従って分析することができる任意の液体又は溶液について言うものである。試料は、シース流体とは異なり、フローサイトメータのチューブを通ってフローセルに進むことのできる任意のものであることができる。浮遊液は、本発明に従って分析することができる１つ又は複数の粒子を典型的に含有する。粒子は浮遊液中に分散している場合がある。このような浮遊液は、これらに限定するものではないが、とりわけ、洗剤、球状化剤、特に測定すべき成分に結合する蛍光色素分子を含む色素、米国特許第３，９６２，１２５号明細書で記載されているものを含む緩衝剤、防腐剤、強化剤、抗菌物質、希釈剤、酸及び塩基などの物質を任意選択で含むことができる。浮遊液は、その中に含まれる粒子に結合している及び結合していない蛍光色素分子を含有することが好ましい。
【００２６】
本明細書を通して用いられる「粒子」という用語は、本発明に従って分析することができる任意の物体について言うものである。本明細書で用いられる場合には、粒子という用語は、これらに限定するものではないが、ウィルス、細菌、植物細胞及び動物細胞（全血若しくは組織試料又は血しょうや血清のような血液成分から得られる）を含む。粒子という用語は、これらに限定するものではないが、白血球、赤血球、末梢血リンパ球、及び組織や生検試料から得られる細胞を含むことが好ましい。
【００２７】
本明細書を通して用いられる「シース」又は「シース流体」という用語は、ソーティングを達成するために浮遊液又は試料が分散されている物理媒体について言うものである。シース流体は一般に、試料が分散されている不活性な導電性の液体である。幾つかのシースが当技術分野で用いられ、これらに限定するものではないが、水及び塩溶液（食塩水を含む）を含む。シースは等張食塩水（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）であることが好ましい。シースは、試料の分析点で目に見えないことが理想的である。これは、電荷が最後の結合流れ部分（以前は最後の結合液滴として知られていた）に達することができるよう導電性である。シースの圧力は、ジェットの速度における主要なファクターである。
【００２８】
本明細書を通して用いられる「流れ」という用語は、シース媒体と本発明の装置を流れる粒子の浮遊液とを含有する物理媒体について言うものである。より具体的には、流れは、シースと粒子を組み合わせたものを含む。流れは、ノズルを出る前の部分、ノズルを出た後の部分、及び液滴が形成された後の部分を含む。
【００２９】
本明細書を通して用いられる「ジェット流」又は「ジェット」という用語は、フローサイトメータのフローセル出口ノズル又は液滴生成器を出た流れの部分について言うものである。より具体的には、ジェットは、ピーク及びピーク間の谷を有する波動又は曲線を含む。谷はまた「ネック」領域とも呼ばれる。ジェットはまた、水がホースを出るような下流を形成する遊離液滴を含む。ジェットの速度は、試料が分析点から最後の結合流れ部分へ移動する速度の主要なファクターである。フローサイトメータでは、圧電発振器によりジェットが出て、ジェットが連続した波動から遊離液滴に移行する正確な点を作り出し、既知の分離点を強制的に作り出す。
【００３０】
本明細書を通して用いられる「液滴」という用語は、一般にはネック領域後に連続したジェットから分離して出口ノズルを出たジェットの液体試料のばらばらに形成された部分について言うものである。本発明によって形成された液滴は、幾つかの異なる形状を有することができる。典型的には、液滴は球形又は楕円形である。
【００３１】
本明細書を通して用いられる「分離点」という用語は、出口ノズルを出た連続ジェットから液滴が完全に分離する流れの位置について言うものである。
【００３２】
本明細書を通して用いられる「画像化手段」という用語は、本発明に従って流れ試料の画像をキャプチャするか又はそれを作成することができる任意の装置について言うものである。画像化手段は、液滴生成器と公知の位相関係を有するジェット流の画像を得る。画像化手段の構成部分は、照射野及び画像キャプチャ手段、例えば、カメラを含む。
【００３３】
本明細書を通して用いられる「有効電荷」という用語は、正電荷、負電荷又は中性電荷について言うものである。
【００３４】
本明細書を通して用いられる「安定なソーティングシステムの維持」という用語は、確立されたソーティングシステムに関する値を一定に維持する能力について言うものである。この値はジェットの幾何学的形状により決定される。確立されたソーティングシステムを維持する能力には、値を監視して、ソートの際にジェットに生じる望ましくない変化を補正するため処理パラメータを調整及び再調整する能力がある。
【００３５】
本明細書を通して用いられる「結晶ドライブ」及び「結晶周波数」という用語は、液滴生成装置への信号について言うものである。結晶ドライブは信号の振幅を意味し、結晶周波数は信号の周波数を意味する。本発明の好ましい実施態様においては、圧電装置は様々な電圧信号で励起され、その周波数は液滴生成速度を決定し、その振幅は液滴の分離点に作用する。
【００３６】
「試料圧力」という用語は、試料をフローセルに送るのに用いられるフローサイトメータ内の圧力を意味する。その代わりとして、これはシリンジドライブであってもよい。試料圧力は電子圧力調整器によって制御され、この電子圧力調整器はフローサイトメータの処理装置によって制御される。試料圧力はシース圧力が変化すると変化し、フローセルとソート流れにおいて相対的な容量を一定に維持する。
【００３７】
「シース圧力」という用語は、シースをフローセルに送るのに用いられるフローサイトメータ内の圧力を意味する。その代わりとして、これはシリンジドライブであってもよい。シース圧力は電子圧力調整器によって制御され、この電子圧力調整器はフローサイトメータの処理装置によって制御される。
【００３８】
ＩＩ．発明の方法及びシステム
本発明は、試料の粒子をソートするための、流れの液滴形成を制御するための、及び安定なソーティングシステムを維持するための、システム、装置、及び方法を提供する。
【００３９】
本発明の粒子をソートするためのシステム、装置、及び方法は、確立された安定なソーティングシステムにおけるジェットの選択部分の複数の画像の群をキャプチャし、複数の画像の統計平均に相当する数値参照標準を作成することによって当技術分野の欠点を克服する。
【００４０】
本発明者らは、安定で効率的なソートの複数の画像をキャプチャし平均化することにより、数値参照標準を作成でき、これを用いてソートの安定性を維持することができることを見出した。複数の画像を分析することによって、先行技術の個々の画像中に存在するノイズを最小限に抑える。ソーティングプロセスを通して絶えずソーティングプロセスの複数の画像をキャプチャし、標準に対応する複数の移動試料平均を作成することにより、数値試料平均を参照標準と比較し、それからの如何なる偏差も検出して補正することができる。
【００４１】
この方法は、ソートの連続した画像を比較するか又は画像の外形を比較する先行技術の方法に対し多くの利点を有する。本発明者らは、複数の画像から得られる「数値平均」である試料値を比較することでソートプロセスにおけるわずかな偏差を平均し、それにより不要なソートパラメータの調整を防ぐことを決定した。しかしながら、試料の複数の移動画像から作成される「平均値」によって、「理想的な」参照標準に対するソート中の直接的な比較が可能となり、それによってより安定なソートの維持が単純化される。
【００４２】
したがって、１つの実施態様においては、フローサイトメータにおいて試料流中の粒子をソートする方法は以下の工程を含む。まず、流れの一部の複数の画像をキャプチャし、その画像から望ましいソート特性を有する安定なソートにおいてバックグラウンドノイズを取り去る。所望の安定なソートのこれら複数の連続画像を解読し平均して１つの参照標準にする。この参照標準は、特定のソーティング操作について理想的な安定なソートに相当する。
【００４３】
次に、ソーティング操作の際に、流れの同じ部分の、好ましくはバックグラウンドノイズを取り去った複数の画像の群が連続的に収集される。次いで、所望の複数のこのような試料画像を解読し平均して、試料ソートに相当する「試料」平均値を所望の時間をおいて作成する。平均値を得るのに用いられる複数の試料画像の群は、連続した移動試料画像であることが好ましい。画像に適用される「移動」という用語は、一連の連続画像を意味する。例えば、試料平均値を作成するのに用いられる最初の複数の画像が画像１〜１０である場合には、次の連続した「移動」試料平均値は、画像２〜１１、次は３〜１２などから作成される。このように、各試料平均値は、ソート流れの連続した複数の移動画像の以降の群を分析することにより作成されることが好ましい。
【００４４】
この方法によれば、各試料平均値は参照標準と比較される。参照標準と試料平均値とに有意な１つ又は複数の偏差があれば、その偏差に応じてサイトメータにおけるソートの１つ又は複数の処理パラメータを調整するよう信号が出る。このように、必要な調整によってソートから得られる以降の試料平均値の偏差を最小にし、参照標準の安定なソートを維持する。
【００４５】
数値標準と平均値を得るための画像に由来する数値平均化の本方法はまた、本方法の他の実施態様又は変形態様において使用することができ、これらに限定するものではないが、流れの中の粒子を順番に並べる工程；流れから液滴を生成する工程；流れの液滴を荷電する工程；荷電した液滴を偏向させる工程；及び偏向した液滴を収集する工程を含む１つ又は複数の通常のフローサイトメトリー工程をさらに含む。例えば、この画像に由来する数値平均化法は、１つ又は複数の通常のフローサイトメトリー工程、例えば、流速を有する流れの中の粒子を順番に並べる工程；共通の初期軌道を有する流れから液滴を生成する工程であって、各液滴が対応するジェット流部分から形成される工程；対応する流れ部分の内容物の特性評価に応じて液滴が荷電されるよう経時変化する電界を流れに印加する工程；液滴の偏向後軌道が電荷の関数となるよう液滴を偏向させる工程；及び共通の偏向後軌道を有する群に液滴を収集する工程を含む方法に適用することができる。
【００４６】
如何なる通常の粒子ソーティングシステムも、本明細書で説明されかつ以下にさらに詳細に説明される画像に由来する数値平均化法を含むよう適合させることができると考えられる。数値とそれから誘導されるものの具体例は、画像化と偏差の説明において後述される。
【００４７】
本発明はまた、流れの中の粒子をソートするシステムを提供する。１つの実施態様においては、任意選択でバックグラウンドノイズが取り去られた流れの一部の複数の画像を作成するための画像化装置を含む流れの中の粒子をソートするシステムが提供される。自動化された、例えば、コンピューター支援された装置によって、望ましい特性を有する安定なソートの複数の画像から、該安定なソートの代表的な平均数値参照標準が作成される。自動化された、例えば、コンピューター支援された装置によって、ソートの際に任意選択でバックグラウンドノイズが取り去られた流れの一部の複数の移動画像が連続的に収集され、複数の移動画像から、複数の移動画像の各集合の試料ソートに相当する少なくとも１つの数値試料平均が作成される。自動化された、例えば、コンピューター支援された手段は、各数値試料平均を数値参照標準と比較し、該試料平均のいずれかが参照標準から有意な偏差を示すかどうか決定するのに用いられる。このシステムはまた、必要であれば、該サイトメータにおけるソートの処理条件を偏差に応じて調整するためのデバイス又は装置を含む。この調整は、以降の試料平均の偏差を最小にして参照標準の安定なソートを維持するのに必要である。
【００４８】
フローサイトメータを含む幾つかの通常の粒子ソーティング装置は、装置をほとんど又は全く変更せずに本発明を実施するよう適合させることができる。流れの中の粒子をソートするための通常のフローサイトメータは、流れ手段、液滴生成器、検出手段、調整手段、荷電手段、偏向手段、及び収集手段を一般に含む。本発明の方法を実施するための他の装置は、より具体的には、ジェットを作り出すための出口ノズルを有する導管を含む流れ手段；流れから液滴を生成するための液滴生成器であって、液滴が共通の初期軌道を有し、各液滴が対応するジェット流部分から形成される液滴生成器；流れの内容物の特性評価を提供するための検出器；対応する流れ部分の内容物の特性評価に応じて液滴が荷電されるよう経時変化する電界を流れに印加するための荷電装置；液滴の偏向後軌道が電荷の関数となるよう液滴を偏向させるための偏向器；及び共通の偏向後軌道を有する液滴を収集するための収集装置を含むことができる。
【００４９】
好ましくは、有用なフローサイトメータは、これらに限定するものではないが、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＴＰＳ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）ＩＶ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）Ｖ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）Ｃ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）７５０ ＳＥＲＩＥＳ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＬＩＴＥ（商標）（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）ＡＬＴＲＡ（商標）サイトメータ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）並びに中でもＬｉｎｄｍｏらの「Ｆｌｏｗ Ｓｏｒｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｅｌｌｓ」ｉｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０），１４５−１６９頁、米国特許第４，３６１，４００号明細書、同第４，９８１，５８０号明細書、同第５，７００，６９２号明細書、同第５，６０２，０３９号明細書、及び同第５，４８３，４６９号明細書に記載されているものを含む。これらの典型的なフローサイトメトリーのソーターは、本発明の方法を達成するために幾つかの変更を加えることで本発明において利用することができ、以下の構成部分を含む。
【００５０】
粒子ソーティングプロセスの以下の説明は、一般に図１Ａと図１Ｂについて言うものである。
【００５１】
Ａ．フローセルチャンバー
本発明の方法に有用な本発明のシステムの１つの構成部分は、試料貯蔵器１０２に含まれる浮遊液中の細胞又は粒子のソーティングを可能とするセルソーター１００である。浮遊液をフローセルチャンバー１０４に押し込み、試料が試料チューブからフローセル１０４に入ると、シース流体貯蔵器１０６からのシース流体が試料を取り囲む。シース流体と試料のこの複合体は、浮遊液を結果として得られる流れにおいて直列化した順序に集束させる。フローセル１０４は、集束した試料がレーザービーム１０８と交差する分析点を提供する。上記のシースと試料の相違がフローセル１０４において検出される。
【００５２】
順番に並べられた浮遊液シース流体混合物１１０は、出口ノズル１１２を通ってフローセルチャンバー１０４の導管から出る。流れ１１０の定常状態流が確立されることが好ましい。典型的には、約０．５〜約１０気圧（ａｔｍ）の圧力が本発明で利用される。しかしながら、当業者であれば容易に圧力を調整できるであろう。
【００５３】
Ｂ．液滴生成器
液滴生成器１１４もまた、本発明の更なる構成部分として含まれる。液滴生成器１１４はジェットをかき乱す。そうすることにより、波動の波がジェットに沿ってジェットの速度で伝わる。好ましくは、ジェットの撹乱を行うのに圧電性結晶が利用される。撹乱の周波数は周波数発生器（図示せず）により設定され、当業者によって決定される通りに変化させることができる。ドライブ振幅は増幅器（図示せず）により設定される。流れが出口ノズル１１２を通して押し出されるとジェットが形成され、液滴生成器のドライブ周波数でばらばらにされて液滴になる。
【００５４】
試料がフローセル１０４中でレーザー１０８により検出された時間から流れが荷電される時間までの経過時間は遅延時間と呼ばれる。遅延時間は、分析点から最後の結合流れ部分１１６までの所望の試料の走行時間に一致しなければならない。流れの配置は、優れたソーティングの結果を確実にするよう最後の結合流れ部分１１６を試料と同じ位置に置かなければならない。流れの配置は本発明において操作される。
【００５５】
図１Ａに関して、ジェット流又はジェットは、流れの液滴形成領域３２を典型的に含む。具体的には、ジェット流又はジェットは、ネック２２、最後の結合液滴２４、及び液滴が隣接するジェットから分離する遠位点３４を含む。形成した液滴は、共通の初期軌道を有することが好ましい。所望の液滴形成速度は、結晶周波数を調整することにより達成することができ、シース圧力と結晶ドライブは最後の結合液滴の位置に作用する。
【００５６】
Ｃ．検出器
本発明において有用な別の構成部分は検出装置１１８であり、特定粒子の流れを監視し、流れの内容物の特性評価を与える。典型的には、浮遊液とシース流体の流れ１１０がキュベット（図示せず）に流入し、これが光源１０８により照射される。キュベットは、フローセル１０４の目に見えるようにしたチャンバー又は部分にあることが好ましい。しかしながら、分析すべき浮遊液を含有するのに他のチャンバーを利用することができ、それは当業者によって選択することができる。好適な光源には、これらに限定するものではないが、中でも、アーク灯、レーザー、電球、発光ダイオード（ＬＥＤ）がある。典型的には、光源１０８は連続的に運転される。
【００５７】
ただ１つの光源１０８と検出器１１８を粒子の特性評価に用いることができるが、より複雑な特性評価及びより複雑なサイトメータでは、複数の光源や検出器を使用することができると解される。図１Ｂでは、光源（レーザー）１０８はノズル１１２の上の流れに焦点を合わせている。蛍光（又は他の）色素が試料中に取り込まれた実施態様においては、この光源は、結合した色素分子と結合していない色素分子の両方を励起することができる。そうすることにより、色素分子は既知の波長で蛍光を発する。照射領域の通過粒子による散乱及び蛍光の強度は検出器により検出される。さらに他の光源及び検出器は、ノズルの下及び液滴形成領域の上の流れに焦点を合わせることができる。
【００５８】
検出器出力は、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）（図示せず）によりデジタル化される。次いで、デジタルデータをデジタルデータ処理装置（ＤＤＰ）（図示せず）により分析し、粒子が存在するかどうか、また存在するのであれば、関係があるかどうかを決定する。他の検出法も同様に当業者により十分理解されている。
【００５９】
Ｄ．画像化手段
本発明の更なる構成部分は、本発明に従ってノズル１１２の下のジェットの画像をキャプチャするための画像化手段３８（図６〜１２を参照）を含む。画像化手段は、ジェットの１つ又は複数の図をキャプチャするため様々な位置に置くことができるが、本発明の実施における液滴形成領域３２（図１Ａを参照）に置くことが好ましい。様々な画像化手段が当技術分野で公知であり、それは本発明において利用することができ、本明細書で記載される画像化手段を含むことができる。
【００６０】
幾つかのフローサイトメータでは、画像化手段として、流れ１１０の後方に位置する幅広の明視野１２０、例えば、ＬＥＤスクリーンと、ビデオカメラ、例えば、照射から流れの反対側に位置するＣＣＤカメラとが用いられる。１つの実施態様においては、画像化手段は１つ又は複数の明視野又は光学源を有する。典型的には、光学源１２０は、流れの１つ又は複数の部分を照射することができる。光学源１２０は、これらに限定するものではないが、中でも、Ｘ線、ＵＶ、可視光及び赤外の領域の波長を含む信号を発生させることが好ましい。画像化手段は、照射された粒子から検出器が受け取る信号を妨害しないことが好ましい。
【００６１】
光学源又は明視野１２０がノズル１１２下のジェット１１０を照射する場合、これはフローサイトメータ１００の液滴生成器１１４、例えば、圧電発振器の周波数と同じ周波数で光をストロボ発光させる。明視野１２０は、発振器と同じ周波数で光をストロボ発光させることができる。１つの実施態様においては、画像化手段は、約０．６〜約１００ｋＨｚの周波数で運転されるが、周波数は、必要に応じて当業者により調整することができる。
【００６２】
ノズル１１２下のジェット１１０の照射においては、光源１２０のＬＥＤがジェットを照射し、画像キャプチャ装置又は検出器、例えば、カメラによって見られるように、ジェットが固定位置に止まっているように見えるが、実際には、ジェットの波動は現にジェットに沿ってジェット流と同様の速度で移動している。
【００６３】
１つの実施態様においては、画像キャプチャ装置は、電荷結合素子（ＣＣＤ）を含む。他の実施態様においては、ビデオキャプチャカメラ、ビデオ画像をビットマップに変換するキャプチャカードを含む。当業者に公知の他のアナログ装置を使用することができる。カメラはＬＥＤ１２０からの光を収集し、この光はジェット１１０が存在する場合にはそれによって遮られ、ジェットの画像が作成される。カメラは、ジェットの長さに沿って様々な位置からジェットを見ることができ、フローサイトメータにおいて移動可能な構成要素であるか又は固定された構成要素である。このようなアナログ装置では、画像がデジタル化のためにキャプチャカードに通される。あるいはまた、画像化手段は、キャプチャカードなしでデジタル画像を作成するデジタルカメラであってもよい。次いで、画像は処理装置（図示せず）に通される。
【００６４】
典型的には、画像化手段は、ジェット１１０の選択部分の画像を得るのに利用される。したがって、本発明においては、カメラは、出口ノズル１１２から最後の結合流れ部分１１６までのジェット１１０を調べるためにフローサイトメータ内に配置される。より具体的には、ジェットの選択部分は、近位点として、ノズル１１２を出た流れ又はジェットの点と、遠位点として、液滴の分離点が生じた点、即ち、連続した流れ又はジェットが個々の液滴に移行した点とを含む。図１Ａに記載されるように、ジェットの選択部分は、流れのネック２２と、最後の結合液滴２４とを含む。ジェットの選択部分は、最後の結合液滴を含むことが好ましい。ジェットのさらに他の部分、例えば、液滴形成領域全体、又は流れから完全に分離する最初の液滴の前に流れのネックを含む流れの部分を調べることができる。しかしながら、ジェットの他の部分も同様に分析することができる。
【００６５】
上記のように、本発明の方法の実施においては、ジェットの複数の画像又はその好ましい部分が典型的に得られ、安定なソートを維持するため本発明の実施において平均される。得られる画像の数は、装置に対して望ましくない調整及び不要な調整を避けるのに十分なものでなければならないが、あまりにも長期間にわたって画像を得ることが必要なほど多いべきではない。典型的に、約３個未満の画像の複数の画像を得る場合には、多量の望ましくないノイズが存在するために、装置に対して望ましくない調整及び不要な調整を行うことになる。同様に、約４０個を超える画像を得る場合には、一般的に非常に多くの時間を必要とし、許される以上にコンピューター上のスペースを占めることになる。これらを考慮して、好ましくは、約５個以上のジェット画像が得られる。より好ましくは、約５〜約４０個のジェット画像が得られる。さらにより好ましくは、約５〜約２５個のジェット画像が得られる。最も好ましくは、約１０個のジェット画像が得られる。典型的には、複数の画像が連続的に又は逐次的に得られる。
【００６６】
Ｅ．数値標準及び試料平均を作成する手段
画像を処理するための、数値標準と試料平均を作成するための、並びに平均を比較してその結果を作成するための装置及び手段が単一の情報処理装置に包含できることは、以下の説明において理解されるであろう。この装置は、コンピューターであってもよいし、コンピュータープログラムを用いてもよい。適切な処理装置の選択は、本明細書に含まれる教示を考慮すれば、当該分野の技術の範囲内である。
【００６７】
典型的には、ジェットの画像（図２Ｂを参照）はノイズを含む。典型的には、画像中に存在するノイズは、光学的照射源又は明視野１２０によって発生する。しかしながら、装置の他の構成部分が、画像中に望ましくないノイズを発生させる場合がある。ノイズを低減又は排除することで、より正確なジェットの表示を得ることができる。したがって、分析すべきジェットの正確な画像を得るためには、ジェットの画像中に存在する残留ノイズを排除又は最小化しなければならない。典型的には、ノイズは、バックグラウンド画像を差し引くことにより排除される。それゆえ、本発明は、ノイズを含む１つ又は複数のバックグラウンド画像を得ることができる（図２Ａを参照）。バックグラウンド画像は、典型的にはシース又は浮遊流体流が存在しない状態で得られる。正確なバックグラウンド画像を得るために、シース又は浮遊流体流なしの複数のバックグラウンド画像が得られる。好ましくは、約５以上のバックグラウンド画像が得られる。より好ましくは、約５〜約４０のバックグラウンド画像が得られる。さらにより好ましくは、約５〜約１０のバックグラウンド画像が得られる。最も好ましくは、約１０のバックグラウンド画像が得られる。複数のバックグラウンド画像が任意選択で平均され、本発明に従って使用されるバックグラウンド画像を得ることができる。
【００６８】
次いで、バックグラウンド画像（図２Ａ）とジェットの実際の画像（図２Ｂ）の両方とも、当業者に公知のソフトウェア及びコンピューター支援媒体を用いて画質を向上させることができる。典型的には、画像は、これらに限定するものではないが、中でも、画像をダイナミックに増大させるスケールリング、画像フィルタリング、及び平滑化を含む技術を用いて向上される。「Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」，Ｒ．Ｃ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ及びＲ．Ｅ．Ｗｏｏｄｓ編，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９２並びに「Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ」，Ｊ．Ｔ．Ｔｏｕ及びＲ．Ｃ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ編，Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９７４などのテキストを参照されたい。
【００６９】
バックグラウンド画像とジェット画像を得てこれらの画質を向上させた後、ジェットの画像からバックグラウンド画像を差し引いてノイズを除去する。図２Ｃを参照されたい。バックグラウンド画像とジェット画像が同じサイズであれば、ジェット画像からバックグラウンド画像を差し引く前の追加の操作は不要とすることができる。通常の及び有用なノイズ低減法は、上記で引用したＴｏｕとＧｏｎｚａｌｅｚのテキストにも記載されている。必要であれば、後日のマニュアル又はコンピューター支援の比較のために、バックグラウンドを差し引く前後のジェットの画像を保存することができる。その代わりとして及び好ましくは、画像は即座に得られ、モニター上に表示される。しかしながら、本発明の利点は、コンピューター上の保存を最適化すること、又はモニター上に表示するのに必要な時間を最適化すること、及びその後の使用のために画像を保存することなく以下に従って画像を即座に処理することを含む。
【００７０】
バックグラウンドを差し引いた後、ジェットの選択部分の画像は、当業者に公知の機能の中でも、画像の向上に関して当技術分野で公知である装置、コンピューター又は技術を用いて処理される。図２Ｄと２Ｅを参照されたい。画像を向上させる追加の方法には、一方の縁から最初の暗い画素までの画素を数え、次いで同じ線上の反対側の縁から最初の暗い画素まで数えることにより、流れの縁の条件を抽出することを含む方法がある。図２Ｆを参照されたい。
【００７１】
画像化手段により複数の画像を作成して、これら複数の画像の画質を向上させた後、画像を処理してこれら複数の画像から、その試料のタイプについて安定なソートの代表的な平均数値参照標準が作成される。同様の技術を用いて参照標準との比較のために移動平均試料値が作成される。
【００７２】
一般には、フローサイトメータの処理装置は、方法のユーザーによって記載される理想的な又は安定なソートの複数の連続画像の群を採用する。当業者に公知の画像処理及び統計分析法を用いて、各画像に関するヒストグラム、又は複数の画像の各群に関する複数の画像に基づいた平均ヒストグラムが得られる。図３を参照されたい。好ましくは、得られた画像のＸ軸に沿ったそれぞれ及び全ての画素について、得られた画像のＹ軸に沿った積分操作を行うことにより、画像の一次元ヒストグラムが作成される。所望の複数の画像、例えば、１０個の画像を使用して１０個のヒストグラムを与え、そのヒストグラムから計算が行われる。あるいはまた、複数のヒストグラムを平均して単一の平均ヒストグラムとし、それから１つの値が得られる。各一次元ヒストグラム又は単一の平均ヒストグラムは、Ｘ軸上の下流と上流の方向、少なくとも１つのネック領域、及びネック領域下流の少なくとも１つの波動によって特徴付けられる。ヒストグラムは、異なるサイズを有し、ネック、最後の結合液滴、第１及び第２の遊離液滴、サテライト及び以降の複数の波長周期を含め、時間の経過とともにジェットの各部分と相関する複数の波動を一般に含む。それゆえ、ヒストグラムの各波動は、正の勾配と負の勾配、ピーク高さの最大値、ピーク幅、ピーク間距離（例えば一般にはネック）並びにピークのサイズ及び形状の均一性又は不一致性を含む。
【００７３】
幾つかのソフトウェアプログラムを利用して画像からヒストグラムを作成することができ、それらにはＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅプログラム（メリーランド州、フレデリックのシオン）及びＭＳ Ｅｘｃｅｌ（カリフォルニア州のマイクロソフト社）がある。さらに他の通常の統計学のテキストが、ヒストグラムの作成に関する説明に利用できる。個々の画像からバックグラウンドを差し引くことで除去されないノイズはまた、Ｘ軸に沿ってヒストグラム操作を実施し、最小画素の閾値についてスキャニングして得られた画像の上下の境界を確立した後、後述するようにＸ軸に沿ってヒストグラムデータを作成することにより最小限に抑えることができる。
【００７４】
それゆえ、１つの実施態様においては、安定なソートからの複数の画像が個々のヒストグラムに変換される。各ヒストグラムから、選択された数値が計算される。次いで、複数のヒストグラムの群の各ヒストグラムからの値を平均して数値参照標準を作成する。図４Ａを参照されたい。数値参照標準を作成する他の方法は、安定なソートの複数の画像を単一の平均ヒストグラムに変換し、単一の平均ヒストグラムから、数値参照標準を規定する選択された数値平均値を決定することによる。したがって、数値平均参照標準は理想的なソートに相当する。参照標準が確立された後、試料ソートが行われ、試料ソートの複数の移動画像の群が収集され、上記したように個々の又は平均された試料ヒストグラムが作成される。参照標準に対応する少なくとも１つの数値試料平均が計算され、これは参照標準と比較できる。したがって、１つの実施態様においては、複数の試料画像は個々の試料ヒストグラムに変換され、各ヒストグラムから、参照標準に対応する選択された数値が決定される。複数の試料画像の複数の試料ヒストグラムからのこれらの数値は平均されて、複数の移動画像の各集合の試料ソートの少なくとも１つの数値試料平均が作成される。あるいはまた、複数の試料画像の群が単一の平均試料に変換され、複数の移動画像の各集合の試料ソートの選択された数値試料平均値が平均ヒストグラムから作成される。
【００７５】
ヒストグラムにアルゴリズムを適用することにより、上記ヒストグラムから参照標準と試料平均が作成される。
【００７６】
１つの実施態様として、参照標準平均及び／又は試料平均は、ヒストグラムから作成された数値の以下のカテゴリー、即ち、
ｉ．    各ヒストグラムのネック領域下流に現れる波動の上流辺の勾配；
ｉｉ．  各ヒストグラムのネック領域上流に現れる波動の下流辺の勾配；
ｉｉｉ．各ヒストグラムのネック領域下流に現れる波動の上流辺の勾配と各ヒストグラムのネック領域上流に現れる波動の下流辺の勾配の絶対値の合計の平均；
ｉｖ．  各ヒストグラムの下流の波動の勾配を規定する部分の中点；及び／又は
ｖ．    勾配（ｉ）と（ｉｉ）の勾配値の低い方の間のヒストグラムの面積の積分
の１つ又は複数から作成することができる。
【００７７】
勾配は、アルゴリズムを用いてｉ、ｉｉ又はｉｉｉの数値について計算される。勾配は、液滴形成領域のネックの波動について測定されることが好ましい。例えば、以下の位置がヒストグラム上に存在し、それぞれの位置はＸ値とＹ値を有する。即ち、Ａは最後の結合液滴に対応するヒストグラム波動のピークであり；Ｂは最後の結合液滴の勾配の上部であり；ＣはＢとＤにより規定される部分の中点であり；Ｄは最後の結合液滴の勾配の底部であり；Ｅは最後の結合液滴の谷の値であり；Ｆは次の上流の液滴の谷の値であり；Ｇは次の上流の液滴の勾配の底部であり；Ｈは点ＧとＩの間の部分の中点であり；Ｉは次の上流の液滴の勾配の上部であり；Ｊは次の上流の液滴のピーク値である。
【００７８】
１つの例において、勾配（ｉ）を作成するには、アルゴリズムは、
勾配＝（（Ｄｙ−Ｂｙ）／（Ｄｘ−Ｂｘ））及び（Ｉｙ−Ｇｙ）／（Ｉｘ−Ｇｘ）であって、式中、Ｂｙ＝Ａｙ−２０％（Ａｙ−Ｅｙ）であり、それが交差するところにヒストグラムはＢｘを与える。Ｄｙ＝Ａｙ−８０％（Ａｙ−Ｅｙ）であり、それが交差するところにヒストグラムはＤｘを与える。Ｇｙ＝Ｊｙ−８０％（Ｊｙ−Ｆｙ）であり、それが交差するところにヒストグラムはＧｘを与える。Ｉｙ＝Ｊｙ−２０％（Ｊｙ−Ｅｙ）であり、それが交差するところにヒストグラムはＩｘを与える。加えて、勾配を規定する線分上の他の位置を利用することができる。
【００７９】
参照標準が勾配の少なくとも１つ又はそれらの組み合わせであり、勾配の試料平均値がこの標準から大きくはずれている場合に、変更すべき処理条件は結晶ドライブの振幅である。
【００８０】
別の計算を用いて各ヒストグラムの下流の波動の勾配を規定する部分の中点を確立し、シース圧力と試料圧力の調整の必要性を示す値であって、それが対応する参照標準からはずれている場合にはその値を与えることができる。この部分は、勾配を規定する２点であるＢとＤ又はＧとＩの間の線である。任意の指定された勾配部分の中点は、上部と底部のＸ値とＹ値を足し算して、それらの合計を２で割ることにより得られる。Ｃｘ中点＝（Ｂｘ＋Ｄｘ）／２、Ｃｙ中点＝（Ｂｙ＋Ｄｙ）／２である。
【００８１】
参照標準が中点であり、中点の試料平均値がこの標準から大きくはずれている場合に、変更すべき処理条件はシース圧力である。
【００８２】
中点Ｃと中点Ｈの間のヒストグラムの積分値（ｖ）は、参照標準と大きく異なっている場合には重大なシステム故障を示す数値である。
【００８３】
本発明によれば、上記の値（ｉ）〜（ｖ）のうち少なくとも１つの参照標準が決定され、その後の使用のために保存されると、複数の移動連続画像からの対応する試料平均値がソートの際に監視される。
【００８４】
好ましくは、少なくとも２つのアルゴリズムが、ソートの偏差を測定しこれを補正するのに用いられる。別の実施態様においては、本発明で用いられるアルゴリズムは、これらに限定するものではないが、勾配により規定される線の位置、好ましくは中点、勾配値、及び勾配を規定する値の低い方（Ｄ〜Ｇ）の間の面積の積分を含む。例えば、図５Ａ〜５Ｃを参照されたい。
【００８５】
好ましくは、ヒストグラムに適用されるアルゴリズムは、とりわけ、最後の結合液滴又はネックの下流側に対応するヒストグラムの領域に適用される。第１のアルゴリズムは、ネックの下流側に対するヒストグラム曲線の勾配の数値を決定する。第２のアルゴリズムは、ネックの下流側に対応するヒストグラム曲線の勾配を規定する線分の中点の位置を決定する。
【００８６】
１つの実施態様においては、まず、最適なソートの最後の結合液滴の勾配を規定する線分の参照勾配値と中点の位置が確立される。参照値を決定するために、最後の結合液滴又はネック領域に関するヒストグラム曲線の勾配の勾配値及び中点の位置が、所与の時間の間に安定して、それにより連続画像がキャプチャされるまで監視されるか、又はユーザーによってソートが最適化したと決定されるまで監視される。安定な位置と平均勾配について言うと、平均勾配が計算され、平均勾配の中点の位置が決定される。次いで、これらの参照値と位置が保存され、後述するように使用される。
【００８７】
本明細書で同定されるアルゴリズムに加え、好適なアルゴリズムの作成は十分に当業者の技術の範囲内である。この方法は、任意の特定のアルゴリズムを選択することで制限されない。典型的には、コンピューター支援媒体が、ソートの偏差を示すことができる数値を決定するための手段として分析アルゴリズムをヒストグラムに適用するのに用いられる。
【００８８】
Ｆ．偏差手段
次に、試料平均が参照標準と比較される。参照標準と比較して、試料平均の変動が当業者によって決定される所定の量よりも小さい場合には、フローサイトメータ又はソートの調整は不要である。しかしながら、参照標準と比較して、試料平均の変動が当業者によって決定される所定の量よりも大きい場合には、フローサイトメータ又はソートの調整が必要であり、これについては以下に記載する。
【００８９】
ソートを補正して初期のソート条件に戻すか又はジェットの外観を最適化するため、上記のようにして作成した参照標準と試料平均値との偏差を決定するための手段が必要である。これら数値のこのような偏差は、マニュアルで又は自動化された若しくはコンピューター支援された媒体を用いて決定することができる。１つの実施態様においては、１つ又は複数の試料値と参照標準との間の偏差は、ジェットがノズルを出る液滴形成領域の近位端に相当する点から、液滴が流れから分離する遠位点に相当する点まで測定された画像から計算される。
【００９０】
好ましい実施態様においては、示した値が本発明に従って計算された後、処理装置によって試料平均、即ち、複数の画像集合から作成された試料平均を参照標準と比較し、試料平均と参照標準の偏差が存在するか決定される。有意な偏差は、ソートを安定化するのにソートパラメータの調整が必要な程度までソート特性の一部が変化しているものである。有意とするのに十分な偏差の程度は本発明によって決定される。したがって、比較の際に認められる偏差には、ソートパラメータを調整してソートを「再最適化」することが必要であることを示す場合があるものもあれば、あるいはまた、サイトメータの重大故障やソートを停止する必要性を示すほど大きいものもある。
【００９１】
Ｇ．調整手段
安定なソートを維持するため、浮遊液の粒子をソートする前及びその間にシステムを調整することができる。参照標準からの試料平均の有意な偏差が検出された場合には、この方法は、処理装置が、試料圧力調整器、シース圧力調整器及び／又は圧電発振器に命令を与えて基準から外れた平均を既知の安定な望ましい状態のソートの代表的な参照標準に戻すようプログラムされた調整工程を伴う。そうすることができない場合には、処理装置は、試料ピンチ、シースピンチ、偏向電圧、流れの荷電、及びユーザーインタフェースに他の命令を出してソーティングを停止し、ユーザーに注意を喚起する。
【００９２】
上に記載した複数の画像の平均化／数値標準と試料値の比較プロセスを使用することにより、特にソート全体を通してソートの安定性を維持することができる。上記の操作パラメータは変化させることができ、これらは、とりわけ、結晶ドライブ、結晶周波数、圧力（シース圧力、試料圧力を含む）、温度、ジェット直径、ジェット速度、周波数、粘度、及びそれらの組み合わせを含む。シース圧力を含む圧力と結晶ドライブを調整することが好ましい。
【００９３】
１つの実施態様においては、勾配平均参照標準と試料勾配平均を比較してそれが試料において相当な量の相違を示す場合には、勾配値を参照標準勾配値に戻すよう幾つかのパラメータを調整することができる。ファクターの中でも、環境条件、分析される試料、及びオペレーターが与えられると、当業者は、勾配平均が変化し得る所定の量を容易に決定することができる。１つの実施態様においては、所定の量を超えて勾配平均が変動したと決定される場合には、フローサイトメータを調整することができる。例えば、上記（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の数値を使用して参照標準と試料平均の間で有意な偏差が生じた場合には、結晶ドライブを調整することができる。別の実施態様においては、中点（ｉｖ）の試料平均が所定の量を超えて変動したと決定される場合には、これらに限定するものではないが、シース圧力、望ましくは試料圧力を調整することができる。あるいはまた、中点値（ｉｖ）が参照標準と比較して低下する場合には、結晶周波数を調整することができる。本発明者らは、最後の結合液滴のヒストグラムの対応する曲線の勾配の中点が経時的に変化する場合があることを見出した。典型的には、最後の結合液滴に対応する曲線の勾配の中点は、上昇してジェットの延長を示すことができるか、又は低下してジェットの短縮を示すことができる。最後の結合液滴の勾配の中点値を観測することにより、勾配の中点の位置を参照値に戻すようパラメータを調整することができる。好ましくは、勾配の中点の値は、参照標準の勾配の中点と比較される。試料平均が所定の量を超えて変動する場合には、勾配の中点を参照値に戻すようパラメータが調整される。当業者は、これらの数値の所定の変動量を容易に決定することができる。好ましくは、シース圧力が調整される。１つの実施態様においては、シース圧力が調整され、それにより最後の結合上流液滴に対応する勾配値の試料平均中点を参照標準のそれに戻す。
【００９４】
本発明のこのシステム及び方法を使用することにより、ソートの安定性の如何なる損失も検出し、直面する問題を補正するようサイトメータ又はオペレーターに信号を送る。典型的には、本発明の複数の画像の平均化／ヒストグラム比較システムは、これらに限定するものではないが、泡の閉じ込め、オリフィスの詰まり若しくは閉塞、又は装置の故障のような重大な事態を含む浮遊液のソーティングに影響を与える任意の問題、即ち、流れを停止させることが必要なほど深刻な任意の問題にセンシティブである。１つの実施態様においては、システムのシース流、試料流、及び偏向電圧は、自動化された又はコンピューター支援された媒体によって停止することができる。別の実施態様においては、システムが、例えば、上記値（Ｖ）の有意な偏差によって問題が生じたことをオペレーターに知らせる場合には、システムはマニュアルで停止される。好ましくは、オペレーターは、アラーム、メッセージ又はそれらの組み合わせの使用により通知される。フローサイトメータのこのようなシグナリングの修飾は現在では通常のものである。最も好ましくは、オペレーターはアラームの使用により通知される。
【００９５】
コンピューター支援媒体が本発明で利用される場合、１つ又は複数のコンピュータープログラムが典型的に利用される。上記の分析及び計算を実施しさらに上記のヒストグラムを作成するコンピュータープログラムが提供される。より具体的には、コンピュータープログラムは、上で与えたシステムのパラメータを記録、ソート及び計算しかつ必要な分析結果を得るよう設計することができる。適切なパラメータの制御が重要である。液滴生成を支配する標準式が公知であり、本発明で使用することができる。上で引用した参考文献を参照されたい。
【００９６】
好ましい実施態様においては、このコンピュータープログラムは、粒子分析装置、特に血液学装置又はフローサイトメータに組み込まれるか又はそれらと通信している。別の好ましい実施態様においては、プログラムは別のコンピューター上にあり、これは分析装置に取り付けるための「プラグイン」装置である。本発明のなおさらに好ましい実施態様は、スタンドアローンのコンピューター上に存在するコンピュータープログラムであり、そこに装置からのデータが送られる。さらに別の好ましい実施態様においては、本発明の方法は、スタンドアローンのパーソナルコンピューター上で通常の表計算プログラムを使用して作成することができる。
【００９７】
このコンピュータープログラムは、流れの複数の試料画像により作成される試料平均値を、許容できるソーティングパラメータを有する流れの参照標準と比較するための手段を含む。このプログラムはまた、好適なアルゴリズムを適用してこれらのヒストグラムから数値を作成するための手段も含む。したがって、このプログラムは、画像を分析することにより本発明の方法を実施するのに必要な全ての計算を行うことが好ましい。このプログラムは、信号を、とりわけ、圧力調整器に送ってシース圧力又は試料圧力を制御し、液滴生成器に送って液滴分離点又は液滴周波数を制御し、シース流用バルブに送ってシース流を停止させ、試料流用バルブに送って試料流を停止させ、そして偏向プレートに送って偏向を停止させることが好ましい。このプログラムのさらに別の実施態様においては、このコンピューターは、異常な結果が確認された場合に、オペレーターに信号又は警報を与えることができる。
【００９８】
Ｈ．荷電手段、偏向手段及び収集手段
上記のように、このシステムの完全な実施に有用なソーティングプロセス又は装置の残りの機能は通常のものである。例えば、流れに含まれる液滴の有効電荷を確立するのに荷電手段（図示せず）がさらに利用される。典型的には、荷電手段は、適切な時間に液滴形成と同期して流れに経時変化する電界を印加する。当業者であれば、流れの中の液滴を適切に荷電するのに必要な電荷を容易に調整することができるであろう。次いで、荷電された液滴は、２つ以上の反対に荷電された偏向プレート１２２を介して共通の初期軌道に従うことができる。液滴は、一対の反対に荷電された静電偏向プレート１２２を介した軌道に従うことが好ましい。これらの静電プレート１２２の間で確立された電界は、荷電された液滴の軌道を変化させ、それが液滴の電荷値と荷電された偏向プレート１２２により作り出される電界の強度との関数となるよう荷電された液滴を偏向する。望ましくは、一方のプレートには約−６キロボルト（ｋＶ）の電圧が印加され、もう一方のプレートには約＋６ｋＶの電圧が印加される。これによってプレート１２２の間で約１２ｋＶの電位差を確立し、これらのプレートは次第に遠くなるよう配置される。
【００９９】
複数の区画を含む収集器（図示せず）がさらに提供され、一方の区画は偏向されていない液滴を受け取り、もう一方の区画は偏向された荷電液滴を受け取る。液滴上の電荷（又は電荷の欠如）は、液滴が流れから分離する時に流れに印加される電位により測定される。
【０１００】
大部分の通常の静電ソーティングフローサイトメータが、本明細書に記載の発明から利益を得ることができる。
【０１０１】
ＩＩＩ．他の画像化アセンブリ
本発明の更なる任意選択の実施態様においては、本発明の方法及びシステムを実施するのに有用なフローサイトメータ又は他の粒子ソーティング装置内の、例えば、流体流の画像を得るためのアセンブリは特有の構成を有する。このアセンブリは、画像のコントラストを劇的に改善することにより先行技術の粒子ソーティングシステムの通常の画像化アセンブリの幾つかの欠点を克服する。より具体的には、画像のコントラストは、本発明の新規バックグラウンド照射技術及び／又は装置を用いて劇的に改善され、それによってソートにおいてより多くの制御が可能となる。改善された画像は、粒子ソーターのより正確な制御を可能にする追加の細部を含む。さらに、サテライト液滴の形成のような追加の流れの特徴を同様に観察、分析及び制御することができる。以下の考察は、図６〜１２に最も良く例示される。
【０１０２】
典型的なジェット流が、わずか約５０〜１００μｍの流れ幅を有する実質的に透明な液体として提供される。先行技術のアセンブリ、例えば、図６に図示されるアセンブリ２００は、典型的には流れ２０４の幅の約６０〜１２０倍である明視野又は照射野２０２を利用して、流れ２０４に対して照射野２０２の正反対にある整列した画像キャプチャ装置２０６に対し流れ２０４を背面から照らす。画像キャプチャ装置２０６は、典型的には任意のタイプのカメラである。照射野２０２は、典型的には一組の発光ダイオード２０８又は任意の他のストロボ発光可能な光源と、ダイオード２０８により発せられる光線を均一に拡散させる拡散プレート２１０とにより提供される。
【０１０３】
本発明の発明者らは、流れ自体が光学レンズとして機能することを認識している。したがって、画像キャプチャ装置２０６の視点から、照射野２０２の少なくとも一部が流れ自体の中に画像化される。例えば、流れ２０４中に画像化される視野を示す図６の線２１２、及びカメラ２０６で見られる流れ２０４中に現れる画像２１４を参照されたい。加えて、カメラ２０６の光許容角度により規定される視野を示す図６の線２１６を参照されたい。カメラの視野は、バックグラウンド画像２１４を有する流れ２０４と、流れ２０４に隣接してその外を通過する照射野２０２から発せられた光とを含む。したがって、流れ２０４中に画像化されるバックグラウンド画像２１４は、流れ２０４の両側に現れる照射野２０２の画像と同じである。
【０１０４】
図７は、カメラ２０６で撮影した流れ２０４の画像２１８の例である。回折が円筒流れ５０４の周りの光を曲げ、カメラに見える薄い影を作り出す。このように、回折によってジェット流２０４の画像２１８が得られ、ジェット流の周囲に薄い影が生じる。さらに、透明な流体液滴の表面で光が反射するため、ジェット流の表面の薄い画像を得ることができるが、重要な位置情報を含む流れの縁は、光を反射してカメラに戻すことができない。
【０１０５】
こうして、一般に粒子ソーターとフローサイトメータにおいて有用な新規の画像化アセンブリが、追加の実施態様とともに上記の方法及びシステムに提供される。本発明のこの態様によれば、図８と図１０に最も良く例示される新規の画像化アセンブリ２２０は、新規の照射野２２２と画像キャプチャ装置２２４とを有する。流れ２２６は、照射野２２２と画像キャプチャ装置、即ち、カメラ２２４との間に位置し、カメラ２２４は、流れ２２６の適切な部分の画像を得ることができるように流れ２２６に対して横又は水平に移動可能である。カメラ２２４の視野又は光許容角度は、図８の線２２８により示されるように流れ２２６の全幅を超えて含むほど十分大きい。流れと照射野の適切な部分をキャプチャするのにズームレンズを使用することもできる。
【０１０６】
不透明マスク２３０が照射野２２２と流れ２２６の間に位置している。照射野は、例えば、光拡散プレート２３４によって覆われた一組の発光ダイオード２３２として提供することができ、不透明マスク２３０は、流れの中のバックグラウンドの画像２３６が暗領域と明領域の両方を含むよう開口を有することができる。開口は、画像キャプチャ装置２２４の視点からジェット流の中に現れる容易に認識可能な幾何学的パターンを形成することが好ましい。
【０１０７】
図８と図１０に最も良く例示されるように、マスク２３０によって与えられる暗領域は、カメラ２２４によって見たときに流れ２２６の外縁に沿って流れ２２６中に画像化されることが好ましい。例えば、マスク２３０は、流れ２２６に対して実質的に平行な中央の細長いスリット２３８を設けることができる。好ましくは、スリットの幅は、カメラ２２４がスリット２３８を通って流れ２２６の外縁付近を通過する光をキャプチャして流れとバックグラウンドとの劇的なコントラストを与えるよう流れ２２６の幅の約３〜３０倍である。
【０１０８】
図９は、本発明に従ってカメラ２２４により撮影された画像２４０の例を与える。流れ２２６、特に流れ２２６の外縁は、スリット２３８により与えられる明るいバックグラウンドに対し何桁かの大きさで非常に対照をなしている。したがって、流れ２２６の実際の形状は画像２４０から正確に決定することができる。上記のように、ジェット流２２６が円筒形レンズとして作用し、その中にバックグラウンドの暗領域と明領域を画像化するため画像２４０が得られる。このため、バックグラウンド画像が縮小され、カメラ２２４から見ると流れの中で反対になる。このように、カメラ２２４は、流れ２２６の中にバックグラウンド画像２３６をキャプチャし、明るいバックグラウンドに対して流れ２２６をキャプチャしてコントラストの所望の劇的向上を与える。これによって、ジェット流のより詳細な画像が作成される。
【０１０９】
マスクはまた、位置情報を与えるのに利用することもできる。例えば、マスクによって縁取られた光の幾何学的パターンを流れの中に画像化して、例えば、流れが流出する出口ノズルから所定の長さで識別マークを与えることができる。この目的で、図１１は、上記のように細長い中央のスリット２４４を有するマスク２４２の一部と、スリット２４４に沿って所定の長さで比較的小さい長方形の開口２４６とを図示している。したがって、マスクを用いて流れが照射されると、識別マーク、チェック又はバー２４８がマスク２４２中の開口２４６に対応して流れの中に画像化される。これは、流れ２５２の画像２５０により最も良く例示され、その中に識別マーク２４８が画像化されている。このような識別マークを使用することにより、励起された流れの波動をより容易に検出かつ測定することができる。加えて、マークを使用して好ましい分離点又は比較的遠い位置を目立たせることができる。
【０１１０】
本発明に従った画像化アセンブリが、本発明の複数の画像の平均化／ヒストグラム比較法以外のフローサイトメトリーシステムで使用できることは容易に明らかである。同様に、通常のフローサイトメータを変更できるか、又は本発明に従った画像化アセンブリを含む新しいフローサイトメータを設計することができる。したがって、フローサイトメータ装置への画像化アセンブリの導入は、フローサイトメータの他の構成部分の設計が当技術分野において周知であるため本発明の一部であると見なされる。
【実施例】
【０１１１】
ＩＶ．例
以下の例は、本発明を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。以下の例において具体的な条件が概説されるが、軽微な変更が可能であり、それらは具体的に例示したものと同等であって、したがって、本発明の趣旨及び範囲に包含されるということは当業者であれば理解するであろう。
【０１１２】
［例１−方法の実施：複数の画像化／ヒストグラムからの数値平均の作成］
本例は、条件が変化、例えば、温度が変化した場合に、どのようにして本発明の方法及びシステムにより、サイトメータのオペレーターがソートの安定性を維持することができるかを実証している。本発明によれば、オペレーターは、流れ、具体的には流れの選択領域の画像を得て、そのヒストグラム表示を作成し、ヒストグラムデータを分析して参照標準と試料平均値を作成し、温度変化に関する補正をしてソートを安定化させる。
【０１１３】
試料粒子のない等張シース流体を、市販のフローソーター、例えば、ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＬＩＴＥ（商標）フローサイトメータ又はＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）ＡＬＴＲＡ（商標）フローサイトメータ（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）に導入した。画像化手段として、これらのサイトメータは、集積ＣＣＤビデオカメラと、市販のビデオデジタル化処理装置（インディアナ州、インディアナポリスのインテグラルテクノロジーズ）と、ソート制御ソフトウェア（フロリダ州、マイアミのベックマン・コールター社）とを含む。これらの装置は通常の照射野を有する。
【０１１４】
得られた流れの液滴形成領域の複数のＣＣＤ画像を作成し、試料画像からバックグラウンド画像を差し引いた。具体的には、図２Ａは、シース流体流なしのキャプチャ画像である。図２Ｂは、シース流を有する画像である。図２Ｃは、図２Ａと図２Ｂの画像の画素ごとの絶対値の引き算をした後に得られた画像を示す。そうして画像を向上させ、その結果として図２Ｄの向上した画像が得られる。図２Ｄの更なる向上は、流れの無関係な部分を切り取り画像を縮小して視野を最小にすることにより行われ、それによって解像度を上げて図２Ｅを得る。図２Ｆは、所望のヒストグラムの作成を可能にするようジェット中の空いたスペースを塗り潰した図２Ｅの画像を示す。次いで、図２Ｅの画像を用いてＸ軸に沿ったそれぞれ及び全ての画素について垂直方向に沿って積分操作を行い、流れ全体についての一次元ヒストグラム（図３）を作成する。
【０１１５】
１０個の連続画像を同様に処理し、流れのこの領域について計算された勾配と勾配の中点を平均して参照勾配と参照勾配の中点値を作成する。プログラムは、この勾配と勾配の中点位置及び１０個の連続したこのような位置が安定であることを確定し、システムが安定であることをユーザーに示した。次いで、オペレーターは、ソート流れを自動制御するようプログラムに命令し、その時点で勾配の参照値と勾配の中点が、既知の安定なシステムについて確立された。
【０１１６】
図４Ａは、バックグラウンドの引き算、向上、解像度の最適化、空いたスペースの塗り潰しを行った後に得られたジェットの画像を示し、対応する平均されたヒストグラムをその画像の下に示す。このヒストグラムは、ネック、最後の結合液滴、第１及び第２の遊離液滴、サテライト及び以降の複数の波長周期の測定を可能にする。図４Ａの得られたヒストグラムチャネルのそれぞれの高さは、図２Ｆの画像中の流れを含む画素の総数である。ヒストグラムのそれぞれの最大と最小を見つけ同定した。したがって、図４Ａのヒストグラムは、流れの同じ領域の１０個の画像の平均に基づいている。このヒストグラムから勾配と中点の数値平均参照標準を計算し、それぞれ０．９００と３８０．０であった。
【０１１７】
次いで、フローサイトメータの温度を約５℃上げた。得られた１０個の連続した試料画像の平均は図４Ｂに表され、それから平均試料ヒストグラムを作成した。アルゴリズムをこのヒストグラムに適用して、試料平均、即ち、参照標準に対応する平均ヒストグラムのピークの部分勾配の中点を作成した。この例の数値試料中点平均は３８７．６である。
【０１１８】
図４Ｂのヒストグラムから作成した試料平均を図４Ａのヒストグラムから作成した参照標準と比較したときに、オペレーターはこれらの数値において７．６の偏差を観測することができた。この偏差は、ソート流れが温度上昇後に変化したことを意味している。流れが長くなり、液滴がノズルからさらに離れていった。この偏差はソーティングシステムのパラメータ調整を必要とする。
【０１１９】
本発明のソート制御プログラムは、絶えず画像を処理して試料平均勾配の数値と試料平均勾配の中点値を作成し、これらを参照勾配と勾配の中点標準と比較して装置パラメータの変更が必要であるかを決定する。次いで、変更の方向と幅を計算し、要求されるパラメータに変更するよう装置に命令する。この場合、結晶ドライブの減少とシース圧力の減少が必要であると決定した。結晶ドライブを約１％下げ、シース圧力を約０．１ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）下げた。
【０１２０】
圧力を下げ、結晶ドライブを下げた後にジェットの複数の画像から作成した別のヒストグラムを図４Ｃに示す。アルゴリズムをこのヒストグラムに適用して計算された試料平均値は、勾配について０．９００、中点について３８０．０であり、即ち、参照標準と実質的に同一であった。したがって、パラメータ調整によって、オペレーターは参照標準に示される安定なソートを回復することができた。
【０１２１】
［例２−エネルギー結合変化］
本例は、流れ、具体的には流れの選択領域の画像を得るための、流れのこの領域を分析するための、及びソート条件の変化がエネルギー結合効率の変化により生じた場合にソートの補正をするための本発明の有効性を示す。エネルギー結合効率は、分離を引き起こす外乱の成長を弱めることができ、それに一致して分離点に影響を及ぼす。エネルギー結合効率は、発振器から流れに移行するエネルギーの量である。
【０１２２】
本発明の方法及びシステムは、安定なソートの参照ヒストグラムが確立された（図５Ａ）後に、参照標準を勾配について０．９００、中点について３８０と計算した以外は、最初に例１において記載した通りに実施される。ソート条件の変化により、図５Ｂの複数（１０個）の移動連続試料ヒストグラムが得られた。対応する試料平均は、適切なアルゴリズムを勾配変化の方向と幅のヒストグラムデータに適用することにより得られ、次いで好適なアルゴリズムにより計算した。試料平均値、即ち、ヒストグラム図５Ｂのデータから作成したネック下流の第１ピークの正の勾配値を参照標準と比較することにより、試料勾配平均の偏差が検出され、即ち、勾配値が０．１８低下した。本発明のソート制御プログラムは、画像を絶えず処理して試料勾配平均と試料勾配の部分中点値を作成し、それらを参照勾配標準と勾配の部分中点標準と比較して装置パラメータの変更が必要であるかを決定する。必要であれば、要求されるパラメータに変更するよう装置に命令する。
【０１２３】
勾配値を参照図５Ａの値に回復するため結晶ドライブを上げることが必要と決定され、結晶ドライブを約２．５％上げた。結晶ドライブを上げた後に複数の画像をキャプチャし、別の試料ヒストグラム（図５Ｃ）を作成して別の試料勾配平均を０．９００と計算し、この方法が最初の条件と参照標準の安定なソートを回復できることを実証した。
【０１２４】
本明細書で引用した全ての刊行物は、その参照により本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ】粒子ソーターの液滴形成領域の略図であり、流れがノズルを出る近位点２０、ジェットのネック２２、最後の結合液滴２４、球を形成する第１の遊離液滴２６、楕円を形成する第２の遊離液滴２８、流体流の方向３０、複数の波長周期の領域３２、及び液滴がジェットから分離する遠位点３４を示す。
【図１Ｂ】フローサイトメータを含む粒子ソータープロセスのフローダイアグラムである。
【図２Ａ】流れの液滴形成部分の電荷結合素子（ＣＣＤ）画像を示し、シース流体流なしのキャプチャ画像である。
【図２Ｂ】シース流を有する画像である。
【図２Ｃ】図２Ａと図２Ｂの画像の画素ごとの絶対値の引き算をした後に得られた画像を示す。
【図２Ｄ】図２Ｃの画像を向上させた後に得られた画像を示す。
【図２Ｅ】視野を最小するために縮小した図２Ｄの画像を示し、それにより解像度を向上させている。
【図２Ｆ】所望のヒストグラムの作成を可能にするようジェット中の空いたスペースを塗り潰した図２Ｅの画像を示す。
【図３】図２Ｆの画素レベルの縦方向の積分により作成されたヒストグラムである。
【図４Ａ】バックグラウンドの引き算、向上、解像度の最適化、空いたスペースの塗り潰しを行った後に得られたジェットの画像、及びその対応するヒストグラムを示す別の流れから作成したヒストグラムであり、ジェット画像と、１０個のこのようなジェット画像を平均して作成したヒストグラムとを図示し、最初のソート設定状態を示す。それから計算した数値標準は、ヒストグラムのネック下流の勾配部分の平均中点である。
【図４Ｂ】ジェットの画像とヒストグラム（１０個の移動試料画像に基づく）である。このヒストグラムから作成した数値試料中点平均と参照標準を比較することによって、ソート条件がソートジェットを変化させ、安定なソートが脅かされることを実証した。
【図４Ｃ】結晶ドライブを増加させた後のジェットの１０個の撮影画像の平均に基づくヒストグラムである。このヒストグラムから数値試料中点平均を計算し参照標準と比較してソートが安定化したことを実証する。
【図５Ａ】バックグラウンドの引き算、向上、解像度の最適化、空いたスペースの塗り潰しを行った後に得られたジェットの画像、及びその対応するヒストグラムを示し、ジェットの画像と、１０個の画像の平均に基づくジェットのヒストグラムを示し、最初の安定なソート設定状態を示す。それから計算した数値標準は、ヒストグラムのネック下流の平均勾配である。
【図５Ｂ】温度上昇後のジェットの画像とヒストグラム（１０個の移動試料画像に基づく）である。このヒストグラムから作成した数値試料勾配平均と参照標準を比較することによって、ソート条件がソートジェットを変化させ、安定なソートが脅かされることを実証した。安定なソーティングシステムのパラメータは調整が必要である。
【図５Ｃ】シース圧力と結晶ドライブを下げた後のジェットの画像及びジェットの撮影画像１０個の平均に基づくヒストグラムである。このヒストグラムから数値試料勾配平均を計算し参照標準と比較してソートが安定化したことを実証する。
【図６】先行技術に従ってジェット流の画像を得るためのアセンブリの平面図である。
【図７】図６の先行技術のアセンブリにより作成したジェット流の画像である。
【図８】本発明に従ってジェット流の画像を得るためのアセンブリの平面図である。
【図９】本発明に従って図８のアセンブリにより作成したジェット流の画像である。
【図１０】本発明に従ってジェット流の画像を得るためのアセンブリの斜視図である。
【図１１】本発明に従った照射野の代替の実施態様の正面図である。
【図１２】図１１の照射野によって照射された励起ジェット流の画像である。
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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