(57)【要約】非侵襲的で危険を有さない出生前診断方法が提供される。本発明の方法によれば、胎児の性別を決定するために、かつ／または、胎児の染色体異常を同定するために、経子宮頸標本は、栄養膜特異的免疫染色に供され、続いてＦＩＳＨおよび／またはＰＲＩＮＳ分析に供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の性別を決定し、かつ／または、胎児の少なくとも１つの染色体異常を同定する方法であって、
（ａ）栄養膜含有細胞サンプルを免疫学的に染色して、それにより、少なくとも１個の栄養膜細胞を同定すること、および
（ｂ）前記少なくとも１個の栄養膜細胞をインシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析に供して、それにより、胎児の性別を決定し、かつ／または、少なくとも１つの染色体異常を同定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記栄養膜含有細胞サンプルは子宮頸部および／または子宮から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記栄養膜含有細胞サンプルは、吸引、細胞採取用ブラシ、綿棒、子宮頸内洗浄および子宮内洗浄からなる群から選択される方法を使用して得られる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記栄養膜細胞サンプルは妊娠の第６週〜第１５週の妊婦から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫学的に染色することは、栄養膜特異的抗原に対する抗体を使用して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記栄養膜特異的抗原は、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＬＡＰ、ＰＡＲ−１、Ｇｌｕｔ１２、Ｈ３１５、ＦＴ１．４１．１、Ｉ０３、ＮＤＯＧ−１、ＮＤＯＧ−５、ＢＣ１、ＡＢ−３４０、ＡＢ−１５４および第ＸＩＩＩ因子からなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析は、蛍光インシチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／またはプライムド・インシチュウ標識化（ＰＲＩＮＳ）を使用して行われる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの染色体異常は、異数性、転座、サブテロメア再配置、欠失、微小欠損、逆位および重複化からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記染色体異数性は完全トリソミーおよび／または部分的トリソミーである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記トリソミーは、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、１６トリソミー、ＸＸＹ、ＸＹＹおよびＸＸＸからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記染色体異数性は完全モノソミーおよび／または部分的モノソミーである請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノソミーは、Ｘモノソミー、２１モノソミー、２２モノソミー、１６モノソミーおよび１５モノソミーからなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経子宮頸試料に由来する栄養膜細胞を使用して遺伝的異常を診断する方法に関連し、より具体的には、胎児の性別および／または胎児における染色体異常を明らかにするための栄養膜細胞の生化学的分析および遺伝子分析に関連する。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断では、ヒト胎児に存在する重大または軽度の胎児の奇形または遺伝的疾患の同定を必要とする。超音波走査では、通常、神経管、心臓、腎臓および四肢などに関わる奇形などの構造的奇形を検出することができる。他方で、様々な染色体異常、例えば、過剰染色体の存在［例えば、２１トリソミー（ダウン症候群）；クラインフェルター症候群（４７、ＸＸＹ）；１３トリソミー（パトー症候群）；１８トリソミー（エドワーズ症候群）；４７、ＸＹＹ；４７、ＸＸＸ］、染色体の非存在［例えば、ターナー症候群（４５、Ｘ０）］、または、様々な転座および欠失などを、現在、絨毛生検（ＣＶＳ）および／または羊水穿刺を使用して検出することができる。
【０００３】
現在、出生前診断は、３５歳を超える女性に対して、かつ／または、平衡転座または微小欠損（例えば、アンゲルマン症候群）などの遺伝的疾患の知られている保因者である女性に対して勧められている。従って、ダウン症候群などに対する染色体異常を有する子供を出産する３５歳を超える女性の割合が劇的に減少してきている。しかしながら、出生前検査がより若い女性では行われていないということにより、ダウン症候群新生児の８０％が実際には３５歳未満の女性に生まれているという驚くべき統計がもたらされた。
【０００４】
ＣＶＳは通常、カテーテルを子宮頸部から挿入するか、または、ニードルを腹部内に挿入し、胎盤の少量のサンプル（すなわち、絨毛）を取り出すことによって妊娠の第９週〜第１４週の間で行われる。胎児の核型が通常、ＣＶＳ処置の１週間〜２週間の内に明らかにされる。しかしながら、ＣＶＳは、侵襲的な処置であるので、処置に関連した流産の危険性が２％〜４％あり、また、おそらくは、吸引された胎盤組織からの出血または塞栓形成に起因すると考えられるが、不完全な四肢発達などの胎児異常の危険性の増大を伴い得る（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｄ他、１９９９、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２：５２１〜５３１）。
【０００５】
他方で、羊水穿刺は、薄いニードルを腹腔から子宮内に挿入することによって妊娠の第１６週〜第２０週の間で行われる。羊水穿刺処置は、処置に関連した流産の危険性が０．５％〜１．０％ある。羊水を吸引した後、胎児の繊維芽細胞が１週間〜２週間さらに培養され、その後、繊維芽細胞が細胞遺伝的分析（例えば、Ｇバンド染色）および／またはＦＩＳＨ分析に供される。従って、胎児の核型分析が、細胞をサンプリングした２週間〜３週間の内に得られる。しかしながら、異常を発見した場合、妊娠中絶が通常、妊娠の第１８週〜第２２週の間で行われ、これには、Ｂｏｅｒｏ手技（心理学的および臨床的な側面の点でより複雑な処置）を伴う。
【０００６】
これらの制限を克服するために、非侵襲的処置を使用して胎児細胞を同定および分析するいくつかの方法が開発されていた。
【０００７】
１つの方法は、妊娠第一期の期間中の母体血液における、胎児の栄養膜、白血球および有核赤血球などの胎児細胞の発見に基づいている。しかしながら、母体血液からの栄養膜の単離はその多核化した形態および抗体の入手性によって制限される一方で、白血球の単離は、母体の白血球を胎児の白血球から区別する特異な細胞マーカーがないことによって制限される。さらに、白血球は２７年もの長い期間にわたって母体血液中に存続し得る（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｊ他、１９７４、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１７：３４６〜３６０；Ｂｉａｎｃｈｉ  ＤＷ他、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３：７０５〜７０８）ので、残存細胞が、以前の妊娠期間から母体血液中に存在している可能性があり、そのような細胞に対する出生前診断を事実上不可能にしている。
【０００８】
他方で、有核赤血球（ＮＲＢＣ）は９０日の比較的短い半減期を有しており、このことは有核赤血球を出生前診断のための優れた候補にしている。しかしながら、いくつかの研究では、母体血液から単離されたＮＲＢＣの少なくとも５０％が母体起源であることが見出されている（Ｓｌｕｎｇａ−Ｔａｌｌｂｅｒｇ  Ａ他、１９９５、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、９６：５３〜７）。さらに、母体血液中の有核胎児細胞の頻度がことのほか低い（０．００３５％）ので、ＮＲＢＣ細胞を、（例えば、Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ遠心分離またはＰｅｒｃｏｌｌ勾配密度遠心分離を使用して）最初に精製し、次いで、例えば、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ、Ｂｕｓｃｈ，Ｊ．他、１９９４、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１４：１１２９〜１１４０）、強磁性流体懸濁（Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｄ．他、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、３９：８０１〜８１３）、電荷流分離（Ｗａｃｈｔｅｌ，Ｓ．Ｓ．他、１９９６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、９８：１６２〜１６６）またはＦＡＣＳ（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｙ．他、２０００、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３９：２２４〜２３０）を使用して濃縮しなければならない。しかしながら、そのような精製工程および濃縮工程は胎児細胞の回収が一定せず、また、胎児の性別の診断する際の感度を制限していた（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｆ．Ｚ．他、２００２、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒ．Ｕｐｄａｔｅ、８：４９３〜５００に総説される）。従って、技術的問題、大きな費用、および、細胞の起源の不確実さの組合せにより、この方法が臨床的に受け入れられることを妨げている。
【０００９】
別の方法は、子宮頸管における（胎盤から脱落した）栄養膜細胞の存在に基づく［Ｓｈｅｔｔｌｅｓ  ＬＢ（１９７１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｏｎｄｏｎ、２３０：５２〜５３；Ｒｈｉｎｅ  ＳＡ他（１９７５）、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ、１２２：１５５〜１６０；ＨｏｌｚｇｒｅｖｅおよびＨａｈｎ（２０００）、Ｃｋｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ、１４：７０９〜７２２］。栄養膜細胞は、（ｉ）吸引、（ｉｉ）細胞採取用ブラシまたは綿棒、（ｉｉｉ）子宮頸管内洗浄、または（ｖｉ）子宮内洗浄を使用して子宮頸管から取り出すことができる。
【００１０】
栄養膜細胞が得られると、栄養膜細胞は、遺伝子疾患または染色体異常を明らかにする様々な方法に供することができる。
【００１１】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ他［Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ．ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ．（１９９２）、９９：５０８〜５１１］は、綿棒を用いて、または、生理食塩水で下部子宮頸管を洗浄することにより取り出された栄養膜細胞を使用して胎児の性別をＰＣＲに基づいて決定することを提示した。しかしながら、この方法は、子宮頸部における残存精液の結果としての偽陽性によって制限された。これらの制限を克服するために、ネスティドＰＣＲ法が、粘膜吸引または細胞採取用ブラシにより得られたサンプルに対して用いられた。これらの分析は胎児の性別予測のより大きな成功率をもたらした（Ｆａｌｃｉｎｅｌｌｉ  Ｃ．他、１９９８、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１８：１１０９〜１１１６）。しかしながら、精製されていない経子宮頸細胞からの直接的なＰＣＲ増幅は母体細胞の混入をもたらす可能性がある。
【００１２】
経子宮頸細胞に対するＰＣＲ分析およびＦＩＳＨ分析を使用するより近年の研究は胎児性別の不良な検出率をもたらしていた（Ｃｉｏｎｉ  Ｒ．他、２００３、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、２３：１６８〜１７１）。
【００１３】
従って、栄養膜細胞を経子宮頸細胞サンプルにおける優勢な母体細胞集団から識別するために、胎盤抗原に対する抗体が用いられた。
【００１４】
Ｍｉｌｌｅｒ他（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１９９９、１４：５２１〜５３１）は、経子宮頸による吸引または洗浄を使用して取り出された経子宮頸細胞から栄養膜細胞を同定するために様々な栄養膜特異的抗体（例えば、Ｆｔ１．４１．１、ＮＣＬ−ＰＬＡＰ、ＮＤＯＧ−１、ＮＤＯＧ−５および３４０）を使用した。これらの分析は２５％〜７９％の全体的な検出率をもたらし、３４０抗体が最も効果的な抗体であった。
【００１５】
Ｂｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｎ．他（Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、２００３、２３：３４〜３９）による別の研究では、胎児の性別を決定するために経子宮頸細胞におけるＦＩＳＨ分析が用いられた。この研究では、男の胎児を有する母体から取り出されたサンプルはすべてが、Ｙ特異的シグナルを有する少数の細胞を含有することが見出された。同時に、二連での経子宮頸サンプルを、絨毛外栄養膜のすべての集団を認識することができるヒト白血球抗原（ＨＬＡ−Ｇ）抗体（Ｇ２３３）（Ｌｏｋｅ、Ｙ．Ｗ．他、１９９７、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ、５０：１３５〜１４６；ＬｏｋｅおよびＫｉｎｇ、２０００、Ｂａｌｌｉｅｒｅｓ  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｃｌｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎａｅｃｏｌ、１４：８２７〜８３７）を使用するＩＨＣに供した。ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞がサンプルの５０％に存在していた（Ｂｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｎ．他（２００３）、上掲）。しかしながら、ＦＩＳＨ分析および栄養膜特異的ＩＨＣアッセイが別個のスライドガラスに対して行われたので、胎児の染色体異常を診断するためにこの方法を使用することは実際的ではなかった。
【００１６】
従って、上記の制限を有しない、胎児の性別を決定し、かつ／または胎児における染色体異常を同定する方法が必要であることは広く認められており、そのような方法を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の１つの局面によれば、胎児の性別を決定し、かつ／または、胎児の少なくとも１つの染色体異常を同定する方法が提供され、この方法は、（ａ）栄養膜含有細胞サンプルを免疫学的に染色して、それにより、少なくとも１個の栄養膜細胞を同定すること、および（ｂ）前記少なくとも１個の栄養膜細胞をインシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析に供して、それにより、胎児の性別を決定し、かつ／または、少なくとも１つの染色体異常を同定することを含む。
【００１８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、栄養膜含有細胞サンプルは子宮頸部および／または子宮から得られる。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、栄養膜含有細胞サンプルは、吸引、細胞採取用ブラシ、綿棒、子宮頸内洗浄および子宮内洗浄からなる群から選択される方法を使用して得られる。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、栄養膜細胞サンプルは妊娠の第６週〜第１５週の妊婦から得られる。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、免疫学的に染色することは、栄養膜特異的抗原に対する抗体を使用して行われる。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、栄養膜特異的抗原は、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＬＡＰ、ＰＡＲ−１、Ｇｌｕｔ１２、Ｈ３１５、ＦＴ１．４１．１、Ｉ０３、ＮＤＯＧ−１、ＮＤＯＧ−５、ＢＣ１、ＡＢ−３４０、ＡＢ−１５４および第ＸＩＩＩ因子からなる群から選択される。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、インシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析は、蛍光インシチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／またはプライムド・インシチュウ標識化（ＰＲＩＮＳ）を使用して行われる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、少なくとも１つの染色体異常は、異数性、転座、サブテロメア再配置、欠失、微小欠損、逆位および重複化からなる群から選択される。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、染色体異数性は完全トリソミーおよび／または部分的トリソミーである。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、トリソミーは、２１トリソミー、１８トリソミー、１３トリソミー、１６トリソミー、ＸＸＹ、ＸＹＹおよびＸＸＸからなる群から選択される。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、染色体異数性は完全モノソミーおよび／または部分的モノソミーである。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、モノソミーは、Ｘモノソミー、２１モノソミー、２２モノソミー、１６モノソミーおよび１５モノソミーからなる群から選択される。
【００２９】
本発明は、非侵襲的で、危険性のない出生前診断方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００３０】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３１】
図面の簡単な記述
本発明は、例としてだけであるが、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている細目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためだけのものであり、従って、本発明の原理および概念的局面の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図１は経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図１ａ、図１ｃ）およびＦＩＳＨ分析（図１ｂ、図１ｄ）を例示する顕微鏡写真である。２名の妊婦から妊娠の第７週（図１ａ〜図１ｂ、表１における事例７３）および第９週（図１ｃ〜図１ｄ、表１における事例８０）で得られた経子宮頸細胞を、ＨＬＡ−Ｇ抗体（ｍＡｂ７７５９、Ａｂｃａｍ）を使用するＩＨＣに供し、その後、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ５Ｊ１０−５１）のプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。赤みを帯びた細胞質を有するＨＬＡ−Ｇ陽性の絨毛外栄養膜細胞が示される（図１ａ、黒色の矢で印がつけられた細胞；図１ｃ、２つの黒色の矢で印が付けられた細胞分裂前の２つの細胞）。Ｙ染色体およびＸ染色体にそれぞれ対応する、それぞれの栄養膜細胞における１つのだけのオレンジ色シグナルおよび緑色シグナルに留意すること（図１ｂおよび図１ｄ、白色の矢）。このことは、それぞれの場合において、正常な男胎児の存在を明らかにしている。
図２は経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図２ａ）およびＦＩＳＨ分析（図２ｂ）を例示する顕微鏡写真である。妊娠第１１週の妊婦（図２ａ〜図２ｂ、表１における事例２２３）から得られた経子宮頸細胞を、ＰＬＡＰ抗体（Ｚｙｍｅｄ、カタログ番号１８−００９９）を使用するＩＨＣに供し、その後、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ５Ｊ１０−５１）のプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。赤みを帯びた細胞質を有するＰＬＡＰ陽性の絨毛細胞栄養芽層細胞が示される（図２ａ、黒色の矢）。Ｙ染色体およびＸ染色体にそれぞれ対応する、絨毛の細胞栄養芽層細胞における１つのだけのオレンジ色シグナルおよび緑色シグナルに留意すること（図２ｂ、白色の矢）。このことは、正常な男胎児の存在を明らかにしている。
図３は経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図３ａ）およびＦＩＳＨ分析（図３ｂ）を例示する顕微鏡写真である。妊娠第８週の妊婦（表１における事例７１）から得られた経子宮頸細胞を、ＨＬＡ−Ｇ抗体（ｍＡｂ７７５９、Ａｂｃａｍ）を使用するＩＨＣに供し、その後、ＬＳＩ  ２１ｑ２２オレンジプローブおよびＣＥＰ  Ｙグリーンプローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号＃５Ｊ１０−２４および＃５Ｊ１３−０２）を使用するＦＩＳＨ分析に供した。ＨＬＡ−Ｇ抗体の反応の後における栄養膜細胞の赤みを帯びた細胞質（図３ａ、白色の矢）、ならびに、第２１染色体およびＹ染色体にそれぞれ対応する３つのオレンジ色シグナルおよび１つの緑色シグナルの存在（図３ｂ、白色の矢）に留意すること。このことは男の胎児における２１トリソミーの存在を明らかにしている。
図４は経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図４ａ）およびＦＩＳＨ分析（図４ｂ）を例示する顕微鏡写真である。妊娠第６週の妊婦（表１における事例７６）から得られた経子宮頸細胞を、ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用するＩＨＣに供し、その後、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（ＡＢＢＯＴＴ、カタログ＃５Ｊ１０−５１）のプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。ＨＬＡ−Ｇ抗体の反応の後における栄養膜細胞の細胞質における赤みを帯びた色（図４ａ、黒色の矢）、ならびに、１つだけのＸ染色体に対応する１つだけの緑色シグナル（図４ｂ、白色の矢）に留意すること。このことは、ターナー症候群を有する女胎児の存在を明らかにしている。
図５は妊娠第７週の妊婦（表１における事例１６１）から得られた経子宮頸細胞（図５ａ〜図５ｂ）または胎盤細胞（図５ｃ）のＩＨＣ分析（図５ａ）およびＦＩＳＨ分析（図５ｂ、図５ｃ）を例示する顕微鏡写真である。図５ａ〜図５ｂ−経子宮頸細胞を、ＨＬＡ−Ｇ抗体（ｍＡｂ７７５９、Ａｂｃａｍ）を使用するＩＨＣに供し、次いで、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ＃５Ｊ１０−５１）のプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。２つの栄養膜細胞の細胞質における赤みを帯びた色（図５ａ、細胞番号１および２）、ならびに、１つの栄養膜細胞における２つのＸ染色体および１つだけのＹ染色に対応する２つの緑色シグナルおよび１つだけのオレンジ色シグナルの存在（図５ｂ、細胞番号１）、そして、別の栄養膜細胞における１つだけのＸ染色体および１つだけのＹ染色体に対応する１つだけの緑色シグナルおよび１つだけのオレンジ色シグナルの存在（図５ｂ、細胞番号２）に留意すること。このことは、栄養膜細胞におけるクラインフェルター症候群についてのモザイク現象を示している。図５ｃ−胎盤細胞を、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ＃５Ｊ１０−５１）のプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。１つの胎盤細胞における１つだけのＸ染色体および１つだけのＹ染色体に対応する１つだけの緑色シグナルおよび１つだけのオレンジ色シグナルの存在（図５ｃ、細胞番号１）、ならびに、別の胎盤細胞における２つのＸ染色体および１つだけのＹ染色体に対応する２つの緑色シグナルおよび１つだけのオレンジ色シグナルの存在（図５ｃ、細胞番号２）に留意すること。このことは、胎盤細胞におけるクラインフェルター症候群についてのモザイク現象を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、胎児の性別を決定し、かつ／または、胎児における少なくとも１つの染色体異常を同定する方法であって、出生前診断において使用することができる方法に関する。具体的には、本発明は、胎児に存在する遺伝子異常（例えば、染色体異数性、転座、逆位、欠失および微小欠損など）を明らかにするために使用することができる非侵襲性で、危険性のない出生前診断方法を提供する。
【００３３】
本発明の原理および操作は、図面および付随する説明を参照して、より良好に理解することができる。
【００３４】
発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、従って、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００３５】
胎児の異常の早期検出および遺伝的異常の出生前診断は、一般的な転座（例えば、ロバートソン転座）、染色体の欠失および／または微小欠損（例えば、アンゲルマン症候群、ディジョージ症候群）などの遺伝的疾患の保因者についても、様々な染色体異数性（例えば、ダウン症候群）について増大した危険性にさらされている（例えば、３５歳を超える）高齢の母体年齢の夫婦の場合と同様に非常に重要である。
【００３６】
出生前診断の現在の方法では、羊水穿刺または絨毛生検（ＣＶＳ）によって得られた胎児細胞について行われる細胞遺伝学的分析およびＦＩＳＨ分析が含まれる。しかしながら、羊水穿刺処置またはＣＶＳ処置は、染色体異常を予測することにおいて効率的ではあるが、処置に関連した流産の危険性がそれぞれ０．５％〜１％または２％〜４％ある。流産の危険性が比較的大きいので、羊水穿刺またはＣＶＳは３５歳未満の女性には勧められていない。このため、検査されていないことの結果として、ダウン症候群新生児の圧倒的多数（８０％）が実際には３５歳未満の女性に生まれている。従って、どの母体年齢においても、すべての女性に勧めることができる非侵襲的で、危険性のない出生前診断方法を開発することは重要である。
【００３７】
妊娠早期の母体血液における胎児の有核赤血球の発見は、多くの研究者に、これらの細胞を単離し、その細胞を遺伝子分析（例えば、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ）に供する方法を開発することを促している。しかしながら、母体血液中の有核胎児細胞の頻度はことのほか低い（０．００３５％）ので、ＮＲＢＣ細胞を、（例えば、Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ遠心分離またはＰｅｒｃｏｌｌ勾配密度遠心分離を使用して）最初に精製し、次いで、例えば、磁気活性化細胞分取（ＭＡＣＳ、Ｂｕｓｃｈ，Ｊ．他、１９９４、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１４：１１２９〜１１４０）、強磁性流体懸濁（Ｓｔｅｅｌｅ，Ｃ．Ｄ．他、１９９６、Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、３９：８０１〜８１３）、電荷流分離（Ｗａｃｈｔｅｌ，Ｓ．Ｓ．他、１９９６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、９８：１６２〜１６６）またはＦＡＣＳ分析（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｙ．他、２０００、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３９：２２４〜２３０）を使用して濃縮しなければならなかった。胎児ＮＲＢＣの回収は、そのような方法を使用して行うことができるが、限られた感度と連動した一定しない回収率は、胎児ＮＲＢＣを使用する診断技術の臨床適用を妨げていた（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｆ．Ｚ．他、２００２、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒ．Ｕｐｄａｔｅ、８：４９３〜５００）。
【００３８】
診断のための潜在的標的として同定されている別の胎児細胞タイプは栄養膜である。先行技術研究では、様々な抗体例えば、ＨＬＡ−Ｇ（Ｂｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｎ．他、２００３、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、２３：３４〜３９）、ＰＬＡＰ、ＦＴ１．４１．１、ＮＤＯＧ−１、ＮＤＯＧ−５および３４０（Ｍｉｌｌｅｒ他、１９９９、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１４：５２１〜５３１）などを使用する、経子宮頸試料における栄養膜細胞の同定が記載される。これらの研究において、抗体は経子宮頸試料の３０％〜７９％で栄養膜細胞を認識した。また、ＦＩＳＨ分析、ＰＣＲ分析および／または定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）分析は、二連の経子宮頸試料に対して行われたが、すべての男胎児のほぼ８０％〜９０％を同定することができた。しかしながら、ＤＮＡ分析（例えば、ＦＩＳＨ分析および／またはＰＣＲ分析）および免疫学的分析（例えば、ＩＨＣ分析）は別個のスライドガラスに対して行われたので、これらの方法は、胎児の染色体異常を診断するために実施することができなかった。
【００３９】
本発明を実施に移し、胎児の遺伝子診断を改善するために様々な取り組みにより実験しているとき、本発明者らは、胎児の性別を決定し、かつ／または、胎児の染色体異常を同定する非侵襲的で、危険性のない方法を考案している。
【００４０】
本明細書中下記、および下記の実施例の節の実施例１において記載されるように、本発明者らは、栄養膜特異的抗体（例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＰＬＡＰに対する栄養膜特異的抗体）で経子宮頸細胞を連続して染色し、その後、染色された細胞のＦＩＳＨ分析を行う方法を考案している。表１および下記の実施例の節の実施例１において示されるように、本発明の方法を使用することにより、胎児の染色体ＦＩＳＨパターンの正しい決定が、継続中の妊婦から、かつ／または妊娠中絶前に得られた栄養膜を含有する経子宮頸試料の９２．８９％において達成された。従って、このことは、結論として、本発明の方法は、胎児の遺伝子異常の診断において、先行技術の方法よりも実質的に正確であることを示している。
【００４１】
従って、本発明の１つの局面によれば、胎児の性別を決定し、かつ／または、胎児の少なくとも１つの染色体異常を同定する方法が提供される。本明細書中で使用される用語「胎児」は、任意の胚段階にある生まれる前のヒト子孫（すなわち、胚および／または胎児）を示す。
【００４２】
本明細書中で使用される「胎児の性別」は、胎児におけるＸ染色体および／またはＹ染色体の存在または非存在を示す。
【００４３】
本明細書中で使用される「染色体異常」は、異常な数の染色体（例えば、２１トリソミー、Ｘモノソミー）または染色体構造の異常（例えば、欠失、転座など）を示す。
【００４４】
本発明の方法によれば、胎児の性別および／または少なくとも１つの染色体異常の同定は、最初に栄養膜含有細胞サンプルを免疫学的に染色して、それにより、少なくとも１個の栄養膜細胞を同定し、続いて、同定された栄養膜細胞をインシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析に供して、それにより、胎児の性別を決定し、かつ／または、少なくとも１つの染色体異常を同定することによって行われる。
【００４５】
用語「栄養膜」は、哺乳動物の胚または胎児の胎盤に由来する上皮細胞を示す（栄養膜は典型的には子宮壁と接触している）。胎盤組織には３つのタイプの栄養膜細胞が存在する（絨毛細胞栄養芽層、合胞体栄養細胞および絨毛外栄養膜）。そのため、本明細書中で使用される用語「栄養膜」はこれらの細胞のいずれをも包含する。絨毛細胞栄養芽層細胞は、分化し、増殖し、子宮壁に侵入して、絨毛を形成する専門化した胎盤上皮細胞である。付着絨毛に存在する細胞栄養芽層は融合して、合胞体栄養細胞層を形成することができるか、または絨毛外栄養膜の柱状体を形成することができる（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．他、２００３、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００：４７〜５２）。
【００４６】
栄養膜含有細胞サンプルは、生存または非生存であっても、栄養膜を含む任意の生物学的サンプルであり得る。好ましくは、栄養膜含有細胞サンプルは、様々な妊娠段階の妊婦に由来する血液サンプルあるいは経子宮頸サンプルおよび／または子宮内サンプルである。
【００４７】
現在好ましい栄養膜サンプルは、妊婦の子宮頸部および／または子宮から得られるサンプル（それぞれ、経子宮頸サンプルおよび子宮内サンプル）である。
【００４８】
本発明の方法によって利用される栄養膜含有細胞サンプルは、数々の広く知られている細胞採取技術のいずれか１つを使用して得ることができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態によれば、栄養膜含有細胞サンプルは、粘膜吸引（Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，Ｊ．他、１９９７、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、３４：３０２〜３０５；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄ．およびＢｒｉｇｇｓ，Ｊ．、１９９６、Ｅａｒｌｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、４７：Ｓ９９〜Ｓ１０２）、細胞採取用ブラシ（Ｃｉｏｎｉ，Ｒ．他、２００３、Ｐｒｅｎｔ．Ｄｉａｇｎ．、２３：１６８〜１７１；Ｆｅｊｇｉｎ，Ｍ．Ｄ．他、２００１、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、２１：６１９〜６２１）、綿棒（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．他、１９９２、上掲）、子宮頸内洗浄（Ｍａｓｓａｒｉ，Ａ．他、１９９６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、９７：１５０〜１５５；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．他、１９９２、上掲；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ，Ｐ．Ａ．他、２００１、２２：６８８〜７０１）、および子宮内洗浄（Ｃｉｏｎｉ，Ｒ．他、２００２、Ｐｒｅｎｔ．Ｄｉａｇｎ．、２２：５２〜５５；Ｉｓｈａｉ，Ｄ．他、１９９５、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１５：９６１〜９６５；Ｃｈａｎｇ，Ｓ−Ｄ．他、１９９７、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１７：１０１９〜１０２５；Ｓｈｅｒｌｏｃｋ，Ｊ．他、１９９７、上掲；Ｂｕｓｓａｎｉ，Ｃ．他、２００２、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、２２：１０９８〜１１０１）を使用して得られる。様々な方法の比較については、Ａｄｉｎｏｌｆｉ，Ｍ．およびＳｈｅｒｌｏｃｋ，Ｊ．（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｕｐｄａｔｅ、１９９７、３：３８３〜３９２、および、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、２００１、４６：９９〜１０４）、Ｒｏｄｅｃｋ，Ｃ．他（Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１９９５、１５；９３３〜９４２）を参照のこと。細胞採取用ブラシ法は、本発明の栄養膜含有細胞サンプルを得る現時点での好ましい方法である。
【００５０】
細胞採取用ブラシ法において、Ｐａｐ塗沫標本のための細胞採取用ブラシ（例えば、ＭｅｄＳｃａｎｄ−ＡＢ、Ｍａｌｍｏ、スウェーデン）が外側子宮口から２ｃｍの最大深さに挿入され、そして、細胞採取用ブラシを完全に１回転（すなわち、３６０°）回転させながら取り出される。ブラシに捕捉された経子宮頸細胞を取り出すために、ブラシは、１％のペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質の存在下、２ｍｌ〜３ｍｌの組織培養培地（例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培地、これはＢｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ（イスラエル）から入手可能である）を含有する試験管の中に振り入れられる。経子宮頸細胞を顕微鏡用スライドガラス上で濃縮するために、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）スライドガラスが、例えば、Ｃｙｔｏｆｕｎｎｅｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｎｄｏｎ、英国）を使用して調製される。細胞遠心分離のために使用される条件は経子宮頸試料の濁度に依存することが理解される。試料がほんの少数の細胞を含有したならば、細胞は、最初に５分間遠心分離され、次いで、１ｍｌの新鮮な培地に懸濁される。調製されると、サイトスピンスライドガラスは、さらなる使用まで、９５％アルコールにおいて保存することができる。
【００５１】
表１および下記の実施例の節の実施例１において示されるように、細胞採取用ブラシ法を使用することにより、本発明者らは、採取された２５５個の経子宮頸試料のうちの２３０個において栄養膜含有細胞サンプルを得た。
【００５２】
栄養膜細胞は胎盤から子宮腔内に剥落するので、栄養膜含有細胞サンプルが、妊娠のおよそ第１３週〜１５週までであるが、子宮腔が存続する限り、取り出されるにちがいない（Ａｄｉｎｏｌｆｉ，Ｍ．およびＳｈｅｒｌｏｃｋ，Ｊ．（２００１、上掲）に総説される）。
【００５３】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、栄養膜含有細胞サンプルは妊娠の第６週〜１５週の妊婦から得られる。好ましくは、細胞は妊娠の第６週〜第１３週の間の妊婦から得られ、より好ましくは妊娠の第７週〜第１１週の間の妊婦から得られ、最も好ましくは妊娠の第７週〜第８週の間の妊婦から得られる。
【００５４】
妊娠期間中の正確な妊娠週の決定は十分に婦人科学および産科学の当業者の能力の範囲内であることが理解される。
【００５５】
栄養膜含有細胞サンプル（例えば、そのサイトスピン調製物）が得られると、栄養膜含有細胞サンプルは免疫学的染色に供される。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態によれば、免疫学的染色は、栄養膜特異的抗原に対する抗体を使用して行われる。
【００５７】
栄養膜特異的抗原に対する様々な抗体がこの分野では知られており、これらには、例えば、絨毛外栄養膜細胞に対して特異的な非古典的クラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原の一部分に対するＨＬＡ−Ｇ（Ｌｏｋｅ，Ｙ．Ｗ．他、１９９７、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５０：１３５〜１４６）、合胞体栄養細胞および／または細胞栄養芽層に対して特異的である抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）抗体（Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ｋ．他、２００１、絨毛栄養膜に関する先端原形質膜および基底原形質膜における胎盤アルカリホスファターゼの発現、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９：１１５５〜１１６４）、胎児細胞の表面に存在するヒト栄養膜の膜糖タンパク質と反応するＨ３１５抗体（Ｃｏｖｏｎｅ  ＡＥおよびＪｏｈｎｓｏｎ  ＰＭ、１９８６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７２：１７２〜１７３）、合胞体栄養細胞について特異的であるＦＴ１．４１．１抗体、および、Ｉ０３抗体（Ｒｏｄｅｃｋ，Ｃ．他、１９９５、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇ．、１５：９３３〜９４２）、合胞体栄養細胞について特異的であるＮＤＯＧ−１抗体（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｄ．他、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、１９９９、１４：５２１〜５３１）、絨毛外細胞栄養芽層について特異的であるＮＤＯＧ−５抗体（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｄ．他、１９９９、上掲）、ＢＣ１抗体（Ｂｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｎ．他、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１９９５、１５：１１４３〜１１５３）、合胞体栄養細胞および細胞栄養芽層、または合胞体栄養細胞に対してそれぞれ特異的であるＡＢ−１５４抗体またはＡＢ−３４０抗体（Ｄｕｒｒａｎｔ  Ｌ．他、１９９４、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１４：１３１〜１４０）、妊娠の第７週〜第１０週の期間中の胎盤細胞について特異的であるプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−１抗体（Ｃｏｈｅｎ  Ｓ．他、２００３、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２００：４７〜５２）、妊娠の第１０週〜第１２週の期間中の合胞体栄養細胞および絨毛外栄養膜に対して特異的であるグルコース輸送体タンパク質（Ｇｌｕｔ）−１２抗体（Ｇｕｄｅ  ＮＭ他、２００３、Ｐｌａｃｅｎｔａ、２４：５６６〜５７０）、そして、細胞栄養芽層外皮に対して特異的である抗第ＸＩＩＩ因子抗体（Ａｓａｈｉｎａ，Ｔ．他、２０００、Ｐｌａｃｅｎｔａ、２１：３８８〜３９３；Ｋａｐｐｅｌｍａｙｅｒ，Ｊ．他、１９９４、Ｐｌａｃｅｎｔａ、１５：６１３〜６２３）が含まれる。
【００５８】
免疫学的染色は、細胞表面に存在する抗原に対する標識抗体の結合に基づく。免疫学的染色手法の例には、蛍光標識された免疫組織化学（抗体にコンジュゲート化された蛍光性色素を使用する）、放射能標識された免疫組織化学（放射能標識（例えば、１２５Ｉ）抗体を使用する）、および免疫細胞化学［酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および発色性基質を使用する］が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明によって使用される免疫学的染色は免疫組織化学および／または免疫細胞化学である。
【００５９】
免疫学的染色の後には、好ましくは、染色されていない細胞成分に結合する色素を使用して細胞を対比染色することが続く。例えば、標識抗体が細胞の細胞質に存在する抗原に結合するならば、核染色（例えば、ヘマトキシリン−エオシン染色）が適切な対比染色である。
【００６０】
細胞に対する免疫学的染色を用いる様々な方法がこの分野では知られている。簡単に記載すると、経子宮頸試料における栄養膜細胞を検出するために、サイトスピンスライドガラスが７０％アルコール溶液で洗浄され、蒸留水に５分間浸けられる。その後、スライドガラスは加湿チャンバーに移され、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄される。顕微鏡用スライドガラスにおける経子宮頸細胞の位置を可視化するために、経子宮頸試料の境界に、例えば、Ｐａｐ  Ｐｅｎ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用して印がつけられる。内因性の細胞ペルオキシダーゼ活性を阻止するために、５０μｌの３％過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）溶液が室温での１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加えられ、その後、スライドガラスをＰＢＳにおいて３回洗浄する。抗体の非特異的な結合を避けるために、２滴のブロッキング試薬（例えば、Ｚｙｍｅｄ  ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）が加湿チャンバーでの１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加えられる。経子宮頸サンプル中の胎児栄養膜細胞を同定するために、アリコート（例えば、５０μｌ）の栄養膜特異的抗体［例えば、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（ｍＡｂ７７５９、Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）または抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼ抗体（ＰＬＡＰ、カタログ番号１８−００９９、Ｚｙｍｅｄ）］がスライドガラスに加えられる。その後、スライドガラスを加湿チャンバーにおいて６０分間、抗体とインキュベーションし、その後、スライドガラスをＰＢＳで３回洗浄する。結合した一次抗体を検出するために、２滴のビオチン化二次抗体（例えば、Ｚｙｍｅｄから入手可能なヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）が加湿チャンバーでの１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加えられる。二次抗体がＰＢＳで３回洗浄され、除かれる。ビオチン化二次抗体を明らかにするために、２滴の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄから入手可能）が加湿チャンバーでの１０分間のインキュベーションのために加えられ、その後、ＰＢＳにおける３回の洗浄が行われる。最後に、ＨＲＰ−コンジュゲート化ストレプトアビジンを検出するために、２滴のアミノエチルカルバゾール（ＡＢＣ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ／Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｚｙｍｅｄ）ＨＲＰ基質が加湿チャンバーでの６分間のインキュベーションのために加えられ、その後、ＰＢＳによる３回の洗浄が行われる。対比染色が、スライドガラスを２％のヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国、カタログ番号ＧＨＳ−２−３２）に２５秒間浸けることによって行われる。その後、スライドガラスは水道水で洗浄され、カバーガラスで覆われた。
【００６１】
図１〜図５および下記の実施例の節の実施例における表１に示されるように、栄養膜細胞が、抗ＨＬＡ−Ｇ抗体（ＭＥＭ−Ｇ／１、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７７５９、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）および／または抗ＰＬＡＰ抗体（Ｚｙｍｅｄ、カタログ番号１８−００９９、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用して、２５５個中２３０個の経子宮頸試料において検出された。
【００６２】
免疫学的染色の後、免疫学的に陽性の細胞（すなわち、栄養膜）が、（染色方法に依存して）蛍光顕微鏡または光学顕微鏡のもとで調べられ、また、好ましくは、例えば、ＣＣＤカメラを使用して写真撮影されることが理解される。同じサンプルの同じ栄養膜細胞をさらなる染色体分析および／またはＤＮＡ分析に供するために、スライドガラス上のそのような細胞の位置（すなわち、座標）が、その後の参照のために、顕微鏡または顕微鏡に接続されたコンピューターに保存される。同定および細胞座標の保存を可能にする顕微鏡システムの例には、Ｂｉｏ  Ｖｉｅｗ  Ｄｕｅｔ（商標）（Ｂｉｏ  Ｖｉｅｗ  ＬｔＤ．、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）、および、本質的にはＭｅｒｃｈａｎｔ，Ｆ．Ａ．およびＣａｓｔｌｅｍａｎ  Ｋ．Ｒ．（Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒ．Ｕｐｄａｔｅ、２００２、８：５０９〜５２１）に記載されるようなＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、英国）が含まれる。
【００６３】
前述されたように、栄養膜細胞が栄養膜含有細胞サンプルにおいて同定されると、栄養膜細胞はインシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析に供される。
【００６４】
本明細書中で使用される「インシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析」は、蛍光インシチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および／またはプライムド・インシチュウ標識化（ＰＲＩＮＳ）を使用する細胞内部の染色体および／またはＤＮＡの分析を示す。
【００６５】
本発明の方法によれば、免疫学的染色ならびにインシチュウ染色体分析および／またはＤＮＡ分析は同じ栄養膜含有細胞サンプルに対して連続して行われる。
【００６６】
特別な処理が、既に免疫学的に染色された細胞を別の染色方法（例えば、ＦＩＳＨ）のために修正可能にするために要求されることが理解される。そのような処理には、例えば、本質的には、下記の実施例の節の実施例１における「材料および実験方法」に、また、Ｓｔｒｅｈｌ  Ｓ．、Ａｍｂｒｏｓ  ＰＦ（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９３、６３：２４〜８）に記載されるように、結合した抗体の洗浄除去（例えば、水および段階的なエタノール系列を使用する）、細胞核の露出（例えば、メタノール−酢酸固定処理液を使用する）、および、タンパク質の消化（例えば、ペプシンを使用する）が含まれる。
【００６７】
間期染色体に対するＦＩＳＨ分析を用いる様々な方法がこの分野では知られている。簡単に記載すると、直接的に標識されたプローブ［例えば、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−５１）］がハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、ＬＳＩ／ＷＣＰ、Ａｂｂｏｔｔ）およびキャリアＤＮＡ（例えば、ヒトＣｏｔ１ＤＮＡ、Ａｂｂｏｔｔから入手可能）と混合される。このプローブ溶液を、例えば、経子宮頸サイトスピン試料を含有する顕微鏡スライドガラスに加え、スライドガラスをカバーガラスで覆う。プローブを含有するスライドガラスを７０℃で３分間変性し、さらに、ハイブリダイゼーション装置（例えば、ＨＹＢｒｉｔｅ、Ａｂｂｏｔｔカタログ番号２Ｊ１１−０４）を使用して３７℃で４８時間インキュベーションする。ハイブリダイゼーション後、スライドガラスを、６０ｍＭのＮａＣｌおよび６ｍＭのクエン酸Ｎａ（０．４ＸＳＳＣ）おける０．３％ＮＰ−４０（Ａｂｂｏｔｔ）の溶液において７２℃で２分間洗浄する。その後、スライドガラスを、２ＸＳＳＣにおける０．１％ＮＰ−４０の溶液に室温で１分間浸け、その後、スライドガラスを暗所で乾燥させる。対比染色を、例えば、ＤＡＰＩ  ＩＩ対比染色剤（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して行う。
【００６８】
ＰＲＩＮＳ分析が、遺伝子欠失の検出（Ｔｈａｒａｐｅｌ  ＳＡおよびＫａｄａｎｄａｌｅ  ＪＳ、２００２、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、１０７：１２３〜１２６）、胎児の性別の決定（Ｏｒｓｅｔｔｉ，Ｂ．他、１９９８、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１８：１０１４〜１０２２）、および染色体異数性の同定（Ｍｅｎｎｉｃｋｅ，Ｋ．他、２００３、Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．、１８：１１４〜１２１）において用いられている。
【００６９】
ＰＲＩＮＳ分析を行う様々な方法がこの分野では知られており、これらには、例えば、Ｃｏｕｌｌｉｎ，Ｐ．他（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、２００２、１０７：１２７〜１３５）；Ｆｉｎｄｌａｙ、Ｌ．他（Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９８、１５：２５８〜２６５）；Ｍｕｓｉｏ，Ａ．他（Ｇｅｎｏｍｅ、１９９８、４１：７３９〜７４１）；Ｍｅｎｎｉｃｋｅ，Ｋ．他（Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．、１８：１１４〜１２１）；Ｏｒｓｅｔｔｉ，Ｂ．他（Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１９９８、１８：１０１４〜１０２２）に記載される方法が含まれる。簡単に記載すると、間期染色体を含有するスライドガラスが、２ＸＳＳＣ（ｐＨ７．２）における７０％ホルムアミドの溶液において７１℃で２分間変性させられ、エタノール系列（７０％、８０％、９０％および１００％）で脱水され、プログラム可能な温度サイクラー（例えば、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）から入手可能な、ガラス製スライドガラスのために改造されたＰＴＣ−２００サーマルサイクラーなど）の平らなプレートブロックに置かれる。ＰＲＩＮＳ反応は通常、非標識プライマーと、標識されたｄＵＴＰ（例えば、直接的または間接的な検出のためにそれぞれ、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰまたはジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ）を伴う各ｄＮＴＰの混合物との存在下で行われる。あるいは、またはさらに、配列特異的なプライマーを、例えば、１−３フルオレセイン分子またはシアニン３（Ｃｙ３）分子を使用して５’末端において標識することができる。従って、典型的なＰＲＩＮＳ反応混合物は、配列特異的なプライマー（５０μｌの反応体積において５０ｐｍｏｌ〜２００ｐｍｏｌ）、非標識の各ｄＮＴＰ（０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび０．００２ｍＭのｄＴＴＰ）、標識されたｄＵＴＰ（０．０２５ｍＭ）、およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２ユニット）を適切な反応緩衝液とともに含む。スライドガラスが所望のアニーリング温度に達すると、反応混合物がスライドガラスに加えられ、スライドガラスが、カバーガラスを使用して覆われる。配列特異的なプライマーのアニーリングを１５分間行うことができ、その後、プライマーが結合した鎖を７２℃でさらに１５分間伸長させる。伸長後、スライドガラスを４ＸＳＳＣ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０の溶液において室温で３回（それぞれ４分ずつ）洗浄し、続いてＰＢＳで４分洗浄する。その後、スライドガラスは、ＤＡＰＩまたはヨウ化プロピジウムを使用する核の対比染色に供される。蛍光染色されたスライドガラスは、蛍光顕微鏡および適切なフィルター組合せ（例えば、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ−ローダミン）を使用して調べることができる。
【００７０】
数個の標的について特異的である数個のプライマーが、異なる５’コンジュゲートを使用して同じＰＲＩＮＳ処理について使用され得ることが理解される。従って、ＰＲＩＮＳ分析は、数個の遺伝子または染色体遺伝子座の存在および／または存在位置を明らかにするための多色アッセイとして使用することができる。
【００７１】
また、Ｃｏｕｌｌｉｎ他（２００２、上掲）において記載されるように、ＰＲＩＮＳ分析は、ＦＩＳＨ分析と同じスライドガラスに対して、好ましくはＦＩＳＨ分析の前に行うことができる。
【００７２】
まとめると、表１および下記の実施例の節の実施例１においてさらに示されるように、成功したＦＩＳＨ結果が、胎盤生検、羊水穿刺またはＣＶＳの胎児細胞を使用して得られた核型決定の結果によって確認されるように、栄養膜を含有する経子宮頸試料の９２．８９％において得られた。
【００７３】
染色体分析および／またはＤＮＡ分析が、栄養膜特異的抗体を使用して免疫学的に染色された同じ細胞に対して行われるので、本発明の方法は、胎児の性別を決定し、かつ／または胎児における少なくとも１つの染色体異常を同定するために使用することができる。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態によれば、染色体異常は、染色体異数性（すなわち、完全および／または部分的なトリソミーおよび／またはモノソミー）、転座、サブテロメア再配置、欠失、微小欠損、逆位、および／または重複化（すなわち、完全および／または部分的な染色体重複化）であり得る。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明によって検出されるトリソミーは、２１トリソミー［例えば、ＬＳＩ  ２１ｑ２２オレンジで標識されたプローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１３−０２）を使用して］、１８トリソミー［例えば、ＣＥＰ１８グリーンで標識されたプローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−１８）；ＣＥＰ（登録商標）１８（Ｄ１８Ｚ１、αサテライト）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ０８−１８）を使用して］、１６トリソミー［例えば、ＣＥＰ１６プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号６Ｊ３７−１７）を使用して］、１３トリソミー［例えば、ＬＳＩ（登録商標）１３ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１４−１８）を使用して］、および、ＸＸＹトリソミー、ＸＹＹトリソミーまたはＸＸＸトリソミー（これらは、例えば、ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジのプローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−５１）；および／またはＣＥＰ（登録商標）Ｘ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）／ＣＥＰ（登録商標）Ｙ（μサテライト）ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−５１）を使用して検出することができる）であり得る。
【００７６】
様々な染色体特異的なＦＩＳＨプローブまたはＰＲＩＮＳプライマーを使用することにより、様々な他のトリソミーおよび部分的なトリソミーが本発明の教示に従って胎児細胞において検出され得ることが理解される。これらには、部分的な１ｑ３２−４４トリソミー（Ｋｉｍｙａ  Ｙ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ．、２００２、２２：９５７〜６１）、１０ｐトリソミーを伴う９ｐトリソミー（Ｈｅｎｇｓｔｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｍ他、Ｆｅｔａｌ  Ｄｉａｇｎ  Ｔｈｅｒ、２００２、１７：２４３〜６）、４トリソミーのモザイク現象（Ｚａｓｌａｖ  ＡＬ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２０００、９５：３８１〜４）、１７ｐトリソミー（Ｄｅ  Ｐａｔｅｒ  ＪＭ他、Ｇｅｎｅｔ  Ｃｏｕｎｓ、２０００、１１：２４１〜７）、部分的な４ｑ２６−ｑｔｅｒトリソミー（Ｐｅｔｅｋ  Ｅ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、２０００、２０：３４９〜５２）、９トリソミー（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  Ｃ他、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、１９９７、１７：９３３〜４０）、部分的な２ｐトリソミー（Ｓｉｆｆｒｏｉ  ＪＰ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、１９９４、１４：１０９７〜９）、部分的な１ｑトリソミー（ＤｕＰｏｎｔ  ＢＲ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、１９９４、５０：２１〜７）、および部分的な６ｐトリソミー／６ｑモノソミー（Ｗａｕｔｅｒｓ  ＪＧ他、Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ、１９９３、４４：２６２〜９）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の方法はまた、流産に関与することが知られているいくつかの染色体モノソミー（例えば、２２モノソミー、１６モノソミー、２１モノソミーおよび１５モノソミーなど）を検出するために使用することができる（Ｍｕｎｎｅ，Ｓ．他、２００４、Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ、８：８１〜９０）。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって検出されるモノソミーは、Ｘモノソミー、２１モノソミー、２２モノソミー［例えば、ＬＳＩ２２（ＢＣＲ）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１７−２４）を使用して］、１６モノソミー（例えば、ＣＥＰ１６（Ｄ１６Ｚ３）（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号６Ｊ３６−１７）を使用して）、および１５モノソミー［例えば、ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ４）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号６Ｊ３６−１５）を使用して］であり得る。
【００７９】
いくつかの転座および微小欠損は保因者患者において無症状であり得るが、それにもかかわらず、重大な遺伝的疾患を子孫において引き起こし得ることが理解される。例えば、１５ｇ１１−ｑ１３の微小欠損を保有する健康な母体は、重症な神経変性障害であるアンゲルマン症候群の子供を出産する可能性がある。従って、本発明は、例えば、そのような欠失について特異的であるＦＩＳＨプローブを使用して、胎児におけるそのような欠失を同定するために使用することができる（Ｅｒｄｅｌ  Ｍ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９６、９７：７８４〜９３）。
【００８０】
従って、本発明はまた、親の一方がそのような異常の既知の保因者であるならば、何らかの染色体異常を検出するために使用することができる。これらには、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：小さい過剰マーカー染色体（ＳＭＣ）についてのモザイク（Ｇｉａｒｄｉｎｏ  Ｄ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００２、１１１：３１９〜２３）；ｔ（１１；１４）（ｐ１５；ｐ１３）転座（Ｂｅｎｚａｃｋｅｎ  Ｂ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、２００１、２１：９６〜８）；非平衡転座ｔ（８；１１）（ｐ２３．２；ｐ１５．５）（Ｆｅｒｔ−Ｆｅｒｒｅｒ  Ｓ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、２０００、２０：５１１〜５）；１１ｑ２３微小欠損（Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｋ、Ｙｕｒａ  Ｋ、Ｒｉｎｓｈｏ  Ｋｅｔｓｕｅｋｉ、２００４、４５：６１〜５）；スミス−マゲニス症候群１７ｐ１１．２．欠失（Ｐｏｔｏｃｋｉ  Ｌ他、Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ、２００３、５：４３０〜４）；２２ｑ１３．３欠失（Ｃｈｅｎ  ＣＰ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、２００３、２３：５０４〜８）；Ｘｐ２２．３微小欠損（Ｅｎｒｉｇｈｔ  Ｆ他、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、２００３、２０：１５３〜７）；１０ｐ１４欠失（Ｂａｒｔｓｃｈ  Ｏ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００３、１１７Ａ：１〜５）；２０ｐ微小欠損（Ｌａｕｆｅｒ−Ｃａｈａｎａ  Ａ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００２、１１２：１９０〜３）、ディ・ジョージ症候群［ｄｅｌ（２２）（ｑ１１．２ｑ１１．２３）］、ウィリアムズ症候群［７ｑ１１．２３および７ｑ３６の欠失、Ｗｏｕｔｅｒｓ  ＣＨ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００１、１０２：２６１〜５］；１ｐ３６欠失（Ｚｅｎｋｅｒ  Ｍ他、Ｃｌｉｎ  Ｄｙｓｍｏｒｐｈｏｌ、２００２、１１：４３〜８）；２ｐ微小欠損（Ｄｅｅ  ＳＬ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００１、３８：Ｅ３２）；神経線維腫症タイプ１（１７ｑ１１．２微小欠損、Ｊｅｎｎｅ  ＤＥ他、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、２００１、６９：５１６〜２７）；Ｙｑ欠失（Ｔｏｔｈ  Ａ他、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、２００１、２１：２５３〜５）；ウォルフ−ヒルシュホルン症候群（ＷＨＳ、４ｐ１６．３微小欠損、Ｒａｕｃｈ  Ａ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００１、９９：３３８〜４２）；１ｐ３６．２微小欠損（Ｆｉｎｅｌｌｉ  Ｐ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００１、９９：３０８〜１３）；１１ｑ１４欠失（Ｃｏｕｐｒｙ  Ｉ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２００１、３８：３５〜８）；１９ｑ１３．２微小欠損（Ｔｅｎｔｌｅｒ  Ｄ他、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２０００、３７：１２８〜３１）；ルビンシュタイン−テービ（１６ｐ１３．３微小欠損、Ｂｌｏｕｇｈ  ＲＩ他、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ、２０００、９０：２９〜３４）；７ｐ２１微小欠損（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ他、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９８、６３：１２８２〜９３）；ミラー・ディーカー症候群（１７ｐ１３．３）、１７ｐｌｌ．２欠失（Ｊｕｙａｌ  ＲＣ他、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９６、５８：９９８〜１００７）；２ｑ３７微小欠損（Ｗｉｌｓｏｎ  ＬＣ他、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、１９９５、５６：４００〜７）。
【００８１】
本発明は、逆位［例えば、逆転したＸ染色体（Ｌｅｐｒｅｔｒｅ，Ｆ．他、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、２００３、１０１：１２４〜１２９；Ｘｕ，Ｗ．他、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、２００３、１２０Ａ：４３４〜４３６）、逆転した第１０染色体（Ｈｅｌｓｚｅｒ，Ｚ．他、２００３、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、４４：２２５〜２２９）］、突発的なサブテロメア染色体再配置（Ｅｎｇｅｌｓ，Ｈ．他、２００３、Ｅｕｒ．Ｊ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ、１１：６４３〜６５１；Ｂｏｃｉａｎ，Ｅ．他、２００４、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．、１０：ＣＲ１４３〜ＣＲ１５１）、および／または重複化（Ｓｏｌｅｒ，Ａ．他、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．、２００３、２３：３１９〜３２２）を検出するために使用することができる。
【００８２】
従って、本発明の教示は、侵襲的で、危険性のある処置に母体をさらすことなく、胎児における染色体異常を同定するために使用することができる。
【００８３】
例えば、胎児の性別および／またはダウン症候群胎児（すなわち、２１トリソミー）の存在を本発明の教示に従って決定するために、経子宮頸細胞が、Ｐａｐ塗沫標本のための細胞採取ブラシを使用して妊娠の第７週〜第１１週の妊婦から得られる。細胞を１％ペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質の存在下でＲＰＭＩ−１６４０培地の組織培養培地（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）に懸濁し、サイトスピンスライドガラスを、Ｃｙｔｏｆｕｎｎｅｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｎｄｏｎ、英国）を製造者の説明書に従って使用して調製する。サイトスピンスライドガラスを、免疫組織化学的分析が行われるまで９５％アルコールにおいて脱水する。
【００８４】
免疫組織化学に先だって、サイトスピンスライドガラスは７０％アルコールおよび水において水和され、ＰＢＳで洗浄され、３％過酸化水素で処理され、その後、ＰＢＳにおいて３回洗浄され、ブロッキング試薬（Ｚｙｍｅｄ  ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）とインキュベーションされる。ＨＬＡ−Ｇ抗体（ｍＡｂ７７５９、Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）が、６０分間のインキュベーションのために、製造者の説明書に従ってスライドガラスに加えられ、その後、ＰＢＳにおける３回の洗浄が行われる。二次のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ  ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）が１０分間のインキュベーションのためにスライドガラスに加えられ、その後、ＰＢＳにおける３回の洗浄が行われる。その後、二次抗体が、ＨＲＰ−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ  ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）およびアミノエチルカルバゾール（ＡＢＣ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ／Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｚｙｍｅｄ）ＨＲＰ基質を製造者の説明書に従って使用して読み取られる。対比染色が、ヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国、カタログ番号ＧＨＳ−２−３２）を使用して行われる。免疫学的に染色された経子宮頸サンプルが、光学顕微鏡（ＡＸ  ７０  Ｐｒｏｖｉｓ、オリンパス、日本）およびそれに接続されたＣＣＤカメラ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、英国）を使用して調べられ、写真撮影され、そして、ＨＬＡ−Ｇ陽性栄養膜細胞の位置に、顕微鏡座標を使用して印が付けられる。
【００８５】
その後、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞を含有するスライドガラスは水で洗浄され、７０％エタノールおよび１００％エタノールにおいて脱水され、メタノール−酢酸（３：１の比率）固定処理液において１０分間固定処理され、その後、スライドガラスは２ＸＳＳＣの（３７℃の）温溶液において洗浄され、ＰＢＳにおける０．９％のホルムアルデヒドにおいて固定処理され、ＰＢＳにおいて洗浄される。ＦＩＳＨ分析の前に、スライドガラスはペプシン溶液（０．１Ｎ  ＨＣｌにおいて０．１５％）で消化され、エタノール系列において脱水され、乾燥される。
【００８６】
胎児の性別を決定するために、７μｌのＬＳＩ／ＷＣＰハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ）が、Ｘｐ１１．１−ｑ１１．１（ＤＸＺ１）およびＹｐ１１．１−ｑ１１．１（ＤＹＺ３）の動原体領域を含有する直接的に標識されたＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジのプローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−５１）の１μｌ、１μｌのヒトＣｏｔ１ＤＮＡ（１μｇ／μｌ、Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号０６Ｊ３１−００１）、および、２μｌの精製された２回蒸留水と混合される。プローブ−ハイブリダイゼーション溶液を１秒間〜３秒間遠心分離し、１１μｌのプローブ−ハイブリダイゼーション溶液が各スライドガラスに加えられ、その後、スライドガラスは、カバーガラスを使用して直ちに覆われる。その後、スライドガラスを７０℃で３分間変性させ、さらに、ＨＹＢｒｉｔｅ装置（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号２Ｊ１１−０４）において３７℃で４８時間インキュベーションする。インキュベーション後、スライドガラスを０．４ＸＳＳＣにおける０．３％ＮＰ−４０において洗浄し、続いて２ＸＳＳＣにおける０．１％ＮＰ−４０において洗浄して、暗所において乾燥させる。対比染色を、ＤＡＰＩ  ＩＩ（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して行う。その後、スライドガラスを、蛍光顕微鏡（ＡＸ−７０  Ｐｒｉｖｉｓ、オリンパス、日本）をＨＬＡ−Ｇ陽性細胞の以前に印が付けられた位置に従って使用して調べ、写真撮影する。
【００８７】
ダウン症候群胎児の存在または非存在を決定するために、最初の１組のＦＩＳＨ分析の後、スライドガラスは１ＸＳＳＣにおいて洗浄され（２０分間、室温）、その後、スライドガラスは、精製された２回蒸留水に７１℃で１０秒間浸けられる。その後、スライドガラスはエタノール系列において脱水され、乾燥される。ハイブリダイゼーションが、２１ｑ２２．１３〜２１ｑ２２．２領域内のＤ２１Ｓ２５９、Ｄ２１Ｓ３４１およびＤ２１Ｓ３４２の遺伝子座を含有するＬＳＩ  ２１ｑ２２オレンジ標識プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１３−０２）と、最初の１組のＦＩＳＨプローブについて使用されたのと同じハイブリダイゼーション条件および洗浄条件とを使用して行われる。２組目のＦＩＳＨプローブの後に得られるＦＩＳＨシグナルが、蛍光顕微鏡およびＨＬＡ−Ｇ陽性栄養膜細胞の同じ座標を使用して調べられる。
【００８８】
間期染色体に対する第１３染色体、第１８染色体、第２１染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体についてのＦＩＳＨプローブの使用は、臨床的に重要な異常についての残存危険性を、間期ＦＩＳＨアッセイ前の０．９％〜１０．１％から、正常な間期ＦＩＳＨパターンの後において０．６％〜１．５％に低下させることが見出された［Ｈｏｍｅｒ  Ｊ他、２００３、インシチュウハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）における間期蛍光による出生前診断後の細胞遺伝学的異常についての残存危険性、Ｐｒｅｎａｔ  Ｄｉａｇｎ、２３：５６６〜７１］。従って、本発明の教示は、出生前診断の効率的な方法を提供することによって、臨床的に異常な乳児を有する危険性を著しく低下させるために使用することができる。
【００８９】
出生前の父子鑑定が現在、ＰＣＲに基づく分析またはＲＦＬＰ分析を使用して、ＣＶＳおよび／または羊水穿刺による細胞サンプルに由来するＤＮＡサンプルに対して行われている（Ｓｔｒｏｍ  ＣＭ他、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ、１９９６、１７４：１８９４〜５３；Ｙａｍａｄａ  Ｙ他、２００１、Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｏｄｏｎｔｏｓｔｏｍａｔｏｌ．、１９：１〜４）。
【００９０】
出生前の父子鑑定もまた、レーザー捕捉顕微解剖を使用して、経子宮頸試料および／または子宮内試料に存在する栄養膜細胞に対して行われ得ることが理解される。
【００９１】
細胞のレーザー捕捉顕微解剖は、スライドガラス上に含有される不均一な細胞集団から特定の細胞タイプを選択的に単離するために使用される。レーザー捕捉顕微解剖を行う様々な方法がこの分野では知られている（例えば、米国特許出願第２００３０２２７６１１号（Ｆｅｉｎ，Ｈｏｗａｒｄ他）；Ｍｉｃｋｅ  Ｐ他、２００４、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、２０２：１３０〜８；Ｅｖａｎｓ  ＥＡ他、２００３、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１：５４；Ｂａｕｅｒ  Ｍ他、２００２、絨毛のレーザー顕微解剖を使用する妊娠中絶後の父子鑑定、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌｅｇａｌ  Ｍｅｄ．、１１６：３９〜４２；Ｆｅｎｄ，Ｆ．およびＲａｆｆｅｌｄ，Ｍ．、２０００、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、５３：６６６〜７２）。
【００９２】
例えば、栄養膜含有細胞サンプル（例えば、経子宮頸細胞のサイトスピンスライドガラス）が、レーザー活性化のときに特定の細胞に接着することができる選択的に活性化された表面（例えば、熱可塑性膜）と接触させられる。細胞サンプルは、本質的には下記の実施例の節の実施例１に記載されるように、（例えば、ＨＬＡ−Ｇ抗体またはＰＬＡＰ抗体を使用する）免疫学的染色に供される。免疫学的染色の後、細胞サンプルは、免疫学的に染色された栄養膜細胞（すなわち、それぞれＨＬＡ−Ｇ陽性細胞またはＰＬＡＰ陽性細胞）を同定するために顕微鏡を使用して調べられる。同定されると、［例えば、ＰＡＬＭ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｍシステム（ＰＡＬＭ  Ｍｉｃｒｏｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ、Ｂｅｒｎｒｅｉｄ、ドイツ）を使用して］光ファイバーを通って送られるレーザービームにより、選択された栄養膜細胞に接着する表面が活性化され、これにより、その顕微解剖および単離がもたらされる。
【００９３】
栄養膜細胞が単離されると、栄養膜細胞は、本質的にはＳｔｒｏｍ  ＣＭ他（上掲）およびＹａｍａｄａ  Ｙ他（上掲）に記載されるように、例えば、短いタンデム反復（ＳＴＲ）および／またはＤ１Ｓ８０遺伝子座に対して特異的なＰＣＲプライマー、ならびに／あるいは、多重遺伝子座（Ｍｙｏ）および単一遺伝子座（ｐＹＮＨ２４）に対して特異的なＲＦＬＰプローブを使用するＰＣＲ分析および／またはＲＦＬＰ分析に供することができる。
【００９４】
本特許の存続期間中において、多くの関連した染色方法が開発されることが予想され、従って、染色するという用語の範囲は、推測されるすべてのそのような新しい技術を包含することが意図される。
【００９５】
本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。
【００９６】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【００９７】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【００９８】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ著、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」（第３版）Ｎ．Ｙ．（１９９４年）；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕ���ｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；Ｃｈｏｏ，Ｋ．Ｈ．Ａ．編「Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４年）；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【００９９】
（実施例１）
経子宮頸試料から得られた絨毛外栄養膜細胞からの胎児ＦＩＳＨパターンの決定
妊娠の第６週〜第１５週の間の妊婦から得られた経子宮頸細胞を、下記のように、免疫学的染色、続くＦＩＳＨ分析を使用して分析した。
【０１００】
材料および実験方法
研究被験者−  妊娠中絶を受ける予定であるか、または進行中の妊娠の日常的な健康診断のために呼ばれた妊娠の第６週〜第１５週の間の妊婦が、そのインフォームドコンセントを与えた後で本研究に登録された。
【０１０１】
経子宮頸細胞のサンプル採取−  Ｐａｐ塗沫標本のための細胞採取用ブラシ（ＭｅｄＳｃａｎｄ−ＡＢ、Ｍａｌｍｏ、スウェーデン）を外側子宮口から２ｃｍの最大深さ（ブラシの長さ）に挿入し、細胞採取用ブラシを完全に１回転（すなわち、３６０°）回転させながら取り出した。ブラシに捕捉された経子宮頸細胞を取り出すために、ブラシを、１％のペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質の存在下、２ｍｌ〜３ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を含有する試験管の中に振り入れた。その後、サイトスピンスライドガラス（それぞれの経子宮頸試料から６枚のスライドガラス）を、経子宮頸細胞を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地の１滴〜３滴をＣｙｔｏｆｕｎｎｅｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｈａｎｄｏｎ、英国）に浸けることによって調製した。細胞遠心分離のために使用される条件は経子宮頸試料の濁度に依存した；試料がほんの少数の細胞を含有したならば、細胞は最初に５分間遠心分離され、次いで、１ｍｌの新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地とともに懸濁された。サイトスピンスライドガラスは９５％アルコールにおいて保存された。
【０１０２】
経子宮頸細胞の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色−  経子宮頸細胞を含有するサイトスピンスライドガラスを７０％アルコール溶液において洗浄し、蒸留水に５分間浸けた。ブロッキング試薬を含めて、ＰＢＳにおける洗浄はすべて、スライドガラスを穏やかに振とうしながら行われた。その後、スライドガラスを加湿チャンバーに移し、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。顕微鏡用スライドガラスにおける経子宮頸細胞の位置を可視化するために、経子宮頸試料の境界に、例えば、Ｐａｐ  Ｐｅｎ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用して印をつけた。５０μｌの３％過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）溶液を室温での１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加え、その後、スライドガラスをＰＢＳにおいて３回洗浄した。抗体の非特異的な結合を避けるために、２滴のブロッキング試薬（Ｚｙｍｅｄ  ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）を加湿チャンバーでの１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加えた。経子宮頸サンプルにおける胎児栄養膜細胞を同定するために、抗体希釈溶液（Ｚｙｍｅｄ）において１：２００希釈された、絨毛外栄養膜細胞に対して特異的な非古典的クラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原のＨＬＡ−Ｇ抗体（ｍＡｂ７７５９、Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）部（Ｌｏｋｅ，Ｙ．Ｗ．他、１９９７、Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５０：１３５〜１４６）の５０μｌ、あるいは、抗体希釈溶液において１：２００希釈された、合胞体栄養細胞および／または細胞栄養芽層に対して特異的な抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼ抗体（ＰＬＡＰ、カタログ番号１８−００９９、Ｚｙｍｅｄ）（Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ｋ．他、２００１、絨毛栄養膜に関する先端原形質膜および基底原形質膜における胎盤アルカリホスファターゼ発現、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４９：１１５５〜１１６４）の５０μｌをスライドガラスに加えた。スライドガラスを加湿チャンバーにおいて６０分間、抗体とインキュベーションし、その後、ＰＢＳで３回洗浄した。結合した一次ＨＬＡ−Ｇ特異的抗体を検出するために、２滴の二次のビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ  ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）を加湿チャンバーでの１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加えた。二次抗体をＰＢＳで３回洗浄した。ビオチン化二次抗体を明らかにするために、２滴の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｚｙｍｅｄ、ＨＩＳＴＯＳＴＡＩＮ（登録商標）−ＰＬＵＳキット、カタログ番号８５８９４３）を加湿チャンバーでの１０分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加え、その後、ＰＢＳにおいて３回洗浄した。最後に、ＨＲＰ−コンジュゲート化ストレプトアビジンを検出するために、２滴のアミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ／Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｚｙｍｅｄ）ＨＲＰ基質を��湿チャンバーでの６分間のインキュベーションのために各スライドガラスに加え、その後、ＰＢＳで３回洗浄した。対比染色を、スライドガラスを２％のヘマトキシリン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国、カタログ番号ＧＨＳ−２−３２）に２５秒間浸けることによって行い、その後、スライドガラスを水道水で洗浄し、カバーガラスで覆った。
【０１０３】
免疫組織化学的染色の顕微鏡分析−  経子宮頸細胞を含有する免疫染色されたスライドガラスを、光学顕微鏡（ＡＸ−７０，Ｐｒｏｖｉｓ、オリンパス、日本）を使用して走査し、染色された細胞（栄養膜）の存在位置に顕微鏡での座標数値を使用して印を付けた。
【０１０４】
ＦＩＳＨ分析前の免疫組織化学的染色スライドガラスの前処理−免疫染色の後、スライドガラスを２回蒸留水に５分間浸け、７０％エタノールおよび１００％エタノールにおいてそれぞれ５分ずつ脱水し、メタノール−酢酸（３：１の比率で、Ｍｅｒｃｋ）固定処理剤溶液において１０分間、固定処理した。その後、スライドガラスを、ｐＨ７．０〜７．５における３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのクエン酸Ｎａ（２ＸＳＳＣ）の（３７℃の）温溶液において１０分間、浸けた。インキュベーション後、過剰な２ＸＳＳＣ溶液を捨て、スライドガラスをＰＢＳにおける０．９％ホルムアルデヒドの溶液において室温で１５分間固定処理した。その後、スライドガラスをＰＢＳにおいて１０分間洗浄し、細胞を０．０１ＮのＨＣｌにおける０．１５％のペプシン（Ｓｉｇｍａ）の溶液において３７℃で１５分間消化した。ペプシン消化後、スライドガラスをＰＢＳにおいて１０分間洗浄し、乾燥させた。完全な脱水を確実にするために、スライドガラスを、７０％エタノール、８５％エタノールおよび１００％エタノールに浸け（それぞれ１分ずつ）、４５℃〜５０℃のインキュベーションにおいて乾燥した。
【０１０５】
ＦＩＳＨプローブ−  ＦＩＳＨ分析を、二色技術および下記の直接的に標識されたプローブ（Ａｂｂｏｔｔ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、米国）を使用して行った：
【０１０６】
性染色体：ＣＥＰ  ＸグリーンおよびＹオレンジ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−５１）；ＣＥＰ（登録商標）Ｘ  ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）／ＣＥＰ（登録商標）Ｙ（μサテライト）ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−５１）；ＣＥＰ  Ｘ／Ｙは、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）で直接的に標識された、動原体領域Ｙｐ１１．１−ｑ１１．１（ＤＹＺ３）内に含有されるμサテライトＤＮＡに対して特異的なプローブと混合された、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）で直接的に標識された動原体領域Ｘｐ１１．１−ｑ１１．１（ＤＸＺ１）特異的なμサテライトＤＮＡからなる。
【０１０７】
第２１染色体：ＬＳＩ  ２１ｑ２２オレンジで標識化されたもの（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１３−０２）。このＬＳＩ  ２１ｑ２２プローブは、第２１染色体の長腕における２１ｑ２２．１３〜２１ｑ２２．２の領域に存在するＤ２１Ｓ２５９遺伝子座、Ｄ２１Ｓ３４１遺伝子座およびＤ２１Ｓ３４２遺伝子座に対して相補的な特異なＤＮＡ配列を含有する。
【０１０８】
第１３染色体：網膜芽細胞腫遺伝子座（ＲＢ−１１３）と、第１３染色体の１３ｑ１４領域に対して特異的な配列とを含むＬＳＩ（登録商標）１３ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ（商標）プローブ（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１４−１８）。
【０１０９】
第１８染色体：ＣＥＰ１８グリーンで標識されたもの（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ１０−１８）；ＣＥＰ（登録商標）１８（Ｄ１８Ｚ１、αサテライト）ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ（商標）（ＡＢＢＯＴＴ、カタログ番号５Ｊ０８−１８）。このＣＥＰ１８プローブは、第１８染色体の動原体領域（１８ｐ１１．１−ｑ１１．１）に含有されるαサテライトＤＮＡ（Ｄ１８Ｚ１）に対して特異的なＤＮＡ配列からなる。
【０１１０】
第１６染色体：ＣＥＰ１６（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号６Ｊ３７−１７）プローブは第１６染色体の動原体領域（サテライトＩＩ、Ｄ１６Ｚ３）（１６ｑ１１．２）にハイブリダイゼーションする。このＣＥＰ１６プローブはスペクトルグリーン蛍光団により直接的に標識されている。
【０１１１】
ＡｎｅｕＶｙｓｉｏｎプローブ：第１８染色体のためのＣＥＰプローブ（水色）、Ｘ染色体のためのＣＥＰプローブ（緑色）、Ｙ染色体のためのＣＥＰプローブ（オレンジ色）、ならびに、第１３染色体のためのＬＳＩプローブ（緑色）、および第２１染色体のためのＬＳＩプローブ（オレンジ色）。このＦＤＡ承認キット（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号５Ｊ３７−０１）は、陽性および陰性のコントロールスライドガラス、２０ＸＳＳＣ、ＮＰ−４０、ＤＡＰＩ  ＩＩ対比染色剤、および詳細な添付文書を含む。
【０１１２】
免疫組織化学染色されたスライドガラスに対するＦＩＳＨ分析−  ハイブリダイゼーションに先だって、７μｌのＬＳＩ／ＷＣＰハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ）を、１μｌの直接的に標識されたプローブ（本明細書中上記参照）、１μｌのヒトＣｏｔ１ＤＮＡ（１μｌ／μｌ）（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号０６Ｊ３１−００１）、および２μｌの精製２回蒸留水と混合した。このプローブハイブリダイゼーション溶液を１秒間〜３秒間遠心分離し、１１μｌのプローブハイブリダイゼーション溶液を各スライドガラスに加え、その後、スライドガラスを、カバースリップを使用して直ちに覆った。
【０１１３】
インシチュウハイブリダイゼーションを、融解温度を７０℃に設定し、融解時間を３分間にすることによってＨＹＢｒｉｔｅ装置（Ａｂｂｏｔｔ、カタログ番号２Ｊ１１−０４）において行った。ハイブリダイゼーションを３７℃で４８時間行った。
【０１１４】
ハイブリダイゼーション後、スライドガラスを、６０ｍＭのＮａＣｌおよび６ｍＭのクエン酸Ｎａ（０．４ＸＳＳＣ）における０．３％のＮＰ−４０（Ａｂｂｏｔｔ）の溶液において７２℃で２分間洗浄した。その後、スライドガラスを２ＸＳＳＣにおける０．１％のＮＰ−４０の溶液に室温で１分間浸け、その後、スライドガラスを暗所で乾燥させた。対比染色を、１０μｌのＤＡＰＩ  ＩＩ対比染色剤（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して行い、その後、スライドガラスを、カバースリップを使用して覆った。
【０１１５】
反復したＦＩＳＨ分析にスライドガラスを供すること−  数枚のスライドガラスについては、ＦＩＳＨ分析を、異なる組のプローブを使用して繰り返した。最初の１組のＦＩＳＨプローブによるハイブリダイゼーションの後、スライドガラスを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１５ｍＭのクエン酸Ｎａ（１ＸＳＳＣ）において２０分間洗浄し、その後、スライドガラスを、精製された２回蒸留水に１０秒間、７１℃で浸けた。その後、スライドガラスを、７０％、８５％および１００％のエタノール系列においてそれぞれ２分間ずつ脱水し、４５℃〜５０℃のインキュベーターにおいて乾燥した。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄は、本明細書中上記に記載されるように行われた。
【０１１６】
ＦＩＳＨ結果の顕微鏡評価−  ＦＩＳＨ分析後、栄養膜細胞（すなわち、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞）を、免疫組織化学的染色の後で得られた印が付けられた座標を使用して同定し、そのような細胞におけるＦＩＳＨシグナルを、蛍光顕微鏡（ＡＸ−７０Ｐｒｏｖｉｓ、オリンパス、日本）を使用して調べた。
【０１１７】
胎盤組織のサンプル採取および加工−  約０．２５ｃｍ２の生検胎盤組織片を妊娠中絶の後で得た。胎盤組織を、メスを使用して小片に押しつぶし、ＫＣｌ（４３ｍＭ）およびクエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）を１：１の比率で含有する溶液において３回洗浄して、室温で１３分間インキュベーションした。その後、胎盤組織を、３滴のメタノール−酢酸（３：１の比率での）固定処理剤溶液を３分間のインキュベーションのために加えることによって固定処理し、その後、溶液を室温での４５分間のインキュベーションのために新鮮な３ｍｌの固定処理剤溶液で置き換えた。胎盤組織を細胞懸濁物に解離させるために、固定処理剤溶液を、振とうしながら１０秒間のインキュベーションのために１ｍｌ〜２ｍｌの６０％酢酸で置き換えた。その後、胎盤細胞懸濁物をスライドガラスに載せ、風乾した。
【０１１８】
進行中の妊娠における染色体ＦＩＳＨ分析の確認−  羊水穿刺および絨毛生検（ＣＶＳ）を、染色体の核型を明らかにするために使用し、超音波走査（ＵＳ）を、進行中の妊娠における胎児の性別を決定するために使用した。
【０１１９】
実験結果
絨毛外栄養膜細胞が母体の経子宮頸細胞の中に同定された−  絨毛外栄養膜を同定するために、経子宮頸試料を妊婦（妊娠の第６週〜第１５週）から調製し、経子宮頸細胞を、ＨＬＡ−Ｇ抗体を使用する免疫組織化学的染色に供した。表１（本明細書中下記）に示されるように、ＨＬＡ−Ｇ抗体および／またはＰＬＡＰ抗体を使用するＩＨＣ染色は、２５５個のうちの２３０個の経子宮頸試料において絨毛外細胞、合胞体栄養細胞または細胞栄養芽層細胞を同定することができた。２５個の経子宮頸試料（全事例の１０％）において、経子宮頸細胞は栄養膜細胞を含まなかった。数例において、患者は、反復した経子宮頸サンプル採取のために呼ばれ、栄養膜の存在が確認された（示されず）。表１（本明細書中下記）から計算され得るように、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞の平均数は経子宮頸試料あたり６．６７個であった（６枚のサイトスピンスライドガラスのすべてを含む）。
【０１２０】
絨毛外栄養膜細胞がＦＩＳＨ分析に供された−  ＩＨＣ染色後、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞またはＰＬＡＰ陽性細胞を含有するスライドガラスをホルムアルデヒド処理およびペプシン処理に供し、その後、ＦＩＳＨ分析を、直接的に標識されたＦＩＳＨプローブを使用して行った。表１（本明細書中下記）のデータから計算され得るように、ＦＩＳＨプローブを使用して印が付けられた細胞の平均数は３．４４であった。ほとんどの場合、ＦＩＳＨの結果は、胎盤組織の細胞の核型決定から得られた結果（妊娠中絶の場合）、あるいは、ＣＶＳおよび／または羊水穿刺の細胞の核型決定から得られた結果（進行中の妊娠の場合）と比較された。一部の事例では、胎児の性別の確認が、超音波走査を使用して行われた。
【表１】
2006523100.tif 000002
2006523100.tif 000003
2006523100.tif 000004
2006523100.tif 000005
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2006523100.tif 000007
2006523100.tif 000008
2006523100.tif 000009
表１：胎児ＦＩＳＨパターンの決定の成功（＋）または失敗（−）が、胎盤生検、ＣＶＳまたは羊水穿刺を使用して、ＩＨＣ陽性細胞およびＦＩＳＨ陽性細胞の数、ならびに、性別および／または染色体異常の決定とともに示される。Ｇｅｓｔ．＝妊娠期間；「偽」＝母体細胞に対するＨＬＡ−Ｇ抗体もしくはＰＬＡＰ抗体の非特異的な結合、および／または、ＦＩＳＨ分析後の残存抗体由来のシグナル；＊＝細胞数が少ないためにモザイク現象の同定の失敗。
【０１２１】
経子宮頸試料に存在する絨毛外栄養膜における正常な男胎児の同定−  妊娠の第７週および第９週の２名の異なる妊婦（それぞれ、本明細書中上記の表１の事例７３および事例８０）から得られた経子宮頸細胞を含有するスライドガラスをＨＬＡ−ＧのＩＨＣ染色に供した。図１ａおよび図１ｃに示されるように、両方の経子宮頸試料はＨＬＡ−Ｇ陽性細胞（すなわち、絨毛外栄養膜）を含んでいた。胎児の性別を決定するために、ＩＨＣ染色の後、スライドガラスを、ＣＥＰ  ＸプローブおよびＹプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。図１ｂおよび図１ｄに示されるように、男胎児に対応する正常なＦＩＳＨパターンがそれぞれの場合において検出された。これらの結果は、胎児細胞のＦＩＳＨパターンを決定することにおける経子宮頸試料の使用を明らかにしている。
【０１２２】
ＦＩＳＨパターンを、ＰＬＡＰ抗体を使用して、経子宮頸試料に存在する細胞栄養芽層細胞において首尾良く決定することができる−  妊娠第１１週の妊婦から得られた経子宮頸細胞を、合胞体栄養細胞および絨毛細胞栄養芽層細胞を同定することができる抗ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）抗体（Ｍｉｌｌｅｒ他、１９９９、Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．、１４：５２１〜５３１）を使用するＩＨＣ染色に供した。図２ａに示されるように、ＰＬＡＰ抗体は経子宮頸試料における絨毛細胞栄養芽層細胞を同定することができた。ＣＥＰ  ＸプローブおよびＹプローブを使用するＦＩＳＨ分析の後、絨毛細胞栄養芽層細胞における１つだけのオレンジ色シグナルおよび１つだけの緑色シグナルの存在（図２ｂ、白色の矢）により、正常な男胎児の存在が確認された。
【０１２３】
経子宮頸試料における絨毛外栄養膜を使用するダウン症候群（２１トリソミー）の診断−  妊娠第８週の妊婦（本明細書中上記の表１の事例７１）から得られた経子宮頸細胞をＨＬＡ−ＧのＩＨＣ染色に供し、続いて、Ｙ染色体および第２１染色体に対して特異的なプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。図３ａ〜図３ｂに示されるように、ＨＬＡ−Ｇ陽性細胞（図３ａ、白色の矢で印が付けられた細胞）は、３つのオレンジ色シグナルと、１つだけの緑色シグナルとを含有した（図３ｂ）。このことは、男胎児の絨毛外栄養膜における２１トリソミー（すなわち、ダウン症候群）の存在を示している。これらの結果は、経子宮頸試料調製物においてダウン症候群を有する胎児を同定するという使用を示唆している。
【０１２４】
経子宮頸細胞を使用するターナー症候群（Ｘ０）の診断−  妊娠第６週の妊婦（本明細書中上記の表１の事例７６）から得られた経子宮頸細胞をＨＬＡ−ＧのＩＨＣ染色に供し、続いて、Ｘ染色体およびＹ染色体に対して特異的なプローブを使用するＦＩＳＨ分析に供した。図４ａ〜図４ｂに示されるように、ＨＬＡ−Ｇ陽性の絨毛外栄養膜細胞におけるＦＩＳＨ分析後の１つだけの緑色シグナルの存在（図４ａ）は、女胎児におけるターナー症候群（すなわち、Ｘ０）の存在を示していた。これらの結果は、経子宮頸試料調製物においてターナー症候群を有する胎児を同定するという使用を示唆している。
【０１２５】
経子宮頸細胞を使用するクラインフェルターモザイク現象の診断−  経子宮頸細胞のサイトスピンスライドガラスを、妊娠中絶を受ける予定である妊娠第７週の妊婦（本明細書中上記の表１の事例１６１）から調製した。図５ａ〜図５ｂに示されるように、１つの絨毛外栄養膜細胞（図５ｂ、細胞番号２）は正常なＦＩＳＨパターン（すなわち、１つだけのＸ染色体および１つだけのＹ染色体）を示した一方で、別の栄養膜細胞（図５ｂ、細胞番号１）は、２つのＸ染色体および１つだけのＹ染色体を有する異常なＦＩＳＨパターンを示した。これらの結果は、男胎児におけるクラインフェルターモザイク現象の存在を示唆していた。これらの結果を確認するために、妊娠中絶後に得られた胎盤組織に由来する細胞を同じＦＩＳＨ分析に供した。図５ｃに示されるように、クラインフェルターモザイク現象の存在が胎盤細胞において確認された。従って、染色体のモザイク現象を経子宮頸試料において検出することができる。しかしながら、そのような同定は、栄養膜細胞内のモザイク細胞の割合だけでなく、経子宮頸試料に存在する栄養膜細胞（すなわち、ＩＨＣ陽性細胞）の総数に依存し得ることが理解される。
【０１２６】
本発明の組み合わされた検出方法により、進行中の妊娠から、また、妊娠中絶の前に得られた栄養膜を含有する経子宮頸試料の９２．８９％において胎児ＦＩＳＨパターンが首尾良く決定された−  表１（本明細書中上記）には、妊娠中絶前の妊娠の第６週〜第１５週の間の妊婦（事例１〜１６５、表１）から、または、日常的な健康診断のときの妊婦（事例１６６〜２５５、表１、進行中の妊娠）から調製された２５５個の経子宮頸試料に対して行われたＩＨＣ分析およびＦＩＳＨ分析の結果がまとめられている。経子宮頸試料において胎児のＦＩＳＨパターンを決定することにおける本発明の組み合わせられた検出方法（すなわち、ＩＨＣ分析およびＦＩＳＨ分析）の全体的な成功率は７６．８６％である。２５５例中２５例において、ＦＩＳＨ分析は、不十分なＩＨＣ陽性細胞のために行われなわれず、また、２５５例中１９例において、ＦＩＳＨパターンが、ＦＩＳＨアッセイの失敗の結果として決定されなかった（表１、「−」で印が付けられた事例）。残る２１１例の中で、９２．８９％において、胎児のＦＩＳＨパターンが、胎盤生検、羊水穿刺またはＣＶＳの胎児細胞を使用して得られる核型の結果によって確認されるように、栄養膜を含有する経子宮頸試料において首尾良く決定された（表１、「＋」で印が付けられた事例）。２１１例中１５例（すなわち、７．１１％）において、ＦＩＳＨ分析が、ＨＬＡ−Ｇ抗体またはＰＬＡＰ抗体と非特異的に相互作用し、従って、母体細胞に対するＦＩＳＨハイブリダイゼーションをもたらした細胞に対して行われた（表１、「偽」で印が付けられた事例）。栄養膜特異的抗体（例えば、ＨＬＡ−ＧまたはＰＬＡＰ）と非特異的に相互作用した細胞の割合は、抗体調製またはＩＨＣアッセイ条件を改善することによって低下することが予想されることが理解される。
【０１２７】
本発明の組み合わされた検出方法により、進行中の妊娠に由来する栄養膜を含有する経子宮頸試料の８７．３４％において胎児ＦＩＳＨパターンが首尾良く決定された−  表１（本明細書中上記）から計算され得るように、進行中の妊娠に由来する栄養膜を含有する経子宮頸試料を使用して胎児細胞におけるＦＩＳＨパターンを決定することにおける全体的な成功率は７６．６７％である。日常的な健康診断（すなわち、進行中の妊娠）のときの妊婦から得られた合計で９０個の経子宮頸試料（事例１６６〜２５５、表１）のうち、１１個の経子宮頸試料（１２．２％）がＩＨＣ陰性細胞を含んでいた。残る７９個の経子宮頸試料の中で、８個のＩＨＣ陽性サンプルにおいて、抗体が母体細胞と非特異的に相互作用し、これにより、母体染色体のＦＩＳＨパターンがもたらされ、（「偽」と印が付けられた事例、表１）、１個の経子宮頸試料（事例番号２４７、表１）は、サンプルにおける栄養膜細胞の数が少ないために、ＸＹ／ＸＸＹモザイク現象を同定することができず、しかしながら、ＸＹ細胞を同定することができ、また、１個の経子宮頸試料（事例番号１７４、表１）は、ＦＩＳＨアッセイに伴う技術的問題のために失敗した。まとめると、ＦＩＳＨパターンを、７９例中６９例（８７．３４％）のＩＨＣ陽性（すなわち、栄養膜含有）経子宮頸試料において決定することに成功した。
【０１２８】
まとめると、これらの結果は、胎児栄養膜のＦＩＳＨパターンを決定するための経子宮頸細胞の使用を明らかにしている。さらに、進行中の妊娠における経子宮頸試料から得られた結果は、胎児の性別および一般的な染色体異常（例えば、トリソミーおよびモザイク現象など）を明らかにするために、日常的な出生前診断における経子宮頸細胞の使用を示唆している。より具体的には、本発明の組み合わせられた検出方法は、ＦＩＳＨ分析を使用して検出することができる染色体異常に関連する疾患の出生前診断において使用することができ、特に、親の一方がそのような疾患の保因者（例えば、ロバートソン転座ｔ（１４；２１）、平衡した相互転座ｔ（１；１９）、微小欠損症候群（例えば、ディジョージ症候群、ミラー・ディーカー症候群）、既知の逆位（例えば、第７染色体、第１０染色体）などの保因者）である場合において使用することができる。
【０１２９】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個に又は適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０１３０】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。本明細書に記載のすべての刊行物、特許及び特許願は、あたかも、個々の刊行物、特許又は特許願各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１ａ−ｂ】経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図１ａ）およびＦＩＳＨ分析（図１ｂ）を例示する顕微鏡写真である。
【図１ｃ−ｄ】経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図１ｃ）およびＦＩＳＨ分析（図１ｄ）を例示する顕微鏡写真である。
【図２】経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図２ａ）およびＦＩＳＨ分析（図２ｂ）を例示する顕微鏡写真である。
【図３】経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図３ａ）およびＦＩＳＨ分析（図３ｂ）を例示する顕微鏡写真である。
【図４】経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図４ａ）およびＦＩＳＨ分析（図４ｂ）を例示する顕微鏡写真である。
【図５ａ−ｂ】妊娠第７週の妊婦（表１における事例１６１）から得られた経子宮頸細胞のＩＨＣ分析（図５ａ）およびＦＩＳＨ分析（図５ｂ）を例示する顕微鏡写真である。
【図５ｃ】妊娠第７週の妊婦（表１における事例１６１）から得られた胎盤細胞のＦＩＳＨ分析を例示する顕微鏡写真である。
【図１ａ−ｂ】
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【図１ｃ−ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−ｂ】
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【図５ｃ】
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【国際調査報告】
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