(57)【要約】本発明は、試料中の粒子の質または量パラメーターを評価するためのイメージング方法に関し、ここに粒子は、１０６未満の検体検出可能位置を含有する。方法は、１）検体位置および標識剤を結合させることが可能な標的種と、試料を混合し、２）試料を暴露ドメインに並べて、試料からの電磁シグナルを外部へと通過させ、３）該シグナルの表示を、検出要素のアレイに暴露し、ここに、該表示は、線状拡大に付されて、検出要素のアレイ上の線状寸法のイメージ対暴露ドメイン中の元の線状寸法の割合は２０：１より小さく、４）該検出要素によって、強度として表示を検出し、５）強度を処理して、粒子を同定し、次いで６）質または量パラメーターを得ることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの試薬物質と液体物質とを混合し、該試薬物質は、少なくとも、選択的かつ直接的に、検体の種の検体位置および標識剤に結合することが可能な第１の標的種を含み、ここに第１の標的種および標識剤は直接的または間接的にお互いに結合し、
暴露領域を規定する壁部を有する試料区画に、液体物質および試薬物質の混合物の少なくとも一部を含むある容量の液体物質を配置し、該壁部は該区画中の試料からの電磁シグナルを壁から外部へと通り抜けさせ、
試料区画中の試料から壁部を通過した電磁シグナルの表示を、動作中の検出要素のアレイに暴露し、ここに暴露ドメインにおける元の線状寸法に対する検出要素のアレイ上の線状寸法のイメージの割合が２０：１より小さくなるように、該表示は線状拡大に付され、
個々の動作中の検出要素によって、強度として表示を検出し、
バックグラウンドからの電磁シグナルの表示と異なる粒子からの電磁シグナルの表示を同定するために、強度を処理し、次いで、
処理の結果から、少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターを得ることを特徴とする、１ｘ１０６未満の量の検体検出可能位置の検体のうちの少なくとも１つの種に結合しているか、あるいはその中に含まれる粒子を含む液体物質中の粒子の少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターを評価する方法。
【請求項２】
粒子が、細胞、細胞壁、細菌、プラスモジウム、ウィルス、プリオン、またはその断片または集団、および高分子およびビーズから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
粒子が、検体が結合しているビーズである請求項２記載の方法。
【請求項４】
検体が、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、リポ蛋白質、炭水化物−複合蛋白質、膜成分、受容体、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその断片または集団から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５】
検体が、細胞膜または細胞核膜に結合している、例えば、検体が細胞受容体である請求項２ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項６】
検体が細胞中に含まれる請求項２ないし４のいずれか１記載の方法。
【請求項７】
検体がオルガネラの中に含まれる請求項６記載の方法。
【請求項８】
検体がオルガネラの表面に位置している請求項６記載の方法。
【請求項９】
粒子が、５ｘ１０５を下回る量の検体検出可能位置、例えば１ｘ１０５を下回る検体検出可能位置、例えば５ｘ１０４を下回る検体検出可能位置、例えば１ｘ１０４を下回る検体検出可能位置、例えば、５ｘ１０３を下回る検体検出可能位置、例えば、１ｘ１０３を下回る検体検出可能位置、例えば５ｘ１０２を下回る検体検出可能位置、例えば１ｘ１０２を下回る検体検出可能位置、例えば、１０を下回る検体検出可能位置、例えば１または２つの検体検出可能位置の検体のうちの少なくとも１つの種に結合しているか、あるいはその中に含まれる前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１０】
粒子が、それに結合しているか、あるいはその中に含まれる５００および５０，０００の間の検体検出可能位置（集団の平均）、より好ましくは１，０００および１０，０００の間の検体検出可能位置（集団の平均）を有する前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、哺乳類細胞、昆虫細胞、爬虫類細胞、魚細胞、酵母細胞、および真菌細胞から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、血液細胞、精子細胞、および骨髄細胞から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１３】
液体物質が、少なくとも２つの異なる種の粒子を含む前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１４】
粒子の種の１つのみが検体の種に結合しているか、あるいはその中に含まれる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの異なる標的種を少なくとも２つの異なる種の検体に結合させ、少なくとも２つの異なる標的種を２つの異なる標識剤で標識することを特徴とする前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１６】
検体の１つの種が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６１、およびＣＤ９１のようなＣＤ（表面抗原分類）マーカー、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、エストロゲン受容体α（ＥＲα）、ヒトサイトケラチン、サイトケラチン７、サイトケラチン２０、Ｋｉ−６７／ＰＩ、ホスファチジルセリン、ＢＣＬ２  腫瘍性蛋白質、ｓｕＰＡＲ（溶解性ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体）、ウロキナーゼ、受容体に結合したホルモン、細胞周期関連蛋白質、アポトーシスのマーカー、および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１７】
検体の１つの種が、染色体ＤＮＡ配列、ミトコンドリアＤＮＡ配列、葉緑体ＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、ｒＲＮＡ配列、単一のヌクレオチド多型を含むヌクレオチド配列から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１８】
検体の１つの種が、細胞周期関連蛋白質、例えば、サイクリン（例えば、サイクリンＤ１）、腫瘍抑制蛋白質(例えば、ｐ５３蛋白質）、上皮成長因子蛋白質（ＥＧＦ蛋白質）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ１）、Ｋｉ−６７蛋白質である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項１９】
検体が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、サイクリン依存性キナーゼ（例えば、ＣＤＫ４）のような細胞周期関連蛋白質である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項２０】
検体の１つの種が、例えば、膜結合ホスファチジルセリン、アネキシンＶで処理したホスファチジルセリン、ＢＣＬ２  腫瘍性蛋白質といったアポトーシスのマーカーである前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの種の検体が、病気の医学マーカーである前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項２２】
病気が、癌、遺伝病、心臓病、感染病、免疫関連病から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
病気が、乳癌、卵巣癌、上皮癌、白血病、敗血症から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
病気が感染病であり、粒子が、ＨＩＶ、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタイン−バーウィルス、ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）、クラミジアウィルス、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウィルスのようなウィルスから選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
検体が、該ウィルスによって感染された細胞内に位置する抗原である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
検体が、ウィルス中またはウィルス上に位置し、該抗原が、ヌクレオチド配列、外殻蛋白質を含む群から選択される請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
試薬物質が第１標的種を１つ以上含み、該標的種の各々が異なる検体に向けられている前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項２８】
異なる標的種が、液体物質と同時に混合される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
異なる標的種が、液体物質と順次に混合される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
標的種が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および／またはキメラまたは合成抗体から選択された抗体のような検体種に向けられた抗体である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項３１】
標的種が、検体種の配列に対して相補的なヌクレオチドプローブである前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項３２】
ヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびその修飾された類似体を含む群から選択される単量体を含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
標的種が、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）プローブ、好ましくは蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブ（ＦＩＳＨ）である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項３４】
液体物質が、血液、尿、唾液、胆液、精液、糞便、脳脊髄液、鼻分泌、涙、骨髄、および乳のような体液、乳製品、排水、加工水、飲み水、食物、食餌、およびその混合物、希釈物、または抽出物から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項３５】
液体物質が、試料ドメインで並べられる前に前処理されている固体または半固体試料から調製される請求項１ないし３４のいずれか１記載の方法。
【請求項３６】
固体または半固体物質が、筋肉、脳、腎臓、肝臓、脾臓の生検である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
試薬物質が、免疫反応性溶液、組織固定液から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項３８】
試薬物質が、遮断剤（例えばウシ血清アルブミン）、界面活性剤ポリマーまたは界面活性剤共−遮断ポリマー（例えば、プルロニックポリマー）、洗剤、デキストラン、硫酸デキストラン、砂糖、またはそれで出来たポリマー化製品から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項３９】
試薬物質が、Ｔｗｅｅｎ  ２０、および／またはホルムアルデヒド、および／またはエタノール、および／またはメタノール、および／またはアセトン、および／またはピクリン酸またはクエン酸のような固定酸を含む前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４０】
混合物のｐＨが、４ないし１０、例えば４ないし５、５ないし６、６ないし７、７ないし８、８ないし９、９ないし１０である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４１】
ＮａＣｌの濃度が、０.１グラム／Ｌないし５０グラム／Ｌ、例えば０.１ｇ／Ｌないし１ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌないし２ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌないし５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌないし１０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌないし１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌないし３０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌないし４０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌないし５０ｇ／Ｌである前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４２】
ハイブリダイゼーションまたは特異的な結合の間の温度が、１０および９０℃の間、例えば、１０および１５℃の間、１５ないし２０℃、２０ないし２５℃、２５ないし３０℃、３０ないし３５℃、３５ないし４０℃、４０ないし４５℃、４５ないし５０℃、５０ないし６０℃、６０ないし７０℃、７０ないし８０℃、８０ないし９０℃である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４３】
標識剤が、蛍光標識された抗体（例えば、抗−ＣＤ３／ＦＩＴＣ）、反応性分子で標識された抗体（例えば、抗−ＣＤ３／ビオチン）から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４４】
標識剤が、蛍光標識されたヌクレオチドプローブ（例えば、Ｃ−ＭＹＣ  ｃＤＮＡ−ＦＩＴＣ）、反応性分子で標識されたヌクレオチドプローブから選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４５】
さらに、試薬物質が、溶解剤および組織固定剤を含む前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４６】
さらに、試薬物質が、蛍光消光剤、光吸収剤、蛍光増幅剤（例えば、フルオレシル−チラミン、Ｃｙ３−チラミン）を含む前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４７】
液体物質および試薬物質の混合物が、試料区画に並べられる前に希釈される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項４８】
混合物が、少なくとも１：２、例えば、少なくとも１：３、例えば、少なくとも１：４、例えば、少なくとも１：５、例えば、少なくとも１：１０、例えば、少なくとも１：２０、例えば、少なくとも１：１００まで希釈される請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
標識剤が、次の事象：電磁放射の弱化、電磁放射で照射された時の光ルミネセンス、電磁放射の散乱、ラマン散乱の１またはいくつかを生じさせる剤から選択される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５０】
標識剤が、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、（ＲＰＥまたはＰＥ）、シアニン染料（Ｃｙ色素）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、インドトリメチンシアニン、インドペンタメチンシアニン、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ヨウ化エチジウム、７−アミノアクチノマイシン  Ｄ、Ｐｅｒ  ＣＰまたはその化学的に結合された組合せから選択される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
化学的に結合した組合せが、ＲＰＥ−Ｃｙ５、およびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５から選択される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
試料ドメインが三次元的である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５３】
試料ドメインが、チャンバーを介するフローである前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５４】
試料ドメインが、使い捨てカセットの一部である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５５】
イメージの記録が、共焦点スキャナーの使用を含む前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５６】
イメージが、検出機器のアレイを用いて記録される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５７】
イメージが、検出機器の一次元的アレイを用いて記録される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項５８】
イメージが、検出機器の二次元的アレイを用いて記録される前記請求項１ないし５７のいずれか１記載の方法。
【請求項５９】
イメージが、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ビデオカメラまたは光子計数カメラを用いて記録される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項６０】
イメージが拡大なしに記録される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項６１】
拡大率が、１０以下、より好ましくは５以下、例えば４、より好ましくは４以下、例えば２、より好ましくは２以下、例えば１である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項６２】
拡大率が、１以下、好ましくは０．９以下、例えば０．８、より好ましくは０．８以下、例えば０．６、より好ましくは０．６以下、例えば０．５である前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項６３】
イメージが１回の暴露で記録される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項６４】
イメージが、２、３またはそれ以上の暴露で記録される請求項１ないし６２のいずれか１記載の方法。
【請求項６５】
粒子の数の評価が、１を超えるイメージ、好ましくは２つのイメージ、より好ましくは２を超えるイメージ、より好ましくは４を超えるイメージを基準にして入手される請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
そのうちに、イメージにおける変化に関する情報が、粒子の数の評価において使用される請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
記録されたイメージが、データ処理手段を用いて処理される前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項６８】
データ処理手段が、標識剤の部分的に重なる領域を識別する請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
標識剤の少なくとも２つのスペクトル特性の間の識別を用いて、粒子の少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターを入手する前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項７０】
さらに、イメージの記録が、試料の第１の表面からの蛍光シグナルを検出するフォーカス手段の使用によって、試料の第１の表面を、少なくとも第１の光源を有する第１の光源からの励起光で直接的に、少なくとも第１の検出器を含む第１の検出手段に暴露することを特徴とする前記請求項のいずれか１記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも第１の光手段が、試料面に対して平行な第１の光面に位置し、該第１の光面は試料面および第１の検出手段の間にある請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
励起光が、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ガスレーザー、固体レーザー、レーザーダイオード、ガス灯、ハロゲンランプ、キセノンランプの群から選択される光源である請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
励起光フィルターが、少なくとも１つの光源からの励起光路に挿入される前記請求項７０ないし７２のいずれか１記載の方法。
【請求項７４】
励起光が、支持物質上の光源として並べられる請求項７０記載の方法。
【請求項７５】
実質的に同一のフィルターが、全ての光源に対して使用される前記請求項７０ないし７４のいずれか１記載の方法。
【請求項７６】
第１の光源が第１のフィルターを介してフィルターにかけられ、第２の光源が第２のフィルターを介してフィルターにかけられ、第１のフィルターおよび第２のフィルターが異なる請求項７０ないし７５のいずれか１記載の方法。
【請求項７７】
さらに、試料の第２の表面を、少なくとも１つの光源を有する第２の光手段からの励起光で直接的に暴露することを特徴とする前記請求項７０ないし７６のいずれか１記載の方法。
【請求項７８】
第２の励起光手段が、第２の光面に位置し、該面は試料面と平行であり、第１の光面とは他の側の試料面上に位置して、試料を２つの反対の表面に暴露させる請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
第２の光手段から光路に挿入されたフィルターが、第１の光手段の光路に挿入されたフィルターとは異なる請求項７７または７８記載の方法。
【請求項８０】
第２の検出手段が、試料区画が、第１の検出手段および第２の検出手段の間にあるように並べられる請求項７０ないし７９記載の方法。
【請求項８１】
第１の検出手段が、第２の検出手段と同一である請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
発光フィルターが、少なくとも第１の検出器へと、発光路に挿入される前記請求項７０ないし８１のいずれか１記載の方法。
【請求項８３】
コリメータレンズが発光路に並べられる前記請求項７０ないし８２のいずれか１記載の方法。
【請求項８４】
励起主要光および検出−試料軸の間の角度が、検出システムの光軸に対して、０°および９０°の間の範囲であり、より好ましくは０°および６０°の間、例えば１０°および４５°の間である前記請求項７０ないし８３のいずれか１記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも第１の光手段が、試料面に対して平行な第１の光面に位置し、該第１の光面が、検出器の後ろの試料面から少し離れて位置する請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
検出器が、発光シグナルが（複数の）検出器に達するのを可能にする開口を有するハウジング内に置かれる請求項８５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願中に引用される全ての特許および非特許文献は、それらの全文において本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、粒子内または粒子の表面上に含有される１０６未満の検体検出可能位置による粒子のイメージングに基づき、粒子を評価する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
物質または粒子の染色を用いて検出を補助する物質または粒子の検出は、広範に使用されている。しかしながら、多くの物質および粒子は非常に小さいため、染色されていても、非常に高い拡大を用いて、使用する器具に対する必要条件を上げ、一度に検査される試料の容量を減らすことなしには、それらを検出することは困難である。
【０００４】
例えばＣＣＤに粒子を含有する試料の容量をイメージすることに基づくほとんどの粒子検出方法は、粒子への何らかの染色の添加に基づく。細胞の場合、特に一般的なタイプの染色は、細胞に存在するＤＮＡへの結合が可能な染色である。この理由は、細胞中のＤＮＡの豊富さである。ヒト細胞において、各細胞において約３ｘ１０９のＤＮＡ塩基がある。すなわち、分子染色が結合する位置の理論上の数は、非常に高い。そのような状況下で、電磁放射の量が高いため、暴露時間は低く（フローサイトメトリーにおいて、収集率は典型的には５，０００ないし１０，０００／秒である）、許容されるシグナル／ノイズ比が達成される。
【０００５】
古典的な増幅技術は、酵素連結アッセイのものである。検体と特異的に反応するリガンドは酵素に結合し、過剰なリガンド−酵素が除去された後、検体−リガンド−酵素複合体は、酵素が作用して着色生成物を形成する無色の物質である発色性基質との反応によって検出される。その大きな増幅因子のため、酵素連結アッセイは高度な感受性を供し、少量の抗原の検出に特に有用である。
【０００６】
ＷＯ９８／５０７７７およびＷＯ００／２８２９７（CHEMOMETEC）は、液体試料中の粒子の特性の評価の方法およびシステムを開示する。これらの開示によると、評価は、ＤＮＡ単量体を染色することが知られている染色によって、粒子を染色することによって行われる。従って、これらの文献は、細胞中の豊富な分子を染色することに基づく評価方法を開示する。そのような状況下では、各細胞から蓄積されたシグナルは比較的高く、シグナル対ノイズ比は同様に低く、そのため、粒子からのシグナルおよびバックグラウンドの間の識別が促進される。
【０００７】
ＤＮＡ単量体より桁違いに少ない検体の染色に基づき、粒子に関する特性の評価のための別法を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
発明の概要
第１の態様において、本発明は：
少なくとも１つの試薬物質と液体物質とを混合し、該試薬物質は、少なくとも、選択的かつ直接的に、検体の種の検体位置および標識剤に結合することが可能な第１の標的種を含み、ここに第１の標的種および標識剤は直接的または間接的にお互いに結合し、
暴露領域を規定する壁部を有する試料区画に、液体物質および試薬物質の混合物の少なくとも一部を含むある容量の液体物質を配置し、該壁部は該区画中の試料からの電磁シグナルを壁から外部へと通り抜けさせ、
試料区画中の試料から壁部を通過した電磁シグナルの表示を、動作中の検出要素のアレイに暴露し、ここに暴露ドメインにおける元の線状寸法に対する検出要素のアレイ上の線状寸法のイメージの割合が２０：１より小さくなるように、該表示は線状拡大に付され、
個々の動作中の検出要素によって、強度として表示を検出し、
バックグラウンドからの電磁シグナルの表示と異なる粒子からの電磁シグナルの表示を同定するために、強度を処理し、次いで、
処理の結果から、少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターを得ることを特徴とする、１ｘ１０６未満の量の検体検出可能位置の検体のうちの少なくとも１つの種に結合しているか、あるいはその中に含まれる粒子を含む液体物質中の粒子の少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターを評価する方法に関する。
【０００９】
電磁シグナルを暴露し検出する工程は、試料区画中の試料のイメージを記録することに対応する。検出要素によって検出されるものは、電磁シグナルの表示である。
【００１０】
驚くべきことに、強度を加工し、粒子中のほとんどの検体が染色されていない時でさえ、バックグラウンドからのシグナルと異なるように、粒子からシグナルを同定し、粒子からの電磁放射に寄与することが可能であることが判明した。添付の実施例において、本発明の方法に従い、同様の課題において一般的に適用されるよりも複雑でない装置を用いて、容易にルーチン分析に適用可能な状況下で、ＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）コンジュゲーテッド抗体を用いて、ＣＤ３＋（ＣＤ３陽性）、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４５＋白血球のパーセンテージを評価することが可能であることが示されている。
【００１１】
発明の詳細な記載
定義
質パラメーター：実質的に特異的な粒子または粒子の特異的な特性の同定と一般的に関連した、粒子の同定にしばしば使用される単一の粒子または粒子の群のパラメーターまたは特性。また、質パラメーターは、一般的に、粒子の異なる型を同定、または識別、あるいは成長または代謝状態のような粒子が示す２またはそれを超える状態を識別する目的で、特異的な粒子または粒子の種の特定の特性の量の測定であり得る。
【００１２】
量パラメーター：粒子の列挙あるいは粒子の２またはそれを超える種または群の相対的列挙にしばしば使用される単一の粒子または粒子の群のパラメーターまたは特性。
【００１３】
統計的質：反復性および再生性のような、一般的に精度および／または正確度に関連するランダムな性質または作用の測定。質のレベル、または質の相対的レベルは、一般的に、予測される値（例えば、正規分布の標準偏差）に相対的な変数で、あるいは信頼性（例えば、区別または分類における信頼性）として表される。
【００１４】
検体の種：少なくとも１つの標的種が結合することができる粒子の表面上または粒子内の化合物。
【００１５】
検体検出可能位置：標的種の１つの分子が（共有結合、親和性結合（抗体、ハイブリダイゼーション）を介して、または水素結合によってのいずれかで)結合することができる検体の種内の位置。
【００１６】
標的種：標識剤の標的種への結合を介して、検体検出可能位置に結合し、直接的または間接的に、それに標識剤を結合させることが可能な化合物。標的種および標識剤の間の結合は、直接または間接であってよい（下記参照）。
【００１７】
標識剤：検出可能な電磁シグナルを生成させるために、電磁放射線を放射、吸収、減衰または散乱させることが可能な化合物。
【００１８】
直接的結合：結合は、標的種および標識剤の間の結合を指す。直接的結合は、標的種および標識剤が共有結合によって結合し、すなわち１つの化合物を形成することを意味する。
【００１９】
間接結合：結合は、標的種および標識剤の間の結合を指す。間接結合は、標的種および標識剤が、非共有結合、例えば親和結合（抗体−抗原、抗体−ハプテン、ヌクレオチドハイブリダイゼーション）を介して結合することを意味する。この場合、標的種および標識剤は２つの異なる化合物である。
【００２０】
粒子
粒子は、好ましくは、生物学的粒子である。生物学的粒子は、特に、細胞、細胞壁、細菌、プラスモジウム、ウィルス、プリオン、高分子、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその断片またはその集団から選択される。好ましくは、生物学的粒子は細胞である。
【００２１】
細胞は、好ましくは、哺乳類細胞、昆虫細胞、爬虫類細胞、魚細胞、酵母細胞、および真菌細胞から選択され、より好ましくは、血液細胞、精液細胞、および骨髄細胞から選択される。
【００２２】
粒子は、ビーズのような固体支持体に結合してもよく、該ビーズは、試料ドメイン中で懸濁することが可能である。ビーズはポリマービーズでもよい。しばしば、ポリマービーズは、常磁性ビーズのような、粒子の処理を助けることができる物理的および／または化学的特性を有することができる。
【００２３】
ウィルスまたは他の小さな粒子の評価に関与する本発明の１つの具体例は、粒子をビーズに結合させることに基づく。これによって、粒子を、遠心分離、濾過または磁選のような前処理の間により単純な様式で処理することが可能になる。
【００２４】
ビーズは、それ自体として標識されて、１またはそれを超える粒子の同定における正確性を改善することができる。本発明の１つの具体例は、２またはそれを超える異なる粒子を結合させる親和性を有し得る２またはそれを超えるタイプのビーズを使用する。
【００２５】
また、粒子は、粒子を含有するＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ/ＲＮＡまたはその画分は、ＤＮＡ染色化合物で染色されてもよい。しばしば、これは、生存度の評価のような粒子特性または粒子特異性のさらなる確証または評価が必要な時に好ましい。
【００２６】
検体および検体検出可能位置
本発明に従い、検体の種は、少なくとも１つの標的種が結合することができる粒子の表面上または粒子内の化合物と定義される。検体の種の例は、蛋白質、ヌクレオチド、核酸配列、脂質、膜成分を含む。
【００２７】
検体検出可能位置は、標的種の１つの分子（共有結合、親和結合(抗体、ハイブリダイゼーション）、または水素結合を介してのいずれかで)結合することができる検体の種内の位置である。かくして、検体の１つの種は、１を超える検体検出可能位置を含有する。検体の種が抗体によって標的され得る蛋白質である時、各蛋白質分子は、抗体が結合することができる１を超えるエピトープを含有し得る。
【００２８】
より具体的には、検体は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物、リポ蛋白質、水化物複合蛋白質、膜成分、受容体、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその断片またはその集団から選択されてもよい。
【００２９】
検体は、細胞膜または細胞壁あるいは細胞核膜に結合してもよい。これは、検体が、例えば細胞膜受容体といった受容体である時に、より特にそうである。
【００３０】
検体は、細胞表面に位置しているか、細胞内に含有されているかのいずれかである。また、検体は、オルガネラの表面に位置するか、あるいはオルガネラ内に含有されていてもよい。
【００３１】
粒子中の検体検出可能位置の総数は、検体の特定の種の数に検体の各種における検体検出可能位置の数を掛けることによって決定される。
【００３２】
粒子は、１ｘ１０６未満の検体検出可能位置、例えば５ｘ１０５未満の検体検出可能位置、例えば１ｘ１０５未満の検体検出可能位置、例えば５ｘ１０４未満の検体検出可能位置、例えば１ｘ１０４未満の検体検出可能位置、例えば５ｘ１０３未満の検体検出可能位置、例えば１ｘ１０３未満の検体検出可能位置、例えば５ｘ１０２未満の検体検出可能位置、例えば１ｘ１０２未満の検体検出可能位置、例えば１０未満の検体検出可能位置、例えば１または２つの検体検出可能位置の量の検体の少なくとも１つの種に結合しているか、あるいはその中に含まれていてもよい。検体検出可能位置の数が少なければ少ないほど、各粒子によって生成されるシグナルは少なくなって、試料ドメインのイメージ中の粒子を同定することがますます困難になる。
【００３３】
本発明は、それに結合しているか、その中に含まれる２５０および２５０，０００検体検出可能位置（集団の平均）、より好ましくは５００および５０，０００の間の検体検出可能位置、さらにより好ましくは１，０００および１０，０００の間の検体検出可能位置を有する粒子を評価するのに特に適合される。
【００３４】
次の表は、様々なヒト細胞に関し、異なる膜抗原の数／細胞を与える。膜抗原は、検体の種の例である。
【表１】
2006504937.tif 000002
引用文献：
1.  Bikoue A.,ら, Quantitative Analysis of Leukocyte Memebrane Antigen Expression: Normal Adult Values, Cytometry, 26, p.137-47,  (1996) 
2.  Lenkei R., Determination of the antibody binding capacity of lymphocyte membrane antigen binding capacity by flow cytometry in 58 blood donors, Journall of Immunogical Methods, 183, p.267-77, (1995)
【００３５】
検体の種の特異的な例は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ６１、およびＣＤ９１のようなＣＤマーカー、上皮膜抗原（ＥＭＡ）、エストロゲン受容体  α（ＥＲα）、サイトケラチン  ヒト、サイトケラチン  ７、サイトケラチン  ２０、Ｋｉ−６７／ＰＩ、ホスファチジルセリン、ＢＣＬ２  腫瘍性蛋白質、ｓｕＰＡＲ（溶解性ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体)、ウロキナーゼ、受容体に結合するホルモン、細胞周期関連蛋白質、アポトーシスのマーカー、および緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）から選択される。検体のこれらの例は、抗体を用いて標的され得る蛋白質全てである。これらの大部分は、エピトープに対して向けられたモノクローナル抗体は商業的に入手可能であるというさらなる利点を有する。
【００３６】
本発明の１つの具体例に従い、検体の種は、インターロイキンに結合しているホルモンのような結合ホルモンを持つ受容体である。ホルモンが受容体に結合する時、後者は、しばしば、他のエピトープが暴露され、抗体が非結合受容体および結合ホルモンを持つ受容体の間を識別できるように、その配置を変える。
【００３７】
検体の種のさらなる例は、ヌクレオチド配列である。検体のそのような種の例は、染色体ＤＮＡ配列、ミトコンドリアＤＮＡ配列、葉緑体ＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列、ｒＲＮＡ配列、単一のヌクレオチド多型を含むヌクレオチド配列を含む。ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡ配列は、比較的高い数で存在し、一方染色体ヌクレオチド配列をコードする特異的な蛋白質は、より少ないコピーで存在する。組織型および状態によって、典型的な生存可能な哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ分子の総数は、１ｘ１０５ないし１ｘ１０６の間を変動する。典型的なヒト細胞中の特異的ｍＲＮＡ分子の数は、約１０コピー／細胞（低い豊富度）ないし約１０，０００コピー／細胞（高い豊富度）を変動する。典型的な哺乳類細胞中の活性遺伝子の数は、３．３ｘ１０９塩基対であるヒトゲノムの３％未満を覆う約1.５ｘ１０４である。
【００３８】
検体の種の１つのさらなる特定の群は、医学マーカーであり、これは病気のマーカーである。医学マーカーに基づく細胞に関連する特性を評価することは、様々な病気の診断および薬物候補の臨床効果の評価に使用することができる。
【００３９】
病気は、癌、遺伝病、心臓病、感染病、免疫関連病から選択される。より詳細には、病気は、乳癌（例えば、ヒトエストロゲン受容体２マーカー）、卵巣癌（例えば、卵巣癌抗原ＣＡ１２５マーカー）、上皮癌（上皮膜抗原マーカー）、悪性黒色腫（Ｓ−１００蛋白質マーカーおよびＣＤＫ４マーカー）、白血病（一般的急性リンパ性白血病抗原またはＣＤ１０マーカー）、敗血症（Ｃ−反応性蛋白質またはカルシトニン）から選択することができる。マーカーの数／細胞は、マーカーの型および病状によって、１０３ないし１０６の間である。
【００４０】
本発明を用いて評価できる病気のさらなる群は、感染病である。ウィルス病を評価する際、粒子はＨＩＶ、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エプスタイン−バーウィルス、ヒト乳頭腫ウィルス、クラミジアウィルス、サイトメガロウィルス、インフルエンザウィルスのようなウィルスから選択される。これらのウィルスは、該ウィルスによって感染している細胞内に位置する抗原である検体の種を用いることによって、またはウィルス、検体の該種、ヌクレオチド配列または被覆蛋白質内または上に位置する検体の種を用いることによって、評価できる。ウィルスコピー／ミリリットル（ウイルス量）の数は、ウィルス型および病状によって、１０２ないし２ｘ１０６の間である。これは、大体、ウィルス型および病状によって、１ないし１，０００コピー／細胞に対応する。
【００４１】
標的種
標的種の異なる型を、本発明に従い使用してよく、２つの重要な型は、抗体およびヌクレオチドプローブである。標的種の他の型は、リガンドまたは他の既知の結合パートナーを含む。
【００４２】
標的種が抗体である時、これは検体種に向けられる。抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および／またはキメラまたは合成抗体を含む。また、抗体の官能的断片も想定される。
【００４３】
また、標的種は、検体種の配列に相補的なヌクレオチドプローブであってよい。ヌクレオチドプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびその修飾された類似体を含む群から選択される単量体を含んでもよい。ハイブリダイズする配列において１またはそれを超えるＬＮＡ単量体を含むプローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ単量体のみを持つプローブよりもより高いＴｍを有することが一般的に知られている。
【００４４】
標的種の１つの特定の型は、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）プローブである。より高いシグナル／ノイズ比を与え、すなわち増幅なしで、より小さいヌクレオチド配列を検出することができるため、ＩＳＨ−プローブの中でも蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブ（ＦＩＳＨ）が好ましい。
【００４５】
選択的結合
用語選択的結合（selective binding）は、用語選択的結合（selective linkage）、つまりそのパラメーターが評価されるべき検体に特異的な結合と同義に用いられる。１つの具体例において、選択的結合は、検体上のエピトープに向けられた、モノクローナル抗体のような抗体を用いる抗原−抗体結合である。もう１つの具体例において、選択的結合はヌクレオチド配列の間のものである。
【００４６】
抗体および／またはヌクレオチドプローブは、直接的または間接的に標識され得る。典型的には、直接−標識は、フィコエリトリン、（ＲＰＥまたはＰＥ）、シアニン色素（Ｃｙ色素）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、インドトリメチンシアニン、インドペンタメチンシアニン、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ヨウ化エチジウム、７−アミノアセチノマイシンＤ、Per CPまたはその化学的に結合した組合せを含む。間接標識は、一次抗体に対する二次抗体を含み、該二次抗体は標識剤で標識される。
【００４７】
間接標識において、検体上のエピトープまたはヌクレオチド配列に対して向けられた一次抗体またはヌクレオチドプローブは、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ハプテン、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニルまたはフルオレセインのように、化合物に共有結合されてよい。次いで、検体は、一次抗体またはプローブに結合した化合物に特異的に結合する第２の標識によって視覚化することができる。そのような間接標識の例は：ハプテン抗−ハプテン複合体；ビオチンストレプトアビジン複合体；ビオチンアビジン複合体；ジゴキシゲニン抗−ジゴキシゲニン複合体;ジニトロフェニル抗−ジニトロフェニル複合体;フルオレセイン抗−フルオレセイン複合体を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
一次抗体またはプローブが、ビオチンに結合している場合、シグナル増幅は、ストレプトアビジンをビオチンに結合させ、さらにビオチン−標識−ビオチン複合体をストレプトアビジンに結合させることによって得ることができる。さらなる増幅のラウンドは、ストレプトアビジンおよびビオチン−標識−ビオチン複合体をさらに結合させることによって得ることができる。結果は、いくつかの−標識が、ただ１つの−標識の代わりに、複雑な結合を介して、エピトープまたはヌクレオチド配列に結合されているということである。
【００４９】
もう１つの具体例において、種−選択的結合は、検体に関連するＤＮＡおよび／またはＲＮＡに対して選択的なＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはＰＮＡおよび／またはＬＮＡプローブを用いて提供され得る。抗体の標識に関して、上記のように、さらなるプローブを通して、直接的または間接的に、プローブは標識され得る。１つの具体例によると、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）は、シグナル増幅につき使用することができる。ｂＤＮＡは、その全文において援用される米国５，６３５，３５２および５，１２４，２４６(Chiron)に記載のように、ヌクレオチド増幅器、標識プローブ、標識延長剤、および所望により捕獲延長剤の使用に関与する。
【００５０】
また、本発明は、さらなる結合が、検体の第２の種および第２の標識の間で形成されるという特徴を含む。
【００５１】
次の検体および−標識の間で形成される選択的結合の例の非限定的なリストにおいて、アスタリスク*は、抗体および抗原の間の結合またはアビジンおよびビオチンの間の結合または相同ヌクレオチド配列の間の結合のような親和性結合またはヌクレオチドハイブリダイゼーションを意味する。ダッシュ−は共有結合を示す。
【００５２】
検体*抗体−標識
検体*抗体*抗体−標識
検体*抗体−ビオチン*アビジン−標識
検体*抗体−ビオチン*ストレプトアビジン−標識
検体*抗体−アビジン*ビオチン−標識
検体*抗体−ストレプトアビジン*ビオチン−標識
検体*抗体*抗体−アビジン*ビオチン−標識
検体*抗体*抗体−ストレプトアビジン*ビオチン−標識
検体*抗体*抗体−アビジン*ビオチン−標識
検体*抗体*抗体−ストレプトアビジン*ビオチン−標識
検体*抗体−ビオチン*ストレプトアビジン*（ビオチン−標識-ビオチン）ｎ*ストレプトアビジンｎ等
検体*抗体−ジゴキシゲニン*抗ジゴキシゲニン−標識
検体*抗体−ジニトロフェニル*抗ジニトロフェニル−標識
検体*抗体−ハプテン*抗ハプテン−標識
検体*抗体−フルオレセイン*抗フルオレセイン標識
検体*ＤＮＡ断片−標識
検体*ＤＮＡ断片*ＤＮＡ断片−標識
検体*ＲＮＡ断片−標識
検体*ＲＮＡ断片*ＲＮＡ断片−標識
検体*ＰＮＡ断片−標識
検体*ＰＮＡ断片*ＰＮＡ断片−標識
検体*ＬＮＡ断片−標識
検体*ＬＮＡ断片*ＬＮＡ断片−標識
検体*ＤＮＡ断片*ＲＮＡ断片−標識
検体*ＤＮＡ断片*ＬＮＡ断片−標識
検体*ＤＮＡ断片*ＰＮＡ断片−標識
検体*ＲＮＡ断片*ＬＮＡ断片−標識
検体*ＲＮＡ断片*ＰＮＡ断片−標識
検体*ＲＮＡ断片*ＬＮＡ断片−標識
検体*ヌクレオチドプローブ-ビオチン*ストレプトアビジン*（ビオチン−標識−ビオチン）ｎ*ストレプトアビジンｎ等
検体*ヌクレオチドプローブ-ジゴキシゲニン*抗ジゴキシゲニン−標識
検体*ヌクレオチドプローブ-ジニトロフェニル*抗ジニトロフェニル−標識
検体*ヌクレオチドプローブ-ハプテン*抗ハプテン−標識
検体*ヌクレオチドプローブ-フルオレセイン*抗フルオレセイン標識
検体*ｂＤＮＡプローブ*標識プローブ
【００５３】
同様に、アビジン*ビオチンまたはＲＮＡ*ＰＮＡ等の順序を逆さにするように、親和結合に加わる２つの成分を逆さにすることによって、種特異的結合が形成され得ることは考えられる。
【００５４】
試料
試料は、乳、乳製品、尿、血液、精液、鼻分泌、涙、糞便、排水、加工水、飲み水、脳脊髄液、胆汁、骨髄、食物、食餌、およびその混合物、希釈物、または抽出物よりなる群から選択される試料のような液体試料であってよい。
【００５５】
また、該方法は、飲み水の制御、排水の制御あるいは浄水場またはスイミングプールからの水のような水の中の粒子の評価に関する。全適用において、制御は、細菌カウントのような総粒子カウントに関連し、あるいは、特に、病理学的細菌のような特異的な細菌のモニタリングプロセスに関する。
【００５６】
さらに、発酵制御、つまり発酵タンク中の細胞成長および生存細胞の制御は本発明によって実施できる。これは、ペプチドまたは蛋白質組成物を生成する製薬産業のような、発酵を用いる全技術および産業分野に関する。
【００５７】
液体試料は、遠心分離、沈殿、濾過、抽出、希釈、照射、かき混ぜ、化学物質の添加、クロマトグラフィー分離のようないずれかの適当な処理で前処理することができる。
【００５８】
もう１つの具体例において、試料は固体試料であり、これは試料ドメインで並べられる前に前処理される。前処理の例は、混合、均質化、（再）懸濁および分解である。所望により、前処理に引き続いて、液体試料に関して言及した処理のいずれかを行ってもよい。
【００５９】
試料は、筋肉、脳、腎臓、肝臓または脾臓の生検のような組織の生検といった生物学的試料であってよい。
【００６０】
また、試料は、細菌汚染のような汚染につきテストされる食物または食餌の試料であってよい。本発明は、サルモネラ種を検出する方法のような、食物または食餌中の細菌を検出し列挙する非常に迅速な方法を供する。また、試料は、土壌試料であってもよい。
【００６１】
試料の形態に関係なく、基質と接触する前に、粒子を媒体中で懸濁することが必要である。該媒体は、粒子に対して天然の媒体または検出に適したいずれの液体であってよい。１つの具体例において、粒子は、前処理された後、媒体中で懸濁される。
【００６２】
蛍光
好ましい具体例において、標識は蛍光化合物である。蛍光に基づくシステムは、一般的に、粒子を視覚化するのに十分な電磁放射を提供するのに少数の生成物分子が必要であるため、色原体よりも感受性である。
【００６３】
蛍光標識は、好ましくは、励起光によって励起された時、３００ないし１２００ｎｍの波長範囲で、シグナルを放射することが可能である。１つの好ましい蛍光方法は、偏光蛍光の方法である。
【００６４】
励起光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ガスレーザー、固体レーザー、レーザーダイオード、ガスランプ、ハロゲンランプ、またはキセノンランプのような、２５０ｎｍないし８００ｎｍの範囲で励起光を放射することが可能ないずれかの適当な光源である。
【００６５】
効率の良い方法で、発光ダイオードのような発散励起光を使用して、可能な限り大きな領域の試料を励起光に暴露することが好ましい。
【００６６】
例えば２またはそれを超える発光ダイオードを用いることによって試料に光束を増加させる目的のため、１を超える光源を使用するのが好ましい。また、いくつかの光源が異なる電磁特性を有する１を超える光源を使用することが可能である。
【００６７】
いくつかのＬＥＤの使用によって、試料は、試料の実質的に最適な励起へと繋がるいくつかの角度から、励起光へと暴露され、光源は、好ましくは、全てが実質的に同時に伝達するように操作される
【００６８】
しかしながら、少なくとも第１および第２の光源が第１の励起光手段で配置されたいくつかの適用において、第１の光源は第２の光源と異なる波長バンドを有し、光源は別の様式で伝達してもよい。２つの異なる光源の使用によって、試料から２つの異なる蛍光シグナルを得ることが可能である。使用されるＬＥＤの数に上限はないが、しばしば３０ＬＥＤほどの、例えば最大で５０ＬＥＤ、例えば最大で１００ＬＥＤ、例えば最大で１５０ＬＥＤ、例えば最大で２００ＬＥＤ、例えば３００またはそれを超えるＬＥＤが供される。
【００６９】
もし少ない発散光源が使用されれば、発散光手段は、励起光路で配置されて、適切に励起光を発散することができる。
【００７０】
励起光としてレーザーダイオードを使用する時、適切な発散は、所望により発散手段と一緒に供される少なくとも４つのレーザーダイオードの配置によって達成することができる。
【００７１】
励起光の入射角は、好ましくは、検出システムの光軸に対して０°および９０°の間の範囲で、より好ましくは０°および６０°の間、例えば,１０°および４５°の範囲で試料の適した励起を供する。
【００７２】
励起光は、試料に直接的に、つまりビームスプリッターまたはそのようなものによって屈折されずに伝達され、それによって、システムおよび装置をよりコンパクトに構築することが可能である。
【００７３】
二色または複数色
好ましい具体例において、標識の少なくとも２つのスペクトル特性の間の区別は、粒子の少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターを得るプロセスにおいて使用される。すなわち、本発明によって、少なくとも２つの異なる型の粒子を同時に検出することが可能である。これは、２つの異なる型の粒子中または上に位置する２つの異なる検体に向けられた少なくとも２つの抗体または２つのヌクレオチドプローブを用いて、２つの異なる標識で２つの抗体またはプローブを、直接的または間接的のいずれかで供し、２つの異なる粒子を検出することによって達成される。
【００７４】
例えば、死細胞および生細胞の間を識別する、またはアポトーシスおよび非アポトーシス細胞の間を識別する、あるいは例えば異なるＣＤマーカーといった表面上に暴露された異なる膜抗原を有する細胞の間を識別するために、粒子の２つの異なる型は、２つの異なる細胞、例えば特異的なＩｇＧおよびＩｇＡ−分泌細胞、または同一の細胞の２つの異なる状態であってよい。例えば、１つでかつ同一の試料中のＢ細胞からＴ細胞を識別することが可能であることは、関心事であり得る、これは、ＣＤ３マーカーをＴ細胞用の検体の種として、およびＣＤ１９マーカーをＢ細胞用の検体の種として使用することによって行うことができる。ホスファチジルセリンは初期アポトーシス細胞の表面上に存在し、非アポトーシス細胞からアポトーシス細胞を識別するために、蛍光標識されたアネキシンＶで検出され得る。
【００７５】
また、後者の状況において、検体に向けられた１つの標識された抗体、次いで慣用的な生死判別染色のような生細胞から死細胞を識別するための粒子の標識のもう１つの型を用いることによって、二重標識を実施することができる。
【００７６】
２を超える異なる粒子、例えば３つの粒子を、これにより評価することができると理解される。
【００７７】
試料ドメイン
本発明に従い確立される試料ドメインは、区画またはその同等物であってよく、ここに試料は、三次元試料ドメインのように、記録の間に配置される。
【００７８】
試料ドメインは、流水システムの一部であってよく、ここに各試料は、一連の試料の一部であり、それによって１つの試料は試料ドメイン中の先の試料を置き換える。そのような具体例において、試料区画はインレットおよびアウトレットの両方を有する。他の具体例において、試料区画はインレットを有するのみである。
【００７９】
１つの特定の具体例において、試料ドメインは、ＰＣＴ／ＤＫ９９／００６０５記載の使い捨てカセットのようなカセットの一部である。いくつかの具体例において、そのようなカセットは、シグナルの発生に寄与する先に添加された化学物質を含有する。
【００８０】
試料は試料区画の内側に含有され、これは通常、２０μｍおよび２００μｍの間、通常３０μｍおよび１５０μｍの間、多くの実際の具体例において、５０μｍおよび１００μｍの間の平均厚みを有する。
【００８１】
シグナルを検出させる試料ドメインの部分は、暴露窓と呼ばれ、これは１ｍｍ２またはそれ以上ほど小さくてもよく、好ましくは２ｍｍ２またはそれ以上の領域、好ましくは４ｍｍ２またはそれ以上の領域、好ましくは１０ｍｍ２またはそれ以上の領域、好ましくは２０ｍｍ２またはそれ以上の領域、好ましくは４０ｍｍ２またはそれ以上の領域、より好ましくは１００ｍｍ２またはそれ以上の領域を有する。
【００８２】
試料容量
１ｍｌほどまたはそれ未満、ならびに０．０２ｍｌほどの試料容量でさえ使用することができる。必要な試料の最適容量は、試料中に存在する粒子の数および求められる所定の統計学的質パラメーターに非常に依存している。
【００８３】
本発明の他の好ましい具体例は、かなり大容量の試料からの粒子を評価することを可能にする。これによって、試料の容量につき、関心のある小数の粒子のみを持つ試料の測定が可能になる。１ｍｌを超えるおよびさらに１００ｍｌを超える試料容量を分析に使用することができ、容量は、試料の測定前に機器に接続されたいずれかのフローシステムに導入されたいずれかの液体試料の総容量として定義される。
【００８４】
しばしば、試料区画または試料の設計は、液体試料の容量のサイズが少なくとも１つの量パラメーターまたは少なくとも１つの質パラメーターの評価を可能として実質的に１回の暴露に基づく評価の統計学的質に対する所定の要件を満たすのに十分に大きく、従って、イメージが１回の暴露で記録されるようなものである。もう１つの具体例において、少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターの評価は、１を超えるイメージ、好ましくは２つのイメージ、より好ましくは２を超えるイメージ、より好ましくは４を超えるイメージに基づき得られる。これらの状況において、イメージは、２、３またはそれを超える暴露を通して記録される。これは、例えば統計学的質の所定の要件を満たすために実行される。
【００８５】
また、経時的なイメージにおける変化に関する情報は、少なくとも１つの質パラメーターまたは少なくとも１つの量パラメーターの評価において使用され、そのような状況において、１を超える暴露が行われる。
【００８６】
粒子の多くの評価において、試料の実質的に大きい容量からのシグナルの暴露を可能にすることが関心事である。電磁放射線のようなシグナルが検出システムに暴露される液体試料の容量は、通常、０．０１μｌおよび２０μｌの間の範囲内である。一般的に、分析下にある試料の容量は可能な限り大きくすべきである。これによって、粒子のより多数の同時評価が可能になるが、最適容量は、しばしば、検出システムおよび分析される試料の１またはそれを超える態様によって規定される。すなわち、試料区画中の試料の容量は、０．１μｌ未満であってよいが、しばしば、０．１μｌを超える、１．０μｌを超えるまたはさらに１０μｌを超える容量が使用される。さらに他の適用において、１００μｌまたはそれを超えるほどの容量の試料区画を使用してよい。
【００８７】
大容量の試料は、好ましくは、フィルター、電場、磁場、重力場のような粒子保持手段を介して、試料の容量を通すことによって測定され、そのような手段は、好ましくは、機器に含まれるか、あるいは機器内のいずれかの試料と相互作用するように並べることができる。粒子保持手段は、好ましくは、試料中に存在する実質的に全ての粒子、または試料中に存在する少なくとも１つの型の粒子の少なくとも実質的な表示端数を保持することが可能であるべきである。
【００８８】
大きい試料からの粒子が保持されると、それらの粒子は、粒子保持手段を介する試料の容量未満の容量において、再懸濁することができる。
【００８９】
１つの具体例において、同一の試料物質の１を超える部分は、検出システムへの暴露によって、分析に付される。これは、試料区画を動かし、すなわち試料区画の異なる部分を暴露することによって行うことができる。
【００９０】
拡大
方法は、好ましくは、低拡大で実施され、そのため、１、または２、３の暴露で大容量において粒子を検出することが可能である。拡大比率は、好ましくは、２０以下、例えば１０以下、例えば５以下、例えば４以下、より好ましくは４以下、例えば２以下、より好ましくは２以下、例えば１以下である。そのような低拡大の利点はいくつかあり、特に、観察の増加された領域および焦点の増加された深度つまり検出機器に暴露される増加された容量がある。
【００９１】
問題の粒子が検出要素のサイズに相当する寸法を有する時、しばしば、約１／１の拡大を有する、すなわちいずれか１または２、３の検出要素上のいずれかの粒子のイメージにフォーカスすることが好ましい。これによって、ある条件下で、いずれかのシグナルの有利な検出を得ることができる。
【００９２】
使用される検出要素に相当またはそれより大きい寸法を有する粒子を分析する時、そのような粒子のイメージのサイズを、イメージのサイズが検出要素のサイズに相当する度合いまで減らすことが、しばしば有利である。従って、１つの具体例において、１以下、好ましくは０．９以下、例えば０．８、より好ましくは０．８以下、例えば０．６、より好ましくは０．６以下、例えば０．５の拡大比率が好ましい。
【００９３】
これらの状況において、粒子のサイズ対検出要素のアレイ上の粒子のイメージのサイズの比率が、１／１またはそれ未満、好ましくは１／１未満で１／１００以上、より好ましくは１／１未満で１／４０以上、より好ましくは１／１未満で１／１０以上、より好ましくは１／１未満で１／４以上、より好ましくは１／１未満で１／２以上であるのが好ましい。
【００９４】
従って、検出要素のアレイに暴露された空間表現は、検出要素のアレイ上の線状寸法のイメージ対試料ドメイン中の元の線状寸法の比率が、４０：１より小さく、通常は最大で２０：１、好ましくは１０：１より小さく、多くの場合、最大で６：１またはさらに４：１より小さいそのような線状拡大に付される。
【００９５】
しばしば、そのパラメーターまたは複数のパラメーターが評価される個々の粒子からの製品のイメージが、最大で２５の検出要素上に、特に、最大で１６の検出要素上に、より好ましくは、最大で９の検出要素上にイメージされるのが、好ましい。そのパラメーターまたは複数のパラメーターが評価される個々の粒子からの製品のイメージが、最大で５の検出要素、またはさらに最大で１の検出要素上にイメージされるのがさらにより好ましい。多数の要素／粒子は、個々の粒子に対してより多くの情報を提供するだろうが、少数の要素／粒子は、暴露において生成され得る総数を増加させるだろう。
【００９６】
統計
上記で言及したように、容量のサイズは、決定の所望の統計的質に、適当に適合される。すなわち、決定が容量における粒子の数の決定、またはサイズおよび／または粒子の形状の決定である場合、液体試料の容量のサイズは、好ましくは、少なくとも２つの粒子のそれにおける同定を可能にするのに十分に大きい。より好ましくは、液体試料の容量のサイズは、少なくとも４つの粒子のそれにおける同定を可能にするのに十分に大きい。これは約５０％の反復率誤差に対応するだろう。なおより好ましくは、液体試料の容量のサイズは、少なくとも１０の粒子のそれにおける同定を可能にするのに十分に大きい。これは約３３％の反復率誤差に対応するだろう。さらにより好ましくは、液体試料の容量のサイズは、少なくとも５０の粒子のそれにおける同定を可能にするのに十分に大きい。これは約１４％の反復率誤差に対応するだろう。明らかに、可能であれば、容量のサイズがさらにより高い数の同定を可能にする状態を目指すのが好ましい。従って、液体試料の容量のサイズが、少なくとも１００の粒子のそれにおける同定を可能にするのに十分に大きい時、それは約１０％の反復率誤差に対応し、液体試料の容量のサイズが、少なくとも１０００の粒子のそれにおける同定を可能にするのに十分に大きい時、それは約３％ほどの低い反復率誤差に対応するだろう。
【００９７】
静止
本発明の好ましい具体例において、評価されている粒子は、分析の間、静止しているか、あるいは実質的に静止して、いずれのシグナル対ノイズ状況も改善するために、測定時間の最適な使用を可能にする。また、この配置は、特に、特性の評価が試料の容量における粒子の計数のような容量関連特性である時、フロー状況における変動によって引き起こされる粒子の評価に固有であり得るいずれの誤差も排除する。
【００９８】
フローシステム
試料ドメインへの粒子および試薬物質の導入は、フローシステムの手段によって提供することができる。フローシステムは、試料に対して実行されるいくつかの操作の少なくとも１つを提供し、該操作は、輸送、試薬と混合、試料および所望により試薬の均一化、熱処理、冷却、音処理、超音波処理、光処理および濾過から選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
試料を試料ドメインに、またはその中で、またはそれから流すために、少なくとも１つの推進手段をシステムにおいて提供させることが好ましい。
【０１００】
好ましくは、試料および／または試薬成分が、システムを介して、段階的に流れることができるように、フロー調節手段は、段階的に機能するように配置される。
【０１０１】
機器における試料は、フローシステムの手段によって流すことができ、これは、ポンプまたは加圧ガス、好ましくは空気によって、あるいはインレットの外部に対する圧力が少なくとも一部のシステム内の圧力より高くなるように、圧力差を引き起こすことによって動かすことができ、従って、試料をインレットを通って流す。本発明の多くの具体例において、該フローシステムにおける流れは、１またはそれを超える弁によって制御され、これは試料の流速を調整することができる。
【０１０２】
多くの好ましい状況において、機器中の液体の流れは、真空によってもたらされ、真空は好ましくは機器内に含有された容器から適用される。真空は、真空を実質的に試料の導入または動きと同時に作る機械的または物理的作用によって確立させることができる。これらの機械的または物理的作用は：蠕動ポンプ、ピストンポンプ、膜ポンプ、遠心力ポンプおよび注射器であり得る。
【０１０３】
試料区画からのアウトレットは、弁のような流れ制御手段を介して通過することができ、これはガスが通過することを可能にするだけである。しばしば好ましい１つのそのような型の弁は、ガスおよび空気を通すが、弁が液体試料と接触すると不可逆的に閉じることができるものである。そのような弁の効果は、分析の間、試料区画内のいずれかの試料の動きを最小化することである。
【０１０４】
本発明の好ましい具体例において、システムは、触媒および／または培地を持つ試料物質の混合が可能である少なくとも１つの区画を含有する。
【０１０５】
本システムおよび方法の１つの利点は、液体中で懸濁された、または溶解された液体試薬および粒子のみを使用して、分析が実施されることである。この配置は、操作および作業の容易にする。
【０１０６】
検出機器
機器の窓から検出可能なイメージは、例えば、検出要素のアレイによって検出することができ、検出要素のアレイは、個々の要素を含み、その各々は、試料窓領域の一部からシグナルを感知することが可能であり、全体として、アレイは、実質的に全ての試料窓領域、または試料窓領域の少なくともよく規定された部分から、シグナルを感知することが可能である。例えば、検出機器のアレイは一次元的アレイまたは二次元的アレイであってもよい。粒子の評価を促進させるために、検出要素のアレイによって検出される強度は、粒子からの電磁シグナルの表示が、電磁バックグラウンドシグナルの表示と異なると同定されるような方法で処理される。
【０１０７】
検出手段は、蛍光シグナルのような試料から発光されたシグナルを感知するまたは検出することが可能ないずれかの検出器を含んでよい。
【０１０８】
好ましい具体例において、検出手段は、電荷結合素子（ＣＣＤ）のような検出機器のアレイまたは検出要素である検出器を含み、ＣＣＤは、フルフレームＣＣＤ、フレーム転送ＣＣＤ、インターライン転送ＣＣＤ、例えば波長増加ＣＣＤアレイといった回線走査ＣＣＤ、焦点面アレイ、フォトダイオードアレイまたはＣＭＯＳのようなフォト検出器アレイであってもよい。ＣＭＯＳは、好ましくは、オンチップ統合シグナル状態および／またはシグナル処理を持つＣＭＯＳイメージセンサーである。上記検出機器のいずれかの選択と関係なく、検出手段は、さらに白／黒またはカラーＣＣＤまたはＣＭＯＳを含み得る。
【０１０９】
走査型共焦点光学顕微鏡は当該分野で知られており、従来の光学顕微鏡を超える多くの利点を供する。走査型共焦点顕微鏡の１つの主な利点は、フォーカスされていない光を弱めるために、それが試料の光学切片を供することである。かくして、フォーカスされた光のみが最終イメージに寄与する。
【０１１０】
走査型共焦点顕微鏡において、ビームは、試料の表面を通り抜ける。試料から生じる（例えば、反射される、発せられるまたは伝えられる）光は、ピンホールに向けられる。フォーカスされた光は、ピンホールを通って、光学検出器へと抜ける。ビームが試料の表面にわたり走査されると、光学検出器からの出力が蓄積され、走査された表面のイメージへと形成され得る。
【０１１１】
走査型共焦点顕微鏡、特にレーザー走査型共焦点顕微鏡の試料ドメインにおいて形成された製品からのシグナルを検出するための使用は、検出されたイメージのより優れた鮮明さのため、有利である。
【０１１２】
検出要素のサイズは、ある程度、その感受性を決定する。従って、いくつかの適用において、約１μｍ２またはそれ未満のサイズの検出要素を持つことは関心事である。特定の状況において、検出要素のアレイにおける検出要素のサイズは２０μｍ２未満であり、好ましくは１０μｍ２未満、より好ましくは５μｍ２未満、より好ましくは２μｍ２未満、より好ましくは１μｍ２未満またはそれに等しい。
【０１１３】
検出要素のアレイは、好ましくは次の領域の１つまたはいくつかにおいて、波長の電磁放射線に対して感受性である：１００ｎｍないし２００ｎｍ、２００ｎｍないし８００ｎｍ、８００ｎｍないし２μｍ、２μｍないし１０μｍ、５μｍないし１０μｍ、１０μｍないし２０μｍ、２０μｍないし４０μｍ。
【０１１４】
シグナルが検出される範囲内の完全な平面角と定義される集束角を最大化する様式で、検出要素に試料からのシグナルをフォーカスするための焦点調整装置の含有は、多くの状況において、評価に対して、改善された状態を付与することが分かっている。
【０１１５】
フォーカス−レンズ
試料の少なくとも一部からのシグナルは、フォーカス手段の使用によって、好ましくは１つのレンズの使用によって、検出要素のアレイにフォーカスされるが、２つのレンズ、または２つを超えるレンズを使用することが可能である。フォーカスシステムに使用されるレンズの数は、いずれかの測定システムの複雑性に作用し得る。
【０１１６】
試料からのシグナルのいずれかの検出器へのフォーカスは、いずれかの検出器に対して相対的な試料の位置によって決まる。測定システムの構築が、試料およびいずれかの検出器の相対的位置が変動し得るならば、システムのフォーカシングを調整することが可能であるというのは有利である。これは、しばしば、まず、試料からのいずれかのシグナルの少なくとも１つの測定を取得し、次いで、これに基づき、システムのフォーカシングを調整することによって達成することができる。許容されるフォーカシングを得るために、この手順を何度も繰り返してもよい。同一の方法で、試料または試料物質からのシグナルのフォーカシングが調整され、ここに、好ましくは、調整の拡張は、試料からのシグナルの少なくとも１つの測定によって決定される。
【０１１７】
本発明のいくつかの好ましい具体例の特性は、本発明を適用する器具の動作時間を通して、同一のフォーカシングを維持することが可能であることである。好ましい具体例において、光学システムを含む要素は、従って、生産の間、しっかりと固定され、好ましくは、それらは、例えば光学システムの要素の接着を介して、不可逆的に固定され、従って、光学部品の整列の意図的なまたは偶然的ないずれの変化も防ぐ。
【０１１８】
使用されるフォーカス配置の集束角は、検出要素のアレイに集められたいずれのシグナルの強度に対しても影響を有し得る。従って、高感度が必要な時には、集束角を増加させるのが実用的である。また、集束角の好ましいサイズは、焦点深度のようなシステムに作られる他の要件によって決定され得る。これらの状況において、フォーカス手段の集束角は、好ましくは少なくとも２度、好ましくは５度以上、より好ましくは１５度以上、より好ましくは２０度以上、より好ましくは５０度以上、より好ましくは１２０度以上、より好ましくは１５０度以上である。
【０１１９】
シグナル
１またはそれを超える検出要素から測定されたシグナルは、計算手段の使用によって、系統的なまたは変動するバイアスで補正されてもよく、該バイアス補正は、１またはそれを超える先に規定された（複数の）値によって達成され、好ましくは、ここに、検出要素の該アレイにおける１またはそれを超える検出要素の各測定されたシグナルは、１またはそれを超える先に規定された（複数の）値を有し、より好ましくは、各先に規定された値は、いずれかの１またはそれを超える先の測定に基づき決定される。
【０１２０】
バイアス補正は、測定されたシグナルから、他の測定の１またはいくつかにおいて入手された結果を引くことによって実施することができ、好ましくは、ここに他の測定は、同一の試料、または試料物質の測定の１またはいくつかであり、より好ましくは、ここに他の測定は、同一の試料または試料物質で先に得られた測定である。
【０１２１】
また、１またはそれを超える検出要素からのシグナルは、計算手段の使用によって強度につき補正することができ、該補正は、１またはそれを超える先に規定された（複数の）値の使用によって達成され、好ましくは、ここに検出要素の該アレイにおける１またはそれを超える検出要素に対する各測定されたシグナルは、１またはそれを超える先に規定された（複数の）値を有し、より好ましくは、ここに各先に規定された値は、１またはそれを超えるいずれかの先の測定に基づき決定される。
【０１２２】
プロセッサー
検出手段によって検出されたシグナルの情報は、処理、表示および所望により情報の保存のために、プロセッサーに入力される。
【０１２３】
粒子の少なくとも１つの質または少なくとも１つの量パラメーターは、検出手段によって検出されるシグナルの処理によって入手される。この処理は、例えば、所定のアルゴリズムを用いる未加工データの得られた質または量パラメーターへの変換を含み得る。また、処理は、例えば実施例において記載されるように、関心のあるシグナルおよびパラメーターの間の関係を明確にする較正曲線または標準曲線の使用を含むことがある。
【０１２４】
シグナル情報は、プロセッサーに接続されたディスプレイに表示されてもよく、および／または印刷されてもよい。表示された情報は、測定されたシグナルおよび／または使用されたシステムに関連する情報のいずれかの種類、例えば数、サイズ分布、形態学、粒子の分類、励起波長、発光波長、拡大であり得る。特に、データ処理手段は、製品の部分的に重複した領域を識別することが可能である。
【０１２５】
計算手段、好ましくは検出要素の合計数の小さな割合に実質的に等しい量の情報を貯蔵できるに過ぎない貯蔵能力を備えたAnalogue Devices(ADSP 2101)から商業的に入手可能なデジタルコンピューターを用いることによって試料のパラメーターの処理および評価をなすことができ、次いで、対象の数の評価は、好ましくは、各検出要素、または検出要素のライン、または検出要素の２以上のラインからの測定された情報が、測定された情報を貯蔵することによって、さもなければ引き起こされるであろう遅延のようないずれの遅延も実質的になくして、評価で用いられるように、実質的にデータのリアルタイム処理に基づく。
【０１２６】
しかしながら、しばしば、好ましくはデジタルコンピューターである第１の計算手段の使用によって、実質的に全ての測定された情報を保存した後に好ましくはデジタルコンピューターといった第２の計算手段による情報を処理することが好ましく、すなわち、測定された情報が、それが得られたのと実質的に同一の速度で、いずれかの情報の測定および同一の情報の処理の間の実質的な時間遅延で処理されるのを可能にし；好ましくは、これは、好ましくは、仕事を達成するのに十分な資源が備わったデジタルコンピューターといった唯一の計算手段を用いることによって達成される。
【０１２７】
片側および両側システム
粒子の検出のための片側および両側システムは、ＷＯ  ０１／７７６４８(Chemometec)から知られている。
【０１２８】
検出機器は、片側機器、つまり、シグナルが検出される側と同じ試料の側から、光が試料に向けられる機器として設計されてもよい。
【０１２９】
また、検出機器は、片側機器として設計されてもよく、ここに試料から発光されるシグナルが検出される側と同じ試料の側から、励起光が試料に向けられる。
【０１３０】
この装置によって、慣用的な蛍光顕微鏡と比べて、様々な利点が達成されている。まず、検出器および励起光の間の試料面にスライドさせる代わりに、試料面で直接的に評価されるように、試料を並べることが可能である。さらに、透明でない試料の表面蛍光を検出することが可能になった。また、検出器を妥協せずに、励起光の強度を増加させることが可能である。
【０１３１】
また、通常、顕微鏡において、試料を並べることが可能でない性質を有する試料を、本システムの使用によって評価することができ、ここに、顕微鏡は試料上に直接置かれて、それにより、試料の表面は、単に試料面を構成する。
【０１３２】
最後に、よりコンパクトで、すなわちより簡単に扱うことができる装置を生産することが可能であり、ここに励起光手段は、検出器と同じ試料面の側に置かれ、従って、慣用的な装置と比較して、装置の軸を少なくとも２５％縮める。
【０１３３】
本発明によって、これまでフローサイトメトリー装置の使用によってのみ確実に評価されてきた試料のパラメーターを評価することが可能である。１度の暴露で大きい試料のパラメーターを評価することが可能であり、すなわち、大きい試料を、その部分のみを、暴露の際に評価することによって評価する時に通常カウントされる統計誤差を減少させる。
【０１３４】
さらに、１度の暴露で、試料から１を超える蛍光シグナルを得ることが可能であり、それにより、それらの異なる蛍光シグナルのため、試料の粒子の分類を促進させる。
【０１３５】
片側および両側励起および検出システムの例
下記において、検出システムの１つの具体例を、図面に関してより詳細に議論する。
【０１３６】
図１８において、照明および検出システム１の例を、図式形態で示す。試料を、試料面の試料区画において並べる。励起光手段３における光源４ａ、４ｂからの励起光は、主要光路５ａ、５ｂを介して、試料へと暴露される。
【０１３７】
試料からの蛍光シグナルは、少なくとも１つの検出器７を含む検出手段６に発光される。発光されたシグナルの路は、試料および検出器の間の軸、検出−試料軸８に続く。
【０１３８】
シグナルデータは、検出手段６に連関したプロセッサーに伝達される。試料からの蛍光シグナルは、発光フィルター１４の手段によって濾過され、フォーカシングレンズ１０の手段によって、検出手段９にフォーカスされる。
【０１３９】
光源４ａ、４ｂは光モジュール１１内に並べられ、そのため励起光の検出手段への直接的な伝達は避けられ、それによりシステムの相対的なシグナル対ノイズ比が増加する。さらに、励起光フィルター１２ａ、１２ｂは、励起光ビーム内に置かれる。
【０１４０】
図１９は、励起光フィルターの円形支持物質１３の断面を示し、ここに、光源の位置は、破線の円によって示されている。
【０１４１】
図２０において、光路およびシグナル路をより詳細に示す。光路において、主要な光路は５と示す。さらに、検出−試料軸を破線８で示す。システムの集束角は、２つの矢印の間に示されたＣと示され、主な光源および検出−試料軸の間の角度はＥと示される。
【０１４２】
図２１において、両側発光／検出システム１が示され、ここに、試料の各側におけるシステムが同一であり、図１の片側システムにつき記載のとおりである。
【０１４３】
図２２は、両側励起システムを示し、ここに、第１の励起光手段３における光源４ａ、４ｂからの励起光および第２の励起光手段３ｂにおける光源４ｃ、４ｄからの励起光は、試料２の両側から試料２へと暴露される。上記のように、光源は評価される情報によって、同一であってもあるいは異なっていてもよい。さらに、各光源に使用されるフィルターは、異なっていてもあるいは同一であってもよい。
【０１４４】
蛍光シグナルは、励起光配置のため、試料を通して伝達され、それから反射され、検出手段６へと発光される。発光されたシグナルの経路は、試料および検出器の間の軸、検出−試料軸８に続く。
【０１４５】
上記のように、シグナルデータは、検出手段に連関されたプロセッサーに伝達される。
【０１４６】
図２３は、片側発光システムを用いる両側検出システムを示し、ここに試料２から反射された蛍光シグナルは、検出器７ａを含む検出手段６ａによって検出される。反射された蛍光シグナルはフィルター１４ａを介して伝達され、レンズ１０ａによってフォーカスされる。
【０１４７】
さらに、試料２から伝達された蛍光シグナルは、検出器７ｂを含む検出手段６ｂによって検出される。反射された蛍光シグナルは、フィルター１４ｂを介して伝達され、レンズ１０ｂによってフォーカスされる。
【０１４８】
フィルター１４ａは、好ましくはフィルター１４ｂと異なり、少なくとも２つの異なる蛍光シグナルに関連する情報が入手可能である。
【０１４９】
また、２つの検出システムにおける拡大は異なっていてよく、例えば、レンズ１０ａはレンズ１０ｂと異なる。
【０１５０】
図２４は、１つの好ましいイメージングシステムの構築を示し、ここに最大４つの互換性のある発光フィルター１４が、モーター１４０によって回転させることができる輪に置かれる。この構築の励起光モジュール１１は、最大１０２の発光ダイオード（ＬＥＤ）を含み、これは独立して作動される同一の型、または異なる型のものであってもよい。ＬＥＤからの光は、フレスネルレンズ(Frenel Optics, Germany, カタログ番号０２５６０００１，  ＳＣ２５６  ＦＬ＝２５．４ｍｍ，収斂非球面レンズ)によって、試料２にフォーカスされる。１を超える励起光の波長および１を超える発光波長の組合せによって、この構築は、順次にイメージを暴露する方法によって、２またはそれを超える検体の検出に適しているようになる。
【実施例】
【０１５１】
実施例１
ヒト血液細胞上の特異的な表面マーカーの検出および定量化の実験的研究
手順
較正曲線を、ＩｇＧ１／フィコエリトリン（ＰＥ）染色対照血液試料中に希釈された既知の蛍光強度（ＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅＰＥビーズ, Becton-Dickinson,カタログ番号３４０４９５）でビーズを測定することによって、構築した。図７ないし１０に基づき、蛍光ビーズの４つの集団のうちの３つを検出し識別することが可能であり、ここに、バックグラウンドレベルを超えるビーズの３つの異なる集団がある（データのある表２も参照）。ビーズの少なくとも４つの異なる集団を識別するために、ビーズの２つの異なるロットを測定した。これによって、積分蛍光強度（ＩＦＩ）および測定される個々の対象上の蛍光ＰＥ分子の数の間の相関を明確にする較正曲線の構築を可能にした(製造者, Becton-Dickinson ＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅＰＥビーズ カタログ番号340495から知られている)。較正曲線は、もちろん、電子設定および使用される化学的手順に対して特異的である。較正曲線に対するより多くのポイントを得るために、ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ(Becton-Dickinson ＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅＰＥビーズ  カタログ番号３４０４９５)の２つの異なるロットを使用した。ロット２０９７７およびロット３２４１７を使用した。ビーズは、＜１０μｍの直径を有する。
【０１５２】
ＰＢＳにおけるビーズ較正曲線：
０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ３１００(消泡試薬, BASF Performance Chemicals Division)の入ったＰＢＳ緩衝液中の分析前のＢＤ  ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅ  ＰＥビーズカタログ番号３４０４９５。
【０１５３】
ＩｇＧ１／ＰＥ対照試料におけるビーズ較正曲線：
分析前に、ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズを、ＩｇＧ１／ＰＥ染色対照血液試料中に溶解した（下記参照）。ビーズを溶解する前に、ビーズ試料を、ＰＢＳ緩衝液中で、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ３１００(消泡試薬, BASF Performance Chemicals Division)によって、１：４で先に希釈した。
【０１５４】
フローサイトメトリー分析のための一般的な商業的「洗浄なし」手順を、ヒト末端血液細胞（全血, EDTA抗−凝固）上の細胞表面マーカーを染色するのに使用した。染色手順は、分析前に、遠心分離または細胞の洗浄を必要としない(DAKO Uti-lyse S-3350, 「洗浄なし」プロトコル, DAKO A/S, Denmark)。
【０１５５】
抗体は、抗−ＣＤ３／ＰＥ(Sigma P-5810)、抗−ＣＤ４／ＰＥ(Sigma P-7562)、抗−ＣＤ８／ＰＥ(Sigma P-5560)、抗−ＣＤ４５／ＰＥ(Sigma P-7687)、マウスアイソタイプ陰性対照ＩｇＧ１／ＰＥ(Sigma P-4685)、ＩｇＧ２ａ／ＰＥ(Sigma P-4810)であった。プロトコルは、試薬の製造者らによって記載されているとおりに実施した(DAKO Uti-Lyse カタログ番号S-3350)。分析前に、試料を、ＰＢＳ緩衝液中で、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００(消泡試薬, BASF Performance Chemicals Division)によって、最大で４回希釈した。
【０１５６】
暴露時間は、全イメージにつき２秒であり（暴露時間が３秒であったＣＤ４を除く）、横拡大は１に近い（ＭＴ＝０．９８）。１つのイメージを捕らえ、処理しデータを保存し、キュベットを介して液体を動かす時間は、約５秒である。２０ないし４０イメージの全ては、約１００ないし２００秒で捕らえられた。
【０１５７】
「洗浄なし」染色手順：
１．１００μＬの抗凝固（ＥＤＴＡ）全血を添加する。
２．血液に特異的なコンジュゲーテッド抗体を１０μＬ添加し、ボルテックスし、３０分間インキュベートする。
３．１００μＬの試薬Ａ（固定試薬）を添加し、ボルテックスし、１０分間インキュベートする。
４．１ｍＬの試薬Ｂ（溶血試薬）を添加し、ボルテックスし、１５分間インキュベートする。
５．０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００（消泡試薬）を持つＰＢＳ緩衝液を３ｍＬ添加して、約１：４で希釈する。
６．ChemoMetec蛍光検出およびイメージングシステム上で、試料を分析する。
【０１５８】
次いで、全血からの総希釈は、上記「洗浄なし」プロトコルが使用される時、約３８回である。
【０１５９】
試料を、１ｍＬシリンジ（図３の図を参照）を用いて、試料キュベットに注入することによって分析する。キュベット（示されず）から延びる配管に、配管スクイーズ−ストッパーを付着させることによって、イメージを捕獲する前に、流体を止める。
【０１６０】
実験装置
図１の図は、元来NucleoCounter ChemoMetec製品からの修飾された顕微鏡モジュールを示す。実験システムの図は、図２に示される。レンズおよびフィルターは修飾されている。修飾されたモジュールは、開口数（ＮＡ＝約０．１０）を増加させたが、なお低い横拡大（ＭＴ＝約０．９８）であった。
【０１６１】
セッティングおよびスペック：
対象サイズ識別：６ピクセル(incl.)
細胞カウント閾値＝１０ＩＦＩ（一般的にバックグラウンド対象はＩＦＩ＜１０を有した）
未加工イメージバックグラウンド、中央値フィルター最大（幅＝４１）：１０
暴露時間：２秒（”Ｄ１９”＝７、暴露時間＝３秒であるＣＤ４を除く）
暴露時間コード：暴露＝０．２６６ｘ（＋”Ｄ１９”）
設定：利得＝８５、オフセット＝１２０、範囲＝２００（利得＝９０であるＣＤ３およびＤ１９＝１１であるＣＤ４を除く)
ＰＣ型：Dell Inspiron 2500（Intel Pentium III，８００ＭＨｚ，１２８Ｍｂ  ＲＡＭ，ＵＳＢポート付きのラップトップ）
ＰＣソフトウェア:
オペレーションシステム：Microsoft Windows 2000 (Microsoft)
NI LabVIEW v.6i (National Instruments, Texas USA)
NI IMAQ vision (National Instruments, Texas USA)
イメージ深度：８ビット（２５６色グレースケール）
ＣＣＤ型：SONY ICX404AL, ５１０ｘ４９２ピクセル、インターレース読み取り(イメージは５１０ｘ２４６ピクセルである)
ＣＣＤ物理的サイズ：４．９０ｍｍｘ３．６９ｍｍ（４：３スケール）
発光フィルター：Omega 510LAF21 （φ＝２５．０ｍｍ）およびFerroperm 2xSWP550+IRブロック（φ＝２５．０ｍｍ）
発光フィルター：Ferroperm OG560+2xLWP575（φ＝２５．０ｍｍ）
レンズタイプ：Edmund Scientific部品番号４５４００．ＥＦＬ＝２５．０ｍｍ
光学システムＮＡ＝約０．１０
光学システムＭＴ＝ＳＱＲＴ（（４．９０ｘ３．６９ｘ１０１．２）／１９０５））＝約０．９８（１に近い）
ドットキュベットグリッドスペック：１０１．２ドット同等１．００ｍｍ２
観察：
平均細胞領域：約２．８ないし３．１ピクセル
（高ＩＦＩを持つ対象は、低ＩＦＩを持つ対象より大きい平均領域を有した）
【０１６２】
実験的「二重トリプレットシステム」（図１）の構成要素は、下記表１にリストする。
【０１６３】
【表２】
2006504937.tif 000003
表１「二重トリプレット」検出システム構成要素：
【０１６４】
イメージデータ処理
イメージデータは、多くの異なる方法で処理されて、分析される対象のための均一な分布パターンを得ることができる。
【０１６５】
この実験システムにおいて、対象のイメージングおよびカウンティングは、LabVIEW, National Instrumentsに基づくソフトウェアを持つＰＣで行われた。また、蛍光対象のカウントは、ChemoMetec顕微鏡モジュール（図１の左）による各イメージ捕獲の間に行った。２つの方法は、個々のイメージに対して同様のカウントを所与したが、イメージの捕獲の後にＰＣソフトウェア分析において可能なように、モジュールは複数のイメージからのデータを要約しなかった。従って、１を超えるイメージに関する分析をＰＣベースソフトウェアで行った。
【０１６６】
ＰＣベースソフトウェアイメージング操作の一般的な記載：
１．幅の広い中央値フィルター（幅＞４０ピクセル）を各寸法上で使用して、イメージプロファイルを排除し、次の作業のためにＳ／Ｎ−率を高めた。
２．単純な閾値化操作を次のものと併せて使用した
３．対象の検出のための対象サイズ識別（ピクセル／対象の最大数）
４．強度の統合、各対象の積分蛍光強度（ＩＦＩ）の計算。
【０１６７】
このシステムに使用される他の潜在的な方法:
マスキングによるバックグラウンド差し引き
イメージ内の分布パターンの決定のためのゾーン検出、
複数のイメージのための統計学的変動分析（例えば、特定の範囲の総数に対するおおよそのＣＶ％分析、データの経験的範囲）を使用することができる。
【０１６８】
図５および図６のようなイメージから作成された、濾過され閾値化されたイメージを、バックグラウンド（中央値フィルター最大値）を超えるＩＦＩを有する対象の同定に対して、自動的に処理した。強度を各対象にわたり統合し、得られたデータをヒストグラムにプロットした。２０ないし４０の異なるイメージからのデータを、約１５μＬないし約３０μＬの試料混合物の総容量に対応して、要約した。試料混合物を、分析前の従来の免疫染色の後、最大４回、希釈した。上記「洗浄なし」プロトコルを使用した後、合計で約３８回、全血から希釈する。
【０１６９】
単一のイメージの処理は、ＰＣベースのソフトウェアを用いて、約０．２秒未満を要した。
【０１７０】
２０ないし４０の異なるイメージからのデータを要約し、ヒストグラムにプロットし、それから異なる集団幾何平均ＩＦＩは、マニュアルゲーティングおよび通常の表計算操作（MS Excel）を用いて予測することができた。
【０１７１】
結果−イメージデータおよびヒストグラム
全染色によって、本発明の実験的システムを用いて、上手く検出され、定量化された細胞を得た。マウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａは両方とも陰性であった。
【０１７２】
図７ないし図１７において、ＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズの検出および定量化からのおよびＰＥコンジュゲーテッド抗体で染色されたヒト末端血液細胞の検出からのイメージの例を示す。
【０１７３】
イメージの一般的印象は、異なるスペーシング（例えば３０−１４０μｍ）を、細胞シグナルの定量的測定に影響を及ぼさずに使用することができることを示唆した。
【０１７４】
【表３】
2006504937.tif 000004
【０１７５】
表２  図７ないし１０からのデータ。「洗浄なし」手順記載とおりに作成された、先に希釈されたＩｇＧ１／ＰＥ対照血液試料中のＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥ  ビーズロット２０９７７（ｂ）およびロット３２４１７（ａ）。データは、MS ExcelおよびNational Instuments LabVIEWソフトウェアを用いて計算し、予測している。約３，０００ビーズが、各データポイントにつき検出された。
【０１７６】
ＩｇＧ２ａ／ＰＥ染色マウスアイソタイプ対照試料から、マウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１／ＰＥ（図１７）に対するものと同様の結果を得た。図１７は、システムの検出限界を規定するバックグラウンドレベルを示す。
【０１７７】
図１３ないし１６のデータに基づき、示差血液細胞カウントの次の概要を作成した：
【０１７８】
【表４】
2006504937.tif 000005
【０１７９】
表３  陽性細胞の通常範囲は、Hall (1991) and Kuby (1994)からおよびWinthereik, M.P. (1995)からのデータから概算する。 Hall, R. and Malia, G. (1991) Medical Laboratory Haematology, Butterworth Heinemann, Oxford Press.; Kuby, J. (1994)  Immunology, W.H.Freeman and Co.; Winthereik, M.P. (1995, DAKO A/S, Denmark). Unpublished reference data, DAKO production QC.
【０１８０】
結論
蛍光対象の検出のための本発明による実験的蛍光システムを使用して、フローサイトメトリー用の一般的な「洗浄なし」免疫染色プロトコルを用いて、ヒト末端血液細胞に対する蛍光分子を検出し定量化することができる。ヒト白血球上の測定されたディファレンシャルパーセンテージカウント（リンパ球の％）は、そのような分析に対して、通常範囲内であるように見受けられる。
【０１８１】
さらに、異なる細胞型の異なるＣＤマーカーに対する抗体結合能（ＡＢＣ）を、ここで構築されたものと同様の較正曲線を用いることによって、および既知の蛍光色素／抗体率を持つ抗体を用いることによって、予測することができる。また、免疫染色細胞の容量差異計算は、技術のさらなる発展によって可能であるように思われる。
【０１８２】
システムの検出限界および感受性および一般的性能は、さらに、光学、電子工学、化学および流体システム設計の最適化によって、高めることができる。ヒト診断の分野および例えば、食物分析産業、水分析産業および関連分野（下記リスト参照）といった同様の分野につき、多くの適用において、該システムを使用することができる可能性が非常に高い。
【０１８３】
本発明による技術の関連のための診断技術：
例えば、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２２、ＣＤ３４、ＣＤ６１のような個々の細胞または粒子のレベルでの表面分子の検出／定量化
細胞内起源(例えば、蛋白質または核酸)を有する分子の検出
異常細胞または異常状態に対するマーカーである分子の検出
血液または体液における有核細胞の濃度における変動の検出（例えば、血液中の有核ＲＢＣの増加された濃度）
細菌または細菌に関する構成要素の検出
【０１８４】
技術を利用することができる臨床適用のうちのいくつか：
免疫染色白血球のディファレンシャルカウンティング
白血病およびリンパ腫の免疫表現型分析
微小残存病変の検出
ステム細胞列挙
ウィルス感染
免疫不全症
網状赤血球分析
血小板機能
食作用の測定
細胞周期関連蛋白質の発現の測定
【０１８５】
実施例２
制限された数の検体位置による粒子の評価に関する本発明の実現可能性の捜査
１ｘ１０６の検体検出可能位置未満の量で、検体によって粒子を検出する実現可能性の一連のテストを行った。全てのテストにおいて、検出システムは、約１の横拡大のために設定された、図２４に示されるシステムと同等であった。
【０１８６】
テスト１−ＰＥビーズ
ＰＥの検出を:０．２％  Ｌ３１の入ったＰＢＳ、ブロック重合体界面活性剤（BASF chemicals, Germany）中で懸濁されたＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅ  ＰＥビーズ(BD, USA カタログ番号３４０  ４９５）を用いて捜索した。励起のために、ＳＷＰ  ５３０ｍｎ(Ferroperm, Denmark)で濾過された５１７ｍｎのＬＥＤの放射（Nichia, Japan, P/N  NSPG300A)を使用した。発光された蛍光を５６５ＡＬＰ(Omega Optical, USA)で濾過した。
ＰＥに対して予測された検出限界は、ＰＢＳにおいて２７８０  ＭＥＳＦ  ＰＥであった。
【０１８７】
テスト２−ＦＩＴＣビーズ
ＦＩＴＣの検出を：０．２％  Ｌ３１を有するＰＢＳ、ブロック重合体界面活性剤(BASF chemicals, Germany)中で懸濁されたＱｕａｎｔｕｍ  ２５  ＦＩＴＣビーズ、高レベル(BANGs labs. カタログ番号８２５，  ７．３０μｍ)を用いて捜索した。励起のために、ＳＷＰ４７５(Ferroperm, Denmark)で濾過された４７０ｍｎのＬＥＤの照射(Nichia, Japan, P/N NSPB300A)を使用した。放射された蛍光を５２０ＤＦ４０，  ＸＦ３００３(Omega Optical, USA)で濾過した。
FITCに対する推定される検出限界は、ＰＢＳにおいて１０，０００  ＭＥＳＦ  ＦＩＴＣであった。
【０１８８】
テスト３−ＰＥ−Ｃｙ５ビーズ
ＰＥ−Ｃｙ５の検出を：０．２％  Ｌ３１を有するＰＢＳ、ブロック重合体界面活性剤（BASF chemicals, Germany）中に懸濁したＱｕａｎｔｕｍ  ２５  ＰＥ−Ｃｙ５、中レベル(Bangs labs.カタログ番号８２８，  ７．４０μｍ)を用いて捜索した。励起のために、ＳＷＰ  ５３０ｍｎ(Ferroperm, Denmark)で濾過された５１７ｍｎのＬＥＤの放射(Nichia, Japan, P/N  NSPG300A)を使用した。発光された蛍光をＬＷＰ  ６５０(Ferroperm, Denmark)で濾過した。
ＰＥ−Ｃｙ５に対する予測された検出限界は、ＰＢＳにおいて７５０  ＭＥＳＦ  ＰＥ−Ｃｙ５であった。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】実験的「二重トリプレットシステム」の概略図。顕微鏡ChemoMetecモジュールを、レンズおよび光学要素を変え、動かすことによって修飾して、フィルターを変えることによって、低い横拡大（ＭＴ＝０．９８）を有するより大きい開口数（ＮＡ＝約０．１０）を得た。４０μｍのスペーシングを有するフローキュベットを使用し、キュベットフロー路は幅８ｍｍであった。距離単位はｍｍである。構成要素は、下記表１にリストする。
【図２】LED PCB（右）に向かって取り付けられた、前（左）および後ろを示す８つのＬＥＤを有するＬＥＤ備品の透視図。直径は、約３０ｍｍである。
【図３】実験的セットアップの図。顕微鏡モジュール（左）を、レンズを変えることによって修飾して、フィルターを変えることによって、低い横拡大（ＭＴ＝０．９８）を有するより大きい開口の数（ＮＡ＝約０．１０）を得た。蛍光対象の計数を、モジュール（左）によって分析の間およびＰＣソフトウェア（LabVIEW, National Instrumentsに基づく）によって、分析の後でも行った。
【図４】フィルターのための光学的特徴およびＲ−ＰＥ（Ｒ−フィコエリトリン）およびＬＥＤのためのスペクトラム。フィルターは、Ｒ−ＰＥから放射された光の検出のために最適化されている。
【図５】抗−ＣＤ８／ＰＥコンジュゲーテッド抗体で染色されたヒト末端血液細胞の検出および定量化からのイメージ（スクリーンダンプ、例）(希釈工程５が省かれることを除いては「洗浄なし」手順に記載のとおり)。イメージは、約０．７５μｌの容量に対応し、これは記載される「洗浄なし」プロトコルが使用される時の希釈されていない全血の約０．０２μＬに対応する。
【図６】ＩｇＧ１／ＰＥ染色対照血液試料中で希釈されたＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズの検出および定量化からのイメージ。ビーズを溶解する前に、ＩｇＧ１／ＰＥ染色対照血液試料を、「洗浄なし」手順記載のとおりに、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ緩衝液中で予め希釈した。イメージは、約０．７５μｌの容量に対応し、これは記載された「洗浄なし」プロトコルが使用された時の希釈されていない全血の約０．０２μＬに対応する。
【図７】０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中のＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ（ロット３２４１７）を、個々の積分蛍光強度によって、ヒストグラムにプロットする。総約１０，５００事象がイメージされ、そのうちの約９，５００事象がビーズ(検出された３つの集団)である。１ピクセルおよびＩＦＩ（積分蛍光強度）＜１０のサイズを有する対象は、検出限界（バックグラウンド）に非常に近い対象である。閾値＝７。集団幾何平均ＩＦＩは、約１２０、５３、１８（右から左の集団）であり、ビーズ集団は、１ビーズにつき、約７８，０００、３７，０００、および１３，４００ＰＥ分子（平均）（右から左の集団）を含有する。
【図８】０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中のＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ（ロット２０９７７）を、個々の積分蛍光強度（ＩＦＩ）によって、ヒストグラムにプロットする。総１０，１９２事象がイメージされ、そのうち約９，５００事象がビーズである。１ピクセルおよびＩＦＩ＜１０のサイズを有する対象は、検出限界（バックグラウンド）に非常に近い対象である。閾値＝７。集団幾何平均ＩＦＩは、約２９０、５１、１９（右から左の集団）であり、ビーズ集団は、１ビーズにつき約１８２，０００、３６，６００、および１４，０００ＰＥ分子(平均)（右から左の集団）を含有する。
【図９】（「洗浄なし」手順に記載のとおり、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００と、ＰＢＳ中で希釈した）ＩｇＧ１／ＰＥ対照血液試料中のＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ（ロット３２４１７）を、個々の積分蛍光強度（ＩＦＩ）によって、ヒストグラムにプロットする。合計で約１０，００２事象がイメージされ、そのうち約９，２００事象がビーズである。１ピクセルおよびＩＦＩ＜１０のサイズを有する対象は、検出限界(バックグラウンド)に非常に近い対象である。閾値＝７。集団幾何平均ＩＦＩは、約１５０、６２、２０（右から左の集団）であり、ビーズ集団は、１ビーズにつき、約７８，０００、３７，０００、および１３，４００ＰＥ分子（平均）（右から左の集団）を含有する。
【図１０】（「洗浄なし」手順に記載のとおりに、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中で希釈した）ＩｇＧ１／ＰＥ対照血液試料中のＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ（ロット２０９７７）を、個々の積分蛍光強度（ＩＦＩ）によって、ヒストグラムにプロットする。合計で約１０，５００の事象がイメージされ、そのうち約９，５００の事象がビーズである。１ピクセルおよびＩＦＩ＜１０のサイズを有する対象は、検出限界（バックグラウンド）に非常に近い対象である。閾値＝７。集団幾何平均ＩＦＩは、約３０５、５３、１８（右から左の集団）であり、ビーズ集団は、１ビーズにつき、約１８２，０００、３６，６００および１４，０００ＰＥ分子（平均)（右から左の集団）を含有する。
【図１１】表２からのデータを用いる較正曲線。０．５％  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ緩衝液中のＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ。
【図１２】表２からのデータを用いる較正曲線。予め希釈したＩｇＧ１／ＰＥ染色血液中で希釈されたＱｕａｎｔｉＢｒｉｔｅＰＥビーズ。ＩｇＧ１／ＰＥ免疫染色血液を、「洗浄なし」手順に記載の通りに、０．５％  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中で予め希釈した。
【図１３】ＣＤ３＋細胞を、積分蛍光強度（ＩＦＩ）に従い、ヒストグラムにプロットする。約８２４の対象が検出され、そのうち約４８０がＣＤ３＋細胞として出現した。分析されている約０．６２５μＬの全血に対応する合計４０イメージ。セッティングは個々の染色手順につき最適化されていないが、図２および３と同じである。「洗浄なし」手順に記載のように、抗−ＣＤ３／ＰＥ免疫染色血液を、ＰＢＳ中で、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００で予め希釈した。
【図１４】積分蛍光強度（ＩＦＩ）に従い、ＣＤ４＋細胞をヒストグラムにプロットする。約３８７の対象が検出され、そのうち約２０２がＣＤ４＋細胞として出現する。分析されている約０．３１３μＬの血液に対応する合計２０イメージ。セッティングは個々の染色手順につき最適化されていないが、図２および３と同じである。抗−ＣＤ４／ＰＥ免疫染色血液は、「洗浄なし」手順に記載のとおりに、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中で予め希釈した。
【図１５】積分蛍光強度（ＩＦＩ）に従い、ＣＤ８＋細胞をヒストグラムにプロットする。 約５２３の対象が検出され、そのうち約４１０がＣＤ８＋細胞として出現する。分析されている約１．２５μＬの血液に対応する合計２０イメージ。セッティングは個々の染色手順につき最適化されていないが、図２および３と同じである。「洗浄なし」手順において、抗−ＣＤ８／ＰＥ免疫染色血液は希釈しなかった（工程５を省く）。
【図１６】個々の積分蛍光強度に従い、ＣＤ４５＋細胞をヒストグラムにプロットする。約４，１００の対象が検出され、そのうち約２，２００がＣＤ４５＋細胞として出現した。分析されている約０．６２５μＬの血液に対応する合計４０のイメージ。セッティングは個々の染色手順につき最適化されていないが、図２および３と同じである。抗−ＣＤ４５／ＰＥ免疫染色血液を、「洗浄なし」手順に記載のとおりに、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中で予め希釈した。
【図１７】マウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１／ＰＥ。対象を、個々の積分蛍光強度によって、ヒストグラムにプロットする。合計で２８０の対象が検出され、そのうち１０ないし２０の対象のみが細胞として出現する。分析されている約０．３１３μＬの血液に対応する合計２０のイメージ。セッティングは個々の染色手順につき最適化されていないが、図２および３と同じである。ＩＦＩ＞１０を有する対象のほとんどは、ＣＣＤの較正によって修正することができるホット−ピクセルである。ＩｇＧ１／ＰＥ免疫染色血液を、「洗浄なし」手順に記載のとおりに、０．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＰＥ３１００を有するＰＢＳ中で予め希釈した。
【図１８】図１８は、片側励起システムを示す。
【図１９】図１９は、試料面に対して平行な面の励起光フィルターの横断面を示す。
【図２０】図２０は、集束角Ｃおよび励起主要光路および検出−試料軸の間の角度Ｅを示す。
【図２１】図２１は、両側励起／検出システムを示す。
【図２２】図２２は、両側励起システムを示す。
【図２３】図２３は両側検出システムを示す。
【図２４】図２４（ａおよびｂ）は、互換性のある発光フィルターを持つ両側検出システムを示す。
【図１】
2006504937.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2006504937.tif 000013
【図９】
2006504937.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2006504937.tif 000018
【図１４】
2006504937.tif 000019
【図１５】
2006504937.tif 000020
【図１６】
2006504937.tif 000021
【図１７】
2006504937.tif 000022
【図１８】
2006504937.tif 000023
【図１９】
2006504937.tif 000024
【図２０】
2006504937.tif 000025
【図２１】
2006504937.tif 000026
【図２２】
2006504937.tif 000027
【図２３】
2006504937.tif 000028
2006504937.tif 000029
2006504937.tif 000030
【国際調査報告】
2006504937.tif 000031
2006504937.tif 000032
2006504937.tif 000033