(57)【要約】本発明はＷｎｔタンパク質が生成するＥｒｂＢシグナルを阻害するアッセイ法と試薬を利用可能とするものであり、ＥｒｂＢとＷｎｔレセプター（フリズルド）を発現する細胞と、ＥｒｂＢシグナル伝達に対する該細胞の感受性を低下させるに十分な量のＷｎｔアンタゴニストとを接触させることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＧＦレセプターシグナル伝達の阻害方法であって、細胞表面にＥＧＦレセプターとフリズルド（Ｆｚ）を有する細胞と、当該細胞中でＥＧＦレセプターシグナル伝達を低減させるのに十分な量のＷｎｔアンタゴニストとを接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
当該ＥＧＦレセプターがＥｒｂＢ１である請求項１記載の方法。
【請求項３】
当該ＷｎｔアンタゴニストがＷｎｔ１またはＷｎｔ５ａのアンタゴニストである請求項１記載の方法。
【請求項４】
該アンタゴニストがＷｎｔに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該アンタゴニストがＦｚに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該アンタゴニストがｓＦＲＰである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
当該細胞が上皮細胞である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
当該細胞が固形腫瘍細胞である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
当該腫瘍細胞が乳癌細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＥＧＦレセプターシグナル伝達を阻害するためのＷｎｔアンタゴニストの使用。
【請求項１１】
Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を変調するために有効な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）Ｗｎｔレセプター（Ｆｚ）とＷｎｔとを候補化合物の存在下に接触させる工程；
（ｂ）Ｗｎｔまたは当該候補化合物と当該Ｗｎｔレセプターとの結合を検出する工程；および
（ｃ）当該候補化合物と当該Ｗｎｔレセプターとの結合を、またはＷｎｔと当該Ｗｎｔレセプターとの結合における変化を、当該候補化合物の存在しないときと比較して、潜在的ＥｒｂＢモジュレーターと相関させる工程；
からなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
当該方法が細胞にもとづくものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらにＥｒｂＢシグナル伝達を検出する工程を含んでなる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
当該ＥｒｂＢシグナル伝達をＥＲＫ活性、ＭＡＰＫ活性、ＥｒｂＢホスホチロシンまたはサイクリンＤの存在により検出する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
当該ＥｒｂＢシグナル伝達をレポーター遺伝子産物の存在により検出する請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
当該候補化合物がＥｒｂＢシグナル伝達を阻害するものである請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）Ｗｎｔ、Ｆｚ、および／またはＷｎｔおよび／またはＦｚを発現する細胞；および
（ｂ）ＥｒｂＢシグナル伝達の検出手段；
を含んでなるキット。
【請求項１８】
当該ＥｒｂＢシグナル伝達の検出手段が抗体である請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
該抗体が検出可能なタグまたは標識を含んでなる請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
患者のＥｒｂＢシグナル伝達を阻害する方法であって、患者の細胞にてＥｒｂＢシグナル伝達を低減させるために十分な量のＷｎｔアンタゴニストを含有してなる組成物を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２１】
該アンタゴニストがＷｎｔに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該アンタゴニストがＦｚに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
障害が癌である請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
当該癌が乳癌または直腸癌である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
当該癌がＥｒｂＢ１を発現する請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＥｒｂＢを発現する癌の処置用医薬の製造におけるＷｎｔアンタゴニストの使用。
【請求項２７】
Ｗｎｔアンタゴニストにより処置する必要のある患者の診断方法であって、ＥｒｂＢレセプターのシグナル伝達を検出することを特徴する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はＥｒｂＢシグナル伝達、とりわけＷｎｔアンタゴニストまたはアゴニストによるＥｒｂＢシグナル伝達を変調する方法、およびＥｒｂＢシグナル伝達の変調に有効な作用因子のスクリーニング法に関する。本方法は医薬の開発、特にＥｒｂＢシグナル伝達の影響を受ける癌およびその他の疾患または症状処置のための医薬の開発に有用である。
【０００２】
背景技術
Ｗｎｔは正常な発生において重要な役割を果たす大型ファミリーの分泌糖タンパク質である。乳腺は多くのＷｎｔを発現し（Gavin and McMahon, 1992）、そのあるものは、Ｗｎｔ４のように特別の発生上の役割をもつことが示されている（Brisken et al., 2000）。Ｗｎｔ１はマウスの乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）誘発乳癌に最初に検出されたプロトタイプの発癌遺伝子であった（Nusse and Varmus, 1982）；また、Ｗｎｔ５ａは通常乳腺において発現される（Gavin and McMahon, 1992）。少なくとも１０種のＷｎｔ遺伝子がマウスで同定されており（Ｗｎｔ−１、２、３、３ａ、４、５ａ、５ｂ、６、７ａおよび７ｂ；Gavin et al., （1990）, Genes Dev., 4, pp.2319-2332）、７種のＷｎｔ遺伝子がヒトにおいて（Ｗｎｔ−１、２、３、４、５ａ、７ａおよび７ｂ）ｃＤＮＡクローニングにより同定されている（Vant Veer et al., 1984, Mol. Cell. Biol., 4, pp.2532-2534; Wainright et al., 1988, EMBO J., 7, pp.1743-1748）。http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html、米国特許（USPNs 5,780,291; 6,043,053; 6,100,060 and 6,297,030）も参照。
【０００３】
フリズルド（Frizzled；Ｆz）ファミリーの７−通過膜貫通タンパク質のメンバーはＷｎｔタンパク質のレセプターである（Wang et al. J Biol Chem 1996 Feb 23:271 （8）: 4468-76; http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html）。Ｆｚに結合するＷｎｔは、リン酸化ベータ−カテニン（その臨界基質の一つ）からグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼ−３Ｂ（ＧＳＫ−３Ｂ）を防護する経路を始動する。これがベータ−カテニンを安定化させ、かつ核に転位させて、そこでＴＣＦ（Ｔ細胞因子）ファミリーの転写因子を引き入れる（van Noort and Clevers, 2002; Nusse, 1999）。この経路は大腸癌およびメラノーマなどある種ヒトの癌発生の推進力となる（Polakis, 2000; Bienz and Clevers, 2000）。
【０００４】
ＥｒｂＢファミリーのレセプターおよびそれらの活性化リガンド、ＥＧＦ関連ペプチドは正常乳腺（Troyer and Lee, 2001）および乳癌（Olayioye et al., 2000）において重要な機能をもつ。さらに、ＥｒｂＢ１はシグナル伝達の重要なメディエーターとして他の分類の膜レセプター、たとえば、Ｇタンパク質カップル結合レセプター（ＧＰＣＲ），他のレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、サイトカインレセプターおよびインテグリンレセプターなどから出現している（Carpenter, 1999; Gschwind et al., 2001）。
【０００５】
癌などのこれらシグナル伝達経路に依存する疾患のより正確で有効な診断および処置を可能とするために、シグナル伝達経路に関与するか、または影響を与える成分を見出す必要がある。本発明が提供するＥｒｂＢ１シグナル伝達経路のより完全な描出および経路の構成成分の同定は、この要請に合致する。
【０００６】
関連文献
Bienz, M. （1998） ＴＣＦ：転写活性化因子か抑制因子か？ Curr. Opin. Cell Biol., 10, 366-372.
Bienz, M. and Clevers, H. （2000） 結腸直腸癌とＷｎｔシグナル伝達とのつながり。 Cell, 103, 311-320.
Brandt, R., Wong, A.M.L. and Hynes, N.E. （2001） Ｎeu／ＥｒｂＢ２形質転換ＨＣ１１細胞により再構築した乳腺は抗癌剤試験用の新規な固有のモデルを提供する。Oncogene, 20, 5459-5465.
Brantjes, H., Roose, J., van de Wetering, M. and Clevers, H. （2001） Ｔcf ＨＭＧボックス転写因子はすべてグルーチョ（groucho）関連補抑制因子と相互作用する。Nucl. Acids Res., 29, 1410-1419.
Brisken, C. et al.,., （2000） プロゲステロン・シグナル伝達の下流での乳腺発生におけるＷｎｔ−４の必須機能。Genes Develop., 14, 650-654.
Carpenter, G. （1999） 増殖因子依存性シグナル伝達経路における上皮増殖因子レセプターの採用。J. Cell Biol., 146, 697-702.
Dong, J., Opresko, L.K., Dempsey, P.J., Lauffenburger, D.A., Coffey, R.J. and Wiley, H.S. （1999） メタロプロテアーゼ仲介リガンド放出が上皮増殖因子レセプターを介して自己分泌シグナル伝達を調節する。Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6235-6240.
【０００７】
Gavin, B. and McMahon, A.P. （1992） 妊娠および授乳期間中のＷｎｔ遺伝子ファミリーの鑑別調節は乳腺の生後発生における役割を示唆する。Mol. Cell. Biol., 12, 2418-2423.
Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M. and Ullrich, A. （2001） 細胞情報伝達ネットワーク：レセプター間シグナル伝達のパラダイムとしての上皮増殖因子レセプタートランス活性化。Oncogene, 20, 1594-1600.
He, T.C. et al.,. （1998） ＡＰＣ経路の標的としてのｃ−Ｍycの同定。Science, 281, 1509-1512.
Hynes, N.E., et al,.（1990） c-erbＢ２ではなくＥＧＦレセプターの活性化がマウス乳腺上皮細胞におけるｂ−カゼイン遺伝子の泌乳刺激ホルモン誘導を妨げる。Mol. Cell. Biol., 10, 4027-4034.
Lane, H.A., Beuvink, I., Motoyama, A.B., Daly, J.M., Neve, R.M. and Hynes, N.E. （2000） ＥｒｂＢ２はｐ27（Ｋip1）-Ｃdk２複合体形成を介して乳癌増殖を増強する：レセプターの過剰発現は増殖依存性を決定しない。Mol. Cell. Biol., 20, 3210-3223.
Massague, J. and Pandiella, A. （1993） 膜固着増殖因子。Annu. Rev. Biochem., 62, 515-541.
Mitamura, T. et al.,. （1997） 部位指向変異誘発によるジフテリアトキシンレセプター毒素結合部位の構造−機能解析。J. Biol. Chem., 272, 27084-27090.
Neve, R., et al.,. （2000） 乳腺腫瘍細胞におけるＧ１細胞サイクルレギュレーターに対する発癌遺伝子ＥrgＢ２の作用。Oncogene, 19, 1647-1656.
Nusse, R. （1999） Ｗｎｔ標的。抑制と活性化。Trends Genet., 15, 1-3.
Nusse, R. and Varmus, H.E. （1982） マウス乳腺腫瘍ウイルスにより誘発される多くの腫瘍は宿主ゲノムの同じ領域に集積したプロウイルスを含む。Cell, 31, 99-109. 
【０００８】
Olayioye, M.A., Neve, R.M., Lane, H.A. and Hynes, N.E. （2000） ＥｒｂＢシグナル伝達ネットワーク：発生におけるレセプターのヘテロ二量化と癌。 EMBO J., 19, 3159-3167.
Polakis, P. （2000） Ｗｎｔシグナル伝達と癌。Genes Dev., 14, 1837-1851.
Prenzel, N., et al. （1999） Ｇタンパク質共役結合レセプターによるＥＧＦレセプターのトランス活性化はプロＨＢ−ＥＧＦのメタロプロテイナーゼ開裂を必要とする。Nature, 402, 884-888.
Sorensen, B.S., Torring, N., Bor, M.V. and Nexo E. （2000） ＥＧＦシステムのｍＲＮＡ発現の定量：前立腺ストロマ細胞の増殖因子刺激によるＨＢ−ＥＧＦおよびＡＲ発現の選択的誘導。J. Lab. Clin. Med., 136, 209-217.
Taverna, D., Groner, B. and Hynes, N.E. （1991） ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＲレセプター、およびｃ−erbＢ２レセプターの活性化はすべて増殖を促進するが、マウス乳腺上皮細胞分化に顕著な作用をもつ。Cell Growth Differ., 2, 145-154. 
Tetsu, O. and McCormick, F. （1999） ベータ−カテニンは結腸癌細胞におけるサイクリンＤ１の発現を調節する。Nature, 398, 422-426. 
Traxler, P., et al., （2001） チロシンキナーゼインヒビター：合理的設計から臨床治験まで。Med. Res. Rev., 21, 499-512. 
Troyer, K.L. and Lee, D.C. （2001） ＥｒｂＢシグナル伝達ネットワークによるマウス乳腺発生と腫瘍発生の調節。J Mammary Gland Biol. Neoplasia, 6, 7-21.
【０００９】
Ugolini, F. et al.,. （2001） ＷＮＴ経路と乳腺発癌：髄質型最大侵襲癌における候補腫瘍抑制因子遺伝子ＳＦＲＰ１の発現喪失。Oncogene, 20, 5810-5817.
Uren, A., et al.,., （2000） 分泌したフリズルド関連タンパク質１はウイングレス遺伝子に直接結合し、Ｗｎｔシグナル伝達の二相性モジュレーターである。J. Biol. Chem., 275, 4374-4382. 
Van Noort, M. and Clevers, H. （2002） ＴＣＦ転写因子、発生と癌におけるＷｎｔシグナル伝達のメディエーター。Dev. Biol., 244, 1-8. 
Wang, Y., Johnson, A.R., Ye, Q.Z. and Dyer, R.D. （1999） ヒト膜型４マトリックス・メタロプロテイナーゼ触媒ドメインの触媒活性と基質特異性。J. Biol. Chem., 274, 33043-33049. 
Willert, K., Brown, J.D., Danenberg, E., Duncan, A.W., Weissmann, I.L., Reya, T., Yates, J.R. 3rd and Nusse, R. （2003） Ｗｎｔタンパク質は脂質修飾され、幹細胞増殖因子として作用し得る。Nature, 423, 448-452. 
Yu, Q., Geng, Y. and Sicinski, P. （2001） サイクリンＤ１切除による乳癌に対する特異的防御。Nature, 411, 1017-1021.
【００１０】
発明の開示
一側面において、本発明はＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を変調する方法であって、細胞表面にＥｒｂＢレセプターとフリズルド（Ｆｚ）を発現する細胞と、当該細胞のＥｒｂＢレセプターシグナル伝達に影響を与えるのに十分な量のＷｎｔアゴニストまたはアンタゴニストとを接触させることを特徴とする方法を提供する。一態様において、ＷｎｔアンタゴニストはＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を阻害する（低減させる）ために使用する。もう一つの態様において、ＷｎｔアゴニストはＥｒｂＢシグナル伝達を増大させるために使用する。ＥｒｂＢレセプターはＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４の１種以上を含んでなる。したがって、該細胞は癌細胞、特に乳癌または直腸癌細胞である。一部の態様において、ＷｎｔアンタゴニストはＷｎｔ１またはＷｎｔ５ａのアンタゴニストである。特に、Ｗｎｔアンタゴニストは抗体またはそのフラグメントであり、Ｗｎｔまたはそのレセプター、Ｆｚ、分泌フリズルド関連タンパク質（ｓＦＲＰ）または小分子に特異的に結合する。したがって、ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を阻害するためのＷｎｔアンタゴニストの使用も提供される。
【００１１】
さらなる側面において、本発明は、Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を変調するのに有効な化合物をスクリーニングする方法であって、Ｗｎｔレセプター（たとえば、Ｆｚ）とＷｎｔとを候補化合物の存在下に接触させる工程；Ｗｎｔまたは該候補化合物と該Ｗｎｔレセプターとの結合を検出する工程；および該候補化合物と該Ｗｎｔレセプターとの結合を、またはＷｎｔと該Ｗｎｔレセプターとの結合における変化を、候補化合物の存在しないときと比較して、潜在的ＥｒｂＢモジュレーターと相関させる工程；からなることを特徴とする方法を提供する。好適な態様において、本方法はさらにＥｒｂＢシグナル伝達をＥＲＫ活性、ＭＡＰＫ活性、ＥｒｂＢホスホチロシンまたはサイクリンＤの存在などにより定量することからなる。したがって、細胞にもとづくアッセイが好ましい。代わり得る態様において、ＥｒｂＢシグナル伝達はレポーター遺伝子産物の存在により検出する。本発明のスクリーニング方法はＥｒｂＢシグナル伝達を阻害する化合物（Ｗｎｔアンタゴニスト）ならびにＥｒｂＢシグナル伝達を増大させる候補化合物（Ｗｎｔアゴニスト）を同定するために使用することができる。
【００１２】
また、本発明ではＷｎｔ、Ｆｚ、および／またはＷｎｔおよび／またはＦｚを発現する細胞；およびＥｒｂＢシグナル伝達の検出手段、たとえば、抗体、選択肢として検出可能なタグまたは標識を含む抗体、を含んでなるキットが提供される。
【００１３】
本発明のさらなる側面においては、患者のＥｒｂＢシグナル伝達を阻害する方法であって、患者の細胞にてＥｒｂＢシグナル伝達を低減させるために十分な量のＷｎｔアンタゴニストを含有してなる組成物を患者に投与することを特徴とする方法が提供される。該アンタゴニストとはＷｎｔまたはＦｚに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである。かかる方法はＥｒｂＢシグナル伝達に依存する疾患または症状、たとえば、癌、とりわけ特定の乳癌または直腸癌などのＥｒｂＢ１を発現する癌の処置に使用し得る。
【００１４】
したがって、本発明はまたＥｒｂＢを発現する癌（またはＥｒｂＢシグナル伝達に依存する他の疾患または症状）を処置するための医薬としてのＷｎｔアンタゴニストの使用、ＥｒｂＢを発現する癌の処置用医薬の製造におけるＷｎｔアンタゴニストの使用、ＥｒｂＢを発現する癌を処置するためのＷｎｔアンタゴニスト、ならびにＷｎｔアンタゴニストおよび医薬上許容される担体を含んでなるＥｒｂＢを発現する癌を処置するための組成物を提供する。逆に、Ｗｎｔアゴニストは適応症によってはＷｎｔアンタゴニストに置換え得る。
【００１５】
本発明のさらなる側面においては、Ｗｎｔアンタゴニストでの処置を必要とする患者の診断方法であって、サンプル中、変化したＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を対照のサンプルと比較して検出することからなる方法を提供する。
【００１６】
発明の詳細な説明
便宜上、本明細書、実施例、および添付の請求項にて使用する特定の用語について以下に説明する。
用語“Ｗｎｔ”はＷｎｔポリペプチドおよびそのペプチドフラグメント、たとえば、制限されるものではないが、Ｗｎｔ−１、２、３、３ａ、４、５ａ、５ｂ、６、７ａ、および７ｂおよびＷｎｔｘの調製物を包含する。
“Ｗｎｔレセプター”という用語は、フリズルド（Frizzled）（Ｆｚ）ならびにそのフラグメントおよび変異体を含むものとする。
【００１７】
“変異体”という用語は変化したアミノ酸配列をもつポリペプチドを含むものとし、この配列は別のタンパク質配列、たとえば、標的への送達または検出のためのタグとの融合物の形状であってもよい。変異体は修飾したペプチド結合または非天然産アミノ酸を含んでもよく、安定性または活性などの性質の改善されたものが含まれる。“変異体”とはアミノ酸配列について説明すると、１個以上のアミノ酸がもう一方のアミノ酸、通常は関連するアミノ酸配列、と異なるアミノ酸配列と定義する。変異体は“同類”変化を有し得るもので、その場合、置換アミノ酸は類似の構造または化学的性質を有する（たとえば、ロイシンとイソロイシンの置換）。滅多にないが、変異体は“非同類”変化をもち得る；たとえば、グリシンとトリプトファンの置換。同様の僅かな変化として、アミノ酸欠失または挿入（すなわち、付加）、またはその両方をも含み得る。活性を損なわずに、どの、また幾つのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失し得るかを決める判断基準は、技術上周知のコンピュータプログラムにより見出し得る。
【００１８】
本明細書にて使用する場合、“ＥｒｂＢレセプター”とは１個以上のＥｒｂＢサブユニット、たとえば、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦレセプターとしても知られる）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４などを含んでなるレセプタータンパク質をいう。下記例示のように、ＥｒｂＢレセプターの生物活性は容易に定量される。たとえば、ＥｒｂＢレセプターのトランス活性化は特異的な測定可能生物作用、すなわち、ＥＲＫおよび／またはＭＡＰＫシグナル伝達の誘導を介するサイクリンＤ１発現の刺激作用を有する。当業者には明らかなように、他のＥｒｂＢレセプターまたはその組合せも他のシグナル伝達経路（たとえば、Ｐ１３Ｋ経路）を誘導するなど、他の特徴的な作用を誘導し得る。
【００１９】
Ｗｎｔに関連する用語“アゴニスト”とはＥｒｂＢレセプターシグナル伝達においてＷｎｔタンパク質の作用を模倣する化合物をいう。
Ｗｎｔの生物活性に関連する用語“アンタゴニスト”とは、Ｗｎｔが仲介するＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を阻害する化合物をいう。本発明の文脈において、かかるアンタゴニストはＷｎｔに結合し、Ｗｎｔがそのレセプター（Ｆｚ）に結合するのをブロックする能力を有する化合物、Ｆｚに結合し、ＷｎｔとＦｚとの同時結合を阻害する能力を有する化合物、または非競合、アロステリックおよび／または他の同様の様式で作用し、それによってＷｎｔに対するＥｒｂＢレセプターの応答を阻害する能力を有する化合物を包含し得る；ただし、その化合物はメタロプロテイナーゼ（たとえば、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ）を直接阻害せずにメタロプロテイナーゼに影響を及ぼすものとする。
【００２０】
用語“競合的アンタゴニスト”とはレセプター（Ｆｚ）部位に結合する化合物をいい、その作用はアゴニスト（ＷｎｔまたはＷｎｔ様活性）の濃度を増大させることにより凌駕することができる。
たとえば、Ｗｎｔアンタゴニストの“有効量”とはＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を所望どおりに低下（たとえば、細胞増殖率の低下）させるアンタゴニストの量をいう。同様に、Ｗｎｔアゴニストの“有効量”とはＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を所望どおりに増加させるアゴニストの量をいう。
【００２１】
細胞の“成長状態”とは細胞の増殖率および／または細胞の分化状態をいう。
本明細書にて使用する場合、“増殖する”および“増殖”とは有糸分裂を受けている細胞をいう。
本発明はＥｒｂＢレセプターに依存するシグナル伝達経路がＷｎｔにより活性化され得るという発見に関連する。下記により詳細に説明するように、本発明者らはＷｎｔペプチドがＥｒｂＢ１をトランス活性化し、それがＭＡＰＫ経路を強力に刺激するに至ることを最初に証明した。特定の理論に拘束されるつもりはないが、ＷｎｔはＥｒｂＢ１リガンド（またはＥｒｂＢレセプターに結合する他のリガンド）の利用能を増大することによりＭＡＰＫ経路を刺激するものと思われる。したがって、ＷｎｔのアンタゴニストはＥｒｂＢレセプターの活性を妨害し、たとえば、癌など種々の疾患に有力な治療効能を有する。
【００２２】
Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達の変調
したがって、本発明の一側面はＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を阻害する方法であって、細胞表面にＥｒｂＢレセプターとフリズルド（Ｆｚ）を発現する細胞と、当該細胞中でＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を低減させるのに十分な量のＷｎｔアンタゴニストとを接触させることを特徴とする方法に関する。代表的には、ＥｒｂＢレセプターはＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４の１種以上を含んでなる。好適な態様において、ＷｎｔアンタゴニストはＷｎｔ１またはＷｎｔ５ａおよびＥｒｂＢレセプターＥｒｂＢ１のアンタゴニストである。
【００２３】
Ｗｎｔアンタゴニストは抗体またはそのフラグメントもしくは変異体でもよく、ＥｒｂＢシグナル伝達のＷｎｔ機能を妨害するものである。かかる抗体はＷｎｔタンパク質またはそのレセプター（Ｆｚ）と特異的に反応し得る。ＷｎｔまたはＦｚポリペプチドに対して生成させる抗体は、該ポリペプチドまたはエピトープ担持フラグメント、変異体または細胞を動物に、好ましくは非ヒトに、常套のプロトコールに従い投与することにより入手し得る。モノクローナル抗体の調製には、連続的な細胞株培養により抗体を提供する技法を使用し得る。その例としては、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature （1975） 256: 495-497）、トリオーマ法，ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al., Immunology Today （1983） 4:72）およびＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）などである。一本鎖抗体の製造技法（米国特許第４,９４６,７７８号公報）は本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体の製造にも適合させ得る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を含むその他の生物もヒト化抗体の発現に使用し得る。
【００２４】
本発明の一側面は、Ｗｎｔタンパク質が産生するＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を妨害するために、ｓＦＲＰ、そのフラグメントもしくは変異体を使用することに関する。かかるＷｎｔアンタゴニストを下記実施例４にて説明する。分泌フリズルド関連タンパク質（ｓＦＲＰ）はＥｒｂＢ１を介してＷｎｔシグナル伝達を阻害することが示されており、したがって、アンタゴニストとして作用する。ｓＦＲＰの変異体またはフラグメントはＷｎｔシグナル伝達を阻害する能力を維持し、ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を妨害する。
【００２５】
具体的に考察するなら、ＥｒｂＢレセプター活性のＷｎｔ依存性の側面を同様に妨害する小分子は、同様にＥｒｂＢレセプター仲介シグナルを阻害し得るということである。好適な態様において、当該インヒビターは、２５００ａｍｕ未満の分子量、より好ましくは１５００ａｍｕ未満、さらにより好ましくは７５０ａｍｕ未満の分子量を有する有機分子であり、Ｗｎｔに依存するＥｒｂＢレセプターシグナル伝達の少なくとも一部の生物活性を阻害し得る。
【００２６】
本発明方法は、ＥｒｂＢレセプターとＷｎｔのレセプターを発現する広範囲の細胞、組織および臓器においてＥｒｂＢレセプターを阻害するために、Ｗｎｔアンタゴニストを使用することを含む。該細胞、組織または臓器は、好ましくは、ＥｒｂＢ１、ならびにＦｚ、特にＦｚ６、７および／または８を発現する。さらに、当該方法は培養により調製する細胞（インビトロ）または動物全体の細胞（インビボ）上にて実施し得る。
【００２７】
適切な細胞は代表的にはＥｒｂＢレセプターおよびＦｚ（またはＷｎｔレセプター）を発現する細胞であり、たとえば、これらは限定されるものではないが、上皮細胞または上皮由来の細胞、筋肉細胞、間充織細胞、グリア細胞またはグリオブラストーマ細胞など、または神経冠由来の細胞、メラニン細胞およびメラノーマ細胞などである。下記実施例では乳腺細胞およびヒト胎児腎臓細胞を用いて本発明を説明する。細胞は細胞増殖を持続させ得る既知の培地、たとえば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、Ｆ−１２などに、細胞の代謝に必要な補助添加物、たとえば、グルタミンと他のアミノ酸、ビタミン、ミネラルおよびトランスフェリンなどの有用なタンパク質などを加えた培地に入れる。培地は酵母、細菌およびかびなどでの汚染を防ぐために、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生物質を含んでいてもよい。場合によっては、該培地は他の生物学的に活性な分子、たとえば、増殖因子、特にＥＧＦなどを含んでいてもよい。
【００２８】
培養条件は生理的条件に近いものとすべきである。培地のｐＨは生理学的ｐＨに近いものとすべきであり、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ７近辺、さらにより好ましくは略ｐＨ７.４とする。細胞は生理的温度に近い温度、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは３２〜３８℃、最も好ましくは３５〜３７℃で培養すべきである。
【００２９】
本発明のもう一つの側面は、ＥｒｂＢレセプターおよびＦｚを発現する細胞の分化状態、生存および／または増殖を、該細胞とＷｎｔアンタゴニストとを接触させることにより、当該方法にしたがって、また状況に応じて変調する方法に関する。たとえば、脊椎動物の様々な細胞型および組織においてＥｒｂＢが広く関わっていると思われる観点から、インビトロおよびインビボの両方でかかる組織でのＥｒｂＢ機能を変調する過程の一部として本方法を使用し得ないかということを本発明が考慮する。Ｗｎｔアンタゴニストは、所定の細胞または組織の増殖または分化に関して誘導的であっても、非誘導的であっても、必要に応じて、上記の調製物、たとえば、抗体、ｓＦＲＰおよび小分子のいずれでもよい。
【００３０】
スクリーニングアッセイ
また、本発明はＷｎｔ介在ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を変調するのに有効な化合物のスクリーニング法を提供する。ＥｒｂＢシグナル伝達を変調する化合物の能力を定量するために利用し得る様々なアッセイ法があり、その多くは容易に高処理能力フォーマットとすることができる。化合物と天然抽出物のライブラリーをテストする多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、一定の期間内に検索すべき化合物の数を最大とするためには、高処理能力アッセイ法が望ましい。したがって、合成産物および天然物のライブラリーは、ＥｒｂＢシグナル伝達を阻害するＷｎｔアンタゴニストにとってのサンプルとなり得る。
【００３１】
精製した組換えＷｎｔ、ＦｚおよびＥｒｂＢポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドを発現する細胞を入手利用することは、Ｗｎｔの正常な細胞機能、とりわけＥｒｂＢシグナル伝達におけるその役割のアンタゴニストである小分子など、薬物のスクリーニングに使用し得るアッセイ系の生成を容易にする。一態様において、アッセイではＷｎｔとＷｎｔレセプター（例、Ｆｚ）間の結合を変調する化合物の能力、またはＷｎｔレセプターに対し単に直接結合する化合物の能力を評価する。好適な態様において、該アッセイではＷｎｔ仲介ＥｒｂＢシグナル伝達を変える試験化合物の能力を評点する。本方法では、種々のアンタゴニストを同定し得る。様々なアッセイフォーマットが適用可能であり、本開示に照らして、当業者もそれを理解しよう。
【００３２】
精製タンパク質または準精製タンパク質で誘導可能な無細胞アッセイ法は、多くの場合“一次”選抜として好適であり、その場合、該アッセイ法は試験化合物が仲介する分子標的の変化を迅速に進展させ、比較的容易に検出し得るように調製することができる。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物利用能の影響は、インビトロの系では一般的に無視することができるが、それよりも本アッセイ法では、レセプタータンパク質との結合親和性の変化に明瞭に現れ得る分子標的に対する薬物の影響に一義的に焦点を絞ることができる。
【００３３】
Ｗｎｔ−または候補化合物−Ｗｎｔレセプター複合体の検出および定量は、ＷｎｔとＷｎｔレセプタータンパク質との間の複合体形成を阻害する（または増強する）際の、およびＥｒｂＢシグナル伝達に影響を及ぼす際の、試験化合物の有効性を判定する手段を提供する。化合物の有効性は種々の濃度の試験化合物を用いて、用量−応答曲線を作成することにより評価し得る。さらに、対照アッセイを実施し、比較のためのベースラインとすることもできる。対照アッセイにおいては、ＷｎｔをＷｎｔレセプタータンパク質に加え、Ｗｎｔ／レセプター複合体の形成を試験化合物の不存在下に定量する。あるいは、Ｗｎｔレセプターに対しＷｎｔアンタゴニストの直接結合を検出・定量することができる。
【００３４】
Ｗｎｔレセプターは全タンパク質（好ましくは、細胞表面に発現したタンパク質）として、あるいは全長タンパク質のフラグメントとしてスクリーニングアッセイにおいて提供されるが、該タンパク質は少なくともＷｎｔに結合するタンパク質、たとえば、細胞外ドメインである。Ｗｎｔレセプタータンパク質は組換え遺伝子から誘導可能であり、たとえば、異種細胞において異所性に発現される。たとえば、該タンパク質は哺乳動物細胞（例、ＨＣ１１、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、３Ｔ３など）に、または標準的組換えＤＮＡ技法により酵母細胞に発現し得るか、または自然にレセプターを発現する細胞上に存在し得る。これらの細胞はレセプター結合、シグナル伝達または遺伝子発現アッセイに使用し得る。
【００３５】
Ｗｎｔ／候補化合物およびＷｎｔレセプターの間の複合体形成は種々の技法、たとえば、限定されるものではないが、イムノアッセイにより、またはクロマトグラフィー検出により検出し得る。たとえば、Ｗｎｔ結合アッセイの一法が文献（Bhanot, Nature 382:225 （1996））に記載されている。複合体形成の変調は、たとえば、放射標識、蛍光標識または酵素標識のＷｎｔなど、検出可能に標識したタンパク質を用いて定量することができる。
【００３６】
無細胞アッセイについては、一般に、ＷｎｔまたはＷｎｔレセプターのいずれかを固定化して、レセプター複合体と複合体を形成しなかったタンパク質の一方との分離をし易くすること、ならびにアッセイの自動化を図ることが望ましい。一態様においては、融合タンパク質を準備し、タンパク質がマトリックスに結合するようにドメインを加える。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／レセプター（ＧＳＴ／レセプター）融合タンパク質をグルタチオンセファロース・ビーズに、またはグルタチオン誘導化マイクロタイタープレートに吸着させ、これを次いで結合パートナー（またはタンパク質結合パートナー）、たとえば、標識Ｗｎｔ、および試験化合物と組合せ、複合体形成に資する条件下、たとえば、塩およびｐＨについて生理的な条件下にインキュベートするが、僅かにより緊縮な条件が望ましい場合もある。同様に、（ヒスチジン）６タグを用いてニッケル結合を介して固定化するか、またはエピトープ（例、ＨＡタグ）を用いて抗体により固定化し得る。インキュベーションに続き、ビーズ（または他の表面）を洗浄して結合しなかったリガンドを除き、マトリックスビーズ結合標識を直接定量する（たとえば、放射標識の場合にはビーズをシンチレーターに入れる）か、または複合体を解離させた後の上清で定量する。別法として、複合体をビーズから解離させ、標準的技法を用いて定量することができる。一部の態様においては、ＷｎｔおよびＷｎｔレセプターの双方を標識する；候補化合物がＷｎｔとＷｎｔレセプターの結合を妨害し、検出可能なシグナルを生成する（たとえば、ＷｎｔをＦｚに接近させ蛍光をクエンチングすると、もし化合物がＷｎｔレセプターからＷｎｔを放出すると、蛍光を発する）。
【００３７】
無細胞アッセイに加えて、上に記載したように、本発明化合物は細胞にもとづくアッセイ法でも試験することが可能であり、この場合、ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達に対する作用をアッセイすることができる。一態様において、Ｗｎｔ誘導に感受性の細胞、たとえば、Ｆｚ−発現細胞または他のＷｎｔ誘導に感受性の細胞は、Ｗｎｔおよび／または対象の候補化合物と接触させ得る；このアッセイでは単純な細胞への結合から標的細胞によるＷｎｔ誘導の応答（とりわけ、ＥｒｂＢシグナル伝達）における阻害までのいずれをもスコア化する。
【００３８】
一般に、かかるスクリーニング手法はＷｎｔレセプターおよびＥｒｂＢシグナル伝達経路の成分を発現する適切な細胞の産生を伴う。かかる細胞は哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、または大腸菌からの細胞を含む。該レセプターを含む細胞（または発現したレセプターを含む細胞膜）は次いで候補化合物と接触させ、結合、または機能的応答の促進もしくは阻害を観察する。したがって、Ｆｚ−発現細胞はＦｚタンパク質を自然に発現する細胞（代表的には哺乳動物細胞）または異所性にＦｚを発現するように遺伝子工学的に設計した細胞でよい。この細胞のその他の特徴も望ましいものである（たとえば、アッセイがＥｒｂＢシグナル伝達にもとづく場合にはＥｒｂＢシグナル伝達の能力）。さらに、組換え細胞はＷｎｔ−および／またはＥｒｂＢ−依存性シグナル経路に関与するタンパク質をエンコードする他の異種遺伝子を含むように設計し、Ｗｎｔ−および／またはＥｒｂＢ−シグナル伝達カスケードの機能的再構成に感受性であるアッセイ法を設計することができる。
【００３９】
これら細胞にもとづくアッセイに使用するＷｎｔタンパク質は、精製源（天然または組換え起源）として、または該タンパク質を発現する細胞／組織、および標的細胞または標的細胞と共に培養した細胞であり得る細胞／組織の形状で提供し得る。
候補化合物とＷｎｔレセプターを担持する細胞との結合は、候補化合物と直接または間接に会合した標識により、または標識した競合物との競合を伴うアッセイにより検出することができる。活性化のインヒビターは一般に既知アゴニスト（例、Ｗｎｔ）の存在下にアッセイし、候補化合物の存在によるアゴニストによる活性化に対する影響を観察する。数値は一般的に試験作用因子の不存在下に実施する同様のアッセイに対してスコア化する。
【００４０】
結合の検討に加えて、細胞間シグナルの変化、たとえば、第二メッセンジャー（例、シグナル伝達、ｐＨ変化、またはカルシウムレベルの変化）または試験作用因子と接触させたＦｚ−およびＥｒｂＢ−発現細胞を検出することにより、ＥｒｂＢシグナル伝達に影響する候補Ｗｎｔアンタゴニストを同定し得る。多くの遺伝子産物が、下記実施例に示すように、Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達に関係している。たとえば、ＥｒｂＢ１のホスホチロシンレベル、ＭＡＰキナーゼ活性、ＥＲＫ活性またはサイクリンＤ１レベルの内のいずれか一つまたは組合せをアッセイして、ＥｒｂＢ１トランス活性化を定量する。同様に、細胞型またはＥｒｂＢイソ型によって、他の経路、たとえば、Ｐ１３Ｋ／ＰＫＢ経路を変調することができる。もし強力なＷｎｔアンタゴニスト（またはアゴニスト）がＷｎｔレセプター（Ｆｚ）に結合し、結果としてそのレセプターに対するＷｎｔの結合を阻害（または増強）するなら、Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢ活性のレベルは低下（または増加）するであろう。
【００４１】
Ｗｎｔタンパク質による細胞の誘導は、運動に際し下流エフェクターの活性化と阻害に関わるカスケードを配置し、その最終的結果が、ある場合には遺伝子の転写または翻訳の検出可能な変化となる。Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢ１シグナル伝達の転写標的はサイクリンＤ１である。ＥｒｂＢシグナル伝達に応答してアップ−またはダウン−レギュレーションを受けるかかる標的遺伝子から転写調節配列を選択することにより、またかかるプロモーターをレポーター遺伝子に操作可能に連結することにより、Ｗｎｔ仲介ＥｒｂＢシグナル伝達経路を修飾するために特定の試験化合物の能力に感受性のある転写にもとづくアッセイ法を得ることができる。レポーター遺伝子の発現は、したがって、ＥｒｂＢシグナル伝達においてＷｎｔアンタゴニストとして作用する化合物開発の価値のあるスクリーニング手段を提供する。本発明のレポーター遺伝子にもとづくアッセイ法では、Ｗｎｔ介在ＥｒｂＢカスケードの終末段階を測定する。したがって、一態様のアッセイを実施する際に、レポーター遺伝子構築物はＷｎｔシグナル伝達に依存する検出シグナルを生成させるために細胞中に挿入する。レポーター遺伝子はｍＲＮＡレベルで、たとえば、ＰＣＲにより、またはタンパク質レベルで、たとえば、特徴的な内在性活性（たとえば、酵素活性、蛍光、抗体活性）により検出し得る。次いで、レポーター遺伝子からの発現量は、同じ細胞にいて試験化合物が存在しない場合の発現量など、対照と比較する。転写量における統計的または別の方法による有意差は、試験化合物がある方式でＷｎｔタンパク質のシグナル伝達活性を変化させたこと、たとえば、試験化合物が有力なＷｎｔアンタゴニスト／アゴニストであることを示している。
【００４２】
候補化合物がＷｎｔ仲介ＥｒｂＢシグナル伝達に影響を及ぼすことを確認するために、ＥｒｂＢのトランス活性化をアッセイすることに加えて、候補化合物のＷｎｔ活性について一般的な方法でスクリーニングする（たとえば、Ｗｎｔレセプターへの結合、メタロプロテイナーゼ活性の変調に先立つ下流効果、またはＴＣＦ誘導などのメタロプロテイナーゼ変調から独立する並行経路での下流効果）。メタロプロテイナーゼ活性はタンパク分解開裂と膜結合ＥｒｂＢリガンドの放出を強力に刺激する。したがって、Ｗｎｔアンタゴニストはメタロプロテイナーゼを直接阻害するものではない。
【００４３】
上記の多くの検討はＷｎｔアンタゴニストに関連するものであるが、本開示に照らして当業者に明瞭なことは、Ｗｎｔアゴニストを本発明のスクリーニング方法で同定し得ることである。同様に、Ｗｎｔアゴニストを用いて、ＥｒｂＢシグナル伝達を阻害するのに使用したと同じ方法で、ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化し得る。したがって、本方法は候補化合物がＷｎｔレセプター結合もしくはＷｎｔ仲介ＥｒｂＢシグナル伝達を活性化するか、または阻害するかを判定するために使用可能であり、また所望によりＥｒｂＢシグナル伝達を活性化するのに非常に有用である。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法により同定された化合物は、コンビナトリアル化学および他の並行合成計画案に適用し得る。結果は、有力なＷｎｔアンタゴニストのリード化合物を同定するために、またリード化合物の特異性、毒性、および／または細胞傷害性−キネティックプロフィールに磨きをかけるために、関連化合物の大型ライブラリーについて高処理能力アッセイ法により迅速にスクリーニングすることができる。たとえば、上記のＥｒｂＢシグナル伝達に関してのＷｎｔ生物活性アッセイ法は、すべてのまたは特定のＥｒｂＢ／Ｆｚイソ型または活性に対しアンタゴニスト活性を有する化合物のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするのに使用し得る。
【００４５】
もう一つの側面において、本発明はＷｎｔ仲介ＥｒｂＢシグナル伝達のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するキットに関し、該キットは、Ｗｎｔ、Ｆｚ、ＥｒｂＢレセプターおよび／またはＷｎｔ、Ｆｚおよび／またはＥｒｂＢを発現する細胞、およびＷｎｔ、Ｆｚおよび／またはＥｒｂＢシグナル伝達を検出する抗体または他の手段を含んでなる。
【００４６】
治療および診断への応用
さらなる側面において、本発明は変化したＥｒｂＢシグナル伝達の影響を受ける症状または疾患をもつと診断された患者において、ＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を阻害する方法であって、患者の細胞にてＥｒｂＢレセプターシグナル伝達を低減（または増大）させるために十分な量のＷｎｔアンタゴニスト（またはアゴニスト）を含有してなる組成物を患者に投与することを特徴とする方法を提供する。該アンタゴニストは、たとえば、ＷｎｔまたはＦｚに特異的に結合する抗体であるか、または本発明のスクリーニング方法により同定した化合物である。
【００４７】
したがって、ＥｒｂＢレセプター活性のモジュレーターとしてのＷｎｔアンタゴニストまたはアゴニストの同定は、ＥｒｂＢレセプター活性に関わる病状の処置に有用である。ＥｒｂＢシグナル伝達の影響を受ける疾患および症状は、細胞増殖および分化の障害を含む。したがって、Ｗｎｔアンタゴニストとアゴニストは、広範囲の治療適用、たとえば、癌（とりわけ、固形腫瘍、たとえば、乳癌、直腸癌、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、肺癌、グリア芽細胞腫、メラノーマ）、心臓疾患、膵臓障害（たとえば、インスリン産生）および神経変性疾患（アルツハイマーおよびパーキンソン病など）の治療に適する。
【００４８】
したがって、本発明方法は多様な細胞型および組織に関わる障害の処置または予防に、また化粧品用途に広く適用し得る。一般に、本方法は処置すべき組織の増殖状態を変化させるために有効な量のＷｎｔアンタゴニスト（またはアゴニスト）を動物に投与するステップを含むことが特徴である。投与様式および投与量処方は処置すべき組織によって変わる。たとえば、局所用剤形は、処置すべき組織が皮膚または粘膜組織などの上皮組織である場合に好適である。
【００４９】
好適な態様において、本発明方法はＥｒｂＢレセプターを発現するヒトの癌の処置に使用し得る。たとえば、ＷｎｔアンタゴニストはＥｒｂＢ１発現乳癌などの、ＥｒｂＢ１を発現する癌の処置にとりわけ有用である。
【００５０】
同様に、ＥｒｂＢレセプター活性のモジュレーターはＷｎｔが関与する病状の処置に有用であり得る。たとえば、ＥｒｂＢレセプター活性のモジュレーターは、たとえば、ＥｒｂＢリガンド結合に影響を与え、Ｗｎｔシグナル伝達のモジュレーションが望ましい疾患、たとえば、骨癌（Ｗｎｔ−ｘの場合）などの骨障害の処置に、また細菌、かび、原虫およびウイルス感染などの感染症；疼痛；糖尿病；肥満症；食欲不振；食欲亢進；喘息；パーキンソン病；急性心不全；低血圧；高血圧；尿うっ滞；骨粗しょう症；狭心症；心筋梗塞；潰瘍；喘息；アレルギー；良性前立腺肥大；および精神神経障害などの処置に有用である。  
【００５１】
ある種態様において、当該アゴニスト／アンタゴニストはそれらＥｒｂＢ経路の選択性にもとづき選択する。特定の態様においては、Ｗｎｔアンタゴニストは一つのＥｒｂＢイソ型に対して次のものよりも、たとえば、１０倍より選択的であり、より好ましくは一つのＥｒｂＢ経路（たとえば、ＥｒｂＢ１）に対して他のものよりも少なくとも１００倍またはさらに１０００倍より選択的であるため、使用に選択する。
【００５２】
ある種好適な態様において、ＷｎｔインヒビターはＥｒｂＢ仲介シグナル伝達を１ｍＭ以下のＥＤ５０で、より好ましくは１μＭ以下、そしてなおさらに好ましくは１ｎＭ以下のＥＤ５０で阻害する。用語“ＥＤ５０”は薬物がその最大応答または作用の５０％を生じる用量を意味する。あるいは、試験対象物または調製物の５０％で既定の応答を生じる用量を意味する。
【００５３】
本方法で使用する化合物は投与のために生物学的に許容し得る媒体、たとえば、水、緩衝塩溶液、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）またはその適当な混合物により使いやすいように製剤化する。選択した媒体において最適な有効成分濃度は、医療従事化学者周知の手法に従い、経験的に決定し得る。本明細書にて使用する場合、“生物学的に許容し得る媒体”は、医薬製剤の所望の投与経路に適し得る溶媒、分散媒体などのいずれかおよびすべてを含む。医薬的に活性な物質に対しかかる媒体を使用することは、技術上既知である。その他のタンパク質を含めての適切なビークルおよびその剤形は、たとえば、文献（Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985）に記載されている。これらのビークルは注射可能な“デポ型製剤”を含む。
【００５４】
一側面において、本発明は、したがって、有効成分として、本明細書に記載したような、ＥｒｂＢシグナル伝達活性を阻害するＷｎｔアンタゴニスト（またはＥｒｂＢシグナル伝達活性を活性化するアゴニスト）を含んでなる医薬製剤を提供する。Ｗｎｔアゴニストまたはアンタゴニストを使用する当該処置はヒトおよび動物対象両方に有効であり得る。本発明に適用し得る動物対象はペットとして、または商業目的で飼育された家庭用動物および畜産用動物にまで及ぶ。例示としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、およびヤギである。
【００５５】
本発明の製剤は、経口、非経口、局所、または直腸投与し得る。それらは勿論各投与経路に適した形状で投与する。たとえば、それらは錠剤またはカプセルの形状で、または注射、吸入により、または軟膏、坐剤などとして投与する。経口および局所投与は小分子に好適である。当該方法はさまざまな異なる小分子を用いて実施し得ることが期待されるが、小分子は、たとえば、本明細書に記載の薬物スクリーニングアッセイにより容易に同定し得る。それにもかかわらず、一部の態様において、本発明の方法および組成物は抗体またはｓＦＲＰ、またはそのフラグメントを使用し、一般的にはそれを適切な経路で投与して活性を維持する（たとえば、タンパク質分解を避けることによる）。
【００５６】
したがって、本発明により期待されることは、ＥｒｂＢシグナル伝達に左右される障害または症状の処置用医薬としてのＷｎｔアゴニストまたはアンタゴニストの使用、ならびにＥｒｂＢに左右される障害または症状の処置用医薬品の製造におけるＷｎｔアンタゴニストまたはアゴニストの使用である。
【００５７】
本発明のさらなる側面においては、Ｗｎｔアゴニストまたはアンタゴニストによる処置を必要とする患者の診断方法であって、患者からのサンプル中にＷｎｔレセプターが存在するか否かを決定し、非罹患個体と比較して、該サンプルのＥｒｂＢシグナル伝達変化を検出することを特徴とする方法が提供される。Ｗｎｔレセプター（Ｆｚ）含有サンプル中のＥｒｂＢシグナル伝達レベルの上昇は、Ｗｎｔアンタゴニストにより処置し得る患者に相関する。逆に、Ｗｎｔレセプター（Ｆｚ）含有サンプル中のＥｒｂＢシグナル伝達レベルの低下は、Ｗｎｔアゴニスト（Ｗｎｔを含む）により処置し得る患者に相関する。
【００５８】
以下、本発明につき以下の非制限的な表および実施例を参照し、さらに説明する。本発明の他の態様はこれらに照らして当業者に自明である。
【実施例】
【００５９】
これらの実施例は説明を目的として記載するものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
本開示および実施例に言及はしているが明示的に記載していない分子遺伝学、タンパク質とペプチドの生化学、および免疫学の方法は科学文献に報告されたものであり、当業者周知のものである。たとえば、遺伝子工学の標準的方法は本質的に文献（Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY, 1989）に記載のとおりに実施する。
【００６０】
実施例１
Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５はＨＣ１１乳腺細胞においてＴＣＦ転写活性を刺激する
本実施例では、増殖、分化および形質転換におけるＥｒｂＢレセプターの役割を特性化するために広範に使用されている不死化細胞株、ＨＣ１１乳腺細胞（Taverna et al., 1991; Brandt et al., 2001）におけるＷｎｔ１およびＷｎｔ５ａの構成的発現が、他の系ではすでに記載されているように、ＴＣＦ転写活性のレベルを上昇させることを証明する。
【００６１】
ＨＣ１１乳腺細胞をＥＧＦとインスリン含有のＲＰＭＩ培地プラス１０％ＦＣＳ（Hynes et al., 1990）にて培養し、特に断りのない限りこの培地中で維持した。ＨＣ１１細胞は先ずスーパーフェクト（SuperFect）ＴＭ（キアゲン（Qiagen））を用い、ピューロマイシン耐性とＴＣＦルシフェラーゼレポーター（ＴopＴＫ）（Brantjes et al., 2001）をエンコードするベクターにより同時形質移入した。次いで細胞はピューロ含有培地で選択した。これらのＴopＴＫ発現細胞を使用して、Ｗｎｔ発現ＨＣ１１細胞株を調製した。２種類の細胞株を調製したが、一方はＷｎｔ１を安定的に発現し、他方はＷｎｔ５ａを発現した。Ｗｎｔ ｃＤＮＡは、http://www.stanford.edu/~rnusse/Wntwindow.htmlに記載されている。
【００６２】
これを実施するために、ＴopＴ ＫＨＣ１１にＬＮＣＸレトロウイルス（Miller AD, Rosman GJ, 1989, Biotechniques 7:980-990）に感染させたが、このものはネオマイシン耐性をエンコードし、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ５ａ発現を推進するＣＭＶプロモーターを使用する（Aberle et al 1997 EMBO J. 16:3797-3804）。細胞の二重薬物耐性（ピューロ／ネオ）プールを選択し、Ｗｎｔ１−ＨＣ１１、Ｗｎｔ５ａ−ＨＣ１１および対照（Ｃ）−ＨＣ１１と呼称する。これらの細胞はそのまま検討するか、またはＷｎｔ含有順化培地の起源として使用した。Ｗｎｔ含有ＣＭを調製するために、ＥＧＦとインスリンを欠く培地で細胞を一夜増殖し、培地を除去して、試験すべき培地に加えた。
【００６３】
マイクロアレイ分析を実施し、Ｃ−ＨＣ１１細胞中のＷｎｔおよびＦｚの発現を定量し、導入されたＷｎｔｃＤＮＡの発現を確認した。ＲＮＡを調製し、製造業者のプロトコールに従い、アフィメトリックス（Affymetrix）ジーンチップ・マウス・ゲノムＵ７４Ａアレイ上で分析した。ハイブリッド形成データは製造業者のソフトウエア（ＭＡＳ４.０）により解析した。ＷｎｔおよびＦｚの発現レベルを任意の単位で示す（表１）。
【表１】
2006516950.tif 000002
【００６４】
Ｃ−ＨＣ１１細胞はＦｚ６、−７および−８、およびＷｎｔ４および−７bのｍＲＮＡを発現する。高レベルのＷｎｔ１およびＷｎｔ５ａのｍＲＮＡはそれぞれの形質移入細胞株にて検出した。
細胞質ゾルのベータ−カテニン・レベルの上昇は、ＴＣＦに結合してその転写を活性化するベータ−カテニンの能力の特質と考えられる（Bienz, 1998）。それ故、各細胞株からの細胞質ゾル・フラクションについてベータ−カテニンを分析し、ＴＣＦが活性化されているか判定した。簡単に説明すると、細胞質ゾル・フラクションは文献記載の方法“細胞成分分画・実用法”（Subcellular Fractionation, A Practical Approach, Edited by JM Graham and D. Rickwood, pp21-22）にしたがって調製し、５０μｇをベータ−カテニン用に免疫ブロットし、また負荷対照としてチューブリンを本質的にすでに記載されている（Lane et al., 2000）とおりにブロットした。ベータ−カテニンとチューブリンの抗体は市販品として入手し得る（たとえば、トランスダクション・ラボラトリーズ、ネオマーカーズ）。Ｃ−ＨＣ１１細胞に比べて、Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞からの細胞質ゾル・フラクションは高レベルのベータ−カテニンを有し、一方、チューブリンレベルは一定のままであった。
【００６５】
全細胞可溶化物（ＷＣＬ）は培養物をＮＰ４０抽出バッファー（Lane et al., 2000）に可溶化することにより調製し、ＴＣＦ４特異抗体（市販入手可能；たとえば、アップステート・バイオテクノロジー）による免疫ブロットに使用した；本質的にすでに記載されているとおりに実施（Lane et al., 2000）。ＴＣＦ４はＨＣ１１細胞、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５ａＨＣ１１株において本質的に同じレベルで発現したが、このことはＷｎｔがＨＣ１１細胞において、多分ＴＣＦ４経由で、プロトタイプのベータ−カテニン／ＴＣＦ経路を活性化することを示唆している。
【００６６】
短期Ｗｎｔ誘導シグナル伝達を試験するために、Ｃ−ＨＣ１１細胞をＷｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞の培養物から取得した順化培地（ＣＭ）で処理した。Ｗｎｔ含有順化培地（ＣＭ）は、ＥＧＦとインスリンを含まない培地中一夜増殖したＷｎｔ１−またはＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞の培養物から集め、ルシフェラーゼのアッセイに先立つ４８時間Ｃ−ＨＣ１１に加えた。両培養物からのＣＭはルシフェラーゼ活性を４〜５倍増大させ、ＴＣＦ経路の誘導における分泌Ｗｎｔタンパク質の生物活性を確認した。
【００６７】
実施例２
ＥｒｂＢ１はＷｎｔ発現ＨＣ１１細胞にて活性化される
ＥｒｂＢ１は多くの分類の膜タンパク質によりトランス活性化される（Carpenter, 1999; Gschwind et al., 2001）。しかし、ＥｒｂＢ１のＷｎｔ／Ｆｚ仲介活性化はこれまで報告されていない。ＥｒｂＢ１チロシンのリン酸化はＥｒｂＢ１活性化における必須のステップであるため、我々はＷｎｔがＥｒｂＢ１を活性化し得るのか、Ｗｎｔ／ＨＣ１１細胞からのレポーターを免疫沈降させ、ホスホチロシン特異抗血清でウエスタン分析することにより試験した。これらの実験のために、ＨＣ１１細胞をＥＧＦを含まない培地にて一夜増殖させた。ＥｒｂＢ１活性化の対照として、Ｃ−ＨＣ１１およびＷｎｔ−ＨＣ１１細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦにて１０分間処理した。ＥｒｂＢ１選択性キナーゼインヒビターＰＫＩ１６６（Traxler et al., 2001）も一部の実験で使用した。このため、ＷＣＬの調製前に、細胞を５μＭのＰＫＩ１６６で１時間事前処理するか、または未処理のままとした；本質的に実施例１に記載のとおりとした。
【００６８】
ＥｒｂＢ１を５００μｇのＷＣＬから免疫沈降させ、ホスホチロシン特異抗体（抗ホスホチロシンＡＧ１０、アップステート・バイオテクノロジー）にて免疫ブロットした（本質的にすでに記載されているとおりに実施（Lane et al., 2000））。これを２％ＳＤＳ、６２.５ｍＭトリスｐＨ６.８、１００ｍＭベータ−メルカプトエタノールに入れ、６０℃３０分間で膜を剥がした。剥がした膜は市販の抗体（抗体１００５、サンタ・クルツ・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology））によりＥｒｂＢ１について再度プローブした。タンパク質は強化化学発光検出システム（アマーシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、リトル・チャルフォント（Little Chalfont）、英国）を用いて、ペルオキシダーゼ結合二次抗体にて可視化した。
【００６９】
ホスホチロシン染色の低かったＣ−ＨＣ１１細胞からのＥｒｂＢ１と対照的に、Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞においてはＥｒｂＢ１が高度にリン酸化され、ＥＧＦ（ＥｒｂＢ１活性因子）での処理がＥｒｂＢ１リン酸化を強力に増大したが、Ｗｎｔ発現細胞ではそうならず、後者では該レセプターがすでに最大に活性化されていることを示唆した。ＥｒｂＢ２もＥｒｂＢ３も対照またはＷｎｔ発現ＨＣ１１細胞ではリン酸化されなかった（抗ＥｒｂＢ２、（２１Ｎ）；Lane et al., 2000）。したがって、ＥｒｂＢ１の特異的リン酸化は、ＥｒｂＢ１がＷｎｔ発現細胞において活性化されたことを示している。
【００７０】
Ｗｎｔ−ＨＣ１１細胞をＥｒｂＢ１選択キナーゼインヒビターであるｐＫＩ１６６インヒビターで１時間処理すると、ＥｒｂＢ１のリン酸化レベルを約５０％低下させ、リン酸化が増大したキナーゼ活性によるものであって、低下したホスファターゼ活性によるものではないことを示唆した。
【００７１】
実施例３
ＭＡＰＫはＷｎｔ発現ＨＣ１１細胞にて活性化される
ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路は、活性化されたＥｒｂＢレセプター下流の主要なシグナル伝達カスケードである（Olayloye et al., 2000）。それぞれの経路上の主要なキナーゼであるＥＲＫ１／２およびＰＫＢの活性なリン酸化形状に特異的な抗血清を用いて、その活性をプローブした。５０μｇのＷＣＬを本質的に上記同様に免疫ブロットした；ただし、ここではホスホ−ＥＲＫ１／２抗体（市販入手可能、ニューイングランド・バイオラブス（New England Biolabs））またはホスホＰＫＢ抗体を使用した。膜を剥がし、ＥＲＫ１／２について再度プローブした（抗ｐ４４／４２ＥＲＫ、ニューイングランド・バイオラブス）。
【００７２】
Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞においては、ホスホ−ＥＲＫ１／２（ホスホ−ＰＫＢではない）の基礎レベルは、Ｃ−ＨＣ１１細胞に比較して上昇していた。Ｗｎｔ−１細胞において、活性化の程度はＥＧＦ−処理ＨＣ１１細胞において観察されるものと等価であった。ホスホＥＲＫ１／２のレベルはＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞において僅かながら低かった。Ｃ−ＨＣ１１細胞をＰＫＩ１６６で事前に処理すると、ＭＡＰＫ活性のＥＧＦ誘導を防止した。さらに、ＰＫＩ１６６処理がＷｎｔ発現ＨＣ１１細胞においてホスホ−ＥＲＫ１／２の構成的レベルを既定レベルまで低下させ、これらの細胞においてはＥｒｂＢ１がＭＡＰＫ経路の活性化に関わっていることを示唆した。
【００７３】
実施例４
ＷｎｔはＨＣ１１細胞において細胞内シグナル伝達経路を刺激する
本実施例では、ＷｎｔがＨＣ１１細胞中でＥｒｂＢ１を介して細胞内シグナル伝達を刺激することを示す。簡単に説明すると、実施例１記載のとおりに調製したＷｎｔ−ＨＣ１１細胞からの順化培地（ＣＭ）をＥｒｂＢ１とＭＡＰＫ活性に対するその影響につき、本質的に上記のとおりに試験した。Ｃ−ＨＣ１１細胞をＷｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＣＭで１０分間処理すると、ホスホ−ＥＲＫ１／２のレベルを５〜６倍刺激し、一方、Ｃ−ＨＣ１１細胞からのＣＭは影響しなかった。さらに、ＰＫＩ１６６（細胞をＰＫＩ１６６で１時間、前処理した）の存在下に、ホスホ−ＥＲＫ１／２レベルを刺激するＷｎｔ含有ＣＭの能力はブロックされたが、このことはＷｎｔ誘導ＥＲＫ１／２のリン酸化におけるＥｒｂＢ１の直接関与を示唆している。
【００７４】
Ｗｎｔ含有ＣＭの作用仲介に際してＥｒｂＢ１リガンドの強力な関与を除外するために、我々は分泌されたフリズルド関連タンパク質−１（ｓＦＲＰ−１）を用い、Ｗｎｔに結合させてＦｚの結合を妨げた（Uren et al., 2000）。ｓＦＲＰ１発現ベクターを安定に発現するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞または対照ＨＥＫ２９３細胞からのＣＭは、Ｗｎｔ含有ＣＭ（１：１）で１時間事前混合し、Ｃ−ＨＣ１１培養物に１０分間加えた。ｓＦＲＰ１−産生２９３細胞とＷｎｔ含有ＣＭとを同時に添加すると、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５ａがホスホ−ＥＲＫ１／２のレベル上昇から防止され、ｓＦＲＰ１がＦｚを介してＥｒｂＢ１にＷｎｔがシグナル伝達するのをブロックすることを示す。対照として、ｓＦＲＰ１の存在下に該細胞をＥＧＦで１０分間処理した。ＥＧＦはこれらの条件下にＥＲＫ１／２リン酸化を誘導することが可能であり、ｓＦＲＰ１のみがＷｎｔ仲介ＥｒｂＢ１活性化をブロックし、ＥｒｂＢ１リガンドは活性化を誘導しないことを示した。
【００７５】
ＥｒｂＢ１とＥＲＫのＷｎｔ仲介活性化はメタロプロテイナーゼ活性を必要とする
上記実施例の結果は、ＨＣ１１乳腺細胞においてＷｎｔがＥｒｂＢ１をトランス活性化し、ＭＡＰＫ経路を刺激する能力を有することを示している。これらの結果についてその可能性を説明すると、Ｆｚに結合するＷｎｔがＥｒｂＢ１活性化リガンドの利用能を増大させるということである。ＨＣ１１細胞は、乳腺のように（Troyer and Lee, 2001）、ＥｒｂＢ１リガンドを発現する。これらはトランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦ−アルファ）（Hynes et al., 1990）、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）およびアンフィレグリン（ＡＲ）などである。これらリガンドのエクトドメインをメタロプロテイナーゼが処理加工して、可溶性増殖因子を発散させる（Massague and Pandiella, 1993）。これらの可溶性ペプチドは、膜結合形状と対照的に、活性レセプターの生物作用の大半に関与していると思われる（Dong et al., 1999）。本実施例では、Ｗｎｔがこれらのリガンドを切断する特定のメタロプロテイナーゼの活性を増大させるか否かを決定した。ここで証明されたことは、ＧＰＣＲ−結合リガンドのエンドセリンおよびトロンビンによるＥｒｂＢ１トランス活性化が、メタロプロテイナーゼ介在プロＨＢ−ＥＧＦの開裂から生じたことである（Prenzel et al., 1999; Gschwind et al., 2000）。
【００７６】
Ｗｎｔ発現ＨＣ１１細胞におけるメタロプロテイナーゼの役割を試験するために、２種のメタロプロテイナーゼインヒビター、すなわち、フェナンスロリン（カルビオケム（Calbiochem））（金属イオンキレート化剤）またはＣＧＳ２７０２３Ａ（酵素インヒビター）（Wang et al., 1999）を使用した。細胞をフェンスロリン、ＣＧＳ２７０２３Ａ（共に５０μＭ）またはＤＭＳＯ担体で１時間処理した。ＥｒｂＢ１は５００μｇのＷＣＬから免疫沈降させ、ホスホチロシン特異抗体により、本質的に上記どおりに免疫ブロットした。膜を剥がし、ＥｒｂＢ１について再度プローブした。ＥＲＫ１／２を５０μｇのＷＣＬからプローブし、ホスホ−ＥＲＫ１／２抗体により、本質的に上記どおりに免疫ブロットした。膜を剥がし、ＥＲＫ１／２について再度プローブした。
【００７７】
いずれのインヒビターでの処理も、ホスホ−ＥｒｂＢ１のレベルを強力に低下させ、またＥｒｂＢ１発現細胞でのホスホ−ＥＲＫ１／２のレベルを低下させた。Ｃ−ＨＣ１１細胞では、ＥｒｂＢ１およびＥＲＫ１／２が基本的活性を発揮し、その両方がさらにメタロプロテイナーゼインヒビターの存在下に低下した；このことはオートクリン活性化ＥｒｂＢ１が基本的ＥＲＫ１／２の活性を生じさせていることを示唆する。Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞において、この過程が強調されたと思われる。
【００７８】
メタロプロテイナーゼインヒビターは、次いでＷｎｔ含有ＣＭの存在下で試験した。Ｃ−ＨＣ１１培養物をメタロプロテイナーゼインヒビターと共に１時間前処理し、次いでＣ−またはＷｎｔ−ＨＣ１１細胞からのＣＭで１０分間処理した。ホスホ−ＥＲＫ１／２のレベルは上記同様に定量した。フェナンスロリンおよびＣＧＳ２７０２３ＡはそれぞれＷｎｔタンパク質の能力をブロックし、Ｃ−ＨＣ１１細胞中のＥＲＬ１／２活性を刺激した。同様の結果は、構成的にＷｎｔタンパク質を発現するＨＣ１１細胞によって得られた。したがって、ＥｒｂＢ１およびＥＲＫのＷｎｔ仲介活性化は、メタロプロテイナーゼ活性に左右される。
【００７９】
実施例６
ＨＥＫ２９３細胞におけるＥＲＫのＷｎｔ仲介活性化はＥｒｂＢ１のモノクローナル抗体によりブロックされる
実施例５の結果は、ＥｒｂＢ１のＷｎｔ／Ｆｚ仲介活性化およびＭＡＰＫ経路が、メタロプロテイナーゼ誘導ＥｒｂＢ１リガンドのプロセシングを介して生じることを示唆する。該レセプターの細胞外ドメインに結合するリガンドを妨害するＥｒｂＢ１特異遮断抗体は、この推定を確認するために採用された。
【００８０】
モノクローナル抗体ｍＡb５２８（市販品入手−サンタ・クルツ）は、ヒトＥｒｂＢ１レセプターに結合するリガンドを妨害するが（Badache and Hynes, 2000）、この抗体を用いて内在的にＥｒｂＢ１を発現するヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を評価した。方法は本質的に上に記載したとおりとする。ＨＥＫ２９３培養物は１０μｇ／ｍｌのＡb５２８と１時間、前処理し、次いで１０分間、Ｃ−またはＷｎｔ−ＨＣ１１細胞からのＣＭで処理した。ＨＣ１１細胞で見られるように、ＨＥＫ−２９３細胞をＷｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ含有ＣＭで処理すると、ＴＣＦの転写活性ならびにＭＡＰＫ活性を刺激した。ｍＡb５２８の存在下、ＥＧＦの能力ならびにＭＡＰＫ活性を刺激するＷｎｔ含有ＣＭはブロックされ、Ｆｚに結合するＷｎｔがＥｒｂＢ１リガンドの利用能を増大させることを示唆する。
【００８１】
実施例７
ＨＢ−ＥＧＦはＷｎｔ発現ＨＣ１１細胞にて発現される
定量的リアルタイムＰＣＲをＨＣ１１細胞またはＷｎｔ発現細胞について実施し、どのＥｒｂＢ１リガンドがＥＲＫへのＷｎｔシグナル伝達に関与しているかを決定した。簡単に説明すると、ｍＲＮＡをＣ−およびＷｎｔ−ＨＣ１１細胞から単離し、ＴＧＦ−ａ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＡＲのレベルを、本質的にすでに記載されているとおりに、特異的オリゴ体を使用して、リアルタイムＰＣＲにより測定した（Sorensen et al., 2000）。値を任意の単位で表２に示す。
【表２】
2006516950.tif 000003
【００８２】
結果は、Ｃ−ＨＣ１１細胞において、またＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞において、ＴＧＦ−アルファ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＡＲが同様のレベルで発現されること、一方、Ｗｎｔ１−ＨＣ１１細胞はＨＢ−ＥＧＦを有するが、検出可能なＴＧＦ−アルファはなく、ＡＲレベルは減少していることを明らかにした。したがって、ＨＢ−ＥＧＦはＥｒｂＢ１上のＷｎｔの作用を仲介し得る。
【００８３】
実施例８
Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５ａはＥｒｂＢ１のトランス活性化を介してサイクリンＤ１を刺激する
Ｗｎｔ標的遺伝子を別の生物学的系において同定した。本報告に関連することは、サイクリンＤ１が直腸癌細胞におけるＷｎｔ／β−カテニン／ＴＣＦ標的遺伝子であると報告されているとの発見である（Tetsu and McCormick, 1999）。さらに、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ１トランスジェニックマウスに生じる乳腺腫瘍には、高レベルのサイクリンＤ２が存在し、サイクリンＤ２は乳腺におけるＷｎｔ１標的であり得ることを示唆する（Yu et al., 2001）。
【００８４】
簡単に説明すると、ＷＣＬはＨＣ１１、Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−発現ＨＣ１１細胞から調製し、市販入手可能なサイクリンＤ１（ノバカストラ（NovaCastra））またはサイクリンＤ２（サンタクルツ）に対する抗体を用いて、本質的に上記のとおりに、その５０μｇを免疫ブロットした。Ｗｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞の両方が、ＨＣ１１細胞に比較して高レベルのサイクリンＤ１を発現する。さらに、Ｗｎｔ１−ＨＣ１１細胞はサイクリンＤ２を発現するが、Ｃ−またはＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞は発現しない。
【００８５】
また、Ｃ−ＨＣ１１細胞を６時間、Ｗｎｔ−ＨＣ１１細胞からのＣＭにより処理した。ＷＣＬを調製し、その５０μｇをサイクリンＤ１またはサイクリンＤ２について免疫ブロットした。Ｗｎｔ−ＨＣ１１細胞株での結果と同様、両方のＷｎｔ（ＣＭ）はサイクリンＤ１の発現を刺激したが、一方、Ｗｎｔ１のみはサイクリンＤ２レベルを上昇させた。
【００８６】
サイクリンＤ１およびサイクリンＤ２の発現に対するＷｎｔ−トランス活性化ＥｒｂＢ１の寄与を評価するために、Ｃ−およびＷｎｔ−ＨＣ１１細胞をＰＫＩ１６６またはＣＧＳ２７０２３ＡまたはＥＧＦにより６時間処置した。ＰＫＩ１６６処置はＷｎｔ１−およびＷｎｔ５ａ−ＨＣ１１細胞の両方において、サイクリンＤ１を対照のレベルまで低下させたが、これはＥｒｂＢ１がサイクリンＤ１レベルを上昇させていることを示唆している。これらの結果は、対照細胞においてサイクリンＤ１の発現を刺激するＥＧＦの能力によって確証された。対照的に、ＥｒｂＢ１インヒビターはサイクリンＤ２レベルに対して影響しなかった。メタロプロテイナーゼインヒビターにより処理したＷｎｔ−ＨＣ１１細胞は、サイクリンＤ１の発現を低下させるが、サイクリンＤ２には影響しない。したがって、サイクリンＤ１とサイクリンＤ２は異なる制御を受けている。Ｗｎｔ１およびＷｎｔ５ａの両方がＥｒｂＢ１をトランス活性化し、サイクリンＤ１の発現を増加させる；対照的に、サイクリンＤ２はＷｎｔ１発現細胞において上昇するだけで、これはＥｒｂＢ１の活性から独立している。
【００８７】
要約すると、本発明はＥｒｂＢ１が乳腺上皮細胞においてＷｎｔ１およびＷｎｔ５ａによりトランス活性化されることを示す。このレセプターをトランス活性化するＷｎｔタンパク質の能力はこれまでに記載されたことがない。トランス活性化されたＥｒｂＢ１は乳腺細胞において他とまったく異なる作用を示す、すなわち、サイクリンＤ１発現の増大に関与する。対照的に、Ｗｎｔ１はＥｒｂＢ１とは独立した様式でサイクリンＤ２発現を刺激する。
【００８８】
上記実施例は、異常なＷｎｔの発現がＥｒｂＢ１の活性を増大させることにより乳癌の悪性化に関わっていることを示唆する。したがって、Ｗｎｔのレセプターと反応するＷｎｔの能力を阻害するように設計された治療薬は、ＥｒｂＢシグナル伝達をダウンレギュレーションするさらなる手段を提供し、それによって特定の乳癌においてＥｒｂＢ１を発現する癌の悪性化に影響を与えることができる。
上記に引用した出版物は、すべてそれぞれに個々に言及したとものとして、参照により本発明の一部とする。
【国際調査報告】
2006516950.tif 000004
2006516950.tif 000005
2006516950.tif 000006