(57)【要約】本発明は、ケモカイン、インターロイキン−８（ＩＬ−８）により介在される病態の治療に有用な、式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）で示される新規化合物およびその組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７−クロロ−３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−クロロ−５−（メチルオキシ）−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド
７−クロロ−Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
７−クロロ−３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−クロロ−３−（シクロペンチルアミノ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−クロロ−３−［（２，３−ジクロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−ブロモフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−ニトロ−３−｛［２−（フェニルオキシ）フェニル］アミノ｝−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−クロロ−３−フルオロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
からなる群から選択される化合物。
【請求項２】
請求項１の記載の化合物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３】
哺乳類の、ケモカインがＩＬ−８ａまたはｂ受容体に結合する、ケモカイン介在疾患の治療方法であって、該哺乳類に、有効量の請求項１記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項４】
哺乳類が、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎（骨またはリウマチ様）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、卒中、敗血性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌敗血症、毒性ショック症候群、心臓および腎臓再潅流傷害、糸球体腎炎、血栓症、移植片対宿主反応、アルツハイマー病、同種移植拒絶反応、マラリア、再狭窄、血管新生、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、歯肉炎、ウイルス性疾患、例えばライノウイルスおよび望ましくない造血幹細胞放出からなる群から選択される、ケモカイン介在疾患を患っている、請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規スルホンアミド置換ジフェニル尿素化合物、医薬組成物、その製造法およびＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８介在疾患の治療におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
インターロイキン−８（ＩＬ−８）に対しては様々な名称、例えば好中球誘引／活性化タンパク質−１（ＮＡＰ−１）、単球由来好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）、好中球活性化因子（ＮＡＦ）およびＴ−細胞リンパ球走化性因子が用いられている。インターロイキン−８は、好中球、好塩基球およびＴ−細胞のサブセットに対する化学誘引物質である。これは、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたはＬＰＳに曝露されたマクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞を含むほとんどの有核細胞により、およびＬＰＳまたはＦＭＬＰのような走化性因子に曝露された場合に好中球自体により産生される。M. Baggiolini et al.,  J. Clin. Invest. 84, 1045 (1989); J. Schroder et al,  J. Immunol. 139, 3474 (1987)およびJ. Immunol. 144, 2223 (1990) ; Strieter, et al.,  Science 243, 1467 (1989)およびJ. Biol. Chem. 264, 10621 (1989); Cassatella et al.,  J. Immunol. 148, 3216 (1992)。
【０００３】
また、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、ケモカインファミリーに属する。ＩＬ−８と同様に、これらのケモカインも異なる名称により示されてきた。例えば、ＧＲＯα、β、γが、それぞれ、ＭＧＳＡα、βおよびγ（黒色腫増殖刺激活性）を意味している。Richmond et al., J. cell Physiology 129, 375 (1986)およびChang et al., J. Immunol 148, 451 (1992)を参照。ＣＸＣモチーフの直前にＥＬＲモチーフを有するαファミリーのケモカインはすべてＩＬ−８Ｂ受容体（ＣＸＣＲ２）に結合する。
【０００４】
ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２およびＥＮＡ−７８は、インビトロで多くの機能を刺激する。これらはすべて好中球に対して化学誘引性を有することが示されたが、ＩＬ−８およびＧＲＯαは、Ｔ−リンパ球および好塩基球走化性活性が示された。加えて、ＩＬ−８は正常な個体およびアトピー性個体由来の両方の好塩基球からのヒスタミン放出を誘発しうる。加えて、ＧＲＯ−αおよびＩＬ−８は、好中球からのリソソーム酵素放出および呼吸バーストを誘発しうる。また、ＩＬ−８は、新たにタンパク質を合成することなく、好中球上でのＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）の表面発現を増加させることが示された。このことは、好中球が血管内皮細胞に付着することを増加させる一因になりうる。多くの既知の疾患が、大量の好中球浸潤により特徴付けられる。ＩＬ−８、Ｇｒｏα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、好中球の蓄積および活性化を促進するので、これらのケモカインは、乾癬および関節リウマチを含む広範囲に及ぶ急性および慢性炎症性障害と関係付けられてきた。Baggiolini et al., FEBS Lett. 307, 97 (1992) ；Miller et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 17 (1992)；Oppenheim et al., Annu. Rev. Immunol. 9, 617 (1991); Seitz et al., J. Clin. Invest. 87, 463 (1991) ；Miller et al., Am. Rev. Respir. Dis. 146, 427 (1992)；Donnely et al., Lancet 341, 643 (1993)。加えて、ＥＬＲケモカイン（ＣＸＣモチーフの直前にアミノ酸ＥＬＲモチーフを含有するもの）はまた、血管形成とも関連付けられてきた。Strieter et al., Science 258, 1798 (1992)。
【０００５】
インビトロで、ＩＬ−８、Ｇｒｏα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２は、７回膜貫通型Ｇ−タンパク質結合ファミリーの受容体と、特に、ＩＬ−８受容体、最も顕著には、ＩＬ−８ｂ受容体（ＣＳＣＲ２）と結合してそれを活性化することにより、好中球形状変化、走化性、顆粒放出および呼吸バーストを誘発する。Thomas et al.,  J. Biol. Chem. 266, 14839 (1991)；およびHolmes et al., Science 253, 1278 (1991)。この受容体ファミリーのメンバーに対する非ペプチド性小型分子アンタゴニストの開発が進められてきた。総説については、R. Freidinger in:  Progress in Drug Research, Vol. 40, pp. 33-98, Birkhauser Verlag, Basel 1993.  Henceを参照。ＩＬ−８受容体は新規抗炎症剤の開発のための有望な標的である。
【０００６】
２つの高親和性ヒトＩＬ−８受容体（７７％相同性）が特徴付けられている：ＩＬ−８Ｒａは、ＩＬ−８のみと高親和性で結合し、ＩＬ−８ＲｂはＩＬ−８に対して高親和性で結合し、ならびにＧＲＯ−α、ＧＲＯβ、ＧＲＯγおよびＮＡＰ−２に関しても同様である。Holmes et al., supra; Murphy et al., Science 253, 1280 (1991)；Lee et al., J. Biol. Chem. 267, 16283 (1992) ； LaRosa et al., J. Biol. Chem. 267, 25402 (1992) ；およびGayle et al., J. Biol. Chem. 268, 7283 (1993)を参照。
【０００７】
当該分野において、ＩＬ−８ａまたはｂ受容体に結合することができる化合物に対する処理が依然として必要とされている。したがって、ＩＬ−８産生の増加（好中球およびＴ−細胞サブセットの炎症部位への走化性に関与する）に付随する症状は、ＩＬ−８受容体結合の阻害剤である化合物により恩恵が得られるだろう。
【０００８】
発明の概要
本発明は、ケモカインがＩＬ−８ａまたはｂ受容体に結合するものである、ケモカイン介在疾患の治療方法であって、有効量の置換３−フェニルアミノ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシドの下記群：
７−クロロ−３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−クロロ−３−（シクロペンチルアミノ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−クロロ−３−［（２，３−ジクロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−ブロモフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−ニトロ−３−｛［２−（フェニルオキシ）フェニル］アミノ｝−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
３−［（２−クロロ−３−フルオロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
から選択される化合物およびその医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
合成実施例
実施例１
【化１】
2006527201.tif 000002
７−クロロ−３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
１）  ４−クロロ−２−（メチルオキシ）アニリン
エタノール（１００ｍｌ）中の２−ニトロ−５−クロロアニソール（７．００ｇ）、亜鉛粉（１２．５ｇ）および酢酸（７．８ｍｌ）の懸濁液を、３０〜６０分間還流した。ついで、懸濁液をセライトにより濾過し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を濃縮して、灰色固体を得、これを酢酸エチル（２５０ｍｌ）に再び溶解させ、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液溶液で洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させて、標題化合物を褐色油として得た（４．６５ｇ、８０％）。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ１５８（Ｍ＋Ｈ）。
【００１０】
１ｂ）  ７−クロロ−５−（メチルオキシ）−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド
ニトロプロパン（５ｍＬ）中の４−クロロ−２−（メチルオキシ）アニリン（４．６５ｇ）の溶液を、ニトロプロパン（４５ｍＬ）中のクロロスルホニルイソシアネート（３．１６ｍＬ）の溶液に、−４０℃で、５分間加えた。反応混合物を、０℃まで加温した。塩化アルミニウム（４．９４ｇ）を一度に加え、透明な溶液が得られた。反応混合物を１１０℃に２０分間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を氷水混合物に注いだ。沈殿を濾過し、水で洗浄し、減圧下で乾燥して、褐色油を得た（４．０ｇ、５２％）。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ２６３（Ｍ＋Ｈ）。
【００１１】
１ｃ）  ７−クロロ−Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
無水トリフリック酸（１．１９ｍｌ）を、ジクロロメタン（１５ｍｌ）中の７−クロロ−５−（メチルオキシ）−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（７４０ｍｇ）およびピリジン（０．８２ｍｌ）の溶液に、−７８℃で加えた。反応混合物を１．５時間この温度で撹拌し、ついで、塩化アンモニウム水溶液（５ｍｌ）でクエンチした。室温に加温した後、水相を、塩化メチレン（３×１５ｍｌ）で抽出した。合した有機相を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮して、アミドイルトリフラートを得た（０．８６ｇ、５６％）。
【００１２】
得られたアミドイルトリフラート（２５０ｍｇ）を、塩化メチレン（１５ｍｌ）中に溶解した。２−クロロアニリン（０．２０ｍｌ）を−７８℃で加えた。溶液を室温に一晩加温した。反応混合物を、ジクロロメタン（４０ｍｌ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）で洗浄した。水相を、ジクロロメタン（２×４０ｍｌ）で抽出した。合した有機抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で蒸発させた。残渣をＤＭＳＯ（１．５ｍｌ）中の溶解し、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣにより精製して、標題化合物（１５６ｍｇ、６３％）を得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ３７２（Ｍ＋Ｈ）。
【００１３】
１ｄ）  ７−クロロ−３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
７−クロロ−Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド（１３０ｍｇ）を、塩化メチレン（１０ｍｌ）に溶解した。ＢＢｒ３（１ｍｌ）を加えた。反応混合物を、６時間還流した。ＬＣＭＳは、出発物質が残っていないことを示した。反応混合物を、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣにより精製して、標題化合物（９１ｍｇ、７２％）を得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ３５８（Ｍ＋Ｈ）。
【００１４】
実施例２
【化２】
2006527201.tif 000003
７−クロロ−３−（シクロペンチルアミノ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
実施例１ｃ）および１ｄ）に記載の一般方法に従って、７−クロロ−５−（メチルオキシ）−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（２５０ｍｇ）を、シクロペンチルアミン（１６３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）で処理し、ついで、保護基を、トリブロモボランで除去して、標題生成物を得た（１２２ｍｇ）（６０％）。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：７．１５（１Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｓ），４．２１（１Ｈ，ｍ），２．０８（２Ｈ，ｍ），１．７２（４Ｈ，ｍ），１．５３（２Ｈ，ｍ）。
【００１５】
実施例３
【化３】
2006527201.tif 000004
７−クロロ−３−［（２，３−ジクロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
実施例１ｃ）および１ｄ）の一般方法に従って、７−クロロ−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（７４０ｍｇ、２．８２ｍｍｏｌ）を、無水トリフリック酸（１．９９１ｇ、７．０６ｍｍｏｌ）で処理して、粗アミドイルトリフラート（０．８６ｇ）を得た。ついで、この粗物質（３１６ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を、２，３−ジクロロアニリン（２６０ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ）と反応させ、ついで、保護基をトリブロモボランで除去して、標題生成物（１３０ｍｇ）（４１％）を得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ３９３（Ｍ＋Ｈ）。
【００１６】
実施例４
【化４】
2006527201.tif 000005
３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
４ａ）  ５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド
実施例１ｂ）の一般方法に従って、２−メチルオキシ−４−ニトロアニリン（４．９７ｇ）を、ニトロエタン（４５ｍｌ）中のクロロスルホニルイソシアネート（３．１７ｍｌ）で、−１０℃で１０分間処理した。この系内で、塩化アルミニウム（５ｇ）で環化させて、所望の生成物を得た（４．９ｇ、６０％）。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ２７４（Ｍ＋Ｈ）。
【００１７】
４ｂ）  Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
実施例１ｃ）の一般方法に従って、５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（７０ｍｇ）を、無水トリフリック酸（０．１３ｍＬ）で処理し、ついで、２−クロロアニリン（０．０３４ｍｌ）と反応させて、標題化合物（３３ｍｇ、３３％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：８．２７（１Ｈ，ｓ），８．１６（１Ｈ，ｄ），７．９９（１Ｈ，ｓ），７．４９（１Ｈ，ｄ），７．３６（１Ｈ，ｄｄ），７．１８（１Ｈ，ｄｄ），４．１７（３Ｈ，ｓ）。
【００１８】
４ｃ）  ３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド（１２０ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（３ｍｌ）中に溶解した。ＬｉＣｌ（６０ｍｇ）を加えた。反応混合物を、１５０℃で８時間加熱した。ＬＣＭＣは、出発物質が残っていないことを示した。室温に冷却した後、ＬｉＣｌを濾過した。濾液を、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣにより精製して、標題化合物（９２ｍｇ、８０％）を得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ３８３（Ｍ＋Ｈ）。
【００１９】
実施例５
【化５】
2006527201.tif 000006
３−［（２−ブロモフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
実施例１ｃ）および４ｃ）に記載の方法に従って、５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（１００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を、２−ブロモアニリン（１８８ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）で処理し、ついで、保護基をＬｉＣｌで除去して、標題生成物（２２ｍｇ）（１５％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ：９．３１（１Ｈ，ｓ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．７７（２Ｈ，ｍ），７．７１（１Ｈ，ｄ），７．４４（１Ｈ，ｔ），７．２１（１Ｈ，ｔ）。
【００２０】
実施例６
【化６】
2006527201.tif 000007
７−ニトロ−３−｛［２−（フェニルオキシ）フェニル］アミノ｝−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
実施例１ｃ）および４ｃ）に記載の一般方法に従って、５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（６２３ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を、２−フェノキシアニリン（８４２ｍｇ、４．５４ｍｍｏｌ）で処理し、ついで、保護基をＬｉＣｌで除去して、標題生成物（１２２ｍｇ）（１３％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ：９．６８（１Ｈ，ｓ），８．１６（１Ｈ，ｄ），７．９３（１Ｈ，ｓ），７．８１（１Ｈ，ｂｒ），７．４１（１Ｈ，ｔ），７．２６−７．０９（３Ｈ，ｍ），７．０８（２Ｈ，ｄ），６．８６（１Ｈ，ｄ）。
【００２１】
実施例７
【化７】
2006527201.tif 000008
３−［（２−クロロ−３−フルオロフェニル）アミノ］−７−ニトロ−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
実施例１ｃ）および４ｃ）に記載の一般方法に従って、５−（メチルオキシ）−７−ニトロ−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシド（５００ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ）を、２−クロロ−３−フルオロ−アニリン（５３２ｍｇ、３．６４ｍｍｏｌ）で処理し、ついで、保護基をＬｉＣｌで除去して、標題生成物（２５０ｍｇ）（３５％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：８．０４（１Ｈ，ｓ），７．８７（１Ｈ，ｄ），７．７１（１Ｈ，ｓ），７．２４（１Ｈ，ｍ），７．０３（１Ｈ，ｍ），２．８６（１Ｈ，ｓ）。
【００２２】
実施例８
【化８】
2006527201.tif 000009
３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
８ａ）  Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド
実施例１ｂ）および１ｃ）に記載の一般方法に従って、２−メチルオキシアニリン（３６．４ｇ、２９．５５ｍｍｏｌ）を、クロロスルホニルイソシアネート（５．１６ｇ、３６．４５ｍｍｏｌ）およびトリクロロアルミニウム（５ｇ、３７．４４ｍｍｏｌ）で処理して、粗５−（メチルオキシ）−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３（４Ｈ）−オン１，１−ジオキシドを得、ついで、２−クロロアニリンと反応させて、標題生成物（３．７６ｇ）（３８％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：８．１３（１Ｈ，ｄ），７．４３（１Ｈ，ｄ），７．３２（４Ｈ，ｍ），７．１１（１Ｈ，ｔ），４．０８（３Ｈ，ｓ）。
【００２３】
８ｂ）  ３−［（２−クロロフェニル）アミノ］−４Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−５−オール１，１−ジオキシド
実施例４ｃ）に記載の一般方法に従って、Ｎ−（２−クロロフェニル）−５−（メチルオキシ）−２Ｈ−１，２，４−ベンゾチアジアジン−３−アミン１，１−ジオキシド（０．５ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を、塩化リチウム（０．５ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）で処理して、標題化合物（２４７ｍｇ）（５２％）を得た。１ＨＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ：８．１３（１Ｈ，ｄ），７．４３（１Ｈ，ｄ），７．３２（１Ｈ，ｔ），７．２１（１Ｈ，ｄ），７．１７（２Ｈ，ｔ），７．０６（１Ｈ，ｄ）。
【００２４】
治療方法
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩は、ヒトまたは他の哺乳類における、かかる哺乳類の細胞、例えば、限定するものではないが、単球および／またはマクロファージ、またはＩ型受容体もしくはＩＩ型受容体とも称されるＩＬ−８ａ受容体もしくはｂ受容体に結合する他のケモカインによる過剰または未制御のＩＬ−８サイトカイン産生により悪化するかまたは引き起こされる病態の予防または治療的処置用の医薬の製造において用いることができる。
【００２５】
したがって、本発明は、ケモカインがＩＬ−８αまたはβ受容体に結合するケモカイン介在疾患の治療方法であって、有効量の式（Ｉ）で示される化合物または医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。特に、ケモカインは、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８である。
【００２６】
式（Ｉ）で示される化合物は、サイトカイン機能、特に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を阻害して、生理学的機能を正常なレベルまたは場合によっては正常下レベルに生物学的にダウンレギュレートして病態を改善するのに十分な量で投与される。例えば、本発明に関するＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の異常なレベルとは、（ｉ）１ピコグラム／ｍＬ以上の遊離ＩＬ−８のレベル；（ｉｉ）正常な生理学的レベルより高いいずれかの細胞性ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８；または（ｉｉｉ）ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８を各々産生する細胞または組織における基底レベル以上のＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８の存在である。
【００２７】
式（Ｉ）で示される化合物は、一般的には、ＷＯ９６／２５１５７およびＷＯ９７／２９７４３（出典明示により本明細書に組み入れる）に記載されている化合物よりもより長いｔ１／２および改善された経口生物学的利用能を有することが示されている。
【００２８】
過剰または非制御ＩＬ−８産生が、疾患の悪化および／または発生に関与している多くの病態がある。ケモカイン介在疾患は、乾癬、アトピー性皮膚炎、関節炎（骨関節炎または関節リウマチ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、卒中、敗血性ショック、内毒素性ショック、グラム陰性菌敗血症、毒性ショック症候群、心臓性および腎性再潅流傷害、糸球体腎炎、血栓症、移植片対宿主反応、アルツハイマー病、同種移植拒絶反応、マラリア、再狭窄、血管形成、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、歯肉炎、ウイルス性疾患、例えば、ライノウイルスまたは望ましくない造血幹細胞放出を含む。
【００２９】
これらの疾患は、主に、大量の好中球浸潤、Ｔ細胞浸潤または新生血管成長により特徴付けられ、好中球の炎症部位への走化性または内皮細胞の定方向増殖を引き起こすＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８産生の増加に付随する。他の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦおよびＩＬ−６）とは対照的に、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、好中球走化性、限定するものではないがエラスターゼ放出を包含する酵素放出ならびにスーパーオキシド産生および活性化を促進する独特の性質を有する。ＩＬ−８Ｉ型またはＩＩ型受容体を介して作用するα−ケモカイン、特に、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８は、内皮細胞の定方向増殖を促進することにより腫瘍の新生血管形成を促進することができる。したがって、ＩＬ−８誘発性走化性または活性化の阻害は、好中球浸潤を直接的に減少させる。
【００３０】
最近の証拠は、また、ＨＩＶ感染症の治療におけるケモカインの役割を示している。Littleman et al., Nature 381, pp. 661 (1996)およびKoup et al., Nature 381, pp. 667 (1996)。
【００３１】
また、最近の証拠は、アテローム性動脈硬化症の治療におけるＩＬ−８阻害剤の使用を示している。第１の文献、Boisvert et al., J. Clin. Invest, 1998, 101:353-363は、骨髄移植を介して、幹細胞（および、したがって、単球／マクロファージ）上にＩＬ−８受容体が存在しないことがＬＤＬ受容体欠損マウスにおいてアテローム性硬化性斑の進行を減少させることを証明している。さらなる支持文献には以下のものがある：Apostolopoulos, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1996, 16:1007-1012；Liu, et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 1997, 17:317-323；Rus, et al., アテローム性動脈硬化症. 1996, 127:263-271；Wang et al., J. Biol. Chem. 1996, 271:8837-8842；Yue, et al., Eur. J. Pharmacol. 1993, 240:81-84；Koch, et al., Am. J. Pathol., 1993, 142:1423-1431；Lee, et al., Immunol. Lett., 1996, 53, 109-113；およびTerkeltaub et al., Arterioscler. Thromb., 1994, 14:47-53。
【００３２】
また、本発明は、式（Ｉ）で示されるケモカイン受容体アンタゴニスト化合物による、ＣＮＳ損傷の急性発症における治療方法、およびＣＮＳ損傷に罹患し易いと考えられる個体における予防方法を提供する。
【００３３】
本明細書で定義されるＣＮＳ損傷は、手術によるような開放性もしくは穿通性頭部外傷、または頭部への損傷によるような非開放性頭部外傷の両方を含む。また、特に、脳領域の虚血性発作もまたこの定義に含まれる。
【００３４】
虚血性卒中は、通常、血管の塞栓、血栓または局所性アテローム性閉鎖の結果として、特定の脳領域への不十分な血液供給により引き起こされる限局性神経障害であると定義できる。この領域における炎症性サイトカインの役割が明らかになってきており、本発明は、これらの損傷の有効な治療方法を提供する。これらのような急性損傷について利用可能な治療法は比較的少ない。
【００３５】
ＴＮＦ−αは、内皮白血球接着分子発現を含む炎症誘発作用を有するサイトカインである。白血球は虚血性脳病変へ浸潤し、したがって、ＴＮＦのレベルを阻害するかまたは減少させる化合物は、虚血性脳損傷の治療に有用である。Liu et al., Stroke, Vol. 25., No. 7, pp. 1481-88 (1994) （出典明示により本明細書に組み入れる）を参照のこと。
【００３６】
非開放性頭部損傷のモデルおよび５−ＬＯ／ＣＯ混合薬剤での処置は、Shohami et al., J. of Vaisc & Clinical Physiology and Pharmacology, Vol. 3, No. 2, pp. 99-107 (1992) （出典明示により本明細書に組み入れる）において検討されている。浮腫形成を減少させる処置は、これらの治療される動物における機能的結果を改善することが見出された。
【００３７】
式（Ｉ）で示される化合物を、例えば、好中球走化性および活性化の減少により証明されるような、ＩＬ−８ａまたはｂ受容体と結合するＩＬ−８がこれらの受容体と結合するのを阻害するのに十分な量で投与する。式（Ｉ）で示される化合物がＩＬ−８結合の阻害剤であるという知見は、本明細書において記載するインビトロ受容体結合検定における式（Ｉ）で示される化合物の効果に基づいている。式（Ｉ）で示される化合物はＩＬ−８ ＩＩ型受容体の阻害剤であることが明らかにされた。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「ＩＬ−８媒介疾患または病態」なる用語は、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８その物を産生することにより、またはＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８が限定するものではないがＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦなどの別のモノカインを放出させることにより役割を果たす全ての病態を意味する。したがって、例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して悪化または分泌される病態は、ＩＬ−８により媒介される病態であると考えられる。
【００３９】
本明細書において用いる場合、「ケモカイン媒介疾患または病態」なる用語は、ＩＬ−８αまたはβ受容体と結合するケモカイン、例えば、限定するものではないがＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯγ、ＮＡＰ−２またはＥＮＡ−７８などが役割を果たす全ての病態を意味する。これは、ＩＬ−８が、ＩＬ−８その物を産生することにより、またはＩＬ−８が、限定するものではないがＩＬ−１、ＩＬ−６またはＴＮＦ等の別のモノカインを放出させることにより役割を果たす病態を含む。したがって、例えば、ＩＬ−１が主成分であり、その産生または作用がＩＬ−８に応答して悪化または分泌される病態は、ＩＬ−８により媒介される病態であると考えられる。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「サイトカイン」なる用語は、細胞の機能に影響を与え、免疫、炎症または造血応答における細胞間の相互作用を調節する分子である分泌ポリペプチドを意味する。サイトカインは、限定するものではないが、どの細胞が産生するかにかかわらず、モノカインおよびリンホカインを含む。例えば、モノカインは、一般に、単核細胞、例えば、マクロファージおよび／または単球により産生および分泌されるものをいう。しかしながら、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳星状細胞、骨髄ストローマ細胞、表皮性ケラチノサイトおよびＢ−リンパ球などの多くの他の細胞もまたモノカインを産生する。リンホカインは、一般に、リンパ球により産生されるものをいう。サイトカインの例としては、限定するものではないが、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−β）が挙げられる。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「ケモカイン」なる用語は、上記した「サイトカイン」なる用語と同様に、細胞の機能に影響を与え、免疫、炎症または造血応答における細胞間の相互作用を調節する分子である分泌ポリペプチドを意味する。ケモカインは主に細胞膜貫通を介して分泌され、特定の白血球、好中球、単球、マクロファージ、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、内皮細胞および平滑筋細胞の走化性および活性化を引き起こす。ケモカインの例としては、限定するものではないが、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＩＰ−１０、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−β、ＰＦ４、ならびにＭＣＰ１、２および３が挙げられる。
【００４２】
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を治療において用いるためには、通常、これを標準的な医薬手法に従って医薬組成物に処方する。したがって、また、本発明は、有効で非毒性である量の式（Ｉ）で示される化合物および医薬上許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物に関する。
【００４３】
式（Ｉ）で示される化合物、その医薬上許容される塩およびこれを配合した医薬組成物は、好都合には、薬剤投与に慣用的に用いられる経路のいずれか、例えば、経口、局所、非経口または吸入によって投与される。式（Ｉ）で示される化合物は、それを慣用的な方法に従って標準的医薬担体と組み合わせることにより調製される慣用的な投与剤形で投与される。式（Ｉ）で示される化合物は、また、公知の第２の治療上活性な化合物と組合せて慣用的な投与形態で投与することができる。これらの方法は、成分を、所望の調製物に適するように、混合し、造粒し、ついで、圧縮または溶解させることからなる。医薬上許容される担体または希釈剤の形態および特性は、組合せる有効成分の量、投与経路および他のよく知られている要因に依存すると考えられる。担体は、他の処方成分と適合し、レシピエントに有害でないという意味で「許容され」なければならない。
【００４４】
用いられる医薬担体は、例えば、固体または液体のいずれでもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、シュークロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液体担体の例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、水などである。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの当該分野で公知の遅延性物質を単独でまたはワックスと共に含んでもよい。
【００４５】
広範囲に及ぶ医薬形態を用いることができる。したがって、固体担体を用いる場合、製剤は、錠剤にしたり、粉末またはペレット形態でハードゼラチンカプセル中に入れたり、トローチまたはロゼンジの形態にすることができる。固体担体の量は、広範囲に及ぶが、好ましくは、約２５ｍｇ〜約１ｇである。液体担体を用いる場合、製剤は、シロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、滅菌注射液、例えば、アンプルまたは非水性液体懸濁液の形態にされる。
【００４６】
式（Ｉ）で示される化合物は、局所的に、すなわち、非全身性投与により投与される。これは、式（Ｉ）で示される化合物の表皮へまたは口腔内への外用、およびかかる化合物の耳、目および鼻への滴下注入を含み、化合物が著しく血流に入らないようにする。これに対して、全身性投与は、経口、静脈内、腹腔内および筋肉内投与を意味する。
【００４７】
局所投与に適した処方は、皮膚を通して炎症部位へ浸透するのに適した液体または半液体製剤、例えば、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏またはペースト、および目、耳または鼻への投与に適した滴剤を含む。有効成分は、局所投与の場合、処方物の０．００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％〜２重量％を含む。しかしながら、それを処方物の１０％ｗ／ｗほども含んでもよいが、好ましくは、５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは、０．１％〜１％ｗ／ｗ含む。
【００４８】
本発明のローションは、皮膚または目への適用に適したものを含む。眼ローションは、所望により殺菌剤を含んでもよい無菌水溶液を含み、滴剤の調製法と類似の方法により調製される。皮膚へ適用するためのローションまたは塗布剤は、また、アルコールまたはアセトンなどの皮膚の乾燥を促進し、冷却する薬剤および／またはグリセロールなどの保湿剤またはヒマシ油もしくは落花生油などの油を含んでもよい。
【００４９】
本発明のクリーム、軟膏またはペーストは、外用のための有効成分を含む半固体処方物である。これらは、有効成分を微粉末または粉末形態で、単独または水性または非水性流体中溶液または懸濁液の形態で、適当な機械を用いて、グリース状または非グリース状基剤と混練することにより調製される。基剤は、炭化水素、例えば、固型、軟または流動パラフィン、グリセロール、ミツロウ、金属石鹸；漿剤；扁桃油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油などの天然起源の油；羊毛脂もしくはその誘導体またはステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸などをアルコール、例えば、プロピレングリコールまたはマクロゲルとともに含んでもよい。処方物は、いずれの適当な界面活性剤、例えば、アニオン、カチオンまたは非イオン性界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体を配合してもよい。懸濁化剤、例えば、天然ガム、セルロース誘導体または無機物質、例えば、ケイ酸質シリカ（silicaceous silicas）および他の成分、例えばラノリンを含んでいてもよい。
【００５０】
本発明の滴剤は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでいてもよく、有効成分を殺菌剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存剤の適当な水溶液に溶かし、好ましくは、界面活性剤を配合することにより調製される。ついで、得られた溶液を濾過により清澄化し、適当な容器に移し、ついで、これを密封し、オートクレーブ処理または９８〜１００℃に半時間維持することにより滅菌する。別法として、溶液を濾過滅菌し、無菌技法により容器に移す。滴剤に配合するのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒としては、グリセロール、希アルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
【００５１】
式（Ｉ）で示される化合物は、非経口的、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、直腸内、膣内または腹腔内投与により投与される。皮下および筋肉内形態の非経口投与が一般に好ましい。かかる投与に適する投与剤形は慣用技術により調製される。式（Ｉ）で示される化合物は、また、吸入、すなわち、鼻内または経口吸入投与によっても投与することができる。エアゾール処方物または定量型吸入器などのかかる投与に適した投与形態は、慣用的な技術により調製される。
【００５２】
式（Ｉ）で示される化合物に関して本明細書に記載したあらゆる使用法に関して、１日の経口投与量は、好ましくは、全体重１ｋｇあたり約０．０１〜約８０ｍｇである。１日の非経口投与量は、全体重１ｋｇあたり約０．００１〜約８０ｍｇである。１日の局所投与量は、好ましくは、０．１ｍｇ〜１５０ｍｇであり、１日に１〜４回、好ましくは、２または３回投与する。１日の吸入量は、好ましくは、１日に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇである。式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の最適量および個々の投与間隔は、治療する症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療する個々の患者により決定されること、およびこのような最適値は慣用技術により決定できることも当業者には理解できるであろう。また、最適な治療単位、すなわち、特定の日数の間、１日につき投与される式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の投与回数は、慣用的な治療単位決定試験を用いて当業者により確認できることも、当業者には理解できるであろう。
【００５３】
単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない以下の生物学的実施例を引用して本発明を記載する。
【００５４】
生物学的実施例
本発明の化合物のＩＬ−８、およびＧｒｏ−αケモカイン阻害効果を以下のインビトロ検定により測定した：
受容体結合検定：
比活性が２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである[125Ｉ]ＩＬ−８（ヒト組換体）をイリノイ州アーリントン・ハイツのアマシャム・コーポレイション（Amersham Corp.）から入手した。Ｇｒｏ−αをエヌイーエヌ−ニュー・イングランド・ニュークリア（NEN-New England Nuclear）から入手した。他の薬品はすべて分析用であった。すでに開示されているようにして（Holmes et al., Science, 1991, 253, 1278）、高レベルの組換えヒトＩＬ−８αおよびβ型受容体を、個別に、チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現させた。すでに開示されているプロトコル（Haour et al., J. Biol. Chem., 249, pp 2195−2205 (1974)）に従って、チャイニーズハムスター卵巣膜をホモジナイズした。ただし、ホモジナイゼーション緩衝液を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１ｍＭのＰＭＳＦ（α−トルエンスルホニルフルオリド）、０．５ｍｇ／Ｌのロイペプチン、ｐＨ７．５に変更した。膜タンパク質濃度を、ピアス・カンパニー（Pierce Co.）のミクロ検定キットを用いて、ウシ血清アルブミンを標準として用いて測定した。すべての検定は、９６−ウェルマイクロプレートフォーマットで行った。各反応混合物は、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＮａＣｌおよび０．０３％のＣＨＡＰＳを含有する２０ｍＭのビス−トリスプロパンおよび０．４ｍＭのＴｒｉｓのＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中１２５Ｉ ＩＬ−８（０．２５ｎＭ）または125Ｉ Ｇｒｏ−αおよび０．５μｇ／ｍＬのＩＬ−８Ｒαまたは１．０μｇ／ｍＬのＩＬ−８Ｒβ膜を含有した。加えて、あらかじめＤＭＳＯに溶解させて最終濃度を０．０１ｎＭ〜１００ｕＭにした目的の薬物または化合物を添加した。検定を、125Ｉ−ＩＬ−８の添加により開始した。室温で１時間後、Ｔｏｍｔｅｃ ９６−ウェルハーベスターを用いて１％ポリエチレンイミン／０．５％のＢＳＡでブロックしたガラス繊維フィルターマット上にてプレートを収穫し、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓのＨＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＣＨＡＰＳ（Ｈ７．４）で３回洗浄した。ついで、フィルターを乾燥させ、Ｂｅｔａｐｌａｔｅ液体シンチレーションカウンターで計数した。組換えＩＬ−８ＲαまたはＩ型受容体は、また、本明細書において非許容受容体とも称され、組換えＩＬ−８ＲβまたはＩＩ型受容体は許容受容体と称される。
【００５５】
式（Ｉ）で示される代表的化合物、実施例１〜１０６は、本アッセイで、ＩＣ５０レベルが３０μＭ未満の正の阻害活性を示した。
【００５６】
走化性検定
Current Protocols in Immunology, vol. I, Suppl 1, Unit 6.12.3.（その開示内容は、全体として出典明示により本明細書の一部とする）に記載されているようにして好中球走化性検定法でこれらの化合物のインビトロ阻害特性を測定する。Current Protocols in Immunology Vol. I, Suppl 1 Unit 7.23.1（その開示内容は、全体として出典明示により本明細書の一部とする）に開示されているようにしてヒト血液から好中球を単離する。化学誘引物質ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γおよびＮＡＰ−２を０．１〜１００ｎＭの濃度で４８マルチウェルチャンバー（メリーランド州キャビン・ジョンのニューロ・プローブ（Neuro Probe））の下部チャンバーに入れる。２つのチャンバーは５μｍポリカーボネートフィルターで隔てられている。本発明の化合物を試験する場合、細胞を上部チャンバーに添加する直前に、該化合物を細胞と混合する（０．００１−１０００ｎＭ）。インキュベーションは、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベータ中にて約３７℃で約４５〜９０分間行う。インキュベーション期間の最後に、ポリカーボネート膜を取り出し、最上部を洗浄し、ついで、該膜を、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｃｋ染色プロトコル（アメリカ合衆国イリノイ州マックゴー・パークのバクスター・プロダクツ（Baxter Products））を用いて染色する。ケモカインに対して走化性を示した細胞を顕微鏡を用いて目視により計数する。一般に、各サンプルについて４つのフィールドを計数し、これらの数を平均して、移動した細胞の平均数を求める。各サンプルを三重に試験し、各化合物を少なくとも４回繰り返し試験する。特定の細胞（正の対照細胞）には化合物を添加せず、これらの細胞は細胞の最大走化性応答を示す。負の対照（刺激しない）が望ましい場合には、下部チャンバーにケモカインを添加しない。正の対照と負の対照との差異は、細胞の走化性活性を表す。
【００５７】
エラスターゼ放出検定：
ヒト好中球からのエラスターゼ放出を防止する能力について本発明の化合物を試験する。Current Protocols in Immunology Vol. I, Suppl 1 Unit 7.23.1.に記載されているようにしてヒト血液から好中球を単離する。リンゲル溶液（ＮａＣｌの１１８、ＫＣｌの４．５６、ＮａＨＣＯ３の２５、ＫＨ２ＰＯ４の１．０３、グルコースの１１．１、ＨＥＰＥＳの５ｍＭ、ｐＨ７．４）中に懸濁したＰＭＮの０．８８×１０６細胞を、５０μｌの容量で９６ウェルプレートの各ウェルに入れる。このプレートに、５０μｌの容量の試験化合物（０．００１〜１０００ｎＭ）、５０μｌ（２０μｇ／ｍｌ）の容量のシトカラシンＢおよび５０μｌの容量のリンゲル緩衝液を添加する。これらの細胞を５分間加温（３７℃、５％のＣＯ2、９５％のＲＨ）した後、最終濃度０．０１〜１０００ｎＭのＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＧＲＯγまたはＮＡＰ−２を添加した。該反応を４５分間進行させた後、９６ウェルプレートを遠心分離し（８００×ｇ、５分）、上清１００ｕｌを取り出した。この上清を第２の９６ウェルプレートに添加し、ついで、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した人工エラスターゼ基質（ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ、カリフォルニア州ラ・ジョラのノヴァ・ビオケム（Nova Biochem））を最終濃度６μｇ／ｍｌになるように添加する。直ちに、プレートを蛍光９６ウェルプレートリーダー（Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ２３５０、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Millipore））に入れ、Nakajima et al., J. Biol Chem 254 4027 (1979) の方法に従って３分間隔でデータを集める。ＰＭＮから放出されたエラスターゼの量を、ＭｅＯＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＡＭＣ分解速度を測定することにより計算する。
【００５８】
ＴＮＦ−α外傷性脳傷害検定
この検定は、ラットにおいて実験的に誘発した側液衝撃外傷性脳傷害（ＴＢＩ）の後に起こる特定の脳領域における腫瘍壊死因子ｍＲＮＡの発現を調べるために行う。成体スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝４２）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、左側頭頭頂皮質上に集中する中度の重篤度（２．４ａｔｍ）の側液衝撃脳傷害（ｎ＝１８）、または「擬似」処置（麻酔、および傷害を伴わない手術、ｎ＝１８）を与えた。傷害の１時間後、６時間後および２４時間後に動物を断頭により屠殺し、脳を取り出し、左（傷害）頭頂皮質（ＬＣ）、対側性右皮質の対応する領域（ＲＣ）、傷害頭頂皮質と隣接する皮質（ＬＡ）、右皮質における対応する隣接領域（ＲＡ）、左海馬（ＬＨ）および右海馬（ＲＨ）の組織試料を調製する。全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション処理し、ＴＮＦ−α正対照ＲＮＡと比較して定量化する（マクロファージ＝１００％）。傷害の１時間後、損傷した半球において、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の著しい増加がＬＨ（正対照の１０４±１７％、擬似処置と比較してｐ＜０．０５）、ＬＣ（１０５±２１％、ｐ＜０．０５）およびＬＡ（６９±８％、ｐ＜０．０１）にて見られる。傷害の６時間後、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現の増加がまたＬＨ（４６±８％、ｐ＜０．０５）、ＬＣ（３０±３％、ｐ＜０．０１）およびＬＡ（３２±３％、ｐ＜０．０１）にて見られ、２４時間後まで続く。対側性半球において、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現は、傷害の１時間後には、ＲＨ（４６±２％、ｐ＜０．０１）、ＲＣ（４±３％）およびＲＡ（２２±８％）において増加し、６時間後にはＲＨ（２８±１１％）、ＲＣ（７±５％）およびＲＡ（２６±６％、ｐ＜０．０５）において増加するが、２４時間後には増加しない。擬似処置（傷害を伴わない手術）またはナイーブ動物においては、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの発現の一貫した変化は、いずれの時点でもいずれの半球における６つの脳領域のいずれにおいても見られない。これらの結果は、側矢状液衝撃脳傷害後、ＴＮＦ−α ｍＲＮＡの一時的発現が、損傷してない半球のものを含めて特定の脳領域において変えられることを示す。ＴＮＦ−αは、神経成長因子（ＮＧＦ）を誘発でき、活性化星状細胞からの他のサイトカインの放出を刺激するので、ＴＮＦ−αの遺伝子発現におけるこの外傷後の変化は、ＣＮＳ外傷に対する急性応答および再生性応答の両方において重要な役割を果たす。
【００５９】
ＩＬ−１β ｍＲＮＡについてのＣＮＳ傷害モデル
この検定は、ラットにおいて実験的側液衝撃外傷性脳傷害（ＴＢＩ）後の特定の脳領域におけるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡの局所的発現を特徴付ける。成体スプレーグ−ドーリーラット（ｎ＝４２）をペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、左側頭頭頂皮質上に集中する中度の重篤度（２．４ ａｔｍ）の側液衝撃脳傷害（ｎ＝１８）、または「擬似」処置（麻酔、および傷害を伴わない手術、ｎ＝１８）を与えた。傷害の１時間後、６時間後および２４時間後に動物を屠殺し、脳を取り出し、左（傷害）頭頂皮質（ＬＣ）、対側性右皮質の対応する領域（ＲＣ）、傷害頭頂皮質と隣接する皮質（ＬＡ）、右皮質における対応する隣接領域（ＲＡ）、左海馬（ＬＨ）および右海馬（ＲＨ）の組織試料を調製する。全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーション処理し、脳組織ＩＬ−１β ｍＲＮＡの量を、同一ゲル上に負荷したＩＬ−１β正マクロファージＲＮＡの相対的な放射能の％として表す。脳傷害の１時間後、損傷した半球において、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現の著しくかつ有意な増加がＬＣ（正対照の２０．０±０．７％、ｎ＝６、擬似処置動物と比較してｐ＜０．０５）、ＬＨ（２４．５±０．９％、ｐ＜０．０５）およびＬＡ（２１．５±３．１％、ｐ＜０．０５）にて見られ、傷害の６時間後まで、ＬＣ（４．０±０．４％、ｎ＝６、ｐ＜０．０５）およびＬＨ（５．０±１．３％、ｐ＜０．０５）にて上昇し続ける。擬似処置またはナイーブ動物においては、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現は、個々の脳領域のいずれにおいても見られない。これらの結果は、ＴＢＩ後、ＩＬ−１β ｍＲＮＡの一時的発現が特定の脳領域において局部的に刺激されることを示す。ＩＬ−１βのようなサイトカインにおけるこれらの局部的変化は、外傷後において役割を果たす。
【００６０】
本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典明示により本明細書の一部とする。
【００６１】
好ましい実施態様を包含する上記記載事項は本発明を十分に開示する。本明細書に具体的に開示した実施態様の変更および改良は特許請求の範囲の範囲内に含まれる。さらに推敲することなく、当業者は上記記載事項を用いて本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、本明細書における実施例は単に例示的であって、如何なる場合も本発明の範囲を制限するものではないと考えられる。排他的性質および優先権を主張する本発明の実施態様は特許請求の範囲に定義するとおりである。
【国際調査報告】
2006527201.tif 000010